(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中から精子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉する方法であって、
少なくとも１種の精子細胞または精子細胞溶解物を含む生体試料を、溶解溶液と接触させ、前記生体試料をプロタミン−ＤＮＡ複合体を含む溶液へ溶解する工程；
少なくとも１種のプロタミン特異的抗体を、前記溶解された生体試料に適用し、前記プロタミン特異的抗体が前記溶解された精子細胞の前記プロタミン−ＤＮＡ複合体に結合して、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成する工程；
前記抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉する工程；ならびに
前記捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体から前記精子ＤＮＡを検出する工程、
を含み、
前記溶解溶液が界面活性剤を含み、
前記溶解された精子細胞に前記プロタミン特異的抗体を適用する前、細胞溶解後に封鎖剤を適用して界面活性剤を封鎖する、方法。
【請求項２】
前記プロタミン特異的抗体を適用する前に、前記溶解溶液を除去または封鎖する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶解溶液が、還元剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記溶解溶液が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはこれらの組み合わせから選択される還元剤を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記溶解溶液が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）またはサルコシルから選択される界面活性剤を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記溶解溶液が４０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５％〜２％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはこれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記封鎖剤が、サイズ排除シェル、α−シクロデキストリン、サイズ排除樹脂またはこれらの組み合わせでコーティングされたリガンド活性化コアビーズを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プロタミン特異的抗体が、約４℃〜約３７℃の範囲においてインキュベーションする間にプロタミン−核酸複合体に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記プロタミン特異的抗体が、約１０分〜４時間の範囲においてインキュベーションする間に前記プロタミン−核酸複合体に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体の捕捉が、前記プロタミン特異的抗体とプレカップリングされた捕捉剤によって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体の捕捉が、前記プロタミン特異的抗体に結合する捕捉剤をさらに添加することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記捕捉剤が、二次抗体、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、プロテインＡ、ストレプトアビジン、セファデックス、ガラスビーズ、セルロース、ニトロセルロース、石英、側方流動ストリップまたはこれらの組み合わせを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記捕捉剤が側方流動ストリップであり、
請求項１に記載の接触工程に続いて、前記生体試料を前記側方流動ストリップの第１のゾーンに適用し、ならびに
請求項１に記載の前記適用工程が、前記生体試料が前記側方流動ストリップに沿って、結合したプロタミン特異的抗体を含む前記側方流動ストリップの第２のゾーンまで移動すると起こる、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の前記適用工程の前に、前記生体試料中のＤＮＡを剪断する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記剪断工程が、機械的、化学的または酵素的手段によって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記剪断工程が酵素的手段によって行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記側方流動ストリップの前記第１のゾーンが、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体に特異的な抗体を含む、請求項１３乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料が、上皮細胞、体細胞、血液細胞、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料が、精子細胞を含む法医学試料から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が固体基材に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
生体試料が射精後少なくとも３日に採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
生体試料中の精子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉するためのキットであって、
プロタミン特異的抗体；
捕捉剤；および
溶解溶液
を含み、
前記捕捉剤が側方流動ストリップである、キット。
【請求項２３】
前記側方流動ストリップが、生体試料の適用のための第１のゾーン、および結合したプロタミン特異的抗体を含む第２のゾーンを含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記第１のゾーンが、前記生体試料中のＤＮＡを剪断するための酵素および／または抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体に特異的な抗体を含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記酵素および前記抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体に特異的な抗体が、存在する場合には乾燥形態である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
サイズ排除シェル、α−シクロデキストリン、サイズ排除樹脂またはこれらの組み合わせでコーティングされたリガンド活性化コアビーズを含む封鎖剤をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、生体試料から精子核酸を捕捉する方法に関する。本発明は、クロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）を用いて精子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
性的暴行に関連して回収される試料は、典型的には、上皮細胞、赤血球、白血球、種々の膣細菌叢（乳酸桿菌など）、精子細胞および細菌性、ウイルス性または真菌性の汚染物質を含む異なる細胞型の混合物である。性的暴行が、例えば、口腔の暴行または肛門の暴行である場合、試料は口腔上皮細胞、口腔細菌叢、腸上皮細胞、結腸上皮細胞、または例えば糞便中に存在する他の細菌細胞をさらに含み得る。性的暴行試料などの試料由来の精子ＤＮＡの捕捉および検出は、法医学的適用または診断適用などの適用のための主な要件である。
【０００３】
精子ＤＮＡの特定のパターンを決定するために、Ｙ染色体プローブ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）または可変数タンデムリピート（ＶＮＴＲ）を用いて男性ＤＮＡを識別するＤＮＡフィンガープリンティングを含む、試料から精子ＤＮＡを捕捉および／または検出するためのさまざまな技術が開発されている。核および細胞質の染色は精子細胞を同定するのにも役立つが、この染色方法は精子細胞の完全形状に依存し、性的暴行試料に存在する場合には得ることができない。これらの方法は、複数の工程を必要とし、かなりの量の出発ＤＮＡを必要とするため、複雑である。出発ＤＮＡの所望の濃度を達成するために、標的ＤＮＡの増幅を含むさまざまな技術が開発されている。増幅においては、汚染種もまた増幅され得、増幅ベースの検出は、増幅されたＤＮＡの細胞源を検出するための特異性を欠いている。これらの適用は、通常、下流の適用における干渉を低減し、所望の結果を達成するために、望ましくない核酸および汚染物質からの標的ＤＮＡの分離および精製が先行する。しかし、伝統的な精製または分離方法および関連する技術は、複雑で、時間および労力がかかる。
【０００４】
精子細胞では、体細胞に見出されるヒストンタンパク質は、大部分がプロタミン（ＰＲＭ１およびＰＲＭ２）によって置換され、精子成熟中にさらなるＤＮＡ凝縮を可能にする。プロタミンは体内の他の細胞と比較してヒトの精子において独特に発現し、精子細胞中のＤＮＡに関連する非常に特異的な因子として働く。プロタミンの存在は種間で高度に保存されている。
【０００５】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）は、関連するタンパク質のアフィニティー捕捉によって特異的ＤＮＡを単離するための確立された方法である。伝統的にＣｈＩＰは、活性遺伝子プロモーター領域への転写因子マッピングに使用されており、より最近では、ＤＮＡおよび関連するヒストンタンパク質両方のエピゲノムおよびそれらのそれぞれの改変の分析に適合されている。ＣｈＩＰはプロタミンＤＮＡ複合体の単離に使用されているが、異なるタイプの細胞を含む試料から精子特異的ＤＮＡの精製するためには一度も使用されていない。
【０００６】
後続の分析のために、性的暴行事件の混合試料中の被害者の細胞および加害者の細胞を含む試料から、加害者のＤＮＡ、特に精子細胞由来ＤＮＡを単離するための単純化された方法が非常に望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００８／１０１１９２号
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、全体として、生体試料から精子核酸を捕捉するための方法およびキットに関する。特定の実施形態において、生体試料は、固体支持体に固定されてもよい。他の実施形態において、生体試料は、射精後３日以上の精子からのものであってもよい。
【０００９】
生体試料中の精子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉する方法の一実施形態は、少なくとも１種の精子細胞または精子細胞溶解物を含む生体試料を、溶解溶液と接触させ、該生体試料をプロタミン−ＤＮＡ複合体を含む溶液へ溶解する工程；少なくとも１種のプロタミン特異的抗体を、溶解された生体試料に適用し、プロタミン特異的抗体が溶解された精子細胞のプロタミン−ＤＮＡ複合体に結合して、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成する工程；抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉する工程；ならびに捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体から精子ＤＮＡを検出する工程を含む。
【００１０】
生体試料中の精子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉する方法の別の実施形態は、プロタミン−ＤＮＡ複合体を含む少なくとも１種の精子細胞、部分的に溶解された精子細胞または精子細胞溶解物を含む試料を提供する工程；溶解溶液と試料とを接触させて、精子細胞または部分的に溶解した精子細胞を溶解させる工程；少なくとも１種のプロタミン特異的抗体を、溶解された精子細胞に適用し、プロタミン特異的抗体が溶解された精子細胞のプロタミン−ＤＮＡ複合体に結合して、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成する工程；抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉剤を添加することによって捕捉する工程；ならびに捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体から、ＤＮＡ増幅反応により精子ＤＮＡを検出する工程を含む。
【００１１】
別の実施形態において、生体試料からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を精製する方法は、プロタミン−ＤＮＡ複合体を含む生体試料を提供する工程；少なくとも１種のプロタミン特異的抗体をプロタミン−ＤＮＡ複合体に適用して抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成する工程；捕捉剤を用いて抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉する工程；ならびに捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体からＤＮＡを精製する工程を含む。
【００１２】
別の実施形態において、固体基材に固定された生体試料中の精子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉するためのキットであって、精子核酸の捕捉を目的とするプロタミン特異的抗体、捕捉剤および溶解緩衝液を含むキットも提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の一実施形態の一例による方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、本発明の一実施形態の一例による、異なる条件下で異なる細胞溶解試薬による細胞溶解百分率を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施形態の一例による、異なる条件下でのプルダウンアッセイ後のＤＮＡ収量を示す棒グラフである。
【図４】図４は、本発明の実施形態の別の例による、異なる条件下でのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の封鎖を示す棒グラフである。
【図５】図５は、精子ゲノム材料の超音波処理の結果を示すＤＮＡゲル電気泳動画像である。精子クロマチンは、超音波処理などの機械力を用いて剪断することができる。
【図６】図６は、側方流動下で１０キロベースより小さなＤＮＡの移動を示すＤＮＡゲル電気泳動画像である。
【図７】図７は、側方流動下で８．３〜４８．５キロベースのサイズ範囲（ｓｉｚ  ｒａｎｇｅｓ）のＤＮＡの移動を示すＤＮＡゲル電気泳動画像である。
【図８】図８は、側方流動下での４８．５キロベースを超えるＤＮＡの移動を示すＤＮＡゲル電気泳動画像である。
【図９】図９は、本発明の実施形態の一例による、異なる条件下でのプルダウンアッセイ後の試料に対する固定効果を示すウエスタンブロットの画像である。
【図１０】図１０は、本発明の実施形態の一例による、異なる条件下でプルダウンアッセイから回収されたＤＮＡ試料に対する固定効果を示すＤＮＡゲル電気泳動画像である。
【図１１】図１１は、本発明の実施形態の別の例による、異なる細胞型を含む試料からの精子ＤＮＡの差次的捕捉を示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、直接的な溶解（Ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  Ｃａｐｔｕｒｅによる）が、溶解前の基材からの細胞の単離（差次的抽出による）に対してＤＮＡ収量が改善されたことを示すグラフである。
【図１３】図１３は、上皮細胞および精子細胞（下）由来のゲノム材料をミクロコッカスヌクレアーゼで処理した結果を示すＤＮＡゲル電気泳動画像である。
【図１４】図１４は、精子細胞（下）由来のゲノム材料をミクロコッカスヌクレアーゼで処理した結果を示すＤＮＡゲル電気泳動画像である。
【図１５】図１５は、９日後に採取した試料からの精子ＤＮＡ捕捉の結果を示すグラフ（ｇｒａｆｔ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
さまざまな実施形態は、標的核酸、例えば精子デオキシリボ核酸（精子ＤＮＡ）を、非標的核酸および望ましくない汚染物質を含む生体試料からの捕捉に適した方法を提供する。この方法は、標的核酸の検出および分析も含む。標的核酸は、タンパク質−ＤＮＡ複合体としてのクロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）およびその後の捕捉剤を用いたタンパク質−ＤＮＡ複合体の捕捉によって生体試料から分離される。最後に、捕捉された複合体から標的核酸を単離し、次いで検出する。
【００１５】
特許請求する発明の主題をより明確かつ簡潔に記載するために、下記の説明および添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語に対して、下記の定義が提供される。本明細書を通して、特定の用語の例示は、限定されない例とみなすべきである。
【００１６】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が特に他のことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。本明細書および特許請求の範囲を通してここで使用される、概略を表す言葉（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｎｇ  ｌａｎｇｕａｇｅ）は、関連する基本的機能に変化をもたらすことなく、差し支えない程度に変動できる任意の量的表現を修飾するために適用することができる。したがって、「約」などの用語により修飾された値は、指定された正確な値に限定されるものではない。いくつかの場合において、概略を表す言葉は、値を測定する機器の精度に対応する。必要に応じて、範囲が供給され、それらの範囲はその間のすべての部分範囲を包括する。
【００１７】
本明細書において言及される用語「核酸」は、すべての形態のＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ）またはＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、非コードＲＮＡ、動物ＲＮＡ、植物ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたは細菌ＲＮＡ）、ならびにヌクレオチド類似体を使用して作製された組換えＲＮＡおよびＤＮＡ分子またはＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体を含む。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。核酸は、コード鎖または非コード鎖を含み得る。この用語はまた、核酸断片、例えば、開示された抽出方法を使用して回収可能な天然に存在するＲＮＡまたはＤＮＡなどを含む。核酸はまた、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）の一部を指すこともある。抽出された核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）をさらに含み得る。
【００１８】
精子ＤＮＡなどの捕捉核酸は、一本鎖であっても、または二本鎖であってもよい。捕捉された精子ＤＮＡの分子量も限定されるものではなく、数ベースペア（ｂｐ）〜数メガベースペア（Ｍｂｐ）の範囲であってよい。
【００１９】
本明細書において使用される場合、用語「精子ＤＮＡ」は、精子細胞によって提供される、男性精液試料中に特異的に見出されるＤＮＡを指す。精子ＤＮＡ配列は、望ましくは抗体によって捕捉される男性起源のものである。精子ＤＮＡは、複数の細胞および汚染物質を含む試料から検出され、さらに、さらなる分析のために増幅反応において増幅されることが望ましい。精子ＤＮＡは、体液（例えば、精液）などの生体試料から得ることができる。精子ＤＮＡは、精子ＤＮＡで汚染された、もしくは精子ＤＮＡを含む任意の材料または生体試料、例えば、布、皮革、または組織、細胞、細胞溶解物、法医学試料、古い試料、または精子ＤＮＡで汚染された膣スワブから得ることができる。精子ＤＮＡを含有するか、または含むことが疑われる生体試料は、ヒト起源から得られるものである。
【００２０】
特定の実施形態において、生体試料は、レイプキットを用いた処理のような法医学試験のための試料を得ることによって固体基材に固定される。したがって、基材としては、セルロース材料またはニトロセルロース、ポリエステル、天然もしくは非天然繊維を挙げることができるが、これらに限定されない。基材は、口腔、膣または肛門試料を採取するために使用されるスワブの形態であり得る。基材はまた、デニム、綿、ポリエステル、ナイロン、または精子試料で汚染されていると思われる他の布などの衣服の収集片由来であってもよい。さらに他の実施形態において、基材はガラス繊維または石英系であってもよい。
【００２１】
「鋳型核酸」は、増幅され得るＤＮＡとして定義される。例えば、鋳型ＤＮＡは、法医学試料から捕捉された精子ＤＮＡである。精子ＤＮＡは、ＤＮＡ増幅反応においてＤＮＡポリメラーゼにより増幅されて、精子ＤＮＡの増幅産物を産生することができる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「捕捉剤」は、プロタミン特異的抗体に対して親和性を有し、さらにプロタミン−ＤＮＡ複合体に結合する試薬、タンパク質、ペプチドまたは核酸を指す。いくつかの実施形態において、捕捉剤は、試料に適用する前に、本明細書においてプロタミン特異的抗体と呼ばれる一次抗体とプレカップリングされる。捕捉剤は、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を含む試料に別々に添加されてもよい。例えば、捕捉剤は、「抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体」に対して親和性を有する。
【００２３】
本明細書で使用される場合、ｄＮＴＰ混合物は、ＮがＡ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕのいずれかを含むランダムヌクレオチドである混合デオキシリボヌクレオチド三リン酸を指す。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「プライマー」または「プライマー配列」は、標的核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ））にハイブリダイズして核酸増幅反応をプライミングする短い直鎖オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、リボ核酸（ＲＮＡ）オリゴヌクレオチド、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、またはキメラ配列であってもよい。プライマーは、天然、合成、または改変されたヌクレオチドを含み得る。プライマーの長さの上限および下限の両方が経験的に決定される。プライマー長の下限は、核酸増幅反応条件下で標的核酸とのハイブリダイゼーション時に安定な二重鎖を形成するために必要とされる最小長である。非常に短いプライマー（通常３〜４ヌクレオチド長未満）は、このようなハイブリダイゼーション条件下で標的核酸と熱力学的に安定な二本鎖を形成しない。上限は、多くの場合、標的核酸中の所定の核酸配列以外の領域に二本鎖形成を有する可能性によって決定される。非限定的な例として、適切なプライマー長は、多くの場合約４〜約４０ヌクレオチド長の範囲である。プライマーを用いて核酸配列を捕捉することもできる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「増幅」、「核酸増幅」または「増幅する」という用語は、核酸鋳型の複数のコピーの産生、または核酸鋳型に相補的な複数の核酸配列コピーの産生を指す。
【００２６】
本明細書において、用語「ＤＮＡポリメラーゼ」は、鋳型として核酸鎖を用いて新たにＤＮＡ鎖を合成する酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ合成のための鋳型として既存のＤＮＡまたはＲＮＡを使用し、それが読み取る鋳型鎖に沿ってデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。新たに合成されたＤＮＡ鎖は鋳型鎖に相補的である。ＤＮＡポリメラーゼは、新たに形成する鎖の３’−ヒドロキシ末端にのみ遊離ヌクレオチドを付加することができる。これは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）から成長中のオリゴヌクレオチド鎖の３’−ヒドロキシル基へのヌクレオシド一リン酸の転移を介してオリゴヌクレオチドを合成する。これは、５’→３’方向の新しい鎖の伸長をもたらす。ＤＮＡポリメラーゼは、既存の３’−ＯＨ基にヌクレオチドを付加することしかできないので、ＤＮＡ合成反応を開始するために、ＤＮＡポリメラーゼは、最初のヌクレオチドを付加することができるプライマーを必要とする。適切なプライマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはヌクレオチド類似体のオリゴヌクレオチドを含む。ＤＮＡポリメラーゼは、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼであっても、または上記活性を有する天然酵素の変異体であってもよい。例えば、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、またはエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを挙げることができる。
【００２７】
本明細書において称される「還元剤」という用語は、電子を別の化学種に提供する任意の化学種を含む。さまざまな還元剤が当分野において公知である。還元剤の例としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられる。さらに、これらまたは他の還元剤の任意の組み合わせも使用され得る。特定の実施形態において、還元剤はＤＴＴである。
【００２８】
本明細書において使用される用語「増幅緩衝液」は、例えば、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、クエン酸緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）およびリン酸緩衝液を含むが、これらに限定されない。増幅緩衝液は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、硫酸二アンモニウム、一価カチオン（ＫＣｌなど）、二価カチオン（ＭｇＳＯ4など）またはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０をさらに含む。緩衝液候補のこのリストは単なる例示目的のためである。緩衝液のｐＨは、典型的には６〜８の範囲に滴定される。いくつかの実施形態において、緩衝液は、ｄＮＴＰ、ＢＳＡまたはこれらの組み合わせを含む。
【００２９】
本明細書で使用される用語「分離する、分離すること、または分離」は、標的核酸、例えば精子ＤＮＡなどを、非標的核酸および／または試料溶液の望ましくない汚染物質から単離または精製する行為または行動を示す。
【００３０】
用語「生体試料」は、核酸、詳細には精子ＤＮＡを含むさまざまな生理学的または臨床的生物源を含むことが意図される。このような供給源には、生検材料および吸引物を含む組織、尿、痰、精液、分泌物などの体液および吸引細菌細胞；ならびにＤＮＡが含まれ得る任意の他の供給源を含むが、これらに限定されない。用語「生体試料」は、本明細書において「試料」と互換的に使用される。試料は、複数のドナー由来の核酸を有し得る性的暴行の法医学試料であってもよい。性的暴行試料は、犠牲者および加害者の両方由来の細胞を含み得る。試料は、上皮細胞もしくは上皮ＤＮＡ、精子細胞もしくは精子ＤＮＡ、細菌細胞もしくはウイルス細胞汚染物質、微生物またはこれらの組み合わせを含み得る。
【００３１】
「少なくとも１種の精子細胞を含む生体試料」は、広い意味で使用され、少なくとも１種の精子細胞、部分的に溶解された精子細胞または精子細胞溶解物を含むことが意図される。精子細胞溶解物の場合、精子細胞は溶解され、その細胞抽出物が試料中に存在し得る。いくつかの実施形態において、試料は、精子頭部、精子尾部、精子クロマチン、完全精子細胞、またはこれらの組み合わせを含む。溶解された精子細胞または部分的に溶解された精子細胞は、一般に古い試料中に存在する。試料溶液は、精子細胞、精子細胞成分または溶解、懸濁、混合もしくは含有されたＤＮＡおよびＲＮＡのいずれか、もしくは両方を含む精子細胞抽出物を含む溶液である。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「溶解溶液」は、精子細胞を溶解することができる溶液を指す。一般に、精子頭部はジスルフィド結合が豊富であり、したがって伝統的な溶解に耐性がある。本明細書で使用される溶解溶液は、還元剤および界面活性剤を含む。溶解溶液は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはこれらの組み合わせを含み得る。溶解溶液は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）から選択される界面活性剤をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＳＤＳの存在は、精子細胞、上皮細胞または他の異なる細胞型の迅速な溶解を示す。
【００３３】
生体試料から精子ＤＮＡを捕捉する方法の１または複数の実施形態が提供される。これらの実施形態において、この方法は、溶解溶液と、少なくとも１種の精子細胞または精子細胞溶解物を含む生体試料とを接触させる工程を含み、精子細胞は、溶解溶液と接触して溶解される。精子細胞または精子細胞溶解物は、一般に、プロタミン−ＤＮＡ複合体を含む。精子細胞を溶解すると、プロタミン−ＤＮＡ複合体が精子細胞から抽出される。これらの実施形態において、この方法は、少なくとも１種のプロタミン特異的抗体を溶解された精子細胞（または精子細胞溶解物）に適用する工程をさらに含む。プロタミン特異的抗体は、溶解された精子細胞から抽出されたプロタミン−ＤＮＡ複合体に結合して、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成する。プロタミン特異的抗体は、本明細書において「一次抗体」と互換的に使用される。この方法は、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉する工程、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体から精子ＤＮＡを検出する工程をさらに含む。
【００３４】
図１は、細胞溶解工程、過剰溶解溶液を除去または中和する処理工程、続いて抗体を細胞溶解物に添加し、共にインキュベートして、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成する工程、その後の捕捉剤、例えば二次抗体またはビーズを用いて抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を精製する工程を包含する異なる方法を例示する。捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体は洗浄されてよく、いくつかの実施形態において、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体は繰り返し洗浄されてよい。精子ＤＮＡは、イオン交換樹脂と一緒にインキュベートすることによって捕捉剤から回収され、回収された精子ＤＮＡは増幅の準備が整う。
【００３５】
この方法のいくつかの実施形態において、プロタミン−ＤＮＡ複合体を含む少なくとも１種の精子細胞または精子細胞溶解物を含む試料に溶解溶液を添加する。上記のように、試料は、少なくとも１種の精子細胞、部分的に溶解された精子細胞、または精子細胞溶解物を含み得る。生きた精子細胞または部分的に溶解された精子細胞は、溶解溶液を用いて完全に溶解することができる。細胞を溶解溶液（または溶解試薬）と接触させて細胞が溶解されると、精子細胞から核酸（精子ＤＮＡ）が抽出される。方法の一例において、溶解溶液としては、カオトロピック物質、界面活性剤および／または他の溶解試薬が挙げられる。
【００３６】
用語「溶解溶液」は、本明細書において「溶解試薬」と互換的に使用することができる。上記のように、溶解溶液は、カオトロピック物質またはカオトロープを含み得る。カオトロピック物質の例としては、塩酸グアニジニウム、塩化グアニジニウム、グアニジニウムイソチオシアネート／チオシアネート、チオシアン酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素および／またはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。典型的なアニオン性カオトロピック系列は、カオトロピック強度の低下の順に示され、ＣＣｌ3ＣＯＯ-、ＣＮＳ-、ＣＦ3ＣＯＯ-、ＣｌＯ4-、Ｉ-、ＣＨ3ＣＯＯ-、Ｂｒ-、Ｃｌ-またはＣＨＯ2-を含む。溶解溶液は、０．１Ｍ〜１０Ｍ、または１Ｍ〜１０Ｍの濃度のカオトロピック物質を含み得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、溶解溶液はまた、十分な量の緩衝液を含む。溶解溶液に使用する緩衝液の例としては、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム−ホウ酸およびグリシン−水酸化ナトリウムが挙げられる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、溶解溶液としてはさらに、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤、および／またはこれらの任意の組み合わせも挙げることができる。非イオン性界面活性剤の例としては、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（商標））、（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ（商標）ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（ＢＲＩＪ（商標）３０）、ソルビタンモノラウレート（ｓｏｒｂｉｔａｒｉ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）（ＳＰＡＮ（商標）２０）、またはポリソルベート２０（すなわちＴＷＥＥＮ（商標）２０）、ＴＷＥＥＮ（商標）４０、ＴＷＥＥＮ（商標）６０およびＴＷＥＥＮ（商標）８０などのポリソルベートファミリー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の化学物質が挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性界面活性剤の例としては、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化ドデシルトリメチルアンモニウム、塩化テトラデシルトリメチルアンモニウムおよび塩化セチルピリジニウムが挙げられる。溶解溶液中の界面活性剤の濃度は、異なる界面活性剤の間で、および溶解すべき生体試料中の成分に応じてわずかに変化し得る。いくつかの実施形態において、界面活性剤の濃度は、約０．０１重量％〜約２０重量％の範囲である。
【００３９】
溶解溶液は、還元剤、界面活性剤またはこれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態において、溶解溶液は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはこれらの組み合わせから選択される還元剤を含む。一実施形態において、溶解溶液はＤＴＴを含む。溶解溶液は、４０ｍＭのＤＴＴを含み得る。いくつかの実施形態において、溶解溶液は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）またはラウロイルサルコシネートナトリウム（サルコシル）から選択されるイオン性界面活性剤を含む。溶解溶液は、０．５％〜２％のＳＤＳを含むことができる。溶解溶液は、０．５％〜２％のＳＬＳを含むことができる。溶解溶液は、０．５％〜２％のサルコシルを含むことができる。一実施形態において、溶解溶液は、４０ｍＭのＤＴＴ、０．５％〜２％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはこれらの組み合わせを含む。
【００４０】
精子細胞頭部はジスルフィド結合が豊富であり、それにより伝統的な溶解に耐性がある。ＳＤＳなどの界面活性剤および／またはＤＴＴなどの還元剤を含む溶解溶液は、精子細胞を迅速に溶解することができる。いくつかの実施形態において、溶解溶液中のＳＤＳの存在は、精子細胞、上皮細胞または他の異なる細胞型の迅速な溶解を示す。標準的なヒストン−ＤＮＡ複合体は、一般的にＳＤＳ処理によって破壊される（Ｓ．Ｚ  Ｂａｔｈａｉｅ，  Ａ．Ａ  Ｍｏｏｓａｖｉ−Ｍｏｖａｈｅｄｉ，  Ｂ  Ｒａｎｊｂａｒ，  Ａ．Ａ  Ｓａｂｏｕｒｙ，  Ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ１−ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ，  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８，  Ｉｓｓｕｅ  １  １  Ａｐｒｉｌ  ２００３，  Ｐａｇｅｓ  １７−２５，  ＩＳＳＮ  ０９２７−７７６５）。ＤＴＴおよびＴＣＥＰを含む溶解溶液を用いて、所望の還元剤および最適な溶解条件を決定した（図２）。ＤＴＴをＳＤＳ含有溶解溶液に添加すると、精子細胞の迅速な溶解（５分未満）を示した（図２）。しかし、精子細胞はＳＤＳを含む溶解溶液によって溶解されたが、驚くべきことに、図３に示すように、プロタミン−ＤＮＡ複合体は、同じ溶解溶液の使用により影響を受けず、これは予想外の結果である。同じ実験において、タンパク質−ＤＮＡ複合体の安定化は、典型的にはＣｈＩＰプロセスに使用される固定試薬を用いて決定された。図３は、プロタミン−ＤＮＡ複合体の免疫沈降に固定条件が必要でないという事実を確立した。図３は、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体をＳＤＳを含む緩衝液で繰り返し洗浄した後でも、プロタミン−ＤＮＡ相互作用が無傷のままであり、影響を受けないことをさらに示し、これは予想外の結果である。プロタミンとＤＮＡとの相互作用はＳＤＳ処理に十分耐えられるほど強く、このことは、抽出されたプロタミン−ＤＮＡ相互作用を妨害せずに精子細胞溶解にＳＤＳを使用する機会を提供する。
【００４１】
抗体結合および核酸増幅反応は、１または複数の阻害剤または汚染物質によって影響を受ける可能性がある。汚染物質は、細胞破片または他の細胞小器官など細胞溶解からもたらされ得るか、または汚染物質は、溶解溶液などの添加された試薬中に存在し得る。汚染物質は、下流プロセスに対して阻害効果を有すると思われ、除去または中和する必要があり得る。いくつかの実施形態において、汚染物質は洗浄によって除去される。別の実施形態において、汚染物質の影響は、試薬を添加することによって中和される。一実施形態において、界面活性剤を含む過剰の溶解溶液は、１または複数の試薬を添加することによって除去される。
【００４２】
１または複数の実施形態において、洗浄工程は、試料から溶解溶液（溶解試薬）を除去するために使用される。いくつかの実施形態において、溶解溶液はＳＤＳを含み、ＳＤＳはプロタミン−ＤＮＡ複合体に結合する抗体の下流適用に対して阻害効果を有する。ＳＤＳは、ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅反応にも干渉する。これらの実施形態において、溶解溶液のＳＤＳは、抗体結合および増幅反応を進める前に除去する必要がある。
【００４３】
いくつかの実施形態において、この方法は、精子細胞の完全な溶解後に、試料と溶解溶液との混合物から過剰溶解溶液を除去または封鎖する工程をさらに含む。これらの実施形態において、過剰溶解溶液は、プロタミン特異的抗体を試料に適用する前に除去または封鎖される。溶解溶液を試料に添加した後に混合物が形成され、本明細書において「溶解後溶液」と呼ばれる。溶解後溶液は、一般に、溶解細胞、細胞抽出物、細胞破片、過剰溶解溶液、過剰界面活性剤および他の汚染物質を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、過剰溶解溶液の溶解後溶液からの除去は、溶解後溶液中に存在する核酸のアルコール沈殿、続いて沈殿物の洗浄によって達成され得る。洗浄した沈殿核酸は、緩衝液を用いて核酸溶液に再構成することができる。核酸溶液は、プロタミン−ＤＮＡ複合体との抗体結合のためにプロタミン特異的一次抗体と一緒にインキュベートすることができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、過剰溶解溶液の界面活性剤は、溶解後溶液から封鎖される。いくつかの実施形態において、この方法は、プロタミン特異的抗体を、溶解精子細胞を含む溶解後溶液に適用する前に、細胞溶解後に封鎖剤を適用して溶解後溶液中に存在する過剰界面活性剤を封鎖する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、封鎖剤は、サイズ排除シェル、α−シクロデキストリン、サイズ排除樹脂またはこれらの組み合わせでコーティングされたリガンド活性化コアビーズを含む。サイズ排除シェルでコーティングされたリガンド活性化コアビーズの例は、Ｃａｐｔｏ（商標）コアビーズ（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）である。これらの実施形態において、溶解溶液のＳＤＳなどの界面活性剤は、Ｃａｐｔｏ（商標）コアビーズ、α−シクロデキストリン、サイズ排除樹脂またはこれらの組み合わせなどの異なる封鎖剤を用いて特異的に封鎖することができる。サイズ排除樹脂としてはセファデックスＧ−５０が挙げられ、これは、溶解後溶液から界面活性剤を封鎖するために使用することができる。過剰溶解試薬、例えばＳＤＳを封鎖した後の溶解後溶液は、本明細書において「界面活性剤非含有試料溶液」と呼ばれる。用語「界面活性剤非含有試料溶液」は、溶液から界面活性剤を実質的に除去することを意味するか、または界面活性剤（ＳＤＳ）レベルを阻害濃度未満にするのに十分な除去を意味する。図４に示すように、ＳＤＳを封鎖するためのＣａｐｔｏ（商標）コア７００ビーズの添加は、界面活性剤（ＳＤＳ）のレベルを阻害濃度未満にするために十分であった。
【００４６】
精子細胞の溶解は、精子細胞中に存在するプロタミン−ＤＮＡ複合体の抽出をもたらす。プロタミン−ＤＮＡ複合体はプロタミン特異的抗体の標的であり、続いてプロタミン−ＤＮＡ複合体から精子ＤＮＡの単離および検出が行われる。プロタミンは、正常な精子頭部凝縮およびＤＮＡ安定化を媒介する、小さなアルギニンに富む（塩基性）核タンパク質である。プロタミンは体内の他の細胞と比較してヒトの精子において独自に発現し、したがって精子細胞中に見出されるＤＮＡに関連する非常に特異的な因子とを提供する。典型的には、ヒトは、プロタミン１（ＰＲＭ１）およびプロタミン２（ＰＲＭ２）などの２以上の異なるプロタミンを有する。ヒトプロタミン１遺伝子は５１アミノ酸タンパク質をコードし、ヒトプロタミン２遺伝子は１０２アミノ酸タンパク質をコードする。ヒト精子ＤＮＡの大部分はプロタミンに結合しており、ヒストンにはわずかな割合しか結合しない。プロタミンは最終的に、精子形成の半数体（ｈａｐｌｏｉｄ）期の後期にヒストンを置換する。成熟した精子細胞において、ＤＮＡはプロタミンと複合体を形成し、これは本明細書では「プロタミン−ＤＮＡ複合体」と呼ばれる。本発明の方法の目的は、上皮細胞、他の異なる細胞型または細胞溶解物も含む界面活性剤非含有試料溶液中に存在するプロタミン−ＤＮＡ複合体から、精子ＤＮＡを捕捉および分離することである。
【００４７】
上記のように、この方法は、溶解された精子細胞を含む界面活性剤非含有試料溶液に少なくとも１種のプロタミン特異的抗体を適用する工程をさらに含む。用語「適用する」は、チューブ、スワブ、ピペット、カテーテル、注射器、導管、自動注入器を使用して、または任意の他の適用可能な方法／ツールを使用して、少なくとも１種のプロタミン特異的抗体を、溶解された精子細胞に接触または配置する工程を含む。いくつかの実施形態において、プロタミン特異的抗体を、溶解された精子細胞上に注いでもよい。
【００４８】
界面活性剤非含有試料溶液は、溶解された精子細胞を含み、この溶解された精子細胞または精子細胞溶解物は、プロタミン−ＤＮＡ複合体を含む。プロタミンは、抗原−抗体相互作用のための抗原として使用され、ここで用いられる抗体はプロタミン特異的抗体（一次抗体）である。プロタミン特異的抗体は、タンパク質「プロタミン」に対する親和性を有し、プロタミン特異的抗体とプロタミンとが接触するとプロタミンに結合する。１または複数の実施形態において、プロタミン特異的抗体は、溶解された精子細胞から抽出された「プロタミン−ＤＮＡ複合体」のプロタミンに結合する。これらの実施形態において、プロタミン特異的抗体は、「抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体」を形成する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、溶解された精子細胞およびプロタミン特異的抗体を含む界面活性剤非含有試料溶液は、最大のプロタミン−抗体結合を達成するために、特定の条件下で一定時間、例えば１時間〜５時間インキュベートする必要がある。プロタミン特異的抗体は、約４℃〜約３７℃の範囲の温度においてインキュベーションする間にプロタミン−ＤＮＡ複合体に結合することができる。プロタミン特異的抗体は、約１０分〜約４時間の範囲の時間、４℃においてインキュベーションする間にプロタミン−ＤＮＡ複合体に結合することができる。いくつかの実施形態において、プロタミン特異的抗体は、４℃において約１０分〜約３０分の範囲、約１０分〜約１時間の範囲、約１０分〜約２時間の範囲、約１０分〜約３時間の範囲の時間インキュベーションする間にプロタミン−ＤＮＡ複合体に結合することができる。
【００５０】
１または複数の実施形態において、この方法は、捕捉剤を用いることによって達成される、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉する工程をさらに含む。捕捉剤は、界面活性剤非含有試料溶液中に存在する抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉する。用語「捕捉する」には、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体と捕捉剤との物理的相互作用、または抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体と捕捉剤との化学的相互作用が含まれ得るが、これらに限定されない。捕捉剤としては、二次抗体、アガロースビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、プロテインＡ、ストレプトアビジン、セファデックスビーズ、ガラスビーズまたはこれらの組み合わせを挙げることができる。一実施形態において、捕捉剤はプロタミン特異的抗体に特異的な二次抗体であり、プロタミン特異的抗体は一次抗体として作用する。一例において、プロテインＡコンジュゲートセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体をアフィニティー精製する。この例において、プロテインＡは、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体中に存在する抗体に結合する。別の例において、ヤギ抗ウサギＩｇＧコンジュゲート磁性ビーズを使用して、ウサギ抗プロタミンＩｇＧ−プロタミン−ＤＮＡ複合体をアフィニティー精製し、ここで、ヤギ抗ウサギＩｇＧは、ウサギ抗−プロタミンＩｇＧ一次抗体に対する二次抗体として機能する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、捕捉剤は、プロタミン特異的抗体とプレカップリングされる。これらの実施形態において、抗体および捕捉剤は、抗体が精子細胞溶解物（または溶解された精子細胞）に適用される前に１つにカップリングされる。用語「カップリングする」は、捕捉剤と抗体との間の物理的付着、化学的付着、結合または架橋を指す。抗体および捕捉剤は、共有結合相互作用によってカップリングされてもよい。第一級アミン、スルフヒドリル基および炭水化物などの官能基は、抗体改変（例えば、標識、架橋または共有結合）のために一般的に利用可能である。
【００５２】
本明細書において「一次抗体」と互換的に使用されるプロタミン特異的抗体は、容易に検出され得る試薬で標識することができる。いくつかの実施形態において、試料に添加された抗体は検出可能な部分で標識され、この検出可能部分は、アフィニティータグ、色素、酵素基質、または磁性プローブを含み得るが、これらに限定されない。例えば、マレイミドまたはヨードアセチル基を有する試薬はスルフヒドリル指向性コンジュゲーションに有効である。マレイミド基で予備活性化された異なるビオチン、蛍光および酵素標識試薬が利用可能である。一例において、ビオチンコンジュゲート一次抗体は、ストレプトアビジンビーズを用いて捕捉される。例示的実施形態において、アフィニティープローブはビオチンであり、ビオチンは、比較的小さい（２４４．３ダルトン）リガンドであり、その生物学的活性の変化を最小限に抑えて多くのタンパク質および他の分子にコンジュゲートすることができる。別の実施形態において、ビオチンタグを使用して、酵素、フルオロフォアまたは他のレポーター分子にコンジュゲートさせたビオチン結合タンパク質を用いて検出を容易にすることができる。最適化されたビオチン対プローブ比は、検出システムのシグナル出力を大きく増加させることができ、検出システムに適切なシグナルを提供する。ビオチン結合プロタミン−ＤＮＡ複合体は、遠心分離または物理的分離によって試料溶液から精製することができる。別の実施形態において、抗プロタミンＩｇＧにコンジュゲートされた磁性ビーズを使用して、プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉する。磁性ビーズ結合プロタミン−ＤＮＡ複合体は、その後磁性ビーズ結合成分および非結合成分が分離される磁場下で溶液から精製される。これらの実施形態において、磁性ビーズのような捕捉剤は、抗体に予備結合される。
【００５３】
いくつかの他の実施形態において、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体の捕捉は、捕捉剤を抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を含む界面活性剤非含有試料溶液に添加する工程によって達成される。これらの実施形態において、捕捉剤はプロタミン特異的抗体に結合する。上記のように、二次抗体、アガロースビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、プロテインＡ、ストレプトアビジン、セファデックスビーズ、ガラスビーズまたはこれらの２以上の組み合わせなどの捕捉剤を、界面活性剤非含有試料溶液中に存在する一次抗体（プロタミン特異的抗体）−結合プロタミン−ＤＮＡ複合体に添加することができる。捕捉剤は、プロタミン特異的一次抗体に親和性を有し、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体に結合する。捕捉剤結合抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体は、本明細書において、「捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体」と呼ばれる。
【００５４】
別の実施形態において、通常性交後５日までの期間に収集された試料を、現在９日間まで収集することができる。これは、プロタミンに結合したＤＮＡに作用し、精子または精子の頭部を取り込まないというアッセイの性質のため、達成可能となる。男性ＤＮＡは、Ｙ染色体特異的検出ＰＣＲに基づくアッセイを用いて同様の時間枠で検出されている。
【００５５】
いくつかの他の実施形態において、プロタミン−ＤＮＡ複合体の捕捉は、プロタミン−ＤＮＡ複合体を含む界面活性剤非含有試料溶液を、側方流動ストリップまたはアフィニティーカラムなどの捕捉剤を通して流動させる工程によって達成される。これらの実施形態において、プロタミン特異的抗体は捕捉剤に結合される。結合したプロタミン特異的一次抗体を有する捕捉剤は、プロタミン−ＤＮＡ複合体に対する親和性を有し、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体に結合する。捕捉剤結合抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体は、本明細書において、「捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体」と呼ばれる。場合により、プロタミン−ＤＮＡ複合体は機械的、化学的または酵素的に剪断され、その後、側方流動ストリップまたはアフィニティーカラムのような捕捉剤を通って流動させてもよい。サイズが小さいほど多孔質マトリックス中で容易に移動するので、剪断により側方流動ストリップにおけるＤＮＡの最適な移動が促進される。一実施形態において、前記剪断は酵素的手段によって行われる。酵素的剪断は、例えば、配列特異的ＤＮＡ切断酵素が使用される場合には、制御可能で予測可能な剪断パターンをもたらす。この酵素的ＤＮＡ剪断工程は、乾燥材料としての側方流動装置の第１の試料適用ゾーンに組み込まれ、溶解工程を酵素的ＤＮＡ剪断から分離することができる。これは、側方流動装置への適用前の溶解物のプレコンディショニングを可能にする。コンディショニングされた移動相は、特定の抗プロタミン抗体または抗ヒストン抗体によって捕捉されるまで、装置に沿って輸送される。捕捉剤を通して流動させる前の剪断の例を図５に示す。図５は、機械力を用いた精子ＤＮＡの剪断結果である。超音波処理プロトコルを変更することにより、ＤＮＡを異なるサイズに切断することができる。
【００５６】
側方流動膜における乾燥材料として、第２抗体（検出抗体）を溶解物に加えることができ、この第２抗体は、ラテックスビーズ、コロイド状金、酵素などの着色ナノ粒子にカップリングさせることができる。精子もしくは上皮細胞またはその両方の存在を示す適切なシグナルが、デバイスの特定の窓または位置で発生され、したがってデバイスのコントロールとして作用し、試料中の精子細胞の存在の指標を直ちに示す。酵素結合抗体試験では、不溶性基材を固体支持体に含浸させるか、または固体支持体上に印刷することができる。
【００５７】
特定の実施形態において、前記捕捉剤が側方流動ストリップである場合、溶解溶液を生体試料と接触させる工程の後に、試料は側方流動ストリップの第１のゾーンに適用される。このような実施形態において、溶解された精子細胞に少なくとも１種のプロタミン特異的抗体を適用する工程は、前記生体試料が、前記側方流動ストリップに沿って、側方流動ストリップに結合されたプロタミン−特異的抗体を含む前記側方流動ストリップの第２のゾーンまで移動すると起こる。側方流動アッセイは当技術分野で公知であり、通常作成済みの多孔性ストリップ上で行われ、該ストリップは、流体試料を添加することによって活性化される乾燥試薬を含む、ナイロン、ニトロセルロース、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、もしくは紙のような膜、または溶融シリカであり得る。これらのタイプの装置は、例えば、妊娠、臓器不全、病原性感染および乱用薬物を確認するための診断目的に有用である。完全なプラスチックの筐体を備えていないこのような装置は、しばしば「ディップスティック」と呼ばれ、典型的には側方流動設計を使用する。側方流動アッセイは、通常、単純作業化された実験室環境において、定性的およびある程度の定量的モニタリングのために使用される。現在の用途には、生物医学、植物検疫、獣医学、飼料／食品および環境設定における病原体、薬物、ホルモンおよび代謝産物に関する試験が含まれるが、これらの試験は法医学分析には広く使用されていない。側方流動アッセイは、典型的にはオン／オフシグナルが十分であり、結果が通常１０〜２０分以内に得られるように設計される。選択性および感度は、典型的には、小型薄層クロマトグラフィー、分析物特異的抗体の使用、および潜在的にＤＮＡ／ＲＮＡ特異的配列を組み合わせる工程によって、および分析物または認識要素を標識化する工程によって達成される。
【００５８】
ＤＮＡの分子量が、図６〜８に示すように、側方流動ストリップまたはアフィニティーカラムのような捕捉剤を通って流動する能力を変化させることが、当技術分野において知られている。図６は、側面流動下で８．３〜４８．５キロベースのＤＮＡの移動を示すＤＮＡゲル電気泳動画像である図７と比較して、側方流動下で１０キロベース未満のＤＮＡの移動を示すＤＮＡゲル電気泳動画像である。さらに図８は、側方流動下で４８．５キロベースを超えるＤＮＡの移動を示すＤＮＡゲル電気泳動画像である。図６〜８は、ＤＮＡサイズに基づく流動の違いを明確に示している。
【００５９】
いくつかの実施形態において、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を洗浄して未結合物質を除去し、精子ＤＮＡを精製する。いくつかの他の実施形態において、この方法は、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体をイオン交換樹脂中でインキュベートして、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体からの精子ＤＮＡを放出させ、精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体は、イオン交換樹脂と一緒に９５℃において少なくとも１０分間インキュベートされて、複合体から核酸を放出する。一実施形態において、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体は、イオン交換樹脂と一緒に９５℃において約１５分間インキュベートされて、複合体から核酸を放出する。
【００６０】
精子ＤＮＡを捕捉した後、例えば検出プローブを用いて検出する。捕捉剤は、検出プローブを含んでいてもよく、または検出プローブは、精子ＤＮＡの精製の間、前または完了時に別々に添加してもよい。１または複数の実施形態において、検出プローブは、プロタミン特異的抗体に結合されたレポーター部分である。これらの実施形態において、レポーター部分の検出は、試料中の精子ＤＮＡの存在を示す。レポーター部分は、発色団部分、蛍光部分、リン光部分、アフィニティープローブ、磁性プローブ、常磁性プローブ、金属プローブまたはこれらの組み合わせを含み得る。
【００６１】
「検出プローブ」は、１または複数の検出方法を用いて精子ＤＮＡを検出することができる。検出プローブは、金粒子、アンチセンスオリゴマー、ピロリン酸、ホスファターゼ、ビオチン−ストレプトアビジンビーズ、抗体、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）プローブおよびルシフェラーゼを含むが、これらに限定されない。アンチセンスオリゴマーは、天然のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含み得る。オリゴヌクレオチドは、フルオレセイン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＢＩＯＤＰＹ（登録商標）などのＦＲＥＴプローブで標識することができる。いくつかの実施形態において、精子ＤＮＡは、サザンブロットによって検出することができる。捕捉され、分離された精子ＤＮＡは、比色検出法、化学的、熱的、電気的、ｐＨ、発光または蛍光に基づく検出方法によって検出することができる。
【００６２】
検出プローブは、一次検出プローブ、二次検出プローブ、またはこれらの組み合わせを含み得る。この方法は、一次検出プローブを用いて精子ＤＮＡを検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、捕捉剤は一次検出プローブを含む。一次検出プローブは、ビオチンもしくは抗体などの結合部分、ストレプトアビジン、金粒子またはこれらの組み合わせをさらに含み得る。異なる実施形態において、一次検出プローブは、異なる分子、基材に結合されてもよく、または別々に添加されてもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態において、この方法は、二次検出プローブを、既に一次検出プローブを含む試料溶液に適用する工程をさらに含む。これらの実施形態において、二次検出プローブは一次検出プローブに結合し、一次検出プローブは予め抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体に結合されている。一次検出プローブまたは二次検出プローブは、発色団部分、蛍光部分、リン光部分、アフィニティープローブ、磁性プローブ、常磁性プローブまたはこれらの組み合わせを含み得る。
【００６４】
いくつかの実施形態において、精子ＤＮＡの検出は、精子ＤＮＡの１または複数の増幅反応によって達成される。この検出方法は、増幅されたＤＮＡを分析する工程をさらに含む。増幅反応において、精子細胞試料のプロタミン−ＤＮＡ複合体から単離された精子ＤＮＡは、本明細書において鋳型ＤＮＡとして使用される。増幅された精子ＤＮＡは、下流の用途のためにさらに分析することができる。検出プロセスは、加害者を特定するために増幅されたＤＮＡの異なる法医学的分析を含むことができる。
【００６５】
１または複数の実施形態において、精子ＤＮＡは、試料中に存在する精子ＤＮＡを増幅する核酸増幅反応に供され、増幅産物またはアンプリコンを形成する。用語「増幅試薬」および「増幅試薬溶液」は、これ以下互換的に使用される。増幅試薬は、ｄＮＴＰ、オリゴマー（プライマー）、ポリメラーゼを含む酵素および増幅緩衝液の混合物を含む。いくつかの実施形態において、増幅反応混合物は、プロタミン−ＤＮＡ複合体から単離された精子ＤＮＡである鋳型核酸と接触すると、増幅緩衝液の存在下で増幅を開始する。増幅試薬はまた、改変されたヌクレオチドを含み得る。
【００６６】
精子ＤＮＡは、標準ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅させることができる。いくつかの実施形態において、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体から回収された精子ＤＮＡは、最初にｑＰＣＲを用いて定量される。いくつかの実施形態において、定量化された精子ＤＮＡは、次いで、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）分析のための多重ＰＣＲに供される。いくつかの実施形態において、増幅は、等温増幅反応によって精子ＤＮＡを増幅するために起こる。等温増幅としては、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ピンポン増幅、クロスプライミング増幅（ＣＰＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）および鎖置換増幅（ＳＤＡ）を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６７】
上記のように、試料は、少なくとも１種の精子細胞、溶解された精子細胞または精子細胞抽出物を含み、上皮細胞、体細胞、血液細胞またはこれらの組み合わせをさらに含む。試料は、精子細胞を含む生理学的または臨床的生物源から調達される生体試料であり得る。１または複数の実施形態において、試料は、生体試料、法医学試料、または生検試料から選択される。１または複数の特定の例には、スワブおよび精液試料が含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、試料は、精子細胞または精子ＤＮＡで汚染された衣服、リネン、布、革を含み得る。
【００６８】
精子核酸を捕捉する方法を実施するために必要な試薬を含むキットも提供される。一実施形態において、キットは、プロタミン特異的抗体、捕捉剤、および溶解緩衝液を含む。
【００６９】
さらに他の実施形態において、捕捉剤は、側方流動ストリップ、磁性ビーズ、アガロースビーズ、またはアフィニティーカラムであり得る。
【００７０】
特定の実施形態において、このキットは、プロタミン特異的抗体を、溶解精子細胞を含む溶解後溶液を適用する前に、細胞溶解後に溶解後溶液中に存在する過剰界面活性剤を封鎖する封鎖剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、封鎖剤は、サイズ排除シェル、α−シクロデキストリン、サイズ排除樹脂またはこれらの組み合わせでコーティングされたリガンド活性化コアビーズを含む。サイズ排除シェルでコーティングされたリガンド活性化コアビーズの例は、Ｃａｐｔｏ（商標）コアビーズである。
【００７１】
特定の実施形態において、還元剤、界面活性剤、またはこれらの組み合わせを含めることができる。さまざまな還元剤が当分野において公知である。還元剤の例としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）が挙げられる。さらに、これらまたは他の還元剤の任意の組み合わせも使用され得る。特定の実施形態において、還元剤はＤＴＴである。特定の実施形態において、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であってもよい。
【００７２】
このキットは、犯罪研究所などの法医学分析作業フローの一部で使用する場合に特に有用であると思われる。
【００７３】
以下の実施例は、特許請求される発明を実施する際に当業者に追加の指針を提供するために含まれる。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲で定義される本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７４】
精子細胞の最適な細胞溶解プロセスの決定
溶解溶液を、精子細胞または精子細胞溶解物を含む試料溶液に添加した。溶解溶液を添加し、３７℃において１時間インキュベートし、プロセスを１時間モニターした。ＣｈＩＰプロセスのための伝統的な細胞溶解は、ＥＺ−Ｚｙｍｅ溶解緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）を用いる。精子細胞頭部はジスルフィド結合が豊富であり、これによりＥＺ−Ｚｙｍｅ溶解緩衝液を用いた伝統的な溶解に耐性である。精子細胞のための適切な溶解溶液を決定するために、一連の溶解溶液を試験した。
【００７５】
ＤＴＴを含む溶解溶液およびＴＣＥＰを含む溶解溶液を使用し、溶解データを比較して、精子細胞のためのより良い溶解溶液を決定した。溶解プロセスは、プレ固定（＋Ｆｉｘ）または固定なし（−Ｆｉｘ）の状態で行った。固定は、典型的には、ホルマリンなどの試薬を用いてＣｈＩＰプロセスにおいてタンパク質−ＤＮＡ複合体を安定化させるために行う。ＥＺ−Ｚｙｍｅ溶解緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）、プレ固定条件でＤＴＴを含む溶解緩衝液、固定化条件なしのＤＴＴを含む溶解緩衝液、プレ固定条件下でＴＣＥＰを含む溶解緩衝液および固定条件なしでＴＣＥＰを含む溶解緩衝液を含む異なる溶解条件を使用した（図２に示す）。
【００７６】
効率的な溶解を、ＣｈＩＰのための伝統的な溶解と比較してすべての還元条件で観察したが、最も迅速な溶解は固定条件のないＤＴＴで達成された。ＳＤＳを含む溶解緩衝液へのＤＴＴの添加は、図２に示すように、５分未満で精子細胞の迅速な溶解を示した。迅速溶解に用いた溶解緩衝液は、４０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含んだ。
【実施例２】
【００７７】
試料溶液からのＳＤＳの封鎖
ＳＤＳを、抗体結合およびＤＮＡポリメラーゼ機能性に対するその阻害効果に起因して封鎖し、その後、抗体インキュベーションおよび結合の次のステップを進めた。通常、Ｃａｐｔｏ（商標）コアリガンドは、広範囲のｐＨおよび塩濃度にわたって、小型の（７００ｋｄａ未満の）負に荷電した分子に結合する。ＳＤＳ分子を封鎖するために、Ｃａｐｔｏ  （商標）コア７００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用し、充填床形式において有効であったことが判明した。溶解後溶液（試料および溶解溶液の混合物）をＣａｐｔｏ（商標）コア７００と１：１の比で混合した。Ｃａｐｔｏ（商標）コア７００を溶解後溶液に添加し、室温において１５分間インキュベートして、Ｃａｐｔｏ（商標）とコア７００ビーズによるＳＤＳ分子との完全な結合を確保した。ＳＤＳ分子をビーズに結合させた後、ビーズを溶解後溶液から分離した。ＳＤＳの濃度は、Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ色素（Ｓｉｇｍａ）ＳＤＳ定量アッセイ（Ｆｉｌｉｐｐｏ  Ｒｕｓｃｏｎｉ，  Ｅｄｏｕａｒｄ  Ｖａｌｔｏｎ，  Ｒｅｇｉｓ  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｅｒｉｃｋ  Ｄｕｆｏｕｒｃ，  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ−Ｖｏｌｕｍｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅｓ  ｂｙ  Ｖｉｓｉｂｌｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２９５，  Ｉｓｓｕｅ  １，  １  Ａｕｇｕｓｔ  ２００１，  Ｐａｇｅｓ  ３１−３７，  ＩＳＳＮ  ０００３−２６９７）を用いて測定した。すべての条件について、ＳＤＳを封鎖するためのＣａｐｔｏ（商標）コア７００ビーズの添加は、図４に示すように、阻害濃度未満の界面活性剤（ＳＤＳ）レベルをもたらすために十分であった。
【００７８】
この実験のために、異なる試料を調製して、Ｃａｐｔｏ（商標）コア７００などの封鎖剤の効果を決定した。対照試料は０．２５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含むＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を含み、封鎖剤Ｃａｐｔｏ（商標）コア７００は添加しなかった。３つの試験試料について、ＥＺ−Ｚｙｍｅ溶解緩衝液（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、０．２５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳおよび４０ｍＭ  ＤＴＴを含むＴＮＥ、０．２５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳおよび４０ｍＭのＴＣＥＰを含むＴＮＥの存在下で封鎖剤Ｃａｐｔｏ（商標）コア７００を用いて封鎖を行った。図４に示すように、３つの実験的溶解条件（試験試料）のそれぞれを、１％ホルマリンの存在下（＋Ｆｉｘ）またはホルマリンなし（−Ｆｉｘ）で行った。図４は、等容量のＣａｐｔｏ（商標）コア７００ビーズによる処理後、ＳＤＳ濃度が有意に低下した結果をさらに示す。封鎖後、ＳＤＳの濃度は実質的に低下し、ＤＮＡ増幅の阻害剤濃度未満に達したことが判明した。
【実施例３】
【００７９】
免疫沈降に対する固定の効果
ホルマリン固定は、いくつかのタンパク質−ＤＮＡ複合体の相互作用が比較的弱いため、従来のＣｈＩＰプロトコルの必須要素である。プロタミン−ＤＮＡ複合体の細胞溶解およびＤＮＡ封鎖の結果は、試料固定の包含または排除のいずれもプロセスに直接的な影響を及ぼさないことを示した（図２および４）。ホルマリン固定の効果は、免疫沈降または捕捉剤を用いた捕捉の間のプロタミン−ＤＮＡ複合体中のプロタミンとＤＮＡとの相互作用によって決定した。
【００８０】
免疫沈降
抗体プルダウンアッセイを、プロテインＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｂｉｏｔｉｎ  ｂｉｎｄｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＫｉｌｏｂａｓｅ  ｂｉｎｄｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施し、この実験は、固定剤の存在下または不在下で調製した試料について行った。プルダウンアッセイの免疫沈降反応からＤＮＡ収量を決定した。この実験には約１７，５００個の細胞を使用した。細胞を１％ホルマリン（＋Ｆｉｘ）で固定すするか、またはホルマリンを使用しなかった（−Ｆｉｘ）。固定化した、または固定化していない細胞を、プロテイン（ｐｒｏｔｉｅｎ）Ａ条件用に１マイクログラムのプロタミン２（ＰＲＭ２）ポリクローナル抗体（Ｂｉｏｓｓ  Ｉｎｃ、ＵＳ）と一緒に、またはＢｉｏｔｉｎ  ｂｉｎｄｅｒおよびＫｉｌｏｂａｓｅ  Ｂｉｎｄｅｒ条件用にビオチンコンジュゲートＰＲＭ２ポリクローナル抗体（Ｂｉｏｓｓ  Ｉｎｃ、ＵＳ）と一緒にインキュベートした。すべての試料を、凝集剤を含むインキュベーション緩衝液中で４℃において４時間インキュベートして、免疫沈降のための抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成させた。凝集剤を含むインキュベーション緩衝液は、０．００１％ＳＤＳ（ｓ／ｖ）、１．６７ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、０．１１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１６．７ｍＭ  ＮａＣｌ、８％デキストラン１００ｋＤａ（ｗ／ｖ）を含む。
【００８１】
磁性ビーズベースの抗体プルダウンアッセイ
三種類の官能化磁性ビーズを用いて、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉した。プロテインＡにより官能化されたビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびにストレプトアビジン、Ｂｉｏｔｉｎ  ｂｉｎｄｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＫｉｌｏｂａｓｅ  ｂｉｎｄｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により官能化された２種の異なるビーズを、ＤｙｎａＭａｇ（商標）２  Ｍａｇｎｅｔ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）磁性マイクロ遠心管スタンドを用いて製造業者の指示に従って使用した。捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体（磁性ビーズの適用による）を５回洗浄し、その後、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体からＤＮＡを回収した。捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を、０．０１％  ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）を含む緩衝液、次いで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  １５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む第２の緩衝液、次いで２５０ｍＭ  ＬｉＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１％  ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  デオキシコール酸を含む第３の緩衝液で連続的に洗浄し、続いて１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８および１ｍＭ  ＥＤＴＡでさらに２回洗浄した。次いで、捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を、１０％（ｗ／ｖ）のＣｈｅｌｅｘ  Ｒｅｓｉｎ（Ｂｉｏｒａｄ）中で９５℃に１０分間加熱して、複合体からＤＮＡを放出させた。抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体からのＤＮＡ放出は、下流増幅のために適切であり、Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ  Ｈｕｍａｎ（ＡＢＩ）およびＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ  Ｙ（ＡＢＩ）キットを用いて分析した。
【００８２】
回収された精子ＤＮＡの定量分析
回収されたＤＮＡ収量を、全ＤＮＡ用のＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｉｔ（ＡＢＩ）および男性特異的ＤＮＡ用のＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ  Ｙキット（ＡＢＩ）を用いて製造業者の指示書を使用して定量した。男性特異的精子ＤＮＡのみをこの実験のための試料として使用したので、２種の定量方法Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ  ＨｕｍａｎおよびＱｕａｎｔｉｆｉｌｉｅｒ  Ｙの使用は、同等のＤＮＡの定量をもたらした。図３の結果は、プロテインＡ、Ｂｉｏｔｉｎ  ｂｉｎｄｅｒおよびＫｉｌｏｂａｓｅ  ｂｉｎｄｅｒなどの、３種すべてのセットにおいて固定が排除された場合に、全ＤＮＡ（ヒト）および男性特異的ＤＮＡ（Ｙ）の両方の収率が高いことを示す。この実験は、プロタミン−ＤＮＡ複合体の免疫沈降のための固定を行い、精子ＤＮＡを選択的に精製したが、固定する必要がないという事実を再び確立した。
【００８３】
捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を、ＤＮＡを放出する前に、ＳＤＳを含有する緩衝液組成物で数回洗浄した。しかし、プロタミン−ＤＮＡ相互作用は無傷のままであり、ＳＤＳ処理によって影響を受けず、これは予想外の発見である。プロタミンとＤＮＡの相互作用は、ＳＤＳ処理に耐えるほど十分に強力である。これは、固定されている試料または固定されていない試料のどちらに対してもこのプロトコルを利用でき、このプロトコル使用できる試料型が増えることを示唆している。
【００８４】
抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体の定性分析：ウエスタンブロット分析
上記の実験の同じ抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体試料を、定性分析のためにウエスタンブロット（図９）およびアガロースゲル電気泳動（図１０）に供した。プルダウンアッセイを、上記のように、プロテインＡ、Ｂｉｏｔｉｎ  ＢｉｎｄｅｒおよびＫｉｌｏｂａｓｅ  Ｂｉｎｄｅｒを用いて設計した。沈降物を、固定した、および固定しなかった抗体プルダウンアッセイ後に各セットから収集し、この沈殿物をウエスタンブロット分析に供した。抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体試料を４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において分析した。ゲルからのタンパク質を、Ｔｒａｎｓ−ＢｌｏｔＳＤ  Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏｒａｄ）を製造業者の指示に従って使用してニトロセルロース膜に転写した。
【００８５】
転写後、ニトロセルロース膜を２５ｍｌのＴＢＳ（１３７ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６で供給）で室温において５分間洗浄した。ニトロセルロース膜を２５ｍｌのブロッキング緩衝液（５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ）中で室温において１時間インキュベートした。次いで膜を、１５ｍｌのＴＢＳＴ（１３７ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．６で供給）で各５分間、３回洗浄した。次いでニトロセルロース膜を１０ｍｌ  ＴＢＳＴ中ロバ抗ウサギＣｙ３標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と一緒に、穏やかに攪拌しながら４℃において一晩インキュベートした。ニトロセルロース膜を、１５ｍｌのＴＢＳＴで各５分間、３回洗浄した。次いでニトロセルロース膜を乾燥させ、その後、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ９５００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて製造者の指示に従って可視化した。図９はブロットの画像であり、固定または非固定条件下の試料について同じ強度を有するバンドを示す。プロテインＡは、抗体プルダウンアッセイについて最も高い効率を示す。この実験によっても、固定とは関係なく、すべての条件において抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体の効率的な捕捉が確立された。抗体のプルダウンは、固定工程を排除することによって影響を受けなかった。
【００８６】
抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体の定性分析：アガロースゲル電気泳動
Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量した上記のプルダウンアッセイ（図３）からの２０ｎｇのＤＮＡ試料を１％アガロースゲルに負荷して、ＤＮＡの回収を目視で確認し、ＤＮＡのサイズを評価した。図１０のＤＮＡゲルの画像は、固定せずに処理した異なるプルダウンアッセイセットから回収したＤＮＡ試料が、固定条件で処理した異なるプルダウンアッセイセットから回収したＤＮＡ試料と比較して分解されなかったことを示す。一般的に、ＤＮＡがホルマリン固定されると、ＤＮＡは分解する。プロタミン−ＤＮＡ相互作用はヒストン−ＤＮＡ相互作用よりも比較的強いので、固定工程はプロタミン−ＤＮＡ複合体の免疫沈降には必要ではないと思われる。固定工程の除去は、精製前の時間および下流の逆架橋を節約する。
【実施例４】
【００８７】
女性上皮細胞を含む試料からの精子ＤＮＡの差次的捕捉：
この実験には、精子細胞と女性上皮細胞の両方を含む試料を用いた。精子／上皮細胞混合物を含む２つの異なる試料を実験で試験したが、いずれの条件においても、３０，０００個の精子細胞が使用され、上皮細胞の数は１つの試料で１００，０００個であり、他の試料では１，０００，０００個であった。１つの対照セットでは、精子細胞のみを試験し、別の対照セットでは、上皮細胞のみを試験した。すべての試料は、前述のように、ＴＮＥ  ｗ／ＳＤＳを用いた迅速溶解、ＣａｐｔｏＣｏｒｅビーズを用いた過剰ＳＤＳ除去、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成するための凝集剤を用いた抗体インキュベーション、その後の繰り返し洗浄、Ｃｈｅｌｅｘ樹脂とのインキュベーションによるＤＮＡ放出、およびＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒキット（ＡＢＩ）を用いた、放出されたＤＮＡの増幅を含む同じワークフローにより調製した。試料が、精子および上皮細胞の両方を含むこの実験によるＤＮＡ収量の結果を、図１１に示す。
【００８８】
差次的捕捉により、使用不可能な６７：１の女性上皮細胞対精子細胞の比率（ＤＮＡ比１４２：１）を２：１に低下させることができた。ＤＮＡ鋳型比の劇的な低下は、プロファイルから女性の痕跡を差し引くことを実現可能にする。ＳＴＲプロファイルもまた、混合試料から作成した（データ非掲載）。差次的捕捉は、完全に溶解された女性上皮細胞と精子細胞との混合物から精子ＤＮＡの特異的捕捉を可能にする。
【００８９】
スワブまたは基材上の試料の直接（Ｓｉｒｅｃｔ）溶解
同じスワブから切断した複製四等分スワブ由来のＤＮＡを、スワブ切断片における直接溶解を用いる精子ＤＮＡ捕捉方法および差次的抽出法を使用して調製し、これによって、スワブ切断片上の細胞を溶解前に単離した。単離したＤＮＡを、Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ  ＨｕｍａｎおよびＱｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ  Ｙ定量キットを用いて分析し、図１２に示すＤＮＡ収量の結果を得た。スワブ材料の直接溶解を可能にする精子ＤＮＡ捕捉方法論により、より高い収率が達成される。
【００９０】
側方流動下でＤＮＡ分子量が移動を変化させる
ＤＮＡサイジングラダーをニトロセルロースからなる側方流動ストリップ上にスポットし、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液を使用して側方流動条件に供した。側方流動は、スポットしたＤＮＡサイジングラダーの起点位置からストリップの端まで、３５ｍｍのその長さにわたり生じた。側方流動の完了時に、ストリップの起点から端部までストリップの６ミリメートルの断片に切断した。各６ミリメートルの切断片をアガロースゲルのウェルに入れ、電気泳動にかけて側方流動ストリップに沿って異なるサイズのＤＮＡの位置を決定した。５００ベースペアから１０キロベースペアの範囲の分子量のＤＮＡの結果を図６に示す。８．３キロベースペアから４８．５２キロベースペアの範囲の分子量のＤＮＡの結果を図７に示す。４８．５キロベースペア超から１０キロベースペアの範囲の分子量のＤＮＡの結果を図８に示す。側方流動条件下のＤＮＡの移動は、ＤＮＡの分子量に依存して変化する
核酸の剪断
精子細胞中に存在するプロタミンＤＮＡ複合体は、酵素消化を用いたＤＮＡ剪断に耐性であるが、機械力を用いて剪断することができる。図１３は、ミクロコッカスヌクレアーゼを用いた上皮ＤＮＡおよび精子ＤＮＡのヌクレアーゼ消化の結果を示す。上皮細胞のＤＮＡはプロタミンに結合されず、ミクロコッカスヌクレアーゼにより消化されやすい。反復反応において、上皮および精子のＤＮＡを、ゼロ単位から４単位のヌクレアーゼの範囲の６つの異なるレベルのミクロコッカスヌクレアーゼで処理した。各条件を３７℃において３０分間インキュベートした。ミクロコッカスヌクレアーゼ処理したＤＮＡを、１％アガロースゲルにおいて１１０ボルトで４５分間電気泳動し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナーで可視化した。上皮細胞由来の核酸は、ヌクレアーゼ消化によって迅速に分解され、一方、精子ＤＮＡプロタミン複合体は核酸を分解から保護する。図１４は、機械力を用いて精子ＤＮＡプロタミン複合体を剪断するために、供給者のガイドラインによりＣｏｖａｒｉｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒを使用した剪断の結果を示す。ＤＮＡ分子量が側方流動下で移動するその能力を変化させ、分子量を改変する能力が重要であり得ることがいくつかの実施形態において知られている。
【００９１】
性交９日後の試料
精子ＤＮＡの捕捉は、混合物からの精子ＤＮＡの性交後９日間の時間窓での特異的捕捉を可能にする。精子ＤＮＡ捕捉法を用いた９日後の精子特異的ＤＮＡ捕捉を図１５に示す。精子ＤＮＡ捕捉は、無傷な精子頭がもはや存在しなくなった後で、混合物（ｍｉｘｅｒ）から精子ＤＮＡを分離する。このように、この結果は、この方法を用いた回収および分析における時間窓の拡大を示す。この方法は、射精後のかなりの期間、収集およびその後の分析を提供する。特定の実施形態において、射精後３日またはそれ以後に生体試料を採取し、肯定的な結果を得ることができる。これは、もはや無傷の精子細胞が存在しないが、この方法は、精子頭と比較してより長い期間存在する精子ＤＮＡを捕捉することに一部起因すると思われる。
【００９２】
本開示は典型的な実施形態で図示され説明されているが、本開示の精神から何ら逸脱することなくさまざまな修正および置換を行うことができるので、示されている詳細に限定されることは意図していない。したがって、本明細書に開示された本開示のさらなる修正および均等物は、当業者には日常的な実験を使用するだけで思いつくことができ、このようなすべての修正および均等物は、以下の特許請求の範囲で定義されている本開示の精神および範囲内であるとみなされる。
［実施態様１］
生体試料中から精子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉する方法であって、
少なくとも１種の精子細胞または精子細胞溶解物を含む生体試料を、溶解溶液と接触させ、前記生体試料をプロタミン−ＤＮＡ複合体を含む溶液へ溶解する工程；
少なくとも１種のプロタミン特異的抗体を、前記溶解された生体試料に適用し、前記プロタミン特異的抗体が前記溶解された精子細胞の前記プロタミン−ＤＮＡ複合体に結合して、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成する工程；
前記抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉する工程；ならびに
前記捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体から前記精子ＤＮＡを検出する工程、
を含む方法。
［実施態様２］
前記プロタミン特異的抗体を適用する前に、前記溶解溶液を除去または封鎖する工程をさらに含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
前記溶解溶液が、還元剤、界面活性剤またはこれらの組み合わせを含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様４］
前記溶解溶液が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはこれらの組み合わせから選択される還元剤を含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様５］
前記溶解溶液が、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）またはサルコシルから選択される界面活性剤を含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様６］
前記溶解溶液が４０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５％〜２％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）またはこれらの組み合わせを含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様７］
前記溶解された精子細胞に前記プロタミン特異的抗体を適用する前に、細胞溶解後に封鎖剤を適用して界面活性剤を封鎖する工程をさらに含む、実施態様３に記載の方法。
［実施態様８］
前記封鎖剤が、サイズ排除シェル、α−シクロデキストリン、サイズ排除樹脂またはこれらの組み合わせでコーティングされたリガンド活性化コアビーズを含む、実施態様７に記載の方法。
［実施態様９］
前記プロタミン特異的抗体が、約４℃〜約３７℃の範囲においてインキュベーションする間にプロタミン−核酸複合体に結合する、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１０］
前記プロタミン特異的抗体が、約１０分〜４時間の範囲においてインキュベーションする間に前記プロタミン−核酸複合体に結合する、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１１］
前記抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体の捕捉が、前記プロタミン特異的抗体とプレカップリングされた捕捉剤によって達成される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１２］
前記抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体の捕捉が、前記プロタミン特異的抗体に結合する捕捉剤をさらに添加することによって達成される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様１３］
前記捕捉剤が、二次抗体、アガロースビーズ、常磁性ビーズ、プロテインＡ、ストレプトアビジン、セファデックス、ガラスビーズ、セルロース、ニトロセルロース、石英、側方流動ストリップまたはこれらの組み合わせを含む、実施態様１１または１２に記載の方法。
［実施態様１４］
前記捕捉剤が側方流動ストリップであり、
実施態様１に記載の接触工程に続いて、前記生体試料を前記側方流動ストリップの第１のゾーンに適用し、ならびに
実施態様１に記載の前記適用工程が、前記生体試料が前記側方流動ストリップに沿って、結合したプロタミン特異的抗体を含む前記側方流動ストリップの第２のゾーンまで移動すると起こる、
実施態様１３に記載の方法。
［実施態様１５］
実施態様１に記載の前記適用工程の前に、前記生体試料中のＤＮＡを剪断する工程をさらに含む、実施態様１４に記載の方法。
［実施態様１６］
前記剪断工程が、機械的、化学的または酵素的手段によって行われる、実施態様１５に記載の方法。
［実施態様１７］
前記剪断工程が酵素的手段によって行われる、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］
前記側方流動ストリップの前記第１のゾーンが検出抗体を含む、実施態様１４乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１９］
前記捕捉剤が、前記プロタミン特異的抗体に特異的な二次抗体である、実施態様１２に記載の方法。
［実施態様２０］
前記捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を洗浄して、前記プロタミン−ＤＮＡ複合体を保持しながら非結合物質を除去する、実施態様１３に記載の方法。
［実施態様２１］
前記捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体をイオン交換樹脂中でインキュベートする工程をさらに含む、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２２］
前記捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を、約９５℃において少なくとも約１０分間インキュベートする、実施態様２１に記載の方法。
［実施態様２３］
レポーター部分が前記プロタミン特異的抗体にカップリングされ、前記レポーター部分の検出が前記試料中の精子ＤＮＡの存在を示す、実施態様１に記載の方法。
［実施態様２４］
前記レポーター部分が、発色団部分、蛍光部分、リン光部分、アフィニティープローブ、磁性プローブ、常磁性プローブ、金属プローブまたはこれらの組み合わせを含む、実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２５］
前記精子ＤＮＡの検出が、前記精子ＤＮＡの１または複数の増幅反応を含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様２６］
前記増幅されたＤＮＡを分析する工程をさらに含む、実施態様２５に記載の方法。
［実施態様２７］
前記生体試料が、上皮細胞、体細胞、血液細胞、またはこれらの組み合わせをさらに含む、実施態様１に記載の方法。
［実施態様２８］
前記生体試料が、精子細胞を含む法医学試料から選択される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様２９］
前記生体試料が固体基材に固定される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３０］
生体試料が射精後少なくとも３日に採取される、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３１］
生体試料から精子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉する方法であって、
プロタミン−ＤＮＡ複合体を含む少なくとも１種の精子細胞、部分的に溶解された精子細胞または精子細胞溶解物を含む生体試料を提供する工程；
溶解溶液と前記試料とを接触させて、精子細胞または部分的に溶解された精子細胞を溶解する工程；
少なくとも１種のプロタミン特異的抗体を、前記溶解された精子細胞に適用し、前記プロタミン特異的抗体が前記溶解された精子細胞の前記プロタミン−ＤＮＡ複合体に結合して、抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成する工程；
前記抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を、捕捉剤を添加することによって捕捉する工程；ならびに
前記捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体から、ＤＮＡ増幅反応により前記精子ＤＮＡを検出する工程、
を含む方法。
［実施態様３２］
前記生体試料が固体基材に固定される、実施態様３１に記載の方法。
［実施態様３３］
前記生体試料が、射精後少なくとも３日に採取される、実施態様３１に記載の方法。
［実施態様３４］
生体試料からデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を精製する方法であって、
プロタミン−ＤＮＡ複合体を含む生体試料を提供する工程；
少なくとも１種のプロタミン特異的抗体を前記プロタミン−ＤＮＡ複合体に適用して抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を形成する工程；
捕捉剤を用いて前記抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体を捕捉する工程；ならびに
前記捕捉抗体−プロタミン−ＤＮＡ複合体からＤＮＡを精製する工程、
を含む方法。
［実施態様３５］
前記生体試料が固体基材に固定される、実施態様３４に記載の方法。
［実施態様３６］
前記生体試料が射精後少なくとも３日に採取される、実施態様３４に記載の方法。
［実施態様３７］
生体試料中の精子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を捕捉するためのキットであって、
プロタミン特異的抗体；
捕捉剤；および
溶解緩衝液
を含むキット。
［実施態様３８］
前記捕捉剤が側方流動ストリップ、磁性ビーズ、アガロースビーズまたはアフィニティーカラムを含む、実施態様３７に記載のキット。
［実施態様３９］
前記捕捉剤が側方流動ストリップである、実施態様３８に記載のキット。
［実施態様４０］
前記側方流動ストリップが、生体試料の適用のための第１のゾーン、および結合したプロタミン特異的抗体を含む第２のゾーンを含む、実施態様３９に記載のキット。
［実施態様４１］
前記第１のゾーンが、前記生体試料中のＤＮＡを剪断するための酵素および／または検出抗体を含む、実施態様３９または４０に記載のキット。
［実施態様４２］
前記酵素および前記検出抗体が、存在する場合には乾燥形態である、実施態様４１に記載のキット。
［実施態様４３］
封鎖剤をさらに含む、実施態様３７に記載のキット。
［実施態様４４］
前記封鎖剤が、サイズ排除シェル、α−シクロデキストリン、サイズ排除樹脂またはこれらの組み合わせでコーティングされたリガンド活性化コアビーズを含む、実施態様４３に記載のキット。
［実施態様４５］
還元剤、界面活性剤、またはこれらの組み合わせの少なくとも１つをさらに含む、実施態様３７に記載のキット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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