(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳腫瘍を処置する方法に使用するための血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む医薬組成物であって、前記方法は：
（ｉ）前記ＶＥＧＦを含む医薬組成物を脳腫瘍を有している対象に全身投与し、ここで前記ＶＥＧＦの量が５〜２００ｎｇ／ｋｇであり；そして
（ｉｉ）ＶＥＧＦを含む医薬組成物の投与の５時間後以内に、有効量の抗癌剤を対象に全身投与すること、
を含み、ここでＶＥＧＦはＶＥＧＦ−Ａである、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＶＥＧＦの量が１０〜１００ｎｇ／ｋｇである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦの量が２５ｎｇ／ｋｇである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗癌剤が、ＶＥＧＦを含む医薬組成物の投与の１５〜１８０分後に投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗癌剤が、ＶＥＧＦを含む医薬組成物の投与の４５分または３時間後に投与される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗癌剤が、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗物質、細胞毒性抗生物質、または生物学的製剤である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記アルキル化剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロールエサミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、およびジアジクオンから成る群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記トポイソメラーゼ阻害剤が、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、およびアクラルビシンから成る群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記代謝拮抗物質が、フルオロピミジン、デオキシヌクレオシド類似体、チオプリン、メトトレキサート、およびペメトレキセドから成る群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記細胞毒性抗生物質が、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アルカルビシン、およびミトキサントロンから成る群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記生物学的製剤が、ベバシズマブ、セツキシマブ、ペムツモマブ、オレゴボマブ、ミンレツモバブ、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ７５１８７１、マパツムマブ、ＫＢ００４およびＩＩＩＡ４から成る群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
（ｉ）血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を含む第一の製剤が入った第一のコンテナ、および
（ｉｉ）脳腫瘍を処置するための抗癌剤を含む第二の製剤が入った第二のコンテナ、
を含み、ここで第一の製剤のＶＥＧＦ−Ａは、５〜２００ｎｇ／ｋｇの量で対象に投与される、脳腫瘍の処置に使用するためのキット。
【請求項１３】
脳腫瘍を処置する方法に使用するためのキットであって、ＶＥＧＦ−Ａを含む第一の製剤および抗癌剤を含む第二の製剤を含み、ここで、第一の製剤と第二の製剤の両方が、脳腫瘍を有している対象への全身投与のための製剤であり、ここで、第一の製剤が、第二の製剤投与の５時間前以内に投与され、かつ、ここで第一の製剤のＶＥＧＦ−Ａは、５〜２００ｎｇ／ｋｇの量で対象に投与されるキット。
【請求項１４】
前記第一の製剤のＶＥＧＦ−Ａが、１０〜１００ｎｇ／ｋｇの量で対象に投与される、請求項１２または１３に記載の使用のためのキット。
【請求項１５】
対象の血液脳関門を横断する作用物質の送達を容易にする方法に使用するための血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）を含む医薬組成物であって、作用物質投与の４５分前に、有効量のＶＥＧＦ−Ａを含む医薬組成物を、それを必要としている対象に全身投与することを含み、ここで、有効量のＶＥＧＦ−Ａが５〜２００ｎｇ／ｋｇであり、かつ、ここで、作用物質が治療薬または診断薬である医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＶＥＧＦ−Ａの有効量が２５ｎｇ／ｋｇである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記対象が脳疾患を有しているか、有していることが疑われるか、または脳疾患の危険があるヒト患者である、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記脳疾患が、虚血性脳卒中、神経変性疾病、および神経精神疾患から成る群から選択される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記作用物質が治療薬である、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記作用物質が診断薬である、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記診断薬が造影剤である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記方法が、対象の脳領域内の診断薬の存在またはレベルを検出することをさらに含む、請求項２０または２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記診断薬が、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によって検出される、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
脳疾患を処置するかまたは診断する方法に使用する治療薬または診断薬と同時に使用するための医薬組成物であって、前記医薬組成物はＶＥＧＦ−Ａを含み、ここで、医薬組成物が、治療薬または診断薬投与の４５分前に、それを必要としている対象に投与され、かつ、ここで、対象に投与されるＶＥＧＦ−Ａの量が５〜２００ｎｇ／ｋｇである医薬組成物。
【請求項２５】
前記対象に投与されるＶＥＧＦ−Ａの量が１０〜１００ｎｇ／ｋｇである、請求項１５または２４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下、２０１４年８月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／０３９，８９９号に対して優先権を主張するものであり、その内容全体を参照によって本明細書中に援用する。
【背景技術】
【０００２】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、タイトジャンクションによって連結された毛細血管内皮細胞のネットワークを備え、体循環とＣＮＳとの間の小分子、タンパク質、および細胞の自由な交換を制限している。ＢＢＢは、病原菌、毒素、および他の攻撃から脳を保護するが、多くの神経障害の処置において難しい障害となる。例えば腫瘍、感染、梗塞／出血、物理的な外傷性傷害および変性疾患（例えば、パーキンソン病）などの脳の病状は、適切な薬物送達および正確な診断造影が重要である一般的でありかつ重大な疾患である。
【０００３】
中枢神経系（ＣＮＳ）疾患は、現在利用可能な限定された外科用または薬物療法のため、深刻な罹患率、死亡率または運動障害をもたらすことが多い。これらの疾患を処置するための潜在的な治療用化合物は膨大な数存在しているが、これらの作用物質をＣＮＳ、特に脳に送達する好適なアプローチの不足がそれらの使用を制限している。現在利用可能な送達技術は、全身、くも膜下腔内、または頭蓋内への薬物投与に依存する；しかしながら、そのすべてに制限がある。例えば、多くの化合物が循環系からＣＮＳへと横断できないことが、全身送達を制限している。全身送達された作用物質がＣＮＳに入ったとしても、斯かる作用物質の量は望ましい治療反応を引き出すことができないくらい少ないことが多い。
従って、脳疾患を治療または診断するためにＢＢＢを横断して治療薬および診断薬の送達を容易にするための新しいアプローチを開発する必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、作用物質投与前の好適な時間域（例えば、４５分）以内に低用量のＶＥＧＦを与えたとき、ＶＥＧＦが、血液脳関門を横断した脳への小分子、巨大分子、ナノ粒子、および幹細胞を含めた作用物質の送達を容易にするという発見に、少なくとも一部が基づいている。
従って、本開示の１つの態様は：（ｉ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を脳腫瘍を有している対象に全身投与し；そして、（ｉｉ）ＶＥＧＦ投与の５時間後以内に、有効量の抗癌剤を該対象に全身投与すること、を含む脳腫瘍の処置方法を特徴とする。
【０００５】
いくつかの例において、ＶＥＧＦの量は、５〜２００ｎｇ／ｋｇ、例えば２５ｎｇ／ｋｇであり得る。あるいはまたは加えて、抗癌剤は、ＶＥＧＦ投与後１５〜１８０分、例えばＶＥＧＦ投与後４５分または３時間で投与され得る。
【０００６】
抗癌剤は、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロールエサミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドブスルファン、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、およびジアジクオン）であっても；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、およびアクラルビシン）であっても；代謝拮抗物質（例えば、フルオロピミジン、デオキシヌクレオシド類似体、チオプリン、メトトレキサート、およびペメトレキセド）であっても；細胞毒性抗生物質（アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アルカルビシン、およびミトキサントロン）であっても；または生物学的製剤（例えば、ベバシズマブ、セツキシマブ、ペムツモマブ、オレゴボマブ、ミンレツモバブ、エタラシズマブ、ボロシキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ＡＶＥ１６４２、ＩＭＣ−Ａ１２、ＭＫ−０６４６、Ｒ１５０７、ＣＰ７５１８７１、マパツムマブ、ＫＢ００４またはＩＩＩＡ４などの治療用抗体）であってもよい。別の態様において、本開示は、対象の血液脳関門を横断する作用物質の送達（例えば、治療薬または造影剤などの診断薬）を容易にする方法であって、作用物質投与の５時間前以内に、有効量の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を、それを必要としている対象に全身投与することを含み、ここで、有効量のＶＥＧＦが５〜２００ｎｇ／ｋｇ（例えば、２５ｎｇ／ｋｇ）であり、かつ、ここで、作用物質が治療薬または診断薬である方法を提供する。いくつかの例において、ＶＥＧＦが、作用物質投与の１５分〜３時間前、例えば、作用物質投与の４５分または３時間前に投与される。
【０００７】
本明細書中に記載した方法のいずれかにおいて、対象は、脳疾患を有しているか、有していることが疑われるか、または脳疾患の危険があるヒト患者であり得る。脳疾患の例としては、これだけに限定されるものではないが、虚血性脳卒中、神経変性疾病、および神経精神疾患が挙げられる。
診断薬が使用されているとき、方法は、対象の脳領域の診断薬の存在またはそのレベルを検出することをさらに含んでもよい。診断薬は、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によって検出され得る。
【０００８】
さらに、本開示は：（ｉ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む第一の製剤が入った第一のコンテナ、および（ｉｉ）例えば、治療薬（例えば、本明細書中に記載の抗癌剤）または本明細書中に記載の診断薬を含む第二の製剤が入った第二のコンテナを具備するキットを提供する。斯かるキットは、例えば脳腫瘍などの脳障害を治療するかまたは診断するのに使用され、ここで、第一の製剤と第二の製剤の両方が、処置を必要としている対象への全身投与のためのものであり得、そして、ここで、第一の製剤が、第二の製剤投与の５時間前以内に投与され得る。
【０００９】
脳疾患を処置するかまたは診断するための治療薬または診断薬と同時に使用するための医薬組成物である、ＶＥＧＦを含む医薬組成物も、本開示の範囲内にあり、ここで、医薬組成物は、治療薬または診断薬投与の５時間前以内に、それを必要としている対象に投与され、および、ここで、対象に投与されるＶＥＧＦの量は、５〜２００ｎｇ／ｋｇである。
本発明の１もしくは複数の実施形態の詳細は、以下での説明に規定される。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、ならびに添付の請求項からも明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＶＥＧＦの全身投与が、マウスにおいて血液脳関門の透過性を増強したことを示すチャートを含む。Ａ．脳組織のエバンスブルー含有量によって計測されたＢＢＢ透過性に対するＶＥＧＦ用量の効果。*＝対照に対してＰ＜０．０５；および**＝ＶＥＧＦ０．１μｇ／ｋｇ群に対してＰ＜０．０５。Ｂ．エバンスブルーによって計測された０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦの全身感染後のＢＢＢ透過性の経時変化。ｎｓ＝有意ではない；*＝対照群に対してＰ＜０．０５；および**＝ＶＥＧＦ３０分群に対してＰ＜０．０５。すべての棒グラフが、平均±ＳＤを示す。すべての群に関してｎ＝６。
【図２−１】図２は、マウスにおいてＢＢＢを通過したペグ化蛍光ナノ粒子の浸透を増強したＶＥＧＦ前処置を示す略図を含む。Ａ．実験計画を示すフローチャート。Ｂ．ＶＥＧＦ前処置を伴うまたは伴っていない脳内のナノ粒子生体分布のＩＶＩＳ画像。Ｃ．ＩＶＩＳ分析による蛍光強度の定量化を示すチャート。Ｄ．ＶＥＧＦ前処置後の脳内において様々な大きさのナノ粒子の生体分布を示す組織切片の蛍光抗体染色を示す写真。マウスを０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦ注射であらかじめ処置し、４５分間保持し、その後、ペグ化ナノ粒子（２０ｎｍ、１００ｎｍまたは５００ｎｍ）を注射し、次に、蛍光強度をＩＶＩＳ分析で計測した。ｎｓは有意でないことを表し、*は対照に対してＰ＜０．０５であることを表す。全ての棒グラフが平均＋ＳＤを表し、すべての群に関してｎ＝６である。
【図２−２】図２−１の説明に同じ。
【図２−３】図２−１の説明に同じ。
【図３−１】図３は、ＶＥＧＦ前処置が脳卒中後のｈＭＳＣベースの細胞療法を促進したことを示す略図を含む。Ａ．０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦ前処置を伴うまたは伴っていない、Ｄｓ−Ｒｅｄを発現するｈＭＳＣｓでの処置後の放出ＭＣＡＯラットにおいて計測された定量的蛍光強度を示すチャート。Ｂ．０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦ前処置を伴うまたは伴っていない、Ｄｓ−Ｒｅｄを発現するｈＭＳＣｓでの処置後のＭＣＡＯラットにおける梗塞サイズを示すチャート。Ｃ．２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色を用いたＭＣＡＯモデルを示す写真。血の気のない領域は梗塞部である。Ｄ．エバンスブルー染色の梗塞部における色素の滞留徴候を示す写真。Ｅ．３日後にｈＭＳＣおよびｈＭＳＣ／ＶＥＧＦ処置群の両方で梗塞サイズが減少していたＭＣＡＯラット脳切片を示す写真。
【図３−２】図３−１の説明に同じ。
【図４−１】図４は、ＶＥＧＦ前処置とそれに続くテモゾロミド（ＴＭＺ）注射がＧＢＭマウスモデルにおけるＧＢＭ腫瘍増殖を効果的に遅らせたことを示すチャートを含む。Ａ．０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦ前処置を伴うまたは伴っていない５ｍｇ／ｋｇのＴＭＺでの処置後の腫瘍体積。Ｂ．０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦ前処置を伴うまたは伴っていない２０ｍｇ／ｋｇのＴＭＺでの処置後の腫瘍体積。
【図４−２】図４−１の説明に同じ。
【図５】図５は、ＶＥＧＦ前処置がＧＢＭマウスの生存率を改善することを示すグラフである。
【図６】図６は、ＶＥＧＦ１６５Ａ（０．３μｇ／ｋｇ）または対照（標準生理的食塩溶液）であらかじめ処置したマウスの６つの重要臓器、脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓、および心臓から単離したドキソルビシンを示すグラフを含む。脳で計測されたドキソルビシンの有意な増大は、他の重要臓器において変化がなかったＶＥＧＦ処置後に検出された。１群あたりｎ＝３。
【図７】図７は、抗ｎｒＣＡＭ抗体の注射の４５分前に０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦ１６５Ａまたは標準生理的食塩溶液対照のいずれかを静脈内注射したマウスの脳における蛍光シグナルの強さの定量分析を示すグラフである。結果は、ＶＥＧＦ処置後にシグナル強度の約５倍の増強を示す。
【図８】図８は、生理的食塩水対照と比較して、ＶＥＧＦ前処置とそれに続くガドリニウム造影剤の注射が、マウス脳において検出可能なレベルの造影剤を増加させたことを示す画像を含む。結果は、生理的食塩水対照であらかじめ処置されたマウスと比較して、ＶＥＧＦであらかじめ処置されたマウスの脳において検出されたガドリニウムの量が約１５．５％増加したことを示す。
【００１１】
発明の詳細な説明
ＢＢＢの破壊、ＢＢＢの迂回、ＢＢＢの透過、またはそれらの組み合わせを含めた数多くのアプローチが、ＢＢＢを横断する薬物送達に関連した課題を克服するために試みられた。浸透圧処理は関門を混乱させることができるので、薬物の取り込みと送達のための内在担体タンパク質を利用した、多くの試みがなされてきた。ＢＢＢは、脳脊髄液中または直接脳内への薬剤の直接注入を完全に回避し得る。しかしながら、これらの方法は、例えばイオン平衡障害、神経伝達物質の漏出および循環中へのケモカイン遊離などのそれ自体の課題を示す。Obermeier et al., Nat Med 19(12): 1584-1596; 2013。
【００１２】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成および血管新生を刺激する細胞によって産生されるシグナルタンパク質である。それは、血小板由来成長因子サブファミリーに属する増殖因子である。ＶＥＧＦの正常機能は、胚発生中の新生血管を作ること、傷害後の新生血管を作ること、運動後の筋を作ること、および詰まった血管を迂回する新しい血管（副行循環）を作ることである。哺乳類のＶＥＧＦファミリーは、５種類のメンバー：ＶＥＧＦ−Ａ、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄ、を含む。選択的スプライシングにより、いくつかのＶＥＧＦファミリー（例えば、ＶＥＧＦ Ａ）には複数のイソ型が存在する。
【００１３】
血管新生は腫瘍増殖や転移癌と密接に関連し、かつ、ＶＥＧＦが血管新生を促進するので、ＶＥＧＦが腫瘍形成における役割を果たすことが示唆された。例えば、ＶＥＧＦ仲介シグナリングが血管新生および血管透過につながるだけではなく、癌幹細胞および腫瘍開始を含め、腫瘍形成の主要な態様にも貢献することが報告された。Goel et al.,  Nature Reviews Cancer  13, 871-882 (2013)。
【００１４】
本開示は、ＶＥＧＦが、ＢＢＢ透過性を投与後４５分でピークに達して、約３倍まで一時的に増強し、そして、２時間後に通常の透過率に戻るという発見に、少なくとも一部基づいている。さらに、２種類の動物モデルにおけるＶＥＧＦ−Ａ１６５での前処置が、浸潤性脳腫瘍へのＴｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ（ＴＭＺ）送達、および脳卒中後の梗塞損傷を低減するためのヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）ベースの治療法を促進した。ＴＭＺによる神経膠芽腫の処置の有効性（例えば、低減された腫瘍体積、高い生存率）は、動物が低用量のＶＥＧＦであらかじめ処置されたときに改善され、そしてそれは、当該技術分野で知られている腫瘍形成におけるＶＥＧＦの役割が与えられることは予期されなかった。そのうえ、本データは、驚いたことに、ＶＥＧＦがＢＢＢを横断する小さい分子薬剤（例えば、ＴＭＺおよびドキソルビシン）の送達を容易にするだけではなく、ＢＢＢを横断する、抗体、ナノ粒子、および幹細胞を含めた巨大作用物質の送達も促進することを示した。本明細書中に提供された結果は、治療薬または診断薬の投与前の好適な時間域以内の低用量のＶＥＧＦの全身投与が、これらの作用物質に対するＢＢＢの透過性を一時的に増強することができ、その結果、脳への作用物質の送達を促進し得ることを示す。
【００１５】
従って、ＶＥＧＦと治療薬または診断薬との同時に使用によって脳疾患の処置または診断の有効性を促進する方法であって、ここで、治療薬／診断薬の投与前の好適な時間域以内に、低用量にてＶＥＧＦを全身送達し得る方法；および斯かる方法をおこなうためのキットが、本明細書中に提供されている。
【００１６】
定義
便宜上、本開示に関連して用いられる特定の用語をここにまとめる。別段の規定がない限り、本明細書中に使用される学術用語は、本願発明が属する当該技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
単数形の「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段明確に指示しない限り、複数の指示物を含むように本明細書中に使用される。
【００１７】
「処置」という用語は、本明細書中で使用される場合、所望の薬理学的および／または生理学的効果、例えば癌増殖の遅延または阻害する、または臓器（例えば、脳）に対する虚血性損傷を改善することを意味することを意図する。効果は、その疾患または症状を完全または部分的に予防することに関しては予防効果であり得、および／または疾患および／または疾患に起因する有害影響の部分的または完全な治癒に関しては治療効果であり得る。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「処置」とは、哺乳動物、特にヒトの疾患の予防手段（例えば、予防薬）、治療または緩和的治療を伴い；そして、（１）疾患に対して前処置されてもよいが、まだそれを有していると診断されていない個人において疾患または症状（例えば、癌または心不全）の発生の予防手段（例えば、予防薬）、治療または緩和的治療；（２）（例えば、その発生を抑えるのによる）疾患の阻害；または（３）（例えば、疾患に関連している症状を軽減する）疾患の緩和、を含む。
【００１９】
「投与した」、「投与すること」または「投与」という用語は、本発明の作用物質（例えば、化合物または組成物）を、これだけに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、動脈内、脳内、または皮下投与することを含め、送達のモードを指すために本明細書中で互換的に使用される。本開示の一実施形態において、増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ）、治療薬または造影のための造影剤を静脈内または脳内注射によって対象に直接投与する。全身投与は、全身が影響を受けるような循環系への作用物質の投与経路である。投与は、経腸投与（胃腸管を通した薬剤の吸収）または非経口投与（注射、輸液、または移植）を介しておこなわれる。
【００２０】
「有効量」という用語は、本明細書中で使用される場合、疾患の処置に関して所望の結果を達成するのに必要な有効性の量、投薬量、および期間を指す。例えば、癌の処置では、癌の任意の症状を軽減、予防、遅延、または抑制もしくは進行を止める作用物質（すなわち、化合物または組成物）も有効である。有効量の作用物質は、疾患または体調を治療するのに必要でないが、疾患または体調の発症を、遅らせる、妨げる、または予防する、あるいは疾患または体調の症状が緩和されるように、疾患または体調に関する処置を提供する。有効量は、示された期間中を通じて１回、２回またはそれを超える回数投与されるべき１個、２個またはそれを超える個数の好適な形態に分割されてもよい。
【００２１】
「対象」または「患者」という用語は、本発明の方法で処置可能である、人類を含めた動物を指す。「対象」または「患者」という用語は、一方の性別が特別に示されない限り、男性と女性の両方を指すことを意図している。従って、「対象」または「患者」という用語は、本開示の治療法の利益を受け得るあらゆる哺乳動物を含む。
【００２２】
「腫瘍」および「癌」という用語は、本明細書中に互換的に使用され、そして、制御されていない増殖、分化の欠如、および／または局部組織に浸潤および転移する能力をもたらす正常な制御の喪失が独自特性であるあらゆる細胞性悪性腫瘍を意味することを意図している。ヒト脳腫瘍としては、これだけに限定されるものではないが、神経膠腫、転移、髄腹腫、脳下垂体腺腫、および聴神経腫が挙げられる。神経膠腫の例としては、星細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、低悪性度星細胞腫、退形成星細胞腫、多形性膠芽腫、脳幹膠腫、上衣腫、上衣下細胞腫、神経節性神経腫、混合膠腫、希突起神経膠腫、および視神経膠腫が挙げられる。非神経膠腫の例としては、聴神経腫、脊索腫、ＣＮＳリンパ腫、頭蓋咽頭腫、血管芽腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫瘍、脳下垂体腫瘍、原始神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）、ラブドイド腫瘍、およびシュワン腫が挙げられる。脳神経に影響する腫瘍としては、視神経の神経膠腫、第八脳神経の神経線維腫、第五脳神経の神経線維腫が挙げられる。良性腫瘍としては、くも膜腫、類皮腫、類上皮腫、膠質腫、神経上皮嚢胞腫、およびその他の増殖の遅い腫瘍が挙げられる。先に記載したもののような原発性脳腫瘍は脳自体で起こるが、転移性脳腫瘍（身体の別の部分の癌として始まる二次脳腫瘍）が最も一般的な脳腫瘍である。脳の転移癌としては、これだけに限定されるものではないが、肺、皮膚（黒色腫）、腎臓、結腸および乳房で起こる癌を含めた原発癌から拡散し得る。
【００２３】
「脳卒中」という用語は、本明細書中で使用される場合、脳の全部または一部への血液の供給が遮断されるか、または低減するあらゆる事象を意味することを意図している。脳卒中は、血栓形成、塞栓症または出血によって引き起こされる可能性があり、虚血性脳卒中（血栓性脳卒中および塞栓性脳卒中を含み、そして、血栓形成、塞栓症、全身的低潅流などから生じる）または脳出血（高血圧性脳内出血、クモ膜下出血、硬膜下出血、硬膜外出血などから生じる）と呼ぶこともできる。本明細書中に使用される場合、脳卒中は、熱中症および一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）を除外する。熱中症は、体温上昇から生じ、脳におけるその臨床徴候は、本明細書中に規定される脳卒中の臨床徴候（すなわち、脳内の酸素低下を伴う血液供給の中断）と異なっている。ＴＩＡは「ミニ脳卒中」と呼ばれることもあるが、しかしながら、出現の２４時間以内に完全に解決するそれらの能力のため、それらは本明細書中に規定される脳卒中と区別される。脳卒中は、例えばコンピューター断層撮影法（ＣＴ）スキャン（例えば、造影剤を用いない）、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）スキャン、Ｄｏｐｐｌｅｒ超音波、動脈造影などの神経学的検査、血液検査、および／または医療画像処理技術によって診断される。
【００２４】
「神経精神疾患」という用語は、４つの心的能力のどの影響を受けるかによって一般的に標識される神経障害を意味することを意図している。例えば、第一群は、統合失調症や譫妄などの思考や認識の疾患を含み；第二群は、情動障害や不安症などの気持ちの疾患を含み；第三群は、文字欠陥や人格障害など社会的行動の疾患を含み；第四群は、精神遅滞や認知症などの学習、記憶、および知能の疾患を含む。従って、本開示の神経精神疾患は、統合失調症、譫妄、アルツハイマー病（ＡＤ）、うつ病、躁病、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、薬物中毒、軽度認識障害、認知症、興奮、感情鈍麻、不安症、精神病、外傷後ストレス障害、興奮性、および双極性障害を包含する。
【００２５】
「神経変性疾病」という用語は、本明細書中で使用される場合、神経系の異なった領域におけるニューロンの死滅および影響を受けた対象の最終的な機能損傷を特徴とする体調を指す。本開示の神経変性疾病は、アルツハイマー病（ＡＤ）、好銀性顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアム型ＡＬＳ−パーキンソン認知症症候群、血管性認知症、前頭側頭認知症、意味認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、封入体ミオパシー、封入体筋炎、またはパーキンソン病（ＰＤ）を包含する。
【００２６】
ＢＢＢを横断した治療薬／診断薬の送達を容易にするためのＶＥＧＦの使用
本開示の一態様は、ＶＥＧＦと治療薬または診断薬の同時使用を伴う脳疾患を治療するかまたは診断する方法を特徴とし、ここで、ＶＥＧＦは、治療薬または診断薬の投与前の好適な時間域中に低用量で全身投与される。ＶＥＧＦと同時に、例えばＩＧＦ−ＩやＩＧＦ−ＩＩなどの他の増殖因子もまた、は本明細書中に記載した方法で使用されてもよい。
【００２７】
（ｉ）ＶＥＧＦ
本明細書中で特に言及した５つのファミリーのいずれのＶＥＧＦも、本明細書中に開示した方法に使用できる。ＶＥＧＦは、好適な起源、例えばヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、イヌ、およびネコに由来し得る。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した方法で使用されるＶＥＧＦ分子は、例えばＶＥＧＦ−Ａ165アイソフォームなどのＶＥＧＦ−Ａ分子である。ヒトＶＥＧＦ−Ａ165のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR（配列番号１）。
【００２８】
場合によっては、本明細書中に記載した方法で使用されるＶＥＧＦ分子は、野生型ＶＥＧＦである。他の例では、それは改変された変異型であってもよく、そしてそれは、野生型対応物と同じであるかまたは同様の生理活性を維持している。
【００２９】
斯かる改変された変異型は、野生型対応物に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を共有し得る。２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993のように修正されたKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して決定される。斯かるアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、着目のタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実行され得る。２つの配列の間にギャップが存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載のとおり利用できる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定のパラメーターが使用できる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、改変された変異型は、野生型対応物と比べて１若しくは複数の保存的なアミノ酸残基置換から成る。当業者は、保存的なアミノ酸置換が、機能的に同等な変異型をＶＥＧＦ分子において作製し得る、すなわち、変異型が特定のＶＥＧＦの機能的な能力を維持することを認識している。本明細書中に使用される場合、「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるンパク質の相対荷電またはサイズ特性を変更しないアミノ酸置換を指す。変異型は、当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製されることができ、そしてそれは、例えば斯かる方法列挙する参照文献、例えば：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds.,  John Wiley & Sons, Inc., New Yorkで見られるような方法などである。アミノ酸の保存的置換としては、以下の群内のアミノ酸の中でなされた置換が挙げられる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００３１】
一般的に機能的に同等な変異型を作製するためのＶＥＧＦのアミノ酸配列の保存的なアミノ酸置換は、変異体をコードする核酸の改変によってなされる。斯かる置換は、当業者に知られているさまざまな方法によって可能である。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲ定方向突然変異、Kunkel（Kunkel, PNAS 82: 488-492, 1985）の方法による部位特異的突然変異誘発、またはＶＥＧＦ変異型をコードする核酸分子の化学合成によってなされてもよい。
【００３２】
本明細書中に記載した方法に使用するためのＶＥＧＦ分子はいずれも、従来の方法によって調製され得る。例えば、分子は、所定のタンパク質精製方法に従って好適な天然源から単離できる。あるいは、それは、従来の組み換え技術によって好適な宿主細胞で産生できる。
【００３３】
（ｉｉ）医薬組成物
本明細書中に記載した方法に使用するための活性物質（例えば、ＶＥＧＦ、治療薬、および診断薬）はいずれも、バッファーを含めた医薬的に許容し得る担体（賦形剤）と混合されて、スクレロスチン発現を阻害する、骨芽細胞分化を促進する、および／または骨折治癒を促進するのに使用するための医薬組成物を形成し得る。「許容される」は、担体が組成物の有効成分に適合できる必要がある（そして好ましくは、有効成分を安定させることができる）および処置されるべき対象にとって有害でないことを意味する。バッファーを含めた医薬的に許容される賦形剤（担体）は、当該技術分野で周知である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照のこと。
【００３４】
本方法で使用されるべき医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態での医薬的に許容し得る担体、賦形剤、または安定化剤を含み得る。（Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover）。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投薬量および濃度において受容者に対して無毒性であり、かつ、例えばリン酸、クエン酸、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；、保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニールピロリドンなどの親水性重合体；例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎタンパク質錯体）；および／または、例えばＴＷＥＥＮ(商標)、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(商標)またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。医薬的に許容される賦形剤は、本明細書中にさらに記載されている。
【００３５】
一例において、１もしくは複数の活性物質が液体医薬組成物に処方されてもよく、そしてそれは、例えば静脈内、筋肉内、皮下または腹腔内注射によって投与できる無菌の溶液または懸濁液である。無菌の注射剤溶液または懸濁液を製造するための好適な希釈剤または溶媒としては、これだけに限定されるものではないが、１，３−ブタンジオール、マンニトール、水、リンゲル溶液、および等張食塩溶液が挙げられる。また、例えばオレイン酸やそのグリセリド誘導体などの脂肪酸も、例えばオリーブ油またはヒマシ油などの天然の医薬的に許容されるオイルである場合、注射可能物質に有用である。これらの油溶液または油懸濁液もまた、アルコール希釈剤、カルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤を含み得る。例えばＴｗｅｅｎｓまたはＳｐａｎｓなどの他の一般的に使用される界面活性剤または医薬的に許容される剤形を製造する際に一般的に使用される他の同様の乳化剤または生物学的利用能促進剤もまた、製剤目的に使用できる。
【００３６】
いくつかの例において、本明細書中に記載の医薬組成物は、１つの活性物質（例えば、ＶＥＧＦ）を含有するリポソームを含み、そしてそれは、例えばEpstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載の方法など当該技術分野で知られている方法によって調製できる。高い循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって作り出される。リポソームは、規定の細孔径のフィルタを通して押出成形されて、所望の直径を有するリポソームをもたらす。
【００３７】
活性物質（例えば、ＶＥＧＦ分子）はまた、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンで、例えばコアセルベーション技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内にそれぞれ封入されてもよい。斯かる技術は、当該技術分野で知られている、例えばRemington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)を参照のこと。
【００３８】
インビボ投与に使用されるべき医薬組成物は無菌でなければならない。これは、例えば無菌濾過膜を通過させる濾過によって容易に達成される。一般的に、治療組成物は、無菌の投与口を有するコンテナ、例えば静脈注射用の溶液バッグまたは皮下注射針で貫通可能な栓を有するバイアル内に入れられる。
【００３９】
本明細書中に記載した医薬組成物は、経口的、非経口、もしくは直腸投与、または吸入もしくは吹送による投与のための、例えば錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液もしくは懸濁液、または坐剤などの単位剤形で存在し得る。
【００４０】
例えば錠剤などの固体組成物を調製するために、主要な有効成分は、医薬担体、例えばコーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムもしくはゴム、または他の医薬的希釈剤、例えば水などの従来の錠剤構成要素と混合されて、本発明の化合物または無毒の医薬的に許容し得るその塩の均一混合物を含有する固形の予備処方組成物を形成する。均質なものとしてこれらの予備処方組成物に言及するとき、有効成分は、該組成物が等しく有効な単位剤形（例えば錠剤、丸薬およびカプセル剤など）に容易に小分けされ得るように、組成物中に均等に分散されていることを意味する。次に、この固形予備処方組成物は、０．１〜約５００ｍｇの本発明の有効成分を含む先に記載したタイプの単位剤形に小分けされる。新規組成物の錠剤または丸薬は、持効性の利点を提供する剤形を提供するために被覆されても、または別の方法で調合されてもよい。例えば、錠剤または丸薬は内剤と外剤を含むことができ、後者は前者の上に包被形態で存在する。２つの成分が、胃での崩壊に抵抗する役目を果たす腸溶性層によって区切られ、そして、内側の成分が完全な状態で十二指腸に通過するか、または放出を遅らせることを可能にする。さまざまな材料が、斯かる腸溶性層またはコーティングのために使用でき、斯かる材料としては、多くの高分子酸、および例えばセラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような材料と高分子酸との混合物を含む。
【００４１】
好適な界面活性剤としては、特に、非イオン性作用物質、例えばポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ(商標)２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ(商標)２０、４０、６０、８０または８５）が挙げられる。界面活性剤を有する組成物は、都合よくは０．０５〜５％の界面活性剤を含み、そして、０．１〜２．５％であってもよい。必要であれば、他の構成要素、例えばマンニトールまたは他の医薬的に許容されるビヒクルが加えられてもよいことは理解される。
【００４２】
好適な乳濁液は、例えばＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ(商標)、Ｌｉｐｏｓｙｎ(商標)、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ(商標)、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ(商標)およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ(商標)などの市販の脂肪乳剤を使用することで調製され得る。有効成分は、予混合乳濁液組成物中に溶解されてもよく、または代わりに、それは、オイル（例えばダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油またはアーモンド油）中に溶かされ、そして、リン脂質（例えば、卵のリン脂質、ダイズリン脂質またはダイズレシチン）と水とを混ぜ合わせることによって乳濁液が形成されてもよい。乳濁液の張度を調整するために他の構成要素、例えばグリセロールまたはグルコースが添加されてもよいことは理解される。例えば、好適な乳濁液は一般的に、最大２０％、例えば５〜２０％のオイルを含む。脂肪乳剤は、０．１〜１．０．ｉｍ、特に０．１〜０．５．ｉｍの脂肪滴を含み、かつ、５．５〜８．０の範囲内のｐＨを有する。
【００４３】
乳濁液組成物は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ(商標)またはその成分（ダイズ油、卵のリン脂質、グリセロール、および水）とＶＥＧＦまたは治療薬／診断薬を混合することによって調製されたものであってもよい。
【００４４】
吸入または吹送のための医薬組成物としては、医薬的に許容される水性または有機溶媒中の溶液および懸濁液、またはその混合物、ならびに散剤が挙げられる。液体または固体組成物は、先に詳述した好適な医薬的に許容される賦形剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、局所的または全身作用のための経口または経鼻の呼吸経路によって投与される。
好ましくは、無菌の医薬的に許容される溶媒中の組成物は、ガスの使用によって噴霧されてもよい。
【００４５】
噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接吸い込まれてもよく、または噴霧デバイスはフェイスマスク、テントまたは間欠的陽圧呼吸装置に取り付けられてもよい。溶液、懸濁液または粉末組成物は、適切な様式で製剤を送達するデバイスから、好ましくは経口的にまたは経鼻的に投与され得る。
【００４６】
（ｉｉｉ）治療適用
ＶＥＧＦ（ならびに他の増殖因子）は、脳腫瘍、脳卒中、神経精神疾患、または神経変性疾病、例えば本明細書中に記載した疾患を含めた脳疾患を治療するかまたは診断するための治療薬または診断薬と同時に使用できる。本明細書中に記載した方法はまた、脳の造影にも適用できる。
【００４７】
本明細書中に記載した方法を実施するために、ＶＥＧＦ（例えば、ヒトＶＥＧＦ−Ａ165）を含む医薬組成物、および好適な治療薬または診断薬を含む医薬組成物は、処置（例えば、本明細書中に記載した処置）を必要としているあらゆる対象に連続して投与できる。ＶＥＧＦは、治療薬または診断薬の投与前の好適な時間域の間に投与され得る。例えば、ＶＥＧＦは、治療薬または診断薬投与の５時間前より後に投与され得る。いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦは、治療薬または診断薬投与の１５〜１８０分前（例えば１５〜１２０、１５〜９０、１５〜６０、３０〜１２０、３０〜９０、または３０〜６０分前）に投与する。いくつかの実施形態において、増殖因子は、治療薬または診断薬投与の１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分または５０分前に投与され得る。一例において、ＶＥＧＦは、治療薬または診断薬投与の４５分前に投与される。別の例において、ＶＥＧＦは、治療薬または診断薬投与の３時間前に投与される。
【００４８】
あるいは、増殖因子および治療薬／診断薬は同時に投与されてもよい。
増殖因子、ならびに治療薬／診断薬は、例えば経口、経鼻、肺、例えば受動またはイオン泳動送達などの経皮、あるいは非経口、例えば直腸、デポー剤、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、動脈内、頭蓋内、小脳内、皮下、点眼液または軟膏剤などで適切なまたは所望の作用部位に増殖因子および／または治療薬を効率的に輸送し得る任意の経路によって、哺乳動物、好ましくはヒトに投与され得る。さらに、治療薬と本願発明の増殖因子の投与は、同時であっても、または連続していてもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態において、例えばＶＥＧＦなどの増殖因子は、従来の全身経路、例えば静脈内注射によって投与されてもよい。注射可能の組成物は、例えば植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、イソプロピルミリステート、エタノール、およびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）などの様々な担体を含んでもよい。静脈内注射において、例えばＶＥＧＦなどの水溶性造影剤が、滴下法によって投与でき、それによって、作用物質と生理学的に許容される添加剤を含む医薬製剤が注入される。生理学的に許容される賦形剤は、例えば５％のデキストロース、０．９％の生理的食塩水、リンゲル液または他の好適な賦形剤を含んでもよい。筋肉内調製物、例えば、好適な可溶性塩形態の作用物質の無菌製剤は、例えば注射用の水、０．９％の生理的食塩水、または５％のグルコース溶液などの医薬賦形剤中に溶解され、そして投与され得る。
【００５０】
ＶＥＧＦなどの増殖因子は、低用量で対象に投与され得る。いくつかの例において、ＶＥＧＦは、５〜２００ｎｇ／ｋｇの量で対象（例えば、ヒト対象）に投与される。選択された用量の増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ）が、ＢＢＢの透過性を高めるのに十分高くなくてはならないが、必然的に脳に対するその後の損害（例えば、水腫）に通じるＢＢＢの構成構造を混乱させるには不十分でなければならない。従って、ＶＥＧＦなどの増殖因子は、好ましくは約１０〜１００ｎｇ／ｋｇ、例えば約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇ／ｋｇといった量で対象（例えば、ヒト対象）に投与される。より一層好ましくは、増殖因子は、約１５〜５０ｎｇ／ｋｇ、例えば約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｎｇ／ｋｇといった量で対象に投与される。最も好ましくは、増殖因子は、約２５ｎｇ／ｋｇの量で対象に投与される。
【００５１】
本開示の増殖因子および／または治療薬の投薬量は、最後には、係りつけの医師の裁量である適切な投薬量と、選択された特定の増殖因子または治療薬、投与経路、および増殖因子または治療薬が患者において期待される応答を引き出す能力だけでなく、例えば緩和すべき疾患の状況および体調の重症度、患者の年齢、性別、体重、患者の現在状態、および処置される病的状態の重症度、患者のその後の併用薬物療法または特別食、ならびに当業者が認める他の条件などの要因によっても患者ごとに異なることが理解される。用法用量は、期待の応答を提供するように調整されてもよい。好ましくは、本発明の増殖因子は、ＢＢＢに対する透過性が増強され、そして、治療薬の少なくとも１つの投薬量が対象に投与されて改善された治療反応を達成するような量および時間にて投与され得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した方法は、例えば神経膠芽腫などの脳腫瘍（多形性神経膠芽腫）を処置するために適用され得る。例えば本明細書中に開示したものなどの抗癌剤が、本明細書中に提供した開示に従ってＶＥＧＦ（ならびに本明細書中に記載した別の増殖因子）と同時に使用されてもよい。低用量のＶＥＧＦが、小分子薬剤だけではなく、タンパク質薬物／ナノ粒子／幹細胞に対してもＢＢＢ透過性を増強することがわかった。従って、小分子抗癌剤および生物製剤の両方が、本明細書中に記載したＶＥＧＦと同時に使用されて、脳腫瘍の治療効能を増進する。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載した方法は、これだけに限定されるものではないが、脳卒中、神経精神疾患、または神経変性疾病を含めた脳障害を処置するために適用され得る。斯かる脳疾患の例は、本明細書中に提供されている。いくつかの例において、ＭＳＣｓなどの幹細胞が、本明細書中に提供された開示に従って、脳卒中または神経変性疾病を処置するためにＶＥＧＦ（ならびに本明細書中に記載した他の増殖因子）と同時に使用されてもよい。他の例では、脳卒中を処置するために、抗凝血物質（例えば本明細書中に記載したもの）がＶＥＧＦと同時に使用されてもよい。さらに、本明細書中に記載したもののいずれかを含めた抗精神病薬または抗認知症薬が、精神病または認知症を治療するのにＶＥＧＦと同時に使用されてもよい。これらの標的疾患の例もまた、本開示に提供する。
【００５４】
他の実施形態において、本明細書中に記載した方法は、例えば造影剤（contrast agent）などのイメージング剤（imaging agent）と共にＶＥＧＦ（または他の増殖因子）を同時に使用することによって、脳の造影のために適用できる。造影剤は、例えば陽電子断層撮影法（ＰＥＴ）または単一光子放射型断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などのコンピューター断層撮影法（ＣＴ）；または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を使用して検出できる。
【００５５】
脳障害の治療または診断に使用するためのキット
本開示はまた、脳疾患を治療するかまたは診断するための本明細書中に記載した方法に使用するためのキットを提供する。斯かるキットは、ＶＥＧＦを含む第一の製剤が入った一方と、本明細書中に記載した治療薬（例えば、抗癌剤）または本明細書中に記載した診断薬（例えば、イメージング剤）を含む第二の製剤の入ったもう片方の、少なくとも２個のコンテナを包含し得る。
【００５６】
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書中に記載した方法のいずれかによる使用の取扱説明書を含み得る。包含されている取扱説明書は、本明細書中に記載した標的脳疾患を治療または診断するためのＶＥＧＦおよび／または治療薬／診断薬の投与に関する説明を含み得る。キットは、個人が標的疾患を有しているかどうかを同定することに基づいた、処置にふさわしい個人の選択に関する説明をさらに含んでもよい。さらに他の実施形態において、取扱説明書は、標的疾患の危険性がある個人に対するＶＥＧＦまたは治療薬／診断薬の投与に関する説明を含んでもよい。
【００５７】
ＶＥＧＦおよび／または治療薬／診断薬の使用に関連する取扱説明書は通常、意図された処置または診断のための投薬量、服薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。コンテナは、単位用量、大量包装（例えば、複数用量の包装）または副次的単位用量であってもよい。本明細書中に記載したキットで供給された取扱説明書は、一般的にラベルまたは添付文書による書面での指示（例えば、キットに入っている紙シート）であるが、機械で読み取り可能な取扱説明書（例えば磁気または光学記憶ディスク上に収められた取扱説明書）もまた許容され得る。
【００５８】
ラベルまたは添付文書は、組成物が本明細書中に記載したものなどの脳疾患または障害を処置または診断する、発症を遅らせる、および／または緩和するために使用されることを表示している。取扱説明書は、本明細書中に記載した方法のいずれかを実施するために提供され得る。
【００５９】
本願発明のキットは好適な包装状態で存在する。好適な包装としては、これだけに限定されるものではないが、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟な包装（例えば、密閉されたＭｙｌａｒまたはポリ袋）が挙げられる。例えば吸入器などの特定のデバイス、鼻腔内投与デバイス（例えば、アトマイザー）またはミニポンプなどの注入デバイスと組み合わせて使用するための包装もまた、企図されている。キットは、無菌の投与口を有してもよい（例えば、コンテナは、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。コンテナもまた、無菌の投与口を有してもよい（例えば、コンテナは、皮下注射針で貫通可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。
【００６０】
キットは、例えばバッファーや説明に役立つ情報などの追加要素を適宜提供してもよい。通常、キットは、
コンテナおよびコンテナ上のまたは付随したラベルまたは（単数若しくは複数の）添付文書を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、製造物品を含んでいる、先に記載したキットの内容物を提供する。
【００６１】
一般的な方法
本発明の実施では、別段の指示がない限り、（遺伝子組み換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生理学、生化学、および免疫学の従来技術を利用し、そしてそれは、当該技術分野の技能の範囲内にある。分子クローニング：A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；細胞生理学：A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；細胞及び組織培養：Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987)；ＰＣＲ：The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；抗体：a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；モノクローナル抗体：a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；抗体の使用：a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。
【００６２】
さらに詳述することなく、上記の説明により当業者は本発明を存分に実施できるものと考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は例証に過ぎず、それ以外の開示を何ら限定するものではないと解釈すべきである。本明細書中に引用されたすべての刊行物はいずれも、本明細書中に参照された目的または内容について参照によって援用される。
【実施例】
【００６３】
実施例１：マウスモデルにおいてＶＥＧＦは血液脳関門の透過性を高めた
材料と方法
（ｉ）エバンスブルー（ＥＢ）浸出によるＢＢＢ透過性の測定
ＢＢＢ透過性を、エバンスブルー（Fluka）によって量的に評価した。エバンスブルー（生理的食塩水中に２％または４％ｖ／ｖ、４ｍｌ／ｋｇ）を静脈内に注射した。浸出分析のために、動物を、動脈、腎臓、および肝臓から無色の液体が出てくるまで５０ｍｌの０．９％ 生理的食塩水（１０ｉ．ｕ．／ｍｌのヘパリンを含む）で灌流して、脈管内の色素を取り除いた。次に、動物を屠殺し、そして、脳を計量し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Sigma-Aldrich）（１ｍｌ／１５０ｍｇ組織重量）中で均質化し、１８時間５５℃にてインキュベートし、遠心分離した（１４０００ｒｐｍ／２０分）。色素上清を６２０ｎｍにて分光測光によって分析した。ＭＣＡＯモデルラットに関しては、脳を梗塞側と非梗塞側に分割し、両側からの上清を計測した。
【００６４】
（ｉｉ）ＢＢＢ透過性に対するＶＥＧＦ作用の測定
ＶＥＧＦ投薬量；対照（生理的食塩水のみ）、０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１．０μｇ／ｋｇ、および２．０μｇ／ｋｇのＶＥＧＦ、に応じて、マウスを６つの群に割り付けた。ＢＢＢ透過性を、先に記載したように、ＶＥＧＦ注射の１時間後のＥＢアッセイによって測定した。最大のＢＢＢ透過性に達する最も低用量のＶＥＧＦを更なる実験のために選択した。ＶＥＧＦおよび薬物送達の最適なタイミングを、最適なＶＥＧＦ用量注射後のさまざまな時点（０、１５、３０、４５、６０、１２０分）でのＥＢ浸出を調べることによって確立した。
【００６５】
（ｉｉｉ）ナノ粒子の調製と注射
ＣＯＯＨ−修飾ナノ粒子（２０〜５００ｎｍ）を、以前に刊行されたプロトコール（Nance et al., Sci Transl Med 4(149): 149ra119; 2012）に従ってメトキシ（ＭｅＯ）−ＰＥＧ−アミン（ＮＨ2）を用いて共有結合修飾した。２０ｎｍ、１００ｎｍ、および５００ｎｍのペグ化蛍光ナノ粒子を、ＦＶＢマウスへの静脈内注射および潅流後の生体分布および浸出を調査するのに使用した。これらのナノ粒子を、ＩＶＩＳと免疫組織化学によって定量化した。
【００６６】
（ｉｖ）ＩＶＩＳ造影
すべてのＩＶＩＳ画像を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍデバイス（PerkinElmer, Waltham, MA）を使用して取得した。
【００６７】
（ｖ）統計的分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェアをデータ分析に使用した。結果を、図面の説明に示したように、標準誤差（ＳＥＭ）または標準偏差（ＳＤ）を伴った平均値として提示する。Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡを多重比較に使用した。２つの群を比較する場合、片側スチューデントｔ−検定が使用して統計的有意性を決定した。結果はＰ＜０．０５で有意であると見なした。
【００６８】
結果
（ｉ）時間域内の低用量でのＶＥＧＦ前処置はＢＢＢ透過性を増強した
この実施例において、ＢＢＢ透過性を増強するＶＥＧＦ前処置の時間域および投薬量を調査した。マウスを、最初に生理的食塩水（対照）または様々な用量のＶＥＧＦ１６５Ａ（０．１μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１．０μｇ／ｋｇ、および２．０μｇ／ｋｇ）で処置し、次に、ＶＥＧＦ処置後のさまざまな時点（０、１５、３０、４５、６０、および１２０分）でＥｖａｎ Ｂｌｕｅ（ＥＢ）を投与した。ＢＢＢ透過性を、「材料と方法」の項に記載の手順に従ってマウス脳組織内のＥＢレベルを計測することによって評価した。結果を図１に示す。
【００６９】
図１、パネルＡで示されるように、ＶＥＧＦは、試験用量にてＥＢのＢＢＢ透過性を増強した。０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦによって引き起こされたＢＢＢ透過性の経時変化をさらに調査し、結果を図１、パネルＢに示した。ＥＢをＶＥＧＦ注射の１５分後に注射したとき、有意なＢＢＢ透過性の増大を観察し、そして、透過性の増大は、少なくとも６０分間持続し、約４５分で最大の透過性が起こった。
よって、この試験から得られた結果は、低用量でのＶＥＧＦの前処置が作用物質のＢＢＢ透過性を促進できることを示し、低用量のＶＥＧＦがＢＢＢを横断する薬物送達を容易にするために使用できることを示唆した。
【００７０】
（ｉｉ）ＶＥＧＦ前処置は、マウスにおいてＢＢＢを通過するペグ化蛍光ナノ粒子の浸透を増強した
マウスにおけるＢＢＢを横断するペグ化蛍光ナノ粒子の浸透を促進するための低用量のＶＥＧＦ前処置の効果を調査した。最初に、マウスに低用量のＶＥＧＦ（０．３μｇ／ｋｇ）を静脈内に注射した。ＶＥＧＦ注射の４５分後、様々なサイズ（直径２０ｎｍ、１００ｎｍまたは２００ｎｍ）を有するペグ化ナノ粒子をマウスに注射した。ナノ粒子の注射の３０分後に、マウスを所定の手順に従った潅流にかけ、そして、脳組織をＩＶＩＳ造影および免疫組織化学によって分析した。図２、パネルＡ。（すなわち、ＢＢＢを通過して）脳組織に蓄積したナノ粒子の量を、蛍光シグナルの強さを計測することによって決定した。結果を、図２、パネルＢ〜Ｄに示す。
【００７１】
この試験から得られた結果は、低用量でのＶＥＧＦの前処置がナノ粒子のＢＢＢ通過を容易にし、および小粒子（例えば、２０ｎｍの粒子）が大粒子（例えば、５００ｎｍの粒子）に対して、より高い浸透速度を示した。
【００７２】
（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ前処置は、マウスにおいてＢＢＢを通過する抗体の浸透を増強した
８週齢の雄ＦＶＢマウスに、抗ｎｒＣＡＭ抗体の注射の４５分前に、０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦ１６５Ａまたは標準生理的食塩溶液対照のいずれか静脈内注射し、そしてそれを、組織切片を染色するための標識二次抗体を使用して検出した。脳が取り出し、そして、組織学切片を調製する前に１時間、抗体を循環させた。正の対照として、標識抗ｎｒＣＡＭ抗体を直接脳組織に注射した。二次抗体を陰性対照として使用した。実験対照として、標準生理的食塩水を注射し、その後、標識した抗ｎｒＣＡＭ抗体を注射した。
【００７３】
マウスを屠殺し、そして、Ａｌｅｘａ−４８８に結合した二次抗体を使用した脳組織の免疫組織化学分析のために調製した。ＶＥＧＦ処置動物は脳組織においてより強いシグナルを示し、より多くの注射抗ｎｒＣＡＭ抗体が脳に浸み込んだことを示した。図７。蛍光シグナルの強さを、ＩｍａｇｅＪで定量化し（１群あたりｎ＝３サンプル）、そして、バックグラウンドを陰性対照に対して補正した。結果は、ＶＥＧＦ処置後のシグナル強度の約５倍の増加を示す。
この試験は、低用量のＶＥＧＦ前処置がＢＢＢを横断した抗体などの巨大分子の送達を容易にしたことを示した。
【００７４】
実施例２：ＶＥＧＦ前処置は、脳卒中後のｈＭＳＣベースの細胞療法を促進した
脳血管障害（ＣＶＡ）としても知られている脳卒中は、脳への血液供給の障害による脳機能の急速な損失である。脳卒中には：脳出血性脳卒中および虚血性脳卒中の２つの型がある。脳出血性脳卒中は、頭蓋内動脈の破損から生じ、その結果、急性頭蓋内血腫を引き起こす。脳梗塞としても知られている虚血性脳卒中は、例えば血栓または遠位塞栓症によるなどして血流量が妨げられた脳の領域における脳の細胞死である。現在、虚血性脳卒中のための２つの標準的治療法は、血栓溶解剤の注射と血管内手順であり、その両方が、局所的な血流量を再確立し、そして、できるだけ早く脳組織に対する低酸素性障害を低減することを目指す。
【００７５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞に分化できる多分化能ストロマ細胞の異種集団である。以前の試験は、ＭＳＣｓが脳損傷後の内在性回復応答を活性化し得ることを示す。Horita et al., Journal of Neuroscience Research 84(7): 1495-1504; 2006; and Li et al., Neurosci Lett 456(3): 120-123; 2009。よって、この実施例において、発明者らは、（１）脳卒中を処置するため、または（２）コンピューター断層撮影法（ＣＴ）またはＭＲＩ向けの改善された脳画像を提供するために、低用量のＶＥＧＦの助けによってＢＢＢを横断して（１）ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）または（２）造影剤を送達する可能性を探った。
【００７６】
中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）ラットモデルを、ＢＢＢを横断したｈＭＳＣｓの浸透に対する低用量のＶＥＧＦ前処置の効果を調査するために使用した。Boykoと同僚（Boyko, et al., Journal of Neuroscience Methods 193(2): 246-253; 2010）によって刊行された手順を、ラットの中脳動脈塞栓（ＭＣＡＯ）モデルを作出するために使用した。要するに、左側頚動脈分岐部を、セルフリトラクターを用いて晒した。末梢軟組織から内部脳動脈（ＩＣＡ）を慎重に切り離した後に、小さい開口部を近位ＩＣＡに作ることにした。シリコンコートした４−０モノフィラメントナイロンを、その開口部から挿入し、そして、前側から中大脳動脈（ＭＣＡ）の始まりまで突き通した。Ｏ２Ｃ酸素濃度計を使用して、同側ＭＣＡ血流量を経頭蓋的に観察するために使用した。血流量がうまく減少した時点で、ナイロン縫合をその場に固定して、虚血性脳卒中を模倣した。９０分の虚血性傷害後に、縫合糸を取り除いて、再潅流を可能にした。安定した再現性のよい脳梗塞はこの手順を用いて作製できた。
【００７７】
ｈＭＳＣ細胞療法のために、８００μｌのα−ＭＥＭ培地中の２×１０6個のｈＭＳＣｓを、虚血性脳障害の９０分後に投与した。すべてのＶＥＧＦ処置に関して、０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦを、虚血性傷害直後に静脈内に投与した。ＭＣＡＯモデルラットを４つの群：ＭＣＡＯのみ、ｈＭＳＣｓを伴ったＭＣＡＯ、ＶＥＧＦ処置だけを伴ったＭＣＡＯ、およびＶＥＧＦ前処置とその後のｈＭＳＣ治療法を伴ったＭＣＡＯ、に割り付けた。ＶＥＧＦ前処置を伴ったＭＣＡＯ群では、ＶＥＧＦ前処置の３５分後に、ｈＭＳＣｓを投与した。
【００７８】
イソギンチャクモドキ属（Discosoma sp.）の赤色蛍光タンパク質（Ｄｓ−Ｒｅｄ）を発現するヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）をＭＣＡＯ細胞療法に使用した。細胞を、５％のＣＯ2で３７℃にて、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で規定通りに培養し、維持した。
梗塞サイズを計測するために、虚血再灌流傷害および処置の３日後に、ラットを屠殺した。脳を摘出し、そして、冠状切片を厚さ２ｍｍにスライスし、そして、２％の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）で２０分間染色した。次に、脳切片をスキャンし、そして、梗塞サイズを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて血の気のない領域を計測することによって計算した。図３、パネルＣ〜Ｅ。
【００７９】
ＭＣＡＯを、低用量でのＶＥＧＦ前処置の３５分後にＤｓ−Ｒｅｄ発現性ｈＭＳＣｓを用いて処置した。Ｄｓ−Ｒｅｄから放出される定量蛍光強度は、マウス対照と比較して、低用量のＶＥＧＦであらかじめ処置したマウスにおける脳卒中後に脳へと多くのｈＭＳＣｓが送達されたことを確認した。図３、パネルＡ。ＶＥＧＦ前処置はまた、脳梗塞を軽減した。図３、パネルＢ。
【００８０】
この実施例の結果は、低用量のＶＥＧＦが、対象において約１時間ＢＢＢの透過性を増強し、そして、最大のＢＢＢ透過性がＶＥＧＦ前処置の約４５分後に生じることを確認した。これらの結果は、低用量のＶＥＧＦがＣＮＳへのＢＢＢを横断した治療薬または診断薬の送達を容易にすることを示す。
【００８１】
実施例３：ＶＥＧＦ前処置は、抗癌剤で処置したマウスにおける脳の腫瘍増殖を遅らせ、そして、ＧＢＭマウス生存率を改善した
グレードＩＶの神経膠腫としても知られている多形性神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、最も一般的で、かつ、最も浸潤性が高いタイプの脳組織の悪性腫瘍である。現行の標準的な処置は、外科的切除、放射線治療法、および化学療法の組み合わせである。ＧＢＭは、健全な組織への侵襲性および浸透性が高いので、ほとんどの患者が、外科的に切除するには腫瘍が大きくなり過ぎ、かつ、広く分散し過ぎてから診断される。そのため、現代の治療を受けたときでさえ、ＧＢＭ患者の生存率の中央値は処置を開始して１２〜１５カ月であり、すべてのヒト癌のうちの最も低い５年生存率の１つである。外科切除がめったにうまくいかないので、薬物療法が改善のための最も有望な領域である。好適な抗癌剤は既に存在している；しかし、ＢＢＢが脳腫瘍への薬物送達を妨げている。Patel et al., J Neurooncol. 61(3): 203-207; 2003。
【００８２】
この試験では、マウスＧＢＭモデルにおけるＢＢＢを横断した抗癌剤、ＴＭＺ、およびドキソルビシンの送達に対する低用量のＶＥＧＦ前処置の効果を調査した。
ルシフェラーゼを発現するヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ−８７ＭＧをすべてのＧＢＭ実験に使用した。細胞を、５％のＣＯ2、３７℃にて１０％のＦＢＳを含むＥＭＥＭ中で規定通りに培養した。
【００８３】
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに、脳内への定位的（ブレグマから右に２ｍｍかつ背側に１ｍｍ、硬膜から深さ３．５ｍｍ）注射によってＵ８７グリオーマ細胞（２×１０5個）を同所（orthotropically）異種移植した。マウス腫瘍の進行を、さまざまな時点（０、１、３、７．．．７日毎に６０日まで）にてＩＶＩＳによって計測した。
ＤＮＡメチル化剤テモゾロミド（ＴＭＺ）を、ＧＢＭモデルマウスの治療法として使用した。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ−ν／νマウスを４つの群；偽手術、ビヒクル対照（生理的食塩水）、ＴＭＺ（生理的食塩水中に５ｍｇ／ｋｇ）、およびＶＥＧＦ前処置（０．３μｇ／ｋｇ）を伴ったＴＭＺ、に割り付けた。腫瘍増殖を、インビボにおける生物発光造影によって観察した。マウスを６０日間にわたって観察し、そして、それらの生存率をカプラン−マイヤー生存率曲線に記録した。
【００８４】
先に記載した手順に従って樹立した異種移植したＧＢＭを有するマウスを３つの群：対照（ビヒクル）、ＴＭＺ（５ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ）群、およびＴＭＺ＋ＶＥＧＦ群、にランダムに割り付け、そして、腫瘍の大きさおよび生存率の経時変化を計測した。
【００８５】
図３は、低用量のＶＥＧＦ前処置の不存在または存在下、ＧＢＭマウスを（Ａ）５ｍｇ／ＫｇのＴＭＺまたは（Ｂ）２０ｍｇ／ＫｇのＴＭＺのいずれかで処置したときの腫瘍体積の経時変化を示す。５ｍｇ／ｋｇのＴＭＺが、（ＴＭＺによって処置されなかったＧＢＭマウスと比較して）少なくとも２０日間ＧＢＭの増殖を遅らせるのに十分であり、そして、ＶＥＧＦ（０．３μｇ／ｋｇ）で前処置がＴＭＺによる腫瘍増殖の遅延をさらに促進することがわかった。同様の結果を、マウスを２０ｍｇ／ｋｇのＴＭＺで処置したときに観察した（図３、パネルＢ）。高用量のＴＭＺ（２０ｍｇ／ｋｇ）は、低用量のＴＭＺ処置（５ｍｇ／ｋｇ）と比べて改善された処置効果を呈さなかった。
試験動物の生存率を、表１にまとめる。
【００８６】
表１．低用量のＶＥＧＦ前処置がＧＢＭマウスの生存率を改善した
【表１】
0006787882.tif 000002
【００８７】
要するに、低用量でのＶＥＧＦ前処置が、ＴＭＺの抗ＧＢＭ効果を改善し、そしてそれが、試験動物の寿命の延長にはっきりと表れた。生存率の中央値は、５ｍｇ／ｋｇのＴＭＺ単独で処置したものより１０％高い。
さらに、６つの重要臓器、脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓、および心臓への抗癌剤ドキソルビシンの送達に対する低用量のＶＥＧＦ前処置の効果を調査した。
【００８８】
使用した動物は１２週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃ ＮＵマウスであり、それに前もって３×１０6個のルシフェラーゼ発現Ｕ８７神経膠芽腫細胞を移植した。腫瘍を３週間進行させ、ＶＥＧＦ／対照／ドキソルビシン投与前にＩＶＩＳによって確認した。ドキソルビシン（８ｍｇ／ｋｇ）を、ＶＥＧＦ／対照前処置の３時間後に投与した。動物を、５０ｍｌの標準生理的食塩水で全身灌流し、臓器を採取し、ドキソルビシンを組織から抽出し、ＨＰＬＣによって定量化した。脳で計測したドキソルビシンの有意な増大がＶＥＧＦ処置後に検出されたが、他の重要臓器では変化がなかった。１群あたりｎ＝３。図６。これらの結果は、低用量のＶＥＧＦ前処置が脳に対してＢＢＢを横断した薬物送達を促進したが、他の臓器に対してはそれがなかったことを示す。
【００８９】
実施例４：ＶＥＧＦ前処理は脳造影を向上させる
脳造影はＣＶＡの診断における主要因の１つである。造影は、梗塞部の位置およびサイズを確認するため、および例えば脳腫瘍または脳間出血などの同様の症状が存在し得る他の発作を除外するために使用される。米国では、脳卒中の疑いに向けた現在の最前線の画像分析法は、無造影コンピューター断層撮影法（ＣＴ）であるが、注射した造影剤を利用するコンピューター断層撮影血管造影法（ＣＴＡ）がより一般的に使用されるようになりつつある。Birenbaum et al., Western Journal of Emergency Medicine 12(1); 2011。
【００９０】
ＣＴＡはより強力な技術であり、経時的に記録すべき血管の３Ｄ画像化を可能にし、より正確に動脈閉塞を視覚化する。この情報は、血栓溶解剤を処方するかどうか決定するときに医療班にとって非常に有効であり、そして、物理的な凝血塊除去血管造影法を試みるとき、外科チームにとって不可欠である。
造影剤は、血管の視覚化を改善するために使用される。低用量は、例えば大動脈などの大血管を視覚化するために好適であるが、より小さい動脈には、より高用量が必要である。
しかし、これらの作用物質は、高価であり、また、何らかの毒性を有し、一部の患者で腎臓障害につながり、そして、禁忌とされている。
【００９１】
ＶＥＧＦ前処置が脳において続いて投与された造影剤の検出可能レベルを増強したことを実証する実験データを、本明細書中に提供する。斯かる増強は、脳造影に使用される造影剤の用量の低減を可能にし、それにより、コスト、副作用の危険性を低減し、および脳内の小さい細動脈のより良好な視覚化を潜在的に可能にする。
簡単に言えば、３匹のマウス（ＦＶＢマウス、２５ｇ、８週齢）に、０．３μｇ／ｋｇのＶＥＧＦを静脈（尾静脈）内に注射した。４５分後に、そのマウスに０．２ｍｍｏｌ／ｋｇのガドリニウム造影剤を注射した。脳画像を、ＶＥＧＦ注射後であるが、造影剤注射前に撮影し、次に、Ｔ１およびＴ２強調画像を造影剤注射の５分後に撮影した。標準生理的食塩水を注射したマウスを対照として使用した（図８）。
【００９２】
三連のＶＥＧＦ処置マウスは、脳において検出されるガドリニウム造影剤のレベルの統計的に有意な増大を一貫して実証した。シグナル対ノイズ比（ＳＮ比）は、それぞれ３匹のマウスに関してＶＥＧＦ処置後に１７％、１４％、１５．５％まで向上した。これは、大脳皮質、線条体、および脳の両側に一貫していた。健常な対照者マウスでは、いずれの造影向上も５．０％を超えなかった。結果は、ＶＥＧＦ前処置後の１５．５％の造影剤の検出可能なレベルの平均増大を実証する（表２）。
【００９３】
表２．低用量のＶＥＧＦ前処置は、脳においてガドリニウム造影剤の検出可能レベルを改善した
【表２】
0006787882.tif 000003
【００９４】
実験に使用した７Ｔ ＭＲＩスキャン条件（Pharmascan 7T ボア径１６ｃｍの水平ＭＲＩシステム）は、以下のとおりである：
ＳＥ−Ｔ１ＷＩパラメーター：ＴＲ＝４００ｍｓ；ＴＥ＝１０．８ｍｓ；ＦＯＶ＝２×２ｃｍ；ＮＥＸ＝８；スライス厚＝０．８ｍｍ、１６スライス；時間＝６分４９秒；マトリクス＝２５６*１２８を２５６*２５６に再構成。
ＦＳＥ−Ｔ２ＷＩパラメーター：ＴＲ＝４０００ｍｓ；ＴＥｅｆｆ＝７０ｍｓ；ＦＯＶ＝２×２ｃｍ；ＮＥＸ＝４；スライス厚＝０．８ｍｍ、１６スライス；時間＝４分１６秒；マトリクス＝２５６*１２８を２５６*２５６に再構成。
【００９５】
当然のことながら、本明細書中に提供した実施形態の説明は、例示のためだけに提供され、そして、様々な修飾が当業者によってなされ得る。上記の明細書、実施例、およびデータは、本発明の代表的な実施形態の構造および使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態を、ある程度の詳しさで、または１若しくは複数の個々の実施形態に関して説明したが、当業者は、この開示の要旨または範囲から逸脱することなく、開示した実施形態に対して頻繁な修飾を加えることができる。
【００９６】
多くの具体例を以下に示す：
対象の血液脳関門（ＢＢＢ）を横断した作用物質の送達を容易にする方法であって、（ｉ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｉ型インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、その一部、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される増殖因子の有効量；および（ｉｉ）任意の治療薬またはイメージング剤である作用物質、を連続してまたは同時に該対象に投与することを含み、ここで、増殖因子の投与量は、該対象のＢＢＢ透過性を一時的に増強することが可能であり、その結果、作用物質がＢＢＢを横断して送達されるようにする。
【００９７】
脳腫瘍、脳卒中、神経精神疾患および／または神経変性疾病を有している対象を処置する方法であって：脳腫瘍、脳卒中、神経精神疾患および／または神経変性疾病に関連する１若しくは複数の症状を緩和するために、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｉ型インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、その一部、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、第一の増殖因子の有効量；および第二の治療薬の有効量、を連続してまたは同時に該対象に投与すること、を含む。
【００９８】
上記の方法のいずれも、増殖因子は５〜２００ｎｇ／ｋｇの量で投与される。イメージング剤とは、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のための造影剤である。治療薬とは、抗癌剤、抗精神病薬、抗凝血物質、タンパク質または幹細胞である。抗癌剤とは、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗物質、または細胞毒性抗生物質である。
【００９９】
アルキル化剤は、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロールエサミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾトシン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、チオテパ、マイトマイシン、またはジアジクオンであってもよい。
【０１００】
トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、エトポシド、ドキソルビシン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、またはアクラルビシンであってもよい。
代謝拮抗物質は、フルオロピミジン、デオキシヌクレオシド類似体、チオプリン、メトトレキサート、またはペメトレキセドであってもよい。
【０１０１】
細胞毒性抗生物質は、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、アルカルビシン、またはミトキサントロンであってもよい。
抗凝血物質は、アスピリン、クロピドグレル（clopidoqrel）、ジピリダモール、ワルファリンまたはヘパリンであってもよい。
タンパク質は、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）であってもよい。
【０１０２】
抗精神病薬は、ブチロフェノン、フェノチアジン、フルフェナジン、ペルフェナジン、プロクロルペラジン、チオリダジン、トリフルオロペラジン、メソリダジン、プロマジン、トリフルプロマジン、レボメプロマジン、プロメタジン、チオキサンテン、クロルプロチキセン、フルペンチキソール、チオチキセン、ズクロペンチキソール、クロザピン、オランザピン、リスペリドン、クエチアピン、ジプラシドン、アミスルピリド、アセナピン、パリペリドン、アリピプラゾール、ラモトリジン、メマンチン、テトラベナジン、カンナビジオール、ＬＹ２１４００２３、ドロペリドール、ピモジド、ブタペラジン、カルフェナジン、レモキシプリド、ピペラセタジン、スルピリド、アカンプロセート、テトラベナジン、安息香酸、安息香酸ナトリウム、安息香酸カリウム、安息香酸カルシウム、安息香酸リチウム、２−アミノ安息香酸エステル、３−アミノ安息香酸エステル、または４−アミノ安息香酸エステルであってもよい。
【０１０３】
幹細胞は、間葉系（meschymal）幹細胞（ＭＳＣ）であってもよい。
抗認知症薬は、メマンチンまたはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤（ＡＣｈＥＩ）であり、そしてそれは、ガランタミン、タクリン、ドネペジル、リバスチグミン、ヒューペルジンＡ、ザナペジル、ガンスチグミン、フェンセリン、フェネチルノルシムセリン、シムセリン、チアシムセリン、ＳＰＨ１３７１、ＥＲ１２７５２８、ＲＳ１２５９またはその混合物であってもよい。
【０１０４】
神経変性疾病は、アルツハイマー病（ＡＤ）、好銀性顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、グアム型ＡＬＳ−パーキンソン認知症症候群、血管性認知症、前頭側頭認知症、意味認知症、レビー小体型認知症、ハンチントン病、封入体ミオパシー、封入体筋炎、またはパーキンソン病（ＰＤ）であってもよい。
【０１０５】
神経精神疾患は、統合失調症、譫妄、アルツハイマー病（ＡＤ）、うつ病、躁病、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、薬物中毒、軽度認識障害、認知症、興奮、感情鈍麻、不安症、精神病、外傷後ストレス障害、興奮性、または双極性障害であってもよい。
【０１０６】
対象の脳領域を画像化する方法であって：（ｉ）血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｉ型インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−ＩＩ、その一部、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される増殖因子の有効量；コンピューター断層撮影法（ＣＴ）または磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のための造影剤の十分量を、連続してまたは同時に対象に投与し；そして（ｉｉ）脳領域を通って移動する造影剤の分布を観察すること、を含む。増殖因子は５〜２００ｎｇ／ｋｇの量で投与される。
【０１０７】
他の実施形態
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示された個々の特徴は、同様の、等価な、あるいは類似の目的を果たす代替の特徴に置き換えることができる。よって、特段の記述がない限り、開示された個々の特徴は等価または同様な一連の一般的な特徴の単なる例示である。上述の説明によって、当業者は本発明の本質的な特徴を簡単に確認することができ、その思想および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変化や修正を加えさまざまな用途や条件に適用することができる。したがって、他の実施形態もまた特許請求の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
0006787882.tif 000006
【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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