(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オートフォーカス光源と、
前記オートフォーカス光源からの光ビームを、光学機器の光路へと導く光学部品と、
前記光学機器の前記光路からオートフォーカスシステムへと返されるオートフォーカス光ビームを集光する集光レンズと、
光軸に沿った前記オートフォーカス光ビームの焦点の位置Ｚｄを検出するように構成されたオートフォーカス検出器と、
Ｚｄに応答して前記光学機器の焦点を調節するように構成されたオートフォーカス処理コンポーネントと
を備えており、
前記オートフォーカス検出器は、前記オートフォーカス光ビームを複数（ｎ個）の下流光ビームへと分割するように構成されたビームスプリッタと、前記下流光ビームの各々の強度を記録するための光検出器装置とを備え、前記下流光ビームは、前記集光レンズから前記光検出器装置まで測定される光路長が異なっており、
前記ビームスプリッタは、第１および第２の反対向きの面を有する所定の厚さの光学的に透明な材料で作られた平坦なウインドウであり、両方の面は部分反射であり、前記ウインドウは、複数の部分内部反射ならびに前記第１および第２の面から出る複数の下流光ビームを生むように、前記オートフォーカス光ビームに対して斜めに配置されている、オートフォーカスサブシステム。
【請求項２】
前記異なる光路長は、オートフォーカス検出範囲にわたっている、請求項１に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項３】
前記光検出器装置は、各々が前記ビームスプリッタに対する異なる距離に配置された複数の光検出器素子を備える、請求項１に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項４】
前記光検出器装置は、所定の光検出器平面に配置された光検出器のアレイである、請求項１に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項５】
前記光検出器のアレイは、２ｎ個よりも多くの光検出器を有する線形アレイである、請求項４に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項６】
前記光検出器のアレイは、２ｎ個よりも多くの光検出器を有する２次元アレイである、請求項４に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項７】
前記光検出器のアレイは、２次元イメージセンサである、請求項４に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項８】
前記ビームスプリッタは、所定の光検出器平面に対する異なる経路長に前記複数の下流光ビームを生成するように構成された１つ以上の光学要素で構成される、請求項３に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項９】
前記光学要素のうちの１つ以上は、１つ以上の部分反射界面を備える、請求項８に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項１０】
前記オートフォーカス処理コンポーネントは、各々の下流光ビームについて記録された強度から、最大強度に対応するＺｄ位置を計算するように構成されている、請求項１に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項１１】
前記オートフォーカス処理コンポーネントは、前記光学機器の対物レンズからオートフォーカス光を後方反射させる前記光路上の地点までの前記光学機器の光軸に沿った計算による対応する距離と、前記光学機器の前記対物レンズからオートフォーカス光を後方反射させる前記光路上の前記地点までの前記光学機器の光軸に沿った所望の距離とから、光軸補正Δｚを計算し、前記光軸補正Δｚを前記光学機器の電気機械式の構成要素へと伝達することにより、前記光学機器の前記対物レンズからオートフォーカス光を後方反射させる前記光路上の前記地点までの前記光学機器の光軸に沿った距離を、前記所望の距離に維持する、請求項１に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項１２】
前記光源は、レーザである、請求項１に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項１３】
前記オートフォーカスシステムは、前記光源からの光が前記光学機器の前記光学部品によってサンプル内の鋭い一点へと集光されることを防止するために、前記光源からの光をわずかに収束するオートフォーカスビームへと集光する追加の集光要素を含む、請求項１に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項１４】
前記オートフォーカスシステムは、前記光源からの光が前記光学機器の前記光学部品によってサンプル内の鋭い一点へと集光されることを防止するために、前記光源からの光をわずかに発散するオートフォーカスビームへと集光する追加の集光要素を含む、請求項１に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項１５】
前記光源によって発せられた光は、リング開口を通過する、請求項１に記載のオートフォーカスサブシステム。
【請求項１６】
請求項１に記載のオートフォーカスサブシステムを備える顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学機器に関し、とくには、対物レンズと画像化対象の上、内部、または近傍の点または表面との間の光軸に沿った一定の距離を維持する光学機器における連続非同期動作オートフォーカスサブシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡法および他の光学に基づく方法は、何百年にもわたって、科学研究から戦争までの人間の活動の多くの領域において利用されてきたが、マイクロプロセッサ、最新のコンピュータの利用、および分子生物学の出現が、新たな光学機器および光学撮像技術の開発をますます加速させている。例えば、生細胞内のタンパク質への蛍光タグの使用が、最新の蛍光顕微鏡装置に組み込まれた計算設備との組み合わせにおいて、生細胞の生物学的要素の細かな詳細を、光学顕微鏡法のいわゆる「回折限界」よりも大幅に低い分解能で画像化することを可能にしている。
【０００３】
多くの新たな光学機器、光学機器の応用、および光学撮像技術は、長時間にわたり、さらには／あるいは光学ｚ軸に直交するｘ−ｙ平面における撮像対象の走査の際に、浅い焦点深度の高出力の光学系の精密な焦点合わせに依存する。例として、比較的長時間にわたって生体サンプル内の弱い発光のフルオロフォアを画像化することによって回折限界を下回る分解能を達成する種々の光学顕微鏡技術、および生細胞および他の生体サンプルを走査し、これらのサンプル内の平面を、サンプルを一定のｚ位置を維持しながら顕微鏡の光路に対してｘ−ｙ平面内で平行移動させることによって画像化する光学顕微鏡技術が挙げられる。光学機器の焦点は、例えば、熱的および電気機械的な不安定性の結果として、時間とともに変化する可能性があり、たとえきわめて精密な電気機械式の顕微鏡ステージであっても、ステージがサンプルを走査し、あるいは或る時間にわたってサンプルからデータを収集しつつ、ｘ−ｙ平面内を平行移動させられるときに、結像光学系に対する距離が変動する可能性がある。精密光学機器の設計者、製造者、およびユーザは、高精度光学機器の焦点を、時間が経っても安定、かつ電気機械式のステージなどの高精度光学機器の種々のサブコンポーネントの動作中でも安定にするシステムおよび方法を、求め続けている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／０１３４２９４号明細書
【発明の概要】
【０００５】
本発明の実施形態は、光学機器内のオートフォーカスサブシステムであって、サンプルの上、内部、または近傍の特定の点または表面における正確かつ安定な光学機器の焦点を維持するために、光学機器の焦点を継続的に監視し、光軸に沿った光学機器内の距離を調節するオートフォーカスサブシステムに関する。本発明の特定の実施形態は、それらが組み込まれた光学機器の他の構成要素およびサブシステムの動作に関して非同期に動作する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】蛍光顕微鏡における光路を示している。
【図１Ｂ】蛍光顕微鏡における光路を示している。
【図１Ｃ】蛍光顕微鏡における光路を示している。
【図２Ａ】サンプル内の光軸に対する対物レンズの焦点の位置、すなわちｚ位置について、経時的な望ましくない変動を示している。
【図２Ｂ】サンプル内の光軸に対する対物レンズの焦点の位置、すなわちｚ位置について、サンプルのｘおよび／またはｙ方向の平行移動の際の望ましくない変動を示している。
【図３】顕微鏡の伝統的なオートフォーカスサブシステムを示している。
【図４】伝統的なオートフォーカスモジュールの動作を説明する制御フロー図を示している。
【図５】伝統的なオートフォーカスモジュールの動作を説明する制御フロー図を示している。
【図６】本発明の特定の実施形態の一態様を説明する制御フロー図を示している。
【図７Ａ】図１Ａ〜図１Ｃおよび図３を参照して上述した蛍光顕微鏡の電気機械式ステージから独立したｚ軸走査を示している。
【図７Ｂ】図１Ａ〜図１Ｃおよび図３を参照して上述した蛍光顕微鏡の電気機械式ステージから独立したｚ軸走査を示している。
【図７Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃおよび図３を参照して上述した蛍光顕微鏡の電気機械式ステージから独立したｚ軸走査を示している。
【図８】小開口焦点検出器の動作の原理を示している。
【図９Ａ】本発明によるオートフォーカスモジュールの実施形態を示している。
【図９Ｂ】本発明によるオートフォーカスモジュールの実施形態を示している。
【図１０】オートフォーカスモジュールの別の実施形態を示している。
【図１１Ａ】オートフォーカスモジュールのさらに別の実施形態を示している。
【図１１Ｂ】オートフォーカスモジュールのさらに別の実施形態を示している。
【図１２】本発明の一実施形態を表すオートフォーカスモジュールであって、やはり本発明の一実施形態を表す蛍光顕微鏡の光路に組み込まれたオートフォーカスモジュールを示している。
【図１３Ａ】オートフォーカスモジュールのさらに別の実施形態を示している。
【図１３Ｂ】オートフォーカスモジュールのさらに別の実施形態を示している。
【図１４】オートフォーカスモジュールの別の実施形態を示している。
【図１５】オートフォーカスモジュールの別の実施形態を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
図１Ａ〜図１Ｃが、蛍光顕微鏡における光路を示している。この光路および光路を含む蛍光顕微鏡は、本発明の一実施形態を説明するための背景として役立つ。しかしながら、以下でも述べられるように、本発明の方法およびシステムは、多くの場合には本発明の実施形態の種々のパラメータおよび構成を個々の用途における使用に合わせて調節することによって、幅広くさまざまな異なる種類の光学機器に組み込まれてよい。
【０００８】
蛍光顕微鏡の光路は、一般的には可視光またはＵＶ光レーザである励起光源１０２と、励起光１０６を１つ以上の対物レンズ１０８へと反射させるポリクロイックミラー１０４とを含み、対物レンズ１０８は、励起光を通過させる開口１１６を有する機械式ステージプラットフォーム１１４上に置かれたカバースリップ１１２の向こう側に位置するサンプル内の地点１１０へと励起光を集める。励起光は、サンプル内のフルオロフォアからの蛍光放射を刺激する。一般的には励起光の波長よりも長い波長を有するフルオロフォアからの放射光は、対物レンズ１０８を再び通過し、ポリクロイックミラー１０４を通って１つ以上のチューブレンズ１１８へと進み、チューブレンズ１１８は、フルオロフォアによって放射された光を多くの場合に電荷結合素子（「ＣＣＤ」）検出器である光検出器１２０へと集める。光検出器によって測定された空間的強度が、演算サブシステムによって電子的に処理され、電子メモリおよび大容量記憶装置に格納され、電子表示装置上での表示のためにレンダリングされる撮像対象の画像が生成される。
【０００９】
ポリクロイックミラー１０４は、励起光を含むより短い波長の光を反射し、赤外光などのきわめて長い波長の光も反射してよいが、フルオロフォアによって標識されたサンプル内のフルオロフォアによって放射される光の波長を含む波長範囲内の可視光に対しては透明である。同様に、さらに詳しくは後述されるように、励起光１０６の初期の経路上のダイクロイックミラー１２２は、比較的短い波長の励起光に対して透明であるが、より長い波長の赤外光を反射する。ステージプラットフォーム１１４、ステージ駆動コンポーネント１２４、ならびにｘ平行移動機構１２６、ｙ平行移動機構１２８、およびｚ平行移動機構１３０を含む電気機械式ステージが、サンプルを対物レンズおよび機器光路に対してｘ、ｙ、およびｚ方向に移動させるために使用される。光軸、すなわちｚ軸が、サンプルの地点１１０から対物レンズ、ポリクロイックミラー、およびチューブレンズを通って検出器１２０上の対応する画像点１３２まで図１Ａにおいて上下方向に延びている光路に平行であることに、留意されたい。
【００１０】
図１Ｂにおいては、ｘ平行移動機構１２６が、ステージプラットフォーム１１４を右方向に小さな距離＋Δｘ１４０だけ移動させるように作動させられており、結果として、ｘ方向において、サンプル内の焦点の大きさは同じであるが反対方向のシフト−Δｘ１４２が生じている。換言すると、以前の焦点１１０と新たな焦点１４４とは、ステージプラットフォームがｘ方向に距離＋Δｘだけ平行移動した後に、大きさ｜Δｘ｜１４２の距離だけ離れている。図１Ｃは、図１Ｂと同様の様相で、機械式ステージ１１４をｚ方向または光軸方向に小さな距離−Δｚ１４６だけ移動させ、サンプル内の焦点を同じ大きさ１４８であるが方向が反対である距離＋Δｚだけ平行移動させるｚ平行移動装置１３０の動作を示している。この検討において、図１Ａに示される検出器１２０とチューブレンズ１１８との間の距離は、少なくともサンプルからの画像取得の期間においては不変であり、したがって対物レンズの焦点は不動であると仮定される。
【００１１】
生細胞の画像化を含む多数の蛍光顕微鏡の用途において、高分解能の画像の取得は、サンプル内のフルオロフォア標識の画像を再現すべく、弱い発光のフルオロフォアから適切な情報を収集できるように充分な時間にわたって対物レンズに対して不動の位置にある特定のサンプルを画像化することに依存する。他の用途では、一定の焦点を保ち、あるいはｚ方向または光軸方向における対物レンズとサンプルとの間の距離を一定に保ちつつ、電気機械式ステージを対物レンズに対してｘ−ｙ平面内で移動させることによって、サンプルが走査される。いずれの場合も、対物レンズとサンプル内の点または表面との間の距離を、或る期間の間および／または機械式ステージのｘおよびｙ方向の平行移動の間、正確な不変の値に維持する必要がある。
【００１２】
図２Ａおよび図２Ｂは、サンプル内の光軸に対する対物レンズの焦点の位置、すなわちｚ位置について、図２Ａの場合には経時的な望ましくない変動を、図２Ｂの場合にはサンプルのｘおよび／またはｙ方向の平行移動の際の望ましくない変動を示している。両方の図において、対物レンズとサンプルとの間の所望の距離は、破線２０２および２０４によって示されている。対物レンズとサンプルとの間の実際の距離は、両方の図において、実線の曲線２０６および２０８として示されている。対物レンズとサンプル内の点または表面との間の不変の距離を維持するための最善の努力にもかかわらず、ｚ方向または光軸方向における対物レンズとサンプルとの間の実際の距離は、時間とともに変動し、さらには／あるいはｘおよび／またはｙ方向の平行移動の最中に変動する。これらの変動には、多数の異なる原因がある。顕微鏡環境における熱的な不安定性が、例えばｚ軸成分を有する方向の光学機器の膨張または収縮をもたらす可能性がある。光学機器は多くの場合に温度制御チャンバによって囲まれているが、光源、モータ、および他のそのような構成要素など、光学機器の構成要素は、発熱および放熱を生じる可能性があり、これを速やかに補償することは不可能である。空気圧および他の環境パラメータの変動も、対物レンズとサンプルとの間の距離に変動を引き起こす可能性がある。電気機械式ステージのｘ−ｙ平面の向きが光軸に対してわずかに非直交であるだけでも、ｘ−ｙ平面内の平行移動による走査の際に、サンプルが対物レンズに対してｚ方向にも移動する。
【００１３】
図３が、顕微鏡の伝統的なオートフォーカスサブシステムを示している。オートフォーカスサブシステムは、サンプル内の光軸に関する焦点位置を、時間の経過に対して安定かつｘ−ｙ平面におけるサンプルの移動時にも安定にするために開発されている。図３は、図１Ａ〜図１Ｃにおいて用いた図解の慣例と同じ図解の慣例を使用している。図３に示すオートフォーカスサブシステムは、励起光源１０２とは異なるオートフォーカス光源３０２を使用する。多くのシステムにおいて、オートフォーカス光源は赤外光３０４を放射し、その一部が、ビームスプリッタ３０８によってダイクロイックミラー１２２へと下方３０６に反射され、ダイクロイックミラー１２２は、赤外光を励起光源１０２によって放射された光が辿る光路と同じ光路に沿って図３の水平方向１０６に反射し、さらに赤外光は、ポリクロイックミラー１０４によって対物レンズ１０８を通ってサンプル１１０へと反射される。赤外光は、カバースリップ３１０の向こう側とサンプル媒体との間の界面において散乱させられ、後方散乱の赤外光の一部が、対物レンズ１０８ならびに光路の要素１０４、１２２、および３０８を通って戻る。後方散乱の赤外光の一部は、ビームスプリッタ３０８を通過してオートフォーカスモジュール３２０に至る。さらに、種々の代案の構成において、オートフォーカス光源３０２およびオートフォーカス検出器モジュール３２０の位置をビームスプリッタ３０８の周囲で逆にしても、同等の結果を得ることができ、照明源およびオートフォーカス光源の相対位置を、他の光路構成要素の特性の変更と併せて、変更することが可能である。用語「カバースリップ」が、顕微鏡検査においてしばしば使用される伝統的なカバースリップならびに種々さまざまな異なる種類のサンプルチャンバおよびサンプル保持装置のいずれかの表面の両方を含むように意図されていることに、留意すべきである。１つ以上の対物レンズに対するサンプル平面のｚ位置のずれを検出および補正するために、サンプルに対して不動の位置を有する種々の界面のいずれも、後方散乱オートフォーカス光の発生源として使用することができる。
【００１４】
オートフォーカスモジュール３２０は、ステージを光軸に沿って或る範囲のｚ軸位置３２２にわたって平行移動させるようにステージ駆動装置１２４を定期的に制御し、各々のｚ軸位置において光の強度を記録して、強度対ｚ位置のプロット３２４を少なくとも概念的に生成する。対物レンズの焦点とカバースリップの向こう側との一致に対応するｚ範囲内のｚ位置は、カバースリップの向こう側が対物レンズの焦点に一致するときに後方散乱光の最高の強度が生じるがゆえに、強度曲線のピーク３２８の下にあるｚ位置３２６によって示される。カバースリップとサンプル媒体との界面が光学機器の焦点と一致するステージプラットフォームの現在のｚ軸位置を割り出すために、定期的なｚ軸走査を実行する種々の異なる種類のオートフォーカスモジュールが存在する。したがって、オートフォーカスモジュールは、サンプル内の所望のｚ軸位置に焦点を再び位置させるために、電気機械式ステージを割り出された焦点のｚ軸位置に対して所望のｚ軸位置へと駆動することができる。
【００１５】
図４および図５が、伝統的なオートフォーカスモジュールの動作を説明する制御フロー図を示している。図４は、伝統的なオートフォーカス動作の上位の制御フロー図を示している。オートフォーカス動作は、ステップ４０２および４０４を含む連続ループである。ステップ４０２において、オートフォーカス動作は、オートフォーカスタイマーの時間の満了または次のオートフォーカス動作を生じさせる光学機器の操作者からの手動入力などの次のオートフォーカス事象が生じるまで、待機する。次に、ステップ４０４において、ルーチン「オートフォーカス」が呼び出され、対物レンズの焦点がカバースリップの向こう側のサンプル媒体との界面に一致する現在のｚ位置を割り出すために、図３を参照して上述したように或る範囲のｚ位置にわたって走査が実行される。図４においては、オートフォーカス動作が連続ループとして示されているが、ルーチン「オートフォーカス」の呼び出しによって表される実際のオートフォーカス動作が、不連続な時間区間において行われ、オートフォーカス動作が割り込み（ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ）であり、一般に撮像または電気機械式ステージの平行移動に関する他の動作を中断させることに、注意すべきである。
【００１６】
図５は、図４のステップ４０４で呼び出されるルーチン「オートフォーカス」の制御フロー図を示している。ステップ５０２〜５０５のｆｏｒループにおいて、オートフォーカスモジュールは、ステージ駆動装置を制御して、或る範囲のｚ位置を走査する。範囲内の各々のｚ位置について、オートフォーカスモジュールは、ステップ５０３において機械式ステージをｚ位置へと駆動し、ステップ５０４において後方散乱させられたオートフォーカス光の強度を測定する。ひとたび後方散乱させられたオートフォーカス光の強度がｚ位置の範囲内の各々の位置について測定されると、ステップ５０２〜５０５のｆｏｒループにおいて、ルーチン「オートフォーカス」は、ステップ５０６において後方散乱光の最大強度に対応するｚ位置を計算し、次いでステップ５０８において、ステップ５０６で計算されたｚ位置に関して計算されたｚ位置へと機械式ステージを駆動する。例えば、焦点をサンプル内の１０ミクロンという一定のｚ位置に維持することが望まれる可能性があり、その場合、オートフォーカスは、ステップ５０８において、１０ミクロンに光学機器の焦点がカバースリップの向こう側に合わせられた現在のｚ位置を加えたものに等しいｚ位置を計算し、この位置へと電気機械式ステージを駆動する。
【００１７】
図３〜図５を参照して上述したオートフォーカスサブシステムなどの伝統的または従来からのオートフォーカスサブシステムには、多くの問題および欠点がつきまとう。１つの大きな問題は、上述したように、オートフォーカスサブシステムの動作により、光学機器によって実行されているあらゆる他の動作が中断されることである。例えば、光学機器が不変のｚ位置においてサンプルのｘ−ｙ平面走査を行っているとき、オートフォーカス動作のたびに、走査中のｚ位置の安定性を監視するために走査が中断される。オートフォーカスのために用いられるｚ軸走査は、画像の取得に必要な時間にかなりの時間を追加する可能性がある。伝統的なオートフォーカスサブシステムに関する第２の欠点は、オートフォーカス動作が不連続な時間区間において実行されるため、機器のｚ軸位置が、オートフォーカス区間の合間にドリフトする可能性にある。ｚ軸のドリフトを最小限に抑えるために、オートフォーカス動作の間の間隔を短くすると、データ収集時間がさらに長くなる。オートフォーカス動作に関するさらに別の問題は、オートフォーカス動作自体が、電気機械式ステージを或る範囲のｚ位置にわたって移動させることによって時間をかけて実行されるため、オートフォーカス動作の最中に機器および環境の不安定性が変化して、機器の焦点位置の割り出しおよびｚ軸のドリフトの補正の精度を著しく損なう可能性にある。
【００１８】
本発明の実施形態は、電気機械式ステージの平行移動および画像取得動作などの光学機器の他の構成要素およびサブシステムの動作に対して非同期に動作する連続動作の高速オートフォーカスモジュールに関する。そのような非同期オートフォーカスシステムのいくつかの実施形態の原理は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８３６２４０９号、米国特許第８５５８１５４号、および米国特許第８７５９７３２号に提示されている。図６が、これらの開示による非同期オートフォーカスシステムの原理を説明する制御フロー図を示している。連続非同期オートフォーカス動作は、ステップ６０２〜６０４の連続的に実行されるループによって表される。ステップ６０２において、カバースリップとサンプル媒体との間の界面のｚ軸位置が、一実施形態においては、この界面からの後方散乱光が最高の強度を生むｚ軸位置を計算することによって、継続的に監視される。対物レンズに対する界面のｚ軸位置が変化するとき、または対物レンズに対する別のｚ軸位置が変化するとき、電気機械式ステージが、ステップ６０４において、対物レンズとサンプル内の特定の点または表面との間の一定の距離を保つように、小さな補正距離Δｚだけ駆動される。オートフォーカスモジュールは、光学機器の他の構成要素の動作を中断することなく連続的に動作するため、データ収集時間が影響を被ることがなく、光学機器の焦点を、伝統的なオートフォーカスモジュールと比べ、時間の経過においてより安定かつより高い精度に維持することができる。オートフォーカスモジュールは、カバースリップの向こう側のサンプル媒体との界面のｚ軸位置を連続的かつ迅速に再計算するため、各々のオートフォーカス動作に必要な時間が伝統的なオートフォーカスモジュールよりもはるかに短く、したがってオートフォーカス動作の最中に生じ得る最大ドリフト量が、説明される本発明の実施形態においては伝統的なオートフォーカスモジュールよりも小さいため、カバースリップの界面に対する対物レンズのｚ軸位置を、伝統的なオートフォーカスモジュールと比べてより高い精度で継続的に割り出すことができる。
【００１９】
図７Ａ〜図７Ｃが、図１Ａ〜図１Ｃおよび図３を参照して上述した蛍光顕微鏡の電気機械式ステージから独立したｚ軸走査を示している。図７Ａ〜図７Ｃは、図１Ａ〜図１Ｃおよび図３に示したものと同様の仮想システムを示しており、ｚ方向の対物レンズに対するサンプルの移動と同時に、オートフォーカスモジュール内の検出器をチューブレンズに対して移動させることができる。図７Ａにおいては、カバースリップの内側の界面上の点が、対物レンズ７０６からの特定のｚ軸位置ｚ０７０４に保持される。カバースリップの内面からの後方散乱光が、集光レンズ７１４に対して不変のｚ軸位置ｚｄ７１２に保持された検出器７１０へと集められる。図７Ｂにおいては、機械式ステージが対物レンズのより近くへと移動させられており、対物レンズ７０６とカバースリップ７０２の内側の界面との間の距離は、図７Ａに示した初期の距離ｚ０７０４ではなく、今やｚ０´７２０である。オートフォーカスモジュールの検出器７１０は、対応する距離だけ集光レンズ７１４から離れるように動かされており、したがって内側カバースリップ界面７０２からの後方散乱光の焦点７０６は、依然として検出器上にある。同様に、図７Ｃに示されるように、ステージが図７Ａよりもさらに対物レンズから動かされ、内側カバースリップ界面と対物レンズとの間の距離がｚ０´７２４となるとき、内側カバースリップ界面からの後方散乱光の焦点が依然として検出器７０６上にあるためには、検出器７１０を集光レンズ７１４に近付くように移動させて、検出器と集光レンズとの隔たりをより短い距離ｚｄ´´７２６にする必要がある。
【００２０】
ｚ軸走査を、ステージプラットフォームを対物レンズに対してｚ方向に移動させることによって実行できるだけでなく、オートフォーカスモジュールの検出器をオートフォーカスサブシステムの光軸に沿ってオートフォーカスモジュールの集光レンズに対して移動させることによっても実行することができる。検出器がオートフォーカスモジュール内の集光レンズに対する或るｚ位置範囲にわたって移動させられるとき、その範囲内の１つのｚ位置が、オートフォーカスモジュール内の集光レンズの焦点に対応し、これは、光学機器の光軸における対物レンズとカバースリップの界面との間のｚ方向の現在の距離に対応する。オートフォーカスモジュールによって検出および補正すべき対物レンズとカバースリップ界面との間の距離の変化は、カバースリップ界面からの後方散乱光の焦点をオートフォーカスモジュールの検出器上に位置させるような集光レンズの焦点距離の変化に反映される。したがって、集光レンズに対してオートフォーカスモジュール内でｚ軸方向に物理的または論理的に移動させることができる検出器であって、カバースリップ界面からの後方散乱光の焦点が検出器上に位置していることを判断することができる検出器を、対物レンズとカバースリップの界面との間の現在の距離ｚｏに対応するオートフォーカスモジュール内の集光レンズに対する検出器の位置ｚｄを割り出すために使用することができる。これにより、対物レンズとカバースリップ界面との間の距離ｚｏの絶対値を、下記の関係によって割り出すことができる。
【００２１】
【数１】
0006662529.tif 000002
比例定数αは、オートフォーカスモジュールと光学機器とによって共有される光路の幾何学的形状ならびにオートフォーカスモジュールの集光レンズおよび光学機器の対物レンズの特性から決定することができる。
【００２２】
図８は、小開口焦点検出器の動作の原理を示している。図８には、不透明材料における小さな円形の開口８０２、８０４、および８０６が、焦点の異なる３つの光ビームに関して示されている。第１の光ビームは、円形の開口８１２の下方の点８１０に焦点を有し、その結果として、光ビームの一部が不透明材料の裏面に当たり、円形断面８１４を有する光ビームの中央の円錐部分だけが、円形の開口を通過する。光ビームが不透明材料によって部分的に遮られることがないのであれば、焦点からの距離が円形断面８１４と同じである光ビームの円形断面８１６は、より大きな直径および面積を有すると考えられる。したがって、開口を通過した後の光の強度の減少は、円形断面８１４の面積の円形断面８１６の面積に対する比に比例する。図８の例８０４のように、光ビームが開口に一致する地点に焦点を有する場合、入射光のすべてが開口を通過し、開口を通過する光の強度は開口を通過する前の光ビームの強度に等しい。図８の第３の例８０６に示されるように、入力光の焦点が開口の向こうに位置する場合、焦点よりも前の入力光の一部が不透明材料の裏面に当たり、したがって事例８０２と同様に、集光された光ビームの一部８２０のみが開口を通過する。したがって、小さな円形開口の後ろに配置され、小さな円形開口を通過する光ビームの強度を測定する光検出器を使用して、入力集光ビームの焦点が開口内に位置しているかどうかを知らせることができる。例えば、光検出器によって検出された強度を円形開口に対する集光レンズのｚ位置に対してプロットすると、測定された強度のピーク８２８に対応するプロット８２４の横軸上の点として、ｚ＝０  ８２６、すなわち集光レンズによって集光された光の焦点が開口内に位置する集光レンズに対するピンホール開口のｚ軸位置が、明らかになる。
【００２３】
図８に示されるように光検出器をピンホール開口の背後の適切な距離に配置して備えている検出器を、図７Ａ〜図７Ｃに関して上述したように集光レンズに対して移動させるための機械式の駆動装置を、カバースリップ界面からの後方散乱光の焦点に対応するピンホール開口と集光レンズとの間の距離ｚｄを決定するために使用することができる。しかしながら、機械式にて移動させることができる検出器は、高価であり、光学機器によるｚ方向の走査にまつわる時間遅延と同じ時間遅延を被る。図７Ａ〜図７Ｃのようにｚ方向に走査することができる焦点検出器を用いるのではなく、米国特許第８３６２４０９号、米国特許第８５５８１５４号、および米国特許第８７５９７３２号は、固定の光検出器ならびにピンホールを有する回転子またはｚ軸走査を繰り返し実行すべく集光ビームを段階的に延ばすための他の光学要素の使用を開示している。しかしながら、そこに開示された実施形態は、摩耗に敏感であり、メンテナンスなどを必要とし得る機械的な構成を伴う。
【００２４】
本発明の実施形態によれば、可動部品がなく、したがって設計がより単純であり、摩耗などの影響を受けにくい焦点検出器が提供される。さらに、開示される実施形態においては、検出が並行モードで実行されることにより、ステージのｚ位置の割り出しおよびオートフォーカス補正を大幅に速くすることができる。
【００２５】
図９ａに概略的に開示される一実施形態によれば、オートフォーカス検出器とも呼ばれる焦点検出器９００が提供され、このオートフォーカス検出器９００は、オートフォーカス光ビーム９０４を複数（ｎ個）の下流光ビーム９０６へと分割するように構成されたビームスプリッタ９０２と、下流光ビームの各々の強度を記録する光検出器装置９０８とを備え、下流光ビームは、集光レンズから光検出器装置まで測定される光路長が異なっている。このようにして、オートフォーカス検出器は、複数の異なる焦点距離においてオートフォーカス光ビームの強度を同時に監視することで、焦点位置のずれおよび変動を瞬時に検出することができる。適切な検出範囲および分解能を提供するために、下流光ビームの異なる光路長は、それらがオートフォーカス検出範囲に及ぶように、かつ下流光ビームの数が充分に多いように選択される。オートフォーカス検出範囲は、システムの構成に応じてさまざまであり得るが、典型的には、サンプル全体の厚さと、新しいサンプルを装てんするときの初期設定を考慮するための追加のバッファ厚さとの合計をカバーすることができる。一実施形態において、下流光ビームの数は、１０、１５、または２０以上など、４以上である。広いオートフォーカス検出範囲を有する実施形態においては、好ましくは下流光ビームの数が多く、用途に応じて４０、６０、または１００以上であってよい。以下でさらに詳しく説明されるように、下流光ビームによって表される所定の距離の間の値への補間によって、検出の分解能をさらに高めることも可能である。
【００２６】
例示の目的で、図９ａにおけるビームスプリッタ９０２は、オートフォーカス光ビーム９０４をｎ個の下流光ビーム９０６へと分割することができ、内部光路長は各々の下流光ビーム９０６について同じである機能ユニットとして、概略的に開示されている。この種のビームスプリッタを設計することは不可能ではないが、設計において複雑にならざるを得ないと考えられ、したがって以下で開示されるように、ビームスプリッタを異なる経路長の下流光ビーム９０６をもたらすように設計することが有利となり得る。図９において、下流光ビーム９０６の異なる経路長は、光検出器装置９０８におけるそれぞれの光検出器９１０の相対変位Δｚによって達成される。図９ａにおいて、光検出器装置９０８は、ｎ個の個別の光検出器９１０から構成されるものとして示されており、各々の検出器は、それぞれの下流光ビーム９０６に組み合わせられ、各々の検出器は、下流光ビーム９０６の方向に距離Δｚだけずらされ、ｎ×Δｚの検出範囲をもたらしている。専用の光検出器９１０を有する実施形態において、各々の検出器は、上記開示のとおりの小開口焦点型検出器であってもよい。しかしながら、以下でさらに詳しく説明されるように、他の実施形態において、光検出器装置９０８は、ＣＣＤまたはＣＭＯＳ画像検出器など、任意の適切な種類の集積検出器アレイであってよい。
【００２７】
図９ａにおいて、オートフォーカス光ビーム９０４は、すでに定義したように、例えば図７のチューブレンズ７１４によって焦点面Ｚｄに集められる収束ビームとして概略的に開示されており、ビームスプリッタ９０２は、下流光ビーム９０６へと共焦点性を保つように構成されている。焦点面Ｚｄは、図９ａにおいて破線によって示されている。
【００２８】
横軸９６０に関する或る範囲の検出器インデックスｉ＝１〜ｎに対してｉ＊Δｚで表される異なるビーム経路長がプロットされた図９Ｂに示すプロットにおいて、黒丸９６２などの黒丸は、ｚ位置についての左側の縦軸９６４に関してプロットされた各々のビーム経路長のｚ位置を表し、白丸９６６などの白丸は、強度についての右側の縦軸９６８に関してプロットされた対応する光検出器による検出強度を表している。図９Ｂの黒丸９６２によって示されるように、ｚ距離が、検出器インデックスＩを増やすことによって増加する一方で、白丸９６６によって示される対応する光検出器による検出強度は、検出器インデックスｉ＝６に対応する９７４におけるピークを有し、したがって対応する距離ｚｄがｚ軸上に示される。すでに述べたように、本発明においては、米国特許第８３６２４０９号、米国特許第８５５８１５４号、および米国特許第８７５９７３２号のｚ軸位置の走査が、それぞれが異なるｚ軸位置を表すｎ個の下流ビームの固定された配置によって置き換えられる。したがって、本発明は、測定される強度が最大となるピンホール開口と集光レンズとの間の距離ｚｄを割り出すために、本発明の一実施形態を呈するオートフォーカスモジュールにおいて、対応するｚ軸位置を割り出すことにより、焦点外れの状態の本質的に瞬時の検出をもたらす。その距離は、上述したように、対物レンズと光学機器のカバースリップの界面との間の距離に関係する。
【００２９】
一実施形態によれば、光検出器装置は、所定の光検出器平面に配置された光検出器のアレイであり、ビームスプリッタは、所定の光検出器平面に対して異なる経路長で複数の下流光ビームを生成するように構成された１つ以上の光学素子で構成される。ビームスプリッタの光学素子および検出器装置は、ベース構造などへの取り付けによってお互いに対して固定された位置に配置されてよく、あるいは一部またはすべての構成要素が互いに取り付けられた一体構造に組み合わせられてもよい。ビームスプリッタは、一部分または基本的に全体が自由空間（例えば、空気）において実現されたビーム経路をもたらすように構成されてよく、あるいはビーム経路が部分的または基本的に完全にガラスまたは石英などの光学的に透明な材料に含まれるように構成されてよい。光学素子は、機械加工、成型、または材料の堆積などの任意の従来からの製造プロセスによって製造することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、光検出器装置は、光検出器のアレイであり、光検出器のアレイは、２ｎ個よりも多くの光検出器を有する線形（１次元）または２次元アレイである。下流ビーム経路の数（ｎ個）と比べてより多数の光検出器を有する光検出器アレイを設けることによって、多くの場合に困難である光検出器をそれぞれのビーム経路に整列させる工程を、例えば１つ以上の光検出器をそれぞれの下流光ビームに対応するアレイ内の最も適切な光検出器として選択し、あるいは２つ以上の光検出器から記録された強度をまとめることによって、容易にし、あるいは完全に省略することができる。またさらに、例えば光検出器アレイがＣＣＤまたはＣＭＯＳ検出器ユニットなどのイメージセンサである場合など、光検出器の数が下流光ビームの数よりも著しく多い場合には、それぞれの下流光ビームの強度を、検出された画像の画像解析を使用して決定することができる。そのような状況においては、それぞれの下流光ビームについて得られる画像が、互いに重なり合う可能性があり、画像解析は、例えばピークフィッティング手順などを含むことができる。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、ビームスプリッタの光学素子のうちの１つ以上が、１つ以上の部分反射界面を含む。部分反射界面を含むビームスプリッタは、光学の分野において光ビームの分割または結合に広く使用されている。本発明によるビームスプリッタを提供するために使用することができる部分反射界面の例として、これらに限られるわけではないが、例えば金属などの薄い反射コーティングや、界面においてフラストレーテッド（ｆｒｕｓｔｒａｔｅｄ）全反射が達成されるように適切な屈折率を有する材料を所定の厚さに設けること、などが挙げられる。特定の材料特性、厚さ、および光ビームの入射角度を調整することによって、反射させられて伝えられる光の量を、所望のレベルに制御することができる。
【００３２】
図１０は、ビームスプリッタ１００２が、第１の面１００６および第２の反対側の面１００８を有する所定の厚さｄの光学的に透明な材料で作られた平坦なウインドウ１００４であり、第１の面１００６に部分反射界面１０１０が設けられ、第２の面１００８にミラーコーティングなどの全反射１０１２が設けられているオートフォーカス検出器１０００の一実施形態を開示している。複数回の内部反射を生じさせるために、ウインドウ１００４は、オートフォーカス光ビーム１０１４に対して角度αに配置される。第１の面１００６における部分反射界面および第２の面１００８の全反射１０１２の界面ゆえに、複数回の部分内部反射がウインドウ１００４内で生じ、第１の面１００６の部分反射界面１０１０ゆえに、複数の下流光ビーム１０１６が生成される。下流光ビーム１０１６は、所定の光検出器平面１０２０において光検出器装置１０１８によって検出され、光検出器装置１０１８は、図１０においては個別の光検出器素子１０２２として概略的に開示されているが、上述したように、ＣＣＤまたはＣＭＯＳ検出器などの任意の適切な検出器装置であってよい。図１０では、光ビームの中心経路だけが示されており、図示のように、後続の各々の下流光ビームは、実行された内部反射によって達成された追加の光路長を有する。ビームスプリッタ１００２によって生成される下流光ビーム１０１６の数および対応する変位Δｚを、部分反射界面１０１２の関連する特性、ウインドウ１００４の光学材料特性、および角度αを選択することによって決定することができる。適切な選択を行うことによって、それぞれの下流光ビームへと出力される光ビーム強度の割り当てを、本質的に等しくなるように制御することができ、そうでない場合には、出力比における相違を補償するために較正因子を使用することができる。
【００３３】
図１１ａは、図１０の実施形態と同様のオートフォーカス検出器１０００の実施形態を概略的に示しており、全反射の界面１０１２が部分反射界面１０１２ａによって置き換えられていることで、オートフォーカス光ビーム１０１４がウインドウ１００４の第２の面１００８を通って進入することができる。図１１ｂは、図１１ａのオートフォーカス検出器１０００の概略的な光線追跡モデルを示している。
【００３４】
図１２は、本発明の一実施形態を呈するオートフォーカスモジュールであって、やはり本発明の一実施形態を呈する蛍光顕微鏡の光路に組み込まれたオートフォーカスモジュールを示している。図１２は、図１Ａ〜図１Ｃ、図３、および図９Ａ〜図１１において用いた図解の慣例と同じ図解の慣例を使用している。オートフォーカスモジュールは、集光レンズ１２０２と、図１０に開示した実施形態のオートフォーカス検出器１０００と、オートフォーカス処理コンポーネント１２１０とを含む。オートフォーカス処理コンポーネント１２１０は、対物レンズ１０８とカバースリップ界面３１０との間の距離が一定のままであるように機械式のステージの位置を継続的に調整するために、Δｚ補正を継続的に計算し、ステージ駆動装置１２４へとΔｚ平行移動指令を発する。上述のように、本発明の一実施形態を呈するオートフォーカスモジュールは、カバースリップ界面からの後方散乱光、またはサンプルに対して不変の位置を有する他の界面からの後方散乱光を使用して、対物レンズとカバースリップ界面との間のｚ方向の距離を算出するが、本発明の一実施形態を呈するオートフォーカスモジュールは、光学機器のチューブレンズおよび検出器に対して対物レンズの焦点をサンプル内の任意の選択された位置に安定に維持するために使用可能である。やはり、用語「カバースリップ界面」および「カバースリップ」は、オートフォーカスシステムによって後方散乱オートフォーカス光の発生源として使用することができるさまざまな種類の界面の任意のいずれかを広く包含するように意図されている。本発明の実施形態を呈するオートフォーカスモジュールを、種々のやり方で光学機器へと組み込むことができることに、注意すべきである。多くの場合、オートフォーカスモジュールは、手動または自動で作動させられ、指定された時間または計算された時間にわたってオートフォーカスを実行することができる。他の場合には、オートフォーカスサブシステムは、特定の種類の画像取得モードの最中に、プログラムによって起動されてもよい。すべての場合において、オートフォーカスサブシステムを、光学機器の通常のｚ平行移動の最中または他の時点において、手動または自動で解除することができる。
【００３５】
図１３Ａおよび図１３Ｂは、下流光ビームの２次元パターンをもたらすように構成されたオートフォーカス検出器１３００を概略的に開示している。２次元パターンは、オートフォーカスビーム１３０６を３つの第１の下流ビームＺ１〜Ｚ３に分割するように構成された図１１ａおよび図１１ｂのビームスプリッタ１００２と同じ種類の第１のビームスプリッタ１３０４と、同じ種類であるが幅がより大きく、第１のビームスプリッタ１３０４に対して斜めの角度に配置された第２のビームスプリッタ１３０８とを備える２段階のビームスプリッタ装置によってもたらされる。３つの第１の下流ビームＺ１〜Ｚ３は、第２のビームスプリッタ１３０８へと伝えられ、第２のビームスプリッタ１３０８において、第１の下流ビームＺ１〜Ｚ３の各々が６つの第２の下流ビームｚ１〜ｚ６に分割され、フォトダイオードアレイ、ＣＭＯＳカメラ、ＣＣＤ検出器、などの２次元の光検出器装置１３１０へと投じられる合計で１８個の下流ビームがもたらされる。開示された実施形態において、下流ビームの数は、例示の目的のために１８に制限されているが、とりわけ高分解能の光検出器装置１３１０を有する実施形態においては、かなり多くてよい。関連する実施形態に関して上述したように、本実施形態は、別個の光学素子として概略的に開示されているが、例えばいくつかの光学的に透明な要素を一体に結合させることにより、任意の適切なやり方で設計されてよく、反射または半反射層などを関連の界面に設けることができる。
【００３６】
図１４は、図１１ａの実施形態と同様のオートフォーカス検出器１０００の実施形態を概略的に示しており、部分反射界面１０１２ａが、第２の光検出器装置１０１８ｂによる検出のために充分な光の透過を可能にするように構成されることで、下流光ビーム１０１６の数が実質的に２倍になり、分解能が改善される。開示されているように、第２の光検出器装置１０１８ｂは、ビームスプリッタ１００２に関して第１の光検出器装置１０１８ａに対応する位置、ただし反対側に配置されている。
【００３７】
図１５が、オートフォーカス検出器１４００の実施形態を概略的に示しており、ビームスプリッタ１４０２が、オートフォーカス光ビーム１４１４ａまたは１４１４ｂに対して斜めかつ直列に配置された複数の部分反射界面１４０６を備えており、各々の部分反射界面１４０６が光検出器装置１４０８へと導かれる下流光ビーム１４１６をもたらす。開示された実施形態において、複数の部分反射界面１４０６は、光学的に透明な材料からなるビームスプリッタ本体１４０４に一体化されることで、一体的な光学素子１４０４を形成するものとして概略的に開示されており、このビームスプリッタ１４０２が、検出器装置１４０８に取り付けられる。代案の実施形態においては、部分反射界面１４０６を、個別の部分反射ミラー要素（図示せず）として設けてもよい。開示された実施形態において、ビームスプリッタ１４０２および光検出器装置１４０８は、オートフォーカス検出器１４００をきわめて簡潔かつ信頼できるものにする一体化されたユニットとして開示されている。光検出器装置１４０８は、上述のような任意の適切な種類の光検出器装置でよい。さらに、初期の部分反射界面１４０６のうちのいくつかを、光ビームの一部を光検出器装置１４０８の表面に平行に反射させ、後続の複数の部分反射界面１４０６に入力光ビームとしてもたらすことで、オートフォーカス光ビーム１４１４を光検出器装置１４０８に衝突する所望の数の下流光ビーム１４１６へと分割するように配置することにより、この考え方に基づく一体型の３次元ビームスプリッタを製作することが可能であると考えられる。
【００３８】
一実施形態によれば、オートフォーカス処理コンポーネントは、各々の下流光ビームの記録された強度から、最大強度に対応するＺｄ位置を計算するように構成される。より詳細には、オートフォーカス処理コンポーネントは、光学機器の対物レンズからオートフォーカス光を後方反射させる光路上の地点までの光学機器の光軸に沿った計算による対応する距離と、光学機器の対物レンズからオートフォーカス光を後方反射させる光路上の地点までの光学機器の光軸に沿った所望の距離とから、光軸補正Δｚを計算し、光軸補正Δｚを光学機器の電気機械式の構成要素へと伝達することにより、光学機器の対物レンズからオートフォーカス光を後方反射させる光路上の地点までの光学機器の光軸に沿った距離を、所望の距離に維持する。
【００３９】
米国特許第８３６２４０９号、米国特許第８５５８１５４号、および米国特許第８７５９７３２号は、本発明の一実施形態を呈するオートフォーカスモジュールのオートフォーカス処理サブコンポーネントによって顕微鏡の対物レンズとカバースリップ界面との間の現在の距離を効率的に計算する方法の実施形態を開示する。この手法は、ステージの現在のｚ位置を割り出すためにロータインデックスの代わりに検出器インデックスを使用することによって本発明の実施形態に容易に適用することができ、本明細書においてさらに詳細に開示される必要はない。
【００４０】
図３のグラフ３２４を参照して上述したように、後方反射のオートフォーカス光の強度を分析することによる対物レンズからカバースリップ界面までの距離の割り出しは、オートフォーカス処理コンポーネント（図１２の１２１２）によるオートフォーカス光検出器によって収集されたデータの分析のための１つの基礎を提供するが、他の手法も可能である。本発明の代案の実施形態を呈する１つの代案の手法においては、後方散乱光の強度が最高となるｚ位置を割り出すのではなく、オートフォーカスシステムは、光学システムのユーザまたは光学システムの自動プログラム制御によって選択されたｚ位置において、Ｚ位置走査が選択されたｚ位置のわずかに上方およびわずかに下方で実行される較正動作を始める。走査の目的は、カバースリップ界面からの後方散乱光のガウス型強度曲線において、ガウス型曲線の急斜面に対応するｚ位置および対応するオートフォーカスビーム位置を特定することである。ガウス曲線のこの部分において、測定される後方散乱オートフォーカス光の強度の変化が、カバースリップ界面に対する対物レンズのｚ位置の変化に最も敏感に依存する。次いで、較正後のデータ収集段階において、特定されたオートフォーカスビーム位置から測定される強度の変化が継続的に監視され、ｚ位置が、特定されたオートフォーカスロータ位置において較正段階の強度を維持するように制御される。このように、オートフォーカス光検出器の取得データの分析に対するこの代案の手法においては、光学機器のｚ位置が、後方散乱のオートフォーカス光が最大限に強くなるｚ位置に対する相対的なオフセットとして制御されるのではなく、むしろｚ位置の変化に対して最も敏感であるオートフォーカスビーム位置において測定される後方散乱光について較正段階において割り出された強度を維持するように制御される。本発明のさらに別の実施形態においては、より複雑な曲線当てはめアルゴリズムを使用し、測定された後方散乱オートフォーカス光の強度を、経験的に決定され、あるいは理論的に導き出される後方散乱オートフォーカス光−Ｚ位置の曲に正確に当てはめることで、光学機器のｚ位置を所望の値に維持する。
【００４１】
本発明の別の実施形態においては、平行光線のビームよりもむしろ、わずかに収束またはわずかに発散するオートフォーカス光ビームを生成するために、追加の光学部品が赤外オートフォーカス源３０２とビームスプリッタ３０８との間においてオートフォーカスシステムに導入され、あるいは光路内にすでに存在する光学部品が調整または変更される。わずかに収束または発散するビームを光学系に入力することにより、オートフォーカス光がサンプル内の或る一点に集光されることがない。オートフォーカス光がサンプル内に正確に集光されると、高強度のオートフォーカス光がサンプルおよび光学データの収集に有害な影響を及ぼす可能性がある。例えば、赤外オートフォーカス光が使用される場合、オートフォーカス光が強く集光されると、サンプル内の高温および生細胞の損傷あるいは温度に起因するサンプルの化学組成の変化につながる可能性がある。
【００４２】
本発明の別の実施形態においては、リング開口が、赤外オートフォーカス源３０２とビームスプリッタ３０８との間に配置され、対物レンズによってカバースリップ界面に向かって急峻な角度で集光される光線だけがリング開口を通過する。後方反射光の割合は、このような急峻な角度の光線に関して最大であり、したがってリング開口を使用し、後方反射の強度への寄与が少ないあまり急峻ではない角度の光線を除くことによって、必要な後方反射オートフォーカス光の強度を維持しつつ、サンプルへの入射光の総量を減らすことが可能である。
【００４３】
本発明を特定の実施形態に関して説明してきたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではない。いくつかの変更が、当業者にとって明らかであろう。プログラミング言語、モジュール構成、制御構造、データ構造、および他のパラメータなどの多数の設計および実施のパラメータの任意のいずれかを変えることにより、オートフォーカスシステムの光検出器から収集される強度データからｚ位置を継続的に計算するために、さまざまな異なる種類のオートフォーカス処理サブコンポーネントを、論理回路またはソフトウェア制御マイクロプロセッサから実現することができる。
【００４４】
以上の説明は、解説の目的で、本発明の完全な理解をもたらすために、特定の専門語を使用している。しかしながら、それらの特定の詳細が、本発明の実施に必要とされないことは、当業者にとって明らかであろう。本発明の特定の実施形態の上述の説明は、例示および説明を目的として提示されている。それらは、網羅的であることも、本発明を開示された正確な形態に限定することも、意図していない。以上の教示に照らして、多数の変更および変形が可能である。上述の実施形態は、本発明の原理およびその実際の応用を最も上手く説明することにより、当業者が本発明および種々の実施形態を想定される個々の用途に合わせた種々の変更を伴って最も上手く利用することを可能にするために、図示および説明されている。本発明の技術的範囲は、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によって定められるように意図されている。
【符号の説明】
【００４５】
１０２  励起光源
１０４  ポリクロイックミラー、要素
１０６  励起光
１０８  対物レンズ
１１０  サンプル、焦点、サンプル内の地点
１１２  カバースリップ
１１４  機械式ステージプラットフォーム、機械式ステージ
１１６  開口
１１８  チューブレンズ
１２０  光検出器
１２２  ダイクロイックミラー、要素
１２４  ステージ駆動コンポーネント、ステージ駆動装置
１２６  ｘ平行移動機構
１２８  ｙ平行移動機構
１３０  ｚ平行移動機構、ｚ平行移動装置
１３２  画像点
１４４  新たな焦点
２０２  破線
２０６  曲線
３０２  赤外オートフォーカス光源
３０４  赤外光
３０８  ビームスプリッタ
３１０  カバースリップ、カバースリップ界面
３２０  オートフォーカスモジュール、オートフォーカス検出器モジュール
３２２  ｚ軸位置
３２４  グラフ、プロット
３２６  ｚ位置
３２８  ピーク
４０２  ステップ
４０４  ステップ
５０２  ステップ
５０３  ステップ
５０４  ステップ
５０５  ステップ
５０６  ステップ
５０８  ステップ
６０２  ステップ
６０３  ステップ
６０４  ステップ
７０２  カバースリップ、内側カバースリップ界面
７０６  対物レンズ、検出器
７１０  検出器
７１４  集光レンズ、チューブレンズ
８０２  開口
８０４  開口
８０６  開口
８１０  点
８１２  開口
８１４  円形断面
８１６  円形断面
８２０  光ビームの一部
８２４  プロット
８２８  ピーク
９００  オートフォーカス検出器、焦点検出器
９０２  ビームスプリッタ
９０４  オートフォーカス光ビーム
９０６  下流光ビーム
９０８  光検出器装置
９１０  光検出器
９６０  横軸
９６２  黒丸
９６４  縦軸
９６６  白丸
９６８  縦軸
１０００  オートフォーカス検出器
１００２  ビームスプリッタ
１００４  ウインドウ
１００６  第１の面
１００８  第２の面
１０１０  部分反射界面
１０１２  全反射、部分反射界面
１０１２ａ  部分反射界面
１０１４  オートフォーカス光ビーム
１０１６  下流光ビーム
１０１８  光検出器装置
１０１８ａ  第１の光検出器装置
１０１８ｂ  第２の光検出器装置
１０２０  光検出器平面
１０２２  光検出器素子
１２０２  集光レンズ
１２１０  オートフォーカス処理コンポーネント
１３００  オートフォーカス検出器
１３０４  第１のビームスプリッタ
１３０６  オートフォーカスビーム
１３０８  第２のビームスプリッタ
１３１０  光検出器装置
１４００  オートフォーカス検出器
１４０２  ビームスプリッタ
１４０４  ビームスプリッタ本体
１４０６  部分反射界面
１４０８  光検出器装置
１４１４ａ  オートフォーカス光ビーム
１４１４ｂ  オートフォーカス光ビーム
１４１６  下流光ビーム
【図１Ａ】
0006662529.tif 000003
【図１Ｂ】
0006662529.tif 000004
【図１Ｃ】
0006662529.tif 000005
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006662529.tif 000007
【図３】
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【図４】
0006662529.tif 000009
【図５】
0006662529.tif 000010
【図６】
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【図７Ａ】
0006662529.tif 000012
【図７Ｂ】
0006662529.tif 000013
【図７Ｃ】
0006662529.tif 000014
【図８】
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【図９Ａ】
0006662529.tif 000016
【図９Ｂ】
0006662529.tif 000017
【図１０】
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【図１１Ａ】
0006662529.tif 000019
【図１１Ｂ】
0006662529.tif 000020
【図１２】
0006662529.tif 000021
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
0006662529.tif 000023
【図１４】
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【図１５】
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