(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオリアクターシステムにおいてフィル・アンド・ドロー発酵プロセスを実施して、細胞により発現される生体高分子、細胞及び微生物から選ばれる生成物を製造する方法であって、前記バイオリアクターシステムが、
適切な培地中に細胞を含む細胞培養槽（１）、
前記細胞培養槽（１）に培地を供給するための細胞培養槽注入口（２）、
前記生成物の分子量（ＭＷ）を下回るＭＷを有する不純物が、前記細胞培養槽（１）の内部に前記生成物を保持しながら、細胞培養槽（１）から除去されるのを可能にする不純物フィルタユニット（３）であって、前記不純物フィルタユニット（３）は前記細胞培養槽（１）内部の前記培地と流体接続されている不純物フィルタユニット（３）、並びに
前記生成物及び不純物を含む前記培地が前記細胞培養槽（１）から除去されるのを可能にする採取物出口（４）
を含み、
前記方法が、
（ａ）前記細胞培養槽（１）内で前記生体高分子を発現する前記細胞、前記細胞又は前記微生物を適切な条件下に適切な培地中で、前記生体高分子を発現する前記細胞が特定の細胞密度に達し、もしくは前記生体高分子が特定の濃度に達し、前記細胞が特定の細胞密度に達し、又は前記微生物が前記微生物の特定の密度に達するまでの十分な時間発酵させる工程であって、発酵中、不純物を含む培地が前記不純物フィルタユニット（３）を介して除去され、第一の新鮮培地が前記細胞培養槽注入口（２）から添加されて前記不純物フィルタユニット（３）を介して除去された前記培地と交換又は一部交換する、工程、
（ｂ）前記生成物及び不純物を含む特定容量の前記培地を前記採取物出口（４）を介して前記細胞培養槽（１）から除去する工程、並びに
（ｃ）第二の新鮮培地を前記細胞培養槽注入口（２）から前記細胞培養槽（１）に添加して工程（ｂ）において前記採取物出口（４）から除去された前記培地と交換又は一部交換する工程、並びに
（ｄ）任意選択で、工程（ｂ）中、工程（ｃ）中又は工程（ｂ）及び工程（ｃ）の両工程中に、不純物を含む前記培地を前記不純物フィルタユニット（３）を介して除去し、第三の新鮮培地を前記細胞培養槽注入口（２）から添加して前記不純物フィルタユニット（３）を介して除去された前記培地と交換又は一部交換する工程、
（ｅ）任意選択で、工程（ｂ）及び（ｃ）を反復する工程、
（ｆ）任意選択で、工程（ｄ）を反復する工程、並びに
（ｇ）任意選択で、前記細胞によって発現される前記生体高分子、前記細胞、又は前記微生物から選ばれる前記生成物を含む前記特定容量の培地及び不純物から前記生成物を精製する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）中、前記細胞培養槽（１）内で前記生体高分子を発現する前記細胞、前記細胞又は前記微生物を適切な条件下に適切な培地中で、前記生体高分子を発現する前記細胞が特定の細胞密度に達し、もしくは前記生体高分子が特定の濃度に達し、前記細胞が特定の細胞密度に達し、又は前記微生物が前記微生物の特定の密度に達するまでの十分な時間、前記不純物フィルタユニット（３）を介して不純物を除去することなく発酵させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）に先行して、前記細胞培養槽（１）内で前記生体高分子を発現する前記細胞、前記細胞又は前記微生物を適切な条件下に適切な培地中で、前記生体高分子を発現する前記細胞が特定の細胞密度に達し、もしくは前記生体高分子が特定の濃度に達し、前記細胞が特定の細胞密度に達し、又は前記微生物が前記微生物の特定の密度に達するまでの十分な時間、前記不純物フィルタユニット（３）を介して不純物を除去することなく発酵させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一、第二及び、任意選択で第三の新鮮培地は同じ組成の培地から選ばれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｄ）を含み、工程（ｄ）は少なくとも２回反復される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｅ）を含み、工程（ｂ）及び（ｃ）は少なくとも２〜３０回反復される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｆ）を含み、工程（ｄ）は少なくとも２〜３０回反復される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｇ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）において、少なくとも５０Ｌ、例えば、少なくとも７５Ｌ、例えば、少なくとも１００Ｌ、例えば、少なくとも２００Ｌ、例えば、少なくとも３００Ｌ、例えば、少なくとも５００Ｌの適切な培地中、前記細胞培養槽（１）において前記生体高分子を発現する前記細胞、前記細胞又は前記微生物を発酵させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）において、前記細胞が少なくとも三千万細胞／ｍｌの細胞密度に達するまで、前記細胞培養槽（１）において前記生体高分子を発現する細胞、前記細胞又は前記微生物を発酵させる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）において、前記生成物及び不純物を含む前記培地の少なくとも３０％を生成物採取モジュール（４）を介して前記細胞培養槽（１）から除去する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体高分子を発現する前記細胞は哺乳動物細胞から選ばれる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記生体高分子は組換えタンパク質である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体高分子は抗体、もしくはその断片、又は血液凝固因子である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記不純物フィルタは、前記生体高分子の分子量の少なくとも１０％の最大公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣ）を有する孔径を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は高細胞密度フィル・アンド・ドロー発酵プロセスに関する。本発明の方法は、高細胞密度種培養物の調製、及びポリペプチドの調製、特に医薬品用薬理学的有効成分の調製のための製造プロセスにおける使用に適している。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に、タンパク質製造などのための細菌、酵母及び動物細胞は、発酵槽とも呼ばれるバイオリアクターにおいて懸濁培養物として初代培養される。そのようなバイオリアクターでは、細胞への栄養物の供給及び不純物の除去を操作することによって環境条件を正確に制御することができ、撹拌手段によりリアクター内の培養培地を撹拌することで細胞の均一な分布をもたらすことができる。
【０００３】
上記バイオリアクターは、回分もしくは流加プロセスでは閉鎖系として、又はいわゆるケモスタットもしくは灌流プロセスでは連続系として運転することができる。
【０００４】
回分運転では、培養培地は、通常、必要な栄養物、例えば、グルコース、ビタミン類、アミノ酸類及び無機物類を含む培地を含有する。発酵中、これらは、培地から栄養物が次第に乏しくなるように消費される。同時に、不純物の濃度が増加し、最終的には細胞増殖の阻害をもたらす。流加プロセスでは、これらの栄養物の１種以上が培養中のバイオリアクターに送り込まれ（供給され）て増殖条件の向上及び細胞密度の増加が達成される。回分プロセスの反復において、採集後に槽内に残された細胞は次の回分のための接種物として用いることができる。
【０００５】
ケモスタットのような連続系では、新鮮培地は連続的に添加されるが、生成物、細胞及び不純物を含む培地は連続的に除去されて培養容量が一定に保たれる。培地をバイオリアクターに添加する速度を変えることによって、微生物又は細胞の増殖速度を制御することができる。酵母及び細菌細胞などの増殖速度の高い細胞の場合、ケモスタットは、一般に、所望の細胞密度を維持するために培地から細胞を培養液と共に除去する。
【０００６】
灌流プロセスは、新鮮培地を含む懸濁細胞培養物がバイオリアクターに連続的に供給されるが、消費された培養培地は連続的に採取される特別なタイプの連続プロセスである。細胞は、連続的にろ過又はその他の方法で採取流から分離されてバイオリアクターに戻されることにより均一な細胞密度が維持される。新鮮培地の常時添加及び不純物の除去により細胞に最適な環境が与えられ、高い細胞濃度とそれによる生産性の向上が達成される。これによって、健全な培養を、潜在的に高い細胞密度で延長することや、バイオリアクター中の生成物の滞留時間を短くすることが可能となる。このことは、生成物の品質には好都合であり、不安定なポリペプチドの生産に必要なことである。この灌流様式の別の利点は、これにより流加プロセスに比してより小さなバイオリアクターの使用が可能となり、定置洗浄操作の低減及び使用容積の低下によるステンレス鋼製リアクターに代えて使い捨てのバイオリアクターを使用できる可能性などの利点が得られる。さらに、生成物は、（生成物、細胞及び不純物を含む）培地を取り出すことで、又はいわゆるブリードによって連続的に採取することができる。
【０００７】
フィル・アンド・ドロー・プロセスは反復回分発酵とよく似ている。回分発酵では、細胞は培養槽内で増殖し、培地は運転の最後に採取される。フィル・アンド・ドロー・プロセスでは、培養槽は栄養物のいずれかが使い尽くされる前に採取される。槽から内容物の全てを除去するのではなく、タンク容量の一部のみ（通常、タンク容量の３０％〜８０％）を除去する。採取後、ほぼ同容量の新鮮培地を槽に追加する。次いで、細胞をもう一度槽内で増殖させ、所定の時間又は日数の後にさらに３０％〜８０％の採取を行う。
【０００８】
上記プロセスは２段階で操作することもでき、第１段階は単純な回分プロセスと全く同様に操作する。この第１の採取後、培養槽は、再度単純な回分プロセスとして操作するが、回分の長さは、最初の細胞密度がより高いために、第１の回分よりも短い。こうした短い「反復回分段階」は、無制限に継続させることができる。培養槽は、広範囲のサイクル時間及び広範囲のフィル・アンド・ドロー容量内で操作することができる。特許文献１には、ビタミンｋ依存性タンパク質を製造するためのそのようなフィル・アンド・ドロー・プロセスが記載されている。しかしながら、特許文献１には、不純物フィルタユニット又は特定生成物採取モジュールを装備した特別なバイオリアクターを用いたフィル・アンド・ドロー・プロセスは開示されていない。
【０００９】
本発明は、大規模バイオリアクターシステムにおけるフィル・アンド・ドロー細胞培養プロセスの利用及び操作の改善及び効率向上に対する要望に応えるものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２４５１９６３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明によって解決すべき課題は、細胞密度を改善し、それによってバイオリアクターの生産性及び採取培地中の生成物の濃度を増大させる高細胞密度フィル・アンド・ドロー発酵プロセスであって、生成物（例えば、種培養物又はポリペプチド）の生産性を、例えば、細胞増殖条件の最適化によって改善することができるプロセスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
解決は、新鮮培地を細胞培養槽の注入口から添加して不純物フィルタユニットを介して除去された培地と交換又は一部交換し、細胞培養槽中の細胞を高細胞密度に培養した後、反復ドロー・アンド・フィル発酵プロセスを実施しながら、細胞培養槽内部に生成物を保持しつつ生成物の分子量（ＭＷ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を下回るＭＷを有する不純物の細胞培養槽からの除去を可能にする不純物フィルタユニットを装備するバイオリアクターを有することによって、発酵プロセス中のバイオリアクターにおいて細胞密度の増大を達成することができ、特に、採取された培地中に有意により高濃度の対象生成物を得、それによって不純物フィルタユニットを有しないバイオリアクターにおける類似の発酵プロセスの生産経済性よりも優れた生産経済性を得ることができることを本発明者が見出したことに基づいている。
【００１３】
本発明の一側面は、バイオリアクターシステムにおいて細胞により発現される生体高分子、細胞及び微生物から選ばれる生成物を製造する方法であって、バイオリアクターシステムが、
適切な培地中に細胞を含む細胞培養槽（１）、
細胞培養槽（１）に培地を供給するための細胞培養槽注入口（２）、
生成物の分子量（ＭＷ）を下回るＭＷを有する不純物が、細胞培養槽（１）の内部に生成物を保持しながら、細胞培養槽（１）から除去されるのを可能にする不純物フィルタユニット（３）であって、不純物フィルタユニット（３）は細胞培養槽（１）内部の培地と流体接続されている不純物フィルタユニット（３）、並びに
生成物及び不純物を含む培地が細胞培養槽（１）から除去されるのを可能にする採取物出口（４）
を含み、
方法が、
（ａ）細胞培養槽（１）内で生体高分子を発現する細胞、細胞又は微生物を適切な条件下に適切な培地中で、生体高分子を発現する細胞が特定の細胞密度に達し、もしくは生体高分子が特定の濃度に達し、細胞が特定の細胞密度に達し、又は微生物が微生物の特定の密度に達するまでの十分な時間発酵させる工程であって、発酵中、不純物を含む培地が不純物フィルタユニット（３）を介して除去され、第一の新鮮培地が細胞培養槽注入口（２）から添加されて不純物フィルタユニット（３）を介して除去された培地と交換又は一部交換する工程、
（ｂ）生成物及び不純物を含む特定容量の培地を採取物出口（４）を介して細胞培養槽（１）から除去する工程、並びに
（ｃ）第二の新鮮培地を細胞培養槽注入口（２）から細胞培養槽（１）に添加して工程（ｂ）において採取物出口（４）から除去された培地と交換又は一部交換する工程、並びに
（ｄ）任意選択で、工程（ｂ）中、工程（ｃ）中又は工程（ｂ）及び工程（ｃ）の両工程中に、不純物を含む培地を不純物フィルタユニット（３）を介して除去し、第三の新鮮培地を細胞培養槽注入口（２）から添加して不純物フィルタユニット（３）を介して除去された培地と交換又は一部交換する工程、
（ｅ）任意選択で、工程（ｂ）及び（ｃ）を反復する工程、
（ｆ）任意選択で、工程（ｄ）を反復する工程、並びに
（ｇ）任意選択で、細胞によって発現される上記生体高分子、細胞、又は微生物から選ばれる生成物を含む特定容量の培地及び不純物から生成物を精製する工程を含む方法に関する。
【００１４】
本発明の他の目的は、本説明、図及び特許請求の範囲を勘案すれば明かとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のバイオリアクターシステムにおいて生成物を製造する方法の模式図である。図１ａには拡大モードの細胞培養槽が示されている。図１ｂでは、生成物及び不純物を含む培地が除去されている。図１ｃでは、新しい新鮮培地が細胞培養槽に添加されて消費された栄養物及び排出された培地と交換されている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本発明の詳細な実施態様の説明に先立って、本発明の主要な側面及び実施態様に関連する特定の用語の定義を行う。全ての用語は、これらの用語についての当業者の通常の理解に従って定義する。
【００１７】
本明細書に用いている「生体高分子」という用語は、ポリペプチド、タンパク質又はウイルス粒子のことを指し、これらは天然のもの又は生物学的もしくは合成的に修飾されたものとすることができ、断片、多量体、凝集体、複合体、融合産物などを含む。
【００１８】
本明細書に用いている「細胞」という用語は、原核細胞及び真核細胞のいずれをも包含する。
【００１９】
本明細書に用いている「微生物」という用語は、原核生物、即ち、細菌及び古細菌の全て、並びに原生動物、菌類、藻類、微小植物（緑藻類）及び輪虫、プラナリア（ｒｏｔｉｆｅｒｓ  ｐｌａｎａｒｉａｎｓ）などの動物、それにウイルスを含む種々の形態の真核生物を包含することを意味する。
【００２０】
本明細書に用いている「バイオリアクター」という用語は、生物学的に活性な環境を支持する任意の装置又はシステムのことを指す。１つの事例では、バイオリアクターは、有機体又はそのような有機体由来の生化学的に活性な物質にかかわる化学的プロセスを実施する容器であるが、これに限定されるものではない。このプロセスは好気性又は嫌気性とすることができる。バイオリアクターは、一般的に円筒形で、大きさが数リットル〜数立方メートルの範囲にあり、ステンレス鋼でできている場合が多いが、使い捨て材料などの他の材料でできていることもあり得よう。
【００２１】
また、バイオリアクターは、細胞培養との関連で細胞又は組織を増殖させるように作られている装置又はシステムのことを指すこともできる。運転方式に基づいて、バイオリアクターは、回分式、流加式又は連続式（例えば、連続撹拌槽リアクターモデル）と分類できる。バイオリアクターの一例は灌流システムである。このバイオリアクターは、細胞に新しい新鮮又は濃縮培地を供給するための１つ以上の注入口及び生成物を採取又はバイオリアクターを空にするための１つ以上の出口を備えることができる。さらに、上記バイオリアクターは、このバイオリアクターに分離装置を取り付けることができるような具合に構成された少なくとも１つの出口を備えることができる。一般に、ガス（即ち、空気、酸素、窒素、二酸化炭素）流量、温度、ｐＨ及び溶存酸素レベル並びに撹拌速度／循環速度のようなバイオリアクターの環境条件は厳密に監視し、制御することができる。
【００２２】
本明細書に用いている「不純物」という用語は、バイオリアクターに存在する細胞もしくは微生物により産生される、又は発酵過程で死滅もしくは崩壊した細胞もしくは微生物から生じる好ましくない化学もしくは生体化合物のことを指す。不純物としては、例えば、エチルアルコール、ブチルアルコール、乳酸、アセトン−エタノール、気体化合物、ペプチド、脂質、アンモニア、芳香族化合物及びＤＮＡ・ＲＮＡ断片並びに培地成分又は生体高分子の分解産物を挙げることができる。
【００２３】
本明細書に用いている「注入口」という用語は、培地、緩衝液又は水などの流体の細胞培養槽、容器、タンク又はユニットへの導入を可能にすると共に、通常、例えば、管又は弁を接続することができる継ぎ手を備えた開口部である任意の手段を包含するものである。
【００２４】
本明細書に用いている「出口」という用語は、培地、緩衝液又は水などの流体が細胞培養槽、容器、タンク又はユニットから出るのを可能にすると共に、通常、例えば、管又は弁を接続することができる継ぎ手を備えた開口部である任意の手段を包含するものである。
【００２５】
本明細書に用いている「流体」という用語は、流動する任意の物質を定義するものであり、従って、流動することができる液体及び気体を含む。本明細書に用いている「流体が接続されている」という用語は、液体、例えば、培地又は緩衝液、などの流体が容器、タンク又はユニット（例えば、不純物フィルタユニット）と別の容器、タンク、槽又はユニット（例えば、細胞培養槽）との間を流動することができることを意味する。この流体接続は、流体接続による流体の流動を決められた通りにいつでも開始又は停止することができるような１つ以上の弁及び／又は保持容器によって遮断することができる。
【００２６】
本明細書に用いている「培地」という用語は、細胞培養培地のことを指す。数多くの細胞培養培地が知られ、市販されている。そのような培地は、一般に、特定種類の細胞の培養に適した組成を有し、塩類、アミノ酸類、ビタミン類、脂質、界面活性剤、緩衝剤、成長因子、ホルモン、サイトカイン、微量元素類及び炭水化物を含むことができる。
【００２７】
本明細書に用いている「発酵」、「細胞を発酵させる」及び「培養する」という用語は、広く、増殖培地中又は上における細胞又は微生物の大量増殖のことを指す。本明細書に用いている発酵、細胞を発酵させる及び培養する、は同じ意味で用いることができ、細胞が通常その自然の環境以外で、制御された条件下において増殖するプロセスのことである。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明者は、生成物の大きさを下回る大きさの不純物及び培地を細胞培養槽から除去しながら細胞培養槽に新しい培地を添加してフィル・アンド・ドロー発酵プロセス中に不純物フィルタユニットを介して除去した培地と交換することを可能にする不純物フィルタユニットを装備したバイオリアクターシステムを用いることにより、採取された培地における有意により高濃度の対象生成物及び消費培地１リットル当たりの生産性の増大を得ることができることを見出した。このプロセスは、本明細書では、高密度フィル・アンド・ドロー発酵プロセスと呼ぶこともある。
【００２９】
生成物
本明細書に用いている生成物とは、細胞によって発現される生体高分子、細胞及び微生物のことを指す。
【００３０】
生体高分子とは、ポリペプチド、タンパク質又はウイルス粒子のことを指し、これらは天然のもの又は生物学的もしくは合成的に修飾されたものとすることができ、断片、多量体、凝集体、複合体、融合産物などを含む。一実施態様において、上記生体高分子は組換えタンパク質などのポリペプチドである。本明細書に用いているタンパク質又はポリペプチドは同じ意味で用いることができ、約３０個のアミノ酸残基よりも長いアミノ酸の鎖のことを指す。タンパク質は、２つ以上の組立ポリペプチド鎖、タンパク質断片、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドを含む単量体又は多量体として存在することができる。
【００３１】
本発明の方法を用いて産生させることができる対象ポリペプチドの例としては、例えば、抗体又はその断片、血液凝固因子、サイトカイン、酵素、ペプチドホルモンなどの治療用組換えタンパク質が挙げられる。そのようなタンパク質の具体例としては、ヒト成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ：ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ：ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、α−Ｌ−イズロニダーゼ（ｒｈＩＤＵ；ラロニダーゼ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン−４−サルフェート（ｒｈＡＳＢ；ガルスルファーゼ）、ＤＮアーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ：ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、グルコセレブロシダーゼ、インターフェロンα、インターフェロンβ及びインターフェロンγなどのインターフェロン（ＩＦ：ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、インスリン、インスリン誘導体、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１：ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  １）、テネクテプラーゼ、抗血友病因子、ヒト凝固因子及びエタネルセプト、並びにトラスツズマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ダクリズマブ、アダリムマブ、アブシキシマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブチウキセタン、メポリズマブ、モタビズマブ、ナタリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、オレゴボマブ、パリビズマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、リツキシマブ、テフィバズマブ及びザノリムマブなどの抗体が挙げられる。
【００３２】
本発明の別の実施態様では、上記生体高分子は、成長ヒト成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、エリスロポエチン（Ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦ）、インスリン、インスリン誘導体、インスリン様成長因子１などの組換えタンパク質である。
【００３３】
本発明のさらに別の実施態様では、上記生体高分子は、抗体又はその断片（この場合、断片は、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆｖ断片もしくは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片とすることができる）、血液凝固因子、サイトカイン、酵素又はペプチドホルモンである。
【００３４】
本発明の好ましい実施態様では、上記生成物は、第ＶＩＩａ血液凝固因子などの血液凝固因子である。
【００３５】
ポリペプチドは、一般に、プロモータ配列と呼ばれる調節配列の制御下に哺乳動物細胞
において発現される。ポリペプチドを発現している細胞は、構成的プロモータ（即ち、非調節配列；これは関連遺伝子の連続的な転写を可能にする）の制御下又は誘導プロモータ（生物的又は非生物的要因の存在又は非存在によって誘導される調節配列）の制御下におくことができる。構成的プロモータの一例はチャイニーズハムスターＥＦ−１αプロモータである。一実施態様では、上記生体高分子は、チャイニーズハムスターＥＦ−１α調節配列の制御下に発現される。
【００３６】
本発明のバイオリアクター装置及び方法を用いることによって、高生産性でポリペプチドを発現させることが可能である。従って、一実施態様では、細胞は、ポリペプチド、例えば、抗体を発現し、少なくとも１グラム／Ｌ／日、好ましくは２又は３グラム／Ｌ／日以上といった高値の生産性を有する。
【００３７】
本発明のシステム及び方法を用いて製造した対象単離生成物（例えば、ポリペプチド）は、この所与の生成物に関して当該分野で既知の方法により精製し、商業上適切な対象最終組成物（例えば、医薬組成物）に製剤化して適切な容器に包装することができる。
【００３８】
本明細書に用いている生成物とは、細胞とすることもできる。この細胞は、全ての既知の生命体の基本的な構造及び機能単位である。細胞には２種類、即ち、真核及び原核細胞が存在する。原核細胞は、通常、自立しており、一方、真核細胞は、単細胞有機体として存在するか、多細胞有機体として存在する。原核細胞は、真核細胞よりも単純であり、従ってより小さく、真核細胞の核及び他の小器官の多くを欠いている。原核細胞には２種類、即ち、細菌及び古細菌が存在し、これらは類似の構造を共有している。植物、動物、菌類、粘菌、原生動物及び藻類は全て真核性である。原核細胞と真核細胞との主な違いは、真核細胞が、特定の代謝活動が行われる、膜結合区画を含むことにある。これらの中で最も重要なものは、真核細胞のＤＮＡを収容している、膜で仕切られた区画である細胞核である。
【００３９】
一実施態様では、上記生成物は哺乳動物細胞などの細胞から選ばれる。
【００４０】
別の実施態様では、上記生体高分子を発現する細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属又はクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ハイブリドーマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）（仔ハムスター腎）細胞、骨髄細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＣＡＰ（登録商標）及びＣＡＰ−Ｔ（登録商標）細胞株などのヒト羊水鏡を含む羊水鏡、ヒトリンパ芽球様細胞並びにＮＳＯ細胞などのマウス細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種の細胞である。
【００４１】
さらに別の実施態様では、上記生体高分子を発現する細胞は、ＣＨＯ、ＮＳＯ、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＢＨＫ又はＨＥＫなどの哺乳動物細胞から選ばれる。
【００４２】
本明細書に用いている微生物は、原核生物、即ち、細菌及び古細菌の全て、並びに原生動物、菌類、藻類、微小植物（緑藻類）及び輪虫、プラナリア（ｒｏｔｉｆｅｒｓ  ｐｌａｎａｒｉａｎｓ）などの動物、それにウイルスを含む種々の形態の真核生物を含む。本発明の一実施態様では、上記微生物は、真菌、酵母、フミコーラ（ｈｕｍｉｃｏｌａ）、サッカロミセス、アスペルギルス、桿菌、乳酸菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）から選ばれる。
【００４３】
本明細書に用いている生成物はウイルスとすることができる。ウイルスは、有機体の生細胞の内部でのみ複製する小さな感染体である。ウイルスは、動物及び植物から細菌及び古細菌まで全ての種類の有機体に感染することができる。ウイルス集団は、無細胞であるので、細胞分裂によって増殖しない。その代わりに、これらは、宿主細胞の機構及び代謝を利用して自身の多重コピーを作り、細胞内で組み立てられる。ワクチン接種はウイルス感染の有効な予防法となり得る。ワクチンは、弱毒化もしくは死滅ウイルス又はウイルスタンパク質（抗原）で構成することができる。生ワクチンは、疾患を引き起こさないが、それでも免疫を付与する弱体化形態のウイルスを含む。そのようなウイルスは弱毒型と呼ばれる。サブユニットワクチンを製造するのにバイオテクノロジー及び遺伝子操作技術が用いられる。こうしたワクチンはウイルスの外被タンパク質のみを用いる。Ｂ型肝炎ワクチンはこのタイプのワクチンの例である。本発明の一実施態様では、上記生成物はウイルス又はウイルスの一部である。
【００４４】
バイオリアクター
本明細書に用いているバイオリアクターとは、例えば、生物学的製剤製造用の細胞の培養のための生物学的に活性な環境を支持する任意の装置又はシステムのことを指す。バイオリアクターは、大きさを２、３リットルから数立方メートル（即ち、数千リットル）の範囲とすることができ、例えば、ステンレス鋼もしくはガラス製の培養槽をベースとした通常のバイオリアクター又は使い捨てバッグなどの使い捨て材料をベースとした「単回使用の」バイオリアクターとすることができる。
【００４５】
バイオリアクターは、これまで一般に、ステンレス鋼製タンクをベースとすることが多い従来型であったが、通常多層構造のプラスチック材料でできた使い捨てバッグをベースとした使い捨てバイオリアクターがより一般化しつつある。かき混ぜのために、一部の単回使用のバイオリアクターは、従来のバイオリアクターの撹拌器と類似の撹拌器を使用するが撹拌器はプラスチックバッグに組み込まれているのに対して、他の単回使用のバイオリアクターはロッキング運動によってかき混ぜる。撹拌器を用いた単回使用のバイオリアクターは最大数千リットル、例えば、２０００〜５０００リットルの容量を有することができるが、ロッキングによる単回使用のバイオリアクターは、通常最大約１０００リットルの容量を有する。
【００４６】
単回使用のバイオリアクターは、洗浄及び滅菌の必要性の低減と共に付随費用の有意な削減を含む、従来のバイオリアクターに対するいくつかの利点を有する。さらに、医薬品製造のための複雑な品質証明及び検証手順を簡略化することができ、交差汚染のリスクが低下する。さらに、単回使用のバイオリアクターは従来のバイオリアクターに比して含む部品が少ないため、初期及び維持費用が低下する。
【００４７】
運転方式に基づいて、バイオリアクターは、回分式、流加式又は連続式と分類することができる。連続式バイオリアクターの例にはケモスタット及び灌流バイオリアクターがある。このバイオリアクターは、一般に、細胞に培養培地を供給するための１箇所以上の注入口及び生成物を採取し、又はバイオリアクターを空にするための１箇所以上の出口を備えている。さらに、上記バイオリアクターは、このバイオリアクターに不純物フィルタユニットを取り付けることができるような具合に構成された少なくとも１つの出口を備えることができる。一般に、ガス（即ち、空気、酸素、窒素、二酸化炭素）流量、温度、ｐＨ及び溶存酸素レベル並びに撹拌速度／循環速度などのバイオリアクターの環境条件は厳密に監視し、制御することができる。
【００４８】
上記バイオリアクターは、任意選択で、ビタミン又は成長因子などの成分を添加するための別の注入口を備えることもできる。この場合、そのような成分は、培地に加えて、細胞培養槽に添加することができ、濃縮又は希釈形態とすることができる。
【００４９】
細胞培養槽
本明細書に用いている「細胞培養槽」とは、適切な培地中、適切な条件下で細胞を増殖させるバイオリアクターシステムの不可欠な部分のことを指す。この細胞培養槽は、上記で説明したように、単回使用の槽、例えば、使い捨てバッグ、又は従来の再使用可能な槽、通常はステンレス鋼もしくはガラス製の槽とすることができる。ステンレス鋼製槽は、通常、所定のポートアセンブリを用いて構成されるのに対して、単回使用のバッグは、使用後に捨てられる、前もって滅菌したプラスチック培養チャンバーを使用する。この場合には、場所をとる高価な定置洗浄（ＣＩＰ：ｃｌｅａｎ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）及び定置蒸気滅菌（ＳＩＰ：ｓｔｅａｍ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）装置は不要になると同時に、製造所要時間が短縮する。
【００５０】
本発明の細胞培養槽は、一般に、少なくとも５０Ｌ、好ましくは少なくとも１００Ｌ、より好ましくは少なくとも２５０Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも５００Ｌの容量を有する。多くの場合、その容量は、例えば、少なくとも１０００Ｌ又は少なくとも２０００Ｌと、さらに大きくなるであろう。
【００５１】
本発明の一実施態様では、上記方法は、少なくとも５０Ｌ、例えば、少なくとも７５Ｌ、例えば、少なくとも１００Ｌ、例えば、少なくとも２００Ｌ、例えば、少なくとも３００Ｌ、例えば、少なくとも５００Ｌの適切な培地中、細胞培養槽（１）において上記生体高分子を発現する細胞、上記細胞又は上記微生物を発酵させることを含む。
【００５２】
不純物フィルタユニット
数多くの特殊化フィルタ及びろ過方法が、それらの化学的及び物理的性質に従って材料を分離するために開発されてきた。既知のフィルタとしては、平面フィルタ、プリーツフィルタ、マルチユニットカセット、及び中空糸などの管形態が挙げられる。本明細書に記載した発明の場合、無菌性が確保可能な限り、限外ろ過技術の任意のシステムを適用することができる。
【００５３】
本明細書に述べたポリペプチドの製造及び不純物の除去用に適用可能なろ過システムの例には、カートリッジシステム、プレート及びフレームシステム並びに中空糸システムなどのシステムがある。これらのシステムは、ポンプで液体を膜を横切って送り込むことで、又は（例えば、ＰａｌｌＳｅｐ（商標）によって供給されるような）振動によって、又は交互接線流（ＡＴＦ：ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）によって操作することができ、高分子及びセラミック膜は共に上記ろ過プロセスに十分適している。当業者であれば、適切な性質を有する膜を選ぶことができよう。
【００５４】
中空糸膜は、多種多様な産業において問題なく使われてきており、膜充填密度が高く、透過液背圧に耐えることができること、従ってシステムの設計及び運用に柔軟性を持たせることができることなどのいくつかの利点を有する。中空糸カートリッジは、ろ過中、内部から外部へ働き、プロセス流体（未透過物）が中空糸の中心を流れ、膜糸の外部へ糸壁を通過するように浸透することを可能にする。接線流は膜汚染を抑えるのに役立たせることができる。中空糸膜システムと共に用いることができる他の操作技術としては透過液及び未透過液逆流によるバックフラッシングが挙げられる。
【００５５】
そこで、上記不純物フィルタユニットは、バイオリアクターに取り付けた外部フィルタモジュール内に設置することができる。或いは、上記不純物フィルタは、バイオリアクターの内部に設置することができる。このフィルタユニットは、制御された横揺れが供給流体を介して膜要素を移動させるＡＴＦシステム又はＰａｌｌＳｅｐ（商標）システムなどの、フィルタの汚染を防止するポンプ又はシステムを含むこともできる。この揺れは膜表面において振動エネルギーを生じさせ、膜表面上方の小さな境界層に限定され、流体の大部分にはかからない（従来の接線流ろ過システムにおいて通常生じる剪断力よりも高い）剪断力を生じる。これにより、高固体供給流中でさえ、膜が保持種と共に固まらないようにする。
【００５６】
一実施態様では、上記不純物フィルタユニットは、膜フィルタ、重力分離ユニット及び遠心分離ユニットから選ばれる。
【００５７】
当業者であれば、上記不純物フィルタから不純物を灌流させることに関して不純物除去のための適切なフィルタのタイプ及び適切な膜公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣ：ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｎｏｍｉｎａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔｏｆｆ）孔径を選び、上記生成物採取出口を介して対象ポリペプチドを採取することができよう。
【００５８】
ＮＭＷＣが１０００〜３０，０００（１〜３０ｋＤａ）の範囲内、例えば、２０００〜２０，０００（２〜２０ｋＤａ）の範囲又は２０００〜１５，０００（２〜１５ｋＤａ）の範囲の不純物フィルタが選ばれることが多い。しかしながら、生成物が細胞である場合、ＮＭＷＣが１０００〜５００，０００（１〜５００ｋＤａ）の範囲の不純物フィルタを選ぶことができるが、通常は、上記不純物フィルタは２０，０００（２０ｋＤａ）未満のカットオフを有することが好ましい。従って、一実施態様では、上記不純物フィルタユニットは、ＮＭＷＣ孔径が少なくとも１０００、例えば、２０００〜１５，０００の範囲内の膜フィルタである。
【００５９】
本発明の一実施態様では、上記不純物フィルタは、上記生体高分子の分子量の最大少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％の公称分子量カットオフ（ＮＭＷＣ）を有する孔径を有する。
【００６０】
別の実施態様では、上記不純物フィルタユニットは、分子量カットオフ（ＮＭＷＣ）孔径が対象生成物（例えば、ポリペプチド）の分子量（ＭＷ）の最大８０％の膜フィルタである。例えば、対象ポリペプチドのＭＷが１００，０００（１００ｋＤａ）である場合、上記不純物フィルタの好ましい最大カットオフは、この場合８０，０００（８０ｋＤａ）であることになる。さらに好ましくは、上記不純物フィルタは、ＮＭＷＣ孔径が対象ポリペプチドのＭＷの最大５０％である。従って、一実施態様では、上記不純物フィルタは、分子量カットオフ（ＮＭＷＣ）孔径が上記生体高分子のＭＷの最大８０％であり、例えば最大５０％である。
【００６１】
長時間にわたる運転中に、発酵を停止させることなくフィルタを変え、システムを再滅菌することは可能である。
【００６２】
採取物出口
一実施態様では、上記採取物出口は、その最も単純な形態では、単に、貯蔵又は更なる下流処理のために不純物及び培地に沿って生成物を収集するのに適した容器又はバッグに導く出口である。また、この採取物出口は、例えば、細胞、細胞デブリ及び上記生体高分子よりも大きい不純物を分離することができる分離装置と流体接続されていてもよい。
【００６３】
上記バイオリアクター中に存在する細胞が十分な細胞密度に達している場合、又は上記採取物出口からの流出物中に十分な生成物が存在する場合、その生成物の採取を開始することができる。これは、例えば、分光光度計を用いて細胞密度を測定することにより、又は既知の手段、例えばポリペプチド生成物の場合には適切なタンパク質アッセイ方法を用いることによって対象生成物の量を測定することにより、判断することができる。
【００６４】
細胞培養培地
本明細書に用いている培地とは、通常、細胞培養培地のことを指す。数多くの細胞培養培地が知られており、市販されている。そのような培地は、一般に、特定種類の細胞の培養に適した組成を有しており、塩類、アミノ酸類、ビタミン類、脂質、界面活性剤、緩衝剤、成長因子、ホルモン、サイトカイン、微量元素類及び炭水化物を含むことができる。塩類の例としては、マグネシウム塩、例えば、ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、鉄塩、例えば、ＦｅＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、カリウム塩、例えば、ＫＨ２ＰＯ４、ＫＣＩ、ナトリウム塩、例えば、ＮａＨ２ＰＯ４又はＮａ２ＨＰＯ４及びカルシウム塩、例えば、ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏが挙げられる。アミノ酸類の例には、２０種の天然アミノ酸、例えば、ヒスチジン、グルタミン、スレオニン、セリン、メチオニンがある。ビタミン類の例としては、アスコルビン酸塩、ビオチン、コリン、ミオ−イノシトール、Ｄ−パントテン酸塩（Ｄ−ｐａｎｔｈｏｔｈｅｎａｔｅ）及びリボフラビンが挙げられる。脂質の例としては、脂肪酸、例えば、リノール酸及びオレイン酸が挙げられる。界面活性剤の例としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８が挙げられる。緩衝剤の一例はＨＥＰＥＳである。成長因子／ホルモン／サイトカインの例としては、ＩＧＦ、ヒドロコルチゾン及び（組換え）インスリンが挙げられる。微量元素類の例としては、Ｚｎ、Ｍｇ及びＳｅが挙げられる。炭水化物の例としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース及びピルビン酸塩が挙げられる。上記培地に含めることができる他の成分の例には大豆ペプトン及びエタノールアミンがある。当業者であれば、適切な培地及び培地サプリメント並びに特定の発現細胞及び対象ポリペプチドに関する適切な条件に精通していよう。
【００６５】
シリコン系泡止め剤及び消泡剤又はエチレンオキサイド／プロピレンオキサイド単量体のコブロックポリマーなどの非イオン性界面活性剤を発酵中の培地に添加することができる。
【００６６】
上記細胞培養培地のｐＨ、温度、溶存酸素濃度及びオスモル濃度は、細胞の特定の種類によって決まり、これらが当該細胞の増殖及び生産性にとって最適であるように選ばれることになる。当業者であれば、所与の培養物に関してｐＨ、温度、溶存酸素濃度及びオスモル濃度などの最適条件をどのように決定するかがわかるであろう。通常、哺乳動物細胞の最適ｐＨは６．６〜７．６であり、最適温度は３０〜３９℃であり、最適オスモル濃度は２６０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇである。微生物系の場合、ｐＨは３〜８、温度は２０〜４５℃とすることができる。
【００６７】
上記各種培地成分の溶解度はかなり異なる。というのは、これらの成分の多くは溶解度が高く、従って水に容易に溶解するのに対して、特定のビタミン、アミノ酸、脂質及び成長因子などの他の成分は水に対する溶解度が低いからである。このため、細胞培養培地は、通常、すぐに使える組成物として全ての成分を混ぜ合わせることにより調製する。
【００６８】
本発明の一実施態様では、上記第一、第二及び任意選択で第三の新鮮培地は、種々の濃度を有する種々の成分から作られる。
【００６９】
別の実施態様では、上記第一、第二及び任意選択で第三の新鮮培地は、同じ組成の培地から選ばれる。
【００７０】
上記第一、第二及び任意選択で第三の新鮮培地は、通常、上記不純物フィルタ（３）又は上記生成物採取出口（４）を介して細胞培養槽から除去した培地と同じ温度に予め加熱し、通常、その除去後直ちに上記細胞培養槽に添加する。
【００７１】
説明した本発明は、好ましくは高細胞密度を用いて機能することから、１回の発酵からの高細胞密度の細胞培養培地を用いて新規の発酵を有利に再開（即ち、播種）することができる。このような状況における高生細胞密度は、一般に、少なくとも一千万細胞／ｍｌ、好ましくは少なくとも二千万細胞／ｍｌ、より好ましくは少なくとも三千万細胞／ｍｌ、例えば、少なくとも五千万細胞／ｍｌなどの少なくとも四千万細胞／ｍｌの密度である。
【００７２】
発酵プロセス
発酵プロセスの開始は、通常、細胞培養槽中の培地に高細胞密度の細胞培養物を添加（即ち、播種）することにより行われる。生成物及び不純物のレベルが低い場合の発酵開始時では、上記不純物フィルタユニットは、液体がこの不純物フィルタユニットを通過しないように閉じることができる。細胞密度が増加し、それによって不純物のレベルも増加する場合、上記不純物フィルタユニットから外への液体の灌流を開始することができ、この上記不純物フィルタユニットを通る培地の速度と同じ速度で新しい新鮮培地を細胞培養槽に供給して、消費された栄養物及び排出された培地を補充することができる。次いで、生成物、細胞及び不純物を含む培地が除去されることになる前の特定の細胞密度に細胞が達するまで十分な時間細胞を増殖させる。
【００７３】
一実施態様では、上記生成物は細胞によって発現される生体高分子から選ばれる。別の実施態様では、この生成物は細胞から選ばれる。さらに別の実施態様では、この生成物は微生物から選ばれる。
【００７４】
本明細書に用いている、工程（ａ）で細胞を発酵させるための十分な時間は、細胞の増殖速度、細胞培養槽の大きさ及び発酵物を播種するための細胞培養物の量によって決まることになる。
【００７５】
本発明の一実施態様では、工程（ａ）で細胞を発酵させるための十分な時間は、１〜３日間など、４〜５日間など、６〜７日間など、８〜９日間など又はさらにそれ以上の間とすることができる。
【００７６】
上記バイオリアクター中に存在する細胞が十分な細胞密度に達している場合、又は上記採取出口からの流出物中に十分な生成物が存在する場合、生成物の採取を開始することができる。これは、例えば、分光光度計を用いて細胞密度を測定することにより、又は既知の手段、例えばポリペプチド生成物の場合には適切なタンパク質アッセイ方法を用いることによって対象生成物の量を測定することにより、判断することができる。
【００７７】
本発明の一実施態様では、工程（ａ）における特定の細胞密度は、少なくとも三千万細胞／ｍｌ、好ましくは少なくとも四千万細胞／ｍｌ、より好ましくは少なくとも五千万細胞／ｍｌ、例えば、少なくとも七千万細胞／ｍｌなど、少なくとも八千万細胞／ｍｌなどの少なくとも六千万細胞／ｍｌの細胞密度である。
【００７８】
別の実施態様では、工程（ａ）における特定の生体高分子レベルは、少なくとも０．０１０ｇ／Ｌ、例えば、少なくとも０．０５０ｇ／Ｌ、例えば、少なくとも０．１０ｇ／Ｌ、例えば、少なくとも０．５０ｇ／Ｌ、例えば、少なくとも１．０ｇ／Ｌ、例えば、少なくとも５．０ｇ／Ｌのレベルである。
【００７９】
本発明の一実施態様では、本方法は、工程（ａ）において、細胞培養槽（１）内で上記生体高分子を発現する上記細胞、上記細胞又は上記微生物を適切な条件下に適切な培地中で、上記生体高分子を発現する上記細胞が特定の細胞密度に達し、もしくは上記生体高分子が特定の濃度に達し、上記細胞が特定の細胞密度に達し、又は上記微生物が上記微生物の特定の密度に達するまでの十分な時間、上記不純物フィルタユニット（３）を介して不純物を除去することなく発酵させる工程を含む。
【００８０】
工程（ａ）における細胞の発酵中、不純物を含む通常１日当たり約０．５〜１リアクター容量の培地を、上記不純物フィルタユニット（３）を介して外へ灌流させ、これを、第一の新鮮培地を上記細胞培養槽注入口（２）から添加することにより交換又は一部交換する。これに関連した「リアクター容量」という用語は、上記特定システムの使用細胞培養槽容量に相当するものとする。
【００８１】
本明細書に用いている、交換又は一部交換する、とは、採取物出口（４）を通って出る同容量の培地を不純物フィルタユニット（３）を介して添加する第一の新鮮培地と交換するか、場合によっては、不純物フィルタユニット（３）を通って出る容量の培地を細胞培養槽注入口（２）から添加する第二の新鮮培地と一部のみ交換することが利点になり得ることを指す。というのは、これが細胞培養槽中の生成物の量、例えば、生体高分子の量、又は上記細胞の細胞密度もしくは上記微生物の細胞密度を制御する方法であるからである。
【００８２】
本発明の一実施態様では、工程（ａ）において、上記第一の新鮮培地の少なくとも６０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、を細胞培養槽注入口（２）から添加して不純物フィルタユニット（３）を介して除去した培地と一部交換する。
【００８３】
別の実施態様では、上記第一の新鮮培地を細胞培養槽注入口（２）から添加して工程（ａ）で不純物フィルタユニット（３）を介して除去した培地と交換する。
【００８４】
別の実施態様では、上記方法は、工程（ａ）において、上記生体高分子を発現する細胞が、同一条件下で不純物フィルタユニット（３）を用いることなく上記バイオリアクターシステムで得ることができる細胞密度よりも高い細胞密度に達することを含む。
【００８５】
さらに別の実施態様では、上記方法は、工程（ａ）において、上記細胞が、同一条件下で不純物フィルタユニット（３）を用いることなく上記バイオリアクターシステムで得ることができる細胞密度よりも高い細胞密度に達することを含む。
【００８６】
別の実施態様では、上記方法は、工程（ａ）において、上記微生物が、同一条件下で不純物フィルタユニット（３）を用いることなく上記バイオリアクターシステムで得ることができる細胞密度よりも高い細胞密度に達することを含む。
【００８７】
工程（ａ）において、上記生体高分子を発現する細胞が特定の細胞密度に達し、もしくは上記生体高分子が特定の濃度に達し、上記細胞が特定の細胞密度に達し、又は上記微生物がこの微生物の特定の細胞密度に達すると、上記生成物及び不純物を含む特定容量の培地が上記採取物出口（４）を介して細胞培養槽（１）から除去される。
【００８８】
上記細胞培養槽から除去される生成物及び不純物を含む培地の特定の容量については、個々のバイオリアクターシステム及び細胞株の特徴を考慮して当業者が決定することができる。一般に、それは、上記細胞培養槽中の培地の約３０％〜約８０％、例えば、約０．３〜約０．８リアクター容量の範囲となる。
【００８９】
本発明の一実施態様では、上記方法は、工程（ｂ）において、上記生成物及び不純物を含む培地の少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％を生成物採取モジュール（４）を介して細胞培養槽（１）から除去する工程を含む。
【００９０】
上記生成物及び不純物を含む上記特定容量の培地を工程（ｂ）において上記細胞培養槽から除去した後、工程（ｃ）において第二の新鮮培地を細胞培養槽注入口（２）を介して細胞培養槽（１）に添加して工程（ｂ）で上記採取物出口（４）から除去した培地と交換又は一部交換する。
【００９１】
本明細書に用いている、交換又は一部交換する、とは、採取物出口（４）を介して外へ灌流する同容量の培地を細胞培養槽注入口（２）から添加する第二の新鮮培地と交換するか、場合によっては、採取物出口（４）を通って出る容量の培地を細胞培養槽注入口（２）から添加する第二の新鮮培地と一部のみ交換ことが利点になり得ることを指す。というのは、これが細胞培養槽中の生成物の量、例えば、生体高分子の量、又は上記細胞の細胞密度もしくは上記微生物の密度を制御する方法であるからである。
【００９２】
本発明の一実施態様では、工程（ｃ）において、上記第二の新鮮培地の少なくとも６０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、を細胞培養槽注入口（２）から添加して工程（ｂ）で採取物出口（３）から除去した培地と一部交換する。
【００９３】
別の実施態様では、上記第二の新鮮培地を細胞培養槽注入口（２）から添加して工程（ｂ）で採取物出口（３）から除去した培地と交換する。
【００９４】
本発明において、工程（ｂ）及び（ｃ）は、不純物フィルタユニット（３）を介して不純物を除去することなく少なくとも２〜２０回反復することができる。
【００９５】
別の実施態様では、上記方法は、工程（ｂ）及び（ｃ）を少なくとも２〜３０回反復する工程（ｅ）をさらに含む。
【００９６】
さらに別の実施態様では、上記方法は、工程（ａ）に先行して、細胞培養槽（１）内で上記生体高分子を発現する上記細胞、上記細胞又は上記微生物を適切な条件下に適切な培地中で、上記生体高分子を発現する上記細胞が特定の細胞密度に達し、もしくは上記生体高分子が特定の濃度に達し、上記細胞が特定の細胞密度に達し、又は上記微生物がこの微生物の特定の密度に達するまでの十分な時間、上記不純物フィルタユニット（３）を介して不純物を除去することなく発酵させる工程を含む。
【００９７】
採取物出口（４）を介した上記細胞培養槽からの上記生成物及び不純物を含む培地の除去並びに細胞培養槽注入口（２）からの新しい培地の添加の数サイクルの後、不純物のレベルは次第に速い速度で上記細胞培養槽に蓄積し始める可能性がある。そのような場面では、上記不純物フィルタユニットを介して不純物を含む培地を除去し、細胞培養槽注入口（２）から第三の新鮮培地を添加して、工程（ｂ）の間、工程（ｃ）の間又は工程（ｂ）及び（ｃ）両方において不純物フィルタユニット（３）を介して除去した培地と交換又は一部交換することは利点とすることができる。
【００９８】
本発明の一実施態様では、上記方法は工程（ｄ）をさらに含む。
【００９９】
本発明の別の実施態様では、上記方法は、工程（ｄ）において、上記第三の新鮮培地を細胞培養槽注入口（２）から添加して不純物フィルタユニット（３）を介して除去した培地と交換することを含む。
【０１００】
本発明の別の実施態様では、工程（ｄ）において、上記第三の新鮮培地の少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、例えば、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、を細胞培養槽注入口（２）から添加して工程（ｂ）の間、工程（ｃ）の間又は工程（ｂ）及び（ｃ）両方の間で採取物出口（３）から除去した培地と一部交換する。
【０１０１】
別の実施態様では、上記方法は、工程（ｄ）が少なくとも２〜３０回反復される工程（ｆ）を含む。
【０１０２】
細胞の種類及び増殖条件にもよるが、細胞は、１時間未満、最長数日以内に倍増することができる。哺乳動物細胞株は約１４〜４８時間ごとに倍増することができるが、バイオリアクターにおけるポリペプチドの高収率発現に適応した細胞株は、一般に、約１５〜約３６時間ごとに倍増する。上記細胞が２４時間ごとに倍増する場合、生成物及び不純物を含むリアクター容量培地の半分（即ち、０．５）を上記採取物出口（４）から毎日除去することができ、リアクター容量の０．５を新しい新鮮培地と交換して消費された栄養物及び排出された培地を補充し、それによって上記バイオリアクターシステムにおいて一定の生産性を維持することができる。
【０１０３】
上記倍増時間が２４時間よりも速い場合には、生成物及び不純物を含むより多くのリアクター容量培地を毎日除去し、新しい新鮮培地と交換することができる。上記倍増時間が２４時間よりも遅い場合には、上記バイオリアクターシステムにおいて一定の生産性を維持しながらより少ないリアクター容量を毎日除去することができる。当業者であれば、対象生成物の最適な製造のために適切な細胞株を選び、細胞増殖を制御する方法を知っている。
【０１０４】
当業者であれば、細胞培養槽における培地の温度は細胞の生産性のための重要な因子であり、多くの場合、約３０〜３８℃の範囲の温度が最適であること、及び発酵中に温度を下げることが有利な場合があることを知っている。そのような手順は、特にＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の場合によく知られており、一般に、所望の細胞密度を得るための、例えば、約３７℃の最初の温度における初期発酵段階と、その後の、ポリペプチド生成物の発現を増加させ、細胞分裂を低下させるための発酵の残り期間における、例えば、約３２〜３５℃への温度低下とを含む。
【０１０５】
本発明の一実施態様では、上記方法は、工程（ａ）において、約３０〜３８℃の範囲の温度を有する適切な培地中、細胞培養槽（１）において細胞を発酵させる工程を含む。
【０１０６】
上記プロセスは、当該分野で周知されているようにして、そうでない場合は本明細書で説明したようにして、増殖状態、培地濃度、細胞密度、ｐＨなどが所望の基準内に維持されるように、連続的にモニターする。
【０１０７】
本発明によって得られた生成物は、上記培地及び不純物から単離することができる。
【０１０８】
生成物が細胞又は微生物である場合は、これらは標準的な技術によるろ過遠心分離又は沈降によって単離することができる。生成物が生体高分子である場合は、これは、清澄化プロセスによって細胞及び不純物から精製し、その後さらに、クロマトグラフィー系を用いて精製することができる。当業者であれば、本発明の生成物を精製する適切な技術を知っている。
【０１０９】
一実施態様では、上記方法は、上記細胞により発現される生体高分子、上記細胞又は上記微生物から選ばれる生成物及び不純物を含む特定容量の培地から生成物を精製する工程（ｇ）をさらに含む。
【０１１０】
本発明の方法は、上記生成物を精製するための精製設備を含む一般的なユニットにおいて、いくつかの細胞培養槽、例えば、２つ、例えば、３つ又はより好ましくは４つの細胞培養槽を順次運転するのに特に有用とすることができる。そのようなケースでは、例えば、４つの細胞培養槽は、培養槽４が他の培養槽への種培養物を調製するために機能するように運転される、例えば、拡大モードで運転される。
【０１１１】
次いで、細胞培養槽１、２及び３は、上記細胞が約３日の倍増時間を有し、生成物及び不純物を含む培地が１日目に細胞培養槽１から除去されて精製設備に供給され、精製のために除去された培地が新しい新鮮培地と交換されるモードで運転することができる。生成物及び不純物を含む培地は、２日目に細胞培養槽２から除去されて精製設備に供給され、精製のために除去された培地が新しい新鮮培地と交換される。生成物及び不純物を含む培地は、３日目に細胞培養槽３から除去されて精製設備に供給され、精製のために除去された培地が新しい新鮮培地と交換され、このプロセスは、上記細胞培養槽の１つの生産性が許容できないレベルまで減少するまで複数サイクル反復され、その後、細胞培養槽中の細胞は新しい発酵物を播種するために使用され、このプロセスは継続する。
【０１１２】
本願において引用した全ての特許及び非特許文献は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。
【０１１３】
本明細書中で特に指摘したり、明らかに文脈と矛盾したりしない限り、考えられるすべての変更における上記要素のいずれの組合せも本発明に包含される。
【０１１４】
本明細書に用いている用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に指示しないか、文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を含むと解釈すべきである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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