(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス  ガセリ由来のＳＤＰ（Ｓｏｒｔａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、かつ、消化管由来物質に対して接着性を有する配列表配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列によってコードされるタンパク質。
【請求項２】
ラクトバチルス  ガセリ由来のＳＤＰ（Ｓｏｒｔａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）であって、かつ、以下の（１）〜（４）のいずれかのタンパク質。
（１）配列表配列番号１に示される塩基配列に９０％以上の同一性を示す塩基配列によってコードされ、ムチンに対して接着性を有するタンパク質。
（２）配列表配列番号２に示される塩基配列に９０％以上の同一性を示す塩基配列によってコードされ、フィブロネクチン又はムチンに対して接着性を有するタンパク質。
（３）配列表配列番号３に示される塩基配列に９０％以上の同一性を示す塩基配列によってコードされ、フィブロネクチン、ムチン又はＣａｃｏー２に対して接着性を有するタンパク質。
（４）配列表配列番号４に示される塩基配列に９０％以上の同一性を示す塩基配列によってコードされ、フィブロネクチン、ムチン又はＣａｃｏー２に対して接着性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は新規タンパク質に関する。さらに、詳しくは、消化管由来物質に対して接着性を有するラクトバチルス  ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）由来の新規タンパク質に関する。更に詳しくは、ＳＤＰ（Ｓｏｒｔａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）であるタンパク質、即ちＬＰＸＴＧ（Ｌはロイシン、Ｐはプロリン、Ｘは任意のアミノ酸、Ｔはスレオニン、Ｇはグリシンを示す（以下、単にＬＰＸＴＧと示す））モチーフを有するタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトバチルス属、ラクトコッカス属等に代表される乳酸菌はグラム陽性細菌群であり、ヒトの腸管等に接着してプロバイオティクス効果、整腸効果や免疫調節効果等を示すことが知られている。
大腸や小腸の腸管表面には、腸管上皮細胞が産生するフィブロネクチンやムチン等が存在し、乳酸菌を含む様々な微生物、物質等の接着に作用している。ヒトの食中毒や肺炎等の感染症の起因菌として知られる黄色ブドウ球菌においても、フィブロネクチンに接着するタンパク質が報告されている（非特許文献１）。また、近年では、ヒト大腸上皮細胞由来の細胞株であるＣａｃｏ−２細胞をモデルとして腸管上皮様の単層膜を形成させたものを用い、様々な物質の腸管への接着やそれによる効果について検討が行われている。
乳酸菌のプロバイオティクス効果等を効率的に得るには、腸管表面に存在する物質等を介した乳酸菌の大腸、小腸等の消化管への接着性を高めることが重要となる。
【０００３】
乳酸菌のようなグラム陽性細菌の表層タンパク質の中には、Ｃ末端領域にＬＰＸＴＧ配列を保有し、この配列を介して細胞壁に結合する細胞壁結合タンパク質（ｃｅｌｌ−ｗａｌｌ−ａｎｃｈｏｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＣＷＡＰ（以下、単にＣＷＡＰと示す））の存在が知られている。ＣＷＡＰのうち細胞壁に共有結合しているものはソルテース（Ｓｏｒｔａｓｅ）により、ＬＰＸＴＧ配列が特異的に切断されることによって細胞壁の表層に提示される（非特許文献２）。
このようなＬＰＸＴＧ配列に対するソルテース（Ｓｏｒｔａｓｅ）の作用を活かし、特許文献１ではＬＰＸＴＧ配列を有するタンパク質をソルテース（Ｓｏｒｔａｓｅ）の存在下で高分子多糖を含む固相担体に結合させる工程を含むタンパク質の固定化方法を開示している。
また、非特許文献３では、ＨＩＶ−１由来のタンパク質とＬＰＸＴＧ型細胞壁アンカーの翻訳複合体を蓄積する遺伝子組換え乳酸菌（ラクトコッカス  ラクティス）において、マウスの粘膜免疫および体液性免疫の反応を誘導したことを開示している。
【０００４】
しかし、これらの開示された技術はいずれも消化管由来物質に対する乳酸菌の接着性を高めることを目的とするものとは言えず、乳酸菌のプロバイオティクス効果、整腸効果や免疫調節効果等を高めるために、より有効な技術の開示が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−５５８３７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｒｉｓｔｅｒ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６，  ６９９−７０３，  Ｊａｎｕａｒｙ  １９８９．
【非特許文献２】瀬脇  智満  ＹＡＫＵＧＡＫＵ  ＺＡＳＳＨＩ  １２９（１）  １３２７−１３３２  （２００９）．
【非特許文献３】Ｘｉｎ  Ｋ．  Ｑ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，  １０２，  ２２３−２２８  （２００３）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この発明は、ラクトバチルス  ガセリ由来のタンパク質として、消化管由来物質に対して接着性を有する新規タンパク質を得ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記新規タンパク質を得るにあたり鋭意検討した結果、ＳＤＰであり、かつ、消化管由来物質であるフィブロネクチン、ムチンまたはＣａｃｏ−２細胞等に接着性を有するラクトバチルス  ガセリ由来の新規タンパク質を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は次のタンパク質、またはこのタンパク質を有する乳酸菌のスクリーニング方法等に関する。
〔１〕ＳＤＰ（Ｓｏｒｔａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）であり、かつ、消化管由来物質に対して接着性を有するラクトバチルス  ガセリ由来のタンパク質。
〔２〕消化管由来物質がフィブロネクチン、ムチンまたはＣａｃｏ−２細胞のいずれか一種以上である上記〔１〕に記載のタンパク質。
〔３〕配列表配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列によってコードされる上記〔１〕または〔２〕に記載のタンパク質。
〔４〕配列表配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列に８５％以上の同一性を示す塩基配列によってコードされる上記〔１〕または〔２〕に記載のタンパク質。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の新規タンパク質を乳酸菌に導入することにより、乳酸菌の消化管接着性を向上させることができる。また、本発明の新規タンパク質を有する乳酸菌をスクリーニングすることで、消化管接着性の高い乳酸菌を得ることが容易となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】フィブロネクチンに対する接着性評価の結果を示した図である（実施例）。
【図２−１】ウシ顎下由来のムチンに対する接着性評価の結果を示した図である（実施例）。
【図２−２】ブタ胃由来のムチンに対する接着性評価の結果を示した図である（実施例）。
【図３】Ｃａｃｏ−２細胞に対する接着性評価の結果を示した図である（実施例）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
この発明において「ＳＤＰであり、かつ、消化管由来物質に対して接着性を有するラクトバチルス  ガセリ由来のタンパク質」とは、ラクトバチルス  ガセリ由来のタンパク質であって、次のＳＤＰであり、かつ、消化管由来物質に対して接着性を有するタンパク質のことをいう。
即ちＬＰＸＴＧモチーフを有するタンパク質に関する。
ここで、Ｘで示されるアミノ酸は、タンパク質を構成する任意のアミノ酸であればいずれであっても良く、具体的には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシ、セリン、スレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジンからなる群から選択される。
【００１３】
このような本発明のタンパク質として、配列表配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列によってコードされるタンパク質が挙げられる。また、配列表配列番号１〜４のいずれかに示される塩基配列に８５％以上の同一性を示す塩基配列によってコードされるタンパク質であっても良く、好ましくは９０％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を示す塩基配列によってコードされるタンパク質であっても良い。
さらに、本発明のタンパク質は、配列表配列番号５〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質であっても良く、このアミノ酸配列のうち１個〜９個のアミノ酸が欠損、置換または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であっても良い。
【００１４】
この発明において「消化管由来物質」とは、大腸、小腸等の消化器系器官から得られる細胞やそれを形質転換等したもの、またはこれらの細胞等から産生される物質のことをいう。この「消化管由来物質」は、これらの消化器系器官に乳酸菌が接着するにあたり、有効に作用する物質であることが好ましい。このような物質として、例えば、フィブロネクチン、ムチン、Ｃａｃｏ−２細胞等が挙げられる。本発明のタンパク質は、これらの消化管由来物質のいずれか一種以上に接着性を有するものであれば良く、二種以上に接着性を有するものであることが好ましい。
【００１５】
以下、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが，本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１６】
次の工程により、ＳＤＰであり、かつ、消化管由来物質に対して接着性を有するラクトバチルス  ガセリ由来の新規タンパク質４種類を特定した。
ＳＤＰであり、かつ、接着性を有する新規タンパク質の候補は７種類想定した。７種類のタンパク質をコードする遺伝子を１種類ずつ個別に破壊したラクトバチルス  ガセリを作成し、該ラクトバチルス  ガセリと、遺伝子が破壊されていないラクトバチルス  ガセリの消化管由来物質への付着の度合いを比較する事により、７種類のタンパク質それぞれについて、消化官由来物質に対する接着性を調べた。
【００１７】
上記で特定した、ＳＤＰであり、かつ、消化管由来物質に対して接着性を有するラクトバチルス  ガセリ由来の新規タンパク質４種類（ＳＤＰ  Ｎｏ．２，Ｎｏ．３，Ｎｏ．８及びＮｏ．１０）について、それぞれコードする塩基配列を配列表配列番号１〜４に示した。また、配列番号１〜４の塩基配列に対応する各新規タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号５〜８に示した。
【００１８】
本発明で特定した新規タンパク質４種類以外に候補とされた他のタンパク質３種類（ＳＤＰ  Ｎｏ．４，Ｎｏ．５及びＮｏ．１２）についても、このタンパク質の塩基配列をコードする塩基配列を配列表配列番号９〜１１にそれぞれ示した。また、配列番号９〜１１の塩基配列に対応する各タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列表配列番号１２〜１４に示した。
【００１９】
１．ＳＤＰ遺伝子の破壊
１）遺伝子破壊用プラスミドの構築
ＳＢＴ２０５５株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として破壊対象であるＳＤＰをコードする遺伝子の両端を一部含む約１ｋｂの領域を、表１に示すプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ（以下、単にＰＣＲと示す））によって増幅した。次に、増幅した断片をＰＣＲにて連結して約２ｋｂの１つのＤＮＡ断片とした。取得した約２ｋｂの断片を、環状ＤＮＡ、ｐＧ＋ｈｏｓｔ６プラスミドベクター（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ社製）（約６．７ｋｂ）に連結し、大腸菌へ導入した。得られた組換え大腸菌からｉｌｌｕｓｔｒａ  ｐｌａｓｍｉｄＰｒｅｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  ｃａｔ  Ｎｏ．２８−９０４２−７０）を用いて製品添付のマニュアルに従って、前記約２ｋｂのＤＮＡ断片を含むプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００２０】
【表１】
0006688014.tif 000002
【００２１】
２）ＳＢＴ２０５５株のコンピテントセルの調製
コンピテントセル（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ；形質転換受容性細胞）とは、外来ＤＮＡ（プラスミド・ファージＤＮＡなど）を細胞内に取り込める状態の細胞である。ラクトバチルス  ガセリＳＢＴ２０５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５３）を１０ｍｌのＭＲＳ液体培地で３７℃、１６時間静置し前培養した。その後、終濃度で０．５Ｍ  スクロースおよび２％  グリシン（Ｇｌｙ）を含有するＭＲＳ液体培地（４０ｍｌ）に前培養液を１％量植菌し３７℃にて静置培養した。Ｏ．Ｄ．６００＝０．２１にて培養停止し、氷上で１０ｍｉｎ間静置した。遠心分離（２，３００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）によって菌体を回収し、冷却した滅菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（２５ｍｌ）にて２回洗菌を行った。洗菌後のペレット状の菌体を５ｍｌの５０ｍＭ  ＥＤＴＡに懸濁し、氷上で５ｍｉｎ静置した。ここに２５ｍｌの滅菌Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（２５ｍｌ）を添加し、遠心分離（２，３００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）により菌体を回収した。続いて２５ｍｌの０．３Ｍ  スクロースを用いて洗菌を行った。遠心分離（２，３００×ｇ，１０ｍｉｎ，４℃）により回収した菌体を１００μｌの０．３Ｍ  スクロースに再懸濁し、これをコンピテントセルとした。
【００２２】
３）ＳＢＴ２０５５株の形質転換体の作成
上記１．１）において調製した２〜３μｇの遺伝子破壊用プラスミドを上記１．２）において調製した１００μｌのコンピテントセルと混合し、氷上で５ｍｉｎ静置した。Ｇａｐ間隔２ｍｍのキュベットを使用し、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ）にてエレクトロポレーションを行った（１，５００Ｖ，６００Ω，１０μＦ）。電気パルスを与えた後にＭＲＳ液体培地を添加し、２８℃にて１５０ｍｉｎインキュベートした。続いて３８℃にて１５０ｍｉｎインキュベートして菌懸濁液を得た後、５０μｇ／ｍｌエリスロマイシン（Ｅｍ）含有ＭＲＳ寒天培地に菌懸濁液１００μｌを塗抹して３８℃、５日間嫌気培養し、ＳＢＴ２０５５株の形質転換体を得た。
【００２３】
４）遺伝子破壊の誘導
上記１．３）において得たＳＢＴ２０５５株の形質転換体を１０ｍｌのＭＲＳ液体培地に植菌し、２８℃にて１日間静置培養した。培養液を適宜希釈した後、菌懸濁液１００μｌをＭＲＳ寒天培地に塗抹し３８℃にて３日間嫌気培養した。その結果、目的の遺伝子破壊株を取得した。
【００２４】
２．遺伝子破壊の確認
１）菌体の培養
上記１．４）において得た遺伝子破壊株からＤＮＡとＲＮＡを抽出する為に、以下の手順にて遺伝子破壊株の培養を行った。
ＤＮＡ抽出のために、上記１．４）において得た遺伝子破壊株を１０ｍｌのＭＲＳ液体培地に植菌し、３７℃にて１６時間静置培養した。
さらに、ＲＮＡ抽出のために、上記１．４）において得た遺伝子破壊株を１０ｍｌのＭＲＳ液体培地に植菌し、３７℃にて１６時間静置培養した。さらに、１０ｍｌ  ＭＲＳ液体培地に１％量植菌し、同様に３７℃にて１６時間静置培養したものを定常期の菌体とした。また、上記の定常期の菌体を１．５ｍｌのＭＲＳ液体培地に５％量植菌し、３７℃にて４時間培養したものを対数期の菌体とした。
【００２５】
２）ＤＮＡ・ＲＮＡ抽出
ＤＮＡ抽出は、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  ｃａｔ  Ｎｏ．６９５０４）を用いて、製品添付のマニュアルに従って行った。ＲＮＡ抽出は、ジルコニアビーズ（製品名：Ｅｚ−Ｂｅａｄｓ、製造会社：エーエムアール株式会社、販売会社：株式会社住化分析センター）とＴｒｉｚｏｌによる菌体破砕を行った後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，  ｃａｔ  Ｎｏ．７４１０４）を用いて、製品添付のマニュアルに従って行った。
【００２６】
３）ＤＮＡのシークエンス解析
上記２．２）にて抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、該当箇所をＰＣＲにより増幅した。増幅には表２に示すプライマーを使用し、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ，  ｃａｔ  Ｎｏ．ＫＯＤ−４０１）を用いてサイクル条件、（１）９４℃、２ｍｉｎ、（２）９８℃、１０ｓｅｃ；６０℃、３０ｓｅｃ；６８℃、１ｍｉｎ  ３０ｓｅｃ、＊３０ｃｙｃｌｅ、（３）６８℃、２ｍｉｎ、（４）４℃、∞、にて行った。取得した増幅断片はｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア，  ｃａｔ  Ｎｏ．２８−９０３４−７０）を用いて製品添付のマニュアルに従って精製し、シークエンス解析用の鋳型ＤＮＡとした。シークエンス解析用のプライマーには表３に示す配列を使用して実施したところ、ゲノムＤＮＡ上から該当の遺伝子が想定通りに削除されている事を確認した。
【００２７】
【表２】
0006688014.tif 000003
【００２８】
【表３】
0006688014.tif 000004
【００２９】
４）ＲＮＡの発現解析
上記２．２）にて抽出したＲＮＡ  １μｇを使用し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ｃａｔ  Ｎｏ．２０５３１１）を用いて製品添付のマニュアルに従ってｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡならびにＲＮＡ（コントロール）を５ｎｇ／μｌに濃度調整し、表４に示すプライマーを用いて定量ＰＣＲにより該当するＳＤＰ遺伝子の発現有無を調べた。なお、内部標準としてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＧＡＰＤＨ（以下、単にＧＡＰＤＨと示す））および乳酸脱水素酵素（Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＬＤＨ（以下、単にＬＤＨと示す））をコードする遺伝子を使用し、次のプライマーを使用して試験した。ＧＡＰＤＨ遺伝子（センス鎖，５’−ＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＧＧＣ−３’(配列番号１０６)）；アンチセンス鎖，５’−ＡＣＣＡＣＣＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＣＣＡＴＣ−３’（配列番号１０７））、ＬＤＨ遺伝子（センス鎖，５’−ＴＴＧＧＴＣＧＴＧＡＡＧＴＴＣＧＴＧＡＣＣ−３’（配列番号１０８）；アンチセンス鎖，５’−ＣＡＡＴＡＡＣＣＴＴＴＧＣＧＣＣＧＡＡＡ−３’（配列番号１０９））。
その結果、いずれのＳＤＰ遺伝子も発現していないことを確認した。
【００３０】
【表４】
0006688014.tif 000005
【００３１】
３．消化管由来物質に対する接着性の確認
Ａ．フィブロネクチン（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ（以下、単にＦｎと示す場合がある））接着性試験
１）Ｆｎコーティングスライドガラスの準備
８穴スライドガラス（品名：チャンバースライドＩＩ  ＩＷＡＫＩ）の表面をアルコール綿で洗浄した後、２０μｇ／ｍｌ  フィブロネクチン（ヒト血漿由来、Ｗａｋｏ、ｃａｔ  Ｎｏ．０６３−０５５９１）含有ＰＢＳ（−）（日水製薬、ｃａｔ  Ｎｏ．０５９１３）を１５０μｌ添加して、一晩静置することでＦｎをガラス上に固定化した。Ｆｎ溶液を破棄し、ＰＢＳ（−）を用いて各ウェルを洗浄した。洗浄後、１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ（Ｗａｋｏ，  ｃａｔ  Ｎｏ．  ０１９−２３２９３）含有ＰＢＳ（−）を１５０μｌずつ各ウェルにのせ、室温で２時間静置することでブロッキングを行った。その後、ＢＳＡ溶液を破棄し、ＰＢＳ（−）で洗浄して、Ｆｎ接着性試験に使用した。
【００３２】
２）菌懸濁液の準備
上記１．２．の工程によって調製した各種供試菌を１０ｍｌのＭＲＳ液体培地を用いて３７℃、１６時間静置培養して賦活した。さらに、これを１０ｍｌのＭＲＳ液体培地に１％（ｖ／ｖ）量植菌し、３７℃、１６時間静置培養した。
菌懸濁液を３回ＰＢＳ（−）で遠心洗浄（１，９１２×ｇ、１０分間、室温）した後に、Ｏ．Ｄ．６００＝０．５になるようにＰＢＳ（−）を用いて洗浄菌体を再懸濁した。
【００３３】
３）Ｆｎ接着性試験
Ｆｎコーティングしたガラススライドに菌懸濁液を１５０μｌ／ウェルずつ添加し、室温で２時間、静置した。菌懸濁液を破棄し、脱イオン水を用いて洗浄した後に、３７℃にてガラス表面を乾燥させた。１ｍｇ／ｍｌのメチレンブルー（Ｍｅｒｃｋ）水溶液を１５０μｌ添加し、５分間静置して菌体を染色した。脱イオン水でメチレンブルー水溶液を洗浄除去した後に、再び３７℃で乾燥させ、顕微鏡で観察して画像を撮影した。スライド上に残存した菌体が占有する面積を顕微鏡ならびにＩｍａｇｅ−Ｊ（画像解析ソフト、ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて計算し、接着率（％）を導出した。
【００３４】
４）結果
図１に示されるように、各種供試菌のうちＳＤＰ３遺伝子（配列表配列番号２）の遺伝子破壊株Δ３、ＳＤＰ８遺伝子（配列表配列番号３）の遺伝子破壊株Δ８、ＳＤＰ１０遺伝子（配列表配列番号４）の遺伝子破壊株Δ１０及びＳＤＰ１２遺伝子（配列表配列番号１１）の遺伝子破壊株Δ１２のいずれにおいても、ＳＢＴ２０５５株に対してフィブロネクチンに対する接着性が有意に低下していた。特に遺伝子破壊株Δ３において、危険率ｐ＝０．００７と顕著であった。
従って、この結果より、配列表配列番号２で示される塩基配列によってコードされるＳＤＰ３タンパク質が、フィブロネクチンに対して高い接着性を有するラクトバチルス  ガセリ由来のタンパク質であることが確認できた。
【００３５】
Ｂ．ムチン接着性試験
１）６−Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＣＦＤＡ）による菌体の標識
上記１．２．の工程によって調製した各種供試菌を、ＭＲＳ液体培地を用いて３７℃、１６時間静置培養した。得られた培養菌体を遠心分離（１，９１２×ｇ，４℃，１０ｍｉｎ）により回収し、ＰＢＳ（−）を用いて３回洗菌後、ＰＢＳ（−）に再懸濁した。菌体懸濁液とその１／１０量の１ｍＭ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＣＦＤＡ，Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ  Ｎｏ．Ｃ５０４１）溶液を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。得られた菌体を遠心分離（１７，８００×ｇ，室温，３ｍｉｎ）により回収し、ＰＢＳ（−）を用いて２回洗菌したものをＣＦＤＡ標識菌体とした。
【００３６】
２）ムチン固定化プレートの作製
接着試験用ムチンとしてＭｕｃｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍ３８９５）とＭｕｃｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｓｔｏｍａｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ｃａｔ  Ｎｏ．Ｍ１７７８）の２種類を使用した。各々ＰＢＳ（−）に３ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、無水マレイン酸プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  Ｐｒｏｄ＃  １５１０８、白色）に１００μｌ添加した。室温にて静置（オーバーナイト）することでムチンを各ウェル内に固定化した。
【００３７】
３）ムチン接着性試験
Ｏ．Ｄ．６００＝５に調整した上記１）の供試菌をＣＦＤＡ標識し、ＰＢＳ（−）に懸濁した。上記２）にて調製したマイクロプレート内のムチン溶液を除去し、２００μｌの０．５Ｍ  エタノールアミン（ＰＢＳ（−）に溶解し、ｐＨ８．３に調整，ｗａｋｏ，  ｃａｔ  Ｎｏ．  ０１１−１７７０２）を各ウェルに添加して室温にて１時間静置することでブロッキングを行った。マイクロプレート内のエタノールアミン溶液を除去し、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄した。続いて、１００μｌのＣＦＤＡ標識菌体を各ウェルに添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。マイクロプレート内の菌体懸濁液を廃棄し、２００μｌのＰＢＳ（−）で３回洗浄した。続いて、各ウェルに１００μｌの破砕液（１％  ＳＤＳ  ａｎｄ  ０．１Ｎ  ＮａＯＨ）を添加し、６０℃で１時間破砕処理をした。冷蔵庫内で５分ほど静置して室温程度に戻した後、蛍光測定を実施した（Ｅｘ  ４９５ｎｍ，Ｅｍ  ５１９ｎｍ）。接着率は各ウェルに添加したＣＦＤＡ標識菌体が全て接着したと仮定した場合の蛍光強度を１００％として、洗浄後にウェル内に残った菌体の蛍光強度から算出した。
【００３８】
４）結果
図２−１に示されるように、各種供試菌のうちＳＤＰ２遺伝子（配列表配列番号１）の遺伝子破壊株Δ２、ＳＤＰ３遺伝子（配列表配列番号２）の遺伝子破壊株Δ３、ＳＤＰ８遺伝子（配列表配列番号３）の遺伝子破壊株Δ８及びＳＤＰ１０遺伝子（配列表配列番号４）の遺伝子破壊株Δ１０のいずれにおいても、ＳＢＴ２０５５株に対して牛顎下ムチンに対する接着性が有意に低下していた。特に遺伝子破壊株Δ２において、危険率ｐ＝０．０１１と顕著であった。
従って、この結果より、配列表配列番号１で示される塩基配列によってコードされるＳＤＰ２タンパク質が、牛顎下ムチンに対して高い接着性を有するラクトバチルス  ガセリ由来のタンパク質であることが確認できた。
【００３９】
図２−２に示されように、各種供試菌のうちＳＤＰ４遺伝子（配列表配列番号９）の遺伝子破壊株Δ４、ＳＤＰ８遺伝子（配列表配列番号３）の遺伝子破壊株Δ８及びＳＤＰ１０遺伝子（配列表配列番号４）の遺伝子破壊株Δ１０のいずれにおいても、ＳＢＴ２０５５株に対してブタ胃ムチンに対する接着性が有意に低下していた。特に遺伝子破壊株Δ８において、危険率ｐ＝０．００２と顕著であった。
従って、この結果より、配列表配列番号３で示される塩基配列によってコードされるＳＤＰ８タンパク質が、ブタ胃ムチンに対して高い接着性を有するラクトバチルス  ガセリ由来のタンパク質であることが確認できた。
【００４０】
Ｃ．Ｃａｃｏ−２細胞との接着試験
１）Ｃａｃｏ−２細胞の培養
Ｃａｃｏ−２細胞培養用の培地として、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ，  Ｇｉｂｃｏ，  ｃａｔ．  Ｎｏ．  １１０９５−０７２）に１０％（ｖ／ｖ）Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，  ｑｕａｌｉｆｉｅｄ，  ＵＳ  ｏｒｉｇｉｎ（ＦＢＳ，  Ｇｉｂｃｏ，  ｃａｔ  Ｎｏ．  ２６１４０−０７９），１％（ｖ／ｖ）ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，  Ｌｉｑｕｉｄ，  Ｇｉｂｃｏ，  ｃａｔ．  Ｎｏ．  １５１４０−１２２），１ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ，  ｃａｔ  Ｎｏ．  １１３６０−０７０），１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ  Ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１００Ｘ（Ｇｉｂｃｏ，  ｃａｔ  Ｎｏ．  １１１４０−０５０）を添加したＭＥＭ（＋ＦＢＳ）培地を準備した。接着細胞培養用の２４穴マイクロプレートに２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度のＣａｃｏ−２細胞を５００μｌ播種し、５％ＣＯ２環境下で３７℃、３日間培養した。顕微鏡観察にてコンフルエントに達したことを確認し、ＭＥＭ培地（−ＦＢＳ）で細胞を洗浄した後、ＭＥＭ（＋ＦＢＳ）を用いてさらに２週間培養を継続することで分化をさせた。この間２〜３日の間隔で培地交換を行った。
【００４１】
２）６−Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  （ＣＦＤＡ）による菌体の標識
上記１．２．の工程によって調整した各種供試菌は１０  ｍｌのＭＲＳ液体培地に植菌し、３７℃にて１６時間静置培養した。供試菌の培養液を遠心分離（１，９１２×ｇ，４℃，１０ｍｉｎ）により回収し、ＰＢＳ（−）を用いて３回洗菌後、ＰＢＳ（−）に再懸濁した。菌体懸濁液とその１／１０量の１ｍＭ  ６−Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＣＦＤＡ，Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ  Ｎｏ．Ｃ５０４１）溶液を混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。得られた菌体を遠心分離（１７，８００×ｇ，室温，３ｍｉｎ）により回収し、ＰＢＳ（−）を用いて２回洗菌したものをＣＦＤＡ標識菌体とした。
【００４２】
３）細胞接着試験
Ｏ．Ｄ．６００＝５に調整した供試菌を上記第３．２．項に従ってＣＦＤＡ標識した。標識菌体をＭＥＭ，  ＨＥＰＥＳ，  ｎｏ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ，  ｃａｔ  Ｎｏ．  １２３６０−０３８）に再懸濁し、５００μｌ／ｗｅｌｌ量をアプライした。５％ＣＯ２環境下で３７℃、１時間静置した後、ＰＢＳ（−）にて３回洗浄を行った。各ウェルに破砕液（１％  ＳＤＳ  ａｎｄ  ０．１Ｎ  ＮａＯＨ）を添加し、６０℃で１時間静置した。冷蔵庫内で５分ほど静置して室温程度に戻した後、１００μｌを９６穴マイクロプレート（蛍光分析用、黒色）に移し、蛍光測定を実施した（Ｅｘ  ４９５ｎｍ，Ｅｍ  ５１９ｎｍ）。接着率は各ウェルに添加したＣＦＤＡ標識菌体が全て接着したと仮定した場合の蛍光強度を１００％として、洗浄後にウェル内に残った菌体の蛍光強度から算出した。
【００４３】
４）結果
図３に示されるように、各種供試菌のうちＳＤＰ４遺伝子（配列表配列番号９）の遺伝子破壊株Δ４、ＳＤＰ５遺伝子（配列表配列番号１０）の遺伝子破壊株Δ５、ＳＤＰ８遺伝子（配列表配列番号３）の遺伝子破壊株Δ８、ＳＤＰ１０遺伝子（配列表配列番号４）の遺伝子破壊株Δ１０及びＳＤＰ１２遺伝子（配列表配列番号１１）の遺伝子破壊株Δ１２のいずれにおいても、ＳＢＴ２０５５株に対してＣａｃｏ−２細胞に対する接着性が有意に低下していた。特に遺伝子破壊株Δ１０において、危険率ｐ＝０．０００と顕著であった。
従って、この結果より、配列表配列番号４で示される塩基配列によってコードされるＳＤＰ１０タンパク質が、Ｃａｃｏ−２細胞に対して高い接着性を有するラクトバチルス  ガセリ由来のタンパク質であることが確認できた。
【００４４】
上記Ａ〜Ｃの接着性試験の結果より、配列表配列番号１〜４に示される塩基配列によってコードされるタンパク質はＳＤＰであり、かつ、フィブロネクチン、ムチンまたはＣａｃｏ−２細胞等の消化管由来物質に対して接着性を有するラクトバチルス  ガセリ由来のタンパク質であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の新規タンパク質を乳酸菌に導入することにより、乳酸菌の消化管接着性を向上させることができる。また、本発明の新規タンパク質を有する乳酸菌をスクリーニングすることで、消化管接着性の高い乳酸菌を得ることが容易となる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【配列表】
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