(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
伝導性表面と、互いに共有結合されている少なくとも一つの酵素分子および少なくとも一つの伝導性ナノ粒子を含む複合体とを含む電極であって、前記複合体が、少なくとも一つの酵素分子を介して前記電極表面へと共有結合されており、および、前記ナノ粒子が、前記電極表面へと共有結合されていない電極。
【請求項２】
前記酵素分子が、Ｈ2Ｏ2を生成するおよび／または消費する酵素分子、特には、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）、ヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．５）、（Ｓ）−２ヒドロキシ酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．１５）、コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．６）、ガラクトースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．９）、アルコールオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．１３）、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．１１）、または、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．１６）、より特には、グルコースオキシダーゼである請求項１記載の電極。
【請求項３】
前記電極表面への酵素分子の前記共有結合が、硫黄含有官能基を介して、特には、スルフィド基またはジスルフィド基を介して起こる、および／または、ナノ粒子への酵素分子の前記共有結合が、硫黄含有官能基を介して、特には、スルフィド基またはジスルフィド基を介して起こる請求項１または２記載の電極。
【請求項４】
前記酵素分子が、前記電極表面およびナノ粒子への共有結合のために、少なくとも一つの官能基が組み込まれるように修飾されており、および、特には前記酵素分子が、アミノ末端および／または側鎖アミノ基で修飾されている請求項１〜３のいずれか１項に記載の電極。
【請求項５】
前記酵素分子が、酵素を官能基導入剤と、例えば酸素：官能基導入剤のモル比が約１：１〜約１：１０で反応させることによって修飾されている請求項４記載の電極。
【請求項６】
前記ナノ粒子が、金属ナノ粒子、特には、プラチナ、パラジウム、イリジウム、金および／または銀ナノ粒子、より特には、プラチナナノ粒子である請求項１〜５のいずれか１項に記載の電極。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、特には、約５ｎｍ〜約１５ｎｍである平均サイズを有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の電極。
【請求項８】
前記複合体が、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍである平均サイズを有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の電極。
【請求項９】
前記複合体が、酸化還元メディエーターを含まない請求項１〜８のいずれか１項に記載の電極。
【請求項１０】
前記電極表面が、金属表面、特には、金表面である請求項１〜９のいずれか１項に記載の電極。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも一つの電極を備える、分析物の濃度を測定するための電気化学的センサー。
【請求項１２】
前記酵素分子が、グルコースオキシダーゼ、特には官能基が導入されたグルコースオキシダーゼであり、および、前記分析物が、グルコースである請求項１１記載のセンサー。
【請求項１３】
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用のための請求項１１または１２記載のセンサー。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の電極を製造するための方法であって、
ａ）複合体中のナノ粒子ではなく酵素分子のみが、前記複合体中の前記ナノ粒子の伝導性表面に共有結合するための遊離の官能基を有している条件下で、少なくとも一つの酵素分子と少なくとも一つのナノ粒子との複合体を準備する工程、および
ｂ）前記複合体を、電極の伝導性表面へと共有結合させる工程であって、前記結合が前記酵素分子上の遊離の官能基を介してのみ起こる工程
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の電極または請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のセンサーを用いることを含む、媒体中で、特には、組織および／または体液中で分析物を測定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、伝導性表面を含む酵素電極であって、少なくとも一つの酵素分子を含む複合体が伝導性表面に共有結合されている酵素電極に関する。電極は、持続的な分析物モニタリング、とりわけ、酵素分子としてグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を用いる持続グルコースモニタリング（ＣＧＭ）に適している。さらに、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、分析物、例えばグルコースなどの濃度を測定するための、酵素電極を備える電気化学的センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
埋め込み可能なまたは挿入可能な電極を備える非流体センサーは、生理学的に重要な分析物、例えば患者の身体内の乳酸またはグルコースなどの測定を容易にする。多くの場合、非流体のセンサーの電極は、酵素分子が結合されている導電層でコーティングされている。酵素分子は、酸化還元反応を触媒し得、これによって、電気的に検出可能なシグナルを生成する。この種類のセンサーは、酵素的非流体センサー（ＥＮＦ、enzymatic non-fluidic）と称される。
【０００３】
グルコースの測定のためのセンサーは、例えば、分析物であるグルコースのグルコノラクトンへの変換を触媒する酵素ＧＯＤ（ＥＣ  １．１．３．４）を備える。合成の酸化還元メディエーターが存在しない場合、補助基質である酸素Ｏ2は、センサーの表面上で過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）へと変換される。生成されたＨ2Ｏ2は、触媒的にＨ2Ｏへと分解され得、グルコース濃度と相関する電流を生じる。
【０００４】
公知のセンサーはしばしば、酵素の触媒部位におけるＨ2Ｏ2の生成と電極表面上でのその分解とが空間的に分離されているという不利益点を有する。したがって、作用電極におけるＨ2Ｏ2の変換速度は非効率的である。さらに酵素層中におけるＨ2Ｏ2の延長された存在が、酵素分子を不活性化し得る。
【０００５】
特許文献１は、電極の表面に適用された、ハイドロゲルに包含された酵素分子を含むセンサーを開示している。しかしながら、ハイドロゲルに包含された酵素は、ゲルが水性溶媒との接触において膨潤するというさらなる不利益点をもつ。これは、膨潤時間全体にわたる電流測定の測定シグナルの変化を引き起こし、センサードリフトをもたらし得る。
【０００６】
他の種類のセンサーにおいて、酵素層は追加で、合成の酸化還元メディエーターを含む。センサードリフトを避けるために、酸化還元メディエーターおよび酵素は、ポリマー構造中に共有結合的に組み入れられていなければならない。しかしながら、このことは、これらの化合物の移動性がポリマー構造への組み込みに起因して制限されているために酵素からメディエーターへの非効率的な電子移動を導く。結果として、酵素上での過酸化水素の形成は、メディエーターへの電子移動と競合し、酸素依存性をもたらす。加えて、ポリマー構造の膨潤プロセスは、障害を引き起こし得る。
【０００７】
例えば特許文献２に記載されているような別の公知のセンサーは、電極表面に適用されている、ポリマー構造のバインダー、炭素粒子、酵素分子、および触媒的な酸化還元メディエーターを含む伝導性ペーストである酵素層でコーティングされている電極を備える。しかしながら、この不利益点は、安定な操作状態が達成されるまでの時間遅延であり、これはこの種類の酵素層は完全に湿潤されおよび分極されなければならないためである。さらに、ペーストベースの酵素層は、もろく、したがって、特にセンサーボディーが湾曲形状である場合に、電極表面上の広いエリアにわたって適用することができない。
【０００８】
特許文献３は、伝導性表面およびそれに結合されたマトリックスを備えた電極であって、マトリックスが少なくとも２つの種類の化合物、すなわち、少なくとも一つの種類の酵素および少なくとも一つの種類の金属ナノ粒子を含み、ここで、構成成分は、第１の結合部位を介して互いに共有結合しており、そして、マトリックスは、一または複数の同じまたは異なる第２の結合部位を介して表面に共有結合している。マトリックスは、伝導性表面上に反応性化合物の層を形成することおよび層状の伝導性表面をナノ粒子および酵素分子（これらの両方が反応性基を有する）に接触させることによって、そしてその後、マトリックスを形成するための反応性基の互いの結合を引き起こすあめに層内で化合物を電解重合することによって、表面へと結合され得る。
【０００９】
特許文献３の電極構造は、電解重合によるその製造が、金属ナノ粒子の化学的修飾を含むいくつかの工程を必要とするため複雑であるという不利益点を有している。この複雑性のため、プロセスは、再現性を欠く傾向にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６２８４１２６号明細書
【特許文献２】欧州特許第２３４８９６４号明細書
【特許文献３】国際公開第２００９／１５３７７７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、効率的な酵素電極であって、容易におよび再現性をもって製造され得る酵素電極を提供することが本発明の目的であった。この目的は、ナノ粒子と電極表面とに共有結合している酵素分子の組成物であって、しかし金属ナノ粒子は電極表面に共有結合していない組成物を提供することによって達成される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の主題は、伝導性表面と、互いに共有結合されている少なくとも一つの酵素分子および少なくとも一つの伝導性ナノ粒子を含む複合体とを含む電極であって、複合体が、少なくとも一つの酵素分子を介して電極表面へと共有結合されており、および、ナノ粒子が、電極表面へと共有結合されていない電極である。
【００１３】
本発明の電極は、少なくとも一つの酵素分子および少なくとも一つの伝導性ナノ粒子を含む複合体を用いてコーティングされている。好ましくは、複合体は、一つの酵素分子と少なくとも一つの伝導性ナノ粒子とを含む。
【００１４】
典型的には、酵素分子は、酸化還元酵素、すなわち、酸化還元反応を触媒する酵素分子である。特には、酵素は、Ｈ2Ｏ2が生成されるおよび／または消費される酸化還元を触媒する。より特には、酵素は、Ｈ2Ｏ2が例えば補助基質としてのＯ2から生成される反応を触媒する。このような酵素の具体的としては、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．４）、ヘキソースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．５）、コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．６）、ガラクトースオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．９）、アルコールオキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．１３）、（Ｓ）−２ヒドロキシ酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．１５）、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．１１）、または、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．１６）が挙げられる。特には、酵素分子は、グルコースオキシダーゼ、例えばアスペルギルス（Aspergillus）またはペニシリウム（Penicillum）由来のグルコースオキシダーゼなどである。
【００１５】
本発明にしたがい、複合体の少なくとも一つの酵素分子は、電極の伝導性表面へ、および少なくとも一つの伝導性ナノ粒子へ、両方に共有結合されている。表面への、およびナノ粒子への共有結合は、同一のまたは異なる官能基を介して起こり得る。いくつかの実施形態において、結合は、同一の官能基を介して起こる。例えば、結合は、電極の伝導性表面へおよびナノ粒子への共有結合を形成し得る硫黄含有の官能基を介して、特にはスルフィド基またはジスルフィド基を介して起こってもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態において、酵素分子は、例えばスルフィド（ＳＨ）基を含むシステイン残基またはジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を含むシステイン架橋などの、電極表面および／またはナノ粒子へと直接的に結合し得る硫黄含有側鎖を有する二またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。別の、一般的にはより好ましい実施形態において、酵素分子は、一または複数の硫黄含有の官能基、特にはスルフィド基またはジスルフィド基を組み入れることによって修飾されている。修飾は、例えばリジンおよび／またはアルギニン残基の側鎖アミノ基、特にはリジン残基の側鎖アミノ基などの、例えば酵素分子内のアミノ末端および／またはアミノ酸残基の側鎖アミノ基など、酵素分子上の第一級アミノ基に官能基を導入することを含み得る。別の実施形態において、修飾は、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基のカルボキシ末端および／または側鎖カルボキシ基に官能基を導入することを含み得る。
【００１７】
酵素分子の修飾は、例えばアミン反応性基またはカルボキシル反応性基などの、ポリペプチドを修飾することのできる基を含む官能基導入剤を使用することによって行われ得る。さらに、官能基導入剤は、例えば硫黄含有官能基などの官能基、または、例えば硫黄含有官能基などの官能基が結合され得るような基を含む。好ましくは、例えばＮＨＳエステル、イソシアネート、イソチオシアネートなどから選択されるアミン反応性基、および、例えばスルフィド基またはジスルフィド基などの硫黄含有官能基を含む試薬が使用される。官能基は、アミン反応性基に直接結合されていてもよく、または、１〜５、例えば１〜３の原子の数の鎖長を有し得るスペーサーを介してアミン反応性基に結合されていてもよい。硫黄含有官能基を含む特に好ましいアミン反応性基は、Ｌｏｍａｎｔ試薬としても知られる、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＳＰ）である。
【００１８】
官能基の導入は、酵素分子の表面に露出した側鎖が官能基化される条件下での酵素分子の官能基導入剤との反応を含み得る。酵素分子と官能基導入剤とのモル比を調整することによって、酵素分子の官能基化の程度が調整され得る。典型的には、酵素分子と官能基導入剤とのモル比は、約１：１以上、例えば、約１：１〜約１：１０、約１：１〜約１：２、約１：２〜約１：５、または約１：５〜約１：１０である。
【００１９】
電極をコーティングするために使用される複合体はまた、少なくとも一つの伝導性ナノ粒子、すなわち、伝導性表面を有するまたは伝導性材料からなるナノ粒子を含む。ナノ粒子は、例えばプラチナ、パラジウム、イリジウム、金、銀、またはそれらの任意の合金などの粒子などの金属ナノ粒子であってもよい。特には、ナノ粒子は、Ｈ2Ｏ2を触媒的に分解することができる、例えば、プラチナまたはパラジウムのナノ粒子などである。典型的には、ナノ粒子は、動的光散乱法による測定で１００ｎｍ以下の平均サイズ、例えば、１ｎｍ〜５０ｎｍ、または５ｎｍ〜１５ｎｍの平均サイズを有し得る。
【００２０】
酵素分子とナノ粒子との複合体は、例えば硫黄含有官能基、特にはスルフィド基および／またはジスルフィド基などの少なくとも一つの官能基を有する酵素分子を提供すること、および、酵素分子とナノ粒子とのあいだの共有結合が形成され得る条件下で、酵素分子をナノ粒子を反応させることによって得られ得る。ナノ粒子それ自体は電極表面と共有結合を形成することのできる官能基を含まない。反応物質のそれぞれの量は、複合体が酵素分子とナノ粒子とを、酵素分子：ナノ粒子のモル比が約１：１〜約１：３、特には約１：１〜約１：２で含むように調整され得る。
【００２１】
反応によって形成される複合体は、少なくとも一つのナノ粒子に結合されている少なくとも一つの酵素分子を含み、ここで、少なくとも一つの遊離の官能基が複合体中の酵素分子上に存在している。複合体の平均のサイズは、動的光散乱法による測定で約１０ｎｍ〜約３００ｎｍ、例えば約５０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲であり得る。
【００２２】
本発明にしたがい、上述の複合体は、電極の伝導性表面へと適用され、ここで、複合体の酵素分子上の遊離の官能基が電極表面と共有結合を形成する。
【００２３】
電極の伝導性表面は、例えば、金、プラチナ、パラジウム、イリジウム、銀、またはそれらの合金などの金属表面であってもよい。伝導性表面はまた、イリジウム−スズ酸化物表面などの金属酸化物表面またはグラファイト表面であってもよい。特には、表面は金表面である。
【００２４】
複合体は、電極表面上に酵素層を形成する。実際の適用例としては、この酵素層は、測定される分析物に拡散抵抗を与え、したがって拡散バリアとして作用するさらなるポリマー層によって被膜されていてもよい。拡散バリアは、例えば、欧州特許第２６９７３８８号明細書に記載されるような交互の親水性ブロックおよび疎水性ブロックを有するブロックコポリマーを含み得る。拡散バリアは、電極の伝導性表面の全体のエリアに実質的にわたって連続的に伸びていてもよい。拡散バリア上には、さらなる生態適合性のメンブレンが、電極上の酵素層と周囲の身体組織の細胞とのあいだの最小の距離を確立するスペーサーとして備えられてもよい。この方法は、酵素層の周囲において流体変化の過渡的な乱れの場合に、そこから分析物分子が対応する酵素層へと到達できるリザーバを有利に形成する。メタアクリレートのコポリマーから形成される好ましいスペーサーは、欧州特許第２６９９７３８８号明細書に記載されている。
【００２５】
いくつかの実施形態において、複合体は、追加で他の成分、例えば合成の酸化還元メディエーターなどを含んでいてもよい。他の一般的により好ましい実施形態において、複合体は合成の酸化還元メディエーターを含まない。さらに他の一般的により好ましい実施形態において、複合体は少なくとも一つの酵素分子および少なくとも一つのナノ粒子から、特には単一の酵素分子および少なくとも一つのナノ粒子、例えば１つまたは２つのナノ粒子などから実質的に構成されるまたは実質的に成る。
【００２６】
さらに、本発明は、上述の少なくとも一つの電極を備える、分析物の濃度を測定するための電気化学的センサーに関する。
【００２７】
本発明のセンサーは、例えば組織、皮膚または体液中などのｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で分析物の濃度を測定するのに適切である。センサーは、とりわけ、皮内または皮下の測定のために適切である。
【００２８】
分析物は、身体内で、例えば組織および／または体液内などで測定され得る任意の種類の化合物であり得る。分析物の例としては例えば、内因性の分析物、すなわち身体内で生成される化合物、または外因性の分析物、例えば身体中へと導入された分析物など、が挙げられる。
【００２９】
例えば、分析物は、糖類、脂肪酸およびアミノ酸を含む酸、ペプチド、タンパク質、塩、およびガスから選択され得る。対象となるものとしては、グルコース、尿素、グリセロール、乳酸、ピルビン酸、酸素、二酸化炭素、ナトリウム塩、および塩化物イオンである。特に対象となるものとしては、グルコース、乳酸、コレステロール、ヘキソース、ガラクトース、またはアルコールなどの、Ｈ2Ｏ2の生成下で酸化または還元され得る分析物である。
【００３０】
本発明のセンサーは、短期のまたは長期の測定に適している。センサーは、とりわけ、一または複数の分析物の、３〜１２か月であるより長期間の、または３〜１４日であるより短期間のあいだの繰り返される、例えば持続的な、モニタリングに適切である。
【００３１】
本発明のセンサーは、少なくとも一つの電極および対応する電気回路構成を備える電気化学的センサーである。より特には、センサーは、上述の複合体が共有結合される伝導性表面を備える少なくとも一つの作用電極を備える電流測定電気化学的センサーである。典型的には、センサーは、少なくとも一つの、さらなる電極、特には対電極および／または参照電極を備える。作用電極は、作用電極と参照電極とのあいだに適用され、およびポテンショスタットによって調整され得る分極電圧で測定される分析物に感受性である。測定シグナルは、対電極と作用電極とのあいだの電流として提供され得る。いくつかの実施形態において、独立した対電極がなく、および、対電極としても作用し得る偽参照電極が存在する。したがって、分析物のためのセンサーは、典型的には、少なくとも２つ、好ましくは３つの電極のセットを備える。ある特定の実施形態において、酵素分子は、作用電極の伝導性表面のみに結合されている。
【００３２】
本発明のさらなるある特定の実施形態において、酵素分子は、例えば上述の化学的に修飾されたグルコースオキシダーゼなどのグルコースオキシダーゼであり、および、分析物はグルコースである。本実施形態において、グルコースの濃度を測定するための電気化学的センサーが提供される。より特には、持続的グルコース測定のためのセンサーが提供される。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、上述の電極を製造するための方法に関し、該方法は、
ａ）複合体中の酵素分子が、電極の伝導性表面への共有結合のための遊離の官能基を有しており、かつ、複合体中のナノ粒子が、伝導性表面への共有結合のための遊離の官能基を有していない条件下で、少なくとも一つの酵素分子と少なくとも一つのナノ粒子との複合体を準備する工程、および
ｂ）電極の伝導性表面へと該複合体を共有結合させる工程であって、結合が酵素分子上の遊離の官能基を介してのみ起こる工程
を含む。
【００３４】
さらに、本発明のさらなる主題は、例えば媒体中のグルコースなどの分析物を、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、特には、被験体の特にはヒト被験者の組織中および／または体液中などで、測定するための方法であって、上述の電極または電気化学的センサーを使用することを含む方法である。代替的には、本発明の方法はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で、例えば被験体から、特にはヒト被験者から得られる体液のサンプル中などでの分析物の測定を包含する。
【００３５】
さらに、本発明は、以下の図面および実施例に照らして記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本発明による作用電極の例示的な実施態様を示す図である。
【図２】図２は、種々のモル比であるグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）およびＬｏｍａｎｔ試薬（ＤＳＰ）の反応混合物の非還元条件でのポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す図である。
【図３】図３は、動的光散乱法により測定された、ＧＯＤとプラチナナノ粒子との種々の複合体のサイズ分布を示す図である。
【図４】図４は、ＧＯＤ−Ｐｔナノ粒子複合体が結合した作用電極の３つの異なる測定からの結果を示す図である。（Ａ）：３つの電圧（０．２０Ｖ−０．３５Ｖ−０．２０Ｖ）での測定サイクルのあいだの電流。（Ｂ）：測定サイクルのあいだの３つの電圧における平均電流。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
図１には、グルコースの測定のための作用電極の例示的な実施形態が示されている。例えばＡｕ電極表面などの電極表面へ、酵素分子が、硫黄含有官能基を介して共有結合されている。さらに、酵素分子は、例えばＰｔナノ粒子などの少なくとも一つのナノ粒子へと、別の硫黄含有官能基を介して共有結合されている。
【００３８】
酵素分子は、表面に露出されている側鎖アミノ基においてＬｏｍａｎｔ試薬で修飾されており、これによって、硫黄含有官能基を形成しているグルコースオキシダーゼである。グルコースオキシダーゼは、グルコースのグルコノラクトンへの酸化を触媒し、この結果、Ｈ2Ｏ2が生成する。Ｈ2Ｏ2のＨ2Ｏへの触媒的分解は、ナノ粒子上で起こり、電子（ｅ-）の流れをもたらす。これにより電流が生成され、その強度は、グルコース濃度に相関する。
【００３９】
本発明の電極は、天然にあるメディエーターシステムＯ2／Ｈ2Ｏ2を使用している。合成の酸化還元メディエーターは存在していない。生成されたＨ2Ｏ2は、触媒的なナノ粒子の存在下でＨ2Ｏへと効率よく分解される。
【００４０】
触媒的なナノ粒子および酵素分子の作用電極への共有結合的なカップリングに起因して、分子の酵素層からの損失が避けられ得る。さらに、伝導性の金属ナノ粒子の存在に起因して、酵素層と作用電極の電気伝導体とのあいだの境界抵抗は起こらないであろう。
【００４１】
したがって、本発明の電極および該電極を備えるセンサーは、ナノ粒子と官能基が導入された酵素との複合体を電極の伝導性表面へと適用することによって容易に製造され得る、簡易で効率的な構成物を提供する。
【００４２】
実施例１：プラチナナノ粒子のグルコースオキシダーゼへのカップリング
アスペルギルス  ニガ−（Aspergillus niger）由来のグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）は３つのシステイン残基を有する。システイン残基１６４は、システイン残基２０６とシステイン架橋を形成し、そして、第３のシステイン残基５２１は、表面に露出していない。したがって、ＧＯＤは、官能性のスルフィド基で、すなわちＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社より入手可能なＬｏｍａｎｔ試薬ＤＳＰ（３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル））で生化学的に修飾された。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基は、ＧＯＤの表面に露出されている側鎖リジン基と反応し、これによって、酵素分子中に硫黄含有基が導入される。
【００４３】
スルフィド基により修飾されたＧＯＤの、Ｌｏｍａｎｔ試薬に対するＧＯＤの異なるモル比を有するいくつかのサンプルが、１：１、１：１０、１：１００、および１：２００のＧＯＤ：ＤＳＰのモル比で化合物を３０分間室温でインキュベートすることにより合成された。反応生成物は、図２に示されている非還元性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析された。
【００４４】
１：１のモル比においてすでに、ＧＯＤ分子の架橋が観察された。１：２００のモル比では、ほとんど全てのＧＯＤ分子が架橋されており、そして、高分子量の凝集体が形成された。コントロールとして、ＤＳＰ無しのＧＯＤが使用された。
【００４５】
図２に記載の全てのサンプルに、１ｍＬのナノ粒子分散液（０．５ｍｇ／ｍＬ；粒子サイズ＜１５ｎｍ）が添加され、そして、粒子のスルフィド基で修飾されたＧＯＤへの共有結合を達成するために、Ｃａｏら（Biosens. Bioelectron. 26 (2010)、87-91）にしたがって、室温にて１２時間終夜でインキュベートされた。
【００４６】
翌日、サンプルは、架橋された粒子のサイズを決定するために、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定された。結果は図３に示されている。
【００４７】
サンプルＡ３（ＧＯＤ：ＤＳＰのモル比＝１：１００）およびサンプルＡ４（ＧＯＤ：ＤＳＰのモル比＝１：２００）において、凝集体が目視で検出され得た。これらの大きな粒子は、ＤＬＳ装置の測定範囲である１０μｍを超えるサイズを有しており、そして、カットオフピークとして示されている。
【００４８】
コントロールのサンプルＡ５（修飾されていないＧＯＤ）は、２つの目立たないピークを示した。サンプルＡ１（ＧＯＤ：ＤＳＰのモル比＝１：１）およびサンプルＡ２（ＧＯＤ：ＤＳＰのモル比＝１：１０）は、コントロールのサンプルＡ５と比較して増大した粒子サイズを有しており、これは、ＧＯＤ分子とＰｔナノ粒子との複合体が得られていたことを示すものである。
【００４９】
実施例２：電極コーティング
ゴールドチップ  ＱＦＸ３１０（ＬＯＴ  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）が作用電極のためのベースとして使用された。続く測定のために、作用電極、参照電極および対電極（Ｍｅｌｉｎｅｘ  ｇｏｌｄ  ｆｉｌｍ）の３つの電極を備えるセンサーセットアップが使用された。
【００５０】
８０μＬの、実施例１で得られたサンプルＡ２の反応混合物が、作用電極のゴールドチップ上へとピペッティングされ、そして、複合体上の遊離のスルフィド基の金表面への共有結合カップリングを得るために、室温で１０分間インキュベートされた。インキュベーションの後、結合していない材料は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中への数回の浸漬によって除去された。
【００５１】
実施例３：グルコース測定
実施例２で得られたセンサーが、Ｇａｍｒｙ社製ポテンショスタット（Ｃ３  Ａｎａｌｙｓｅｎｔｅｃｈｎｉｋ  Ｍｅｕｎｃｈｅｎ）を用いて試験された。この目的のために、３つの電圧レベル（２００ｍＶ、３５０ｍＶ、２００ｍＶ）を用いたクロノアンペロメトリー測定が行われ、そこでは、生じた電流が毎回１０分間測定された。測定は、コントロールとしてのＰＢＳ溶液中、および２６ｍＭグルコース中で行われた。結果が図４に示されている。
【００５２】
０．２０Ｖのプレセット電圧においては、溶液間での顕著な差は見られなかった。０．３５Ｖでは、両方の溶液において電流の増加が見られ、ここで、２６ｍＭグルコース中での電流は、ＰＢＳ中と比較して顕著に高かった（図４Ａ）。この結果は、コーティングされた作用電極がグルコースに感受性であることを示している。測定サイクルの３つの電圧レベル（０．２０Ｖ、０．３５Ｖ、０．２０Ｖ）における測定の最後の５分間のあいだの平均電流が、図４Ｂに示されている。０．３５Ｖの電圧におけるＰＢＳおよび２６ｍＭグルコースの測定シグナルにおける顕著な差異が明確に識別可能である。顕著なセンサードリフトは、所定の電圧における測定の最初の数分のみでしか見られず、これは、センサーが短い較正時間を有していることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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