(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）妊婦から得た羊水から胎児由来細胞を分離する段階と、
（ｂ）前記分離した胎児由来細胞をＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、セレニウムおよびアスコルビン酸含有培地で継代培養して、羊水内胎児由来間葉系幹細胞を収得する段階と、
（ｃ）前記収得された羊水内胎児由来間葉系幹細胞にナノグ（Ｎａｎｏｇ）を導入して、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を収得する段階と、
（ｄ）前記収得されたナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を無血清培地で１〜５日間培養して、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、基本線維芽細胞成長因子）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｗｎｔ７ａ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ７Ａ）およびＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）が含有されたコンディションド培地を製造する段階と、を含む、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞からｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡを含むヒト成長因子を生産する方法。
【請求項２】
前記段階（ｃ）で、ナノグは、レトロウイルスベクターを利用して導入するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）妊婦から得た羊水から胎児由来細胞を分離する段階と、
（ｂ）前記分離した胎児由来細胞をＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、セレニウムおよびアスコルビン酸含有培地で継代培養して、羊水内胎児由来間葉系幹細胞を収得する段階と、
（ｃ）前記収得された羊水内胎児由来間葉系幹細胞にナノグを導入して、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を収得する段階と、
（ｄ）前記収得されたナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を無血清培地で１〜５日間培養して、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、基本線維芽細胞成長因子）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｗｎｔ７ａ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ７Ａ）およびＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）が含有されたコンディションド培地を製造する段階と、
（ｅ）前記製造したコンディションド培地を有効成分として含む組成物を製造する段階と、を含む、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞から生産されたｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡが含有されたコンディションド培地を有効成分として含む育毛促進用組成物の製造方法。
【請求項４】
前記段階（ｃ）で、ナノグは、レトロウイルスベクターを利用して導入するものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡが含有されたコンディションド培地を有効成分として含む育毛促進用組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物を含む育毛促進用化粧料組成物。
【請求項７】
請求項５に記載の組成物を含む育毛促進用薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、逆分化因子ナノグ（Ｎａｎｏｇ）を過発現させた羊水内胎児由来間葉系幹細胞の培養液を有効成分として含む育毛促進用組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、身体内外の環境および刺激を介して身体を構成する各種細胞に分化できる能力を備えており、自家増殖能力を備えている細胞であって、初期胚芽から分離した胚芽幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ、ＥＳ細胞）、胚芽期の原始生殖細胞から分離した胚芽生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ、ＥＧ細胞）、および成体の骨髄から分離した多能性成体幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ、ＭＡＰＣ細胞）等３種がよく知られている。
【０００３】
成体幹細胞の一種類である骨髄に由来する間葉系幹細胞は、古くから使用されて来、多様な効果も立証された。また、最近、脂肪組織や他の組織から分離した細胞も、骨髄由来間葉系幹細胞と類似した特性があることが明らかにされている。
【０００４】
本発明者らは、妊婦や胎児から容易に分離可能な羊水に注目した。羊水を介して胎児の健康に対する様々な情報を調べる検査を行い、妊娠が始まる瞬間から出産直後まで母体に悪影響を与えることなく羊水を抽出することができる。検査に使用された羊水細胞は、検査後に廃棄するようになるが、患者の同意を得る場合、廃棄せずに研究用の目的で使用できるので、羊水細胞は、従来研究されてきた他の成体幹細胞に比べて容易に多量の細胞を獲得できるという長所を有する。
【０００５】
一方、ヒトの毛髪は、各々の独自の成長周期、すなわち成長期（Ａｎａｇｅｎ）→退行期→休止期→成長期の毛周期（ヘアサイクル）を有しているため、換毛なしに常に一定の毛髪の数を維持するようになる。しかし、ハゲ頭が進行されると、毛根に存在する毛乳頭が小さくなり、毛乳頭が小さくなると、髪の毛の太さも細くなり、同時に毛周期も短くなり、新しく生えてくる毛は、さらに細くなる。したがって、ハゲ頭が進行されると、髪の毛は綿毛に変わり、毛髪の成長周期は、さらに短くなって、少し育った後に抜けるようになる。ハゲ頭の最も大きい原因は、遺伝であり、ハゲ頭遺伝子の発現には、男性ホルモンであるテストステロンが関与すると知られている。遺伝的にハゲ頭でないとしても、老化、ストレスなどで脱毛現象が起こる場合も多い。老化による脱毛は、頭皮細胞の減少と頭皮脂肪質の蓄積量の増加による毛穴の閉鎖で酸素供給が減少し、そのため、毛穴の周囲の毛細血管が圧迫を受けて血液の循環が円滑に行われないことに原因があると知られている。また、ストレス、不規則な生活、環境汚染なども、脱毛現象を起こす原因であると考えられている。
【０００６】
ハゲ頭や脱毛現象で当事者が感じる精神的な苦痛は非常に大きいが、現在開発されて販売されている発毛剤は、ほとんど発毛効果が一時的または制限的であるため、ユーザの欲求を十分に満足させていない。ある程度効果が検証されて使用されている塗る発毛剤であるミノキシジルは、血管拡張作用によって、経口用であるプロペシアは、フィナステリドを主剤とする男性ホルモンの活性化抑制作用によって脱毛防止効果に優れた製剤として多く利用されている。しかし、前述した発毛剤は、脱毛の防止にはある程度の効果を示すが、発毛と関連した効果は微小である。すなわち、前記発毛剤を使用してから中断する時には、再び脱毛現象が起こるようになり、長期使用時には副作用のおそれが大きく、また、長期使用による費用問題もあるため、多くの患者が治療をあきらめているのが現況である。
【０００７】
これにより、本発明者らは、羊水内胎児由来間葉系幹細胞の生長および寿命を延長し、コンディションド培地の発毛効能を増進させることができる逆分化因子を発掘して、コンディションド培地のいかなる成分が発毛効能に有効であるかを明らかにした。また、本発明者らは、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験を通じて前記コンディションド培地組成物の毛髪の密度および発毛促進効果を確認することにより本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、ナノグ（Ｎａｎｏｇ）が過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞からヒト成長因子を生産する方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞から生産されたヒト成長因子が含有されたコンディションド培地を有効成分として含む育毛促進用組成物の製造方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞から生産されたヒト成長因子が含有されたコンディションド培地を有効成分として含む育毛促進用組成物、およびその化粧料組成物または薬学的組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明は、ナノグ（Ｎａｎｏｇ）が過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞からヒト成長因子を生産する方法を提供し、より具体的に、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞からｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡよりなる群から選択されたいずれか一つ以上のヒト成長因子を生産する方法を提供し、さらに具体的に、
（ａ）妊婦から得た羊水から胎児由来細胞を分離する段階と、
（ｂ）前記分離した胎児由来細胞をＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、セレニウムおよびアスコルビン酸含有培地で継代培養して、羊水内胎児由来間葉系幹細胞を収得する段階と、
（ｃ）前記収得された羊水内胎児由来間葉系幹細胞にナノグを導入して、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を収得する段階と、
（ｄ）前記収得されたナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を無血清培地で１〜５日間培養して、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、基本線維芽細胞成長因子）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｗｎｔ７ａ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ７Ａ）およびＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）よりなる群から選択されたいずれか一つ以上のヒト成長因子が含有されたコンディションド培地を製造する段階と、を含むナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞からｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡよりなる群から選択されたいずれか一つ以上のヒト成長因子を生産する方法を提供する。
【００１３】
前記段階（ａ）で、胎児由来細胞は、妊婦から得た羊水に含まれていてもよい。
【００１４】
本明細書において使用された用語「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）」とは、骨、軟骨、脂肪、骨髄間質、筋肉、神経などを作ることの元祖になる細胞であって、成人では、一般的に骨髄に留まっているが、臍帯血、末梢血液、その他組織などにも存在し、これらから収得できる細胞を意味する。妊婦から得た羊水には、胎児の体から出た様々な化学物質が含まれていて、人体にある大部分の細胞を生成することができ、その採取が容易である。また、羊水には、異種（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）形態の細胞が存在するが、そのうち、間葉系幹細胞の特徴である線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）のような形状を有する同種（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）の間葉系幹細胞が存在することを確認した。
【００１５】
本明細書において使用された用語「培地（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）」とは、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で羊水内胎児由来細胞の成長および生存を支持できるようにする培地を意味し、羊水内胎児由来細胞の培養に適切な当業界において使用される通常の培地を全部含む。培地および培養条件は、細胞の種類によって選択し得る。培養に使用される培地は、好ましくは、細胞培養最小培地（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｍｅｄｉｕｍ；ＣＣＭＭ）であって、一般的に炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。このような細胞培養最小培地には、例えば、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、αＭＥＭ（αＭｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ  Ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）およびＩＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）等がある。また、前記細胞培養最小培地は、ペニシリン、ストレプトマイシンまたはゲンタマイシン等の抗生剤を含むことができる。
【００１６】
前記段階（ｂ）で、羊水内胎児由来間葉系幹細胞は、羊水から分離した細胞をＦＢＳ、ｂＦＧＦ、セレニウムおよびアスコルビン酸を含有する基本培地で培養することにより収得することができ、好ましくは、ＦＢＳが含まれた低グルコースＤＭＥＭ培地にｂＦＧＦ、セレニウム、アスコルビン酸を添加して培養することにより収得することができ、より好ましくは、１０％ＦＢＳ低グルコースＤＭＥＭ培地にｂＦＧＦ  ４ｎｇ／ｍｌ、セレニウム５ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌ、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含んでいてもよいが、これらに限定されない。
【００１７】
前記段階（ｃ）で、ナノグは、レトロウイルスベクターを利用して導入するものであってもよく、好ましくは、ｐＭＸｓウイルスベクターが使用できるが、これに限定されない。
【００１８】
前記段階（ｃ）で、ナノグは、配列番号１で表示される塩基配列よりなる遺伝子であってもよく、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のナノグ遺伝子であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１９】
本発明の一実施例において、間葉系幹細胞にナノグを導入し培養する段階により間葉系幹細胞の成長および増殖が増加することを確認した。
【００２０】
本明細書において使用された用語「ナノグ（Ｎａｎｏｇ）」とは、逆分化因子であって、逆分化因子は、２００６年に山中教授チームにより導入された概念である逆分化（Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）から始まった。成体のすべての組織は、正常発達過程を経て、分化しない状態から少しずつ分化して各機能が専門化された細胞に変化する。そのうち受精卵の細胞は、全能性（Ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ）を有していて、その後、発達段階が進行されて、胚盤胞になると、内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ）細胞と外部細胞に区分が可能であり、内部細胞塊細胞は、胚芽体細胞と生殖細胞に発生し得、これを万能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）と呼ぶ。この内部細胞塊細胞は、胚芽幹細胞とも呼ばれ、万能性特異的遺伝子（逆分化因子）を発現するが、その代表的な例がＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ナノグ、Ｌｉｎ２８等である。逆分化は、体細胞にこのような万能性特異的遺伝子の発現を誘導して、胚芽幹細胞と類似した性質に戻す技術である。このような背景下で、本発明は、多様な逆分化因子のうちナノグを単独で使用し、その理由としては、（１）様々な外来遺伝子の導入時に細胞特性の変性のおそれ、（２）ウイルスを介した様々な因子の導入時に成功的な細胞株構築の困難、（３）各万能性特異的遺伝子を導入した後、細胞株の維持が持続する遺伝子を調査した結果、ナノグが単独導入された場合、持続的維持が可能な点（図１５参照）がある。
【００２１】
また、本発明は、前記段階（ｄ）により製造されたコンディションド培地、より具体的に、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を培養して製造したコンディションド培地、さらに具体的に、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を培養したｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、基本線維芽細胞成長因子）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｗｎｔ７ａ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ７Ａ）およびＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）よりなる群から選択されたいずれか一つ以上のヒト成長因子が含有されたコンディションド培地を提供することができる。
【００２２】
本明細書において使用された用語「コンディションド培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）」とは、細胞を液体懸濁培養して細胞分裂の最盛期である対数成長期に到達した時、分裂細胞を遠心分離または濾過して除去し、培養液のみを採取して、これを培養基質に混合した培地をいう。これは、分裂中の細胞から培地内で抽出されて出る未知の成長要素（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を利用するものであって、低密度の細胞プレーティングや原形質体の培養に多く用いられる。
【００２３】
前記段階（ｄ）により製造されたコンディションド培地は、胎児由来間葉系幹細胞を培養した培地から胎児由来間葉系幹細胞を除去した培地であって、胎児由来間葉系幹細胞に由来する成長因子などの物質が豊富に含有されている培地をいう。
【００２４】
また、本発明は、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を培養して製造したコンディションド培地を有効成分として含む育毛促進用組成物の製造方法を提供し、さらに具体的に、
（ａ）妊婦から得た羊水から胎児由来細胞を分離する段階と、
（ｂ）前記分離した胎児由来細胞をＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、セレニウムおよびアスコルビン酸含有培地で継代培養して、羊水内胎児由来間葉系幹細胞を収得する段階と、
（ｃ）前記収得された羊水内胎児由来間葉系幹細胞にナノグを導入して、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を収得する段階と、
（ｄ）前記収得されたナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を無血清培地で１〜５日間培養して、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、基本線維芽細胞成長因子）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｗｎｔ７ａ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ７Ａ）およびＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）よりなる群から選択されたいずれか一つ以上のヒト成長因子が含有されたコンディションド培地を製造する段階と、
（ｅ）前記製造したコンディションド培地を有効成分として含む組成物を製造する段階と、を含む、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞から生産されたｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡよりなる群から選択されたいずれか一つ以上のヒト成長因子が含有されたコンディションド培地を有効成分として含む育毛促進用組成物の製造方法を提供する。
【００２５】
本明細書において使用された用語「育毛促進」とは、毛髪成長効果および毛髪成長時期の促進による毛髪成長促進を意味する。
【００２６】
前記段階（ｄ）により製造されたコンディションド培地は、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）またはＷｎｔ７ａ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−ｔｙｐｅ  ＭＭＴＶ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ７Ａ）、およびこれらの２以上の組合せのヒト成長因子を含有することが好ましいが、これらに限定されない。前記ｂＦＧＦ（Ｄｕ  Ｃｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈａｉｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｌｔｏ．１０１：１０６Ｓ−１１３Ｓ、１９９３）、ＩＧＦ（Ｎｉｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．ＩＧＦ−Ｉ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｈａｉｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈａｉｒ  ｓｈａｆｔｓ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｌｔｏ  １２５：８７３−８８２、２００５）、ＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．ＰＤＧＦ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ４３（２）：１０５−１５、２００６）またはＷｎｔ７ａ（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｔｈｅ  ｈａｉｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ．Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４：１１９１−１１８５、２０００）は、毛髪成長を促進する成長因子であると知られている。
【００２７】
また、前記段階（ｄ）により製造されたコンディションド培地は、Ａｐｏ−１（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  １）／Ｆａｓ、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ；Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＰ−１０（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１０）、レプチン（Ｌｅｐｔｉｎ）、ＭＩＰ４（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４）、ＭＭＰ３（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ３）、ランテス（Ｒａｎｔｅｓ）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  γ）、ヒト形質転換成長因子β（ＴＧＦβ、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒｓ  α）、腫瘍壊死因子受容体Ｉ（ＴＮＦＲＩ、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉ）、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩ）、細胞接着分子１（ＩＣＡＭ１；Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１；ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １）、脈管内皮細胞成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）、インターロイキン−１受容体α（ＩＬ−１Ｒα、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  α）、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−６Ｒ、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５等の成長因子をさらに含んでいてもよいが、このような成長因子の毛髪成長促進効果は証明された前例がないものと知られている。
【００２８】
したがって、前記コンディションド培地を有効成分として含む育毛促進用組成物の製造方法を利用すると、毛髪成長効果があるものと知られているｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａ、ＰＤＦＧ−ＡＡ、またはこれらの２以上の組合せの成長因子の発現量が顕著に増加することにより、毛髪成長増進効果がさらに増大し得る。
【００２９】
本発明の一実施例において、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞から収得したコンディションド培地を処理したグループにおいて毛嚢組織がさらに多く生成され、組織的分析で成長期段階の区別時に成長期後期段階の形態を示すことを確認し、毛髪成長段階で多く発現するＡＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＬＥＦ、バーシカン（Ｖｅｒｓｉｃａｎ）およびＨｅｙのｍＲＮＡがさらに多く発現することを確認した。
【００３０】
また、本発明は、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地を有効成分として含む育毛促進用組成物、より具体的に、ナノグが過発現した羊水内胎児由来間葉系幹細胞から生産されたｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＦＧ−ＡＡよりなる群から選択されたいずれか一つ以上のヒト成長因子が含有されたコンディションド培地を有効成分として含む育毛促進用組成物、さらに具体的に、前記育毛促進用組成物の製造方法により製造された育毛促進用組成物を提供する。
【００３１】
本発明の一実施例において、ナノグが過発現した羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地は、培地内毛髪成長促進因子の発現量が顕著に増加し、これをマウスに処理した場合、速い毛髪成長を示して、育毛促進、毛髪再生および脱毛防止効果を確認した。
【００３２】
また、本発明は、前記育毛促進用組成物を含む育毛促進用化粧料組成物を提供する。
【００３３】
前記化粧料組成物は、育毛促進、毛髪再生および脱毛防止効果を有する毛髪化粧品に多様に用いられる。
【００３４】
前記化粧料組成物は、全体化粧料組成物１００重量部に対して０．００１〜１０重量部を含むことができる。
【００３５】
前記化粧料組成物は、脂肪物質、有機溶媒、溶解剤、濃縮剤、ゲル化剤、軟化剤、抗酸化剤、懸濁化剤、安定化剤、発泡剤、芳香剤、界面活性剤、水、イオン型または非イオン型乳化剤、充填剤、金属イオン封鎖剤、キレート化剤、保存剤、ビタミン、遮断剤、湿潤化剤、必須オイル、染料、顔料、親水性または親油性活性剤、脂質小胞または化粧品に通常使用される任意の他の成分のような化粧品学または皮膚科学分野において通常使用される補助剤を含有することができる。前記補助剤は、化粧品学または皮膚科学分野において一般的に使用される量で導入される。
【００３６】
前記化粧料組成物の外形は、化粧品学または皮膚科学的に許容可能な媒質または基剤を含有する。これは、局所適用に適合したすべての剤形であり、例えば、溶液、ゲル、固体、混練無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球またはイオン型（リポソーム）および非イオン型の小胞分散剤の形態で、またはクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレーまたはコンシーラースティックの形態で提供され得る。これらの組成物は、当該分野における通常の方法により製造され得る。本発明による組成物は、また、泡沫（フォーム）の形態で、または圧縮された推進剤をさらに含有するエアロゾル組成物の形態で使用され得る。
【００３７】
本発明の化粧料組成物は、その剤形において特に限定されるものではなく、例えば、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、パウダー、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディエッセンス、ヘアトニック、ヘアコンディショナー、ヘアエッセンス、ヘアローション、ヘア栄養ローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアトリートメント、ヘアクリーム、ヘア栄養クリーム、ヘアモイスチャークリーム、ヘアマッサージクリーム、ヘアワックス、ヘアエアロゾル、ヘアパック、ヘア栄養パック、ヘア石鹸、ヘアクレンジングフォーム、ヘアオイル、毛髪乾燥剤、毛髪保存処理剤、毛髪染色剤、毛髪用ウェーブ剤、毛髪脱色剤、ヘアジェル、ヘアグレーズ、ヘアドレッシング、ヘアラッカー、ヘアモイスチャライザー、ヘアムースまたはヘアスプレーなどの化粧品で剤形化され得る。
【００３８】
前述したような化粧料組成物は、皮膚に塗る形態で適用されてもよく、マイクロニードルなどを利用して皮膚内部に吸収される形態で適用されてもよい。
【００３９】
また、本発明は、前記育毛促進用組成物を含む育毛促進用薬学的組成物を提供する。
【００４０】
前記薬学的組成物は、育毛促進、毛髪再生および脱毛防止効果を有する毛髪化粧品に多様に利用され得る。
【００４１】
前記薬学的組成物は、全体薬学的組成物１００重量部に対して０．００１〜１０重量部を含むことができる。
【００４２】
前記薬学的組成物は、育毛促進用錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、注射剤、ジェル、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、パッチ、噴霧剤、クリーム、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラズマ剤の形態の薬学組成物で製造して使用できるが、これらに限定するものではない。
【００４３】
前記薬学的組成物を製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用され得る。坐剤の基剤としては、ウィテプソル（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。
【００４４】
前記薬学的組成物の投与形態は、これらの薬学的許容可能な塩、単独または他の薬学的活性化合物と結合だけでなく、適当な集合の形態で使用され得る。前記塩としては、薬学的に許容されるものであれば、特に限定されず、例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、スクシン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などが使用できる。
【００４５】
前記薬学的組成物は、目的に応じて非経口投与したり、経口投与することができ、一日に体重１ｋｇ当り０．１〜５００ｍｇ、１〜１００ｍｇの量で投与されるように、１〜数回に分けて投与することができる。特定の患者に対する投与用量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度などによって変化し得る。
【００４６】
前記薬学的組成物は、マウス、ラット、家畜、ヒトなどの哺乳動物に非経口、経口などの多様な経路で投与され得、投与のすべての方式は予想され得るが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射により投与され得る。
【００４７】
間葉系幹細胞のコンディションド培地の生産において、主な限界点は、幹細胞の老化と大きく関連がある。細胞の老化は、細胞成長の低調を誘発し、分泌する成長因子およびサイトカインの量を減少させ、細胞の死滅を引き起こす。また、細胞由来コンディションド培地の量および質的損失を誘発し、均一な組成を維持しにくくし、これは、結局、コンディションド培地およびこれを有効成分として含む組成物の大量生産および産業化時に困難を招く。これにより、本発明者らは、間葉系幹細胞の培養に逆分化技術を導入した。先行研究によれば、間葉系幹細胞で発現する万能性因子（Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒｓ）の発現によって幹細胞能の様相に変化が起こると知られている。これに着目して、羊水由来間葉系幹細胞に多様な万能性因子であるＯｃｔ４、ナノグ、Ｌｉｎ２８を導入し、そのうちナノグを導入した羊水由来間葉系幹細胞は、細胞株を確立可能であり、持続的な培養が可能であるのに対し、他の遺伝子の導入は、細胞死滅をもたらし、持続的な細胞培養が困難であることが分かった（図１５参照）。さらに、ナノグを導入した羊水幹細胞において細胞成長の増大および幹細胞能の保存効果が従来の羊水幹細胞より向上したことを確認した。
【００４８】
本発明の一実施例において、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞数は、羊水由来幹細胞に比べて顕著に多く（図４）、ナノグが羊水由来間葉系幹細胞の細胞成長の増進に肯定的な影響を及ぼすことを確認した。ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞は、羊水由来間葉系幹細胞よりβ−ガラクトシダーゼを少なく発現し（図５の左側）、ｐ５３およびｐ２１の発現量が減少した（図５の右側）。したがって、ナノグの導入によって羊水由来間葉系幹細胞の寿命延長効果があることを確認した。また、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞において万能性特異的マーカーＯｃｔ４およびＳｏｘ２の発現が向上し（図７）、ナノグの導入にも羊水由来間葉系幹細胞の幹細胞能が保存されることを確認した。
【００４９】
本発明の一実施例において、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞において毛髪成長を促進する成長因子であるｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）の発現が羊水由来間葉系幹細胞より増加したことを確認したので（図８および図９）、ナノグの導入によって羊水由来間葉系幹細胞において毛髪成長因子の分泌が促進されることを確認した。
【００５０】
本発明の一実施例において、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞から収得したコンディションド培地を処理したグループにおいて毛嚢組織がさらに多く生成されることを観察した（図１２）。また、組織的分析で成長期段階を区別した時、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地を処理したグループが成長期後期段階の形態を示すことを確認し（図１３）、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞がコンディションド培地を処理したグループにおいて毛髪成長段階で多く発現するＡＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＬＥＦ、バーシカンおよびＨｅｙのｍＲＮＡがさらに多く発現することを確認した（図１４）。したがって、ナノグを導入した羊水由来間葉系幹細胞コンディションド培地を適用する時、体外および体内で毛髪成長促進効果を示すことを確認した。
【発明の効果】
【００５１】
本発明は、羊水内胎児由来間葉系幹細胞に逆分化因子であるナノグを導入して過発現することにより、間葉系幹細胞の成長、幹細胞能、寿命を増大し、これから分泌される成長因子の発現を増大した。また、ナノグが導入された羊水内胎児由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地は、毛髪成長促進効果を示すので、育毛促進用化粧料組成物および薬学的組成物として活用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、羊水由来細胞を低グルコースＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ｂＦＧＦ、セレニウムおよびアスコルビン酸で培養する時、羊水由来間葉系幹細胞の成長が向上することを示す図である；ｂ：ｂＦＧＦ含有培地、ｂｖ：ｂＦＧＦおよびアスコルビン酸含有培地、ｂｓ：ｂＦＧＦおよびセレニウム含有培地、ｂｖｓ：ｂＦＧＦ、アスコルビン酸およびセレニウム含有培地。
【図２】図２は、従来羊水由来間葉系幹細胞とナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞の形態を示す図である；ノーマルＡＦ：羊水由来間葉系幹細胞、ＡＦ−ナノグ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞。
【図３】図３は、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞におけるナノグ過発現を確認したＲＴ−ＰＣＲ（左側）および免疫蛍光染色結果（右側）を示す図である；左側：ＡＦＳＣ：羊水由来間葉系幹細胞、ＡＦ−Ｎ  ＃１、＃２、＃３：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞、右側：ＡＦＳＣ：羊水由来間葉系幹細胞、ＡＦ−ナノグ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞。
【図４】図４は、羊水由来間葉系幹細胞とナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞株（＃１、＃２、＃３）の成長曲線を示す図である；ノーマルＡＦ：羊水由来間葉系幹細胞、ＡＦ−Ｎ  ＃１、＃２、＃３：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞。
【図５】図５は、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞（継代培養３５回後）のβ−ガラクトシダーゼ染色結果（左側）およびｐ５３、ｐ２１  ｍＲＮＡの発現量（右側）を示す図である；左側：ＡＦ−Ｎ  ＃１、＃２、＃３：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞、ノーマルＡＦ：羊水由来間葉系幹細胞、右側：ＡＦ：羊水由来間葉系幹細胞、ＡＦ−Ｎ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞、ＲＴ（−）：プライマー間のダイマー形成有無を把握可能な陰性対照群。
【図６】図６は、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞の特性が変性されないことを証明するために間葉系幹細胞特異的マーカー（フィブロネクチン、ＭＭＰ１、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ）の発現をＲＴ−ＰＣＲで確認した図である；ＡＦ−ｎｏｒｍａｌ：羊水由来間葉系幹細胞、ＡＦ−Ｎ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞。
【図７】図７は、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞における万能性遺伝子Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２の発現量を示す図である；ＡＦ：羊水由来間葉系幹細胞、ＡＦ−Ｎ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞。
【図８】図８は、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞における成長因子ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）の発現量を示す図である；ＡＦ：羊水由来間葉系幹細胞、ＡＦ−Ｎ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞。
【図９】図９は、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞における成長因子ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）の発現量を確認したウェスタンブロット（上）およびナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地内のｂＦＧＦおよびＰＤＧＦの発現量を確認したＥＬＩＳＡ（下）を示す図である；ＡＦ：羊水由来間葉系幹細胞、ＡＦ−Ｎ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞、ＡＦ  ＣＭ：羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地、ＡＦ−Ｎ  ＣＭ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地。
【図１０】図１０は、羊水由来間葉系幹細胞とナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞をそれぞれ培養したコンディションド培地を毛嚢細胞に処理した後の細胞成長率を示す図である；ＡＦ  ＣＭ：羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地、ＡＦ−Ｎ  ＣＭ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地、Ｍｉｎｏｘ（ミノキシジル、Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）：陽性対照群。
【図１１】図１１は、羊水由来間葉系幹細胞とナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞をそれぞれ培養したコンディションド培地を、毛を除去したマウスの背中の部分に処理した後に毛髪が生成される程度を確認した図である；ＡＦ−ＣＭ：羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地、ＡＦ−Ｎ−ＣＭ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地、Ｍｉｎｏｘ（ミノキシジル、Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）：陽性対照群。
【図１２】図１２は、羊水由来間葉系幹細胞とナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞をそれぞれ培養したコンディションド培地を処理したマウスの皮膚毛嚢組織に対するＨ＆Ｅ染色結果（上）および毛嚢の数（下）を示す図である；ＡＦ−ＣＭ：羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地、ＡＦ−Ｎ−ＣＭ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地。
【図１３】図１３は、羊水由来間葉系幹細胞とナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞をそれぞれ培養したコンディションド培地を処理したマウスの皮膚組織に対するＨ＆Ｅ染色結果を示す図である；ＡＦ−ＣＭ：羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地、ＡＦ−Ｎ−ＣＭ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地、Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ（ミノキシジル）：陽性対照群。
【図１４】図１４は、羊水由来間葉系幹細胞とナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞をそれぞれ培養したコンディションド培地を処理したマウスの皮膚組織で毛髪形成特異的マーカーであるＡＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＬＥＦ、バーシカンおよびＨｅｙ  ｍＲＮＡの発現量を示す図である；ＡＦ−ＣＭ：羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地、ＡＦ−Ｎ−ＣＭ：ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞を培養したコンディションド培地、Ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ（ミノキシジル）：陽性対照群、ＲＴ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）：プライマー間のダイマー形成の有無把握可能な陰性対照群。
【図１５】図１５は、羊水由来間葉系幹細胞に様々な万能性遺伝子を導入させた後に持続的な培養が可能であるかに関する実験を進めたものであり、写真は、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０）で４０倍率で撮影した図である；Ｏｃｔ４：Ｏｃｔ４単独導入、Ｎａｎｏｇ：Ｎａｎｏｇ単独導入、Ｌｉｎ２８：Ｌｉｎ２８単独導入、Ｏｃｔ４＋Ｌｉｎ２８：Ｏｃｔ４およびＬｉｎ２８導入、Ｏｃｔ４＋Ｎａｎｏｇ：Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ導入、Ｏ＋Ｎ＋Ｌ：Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８導入。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
以下、本発明の理解を助けるために実施例により詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は、当業界における平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【００５４】
＜実施例１＞羊水由来間葉系幹細胞分離および培養
妊婦から得た羊水内から分離した胎児由来細胞を１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン、ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、基本線維芽細胞成長因子）４ｎｇ／ｍｌ、セレニウム５ｎｇ／ｍｌ、アスコルビン酸５０μｇ／ｍｌが含まれた低グルコースＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）培地で継代培養して、羊水内胎児由来間葉系幹細胞を収得した。このような培地条件は、ｂＦＧＦ処理、ｂＦＧＦとセレニウム処理、ｂＦＧＦとアスコルビン酸処理条件よりさらに向上した羊水由来間葉系幹細胞成長効果を示す（図１）。
【００５５】
羊水由来間葉系幹細胞の成長効果は、２日または４日間培養した後に成長率を調査し、定量化は、クリスタルバイオレット染色（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いて進めた。クリスタルバイオレット染色技法は、細胞を同じ数で準備した後、２日または４日間隔で１０％ホルマリン固定（ｆｏｒｍａｌｉｎ  ｆｉｘａｔｉｏｎ）を進めた後、クリスタルバイオレット染色を２０分間進めた。これを１０％酢酸で脱色（ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ）して、酢酸の５９５ｎｍ吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）をＵｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２１００ｐｒｏ機器を利用して測定した後、定量分析した。
【００５６】
収得した羊水内胎児由来間葉系幹細胞は、上記と同じ条件のＤＭＥＭ培地で培養した。
【００５７】
＜実施例２＞ナノグが導入された羊水由来間葉系幹細胞の製造
レトロウイルスベクターシステム（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ）を利用して前記実施例１で収得した羊水由来間葉系幹細胞にナノグ遺伝子を導入してナノグの過発現を誘導することにより、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞株（＃１、＃２、＃３）を製造した（図２）。
【００５８】
具体的に、ｐＢＳ−Ｎａｎｏｇベクター（Ｙａｍａｎａｋａ  ｌａｂ’ｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｔｏｃｋ  ＃Ａ４、ＪＡＰＡＮ）で制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）を利用してナノグ遺伝子（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０２４８６５．３）（配列番号１）を分離した。分離したナノグ遺伝子をｐＭＸｓベクター（Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌａｂ、ＪＡＰＡＮ）にＴ４連結酵素（ｌｉｇａｓｅ）でライゲーションしてｐＭＸｓ−Ｎａｎｏｇを製作した。ｐＭＸｓ−Ｎａｎｏｇベクターを２９３ＧＰＧ細胞に形質導入試薬（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ）を利用して６時間形質導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。７２時間ナノグ遺伝子を有するウイルスを生産し、上清液を分離した後、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、該上清液を０．４５μｍのフィルタにフィルタリングした。このウイルスを８０％コンフルエンス状態の羊水由来間葉系幹細胞に６時間処理して、細胞内に感染（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた。
【００５９】
製造したナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞は、実施例１の培地で培養した時、持続的に且つ正常的に細胞が成長した。
【００６０】
＜実施例３＞ナノグが導入された羊水由来間葉系幹細胞のナノグ発現の検定
実施例２で製造したナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞株（＃１、＃２、＃３）でナノグの過発現が正確に起こっているかを確認するために、ナノグｍＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）および免疫蛍光染色（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。
【００６１】
ＲＴ−ＰＣＲ実行のために、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞をトリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を利用して製造者の指示に応じてトータルＲＮＡを分離した。分離したトータルＲＮＡ５００μｇをｃＤＮＡ製造ミックス（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を利用してｃＤＮＡで逆転写した。実験チューブを４５℃で６０分間静置した後、９５℃で５分間静置し、その後、使用時まで−２０℃で保管された。ｃＤＮＡは、Ｔａｑ合成酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）とナノグｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｅｘｏ−Ｎａｎｏｇ  ｆｏｗａｒｄ：５’−ＧＣＴＴＧＧＡＴＡＣＡＣＧＣＣＧＣ−３’（配列番号２）；およびＥｘｏ−Ｎａｎｏｇ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＡＴＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＧＴＧ−３’（配列番号３））を介して増幅された。ＲＴ−ＰＣＲは、９４℃で２０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で２分のサイクルを３５回繰り返した後、最終合成のために７２℃で１０分間進めた。ＰＣＲ結果物を１％アガロースゲルに電気泳動し、これを分析した。
【００６２】
免疫蛍光染色のために、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞をＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドで１時間固定した後、０．５％ＰＢＳＴ（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−１００添加されたＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ））で５分ずつ３回洗浄した。３％ウシ胎児血清が含まれたＰＢＳＴで１時間ブロッキングした後、ナノグ受容体を探知する抗体（ＡＦ２７６、Ｒ＆Ｄ）を１：５０の比率で１時間処理した。その後、０．５％ＰＢＳＴで５分ずつ３回洗浄し、蛍光標識２次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ、＃Ａ１１０１３、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を１：２００の比率で希釈して、１時間処理した。５分間核染色のためにＤＡＰＩ（４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）溶液を１：１０００で処理した後、上記と同一にＰＢＳＴで３回洗浄した。その後、サンプルを蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０）で撮ってイメージ化した。
【００６３】
その結果、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞がｍＲＮＡ水準での外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）ナノグ遺伝子の発現量とタンパク質水準でのナノグの発現量が羊水由来間葉系幹細胞より顕著に向上し、過発現したことを確認した（図３）。
【００６４】
＜実施例４＞ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞の細胞成長増進効果検定
実施例２で製造したナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞株（＃１、＃２、＃３）とナノグの導入なしに実施例１の培地で持続的に培養した羊水由来幹細胞の成長率を比較分析した。
【００６５】
実施例１の培地を利用して幹細胞を１３回継代培養すると同時に、それぞれの細胞株の細胞数を３日間隔でＣｏｕｎｔｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒ（ＭＡＲＩＥＮＦＥＬＤ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して測定し、比較した。
【００６６】
その結果、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞は、いずれも羊水由来幹細胞に比べて細胞数が顕著に多いことを確認した（図４）。これは、ナノグが羊水由来間葉系幹細胞の細胞成長の増進に肯定的な影響を及ぼすことを示唆した。
【００６７】
＜実施例５＞ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞の寿命延長効果検定
ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞の寿命実験を行うために、持続的な継代培養による細胞死滅程度をβ−ガラクトシダーゼ染色（β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）および細胞死滅に関連したタンパク質であるｐ５３およびｐ２１のｍＲＮＡ発現量で分析した。
【００６８】
β−ガラクトシダーゼ染色のために、実施例１の培地で３５回継代培養したナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞を６ウェルプレートに５×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルに分株し、一晩付着させた後、ＰＢＳで洗浄し固定した。β−ガラクトシダーゼ染色キット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）のプロトコルによってｐＨ６．０のＸ−ｇａｌ発色基質（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を３７℃で一晩培養した後、顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７０）で１００倍拡大して色の変化を確認した。
【００６９】
細胞死滅に関連したタンパク質であるｐ５３およびｐ２１のｍＲＮＡ発現量を測定するために、実施例３と同じ方法で３５回継代培養したナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞からトータルＲＮＡを抽出し、これからｃＤＮＡを増幅した。ｃＤＮＡは、Ｔａｑ合成酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）とｐ５３、ｐ２１およびＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｍＲＮＡにそれぞれ特異的なプライマーを通じて増幅された。ｐ５３特異的プライマーは、ｐ５３  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＡＣＴＧＧ−３’（配列番号４）およびｐ５３  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＡＴＧＧＣＧＧＧＡＧＧＴＡＧＡＣＴＧ−３’（配列番号５）を使用し、ｐ２１特異的プライマーは、ｐ２１  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＣＣＴＧＴ−３’（配列番号６）およびｐ２１  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＧＧＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧＣＧＧ−３’（配列番号７）を使用し、ＧＡＰＤＨ特異的プライマーは、ＧＡＰＤＨ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡ−３’（配列番号８）およびＧＡＰＤＧ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴ−３’（配列番号９）を使用した。ＰＣＲ結果物を１％アガロースゲルに電気泳動して、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを基準として相対的なｍＲＮＡ発現量をＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアを利用して定量化した。
【００７０】
その結果、ナノグ導入後、実施例１の培地で持続的に継代培養した羊水由来間葉系幹細胞が相対的にナノグを導入せず、実施例１と同じ培地で継続的に継代培養をした羊水由来間葉系幹細胞よりβ−ガラクトシダーゼを少なく発現し（図５の左側）、ｐ５３およびｐ２１の発現量が減少することを確認した（図５の右側）。したがって、ナノグの導入によって羊水由来間葉系幹細胞の寿命延長効果があることを確認した。
【００７１】
＜実施例６＞ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞の固有特性変化有無の確認
ナノグ導入による幹細胞固有の発現マーカーの発現変化が生じたか否かを確認するためにフィブロネクチン、ＭＭＰ１、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ発現様相をＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した。
【００７２】
ＲＴ−ＰＣＲは、実施例３と同じ方式でＲＮＡ抽出およびＰＣＲを進め、それぞれのプライマーは、次の通りである。フィブロネクチン特異的プライマーは、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＣＧＡＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴ−３’（配列番号１０）およびＦｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＡＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号１１）を使用し、ＭＭＰ１特異的プライマーは、ＭＭＰ１  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＴＧＡＧＡＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＴＣＴＧ−３’（配列番号１２）およびＭＭＰ１  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＣＧＣＡＡＣＡＣＧＡＴＧＴＡＡＧＴＴＧＴＡ−３’（配列番号１３）を使用し、Ｓｎａｉｌ特異的プライマーは、Ｓｎａｉｌ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＴＣＣＴＴＣＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＴＡＣＴＴ−３’（配列番号１４）およびＳｎａｉｌ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＴＴＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧ−３’（配列番号１５）を使用し、Ｓｌｕｇ特異的プライマーは、Ｓｌｕｇ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＣＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＡ−３’（配列番号１６）およびＳｌｕｇ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＴＧＴＣＡＴＴＴＧＧＣＴＴＣＧＧＡＧＴＧＡ−３’（配列番号１７）を使用した。
【００７３】
ＲＴ−ＰＣＲの結果によれば、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞は、羊水由来間葉系幹細胞と間葉系幹細胞特異的マーカーの発現に差異がないことを確認することができる（図６）。したがって、ナノグの導入は、羊水由来間葉系幹細胞の固有特性に大きい影響を及ぼさなかった。
【００７４】
＜実施例７＞ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞の万能性遺伝子発現の検定
多能性幹細胞は、万能性特異的マーカーであるＯｃｔ４およびＳｏｘ２が少量発現するものと知られている（Ｒｉｅｋｓｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ，ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ，ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｄｅｒｍｉｓ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐ  ５（４）：３７８−３８６．（２００９））。ナノグ導入による幹細胞の万能性遺伝子発現の有無を確認するために、実施例２で製造したナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞のＯｃｔ４およびＳｏｘ２  ｍＲＮＡ発現量をｑＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用して分析した。
【００７５】
ｑＲＴ−ＰＣＲは、上記のＲＴ−ＰＣＲ時に、ＲＮＡ  ｐｒｅｐと同一にＲＮＡを収得し、同一にｃＤＮＡを製作した。このように準備されたｃＤＮＡは、ＣＦＸ−９６  ＰＣＲシステムを用いてｑＲＴ−ＰＣＲを行い、ｃＤＮＡは、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２のｍＲＮＡに特異的なプライマーを利用して増幅した。Ｏｃｔ４特異的プライマーは、Ｏｃｔ４  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＡＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＡＧＧ−３’（配列番号１８）およびＯｃｔ４  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＴＴＣＣＣＴＣＣＡＡＣＣＡＧＴＴＧＣＣＣＣＡＡＡＣ−３’（配列番号１９）を使用し、Ｓｏｘ２特異的プライマーは、Ｓｏｘ２  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＣＣＡＡＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＣＡＣＧＣＡ−３’（配列番号２０）およびＳｏｘ２  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＣＡＡＡＣＴＴＣＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＴＡＣＣＧ−３’（配列番号２１）を使用した。標的ｍＲＮＡの相対的定量は、ＣＴ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）方法（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＭＲ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０００；２７８：１７５−１８４）で分析した。
【００７６】
その結果、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞において万能性特異的マーカーＯｃｔ４およびＳｏｘ２の発現がさらに向上することを確認した（図７）。したがって、ナノグの導入によって羊水由来間葉系幹細胞の万能性特異遺伝子の発現が増加した。
【００７７】
＜実施例８＞ナノグの過発現による羊水由来間葉系幹細胞の毛髪成長因子発現の検定
ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞における毛髪成長因子発現の有無を確認するために、毛髪に関連した成長因子であるｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＧＦ（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）のｍＲＮＡ発現量およびタンパク質の発現量をｑＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを利用して分析した。
【００７８】
ｑＲＴ−ＰＣＲは、実施例７と同じ方法で行い、ｃＤＮＡは、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡのｍＲＮＡに特異的なプライマーを利用して増幅した。ｂＦＧＦ特異的プライマーは、ｂＦＧＦ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＡＧＡＴＴＡＧＣＧＧＡＣＧＣＧＧＴＧＣ−３’（配列番号２２）およびｂＦＧＦ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＡＣＧＧＡＴＧＧＧＴＧＴＣＴＣＣＧＣ−３’（配列番号２３）を使用し、ＩＧＦ特異的プライマーは、ＩＧＦ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＣＡＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＧＣＡＴＣＴＣＴＴＣＴ−３’（配列番号２４）およびＩＧＦ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＣＣＡＴＡＣＣＣＴＧＴＧＧＧＣＴＴＧＴＴＧＡＡ−３’（配列番号２５）を使用し、Ｗｎｔ７ａ特異的プライマーは、Ｗｎｔ７ａ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＣＴＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＧＴ−３’（配列番号２６）およびＷｎｔ７ａ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＣＴＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＴＧＧＣＧＴＣＧ−３’（配列番号２７）を使用し、ＰＤＦＧ−ＡＡ特異的プライマーは、ＰＤＧＦ−ＡＡ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧＧＡＧＧＡＡＧＡＧＡＡ−３’（配列番号２８）およびＰＤＧＦ−ＡＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＧＣＡＣＴＴＧＡＣＡＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴ−３’（配列番号２９）を使用した。標的ｍＲＮＡの相対的定量は、ＣＴ方法で分析した。
【００７９】
ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡに対するウェスタンブロットを行うために、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で１００％飽和されるまで培養した後に収得し、細胞を破砕した後、タンパク質が含有された上清液３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）に展開して分離し、ニトロセルロース膜に移動して４％スキムミルクでブロッキングした。その後、膜に１次抗体として抗−ｂＦＧＦ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）、抗−ＩＧＦ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）、抗−Ｗｎｔ７ａ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）および抗−ＰＤＧＦ−ＡＡ抗体（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を処理して、４℃で一晩培養し、ＴＢＳＴ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０添加されたＴｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ））で洗浄した。２次抗体としてマウスおよびヤギ由来の抗−マウスＩｇＧ抗体（ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＵＳＡ）を１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含むＴＢＳＴと共に膜に処理し、１時間培養してウェスタンブロットを行った。発現の程度を比較するための対照群として、抗−α−チューブリン抗体（Ｒ＆Ｄ、ＵＳＡ）を１次抗体として使用して上記方法と同じ方法を行い、α−チューブリンの発現を確認した。
【００８０】
ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡタンパク質の分泌程度を調べるために、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞で生産されたコンディションド培地について酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙ）を行った。コンディションド培地内ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡＡタンパク質の量は、ＥＬＩＳＡキット（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してそれぞれのコンディションド培地内タンパク質の含量を確認した。ＥＬＩＳＡは、コンディションド培地を準備した後、ｓｔａｎｄａｒｄおよびサンプルにビオチン抗体を１時間処理した後、ストレプトアビジンを４５分間処理した。その後、３０分間ＴＭＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔを処理した後、ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えて反応を中止させた。結果は、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した後、定量分析した。
【００８１】
その結果、ナノグの導入後に、実施例１に該当する培地で３回継代培養した羊水由来間葉系幹細胞においてｂＦＧＦ、ＩＧＦ、Ｗｎｔ７ａおよびＰＤＧＦ−ＡＡの発現が、ナノグが導入されずに、同様に３回継代培養した羊水由来間葉系幹細胞より増加したことを確認し（図８）、それぞれのタンパク質の発現量は、図８の結果と同一であった（図９の上側）。また、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地が、羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地よりさらに多くの量のタンパク質を確認した（図９の下側）。したがって、ナノグの導入によって羊水由来間葉系幹細胞で毛髪成長因子の分泌が促進されることを確認した。
【００８２】
＜実施例９＞ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞の毛髪成長促進効果のインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）検定
ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地が実際に毛髪成長を促進するかをインビトロで確認した。
【００８３】
高グルコースＤＭＥＭ無血清培地で同じ羊水細胞の数から培養液を３日間取得して、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を進めた後、０．２５μｍのフィルタリングを通じてコンディションド培地を製造した。羊水由来間葉系幹細胞とナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞からそれぞれコンディションド培地を抽出した後、これを毛嚢細胞（ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ）に処理し、２日間隔の細胞の数をクリスタルバイオレット染色技法で相対的成長率を測定した。クリスタルバイオレット染色技法は、細胞を同じ数で準備した後、２日または４日間隔で１０％ホルマリン固定を進めた後、クリスタルバイオレット染色を２０分間進めた。その後、１０％酢酸で脱色して、酢酸の５９５ｎｍの吸光度をＵｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２１００ｐｒｏ機器を利用して測定した後、定量分析した。
【００８４】
その結果、羊水由来間葉系幹細胞に由来するコンディションド培地よりナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞に由来するコンディションド培地を処理したグループにおいて毛嚢細胞数がさらに多いことを確認した（図１０）。したがって、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地が毛嚢細胞の成長に影響を及ぼすことをインビトロで確認した。
【００８５】
＜実施例１０＞ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞の毛髪成長促進効果のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）検定
ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地が実際に毛髪成長を促進するかをインビボで確認した。
【００８６】
マウスの首部位から尻尾部位まで除毛ツールを利用して毛を全部除去した後、実施例１の培地で１５回継代培養したナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地を毎日５０μＬずつ処理し、毛髪成長の初期段階である成長期（背中の部位に茶色ないしは黒色の毛が生成される時期）に毛髪成長程度を分析した。陰性対照群は、羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地を毎日５０μＬずつ処理し、陽性対照群は、ミノキシジル（ｍｉｎｏｘ）１０ｕＭ／ｍｌを毎日５０μＬずつ処理した。
【００８７】
組織的分析のために、同じコンディションド培地を１０日間処理したマウスの皮膚組織を採取して、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンとエオシン）染色して分析した。
【００８８】
組織単位の発毛促進効能を遺伝子段階で確認するために、毛髪成長段階で多く発現する毛髪形成特異的マーカーであるＡＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、ＬＥＦ、バーシカンよびＨｅｙのｍＲＮＡ発現量をＲＴ−ＰＣＲで分析した。マウスの皮膚組織を採取して細胞を分離し、実施例３と同じ方法で細胞のトータルＲＮＡを分離してｃＤＮＡで逆転写し、ｃＤＮＡは、Ｔａｑ合成酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＡＬＰ、ＬＥＦ、バーシカンおよびＨｅｙのｍＲＮＡに特異的なプライマーを用いて増幅された。ＡＬＰ特異的プライマーは、ＡＬＰ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＴＧＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＡＧＡＣＧＴＡＣＡＡ−３’（配列番号３０）およびＡＬＰ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＧＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡ−３’（配列番号３１）を使用し、ＬＥＦ特異的プライマーは、ＬＥＦ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＴＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＣＧＡＧＴＣＴＧ−３’（配列番号３２）およびＬＥＦ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＴＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＧＴ−３’（配列番号３３）を使用し、バーシカン特異的プライマーは、Ｖｅｒｓｉｃａｎ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＡＡＣＴＡＧＣＣＧＴＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＴＣ−３’（配列番号３４）およびＶｅｒｓｉｃａｎ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＡＡＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＡ−３’（配列番号３５）を使用し、Ｈｅｙ特異的プライマーは、Ｈｅｙ  ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＣＣＧＧＡＴＣＡＡＴＡＡ−３’（配列番号３６）およびＨｅｙ  ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＴＣＣＣＧＡＡＡＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＧＡＰＣＲ−３’（配列番号３７）を使用した。結果物を１％アガロースゲルに電気泳動して、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを基準として相対的なｍＲＮＡ発現量をＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアを利用して定量化した。
【００８９】
その結果、外形的な側面で成長期が始まる時期の毛の色が有意な差異を示すことを確認し（図１１）、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞から収得したコンディションド培地を処理したグループにおいて毛嚢組織がさらに多く生成されることを観察した（図１２）。また、コンディションド培地処理５日目の組織的分析で成長期段階を区別したとき、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地を処理したグループが、成長期後期段階の形態を示すことを確認して、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地が、陽性対照群であるミノキシジル（ｍｉｎｏｘｉｄｉｌ）に比べて毛髪成長促進効果に優れていることを確認した（図１３）。また、ナノグ導入羊水由来間葉系幹細胞のコンディションド培地を処理したグループにおいてＡＬＰ、ＬＥＦ、バーシカンおよびＨｅｙがさらに多く発現することを確認した（図１４）。
【００９０】
＜比較例１＞ナノグでない他の万能性遺伝子を導入させた時の幹細胞培養効果の検定
羊水由来間葉系幹細胞にナノグでない他の万能性遺伝子を導入させた後、持続的な培養が可能であるかを確認するための実験を進めた。
【００９１】
具体的に、実施例１で収得した羊水由来間葉系幹細胞に多様な種類の万能性遺伝子を単独でまたは組み合わせて導入した。ナノグ遺伝子の導入は、実施例２で製作したｐＭＸｓ−Ｎａｎｏｇベクターを利用し、Ｏｃｔ４遺伝子（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００２７０１．５）の導入は、ｐＭＸｓ−ｈＯｃｔ３／４（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃１７２１７）ベクターを利用し、Ｌｉｎ２８遺伝子（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿０２４６７４．４）の導入は、ｐＭＸｓ−ｈＬｉｎ２８Ａ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｐｌａｓｍｉｄ  ＃４７９０２）ベクターを利用して実施例２と同じ方法で行った。複数の遺伝子の導入は、それぞれのウイルスを混合して細胞内に注入する方法を使用した。実験群は、１．Ｏｃｔ４単独導入群、２．Ｎａｎｏｇ単独導入群、３．Ｌｉｎ２８単独導入群、４．Ｏｃｔ４およびＬｉｎ２８組合せ導入群、５．Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ組合せ導入群、そして６．Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８組合せ導入群（Ｏ＋Ｎ＋Ｌ）の合計６種類の群を設定した。写真は、顕微鏡（Ｏｌｙｐｕｓ  ＤＰ７０）で４０倍率で撮影した。
【００９２】
その結果、羊水由来間葉系幹細胞は、ナノグを単独で導入した時以外には、持続的な成長が不可能であった（図１５）。
【００９３】
実施例による結果から、ナノグを導入した羊水由来間葉系幹細胞コンディションド培地を適用した時、体外および体内で毛髪成長促進効果を示すことを確認した。
【００９４】
＜製剤例１＞ヘアローションの製造
通常のヘアローションの製造方法によって、本発明のナノグを導入した羊水由来間葉系幹細胞コンディションド培地を有効成分として含むヘアローションを表１のように製造した。
【００９５】
【表１】
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【００９６】
＜製剤例２＞親水性軟膏剤の製造
通常の親水性軟膏剤の製造方法によって、本発明のナノグを導入した羊水由来間葉系幹細胞コンディションド培地を有効成分として含む親水性軟膏剤を表２のように製造した。
【００９７】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006756820.tif 000010
【図８】
0006756820.tif 000011
【図９】
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【図１０】
0006756820.tif 000013
【図１１】
0006756820.tif 000014
【図１２】
0006756820.tif 000015
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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