(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルから細胞外核酸を単離するための方法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルから、
ｉ）細胞外核酸；
ｉｉ）アニオン交換表面を提供する粒子；
ｉｉｉ）ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルである少なくとも１つの非イオン性界面活性剤；
ｉｖ）場合により、少なくとも１つの塩
を含む結合混合物であって、細胞外核酸が前記粒子に結合するようなｐＨを有する結合混合物を調製すること；
（ｂ）残りの結合混合物から、前記結合した細胞外核酸を有する粒子を分離すること；
（ｃ）場合により、前記結合した細胞外核酸を洗浄すること；
（ｄ）場合により、結合した細胞外核酸を溶出すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルと、前記少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む組成物であって、場合により塩および／またはバッファーを含む組成物とを接触させることによって、前記結合混合物を調製する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合混合物を調製することが、前記サンプルとタンパク質分解酵素とを接触させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
−前記粒子と、前記少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む溶解および／または結合組成物であって、場合により塩および／またはバッファーを含む溶解および／または結合組成物とを接触させることによって、懸濁液を形成すること；
−前記懸濁液と、細胞外核酸を含む前記サンプルとを接触させること；
−場合により、前記サンプルと前記懸濁液とを接触させる前に、それと同時に、またはその後に、タンパク質分解酵素を添加することによって、前記結合混合物を調製する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記結合混合物をインキュベートし、前記サンプルを前記結合混合物中で溶解する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記結合混合物が、≦７、≦６．５、≦６．２５および≦６から選択されるｐＨを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記結合混合物が塩を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記塩が、以下の特徴：
ａ．前記塩は、アルカリ金属塩またはアンモニウム塩である；
ｂ．前記塩は、アルカリ金属ハロゲン化物である；ならびに／または
ｃ．前記塩は、５０ｍＭ〜１．５Ｍ、７５ｍＭ〜１Ｍ、１００ｍＭ〜７５０ｍＭ、１２５ｍＭ〜５００ｍＭおよび１５０ｍＭ〜３５０ｍＭから選択される濃度で、前記結合混合物中に含まれる
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化リチウムから選択されるアルカリ金属ハロゲン化物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルが、以下の特徴：
ａ．それは、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルである；
ｂ．前記脂肪アルコール成分の鎖長は、８〜２２個の炭素原子、１０〜２０個の炭素原子、１２〜１９個の炭素原子、１４〜１８個の炭素原子および１６〜１８個の炭素原子から選択される；
ｃ．それは、１４〜２２個の炭素原子を有する脂肪アルコール成分と、２〜１５０個の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位を有するポリオキシエチレン成分とを含む；
ｄ．それは、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンオレイルエーテルからなる群より選択される；
ｅ．それは、０．１５ｍＭもしくはそれ未満、０．１２５ｍＭもしくはそれ未満、０．１２ｍＭもしくはそれ未満、０．１１５ｍＭもしくはそれ未満、０．１ｍＭもしくはそれ未満、０．０９５ｍＭもしくはそれ未満、０．９０ｍＭもしくはそれ未満または０．０８５ｍＭもしくはそれ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する；ならびに／または
ｆ．前記結合混合物は、０．０５％〜１５％、０．７５％〜１２％、０．１％〜１０％、０．１２５〜８％、０．１５％〜７．５％、０．１７５％〜６．５％および０．２％〜６％から選択される濃度で、前記ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂肪アルコール成分が飽和している、請求項１０のｂに記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルが、１６〜２０個の炭素原子を有する脂肪アルコール成分を含む、請求項１０のｃに記載の方法。
【請求項１３】
前記アニオン交換粒子が、前記結合混合物中における前記粒子の移動を妨げるカラムまたは他のデバイスに含まれず、前記結合混合物から前記粒子を収集して前記結合した細胞外核酸を回収する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記粒子が、以下の特徴：
ａ．前記粒子は、磁性である；
ｂ．前記粒子は、１００ｎｍ〜１０μｍ、１５０ｎｍ〜７．５μｍ、２００ｎｍ〜５μｍ、３００ｎｍ〜４μｍ、５００ｎｍ〜３．５μｍ、５５０ｎｍ〜２μｍおよび６００ｎｍ〜１．５μｍから選択される範囲内の平均直径を有する；ならびに／または
ｃ．前記アニオン交換表面は、アニオン交換基を提供するアニオン交換部分を含み、前記アニオン交換部分は、モノアミン、ジアミン、ポリアミン、含窒素芳香族または脂肪族複素環基、環状アミン、芳香族アミンおよび複素環アミンから選択される
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アニオン交換部分が、少なくとも１つの第１級、第２級および／または第３級アミノ基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物学的サンプルが、以下の特徴：
ａ．それは、無細胞、細胞枯渇または細胞含有サンプルである；
ｂ．それは、全血、血漿、血清、滑液、胸水、リンパ液、尿、リカー、脳脊髄液、腹水、ミルク、気管支洗浄液、唾液、羊水、精液／精漿、体液、体分泌物、鼻汁、膣分泌物、創傷分泌物および抽出物、ならびに上記のもの由来のサンプル、特に細胞の除去による上記サンプル由来の無細胞または細胞枯渇サンプルからなる群より選択される；
ｃ．それは、全血、血漿および／または血清から選択される；
ｄ．それは、血漿サンプルである；
ｅ．それは、安定化サンプルである；
ｆ．前記サンプルは、ホルムアルデヒドリリーサーで安定化されている；ならびに／または
ｇ．それは、安定化血漿サンプルである
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）前記生物学的サンプルから、
ｉ）細胞外核酸；
ｉｉ）アニオン交換表面を提供する磁性粒子；
ｉｉｉ）０．１％〜１０％の濃度の少なくとも１つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル；
ｉｖ）少なくとも１つのアルカリ金属塩；
ｖ）場合により、少なくとも１つのタンパク質分解酵素
を含む結合混合物であって、細胞外核酸が前記粒子に結合するように≦６．５のｐＨを有する結合混合物を調製すること；
（ｂ）残りの結合混合物から、前記結合した細胞外核酸を有する磁性粒子を磁気により分離すること；
（ｃ）前記結合した細胞外核酸を洗浄すること；
（ｄ）結合した細胞外核酸を溶出すること
を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）で調製される前記結合混合物が、０．１５％〜７．５％または０．２％〜６％の濃度の少なくとも１つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）前記生物学的サンプルから、
ｉ）細胞外核酸；
ｉｉ）アミン基を含むアニオン交換表面を提供する磁性粒子；
ｉｉｉ）０．１％〜６％、０．２％〜５％、０．２５％〜４％および０．３％〜３％から選択される濃度の少なくとも１つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルであって、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンオレイルエーテルからなる群より選択されるポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル；
ｉｖ）１００ｍＭ〜１Ｍから選択される濃度の少なくとも１つのアルカリ金属ハロゲン化物；
ｖ）場合により、少なくとも１つのタンパク質分解酵素
を含む結合混合物であって、細胞外核酸が前記粒子に結合するように≦６．５のｐＨを有する結合混合物を調製すること；
（ｂ）残りの結合混合物から、前記結合した細胞外核酸を有する磁性粒子を磁気により分離すること；
（ｃ）前記結合した細胞外核酸を洗浄すること；
（ｄ）結合した細胞外核酸を溶出すること
を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）で調製される前記結合混合物が、１２５ｍＭ〜７５０ｍＭおよび１２５ｍＭ〜５００ｍＭから選択される濃度の少なくとも１つのアルカリ金属ハロゲン化物を含み、ならびに／または、前記結合混合物に含まれる少なくとも１つのアルカリ金属ハロゲン化物が、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化リチウムから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
（ａ）
ｉ）少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル；
ｉｉ）少なくとも１つの塩；
ｉｉｉ）少なくとも１つのバッファー
を含む溶解および／または結合組成物であって、酸性ｐＨを有する溶解および／または結合組成物；
（ｂ）アニオン交換表面を提供する粒子；ならびに
（ｃ）場合により、タンパク質分解酵素；
（ｄ）場合により、１つまたはそれを超える洗浄溶液、ならびに
（ｅ）場合により、１つまたはそれを超える溶出溶液
を含む、キット。
【請求項２２】
以下の特徴：
ａ．前記ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルは、請求項９のａ．〜ｅ．で定義される１つまたはそれを超える特徴を有する；
ｂ．前記溶解および／または結合組成物は、０．５％〜１５％、０．７５％〜１２．５％、１％〜１０％、１．５％〜７．５％および２％〜６％から選択される濃度で、前記ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む；
ｃ．前記塩は、請求項８のａ．およびｂ．で定義される１つまたはそれを超える特徴を有する；
ｄ．前記溶解および／または結合組成物は、１００ｍＭ〜４Ｍ、２００ｍＭ〜３．５Ｍ、３００ｍＭ〜３Ｍ、５００ｍＭ〜２．５Ｍ、７５０ｍＭ〜２．２５Ｍおよび１Ｍ〜２Ｍから選択される濃度で、前記塩を含む；
ｅ．前記粒子は、請求項１４で定義される１つまたはそれを超える特徴を有する；
ｆ．前記溶解および／または結合組成物は、３〜６．５、３．５〜６および４〜５．５から選択される範囲内のｐＨを有する；ならびに／または
ｇ．前記キットは、プロテイナーゼＫであるタンパク質分解酵素を含む
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
以下の特徴：
ａ．前記サンプルの消化が室温で起こる；
ｂ．工程（ａ）および（ｂ）ならびに場合により（ｃ）および（ｄ）を室温で実施する；ならびに／または
ｃ．請求項２１または２２に記載のキットを方法の実施に使用する
の１つまたはそれよりも多くを有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニオン交換粒子を使用して生物学的サンプルから細胞外核酸を単離するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
細胞外核酸は、血液、血漿、血清および他の体液などの多くの種類の生物学的サンプルにおいて同定されており、非常に注目されている。細胞外核酸の分析は、多くの医学的状態、悪性腫瘍および感染プロセスにおいて、とりわけスクリーニング、診断、予後予測、疾患進行の監視のために、潜在的な治療標的を同定するために、および処置応答をモニタリングするために注目されている。加えて、例えば、性同一性、遺伝障害、例えば染色体異常を決定もしくは分析するために、および／または妊娠関連合併症をモニタリングするために、母親の血液中に存在する胎児細胞外核酸は、診断または医療目的で分析されている。したがって、細胞外核酸は、非侵襲的な診断および予後予測において特に有用であり、それらは、例えば、非侵襲的な出生前遺伝子検査、腫瘍学、移植医療または他の多くの疾患などの適用の多くの分野において診断マーカーまたは予後予測マーカーとして使用され得る。しかしながら、細胞外核酸は、健康なヒトにおいても見られる。細胞外核酸の一般的な適用および分析方法は、例えば、国際公開第９７／０３５５８９号、国際公開第９７／３４０１５号、Ｓｗａｒｕｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１（２００７）７９５−７９９、Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７５：４０−４９（２００６）、Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７５（２００７）１９１−２３２、Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａら、（２００６）ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２５，Ｎｕｍｂｅｒ  １１  ｐｐ  ６３５−６４０；Ｆａｎら、（２０１０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：８に記載されている。例えば、腫瘍細胞または胎児由来の哺乳動物細胞外核酸の他に、細胞含有サンプルはまた、細胞中に含まれない他の目的の核酸を含み得る。重要で非限定的な例は、ウイルス核酸などの病原体核酸である。
【０００３】
サンプルは、通常、低濃度の細胞外核酸を含有するに過ぎない。例えば、疾患症状（例えば、癌など）では、より高レベルが見られ得るが、血漿中では、遊離循環核酸は、わずか１〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することが多い。さらに、細胞外核酸は、１００〜５００ｎｔ、特に１２０〜２５０ｎｔの範囲内のサイズの断片として循環することが多い（ＤＮＡの場合、分子のサイズを、したがって鎖長を示す際に、「ｎｔ」という用語はまた、「ｂｐ」を含む）。血漿中のｃｃｆＤＮＡについて、平均長は、わずか約１４０〜１８０ｂｐであることが多い。加えて、診断または医療目的で同定すべきと考えられる実際の標的細胞外核酸はまた、通常、全細胞外核酸内のわずかな割合であるに過ぎない。ｃｃｆＤＮＡに関して、通常、状況（例えば、妊娠状態または腫瘍悪性度など）に応じて、血液１ｍｌ当たりわずか数千の増幅可能なコピーが存在する。具体的には、腫瘍特異的ＤＮＡ断片は非常にわずかであり、多くの場合は「正常な」細胞外核酸バックグラウンドより１０００倍低い濃度で含まれる。この低濃度は、細胞外核酸の単離に関して高度に効率的かつロバストでなければならないという課題を提起する。
【０００４】
従来技術では、生物学的サンプル、例えば特に血漿サンプルから細胞外核酸を単離するための方法が公知である。ここでは、いくつかのキットも市販されている。例えば、ＱＩＡａｍｐ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）は、細胞外核酸を単離するために、最大５ｍｌのサンプルサイズを処理することを可能にする効率的なプロトコールを提供する。処理容量が多いので（最大２５ｍｌ）、それは、基本的には手動による核酸抽出を必要とする。
【０００５】
しかしながら、自動化に適切な方法を提供することが望ましい。例えば、ルーチンな検査のために診断標的が確立されたら、顧客は、例えば、研究室でより高いスループットを管理するために自動化を必要とする。大規模な研究室は、例えば、１日当たり２５０〜２５００個の標本を処理し得るので、可能な限り手動工程を回避して、サンプル調製を自動化する需要が大きい。自動単離プロトコールは、手動核酸単離中に起こるエラーによる誤った結果のリスクを減少させるので、大きな利点を有する。
【０００６】
細胞外核酸を単離するための方法であって、自動化に適切な方法は、国際公開第２０１３／０４５４３２号に記載されている。細胞外核酸は、適切なｐＨ条件を使用して、アニオン交換基を含む固相に結合される。固相は、磁性粒子によって提供され得る。記載されている方法は効率的であり、迅速に実施され得る。
【０００７】
核酸単離の分野では、単離方法で使用される材料をキット形式で提供することが望ましい。これは、キット材料が、核酸単離に使用される場合に、保存後においても均一な結果を提供することを必要とする。加えて、特に単離された核酸の収率および純度に関して、信頼性が高い均一な単離結果が達成されることを保証するために、バッチ間の変動を防ぐべきである。単離は、好ましくは、定量的であるべきである。
【０００８】
アニオン交換粒子を用いて均一な結果で細胞外核酸を単離することは、特に困難であることが見出された。アニオン交換ビーズの核酸結合表面は、サンプル中の少量の細胞外核酸と比較して非常に過剰であるにもかかわらず、同じ種類の試薬およびアニオン交換ビーズを同じプロトコールで使用した場合であっても、単離結果が変動することが見出された。利用可能なアニオン交換表面が過剰であるにもかかわらず、定量的な単離結果は、合成ビーズロット（バッチとも称される）に強く依存し得ることが見出された。アニオン交換表面の小さな変動でさえ、細胞外核酸の回収効率に関して大きな性能変動をもたらした。アニオン交換表面の小さな変動が細胞外核酸収率に対して顕著な影響を有することはおそらく、細胞外核酸がサンプル中に少量しか含まれないという事実に起因する。アニオン交換表面のこのような変動は、アニオン交換粒子の標準的な生産プロセス中に起こり得るか、または保存中に起こり得る（経年劣化とも称される）。アニオン交換表面のこのような小さな変動を排除するためには、アニオン交換粒子の生産プロセスにおけるさらにより厳格な管理が必要であり、コストを増加させるより多くの無駄が生じるので、これは不利である。さらに、不都合なことに、この性能リスクは、キットの許容可能な保存時間を減少させる。
【０００９】
本発明の目的は、細胞外核酸を含有するサンプルから細胞外核酸を単離するための方法であって、上記従来技術の欠点の少なくとも１つを回避する方法を提供することである。特に、本発明の目的は、細胞外核酸を単離するための方法であって、性能変動の影響を受けにくい方法を提供することである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第９７／０３５５８９号
【特許文献２】国際公開第９７／３４０１５号
【特許文献３】国際公開第２０１３／０４５４３２号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｗａｒｕｐら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８１（２００７）７９５−７９９
【非特許文献２】Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０７５：４０−４９（２００６）
【非特許文献３】Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｂｉｏｃｈｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７７５（２００７）１９１−２３２
【非特許文献３】Ｈｒｏｍａｄｎｉｋｏｖａら、（２００６）ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２５，Ｎｕｍｂｅｒ  １１  ｐｐ  ６３５−６４０
【非特許文献４】Ｆａｎら、（２０１０）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５６：８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、アニオン交換表面を提供する粒子を細胞外核酸の単離に使用する技術に関する。本発明は、とりわけ、特定の非イオン性界面活性剤（すなわち、ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル）を結合混合物中に組み込むことにより、例えば、異なるロット／バッチのアニオン交換粒子間で、および／または前記粒子の保存中に起こり得るようなアニオン交換表面の差異に起因する性能変動が補償されるという驚くべき知見に基づくものである。他の非イオン性界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または他のクラスの界面活性剤、例えばカチオン性界面活性剤では、この効果は見られない。また、ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを結合混合物中に含めることにより、得られる溶出液の純度がより高くなったが、これは、下流反応、例えばＰＣＲ反応などの増幅反応における阻害が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００などの他の非イオン性界面活性剤を使用した場合と比較して有意に少ないことを示している。それにより、本発明は、アニオン交換粒子を使用して生物学的サンプルから細胞外核酸を単離するための改善された方法を提供する。
【００１３】
第１の態様によれば、本発明は、
生物学的サンプルから細胞外核酸を単離するための方法であって、
（ａ）前記サンプルから、
ｉ）細胞外核酸；
ｉｉ）アニオン交換表面を提供する粒子；
ｉｉｉ）ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルである少なくとも１つの非イオン性界面活性剤；
ｉｖ）場合により、少なくとも１つの塩
を含む結合混合物であって、細胞外核酸が前記粒子に結合するようなｐＨを有する結合混合物を調製すること；
（ｂ）残りの結合混合物から、前記結合した細胞外核酸を有する粒子を分離すること；
（ｃ）場合により、前記結合した細胞外核酸を洗浄すること；ならびに
（ｄ）場合により、結合した細胞外核酸を溶出すること
を含む方法を提供する。
【００１４】
第２の態様によれば、第１の態様の方法を実施するためのキットであって、
（ａ）
ｉ）ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルである少なくとも１つの非イオン性界面活性剤；
ｉｉ）場合により、少なくとも１つの塩；
ｉｉｉ）少なくとも１つのバッファー
を含む溶解および／または結合組成物であって、酸性ｐＨを有する溶解および／または結合組成物；
（ｂ）アニオン交換表面を提供する粒子；
（ｃ）場合により、タンパク質分解酵素；
（ｄ）場合により、１つまたはそれを超える洗浄溶液、ならびに
（ｅ）場合により、１つまたはそれを超える溶出溶液
を含むキットが提供される。
【００１５】
特定の態様では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
生物学的サンプルから細胞外核酸を単離するための方法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルから、
ｉ）細胞外核酸；
ｉｉ）アニオン交換表面を提供する粒子；
ｉｉｉ）ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルである少なくとも１つの非イオン性界面活性剤；
ｉｖ）場合により、少なくとも１つの塩
を含む結合混合物であって、細胞外核酸が前記粒子に結合するようなｐＨを有する結合混合物を調製すること；
（ｂ）残りの結合混合物から、前記結合した細胞外核酸を有する粒子を分離すること；
（ｃ）場合により、前記結合した細胞外核酸を洗浄すること；
（ｄ）場合により、結合した細胞外核酸を溶出すること
を含む、方法。
（項目２）
前記サンプルと、前記少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む組成物であって、場合により塩および／またはバッファーを含む組成物とを接触させることによって、前記結合混合物を調製する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記結合混合物を調製することが、前記サンプルとタンパク質分解酵素とを接触させることを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
−前記粒子と、前記少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む溶解および／または結合組成物であって、場合により塩および／またはバッファーを含む溶解および／または結合組成物とを接触させることによって、懸濁液を形成すること；
−前記懸濁液と、細胞外核酸を含む前記サンプルとを接触させること；
−場合により、前記サンプルと前記懸濁液とを接触させる前に、それと同時に、またはその後に、タンパク質分解酵素を添加することによって、前記結合混合物を調製する、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記結合混合物をインキュベートし、前記サンプルを前記結合混合物中で溶解する、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記結合混合物が、≦７、≦６．５、≦６．２５および≦６から選択されるｐＨを有する、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記結合混合物が塩を含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記塩が、以下の特徴：
ａ．前記塩は、アルカリ金属塩またはアンモニウム塩である；
ｂ．前記塩は、アルカリ金属ハロゲン化物であり、好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化リチウムから選択され、より好ましくは、前記塩は、塩化ナトリウムである；ならびに／または
ｃ．前記塩は、５０ｍＭ〜１．５Ｍ、７５ｍＭ〜１Ｍ、１００ｍＭ〜７５０ｍＭ、１２５ｍＭ〜５００ｍＭおよび１５０ｍＭ〜３５０ｍＭから選択される濃度で、前記結合混合物中に含まれる
の１つまたはそれよりも多くを有する、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルが、以下の特徴：
ａ．それは、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルである；
ｂ．前記脂肪アルコール成分の鎖長は、８〜２２個の炭素原子、１０〜２０個の炭素原子、１２〜１９個の炭素原子、１４〜１８個の炭素原子および１６〜１８個の炭素原子から選択され、前記脂肪アルコール成分は、好ましくは飽和している；
ｃ．それは、１４〜２２個の炭素原子、好ましくは１６〜２０個の炭素原子を有する脂肪アルコール成分と、２〜１５０個の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位を有するポリオキシエチレン成分とを含む；
ｄ．それは、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンオレイルエーテルからなる群より選択され、好ましくはポリオキシエチレンセチルエーテルである；
ｅ．それは、０．１５ｍＭもしくはそれ未満、０．１２５ｍＭもしくはそれ未満、０．１２ｍＭもしくはそれ未満、０．１１５ｍＭもしくはそれ未満、好ましくは０．１ｍＭもしくはそれ未満、０．０９５ｍＭもしくはそれ未満、０．９０ｍＭもしくはそれ未満または０．０８５ｍＭもしくはそれ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する；ならびに／または
ｆ．前記結合混合物は、０．０５％〜１５％、０．７５％〜１２％、０．１％〜１０％、０．１２５〜８％、０．１５％〜７．５％、０．１７５％〜６．５％および０．２％〜６％から選択される濃度で、前記ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む
の１つまたはそれよりも多くを有する、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記アニオン交換粒子が、前記結合混合物中における前記粒子の移動を妨げ得るカラムまたは他のデバイスに含まれず、前記結合混合物から前記粒子を収集して前記結合した細胞外核酸を回収する、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記粒子が、以下の特徴：
ａ．前記粒子は、磁性である；
ｂ．前記粒子は、１００ｎｍ〜１０μｍ、１５０ｎｍ〜７．５μｍ、２００ｎｍ〜５μｍ、３００ｎｍ〜４μｍ、５００ｎｍ〜３．５μｍ、５５０ｎｍ〜２μｍおよび６００ｎｍ〜１．５μｍから選択される範囲内の平均直径を有する；ならびに／または
ｃ．前記アニオン交換表面は、アニオン交換基を提供するアニオン交換部分を含み、前記アニオン交換部分は、モノアミン、ジアミン、ポリアミン、含窒素芳香族または脂肪族複素環基、環状アミン、芳香族アミンおよび複素環アミンから選択され、好ましくは、前記アニオン交換部分は、少なくとも１つの第１級、第２級および／または第３級アミノ基を含む
の１つまたはそれよりも多くを有する、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記生物学的サンプルが、以下の特徴：
ａ．それは、無細胞、細胞枯渇または細胞含有サンプルである；
ｂ．それは、全血、血漿、血清、滑液、胸水、リンパ液、尿、リカー、脳脊髄液、腹水、ミルク、気管支洗浄液、唾液、羊水、精液／精漿、体液、体分泌物、鼻汁、膣分泌物、創傷分泌物および抽出物、ならびに上記のもの由来のサンプル、特に細胞の除去による上記サンプル由来の無細胞または細胞枯渇サンプルからなる群より選択される；
ｃ．それは、全血、血漿および／または血清から選択される；
ｄ．それは、血漿サンプルである；
ｅ．それは、安定化サンプルである；
ｆ．前記サンプルは、ホルムアルデヒドリリーサーで安定化されている；ならびに／または
ｇ．それは、安定化血漿サンプルである
の１つまたはそれよりも多くを有する、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
（ａ）前記生物学的サンプルから、
ｉ）細胞外核酸；
ｉｉ）アニオン交換表面を提供する磁性粒子；
ｉｉｉ）０．１％〜１０％、好ましくは０．１５％〜７．５％、より好ましくは０．２％〜６％の濃度の少なくとも１つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル；
ｉｖ）少なくとも１つのアルカリ金属塩；
（ｖ）場合により、少なくとも１つのタンパク質分解酵素
を含む結合混合物であって、細胞外核酸が前記粒子に結合するように≦６．５のｐＨを有する結合混合物を調製すること；
（ｂ）残りの結合混合物から、前記結合した細胞外核酸を有する磁性粒子を磁気により分離すること；
（ｃ）前記結合した細胞外核酸を洗浄すること；
（ｄ）結合した細胞外核酸を溶出すること
を含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
（ａ）前記生物学的サンプルから、
ｉ）細胞外核酸；
ｉｉ）アミン基を含むアニオン交換表面を提供する磁性粒子；
ｉｉｉ）０．１％〜６％、０．２％〜５％、０．２５％〜４％および０．３％〜３％から選択される濃度の少なくとも１つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルであって、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンオレイルエーテルからなる群より選択され、好ましくはポリオキシエチレンセチルエーテルであるポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル；
ｉｖ）１００ｍＭ〜１Ｍ、１２５ｍＭ〜７５０ｍＭおよび１２５ｍＭ〜５００ｍＭから選択される濃度の少なくとも１つのアルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化リチウムから選択され、より好ましくは塩化ナトリウムである）；
（ｖ）場合により、少なくとも１つのタンパク質分解酵素
を含む結合混合物であって、細胞外核酸が前記粒子に結合するように≦６．５のｐＨを有する結合混合物を調製すること；
（ｂ）残りの結合混合物から、前記結合した細胞外核酸を有する磁性粒子を磁気により分離すること；
（ｃ）前記結合した細胞外核酸を洗浄すること；
（ｄ）結合した細胞外核酸を溶出すること
を含む、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
以下の特徴：
ａ．前記サンプルの消化が室温で起こる；
ｂ．工程（ａ）および（ｂ）ならびに場合により（ｃ）および（ｄ）を室温で実施する；ならびに／または
ｃ．項目１６または１７に記載のキットを方法の実施に使用する
の１つまたはそれよりも多くを有する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
（ａ）
ｉ）少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル；
ｉｉ）少なくとも１つの塩；
ｉｉｉ）少なくとも１つのバッファー
を含む溶解および／または結合組成物であって、酸性ｐＨを有する溶解および／または結合組成物；
（ｂ）アニオン交換表面を提供する粒子；ならびに
（ｃ）場合により、タンパク質分解酵素；
（ｄ）場合により、１つまたはそれを超える洗浄溶液、ならびに
（ｅ）場合により、１つまたはそれを超える溶出溶液
を含む、キット。
（項目１７）
以下の特徴：
ａ．前記ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルは、項目９のａ．〜ｅ．で定義される１つまたはそれを超える特徴を有する；
ｂ．前記溶解および／または結合組成物は、０．５％〜１５％、０．７５％〜１２．５％、１％〜１０％、１．５％〜７．５％および２％〜６％から選択される濃度で、前記ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む；
ｃ．前記塩は、項目８のａ．およびｂ．で定義される１つまたはそれを超える特徴を有する；
ｄ．前記溶解および／または結合組成物は、１００ｍＭ〜４Ｍ、２００ｍＭ〜３．５Ｍ、３００ｍＭ〜３ｍＭ、５００ｍＭ〜２．５ｍＭ、７５０ｍＭ〜２．２５Ｍおよび１Ｍ〜２Ｍから選択される濃度で、前記塩を含む；
ｅ．前記粒子は、項目１１で定義される１つまたはそれを超える特徴を有する；
ｆ．前記溶解および／または結合組成物は、３〜６．５、３．５〜６および４〜５．５から選択される範囲内のｐＨを有する；ならびに／または
ｇ．前記キットは、プロテイナーゼＫであるタンパク質分解酵素を含む
の１つまたはそれよりも多くを有する、項目１６に記載のキット。
本出願の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から当業者には明らかになるであろう。しかしながら、以下の説明、添付の特許請求の範囲および具体例は、本出願の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として示されていることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（Ｉ）磁性アニオン交換粒子を使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＢｒｉｊ５８を結合バッファー中に有する異なる「低性能」ビーズロットを比較）および参照方法として（ＩＩ）ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔを使用して、２ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。製品Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴ（Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ：２１８９６２）を使用して安定化した血液サンプルから、血漿サンプルを得た。各条件を４回反復で試験した（ｎ＝４）。溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：６６ｂｐアンプリコンが示されている）に供し、ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算し、手動と比較し、ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算し、手動のＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  ｋｉｔ（回収を１００％に設定）と比較した。非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ここでは、Ｂｒｉｊ５８）を結合バッファー中に含めることによりビーズロットが補償され、これは、ｃｃｆＤＮＡ親和性の減少を示している。非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した場合、この効果は見られなかった。
【００１７】
【図２】（Ｉ）磁性アニオン交換粒子を使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＢｒｉｊ５８を結合バッファー中に有する異なるビーズロットを比較）および参照方法として（ＩＩ）ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔを使用して、２ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。ＥＤＴＡを使用して安定化した血液サンプルから、血漿サンプルを得た。溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：６６ｂｐアンプリコンが示されている）に供し、ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算し、手動のＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  ｋｉｔ（回収を１００％に設定）と比較した。ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ここでは、Ｂｒｉｊ５８）を結合バッファー中に含めることにより、したがって結合混合物により、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較して、感受性ビーズロットを使用したｃｃｆＤＮＡ回収がよりロバストになる。
【００１８】
【図３】（Ｉ）磁性アニオン交換粒子を使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコール（結合バッファー中異なる界面活性剤濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＢｒｉｊ５８を比較）および参照方法として（ＩＩ）ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔを使用して、２ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：６６ｂｐまたは５００ｂｐアンプリコンが示されている）に供し、ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算し、手動のＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  ｋｉｔ（回収を１００％に設定）と比較した。結果は、結合バッファー中のポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ここでは、Ｂｒｉｊ５８）が、したがって結合混合物が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と同程度かまたはそれよりも多いｃｃｆＤＮＡ収率をもたらし、結合混合物中様々な濃度で使用することができることを示している。
【００１９】
【図４】（Ｉ）磁性アニオン交換粒子を使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコール（結合バッファー中異なる界面活性剤濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＢｒｉｊ５８を比較）および参照方法として（ＩＩ）ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔを使用して、２ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：６６ｂｐまたは５００ｂｐアンプリコンが示されている）に供し、ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算し、手動のＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  ｋｉｔ（回収を１００％に設定）と比較した。結果は、結合バッファー中のポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ここでは、Ｂｒｉｊ５８）が、したがって結合混合物が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と同程度かまたはそれよりも多いｃｃｆＤＮＡ収率をもたらし、結合混合物中様々な濃度で使用することができることを示している。
【００２０】
【図５】（Ｉ）磁性アニオン交換粒子を使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコール（結合バッファー中異なる界面活性剤濃度のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＢｒｉｊ５８を比較）および参照方法として（ＩＩ）ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔを使用して、２ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：６６ｂｐまたは５００ｂｐアンプリコンが示されている）に供し、ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算し、手動のＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  ｋｉｔ（回収を１００％に設定）と比較した。結果は、結合バッファー中のポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ここでは、Ｂｒｉｊ５８）が、したがって結合混合物が、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と同程度かまたはそれよりも多いｃｃｆＤＮＡ収率をもたらし、結合混合物中様々な濃度で使用することができることを示している。
【００２１】
【図６】Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（図６）またはＢｒｉｊ５８（図７）のいずれかを結合混合物中で使用して磁性アニオン交換粒子を使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコールを用いて、Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴ（Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ：２１８９６２）で安定化した血液から得られた２、４および６ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。異なる溶出液投入量（２〜８μｌ；Σ２０μｌ）を使用して、溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：５００ｂｐアンプリコンが示されている）に供した。ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算した。ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ここでは、Ｂｒｉｊ５８）を結合混合物中に含めることにより、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較して、不純物の除去がより効率的になる。
【００２２】
【図７】Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（図６）またはＢｒｉｊ５８（図７）のいずれかを結合混合物中で使用して磁性アニオン交換粒子を使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコールを用いて、Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴ（Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ：２１８９６２）で安定化した血液から得られた２、４および６ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。異なる溶出液投入量（２〜８μｌ；Σ２０μｌ）を使用して、溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：５００ｂｐアンプリコンが示されている）に供した。ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算した。ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル（ここでは、Ｂｒｉｊ５８）を結合混合物中に含めることにより、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較して、不純物の除去がより効率的になる。
【００２３】
【図８】プロテイナーゼＫが関与する溶解中の高温は、ｃｃｆＤＮＡ収率の減少をもたらす。（Ｉ）磁性アニオン交換粒子を使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコールを使用して、２ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。室温または６５℃における１０分間のインキュベーションと組み合わせて、３０μｌまたは６０μｌのＰｒｏｔＫを結合混合物中で使用して、消化を実施した。参照方法（ＩＩ）として、ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔを使用した。溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：６６ｂｐアンプリコンが示されている）に供し、ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算し、手動のＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  ｋｉｔ（回収を１００％に設定）と比較した。
【００２４】
【図９】磁性アニオン交換粒子を使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコールを使用して、２ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。異なるポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル非イオン性界面活性剤を、結合混合物中異なる濃度で使用した（２．０％、０．５％および０．１％）。溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：６６ｂｐアンプリコンが示されている）に供した。結果は、異なるポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルが、Ｂｒｉｊ５８と同様の有利な結果を達成することを示している。
【００２５】
【図１０】磁性アニオン交換粒子および異なる非イオン性界面活性剤を結合混合物中で使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコールを使用して、２ｍｌおよび４ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：６６ｂｐ（図１０Ａ．）または５００ｂｐアンプリコン（図１０Ｂ．）が示されている）に供した。結果は、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルを結合混合物中で使用することにより、他の非イオン性界面活性剤と比較して、収率および純度に関して優れた結果が提供されることを示している。
【００２６】
【図１１】経年劣化磁性アニオン交換粒子および異なる非イオン性界面活性剤を結合混合物中で使用して循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコールを使用して、４ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡを抽出した。溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ：６６ｂｐアンプリコンが示されている）に供した。結果は、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルを結合混合物中で使用することにより、他の非イオン性界面活性剤と比較して優れたよりロバストな結果が提供されることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、アニオン交換表面を提供する粒子を使用して生物学的サンプルから細胞外核酸を単離するための改善された技術を提供する。
【００２８】
（方法）
第１の態様によれば、本発明は、生物学的サンプルから細胞外核酸を単離するための方法であって、
（ａ）前記サンプルから、
ｉ）細胞外核酸；
ｉｉ）アニオン交換表面を提供する粒子；
ｉｉｉ）ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルである少なくとも１つの非イオン性界面活性剤；
ｉｖ）場合により、少なくとも１つの塩
を含む結合混合物であって、細胞外核酸が前記粒子に結合するようなｐＨを有する結合混合物を調製すること；
（ｂ）残りの結合混合物から、前記結合した細胞外核酸を有する粒子を分離すること；
（ｃ）場合により、前記結合した細胞外核酸を洗浄すること；ならびに
（ｄ）場合により、結合した細胞外核酸を溶出すること
を含む方法を提供する。
【００２９】
本方法は、粒子のアニオン交換表面の変動が起こる場合であっても、良好で均一な収率で細胞外核酸を単離することを可能にする。このような変動は、生産プロセス中に、および／または粒子の保存中に起こり得る。本方法は自動化に適切であり、使用される材料は、長期保存にも適切なキット形式で提供され得る。したがって、前記方法は、重要な利点を有する。個々の工程および好ましい実施形態を以下に説明する。
【００３０】
（工程（ａ）−結合混合物の調製）
本方法の工程ａ）では、結合混合物は、細胞外核酸を含有する生物学的サンプルから調製される。結合混合物は、細胞外核酸に結合するためのアニオン交換粒子を含み、ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルである少なくとも１つの非イオン性界面活性剤をさらに含む。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「結合混合物」という用語は、核酸結合工程のために調製される組成物であって、サンプル中に含まれる細胞外核酸を粒子のアニオン交換表面に結合させることを可能にする組成物を指す。結合混合物を調製することによって、結合混合物中に含まれる細胞外核酸が粒子のアニオン交換表面に結合するように、条件を確立する。結合混合物は、特に、生物学的サンプル、アニオン交換粒子、ならびに結合工程のためのサンプルを調製するために添加された試薬および／もしくは化合物を含む。
【００３２】
本発明の重要な特徴は、非イオン性界面活性剤として少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを結合混合物中に組み込むことである。ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルは、脂肪アルコールのアルコキシル化、好ましくはエトキシル化によって調製される。ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルは、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルおよびポリオキシプロピレン脂肪アルコールエーテルから選択され得、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルの使用が好ましい。続いて、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルを使用する好ましい実施形態に関して、本発明の実施形態を特に説明する。本開示は、一般にポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルの使用に準用される。加えて、一般にポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルに関して本明細書に記載される実施形態は、特に、ポリオキシエチレングリコール脂肪アルコールエーテルの使用に関するものであり、したがってこれを指す。
【００３３】
「脂肪アルコール」という用語は、特に、本発明の目的のために、６〜２２個の炭素原子の鎖長を有するアルコールを意味する。鎖長は、８〜２０個の炭素原子、１０〜１９個の炭素原子および１２〜１８個の炭素原子から選択され得る。特に、１４〜２０個の炭素原子、より好ましくは１５〜１９個の炭素原子または１６〜１８個の炭素原子の鎖長を有する脂肪アルコールが好ましい。脂肪アルコールは、一価不飽和または多価不飽和であり得るが、それは、好ましくは飽和脂肪アルコールである。
【００３４】
「ポリオキシエチレン」という用語は、特に、本発明の目的のために、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ単位、特にＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ単位を意味し、ｎは、好ましくは、２〜１５０の整数、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９および１５０から選択される整数である。好ましくは、ｎは、４〜１２０、８〜８０、１０〜６０および１２〜５０から選択される範囲内である。
【００３５】
適切なポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルの好ましい例は、単独でまたは組み合わせて使用され得るポリエトキシル化ラウリル、セチル、オレイルまたはステアリルアルコールである。一実施形態によれば、少なくとも１つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルは、６〜２２個の炭素原子を有する脂肪アルコール成分と、２〜１５０個の（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）単位を有するポリオキシエチレン成分とを含む。一実施形態によれば、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルは、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（２）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルおよびポリオキシエチレン（１００）ステアリルエーテルからなる群より選択される。数字は、エチレンオキシド単位の平均数を示す。例えば、ＩＣＩ  ＳｕｒｆａｃｔａｎｔｓによってＢｒｉｊ（登録商標）の商品名で販売されているポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルが特に適切である。
【００３６】
ポリオキシエチレンセチル、ポリオキシエチレンオレイルまたはポリオキシエチレンステアリルアルコールエーテルは、ポリオキシエチレン（２）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５２）、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５６）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５８）、ポリオキシエチレン（２）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７２）、ポリオキシエチレン（１０）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７６）、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７８）、ポリオキシエチレン（２）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９２）、ポリオキシエチレン（１０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９７）、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９８）およびポリオキシエチレン（１００）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７００）を含む群より選択され得る。ポリオキシエチレンセチル、ポリオキシエチレンオレイルまたはポリオキシエチレンステアリルアルコールエーテルはまた、粉末、例えばポリオキシエチレン（２１）ステアリルエーテル粉末（Ｂｒｉｊ（登録商標）７２１Ｐ）として使用され得る。
【００３７】
一実施形態によれば、ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルは、ポリオキシエチレンセチル、ポリオキシエチレンオレイルおよびポリオキシエチレンステアリルアルコールエーテルから選択され、好ましくは、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５６）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５８）、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７８）およびポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９８）からなる群より選択される。ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの使用が特に好ましい。
【００３８】
界面活性剤は性質が両親媒性であり、一方の末端に極性基を含有し、他方の末端に疎水性炭素鎖を含有する。表面活性化合物が溶液中で非共有結合性クラスタを形成すると、ミセル化が起こり、このプロセスは、疎水性効果によって駆動される。界面活性剤の用途を考慮すると、ミセル化は重要な現象である。各界面活性剤は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）（それを超えるとモノマーが非共有結合性凝集体（これは、ミセルと称される）に自己会合する上記界面活性剤の濃度）を特徴とし得る（Ｒｏｓｅｎ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  ｐｈｅｎｏｍｅｎａ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００４；Ｈｅｌｅｎｉｕｓら、Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１９７９，５６：ｐ  ７３４−４９およびＭｕｋｅｒｊｅｅら、Ｃｒｉｔｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ｖｏｌ．ＮＳＲＤＳ−ＮＢＳ  ３６．１９７０を参照のこと）。実際には、ＣＭＣは、単一の濃度ではなくむしろ狭い濃度範囲で存在する。総界面活性剤濃度がＣＭＣ未満である場合、界面活性剤モノマーは、バルク溶液中で遊離している。しかしながら、より多くの界面活性剤がＣＭＣを超えて添加されると、さらなる界面活性剤モノマーがミセル中に入り得る。界面活性剤ミセルは、動的構造である；ミセル内の界面活性剤モノマーは一定であり、溶液中のプレ界面活性剤モノマーと迅速に交換される。ＣＭＣは、表面張力測定（Ｍｉｔｔａｌ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＭＣ  ｏｆ  ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，１９７２．６１（８）：ｐ．１３３４−５を参照のこと）および色素（例えば、アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸［ＡＮＳ］結合実験（Ｄｅ  Ｖｅｎｄｉｔｔｉｓら、Ａ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍｉｃｅｌｌｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８１，１１５：ｐ．２７８−２８６を参照のこと）を含む様々な方法によって決定され得る。界面活性剤の疎水性基は、ＣＭＣに影響を与える。直鎖状アルキルでは、アルキル鎖の炭素原子の数が最大約１６〜１８個に増加するにつれて、ＣＭＣは通常減少する。
【００３９】
低いＣＭＣを有するポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルの使用が有益であることが見出された。一実施形態によれば、ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルは、０．１５ｍＭまたはそれ未満のＣＭＣを有する。一実施形態によれば、それは、０．１２５ｍＭもしくはそれ未満、０．１２ｍＭもしくはそれ未満、０．１１５ｍＭもしくはそれ未満、０．１ｍＭもしくはそれ未満、０．０９５ｍＭもしくはそれ未満、０．９０ｍＭもしくはそれ未満または０．０８５ｍＭもしくはそれ未満のＣＭＣを有する。０．１ｍＭまたはそれ未満のＣＭＣが好ましい。ＣＭＣの範囲としては、限定されないが、０．００５〜０．１５ｍＭ、０．０１〜０．１２５ｍＭ、０．０１５ｍＭ〜０．１２ｍＭ、０．０２ｍＭ〜０．１１５ｍＭ、０．０２５ｍＭ〜０．１ｍＭ、０．０３ｍＭ〜０．０９５ｍＭおよび０．０３５ｍＭ〜０．０９ｍＭが挙げられる。例えば、好ましい実施形態のポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルは、約０．０８ｍＭのＣＭＣを有する。一実施形態によれば、ＣＭＣは、０．０５ｍＭ〜０．０９ｍＭの範囲内にある。
【００４０】
一実施形態によれば、結合混合物は、０．０５％〜１５％、０．７５％〜１２％、０．１％〜１０％、０．１２５％〜８％、０．１５％〜７．５％、０．１７５％〜６．５％および０．２％〜６％から選択される濃度で、少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む。実施例によって実証されているように、０．１％〜５％および０．１％〜２％の範囲内の濃度が特に適切である。１つを超えるポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルが結合混合物中に含まれる場合、示されている濃度範囲は、一実施形態によれば、含まれるポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルの総濃度を指す。
【００４１】
粒子は、アニオン交換表面を提供する。したがって、それらは、それらの表面にアニオン交換基を含む。アニオン交換基は、同じ種類のものであり得るが、異なる種類のアニオン交換基も使用され得る。このようなアニオン交換基の例は、モノアミン、ジアミン、ポリアミンおよび含窒素芳香族または脂肪族複素環基である。好ましくは、アニオン交換基は、少なくとも１つのアミノ基、例えば第１級、第２級、第３級または第４級アミノ基を含む。好ましい実施形態では、アニオン交換基は、第１級、第２級および第３級アミンからなる群より選択される基を含み、より好ましくは、式
Ｒ３Ｎ、Ｒ２ＮＨ、ＲＮＨ２および／またはＸ−（ＣＨ２）ｎ−Ｙ
（式中、
Ｘは、Ｒ２Ｎ、ＲＮＨまたはＮＨ２であり、
Ｙは、Ｒ２Ｎ、ＲＮＨまたはＮＨ２であり、
Ｒは互いに独立して、直鎖状、分枝状または環状アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール置換基（これらは、好ましくはＯ、Ｎ、ＳおよびＰから選択される１個またはそれを超えるヘテロ原子を含み得る）であり、ならびに
ｎは、０〜２０、好ましくは０〜１８の範囲内の整数である）の基を含む。
【００４２】
したがって、アニオン交換基は、プロトン化可能な基を有し得、場合により、１個を超えるプロトン化可能な基（これは、同じものでもよいし、または異なるものでもよい）を有し得る。プロトン化可能な基は、好ましくは、高いｐＨ値では中性または非荷電性の化学基であって、低いｐＨ値ではプロトン化され、それにより、正電荷を有する化学基である。特に、プロトン化可能な基は、粒子に対する細胞外核酸の結合が起こる結合ｐＨでは、正荷電性である。好ましくは、（プロトン化された）プロトン化可能な基のｐＫａ値は、約８〜約１３、より好ましくは約８．５〜約１２または約９〜約１１．５の範囲内である。
【００４３】
適切なアニオン交換基の例は、特にアミノ基、例えば第１級、第２級および第３級アミノ基ならびに環状アミン、芳香族アミンおよび複素環アミン、好ましくは第３級アミノ基である。アミノ基は、好ましくは、環状置換基、および窒素原子と一緒に複素環または複素芳香環を形成する置換基を含むアルキル、アルケニル、アルキニルおよび／または芳香族置換基を有する。置換基は、好ましくは、１〜２０個の炭素原子、より好ましくは１〜１２個、１〜８個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個または１個もしくは２個の炭素原子を含む。それらは、直鎖状または分枝状であり得、ヘテロ原子、例えば酸素、窒素、硫黄、シリコンおよびハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）原子を含み得る。好ましくは、置換基は、４個以下のヘテロ原子、より好ましくは３個以下のヘテロ原子、２個以下のヘテロ原子または１個以下のヘテロ原子を含む。
【００４４】
一実施形態では、アニオン交換基は、好ましくは、１〜１０個のアミノ基を有する。より好ましくは、アニオン交換基は２〜８個のアミノ基を有し、特に、アニオン交換基は２〜６個のアミノ基を有する。
【００４５】
アミン官能基の例は、第１級アミン、例えばアミノメチル（ＡＭ）、アミノエチル（ＡＥ）、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、テトラエチレンペンタアミン、ペンタエチレンヘキサアミン、トリメチルアミノ（ＴＭＡ）、トリエチルアミノエチル（ＴＥＡＥ）、直鎖状または分枝状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カルボキシル化またはヒドロキシアルキル化ポリエチレンイミン、ジェファーミン、スペルミン、スペルミジン、３−（プロピルアミノ）プロピルアミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、Ｎ−モルホリノエチル、ポリリシンおよびテトラアザシクロアルカンである。
【００４６】
好ましくは、使用される粒子は、ジアルキルアミノ基、特にジエチルアミノ基を含み、粒子はまた、１種類を超えるジアルキルアミノ基を含み得る。
【００４７】
本発明との関連で使用され得るアニオン交換粒子としては、限定されないが、アニオン交換基で官能化された粒子材料が挙げられる。粒子の基本材料として、限定されないが、シリコン含有材料、例えばシリカおよびポリケイ酸材料、ホウケイ酸塩、ケイ酸塩、無機ガラス、有機ポリマー、例えばポリ（メタ）アクリレート、ポリウレタン、ポリスチレン、アガロース、多糖、例えばセルロース、金属酸化物、例えば酸化アルミニウム、酸化マグネシウム、酸化チタンおよび酸化ジルコニウム、金属、例えば金または白金、セファデックス、セファロース、ポリアクリルアミド、ジビニルベンゼンポリマー、スチレンジビニルベンゼンポリマー、デキストランおよびそれらの誘導体；ガラスまたはシリカを含むアニオン交換クロマトグラフィーに適切な任意の材料が使用され得る。実施形態では、粒子は、鉱物またはポリマー材料、例えばシリカ、ガラス、石英、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリアクリロニトリル、ポリ塩化ビニル、ポリアクリレート（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｄｅ）、メタクリレートまたはメタクリル酸メチルで作られるか、またはこれらを含有する。重要なのは、粒子がそれらの表面にアニオン交換基を含み、細胞外核酸との相互作用のためのアニオン交換表面を提供することである。このような表面は、適切なアニオン交換基で粒子の基本材料を官能基化することによって提供され得る。アニオン交換表面を提供するためのアニオン交換基による粒子の官能基化については、いくつかの方法が実行可能であり、当業者に公知である。アニオン交換基は、粒子の表面に共有結合により、もしくは非共有結合により、静電気により直接結合され得、および／または表面コーティングを形成するかもしくは粒子の表面に提供されるポリマーもしくは他の組成物の一部を形成し得る。アニオン交換基はまた、粒子上に沈殿され得る。一実施形態によれば、アニオン交換基は、粒子上にコーティングの形態で適用される。アニオン交換基の共有結合が好ましい。粒子は、それらの表面にアニオン交換基の結合のための官能基、例えばＳｉ−Ｏ−Ｓｉ、Ｓｉ−ＯＨ、アルコール、ジオールまたはポリオール、カルボキシレート、アミン、ホスフェートまたはホスホネートなどの官能基を含み得る。アニオン交換基は、例えば、エポキシド、（活性化）カルボン酸、シラン、酸無水物、酸塩化物、ホルミル基、トレシル基またはペンタフルオロフェニル基を使用することによって、固相に結合され得る。官能基は、固相に直接結合され得るか、または（直鎖状または分岐状）スペーサー基、例えば炭化水素、例えば−（ＣＨ２）ｎ−基、炭水化物、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールを介して結合され得る。あるいは、アミノ官能基などのアニオン交換基を含むモノマーから構成されるポリマーもまた、アニオン交換材料として使用され得る。特定の実施形態では、粒子は、ポリケイ酸表面などのシリコン含有表面を有し、アニオン交換基は、アミノシランなどの適切な有機シランを使用することによって、前記表面にカップリングされる。
【００４８】
アニオン交換基は、リンカー構造に結合したプロトン化可能な基を含み得る。好ましくは、リンカーは、好ましくは１〜２０個の炭素原子、より好ましくは１〜１２個、１〜８個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個または１個もしくは２個の炭素原子を含む直鎖状、分枝状または環状アルキレン、アルケニレンまたはアルキニル基である。それは、酸素、窒素、硫黄、シリコンおよびハロゲン（例えば、フッ素、塩素、臭素）原子などのヘテロ原子、好ましくは４個以下のヘテロ原子、より好ましくは３個以下のヘテロ原子、２個以下のヘテロ原子または１個以下のヘテロ原子をさらに含み得る。好ましい実施形態では、リンカー基は、アルキレン基、特にプロピレン基である。
【００４９】
一実施形態によれば、粒子は、シリコン含有表面、好ましくは、少なくとも１つのアニオン交換基を含むシラン化合物で誘導体化されたポリケイ酸表面を含む。アミノシランなどのオルガノシランの使用を伴う適切な方法は周知である。
【００５０】
粒子は、好ましくは球状である。粒子は、１００ｎｍ〜３５μｍ、１５０ｎｍ〜３０μｍ、２００ｎｍ〜２５μｍ、２５０ｎｍ〜２０μｍ、３００ｎｍ〜１５μｍ、３５０ｎｍ〜１０μｍ、４００ｎｍ〜７．５μｍ、４５０ｎｍ〜５μｍ、５００ｎｍ〜３μｍ、５５０ｎｍ〜２．５μｍ、６００ｎｍ〜２μｍおよび６５０ｎｍ〜１．７５μｍの範囲内から選択される平均直径を有し得る。特に好ましい範囲としては、限定されないが、１００ｎｍ〜１０μｍ、１５０ｎｍ〜７．５μｍ、２００ｎｍ〜５μｍ、３００ｎｍ〜４μｍ、５００ｎｍ〜３．５μｍ、５５０ｎｍ〜２μｍおよび６００ｎｍ〜１．５μｍが挙げられる。各サイズ、特により小さなサイズ、例えば１０μｍもしくはそれ未満、７．５μｍもしくはそれ未満、好ましくは５μｍもしくはそれ未満、２．５μｍもしくはそれ未満または１．５μｍもしくはそれ未満の粒子は取り扱い容易であり、結合混合物によく再懸濁され得る。さらに、各小粒子は、細胞外核酸に結合し、そしてそれ故結合混合物からそれを効率的に収集し得る大きな表面積を提供する。
【００５１】
結合工程を実施する際、アニオン交換粒子は、結合混合物中で粒子の移動を妨げるカラムまたは他のデバイスに含まれず、例えば結合混合物を撹拌する際、粒子は、結合混合物中で移動し得る。したがって、粒子を結合混合物から収集して、結合した細胞外核酸を回収しなければならない。一実施形態によれば、粒子は、磁性である。それらは、自動化に有利なマグネットを用いて処理され得るので、これは、粒子の処理を簡略化する。粒子は、フェリ磁性、強磁性、常磁性または超常磁性特性を有し得、好ましくは超常磁性である。このような特性は、適切な磁性材料を粒子中に組み込むことによって達成され得る。適切な方法は、当業者に公知である。好ましくは、磁性材料は、例えば、粒子の基材として使用されるシリカ、ポリケイ酸、ガラスまたはポリマー材料によって完全に封入される。特定の好ましい実施形態では、核酸結合マトリックスは、シリコン含有粒子、好ましくはポリケイ酸粒子、好ましくはアニオン交換基を有する磁性ポリケイ酸粒子である。
【００５２】
適切な粒子およびアニオン交換基の例は、それが参照される国際公開第２０１０／０７２８３４号、独国特許出願公開第１０  ２００８  ０６３  ００１号、国際公開第２０１００７２８２１号、独国特許出願公開第１０  ２００８  ０６３  ００３号および国際公開第９９／２９７０３号に記載されている。
【００５３】
アニオン交換粒子は、アニオン交換表面の結合能力が、サンプル中に含まれる核酸を上回るような量で添加される。これは、細胞外核酸の定量的な単離を支援する。サンプル１ｍｌ当たりの粒子の適切な量（ｍｇ単位）の非限定的な例としては、０．１５ｍｇ〜１０ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜３．５ｍｇ、０．７５ｍｇ〜３ｍｇ、１ｍｇ〜２．５ｍｇおよび１．２５ｍｇ〜２ｍｇが挙げられる。適切な量は、とりわけ、処理すべきサンプル容量および使用されるアニオン交換粒子に依存し、当業者によって決定され得る。
【００５４】
結合混合物は、粒子のアニオン交換表面に対する細胞外核酸の結合を可能にするｐＨを有する。結合混合物のｐＨは、本明細書では「結合ｐＨ」とも称される。結合ｐＨでは、アニオン交換基は、それらが核酸と相互作用してそれに結合し得るように荷電している。結合に適切なｐＨは、アニオン交換基の性質に特に依存する。結合ｐＨのための適切なｐＨ値は、当業者によって決定され得る。一実施形態によれば、結合ｐＨは、アニオン交換基のプロトン化可能な基のｐＫａ値未満である。アニオン交換基が、１種類を超えるプロトン化可能な基を含む場合、結合ｐＨは、少なくとも１つのプロトン化可能な基、好ましくはすべてのプロトン化可能な基のｐＫａ未満である。好ましくは、結合ｐＨは、ｐＫａ値よりも少なくとも０．５単位低く、より好ましくは前記ｐＫａよりも少なくとも１単位、少なくとも１．５単位、少なくとも２単位、少なくとも２．５単位、最も好ましくは少なくとも３単位低い。
【００５５】
結合混合物は、≦７、≦６．５、≦６．２５および≦６から選択されるｐＨを有し得る。一実施形態によれば、結合ｐＨは、３〜７の範囲内、より好ましくは３．５〜６．５；４〜６．２５；４．２５〜６および４．５〜５．７５から選択される範囲内である。酸性ｐＨ値は結合を増強し、さらに、例えばヒストン複合体中に捕捉され得る細胞外核酸（例えば、ＤＮＡ）の放出を支援し得るので有利である。
【００５６】
一実施形態によれば、結合混合物の調製は、サンプルのｐＨを結合ｐＨに調整することを含む。これは、酸性化化合物および／または試薬を添加することによって達成され得る。酸性化試薬の適切な例としては、限定されないが、酸、酸性緩衝剤、例えばカルボン酸、例えば酢酸、酢酸ナトリウム／酢酸バッファー、クエン酸／クエン酸塩バッファー、マレイン酸、マロン酸、酒石酸、ＨＣｌ、ＨＣｌＯ４、ＨＣｌＯ３、ギ酸、ホウ酸、Ｈ２ＳＯ４、Ｈ２ＳＯ３、酸性リン酸／リン酸塩緩衝系、ＭＥＳまたは他の水溶性無機酸もしくは有機酸が挙げられる。酸性化化合物は、結合混合物中の結合条件を確立するためにサンプルと接触される溶解および／または結合組成物中に含まれ得る。
【００５７】
結合ｐＨを維持するために、結合混合物はバッファーを含むことが好ましい。使用されるバッファーに応じて、バッファーは、結合混合物中の酸性条件を確立するために、酸性化化合物として同時に機能し得る。適切なバッファーとしては、限定されないが、カルボン酸系バッファー、リン酸系バッファー、ホスフェートバッファーおよびアミノ酸系バッファー、例えばグリシン、グルタミン酸／グルタミン、アスパラギン酸／アスパラギンが挙げられる。これらの種類のバッファーは、本発明の方法において十分に作用することが見出されたが、他のバッファー系も当業者によって決定され得る。カルボン酸、例えば酢酸、酢酸ナトリウム／酢酸バッファー、クエン酸／クエン酸バッファー、マレイン酸、マロン酸および酒石酸、特にクエン酸の使用が好ましい。バッファーは、溶解および／または結合組成物中に、したがって結合混合物中の結合条件を確立するためにサンプルと接触される試薬中に含まれ得る。
【００５８】
結合混合物は、塩を含み得る。塩を結合混合物中に組み込むことにより、単離結果が改善される。一実施形態によれば、塩は、アルカリ金属塩またはアンモニウム塩である。アルカリ金属塩は、一実施形態によれば、アルカリ金属ハロゲン化物である。適切な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化リチウムが挙げられ、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが好ましい。一実施形態によれば、塩化ナトリウムが使用される。塩は、５０ｍＭ〜１．５Ｍ、７５ｍＭ〜１Ｍ、１００ｍＭ〜７５０ｍＭ、１２５ｍＭ〜５００ｍＭおよび１５０ｍＭ〜３５０ｍＭから選択される濃度で、結合混合物中に含まれ得る。例えば、７５０ｍＭおよびそれを超える塩濃度を使用する場合、５またはそれ未満、好ましくは４．５またはそれ未満のｐＨを使用することが有利であり得る。５０ｍＭ〜７５０ｍＭまたは７５ｍＭ〜５００ｍＭの範囲内の塩濃度が特に好ましい。塩は、結合混合物中の結合条件を確立するためにサンプルと接触される溶解および／または結合組成物中に含まれ得る。
【００５９】
一実施形態によれば、結合混合物は、５００ｍＭもしくはそれを超える、２００ｍＭもしくはそれを超えるまたは１００ｍＭもしくはそれを超える濃度で、カオトロピック塩、例えばグアニジニウム塩、ヨウ化物、チオシアン酸塩、過塩素酸塩または同等かもしくはそれよりも強いカオトロピック性の他のカオトロピック塩を含まない。好ましくは、結合混合物は、このようなカオトロピック塩を欠く。これは、例えば、粒子に非特異的に結合し得るか、または収率に不利な循環ＤＮＡを共沈殿させ得る望ましくないタンパク質沈殿の防止を支援する。上記カオトロピック塩の欠如は、タンパク質が豊富なサンプル（例えば、血漿など）と直面した場合に特に有利である。
【００６０】
好ましい実施形態によれば、結合混合物は、タンパク質分解酵素をさらに含む。タンパク質分解酵素は、例えばタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドにおけるペプチド結合の切断を触媒する酵素である。例示的なタンパク質分解酵素としては、限定されないが、プロテイナーゼおよびプロテアーゼ、特にサブチリシン、サブチラーゼ、アルカリセリンプロテアーゼなどが挙げられる。例示的なサブチリシンとしては、限定されないが、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＲ、プロテイナーゼＴ、サブチリシン、サブチリシンＡ、ＱＩＡＧＥＮプロテアーゼなどが挙げられる。サブチラーゼ、サブチリシン、プロテイナーゼＫおよび他のプロテアーゼの議論は、特にＧｅｎｏｖら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４５：３９１−４００，１９９５に見られ得る。好ましくは、タンパク質分解酵素は、プロテイナーゼＫである。タンパク質分解酵素を組み込むことにより、得られる溶出液の純度が改善されることが見出された。特に、タンパク質混入の量が有意に減少する。加えて、特にタンパク質分解酵素の使用は、細胞外核酸収率を増加させることが見出された。これは、安定化サンプル（例えば、ホルムアルデヒドリリーサーを使用して安定化されたサンプル）が処理される場合に見られる。実施例によって実証されているように、前記方法は、例えば、Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴ（Ｓｔｒｅｃｋ）で安定化されたサンプルから無細胞ＤＮＡを単離する場合に高度に効率的である。酵素は、好ましくは、溶解および／または結合組成物中に含まれず、別個に添加される。
【００６１】
一実施形態によれば、結合混合物は、サンプルを組成物と、したがって少なくともポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む試薬と接触させることによって調製される。前記組成物は、場合により、塩および／またはバッファーを含み得る。塩およびバッファーに関する詳細は、上記に記載されている。溶解／結合組成物の成分は、結合混合物中に組み込まれ、したがって結合混合物中に存在する。したがって、この組成物は、結合条件の調製を支援し、加えて、サンプルの消化を支援して細胞外核酸を結合にアクセス可能にし得る。したがって、この組成物は、溶解および／または結合組成物（本明細書では簡潔に、溶解／結合組成物または溶解／結合試薬とも称される）として機能し得る。「消化」および「溶解」という用語は、本明細書では互換的に使用され、細胞含有サンプルの消化、および細胞枯渇または無細胞サンプルの消化を指す。消化または溶解は、例えば、関連タンパク質または他の成分から細胞外核酸を放出させることによって、それらが結合にアクセス可能になることを支援する。好ましくは、前記組成物は水溶液であり、酸性ｐＨ値を有する。この実施形態は、単に組成物をサンプルに添加することによって、結合混合物中の結合条件（結合ｐＨを含む）を確立することを可能にするので好ましい。組成物のｐＨは、３〜６．５、３．５〜６および４〜５．５から選択される範囲内あり得る。組成物のｐＨは、好ましくは、組成物が結合混合物中に組み込まれる場合に、本明細書に記載される結合ｐＨが確立されるようなものである。組成物は、ｐＨを維持するためのバッファーを含むことが好ましい。溶解および／または結合組成物の詳細はまた、第２の態様のキットと併せて記載されており、本明細書でも適用される各開示について言及されている。
【００６２】
一実施形態によれば、溶解および／または結合組成物は、結合条件を確立するために適切な量でサンプルに添加される。処理容量を少量に維持し、多量のサンプルを結合混合物中に含めるために、サンプルは、結合混合物の少なくとも５０％、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％または少なくとも８０％を構成することが好ましい。溶解および／または結合組成物は、その組成に応じて、例えば１：２５〜１：２、１：２０〜１：３、１：１５〜１：６および１：１０〜１：４から選択される比で添加され得る。
【００６３】
結合混合物を調製するために、サンプル、アニオン交換粒子ならびに溶解および／または結合組成物は、任意の順序で接触または添加され得る。本明細書で議論されるように、サンプルは、アニオン交換粒子が添加される前に溶解／結合組成物中で分解され得、および／またはそれは、結合混合物中で、したがってアニオン交換粒子の存在下で分解され得る。加えて、タンパク質分解酵素が、例えばサンプルに添加され得る。タンパク質分解酵素は、例えば、溶解／結合組成物の前に、その後に、もしくはそれと同時にサンプルと接触され得、ならびに／またはアニオン交換粒子の前に、その後に、もしくはそれと同時に添加され得る。
【００６４】
一実施形態によれば、サンプルを消化するために、サンプルは、溶解／結合組成物および場合により、しかし好ましくは、タンパク質分解酵素と接触される。サンプルを消化するために、得られた組成物は、インキュベートされ得る。このような消化工程は、例えば細胞外核酸に付随するタンパク質または他の成分からの細胞外核酸の放出を支援する。それにより、細胞外核酸は、核酸結合にアクセス可能になり得る。前記消化工程の後、結合混合物を調製するために、アニオン交換粒子が添加され得る。
【００６５】
代替の実施形態では、結合混合物は、
−アニオン交換粒子と、少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む組成物であって、場合により塩および／またはバッファーを含む組成物とを接触させることによって、懸濁液を形成すること；
−前記懸濁液と、細胞外核酸を含む生物学的サンプルとを接触させること；
−場合により、前記サンプルと前記懸濁液とを接触させる前に、それと同時に、またはその後に、タンパク質分解酵素を添加することによって調製される。
【００６６】
この実施形態は、重大な利点を有する。細胞外核酸を含む生物学的サンプルは、溶解／結合組成物を含む懸濁液およびアニオン交換粒子が提供された後に添加される。これは、サンプルと接触される取り扱い工程を減少させ、それにより、汚染リスクを減少させる。好ましい実施形態によれば、タンパク質分解酵素は、懸濁液とサンプルとを接触させる前に前記懸濁液中に組み込まれる。懸濁液を調製するために、タンパク質分解酵素、好ましくは上記溶解および／または結合組成物である組成物、ならびにアニオン交換粒子は、任意の順序で添加され得る。実施例によって実証されているように、サンプルの消化は、結合混合物中で起こり得る。
【００６７】
結合は、アニオン交換粒子に対する細胞外核酸の実質的な結合を可能にするために十分な時間の間に起こる。アニオン交換粒子に対する細胞外核酸の結合のために、結合混合物は、インキュベートされ得る。それぞれの必要かつ適切なインキュベーション時間は、使用される粒子およびアニオン交換基の種類および量、サンプル容量ならびにサンプル中の細胞外核酸の濃度に依存する。例えば、高密度のアニオン交換基を有し、したがって細胞外核酸に迅速かつ強固に結合することができる粒子が使用される場合、より短いインキュベーション時間で十分であり得る。より長いインキュベーション時間は、核酸がアニオン交換粒子に高度に効率的に結合し、それにより、サンプルからの細胞外核酸回収を最大化することを保証する。結合混合物は、例えば２分間〜１時間、好ましくは５分間〜４５分間、より好ましくは１０分間〜３５分間、より好ましくは１５分間〜３０分間インキュベートされ得る。結合混合物は、インキュベーション中に撹拌され得る。アニオン交換粒子と接触させる前にサンプルが溶解されない場合、長期インキュベーション工程が特に有利である。この実施形態では、サンプルの消化および放出された細胞外核酸の結合は、同じ処理工程で本質的に起こる。タンパク質分解酵素が用いられる場合、少なくとも１０分間または少なくとも１５分間のインキュベーション時間が、これがサンプル中に含まれるタンパク質の完全な消化を促進するので有利である。結合混合物は、前記インキュベーション工程中に撹拌され得る。
【００６８】
サンプルの消化を支援するためにタンパク質分解酵素を使用する場合、例えば、３５℃〜６５℃、例えば４０℃〜５５℃の範囲内の温度で加熱することによって、タンパク質分解酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）の活性を支援することが当技術分野では一般的である。このような加熱工程は、本発明の方法で実施され得るが、驚くべきことに、加熱工程を消化中に実施せずに消化が室温で起こると、単離結果が大幅に改善されることが見出され、実施例に示されている。したがって、消化および好ましくはさらに結合工程も室温で実施すれば、改善された結果が得られる。より好ましくは、前記方法のすべての工程（ａ）〜（ｄ）は、加熱せずに、したがって室温で行われる。
【００６９】
サンプルは、細胞外核酸を含む生物学的サンプルである。生物学的サンプルは、生物学的供給源から得られる。サンプルは、合成的に生産された核酸を有する人工サンプルではなく、生物学的供給源から得られる。生物学的サンプルは、通常、複雑な組成を有し、十分な純度による核酸単離を困難にする多くの異なる成分を含む。生物学的サンプルは、例えば、体液、全血、血漿、血清、痰、涙液、リンパ液、滑液、胸水、尿、汗、リカー、脳脊髄液、腹水、ミルク、便、気管支洗浄液、唾液、羊水、鼻汁、膣分泌物、表面生検、精子、精液／精漿、創傷分泌物および抽出物、ならびに細胞培養上清および他のスワブサンプルから得られた上清から群より選択され得る。一実施形態によれば、サンプルは、体液、体分泌物または体排泄物、好ましくは体液、または細胞外核酸を含む体液由来のサンプルである。最も好ましくは、サンプルは、全血、血漿または血清である。本発明の方法で処理され得るサンプルの他の例としては、限定されないが、細胞外核酸を含む、生物学的サンプルの細胞懸濁液、細胞培養物、細胞培養物の上清などが挙げられる。生物学的サンプルは、特に、例えばヒトもしくは動物から得られた、または細胞培養物由来の天然サンプルである。生物学的サンプルは、安定化され得る。安定化サンプルはまた、生物学的サンプルという用語およびさらに天然サンプルという用語によって包含される。さらに、細胞は、元のサンプルから除去されたものであり得る。各細胞枯渇または無細胞サンプルはまた、生物学的サンプルという用語およびさらに天然サンプルという用語によって包含される。各天然サンプルの典型的な例は、体液、例えば血液および体液由来サンプル、特に体液から細胞を除去することによって体液から生じるサンプルである。
【００７０】
一実施形態によれば、細胞外核酸を含む生物学的サンプルは、無細胞または細胞枯渇サンプルである。各無細胞または細胞枯渇生物学的サンプルは、例えば、細胞を除去するための適切な技術を使用して、細胞含有サンプルから得られ得る。典型的な例は、全血から得られ得る血漿または血清である。例えば全血の場合のように、サンプルが大量の細胞を含む場合、細胞外核酸を含むサンプルの無細胞、それぞれ細胞減少画分を得るために、細胞は、残りのサンプルから分離される。したがって、一実施形態によれば、細胞外核酸を含む無細胞または細胞枯渇サンプルであって、本発明の方法を使用して細胞外核酸が単離される無細胞または細胞枯渇サンプルを提供するために、細胞は、細胞含有サンプルから除去される。この細胞除去工程は任意選択的なものに過ぎず、例えば、微量の残存細胞を含むに過ぎないサンプル（例えば、血漿または血清など）が処理される（それぞれ処理のために得られる）場合にはもはや用いられないことがある。しかしながら、結果を改善するために、残りの各細胞（または潜在的に残る細胞）もまた、単離中に細胞外核酸集団に混入し得るので、除去されることが好ましい。サンプルの種類に応じて、細胞（残存細胞を含む）は、例えば、遠心分離、好ましくは高速遠心分離によって、または遠心分離工程を回避すべき場合には遠心分離以外の手段、例えばろ過、沈降もしくは（場合により、磁性）粒子上の表面に対する結合を使用することによって分離および除去され得る。各細胞除去工程はまた、自動サンプル調製プロトコールに容易に含められ得る。例えば、細胞内核酸を分析するために、それぞれ除去された細胞はまた、さらに処理され得る。細胞は、例えば保存され得、および／または生体分子、例えば核酸もしくはタンパク質などは、除去された細胞から単離され得る。
【００７１】
本方法は、少量の細胞外核酸を含む生物学的サンプルを処理するために特に適切である。サンプル中の核酸濃度が非常に低い場合であっても、良好な核酸収率が達成される。イントロダクションで議論されているように、例えば癌患者の血漿がより多量を含み得るとしても、細胞外核酸は、サンプル１ｍｌ当たり１〜１００ｎｇの比較的少量のサンプル（例えば、血漿または血清サンプルなど）中に含まれることが多いサンプルに依存している。一実施形態によれば、核酸を含有するサンプルは、サンプル１ｍｌ当たり２．５μｇまたはそれ未満、サンプル１ｍｌ当たり２μｇまたはそれ未満、サンプル１ｍｌ当たり１．５μｇまたはそれ未満、サンプル１ｍｌ当たり１μｇまたはそれ未満、サンプル１ｍｌ当たり７５０ｎｇまたはそれ未満、サンプル１ｍｌ当たり５００ｎｇまたはそれ未満、サンプル１ｍｌ当たり３００ｎｇまたはそれ未満、サンプル１ｍｌ当たり２００ｎｇまたはそれ未満、サンプル１ｍｌ当たり１５０ｎｇまたはそれ未満およびサンプル１ｍｌ当たり１００ｎｇまたはそれ未満から選択される濃度で、核酸を含む。
【００７２】
サンプルは、安定化サンプルを、したがって適切な薬剤によって安定化されたサンプルを構成し得る。例は、本明細書に記載される。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「複数の細胞外核酸」または「細胞外核酸」という用語は、特に、細胞中に含まれない核酸を指す。各細胞外核酸はまた、無細胞核酸とも称されることが多い。これらの用語は、本明細書では同義語として使用される。したがって、細胞外核酸は、通常、サンプル内の１つの細胞の外部にまたは複数の細胞の外部に存在する。「細胞外核酸」という用語は、例えば、細胞外ＲＮＡおよび細胞外ＤＮＡおよびそれらの混合物を指す。体液などの生物学的サンプルまたは例えば血漿などの体液由来のサンプルの無細胞画分（それぞれ一部）に見られる典型的な細胞外核酸の例としては、限定されないが、哺乳動物細胞外核酸、例えば細胞外腫瘍関連または腫瘍由来ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、他の細胞外疾患関連ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、エピジェネティック修飾ＤＮＡ、胎児ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ、ならびに非哺乳動物細胞外核酸、例えばウイルス核酸、例えば原核生物（例えば、細菌）、ウイルスまたは真菌から細胞外核酸集団に放出される病原性核酸が挙げられる。一実施形態によれば、細胞外核酸は、体液、または生物学的サンプルのような体液由来のサンプル、例えば血液、血漿、血清、唾液、尿、リカー、脳脊髄液、痰、涙液、汗、羊水またはリンパ液から得られる；好ましくは、細胞外核酸は、上記サンプルの無細胞または細胞枯渇部分から得られる。一実施形態によれば、細胞外核酸という用語は、特に、哺乳動物細胞外核酸、好ましくは疾患関連もしくは疾患由来細胞外核酸、例えば腫瘍関連もしくは腫瘍由来細胞外核酸、炎症もしくは傷害、特に外傷により放出される細胞外核酸、他の疾患に関連するおよび／もしくは他の疾患により放出される細胞外核酸、または胎児由来細胞外核酸を指す。本明細書に記載される「複数の細胞外核酸」または「細胞外核酸」という用語はまた、他のサンプル、特に体液以外の生物学的サンプルから得られる細胞外核酸を指す。本明細書では、本発明者らは、循環体液または循環体液（特に、循環体液の無細胞または細胞枯渇部分）由来サンプルから得られる細胞外核酸を循環細胞外または循環無細胞（ｃｃｆ）核酸と称する。一実施形態によれば、細胞外ＤＮＡ、特に循環無細胞ＤＮＡが単離される。
【００７４】
工程ａ）の終了時に、結合混合物中に含まれる細胞外核酸は、アニオン交換粒子に結合される。
【００７５】
（工程（ｂ）−分離）
工程（ｂ）では、結合した細胞外核酸を有する粒子は、残りの結合混合物から分離される。それにより、結合した細胞外核酸を有する粒子が収集される。この目的のために、当技術分野で公知の任意の手段が使用され得る。適切な手段としては、限定されないが、磁性粒子が使用される場合には磁気分離、例えば非磁性粒子が使用される場合には遠心分離、沈降、減圧の適用、ろ過などが挙げられる。
【００７６】
（工程（ｃ）−洗浄）
工程（ｂ）の後、工程（ｃ）では、場合により、１回またはそれを超える洗浄工程が実施され得る。一実施形態によれば、少なくとも１つの洗浄溶液、好ましくは洗浄バッファーは、細胞外核酸が結合した粒子と接触される。結合した細胞外核酸の最大回収を保証するために、洗浄条件は、洗浄中に、核酸結合マトリックスに結合したかなりの量の細胞外核酸がそこから除去されないように選択されるべきである。
【００７７】
洗浄溶液は、界面活性物質を含有し得る。適切な界面活性物質としては、限定されないが、非イオン性界面活性物質、例えば好ましくはポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーからなる群より選択されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性物質が挙げられる。好ましい例は、例えば約０．０１％〜１％の濃度のＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＢｒｉｊ５８である。
【００７８】
単離された細胞外核酸が、例えば、さらに精製されずに診断アッセイにおいて例えば直接分析および／または検出されることになる場合、洗浄は特に推奨される。単離された細胞外核酸が、例えば、潜在的な不純物（例えばＰＣＲ法など）に感受性の方法を使用して直接分析されることになる場合、少なくとも２回の洗浄工程を実施することが推奨される。一実施形態によれば、好ましくは、２つの異なる容量の洗浄溶液が使用される。本明細書では、第１の洗浄溶液の容量は、好ましくは、第２の洗浄溶液の容量よりも大きい。しかしながら、続いて、不純物に対して比較的非感受性の検出および／または分析方法が使用される場合、洗浄は必ずしも必要ではない。
【００７９】
適切な洗浄溶液もまた従来技術で公知であるので（例えば、国際公開第２０１３／０４５４３２号を参照のこと）、本明細書ではいかなるさらなる説明も必要としない。
【００８０】
（工程（ｄ）−溶出）
一実施形態によれば、前記方法は、アニオン交換粒子から細胞外核酸を溶出する工程（ｄ）をさらに含む。この工程は任意選択であるが、好ましい。
【００８１】
任意の適切な溶出方法が使用され得、適切な実施形態は当業者に公知である。好ましくは、溶出は、ｐＨ値の変化を伴う。したがって、一実施形態によれば、溶出は、結合ｐＨよりも高い溶出ｐＨで起こる。溶出ｐＨの選択は、とりわけ、粒子上に存在するアニオン交換基の性質、アニオン交換基の密度および溶出溶液のイオン強度に依存する。溶出ｐＨは、好ましくは、結合ｐＨよりも少なくとも０．５単位高く、結合ｐＨよりも少なくとも１単位高く、より好ましくは結合ｐＨよりも少なくとも１．５単位高くまたは少なくとも２単位高い。溶出ｐＨは、アニオン交換基のプロトン化可能な基のｐＫａ未満であり得るか、前記ｐＫａであり得るか、または前記ｐＫａを超え得る。
【００８２】
好ましくは、溶出溶液は、細胞外核酸が結合した粒子に添加される。溶出は緩衝剤を含有し得るが、これは必須ではない。２つまたはそれを超える溶出溶液を使用して溶出条件を作ることも本発明の範囲内である。例えば、２つまたはそれを超える溶出溶液を混合して単一の溶出溶液を形成し得、これと粒子とを接触させるか、または結合した核酸を有する粒子と、２つまたはそれを超える別個の溶出溶液（これらは共に、粒子と接触すると溶出条件を、したがって「溶出溶液」を作る）とを接触させ得る。溶出は、好ましくは、ｐＨ≧８および≦１４；ｐＨ≧８および≦１３．５；ｐＨ≧８および≦１３；≧８および≦１２．７５からなる群より選択される範囲内にあるｐＨで起こる。したがって、これらの範囲内のｐＨを有する溶出溶液が使用され得る。ｐＨ値はまた、目的のさらなる溶出用途に依存し得る。溶出がより高いｐＨ値（例えば、１０またはそれを超える）で起こるならば、例えば、各中性ｐＨ値が目的の下流用途に有益である場合、核酸を含む溶出液は中和され得る。
【００８３】
溶出はまた、加熱および／または振盪によって補助され得る。適切な溶出手順はまた、それが参照される国際公開第２０１３／０４５４３２に記載されている。
【００８４】
（工程（ｅ）−単離された細胞外核酸の分析）
単離された細胞外核酸は、適切なアッセイおよび／または分析方法を使用して分析および／またはさらに処理され得る。したがって、一実施形態によれば、工程（ｅ）では、単離された細胞外核酸は分析される。疾患、感染および／または少なくとも１つの胎児特徴を同定、検出、スクリーニング、モニタリングまたは排除するために、分析が実施され得る。
【００８５】
単離された細胞外核酸および／または単離された細胞外核酸中に含まれるもしくは含まれると疑われる特定の標的細胞外核酸は、同定され、定量され、改変され、少なくとも１つの酵素と接触され、増幅され、逆転写され、クローニングされ、配列決定され、プローブと接触され、および／または検出され得る。各方法は従来技術で周知であり、細胞外核酸を分析するために、医療、診断および／または予後予測分野で一般に適用されている（本発明の背景の詳細な説明も参照のこと）。したがって、場合により全核酸、全ＲＮＡおよび／または全ＤＮＡの一部として、細胞外核酸が単離された後、限定されないが、多数の新生物疾患、特に前悪性腫瘍および悪性腫瘍、例えば様々な形態の癌を含む疾患状態の存在、非存在または重症度を同定するために、それらは分析され得る。例えば、限定されないが、非侵襲的な出生前遺伝子検査、各スクリーニング、疾患スクリーニング、腫瘍学、癌スクリーニング、早期癌スクリーニング、癌治療モニタリング、遺伝子検査（ジェノタイピング）、感染症検査、病原体検査、傷害診断、外傷診断、移植医療または多くの他の疾患を含む適用の、したがって診断および／または予後予測関連の多くの分野で診断および／または予後予測マーカー（例えば、胎児または腫瘍由来細胞外核酸）を検出するために、単離された細胞外核酸は分析され得る。一実施形態によれば、疾患感染または胎児特徴を同定および／または特性評価するために、単離された細胞外核酸は分析される。核酸の分析／さらなる処理は、限定されないが、増幅技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、等温増幅、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、質量分析、蛍光検出、紫外線分光法、ハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列決定、制限分析、逆転写、ＮＡＳＢＡ、対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）、非対称ポリメラーゼ連鎖反応、指数関数後線形ポリメラーゼ連鎖反応（ｌｉｎｅａｒ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＬＡＴＥ−ＰＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ホットスタートポリメラーゼ連鎖反応、配列間特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＩＳＳＲ）、逆ポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション媒介性ポリメラーゼ連鎖反応、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応、固相ポリメラーゼ連鎖反応、またはそれらの任意の組み合わせを含む任意の核酸分析／処理方法を使用して実施され得る。各技術は当業者に周知であるので、本明細書ではさらなる説明を必要としない。
【００８６】
（実施形態）
本発明の方法は、手動で、または自動システムを使用することによって実施され得る。手動方法では、より大きなサンプル容量を処理し得ることが多い。自動システムは、通常、それらの設計により、それらが処理し得る容量に関する一定の限界を有する。自動システムは、特に、多くのサンプルを同時に処理可能であり、取扱いエラーが回避されるので自動システムはエラーが起こりにくいという利点を有する。多くの研究室において、医療および／または診断目的でサンプルが分析される場合のように、多数のサンプルを処理すべき場合には、これは特に有利である。本方法は、自動化に特に適切である。したがって、一実施形態によれば、前記方法は、自動システムを使用して実施される。この実施形態では、磁性粒子は粒子の処理を簡略化するので、磁性粒子を使用することが好ましい。結合した細胞外核酸を含む磁性粒子は、磁場の支援で、例えば永久磁石を使用することによって容易に処理され得る。この実施形態は、例えば、磁性粒子を処理することができる確立されたロボットシステムと適合する。本明細書では、本方法と併せて使用され得る様々なロボットシステムが当技術分野で使用されている。一実施形態によれば、磁性粒子を反応容器の底面または側面に収集し、残りの液体サンプルを反応容器から除去し、細胞外核酸が結合している収集した磁性粒子が残る。残りのサンプルの除去は、デカンテーションまたは吸引によって行われ得る。このようなシステムは従来技術で周知であるので、本明細書では詳細な説明を必要としない。磁性粒子を処理するための公知の代替システムでは、カバーまたはエンベロープによって通常覆われている磁石を反応容器に入れて、磁性粒子を収集する。次いで、例えば、洗浄または溶出工程を実施するために、収集した粒子を新たな反応容器に移す。各システムは従来技術で周知であり、また市販されているので（例えばＱＩＡＳＹＭＰＨＯＮＹ（登録商標）；ＱＩＡＧＥＮ）、本明細書ではいかなる詳細な説明も必要としない。実施例では、自動システムＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ（核酸濃縮および精製プロトコールを完全に自動で実行することができる市販の核酸抽出ロボット）も使用した。磁性粒子を処理するためのさらなる代替システムでは、磁性シリカ粒子を含むサンプルをピペットチップに吸引し、磁石を例えばピペットチップの側面に適用することによって、磁性粒子をピペットチップ内に収集する。次いで、残りのサンプルをピペットチップから放出させ得、ピペットチップ中の磁石により、結合した標的ＤＮＡ分子を有する収集した磁性シリカ粒子が残る。次いで、収集した磁性粒子をさらに処理し得る。このようなシステムもまた従来技術で周知であり、また市販されているので（例えば、ＢｉｏＲｏｂｏｔ  ＥＺ１，ＱＩＡＧＥＮ）、本明細書ではいかなる詳細な説明も必要としない。
【００８７】
一実施形態によれば、本方法で処理されるサンプル容量は、０．１ｍｌ〜２０ｍｌ、０．５ｍｌ〜１５ｍｌ、０．７５ｍｌ〜１０ｍｌ、１．０ｍｌ〜８ｍｌ、１．５ｍｌ〜６ｍｌおよび１．７５ｍｌ〜５ｍｌから選択される。
【００８８】
（例えば、多くの自動システムを用いた場合のように）一度に処理され得るサンプル容量に関する限界は、元のサンプルを分割し、サンプル部分を並行して処理し、例えば溶出前に溶出液またはアニオン交換材料を再統合することによって克服され得る。溶出液および／または固相のこのサンプル分割および再統合は、限られたサンプル容量しか処理し得ない自動システムを使用して、より大きなサンプル容量を容易に処理することを可能にする。さらなる非常に有利な実施形態では、細胞外核酸が単離されることになるサンプルもまた、２つまたはそれを超える部分に分割される。第１の部分（サンプル部分１とも称される）については、本明細書に記載されるように、工程（ａ）および（ｂ）を実施する。次いで、サンプル部分１から得られた結合した細胞外核酸を有する粒子を、第２のサンプル部分（サンプル部分２とも称される）の粒子として使用し、さもなければ、本明細書に記載される工程（ａ）にしたがってこれを処理する。したがって、工程（ａ）では、サンプル部分２中に含まれる細胞外核酸は、サンプル部分１由来の細胞外核酸が既に結合したのと同じ粒子に結合する。サンプル部分２の結合工程の後、第１および第２のサンプル部分由来の細胞外核酸が結合した粒子を提供する。次いで、サンプル部分１およびサンプル部分２由来の結合した細胞外核酸を有する粒子を、サンプル部分２の残りの結合混合物から分離する。次いで、場合により、工程（ｃ）および（ｄ）で定義されるように、サンプル部分１および２由来の結合した細胞外核酸を洗浄および溶出し、または存在する場合には、サンプル部分１および２由来の結合した細胞外核酸を有する粒子を、サンプル部分３の結合混合物中の粒子として使用し得る。この原理は、存在するサンプル部分の数に対して実施され得る。次いで、場合により、サンプル部分１、サンプル部分２および場合によりさらなるサンプル部分由来の結合した細胞外核酸を洗浄および溶出し得る。それにより、元のサンプル由来の細胞外核酸を含む溶出液を得ることができる。必要な溶出工程はわずか１回である。自動システムを使用して前記方法を実施する場合、この原理は特に有利であることが見出された。本明細書では、サンプル部分１を処理し、例えば粒子に対するサンプル部分１の細胞外核酸の結合のためにインキュベートする時間中は、粒子を除いて、サンプル部分２のための結合混合物を調製し得る。さらに、サンプル投入量とは無関係に、同量の粒子を使用し得、これは、核酸の一定の／ロバストな溶出に有利である。
【００８９】
一実施形態によれば、前記方法は、
（ａ）前記生物学的サンプルから、
ｉ）細胞外核酸；
ｉｉ）アニオン交換表面を提供する磁性粒子；
ｉｉｉ）０．１％〜１０％、好ましくは０．１５％〜７．５％、より好ましくは０．２％〜６％の濃度の少なくとも１つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル；
ｉｖ）少なくとも１つのアルカリ金属塩；
（ｖ）場合により、少なくとも１つのタンパク質分解酵素
を含む結合混合物であって、細胞外核酸が前記粒子に結合するように≦６．５のｐＨを有する結合混合物を調製すること；
（ｂ）残りの結合混合物から、前記結合した細胞外核酸を有する磁性粒子を磁気により分離すること；
（ｃ）前記結合した細胞外核酸を洗浄すること；
（ｄ）結合した細胞外核酸を溶出すること
を含む。
【００９０】
適切で好ましいポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルおよびアニオン交換粒子は、上記に記載されており、それは、各開示について言及されている。生物学的サンプルは、一実施形態によれば、体液または体液由来サンプル、例えば血漿または血清などである。結合混合物のｐＨを維持するために、緩衝剤が使用され得る。
【００９１】
一実施形態によれば、前記方法は、
（ａ）前記生物学的サンプルから、
ｉ）細胞外核酸；
ｉｉ）アミン基を含むアニオン交換表面を提供する磁性粒子；
ｉｉｉ）０．１％〜６％、０．２％〜５％、０．２５％〜４％および０．３％〜３％から選択される濃度の少なくとも１つのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルであって、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテルおよびポリオキシエチレンオレイルエーテルからなる群より選択され、好ましくはポリオキシエチレンセチルエーテルであるポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル；
ｉｖ）１００ｍＭ〜１Ｍ、１２５ｍＭ〜７５０ｍＭおよび１２５ｍＭ〜５００ｍＭから選択される濃度の少なくとも１つのアルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化リチウムから選択され、より好ましくは塩化ナトリウムである）；
（ｖ）場合により、少なくとも１つのタンパク質分解酵素
を含む結合混合物であって、細胞外核酸が前記粒子に結合するように≦６．５のｐＨを有する結合混合物を調製すること；
（ｂ）残りの結合混合物から、前記結合した細胞外核酸を有する磁性粒子を磁気により分離すること；
（ｃ）前記結合した細胞外核酸を洗浄すること；
（ｄ）結合した細胞外核酸を溶出すること
を含む。
【００９２】
生物学的サンプルは、一実施形態によれば、体液または体液由来サンプル、例えば血漿または血清などである。結合混合物のｐＨを維持するために、緩衝剤が使用され得る。
【００９３】
一実施形態によれば、細胞外核酸が単離されるサンプルは、安定化サンプルである。血液サンプルまたは血液由来サンプル、例えば血漿または血清などの多くのサンプルは、収集の際に適切な安定剤を使用して安定化される。例えば、血液または血液由来サンプル、例えば血漿または血清は、通常、少なくとも抗凝固剤、好ましくはキレート剤、例えばＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウムを添加することによって安定化される。使用される安定化は、サンプル中の細胞外核酸集団を保存するために添加され得る。サンプル中に含まれる細胞外核酸集団の安定化を含むサンプルの安定化を達成するいくつかの方法は、従来技術で公知である。安定化は、細胞外核酸の分解を防止し、および／または細胞内核酸、特にサンプル中に含まれる細胞から放出されるゲノムＤＮＡによる細胞外核酸の混入を防止する。
【００９４】
細胞外核酸を安定化するための高度に効率的な安定化技術は、国際公開第２０１３／０４５４５７号、国際公開第２０１３／０４５４５８号、国際公開第２０１４／１４６７８１号、国際公開第２０１４／０４９０２２号およびＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５５６９９号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。これらの方法は、ホルムアルデヒドリリーサーの使用に依拠しないという利点を有する。実験では、本発明の方法は、これらの技術にしたがって安定化した血漿サンプルなどのサンプルから細胞外核酸を単離する際にも高度に効率的であることが示された。
【００９５】
さらなる公知の原理は、ホルムアルデヒドリリーサーの使用を用いる（例えば、米国特許第７，３３２，２７７号および米国特許第７，４４２，５０６号を参照のこと）。ホルムアルデヒドリリーサーに基づく安定剤は、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＲＮＡ  ＢＣＴ（採血管）という名称でＳｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ．から市販されており、米国特許第８，３０４，１８７号および米国特許第８，５８６，３０６号の特許によって保護されていると記載されている。本明細書では、安定化は、とりわけ、ジアゾリジニル尿素の使用を伴う。しかしながら、ホルムアルデヒドまたはホルムアルデヒド放出物質の使用は、核酸分子間またはタンパク質と核酸との間の架橋の誘導による細胞外核酸の単離が妨げられ得るので、欠点を有する。したがって、多くの従来の核酸単離方法は、ホルムアルデヒドリリーサー安定化サンプルからの細胞外核酸の定量的な単離を可能にせず、収率の減少をもたらす。本発明の方法は、ホルムアルデヒドリリーサー安定化サンプル、例えばジアゾリジニル尿素などのホルムアルデヒドリリーサーを使用して安定化された血液から得られた血漿サンプルなどから細胞外核酸を効率的に単離するために使用され得る。達成可能な細胞外核酸収率は高い。これは、特に、タンパク質分解酵素が結合混合物中に含まれる場合である。
【００９６】
したがって、一実施形態によれば、ホルムアルデヒドリリーサー安定化サンプルから細胞外核酸を単離するために、本発明の方法は使用される。ホルムアルデヒドリリーサーの使用に基づく各安定化方法は従来技術で公知であり、例えば、米国特許出願公開第号２０１１／０１１１４１０号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。安定化サンプルは、サンプル、例えば血液と、少なくとも１つのホルムアルデヒドリリーサーとを接触させることによって得られる。本明細書に記載されるように、好ましくは、細胞は除去され、細胞外核酸は、安定化サンプルの無細胞画分、例えば血液の場合には血漿または血清などから単離される。ホルムアルデヒドリリーサーは、ホルムアルデヒドおよび／またはパラホルムアルデヒドを経時的に放出する化合物として一般に記載されている。本方法と併せて使用され得る適切な「ホルムアルデヒドリリーサー」としては、限定されないが、ジアゾリジニル尿素、イミダゾリジニル尿素、ジメチロール（ｄｉｍｅｔｈｏｙｌｏｌ）−５，５ジメチルヒダントイン、ジメチロール尿素、２−ブロモ−２．−ニトロプロパン−１，３−ジオール、オキサゾリジン、ヒドロキシメチルグリシンナトリウム、５−ヒドロキシメトキシメチル−１−１アザ−３，７−ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン、５−ヒドロキシメチル−１−１アザ−３，７ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン、５−ヒドロキシポリ［メチレンオキシ］メチル−１−１アザ−３、７−ジオキサビシクロ［３．３．０］オクタン、第４級アダマンティンまたは上記の任意の組み合わせが挙げられる。ホルムアルデヒドリリーサーは、好ましくは複素環式尿素であり、ジアゾリジニル尿素（ＤＵ）、イミダゾリジニル尿素（ＩＤＵ）およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択され得る。有利な実施形態では、安定化は、ジアゾリジニル尿素（ＤＵ）および／またはイミダゾリジニル尿素、好ましくはジアゾリジニル尿素の使用を伴った。安定化効果を改善するために、サンプルは、さらなる添加物と接触され得る。例えば、血液または血液由来サンプルを安定化する場合、安定化は、抗凝固剤の添加を伴い得る。安定化組成物中に含まれ得るか、またはサンプルに別個に添加され得る抗凝固剤の例としては、限定されないが、ヘパリン、金属イオンキレート剤、特にクエン酸塩、シュウ酸塩、ＥＤＴＡおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９７】
一実施形態によれば、全核酸がサンプルから単離され、細胞外核酸は一部としてそこに含まれる。サンプルが無細胞または細胞枯渇サンプルである場合、そこから単離された全核酸は、主に細胞外核酸を含むか、またはまったく細胞外核酸からなる。少なくとも優勢に特定の標的核酸を単離することも本発明の範囲内である。標的核酸は、例えば、特定の種類の核酸、例えばｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、他の非コード核酸、エピジェネティック修飾核酸、および細胞外核酸集団に含まれる他の核酸を含むＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。例えば、単離後にヌクレアーゼを使用して非標的核酸を消化することも本発明の範囲内である。標的核酸という用語はまた、特定の種類の核酸、例えば特定の疾患マーカーまたはウイルス核酸であることが公知の細胞外核酸を指し得る。上記のように、細胞外核酸の単離はまた、例えば適切な捕捉プローブを使用することによって、各標的核酸の特異的単離を含み得る。「標的核酸」という用語はまた、特定の長さを有する核酸、例えば、２０００ｎｔもしくはそれ未満、１０００ｎｔもしくはそれ未満または５００ｎｔもしくはそれ未満の長さを有する核酸を指す（上記のように、二本鎖ＤＮＡの場合、「ｎｔ」によって示される鎖長は、ｂｐを指す）。細胞外核酸は、通常、２０００ｎｔ未満、通常は１０００ｎｔ未満、多くの場合にはさらに５００ｎｔ未満のより小さなサイズを有することが公知であるので、より小さな各標的核酸の単離が有利であり得る。単離、それぞれ精製を小さな各核酸に集中することにより、単離された核酸における得られる細胞外核酸の部分を増加させ得る。
【００９８】
好ましくは、第１の態様の方法を実施するために、第２の態様のキットが使用される。キットの特徴に関しては、以降の開示を参照のこと。
【００９９】
（キット）
第２の態様によれば、第１の態様の方法を実施するためのキットが提供される。前記キットは、
（ａ）
ｉ）少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル；
ｉｉ）少なくとも１つの塩；
ｉｉｉ）少なくとも１つのバッファー
を含む溶解および／または結合組成物であって、酸性ｐＨを有する溶解および／または結合組成物；
（ｂ）アニオン交換表面を提供する粒子；ならびに
（ｃ）場合により、タンパク質分解酵素；
（ｄ）場合により、１つまたはそれを超える洗浄溶液、ならびに
（ｅ）場合により、１つまたはそれを超える溶出溶液
を含む。
【０１００】
第１の態様の方法を実施するために、前記キットが使用され得る。利点は上記に記載されている。結合混合物を調製するためにサンプルに添加される溶解および／または結合組成物中にポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含めることが有利である。粒子の保存中に起こり得るアニオン交換表面の変動が補償され、それにより、単離結果が改善される。単離された核酸は、高い品質および純度のものである。それにより、前記方法はより信頼性が高くなり、これは特に、細胞外核酸が医療および／または診断分野で単離される場合に重要な利点である。
【０１０１】
溶解および／または結合組成物は、少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む。詳細は上記に記載されており、本明細書でまた適用される上記開示に言及されている。上記のように、ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルは、ポリオキシエチレンセチル、ポリオキシエチレンオレイルおよびポリオキシエチレンステアリルアルコールエーテルから選択され得、好ましくは、ポリオキシエチレン（１０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５６）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）５８）、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）７８）およびポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）９８）からなる群より選択される。ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルの使用が特に好ましい。
【０１０２】
少なくとも１つのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル（これは、好ましくは、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルである）は、０．２％〜飽和限界までの濃度で、溶解および／または結合組成物中に含まれ得る。適切な濃度としては、限定されないが、０．５％〜１５％、０．７５％〜１２．５％、１％〜１０％、１．５％〜７．５％および２％〜６％が挙げられる。１つを超えるポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルが溶解および／または結合組成物中に含まれる場合、示されている濃度範囲は、一実施形態によれば、含まれるポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルの総濃度を指す。
【０１０３】
溶解および／または結合組成物は、塩を含む。塩は、一実施形態によれば、アルカリ金属塩またはアンモニウム塩である。アルカリ金属塩は、好ましくは、アルカリ金属ハロゲン化物である。適切な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化リチウムが挙げられ、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが好ましい。一実施形態によれば、塩化ナトリウムが使用される。塩は、１００ｍＭ〜４Ｍ、２００ｍＭ〜３．５Ｍ、３００ｍＭ〜３Ｍ、５００ｍＭ〜２．５Ｍ、７５０ｍＭ〜２．２５Ｍおよび１Ｍ〜２Ｍから選択される濃度で、溶解および／または結合組成物中に含まれ得る。
【０１０４】
溶解および／または結合組成物は、バッファーを含む。バッファーは、好ましくは酸性である。適切なバッファーは、本方法と併せて上記に記載されている。それらとしては、限定されないが、酸性緩衝剤、例えばカルボン酸、例えば酢酸、酢酸ナトリウム／酢酸バッファー、クエン酸／クエン酸塩バッファー、マレイン酸、マロン酸および酒石酸、リン酸系バッファー、ホスフェートバッファーおよびアミノ酸系バッファー、例えばグリシン、グルタミン酸／グルタミン、アスパラギン酸／アスパラギンが挙げられる。クエン酸などのカルボン酸の使用が好ましい。
【０１０５】
溶解および／または結合組成物は、酸性ｐＨを有する。組成物のｐＨは、３〜６．５、３．５〜６および４〜５．５から選択される範囲内にあり得る。サンプルと溶解および／または結合組成物とを接触させると、サンプルのｐＨは低下し、結合ｐＨが確立される。
【０１０６】
キットは、アニオン交換表面を提供する粒子をさらに含む。粒子およびアニオン交換基に関する詳細は上記に詳細に記載されており、本明細書でまた適用される上記開示に言及されている。好ましくは、粒子は、アミノ基、例えば第１級、第２級または第３級アミノ基などを含む。上記のように、粒子は、好ましくは磁性である。
【０１０７】
キットは、タンパク質分解酵素をさらに含み得る。詳細は上記に記載されており、本明細書でも適用される上記開示に言及されている。好ましくは、タンパク質分解酵素は、プロテイナーゼＫである。酵素は、好ましくは、溶解および／または結合組成物中に含まれない。
【０１０８】
キットは、１つまたはそれを超える（ｏｎｅ  ｍｏｒｅ）洗浄溶液をさらに含み得る。詳細は上記に記載されており、本明細書でまた適用される上記開示に言及されている。
【０１０９】
キットはまた、１つまたはそれを超える溶出溶液を含み得る。詳細は上記に記載されており、本明細書でまた適用される上記開示に言及されている。
【０１１０】
本発明は、本明細書に開示される例示的な方法および材料によって限定されず、本明細書に記載されるものと類似または等価な任意の方法および材料は、本発明の実施形態の実施または試験において使用され得る。数値範囲は、範囲を規定する数字を含む。本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態の限定ではなく、全体として本明細書を参照することにより読まれ得る。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の態様を含む。したがって、例えば、「ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル」についての言及は、単一の種類のポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル、および２つまたはそれを超えるポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを含む。同様に、「ａ」「塩」、「添加物」、「バッファー」などについての言及は、単一の実体およびこのような実体の２つまたはそれを超える組み合わせを含む。「開示」および「本発明」などについての言及は、本明細書で教示される単一または複数の態様を含む；など。本明細書で教示される態様は、「本発明」という用語によって包含される。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「溶液」という用語は、特に液体組成物、好ましくは水性組成物を指す。それは、一相のみの均一な混合物であり得るが、溶液が、特に安定剤などの含まれる化学物質の固体添加物（例えば、沈殿物など）を含むことも本発明の範囲内である。
【０１１３】
ヌクレオチド（ｎｔ）に関して本明細書に示されるサイズ、それぞれサイズ範囲は、鎖長を指し、したがって、一本鎖および二本鎖分子の長さを記載するために使用される。二本鎖分子では、前記ヌクレオチドは対合している。
【０１１４】
一実施形態によれば、方法の場合には特定の工程を含むものとして、または組成物、溶液および／もしくはバッファーの場合には特定の成分を含むものとして本明細書に記載される主題は、各工程または成分からなる主題を指す。本明細書に記載される好ましい実施形態を選択および組み合わせることが好ましく、好ましい実施形態の各組み合わせから生じる特定の主題もまた本開示に属する。
【０１１５】
本出願は、ＥＰ１５１７１４６６号（出願日：２０１５年６月１０日）（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）の優先権を主張している。
【実施例】
【０１１６】
（材料および方法）
２回の遠心分離工程を実施して細胞を除去することによって（１．９００×ｇで１５分間、１６．０００×ｇ（４℃）で１０分間）、全血サンプルから血漿サンプルを得た。自動システム（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ）を使用して、血漿サンプル（特に指示がない場合には２ｍｌ）から、細胞外ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）を単離した。血漿と以下の試薬とを接触させて、結合混合物（ｐＨ約５）を調製した：
−アルカリ金属塩（１．５〜２Ｍ）、カルボン酸および非イオン性界面活性剤を含む溶解／結合バッファー（ｐＨ４〜５）。実施した実験では、異なる非イオン性界面活性剤を使用し、異なる濃度で比較した（以下を参照のこと）。溶解／結合バッファーは、サンプルの消化および細胞外核酸の放出を支援する。それは、結合条件を確立する。
−サンプル中に含まれるタンパク質を消化するためのプロテイナーゼＫ。
−アニオン交換基として第３級アミン基を含む磁性シリカ粒子（２ｍｌの血漿に対して約３ｍｇ）。
【０１１７】
結合混合物を２０分間インキュベートして、アニオン交換粒子に対するｃｃｆＤＮＡの結合を可能にした。結合したｃｃｆＤＮＡを３回洗浄し、７５μｌのアルカリ溶出溶液（ｐＨ約１２）を使用して溶出した。
【０１１８】
比較のために、「１ｍｌ、２ｍｌまたは３ｍｌの血清または血漿から循環核酸を精製する」ためのプロトコールを使用し、ＱＩＡａｍｐ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を使用して、血漿からｃｃｆＤＮＡを単離した。特に指定がない場合には、２ｍｌの血漿をプロテイナーゼＫおよび溶解バッファーＡＣＬと混合し、６０℃で３０分間インキュベートし、バッファーＡＣＢと混合し、ＱＩＡｖａｃ  ２４  Ｐｌｕｓ  ｖａｃｕｕｍ  ｍａｎｉｆｏｌｄを使用してＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉ  ｃｏｌｕｍｎｓ（これは、核酸を結合するためのシリカ固相を含む）上に結合させ、洗浄し、製造業者の推奨にしたがってそれぞれ６０μｌおよび７５μｌの溶出バッファーＡＶＥで溶出した。
【０１１９】
得られた核酸収率（１８ｓ  ｒＤＮＡ（６６ｂｐ）および１８ｓ  ｒＤＮＡ（５００ｂｐ）をＰＣＲによって分析し、ゲノムＤＮＡ希釈系列と比較して、コピー数を決定した。特に指定がない場合には、単離されたｃｃｆＤＮＡを、８μｌの溶出液を使用してＡｂｉ  Ｐｒｉｓｍ  ＨＴ７９００（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってリアルタイムＰＣＲアッセイで分析した。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ）を使用した２０μｌのアッセイ容量では、ヒト１８Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の２つの断片（６６ｂｐおよび５００ｂｐ）をマルチプレックスＰＣＲで増幅した。個々のサンプルのサイクル閾値（Ｃｔ値）を、ｇＤＮＡ標準曲線にしたがって溶出液中のｇＤＮＡの量に変換した：１０．０００〜１０ゲノム当量（１ゲノム当量は、約３．６ｐｇのヒトゲノムハプロイドＤＮＡに等しい）に希釈したヒトゲノムＤＮＡを用いて作成した標準曲線との比較によって、全体的な定量を行った。それにより、溶出液中のコピー数を決定することができる。次いで、使用した溶出液の量の差異を排除するために、このコピー数を、使用した溶出液の量（例えば、８μｌの溶出液を使用した場合には８）で割った。それにより、溶出液１μｌ当たりのコピー数を決定する。次いで、この値に、全溶出液の量（例えば、溶出液の容量が７５μｌの場合には７５）を掛けた。それにより、溶出液中のコピー数を決定し、異なる実験間で比較することができる。加えて、使用した血漿容量の量の差異を排除するために、この計算した全コピー数を、次いで、使用した血漿容量の量（例えば、２ｍｌの血漿を使用した場合には２）で割った。それにより、血漿１ｍｌ当たりのコピー数を決定し、異なる実験間で比較することができる。
【表１】
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【０１２０】
（実施例１）
血漿中のｃｃｆＤＮＡ濃度が非常に低いので、ｃｃｆＤＮＡによるビーズの飽和は限界ではないが、粒子のアニオン交換表面の小さな差異（利用可能な正荷電基の可能性が最も高い）は、ｃｃｆＤＮＡ回収に対する大きな効果をもたらすことが見出された。１つの説明は、（血漿中で非常に過剰な利用可能な）不純物が、アニオン交換粒子に対する結合についてｃｃｆＤＮＡと競合するということである。加えて、ｃｃｆＤＮＡの親和性は、利用可能な負荷電骨格に強く依存し、そしてこれは、相互作用タンパク質からの放出に依存する。したがって、アニオン交換表面の小さな変化は、不純物およびｃｃｆＤＮＡの競合する親和性に強く影響し、ｃｃｆＤＮＡ回収の有意な減少をもたらし得る。アニオン交換表面のこのような変化は、アニオン交換粒子の製造プロセス中に、または例えばキットとして提供される場合には粒子の長期保存中に起こり得る。この効果は、界面活性剤を結合混合物中で使用しない場合に見られ、非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を結合混合物中で使用した場合にも見られた。
【０１２１】
実施例１では、Ｂｒｉｊ５８などのポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを結合バッファー中に含めることにより、アニオン交換粒子の性能の差異が補償されることを実証する。この結果は、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルが、アニオン交換粒子に対するｃｃｆＤＮＡの親和性を増加させ、したがってアニオン交換表面の変動に直面した場合であっても、一貫して高い収率によるｃｃｆＤＮＡの単離を達成することを示している。非イオン性界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した場合、この有利な効果は見られなかった。
【０１２２】
実施例１では、同じ種類のアニオン交換粒子の４つの異なるビーズロットを使用した。以前の実験から、これらのビーズロットは、非イオン性界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を結合混合物中で使用した場合、ｃｃｆＤＮＡ回収の減少を示すことが既知であった。対照的に、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルＢｒｉｊ５８を結合混合物中で使用した場合、ｃｃｆＤＮＡ回収に関してよりロバストな性能が見られた（図１を参照のこと）。結合したｃｃｆＤＮＡを有する粒子を除去した結合混合物の残留物（上清）の分析により、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用した際のｃｃｆＤＮＡ収率の減少は、上清中に見られる高い割合のｃｃｆＤＮＡに基づくものであり、したがってこれは、アニオン交換表面が、サンプル中に存在するｃｃｆＤＮＡに対して非常に過剰であるにもかかわらず、結合工程中にこれらがアニオン交換粒子に結合しなかったことが確認された。
【０１２３】
（実施例２）
ＥＤＴＡ安定化血漿から細胞外核酸を単離した第２の実験設定では、Ｂｒｉｊ５８を結合混合物中に組み込む結合条件と組み合わせてより感受性のビーズ（「経年劣化プロセス」）を使用して、ｃｃｆＤＮＡ回収のロバスト性の増加が確認された。２カ月間の保存中に性能低下を示すアニオン交換粒子（Ｒ１．１．１およびＲ１．２．１）、または７カ月間の保存後に性能低下を示す参照ビーズ（Ｐ７．１．１）では、非イオン性界面活性剤としてＢｒｉｊ５８を結合混合物中で使用した場合、ｃｃｆＤＮＡ収率を初期収率に回復させることができた（図２を参照のこと）。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によるｃｃｆＤＮＡ回収に関して良好な性能を示すアニオン交換粒子は、Ｂｒｉｊ５８を使用した場合、性能をさらに増加させることができなかった。
【０１２４】
（実施例３）
ｃｃｆＤＮＡ回収に対する影響を評価するために、異なるさらなる界面活性剤を試験した。ＣＴＡＢ、ＤＴＡＢ、ＣＨＡＰＳなどの界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較して低い性能を示した（データは示さず）。
【０１２５】
（実施例４）
結合混合物中異なる濃度の非イオン性界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＢｒｉｊ５８（ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル）を比較するために、実験を実施した。目的は、ｃｃｆＤＮＡ抽出効率に対する非イオン性界面活性剤の影響を評価することであった。図３は、リアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列）における小さなアンプリコン（６６ｂｐ）の増幅について、Ｂｒｉｊ５８がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較して同程度のｃｃｆＤＮＡ回収を示したことを示す。５００ｂｐアンプリコンの増幅により、０．５％Ｂｒｉｊ５８を結合混合物中で使用した場合の大きなＤＮＡ断片の抽出効率／純度は、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較して改善したことが明らかになった（図４を参照のこと）。
【０１２６】
結合バッファー中異なる濃度のＢｒｉｊ５８を比較するさらなる実験では、結合混合物中０．１〜２．０％Ｂｒｉｊ５８の範囲内でｃｃｆＤＮＡ抽出性能の有意差は示されなかった。図５に示されているように、参照（ＱＩＡａｍｐ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｋｉｔ）と同程度の性能を達成しながら、結合混合物中最大５％のより高濃度のＢｒｉｊ５８を使用することもできる。したがって、ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルＢｒｉｊ５８は、結合混合物中様々な濃度で有効であった。さらに、このポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルは、溶解および／または結合組成物中で、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較して高い溶解性を示した。したがって、Ｂｒｉｊ５８は、結合混合物だけではなく溶解および／または結合組成物中でも、より高濃度で使用することができた。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の濃度の増加、ならびに４５℃におけるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００含有溶解および／または結合組成物の保存（長期保存のシミュレーション）は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の溶解度の限界を超える。実験において、この効果は、Ｂｒｉｊ５８では見られなかった。
【０１２７】
（実施例５）
Ｂｒｉｊ５８を結合混合物中に含めたプロトコールを使用して得られた溶出液で見られた改善が、ｃｃｆＤＮＡ収率の増加に起因し、および／または溶出液のより高い純度に起因したかを分析した。溶出液は、より少ないＰＣＲ阻害剤を含むか、またはＰＣＲ阻害剤を含まないので、より純粋な溶出液は、ＰＣＲ反応に対するより低い阻害効果を示す。そして、これがｃｃｆＤＮＡの検出を増加させ、結果を改善する。
【０１２８】
図６および７は、溶出液の純度に対する結合混合物中のＢｒｉｊ５８の影響およびその後のＰＣＲ効率／ＰＣＲ阻害をＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較して示す。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を結合混合物中で使用した場合（図６を参照のこと）、血漿投入量を２ｍｌから６ｍｌに増加させ（溶出液中の不純物濃度の増加）、ＰＣＲにおいて使用する投入量を２μｌから８μｌに増加させると、ＰＣＲ阻害がある程度見られ、大きな５００ｂｐアンプリコンのｃｃｆＤＮＡ収率の減少が示された。
【０１２９】
対照的に、Ｂｒｉｊ５８を結合混合物中で使用した場合、ＰＣＲ阻害は見られなかった（図７を参照のこと）。２〜６ｍｌの血漿投入量では、大きな５００ｂｐアンプリコンについて、同程度のｃｃｆＤＮＡ収率が見られ、ＰＣＲにおいて使用する投入量を２μｌから８μｌに増加させると、ｃｃｆＤＮＡ回収がわずかに増加した。
【０１３０】
下流用途との適合性の増加を伴う溶出液の純度の明確な増加に関する１つの説明は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）である。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を１．６ｍＭ（ＣＭＣ：０．２〜０．９ｍＭ）の最終濃度で使用し、Ｂｒｉｊ５８を４．５ｍＭ（ＣＭＣ：０．０８ｍＭ）の最終濃度で使用する。Ｂｒｉｊ５８は、血漿由来の不純物を含み得る処理溶液内でミセルを形成し、それにより、ビーズに対する不純物の結合を防止する可能性が高い。
【０１３１】
（Ｉ）（ミセルに包埋された）競合物質不純物のアベイラビリティの減少、および（ＩＩ）タンパク質複合体に封入されたＤＮＡと比較して高いＡｎＥｘビーズ親和性を示す、より「ネイキッドな」ｃｃｆＤＮＡ（ＤＮＡ−タンパク質複合体からの不純物（＝タンパク質）の除去）により、不純物の除去は、溶出液の純度に影響を与え得るだけではなく、ｃｃｆＤＮＡのＡｎＥｘビーズ親和性にも影響を与え得る。
【０１３２】
（実施例６）
驚くべきことに、消化中の温度は、ｃｃｆＤＮＡ収率に影響を及ぼすことが見出された。実施例６では、２ｍｌの血漿サンプルからｃｃｆＤＮＡを抽出した。室温または６５℃における１０分間のインキュベーションと組み合わせて、３０μｌまたは６０μｌのＰｒｏｔＫのいずれかを結合混合物中で使用することによって、消化条件を改変した。結合バッファー中、ＰｒｏｔＫの存在下でサンプルを消化した後、磁性アニオン交換粒子を添加してｃｃｆＤＮＡを結合した。各条件を６回反復で試験した。
【０１３３】
驚くべきことに、溶解中の高温は、ｃｃｆＤＮＡ収率を減少させたことが見出された。３０μｌまたは６０μｌのＰｒｏｔＫのいずれかを６５℃で使用した場合、６回反復のうちの２回において、ｃｃｆＤＮＡ収率の大きな減少が示された。対照的に、室温で処理したサンプルは、一貫して良好な収率を提供し、低下は認められなかった。図８は、ボックスプロットの形で結果を要約したものである。見られるように、高温では、広いボックスが得られる（２５〜７５％の回収）。したがって、抽出結果の均一性および信頼性を高めるために、したがって一貫して高いｃｃｆＤＮＡ収率を保証するために、室温における消化を実施することが有利である。
【０１３４】
（実施例７）
他のポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル非イオン性界面活性剤を用いて得られた結果と、ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルＢｒｉｊ５８を用いて得られた結果とを比較するために、さらなる実験を実施した。上記磁性アニオン交換粒子を使用して血漿サンプルから循環ＤＮＡを単離するための自動抽出プロトコールを使用して、以下の非イオン性界面活性剤を試験した：
−Ｂｒｉｊ５８（ポリオキシエチレンセチルエーテル）；
−Ｂｒｉｊ３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）；
−Ｂｒｉｊ７８（ポリオキシエチレンステアリルエーテル）；および
−Ｂｒｉｊ９８（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）。
【０１３５】
製品Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ  ＢＣＴ（Ｓｔｒｅｃｋ  Ｉｎｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ：２１８９６２）を使用して安定化した血液サンプルから、血漿サンプルを得た。２ｍｌの血漿と、３００μｌの結合バッファー、異なる界面活性剤、プロテイナーゼＫおよび磁性アニオン交換粒子（これは、アニオン交換基として第３級アミン基を有していた）とを接触させた。２％、０．５％および０．１％の最終濃度の結合混合物中で、各非イオン性界面活性剤を試験した。各条件を２回反復で試験した（ｎ＝２）。結合混合物を約２０分間インキュベートして、アニオン交換粒子に対するｃｃｆＤＮＡの結合を可能にした。結合したｃｃｆＤＮＡを有する磁性粒子を残りのサンプルから分離し、３回洗浄し、７５μｌのアルカリ溶出溶液（ｐＨ約１２．０）を使用して溶出した（上記材料および方法も参照のこと）。
【０１３６】
溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ）に供し、ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算した。様々な非イオン性ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル界面活性剤を結合混合物中で用いて得られた結果を、等濃度のＢｒｉｊ５８（２％のＢｒｉｊ５８  ｃｃｆＤＮＡ回収を１００％に設定）を用いて得られた結果と比較した。
【０１３７】
結果を図９に示す（６６ｂｐアンプリコンが示されている）。見られるように、試験した他のポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル非イオン性界面活性剤もまた、Ｂｒｉｊ５８と同様の良好な結果を示した。これは、先の実施例に示されている有利な効果がＢｒｉｊ５８に限定されず、他のポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルでも達成されることを実証している。
【０１３８】
（実施例８）
結果に対する血漿容量の増加（ＰＣＲ阻害リスクの増加）の影響を、２ｍｌまたは４ｍｌの血漿容量および異なる非イオン性界面活性剤を結合混合物中で使用して分析した。以下の非イオン性界面活性剤を試験した（試験した各非イオン性界面活性剤について、０．５％の結合混合物中最終濃度）。
１．ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル
−Ｂｒｉｊ５８（参照として１００％ｃｃｆＤＮＡ回収に設定）；
−Ｂｒｉｊ３５；
−Ｂｒｉｊ７８；
−Ｂｒｉｊ９８。
２．他の非イオン性界面活性剤
−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；
−Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ６３０；
−Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ６３０。
【０１３９】
一設定では、界面活性剤を結合混合物中に含めなかった。各条件を２回反復で試験した（ｎ＝２）。
【０１４０】
実施例７に記載されているプロトコールを使用して、２ｍｌの血漿（Ｓｔｒｅｃｋ）からｃｃｆＤＮＡを抽出した。４ｍｌの血漿からｃｃｆＤＮＡを抽出するために、以下のプロトコールを使用した：各血漿サンプルから、２つの２ｍｌ血漿アリコートを得た。実施例７に記載されているように、第１の２ｍｌ血漿アリコートから第１の結合混合物を調製し、ｃｃｆＤＮＡを磁性アニオン交換粒子に結合させた。次いで、結合したｃｃｆＤＮＡを有する磁性粒子を、アニオン交換粒子として、第２の２ｍｌ血漿アリコートから調製した第２の結合混合物（アニオン交換粒子を未だに含有していない）に移した。結合混合物を再びインキュベートして、第２の結合混合物由来のｃｃｆＤＮＡを、第１の結合混合物由来のｃｃｆＤＮＡが既に結合したアニオン交換粒子に結合させた。この第２の結合工程の後、全４ｍｌの血漿由来のｃｃｆＤＮＡをアニオン交換粒子に結合させる。次いで、実施例７に記載されているように、洗浄および溶出を実施した。
【０１４１】
溶出液をリアルタイムＰＣＲ（１８Ｓコード配列；デュプレックスＰＣＲ）に供し、２ｍｌの血漿サンプルの結果が４ｍｌの血漿サンプルの結果と比較可能になるように、ｃｃｆＤＮＡ回収を血漿１ｍｌ当たりのコピーとして計算した。
【０１４２】
結果を図１０Ａ（６６ｂｐアンプリコン）および図１０Ｂ（５００ｂｐアンプリコン）に示す。見られるように、２ｍｌまたは４ｍｌの血漿を処理したかにかかわらず、本発明にしたがって使用される非イオン性界面活性剤（ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル）は、高い収率でｃｃｆＤＮＡを回収し、安定的な性能を示した。ＰＣＲ阻害の増加は見られなかった。比較試験した他の非イオン性界面活性剤については、全ｃｃｆＤＮＡ収率は、ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを用いて得られた結果と比較して減少した。また、４ｍｌの血漿を処理した場合、１ｍｌ当たりの計算ｃｃｆＤＮＡ回収は、より少なかった。これは、ＰＣＲ阻害剤が精製中に持ち越され、それにより溶出液の純度がより低くなるという指標である。より長い断片は、ＰＣＲ阻害に対してより感受性であるので、５００ｂｐアンプリコンでは、このような阻害効果がより顕著である。試験した他の非イオン性界面活性剤と比較した、試験したポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル間の差異は、５００ｂｐ断片（したがってこれは、ＰＣＲ阻害を示す）を見るとさらに顕著である。非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルを使用する場合、これを回避することができる。
【０１４３】
（実施例９）
実施例８に記載されている自動化プロトコール（ＱＩＡｓｙｍｐｈｏｎｙ）を使用して、および経年劣化磁性アニオン交換ビーズを使用して４ｍｌのＳｔｒｅｃｋ安定化血漿からｃｃｆＤＮＡを単離したさらなる実験設定では、異なるポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテルを結合混合物中で使用した場合、ｃｃｆＤＮＡ回収のロバスト性の増加が確認された。本明細書で議論されるように、経年劣化アニオン交換粒子は、保存後に性能低下を示す可能性があり、これが困難な問題を引き起こす。経年劣化磁性アニオン交換ビーズを用いて観察された性能変動を補償する能力について、以下の非イオン性界面活性剤を試験した：
１．ポリオキシアルキレン脂肪アルコールエーテル
−Ｂｒｉｊ５８（２％を参照として１００％ｃｃｆＤＮＡ回収に設定）；
−Ｂｒｉｊ３５；
−Ｂｒｉｊ７８；
−Ｂｒｉｊ９８。
２．他の非イオン性界面活性剤
−Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；
−Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ６３０；
−Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ７２０；
−Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ７２０。
【０１４４】
各界面活性剤を、２％または０．５％の結合混合物中最終濃度で試験した。溶解限度により、Ｉｇｅｐａｌ  ＣＯ６３０のみは、０．５％の最終濃度で試験した。一設定では、界面活性剤を結合混合物中に含めなかった。各条件を２回反復で試験した（ｎ＝２）。
【０１４５】
結果を図１１に示す。見られるように、アニオン交換磁性粒子として経年劣化ビーズロットを使用したとしても、試験したすべてのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルは、良好なｃｃｆＤＮＡ収率を示した。対照的に、特に界面活性剤を０．５％の濃度で使用した場合、試験したすべての他の非イオン性界面活性剤は、ｃｃｆＤＮＡ回収の減少を示した。この設定では、ｃｃｆＤＮＡ回収は、３０％未満に低下した。
【０１４６】
したがって、実施例９はまた、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルを結合混合物中で使用する場合に達成される有利な効果を実証している。全体として、アニオン交換表面の変動が起こる場合であっても、ｃｃｆＤＮＡを一貫して高い収率で回収することができるので、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルは、ｃｃｆＤＮＡ単離の信頼性を有意に改善する。議論されているように、このような変動は、（キット形式の単離方法において使用される材料を提供する場合に一般的であるように）製造中に、および／または固相の保存中に起こり得る。本発明は、これらの問題を回避する。通常、例えば血漿サンプルなどの典型的なサンプル中のｃｃｆＤＮＡ濃度は低いことも考慮すると、信頼性の改善およびｃｃｆＤＮＡ回収の改善は、重要な利点である。信頼性が高く効率的なｃｃｆＤＮＡ単離方法は、本発明が重要な貢献をするようなすべての医療および／または診断適用に特に必要である。また、非イオン性界面活性剤としてのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルは、さらなる重要な利点、例えば保存安定性の改善、ならびに水性溶解および／または結合組成物中の高い溶解性（前記組成物がより高濃度の塩を含む場合であっても）に関連する。したがって、本方法で使用される試薬／材料は、有利にはキット形式で提供され得る。このようなキットは、有利には保存安定性であり、したがって長い保管期間を有する。これらの利点は重要であり、他の非イオン性界面活性剤では達成されない。
【０１４７】
（実施例１０）
Ｂｒｉｊ５８などのポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル非イオン性界面活性剤を結合混合物中に組み込む場合に達成される信頼性の改善および細胞外核酸収率の改善に関する有利な性能特徴を、複数の実験において連続的に実証することができた。進行中の性能試験では、異なるロットの磁性アニオン交換粒子を使用した。Ｂｒｉｊ５８を結合混合物中で用いて達成された結果を試験し、各ビーズロットについて、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を結合混合物中で使用した場合に達成された結果と比較した。
【０１４８】
表２は、結果を示す。数字は、ＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＮＡ  Ｋｉｔ（参照−１００％として設定）と比較した％回収を示す。アニオン交換粒子ロットの生産後約１カ月以内に３つの連続する時点（ＴＴＰ１、ＴＰＰ２、ＴＰＰ３）において、各ビーズロットを試験した。試験したポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と比較して改善された収率を一貫して達成した。また、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とは対照的に、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルを結合混合物中で使用した場合、異なるビーズロット間において有意な性能変動は観察されなかった。ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルは、異なるビーズロットにおける性能変動を有効に補償した。非イオン性界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を結合混合物中で使用した場合、これは達成されなかった。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いると、全ｃｃｆＤＮＡ収率は、通常、Ｂｒｉｊ５８と比較して低かった。また、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いると、既に保存１カ月以内に、多数のビーズロットで有意な性能変動が見られ、回収率は８０％未満であった（ビーズロット４、７、８、１０、１１、１２、１５、１６および１７および２１を参照のこと−回収が８０％未満の結果が強調されている）。したがって、実施例１０はまた、非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテルを結合混合物中で使用した場合に達成される有利な効果を明確に実証している。
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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