(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞において発現される目的の標的タンパク質の発現レベルを増強させるための融合タンパク質であって、
前記融合タンパク質が、タンパク質発現増強ポリペプチド（ＰＥＥＰ）を標的タンパク質結合ドメイン（ＴＰＢ）と連結させた、（ＰＥＥＰ）−（ＴＰＢ）または（ＴＰＢ）−（ＰＥＥＰ）の構造を含み、
前記タンパク質発現増強ポリペプチド（ＰＥＥＰ）が、
（ａ）４つのαヘリックス（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）によって特徴付けられ、ヒスチジン、プロリン、およびアスパラギン酸配列モチーフ（ＨＰＤモチーフ）のトリペプチド配列をヘリックスＩＩとヘリックスＩＩＩとの間に有するＪタンパク質のポリペプチドドメインを含むＪタンパク質から単離されたＪドメイン；または、
（ｂ）式Ｉのアミノ酸配列を有する、Ｊドメインアナログポリペプチド：
（Ｉ）Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｘ９（配列番号４７）：
（式中、Ｘ１はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、
ジペプチドＸ２‐Ｘ３がＫＲ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＲ、ＡＫ、ＡＲ、ＫＡ、ＩＫ、ＮＫ、ＫＱ、ＲＱ、およびＲＤからなる群から選択され、
Ｘ４がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、またはＩであり、
Ｘ５がＹまたはＦであり、
ジペプチドＸ６‐Ｘ７がＫＲ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＲ、ＲＱ、ＦＲ、ＲＬ、ＫＬ、ＨＫ、ＬＫ、ＱＫ、およびＫＶからなる群から選択され、
ジペプチドＸ８‐Ｘ９がＬＡ、ＬＬ、ＡＬ、ＡＡ、ＬＣ、ＬＶ、ＱＡ、ＫＡ、ＬＳ、ＬＩ、ＬＹ、およびＲＡからなる群から選択されるものである）
；
であって、
前記標的タンパク質結合ドメイン（ＴＰＢ）が、前記目的の標的タンパク質に結合できるポリペプチドであり、
前記融合タンパク質と前記標的タンパク質の前記宿主細胞内での共発現によって、目的の標的タンパク質の発現レベルを、前記融合タンパク質の共発現の非存在下での前記宿主細胞において発現した前記標的タンパク質の発現レベルに比べて増強させる、前記融合タンパク質。
【請求項２】
宿主細胞において発現される目的の標的タンパク質が、宿主細胞内で発現される天然のタンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
宿主細胞において発現される目的の標的タンパク質が、宿主細胞に関する外因性のタンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
目的の標的タンパク質が、抗体、抗体の抗原結合部分、受容体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域と連結されている受容体タンパク質の１以上の結合ドメインを含む融合タンパク質、サイトカイン、ペプチドホルモン、酵素、または形態形成タンパク質である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
目的の標的タンパク質が、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
タンパク質発現増強ポリペプチド（ＰＥＥＰ）がＪタンパク質から単離されたＪドメインである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
単離されたＪドメインが、ＥＲｄｊタンパク質、ＳＶ４０ラージＴ抗原、または哺乳類のシステインストリングタンパク質α（ＣＳＰ‐α）から単離されたＪドメインである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
単離されたＪドメインが、Ｅｒｄｊ１、Ｅｒｄｊ２、Ｅｒｄｊ３、Ｅｒｄｊ４、Ｅｒｄｊ５、Ｅｒｄｊ６、およびＥｒｄｊ７からなる群から選択されるＥｒｄｊタンパク質から単離されたＪドメインである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
単離されたＪドメインがＥｒｄｊ３から単離されたＪドメインである、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
タンパク質発現増強ポリペプチド（ＰＥＥＰ）が、式Ｉのアミノ酸配列を含むＪドメインアナログポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
タンパク質発現増強ポリペプチドが、以下からなる群から選択されるＪドメインアナログポリペプチドである、請求項１０に記載の融合タンパク質：
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ（配列番号４８）、
Ｉ‐Ｒ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｔ‐Ｌ（配列番号８３）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｑ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｌ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号８４）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｆ‐Ｈ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｍ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号８５）、
Ｉ‐Ｒ‐Ｑ‐Ａ‐Ｆ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｌ（配列番号８６）、
Ｉ‐Ｉ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｑ‐Ｗ（配列番号８７）、
Ｉ‐Ａ‐Ｒ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｑ‐Ｌ‐Ａ‐Ｒ‐Ｒ‐Ｙ（配列番号８８）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｒ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｒ‐Ｑ‐Ａ‐Ｌ‐Ｒ‐Ｙ（配列番号８９）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｓ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号９０）および
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｋ‐Ｒ‐Ｌ‐Ａ‐Ｍ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号９１）。
【請求項１２】
タンパク質発現増強ポリペプチドが以下のアミノ酸配列の１つを含む、請求項１０に記載の融合タンパク質：
【表１】
0006688237.tif 000089
。
【請求項１３】
標的タンパク質結合ドメイン（ＴＰＢ）が、抗体またはその抗原結合断片、抗体結合タンパク質、受容体タンパク質のリガンド結合ドメイン、受容体タンパク質のタンパク質リガンド、抗体またはその抗原結合断片が結合するタンパク質抗原、またはＰＤＺドメインである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
標的タンパク質結合ドメイン（ＴＰＢ）が、抗体結合タンパク質である、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
抗体結合タンパク質が、Ｆｃ結合タンパク質またはそのＦｃ結合断片である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
Ｆｃ結合タンパク質が、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
抗体結合タンパク質が、タンパク質Ｌである、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
標的タンパク質結合ドメイン（ＴＰＢ）が受容体タンパク質のリガンド結合ドメインであり、受容体タンパク質がサイトカイン受容体である、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
標的タンパク質結合ドメイン（ＴＰＢ）が受容体タンパク質に対するタンパク質リガンドであり、タンパク質リガンドがサイトカインである、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の単離された核酸分子を含む核酸ベクター分子。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸ベクター分子を含む宿主細胞。
【請求項２３】
融合タンパク質を発現させる方法であって、請求項２２に記載の宿主細胞を融合タンパク質を発現させるために十分な条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項２４】
宿主細胞が発現する目的の標的タンパク質の発現を増強する方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に形質移入すること、ここで前記融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメイン（ＴＰＢ）が目的の標的タンパク質に結合できるものであり；および、形質移入宿主細胞を、前記融合タンパク質と前記目的の標的タンパク質の共発現を生じる条件下で培養することとを含む、前記方法。
【請求項２５】
分泌タンパク質機能を提供する天然の分泌タンパク質の分泌不足に関連した疾患を有する哺乳類対象において前記分泌タンパク質機能を回復させるための細胞製剤の製造方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする外因性の核酸分子を、前記対象から採取した細胞に挿入することを含み、ここで前記融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメイン（ＴＰＢ）が天然の分泌タンパク質に結合できるものであり、前記融合タンパク質と前記天然分泌タンパク質が該核酸分子を挿入された該細胞内で共発現されることによって、十分な天然分泌タンパク質が分泌され、前記不足が補充される、前記製造方法。
【請求項２６】
疾患が、プリオン関連疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症（ＣＦ）、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者が、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質の分泌が不足したヒト患者であり、疾患が嚢胞性線維症である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
患者が、ＡＡＴの分泌が不足しているヒト患者であり、疾患がＡＡＴ欠損症である、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１２年１２月５日出願の米国特許仮出願第６１／７３３，８８４号および２０１２年１２月５日出願の米国特許仮出願第６１／７３３，７４３号に対する優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は改変タンパク質の分野の発明である。具体的には、本発明はタンパク質の発現を増強するポリペプチド、および当該タンパク質発現増強ポリペプチドをコードする核酸分子を目的とする。本発明はさらに、目的のタンパク質の生成レベルを増加する方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子改変細胞の培養液中に目的のタンパク質を研究、開発、または商業用途に十分な量を容易に単離できるレベルで発現するには、多様な組換え技術と細胞培養方法を最適化する必要がある。このような技術には、所望のタンパク質分子をコードする核酸分子を単離し、組換え、所望のコード配列を適切な転写要素および翻訳要素と作動可能に連結し、改変遺伝子材料を適切な発現ベクターへ挿入し、得られた組換え発現ベクターを適合する宿主細胞へ導入し、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を所望の組換えタンパク質の発現が可能な条件下で培養するインビトロの方法が含まれる。このような方法を適切に選択し最適化することによって、細菌宿主細胞、真菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、哺乳類宿主細胞などの多様な宿主細胞に由来する多様な組換えタンパク質の発現と使用が可能になった。
【０００４】
組換えや細胞培養の方法には多くの進歩があったが、それでも未だ適切なタンパク質折り畳みを確実にするという課題が、有用な量の所望の組換えタンパク質を生産するための非常に幅広い努力に障害となる場合がある。すべてのタンパク質は、目的位置で適切に機能するために適切な二次元および三次元の立体構造を得なければならない。適切な立体構造によって、タンパク質は細胞または多細胞生物に対し、目的位置で（たとえば細胞質、核、細胞内構造、細胞小器官、細胞膜、または細胞外の（分泌された）位置で）目的の機能（たとえば酵素活性、シグナル伝達または構造的特徴）を確実に与えることができる。適切な構造および立体構造のための情報はタンパク質のアミノ酸配列に存在するが、全体の細胞内環境や多様な刺激、および酸化ストレス、栄養枯渇、高温といった環境ストレスによって、内因的に生じたタンパク質の適切な折り畳みすら困難になり、多くのタンパク質分子が望ましくない構造になるため目的の機能を細胞に与えることができなくなる可能性がある。適切な機能的立体構造を得られないまたは維持できないという頻繁に生じるリスクに対処するため、細胞は新生タンパク質や成熟タンパク質が適切な立体構造へと折り畳みおよび再折り畳みするよう補助する分子シャペロンとして機能するタンパク質の系を有する。７０ｋＤａ熱ショックタンパク質（本明細書中では「Ｈｓｐ７０」という）は多様な種の細胞内に最も広く存在するシャペロンタンパク質の種類の１つである。Ｈｓｐ７０の機構にはＪタンパク質などの補助因子（すなわちシャペロン補助因子）タンパク質およびヌクレオチド交換因子（nucleotide exchange factor（ＮＥＦ））が関与する。
【０００５】
Ｈｓｐ７０シャペロンのタンパク質折り畳みの機構の最新モデルでは、Ｈｓｐ７０はＡＴＰ結合状態とＡＤＰ結合状態を循環する。このモデルでは、Ｊタンパク質が折り畳みまたは再折り畳みが必要なタンパク質（「クライアントタンパク質」という）に結合し、ＡＴＰ結合状態のＨｓｐ７０（Ｈｓｐ７０‐ＡＴＰ）と相互作用する。Ｊタンパク質とクライアントタンパク質との複合体がＨｓｐ７０‐ＡＴＰに結合すると、ＡＴＰ加水分解が刺
激され、Ｈｓｐ７０タンパク質ではヘリックスの蓋状の部分を閉じる立体構造の変化が起こり、それによってクライアントタンパク質とＨｓｐ７０‐ＡＤＰとの相互作用が安定し、Ｊタンパク質は遊離されて別のクライアントタンパク質と自由に結合する。Ｈｓｐ７０‐ＡＤＰに結合している間、クライアントタンパク質には適切な立体構造に折り畳みまたは再折り畳みできる環境が与えられる。次に、ヌクレオチド交換因子（ＮＥＦ）がＨｓｐ７０‐ＡＤＰに結合し、その結果ＡＤＰが遊離されＡＴＰが結合する。次いで、クライアントタンパク質はＨｓｐ７０‐ＡＴＰに対する親和性が低いため（Ｊタンパク質がない場合）遊離される。クライアントタンパク質が適切な立体構造を得られなかった場合、クライアントタンパク質にＪタンパク質が再結合し、再び循環することができる。Kampinga et al., Nat. Rev., 11: 579-592 (2010)を参照のこと。このように、このモデルによれば、Ｊタンパク質は個々のクライアントタンパク質と結合し、Ｈｓｐ７０シャペロンタンパク質とも結合して橋渡しの機能をすることによってＨｓｐ７０機構において重要な役割を果たしている。この橋渡しの機能によって多様なクライアントタンパク質の捕捉とＨｓｐ７０機構への提示が容易になり、適切な立体構造への折り畳みまたは再折り畳みが促される。Ｈｓｐ７０シャペロン機構がタンパク質を適切な機能的立体構造へ折り畳みまたは再折り畳みさせようとしてもできなかった場合、Ｈｓｐ７０シャペロン機構は不適切に折り畳まれたタンパク質がアミノ酸の分解と再利用のために細胞のタンパク質分解系（たとえばプロテアソーム）へ移行されるのを促進することもできる。Ｊタンパク質の重要な役割を含め、Ｈｓｐ７０シャペロン機構の概説についてはKampinga et al, Nature Rev., 11:
579-592 (2010)およびVoisine et al., Neurobiol. Dis., 40: 12-20 (2010)を参照のこと。
【０００６】
発現されたタンパク質はこのように、適切な立体構造を維持するためのＨｓｐ７０機構による厳しい品質管理システムのもとに置かれる。タンパク質を適切に折り畳むという課題は、多様な組換え宿主細胞内で発現される外因性の（組換えの）機能性タンパク質を有用な量で生成する場合に特に懸念される課題である。この課題は真核生物の宿主細胞でも原核生物の宿主細胞でも生じ得る。細菌宿主細胞内で発現した外因性タンパク質が適切に折り畳みできなかった場合、その外因性タンパク質の不活性な分子が有毒性の可能性のある大きな凝集体を細胞内に形成することがよくある。このような凝集体を「封入体」といい、これは、無効なタンパク質折り畳みの結果、疎水性ドメインが露出した非機能立体構造となり、それによって他の不適切に折り畳まれたタンパク質分子との結合や凝集が促進されたものと考えられている。
【０００７】
タンパク質をコードする野生型遺伝子が変異すると、コードされた変異型のタンパク質がさらに細胞内で発現される可能性がある。発現されたこのような変異タンパク質は通常、野生型タンパク質の適切な機能的立体構造を得ることができず、不活性な凝集体を形成する可能性がある。このような不適切に折り畳まれた変異タンパク質種は一般的に、Ｈｓｐ７０機構によってアミノ酸の分解と再利用のために細胞のタンパク質分解系へ誘導される。不適切に折り畳まれた変異タンパク質を除去しても、当然、細胞には機能性タンパク質の損失が残り、このような機能の損失の結果は細胞を衰弱させ、あるいは致命的にもなる可能性がある。実際、プリオン関連疾患（伝染性海綿状脳症）やアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および嚢胞性線維症などの多くの疾患において、適切に折り畳まれた機能性タンパク質種の損失が実証または示唆されている。
【０００８】
真核生物に見られるタンパク質のＢＡＧファミリーのメンバーは、ヌクレオチド交換因子（ＮＥＦ）であり、Ｎ末端ドメインは多様であるが、Ｈｓｐ７０のＡＴＰａｓｅドメインと相互作用できるＨｓｐ７０結合性のＣ末端ドメイン（ＢＡＧドメイン）は保存されている。たとえばKampinga et al., Nat. Rev. Biol., 11:579-592 (2010)を参照のこと。
このように、ＢＡＧタンパク質はＨｓｐ７０シャペロン機構の動員に関与するよう設計されたタンパク質に合う形態、結合ドメイン、結合特異性を有する。ＢＡＧタンパク質はＮ
ＥＦとしてＨｓｐ７０機構に関与できるが、多くの研究では、ＢＡＧタンパク質が細胞の増殖、休眠またはアポトーシスの促進、転写複合体の形成の調節、シグナル伝達の調節などの多様な活性を制御する調節メカニズムに主に関与する可能性があることが示唆されている。たとえば、Takayama et al., Nat.Cell. Biol., 3: E237-E241 (2001)による概説
を参照のこと。近年、所望の組換えタンパク質をＢＡＧドメインに連結した場合、得られた融合タンパク質は所望のタンパク質単独の場合よりも高いレベルで発現されることが報告されている。国際公開第２０１２／０８７８３５号（Ａ２）を参照のこと。
【０００９】
一般的に、細胞内でのタンパク質の発現レベルが増加する（組換え遺伝子発現系で容易に起こり得る）と、そのタンパク質が適切な機能的立体構造へ折り畳みまたは再折り畳みしないリスクも増加する。したがって、所望の外因性または内因性タンパク質の発現を増強することが絶えず望まれてきたのとともに、細胞内で発現された外因性および内因性タンパク質の適切な折り畳みを促進する、すなわち適切な立体構造の機能性タンパク質の産生を増強するための手段が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、細胞が産生する目的の標的タンパク質の発現レベルを増強するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、遺伝子改変融合タンパク質に組み込むことができ、宿主細胞によって発現されるときに特定の目的の標的タンパク質の目的位置での発現レベルを増強することができるタンパク質発現増強ポリペプチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ある態様では、本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドは以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される：
（ａ）Ｊタンパク質から単離されたＪドメイン；
（ｂ）Ｊドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片；
（ｃ）Ｊドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドアナログであって、該Ｊドメインアナログポリペプチドは式Ｉのアミノ酸配列を有する、タンパク質発現増強ポリペプチドアナログ：
（Ｉ）Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｘ９（配列番号４７）：
（式中、Ｘ１はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がＫまたはＲであり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であるか；Ｘ１〜Ｘ３が存在しＸ５〜Ｘ９が存在する場合、Ｘ４は存在しなくてもよく、
Ｘ５はチロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、またはフェニルアラニン（Ｆ）であり、Ｘ６およびＸ７はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であるか；Ｘ６およびＸ７のいずれか一方がＫまたはＲであり、Ｘ１〜Ｘ５が存在しＸ８およびＸ９が存在する場合、Ｘ６およびＸ７の他方は存在しなくてもよく、
Ｘ８およびＸ９は任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がロイシン（Ｌ）またはアラニン（Ａ）であるか；Ｘ８およびＸ９の一方がＬまたはＡでありＸ１〜Ｘ７が存在する場合、Ｘ８およびＸ９の他方は存在しなくてもよい）；および
（ｄ）以下からなるデカペプチド群から選択される単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド：
ＩＫＫＡＹＫＬＡＬＱ（配列番号４９）、
ＩＫＫＡＹＲＬＡＬＱ（配列番号５０）、
ＩＫＫＡＹＲＫＡＬＱ（配列番号５１）、および
ＩＫＫＡＹＲＫＬＬＱ（配列番号５２）。
【００１２】
本発明に従い、タンパク質発現増強ポリペプチドによって、宿主細胞内で発現される目的の標的タンパク質の発現レベルは該タンパク質発現増強ポリペプチドが存在しない場合の目的の標的タンパク質の発現レベルに比べて増強される。本発明のポリペプチドを用いることによって、産生細胞の所望の位置（区画）に存在する所望の組換えタンパク質の量を増加させる手段が得られる。
【００１３】
特定の態様では、本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドは、下記の表１−１〜表１−４に示すＪドメイン配列から選択されるアミノ酸配列を有する単離されたＪドメインである。
【００１４】
本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドは、Ｅｒｄｊタンパク質、ＳＶ４０ラージＴ抗原、または哺乳類のシステインストリングタンパク質α（ＣＳＰ‐α）から単離されたＪドメインであることが好ましい。本発明にかかる、Ｅｒｄｊタンパク質から単離されたＪドメインとしては、Ｅｒｄｊ１、Ｅｒｄｊ２、Ｅｒｄｊ３、Ｅｒｄｊ４、Ｅｒｄｊ５、Ｅｒｄｊ６、またはＥｒｄｊ７から単離されたＪドメインが好ましい。Ｅｒｄｊ３から単離されたＪドメインが特に好ましい。
【００１５】
別の態様では、本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドはＪドメインのポリペプチド断片であり、以下から選択されるアミノ酸配列を有する：
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ（配列番号４８）、
Ｉ‐Ｒ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｔ‐Ｌ（配列番号８３）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｑ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｌ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号８４）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｆ‐Ｈ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｍ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号８５）、
Ｉ‐Ｒ‐Ｑ‐Ａ‐Ｆ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｌ（配列番号８６）、
Ｉ‐Ｉ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｑ‐Ｗ（配列番号８７）、
Ｉ‐Ａ‐Ｒ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｑ‐Ｌ‐Ａ‐Ｒ‐Ｒ‐Ｙ（配列番号８８）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｒ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｒ‐Ｑ‐Ａ‐Ｌ‐Ｒ‐Ｙ（配列番号８９）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｓ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号９０）および
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｋ‐Ｒ‐Ｌ‐Ａ‐Ｍ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号９１）。
【００１６】
別の態様では、タンパク質発現増強ポリペプチドは上記式Ｉのアミノ酸配列を有するＪドメインアナログポリペプチドである。特定の態様では、本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドは配列Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｘ９（配列番号４７）を有するポリペプチドを含み、
Ｘ１はＩ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＭであり、
ジペプチドＸ２〜Ｘ３はＫＲ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＲ、ＡＫ、ＡＲ、ＫＡ、ＩＫ、ＮＫ、ＫＱ、ＲＱ、ＲＤからなる群から選択され、
Ｘ４はＡ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、またはＩであり、
Ｘ５はＹまたはＦであり、
ジペプチドＸ６‐Ｘ７はＫＲ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＲ、ＲＱ、ＦＲ、ＲＬ、ＫＬ、ＨＫ、ＬＫ、ＱＫ、ＫＶからなる群から選択され、
ジペプチドＸ８‐Ｘ９はＬＡ、ＬＬ、ＡＬ、ＡＡ、ＬＣ、ＬＶ、ＱＡ、ＫＡ、ＬＳ、ＬＩ、ＬＹ、およびＲＡからなる群から選択される。
【００１７】
特定の態様では、本発明のＪドメインアナログポリペプチドは以下のアミノ酸配列の１つを含む。
【００１８】
【表Ａ】
0006688237.tif 000002
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と融合させた融合タンパク質を提供する。ここで、該タンパク質発現増強ポリペプチドである融合パートナーは、Ｊタンパク質のＪドメイン、目的のタンパク質である融合パートナーの発現を増強する能力を有するＪドメイン断片、または上記式Ｉ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有するＪドメインアナログポリペプチドである。この融合タンパク質を発現させると、融合された目的の標的タンパク質の発現は、タンパク質発現増強ポリペプチドである融合パートナーを使用しない場合の目的の標的タンパク質の発現に比べて増加する。標準の方法を用いてこの融合タンパク質からタンパク質発現増強ポリペプチド部分を除去することによって、目的の標的タンパク質の回収率が増加する。
【００２０】
本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた本発明の融合タンパク質を、あるタンパク質機能を与える天然分泌タンパク質の分泌が不足した哺乳類患者の細胞に該タンパク質機能を回復させる方法に使用してもよい。この方法は、上記タンパク質発現増強ポリペプチドを該分泌タンパク質と連結させた融合タンパク質をコードする外因性核酸分子を該哺乳類患者（ヒト、ヒト以外の霊長類、齧歯類、または家畜など）の細胞に挿入する工程を包含し、該融合タンパク質を発現させることによって、該外因性核酸が存在しない場合は該患者の細胞での分泌が不足している該天然分泌タンパク質の機能が与えられる。
【００２１】
好ましい態様では、哺乳類患者の細胞のタンパク質機能を回復させる上記方法は、天然分泌タンパク質の分泌不足に関連する疾患を有する患者を治療するために用いられる。このような疾患としては、プリオン関連疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症（ＣＦ）、α１アンチトリプシン欠損症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましい態様では、タンパク質機能を回復させる方法は、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御（ＣＦＴＲ）タンパク質の分泌が不足したヒト患者を治療するために用いられ、該疾患は嚢胞性線維症である。この態様では、該ヒト患者の細胞に挿入する外因性核酸分子は、上記タンパク質発現増強ポリペプチドをＣＦＴＲと連結させた融合タンパク質をコードする。該ヒト患者の細胞内で該融合タンパク質を発現させることによってＣＦＴＲ機能の不足から回復させる。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、タンパク質発現増強ポリペプチドを標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質を提供する。ここで該タンパク質発現増強ポリペプチド要素は、Ｊタンパク質のＪドメイン、目的のタンパク質である融合パートナーの発現を増強する能力を有するＪドメイン断片、または上記式Ｉ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有するＪドメインアナログポリペプチドであり、該標的タンパク質結合ドメインは、該融合タンパク質と目的の標的タンパク質を同一の宿主細胞内で共発現させた場合に目的の標的タンパク質に結合することができるポリペプチドであ。目的の標的タンパク質に結合する融合タンパク質によって、該標的タンパク質の発現レベルおよび／または適切な細胞内位置または細胞外位置にある該標的タンパク質のレベルが増強される。したがって、発現量が十分でないか適切な細胞内位置または細胞外位置に発現されていない目的の標的タンパク質の発現レベルを特定の目的で増強するために、本明細書に記載の融合タンパク質を用いることができる。本明細書に記載の融合タンパク質が有用となる状況としては、所望の量の目的の内因性タンパク質または異種性（組換え）タンパク質を細胞培養液中で発現させられない場合や、十分なレベルのタンパク質を生体内で発現させられない場合などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。生体内では、１種以上の機能性タンパク質の発現が不十分な場合、病理的状態（プリオン関連疾患（伝染性海綿状脳症）やアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症、α１アンチトリプシン欠損症などが挙げられるが、これらに限定されるものではない）につながる。
【００２３】
本発明の融合タンパク質が発現レベルの増強および／または所望の細胞内位置または細
胞外位置での発現の増強の標的とするタンパク質は、可溶性タンパク質、膜結合タンパク質、または分泌タンパク質であり得る。
【００２４】
本発明の融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインは標的タンパク質に結合するポリペプチドである。標的結合ドメインは標的タンパク質に対し、標的タンパク質の発現レベルの増強を妨げないよう他のタンパク質を排除するために十分に特異的な結合親和性を有することが好ましい。本発明の標的結合ドメインとして使用できるポリペプチドとしては、標的タンパク質に結合する抗体またはその抗原結合部分、標的免疫グロブリンに結合する免疫グロブリン特異的結合タンパク質（タンパク質Ａ、タンパク質Ｌ、タンパク質Ｇなど）またはその断片、標的タンパク質のＦｃドメインに結合するＦｃ結合タンパク質（タンパク質Ａ、タンパク質Ｇなど）、標的タンパク質のＦｃドメインに結合するＦｃ結合ペプチド、目的の標的タンパク質に結合する受容体タンパク質のリガンド結合ドメイン、標的タンパク質のタンパク質リガンド（受容体のタンパク質リガンドなど）、標的タンパク質のＰＤＺ結合ドメインに結合するＰＤＺタンパク質のＰＤＺドメインなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の一態様では、標的タンパク質がサイトカインである場合、本発明の融合タンパク質の標的結合ドメインは、標的サイトカインタンパク質に結合するサイトカイン受容体タンパク質のリガンド結合ドメインを含み得る。
【００２６】
別の態様では、標的タンパク質が受容体タンパク質またはそのリガンド結合部分である場合、本発明の融合タンパク質の標的結合ドメインは、該受容体またはそのリガンド結合部分が結合するタンパク質リガンドを含み得る。好ましい態様では、標的タンパク質がサイトカイン受容体タンパク質またはそのサイトカイン結合部分である場合、該標的結合ドメインはサイトカイン受容体または当該受容体のサイトカイン結合部分が結合するサイトカインを含む。
【００２７】
嚢胞性線維症膜通過伝導率制御（ＣＦＴＲ）タンパク質などの標的タンパク質がＰＤＺ結合ドメインを有する態様では、本発明の融合タンパク質の標的結合ドメインはＰＤＺドメインを有する多様なタンパク質のいずれか１種に由来するＰＤＺドメインを含み得る。好ましい態様では、標的タンパク質がＰＤＺ結合ドメインを有する場合、本発明の融合タンパク質の標的結合ドメインは、ＰＤＺアダプタータンパク質のＮＨＥＲＦファミリーに属する任意のタンパク質に由来するＰＤＺドメインを含む。ＮＨＥＲＦファミリーに属するＰＤＺアダプタータンパク質としては、ＮＨＥＲＦ１（ＮＨＥＲＦ、ＥＢＰ５０、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１としても知られる）、ＮＨＥＲＦ２（Ｅ３ＫＡＲＰまたはＳＬＣ９Ａ３Ｒ２としても知られる）、ＰＤＺＫ１（ＣＡＰ７０またはＮＨＥＲＦ３としても知られる）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の標的タンパク質結合融合タンパク質の特定の態様では、Ｊタンパク質のＪドメインまたはその活性な（発現を増強する）断片、または式Ｉのタンパク質発現増強ポリペプチドがリンカーペプチドを介してまたはリンカーペプチドを介さずに標的タンパク質結合ドメインに融合されている。本発明の標的タンパク質結合融合タンパク質にリンカーペプチドを用いる場合、リンカーは１個以上のアミノ酸であり、たとえば１〜１０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、さらに１〜５０個のアミノ酸などであり得る。一般的にはリンカーは２０個以下のアミノ酸であり、標的タンパク質結合ドメインとタンパク質発現増強ポリペプチドのいずれの機能についても妨害しない（かつ増強することが望ましい）ように選択または設計される。リンカーを用いる場合、リンカーは融合タンパク質の両方の要素を最適に寄与させて目的の標的タンパク質の発現および／または適切に配置のレベルが増強されるように選択されることが好ましい。標的タンパク質結合ドメインにタンパク質発現増強ポリペプチドを直接結合してもいずれかの要素の機能が許容できないほど低
下したり、あるいは標的タンパク質の発現および／または配置のレベルに所望される増強が許容できないほど低下したりしなければ、リンカーはなくてもよい。
【００２９】
本発明の融合タンパク質に有用なリンカーとしては、酵素で切断可能なペプチド、すなわち酵素切断部位を挙げることができる。酵素は、たとえばエンテロキナーゼ、エンテロキナーゼの軽鎖、トロンビン、ウロキナーゼ、タバコエッチウイルス（tobacco etch virus（ＴＥＶ））プロテアーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（matrix metalloproteinase（ＭＭＰ））、セラリシン、アスタシン、アダマリシン、ディスインテグリン、ＡＤＡＭ、カスパーゼ、カテプシン、カルパインなどである。本明細書に記載の融合タンパク質に切断可能なリンカーを用いることは、融合タンパク質の機能を停止させるか緩やかにする、あるいは細胞内や標的タンパク質分子の集団から融合タンパク質の存在を排除するのに有利となり得る。一部の細胞は、対応するタンパク質分解性の認識部位を含む、ポリペプチドリンカー分子を切断できる１種以上の細胞内プロテアーゼを有する。したがって、本発明の融合タンパク質に使用する、細胞内で発現された後に細胞内プロテアーゼによって融合タンパク質を切断できるような切断可能なリンカーを選択することができる。
【００３０】
本発明の融合タンパク質はさらに、融合タンパク質の検出または単離を補助するエピトープタグを含んでいてもよい。本発明において有用なエピトープタグとしては、ポリヒスチジンタグ（ヘキサヒス（hexaHis）など）、Ｖ５エピトープタグ、Ｍｙｃエピトープタ
グ、Ｆｌａｇエピトープタグ、ＨＡ（ヒトインフルエンザ血球凝集素（human influenza hemagglutinin））エピトープタグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明の融合タンパク質は、標的タンパク質単独の場合、すなわち融合タンパク質が存在しない場合の発現レベルに比べ、標的タンパク質の発現レベルを増強することが実証されている。本明細書に記載の方法に従えば、目的の標的タンパク質の発現レベルを少なくとも約１．５倍、また、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、２５倍以上まで増加させることができる。本発明の融合タンパク質は、適切な細胞内位置または細胞外位置に存在する標的タンパク質のレベルも増強する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、融合タンパク質を個体に与えて標的タンパク質の発現を増強するのに有用な、該融合タンパク質を含有する組成物を提供する。本発明の組成物には、融合タンパク質と医薬的に許容可能な担体とを含有する、ヒトを含む個体の疾患または障害の治療に使用するための医薬組成物も包含される。本明細書に記載の融合タンパク質を含有する医薬組成物はさらに、治療に有効な他の化合物を１種以上含有してもよい。本発明の医薬組成物に組み入れてもよい治療に有効な追加の化合物の例としては、抗生物質、抗ウイルス性化合物、抗がん性化合物、鎮静剤、刺激剤、局所麻酔剤、副腎皮質ステロイド、鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、非ステロイド抗炎症薬（non-steroid anti-inflammatory drug（ＮＳＡＩＤ））、およびそれらの適切な組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
本発明はさらに、本明細書に記載の融合タンパク質の１種によって発現が増強される目的の標的タンパク質が与えることのできる機能または特性の損失または減少を特徴とする疾患状態についてヒトまたは動物である患者を治療する方法を提供する。当該方法には、治療を必要とする患者に対し本明細書に記載の融合タンパク質を投与することが包含され得る。
【００３４】
本発明はさらに、Ｊタンパク質から単離されたＪドメイン、目的の標的タンパク質の発現を増強する能力を有する単離されたＪドメイン断片、および式Ｉ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有する単離されたＪドメインアナログポリペプチドからなる群から選択され
る上記タンパク質発現増強ポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供する。
【００３５】
本発明はさらに、上記の単離された核酸を含む核酸ベクターを提供する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、上記の単離された核酸または核酸ベクターを含む宿主細胞を包含する。
【００３７】
本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。本発明の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を挿入した組換えベクター分子も提供される。このような組換えベクター分子には、挿入した核酸を形質移入宿主細胞内で複製するためのクローニングベクターを含む組換えベクター分子や、コードされた融合タンパク質を適合する形質移入宿主細胞内で発現させるための発現ベクターが包含される。当技術分野において入手可能な多様な発現ベクターから任意の発現ベクターを本発明の融合タンパク質の生成に使用することができる。本発明の融合タンパク質を発現させるのに有用な発現ベクターの例としては、プラスミドｐｃＤＮＡ、pcDNA3.3 TOPO（Life Technologies, New York）、プラスミドｐＴＴ３、プラスミドｐＥＦ‐ＢＯＳなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
本発明はさらに、単離されたＪドメイン、活性なＪドメイン断片、または式ＩのＪドメインアナログをコードする単離された核酸を挿入した、本発明の融合タンパク質を適合する宿主細胞内にインビトロで発現させるのに使用するための発現ベクター分子を提供する。
【００３９】
本発明の発現ベクターには、植物または動物（ヒト、ヒト以外の霊長類、齧歯類、家畜などの哺乳類を含む）の損失または不足した標的タンパク質機能を回復させるための遺伝子治療において本発明の融合タンパク質を生体内で発現させるための遺伝子治療ベクターも包含される。
【００４０】
別の側面では、本発明は、本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドまたは本明細書に記載の融合タンパク質を発現するための発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明において有用な宿主細胞としては真核生物宿主細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましい真核生物宿主細胞としては、哺乳類宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核藻類宿主細胞、線虫宿主細胞、原虫宿主細胞、魚類宿主細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary（ＣＨＯ））細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅ
ｒｏ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓（human embryonic kidney（ＨＥＫ２９３））細胞、ベビーハムスター腎臓（baby hamster kidney（ＢＨＫ））
細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＢ細胞、ＣＶ‐１／ＥＢＮＡ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＰｅｒＣ６細胞、またはＭＤＣＫ細胞であることが好ましい。好ましい真菌宿主細胞としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属が挙げられる。サッカロミセス属宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞であることがより好ましい。
【００４１】
本発明は、Ｊタンパク質のＪドメイン、そのタンパク質発現増強断片、または式ＩのＪドメインアナログを目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質を発現する方法であって、該融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含むベクター分子を含む宿
主細胞を該融合タンパク質の産生に十分な条件下で培養することを含む、方法を提供する。
【００４２】
別の態様では、本発明は、Ｊタンパク質のＪドメイン、そのタンパク質発現増強断片、または式ＩのＪドメインアナログを目的の標的タンパク質に連結させた上記融合タンパク質を発現する方法であって、該融合タンパク質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に形質移入することと、形質移入された該宿主細胞を該融合タンパク質の発現を生じる条件下で培養することとを含む、方法を提供する。
【００４３】
本発明はさらに、本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質に連結させた融合タンパク質を発現する方法であって、
１）該融合タンパク質をコードする組換え遺伝子配列を構築する工程と、
２）該組換え遺伝子配列を発現ベクターに挿入し、該組換え遺伝子配列が転写プロモーター配列に作動可能に連結された組換え発現ベクターを形成する工程と、
３）該プロモーター配列と適合する宿主細胞に該組換え発現ベクターを形質移入する工程と、
４）形質移入された該宿主細胞を、該融合タンパク質を発現可能な条件下で培養する工程とを含む方法を提供する。
【００４４】
本発明はさらに、本明細書に記載の単離された発現増強ポリペプチドを標的タンパク質結合ドメインに連結させた融合タンパク質を発現する方法であって、該融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を該融合タンパク質の産生に十分な条件下で培養することを含む、方法を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、宿主細胞が発現する目的の標的タンパク質の発現を増強する方法であって、上記のＪタンパク質から単離されたＪドメイン、目的の標的タンパク質の発現を増強する能力を有する単離されたＪドメイン断片、または式Ｉ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有する単離されたＪドメインアナログポリペプチドを標的タンパク質結合ドメインに連結させた融合タンパク質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターを該宿主細胞に形質移入することと、形質移入された該宿主細胞を該構造遺伝子がコードする該融合タンパク質と該目的の標的タンパク質の共発現を生じる条件下で培養することとを含む、方法を提供する。
【００４６】
本発明は、目的の標的タンパク質の発現を増強する方法であって、（ａ）Ｊタンパク質のＪドメイン、その活性な断片、または式ＩのＪドメインアナログを標的タンパク質結合ドメインに連結させた、該目的の標的タンパク質に結合する融合タンパク質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターを用いて宿主細胞を形質移入することと、（ｂ）形質移入した該宿主細胞を、該構造遺伝子上にコードされた該融合タンパク質の発現が生じる条件下で培養することとを含む、方法を提供する。該構造遺伝子はさらに、該Ｊドメイン／Ｊドメイン断片／Ｊドメインアナログ要素と該標的タンパク質結合ドメイン要素とを連結するリンカーペプチドをコードする任意選択可能なセグメントを含んでもよく、エピトープタグ、酵素切断部位などをコードするセグメントを含んでもよい。該方法は、以下の工程によって有利に実行できる：
１）タンパク質発現増強ポリペプチドを標的結合ドメインに連結させた融合タンパク質をコードする組換え遺伝子配列を構築する工程と、
２）該組換え遺伝子配列を発現ベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製する工程であって、該組換え遺伝子配列は転写プロモーター配列に作動可能に連結されている、工程と、
３）該プロモーター配列と適合する適切な宿主細胞を該組換え発現ベクターで形質移入する工程と、
４）形質移入した該宿主細胞を、該融合タンパク質の発現を生じる条件下で培養する工程。
【００４７】
本発明のある態様では、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を植物またはヒト以外の動物の細胞に挿入し、融合タンパク質を発現させ、標的タンパク質の発現レベルを増強することによって、欠損した機能または所望の機能をその植物またはヒト以外の動物に与える。このような方法にはトランスジェニック植物およびヒト以外のトランスジェニック動物の作製が包含され、融合タンパク質をコードする核酸が機能性遺伝子（導入遺伝子）として永久的にゲノムに組み込まれ、該植物またはヒト以外の動物が該融合タンパク質を発現するのみならず発現可能な該導入遺伝子のコピーが子孫に伝えられる。
【００４８】
別の態様では、本発明は、標的タンパク質の発現が不足した患者の細胞に該標的タンパク質によって与えられる機能を回復させる方法であって、本発明の融合タンパク質をコードする外因性核酸分子を該患者の細胞に挿入することを包含し、該外因性核酸分子を該細胞へ挿入した後、該融合タンパク質が発現されて該標的タンパク質の発現レベルを増強する（この増強は該内因性標的タンパク質が安定すること、適切に折り畳まれた標的タンパク質の量が増加すること、該標的タンパク質の所望の細胞区画または細胞外区画への配置が改善すること（たとえば分泌タンパク質の分泌の改善）などによるものである可能性がある）ことによって、該外因性核酸が存在しない場合には患者の細胞内で発現が不足している該標的タンパク質の機能が与えられる、方法を提供する。このような方法は、タンパク質の発現不足に関連する疾患を有する患者を治療するのに特に有用である。このような疾患としては、プリオン関連疾患（伝染性海綿状脳症）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましい態様は、該患者が嚢胞性線維症膜通過伝導率制御（ＣＦＴＲ）タンパク質の発現が不足したヒト患者であり、該疾患が嚢胞性線維症である、方法、または該患者がα１アンチトリプシンが不足したヒト患者であり、該疾患がα１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症である、方法である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、実施例２に記載の一連の実験を示す。実施例２では、目的の標的タンパク質（ＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質）をＪドメイン（Ｈｓｐ４０、ＳＶ４０、またはCSP Jタンパク質由来）と連結させた改変配列の場合、標的タンパク質の発現レベルが同タンパク質単独の場合（ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ）またはＢＡＧドメイン（ＢＡＧ３、ＢＡＧ４、ＢＡＧ５またはＢＡＧ６タンパク質由来）との融合タンパク質として発現した場合に比べて改善したことを実証する。図１Ａは、宿主細胞の形質移入に用いる発現ベクタープラスミドに挿入される構造遺伝子の図を示す。ＩＬ１３Ｒα２タンパク質（野生型タンパク質（「ＷＴ」））をコードするｃＤＮＡの３’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加し、「ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ」発現産物を得た。ＢＡＧドメイン融合タンパク質については、ＩＬ１３Ｒα２をコードするｃＤＮＡを、ＢＡＧドメインをコードするセグメントとインフレームで連結させ、さらにＶ５エピトープタグをコードするセグメントと連結させてＢＡＧドメイン融合タンパク質発現産物を得た。本発明のＪドメイン融合タンパク質については、ＩＬ１３Ｒα２をコードするｃＤＮＡを、Ｊドメインをコードするセグメントとインフレームで連結させ、さらにＶ５エピトープタグをコードするセグメントと連結させてＪドメイン融合タンパク質発現産物を得た。図１Ｂは、細胞可溶化物のウェスタンブロット（免疫ブロット）分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、形質移入細胞内で発現された標識ＩＬ１３Ｒα２野生型（ＷＴ）タンパク質またはその融合タンパク質対照物の相対レベルを示す。Ｊタンパク質Ｈｓｐ４０、ＳＶ４０またはＣＳＰのＪドメインを目的のＩＬ１３Ｒα２タンパク質に対する融合パートナーとして採用した結果、野生型ＩＬ１３Ｒα２タンパク質（ＷＴ）またはそのＢＡＧタンパク質ＢＡＧ３、ＢＡＧ４、ＢＡＧ５、ＢＡＧ６のＢＡＧドメインとの融合タンパク質対照物のいずれと比較してもタンパク質発現レベルが有意に高くなったことがわかる。形質移入に成功したことと形質移入体が作動可能であることがわかるように、形質移入体はすべて緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein（ＧＦＰ））を発現するレポータープラスミドと共に形質移入した。図１Ｂの下図を参照のこと。図１Ｃは、図１Ｂの免疫ブロットにおける化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図１Ｃの棒グラフは、分泌された３種類すべてのＩＬ１３Ｒα２‐Ｊドメイン融合タンパク質の発現レベルが４種類のいずれのＩＬ１３Ｒα２‐ＢＡＧドメイン融合タンパク質または野生型ＩＬ１３Ｒα２タンパク質の発現レベルと比較しても（ＩＬ１３α２ＷＴの発現量を１００％とする）有意に高いことを明確に示している。
【図２】図２は実施例２に記載の実験の結果を示す。この実験では、ＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質の切断型（truncated form（「ＴＦ」））（リガンド結合ドメインを含むＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質の細胞外部分）をＪドメインと連結させた改変配列（Ｊ‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）の場合に切断型受容体タンパク質単独（ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）の場合と比較してみられる、目的の標的分泌タンパク質の発現レベルの改善について試験した。図２Ａは、宿主細胞の形質移入に用いる発現ベクタープラスミドに挿入される構造遺伝子構築物の図を示す。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦをコードするｃＤＮＡの３’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加し、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ発現産物を得た。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦをコードするｃＤＮＡの３’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加し、５’末端にＪドメイン（Ｊタンパク質Ｅｒｄｊ３由来）をコードするセグメントを連結させて本発明のＪドメイン融合タンパク質発現産物（Ｊ‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）を得た。図２Ｂはウェスタンブロットの化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、細胞（細胞可溶化物）内で発現され培地（培養液）へ分泌された、Ｖ５エピトープタグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質とそのＪドメイン融合タンパク質対照物の相対レベルを示す。Ｊドメインを目的のＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質に対する融合パートナーとして採用した結果、Ｊドメインを含まないＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質と比較してタンパク質発現レベルが有意に高くなったことがわかる。形質移入に成功したことと形質移入体が作動可能であることがわかるように、形質移入体はすべて緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein（ＧＦＰ））を発現するレポータープラスミドと共に形質移入した。図２Ｂの下図を参照のこと。疑似培養液には、「空の」ベクター、すなわちいずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた。
【図３】図３は実施例２に記載の実験の結果を示す。この実験では、切断型受容体タンパク質（ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）、ＢＡＧドメイン‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質（ＢＡＧ‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）、Ｊドメイン‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質（Ｊ‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）を発現するための発現ベクターを用いて形質移入した宿主細胞が培地に分泌したタンパク質の相対発現レベルを比較した。図３Ａは、形質移入細胞が培地に分泌したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ、ＢＡＧドメイン‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質、Ｊドメイン‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質のドットブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像を示す。すべてのタンパク質に、抗Ｖ５抗体で免疫検出できるようにＶ５エピトープを担持させた。図３Ｂは、図３Ａの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図３Ｂの棒グラフは、分泌されたＪドメイン‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質（棒グラフ４）の発現レベルが、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（棒グラフ２）とＢＡＧドメイン‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質（棒グラフ３）のいずれと比較しても有意に高かったことを明確に示している。疑似培養液（棒グラフ１）には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた。
【図４】図４は、実施例２に記載の実験の結果を示す。この実験では、α１ＡＴをＪドメイン融合パートナーと連結（融合）させた改変配列の場合に同タンパク質単独の場合またはＢＡＧドメインとの融合物として発現された場合と比較してみられる、分泌されるα１アンチトリプシン（α１ＡＴ）の発現レベルの改善について試験した。図４Ａは、宿主細胞の形質移入に用いる発現ベクタープラスミドに挿入される構造遺伝子構築物の図を示す。α１ＡＴをコードするｃＤＮＡの３’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加し、α１ＡＴ発現産物を得た。α１ＡＴをコードするｃＤＮＡを、ＢＡＧドメインをコードするセグメントとインフレームで連結し、さらにＶ５エピトープタグをコードするセグメントと連結し、ＢＡＧドメイン融合タンパク質（α１ＡＴ‐ＢＡＧ）発現産物を得た。α１ＡＴをコードするｃＤＮＡを、Ｊドメインをコードするセグメントとインフレームで連結し、さらにＶ５エピトープタグをコードするセグメントと連結し、本発明のＪドメイン融合タンパク質（α１ＡＴ‐Ｊ）発現産物を得た。図４Ｂは、培地へ分泌されたα１ＡＴタンパク質または分泌されたその融合タンパク質対照物の相対発現レベルを示す、ドットブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像を示す。Ｊドメインを目的のα１ＡＴタンパク質に対する融合パートナーとして採用した（α１ＡＴ‐Ｊ）結果、分泌タンパク質（α１ＡＴ‐Ｊ）の発現レベルが、α１ＡＴタンパク質単独の場合またはそのＢＡＧドメイン融合対照物（α１ＡＴ‐ＢＡＧ）の場合と比較して有意に高くなったことがわかる。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた。図４Ｃは、図４Ｂの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図４Ｃの棒グラフは、分泌されたα１ＡＴ‐Ｊ融合タンパク質（棒グラフ４）の発現レベルが、（融合していない）α１ＡＴ（棒グラフ２）タンパク質とＢＡＧドメイン‐α１ＡＴ融合タンパク質（棒グラフ３）のいずれと比較しても有意に高かったことを明確に示している。
【図５】図５は、実施例２に記載の実験の結果を示す。この実験では、分泌された切断型のＴＮＦ‐α受容体１（ＴＮＦＲ１ＴＦ）タンパク質をＪドメイン融合パートナーと連結させた改変配列の場合、ＴＮＦＲ１ＴＦの発現レベルが同タンパク質単独の場合（ＴＮＦＲ１ＴＦ）と比較して改善することを実証する。図５Ａは、宿主細胞の形質移入に用いる発現ベクタープラスミドに挿入される構造遺伝子構築物の図を示す。ＴＮＦＲ１ＴＦをコードするｃＤＮＡの３’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加し、ＴＮＦＲ１ＴＦ発現産物を得た。ＴＮＦＲ１ＴＦをコードするｃＤＮＡを、Ｊドメインをコードするセグメントとインフレームで連結させ、さらにＶ５エピトープタグをコードするセグメントと連結させ、本発明のＪドメイン融合タンパク質発現産物を得た。図５Ｂは、培地に分泌されたＴＮＦＲ１ＴＦおよびＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｊドメイン融合タンパク質の相対レベルを示す、ドットブロットの化学発光シグナルのＸ線フィルム画像である。Ｊドメインを目的のＴＮＦＲ１ＴＦタンパク質に対する融合パートナーとして採用した（ＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｊ）結果、（融合していない）ＴＮＦＲ１ＴＦタンパク質よりも分泌タンパク質の発現が有意に高くなったことがわかる。図５Ｃは図５Ｂのドットブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図５Ｃの棒グラフは、分泌されたＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｊドメイン融合タンパク質（棒グラフ３）の発現レベルがＴＮＦＲ１ＴＦ（棒グラフ２）に比べて有意に高いことを明確に示している。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現する構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた。
【図６】図６は、実施例２に記載の一連の実験の結果を示す。この実験では、３種の目的の標的タンパク質のそれぞれをＪドメイン融合パートナーと連結させた改変配列の場合、目的の標的Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルが改善することを実証する。図６Ａはこの実施例に使用した構造遺伝子構築物の図を示す。Ｆｃ融合タンパク質を得るため、目的のタンパク質（ＴＮＦＲ１ＴＦ、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦまたはα１ＡＴ）のそれぞれをコードするｃＤＮＡの３’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加し、さらに免疫グロブリンＦｃ領域の定常ドメインをコードするセグメント（「Ｆｃ」）と連結させた。Ｊドメインを融合するために、ＪドメインをコードするｃＤＮＡを、目的のタンパク質のそれぞれをコードするｃＤＮＡとＶ５エピトープタグをコードするセグメントとの間にインフレームで連結させた。図６Ａを参照のこと。図６Ｂは、形質移入細胞の培養液の培地中に分泌されたタンパク質のドットブロット分析を示す。各Ｆｃ融合タンパク質（ＴＮＦＲ１‐Ｖ５‐Ｆｃ、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃおよびα１ＡＴ‐Ｆｃ）を、図６Ｂの各図の中央レーンのドットブロットに示す培地で発現させた。このＦｃ融合タンパク質の発現レベルは目的の各タンパク質単独（すなわちＦｃドメインと融合していない場合（データは示さず））の場合よりも高かった。図６Ｂの各図の右レーンのドットブロットに示すように、Ｆｃ融合タンパク質に含まれる目的のタンパク質のセグメントにＪドメインを連結させたいずれの場合にも、有意に高い発現レベルが観察された。図６Ｂのドットブロットの化学発光シグナルを濃度分析した結果が図６Ｃ中の対応する図に示されており、図６Ｃの各図の棒グラフ２（目的のタンパク質‐Ｆｃ融合タンパク質）と棒グラフ３（目的のタンパク質‐Ｊドメイン‐Ｆｃ融合タンパク質）とを比較すれば、Ｊドメイン融合タンパク質の発現レベルが有意に高いことが明らかに明白である。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現させるための構造遺伝子も含まない発現ベクターで形質移入した細胞を入れた。
【図７】図７は、実施例２に記載の実験の結果を示す。この実験では、細胞質ｐ５３タンパク質をＪドメイン融合パートナーと連結（融合）させた改変配列の場合、ｐ５３タンパク質単独の場合と比較してｐ５３タンパク質の発現レベルが改善することを実証する。図７Ａは、この実験に用いた構築物の図を示す。ｐ５３をコードするｃＤＮＡの５’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加し、ｐ５３発現産物を得た。ｐ５３をコードするｃＤＮＡの５’末端を、SV40 Jタンパク質のＪドメインをコードするセグメントとインフレームで連結させ、さらにその５’末端とＶ５エピトープタグをコードするセグメントとを連結させ、本発明のＪドメイン融合タンパク質（Ｊ‐ｐ５３）発現産物を得た。図７Ｂは、細胞可溶化物のウェスタンブロットの化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、細胞内での標識ｐ５３タンパク質とそのＪドメイン融合タンパク質対照物（Ｊ‐ｐ５３）の相対発現レベルを示す。Ｊドメインを目的のｐ５３タンパク質に対する融合パートナーとして採用した（Ｊ‐ｐ５３）結果、形質移入細胞内での発現レベルが、Ｊドメインを含まないｐ５３タンパク質（ｐ５３）を形質移入細胞内で発現させた場合と比較して有意に高くなったことがわかる。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現する構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた。
【図８】図８は実施例２に記載の一連の実験の結果を示す。この実験では、２種の目的の標的タンパク質、すなわち野生型ＣＦＴＲタンパク質および対応するＣＦＴＲΔ５０８Ｆ変異タンパク質（５０８位のフェニルアラニン残基を欠失させた結果、ＣＦＴＲΔ５０８Ｆ変異タンパク質は不完全に折り畳まれ、急速に分解した）の各タンパク質をドメイン融合パートナーと連結（融合）させた改変配列の場合、各タンパク質単独の場合またはＢＡＧドメインとの融合タンパク質として発現された場合と比べて発現レベルが改善することを実証する。図８Ａは、宿主細胞の形質移入に用いる発現ベクタープラスミドに挿入する構築物の図を示す。目的の各タンパク質、すなわち野生型ＣＦＴＲタンパク質（CFTR WT）またはＣＦＴＲΔ５０８Ｆ変異タンパク質（Δ５０８Ｆ）をコードするｃＤＮＡの５’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加した。ＢＡＧドメイン融合タンパク質を得るため、ＢＡＧドメインをコードするｃＤＮＡを、目的の各タンパク質をコードするｃＤＮＡとＶ５エピトープタグをコードする５’セグメントとの間にインフレームで連結させた。本発明のＪドメイン融合タンパク質発現産物を得るため、ＳＶ４０のＪドメインをコードするｃＤＮＡを、目的の各タンパク質をコードするｃＤＮＡとＶ５エピトープタグをコードする５’セグメントとの間にインフレームで連結させ、Ｊドメイン融合タンパク質発現産物を得た。図８Ａを参照のこと。図８Ｂは、細胞可溶化物のウェスタンブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、細胞内での目的の標識タンパク質（CFTR WTおよびＣＦＴＲΔ５０８Ｆ）、ＢＡＧドメイン融合タンパク質（ＢＡＧ‐CFTR WTおよびＢＡＧ−ＣＦＴＲΔ５０８Ｆ）、Ｊドメイン融合タンパク質（J-CFTR WTおよびＪ‐ＣＦＴＲΔ５０８Ｆ）の相対発現レベルを示す。ＪドメインをCFTR WTおよびＣＦＴＲΔ５０８Ｆタンパク質に対する融合パートナーとして採用した結果、形質移入細胞内での発現レベルが、（融合していない）CFTR WTおよび変異ＣＦＴＲΔ５０８Ｆタンパク質またはそのＢＡＧドメイン融合対照物の発現レベルと比較して有意に高くなったことがわかる。形質移入が成功したことと形質移入体が作動可能であることがわかるように、形質移入体はすべて緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレポータープラスミドと共に形質移入された（図８Ｂの下図）。
【図９】図９は、目的の標的タンパク質の発現を増強するための非改変配列の一般的スキームの図を示す。この非改変配列では、実施例４に記載のように、本発明の融合タンパク質を共発現させることによって目的の標的タンパク質の発現が増強される。このスキームでは、本発明の融合タンパク質はタンパク質発現増強ポリペプチド（protein expression enhancing polypeptide（ＰＥＥＰ））ドメインを標的タンパク質結合ドメインと連結させたものであり、標的タンパク質結合ドメインが目的の標的タンパク質に結合することによって標的タンパク質がＰＥＥＰドメインに近づくため、適切な細胞内位置または細胞外位置の標的タンパク質の発現レベルが増加する。  図９Ｂは、発現ベクタープラスミドに挿入される、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質（標的タンパク質）をコードする構造遺伝子の図である。下記の実施例４に記載のように、この発現ベクタープラスミドを用いて宿主細胞を形質移入した。ＩＬ１３Ｒα２の細胞外ＩＬ１３リガンド結合ドメインを含む切断型ＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質(ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）をコードするｃＤＮＡの３’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加した。  図９Ｃは、実施例４に記載の、図９ＢのＶ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ標的タンパク質の発現を増強する本発明の融合タンパク質を発現するための構築物の図を示す。Erdj3 Jタンパク質のＪドメイン（タンパク質発現増強ポリペプチドドメイン）をコードするｃＤＮＡを、ＩＬ１３タンパク質（標的タンパク質結合ドメイン）をコードするセグメントと連結させ、ＩＬ１３標的タンパク質結合ドメインをコードするセグメントの３’末端にＦｌａｇエピトープタグをコードするセグメントを連結させた。
【図１０】図１０は、切断型ＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質（ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）を発現する形質移入細胞の培地および細胞可溶化物のウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり（上図が培地、中央図が細胞可溶化物である）、実施例４に記載されるように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦを単独で発現させた場合(左から２番目のレーン）、そのＩＬ１３リガンドと共発現させた場合(ＩＬ１３のみ、左から３番目のレーン）、非改変配列で本発明のＪドメイン‐ＩＬ１３融合タンパク質と共発現させた場合(Ｊ‐ＩＬ１３、左から４番目のレーン）を示す。適切に折り畳まれたＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質（標的タンパク質）は形質移入細胞から分泌されると予想される。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質をＪドメイン‐ＩＬ１３融合タンパク質と共発現させることによって、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質の発現レベルが、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質を単独で発現させた場合（上図の左から２番目のレーン）またはＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質をそのＩＬ１３リガンドと共発現させた場合（上図の左から３番目のレーン）と比較して有意に増強されたことがわかる（上図の左から４番目のレーン）。さらに、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質をＪドメイン‐ＩＬ１３融合タンパク質と共発現させた結果、細胞内のＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質の発現レベル（中央図の左から４番目のレーン）が、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質を単独で発現させた場合（中央図の左から２番目のレーン）またはＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質をそのＩＬ１３リガンドと共発現させた場合（中央図の左から３番目のレーン）の発現レベルと比較して有意に増強された。形質移入に成功したことと形質移入体が作動可能であることがわかるように、形質移入体はすべて緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein（ＧＦＰ））を発現するレポータープラスミドと共に形質移入した。図１０の下図を参照のこと。疑似培養液には、「空の」ベクター、すなわちいずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた（ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質なし、共発現なし；ブロットの左から１番目のレーンの「なし」）が、空のベクターによる形質移入体もＧＦＰベクターと共に形質移入し、図１０の下図でＧＦＰの発現が検出されたことから、同時形質移入に成功したことがわかる。
【図１１】図１１は、下記の実施例５に記載の実験のために宿主細胞の形質移入に用いる発現ベクタープラスミドに挿入される、タンパク質をコードする核酸構築物の概略図を示す。図１１Ａは、目的のタンパク質をコードするｃＤＮＡの３’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加し、さらに免疫グロブリンＦｃドメインの定常ドメインをコードするセグメントと連結させた、Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）をコードするＤＮＡ構築物の図を示す。下記の実施例５については、Ｆｃ融合タンパク質標的は切断型ＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質（ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）を含むものにした。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦをＶ５エピトープタグと連結させ、さらにＦｃドメインと連結させて所望のＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を得た。図１１Ｂは、タンパク質発現増強ポリペプチド（protein expression enhancing polypeptide（ＰＥＥＰ））ドメイン（Ｊタンパク質のＪドメインなど）を標的タンパク質結合ドメイン（Ｆｃドメインに結合することが知られているタンパク質Ａなど）と連結させた、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を示す。さらにこの構築物の３’末端にＦｌａｇエピトープタグをコードするセグメントを付加し、標準の抗Ｆｌａｇ抗体を用いて容易に認識や単離ができるようにした。
【図１２】図１２は、実施例５に記載の実験の結果を示す。この実験では、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させる非改変配列の場合、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現が有意に増強されるが、標的タンパク質をタンパク質Ａのみと共発現させた場合には有意な増強が見られないことを実証する。  図１２Ａは、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）を発現する形質移入細胞の培地のウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、実施例５に記載されるように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現させた場合（レーン２、なし）、タンパク質Ａのみと共発現させた場合（レーン３、タンパク質Ａのみ）、Erdj3 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン４、Ｊ‐タンパク質Ａ）、Erdj5 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン５、Ｊ２‐タンパク質Ａ）を示す。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた（左から１番目のレーン）。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合標的タンパク質をいずれかのＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた結果、培地に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合標的タンパク質の発現レベル（左から４番目と５番目のレーン）が、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合標的タンパク質を単独で発現する形質細胞内での発現レベル（左から２番目のレーン）またはＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合標的タンパク質と融合していないタンパク質Ａとを共発現する形質移入細胞内での発現レベル（左から３番目のレーン）と比較して有意に高くなったことがわかる。  図１２Ｂは、図１２Ａの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図１２Ｂの棒グラフ１〜５は図１２Ａのレーン１〜５のシグナルと対応している。図１２Ｂの棒グラフは、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ標的タンパク質をいずれかのＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた（棒グラフ４および５）ことによって、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃの発現レベルが、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃを単独で発現させた場合（棒グラフ２）またはＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃを（融合していない）タンパク質Ａのみと共発現させた場合（棒グラフ３）と比較して有意に増強されたことを明確に示している。  図１２Ｃは、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（Ｆｃドメインなし）タンパク質を発現する形質移入細胞の培地のウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、実施例５に記載のように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（Ｆｃドメインは含まない）タンパク質を単独で発現させた場合（レーン１、なし）、Erdj3 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン２、Ｊ‐タンパク質Ａ）、タンパク質Ａのみと共発現させた場合（レーン３、タンパク質Ａのみ）を示す。この結果は、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質の発現が見られた場合でもほとんど観察されなかったことを示しており、図１２Ａおよび図１２Ｂで分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合標的タンパク質レベルの増強がＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインがＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ標的タンパク質のＦｃドメインに対して有する特異性に依存していた場合に得られる結果として予想されていたとおりである。図１２Ｄは、図１２Ｃの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。このように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合が認識しなかった（標的結合ドメインの対象となるＦｃリガンド（タンパク質Ａ）がないため）という点で図１２Ｃおよび図１２Ｄは対照実験結果となる。したがって、結果が示すように、Ｊドメイン（タンパク質発現増強ポリペプチドドメイン）がもたらした可能性のあった発現レベルの増強はＩＬ１３Ｒα２ＴＦを対象としたものではなかった。
【図１３】図１３は、下記の実施例６に記載の一連の実験の結果を示す。実施例６では、３種の異なるＦｃ融合標的タンパク質の発現レベルが、対応する本発明の融合タンパク質と共発現させた場合に有意に増強されることを実証する。図１３Ａ（左図）は、培地に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）の発現に関する、培地のウェスタンブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、実施例５に記載の実験と同様、下記の実施例６．１に記載のように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞の培地（左から１番目のレーン）、およびＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質とＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質）とを共発現する形質移入細胞の培地（左から２番目のレーン）を示す。図１３Ａの右図は、図１３Ａの左図の化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図１３Ａの右図の棒グラフ１および２（左から順に）は図１３Ａの左図のレーン１および２（左から順に）のシグナルと対応している。結果は、本発明のＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質を共発現させたことによって、培地に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルが、Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質がない場合の標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に（８倍）増強されたことを示している。この結果は実施例５および図１２に記載の結果と合致する。  図１３Ｂ（左図）は、培地に分泌されたＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）の発現に関するウェスタンブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、下記の実施例６．２に記載のように、ＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合標的タンパク質を単独で発現する形質移入細胞の培地（左から１番目のレーン）、およびＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質とＪドメイン‐タンパク質Ａ融合物とを共発現する形質移入細胞の培地（左から２番目のレーン）を示す。図１３Ｂの右図は、図１３Ｂの左図の化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図１３Ｂの右図の棒グラフ１および２（左から順に）は図１３Ｂの左図のレーン１および２（左から順に）のシグナルと対応する。結果は、Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質を共発現させることによって、培地に分泌されたＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルが、Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質がない場合の標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に（６倍）増強されたことを示している。  図１３Ｃ（左図）は、培地に分泌されたα１アンチトリプシン（α１ＡＴ）‐Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）の発現に関するウェスタンブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、下記の実施例６．３に記載のように、α１アンチトリプシン（α１ＡＴ）‐Ｆｃ融合標的タンパク質を単独で発現する形質移入細胞の培地（左から１番目のレーン）、およびα１ＡＴ‐Ｆｃ融合標的タンパク質とＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地（左から２番目のレーン）を示す。図１３Ｃの右図は、図１３Ｃの左図の化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図１３Ｃの右図の棒グラフ１および２（左から順に）は図１３Ｃの左図のレーン１および２（左から順に）のシグナルと対応している。結果は、Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質を共発現させることによって、培地に分泌されたα１ＡＴ‐Ｆｃ融合標的タンパク質の発現レベルが、Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質がない場合の標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に（３倍）増強されたことを示している。
【図１４】図１４は、下記の実施例７に記載の一連の実験の結果を示す。実施例７では、非改変配列の場合にみられる、分泌されるヒト化抗IL8 IgG1抗体の発現レベルの増強について試験する。図１４Ａは、培地に分泌された抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）の発現に関するドットブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、抗ＩＬ８抗体を単独で発現する形質移入細胞（レーン２）、抗ＩＬ８抗体とタンパク質Ａとを共発現する形質移入細胞（レーン３、タンパク質Ａのみ）、抗ＩＬ８抗体と本発明のErdj3 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン４、Ｊ‐タンパク質Ａ）、抗ＩＬ８抗体とタンパク質Ｌとを共発現する形質移入細胞（レーン５、タンパク質Ｌのみ）、抗ＩＬ８抗体と本発明のErdj3 Jドメイン‐タンパク質Ｌ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン６、Ｊ‐タンパク質Ｌ）、抗ＩＬ８抗体とそのＩＬ８リガンドを共発現する形質移入細胞（レーン７、ＩＬ８）、本発明のErdj3 Jドメイン‐ＩＬ８リガンド融合タンパク質を共発現する形質移入細胞（レーン８、Ｊ‐ＩＬ８）、Erdj3 J‐タンパク質Ａ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（レーン９、Ｊ‐タンパク質Ａ）、Erdj3 Jドメイン‐タンパク質Ｌ融合タンパク質を単独発現する形質移入細胞（レーン１０、Ｊ‐タンパク質Ｌ）、Erdj3 Jドメイン‐ＩＬ８リガンド融合タンパク質を発現する形質移入細胞（レーン１１、Ｊ‐ＩＬ８）の培地を示す。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた（レーン１、抗ＩＬ８抗体なし）。培地での抗ＩＬ８抗体の発現について、抗ヒトＩｇＧ抗体（「anti-huIgG Ab」）を用いたドットブロット分析で分析した（カタログ番号ＡＰ１１２Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）。形質移入細胞内で抗ＩＬ８抗体をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン４）、Ｊドメイン‐タンパク質Ｌ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン６）、またはＪドメイン‐ＩＬ８融合タンパク質と共発現させた場合（レーン８）、培地に分泌された抗ＩＬ８抗体の発現レベルが、抗ＩＬ８抗体を単独で発現する形質移入細胞（レーン２）、タンパク質Ａのみと共発現する形質移入細胞（レーン３、タンパク質Ａのみ）、タンパク質Ｌのみと共発現する形質移入細胞（レーン５、タンパク質Ｌのみ）、またはＩＬ８リガンドタンパク質のみと共発現する形質移入細胞（レーン７）で発現された抗体のレベルと比較して有意に増強されたことがわかる。Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（レーン９、Ｊ‐タンパク質Ａ）、Ｊドメイン‐タンパク質Ｌ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（レーン１０、Ｊ‐タンパク質Ｌ）、またはＪドメイン‐ＩＬ８融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（レーン１０、Ｊ‐ＩＬ８）の培地ではシグナルが検出されなかった。このことは、３種すべての融合タンパク質が、共発現された抗ＩＬ８抗体標的タンパク質を特異的に標的としてその発現を増強したことを示す。  図１４Ｂは、図１４Ａの各レーンの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図１４Ｂの棒グラフの番号は図１４Ａのレーン番号と対応している。この一連の実験の結果は、標的である抗ＩＬ８抗体を、タンパク質発現増強ポリペプチド（ここではErdj3 Jドメイン）を標的タンパク質結合ドメイン（ここではタンパク質Ａ、タンパク質Ｌ、またはＩＬ８）と連結させた本発明の融合タンパク質と共発現させることによって、分泌された抗ＩＬ８抗体の発現が、融合していない標的タンパク質結合ドメインタンパク質のみ（タンパク質Ｇのみ、タンパク質Ｌのみ、またはＩＬ８のみ）と共発現させた場合と比較して有意に増強されたことを明確に示している。
【図１５】図１５は、下記の実施例８に記載の結果を示す。この結果は、商業価値のある確立された細胞株で既に安定に産生されている標的タンパク質の発現のレベルを増強するために本発明の融合タンパク質を用いることができることを実証する。図１５Ａは、培地に分泌された抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）の発現に関する、ドットブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、抗ＩＬ８抗体を単独で発現するＣＨＯ‐ＤＰ１２細胞株の細胞（受託番号ＣＲＬ‐１２４４４４、American Type Culture Collection（バージニア州、マナナス））（レーン２）、および抗ＩＬ８抗体とErdj3 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン３、Ｊ‐タンパク質Ａ）の場合を示す。培地での抗ＩＬ８抗体の発現について、抗ヒトＩｇＧ抗体（「anti-huIgG Ab」）を用いたドットブロット分析で分析した。抗体をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させたことによって、培地に分泌された抗体の発現レベル（レーン３）が、Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質がない場合に発現された抗体のレベル（レーン２、なし）と比較して有意に増強されたことがわかる。レーン１は対照である（培地のみ）。図１５Ａのレーンのドットブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図１５Ｂの各棒グラフに示す。結果は、抗体をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた結果、分泌された抗体の発現（棒グラフ３）が有意に増強され、抗体をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質の非存在下で発現させた場合に得られた発現レベル（棒グラフ２）の約４〜５倍に発現レベルが増強されたことを示している。この結果は、確立された産生細胞株で既に安定に発現されている標的タンパク質の産生レベルを有意に増強するために本発明の融合タンパク質を採用できることを示す。
【図１６】図１６は、下記の実施例９．１に記載の一連の実験の結果を示す。実施例９．１では、Ｊタンパク質のＪドメイン（タンパク質発現増強ポリペプチドドメインとして）を多様なタンパク質のいずれかと連結させた様々な融合タンパク質について試験した。ここでは、多様なＪドメイン融合タンパク質とその他のタンパク質を、形質移入ＨＥＫ２９３細胞の培地に分泌されるＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）の発現レベルに対する増強能力について試験し比較した。図１６Ａは、以下の細胞の培養液から採取したサンプルのウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像を示す：ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）を単独で発現する形質移入細胞（レーン１）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン２）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃとタンパク質Ａのみを共発現する形質移入細胞（レーン３、タンパク質Ａのみ）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン４）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ｈＦｃＲ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン５、Ｊ‐ｈＦｃＲ）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ｖＦｃＲ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン６、Ｊ‐ｖＦｃＲ）、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ｇＩ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン７、Ｊ‐ｇＩ）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ｇＥ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン８、Ｊ‐ｇＥ）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ｇＩ融合タンパク質およびＪドメイン‐ｇＥ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン９、Ｊ‐ｇＩ＋Ｊ‐ｇＥ）。図１６Ａのウェスタンブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図１６Ｂの各棒グラフに示す。詳細については下記の実施例９．１を参照のこと。
【図１７】図１７は、下記の実施例９．２に記載の一連の実験の結果を示す。実施例９．２では、Ｊタンパク質のＪドメイン（タンパク質発現増強ポリペプチドドメインとして）を６種のＦｃ結合ペプチド（ＦｃＢＰ１〜ＦｃＢＰ６）のそれぞれと連結させた、Ｆｃドメインを有するタンパク質の発現レベルを増強するのに用いるための多様な融合タンパク質を試験した。Ｆｃ結合ペプチドのアミノ酸配列を図１７のＡ図とＢ図の間に示す。図１７Ａは、以下の細胞の培養液から採取したサンプルのウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像を示す：ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）を単独で発現する形質移入細胞（レーン１および３）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン２、Ｊ‐タンパク質Ａ）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ＦｃＢＰ１融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン４、Ｊ‐ＦｃＢＰ１）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ＦｃＢＰ２融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン５、Ｊ‐ＦｃＢＰ２）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ＦｃＢＰ３融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン６、Ｊ‐ＦｃＢＰ３）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ＦｃＢＰ４融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン７、Ｊ‐ＦｃＢＰ４）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ＦｃＢＰ５融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン８、Ｊ‐ＦｃＢＰ５）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐ＦｃＢＰ６融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン９、Ｊ‐ＦｃＢＰ６）；ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＪドメイン‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（レーン１０、Ｊ‐タンパク質Ｇ）。図１７Ａに示すように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を６種のＪドメイン‐ペプチド融合タンパク質のそれぞれとＨＥＫ２９３形質移入体で共発現させることによって、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベル（レーン４〜９）が、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現させた場合の発現レベル（レーン１および３）と比較して有意に増強された。さらに、比較のために、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン２）またはＪドメイン‐タンパク質Ｇ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン１０）に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現にもたらされる効果についても実験した。図１７Ａに示すとおり、実施例５（図１２）、６．１（図１３Ａ）、９．１（図１６）でも見られたように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン２）またはＪドメイン‐タンパク質Ｇ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン１０）に、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルが有意に増強された。図１７Ａのウェスタンブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図１７Ｂの各棒グラフに示す。
【図１８】図１８は、ドットブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、実施例１０に記載の３種のポリペプチドを非改変配列で用いた場合の標的タンパク質発現増強活性の相対レベルの例を示す。「３（Ｊドメイン）」、「３‐４５」、「３‐７２」と命名したポリペプチド（以下の表５８−１〜表５８−３を参照のこと）に対し、ドットブロットに示す発現レベル、すなわち、高活性（ＨＡ）、活性（Ａ）、非活性（ＮＡ）と決定した。各ポリペプチドをタンパク質Ａと連結させて融合タンパク質を作製し、Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２‐Ｆｃ標的タンパク質と形質移入細胞内で共発現させた。培地で発現されたＶ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルを、抗Ｖ５抗体を用いたドットブロットで測定した。ドットブロットは、以下の形質移入細胞の培地で発現されたＶ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２‐Ｆｃ標的タンパク質の発現量を示す：標的タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（左から２番目のレーン）；標的タンパク質とポリペプチド３‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（左から３番目のレーン）；標的タンパク質とポリペプチド３‐４５‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（左から４番目のレーン）；標的タンパク質とポリペプチド３‐７２‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（左から５番目のレーン）。非改変配列のポリペプチドの標的タンパク質発現増強活性が高い場合（ＨＡ）をドットブロットのレーン３（左から）に示す発現レベルで表す。ポリペプチドの標的タンパク質発現増強活性が陰性対照と比較して改善された場合（Ａ）をドットブロットのレーン４（左から）に示す発現レベルで表す。ポリペプチドに標的タンパク質発現増強活性がない場合（ＮＡ）をドットブロットのレーン５（左から）に示す。ドットブロットのレーン１（左から）は、標的タンパク質もいずれのポリペプチド‐Ｆｃ融合タンパク質も発現しない細胞を入れた疑似培養液の培地では標的タンパク質が発現されなかったことを示している。
【図１９】図１９は、Ｅｒｄｊ３のＪドメインのアミノ酸配列比較表であり、全長のＪドメインからＮ末端欠失変異体およびＣ末端欠失変異体として作製した実施例１１に記載の一連のポリペプチドのアミノ酸配列を示す。Ｊドメインのαヘリックスとループドメインを括弧で示し、各ポリペプチドの番号、長さ（アミノ酸残基）、タンパク質発現増強活性（ＨＡ、ＮＡ）、配列番号も示す。（標的タンパク質発現増強活性が高い場合（ＨＡ）、活性が改善された場合（Ａ）、活性がない場合（ＮＡ）の説明については図１８および実施例１０を参照のこと。）比較表に示すように、ポリペプチド３と命名したＪドメインは６１アミノ酸の長さであり、非改変配列で標的タンパク質に対し高い発現増強活性（ＨＡ）を有する。
【図２０】図２０は、実施例１２に記載の一連の実験の結果を示す。実施例１２では、改変配列で用いた２種類のポリペプチドの標的タンパク質発現増強活性を比較する。図２０Ａは、細胞の形質移入に用いる発現ベクターに挿入される核酸構築物の図を示す。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ構築物は、細胞外ＩＬ１３結合ドメインを含む切断型ＩＬ１３Ｒα２のＣ末端にＶ５エピトープタグを融合した融合ポリペプチドをコードする。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１構築物は、切断型ＩＬ１３Ｒα２をＢＳＣ１配列（ポリペプチド３‐２９、ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ（配列番号４８））と融合してＣ末端にＶ５エピトープタグを融合した融合ポリペプチドをコードする。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１ＭＴ構築物は、切断型ＩＬ１３Ｒα２をＢＳＣ１ＭＴ配列（ポリペプチド３‐５５、ＩＡＱＡＹＲＫＬＡ（配列番号２９８））と融合してＣ末端にＶ５エピトープタグを融合したものをコードする。図２０Ａの下部に示すように、ポリペプチド３‐５５のアミノ酸配列は２か所でポリペプチド３‐２９のアミノ酸配列と異なる。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ構築物を含むベクターを用いて形質移入した細胞を対照とした（ＢＳＣ１またはＢＳＣ１ＭＴポリペプチドとの融合なし）。  図２０Ｂは、抗Ｖ５抗体を用いたドットブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質を発現する形質移入細胞の培地、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１タンパク質を発現する形質移入細胞の培地、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１ＭＴタンパク質を発現する形質移入細胞の培地を示す。図２０Ｂのレーン２（左から）は、対照細胞の培地では非常に低いレベルのＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質しか検出されなかったことを示している。図２０Ｂのレーン３（左から）は、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１構築物を含むベクターを用いて形質移入した細胞の培地で有意なレベルのＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１融合タンパク質が発現されたことを示している。図２０Ｂのレーン４（左から）は、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１ＭＴ構築物を含むベクターを用いて形質移入した細胞の培地では非常に低いレベルのＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１ＭＴ融合タンパク質しか発現されなかったことを示している。結果は、改変配列の場合にポリペプチド３‐２９が標的タンパク質発現増強「活性が高い」のに対し、ポリペプチド３‐５５は改変配列の場合に標的タンパク質発現増強「活性がない」と考えられることを示している。
【図２１】図２１は、実施例１３に記載のように、ＨＥＫ２９３細胞内で非改変配列のＢＳＣ１‐タンパク質Ａと共発現させた場合のＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ標的タンパク質のＩＬ１３結合活性を示す棒グラフである。実施例１３に記載のように、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質は、ポリペプチド３‐２９（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ（配列番号４８））をタンパク質Ａと連結させた融合タンパク質である。ＩＬ１３結合活性の測定に用いた試験はサンドイッチＥＬＩＳＡ（enzyme-linked immune solvent assay）法である。この方法では、ＩＬ１３がＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質に捕捉されるとヒトＩＬ１３の検出量が減少する。図２１の棒グラフ１（左から）は、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質もＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質も発現しない対照細胞の培養液の培地ではＩＬ１３結合活性が見られなかったことを示す。図２１の棒グラフ２（中央）は、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質のみを発現する細胞の培養液の培地では低レベルのＩＬ１３結合活性が少し検出されたことを示している。対照的に、図２１の棒グラフ３（右端）に示すように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃとＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する細胞の培地では、有意なレベルのヒトＩＬ１３結合活性が見られた。結果は、非改変配列でより高いレベルで培地に発現されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ標的タンパク質がＩＬ１３結合活性を保持していたことを示している。
【図２２】図２２は、実施例１４に記載の実験の結果を示す。実施例１４では、第ＶＩＩ因子（Factor VI（ＦＶＩＩ））‐Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）をポリペプチド３‐２９（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ（配列番号４８））をタンパク質Ｇと連結させたＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質と非改変配列で共発現させた場合、培地に分泌されるＦＶＩＩ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルが有意に増強されることを実証する。図２２Ａは、培地に分泌されたＦＶＩＩ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現に関するウェスタンブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像（上図）であり、ＦＶＩＩ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞の場合（レーン２）およびＦＶＩＩ‐Ｆｃ融合タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の場合（レーン３）を示す。レーン１は発現しない細胞培地を対照として示す。細胞可溶化物中のＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ（中央図）と分泌されたＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ（下図）を、抗Ｆｌａｇ抗体を用いてそれぞれ検出した。図２２Ｂは、図２２Ａの上図の化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図２２Ｂの棒グラフ１〜３は、図２２Ａの上図のレーン１〜３のシグナルと対応している。結果は、ＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とを共発現させることによって、培地に分泌されたＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルが、ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質の非存在下で発現させた場合の標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に増強されたことを示している。さらに、ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質は分泌されず細胞内に残っていた。細胞可溶化物中のＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質の発現量（図２２Ａの中央図）と培地での発現量（図２２Ａの下図）を比較のこと。
【図２３】図２３は、実施例１５に記載の実験の結果を示す。この実験では、ポリペプチド３‐２９（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ（配列番号４８））をタンパク質Ａと連結させたＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質の存在下で第ＩＸ因子（Factor IX（ＦＩＸ））‐Ｆｃ融合（ＦＩＸ‐Ｆｃ）標的タンパク質の発現レベルが改善することを実証する。図２３Ａは、培地に分泌されたＦＩＸ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現に関するウェスタンブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、ＦＩＸ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞の場合（列２）およびＦＩＸ‐Ｆｃ融合タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の場合（列３）を示す。列１は発現しない細胞培地を対照として示す。図２３Ｂは、図２３Ａの上図の化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図２３Ｂの棒グラフ１〜３は図２３Ａの列１〜３のシグナルと対応する。結果は、ＦＩＸ‐Ｆｃ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現させることによって、培地に分泌されたＦＩＸ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルが、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質がない場合の標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に増強されたことを示している。
【図２４】図２４は、実施例１６に記載の一連の実験の結果を示す。実施例１６では、第ＶＩＩＩ因子（Factor VIII（ＦＶＩＩＩ））‐Ｆｃ融合タンパク質（ＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ）をポリペプチド３‐２９（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ（配列番号４８））をタンパク質Ｇと連結させたＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質と非改変配列で共発現させた場合、ＦＶＩＩＩ‐Ｆｃの発現レベルが有意に増強されることを実証する。ＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ融合タンパク質（標的タンパク質）とＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とを共発現する形質移入ＨＥＫ２９３細胞またはＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する細胞の培養液から培地を回収し、ＦＶＩＩＩ活性をＥＬＩＳＡ法（ＶｉｓｕＬｉｚｅ（商標）ＦＶＩＩＩ抗原キット、Affinity Biologicals Inc.）で分析した。空のベクターを形質移入した細胞培地を陰性対照とした（左から１番目の棒グラフ）。左から２番目の棒グラフは、ＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質を単独で発現する細胞の培地ではＦＶＩＩＩが検出されなかったことを示している。左から３番目の棒グラフは、ＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とを共発現する細胞の培地に有意なレベルのＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質が分泌されたことを示している。ヒト血清を陽性対照として用いた（左から４番目の棒グラフ）。結果は、ＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とを共発現させることによって、培地に分泌されたＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルが、ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質がない場合の標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に増強されたことを示している。
【図２５】図２５は、実施例１７に記載の実験の結果を示す。この実験では、抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）を３‐２９ポリペプチド（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ（配列番号４８））をタンパク質Ａと連結させたＢＳＣ１‐タンパク質Ａと非改変配列で共発現させた場合、培地に分泌される抗ＩＬ８抗体の発現レベルが改善することを実証する。図２５Ａは、培地に分泌された抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）の発現に関するドットブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、抗ＩＬ８抗体を単独で発現する形質移入細胞の場合（列２）、および抗ＩＬ８抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する細胞の場合（列３、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ）を示す。培地での抗ＩＬ８抗体の発現について、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたドットブロット分析で分析した。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた（抗ＩＬ８抗体なし、列１）。形質移入細胞内で抗ＩＬ８抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させたことによって、培地に分泌された抗ＩＬ８抗体発現レベル（列３）が、抗ＩＬ８抗体を単独で発現する形質移入細胞で発現された抗体のレベル（列２）と比較して有意に増強されたことがわかる。  図２５Ｂは、図２５Ａの各列の化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図２５Ｂの棒グラフの番号は図２５Ａの列番号と対応している。この一連の実験の結果は、標的抗ＩＬ８抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させることによって、分泌された抗ＩＬ８抗体の発現が、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質がない場合の抗体の発現レベルと比較して有意に増強されたことを明確に示している。  図２５Ｃは、発現された抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）のＩＬ８結合活性をＥＬＩＳＡ法で検出した結果の棒グラフを示す。精製した組換えヒトＩＬ８を９６穴プレートに塗布し、以下の培地に分泌された抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）を加えてインキュベートした：抗ＩＬ８抗体を単独で発現する形質移入細胞の培地（棒グラフ２）または抗ＩＬ８抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地（棒グラフ３、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ）。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた（棒グラフ１、抗ＩＬ８抗体なし）。この一連の実験の結果は、より高レベルで発現され培地に分泌された抗ＩＬ８抗体がヒトＩＬ８結合活性を保持することを明確に示しており、分泌された抗体が適切な立体構造を有することを示す。
【図２６】図２６は、実施例１８に記載の一連の実験の結果を示す。実施例１８では、抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブを３‐２９ポリペプチド（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ（配列番号４８））をタンパク質Ａと連結させたＢＳＣ１‐タンパク質Ａと共発現させた場合、発現レベルが有意に増強することを実証する。図２６Ａは、培地に分泌された抗ＶＥＧＦ抗体の発現に関するドットブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、抗ＶＥＧＦ抗体を単独で発現する形質移入細胞の場合（列２）または抗ＶＥＧＦ抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の場合（列３）を示す。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた（抗ＶＥＧＦ抗体なし、列１）。培地での抗ＶＥＧＦ抗体の発現について、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたドットブロット分析で分析した。形質移入細胞内で抗ＶＥＧＦ抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させたこと（列３）によって、培地に分泌された抗ＶＥＧＦ抗体の発現レベルが、抗ＶＥＧＦ抗体を単独で発現する形質移入細胞で発現された抗体のレベル（列２）と比較して有意に増強されたことがわかる。  図２６Ｂは、図２６Ａの各列の化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図２６Ｂの棒グラフの番号は図２６Ａの列番号と対応している。結果は、抗ＶＥＧＦ抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させることによって、分泌された抗ＶＥＧＦ抗体の発現が、単独で発現した場合の抗体のレベルと比較して有意に増強されたことを明確に示している。  図２６Ｃは、形質移入細胞の培地で発現された抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦ結合をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す。精製した組換えヒトＶＥＧＦ‐Ａを９６穴プレートに塗布し、以下の培地に分泌された抗ＶＥＧＦ抗体（標的タンパク質）を加えてインキュベートした：抗ＶＥＧＦ抗体を単独で発現する形質移入細胞の培地（棒グラフ２）；または抗ＶＥＧＦ抗体と本発明のＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地（棒グラフ３）。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた（抗ＶＥＧＦ抗体なし、棒グラフ１）。この一連の実験の結果は、より高レベルで発現され培地に分泌された抗ＶＥＧＦ抗体がヒトＶＥＧＦ‐Ａ結合活性を保持することを明確に示しており、分泌された抗体が適切な立体構造を有することを示す。
【図２７】図２７は、実施例１９に記載の一連の実験の結果を示す。実施例１９では、３‐２９ポリペプチド（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ（配列番号４８））をタンパク質Ａと連結させたＢＳＣ１‐タンパク質Ａと共発現させた場合、治療用抗ＴＮＦα抗体であるアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、ＡｂｂＶｉｅ社）の発現レベルが有意に増強されることを実証する。図２７Ａは、培地に分泌された抗ＴＮＦα抗体の発現に関するドットブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、抗ＴＮＦα抗体を単独で発現する形質移入細胞の場合（列２）および抗ＴＮＦα抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合物とを共発現する形質移入細胞の場合（列３）を示す。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた（列１、抗ＴＮＦα抗体なし）。培地での抗ＴＮＦα抗体の発現について、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたドットブロット分析で分析した。形質移入細胞内で抗ＴＮＦα抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させたことによって、培地に分泌された抗ＴＮＦα抗体の発現レベル（最下列）が、抗ＴＮＦα抗体を単独で発現する形質移入細胞で発現された抗体のレベル（中央）と比較して有意に増強されたことがわかる。  図２７Ｂは、図２７Ａの各列の化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図２７Ｂの棒グラフの番号は図２７Ａの列番号と対応している。この一連の実験の結果は、抗ＴＮＦα抗体（標的タンパク質）をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させることによって、分泌された抗ＴＮＦα抗体の発現が有意に増強されたことを明確に示している。  図２７Ｃは、形質移入細胞の培地で発現された抗ＴＮＦα抗体のＴＮＦα結合活性をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す。精製した組換えヒトＴＮＦαを９６穴プレートに塗布し、以下の培地に分泌された抗ＴＮＦα抗体（標的タンパク質）を加えてインキュベートした：抗ＴＮＦα抗体を単独で発現する形質移入細胞の培地（棒グラフ２）；または抗ＴＮＦα抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地（棒グラフ３）。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた（棒グラフ１）。この一連の実験の結果は、より高レベルで発現され培地に分泌された抗ＴＮＦα抗体がヒトＴＮＦα結合活性を保持することを明確に示しており、分泌された抗体が適切な立体構造を有することを示す。
【図２８】図２８は、実施例２０に記載の結果を示す。この結果は、商業価値のある確立された細胞株で既に安定に産生されているタンパク質の発現レベルを、３‐２９ポリペプチド（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ（配列番号４８））をタンパク質Ａと連結させたＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合物と共発現させた場合に増強することができることを実証する。図２８Ａは、培地に分泌された抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）の発現に関するドットブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、抗ＩＬ８抗体を単独で発現するＣＨＯ‐ＤＰ１２細胞株の細胞（受託番号ＣＲＬ‐１２４４４４、American Type Culture Collection（バージニア州、マナナス））の場合（列２）、および抗ＩＬ８抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の場合（列３）を示す。抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させたことによって、培地に分泌された抗体の発現のレベル（列３）が、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質の非存在下で発現された抗体のレベル（列２）と比較して有意に増強されたことがわかる。列１は対照である（培地のみ）。図２８Ａの各列のドットブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を、図２８Ｂの各棒グラフに示す。結果は、抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合分子と共発現させた結果（棒グラフ３）、分泌された抗体の発現が有意に増強され、抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合分子の非存在下で発現させた場合に得られた発現レベル（棒グラフ２）の約４〜５倍に発現レベルが増強されたことを示している。  図２８Ｃは、形質移入細胞の培地で発現された抗ＩＬ８抗体のＩＬ８結合活性をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す。精製した組換えヒトＩＬ８を９６穴プレートに塗布し、以下の培地に分泌された抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）を加えてインキュベートした：安定に抗ＩＬ８抗体を発現する細胞の培地（棒グラフ２）；または抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する細胞の培地（棒グラフ３）。培地を陰性対照として用いた（棒グラフ１、ＩＬ８結合活性なし）。この一連の実験の結果は、より高レベルで発現され培地に分泌された抗ＩＬ８抗体がヒトＩＬ８結合活性を保持することを明確に示しており、分泌された抗体が適切な立体構造を有することを示す。
【図２９】図２９は、実施例２１に記載した実験の結果を示す。これらの結果からは、適切な立体構造に折り畳まれない変異タンパク質を原因とする疾患の治療に本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドを使用できることがわかる。図２９Ａは、野生型α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）またはＺ変異を有する変異型α１アンチトリプシン（ＡＡＴＺ（ＡＡＴコドン３４２のＧｌｕをＬｙｓで置換したもの）をヒトＩｇＧのＦｃドメインと連結させた融合タンパク質を、３‐２９ポリペプチド（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ（配列番号４８））をタンパク質Ａと連結させたＢＳＣ１‐タンパク質Ａと共発現させた場合と共発現させなかった場合の、各融合タンパク質の発現量に関するウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像を示す。図２９の上図は、以下の形質移入細胞の培地内のＦｃ融合タンパク質の発現量を示す：ＡＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（左から２番目のレーン）；ＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（左から３番目のレーン）；ＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（左から４番目のレーン）。レーン１は、発現しない細胞培地を対照として示す。明らかに、ＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する細胞の培地にはＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質が分泌されていなかった（左から３番目のレーン）。図２９の中央図（細胞可溶化物）に示すように、ＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する細胞についてはＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質が細胞内に残っており（左から３番目のレーン）、融合していないＡＡＴＺタンパク質について知られているように、小胞体に留まっていたと推定される。対照的に、図２９の上図（培地）のレーン４（左から）に示すように、ＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現させた結果、培地に分泌されたＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質のレベルが有意に増強された。さらに、図２９の中央図（細胞可溶化物）のレーン４（左から）に示すように、細胞には実質的にはＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質が残っていなかった。抗チューブリン抗体を用いて同じ膜にブロッティングし、図２９に示す負荷対照（下図）とした。結果は、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質の非存在下で発現させた場合の標的タンパク質の発現レベルではＡＡＴＺ‐Ｆｃが実質的には細胞内に残っていなかったのに比べて、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を共発現させたことによって培地に分泌されたＡＡＴＺ‐Ｆｃ標的タンパク質のレベルが有意に増強されたことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、目的の標的タンパク質の発現レベルを増強するための新規なポリペプチドのファミリーを提供する。本発明は、宿主細胞内で目的の標的タンパク質を２種類の配列のいずれかの配列で以下のタンパク質発現増強ポリペプチドと共発現させた場合、適切な細胞内位置または細胞外位置に有意に高いレベルで発現できるという発見に基づく。タンパク質発現増強ポリペプチドは、以下を含む：
Ｊタンパク質から単離されたＪドメイン；
Ｊドメインのタンパク質発現増強ポリペプチド断片；または
以下の式を有するタンパク質発現増強Ｊドメインアナログポリペプチド：
式：Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｘ９（配列番号４７）
（式中、Ｘ１はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、
またはメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし少なくとも一方リジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であるか；Ｘ１〜Ｘ３が存在しＸ５〜Ｘ９が存在する場合、Ｘ４は存在しなくてもよく、
Ｘ５はチロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、またはフェニルアラニン（Ｆ）であり、Ｘ６およびＸ７はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし少なくとも一方がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であるか；Ｘ６およびＸ７のいずれか一方がＫまたはＲであり、Ｘ１〜Ｘ５が存在しＸ８およびＸ９が存在する場合、Ｘ６およびＸ７の他方は存在しなくてもよく、
Ｘ８およびＸ９は任意のアミノ酸であり、ただし少なくとも一方がロイシン（Ｌ）またはアラニン（Ａ）であるか；Ｘ８およびＸ９の一方がＬまたはＡでありＸ１〜Ｘ７が存在する場合、Ｘ８およびＸ９の他方は存在しなくてもよい）。
【００５１】
本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドは、２種類の配列のいずれの配列でも、宿主細胞による目的の標的タンパク質の発現を増強するために採用できる。「改変」配列の場合、融合タンパク質はタンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた（融合した）融合タンパク質である。したがって、この融合タンパク質は目的の標的タンパク質の機能を代わりに果たす「改変された」標的タンパク質であり、改変されていない標的タンパク質を単独で発現させた場合の発現レベルよりも高いレベルで宿主細胞に発現される。「非改変」配列では、融合タンパク質は、本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドを通常の「改変されていない」目的の標的タンパク質に親和性を有し結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質である。この融合タンパク質と目的の標的タンパク質とを宿主細胞内で共発現させることによって、改変されていない標的タンパク質の発現は、本発明の標的タンパク質結合融合タンパク質がない場合の発現レベルに比べて増強される。本発明に従って、改変配列または非改変配列の場合のタンパク質発現レベルの増強には、それぞれ、改変された目的の標的タンパク質または改変されていない目的の標的タンパク質がその目的の標的タンパク質の適切な位置（細胞内または細胞外）で発現されることが含まれる。
【００５２】
したがって、本発明は、所望の量の目的の内因性タンパク質または異種性（組換え）タンパク質を細胞内で発現できない場合に技術的解決策を提供する。本発明はさらに、十分なレベルの機能性タンパク質を生体内で発現できない個体の疾患または障害を治療するための組成物および方法を提供する。生体内では、タンパク質またはその機能的な型の発現が不十分な場合、病理的状態につながる。不適切に折り畳まれたタンパク質種が実証または示唆されている疾患の例としては、プリオン関連疾患（伝染性海綿状脳症）やアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症（cystic fibrosis（ＣＦ）
）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５３】
より明確に本発明を説明するために、以下の解説と用語の定義が適用される。
【００５４】
本明細書中に特に定義しない限り、本発明に関連して使用する科学技術用語は、当業者が一般的に理解する意味を有するものとする。用語の意味と範囲は明確であるべきであるが、何らかの潜在的多義性があった場合、いかなる辞書または本明細書外の定義よりも本明細書に示す定義が優先される。さらに、文脈上他の意味に解釈する必要がある場合を除いて、単数形の用語は複数形を包含し、複数形の用語は単数形を包含するものとする。本願では、特に指定しない限り、「または」という語を用いた場合は「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という語を用いた場合、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」や「〜が含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形の場合と同様、限定的ではない。
【００５５】
一般的に、本明細書に記載のタンパク質化学や核酸化学（組換え核酸やポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction（ＰＣＲ））の方法を含む）、細胞や組織の培養、
分子生物学、遺伝学、微生物学、生化学、プロテオミクス、薬理学、薬科学に関連して用いる用語やこれらに関する技術は、一般的に当技術分野において周知であり一般に使用されるものである。本発明の方法および技術は、当技術分野の従来の方法に従い、また、当技術分野で入手可能な様々な一般的参考文献や詳細な参考文献に記載されたとおりに一般に実施される。分析および精製の技術は、実験技術の説明書や製造者による仕様書など、当技術分野で入手可能な手順書に従い、当技術分野で一般に遂行されているとおりに、または本明細書に記載したとおりに実施される。
【００５６】
特に指定しない限り、「約」という用語をある量、数または値と組み合わせて用いた場合、その組み合わせは記載された量、数、または値のみでなく、その量、数、または値±１０％を表す。例として、「約４０％」という表現は「４０％」と「３６％〜４４％（３６％と４４％を含む）」の両方を示す。
【００５７】
「目的の標的タンパク質」、「標的タンパク質」または「目的のタンパク質」とは、意図される細胞内（細胞内部および膜結合部位を含む）または細胞外の（分泌された）位置での発現レベルを増強することが必要であるか望まれるような任意のタンパク質を意味する。
【００５８】
「単離された分子」（たとえば「単離されたタンパク質」または「単離された核酸」）の「単離された」とは、その分子の起源または由来に基づいて、天然の状態ではその分子に付随していて本来は結合していた成分と結合していない分子、同一種に由来するその他の種類の分子を実質的に含まない分子、異種に由来する細胞によって発現される分子、または自然界に存在しない分子を意味する。このように、化学合成したタンパク質分子や核酸分子、あるいはその分子の天然の起源である細胞とは別の細胞系で合成したタンパク質分子または核酸分子は、その分子に本来は結合している成分から「単離される」。タンパク質または核酸分子はさらに、当技術分野において周知のタンパク質精製技術または核酸精製技術を用いて単離することによって、本来は結合している成分を実質的に含まない状態にすることができる。
【００５９】
本明細書中、「ベクター」とは、核酸分子であり、その核酸分子と連結された別の核酸を輸送することができる。ベクターの一種は「プラスミド」である。「プラスミド」とは環状の二本鎖核酸（一般的にはＤＮＡ）のループであり、そのループに別の核酸セグメントを挿入することができる。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに挿入することができる。ある種のベクターは、導入先の宿主細胞内で自己複製できる（たとえば、細菌由来複製開始点を有する細菌ベクターやエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（たとえば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞へ導入すると宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、作動可能に連結している遺伝子の発現を指示することができる。本明細書では、そのようなベクターを「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）という。一般的に、組換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、プラスミド形態であることが多い。プラスミドは最も一般的に使用されるベクター形態であるため、本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」を同義的に使用できるが、本発明は、ウイルスベクター（たとえば、複製欠損レトロウイルス、レンチウイルス由来ベクター、アデノウイルス由来ウイルス）など、同等または匹敵する機能を果たすその他の形態の発現ベクターも含むものとする。
【００６０】
「作動可能に連結された」とは、記載された複数の成分が、意図された形で機能できる
ような位置関係に並べられていることを意味する。コード配列と「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合する条件でコード配列が発現するように連結されている。「作動可能に連結された」配列には、目的の遺伝子に隣接した発現制御配列と、トランスで、すなわち離れて目的の遺伝子を制御する働きをする発現制御配列とが含まれる。「発現制御配列」とは、その配列と連結されたコード配列の発現やプロセシングに作用するために必要なポリヌクレオチド配列である。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列、およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルやポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を増強する配列（たとえばコザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；望ましい場合にはタンパク質の分泌を増強する配列などが挙げられる。このような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なる。原核生物の場合、このような制御配列としては一般的にプロモーター配列、リボソーム結合部位配列、および転写終結配列が挙げられ、真核生物の場合は、このような制御配列としては一般的にプロモーター配列および転写終結配列が挙げられる。「制御配列」という用語は、発現およびプロセシングに必須である構成要素を包含することが意図され、リーダー配列や融合パートナー配列など、存在すれば有利である追加的な構成要素も包含し得る。特に指定しない限り、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクターに挿入することについて本明細書に説明または記載したときは、挿入された核酸分子を含む発現ベクターを適合する宿主細胞または適合する生物の細胞へ導入した際にコードされた融合タンパク質の発現に必要となる機能性プロモーターやその他の転写制御要素および翻訳制御要素と、挿入された核酸とがベクター内で作動可能に連結されていることを意味する。
【００６１】
本明細書中、「組換え」という用語は、形容詞的に用いた場合、単離された核酸（一般的にはＤＮＡ）の操作および宿主細胞の形質移入、または非内因性核酸を導入して内因性核酸を操作し代替物を発現させることによって得られた、人工的に改変または操作された核酸、外因性核酸を形質移入した宿主細胞、または人工的に発現されたポリペプチドを表す。「組換え」は、具体的には遺伝子工学技術を用いてインビトロで構築したＤＮＡ分子を包含する用語であり、分子、構築物、ベクター、細胞、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはポリヌクレオチドを説明するために形容詞的に用いた場合、具体的には、それぞれの単離されていない本来の位置（たとえば細胞内、組織内、または臓器内の位置）に天然に存在する（「内因性の」）分子、構築物、ベクター、細胞、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、およびポリヌクレオチドについては包含しない。
【００６２】
本明細書中、「組換え宿主細胞」（または本文中では単に「宿主細胞」ともいう）とは、中に外因性核酸が導入された細胞を指すことが意図される。なお、この用語は、特定の対象細胞を指すのみではなく、その細胞の子孫も指すことが意図されているものである。子孫細胞では変異または環境的影響による何らかの改変が生じ得るため、子孫細胞は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書で使用する場合は、「宿主細胞」という用語の範囲に子孫細胞も包含する。本発明の多様な側面で有用な宿主細胞は原核生物細胞および真核生物細胞が挙げられる。好ましい原核生物宿主細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）などの多様な細菌細胞が挙げられる。本発明に関連する核酸またはコードされたポリペプチドに関する一部の操作、構築、発現、または複製は、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞を用いて行うことができるが、本明細書に記載の改変配列の場合も非改変配列の場合も、目的の標的タンパク質の発現を増強するために好ましい宿主細胞は真核生物宿主細胞である。好ましい真核生物宿主細胞としては、哺乳類宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核藻類宿主細胞、線虫宿主細胞、原虫宿主細胞、魚類宿主細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary（ＣＨＯ））細胞、ＣＯＳ細胞
、Ｖｅｒｏ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓（human embryonic kidney（ＨＥＫ２９３））細胞、ベビーハムスター腎臓（baby hamster kidney（ＢＨ
Ｋ））細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＢ細胞、ＣＶ‐１／ＥＢＮＡ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＰｅｒＣ６細胞、またはＭＤＣＫ細胞であることが好ましい。好ましい真菌宿主細胞としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属が挙げられる。特に好ましいサッカロミセス属宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。特に好ましい昆虫宿主細胞はＳｆ９細胞である。
【００６３】
用語「異種性の」と「外因性の」は同義であり、ある宿主細胞に含まれるか発現される分子で、その宿主細胞が本来産生しない任意の分子（たとえばタンパク質、ポリペプチド、核酸）を説明するために形容詞的に広く用いられる。したがって、「異種性の」および「外因性の」には先に定義した「組換え」という用語が包含される。
【００６４】
当技術分野において公知であり本明細書で使用される「トランスジェニック生物」は、導入遺伝子を含む細胞を有する生物を意味する。ここで、当該生物（またはその祖先）に導入された導入遺伝子は、その生物では天然に発現されないポリペプチドまたは目的の機能を生物に与えるための正常または適切なレベルでは天然に発現されないポリペプチドを発現する。「導入遺伝子」は、トランスジェニック生物を発生させる元の細胞のゲノムに安定かつ作動可能に組み込まれる核酸構築物であり、コードされた遺伝子産物がトランスジェニック生物の１種以上の細胞型または組織で発現されるよう指示する。
【００６５】
用語「疾患」と「障害」は同義的に用いられ、当技術分野で許容される医学的基準と実務に従って認識される病理的状態を示す。
【００６６】
本明細書中、「有効量」とは治療に関する量であり、疾患または当該疾患の１つ以上の症状の重症度および／または持続期間の軽減や短縮または改善のため；有害または病理的な状態の進行を予防するため；病理的状態を退行させるため；病理的状態に関連する１つ以上の症状の再発、発症、発病または進行を予防するため；障害を検知するため；あるいは治療（別の予防薬または治療薬の投与など）による予防効果または治療効果の増強または改善のために十分な量を意味する。
【００６７】
本明細書中、「生物サンプル」としては、生物の生体または死体から採取した任意の量の物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような生物としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギ、反芻動物、およびその他の動物が挙げられるがこれらに限定されるものではない。このような生物サンプルの物質としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、痰、粘液、滑液、乳汁、精液、細胞、臓器（たとえば心臓、脾臓、肺、腎臓、乳房、脳、眼、舌、胃、膵臓、腸、胆嚢、生殖器、虫垂）、組織（たとえば骨、軟骨、筋肉、皮膚）、骨髄、リンパ節を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
【００６８】
指定された１つ以上の構成要素または工程を「含む」として本明細書に記載された組成物または方法は非制限的であり、指定された構成要素または工程が必須であるが他の構成要素または工程をその組成物または方法の範囲内で追加することができることを意味する。冗長を避けるため、指定された１つ以上の構成要素または工程を「含む」として記載された任意の組成物または方法は、指定された同一の構成要素または工程から「実質的になる」、さらに限定された対応の組成物または方法も示し、その組成物または方法が、指定された必須の構成要素または工程を含み、その組成物または方法の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しない追加的な構成要素または工程をさらに含んでもよいという意味であ
ることも理解される。指定された１つ以上の構成要素または工程「を含む」、または「から実質的になる」と本明細書に記載された任意の組成物または方法は、指定された構成要素または工程「からなり」、指定されていない他のいかなる構成要素または工程も含まない、さらに限定された制限的な対応の組成物または方法も示すということも理解される。
【００６９】
本明細書中、「Ｊドメインアナログ」とは、式Ｉ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む標的タンパク質発現増強ポリペプチド（protein expression enhancing polypeptide、すなわちＰＥＥＰ）を意味する。このようなポリペプチドは、標的タンパク質配列に組み込んで改変標的タンパク質を形成する場合、またはこれを用いてタンパク質発現増強ポリペプチドと標的タンパク質結合ドメインの融合タンパク質を構築した場合、目的の標的タンパク質の発現の増加に作用するために有用である。
【００７０】
「Ｊドメイン活性断片」または「Ｊドメインの活性断片」とは、Ｊタンパク質のＪドメインに含まれる断片であり、本明細書に記載の２種類の融合タンパク質（ＰＥＥＰと標的タンパク質との融合物またはＰＥＥＰと標的タンパク質結合ドメインとの融合物）に使用した場合に標的タンパク質の発現レベルを増強する能力を保持する断片を意味する。以下の実施例は、Ｊドメイン活性断片がＪドメインのうちαヘリックスＩＩのＣ末端側の端にある領域を共通して保持することを示す。Ｊドメインに含まれるさらに大きな部分も活性を有し得るが、αヘリックスＩＩのＣ末端側の９個のアミノ酸の全部または一部を取り除くと、タンパク質発現増強活性は必ず失われる。
【００７１】
本明細書に開示する任意の組成物または方法では、指定された任意の必須の構成要素または工程を、それらに対する公知であるか開示されている均等物で置き換えてもよい。
【００７２】
特に指定しない限り、また、方法に含まれる特定の工程よりも先に別の工程を実行する必要があるのでない限り、組成物または方法は、列挙された構成要素または工程のいかなる特定の順序によっても限定されない。
【００７３】
「〜からなる群から選択される」または「〜のいずれか」（または同等の表現）の構成要素または工程は、後に続いて列挙されたうちの１つ以上の構成要素または工程を指し、列挙された構成要素または工程のうち任意の２つ以上の組み合わせも包含されることも理解される。
【００７４】
本発明において有用なＪドメイン
多様なＪタンパク質のＪドメインが決定されている。たとえばKampinga et al., Nat. Rev., 11: 579-592（2010）; Hennessy et al., Protein Science, 14:1697-1709（2005
）を参照のこと。本発明の融合タンパク質を調製するのに有用なＪドメインは、Ｊタンパク質ファミリーに属するいずれかのタンパク質のＪドメインを定義する重要な特徴を有する（改変配列の場合も非改変配列の場合も）。したがって、本発明において有用な単離されたＪドメインは、４つのαヘリックス（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）を特徴とし、通常は高度に保存されたヒスチジン、プロリン、アスパラギン酸からなるトリペプチド配列（「ＨＰＤモチーフ」という）をヘリックスＩＩとＩＩＩとの間に有する、Ｊタンパク質のポリペプチドドメインを含む。一般的には、Ｊタンパク質のＪドメインは５０〜７０アミノ酸の長さであり、ＪドメインがＨｓｐ７０‐ＡＴＰシャペロンタンパク質と相互作用（結合）する部位は、ヘリックスＩＩ内から始まりＨＰＤモチーフを含む領域であると考えられている。代表的なＪドメインとしては、ＥＲｄｊタンパク質のＪドメイン（たとえばＥＲｄｊ３またはＥＲｄｊ５のＪドメイン）、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＪドメイン、および哺乳類のシステインストリングタンパク質（ＣＳＰ‐α）のＪドメインが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらのＪドメインや、本発明の融合タンパク質に用いることのできる他のＪドメインのアミノ酸配列を表１−１〜表１−４に示す。
表１−１〜表１−４．代表的な単離されたＪドメインのアミノ酸配列
【００７５】
【表１−１】
0006688237.tif 000003
【００７６】
【表１−２】
0006688237.tif 000004
【００７７】
【表１−３】
0006688237.tif 000005
【００７８】
【表１−４】
0006688237.tif 000006
タンパク質発現増強活性を有するＪドメイン断片およびＪドメインアナログ
アミノ末端およびカルボキシ末端の欠失解析を含む配列解析を用いてさらにＪドメインを研究した結果、Ｊドメインのうち比較的小さな部分のみがタンパク質発現増強活性の提供に必要であることが明らかになった。解析の結果、意外にも本発明のタンパク質発現増強活性はＪドメイン内から単離されたわずか９〜１０個のアミノ酸からなるポリペプチド断片によって提供できることが決定された。以下の実施例１０および１１を参照のこと。単離されたＪドメインと同様にこのようなＪドメインポリペプチド断片も、本明細書に記載された目的の細胞内（細胞内部および膜結合部位）または細胞外の（分泌された）位置での目的の標的タンパク質の発現を増強するための方法および組成物に使用できる。個々のＪドメインポリペプチド断片のアミノ酸配列はすべて同一ではないが、本明細書に記載の改変配列でも非改変配列でもタンパク質発現増強活性を提供するという点の他、いくらかの配列相同性と構造的特徴を共有し得る。
【００７９】
上記Ｊドメインポリペプチド断片の欠失変異および置換変異についてさらに解析した結果、標的タンパク質発現増強活性を有する新規なＪドメインアナログポリペプチドのファミリーの構造式を定義するための基準が得られた。このアナログポリペプチドファミリーのメンバーは８個〜９個のアミノ酸を有し、このファミリーにはＪドメインの最新のライブラリーでも現在まで同定されていない数個のＪドメインポリペプチド断片とポリペプチドが含まれる。実施例１１を参照のこと。
【００８０】
Ｊドメインポリペプチド断片およびＪドメインアナログポリペプチドのサイズは完全な（全長の）Ｊドメインより小さいため、目的の標的タンパク質の発現を増強するために改変配列および非改変配列で構築し発現できる本発明の融合タンパク質のサイズも小さくな
る。したがって、それに応じて、このような融合タンパク質をコードする組換え核酸分子のサイズも、完全なＪドメインを含む融合タンパク質をコードする核酸分子より小さくすることができる。本発明のＪドメインポリペプチド断片およびＪドメインアナログポリペプチドのサイズが比較的小さいことは、タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結（融合）させて（連結させていない）目的の標的タンパク質の代わりに患者の体内で発現させるか患者に投与する改変（融合）標的タンパク質とした、改変配列の融合タンパク質の免疫原性を低下させるうえで特に有益となり得る。融合タンパク質の免疫原性が低くなればなるほど、融合タンパク質に対する免疫反応によって融合タンパク質が急速に消失したり阻害されたりすることなく、融合タンパク質の有益な特性または効果を患者に提供するべく患者の体内に残留できる可能性が高くなる。
【００８１】
タンパク質発現増強ポリペプチドを含む融合タンパク質
本発明によれば、本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドは、宿主細胞での発現を改善する必要のある目的の標的タンパク質の発現を増強する融合タンパク質の成分として使用される。タンパク質発現増強ポリペプチドは、目的の標的タンパク質の発現を増強するために２種類の配列のいずれかの配列で使用される。２種類の配列とは、発現された目的の標的タンパク質の一次構造（アミノ酸配列）のことである。
【００８２】
タンパク質の発現を増強するための「改変」配列では、タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させて融合タンパク質、すなわち「改変された」目的の標的タンパク質を作製する。この融合タンパク質は、タンパク質発現増強ポリペプチドの非存在下では発現が不十分な改変されていない標的タンパク質の発現レベルと比較して発現レベルが増強される。このように、改変配列の融合タンパク質は目的の標的タンパク質の改変体であり、発現が不十分な非改変標的タンパク質に代わるものとして発現され採用される。
【００８３】
タンパク質の発現を増強するための「非改変」配列では、目的の標的タンパク質がタンパク質発現増強ポリペプチドと融合されていないという意味で目的の標的タンパク質の一次構造は変わらない（「改変されない」）。本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドを、目的の標的タンパク質に親和性を有し結合する標的タンパク質結合ドメインと連結する。この融合タンパク質と、改変されていない目的の標的タンパク質とを宿主細胞内で共発現させると、目的の標的タンパク質の発現レベルは標的タンパク質結合融合タンパク質がない場合の発現レベルに比べて増強される。
【００８４】
非改変配列では目的の標的タンパク質の一次構造（アミノ酸配列）は変わらない（連結して融合タンパク質となっていない）ため、多くの用途に関して、タンパク質の発現を増強するための非改変配列は改変配列よりも好ましい可能性がある。しかし、以下に説明するように、改変配列の融合タンパク質を操作して、同融合タンパク質に含まれるタンパク質発現増強ポリペプチド成分が容易に切断されて標的タンパク質の元のアミノ酸配列を有する標的タンパク質成分が遊離されるようにし、融合タンパク質からは他に残余アミノ酸が全く生じないかわずかしか生じないようにすることも可能である。特定の用途については、改変されていない標的タンパク質よりもこのような融合タンパク質が適切である場合がある。
【００８５】
融合タンパク質はいずれの配列の場合も直接合成（たとえば固相ペプチド合成、液相合成など）によって合成できるが、ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction（
ＰＣＲ））技術などの標準的な組換え核酸技術を細胞培養方法または遺伝子導入方法と組み合わせて、ほとんどの場合はより経済的に本明細書に記載の融合タンパク質を製造できると考えられる。
【００８６】
本発明の融合タンパク質を発現させるための組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチドの合成、細胞の形質移入（たとえば電気穿孔法、リポソーム媒介形質移入法、形質転換法などであるがこれらに限定されるものではない）、細胞および組織の培養の方法には標準の技術を使用できる。酵素反応および精製の技術は、当技術分野で一般に遂行されるとおり、製造者による仕様書に記載のとおり、または本明細書に記載のとおりに実施することができる。上記の技術および方法は、当技術分野で周知の従来の方法に従い、また、本明細書全体で引用し記載する様々な一般的参考文献や詳細な参考文献に記載のとおりに一般的に実施できる。たとえば、Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition（分子クローニング：実験の手引き、第２版）（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989）およびAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学の最新手順書）（John Wiley & Sons, New York, 2012）を参照のこと。これらの文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
先に述べたように、「改変された」および「改変されていない」という用語は、目的の標的タンパク質がタンパク質発現増強ポリペプチドと連結されているかを示す。なお、改変配列および非改変配列の一部の態様では、１つ以上の追加のドメインを融合タンパク質または目的の標的タンパク質と連結させることが有益となり得る。たとえば、任意の周知のエピトープタグペプチド（エピトープタグ）をタンパク質に組み込むことによって、発現されたタンパク質の検出および／または精製を容易にすることができる。このようなエピトープタグとしては、Ｖ５エピトープタグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号１１０））、Ｆｌａｇエピトープタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１１１））、ヘキサヒスチジンエピトープタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１２））、血球凝集素エピトープタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１１３））、ｃ‐ｍｙｃエピトープタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号１１４））、ＶＳＶ‐Ｇエピトープタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ（配列番号１１５））、ＨＳＶエピトープタグ（ＱＰＥＬＡＰＥＤＰＥＤ（配列番号１１６））が挙げられるがこれらに限定されるものではない。以下に説明するように、リンカーを用いてタンパク質をこのようなエピトープタグと連結させることも可能である。リンカーはタンパク質分解酵素で切断することによってタンパク質から除去（または実質的に除去）できる。
【００８８】
リンカー
当技術分野で公知の方法によって、任意のドメインを本発明の融合タンパク質に含まれる別のドメインと連結させることができる。たとえば、本発明の改変配列では、融合タンパク質はタンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させたものである。したがって、発現される融合タンパク質は改変された標的タンパク質であり、発現が不十分な融合されていない目的の標的タンパク質の代わりに用いることができる。タンパク質発現増強ポリペプチドは目的の標的タンパク質と直接連結させてもよく、リンカー分子を介して間接的に連結させてもよい。本発明の非改変配列では、融合タンパク質は、タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質に親和性を有し結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質である。この融合タンパク質を目的の標的タンパク質と共発現させることによって、改変されていない（融合されていない）目的の標的タンパク質の発現レベルは融合タンパク質がない場合の発現レベルに比べて増強される。タンパク質発現増強ポリペプチドは標的タンパク質結合ドメインと直接連結させてもよく、リンカー分子を介して間接的に連結させてもよい。改変配列の場合でも非改変配列の場合でも、その他のドメインを融合タンパク質または融合していないタンパク質と連結させることによって１つ以上の追加的特徴を与えることも可能である。たとえば、エピトープタグを融合タンパク質または融合していないタンパク質と連結させることによって、タグで標識したタンパク質の検出または精製を容易にすることができる。
【００８９】
アミノ酸レベルでは、リンカーは１個以上のアミノ酸であり、たとえば１〜１０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、さらに１〜５０個のアミノ酸などであり得る。一般的には、タンパク質発現増強ポリペプチドと目的の標的タンパク質との連結（改変配列の場合）または標的タンパク質結合ドメインとの連結（非改変配列の場合）について２１個以上のアミノ酸であるリンカーを用いる必要はない。タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質または標的タンパク質結合ドメインと直接的に連結させても、目的のタンパク質または標的タンパク質結合ドメインの有する必要な生化学的特性および機能的特性が有意に減少するとは思われないためである（データは示さず）。
【００９０】
本発明の融合タンパク質を作製するための１つ以上のリンカーは、当業者の知識の範囲内で選択される。たとえばArai et al., Protein Eng., 14(8): 529-532 (2001); Crasto
et al., Protein Eng., 13(5): 309-314 (2000); George et al., Protein Eng., 15(11): 871-879 (2003); Robinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5929-5934 (1998)を参照のこと。タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質または標的タンパク質結合ドメインと連結させるために特定のリンカーを用いることについて一般的に考慮すべき点としては、ある機能性ドメインを別の機能性ドメインと連結させて作製するその他の融合タンパク質の作製の際に考慮すべき点が挙げられる。たとえば、改変された機能性結合タンパク質を作製するために免疫グロブリンの可変ドメインおよび／または定常ドメインを多様な形式で連結する際に考慮するような点が挙げられる。タンパク質発現増強ポリペプチドと連結された目的の標的タンパク質または標的タンパク質結合ドメインの折り畳みをリンカーが妨げてはならないことは明らかである。融合タンパク質にリンカーを用いる場合、リンカーはタンパク質発現増強ポリペプチドを最適に寄与させて改変配列の融合タンパク質または非改変配列の（融合していない）目的の標的タンパク質の発現または産生のレベルが増強されるように選択される。目的の標的タンパク質または標的タンパク質結合ドメインにタンパク質発現増強ポリペプチドを直接結合しても所望の発現レベルの増強が得られる場合には、リンカーはなくてもよい。本発明の融合タンパク質に存在するリンカー分子は、発現ベクターのクローニング部位またはその周辺の核酸のセグメントに存在するヌクレオチド配列によってコードされる１個以上のアミノ酸を含み得る。この発現ベクターには、タンパク質ドメイン（たとえばタンパク質発現増強ポリペプチド、目的のタンパク質、標的タンパク質結合ドメイン）または融合タンパク質全体をコードする核酸セグメントをインフレームで挿入する。
【００９１】
リンカー分子は、特に４アミノ酸以上の長さのものは、目的のタンパク質が適切な立体構造に折り畳まれるのを可能にする柔軟性を有することが好ましい。当分野では機能性ドメインを連結するための比較的柔軟な様々なリンカーが知られている。リンカーは、エピトープタグなどの１つ以上の追加的ドメインを本発明の融合タンパク質のタンパク質発現増強ポリペプチドまたは目的のタンパク質と連結させるのに用いることもできる。本発明の融合タンパク質の作製に用いることができるリンカーとしては以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない：ＤＩＡＡＡ（配列番号１１７）；ＤＩＡＡＡＬＥ（配列番号１１８）；ＧＴＧＳＥＦ（配列番号１１９）；ＡＳ；ＴＶＡ；ＡＳＴＫ（配列番号１２０）；ＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号１２１）；ＤＩＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＡＡＡ（配列番号１２２）；ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲ（配列番号１２３）；ＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号１２４）；ＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号１２５）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＧＧ（配列番号１２６）；ＳＡＫＴＴＰ（配列番号１２７）；ＲＡＤＡＡＰ（配列番号１２８）；ＲＡＤＡＡＰＴＶＳ（配列番号１２９）；ＲＡＤＡＡＡＡＧＧＰＧＳ（配列番号１３０）；ＲＡＤＡＡＡＡ（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１３１）；ＳＡＫＴＴＰＫＬＥＥＧＥＦＳＥＡＲＶ（配列番号１３２）；ＡＤＡＡＰ（配列番号１３３）；ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰ（配列番号１３４）；ＴＶＡＡＰ（配列番号１３５）；ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号１３６）；ＱＰＫＡＡＰ（配列番号１３７）；ＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰ（配列番号１３８）；ＡＫＴＴＰＰ（配列番号１３９）；ＡＫ
ＴＴＰＰＳＶＴＰＬＡＰ（配列番号１４０）；ＡＫＴＴＡＰ（配列番号１４１）；ＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰ（配列番号１４２）；ＡＳＴＫＧＰ（配列番号１４３）；ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号１４４）；ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４５）；ＧＥＮＫＶＥＹＡＰＡＬＭＡＬＳ（配列番号１４６）；ＧＰＡＫＥＬＴＰＬＫＥＡＫＶＳ（配列番号１４７）；ＧＨＥＡＡＡＶＭＱＶＱＹＰＡＳ（配列番号１４８）；ＧＧＧＧＧＧＧＰ（配列番号１４９）；ＧＧＧＧＧＧＧＧＰ（配列番号１５０）；ＰＡＰＮＬＬＧＧＰ（配列番号１５１）；ＰＮＬＬＧＧＰ（配列番号１５２）；ＧＧＧＧＧＧＰ（配列番号１５３）；ＰＡＰＥＬＬＧＧＰ（配列番号１５４）；ＰＴＩＳＰＡＰＮＬＬＧＧＰ（配列番号１５５）；ＴＶＡＡＤＤＤＤＫＳＶＦＩＶＰＰ（配列番号１５６）；ＴＶＤＤＤＤＫＡＡＰ（配列番号１５７）；ＬＶＰＲＧＳＡＡＰ（配列番号１５８）；ＡＳＴＫＧＰＳＶ（配列番号１５９）；ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ（配列番号１６０）；ＴＶＡＡＰＳＶ（配列番号１６１）；ＴＶＡＡＰＳＶＦＩ（配列番号１６２）など。
【００９２】
一部の態様では、融合タンパク質は１種以上のプロテアーゼによって切断できる１つ以上のリンカーを含んでもよい。このようなリンカーは、認識配列またはその付近でタンパク質を切断するべくプロテアーゼに認識されるアミノ酸配列を有する。１つ以上の切断可能なリンカー分子を融合タンパク質に組み込むことによって、発現された融合タンパク質から１つ以上のドメインを除去するという選択肢が得られる。たとえば、一部の用途または製法では、目的のタンパク質と連結されたポリペプチド発現増強ポリペプチドの除去（たとえば潜在的な免疫原性を低下させるため）、および／または発現された融合タンパク質を容易に検出または精製できるように融合タンパク質に組み込んであったエピトープタグの除去が望ましい場合があるが、この例に限定されるものではない。別の例では、融合タンパク質が分泌された場合、切断可能なリンカーによって目的のタンパク質と連結されているポリペプチド発現増強ポリペプチド（またはその他のドメイン）を、その融合タンパク質が発現されている培養液に適切なプロテアーゼを直接添加することによって除去することができる。あるいは、切断可能なリンカーによって連結されたタンパク質発現増強ポリペプチド（またはその他のドメイン）を、融合タンパク質を培養液から精製するための１つ以上の工程を実施した後で除去してもよい。
【００９３】
状況によっては、タンパク質と連結されたドメインまたはエピトープタグを除去することが有用となり得る。このことは、たとえば、追加的ドメインまたはタグを含むタンパク質を、そのタンパク質のリンカーを切断できるプロテアーゼの発現が制御されている細胞内で発現させることによって遂行できる。たとえば、適切なプロテアーゼを発現するための組換え遺伝子を細胞に組み込むことが挙げられる。この組換え遺伝子はプロモーターによって制御され、プロモーターは、細胞が融合タンパク質を発現した後に培養液に対して与えることのできる誘因（たとえば温度変化）や作用（イオン変化）によって制御できる。原核生物細胞または真核生物細胞の遺伝子発現を制御するための多様なプロモーターが当技術分野で利用可能である。また、ある細胞は、対応する切断部位を含むリンカー分子を切断することができる１種以上のプロテアーゼを発現する。宿主細胞が発現できるプロテアーゼを使用することがその宿主細胞によって発現された融合タンパク質に含まれるリンカーを切断するのに有用となり得るかどうかは、当業者の技術の範囲内で決定される。また、プロテアーゼで切断可能なリンカーを介して追加的ドメインまたはタグと連結されたタンパク質を含む、培地や細胞可溶化物などのサンプルに適切なプロテアーゼを添加することも可能である。
【００９４】
あるタンパク質またはタンパク質ドメインを別のものと連結させるための、タンパク質分解切断部位を含む多様なリンカー分子が当技術分野で公知であり利用可能である。このようなリンカーとしては、以下の例のうち１種以上が挙げられるが、これに限定されるものではない（アスタリスク（＊）はタンパク質分解切断部位を示す）：ＤＹＫＤＤＤＤＫ＊（配列番号１６３）；ＡＳＤＤＤＤＫ＊ＧＧＰ（配列番号１６４）；ＡＬＶＰＲ＊ＧＳ
ＧＰ（配列番号１６５）；ＡＳＴＤＤＤＤＫ＊ＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号１６６）；ＴＶＡＬＶＰＲ＊ＧＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号１６７）；ＡＳＴＬＶＰＲ＊ＧＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号１６８）；ＴＶＡＡＤＤＤＫ＊ＳＶＦＩＶＰＰ（配列番号１６９）；ＡＳＴＤＤＤＫ＊ＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号１７０）；ＬＥＶＬＦＱ＊ＧＰ（配列番号１７１）；ＴＶＡＡＬＥＶＬＦＱ＊ＧＰＡＰ（配列番号１７２）；ＡＳＴＬＥＶＬＦＱ＊ＧＰＬＡＰ（配列番号１７３）；ＰＡＰＬＥＶＬＦＱ＊ＧＰ（配列番号１７４）；ＴＡＥＮＬＹＦＱ＊ＧＡＰ（配列番号１７５）；ＡＥＮＬＹＦＱ＊ＧＡ（配列番号１７６）；ＰＧＰＦＧＲ＊ＳＡＧＧＰ（配列番号１７７）；ＰＧＰＦＧＲ＊ＳＡＧＧ（配列番号１７８）；ＰＱＲＧＲ＊ＳＡＧ（配列番号１７９）；ＰＨＹＧＲ＊ＳＧＧ（配列番号１８０）；ＧＰＦＧＲ＊ＳＡＧＰ（配列番号１８１）；ＧＤＤＤＤＫ＊ＧＧＰ（配列番号１８２）；ＡＧＤＤＤＤＫ＊ＧＧＰ（配列番号１８３）；ＧＧＤＤＤＤＫ＊ＧＧＰ（配列番号１８４）；ＥＮＬＹＦＱ＊Ｇ（配列番号１８５）；ＥＮＬＹＦＱ＊Ｓ（配列番号１８６）など。
【００９５】
本発明のタンパク質に採用した切断可能なリンカーを切断するために使用できる多様なタンパク質分解酵素が当技術分野で知られている。目的の標的タンパク質を含む融合タンパク質に含まれる切断可能なリンカーを切断するために選択されるプロテアーゼが、目的の標的タンパク質またはリンカーの切断後も保持されることが所望される他のドメインまで切断してはならないことは明らかである。融合タンパク質に含まれるリンカーの中の部位で融合タンパク質を切断するのに使用できるタンパク質分解酵素としては、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ、タバコエッチウイルス（tobacco etch virus（ＴＥＶ））プロテアーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（tissue
plasminogen activator（ｔＰＡ））、亜鉛依存性エンドペプチダーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（matrix metalloproteinase（ＭＭＰ））、セラリシン、アスタシン、アダマリシン、ディスインテグリン、ＡＤＡＭ、カスパーゼ、カテプシン、カルパインなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
融合タンパク質をコードする核酸
目的の標的タンパク質の発現を増強するために改変配列または非改変配列で使用される融合タンパク質をコードする核酸（一般的にはＤＮＡ）分子は、当技術分野で利用可能な標準の方法を用いて構築される。タンパク質の検出および／または精製を容易にするために用いる標準的なエピトープタグのような１つ以上の追加のドメインをタンパク質に組み込むこともできる。所望の融合タンパク質をコードする核酸分子を、その融合タンパク質を発現するための組換え構造遺伝子を複製させるために、当技術分野で入手可能な多様なクローニングベクターのうち任意のベクターに挿入することができる。融合タンパク質を発現させるため、その融合タンパク質をコードする核酸分子を、当技術分野で入手可能な多様なクローニングベクターのうち任意のベクターに挿入することができる。次いで、融合タンパク質をコードする挿入された核酸を含む発現ベクターを、発現ベクターから融合タンパク質を発現させることのできる適合宿主細胞に導入する。非改変配列については、宿主細胞が目的の標的タンパク質を発現すための機能性遺伝子を有さない場合、ベクターは改変されていない目的の標的タンパク質をコードする機能性構造遺伝子のコピーも含み得る。
【００９７】
本発明の発現ベクターは、本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドをコードする核酸セグメントと、タンパク質発現増強ポリペプチドのコード配列の５’末端または３’末端に位置する１つ以上のクローニング部位（たとえば特有の制限酵素部位）とを有する発現ベクター分子を含む。このクローニング部位には融合タンパク質の別のドメインをコードする核酸分子を挿入できる。改変配列の場合、目的の標的タンパク質をコードする核酸を挿入して所望の融合タンパク質（改変された標的タンパク質）を作製できる。これに対し、非改変配列の場合、標的タンパク質結合ドメインをコードする核酸を挿入して、改変されていない目的の標的タンパク質に結合しその発現を増強することが可能な融合
タンパク質を作製できる。発現ベクターは複数のクローニング部位を有していてもよい。複数のクローニング部位によって、１つ以上のその他の所望のドメイン（たとえばエピトープタグ、Ｆｃ領域など）をコードする１つ以上の追加的核酸セグメントを挿入して所望の融合タンパク質を構築および発現させることが可能になる。所望の融合物をコードする最終的な核酸融合構築物は、発現ベクターのプロモーターと作動可能に連結される。ベクター分子へのクローニング部位の設計や、所望のタンパク質をコードする挿入された核酸セグメントを適合する宿主細胞内でタンパク質を発現させるのに必要なプロモーターやその他のシグナルと作動可能に連結することについては、当分野の技術の範囲内で行うことができる。
【００９８】
本発明の融合タンパク質をコードする核酸構築物の構築に関し、本明細書中の記載では、様々な核酸分子を連結させて完全に構築された核酸構築物を発現ベクターへ挿入するまでの特定の段階的順序を示唆する場合があるが、所望の融合タンパク質をコードする核酸構築物を作製するために核酸分子のセグメントを連結する正確な順序は当業者の判断、技術、経験の範囲内で決められることが理解され認識される。また、最初にすべてのセグメントを連結させ、融合タンパク質をコードする核酸分子を発現ベクターへの挿入前に作製することは可能であるが、場合によっては、１つ以上のドメインをコードする核酸セグメントが発現ベクター内に既に適切に存在しているため、発現ベクター内に既に存在しているそのセグメントに隣接するように１つ以上の核酸セグメントを挿入することによって本発明の所望の融合タンパク質を発現させるための作動可能に連結された構造遺伝子を発現ベクター内で構築するのが実用的である。
【００９９】
本発明の融合タンパク質をコードする発現ベクターは、特定の発現ベクターから融合タンパク質を発現させるのに適合する多様な宿主細胞のうち任意の宿主細胞に形質移入することができる。本発明の融合タンパク質をコードする組換え構造遺伝子の構築方法の一部の工程は、原核生物細胞でも真核生物細胞でも行うことができるが、本発明の融合タンパク質の発現を増強するために好ましい宿主細胞は真核生物細胞である。本発明において有用な真核生物宿主細胞としては、哺乳類宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真菌宿主細胞、真核藻類宿主細胞、線虫宿主細胞、原虫宿主細胞、魚類宿主細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明の融合タンパク質を発現させるのに有用な哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese Hamster Ovary（ＣＨＯ
））細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、ヒト胎児腎臓（human embryonic kidney（ＨＥＫ２９３））細胞、ベビーハムスター腎臓（baby hamster kidney（ＢＨＫ））細胞、ＨｅＬａ細胞、ヒトＢ細胞、ＣＶ‐１／ＥＢＮＡ細胞
、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＰｅｒＣ６細胞、ＭＤＣＫ細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のＪドメイン融合タンパク質を発現するのに有用な真菌宿主細胞としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に好ましいサッカロミセス属宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）細胞である。
【０１００】
本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子は、当技術分野で利用可能な方法を用いて、その融合タンパク質を容易に精製できるレベルで発現させるために植物またはヒト以外の動物の細胞に導入することができ、あるいは遺伝子治療として、発現された融合タンパク質に含まれる目的のタンパク質が提供する機能による利益をもたらすために、植物、ヒト、またはヒト以外の動物の細胞に導入することができる。このような方法を用いて、融合タンパク質をコードする導入核酸（導入遺伝子）によってコードされる融合タンパク
質を発現するトランスジェニック植物またはトランスジェニック動物を提供することができる。植物およびヒト以外の動物の場合、そのトランスジェニック生物の子孫もその融合タンパク質を発現できるように、タンパク質をコードする発現可能な核酸を生殖系列に組み込むための技術が利用可能である。植物またはヒト以外の動物の細胞に核酸を導入するには多様なベクターおよび方法が利用可能であり、ネイキッドＤＮＡを細胞内に注射する方法、弾道を利用する導入（たとえば遺伝子銃を用いる）、リポソーム、ウイルス由来ベクター分子などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０１】
本発明によるヒト患者を治療するための遺伝子治療には、本明細書に記載の改変配列または非改変配列の発現増強ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする組換え遺伝子を採用できる。このような遺伝子治療は、不適切に折り畳まれたタンパク質種が原因で機能の損失または実質的な損失が生じたために臨床的に認識された病理的状態が起こるような疾患には特に有用である。不適切に折り畳まれたタンパク質種が機能の損失につながっていることが実証または示唆された疾患の例としては、プリオン関連疾患（伝染性海綿状脳症）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症（cystic fibrosis（ＣＦ））α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症などが挙げられるが、これら
に限定されるものではない。
【０１０２】
本発明の改変配列を採用する遺伝子治療では、タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質をコードする組換え遺伝子を構築する。この組換え遺伝子をベクターに挿入し、それをヒト患者の体細胞のゲノムに組み込む。たいていの場合、組換えベクターがすべての体細胞のゲノムに取り込まれて組み込まれる必要はなく、特定の疾患に関連する可能性のある細胞の亜集団に組み込まれればよい。ヒト患者の体細胞で、組み込まれた組換え遺伝子から発現された融合タンパク質は、欠けているか、失われていたか、あるいは低下して患者の体内で臨床的に認識された疾患を引き起こす目的の内因性標的タンパク質の機能を回復させることによって疾患を治療する。
【０１０３】
本発明の非改変配列を採用する遺伝子治療では、タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質に親和性を有し結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質をコードする組換え遺伝子を構築する。この組換え遺伝子をベクターに挿入し、それをヒト患者の体細胞のゲノムに組み込む。ここでも、たいていの場合、組換えベクターがすべての体細胞のゲノムに取り込まれて組み込まれる必要はなく、特定の疾患に関連する可能性のある細胞の亜集団に組み込まれればよい。ヒト患者の細胞内で組み込まれた遺伝子から融合タンパク質が発現されることによって、目的の内因性標的タンパク質の発現が増強され、タンパク質はその標的タンパク質によって与えられる必要な機能を細胞にもたらすため、臨床的に認識された疾患を防ぐことができる。目的の内因性標的タンパク質を発現するための内因性遺伝子が機能しないか欠失した場合、目的の標的タンパク質をコードする組換え遺伝子も構築し、融合タンパク質と共発現させるためにベクターに挿入してヒト患者のゲノムに組み込まなければならない。
【０１０４】
ヒト患者の体細胞への核酸分子の導入には、多様なベクター、薬剤、方法のうち任意のものを使用することができ、改変ウイルス（たとえば改変アデノウイルス、改変レンチウイルス）、ウイルス随伴ウイルス（たとえばアデノウイルス随伴ウイルス）、ネイキッドＤＮＡ（ネイキッドプラスミドＤＮＡなど）、ＤＮＡを高密度で内封したナノ粒子、リポソーム(たとえば様々な陽イオン性脂質を用いる)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
タンパク質発現増強ポリペプチドと目的の標的タンパク質とを含む本発明の改変配列の融合タンパク質
本発明の改変配列の融合タンパク質は、タンパク質発現増強ポリペプチド（ＰＥＥＰ（
本明細書に記載の単離されたＪドメイン、Ｊドメイン活性ポリペプチド断片、およびＪドメインアナログポリペプチドが包含される））を目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質である。タンパク質発現増強ポリペプチドは目的の標的タンパク質のアミノ（Ｎ）末端またはカルボキシ（Ｃ）末端に連結させることが好ましい。タンパク質発現増強ポリペプチドは、目的のタンパク質との間にリンカー、酵素切断部位、エピトープタグなどの１つ以上の介在ポリペプチド配列を挟んで目的のタンパク質と離れていてもよい。タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質に挿入することは可能であるが、実務上の問題として、そのためにはより複雑な組換えＤＮＡ操作が必要であり、目的の標的タンパク質の適切な折り畳み、所望の機能またはその他の特性を妨げる可能性が高いため、一般的にはあまり好まれない。本発明の改変配列の融合タンパク質を作製するのに用いることのできる目的の標的タンパク質は、所望の特性を有する任意のタンパク質またはポリペプチドであり、細胞内位置に通常は存在している可溶性タンパク質、膜結合タンパク質（膜貫通タンパク質など）、分泌タンパク質、遺伝子改変した非天然タンパク質が含まれる。遺伝子改変した非天然タンパク質としては、天然の膜結合タンパク質の組換え可溶型タンパク質、たとえば膜貫通タンパク質（たとえばインテグリン、補体調節タンパク質）の細胞外ドメインを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。改変配列の融合タンパク質の標的タンパク質成分として用いることができる改変した非天然タンパク質の別の例は、組換え可溶受容体分子を含む組換え融合タンパク質であり、このような融合タンパク質では細胞表面受容体の細胞外結合ドメインが免疫グロブリンＦｃドメインまたは免疫グロブリン骨格に融合されている。このような非天然の融合タンパク質としてはエタネルセプトを挙げることができるが、これに限定されるものではない。エタネルセプトではｐ７５ヒトＴＮＦα受容体分子の細胞外ドメインがＩｇＧ１免疫グロブリンのヒンジおよびＦｃドメインと連結されている。本発明の改変配列の融合タンパク質に目的の標的タンパク質として用いることのできるその他のタンパク質としては、抗体およびその抗原結合部分、サイトカイン、ペプチドホルモン、酵素（たとえばトロンビン、ラクターゼ、プロテアーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼなど）、形態形成タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０６】
タンパク質発現増強ポリペプチドと標的タンパク質結合ドメインとを含む本発明の非改変配列の融合タンパク質
タンパク質発現増強ポリペプチド（本明細書に記載の単離されたＪドメイン、Ｊドメイン活性ポリペプチド断片およびＪドメインアナログポリペプチドが包含される）は、目的位置での目的の標的タンパク質の発現を増強するために非改変配列で使用することもできる。本発明の非改変配列では、融合タンパク質はタンパク質発現増強ポリペプチドを標的タンパク質に親和性を有し結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質である。したがって、本発明の非改変配列では、目的の標的タンパク質は融合タンパク質の成分ではないため、その一次構造（アミノ酸配列）は変化しない。特定の機序に拘束されるものではないが、融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインに目的の標的タンパク質が結合すると目的の標的タンパク質がタンパク質発現増強ポリペプチド（同じく融合タンパク質に含まれる）と比較的接近するため、目的の細胞内位置または細胞外位置での標的タンパク質の発現レベルが、融合タンパク質が存在しない場合の発現レベルに比べて増強されると考えられる。タンパク質の折り畳み、区画化または分泌に関与する、シャペロンタンパク質またはその他の翻訳後の細胞機構の動員が増加することがこのことと関係しているかもしれないし、あるいは細胞内の分解経路からの回避が改善することが関係しているかもしれない。所望の細胞内位置または細胞外位置で見られる発現タンパク質が有意に増加することからもこの効果が証明される。
【０１０７】
非改変配列に有用な標的タンパク質結合ドメイン
本発明の非改変配列の融合タンパク質は、適切な細胞内位置または細胞外位置での発現の増強が所望される目的の標的タンパク質に結合する標的タンパク質結合ドメインを含む
。本発明の標的タンパク質結合性融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインには、標的タンパク質に結合することが知られている任意のタンパク質またはその結合ドメインを用いてよい。標的タンパク質に対するタンパク質またはその結合ドメインの結合親和特異性が高いほど、目的の標的タンパク質に対して所望された発現レベルの増強をその他のタンパク質が妨げる可能性は低くなる。
【０１０８】
標的タンパク質結合ドメインの例としては、天然の抗体および遺伝子改変抗体から単離された抗原結合部位および抗原結合断片が挙げられる。ここで、抗体の抗原結合部位または抗原結合断片は、発現の増強が所望される標的タンパク質に結合する。これに関して、目的の標的タンパク質に結合する抗体および抗原結合断片は当技術分野で利用可能な標準の技術を用いて容易に産生することができる。本発明の非改変配列の融合タンパク質に含まれる標的タンパク質結合ドメインの由来として使用できる多様な遺伝子改変抗体の形態が当技術分野で公知である。このような形態としては、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）が挙げられるがこれらに限定されるものではない。たとえば、Marvin et al., Acta Pharmacol. Sin., 26(6): 649-658 (2005)；Kufer et al, Trends Biotechnol., 22(5): 238-244 (2004)；Kontermann, Acta Pharmacol. Sin., 26(1): 1-9 (2005)；およびChan et al., Nat. Rev, 10: 301-316 (2010)による、当技術分野で利用できる多様な機能性遺伝子改変抗体の結合性形態についての概説を参照のこと。
【０１０９】
本発明では、標的タンパク質を対象とする抗原結合ドメインを単一ポリペプチドの形で有する抗体分子または断片が特に有用である。このようなポリペプチドは標準的なインビトロのＤＮＡ技術を用いて容易にタンパク質発現増強ポリペプチドと連結させ、本発明の融合タンパク質を作製することができるためである。たとえば単鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）では、抗原結合部位のＶＨドメインおよびＶＬドメインが連結されて単一ポリペプチドをなしている。抗原結合部位全体を単一の重鎖可変ドメイン内に有する単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）から単鎖抗原結合部位を得ることもできる。たとえば、Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)；Muyldermans et al., ProteinEng., 7: 1129-1135 (1994)；Vu et al., Mol. Immunol., 34: 1121-1131 (1997)；Muyldermans et al., Trends Biochem. Sci., 26: 230-235 (2001)；Nguyen et al., Immunogenetics, 54: 39-47 (2002)を参照の
こと。
【０１１０】
免疫グロブリンＦｃドメインを有する標的タンパク質に関して、上記のように、標的タンパク質結合ドメインには抗体または抗体の抗原（Ｆｃドメイン）結合断片を用いることができる。抗体またはその抗原結合ドメインの代わりに、Ｆｃドメインに特異的に結合することが知られている多様な非免疫グロブリンタンパク質および非免疫グロブリンポリペプチドのうち任意のものを用いてもよい。Ｆｃ結合ドメインを有するタンパク質としては、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、単純ヘルペスウイルス１型（herpes simplex virus type 1（ＨＳＶ‐１））のｇＥタンパク質などが挙げられるがこれらに限定されるものでは
ない。また、Ｆｃドメインに結合する多数の合成ペプチドが同定されている。たとえば、DeLano et al., Science, 287:1279-1283 (2000)およびYang et al., J. Peptide Res., 66(Suppl. 1): 120-137 (2006)を参照のこと。以下の実施例に示すように、このようなＦｃ結合性のタンパク質およびペプチドはＦｃドメインを含む目的の標的タンパク質を対象とした本発明の融合タンパク質の標的結合ドメインとして容易に採用される。
【０１１１】
目的の標的タンパク質があるタンパク質リガンドに結合する受容体またはその機能部分である場合、そのタンパク質リガンドを本発明の融合タンパク質の標的結合ドメインとして用いることができる。受容体の機能部分としては、膜結合受容体のうちリガンドに結合する機能性ドメインを含む細胞外ドメインが挙げられるがこれに限定されるものではない。一般的に、リガンドに結合する機能性ドメインを含むこのような細胞外部分は受容体の膜貫通ドメインと細胞質ドメインを除いた部分であるため、「切断型受容体」と呼ばれる。本発明によれば、このような切断型受容体分子の発現は、受容体のタンパク質リガンドを含む本発明の融合タンパク質と共発現させることによって増強できる。したがって、以下の実施例に示すようなある種のサイトカインポリペプチド（たとえばＩＬ８、ＩＬ１３など）などの単一ポリペプチドであるリガンドタンパク質が本発明の非改変配列の融合タンパク質の標的結合ドメインとして使用するのに特に適している。標的となる受容体タンパク質またはそのリガンド結合部分に結合させるために融合タンパク質に用いることができるその他のタンパク質リガンドとしては、ポリペプチド補助受容体、ポリペプチド補助抑制因子、ポリペプチド補助因子が挙げられる。
【０１１２】
標的タンパク質が公知の受容体分子が結合するタンパク質リガンド（たとえばサイトカイン）である場合、本発明の非改変配列の融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインは、同族の受容体か、標的タンパク質に結合する受容体の細胞外リガンド結合部分を含み得る。
【０１１３】
標的タンパク質の発現を増強するための融合パートナーとしてＢＡＧドメインが当該技術分野で提案されている。多様なＢＡＧタンパク質のＢＡＧドメインが特定されている。たとえばTakayama et al., Nat.Cell Biol., 3: E237-E241(2001)を参照のこと。ＢＡＧ
ドメインには、ＢＡＧタンパク質ファミリーに属する任意のタンパク質のＢＡＧドメインを定義する重要な特徴がある。つまり、ＢＡＧドメインはＢＡＧタンパク質のポリペプチドドメインからなり、一般的には８５〜１２４アミノ酸の長さであり、Ｈｓｐ７０シャペロンタンパク質のＡＴＰａｓｅドメインに結合し、αヘリックス（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ）の逆平行配置が３か所あることを特徴とする。ここで、ヘリックスＩＩＩとＩＶはＨｓｐ７０シャペロンタンパク質のＡＴＰａｓｅドメインと相互作用する。近年、所望の組換えタンパク質をＢＡＧドメインと連結させて得られた融合タンパク質はそのタンパク質単独の発現レベルよりも高いレベルで発現されることが報告された。国際公開第２０１２／０８７８３５号（Ａ２）を参照のこと。
【０１１４】
以下の実施例によると、非改変配列で採用されたＢＡＧドメインでは目的の標的タンパク質の発現レベル有意な増強は得られなかった。対照的に、本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドは改変配列でも非改変配列でも有意に目的の標的タンパク質の発現レベルを増強する。以下の実施例に示すように、タンパク質発現増強ポリペプチド（単離されたＪドメイン、Ｊドメイン活性断片またはＪドメインアナログポリペプチドなど（たとえば本明細書に記載の式Ｉのものまたはそれと同種の特定の１０〜１２アミノ酸のもの）を目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質（本発明の改変配列の場合）は、対照細胞（融合タンパク質なし）での発現レベルよりも有意に高いレベルで発現された。その他の試験から、本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドを標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質（非改変配列の場合）は、改変されていない目的の標的タンパク質の発現レベルを、この融合タンパク質もＢＡＧドメインを標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質もない場合（対照）と比較して有意に増強するのに有効であることがわかった。したがって、本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドは、改変配列および非改変配列で目的の標的タンパク質の発現を増強するのに用いるための新規なポリペプチドのファミリーを提供する。
【０１１５】
嚢胞性線維症を治療するための遺伝子治療法
嚢胞性線維症（ＣＦ）とは、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（ＣＦＴＲ））タンパク質、ｃＡＭＰ調節性塩素イオン
チャネルおよびチャネル調節因子をコードする遺伝子の変異を原因とする常染色体劣性遺伝疾患である。ＣＦＴＲの５０８位のフェニルアラニン残基の欠失（Δ５０８Ｆ）が、ＣＦＴＲタンパク質の立体構造を変化させる最も一般的な変異である。この変異が起きると
、ＣＦＴＲタンパク質は小胞体（endoplasmic reticulum（ＥＲ））の品質システムによ
って急速に分解される。野生型ＣＦＴＲタンパク質機能の一部を回復させることさえできればＣＦ患者に有益な治療を提供できるというのが一般的な統一見解である。そのため、ＣＦＴＲを用いた多数の遺伝子治療試験が試みられてきたが、ＣＦＴＲを発現させるための遺伝子の送達が非効率的であることや、媒介物（たとえばウイルスベクター）に対する免疫原性が理由で未だに成功していない。野生型ＣＦＴＲの適切なタンパク質折り畳みは難しいことが知られていることから、ＣＦＴＲタンパク質のタンパク質折り畳みが改善できれば非常に有用であろう。
【０１１６】
２０年以上前にＣＦＴＲ遺伝子が同定され単離されて以来、嚢胞性線維症（ＣＦ）を治療するための遺伝子治療について２０件以上の臨床試験が実施されてきた。Davies et al., Proc. Am. Thor. Soc., 7: 408-414(2010)に記載の嚢胞性線維症の遺伝子治療に関す
る概説を参照のこと。このような臨床試験によって、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御（ＣＦＴＲ）タンパク質の補充についての概念実証は既に確立されたが、ヒト患者の細胞内で補充ＣＦＴＲタンパク質の有効な発現レベルを維持できるようにすることが、ＣＦを治療するための有効な遺伝子治療の開発における根強い課題のひとつとして残っている。野生型ＣＦＴＲタンパク質は不安定なことでよく知られるタンパク質である。ＣＦ患者の９０％以上は、変異型ＣＦＴＲの遺伝子（ＣＦＴＲΔ５０８Ｆ）のコピーを少なくとも１つ有する。この変異型ＣＦＴＲは、５０８位のフェニルアラニン残基が欠失しているために細胞内で急速に分解される非常に不安定なタンパク質である。このことから、ＣＦ患者のＣＦＴＲ機能の改善または回復につながるようなＣＦ治療のための融合遺伝子治療法が示唆される。このような遺伝子治療は、本発明の改変配列または非改変配列の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。
【０１１７】
以下の実施例に示すように、野生型ＣＦＴＲタンパク質またはＣＦＴＲΔ５０８Ｆタンパク質を改変配列でタンパク質発現増強ポリペプチド（Ｊドメインなど）と融合した融合タンパク質は、いずれの融合していないタンパク質よりも有意に高いレベルで発現された。このことから、ＣＦ患者のＣＦＴＲ機能の改善または回復につながるようなＣＦ治療のためのＪドメイン融合遺伝子治療法が示唆される。したがって、本発明の改変配列は新規な形態の遺伝子治療を提供する。この遺伝子治療では有意に高いレベルで発現される融合タンパク質を使用するため、多様な疾患に関連する、欠けているか失われた機能を過去の治療法よりも有効に補充または回復する。
【０１１８】
非改変配列については、融合タンパク質はタンパク質発現増強ポリペプチドを野生型ＣＦＴＲタンパク質またはＣＦＴＲΔ５０８Ｆタンパク質に結合する結合ドメインと連結させた融合タンパク質である。多数のタンパク質がＣＦＴＲのカルボキシ末端の高度に保存されたＰＤＺ結合領域と結合するＰＤＺドメインを有することが知られている。本発明の非改変配列の融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインとして使用するＰＤＺドメインの由来として用いることができるタンパク質としては、ＰＤＺアダプタータンパク質のＮＨＥＲＦファミリーに属する任意のタンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＮＨＥＲＦファミリーに属するＰＤＺアダプタータンパク質としては、ＮＨＥＲＦ１（ＮＨＥＲＦ、ＥＢＰ５０、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１としても知られる）、ＮＨＥＲＦ２（Ｅ３ＫＡＲＰまたはＳＬＣ９Ａ３Ｒ２としても知られる）、ＰＤＺＫ１（ＣＡＰ７０またはＮＨＥＲＦ３としても知られる）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。たとえば、Haggie et al., J. Biol. Chem., 279(7): 5494-5500 (2004)；Guggino, W.B., Proc. Am. Thorac. Soc., 1: 28-32 (2004)；およびSingh et al., J. Clin. Investig., 119(3): 540-550 (2009)を参照のこと。このように、ＰＤＺタンパク質のＰＤＺド
メインは、ＣＦＴＲΔ５０８Ｆおよび野生型ＣＦＴＲタンパク質のいずれか一方または両方を標的とするよう設計された融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインとして、本発明の遺伝子治療に特に有用となり得る。
【０１１９】
したがって、本発明は新規な形態の遺伝子治療を提供する。この遺伝子治療では、不安定な内因性タンパク質（不安定なＣＦＴＲΔ５０８Ｆなど）の発現レベルおよび／または所望の異種性タンパク質（野生型ＣＦＴＲなど）の発現レベルを有意に増強する融合タンパク質が提供されるため、多様な疾患に関連する、欠けているか失われた機能をより有効に補充または回復する。
【０１２０】
本発明のさらなる態様と特徴は、以下に示す実施例から明らかであるが、この実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１２１】
実施例１．改変配列を用いた目的の標的タンパク質の発現を増強するための組成物および方法
本明細書に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドと連結した目的の標的タンパク質を発現するための発現ベクタープラスミドを構築した。この融合タンパク質は、標準のエピトープタグとさらに連結させてもよい。エピトープタグは、それに対応する抗タグ抗体と標準の免疫ブロット分析によって容易に認識または単離できるように、通常はタンパク質構築物のカルボキシ（Ｃ）末端またはアミノ（Ｎ）末端に結合させる。
【０１２２】
多様な制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を有するＤＮＡリンカー分子を、以下の配列を有する２種類の一本鎖ＤＮＡ分子をアニーリングすることによって作製した（配列は５’末端から３’末端方向に記載する）：
ＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣ（配列番号１８７）；および
ＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡ（配列番号１８８）。
【０１２３】
次いで、アニーリングしたリンカー分子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３（カタログ番号Ｖ７９０‐２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、プラスミドｐｃＤＮＡ’を得た。
【０１２４】
Ｖ５エピトープタグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号４７））またはＦｌａｇエピトープタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１１１））をコードするＤＮＡ分子をプラスミドｐｃＤＮＡ’に挿入した。Ｖ５エピトープタグのＮ末端にメチオニンを付加した配列に対するコード配列、すなわち：
ＡＴＧＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧ（配列番号１８９）を有する二本鎖ＤＮＡ分子を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化したｐｃＤＮＡ’に挿入し、プラスミドＶ５（Ｃ）‐ｐｃＤＮＡ’を得た。また、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化したｐｃＤＮＡ’に挿入し、プラスミドＶ５（Ｎ）‐ｐｃＤＮＡ’を得た。
【０１２５】
Ｆｌａｇエピトープタグに対するコード配列、すなわち：
ＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ（配列番号１９０）を有するＤＮＡ分子を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ’に挿入し、プラスミドＦｌａｇ（Ｎ）‐ｐｃＤＮＡ’を得た。
【０１２６】
ＤＮＡ分子の作製
ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction（ＰＣＲ））、遺伝子合成、また
は相補的ＤＮＡ分子のアニーリングによって、タンパク質配列をコードするＤＮＡ分子を標準的な手順で得た。免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ分子を
標準のオリゴヌクレオチド合成によって作製した。グリシンとセリンからなるリンカー配列ＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（配列番号１２１）をコードするＤＮＡ配列ＧＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＧＡＧＣＧＧＴＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＧＣ（配列番号１９１）を有するＤＮＡ分子を、標準の方法で合成した相補一本鎖をアニーリングすることによって作製した。
【０１２７】
Ｊドメイン融合タンパク質を発現する発現ベクタープラスミドの作製
Ｃ末端にＶ５タグを付加したＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質（図１Ａ参照）を発現させるため、ＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質をコードするＤＮＡ分子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化したプラスミドＶ５（Ｃ）‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０１２８】
ＪドメインまたはＢＡＧドメインをＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質のＮ末端に結合させた融合タンパク質（図３Ａ参照）を発現させるため、シグナル配列を欠失させた切断型ＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質を、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化したプラスミドＶ５（Ｃ）‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０１２９】
Ｖ５タグで標識した切断型ＴＮＲ１受容体タンパク質（図５Ａ参照）を発現させるため、切断型（細胞外ドメインのみ）ＴＮＲ１受容体タンパク質をコードするＤＮＡ分子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化したプラスミドＶ５（Ｃ）‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０１３０】
Ｖ５タグで標識したα１アンチトリプシン（「α１ＡＴ」）（図４Ａ参照）を発現させるため、α１アンチトリプシンをコードするＤＮＡ分子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化したプラスミドＶ５（Ｃ）‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０１３１】
Ｎ末端にＶ５タグを付加したｐ５３タンパク質（図７Ａ参照）を発現させるため、ｐ５３タンパク質をコードするＤＮＡ分子を、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化したプラスミドＶ５（Ｎ）‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０１３２】
Ｖタグで標識したＣＦＴＲとＶ５タグで標識した変異ＣＦＴＲΔ５０８Ｆ（図８Ａ参照）を発現させるため、ＣＦＴＲタンパク質またはＣＦＴＲΔ５０８Ｆタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化したプラスミドＶ５（Ｎ）‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０１３３】
目的のタンパク質をＪドメインと融合した融合タンパク質を発現させるため、ＪドメインをコードするＤＮＡ分子をプラスミドＶ５（Ｃ）‐ｐｃＤＮＡ’のＥｃｏＲＩ部位またはプラスミドＶ５（Ｎ）‐ｐｃＤＮＡ’のＥｃｏＲＶにサブクローニングし、それぞれプラスミドベクターＪ‐Ｖ５（Ｃ）‐ｐｃＤＮＡ’またはＶ５（Ｎ）‐Ｊ‐ｐｃＤＮＡ’を得た。融合タンパク質は、Ｈｓｐ４０、ＳＶ４０、ＣＳＰのＪドメインを用いて作製した。
【０１３４】
目的のタンパク質をＢＡＧドメインと融合した融合タンパク質を発現させるため、ＢＡＧドメインをコードするＤＮＡ分子をプラスミドＶ５（Ｃ）‐ｐｃＤＮＡ’のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてプラスミドベクターＢＡＧ‐Ｖ５（Ｃ）‐ｐｃＤＮＡ’を得た。また、同じＤＮＡ分子をプラスミドＶ５（Ｎ）‐ｐｃＤＮＡ’のＥｃｏＲＶ部位にサブクローニングし、Ｖ５（Ｎ）‐ＢＡＧ‐ｐｃＤＮＡ’を得た。融合タンパク質は、以下に示すように、ＢＡＧ３ドメイン、ＢＡＧ４ドメイン、ＢＡＧ５ドメイン、ＢＡＧ６ドメインを用いて作製した。
【０１３５】
次に、ＩＬ１３Ｒα２、ＴＮＦＲ１、α１ＡＴ、ｐ５３、またはＣＦＴＲ（野生型また
はΔ５０８Ｆ変異型）をコードするＤＮＡ分子を、上記の１個以上の発現ベクターにＪドメイン（場合によってはＢＡＧドメイン）配列とインフレームで挿入し、融合タンパク質を発現させた。この融合タンパク質はさらに、コードされたタンパク質を認識しやすくするため、Ｎ末端またはＣ末端にＶ５エピトープタグを有している。
【０１３６】
ＨＥＫ２９３細胞でのタンパク質の発現と検出
多様なタンパク質構築物をコードする発現ベクタープラスミドを、X-tremeGENE HP形質移入試薬（カタログ番号０６３６５７５２００１、Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。以下の実施例に示すように、形質移入の効率を確認するため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する別のプラスミドを、本発明の融合タンパク質をコードする各発現ベクタープラスミドと共に形質移入した。形質移入細胞の培養液を２日間インキュベートし、培地および／または細胞可溶化物の発現タンパク質について、ドットブロット分析またはウェスタンブロット分析を用いて分析した。分析の前に、培養液のサンプルを遠心分離し、細胞片を除去した。細胞可溶化物を得るため、２ｍＭのＰＭＳＦを含有する溶解緩衝液（10mM Tris-HCl、pH8.0、150mM NaCl、10mM EDTA、2%SDS）に細胞を溶解した。超音波処理を短時間行った後、サンプルの発現タンパク質について、ドットブロット分析またはウェスタン免疫ブロット分析を用いて分析した。ウェスタンブロット分析のため、サンプルをＳＤＳ‐サンプルの緩衝液中で煮沸し、ポリアクリルアミド電気泳動に供し、続いて、分離されたタンパク質バンドを膜（ＰＶＤＦ膜）に転写した。
【０１３７】
形質移入の内部管理としてのＧＦＰの発現を、抗ＧＦＰ抗体を用いて検出した。ドットブロットおよびウェスタンブロットで得られた発現タンパク質を化学発光シグナルで検出した。ブロットの吸着物を、タンパク質が担持していた特定のエピトープタグ（たとえばＶ５タグまたはＦｌａｇタグ）に結合する一次抗体と短時間反応させた。未反応の一次抗体を洗浄で除去した後、酵素と連結した二次抗体（たとえばセイヨウワサビペルオキシダーゼと連結した抗ＩｇＧ抗体）を、吸着物と結合した一次抗体分子と反応させた。洗浄後、製造業者の化学発光試薬を添加した。ブロットで得られた化学発光シグナルをＸ線画像に記録した。記載のある場合は、化学発光シグナルの画像を濃度計で走査し、NIH ImageJ画像処理プログラムを用いて分析した。
【０１３８】
タンパク質の活性に関する分析
本明細書に記載のＪドメイン融合タンパク質の作製に用いた目的のタンパク質の活性を検出するには、標準的な分析を利用できる。
【０１３９】
ＩＬ１３Ｒα２結合機能に関する結合分析は、"Identification of distinct roles for a dileucine and a tyrosine internalization motif in the interleukin (IL)-13 binding component IL13 receptor alpha 2 chain（インターロイキン（ＩＬ）１３結合成
分ＩＬ１３受容体α２鎖のジロイシン内部移行モチーフとチロシン内部移行モチーフの異なる役割の認識）"J. Biol. Chem., 276(27): 25114-25120(2001)に記載されている。
【０１４０】
ＴＮＦＲ結合機能に関する結合分析は、"Recombinant 55-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor: Stoichiometry of binding to TNF alpha and TNF beta and inhibition of TNF activity（組換え５５ｋＤａ腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体：ＴＮＦαおよび
ＴＮＦβに対する結合とＴＮＦ活性阻害に関する化学量論）"J. Biol. Chem., 266(27): 18324-18329 (1991)に記載されている。
【０１４１】
α１アンチトリプシン（α１ＡＴ）活性の分析は、"Alpha 1-antitrypsin and protease complexation is induced by lipopolysaccharide, interleukin-1beta, and tumor necrosis factor-alpha in monocytes（α１アンチトリプシンとプロテアーゼの複合体形成は単球のリポ多糖、インターロイキン１βおよび腫瘍壊死因子αに誘導される）"Am. J. 
Respir. Crit. Care Med., 157(1): 246-255(1998)に記載されている。
【０１４２】
ｐ５３活性の分析は、"Influenza virus infection increases p53 activity: role of
p53 activity in cell death and viral replication（インフルエンザウイルス感染は
ｐ５３活性を高める：細胞死とウイルス複製におけるｐ５３活性の役割）", J. Virol., 79(14): 8802-8811 (2005)に記載されている。
【０１４３】
ＣＦＴＲ活性の分析は、"Pharmacology of CFTR chloride channel activity（ＣＦＴ
Ｒ塩素イオンチャネル活性の薬理作用）", Physiol. Rev., 79(1 Suppl.): S109-S144 (1999)に記載されている。
【０１４４】
実施例２．改変配列の標的タンパク質の発現増強
図１Ａは、Ｃ末端にＶ５エピトープを付加した全長のＩＬ１３Ｒα２タンパク質（「ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ」）を発現させるための構築物と、ＩＬ１３Ｒα２をＢＡＧまたはＪドメインと融合しＣ末端にＶ５エピトープを付加した融合タンパク質を発現させるための構築物の全体図を示す。
【０１４５】
Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＷＴタンパク質は、全長のＩＬ１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸配列のＣ末端にＶ５エピトープタグを連結させ、そのＣ末端側にさらに発現ベクターのクローニング部位に由来する１２個のアミノ酸残基を連結させたアミノ酸配列を有する。Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＷＴのアミノ酸配列を下の表に示す。
表２．Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＷＴタンパク質のアミノ酸配列
【０１４６】
【表２】
0006688237.tif 000007
Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ３ドメイン融合タンパク質は、アミノ（Ｎ）末端側が全長のＩＬ１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸配列であり、そこにＢＡＧ３タンパク質のＢＡＧドメインを連結させ、さらにＶ５エピトープタグを連結させ、そのＣ末端側にさらに発現ベクターのクローニング部位に由来する１２個のアミノ酸残基を連結させたアミノ酸配列を有する。ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ３ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表３．ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ３ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１４７】
【表３】
0006688237.tif 000008
Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ４ドメイン融合タンパク質は、アミノ（Ｎ）末端側が全長のＩＬ１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸配列であり、そこにＢＡＧ４タンパク質のＢＡＧドメインを連結させ、さらにＶ５エピトープタグを連結させ、そのＣ末端側にさらに発現ベクターのクローニング部位に由来する１２個のアミノ酸残基を連結させたアミノ酸配列を有する。ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ４ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
【０１４８】
表４．ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ４ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１４９】
【表４】
0006688237.tif 000009
Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ５ドメイン融合タンパク質は、アミノ（Ｎ）末端側が全長のＩＬ１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸配列であり、そこにＢＡＧ５タンパク質のＢＡＧドメインを連結させ、さらにＶ５エピトープタグを連結させ、そのＣ末端側にさらに発現ベクターのクローニング部位に由来する１２個のアミノ酸残基を連結させたアミノ酸配列を有する。ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ５ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表５．ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ５ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１５０】
【表５】
0006688237.tif 000010
Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ６ドメイン融合タンパク質は、アミノ（Ｎ）末端側が全長のＩＬ１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸配列であり、そこにＢＡＧ６タンパク質のＢＡＧドメインを連結させ、さらにＶ５エピトープタグを連結させ、そのＣ末端側にさらに発現ベクターのクローニング部位に由来する１２個のアミノ酸残基を連結させたアミノ酸配列を有する。ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ６ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表６．ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐ＢＡＧ６ドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１５１】
【表６】
0006688237.tif 000011
Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐Hsp40 Jドメイン融合タンパク質は、アミノ
（Ｎ）末端側が全長のＩＬ１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸配列であり、そこにＨｓｐ４０タンパク質のＪドメインを連結させ、さらにＶ５エピトープタグを連結させ、そのＣ末端側にさらに発現ベクターのクローニング部位に由来する１２個のアミノ酸残基を連結させたアミノ酸配列を有する。ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐Hsp40 Jドメイン融合タンパク質のア
ミノ酸配列を下の表に示す。
表７．ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐Hsp40 Jドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１５２】
【表７】
0006688237.tif 000012
Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐SV40 Jドメイン融合タンパク質は、アミノ（Ｎ）末端側が全長のＩＬ１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸配列であり、そこにSV40 Jタンパク質のＪドメインを連結させ、さらにＶ５エピトープタグを連結させ、そのＣ末端側にさらに発現ベクターのクローニング部位に由来する１２個のアミノ酸残基を連結させたアミノ酸配列を有する。ＩＬ１３Ｒα２‐SV40 Jドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表８．ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐SV40 Jドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１５３】
【表８】
0006688237.tif 000013
Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐CSP Jドメイン融合タンパク質は、アミノ（
Ｎ）末端側が全長のＩＬ１３Ｒα２タンパク質のアミノ酸配列であり、そこにＣＳＰタンパク質のＪドメインを連結させ、さらにＶ５エピトープタグを連結させ、そのＣ末端側にさらに発現ベクターのクローニング部位に由来する１２個のアミノ酸残基を連結させたアミノ酸配列を有する。ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐CSP Jドメイン融合タンパク質のアミノ酸配
列を下の表に示す。
表９．ＩＬ１３Ｒα２ＷＴ‐CSP Jドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１５４】
【表９】
0006688237.tif 000014
上記の発現ベクターを用いて、形質移入ＨＥＫ２９３細胞でのＩＬ１３Ｒα２‐Ｖ５の発現レベルを、ＢＡＧドメインまたはＪドメインを含む多様なＩＬ１３Ｒα２融合タンパク質の発現レベルと比較した。細胞内での多様な融合タンパク質の発現レベルを図１Ｂのウェスタンブロットに示す。第１列は等量の細胞可溶化物タンパク質を泳動したゲルのレーンである。第２列は形質移入の内部管理としてのＧＦＰの発現を示す。図１Ｂの第１列に示すように、Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２については微かなバンドしか検出され
なかった。このバンドを野生型（ＷＴ）ＩＬ１３Ｒα２タンパク質の発現を表すのに用いた。バンドは発現が不十分であったことを示している。ＩＬ１３Ｒα２とＢＡＧドメイン（ＢＡＧ３、ＢＡＧ４、ＢＡＧ５、ＢＡＧ６）とを含む融合タンパク質は、それよりもわずかに高いレベルで発現された。対照的に、ＩＬ１３Ｒα２といずれかのＪドメインとを含む融合タンパク質はすべて、Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２またはＩＬ１３Ｒα２とＢＡＧドメインとを含む融合タンパク質よりも著しく高いレベルで発現された。図１Ｂのシグナルを濃度測定分析した結果を図１Ｃに示す。ＩＬ１３Ｒα２といずれかのＪドメインとを含む融合タンパク質は、Ｖ５エピトープタグで標識したＩＬ１３Ｒα２の発現量（１００％とする）の２５倍のレベルで発現された。図１Ｃの棒グラフを参照のこと。
【０１５５】
切断型ＩＬ１３Ｒα２の発現と分泌
ＩＬ１３Ｒα２は、インターロイキン‐１３（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐１３（ＩＬ１３））に結合しアレルギー性炎症を媒介する膜受容体タンパク質である。ＩＬ１３が膜結合受容体であるＩＬ１３Ｒα２受容体と結合すると、炎症反応を誘発するシグナルが細胞質へ伝達される。このような反応は喘息の場合には特に有害である。発現された膜結合性ＩＬ１３Ｒα２分子の一部分は細胞表面で切断され、可溶性の切断型ＩＬ１３Ｒα２（ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）を細胞外空間へ遊離する。切断型ＩＬ１３Ｒα２はＩＬ１３結合能を保持しているが、全長の膜結合性タンパク質に見られる膜貫通領域および細胞質領域がないため、シグナルを細胞に送ることはできない。このため、切断型ＩＬ１３Ｒα２は炎症反応を誘発するシグナルを細胞へ伝達することなくＩＬ１３分子に結合することによって喘息を治療するために囮受容体として採用されてきた。このような治療用途のため、遺伝子改変した切断型ＩＬ１３Ｒα２が哺乳類細胞で発現され、その培養液をもとに分泌タンパク質として精製されてきた。しかし、切断型ＩＬ１３Ｒα２は発現や分泌が難しいため、生成が非効率的である。
【０１５６】
Ｊドメインが有する、可溶性の切断型ＩＬ１３Ｒα２（ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）の発現を増強する能力を試験した。Ｊドメインを切断型ＩＬ１３Ｒα２と結合させることによってこの分泌タンパク質の発現が増強されるかを確認するために、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦまたはＩＬ１３Ｒα２ＴＦのＮ末端にＥｒｄｊ３タンパク質のＪドメインを融合した融合タンパク質を発現するプラスミドを構築した。タンパク質は、認識しやすいようにＶ５エピトープをさらに有するタンパク質とした。図２Ａの構築物の図を参照のこと。
【０１５７】
この実験に使用した、Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦのアミノ酸配列を下の表に示す。
表１０．Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１５８】
【表１０】
0006688237.tif 000015
Ｊタンパク質Ｅｒｄｊ３のＪドメインをＮ末端側に有し、成熟した（すなわちシグナル配列を含まない）切断型ＩＬ１３Ｒα２（ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）と、Ｖ５エピトープタグとを有するＪドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
【０１５９】
表１１．Ｖ５タグで標識したErdj3 Jドメイン-ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質のアミノ酸配列
【０１６０】
【表１１】
0006688237.tif 000016
シグナル配列と、ＢＡＧ３のＢＡＧドメインと、成熟した（すなわちシグナル配列を含まない）切断型ＩＬ１３Ｒα２（ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）と、Ｖ５エピトープタグとを含むＢＡＧドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表１２．Ｖ５タグで標識したＢＡＧドメイン‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１６１】
【表１２】
0006688237.tif 000017
発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦまたはＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｊドメイン融合タンパク質の発現について、形質移入細胞を２日間培養した培養液から得た細胞可溶化物と培地のサンプルを、抗Ｖ５抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析した。図２Ｂに示すように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質の発現は細胞可溶化物ではわずかに検出された（レーン２）が、培地では全く検出されなかった。対照的に、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｊドメイン融合タンパク質の発現レベルは細胞内（細胞可溶化物サンプル）でも培地に分泌された発現レベルとしても著しく高かった。図２Ｂを参
照のこと。Ｊドメインを切断型ＩＬ１３Ｒα２のＣ末端に結合させた場合にも同様の効果が見られた（データは示さず）。
【０１６２】
分泌タンパク質をさらに定量化するために、ドットブロット免疫測定法を用いた別の実験を実施した。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ、ＢＡＧドメインと融合したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（ＢＡＧ‐ＩＬ１３ＲαＴＦ）、またはＪドメインと融合したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（Ｊ‐ＩＬ１３ＲαＴＦ）を発現する発現ベクタープラスミドを用いてＨＥＫ２９３細胞を形質移入した。形質移入細胞を２日間培養し、分泌タンパク質について、細胞培地のサンプルを、ドットブロット免疫測定法を用いて分析した。結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。図３Ａは、培地に分泌された、Ｖ５タグで標識したタンパク質の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像を示す。図３Ａに示すように、ＢＡＧドメインをＩＬ１３Ｒα２ＴＦと連結させた融合タンパク質（レーン３）では、融合していないＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（レーン２）と比較してわずかに分泌タンパク質のレベルが増強された可能性があるが、ＪドメインをＩＬ１３Ｒα２ＴＦと連結させた融合タンパク質（レーン３）では、融合していないＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（レーン２）またはＢＡＧドメイン‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質（レーン３）に比べて、分泌タンパク質のレベルが有意に増強された。図３ＡのドットブロットのシグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図３Ｂに示す。図３Ｂの棒グラフは、分泌されたＪドメイン‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質（棒グラフ４）の発現レベルが、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（棒グラフ２）とＢＡＧドメイン‐ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ融合タンパク質（棒グラフ３）のいずれと比較しても有意に高かったことを明確に示している。Ｊドメイン融合物を用いた結果、形質転換細胞が分泌したＩＬ１３Ｒα２ＴＦの量は、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質を単独で発現するよう形質転換した細胞による発現レベルと比較して約３．５倍に増加した。
【０１６３】
ヒト細胞での改変配列のＪドメイン‐α１アンチトリプシン融合タンパク質
α１アンチトリプシン（α１ＡＴ）タンパク質は肝臓から分泌され血管内を循環する。α１ＡＴの機能は組織（特に肺組織）を過剰なプロテアーゼから保護することである。α１アンチトリプシン欠損症と呼ばれる疾患では、プロテアーゼによって肺が損傷される。α１アンチトリプシン欠損症の患者は、肺気腫、喘息、および／または慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease（ＣＯＰＤ））を発症する可能性がある。現
在、α１ＡＴ（ヒト血清から精製される）がα１アンチトリプシン欠損症の患者の治療に用いられているが、この治療は高価であり、ヒト血清治療を受ける患者にはヒト血清中に存在する病原体に感染する危険性がある。
【０１６４】
治療に有効な所望のタンパク質の発現レベルおよび分泌レベルを増強するための有望な戦略として、Ｊドメインをα１アンチトリプシン（α１ＡＴ）と融合することによる効果を形質移入細胞内で試験した。図４Ａに示すように、Ｖ５タグで標識したα１ＡＴ、Ｖ５タグで標識したα１ＡＴ‐ＢＡＧドメイン融合タンパク質、Ｖ５タグで標識したα１ＡＴ‐Ｊドメイン融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物をそれぞれ作製した。
【０１６５】
Ｖ５タグで標識したα１ＡＴタンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表１３．Ｖ５タグで標識したα１ＡＴタンパク質のアミノ酸配列
【０１６６】
【表１３】
0006688237.tif 000018
α１ＡＴとＢＡＧ３のＢＡＧドメインとＶ５エピトープタグとを含むＢＡＧドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表１４．α１ＡＴ‐ＢＡＧ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１６７】
【表１４】
0006688237.tif 000019
α１ＡＴとErdj3 JドメインとＶ５エピトープタグとを含むＪドメイン融合タンパク質
のアミノ酸配列を下の表に示す。
表１５．α１ＡＴ‐Ｊドメインタンパク質のアミノ酸配列
【０１６８】
【表１５】
0006688237.tif 000020
上記の３種類の組換えα１ＡＴタンパク質構築物をコードする発現ベクタープラスミドをそれぞれＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。形質移入細胞を２日間培養した培養液から培地を回収し、培地に分泌された組換えα１ＡＴタンパク質のレベルをドットブロット免疫測定法によって決定した。図４Ｂは、ドットブロット分析の化学発光シグナルのＸ線フィルム画像を示す。培地に分泌された融合していないα１ＡＴ（レーン２）およびα１ＡＴ‐ＢＡＧドメイン融合タンパク質（レーン３）は検出可能な量であったが、分泌されたα１ＡＴ‐Ｊドメイン融合タンパク質（レーン３）の発現レベルはさらに高かった。図４
ＢのドットブロットのシグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図４Ｃに示す。図４Ｃの棒グラフは、分泌されたα１ＡＴ‐Ｊドメイン融合タンパク質（棒グラフ４）の発現レベルが、α１ＡＴ（棒グラフ２）タンパク質とα１ＡＴ‐ＢＡＧドメイン融合タンパク質（棒グラフ３）のいずれの発現レベルと比較しても有意に高かったことを明確に示している。Ｊドメイン融合物を用いた結果、形質転換細胞が分泌したＩＬ１３Ｒα２ＴＦの量は、α１ＡＴを単独で発現するよう形質転換した細胞またはα１ＡＴ‐ＢＡＧ融合タンパク質を発現するよう形質転換した細胞による発現レベルと比較して１．５倍を超えた。
【０１６９】
改変配列の切断型ＴＮＦＲ１タンパク質
治療に有効な融合タンパク質を設計するための形態の１つでは、所望の標的分子に特異的に結合する結合ドメインを免疫グロブリンのＦｃ領域と連結させたものを組み合わせ、それによって融合タンパク質の生体内半減期を延長する。この種類の薬物の一例は、多くの自己免疫疾患に関与する重要な免疫系タンパク質である腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）に結合してその作用を阻害するエタネルセプト（分子標的治療薬の一つ）である。たとえば、エタネルセプトでは切断型の腫瘍壊死因子α受容体（ＴＮＦＲ１ＴＦ）が免疫グロブリンのＦｃドメインと連結されている。エタネルセプトのＴＮＦＲ１ＴＦ部分が薬物標的（ＴＮＦα）に対する特異性を付与し、Ｆｃドメインが生体内での薬物の安定性と送達可能性を加えると考えられている。しかし、Ｆｃドメインは一部の疾患の治療計画には望ましくないかもしれない何らかのエフェクター機能を有することも知られている。
【０１７０】
受容体を利用した所望の分子の発現レベルと分泌レベルを増強するための有望な戦略として、Ｊドメインを切断型受容体分子と融合することによる効果について試験した。このようなＪドメイン融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃドメインと連結させた切断型受容体分子を含むこれまでの薬物設計に対する有望な選択肢となる可能性がある。Ｊドメインを含む場合と含まない場合の切断型腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ１ＴＦ）の発現について、発現ベクタープラスミドＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｖ５‐ｐｃＤＮＡ’およびＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｊドメイン‐Ｖ５‐ｐｃＤＮＡ’を用いて試験した。抗Ｖ５抗体を用いて容易に検出できるように、いずれのタンパク質にも発現ベクターによってＶ５エピトープタグを付加した。図５Ａの構築物の図を参照のこと。
【０１７１】
Ｖ５タグで標識したＴＮＦＲ１ＴＦのアミノ酸配列を下の表に示す。
表１６．Ｖ５タグで標識したＴＮＦＲ１ＴＦタンパク質のアミノ酸配列
【０１７２】
【表１６】
0006688237.tif 000021
ＴＮＦＲ１ＴＦとErdj3 JドメインとＶ５エピトープタグとを含むＪドメイン融合タン
パク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表１７．Ｖ５タグで標識したＴＮＦＲ１ＴＦ‐Erdj3 Jドメイン融合タンパク質のアミノ
酸配列
【０１７３】
【表１７】
0006688237.tif 000022
発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。ＴＮＦＲ１ＴＦまたはＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｊドメイン融合タンパク質の発現について、形質移入細胞を２日間培養した培養液から得た細胞可溶化物と培地のサンプルを、抗Ｖ５抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析した。図５Ｂのドットブロットに示すように、ＴＮＦＲ１ＴＦは培地で少し検出された（レーン２）が、培地で検出されたＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｊドメイン融合タンパク質のレベルはそれよりも有意に高かった（レーン３）。図５ＢのドットブロットのシグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図５Ｃに示す。明らかに、分泌されたＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｊドメイン融合タンパク質（棒グラフ３）の発現レベルが（融合していない）ＴＮＦＲ１ＴＦタンパク質（棒グラフ２）の発現レベルに比べて有意に高く、すなわち、ＴＮＦＲ１ＴＦ単独のレベルの約６倍であった。
【０１７４】
改変配列のＦｃ融合タンパク質の分泌
分泌された切断型ＴＮＦＲ１の発現レベルがＪドメインを結合させることによって増強された（図５Ｂおよび図５Ｃ）ことを示す以上の結果からみて、免疫グロブリンのＦｃドメインと融合したＴＮＦ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質などの目的のタンパク質の発現がＪドメインによって増強されるかを調べることは興味深い。このようなＦｃ融合分子は、薬物であるエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）として市販されている）を例とする薬物形態の種類である。エタネルセプトは重症の関節リウマチ、多関節型若年性特発性関
節炎（juvenile idiopathic arthritis（ＪＩＡ））、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、尋
常性乾癬などの多くの自己免疫疾患の治療用に認可されているＴＮＦ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質である。
【０１７５】
この試験のために、目的のタンパク質（ＴＮＦＲ１ＴＦ、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦまたはα１ＡＴ）のそれぞれをコードするｃＤＮＡの３’末端にＶ５エピトープタグをコードするセグメントを付加し、さらに免疫グロブリンＦｃ領域の定常ドメインをコードするセグメント（「Ｆｃ」）と連結させた。Ｊドメインを融合するために、ＪドメインをコードするｃＤＮＡを、目的のタンパク質のそれぞれをコードするｃＤＮＡとＶ５エピトープタグをコードするセグメントとの間にインフレームで連結させた。図６Ａの構築物の図を参照のこと。対応する発現ベクタープラスミドをＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。分泌されたタンパク質について、培地をドットブロット分析によって分析した。
【０１７６】
ＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表１８．Ｖ５タグで標識したＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１７７】
【表１８】
0006688237.tif 000023
ＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｊドメイン‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表１９．Ｖ５タグで標識したＴＮＦＲ１ＴＦ‐Erdj3 Jドメイン‐Ｆｃタンパク質のアミ
ノ酸配列
【０１７８】
【表１９】
0006688237.tif 000024
ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表２０．Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１７９】
【表２０】
0006688237.tif 000025
ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｊドメイン‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表２１．Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Erdj3 Jドメイン‐Ｆｃタンパク質の
アミノ酸配列
【０１８０】
【表２１】
0006688237.tif 000026
α１ＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表２２．Ｖ５タグで標識したα１ＡＴ‐Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列
【０１８１】
【表２２】
0006688237.tif 000027
α１ＡＴ‐Ｊドメイン‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表２３．Ｖ５タグで標識したα１ＡＴ‐Erdj3 Jドメイン‐Ｆｃタンパク質のアミノ酸配
列
【０１８２】
【表２３】
0006688237.tif 000028
各Ｆｃ融合タンパク質（ＴＮＦＲ１‐Ｖ５‐Ｆｃ、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃおよびα１ＡＴ‐Ｆｃ）を、図６Ｂの各図の中央レーンのドットブロットに示す培地で発現させた。このＦｃ融合タンパク質の発現レベルは目的の各タンパク質単独（すなわちＦｃドメインと融合していない場合（データは示さず））の場合よりも高かった。図６Ｂの各図の右レーンのドットブロットに示すように、Ｆｃ融合タンパク質に含まれる目的のタンパク質のセグメントにＪドメインを連結させたいずれの場合にも、有意に高い発現レベルが観察された。図６Ｂのドットブロットの化学発光シグナルを濃度分析した結果が図６Ｃ中の対応する図に示されており、Ｊドメイン融合タンパク質の発現レベルが有意に高いことが明らかに明白である。
【０１８３】
ヒト細胞での改変配列のｐ５３タンパク質の発現増強
ＩＬ１３Ｒα２、ＴＮＦＲ、α１ＡＴのようなタンパク質は、小胞体（endoplasmic reticulum（ＥＲ））で合成され、細胞膜へ送達されるか、細胞から分泌される。Ｊドメイ
ンの存在が細胞質タンパク質の発現に対して与える効果を測定するために、ｐ５３タンパク質とＪドメインとの融合物の発現について試験した。ｐ５３タンパク質はゲノム安定性において中心的役割を果たす転写因子である。がん患者の過半数はｐ５３を含む経路に何らかの異常を有している。このため、がん患者の体内でｐ５３を大量に発現させることが、がん治療として試みられてきた。
【０１８４】
ｐ５３をコードするｃＤＮＡを発現プラスミドＶ５（Ｎ）‐ｐｃＤＮＡ’に挿入し、Ｎ末端にＶ５エピトープタグを有するｐ５３タンパク質を発現するプラスミドＶ５（Ｎ）‐ｐ５３‐ｐｃＤＮＡ’を得た。ｐ５３‐Ｊドメイン融合タンパク質を発現させるため、ＳＶ４０ラージＴ抗原のＪドメインをコードするｃＤＮＡを、次いでＶ５（Ｎ）−ｐ５３‐ｐｃＤＮＡ’ベクターのＶ５コード領域とｐ５３コード領域との間に挿入した。図７Ａの構築物の図を参照のこと。
【０１８５】
Ｖ５タグで標識したｐ５３タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表２４．Ｖ５タグで標識したｐ５３タンパク質のアミノ酸配列
【０１８６】
【表２４】
0006688237.tif 000029
Ｖ５エピトープタグとSV40 Jドメインとｐ５３タンパク質とを含むＪドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表２５．Ｖ５タグで標識したSV40 Jドメイン‐ｐ５３融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１８７】
【表２５】
0006688237.tif 000030
プラスミドＶ５（Ｎ）‐ｐ５３‐ｐｃＤＮＡ’とＶ５（Ｎ）‐Ｊ‐ｐ５３‐ｐｃＤＮＡ’をＭＣＦ細胞に形質移入し、２日間インキュベートした。溶解緩衝液に細胞を溶解し、抗Ｖ５抗体を用いたウェスタン免疫ブロット分析によってタンパク質を検出した。図７Ｂに示すように、ｐ５３‐Ｊドメイン融合タンパク質の発現レベル（レーン３）は、Ｊドメインがない場合のｐ５３タンパク質の発現レベルよりも有意に高かった。したがって、結果は、Ｊドメインとの融合によって膜結合タンパク質と分泌タンパク質に加えて細胞質タンパク質も増加させることができることを示している。
【０１８８】
ヒト細胞での改変配列のＣＦＴＲの発現
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（ＣＦＴＲ））タンパク質、ｃＡＭＰ調節性塩素イオンチ
ャネルおよびチャネル調節因子をコードする遺伝子の変異を原因とする常染色体劣性遺伝疾患である。ＣＦＴＲの５０８位のフェニルアラニン残基の欠失（Δ５０８Ｆ）が、ＣＦＴＲタンパク質の立体構造を変化させる最も一般的な変異である。この変異が起きると、ＣＦＴＲタンパク質はＥＲの品質システムによって急速に分解される。野生型ＣＦＴＲタンパク質機能の一部を回復させることさえできればＣＦ患者に有益な治療を提供できるというのが一般的な統一見解である。そのため、ＣＦＴＲを用いた多数の遺伝子治療試験が試みられてきたが、ＣＦＴＲを発現させるための遺伝子の送達が非効率的であることや、媒介物（たとえばウイルスベクター）に対する免疫原性が理由で未だに成功していない。野生型ＣＦＴＲの適切なタンパク質折り畳みは難しいことが知られていることから、ＣＦＴＲタンパク質のタンパク質折り畳みが改善できれば非常に有用であろう。
【０１８９】
ｃｆｔｒ遺伝子またはそのＰｈｅ５０８欠失変異体（ｃｆｔｒΔ５０８Ｆ）をプラスミドＶ５（Ｎ）‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。ＢＡＧ３タンパク質のＢＡＧドメインをコードするＤＮＡまたはＪタンパク質Ｈｓｐ４０のＪドメインをコードするＤＮＡを、プラスミドのＶ５コード配列とｃｆｔｒコード配列との間に挿入し、Ｎ末端にＶ５エピトープタグを連結させた野生型ＣＦＴＲまたは変異型ＣＦＴＲ（Δ５０８Ｆ）タンパク質、あるいはＮ末端にＢＡＧドメインまたはＪドメインを融合しさらにＮ末端にＶ５エピトープタグを融合させた野生型または変異型ＣＦＴＲタンパク質を発現するプラスミドを得た。この実験に用いた多様な構築物の図を図８Ａに示す。
【０１９０】
Ｖ５タグで標識した野生型ＣＦＴＲ（CFTR WT）のアミノ酸配列を下の表に示す。
表２６−１〜表２６−２．Ｖ５タグで標識したＣＦＴＲタンパク質のアミノ酸配列
【０１９１】
【表２６−１】
0006688237.tif 000031
【０１９２】
【表２６−２】
0006688237.tif 000032
Ｖ５タグで標識したＢＡＧ‐ＣＦＴＲ（野生型）タンパク質のアミノ酸配列を下の表に
示す。
表２７−１〜表２７−２．Ｖ５タグで標識したＢＡＧドメイン‐ＣＦＴＲタンパク質のアミノ酸配列
【０１９３】
【表２７−１】
0006688237.tif 000033
【０１９４】
【表２７−２】
0006688237.tif 000034
Ｖ５エピトープタグとSV40 JドメインとＣＦＴＲ野生型タンパク質とを含むＪドメイン融合物のアミノ酸配列を下の表に示す。
表２８−１〜表２８−２．Ｖ５タグで標識したSV40 Jドメイン‐ＣＦＴＲタンパク質のアミノ酸配列
【０１９５】
【表２８−１】
0006688237.tif 000035
【０１９６】
【表２８−２】
0006688237.tif 000036
Ｖ５タグで標識したＣＦＴＲ（Δ５０８Ｆ）タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表２９−１〜表２９−２．Ｖ５タグで標識したＣＦＴＲ（Δ５０８Ｆ）タンパク質のアミノ酸配列
【０１９７】
【表２９−１】
0006688237.tif 000037
【０１９８】
【表２９−２】
0006688237.tif 000038
Ｖ５タグで標識したＢＡＧドメイン‐ＣＦＴＲ（Δ５０８Ｆ）融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表３０−１〜表３０−２．Ｖ５タグで標識したＢＡＧドメイン‐ＣＦＴＲ（Δ５０８Ｆ）融合タンパク質のアミノ酸配列
【０１９９】
【表３０−１】
0006688237.tif 000039
【０２００】
【表３０−２】
0006688237.tif 000040
Ｖ５タグで標識したＪドメイン‐ＣＦＴＲ（Δ５０８Ｆ）融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表３１−１〜表３１−２．Ｖ５タグで標識したSV40 Jドメイン‐ＣＦＴＲ（Δ５０８Ｆ）融合タンパク質のアミノ酸配列
【０２０１】
【表３１−１】
0006688237.tif 000041
【０２０２】
【表３１−２】
0006688237.tif 000042
多様なＣＦＴＲタンパク質構築物の発現を試験するため、プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。形質移入細胞を２日間培養した培養液から得た細胞可溶化物のサンプルを、抗Ｖ５抗体を用いた免疫ブロッティングによって分析した。図８Ｂに示すように、野生型ＣＦＴＲタンパク質も変異型ＣＦＴＲ（Δ５０８Ｆ）タンパク質も形質移入細胞内で十分に発現されなかった。いずれかのタンパク質とＢＡＧ３ドメインとの融合物（BAG-CFTR WT、ＢＡＧ‐ＣＦＴＲΔ５０８Ｆ）は、発現をいくらか増強した。対照的に、Ｊド
メインとの融合物（J-CFTR WT、Ｊ‐ＣＦＴＲΔ５０８Ｆ）は、野生型および変異型タン
パク質の両方の発現レベルを有意に増強した。図８Ｂを参照のこと。
【０２０３】
結果から得た結論
上記の実験の結果は、Ｊドメインと融合することによって治療に有用なタンパク質などの目的のタンパク質の発現レベルが有意に増強されることを明確に示している。
【０２０４】
実施例３．非改変配列を用いた目的の標的タンパク質の発現を増強するための組成物および方法
特定のタンパク質（標的タンパク質）の発現を増強するための融合タンパク質を発現させるための発現ベクタープラスミドを構築した。以下に記載するように、融合タンパク質は通常、対応する抗タグ抗体および標準の免疫ブロット（ドットブロット、ウェスタンブロットなど）分析を用いて容易に認識または単離するため、標準のエピトープタグと連結させた。
【０２０５】
異種性ＤＮＡ分子をクローニングするための多様な制限酵素部位を含むヌクレオチド配列を有するＤＮＡリンカー分子を、以下の配列を有する２種類の一本鎖ＤＮＡ分子をアニーリングすることによって作製した（配列は５’末端から３’末端方向に記載する）：
ＡＧＣＴＴＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＧＧＧＣＣ（配列番号１８７）；および
ＣＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡ（配列番号１８８）。
【０２０６】
次いで、アニーリングしたリンカー分子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｐａＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ３（カタログ番号Ｖ７９０‐２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＣＭＶプロモーターの下流に挿入し、哺乳類宿主細胞に使用するための発現ベクタープラスミドｐｃＤＮＡ’を得た。
【０２０７】
Ｖ５エピトープタグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号１１０））またはＦｌａｇエピトープタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１１１））をコードするＤＮＡ分子を合成し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ’に挿入した。Ｖ５エピトープタグのＮ末端にメチオニンを付加した配列に対するコード配列、すなわち：
ＡＴＧＧＧＴＡＡＧＣＣＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＡＣＧ（配列番号１８９）を有する二本鎖ＤＮＡ分子を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化したｐｃＤＮＡ’に挿入し、プラスミドＶ５‐ｐｃＤＮＡ’を得た。
【０２０８】
Ｆｌａｇエピトープタグに対するコード配列、すなわち：
ＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ（配列番号１９０）を有するＤＮＡ分子を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで消化したプラスミドｐｃＤＮＡ’に挿入し、プラスミドＦｌａｇ‐ｐｃＤＮＡ’を得た。
【０２０９】
ＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質を発現させるため、ＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質をコードするＤＮＡ分子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化したプラスミドＶ５‐
ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０２１０】
ＴＮＲ１受容体タンパク質を発現させるため、ＴＮＲ１受容体タンパク質をコードするＤＮＡ分子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化したプラスミドＶ５‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０２１１】
α１アンチトリプシン（「α１ＡＴ」）を発現させるため、α１アンチトリプシンをコードするＤＮＡ分子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで消化したプラスミドＶ５‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０２１２】
ヒトＩｇＧ１分子のＦｃ領域ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を合成し、ＸｂａＩおよびＡｐａＩで消化したＶ５‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０２１３】
特に指定しない限り、特定のタンパク質発現増強ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化したプラスミドＦｌａｇ‐ｐｃＤＮＡ’にクローニングし、Erdj3 Jタンパク質のＪドメインをコードするＤＮＡセグメントを挿入した。
また、同じＤＮＡ分子をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドＦｌａｇ‐ｐｃＤＮＡ’にクローニングし、Erdj5 Jタンパク質のＪドメインをコードするＤＮＡセグメ
ントを挿入してプラスミド（Ｊドメイン）‐Ｆｌａｇ‐ｐｃＤＮＡ’を得た。ここで、「（Ｊドメイン）」とは、以下の実施例に明記するタンパク質発現増強ポリペプチドを指す。
【０２１４】
特に指定しない限り、以下の実施例にある標的タンパク質に対応する標的結合ドメインをコードする各ＤＮＡ分子を、ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩで消化したプラスミドＦｌａｇ‐ｐｃＤＮＡ’に挿入した。
【０２１５】
ＨＥＫ２９３細胞での標的タンパク質の発現と検出
多様なタンパク質構築物をコードする発現ベクタープラスミドを、X-tremeGENE HP形質移入試薬（カタログ番号０６３６５７５２００１、Ｒｏｃｈｅ）を用いてＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。以下の実施例に示すように、形質移入の効率を確認するため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する別のプラスミドを、本発明の融合タンパク質をコードする各発現ベクタープラスミドと共に形質移入した。形質移入細胞の培養液を２日間インキュベートし、細胞を２ｍＭのＰＭＳＦを含有する溶解緩衝液（10mM Tris-HCl、pH8.0、150mM NaCl、10mM EDTA、2%SDS）に溶解した。超音波処理を短時間行った後、サンプルの発現タンパク質について、ドットブロット分析またはウェスタン免疫ブロット分析を用いて分析した。ウェスタンブロット分析のため、サンプルをＳＤＳ‐サンプルの緩衝液中で煮沸し、ポリアクリルアミド電気泳動に供し、続いて、分離されたタンパク質バンドを膜（ＰＶＤＦ膜）に転写した。形質移入の内部管理としてのＧＦＰの発現を、抗ＧＦＰ抗体を用いて検出した。
【０２１６】
ドットブロットおよびウェスタンブロットで得られた発現タンパク質を化学発光シグナルで検出した。ブロットの吸着物を、タンパク質が担持していた特定のエピトープタグ（たとえばＶ５タグまたはＦｌａｇタグ）に結合する一次抗体と短時間反応させた。未反応の一次抗体を洗浄で除去した後、酵素と連結した二次抗体（たとえばセイヨウワサビペルオキシダーゼと連結した抗ＩｇＧ抗体）を、吸着物と結合した一次抗体分子と反応させた。洗浄後、製造業者の化学発光試薬を添加した。ブロットで得られた化学発光シグナルをＸ線画像に記録した。記載のある場合は、化学発光シグナルの画像を濃度計で走査し、NIH ImageJ画像処理プログラムを用いて分析した。
【０２１７】
ヒト化抗ＩＬ８抗体を発現する細胞（CHO DP-12クローン、クローン番号１９３３；カ
タログ番号ＣＲＬ‐１２４４４）とプラスミドｐ６Ｇ４２５Ｖ１１Ｎ３５Ａ．ｃｈｏＳＤ（カタログ番号２０９５５２）はAmerican Type Culture Collection（バージニア州、マナナス）から購入した。
【０２１８】
実施例４．非改変配列を用いた場合の分泌されるＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質の発現増強
ＩＬ１３受容体であるＩＬ１３Ｒα２は、インターロイキン１３（ＩＬ１３）に結合してアレルギー性炎症を媒介する膜タンパク質である。ＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質はタンパク質折り畳みが難しいため、哺乳動物細胞では不安定なタンパク質であることが知られている（Genetic Engineering & Biotechnology News, 28(5)(2008)）。発現された
ＩＬ１３Ｒα２タンパク質の一部は細胞表面で消化されて細胞外空間に排出される。この切断型ＩＬ１３Ｒα２（「ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ」ともいう）になってもＩＬ１３結合能は有しているが、全長ＩＬ１３Ｒα２タンパク質の膜貫通領域および細胞質領域がないため、細胞にシグナルを伝達することはできない。このため、切断型ＩＬ１３Ｒα２は、炎症反応を誘発するシグナルを細胞に伝達することなくＩＬ１３分子を結合することによって喘息を治療するための一種の囮受容体として使用されてきた（Zhang, et al., J. Biol. Chem., 272(14): 9474-80 (1997)）。遺伝子改変した切断型ＩＬ１３Ｒα２が細菌で発現されたが、そのタンパク質は凝集して封入体となり、そこからタンパク質が精製された（Tang et al., Molec. Immunol. 39:719-727(2003)）。しかし、形質移入細胞によるＩＬ
１３Ｒα２ＴＦタンパク質の発現に対する制限の１つは、適切な機能性立体構造への折り畳みの効率の悪さが原因だと考えられてきたことがわかっている。タンパク質は、適切な立体構造に折り畳みできない場合、アミノ酸の分解と除去のためにプロテアソームへ誘導される。したがって、形質移入細胞内でＩＬ１３Ｒα２ＴＦ分子を産生するには、タンパク質の発現と分泌という制限が伴うことが認識されている（Lee et al., Cell Technol. for Cell Products, 29-39 （2007））。
【０２１９】
この実験では、目的の標的タンパク質を本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドと融合することによって改変した実施例１〜３に記載の「改変」配列に代わる配列を用いて、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質のレベルと分泌の増強を試験した。「非改変」配列では、目的の標的タンパク質は本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドと融合されていないという点で「改変されていない」。その代わりに、標的タンパク質は、タンパク質発現増強ポリペプチドを標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質と共発現される。図９Ａは、目的の標的タンパク質の発現を増強するためのこの非改変配列の概略図を示す。このスキームによれば、目的の標的タンパク質に融合タンパク質の標的タンパク質結合ドメインが結合する。融合タンパク質はタンパク質発現増強ポリペプチドドメインも含む。標的タンパク質が融合タンパク質に結合することによって標的タンパク質がタンパク質発現増強ポリペプチドドメインに近づくため、目的の標的タンパク質の発現が増強されると推定される。
【０２２０】
図９Ｂは、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質をコードするｃＤＮＡの３’末端にＶ５エピトープタグをコードする核酸を付加した核酸構築物の図を示す。図９Ｃは本発明の融合タンパク質を発現させるための核酸構築物の図を示す。この実験では、本発明の融合タンパク質は、タンパク質発現増強ポリペプチドとしてのErdj3 Jタンパク質のＪドメインを標
的結合ドメインとしてのＩＬ１３タンパク質と連結させた融合タンパク質とした。
【０２２１】
Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表３２．Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質のアミノ酸配列
【０２２２】
【表３２】
0006688237.tif 000043
下の表に示すように、この実験に使用したＩＬ１３タンパク質のアミノ酸配列にはＦｌａｇエピトープタグとシグナル配列が含まれ、さらにタンパク質の発現に用いた発現ベクターに由来する１３個のアミノ酸残基がＣ末端側に付加された配列であった。
表３３．Ｆｌａｇタグで標識したＩＬ１３タンパク質のアミノ酸配列
【０２２３】
【表３３】
0006688237.tif 000044
下の表に示すように、Ｊドメイン-ＩＬ１３融合タンパク質のアミノ酸配列にはＦｌａ
ｇエピトープタグが含まれていた。
表３４．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ＩＬ１３融合タンパク質のアミノ酸
配列
【０２２４】
【表３４】
0006688237.tif 000045
ＨＥＫ２９３細胞を、Ｖ５タグで標識されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦを発現させるための発現ベクターとＪドメイン‐ＩＬ１３融合タンパク質を発現させるための発現ベクターとを用いて同時形質移入した。形質移入細胞を２日間培養し、細胞可溶化物および細胞培地のサンプルを回収し、Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦの分泌を検出するために抗Ｖ５抗体を用いたウェスタンブロット（免疫ブロット）分析によって分析した。図１０に示すように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質を単独で発現させるための発現ベクターで形質移入した細胞は、細胞内では少量のタンパク質を発現した（中央図、左から２番目のレーン）が、培地ではＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質が見られた場合でもほとんど検出されなかった（上図、左から２番目のレーン）。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質とそのＩＬ１３タンパク質リガンドとを共発現させた結果、形質移入細胞内（中央図、左から３番目のレーン）および培地内（上図、左から３番目のレーン）では検出可能なレベルのＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質が発現された。この結果は、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦとそのＩＬ１３リガンドとを共発現させることによってＩＬ１３Ｒα２ＴＦの分泌が改善されるという先の報告とも一致する（Lee et al., Cell Technol. for Cell Products, 29-39 （2007））。
しかし、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦを本発明のＪドメイン‐ＩＬ１３融合タンパク質と共発現させたところ、細胞内でのＩＬ１３Ｒα２ＴＦの発現レベルがさらに増強され（中央図、左から４番目のレーン）、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質の発現レベルは、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦを単独で発現させた場合（上図、左から２番目のレーン）またはＩＬ１３Ｒα２ＴＦとＩＬ１３リガンドとを共発現させた場合（上図、左から３番目のレーン）と比較して著しく増加した（上図、左から４番目のレーン）。結果は、本発明のＪドメイン‐ＩＬ１３融合タンパク質と共発現させることによってＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質の安定性も分泌も改善されたことを示している。
【０２２５】
実施例５．非改変配列を用いた場合に見られる分泌されるＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現増強
先に述べたとおり、切断型ＩＬ１３Ｒα２（ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ）はＩＬ１３Ｒα２受容体タンパク質のうちＩＬ１３リガンドに結合する機能性ドメインを含む細胞外ドメインを含む。しかし、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦの生成もタンパク質の発現および分泌が難しいため非効率的である。治療的に重要なタンパク質、特に受容体タンパク質のより安定な形態を生成するために採用されてきた戦略の１つは、目的のタンパク質の機能性部分の全部または一部を免疫グロブリンのＦｃドメインの定常ドメインと連結させた融合タンパク質を作製することである。このようなＦｃ融合タンパク質形態は、治療に重要な所望の活性が得られ、Ｆｃドメインによって生体内での血清半減期が長くなり投薬頻度も減るような、役立つ可能性のある薬物群を設計するために用いられてきた。このようなＦｃ融合タンパク質では、「目的のタンパク質」ドメイン（たとえば受容体タンパク質の細胞外のリガンド結合ドメイン）は所望の機能的特性（たとえばリガンド結合性）を保持する。
【０２２６】
この実験では、Ｆｃ融合タンパク質を本発明の非改変配列の融合タンパク質と共発現した場合にみられるＦｃ融合タンパク質（標的タンパク質）発現レベルに対する効果について調べた。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をＦｃ融合タンパク質薬物の代表例として用いた。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質はさらに、抗Ｖ５エピトープ抗体を用いて容易に認識できるようにＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（「目的のタンパク質」）ドメインとＦｃドメインとの間にＶ５エピトープタグを有するタンパク質とした。図１１ＡのＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物の図を参照のこと。この実験について、本発明の融合タンパク質の例は、タンパク質発現増強ポリペプチドドメインとしてのＪタンパク質のＪドメインを免疫グロブリンのＦｃドメインに結合する標的結合ドメインとしてのタンパク質Ａと連結させたタンパク質である。図１１Ｂを参照のこと。
【０２２７】
この実験に使用した、Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表３５．Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０２２８】
【表３５】
0006688237.tif 000046
この実験の一側面では、タンパク質Ａ分子と共発現させた場合のＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルについて試験した。標準の抗Ｆｌａｇ抗体を用いて容易に認識できるように、タンパク質Ａ分子をＦｌａｇエピトープタグで標識した。Ｆｌａｇタグで標識したタンパク質Ａのアミノ酸配列を下の表に示す。
表３６．Ｆｌａｇタグで標識したタンパク質Ａのアミノ酸配列
【０２２９】
【表３６】
0006688237.tif 000047
ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現を増強するための融合タンパク質の一例では、Ｅｒｄｊ３タンパク質のＪドメインをタンパク質Ａと連結させ、タンパク質ＡドメインのＣ末端にＦｌａｇエピトープタグを連結させた。図１１ＢのＤＮＡ構築物の図を参照のこと。Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。表３７．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質のアミ
ノ酸配列
【０２３０】
【表３７】
0006688237.tif 000048
ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現を増強するための融合タンパク質の別の例では、Ｅｒｄｊ５タンパク質のＪドメインをタンパク質Ａと連結させ、タンパク質ＡドメインのＣ末端にＦｌａｇエピトープタグを連結させた。図１１ＢのＤＮＡ構築物の図を参照のこと。Ｆｌａｇタグで標識したErdj5 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質
のアミノ酸配列を下の表に示す。
表３８．Ｆｌａｇタグで標識したErdj5 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質のアミ
ノ酸配列
【０２３１】
【表３８】
0006688237.tif 000049
ＨＥＫ２９３細胞を発現ベクタープラスミドで形質移入し、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現させた場合、タンパク質Ａと共発現させた場合（「タンパク質Ａのみ」）、Erdj3 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合（「
Ｊ‐タンパク質Ａ」）、Erdj5 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた
場合（「Ｊ２‐タンパク質Ａ」）の、培地でのＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルを比較した。形質移入細胞を２日間培養し、細胞培地のサンプルを回収し、Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の分泌を検出するために、抗Ｖ５抗体を用いたウェスタンブロット（免疫ブロット）分析によって分析した。図１２Ａは、培地のウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像を示す。図１２Ａのレーン１は、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクター（空のベクター）を用いて形質移入した細胞を含む「疑似」培養液の培地である。単独で発現させた場合（レーン２）、多少のＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質が培地で検出された。図１２Ａのレーン３に示すように、タンパク質Ａと共発現させた場合（タンパク質Ａのみ）、培地に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質のレベルの有意な増強は得られなかった。しかし、いずれかのＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させることによって培地に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルは有意に増強された（図１２Ａのレーン４およびレーン５）。重要なことに、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃをタンパク質Ａのみと共発現させてもＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃの分泌には影響しなかった（レーン３）という事実から、以下のことがわかる：（１）分泌されるＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃの発現レベルを増強するにはＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質のＪドメインが必須である；（２）分泌されるＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルを増強するための標的特異性を得るにはＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質のタンパク質Ａドメインが必須である。
【０２３２】
図１２Ａのレーンの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測
定分析した結果を図１２Ｂの各棒グラフに示す。図１２Ｂの棒グラフは、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃをいずれかのＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた（棒グラフ４および５）ことによって、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃの発現レベルが、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃを単独で発現させた場合（棒グラフ２）またはＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃをタンパク質Ａのみと共発現させた場合（棒グラフ３）と比較して有意に増強されたことを明確に示している。
【０２３３】
図１２Ａおよび図１２Ｂの分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質の発現レベルの増強がＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質の標的結合ドメインがＦｃドメインに対して有する特異性に依存していることは、図１２Ｃに示す結果によって裏付けられている。図１２Ｃの左図にある培地のウェスタンブロット分析に示すように、形質移入細胞がＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質を単独で発現した場合（レーン１）、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質をＪ‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現した場合（レーン２）、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質をタンパク質Ａのみと共発現した場合（タンパク質Ａのみ、レーン３）には、いずれも培地に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（Ｆｃドメインは含まない）の有意な発現は検出されなかった。図１２Ｃの左図のレーンに示す化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図１２Ｃの右図の各棒グラフに示す。
【０２３４】
実施例６．非改変配列を用いた場合の別のＦｃ融合タンパク質の分泌の発現増強
数種類の異なるＦｃ融合タンパク質の増強について本発明のＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質の有効性を試験し比較するために、一連の実験を実施した。形質移入細胞の培養液から採取した培地のウェスタンブロット分析の結果を図１３に示す。
【０２３５】
実施例６．１．分泌されるＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現増強
上記の実施例５の結果と一致して、形質移入細胞内でＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質をErdj3 Jドメイン-タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させることによって、培地に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質の発現レベル（図１３Ａの左図のレーン２参照）が、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質を単独で発現する形質移入細胞に見られたレベル（図１３Ａの左図のレーン１参照）と比較して有意に増強された。分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質の発現レベルが有意に増強したことは、図１３Ａの左図の化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した図１３Ａの右図の各棒グラフに示す結果からも明らかである。
【０２３６】
実施例６．２．分泌されるＴＮＦＲＩＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現増強
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）は、ＴＮＦ‐α受容体（ＴＮＦＲ１）に結合して炎症反応を誘発する主要なサイトカインである。この炎症反応は、関節リウマチ、クローン病、乾癬などの多くの自己免疫疾患に関与する。切断型ＴＮＦ‐α受容体（ＴＮＦＲ１ＴＦ）タンパク質は、ＴＮＦ‐αに結合することによってＴＮＦ‐αの活性を阻害するための囮受容体として用いられる。エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）として市販されている（Ａｍｇｅｎ））は、切断型ＴＮＦＲをＦｃドメインと融合した（ＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ）ＴＮＦ‐α阻害薬である。その分子のうちＴＮＦＲ１ＴＦドメインが所望のＴＮＦ‐α結合特異性を付与し、免疫グロブリンＦｃドメインが患者の体内を循環する薬物の生体内安定性を加えると考えられている。
【０２３７】
この実験に用いたＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合標的タンパク質は、さらにＴＮＦＲ１ドメインとＦｃドメインとの間にＶ５エピトープタグを有するタンパク質とした。この実験に用いたＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表３９．ＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃタンパク質のアミノ酸配列
【０２３８】
【表３９】
0006688237.tif 000050
図１３Ｂの左図は、培地のウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像であり、ＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合標的タンパク質を単独で発現する形質移入細胞の培地（レーン１）、またはＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質と上記のErdj3 J
ドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地（レーン２）を示す。結果は、ＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質とErdj3 Jドメイン‐タンパク質
Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞内で分泌されたＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルが、Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質の非存在下で発現されたＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質のレベルと比較して有意に増強されたことを示している。分泌されたＴＮＦＲ１ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルが有意に増強したことは、図１３Ｂの左図のレーンのシグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した図１３Ｂの右図の各棒グラフに示す結果からも明らかである。
【０２３９】
実施例６．３．分泌されるα１ＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現増強
α１アンチトリプシンタンパク質（α１ＡＴ）は肝臓で分泌されて循環器系へ移動する。α１ＡＴの機能は組織（特に肺組織）を過剰なプロテアーゼ活性から保護することである。α１アンチトリプシン欠損症の患者の肺組織はプロテアーゼによって重度の損傷を受ける可能性がある。このような患者は、肺気腫、喘息、および／または慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease（ＣＯＰＤ））を発症する可能性がある。現
在、α１ＡＴ（ヒト血清から精製される）がα１アンチトリプシン欠損症の患者の治療に用いられているが、この治療は高価であり、精製したα１ＡＴを受ける患者にはヒト血清中に存在する病原体に感染する危険性がある。
【０２４０】
この実験に用いた標的α１ＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質はさらに、α１ＡＴドメインとＦｃドメインとの間にＶ５エピトープタグを有するタンパク質とした。この実験に用いたα１ＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質（α１ＡＴ‐Ｆｃ）のアミノ酸配列を下の表に示す。
表４０．Ｖ５タグで標識したα１ＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０２４１】
【表４０】
0006688237.tif 000051
図１３Ｃの左図は、培地のウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フ
ィルム画像であり、α１ＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞の培地（レーン１）またはα１ＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質と上記のErdj3 Jドメイン-タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地（レーン２）を示す。結果は、分泌されたα１ＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質のレベル（レーン２）が、Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質の非存在下で発現されたα１ＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質のレベル（レーン１）と比較して有意に増強されたことを示している。分泌されたα１ＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルが有意に増強したことは、図１３Ｃの左図のレーンのシグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した図１３Ｃの右図の各棒グラフに示す結果からも明らかである。
【０２４２】
実施例７．非改変配列を用いた場合の分泌されるＩｇＧ１抗体分子の発現増強
上記の試験から、Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質を共発現させることによってＦｃ融合タンパク質の発現および分泌が有意に増強されたことがわかった。タンパク質Ａは、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する公知のタンパク質の１つである。この試験では、免疫グロブリンドメインに結合することが知られている他のタンパク質をＪタンパク質のＪドメインと融合することによって、分泌される標的抗体の発現レベルを増強することが可能かを調べた。
【０２４３】
この試験では、ヒト化ＩｇＧ１抗ＩＬ８抗体を標的抗体タンパク質として用いた。以下に説明するように、多様なＪドメイン融合タンパク質の存在下と非存在下で分泌された抗ＩＬ８抗体の発現レベルを調べた。
【０２４４】
この実験の一側面では、免疫グロブリンＦｃドメインに結合することが知られているタンパク質Ａ分子と共発現させた場合の抗ＩＬ８抗体の発現レベルを調べた。タンパク質Ａ分子は、上記の実施例５に記載のＦｌａｇタグで標識したタンパク質Ａを用いた。
【０２４５】
この実験の別の側面では、抗体の軽鎖に結合することが知られているタンパク質Ｌ分子と共発現させた場合の抗ＩＬ８抗体の発現レベルを調べた。タンパク質Ａ分子について先に述べたとおり、この実験に使用したタンパク質Ｌ分子を、標準の抗Ｆｌａｇ抗体を用いて容易に認識できるようにＦｌａｇエピトープタグで標識した。Ｆｌａｇタグで標識したタンパク質Ｌのアミノ酸配列を下の表に示す。
表４１．Ｆｌａｇタグで標識したタンパク質Ｌのアミノ酸配列
【０２４６】
【表４１】
0006688237.tif 000052
下の表に示すように、Erjd3 Jドメイン‐タンパク質Ｌ融合タンパク質のアミノ酸配列
にはＦｌａｇエピトープタグが含まれていた。
表４２．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐タンパク質Ｌ融合タンパク質のアミ
ノ酸配列
【０２４７】
【表４２】
0006688237.tif 000053
下の表に示すように、この実験で用いたＩＬ８タンパク質のアミノ酸配列は、Ｆｌａｇエピトープタグとシグナル配列を含み、さらにタンパク質の発現に用いた発現ベクターに由来する１３個のアミノ酸残基がＣ末端側に付加した配列であった。
表４３．Ｆｌａｇタグで標識したＩＬ８タンパク質のアミノ酸配列
【０２４８】
【表４３】
0006688237.tif 000054
下の表に示すように、Erdj3 Jドメイン‐ＩＬ８融合タンパク質のアミノ酸配列はＦｌ
ａｇエピトープタグを含んでいた。
表４４．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ＩＬ８融合タンパク質のアミノ酸配
列
【０２４９】
【表４４】
0006688237.tif 000055
ＨＥＫ２９３細胞を発現プラスミドで形質移入し、以下の形質移入細胞を得た：抗ＩＬ８抗体を単独で発現する形質移入細胞；抗ＩＬ８抗体とタンパク質Ａとを共発現する形質移入細胞（タンパク質Ａのみ）；抗ＩＬ８抗体と本発明のErdj3 Jドメイン‐タンパク質
Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（Ｊ‐タンパク質Ａ）；抗ＩＬ８抗体とタンパク質Ｌとを共発現する形質移入細胞（タンパク質Ｌのみ）；抗ＩＬ８抗体と本発明のErdj3 Jドメイン‐タンパク質Ｌ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞（Ｊ‐タン
パク質Ｌ）；抗ＩＬ８抗体とそのＩＬ８リガンドを共発現する形質移入細胞（ＩＬ８）；本発明のErdj3 Jドメイン‐ＩＬ８リガンド融合タンパク質を共発現する形質移入細胞（
Ｊ‐ＩＬ８）；Erdj3 J‐タンパク質Ａ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（
Ｊ‐タンパク質Ａ）；本発明のErdj3 Jドメイン‐タンパク質Ｌ融合タンパク質を単独発
現する形質移入細胞（Ｊ‐タンパク質Ｌ）；および本発明のErdj3 Jドメイン‐ＩＬ８リ
ガンド融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（Ｊ‐ＩＬ８）。培地での抗ＩＬ８抗体の発現を、抗ヒトＩｇＧ（抗ｈＩｇＧ抗体、カタログ番号ＡＰ１１２Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体を用いたドットブロット分析によって分析した。
【０２５０】
図１４Ａの培地のドットブロットに示すように、形質移入細胞内で抗ＩＬ８抗体をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン４）、Ｊドメイン‐タンパク質Ｌ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン６）、またはＪドメイン‐ＩＬ８融合タンパク質と共発現させた場合（レーン８）、培地に分泌された抗ＩＬ８抗体の発現レベルが、抗ＩＬ８抗体を単独で発現する形質移入細胞（レーン２）、タンパク質Ａのみと共発現する形質移入細胞（レーン３、タンパク質Ａのみ）、タンパク質Ｌのみと共発現する形質移入細胞（レーン５、タンパク質Ｌのみ）、またはＩＬ８リガンドタンパク質のみと共発現する形質移入細胞（レーン７）で発現された抗体のレベルと比較して有意に増強されたことがわかる。Ｊドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（レーン９、Ｊ‐タンパク質Ａ）、Ｊドメイン‐タンパク質Ｌ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（レーン１０、Ｊ‐タンパク質Ｌ）、またはＪドメイン‐Ｉ
Ｌ８融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞（レーン１０、Ｊ‐ＩＬ８）の培地ではシグナルが検出されなかった。このことは、３種すべての融合タンパク質が、共発現された抗ＩＬ８抗体標的タンパク質を特異的に標的としてその発現を増強したことを示す。
【０２５１】
図１４ＡのレーンのシグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図１４Ｂの各棒グラフに示す。この一連の実験の結果は、標的である抗ＩＬ８抗体を、タンパク質発現増強ポリペプチド（ここではErdj3 Jドメイン）を標的タンパク質
結合ドメイン（ここではタンパク質Ａ、タンパク質Ｌ、またはＩＬ８）と連結させた本発明の融合タンパク質と共発現させることによって、分泌された抗ＩＬ８抗体の発現が、融合していない標的タンパク質結合ドメインタンパク質のみ（タンパク質Ｇのみ、タンパク質Ｌのみ、またはＩＬ８のみ）と共発現させた場合と比較して有意に増強されたことを明確に示している。
【０２５２】
実施例８．非改変配列を用いた場合のＣＨＯ‐ＤＰ１２産生細胞株で確立されている発現に対する増強
この試験では、商業価値のある確立された産生細胞株で既に安定に産生されている標的タンパク質の発現のレベルを改善するために本発明の融合タンパク質を用いることができるかを調べる。この実験には、American Type Culture Collection（受託番号ＣＲＬ‐１２４４４４、American Type Culture Collection（バージニア州、マナナス））から入手した、ヒト化抗IL8 IgG1抗体を安定に発現するＣＨＯ‐ＤＰ１２細胞株を、抗ＩＬ８抗体を発現させるための発現ベクタープラスミド（受託番号２０９５５２、ＡＴＣＣ（バージニア州、マナナス））と共に使用した。本発明の融合タンパク質としては、上記のErdj3 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質を使用した。ＣＨＯ‐ＤＰ１２産生細胞株の細
胞を、Erdj3 Jドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質をコードする構造遺伝子を作動可
能に連結させた発現ベクターで形質移入した。形質移入の効率は、ＣＨＯ‐ＤＰ１２細胞ではＨＥＫ２９３細胞ほど高くはなかった。しかし、図１５Ａのドットブロット分析に示すように、ヒト化抗体をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させることによって、培地に分泌された抗体の発現レベル（レーン３）はＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質の非存在下で発現された抗体の発現レベル（レーン２、なし）と比較して有意に増強された。
【０２５３】
図１５Ａのレーンのドットブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図１５Ｂの各棒グラフに示す。結果は、抗体をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた結果、分泌された抗体の発現（棒グラフ３）が有意に増強され、抗体をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質の非存在下で発現させた場合に得られた発現レベル（棒グラフ２）の約４〜５倍に発現レベルが増強されたことを示している。
【０２５４】
この結果は、確立された産生細胞株で既に安定に発現されているタンパク質の産生レベルを有意に増強するために本発明の融合タンパク質を採用できることを示す。
【０２５５】
実施例９．分泌されるＦｃ含有分子の発現を増強するためのその他の非改変配列の融合タンパク質
実施例９．１．別のタンパク質種に由来するＦｃ結合ドメインを含む融合タンパク質
本実施例では、Ｊドメイン（タンパク質発現増強ポリペプチドドメインとして）を抗体分子のＦｃ領域に結合することが報告されている多様なポリペプチドのいずれかと連結させた様々な融合タンパク質について試験する一連の実験を示す。多様なＪドメイン融合タンパク質を、形質移入ＨＥＫ２９３細胞の培地に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルに対する増強能力について、上記実施例５に記載のとおり試験し比較した。
【０２５６】
本実施例に使用した本発明のＪ‐タンパク質Ａ融合タンパク質は、上記実施例５に記載のＥｒｄｊ３‐タンパク質Ａ融合タンパク質である。
【０２５７】
本明細書に記載の実験で使用した別の融合タンパク質では、Erdj3 Jタンパク質のＪド
メインを、ある種の免疫グロブリンのＦｃドメインに結合することが知られているタンパク質Ｇと連結させた。実施例５および図１１ＢでＪ‐タンパク質Ａ融合タンパク質について示したように、Ｆｌａｇエピトープタグをタンパク質ＧドメインのＣ末端に連結させた。Ｆｌａｇタグで標識した本発明のＪドメイン‐タンパク質Ｇ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表４５．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐タンパク質Ｇ融合タンパク質のアミ
ノ酸配列
【０２５８】
【表４５】
0006688237.tif 000056
本明細書に記載の実験で使用した別の融合タンパク質では、Erdj3 Jタンパク質のＪド
メインを、ある種の免疫グロブリンのＦｃドメインに結合する受容体であるヒトＦｃ受容体（ｈＦｃＲ）タンパク質と連結させた。実施例５および図１１ＢでＪ‐タンパク質Ａ融合タンパク質について示したように、ＦｌａｇエピトープタグをｈＦｃＲドメインのＣ末端に連結させた。Ｆｌａｇタグで標識したＪドメイン‐ｈＦｃＲ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表４６．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ｈＦｃＲ融合タンパク質のアミノ酸
配列
【０２５９】
【表４６】
0006688237.tif 000057
本明細書に記載の実験で使用した別の融合タンパク質では、Erdj3 Jタンパク質のＪド
メインを、ある種の免疫グロブリンのＦｃドメインに結合する受容体であるアカゲザル（Macaca mulatta）ラジノウイルスＦｃ受容体（ｖＦｃＲ）タンパク質と連結させた。実施例５および図１１ＢでＪ‐タンパク質Ａ融合タンパク質について示したように、ＦｌａｇエピトープタグをｖＦｃＲドメインのＣ末端に連結させた。Ｆｌａｇタグで標識したＪドメイン‐ｖＦｃＲ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表４７．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ｖＦｃＲ融合タンパク質のアミノ酸
配列
【０２６０】
【表４７】
0006688237.tif 000058
本明細書に記載の実験で使用した別の融合タンパク質では、Erdj3 Jタンパク質のＪド
メインを、有意なＦｃ結合活性を有さない単純ヘルペスウイルス１型のｇＩタンパク質と連結させた。実施例５および図１１ＢでＪ‐タンパク質Ａ融合タンパク質について示したように、ＦｌａｇエピトープタグをｇＩドメインのＣ末端に連結させた。Ｆｌａｇタグで標識したＪドメイン‐ｇＩ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表４８．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ｇＩ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０２６１】
【表４８】
0006688237.tif 000059
本明細書に記載の実験で使用した別の融合タンパク質では、Erdj3 Jタンパク質のＪド
メインを、免疫グロブリンのＦｃドメインに対し比較的弱い親和性を有する単純ヘルペスウイルス１型のｇＥタンパク質と連結させた。実施例５および図１１ＢでＪ‐タンパク質Ａ融合タンパク質について示したように、ＦｌａｇエピトープタグをｇＥドメインのＣ末端に連結させた。Ｆｌａｇタグで標識したＪドメイン‐ｇＥ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表４９．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ｇＥ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０２６２】
【表４９】
0006688237.tif 000060
ＨＥＫ２９３細胞を発現ベクタープラスミドで形質移入し、以下の場合の培地でのＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルを比較した：ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現させた場合；Ｊドメイン‐タンパク質Ａと共発現させた場合（上記実施例５に記載）；タンパク質Ａと共発現させた場合（実施例５に記載の「タンパク質Ａのみ」）；Ｊドメイン‐タンパク質Ｇ融合タンパク質と共発現させた場合（Ｊ‐タンパク質Ｇ）；ＪドメインをヒトＦｃ受容体タンパク質と連結させたＪドメイン融合タンパク質と共発現させた場合（「Ｊ‐ｈＦｃＲ」）；ＪドメインをウイルスＦｃ受容体タンパク質と連結させたＪドメイン融合タンパク質（「Ｊ‐ｖＦｃＲ」）と共発現させた場合；Ｊドメインをヘルペス単純ヘルペスウイルス１型のｇＩタンパク質と連結させたＪド
メイン融合タンパク質と共発現させた場合（「Ｊ‐ｇＩ」）；Ｊドメインを単純純ヘルペスウイルス１型のｇＥタンパク質と連結させたＪドメイン融合タンパク質と共発現させた場合（「Ｊ‐ｇＥ」）；およびＪ‐ｇＩとＪ‐ｇＥ両方と共発現させた場合（「Ｊ‐ｇＩ＋Ｊ‐ｇＥ」）。形質移入細胞を２日間培養し、細胞培地のサンプルを回収し、Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦの分泌を検出するために抗Ｖ５抗体を用いたウェスタンブロット（免疫ブロット）分析によって分析した。
【０２６３】
図１６Ａは、形質移入細胞の培養液から得た培地のウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像を示す。図１６Ａのレーン１は、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現させる発現ベクターで形質移入した細胞の培養液から得た培地である。単独で発現させた場合、少量のＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質が培地で検出された（図１６Ａのレーン１）。実施例５と図１２Ａに示した結果について先に述べたとおり、タンパク質Ａのみと共発現させた場合も少量のＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質が検出された（図１６Ａのレーン３）。同じく実施例５および図１２Ａに先に示したとおり、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させることによって、培地に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルが、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦを単独で発現させた場合の発現レベル（図１６Ａのレーン１）またはＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃをタンパク質Ａのみと共発現させた場合 （図１６Ａのレーン３）と比較して有意に増強された（図１６Ａのレ
ーン２）。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質をＪドメイン‐タンパク質Ｇ融合タンパク質と共発現させた場合にも、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質の発現レベル（図１６Ａのレーン４）が、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦを単独で発現させた場合の発現レベル（図１６Ａのレーン１）またはＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃをタンパク質Ａのみと共発現させた場合の発現レベル（図１６Ａのレーン３）と比較して有意に増強された。
【０２６４】
単純ヘルペスウイルス１型に由来するウイルスタンパク質ｇＩおよびｇＥは、ヘテロ二量体を形成することが知られている。ここで、ｇＥタンパク質は抗体分子への結合が弱い。また、ｇＥタンパク質単独では抗体分子への結合が弱いが、ｇＩ単独では抗体分子に結合しない。これらの従来の知見に一致して、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をＪドメイン‐ｇＩ融合タンパク質と共発現させた結果（図１６Ａのレーン７）、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃの発現レベルは比較的低く、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃを単独で発現する細胞に見られた発現レベル（図１６Ａのレーン１）と類似していた。対照的に、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をＪドメイン‐ｇＥ融合タンパク質と共発現させることによって、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃの発現レベルが有意に増強された（図１６Ａのレーン８）。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃの分泌レベルについて、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＦｃをＪ‐ｇＩ融合タンパク質およびＪ‐ｇＥ融合タンパク質と共発現させた場合にも類似の増強が見られた（図１６Ａのレーン９）。このことは、Ｊ‐ｇＩ融合タンパク質は分泌されるＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃの発現レベルを有意に増強しないことを示し、これはｇＩタンパク質がＦｃドメインに結合しないという従来の知見に一致している。
【０２６５】
ヒトＦｃ結合受容体（ｈＦｃＲ）とアカゲザル（Macaca mulatta）ラジノウイルスのＦｃ結合受容体（ｖＦｃＲ）は、抗体分子のＦｃ領域に結合する、十分に特徴的な受容体である。これらのＦｃＲ分子を含むＪドメイン融合物を作製し、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質に対する発現増強能力について試験した。図１６Ａに示すように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質をＪドメイン‐ｈＦｃＲ融合タンパク質またはＪドメイン‐ｖＦｃＲ融合タンパク質と共発現させた結果、分泌されるＩＬ１３Rα２ＴＦ‐Ｆｃの
発現を増強できなかった（図１６Ａのレーン５およびレーン６）うえ、実際にはＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃタンパク質を単独で発現する細胞に見られた低レベルの分泌タンパク質（図１６Ａのレーン１）の発現さえも抑制したようであった。このように基準の分泌量す
らも明らかに抑制したことについて、考えられる説明としては、これらの実験に使用したＪドメイン‐ＦｃＲ融合タンパク質が小胞体（ＥＲ）で捕捉されたという可能性がある。Ｆｃ領域を有するタンパク質を標的としてその発現を増強するためのＦｃＲ領域を含む機能的な構築物を見出すには、さらなる研究が必要である。
【０２６６】
図１６Ａのウェスタンブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図１６Ｂの各棒グラフに示す。
【０２６７】
実施例９．２．非改変配列で標的タンパク質の発現を増強するのに使用するためのＦｃ標的ペプチド含有融合タンパク質
免疫グロブリン分子のＦｃドメインに結合する多様なペプチドが知られている。この実験では、Ｊドメイン（タンパク質発現増強ポリペプチドとして）を数種類の代表的なＦｃ結合性ペプチドのそれぞれ（標的結合ドメインとして）と連結させた、Ｆｃドメインを有するタンパク質の発現レベルを増強するのに用いるための多様な融合タンパク質を試験した。融合タンパク質を構築するのに用いた６種類のペプチドを下の表に示す。
表５０．Ｆｃドメインに結合する代表的なペプチドのアミノ酸配列
【０２６８】
【表５０】
0006688237.tif 000061
Ｊドメイン（Ｅｒｄｊ３タンパク質由来）を上記６種類のペプチドのそれぞれと連結させたＪドメイン融合タンパク質を発現させるための発現ベクタープラスミドを作製した。Ｆｃドメインを有する代表的な標的タンパク質としてＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を用いた。
【０２６９】
下の表に示すように、この実験に使用した、Erdj3 Jタンパク質のＪドメインをＦｃＢ
Ｐ１ペプチドと連結させたＪドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｆｌａｇエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する１３個のアミノ酸残基がＣ末端に付加された配列であった。
表５１．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ＦｃＢＰ１融合タンパク質のアミノ
酸配列
【０２７０】
【表５１】
0006688237.tif 000062
下の表に示すように、この実験に使用した、Erdj3 Jタンパク質のＪドメインをＦｃＢ
Ｐ２ペプチドと連結させたＪドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｆｌａｇエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する１３個のアミノ酸残基をＣ末端に付加された配列であった。
表５２．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ＦｃＢＰ２融合タンパク質のアミノ
酸配列
【０２７１】
【表５２】
0006688237.tif 000063
下の表に示すように、この実験に使用した、Erdj3 Jタンパク質のＪドメインをＦｃＢ
Ｐ３ペプチドと連結させたＪドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｆｌａｇエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する１３個のアミノ酸残基をＣ末端に付加された配列であった。
表５３．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ＦｃＢＰ３融合タンパク質のアミノ
酸配列
【０２７２】
【表５３】
0006688237.tif 000064
下の表に示すように、この実験に使用した、Erdj3 Jタンパク質のＪドメインをＦｃＢ
Ｐ４ペプチドと連結させたＪドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｆｌａｇエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する１３個のアミノ酸残基をＣ末端に付加された配列であった。
表５４．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ＦｃＢＰ４融合タンパク質のアミノ
酸配列
【０２７３】
【表５４】
0006688237.tif 000065
下の表に示すように、この実験に使用した、Erdj3 Jタンパク質のＪドメインをＦｃＢ
Ｐ５ペプチドと連結させたＪドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｆｌａｇエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する１３個のアミノ酸残基をＣ末端に付加された配列であった。
表５５．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ＦｃＢＰ５融合タンパク質のアミノ
酸配列
【０２７４】
【表５５】
0006688237.tif 000066
下の表に示すように、この実験に使用した、Erdj3 Jタンパク質のＪドメインをＦｃＢ
Ｐ６ペプチドと連結させたＪドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ｆｌａｇエピトープタグを有し、さらにこのタンパク質を発現させるのに使用した発現ベクターに由来する１３個のアミノ酸残基をＣ末端に付加された配列であった。
表５６．Ｆｌａｇタグで標識したErdj3 Jドメイン‐ＦｃＢＰ６融合タンパク質のアミノ
酸配列
【０２７５】
【表５６】
0006688237.tif 000067
形質移入細胞を２日間培養し、細胞培地のサンプルを回収し、Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の分泌を検出するために抗Ｖ５抗体を用いたウェスタンブロット分析によって分析した。図１７Ａは、培地のウェスタンブロット分析における化学発光シグナルのＸ線フィルム画像を示す。図１７Ａに示すように、ＨＥＫ２９３形質移入細胞内でＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を６種類のＪドメイン‐ペプチド融合タンパク質のそれぞれと共発現させることによって、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベル（レーン４〜９）が、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現させた場合の発現レベル（レーン１および３）と比較して有意に増強された。さらに、比較のために、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン２）またはＪドメイン‐タンパク質Ｇ融合タンパク質と共発現させた場合（レーン１０）に分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現にもたらされる効果についても実験した。図１７Ａに示すように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質をＪドメイン‐タンパク質Ａ融合タンパク質（レーン２）またはＪドメイン‐タンパク質Ｇ融合タンパク質（レーン１０）と共発現させることによって、分泌されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現レベルが有意に増強された。
【０２７６】
図１７Ａのウェスタンブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図１７Ｂの各棒グラフに示す。
【０２７７】
実験結果から得た結論
上記の実験の結果は、目的の標的タンパク質と、タンパク質発現増強ポリペプチドドメインを標的タンパク質に結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質とを共発現させることによって、標的タンパク質の適切な細胞内位置または細胞外位置での発現レベルが、融合タンパク質の非存在下での標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に増強されることを示している。
【０２７８】
実施例１０．タンパク質発現増強ポリペプチドに必要な最小限の配列
非改変配列または改変配列で用いた場合に目的の標的タンパク質の発現レベルを増強するのに有効な必要最小限のアミノ酸を決定するためにさらに分析を行った。
【０２７９】
現存するＪドメイン配列のライブラリーについて、ＢＬＡＳＴを用いた配列相同性分析を行い、Ｊドメインがタンパク質の発現レベルを増強することのできる類似の最小の「コア」配列を共有しているかを決定した。分析から、Ｅｒｄｊ３タンパク質のＪドメインが他のＪタンパク質のＪドメインの特徴を有していたことがわかった。Ｅｒｄｊ３のＪドメインは既に改変配列と非改変配列いずれにおいてもタンパク質発現の増強に有効であることが知られているため（上記の実施例を参照のこと）、これをタンパク質発現増強活性を保持する最小限のポリペプチド配列が特定できるかを決定するためのさらなる欠失および置換変異分析の対象に選んだ。
【０２８０】
この試験では、改変ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃタンパク質を目的の標的タンパク質とし、これに対する発現の増強についてＥｒｄｊ３のＪドメインの多様な欠失変異体および置換変異体を評価した。この改変タンパク質は、Ｖ５エピトープタグをＩＬ１３Ｒα２ＴＦポリペプチドとＦｃドメインとの間に有し、抗Ｖ５抗体を用いて容易に検出できるようにした。Ｅｒｄｊ３のＪドメインの全長または多様な変異ポリペプチドを、改変ＩＬ１３Ｒα２‐Ｆｃ標的タンパク質のＦｃドメインに結合する（したがって標的タンパク質結合ドメインの働きをする）タンパク質Ａと連結させた融合タンパク質を構築した。したがって、変異ポリペプチドのそれぞれについて、試験に用いた対応する融合タンパク質の一般式は以下のとおりである：
シグナル配列−リンカー１−（Ｊドメイン、断片またはＪドメインアナログポリペプチド配列）−リンカー２−タンパク質Ａ−リンカー３−Ｆｌａｇエピトープタグ。
【０２８１】
これらの融合タンパク質のドメインのアミノ酸配列を、挿入されたＪドメイン、Ｊドメイン断片、またはＪドメインアナログの配列を除き、下の表に示す。
表５７．Ｆｌａｇタグで標識した試験タンパク質Ａ融合物のアミノ酸構造
【０２８２】
【表５７】
0006688237.tif 000068
各融合タンパク質のタンパク質発現増強活性を、検出可能な抗Ｖ５抗体を用いたドットブロット分析によって決定した。ＩＬ１３Ｒα２‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質を、各変異ポリペプチド配列を含む融合タンパク質の存在下または非存在下で発現させ、細胞培地を回収して短時間回転させて細胞片を除去した。サンプルをニトロセルロース膜にブロットし、乾燥させた膜を免疫ブロット分析用に処理した。タンパク質発現増強活性を試験した欠失体ポリペプチドおよび置換体ポリペプチドを、免疫ブロットによって決定したタンパク質発現増強活性と共に下の表に示す。
表５８−１〜表５８−３．タンパク質発現増強活性について試験したポリペプチドのアミノ酸配列
【０２８３】
【表５８−１】
0006688237.tif 000069
【０２８４】
【表５８−２】
0006688237.tif 000070
【０２８５】
【表５８−３】
0006688237.tif 000071
上の表に示すように、各変異ポリペプチドを、ＩＬ１３Ｒα２‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質と共発現させた場合の発現増強活性について評価した。発現レベルを、高活性（「ＨＡ」）、活性（「Ａ」）、または非活性（「ＮＡ」）に分類した。これらの発現レベルの例を図１８の免疫ブロットに示す。融合タンパク質がない場合のＩＬ１３Ｒα２‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルを「非活性」とした。図１８のレーン２（左から）を参照のこと。上の表５８−１でポリペプチド３と表記したＥｒｄｊ３の完全なＪドメインをタンパク質Ａと連結させた融合タンパク質を共発現させると、分泌されたＩＬ１３Ｒα２‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルは著しく増強された。図１８の左から３番目のレーンを参照のこと。この発現増強レベルを「高活性」とした。図１８のレーン４に示すように、内部に欠失を有する変異体ポリペプチド３‐４５をタンパク質Ａと連結させた融合タンパク質を共発現させると、分泌されたＩＬ１３Ｒα２‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルは対照（融合タンパク質なし、図１８のレーン２）と比較して明らかに有意に増強されたが、その発現レベルは図１８のレーン３に示す高活性よりはいくらか低かった。この発現増強のレベルを「活性」とした。対照的に、図１８のレーン５に示すように、最小限のポリペプチド配列の置換変異体である３‐７２をタンパク質Ａと連結させた融合タンパク質を共発現させると、図１８のレーン２の対照について検出された発現レベルと同程度の発現レベルであった。これを「非活性」とした。
【０２８６】
この分析の結果は、Ｅｒｄｊ３のＪドメインに含まれるポリペプチド断片３‐２９が高いタンパク質発現増強活性をもたらす最小限のポリペプチド配列（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ；
配列番号４８）を有することを示している。ポリペプチド３‐２９配列はＪドメインのαヘリックスＩＩに位置するが、隣接する（Ｃ末端側）ループドメインの残基を全く含まない。
【０２８７】
Ｊドメイン断片３‐２９配列の多様な変異体を作製し、タンパク質発現増強活性を評価した。変異配列は上の表に示した。ポリペプチド３‐４４〜３‐８８を参照のこと。
【０２８８】
他のＪタンパク質のＪドメインについても、Ｅｒｄｊ３のＪドメインに含まれる３‐２９ポリペプチドと同様の位置に含まれるポリペプチド配列について評価した。これらの配列は上の表に３‐８９〜３‐９９として示した。これらのポリペプチドのほとんどが、分泌されるＩＬ１３Ｒα２‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現増強の分析で完全な活性または部分的な活性を示した。しかし、これらのうち３‐９８および３‐９９の２つのポリペプチドは、ポリペプチド３‐２９とは大きく異なるアミノ酸配列を有し、これらのポリペプチドにはタンパク質発現増強活性もなかった。
【０２８９】
実施例１１．新規なタンパク質発現増強ポリペプチドのファミリーを定義する構造式
以下はポリペプチド配列の変異データの分析の概要である。この分析によって、Ｅｒｄｊ３のＪドメインのうちタンパク質発現増強活性をもたらす最小限のポリペプチド断片配列（ポリペプチド３‐２９；配列番号４８）に加え、以下に示す新規なタンパク質発現増強ポリペプチドのファミリーを定義する構造式も見出すことができた。
【０２９０】
図１９は、Ｅｒｄｊ３のＪドメインと、一連の欠失変異ポリペプチドのアミノ酸配列の比較表を示す。各ポリペプチドを用いて上記のＦｌａｇタグで標識したタンパク質Ａ融合タンパク質を構成した非改変配列によって決定した、各ポリペプチドのタンパク質発現増強活性も示す。Ｆｌａｇタグで標識した各タンパク質Ａ融合物とＩＬ１３Ｒα２‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質とを共発現する細胞の培地に分泌されたＩＬ１３Ｒα２‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルを、上記のように抗Ｖ５抗体を用いた免疫ブロットによって決定した。
【０２９１】
図１９に示す欠失変異ポリペプチド３‐６、３‐７、３‐８、３‐９はすべてタンパク質発現増強する活性がなく（非活性）、αヘリックスＩＩのアミノ酸配列が活性に必須であることを示している。図１９の欠失変異ポリペプチド３‐１５および３‐１７は高活性を保持しており、配列ＤＩＫＫＡＹＲＫＬＡＬＱＬ（配列番号２７４）が高いタンパク質発現増強活性をもたらすのに十分であることを示している。続いて、このポリペプチドを下の表に示すようにさらに変異分析した。
表５９．変異ポリペプチドのアミノ酸配列およびタンパク質発現増強活性
【０２９２】
【表５９】
0006688237.tif 000072
先に述べたように、ポリペプチド３‐２１の活性（高活性、ＨＡ）とポリペプチド３‐２２の活性（非活性、ＮＡ）との違いから、Ｃ末端のロイシン（Ｌ）残基がタンパク質発現増強活性に必須であることがわかった。同様に、ポリペプチド３‐２５の活性とポリペプチド３‐２６の活性との違いから、Ｎ末端のイソロイシン（Ｉ）が活性に必須であることがわかった。既に述べたように、ポリペプチド３‐２９はＥｒｄｊ３のＪドメインが完全なタンパク質発現増強活性をもたらすための最小限のポリペプチド配列を定義する。
【０２９３】
以上の結果に加え、以下に概要を示す追加の分析によって、本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドに必須の共通アミノ酸配列を特定するに至った。
【０２９４】
タンパク質発現増強活性を提供するために必須のアミノ酸配列を特定するために、３‐２９配列の各アミノ酸を欠失させ、ＩＬ１３Ｒα２‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質を上記の非改変配列で用いてポリペプチドのタンパク質発現増強活性を試験した。
【０２９５】
Ｅｒｄｊ３のＪドメインのポリペプチド断片の最小配列をもとに、ポリペプチド３‐２９配列（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ；配列番号４８）について９個のアミノ酸のそれぞれについて以下の変異分析を行った。
（ａ）３‐２９：IKKAYRKLA（配列番号４８）（１位について、下の解析要約（１）を参
照）
（ｂ）３‐４４：IKAYRKLA（配列番号２９５）（非活性；３位について、下の解析要約（２）を参照）
（ｃ）３‐４５：IKK YRKLA（配列番号５３）（活性；４位について、下の解析要約（３
）を参照）
（ｄ）３‐３９：IKKARKLA（配列番号２９４）（非活性；５位について、下の解析要約（４）を参照）
（ｅ）３‐４６：IKKAYKLA（配列番号５４）（活性；６位について、下の解析要約（５）を参照）
（ｆ）３‐４７：IKKAYRLA（配列番号５５）（活性；７位について、下の解析要約（５）を参照）
（ｇ）３‐４８：IKKAYRKA（配列番号５６）（活性；８位について、下の解析要約（６）を参照）
（ｈ）３‐２９：IKKAYRKLA（配列番号４８）（高活性；９位について、下の解析要約（
６）を参照）
解析要約
（１）IKKAYRKLA（配列番号４８）
１位のアミノ酸が活性に必須である。
Ｊタンパク質メンバー（４７種類のＪタンパク質）間で１位のアミノ酸を比較した結果、１位のアミノ酸の割合は以下のとおりであった：
Ｉ（３４例）、Ｌ（６例）、Ｖ（４例）、Ｍ（１例）、Ａ（１例）、Ｒ（１例）。
これらのアミノ酸は、Ａｒｇ（Ｒ）を除いてすべて非極性側鎖基を有する。
その他のＪタンパク質メンバーに由来する以下の構築物を作製し試験した：
３‐４９：LKKAYRKLA（配列番号５７）、高活性
３‐５０：VKKAYRKLA（配列番号５８）、高活性
３‐５１：MKKAYRKLA（配列番号５９）、高活性
３‐５２：AKKAYRKLA（配列番号６０）、高活性
３‐５３：SKKAYRKLA（配列番号２９６）、非活性
３‐５４：FKKAYRKLA（配列番号２９７）、非活性。
したがって、１位は非極性アミノ酸側鎖基を有するアミノ酸すなわちＩ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｍであることが好ましい。
（２）IK AYRKLA（配列番号２９５）、非活性
このことから２つの可能性が示唆される：
ａ）この位置には２個のアミノ酸が必要である。
３‐５５：IAQAYRKLA（配列番号２９８）、非活性
３‐５６：ILAAYRKLA（配列番号２９９）、非活性
何らかの特定のアミノ酸が必要であることが示されている。
ｂ）リジンが２個必要であるか、１個で十分である。
これらの２つの位置についてＪタンパク質メンバー（４７種類のＪタンパク質）間で比較したところ、これらの２つの位置は以下の割合によっても示されるように、よく保存されていることがわかった：
ＫＫ（２６例）、ＫＲ（５例）、ＲＫ（３例）、ＡＲ（３例）、ＫＡ（２例）、ＫＱ（２例）、ＫＬ（１例）、ＩＫ（１例）、ＮＫ（１例）、ＲＱ（１例）、ＲＤ（１例）、ＬＡ（１例）。
これらは１例を除いて、すべて塩基性アミノ酸側鎖を有するアミノ酸を少なくとも１個含む。
そこで、以下の置換変異体を作製し試験した:
３‐５７：IAKAYRKLA（配列番号６１）、活性
３‐５８：IKAAYRKLA（配列番号６２）、活性。
したがって、２位と３位のうち少なくとも一方のアミノ酸が塩基性アミノ酸ＫまたはＲであると結論づけられる。
（３）IKK YRKLA（配列番号５３）、活性
この結果は、この位置には何らかのアミノ酸が存在する方が良いが必須ではないことを示している。
この位置についてＪタンパク質メンバー（４７種類のＪタンパク質）間で比較したところ、以下の割合にも示されるように、この位置もよく保存されている：
Ａ（３６例）、Ｋ（２例）、Ｒ（２例）、Ｓ（２例）、Ｑ（２例）、Ｔ（１例）、Ｉ（１例）、Ｅ（１例）。
以下のポリペプチドを構築し試験した：
３‐５９：IKKRYRKLA（配列番号６３）；塩基性アミノ酸、高活性
３‐６０：IKKSYRKLA（配列番号６４）；極性無電荷アミノ酸、活性
３‐６１：IKKQYRKLA（配列番号６５）；極性無電荷アミノ酸、活性
３‐６２：IKKEYRKLA（配列番号６６）；酸性アミノ酸、活性
３‐６３：IKKFYRKLA（配列番号６７）；芳香族アミノ酸、活性
３‐６４：IKKCYRKLA（配列番号６８）；極性無電荷アミノ酸、活性。
以上の置換変異体から、４位を欠失させても活性は保持されるため、４位は２０種類の天然アミノ酸のいずれであってもよいことが結論づけられる。
（４）IKKA RKLA（配列番号３１２)；非活性
この結果は、５位のアミノ酸が必須であることを示す。
この部分をＪタンパク質メンバー（４７種類のタンパク質）間で比較したところ、アミノ酸の分布は以下のとおりであった：
Ｙ（３４例）、Ｆ（１０例）、Ｈ（２例）、Ｉ（１例）。
そこで、以下のポリペプチドを作製し試験した：
３‐６５：IKKAFRKLA（配列番号６９）：芳香族アミノ酸、高活性
３‐６６：IKKAHRKLA（配列番号３００）：正電荷アミノ酸、非活性
３‐６７：IKKAIRKLA（配列番号３０１）：非極性アミノ酸、非活性
３‐６８：IKKAWRKLA（配列番号７０）：芳香族 アミノ酸、高活性
３‐６９：IKKAARKLA（配列番号３０２）：非極性アミノ酸、非活性
３‐７０：IKKASRKLA（配列番号３０３）：非極性アミノ酸、非活性。
したがって、５位のアミノ酸は芳香族アミノ酸すなわちＹ、ＦまたはＷである。
（５）
IKKAY KLA（配列番号３１３）、活性
IKKAYR LA（配列番号３１４）、活性
この位置をＪタンパク質メンバー（４７種類のＪタンパク質）間で比較したところ、少なくとも一方のアミノ酸が塩基性アミノ酸である例は４７例中４３例であった（両方が塩基性アミノ酸である例は２３例、一方が塩基性アミノ酸である例は２０例）。
以下の変異ポリペプチドは６位と７位の２個のアミノ酸が置換されている：
３‐７１：IKKAYHQLA（配列番号３０４）、非活性
３‐７２：IKKAYYQLA（配列番号３０５）、非活性
３‐７３：IKKAYFSLA（配列番号３０６）、非活性。
したがって、６位と７位のアミノ酸のうち少なくとも一方は塩基性アミノ酸ＫまたはＲである。
（６）
IKKAYRK A（配列番号５６）、活性
IKKAYRKL （配列番号３１５）、活性
これらの位置についてＪタンパク質メンバー（４７種類のＪタンパク質メンバー）間で比較したところ、両方がＬおよびＡである例は４７例中２５例であり、そのすべての例でＬ‐Ａであった。これらの位置のアミノ酸のうち少なくとも一方がＬまたはＡである例は１４例、ＬでもＡでもない例は８例であった。
２個のアミノ酸を置換して以下の変異ポリペプチドを作製し、活性を試験した：
３‐７４：IKKAYRKQS（配列番号３０７）、非活性
３‐７５：IKKAYRKQC（配列番号３０８）、非活性
３‐７６：IKKAYRKDI（配列番号３０９）、非活性。
以下の変異ポリペプチドは、記載のとおり８位が置換されている：
３‐７７：IKKAYRKQA（配列番号７１）：極性アミノ酸、高活性
３‐７８：IKKAYRKMA（配列番号７２）：非極性アミノ酸、高活性
３‐７９：IKKAYRKIA（配列番号７３）：非極性アミノ酸、活性
３‐８０：IKKAYRKAA（配列番号７４）：非極性アミノ酸、活性
３‐８１：IKKAYRKVA（配列番号７５）：非極性アミノ酸、活性
３‐８２：IKKAYRKRA（配列番号７６）：塩基性アミノ酸、活性。
【０２９６】
以下の変異ポリペプチドは、記載のとおり９位が置換されている：
３‐８３：IKKAYRKLM（配列番号７７）：非極性アミノ酸、高活性
３‐８４：IKKAYRKLI（配列番号７８）：非極性アミノ酸、高活性
３‐８５：IKKAYRKLV（配列番号７９）：非極性アミノ酸、高活性
３‐８６：IKKAYRKLC（配列番号８０）：極性無電荷アミノ酸、活性
３‐８７：IKKAYRKLS（配列番号８１）：極性無電荷アミノ酸、高活性
３‐８８：IKKAYRKLY（配列番号８２）：芳香族アミノ酸、活性。
その他の変異ポリペプチドの結果は以下のとおりである：
３‐４２：IKKAYRKALQ（配列番号５１）：ＬとＡの置換、高活性
３‐４３：IKKAYRKLLQ（配列番号５２）：両方ともＬ、高活性
したがって、Ｘ８とＸ９のアミノ酸のうち少なくとも一方はＬまたはＡである。
【０２９７】
これらの試験から、単離されたタンパク質発現増強Ｊドメインアナログポリペプチドは以下の式を有することが結論づけられる：
Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｘ９（配列番号４７）：
（式中、Ｘ１はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であるか；Ｘ１〜Ｘ３が存在しＸ５〜Ｘ９が存在する場合、Ｘ４は存在しなくてもよく、
Ｘ５はチロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、またはフェニルアラニン（Ｆ）であり、Ｘ６およびＸ７はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であるか；Ｘ６およびＸ７のいずれか一方がＫまたはＲであり、Ｘ１〜Ｘ５が存在しＸ８およびＸ９が存在する場合、Ｘ６およびＸ７の他方は存在しなくてもよく、
Ｘ８およびＸ９は任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がロイシン（Ｌ）またはアラニン（Ａ）であるか；Ｘ８およびＸ９の一方がＬまたはＡでありＸ１〜Ｘ７が存在する場合、Ｘ８およびＸ９の他方は存在しなくてもよい）。
【０２９８】
上記の式は、その他のＪタンパク質に由来する以下のポリペプチド断片の配列にも当てはまり、これらのポリペプチドはすべて活性を有する：
３‐８９：IRKAYRKLSLTL（配列番号８３）Ｅｒｄｊ１、活性
３‐９０：IKKQYRLLSLKY（配列番号８４）Ｅｒｄｊ２、活性
３‐９１：IKKAFHKLAMKY（配列番号８５）Ｅｒｄｊ４、高活性
３‐９２：IRQAFKKLALKL（配列番号８６）Ｅｒｄｊ５、活性
３‐９３：IIKAYRKLALQW（配列番号８７）Ｅｒｄｊ６、活性
３‐９４：IARAYRQLARRY（配列番号８８）Ｅｒｄｊ７、高活性
３‐９５：IKRAYRRQALRY（配列番号８９）Ｈｓｐ４０、高活性
３‐９６：IKKSYRKLALKY（配列番号９０）ＣＳＰ、高活性
３‐９７：IKKAYKRLAMKY（配列番号９１）ＤｎａＪ、高活性
その他のＪタンパク質に由来する以下の配列は、上記の式とは一致せず、これらのポリペプチドはタンパク質発現増強活性を有していない：
３‐９８：MRKAYLKKC（配列番号３１０）SV40 Jタンパク質、非活性
３‐９９：ILAEFKVRAL（配列番号３１１）ＤｎａｊホモログサブファミリーＣメンバー１２、非活性。
【０２９９】
以上に要約した分析と結果から、上記の式がタンパク質発現増強活性をもたらす新規なポリペプチドのファミリーを定義することがわかる。
【０３００】
実施例１２．Ｊドメインの最小ポリペプチドによる改変配列での標的タンパク質発現増強
先に説明したとおり、Ｅｒｄｊ３のＪドメインの変異分析の結果は、Ｊドメイン内に含まれるポリペプチド配列３‐２９（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ；配列番号４８）が、非改変配列で上記の分析を用いた場合にポリペプチドが高いタンパク質発現増強活性をもたらすために最小限必要なＪドメインの配列であることを示した。３‐２９ポリペプチドのタンパク質発現増強活性を改変配列の場合についても試験した。
【０３０１】
この実験では、第１の融合タンパク質は目的の標的タンパク質としてのＩＬ１３Ｒα２ＴＦをＢＳＣ１ポリペプチド（配列番号４８）と連結させ、さらにＶ５エピトープタグと連結させたタンパク質である。この融合タンパク質を下の表に示すＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１とした。
表６０．Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１融合タンパク質のアミノ酸配列
【０３０２】
【表６０】
0006688237.tif 000073
第２の融合タンパク質は、目的の標的タンパク質としてのＩＬ１３Ｒα２ＴＦを、ＢＳＣ１ポリペプチドの変異型「ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１ＭＴ」と連結させたタンパク質である。下の表に示すように、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１ＭＴは、ＢＳＣ１ポリペプチドの２位と３位をＫ‐ＫからＡ‐Ｑに変異させたポリペプチドである。ＢＳＣ１ＭＴポリペプチドは３‐５５とした。
表６１．Ｖ５タグで標識したＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１ＭＴ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０３０３】
【表６１】
0006688237.tif 000074
ＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質（標的タンパク質のみ）、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１タンパク質、およびＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１ＭＴタンパク質の概略図を図２０Ａに示す。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ（対照）、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１、またはＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１ＭＴをコードする組換え遺伝子を含むベクターで細胞を形質移入し、上記のように別の培養液中で培養した。上記のように、各培養液から採取した培地を、抗Ｖ５抗体を用いた免疫ブロットによってタンパク質の存在について分析した。
【０３０４】
図２０Ｂに示すように、対照細胞の培養液から得た培地では比較的わずかな量のＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質が検出された。図２０Ｂのレーン２を参照のこと。対照的に、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１融合タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質移入した細胞の培地では有意に高いレベルのＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１融合タンパク質が検出された。図２０Ｂのレーン３を参照のこと。培地で検出されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１融合タンパク質の量は、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐ＢＳＣ１ＭＴ融合タンパク質をコードするベクターで形質移入した細胞の培地で検出されたタンパク質のレベルと比較しても有意に高かった。後者のタンパク質の発現レベルは、対照細胞で検出されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦタンパク質とほぼ同程度の低いレベルであった。図２０Ｂのレーン４を参照のこと。結果は、ＢＳＣ１ポリペプチド（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ；配列番号４８）が本発明の改変配列のタンパク質発現増強ポリペプチドとして有効であるが、同ポリペプチドに含まれるジペプチドＫ‐Ｋを変異させるとこの活性を損なう可能性があることを示している。
【０３０５】
実施例１３．ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質による非改変配列のＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現増強
上記のＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現を増強するためにＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を非改変配列で用いることができるかを決定するため、上記Ｅｒｄｊ３のＪドメインの最小ポリペプチド断片であるＢＳＣ１ポリペプチド（ＩＫＫＡＹＲＫＬＡ；配列番号４８）を用いて、下の表に示すＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を構成した。
表６２．Ｆｌａｇタグで標識したＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０３０６】
【表６２】
0006688237.tif 000075
ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質の存在下と非存在下で、ＨＥＫ２９３細胞内で発現させた。培養液を２日間培養し、培地を回収して遠心分離し、細胞片を除去した。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現は、標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を共発現する細胞の培地ではＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質の非存在下での標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に増強された（データは示さず）。
【０３０７】
培地で発現されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質がＩＬ１３結合活性を保持しているか確認するため、下記の結合分析を行った。いずれのタンパク質も発現しなかった細胞（対照）、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質のみを発現した細胞、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現した細胞の培養液から得た培地のサンプルに組換えヒトＩＬ１３を添加した。サンプルをＩＬ１３と共に２時間インキュベートした。このサンプルを用いてＩＬ１３検出分析を行った（ＲａｙＢｉｏ（登録商標）ヒトＩＬ１３ＥＬＩＳＡキット；ＥＬＨ‐ＩＬ１３‐００１）。この分析では、ヒトＩＬ１３がＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質に捕捉されるとヒトＩＬ１３の検出量が減少する。図２１Ｂに示すように、いずれのタンパク質も発現しない細胞の培養液から得た培地は、明らかにＩＬ１３に結合せず、このことは吸光度の高さからもわかる（図２１のレーン１）。ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質のみを発現する細胞の培養液から得た培地ではわずかにＩＬ１３と結合した（レーン２）が、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する細胞の培養液から得た培地には有意に高い量のＩＬ１３が結合した（レーン３）。結果は、ＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質がより高レベルで発現された培地により多くのヒトＩＬ１３が結合したことを明確に示している。したがって、より高レベルで培地に発現されたＩＬ１３Ｒα２ＴＦ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質はＩＬ１３結合活性を保持していた。
【０３０８】
実施例１４．ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質による非改変配列での第ＶＩＩ因子‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現増強
第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は外因性凝固経路のセリンエステラーゼであり、様々な出血性合併症の治療に広く利用されている。Hedner, Semin. Hematol., 43(suppl 1): S105-S107 (2006)を参照のこと。ＦＶＩＩと組織因子（tissue factor（ＴＦ））との複合体は
、リン脂質とカルシウムの存在下で第Ｘ因子と活性化させ第Ｘａ因子にする。
【０３０９】
ＢＳＣ１ポリペプチドを用いてＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質を構成し、この融合タンパク質が非改変配列でＦＶＩＩ‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質を増強するのに有効であるかを確認した。
【０３１０】
Ｖ５タグで標識したＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表６３．Ｖ５タグで標識したＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質のアミノ酸配列
【０３１１】
【表６３】
0006688237.tif 000076
Ｆｌａｇタグで標識したＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表６４．Ｆｌａｇタグで標識したＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質のアミノ酸配列
【０３１２】
【表６４】
0006688237.tif 000077
いずれのタンパク質も発現しない細胞、ＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質のみを発現する細胞、およびＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とを共発現する細胞の培地および細胞可溶化物でのＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルを、抗Ｆｌａｇ抗体を用いた免疫ブロット分析によって測定した。結果を図２２Ａに示す。図２２Ａの上図に示すように、培地に分泌されたＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルは、ＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とを共発現する細胞の培地（レーン２）では、ＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質を単独で発現する細胞の培地（レーン３）に比べて有意に高かった。図２２Ａの中央図は抗Ｆｌａｇ抗体を用いた細胞可溶化物の免疫ブロットである。免疫ブロットは、ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質が、ＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とを発現する細胞で発現されたことを示している。図２２Ａの下図に示すように、ＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質の培地へは有意な量のＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質は分泌されなかった（レーン３参照）。
【０３１３】
図２２Ｂは図２２Ａの上図の免疫ブロットに示す培地でのＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現に関するシグナルの濃度測定分析の棒グラフを示す。図２２Ｂの棒グラフ１〜３は、図２２Ａの上図の免疫ブロットのレーン１〜３のシグナルと対応している。
【０３１４】
結果は、ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とＦＶＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質とを共発現させることによって、培地に分泌された標的タンパク質の発現レベルが、ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質の非存在下での標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に増強されたことを示している。
【０３１５】
実施例１５．ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質による非改変配列での第ＩＸ因子‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現増強
第ＩＸ因子は血友病Ｂの治療に広く利用されており、そのＦｃ融合タンパク質（ＦＩＸ‐Ｆｃ）は現在、治験中であり（第ＩＩＩ相）、良好な結果が得られている（効果の持続）。
【０３１６】
この実験では、上記のＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質による、非改変配列でのＦＩＸ‐ＦＣ標的タンパク質の発現レベルに対する効果を決定する。
【０３１７】
Ｖ５タグで標識したＦＩＸ‐Ｆｃ標的タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表６５．Ｖ５タグで標識したＦＩＸ‐Ｆｃ標的タンパク質のアミノ酸配列
【０３１８】
【表６５】
0006688237.tif 000078
図２３Ａは、培地に分泌されたＦＩＸ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現を示し、ＦＩＸ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞の場合（レーン２）およびＦＩＸ‐Ｆｃ融合タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の場合（レーン３）を示す。図２３Ａのレーン１は、発現しない細胞の培地を対照として示す。図２３Ａのレーン２に示すように、ＦＩＸ‐Ｆｃ標的タンパク質を単独で発現する細胞によって少量のＦＩＸ‐Ｆｃ標的タンパク質が分泌されている。しかし、図２３Ａのレーン３に明らかに示されるように、ＦＩＸ‐Ｆｃ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを発現する細胞では培地に分泌された標的タンパク質の発現レベルは有意に増強されている。図２３Ｂは、図２３Ａの免疫ブロットにおけるシグナルの濃度測定分析の棒グラフを示す。図２３Ｂの棒グラフ１〜３は図２３Ａのレーン１〜３のシグナルと対応する。
【０３１９】
結果は、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とＦＩＸ‐Ｆｃ標的タンパク質とを共発現させることによって、培地に分泌された標的タンパク質の発現レベルが、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質がない場合のレベルと比較して有意に増強されたことを明確に示している。
【０３２０】
実施例１６．ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質による非改変配列での第ＶＩＩＩ因子‐Ｖ５‐Ｆｃ標的タンパク質の発現増強
第ＦＶＩＩＩ因子の生物学的重要性は、血友病Ａについて実証されている。血友病Ａは主に男性に起こる先天性の出血障害であり、Ｘ染色体関連性の第ＦＶＩＩＩ因子欠損が原因である。標準の治療には、止血に必要な欠けているＦＶＩＩＩの補充が含まれる。血友病Ａ患者の体内でのＦＶＩＩＩ活性の半減期を延長するＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ融合タンパク質が開発された（Powell et al., Blood, 119(13): 3031-3037 (2012)）。融合タンパク質
は２０１３年に米国食品医薬品局（United States Food and Drug Administration）に承認された（ＥＬＯＣＴＡＴＥ（商標）（Biogen Idec））。
【０３２１】
この実験では、上記のＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質による、非改変配列の場合の、Ｖ５タグで標識したＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルに対する効果を調べた。Ｖ５タグで標識したＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表６６−１〜表６６−４．Ｖ５タグで標識したＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質のアミノ酸配列
【０３２２】
【表６６−１】
0006688237.tif 000079
【０３２３】
【表６６−２】
0006688237.tif 000080
【０３２４】
【表６６−３】
0006688237.tif 000081
【０３２５】
【表６６−４】
0006688237.tif 000082
この実験では、ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質の存在下と非存在下でのＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルを調べた。いずれのタンパク質も発現しない細胞（ＨＥＫ２９３）の培養液から得た培地と、ＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質のみを発現する細胞の培養液から得た培地と、ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質とを共発現する細胞の培養液から得た培地を、市販の酵素結合免疫分析（ＥＬＩＳＡ）（Ｖｉｓｕｌｉｚｅ（商標）ＦＶＩＩＩ抗原キット（Affinity Biologics Inc.））によってＦＶＩＩＩについて分析した。４５０ｎｍでの吸光度の棒グラフ
として結果を図２４に示す。空のベクターで形質移入しタンパク質を発現しない細胞培地を陰性対照とした（図２４の左から１番目の棒グラフ）。ヒト血清を陽性対照として用いた（図２４の右側の左から４番目の棒グラフ）。結果は、ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質とＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質とを共発現させることによって、培地に分泌されたＦＶＩＩＩ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベル（図２４の左から３番目の棒グラフ）が、ＢＳＣ１‐タンパク質Ｇ融合タンパク質がない場合の標的タンパク質の発現レベル（図２４の左から２番目の棒グラフ）と比較して有意に増強されたことを示している。
【０３２６】
実施例１７．ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質による非改変配列での抗ＩＬ８抗体標的タンパク質の発現増強
この実験では、上記のＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を非改変配列で用いてＨＥＫ２９３形質移入細胞での抗ＩＬ８抗体標的タンパク質の発現レベルを改善できるかを調べた。
【０３２７】
培地での抗ＩＬ８抗体の発現を、抗ＩｇＧ抗体を用いた免疫ブロットによって測定した。図２５Ａの免疫ブロットに示すように、抗ＩＬ８抗体標的タンパク質をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させることによって、培地に分泌された抗体の発現レベル（図２５Ａの下部、第３列）が、抗体を単独で発現する細胞で発現された抗体のレベル（図２５Ａの中央、第２列）と比較して有意に増強された。図２５Ａの第１列は、いずれのタンパク質も発現しない対照細胞を含む疑似培養液から得た培地には抗体が分泌されなかったことを示す。
【０３２８】
図２５Ａの列に示すドットブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を図２５Ｂの各棒グラフに示す。図２５Ｂの棒グラフの
番号は図２５Ａの列番号と対応している。この一連の実験の結果は、抗ＩＬ８抗体標的タンパク質を、ＢＳＣ１ポリペプチドをタンパク質Ａ（標的タンパク質結合ドメイン）と連結させた本発明の融合タンパク質と共発現させることによって、分泌された抗ＩＬ８抗体の発現が有意に増強されたことを明確に示している。
【０３２９】
図２５Ｃは、ＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。精製した組換えヒトＩＬ８を９６穴プレートに塗布し、以下の培地に分泌された抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）を加えてインキュベートした：抗ＩＬ８抗体を単独で発現する形質移入細胞の培地（レーン２）；および抗ＩＬ８抗体標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する細胞の培地（レーン３、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ）。疑似培養液には、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた（レーン１、抗ＩＬ８抗体なし）。結果は、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現された場合により高レベルで発現され分泌された抗ＩＬ８抗体がヒトＩＬ８結合活性を保持していたことを明確に示している。
【０３３０】
実施例１８．ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質による非改変配列での治療用抗ＶＥＧＦ抗体（ベバシズマブ）標的タンパク質の発現増強
この実験では、上記のＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を非改変配列で用いて治療用抗体の発現レベルを改善できるかを調べた。
【０３３１】
ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）は、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ‐Ａ）を阻害することによって血管新生を阻害するヒト化モノクローナル抗体である。２０１０年のベバシズマブの売上高は７０億ドル近く、他のどの抗体医薬をも上回った。ベバシズマブを標準の治療に加えることによって、乳がん患者および肺がん患者の寿命を数か月延長することができ、米国での現在の費用は年間約１００，０００ドルである。
【０３３２】
ベバシズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を下の表に示す。
表６７．ベバシズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列
【０３３３】
【表６７】
0006688237.tif 000083
抗ＶＥＧＦ抗体ベバシズマブ（標的タンパク質）をヒト細胞内で、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質の存在下と非存在下で発現させた。疑似培養液には、いずれのタンパク質も発現しない細胞を入れた。細胞培養液から採取した培地のサンプルを、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた免疫ブロット分析で抗体について分析した。
【０３３４】
図２６Ａは、培地に分泌されたベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）の発現に関するドットブロット分析を示し、ベバシズマブを単独で発現する形質移入細胞の場合（中央列）およびベバシズマブとＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の場合（下列）を示す。図２６Ａの上列は、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない対照細胞を含む疑似培養液の培地には抗体が分泌されなかったことを示している。結果は、ベバシズマブ標的タンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを形質移入細胞内で共発現させることによって、培地に分泌されたベバシズマブの発現レベルが、ベバシズマブを単独で発現する細胞の培養液の培地に分泌された抗体のレベルと比較して有意に増強されたことを示している。
【０３３５】
図２６Ｂは、図２６Ａの各列のドットブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図２６Ｂの棒グラフの番号は図２６Ａの列番号と対応している。この一連の実験の結果は、抗ＶＥＧＦ抗体標的タンパク質をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させることによって、培地に分泌された抗ＶＥＧＦ抗体の発現レベルが有意に増強されたことを明確に示している。
【０３３６】
図２６Ｃは、培地での抗ＶＥＧＦ結合活性をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す。精製した組換えヒトＶＥＧＦ‐Ａを９６穴プレートに塗布し、以下の培地に分泌されたベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体標的タンパク質）を加えてインキュベートした：抗ＶＥＧＦ抗体
を単独で発現する形質移入細胞の培地（棒グラフ２）；または抗ＶＥＧＦ抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地（棒グラフ３）。図２６Ｃの棒グラフ１は、いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた疑似培養液の培地には有意なＶＥＧＦ結合活性がなかったことを示している。結果は、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合により高レベルで発現され分泌された抗ＶＥＧＦ抗体がヒトＶＥＧＦ‐Ａ結合活性を保持することを明確に示している。
【０３３７】
実施例１９．ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質による非改変配列での治療用抗ＴＮＦα抗体（アダリムマブ）標的タンパク質の発現増強
この実験では、上記のＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を非改変配列で用いて治療用ＴＮＦα抗体（アダリムマブ；Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、ＡｂｂＶｉｅ）の発現レベルを改善できるかを調べた。
表６８．アダリムマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列
【０３３８】
【表６８】
0006688237.tif 000084
図２７Ａは、培地に分泌された抗ＴＮＦα抗体（標的タンパク質）の発現に関するドットブロット分析を示し、ＴＮＦα抗体を単独で発現する形質移入細胞の場合（中央列）および抗ＴＮＦα抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の場合（図２７Ａの下列）を示す。いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターで形質移入した細胞を含む疑似培養液の培地では抗ＴＮＦα抗体は検出されなかった（図２７Ａの上列）。培地での抗ＴＮＦα抗体の発現について、抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたドットブロット分析で分析した。形質移入細胞内で抗ＴＮＦα抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた（最下列）ことによって、培地に分泌された抗ＴＮＦα抗体の発現レベルが、抗ＴＮＦα抗体を単独で発現する形質移入細
胞で発現された抗体のレベル（中央列）と比較して有意に増強されたことがわかる。
【０３３９】
図２７Ｂは、図２７Ａの各列のドットブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図２７Ｂの棒グラフの番号は図２７Ａの列番号と対応している。この一連の実験の結果は、抗ＴＮＦα抗体標的タンパク質を、ＢＳＣ１ポリペプチドを標的結合ドメイン（タンパク質Ａ）と連結させた融合タンパク質と共発現させることによって、分泌された抗ＴＮＦα抗体の発現レベルが有意に増強されたことを明確に示している。
【０３４０】
図２７Ｃは、発現された抗ＴＮＦα抗体のＴＮＦα結合活性をＥＬＩＳＡ法で検出した結果を示す。精製した組換えヒトＴＮＦαを９６穴プレートに塗布し、以下の培地に分泌された抗ＴＮＦα抗体（標的タンパク質）を加えてインキュベートした：抗ＴＮＦα抗体を単独で発現する形質移入細胞の培地（棒グラフ２）；または抗ＴＮＦα抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の培地（棒グラフ３）。いずれのタンパク質を発現するための構造遺伝子も含まない発現ベクターを用いて形質移入した細胞を入れた疑似培養液の培地では、ＴＮＦα結合活性は検出されなかった（棒グラフ１）。この一連の実験の結果は、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現させた場合により高レベルで発現され分泌された抗ＴＮＦα抗体がヒトＴＮＦα結合活性を保持していたことを明確に示している。
【０３４１】
実施例２０．ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を非改変配列で用いた場合のＣＨＯ‐Ｄ１２細胞株で確立されている抗ＩＬ８抗体の発現に対する増強
この実験では、上記の実施例８と同様の設計で、商業価値のある確立されたＣＨＯ‐ＤＰ１２細胞株(American Type Culture Collection受託番号ＣＲＬ‐１２４４４４、American Type Culture Collection（バージニア州、マナナス）)で既に安定に産生されている抗ＩＬ８抗体の発現レベルを、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質によって増強することができるかを調べた。
【０３４２】
図２８Ａは、培地に分泌された抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）の発現に関する免疫ドットブロット分析を示し、抗ＩＬ８抗体を単独で発現するＣＨＯ‐ＤＰ１２細胞株の細胞の場合（中央列２）、および抗ＩＬ８抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する形質移入細胞の場合（最下列３）を示す。抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合分子と共発現させたことによって、培地に分泌された抗体の発現のレベル（最下列３）が、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合分子の非存在下で発現された抗体のレベル（列２）と比較して有意に増強されたことがわかる。培地のみでは抗体は検出されなかった（図２８Ａの上列１）。
【０３４３】
図２８Ｂは、図２８Ａの各列のドットブロットの化学発光シグナルをNIH ImageJ画像処理プログラムを用いて濃度測定分析した結果を示す。図２８Ｂの各棒グラフの番号は、図２８Ａの各列の番号と一致している。結果は、抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合分子と共発現させた結果（棒グラフ３）、分泌された抗体の発現が有意に増強され、抗体をＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合分子の非存在下で発現させた場合に得られた発現レベル（棒グラフ２）の約４〜５倍に発現レベルが増強されたことを示している。
【０３４４】
図２８Ｃは、ＩＬ８結合性をＥＬＩＳＡ法で分析した結果を示す。精製した組換えヒトＩＬ８を９６穴プレートに塗布し、以下の培地に分泌された抗ＩＬ８抗体（標的タンパク質）を加えてインキュベートした：安定に抗ＩＬ８抗体を単独で発現する細胞の培地（棒グラフ２）；または抗ＩＬ８抗体とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質とを共発現する細胞の培地（棒グラフ３）。細胞培地を陰性対照として用いた（棒グラフ１、抗ＩＬ８抗体なし）。この一連の実験の結果は、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質と共発現
させた場合により高レベルで発現され分泌された抗ＩＬ８抗体がＩＬ８結合活性を保持していたことを明確に示している。
【０３４５】
結果は、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を非改変配列で用いることによって、商業価値のある確立された産生細胞株で既に安定に発現されている標的タンパク質の産生レベルを有意に増強することができることを示している。
【０３４６】
実施例２１．分泌されるα１アンチトリプシンＺタンパク質の発現増強
この実験は、本発明によるタンパク質発現の増強が、重要なタンパク質の立体構造が不適切であるために起こる疾患を治療するのに有効であることを示す。
【０３４７】
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症は、男女とも罹患する常染色体遺伝疾患である。ＡＡＴは主に肝臓で産生される５２ｋＤａのセリンプロテアーゼ阻害因子である。ＡＡＴ欠損症に関連するプロテアーゼ阻害因子１（ＰＩ）遺伝子の染色体１４について９０種以上の遺伝子変異体が同定されている。ＡＡＴ欠損症の理由として最も一般的なものはＺ変異体であり、１つの塩基対が置換され、コドン３４２のＧｌｕをＬｙｓに変える（Ｇｌｕ３４２Ｌｙｓ）。Ｚ変異を有する変異型ＡＡＴタンパク質（ＡＡＴＺタンパク質）のセリンプロテアーゼ活性は野生型ＡＡＴタンパク質の約８０％である。また、ＡＡＴＺタンパク質は折り畳みによる正常な立体構造を確立することができないため、小胞体（ＥＲ）内で蓄積し凝集体となる。凝集したＡＡＴＺが肝細胞に蓄積すると、肝毒性や肝硬変を引き起こす。
【０３４８】
この実験では、標的タンパク質は改変ＡＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質とＶ５タグで標識した改変α１ＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質とした。ＡＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、上記の実施例４．３に記載のものと同様である。ＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を下の表に示す。
表６９．Ｖ５タグで標識したα１ＡＡＴＺ‐Ｆｃ標的タンパク質のアミノ酸配列
【０３４９】
【表６９】
0006688237.tif 000085
図２９Ａは、Ｖ５タグで標識したＡＡＴ‐Ｆｃ融合タンパク質とＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質の発現を検出するために行った抗Ｖ５抗体を用いたウェスタンブロット分析における化学シグナルの画像を示す。図２９Ａの上図のレーン１は、発現のない細胞培地を対照として示す。上図のレーン２は、ＡＡＴ‐Ｆｃを単独で発現する細胞の培地を示す。野生型ＡＡＴタンパク質について予測されるように、ＡＡＴ‐Ｆｃ融合物が培地に分泌された。図２９Ａの上図のレーン３は、ＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質を単独で発現する形質移入細胞の培養液の培地には、ＡＡＴＺ‐Ｆｃタンパク質が分泌された場合でもほとんど分泌されなかったことを示している。小胞体に留まることが知られているＡＡＴＺタンパク質について予測されるように、ＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質はＡＡＴＺ‐Ｆｃタンパク質を単独で発現する細胞の細胞可溶化物で検出された。中央図のレーン３を参照のこと（細胞可溶化物）。意外にも、図２９Ａの上図のレーン４に示すように、ＡＡＴＺ‐Ｆｃタンパク質とＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を共発現させた結果、培地に分泌されたＡＡＴＺ‐Ｆｃタンパク質の発現レベルが著しく増加した。さらに、細胞可溶化物では、ＡＡＴＺ‐Ｆｃ融合タンパク質が検出されたとしてもほとんど見られなかった（図２９Ａの中央図、レーン４）。抗チューブリン抗体を用いて同じ膜にブロッティングし、負荷対照とした。
【０３５０】
結果は、ＢＳＣ１‐タンパク質Ａ融合タンパク質を共発現させることによって、培地に分泌されたＡＡＴＺ‐Ｆｃ標的タンパク質の発現レベルが、ＢＳＣ１‐Ｆｃタンパク質Ａ融合タンパク質の非存在下での標的タンパク質の発現レベルと比較して有意に増強されたことを明確に示している。さらに、細胞可溶化物では検出されたとしてもほとんどＡＡＴＺ‐Ｆｃタンパク質が見られず、このことはＡＡＴＺ‐Ｆｃタンパク質が小胞体に留まっていなかったことを示す。したがって、これらのデータから、ＡＡＴＺ結合ドメインと本発明のタンパク質発現増強ポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する遺伝子治療が、個体の細胞から分泌されたＡＡＴＺタンパク質の発現を増強し、ＡＡＴＺが小胞体に留まることによる肝毒性を除去または低減し、必要なレベルの細胞外ＡＡＴセリンプロテアーゼ活性を個体に回復させることによってＺ変異に起因するＡＡＴ欠損症の個体を治療するのに有効であることが初めて示唆される。
【０３５１】
以上の本文に引用したすべての特許、出願、および公報の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０３５２】
本発明の開示または以下の特許請求の範囲から逸脱しない範囲で、本明細書に記載した
本発明のその他の変更および態様が当業者に明らかである。
以下に、出願時の特許請求の範囲の記載を示す。
［請求項１］
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される、単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド：
（ａ）Ｊタンパク質から単離されたＪドメイン；
（ｂ）Ｊドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片；
（ｃ）Ｊドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドアナログであって、Ｊドメインポリペプチドアナログは式Ｉのアミノ酸配列を含む、タンパク質発現増強ポリペプチドアナログ：
（Ｉ）Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｘ９（配列番号４７）：
（式中、Ｘ１はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がＫまたはＲであり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であるか；Ｘ１〜Ｘ３が存在しＸ５〜Ｘ９が存在する場合、Ｘ４は存在しなくてもよく、
Ｘ５はチロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、またはフェニルアラニン（Ｆ）であり、
Ｘ６およびＸ７はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であるか；Ｘ６およびＸ７のいずれか一方がＫまたはＲであり、Ｘ１〜Ｘ５が存在しＸ８およびＸ９が存在する場合、Ｘ６およびＸ７の他方は存在しなくてもよく、
Ｘ８およびＸ９は任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がロイシン（Ｌ）またはアラニン（Ａ）であるか；Ｘ８およびＸ９の一方がＬまたはＡでありＸ１〜Ｘ７が存在する場合、Ｘ８およびＸ９の他方は存在しなくてもよい）；および
（ｄ）以下からなるデカペプチド群から選択される単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド：
ＩＫＫＡＹＫＬＡＬＱ（配列番号４９）、
ＩＫＫＡＹＲＬＡＬＱ（配列番号５０）、
ＩＫＫＡＹＲＫＡＬＱ（配列番号５１）、または
ＩＫＫＡＹＲＫＬＬＱ（配列番号５２）。
［請求項２］
タンパク質発現増強ポリペプチドがＪタンパク質から単離されたＪドメインである、請求項１に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
［請求項３］
単離されたＪドメインが、ＥＲｄｊタンパク質、ＳＶ４０ラージＴ抗原、または哺乳類のシステインストリングタンパク質α（ＣＳＰ‐α）から単離されたＪドメインである、請求項２に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
［請求項４］
単離されたＪドメインが、Ｅｒｄｊ１、Ｅｒｄｊ２、Ｅｒｄｊ３、Ｅｒｄｊ４、Ｅｒｄｊ５、Ｅｒｄｊ６、Ｅｒｄｊ７から選択されるＥｒｄｊタンパク質から単離されたＪドメインである、請求項３に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
［請求項５］
単離されたＪドメインがＥｒｄｊ３から単離されたＪドメインである、請求項４に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
［請求項６］
タンパク質発現増強ポリペプチドがＪドメインから単離されたポリペプチド断片である、請求項１に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
［請求項７］
タンパク質発現増強ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、Ｊドメインから単離されたポリペプチド断片である、請求項６に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド：
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ（配列番号４８）、
Ｉ‐Ｒ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｔ‐Ｌ（配列番号８３）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｑ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｌ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号８４）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｆ‐Ｈ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｍ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号８５）、
Ｉ‐Ｒ‐Ｑ‐Ａ‐Ｆ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｌ（配列番号８６）、
Ｉ‐Ｉ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｑ‐Ｗ（配列番号８７）、
Ｉ‐Ａ‐Ｒ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｑ‐Ｌ‐Ａ‐Ｒ‐Ｒ‐Ｙ（配列番号８８）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｒ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｒ‐Ｑ‐Ａ‐Ｌ‐Ｒ‐Ｙ（配列番号８９）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｓ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号９０）および
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｋ‐Ｒ‐Ｌ‐Ａ‐Ｍ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号９１）。
［請求項８］
タンパク質発現増強ポリペプチドがＪドメインアナログポリペプチドであり、該ポリペプチドアナログが式Ｉのアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
［請求項９］
Ｘ１がＩ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＭであり、
ジペプチドＸ２‐Ｘ３がＫＲ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＲ、ＡＫ、ＡＲ、ＫＡ、ＩＫ、ＮＫ、ＫＱ、ＲＱ、ＲＤからなる群から選択され、
Ｘ４がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、またはＩであり、
Ｘ５がＹまたはＦであり、
ジペプチドＸ６‐Ｘ７がＫＲ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＲ、ＲＱ、ＦＲ、ＲＬ、ＫＬ、ＨＫ、ＬＫ、ＱＫ、ＫＶからなる群から選択され、
ジペプチドＸ８‐Ｘ９がＬＡ、ＬＬ、ＡＬ、ＡＡ、ＬＣ、ＬＶ、ＱＡ、ＫＡ、ＬＳ、ＬＩ、ＬＹ、およびＲＡからなる群から選択される、
請求項８に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド。
［請求項１０］
タンパク質発現増強ポリペプチドが以下のアミノ酸配列の１つを含む、請求項１に記載のタンパク質発現増強ポリペプチド：
【表７０】
0006688237.tif 000086
。
［請求項１１］
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
［請求項１２］
請求項１１に記載の単離された核酸分子を含む核酸ベクター分子。
［請求項１３］
請求項１２に記載の核酸ベクター分子を含む宿主細胞。
［請求項１４］
単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質であって、
単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドは以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される、前記融合タンパク質：
（ａ）Ｊタンパク質から単離されたＪドメイン；
（ｂ）Ｊドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片；
（ｃ）Ｊドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドアナログであって、Ｊドメインアナログポリペプチドは式Ｉのアミノ酸配列を含む、タンパク質発現増強ポリペプチドアナログ：
（Ｉ）Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｘ９（配列番号４７）：
（式中、Ｘ１はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がＫまたはＲであり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であるか；Ｘ１〜Ｘ３が存在しＸ５〜Ｘ９が存在する場合、Ｘ４は存在しなくてもよく、
Ｘ５はチロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、またはフェニルアラニン（Ｆ）であり、
Ｘ６およびＸ７はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であるか；Ｘ６およびＸ７のいずれか一方がＫまたはＲであり、Ｘ１〜Ｘ５が存在しＸ８およびＸ９が存在する場合、Ｘ６およびＸ７の他方は存在しなくてもよく、
Ｘ８およびＸ９は任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がロイシン（Ｌ）またはアラニン（Ａ）であるか；Ｘ８およびＸ９の一方がＬまたはＡでありＸ１〜Ｘ７が存在する場合、Ｘ８およびＸ９の他方は存在しなくてもよい）；および
（ｄ）以下からなるデカペプチド群から選択される単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド：
ＩＫＫＡＹＫＬＡＬＱ（配列番号４９）、
ＩＫＫＡＹＲＬＡＬＱ（配列番号５０）、
ＩＫＫＡＹＲＫＡＬＱ（配列番号５１）、または
ＩＫＫＡＹＲＫＬＬＱ（配列番号５２）。
［請求項１５］
タンパク質発現増強ポリペプチドが単離されたＪドメインである、請求項１４に記載の融合タンパク質。
［請求項１６］
単離されたＪドメインが、ＥＲｄｊタンパク質、ＳＶ４０ラージＴ抗原、または哺乳類のシステインストリングタンパク質α（ＣＳＰ‐α）から単離されたＪドメインである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
［請求項１７］
単離されたＪドメインが、Ｅｒｄｊ１、Ｅｒｄｊ２、Ｅｒｄｊ３、Ｅｒｄｊ４、Ｅｒｄｊ５、Ｅｒｄｊ６、Ｅｒｄｊ７から選択されるＥｒｄｊタンパク質から単離されたＪドメインである、請求項１６に記載の融合タンパク質。
［請求項１８］
単離されたＪドメインがＥｒｄｊ３から単離されたＪドメインである、請求項１７に記載の融合タンパク質。
［請求項１９］
タンパク質発現増強ポリペプチドがＪドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
［請求項２０］
タンパク質発現増強ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、Ｊドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片である、請求項１９に記載の融合タンパク質：
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ（配列番号４８）、
Ｉ‐Ｒ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｔ‐Ｌ（配列番号８３）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｑ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｌ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号８４）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｆ‐Ｈ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｍ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号８５）、
Ｉ‐Ｒ‐Ｑ‐Ａ‐Ｆ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｌ（配列番号８６）、
Ｉ‐Ｉ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｑ‐Ｗ（配列番号８７）、
Ｉ‐Ａ‐Ｒ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｑ‐Ｌ‐Ａ‐Ｒ‐Ｒ‐Ｙ（配列番号８８）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｒ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｒ‐Ｑ‐Ａ‐Ｌ‐Ｒ‐Ｙ（配列番号８９）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｓ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号９０）および
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｋ‐Ｒ‐Ｌ‐Ａ‐Ｍ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号９１）。
［請求項２１］
タンパク質発現増強ポリペプチドがＪドメインアナログポリペプチドであり、ポリペプチドアナログが式Ｉのアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の融合タンパク質。
［請求項２２］
Ｘ１がＩ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＭであり、
ジペプチドＸ２‐Ｘ３がＫＲ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＲ、ＡＫ、ＡＲ、ＫＡ、ＩＫ、ＮＫ、ＫＱ、ＲＱ、ＲＤからなる群から選択され、
Ｘ４がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、またはＩであり、
Ｘ５がＹまたはＦであり、
ジペプチドＸ６‐Ｘ７がＫＲ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＲ、ＲＱ、ＦＲ、ＲＬ、ＫＬ、ＨＫ、ＬＫ、ＱＫ、ＫＶからなる群から選択され、
ジペプチドＸ８‐Ｘ９がＬＡ、ＬＬ、ＡＬ、ＡＡ、ＬＣ、ＬＶ、ＱＡ、ＫＡ、ＬＳ、ＬＩ、ＬＹ、およびＲＡからなる群から選択される、
請求項２１に記載の融合タンパク質。
［請求項２３］
タンパク質発現増強ポリペプチドが以下のアミノ酸配列の１つを含む、請求項１４に記載の融合タンパク質：
【表７１】
0006688237.tif 000087
。
［請求項２４］
請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
［請求項２５］
請求項２４に記載の単離された核酸分子を含む核酸ベクター分子。
［請求項２６］
請求項２５に記載の核酸ベクター分子を含む宿主細胞。
［請求項２７］
タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質を発現させる方法であって、請求項２６に記載の宿主細胞を融合タンパク質を発現させるために十分な条件下で培養することを含む、前記方法。
［請求項２８］
タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質を発現させる方法であって、請求項１４に記載の融合タンパク質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に形質移入することと、形質移入された宿主細胞を融合タンパク質の発現を生じる条件下で培養することとを含む、前記方法。
［請求項２９］
タンパク質発現増強ポリペプチドを目的の標的タンパク質と連結させた融合タンパク質を発現させる方法であって、下記工程を含む前記方法：
１）請求項１４に記載の融合タンパク質をコードする組換え遺伝子配列を構築する工程、
２）組換え遺伝子配列を発現ベクターに挿入し、組換え遺伝子配列が転写プロモーター配列と作動可能に連結された組換え発現ベクターを作製する工程、
３）プロモーター配列と適合する宿主細胞に組換え発現ベクターを形質移入する工程、および
４）形質移入宿主細胞を、融合タンパク質の発現が可能な条件下で培養する工程。
［請求項３０］
タンパク質機能を提供する天然の分泌タンパク質の分泌が不足している哺乳類患者細胞にタンパク質機能を回復させる方法であって、請求項１に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドを分泌タンパク質と連結させた融合タンパク質をコードする外因性の核酸分子を患者の細胞に挿入することを含み、融合タンパク質が発現されることによって、外因性核酸の非存在下では患者細胞内での分泌が不足している天然の分泌タンパク質の機能が提供される、前記方法。
［請求項３１］
患者が、患者体内での天然の分泌タンパク質の分泌不足に関連した疾患を有する、請求項３０に記載の方法。
［請求項３２］
疾患が、プリオン関連疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症（ＣＦ）、α１アンチトリプシン欠損症からなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
［請求項３３］
患者が、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質の分泌が不足したヒト患者であり、疾患が嚢胞性線維症である、請求項３２に記載の方法。
［請求項３４］
単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドを標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質であって、
単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドは以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される、前記融合タンパク質：
（ａ）Ｊタンパク質から単離されたＪドメイン；
（ｂ）Ｊドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片；
（ｃ）Ｊドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチドアナログであって、Ｊドメインアナログポリペプチドは式Ｉのアミノ酸配列を含む、前記タンパク質発現増強ポリペプチドアナログ：
（Ｉ）Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５‐Ｘ６‐Ｘ７‐Ｘ８‐Ｘ９（配列番号４７）：
（式中、Ｘ１はイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、またはメチオニン（Ｍ）であり、
Ｘ２およびＸ３はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がＫまたはＲであり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であるか；Ｘ１〜Ｘ３が存在しＸ５〜Ｘ９が存在する場合、Ｘ４は存在しなくてもよく、
Ｘ５はチロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、またはフェニルアラニン（Ｆ）であり、
Ｘ６およびＸ７はそれぞれ独立して任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）であるか；Ｘ６およびＸ７のいずれか一方がＫまたはＲであり、Ｘ１〜Ｘ５が存在しＸ８およびＸ９が存在する場合、Ｘ６およびＸ７の他方は存在しなくてもよく、
Ｘ８およびＸ９は任意のアミノ酸であり、ただし一方または両方がロイシン（Ｌ）またはアラニン（Ａ）であるか；Ｘ８およびＸ９の一方がＬまたはＡでありＸ１〜Ｘ７が存在する場合、Ｘ８およびＸ９の他方は存在しなくてもよい）；および
（ｄ）以下からなるデカペプチド群から選択される単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド：
ＩＫＫＡＹＫＬＡＬＱ（配列番号４９）、
ＩＫＫＡＹＲＬＡＬＱ（配列番号５０）、
ＩＫＫＡＹＲＫＡＬＱ（配列番号５１）、または
ＩＫＫＡＹＲＫＬＬＱ（配列番号５２）。
［請求項３５］
タンパク質発現増強ポリペプチドが単離されたＪタンパク質である、請求項３４に記載の融合タンパク質。
［請求項３６］
単離されたＪドメインが、ＥＲｄｊタンパク質、ＳＶ４０ラージＴ抗原、または哺乳類のシステインストリングタンパク質α（ＣＳＰ‐α）から単離されたＪドメインである、請求項３５に記載の融合タンパク質。
［請求項３７］
単離されたＪドメインが、Ｅｒｄｊ１、Ｅｒｄｊ２、Ｅｒｄｊ３、Ｅｒｄｊ４、Ｅｒｄｊ５、Ｅｒｄｊ６、Ｅｒｄｊ７から選択されるＥｒｄｊタンパク質から単離されたＪドメインである、請求項３５に記載の融合タンパク質。
［請求項３８］
単離されたＪドメインがＥｒｄｊ３から単離されたＪドメインである、請求項３７に記載の融合タンパク質。
［請求項３９］
タンパク質発現増強ポリペプチドがＪドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片である、請求項３４に記載の融合タンパク質。
［請求項４０］
タンパク質発現増強ポリペプチドが、以下からなる群から選択される、Ｊドメインから単離されたタンパク質発現増強ポリペプチド断片である、請求項３９に記載の融合タンパク質：
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ（配列番号４８）、
Ｉ‐Ｒ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｔ‐Ｌ（配列番号８３）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｑ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｌ‐Ｌ‐Ｓ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号８４）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｆ‐Ｈ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｍ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号８５）、
Ｉ‐Ｒ‐Ｑ‐Ａ‐Ｆ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｌ（配列番号８６）、
Ｉ‐Ｉ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｑ‐Ｗ（配列番号８７）、
Ｉ‐Ａ‐Ｒ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｑ‐Ｌ‐Ａ‐Ｒ‐Ｒ‐Ｙ（配列番号８８）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｒ‐Ａ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｒ‐Ｑ‐Ａ‐Ｌ‐Ｒ‐Ｙ（配列番号８９）、
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ｓ‐Ｙ‐Ｒ‐Ｋ‐Ｌ‐Ａ‐Ｌ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号９０）および
Ｉ‐Ｋ‐Ｋ‐Ａ‐Ｙ‐Ｋ‐Ｒ‐Ｌ‐Ａ‐Ｍ‐Ｋ‐Ｙ（配列番号９１）。
［請求項４１］
タンパク質発現増強ポリペプチドがＪドメインアナログポリペプチドであり、Ｊドメインアナログポリペプチドが式Ｉのアミノ酸配列を有する、請求項３４に記載の融合タンパク質。
［請求項４２］
Ｘ１がＩ、Ｌ、Ｖ、ＡまたはＭであり、
ジペプチドＸ２‐Ｘ３がＫＲ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＲ、ＡＫ、ＡＲ、ＫＡ、ＩＫ、ＮＫ、ＫＱ、ＲＱ、ＲＤからなる群から選択され、
Ｘ４がＡ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｓ、Ｑ、Ｅ、Ｆ、Ｃ、またはＩであり、
Ｘ５がＹまたはＦであり、
ジペプチドＸ６‐Ｘ７がＫＲ、ＫＫ、ＲＫ、ＲＲ、ＲＱ、ＦＲ、ＲＬ、ＫＬ、ＨＫ、ＬＫ、ＱＫ、ＫＶからなる群から選択され、
ジペプチドＸ８‐Ｘ９がＬＡ、ＬＬ、ＡＬ、ＡＡ、ＬＣ、ＬＶ、ＱＡ、ＫＡ、ＬＳ、ＬＩ、ＬＹ、およびＲＡからなる群から選択される、
請求項４１に記載の融合タンパク質。
［請求項４３］
タンパク質発現増強ポリペプチドが以下のアミノ酸配列の１つを含む、請求項３４に記載の融合タンパク質：
【表７２】
0006688237.tif 000088
。
［請求項４４］
標的タンパク質結合ドメインが抗体またはその抗原結合断片、抗体結合タンパク質、受容体タンパク質のリガンド結合ドメイン、受容体タンパク質のタンパク質リガンド、抗体またはその抗原結合断片が結合するタンパク質抗原、またはＰＤＺドメインである、請求項３４に記載の融合タンパク質。
［請求項４５］
標的タンパク質結合ドメインが抗体結合タンパク質である、請求項４４に記載の融合タンパク質。
［請求項４６］
抗体結合タンパク質がＦｃ結合タンパク質である、請求項４５に記載の融合タンパク質。
［請求項４７］
Ｆｃ結合タンパク質がタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇである、請求項４６に記載の融合タンパク質。
［請求項４８］
抗体結合タンパク質がタンパク質Ｌである、請求項４５に記載の融合タンパク質。
［請求項４９］
標的タンパク質結合ドメインが受容体タンパク質のリガンド結合ドメインであり、該受容体タンパク質がサイトカイン受容体である、請求項４３に記載の融合タンパク質。
［請求項５０］
標的タンパク質結合ドメインが受容体タンパク質に対するタンパク質リガンドであり、タンパク質リガンドがサイトカインである、請求項４４に記載の融合タンパク質。
［請求項５１］
請求項３４〜５０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
［請求項５２］
請求項５１に記載の単離された核酸分子を含む核酸ベクター分子。
［請求項５３］
請求項５２に記載の核酸ベクター分子を含む宿主細胞。
［請求項５４］
融合タンパク質を発現させる方法であって、請求項５３に記載の宿主細胞を融合タンパク質を発現させるために十分な条件下で培養することを含む、前記方法。
［請求項５５］
宿主細胞が発現する目的の標的タンパク質の発現を増強する方法であって、タンパク質発現増強ポリペプチドを標的タンパク質結合ドメインと連結させた請求項３４に記載の融合タンパク質をコードする構造遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に形質移入することと、形質移入宿主細胞を、構造遺伝子にコードされる融合タンパク質と目的の標的タンパク質との共発現を生じる条件下で培養することとを含む、前記方法。
［請求項５６］
目的の標的タンパク質の発現を増強する方法であって、下記工程を含む前記方法：
１）請求項１に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドを、目的の標的タンパクに結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質をコードする組換え遺伝子配列を構築する工程、
２）組換え遺伝子配列を発現ベクターに挿入し、組換え遺伝子配列が転写プロモーター配列と作動可能に連結された組換え発現ベクターを作製する工程、
３）プロモーター配列と適合する宿主細胞に組換え発現ベクターを形質移入する工程、および
４）形質移入宿主細胞を、融合タンパク質の発現が可能な条件下で培養する工程。
［請求項５７］
分泌タンパク質機能を提供する天然の分泌タンパク質の分泌が不足している哺乳類患者細胞に分泌タンパク質機能を回復させる方法であって、請求項１に記載のタンパク質発現増強ポリペプチドを天然分泌タンパク質と結合する標的タンパク質結合ドメインと連結させた融合タンパク質をコードする、外因性の核酸分子を患者の細胞に挿入することを含み、融合タンパク質と天然分泌タンパク質が細胞内で発現されることによって、天然タンパク質の分泌が増強され、タンパク質機能が患者の細胞に与えられる、前記方法。
［請求項５８］
患者が、患者体内での天然の分泌タンパク質の分泌不足に関連した疾患を有する、請求項５７に記載の方法。
［請求項５９］
疾患が、プリオン関連疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、嚢胞性線維症（ＣＦ）、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠損症からなる群より選択される、請求項５８に記載の方法。
［請求項６０］
患者が、嚢胞性線維症膜通過伝導率制御タンパク質の分泌が不足したヒト患者であり、疾患が嚢胞性線維症である、請求項５９に記載の方法。
［請求項６１］
患者が、ＡＡＴの分泌が不足しているヒト患者であり、疾患がＡＡＴ欠損症である、請求項５９に記載の方法。
【図１】
0006688237.tif 000090
【図２】
0006688237.tif 000091
【図３】
0006688237.tif 000092
【図４】
0006688237.tif 000093
【図５】
0006688237.tif 000094
【図６】
0006688237.tif 000095
【図７】
0006688237.tif 000096
【図８】
0006688237.tif 000097
【図９】
0006688237.tif 000098
【図１０】
0006688237.tif 000099
【図１１】
0006688237.tif 000100
【図１２】
0006688237.tif 000101
【図１３】
0006688237.tif 000102
【図１４】
0006688237.tif 000103
【図１５】
0006688237.tif 000104
【図１６】
0006688237.tif 000105
【図１７】
0006688237.tif 000106
【図１８】
0006688237.tif 000107
【図１９】
0006688237.tif 000108
【図２０】
0006688237.tif 000109
【図２１】
0006688237.tif 000110
【図２２】
0006688237.tif 000111
【図２３】
0006688237.tif 000112
【図２４】
0006688237.tif 000113
【図２５】
0006688237.tif 000114
【図２６】
0006688237.tif 000115
【図２７】
0006688237.tif 000116
【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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