(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
純度９０％（ｗ／ｗ）以上のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びトキソイドＢを含む、
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及びトキシンＢに対する中和免疫応答を症候性クロストリジウム・ディフィシル感染症にかかる危険性のあるヒト対象において惹起する方法で使用するための組成物であって、
前記方法が、前記対象に、該組成物を少なくとも３回、各投与を少なくとも約７日あけて投与することを含み、第三の投与が第一の投与の約１８０日後であり、
クロストリジウム・ディフィシルトキシンＡ及びトキシンＢに対する前記免疫応答が、少なくとも約２１０日間持続する、組成物。
【請求項２】
前記ヒト対象が成人ヒト対象である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記惹起される免疫応答が、前記成人ヒト対象において、症候性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を予防及び／又はその危険性を低減させるのに充分である、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記惹起される免疫応答が、前記成人ヒト対象において、症候性のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の発症を予防するのに充分である、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
第二の投与が第一の投与の約７日後であり、第三の投与が第一又は第二の投与の約１８０日後である、請求項１〜４いずれか１項記載の組成物。
【請求項６】
第二の投与が第一の投与の約３０日後である、請求項１〜４いずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、少なくとも約９０％以上の純度を有するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡとトキソイドＢのそれぞれを、約３：１〜約１：１の比で含む、請求項１〜６いずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡとトキソイドＢの比が約３：２である、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、合計約４０から５００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びトキソイドＢを含む、請求項１〜８いずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、合計約２００μｇのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びトキソイドＢを含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物がアジュバントを含む、請求項１〜１０いずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物がアルミニウムアジュバントを含む、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記成人ヒト対象が少なくとも４０歳であり：
（ｉ）第一の投与の前１２か月の期間に、それぞれ少なくとも約２４又は７２時間継続する少なくとも２回の入院を有し、全身性（局所でない）抗生剤を服用したか、又は
（ｉｉ）第一の投与の６０日以内に、予定された外科手術のために入院するように手配されている、請求項２〜１２いずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
前記手配された入院が、少なくとも約２４又は７２時間にわたると予定され、以下の系：
（ｉ）腎臓／膀胱／尿系；（ｉｉ）筋骨格系；（ｉｉｉ）呼吸器系；（ｉｖ）循環器系；及び（ｖ）中枢神経系の少なくとも１つに関する手術のためのものである、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記成人ヒト対象が少なくとも約６５歳以上である、請求項２〜１４いずれか１項記載の組成物。
【請求項１６】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及び／又はトキシンＢに対する免疫応答が、少なくとも約１０００日間持続する、請求項１〜１５いずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、本開示に全体として組み込まれる２０１３年６月１４日に出願の米国特許出願第６１／８３５，２４６号明細書に対する優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本願は、成人ヒト対象（例えば、原発性・症候性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症にかかる危険性のある成人のヒト）において、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及びトキシンＢに対する免疫応答を惹起する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、グラム陽性芽胞形成性嫌気性菌である。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の病理学的作用は、分泌されるトキシンＡ及びＢにより媒介され、結腸粘膜の創傷及び炎症を起こす。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症（ＣＤＩ）は、患者によっては無症候性であるが、ＣＤＩは急性の下痢及び大腸炎を起こすことがあり、重症の場合では、偽膜性大腸炎及び中毒性巨大結腸症を起こし得る。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は、正常な腸内細菌叢を変化させる薬物を服用している入院患者における医原性の下痢及び大腸炎の臨床的に重要な原因であり、ＣＤＩは地域社会において報告数が増加している。症候性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の危険因子には、抗生剤治療、高齢、基礎疾患、及び入院又は長期介護施設における滞在がある。
【０００４】
前期臨床試験が実施され、数バージョンのクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドワクチンの安全性及び免疫原性が評価された。健常な成人（１８〜５５歳）及び高齢（６５歳以上）の志願者で、以前に評価されたトキソイドＡ及びＢを含むクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンは安全であることが証明され、トキシンＡとトキシンＢの両方に対する免疫応答を惹起した（非特許文献１；非特許文献２）。そのような試験での最大投与量は５０μｇであり、トキシンＡとトキシンＢの比は３：１であった。候補ワクチンは、０日、２８日、及び５６日に投与された。健常な成人と高齢の志願者群のどちらでも、反復投与後に、トキシンＡに対する血清変換(serotoconversion)はトキシンＢよりも高く、より若い群に比べて高齢の対象では抗体応答の速い低下が観察された。高齢者は免疫低下状態（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）であることが多いので、当業者はこれを重大な問題として認識する。症候性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症にかかる危険性のある成人に使用するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ワクチンの必要性は、特に高齢者において続いている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：２２４５−２２４９（２０１２）
【非特許文献２】Ｆｏｇｌｉａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ，３０：４３０７−４３０９（２０１２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、成人ヒト対象（例えば、原発性・症候性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症にかかる危険性のある成人）において、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及びトキシンＢに対する免疫応答を惹起する方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、有効なトキソイドＡ：Ｂ比（例えば、重量によるトキソイドＡとトキソイドＢ、３：１、３：２、又は１：１のいずれかの概略値）及び充分な純度（例えば、約９０〜１００％（ｗ／ｗ）など少なくとも約５０から約１００％）の有効量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びトキソイドＢ（例えば、約４０から約５００μｇ／投与量（ｗ／ｗ、組成物中のトキソイドＡとＢの総量））を含む組成物（例えば、ワクチン）を投与する工程、任意の好適な経路（例えば、筋肉内）により、本明細書に記載される通り当業者により決定され得る通りに反復投与（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｏｓｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）レジメンの各投与が互いから好適に分離されるように（例えば、約７日など約１日から１０日からあけて）１回以上の投与（例えば、３回）を利用する工程を含み得る。一実施形態において、方法は、第二の投与が第一の投与の約７日後であり、第三の投与が第一及び／又は第二の投与の少なくとも約３０日及び／又は少なくとも約１８０日後である第一、第二、及び第三の投与を含み得る。反復投与（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ）レジメンの好ましい実施形態において、第二の投与は、第一の投与の約７日後に投与してよく、且つ／又は、第三の投与は第一の投与の約３０日後（又は第二の投与の約２０〜２５日後）に投与される。いくつかの実施形態において、方法は、１種以上のアジュバント（例えば、アルミニウムアジュバント）を含み得る。特定の実施形態において、方法は、組成物を、感染症にかかる危険性があるヒトの対象に投与する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、少なくとも４０歳、５０歳、６５歳、又はそれ以上のいずれかの概略値でよい。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、年齢が約４０歳から約６５歳でよい。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、年齢が約６５〜７５歳又はそれ以上でよい。そのような特定の実施形態において、そのヒト対象は、第一の投与の前１２か月の期間に、それぞれ少なくとも２４時間、４８時間、若しくは７２時間以上のいずれかの概略値継続する少なくとも１回若しくは２回の入院をしたかもしれず、全身性（局所でない）抗生剤を服用したかもしれず；且つ／又は、第一の投与の６０日以内に計画された外科手術のために入院するように手配されている。いくつかの実施形態において、手配された／切迫した入院（ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｓｔａｙ）／入院（ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）は７２時間以上にわたると計画されることがあり、腎臓／膀胱／尿系、筋骨格系、呼吸器系、循環器系、及び／又は中枢神経系の少なくとも１つを含む手術のためであり得る。これらの方法により惹起された免疫応答が、症候性のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を、予防し、且つ／又は治療し、且つ／又は���減し、且つ／又はその危険性を低減させるのに充分であることが好ましい。当業者は、本明細書に提供される記載から他の実施形態を導くことができる。
本発明の一態様例として、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びトキソイドＢを含む、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及びトキシンＢに対する免疫応答をヒト対象において惹起する方法で使用するための組成物であって、前記方法が、前記対象に、該組成物を少なくとも３回、各投与を少なくとも約７日あけて投与することを含む組成物が挙げられる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本願は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による症候性の感染症を治療し、軽減し、その危険性を低減させ、且つ／又は予防するために使用できる組成物及び方法に関する。上述の通り、当業者は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）により起こる感染症に対して効能のあるワクチンを設計する困難に遭遇した。効能のあるワクチンは、例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による症候性の感染症を、治療し、軽減し、その危険性を低減させ、且つ／又は予防するものであり得る。これらの問題は、驚くべきことに、本明細書に記載される組成物及び方法により解決された。これらの驚くほど有効な解決法の種々の実施形態は本明細書に記載される。典型的な組成物が提供される。例えば、有効量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びトキソイドＢ（例えば、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００μｇ／投与量のいずれかの概略値などの約４０から約５００μｇ／投与量、約５０から約１００μｇ／投与量など（ｗ／ｗ、組成物中のトキソイドＡ及びＢの総量））を、有効なトキソイドＡ：Ｂ比で（例えば、重量によるトキソイドＡとトキソイドＢ、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、３：１、３：２、又は１：１のいずれかの概略値）、充分な純度で（例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９０〜１００％（ｗ／ｗ）のいずれかの概略値など少なくとも約５０から約１００％）含む組成物が、反復投与レジメンの各投与が互いから好適に分離されるように（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のいずれかの概略値など少なくとも約１日から約１０日、約７日など）、任意の好適な経路による（例えば、筋肉内）一回以上の投与を利用して（例えば、３回の投与又は投与量）提供される。投与の間の時間の長さ（時間間隔）は、個体によりさまざまであると当業者により理解されるだろうが、その間隔は、先の投与両方からの免疫応答が生じる時間があるように（例えば、初回刺激があるように）、且つその後の投与（例えば、追加刺激投与）により決して阻害されないように、充分に長くなくてはならない（例えば、日で測定して）。例えば、ある特定の個体は、投与の間に少なくとも約７日（例えば、５〜８日）要することがある一方で、別の個体は少なくとも約４日（例えば、３〜５日）しか要さないことがある。いくつかの実施形態において、そのため、投薬間隔は、例えば、約１０〜２０％変動し得る。当業者ならば、投与間の時間が本明細書に記載される通り調整される必要があり得ることを理解するだろう。いくつかの実施形態において、第二の投与は、第一の投与（例えば、０日）の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、又は１０日後であり、第三の投与は、第一の投与の少なくとも約２０〜２００（例えば、約３０又は約１８０日など、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、又は２００）日後である。例えば、方法は、第二の投与が第一の投与の少なくとも７日後であり、第三の投与が第一又は第二の投与の少なくとも約３０日及び／又は少なくとも約１８０日後である、第一、第二、及び／又は第三の投与を含み得る。いくつかの実施形態において、第二の投与は第一の投与の約７日後であり、第三の投与は第一の投与の約３０日後である。そのような方法を利用してそのような組成物を宿主／対象に投与すると、免疫応答が典型的には観察され、それは典型的には体液性免疫応答を含み、細胞性免疫応答を含み得る。特定の実施形態において、方法は、免疫原性組成物を、感染症にかかる危険性のあるヒト対象に投与する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、少なくとも４０歳、５０歳、６５歳、又はそれ以上のいずれかの概略値でよい。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、年齢が約４０歳から約６５歳でよい。いくつかの実施形態において、ヒト対象は、年齢が６５〜７５歳でよい。このように、組成物を投与する方法も提供される。組成物を製造する方法は本明細書に記載され、当業者に利用可能である。他の実施形態は本明細書に提供される記載から明らかであろう。
【０００８】
本開示は、対象（例えばヒト）にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の１種以上の抗原を含む組成物を投与する工程により、対象をクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対して免疫する方法も記載する。例えば、好適な組成物は、合計で約５０又は約１００μｇ（又は約５０〜１００μｇ）のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイド（トキソイドＡ及びトキソイドＢ）を、約３：２のおよそのトキソイドＡとトキソイドＢの比で、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）と共に又はなしで含み得る。比較のために、抗原含有組成物を一群の対象に、プラセボ組成物（例えば、０．９％生理食塩水）を別の群に投与できる（例えば、同じスケジュールで）。免疫学的データ及び安全性データは、特定の日（例えば、最初の投与後０日、１４日、３０日、６０日、１８０日、及び／又は２１０日、及び／又は１０００日まで）に対象から得ることができる。組成物の投与は、例えば、０日（第一の投与）、約７日（第二の投与）、約３０日（第三の投与）、及び／又は約１８０日（代替の第三の投与又は第四の投与）に起こり得る。
【０００９】
上述の通り、組成物は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びトキソイドＢを、有効なトキソイドＡ：Ｂ比（例えば、重量によるトキソイドＡとトキソイドＢ、３：１、３：２、又は１：１のいずれかの概略値）で、充分な純度で（例えば、約９０％以上の純度（ｗ／ｗ））含み得る。例えば、組成物は、約３：２のおよそのトキソイドＡとトキソイドＢの比のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びＢの高純度（例えば、９０％超（ｗ／ｗ））の調合物を含み得る。そのような組成物は、利用可能な調製方法のいずれを利用しても調製できる（例えば、それぞれ全体として本開示に組み込まれる２０１３年３月１５日に出願の米国仮特許出願第６１／７９０，４２３号明細書、２０１４年３月１４日に出願の同時係属中のＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９０３５号明細書、２０１３年３月１５日に出願の第６１／７９３，３７６号明細書、及び／又は２０１４年３月１４日に出願の同時係属中のＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９０７０号明細書）に記載の通り）。本開示の実施例に記載される通り、トキシンＡ及びＢは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の培養物から精製され、不活化され、目標とする３：２の比で混合され、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及びＢに対する免疫応答を誘起及び／又は増大させるのに効能があることが示された。しかし、上述の通り、トキソイドＡとＢは、任意の有効量及び／又は有効比（例えば、効能のあるワクチンが提供されることを示すのに有効な）で組み合わせることができる。
【００１０】
用語「クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイド」は、部分的又は完全に不活化されたクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシン（トキシンＡ又はトキシンＢ）を指すように本明細書で使用される。トキシンは、例えば、インビトロ細胞傷害性アッセイ又は動物毒性により測定して、未処理のトキシンよりも低い毒性（例えば、１００％、９９％、９８％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下の毒性、又はこれらの間の任意の値）を有する場合不活化されている。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養物からのトキシンの精製及び化学薬品（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、過酸化物、又は酸素処理）によるトキシンの不活化により製造できる。或いは、毒性を欠くか又は毒性が低下した野生型又は変異体のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンを遺伝子組換え法を利用して製造できる。遺伝子的方法によりトキソイドを製造する方法は当技術分野に周知である。例えば、毒性低下を生み出す突然変異を作ることができる。特異的領域を欠いていて毒性が低下している野生型又は変異体のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンを作ることもできる。
【００１１】
組成物は、ワクチンであり得るが、臨床現場で希釈剤により再構成され、明示される場合アジュバント（例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム）などのアルミニウムアジュバントか注射用水（ＷＦＩ）のいずれかと混合され得る凍結乾燥製剤として提供され得る。希釈剤は、例えば、任意の薬学的に許容できる希釈剤でよい（例えば、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５％スクロース、及び０．０１６％ホルムアルデヒド；１０ｍＭクエン酸塩、４％スクロース、０．００８％ホルムアルデヒド、０．５７％塩化ナトリウム）。アジュバントは、例えば、好適な濃度の（例えば、８００〜１６００μｇ／ｍＬのいずれかの概略値）アルミニウム（例えば、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム）を含むアジュバントなどのアジュバントをＷＦＩ中に含み得る。例えば、アジュバント（例えば、０．５７％塩化ナトリウム中の８００〜１６００μｇ／ｍＬ水酸化アルミニウム）は、凍結乾燥製剤を再構成する希釈剤として使用できる。ＷＦＩを使用して、アジュバント不使用の製剤用の凍結乾燥ワクチンを希釈できる。最終投薬溶液は、例えば、組成物／ワクチン、希釈剤、及びアジュバントを含み得る。上述の通り、プラセボも液体製剤（例えば、０．９％生理食塩水）として与えることができる。被験薬（ワクチン又はプラセボ）の各送達される投与の体積は、約０．５ｍＬであり得る。製剤は、任意の好適な経路（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、節内、鼻腔内、経口）により投与できる。
【００１２】
本明細書に記載される物質（例えば、組成物）及び／又は方法のいずれの有用性（例えば、免疫原性）も、当業者に公知である種々の方法のいずれかによりアッセイできる。本明細書に記載される１つ以上のアッセイ又は他の１つ以上の好適なアッセイを利用して、意図される目的のための本明細書に記載される物質(materials)のいずれの好適性も決定できる。これらの方法が典型的で非限定的であることを理解されたい。他のアッセイも好適になり得る。
【００１３】
例えば、本明細書に記載される組成物は、典型的には、対象への投与と同時にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する抗体の産生を誘起及び／又は増大させる。そのような抗体は、当業者に利用可能な方法のいずれを利用しても対象中に検出できる。例えば、実施例の項に記載の通り、血清を対象から得て、ＥＬＩＳＡにより試験して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及び／又はトキシンＢに対する免疫グロブリンタイプＧ（ＩｇＧ）抗体を検出できる（例えば、「一次免疫原性データ」）。試験血清中に存在する抗体は、マイクロタイタープレートの個々のウェルに吸着されたトキシンＡ又はＢ抗原と反応し得る。抗原にコートされたウェルに結合した抗体の量は、二次抗ＩｇＧ（例えば、抗ヒトＩｇＧ）抗体−酵素コンジュゲートの結合後に、比色定量基質反応を利用して決定できる。次いで、酵素の基質が典型的には加えられ、抗原に結合した抗体に正比例する比色定量変化を起こす。血清中の抗体の濃度は標準曲線からの外挿により得ることができるが、標準曲線は、定義されたＩｇＧ単位数（ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）／ｍＬ））を有する参照標準血清の複数の希釈液から作成した。
【００１４】
トキシン中和アッセイ（ＴＮＡ）を利用して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンに対する中和抗体を定量することもできる。このアッセイにおいて、連続希釈された血清は、固定量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ又はＢとインキュベートすることができる。次いで、試験細胞（例えば、ベロ細胞）を加えることができ、血清−トキシン−細胞混合物が、適切な条件下（例えば、３７℃で６日間）インキュベートされる。血清がクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンの細胞傷害性作用を中和する能力は、細胞の生存率により決定され、細胞の生存率に相関し得る。アッセイは、正常な細胞の呼吸のしるしとして密閉された培養ウェル中の酸性代謝物の蓄積を利用する。トキシンに曝露された細胞では、代謝及びＣＯ２産生が低減する。したがって、細胞培地中でフェノールレッドｐＨ指示薬により示される通りｐＨは上昇する（例えば、７．４以上に）。このｐＨで、培地は赤く見える。しかし、細胞対照、又は抗体により中和されたトキシンに曝露された細胞は代謝し、正常な量のＣＯ２を産生する。結果として、ｐＨは維持され（例えば、７．０以下に）、このｐＨでは、培地は黄色く見える。したがって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシン中和抗体は、特定のｐＨ（例えば、７．０以下）を維持する能力により明示される通り、細胞に対するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンの代謝作用を血清が中和する能力と相関する。培地の色変化を、プレートリーダーを使用して（例えば、５６２ｎｍから６３０ｎｍで）測定して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシン媒介性の細胞傷害性の５０％阻害での抗トキシン中和抗体価をさらに計算できる。
【００１５】
特定の実施形態において、本明細書に記載される組成物が、対象への適切な投与の後に、免疫原性（例えば、検出可能な免疫応答及び／又は中和免疫応答及び／又は防御免疫応答を誘起する）を示すことが好ましい。中和免疫応答及び／又は防御免疫応答の存在は、上述の通り、及び／又は、病原体（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））による感染が、本明細書に記載される物質が投与された個体（例えば、ヒト又は他の動物）において、物質が投与されなかった個体に比べて影響を受ける（例えば、減少する）ことを示すことにより示すことができる。例えば、１つ以上の被験対象（例えば、ヒト又は非ヒト）に、本明細書に記載される組成物を、任意の好適な経路及びスケジュールにより投与することができ、次いで、好適な量の時間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０週）後、病原性生物に曝露させることができる。投与及び／又は曝露の後で、動物を免疫機能（例えば、抗体産生、Ｔ細胞活性）に関してモニターできる。血清を、総抗体応答に関しても、例えば抗体ＥＬＩＳＡ及び／又は病原体中和アッセイを利用して特定のサブタイプの発現に関しても分析できる。Ｔ細胞活性は、例えば、抗原による再刺激の後のＩＦＮ−γ産生を測定することにより測定できる。次いで、統計解析（例えば、フィッシャーの正確検定、ウィルコクソン検定、マン・ホイットニ検定）をデータに対して実施し、免疫応答に影響を与えることにおける物質の有効性を決定できる。
【００１６】
本明細書に記載されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及び／又はＢを、１種以上の薬学的に許容できる担体と組み合わせて、宿主への投与の前に組成物を提供してもよい。薬学的に許容できる担体は、生物学的にも他の面でも望ましくないものでない物質であり、例えば、その物質は、望ましくない生物学的作用を全く起こさずに、それが含まれる医薬組成物の他の成分のいずれとも有害に相互作用もせずに、対象に投与することができる。担体は、当業者には周知であろう通り、有効成分の劣化を最低限にし、対象における有害な副作用を最低限にするように、当然選択されるだろう。好適な医薬担体及びその製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されており、適切であり得る。典型的には、適切な量の薬学的に許容できる塩が製剤に使用されて、製剤を等張性にする。薬学的に許容できる担体の例には、滅菌水、食塩水、リンゲル液などの緩衝液、及びデキストロース液があるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、一般的に、約５から約８又は約７から約７．５である。他の担体には、ポリペプチド又はその断片を含む固体疎水性ポリマーの半透性のマトリックスなどの徐放性調合物がある。マトリックスは、付形された物品、例えば、フィルム、リポソーム、又は微粒子の形態でよい。特定の担体が、例えば、投与経路及び投与される組成物の濃度によってより好ましくなり得ることは、当業者には明らかであろう。担体は、ヒト又は他の対象への投与に好適なものである。
【００１７】
医薬組成物は、増粘剤、希釈剤、緩衝液、保存剤、界面活性剤、アジュバント、免疫刺激剤も含み得る。医薬組成物は、抗微生物剤、消炎剤、及び麻酔薬などの１種以上の有効成分も含み得る。アジュバント（例えば、本明細書に記載されるもの、又は他の方法で利用可能なもの）も、免疫応答を刺激又は増大させるために含まれてよい。
【００１８】
上述の通り、組成物は、１種以上のアジュバントも含んでよい。アジュバントは、免疫応答を刺激又は増大させるために含まれてよい。好適な種類のアジュバントの非限定的な例には、とりわけ、ゲルタイプのもの（すなわち水酸化アルミニウム／リン酸アルミニウム（「アラムアジュバント」）、リン酸カルシウム、微生物由来（ムラミルジペプチド（ＭＤＰ））、細菌外毒素（コレラ毒素（ＣＴ）、天然コレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）、エシェリキア・コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）不安定毒素（ＬＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＢＣＧ配列、破傷風トキソイド、例えば、エシェリキア・コリ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、又はシゲラ・エキセリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｅｘｓｅｒｉ）のモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ））、粒状アジュバント（生分解性、ポリマー微小球）、免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭ））、油エマルション及び界面活性剤系アジュバント（フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、微小流体化されたエマルション（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）（ＭＦ５９、ＳＡＦ）、サポニン（ＱＳ−２１））、合成（ムラミルペプチド誘導体（ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰ）、非イオン性ブロックコポリマー（Ｌ１２１）、ポリホスファゼン（ＰＣＣＰ）、合成ポリヌクレオチド（ポリＡ：Ｕ、ポリＩ：Ｃ）、サリドマイド誘導体（ＣＣ−４４０７／ＡＣＴＩＭＩＤ））、ＲＨ３−リガンド、又はポリラクチドグリコリド（ＰＬＧＡ）微小球がある。これらの毒素のいずれの断片、ホモログ、誘導体、及び融合体も、それらがアジュバント活性を保持しているならば好適である。アジュバントの好適な変異体又は多様体は、例えば、国際公開第９５／１７２１１号（Ａｒｇ−７−Ｌｙｓ  ＣＴ変異体）、国際公開第９６／６６２７号（Ａｒｇ−１９２−Ｇｌｙ  ＬＴ変異体）、及び国際公開第９５／３４３２３号（Ａｒｇ−９−Ｌｙｓ及びＧｌｕ−１２９−Ｇｌｙ  ＰＴ変異体）に記載されている。利用され得る追加のＬＴ変異体には、例えば、Ｓｅｒ−６３−Ｌｙｓ、Ａｌａ−６９−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−１１０−Ａｓｐ、及びＧｌｕ−１１２−Ａｓｐ変異体がある。アラムアジュバントなどの金属塩アジュバントは、安全な賦形剤にアジュバント活性を与えるものとして当技術分野に周知である。これらのアジュバントの作用機序は、抗原が投与後３週までの間注射部位に留まることができるような抗原補給所の形成及び抗原提示細胞により容易に取り上げられる抗原／金属塩複合体の形成を含むものと考えられている。アルミニウムに加え、亜鉛、カルシウム、セリウム、クロム、鉄、及びベリリウム（ｂｅｒｉｌｉｕｍ）の塩など、他の金属塩も抗原を吸着するのに使用されてきた。アルミニウムの水酸化物及びリン酸塩が最も一般的である。アルミニウム塩、抗原、及び追加の免疫刺激剤を含む製剤又は組成物は当技術分野に公知である。免疫刺激剤の例は、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。いくつかの実施形態において、１種以上のアジュバントは、アルミニウム塩、���マルション、リポソーム、ポリマー、及び／又はこれらの組合せの任意の１つ以上でよい。例えば、好適なアジュバントは、アニオン性ポリマー、リポソーム及びＴｏｌｌ様受容体７／８アゴニストを含むアジュバント、エチルＤＯＰＣリポソーム、ＤＣ−ｃｈｏｌ、Ｔｏｌｌ様受容体７／８アゴニスト又はＴｏｌｌ様受容体４アゴニストを含むスクアレンエマルション、Ｔｏｌｌ様受容体４アゴニストを含むアルミニウム塩の任意の１つ以上を含み得る。これらの組成物のいくつかは、免疫原性組成物及び／又はワクチン（例えば、治療的又は予防的な免疫原性組成物）に含められてよい。他のアジュバントも、当業者により理解されるだろう通り好適になり得る。そのようなアジュバントのいずれも、製造プロセスの前、その間、又はその後に組成物に導入できる。
【００１９】
上記で言及された通り、免疫学的組成物は、典型的には、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原を含み、宿主（例えば、動物）への投与と同時に、抗原（及び、例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））に対する免疫応答を誘起又は増大させるものである。そのような応答は、上述の通り、抗体の生成（例えば、Ｂ細胞の刺激により）又はＴ細胞系の応答（例えば、細胞溶解反応）を含み得るが、それらは防御性及び／又は中和性であり得る。防御免疫応答又は中和免疫応答は、その抗原に対応する（例えば、その抗原が由来する）感染性生物には有害であり、宿主には有益である（例えば、感染を低減又は予防することにより）ものであり得る。本明細書では、防御抗体若しくは中和抗体及び／又は細胞応答は特に、有効量及び／又は有効なスケジュールで投与されたときに、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原と反応性であり得る。これらの抗体及び／又は細胞応答は、動物で試験される場合、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の重症度、時間、及び／又は致死率を低減又は阻害し得る。実施例に示される通り、本明細書に記載される組成物を使用して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する免疫応答を誘起できる。宿主に投与したときに、治療免疫応答（例えば、典型的には、活動性感染の間に投与される）及び／又は防御免疫応答（例えば、典型的には、活動性感染の前又は後に投与される）及び／又は中和免疫応答をもたらす免疫学的組成物は、ワクチンとみなすことができる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）による感染症を予防し、軽減し、その危険性を低下させ、且つ／又は治療する（例えば、影響を与える）方法も提供される。対象に、少なくとも１つ以上の有効投与量の本明細書に記載される組成物（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原、例えば、トキソイドＡ、トキソイドＢを含む）を投与する工程を含む、対象においてクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）により起こるか、又はクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含む１つ以上の病状を治療する方法。抗原は、約１から約３００μｇ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、及び／又は３００μｇのいずれかの概略値）の用量で投与できる。抗原は、同じ用量ででも、異なる用量ででも、２回以上投与できる。特定の実施形態において、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原は、対象に、同じ又は異なる好適な経路により、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、又はそれ以上の回数投与できる。反復投与が投与される場合、投与は、各投与に、およそ同じ若しくは異なる種類及び／又は量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原を含み得る。投与は、同じ又は異なる間隔により、互いから時間が離れていてもよい。例えば、投与は、６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、若しくは９６時間、７日、１４日、２１日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、１００日、１１０日、１２０日、１３０日、１４０日、１５０日、１６０日、１７０日、１８０日、１９０日、２００日、１週、２週、３週、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１．５年、２年、３年、４年、５年のいずれかの概略値、又は任意の期間で、これらの期間のいずれかの前、後、及び／又はその間で分かれていてよい。いくつかの実施形態において、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原は、単独でも、他の薬剤（例えば、抗生剤）と組み合わせても投与できる。そのような他の薬剤は、同じ又は異なるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原と同時にも（又はほぼ同時に）、異なる時間及び／又は頻度でも投与できる。そのような方法の他の実施形態も、当業者により容易に決定できる通り、適切になり得る。
【００２１】
クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原を投与するためのキットも本明細書に提供される。一実施形態において、１種以上のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原は、対象への投与のためのキットの一部を形成し得るか、且つ／又はキットとして提供され得る。クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原を投与するための説明書もキットにより提供され得る。本明細書に記載されるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原を含む組成物はキット（例えば、ワクチンキット）に含まれ得る。例えば、キットは、乾燥された形態で本明細書に記載される組成物を収容する第一の容器及び組成物を再構成するための水溶液を収容する第二の容器を含み得る。キットは、任意選択で、再構成された液体形態の組成物の投与のための装置（例えば、皮下注射器、マイクロニードルアレイ）及び／又は使用のための説明書を含み得る。投与用の装置は、組成物の再構成のための水溶液があらかじめ充填された状態で供給できる。
【００２２】
したがって、本開示は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に対する治療免疫応答又は防御免疫応答を与える組成物であって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びトキソイドＢを含む組成物を提供する。本開示は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原）に対する免疫応答を誘起及び／又は増大させるように、そのような組成物を投与する方法も提供する。特定の実施形態において、組成物は、１種以上のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原、１種以上の薬学的に許容できる担体、及び／又は１種以上のアジュバント（例えば、アルミニウム塩、エマルション、カチオン性リポソーム、アニオン性ポリマー、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト、及びこれらの組合せ）をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、免疫原性組成物及び／又はワクチンである。対象（ヒトなど）に任意のそのような組成物を投与する工程による、対象を免疫する方法も提供される。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、有効量（例えば、少なくとも約４０から約５００、約５０から約１００μｇ）のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びトキソイドＢ（合わせたｗ／ｗ）を、有効なトキソイドＡ：Ｂ比で（例えば、重量で（ｗ／ｗ）３：１、３：２、１：１）、充分な純度で（例えば、少なくとも９０％（ｗ／ｗ））含む免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を投与する工程、１回以上の投与を利用する工程（例えば、少なくとも３回、各投与は互いから好適に分かれている（例えば、少なくとも約７日））を含み得る。有効なトキソイドＡ：Ｂ比は、組成物に含まれることができ、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及び／又はトキシンＢに対する有効な免疫応答を誘起し得る任意の比である。一実施形態において、方法は、第二の投与が第一の投与の少なくとも７日後であり、第三の投与が、第一及び／又は第二の投与の少なくとも約３０日及び／又は少なくとも約１８０日後である、第一、第二、及び第三の投与を含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、第二の投与が第一の投与（０日）の約７日後であり、第三の投与が、第一の投与の約３０日後である、第一、第二、及び第三の投与を含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、第二の投与が第一の投与の約７日後であり、第三の投与が第一の投与の約１８０日後である、第一、第二、及び第三の投与を含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、１種以上のアジュバント（例えば、アルミニウムアジュバント）を含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、以前にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に曝露されたヒトにおける既存の免疫応答（例えば、血清陽性のヒト、既往の（ａｎｅｍｎｅｓｔｉｃ）免疫応答）を増大及び／又は誘起し得る。特定の実施形態において、ヒトは、第一の投与の前１２か月の期間内に、それぞれ少なくとも約２４、４８、又は７２時間以上継続する少なくとも１回又は２回の入院をしたかもしれ���、且つ／又は、全身性（局所でない）抗生剤を服用したかもしれず；且つ／又は、第一の投与の約６０日以内に計画された外科手術のための入院をするように手配されている。いくつかの実施形態において、手配された／切迫した入院／入院は、約２４、４８から７２時間以上にわたると計画されることがあり、腎臓／膀胱／尿系、筋骨格系、呼吸器系、循環器系、及び中枢神経系の少なくとも１つを含む手術のためであり得る。これらの方法により惹起される免疫応答が、症候性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を、予防し、且つ／又は軽減し、且つ／又はその危険性を低減させるのに充分であることが好ましい。特定の実施形態において、方法は、免疫原性組成物を、症候性の感染症にかかる危険性がある、少なくとも約４０歳、５０歳、又は６５歳のヒト対象に投与する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、組成物を、約４０から約６５歳の群及び／又は約６５から約７５歳の群の各個体に投与する工程を含み得る。いくつかの実施形態において、方法は、第一の投与前に血清陽性とみなされた個体の集団の８０、８５、９０、９５、又は１００％のいずれかの概略値において、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴＮＡにより測定して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及び／又はトキシンＢに対する抗体系免疫応答の約２倍から４倍の増大を誘起し得る。いくつかの実施形態において、方法は、組成物の投与前に血清陰性とみなされた個体の集団の２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０％のいずれかの概略値において、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴＮＡにより第一の投与の１４日後に測定して（例えば、０日、７日、及び３０日での投与の後）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及び／又はトキシンＢに対する抗体系免疫応答の約２倍から４倍の増大を誘起し得る。いくつかの実施形態において、方法は、組成物の投与前に血清陰性とみなされた個体の集団の３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０％のいずれかの概略値において、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴＮＡにより第一の投与の６０日後に測定して（例えば、０日、７日、及び３０日での投与の後）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及び／又はトキシンＢに対する抗体系免疫応答の約２倍から４倍の増大を誘起し得る。いくつかの実施形態において、そのような集団中の個体は、約４０から約６５歳である。いくつかの実施形態において、そのような集団中の個体は、約７５から約６５歳である。いくつかの実施形態において、この増大は、第一の投与（０日）の約３０日後に観察され、典型的には７日の第二の投与に続き、典型的には第三の投与（例えば、約３０日又は１８０日）の前に観察される。いくつかの実施形態において、免疫応答は、複数レジメン投与プロトコル（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ）において、第一、第二、及び／又は第三の投与後に約３０か月までの間（例えば、約１０００日）、トキシンＡ及び／又はトキシンＢに対して検出され得る。いくつか���実施形態において、本明細書に記載される組成物のヒト対象への０日での投与（第一の投与）、約７日での投与（第二の投与）、及び約３０日での投与（第三の投与）は、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴＮＡにより測定して、約３０か月までの間、又は約１０００日間、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及び／又はトキシンＢに対する免疫応答を増大又は誘起する。いくつかの実施形態において、免疫応答のレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴＮＡにより測定して、３用量投与レジメンの第一の投与後約１０００日で、第一の投与後約１４日とほぼ少なくとも同じくらい高くなり得る。いくつかの実施形態において、免疫応答のレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴＮＡにより測定して、第一の投与後１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、及び１０００日のいずれかの概略値で、第一の投与後約１４日とほぼ少なくとも同じくらい高くなり得る。いくつかの実施形態において、免疫応答は、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴＮＡにより測定して、ベースラインより（例えば、第一の投与前０日での抗トキシンＡ及び／又はトキシンＢ抗体レベル）約２倍から８倍になり得る。いくつかの実施形態において、免疫応答は、例えば、ＥＬＩＳＡ及び／又はＴＮＡにより測定して、ベースラインの約２．５から約６．８倍になり得る。いくつかの実施形態において、血清陽性の個体（例えば、非ナイーブ）中の免疫応答は、ＥＬＩＳＡによりトキシンＡ及び／又はＢに関して（例えば、０日、７日、及び３０日での投与後に）測定して、ベースラインから、約７日で約３倍；約１４日で約１０から約７０倍；約３０日で約３０から約２００倍；及び約６０日で約１００から約２００倍に増加する。いくつかの実施形態において、血清陽性の個体（例えば、非ナイーブ）中の免疫応答は、ＴＮＡによりトキシンＡ及び／又はＢに関して（例えば、０日、７日、及び３０日での投与後に）測定して、ベースラインから、約７日で約３倍；約１４日で約１０から約１００倍；約３０日で約１５から約１３０倍；及び約６０日で約１００から約１３０倍に増加する。いくつかの実施形態において、血清陰性の個体（例えば、ナイーブ）中の免疫応答は、ＥＬＩＳＡによりトキシンＡ及び／又はＢに関して（例えば、０日、７日、及び３０日の投与後に）測定して、ベースラインから、約１４日で約２倍；約３０日で約５から約１０倍；及び約６０日で約２５から約６０倍に増加する。いくつかの実施形態において、血清陰性の個体（例えば、ナイーブ）中の免疫応答は、ＴＮＡによりトキシンＡ及び／又はＢに関して（例えば、０日、７日、及び３０日の投与後に）測定して、ベースラインから、約１４日で約２から３倍；約３０日で約２から約５倍；及び約６０日で約５から約４０倍に増加する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される免疫応答は、０日で（例えば、第一の投与の前）血清陽性と血清陰性とみなされるどちらの個体においても検出される。いくつかの実施形態において、そのような免疫応答は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡとトキシンＢの両方に関して、例えば、ＥＬＩ���Ａ及び／又はＴＮＡにより測定して検出される。そのようなクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）抗原（例えば、トキソイドＡ及び／又はＢ）、及びそれを含む組成物を製造する方法（例えば、インビトロ又はインビボ）も提供される。そのような方法は、例えば、当業者に利用可能、且つ／又は当業者に公知であるもののいずれも、且つ／又は先に言及された、２０１３年３月１５日に出願の同時係属中の米国仮特許出願第６１／７９０，４２３号明細書、２０１４年３月１４日に出願の同時係属中のＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９０３５号明細書、２０１３年３月１５日に出願の６１／７９３，３７６号、及び／又は２０１４年３月１４日に出願の同時係属中のＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２９０７０号明細書に記載されている方法を含み得る。当業者は、本明細書に提供される記載から他の実施形態を導くことができる。
【００２３】
当業者により理解される得るように、他の実施形態も提供される。
【００２４】
用語「約」、「およそ」などは、数値のリスト又は範囲に先立つ場合、リスト中の各個別の値又は範囲の直前にその用語があるようかのように、リスト中の各個別の値又は範囲を独立に指す。その用語は、それが指す値が、正確にその値であるか、その値に近いか、その値に類似であることを意味する。
【００２５】
本明細書では、対象又は宿主は、個体であるものとする。対象は、ネコ及びイヌなどの飼育動物、家畜（例えば、畜牛、ウマ、ブタ、ヒツジ、及びヤギ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）、及び鳥類を含み得る。一態様において、対象は、霊長類又はヒトなどの哺乳動物である。
【００２６】
任意選択の又は任意選択では、その後に記載される事象又は状況が起こることも起こらないこともあり、記載が、事象又は状況が起こる場合及びそれが起こらない場合を含むことを意味する。例えば、任意選択で組成物は組合せを含み得るという句は、記載が組合せと組合せの欠如の両方（すなわち組合せの個別の要素）を含むように、組成物が異なる分子の組合せを含むことも、組合せを含まないこともあることを意味する。
【００２７】
範囲は、およそある特定の値から、及び／又はおよそ別の特定の値までとして本明細書に表すことができる。そのような範囲が表される場合、別の態様は、そのある特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、先行詞約又はおよその使用により値が近似値として表される場合、その特定の値が別の態様を形成することが理解されるだろう。範囲のそれぞれの終点が、他の終点と関連する場合と、他の終点とは独立の場合の両方で、重要であることがさらに理解されるだろう。範囲（例えば、９０〜１００％）は、範囲自体並びに範囲内の各独立値を、各値が個別に列記されているかのように含むものとする。
【００２８】
予防する、予防すること、及び予防という用語が、本明細書において、所与の病態のための所与の治療（例えば、感染の予防）に関連して使用される場合、治療される対象が臨床的に観察可能なレベルの病態を全く生じさせないことか、彼／彼女が治療から遠ざかっていただろうよりも低頻度でそれを生じさせることのいずれかを伝えるものとする。これらの用語は、対象がどのような様態の病態も全く経験しない状況のみには限定されない。例えば、治療は、病態の所与の発現を生み出すと期待されただろう刺激への対象の曝露の間に与えられ、そうでない場合に期待されるより対象がより少ない及び／又はより軽度の病態の症状を経験する場合、病態を予防したと言われるだろう。治療は、対象に感染のほんの軽度の明白な症状を示させることにより、感染を「予防」できる。それは、感染性の微生物による細胞の侵入が全くなかったに違いないことを意味しない。同様に、本明細書での低減させる、低減させること、及び低減は、所与の治療と共に症候性の感染症にかかる危険性に関連して述べられ得る（例えば、症候性のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の危険性を低減させること）。例えば、低減させる、低減させること、及び低減は、典型的には、治療（例えば、開示される抗原又は組成物を使用した投与又はワクチン接種）が無い場合に感染症を生じる対照又は基礎レベルと比べて、よりゆっくりと、又はより低い程度に感染症を生じる対象を意味する。症候性の感染症にかかる危険性の低減は、対象に感染のほんの軽度の明白な症状又は感染の遅延した症状を示させることがある。それは、感染性の微生物による細胞の侵入が全くなかったに違いないことを意味しない。
【００２９】
本開示内で引用された全参照文献は、引用により本明細書に全体として組み込まれる。特定の実施形態は、以下の実施例でさらに説明される。これらの実施形態は、例としてのみ与えられ、請求項の範囲を決して限定するものではない。
【実施例】
【００３０】
実施例１
Ａ．臨床設計
成人の第ＩＩ相、無作為、プラセボ対照、改変された二重盲検（用量及び製剤で二重盲検；ワクチン接種スケジュールに関して非盲検）、用量範囲探索、多施設治験を実施した。（ｉ）登録の６０日以内の切迫した入院又は（２）登録の６０日以内の長期介護施設又は機能回復施設への現在又は切迫した滞在のため、治験の間にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を生じる危険性のある４０から７５歳の成人対象を登録した。現在又は以前のＣＤＩエピソードを有する対象は除外した。対象は年齢により層化した：４０から６５歳（対象の５０％）及び６５から７５歳（対象の５０％）。治験には、２段階あった。ステージＩは、ワクチン候補の４種の異なる製剤を試験し、ステージＩＩはこれらの製剤の１つを使用して異なるワクチン接種スケジュールを調査した。ステージＩにおいて、合計で４５５名の対象を登録し、以下の製剤の１つ又はプラセボを０日、７日、及び３０日に受け取るように無作為に割り付けた：
第１群：低投与量（３：２のトキソイドＡとトキソイドＢの適切な比で、合計で５０μｇの抗原（トキソイドＡ、トキソイドＢ））、アジュバント（４００μｇ水酸化アルミニウム（ＡＬＯＨ））あり；
第２群：低投与量（３：２のトキソイドＡとトキソイドＢの適切な比で、合計で５０μｇの抗原（トキソイドＡ、トキソイドＢ））、アジュバントなし；
第３群：高投与量（３：２のトキソイドＡとトキソイドＢの適切な比で、合計で１００μｇの抗原（トキソイドＡ、トキソイドＢ））、アジュバント（４００μｇＡＬＯＨ）あり；
第４群：高投与量（３：２のトキソイドＡとトキソイドＢの適切な比で、合計で１００μｇの抗原（トキソイドＡ、トキソイドＢ））アジュバントなし；及び
第５群：プラセボ（０．９％生理食塩水）。
血液試料の免疫学的結果及び０日、１４日、３０日、及び６０日に採られた安全性データに基づき、１製剤をステージＩＩでの使用に選択した。ステージＩＩでは、２０６名の対象を、２つの追加スケジュールのいずれかで、選択された製剤の３投与量を受け取るように無作為に割り付けた：
第６群：０日、７日、及び１８０日
第７群：０日、３０日、及び１８０日
ステージＩＩに登録した対象からの結果を、試験のステージＩの間の０日、７日、及び３０日に選択されたワクチン製剤を受け取った対象に関して得たデータと比較した。ステージＩにおいて、対象は、血液試料を、製剤が選択されるまで１８０日及び２１０日を含めて、０日、７日、１４日、３０日、６０日まで与えるよう依頼された。ステージＩＩにおいて、全対象は、血液試料を、０日、７日、１４日、３０日、６０日、１８０日、及び２１０日に与えるように依頼された。
【００３１】
評価されたワクチンは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキソイドＡ及びＢ（３：２のトキソイドＡとトキソイドＢの適切な比率で）の高度に精製された調合物であった。トキシンＡ及びＢは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養物から精製され、不活化され、目標とする３：２の比に混合された。ワクチンは、凍結乾燥製剤として提供され、臨床現場で希釈剤により再構成され、明示された場合ＡＬＯＨアジュバントか注射用水（ＷＦＩ）のいずれかと混合された。希釈剤は、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５％スクロース、及び０．０１６％ホルムアルデヒドからなっていた。アジュバントは、ＷＦＩ中の１６００μｇ／ｍＬのＡＬＯＨからなっていた。ＷＦＩは、アジュバント不使用の製剤用の凍結乾燥ワクチンの希釈にも使用された。最終ワクチン投薬溶液は、ワクチン及び希釈剤及びアジュバント（必要な場合）からなっていた。プラセボは、液体製剤（０．９％生理食塩水）として与えられた。被験薬（ワクチン又はプラセボ）の各送達された投与量の体積は０．５ｍＬであった。ワクチン製剤は、筋肉内投与された。
【００３２】
血清を、ＥＬＩＳＡにより、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ及びトキシンＢに対する免疫グロブリンタイプＧ（ＩｇＧ）抗体に関して試験して、一次免疫原性データを生成した。試験血清中に存在する抗体を、マイクロタイタープレートの個々のウェルに吸着させたトキシンＡ又はＢ抗原と反応させた。抗原にコートされたウェルと結合した抗体の量を、二次抗ヒトＩｇＧ抗体−酵素コンジュゲートの結合後に、比色定量基質反応を利用して決定した。酵素の基質を加え、それが、抗原に結合した抗体に正比例する比色定量変化を起こした。血清中の抗体の濃度を、標準曲線からの外挿により得たが、標準曲線は、定義されたＩｇＧ単位数（ＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ）／ｍＬ））を有する参照標準血清の複数の希釈液から作成した。
【００３３】
トキシン中和アッセイも、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンに対する中和抗体を定量するのに利用した。アッセイにおいて、連続希釈された血清を、固定量のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンＡ又はＢと共にインキュベートした。次いで、ベロ細胞を加え、血清−トキシン−細胞混合物を３７℃で６日間インキュベートした。血清が、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンの細胞傷害性作用を中和する能力を、ベロ細胞の生存率により決定し、ベロ細胞の生存率に相関させた。アッセイは、正常な細胞の呼吸のしるしとして密閉された培養ウェル中の酸性代謝物の蓄積を利用した。トキシンに曝露された細胞では、代謝及びＣＯ２産生が低下した。したがって、ｐＨは、細胞培地中でフェノールレッドｐＨ指示薬により示される通り７．４以上に上昇した。このｐＨでは、培地は赤く見えた。しかし、細胞対照又は抗体により中和されたトキシンに曝露された細胞は、代謝し正常な量でＣＯ２を産生した。結果として、ｐＨは、７．０以下に維持された。このｐＨでは、培地は黄色く見えた。したがって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシン中和抗体は、７．０以下のｐＨを維持するその能力により証明される通り、細胞に対するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシンの代謝作用を血清が中和する能力と相関した。培地の色変化を、５６２ｎｍから６３０ｎｍでプレートリーダーにより測定して、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）トキシン−媒介性細胞傷害性の５０％阻害での抗トキシン中和抗体価をさらに計算できる。試験は、観察目的を含んでおり、すなわちＣＤＩ最初のエピソードの発生を記載した。
【００３４】
Ｂ．ステージＩ
安全性評価
どの治療群における対象にも関連するＳＡＥも死亡も報告されず、特定又は非特定グレード３反応の数は全治療群の間で類似であり最低限であった。特定有害反応（ＡＲ）及び非特定ＡＥは、全般的に強度がグレード１であり、持続時間が短く、試験中断には至らず、臨床的に重要であるとは考えられなかった。ワクチン治療群には、より多くの特定注射部位反応及び全身性反応があった。しかし、忍容性プロファイルは許容でき、他の認可されたワクチンの忍容性プロファイルに類似であるか、それより良好であった。具体的に非特定注射部位反応に関する、全身障害および投与部位の状態のＳＯＣにおける非特定の非重篤なＡＲは、アジュバントありの群において、アジュバントなしの群よりも多くの対象により報告された。しかし、忍容性プロファイルは許容でき、他の認可されたワクチンの忍容性プロファイルに類似であるか、それより良好であった。全体として、より高齢の群の対象（６５〜７５歳）は、増加した特定ＡＲ又は非特定ＡＥを経験しなかった。安全性概要は、４０〜６４歳のより若い対象のものに類似であった。若い対象と同様に、アジュバントありの群において、わずかに多い対象がＡＥ及びＡＲを報告した。しかし、忍容性プロファイルは許容できた。安全性の問題は全く確認されなかった。
【００３５】
免疫原性評価
プラセボに比べて、全ワクチン群の間で治療効果が認められた。
【００３６】
ＥＬＩＳＡの結果−幾何学的平均濃度（ＧＭＣ）
全治療群における免疫応答は強固であり、６０日で増加し続けた。トキシンＡとトキシンＢの両方に関して、各活性ワクチン群における最高ＧＭＣ（ＥＵ／ｍＬ）は、第三のワクチン投与の３０日後である、６０日に見られた。０日から６０日までの各採血日でＧＭＣの一貫した上昇があった（表１）。トキシンＡ及びトキシンＢに関するＧＭＣは、０日から６０日に、４０から６４歳の対象及び６５から７５歳の対象で増加した。ＧＭＣは、アジュバントのあるワクチンが投与された場合、６５から７５歳の対象で高い傾向があった。ベースラインで血清陽性であった（トキシンＡで≧１．５ＥＵ／ｍＬ、トキシンＢで≧０．８ＥＵ／ｍＬと定義）対象の数は、トキシンＢについての方がトキシンＡについてより多く、これは以前の曝露及び／又はアッセイの感度を表し得る。ベースラインでの血清陽性は、６０日でトキシンＡ及びＢに関する免疫応答を増大させた。
【００３７】
ＥＬＩＳＡの結果−血清変換
第３群対象は、６０日で０日に比べて４倍の血清変換を示したプロトコル適合解析集団中の全対象のうち最高のパーセンテージ（トキシンＡで９７．３％及びトキシンＢで９１．８％）を有した。トキシンＡとＢのコンポジット（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）（トキシンＡとＢの両方に関して血清変換した対象と定義）に関して、０日と６０日の間でＩｇＧの４倍以上の上昇と共に血清変換した第３群中の全対象の数及びパーセンテージは９０．４％（６６／７３）であった。これは、第１群（８５．７％；６０／７０）、第２群（８２．４％；５６／６８）、及び第４群（８６．１％；６２／７２）よりも高かった。トキシンＡとＢのコンポジットに関して、０日と６０日の間でＩｇＧの４倍以上の上昇と共に血清変換した第３群中の６５から７５歳の対象の数及びパーセンテージは８９．１％（４１／４６）であった。これは、第１群（７７．３％；３４／４４）、第２群（７１．１％；３２／４５）、及び第４群（７３．８％；３１／４２）よりも高かった。免疫原性のための最大の解析対象集団（ＦＡＳＩ）において、トキシンＡに関して、０日と６０日の間でＩｇＧの４倍以上の上昇と共に血清変換した各群における対象の数及びパーセンテージは以下の通りであった：第１群９４．３％（８２／８７）；第２群８８．３％（８３／９４）；第４群８８．６％（７８／８８）；第５群６．３％（３／４８）。トキシンＢに関して、０日と６０日の間でＩｇＧの４倍以上の上昇と共に血清変換した各群における対象の数及びパーセンテージは以下の通りであった：第１群８７．５％（７７／８８）；第２群７７．７％（７３／９４）；第４群９１．１％（８２／９０）；第５群１２．５％（６／４８）。トキシンＡとＢのコンポジットに関して、０日と６０日、１８０日、及び２１０日の間でＩｇＧの４倍以上の上昇と共に血清変換した各群における対象の数及びパーセンテージを、表２に説明する。
【００３８】
トキシン中和アッセイ（ＴＮＡ）の結果−ＧＭＴ
トキシンＡとトキシンＢの両方で、各活性ワクチン群における最高ＧＭＴは、第三のワクチン投与の３０日後である、６０日に見られた。０日から６０日の各採血日で一貫したＧＭＴの上昇があった。トキシンＡに関して、ＧＭＴは、第１群及び第３群でより高かった。最高ＧＭＴは、第３群において６０日に見られた。トキシンＢに関して、ＧＭＴは第１群と第２群において類似であった。ＧＭＴは、高投与量ワクチンが投与された場合に、低投与量が投与された場合よりも高かった。最高ＧＭＴは、第４群において６０日に見られた。
【００３９】
ＴＮＡ結果−血清変換
トキシンＡに関して、第３群対象は、０日に比べて６０日で４倍の血清変換を示した対象の最高のパーセンテージ（９７．３％）を有した。第４群対象は、トキシンＢ（６６．２％）及びトキシンＡとＢのコンポジット（６３．５％）に関して、０日に比べて６０日で４倍の血清変換を示した対象の最高のパーセンテージを有した。トキシンＡとＢのコンポジットに関して、０日と６０日、１８０日、及び２１０日の間で４倍以上のＩｇＧ上昇と共に血清変換したＦＡＳＩ中の各群における対象の数及びパーセンテージを表２に示す。
【００４０】
ステージＩ結論
安全性の問題は確認されず、そのため、安全性の理由に基づいてさらなる評価から除かれた治療群はなかった。ステージＩの結果は、全治療群においてワクチンの安全性を支持した。
【００４１】
全体として、より高い投与量が、ＥＬＩＳＡとトキシン中和アッセイ（ＴＮＡ）の両方により測定して最良の免疫応答を誘起した。高投与量プラスアジュバントワクチンは、ＥＬＩＳＡにより測定して、特に６５から７５歳の群において最良の免疫応答を誘起した。忍容性プロファイルが許容でき、全体的な免疫応答が特に６５〜７５歳の群において好ましいと考えられたため、高投与量プラスアジュバント（第３群）をステージＩＩに進行するように選択した。高齢の個体は、症候性のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症（ＣＤＩ）に対するワクチンの投与のための標的集団の主要な部分になりそうであるので、この投与量は最大のワクチン防御を与えそうである。
【００４２】
ステージＩの間に決定された通り６０日までの安全性及び免疫原性の結果に基づき（ブートストラップ解析含む）、製剤１００μｇ＋ＡＬＯＨ（第３群）を、ステージＩＩに進展すべき好ましい製剤として選択した。この選択は、免疫原性のためのプロトコル適合解析集団（ＰＰＳＩ）における全対象のコンポジットＥＬＩＳＡランキング解析により影響された。特に、免疫原性のための最大の解析対象集団（ＦＡＳＩ）における６５から７５歳の対象には、第３群（高投与量ワクチンプラスアジュバント）が最良の製剤であると決定した。重要なことに、他の群よりも高投与量プラスアジュバント群において、より多くの対象（数及びパーセンテージ）が、０日と６０日の間に４倍の血清変換を示した。
【００４３】
０日から２１０日の第３群のデータを、第６群及び第７群のデータと共に、「ステージ２」の見出しで表す。ステージＩＩ製剤の選択後、安全性データを、第１群から第５群で、６０日と２１０日の間に継続して収集した。２つの追加の血液試料を、免疫原性試験のために１８０日及び２１０日に得た。第１群、第２群、及び第４群では、トキシンＡとトキシンＢの両方に関するＧＭＣ（ＥＬＩＳＡにより測定）及びＧＭＴ（ＴＮＡにより測定）は、０日から６０日に増加し、６０日にピークに達し、次いで２１０日まで減少した。しかし、２１０日の値はベースラインに比べて高いままであった。２１０日では、トキシンＡのＧＭＣは３０日のＧＭＣにほぼ等しく、トキシンＢのＧＭＣは１４日のＧＭＣにほぼ等しかった。２１０日で、トキシンＡ及びトキシンＢのＧＭＴは、６０日のＧＭＴのおよそ半分であった。０日のＧＭＴベースライン値を各群で測定した。第５群（プラセボ）で測定されたＧＭＣ又はＧＭＴのベースラインからの変化は実質的に全くなかった。
【００４４】
トキシンＡ及びＢのＥＬＩＳＡコンポジットに関して血清変換の最高の４倍以上の上昇が、第１群、第２群、及び第４群のそれぞれで０日に対して６０日に見られた。血清変換は６０日の後減少したが、第１群の対象の６８．９％（５１／７４）、第２群の対象の４７．４％（３６／７６）、及び第４群の対象の６４．９％（４８／７４）で、２１０日で高いままであった。トキシンＡとＢのＴＮＡコンポジットに関して血清変換の最高の４倍以上の上昇が、第１群、第２群、及び第４群のそれぞれで０日に対して６０日で見られた。血清変換は６０日の後減少したが、第１群の対象の３９．７％（２９／７３）、第２群の対象の４０．８％（３１／７６）、及び第４群の対象の５８．１％（４３／７４）で、２１０日で高いままであった。２１０日までの全てのステージＩデータに基づき、６０日の後に到達した全体的な結論は、選択された製剤が安全で免疫原性であることであった。アジュバントあり又はなしの低投与量（すなわち５０μｇ／投与量、３：２の比のトキソイドＡ及びＢ、Ａ：Ｂ）は、特により若い群（すなわち４０〜６４歳）で、良好な免疫応答を与えた。
【００４５】
Ｃ．ステージＩＩ
試験のステージＩＩの間に、高投与量プラスアジュバント製剤（１００μｇ＋ＡＬＯＨ）を、２つの追加スケジュール（０、７、１８０日；及び０、３０、１８０日）を使用して評価した。データ（２１０日まで）を、第３群で得られたデータと比較した−すなわち、データを、ステージＩのスケジュール（０、７、３０日）を利用して同じ製剤を投与された対象群でステージＩにおいて得られたデータと比較した。
【００４６】
１．安全性評価−概観
全体として、３つの異なるスケジュールで投与されたワクチン製剤（１００μｇ＋ＡＬＯＨ）は、許容できる安全性プロファイルを有し、安全性シグナルは全く確認されなかった。どの治療群の対象にも、関連するＳＡＥは報告されなかった。特定又は非特定グレード３反応を報告した対象の数は治療群の間で類似であり最低限であった。特定ＡＲ及び非特定ＡＥは、全般的に強度がグレード１であり、持続期間が短く、試験の中断につながらず、臨床的に重要であるとは考えられなかった。ワクチン注射後の特定反応は、３つの群で類似な数及びパーセンテージの対象により報告された。非特定非重篤なＡＲ（注射部位及び全身性ＡＲの両方を含む）は、各群において類似の数及びパーセンテージの対象により報告された。より高齢の群（６５〜７５歳）の対象は、増加した特定ＡＲも非特定ＡＥも経験しなかった。安全性概要は、４０〜６４歳のより若い対象のものに類似であった。全体として、安全性の問題は全く確認されなかった。
【００４７】
免疫原性評価
ＥＬＩＳＡの結果
トキシンＡとトキシンＢの両方に関して、第３群及び第７群における最高ＧＭＣ（ＥＵ／ｍＬ）は０日から６０日に増加したが、第６群においては、最高ＧＭＣは３０日に測定された。第３群においてＧＭＣは２１０日に減少したが、第６群及び第７群においては、ＧＭＣは、１８０日の第三のワクチン接種の後で、２１０日に増加した。この同じパターンが、４０から６４歳の対象と６５から７５歳の対象で見られた。ベースラインで血清陽性だった（トキシンＡで≧１．５ＥＵ／ｍＬ及びトキシンＢで≧０．８ＥＵ／ｍＬと定義）対象の数は、トキシンＢについて、トキシンＡよりも多かった。ベースラインでの血清陽性は、トキシンＡ及びＢに関する免疫応答を、第３群及び第７群では６０日で、又は第６群では３０日で増大させた。
【００４８】
２１０日解析に含められるＰＰＳＩ中の対象の第３群及び第７群では、トキシンＡのＧＭＣ（ＥＬＩＳＡにより測定）は０日から６０日に増加し、その時点でそれぞれ９６．４４ＥＵ／ｍＬ及び８０．３７ＥＵ／ｍＬであった。第６群では、２１０日より前の最高ＧＭＣには３０日に（６０日ではなく）到達し、その時点で２３．３３ＥＵ／ｍＬであった。第３群では、ＧＭＣは２１０日に２０．７４ＥＵ／ｍＬに減少したが、第６群及び第７群では、ＧＭＣは、１８０日の第三のワクチン接種の後で、２１０日にそれぞれ２６６．２ＥＵ／ｍＬ及び２５２．１ＥＵ／ｍＬに増加した。第３群及び第７群では、２１０日解析に含められるＰＰＳＩ中の対象では、トキシンＢのＧＭＣ（ＥＬＩＳＡにより測定）は０日から６０日に増加し、その時点でそれぞれ１４２．１ＥＵ／ｍＬ及び８７．６５ＥＵ／ｍＬであった。第６群では、２１０日の前の最高ＧＭＣには３０日に（６０日ではなく）到達し、その時点で９３．５９ＥＵ／ｍＬであった。第３群において、ＧＭＣは２１０日に２６．５７ＥＵ／ｍＬに減少したが、第６群及び第７群では、ＧＭＣは、１８０日の第三のワクチン接種の後で、２１０日にそれぞれ１１９．６ＥＵ／ｍＬ及び１２４．７ＥＵ／ｍＬに増加した。
【００４９】
２１０日解析に含められる第３群、第６群、及び第７群におけるＦＡＳＩ中の４０から６４歳と６５から７５歳の対象によるＥＬＩＳＡ  ＧＭＣには顕著な差が全くなかった。
【００５０】
ベースラインで血清陽性だった対象に関して、第３群、第６群、及び第７群の対象で、それぞれトキシンＡ（３．７５ＥＵ／ｍＬ、３．５５ＥＵ／ｍＬ、及び２．９９ＥＵ／ｍＬ）とＢ（８．６５ＥＵ／ｍＬ、５．６５ＥＵ／ｍＬ、及び４．６８ＥＵ／ｍＬ）の両方で０日でのベースラインＧＭＣが低いが、ＧＭＣは、３０日又は６０日で、ベースラインで血清陰性だった対象のＧＭＣよりも高いピーク値に達する傾向があった。
【００５１】
６０日で、２１０日解析に含められるＰＰＳＩ中の対象では、ブートストラップ解析は、第３群を、トキシンＢ（９１．５％）及びトキシンＡとＢのコンポジット（８４．７％）で一位になる確率が少なくとも８０％であると特定した。６０日で、トキシンＡに関して、８０％の確率には達しなかったが、第３群は７２．１％で第６群又は第７群より高位に位置した。
【００５２】
トキシンＡ（ＥＬＩＳＡにより測定）に関して、２１０日解析に含められるＰＰＳＩ中の対象では、第３群において、ＧＭＦＲは、０日に比べて６０日で最高であった（５７．０）。第６群において、ＧＭＦＲは、０日に比べて３０日で１４．４であり、０日に比べて６０日で１１．３であったが、０日に比べて２１０日で１５８．８に達した。第７群において、ＧＭＦＲは、０日に比べて６０日で４８．８であったが、０日に比べて２１０日で１５１．４に達した。トキシンＢ（ＥＬＩＳＡにより測定）に関して、２１０日解析に含められるＰＰＳＩ中の対象では、第３群において、ＧＭＦＲは、０日に比べて６０日で最高（６４．２）であった。第６群において、ＧＭＦＲは、０日に比べて３０日で４３．０であり、０日に比べて６０日で３４．５であったが、０日に比べて２１０日で５２．５に達した。第７群において、ＧＭＦＲは、０日に比べて３０日で２３．０であり、０日に比べて６０日で４０．１であり、０日に比べて２１０日で５３．６に達した。
【００５３】
ＥＬＩＳＡの結果−血清変換
６０日で、トキシンＡに関して、第３群の対象の９７．０％（６４／６６）、第６群の対象の６５．６％（４０／６１）、及び第７群の対象の９１．２％（５２／５７）で、ＥＬＩＳＡにより測定された血清変換の４倍以上の上昇があった（第３群及び第７群の対象は３０日にワクチン接種を受けた；第６群の最後のワクチン接種は７日であった）。対照的に、６０日で、トキシンＢに関して、ＥＬＩＳＡにより測定された血清変換の４倍以上の上昇は、治療群の間で類似であった：第３群の対象の９２．４％（６１／６６）、第６群の対象の８５．２％（５２／６１）、及び第７群の対象の８９．５％（５１／５７）。６０日で、トキシンＡとＢのコンポジットに関して、第３群の対象の９０．９％（６０／６６）、第６群の対象の６０．７％（３７／６１）、及び第７群の対象の８４．２％（４８／５７）で、ＥＬＩＳＡにより測定された血清変換の４倍以上の上昇があった。トキシンＡ及びＢ並びにトキシンＡとＢのコンポジットに関する４倍以上の血清変換率（ＥＬＩＳＡにより測定）の概要を、表３で、２１０日解析に含められるＰＰＳＩ中の対象に関して、６０日／０日、１８０日／０日、及び２１０日／０日に関して表す。２１０日解析に含められる第３群、第６群、及び第７群中のＦＡＳＩ中の４０から６４歳の対象と６５から７５歳の対象で、ＥＬＩＳＡ血清変換率に顕著な差はなかった。
【００５４】
ベースラインでトキシンＡに関して血清陽性であり０日に比べて６０日で４倍以上の血清変換を有した、２１０日解析に含められるＦＡＳＩ中の対象のパーセンテージは、第３群の対象で１００％、第６群の対象の９２．３％（１２／１３）、及び第７群の対象の８７．５％（７／８）であった。ベースラインでトキシンＢに関して血清陽性であり０日に比べて６０日で４倍以上の血清変換を有した、２１０日解析に含められるＦＡＳＩ中の対象のパーセンテージは、第３群の対象の９４．６％（３５／３７）、第６群の対象の９１．５％（４３／４７）、及び第７群の対象の９４．１％（４８／５１）であった。
【００５５】
ＴＮＡの結果−ＧＭＴ
第３群及び第７群では、トキシンＡ及びＢに関するＧＭＴは、０日から６０日に増加した。第６群では、最高ＧＭＴには３０日に達した。第３群では、ＧＭＴは２１０日で減少したが、第６群及び第７群では、ＧＭＴは、１８０日の第三のワクチン接種の後で、２１０日に増加した。この同じパターンが、４０から６４歳の対象と６５から７５歳の対象に見られた。ベースラインで血清陽性であった対象の数は、トキシンＢに関して、トキシンＡよりも高かった。ベースラインでの血清陽性は、第３群及び第７群で６０日に、又は第６群で３０日にトキシンＡ及びＢに関する免疫応答を増大させた。
【００５６】
２１０日解析に含められるＰＰＳＩ中の対象の第３群及び第７群では、トキシンＡに関するＧＭＴ（ＴＮＡにより測定）は０日から６０日で増加し、その時点で、それぞれ６２８．６  １／ｄｉｌ及び５５３．７  １／ｄｉｌであった。第６群では、２１０日の前の最高ＧＭＴには３０日に達し（６０日ではなく）、その時点で１５８．６  １／ｄｉｌであった。第３群では、ＧＭＴは２１０日に２７０．２  １／ｄｉｌに減少したが、第６群及び第７群では、ＧＭＴは、１８０日の第三のワクチン接種の後で、２１０日に、それぞれ８９３９．４  １／ｄｉｌ及び９０１５．６  １／ｄｉｌに顕著に増加した。第３群及び第７群では、トキシンＢに関するＧＭＴ（ＴＮＡにより測定）は０日から６０日で増加し、その時点で、それぞれ４６６．３  １／ｄｉｌ及び４１５．０  １／ｄｉｌであった。第６群では、２１０日の前の最高ＧＭＴには３０日に到達し（６０日ではなく）、その時点で３５１．１  １／ｄｉｌであった。第３群では、ＧＭＴは２１０日で１６４．４  １／ｄｉｌに減少したが、第６群及び第７群では、ＧＭＴは、１８０日の第三のワクチン接種の後で、２１０日に、それぞれ１４８８．４  １／ｄｉｌ及び２０７０．３  １／ｄｉｌに増加した。
【００５７】
２１０日解析に含められる第３群、第６群、及び第７群の４０から６４歳の対象と６５から７５歳の対象で、トキシンＡ又はＢに関するＴＮＡ  ＧＭＴに顕著な差は全くなかった。
【００５８】
ベースラインで血清陽性であった対象では、トキシンＡに関する０日のベースラインＧＭＴは、第３群、第６群、及び第７群の対象に関してそれぞれ７２．０７  １／ｄｉｌ、４４．５５  １／ｄｉｌ、及び５９．９４  １／ｄｉｌであり、トキシンＢに関しては、それぞれ１６１．８  １／ｄｉｌ、７９．３１  １／ｄｉｌ、及び７６．３５  １／ｄｉｌであった。ＧＭＴは、ベースラインで血清陰性であった対象のＧＭＴよりも、３０日又は６０日で何倍も高いピーク値に達する傾向があった。
【００５９】
ＴＮＡブートストラップランキング解析を、第３群、第６群、及び第７群で、２１０日解析に含められるＰＰＳＩ中の対象に実施した（表４）。６０日での第３群のトキシンＡ（６６．９％）、トキシンＢ（５８．７％）、及びトキシンＡとＢのコンポジット（６３．０％）に関する確率は、第６群又は第７群よりも高位に位置した。
【００６０】
ＧＭＦＲ（ＴＮＡにより測定）の概要を、２１０日解析に含められるＰＰＳＩ中の第３群、第６群、及び第７群中の対象に関して表５に表す。
【００６１】
２１０日解析中のＰＰＳＩ中の対象のトキシンＡ（ＴＮＡにより測定）に関して、第３群では、ＧＭＦＲは、０日に比べて６０日で最高（３１．６）であった。第６群では、ＧＭＦＲは、０日に比べて３０日で８．５であり、０日に比べて６０日で６．１であったが、０日に比べて２１０日で４１９．８に達した。第７群では、ＧＭＦＲは、０日に比べて６０日で２６．０であったが、０日に比べて２１０日に４１２．６に達した。２１０日解析中のＰＰＳＩ中の対象のトキシンＢ（ＴＮＡにより測定）に関して、第３群では、ＧＭＦＲは０日に比べて３０日で１４．６であり、０日に比べて６０日で１７．０であった。第６群において、ＧＭＦＲは、０日に比べて３０日で１７．８であり、０日に比べて６０日で１３．３であったが、０日に比べて２１０日で６０．２に達した。第７群では、ＧＭＦＲは、０日に比べて３０日で１４．２であり、０日に比べて６０日で１６．７だったが、０日に比べて２１０日で７０．２に達した。
【００６２】
ＴＮＡの結果−血清変換
６０日で、トキシンＡに関して、第３群の対象の９７．０％（６４／６６）、第６群の対象の４１．０％（２５／６１）、及び第７群の対象の８２．５％（４７／５７）で、血清変換の４倍以上の上昇があった（第３群及び第７群の対象は３０日にワクチン接種を受けた；第６群の第二のワクチン接種は７日であった）。対照的に、６０日で、トキシンＢに関して、血清変換の４倍以上の上昇は、治療群の間で類似であった：第３群の対象の６３．６％（４２／６６）、第６群の対象の５７．４％（３５／６１）、及び第７群の対象の６３．２％（３６／５７）。６０日に、トキシンＡとＢのコンポジットに関して、第３群の対象の６２．１％（４１／６６）、第６群の対象の３１．１％（１９／６１）、及び第７群の対象の５６．１％（３２／５７）で血清変換の４倍以上の上昇があった。トキシンＡとＢのコンポジットに関する４倍以上の血清変換率（ＴＮＡにより測定）の概要を、表６に、２１０日解析に含められるＰＰＳＩ中の対象に関して、６０日／０日、１８０日／０日、及び２１０日／０日に関して表す。
【００６３】
２１０日解析に含まれる第３群、第６群、及び第７群中のＦＡＳＩ中の４０から６４歳の対象と６５から７５歳の対象で、ＴＮＡ血清変換率に顕著な差は全くなかった（付録１５、表１５．５６）。
【００６４】
ベースラインでトキシンＡに関して血清陽性であり０日に比べて６０日で４倍以上の血清変換を有した２１０日解析に含められるＦＡＳＩ中の対象のパーセンテージは、第３群の対象の１００％、第６群の対象の９６．０％（２４／２５）、及び第７群の対象の１００％であった（付録１５、表１５．５９）。ベースラインでトキシンＢに関して血清陽性であり０日に比べて６０日で４倍以上の血清変換を有した２１０日解析に含められるＦＡＳＩ中の対象のパーセンテージは、第３群の対象の９６．２％（２５／２６）、第６群及び第７群の対象の１００％であった。ベースラインでトキシンＡに関して血清陰性であり０日に比べて６０日で４倍以上の血清変換を有した２１０日解析に含められるＦＡＳＩ中の対象のパーセンテージは、第３群の対象の９５．１％（７８／８２）、第６群の対象の２５．０％（１７／６８）、及び第７群の対象の８０．０％（６０／７５）であった。ベースラインでトキシンＢに関して血清陰性であり０日に比べて６０日で４倍以上の血清変換を有した２１０日解析に含められるＦＡＳＩ中の対象のパーセンテージは、第７群の４５．６％（３１／６８）であった。
【００６５】
ステージＩＩ結論
ステージＩと同様に、ステージＩＩの結果は、ワクチンの安全性を支持し続けた。安全性シグナルは全く確認されず、全体的な忍容性プロファイルは許容でき、ステージＩと同等であった。具体的には、ＳＡＥを報告した対象の数は群全体にわたって同等であった。ワクチン接種に関連していると考えられるＳＡＥは全くなかった。４名の対象が試験の間に死亡したが、死亡はワクチン接種と関連していると考えられなかった。試験中断につながるＡＥを報告した対象はほとんどいなかった。特定反応（具体的には、注射部位の疼痛及び筋痛の全身性反応）は、１８０日の最後のワクチン接種の後第６群及び第７群において幾分高かった。生物学的に重要な検査パラメーターは、ほとんどが基礎の病状と関連していた。
【００６６】
全３スケジュールでのワクチン製剤は、ＥＬＩＳＡ及びＴＮＡによりトキシンＡ及びＢに関して免疫原性であった。免疫応答は強固であり、第３群及び第７群では６０日まで増加し続け、第６群では３０日まで増加し続けた。第３群の免疫応答は、２１０日で高いままであった。ベースラインでトキシンＢに関して血清陽性であった対象が、トキシンＡに関して血清陽性であった対象よりも多かった。全体として、０、７、３０日のスケジュール（第３群）は、対象がＣＤＩの最高の危険性に曝され得る時期の間に、ＥＬＩＳＡとＴＮＡの両方により測定して最良の免疫応答を惹起した。
【００６７】
最後に、最適なワクチンスケジュールは、入院前の期間の間、入院の間及び後での急速な防御の開始並びにレジメンへの高度なコンプライアンスに一致しなくてはならない。試験により、ＣＤＩの最高の危険性が、病院の芽胞への曝露後３から５日付近で始まることが示された。さらに、ＣＤＩ症例の７０％が退院の１か月以内に起こり、残りの症例は退院の３か月後に起こることが示された（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ）。世界的には、計画された手術の平均待ち時間は、２週間から５か月であると推定された（３１）。６０日での応答は最高のＣＤＩ危険性の期間の間に起こっているはずなので、スケジュール選択の間に、６０日での免疫応答の決定ランキングを優先した。免疫学的防御の具体的な相関関係は未知であるが、６０日での良好な免疫応答及び１８０日までの持続した応答の明示は、計画された入院の間及びその後で対象に防御を与えると期待できる好ましいワクチンレジメンの選択において重要な基準であった。
【００６８】
１００μｇ＋ＡＬＯＨのワクチン製剤は、試験した３つのワクチン注射スケジュール（０、７、３０日；０、７、１８０日；０、３０、１８０日）で、全ての時点で、成人（４０から６４歳）と高齢（６５から７５歳）の両方の対象に関して、免疫原性であった。７日と１４日の免疫応答は、３つの試験スケジュールで、成人及び高齢の対象において類似であった。ＥＬＩＳＡ  ＧＭＣ及びＴＮＡ  ＧＭＴは、６０日及び１８０日で、第３群の対象では、第６群又は第７群よりも高かった。予測通り、第６群及び第７群の対象は、２１０日に最高ＧＭＣ及びＧＭＴを有したが、その理由は、彼らが（第３群の対象とは異なり）３０日前の１８０日にワクチン接種されたからである。血清変換（ＥＬＩＳＡとＴＮＡのいずれかにより測定）は、６０日及び１８０日で、第３群の対象では、第６群又は第７群より高かった。主に最初の６０日の期間にわたる免疫応答に焦点を置くブートストラップランキング解析に基づいて、第３群を最良のスケジュールに選んだ。重要なことに、定義されるＣＤＩの危険期間に入ったばかりの患者に最大のワクチン防御が望まれる１８０日の期間（すなわち０日＋１８０日＝１８０日）にわたって考察される場合、３０日、６０日、及び１８０日にわたって測定された免疫応答を考慮すると、０、７、及び３０日レジメン（第３群）での３投与による投与は、他の２つのレジメン（第６群又は第７群）と比べて全体として最良の免疫応答を与えた。この期間は、患者がＣＤＩにかかる最大の危険性にありそうな期間を表す。全体として、０日、７日、及び３０日のワクチンスケジュールの第３群は、３０日、６０日、及び１８０日に良好な免疫応答を生み出した。重要なことに、ステージＩＩの結果は第３群の対象のより良好なコンプライアンスも示唆するが、その理由は、第三のワクチンが１８０日である群に比べてこれらの対象のより多くが３つ全てのワクチン注射を受けたからである。特に高齢者又は慢性の基礎疾患を有するものを担当する総合診療医又は一次診療医によりワクチンが外来患者の状況で投与されるだろうことが企図される。個体は疾病発症に先立って０、７、及び３０日ワクチンスケジュールを利用して免疫されるだろうから、防御免疫応答は、早くも第二のワクチン投与の１週間後（例えば、１４日）に最良に得ることができる。このレジメンは、血清陰性の個体（例えば、ナイーブな個体）でも、トキシンＡとＢの両方に対する持続した中和抗体価を、少なくとも３０か月（例えば、１０００日）、１４日までに得られる抗体価以上で惹起することも見出された。免疫応答は、両トキシンに関して３０か月を過ぎても持続することが認められた。
【００６９】
試験は、ワクチン接種後に、血清陰性の個体（例えば、ナイーブな個体）よりも、０日で血清陽性の個体が血清変換の２倍超から４倍の増加を示したことも明らかにした。ワクチン後１４日（０日及び７日投薬）で、血清陽性の個体は、血清陰性の個体の約２から３倍の頻度で血清変換した（ＥＬＩＳＡ又はＴＮＡにより測定して２から４倍の増加）。ワクチン後３０日で（第二の投与の約２１日後、第三の投与の前）、血清陽性の個体は、血清陰性の個体より高頻度で血清変換した（ＥＬＩＳＡにより測定して２から４倍の増加）が、差はそれほど大きくなかった。例えば、ＥＬＩＳＡにより測定された血清変換（トキシンＡ及びトキシンＢ）は、３０日で、血清陽性の個体において約２０〜３０％頻度が高かった。ＴＮＡにより測定すると、血清陽性の個体は、血清陰性の個体の２〜３倍の血清変換頻度を維持した。しかし、ベースライン血清陽性と血清陰性のどちらでも、抗体価の増加が各投与の後で示されたことが認められる。
【００７０】
このレジメンが、抗トキシンＡと抗トキシンＢの両方に関して、成人（４０〜６５歳）と高齢の（６５〜７５歳）対象において同等な血清変換率（例えば、ＥＬＩＳＡにより測定して、０日から４倍の上昇を有する対象の％）を惹起することも見出された。
【００７１】
結論
結果は、評価された投与量レベルでのワクチンが、トキシンＡとＢの両方に対して完全な血清変換を惹起可能であることを示す。そのような応答は、トキシン−Ａ陰性／トキシン−Ｂ陽性クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）病原性株に対する有効性、及びより多量のトキシンＡ及びＢを産生するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の流行株に対する有効性に有用である。そのような応答は、高齢の個体及び免疫機能が低下した対象を含む意図される標的集団にも有用である。以前のヒト臨床試験において、トキシンＡに対して良好な応答が惹起されたが、トキシンＢへの応答は期待したよりも低かった。結果は、１００μｇ投与量の抗原が、５０μｇ投与量で観察された率よりもトキシンＢに対する血清変換率を増加させたことを示す。トキソイドＡとＢの両方のより高い投与量は、両トキシンに対する血清変換のより速い応答時間に関連した。６０日免疫応答を優先したが、その理由は、これが、疫学データによると対象が病院環境に曝露された場合にＣＤＩの最高の危険性の期間であるからである。ＣＤＩ症例の７０％が病院からの退院の３０日以内に起こり、残りが退院後３か月までに起こることが確認された。ステージＩの後に選択され３つの異なるスケジュール（０、７、３０日；０、７、１８０日；０、３０、１８０日）で評価されたワクチン製剤（１００μｇ＋ＡＬＯＨ）は、許容できる安全性プロファイルを有し、安全性シグナルは全く確認されなかった。ワクチンは、異なるスケジュールで投与された場合、成人及び高齢の対象において、ＩｇＧ抗体のＧＭ測定及び血清変換率並びにＴＮＡ結果により証明された通り、トキシンＡ及びＢに対して強い免疫応答を誘起した。結果は、免疫応答が１４日までに確立可能であったことを示す。２１０日での応答の持続性も持続した。全体として、０、７、３０日のスケジュールが、６０日までの対象とする期間の間の最大防御の所望のプロファイルに最も良く合致した。安全性と免疫原性の両面で、製剤（１００μｇ＋ＡＬＯＨ）と０、７、３０日のスケジュールの組合せは最良の結果を生み出した。
【００７２】
特定の実施形態が好ましい実施形態の点で記載されてきたが、当業者が変形及び改善を思いつくだろうことが理解される。したがって、添付される特許請求の範囲が、以下の特許請求の範囲にあるそのような等価な変形の全てを網羅することが意図される。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
【表２】
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【００７５】
【表３】
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【００７６】
【表４】
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【００７７】
【表５】
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【００７８】
【表６】
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