(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列；
（ｂ）（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＡＴＥＦＴＳＲＦ（配列番号７）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列；
（ｃ）（１）アミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号３）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＲＴＮＩＨ（配列番号１６）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＧＳＥＳＩＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列；又は
（ｄ）（１）アミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号３）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＳＴＮＩＨ（配列番号１９）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＧＳＥＳＩＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列；
を含む、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＡＴＥＦＴＳＲＦ（配列番号７）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
（１）アミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号３）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＲＴＮＩＨ（配列番号１６）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＧＳＥＳＩＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
（１）アミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号３）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＳＴＮＩＨ（配列番号１９）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＧＳＥＳＩＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
ａ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｂ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
ｃ）配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、又は
ｄ）配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン
を含む、請求項１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
抗体がヒトＩｇＧのＦｃ配列を含む、請求項１−１０の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、ダイアボディ、及び線状抗体からなる群から選択される、請求項１−１１の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片。
【請求項１３】
抗体が多重特異性抗体である、請求項１−１１の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項１４】
抗体がアフコシル化抗体である、請求項１−１３の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項１５】
治療剤にコンジュゲートした、請求項１−１４の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
標識にコンジュゲートした、請求項１−１４の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
標識が放射性同位体、蛍光色素、及び酵素からなる群から選択される、請求項１６に記載の抗ＥＧＦＲ抗体。
【請求項１８】
請求項１−１４の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項１９】
請求項１８の核酸分子をコードする発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１９の発現ベクターを含む細胞。
【請求項２１】
請求項２０の細胞を培養すること及び細胞培養物から抗体を回収することを含む、抗体を産生する方法。
【請求項２２】
請求項１−１５の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
【請求項２３】
請求項１−１０の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を試料に接触させること、及びＥＧＦＲタンパク質に結合した抗ＥＧＦＲ抗体を検出することにより、患者からの試料中のＥＧＦＲタンパク質を検出する方法。
【請求項２４】
抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片が免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）又はＥＬＩＳＡアッセイで使用される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１−１５の何れか一項に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片、又は請求項２２に記載の組成物を含む、被験体におけるがんを治療することに使用するための組成物。
【請求項２６】
がんが、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がん、及び頭頸部がんから選択される、請求項２５に記載の使用のための組成物。
【請求項２７】
抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、及び細胞傷害性剤からなる群から選択される更なる治療剤との共投与のために製剤化される、請求項２５に記載の使用のための組成物。
【請求項２８】
放射線療法と組み合わせて投与するために製剤化される、請求項２５に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１４年５月３０日に出願された米国仮出願第６２／００５８８７号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−１及びＨＥＲ１としても知られている）は、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む、４つの密接に関連する受容体チロシンキナーゼのサブファミリーである、ＥｒｂＢファミリーの受容体の細胞表面受容体である。ＥＧＦＲのリガンド（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ａ（ＴＧＦα）、ＨＢ−ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベータセルリン／ＢＴＣ、エピゲン／ＥＰＧＮ、又はその他）は、ＥＧＦＲのＣ末端ドメインにおける幾つかのチロシン（Ｙ）残基（Ｙ９９２、Ｙ１０４５、Ｙ１０６８、Ｙ１１４８、及びＹ１１７３）の受容体二量体化及び自己リン酸化を誘導する。この自己リン酸化は、ＭＡＰＫ、Ａｋｔ、及びＪＮＫ経路を含む幾つかのシグナル伝達カスケードの下流での活性化を誘発し、細胞移動、接着及び細胞増殖を導く。
【０００３】
ＥＧＦＲ若しくはファミリーメンバーの変異、増幅又は誤調節は、全ての上皮がんの約３０％に関与している。例えば、ＥＧＦＲの過剰発現又は過剰活性をもたらす変異は、肺がん、肛門がん、頭頸部がん及び多形性グリア芽細胞腫を含む多くのがんに関連している。がん遺伝子としてのＥＧＦＲの同定は、ＥＧＦＲに対する抗がん剤の開発の必要性を導いた。本発明は、この必要性及び他の必要性を満たしている。
【０００４】
発明の概要
本発明により提供されるのは、（１）アミノ酸配列Ｎ／Ｔ／Ｑ−ＹＧＶＨ（配列番号４）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列Ｙ−Ｎ／Ａ／Ｇ／Ｄ−Ｔ／Ｄ／Ｎ−Ｐ／Ｋ／Ｅ−ＦＴＳＲＦ（配列番号９）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列Ｔ／Ｄ−Ｙ／Ｌ−ＹＤＹ−Ｅ／Ｎ−ＦＡＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列Ｉ−Ｇ／Ｒ／Ｓ−Ｔ／Ｌ／Ｐ−ＮＩＨ（配列番号２０）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹ−Ａ／Ｇ−ＳＥ−Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｒ（配列番号２４）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴ−Ｔ／Ｌ／Ｓ／Ａ／Ｙ（配列番号３０）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体又はその抗原結合断片である。
【０００５】
幾つかの実施態様において、抗体は、（１）配列番号１−３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号５−８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）配列番号１０−１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）配列番号１５−１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号２１−２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）配列番号２５−２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体は、（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＮＴＰＦＴＳＲＦ（配列番号５）を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（３）アミノ酸配列ＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＴ（配列番号２５）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体は、（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＮＴＰＦＴＳＲＦ（配列番号５）を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体は、（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【０００６】
上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体は、（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＡＴＥＦＴＳＲＦ（配列番号７）を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体は、（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＤＤＫＦＴＳＲＦ（配列番号６）を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体は、（１）アミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号３）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＲＴＮＩＨ（配列番号１６）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＧＳＥＳＩＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体は、（１）アミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号３）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＳＴＮＩＨ（配列番号１９）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＧＳＥＳＩＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【０００７】
また本発明により提供されるのは、アミノ酸配列Ｙ−Ａ／Ｇ／Ｄ−Ｄ／Ｎ−Ｋ／Ｅ−ＦＴＳＲＦ（配列番号３１）を含む選択されたＣＤＲ−Ｈ２を含む重鎖可変ドメインを含む、アグリコシル化されたＣＤＲ−Ｈ２抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体又はその抗原結合断片である。幾つかの実施態様において、重鎖可変ドメインは、アミノ酸配列Ｎ／Ｔ／Ｑ−ＹＧＶＨ（配列番号４）を含むＣＤＲ−Ｈ１及びアミノ酸配列Ｔ／Ｄ−Ｙ／Ｌ−ＹＤＹ−Ｅ／Ｎ−ＦＡＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ−Ｈ３を更に含む。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列Ｉ−Ｇ／Ｒ／Ｓ−Ｔ／Ｌ／Ｐ−ＮＩＨ（配列番号２０）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹ−Ａ／Ｇ−ＳＥ−Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｒ（配列番号２４）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びアミノ酸配列ＮＷＰＴ−Ｔ／Ｌ／Ｓ／Ａ／Ｙ（配列番号３０）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を更に含む。
【０００８】
上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体は、ヒトＩｇＧのＦｃ配列を含む。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、ダイアボディ及び線状抗体からなる群から選択される。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体は多重特異性抗体である。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は治療剤にコンジュゲートされる。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は標識にコンジュゲートされる。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、標識は、放射性同位体、蛍光色素、及び酵素からなる群から選択される。
【０００９】
上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗体はアフコシル化抗体である。
【００１０】
上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は細胞傷害性剤にコンジュゲートされる。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、細胞傷害性剤はメイタンシン又はその誘導体である。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、メイタンシン又はその誘導体はＤＭ−１である。
【００１１】
本発明は、上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子を提供する。また、上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）核酸分子をコードする発現ベクターも提供される。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）発現ベクターを含む細胞もまた提供される。本発明はまた、上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）細胞を培養すること及び細胞培養物から抗体又はその抗原結合断片を回収することを含む抗体を産生する方法を提供する。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、細胞は哺乳動物細胞である。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、細胞は安定な哺乳動物細胞株である。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、安定な哺乳動物細胞株はＣＨＯ細胞株である。
【００１２】
本発明は、上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を試料に接触させること、及びＥＧＦＲタンパク質に結合した抗ＥＧＦＲ抗体を検出することにより、患者からの試料中のＥＧＦＲタンパク質を検出する方法を提供する。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）又はＥＬＩＳＡアッセイで使用される。
【００１４】
また、従うか（又は適用される）組成物の有効量を被験体に投与することを含む、被験体におけるがんを治療する方法も提供される。また提供されるのは、がんの治療に使用のための、上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を含む組成物である。提供されるのは、がんを治療するための医薬の製造における、上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片の使用である。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、がんは、結腸直腸がん、肺がん、及び頭頸部がんから選択される。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、被験体は、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤及び細胞傷害性剤からなる群から選択される治療剤を更に投与される。
【００１５】
上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、がんは咽喉がんである。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、被験体は、放射線療法を更に施される。
【００１６】
上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、被験体は、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤及び細胞傷害性剤からなる群から選択される治療剤を更に投与される。
【００１７】
上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を含む組成物が投与される被験体は、ＫＲＡＳについて野生型である。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を含む組成物が投与される被験体は、ＫＲＡＳＧ１３Ｄ変異を有する。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を含む組成物が投与される被験体は、ＢＲＡＦについて野生型である。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を含む組成物が投与される被験体は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有する。
【００１８】
上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を含む組成物が投与される被験体は、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）又はそのバイオシミラーに耐性がある。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を含む組成物が投与される被験体は、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）又はそのバイオシミラーに対して進行している。上記の実施態様の何れかに従う（又は適用される）幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を含む組成物が投与される被験体は、アービタックス（Ｅｒｂｉｔｕｘ）又はそのバイオシミラーに抵抗性である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＣＤＲ−Ｌ３／ＣＤＲ−Ｈ３ライブラリーから得られた抗ＥＧＦＲ  Ｆａｂ変異体のＥＧＦＲへの結合を比較するために行われたＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】図２は、ＣＤＲ−Ｌ３／ＣＤＲ−Ｈ３ライブラリーから得られた全長抗ＥＧＦＲ  ＩｇＧ抗体変異体のＥＧＦＲへの結合を比較するために行われたＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３】図３は、ＨＬＸ０５抗体（すなわち、社内で製造されたＥＲＢＩＴＵＸバイオシミラー抗体）及びＣＤＲ−Ｈ２ライブラリーから得られた抗ＥＧＦＲ抗体変異体のＥＧＦＲに対するオフ速度（ｏｆｆ  ｒａｔｅ）を比較するために行われたオフ速度ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図４】図４は、ＨＬＸ０５抗体（すなわち、社内で製造されたＥＲＢＩＴＵＸバイオシミラー抗体）、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、抗ＥＧＦＲ抗体１−２６／２−６８、１−２６／３−６７、＃８／＃３３、＃３４／＃３３、及びリツキシマブの直接ＥＧＦＲ結合を比較するために行われたＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図５】図５は、ＨＬＸ０５、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、リツキシマブ、及び抗ＥＧＦＲ抗体１１−２６／２−６８、１−２６／３−６７、＃８／＃３３、及び＃３４／＃３３のＥＧＦＲ結合を比較するための競合的ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ−６Ｂは、ＨＬＸ０５、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、リツキシマブ、及び抗ＥＧＦＲ抗体１１−２６／２−６８、１−２６／３−６７、＃８／＃３３、＃３４／＃３３において行われたグリカン分析の結果を示す。
【図７】図７は、ＨＬＸ０５、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、及び抗ＥＧＦＲ抗体１−２６／２−６８、１−２６／３−６７、＃８／＃３３、＃３４／＃３３のＦｃγＩＩＩ結合を比較するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ＨＬＸ０５と抗ＥＧＦＲ抗体１−２６／２−６８のＡＤＣＣ活性を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＨＬＸ０５と抗ＥＧＦＲ抗体＃８／＃３３のＡＤＣＣ活性を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、抗ＥＧＦＲ抗体１−２６／２−６８及び１−２６／３−６７のＡＤＣＣ活性を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＨＬＸ０５と抗ＥＧＦＲ抗体１−２６／３−６７のＡＤＣＣ活性を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図８Ｅ】図８Ｅは、ＨＬＸ０５と抗ＥＧＦＲ抗体＃３４／＃３３のＡＤＣＣ活性を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図８Ｆ】図８Ｆは、抗ＥＧＦＲ抗体＃８／＃３３及び＃３４／＃３３のＡＤＣＣ活性を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図８Ｇ】図８Ｇは、ＨＬＸ０５、１−２６／２−６８、１−２６／３−６７、＃８／＃３３、及び＃３４／＃３３のＡＤＣＣ活性を比較するために行われた分析の定量化された結果を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、Ａ４３１細胞に対するＨＬＸ０５及び抗ＥＧＦＲ抗体１−２６／２−６８の抗増殖効果を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、Ａ４３１細胞に対するＨＬＸ０５及び抗ＥＧＦＲ抗体＃８／＃３３の抗増殖効果を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、Ａ４３１細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体１−２６／２−６８及び１−２６／３−６７の抗増殖効果を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、Ａ４３１細胞に対するＨＬＸ０５及び抗ＥＧＦＲ抗体１−２６／３−６７の抗増殖効果を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図９Ｅ】図９Ｅは、Ａ４３１細胞に対するＨＬＸ０５及び抗ＥＧＦＲ抗体＃３４／＃３３の抗増殖効果を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図９Ｆ】図９Ｆは、Ａ４３１細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体＃８／＃３３及び＃３４／＃３３の抗増殖効果を比較するために行われた分析の結果を示す。
【図９Ｇ】図９Ｇは、Ａ４３１細胞に対するＨＬＸ０５、１−２６／２−６８、１−２６／３−６７、＃８／＃３３、及び＃３４／＃３３の抗増殖効果を比較するために行われた分析の定量化された結果を示す。
【図１０】図１０は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、＃３４／＃３３、１−２６／３−６７、及び１−２６／２−６８の腫瘍増殖を阻害する能力を測定するＡ４３１腫瘍異種移植アッセイの結果を示す。
【図１１】図１１は、３日目及び３５日目の両日の＃３４／＃３３、１−２６／３−６７、１−２６／２−６８、及びＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）の血清レベルを示す。
【図１２】図１２は、ＨＬＸ０５，１−２６／３−６７、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、及びプラセボの腫瘍増殖を阻害する能力を測定するＦａＤｕ腫瘍異種移植アッセイの結果を示す。
【図１３】図１３は、１−２６／３−６７＋放射線療法、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、＋放射線療法及びプラセボ＋放射線療法の腫瘍増殖を阻害する能力を測定するＦａＤｕ腫瘍異種移植アッセイの結果を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＤｉＦｉ細胞（ＫＲＡＳＷＴ、ＢＲＡＦＷＴ）の増殖を阻害するＨＬＸ０７−ＤＭ１、ＨＬＸ０７、及び対照抗体の能力を評価するために行われたインビトロ実験の結果を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＨＣＴ−１１６細胞（ＫＲＡＳＧ１３Ｄ）の増殖を阻害するＨＬＸ０７−ＤＭ１、ＨＬＸ０７、及び対照抗体の能力を評価するために行われたインビトロ実験の結果を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＨＴ２９細胞（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）の増殖を阻害するＨＬＸ０７−ＤＭ１、ＨＬＸ０７、及び対照抗体の能力を評価するために行われたインビトロ実験の結果を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＰＢＭＣエフェクター細胞を用いたＤｉＦｉ細胞（ＫＲＡＳＷＴ）に対する１−２６／３−６７−ＦＦ（すなわち、「フコースフリー」）、１−２６／３−６７、及び対照抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＰＢＭＣエフェクター細胞を用いたＨＣＴ−１１６細胞（ＫＲＡＳＧ１３Ｄ）に対する１−２６／３−６７−ＦＦ（すなわち、「フコースフリー」）、１−２６／３−６７、及び対照抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＰＢＭＣエフェクター細胞を用いたＨＴ２９細胞（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）に対する１−２６／３−６７−ＦＦ（すなわち、「フコースフリー」）、１−２６／３−６７、及び対照抗体のＡＤＣＣ活性を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、カニクイザルにおける経時的な３４／３３及び３／６７の血清濃度を比較するために行われたＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、カニクイザルにおける経時的なＨＬＸ０５（すなわち、１−３）、及びＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（すなわち、４−６）の血清濃度を比較するために行われたＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１７】図１７は、安定な細胞株によって産生される時間に対する１−２６／３−６７抗体の濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、新規な抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体を提供する。出願人は驚くべきことに、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体は、転移性結腸直腸がん及び頭頸部がんの治療のために使用されるＦＤＡ承認抗ＥＧＦＲ抗体であるＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）と比較して増強された治療効果を示すことを見いだした。本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体はまた、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも長い半減期を示す。
【００２１】
関連する態様において、本発明は、ＣＤＲ−Ｈ２にＮ−グリコシル化モチーフを欠く新規抗ＥＧＦＲ抗体を提供する。抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域内のグリコシル化、例えばＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）のＶＨ領域のＡｓｎ９９でのＮ−グリカンなどは、抗原結合を妨害することによって抗体の治療効果を低下させることができる。更に、このようなグリコシル化は、変化した機能、免疫原性、又は安定性をもたらし得る抗体のバッチ内で不均一性を引き起こし得る。ＣＤＲ−Ｈ２にグリコシル化モチーフを欠く抗ＥＧＦＲ抗体の産生バッチに存在するグリコフォームはより少ない。
【００２２】
また、本明細書に記載のイムノコンジュゲート、新規抗ＥＧＦＲ抗体をコードする核酸、及び組成物（薬学的組成物など）も提供される。本発明はまた、試料（例えば、インビボ又はエキソビボの試料）中のＥＧＦＲを検出するための新規抗ＥＧＦＲ抗体を使用する方法、がんの治療に使用のためのこのような抗体を含む組成物、及びがんの治療のための医薬の製造におけるこのような抗体の使用に関する。
【００２３】
定義
本明細書で使用する「治療」又は「治療する」は、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るためのアプローチである。この発明の目的では、有益な又は所望の結果は、限定するものではないが、次のものの一又は複数を含む：疾患から生じる一又は複数の症状を軽減させること、疾患の程度を減少させること、疾患を安定化させること（例えば、疾患の悪化を防止又は遅延させる）、疾患の広がり（例えば、転移）を予防又は遅延させること、疾患の再発を予防又は遅延させること、疾患の進行を遅延又は緩慢にすること、疾患状態を寛解させること、疾患の寛解（部分的又は完全）を提供すること、疾患を治療するために必要とされる一又は複数の他の医薬の用量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、生活の質を向上又は改善すること、体重増加を増やすこと、及び／又は生存を延長すること。また、「治療」に包含されるのは、がんの病理学的帰結（例えば、腫瘍体積など）の減少である。本明細書で提供される方法は、治療のこれらの態様の何れか一又は複数を企図する。
【００２４】
「再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）」、「再発（ｒｅｌａｐｓｅ）」又は「再発（ｒｅｌａｐｓｅｄ）」という用語は、疾患の消失を臨床的に評価した後のがん又は疾患の再発（ｒｅｔｕｒｎ）を指す。遠隔転移又は局所再発の診断は再発とみなすことができる。
【００２５】
用語「難治性」又は「耐性」とは、治療に応答しないがん又は疾患を指す。
【００２６】
「補助療法」という用語は、一次療法（通常は外科手術）後に施される治療を意味する。がん又は疾患のための補助療法には、免疫療法、化学療法、放射線療法、又はホルモン療法が含まれ得る。
【００２７】
「維持療法」という用語は、以前の治療効果を維持するのに役立つよう与えられるスケジュールされた再治療を指す。維持療法は、がんを寛解状態に保つのを助けるために、又は疾患の進行にかかわらず特定の療法への応答を延長するために、しばしば施される。
【００２８】
用語「侵襲性がん」とは、正常な周囲組織に始まった組織の層を越えて広がっているがんを指す。浸潤性がんは転移性である場合と転移性でない場合がある。
【００２９】
用語「非侵襲性がん」とは、非常に初期のがん又は起源の組織を超えて広がっていないがんを指す。
【００３０】
腫瘍学における「無増悪生存期間」という用語は、がんが増殖しない治療中及び治療後の期間を指す。無増悪生存期間には、患者が完全な応答又は部分応答を経験した時間、並びに患者が安定した疾患を経験した時間が含まれる。
【００３１】
腫瘍学における「進行性疾患」という用語は、治療の開始以来、腫瘍の質量の増加又は広がりに起因した、２０％以上の腫瘍増殖を指すことができる。
【００３２】
「障害」は、抗体による治療から利益を得るであろう任意の状態である。例えば、異常なＥＧＦＲ活性に罹患しているか又は予防が必要な哺乳類。これには、哺乳動物に問題の疾患に罹らせる病的状態を含む慢性及び急性の障害又は疾患が含まれる。本明細書において治療される障害の非限定的な例には、がん（頭頸部がん、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がんなど）が含まれる。
【００３３】
本明細書で用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍細胞成長及び増殖、及び全ての前がん性及びがん性の細胞及び組織を意味する。
【００３４】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、単一モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト及び中和抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル抗体、一本鎖抗抗体、及び抗体断片（それらが本発明の生物学的活性又は免疫学的活性を示す限り）（以下を参照されたい）を含み得る。一実施態様によれば、抗体は、オリゴマー形態の標的タンパク質（例えば、三量体形態）に結合する。別の実施態様によれば、抗体はタンパク質に特異的に結合し、この結合は本発明のモノクローナル抗体（例えば、本発明の寄託抗体など）によって阻害され得る。抗体の「機能的断片又は類似体」という語句は、それが参照される抗体と共通の定性的な生物活性を有する化合物である。例えば、本発明の抗体の機能的断片又は類似体は、ＥＧＦＲに特異的に結合することができるものであり得る。一実施態様において、抗体は、ＥＧＦＲが細胞増殖を誘導する能力を予防するか、又は実質的に低下させることができる。
【００３５】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含むことができる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法により判定して抗体９５重量％超、及び最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クーマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いる還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一つの精製工程により調製される。
【００３６】
基本的な４鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖及び２つの同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる付加的ポリペプチドと共に５つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、従って、１０の抗原結合部位を含み、一方分泌型ＩｇＡ抗体は重合し、Ｊ鎖と共に２つから５つの基本的な４鎖単位を含む多価集合体を形成することができる）。ＩｇＧの場合、４鎖単位は一般的に約１５００００ダルトンである。各Ｌ鎖は一つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結している一方、２つのＨ鎖はＨ鎖のアイソタイプに応じて一又は複数のジスルフィド結合により互いに連結されている。また各Ｈ及びＬ鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有している。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）と、これに続くα及びγ鎖それぞれに対しては３つの定常ドメイン（ＣＨ）と、μ及びεアイソタイプに対しては４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）と、これに続く定常ドメイン（ＣＬ）をその他端に有する。ＶＬはＶＨに整列しており、ＣＬは重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）に整列している。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖の可変ドメインの界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬは対になって単一の抗原結合部位を形成する。異なったクラスの抗体の構造及び特性について、例えば、Basic and Clinical Immunology, ８版、Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow （編）、Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 71頁、６章を参照のこと。
【００３７】
任意の脊椎動物種からのＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ及びラムダと呼ばれる明確に区別される２つのタイプのタイプを割り当てることができる。それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に基づき、免疫グロブリンは、種々のクラス又はアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、それぞれ、α、δ、γ、ε及びμと命名された重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つのクラスがある。γ及びαクラスは更にＣＨ配列及び機能の比較的小さな差異に基づいてサブクラスに分割され、例えばヒトでは、次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。
【００３８】
「可変」なる用語は、可変ドメインの所定のセグメントが抗体間で配列の点で広範囲に相違していることを意味する。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を定める。しかしながら、可変性は可変ドメインの１１０アミノ酸全長にわたって均一に分布しているのではない。その代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９−１２アミノ酸長である「高頻度可変領域」と呼ばれる極度の可変性のより短い領域により分離した１５−３０のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる相対的に不変の伸長部からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の超可変領域はＦＲによって極く近傍に一緒に保持され、他の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接は関係しないが、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続抗原結合部位を意味することが意図される。これらの特定の領域は、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest" (1991); by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)；及びMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)により記載され、ここではその定義は、互いに比較した場合に、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体若しくは移植抗体又はその変異体のＣＤＲを意味する何れかの定義の適用は、本明細書において定義され、使用される場合の用語の範囲内にあることを意図している。上記の引用文献の各々によって定義されるように、ＣＤＲを包含するアミノ酸残基が、比較として以下の表１に記載されている。
0006691872.tif 000002
【００４０】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在することができる可能な自然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であって、単一の抗原部位に対するものである。更に、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、他の抗体により汚染されずに合成されることができる点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al. Nature. 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製することができ、又は細菌、真核生物の動物又は植物細胞において組換えＤＮＡ法を用いて作製することができる（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol. , 222:581-597 (1991)、及び以下の実施例に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００４１】
本発明のモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるが、その（それらの）鎖の残部は別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体の断片（但し、それらが本発明の生物学的活性を示すことを条件とする）であり得る（米国特許第４８１６５６７号；Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)）。本明細書における対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）及びヒト定常領域配列に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含む霊長類化抗体が含まれる。
【００４２】
「インタクトな」抗体は、抗原結合部位並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列変異体であることができる。好ましくは、インタクトな抗体は、一又は複数のエフェクター機能を有する。
【００４３】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体（米国特許第５６４１８７０号の実施例２； Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]参照）；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００４４】
「直鎖状抗体」という表現は、一般的には、Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を意味する。簡単に言えば、これらの抗体は、相補的な軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域の対を形成する一対の直列のＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は二重特異性であっても単一特異性であってもよい。
【００４５】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片と、残りの「Ｆｃ」断片（容易に結晶化する能力を反映する命名である）を生成する。Ｆａｂ断片は、Ｌ鎖全体並びにＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、及び一つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が生じ、これは凡そ、二価の抗原結合活性を有するジスルフィド結合した二つのＦａｂ断片に対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基を更に有している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、Ｆａｂ’の一般名称であり、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つ。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００４６】
Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一緒に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域内の配列によって決定される。この領域は、特定の細胞型に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
【００４７】
「変異体Ｆｃ領域」は、本明細書に定義される少なくとも１つの「アミノ酸修飾」により、天然配列Ｆｃ領域とは異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を、例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域に、約１から約１０のアミノ酸置換、及び好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。一実施態様において、本明細書の変異体Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約８５％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性又は少なくとも約９９％の相同性を有する。別の実施態様において、本明細書の変異体Ｆｃ領域は、親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約８５％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性又は少なくとも約９９％の相同性を有する。
【００４８】
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」という用語は、Ｆｃ領域を含む抗体又はイムノアドヘシン（本明細書の他の箇所の定義を参照のこと）などのポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７）は、例えば、ポリペプチドの精製中に、又はポリペプチドをコードする核酸を組換え的に遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。従って、本発明によるＦｃ領域を有する抗体を含むポリペプチドを含む組成物は、全てのＫ４４７残基が除去されたポリペプチド集団、Ｋ４４７残基が除去されていないポリペプチド集団、又はＫ４４７残基を有するポリペプチドと有さないポリペプチドの混合物を有するポリペプチド集団を含むことができる。
【００４９】
抗体「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因しうる生物学的活性を指し、抗体のアイソタイプにより変化する。抗体のエフェクター機能の例は：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化を含む。「天然配列Ｆｃ領域」は、天然にみられるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含む。Ｆｃ配列の例は、例えば、限定されるものではないが、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載される。
【００５０】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、一つの重鎖及び一つの軽鎖可変領域ドメインが、堅固な非共有結合をなした二量体からなる。これら二つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖それぞれ由来の３つのループ）が生じる。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な三つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００５１】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖内に結合したＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦｖが抗原結合のために望まれる構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infraを参照のこと。
【００５２】
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」は、鎖間ではなく鎖内でＶドメインを対形成させ、結果として二価の断片、すなわち２つの抗原−結合部位を有する断片が得られるように、ＶＨとＶＬドメインとの間に短いリンカー（約５−１０残基）を有するｓＦｖ断片（前の段落を参照）を構築することにより調製される小型の抗体断片を意味する。二重特異性ダイアボディは、二つの抗体のＶＨドメインとＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する二つの「クロスオーバー」Ｆｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により完全に記載されている。
【００５３】
非ヒト（例えばげっ歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大抵の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、非ヒト種、例えば、所望の抗体特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長動物の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例においては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。更に、ヒト化抗体はレシピエント抗体又はドナー抗体において見いだされない残基を含むことが可能である。これらの修飾は、抗体の性能を更に改良するために作成される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの全てを実質的に含み、ここでは超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含むであろう。更なる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照。
【００５４】
本明細書において同定されたポリペプチド及び抗体配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」又は「相同性」は、任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮して配列を整列させた後に、比較されるポリペプチド中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、カリフォルニア州サウスサンフランシスコのジェネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）から公的に入手可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルする必要がある。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて変動しない。
【００５５】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述するために使用される。一実施態様において、本発明のＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫受容体チロシン−ベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫受容体チロシン−ベース活性化モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する（概説Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)を参照）。その用語には、ＦｃγＲＩＩＩＡアロタイプ：ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｐｈｅ１５８、ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｖａｌ１５８、ＦｃγＲＩＩＡ−Ｒ１３１及び／又はＦｃγＲＩＩＡ−Ｈ１３１などのアロタイプが含まれる。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)に総説される。他のＦｃＲは、将来同定されるべきものを含み、本明細書にて用語「ＦｃＲ」により網羅される。この用語には、胎児への母親のＩｇＧの移行に関与している新生児の受容体ＦｃＲｎも含まれる（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 249 (1994)）。
【００５６】
「ＦｃＲｎ」という用語は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を指す。ＦｃＲｎは主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と構造的に類似しており、β２−マイクログロブリンに非共有結合したα鎖からなる。新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎの複数の機能は、Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766に総説される。ＦｃＲｎは、母親から子どもへの免疫グロブリンＩｇＧの受動的送達及び血清ＩｇＧレベルの調節において役割を果たす。ＦｃＲｎは、サルベージ受容体として作用し、細胞内及び細胞間のインタクトな形態の貪食されたＩｇＧを結合及び輸送し、それらをデフォルトの分解経路から救出することができる。
【００５７】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ１ドメイン」（「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも称される）は、通常約アミノ酸１１８から約アミノ酸２１５（ＥＵ番号付けシステム）に及ぶ。
【００５８】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０まで延びていると定義される（Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりＩｇＧ１と整列させることができる。
【００５９】
Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は、通常、ヒンジ領域のすぐＣ末端の残基、すなわちＦｃ領域の残基２３３から２３９のストレッチとして定義される。以前の報告では、ＦｃＲ結合は、一般に、ＩｇＧ  Ｆｃ領域の下部ヒンジ領域のアミノ酸残基によるものである。
【００６０】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｈ２」ドメインの「Ｃ２」とも称される）は、通常約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０に及ぶ。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合しないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐型糖鎖が、インタクトな天然型ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。糖鎖はドメイン−ドメイン対合の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測される。Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985)。
【００６１】
「ＣＨ３ドメイン」（「Ｃ２」又は「Ｈ３」ドメインとも称される）は、Ｆｃ領域のＣ末端からＣＨ２ドメインまでの残基のストレッチ（すなわち、抗体配列のアミノ酸残基約３４１からＣ末端まで、典型的にはＩｇＧのアミノ酸残基４４６又は４４７まで）を含む。
【００６２】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然型配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わさることを必要とし、例えばここに開示される様々なアッセイを使用して評価することができる。
【００６３】
「Ｃ１ｑ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは、２つのセリンプロテアーゼＣ１ｒ及びＣ１ｓとともに、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の第１成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは、例えばＱｕｉｄｅｌ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから商業的に購入することができる。
【００６４】
「結合ドメイン」という用語は、別の分子に結合するポリペプチドの領域を指す。ＦｃＲの場合、結合ドメインは、Ｆｃ領域の結合に関与するポリペプチド鎖の一部（例えば、そのアルファ鎖）を含むことができる。有用な結合ドメインの１つは、ＦｃＲアルファ鎖の細胞外ドメインである。
【００６５】
「改変された」ＦｃＲ結合親和性又はＡＤＣＣ活性を有する変異体ＩｇＧ  Ｆｃを有する抗体は、親ポリペプチド又は天然配列Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して、ＦｃＲ結合活性（例えば、ＦｃγＲ又はＦｃＲｎ）及び／又はＡＤＣＣ活性の何れかを増強又は低下させたものである。ＦｃＲに対して「増加した結合を示す」変異体Ｆｃは、親ポリペプチド又は天然配列ＩｇＧ  Ｆｃよりも高い親和性（例えば、低い見かけのＫｄ又はＩＣ５０値）で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。幾つかの実施態様によれば、親ポリペプチドと比較した結合の改善は、約３倍、好ましくは約５，１０，２５，５０，６０，１００，１５０，２００，最大５００倍又は約２５％から１０００％の結合の改善である。ＦｃＲに対して「減少した結合を示す」ポリペプチド変異体は、親ポリペプチドよりも低い親和性（例えば、高い見かけのＫｄ又はＩＣ５０値）で少なくとも１つのＦｃＲに結合する。親ポリペプチドと比較した結合の減少は、結合の約４０％以上の減少であり得る。
【００６６】
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性」又はＡＤＣＣは、ある種の細胞傷害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞傷害エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞傷害性の形態を意味する。抗体は細胞傷害性細胞を「作動可能にし」、このような死滅に絶対的に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号若しくは同第５８２１３３７号又は以下の例に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代わりに、又は更に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されている動物モデルなどの動物モデルで評価されうる。
【００６７】
野生型ＩｇＧ  Ｆｃ又は親ポリペプチドを有するポリペプチドよりも効果的にヒトエフェクター細胞の存在下で「ＡＤＣＣを増加させる」、又は抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介する変異体Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチド及び野生型Ｆｃ領域を有するポリペプチド（又は親ポリペプチド）の量が本質的に同じである場合、インビトロ又はインビボでＡＤＣＣを媒介する上で実質的により効果的であるものである。一般に、そのような変異体は、例えば動物モデルにおいてＡＤＣＣ活性を測定するためのアッセイ又は方法など、当技術分野で公知の任意のインビトロＡＤＣＣアッセイを用いて同定されるであろう。一実施態様において、好ましい変異体は、野生型Ｆｃ（又は親ポリペプチド）よりもＡＤＣＣを媒介する点において、約５倍から約１００倍、例えば約２５倍から約５０倍、より有効である。
【００６８】
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。標準的補体経路の活性化は、補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）の、それらの同種抗原に結合した（適切なサブクラスの）抗体への結合により開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されるように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列が改変されてＣ１ｑ結合能力が向上したか又は低下したポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５Ｂ１号及び国際公開第９９／５１６４２号に記述されている。これらの特許文献の内容は出典明示により本明細書に援用される。また、Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
【００６９】
本明細書に開示される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）又は組成物の「有効量」は、具体的に述べられた目的を実行するのに十分な量である。「有効量」は、経験的に、及び記載された目的に関連する公知の方法によって決定することができる。
【００７０】
「治療的有効量」という用語は、哺乳動物（別名患者）の疾患又は障害の「治療」のために有効な、本明細書に開示される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）又は組成物の量を指す。がんの場合は、本明細書に開示される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）又は組成物の治療的有効量は、がん細胞の数を減少させる；腫瘍の大きさ又は重さを小さくする；がん細胞の周辺器官への浸潤を阻害する（すなわち、ある程度まで遅くする、好ましくは止める）；腫瘍の転移を阻害する（すなわち、ある程度まで遅くする、好ましくは止める）；腫瘍の増殖をある程度まで阻害する；及び／又はがんに関連する一又は複数の症状をある程度まで和らげることが可能である。本明細書に開示される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）又は組成物が、現存のがん細胞の増殖を妨げ及び／又は死滅させる範囲において、それは細胞分裂停止性及び／又は細胞傷害性である。一実施態様では、治療的有効量は増殖阻害量である。別の実施態様では、治療的有効量は、患者の生存期間を延長する量である。別の実施態様では、治療的有効量は、患者の無増悪生存期間を改善する量である。
【００７１】
本発明の本明細書に開示される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）又は組成物の「増殖阻害量」は、インビトロ又はインビボの何れかで細胞、特に腫瘍、例えばがん細胞の増殖を阻害することができる量である。腫瘍細胞増殖を阻害する目的のための本発明のポリペプチド、抗体、アンタゴニスト又は組成物の「増殖阻害量」は、経験的に、及び既知の方法又は本明細書で提供される実施例により決定することができる。
【００７２】
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）又は組成物の「細胞傷害性量」は、インビトロ又はインビボの何れかで細胞、特に腫瘍、例えばがん細胞の破壊を引き起こすことができる量である。腫瘍細胞増殖を阻害する目的のための本発明の抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）又は組成物の「細胞傷害性量」は、経験的に、及び当技術分野で公知の方法により決定することができる。
【００７３】
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）又は組成物の「増殖阻害量」は、インビトロ又はインビボの何れかで細胞、特に腫瘍、例えばがん細胞の増殖を阻害することができる量である。腫瘍細胞増殖を阻害する目的のための本発明の抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）又は組成物の「増殖阻害量」は、経験的に、及び既知の方法又は本明細書で提供される実施例により決定することができる。
【００７４】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能」又は「薬理学的に適合性」とは、生物学的又はその他の点で所望されなくない物質を意味し、例えば、物質は、有意な所望されない生物学的効果を引き起こすことなく、又はそれが含まれる組成物の他の成分の何れかと有害な様式で相互作用することなく、患者に投与される薬学的組成物に組み込むことができる。薬学的に許容可能な担体又は賦形剤は、好ましくは、毒物学及び製造試験の要求基準を満たしているか、及び／又は米国食品医薬品局によって作成された不活性成分ガイドに含まれている。
【００７５】
「検出する」という用語は、物質の存在又は非存在を決定すること又は物質（ＥＧＦＲなど）の量を定量することを含むことを意図する。従って、その用語は、定性的及び定量的測定のための本発明の材料、組成物、及び方法の使用を指す。一般に、検出に使用される特定の技術は、本発明の実施には重要ではない。
【００７６】
例えば、本発明による「検出する」とは、ＥＧＦＲ遺伝子産物、ｍＲＮＡ分子、又はＥＧＦＲポリペプチドの存在又は非存在；ＥＧＦＲポリペプチドのレベル又は標的に結合した量の変化；ＥＧＦＲポリペプチドの生物学的機能／活性の変化を観察することを含み得る。幾つかの実施態様において、「検出する」は、野生型ＥＧＦＲレベル（例えば、ｍＲＮＡ又はポリペプチドレベル）を検出することを含み得る。検出するとは、対照と比較した場合、１０％から９０％の間の任意の値、又は３０％から６０％の間の任意の値、又は１００％を超える任意の値の変化（増加又は減少）を定量化することを含み得る。検出するとは、２倍から１０倍までの間の任意の値、又はそれ以上、例えば１００倍の変化を定量化することが含まれ得る。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「標識」という単語は、抗体に直接的又は間接的にコンジュゲートした検出可能な化合物又は組成物を指す。標識がそれ自体で検出可能（例えば放射性標識又は蛍光性標識）であってもよく、又は酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
【００７８】
本明細書において「約」の値又はパラメーターへの言及は、この技術分野における当業者に容易に知られるそれぞれの値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書において「約」の値又はパラメーターへの言及は、その値又はパラメーター自体を対象にする態様を含む（及び記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は「Ｘ」の記述が含まれる。
【００７９】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施態様は、態様及び実施態様を「含む」、「からなる」及び／又は「から本質的になる」を含む。
【００８０】
特許出願及び刊行物を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参考により本明細書に援用される。
【００８１】
抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体
本発明は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合する新規な抗体の同定に基づく。抗ＥＧＦＲ抗体は、様々な治療方法及び診断方法において使用することができる。例えば、頭頸部がん、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がんなどを含む、異常なＥＧＦＲ発現又は異常なＥＧＦＲ活性を特徴とする疾患の治療において、抗ＥＧＦＲ抗体を単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。本明細書で提供される抗体は、抗ＥＧＦＲ抗体を患者に投与し、患者からの試料中において（例えば、インビボ又はエクスビボで）ＥＧＦＲタンパク質に結合した抗ＥＧＦＲ抗体を検出することによって、又は患者からの試料と抗ＥＧＦＲ抗体とを接触させ、ＥＧＦＲタンパク質に結合した抗ＥＧＦＲ抗体を定性的に又は定量的に検出することによって、患者又は患者試料中のＥＧＦＲタンパク質を検出するために使用することもできる。
【００８２】
上皮増殖因子受容体又は「ＥＧＦＲ」（ＥＲＢＢ、ＥＲＢＢ１、ＨＥＲ１、ＰＩＧ６１、ｍＥＮＡ、細胞増殖抑制タンパク質４０、細胞増殖誘導タンパク質６１及びＥＣ２．７．１０．１としても知られている）は、４つの密接に関連する受容体チロシンキナーゼのサブファミリーである、ＥｒｂＢ  ファミリーの受容体のメンバーである。ＥＧＦＲは、その特異的リガンド（上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦα、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子、アンフィレグリン、ベータセルリン（ＢＴＣ）、エピゲン（ＥＰＧＮ）など）の結合によって活性化され、その上でＥＧＦＲが二量体化及びチロシン自己リン酸化を受ける。自己リン酸化は、例えばホスファチジル３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ホスホリパーゼ（ＰＬ）Ｃ−ｇ１、Ａｋｔ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）、並びに細胞増殖、運動性、接着及び移動に関連する他のシグナル伝達カスケードの下流の活性化につながる。異常なＥＧＦＲ発現又はＥＧＦＲ活性は、多くのがん（頭頸部がん、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がんなど）に関連する。
【００８３】
抗ＥＧＦＲ抗体は、十分な親和性及び特異性でＥＧＦＲに結合する抗体である。好ましくは、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその抗原結合断片）は、ＥＧＦＲ活性が関与する疾患又は状態を標的としかつ妨げる治療剤として使用することができる。抗ＥＧＦＲ抗体は、通常、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、Ｈｅｒ３／ＥＲＢｂ３又はＨｅｒ４／ＥＲＢｂ４などの他のＥＲＢｂファミリーに結合しないであろう。好ましくは、抗ＥＧＦＲ抗体は、組換えヒト化抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である。一実施態様によれば、抗ＥＧＦＲ抗体は、本明細書中に開示される抗体の何れか１つのＣＤＲ、可変重鎖領域、及び／又は可変軽鎖領域を含む。
【００８４】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体（又はその抗原結合断片）は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；アミノ酸配列ＹＮＴＰＦＴＳＲＦ（配列番号５）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及びアミノ酸配列ＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；及びアミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＴ（配列番号２５）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む抗ＥＧＦＲ抗体の変異体であり、ここで該変異体は、配列番号５，１０，１５，２１、及び／又は２５の１つ又は複数における少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。幾つかの実施態様において、変異体は、配列番号５，１０，１５，２１、及び／又は２５のうちの１つ又は複数において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個のアミノ酸置換を含む。ある実施態様において、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。ある実施態様において、アミノ酸置換は、抗体が抗原に結合する能力を実質的に低下させない。例えば、ＥＧＦＲ結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）が作成され得る。抗ＥＧＦＲ抗体変異体の結合親和性は、以下の実施例に記載の方法を用いて評価することができる。
【００８５】
保存的置換は、表２の「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表２の「典型的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は対象の抗体に導入され、生成物は、所望の活性、例えば、保持された／改善されたＥＧＦＲ結合性、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングされうる。
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【００８６】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一クラスのメンバーを別のクラスのもと交換することを必要とするであろう。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば本明細書に記載のファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成することができる。簡潔に言えば、一以上のＣＤＲ残基が変異され、変異体抗体は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変（例えば、置換）は、例えば抗体の親和性を向上させるために、ＨＶＲで行うことができる。このような改変は、ＨＶＲの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異を受けるコドンにコードされた残基で（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照）、及び／又はＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）で行うことができ、得られた変異体ＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリから構築し選択し直すことによる親和性成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)に記載されている。
【００８７】
親和性成熟の幾つかの実施態様において、多様性が、種々の方法（例えば変異性ＰＣＲ、鎖シャッフリング又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）の何れかにより、成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次に、二次ライブラリーが作製される。次に、前記ライブラリーはスクリーニングされて、所望の親和性を有る任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するするもう一つの方法は、幾つかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４から６残基）がランダム化されたＨＶＲ指向のアプローチを含む。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを用いて特異的に同定することができる。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３が多くの場合標的とされる。
【００８８】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体（又はその抗原結合断片）は、アミノ酸配列Ｎ／Ｔ／Ｑ−ＹＧＶＨ（配列番号４）を含むＣＤＲ−Ｈ１；アミノ酸配列Ｙ−Ｎ／Ａ／Ｇ／Ｄ−Ｔ／Ｄ／Ｎ−Ｐ／Ｋ／Ｅ−ＦＴＳＲＦ（配列番号９）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及びアミノ酸配列Ｔ／Ｄ−Ｙ／Ｌ−ＹＤＹ−Ｅ／Ｎ−ＦＡＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びにアミノ酸配列Ｉ−Ｇ／Ｒ／Ｓ−Ｔ／Ｌ／Ｐ−ＮＩＨ（配列番号２０）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹ−Ａ／Ｇ−ＳＥ−Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｒ（配列番号２４）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びアミノ酸配列ＮＷＰＴ−Ｔ／Ｌ／Ｓ／Ａ／Ｙ（配列番号３０）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体（又はその抗原結合断片）は、配列番号１−３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；配列番号５−８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び配列番号１０−１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに配列番号１５−１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；配列番号２１−２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び配列番号２５−２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。本明細書に記載のＣＤＲの配列を以下の表３に示す。
0006691872.tif 000004
【００８９】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体（又はその抗原結合断片）は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；アミノ酸配列ＹＮＴＰＦＴＳＲＦ（配列番号５）を含むＣＤＲ−Ｈ２及びアミノ酸配列ＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びにアミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＴ（配列番号２５）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００９０】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；アミノ酸配列ＹＮＴＰＦＴＳＲＦ（配列番号５）を含むＣＤＲ−Ｈ２及びアミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びにアミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びアミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００９１】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２及びアミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びにアミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びアミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００９２】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；アミノ酸配列ＹＡＴＥＦＴＳＲＦ（配列番号７）を含むＣＤＲ−Ｈ２及びアミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びにアミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びアミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００９３】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；アミノ酸配列ＹＤＤＫＦＴＳＲＦ（配列番号６）を含むＣＤＲ−Ｈ２及びアミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びにアミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びアミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００９４】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号３）を含むＣＤＲ−Ｈ１；アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２及びアミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びにアミノ酸配列ＩＲＴＮＩＨ（配列番号１６）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹＧＳＥＳＩＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びアミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００９５】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号３）を含むＣＤＲ−Ｈ１；アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２及びアミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びにアミノ酸配列ＩＳＴＮＩＨ（配列番号１９）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹＧＳＥＳＩＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びアミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００９６】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号３２−３５の何れか１つに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号３６−３９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。配列番号３２−３９のアミノ酸配列が以下に提供される。
配列番号３２
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＳＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴ
配列番号３３
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＲＴＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＧＳＥＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＳＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴ
配列番号３４
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＴＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＧＳＥＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＳＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴ
配列番号３５
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴ
配列番号３６
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＴＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＧＮＥＦＴＳＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＬＤＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡ
配列番号３７
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＧＮＥＦＴＳＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＬＤＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡ
配列番号３８
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＡＴＥＦＴＳＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＬＤＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡ
配列番号３９
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡ
【００９７】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００９８】
重鎖及び軽鎖可変ドメインは、可能な全てのペアワイズの組み合わせで組み合わせて、幾つかの抗ＥＧＦＲ抗体を生成する。
【００９９】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＣＤＲ−Ｈ２においてＮ−グリコシル化モチーフを欠いている（「アグリコシル化ＣＤＲ−Ｈ２抗ＥＧＦＲ抗体」）。ＶＨ領域のＡｓｎ９９におけるＮ−グリカン又はＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）のような治療用抗体の重鎖又は軽鎖可変領域におけるグリコシル化は、改変された機能、免疫原性、又は安定性をもたらし得る抗体のバッチ内の差異を引き起こし得る。
【０１００】
ある実施態様において、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＣＤＲ−Ｈ２抗ＥＧＦＲ抗体は、アミノ酸配列Ｙ−Ａ／Ｇ／Ｄ−Ｄ／Ｎ−Ｋ／Ｅ−ＦＴＳＲＦ（配列番号３１）を含むＣＤＲ−Ｈ２を含む重鎖可変ドメインを含む。ある実施態様において、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＣＤＲ−Ｈ２抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列Ｎ／Ｔ／Ｑ−ＹＧＶＨ（配列番号４）を含むＣＤＲ−Ｈ１及びアミノ酸配列Ｔ／Ｄ−Ｙ／Ｌ−ＹＤＹ−Ｅ／Ｎ−ＦＡＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖を更に含む。ある実施態様において、アグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ＣＤＲ−Ｈ２抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列Ｉ−Ｇ／Ｒ／Ｓ−Ｔ／Ｌ／Ｐ−ＮＩＨ（配列番号２０）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹ−Ａ／Ｇ−ＳＥ−Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｒ（配列番号２４）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びアミノ酸配列ＮＷＰＴ−Ｔ／Ｌ／Ｓ／Ａ／Ｙ（配列番号３０）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を更に含む。上記のＣＤＲの配列が以下の表４に提供される。
0006691872.tif 000005
【０１０１】
抗体グリコシル化を分析する方法には、限定されないが、例えばクロマトグラフィー（陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）又は液体クロマトグラフィーなど）、質量分析（エレクトロスプレーイオン化質量分析など）及びキャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウムが含まれる。そのような方法は、例えば、以下に記載される。Jung et al. (2011) Curr Op Biotechnol. 22(6):858-67; Cummings RD, Etzler ME. Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 45; Mulloy B, Hart GW, Stanley P. Structural Analysis of Glycans. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 47; Leymarie, et al. (2012) Anal Chem. 84(7): 3040-3048; Fernandez (2005) European Biopharmaceutical Review. pp 106 -110; and Raju, T. (2013) Methods Mol Biol. 988: 169-180。
【０１０２】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｈｅｒ２／ＥＲＢｂ２、Ｈｅｒ３／ＥＲＢｂ３、又はＨｅｒ４／ＥＲＢｂ４などのＥＧＦＲホモログに対して有しているよりも、ＥＧＦＲに対する強い結合親和性を有する。通常、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲに「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０−７Ｍ以下、好ましくは約１×１０−８Ｍ以下、最も好ましくは約１×１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）値を有する）が、ＥＧＦＲに対するその結合親和性よりも少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い、ＥＲＢｂファミリーのメンバーに対する結合親和性を有する。ＥＧＦＲに特異的に結合する抗ＥＧＦＲ抗体は、上で定義した様々な型の抗体の何れでもありうるが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
【０１０３】
幾つかの実施態様において、非標的タンパク質（Ｈｅｒ２／ＥＲＢｂ２、Ｈｅｒ３／ＥＲＢｂ３、又はＨｅｒ４／ＥＲＢｂ４など）に対する抗ＥＧＦＲ抗体の結合の程度は、ＥＬＩＳＡ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析、又はラジオイムノ沈降（ＲＩＡ）などの当技術分野で公知の方法によって決定されるように、抗体のＥＧＦＲへの結合の約１０％未満である。特異的結合は、例えば、一般には結合活性を有さない類似の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を測定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的、例えば標識していない過剰な量の標的に類似したコントロール分子との競合により決定することができるこの場合、プローブに対する標識した標的の結合が、標識していない過剰な量の標的により競合的に阻害された場合、特異的結合が示される。本明細書で使用される特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド標的上のエピトープに対する「特異的結合」又は「に特異的に結合する」又は「に特異的である」といった用語は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、又はそれ以上の標的に対するＫｄ有する分子によって示されることができる。一実施態様では、用語「特異的な結合」は、分子が他のいかなるポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合せずに特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。
【０１０４】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、腫瘍細胞に対する治療用抗体の作用機序である。ＡＤＣＣは、免疫系のエフェクター細胞が、膜表面抗原が特異的抗体（例えば、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体など）によって結合されている標的細胞（例えば、がん細胞）を能動的に溶解する細胞媒介性免疫防御である。幾つかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば、実施例に記載のアッセイによって示されるように、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）と類似の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。例えば、ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のＡＤＣＣエフェクター機能活性は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）のＡＤＣＣエフェクター機能活性の、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、又は１００％超（例えば、約１０５％、約１０６％、約１０７％、約１０８％、約１０９％、約１１０％、約１１１％、約１１２％、約１１３％、約１１４％、約１１５％、約１１６％、約１１７％、約１１８％、約１１９％、約１２０％、約１２１％、約１２２％、約１２３％、約１２４％、約１２５％、又は約１３０％）であり、これらの値の間の任意の範囲を含む。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）と類似のＦｃγＲＩＩＩａに対する類似の結合親和性を示す。ある実施態様において、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合は、実施例に記載されるように、ＥＬＩＳＡによって実証される。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａに対する抗ＥＧＦＲ抗体の結合親和性は、ＦｃγＲＩＩＩａに対するＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）の結合親和性よりも約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、又は約１００％超高い（例えば、約１０５％、約１０６％、約１０７％、約１０８％、約１０９％、約１１０％、約１１１％、約１１２％、約１１３％、約１１４％、約１１５％、約１１６％、約１１７％、約１１８％、約１１９％、約１２０％、約１２１％、約１２２％、約１２３％、約１２４％、約１２５％、又は１２５％を超える）。
【０１０５】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、約０．１ｐＭから２００ｐＭ（０．２ｎＭ）の間のＫｄ、例えば、約０．１ｐＭ、約０．２５ｐＭ、約０．５ｐＭ、約０．７５ｐＭ、約１ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約２０ｐＭ、約３０ｐＭ、約４０ｐＭ、約５０ｐＭ、約６０ｐＭ、約７０ｐＭ、約８０ｐＭ、約９０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１１０ｐＭ、約１２０ｐＭ、約１３０ｐＭ、約１４０ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１６０ｐＭ、約１７０ｐＭ、約１８０ｐＭ、約１９０ｐＭ、又は約１９０ｐＭを超える）（これらの値の間の任意の範囲を含む）でヒトＥＧＦＲに結合する。ある実施態様において、ＥＧＦＲに対する抗ＥＧＦＲ抗体の結合親和性は、ＥＧＦＲに対するＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）の結合親和性よりも、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、又は約１００％超高い（例えば、約１０５％、約１１０％、約１２０％又は約１３０％）。ある実施態様において、ＥＧＦＲに対する抗ＥＧＦＲの結合親和性は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）とＥＧＦＲとの結合親和性よりも、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３倍、約３．２５倍、約３．５倍、約３．７５倍、約４倍、約４．２５倍、約４．５倍、約４．７５倍、又は約４．７５倍超高い（これらの値の間の任意の範囲を含む）。
【０１０６】
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）と比較して、インビボでの半減期が延長されている。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のインビボ半減期は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）のインビボ半減期よりも短くはない。
【０１０７】
ある実施態様において、本明細書において提供される抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）又はそのバイオシミラーのものと同様である薬物動態学的特性を示す。ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（セツキシマブ）又はそのバイオシミラーの血清濃度−時間プロファイルの約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は９５％超（例えば、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９％超）（これらの値の間の任意の範囲を含む）であるＡＵＣ（曲線下面積）を示す。
【０１０８】
ある実施態様において、抗体は、ヒトＩｇＧ、例えばヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ４のＦｃ配列を含む。ある実施態様において、Ｆｃ配列は、しばしばＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関連する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を欠如するように改変又は変化されている。エフェクター機能を改変し得るＦｃ配列に対する変化又は突然変異の多くの例が存在する。例えば、国際公開第００／４２０７２号及びShields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) は、ＦｃＲへの結合が改善又は減少した抗体変異体が記載されている。これらの出版物の内容は出典明示により本明細書に援用される。抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片；ダイアボディ及び線状抗体の形態であり得る。また、抗体は、ＥＧＦＲに結合するが、しかしまた一以上の他の標的に結合し、それらの機能を阻害する多特異的抗体であり得る。抗体は、治療剤（例えば、細胞傷害性剤、放射性同位元素及び化学療法剤）又は又は患者試料中若しくはインビボで画像化（例えば、放射性同位元素、蛍光色素及び酵素）によりＥＧＦＲを検出するための標識にコンジュゲートさせることができる。他の修飾には、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体への毒素のコンジュゲーションが含まれる。
【０１０９】
抗ＥＧＦＲ抗体をコードする核酸分子、本明細書に記載のＣＤＲ及び／又は重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸分子を含む発現ベクター並びに核酸分子を含む細胞もまた意図される。これらの抗体は、本明細書中に記載される療法において、かつ患者試料中のＥＧＦＲタンパク質を（例えば、ＦＡＣＳ、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ＥＬＩＳＡアッセイを介して）検出するために使用することができる。
【０１１０】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、例えば、Kohler and Milstein、Nature、256:495(1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を用いて調製することができ、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）若しくは以下の実施例において本明細書に記載の方法により作製することができる。ハイブリドーマ法においては、ハムスター、マウス、又は他の適切な宿主動物は、免疫剤に特異的に結合するであろう抗体を産生する、又は産生することができるリンパ球を誘発するために、免疫剤で典型的に免疫される。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。
【０１１１】
免疫剤は、典型的には、目的のタンパク質のポリペプチド若しくは融合タンパク質又はタンパク質を含む組成物を含む。一般には、ヒト起源の細胞が所望される場合には、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、又は非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる。Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (New York: Academic Press, 1986), pp. 59-103。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシ及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウス骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、融合されていない不死化細胞の増殖又は生存を阻害する１つ又は複数の物質を好ましくは含有する好適な培地で培養することができる。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含むであろう（ＨＡＴ培地）。
【０１１２】
好適な不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。より好適な不死化細胞株は、例えば、カリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ及びバージニア州マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクションから得ることができるマウス骨髄腫株である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている。Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al. MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS (Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987) pp. 51-63。
【０１１３】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。そのような技術及びアッセイは、当技術分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析によって決定することができる。
【０１１４】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈法によってクローンをサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる。Ｇｏｄｉｎｇ，ｓｕｐｒａ．この目的に対して好適な培地は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳類の腹水としてインビボで増殖させることができる。
【０１１５】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培養培地又は腹水から単離又は精製することができる
【０１１６】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換えＤＮＡ法によっても作製することができる。本明細書で提供されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定することができる。本明細書で提供されるハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。ＤＮＡは、また例えばヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を相同的マウス配列に代えて置換することにより（米国特許第４８１６５６７号；Morrison et al., 上掲）、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって、修飾することができる。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本明細書で提供される抗体の定常ドメインと置換することができ、又はキメラ二価抗体を作製するために本明細書で提供される抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換することができる。
【０１１７】
ある実施態様において、本発明により提供される抗ＥＧＦＲ抗体は、安定な哺乳動物細胞株によって発現される。ある実施態様において、本発明により提供される抗ＥＧＦＲ抗体は、安定な哺乳動物細胞株から、約２．０グラム／リットル、約２．５グラム／リットル、約３．０グラム／リットル、約３．５グラム／リットル、約４．０グラム／リットル、約４．５グラム／リットル、約５．０グラム／リットル、約５．５グラム／リットル、約６グラム／リットル、約６．５グラム／リットル、約７．０グラム／リットル、又は約７．０グラム／リットル超の力価（ｔｉｔｅｒ）（これらの値の間の任意の範囲を含む）で発現される。ある実施態様において、本発明により提供される抗ＥＧＦＲ抗体が発現される安定な哺乳動物細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。
【０１１８】
ある実施態様において、抗体は一価抗体である。．一価抗体を調製するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、重鎖の架橋を防止するために、Ｆｃ領域の任意の点で一般的に切断される。あるいは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、又はあ架橋を防止するために欠失させる。
【０１１９】
インビトロ法はまた、一価抗体を調製するために適している。抗体断片、特にＦａｂ断片を産生するための抗体の消化は、限定されないが、当該分野で公知の技術を用いて達成され得る。
【０１２０】
ヒト及びヒト化抗体
抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得る。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化型とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を典型的に含むものである。ヒト化抗体はレシピエントのＣＤＲ由来の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは殆ど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは殆ど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含むことができる。ヒト化抗体は、好ましくは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含むであろう。Jones et al. Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
【０１２１】
一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。一実施態様によれば、ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Jones et al. Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science,239: 1534-1536 (1988)）の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより本質的に実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換された抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体の類似部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１２２】
ヒト化の代わりに、ヒト抗体を生成することができる。例えば、内在性免疫グロブリン産生の非存在下で、免疫化により、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えば、マウス）を生み出すことが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖系列突然変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジ時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、Jakobovits et al. PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al.Year in Immunol.,7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、第５５６９８２５号、第５５９１６６９号；第５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照。あるいは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することによって、ヒト抗体を作製することができる。チャレンジすると、遺伝子再構成、アセンブリ、及び抗体レパートリーを含む、ヒトの全ての点で見られるものに非常に類似したヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；及び第５６６１０１６号、並びにMarks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al. Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)に記載されている。
【０１２３】
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature348:552-553 [1990]）を使用して、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体及び抗体断片をインビトロで産生させることができる。この技術の一実施態様によれば、抗体Ｖドメイン配列は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄのメジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子の何れかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示される。ファージディスプレイは、例えば以下の実施例の項で説明するように、又は例えば、Johnson, Kevin S.及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)に総説されたように、様々なフォーマットで実施することができる。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson et al., Nature,352:624-628 (1991) は、免疫マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。免疫されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーを構築す、抗原（自己抗原を含む）の異なるアレイに対する抗体を、Marks eta!., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)、又はGriffith et al., EMBO J.12:725-734 (1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び第５５７３９０５号を参照のこと。
【０１２４】
上で検討した通り、ヒト抗体はインビトロで活性化されたＢ細胞によって産生されうる（米国特許第５５６７６１０号及び第５２２９２７５号を参照のこと）。
【０１２５】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で公知の様々な技術を用いて産生することができる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.,222: 581 (1991)。Ｃｏｌｅら、及びＢｏｅｒｎｅｒらの技法は、ヒトモノクローナル抗体の調製にも利用可能である。Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) 及びBoerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)。
【０１２６】
多重特異性抗体
多重特異性抗体は、２つ以上の異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト又はヒト化抗体である（例えば、二重特異性抗体は少なくとも２つの抗原に対する結合特異性を有する）。例えば、結合特異性の１つはａ５−１タンパク質のためのものであり、他方は任意の他の抗原のためのものであり得る。１つの好ましい実施態様によれば、他の抗原は細胞表面タンパク質又は受容体又は受容体サブユニットである。例えば、細胞表面タンパク質は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体であり得る。従って、一実施態様によれば、本発明の二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及び例えば第２の細胞表面受容体の両方に結合することができる。
【０１２７】
二重特異性抗体を作製するための適切な方法は、当技術分野において周知である。例えば、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいている。Milstein and Cuello, Nature,305: 537-539 (1983)。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな分類のために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生成し、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって達成される。類似の手順が国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO, 10: 3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１２８】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合することができる。融合は、好ましくは、ヒンジの少なくとも一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインとである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、及び所望される場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時導入される。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照のこと。
【０１２９】
組換え細胞培養物から二重特異性抗体断片を直接作製及び単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny et al., J. Immunol.,148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、次いで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法は、抗体ホモ二量体の産生のために利用することもできる。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) によって記載された「ダイアボディー」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替の機構を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによってＶＬに連結されたＶＨを含む。従って、一方の断片のＶＨ及びＶＬドメインは、別の断片の相補的なＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対を形成し、それによって２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用によって二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照。
【０１３０】
３価以上の抗体が考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【０１３１】
ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために提案されている。国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／２００３７３号；ＥＰ０３０８９。この抗体は、架橋剤を含むものを含む合成タンパク質化学における既知の方法を用いてインビトロで調製することができると考えられる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
【０１３２】
エフェクター機能工学
例えばがんを治療する際の抗体の有効性を高めるために、エフェクター機能に関して本明細書で提供される抗体を改変することが望ましい場合がある。例えば、例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することができ、それによってこの領域内に鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力及び／又は補体媒介性細胞死滅並びに抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる。Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992)及びShapes, J. Immunol.,148: 2918-2922 (1992)を参照。増強された抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体は、Wolff et a!., Cancer Research,53: 2560-2565 (1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、それによって亢進された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有することができるように抗体を操作することができる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design3: 219-230 (1989)を参照。
【０１３３】
Ｆｃ領域の配列の変異又は改変は、ＦｃＲ結合（例えば、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ）を改善するために行うことができる。一実施態様によれば、本発明の抗体は、天然型ＩｇＧ又は親抗体と比較して、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び改善されたＦｃＲｎ結合からなる群から選択される少なくとも１つの変化したエフェクター機能を有する。幾つかの有用な特異的変異の例は、例えば、Shields, RL et al. (2001) JBC 276(6)6591-6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490；及び国際公開第００／４２０７２号に記載される。
【０１３４】
一実施態様によれば、Ｆｃ受容体変異は、Ｆｃ領域の３８、２３９、２４６、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９からなる群から選択される少なくとも１つの位置での置換であり、ここでＦｃ領域の残基の番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う。幾つかの実施態様において、Ｆｃ受容体変異はＤ２６５Ａ置換である。幾つかの実施態様において、Ｆｃ受容体変異はＮ２９７Ａ置換である。更なる適切な変異は、米国特許第７，３３２，５８１号に記載されている。
【０１３５】
ある実施態様において、本明細書において提供される抗ＥＧＦＲ抗体は、アフコシル化される（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）（すなわち、「アフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体」又は「非フコシル化抗ＥＧＦＲ抗体」）。「アフコシル化抗体」又は「非フコシル化抗体」とは、Ａｓｎ２９７でのＦｃ領域のグリコシル化パターンが改変され、フコース残基の量が低下しているＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプの抗体を指す。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３のグリコシル化は、コアフコシル化された二分岐複合オリゴ糖のグリコシル化が最大２つのＧａｌ残基で終結している場合、Ａｓｎ２９７で生じる。これらの構造は、末端Ｇａｌ残基の量に応じて、ＧＯ、Ｇ１（ａ１，６又はａ１，３）、又はＧ２グリカン残基と命名される（Raju, T.S., Bioprocess Int. 1(2003) 44-53）。抗体のＦｃ部分のＣＨＯ型グリコシル化は、例えば、Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14(1997) 201-207により記載されている。非糖修飾されたＣＨＯ宿主細胞で組換えにより発現している抗体は、通常、少なくとも８５％の量で、Ａｓｎ２９７でフコシル化されている。ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、低下したレベルのフコース残基を有する。ある実施態様において、本明細書において提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、そのグリコシル化パターンにおいてフコースを有しない。抗体における典型的なグリコシル化残基の位置は、ＥＵ番号付けシステムに従って位置２９７のアスパラギンであることが一般に知られている（「Ａｓｎ２９７」）。
【０１３６】
従って、ある実施態様において、本明細書において提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、そのグリコシル化パターンにおいてフコース残基の減少したレベルを有するか又はフコースを有しないように、改変されるか又はさもなければ変化したＦｃ配列を含む。ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＵ番号付けシステムに従って位置２９７に改変を有するＦｃ配列を含む。
【０１３７】
ある実施態様において、本明細書において提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、低又はアフコシル化グリカンを産生することができる宿主細胞によって産生される。アフコシル化抗体を産生することができる安定な哺乳動物宿主細胞株が確立されており、例えば、Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng. 87, 614-622; Mori et al. (2004) Biotechnol Bioeng. 88, 901-908; Kanda et al (2006) Biotechnol Bioeng. 94, 680-688; Kanda (2007) J Biotechnol. 130, 300-310; Imai-Nishiya (2007) BMC Biotechnol 7, 84; Yamane-Ohnuki and Satoh (2009) mAbs 1, 230-236に記載される。ある実施態様において、本明細書において提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、ｂ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ活性を発現するように操作された糖修飾宿主細胞において発現される。ある実施態様において、本明細書において提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、１，６−フコシルトランスフェラーゼ活性が減少又は消失した糖修飾宿主細胞において発現される。糖修飾された宿主細胞の生産に関する詳細については、例えば、米国特許第６，９４６，２９２号を参照されたい。抗体のフコシル化の量は、例えば、発酵条件（例えば発酵時間）によって又はフコシル化した量が異なる少なくとも二つの抗体の組み合わせによっての何れかにより、予め決定することができる。このようなアフコシル化抗体及びそれぞれの糖操作方法は、国際公開第２００５／０４４８５９号、国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００７／０３１８７５号、Umana et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180、国際公開第９９／１５４３４２号、国際公開第２００５／０１８５７２号、国際公開第２００６／１１６２６０号、国際公開第２００６／１１４７００号、国際公開第２００５／０１１７３５号、国際公開第２００５／０２７９６６号、国際公開第９７／０２８２６７号、米国特許出願公開第２００６／０１３４７０９号、米国特許出願公開第２００５／００５４０４８号、米国特許出願公開第２００５／０１５２８９４号、国際公開第２００３／０３５８３５号、国際公開第２０００／０６１７３９号に記載されている。これらの糖操作された抗体は、増加したＡＤＣＣを有する。本発明によるアフコシル化抗体を産生する他の糖鎖工学方法は、例えば、Niwa, R. et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160; Shinkawa, T., et al., J. Biol. Chem, 278 (2003) 3466-3473；国際公開第０３／０５５９９３号又は米国特許出願公開第２００５／０２４９７２２号に記載される。
【０１３８】
ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、インビトロ技術を用いて産生される。ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、化学的に合成される。（例えば、単球走化性タンパク質３（ＭＣＰ−３）の非フコシル化形態の化学合成を記載しているYamamoto et al. (2008) JACS 130, 501-510を参照されたい）。ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、ＩｇＧ上のフコース残基を除去するためにフコシダーゼを使用することによって産生される。（例えば、Yazawa et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun. 136, 563-569を参照）。
【０１３９】
ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば実施例に記載のアッセイによって示されるように、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）と比較して改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する。例えば、ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のＡＤＣＣエフェクター機能活性は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）のＡＤＣＣエフェクター機能活性の、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも約２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、又は少なくとも約３００％であり、これらの値の間の任意の範囲を含む。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体のＡＤＣＣエフェクター機能活性は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）のＡＤＣＣエフェクター機能活性の約３００％超であり、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）のＡＤＣＣエフェクター機能活性の少なくとも約３５０％、少なくとも約３６０％、少なくとも約３７０％、少なくとも約３８０％、少なくとも約３９０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４１０％、少なくとも約４２０％、少なくとも約４３０％、少なくとも約４４０％、少なくとも約４５０％、少なくとも約４６０％、少なくとも約４７０％、少なくとも約４８０％、少なくとも約４９０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５１０％、少なくとも約５２０％、少なくとも約５３０％、少なくとも約５４０％、少なくとも約５５０％、少なくとも約５６０％、少なくとも約５７０％、少なくとも約５８０％、少なくとも約５９０％、又は少なくとも約６０００％を含み、これらの値の間の任意の範囲を含む。
【０１４０】
ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、野生型ＫＲＡＳを有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、ＫＲＡＳ変異を有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、ＫＲＡＳ変異は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１２における変異である。ある実施態様において、ＫＲＡＳ変異は、ＫＲＡＳ遺伝子のエクソン２におけるコドン１３の変異である。ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、ＫＲＡＳＧ１３Ｄ変異を有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、ＫＲＡＳ変異は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン６１における変異である。ある実施態様において、ＫＲＡＳ変異は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１１７における変異である。ある実施態様において、ＫＲＡＳ変異は、ＫＲＡＳ遺伝子のコドン１４６における変異である。
【０１４１】
ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、野生型ＢＲＡＦを有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、ＢＲＡＦ変異を有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、ＢＲＡＦ変異は、ＢＲＡＦ遺伝子のコドン６００における変異である。ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、ＢＲＡＦ変異は、ＢＲＡＦ遺伝子のコドンＧ４６６における変異である。ある実施態様において、ＢＲＡＦ変異は、ＢＲＡＦ遺伝子のコドンＧ４６９における変異である。ある実施態様において、ＢＲＡＦ変異は、ＢＲＡＦ遺伝子のコドンＬ５９７における変異である。
【０１４２】
ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、野生型ＰＴＥＮを有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、ＰＴＥＮ変異を有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、ＰＴＥＮ変異は、ＰＴＥＮ遺伝子のエクソン３における変異である。ある実施態様において、ＰＴＥＮ変異は、ＰＴＥＮ遺伝子のエクソン４における変異である。ある実施態様において、ＰＴＥＮ変異は、ＰＴＥＮ遺伝子のエクソン５における変異である。ある実施態様において、ＰＴＥＮ変異は、ＰＴＥＮ遺伝子のエクソン６における変異である。ある実施態様において、ＰＴＥＮ変異は、ＰＴＥＮ遺伝子のエクソン７における変異である。ある実施態様において、ＰＴＥＮ変異は、ＰＴＥＮ遺伝子のエクソン８における変異である。ある実施態様において、ＰＴＥＮ変異は、ＰＴＥＮ遺伝子のコドン２３３における変異である。
【０１４３】
ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、野生型ＮＲＡＳを有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、ＮＲＡＳ変異を有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、ＮＲＡＳ変異は、ＮＲＡＳ遺伝子のコドン１２における変異である。ある実施態様において、ＮＲＡＳ変異は、ＮＲＡＳ遺伝子のコドン１３における変異である。ある実施態様において、ＮＲＡＳ変異は、ＮＲＡＳ遺伝子のコドン６１における変異である。
【０１４４】
ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、野生型ＰＩＫ３ＣＡを有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、本明細書で提供されるアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体は、ＰＩＫ３ＣＡ変異を有する被験体において、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも改善された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。ある実施態様において、ＰＩＫ３ＣＡ変異は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のエクソン２０における変異である。
【０１４５】
ある実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体を投与される被験体は、アービタックス又はそのバイオシミラーに耐性がある。ある実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体を投与される被験体は、アービタックス又はそのバイオシミラーで進行している。ある実施態様において、本明細書に記載のアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体を投与される被験体は、アービタックス又はそのバイオシミラーに対して難治性である。
【０１４６】
イムノコンジュゲート
本発明はまた、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はその断片）などの細胞傷害性剤、あるいは放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートした抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。
【０１４７】
使用可能な酵素的に活性な毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン（ｓａｒｃｉｎ）、アレウライツ・フォルディイ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）プロテイン、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）プロテイン（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・キャランティア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン、サパオナリア（ｓａｐａｏｎａｒｉａ）オフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテシン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。その例は、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、及び１８６Ｒｅを含む。このようなイムノコンジュゲートの生成に有用な例示的な化学療法剤としては、本明細書の他の箇所に記載されているものが挙げられる。
【０１４８】
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、アグリコシル化ＣＤＲ−Ｈ２抗ＥＧＦＲ抗体、アフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体、又はアフコシル化されているアグリコシル化ＣＤＲ−Ｈ２抗ＥＧＦＲ抗体）は、メイタンシノイド、メイタンシノイド、又はカリケアマイシンにコンジュゲートされる。ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（例えば、アグリコシル化ＣＤＲ−Ｈ２抗ＥＧＦＲ抗体及び／又はアフコシル化抗ＥＧＦＲ抗体）は、メイタンシノイドＤＭ１にコンジュゲートされる。
【０１４９】
抗体及び細胞傷害性剤の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science,238: 1098(1987)に記載されているように調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照。
【０１５０】
別の実施態様では、腫瘍プレターゲティングに利用するために、抗体を「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）に結合させることができ、ここでは抗体−受容体コンジュゲートを患者に投与し、続いてクリアリング剤を用いて循環から未結合コンジュゲートを除去し、次いで細胞傷害性剤（例えば放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートした「リガンド」（例えばアビジン））を投与する。
【０１５１】
共有結合性修飾
抗ＥＧＦＲ抗体及びその断片の共有結合性修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合性修飾の１つのタイプは、ポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、ポリペプチドの選択された側鎖又はＮ−又はＣ−末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることを含む。二官能性薬剤による誘導体化は、例えば、抗体を精製するための方法における使用のためにポリペプチドを水不溶性支持マトリックス又は表面に架橋するのに有用であり、逆もまた同様である。一般に用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオナート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダートなどの薬剤が挙げられる。
【０１５２】
他の修飾は、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)］、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１５３】
ポリペプチドの共有結合性修飾の別のタイプは、ポリペプチドを種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
【０１５４】
キメラ分子
本発明の抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）は、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列（例えば、イムノアドヘシン又はペプチボディ）に融合されたポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法において有利であれば修飾することもできる。
【０１５５】
一実施態様において、このようなキメラ分子は、例えば、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質のタンパク質導入ドメインを用いて、ポリペプチドと、そのポリペプチドを様々な組織へ、より具体的には脳血液関門を越えて送達するための標的とするタンパク質導入ドメインとの融合を含む（Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72）。
【０１５６】
別の実施態様において、そのようなキメラ分子は、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープを提示するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に配置される。そのようなエピトープタグが付加された形態のポリペプチドの存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する別のタイプの親和性マトリックスを用いたアフィニティー精製によってポリペプチドを容易に精製することを可能にする。様々なタグポリペプチド及びそれらのそれぞれの抗体は、当技術分野で公知である。例としては、ポリヒスチジン（ポリＨｉｓ）又はポリヒスチジングリシン（ポリＨｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］が挙げられる。他のタグポリペプチドは、Ｆｌａｇ−ペプチド［Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)］；α−チューブリンエピトープペプチド［Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
【０１５７】
代替的な実施態様において、キメラ分子は、ポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（例えば、「イムノアドヘシン」）について、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。本発明のＩｇ融合物は、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、おおよそ又は僅かにヒトの残基９４−２４３、残基３３−５３又は残基３３−５２を含むポリペプチドを含む。特に好ましい実施態様において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子の、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３の領域、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日に発行された米国特許第５４２８１３０号も参照のこと。
【０１５８】
免疫リポソーム
本明細書中に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗体を含むリポソームは、Epstein et al., PNAS USA, 82: 3688 (1985)； Hwang et al., PNAS USA,77: 4030 (1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同第４５４４５４５号に記載されるような当該分野で公知の方法によって調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
【０１５９】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所定の細孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martinet al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートすることができる。抗腫瘍剤、増殖阻害剤、又は化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）も任意でリポソーム内に含まれる。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照。
【０１６０】
抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体を用いた治療
本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）及び／又は組成物は、例えば、がん（頭頸部がん、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がんなど）を含む異常なＥＧＦＲ活性に関与する疾患及び障害を処置するために被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することができる。ある実施態様において、本発明は、被験体におけるがん（例えば、頭頸部がん、肺がん又は結腸直腸がんなど）の処置のための医薬の製造における使用のための、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）を提供する。ある実施態様において、本発明は、被験体におけるがん（例えば、頭頸部がん、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がんなど）の処置における使用のための、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）を提供する。ある実施態様において、本発明は、被験体におけるがん（例えば、頭頸部がん、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がんなど）の処置における使用のための、本明細書において提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）を含む薬学的組成物を提供する。ある実施態様において、処置される被験体は哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。ある実施態様において、被験体はヒトである。ある実施態様において、被験体は、臨床患者、臨床試験ボランティア、実験動物などである。ある実施態様において、被験体は、がん（頭頸部がん、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がんなど）を有するか、又は有するリスクがあると疑われているか、或いはがん又は異常なＥＧＦＲ発現若しくは活性を有する他の疾患と診断されている。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体が投与される被験体は、ＫＲＡＳについて野生型である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体が投与される被験体は、ＫＲＡＳＧ１３Ｄ変異を有する。幾つかの実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体が投与される被験体は、ＢＲＡＦについて野生型である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体が投与される被験体は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有する。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体を投与される被験体は、アービタックス又はそのバイオシミラーに耐性がある。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体を投与される被験体は、アービタックス又はそのバイオシミラーで進行している。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体を投与される被験体は、アービタックス又はそのバイオシミラーに対して難治性である。
【０１６１】
ある実施態様において、本明細書に記載のＤＭ１コンジュゲート型抗ＥＧＦＲ抗体は、野生型ＫＲＡＳを有する被験体に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載のＤＭ１コンジュゲート型抗ＥＧＦＲ抗体は、ＫＲＡＳＧ１３Ｄ変異を有するがん患者に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載のＤＭ１コンジュゲート型抗ＥＧＦＲ抗体は、野生型ＢＲＡＦを有するがん患者に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載のＤＭ１コンジュゲート型抗ＥＧＦＲ抗体は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有する被験体に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載のＤＭ１コンジュゲート型抗ＥＧＦＲ抗体は、アービタックス又はそのバイオシミラーに耐性がある被験体に投与される。ある実施態様において、本明細書に記載のＤＭ１コンジュゲート型抗ＥＧＦＲ抗体は、アービタックス又はそのバイオシミラーで進行している。ある実施態様において、本明細書に記載のＤＭ１コンジュゲート型抗ＥＧＦＲ抗体は、アービタックス又はそのバイオシミラーに対して難治性である被験体に投与される。
【０１６２】
異常なＥＧＦＲ活性を示すがん（頭頸部がん、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がんなど）又は他の疾患のための多くの診断方法及びそれらの疾患の臨床的描写は、当技術分野で公知である。そのような方法としては、限定されないが、例えば、免疫組織化学、ＰＣＲ、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が挙げられる。異常なＥＧＦＲ活性又は発現の診断方法に関する更なる詳細は、例えば、Gupta et al. (2009) Mod Pathol. 22(1): 128-133; Lopez-Rios et al. (2013) J Clin Pathol. 66(5): 381-385; Ellison et al. (2013) J Clin Pathol 66(2): 79-89；及びGuha et al. (2013) PLoS ONE 8(6): e67782に記載される。
【０１６３】
投与は、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下などの任意の適切な経路によって行うことができる。幾つかの実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）及び／又は組成物は、第２、第３又は第４の薬剤（例えば、抗腫瘍剤、増殖阻害剤、細胞傷害性剤、又は化学療法剤を含む）を用いて、異常なＥＧＦＲ活性に関与する疾患又は障害を治療する。そのような薬剤には、例えば、ドセタキセル、ゲフィチニブ、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン、５−フルオロウラシル及びロイコボリン）、イリノテカン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）、ＦＯＬＦＯＸ−４（注入フルオロウラシル、ロイコボリン及びオキサリプラチン、アファチニブ、ゲムシタビン、カペシタビン、ペニトレキシド、チバンチニブ、エベロリムス、ＣｐＧ−ＯＤＮ、ラパマイシン、レナリドマイド、ベムラフェニブ、エンドスタチン、ラパチニブ、ＰＸ−８６６、Ｉｍｐｒｉｍｅ  ＰＧＧ及びｉｒｌｏｔｉｎｉｂｍを含む。幾つかの実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）は、付加的薬剤にコンジュゲートされる。
【０１６４】
ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）及び／又は組成物は、放射線療法、外科手術、化学療法及び／又は標的療法などの１つ又は複数の付加的療法と組み合わせて投与される。ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）及び／又は組成物は、放射線療法と組み合わせて投与される。ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）及び／又は組成物並びに放射線療法は、頭頸部がんを治療するために使用される。ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）及び／又は組成物並びに放射線療法は、咽喉がんを治療するために使用される。ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）及び／又は組成物並びに放射線療法は、結腸直腸がんを治療するために使用される。ある実施態様において、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）及び／又は組成物並びに放射線療法は、肺がんを治療するために使用される。
【０１６５】
処置すべき適応症及び当該分野の医師が熟知している用量に関連する因子に依存して、本明細書で提供される抗体は、毒性及び副作用を最小限に抑えながらその適応症の治療に有効な用量で投与されるであろう。がん（例えば、頭頸部がん、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がんなど）の治療のために、典型的な用量は、例えば、０．００１から１０００μｇとすることができるが；しかしながら、この例示的な範囲より下又は上の用量は本発明の範囲内である。１日の用量は、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ全体重（例えば、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、又は上記の値の何れか２つによって規定される範囲）、好ましくは約０．３μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ全体重（例えば約０．５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、又は上記の値の何れか２つによって定義される範囲）、より好ましくは約１μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇ全体重（例えば、約３μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約７５μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、又は上記の値の任意の２つによって規定される範囲）、更により好ましくは約０．５から１０ｍｇ／ｋｇ体重／日（例えば、約２ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、又は上記の値の任意の２つの値によって規定される範囲、上記値の間の任意の範囲を含む）とすることができる。上記のように、治療的又は予防的有効性は、治療された患者の定期的な評価によってモニターすることができる。数日又はそれ以上にわたる反復投与では、状態に応じて、治療は疾患症状の所望の抑制が生じるまで反復される。しかしながら、他の投薬レジメンが有用であり得、本発明の範囲内である。所望の投与量は、組成物の単回ボーラス投与、組成物の複数回のボーラス投与、又は組成物の連続注入投与によって送達することができる。
【０１６６】
抗ＥＧＦＲ抗体を含む医薬組成物は、１日に１、２、３又は４回投与することができる。組成物はまた、毎日よりも少ない頻度で、例えば、週に６回、週に５回、週に４回、週に３回、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、６ヶ月に１回、又は６ヶ月に１回投与することができる。組成物はまた、ある期間にわたって使用するために組成物を徐々に放出し、かつ組成物の投与頻度を１ヶ月に１回、２から６ヶ月に１回、毎年１回、又は実に１回の投与など低くすることができるインプラントのような徐放性製剤で投与することができる。持続放出デバイス（ペレット、ナノ粒子、微粒子、ナノスフェア、マイクロスフェアなど）は、注射によって投与することができる。
【０１６７】
抗体（又はその抗原結合断片）は、１日１回の投与で投与してもよく、又は１日総用量を１日２回、３回又は４回の分割投与で投与してもよい。組成物はまた、毎日よりも少ない頻度で、例えば、週に６回、週に５回、週に４回、週に３回、週に２回、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、６ヶ月に１回、又は６ヶ月に１回投与することができる。組成物はまた、ある期間にわたって使用するために組成物を徐々に放出し、かつ組成物の投与頻度を１ヶ月に１回、２から６ヶ月に１回、毎年１回、又は実に１回の投与など低くすることができるインプラントのような徐放性製剤で投与することができる。持続放出デバイス（ペレット、ナノ粒子、微粒子、ナノスフェア、マイクロスフェアなど）は、注射によって投与することができ、又は様々な場所に外科的に埋め込むことができる。
【０１６８】
がん治療は、限定するものではないが、例えば、腫瘍再発、腫瘍重量ないしサイズの収縮、進行時間、生存期間、進行がない生存、全体の応答速度、応答の継続期間、生活の質、タンパク質の発現及び／又は活性などで評価されてもよい。例えば放射線画像法による応答の測定を含む、治療の有効性を判定するためのアプローチを用いることができる。
【０１６９】
幾つかの実施態様において、処置の有効性は、式１００−（Ｔ／Ｃ×１００）を用いて計算した腫瘍増殖阻害率（％ＴＧＩ）として測定され、ここで、Ｔは治療された腫瘍の平均相対腫瘍体積であり、Ｃは非処置腫瘍の腫瘍体積である。ある実施態様において、％ＴＧＩは、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、９３％、約９４％、約９５％、又は９５％超である。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲの％ＴＧＩは、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）の％ＴＧＩと同じか又はそれ以上、例えば約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．１倍、約２．２倍、約２．３倍、約２．４倍、約２．５倍、約２．６倍、約２．７倍（これらの値の間の任意の範囲を含む）であるか、又はＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）の％ＴＧＩよりも約２．７倍大きい。
【０１７０】
薬学的製剤
抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）は、それらが投与に適しているように、適切な担体又は賦形剤と共に製剤化することができる。抗体の適切な製剤は、所望の純度を有する抗体（又はその断片）を任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と混合することによて凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で得ることができる。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。例示的な抗体製剤は、参照により本明細書に援用される国際公開第９７／５６４１８号に記載されている。皮下投与に適した凍結乾燥製剤は、国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。そのような凍結乾燥製剤は、適切な希釈剤を用いて高タンパク質濃度まで再構成することができ、再構成製剤は、本明細書で治療される哺乳動物に皮下投与することができる。
【０１７１】
本明細書の製剤は、治療される特定の徴候に必要な２つ以上の活性化合物、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含み得る。例えば、抗腫瘍剤、増殖阻害剤、細胞傷害性剤、又は化学療法剤を更に提供することが望ましい場合がある。そのような分子は、意図される目的のために有効な量で組み合わされて適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患若しくは障害又は治療の種類、及び上記の他の要因に依存する。これらは一般には本明細書に記載されるように同じ投薬量及び投与経路で又はこれまでに用いられている投薬量のおよそ１から９９％で使用される。活性成分もまた、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンで、ヒドリキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入されうる。このような技術は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形をしている。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【０１７２】
リポフェクチン又はリポソームを用いて、本発明のポリペプチド及び抗体（又はその断片）又は組成物を細胞に送達することができる。抗体断片が使用される場合には、標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子は、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するように設計できる。そのようなペプチドは、化学的に合成することができ、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。例えば、Marasco et al., PNAS USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照。
【０１７３】
活性成分もまた、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンで、ヒドリキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入されることができる。このような技術は、上掲のRemington's PHARMACEUTICAL SCIENCESにおいて開示される。
【０１７４】
徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の好適な例は、抗体（又はその断片）を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形をしている。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エエチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日に亘る分子の放出を可能にする一方、特定のハイドロゲルは、それよりも短期間に亘ってタンパク質を放出する。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。関与する機序に応じて、安定化のために合理的な戦略を講じることができる。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結、水分含有率の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマー基質組成物の開発により、安定化させることができる。
【０１７５】
ある実施態様において、製剤は、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体を、約０．５ｍｇ／ｍｌ超、約１ｍｇ／ｍｌ超、約２ｍｇ／ｍｌ超、約３ｍｇ／ｍｌ超、約４ｍｇ／ｍｌ超、約５ｍｇ／ｍｌ超、約６ｍｇ／ｍｌ超、約７ｍｇ／ｍｌ超、約８ｍｇ／ｍｌ超、約９ｍｇ／ｍｌ超、約１０ｍｇ／ｍｌ超、約１１ｍｇ／ｍｌ超、約１２ｍｇ／ｍｌ超、約１３ｍｇ／ｍｌ超、約１４ｍｇ／ｍｌ超、約１５ｍｇ／ｍｌ超、約１６ｍｇ／ｍｌ超、約１７ｍｇ／ｍｌ超、約１８ｍｇ／ｍｌ超、約１９ｍｇ／ｍｌ超、約２０ｍｇ／ｍｌ超、約２１ｍｇ／ｍｌ超、約２２ｍｇ／ｍｌ超、約２３ｍｇ／ｍｌ超、約２４ｍｇ／ｍｌ超、約２５ｍｇ／ｍｌ超、約２６ｍｇ／ｍｌ超、約２７ｍｇ／ｍｌ超、約２８ｍｇ／ｍｌ超、約２９ｍｇ／ｍｌ超、又は約３０ｍｇ／ｍｌ超（これらの値の間の任意の範囲を含む）の濃度で含む。
【０１７６】
ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、クエン酸塩、ＮａＣｌ、酢酸塩、コハク酸塩、グリシン、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、又はこれらの任意の組み合わせを含む緩衝液中で、（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ超、約１ｍｇ／ｍｌ超、約５ｍｇ／ｍｌ超、約１０ｍｇ／ｍｌ超、約１５ｍｇ／ｍｌ超、約２０ｍｇ／ｍｌ超、又は約２５ｍｇ／ｍｌ超（これらの値の間の任意の範囲を含む）の濃度で）処方される。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、約１００ｍＭから約１５０ｍＭのグリシンを含む緩衝液中で、（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ超、約１ｍｇ／ｍｌ超、約５ｍｇ／ｍｌ超、約１０ｍｇ／ｍｌ超、約１５ｍｇ／ｍｌ超、約２０ｍｇ／ｍｌ超、又は約２５ｍｇ／ｍｌ超（これらの値の間の任意の範囲を含む）の濃度で）処方される。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、約５０ｍＭから約１００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中で処方される。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、約１０ｍＭから約５０ｍＭの酢酸塩を含む緩衝液中で、（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ超、約１ｍｇ／ｍｌ超、約５ｍｇ／ｍｌ超、約１０ｍｇ／ｍｌ超、約１５ｍｇ／ｍｌ超、約２０ｍｇ／ｍｌ超、又は約２５ｍｇ／ｍｌ超（これらの値の間の任意の範囲を含む）の濃度で）処方される。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、約１０ｍＭから約１００ｍＭのコハク酸塩を含む緩衝液中で処方される。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、約０．００５％から約０．０２％のポリソルベート８０を含む緩衝液中で、（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ超、約１ｍｇ／ｍｌ超、約５ｍｇ／ｍｌ超、約１０ｍｇ／ｍｌ超、約１５ｍｇ／ｍｌ超、約２０ｍｇ／ｍｌ超、又は約２５ｍｇ／ｍｌ超（これらの値の間の任意の範囲を含む）の濃度で）処方される。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体は、約５．１から５．６のｐＨを有する緩衝液中で処方される。ある実施態様において、抗ＥＧＦＲ抗体を、１０ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、及び０．０１％のポリソルベート８０を含む緩衝液（製剤はｐＨ＝５．５）に処方する。
【０１７７】
ある実施態様において、本明細書に記載のＥＦＧＲ抗体を含む製剤（例えば、１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、及び０．０１％ポリソルベート８０を含む緩衝液を含む処方物であって、製剤はｐＨ＝５．５である）は、（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ超、約１ｍｇ／ｍｌ超、約５ｍｇ／ｍｌ超、約１０ｍｇ／ｍｌ超、約１５ｍｇ／ｍｌ超、約２０ｍｇ／ｍｌ超、又は約２５ｍｇ／ｍｌ超（これらの値の間の任意の範囲を含む）の濃度で）、室温で（約２０−２５℃など）、約０．５週間、１．０週間、１．５週間、２．０週間、２．５週間、３．５週間、４．０週間、４．５週間、又は５．０週間（これらの値の間の任意の範囲を含む）安定である。ある実施態様において、本明細書に記載のＥＦＧＲ抗体を含む製剤（例えば、１０ｍＭクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシン、及び０．０１％ポリソルベート８０を含む緩衝液を含む処方物であって、製剤はｐＨ＝５．５である）は、（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ超、約１ｍｇ／ｍｌ超、約５ｍｇ／ｍｌ超、約１０ｍｇ／ｍｌ超、約１５ｍｇ／ｍｌ超、約２０ｍｇ／ｍｌ超、又は約２５ｍｇ／ｍｌ超（これらの値の間の任意の範囲を含む）の濃度で）、加速条件下（約３７℃での保存など）で、約０．５週間、１．０週間、１．５週間、２．０週間、２．５週間、３．５週間、４．０週間、４．５週間、又は５．０週間（これらの値の間の任意の範囲を含む）安定である。
【０１７８】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、物理的及び化学的不安定性に対応する、潜在的な断片化及び凝集を検出するためのタンパク質安定性試験に使用される周知の広く使用される方法である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定される場合、３７℃で１週間後に最初の高分子量種の％に対して、高分子量種（ＨＭＷＳ）の約１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）の増加を示す。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定される場合、３７℃で２週間後に最初の高分子量種の％に対して、高分子量種の約２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）の増加を示す。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定される場合、３７℃で４週間後に最初の高分子量種の％に対して、高分子量種の約３．３％、３．２％、３．１％、３．０％、２．９％、２．８％、２．７％、２．６％、２．５％、２．４％、２．２％、２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）の増加を示す。
【０１７９】
ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定される場合、３７℃で１週間後に最初の低分子量種の％に対して、低分子量種（ＬＭＷＳ）の約１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）の増加を示す。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定される場合、３７℃で２週間後に最初の低分子量種の％に対して、低分子量種の約２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）の増加を示す。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定される場合、３７℃で４週間後に最初の低分子量種の％に対して、低分子量種の約２．４％、２．２％、２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、又は０．１％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）の増加を示す。
【０１８０】
ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定される場合、３７℃で１週間後に最初の単量体の％に対して、単量体の約０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、又は３．５％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）の減少を示す。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定される場合、３７℃で２週間後に最初の単量体の％に対して、単量体の約０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、又は３．５％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）の減少を示す。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤は、ＳＥＣを使用して測定される場合、３７℃で２週間後に最初の単量体の％に対して、単量体の約０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、又は３．５％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）の減少を示す。
【０１８１】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、脱アミド化又は酸化などのタンパク質分解事象を検出するためのよく知られて広く使用されているツールである（Moorhouse et al. (1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 593-603）。分解生成物は、典型的には、より高い見かけのｐＩを有する生成物と比較して、酸性又は塩基性種と称される。酸性種は、ＣＥＸの主ピークよりも早く溶出する変異体であるが、塩基性種はＣＥＸの主ピークより後に溶出する変異体である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤の酸性ピーク画分は、ＣＥＸを使用して測定される場合、３７℃で１週間後に、総タンパク質の約７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、又は１５％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤の酸性ピーク画分は、ＣＥＸを使用して測定される場合、３７℃で２週間後に、総タンパク質の約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、又は１８％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤の酸性ピーク画分は、ＣＥＸを使用して測定される場合、３７℃で２週間後に、総タンパク質の約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、又は２７％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。
【０１８２】
ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤の塩基性ピーク画分は、ＣＥＸを使用して測定される場合、３７℃で１週間後に、総タンパク質の約３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤の塩基性ピーク画分は、ＣＥＸを使用して測定される場合、３７℃で２週間後に、総タンパク質の約３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤の塩基性ピーク画分は、ＣＥＸを使用して測定される場合、３７℃で４週間後に、総タンパク質の約３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％未満（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。
【０１８３】
ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤の主要ピーク画分は、ＣＥＸを使用して測定される場合、３７℃で１週間後に、総タンパク質の約３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％以上（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤の塩基性ピーク画分は、ＣＥＸを使用して測定される場合、３７℃で２週間後に、総タンパク質の約３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％以上（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＥＦＧＲ抗体５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌを含む製剤の塩基性ピーク画分は、ＣＥＸを使用して測定される場合、３７℃で４週間後に、総タンパク質の約３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、又は４６％以上（これらの値の間の任意の範囲を含む）である。
【０１８４】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
【０１８５】
抗上皮増殖因子受容体抗体を用いた診断及び画像化の方法
ＥＧＦＲポリペプチドに特異的に結合する、標識抗ＥＧＦＲ抗体、その断片、及びその誘導体及び類似体は、ＥＧＦＲの発現、異常な発現及び／又は活性に関連する疾患及び／又は障害を検出、診断又はモニターする診断目的のために使用することができる。例えば、本明細書において提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）は、インサイツ、インビボ、エクスビボ、及びインビトロ診断アッセイ又は画像化アッセイにおいて使用され得る。（ａ）本発明の１つ以上の抗体を用いて個体の細胞（例えば、組織）又は体液中のポリペプチドの発現をアッセイすること及び（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準的な遺伝子発現レベルと比較することを含む、ＥＧＦＲポリペプチドの発現を検出するための方法であって、それによって、標準的な発現レベルと比較してアッセイされた遺伝子発現レベルの増加又は減少が、異常な発現を示す、方法。
【０１８６】
本明細書で提供される更なる実施態様は、動物（例えば、ヒトなどの哺乳類）におけるＥＧＦＲの発現又は異常発現に関連する疾患又は障害を診断する方法を含む。本方法は、哺乳動物においてＥＧＦＲ分子を検出することを含む。ある実施態様において、診断は、（ａ）有効量の標識抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）を哺乳動物に投与すること、（ｂ）標識抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）が、ＥＧＦＲ分子が発現される被験体の部位に優先的に集中すること（未結合の標識分子がバックグラウンドレベルまでクリアされること）を可能にするために、投与後の時間間隔を待機する；（ｃ）バックグラウンドレベルを決定すること；（ｄ）バックグラウンドレベルを上回る標識分子の検出が、被験体がＥＧＦＲの発現又は異常発現に関連する特定の疾患又は障害を有することを示すように、被験体における標識分子を検出することを含む。バックグラウンドレベルは、検出された標識分子の量を、特定の系について以前に決定された標準値と比較することを含む様々な方法によって決定することができる。
【０１８７】
本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）は、当業者に公知の古典的な免疫組織学的方法を用いて、生物学的試料中のタンパク質レベルをアッセイするために使用することができる（例えば、Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol.105:3087-3096 (1987)を参照）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体ベースの方法には、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のようなイムノアッセイが含まれる。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知であり、酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ；放射性同位体、例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ；ルミノール；及びフルオレセイン及びローダミンなどの蛍光標識、及びビオチンが挙げられる。
【０１８８】
当該分野で公知の技術は、本明細書で提供される標識抗体（又はその断片）に適用され得る。そのような技術には、限定されないが、二官能性結合剤の使用が含まれる（例えば、米国特許第５７５６０６５号；第５７１４６３１号；第５６９６２３９号；第５６５２３６１号；第５５０５９３１号；第５４８９４２５号；第５４３５９９０号；第５４２８１３９号；第５３４２６０４号；第５２７４１１９号；第４９９４５６０号；及び第５８０８００３号を参照）。あるいは、又はそれに加えて、例えば、ＥＧＦＲをコードする核酸又はその相補物に対応する核酸ベースのプローブを用いた蛍光インサイツハイブリダイゼーションを介して、細胞内のＥＧＦＲポリペプチドをコードする核酸又はｍＲＮＡのレベルを測定することができる；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月公開の国際公開第９８／４５４７９号を参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、又はリアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術）。例えば抗体に基づくアッセイを用いて、血清などの生物学的流体中の脱落抗原を測定することによってＥＧＦＲ過剰発現を研究することもできる（例えば、１９９０年６月１２日に発行された米国特許第４９３３２９４号；１９９１年４月１８日に公開された国際公開第９１／０５２６４号；１９９５年３月２８日に発行された米国特許第５４０１６３８号；及びSias et al., J. Immunol. Methods132:73-80 (1990)も参照）。上記のアッセイとは別に、様々なインビボ及びエクスビボアッセイが当業者に利用可能である。例えば、哺乳動物の体内の細胞を、検出可能な標識、例えば、放射性同位元素で任意に標識された抗体に曝露することができ、抗体への抗体の結合は、例えば、放射能の外部走査によって、又は抗体に前もって暴露された哺乳動物から採取された試料（例えば、生検又は他の生物学的試料）を分析することによって評価することができる。
【０１８９】
製造品及びキット
本明細書で提供される別の実施態様は、頭頸部がん、肺がん、又は結腸直腸がん（例えば、腫瘍）などのがんの治療に有用な物質を含有する製造品である。製造品は、容器と、容器上又は容器に付随したラベル又は添付文書を含むことができる。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、ガラス又はプラスチックのような様々な材料から形成されてよい。一般に、容器は、症状の治療に有効である組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）である。ラベル又は添付文書は、組成物が特定の疾患の治療に用いられることを示す。ラベル又は添付文書は、抗体組成物を患者に投与するための説明書を更に含むであろう。また、本明細書中に記載の併用治療薬を含む製造品及びキットも考慮される。
【０１９０】
添付文書は、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、用量、投与、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む治療用製品の市販パッケージに慣例的に含まれる説明書を指す。一実施態様において、添付文書は、組成物ががん（頭頸部がん、肺がん、又は結腸直腸がんなど）を治療するために使用されることを示す。
【０１９１】
更に、製造品は、静菌注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容可能な緩衝液を含む第２の容器を更に含むことができる。それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む商業的及びユーザーの観点から望ましい他の物質を更に含み得る。
【０１９２】
任意に製造品と組み合わせて、様々な目的、例えば患者におけるＥＧＦＲの単離又は検出のために有用なキットも提供される。ＥＧＦＲの単離及び精製のために、キットは、ビーズ（例えば、セファロースビーズ）に結合した本明細書で提供される抗ＥＧＦＲ抗体（又はその断片）を含み得る。例えば、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロットにおいて、ＥＧＦＲを検出及び定量するための抗体（又はその断片）を含むキットが提供されうる。製造物品と同様に、キットは、容器と、容器に付随したラベル又は添付文書を含む。例えば、容器は、本明細書で提供される少なくとも１つの抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物を保持する。例えば、希釈剤及び緩衝液、対照抗体を含有する追加の容器を含めることができる。ラベル又は添付文書は、組成物の説明並びに意図されたインビトロ又は診断使用のための指示を提供することができる。
【実施例】
【０１９３】
実施例１．グリコシル化及びアグリコシル化ＣＤＲ−Ｈ２抗上皮増殖因子抗体の生成及び親和性成熟
生殖系列重鎖可変領域ＶＨ３．４８及び生殖系列軽鎖可変領域ＶＫ３．１１を用いて、ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体３４８３１１を生成した。次いで、３４８３１１は、改良された結合性能を有するクローンを生成するために、インビトロファージディスプレイに基づく親和性成熟実験に使用された。最初に、ＣＤＲ−Ｌ３／ＣＤＲ−Ｈ３核酸ライブラリーをＰＣＲにより生成し、ファージディスプレイベクターにクローニングし、大腸菌に形質転換してファージライブラリーを作製した。２ラウンドのパニングの後、２８４のＦａｂクローンをＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、７つのクローン（すなわち、１−１５，１−１６，１−２６，１−８６，２−４８，１−１３及び３−６６）が３４８３１１と同等又はそれ以上の結合性能を有することが判明した（図１）。更なるＥＬＩＳＡを、以下の軽鎖／重鎖の組合せを含む全長ＩｇＧクローンを用いて行った：３４８３１１／３４８３１１（ＬＣ／ＨＣ）、１−１５／３４８３１１（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３４８３１１（ＬＣ／ＨＣ）、１−８６／３４８３１１（ＬＣ／ＨＣ）、２−４８／３４８３１１（ＬＣ／ＨＣ）、３４８３１１／１−２６（ＬＣ／ＨＣ）、１−１５／１−２６（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／１−２６（ＬＣ／ＨＣ）、１−８６／１−２６（ＬＣ／ＨＣ）、及び２−４８／１−２６（ＬＣ／ＨＣ）。ＨＬＸ０５（すなわち、社内で製造されたＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）バイオシミラー抗体）も試験した。１−２６の重鎖を含むクローンは、３４８３１１の重鎖を含むクローンよりもＥＧＦＲに対するより良好な結合性能を示した。（図２を参照）。
【０１９４】
１−２６重鎖を選択し、グリコシル化部位の欠失のためのＣＤＲ−Ｈ２ライブラリーを作製するための基礎として使用した。ＣＤＲ−Ｈ２核酸ライブラリーをＰＣＲにより生成し、ファージディスプレイベクターにクローニングし、大腸菌に形質転換してファージライブラリーを作製した。２ラウンドのパニング後、２つのクローン、すなわち２−６８及び３−６７をＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、改善された結合特性を有することが見いだされた。オフレートＥＬＩＳＡを、社内で製造されたＥＧＦＲ抗原でコートされたウェル及び以下の軽鎖／重鎖の組合せを含む抗ＥＧＦＲ抗体クローンで行った：１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／１−２６（ＬＣ／ＨＣ）及び３４８３１１／１−２６（ＬＣ／ＨＣ）。１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）、及び３４８３１１／１−２６（ＬＣ／ＨＣ）を含むクローンは、オフレートＥＬＩＳＡにおいてＨＬＸ０５よりもＥＧＦＲ結合の親和性がより高いことが見いだされた（図３）。
【０１９５】
ＣＤＲ−Ｌ１／ＣＤＲ−Ｌ２／ＣＤＲ−Ｈ１ライブラリーを作製するための基礎として、クローン３−６７を用いた。ＣＤＲ−Ｌ１／ＣＤＲ−Ｌ２／ＣＤＲ−Ｈ１核酸ライブラリーをＰＣＲにより生成し、ファージディスプレイベクターにクローニングし、大腸菌に形質転換してファージライブラリーを作製した。２ラウンドのパンニングの後、ＥＬＩＳＡによってクローン＃８、＃３１、＃３３及び＃３４をスクリーニングし、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）と類似の親和性でＥＧＦＲに結合することが示された。
【０１９６】
クローン１−２６、２−６８、３−６７、＃８、＃３１、＃３３、及び＃３４の重鎖及び軽鎖をシャッフルして追加の抗ＥＧＦＲ抗体変異体を作製し、これもまたＥＬＩＳＡで試験した。以下のリード抗体を、直接結合ＥＬＩＳＡにおける更なる分析のために選択した：１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）、＃８／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、及び＃３４／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）。簡潔には、各クローン、ＨＬＸ０５、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）及びリツキシマブ（すなわち、抗ＣＤ２０抗体）の連続希釈物を、マイクロタイターディッシュのウェルにヤギ抗ｆｄ抗体で捕捉した。抗ヒトカッパ−ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を用いて各ウェル中の捕捉された抗体の量を定量した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体をウェルに添加し、インキュベーション後、過剰の二次抗体を洗い流した。ＴＭＢをウェルに添加し、インキュベーション後反応を停止させ、ＨＲＰ活性を４５０ｎｍでの吸光度の増加をモニターすることによって測定した。ＥＧＦＲ結合は、ＥＧＦＲ−ＡＰ融合タンパク質をウェルに添加することによって測定した。インキュベーション及び洗浄後、ｐＮＰＰをウェルに添加し、３０分間インキュベートした。ＡＰ活性は、４０５ｎｍにおける吸光度の増加をモニターすることによって測定した。抗体濃度をＡＰ活性の関数としてプロットした（図４）。図４に示すように、クローン１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）は、ＨＬＸ０５及びＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）と類似のＥＧＦＲに対する結合親和性を有することが示された。
【０１９７】
クローン１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）；＃８／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、＃３４／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、ＨＬＸ０５、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）及びリツキシマブをビオチン化ＨＬＸ０５とのＥＧＦＲ結合について競合的ＥＬＩＳＡで試験した。簡潔には、各抗体の試料をビオチン化ＨＬＸ０５と予め混合した。次に、アルカリホスファターゼコンジュゲートＥＧＦＲを予混合溶液に加え、室温で１時間プレインキュベートした。次に、プレインキュベーション混合物を、アビジンでコーティングされたマイクロタイターウェルに添加した。１時間のインキュベーション後、全てのウェルをＰＢＳＴで洗浄し、ｐＮＰＰを各ウェルに添加した。３７℃で２回目のインキュベーション後、反応を停止した。アルカリホスファターゼ活性は、４０５ｎｍにおける吸光度の増加をモニターすることによって測定した。試験した全てのクローンは、ＨＬＸ０５又はＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）よりも高い競合能力を示した（図５）。このような結果はまた、試験した全てのクローンがＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）と同じＥＧＦＲエピトープに結合することを証明する。
【０１９８】
クローン１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）；＃８／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、及び＃３４／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）の各々は、グリコシル化部位を除去するように操作されたＣＤＲ−Ｈ２を含む。全ＩｇＧクローン１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）；＃８／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、及び＃３４／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）及びＨＬＸ０５のグリコシル化プロファイルをＨＰＬＣで分析した。Ｇ０Ｆ及びＧ１Ｆは試験されたクローンの中のほとんどのタイプのグリカンを説明するが、Ｇ０はＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡからのＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）及びＨＬＸ０５（図６）の両方で検出された。更なるグリカン分析が、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、及びＨＬＸ０５のＦａｂ断片及びＦｃ断片で実施された。Ｇ０Ｆ及びＧ１Ｆは１−２６／３−６７のＦｃ上で検出されたが、１−２６／３−６７のＦａｂ上ではグリカンは検出されなかった。対照的に、Ｇ２ＦならびにＧ０Ｆ及びＧ１Ｆのトレースは、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）及びＨＬＸ０５の両方からのＦｃ断片上で検出された。Ｇ２Ｆ＋２＊Ｇａｌ及びＧ２Ｆ＋Ｇａｌ＋ＳＡ（ＮｅｕＡｃ）は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）のＦａｂ断片上で検出され、Ｇ２Ｆ＋２＊ＳＡ（ＮｅｕＡＣ）及びＧ２Ｆ＋Ｇａｌ＋ＳＡ（ＮｅｕＡｃ）はＨＬＸ０５のＦａｂ断片上で検出された（図６）。
【０１９９】
ＳＰＲは社内で製造されたＨＬＸ０５、３４８３１１／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、３４８３１１／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）、及び１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）で実施された。結果を以下の表５に示す。
0006691872.tif 000006
【０２００】
クローン１−２６／２−６８は、６．４９×１０−１１のＫｄを有するものとして測定され、すなわちＥＧＦＲに対する親和性はＨＬＸ０５の２倍である。１−２６／３−６７は、１．０９×１０−１０のＫｄを有するものとして測定され、すなわちＥＧＦＲに対する親和性はＨＬＸ０５の１．２倍である。
【０２０１】
１−２６軽鎖及び２−６８又は３−６７の何れかの重鎖を含むＩｇＧクローンは、ＨＬＸ０５よりもＥＧＦＲに対して２から３倍高い親和性を実証した。（下記の表６を参照）。
0006691872.tif 000007
【０２０２】
親和性成熟により生成した抗ＥＧＦＲ抗体クローンのＦｃγＲＩＩＩＡ結合をＥＬＩＳＡによりアッセイした。簡潔には、マイクロタイターウェルをＦｃγＲＩＩＩＡでコーティングし、ＢＳＡでブロックした。以下の抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で加えた：社内で製造されたＨＬＸ０５、１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）、＃８／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、＃３４／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）及びＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）。１時間のインキュベーション後、抗ヒトカッパ軽鎖−ＨＲＰコンジュゲート抗体を各ウェルに添加した。ＴＭＢ基質をウェルに添加し、７分間インキュベートした。反応停止後、ＨＲＰ活性を４５０ｎｍにおける吸光度の上昇をモニターすることにより測定した。図７に示すように、１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）、＃８／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、＃３４／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）の各々は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから購入したＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）のそれ及びＨＬＸ０５のそれと類似の親和性でＦｃγＲＩＩＩａに結合する。
【０２０３】
親和性成熟によって生成した抗体クローンのＡＤＣＣ活性を、社内で製造されたＨＬＸ０５のＡＤＣＣ活性と比較した。アッセイは、Suzuki et al. (2007) “A Nonfucosylated Anti-HER2 Antibody Augments Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in Breast Cancer Patients."Clin Cancer Res13, 1875-1882に記載されたように実施された。試験された全てのクローンは、社内で製造されたＨＬＸ０５と類似のＡＤＣＣ活性を示すことが示された。＃３４／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）はわずかに改善されたＡＤＣＣ活性を有することが見いだされた（図８Ａ−Ｇ）。
【０２０４】
１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）、＃８／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、＃３４／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、及びＨＬＸ０５の抗増殖効果は、ヒトＡ４３１類表皮癌細胞に対してであり、ＭＴＴアッセイで比較された。ＭＴＴ比色アッセイは、増殖及び細胞毒性研究における生存細胞数を決定する確立された方法である。このアッセイは、ミトコンドリア酵素による可溶性青ホルマザン生成物を形成する黄色テトラゾリウム塩、ＭＴＴの切断に基づいており、生成されるホルマザンの量は、ＭＴＴ暴露中に存在する生存細胞の数に直接比例する（Mosmann (1983) J Immunol Methods 1983, 65:55-63を参照）。１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）、＃８／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、＃３４／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）又はＨＬＸ０５を漸増濃度で細胞に添加した。インキュベーション後、ＭＴＴ試薬を細胞に添加した。得られたＭＴＴ生成物を、５７０ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。細胞生存度は、式：
生存率％＝（試料の光学密度／対照の光学密度）×１００
を用いて決定された。
【０２０５】
ＩＣ５０値は、試験したいずれの細胞株においても増殖の５０％阻害を示す濃度として算出した。図９に示すように、１−２６／２−６８（ＬＣ／ＨＣ）、１−２６／３−６７（ＬＣ／ＨＣ）、＃８／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）、及び＃３４／＃３３（ＬＣ／ＨＣ）は、ＨＬＸ０５と比較して改善された抗増殖効果を有することが示された。
【０２０６】
ヒトＡ４３１類表皮癌腫瘍異種移植片を保有するマウスを、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体の治療有効性をアッセイするために使用した。簡潔には、ヒトＡ４３１上皮癌細胞（接種＝２×１０６細胞）を雄のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに移植した。マウスを無作為に５群に分けた。各群は、以下の表７に記載の投与計画の１つにより処置した：
0006691872.tif 000008
【０２０７】
処置開始の３５日後、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）で処置したマウスの腫瘍は、プラセボを受けたマウスの腫瘍より約２６％小さかった。１−２６／２−６８で処置したマウスの腫瘍は、プラセボを受けたマウスの腫瘍より約３１％小さかった（ｐ＜０．０５）。＃８／＃３３又は＃３４／＃３３で処置したマウスの腫瘍は、プラセボを受けたマウスの腫瘍より約５０％小さく（ｐ＜０．０１）、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）を埋めたマウスよりも約５０％小さかった（ｐ＜０．０５）。図１０及び下記の表８を参照。
0006691872.tif 000009
【０２０８】
＃３４／＃３３、１−２６／３−６７、１−２６／２−６８又はＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）の血清濃度をこれらの２つの時点で測定するために、３日目及び３５日目に各マウスから血清試料を採取した。簡潔には、マイクロタイターディッシュのウェルを、８倍に希釈したＥＧＦＲ−ＡＰでコーティングした。血清試料を５０００倍に希釈し、ウェルに添加した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ−ＨＲＰコンジュゲート二次抗体を用いて各ウェル中の捕捉された抗体の量を定量した。この実験は２回実施され、その結果を図１１に示す。３日目及び３５日目の両日の＃３４／＃３３、１−２６／３−６７、１−２６／２−６８の血清レベルは、及びＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）の血清レベルよりも高い。
【０２０９】
実施例２．ＦａＤｕ下咽頭扁平上皮細胞癌腫瘍異種移植アッセイ
ヒトＦａＤｕ下咽頭扁平上皮癌腫瘍異種移植片を保有するマウスを、本明細書に記載の抗ＥＧＦＲ抗体の治療有効性をアッセイするために使用した。簡潔には、ヒトＦａＤｕ下咽頭扁平上皮癌細胞（接種＝２×１０６細胞）を雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮下移植した。マウスを７匹のマウスを各々含む４群に無作為に分けた。各群は、以下の表９に記載の投与計画の１つにより処置した：
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【０２１０】
処置開始の１７日後、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）で処置したマウスの腫瘍は、プラセボを受けたマウスの腫瘍より約３８％小さかった。ＨＬＸ０５で処置したマウスの腫瘍は、プラセボを受けたマウスの腫瘍より約２９％小さかった（ｐ＜０．０５）。１−２６／３−６７で処置したマウスの腫瘍は、プラセボを受けたマウスの腫瘍より約５１％小さかった（ｐ＜０．０１）。下記の図１２及び表１０を参照。
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【０２１１】
別の一連の実験では、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに抗体治療＋放射線療法（ＸＲＴ）が施された。簡潔には、ヒトＦａＤｕ下咽頭扁平上皮癌細胞（接種＝１×１０６細胞）を雄のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下移植した。マウスを無作為に３群に分けた。各群は、以下の表１１に記載の投与計画の１つにより処置した：
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【０２１２】
５日間の治療後、ＥＲＢＩＴＵＸ及びＸＲＴ併用処置を与えられたマウスの腫瘍は、ＸＲＴ単独を与えたマウスの腫瘍より９１％小さかった。ＥＲＢＩＴＵＸ及びＸＲＴ併用処置を与えられたマウスの腫瘍は、ＸＲＴ単独を与えたマウスの腫瘍より１０５％小さかった。図１３及び下記の表１２を参照。（ＲＴ＝放射線療法）
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【０２１３】
実施例３．抗表皮増殖因子抗体−薬物コンジュゲート
ＤＭ１（Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）メイタンシン）は、有糸分裂停止を誘導することが示されている微小管集合の強力な阻害剤である（例えば、Chan (2008) Acc Chem Res 41, 98-107;Oroudjev et al. (2010) Mol Cancer Ther 9, 2700-2713；及びRemillard et al.(1975) Science 189, 1002-1005を参照）。ＨＬＸ０７−ＤＭ１コンジュゲートを調製し、抗がん剤としてのその有効性を下記のように評価した。
【０２１４】
ＰＤＸ脱塩カラムを用いてＨＬＸ０７をＰＢＳ、ｐＨ６．５に処方した。ＨＬＸ０７の最終濃度を同じ緩衝液を用いて７．５ｍｇ／ｍＬに調整した。別々の管で、ＤＭ１及びＳＭＣＣを１０ｍＭのＤＭＦ溶液として調製した。等量のＤＭ１及びＳＭＣＣ溶液を混合し、室温で３０分間で反応を完結させた。次いで、ＤＭ１−ＳＭＣＣを、４．５：１のモル比でＨＬＸ０７溶液に添加した。混合溶液を室温で２時間インキュベートした。ＰＤ１０カラムを使用して過剰量の小反応物を除去した。抗体−薬物コンジュゲートの濃度は、Ａ２５２からの適切な修正を伴って、Ａ２８０を用いて決定した。Ａ２８０／Ａ２５２の比を用いて薬物対抗体比を決定した。
【０２１５】
ＥＧＦＲ陽性ヒト結腸がん細胞の阻害を媒介するＨＬＸ０７−ＤＭ１の能力を、ＤｉＦｉ（ＫＲＡＳＷＴ及びＢＲＡＦＷＴ）、ＨＣＴ−１１６（ＫＲＡＳＧ１３Ｄ）、及びＨＴ−２９（ＢＲＡＦＶ６００Ｅ）細胞株を用いて、一連のインビトロ実験で測定した。全ての研究において、各細胞株由来の細胞を、漸増濃度のＨＬＸ０７−ＤＭ、ＨＬＸ０７又は対照抗体（抗ＣＤ２０）（連続して３倍）と共に３７℃で３日間インキュベートした。増殖阻害は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。活性代謝を有する生存細胞は、ＭＴＴ（すなわち、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、黄色染料）を５６５ｎｍの吸光度を有する紫色のホルマザン生成物に変換する。図１４Ａに示すように、ＨＬＸ０７−ＤＭ１及びＨＬＸ０７の増殖阻害効果は、ＥＧＦＲ野生型ＤｉＦｉヒト直腸癌細胞において同様であった。しかし、ＨＬＸ０７−ＤＭ１のみが、ＫＲＡＳ変異型ＨＣＴ−１１６（図１４Ｂ）及びＢＲＡＦ変異型ＨＴ−２９細胞（図１４Ｃ）に対して抗増殖効果を示した。
【０２１６】
実施例４．アフコシル化抗表皮増殖因子抗体
フコースを含まないＨＬＸ０７（すなわち、ＨＬＸ０７−ＦＦ）の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害活性を評価するために、エフェクター細胞として健康なヒトドナー由来のＰＢＭＣ及び標的細胞としてＫＲＡＳについて野生型であるヒト直腸癌細胞株であるＤｉＦｉを用いてＡＤＣＣアッセイを行った。ヒトＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて健康なドナーの全血から新たに調製し、５×１０６細胞／ｍＬの密度でＲＰＭＩ培地（Ｌ−グルタミン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０）に懸濁した。ＤｉＦｉ標的細胞をＲＰＭＩ培地に懸濁し、９６ウェルＵ底マイクロタイタープレートに１×１０４細胞／ウェルで播種した。ＨＬＸ０７−ＦＦ、ＨＬＸ０７、及び対照抗体（抗ＣＤ２０）の連続希釈物を、１．５ｐｇ／ｍｌから３．３ｎｇ／ｍＬの様々な濃度で個々のウェルに添加した。次に、ＰＢＭＣをウェルに添加してエフェクター細胞：標的細胞比２５：１を達成し、プレートを３７℃で５時間インキュベートした。次いで、プレートを遠心分離し、上清を乳酸デヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。４９０ｎｍでの上清の吸光度を記録し、ＣｙｔｏｓｃａｎＴＭ−ＬＤＨ細胞毒性アッセイキット（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて乳酸脱水素酵素の放出を測定した。ＥＣ５０値は、試験した細胞株においてＡＤＣＣの５０％誘導を示す濃度として算出した。図１５Ａに示すように、ＨＬＸ０７−ＦＦは１．６９ｎｇ／ｍｌで５０％誘導を示し、５０％誘導を示すのに必要なＨＬＸ０７の濃度（すなわち４．３８８ｎｇ／ｍｌ）より６０％低い濃度であった。
【０２１７】
ＫＲＡＳ変異は、転移性結腸がんにおいてＥＲＢＩＴＵＸに対する耐性の予測バイオマーカーである。「抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体、セツキシマブ（アービタックス）及びパニツムマブ（ベクティビックス）のクラスラベリングの変化：ＫＲＡＳ変異」米国食品医薬品局２０１０−０１−１１を参照のこと。ＫＲＡＳ変異細胞におけるＨＬＸ０７−ＦＦ及びＨＬＸ０７のＡＤＤＣ活性を比較するために、ＨＣＡＳ−１１６、すなわちＫＲＡＳＧ１３Ｄ変異を有するヒト結腸癌細胞株を標的細胞として用いて上記アッセイを繰り返した。アッセイは、３０：１エフェクター細胞：標的細胞比を用いて実施された。ＨＬＸ０７−ＦＦ、ＨＬＸ０７、及び対照抗体（抗ＣＤ２０）の連続希釈物を、連続３倍希釈後に０．１μｇ／ｍｌから５．１ｐｇ／ｍｌの様々な濃度で個々のウェルに添加した。図１５Ｂに示すように、ＨＬＸ０７−ＦＦは、非フコシル化ＨＬＸ０７よりもＨＣＴ−１１６細胞において４．８倍高いＡＤＣＣ活性を示した。
【０２１８】
ＢＲＡＦ変異は、転移性結腸がんにおいてＥＲＢＩＴＵＸに対する耐性の予測バイオマーカーである。Di Nicolitano et al. (2008) J. Clin Oncol. 26, 5705-5712を参照。ＢＲＡＦ変異細胞におけるＨＬＸ０７−ＦＦ及びＨＬＸ０７のＡＤＤＣ活性を比較するために、ＨＴ２９、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異を有するヒト結腸直腸腺癌細胞株を標的細胞として用いて、上述されるように上記アッセイを繰り返した。アッセイは、３０：１エフェクター細胞：標的細胞比を用いて実施された。ＨＬＸ０７−ＦＦ、ＨＬＸ０７、及び対照抗体（抗ＣＤ２０）の連続希釈物を、連続３倍希釈後に０．１μｇ／ｍｌから５．１ｐｇ／ｍｌの様々な濃度で個々のウェルに添加した。図１５Ｃに示すように、ＨＬＸ０７−ＦＦは、フコシル化ＨＬＸ０７よりもＨＴ２９細胞において４．７倍高いＡＤＣＣ活性を示した。
【０２１９】
実施例５．抗表皮増殖因子抗体の薬物動態プロファイル
２匹のカニクイザル（１匹の雄及び１匹の雌）に２４ｍｇ／ｋｇの抗体（すなわち、３３／３４−＃１、３３／３４−＃２、３／６７−＃３、及び３／６７−＃４）を静脈内を経由して注射した。抗ＥＧＦＲ抗体の血清濃度を、注入後の様々な時点でＥＬＩＳＡ法によって測定した。この実験をカニクイザルの第２セットで繰り返した。図１６Ａの血清濃度−時間プロファイルに示されるように、抗体３／６７は、抗体３４／３３より約１００倍長い間、カニクイザルの血清中で検出することができる。図１６Ｂは、カニクイザルにおけるＨＬＸ０５（１−３）及びＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（すなわち、４−６）の血清濃度−時間プロファイルを示す。
【０２２０】
実施例６．安定した細胞株からの抗表皮増殖因子抗体の産生
ＨＬＸ０７  １−２６／３−６７のトップサブクローンは、確立されたＤＡＳＧＩＰバイオリアクタープラットホームに組み込むことによってスクリーニングされた。流加給餌スケジュールにより、酪酸塩を添加し、ｐＨ７での制御を伴うより低温のインキュベーション条件により、サブクローン１−２６／３−６７−４５−９は１７日目に４．９ｇ／Ｌに達した。図１７を参照。
【０２２１】
実施例７．抗表皮増殖因子抗体の安定性
５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ及び２５ｍｇ／ｍｌを含むＨＬＸ０７抗体製剤が最大４週間まで加速保存条件（すなわち３７℃）に供される安定性試験が実施された。０週間、１週間、２週間、及び４週間の時点で各製剤から試料を採取し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって分析した。ＳＥＣは、抗体凝集体（すなわち、高分子量種、又はＨＭＷＳ）、単量体及び断片（すなわち、低分子量種、又はＬＭＷＳ）を検出するために広く使用されている。陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、脱アミド化又は酸化などのタンパク質分解事象を検出するためのよく知られて広く使用されているツールである（Moorhouse et al. (1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 593-603）。分解生成物は、典型的には、主要種と比較して酸性又は塩基性種と称される。酸性種は、より低い見かけのｐＩを有する変異体であり、塩基性種は、より高い見かけのｐＩを有する変異体である。酸性種は、ＣＥＸの主ピークよりも早く溶出する変異体であるが、塩基性種はＣＥＸの主ピークより後に溶出する変異体である。加速条件下で保存された製剤から採取した試料のＳＥＣ及びＣＥＸ分析の結果を以下の表１３に示す。
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【０２２２】
前述の実施例は、説明の目的でのみ提供されており、決して本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な改変は、前述の説明から当業者には明らかであり、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０２２３】
実施態様の一覧
本発明によって提供される実施態様には、限定するものではないが、以下が含まれる。
【０２２４】
１．  （１）アミノ酸配列Ｎ／Ｔ／Ｑ−ＹＧＶＨ（配列番号４）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列Ｙ−Ｎ／Ａ／Ｇ／Ｄ−Ｔ／Ｄ／Ｎ−Ｐ／Ｋ／Ｅ−ＦＴＳＲＦ（配列番号９）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列Ｔ／Ｄ−Ｙ／Ｌ−ＹＤＹ−Ｅ／Ｎ−ＦＡＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列Ｉ−Ｇ／Ｒ／Ｓ−Ｔ／Ｌ／Ｐ−ＮＩＨ（配列番号２０）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹ−Ａ／Ｇ−ＳＥ−Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｒ（配列番号２４）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴ−Ｔ／Ｌ／Ｓ／Ａ／Ｙ（配列番号３０）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体又はその抗原結合断片。
【０２２５】
２．  抗体が、（１）配列番号１−３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号５−８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）配列番号１０−１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）配列番号１５−１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号２１−２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）配列番号２５−２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、実施態様１に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２２６】
３．  抗体が、（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＮＴＰＦＴＳＲＦ（配列番号５）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＴＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１０）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＴ（配列番号２５）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、実施態様２に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２２７】
４．  抗体が、（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＮＴＰＦＴＳＲＦ（配列番号５）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、実施態様２に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２２８】
５．  抗体が、（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、実施態様２に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２２９】
６．  抗体が、（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＡＴＥＦＴＳＲＦ（配列番号７）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、実施態様２に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２３０】
７．  抗体が、（１）アミノ酸配列ＮＹＧＶＨ（配列番号１）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＤＤＫＦＴＳＲＦ（配列番号６）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＧＴＮＩＨ（配列番号１５）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＡＳＥＳＩＳ（配列番号２１）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、実施態様２に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２３１】
８．  抗体が、（１）アミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号３）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＲＴＮＩＨ（配列番号１６）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＧＳＥＳＩＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、実施態様２に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２３２】
９．  抗体が、（１）アミノ酸配列ＴＹＧＶＨ（配列番号３）を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）アミノ酸配列ＹＧＮＥＦＴＳＲＦ（配列番号８）を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（３）アミノ酸配列ＤＹＹＤＹＥＦＡＹ（配列番号１１）を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン配列；並びに（１）アミノ酸配列ＩＳＴＮＩＨ（配列番号１９）を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）アミノ酸配列ＫＹＧＳＥＳＩＳ（配列番号２２）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（３）アミノ酸配列ＮＷＰＴＳ（配列番号２７）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を含む、実施態様２に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２３３】
１０．  アミノ酸配列Ｙ−Ａ／Ｇ／Ｄ−Ｄ／Ｎ−Ｋ／Ｅ−ＦＴＳＲＦ（配列番号３１）を含む選択されたＣＤＲ−Ｈ２を含む重鎖可変ドメインを含む、アグリコシル化されたＣＤＲ−Ｈ２抗上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）抗体又はその抗原結合断片。
【０２３４】
１１．  重鎖可変ドメインが、アミノ酸配列Ｎ／Ｔ／Ｑ−ＹＧＶＨ（配列番号４）を含むＣＤＲ−Ｈ１及びアミノ酸配列Ｔ／Ｄ−Ｙ／Ｌ−ＹＤＹ−Ｅ／Ｎ−ＦＡＹ（配列番号１４）を含むＣＤＲ−Ｈ３を更に含む、実施態様１０に記載のアグリコシル化ＣＤＲ−Ｈ２抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２３５】
１２．  抗体又はその抗原結合断片が、アミノ酸配列Ｉ−Ｇ／Ｒ／Ｓ−Ｔ／Ｌ／Ｐ−ＮＩＨ（配列番号２０）を含むＣＤＲ−Ｌ１；アミノ酸配列ＫＹ−Ａ／Ｇ−ＳＥ−Ｓ／Ｔ−Ｉ−Ｓ／Ｒ（配列番号２４）を含むＣＤＲ−Ｌ２；及びアミノ酸配列ＮＷＰＴ−Ｔ／Ｌ／Ｓ／Ａ／Ｙ（配列番号３０）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン配列を更に含む、実施態様１０又は実施態様１１に記載のアグリコシル化ＣＤＲ−Ｈ２抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２３６】
１３．  抗体がヒトＩｇＧのＦｃ配列を含む、実施態様１−１２の何れか一に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２３７】
１４．  抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖ断片、ダイアボディ、及び線状抗体からなる群から選択される、実施態様１−１３の何れか一に記載の抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片。
【０２３８】
１５．  抗体が多重特異性抗体である、実施態様１−１３の何れか一に記載の抗ＥＧＦＲ抗体。
【０２３９】
１６．  抗体がアフコシル化抗体である、実施態様１−１５の何れか一に記載の抗体。
【０２４０】
１７．  治療剤にコンジュゲートした、実施態様１−１６の何れか一に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２４１】
１８．  標識にコンジュゲートした、実施態様１−１６の何れか一に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片。
【０２４２】
１９．  標識が放射性同位体、蛍光色素、及び酵素からなる群から選択される、実施態様１８に記載の抗体。
【０２４３】
２０．  実施態様１−１６の何れか一に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片をコードする単離された核酸分子。
【０２４４】
２１．  実施態様２０の核酸分子をコードする発現ベクター。
【０２４５】
２２．  実施態様２１の発現ベクターを含む細胞。
【０２４６】
２３．  実施態様２２の細胞を培養すること及び細胞培養物から抗体を回収することを含む、抗体を産生する方法。
【０２４７】
２４．  実施態様１−１７の何れか一に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【０２４８】
２５．  実施態様１−１６及び１８−１９の何れか一に記載の抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片を試料に接触させること、及びＥＧＦＲタンパク質に結合した抗ＥＧＦＲ抗体を検出することにより、患者からの試料中のＥＧＦＲタンパク質を検出する方法。
【０２４９】
２６．  抗ＥＧＦＲ抗体又はその抗原結合断片が免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）又はＥＬＩＳＡアッセイで使用される、実施態様２５に記載の方法。
【０２５０】
２７．  実施態様２６に記載の組成物の有効量を被験体に投与することを含む、被験体におけるがんを治療する方法。
【０２５１】
２８．  がんが、咽喉がん、結腸直腸がん、肺がん、及び頭頸部がんから選択される、実施態様２７に記載の方法。
【０２５２】
２９．  被験体が、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤及び細胞傷害性剤からなる群から選択される治療剤を更に投与される、実施態様２７に記載の方法。
【０２５３】
３０．  被験体が放射線療法を更に施される、実施態様２７に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図９Ａ−Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【配列表】
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