(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象である抗体に対する固相抗原、蛋白質及び界面活性剤を含有する凍結乾燥試薬、並びに
測定対象である抗体に対する標識抗体、蛋白質及び界面活性剤を含有する凍結乾燥試薬、
を有することを特徴とする免疫反応試薬。
【請求項２】
測定対象である抗体に対する固相抗原、蛋白質及び界面活性剤を溶液中に共存させ凍結乾燥し、かつ
測定対象である抗体に対する標識抗体、蛋白質及び界面活性剤を溶液中に共存させ凍結乾燥する
ことを特徴とする、免疫反応試薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体外診断薬等に使用される凍結乾燥状態の免疫反応試薬及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ビーズや微粒子などの固相担体に固定化した抗原（以下、固相抗原）、酵素等の標識が結合した抗体（以下、標識抗体）は、臨床検査等の分野で広く利用されている。しかしながら抗体、抗原や酵素等の活性は温度の影響を受けやすく、活性を維持した状態で長期間保存することは困難である。このためこれらの活性を維持するために様々な安定化方法が提案されている。
【０００３】
特許文献１では、二糖類以上の非還元糖類及び糖アルコール等を添加して凍結乾燥することで標識抗体を安定化させることが報告されている。特許文献２では、ガラクトース、ラクトース及びフルクトースからなる群より選ばれる糖とアルブミンあるいはデキストランとの存在下で凍結乾燥することでヒト由来アルカリホスファターゼを安定化させることが報告されている。しかしながら凍結乾燥状態の免疫反応試薬においては、適切な化合物、糖や蛋白質などを選択して臨床検査の分野で求められている保存安定性が得られた場合には、試薬が強固な乾燥ケーキ状となっている場合が多く、再溶解した後の溶解性が悪く、その結果、測定再現性が悪くなり測定対象成分を高精度に測定することが妨げられることが問題となっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６０−１４９９７２号公報
【特許文献２】特許第４１６９３４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
臨床検査の分野において、試薬の長期間の保存安定性は種々の試薬で求められている。また測定時における再現性も同時に求められている。そこで本発明の目的は、体外診断薬等に使用される安定かつ測定再現性が良好な凍結乾燥状態の免疫反応試薬及びその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、凍結乾燥状態の免疫反応試薬を安定化するために蛋白質を選定し、さらに界面活性剤を加えることにより、保存安定性と測定再現性が共に良好であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち本発明は以下のとおりである。
（１）測定対象である抗体に対する固相抗原、蛋白質及び界面活性剤を含有する凍結乾燥試薬、並びに
測定対象である抗体に対する標識抗体、蛋白質及び界面活性剤を含有する凍結乾燥試薬、
を有することを特徴とする免疫反応試薬。
（２）測定対象である抗体に対する固相抗原、蛋白質及び界面活性剤を溶液中に共存させ凍結乾燥し、かつ
測定対象である抗体に対する標識抗体、蛋白質及び界面活性剤を溶液中に共存させ凍結乾燥する
ことを特徴とする、免疫反応試薬の製造方法。
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明における測定対象は抗体であり、特に限定されるものではないが、例えば臨床検査に利用される物質であり、ヒトイムノグロブリン、抗甲状腺ペルオキシターゼ抗体、抗サイログロブリン抗体等があげられる。
【００１０】
本発明において固相抗原は、前述の測定対象である抗体に対する抗原をビーズや微粒子などの固相担体に固定化したものであり、抗原抗体反応を行う溶液に不溶性のものを指すが、固相に直接抗原が結合していなくても、アビジン−固相複合体を結合するためのビオチンを結合した抗原で可溶性のものも含まれる。
【００１１】
標識抗体は、前述の測定対象である抗体に対する抗体であって標識を結合したものであり、抗原抗体反応を行う溶液に可溶性のものを指すが、標識を直接抗体に結合していなくても、アビジン−標識複合体を結合するためのビオチンを結合した抗体で可溶性のものも含まれる。
【００１２】
固相としては、ビーズや微粒子を使用することできる。特に微粒子が好ましく、ガラス、金属、セラミツクス等の無機物であってもよく、また高分子ポリマー等の有機物であってもよい。またそれらの微粒子は磁性体を含むものであってもよい。微粒子の粒子径は０．１から５０μｍが好ましく、さらには１から１０μｍが好ましい。
【００１３】
標識としては特に限定されるものではないが、例えば酵素、放射性同位元素等があげられ、特に酵素が好ましく、例えばアルカリ性ホスファターゼ、パーオキシダーゼ等があげられる。
【００１４】
これらを用いる免疫測定法は固相法であり、サンドイッチ法や競合法が含まれる。また、固相に抗原が直接結合されていなくても、抗原抗体反応に続く反応工程で固相に結合するような測定法、例えば、ビオチニル化抗原を用いたサンドイッチ法による免疫反応工程の後に、アビジン−固相複合体を反応させるような測定法も含まれる。また標識に抗体が直接結合されていなくても、抗原抗体反応に続く反応工程で標識を結合するような測定法、例えば、ビオチニル化抗体を用いたサンドイッチ法による免疫反応工程の後に、アビジン−標識複合体を反応させるような測定法も含まれる。
【００１５】
本発明における抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、抗体を産生する実際上任意の動物種、例えばウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、マウスまたはラットなど由来の抗体が使用できる。抗体の形態には完全抗体や、それを酵素処理や化学処理により切断したＦ（ａｂ’）２やＦａｂ’等のような抗体断片であってもよい。
【００１６】
本発明に用いられる蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン、コラーゲンペプチド、スキムミルク等を使用することができ、特にウシ血清アルブミンが好ましい。凍結乾燥前の溶液において０．１〜２０％（重量／容量）の濃度範囲とすることが好ましく、特に１〜１０％（重量／容量）の濃度範囲とすることが好ましい。
【００１７】
本発明に用いられる界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤を使用することができる。特に非イオン性界面活性剤が好ましく、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、ノニデットＰ４０、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０が使用でき、中でもＴｒｉｔｏｎＸ−１００が好ましい、界面活性剤は凍結乾燥前の溶液において０．００１〜１％（重量／容量）の濃度範囲とすることが好ましく、特に０．０１〜０．５％（重量／容量）の濃度範囲とすることが好ましい。
【００１８】
本発明の免疫反応試薬は、固相抗原、蛋白質及び界面活性剤を溶液中に共存させ、凍結乾燥し、かつ標識抗体、蛋白質及び界面活性剤を溶液中に共存させ、凍結乾燥することにより製造することができる。
【００１９】
このときの溶液としては、緩衝液や水、更にそれらに糖や塩類を含有させたものがあげられる。糖であれば例えばスクロース、マンニトール、トレハロースやイノシトール等を使用することができる。緩衝液としては、例えばＴｒｉｓ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳやＭＥＳ等を使用することができ、塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化亜鉛等を使用することができる。なお、凍結乾燥時にこれら以外にも、必要に応じて他の試薬成分等を共存させることもできる。
【００２０】
このようにして、本発明の凍結乾燥状態の免疫反応試薬を製造することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、保存安定性が良好かつ測定再現性が良好な、体外診断薬等に使用される凍結乾燥状態の免疫反応試薬を得ることが可能となる。例えば、本発明で得られた免疫測定試薬は長期間の保存が可能となる。さらに精度よく測定することができるので、本発明によって高精度な測定も実現できる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。
【００２３】
免疫測定装置として全自動エンザイムイムノアッセイ装置（ＡＩＡ−ＣＬ２４００、東ソー社製）と免疫測定用試薬として当該装置用免疫反応試薬を用い、２ステップサンドイッチ法により各測定を行った。なお、各免疫反応試薬は後述したようにして調製した。
【００２４】
（実施例１）
甲状腺ペルオキシターゼ固定化磁性微粒子をスクロース、塩化ナトリウム、ヘパリンナトリウム、カゼインナトリウム、プロクリン３００、未脱脂ウシ血清含むＴｒｉｓ緩衝液に加え、さらに５％（重量／容量）ウシ血清アルブミン、０．１％（重量／容量）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて凍結乾燥を行った。なお、未脱脂ウシ血清中のウシ血清アルブミンの濃度はごく少量であり、組成には実質的に影響しないものである。さらにアルカリ性ホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体をトレハロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、プロクリン３００を含むＭＯＰＳ緩衝液に加え、さらに５％（重量／容量）ウシ血清アルブミン、０．２％（重量／容量）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて凍結乾燥を行った。
【００２５】
次に調製した試薬に対して、３５℃で１３日間の加速劣化試験を実施した。尚、比較のための試験は４℃で１３日間保存した。前記自動免疫測定装置で各試薬に対して血清サンプル３種類を測定し、アルカリ性ホスファターゼの基質である化学発光基質の発光強度を測定した。各血清サンプルは５回ずつ測定し、その平均値を測定値とした。さらにその測定値を元に、測定再現性を算出した。結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
0006658164.tif 000002
（比較例１）
甲状腺ペルオキシターゼ固定化磁性微粒子をスクロース、塩化ナトリウム、ヘパリンナトリウム、カゼインナトリウム、プロクリン３００、未脱脂ウシ血清を含むＴｒｉｓ緩衝液に加え、さらに５％（重量／容量）ウシ血清アルブミンを加えて凍結乾燥を行った。なお、未脱脂ウシ血清中のウシ血清アルブミンの濃度はごく少量であり、組成には実質的に影響しないものである。さらにアルカリ性ホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体をトレハロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、プロクリン９５０及びゲンタマイシン硫酸塩を含むＴｒｉｓ緩衝液に加え、さらに５％（重量／容量）ゲリゼートを加え、さらに１％（重量／容量）ウシ血清アルブミンを加えて凍結乾燥を行った。
【００２７】
次に調製した試薬に対して、実施例１と同様にして試験を行った。結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
0006658164.tif 000003
（比較例２）
甲状腺ペルオキシターゼ固定化磁性微粒子をスクロース、塩化ナトリウム、ヘパリンナトリウム、カゼインナトリウム、プロクリン３００、未脱脂ウシ血清を含むＴｒｉｓ緩衝液に加え、さらに５％（重量／容量）ウシ血清アルブミン、０．１％（重量／容量）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えて凍結乾燥を行った。なお、未脱脂ウシ血清中のウシ血清アルブミンの濃度はごく少量であり、組成には実質的に影響しないものである。さらにアルカリ性ホスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体をトレハロース、塩化マグネシウム、塩化亜鉛、プロクリン９５０及びゲンタマイシン硫酸塩を含むＴｒｉｓ緩衝液に加え、さらに５％（重量／容量）ゲリゼートを加え、さらに１％（重量／容量）ウシ血清アルブミンを加えて凍結乾燥を行った。
【００２９】
次に調製した試薬に対して、実施例１と同様に試験を行った。結果を表３に示す。
【００３０】
【表３】
0006658164.tif 000004
界面活性剤が含まれていない比較例１の場合は、サンプルの発光強度の残存率が４℃保存品と比較して、１３日間で８４．２％、７９．９％、７７．０％であり、５回測定の再現性は４．１％、９．５％、１４．３％であった。また固相抗原に界面活性剤を添加した比較例２の場合、発光強度の残存率は１３日間で８９．３％、９０．９％、８７．５％であり、５回測定の再現性は５．８％、３．６％、５．８％と安定性と測定再現性が良くなる傾向が見られた。これに対し、固相抗原と酵素標識抗体ともに界面活性剤とウシ血清アルブミンを添加した実施例１の場合、発光強度の残存率は１３日間で９０．１％、９０．４％、９０．１％であり、５回測定の再現性は０．９％、２．４％、１．８％と安定性と測定再現性がともに大きく改善された。これは固相抗原と酵素標識抗体ともに界面活性剤とウシ血清アルブミン添加を行ったことで免疫反応試薬の性能が向上したことを示している。