(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、メタクリル酸ブチル、２−メタクリロイルオキシエチルコハク酸を含む共重合体であって、
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、メタクリル酸ブチル、２−メタクリロイルオキシエチルコハク酸の共重合比が１５〜５０：４０〜７５：２〜２０であり、
重量平均分子量が３００，０００以上であることを特徴とする共重合体。
【請求項２】
請求項１記載の共重合体を含むことを特徴とするコーティング剤。
【請求項３】
生理活性物質を基板にコートするためのものであることを特徴とする請求項２記載のコーティング剤。
【請求項４】
前記生理活性物質が、核酸、ポリペプチド、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンを含むものであることを特徴とする請求項３記載のコーティング剤。
【請求項５】
前記ポリペプチドがＥｐＣＡＭに対するペプチドアプタマーであることを特徴とする請求項４記載のコーティング剤。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項記載のコーティング剤、及び活性化剤を含むことを特徴とする基材をコーティングするためのキット。
【請求項７】
請求項１に記載の共重合体に生理活性物質が結合していることを特徴とする生理活性物質結合コーティング剤。
【請求項８】
請求項７記載の前記生理活性物質が、
核酸、ポリペプチド、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンを含むものであることを特徴とする生理活性物質結合コーティング剤。
【請求項９】
前記ポリペプチドがＥｐＣＡＭに対するペプチドアプタマーであることを特徴とする請求項８記載の生理活性物質結合コーティング剤。
【請求項１０】
請求項１記載の共重合体を基材にコーティングする工程と、
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）でカルボキシル基を活性化させる工程と、
生理活性物質を導入する工程を含むことを特徴とするコーティング方法。
【請求項１１】
請求項１記載の共重合体をＥＤＣで活性化させる工程と、
生理活性物質を導入する工程と、
基材にコートする工程を含むことを特徴とするコーティング方法。
【請求項１２】
請求項７〜９のいずれか１項記載の生理活性物質結合コーティング剤を基材にコートする工程を含むことを特徴とするコーティング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な共重合体、及び該共重合体を用いたコーティング剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療分野、生命科学分野では、診断や分析の技術が日々進歩している。これらの分野では、タンパク質などの生体分子や、細胞などの分離を行うにあたり、抗体などのタンパク質や、ＤＮＡ、ＲＮＡなど特定の分子に親和性を有する生理活性物質を基材にコートすることが従来から行われている。
【０００３】
近年では、ＭＥＭＳ技術を利用して、マイクロタス（μ-ＴＡＳ）、ラボ・オン・チップ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ）といった微細加工されたデバイス上で、実験操作、反応を行わせる分析技術が開発されてきている。また、プロテインアレイ、ＤＮＡアレイのように、非常に小さい面積に高密度に生理活性物質を固定化し、網羅的に解析する技術も開発されている。
【０００４】
これらの技術によれば、これまで多くの時間を必要としていた分析時間を非常に短縮することができる。また、極めて小規模での実験操作の実現は、容積が小さいことから試薬や検体が少なくて済むというメリットがある。
【０００５】
しかしながら、従来のタンパク質や核酸の固相化法は、非特異的吸着を利用するものであったことから使用できる基材は限られていた。例えば、タンパク質の固相化であれば、通常ポリスチレンなどの基材表面に、吸着性を高めるような加工が施されているものを使用している。しかし、非特異的吸着を利用するものであることから、生理活性物質を高密度で固相化することは困難であった。
【０００６】
そこで、基材自体に表面修飾を行い、生理活性物質を結合させる方法が開発されてきている。例えば、スライドグラス表面の化学処理や修飾によって、高密度にタンパク質を固定する方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。しかしながら、基材表面の化学処理や、固相化するタンパク質を修飾する必要があるなど煩雑な工程が必要とされている。そのため、簡便に種々の生理活性物質を固相化する方法が望まれている。
【０００７】
また、固相化が要求される生理活性物質もタンパク質、核酸、糖、ステロイド、脂質など多岐にわたっている。固相化する化合物により、基材及び固相化方法が異なるため、最適な方法を検討し選択する必要がある。そのため基材の材質を選ばず、種々の生理活性物質を効率良く固相化することのできる技術の開発が望まれている。
【０００８】
種々の生理活性物質を固相化する方法として、ポリマーを用いる方法が開発されている。ポリマー中のカルボキシル基等の官能基を用いて、生理活性物質を結合することにより生理活性物質の固相化を行うことができる。中でも、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、ＭＰＣと略す。）を用いた重合体は、極めて高い親水性、生体適合性を備えることから、ＭＰＣを用いて生体分子を固相化する技術が報告されている（特許文献１〜３）。
【０００９】
特許文献１には、カルボキシル基を有する単量体と、親水性側鎖を含む単量体、及び架橋性単量体を重合して得られる生理活性物質固定化粒子が開示されている。親水性側鎖を含む単量体としてＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、カルボキシル基を有する単量体として２−メタクリロイルオキシエチルコハク酸（ｍｏｎｏ‐２‐（Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｏｘｙ）ｅｔｈｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、架橋性重合体としてＮ，Ｎ´‐メチレンビスアクリルアミドの共重合体からなる粒子を作成し、水溶性カルボジミイド（Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ、ＷＳＣ）で活性化させたのち、ＣＲＰ抗体を固相化したことが開示されている。しかしながら、特許文献１に記載の発明は、共重合体からなる粒子の発明であり、μＴＡＳなどのデバイスに適用することができず、応用範囲の狭いものであった。
【００１０】
特許文献２には、ＭＰＣとメタクリル酸の共重合体に酵素、酵素標識抗体を結合させたことが開示されている。しかしながら、特許文献２に記載の共重合体は、水溶性であるため、反応系に加えて酵素反応を行う場合には有効であるが、基材への固相化に適用することができない。
【００１１】
特許文献３には、ＭＰＣと疎水性ユニット、カルボキシル基を含む共重合体を用いてペプチドアプタマーを固定したことが開示されている。さらに、共重合体をコーティングすることにより、ポリスチレンだけではなく、ポリプロピレン、塩化ビニル等、種々の基材にペプチドを固相化したことが開示されている。種々の基材に、コーティング剤として適用可能な共重合体は画期的なものであったが、生体に微量に含まれる物質、細胞の分離、分析をするためには、検出感度を上げる必要があり、より高密度で生理活性物質を固相化しなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１５−１７８５８１号公報
【特許文献２】特開２０００−０９３１６９号公報
【特許文献３】国際公開第２０１４／１６８２３０号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｐ．＆Ｓｎｙｄｅｒ，Ｍ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒ，２００５，Ｖｏｌ．２７２，ｐｐ．５４００−５１１１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述のように、種々のマイクロデバイスによる分析に用いるためには、基材にコーティング剤として塗布することにより、生理活性物質を高密度に結合するポリマーの開発が望まれている。
【００１５】
本発明は、種々の基材に生理活性物質を固相化するための共重合体を提供することを課題とする。さらに、どのような基材であっても生理活性物質の固相化を簡便に行うことができる該共重合体を利用したコーティング剤、及び該コーティング剤を用いたコーティング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、上記課題を解決するための共重合体、該共重合体を用いたコーティング剤、及びコーティング方法に関する。
（１）２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、メタクリル酸ブチル、２−メタクリロイルオキシエチルコハク酸を含む共重合体であって、
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、メタクリル酸ブチル、２−メタクリロイルオキシエチルコハク酸の共重合比が１５〜５０：４０〜７５：２〜２０であり、
重量平均分子量が３００，０００以上であることを特徴とする共重合体。
（２）（１）記載の共重合体を含むことを特徴とするコーティング剤。
（３）生理活性物質を基板にコートするためのものであることを特徴とする（２）記載のコーティング剤。
（４）前記生理活性物質が、核酸、ポリペプチド、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びこれらの類縁体を含むものであることを特徴とする（３）記載のコーティング剤。
（５）前記ポリペプチドがＥｐＣＡＭに対するペプチドアプタマーであることを特徴とする（４）記載のコーティング剤。
（６）（２）〜（５）のいずれか１つ記載のコーティング剤、及び活性化剤を含むことを特徴とする基材をコーティングするためのキット。
（７）（１）に記載の共重合体に生理活性物質が結合していることを特徴とする生理活性物質結合コーティング剤。
（８）（７）記載の前記生理活性物質が、核酸、ポリペプチド、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、及びこれらの類縁体を含むものであることを特徴とする生理活性物質結合コーティング剤。
（９）前記ポリペプチドがＥｐＣＡＭに対するペプチドアプタマーであることを特徴とする（８）記載の生理活性物質結合コーティング剤。
（１０）（１）記載の共重合体を基材にコーティングする工程と、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）でカルボキシル基を活性化させる工程と、生理活性物質を導入する工程を含むことを特徴とするコーティング方法。
（１１）（１）記載の共重合体をＥＤＣで活性化させる工程と、生理活性物質を導入する工程と、基材にコートする工程を含むことを特徴とするコーティング方法。
（１２）（７）〜（９）のいずれか１つ記載の生理活性物質結合コーティング剤を基材にコートする工程を含むことを特徴とするコーティング方法。
【発明の効果】
【００１７】
コーティング剤として使用することのできる共重合体によって、基材の材質によらず、種々の生理活性物質を簡便に固相化することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ペプチドアプタマー導入コーティング剤の種々の金属基材への塗布を示す顕微鏡像。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明に記載の生理活性物質としては、一般に生命科学分野、医療分野で研究、診断、治療に用いられるタンパク質、核酸、糖などの物質を指す。生理活性物質には、生体に含まれる物質、あるいは天然に存在するものだけではなく、化学合成されたものや、遺伝子工学的な手法によって生産されたものも含まれる。また、特定の化合物だけではなく、細胞、オルガネラ、細胞分画のような生体に含まれる構成要素であってもよい。
【００２０】
具体的には、タンパク質としては、例えば、抗原、抗体、ペプチドホルモン、酵素等が挙げられる。抗原としては、いわゆる癌マーカーのような疾患マーカーが挙げられる。抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体だけではなく、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ）２のような抗体結合断片が挙げられる。また、抗体のＦｃ領域に強い結合性を有するｐｒｏｔｅｉｎＡ、ｐｒｏｔｅｉｎＧのようなタンパク質であってもよい。また、アビジン、ストレプトアビジンのように従来から当該分野で使用されているタンパク質が挙げられる。
【００２１】
核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸アプタマーなどが挙げられる。核酸は、天然の配列、人工的な配列、また、修飾されているものなどが含まれる。また、Ｎ-アセチルグルコサミン、ガラクトサミン、ノイラミン酸、シアル酸などの糖、インスリン、成長ホルモンなどのペプチドホルモン、ドーパミンなどの神経伝達物質であってもよい。
【００２２】
本発明において、生理活性物質をコートする基材としては、どのようなものを用いても構わないが、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、シリコン、親水性ポリジメチルシロキサン、疎水性ポリジメチルシロキサン、ガラス、ステンレス、アルミなどの金属が好適に挙げられる。
【００２３】
また、本発明のコーティング方法は、本発明の共重合体を基材に塗布してから、生理活性物質を導入してもよいし、生理活性物質が予め導入されたコーティング剤を基材に塗布してもよい。
【００２４】
また、本発明のキットとしては、本発明の共重合体と、ＨＯＭＳセグメントのカルボキシル基を活性化するための試薬である水溶性カルボジミイド、及び反応に必要な緩衝液や、未反応の活性エステル基を処理するためのグリシンを含む溶液など、生理活性物質との結合や除去反応に必要な種々の試薬を含むことができる。
【００２５】
また、本発明の共重合体は、ビーズ、マイクロタイタープレート、スライドグラス、マイクロタス、ラボ・オン・チップ、メンブレン等、当該分野で用いられている分析器具、分析機器にコートすることにより適用することができる。
【００２６】
本発明の共重合体は後述するように、生理活性物質との結合のために、ＨＯＭＳを含有させる必要がある。また、共重合体が水溶性の場合には、基材にコーティングをしても、その後の生理活性物質との反応工程において基材から溶出してしまうので、水に対して不溶性である必要がある。そのような条件を満たす共重合比としては、ＭＰＣ：ＢＭＡ：ＨＯＭＳのモル比が、１５〜５０：４０〜７５：２〜２０が好ましく、２０〜４５：４５〜７０：５〜１５がより好ましい。また、共重合体の重量平均分子量が３００、０００よりも小さい場合には、水溶性となる場合があることから、重量平均分子量は３００，０００以上であることが好ましい。
【００２７】
また、本発明をコーティング剤として用いる場合の溶媒としては、ポリマーを溶解することができるものであればどのようなものを用いてもよい。そのような溶媒としては、アルコール類が上げられ、特にエタノールやメタノールが好ましい。共重合体を含有させる濃度は０．０１〜５．０重量％が好ましく、十分なコーティング量と取り扱いの容易さから、０．１〜１．０重量％がより好ましい。コーティングに要する時間は基材とコーティング液が接触すればよく、数１０分から２４時間程度の任意の時間に設定することができる。
【実施例】
【００２８】
[１]  共重合体の合成
次に、実施例を示しながら、本発明を詳細に説明する。なお、共重合体は、以下に示すゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により重量平均分子量を、プロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）により組成分析を行った。
【００２９】
＜ＧＰＣの測定条件＞
試料は０．５重量％臭化リチウムを含むクロロホルム／メタノール（６／４（体積比））混合溶媒に溶解し、０．５重量％の重合体溶液を調製した。試料溶液の使用量は２０μＬである。
【００３０】
ＧＰＣ分析は、カラムとして、ＰＬｇｅｌ  ５μｍ  ＭＩＸＥＤＣ−Ｃ（ポリマー・ラボラトリー社製）を２本直列で、カラム温度は４０℃で用いた。溶出溶媒は、０．５重量％臭化リチウムを含むクロロホルム／メタノール（６／４（体積比））混合溶媒、流速は１．０ｍＬ／分で溶出した。検出は、示差屈折計、標準物質としては、ポリメチルメタクリレート（ポリマー・ラボラトリー社製）を用い、東ソー社製のインテグレーター内蔵分子量計算プログラム（ＳＣ−８０２０用ＧＰＣプログラム）にて求めた。
【００３１】
〔合成例１〕
＜共重合体の調製＞
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）２０．２ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）１９．５ｇ、及び２−メタクリロイルオキシエチルコハク酸（ＨＯＭＳ）５．３ｇ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＨＯＭＳ＝３０／６０／１０（モル比））をエタノール１０５ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃でアゾビスイソブチロニトリル０．４９ｇを加えて２４時間重合反応した。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ過、室温で４８時間真空乾燥を行って共重合体の粉末２９．７ｇを得た。共重合体は、上述のようにゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により重量平均分子量を、また、重溶媒を重メタノール、測定温度は室温、緩和時間５秒、積算回数を６４回として、ＪＮＭ−ＥＣＳ４００（日本電子社製）にてプロトン核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）を行い組成分析した。結果を表１に示す。
【００３２】
〔合成例２〜４〕
配合するモノマーの組成を、合成例２は、ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＨＯＭＳ＝２０／７０／１０、合成例３は４５／５０／５、合成例４は４０／４０／２０（いずれもモル比）に変更した以外は合成例１に従って共重合体を合成した。なお、回収率、ＧＰＣにより測定した重量平均分子量、及び１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果も合わせて表１に記載した。
【００３３】
〔比較合成例１〜２〕
配合するモノマーの組成を比較合成例１は、ＨＯＭＳに代えてメタクリル酸（ＭＡ）を用いた他は合成例１と同様の共重合比で、すなわちＭＰＣ／ＢＭＡ／ＭＡ＝３０／６０／１０の共重合比で、比較合成例２はＭＰＣ／ＢＭＡ／ＨＯＭＳ＝７０／２０／１０の共重合比に変更した以外は合成例１に従って共重合体を合成した。ＧＰＣにより測定した重量平均分子量、及びプロトン１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果も合わせて表１に記載した。
【００３４】
比較合成例１は、ＭＰＣの代わりにＭＡを用いており、カルボキシル基までのスペーサーが短くなっている。また、比較合成例２はＭＰＣが多いことから、水溶性の共重合体となっている。
【００３５】
【表１】
0006691790.tif 000002
【００３６】
[２]  コーティング剤としての適用
共重合体を含むコーティング剤を基材に塗布後、生理活性物質を導入する方法
［実施例１］
本発明の共重合体を含むコーティング剤を調整し基材に塗布後、生理活性物質であるビオチンを共重合体中のＨＯＭＳセグメントのカルボキシル基に導入した。
【００３７】
＜コーティング剤溶液の調製とプレートへの塗布＞
合成例１で調製した共重合体０．５ｇをエタノールで溶解し、全量をエタノールで１００ｍＬとして０．５重量％の共重合体溶液をコーティング剤として調製した。この溶液をポリスチレン製９６穴イムノプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に１ウェルあたり２００μＬとなるように分注、ポリマー液を吸引除去、室温で２４時間乾燥させ、共重合体塗布プレートを調製した。
【００３８】
＜基材に塗布された共重合体の活性化と生理活性物質との反応＞
基材に塗布された共重合体中のＨＯＭＳセグメントのカルボキシル基を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）により活性化しビオチンと結合させた。
【００３９】
合成例１で調整したコーティング剤を塗布したプレートに、１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＥＤＣの塩酸塩であるＷＳＣ（同仁化学社製）および０．５μｇ／ｍＬの濃度でビオチン−（ＰＥＯ）３−アミン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を含有するｐＨ５．８の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（以下、ＮａＰＢと記載する。）を１ウェルあたり１００μＬ分注し、３７℃で２時間静置した。その後、余剰のＷＳＣおよびビオチン−（ＰＥＯ）３−アミンを除去するために、ＮａＰＢを１ウェルあたり２００μＬ分注してから吸引除去した。この操作を４回繰り返し、プレートを洗浄した。続いて、１０ｍｍｏｌ／ｍＬの濃度でグリシンを含むＮａＰＢを１ウェルあたり２００μＬ分注し、３７℃で２時間静置することにより、未反応の活性エステル基を処理した。その後、上記と同様にＮａＰＢで４回洗浄することで余剰のグリシンを除去した。
【００４０】
＜導入されたビオチン量の測定＞
導入されたビオチン量は、ビオチンと特異的に反応するペルオキシダーゼ標識アビジンに由来する酵素活性を検出することにより評価した。ビオチンを導入したプレートに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で任意倍率に希釈したぺルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓｓ社製）を１ウェルあたり１００μＬ分注し、室温で２時間静置した。０．０５％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートを含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）を１ウェルあたり２００μＬ分注、除去する操作を４回繰り返して洗浄後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジンを発色成分とするペルオキシダーゼの発色試薬（ＫＰＬ社製）を１ウェルあたり１００μＬ分注し、室温で１０分間反応させた。１ウェルあたり５０μＬの２Ｎ硫酸を分注して発色反応を停止してからマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０、モレキュラーデバイス社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２に示す。なお、ビオチンを導入していない共重合体塗布プレートを用いて同様の操作を実施（コントロール）したときの吸光度は０．０９８であり、非特異的な吸着による発色ではないことを確認した。
【００４１】
［実施例２〜４］
実施例１の合成例１の共重合体に代えて、合成例２〜４の共重合体を使用する以外は実施例１の方法に従って実施した。結果を表２に示す。
【００４２】
［比較例１、２］
実施例１の合成例１の共重合体の代わりに比較合成例１、２の共重合体を使用する以外は実施例１の方法に従って実施した。結果を表２に示す。
【００４３】
生理活性物質が導入されたコーティング剤を基材に塗布する固相化方法
［実施例５］
共重合体のＨＯＭＳセグメントのカルボキシル基を活性化し、生理活性物質を導入後、基材に塗布することにより生理活性化物質を固相化した。
【００４４】
＜共重合体中の活性化と生理活性物質との反応＞
合成例１で得られた共重合体５０ｍｇを含有するエタノール溶液２．５ｍＬに９．５ｍｇのビオチン−（ＰＥＯ）３−アミン（カルボキシル基量に対して１０モル当量）を加えた後、３５０ｍｇの４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウムクロリド・ｎ−水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）（和光純薬工業社製）（カルボキシル基量に対して５０モル当量）を加え、室温で一昼夜反応させた。反応後、反応溶液を透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ社製，ＭＷＣＯ：８０００）に入れ、外液を１００倍のエタノールにして交換しながら２日間透析を行った。透析チューブから全量を回収、エバポレータで濃縮後、全容を１０ｍＬのエタノール溶液としてビオチン標識コーティング剤を得た（共重合体として０．５重量％のエタノール溶液）。
【００４５】
＜生理活性物質（ビオチン）導入コーティング剤のプレートへの塗布＞
上記で調製したビオチン標識共重合体溶液（共重合体として０．５重量％のエタノール溶液）を９６穴イムノプレートに１ウェルあたり２００μＬとなるように分注後、ポリマー液を吸引除去、室温で２４時間乾燥させ、ビオチン標識共重合体塗布プレートを調製した。
【００４６】
＜導入されたビオチン量の測定＞
導入されたビオチン量の測定は、実施例１に記載の導入されたビオチン量の測定に従って実施した。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
0006691790.tif 000003
【００４８】
上述のようにコントロールの吸光度は０．０９８であり、比較例１のコーティング剤は、まったくビオチンが結合しなかったことを示している。比較例１のコーティング剤に含まれる比較合成例１の共重合体は、カルボキシル基を含有するＨＯＭＳセグメントを組成に含まない。そのため、ビオチンが結合するＥＤＣにより活性化されるカルボキシル基を持たずビオチンが結合しなかったと考えられる。比較例２のコーティング剤は、同様の方法によりビオチンを導入した実施例１の約１／１０程度しかビオチンの結合が見られなかった。比較合成例２の共重合体は、ＨＯＭＳを含有するが、ＭＰＣの割合が多いため水溶性であり、基材に塗布後、ビオチン導入工程、洗浄工程で基材から離脱するためであると考えられる。
【００４９】
また、実施例５のビオチン標識化コーティング剤は、最も高密度にビオチンを基材に塗布することができた。実施例１も実施例５もどちらも合成例１の共重合体を用いたコーティング剤であるにもかかわらず、実施例５のコーティング剤がより高密度にビオチンを固相化できたことは、溶液中で生理活性物質の導入を行うことにより、より高率に生理活性物質が導入されるためだと考えられる。また、実施例５で示した方法は、予め生理活性物質が導入されているコーティング剤を用意しておくことにより、解析の際に基材に塗布するだけで済むことから非常に簡便なコーティング方法を提供することができる。また、反応毎のカルボキシル基の活性化効率を考慮する必要がないことから、安定した解析結果を得ることができる。
【００５０】
［実施例６］
＜核酸の共重合体への導入＞
共重合体中のＨＯＭＳセグメントのカルボキシル基をＥＤＣにより活性化し、ＤＮＡと反応させた。
【００５１】
以下のＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチド（エスペックオリゴサービス社製）を用いた。５´末端がアミノ基で修飾されたＰＵＣ−ＮＨ２を固定化用オリゴＤＮＡとし、該ＰＵＣ−ＮＨ２と相補的な配列を有する５’末端がビオチンで修飾されたオリゴＤＮＡ（ＰＵＮ）を用いて試験を実施した。
【００５２】
PUC-NH2：5’-ACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGG-3’  （配列番号１）
PUC    ：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAA-3’              （配列番号２）
【００５３】
１ｍＭのＥＤＴＡを添加したｐＨ８．５の５０ｍＭリン酸緩衝液（Ｅ−ＮａＰＢ）に溶解した２５ｐｍｏｌ／ｍＬのＰＵＣ−ＮＨ２溶液を実施例１で調整した共重合体塗布プレートに１ウェルあたり１００μＬ分注し、４℃で一昼夜静置した。その後、各ウェルからＰＵＣ−ＮＨ２溶液を除去し、ダルベッコのリン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。続いて、３％ＢＳＡを添加したＥ−ＮａＰＢ溶液（Ｂ−Ｅ−ＮａＰＢ）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートしブロッキングを行った。その後、各ウェルからＢ−Ｅ−ＮａＰＢを除去してＰＵＣ−ＮＨ２固定化プレートを得た。
【００５４】
上記で調製したプレートに、０．２ｐｍｏｌ／ｍＬのＰＵＣを含む５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム溶液）を１ウェルあたり１００μＬ分注し、５５℃で１時間静置し、ハイブリダイゼーションを行った。次に、各ウェルから溶液を除去し、５５℃、２×ＳＳＣ（３００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム溶液）を分注して２回洗浄した。続いて、Ｂ−Ｅ−ＮａＰＢを１ウェルあたり２００μＬ分注し、３７℃で３０分間静置し、ブロッキングを行った。液を除去した後、Ｂ−Ｅ−ＮａＰＢにより任意倍率に希釈したぺルオキシダーゼ標識アビジン（ＳＩＧＭＡ社製）を１ウェルあたり１００μＬ分注し、３７℃で３０分間インキュベートし、アビジン−ビオチン反応を行わせた。次いで、Ｄ−ＰＢＳで３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ用発色キットＴ（住友ベークライト社製）の基質溶液を１ウェルあたり１００μＬ分注し、２５℃で１０分間静置した。その後、ペルオキシダーゼ用発色キットＴの反応停止液を１ウェルあたり１００μＬ分注して発色反応を停止しマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表３に示す。
【００５５】
［比較例３、４］
実施例６の合成例１の共重合体の代わりに比較合成例１、２の共重合体を使用する以外は実施例１の方法に従って実施した。結果を表３に示す。
【００５６】
なお、ＰＵＣ−ＮＨ２を導入していない共重合体塗布プレートを用いて同様の操作を実施したときの吸光度は０．０７３であり、非特異的な吸着による発色ではないことを確認した。
【００５７】
【表３】
0006691790.tif 000004
【００５８】
表３に示すように、本発明の共重合体を用いた実施例６のコーティング剤は高密度にＤＮＡが固相化されたのに対し、比較例３、比較例４のコーティング剤はほとんどＤＮＡの導入が見られなかった。
【００５９】
本発明の共重合体はＨＯＭＳセグメントに含まれるカルボキシル基を活性化することにより、アミノ基を含むポリペプチド、アミノ基で修飾されている核酸を高密度に固相化することができる。
【００６０】
［実施例７］
＜ペプチドアプタマーの共重合体への導入＞
次に、本発明の共重合体にペプチドアプタマーを導入した例を示す。本発明の共重合体に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを介して、ＥｐＣＡＭに結合能を有するペプチドアプタマーを導入した。ＥｐＣＡＭアプタマー（Ｅｐ１１４）は、以下の配列のペプチドを用いた。
Ｅｐ１１４：ＫＨＬＱＣＶＲＮＩＣＷＳ    （配列番号３）
【００６１】
詳細なペプチドアプタマー導入法は以下のとおりである。本発明の共重合体（合成例１）エタノール溶液（０．５重量％）にＰＥＧリンカー（ｄＰＥＧ７、Ｑｕａｎｔａ  ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ社製）を１０当量入れた後、ＤＭＴ−ＭＭを５０当量加え、室温で一晩反応させる。その後、溶液を透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）、Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＭＷＣＯ：８０００）に入れ、外液をメタノールにして２日間透析を行う。透析チューブから回収後、溶液を元の反応液の体積までエバポレータを用いて濃縮する。
【００６２】
続いて、リンカーを導入した共重合体メタノール溶液０．５ｍｌに対し、２ｍｌのメタノールと２．５ｍｌのＨ２Ｏを加える。続いて、Ｅｐ１１４のＣ末側にＧＧＫ（ＦＩＴＣ）ＧＧ（ｐｒｏｐａｒｇｙｌ）を導入したものを１０当量加えた後、ソニケーションによりペプチドを溶解させる。
【００６３】
次に、０．５Ｍのアスコルビン酸ナトリウム水溶液（和光純薬）を加え、試験管内の黄色が濃くなったら、０．５Ｍの硫酸銅水溶液を加える。色が黄色から黒褐色に変化したら、試験管を密栓し、５０℃、３０分、加熱する。
【００６４】
反応終了後、精製は以下のいずれかの方法で行えばよい。反応溶液内に、キレストファイバーＩＲＹ−ＨＷ  １ｇ（キレスト株式会社製）を加え、室温で１時間、攪拌する。続いて、キレストファイバーを濾紙にて濾過する。濾液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（商標、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に入れ、２５℃、４，０００ｇ、５０分で限外濾過を行い、ペプチドアプタマー導入コーティング剤を精製する。
【００６５】
または、反応終了後、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム（同仁化学）水溶液、ｐＨ８を加えながら、前出の透析チューブへと移し入れる。外液のメタノール／ミリＱ水混合溶液（１：１）３Ｌに対し、３０ｍｌの０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム水溶液、ｐＨ８を加え１週間透析し、さらにその後外液をミリＱ水、メタノールと変更して精製すればよい。
【００６６】
＜ペプチドアプタマー導入コーティング剤の種々の基材への塗布＞
基材はメタノールに浸漬し５分間ソニケーションし、洗浄を行う。用いた金属は、亜鉛粒子（高純度化学研究所製、Ｐｏｗｄｅｒ  Ｍ  １５０μｍ  ｐａｓｓ、０４９６６０）、鉄粒子（高純度化学研究所製、Ｐｏｗｄｅｒ  Ｍ  １５０μｍ  ｐａｓｓ、０４９６５６）、ケイ素小片（高純度化学研究所製、Ｐｏｗｄｅｒ  Ｍ  １５０  μｍ  ｐａｓｓ、０４９６６１）、ジルコニア粒子（高純度化学研究所製、Ｐｏｗｄｅｒ  ｃａ．１μｍ、２１３２５９）、フロリジル（ケイ酸マグネシウム）小片（Ｍｅｒｃｋ製、０．１５０−０．２５０ｍｍ、１．１２５１８．０１００）である。洗浄処理した金属粒子、金属小片は、作製したペプチドアプタマー導入コーティング剤に浸漬し、３７℃、２時間振とうした後、０．４５μｍ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒｓ、ＵＦＣ３０ＬＨ００）で濾過し、過剰量のペプチドアプタマー導入コーティング剤を除く。３０分間風乾した後、２時間真空乾燥させる。その後、ＰＢＳにて４℃、１５時間平衡化した。
【００６７】
コート後のＥｐ１１４の量を抗体染色により比較検討した。各金属担体をブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ、ナカライテスク株式会社製)で、１時間ブロッキングし、０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で３回洗浄した。
【００６８】
ブロッキング後、一次抗体として、抗Ｅｐ１１４ウサギＩｇＧ、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｚｅｎｏｎ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４）を使用した。各抗体との反応後は、０．０５重量％のＴｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを用いて洗浄し、共焦点顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＦＬＵＯＶＩＥＷ  １０００）を用い観察を行った。コントロールとして、鉄粒子にコーティング剤をしていない試料を用いた。結果を図１に示す。
【００６９】
検討を行った金属、すなわち亜鉛、鉄、ケイ素、ジルコニア、フロリジルのすべてでペプチドアプタマーがコートされていることが確認された。これに対し、コーティング剤を塗布しなかったコントロールの鉄粒子は、まったく抗体の結合が観察されなかった。上記で示したように本発明の共重合体を含むコーティング剤は、合成樹脂製の基材だけではなく、金属基材にも被覆可能であり、また、顕微鏡観察を行うことができることが確認された。
【００７０】
［実施例８］種々の基材へのコート
本発明の共重合体は実施例７で示したように金属や、実施例５で示したようにポリスチレン製のイムノプレートだけではなく様々な担体をコートすることができる。ポリスチレン以外の樹脂としては、担体として汎用されているポリプロピレン、塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、シリコン、親水性ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、疎水性ポリジメチルシロキサン、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、また、ガラスを効率良くコートすることを確認している。以下に、基材として多用される材料へのコーティングの評価結果の例を示す。
【００７１】
〔ポリエチレンテレフタラート基材での評価〕
＜コーティング剤溶液の調製とプレートへの塗布＞
合成例１で調製した共重合体０．５ｇをエタノールで溶解し、全量をエタノールで１００ｍＬとして０．５重量％の共重合体溶液をコーティング剤として調製した。この溶液をポリエチレンテレフタラート製９６穴イムノプレート（アズワン社製）に１ウェルあたり２００μＬとなるように分注、ポリマー液を吸引除去、室温で２４時間乾燥させ、共重合体塗布プレートを調製した。
【００７２】
＜基材に塗布された共重合体の活性化と生理活性物質との反応＞
上記で調整したコーティング剤を塗布したポリエチレンテレフタラート製プレートを実施例１と同様にしてＷＳＣを用いてＨＯＭＳセグメントのカルボキシル基を活性化した。次に、ビオチンを結合した後に洗浄を行い、さらに、未反応の活性エステル基の処理を行い、再度洗浄操作を繰り返余剰のグリシンを除去した。
【００７３】
＜導入されたビオチン量の測定＞
導入されたビオチン量は、実施例１と同様にして測定した。マイクロプレートリーダーでの４５０ｎｍの吸光度の測定値は１．５２６であった。なお、ビオチンを導入していない共重合体塗布プレートを用いて同様の操作を実施（コントロール）したときの吸光度は０．０４３であり、非特異的な吸着による発色ではなく、ポリエチレンテレフタラート製の基材にもコートできることを確認した。
【００７４】
〔ポリメチルメタクリレート基材での評価〕
＜ポリメチルメタクリレート基材へのコーティング＞
合成例１で調製した共重合体０．５ｇをエタノールで溶解し、全量をエタノールで１００ｍＬとして０．５重量％の共重合体溶液をコーティング剤として調製した。この溶液をポリメチルメタクリレート製ディスポセル（１２．５ｍｍ×１２．５ｍｍ×４５ｍｍ、アズワン社製）に１セルあたり２ｍＬとなるように分注、ポリマー液を吸引除去、室温で２４時間乾燥させ、共重合体塗布セルを調製した。
【００７５】
＜基材に塗布された共重合体の活性化と生理活性物質との反応＞
上記で調整したコーティング剤を塗布したポリメチルメタクリレート製ディスポセルを実施例１と同様にしてＷＳＣを用いてＨＯＭＳセグメントのカルボキシル基を活性化した。次に、ビオチンを結合した後に洗浄を行い、さらに、未反応の活性エステル基の処理を行い、再度洗浄操作を繰り返余剰のグリシンを除去した。
【００７６】
＜導入されたビオチン量の測定＞
導入されたビオチン量は、実施例１と同様にビオチンと特異的に反応するペルオキシダーゼ標識アビジンに由来する酵素活性を検出することにより評価した。ただし、１セルあたりの試薬量を実施例１の１０倍量添加して反応を行わせた。また、２Ｎ硫酸による反応停止後、反応停止液から１５０μＬをポリスチレン製９６ウェルプレートに移してからマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。ビオチンを導入したコーティング剤を塗布した共重合体セルでは、１．９５３の吸光度を得たのに対し、ビオチンを導入していない共重合体塗布セルを用いて同様の操作を実施（コントロール）したときの吸光度は０．０７３であった。したがって、非特異的な吸着による発色ではなく、ポリメチルメタクリレートにも本発明の共重合体を含むコーティング剤を塗布できることを確認した。
【００７７】
〔ガラス基材での評価〕
容器をポリメチルメタクリレート製ディスポセルからディスポーザブルガラス試験管（６ｍＬ、アズワン社製）に変更する以外は上記〔ポリメチルメタクリレート製ディスポセルでの評価〕に従って実験を実施した。その結果、ビオチンを導入した共重合体塗布ガラス試験管を用いた時、１．３７２の吸光度を得た。なお、ビオチンを導入していない共重合体塗布ガラス試験管を用いて同様の操作を実施（コントロール）したときの吸光度は０．０５１であった。したがって、非特異的な吸着による発色ではなく、ガラスにも本発明の共重合体を含むコーティング剤を用いて高密度に生理活性物質を塗布できることを確認した。
【００７８】
以上示してきたように、本発明の共重合体を用いたコーティング剤は、非常に簡便な方法により様々な基材に生理活性物質を高密度でコートすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
種々の生理活性物質を高密度に基材にコーティングすることができるため、感度良く分析を行うことができる。また、基材をコーティングする方法は汎用性があるため、あらゆるデバイスに応用が可能である。
【図１】
0006691790.tif 000005
【配列表】
0006691790000001.app