(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を調製するための方法であって、
ａ．Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドをプロピオン酸に溶解するステップと、
ｂ．ステップａ）で得られた溶液にクエン酸を加えて、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態を含む懸濁液を得るステップと、
ｃ．ステップｂで得られた懸濁液から、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を単離するステップと
を含む方法。
【請求項２】
ステップｂ）で得られた溶液に、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子をシーディングして、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態を含む懸濁液を得るステップを、ステップｂ）の後に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クエン酸は、ヘプタン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、アセトン、アセトニトリル、トルエン、および水またはそれらの混合物から選択される溶媒中のクエン酸溶液として加える、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
２００〜３００ミクロンのメジアン粒径ｘ５０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子。
【請求項５】
５〜１０ミクロンの粒径ｘ１０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子。
【請求項６】
４００〜５００ミクロンの粒径ｘ９０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子。
【請求項７】
１０〜２０ミクロンのメジアン粒径ｘ５０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子。
【請求項８】
柱状結晶形を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の結晶一次粒子。
【請求項９】
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体であって、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子が、請求項７または８に記載の一次粒子である、凝集体。
【請求項１０】
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体であって、３００〜４００ミクロンのメジアン径ｘ５０を有する、凝集体。
【請求項１１】
治療有効量のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドと、場合により１種または複数の医薬として許容される担体とを含む医薬組成物の製造における、請求項４〜８のいずれか１項に記載の粒子の使用。
【請求項１２】
請求項４〜８のいずれか１項に記載のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態の粒子と、場合により１種または複数の医薬として許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
癌の処置に使用するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
癌は、肝臓癌、乳癌、膠芽腫、前立腺癌、横紋筋肉腫、胃癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの粒子、前記粒子の作製方法、および医薬組成物における前記粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドは、特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載されている選択的および強力なＦＧＦＲ４阻害剤である。ＦＧＦＲ４によって媒介される疾患、例えば癌、特に肝臓癌などの処置に有用性が見込まれる。ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの遊離形態または医薬として許容される塩の形態の作製方法を記載している。
【０００３】
薬物開発においては、薬剤物質の特性および／または特徴の向上を目的とした新たな方法の開発が、継続的に必要とされている。例えば、薬剤物質は、取扱い易く、薬物製剤に加工し易い形態であるべきである。薬剤物質のそのような理想的特性は、規模の変更が可能で、再現性のある方法によって達成されるべきである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子、および前記粒子の作製方法を提供する。粒子は、医薬組成物の製造において使用することができ、癌の処置、予防または緩和方法において使用することができる。本明細書に記載の方法は、加工性の容易さの点で有利な特性を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの粒子の作製を可能にする。本粒子は、本明細書で提供される詳細な説明、実験部分および図面においてより詳細に示されるように、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法で得られた粒子と比較して、向上した流動特性を有する。
【０００５】
本発明の様々な実施形態が、本明細書に記載される。
【０００６】
本明細書において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を調製するための方法が提供される。方法は、
ａ．Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドをプロピオン酸に溶解するステップと、
ｂ．ステップａ）で得られた溶液にクエン酸を加えて、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態を含む懸濁液を得るステップと、
ｃ．ステップｂで得られた懸濁液から、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を単離するステップと
を含む。
【０００７】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の方法によって得ることができるＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を提供する。
【０００８】
本明細書において、２００〜３００ミクロンのメジアン粒径（ｘ５０）を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子も提供される。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、５〜１０ミクロンの粒径分布ｘ１０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を提供する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、４００〜５００ミクロンの粒径分布ｘ９０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、１０〜２０ミクロンの粒径分布ｘ５０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を提供する。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、１〜５ミクロンの粒径分布ｘ１０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を提供する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、５０〜７０ミクロンの粒径分布ｘ９０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、柱状結晶形を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の結晶一次粒子を提供する。
【００１５】
別の実施形態において、本発明は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体であって、３００〜４００ミクロンのメジアン径（ｘ５０）を有する凝集体を提供する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態と、場合により１種または複数の医薬として許容される担体とを含む医薬組成物の製造における、本明細書に記載のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子の使用に関する。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子と、場合により１種または複数の医薬として許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００１８】
別の実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、医薬として使用するための医薬組成物である。特定の実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、癌の処置に使用するための医薬組成物である。より詳細には、本明細書に記載の医薬組成物は、肝臓癌、乳癌、膠芽腫、前立腺癌、横紋筋肉腫、胃癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌から選択される適応症の処置に使用するための医薬組成物である。さらにより詳細には、肝臓癌の処置に使用するための医薬組成物である。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、対象に、本明細書に記載の治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、癌の処置方法に関する。
【００２０】
一実施形態において、本発明は、癌の処置のための医薬の製造における、本明細書に記載の医薬組成物の使用に関する。より詳細には、本明細書に記載の医薬組成物は、肝臓癌、乳癌、膠芽腫、前立腺癌、横紋筋肉腫、胃癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌から選択される適応症の処置のための医薬組成物である。さらにより詳細には、肝臓癌の処置のための医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、本発明の方法を使用して得られた粒子の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像（スケール２０ミクロン）である。画像は、Ｓｕｐｒａ４０顕微鏡を備えたＺｅｉｓｓ製のＳＥＭ装置を使用して撮影した。画像は柱状結晶形を有する一次粒子を示している。
【図２】図２は、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法を使用して得られた粒子の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）（スケール２０ミクロン）である。画像は、Ｓｕｐｒａ４０顕微鏡を備えたＺｅｉｓｓ製のＳＥＭ装置を使用して撮影した。画像は針状一次粒子の凝集塊を示している。
【図３】図３は、本発明の方法を使用して得られた粒子の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）（スケール１００ミクロン）である。画像は、Ｓｕｐｒａ４０顕微鏡を備えたＺｅｉｓｓ製のＳＥＭ装置を使用して撮影した。この図は一次粒子の凝集体を示している。凝集体において、柱状結晶形を有する一次粒子が見える。
【図４】図４は、本発明の方法を使用して得られた粒子の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）（スケール５００ミクロン）である。画像は、Ｓｕｐｒａ４０顕微鏡を備えたＺｅｉｓｓ製のＳＥＭ装置を使用して撮影した。この図は一次粒子の凝集体を示している。
【図５】図５は、本発明の方法を使用して得られた粒子のＸＲＰＤと、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法を使用して得られた粒子のＸＲＰＤとのオーバーレイを示す。オーバーレイは、本発明の粒子とＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５記載の方法を使用して得られた粒子の両方について、同じシグネチャを示している。
【図６】図６は、本発明の方法を使用して得られた粒子の粒径分布を示す。この図は、粒径の関数としての分布密度および積算分布曲線を示している。この図は、０．５〜１５０ミクロンの粒径範囲を有する一次粒子と、１５０〜８７５ミクロンの粒径範囲を有する凝集体との混合物を含有する粒子を示している。
【図７】図７は、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法を使用して得られた粒子の粒径分布を示す。図は、粒径の関数としての分布密度および積算分布曲線を示す。図は、粒子が約０．５〜３０ミクロンの粒径範囲を有することを示している。
【図８】図８は、本発明のステップａ）およびｂ）の方法で得られた粒子、つまり単離ステップの前の粒子のＳＥＭ（２００ミクロン）である。画像は、カメラＤＰ２５（シリアル番号ＳＮ８Ｋ０８７８２）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡（シリアル番号ＳＮ８Ｇ３０６３７）で撮影した。画像化に使用したソフトウェアは、ＳｔｒｅａｍＳｔａｒｔである。画像は、柱状晶癖を有する結晶粒子を示している。
【図９】図９は、実施例１および１ａに記載の本発明の粒子ならびにＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法（参照例１）を使用して得られた粒子の基本流動性エネルギーを示す。グラフは、本発明の粒子がＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法（参照例１）で得られた粒子と比較して流動に必要なエネルギーが少ないことを示しており、流動性が向上していることを提示している。
【図１０】図１０は、実施例１および１ａに記載の本発明の粒子ならびにＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法（参照例１）を使用して得られた粒子の、負荷された法線応力の関数としての圧縮率（％）を示す。グラフは、本発明の粒子が高い圧縮率（％）を有することを示しており、本発明の粒子の使用によって最終薬物製剤においてより高い薬物充填量を達成しうることを示唆している。
【図１１】図１１は、実施例１および１ａに記載の本発明の粒子ならびにＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法（参照例１）を使用して得られた粒子の、負荷された法線応力の関数としての剪断応力のプロットを示す。これにより壁面摩擦角を計算することができる。グラフは、本発明の粒子がＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法（参照例１）を使用して得られた粒子と比較して壁面摩擦角が小さいことを示しており、本発明の粒子が金属表面に対して粘着挙動がより少なく、したがって加工性が向上していることを提示している。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
溶液中の化合物の濃度で定義するとき、用語「％」は、「ｗ／ｗ％」、つまり、溶液（つまり化合物＋溶媒）の重量に対する化合物の重量を指す。
【００２３】
他に定義しない限り、複数形の用語「粒子」は、本明細書で使用するとき、粒子の塊を指す。他に定義しない限り、複数形の用語「結晶」は、本明細書で使用するとき、結晶の塊を指す。
【００２４】
用語「粒子」は、一次粒子および凝集体を包含するものとする。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「一次粒子」は、単一の実体を指す。本発明の一次粒子は、例えば、図１および８で確認することができる。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「凝集体」は、一次粒子のクラスターを指す。本明細書で使用するとき、用語「凝集体」は、一次粒子間の結合の性質について限定することを意図しておらず、例えば、用語「集合体」と交換可能に使用することができる。
【００２７】
粒径は、レーザー光回折によって測定される体積基準による積算篩下粒径分布によって決定される。例えば、メジアン粒径値（ｘ５０またはｄ５０）は、その下に試料中の粒子の５０重量％が存在する大きさである。例として、１０ミクロンのｘ５０値は、粒子の５０重量％が、１０ミクロンより小さい大きさを有することを示す。
【００２８】
同様に、ｘ１０またはｄ１０の粒径は、その下に試料中の粒子の１０重量％が存在する大きさである。
【００２９】
同様に、ｘ９０またはｄ９０の粒径は、その下に試料中の粒子の９０重量％が存在する大きさである。
【００３０】
本明細書に示される粒径は、使用する装置および方法に依存して変動を受けることが理解される。当業者はこれらの値が絶対的値ではなく、約＋／−１０％で変動しうることを理解する。
【００３１】
本明細書において、粒径は、レーザー光回折で測定される。レーザー光回折のために使用される装置は、Ｓｙｍｐａｔｅｃ  Ｈｅｌｏｓ装置である。使用する装置および測定の詳細は、実施例３および４に示される。
【００３２】
本明細書で使用するとき、略語「ミクロン」は、ミクロンに対応する。
【００３３】
本明細書で使用するとき、本発明の粒子の結晶形を指すときの用語「柱状」は、例えば図１に示す結晶形を説明するものである。「柱状」結晶形は、ファセット型三次元成長結晶である。柱状結晶形は、細帯（lath）として定義することもできる。柱状結晶形は、結晶成長が一方向性である針状結晶（または針晶（acicular crystal））と区別可能である。
【００３４】
本明細書で使用するとき、用語「医薬として許容される担体」としては、当業者にとって公知の、任意および全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、芳香剤、色素など、およびそれらの組み合わせが挙げられる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp.1289-1329参照）。任意の従来の担体は、有効成分と適合性がないものでない限り、治療組成物または医薬組成物で使用することが企図される。
【００３５】
本発明の化合物の「治療有効量」という用語は、対象の生物学的または医学的応答を誘発させる、例えば、酵素またはタンパク質活性の低下または阻害、または症状の緩和、状態の軽減、疾患進行の減速もしくは遅延、または疾患の予防などを誘発する、本発明の化合物の量を指す。１つの非制限的実施形態において、用語「治療有効量」は、対象に投与されたとき、（１）（ｉ）ＦＧＦＲ４によって媒介、もしくは（ｉｉ）ＦＧＦＲ４活性と関連、もしくは（ｉｉｉ）ＦＧＦＲ４の（正常または異常な）活性によって特徴づけられる状態、または障害もしくは疾患を少なくとも部分的に緩和、阻害、予防および／もしくは改善する、または（２）ＦＧＦＲ４の活性を減少もしくは阻害、または（３）ＦＧＦＲ４の発現を減少もしくは阻害するために有効な本発明の化合物の量を指す。他の非限定的実施形態において、用語「治療有効量」は、細胞、もしくは組織、もしくは非細胞性生物学的材料または媒体に投与されたときに、ＦＧＦＲ４の活性を少なくとも部分的に減少または阻害するために有効な本発明の化合物の量を指す。
【００３６】
本明細書で使用するとき、用語「対象」は動物を指す。典型的には、動物は哺乳類である。さらに対象は、例えば、霊長類（例えば、ヒト、雄、雌）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚、鳥類などを指す。ある特定の実施形態において、対象は霊長類である。さらに別の実施形態において、対象はヒトである。
【００３７】
本明細書で使用するとき、用語「阻害する」、「阻害」、または「阻害すること」は、所与の状態、症状、障害または疾患の減少もしくは抑制、または生物学的活性もしくは過程のベースライン活性の有意な低下を指す。
【００３８】
本明細書で使用するとき、任意の疾患または障害を「処置する」、「処置すること」、または「処置」という用語は、一実施形態において、疾患または障害を改善すること（つまり、疾患またはその少なくとも１つの臨床的症状の発生を遅延、停止または減少させること）を指す。別の実施形態において、「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、患者によって認識可能でないものも含めて少なくとも１つの身体的パラメータを緩和または改善することを指す。さらに別の実施形態において、「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、身体的に（例えば識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば身体的パラメータの安定化）またはその両方のいずれかで疾患または障害を調節することを指す。さらに別の実施形態において、「処置する」、「処置すること」、または「処置」は、疾患または障害の発生または発達または進行を防止することまたは遅延することを指す。
【００３９】
本明細書で使用するとき、対象は、その対象が前記のような処置から生物学的、医学的または生活の質的に利益を得る場合、処置を「必要とする」。
【００４０】
本明細書で使用するとき、用語「１つ（種）の（ａ）」および「１つ（種）の（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」ならびに本発明の文脈（特に特許請求の範囲の文脈）で使用される同様の用語は、本明細書で他に言及されない限りまたは内容に明確に矛盾が生じない限り、単数形および複数形のいずれも包含すると解釈される。
【００４１】
本発明は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を調製するための方法に関する。Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態は、以下の構造
【００４２】
【化１】
0006696995.tif 000002
を有する。
【００４３】
方法は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの遊離形態をプロピオン酸に溶解するステップａ）を含む。Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの遊離形態は、例えば、実施例１（ステップ１〜１４）に記載の方法によって得ることができる。プロピオン酸中のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの遊離形態の濃度は、５〜１５％（重量基準）、好ましくは５〜１５％である。一実施形態において、プロピオン酸中のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの遊離形態の濃度は、約５〜１０重量％である。一実施形態において、プロピオン酸中のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの遊離形態の濃度は、約１０〜１５重量％である。一実施形態においては約１２重量％である。一実施形態においては約１３重量％である。本方法で使用されるプロピオン酸は、好ましくはニートである。「ニート」は、プロピオン酸が少なくとも９９％純粋であることを意味する。好ましくは、プロピオン酸は、少なくとも９９．５％純粋である。典型的に、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの遊離形態をプロピオン酸に溶解するために使用する温度は、５０℃〜８０℃、好ましくは約７０℃である。完全に溶解するために必要な時間は、使用する温度に依存する。典型的には、約７０℃で必要な時間は１０〜３０分、好ましくは約２０分である。完全な溶解は、当業者によって、例えば目視により、容易に判断することができる。
【００４４】
本発明の方法のステップｂ）では、クエン酸を、ステップａ）で得られた溶液に加える。クエン酸は、固体として、溶液として、または懸濁液として加えうる。溶液または懸濁液として加えるとき、濃度は１〜５０ｗ／ｗ％で変動しうる。典型的には、クエン酸を、溶液または懸濁液として加える。クエン酸溶液のために使用される溶媒は、典型的に、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態が難溶の溶媒である。そのような溶媒は、例えば、ヘプタン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、アセトン、アセトニトリル、トルエン、水またはそれらの混合物から選択されうる。一実施形態において、クエン酸溶液／懸濁液のために使用される溶媒はアセトンである。一実施形態において、クエン酸溶液／懸濁液のために使用される溶媒は酢酸エチルである。一実施形態においては、クエン酸を、アセトン中溶液として、ステップａ）で得られた溶液に加える。一実施形態において、アセトン中のクエン酸の濃度は、１〜５０％、好ましくは２０〜３０％、より好ましくは約２３％である。別の実施形態において、アセトン中のクエン酸の濃度は、１〜１０％、好ましくは１〜５％、より好ましくは約２．５％である。
【００４５】
一実施形態においては、クエン酸を、酢酸エチル中溶液として、ステップａ）で得られた溶液に加える。一実施形態において、酢酸エチル中のクエン酸の濃度は、１〜１０％、好ましくは１〜５％、より好ましくは約１．３％である。
【００４６】
方法の間に加えるクエン酸の量は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の所望の化学量論に依存する。好ましい実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の所望の化学量論は、１：１（クエン酸：Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド）である。別の実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の所望の化学量論は、０．５：１（クエン酸：Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド）である。当業者は、所望の化学量論を得るために必要なクエン酸の量を決定することができる。必要なクエン酸の量は、一度にまたはいくつかのアリコートで加えうる。一実施形態においては、クエン酸を一度に加える。別の実施形態においては、クエン酸をいくつかのアリコートで加える。各アリコートは、形態に応じて変化させてもよく、同じであってもよい。例えば、一アリコートにおいて、クエン酸は固体形態で加えうる。別のアリコートにおいて、クエン酸は溶液として加えうる。別のアリコートにおいて、クエン酸は懸濁液として加えうる。クエン酸の各アリコートは、同じ濃度であっても、異なる濃度であってもよい。溶液または懸濁液として加えるとき、クエン酸の各アリコートについて使用される溶媒は、同じであっても異なってもよい。アリコートは、１秒から１０時間の一定期間にかけて添加してもよい。クエン酸を加える温度は、２０〜８０℃で変動しうる。好ましくは、クエン酸を加える温度は約５５℃である。クエン酸を添加すると、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態を含む懸濁液が形成される。
【００４７】
一実施形態においては、ステップｂ）で得られた懸濁液に、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態を含むシード懸濁液をシーディングする、さらなるステップがある。シード懸濁液は、本発明の方法によって得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を含む。好ましくは、シード懸濁液で使用するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子は、１：１（クエン酸：Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド）の化学量論を有する。シード懸濁液に関して、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子は、溶媒、例えばアセトンに懸濁される。シード懸濁液は、クエン酸のアリコートの添加の間に加えてもよく、または必要なクエン酸の全量を反応混合物に添加した後に加えてもよい。シード懸濁液は、典型的に、本発明の方法によって得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を、約０．００５〜５％、好ましくは０．０１〜１％含む。一実施形態において、シード懸濁液は、本発明の方法によって得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を０．５％含む。シード懸濁液の温度は、典型的に約２０℃である。
【００４８】
本発明の方法のステップｂ）で得られた懸濁液は、典型的に、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態を溶液から結晶化するために可能にする時間、撹拌される。典型的に、懸濁液は、１分から２０時間、撹拌されうる。先行のステップを２０℃より高い温度下で実施した場合には、得られた懸濁液の温度を約２０℃まで低下させてもよい。図８は、ステップｂ）の後に得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子の顕微鏡画像を示す。図８において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子は、反応媒体中に懸濁化されている。
【００４９】
本発明の方法のステップｃ）は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を、先行のステップｂ）で得られた懸濁液から単離することを含む。この単離は、典型的に、濾過、洗浄および乾燥によって行われる。したがって、さらなる実施形態において、本発明の方法のステップｃ）は、
ステップｃ１）ステップｂ）で得られた懸濁液を濾過して、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を得ることと、
ステップｃ２）濾過ステップｃ１）の後に得られた粒子を洗浄することと、
ステップｃ３）ステップｃ２）で得られた粒子を乾燥することと
を含む。
【００５０】
濾過は、標準技術および装置を使用して行いうる。例えば濾過は、ガラスフィルター／シンター（sinter）を使用して行うことができる。濾過は、真空下、例えば、５００ｍｂａｒ下に行ってもよい。濾過は室温で行ってもよい。濾過は窒素雰囲気下で行ってもよい。
【００５１】
洗浄は、単一溶媒系または複数溶媒系で行いうる。例えば、一実施形態において、使用される溶媒系は、室温でプロピオン酸とアセトンとの１：１混合物でありうる。別の実施形態において、使用される溶媒系は、室温でプロピオン酸と酢酸エチルとの１：１混合物でありうる。一実施形態において、使用される溶媒系は、室温でアセトン単独であってもよい。一実施形態において、第１の洗浄ステップが、室温でプロピオン酸とアセトンとの１：１混合物を用いて実施され、その後に第２の洗浄ステップが室温でアセトンのみを用いて実施される。一実施形態において、第１の洗浄ステップが、室温でプロピオン酸と酢酸エチルとの１：１混合物を用いて実施され、その後に第２の洗浄ステップが室温で酢酸エチルのみを用いて実施される。
【００５２】
典型的に、乾燥は、標準技術を使用して実施される。例えば、得られた粒子をオーブン内で、場合により真空下、例えば約５ｍｂａｒ下に乾燥させてもよい。乾燥は、窒素雰囲気下で行ってもよい。典型的に、乾燥は、約４０℃で実施される。
【００５３】
本発明は、一実施形態において、本明細書に記載の本発明の方法によって取得可能な粒子を包含する。
【００５４】
本発明の粒子の粒径は、実施例３に記載のレーザー光回折を使用して測定され、したがってそのように得られた体積加重粒径分布に基づく。粒径分布は、例えば図６に示されるような積算（篩下）分布曲線（Ｑ３（ｘ）％）および密度分布曲線（ｑ３ｌｇ（ｘ））によって表される。
【００５５】
したがって、一実施形態において、本発明は、図６に示される粒径分布と実質的に同じ粒径分布を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子に関する。一実施形態において、本発明は、図６に示される積算篩下分布曲線と実質的に同じ積算篩下分布曲線を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子に関する。一実施形態において、本発明は、図６に示される密度分布曲線と実質的に同じ密度分布曲線を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子に関する。
【００５６】
本発明において、ｘ１０、ｘ５０およびｘ９０値を含む粒径は、好ましくは、レーザー光回折によって測定される。
【００５７】
図６に示される粒径分布グラフで確認することができるように、本発明の方法を使用して得られた粒子は、
５〜１０ミクロンのｘ１０値、
２００〜３００ミクロンのｘ５０値、
４００〜５００ミクロンのｘ９０値
の特性値を有する、体積基準の積算篩下粒径分布を有する。
【００５８】
したがって、一実施形態において、本発明は、５〜１０ミクロンのｘ１０値を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子に関する。好ましくは、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子は、約７ミクロンのｘ１０値を有する。一実施形態において、ｘ１０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子は、４．５〜１１ミクロンのｘ１０値を有する。比較として、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５（参照例１）に記載の方法で得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態は、約１ミクロンの粒径ｘ１０またはｄ１０を有する（実施例４および図７参照）。
【００５９】
一実施形態において、本発明は、２００〜３００ミクロンのｘ５０値を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子に関する。好ましくは、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子は、約２６５ミクロンのｘ５０値を有する。一実施形態において、ｘ５０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子は、１８０〜３３０ミクロンのｘ５０値を有する。比較として、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５（参照例１）に記載の方法で得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態は、約３ミクロンのメジアン粒径（ｘ５０またはｄ５０）を有する（実施例４および図７参照）。
【００６０】
一実施形態において、本発明は、４００〜５００ミクロンのｘ９０値を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子に関する。好ましくは、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子は、約４５０ミクロンのｘ９０値を有する。一実施形態において、ｘ１０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子は、３６０〜５５０ミクロンのｘ９０値を有する。比較として、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５（参照例１）に記載の方法で得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態は、約７ミクロンの粒径ｘ９０またはｄ９０を有する（実施例４および図７参照）。
【００６１】
また図６に示されるグラフで確認することができるように、本発明の方法により得られた粒子は、０．５〜１５０ミクロンの粒径範囲を有する一次粒子と、１５０〜８７５ミクロンの粒径範囲を有する凝集体とに区別可能である。
【００６２】
したがって、一実施形態において、本発明の粒子は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子と、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子の凝集体との混合物を含む。一次粒子は、例えば篩などの、当業者に既知の方法によって凝集体から分離することができる。
【００６３】
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の本発明の方法によって得ることができる、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子に関する。
【００６４】
一実施形態において、本発明は、０．５〜１５０ミクロンの粒径範囲を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子に関する。
【００６５】
一実施形態において、本発明は、１０〜２０ミクロン、好ましくは約１５ミクロンのメジアン粒径ｘ５０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子（実施例３および図６参照）に関する。一実施形態において、ｘ５０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子は、９〜２２ミクロンのメジアン粒径ｘ５０を有する。
【００６６】
一実施形態において、本発明は、１〜５ミクロン、好ましくは約３ミクロンのｘ１０粒径を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子（実施例３および図６参照）に関する。一実施形態において、ｘ１０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子は、０．９〜５．５ミクロンのｘ１０値を有する。
【００６７】
一実施形態において、本発明は、５０〜７０ミクロン、好ましくは約６０ミクロンの粒径ｘ９０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子（実施例３および図６参照）に関する。一実施形態において、ｘ９０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子は、４５〜７７ミクロンの粒径ｘ９０を有する。
【００６８】
本発明の一次粒子とＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法を使用して得られた粒子との間の粒径の差異は、それぞれ図１および図２に示す走査電子顕微鏡画像においても確認することができる。
【００６９】
一実施形態において、本発明の一次粒子は、柱状結晶形を有する。このことは、図１および図８において確認することができる。
【００７０】
一実施形態において、本発明は、柱状結晶形を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の結晶一次粒子に関する。柱状結晶形は、例えば、図１に示される。本発明の一次粒子の結晶形は、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法を使用して得られた粒子および図２に示される粒子の結晶形とは異なっている。
【００７１】
興味深いことに、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態を生成するために本発明の方法を使用してまたはＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法を使用して得られた多形は、図５で確認することができるように、同一である。
【００７２】
また本発明は、別の態様において、本明細書に記載のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体に関する。本発明の凝集体は、図３および４で確認することができる。
【００７３】
それゆえ一実施形態において、本発明は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体であって、本明細書に記載の本発明の方法によって得ることができる、凝集体に関する。
【００７４】
別の実施形態において、本発明は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体であって、その一次粒子が１０〜２０ミクロン、好ましくは約１５ミクロンのメジアン粒径（ｘ５０またはｄ５０）を有する、凝集体に関する。一実施形態において、一次粒子のｘ５０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、本発明は、９〜２２ミクロンのメジアン粒径ｘ５０を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体に関する。凝集体自体は、３００〜４００ミクロン、好ましくは約３４０ミクロンのメジアン径（ｘ５０またはｄ５０）を有する。一実施形態において、凝集体のｘ５０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体は、２７０〜４４０ミクロンのメジアン径ｘ５０を有する。
【００７５】
別の実施形態において、本発明は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体であって、その一次粒子が１〜５ミクロン、好ましくは約３ミクロンの粒径（ｘ１０またはｄ１０）を有する、凝集体に関する。一実施形態において、一次粒子のｘ１０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、本発明は、０．９〜５．５ミクロンのｘ１０値を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体に関する。凝集体自体は、２００〜３００ミクロン、好ましくは約２３０ミクロンの大きさｘ１０またはｄ１０を有する。一実施形態において、凝集体のｘ１０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体は、１８０〜３３０ミクロンの大きさｘ１０を有する。
【００７６】
別の実施形態において、本発明は、５０〜７０ミクロン、好ましくは約６０ミクロンの粒径（ｘ９０またはｄ９０）を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体に関する。一実施形態において、一次粒子のｘ９０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、本発明は、４５〜７７ミクロンの粒径ｘ９０を有するＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体に関する。
【００７７】
凝集体自体は、４５０〜５５０ミクロン、好ましくは約４９０ミクロンの大きさｘ９０またはｄ９０を有する。一実施形態において、凝集体のｘ９０値は、＋／−１０％以内で変動しうる。したがって、一実施形態において、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体は、４０５〜６０５ミクロンの大きさｘ９０を有する。
【００７８】
理論に拘束されることを望むものではないが、凝集体は、本発明の方法のステップｂ）で得られた一次粒子の乾燥の際に形成されると考えられる。凝集体の形成は、一次粒子表面上の残留溶媒により、凝集体の形成が誘導されうるためでありうる。
【００７９】
本明細書に記載の粒子は、医薬組成物の製造において使用しうる。したがって、本発明は、一実施形態において、本明細書に記載のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子と、場合により１種または複数の医薬として許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【００８０】
一実施形態において、医薬組成物は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子と、医薬として許容されない担体とを含む。一実施形態において、医薬組成物は、治療有効量のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子と、１種または複数の医薬として許容される担体とを含む。
【００８１】
別の態様において、本発明は、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子と、医薬として許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。さらなる実施形態において、組成物は、少なくとも２種の医薬として許容される担体、例えば本明細書に記載される担体を含む。本発明の目的において、他で指定されない限り、溶媒和物および水和物は、一般に、組成物と考えられる。好ましくは医薬として許容される担体は、無菌である。医薬組成物は、特定の投与経路、例えば、経口投与、非経口投与および直腸投与などのために製剤化することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、固体形態（例えば、限定されないが、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒、粉末または坐剤）または液体形態（例えば、限定されないが、溶液、懸濁液または乳濁液）で形成することができる。医薬組成物には、従来の医薬的操作、例えば、滅菌処理を施すことができ、ならびに／または従来の不活性な希釈剤、滑沢剤もしくは緩衝剤、佐剤、例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、およびバッファーなどを含有することができる。
【００８２】
典型的には、医薬組成物は、有効成分と、
ａ）希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン、
ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコール、
ｃ）結合剤、例えばケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン、
ｄ）崩壊剤、例えばデンプン、寒天、アルギン酸、そのナトリウム塩、発泡性の混合物、ならびに
ｅ）吸収剤、着色剤、香料および甘味剤
の１種または複数とを含む、錠剤またはゼラチンカプセルである。
【００８３】
一実施形態において、医薬組成物は、有効成分のみを含むカプセルの形態である。別の実施形態において、医薬組成物は、有効成分と賦形剤とのブレンドを含むカプセルの形態である。錠剤は、当技術分野で公知の方法にしたがって、フィルムコーティングまたは腸溶コーティングされていてもよい。
【００８４】
経口投与のための適切な組成物は、有効量の本発明の化合物を、錠剤、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、分散性散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤、または溶剤もしくは固体分散体の形態で含む。経口使用のための組成物は、医薬組成物の製造のために当技術分野で公知の任意の方法で調製され、そのような組成物は、医薬として洗練された良好な風味の製剤を提供するために、甘味剤、芳香剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１種または複数の薬剤を含んでもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒で医薬として許容される賦形剤と混合された形態で有効成分を含んでいてもよい。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム、顆粒化剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチまたはアルギン酸、結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンもしくはアカシア、または滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクである。錠剤は、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させるために、したがって長期間の持続的作用を提供するために、コーティングされていなくてもまたは公知の技術によりコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの遅延材料を用いることができる。経口使用のための製剤は、有効成分を不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリンと混合させた硬ゼラチンカプセルとして、または有効成分を水または油性媒体、例えば落花生油、流動パラフィンもしくはオリーブ油と混合させた軟ゼラチンカプセルとして、提供することができる。
【００８５】
本発明の粒子は、加工性の容易さの点で有利な特性を提供する。実際、本発明の粒子の流動特性は、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法（参照例１）を使用して得られた粒子の流動特性と比較して向上している。流動特性は、粉体レオメトリにより定量することができる。粉体レオメトリにより、基本流動性エネルギー、圧縮率（％）、壁面摩擦角などの薬剤物質に関するいくつかのパラメータの測定が可能になる。図９で確認することができるように、本発明の粒子は、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法を使用して得られた粒子と比較して、少なくとも基本流動性エネルギーにおいて有意に異なっている。このことは、本発明の粒子が、加工性の点で利点をもたらすことを示唆する。また図１０で確認することができるように、圧縮率（％）が、本発明の粒子では、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法を使用して得られた粒子と比較して、増加している。このことは、薬物製剤の製造における薬物充填量を向上しうることを示唆する。
【００８６】
さらに図１１で確認することができるように、壁面摩擦角が、本発明の粒子と、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法を使用して得られた粒子とでは異なっている。このことは、粒子の表面特性が異なることを示し、本発明の粒子が、粘着挙動がより少ない（ステンレス鋼との相互作用がより少ない）ことを示唆する。このことは再び、本発明の粒子を使用するときの加工性の点における利点をもたらす。
【００８７】
本発明の粒子の使用により、薬物製剤の製造、例えばカプセル充填が容易となり、（ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法で得られた粒子の使用と比較して）収率が高くなる。さらに、本発明の粒子の使用により、薬物製剤の製造に必要な賦形剤の量が減少し、費用、時間、および処理効率において利点を提供することが可能になりうる。実際、薬剤物質が粘着性で容易に流動しない場合には、前記薬剤物質の取扱い性を向上させるために、より多くの賦形剤が必要となりうる。
【００８８】
本発明の医薬組成物は、約５０〜７０ｋｇの対象に対する単位投与量が、約１〜１０００ｍｇの有効成分、または約１〜５００ｍｇ、約１〜２５０ｍｇ、約１〜１５０ｍｇ、約０．５〜１００ｍｇ、もしくは約１〜５０ｍｇの有効成分でありうる。一実施形態においては約５０ｍｇの有効成分である。別の実施形態においては約１００ｍｇの有効成分である。別の実施形態においては約２００ｍｇの有効成分である。別の実施形態においては約３００ｍｇの有効成分である。医薬組成物の治療有効投与量は、対象の種、体重、年齢、個々の処置される状態、障害もしくは疾患またはその重症度に依存する。通常の技術を有する内科医、臨床医または獣医であれば、障害または疾患を予防、処置、または進行を阻害するために必要となる有効成分の有効量を、容易に決定することができる。
【００８９】
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの活性を、実施例２に示す。
【００９０】
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのＦＧＦＲ４阻害剤としての活性を考慮するに、本発明の医薬組成物は、ＦＧＦＲ４タンパク質の活性により媒介される状態、例えば癌、および／またはＦＧＦＲ４の阻害に応答性（特に治療的に有益な様式における意味の応答性）の状態、最も特には本明細書で下記に言及する疾患または状態、の処置に有用でありうる。
【００９１】
本発明の医薬組成物は、癌の処置に有用でありうる。特に本発明の医薬組成物は、肝臓癌、乳癌、膠芽腫、前立腺癌、横紋筋肉腫、胃癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌から選択される適応症の処置に有用でありうる。
【００９２】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、治療における、本明細書に記載のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を含む医薬組成物の使用を提供する。さらなる実施形態において、治療は、ＦＧＦＲ４の阻害によって処置されうる疾患から選択される。別の実施形態において、疾患は、上記リストから選択され、適切には肝臓癌である。
【００９３】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、治療に使用するための、本明細書に記載のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を含む医薬組成物を提供する。さらなる実施形態において、治療は、ＦＧＦＲ４の阻害によって処置されうる疾患のための治療である。別の実施形態において、疾患は、上記リストから選択され、適切には肝臓癌である。
【００９４】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の治療有効量のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を含む医薬組成物を投与することを含む、ＦＧＦＲ４の阻害により処置される疾患の処置方法を提供する。さらなる実施形態において、疾患は、上記リストから選択され、適切には肝臓癌である。
【００９５】
したがって、さらなる実施形態において、本発明は、医薬の製造のための、本明細書に記載のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子の使用を提供する。さらなる実施形態において、医薬は、ＦＧＦＲ４の阻害によって処置されうる疾患のための医薬である。別の実施形態において、疾患は、上記リストから選択され、適切には肝臓癌である。
【００９６】
本発明の医薬組成物はまた、正のＦＧＦＲ４発現によって特徴づけられる固形悪性腫瘍の処置に有用でありうる。
【００９７】
本発明の医薬組成物はまた、正のＫＬＢ（β−クロトー）発現によって特徴づけられる固形悪性腫瘍の処置に有用でありうる。
【００９８】
本発明の医薬組成物はまた、正のＦＧＦ１９発現によって特徴づけられる固形悪性腫瘍の処置に有用でありうる。
【００９９】
本発明の医薬組成物はまた、正のＦＧＦＲ４および正のＫＬＢ発現によって特徴づけられる固形悪性腫瘍の処置に有用でありうる。
【０１００】
本発明の医薬組成物はまた、正のＦＧＦＲ４および正のＦＧＦ１９発現によって特徴づけられる固形悪性腫瘍の処置に有用でありうる。
【０１０１】
本発明の医薬組成物はまた、正のＦＧＦＲ４、正のＫＬＢおよび正のＦＧＦ１９発現によって特徴づけられる固形悪性腫瘍の処置に有用でありうる。
【０１０２】
上述のＦＧＦＲ４、ＫＬＢおよび／またはＦＧＦ１９における任意の正の発現は、当業者に公知の方法、例えば、ＲＴ−ｑＰＣＲ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学によって評価することができる。
【０１０３】
［実施例］
以下の実施例は、本発明の例示を目的とするものであり、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。温度は摂氏度で示される。他に言及がない場合、全ての蒸発は、減圧下、通常、約１５ｍｍＨｇ〜１００ｍｍＨｇ（＝２０〜１３３ｍｂａｒ）で実施される。最終生成物、中間体および出発材料の構造は、標準的分析方法、例えば微量分析、分光学的特性、例えばＭＳ、ＩＲ、ＮＭＲによって確認される。使用される略語は、当技術分野で従来使用されている略語である。
【０１０４】
本発明の化合物の合成で使用される全ての出発原料、構成要素、試薬、酸、塩基、脱水剤、溶剤、および触媒は、市販されているか、または当業者に既知の有機的合成方法で製造することができる。さらに、本発明の化合物は、以下の実施例に示されるように、当業者に公知の有機合成方法によって製造することができる。
【０１０５】
【表１−１】
0006696995.tif 000003
【０１０６】
【表１−２】
0006696995.tif 000004
【０１０７】
分析の詳細
ＮＭＲ：測定は、内部標準としてトリメチルシランを使用してまたは使用せずに、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ（商標）４００（４００ＭＨｚ）、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ（商標）６００（６００ＭＨｚ）、４００ＭＨｚ  ＤＲＸ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＣｒｙｏＰｒｏｂｅ（４００ＭＨｚ）または５００ＭＨｚ  ＤＲＸ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＣｒｙｏＰｒｏｂｅ（５００ＭＨｚ）分光計で行った。化学シフト（ｄ−ｖａｌｕｅｓ）は、トリメチルシランからのダウンフィールドをｐｐｍで示し、分裂パターンスペクトルを、シングレット（ｓ）、ダブレット（ｄ）、トリプレット（ｔ）、クアトレット（ｑ）、マルチプレット、非特定またはさらなる重複シグナル（ｍ）、ブロードシグナル（ｂｒ）として設定した。溶媒を括弧内に示す。
【０１０８】
ＤＳＣ：ＤＳＣ測定は、ＤＳＣ冷凍冷却システム（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ、ＵＳＡ）を備えたＤＳＣ  Ｑ２０００（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ、ＤＥ、ＵＳＡ）を使用して行った。データは、常駐のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して数学的に処理した。温度および融解熱の較正、参照材料としてインジウムを使用して実施した。試料は、開放されたアルミニウム鍋中で分析し、窒素パージ下、１０℃／分の加熱速度で２０〜３００℃で走査した。
【０１０９】
ＵＰＬＣ−ＭＳ３：
システム：Ｗａｔｅｒｓ  ＳＱ検出器を有するＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ。
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＨＳＳ  Ｔ３  １．８μｍ  ２．１×５０ｍｍ。
流速：１．０ｍＬ／分。カラム温度：６０℃。
濃度勾配：１．４分でＢ５から９８％、Ａ＝水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ＝アセトニトリル＋０．０４％ギ酸。
【０１１０】
ＵＰＬＣ−ＭＳ６：
システム：Ｗａｔｅｒｓ  ＳＱ検出器を有するＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙウルトラパフォーマンス。
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＨＳＳ  Ｔ３  １．８μｍ  ２．１×５０ｍｍ。
流速：１．０ｍＬ／分。カラム温度：６０℃。
濃度勾配：１．４分でＢ５から９８％、Ａ＝水＋０．０５％ギ酸＋３．７５ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ＝アセトニトリル＋０．０４％ギ酸。
【０１１１】
ＥＳＩ−ＭＳ：Ｗａｔｅｒ  Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）超高速ＬＣ
【実施例１】
【０１１２】
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態（１：１）
【０１１３】
【化２】
0006696995.tif 000005
【０１１４】
ステップ１：２−（ジメトキシメチル）−１，８−ナフチリジン．
J. Org. Chem., 2004, 69(6), pp1959-1966に記載されている手順を使用した。２０リットルの四つ口丸底フラスコ中に、２−アミノピリジン−３−カルバルデヒド（１０００ｇ、８．１９ｍｏｌ）、１，１−ジメトキシプロパン−２−オン（１２５７ｇ、１０．６４ｍｏｌ）、エタノール（１０リットル）、および水（２リットル）を入れた。続いて０〜１５℃で撹拌しながら水酸化ナトリウム（４０９．８ｇ、１０．２４ｍｏｌ）の水（１０００ｍＬ）中溶液を滴下添加した。溶液を０〜２０℃で３時間撹拌し、次いで真空下に濃縮した。得られた溶液を酢酸エチル３×１２００ｍＬで抽出し、有機層を合わせた。混合物を硫酸ナトリウムで脱水し、真空下に濃縮した。残留物をヘキサン３×３００ｍＬで洗浄し、固体を濾取した。これにより標題化合物を黄色固体として得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.11 (dd, 1H), 8.53 (d, 1H), 8.50 (dd, 1H), 7.73 (d, 1H), 7.67 (dd, 1H), 5.44 (s, 1H), 3.41 (s, 6H).
【０１１５】
ステップ２：７−（ジメトキシメチル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン。
J. Org. Chem., 2004, 69(6), pp 1959-1966に記載されている手順を使用した。５リットルの圧力タンク反応器（５ａｔｍ）中に、２−（ジメトキシメチル）−１，８−ナフチリジン（２００ｇ、９７９ｍｍｏｌ）、エタノール（３リットル）、ＰｔＯ２（１２ｇ）を入れた。反応器を排気し、窒素で３回フラッシュし、続いて水素でフラッシュした。混合物を水素雰囲気下２３℃で終夜撹拌した。この反応を４回繰り返した。固体を濾別し、得られた混合物を真空下に濃縮して、標題化合物を黄色固体として得た。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.14 (d, 1H), 6.51 (d, 1H), 6.47 - 6.41 (m, 1H), 4.98 (s, 1H), 3.28 - 3.19 (m, 2H), 3.23 (s, 6H), 2.64 (t, 2H), 1.73 - 1.79 (m, 2H).
【０１１６】
ステップ３：６−ブロモ−７−（ジメトキシメチル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン。
３リットルの四つ口丸底フラスコ中に、アセトニトリル（２リットル）中の７−（ジメトキシメチル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン（１１４．６ｇ、５５０．３ｍｍｏｌ）を入れた。これに続いて２５℃で撹拌しながらＮＢＳ（１０３ｇ、５７８ｍｏｌ）を少しずつ加えた。得られた溶液を２５℃で３０分間撹拌した。得られた混合物を真空下に濃縮し、残留物をジエチルエーテル１０００ｍＬで希釈した。混合物を氷／水３×１００ｍＬで洗浄した。水相をジエチルエーテル２×１００ｍＬで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物をブライン１×１００ｍＬで洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、真空下に濃縮して、標題化合物を薄黄色固体として得た。ＬＣ−ＭＳ：（ＥＳ、ｍ／ｚ）：２８６．０３［Ｍ＋Ｈ］＋。1H-NMR: (300MHz, CDCl3) δ 1.86 - 1.94 (2H, m), 2.70 - 2.74 (2H, m), 3.9 - 3.43 (2H, m), 3.47 (6H, s), 5.23 (1H, s), 5.58 (1H, s), 7.29 (1H, s).
【０１１７】
ステップ４：２−（ジメトキシメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−３−カルバルデヒド。
アルゴン下−７８℃の６−ブロモ−７−（ジメトキシメチル）−１，２，３，４−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン（１５．０ｇ、５２．２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４００ｍＬ）中溶液に、ＭｅＬｉ（Ｅｔ２Ｏ中１．６Ｍ、３２．６ｍＬ、５２．２ｍｍｏｌ）を加え、溶液を５分間撹拌し、次いでｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中１．６Ｍ、３５．９ｍＬ、５７．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、溶液を２０分間撹拌した。ＴＨＦ（１００ｍＬ）を、反応物に−７８℃で加えた。続いて、ｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中１．６Ｍ、４９．０ｍＬ、７８ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を２０分間撹拌し、次いで再びｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中１．６Ｍ、６．５３ｍＬ、１０．４５ｍｍｏｌ）を加え、混合物を−７８℃で１０分間撹拌した。ＤＭＦ（２．１０ｍＬ、２７．２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を−７８℃で４５分間撹拌し、次いで室温に加温し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液中に注ぎ、ＤＣＭ（２回）で抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、蒸発させて、標題化合物をオレンジ色油状物として得た。（ＵＰＬＣ−ＭＳ  ３）ｔＲ０．６３分；ＥＳＩ−ＭＳ  ２３７．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１１８】
ステップ５：エチル２−（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）（メチル）アミノ）アセテート。
エチルブロモアセテート（１．２７ｍＬ、１１．４８ｍｍｏｌ）を、０℃で、ｔｅｒｔ−ブチル（２−（メチルアミノ）エチル）カルバメート（２．０ｇ、１１．４８ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（４．８１ｍＬ）およびＴＨＦ（２４ｍＬ）の混合物に加えた。室温で２４時間撹拌した後、反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液とＤＣＭとの間で分配し、ＤＣＭ（２回）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、蒸発させて、標題化合物を透明淡黄色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.20 (s, br, 1H), 4.18 (q, 2H), 3.24 (s, 2H), 3.22 - 3.16 (m, 2H), 2.65 - 2.61 (m, 2H), 2.38 (s, 3H), 1.42 (s, 9H), 1.24 (t, 3H).
【０１１９】
ステップ６：エチル２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）アセテート二塩酸塩。
濃塩酸（１０ｍＬ）を、エチル２−（（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）エチル）（メチル）アミノ）アセテート（３．０５ｇ、１１．１３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）およびＥｔＯＨ（１００ｍＬ）中溶液に室温で加えた。室温で１時間撹拌した後、反応混合物を蒸発させ、エタノール（２０ｍＬ）を加え、蒸発させ、さらにエタノール（５０ｍＬ）を加え、次いで６０℃で７０分間撹拌した。冷却した反応混合物を次いで蒸発させて、標題化合物を淡黄色ガラス状物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.58 (s, br, 3H), 4.19 (q, 2H), 4.26 - 4.15 (m, 2H), 3.44 (s, br, 2H), 3.21 (s, br, 2H), 2.88 (s, 3H), 1.21 (t, 3H).
【０１２０】
ステップ７：１−（（２−（ジメトキシメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−３−イル）メチル）−４−メチルピペラジン−２−オン。
トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３．１０ｇ、１４．６１ｍｍｏｌ）を、室温で２−（ジメトキシメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−３−カルバルデヒド（ステップ４で取得、２．３０ｇ、９．７４ｍｍｏｌ）、エチル２−（（２−アミノエチル）（メチル）アミノ）アセテート二塩酸塩（ステップ６で取得、２．６ｇ、１４．６１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（６．７５ｍＬ、４８．７ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン（２０ｍＬ）中混合物に加えた。反応混合物を室温で２１時間撹拌し、さらなるトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．６ｇ、９．７４ｍｍｏｌ）を加えた。室温でさらに４時間撹拌した後、再びさらなるトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（１．３ｇ、４．８７ｍｍｏｌ）を加え、反応物を４℃で２．５日間維持した。反応混合物を次いで室温に加温し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加え、混合物をＤＣＭ（３回）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、蒸発させた。残留物をＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）シリカカラム１２０ｇにＤＣＭ溶液として塗布し、ＤＣＭからＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨの濃度勾配で溶出する順相クロマトグラフィーにより精製した。生成物含有フラクションを合わせ、蒸発させて、標題化合物をオレンジ色泡状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.08 (s, 1H), 5.30 (s, br, 1H), 5.20 (s, 1H), 4.69 (s, 2H), 3.44 - 3.34 (m, 2H), 3.40 (s, 6H), 3.22 - 3.15 (m, 2H), 3.24 (s, 2H), 2.71 - 2.64 (m, 2H), 2.58 - 2.50 (m, 2H), 2.31 (s, 3H), 1.98 - 1.82 (m, 2H).（ＵＰＬＣ−ＭＳ  ６）ｔＲ０．３３；ＥＳＩ−ＭＳ  ３３５．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２１】
ステップ８：４−フルオロ−５−ヨードピリジン−２−アミン。
４−フルオロピリジン−２−アミン（３３６ｇ、２．５ｍｏｌ）およびＮＩＳ（７４５ｇ、２．７５ｍｏｌ）のＭｅＣＮ（９リットル）中懸濁液を、ＴＦＡ（１１４ｇ、１ｍｏｌ）で処理した。次いで反応混合物を室温で８時間撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃ（１０リットル）で希釈し、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３水溶液（２×５リットル）、ブライン（４×５リットル）で洗浄した。合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、濾過し、濃縮して、粗生成物を得た。粗生成物をＥｔＯＡｃ／ペンタン（１／１０）から再結晶化することにより精製して、標題化合物を白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.14 (d, 1H), 6.45 (s, 2H), 6.33 (d, 1H).
【０１２２】
ステップ９：６−アミノ−４−フルオロニコチノニトリル。
ＤＭＡ（８００ｍＬ）中の４−フルオロ−５−ヨードピリジン−２−アミン（ステップ８で取得、２４０ｇ、１ｍｏｌ）、シアン化亜鉛（１２５ｇ、１．０５ｍｏｌ）、亜鉛（１３ｇ、０．２ｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（２５ｇ、２５ｍｍｏｌ）およびｄｐｐｆ（５５ｇ、０．１ｍｏｌ）を脱気し、窒素下丸底フラスコ中に仕込んだ。混合物を１００℃で３時間撹拌した。反応混合物を５％ＮａＨＣＯ３（２リットル）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（４×６００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を５％ＮａＯＨ（１リットル）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、７００ｍＬに濃縮した。得られた有機相を、ＥｔＯＡｃ（１．７リットル）を用いてシリカゲルカラムに通して溶出した。合わせた有機濾液を２Ｍ  ＨＣｌ（３×８００ｍＬ）で洗浄した。水相のｐＨを飽和ＮａＨＣＯ３で１０に調節した。水相をＤＣＭ（３×５００ｍＬ）で抽出した。合わせたＤＣＭをＮａ２ＳＯ４で脱水し、濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィー（ペンタン：ＥｔＯＡｃ  １０：１から３：２で溶出）によりさらに精製し、続いてペンタン／ＥｔＯＡｃ  ３／１から再結晶化して、標題化合物を白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.40 (d, 1H), 7.40 (s, 2H), 6.34 (d, 1H).
【０１２３】
ステップ１０：ｔｅｒｔ−ブチル（４−クロロ−５−シアノピリジン−２−イル）カルバメート。
２，４−ジクロロ−５−シアノピリジン（１０ｇ、５７．８ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート（８．２ｇ、７０．５ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（０．２６ｇ、１．１ｍｍｏｌ）、Ｘａｎｔｐｈｏｓ（１．３４ｇ、２．３ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（１２ｇ、８７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）中混合物を窒素（３回）で排気した。次いで混合物を７０℃で４〜５時間加熱し、完全に転化するまでクロマトグラフィーにより監視した。反応の完了後、さらなるＴＨＦ（１００ｍＬ）を加え、混合物を７０℃でさらに１時間加熱し、次いで室温に冷却した。次いで懸濁液をセライトのパッドに通して濾過して、固体を除去した。次いで濾液を濃縮し、酢酸エチルと共沸蒸留した後、濾過して、標題化合物を得た。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 10.82 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.09 (s, 1H), 1.49 (s, 9H).
【０１２４】
ステップ１１：ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）カルバメート。
ｔｅｒｔ−ブチル（４−クロロ−５−シアノピリジン−２−イル）カルバメート（ステップ１０で取得、９．８ｇ、３８．６ｍｍｏｌ）、２−メトキシエチルアミン（５．８ｇ、７７．３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６ｇ、４６．４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（８０ｍＬ）中混合物を６５〜７０℃で２４時間加熱し、完全に転化するまでクロマトグラフィーにより監視した。次いで、溶液を室温に冷却すると、白色固体が徐々に沈殿した。次いで、１時間以内でゆっくりと水（２０ｍＬ）を加えた。懸濁液をさらに１時間撹拌し、濾過し、乾燥して、標題化合物を白色固体として得た。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 9.87 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 6.86 (s, 9H), 3.51 (t, 2H), 3.36 (t, 2H), 3.28 (s, 3H), 1.47 (s, 9H).
【０１２５】
ステップ１２：６−アミノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ニコチノニトリル。
６−アミノ−４−フルオロニコチノニトリル（ステップ９で取得、１．１０ｇ、８．０２ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（２０ｍＬ）中溶液を、２−メトキシエチルアミン（２．０７ｍＬ、２４．１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（４．２０ｍＬ、２４．１ｍｍｏｌ）で処理し、５０℃に加熱し、１５時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、濃縮した。粗製材料を順相クロマトグラフィー（シリカゲルカートリッジ２４ｇ、ヘプタン／ＥｔＯＡｃ  １００：０から０：１００）により精製した。生成物含有フラクションを濃縮し、真空下で乾燥して、標題化合物を灰白色固体として得た。
【０１２６】
６−アミノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ニコチノニトリルの代替合成を以下に概説する：
ｔｅｒｔ−ブチルＮ−｛５−シアノ−４−［（２−メトキシエチル）アミノ］ピリジン−２−イル｝カルバメート（ステップ１１で取得、７ｇ）に、３０〜３６％ＨＣｌ水溶液（４０ｍＬ）を加え、混合物を室温で３０分間撹拌し、完全に転化するまでクロマトグラフィーにより監視した。次いで溶液を２０〜３０％ＮａＯＨ溶液でｐＨ＝９〜１０に塩基性化し、濾過して、白色固体を得た。固体を酢酸エチル（１５ｍＬ）に加え、５０〜５５℃に加熱して、透明溶液を得た。次いで溶液を３〜６℃に冷却し、２〜３時間撹拌し、濾過した。次いで含水ケーキを乾燥して、標題化合物を白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.92 (s, 1H), 6.39 (s, 2H), 6.15 (t, 1H), 5.61 (s, 1H), 3.46 (t, 2H), 3.27 (s, 3H), 3.24 (q, 2H). (UPLC-MS 3) tR 0.62; ESI-MS 193.1 [M+H]+.
【０１２７】
ステップ１３：Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−（ジメトキシメチル）−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド。
６−アミノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ニコチノニトリル（ステップ１２で取得、４８１ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中溶液を、０℃で冷却したジ（１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−１−イル）メタノン（４１０ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（１．５ｍＬ）との混合物に１０分かけて滴下添加した。０℃で４５分間撹拌した後、反応混合物を室温に加温し、さらに室温で９０分後、１−（（２−（ジメトキシメチル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，８−ナフチリジン−３−イル）メチル）−４−メチルピペラジン−２−オン（ステップ７で取得、４１８ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）中溶液を加えた。反応混合物を室温で１７．５時間撹拌し、ＭｅＯＨを加えることによりクエンチし、蒸発させた。残留物をＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）シリカカラム８０ｇにＤＣＭ溶液として塗布し、ＤＣＭからＤＣＭ中２％ＭｅＯＨの濃度勾配で溶出する順相クロマトグラフィーにより精製した。生成物含有フラクションを合わせ、蒸発させて、標題化合物をオレンジ色泡状物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.50 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 6.93 (t, 1H), 5.45 (s, 1H), 4.65 (s, 2H), 3.94 - 3.89 (m, 2H), 3.54 - 3.50 (m, 2H), 3.40 - 3.35 (m, 2H), 3.38 (s, 6H), 3.29 (s, 3H), 3.20 - 3.16 (m, 2H), 3.05 (s, 2H), 2.86 - 2.80 (m, 2H), 2.61 - 2.55 (m, 2H), 2.22 (s, 3H), 1.94 - 1.88 (m, 2H).（ＵＰＬＣ−ＭＳ６）ｔＲ０．７２；ＥＳＩ−ＭＳ  ５５３．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２８】
ステップ１４：Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド
濃塩酸（０．４０ｍＬ）を、室温でＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−（ジメトキシメチル）−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド（ステップ１３で取得、４７０ｍｇ、０．８０８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）および水（１ｍＬ）中溶液に加えた。室温で３時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加え、混合物をＤＣＭ（３回）で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で脱水し、蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃ（６ｍＬ）およびペンタン（６ｍＬ）と共に超音波処理し、次いで濾過した。次いで、得られた白色固体をＤＣＭ（６ｍＬ）に溶解し、ＥｔＯＡｃ（３ｍＬ）を加え、溶液を加温し、密封し、室温で２時間静置した。濾過し、乾燥して、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドを白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.43 (s, 1H), 10.06 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.49 (s, 1H), 7.47 (s, 1H), 6.96 (t, br, 1H), 4.86 (s, 2H), 3.96 - 3.90 (m, 2H), 3.52 - 3.46 (m, 2H), 3.39 - 3.33 (m, 2H), 3.30 - 3.21 (m, 2H), 3.37 (s, 3H), 3.02 (s, 2H), 2.93 - 2.86 (m, 2H), 2.61 - 2.56 (m, 2H), 2.21 (s, 3H), 1.95 - 1.85 (m, 2H).（ＵＰＬＣ−ＭＳ  ６）ｔＲ０．７０；ＥＳＩ−ＭＳ  ５０７．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１２９】
ステップ１５：Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態（１：１）。
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド（ステップ１４で取得、４ｇ、７．８９６ｍｍｏｌ）を、プロピオン酸（２９．３ｇ、２９．６０ｍＬ）中７０℃で、溶解が完全になるまで（２０分間）撹拌した。溶液を５５℃に冷却し、クエン酸のアセトン中溶液（２３％ｗ／ｗ）をそれに加えた。別個に、アセトン（０．２ｇ、０．２５２ｍＬ）をＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態（０．０１８５ｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）に加えることによって、シード懸濁液を調製した。シード懸濁液を５０℃で溶液に加え、得られた懸濁液を５０℃で４０分間撹拌した。さらにクエン酸のアセトン中溶液（２６．６ｇ、２．５１％ｗ／ｗ、３３．６３ｍＬ）を反応物に３８０分かけて加えた。得られた懸濁液をさらに１２０分間撹拌し、撹拌しながら４時間かけて２０℃に冷却した。懸濁液をさらに１２時間撹拌した後、真空下に懸濁液を濾過し、得られた固体を、プロピオン酸：アセトン溶液（１：１、７ｇ、７．９６ｍＬ）を用いて室温で洗浄した。固体を、アセトン（７ｇ、８．８５ｍＬ）を用いて室温でさらに洗浄した。得られた固体をオーブン内で４０℃および５ｍｂａｒで乾燥させ、標題化合物を薄オレンジ色固体（５．２ｇ、７．４４３ｍｍｏｌ）として得た（ｍｗ６９８．７０）、ｍｐ（ＤＳＣ）１６８．８℃（開始）。
【０１３０】
ＸＲＰＤ分析は、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５（参照例１）に記載の方法で得られた粒子と同じパターンを示した−図５参照。
【０１３１】
実施例１ａ
ステップ１〜１４は、実施例１に記載の通りに実施した。
【０１３２】
ステップ１５ａ：Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態（１：１）。
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド（ステップ１４で取得、５ｇ、９．９３０ｍｍｏｌ）を、プロピオン酸（３３．５ｇ、３３．８４ｍＬ）中６０℃で撹拌した。Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドが溶解したら、無水クエン酸粉末（０．１９ｇ、０．９８８９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた懸濁液を７０℃に加熱し、５分間超音波処理し、確実に完全溶解した。得られた溶液を５０℃に冷却し、クエン酸の酢酸エチル中溶液（３．７ｇ、酢酸エチル中１．３％クエン酸）を２０分間かけて加えた。Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態（０．０２ｇ）のシードを溶液に加え、懸濁液を１５分間熟成した。酢酸エチル中クエン酸の別のアリコート（１２８ｇ、酢酸エチル中１．３％クエン酸）を１１．８５時間かけて懸濁液に加えた。懸濁液を４時間にわたり撹拌した。次いで懸濁液を真空下（５００ｍｂａｒ）に濾過し、得られた固体を、最初にプロピオン酸：酢酸エチル溶液（１：１、７ｇ、７．４４ｍＬ）を用いて室温で洗浄し、次いで酢酸エチル（１２ｇ、１３．３８ｍＬ）を用いて室温で洗浄した。得られた固体をオーブン内で４０℃および５ｍｂａｒで乾燥させ、標題化合物を薄オレンジ色固体（６．３ｇ、９．０７４ｍｍｏｌ）として得た。
【０１３３】
ＸＲＰＤ分析は、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５（参照例１）に記載の方法で得られた粒子と同じパターンを示した−図５参照。
【０１３４】
参照例１（ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載）  −  Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態（１：１）
【０１３５】
ステップ１〜１４は、実施例１に記載の通りに実施した。
【０１３６】
参照ステップ１５  −  Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態（１：１）
クエン酸（９６．９ｍｇ）のアセトン（５ｍＬ）中溶液を、室温で調製した（０．１Ｍ）。次いで０．１Ｍのクエン酸のアセトン中溶液の一部（２ｍＬ）を、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド（１００ｍｇ）のアセトン（４ｍＬ）中懸濁液に加え、混合物を１分間超音波処理し、撹拌しながら５５℃で２時間加熱した後、ゆっくりと室温に冷却した。次いで白色固体を濾取し、アセトン（２ｍＬ）で２回洗浄し、真空下に４０℃で１８時間乾燥させて、標題の塩を得た。
【０１３７】
代替として、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド（６．５ｇ、１２．８３ｍｍｏｌ）を５００ｍｌの４−フラスコ反応器に入れた。氷酢酸４９ｍＬを加え、透明混合物が得られるまで得られた懸濁液を２３℃で撹拌した。分離フラスコ中、無水２−ヒドロキシプロパン−１，２，３−トリカルボン酸（２．５９ｇ、１３．４７ｍｍｏｌ、１．０５当量）を、透明な溶液が得られるまで５０℃で氷酢酸４９ｍＬに溶解した。次いでこの溶液を、予め調製したＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミド溶液に２３℃で加えた。この混合物を２３℃で３０分間撹拌し、次いで７５℃に加温した酢酸エチル１９２ｍＬに１時間かけて滴下添加した。添加の間温度を維持した。添加終了時点で、混合物の温度を２３℃にゆっくり冷却し、穏やかに撹拌しながらこの温度で１６時間置いた。懸濁液を５〜１０℃に冷却し、濾過した。ケーキを酢酸エチル１５ｍＬおよびアセトン１５ｍＬで洗浄した。含水ケーキ（約８．５ｇ）を、乾燥アセトン１９２ｍＬを含む５００ｍＬフラスコ中に移した。得られた懸濁液を２４時間還流させた。懸濁液を濾過し、ケーキを乾燥アセトン１５ｍＬで２回洗浄し、次いで５０℃で数時間真空下で乾燥して、標題塩を得た。
【実施例２】
【０１３８】
ＦＧＦＲ４に対するインビトロ生化学キナーゼアッセイ
全てのアッセイは、３８４ウェルマイクロタイタープレートで実施した。各アッセイプレートに、４０の試験化合物についての８点連続希釈物と、参照化合物としてのスタウロスポリンの４つの８点連続希釈物、さらに１６の高対照物および１６の低対照物を含有させた。
【０１３９】
液体処理およびインキュベーションステップは、ロボットアームを備えたＩｎｎｏｖａｄｙｎｅ  Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＣａｔＸ、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｔｗｉｓｔｅｒ  ＩＩ）およびインキュベータ（Ｌｉｃｏｎｉｃ  ＳＴＸ４０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｙｔｏｍａｔ  ２Ｃ４５０）で行った。アッセイプレートは、ウェルあたり５０ｎｌの化合物の９０％ＤＭＳＯ溶液の添加により調製した。キナーゼ反応の開始は、ウェルあたり４．５μｌのペプチド／ＡＴＰ−溶液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、０．０２％のＢＳＡ、０．６％のＤＭＳＯ、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸、および１０μＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１６ｍＭのＭｇＣｌ２、１１２２μＭのＡＴＰ、４μＭのペプチド（５−Ｆｌｕｏ−Ａｈｘ−ＫＫＫＫＥＥＩＹＦＦＦＧ−ＮＨ２、Ｂｉｏｓｙｎｔａｎ  ＧｍｂＨ）と、ウェルあたり４．５μｌの酵素溶液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、０．０２％のＢＳＡ、０．６％のＤＭＳＯ、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸および１０μＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１６ｍＭのＭｇＣｌ２、６ｎＭのＦＧＦＲ４（ＧＳＴ−ＦＧＦＲ４（３８８−８０２）、昆虫細胞による発現および親和性クロマトグラフィーにより内製）とを段階的に添加することによって行った。キナーゼ反応は、３０℃で６０分間インキュベートし、続いてウェルあたり１６μｌの停止溶液（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５％のＤＭＳＯ、０．１％のＣａｌｉｐｅｒコーティング試薬、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および０．０１５％のＢｒｉｊ３５）を添加して終結させた。終了したキナーゼ反応物を含んだプレートを、読取りのために、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬＣ３０００ワークステーションに移した。リン酸化および非リン酸化ペプチドは、Ｃａｌｉｐｅｒマイクロ流体モビリティーシフト技術を使用して分離した。簡潔に述べると、終了したキナーゼ反応物由来の試料をチップに適用した。分析物を、チップを通じて一定のバッファーフローにより移し、基質ペプチドの移動は、そのペプチドの標識の蛍光シグナルによって観察する。リン酸化ペプチド（生成物）および非リン酸化ペプチド（基質）は、それらの電荷／質量比により電場の中で分離される。キナーゼ活性は、形成されたリン酸化ペプチドの量から計算した。ＩＣ５０値は、様々な化合物濃度での阻害％値から非線形回帰分析により決定した。
【０１４０】
化合物希釈液の調製
試験化合物を、ＤＭＳＯ（１０ｍＭ）で溶解し、１．４ｍＬの平底または特有の２Ｄ−マトリックスを備えるＶ字形チューブに移した。すぐに使用しない場合は、原液を＋２℃で保存した。試験手順のために、バイアルの霜を取り除き、スキャナで次の操作ステップが指示されたワーキングシートを作成して識別した。
【０１４１】
化合物希釈液は、９６ウェルプレートで作製した。この形式により、４つの参照化合物を含む最大で４０種の個々の試験化合物を、８濃度（単一点）でアッセイすることが可能であった。希釈プロトコールは、「前希釈プレート」、「マスタープレート」および「アッセイプレート」の製造を含んだ。
【０１４２】
前希釈プレート：９６ポリプロピレンウェルプレートを、前希釈プレートとして使用した。全４枚の前希釈プレートを、１０種の試験化合物をそれぞれプレートのＡ１−Ａ１０の位置に、１種の標準化合物をＡ１１に、および１つのＤＭＳＯ対照をＡ１２に含めて調製した。全希釈ステップは、ＨａｍｉｌｔｏｎＳＴＡＲロボットで実施した。
【０１４３】
マスタープレート：４枚の「前希釈プレート」の標準化合物および対照を含む３０μＬの個々の化合物希釈物を、９０％ＤＭＳＯ中の１’８１０、３６２、７２．５、５４．６、１４．５、２．９、０．５８および０．１２μＭの各濃度を含む３８４「マスタープレート」に移した。
【０１４４】
アッセイプレート：同一の「アッセイプレート」は、「マスタープレート」の５０ｎＬの各化合物の希釈物を、３８４ウェルの「アッセイプレート」に、Ｈｕｍｍｉｎｇ  Ｂｉｒｄ  ３８４−チャネルディスペンサーで分注することにより調製した。これらのプレートを直接使用し、全体積９．０５μＬでアッセイを行った。これにより、アッセイにおける化合物の最終濃度が１０、２．０、０．４、０．０８、０．０１６、０．００３２、０．０００６４および０．０００１２８μＭ、ＤＭＳＯの最終濃度が０．５％と導かれた。
【０１４５】
ＦＧＦＲ４についてのインビトロ細胞キナーゼアッセイ
細胞のＦＧＦＲ４キナーゼ活性についての読取として、ＦＧＦＲ４におけるチロシンリン酸化含有物を測定するアッセイを行った。このために、ＢａＦ３−Ｔｅｌ−ＦＧＦＲ４細胞株を作製した。ＢａＦ３細胞を、ＴＥＬ（ａａ１−３３７）のアミノ末端部分を、膜近傍（yuxtamembrane）ドメインを含むＦＧＦＲ４の細胞質ドメインに融合させた融合タンパク質をコードするレトロウイルスで安定に形質導入した。ＴＥＬドメインの存在により、オリゴマー化による融合ＦＧＦＲ４キナーゼの構成的活性化、したがってチロシン部位での自己リン酸化が媒介される。
【０１４６】
ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）−ベース捕捉ＥＬＩＳＡを展開させ、以下のように用いた：
−  細胞処理：ウェルあたり２５００００個のＢａＦ３−Ｔｅｌ−ＦＧＦＲ４細胞を、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃａｔ＃３３５９）に、１０％ウシ胎仔血清、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭの安定グルタミンおよび１×ペニシリン−ストレプトマイシン）を補充した４０μＬの成長培地（ＲＰＭＩ−１６４０（Ａｍｉｍｅｄ  Ｃａｔ＃１−４１Ｆ０１−Ｉ）中で播種した。液体処理装置（Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１  Ｂｒａｖｏ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、化合物の連続３倍希釈物をＤＭＳＯで調製し、成長培地で前希釈し、その後、１０μＬ／ウェルで細胞プレートに移した。１時間、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベーション後、５０μＬの溶解バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０ｍＭのＮａＦ、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ、Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃  １１８３６１５３００１）およびホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ））阻害剤（供給業者の指示にしたがってＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂ  Ｉ、ＳＩＧＭＡ  Ｃａｔ＃  Ｐ２８５０、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂ  ＩＩ、ＳＩＧＭＡ  Ｃａｔ＃  Ｐ５７２６）を添加し、振盪させながら３００ｒｐｍで３０分間、氷上でインキュベートした。次いで試料プレートを凍結し、−７０℃で保存した。氷上で解凍後、試料プレートを１２００ｒｐｍで６℃において１５分間、遠心分離した。
【０１４７】
−  ＥＬＩＳＡアッセイ：マルチアレイ９６ウェルプレート（ＭＳＤ、Ｃａｔ＃  Ｌ１５ＸＢ−３）を、１時間、室温で、２５μＬ／ウェルのマウス抗−Ｈ−ＴＥＬ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｔ＃  ｓｃ−１６６８３５）の１：４００のＰＢＳ／Ｏ希釈物でコーティングした。１５０μＬの３％ＭＳＤ−ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ（Ｃａｔ＃  Ｒ９３ＢＡ−１）含有ＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０２％のＴｗｅｅｅｎ−２０）を添加後、プレートを１時間、室温で振盪しながらインキュベートした。次いで、プレートを、２００μＬ／ウェルのＴＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、５０μＬの細胞溶解物を、コーティングされたプレートに移し、１５時間、４℃でインキュベートし、次いで２００μＬのＴＢＳ−Ｔ／ウェルで３回洗浄し、２５μｌ／ウェルのＭＳＤ  ＳＵＬＦＯＴＡＧＧＥＤ  ＰＹ２０抗体（ＭＳＤ  Ｃａｔ＃  Ｒ３２ＡＰ−５）の１：２５０のＴＢＳ−Ｔ＋１％  ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ希釈物を添加した。１時間、室温で、振盪しながらインキュベーションした後、ウェルを、２００μＬのＴＢＳ−Ｔ／ウェルで３回洗浄した。１５０μＬのＭＳＤリードバッファー（ＭＳＤ、Ｃａｔ＃  Ｒ９２ＴＣ−２）原液の１：４ナノウォーター希釈物を添加後、電気化学発光シグナル生成をＳｅｃｔｏｒＩｍａｇｅｒ６０００（ＭＳＤ）ですぐに定量した。ＩＣ５０計算：データ分析においては、アッセイバックグラウンドを培地および溶解バッファーを含むが細胞を含まないウェルで測定し、相当するバックグラウンド値を、全てのデータ点から差し引いた。ＦＧＦＲ４リン酸化に対する特定の試験化合物の濃度の効果は、ビヒクルのみ（ＤＭＳＯ、０．２％  ｆ．ｃ．）で処置した細胞について得られた読取値を１００とするバックグラウンド補正を行った電気化学蛍光読取値の割合（％）として表す。半数最大シグナル阻害（ＩＣ５０）を導く化合物濃度は、標準４パラメータ曲線あてはめ（ＸＬｆｉｔ  ５．４、ＩＤＢＳ）によって計算した。
【０１４８】
細胞増殖アッセイ
メチレンブルー染色増殖アッセイ（ＭＢＳ）：化合物の細胞増殖に対する効果は、医薬基盤研究所生物資源細胞バンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ、Ｃａｔ＃  ＪＣＲＢ０４０３）から取得し、事業者が推奨する培地（ＤＭＥＭ高グルコース（Ａｍｉｍｅｄ  Ｃａｔ＃  １−２６Ｆ０１−Ｉ）、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃  １６１４０−０７１）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ａｍｉｍｅｄ  Ｃａｔ＃  ５−６０Ｆ００−Ｈ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ａｍｉｍｅｄ  Ｃａｔ＃  ４−０１Ｆ００−Ｈ））中で、３７℃、湿潤５％ＣＯ２インキュベータ下で培養したＨｕＨ−７肝細胞癌細胞を使用して評価した。詳細には、三重反復で、５０００細胞／ウェルを、９６ウェル組織培養プレート（ＴＰＰ  Ｃａｔ＃  ９２６９６）に、全培地体積１００μｌ／ウェルで播種し、化合物の漸増希釈物またはＤＭＳＯを２４時間後に添加した。化合物の添加から７２時間後、細胞を２５μＬ／ウェルの２０％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｔ＃  Ｇ４００−４）を添加して固定し、室温で１０分間インキュベートした。細胞を、Ｈ２Ｏ、２００μＬ／ウェルで３回洗浄し、１００μＬ／ウェルの０．０５％メチレンブルー（ＡＢＣＲ  ＧｍｂＨ  Ｃａｔ＃  ＡＢ１１７９０４）を用いて室温で１０分間染色した。細胞を、Ｈ２Ｏ、２００μＬ／ウェルで３回洗浄し、次いで２００μＬ／ウェルの３％ＨＣｌ（Ｆｌｕｋａ  Ｃａｔ＃  ８４４２２）を添加し、振盪させながら室温で３０分間溶解させた。光学濃度は、Ａ６５０ｎｍで測定した。ＤＭＳＯ処理細胞に対して５０％増殖阻害を示す化合物の濃度を、ＸＬＦｉｔソフトウェアを使用して測定した（ＩＣ５０）。
【０１４９】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（ＣＴＧ）アッセイ：化合物の細胞増殖に対する機能効果は、医薬基盤研究所生物資源細胞バンク（Ｃａｔ＃  ＪＣＲＢ０４０３）から取得し、事業者が推奨する培地（ＤＭＥＭ高グルコース（Ａｍｉｍｅｄ  Ｃａｔ＃  １−２６Ｆ０１−Ｉ）、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃａｔ＃  １６１４０−０７１）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ａｍｉｍｅｄ  Ｃａｔ＃  ５−６０Ｆ００−Ｈ）、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ａｍｉｍｅｄ  Ｃａｔ＃  ４−０１Ｆ００−Ｈ））中で、３７℃、湿潤５％ＣＯ２インキュベータ下で培養したＨｕＨ−７肝細胞癌細胞を使用して評価した。化合物で媒介された、細胞増殖／生存能の抑制は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＣＴＧ）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃  Ｇ７５７３）を使用して、細胞のＡＴＰレベルを定量することによって評価する。簡潔には、細胞を、３’０００細胞／ウェル／８０μＬ新鮮培地で組織培養処理９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  Ｃａｔ＃３９０４）に播種し、その最終目的濃度の５倍で化合物希釈物を含有する２０μＬの培地を添加する。用量応答効果は、試験化合物の３倍連続希釈で、１０μＭから開始して、評価する。細胞を３７℃、５％ＣＯ２下で３日間インキュベートした後、細胞の生存能に対する阻害剤の効果を、ベンダーマニュアルにしたがって、５０μＬのＣＴＧを添加して、蛍光測定（積分時間：５００ｍｓ）により、対応する備え付けのマルチモードプレートリーダー（Ｍ２００Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して定量する。データ分析においては、培地を含むが細胞を含まないウェルで測定されたアッセイバックグラウンド値を、全てのデータ点から差し引いている。細胞抑制性化合物と細胞毒性性化合物の区別を可能にするために、生存細胞数を、別個の細胞プレートを使用して、化合物の添加時に観察される生存細胞数（０日目）と比較して評価する。細胞増殖／生存能に対する特定の試験化合物の濃度の効果は、ビヒクルのみ（ＤＭＳＯ、０．１％  ｆ．ｃ．）で処置した細胞について得られた値を１００％、一方、培地のみを含み細胞は含まないウェルの値を−１００％に設定したバックグラウンドおよび０日目補正を行った蛍光読取値に対する割合（％）として示す。半数最大成長阻害（ＧＩ５０）を導く化合物濃度は、標準４パラメータ曲線あてはめ（ＸＬｆｉｔ  ５．２．、ＩＤＢＳ、ＵＫ）を使用して決定する。
【０１５０】
【表２】
0006696995.tif 000006
【０１５１】
比較データ
ＦＧＦＲ１（４０７−８２２）、ＦＧＦＲ２（４０６−８２１）およびＦＧＦＲ３（４１１−８０６）についてのインビトロ生化学アッセイは、キナーゼドメインの示された部分を使用して、上記のＦＧＦＲ４のためのインビトロ生化学アッセイと同様にして行った。実施例１が、生化学ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３アッセイにおいて、ＩＣ５０値＞１００００ｎＭを生じた。
【実施例３】
【０１５２】
実施例１で得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの粒子のレーザー回折測定
実施例１で得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態（１：１）の粒径分布を、欧州薬局方第２．９．３１章のレーザー回折による粒径分析に記載の方法にしたがって分析した。
【０１５３】
測定については、Ｓｙｍｐａｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ製の湿式分散装置Ｃｕｖｅｔｔｅを備えた、Ｓｙｍｐａｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ製の焦点距離５００ｍｍのＳｙｍｐａｔｅｃ  ＨＥＬＯＳ装置を使用した。試験物質を、揮発油、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒｈａｌｌ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（カタログ番号１２２００−１５０）中に、分散助剤（例えば、Ｓｔａｔｓａｆｅ（商標）６０００、ＩＮＮＯＳＰＥＣ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、揮発油中約１％）を使用して分散させた。
【０１５４】
手順：数滴の分散助剤を、実施例１で得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態（１：１）の粉末試料に手動混合下で加えた。粒子を、激しく、例えばボルテックスミキサーで混合し、物質を完全に濡らして、滑らかで均質なペーストを形成した。ペーストを揮発油で希釈し、最終体積を数ミリリットルとし、ストック分散液を再び混合した。
【０１５５】
測定：試験分散液は、ストック分散液を揮発油で適切な光学濃度になるように希釈して調製し、積算体積分布は、指示マニュアルにしたがってレーザー光回折機器を使用して決定した。測定は、超音波処理の前、１０秒後、２０秒後、３０秒後に行った。パラメータは、以下の通りに設定した：Ｂａｎｄｅｌｉｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ製の超音波処理装置ＧＭ７０にて３０％振幅および８０％サイクル時間、測定期間は約２０秒。
【０１５６】
１０％、５０％および９０％（ｘ１０、ｘ５０、ｘ９０）の篩下値での粒径を、超音波処理なしの積算体積分布から評価した。超音波処理は、測定された粒子の大きさに有意な影響を与えなかった。
【０１５７】
得られた粒径分布を図６に示す。
【実施例４】
【０１５８】
参照例１（ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載）で得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの粒子のレーザー回折測定
参照例１で得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態（１：１）の粒径分布を、欧州薬局方第２．９．３１章レーザー回折による粒径分析に記載の方法にしたがって分析した。
【０１５９】
測定については、Ｓｙｍｐａｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ製の湿式分散装置Ｃｕｖｅｔｔｅを備えた、Ｓｙｍｐａｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ製の焦点距離１００ｍｍのＳｙｍｐａｔｅｃ  ＨＥＬＯＳ装置を使用した。試験物質を、揮発油、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒｈａｌｌ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（カタログ番号１２２００−１５０）中に、分散助剤（例えば、Ｓｔａｔｓａｆｅ（商標）６０００、ＩＮＮＯＳＰＥＣ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、揮発油中約１％）を使用して分散させた。
【０１６０】
手順：数滴の分散助剤を、実施例１で得られたＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態（１：１）の粉末試料に手動混合下で加えた。粒子を、激しく、例えばボルテックスミキサーで混合し、物質を完全に濡らして、滑らかで均質なペーストを形成した。ペーストを揮発油で希釈し、最終体積を数ミリリットルとし、ストック分散液を再び混合した。
【０１６１】
測定：試験分散液は、ストック分散液を揮発油で適切な光学濃度になるように希釈して調製し、積算体積分布は、指示マニュアルにしたがってレーザー回折機器を使用して決定した。測定は、超音波処理の前、および超音波処理後６００秒まで行った。パラメータは、以下の通りに設定した：Ｔｅｌｓｏｎｉｃ  ＡＧ製の超音波処理装置ＵＳＧＤ−１００にて５０％振幅、測定期間は約２０秒。測定は２回実施した。
【０１６２】
１０％、５０％および９０％（ｘ１０、ｘ５０、ｘ９０）の篩下値での粒径を、２４０秒の超音波処理後の積算体積分布から評価した。これを一次粒径の代表例として決定した。
【０１６３】
得られた粒径分布を図７に示す。
【実施例５】
【０１６４】
基本流動性エネルギー測定
基本流動性エネルギー（ＢＦＥ）は、条件づけされた正確な体積の粉体において、特定の流動パターンを確立するために必要なエネルギーである。この流動パターンは、ブレードが反時計回りに下降する動きであり、圧縮力のある比較的高応力の流動モードを粉体中に生じさせる。ＢＦＥは、ブレードが容器の頂部から底部まで粉体を通って移動、つまり下降横断する間になされる仕事から計算される。
【０１６５】
本例では、基本流動性エネルギーは、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＦＴ４粉体レオメータを使用して、以下の条件下で測定した：容器サイズ：２５ｍｍ；標準プログラム名称：２５ｍｍ＿１Ｃ＿Ｓｐｌｉｔ＿１Ｔ；初回付属品：２３．５ｍｍブレード；容器：２５ｍｍ×２５ｍＬ  Ｓｐｌｉｔ容器。結果を図９にプロットした。
【０１６６】
本発明の粒子の２つの試料について測定された基本流動性エネルギーは、実施例１ａに記載の方法で得られた粒子について３９．１７ｍＪであり、実施例１に記載の方法で得られた粒子について６５．０７ｍＪであった。
【０１６７】
ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法で得られた粒子の試料について測定された基本流動性エネルギーは、１８５．２０ｍＪであった。
【０１６８】
これらの結果は、本発明の粒子が、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法で得られた粒子に対して向上した流動特性を有することを示唆する。
【実施例６】
【０１６９】
圧縮率測定
圧縮率は、負荷された法線応力の関数としての密度の変化の仕方の尺度である。定義により、圧縮率は、圧縮後の体積の変化の割合（％）である。測定は、Ｆｒｅｅｍａｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＦＴ−４粉体レオメータを使用して行った。
【０１７０】
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの本発明の方法で得られた粒子とＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法で得られた粒子とを容器に入れ、通気ピストン（vented piston）を使用して粒子を圧縮した。通気ピストンは、圧縮面がステンレス鋼織網から構築され、粉体中に取り込まれた空気が粉体床の表面全体から均一に逃れるように設計される。法線応力は、０．５ｋＰａから開始して１５ｋＰａで終了する８つの連続的圧縮ステップで負荷した。各ステップにおいて、法線応力を６０秒間一定に保持し、圧縮率を体積の変化（％）として機械的に計算した。結果を図１０にプロットした。
【０１７１】
１５ｋＰａで測定された圧縮率（％）は、本発明の粒子については５４．１４％および５４．６３％であった。ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法で得られた粒子については、１５ｋＰａで測定した圧縮率（％）は４９．９３％であった。
【０１７２】
これらの結果は、本発明の粒子が、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法で得られた粒子と比較して、より圧縮可能であり、本発明の粒子の使用によって最終薬物製剤においてより高い薬物充填量を達成しうる利点がもたらされることが示唆される。
【実施例７】
【０１７３】
壁面摩擦角測定
壁面摩擦試験方法を、薬剤物質とステンレス鋼との間の相互作用を評価するように開発した。使用する装置は、Ｆｒｅｅｍａｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製のＦＴ−４粉体レオメータである。
【０１７４】
Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドの本発明の方法で得られた粒子とＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法で得られた粒子とを、試料と垂直および回転ストレスの両方を誘導する壁面摩擦ヘッドを含有する容器に入れた。粉体試料は、コンディショニング、次いで標準ＦＴ４ブレードおよび通気ピストンを用いた先行圧密により調製する。
【０１７５】
１．２ミクロンの平均粗さの３１６ステンレス鋼ディスクを備えた壁面摩擦ヘッドを、試料の表面に向けて下方に移動させ、試料の表面にディスクが接触するときの法線応力を誘導させる。ヘッドは、必要な法線応力が確立されるまで、下方に移動させ続ける。次いで壁面摩擦ヘッドをゆっくりと回転し始め、剪断応力を誘導させる。ディスクと試料表面との間に剪断面が確立される。粉体床が壁面摩擦ヘッドの回転に抵抗するにつれて、トルクが、抵抗により最終的に克服されるまで増加する。この点で最大トルクが観察される。壁面摩擦ヘッドを１８度／分で５分間、回転し続ける。この回転性を維持するために必要なトルクを測定し、これにより「定常状態」剪断応力を計算する。法線応力は、各ステップについての標的負荷応力で、そのステップ全体を通して、一定に維持する。一連の剪断応力を、一定範囲の標的負荷応力について測定する。試料の性質、および完全に一定の回転トルクは達成し難いという事実により、ソフトウェアは、剪断時間の１０％の間で平均値を決定する。次いで、グラフのデータ点に沿って最良適合線を描き、最良適合線と水平線との間の傾斜角を測定することによって、壁面摩擦角を計算する。結果を図１１にプロットした。
【０１７６】
測定された壁面摩擦角は、本発明の粒子について３４．５８°および３５．８５°であった。ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法で得られた粒子について、壁面摩擦角は４３．１８°であった。
【０１７７】
これらの結果は、本発明の粒子が、ＰＣＴ／ＩＢ２０１４／０６５５８５に記載の方法を使用して得られた粒子と比較して、金属表面に対する粘着挙動がより少なく、したがって向上した加工性を有することを示唆している。
本発明は次の実施態様を含む。
［１]  Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を調製するための方法であって、
ａ．Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドをプロピオン酸に溶解するステップと、
ｂ．ステップａ）で得られた溶液にクエン酸を加えて、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態を含む懸濁液を得るステップと、
ｃ．ステップｂで得られた懸濁液から、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子を単離するステップと
を含む方法。
［２]  ステップｂ）で得られた溶液に、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子をシーディングして、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態を含む懸濁液を得るステップを、ステップｂ）の後に含む、［１］に記載の方法。
［３]  ステップｂ）で加えるクエン酸は、アリコートで加える、［１または２］に記載の方法。
［４]  ステップｂ）で加えるクエン酸は、溶液としておよび／または固体形態で加える、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５]  クエン酸は、ヘプタン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ｎ−ヘキサン、酢酸エチル、酢酸ｎ−プロピル、アセトン、アセトニトリル、トルエン、水またはそれらの混合物から選択される溶媒中のクエン酸溶液として加える、［４］に記載の方法。
［６]  ［１］〜［５］のいずれかに記載の方法によって得ることができる、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子。
［７]  ２００〜３００ミクロンのメジアン粒径ｘ５０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子。
［８]  ５〜１０ミクロンの粒径ｘ１０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子。
［９]  ４００〜５００ミクロンの粒径ｘ９０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の粒子。
［１０]  １０〜２０ミクロンのメジアン粒径ｘ５０を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子。
［１１]  柱状結晶形を有する、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の結晶一次粒子。
［１２]  Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体であって、Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子が、［１０または１１］に記載の一次粒子である、凝集体。
［１３]  Ｎ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸塩の形態の一次粒子を含む凝集体であって、３００〜４００ミクロンのメジアン径ｘ５０を有する、凝集体。
［１４]  治療有効量のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドと、場合により１種または複数の医薬として許容される担体とを含む医薬組成物の製造における、［６］〜［１１］のいずれかに記載の粒子の使用。
［１５]  ［６］〜［１１］のいずれかに記載のＮ−（５−シアノ−４−（（２−メトキシエチル）アミノ）ピリジン−２−イル）−７−ホルミル−６−（（４−メチル−２−オキソピペラジン−１−イル）メチル）−３，４−ジヒドロ−１，８−ナフチリジン−１（２Ｈ）−カルボキサミドのクエン酸形態の粒子と、場合により１種または複数の医薬として許容される担体とを含む医薬組成物。
［１６]  医薬として使用するための、［１５］に記載の医薬組成物。
［１７]  癌の処置に使用するための、［１５］または［１６］に記載の医薬組成物。
［１８]  癌は、肝臓癌、乳癌、膠芽腫、前立腺癌、横紋筋肉腫、胃癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌から選択される、［１６］または［１７］に記載の使用のための医薬組成物。
［１９]  癌の処置のための医薬の製造における、［１５］に記載の医薬組成物の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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