(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルから生体分子を精製するための完全に閉鎖されたコンポーネントであって、
前記コンポーネントは、
１つ以上の混合チャンバー、接続チューブ、保管容器、シーリング膜、押圧シールまたはスイッチ、精製サンプル採取チューブまたは検査チャンバー；
液体、固体または固−液懸濁形態の生物学的サンプル；
磁性ビーズ、（溶解バッファーまたは結合バッファーまたは溶解バッファーおよび結合バッファーの両方である）溶解／結合バッファー、洗浄溶液
を有して成り、
前記コンポーネントは、任意には溶離液、検査溶液、またはサンプル採取デバイス
を更に有して成り；
各混合チャンバーは使い捨てプラスチック容器であり、混合チャンバーはシール可能な軟質チューブまたはスイッチである接続チューブによって互いに接続されており；
各混合チャンバーは隣の混合チャンバーに対して隣接し、かつ水平方向にまたは垂直方向に設けられ；
押圧シールまたはスイッチは、接続チューブを開放または閉鎖するように切替え可能に成っており、隣接する混合チャンバー間にて液体交換を可能または不可能となるように切替え可能に成っており、および各接続チューブの中央および該中央の周りに設けられ；
混合チャンバーから分離された生物学的サンプルが検査のための１つ以上の検査チャンバーまたは採取のための１つ以上のサンプル採取チューブに移されるように、コンポーネントは１つ以上の検査チャンバー／精製サンプル採取チューブを有し；
１つ以上の混合チャンバーは、接続された混合チャンバーと保管容器との間のシーリング膜によって、１つ以上の保管容器と物理的に接続されるが液体接触せず、前記シーリング膜は、シリンジ、ピペット、キャピラリー、または圧力により穿孔可能な穿孔膜であり；
保管容器のシーリング膜は、膜が穿孔される前に混合チャンバーへの生物学的サンプルの移動を防止するように成っており；
保管容器は、同じまたは異なる場所（例えば、異なる温度の場所）に保管され、操作前に混合チャンバーまたは検査チャンバーに取り付けられ；
生物学的サンプルは、シーリングキャップおよび穿孔デバイスを有する圧縮可能なプラスチック容器であり、コンポーネントの一部ではないがサンプルを添加するためにコンポーネントに接続されているサンプル採取デバイスに予め装填されており；または
生物学的サンプルは、シーリング膜を介して、またはシリンジを用いた注入によって、またはピペット操作によって、保管容器／混合チャンバーに入り；または
生物学的サンプルは、コンポーネントに添加される前に磁性ビーズおよび溶解／結合溶液と混合され；
混合チャンバーまたは検査チャンバーに保管容器が取り付けられており；各保管容器は穿孔デバイスを有して成り；１つ以上の保管容器が洗浄溶液を含み；１つ以上の保管容器は溶離液を含み；１つ以上の保管容器は溶解および／または結合バッファーを含み；および１つ以上の保管容器が磁性ビーズを含み；
磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーは、同じまたは異なる保管容器に保管され；
１つ以上の検査チャンバーまたは１つ以上の混合チャンバーに取り付けられた１つ以上の保管容器は、任意には検査溶液または乾燥粉末を含み；
コンポーネントは、磁性ビーズが回転または振動によって生物学的サンプルと接触するように成っており；および
コンポーネントは完全に閉鎖されている（すなわち、密閉されている）、コンポーネント。
【請求項２】
コンポーネントはマシンの一部であり、該マシンが磁場を有して成る、請求項１に記載のコンポーネント。
【請求項３】
保管容器のシーリング膜は、シール箔、プラスチックまたはゴムクロージャーである、請求項１に記載のコンポーネント。
【請求項４】
１つ以上の保管容器が各混合チャンバーまたは検査チャンバーの上方に設けられる、請求項１に記載のコンポーネント。
【請求項５】
磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーの異なるセットが異なる保管容器内に設けられ、各異なるセットが小分子、タンパク質および／または核酸の吸着および結合のためとなるように、各セットが異なる吸着および結合プロファイルを有する、請求項１に記載のコンポーネント。
【請求項６】
生体分子は、核酸、タンパク質、または小分子である、請求項１に記載のコンポーネント。
【請求項７】
生物学的サンプルは、血液、唾液、口腔粘膜、体液、毛根、組織、血清、糞便、体分泌物、および培地から成る群から選択されるサンプルである、請求項１に記載のコンポーネント。
【請求項８】
シーリング膜を通じて保管容器または混合チャンバーに接続され、またはシーリングキャップを通じてシーリング膜に接続された、サンプル採取デバイスを更に有して成り、
サンプル採取デバイスは、指先穿刺デバイス、指先採血針、スワブ、吸収紙、塗抹標本、キャピラリー、および滴下器具から成る群から選択される採血デバイスである；またはサンプル採取デバイスは、口腔粘膜細胞の採取のためのスクレーパーまたは唾液採取器である；またはサンプル採取デバイスはマイクロサンプル採取デバイスである、請求項１に記載のコンポーネント。
【請求項９】
１つ以上の検出センサーを更に有して成る、請求項１に記載のコンポーネント。
【請求項１０】
定性的分析または定量的分析が検査チャンバーで更に実施される、請求項１に記載のコンポーネント。
【請求項１１】
定性的分析または定量的分析が免疫測定、核酸検出測定、または生化学的検出測定により実施される、請求項１０に記載のコンポーネント。
【請求項１２】
磁性ビーズが異なる混合チャンバー間で規則的に移動可能となるように成っている可動磁場、モータ、前記コンポーネントを回転、振動、または傾斜させるための手段、および任意には検出センサーを有して成り、電源（ＡＣおよび／またはＤＣ）により動力供給されるように成っている、請求項１に記載のコンポーネントを有して成る装置。
【請求項１３】
生物学的サンプルから生体分子を精製するための方法であって、
ａ．請求項１に記載のコンポーネントを、単独でまたはマシン中に収容して供すること；
ｂ．生物学的サンプルを該コンポーネントに加えること；および
ｃ．前記コンポーネントを用いて生体分子を精製すること
を含む、方法。
【請求項１４】
（ｄ）前記コンポーネントを用いて前記生体分子の検査を実施することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記コンポーネント内に前記生体分子を保管することを更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
コンポーネントがマシン内に収容される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的サンプルから生体分子を精製するための方法であって、
（ａ）磁場および請求項１に記載のコンポーネントを、単独で、またはマシンに収容して供すること；
（ｂ）生物学的サンプルを第１保管容器内に設けることによって生物学的サンプルをコンポーネントに導入し、第１保管容器を圧縮して、穿孔デバイスがシーリング膜の構造的完全性を損なわせ、それによって生物学的サンプル、磁性ビーズ、および溶解／結合バッファーを、コンポーネントの最も左側または最も右側のチャンバーである接続された混合チャンバー（第１混合チャンバー）内で混合させること；
（ｃ）溶液中の生物学的サンプル、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーを回転または振動によって混合すること；
（ｄ）第１混合チャンバーと隣接する混合チャンバー（第２混合チャンバー）との間の押圧シール（第１押圧シール）を開放し、それにより第１混合チャンバーと隣接する混合チャンバーとの間にある接続チューブ（第１接続チューブ）を通じて２つの混合チャンバーを接続すること；
（ｅ）サンプルおよび溶液を含む第２混合チャンバーの下方に磁場を配置して、磁性ビーズを捕捉し、それによって磁性ビーズを富ませること；
（ｆ）密閉されたコンポーネントを傾けて、液体を第１混合チャンバー内に流し、磁場により第２混合チャンバー内に磁性ビーズを残すこと；
（ｇ）第１押圧シールを閉じそれによって第１接続チューブを閉じ、第１混合チャンバーと第２混合チャンバーとの間の液体の流れを止めること；
（ｈ）第２混合チャンバーに接続された保管容器（第２保管容器）を圧縮することで、穿孔デバイスがシーリング膜の構造的安定性を損なわせ、それにより洗浄溶液を含んで成る第２保管容器内の洗浄溶液を第２混合チャンバー内に導入させ、それにより第２混合チャンバー内で磁性ビーズおよび洗浄溶液を混合させて、磁性ビーズを回転または振動によって洗浄すること；
（ｉ）第２混合チャンバーと第１混合チャンバーではない隣接する混合チャンバー（第３混合チャンバー）との間の押圧シールを開き、第２混合チャンバーと第３混合チャンバーとの間にある接続チューブ（第２接続チューブ）を通じて第２混合チャンバーと第３混合チャンバーとを接続すること；
（ｊ）第３混合チャンバーの下方に磁場を移動させて、磁性ビーズを捕捉し富ませること；
（ｋ）密閉されたコンポーネントを傾けて、液体を第２混合チャンバー内に流すこと；
（ｌ）第２押圧シールをリセットし、第２接続チューブを閉じて、第２混合チャンバーと第３混合チャンバーとの間における液体の流れを止めること；
（ｍ）任意には洗浄工程（ｄ）〜（ｌ）を繰り返して、第３混合チャンバーに隣接するが第２混合チャンバーに対して遠位にある追加の混合チャンバー内の不純物を除去すること；
（ｎ）洗浄した後、最後の洗浄が行われた最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーで磁性ビーズを富ませ、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーと該２番目の混合チャンバーに隣接し、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーに存在する前に磁性ビーズが存在していた混合チャンバー（最後の混合チャンバーから３番目の混合チャンバー）との間にある接続チューブを閉じること；
（ｏ）溶離液を含む、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーの上方にある保管容器（最後の保管容器から２番目の保管容器）を圧縮することにより、穿孔デバイスがシーリング膜の構造的完全性を損なわせ、それにより磁性ビーズおよび溶離液を混合し、磁性ビーズ上の結合材料を回転または振動によって磁性ビーズから溶離させること；
（ｐ）最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーに磁場を移動させて、磁性ビーズを捕捉し富ませること；
（ｑ）密閉されたコンポーネントを傾斜させ、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーと最後の混合チャンバーとの間の押圧シール（最後の押圧シールから２番目の押圧シール）を開き、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーと最後の混合チャンバーとを、これらの２つの混合チャンバー間にある開放された接続チューブ（最後の接続チューブから２番目の接続チューブ）で接続し、それによって、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーから最後の混合チャンバー内に液体が流れることを可能にすること；
（ｒ）最後の押圧シールから２番目の押圧シールをリセットし、最後の接続チューブから２番目の接続チューブを閉じて、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーと最後の混合チャンバーとの間の液体流れを止めること；
（ｓ）最後の混合チャンバーに接続された検査溶液／乾燥粉末を含む保管容器（最後の保管容器）を圧縮して、穿孔デバイスがシーリング膜の構造的完全性を損なわせ、それにより精製されたサンプルを回転または振動により検査溶液／乾燥粉末と混合させること；
（ｔ）押圧シール（最後の押圧シール）を開放し、最後の接続チューブを介して最後の混合チャンバーと検査チャンバーを接続し、次いで密閉されたコンポーネントの傾斜を維持し、液体を検査のための検査チャンバー内に流入させることを含み、
（ｕ）検査溶液／乾燥粉末の追加または検査をすることなく、磁性ビーズから生体分子を溶離させた後（工程ｐ）、精製されたサンプルを精製サンプル採取チューブに採取することも可能であり、
（ｖ）前記溶離工程または検査工程を省略可能であり、前記方法は、酵素、抗体溶液、基質溶液および／または追加のインキュベーションの追加等更なる工程を含むことが可能であり、
多数または少数の混合チャンバー、接続チューブ、保管容器、シーリング膜、押圧シールまたはスイッチ、および精製されたサンプル採取チューブまたは検査チャンバーを供することが可能であり、より多くの生物学的サンプル、より多くの磁性ビーズ、溶解／結合バッファー、洗浄溶液、任意には溶離液、および任意には検査溶液を追加することが可能であり、任意には、シーリングキャップを有するサンプル採取デバイスを追加することが可能であり、任意には、加熱器および／または冷却器を追加することが可能であり、任意には、検出センサーを追加することが可能であり、
前記工程（ｂ）では、磁性ビーズ、および／または、結合バッファー若しくは溶解バッファー若しくは結合バッファーおよび溶解バッファーの両方であり得る溶解／結合バッファーは、サンプルを有する第１保管容器または第１混合チャンバーと物理的に接触する別の保管容器のいずれかから第１混合チャンバー内に導入され、該保管容器を圧縮すると、穿孔デバイスはシーリング膜の構造的完全性を損なわせ、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーを第１混合チャンバー内に進入させる、方法。
【請求項１８】
コンポーネントがマシン内に収容される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記コンポーネント内で前記生体分子の検査を実施することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
磁石および請求項１に記載のコンポーネントを有して成るキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的サンプルから生体分子を精製することおよび当該生体分子を検査することに関する医療デバイスの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的サンプルは、血液、唾液、口腔粘膜、体液、毛根、糞便、および組織を含む。診断等の多くの医療用途のためには、生物学的サンプルからの核酸、タンパク質、および小分子を含む生体分子の抽出および精製が必要である。典型的には、血液または他の生物学的サンプルが採取され、核酸、タンパク質、または小分子の分離および抽出（すなわち、精製）後、分析および／または検査のために中央実験場に送られる。これらの生物学的サンプルは感染性のウイルスおよびバクテリアを潜在的に含むので、当該生物学的サンプルはオペレーターにとって健康上のリスクである。さらに、いくつかの精製および検出試薬は、実験室の環境および／または操作員の健康に悪影響を与える可能性がある。したがって、生物学的サンプルの完全に閉鎖された精製および検査システムは、感染源および有害化学物質に対する操作員の継続的な曝露を効果的に防止し、サンプル間の相互汚染を低減し、診断精度を改善することが可能である。さらに、操作が簡単で小さいサイズの装置は、ポイント・オブ・ケアの診断（point-of-care diagnosis）、および個々のラボや現場での検査のために都合がよい。
【０００３】
液体添加、固液混合、磁気分離、およびサンプル移送を含む機能を達成することができる完全に閉鎖され、操作が容易なデバイス（すなわち、装置またはマシン（または機械；machine））のコンポーネント（又は部品又は構成要素;component）が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、一態様において、生物学的サンプルから生体分子を精製するために使用するための、デバイス（すなわち、装置（または機器または器具または機具;instrument）またはマシン）の一部であり得る又は一部ではない完全に閉鎖され、操作が容易なコンポーネント（すなわち、ユニット）を供することにより、上記の技術的課題を解決する。これら生体分子の（分析を含む）検査又は保管は同コンポーネント内で実施され得る。コンポーネントおよびコンポーネントを含む装置は、液体添加、固液混合、磁気分離およびサンプル移動を含む機能を有し、生体分子の精製、移動および検査に使用することができる。完全に閉鎖され操作が容易なコンポーネントは、混合チャンバー、接続チューブ（connection tubes or connecting tubes）、保管容器（又は保存容器;storage containers）、シーリング膜（又は封止膜又は密封膜又は密閉膜;sealing membranes）、圧力シールまたはスイッチ、精製サンプル採取チューブまたは検査チャンバー（又は試験チャンバー；testing chamber）、サンプル（溶液、懸濁、又は固体形態である生物学的サンプル）、磁性ビーズ（又は磁気ビーズ;magnetic bead）、（溶解バッファーおよび／または結合バッファーを含む）溶解／結合バッファー（又は緩衝液又は緩衝剤;buffer）、洗浄溶液、任意には溶離液（又は溶離剤又はエルエント;eluent）、任意には検査溶液、任意にはシーリングキャップ付きサンプル採取デバイス、および任意には検出センサーを有して成る。
【０００５】
別の態様では、このコンポーネントを有して成る装置が供される。当該装置はまた、移動磁場、モータ、およびコンポーネントを回転させ、振動させ、傾けるための手段を有して成る。しかしながら、当該コンポーネントはマシンを用いることなく手動で機能することができる。
【０００６】
さらに別の態様では、生物学的サンプルから生体分子を精製し、装置を用いてまたは用いずに本発明の装置のコンポーネントを使用して、精製生体分子を検査または保存する方法が供される。
【０００７】
多数の他の態様が、本発明のこれらおよび他の態様に従って供される。本発明の他の特徴および態様は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｈ】図２Ｈは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｉ】図２Ｉは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｊ】図２Ｊは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｋ】図２Ｋは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｌ】図２Ｌは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｍ】図２Ｍは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｎ】図２Ｎは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｏ】図２Ｏは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｐ】図２Ｐは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｑ】図２Ｑは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｒ】図２Ｒは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｓ】図２Ｓは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｔ】図２Ｔは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｕ】図２Ｕは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｖ】図２Ｖは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｗ】図２Ｗは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｘ】図２Ｘは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図２Ｙ】図２Ｙは、本発明の実施形態に従った、本発明の装置のコンポーネントおよび磁場の態様を使用した例示的な抽出および検出プロセスの実施を示す。
【図３】図３は、本発明の実施形態に従った、血液ＤＮＡを抽出し、検査するための本発明の装置のコンポーネントの態様を示す。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従った、血液ＤＮＡを抽出するための本発明の装置のコンポーネントの態様を示す。
【図５】図５は、本発明の実施形態に従った、ＥＬＩＳＡを使用してタンパク質を抽出し、検査するための本発明の装置のコンポーネントの態様を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
マシンの一部であり得る、又は一部ではない本発明のコンポーネントは、様々な生物学的サンプルから核酸、タンパク質、または小さい分子等の生体分子の抽出および精製に使用される。本願では、検査溶液および検出センサーは必要ではない。精製した生体分子を得た後、当該精製した生体分子を安定して保存することができる。その結果、これは例えば一般的な実験室または現場等でのサンプル採取等、大規模な生物学的サンプル採取および保管に特に適している。検査溶液と検出センサーを追加することにより、装置のコンポーネントは、ポイント・オブ・ケアの診断試験（例えば、遺伝子型判定のみならず感染症、癌、他の疾患等の診断）のみならず遺伝子配列決定、生体分子の定量化、および他の適当な用途を含む実験場での検査および医療使用のため使用することができる。
【００１０】
一態様では、本発明は、装置（デバイスまたはマシン）の一部であり得るまたは一部でない、完全に閉鎖された（すなわち、密封された）コンポーネントを供する。コンポーネントは、生物学的サンプルから生体分子を精製し、場合によりさらに（分析を含む）検査を実施するためのシステムを供する。コンポーネントは、混合チャンバー、接続チューブ、保管容器、シーリング膜、圧力シールまたはスイッチ、精製サンプル採取チューブまたは検査チャンバー、サンプル（溶液、懸濁液、又は固体形態の生物学的サンプル）、磁性ビーズ、（溶解バッファーおよび／または結合バッファーを含む）溶解／結合バッファー、洗浄溶液、任意には検査のために使用される溶離液、任意には検査溶液、任意にはシーリングキャップを有するサンプル採取デバイス、および任意には検出センサーを有して成る。検出センサーは実施される検査に応じて変わり、任意の検出器デバイスが考えられる。検出器デバイスは、コンポーネントの一部であってもなくてもよく、マシンの一部であってもなくてもよい。コンポーネントの任意の部分は、任意の適当な材料から成り、任意の適当なサイズから成り得る。コンポーネントの任意の部分は、押出、射出成形、ブロー成形、および３Ｄ印刷等の当業者に知られた任意の適当な手段により作られ得る。コンポーネントのパーツは、当業者に知られた方法により接続され得る。特定の実施形態では、コンポーネントはプラスチックから作製される。ポリ塩化ビニル等の任意の種類のプラスチックが考えられる。特定の実施形態では、コンポーネントは、ほぼボールペンのサイズである。特定の実施形態において、当該コンポーネントは、使用前に当業者に知られた方法によって滅菌することができる。
【００１１】
別の態様では、装置（すなわち、デバイスまたはマシン）が供される。当該装置は、本発明のコンポーネントを収容するように成っている。又、当該装置は、可動磁場、当該磁場を移動させるための手段、モータ、コンポーネントを回転、振動、および傾斜させるための手段、電気プラグ、電気コンポーネント、モータ、および機能のために必要な他のコンポーネントを有してなり得る。当該装置は、電源（ＡＣおよび／またはＤＣ）に接続するように成っている。装置は、検出センサーを含み得る。特定の実施形態では、装置は、ＤＶＤ、ＣＤ、メモリスティックなどのコンピュータ可読媒体を任意に含むコンピュータプロセッサを有して成る。特定の実施形態では、装置は加熱器／冷却器を有して成る、または加熱器／冷却器に連結されている。任意の適当な加熱器／冷却器が考えられる。マシンは、コンベアトラックまたはロボットアームなどの適当な取付け（又は据付け;mounting）手段および輸送手段を有して成り得る。任意の適当なマシンが考えられ、任意の適当な材料を使用する従来の方法によって作製され得、任意の適当なサイズからなり得る。
【００１２】
特定の実施形態では、装置はプロセッサを有するコンピュータに接続され、コンピュータはコンピュータ可読媒体を任意に有して成る。コンピュータ可読媒体は、媒体を処理することができるプロセッサを備えたコンピュータデバイスの一部であり得る。コンピュータは、生体分子の検査から生じたデータなどのデータを処理し保存するために、および任意にはマシンを操作するために使用され得る。コンピュータは、ラップトップ、タブレット、電話、メインフレームコンピュータ、およびデスクトップコンピュータを含む任意のコンピュータであり得る。
【００１３】
「コンピュータ可読媒体」は、コンピュータまたはコンピュータ関連のマシン的デバイスによって読み取り可能なフォーマットでデータを保存することができる媒体を指す。そのようなコンピュータ可読媒体の例としては、磁気ディスク、カード、テープ、ドラム、パンチカードおよび紙テープなどの磁気媒体、光ディスク（例えばＣＤ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤなど）、オンラインデータ保存／転送、および当業者に周知の他の媒体を含む。媒体は、例えば、検査データを保存するために使用され得る。
【００１４】
装置を用いて、アプリケーションのすべてまたは一部を自動化して行うことができる。当該コンポーネントは、装置がない場合でも磁場の存在下で手動で操作することもできる。マシンは、オペレーターにより手動で少なくとも部分的に操作することもできる。
【００１５】
本発明のこれらのおよび他の実施形態を図１〜図５を参照して下記に説明する。図中、類似の参照番号は類似の要素を示すために全体を通して使用される。
【００１６】
図１は、本発明のコンポーネント１００の実施形態を示す。コンポーネントは、任意の適当な材料、例えばプラスチック等から作製され得る。コンポーネントは、ボールペンのサイズのような任意の適当なサイズであり得る。磁場も示されている。コンポーネントと磁場の両方はマシンの一部であってもなくてもよい。
【００１７】
１．複数の混合チャンバー１，４，７，１０，１３及び１６。
より多くの混合チャンバーまたはより少ない混合チャンバーが存在し得る。混合チャンバーは、水平方向に隣接して一列に配置される。又、混合チャンバーは、他の適当な態様、例えば垂直方向に隣接して配置され得る。特定の実施形態では、混合チャンバーは、使い捨てプラスチック容器である。
【００１８】
２．複数の接続チューブ２，５，８，１１，１４および１７。
より多くの接続チューブまたはより少ない接続チューブが存在し得る。各接続チューブは、２つの隣接する混合チャンバーまたは単一の混合チャンバーと、精製されたサンプル採取チューブまたは検査チャンバーを接続する。特定の実施形態では、接続チューブはシール可能な軟質チューブである。他の実施形態では、接続チューブはスイッチである。任意の適当なチューブまたは任意の適当なスイッチが考えられる。チューブまたはスイッチは、任意の適当なサイズとし得、当業者に知られた任意の適当な手段により作製され得る。
【００１９】
３．複数の保管容器２０，２１，２２，２３，２４，２５および２６。
より多くの保管容器またはより少ない保管容器が存在し得る。特定の実施形態では、保管容器は圧縮可能である。１つ以上の保管容器が各混合チャンバーの上方に取り付けられる。各保管容器は、その下方にある混合チャンバーと直接物理接触しているが、直接流体接触するものではない。混合チャンバーに１つよりも多い複数の保管容器が取り付けられている場合、それらは互いに隣り合って配置され得る。又、保管容器は、他の適当な位置に配置され得る。各保管容器は、穿刺デバイスを有して成る。１つ以上の保管容器は磁性ビーズを有して成る。磁性ビーズは、小分子、タンパク質および／または核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡなど）の吸着および結合のためのものである。特定の実施形態では、３つ以上の保管容器の各々は、核酸を精製するためのもの、タンパク質を精製するためのもの、および小分子を精製するためのものの異なるタイプの磁性ビーズを有して成る。適当な溶解／結合バッファー（細胞を溶解可能なバッファー［溶解バッファー］および／または生体分子の磁性ビーズへの結合を増強可能なバッファー［結合バッファー］）が供される。核酸、タンパク質、および小分子はこの技術分野で知られている。これらを精製するための異なる磁性ビーズもこの技術分野で知られている。特定の実施形態では、保管容器は、溶解／結合バッファー、細胞を溶解しおよび／または生体分子の磁性ビーズへの結合を増強可能なバッファー；洗浄溶液、磁性ビーズに非特異的に結合した不純物を除去するための溶液；溶離液、磁性ビーズから生体分子を溶出するための溶液；精製された生体分子の定性的または定量的分析のための検査溶液／乾燥粉末の１つ以上を有して成り得る。特定の実施形態では、溶解／結合バッファーは、溶解バッファーおよび結合バッファーの両方を含み、１つの保管容器に保存可能である。特定の実施形態では、溶解／結合バッファーは、異なる保管容器に保管された分離バッファーであり得る、または単一のみのバッファー（溶解バッファーまたは結合バッファー）が使用される。特定の実施形態では、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーは、異なる保管容器に保存される。特定の他の実施形態では、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーは、同じ保管容器に保管される。特定の実施形態では、保管容器は使い捨て容器である。特定の更なる実施形態では、保管容器は圧縮可能な使い捨て容器である。特定の実施形態では、保管容器は、特定量の液体、固体または固−液懸濁液が予め装填されたプラスチック容器である。特定の実施形態では、保管容器の容量は約０．０１ｍｌ〜約１５ｍｌである。保管容器は、任意の適当な材料および方法によって作製され得、任意の適当な体積を保持する任意の適当なサイズであり得る。保管容器は、異なる場所（例えば、異なる温度を有する位置）に保管され、運転前に混合チャンバーまたは検査チャンバーに取り付けられ得る。
【００２０】
４．複数のシーリング膜３４，３５，３６，３７，３８，３９、及び４０。
より多くのシーリング膜またはより少ない密封膜が存在し得る。混合チャンバーは、接続された混合チャンバーと保管容器との間にシーリング膜を有する１つ以上の保管容器と接続される。生物学的サンプルは、シーリング膜３４を使用してコンポーネントシステムに入る。又、サンプルは、１つのみのシーリング膜よりもむしろ他のシーリング膜からおよび／または保管容器から入ることができる。特定の実施形態では、シリンジまたはピペットを使用して、保管容器２０内にサンプルを添加する、またはシーリング膜を使用して混合チャンバー１にサンプルを直接添加する。シーリング膜は、シリンジ、ピペット、キャピラリー、または圧力によって穿孔（又は穿刺又は貫通;pierce）可能となっている穿刺可能膜である。特定の実施形態では、保管容器のシーリング膜は、シール箔（又はシールされた箔;sealed foil）、プラスチックまたはゴムクロージャー（又は閉鎖部分；closure）である。保管容器のシーリング膜は、膜が穿孔される前に液体、固体または固−液懸濁液の混合チャンバーへの移動を防止し、それによって膜が穿孔されるまで保管容器と混合チャンバーの流体接触が抑制される。シーリング膜の構造的一体性は圧縮を通じて穿孔デバイスによって損傷され、液体、固体または固−液懸濁液が保管チャンバーから混合チャンバーに移動される。
【００２１】
５．複数の圧力シール３，６，９，１２，１５及び１８。
より多くの圧力シールまたはより少ない圧力シールが存在し得る。各圧力シールは、隣接する混合チャンバーまたは単一の混合チャンバーと、接続チューブ上の精製サンプル採取チューブ／検査チャンバーとの間に設けられる。圧力シールは、隣接する混合チャンバーまたは単一の混合チャンバーと精製されたサンプル採取チューブ／検査チャンバーとの間の液体交換を可能にするおよび／または無効にするために、接続チューブを開放および／または閉鎖するように成っている。圧力シールは、任意の適当な材料および方法から作製することができ、任意の適当なサイズから成り得る。スイッチが圧力シールの代わりに使用可能である。
【００２２】
６．精製サンプル採取チューブ又は検査チャンバー１９。
精製サンプル採取チューブまたは検査チャンバー１９は、最後の混合チャンバ（１６）に隣接して設けられる。精製されたサンプル採取チューブまたは検査チャンバーは、混合チャンバーの下方または上方などの任意の適当な位置に設けられ得、任意の適当な数のサンプル採取チューブ／検査チャンバーが存在し得る。特定の実施形態において、１つ以上の混合チャンバーは、生物学的サンプルから精製された生体分子が検査のために混合チャンバーから検査チャンバーに、又は採取のために混合チャンバーからサンプル採取チューブへ移されるように、１つ以上の検査チャンバーまたは１つ以上の精製されたサンプル採取チューブと接続される。特定の実施形態では、生物学的サンプルを混合チャンバーから検査チャンバー内または精製サンプル採取チューブ内に流すことが可能であるが、混合チャンバーに逆戻りしないように、接続された混合チャンバーと検査チャンバーとの間または精製されたサンプル採取チューブとの間に一方向性膜が存在する。特定の実施形態では、混合チャンバーと試験チャンバーまたは精製されたサンプル採取チューブとは、シール可能な軟質チューブである接続チューブを使用して接続される。特定の実施形態では、混合チャンバーと検査チャンバーまたは精製サンプル採取チューブとは、スイッチを使用して接続される。精製されたサンプル採取チューブまたは検査チャンバーは、任意の適当な材料および方法で作製され得、任意の適当なサイズから成り得る。
【００２３】
７．保管容器２０内に設置されたサンプル溶液２７。
サンプル溶液は生物学的サンプルを含み、例えば、ＰＭＳＦ、塩、バッファー、生理食塩水（saline）、抗凝固剤（anticoagulant）などの他の適当な要素（ingredients）をさらに含み得る。
【００２４】
８．磁性ビーズおよび（溶解バッファーおよび／または結合バッファーを含む）溶解／結合バッファー２８を保管容器２１内に供する。磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーを別個の保管容器に供することも可能である。
【００２５】
溶解／結合バッファーは、例えば、中国上海のエマーサー（Emerther）社、米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック（ThermoFisher Schientific）社、および米国ニュージャージー州ジャージーシティのベックマン・コールター（Beckman Coulter）社製のバッファー等市販品で可能である。溶解／結合バッファーは、磁性ビーズのための任意の適当なバッファーであり、細胞を溶解し、および／または磁性ビーズへの特定の生体分子の結合を増強するための溶解−結合バッファーであり得る。用途（すなわち、異なる生体分子の精製）に応じて、異なる溶解／結合バッファーおよび磁性ビーズを使用することは当業者に知られている。例えば、溶解／結合バッファーは、以下の成分を含む単一溶液であり得る：３〜６Ｍの濃度のカオトロピック塩；アルカリ金属塩およびアンモニウム塩のような一価塩、マグネシウム塩および亜鉛塩のような二価塩、またはそれらの組合せを含む、０．０１〜３Ｍの濃度の塩；２〜５％（ｖ／ｖ）の濃度の界面活性剤；および２０〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度アルコールを含む。当該アルコールはエタノールまたはイソプロパノールである。この溶解／結合バッファーは、０〜１００ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のキレート剤を更に含み得る。又、溶解／結合バッファーは、４Ｍグアニジン塩酸塩、２％トリトン（Triton）Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、０．０１％メルカプトエタノール、０．１ＭＮａＣｌ、０．６ＭＬｉＣｌ、１０ｍＭのトリス（tris）−ＨＣｌ（ｐＨ５．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５％イソプロパノールであり得る。
【００２６】
磁性ビーズは、磁場を介した吸着を通じて、核酸、タンパク質、および小分子を含む生体分子を精製するために使用される。適切な条件下では、生体分子は磁場中で磁性ビーズに結合し、結合できない物質は溶液中に残り、除去され得る。次いで、結合した生体分子を適当なバッファー中で磁性ビーズから溶出させ、磁場を用いて磁性ビーズから分離し得る。任意の適当な磁性ビーズ（磁性粒子、磁性微粒子、または磁性ナノ粒子とも呼ばれる）を使用し得る。例としては、市販のシラノールシリカ磁性微粒子、アミノ化シリカ磁性微粒子、およびカルボキシル化シリカ磁性微粒子が挙げられるが、これらに限定されない。磁性ビーズは、生物学的サンプルの分離および検出、核酸抽出、免疫測定（immunoassay）などで使用されている。
【００２７】
９．保管容器２２，２３および２４に洗浄溶液２９，３０および３１をそれぞれ供する。
【００２８】
洗浄溶液は、例えば、中国上海のエマーサー（Emerther）社、米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック（ThermoFisher Schientific）社、および米国ニュージャージー州ジャージーシティのベックマン・コールター（Beckman Coulter）社製の洗浄溶液等市販品で可能である。洗浄溶液は、任意の適当な洗浄溶液である。洗浄溶液は、例えば洗剤などを含み得る。例えば、洗浄溶液は、２００ｍＭのＮａＣｌ溶液、０．８ＭのＬｉＣｌ、７０％のエタノール、５０ｍＭのトリスバッファー（ｐＨ６．５）を含み得る。あるいは、別の例では、洗浄溶液は７０％〜７５％のエタノールを含み得る。
【００２９】
１０．保管容器２５に入れられた溶離液３２。
溶離液は、磁性ビーズから精製された生体分子を溶出するためのバッファーを含む。特定の実施形態では、溶離液は任意である。
【００３０】
溶離液は、例えば、中国上海のエマーサー（Emerther）社、米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック（ThermoFisher Schientific）社、および米国ニュージャージー州ジャージーシティのベックマン・コールター（Beckman Coulter）社製の溶離液等市販品で可能である。溶離液は、任意の適切な溶離液である。例えば、溶離液は、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、ＴＥバッファーｐＨ７．５−８．５、または滅菌水であり得る。
【００３１】
１１．試験溶液３３を保管容器２６内に入れ、これを混合チャンバーに取り付ける。
特定の実施形態では、検査溶液を検査チャンバーに取り付けられた保管容器に保管することも可能であるので、検査溶液を検査チャンバーに直接加えることができる。
【００３２】
当業者は、検査溶液が実施される試験によって異なること、および検査溶液が例えば、米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック（ThermoFisher Schientific）社、および米国ニュージャージー州ジャージーシティのベックマン・コールター（Beckman Coulter）社製の市販品で可能であることを理解するであろう。検査溶液は任意の適当な検査溶液であり、乾燥粉末であってもよい。
【００３３】
１２．移動磁場４１は、混合チャンバー１，４，７，１０，１３又は１６に、または精製されたサンプル採取チューブまたは検査チャンバー１９に配置され得るか、または磁場がシールユニットに影響しない位置に配置され得る。特定の実施形態では、移動磁場は、装置の一部であり、密閉されたコンポーネントの一部ではない。磁場の位置を変えることができ、それによって、磁性ビーズを吸着し、磁性ビーズを懸濁させるまたは混合チャンバー内に引き寄せて富ませる（又は強化する又は補強する又は高める；enrich）ことができる。
【００３４】
コンポーネントは完全に密封され（完全に閉鎖されたシステム）、密閉されたコンポーネントと開放された外部環境（例えば、液体、気体、含有水、酸素および他の拡散物質など）との間にて物質交換はない。
【００３５】
図２Ａ〜図２Ｙは、本開示の閉鎖抽出および検出コンポーネントを使用する例示的な抽出および検出プロセスを示し、以下の工程（工程１〜２７）を含む。
【００３６】
１．穿刺デバイスがシーリング膜３４及び３５の構造的完全性を損なう（damage the structural integrity）ように保管容器２０及び２１を圧縮し、それによって生物学的サンプル、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーを混合チャンバー１内で混合させる。溶液中で液体、（任意に溶液中で）固体または固液懸濁液である生物学的サンプル、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーを回転または振動によって十分に混合し、それによって生体分子を磁性ビーズに結合させる。生体分子を精製するための磁場中での磁性ビーズの使用はこの技術分野において周知である。
【００３７】
２．圧力シール３を開き、接続チューブ２を介して混合チャンバー１と混合チャンバー４を接続する。
【００３８】
圧力シールを開く前に、液体は、混合チャンバー１および最大圧力シールまでの接続チューブの一部に含まれる。
【００３９】
３．磁場４１を混合チャンバー４に配置して、磁性ビーズを捕捉し、富ませる（又は強化する又は補強する又は高める又は濃縮する；enrich）。
【００４０】
４．液体が混合チャンバー１に流入するように、密閉されたコンポーネントを傾斜させる。磁性ビーズは混合チャンバー４内に残り、磁場によって捕捉される。
【００４１】
５．圧力シール３をリセットし、接続管２を閉じ、混合チャンバー１と４の間の液体の流れを停止する。
【００４２】
６．保管容器２２を圧縮することにより、穿刺デバイスがシーリング膜３６の完全性を損ない、それによって、磁性ビーズと洗浄溶液２９とが混合チャンバー４内で混合され、磁性ビーズが回転または振動によって洗浄される。
【００４３】
７．圧力シール６を開き、接続チューブ５を介して混合チャンバー４と混合チャンバー７を接続する。
【００４４】
８．磁性ビーズを捕捉し富ませるために、磁場４１を混合チャンバー７に移動させる。
【００４５】
９．液体が混合チャンバー４内に流れるように、密閉されたコンポーネントを傾斜させる。
【００４６】
１０．圧力シール６をリセットし、接続チューブ５を閉じて、混合チャンバー４と７との間の液体の流れを停止させる。
【００４７】
１１−１９．図示するように、上記の工程を繰り返して、磁性ビーズを洗浄して混合チャンバー７，１０および１３中の不純物を除去する。
【００４８】
２０．洗浄後、磁性ビーズは混合チャンバー１３内で富み、接続チューブ１２は閉じられる。
【００４９】
２１．保管容器２５を圧縮することにより、穿刺デバイスがシーリング膜３９の構造的完全性に損傷を与え、それによって磁性ビーズおよび溶離液３２が混合され、結合物質が回転または振動によって磁性ビーズから溶出される。
【００５０】
２２．磁性ビーズを捕捉し富ませるために、磁場４１を混合チャンバー１３に移動させる。
【００５１】
２３．密閉されたコンポーネントを傾斜させ、圧力シール１５を開き、接続チューブ１４を介して混合チャンバー１３と混合チャンバー１６を接続し、混合チャンバー１３から混合チャンバー１６内に液体を流す
【００５２】
２４．圧力シール１５をリセットし、接続チューブ１４を閉じて、混合チャンバー１３と１６との間の液体の流れを停止させる。
【００５３】
２５．穿刺デバイスがシーリング膜４０の構造的完全性を損なうように保管容器２６を圧縮し、それにより、精製されたサンプルを回転または振動によって検査溶液３３と混合させる。
【００５４】
２６．圧力シール１８を開き、接続チューブ１７を介して混合チャンバー１６と検査チャンバー１９とを接続する。次いで、密閉されたコンポーネントの傾斜を維持し、それによって液体が検査チャンバー１９に流入するようにして、取り付けられた検出センサー（図示せず）によって検査する。
【００５５】
２７．または、下記工程の後に、取り付けられたセンサーによって検査を行うことができる。圧力シール１８をリセットし、接続チューブ１７を閉じる。シールされたユニットは特定の位置に更に戻され得る。
【００５６】
当業者であれば、上述のプロセスまたは修正を伴う上記のプロセスはマシンなしで手動で、またはコンポーネントがマシンまたはマシンの一部内に置かれた状態で自動的に／半自動的に実施され得ることは理解されよう。
【００５７】
図１および図２Ａ〜図２Ｙは、本発明の特定の実施形態の一般的な説明を供する。小分子、核酸、および／またはタンパク質のような生体分子を抽出および／または検査するための特定の測定の場合、システムコンポーネントの設定および手順は、状況に応じて変わる。限定されるものではないが、いくつかの混合チャンバーが追加、バイパス、又は省略され得る；保管容器は、個々の測定に特定の異なる試薬を含み得る；いくつかの保管容器は空であってもよい；および１つ以上の保管容器は、いくつかの混合チャンバーまたは検査チャンバーなどから除去されまたはこれらに追加されてよい。
【００５８】
コンポーネントシステムのコンポーネントの特定の実施形態の追加変更には、例えば、単一の検査チャンバー／精製されたサンプル採取チューブ１９を多重検査／サンプル採取を実施するため複数の並列検査チャンバー／精製サンプル採取チューブに置き換えて使用することが含まれる。多重（又はマルチプレックス；multiplex）の磁性ビーズまたは試薬を使用して多重（又はマルチプレックス；multiplex）分析を行うことも可能である。検査を並行して実施するために１つ以上の検出センサーが設置され得る。
【００５９】
さらに、多数のシールコンポーネントが、１つ以上のサンプルから小分子、核酸、および／またはタンパク質などの生体分子を抽出および検査するために、１つのデバイス内に設置され得る。当該抽出および検査としては、限定されるものではないが平行したＤＮＡおよび／またはＲＮＡの抽出および検査、平行したＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の抽出および検査することなどが含まれる。
【００６０】
特定の実施形態では、コンポーネント（すなわち、システムまたはユニット）は、後刻使用のための精製サンプルを保存するために検査を行うことなく小分子／核酸／タンパク質の抽出のためのみに使用され得る。この場合、検査溶液は追加されない。精製されたサンプルが採取チューブ１９に採取された後、採取チューブ１９（すなわち、サンプル採取チューブ）は、ユニット（すなわちコンポーネント）全体から分離され、保管のためにキャップされ得る。
【００６１】
バッファーおよび溶液のいずれも、注入による、または穿孔可能な（piercible）シールを通じてピペットにより導入されるなどによって、コンポーネントを開封することなく保管容器に導入することができる。
【００６２】
特定の検査では、適当な標準および／または内部基準を含めることが有利であり得る。
【００６３】
特定の実施形態では、試験は、例えば、免疫測定、核酸検出測定、または生化学的検出によって行われる。任意の適当な試験が考えられる。
【００６４】
生体分子は、任意の生体分子、例えば、核酸、タンパク質、および小分子を含む。
【００６５】
生物学的サンプルは、例えば、血液、唾液、口腔粘膜、体液、毛根、組織、血清、糞便、体分泌物、培地および植物を含む任意の生物学的サンプルを含む。
【００６６】
特定の実施形態では、コンポーネントは、生物学的サンプルを採取するためのサンプル採取デバイスをさらに含む。特定の実施形態では、サンプル採取デバイスは、保管容器または混合チャンバーに接続される。特定の実施形態において、サンプル採取デバイスは、穿刺デバイスを有して成る。特定の実施形態では、サンプル採取デバイスは、マイクロサンプル採取デバイスである。特定の実施形態では、患者（例えば、人間の患者または動物）から血液を採取するためのデバイスのようなサンプル採取デバイスは、封止キャップでキャップされ、サンプル採取デバイスは、混合チャンバー、例えば混合チャンバー１にねじ込まれ、シーリング膜３４のようなシーリング膜の側に配置されるように成っている。この時点で、サンプルは混合チャンバー１と流体接触していない。圧縮されると、穿刺デバイスは、シーリング（又は封止又は密閉；sealing）キャップおよびシーリング膜３４の構造的完全性を損なせ、それによって生物学的サンプルを混合チャンバー１に流入させる。
【００６７】
特定の実施形態では、サンプル採取デバイスは採血デバイスである。特定の実施形態では、採血デバイスは指先穿刺デバイスである。特定の実施形態では、指先穿刺デバイスは、指先採血針、スワブ（swab）、吸収紙、塗抹標本（又は塗抹又はスメア；smears）、キャピラリー、またはスポイト（又はドロッパー又は滴下器具；dropper）である。特定の実施形態では、サンプル採取デバイスは、口腔粘膜細胞の採取のためのスクレーパーまたは唾液採取器である。血液サンプル採取デバイスは、抗凝固剤をさらに含み得る。特定の実施形態では、生体サンプルは、コンポーネントに添加される前に、サンプル採取デバイス内の磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーと混合される。
【００６８】
特定の実施形態では、当該コンポーネントには微量のサンプル採取がさらに含まれる。特定の実施形態では、微量のサンプル採取量は、液体サンプル１０μＬ〜５ｍｌである。特定の実施形態では、微量のサンプル採取量は、体積で≦２ｍｌ、≦１ｍｌ、≦０．５ｍｌである。
【００６９】
コンポーネントは、混合および／または振動に適合される。特定の実施形態では、装置は、装置が装置の閉鎖したコンポーネントを傾斜させるように成っており、溶液は、より高い位置のチャンバーからより低い位置のチャンバーへと一方向に流れる。
【００７０】
精製された生体分子について当該技術分野で知られている任意の適当な検査および分析が考えられる。核酸については、検査および分析には増幅、シークエンシング（又はシーケンシング;sequencing）等が含まれる。タンパク質およびポリペプチドについて、検査および分析には、サイズ決定、免疫測定、別の分子への結合などの機能分析などが含まれる。小分子の場合、検査および分析には、分光分析、別の分子との結合などの機能解析などが挙げられる。
【００７１】
図３は、血液ＤＮＡの抽出および検査のための本発明のコンポーネントおよび本発明の方法の実施形態を示す。
【００７２】
穿孔可能なシールＡ−血液サンプルは穿孔可能なシールＡを介して加えられる。
【００７３】
保管容器Ｂは、内部標準２００μＬを含む。
【００７４】
保管容器Ｃは、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーを含む。１．５ｍＬの溶解／結合バッファー中には磁性ビーズ１ｍｇが含まれる。
【００７５】
保管容器Ｄは、洗浄液Ｉ１ｍｌを含む。
【００７６】
保管容器Ｅは、洗浄液ＩＩ１ｍｌを含む。
【００７７】
保管容器Ｆは、洗浄液ＩＩＩ１ｍｌを含む。
【００７８】
保管容器Ｇは、溶離液１００μｌを含む。また、保管容器Ｈは、１００μｌのｑＰＣＲ検出溶液を含む。
【００７９】
磁性ビーズ、溶解／結合バッファー、内部標準、洗浄溶液Ｉ、洗浄溶液ＩＩ、洗浄溶液ＩＩＩ、溶離液、ｑＰＣＲ検出溶液（ＰＣＲバッファー、ＨＢＶプライマープローブ、Ｔａｑポリメラーゼ）は、中国上海のエマーサー（Emerther）社、米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック（ThermoFisher Schientific）社、および米国ニュージャージー州ジャージーシティのベックマン・コールター（Beckman Coulter）社製の市販品で可能である。
【００８０】
上記の手順（図２Ａ〜図２Ｙ）に基づいて、ＤＮＡを抽出し、精製ＤＮＡとｑＰＣＲ検出溶液とを混合した後、典型的な増幅測定を用いて、核酸増幅および検出のために核酸溶液を検査チャンバー１９に移す。装置の一部であってもなくてもよい加熱器／冷却器は、ｑＰＣＲ反応サイクルを実施するのに適した温度を供するために検査チャンバー１９の隣に取り付けられる。異なる温度を供するために、１つ以上の検査チャンバーが使用され得る。レポーター色素（reporter dye）からのリアルタイム蛍光発光をモニターするために、光度計のような検出センサーが検査チャンバー１９の隣に取り付けられる。装置は検査結果を記録し、医療診断のためのＨＢＶ遺伝子などの遺伝子の量の最終的な読み取りを供する。
【００８１】
図４は、本発明のコンポーネントおよび血液ＤＮＡの抽出のための本発明の方法の実施形態を示す。
【００８２】
保管容器Ａは、精製され得る生体サンプル２００μＬを含む。
【００８３】
保管容器Ｂは、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーを含む。１．５ｍＬの溶解／結合バッファー中には磁性ビーズ１ｍｇが含まれる。
【００８４】
保管容器Ｃは、洗浄溶液Ｉ：１ｍｌを含む。
【００８５】
保管容器Ｄは、洗浄溶液ＩＩ：１ｍｌを含む。
【００８６】
保管容器Ｅは、洗浄溶液ＩＩＩ：１ｍｌを含む。
【００８７】
保管容器Ｆは、溶離液１００μＬを含む。
【００８８】
磁性ビーズ、溶解／結合バッファー、洗浄溶液Ｉ、洗浄溶液ＩＩ、洗浄溶液ＩＩＩ、溶離液は、中国上海のエマーサー（Emerther）社、米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック（ThermoFisher Schientific）社、および米国ニュージャージー州ジャージーシティのベックマン・コールター（Beckman Coulter）社製の市販品で可能である。
【００８９】
上記の工程１〜２２（図２Ａ〜図２Ｔ）に基づいてＤＮＡを抽出した後、シールされたユニット（すなわちコンポーネント）を傾斜させ、圧力シール１５および１８を開放し、混合チャンバー１３，１６および精製した接続チューブ１４，１７を介してサンプル採取チューブ１９が接続される。これにより、液体が混合チャンバー１３から混合チャンバー１６を通って精製されたサンプル採取チューブ１９に流れるようにする。圧力シール１５および１８はリセットされる。接続チューブ１４および１７は閉鎖されている。精製されたサンプルは、精製されたサンプル採取チューブ１９内に採取され、精製されたサンプル採取チューブ１９は、ユニット全体から離され、保管のためにキャップされ得る。
【００９０】
図５は、本発明のコンポーネントおよびＥＬＩＳＡを用いたタンパク質の抽出および検査のための本発明の方法の実施形態を示す。
【００９１】
保管容器Ａは、分析され得る抗原を含む血漿サンプル（plasma sample）を含む。
【００９２】
保管容器Ｂは、磁性ビーズおよび結合バッファーを含む。
【００９３】
保管容器Ｃは、非特異的に結合したタンパク質を除去するための洗浄溶液Ｉを含む。
【００９４】
保管容器Ｄは、検出抗体溶液を含む。
【００９５】
保管容器Ｅは、非特異的に結合したタンパク質を除去するための洗浄溶液ＩＩを含む。
【００９６】
保管容器Ｆは基質溶液を含む。
【００９７】
検出抗体は、酵素に共有結合させることができ、またはそれ自体を、生体共役反応（bioconjugation）によって酵素に連結された二次抗体によって検出することができる。この例では、検出抗体は酵素に共有結合している。基質は、サンプル中の抗原の量を示す可視シグナルを生成するために酵素によって触媒作用が及ぼされる。
【００９８】
磁性ビーズ、結合バッファー、洗浄溶液Ｉ、検出抗体溶液、洗浄溶液ＩＩ、洗浄溶液ＩＩＩ、基質溶液は、中国上海のエマーサー（Emerther）社、米国マサチューセッツ州ウォルサムのサーモフィッシャーサイエンティフィック（ThermoFisher Schientific）社、および米国ニュージャージー州ジャージーシティのベックマン・コールター（Beckman Coulter）社製の市販品で可能である。
【００９９】
プラズマサンプル、磁性ビーズおよび結合バッファーは、（デバイスに取り付けられ得る加熱器または冷却器により）適当な温度で混合チャンバー１内にて最初に混合される。抗原は磁性ビーズに結合する。磁性ビーズは、混合チャンバー４に移動され、洗浄溶液Ｉによって洗浄される。その後、磁性ビーズは、混合チャンバー７に移動され、（デバイスに取り付けられ得る加熱器または冷却器により）適当な温度で検出抗体溶液とインキュベートされる。その後、磁性ビーズを混合室１０に移動させ、洗浄液ＩＩで洗浄する。次いで、磁性ビーズは、混合チャンバー１３に移動され、基質溶液と混合される。ビーズおよび溶液は、検査チャンバー１９に移動され、（デバイスに取り付けられ得る加熱器または冷却器により）適切な温度でインキュベートされる。抗原のレベルを定量するために、分光光度計などの検出センサーを検査チャンバー１９の隣に取り付けることが可能である。
【０１００】
特定の態様では、下記のコンポーネントが供される。具体的には、生体サンプルから生体分子を精製するための完全に閉鎖されたコンポーネントが供される。当該コンポーネントは、混合チャンバー、接続チューブ、保管容器、シーリング膜、圧力シールまたはスイッチ、精製サンプル採取チューブまたは検査チャンバー、液体、固体または固−液懸濁形態の生物学的サンプル、磁性ビーズ、（溶解バッファーおよび／または結合バッファーを含む）溶解／結合バッファー、洗浄溶液、任意には溶離液、任意には検査溶液、任意にはシーリングキャップを有するサンプル採取デバイスを有して成る。
ここで、各混合チャンバーは使い捨てプラスチック容器であり、混合チャンバーはシール可能な軟質チューブまたはスイッチである接続チューブによって互いに接続されている；各混合チャンバーは隣の混合チャンバーに対して隣接して、水平方向にまたは垂直方向に設けられ；
圧力シールまたはスイッチは、隣接する混合チャンバー間にて液体交換を可能または不可能にするために、接続チューブを開放および／または閉鎖するように成っており、各接続チューブの中央および当該中央の周りに設けられ；
１つ以上の混合チャンバーは、接続された混合チャンバーと保管容器との間のシーリング膜によって、物理的に接触するが液体接触しない１つ以上の保管容器と接続され、前記シーリング膜は、シリンジ、ピペット、キャピラリー、または圧力により穿孔可能な穿孔膜であり；
保管容器のシーリング膜は、膜が穿孔される前に混合チャンバーへの生物学的サンプルの移動を防止し；
保管容器は、異なる場所（例えば、異なる温度の場所）に保管され、操作前に混合チャンバーまたは試験チャンバーに取り付けられ得；
生物学的サンプルは、シーリングキャップおよび穿孔デバイスを有する圧縮可能なプラスチック容器であり、コンポーネントの一部ではないがサンプルに添加するためにコンポーネントに接続され得るサンプル採取デバイスに予め装填され得；
又、生物学的サンプルは、シーリング膜を介して、またはシリンジを用いた注入によって、またはピペット操作によって、保管容器／混合チャンバーに入り得る；または生物学的サンプルは、コンポーネントに添加する前に磁性ビーズおよび溶解／結合溶液と混合され得；
混合チャンバーまたは検査チャンバーに１つよりも多い保管容器が取り付けられている場合、これらは互いに隣接して設けられ；
各保管容器は穿孔デバイスを有して成り；
１つ以上の保管容器が洗浄溶液を含み；
１つ以上の保管容器は溶離液を含み；
１つ以上の保管容器は溶解および／または結合バッファーを含み；１つ以上の保管容器が磁性ビーズを含み；磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーは、同じまたは異なる保管容器に保管され得；
混合チャンバーから単離された生物学的サンプルが、検査のために１つ以上の検査チャンバーに、または採取のために１つ以上のサンプル採取チューブに移されるように、１つ以上の混合チャンバーは、密封可能な軟質チューブまたはスイッチである接続チューブと、接続チューブの中央および当該中央の周囲の圧力シールとによって１つ以上の検査チャンバー／精製されたサンプル採取チューブと接続され、１つ以上の検査チャンバーまたは１つ以上の混合チャンバーに取り付けられた１つ以上の保管容器は、検査溶液または乾燥粉末を含み得；
磁性ビーズは回転または振動によって生体サンプルと接触し；および
コンポーネントは完全に閉鎖されている（すなわち、密封されている）。
【０１０１】
別の態様では、生物学的サンプルから生体分子を精製するための方法が供される。当該方法は、
ａ．本発明のコンポーネントを、単独でまたは本明細書に開示された装置中に収容して供すること；
ｂ．生物学的サンプルを当該コンポーネントに加えること；および
ｃ．前記コンポーネントを用いて生体分子を精製すること
を含む。
【０１０２】
更なる実施形態では、当該方法は、精製された生体分子を検査することを更に含む。例えば、ＰＣＲ増幅に付して、精製された核酸分子の配列決定（sequence）等をし得る。精製されたタンパク質分子は免疫測定などの任意の測定に付され得る。他の更なる実施形態では、当該方法は、精製された生体分子を保存することを更に含む。特定の実施形態では、コンピュータ、加熱器／冷却器などの他のデバイスがこのマシンに接続され得る。
【０１０３】
一旦本開示の教示が供されると、当業者はこの態様の方法を各用途に適合するように変更し得る。
【０１０４】
別の態様では、生物学的サンプルから生体分子を精製するための方法が供される。当該方法は、
（ａ）磁場および本発明のコンポーネントを、単独で、または本明細書に開示された装置に収容して供すること；
（ｂ）例えば、生物学的サンプルを第１保管容器内に配置することによって、生物学的サンプルをコンポーネントに導入すること；第１保管容器を圧縮して、穿孔デバイスがシーリング膜の構造的完全性を損なわせ、それによって生物学的サンプル、磁性ビーズ、および溶解／結合バッファーを、コンポーネントの最も左側または最も右側のチャンバーであるサンプルを有する混合チャンバー（第１混合チャンバー）内で混合させること（チャンバーは、混合チャンバーまたは検査チャンバーのいずれかである）；
（ここで、磁性ビーズ、および／または結合バッファー若しくは溶解バッファーのいずれか又はこれらの両方であり得る溶解／結合バッファーは、サンプルを有する第１の保管容器または第１混合チャンバーと物理的に接触する別の保管容器のいずれかから第１混合チャンバー内に導入され、当該保管容器を圧縮すると、穿孔デバイスはシーリング膜の構造的完全性を損なわせ、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーを第１混合チャンバー内に進入させる。）
（ここで、生物学的サンプルは、本明細書に開示されているように、他の方法でコンポーネント内に導入可能であり、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーは同じ保管容器に入れるか、または異なる保管容器に分けられ得る。）
（ｃ）溶液中の生物学的サンプル、磁性ビーズおよび溶解／結合バッファーを回転または振動によって混合すること；
（ｄ）第１混合チャンバーと隣接する混合チャンバー（第２の混合チャンバー）との間の圧力シール（第１圧力シール）を開放し、それにより第１混合チャンバーと隣接する混合チャンバーとの間にある接続チューブ（第１接続チューブ）を通じて２つの混合チャンバーを接続すること；
（用途に応じて、多かれ少なかれ圧力シールと、多かれ少なかれ混合チャンバーと、多かれ少なかれ接続チューブが存在し得る。）
（ｅ）サンプルおよび溶液を含む第２混合チャンバーの下方に磁場を配置して、磁性ビーズを捕捉し、それによって富ませること；
（ｆ）密閉されたコンポーネントを傾けて、液体が第１混合チャンバーに流れるようにすることと、磁場により第２混合チャンバー内に磁性ビーズを残すこと；
（ｇ）第１圧力シールを閉じそれによって第１接続チューブを閉じ、第１混合チャンバーと第２混合チャンバーとの間の液体の流れを止めること；
（ｈ）第２混合チャンバーに接続された保管容器（第２保管容器）を圧縮することで、穿孔デバイスがシーリング膜の構造的安定性を損なわせ、それにより第２保管容器内の洗浄溶液（第２保管容器は洗浄溶液を含んで成る）を第２混合チャンバーに導入させ、それにより第２混合チャンバー内で磁性ビーズおよび洗浄溶液を混合させて、磁性ビーズを回転又は振動によって洗浄すること；
（ｉ）第２混合チャンバーと第１混合チャンバーではない隣接する混合チャンバー（第３混合チャンバー）との間の圧力シールを開き、第２混合チャンバーと第３混合チャンバーの間にある接続チューブ（第２接続チューブ）を通じて第２混合チャンバーと第３混合チャンバーとを接続すること；
（ｊ）第３混合チャンバーの下方に磁場を移動させて、磁性ビーズを捕捉し富ませること；
（ｋ）密封されたコンポーネントを傾けて、液体が第２混合チャンバーに流れるようにすること；
（ｌ）第２圧力シールをリセットし、第２接続チューブを閉じて、第２混合チャンバーと第３混合チャンバーとの間における液体の流れを止めること；
（ｍ）任意には洗浄工程（ｄ）〜（ｌ）を任意に繰り返して、第３混合チャンバーに隣接するが第２混合チャンバーに対して遠位にある追加の混合チャンバー内の不純物を除去すること；
（ｎ）洗浄した後、磁性ビーズは最後の洗浄が行われた最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーで富化され、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーと該第２番目の混合チャンバーに隣接し、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーに存在する前に磁性ビーズが存在していた混合チャンバー（最後の混合チャンバーから３番目の混合チャンバー）との間にある接続チューブを閉じること；（最後の混合チャンバーから３番目の混合チャンバーよりも最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーは第１混合チャンバーより遠位にある。）
（ｏ）溶離液を含む、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーの上方にある保管容器（最後の保管容器から２番目の保管容器）を圧縮することにより、穿孔デバイスがシーリング膜の構造的完全性を損なわせ、それにより磁性ビーズおよび溶離液を混合し、磁性ビーズ上の結合材料を回転または振動によって磁性ビーズから溶離させること；
（ｐ）最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーに磁場を移動させて、磁性ビーズを捕捉し富ませること；
（ｑ）シールされたコンポーネントを傾斜させ、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーと最後の混合チャンバーとの間の圧力シール（最後の圧力シールから２番目の圧力シール）を開き、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーと最後の混合チャンバーとを、これらの２つの混合チャンバー間にある開放された接続チューブ（最後の接続チューブから２番目の接続チューブ）で接続し、それによって、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーから最後の混合チャンバーに液体が流れることを可能にすること；
（ｒ）最後の圧力シールから２番目の圧力シールをリセットし、最後の接続チューブから２番目の接続チューブを閉じて、最後の混合チャンバーから２番目の混合チャンバーと最後の混合チャンバーとの間の液体流れを止めること；
（ｓ）最後の混合チャンバーに接続された検査溶液／乾燥粉末を含む保管容器（最後の保管容器）を圧縮して、穿孔デバイスがシーリング膜の構造的完全性を損なわせ、それによって精製されたサンプルが回転または振動により検査溶液／乾燥粉末と混合させること；
（ｔ）圧力シール（最後の圧力シール）を開放し、最後の接続チューブを介して最後の混合チャンバーと、第１混合チャンバーから最も遠位側にあるチャンバーである検査チャンバーを接続し、次いで密閉したコンポーネントの傾斜を維持し、検査のために液体を検査チャンバーに流入させること；
（ｕ）検査溶液／乾燥粉末の追加または検査をすることなく、磁性ビーズから生体分子を溶離させた後（工程ｐ）、精製されたサンプルを精製サンプル採取チューブに採取し得ることを含む。
（ｖ）なお、いくつかの特定の測定では、溶離工程または検査工程などのいくつかの前述の工程を省略し得る。酵素、抗体溶液、基質溶液および／または追加のインキュベーションの追加等、いくつかの更なる工程が追加され得る。
【０１０５】
特定の実施形態では、この態様の方法は、コンポーネント上に取り付けられた検出センサーによる検査をさらに含む；又は、最後の圧力シールをリセットする工程と最後の接続チューブを閉じる工程との２つの工程後に、取り付けられたセンサーによって検査を行うことが可能である。検出センサーは、装置の一部、コンポーネントの一部、またはこれらのどちらでなくてもよい。本開示の教示が与えられると、当業者は、各用途に適合するようにこの態様の方法を変更することが可能である。例えば、多かれ少なかれ混合チャンバー、多かれ少なかれ接続チューブ、多かれ少なかれ保管容器、多かれ少なかれシーリング膜、多かれ少なかれ圧力シールまたはスイッチ、多かれ少なかれ精製されたサンプル採取チューブまたは検査チャンバーがあり得る。１つ以上のセットの洗浄工程、本明細書に開示される１つ以上のサンプル採取デバイスが存在し得る。ある場合、いくつかの混合チャンバーが追加され、バイパスされ、または省略され得る。保管容器は、個々の測定に特異的な異なる試薬を含み得る。いくつかの保管容器は空であってよい。１つ以上の保管容器がいくつかの混合チャンバー又は検査チャンバーから除去され又は追加されてよい。追加の変更には、例えば、多重検査／サンプル採取を実施するため、単一の検査チャンバー／精製されたサンプル採取チューブを複数の平行である検査チャンバー／精製されたサンプル採取チューブに置き換えて使用することが含まれる。多重の磁性ビーズまたは試薬を使用して多重分析を行うことも可能である。１つ以上の検出センサーを設置して、検査を並行して実施してよい。更に、限定されないが、並行したＤＮＡおよび／またはＲＮＡの抽出および検査、並行したＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の抽出および検査等を含む、並行した１つ以上のサンプルからの小分子、核酸および／またはタンパク質などの生体分子の抽出および検査のために、複数の密閉されたコンポーネントを１つのデバイスに設置し得る。多数又は少数の混合チャンバー、接続チューブ、保管容器、シーリング膜、圧力シールまたはスイッチ、および精製されたサンプル採取チューブまたは検査チャンバーがあり得る。より多くの生物学的サンプル、より多くの磁性ビーズ、溶解／結合バッファー、洗浄溶液、任意には溶離液、および任意には検査溶液が追加され得る。任意には、シーリングキャップを有するサンプル採取デバイスが追加され得る。任意には、加熱器および／または冷却器が追加され得る。任意には、検出センサーが追加され得る。
【０１０６】
本明細書で使用されるように、名詞の前の単語「ａ」または「複数」は、特定の名詞の１つ以上の特定の名詞を示す。
【０１０７】
定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載される。当該技術分野で公知の他の適当な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は、例示的なものに過ぎず、限定を意図するものではない。
【０１０８】
本明細書中にて言及された全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、参照することでその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【０１０９】
前述の説明は、本発明の例示的な実施形態のみを開示するものである。本発明は、その詳細な説明と関連して記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲を例示するものであり、本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解されよう。他の態様、利点および変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。したがって、本発明の特定の特徴のみを例示し説明したが、当業者には多くの修正および変更が創出されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神に含まれるすべてのそのような修正および変更を包含するように意図されていることは理解されよう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図２Ｍ】
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【図２Ｎ】
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【図２Ｏ】
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【図２Ｐ】
0006688883.tif 000018
【図２Ｑ】
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【図２Ｒ】
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【図２Ｓ】
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【図２Ｔ】
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【図２Ｕ】
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【図２Ｖ】
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【図２Ｗ】
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【図２Ｘ】
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【図２Ｙ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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