(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンをプロトン型強酸性陽イオン交換樹脂にて処理し、プロトン型プロテオグリカン水溶液を得て、該プロテオグリカン水溶液を減圧下で４７℃以上で加温することを特徴とする、プロテオグリカン分解物の製造方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料や医薬品、飲食品、日用品などで使用されるプロテオグリカンの分解物及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンは天然の高分子化合物であり、アミノ糖やウロン酸から構成されるグリコサミノグリカンを主成分とする多糖類とタンパク質との共有結合物の総称である。プロテオグリカンは、一般の糖タンパク質と比較して、全成分中のグリコサミノグリカン含量が極めて多いことを特徴とする。プロテオグリカンは、起源となる原料の種類や抽出・製造条件により、分子量や含まれるアミノ酸や糖（中性糖、ウロン酸、アミノ糖など）の種類や量、比率も異なり、千差万別である。
【０００３】
プロテオグリカンは、生体成分として多様な機能性を持つ重要な天然成分である。主要な各種臓器、脳、皮膚をはじめとした体全体の組織中の細胞外マトリックスや細胞表面に存在するほか、関節軟骨の主成分としても存在している。プロテオグリカンは、コラーゲンやヒアルロン酸と複合体を作ることで身体組織や皮膚組織を維持しており、組織形成や伝達物質としての役割などを有し、組織修復にも関係する成分である。
【０００４】
プロテオグリカンは、保水性や上皮細胞増殖作用などの様々な機能を有することが明らかになってきており、化粧品や食品など様々な分野において用いられている。しかし、プロテオグリカンは高分子のため、水に溶解すると高い粘性を有し、濃度が高くなると水に溶解しにくかったり、添加対象の化粧品や食品などの粘性へ影響を与えたりするなど、取扱いに難点がある。そのため、粘度の低いプロテオグリカンが求められている。一般的に、粘度は物質の分子量と相関があり、分子量が小さくなる程、その物質を溶解した溶液の粘度も低くなる。
【０００５】
プロテオグリカンを分解する技術として、酵素を用いた方法が報告されている（特許文献１〜５）。しかし、これら酵素を用いた方法では、プロテオグリカンを分解する酵素自体が高価であり、また、分解して得た低分子プロテオグリカンと酵素とを分離しなければならないなど、コスト面および工程面で欠点があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−１６９７５１号  公報
【特許文献２】特開２００８−２７３９５５号  公報
【特許文献３】特開２００９−２７８９０７号  公報
【特許文献４】特開２０１１−１２６８８０号  公報
【特許文献５】特開２０１４−６４５８０号  公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記課題を鑑み、本発明は、より低コストでかつ簡易な方法でプロテオグリカン分解物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明の一つの態様は、原料のプロテオグリカンをプロトン型強酸性陽イオン交換樹脂、もしくは強酸やクエン酸の少なくとも一つにて処理し、次に加温することを要旨とする。
【０００９】
本発明の他の態様は、分子量が４０ｋＤａ以下であり、純水に対する相対粘度が２６．５℃で１．５以下であり、１ｗ／ｖ％水溶液の２７０ｎｍの吸光度が２以上であるプロテオグリカン分解物であることを要旨とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、低コストでかつ簡易な方法でプロテオグリカン分解物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の、実施例２に係り、実施例１に係るプロテオグリカン分解物の分子量分布を示す図である。
【図２】実施例２および比較例１、実施例４、比較例２、実施例６、実施例８、実施例１０に係り、プロテオグリカン分解物の原料とした鮭由来プロテオグリカンの分子量分布を示す図である。
【図３】比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの分子量分布を示す図である。
【図４】比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの１ｗ／ｖ％水溶液の１９０〜８００ｎｍの紫外可視吸収スペクトルを表す図である。
【図５】原料の鮭由来プロテオグリカンの１ｗ／ｖ％水溶液の１９０〜８００ｎｍの紫外可視吸収スペクトルを表す図である。
【図６】実施例４に係り、実施例３に係るプロテオグリカン分解物の分子量分布を示す図である。
【図７】実施例４に係り、実施例３に係るプロテオグリカン分解物の１ｗ／ｖ％水溶液の１９０〜８００ｎｍの紫外可視吸収スペクトルを表す図である。
【図８】比較例２に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの分子量分布を示す図である。
【図９】比較例２に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの１ｗ／ｖ％水溶液の１９０〜８００ｎｍの紫外可視吸収スペクトルを表す図である。
【図１０】実施例６に係り、実施例５に係るプロテオグリカン分解物の分子量分布を示す図である。
【図１１】実施例６に係り、実施例５に係るプロテオグリカン分解物の１ｗ／ｖ％水溶液の１９０〜８００ｎｍの紫外可視吸収スペクトルを表す図である。
【図１２】実施例８に係り、実施例７に係るプロテオグリカン分解物の分子量分布を示す図である。
【図１３】実施例１０に係り、実施例９に係るプロテオグリカン分解物の分子量分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、実施の形態をより具体的に説明する。
【００１３】
プロテオグリカンの原料由来としては、牛、鶏、鯨などの哺乳類や鳥類の軟骨や、鮭、鮫、エイなどの魚類の軟骨であり、その種類を問わない。また、プロテオグリカンの抽出薬剤についても、酢酸などの有機酸などの酸、アルカリ、グアニジン塩酸、水、温熱水など様々あるが、本発明では抽出薬剤や温度や時間などの抽出・製造の条件も限定しないものである。
【００１４】
本発明のプロテオグリカンの分解方法としては、その一つは最初に原料のプロテオグリカンを含む水溶液をプロトン型強酸性陽イオン交換樹脂にて処理することである。プロトンとは水素イオンのことであり、プロトン型強酸性陽イオン交換樹脂とは、樹脂のイオン交換基と結合している陽イオンがプロトンである強酸性陽イオン交換樹脂のことである。強酸性陽イオン交換樹脂は、担体にスルホン酸基のイオン交換基が導入された水不溶性の高分子樹脂である。担体としてはスチレン系やフェノール系、ビニル系、アクリルアミド系などの合成樹脂やセルロース系、アガロース系、デキストラン系などがある。樹脂を使用する前には、常法により酸やアルカリなどで予備洗浄し、酸によりプロトン型に活性化する必要がある。
【００１５】
原料のプロテオグリカンを含む水溶液をプロトン型強酸性陽イオン交換樹脂に接触させる際、原料のプロテオグリカンを含む水溶液には、原料のプロテオグリカン以外の物質、特にイオン物質は入っていないほうが好ましい。イオン物質が共存するときは、イオン強度は低いほうが望ましい。
【００１６】
プロトン型強酸性陽イオン交換樹脂の接触方法としては、カラムなどに樹脂を充填し、原料のプロテオグリカンを含む水溶液をカラムに通過させる方式や、バッチ式などがある。接触時間は数分以上必要である。使用するプロトン型強酸性陽イオン交換樹脂の量は、樹脂の種類により異なるが、出発原料となる元のプロテオグリカンに対して、その樹脂の交換容量に安全率を乗じた以上の樹脂量は必要である。次に、プロトン型強酸性陽イオン交換樹脂と接触させたプロテオグリカンを、ろ過などの方法により、樹脂から分離して回収する。ろ過後のプロトン型強酸性陽イオン交換樹脂を水で洗浄し、樹脂に付着しているプロテオグリカンの残留分を回収する。
【００１７】
原料のプロテオグリカンを強酸で処理するとき、強酸としては塩酸、硫酸、硝酸などの無機酸やトリフルオロ酢酸などが挙げられる。また、原料のプロテオグリカンはクエン酸で処理してもよいし、強酸とクエン酸の混合物で処理してもよい。原料のプロテオグリカンと強酸、クエン酸の接触方法は、強酸やクエン酸の溶液に原料のプロテオグリカンを溶解してもよいし、原料のプロテオグリカンの水溶液に強酸やクエン酸を添加してもよい。強酸やクエン酸の濃度は原料のプロテオグリカンの種類や濃度にもよるが、原料のプロテオグリカン水溶液中の強酸の濃度はおおよそ５ｍＭ以上、クエン酸濃度はおおよそ０．１％以上が好ましい。また、接触時間は、強酸、クエン酸共に１時間以上、好ましくは１０時間以上必要である。接触後、添加した強酸やクエン酸は除去したほうがよい。除去方法は限外ろ過でもよいし、透析、その他通常用いられている方法でよい。
【００１８】
次に、プロトン型強酸性陽イオン交換樹脂、または強酸やクエン酸で処理して得たプロテオグリカンを含む水溶液を加温する。加温の温度と時間は、原料のプロテオグリカンの種類や量にもよるが、加温の温度が７０℃以上の場合は、加温時間は２４時間以上必要である。加温の温度が５０℃や６０℃の場合は、より長時間必要である。
【００１９】
得られた水溶液はプロテオグリカン分解物を含む水溶液であり、そのまま使用することもできるが、噴霧乾燥や凍結乾燥などにより粉末化してもよいし、アルコールやアセトンなどの有機溶剤により沈殿、風乾して、粉末化してもよい。また、中和してプロテオグリカン分解物の金属塩水溶液とした後に同様の処理を行うと、酸性であるプロテオグリカン分解物が中性になり、様々な製品の原料としての扱いが容易になる。
【００２０】
また、プロトン型強酸性陽イオン交換樹脂、または強酸やクエン酸で処理して得たプロテオグリカンを含む水溶液を、加温しながら濃縮、粉末化することでもプロテオグリカンを分解することができる。
【００２１】
本発明の物質は、ゲルろ過クロマトグラフィー法で測定した分子量が４０ｋＤａ以下であり、オストワルド式による純水に対する相対粘度が２６．５℃で１．５以下であり、１ｗ／ｖ％水溶液の２７０ｎｍの吸光度が光路長１ｃｍで、２以上であるプロテオグリカン分解物である。
【００２２】
本発明のプロテオグリカン分解物は、化粧料や飲料・食品などの原料として用いても、元の化粧料や飲料・食品などの粘性をほとんど変化させないという特徴がある。化粧料としては、化粧水や美容液、乳液、クリ−ム、リップ類などの化粧品や、シャンプー、リンス、入浴剤、石鹸などのトイレタリー用品が挙げられる。また、飲料にも容易に添加が可能であり、食品にも同様に適用できる。
【００２３】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これは単に例示の目的で述べるものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
（プロテオグリカン分解物の製造１：強酸性陽イオン交換樹脂処理）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入して用いた。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８ ｒｅｓｉｎ、バイオラッド社製）をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、１Ｍ塩酸１００ｍＬを流下して樹脂を洗浄・活性化した後、脱イオン水２００ｍＬを流下して過剰の塩酸を除去した。原料の鮭由来プロテオグリカン０．６ｇを脱イオン水４５ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１１０ｍＬ流下し、溶出液１５０ｍＬを得た。
【００２５】
この強酸性陽イオン交換樹脂の溶出液１０ｍＬをバイアル瓶に入れ、蓋を閉め、７０℃に加温した定温乾燥器（Ｄｒｙｉｎｇ Ｏｖｅｎ ＤＸ３１、ヤマト科学（株）製）内へ静置した。２４時間後、定温乾燥器よりバイアル瓶を取り出し、自然に冷却した。蓋を開け、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬ、５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液９ｍＬを反応液に加えて中和をし、プロテオグリカン分解物水溶液２０ｍＬを得た。
【実施例２】
【００２６】
（プロテオグリカン分解物の分子量測定）
実施例１に係るプロテオグリカン分解物の分子量を、ゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した。ゲルろ過クロマトグラフィー用樹脂はトヨパール ＨＷ５５Ｆ（内径２．７ｃｍ、高さ１１６ｃｍ、東ソー（株）製）、ポンプはＬＫＢ・ＰｕｍｐＰ−１（ファルマシア社製）、フラクションコレクターはＬＫＢ・ＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）を用いた。実施例１に係るプロテオグリカン分解物水溶液５ｍＬを、カラム上方から添加した。溶離液は１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、４ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量７５，０００、３８，５００；和光純薬工業（株）製、１５０，０００、１０，０００；シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。
【００２７】
図１は、実施例１に係るプロテオグリカン分解物のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すものであり、横軸はゲルろ過クロマトグラフィーの溶出体積、縦軸はゲルろ過クロマトグラフィー溶出液画分のカルバゾール硫酸法呈色液の５３５ｎｍでの吸光度を示す。図１中の数字（ｋＤａ表記）は、分子量標準物質であるデキストランの平均分子量を示す。この結果から、実施例１に係るプロテオグリカン分解物の分子量は１０ｋＤａ以下と算出された。
【００２８】
なお、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量をゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した。ゲルろ過クロマトグラフィー用樹脂はＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００ ＨＲ（内径２．８ｃｍ、高さ１２０ｃｍ、ＧＥヘルスケア社製）、ポンプはＡＣ−２１２０ペリスタ・バイオミニポンプ（アトー（株）製）、フラクションコレクターはＡＤＶＡＮＴＥＣ ＦＲＣ−２１２０ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（アドバンテック東洋（株）製）を用いた。原料の鮭由来プロテオグリカン１０ｍｇを０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍＬに溶解した溶液を、カラム上方から添加した。溶離液は０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、５．５ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量１，４００，０００、６７０，０００、４１０，０００、１５０，０００、シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。
【００２９】
図２は、原料の鮭由来プロテオグリカンのゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すものであり、横軸はゲルろ過クロマトグラフィーの溶出体積、縦軸はゲルろ過クロマトグラフィー溶出液画分のカルバゾール硫酸法呈色液の５３５ｎｍでの吸光度を示す。図２中の数字（ｋＤａ表記）は、分子量標準物質であるデキストランの平均分子量を示す。この結果から、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量は、１，４００ｋＤａ以上と確認された。
【００３０】
実施例１に係るプロテオグリカン分解物と原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量の比較より、実施例１に係るプロテオグリカン分解物は、原料の鮭由来プロテオグリカンが約１４０分の１の大きさに分解されたものであることがわかった。
【比較例１】
【００３１】
（プロテオグリカン分解物の製造条件の検討：加温温度）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入して用いた。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８ ｒｅｓｉｎ、バイオラッド社製）をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、１Ｍ塩酸１００ｍＬを流下して樹脂を洗浄・活性化した後、脱イオン水２００ｍＬを流下して過剰の塩酸を除去した。原料の鮭由来プロテオグリカン０．６ｇを脱イオン水４５ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１１０ｍＬ流下し、溶出液１５０ｍＬを得た。
【００３２】
この強酸性陽イオン交換樹脂の溶出液１０ｍＬをバイアル瓶に入れ、蓋を閉め、４７℃に加温した定温乾燥器（Ｄｒｙｉｎｇ Ｏｖｅｎ ＤＸ３１、ヤマト科学（株）製）内へ静置した。２４時間後、定温乾燥器よりバイアル瓶を取り出し、自然に冷却した。蓋を開け、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬ、５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液９ｍＬを反応液に加えて中和をし、プロテオグリカン分解条件検討サンプル水溶液２０ｍＬを得た。
【００３３】
比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプル水溶液１０ｍＬを、透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ１５ｃｍ、エーディア（株）製）に入れ、上下の口を封じ、４℃の低温室で、外液を脱イオン水にして３日間透析した。外液の脱イオン水は１日に３回交換した。その後セルロースチューブ内液を回収し、凍結乾燥し（凍結乾燥機 ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ−１２００、東京理科器械（株）製）、１５．９ｍｇの白色綿状固体である比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルを得た。
【００３４】
比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの分子量を、ゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した。ゲルろ過クロマトグラフィー用樹脂はＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００ ＨＲ（内径２．８ｃｍ、高さ１２０ｃｍ、ＧＥヘルスケア社製）、ポンプはＡＣ−２１２０ペリスタ・バイオミニポンプ（アトー（株）製）、フラクションコレクターはＡＤＶＡＮＴＥＣ ＦＲＣ−２１２０ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（アドバンテック東洋（株）製）を用いた。比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプル水溶液５ｍＬをカラム上方から添加した。溶離液は０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、５．５ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量１，４００，０００、６７０，０００、４１０，０００、１５０，０００、シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。
【００３５】
図３は、比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルのゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すものであり、横軸はゲルろ過クロマトグラフィーの溶出体積、縦軸はゲルろ過クロマトグラフィー溶出液画分のカルバゾール硫酸法呈色液の５３５ｎｍでの吸光度を示す。図３中の数字（ｋＤａ表記）は、分子量標準物質であるデキストランの平均分子量を示す。この結果から、比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの分子量は１，４００ｋＤａ以上と確認された。
【００３６】
実施例２に記載したとおり、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量が１，４００ｋＤａ以上であることより、原料の鮭由来プロテオグリカンは分解されておらず、比較例１の方法ではプロテオグリカン分解物を製造することはできないことがわかった。
【００３７】
比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの紫外可視吸収スペクトルを測定した。比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの１ｗ／ｖ％水溶液をセル長１ｃｍの石英セルに入れ、紫外可視分光光度計（Ｕ−３０１０型分光光度計、（株）日立製作所製）で測定した。測定条件については、測定波長範囲は１９０〜８００ｎｍ、スキャンスピードは６０ｎｍ／分、サンプリング間隔は０．２ｎｍ、対照溶液として純水を用意し、ダブルビーム方式で実施した。なお、比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの１ｗ／ｖ％水溶液の８００ｎｍの吸光度をゼロとして、各波長での吸光度を測定した。
【００３８】
図４は比較例１に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの１ｗ／ｖ％水溶液の１９０〜８００ｎｍの紫外可視吸収スペクトルを表す図であり、横軸は測定波長（ｎｍ）、縦軸は吸光度を表す。図４の測定結果より、２７０ｎｍの吸光度は０．８０３であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについても、同様の条件で測定を行った。図５は原料の鮭由来プロテオグリカンの１ｗ／ｖ％水溶液の１９０〜８００ｎｍの紫外可視吸収スペクトルを表す図であり、横軸は測定波長（ｎｍ）、縦軸は吸光度を表す。図５の測定結果より、２７０ｎｍの吸光度は０．５４２であった。
【実施例３】
【００３９】
（プロテオグリカン分解物の製造２：強酸性陽イオン交換樹脂処理）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入して用いた。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８ ｒｅｓｉｎ、バイオラッド社製）をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、１Ｍ塩酸６０ｍＬを流下して樹脂を洗浄・活性化した後、脱イオン水１５０ｍＬを流下して過剰の塩酸を除去した。原料の鮭由来プロテオグリカン０．４ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を２７０ｍＬ流下し、溶出液約３００ｍＬを得た。得られた溶出液をウォーターバスで４７℃に加温しながら、約１０ｍＬになるまで４５分間濃縮した（エバポレーター；ＥＹＥＬＡ ＲＯＴＡＲＹ ＶＡＣＵＵＭ ＥＶＡＰＯＲＡＴＯＲ Ｎシリーズ、東京理科器械（株）製、恒温水循環装置；Ｎｅｏ Ｃｏｏｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ ＣＦ６００（アスピレーター付）、ヤマト科学（株）製）。得られた濃縮液を凍結乾燥し（凍結乾燥機 ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ−１２００、東京理科器械（株）製）、０．３２ｇの白色綿状固体であるプロテオグリカン分解物を得た。
【実施例４】
【００４０】
（プロテオグリカン分解物の分析）
実施例３に係るプロテオグリカン分解物のタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社）を標準物質とした検量線から求めたところ、６．３重量％であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社）を標準物質とした検量線から求めたところ、３８．３重量％であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は６．５重量％、ウロン酸含量は３４．６重量％であった。これらの結果から、実施例３に係るプロテオグリカン分解物のタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮭由来プロテオグリカンとほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００４１】
実施例３に係るプロテオグリカン分解物０．２ｗ／ｖ％の水溶液のｐＨは２．５であり、原料の鮭由来プロテオグリカン０．２ｗ／ｖ％の水溶液のｐＨは６．２であった。
【００４２】
実施例３に係るプロテオグリカン分解物の相対粘度をオストワルド式で測定した。測定器具にはオストワルド相対粘度計Ｎｏ．１（柴田科学（株）製）を用い、溶媒は脱イオン水とし、実施例３に係るプロテオグリカン分解物の５ｍｇ／ｍＬ水溶液の粘度を２６．５℃の水浴中で測定した。結果、実施例３に係るプロテオグリカン分解物５ｍｇ／ｍＬ水溶液の相対粘度は１．１であった。原料の鮭由来プロテオグリカン５ｍｇ／ｍＬ水溶液を同様の条件で測定したところ、相対粘度は３．７であった。
【００４３】
実施例３に係るプロテオグリカン分解物の分子量をゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した。ゲルろ過クロマトグラフィー用樹脂はトヨパール ＨＷ５５Ｆ（内径２．７ｃｍ、高さ１１６ｃｍ、東ソー（株）製）、ポンプはＬＫＢ・ＰｕｍｐＰ−１（ファルマシア社製）、フラクションコレクターはＬＫＢ・ＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）を用いた。実施例３に係るプロテオグリカン分解物１０ｍｇを１Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍＬに溶解し、カラム上方から添加した。溶離液は１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、４ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量７５，０００、３８，５００；和光純薬工業（株）製、１５０，０００、１０，０００；シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。
【００４４】
図６は、実施例３に係るプロテオグリカン分解物のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すものであり、横軸はゲルろ過クロマトグラフィーの溶出体積、縦軸はゲルろ過クロマトグラフィー溶出液画分のカルバゾール硫酸法呈色液の５３５ｎｍでの吸光度を示す。図６中の数字（ｋＤａ表記）は、分子量標準物質であるデキストランの平均分子量を示す。この結果から、実施例３に係るプロテオグリカン分解物の分子量は３２ｋＤａと算出された。
【００４５】
実施例２に記載したとおり、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量は、１，４００ｋＤａ以上であった。実施例３に係るプロテオグリカン分解物と原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量の比較より、実施例３に係るプロテオグリカン分解物は、原料の鮭由来プロテオグリカンが約４４分の１の大きさに分解されたものであることがわかった。
【００４６】
実施例３に係るプロテオグリカン分解物の紫外可視吸収スペクトルについて、比較例１と同様の条件で測定を行った。図７は実施例３に係るプロテオグリカン分解物の１ｗ／ｖ％水溶液の１９０〜８００ｎｍの紫外可視吸収スペクトルを表す図であり、横軸は測定波長（ｎｍ）、縦軸は吸光度を表す。図７の測定結果より、２７０ｎｍの吸光度は２．６５０であった。
【比較例２】
【００４７】
（プロテオグリカン分解物の製造条件の検討：中和工程の導入）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入して用いた。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８ ｒｅｓｉｎ、バイオラッド社製）をガラス製カラムに充填し（内径２．５ｃｍ、高さ８．２ｃｍ）、３Ｍ塩酸１００ｍＬを流下して樹脂を洗浄・活性化した後、脱イオン水２００ｍＬを流下して過剰の塩酸を除去した。原料の鮭由来プロテオグリカン０．４ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を３００ｍＬ流下し、溶出液約３００ｍＬを得た。得られた溶出液を撹拌しながら、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液および５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液を滴下して中和をした。次に、ウォーターバスで４７℃に加温しながら、約４０ｍＬになるまで４０分間濃縮した（エバポレーター；ＥＹＥＬＡ ＲＯＴＡＲＹ ＶＡＣＵＵＭ ＥＶＡＰＯＲＡＴＯＲ Ｎシリーズ、東京理科器械（株）製、恒温水循環装置；Ｎｅｏ Ｃｏｏｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ ＣＦ６００（アスピレーター付）、ヤマト科学（株）製）。この濃縮液を透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株）製）に入れ、外液を脱イオン水にして３日間透析した。外液の脱イオン水は１日に３回交換した。その後セルロースチューブ内液を回収し、ウォーターバスで４７℃に加温しながら、約１０ｍＬになるまで３０分間濃縮した（エバポレーター；ＥＹＥＬＡ ＲＯＴＡＲＹ ＶＡＣＵＵＭ ＥＶＡＰＯＲＡＴＯＲ Ｎシリーズ、東京理科器械（株）製、恒温水循環装置；Ｎｅｏ Ｃｏｏｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ ＣＦ６００（アスピレーター付）、ヤマト科学（株）製）。得られた濃縮液を凍結乾燥し（凍結乾燥機 ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ−１２００、東京理科器械（株）製）、０．３６ｇの白色綿状固体であるプロテオグリカン分解条件検討サンプルを得た。
【００４８】
比較例２に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの分子量を、ゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した。ゲルろ過クロマトグラフィー用樹脂はＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−５００ ＨＲ（内径２．８ｃｍ、高さ１２０ｃｍ、ＧＥヘルスケア社製）、ポンプはＡＣ−２１２０ペリスタ・バイオミニポンプ（アトー（株）製）、フラクションコレクターはＡＤＶＡＮＴＥＣ ＦＲＣ−２１２０ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（アドバンテック東洋（株）製）を用いた。比較例２に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプル１０ｍｇを０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍＬに溶解し、カラム上方から添加した。溶離液は０．１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、５．５ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量１，４００，０００、６７０，０００、４１０，０００、１５０，０００、シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。
【００４９】
図８は、比較例２に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルのゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すものであり、横軸はゲルろ過クロマトグラフィーの溶出体積、縦軸はゲルろ過クロマトグラフィー溶出液画分のカルバゾール硫酸法呈色液の５３５ｎｍでの吸光度を示す。図８中の数字（ｋＤａ表記）は、分子量標準物質であるデキストランの平均分子量を示す。この結果から、比較例２に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの分子量は１，４００ｋＤａ以上と確認された。
【００５０】
実施例２に記載したとおり、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量が１，４００ｋＤａ以上であることより、原料の鮭由来プロテオグリカンは分解されておらず、比較例２の方法ではプロテオグリカン分解物を製造することはできないことがわかった。
【００５１】
比較例２に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの紫外可視吸収スペクトルについて、比較例１と同様の条件で測定を行った。図９は比較例２に係るプロテオグリカン分解条件検討サンプルの１ｗ／ｖ％水溶液の１９０〜８００ｎｍの紫外可視吸収スペクトルを表す図であり、横軸は測定波長（ｎｍ）、縦軸は吸光度を表す。図９の測定結果より、２７０ｎｍの吸光度は０．５２６であった。
【実施例５】
【００５２】
（プロテオグリカン分解物の製造３：強酸性陽イオン交換樹脂処理）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入して用いた。強酸性陽イオン交換樹脂（商品名：ダイヤイオンＳＫ１Ｂ、三菱化学（株）製）をガラス製カラムに充填し（内径２ｃｍ、高さ８ｃｍ）、１Ｍ塩酸１００ｍＬを流下して樹脂を洗浄・活性化した後、脱イオン水２００ｍＬを流下して過剰の塩酸を除去した。原料の鮭由来プロテオグリカン０．４ｇを脱イオン水３０ｍＬに溶解した溶液を、室温でカラム上方から添加・流下した。その後、樹脂に脱イオン水を１００ｍＬ流下し、溶出液約１２５ｍＬを得た。得られた溶出液をウォーターバスで４７℃に加温しながら、約１０ｍＬになるまで３０分間濃縮した（エバポレーター；ＥＹＥＬＡ ＲＯＴＡＲＹ ＶＡＣＵＵＭ ＥＶＡＰＯＲＡＴＯＲ Ｎシリーズ、東京理科器械（株）製、恒温水循環装置；Ｎｅｏ Ｃｏｏｌ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒ ＣＦ６００（アスピレーター付）、ヤマト科学（株）製）。得られた濃縮液を凍結乾燥し（凍結乾燥機 ＥＹＥＬＡ ＦＤＵ−１２００、東京理科器械（株）製）、０．３５ｇの白色綿状固体であるプロテオグリカン分解物を得た。
【実施例６】
【００５３】
（プロテオグリカン分解物の分析）
実施例５に係るプロテオグリカン分解物のタンパク質含量を、比色法であるローリー法にて、牛血清アルブミン（アクロス社製）を標準物質とした検量線から求めたところ、６．３重量％であった。ウロン酸含量を、比色法であるカルバゾール硫酸法にて、グルクロン酸（シグマ社製）を標準物質とした検量線から求めたところ、３７．２重量％であった。原料の鮭由来プロテオグリカンについて同様に分析したところ、タンパク質含量は６．５重量％、ウロン酸含量は３４．６重量％であった。これらの結果から、実施例５に係るプロテオグリカン分解物のタンパク質とウロン酸含量は、原料の鮭由来プロテオグリカンとほとんど変化がないことが明らかとなった。
【００５４】
実施例５に係るプロテオグリカン分解物０．２ｗ／ｖ％の水溶液のｐＨは２．６であり、原料の鮭由来プロテオグリカン０．２ｗ／ｖ％の水溶液のｐＨは６．２であった。
【００５５】
実施例５に係るプロテオグリカン分解物の相対粘度をオストワルド式で測定した。測定器具にはオストワルド相対粘度計Ｎｏ．１（柴田科学（株）製）を用い、溶媒は脱イオン水とし、実施例５に係るプロテオグリカン分解物の５ｍｇ／ｍＬ水溶液の粘度を２６．５℃の水浴中で測定した。結果、実施例５に係るプロテオグリカン分解物５ｍｇ／ｍＬ水溶液の相対粘度は１．２であった。原料の鮭由来プロテオグリカン５ｍｇ／ｍＬ水溶液を同様の条件で測定したところ、相対粘度は３．７であった。
【００５６】
実施例５に係るプロテオグリカン分解物の分子量をゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した。ゲルろ過クロマトグラフィー用樹脂はトヨパール ＨＷ５５Ｆ（内径２．７ｃｍ、高さ１１６ｃｍ、東ソー（株）製）、ポンプはＬＫＢ・ＰｕｍｐＰ−１（ファルマシア社製）、フラクションコレクターはＬＫＢ・ＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）を用いた。実施例５に係るプロテオグリカン分解物１０ｍｇを１Ｍ塩化ナトリウム水溶液５ｍＬに溶解し、カラム上方から添加した。溶離液は１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、４ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量７５，０００、３８，５００；和光純薬工業（株）製、１５０，０００、１０，０００；シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。
【００５７】
図１０は、実施例５に係るプロテオグリカン分解物のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すものであり、横軸はゲルろ過クロマトグラフィーの溶出体積、縦軸はゲルろ過クロマトグラフィー溶出液画分のカルバゾール硫酸法呈色液の５３５ｎｍでの吸光度を示す。図１０中の数字（ｋＤａ表記）は、分子量標準物質であるデキストランの平均分子量を示す。この結果から、実施例５に係るプロテオグリカン分解物の分子量は１２ｋＤａと算出された。
【００５８】
実施例２に記載したとおり、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量は、１，４００ｋＤａ以上であった。実施例５に係るプロテオグリカン分解物と原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量の比較より、実施例５に係るプロテオグリカン分解物は、原料の鮭由来プロテオグリカンが約１２０分の１の大きさに分解されたものであることがわかった。
【００５９】
実施例５に係るプロテオグリカン分解物の紫外可視吸収スペクトルについて、比較例１と同様の条件で測定を行った。図１１は実施例５に係るプロテオグリカン分解物の１ｗ／ｖ％水溶液の１９０〜８００ｎｍの紫外可視吸収スペクトルを表す図であり、横軸は測定波長（ｎｍ）、縦軸は吸光度を表す。図１１の測定結果より、２７０ｎｍの吸光度は２．６８７であった。
【実施例７】
【００６０】
（プロテオグリカン分解物の製造４：強酸処理）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入して用いた。原料の鮭由来プロテオグリカン０．１ｇを脱イオン水４０ｍＬに溶解し、撹拌しながら、塩酸の終濃度が０．０５Ｍになるように１Ｍ塩酸を２．１ｍＬ滴下した。４℃で３時間撹拌した後、反応液を透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株）製）に入れ、外液を２５ｍＭ塩酸にし、４℃で一晩透析した。その後、外液を脱イオン水に変え、３日間透析した。外液の脱イオン水は１日３回交換した。セルロースチューブ内液をメスシリンダーに移し、全量１００ｍＬとなるよう、脱イオン水を加えた。溶液のうち３０ｍＬをバイアル瓶に入れ、蓋を閉め、７０℃に加温した定温乾燥器（Ｄｒｙｉｎｇ Ｏｖｅｎ ＤＸ３１、ヤマト科学（株）製）内へ静置した。２４時間後、定温乾燥器よりバイアル瓶を取り出し、自然に冷却した。蓋を開け、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬ、５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液４ｍＬを反応液に加えて中和をし、プロテオグリカン分解物水溶液３５ｍＬを得た。
【実施例８】
【００６１】
（プロテオグリカン分解物の分子量測定）
実施例７に係るプロテオグリカン分解物の分子量を、ゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した。ゲルろ過クロマトグラフィー用樹脂はトヨパール ＨＷ５５Ｆ（内径２．７ｃｍ、高さ１１６ｃｍ、東ソー（株）製）、ポンプはＬＫＢ・ＰｕｍｐＰ−１（ファルマシア社製）、フラクションコレクターはＬＫＢ・ＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）を用いた。実施例７に係るプロテオグリカン分解物水溶液５ｍＬを、カラム上方から添加した。溶離液は１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、４ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量７５，０００、３８，５００；和光純薬工業（株）製、１５０，０００、１０，０００；シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。
【００６２】
図１２は、実施例７に係るプロテオグリカン分解物のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すものであり、横軸はゲルろ過クロマトグラフィーの溶出体積、縦軸はゲルろ過クロマトグラフィー溶出液画分のカルバゾール硫酸法呈色液の５３５ｎｍでの吸光度を示す。図１２中の数字（ｋＤａ表記）は、分子量標準物質であるデキストランの平均分子量を示す。この結果から、実施例７に係るプロテオグリカン分解物の分子量は１７ｋＤａと算出された。
【００６３】
実施例２に記載したとおり、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量は、１，４００ｋＤａ以上であった。実施例７に係るプロテオグリカン分解物と原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量の比較より、実施例７に係るプロテオグリカン分解物は、原料の鮭由来プロテオグリカンが約８２分の１の大きさに分解されたものであることがわかった。
【実施例９】
【００６４】
（プロテオグリカン分解物の製造５：クエン酸処理）
原料のプロテオグリカンは、市販の鮭由来プロテオグリカン（（株）角弘プロテオグリカン研究所）を購入して用いた。原料の鮭由来プロテオグリカン０．１ｇを脱イオン水４０ｍＬに溶解し、撹拌しながら、クエン酸の終濃度が１．８％になるようにクエン酸一水和物を０．８ｇ加えた。４℃で３時間撹拌した後、反応液を透析用セルロースチューブ（外周９ｃｍ×長さ３５ｃｍ、エーディア（株）製）に入れ、外液を１％クエン酸水溶液にし、４℃で一晩透析した。その後、外液を脱イオン水に変え、３日間透析した。外液の脱イオン水は１日３回交換した。セルロースチューブ内液をメスシリンダーに移し、全量１００ｍＬとなるよう、脱イオン水を加えた。溶液のうち３０ｍＬをバイアル瓶に入れ、蓋を閉め、７０℃に加温した定温乾燥器（Ｄｒｙｉｎｇ Ｏｖｅｎ ＤＸ３１、ヤマト科学（株）製）内へ静置した。２４時間後、定温乾燥器よりバイアル瓶を取り出し、自然に冷却した。蓋を開け、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬ、５ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液４ｍＬを反応液に加えて中和をし、プロテオグリカン分解物水溶液３５ｍＬを得た。
【実施例１０】
【００６５】
（プロテオグリカン分解物の分子量測定）
実施例９に係るプロテオグリカン分解物の分子量を、ゲルろ過クロマトグラフィー法により測定した。ゲルろ過クロマトグラフィー用樹脂はトヨパール ＨＷ５５Ｆ（内径２．７ｃｍ、高さ１１６ｃｍ、東ソー（株）製）、ポンプはＬＫＢ・ＰｕｍｐＰ−１（ファルマシア社製）、フラクションコレクターはＬＫＢ・ＦＲＡＣ−１００（ファルマシア社製）を用いた。実施例９に係るプロテオグリカン分解物水溶液５ｍＬを、カラム上方から添加した。溶離液は１Ｍ塩化ナトリウム水溶液、流速０．５ｍＬ／分で、４ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた各溶出液画分に対して、比色法であるカルバゾール硫酸法にてウロン酸含量を分析した。得られたウロン酸含量ピークの溶出体積に対して、分子量標準物質としてデキストラン（平均分子量７５，０００、３８，５００；和光純薬工業（株）製、１５０，０００、１０，０００；シグマアルドリッチ社製）を用いた検量線から分子量を求めた。
【００６６】
図１３は、実施例９に係るプロテオグリカン分解物のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示すものであり、横軸はゲルろ過クロマトグラフィーの溶出体積、縦軸はゲルろ過クロマトグラフィー溶出液画分のカルバゾール硫酸法呈色液の５３５ｎｍでの吸光度を示す。図１３中の数字（ｋＤａ表記）は、分子量標準物質であるデキストランの平均分子量を示す。この結果から、実施例９に係るプロテオグリカン分解物の分子量は１７ｋＤａと算出された。
【００６７】
実施例２に記載したとおり、原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量は、１，４００ｋＤａ以上であった。実施例９に係るプロテオグリカン分解物と原料の鮭由来プロテオグリカンの分子量の比較より、実施例９に係るプロテオグリカン分解物は、原料の鮭由来プロテオグリカンが約８２分の１の大きさに分解されたものであることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、プロテオグリカン分解物が低コストで製造され、安価に提供されることになり、化粧料産業や食品産業に広く利用されることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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