(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的植物由来の組織片を培養して培養組織片を得る培養工程、前記培養工程で得られた培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換する形質転換工程、前記形質転換工程により形質転換された組織片から植物体を再生する再生工程を含み、
前記培養組織片が、シュートであり、
前記標的植物が、Ｈｅｖｅａ属に属する植物である
遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法。
【請求項２】
前記培養工程後、更に、該培養工程により得られた培養組織片を採取し、分割した後、該分割された培養組織片を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することで、培養組織片を得る増殖工程を行い、該増殖工程により得られた培養組織片を形質転換工程に供する請求項１記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項３】
前記形質転換工程が、前記培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換されたアグロバクテリウム属菌とともに培養する感染工程を含む請求項１又は２記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項４】
前記遺伝子コンストラクトが、選択試薬に対する抵抗性を付与する選択マーカー遺伝子を含み、
前記製造方法が、更に、前記選択試薬を含む選択培養培地で培養して、前記形質転換工程により形質転換された組織片を選択する選択培養工程を含む請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項５】
前記選択培養培地中の選択試薬の濃度が、０．０１〜１０ｍＭである請求項４記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項６】
前記遺伝子コンストラクトが、前記標的植物のゲノムと同種の遺伝物質を含む請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項７】
前記遺伝子コンストラクトが、前記標的植物のゲノムと異種の遺伝物質を含む請求項１〜５のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項８】
前記再生工程が、前記形質転換された組織片を発根誘導培地で培養して発根させる発根工程を含む請求項１〜７のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項９】
培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換する形質転換工程を含み、
前記培養組織片が、シュートである
遺伝的に改変されたＨｅｖｅａ植物体を作製するための形質転換Ｈｅｖｅａ植物体の製造方法。
【請求項１０】
前記製造方法は、標的植物由来の組織片を培養して培養組織片を得る培養工程を含み、該培養工程で得られた培養組織片を形質転換工程に用いる請求項９記載の形質転換Ｈｅｖｅａ植物体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法、及びこの製造方法により作製された、遺伝的に改変された形質転換植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物に遺伝子を導入して形質転換植物を作出する研究が多くなされており、数多くの植物種で成功した例が報告されている。
【０００３】
ところで、通常、木本植物の品種改良育種は交雑育種により行われているが、木本植物は、実生から開花、結実までに数年、場合によっては数十年単位の長期間を要するため、草本植物に比べ遺伝子解析に長期を要する。
【０００４】
一方で、植物の遺伝子操作は商業的に重要な植物種の改良に大きな可能性を提供できる。近年では、樹木への遺伝子操作も種々検討されており、特にパルプ及び木材業界において応用されている。
【０００５】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。
【０００６】
現状、工業用天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。またゴム製品の主原料として、様々な用途において幅広くかつ大量に用いられている。しかしながら、パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、採取出来る季節が限られる場合がある。また、成木から天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年に限られる。
【０００７】
今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれており、天然ゴム資源の枯渇が懸念されていることから、安定的な天然ゴムの供給源が望まれている。
【０００８】
このような状況下において、パラゴムノキによる天然ゴムの増産を図る動きが見られる。パラゴムノキは、播種により実生苗を育成させ成長させた後台木とし、クローン苗から得た芽を台木に接ぎ木することで苗を増殖させる。クローン苗から得られる芽には限りがあるため、優良品種を普及させるには、優良品種のクローン苗を大量増殖させる必要がある。
【０００９】
また、遺伝子操作技術の適用を検討した例としては、パラゴムノキにおいて、未熟胚等の組織由来カルスを用いた遺伝子導入から不定胚を誘導し、再分化の後、植物体として再生させる不定胚形成系を利用した形質転換体の作出に成功した例が報告されている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ジャヤシュリー（Ｒ．Ｊａｙａｓｈｒｅｅ）、外１２名、「プラント  セル  レポート（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）」、２００３年、第２２巻、ｐ．２０１−２０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述のように、木本植物であるパラゴムノキにおいて、不定胚形成系を利用した形質転換体の作出が行われているが、このような方法は、形質転換効率が低く不安定であったり、再分化効率が悪かったりして、所望する遺伝子型をもつ形質転換植物を得る有効な形質転換方法としては改善の余地があった。
【００１２】
また、受精した種子の未熟胚を利用する場合、親と同形質をもった個体を得られないため、品種の品質を維持することは難しかった。
【００１３】
そのため、再分化の難しい木本植物において、短期間で効率的に遺伝子導入でき、該植物の有用な形質を保持しながら目的の遺伝子を導入することができる遺伝子導入方法、及び、効率的に再分化可能な形質転換体作出方法が望まれている。
【００１４】
本発明は、前記課題を解決し、短期間で効率的に遺伝子導入でき、遺伝子導入される植物の有用な形質を保持しながら、目的の遺伝子を導入することが可能な、また、効率的な再分化が可能な、遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
従来、木本植物において、葉柄や葉片、胚軸等からの不定芽誘導や不定胚誘導を利用した遺伝子導入が行われている。しかしながら、個体の再分化が難しく、不定芽や不定胚の形成が難しい品種によっては、遺伝子導入して、形質転換植物を作出することが困難であった。
【００１６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、標的植物の組織片を培養して得られる培養組織片を用いて、形質転換を行い、当該形質転換によって得られる形質転換された組織片から植物体を再生することで、遺伝的に改変された遺伝子導入植物を短期間で効率的に得ることが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明は、標的植物由来の組織片を培養して培養組織片を得る培養工程、該培養工程で得られた培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換する形質転換工程、該形質転換工程により形質転換された組織片から植物体を再生する再生工程を含むことを特徴とする遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法に関する。
【００１８】
上記標的植物は、木本植物であることが好ましい。
【００１９】
上記標的植物は、Ｈｅｖｅａ属に属する植物であることが好ましい。
【００２０】
上記培養工程後、更に、該培養工程により得られた培養組織片を採取し、分割した後、該分割された培養組織片を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することで、培養組織片を得る増殖工程を行い、該増殖工程により得られた培養組織片を形質転換工程に供することが好ましい。
【００２１】
上記形質転換工程は、上記培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換されたアグロバクテリウム属菌とともに培養する感染工程を含むことが好ましい。
【００２２】
上記遺伝子コンストラクトは、選択試薬に対する抵抗性を付与する選択マーカー遺伝子を含み、上記製造方法は、更に、上記選択試薬を含む選択培養培地で培養して、上記形質転換工程により形質転換された組織片を選択する選択培養工程を含むことが好ましい。
【００２３】
上記選択培養培地中の選択試薬の濃度は、０．０１〜１０ｍＭであることが好ましい。
【００２４】
上記遺伝子コンストラクトは、上記標的植物のゲノムと同種の遺伝物質を含むことが好ましい。
【００２５】
上記遺伝子コンストラクトは、上記標的植物のゲノムと異種の遺伝物質を含むことが好ましい。
【００２６】
上記再生工程は、上記形質転換された組織片を発根誘導培地で培養して発根させる発根工程を含むことが好ましい。
【００２７】
本発明はまた、培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換する形質転換工程を含むことを特徴とする遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法に関する。
【００２８】
上記製造方法は、標的植物由来の組織片を培養して培養組織片を得る培養工程を含み、該培養工程で得られた培養組織片を形質転換工程に用いることが好ましい。
【００２９】
本発明はまた、上記製造方法により作製された、遺伝的に改変された形質転換植物体に関する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法は、標的植物由来の組織片を培養して培養組織片を得る培養工程、該培養工程で得られた培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換する形質転換工程、該形質転換工程により形質転換された組織片から植物体を再生する再生工程を含む製造方法であるので、遺伝的に改変された遺伝子導入植物を短期間で効率的に得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１において、形質転換用の材料とするシュートの様子を示す写真である。
【図２】実施例１において、アグロバクテリウムに感染後のシュートの様子を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の製造方法は、標的植物由来の組織片を培養して培養組織片を得る培養工程、該培養工程で得られた培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換する形質転換工程、該形質転換工程により形質転換された組織片から植物体を再生する再生工程を含む製造方法である。上述のように、このような方法で、遺伝的に改変された遺伝子導入植物を作製することにより、遺伝子導入植物を短期間で効率的に得ることができる。特に、培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換する形質転換工程を含むところに特徴があり、このような遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法もまた、本発明の１つである。その際、標的植物由来の組織片を培養して培養組織片を得る培養工程を含み、該培養工程で得られた培養組織片を形質転換工程に用いることが好ましい。
なお、本発明の製造方法は、上記各工程を含む限りその他の工程を含んでいてもよく、上記各工程は、１回行ってもよいし、植え継ぐなどして複数回行ってもよい。
【００３３】
上記培養工程に用いられる標的植物由来の組織片としては、特に限定されず、例えば、葉柄、葉片、体細胞胚の胚軸、節、腋芽、頂芽等が挙げられる。なかでも、培養組織片（好ましくは、シュート）を安定的に誘導することが可能であることから、節、腋芽、又は頂芽を含む組織を上記組織片として用いることが好ましい。このように、上記培養工程は、標的植物由来の節、腋芽、又は頂芽を含む組織を培養して培養組織片（好ましくは、シュート）を得る工程であることが好ましい。
【００３４】
上記標的植物としては特に制限されないが、本発明の製造方法は再分化の難しい木本植物においても適用することができることから、上記標的植物が木本植物である場合に本発明の効果がより顕著に発揮される。このように、上記標的植物が木本植物であることもまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
【００３５】
上記木本植物としては、特に制限されず、落葉樹、常緑樹の広い範囲の種類及び品種の木本植物を挙げることができるが、特に、ゴムを資源として採取できるゴムノキであることが好ましく、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）がより好ましい。更に好ましくは、Ｈｅｖｅａ属に属する植物等のトウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）に属する植物であり、更により好ましくは、Ｈｅｖｅａ属に属する植物である。なかでも、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）が特に好ましい。
【００３６】
以下において、本発明の製造方法における各工程について説明する。なお、以下の説明においては、標的植物の一例としてパラゴムノキを使用する場合について述べるが、パラゴムノキ以外の他の植物においてもこれと同様に実施することができる。
【００３７】
（培養工程）
培養工程では、標的植物由来の組織片を培養して培養組織片を得る。この工程は、標的植物由来の組織片を培養して培養組織片を得るために通常行われる方法を採用することができ特に制限されないが、例えば、パラゴムノキ由来の節、腋芽、又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することで、培養組織片（好ましくは、シュート）を誘導、形成させる誘導工程であることが好ましい。
【００３８】
培養組織片としては、シュート、節等が挙げられるが、なかでも、以降の遺伝子導入植物を作製するための各工程をより効率よく、より安定的に行うことができることから、シュートが好ましい。なお、以下においては、主として、培養組織片がシュートである場合について説明するが、培養組織片がシュート以外の場合においてもこれと同様に実施することができる。
【００３９】
上記シュートを誘導するための材料（組織）としては、パラゴムノキの節、腋芽、又は頂芽を含む組織を用いることができるが、具体的には、成木や幼木、苗木、クローン苗、又は試験管内で実生から生育させた無菌苗（無菌実生苗）由来の節、腋芽、若しくは頂芽を含む組織などが挙げられる。成木や幼木、苗木、又はクローン苗由来の節、腋芽、若しくは頂芽を含む組織を使用する場合には、適宜必要な大きさに切断した後、表面を殺菌又は滅菌することで使用することができるが、試験管内で実生から生育させた無菌苗（無菌実生苗）由来の節、腋芽、又は頂芽を含む組織を使用する場合には、適宜必要な大きさに切断した後に使用することが可能である。
【００４０】
成木や幼木、苗木、又はクローン苗由来の節、腋芽、若しくは頂芽を含む組織を用いる場合、誘導培地で培養する前にまず、組織の表面を洗浄する。例えば、磨き粉で洗浄したり、柔らかいスポンジで洗浄したりしても良いが、流水で洗浄するのが好ましい。当該洗浄用の水は、界面活性剤を約０．１質量％含むものであってもよい。
【００４１】
次に、組織を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤、滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩化ベンザルコニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好ましい。なお、殺菌又は滅菌処理の後、更に滅菌水で洗浄してもよい。
【００４２】
上記洗浄、殺菌又は滅菌処理を行う具体例として例えば以下の手順が挙げられる。流水で表面組織を洗浄した後、エタノールで洗浄。次いで次亜塩素酸ナトリウム水溶液で必要に応じて撹拌しながら滅菌。その後、滅菌水を用いて洗浄。
【００４３】
誘導工程では、パラゴムノキの節、腋芽、又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することにより、シュートを誘導、形成させる。なお、誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地に上記組織を差し込んで培養することでシュートを誘導しやすくなるため、固体培養が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
また、殺菌又は滅菌処理を行った組織を用いる場合には、殺菌剤、滅菌剤の影響を除くため切り口を切除して培養に用いてもよい。
【００４４】
植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。中でも、サイトカイニン系植物ホルモンを用いることが好ましい。
【００４５】
オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、ピコリン酸等が挙げられる。なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸、インドール−３−酪酸が好ましく、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸がより好ましい。
【００４６】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンチニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリポシド、ジヒドロゼアチン等が挙げられる。なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。
【００４７】
炭素源としては、特に限定されず、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アロース、タロース、グロース、アルトロース、マンノース、イドース、アラビノース、アピオース、マルトース等の糖類が挙げられる。なかでも、スクロースが好ましい。
【００４８】
誘導培地は、上記組織への成長阻害物質の蓄積を防止するために、更に活性炭を含むことが好ましい。また、シュートの形成を促進するために、更に硝酸銀を含むことが好ましい。更には、シュートの形成を促進するために、ココナッツウォーター（ココナッツミルク）を含んでもよい。
【００４９】
誘導培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｂｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｅｇ．Ｐａｒｉｓ  １４  １−２２３（１９５３））、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地を使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地又はその組成に変更を加えたＭＳ改変培地が好ましい。
【００５０】
誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【００５１】
好適な誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の組成である。
【００５２】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１．０質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５．０質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【００５３】
誘導培地にオーキシン系植物ホルモンを実質的に加えないことが好ましく、誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、具体的には、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以下である。
【００５４】
誘導培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加える場合の、誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。特に好ましくは０．８ｍｇ／Ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは７．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下である。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、５．０ｍｇ／Ｌである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、０．８〜１．２ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、１．０ｍｇ／Ｌである。
【００５５】
誘導培地中の活性炭の濃度は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０３質量％以上である。該活性炭の濃度は、好ましくは１．０質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。
【００５６】
誘導培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【００５７】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．５〜６．０が更に好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。
【００５８】
誘導工程は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４〜１６時間の明時間という条件などが挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましく、４〜８週間がより好ましい。
【００５９】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。
【００６０】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがサイトカイニン系植物ホルモン（特に、ベンジルアデニン、又はカイネチン）で、その濃度が０．８〜６．０ｍｇ／Ｌであり、培養温度が２５〜３５℃であることが特に好ましい。
【００６１】
以上のように、パラゴムノキの節、腋芽、又は頂芽を含む組織を上記誘導培地で培養することにより、シュートを誘導、形成することが可能である。
【００６２】
上記誘導工程（培養工程）により形成されたシュートは、後述する形質転換工程に供されるが、また後述する増殖工程に供することにより、シュートの数を増加させることができ、接ぎ穂となる組織を大量に増殖させることが可能となる。そしてこのように増殖工程により大量に増殖させた接ぎ穂となる組織を後述の形質転換工程に供することもできる。これにより、シュートの数を増加させることができ、接ぎ穂となる組織を大量に増殖させることが可能である。そして更には、この増殖工程を繰り返し行ったり、植え継ぎ培養したりすることによって更に大量に増殖させることができる。このように、上記培養工程後、更に増殖工程を経た後、形質転換工程を行い、いわゆるマイクロプロパゲーション法により増殖されたシュートを形質転換工程に供してもよい。すなわち、本発明の製造方法が、上記培養工程後、更に、該培養工程により得られた培養組織片を採取し、分割した後、該分割された培養組織片を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することで、培養組織片を得る増殖工程を行い、該増殖工程により得られた培養組織片を形質転換工程に供する形態であることもまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
【００６３】
ここで、上記誘導工程により形成されたシュートは、シュートが安定して成長したことが確認できれば形質転換工程や増殖工程に供することが可能であるが、例えば誘導培地で４週間培養すると、シュートが誘導されるだけでなく、伸長することとなり、誘導されたシュートだけでなく、このような誘導、伸長されたシュートを形質転換工程、増殖工程に供してもよい。この際のシュートの伸長度合いは、誘導培地での培養期間等の培養条件により適宜調整することができる。そして更には、誘導工程により誘導されたシュートを後述する伸長工程に供して伸長させた後に、形質転換工程や増殖工程に供してもよい。
【００６４】
（伸長工程）
伸長工程では、誘導工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養することにより、シュートを伸長させる。具体的には、誘導工程により形成させたシュート（例えば、２〜３ｃｍ程度）を伸長培地に差し込み移植し、４週間程度培養することで、シュートが伸長し、また新たな芽を取得することも可能となる。
なお、伸長培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地にシュートを差し込んで培養することでシュートが伸長しやすくなるため、固体培養が好ましい。また、伸長培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００６５】
伸長培地は、植物生長ホルモン及び炭素源を含むものであるが、該植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。中でも、オーキシン系植物ホルモンとサイトカイニン系植物ホルモンとを併用することが好ましい。
【００６６】
オーキシン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるオーキシン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸、インドール−３−酪酸が好ましく、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸がより好ましく、１−ナフタレン酢酸が特に好ましい。
【００６７】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるサイトカイニン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。
【００６８】
伸長培地に用いられる炭素源としては、特に限定されず、上記誘導培地に用いられる炭素源と同様のものを用いることができるが、なかでも、スクロースが好ましい。
【００６９】
伸長培地は、上記誘導培地同様、更に、活性炭、硝酸銀を含むことが好ましい。
【００７０】
伸長培地としては、上記誘導培地として用いられる基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地を用いることができるが、なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地が好ましく、ＭＳ培地又はその組成に変更を加えたＭＳ改変培地がより好ましい。
【００７１】
伸長培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【００７２】
好適な伸長培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の組成である。
【００７３】
伸長培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１．０質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５．０質量％以下である。
【００７４】
伸長培地にオーキシン系植物ホルモンを加える場合の、伸長培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．０３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０８ｍｇ／Ｌ以下である。
【００７５】
伸長培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加える場合の、伸長培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／Ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは２．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【００７６】
伸長培地中の活性炭の濃度は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０３質量％以上である。該活性炭の濃度は、好ましくは１．０質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。
【００７７】
伸長培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【００７８】
伸長培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．５〜６．０が更に好ましい。
【００７９】
伸長工程は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４〜１６時間の明時間という条件などが挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましく、３〜５週間がより好ましい。
【００８０】
固体培地の場合、伸長培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。
【００８１】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがオーキシン系植物ホルモン（特に、１−ナフタレン酢酸）及びサイトカイニン系植物ホルモン（特に、ベンジルアデニン）で、その濃度がそれぞれ０．０５〜０．０８ｍｇ／Ｌ、０．８〜２．０ｍｇ／Ｌであり、培養温度が２５〜３５℃であることが特に好ましい。
【００８２】
以上のように、誘導工程により形成させたシュートを上記伸長培地で培養することにより、シュートを伸長させることができる。また、この伸長工程では、シュートが伸長するだけではなく、新たなシュートも形成される。この伸長工程により伸長させたシュートは更に後述の形質転換工程や増殖工程に使用することができる。
【００８３】
（増殖工程）
増殖工程では、誘導工程により形成させたシュート、又は、伸長工程により伸長させたシュートを採取し、分割した後、該分割されたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することで、シュートを形成させる。この工程を行うことにより、シュートの数を増加させることができ、接ぎ穂となる組織を大量に増殖させることが可能である。そして更には、この工程を繰り返し行ったり、植え継ぎ培養したりすることによって更に大量に増殖させることができる。
【００８４】
増殖工程において、誘導工程により形成させたシュート、又は、伸長工程により伸長させたシュートを採取する際には、節、腋芽や頂芽の部分は採取しないようにしてシュートを採取すると、増殖工程において安定的にシュートの数を増加させることが可能となり好ましい。
なお、採取したシュートの分割は従来公知の方法により行うことができ、分割する大きさは適宜設定することができる。
【００８５】
増殖工程において用いる誘導培地としては、上記誘導工程において用いられる誘導培地と同様のものを用いることができる。
【００８６】
以上のように、増殖工程では、シュートを採取、分割した後、該分割されたシュートを上記誘導培地で培養することにより、シュートを形成させ、シュートを大量に増殖させることが可能である。この増殖工程により形成させたシュートは後述の形質転換工程に供される。シュートが安定して成長したことが確認できれば形質転換工程に供することが可能であるが、形質転換工程に供する前に、形成させたシュートを上記誘導培地に植え継いで成長させてから形質転換工程に供してもよいし、上述の伸長工程を経てから形質転換工程に供してもよい。
【００８７】
（形質転換工程）
形質転換工程では、培養工程で得られた培養組織片、又は、増殖工程により得られた培養組織片、具体的には、誘導工程により形成されたシュート、又は、増殖工程により形成されたシュート、を遺伝子コンストラクトで形質転換する。
【００８８】
上記形質転換の方法としては、例えば、アグロバクテリウム属菌を用いて遺伝子を間接的に植物体に導入する方法や、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポーレーション法等の遺伝子を直接細胞に導入する方法などが挙げられる。なかでも、本発明においては、アグロバクテリウム属菌を用いた方法が好適に採用される。
すなわち、上記形質転換工程が、培養工程で得られた培養組織片、又は、増殖工程により得られた培養組織片を、遺伝子コンストラクトで形質転換されたアグロバクテリウム属菌とともに培養する感染工程を含むこともまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
【００８９】
上記感染工程においては、標的遺伝子又はそのフラグメント（以下、標的遺伝子等、又は、遺伝物質、とも称する。）を含む遺伝子コンストラクトを含有するアグロバクテリウム属菌を、誘導工程により形成されたシュート、又は、増殖工程により形成されたシュートに感染させる。そこで、まず、アグロバクテリウム属菌の調製方法（アグロバクテリウム属菌調製工程）について説明する。
【００９０】
（アグロバクテリウム属菌調製工程）
上記感染工程において用いられるアグロバクテリウム属菌としては、含有する遺伝子コンストラクトを植物細胞に導入させることができるアグロバクテリウム属菌であれば特に限定されるものではないが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）であることが好ましい。感染効率が良好であり、アグロバクテリウム法において汎用されているためである。
【００９１】
標的遺伝子等を含む遺伝子コンストラクトを含有するアグロバクテリウム属菌は、従来公知の何れの手法を用いて作製してもよい。例えば、アグロバクテリウム属菌が有するＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域と相同組み換え可能なプラスミドに、標的遺伝子等を組み込んだ標的遺伝子組み換え中間ベクターを作製し、該標的遺伝子組み換え中間ベクターをアグロバクテリウム属菌に導入することで、標的遺伝子等を含む遺伝子コンストラクトを含有するアグロバクテリウム属菌を作製する方法や、アグロバクテリウム法において汎用されているバイナリーベクターに標的遺伝子等を組み込んだ標的遺伝子バイナリーベクターをアグロバクテリウム属菌に導入することで、標的遺伝子等を含む遺伝子コンストラクトを含有するアグロバクテリウム属菌を作製する方法などが挙げられる。
【００９２】
上記遺伝子コンストラクトに含まれる標的遺伝子とは、標的植物に導入する目的の遺伝子を意味する。標的遺伝子としては、標的植物に導入された結果、当該標的植物の遺伝的形質を変化させ得るものであれば特に限定されるものではなく、導入される標的植物が本来有している遺伝子であってもよく、当該標的植物以外の生物由来の遺伝子であってもよく、人工的に作製した遺伝子であってもよい。人工的に作製した遺伝子としては、例えば、２種類以上の遺伝子をつなぎ合わせたキメラ遺伝子であってもよく、いずれかの生物が有する遺伝子を変異させた変異遺伝子であってもよい。変異遺伝子としては、例えば、遺伝子を構成するＤＮＡの塩基配列のうちの一部の塩基を欠損させたものであってもよく、置換させたものであってもよい。また、該塩基配列の途中に部分塩基配列を挿入したものであってもよい。
このように、上記遺伝子コンストラクトが、標的植物のゲノムと同種の遺伝物質を含むこともまた、本発明の好適な実施形態の１つであり、また、標的植物のゲノムと異種の遺伝物質を含むこともまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
【００９３】
また、標的遺伝子は、構造遺伝子であってもよく、調節領域であってもよい。例えば、プロモーターやターミネーター等の転写や翻訳の制御領域を含む構造遺伝子であってもよい。なお、制御領域の遺伝子は、遺伝子が導入される標的植物中で機能し得るものであればよく、遺伝子が導入される標的植物と同種の生物由来の遺伝子であってもよいし、異種の生物由来の遺伝子であってもよいことは言うまでもない。このような異種プロモーターとしては、例えば、ＣａＭＶ３５  ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ＮＯＳ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の遺伝子組み換えに係る分野において汎用されているプロモーターを使用することができる。
【００９４】
標的植物に導入される標的遺伝子は、遺伝子の全長であってもよいし、フラグメントであってもよい。例えば、構造遺伝子の機能ドメインのみからなるフラグメントを導入するものであってもよい。
【００９５】
標的植物に導入する標的遺伝子としては、後述するレポーター遺伝子、又は、標的植物の細胞内で所望する効果を発揮する遺伝子であれば特に制限されない。当該所望する効果は、例えば、成長促進、耐病性、植物生産物の品質の変化や向上など、任意の変化であればよい。
また、これらの遺伝子に組織特異的に機能するプロモーター等の調節領域を含ませることにより、標的遺伝子がコードしているタンパク質を、植物体の特定の組織において発現させることもできる。
【００９６】
上記遺伝子コンストラクトに含まれる標的遺伝子等は、好適には、マーカー遺伝子、場合により、レポーター遺伝子とともにベクターに組み込まれる。
マーカー遺伝子（選択マーカー遺伝子ともいう。）としては、後述する選択培養培地に含まれる選択試薬に対する抵抗性を付与する選択マーカーをコードする遺伝子であればよく、例えば、カナマイシン耐性遺伝子（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ｈｐｔＩ）、グリフォサート耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。植物体での発現位置を確認するためのレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）等を挙げることができる。
このように、上記遺伝子コンストラクトが、選択試薬に対する抵抗性を付与する選択マーカー遺伝子を含むこともまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
【００９７】
アグロバクテリウム属菌調製工程では、上述の説明等の通りに作製した標的遺伝子等を含む遺伝子コンストラクトを含有するアグロバクテリウム属菌を、常法により培養（例えば、培養温度２０〜３５℃で、ＹＥＢ培地で１０〜３０時間振とう培養）し、増殖させることにより、標的植物由来のシュートに感染させるために必要な量を調製することができる。
【００９８】
（感染工程）
感染工程では、標的遺伝子等を含む遺伝子コンストラクトを含有するアグロバクテリウム属菌（アグロバクテリウム属菌調製工程により得られたアグロバクテリウム属菌）を、誘導工程により形成されたシュート、又は、増殖工程により形成されたシュートに感染させる。
【００９９】
感染工程は、アグロバクテリウム法において一般的に行われている手法で行うことができる。例えば、アグロバクテリウム属菌を液体の感染培地中に懸濁させ、該懸濁液中に、上記誘導工程により形成されたシュート、又は、増殖工程により形成されたシュートを浸漬させることにより、感染させることができる。そして、浸漬後、懸濁液と、上記シュートをろ紙等で分離すればよい。なお、浸漬中は、静置してもよく、振とうしてもよいが、シュートにアグロバクテリウム属菌を感染させやすいことから、振とうすることが好ましい。
【０１００】
感染に用いられるアグロバクテリウム属菌懸濁液の菌濃度は、アグロバクテリウム属菌の種類や増殖活性、感染させるシュートのシュート誘導後の培養期間、浸漬時間等を考慮して適宜決定することができる。例えば、シュート５本に対し、６００ｎｍで測定した吸光度（Ｏ．Ｄ．６００）が０．０１〜１．０（好ましくは０．０５〜０．８、より好ましくは０．０８〜０．６）のアグロバクテリウム属菌懸濁溶液１０〜５０ｍＬ（好ましくは２０〜４０ｍＬ、より好ましくは２５〜３５ｍＬ）に相当する菌体数のアグロバクテリウム属菌を接触させることが好ましい。これにより、シュートへ感染するアグロバクテリウム数を最適化でき、形質転換シュートを効率的に作成できる。
【０１０１】
感染工程におけるアグロバクテリウム属菌とシュートとの共存時間、すなわち、アグロバクテリウム属菌とシュートを接触させる時間は、０．５〜６０分が好ましく、１〜４０分がより好ましく、２５〜３５分が更に好ましい。これにより、シュートへ感染するアグロバクテリウム数を最適化でき、形質転換シュートを効率的に作成できる。なお、該共存時間は、例えば、アグロバクテリウム属菌懸濁液中に、シュートを浸漬させる場合、浸漬時間を意味する。
【０１０２】
アグロバクテリウム属菌を懸濁させる感染培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモン、炭素源を加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地が好ましく、ＭＳ培地がより好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。なお、炭素源として、スクロースとグルコースとを併用して用いてもよい。
また、感染培地は、上記誘導培地同様、更に、硝酸銀を含むことが好ましい。
【０１０３】
好適な感染培地の組成は、植物種により異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の組成である。
【０１０４】
感染培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上、特に好ましくは３質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。
【０１０５】
感染培地にオーキシン系植物ホルモンを実質的に加えないことが好ましく、感染培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、具体的には、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１０６】
感染培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加える場合の、感染培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。特に好ましくは０．８ｍｇ／Ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは７．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下である。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、５．０ｍｇ／Ｌである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、０．８〜１．２ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、１．０ｍｇ／Ｌである。
【０１０７】
感染培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１０８】
シュートがアグロバクテリウムに感染しやすくなるという理由から、感染培地は更にアセトシリンゴンを含むアセトシリンゴン含有培地であることも好ましい形態の１つである。感染培地にアセトシリンゴンを加える場合の、感染培地中のアセトシリンゴン濃度としては、好ましくは１〜５００μＭ、より好ましくは１０〜４００μＭ、更に好ましくは５０〜２５０μＭである。
【０１０９】
感染培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．０がより好ましい。感染させる温度（感染培地の温度）は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましく、２２〜３０℃が更に好ましく、２８℃が最も好ましい。感染工程は、暗所で行っても明所で行ってもよい。
【０１１０】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがサイトカイニン系植物ホルモン（特に、ベンジルアデニン）で、その濃度が４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであり、培養温度が２２〜３０℃であることが特に好ましい。
【０１１１】
以上のように、感染工程では、例えば、アグロバクテリウム属菌調製工程により得られたアグロバクテリウム属菌を液体の感染培地中に懸濁させ、該懸濁液中に、誘導工程により形成されたシュート、又は、増殖工程により形成されたシュートを浸漬させることにより、シュートにアグロバクテリウム属菌を感染させることができる。そして、浸漬後、懸濁液と、シュートをろ紙等で分離し、分離したシュートは、次の共存培養工程に供される。すなわち、上記感染工程を含む形質転換工程では、感染工程に続いて、共存培養工程が行われる。
【０１１２】
（共存培養工程）
共存培養工程では、感染工程により得られたシュート（アグロバクテリウム属菌が感染したシュート）を共存培養培地中で培養する。これにより、感染によりシュートに導入された標的遺伝子等の遺伝子断片が、植物細胞の遺伝子中に組み込まれ、安定した形質転換シュートを得ることができる。
【０１１３】
なお、共存培養培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、安定した形質転換シュートを得ることができるため、固体培養が好ましい。また、共存培養培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよいし、振とう培養を行ってもよい。
【０１１４】
共存培養培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に必要に応じて植物生長ホルモン、炭素源を加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地が好ましく、ＭＳ培地又はその組成に変更を加えたＭＳ改変培地がより好ましい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に用いられる。
また、共存培養培地は、上記誘導培地同様、更に、硝酸銀を含むことが好ましい。
【０１１５】
好適な共存培養培地の組成は、植物種により異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の組成である。
【０１１６】
共存培養培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上、特に好ましくは３質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。
【０１１７】
共存培養培地にオーキシン系植物ホルモンを実質的に加えないことが好ましく、共存培養培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、具体的には、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１１８】
共存培養培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加える場合の、共存培養培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。特に好ましくは０．８ｍｇ／Ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは７．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下である。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、５．０ｍｇ／Ｌである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、０．８〜１．２ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、１．０ｍｇ／Ｌである。
【０１１９】
共存培養培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１２０】
安定した形質転換シュートがより得やすくなるという理由から、共存培養培地は更にアセトシリンゴンを含むアセトシリンゴン含有培地であることが好ましい。共存培養培地中のアセトシリンゴン濃度としては、好ましくは１〜５００μＭ、より好ましくは１０〜４００μＭ、更に好ましくは５０〜２５０μＭである。
【０１２１】
共存培養培地を固体培地とする場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。
【０１２２】
固体培地の場合、共存培養培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。
【０１２３】
共存培養培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．０がより好ましい。
【０１２４】
培養温度は、０〜４０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、２０〜２８℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、暗所で培養を行うことが好ましく、暗所の照度は、０〜０．１ｌｘが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、２〜４日間培養することが好ましい。
【０１２５】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがサイトカイニン系植物ホルモン（特に、ベンジルアデニン）で、その濃度が４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであり、培養温度が２０〜２８℃であることが特に好ましい。
【０１２６】
以上のように、共存培養工程では、感染工程により得られたシュート（アグロバクテリウム属菌が感染したシュート）を上記共存培養培地中で培養することにより、感染によりシュートに導入された標的遺伝子等の遺伝子断片が、植物細胞の遺伝子中に組み込まれ、安定した形質転換シュートを得ることができる。この共存培養工程により得られたシュート（形質転換されたシュートと、形質転換されていないシュートの混合物）は、先ず、次の除菌工程に供され、その後、次の選択培養工程に供されることが好ましい。
【０１２７】
（除菌工程）
除菌工程は、アグロバクテリウム法において一般的に行われている手法で行うことができる。この工程により、共存培養工程により得られるシュートとともに存在するアグロバクテリウム属菌を除菌することができる。
【０１２８】
除菌工程は、共存培養工程により得られるシュート（形質転換されたシュートと、形質転換されていないシュートの混合物）とともに存在するアグロバクテリウム属菌を除菌し、除くことができれば特に制限されないが、例えば、共存培養工程により得られたシュートを液体除菌培地で洗浄し、その後、除菌培地中で培養することによりアグロバクテリウム属菌を除菌することができる。具体的には、共存培養工程により得られたシュートを液体除菌培地中に浸漬させて洗浄し、浸漬後、液体除菌培地と上記シュートとをろ紙等で分離して、分離した当該シュートを除菌培地で培養することにより行うことができる。
なお、液体除菌培地に浸漬する際には、静置してもよいし、振とうしてもよい。また、液体除菌培地での洗浄は、１回行ってもよいし、複数回繰り返し行ってもよい。
【０１２９】
液体除菌培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に除菌剤を加え、必要に応じて植物生長ホルモン、炭素源を加えたものを使用すればよい。具体的には、上記感染培地と同様の培地に除菌剤を加えたものを好適に使用できる。
また、液体除菌培地は、上記感染培地同様、更に、硝酸銀を含むことが好ましい。
【０１３０】
上記除菌剤としては、アグロバクテリウム属菌を除菌することができればその種類は特に制限されないが、例えば、セフォタキシム、カルベニシリン、メロペネム三水和物等が挙げられる。
【０１３１】
液体除菌培地中の除菌剤の濃度としては、好ましくは５０ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１００ｍｇ／Ｌ以上であり、５０ｍｇ／Ｌ未満であると、アグロバクテリウム属菌を充分に除菌できないおそれがある。また、該除菌剤の濃度は、好ましくは８００ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは５００ｍｇ／Ｌ以下であり、８００ｍｇ／Ｌを超えると、除菌剤が高濃度過ぎて、アグロバクテリウム属菌のみならず、シュートの生存にまで悪影響が及ぶおそれがある。
【０１３２】
液体除菌培地での洗浄時間、すなわち、液体除菌培地とシュートとを接触させる時間は、０．５〜６０分が好ましく、１〜４０分がより好ましく、５〜３０分が更に好ましい。これにより、アグロバクテリウム属菌を充分に除菌することができる。なお、該洗浄時間は、例えば、液体除菌培地中に、シュートを浸漬させる場合、浸漬時間を意味する。
【０１３３】
好適な液体除菌培地の組成は、植物種により異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の組成である。
【０１３４】
液体除菌培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上、特に好ましくは３質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。
【０１３５】
液体除菌培地にオーキシン系植物ホルモンを実質的に加えないことが好ましく、液体除菌培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、具体的には、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１３６】
液体除菌培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加える場合の、液体除菌培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。特に好ましくは０．８ｍｇ／Ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは７．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下である。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、５．０ｍｇ／Ｌである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、０．８〜１．２ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、１．０ｍｇ／Ｌである。
【０１３７】
液体除菌培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１３８】
液体除菌培地のｐＨは、特に限定されないが、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．０がより好ましい。除菌温度（液体除菌培地の温度）は、０〜４０℃が好ましく、２０〜３６℃がより好ましく、２２〜３０℃が更に好ましく、２４〜２８℃が特に好ましい。
【０１３９】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがサイトカイニン系植物ホルモン（特に、ベンジルアデニン）で、その濃度が４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであり、除菌剤（特に、セフォタキシム）を濃度１００〜５００ｍｇ／Ｌで含むことが特に好ましい。
【０１４０】
除菌工程は、共存培養工程により得られたシュートを液体除菌培地で洗浄した後、液体除菌培地と上記シュートとをろ紙等で分離して、分離した当該シュートを除菌培地で培養する。
【０１４１】
上記除菌培地は、液体であってもよいし固体であってもよいが、培地上に置床して培養することで、より効果的に除菌することができるため、固体培養が好ましい。また、除菌培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよいし、振とう培養を行ってもよい。
【０１４２】
除菌培地としては、上記液体除菌培地と同様のものを用いることができる。ただし、除菌培地における除菌剤の濃度は、５０ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、１００ｍｇ／Ｌ以上がより好ましい。５０ｍｇ／Ｌ未満であると、アグロバクテリウム属菌を充分に除菌できないおそれがある。また、該除菌剤の濃度は、４００ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、３００ｍｇ／Ｌ以下がより好ましい。４００ｍｇ／Ｌを超えると、除菌剤が高濃度過ぎて、アグロバクテリウム属菌のみならず、シュートの生存にまで悪影響が及ぶおそれがある。
【０１４３】
除菌培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【０１４４】
除菌培地が固体培地の場合、除菌培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。
【０１４５】
除菌培地中での培養は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４〜１６時間の明時間という条件などが挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましく、３〜５週間がより好ましい。そして、１〜４週間おきに再度液体除菌培地での洗浄を行い継代培養することが好ましい。
【０１４６】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがサイトカイニン系植物ホルモン（特に、ベンジルアデニン）で、その濃度が４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであり、除菌剤（特に、セフォタキシム）を濃度１００〜３００ｍｇ／Ｌで含み、培養温度が２５〜３５℃であることが特に好ましい。
【０１４７】
（選択培養工程）
選択培養工程は、アグロバクテリウム法において一般的に行われている手法で行うことができる。この工程により、形質転換されたシュートと、形質転換されていないシュートを選別することができる。
【０１４８】
選択培養工程では、上記除菌工程で除菌されたシュートを選択培養培地中で培養する。選択培養工程の培養条件は、形質転換シュート（標的遺伝子を獲得したシュート）が選択的に生育できる条件であれば、特に限定されない。
【０１４９】
なお、選択培養培地は、液体であっても固体であってもよい。また、選択培養培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１５０】
選択培養培地としては、上述の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に、選択マーカー遺伝子に対応する選択試薬を加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に上記選択試薬を加えたものが好ましく、ＭＳ培地に上記選択試薬を加えたものがより好ましい。なお、必要に応じて、植物生長ホルモン、炭素源を加えてもよい。植物生長ホルモン、炭素源としては、上記誘導培地と同様のものが好適に使用できる。また、選択培養培地は、上記誘導培地同様、更に、硝酸銀を含むことが好ましい。
【０１５１】
上記選択マーカー遺伝子に対応する選択試薬としては、特に限定されないが、当業者であれば、使用した選択マーカー遺伝子に応じて適宜選択することができる。例えば、上記選択マーカー遺伝子として、グリフォサート耐性遺伝子を使用した場合にはグリフォサートを培地に添加し、カナマイシン耐性遺伝子を使用した場合にはカナマイシンを培地に添加し、また、ハイグロマイシン耐性遺伝子を使用した場合にはハイグロマイシンを培地に添加して、シュート（除菌工程で除菌されたシュート（形質転換されたシュートと、形質転換されていないシュートの混合物））を培養することにより、形質転換されたシュートは、標的遺伝子と共にグリフォサート耐性遺伝子も導入されているため当該培地中で生育することができるが、形質転換されていないシュートは、当該培地中で生育することがない。このように、上記選択マーカー遺伝子に対応する選択試薬を加えた培地で、形質転換されたシュートと、形質転換されていないシュートの混合物を培養することにより、形質転換されたシュートを選択的に生育させることができる。すなわち、本発明の製造方法が、更に、上記選択試薬を含む選択培養培地で培養して、上記形質転換工程により形質転換された組織片を選択する選択培養工程を含むこともまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
【０１５２】
選択培養培地中の選択試薬の濃度としては、好ましくは０．０１ｍＭ以上、より好ましくは０．０５ｍＭ以上であり、０．０１ｍＭ未満であると、形質転換されていないシュートの生育を充分に阻害することができずに、形質転換されたシュートを選択的に生育させることができないおそれがある。また、該選択試薬の濃度は、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは５ｍＭ以下、更に好ましくは３ｍＭ以下である。１０ｍＭを超えて選択試薬を添加しても、形質転換されたシュートの選択性に大きな影響はなく不経済となる場合がある。このように、選択培養培地中の選択試薬の濃度が、０．０１〜１０ｍＭである形態もまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
【０１５３】
好適な選択培養培地の組成は、植物種により異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の組成である。
【０１５４】
選択培養培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１質量％以上、更に好ましくは２質量％以上、特に好ましくは３質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは６質量％以下、更に好ましくは４質量％以下である。
【０１５５】
選択培養培地にオーキシン系植物ホルモンを実質的に加えないことが好ましく、選択培養培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、具体的には、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１５６】
選択培養培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加える場合の、選択培養培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。特に好ましくは０．８ｍｇ／Ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは７．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下である。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、５．０ｍｇ／Ｌである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、０．８〜１．２ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、１．０ｍｇ／Ｌである。
【０１５７】
選択培養培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１５８】
選択培養培地が固体培地の場合、上記誘導培地の場合と同様に、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【０１５９】
選択培養培地が固体培地の場合、選択培養培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。
【０１６０】
選択培養培地のｐＨは、特に限定されないが、５．０〜７．０が好ましく、５．６〜６．５がより好ましい。
【０１６１】
選択培養培地中での培養は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４〜１６時間の明時間という条件などが挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましく、３〜５週間がより好ましい。そして、１〜４週間おきに継代培養することが好ましい。
【０１６２】
選択培養工程は、１回行ってもよいし、複数回繰り返し行ってもよい。なお、複数回繰り返し選択培養工程を実施する場合の、選択培養培地中の選択試薬の濃度は、毎回同一であってもよいし、少なくとも１回異なるものであってもよい。なかでも、より選択的に形質転換されたシュートを選別することができることから、複数回繰り返し選択培養工程を行い、その際、選択培養培地中の選択試薬の濃度を段階的に上げていく形態も好ましい形態の１つである。
【０１６３】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがサイトカイニン系植物ホルモン（特に、ベンジルアデニン）で、その濃度が４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであり、選択試薬（例えば、グリフォサート）を濃度０．０５〜１ｍＭで含み、培養温度が２５〜３５℃であることが特に好ましい。
【０１６４】
以上のように、選択培養工程では、共存培養工程により得られ、除菌工程で除菌されたシュート（形質転換されたシュートと、形質転換されていないシュートの混合物）を、選択培養培地中で培養することにより、形質転換されたシュートを選択的に生育させることができ、形質転換されたシュートと、形質転換されていないシュートを選別することができる。この選択培養工程により選別された形質転換シュートは、次の再生工程に供される。
また、このようにして選別された形質転換シュートを上述の増殖工程に供すれば、標的遺伝子等の導入された形質転換シュートを大量に増殖させることも可能である。
なお、上記選別された形質転換シュートが実際に形質転換されているかは、当該シュートからＤＮＡ抽出を行い、標的遺伝子等が導入されているかをＰＣＲ分析により分析する、といった従来公知の方法により確認することができる。
【０１６５】
（再生工程）
再生工程では、形質転換工程により形質転換された組織片、より好ましくは、選択培養工程により選別された形質転換組織片、から植物体を再生する。
【０１６６】
上記再生方法としては、形質転換された組織片から植物体を再生できれば特に制限されないが、例えば、形質転換された組織片を発根誘導培地で培養して発根させる発根工程に供することで植物体を再生することができる。そして更には、該発根工程により発根した組織片を栽培用土に移植して馴化させることで、より大きく生育させることが可能となる。このように、上記再生工程が、形質転換された組織片を発根誘導培地で培養して発根させる発根工程を含む形態もまた、本発明の好適な実施形態の１つである。
以下、発根工程について説明する。
【０１６７】
（発根工程）
発根工程では、形質転換された組織片を発根誘導培地で培養することにより発根させる。ここで、形質転換された組織片としては、上記形質転換工程により形質転換された組織片（シュート）、より好ましくは、上記選択培養工程により選別された形質転換組織片（シュート）が使用される。
【０１６８】
発根誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地にシュートを差し込んで培養することで発根させやすくなるため、固体培養が好ましい。また、発根誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１６９】
発根誘導培地は、植物生長ホルモン及び炭素源を含むものであるが、該植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。中でも、オーキシン系植物ホルモンを用いることが好ましい。
【０１７０】
オーキシン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるオーキシン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸が好ましく、インドール−３−酪酸がより好ましい。
【０１７１】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるサイトカイニン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましい。
【０１７２】
発根誘導培地に用いられる炭素源としては、特に限定されず、上記誘導培地に用いられる炭素源と同様のものを用いることができるが、なかでもスクロースが好ましい。
【０１７３】
発根誘導培地は、上記誘導培地同様、更に、硝酸銀を含むことが好ましい。
【０１７４】
発根誘導培地としては、上記誘導培地として用いられる基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地を用いることができるが、なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地が好ましく、ＭＳ培地又はその組成に変更を加えたＭＳ改変培地がより好ましい。
【０１７５】
発根誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【０１７６】
好適な発根誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、パラゴムノキの場合は）以下の組成である。
【０１７７】
発根誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１．０質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５．０質量％以下である。
【０１７８】
発根誘導培地にオーキシン系植物ホルモンを加える場合の、発根誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１７９】
発根誘導培地にサイトカイニン系植物ホルモンを実質的に加えないことが好ましく、具体的には、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１８０】
発根誘導培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１８１】
発根誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．５〜６．０が更に好ましい。
【０１８２】
発根工程は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４〜１６時間の明時間という条件などが挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましく、４〜８週間がより好ましい。
【０１８３】
固体培地の場合、発根誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。
【０１８４】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがオーキシン系植物ホルモン（特に、インドール−３−酪酸）で、その濃度が３．０〜６．０ｍｇ／Ｌであり、培養温度が２５〜３５℃であることが特に好ましい。
【０１８５】
以上のように、形質転換されたシュートを上記発根誘導培地で培養することにより、発根させることが可能であり、発根させたシュートが得られ、完全な植物体であるクローン苗が形成される。
なお、上記形成されたクローン苗を用いて、上述した増殖工程を繰り返し実施することにより、優良品種のクローン苗を大量に生産することも可能である。
【０１８６】
以上の説明の通り、本発明では、標的植物由来の組織片を培養して培養組織片を得、得られた培養組織片を遺伝子コンストラクトで形質転換し、形質転換された組織片から植物体を再生することができ、これにより、遺伝的に改変された遺伝子導入植物を短期間で効率的に得ることができる。このように、本発明の遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法により作製された、遺伝的に改変された形質転換植物体もまた、本発明の１つである。
【０１８７】
まとめとして、本発明の遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法の一例について、標的植物としてパラゴムノキを用いた場合を例に、一連の工程の流れを説明する。まず、パラゴムノキの成木から腋芽を含む組織を採取し、誘導培地で培養して、シュートを形成させ（誘導工程）、形成させたシュートを伸長培地で培養し（伸長工程）、伸長させたシュートを採取し、分割した後、該分割されたシュートを誘導培地で培養してシュートを形成させ（増殖工程）、形成させたシュートを遺伝子コンストラクトで形質転換し（形質転換工程）、形質転換されたシュートを発根誘導培地で培養して発根、成長させる（発根工程）。
【０１８８】
このように、本発明の遺伝的に改変された植物体を作製するための形質転換植物体の製造方法は、短期間で効率的に、遺伝的に改変された遺伝子導入植物（形質転換植物）を得ることができる方法であることから、標的植物としてパラゴムノキを用いることで、イソプレノイドの産業利用上、パラゴムノキ由来の天然ゴムの可能性を広げることができる。また、パラゴムノキをはじめとしたイソプレノイド産生植物の大量培養、分子育種に貢献することができる。
【実施例】
【０１８９】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【０１９０】
以下、実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＢＡ：ベンジルアデニン
ＩＢＡ：インドール−３−酪酸
硝酸銀：メルク社製の硝酸銀
アガー：フルカ（ＦＬＵＫＡ）社製のアガー（Ａｇａｒ）（パウダー）
アセトシリンゴン：東京化成工業社製の４−ヒドロキシ−３′，５′−ジメトキシアセトフェノン
セフォタキシム：ＵＴＯＰＩＡＮ社製のセフォタキシム（ＣＥＦＯＸ（商品名））
グリフォサート：ＡＬＤＲＩＣＨ社製のグリフォサート（Ｎ−（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ〔Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン〕）
アグロバクテリウム：ＥＨＡ１０５株
パラゴムノキ：プリンス・オブ・ソンクラ大学内に自生しているパラゴムノキ
【０１９１】
（実施例１）
＜誘導工程＞
パラゴムノキの成木、苗木から節、腋芽、頂芽を含む組織を採取した。また、パラゴムノキの種子を試験管内で無菌的に発芽させて培養した実生苗（無菌実生苗）から節、腋芽、頂芽を含む組織を採取した。
次に、成木、苗木から採取した節、腋芽、頂芽を含む組織を流水で洗浄し、更に７０質量％エタノールで洗浄した後、約５〜１０体積％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム水溶液で滅菌し、滅菌水で洗浄した。
【０１９２】
次に、滅菌した組織及び無菌実生苗由来の組織をまとめて誘導培地（固体培地）に差し込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、ベンジルアデニン（ＢＡ）、硝酸銀、活性炭、スクロースをそれぞれ、５．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、０．０５質量％、３．０質量％添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、アガーを０．７５質量％となるように添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０１９３】
パラゴムノキの上記組織を誘導培地（固体培地）に差し込み、培養温度２８℃、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１６時間の明時間という条件で４週間培養し、シュートを誘導した。良好にシュートが誘導され、シュートや多芽体の形成が見られた。形成されたシュート、多芽体については４週間ごとに同じ組成の誘導培地に移植する植え継ぎを行った。
引き続いて、植え継ぎにより３ｃｍ程度に成長したシュートを、節、腋芽や頂芽の部分を残して１〜２．５ｃｍに分割し、形質転換用の材料とした。実施例１における、形質転換用の材料とするシュートの様子を示す写真を図１に示す。
【０１９４】
＜アグロバクテリウム属菌調製工程＞
ＧＵＳ（βグルクロニダーゼ）遺伝子と共に選択マーカー遺伝子であるグリフォサート耐性遺伝子を挿入したバイナリーベクターを導入したアグロバクテリウム（アグロバクテリウム・ツメファシエンス；ＥＨＡ１０５株）をＹＥＢ培地中で培養温度２８℃、２４時間、振とう培養した。６００ｎｍで測定した吸光度（ＯＤ６００）＝約１．０になるまで培養し、遠心分離で集菌し、懸濁用溶液（５．０ｍｇ／ＬのＢＡ、３．０質量％のスクロース、１．０ｍｇ／Ｌの硝酸銀を添加したＭＳ液体培地）でＯＤ６００＝０．６になるように調整した。
【０１９５】
＜感染工程、共存培養工程＞
準備したアグロバクテリウム懸濁液２５ｍＬと、誘導工程で調製した形質転換用の材料（シュート）５本を５０ｍＬチューブに入れ、２８℃で３０分間穏やかに振とうした（感染工程）。振とう後、シュートを滅菌したろ紙上に置き、余分な懸濁液をよく除去した。当該シュートを共存培養培地（固体培地）に差し込み、培養温度２８℃、暗所（０．１ｌｘ未満の明るさ）で、３日間共存培養した（共存培養工程）。実施例１における、アグロバクテリウムに感染後のシュートの様子を示す写真を図２に示す。
共存培養培地は、ＭＳ培地に、ベンジルアデニン（ＢＡ）、硝酸銀、スクロース、アセトシリンゴンをそれぞれ、５．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０質量％、２００μＭ添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、アガーを０．７５質量％となるように添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０１９６】
＜除菌工程＞
共存培養させたシュートを取り出し、液体除菌培地（５．０ｍｇ／ＬのＢＡ、３．０質量％のスクロース、１．０ｍｇ／Ｌの硝酸銀、４００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを添加したＭＳ液体培地）に１０分間浸漬し、洗浄した。
洗浄後、シュートを滅菌したろ紙上に置き、余分な水気を拭き取った。当該シュートを除菌培地（固体培地）に差し込み、培養温度２８℃、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４時間の明時間という条件で４週間培養した（除菌工程）。なお、１週間ごとに同じ組成の除菌培地に移植する植え継ぎを行った。
除菌培地は、ＭＳ培地に、ベンジルアデニン（ＢＡ）、硝酸銀、スクロース、セフォタキシムをそれぞれ、５．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０質量％、２００ｍｇ／Ｌ添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、アガーを０．７５質量％となるように添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０１９７】
除菌培地での培養後のシュートの生存率を下記式により算出した。
（シュート生存率（％））＝｛（枯渇せずに生存が確認できたシュート数）／（除菌工程に供したシュート数）｝×１００
【０１９８】
実施例１におけるシュート生存率は、９５％であった。
【０１９９】
＜選択培養工程＞
除菌培地で培養したシュートを取り出し、当該シュートを選択培養培地（固体培地）に差し込み、遺伝子導入個体の選抜のために、培養温度２８℃、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４時間の明時間という条件で４週間培養した（選択培養工程）。なお、１週間ごとに同じ組成の選択培養培地に移植する植え継ぎを行った。
選択培養培地は、ＭＳ培地に、ベンジルアデニン（ＢＡ）、硝酸銀、スクロース、グリフォサートをそれぞれ、５．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０質量％、０．０５ｍＭ添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、アガーを０．７５質量％となるように添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０２００】
選択培養培地での培養後のシュートの生長確認率を下記式により算出した。
（シュート生長確認率（％））＝｛（新芽又は伸長等の生長が確認できたシュート数）／（選択培養工程に供したシュート数）｝×１００
【０２０１】
実施例１におけるシュート生長確認率は、７８％であった。このように、選択培養培地での培養後にシュートの生長が確認され、遺伝子が導入された個体を選抜することができた。選抜された遺伝子導入個体は更に同じ組成の選択培養培地に移植する植え継ぎを継続して培養し、シュートや多芽体を得た。
【０２０２】
＜発根工程＞
選択培養工程後、植え継ぎを継続して成長したシュートを発根誘導培地（固体培地）に差し込み、培養温度２８℃、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１６時間の明時間という条件で４週間培養した（発根工程）。４週間の培養後、発根が確認され、形質転換植物体が得られた。
発根誘導培地は、１／２ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、硝酸銀、スクロースをそれぞれ、５．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０質量％添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、アガーを０．７５質量％となるように添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【図１】
0006716876.tif 000002
【図２】
0006716876.tif 000003