(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉鎖系での細胞凝集体の増殖方法であって、
揺動プラットフォームバイオリアクター上の細胞培養容器の設置と、
容器内での凝集体形成と、
容器内での細胞凝集体の自動灌流と、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過であって、灌流中、細胞凝集体が細胞凝集体の重力沈降によって濾過メンブレンの不在下でバッグ内に保持される、メンブレンフリー濾過と、
閉鎖系での細胞凝集体の回収及び継代と
を含む方法。
【請求項２】
増殖させる細胞凝集体が、多能性幹細胞又は分化ヒト細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
連続継代を行うことによって、細胞凝集体又はその子孫の１回以上のさらなる増殖をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
細胞凝集体又はその子孫の１回以上のさらなる増殖が、膜フィルターを有する第２の容器への継代によって実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞凝集体の連続継代が、閉鎖系においてスライサー格子を使用する無酵素継代によって実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
細胞凝集体が、約２０〜約５００μｍの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
細胞凝集体が、約１００μｍの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
細胞凝集体が、チュービング及び細胞凝集物の混合用装置にインラインのスライサー格子で解離される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
スライサーが、疎水性材料でコーティングされるか、又は疎水性材料を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
細胞凝集体の連続継代が、閉鎖系容器において酵素の存在下の細胞凝集体の解離によって実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
増殖した各細胞凝集体の平均直径が、約８００μｍ以下のサイズである、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、揺動プラットフォームバイオリアクターを用いた多能性幹細胞の増殖及び継代に関する。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、全体として、揺動プラットフォームを用いた細胞及び／又は細胞凝集体の増殖に関する。
【０００３】
多能性幹細胞バンキング（例えば、人工多能性幹細胞）、細胞の商業生産（例えば、ＧＥのＣｙｔｉｖａ（商標）心筋細胞）及び臨床試験のための細胞増殖の用途のための大規模な多能性幹細胞培養の必要性が出現している。フィーダーフリー多能性幹細胞培養の進歩により、バイオリアクター内で、マイクロキャリア（直径１５０〜２５０μｍ）又はマクロキャリア（直径約６ｍｍ）においてフラスコ中で大規模な細胞増殖が可能になった。懸濁培養の使用により、キャリアからの細胞の非効率的な播種及び放出、収穫の際のマイクロキャリアと細胞との物理的分離、及び細胞の表現型変化につながる細胞キャリアの凝集の形成を含む伝統的なマイクロキャリアで多能性細胞を培養する場合に生じるいくつかの課題が回避される。典型的には、灌流が、バイオリアクターにおける懸濁培養に使用される。
【０００４】
しかし、灌流／懸濁培養における１つの課題は、どのようにして細胞をバイオリアクター内に保持するかということである。先行技術はいくつかの基本的な分離技術、１）濾過、２）重力沈降及び３）遠心分離を提供する。濾過方法は、操作に必要な数週間にわたってフィルターが目詰まりを起こさないようにするためのいくつかの手段を必要とする。重力沈降の問題は、異なる細胞の様々な沈降特性、産業システムへのスケールアップの困難さ及び無菌性の維持が困難なことである。同様に、遠心分離は開放型細胞培養では日常的に使用されているが、完全閉鎖系細胞培養では、無菌性に関する懸念から限られた用途しか見出されていない。
【０００５】
多能性幹細胞及び／又は分化ヒト細胞を含む細胞の培養プロセスの間に人間の介入及び交差汚染を減少させる技術が、この分野で必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書では、多能性幹細胞及び／又は分化ヒト細胞を含む細胞を培養するための改良方法について記載する。
【０００７】
本明細書では、閉鎖系での細胞凝集体の増殖方法であって、
揺動プラットフォーム上の細胞培養容器と、
容器内での細胞凝集体の自動灌流と、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過と
を含む方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、閉鎖系での細胞凝集体の増殖方法であって、
揺動プラットフォームバイオリアクター上の細胞培養容器と、
容器内での凝集体形成と、
容器内での細胞凝集体の自動灌流と、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過と、
閉鎖系での細胞凝集体の回収及び継代と
を含む方法を提供する。
【０００９】
本明細書では、さらに、閉鎖系のバイオリアクターに付随するスライサー格子によってサイズが縮小された細胞凝集体を継代する方法を提供する。
【００１０】
また、本明細書では、本明細書に記載の方法を用いて細胞凝集体の増殖に使用するための閉鎖系を提供する。
【００１１】
本発明のこれら及び他の特色、態様及び有利性は、添付の図面を参照しながら下記の詳細な説明を読んだ場合、より良く理解され、図面全体において、同じ符号は同じパーツを表す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、１０継代を超える増殖のための適合を示す。細胞培養容器（例えば、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇバイオリアクター）中で培養する前に、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）から、低接着６ウェルプレート及びフラスコにおいて、又は揺動条件下のＶｕｅＬｉｆｅバッグにおいて懸濁凝集体に適応させる。
【図２】図２は、例示的システム、すなわち多能性幹細胞培養のためのＸｕｒｉ  Ｗ２５システムの概略図を示す。
【図３】図３は、制御ソフトウェアのユーザーインタフェースのサンプル画像を示す。示したサンプル画像は、本明細書に記載の培養条件を表すこと、及び／又はそうでなければ制限することを意味するものではない。
【図４】図４は、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇバイオリアクターを示す。
【図５】図５は、Ｘｕｒｉ  Ｗ２５システムにおける閉鎖系細胞培養プロセスを示す。すべてのステップは、ポンプ、ソフトウェア制御及びロードセルが組み込まれた２ＬのＣｅｌｌｂａｇバイオリアクター中でＸｕｒｉ  Ｗ２５システムにおいて実行した。
【図６】図６は、Ｘｕｒｉ  Ｗ２５システムにおける増殖の結果を示す。灌流培養により高い増殖率が観察された。
【図７】図７は、Ｘｕｒｉ  Ｗ２５システムにおける増殖の結果を示す。
【図８】図８の上段は、６ウェルプレートにおいて５継代増殖させ、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ中で懸濁凝集体として３継代増殖させたＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の分化能を示し、多分化能の維持が確認されている。図８Ａ〜Ｆ及び実施例２は、６ウェルプレートにおいて５回の連続継代及びＣｅｌｌｂａｇ中で３回の連続継代後のＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体についての、フローサイトメトリーによる多能性マーカーの分析を示す。さらに、６ウェルプレートにおいて５継代増殖させ、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ中で懸濁凝集体として３継代増殖させたＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の核型を示す。
【図９】図９は、本明細書に記載の方法を用いたＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇバイオリアクターにおける凝集体の形態の例を示す。
【図１０】図１０は、４日間にわたる培地消費及び細胞収量を示す。
【図１１】図１１は、潅流Ｃｅｌｌｂａｇを用いた閉鎖系継代を示す。任意の選択肢：灌流フィルターを介して大部分の培地を除去する。バッグを斜めに吊し、凝集体を隅に重力沈降させる。ディップチューブが存在しない場合はバッグを収縮させる。蠕動ポンプを使用して培地の大部分を引き出す。ディップチューブが存在しない場合は、バッグを後方に傾け、ほとんどの培地を除去する（１）。チューブをＰＢＳを含むバッグに取り付け、細胞を洗浄する（２）。重力沈降を繰り返し、上記のプロセスを使用してＰＢＳの大部分を除去する。（２）。チューブを予熱したＡｃｃｕｔａｓｅを含むバッグに取り付け、ポンプでＣｅｌｌｂａｇに汲み入れる（３）。ペレットをつまんで凝集体をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）に再懸濁し、５〜８分インキュベートする。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理した細胞をキャピラリー又は改変シリンジに通してばらばらにする（４）。培地を加え、解離した細胞を回収するか、次のバッグ／培養システムに継代する（１又は４）。
【図１２】図１２は、閉鎖系培地交換及び非灌流Ｃｅｌｌｂａｇを用いた継代を示す。ディップチューブを使用せずに５０〜８０％の培地を交換する場合：バッグを６０°の角度で吊し、凝集体を（凝集体サイズに応じて）２〜５分間重力沈降させる。培養容量がより小さい場合、ユーザーは凝集体が沈降する前にバッグを収縮させる必要がある。蠕動ポンプを使用して、使用済みの培地を廃棄バッグに取り出す。バッグの底の継ぎ目をつまんで、沈降した凝集体を再懸濁し、再度揺動を開始する。チューブで、予熱した培地を含むバッグをＣｅｌｌｂａｇに取り付け、蠕動ポンプを使用して揺動しながら培地を加える。ディップチューブを使用すると、より大きな容量を取り除くことができ、バッグの収縮を必要としない。
【図１３】図１３は、接着細胞の懸濁細胞培養への適合を示す。本明細書に記載の方法は、３〜４日間かけて３〜１４倍の増殖倍率範囲及び生存率＞９８％を有する再現性のあるプロセスを提供した
【図１４】図１４は、より大きなフラスコ／容器へのサンプルスケールアップを示す。Ｔ２５については２ｍＬから１０ｍＬへ、Ｔ７５については３０ｍＬへのスケールアップを示す。フラスコは、Ｗａｖｅバイオリアクターの運動を模倣するためにロッカー上に配置される。スケールが拡大するにつれて、凝集体形成及び増殖の効率が低下する。様々な揺動速度／揺動角度における液体経路の長さが増殖率に影響を及ぼすことが観察された。したがって、揺動角度及び揺動速度は、スケールの拡大に伴い調整される。
【図１５】図１５は、６ウェルプレート又はＴフラスコにおける懸濁凝集多能性幹細胞の増殖及び継代のデータを示す。
【図１６】図１６は、４×１０5細胞／ｍＬで播種したＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体についての、酵素継代又はスライサーによる機械的継代の後の増殖率の比較を示す。（１）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）＋ＲＯＣＫ阻害剤を用いて継代したＣＴ−２；（２）正方格子＋ＲＯＣＫ阻害剤用いて継代したＣＴ−２；（３）六角格子＋ＲＯＣＫ阻害剤用いて継代したＣＴ−２；（４）ＲＯＣＫ阻害剤を用いずに正方格子を用いて継代したＣＴ−２；（５）ＲＯＣＫ阻害剤を用いずに六角格子を用いて継代したＣＴ−２。
【図１７】図１７は、１．５×１０6細胞／ｍＬで播種したＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体についての、酵素継代又はスライサーによる機械的継代の後の増殖率の比較を示す。（１）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）＋ＲＯＣＫ阻害剤を用いて継代したＣＴ−２；（２）正方格子＋ＲＯＣＫ阻害剤用いて継代したＣＴ−２；（３）六角格子＋ＲＯＣＫ阻害剤用いて継代したＣＴ−２；（４）ＲＯＣＫ阻害剤を用いずに正方格子を用いて継代したＣＴ−２；（５）ＲＯＣＫ阻害剤を用いずに六角格子を用いて継代したＣＴ−２。
【図１８】図１８は、Ａ）１日目、Ｂ）２日目、Ｃ）３日目及びＤ）４日目のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）解離の後のＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の形態を示す。
【図１９】図１９は、Ａ）１日目、Ｂ）２日目、及びＣ）４日目の、正方格子スライサーでスライスした後のＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の形態を示す。
【図２０】図２０は、Ａ）１日目、Ｂ）２日目、及びＣ）４日目の、六角格子スライサーでスライスした後のＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の形態を示す。
【図２１】図２１は、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地中で培養した場合の、Ａ）１日目、Ｂ）２日目及びＣ）４日目の、六角格子スライサーでスライスした後のＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の形態を示す。
【図２２】図２２は、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地中で培養した場合の、Ａ）１日目、Ｂ）２日目及びＣ）４日目の、正方格子スライサーでスライスした後のＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の形態を示す。
【図２３】図２３は、使用済み培地がＣｅｌｌｂａｇから除去されている非灌流バッグにおける、重力沈降及び培地交換のためのチュービングアセンブリの図を示す。
【図２４】図２４は、新鮮な培地がＣｅｌｌｂａｇに添加されている、非灌流バッグにおける重力沈降及び培地交換のためのチュービングアセンブリの図を示す。
【図２５】図２５は、非灌流Ｃｅｌｌｂａｇに取り付けられた、重力沈降及び培地交換のためのチュービングアセンブリの画像を示す。
【図２６】図２６は、フィルターレス非灌流Ｃｅｌｌｂａｇから、浮遊膜を含む灌流ＣｅｌｌｂａｇへのＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の連続継代を示す。ＣＴ−２凝集体の連続継代は、最初にＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を用いて、１Ｌの非灌流Ｃｅｌｌｂａｇにおいて２５０ｍＬ容量で、次に２Ｌの灌流Ｃｅｌｌｂａｇにおいて１Ｌ容量で行った。
【図２７】図２７は、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体を異なる容量及びタイプのＣｅｌｌｂａｇにわたって連続継代する間の増殖を示す。ＣＴ−２凝集体の連続継代は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）を用いて、１Ｌの非灌流Ｃｅｌｌｂａｇにおいて１５０ｍＬ容量から、１Ｌの非灌流Ｃｅｌｌｂａｇにおいて１５０ｍＬ容量から、１Ｌの非灌流Ｃｅｌｌｂａｇにおいて４００ｍＬ容量から、２Ｌの潅流Ｃｅｌｌｂａｇにおいて１Ｌ容量で行った。
【図２８】酵素解離のためのＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いたＣｅｌｌｂａｇにおける連続継代及びＣｅｌｌｂａｇにおける解離細胞からの凝集体形成の間のＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の形態の画像を示す。（Ａ）１日目、２連続継代、Ｂ）４日目、２連続継代、Ｃ）１日目、３連続継代、Ｄ）４日目、３連続継代。
【図２９】図２９は、１００ｕｍ〜３００ｕｍの厚さを有する１０ｍｍのスライサー格子構造の図を示す。
【図３０】図３０は、壁間に１００ｕｍの間隔及び壁厚３０ｕｍを有する正方格子スライサーの図を示す。
【図３１】図３１は、壁間に１００ｕｍの間隔及び壁厚３０ｕｍを有する六角格子スライサーの図を示す。
【図３２】図３２は、スライサーを介した凝集体の閉鎖系処理のための方法の図を示す。ポンプ及びインラインのコロニカルバッグによって駆動される循環ループは、凝集体を懸濁させ、分布させる。スライサーに通じるチュービングは、主循環ループに接続され、細胞凝集体の一部は、低速で動作する第２ポンプを介してスライサーに送達される。
【図３３】図３３は、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞のスライスされた凝集体の形態の画像を示す。
【図３４】図３４は、ニッケル合金六角格子スライサーを用いたＣＴ２ヒト胚性幹細胞の連続継代の結果を示す。ＣＴ−２凝集体の連続継代は、ニッケル合金六角スライサーを用いて、１ＬのＣｅｌｌｂａｇにおいて２−５ｕＭのＲＯＣＫ阻害剤と共に播種した２５０〜５００ｍＬ容量で行った
【図３５】図３５は、ニッケル合金正方格子スライサーを用いたＣＴ２ヒト胚性幹細胞の連続継代の結果を示す。ＣＴ−２凝集体の連続継代は、ニッケル合金正方格子スライサーを用いて、１ＬのＣｅｌｌｂａｇにおいて２−５ｕＭのＲＯＣＫ阻害剤と共に播種した２５０ｍＬ容量で行った
【図３６】図３６は、ケイ素六角スライサー格子を用いたＣＴ２ヒト胚性幹細胞の連続継代の結果を示す。ＣＴ−２凝集体の連続継代は、ケイ素六角スライサーを用いて、１ＬのＣｅｌｌｂａｇにおいて２−５ｕＭのＲＯＣＫ阻害剤と共に播種した２５０ｍＬ容量で行った
【図３７】図３７は、ケイ素六角スライサー格子及び循環バッグを用いて、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を欠く培地中に維持された、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞の閉鎖系連続継代の結果を示す。ＣＴ−２凝集体の連続継代は、ケイ素六角スライサーを用いて、ＣｅｌｌｂａｇにおいてＲＯＣＫ  阻害剤を用いずに２５０ｍＬ〜３００ｍＬ容量で行った
【図３８】図３８は、ケイ素六角スライサー及び循環バッグを用いて、Ｃｅｌｌｂａｇにおける閉鎖系連続継代の間のＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の形態の画像を示す。Ａ）１日目、１連続継代、Ｂ）４日目、１連続継代、Ｃ）１日目、２連続継代、Ｄ）５日目、２連続継代。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
「Ａ」又は「ａｎ」は、本明細書では１以上、少なくとも１を意味する。複数形が本明細書で使用される場合、それは概して単数形を含む。
【００１４】
本明細書では使用する場合、「灌流」とは、細胞に新鮮な培地を連続的に供給し、細胞を培養液中に保ちながら使用済み培地を除去することによって培養細胞の生存を維持するプロセスをいう。
【００１５】
「凝集体」は、会合が基質への接着ではなく細胞−細胞の相互作用によって引き起こされる細胞の会合をいう。凝集体では、２つ以上の細胞が互いに生物学的接着によって相互に会合する。これは、細胞外マトリックスタンパク質のような表面タンパク質を介することができる。一実施形態では、細胞は基質上で最初に成長させることができ、基質においていくつかの細胞が該基質と会合（基質と接着）するが、さらなる成長は、さらなる成長細胞と基質との会合（接着）に依存しない細胞−細胞の会合を形成する。別の実施形態では、細胞は懸濁液中で自発的に会合して、表面への接着とは無関係に細胞−細胞の接着を形成する。細胞フィーダー層もまた基質と考えられる。したがって、フィーダー層への細胞の接着は、細胞が互いに接着するのではなく、フィーダー層中の細胞に接着するので、接着培養（凝集体ではない）の形態でもある。
【００１６】
「増殖」は、分化の有無にかかわらず、細胞の増殖をいい、継代なし、１継代又は複数継代及び／又は連続継代を含み得る。
【００１７】
「幹細胞」は、自己再生（すなわち、同じ分化能を有する子孫）を受け、さらに分化能がより制限された子孫細胞を産生することができる細胞を意味する。本開示の文脈内では、幹細胞は、例えば、核移植、より原始的な幹細胞との融合、特異的転写因子の導入又は特定の条件下での培養によって脱分化した、より分化した細胞も包含する。「多能性幹細胞」は、身体がそれ自体を修復する必要がある任意の細胞又は組織を潜在的に産生することができる。多能性幹細胞はまた自己再生することもでき、絶えずそれ自体のコピーをより多く産生することができる。多能性幹細胞には、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及び胚性幹細胞（ＥＳＣ）が含まれる。
【００１８】
「培養容器」は、使い捨て及び非使い捨てのプラスチック製品、バッグ及び／又はコンテナ及び／又はバイオリアクターを含む。この用語には、一回使用のプラスチック製品、バッグ及び／又はコンテナ及び／又はバイオリアクター並びに複数回使用のプラスチック製品、バッグ及び／又はコンテナ及び／又はバイオリアクターが含まれる。
【００１９】
「閉鎖系」とは、閉鎖及び／又は密閉されている間に予め滅菌され、完全性及び／又は無菌性を保持する培養容器及びアクセサリー構成要素をいう。容器及び構成要素は、系の完全性を損なうことなく利用され、無菌状態を維持しながら流体のうち及び／又は外への移送を可能にし、完全性を失うことなく他の閉鎖系に接続可能である。閉鎖系バイオリアクター及び／又は容器とは、細胞、細胞培養培地、化学物質及び試薬が、（例えば、チューブのキャップを開くことによって、又は細胞培養プレート又は皿の蓋を持ち上げることによって）系の完全性を損なうことなく、無菌的に添加、除去及び／又は操作される系をいう。閉鎖系内の単回使用又は複数回使用のバッグ及び／又はコンテナ及び／又はバイオリアクターは、閉鎖系の上又は中に、例えば容器又はバイオリアクターの部位に滅菌チューブを接合させることによって加えられる。
【００２０】
「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、ヒト、家畜、スポーツ動物及びペットが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法による治療を必要とする対象としては、身体的又は疾患関連の損傷の結果として機能の喪失を患う対象が含まれる。
【００２１】
用語「治療有効量」は、哺乳動物において任意の治療応答を生じるように決定される量をいう。例えば、治療用細胞又は細胞関連物質の有効量は、患者の生存性を延長させる可能性がある。又は、前記治療は、予防的であり、明白な臨床症状を予防及び／又は抑制することができる。本明細書では使用する用語の意味において、治療上有効な治療には、それ自体が疾患の転帰を改善しないとしても、対象の生活の質を改善する治療が含まれる。このような治療有効量は、臨床及び前臨床試験などの対象集団への日常的な適用を通じて、当業者によって確定される。したがって、「治療する」とは、そのような量を送達することを意味する。
【００２２】
「治療」は、本発明に関して広く使用され、そのような各用語は、とりわけ、欠損、機能不全、疾患又は療法を妨げる及び／又は療法からもたらされるものを含む他の有害なプロセスを改善、抑制又は治癒することを包含する。
【００２３】
多能性幹細胞バンキング（例えば、人工多能性幹細胞）、細胞の商業生産（例えば、ＧＥのＣｙｔｉｖａ（商標）心筋細胞）及び／又は臨床試験のための細胞増殖のために、大規模な多能性幹細胞培養が必要とされている。多能性幹細胞は、人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）、胚由来の「真の」胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞核移植によって製造された胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）又は未受精卵由来の胚性幹細胞（単為生殖胚性幹細胞又はｐＥＳ細胞）であってよい。フラスコにおける大規模な細胞フィーダーを用いない胚性幹細胞の増殖は大きな労働力を要し、空間制約的であり、分離された集団は表現型のドリフトを呈することがある。したがって、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ（登録商標））及びバイオリアクター（マイクロキャリア又は懸濁培養）など、大規模な多能性幹細胞培養のための代替アプローチを開発することが当該技術分野において試みられてきた。
【００２４】
揺動プラットフォームにおける胚様体（ＥＢ）の分化が実証されている。Ｃｏｒｒｅｉａ  ｅｔ．ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ  ａｎｄ  Ｒｅｐ（２０１４）１０：７８６・８０１。しかし、ＥＢの三次元構造は、定方向の分化及び／又は増殖に課題を提示する。例えば、典型的には、ＥＢの外面は、密接に連結された上皮様細胞及び緻密な細胞外マトリックスからなる外「殻」を含む。このような構造的特徴は、ＥＢのサイズと組合せて、モルフォゲン、代謝産物及び栄養素の勾配を生じさせ、それによりＥＢの定方向増殖の有効性を低下させ、異種性の増加及び分化した細胞集団の効率低下を生じる。スピナーフラスコ中の多能性成体前駆細胞凝集体（ＭＡＰＣ）の増殖が実証されている（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．８，６０９，４０６）。しかし、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎらによって記載された方法は、酵素消化及び遠心分離などのステップを含む。最近、インペラー攪拌タンクバイオリアクターシステムにおける多能性幹細胞の懸濁凝集体培養が実証されており（Ｃｈｅｎ、ＶＣ  ｅｔ．ａｌ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｍａｙ；  ８（３）：３８８−４０２）、これは、バイオリアクター培養において任意の基質又はキャリアの必要性を取り除いている。懸濁培養物から細胞を継代するためのＣｈｅｎの方法において、凝集体は遠心分離によって回収された。対照的に、本明細書に提供する方法は、揺動プラットフォームを使用する閉鎖系での多能性幹細胞及び／又は多能性幹細胞凝集体の閉鎖系増殖（播種、灌流及び回収を含む）を可能にし、この方法は本研究以前には実証されていない。さらに、本明細書に記載の方法はまた、膜フィルター及び／又は遠心分離及び／又は酵素消化を用いずに、閉鎖系において多能性幹細胞の懸濁培養及び／又は非接着培養を可能にし、これにより、閉鎖系での無菌性の維持、（例えば、遠心分離機を設置するための）コストの低減及び交差汚染を低減するのに役立つ人間の介入の低減を可能にする。また、膜フィルター及び／又は遠心分離などの使用を含むことができ、細胞又は細胞凝集体のさらなる継代における凝集体の解離のための酵素消化の使用を含むことができる、細胞又は細胞凝集体のさらなる継代と組合せた本発明の使用が、本明細書に提示した実施形態の範囲内であることが企図される。
【００２５】
したがって、例えば、Ｘｕｒｉ（商標）Ｗ２５  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（２０１３年に発売された次世代Ｗａｖｅ（商標）バイオリアクターシステム）及び例えば、従来のＷａｖｅバイオリアクター２／１０システムにおけるヒト多能性幹細胞の増殖を含む、細胞凝集体の増殖のための方法を本明細書に記載する。プラットフォームの揺動運動は、連続的な混合及び通気を提供する培養液中の波を誘導し、細胞成長のためのロバストな環境をもたらす。本方法は、様々なサイズの培養容器（例えば、単回使用の使い捨てＣｅｌｌｂａｇは洗浄又は滅菌を必要としない）を使用し、操作の容易さ及び交差汚染に対する保護を提供する。通常、Ｃｅｌｌｂａｇは、スケーラブルな細胞培養のために、１、２、１０、２０及び５０Ｌのサイズで利用可能である。場合により、本明細書に記載の方法のために、より大きい又はより小さな容量の他のＣｅｌｌｂａｇ及び／又は容器を用いることができる。光学センサーは、溶存酸素及びｐＨの連続的なモニタリングのために、リアルタイム制御及びデータ記憶を用いて利用可能である。プラットフォームソフトウェアは、閉鎖系において連続的又は不連続的な灌流／培地交換を行う能力を提供する。
【００２６】
典型的には、灌流の間に、使用済み培地を除去しながら細胞を培養液中に留めるための様々な方法がある。１つの方法は、細胞が結合するキャピラリー繊維又は膜を使用することによって、細胞をバイオリアクター内に留めることである。別の方法は、細胞を結合又は接着させるのではなく、むしろ培地を除去することを可能にしながら細胞をバイオリアクター内に留める「リリーパッド」浮遊フィルターを利用することである。別の方法は、細胞を分離してバイオリアクターに戻すための遠心分離機の使用である。さらに別の方法は、消費された培地が除去されている間に、細胞培養容器又は関連するチュービング内の細胞を捕捉するための音波などの物理的アプローチを使用する。
【００２７】
対照的に、本明細書に記載の方法は、培地の除去を可能にしながら細胞をバイオリアクター内に留めるために通常使用される濾過システムを使用せずに使用済み培地の除去を可能にする、細胞凝集体の重力沈降に依存する。この方法の有利性は、単細胞の喪失及び凝集体の維持であり、それによって培養物の全体的な品質及び生存率が増加する。
【００２８】
使用済み培地を連続的に除去して新しい培地と交換することにより、最適な生育条件のために栄養レベルが維持され、毒性を避けるために細胞廃棄物が除去される。本明細書に記載の方法を用いて閉鎖系で灌流を行う場合、汚染の可能性が低減される。有利には、本明細書に記載の閉鎖系及び細胞培養法は細胞凝集体の重力沈降を利用し、これにより細胞が濾過膜に接着することによる損失及び／又は濾過プロセス中にせん断による細胞の損傷の低減を可能にする、Ｃｅｌｌｂａｇにおける膜のない濾過が可能になる。
【００２９】
本明細書に記載の方法は、好ましくは閉鎖系で使用され、培養汚染及び細胞交差汚染のリスクを最小限にし、高い生存率及び高い細胞密度に自信を持って到達させることができる。本明細書に記載の方法は、使いやすさと信頼性を考慮して設計されている。
【００３０】
本発明の方法において、培養培地及び細胞は、特別な揺動プラットフォーム上に配置された滅菌済みのチャンバーにのみ接触する。プラットフォームの揺動運動は培養液中に波を誘導し、それによって連続的な混合及び酸素の移送を提供し、細胞成長のためのロバストな環境をもたらす。この系は、洗浄又は滅菌を必要とせず、操作の容易さ及び交差汚染に対する保護を提供する。
【００３１】
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のフィーダーフリー条件から揺動運動を用いて懸濁凝集体に細胞を適応させるための新規プロトコルを本明細書に提供する。典型的には、攪拌タンクリアクター又はスピナーフラスコを用いて適合を達成した。本明細書に記載の方法は、揺動運動を使用するだけで細胞を維持可能にする（６ウェルプレートからフラスコ、ＶｕｅＬｉｆｅバッグ、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇまで）。本明細書では、一連の継代及び最大２７９倍の増殖を伴う、揺動運動システムにおいて懸濁凝集体として多能性幹細胞増殖を実証する方法を提供する。本明細書に記載の倍数増殖は、スピナーフラスコ又は攪拌タンクリアクターを使用して報告された増殖と比較して、灌流Ｃｅｌｌｂａｇにおいて同等又はより良好である。本明細書では、スライサーと組合せた揺動プラットフォーム上の培養容器の、継代のための使用が、一体化閉鎖系での多能性幹細胞の増殖及び連続継代、特に時間、試薬及び労力の低減において有利であることを示す実施例を提供する。本発明のスライサーアセンブリは、他の非揺動式バイオリアクターシステムに対して類似の有利性を提供することができる。
【００３２】
本明細書では、自動培地交換を駆動を駆動するコンピュータ制御の蠕動ポンプと相互作用する培養容器（例えば、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ）に接続されたチュービングの特定のアセンブリも提供される。一実施形態では、チュービングは、下部垂直ピースのチュービング、分岐点、及び分岐点に接続された２つの追加の長さのチュービングを有するＴ字型である。追加のチュービングは、ソフトウェアによって制御される蠕動ポンプに配置される。遅い回収速度が、培地を取り出すために使用される。チュービングの垂直性により、凝集体は、除去される培地の流速を超える速度で重力沈降することが可能になる。究極の効果は、培地除去ステップの間に、凝集体が容器（例えば、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ）中に最適な細胞培養条件で残ることである。培地の除去は、例えば最大８時間、最大４時間などの間継続することができるが、培地の除去は、はるかに短時間又はより長時間にわたって実施することができる。培地除去ステップの後、新鮮な培地を数秒から数分又は任意の適切な時間にわたって容器（例えば、Ｃｅｌｌｂａｇ）に迅速に添加する。所望の長さの細胞培養の間、培地除去／迅速培地添加のサイクルが繰り返される。代替の例において、潅流は不連続であってもよく、このような実施形態も本明細書に提示される実施形態の範囲内で企図される。
【００３３】
本明細書に記載の自動灌流設計は、本質的に低コストであり、現在のＸｕｒｉシステム及びＣｅｌｌｂａｇｓを含む培養容器と完全に適合し、任意の他の培養容器と完全に適合するように調整することができ、コストを上げ、汚損のリスクを高め、性能を低下させるフィルターを全く必要としない。さらに、本明細書に記載の自動灌流は、複雑さ、コスト、及び失敗のリスクを増大させる可動部品又は電子機器を含まない。
【００３４】
本明細書では、閉鎖系での細胞凝集体の増殖方法であって、
揺動プラットフォームバイオリアクター上の細胞培養容器と、
該容器内での細胞凝集体の自動灌流と、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過と
を含む方法を提供する。
【００３５】
さらに、閉鎖系での細胞凝集体の増殖方法であって、
揺動プラットフォームバイオリアクター上の細胞培養容器と、
該容器内での凝集体形成と、
該容器内での細胞凝集体の自動灌流と、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過と、
閉鎖系での細胞凝集体の回収及び継代と
を含む方法を提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、増殖させる細胞凝集体は、植物、動物、昆虫又は微生物由来である。いくつかのこのような実施形態では、増殖させる細胞凝集体は、多能性幹細胞又は分化ヒト細胞を含む。
【００３７】
いくつかの例において、灌流中、細胞凝集体は細胞凝集体の重力沈降によって濾過膜の不在下でバッグ内に保持される。
【００３８】
さらに、自動灌流は、人の介入なしに閉鎖系で実施され、それにより汚染の可能性を低減し、増殖の間の無菌性の維持を可能にする。
【００３９】
いくつかの実施形態では、上記の方法は、連続継代を行うことによって、細胞凝集体及び／又はその子孫の１以上回のさらなる増殖をさらに含む。このような実施形態のいくつかにおいて、細胞凝集体及び／又はその子孫の１以上回のさらなる増殖は、膜フィルターを有する第２の容器への継代によって実施される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、上記の方法は、１以上回のさらなる継代が同じ容器内で行われる、細胞凝集体及び／又はその子孫の１以上回のさらなる増殖を含む。他の実施形態では、上記の方法は、１以上回のさらなる継代が、培養容器内に膜フィルターが不在の第２の容器内で行われる、細胞凝集体及び／又はその子孫の１以上回のさらなる増殖を含む。他の例において、上記の方法は、１以上回のさらなる継代が、膜フィルター（例えば、浮遊膜フィルター）を有する第２の容器内で行われる、細胞凝集体及び／又はその子孫の１以上回のさらなる増殖を含む。
【００４１】
このような実施形態では、さらなる増殖及び／又は継代は、任意の順序で実行され得る。一例として、初回継代は、培養容器にメンブレンフリー条件下で実施し、続いて１以上回のさらなる増殖が、膜フィルターを有する培養容器中で行ってもよい。別の例として、１以上回の初回増殖及び／又は継代を、膜フィルターを含む培養容器中で行い、続いて、メンブレンフリー濾過条件下で、その後の増殖及び／又は継代を行ってもよい。したがって、膜濾過又はメンブレンフリー濾過を含む増殖及び／又は継代の任意の連続が、本明細書に記載された実施形態の範囲内で企図され、前記連続はこのメンブレンフリー条件の下で少なくとも１回の増殖を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、細胞凝集体の連続継代は、閉鎖系においてスライサー格子を使用する無酵素継代によって可能になる。いくつかのこのような実施形態では、細胞凝集体は、約２０〜約５００μｍの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される。いくつかの他の実施形態では、細胞凝集体は、約１００μｍの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される。いくつかのこのような実施形態では、細胞凝集体は、チュービング及び細胞凝集物の混合用装置と一直線になったスライサー格子で解離される。言い換えれば、いくつかの実施形態では、細胞凝集体は、例えば図３２に示すようなコロニカルバッグ中で混合され、その後スライサーで解離され、混合バッグは、典型的には、閉鎖系において培養容器とスライサーの間に配置される。
【００４３】
スライサーを通過するために使用される細胞凝集体濃度は、スライスされた細胞凝集体の高い生存率での回収に影響を与える。予想外に、約３×１０6細胞／ｍＬ未満の細胞凝集体濃度をスライスした場合、図２９−３１に示すスライサー形状を用いると、細胞濃度が約３×１０6細胞／ｍＬを超える場合よりも高い回収率でより高い生存率のサンプルが生成されたことが判明した。当業者であれば、別のスライサー形状が比較的高い生存率及び回収率をもたらす閾値濃度を変更することを認識するであろう。例えば図３２に示す混合装置を使用することによって、フローストリーム中の凝集体の均一な懸濁液を維持することで汚損を最小限に抑え、高い細胞生存率及び回収率をもたらす。有利には、単一多能性細胞の生存率を維持するためにＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤のような薬剤を一般に必要とする酵素継代された多能性幹細胞凝集体とは異なり、スライサーを使用すると、スライスされた多能性幹細胞凝集体の増殖中にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤が不要となる。
【００４４】
一群の実施形態では、スライサーは疎水性材料でコーティングされている。いくつかの実施形態では、スライサーは疎水性材料を含む。
【００４５】
いくつかの他の実施形態では、細胞凝集体の連続継代は、閉鎖系容器において酵素の存在下の細胞凝集体の解離によって可能になる。
【００４６】
上記の方法のいくつかの実施形態では、増殖及び／又は継代中に増殖した各細胞凝集体の平均直径は約８００μｍ以下のサイズである。上記の方法のいくつかの実施形態では、増殖及び／又は継代中に増殖した各細胞凝集体の平均直径は約５００μｍ以下のサイズである。上記の方法のいくつかの実施形態では、増殖及び／又は継代中に増殖した各細胞凝集体の平均直径は約４００μｍ以下のサイズである。上記の方法のいくつかの実施形態では、増殖及び／又は継代中に増殖した各細胞凝集体の平均直径は約３００μｍ以下のサイズである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約５０ｍＬ〜約１００Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約５０ｍＬ〜約５０Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約１００ｍＬ〜約１０Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約１００ｍＬ〜約５Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約１５０ｍＬ〜約１Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は、約５０ｍＬ〜約２０Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は、約２００ｍＬ〜約２Ｌである。
【００４８】
本明細書では、閉鎖系のバイオリアクターに付随するスライサー格子によってサイズが縮小された細胞凝集体を継代する方法がさらに提供される。本明細書に記載の任意の方法の一群の実施形態では、細胞凝集体は１００ｍＬを超える容量で継代される。言い換えれば、継代は、一般に、より少量の培地で、より少ない細胞数で実施されている。対照的に、本発明の方法は、閉鎖系において大量の培地の使用を可能にし、それによってバイオリアクター及び／又は工業規模での細胞凝集体の継代を可能にする。例えば、１００ｍＬを超える大量で細胞凝集体を継代するための閉鎖系においてバイオリアクターと組合せたスライサー格子の使用は、本開示よりも先に当技術分野において開示されていない。別の実施形態では、細胞凝集体は、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ又は５Ｌを超える容量で継代される。一実施形態では、スライサー格子は多角形スライサー格子である。一実施例では、１００ｍＬを超える容量での細胞凝集体の継代は、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）を培地に添加することなく行われる。
【００４９】
上記の細胞を継代するための方法のいくつかの実施形態では、細胞凝集体は、約２０〜約５００μｍの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される。上記の細胞を継代するための方法のいくつかの実施形態では細胞凝集体は、約１００μｍの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される。いくつかのこのような実施形態では、細胞凝集体は、チュービング及び細胞凝集物の混合用装置と一直線になったスライサー格子で解離される。特定の例において、スライサーは疎水性材料でコーティングされている。他の例において、スライサーは疎水性材料を含む。
【００５０】
細胞を継代するための上記の方法のいくつかの実施形態では、継代前の各細胞凝集体の平均直径は約８００μｍ以下のサイズである。細胞を継代するための上記の方法のいくつかの実施形態では、継代前の各細胞凝集体の平均直径は約５００μｍ以下のサイズである。細胞を継代するための上記の方法のいくつかの実施形態では、継代前の各細胞凝集体の平均直径は約４００μｍ以下のサイズである。細胞を継代するための上記の方法のいくつかの実施形態では、継代前の各細胞凝集体の平均直径は約３００μｍ以下のサイズである。
【００５１】
したがって、本明細書で提供する方法は、限定されるものではないが、（１）酵素解離された凝集体（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標））、凍結保存されたストック及び／又は機械的にスライスされた凝集体（例えば、多角形のスライサー格子）の供給源からの、例えばＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇを含むバイオリアクターにおける凝集体形成；（２）揺動プラットフォームでの増殖方法：ウェルプレート、Ｔフラスコ及びＶｕｅＬｉｆｅバッグ、重力沈降用のチュービングアセンブリを備えた非灌流バイオリアクター（例えば非灌流Ｃｅｌｌｂａｇ）及び／又は灌流バイオリアクター（例えば、浮遊膜Ｃｅｌｌｂａｇ）を用いる；及び（３）連続継代：酵素を細胞培養容器内での凝集体に添加（例えば、Ｃｅｌｌｂａｇ中のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標））、細胞培養容器の外側の凝集体に酵素を添加及び／又は多角形スライス格子を用いた機械的継代、を含むいくつかのワークフローを可能にする。
【００５２】
本明細書では提供する実施形態の範囲内において、細胞のバンクを製造するため、研究用途のために増殖された細胞凝集体を産生するため、治療及び／又は診断試験（例えば、薬物試験、毒物学又は臨床試験における品質管理アッセイ）のため、及び／又は患者の治療のための、本明細書に記載の方法の使用が企図される。薬学的に許容される担体と、本明細書に記載の方法から得られた１以上の細胞及び／又は細胞凝集体とを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を本明細書では提供する。
【００５３】
上記の方法で産生された細胞及び／又は凝集体の治療有効量を、それを必要とする対象に投与するステップによって、治療を必要とする対象において障害を治療する方法も本明細書では提供する。本方法は、薬学的に許容される担体と、上記の方法で産生された細胞及び／又は凝集体とを含む医薬組成物の治療有効量を投与することによって、治療を必要とする対象において障害を治療する方法をさらに含む。本明細書に記載の方法は、多能性幹細胞及び分化細胞にも適用可能であることが理解されよう。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で得られた増殖細胞及び／又は対象への投与のための増殖細胞の純度及び／又は均一性は、約１００％（実質的に均一）である。他の実施形態では、本明細書に記載の方法で得られた増殖細胞及び／又は対象への投与のための増殖細胞の純度及び／又は均一性は、９５％〜１００％である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で得られた増殖細胞及び／又は対象への投与のための増殖細胞の純度及び／又は均一性は、８５％〜９５％である。他の細胞との混合物の場合、百分率は約１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％  ４０％〜４５％、４５％〜５０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、又は９０％〜９５％であってよい。
【００５５】
所与の用途で細胞を投与するための製剤の選択は、様々な要因に依存する。これら要因のうち顕著なものは、対象の種、治療される状態の性質、対象におけるその状態及び分布、投与される他の療法及び薬剤の性質、投与のための最適経路、経路による生存性、投薬レジメン、及び当業者に明らかである他の要因である。例えば、適切な担体及び他の添加剤の選択は、正確な投与経路及び特定の剤形の性質に依存する。細胞／培地の水性懸濁液の最終製剤は、典型的には、懸濁液のイオン強度を等張性（すなわち、約０．１〜０．２）及び生理学的ｐＨ（すなわち、約ｐＨ６．８〜７．５）に調整することを含む。最終製剤はまた、典型的には流体潤滑剤を含有する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、細胞は、溶液、懸濁液又はエマルジョンのような単位用量の注射可能形態で製剤化される。細胞の注射に適した医薬製剤は、典型的には、滅菌水溶液及び分散液である。注射可能製剤のための担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）及びこれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。当業者は、本発明の方法において投与される組成物中の細胞及び任意選択の添加物、ビヒクル及び／又は担体の量を容易に決定することができる。
【００５７】
組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重及び状態並びに投与される製剤（例えば、固体対液体）などの要因を考慮して、医学及び獣医学の当業者に周知の投薬量及び技術によって投与することができる。
【００５８】
単回用量は、一度にすべて、分割して又はある期間にわたって連続して送達されてよいことが理解されるべきである。全用量を単一の場所に送達してもよいし、複数の場所に分割分散してもよい。
【００５９】
様々な実施形態では、細胞は初回用量で投与され、その後、さらなる投与によって維持されてもよい。細胞は、最初に１つの方法によって投与され、その後、同じ方法又は１以上の異なる方法によって投与されてもよい。レベルは、細胞の継続的な投与によって維持することができる。様々な実施形態は、初回投与もしくは対象におけるそのレベルの維持又はその両方のために細胞を、静脈内注射によって投与する。様々な実施形態では、本明細書の他の箇所で論じられている患者の状態及び他の要因に依存して、他の投与形態が使用される。初回投与及びさらなる用量のための、又は連続投与のための適切なレジメンは、すべて同じであってもよいし、変更されてもよい。本開示、本明細書に引用される文献及び当技術分野における知識から、当業者は適切なレジメンを確定することができる。治療の用量、頻度及び持続時間は、疾患の性質、対象及び同時投与され得る他の療法を含む多くの要因に依存する。本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、細胞は、分化していても、又は分化していなくてもよい。本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、細胞は解離していても、又は凝集体であってもよい。本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、細胞及び／又は細胞凝集体は、多能性幹細胞及びその子孫の組合せを含んでよい。
【実施例】
【００６０】
材料と方法
材料：凝集体を、灌流あり（２８−９３７６−５２）及び灌流なし（ＣＢ０００１Ｌ１０−０１）のＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇにおいて培養した。供給用培地バッグは５ＬのＨｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｔａｉｎｅｒ（ＳＨ３０７１３．０１）であった。廃棄バッグはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＭＢ００２０Ｌ１０−０１）のＭｂａｇであった。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（ＣＡ、ＵＳＡ）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）（ＮＹ、ＵＳＡ）から購入し、ｍＴｅＳＲＴＭ１培地は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）から購入した。ＣＴ２  ｈＥＳＣは、コネチカット大学医学センタ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）のＲｅｎ−Ｈｅ  Ｘｕ氏より入手した。ＣＨＢ１０は、ボストン小児病院（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｏｓｔｏｎ）のＧｅｏｒｇｅ  Ｄａｌｅｙ氏より入手した。ＮＬ５  ｉＰＳＣは、ＮＩＨ（アメリカ国立衛生研究所）のＧｕｏｋａｉ  Ｃｈｅｎ氏より入手した。
【００６１】
方法：ヒト胚性幹細胞を、Ｘｕｒｉ（商標）Ｗ２５実験の前に、５継代を超える間、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）から懸濁凝集体に適応させた。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＶａｒｉＭｉｘ試験管ロッカーを用いて揺動させた超低接着６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）においてｍＴｅＳＲ（商標）１で細胞を維持した。ストック細胞は核型正常であることが確認された。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて連続継代を行い、凝集体を小型クラスタ及び単一細胞に縮小した。細胞数及び生存率は、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−２００（商標）（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて決定した。
【００６２】
実施例１
ヒト胚性幹細胞ＣＴ２（コネチカット大学のＲｅｎ−Ｈｅ  Ｘｕ氏より入手）及びヒト人工多能性幹細胞株ＮＣＲＭ５（ＮＬ５としても知られている、ＮＩＨのＧｕｏｋａｉ  Ｃｈｅｎ氏より入手）を、フィーダーフリーの細胞ストックから適合させた懸濁液であり、バイオリアクター培養の前に小規模で少なくとも５回継代維持した。活発に増殖する小規模培養及び凍結ストック由来の細胞を、１５０ｍＬ容量を保持する改変Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。単一細胞及び小型（＜５細胞）クラスタは、およそ直径約１００μｍの凝集体を急速に形成し、これは４日間にわたっておよそ２５０μｍの直径に増殖した。半分〜全部の培地交換を毎日行い、細胞を４日間の培養後に回収した。１５０ｍＬの培養液で最大５．５倍の増殖が観察された。１５０ｍＬの規模から回収した細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）で解離させ、２Ｌ灌流バッグ内の１Ｌ容量に再播種した。細胞を、灌流条件下で４日間増殖させ、凝集体は直径３００〜３５０ｕｍに増殖した。４日後に最大９倍の増殖（約４００万細胞／ｍＬに相当する）が得られた。細胞を、多分化能マーカーＯｃｔ４、Ｔｒａ−１−６０及びＳＳＥＡ３についてはフローサイトメトリーにより、胚様体形成については核型によって特徴づけた。結論として、本発明者らの結果は、Ｘｕｒｉ（商標）細胞増殖システムＷ２５における懸濁凝集体に適合させた多能性幹細胞株の増殖の成功を記載している。
【００６３】
ｈＥＳＣの懸濁培養（Ａ）
Ｈ１及びＣＴ２細胞の懸濁凝集体培養物を確立し、凍結ストックをそれぞれ製造した。標準的な細胞培養プレートにおいてよりも低接着プレートにおいて培養した場合、細胞が増殖し、多能性（Ｏｃｔ４、Ｔｒａ−１−６０及びＳＳＥＡ３発現に基づく）を良好に維持することが判定された。懸濁凝集体培養物は、５週間連続して成長することが見出された。６ウェルプレート、Ｔ２５及びＴ７５フラスコにおいて凝集体形成及び増殖が成功したことが実証された。
【００６４】
播種、凝集体形成及び増殖率を特徴づけるために多数の実験を行った。標準的な播種密度（４００Ｋ／ｍＬ培地）では、倍加時間は３日間で約４倍である。１００Ｋ／ｍＬで播種した場合、増殖率はより高い（３日間で最大１０倍）。播種される細胞が高密度なほど、一般に、増殖率は低い。播種効率は＞９０％であると思われる。凝集体はＭＧコーティング表面に再接着し、正常なｈＥＳＣ形態を回復することができる。
【００６５】
ｈＥＳＣの懸濁培養（Ｂ）
ＣＴ２凝集体の連続継代の間、多能性マーカーは保持されることを見出した。
【００６６】
ｈＥＳＣの懸濁培養（Ｃ）
ＣＴ２及びＨ１懸濁凝集体の凍結保存細胞バンクを増殖させ、ＣＨＢ１０凍結保存細胞バンクも増殖させた。ＣＴ２及びＣＨＢ１０についてのフローサイトメトリーは、高い多能性マーカー発現を示した。これらの細胞株の増殖率のモニタリングを続け、典型的には、３日で３〜４倍の増殖を観察し、４日で６〜８倍の増殖を観察した。これは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）で通常観察される成長速度よりも遅い。
【００６７】
６ウェルプレート（３５ｍｍ）から１００ｍｍプレート並びにＴ２５及びＴ７５フラスコへの凝集体培養物のスケールアップの評価を続けた。結果は、容器のサイズがスケールアップするにつれて、増殖率の漸進的な低下を示し、これは揺動角度をより小さくすることによって緩和することができる。容器の端から端までの距離が大きくなるにつれて、より小さい揺動角度が必要となる可能性がある。
【００６８】
ｈＥＳＣの懸濁培養（Ｄ）
Ｖｕｅ  Ｌｉｆｅ  ３２ｃ及びＶｕｅ  Ｌｉｆｅ  ７２ｃバッグにおける播種及び増殖が成功したことを実証した。Ｖｕｅ  Ｌｉｆｅバッグにおいて４日間に７倍の増殖を観察した。１つのＶｕｅ  Ｌｉｆｅ７２ｃバッグから別のＶｕｅ  Ｌｉｆｅ  ７２ｃバッグへｈＥＳＣ凝集体を連続的に継代する能力を実証した。
【００６９】
ｈＥＳＣの懸濁培養（Ｅ）
ＶｕｅＬｉｆｅ  ７２バッグで５回連続継代が成功し、典型的な４日間の増殖は５〜７倍であり、生存率は＞９０％であった。
【００７０】
ｈＥＳＣの懸濁培養（Ｆ）
ＶｕｅＬｉｆｅバッグにおいて５継代の間継代した凝集体のフローサイトメトリー分析は、６ウェルプレートに維持された凝集体と比較して、同様に高レベルのＯｃｔ４及びＴｒａ−１−６０の発現を示している。しかし、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）におけるＣＴ２（既存対照に見られるレベル）と比較して、すべての凝集体において多能性マーカー発現量の全体的な低下があった。
【００７１】
ｈＥＳＣの懸濁培養
ＣＴ２の増殖の成功（最大５．３倍）は４回の実験で実証された。細胞を改変Ｗａｖｅｂａｇにおいて１５０ｍＬ容量で増殖させ、２／１０プラットフォームにおいて維持した。Ｗａｖｅｂａｇにおいて増殖させた凝集体のフローサイトメトリー分析は、Ｏｃｔ４、Ｔｒａ−１−６０及びＳＳＥＡ３の発現＞  ９５％を示し、多能性表現型を実証した。確立されたＮＬ−５  ｉＰＳＣ懸濁凝集体に関する３回の実験で、Ｗａｖｅｂａｇにおける凝集体形成を実証した。
【００７２】
ｈＥＳＣの懸濁培養（Ｇ）
Ｘｕｒｉ  Ｗ２５システムにおいて改変Ｗａｖｅｂａｇから１Ｌ灌流バッグへのＣＴ２の連続移植を２回の実験で実証した。１Ｌ規模の灌流で最大９倍の増殖が観察され、３．８Ｍ／ｍＬの細胞密度が達成された。８日間で約４０倍の増殖が観察された。
【００７３】
ｈＥＳＣの懸濁培養（Ｈ）
改変Ｗａｖｅｂａｇから改変Ｗａｖｅｂａｇへ、改変ＷａｖｅｂａｇからＸｕｒｉ  Ｗ２５システムの１Ｌバッグへの４連続継代におけるＣＴ２の連続移植の成功を実証した。１Ｌバッグは灌流せず、バッチの半分の培地交換を行った。１６日間で約２５６倍の増殖を観察した。潅流により、増殖率がより高くなることが予想される。Ｘｕｒｉ  Ｗ２５灌流Ｃｅｌｌｂａｇにおける播種、供給（灌流）及び回収の実証を、閉鎖系、無菌プロセスで実施した。フローサイトメトリーの結果は、連続継代の間にＸｕｒｉ  Ｗ２５増殖細胞において正常レベルの多分化能が維持されることを示す。細胞は、連続継代後に正常な核型を保持した。
【００７４】
ｈＥＳＣの懸濁培養
ＥＢの結果は、Ｘｕｒｉ  Ｗ２５増殖細胞が３つの胚葉すべてに分化する能力を保持していることを示す。細胞は、連続継代後に正常な核型を保持した。多能性幹細胞株ＣＴ２のさらなる増殖は、ＷＡＶＥ  ２／１０及びＸｕｒｉ  Ｗ２５システムにおいて実施して、成功した。
【００７５】
方法：
凝集体を最初に超低接着６ウェルプレートで確立し、３−５日間増殖させて、その後、凝集体を単一細胞／小型クラスタに解離させて新たなウェルに再播種した。播種密度は１００Ｋから８００Ｋ／ｍＬの範囲であった。使用された揺動角度は１５〜２５度の範囲で、揺動速度は１５〜２５回／分であった。好ましい揺動角度は１５〜２０度の範囲であり、揺動速度は２０ｒｐｍである。
【００７６】
多能性幹細胞株はそれぞれ、耐えられる揺動角度が異なる。ＣＴ２株は、ＮＬ５株より大きい揺動角度に耐える。ＮＬ５細胞は、６ウェルプレートにおいて、５〜１５度の揺動角度及び１５〜２５揺動／分の揺動速度を好む。ＮＬ５の好ましい角度は７〜１５度の範囲であり、９度で最高の結果をもたらす。
【００７７】
Ｔ２５、Ｔ７５フラスコ、ＶｕｅＬｉｆｅバッグ及びＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇは、６ウェルプレートと比較して、揺動角度の低減を必要とする。典型的には、フラスコ、ＶｕｅＬｉｆｅバッグ及び２Ｌ  Ｃｅｌｌｂａｇの揺動角度は、６ウェルプレートに播種及び増殖を駆動するために使用する角度と比較して３〜７度低減する必要があった。この範囲外の揺動角度を使用することに伴う問題には、初期播種の低減（凝集体形成不良）及び／又は凝集体のクランピングが挙げられる。凝集体のクランピングは、フラスコ及びバッグの隅でも起こり、したがって、直線状エッジではなく丸みのある隅を有することが有利である。ＶｕｅＬｉｆｅバッグの隅にペーパークリップを使用することにより、コーナーエッジがなくなり、クランピングが減少することを観察した。
【００７８】
改変Ｗａｖｅバッグは、デュアルバッグ内の細胞培養チャンバーの間の継ぎ目をスライスし、両端にフィルムを加えて、より小さな容量（最大５００ｍＬ）の細胞培養容量を可能にする改変Ｗａｖｅｂａｇ（Ｃｅｌｌｂａｇ）を製造することによって調製した。培地のコストを考えて、当初はより低い容量（１５０ｍＬ）を最初の研究のために選択した。１５０ｍＬ容量での増殖は、多くの場合、より大きな容量での改変Ｃｅｌｌｂａｇにおける増殖よりも低く、これは膨張後のＣｅｌｌｂａｇの形状に起因する可能性が高いことに留意されたい。過膨張したバッグは、細胞培養領域とは異なる湾曲を有し、その結果、細胞がバッグのエッジで乾燥して、細胞が失われる可能性がある。加えて、湾曲の増加は、凝集体のクランピングが増し、細胞増殖が低減する。
【００７９】
したがって、Ｃｅｌｌｂａｇの容量は細胞増殖に影響を及ぼし、改変Ｗａｖｅｂａｇでは１５０ｍＬを超える量が好ましいことが認識された。同様に、１Ｌ  Ｃｅｌｌｂａｇでは４００ｍＬを超える容量が好ましい。６ウェルプレート、フラスコ、ＶｕｅＬｉｆｅバッグもしくは以前のＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇにおいて成長させたストック細胞由来、又は凍結保存されたストック由来の細胞を、Ｃｅｌｂａｇに播種した。すべての場合において、Ｃｅｌｌｂａｇにおいて凝集体形成及び増殖が観察された。
【００８０】
市販のＣｅｌｌｂａｇにいくつかの改変を加えて、細胞の閉鎖系操作を行った。特別なチュービングセット（ＰＶＣ及びＣフレックス）は、適切な長さ及び正しい連結で、無菌層流キャビネット内か、又はチューブの無菌接合によってかのいずれかで培地バッグ、灌流廃棄バッグの組み立てを可能にするように設計した。Ａｃｃｕｔａｓｅ処理した単一細胞及び小型（＜５細胞）クラスタを、揺動プラットフォーム上で膨らませたＣｅｌｌｂａｇに播種した。細胞を保持するバッグを、Ｃｅｌｌｂａｇに接続するチュービングに無菌接合した。ソフトウェアは、灌流の動作を制御する（新鮮な培地を添加し、灌流廃液を４００ｍＬ／日〜１Ｌ／日除去する）。非灌流バッグにおいて、バッチ培地交換を、使用済み培地の除去及び新鮮培地の添加のために、細胞の重力沈降及びＸｕｒｉシステムの蠕動ポンプを用いて行った。プロセスの説明を添付図面に示す。
【００８１】
バッグ内のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）は、凝集体の重力沈降又は灌流フィルターを介して大部分の成長培地を除去することによって実施した。ＰＢＳバッグをＷａｖｅ供給チュービングラインに無菌接合し、Ｃｅｌｌｂａｇ中の残りの容量を約２００ｍＬのＰＢＳで洗浄した。次いで、ＰＢＳを重力沈降又は灌流フィルターのいずれかを介して除去し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を含むバッグを無菌接合により取り付け、細胞をＣｅｌｌｂａｇにおいて３〜１０分間Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）に曝露した。ディップチューブを含むポートに注射器を配置し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）インキュベーションの後、細胞をディップチューブを通して注射器に引き込み、凝集体をばらばらにした。注射器は閉鎖系ではないが、Ｃｅｌｌｂａｇにすでにあるエアフィルターと同様の設計で空気を濾過する、注射器に付随する滅菌フィルターを含む様々な設計で代用することができる。
【００８２】
したがって、灌流フィルターなしのＸｕｒｉ  Ｗ２５において、懸濁凝集体のための閉鎖系培地交換のための１つの方法は、以下の通りである。
供給バッグ内の培地を予熱する。
いったん予熱したら、供給バッグと回収バッグにチューブが取り付けられていることを確認する。
リアクターを一時停止し、１２度の角度で停止するまで待つ。
トレイを持ち上げて６０度の角度にする。
ガスの流れを止め、バッグを押して収縮させる。
凝集体を２分間沈殿させる。
【００８３】
回収：
上段のメニューバーから、マニュアル（Ｍａｎｕａｌ）→マニュアルの指令を実行（Ｅｘｅｃｕｔｅ  ｍａｎｕａｌ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）を選択する。
培地制御（Ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｔｒｏｌ）→回収（Ｈａｒｖｅｓｔ）→チューブ内径＝３．２ｍｍ（Ｔｕｂｅ  ｉｎｎｅｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒ＝３．２ｍｍ）→挿入（Ｉｎｓｅｒｔ）を選択する。
ポンプの制御（Ｐｕｍｐ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）→回収ポンプ始動（Ｓｔａｒｔ  Ｈａｒｖｅｓｔ  Ｐｕｍｐ）→限定範囲（Ｌｉｍｉｔｅｄ）→６０秒間、２００  ｒｐｍ（６０  ｓｅｃ  ｄｕｒａｔｉｏｎ，２００  ｒｐｍ）→挿入（Ｉｎｓｅｒｔ）を選択する。
実行する。
ポンプは約７５ｍＬを引き出す。２００ｒｐｍを使用して、６０秒ごとにおよそ７５ｍＬが除去される。ポンプの較正は変更可能であり、４日ごとの較正が推奨される。
閉じる（Ｃｌｏｓｅ）をクリックする。
【００８４】
供給：
上段のメニューバーから、マニュアル（Ｍａｎｕａｌ）→マニュアルの指令を実行（Ｅｘｅｃｕｔｅ  ｍａｎｕａｌ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）を選択する。
培地制御（Ｍｅｄｉａ  ｃｏｎｔｒｏｌ）→供給（Ｆｅｅｄ）→チューブ内径＝３．２ｍｍ（Ｔｕｂｅ  ｉｎｎｅｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒ＝３．２ｍｍ）→挿入（Ｉｎｓｅｒｔ）を選択する。
ポンプの制御（Ｐｕｍｐ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）→供給ポンプ始動（Ｓｔａｒｔ  Ｆｅｅｄ  Ｐｕｍｐ）→限定範囲（Ｌｉｍｉｔｅｄ）→６５秒間、２００  ｒｐｍ（６５  ｓｅｃ  ｄｕｒａｔｉｏｎ，２００  ｒｐｍ）→挿入（Ｉｎｓｅｒｔ）を選択する。
実行する。
ポンプは約７５ｍＬを加える。２００ｒｐｍを使用して、６０秒ごとにおよそ７５ｍＬが添加される。新鮮な培地をすべてバッグに移送し、チュービングが空であることを確実にするために、必要より５秒長く稼働させる。ポンプの較正は変更可能であり、４日ごとの較正が推奨される。
閉じるをクリックする。
【００８５】
上記のプロトコルは、細胞を重力沈降させるためのマニュアルの指令を必要とする。又は、灌流制御は、連続灌流（約０．３ｍＬ  ／分の供給及び５００ｍＬ  ／日の除去）又は少なくとも１日に１回発生するように設定された不連続（一度に５０〜５００ｍＬのバッチ除去及び新鮮な培地との交換）のいずれかを用いて、Ｘｕｒｉ制御ソフトウェアを用いて設定することができる。場合によっては、細胞増殖が改善される場合、不連続的な灌流が好ましいことがある。図１０は、様々な連続的及び不連続的な灌流シナリオにおける経時的な新鮮培地対使用済み培地の量を詳細に示す。すべての場合において、培地交換は完全に自動化され、ユーザーの介入は不要である。
【００８６】
本明細書に記載の例示的Ｘｕｒｉ細胞増殖システムＷ５及び／又はＷ２５は、迅速なセットアップのために設計されており、本明細書に記載されているように約１５０ｍｌ〜約５Ｌ又はそれ以上もしくはそれ以下の作業培養容量で使用することができる。この小型ユニットには、エアレーション、加熱、温度制御などの不可欠な機能が組み込まれている。他のオプションには、灌流培養用の重量コントローラー、溶存酸素増幅器及びｐＨコントローラーが含まれる。
【００８７】
実施例２
ここに記載された増殖率は例であり、本発明、システム又はアプローチの性能又は固有の制限を定義することを意図するものではない。当業者は、使用される細胞株、使用される培地の配合、培地容量、培地交換及び灌流のスケジュール、初期播種密度及び使用される培養条件によって、増殖率が影響を受けることを認識するであろう。以下の実施例は、約６００万細胞／ｍＬの最大細胞濃度を記載しているが、これらの実施例に記載の方法を上記の文章で言及した変更と組合せて用いると、より高い細胞濃度が達成可能であると考えられる。これらの実施例は、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ  Ｗａｖｅモーションバイオリアクターシステムを利用しているが、当業者は、他の揺動プラットフォームも同様の性能を達成できることを認識するであろう。
【００８８】
材料：次の実施例に使用される材料には、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（登録商標）（ＭＡ、ＵＳＡ）の遠心チューブ、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇバイオリアクター（例えば、製品２９１０８４４２及びＣＢ０００１Ｌ１０−０１）が含まれる。Ｃｅｌｌｂａｇに関連する揺動プラットフォームはＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｗ２５及びＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｗ５（旧称Ｗａｖｅ  ２／１０）である。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（ＣＡ、ＵＳＡ）及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）（ＮＹ、ＵＳＡ）から購入し、ｍＴｅＳＲ（商標）−１培地はＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）から購入したＹ−２７６３２（Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤）は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）から購入した。多角形格子スライサー及び継代に使用される重力沈降のためのチュービングアセンブリは、この用途のために特別に製造したものであり、市販品販売会社を介して購入したものではない。
【００８９】
細胞：ＣＴ−２細胞株（ヒト胚性幹細胞）は、コネチカット大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ、ＵＳＡ）から入手し、ＣＨＢ−１０細胞株は、ボストン小児病院（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｂｏｓｔｏｎ）、ＵＳＡのＧｅｏｒｇｅ  Ｄａｌｅｙ氏より入手し、ＮＬ５（ＮＣＲＭ−５としても知られている）細胞株（ヒト人工多能性幹細胞）は、国立心肺血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ，ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ）ｉＰＳＣ及びゲノムエンジニアリングコア施設のＧｕｏｋａｉ  Ｃｈｅｎ氏より入手した。
【００９０】
接着培養から懸濁凝集体培養への多能性幹細胞の適合：
３種の多能性幹細胞株（２種の胚性幹細胞株ＣＴ２、ＣＨＢ１０及び１種の人工多能性幹細胞株ＮＬ５）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）の接着培養から、揺動培養システムにおける懸濁凝集体に適合させた。小規模で揺動を提供するために、細胞を６ウェルプレート又はＴフラスコ中に維持し、標準の加湿ＣＯ2インキュベーター内に維持されたＴｈｅｒｍｏ  Ｖａｒｉｍａｘ試験管ロッカー又はＢｏｅｋｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｏｃｋｅｒ  ＩＩ  ２６０３５０揺動プラットフォームを用いて揺動させた。細胞株は、Ｘｕｒｉ  Ｗ２５システムで増殖させる前に、安定した細胞培養を可能にするために数継代にわたって維持した。各細胞株について、好ましい細胞プレーティング濃度、揺動角度、揺動速度、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤の濃度及び継代中のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）曝露の長さに関して系統的に条件を試験した。３種の細胞株すべてが異なる培養条件を好むことに注目した。
【００９１】
３種の異なる細胞株について、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で解離した細胞を、１〜１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中１００Ｋ〜１．５Ｍ細胞／ｍＬの細胞密度で低接着６ウェルプレート又はＴフラスコに播種し、一晩培養後に形成された直径約５０〜約２００ｕｍの凝集体の培養を確立した。最初に培養物を確立した際に異なる播種密度を試験し、各細胞型の好ましい播種密度を決定した。異なる細胞株の増殖に好ましい揺動角度／揺動速度を系統的に決定した。３種の細胞株にわたって、６ウェルプレート及びＴフラスコにおける好ましい培養条件は、約１０〜２５回／分（ｒｐｍ）、及び１２〜２０度の揺動角度であった。
【００９２】
細胞への毎日の供給は、多分化能の最適な維持のために用いられた。毎日５０〜１００％の培地交換を使用した。培地交換を行うために、凝集体を１８０×ｇで１分間遠心分離するか、又は代わりに２〜５分間重力沈降させた。重力沈降は凝集体が大きいほど、小さい凝集体よりも速い。上清を慎重に除去し、新鮮な培地と交換し、穏やかなピペッティングによって凝集体を懸濁した。細胞増殖率は、播種した細胞濃度に依存し、初期細胞密度が低いほど高い増殖率が得られた。
【００９３】
６ウェルプレート／Ｔフラスコ中の懸濁凝集体ＰＳＣの増殖及び継代：
ＰＳＣ懸濁凝集体を、凝集体の密度及び直径に依存して、３〜５日ごとに継代した。凝集体は、直径約２５０〜４００ｕｍになった時に継代した。凝集体の直径が大きくなると、中心が暗くなるか、又は凝集体に穴又は空き領域のように見えるものが発生することがある。細胞数は、３〜５日の培養中に約４〜１２倍増加した。
【００９４】
継代のために、凝集体をＰＢＳ中で１回洗浄し、続いてＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）で３７℃において５〜７分間処理した。解離した細胞を２００ｘｇで５分間遠心分離し、次いで上清を慎重に除去し、１〜１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中所望の細胞濃度まで完全培地と交換した。代替として、壁間に１００ｕｍの間隔を有する正方形又は六角形の格子パターンからなるニッケル合金又はケイ素で構成されるスライサーを用いて凝集体を継代した。
【００９５】
一実施例では、凝集体形成及び細胞増殖は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）又は正方格子又は六角格子スライサーによる継代の後に測定した。継代後、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞を、１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含む、又は含まない、６ウェルプレート中２ｍｌのｍＴｅＳＲ１に４×１０5細胞／ｍｌ又は１．５×１０6細胞／ｍＬのいずれかで播種した。プレートを、標準的な細胞培養インキュベーター中のＢｏｅｋｅｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｏｃｋｅｒ  ＩＩ  ２６０３５０ロッカープラットフォームに３７℃、５％ＣＯ2において、２０回の揺動／分、１５°の揺動角度の培養条件で維持した。一晩培養後、Ａｃｃｕｔａｓｅ処理した細胞から凝集体が形成された。毎日、使用済みのｍＴｅＳＲ１を完全に除去し、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新鮮なｍＴｅＳＲ１と交換した。４日目に、凝集体を回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて解離させ、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）によって継代した凝集体について、４×１０5／ｍＬでプレーティングした細胞に関して約８倍の増殖が観察された（図１６）。正方形又は六角形のスライサーを用いて継代した後の凝集体に関して、同様に約８倍の増殖が観察された（図１６）。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）によって継代した両方の細胞について、１．５×１０6／ｍＬでプレーティングした細胞関して約４倍の増殖が観察された（図１７）。正方形又は六角形のスライサーを用いて継代した後の凝集体に関して、同様に約４倍の増殖が観察された（図１７）。両方の初期細胞密度において、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を用いて、又は用いずに培養した、スライサーにより継代した凝集体の増殖速度は同様であった。４日間の培養期間にわたる凝集体の形態を図１８〜２２に示す。
【００９６】
ＶｕｅＬｉｆｅバッグの増殖データ：
一実施例では、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて解離させた。１日目にＣＴ２凝集体を、７２ｍＬのｍＴｅＳＲ１＋１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中２５０，０００細胞／ｍＬでＶｕｅＬｉｆｅ  ７２Ｃガス透過性バッグに播種した。ＶｕｅＬｉｆｅバッグを標準インキュベーター内に配置し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｖａｒｉｍａｘ試験管揺動プラットフォームを用いて揺動させた。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度９度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。完全な培地交換は、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新鮮なｍＴｅＳＲ１で毎日行った。４日目に、凝集体をＣｅｌｌｂａｇから回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞／小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計８．６７×１０7の生存細胞が全培養物に対して９６．３％の生存率で回収され、４．８倍の増殖を示した。
【００９７】
Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）により解離させた細胞のＣｅｌｌｂａｇへの播種：
多能性幹細胞懸濁凝集体をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）によって解離させた。Ａｃｃｕｔａｓｅ処理した細胞産物は、大部分が２〜１０個の小型細胞塊及び単一細胞で構成されていた。ｍＴｅＳＲ１＋１〜１０ｕＭのＹ２７６３２ＲＯＣＫ阻害剤中、１ＬのＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ中に全容量１２５ｍＬから５００ｍＬで、又は２Ｌの  Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ中に３５０ｍＬ〜１Ｌで、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに細胞を加えた。播種細胞濃度は、１００，０００〜２，０００，０００細胞／ｍＬであった。この培地は、場合により０．２％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含有した。最初の播種後２〜１８時間かけて凝集体が自発的に確立された。
【００９８】
一実施例では、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて解離させた。細胞を、２８３ｍＬのｍＴｅＳＲ１＋１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中  ４００，０００細胞／ｍＬで１ＬのＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度５度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。直径約１００〜１５０ｕｍの凝集体が翌朝までに形成された。使用済み培地の半量を、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新鮮な培地と毎日交換した。４日目に、凝集体をＣｅｌｌｂａｇから回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞／小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計４．４１×１０8個の生存細胞が全培養物に対して９８．６％の生存率で回収され、３．９倍の増殖を示した。
【００９９】
別の実施例では、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて解離させ、次いで凍結保存した。凍結保存ストックを解凍し、１５０ｍＬのｍＴｅＳＲ１＋１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中４００，０００細胞／ｍＬで１ＬのＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度５度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。直径約１００〜１５０ｕｍの凝集体が翌朝までに形成された。使用済み培地の半量を、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新鮮な培地と毎日交換した。４日目に、凝集体をＣｅｌｌｂａｇから回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞／小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計２．７６×１０8の生存細胞が全培養物に対して９６．１％の生存率で回収され、４．６倍の増殖を示した。
【０１００】
Ｃｅｌｌｂａｇ及びＸｕｒｉ  Ｗ２５バイオリアクターにおけるＰＳＣ増殖の設定：
すべての多能性細胞株が同じ培養条件を好むわけではない。Ｘｕｒｉ  Ｗ２５  システムにおけるＰＳＣ増殖に下記のパラメーターを使用したが、当業者は、他の容器において他の条件によりＰＳＣの増殖が提供されることを認識するであろう：温度３７℃、ＣＯ2レベル５％、周囲Ｏ2（約２１％）又はそれ以下のＯ2レベル。すべての実験は、２．５〜６度の揺動角度及び１２〜２０ｒｐｍの揺動速度を用いて行ったが、当業者は、他の条件もまたＰＳＣ増殖をもたらすことを認識するであろう。
【０１０１】
Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに単一細胞／小型細胞塊を添加してから２〜１２時間後に凝集体が形成された。細胞は、直径約５０〜２００ｕｍの間の凝集体を形成した。通常、凝集体の平均直径の上下５０ｕｍの凝集体直径分布を得た。大部分の凝集体はそのサイズの範囲内に収まったが、時折、約２００〜４００ｕｍの比較的大きい凝集体が形成された。凝集体が大きいほど栄養利用性が制限され、凝集体が小さいほど培養において相対的に大きな増殖をもたらすので、比較的小さい凝集体に有利な条件が好ましい。
【０１０２】
好ましい条件は、クランピングを最小限に抑えた球状凝集体を提供する。Ｃｅｌｌｂａｇにおける攪拌レベルのバランスが重要であり、攪拌が多すぎると、凝集体の変形を含むせん断及び過剰数の非凝集単一細胞の産生をもたらす。攪拌が少なすぎると、凝集体のクランピングをもたらす。
【０１０３】
一実施例では、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）によって単一細胞又は５個以下の細胞の小型細胞塊に解離させた。解離させた細胞を、４００，０００細胞／ｍＬ、１５０ｍＬのｍＴｅＳＲ１でＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度５度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。直径約１００〜１５０ｕｍの凝集体が翌朝までに形成された。使用済み培地の半量を、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新鮮な培地と毎日交換した。４日目に、凝集体をＣｅｌｌｂａｇから回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞／小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計２．２×１０8の生存細胞が全培養物に対して９９．１％の生存率で回収され、７．０倍の増殖を示した。
【０１０４】
別の実施例では、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）によって単一細胞又は５個以下の細胞の小型細胞塊に解離させた。解離した細胞を、１ＬのｍＴｅＳＲ＋１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中４００，０００細胞／ｍＬで２ＬのＸｕｒｉ潅流Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度５度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。直径約１００〜１５０ｕｍの凝集体が翌朝までに形成された。使用済み培地の半量を、連続潅流を介してＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新鮮な培地と毎日交換した。４日目に、凝集体をＣｅｌｌｂａｇから回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞／小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計２．２３×１０9の生存細胞が全培養物に対して９３．５％の生存率で回収され、５．６倍の増殖を示した。
【０１０５】
別の実施例では、ＮＬ５ヒト人工多能性幹細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）によって単一細胞又は５個以下の細胞の小型細胞塊に解離させた。解離した細胞を、２５０ｍＬのｍＴｅＳＲ１＋１０ｕＭのＹ２７６３２ＲＯＣＫ阻害剤中４００，０００細胞／ｍＬで１ＬのＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度４度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。直径約２００〜３００ｕｍの凝集体が翌朝までに形成された。使用済み培地の半量を、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新鮮な培地と毎日交換した。４日目に、凝集体をＣｅｌｌｂａｇから回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞／小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計３．７×１０8の生存細胞が全培養物に対して９２％の生存率で回収され、３．７倍の増殖を示した。
【０１０６】
重力沈降のためのチュービングアセンブリ及び非灌流バッグにおける培地交換：
チュービングアセンブリの概念的構成を図２３及び図２４に示し、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇのアセンブリの画像を図２５に示す。このアセンブリは下記の機能を提供するが、これらに限定されるものではない：（１）細胞／細胞培養培地混合物の除去、（２）排出される細胞培養培地からの細胞凝集体分離、（３）細胞培養培地の添加、及び（４）細胞培養培地の除去。
【０１０７】
細胞凝集体／細胞培養培地混合物の除去は、非灌流バッグの利用可能なポートの１つを通って進入するディップチューブの使用によって達成される。ディップチューブは、細胞／培地がＸｕｒｉプラットフォームに設置され動作しながら非灌流バッグから除去できるように、十分な長さ／配向でなければならない。培地除去の間の適切な重力設定を確保するために十分な長さ（高さ）及び直径を有する重力沈降チャンバーを導入することにより、排出される培地からの細胞凝集体の分離が達成される。このチャンバーの設計は、大口径のチューブに限定されるものではなく、十分な細胞凝集体分離のために必要であれば、曲がりくねった経路を一体化することもできる。流体の追加／除去のためのチュービングは、培地／廃棄容器への接続を確実に達成するために適切な長さでなければならない。流体除去は流体添加経路を閉じたまま、流体除去経路を通して培地を引き出すことによって達成される。流体添加は、流体除去経路を閉じたまま流体添加経路を通して新鮮な培地を注入することによって達成される。
【０１０８】
非灌流細胞培養容器における培地交換：
多能性幹細胞培養は、頻繁な培地交換を必要とする。閉鎖系培地交換を、２つの方法、すなわち１）マニュアルプロセス又は２）自動プロセスを用いて、揺動プラットフォームからＣｅｌｌｂａｇを取り外す必要なく実施した。
【０１０９】
培地交換のためのマニュアルプロセスは、以下の通りである：使用済み培地収集バッグを、Ｃｅｌｌｂａｇ上に無菌チューブ接合した。揺動プラットフォームを直立させ６０度の角度に傾けた。凝集体を、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ中で１〜５分間重力沈降させた。凝集体の沈降時間は、凝集体が大きいほど小さな凝集体より速い。ポンプを使用して、使用済み培地の５０％以上を、沈降した凝集体より上のポートから培地を引き抜いてＣｅｌｌｂａｇから除去した。通常非生存である単一細胞は、高い頻度で除去培地中に失われた。培地を除去しながら沈降した凝集体を撹乱しないように注意した。凝集体を穏やかに再懸濁させ、その後予熱した新鮮な培地を、Ｃｅｌｌｂａｇに無菌接合した細胞培養培地バッグからＣｅｌｌｂａｇに添加した。３〜５日後、凝集体を継代した。
【０１１０】
非灌流バッグにおける自動培地交換プロセスは、あらゆるサイズの非灌流Ｃｅｌｌｂａｇに適用可能である。例えば、１Ｌの非灌流Ｃｅｌｌｂａｇを、重力沈降用にチュービングアセンブリを用いて改変し、１０〜１００ｍＬの使用済み培地を１５分〜６時間かけて除去した後、１０〜１００ｍＬの新鮮な培地をＣｅｌｌｂａｇに添加した。制御ソフトウェアにより、重力沈降のためのチュービングアセンブリを介して使用済み培地除去及び新鮮培地添加の速度を調節した。新鮮な培地バッグ及び廃棄バッグを無菌的に細胞バッグに取り付けた。新鮮な培地バッグは、場合により、細胞培養期間中、冷蔵庫に保存した。３〜５日後、凝集体を継代した。
【０１１１】
一実施例では、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に１００ｕｍの間隔を有するニッケル合金正方格子スライサーを用いて継代した。細胞を、７２５，０００細胞／ｍＬで２５０ｍＬのｍＴｅＳＲ１の１Ｌ  Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度４度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。潅流条件は、５０分間かけてバイオリアクターから１５ｍＬの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて１２５ｍＬ／日を補充するように、１分間に１５ｍＬを添加するように設計した。４日目に、凝集体をＣｅｌｌｂａｇから回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて単一細胞／小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計１．１３×１０9の細胞が全培養物に対して９７．４％の生存率で回収され、６．２倍の増殖を示した。
【０１１２】
灌流Ｃｅｌｌｂａｇにおける培地交換：
使用済み培地の除去及びＣｅｌｌｂａｇ内の細胞の保持のために、Ｃｅｌｌｂａｇ内に浮遊膜を含む灌流Ｃｅｌｌｂａｇを用いて、自動ＰＳＣ増殖を達成した。このプロトコルは、すべてのタイプの灌流容器、例えば、灌流のための浮遊膜を有するＣｅｌｌｂａｇに適用可能である。例えば、典型的には３５０ｍＬ〜１Ｌの容量を培養し、２Ｌの浮遊膜灌流Ｃｅｌｌｂａｇで灌流する。連続的及び不連続的な灌流のためのプロトコルを以下に記載する。
【０１１３】
灌流Ｃｅｌｌｂａｇにおける連続灌流のために、重量ベースのＸｕｒｉ  Ｗ２５  Ｕｎｉｃｏｒｎソフトウェア制御を使用して、Ｃｅｌｌｂａｇ中の容量を特定のレベルに維持し、培地制御を用いて連続的な使用済み培地除去及び新鮮培地添加を調節した。この方法において、新鮮な培地添加及び使用済み培地除去の速度を調節するために、バッグの重量を連続的にモニターした。別の方法において、ポンプを、重量測定とは無関係に所定の速度で新鮮な培地を添加し、使用済み培地を除去するようにプログラムした。好ましくは、除去された使用済み培地の容量は、一定の容量を維持するために添加された新鮮な培地の容量に等しいが、２種の速度は異なっていてもよい。
【０１１４】
不連続的灌流のために、ソフトウェア制御は、特定量の使用済み培地の除去及び新鮮な培地の添加を調節する。このアプローチは、通常、容器の重量とは無関係である。好ましくは、所定の量の使用済み培地が除去され、続いて所定の供給スケジュールに従ってある量の新鮮培地がボーラス添加される。例えば、供給スケジュールは、２時間ごとに５０ｍＬの使用済み培地を除去し、続いて５０ｍＬの新鮮な培地を添加するように設定することができる。
【０１１５】
一実施例では、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて解離させた。細胞を、１ＬのｍＴｅＳＲ１＋１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中２７２，０００細胞／ｍＬで、浮遊膜を有する２Ｌ  Ｘｕｒｉ灌流Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度５度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。直径約１００〜１５０ｕｍの凝集体が翌朝までに形成された。連続灌流プロトコルを使用し、Ｘｕｒｉ  Ｗ２５ソフトウェア制御を用いて、１日にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない５００ｍＬのｍＴｅＳＲ１と交換した。４日目に、凝集体をＣｅｌｌｂａｇから回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞／小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計２．５９×１０9の生存細胞が全培養物に対して９５％の生存率で回収され、９．５倍の増殖を示した。
【０１１６】
凝集体の酵素継代のための２つの方法は、１）Ｃｅｌｌｂａｇにおける閉鎖系酵素処理及び２）Ｃｅｌｌｂａｇからの細胞回収、続くＣｅｌｌｂａｇ外部への開放型酵素継代、である。両方の方法を以下に記載する。開放型継代方法は、必要なバッグの無菌接合を少なくすることにより、短時間で達成することができる。閉鎖系方法は、継代の間を通してずっと凝集体を閉鎖系において維持することが可能である。
【０１１７】
Ｃｅｌｌｂａｇ中の凝集体のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）解離方法：この方法において、培地を除去し、凝集体をＰＢＳで洗浄し、次にＣｅｌｌｂａｇ中でＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて処理する。せん断を使用して凝集体をばらばらにする方法が必要である。
【０１１８】
Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇにおいて懸濁凝集体を継代するための閉鎖型方法を記載する。Ｘｕｒｉプラットフォームのトレイを６０度の角度に持ち上げた後、凝集体を１〜５分間重力沈降させた。凝集体の沈降時間は、凝集体が大きいほど小さな凝集体より速い。ポンプを使用して、沈降した凝集体を撹乱することなく、できるだけ多くの培地をＣｅｌｌｂａｇから除去した。好ましくは、容量を２５〜５０ｍＬに減少させた。３７℃に予熱されたＰＢＳを含むバッグを、細胞を洗浄するためにＣｅｌｌｂａｇに無菌チューブ接合した。２５０ｍＬ〜５００ｍＬのＰＢＳをＣｅｌｌｂａｇに添加して、細胞を洗浄した。凝集体をＰＢＳ中で混合し、次いで１〜５分間重力沈降させた。ポンプを使用して、沈降した凝集体を撹乱することなく、Ｃｅｌｌｂａｇから多くのＰＢＳを除去した。好ましくは、容量を２５〜５０ｍＬに減少させた。追加の２５０ｍＬ〜５００ｍＬのＰＢＳをＣｅｌｌｂａｇに添加し、２回目の細胞洗浄をした。凝集体をＰＢＳ中で混合し、次いで１〜５分間重力沈降させた。ポンプを使用して、沈降した凝集体を撹乱することなく、Ｃｅｌｌｂａｇから多くのＰＢＳを除去した。好ましくは、容量を２５〜５０ｍＬに減少させた。
【０１１９】
３７℃に予熱されたＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を含むバッグを、Ｃｅｌｌｂａｇに無菌チューブ接合した。５０ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）をＣｅｌｌｂａｇに添加し、３７℃で揺動しながらインキュベートした。Ｃｅｌｌｂａｇのポートの０．２２ｕｍフィルターチュービングアセンブリに取り付けられた注射器を使用して、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）中で凝集体をばらばらにした。５０ｍＬの完全培地を添加し、細胞を下流用途のために収集した。
【０１２０】
一実施例では、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）によって単一細胞又は５個以下の細胞の小型細胞塊に解離させた。解離した細胞を、１５０ｍＬのｍＴｅＳＲ１＋１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中４００，０００細胞／ｍＬでＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度５度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。直径約１００〜１５０ｕｍの凝集体が翌朝までに形成された。使用済み培地の半量を、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新鮮な培地と毎日交換した。４日目に、凝集体を上記のようにＣｅｌｌｂａｇ内でＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計４．２×１０8の生存細胞が全培養物に対して９７．８％の生存率で回収され、７．０倍の増殖を示した。
【０１２１】
Ｃｅｌｌｂａｇの外において凝集体をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）解離するための方法：
代替的に、容器から凝集体を回収し、開放系において継代した。この方法は、２つの方法で実施した：１）容器からの細胞の全培養容量の収集、又は２）バッグ内で凝集体が重力沈降した後で、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇから大部分の培地を除去し、その後、バッグ内においてＰＢＳで洗浄するか、又はバッグの外側で洗浄／  Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理するためにバッグから収集する。
【０１２２】
一実施例では、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇを用いた開放型Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）処理の方法を記載する。Ｘｕｒｉプラットフォームのトレイを６０度の角度に持ち上げた後、凝集体を１〜５分間重力沈降させた。凝集体の沈降時間は、凝集体が大きいほど小さな凝集体より速い。ポンプを使用して、沈殿した凝集体を撹乱することなく大部分の培地をＣｅｌｌｂａｇから除去した。好ましくは、容量を２５〜５０ｍＬに減少させた。収集バッグをこの系にチューブで取り付けて、ポンプを使用して凝集体をＣｅｌｌｂａｇから収集バッグに移送した。収集バッグを層流キャビネットに入れ、凝集体を無菌的にコニカルチューブに移送した。コニカルチューブを１８０ｘｇで１分間遠心分離し、次いで上清を慎重に除去した。凝集体をＰＢＳで洗浄し、再度１８０ｘｇで１分間遠心分離し、次いで上清を除去した。凝集体を解離させるために、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を３７℃において５〜７分間添加した。
【０１２３】
連続継代：フィルターレスバッグから浮遊膜灌流バッグへの酵素継代：
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞のフィルターレスバッグから浮遊膜灌流バッグへの連続継代を行った。１回目の継代を２５０ｍＬ容量で増殖させ、２回目の継代を１Ｌ容量で増殖させた。ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて解離させた。各継代において、細胞を、ｍＴｅＳＲ１＋１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中４００，０００細胞／ｍＬで、１Ｌの非灌流又は２Ｌの灌流Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度５度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。直径約１００〜１５０ｕｍの凝集体が翌朝までに形成された。使用済み培地の半量を、フィルターレスバッグ中のＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新鮮培地と毎日交換し、連続灌流プロトコルを使用し、Ｘｕｒｉ  Ｗ２５ソフトウェア制御を用いて浮遊膜灌流Ｃｅｌｌｂａｇにおいて１日あたり５００ｍＬの培地を交換した。凝集体を、播種後４日目にＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて単一細胞／小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。継代１において、合計６．９６×１０8の生存細胞が全培養物に対して９９．４％の生存率で回収され、７倍の増殖を示した（図２６）。継代２において、合計２．２３×１０9の生存細胞が全培養物に対して９３．５％の生存率で回収され、５．６倍の増殖を示した。８日間かけて、全体で３９．２倍の増殖があった。
【０１２４】
連続継代：Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇｓにおける４回続く酵素的連続継代：
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞の４継代にわたる連続的継代を、１Ｌ及び２ＬのＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇで行った。２回の継代を１５０ｍＬ容量で増殖させ、続いて１回を４００ｍＬ容量で、１回を１Ｌ容量で継代した。ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体をＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて解離させた。各継代において、細胞を、ｍＴｅＳＲ１＋１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中  ４００，０００細胞／ｍＬでＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度５度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。直径約１００〜１５０ｕｍの凝集体が翌朝までに形成された。使用済み培地の半量を、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない新鮮な培地と毎日交換した。凝集体を、播種後４日目にＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて単一細胞／小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。継代１において、合計２．１９×１０8の生存細胞が全培養物に対して９９．１％の生存率で回収され、３．７倍の増殖を示した（図２７）。継代２において、合計４．１７×１０8の生存細胞が全培養物に対して９７．８％の生存率で回収され、７倍の増殖を示した。継代３において、合計５．６４×１０8の生存細胞が全培養物に対して９７．２％の生存率で回収され、３．５倍の増殖を示した。継代４において、合計１．２５×１０9の生存細胞が全培養物に対して９４．４％の生存率で回収され、３．１倍の増殖を示した。全体的な増殖は、１６日間で２７９倍であった。連続継代間の凝集体形態を図２８に示す。
【０１２５】
スライサーの設計：
スライサーは、様々な生体適合性材料で構成することができる。この材料は、滅菌に適していなければならず、細胞サンプルの流動の間に受ける応力に耐えられる機械的強度を有していなければならない。多能性幹細胞凝集体の継代について試験した２つの材料は、ニッケル合金とケイ素であった。当業者は、他の材料が、凝集体の継代のための所望のスライサー性能を可能にする特性を有することを認識するであろう。スライサーは、例えば、正方形又は六角形の格子のような多角形格子様のパターンで設計され、格子壁の間に５０μｍから４００μｍの間の間隔を有する（図２９〜３１）。いくつかの実験において、スライサーを疎水性材料でコーティングして、せん断及び汚損を低減した。以下に記載する多能性幹細胞凝集体の継代実験のために、１００ｕｍの間隔を有する正方形及び六角形の格子を使用した。スライサーを、閉鎖系において、チュービングを通り、スライサーを越える凝集体の無菌流動を可能にするチュービングと一直線になるように取り付けた。スライサーは、限定するものではないが、接着剤、溶融ポリマー流、又は締付けを含む様々な締結機構によって閉鎖系に一体化することができる。好ましい方法において、ポンプ及びインラインコロニカルバッグによって駆動される循環ループを介して、凝集体を懸濁液中に維持する（図３２）。スライサーに通じるチュービングは、主循環ループに接続され、循環ループ内の細胞凝集体の分画は、循環ループを制御するポンプよりも低速で作動する第２のポンプを介してスライサーに送達される。スライスされた凝集体は別の容器に収集されても、又は同じ容器に再導入されてもよい。
【０１２６】
細胞凝集体の継代の間のスライサー性能：
凝集体は、１００ｍＬ〜１Ｌの容量からなる流動流の中でスライサーを通過した。酵素継代と比較したスライサーの利点は、時間、労力及び試薬の削減である。約１００ｕｍの寸法への縮小スライスの成功は、一方向又は双方向の流れでスライサーを１以上回通過することによって達成された。流速はせん断を最小にするように制御した。サイズ縮小、細胞生存率の維持及びその後の増殖のための凝集体スライス性能を、１５〜１５０ｍＬ  ／分の流速でスライサーを通過した多能性幹細胞凝集体に対して実証した。当業者であれば、他の流速でも良好な性能を達成できることを理解するであろう。スライサーを通過するために使用された細胞凝集体濃度は、スライスされた細胞凝集体の高い生存率での回収に影響を及ぼすように決定した。スライサーの汚損は、細胞の回収率及び生存率を低下させる可能性がある。約３×１０6細胞／ｍＬ未満の細胞凝集体濃度をスライスすることにより、約３×１０6細胞／ｍＬを超える細胞濃度よりも高い生存率サンプルが高い回収率で生成されることが判明した。例えば図３２に示す混合装置を使用することによって、フローストリーム中の凝集体の均一な懸濁液を維持することで汚損を最小限に抑え、高い細胞生存率及び回収率をもたらす。スライスした凝集体の試料画像を図３３に示す。スライス後の凝集体の形態は、不規則形状、立方体形状及び球形を含む。１００ｕｍのスライサーの場合、凝集体の１以上の寸法は、直径約１００ｕｍに縮小される。スライスした凝集体をｍＴｅＳＲ１及び場合により１〜１０ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中で培養し、増殖させた。Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤は、単一多能性細胞の生存率を維持するために一般的にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤のような薬剤を必要とする酵素的に継代された多能性幹細胞凝集体とは異なり、スライスされた多能性幹細胞凝集体の増殖には必要ではなかった。スライスされた凝集体の形態は、連続揺動培養条件下で急速に球形に再形成された。スライスされた凝集体の増殖速度は、酵素的に継代された細胞の増殖速度と同様であった（図１６及び１７）。凝集体は、酵素継代に必要なＰＢＳ洗浄を行わずにスライサーによって継代することができ、したがって、スライスによる継代は、酵素継代よりも少ない時間と少ない全体努力で行われる。当業者であれば、スライサーの機能及び性能は、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇバイオリアクタープラットフォームに依存せず、例えば、限定するものではないが、他の揺動運動プラットフォーム又は攪拌タンクバイオリアクターを含む他のタイプのバイオリアクターとも適合可能であることを認識するであろう。
【０１２７】
スライサー後の凝集体の増殖：
一実施例では、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に１００ｕｍの間隔を有するニッケル合金六角格子スライサーを用いて継代した。細胞を、２５０ｍＬのｍＴｅＳＲ１＋３ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中  ４６０，０００細胞／ｍＬでＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度４度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。潅流条件は、５０分間かけてバイオリアクターから１５ｍＬの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて１２５ｍＬ／日を補充するように、１分間にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない１５ｍＬの新鮮なｍＴｅＳＲ１を添加するように設計した。５日目に、凝集体をＣｅｌｌｂａｇから回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）で単一細胞／小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計６．９×１０8の生存細胞が全培養物に対して９１．９％の生存率で回収され、６．０倍の増殖を示した。
【０１２８】
別の例では、ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に１００ｕｍの間隔を有するケイ素六角形格子スライサーを用いて継代した。細胞を、２５０ｍＬのｍＴｅＳＲ１中２００，０００細胞／ｍＬのＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇに、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を添加せずに播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度４度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。潅流条件は、１１０分間かけてバイオリアクターから３０ｍＬの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて１２５ｍＬ／日を補充するように、２分間にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない３０ｍＬの新鮮なｍＴｅＳＲ１を添加するように設計した。４日目に、凝集体をＣｅｌｌｂａｇから回収し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて単一細胞／小型細胞塊に解離させた。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。合計２．９０×１０8の生存細胞が全培養物に対して９２．９％の生存率で回収され、５．８倍の増殖を示した。
【０１２９】
連続継代：ニッケル合金の六角格子スライサーを用いた、フィルターレスバッグからフィルターレスバッグへの継代
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞の３継代にわたる連続的継代を、１ＬのＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇで行った。２回の継代を２５０ｍＬ容量で増殖させ、続いて１回を５００ｍＬ容量で継代した。ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に１００ｕｍの間隔を有するニッケル合金六角格子スライサーを用いて継代した。各継代において、スライスした凝集体を、１ＬのＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ内のｍＴｅＳＲ１＋２〜５ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤に播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度４度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。潅流条件は、５０分間かけてバイオリアクターから１５ｍＬの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて１２５ｍＬ／日を補充するように、１分間にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない１５ｍＬのｍＴｅＳＲ１を添加するように設計した。凝集体の一部を、４又は５日目に、計数のためにＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて単一細胞／小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。継代１において、合計１．２２×１０8の生存細胞を播種し、３．１２×１０8の生存細胞が全培養物に対して９６．８％の生存率で回収され、２．６倍の増殖を示した（図３４）。継代２において、合計１．１５×１０8の生存細胞を播種し、６．９３×１０8の生存細胞が全培養物に対して９１．９％の生存率で回収され、６倍の増殖を示した。継代３において、合計３．４８×１０8の生存細胞を播種し、１．８８×１０9の生存細胞が全培養物に対して９２％の生存率で回収され、５．４倍の増殖を示した。１４日間かけて、全体で８３倍の増殖があった。
【０１３０】
連続継代：ニッケル合金の正方格子スライサーを用いた、フィルターレスバッグからフィルターレスバッグへの継代
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞の３継代にわたる連続的継代を行った。２回の継代を２５０ｍＬ容量で増殖させ、続いて１回を５００ｍＬ容量で継代した。ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に１００ｕｍの間隔を有するニッケル合金正方格子スライサーを用いて継代した。各継代において、スライスした凝集体をＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ内のｍＴｅＳＲ１＋２〜５ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤に播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度４度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。潅流条件は、５０分間かけてバイオリアクターから１５ｍＬの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて１２５ｍＬ／日を補充するように、１分間にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない１５ｍＬのｍＴｅＳＲ１を添加するように設計した。凝集体の一部を、５日目に、計数のためにＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて単一細胞／小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。継代１において、合計１．１４×１０8の生存細胞を播種し、５．１３×１０8の生存細胞が全培養物に対して９７．５％の生存率で回収され、４．５倍の増殖を示した（図３５）。継代２において、合計１．８２×１０8の生存細胞を播種し、１．１３×１０9の生存細胞が全培養物に対して９７．４％の生存率で回収され、６．２倍の増殖を示した。１０日間かけて、全体で２８倍の増殖があった。
【０１３１】
連続継代：ケイ素の六角格子スライサーを用いた、フィルターレスバッグからフィルターレスバッグへの継代
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞の２継代にわたる連続的継代を行った。両方の継代を２５０ｍＬ容量で増殖させた。ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に１００ｕｍの間隔を有するケイ素六角形格子スライサーを用いて継代した。各継代において、スライスした凝集体を、１ＬのＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ内のｍＴｅＳＲ１＋２〜５ｕＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤に播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度４度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。潅流条件は、５０分間かけてバイオリアクターから１５〜３０ｍＬの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて１２５ｍＬ／日を補充するように、１〜２分間にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない１５〜３０ｍＬのｍＴｅＳＲ１を添加するように設計した。凝集体の一部を、４又は５日目に、計数のためにＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて単一細胞／小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。継代１において、合計５．７４×１０7の生存細胞を播種し、３．１５×１０8の生存細胞が全培養物に対して９３．８％の生存率で回収され、５．５倍の増殖を示した（図３６）。継代２において、合計１．９５×１０8の生存細胞を播種し、１．０４×１０9の生存細胞が全培養物に対して９７．８％の生存率で回収され、５．４倍の増殖を示した。９日間かけて、全体で２９．４倍の増殖があった。
【０１３２】
連続継代：ケイ素の六角格子スライサーを用い、ＲＯＣＫ阻害剤を用いない、フィルターレスバッグからフィルターレスバッグへの継代
一実施例では、懸濁凝集多能性幹細胞の２継代にわたる連続的継代を行った。１回の継代を２５０ｍＬ容量で増殖させ、続いて１回を３００ｍＬ容量で継代した。ＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体を、壁間に１００ｕｍの間隔を有し、疎水性材料でコーティングされたケイ素六角形格子スライサーを用いて継代した。各継代において、スライスした凝集体を、１Ｌ  Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ内のＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まないｍＴｅＳＲ１に播種した。培養条件を、２０回の揺動／分、揺動角度４度、３７℃、５％ＣＯ2で構成した。潅流条件は、１００分間かけてバイオリアクターから３０ｍＬの使用済み培地を除去し、続いて非灌流バッグにおける重力沈降のためのチュービングアセンブリを用いて培地の半分／日を補充するように、２分間にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない３０ｍＬのｍＴｅＳＲ１を添加するように設計した。凝集体の一部を、４又は５日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて単一細胞／小型細胞塊に解離することによって継代した。解離した細胞をＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ  ＮＣ２００を用いて計数した。継代１において、合計４．９×１０7の生存細胞を播種し、２．９×１０8の生存細胞が全培養物に対して９２．９％の生存率で回収され、５．９倍の増殖を示した（図３７）。継代２において、合計１．４５×１０8の生存細胞を播種し、１．１１×１０9の生存細胞が全培養物に対して９８．４％の生存率で回収され、７．７倍の増殖を示した。９日間かけて、全体で４５倍の増殖があった。Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地においてスライス直後及び増殖後の凝集体の形態を図３８に示す。
【０１３３】
連続継代後の多能性の確認
一実施例では、ＣＴ２細胞を、６ウェルプレートに懸濁凝集体として５継代にわたって維持し、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ中に３継代にわたって維持した。増殖細胞を、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４及びＴｒａ−１−６０の発現についてはフローサイトメトリーにより、胚様体からの３つの胚葉分化については核型により分析した。細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で透過性にし、その後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７とコンジュゲートしたＯｃｔ４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）とコンジュゲートしたＴｒａ−１−６０抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）又はフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートしたＳＳＥＡ４抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ又はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて、フローサイトメトリーにより分析した。図８に示す結果は、６ウェルプレートで懸濁凝集体として５継代及びＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇで懸濁凝集体として３連続継代の後の多能性マーカーの維持を実証する。図８Ａは、細胞の前方散乱及び側方散乱特性を示し、図８Ｂは、Ｏｃｔ４及びＴｒａ−１−６０の軸を示し、図８Ｃは、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇにおいて３継代にわたって増殖させた凝集体におけるＯｃｔ４及びＴｒａ−１−６０の発現を示し、図８Ｄはアイソタイプ抗体による染色を示し、図８ＥはＳＳＥＡ３の軸を示し、図８ＦはＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇにおいて３継代にわたって増殖させた凝集体におけるＳＳＥＡ３の発現を示す。このデータは、６ウェルプレート及びＸｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇにおいて揺動条件下で維持された懸濁凝集体中の、複数継代にわたる多能性の維持を実証している。
【０１３４】
６ウェルプレートに懸濁凝集体として５継代にわたって維持し、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇ中に懸濁液凝集体として３継代にわたって維持したＣＴ２細胞は、図８に示す正常核型を示した。胚様体の凝集体を形成した後、分化を促進するために細胞をプレーティングした。分化した細胞を１０％ホルマリンで一晩固定し、パラフィンに包埋し、５μｍの連続切片に切断し、抗アルファ  −  フェトプロテイン（内胚葉）、抗平滑筋アクチン（中胚葉）及び抗チューブリンＩＩＩ（外胚葉）を用いて免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を実施した。分化した細胞はすべての抗体について陽性に染色され、６ウェルプレートにおいて５継代し、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇにおいて３継代した後の懸濁凝集体としての連続継代の間の多分化能の維持を実証している（図８上部パネル）。
【０１３５】
本発明のわずかな特定の特色を、本明細書に例示及び記載してきたが、多くの改良及び変形が当業者には思い浮かぶことであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の精神の範囲内にあるすべてのこのような改良及び変形を含むことが意図されることを理解すべきである。
［実施態様１］
揺動プラットフォームバイオリアクター上の細胞培養容器を含む閉鎖系での細胞凝集体の増殖、
容器内での凝集体形成、
容器内での細胞凝集体の自動灌流、
灌流中の細胞凝集体のメンブレンフリー濾過、並びに
閉鎖系での細胞凝集体の回収及び継代、
の方法。
［実施態様２］
増殖させる細胞凝集体が、植物、動物、昆虫又は微生物由来である、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
増殖させる細胞凝集体が、多能性幹細胞又は分化ヒト細胞を含む、実施態様１又は２に記載の方法。
［実施態様４］
灌流中、細胞凝集体が細胞凝集体の重力沈降によって濾過膜の不在下でバッグ内に保持される、実施態様１、２又は３に記載の方法。
［実施態様５］
自動灌流が人間の介入なしに閉鎖系において実施される、実施態様１乃至実施態様４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様６］
連続継代を行うことによって、細胞凝集体又はその子孫の１以上回のさらなる増殖をさらに含む、実施態様１乃至実施態様５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様７］
細胞凝集体又はその子孫の１以上回のさらなる増殖が、膜フィルターを有する第２の容器への継代によって実施される、実施態様６に記載の方法。
［実施態様８］
細胞凝集体の連続継代が、閉鎖系においてスライサー格子を使用する無酵素継代によって可能になる。実施態様６に記載の方法。
［実施態様９］
細胞凝集体が、約２０〜約５００μｍの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される、実施態様８に記載の方法。
［実施態様１０］
細胞凝集体が、約１００μｍの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される、実施態様８又は９に記載の方法。
［実施態様１１］
細胞凝集体が、チュービング及び細胞凝集物の混合用装置にインラインのスライサー格子で解離される、実施態様８に記載の方法。
［実施態様１２］
スライサーが、疎水性材料でコーティングされるか、又は疎水性材料を含む、実施態様８に記載の方法。
［実施態様１３］
細胞凝集体の連続継代が、閉鎖系容器において酵素の存在下の細胞凝集体の解離によって可能になる、実施態様６に記載の方法。
［実施態様１４］
増殖した各細胞凝集体の平均直径が、約８００μｍ以下のサイズである、実施態様１乃至実施態様１３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１５］
増殖した各細胞凝集体の平均直径が、約５００μｍ以下のサイズである、実施態様１乃至実施態様１４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１６］
培養容器の容量が約５０ｍＬ〜約１００Ｌである、実施態様１乃至実施態様１５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１７］
培養容器の容量が約１００ｍＬ〜約１０Ｌである、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］
閉鎖系のバイオリアクターに付随するスライサー格子によってサイズが縮小された細胞凝集体を継代する方法。
［実施態様１９］
細胞凝集体が１００ｍＬを超える容量で継代される、実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２０］
細胞凝集体が、約２０〜約５００μｍの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される、実施態様１８又は１９に記載の方法。
［実施態様２１］
細胞凝集体が、約１００μｍの間隔のブレードを有するスライサー格子で解離される。実施態様１８、１９又は２０に記載の方法。
［実施態様２２］
細胞凝集体が、チュービング及び細胞凝集物の混合用装置にインラインのスライサー格子で解離される、実施態様１８乃至実施態様２１のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２３］
スライサーが、疎水性材料でコーティングされるか、又は疎水性材料を含む、実施態様１８乃至実施態様２２のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２４］
継代前の各細胞凝集体の平均直径が約８００μｍ以下のサイズである、実施態様１８乃至実施態様２３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２５］
継代前の各細胞凝集体の平均直径が約５００μｍ以下のサイズである、実施態様２４に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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