(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの組換えアルカリホスファターゼを含む、ヒト対象における低ホスファターゼ症(HPP)関連てんかん性発作の処置における使用のための組成物であって、前記対象は正常な血中及び/又は尿中レベルを超える、ピリドキサール5'-リン酸(PLP)、無機ピロリン酸(PPi)、及びホスホエタノールアミン(PEA)から選択される少なくとも１つのアルカリホスファターゼ基質を有し、前記対象は発作に対するビタミンB6処置に対し非応答性であると判定されている、組成物。
【請求項２】
前記対象は：
（i）欠損したアルカリホスファターゼ活性を有し、発作を患う又は患うリスクのあるものとして特定される；及び／又は、
（ii）正常レベルを超える少なくとも１つのアルカリホスファターゼ基質を有し、発作を患う又は患うリスクのあるものとして特定される、
請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記ヒト対象がHPPを有すると診断されており、かつ、対象が軽症又は検出不能の骨石灰化障害を有する、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
前記ヒト対象がHPPを有すると診断されていない、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
前記ヒト対象が、増加した血清ピリドキサール5'-リン酸(PLP)を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
前記ヒト対象が、減少した細胞内ピリドキサール5'-リン酸(PLP)を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
前記ヒト対象が、減少した脳ガンマ−アミノ酪酸(GABA)及び減少した脳セリンの少なくとも1つを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記ヒト対象が、増加した脳及び尿中シスタチオニンの少なくとも１つを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記組成物が、以下のａ）〜ｃ）：
ａ）少なくとも1週間、1ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間又は1年間毎日；
ｂ）少なくとも1つの付加的治療剤と組み合わせて；及び
ｃ）約0.1mg/kg/日〜約20mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で
のうち少なくとも1つでヒト対象に投与するために製剤化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも1つの付加的治療剤が、抗発作薬、又はビタミンB6（ピリドキシン）及びビタミンB6ビタマーの少なくとも1つである、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
抗発作薬及び少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、ヒト対象に、少なくとも1ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、又は少なくとも1年間、同時投与するために製剤化されている、請求項１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、所定の期間前記少なくとも1つの付加的治療剤と同時投与するために製剤化されている、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、約0.5mg/kg/日〜約5mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与するために製剤化されている、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、投与により脳GABAを上昇させることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、以下のａ）〜ｅ）：
ａ）組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP)、胎盤型アルカリホスファターゼ(PALP)、生殖細胞型アルカリホスファターゼ(GCALP)、小腸型アルカリホスファターゼ(IALP)、又はそれらの可溶性断片、生物学的に機能的な断片、融合物若しくはキメラ構築物の少なくとも1つを含む；
ｂ）配列番号2に示されたアミノ酸配列を含む；
ｃ）融合タンパク質である；
ｄ）免疫グロブリン分子又は負に荷電したペプチドに融合される；及び
ｅ）sALP-Fc-D10を含み、sALPは組換えアルカリホスファターゼの可溶性形態であり、Fcは断片結晶性領域(Fc)であり、前記D10は10個のポリアスパラギン酸残基を含む、
のうち少なくとも1つである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
前記免疫グロブリン分子が、断片結晶性領域(Fc)である、請求項１５に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
前記Fcが、配列番号3に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１５又は１６に記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
前記負に荷電したペプチドが、D10、D16、E10、及びE16の少なくとも1つである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、配列番号1又は配列番号4に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、静脈内、筋肉内、皮下、舌下、髄腔内又は皮内投与のために製剤化されている、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、静脈内投与のために製剤化されている、請求項２０に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ASCIIの写しは、2015年12月1日に作成され、0239PCT_SL.txtと名付けられ、大きさが19,449バイトである。
【０００２】
技術分野
本開示は、HPP又は非HPP患者における発作を処置する方法に関する。より詳細には、本開示は、少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質の異常なレベル及び/又は機能を有するが、正常又は非罹患の石灰化表現型を有するHPP患者又は非HPP患者の部分集団を特定すること、並びにそのような患者の部分集団を少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを用いて処置することに関する。
【背景技術】
【０００３】
低ホスファターゼ症(hypophosphatasia、HPP)は、くる病又は骨軟化症の稀な遺伝形態であり、その発生率は、疾患のより重度の形態については、カナダのメノナイトで2,500出生あたり1人程度であり、一般的集団において100,000出生あたり1人である。より軽度の形態は、さらに広く認められる。この「代謝先天異常」は、アルカリホスファターゼの組織非特異的アイソザイム(TNALP、別名:肝臓/骨/腎臓型ALP)をコードする遺伝子(ALPL)の機能喪失変異によって引き起こされる。その生化学的特徴は、血清中のALP活性が正常未満であること(低ホスファターゼ血症(hypophosphatasemia))であり、これにより、3つのリン化合物基質である無機ピロリン酸(PPi)、ホスホエタノールアミン(PEA)及びピリドキサール5'-リン酸(PLP)の血中及び/又は尿中レベルの上昇が生じる。
【０００４】
HPPは、周産期、乳児期、小児期、成人期、及び歯型低ホスファターゼ症形態に特色を有し、診断で年齢に応じて歴史的に分類される。表現型は、子宮内で骨石灰化がほとんど全く無く死産する型から、成人期に初めて特発骨折及び歯疾患が起こる型まである。周産期致死性HPP(周産期HPP又はPL-HPP)は子宮内で発現し、死産の原因となりうる。一部の新生児は数日間生存するが、胸の低形成及びくる病疾患により呼吸器不全の増大を被る。6ヶ月齢前に診断される乳児期HPPでは、栄養不良、不十分な体重増加及びくる病の出現が始まるまで、出生後の発達は正常のようにみえる。放射線学的特色は、特徴的であり、骨格石灰化不全を示し、しばしば肋骨骨折及び胸の奇形に至る進行性の骨格脱石灰化が伴う。小児期HPPは、非常に多様な臨床発現を有する。乳歯の早期喪失は、歯根と歯周靭帯をつなげるセメント質の形成不全、低形成又は異形成から生じる。くる病は、低身長並びに骨格変形、例えば、内反膝、骨幹端の広がりによる手首、膝及び足首の拡大の原因となる。成人のHPPは、通常、中年で現れるが、くる病及び/又は歯の早期喪失の経歴があり、その後に青年期及び若年青年期の良好な健康状態があることが多い。反復性中足骨疲労骨折はよく見られ、ピロリン酸カルシウム二水和物沈着は関節炎及びピロリン酸関節症の発病を引き起こす。歯型低ホスファターゼ症は、唯一の臨床異常が歯科疾患であるときに診断され、放射線学的研究、さらには骨生検では、くる病又は骨軟化症の徴候は明らかでない。
【０００５】
HPPの重度の臨床形態は、通常、常染色体性劣性形質として遺伝され、そのような患者の親は、正常レベル未満の血清AP活性を示す。HPPのより軽度の形態、例えば、成人及び歯型低ホスファターゼ症についても、常染色体性優性遺伝パターンが記録されている。
【０００６】
HPPの発生が稀であるため、HPPの診断は、疾患の早期段階では通常、見逃される。加えて、ほとんどのHPP症状、例えば、異常な頭部形態、背部痛、骨折、骨棘(関節周辺の隆起)、内反膝、胸郭における隆起、長期的な高さの喪失/低身長、及び関節における疼痛は、他のより一般的な疾患、例えば、骨形成不全症、栄養性くる病、変形性関節炎、及び骨粗鬆症により生じる症状と類似している。HPPを診断するために時々使用される他の因子としては、例えば、血中のアルカリホスファターゼ(ALP)が低レベルであること、血液及び尿中のカルシウムレベルが正常より高いこと、骨の変化(例えば、腕及び脚における骨の内反(屈曲))、成長不良、手首及び足首の肥厚、靱帯の弛緩、骨痛、骨折、歯の早期喪失、HPPの家族歴、並びにALPL遺伝子における変異が挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
HPP患者は、様々な重症度で症状(例えば、石灰化障害)を発症しうることから、HPPの典型的症状が軽度から無しである未特定のHPP患者部分集団があり、この部分集団は従来的に誤って診断され、及び/又は処置(例えば、組換えTNALPによる酵素補充)について無視されてきた。さらに、多くのHPP患者は、特徴的な石灰化障害に加えて、付加的症状(例えば、発作)を有する。したがって、HPP症状を伴う健康状態悪化の可能性のモニタリング(及びその早期処置)のためだけではなく、石灰化障害以外の症状を、組換えTNALPを用いて処置するために、そのような患者集団を特定することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、アルカリホスファターゼ(例えば、ヒトにおけるALPL及びマウスにおけるAkp2)遺伝子変異を有する対象の集団を特定する方法を提供する。対象のそのような集団は、HPPを有すると以前に診断されている場合もあり、HPPを有するとまだ診断されていない場合もある。そのような遺伝子変異は、減少したアルカリホスファターゼタンパク質レベル及び/又はタンパク質機能(例えば、PPi、PLP及び/又はPEA、又は他の基質、例えば、パラニトロフェニルリン酸(pNPP)などに対する酵素機能)をもたらしうる。そのような遺伝子変異は、当該分野で周知の方法によって特定しうる。そのような集団を特定した後、続けて、発作及び/又は他のHPP症状を伴う疾患の進行を密接にモニタリングする。組換えアルカリホスファターゼは、発作及び/又は他の症状を処置又は防止するために、そのような集団に与えられる。
【０００９】
本開示は、一態様で、アルカリホスファターゼ遺伝子変異及び少なくとも1つの症状を有する対象の集団を特定する方法を提供する。一部の実施形態では、そのような集団における対象は、以前にHPPを有すると診断されているが、骨及び/又は歯石灰化障害は、軽症、非罹患、又は検出不能である。他の実施形態では、そのような集団の対象は、HPPを有するとまだ診断されていない。一実施形態では、そのような集団の対象は、HPPを有するとまだ診断されておらず、特徴的なHPP症状(例えば、骨及び/又は歯石灰化障害)を有しない。一部の実施形態では、少なくとも1つの非HPP症状は、発作である。そのような発作は、ビタミンB6及び/又は他の従来的な抗発作薬処置に対して、応答性の場合も非応答性の場合もある。本開示における用語「検出不能」は、患者における表現型(例えば、骨及び/若しくは歯石灰化表現型の1つ)があまりにも軽症で、当業者が当該分野で公知の一般的技術を使用して検出できないというシナリオ、又は、当業者が、患者の表現型と、一般的な健常者、若しくは表現型が一般的に認められた診断標準である疾患若しくは障害(例えば、HPP)を有しない一般的患者の表現型とを識別できないシナリオを指す。本開示における用語「非罹患」は、患者の表現型(例えば、骨及び/若しくは歯の石灰化表現型)が、検出不能であるか、又は検出可能であるが、あまりにも軽症であって、そのような表現型を有する患者が、表現型が一般的に認められた診断標準である疾患若しくは障害(例えば、HPP)を有する患者であると当業者がみなすような一般的に認められた診断閾値には適合しないというシナリオを指す。
【００１０】
本開示は、HPPを有する対象の部分集団を特定する方法であって、そのような対象における骨及び/又は歯の石灰化の程度を測定すること、並びに当該程度を正常な健常対象における程度と比較することを含み、ここで部分集団におけるそのような対象は、正常な健常対象と比較して石灰化障害が軽症、非罹患又は検出不能である、方法を提供する。一部の実施形態では、そのような部分集団の対象は、発作症状を有する。そのような発作症状は、ビタミンB6及び/又は他の従来的抗発作薬処置に対して、応答性の場合も非応答性の場合もある。
【００１１】
本開示は、HPPを有すると診断されていない対象の部分集団を特定する方法であって、そのような部分集団におけるアルカリホスファターゼレベル及び/又は酵素機能を測定することを含み、ここでそのような部分集団における対象は、正常な健常対象と比較して、欠陥アルカリホスファターゼレベル及び/又は酵素機能を有する、方法を提供する。一部の実施形態では、そのような部分集団の対象は、発作症状を有する。そのような発作症状は、ビタミンB6及び/又は他の従来的抗発作薬処置に対して、応答性の場合も非応答性の場合もある。当該分野における従来的技術を使用して、これらの対象におけるアルカリホスファターゼレベルを測定することができる。例えば、アルカリホスファターゼのDNA/RNAレベルは、PCR又は遺伝子スクリーニングで使用されるハイブリダイゼーション(例えば、サザン/ノザンブロット)法により試験されうる。アルカリホスファターゼのタンパク質レベルは、PAGE/SDS-PAGE、ウェスタンブロット、ELISA又は抗アルカリホスファターゼ抗体を使用する他のイムノアッセイにより試験してもよい。アルカリホスファターゼの酵素機能は、アルカリホスファターゼ基質PPi、PLP及び/又はPEA、又は他の基質、例えば、パラニトロフェニルリン酸(pNPP)などを使用してin vitro又はin vivoで試験してもよい。一実施形態では、部分集団におけるそのような対象は、軽症、非罹患、又は検出不能の石灰化障害を有する。
【００１２】
一態様として、本開示は、上記に開示されるような対象の集団又は部分集団を特定する方法を提供する。別の態様として、本開示は、特定された集団又は部分集団における対象の少なくとも1つの症状を、組換えALP補充療法を用いて処置する方法を提供する。一部の実施形態では、そのような少なくとも1つの症状は、発作であり、発作は、ビタミンB6及び/又は他の抗発作薬処置に対して応答性又は非応答性のいずれかである。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、異常なアルカリホスファターゼ活性を有する対象における発作を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを対象に投与することを含む、方法を提供する。そのような異常なアルカリホスファターゼ活性は、対象における少なくとも1つのアルカリホスファターゼの異常なタンパク質レベル及び/又は機能によるものでありうる。本明細書に開示のアルカリホスファターゼ活性は、ホスホエタノールアミン(PEA)、無機ピロリン酸(PPi)及び/又はピリドキサール5'-リン酸(PLP)、又は他の基質、例えば、パラニトロフェニルリン酸(pNPP)などに対する生理学的条件下での少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼの酵素活性により測定することができる。好ましい一実施形態では、少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質は、PLP、PPi及びPEAからなる群から選択される。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、正常レベルを超える少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質を有する対象における発作を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを対象に投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質は、PLP、PPi、PEA、及び他の基質、例えば、パラニトロフェニルリン酸(pNPP)などからなる群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質は、PLP、PPi及びPEAからなる群から選択される。
【００１５】
本開示における、「正常を超える」、「正常より低い」、「正常より高い」又は他の類似の様々な用語は、特定の対象(例えば、ヒト)における少なくとも1つの分子のレベル及び/又は活性が、正常対象(例えば、正常なヒト)における少なくとも1つの分子(又はその内在性対応物)におけるレベル及び/又は活性を超える、より低い又はより高いことを指す。正常なヒトの最も明らかな例は、HPP又はHPP症状を有しないヒト、並びにHPP関連症状をもたらしうるALPL遺伝子及びALPタンパク質に変異又は修飾を有しないヒトである。ALP機能に着目する別のシナリオにおいて、本開示における「正常」なヒトの範囲は、異常な内在性アルカリホスファターゼ活性(例えば、基質(PPi、PEA、PLP又はpNPP)のレベルにより、他の健常又は正常なヒトの対応する活性と比較して試験されうる)を有しない任意のヒトを含むように拡大されてもよい。
【００１６】
他の実施形態では、本開示は、対象における発作を処置する方法であって、
(i)異常なアルカリホスファターゼ活性(例えば、異常なタンパク質レベル及び/又は機能による)を有する、発作を患う又は患う可能性のある対象の部分集団を特定すること、並びに
(ii)治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを、前記部分集団における対象に投与すること
を含む、方法を提供する。本明細書に開示のアルカリホスファターゼ活性は、ホスホエタノールアミン(PEA)、無機ピロリン酸(PPi)及び/又はピリドキサール5'-リン酸(PLP)、又は他の基質、例えば、パラニトロフェニルリン酸(pNPP)などに対する生理学的条件下での少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼの酵素活性により測定することができる。好ましい一実施形態では、少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質は、PLP、PPi及びPEAからなる群から選択される。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、対象における発作を処置する方法であって、
(i)正常レベルを超える少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質を有する、発作を患う又は患うリスクのある対象の集団を特定すること、及び
(ii)治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを、前記集団における対象に投与すること
を含む方法を提供する。一実施形態では、少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質は、PLP、PPi、PEA、及び他の基質、例えば、パラニトロフェニルリン酸(pNPP)などからなる群から選択される。好ましい一実施形態では、少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質は、PLP、PPi及びPEAからなる群から選択される。
【００１８】
本明細書に開示の集団又は部分集団の対象は、軽症又は検出不能の骨及び/又は歯石灰化障害を有する低ホスファターゼ症(HPP)患者、非HPP患者、又はHPPを有すると診断されていない対象でありうる。
【００１９】
本明細書に開示の集団又は部分集団の対象は、増加した血清ピリドキサール5'-リン酸(PLP)及び/又は減少した細胞内ピリドキサール5'-リン酸(PLP)を有しうる。
【００２０】
本明細書に開示の集団又は部分集団の対象は、脳及び/又は他の組織/器官におけるガンマ-アミノ酪酸(GABA)及びセリンレベルの少なくとも1つが減少している場合がある。本明細書に開示の集団又は部分集団の対象は、脳及び他の組織/器官の増加したシスタチオニンレベル(例えば、尿中で検出可能)の少なくとも1つを有しうる。一実施形態では、対象は、減少した脳GABA及び減少した脳セリンの少なくとも1つを有する。別の実施形態では、対象は、増加した脳及び尿中シスタチオニンの少なくとも1つを有する。
【００２１】
一部の実施形態では、本明細書に開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、少なくとも1週間、1ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間又は1年間連続して部分集団の対象に投与される。例えば、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、3日間、1週間、2週間、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間、9ヶ月間、10ヶ月間、11ヶ月間、1年間、15ヶ月間、18ヶ月間、2年間、30ヶ月間、3年間又はより長い期間、毎日投与されてもよい。
【００２２】
一実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼの投与は、脳GABA及び/又はセリンレベルを上昇させる。別の実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼの投与は、脳及び/又は尿シスタチオニンレベルを低下させる。
【００２３】
一部の実施形態では、治療有効量の少なくとも1つの付加的治療剤を、本明細書に記載の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼと組み合わせて、本明細書に開示の集団又は部分集団の対象に投与する。一実施形態では、そのような少なくとも1つの付加的治療剤は、少なくとも1つの抗発作薬を含む。そのような少なくとも1つの抗発作薬は、1つ以上の薬物でありえ、例えば、限定されないが、ビタミンB6及びそのバリアント、ナトリウムチャネルを遮断する又はγ-アミノ酪酸(GABA)機能を増強する任意の抗発作薬、GABAA受容体、GAT-1 GABAトランスポーター、GABAトランスアミナーゼ、電位開口型カルシウムチャネルを遮断する任意の抗発作薬、シナプス小胞糖タンパク質2A(SV2A)、α2δ-アルデヒド(例えば、パラアルデヒド)、芳香族アリルアルコール(例えば、スチリペントール)、バルビツレート(例えば、フェノバルビタール、メチルフェノバルビタール、及びバルベキサクロン)、ベンゾジアゼピン(例えば、クロバザム、クロナゼパム、クロラゼペート、ジアゼパム、ミダゾラム、ロラゼパム、ニトラゼパム、テマゼパム、及びニメタゼパム)、臭化物(例えば、臭化カリウム)、カルバメート(例えば、フェルバメート)、カルボキサミド(例えば、カルバマゼピン、オクスカルバゼピン、及びエスリカルバゼピンアセテート)、脂肪酸(例えば、バルプロエート、ビガバトリン、プロガビド、及びチアガビン)、フルクトース誘導体(例えば、トピラメート)、GABA類似体(例えば、ガバペンチン及びプレガバリン)、ヒダントイン(例えば、エトトイン、フェニトイン、メフェニトイン、及びホスフェニトイン)、オキサゾリジンジオン(例えば、パラメタジオン、トリメタジオン、ジメタジオン、及びエタジオン)、プロピオネート(例えば、ベクラミド)、ピリミジンジオン(例えば、プリミドン)、ピロリン(例えば、ブリバラセタム、レベチラセタム、及びセレトラセタム)、スクシンイミド(例えば、エトスクシミド、フェンスクシミド、及びメスクシミド)、スルホンアミド(例えば、アセタゾラミド、スルチアム、メタゾラミド、及びゾニサミド)、トリアジン(例えば、ラモトリギン)、ウレア(例えば、フェネツリド及びフェナセミド)、バルプロイルアミド(バルプロエートのアミド誘導体)(例えば、バルプロミド及びバルノクタミド)、又は他の薬物(例えば、ペランパネル)が挙げられる。本開示の用語「に組み合わせた(in conjunction to)」又は「と組み合わせた(in conjunction with)」は、少なくとも2つの行為(例えば、本明細書に開示の任意の組換えアルカリホスファターゼ及び/又は任意の付加的抗発作薬の少なくとも少なくとも2つの投与)が、時間的又は空間的に同じ点で生じること、例えば、限定されないが、同じ投与製剤であること、異なる製剤だが同じ時間に投与されること、異なる製剤で当業者によって同じ時間に投与されたとみなされるに十分短い時間間隔で逐次投与されること、並びに異なる製剤で互いに少なくとも、例えば、30分間、1時間、2時間、4時間、6時間、8時間、12時間、18時間、1日間、2日間、3日間、1週間、2週間又はより長い時間の時間間隔で逐次投与され、そのような時間間隔が当業者によって治療のための時間的に又は空間的に同じ点の投与であって、別の投与時点とは考えられない間隔であることを意味する。
【００２４】
別の態様として、本開示はさらに
少なくとも1つの付加的抗発作薬及び少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼの同時投与を、所定の期間維持すること、及び
対象への少なくとも1つの付加的抗発作薬の投与は停止するが、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼの投与は維持すること
を含む、本明細書に開示の発作を処置する方法を提供する。
【００２５】
一部の実施形態では、少なくとも1つの付加的抗発作薬及び本明細書に開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、対象に、少なくとも1ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、又は少なくとも1年間、同時投与される。例えば、同時投与の所定期間は、少なくとも3日間、1週間、2週間、1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間、9ヶ月間、10ヶ月間、11ヶ月間、1年間、15ヶ月間、18ヶ月間、2年間、30ヶ月間、3年間、又はより長い期間でありうる。一実施形態では、少なくとも1つの付加的抗発作薬は、ビタミンB6(ピリドキシン)又はそのバリアントの少なくとも1つである。
【００２６】
一部の実施形態では、処置のために本明細書で記載される少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、ホスホエタノールアミン(PEA)、無機ピロリン酸(PPi)及び/又はピリドキサール5'-リン酸(PLP)、又は他の基質、例えば、パラニトロフェニルリン酸(pNPP)などに対して生理学的に活性である。一部の実施形態では、そのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP)、胎盤型アルカリホスファターゼ(PALP)、生殖細胞型アルカリホスファターゼ(GCALP)、小腸型アルカリホスファターゼ(IALP)、又はそれらの機能的断片、融合物若しくはキメラ構築物を含む。一実施形態では、そのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、TNALP、PALP、GCALP若しくはIALPの可溶性断片又はそれらの機能的断片、融合物若しくはそのキメラ構築物である。一実施形態では、そのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、少なくとも1つ、2つ、3つ又は4つの様々な種類のアルカリホスファターゼに由来する断片又は部分を含む融合物又はキメラタンパク質、例えば、TNALP-IALPキメラ構築物、IALP-PALPキメラ構築物、及び他のTNALPキメラ又は融合タンパク質である。一実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2に示されたアミノ酸配列を含む。一部の他の実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも75％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2に示された配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。一部の他の実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。一実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも75％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。別の実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。別の実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。別の実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。別の実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。一実施形態では、本開示の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも90％、95％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド分子によってコードされ、ここで高ストリンジェンシー条件は、6×SSC、5×Denhardt試薬、0.5％SDS及び100mg/mlの変性断片化サケ精子DNA中68℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに2×SSC及び0.5％SDS中にて室温で10分間、2×SSC及び0.1％SDS中にて室温で10分間、及び0.1×SSC及び0.5％SDS中65℃で5分間3回の洗浄を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、処置のために本明細書で記載される少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、融合タンパク質である。当該分野で公知の少なくとも1つのリンカーを、そのような融合タンパク質に挿入してもよい。一部の実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、免疫グロブリン分子に融合される。一実施形態では、免疫グロブリン分子は、断片結晶性領域(Fc)である。別の実施形態では、Fcは、配列番号3に示されたアミノ酸配列を含む。一部の他の実施形態では、Fcは、配列番号3と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の他の実施形態では、Fcは、配列番号3と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。一実施形態では、Fcは、配列番号3と少なくとも90％、95％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド分子によってコードされ、ここで高ストリンジェンシー条件は、6×SSC、5×Denhardt試薬、0.5％SDS及び100mg/mlの変性断片化サケ精子DNA中68℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに2×SSC及び0.5％SDS中にて室温で10分間、2×SSC及び0.1％SDS中にて室温で10分間、及び0.1×SSC及び0.5％SDS中65℃で5分間3回の洗浄を含む。
【００２８】
他の実施形態では、処置のために本明細書で記載される少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、負に荷電したペプチドに融合されている。そのような負に荷電したペプチドは、任意の長さの、例えば、6〜20アミノ酸残基のポリアスパルテート又はポリグルタメートを含みうる。一部の実施形態では、負に荷電したペプチドは、D10、D8、D16、E10、E8又はE16である。一部の実施形態では、負に荷電したペプチドは、D10、D16、E10又はE16である。好ましい一実施形態では、負に荷電したペプチドは、D10である。
【００２９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、sALP-Fc-D10の構造、又はsALP-Fc、Fc-sALP、Fc-sALP-D10、D10-sALP-Fc若しくはD10-Fc-sALPの構造を含む可溶性ALP(sALP)融合タンパク質を含む。一実施形態では、本明細書に記載の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、sALP-Fc-D10の構造を含む。別の実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1又は4に示されたアミノ酸配列を含む。一部の他の実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1又は4と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の他の実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1又は4と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。一実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号1又は4と少なくとも90％、95％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド分子によってコードされ、ここで高ストリンジェンシー条件は、6×SSC、5×Denhardt試薬、0.5％SDS及び100mg/mlの変性断片化サケ精子DNA中68℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに2×SSC及び0.5％SDS中にて室温で10分間、2×SSC及び0.1％SDS中にて室温で10分間、及び0.1×SSC及び0.5％SDS中65℃で5分間3回の洗浄を含む。
【００３０】
一部の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、約0.1mg/kg/日〜約20mg/kg/日、約0.1mg/kg/日〜約10mg/kg/日、約0.1mg/kg/日〜約8mg/kg/日、約0.1mg/kg/日〜約5mg/kg/日、約0.1mg/kg/日〜約1mg/kg/日、約0.1mg/kg/日〜約0.5mg/kg/日、約0.5mg/kg/日〜約20mg/kg/日、約0.5mg/kg/日〜約10mg/kg/日、約0.5mg/kg/日〜約8mg/kg/日、約0.5mg/kg/日〜約5mg/kg/日、約0.5mg/kg/日〜約1mg/kg/日、約1mg/kg/日〜約20mg/kg/日、約1mg/kg/日〜約10mg/kg/日、約1mg/kg/日〜約8mg/kg/日、約1mg/kg/日〜約5mg/kg/日、又は同程度の毎週の投与量(例えば、6mg/kg/週は1mg/kg/日と同程度である)の投与量で投与することができる。本明細書に記載の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼの投与経路としては、当該分野で公知の方法を挙げることができ、例えば、少なくとも静脈内、筋肉内、皮下、舌下、髄腔内及び/又は皮内投与が挙げられる。一実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、静脈内に投与される。一部の実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、同じ又は異なる投与経路を通じて複数回投与で投与される。他の実施形態では、少なくとも1つの組換えのアルカリホスファターゼは、異なる経路を通じて同時に又は逐次的に複数回投与で投与される。例えば、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、最初に静脈内に投与され、次いで後に皮下に投与されてもよい。代替的に、静脈内投与は、迅速な治療応答のために、後の投与で使用されてもよい。複数回投与のための経路の選択は、最大の有効性、安定性(例えば、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼ及び/又は少なくとも1つの付加的抗発作薬の半減期)、効率及び/又は高い対費用効果の目的を達成するために、当業者により決定されうる。様々な投与量における投与経路の選択及び/又は様々な投与経路の適用に対して、本開示において特別な限定は意図されていない。
【００３１】
別の態様として、本開示は、異常なアルカリホスファターゼ活性を有する対象における発作を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを前記対象に投与することを含み、ここで少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、sALP-Fc-D10の構造を含む、方法を提供する。一実施形態では、そのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示のそのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。別の実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも90％、95％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド分子によってコードされ、ここで高ストリンジェンシー条件は、6×SSC、5×Denhardt試薬、0.5％SDS及び100mg/mlの変性断片化サケ精子DNA中68℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに2×SSC及び0.5％SDS中にて室温で10分間、2×SSC及び0.1％SDS中にて室温で10分間、及び0.1×SSC及び0.5％SDS中65℃で5分間3回の洗浄を含む。
【００３２】
別の態様として、本開示は、正常レベルを超える少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質を有する対象における発作を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを前記対象に投与することを含み、ここで少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、sALP-Fc-D10の構造を含む、方法を提供する。一実施形態では、そのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示のそのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。別の実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも90％、95％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド分子によってコードされ、ここで高ストリンジェンシー条件は、6×SSC、5×Denhardt試薬、0.5％SDS及び100mg/mlの変性断片化サケ精子DNA中68℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに2×SSC及び0.5％SDS中にて室温で10分間、2×SSC及び0.1％SDS中にて室温で10分間、及び0.1×SSC及び0.5％SDS中65℃で5分間3回の洗浄を含む。
【００３３】
別の態様として、本開示は、対象における発作を処置する方法であって、
(i)異常なアルカリホスファターゼ活性を有する、発作を患う又は患うリスクのある対象の集団を特定すること、及び
(ii)治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを、前記集団における対象に投与すること
を含み、ここで少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼはsALP-Fc-D10の構造を含む、方法を提供する。一実施形態では、そのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示のそのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。別の実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも90％、95％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド分子によってコードされ、ここで高ストリンジェンシー条件は、6×SSC、5×Denhardt試薬、0.5％SDS及び100mg/mlの変性断片化サケ精子DNA中68℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに2×SSC及び0.5％SDS中にて室温で10分間、2×SSC及び0.1％SDS中にて室温で10分間、及び0.1×SSC及び0.5％SDS中65℃で5分間3回の洗浄を含む。
【００３４】
別の態様として、本開示は、対象における発作を処置する方法であって、
(i)少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質が正常レベルを超えている、発作を患う又は患うリスクのある対象の集団を特定すること、及び
(ii)治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを、前記集団における対象に投与すること
を含み、ここで少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼはsALP-Fc-D10の構造を含む、方法を提供する。一実施形態では、そのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本開示のそのような少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子によってコードされる。別の実施形態では、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼは、配列番号2と少なくとも90％、95％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチド分子と高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド分子によってコードされ、ここで高ストリンジェンシー条件は、6×SSC、5×Denhardt試薬、0.5％SDS及び100mg/mlの変性断片化サケ精子DNA中68℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに2×SSC及び0.5％SDS中にて室温で10分間、2×SSC及び0.1％SDS中にて室温で10分間、及び0.1×SSC及び0.5％SDS中65℃で5分間3回の洗浄を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の対象は、ヒト又は非ヒト哺乳動物である。一実施形態では、対象は、ヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図1は、ヒト可溶性TNALP融合タンパク質hsTNALP-FcD10により例証される本開示の組換えALPの設計及び模式的構造を表している。パネルAは、N末端シグナルペプチド及びGPI付加のための一過性膜アンカーシグナルを含む、ヒト組織非特異的アルカリホスファターゼ遺伝子(TNALP)の完全一次翻訳産物の模式図を表す。パネルBは、融合タンパク質の一次翻訳産物を表す。パネルCは、切断可能なTNALPシグナルペプチドを欠く一次翻訳産物を表す。
【図２】図2は、N末端ペプチドシグナルを有するhsTNALP-FcD10についてのタンパク質配列を表している(配列番号1)。この配列において、17-aa N末端ペプチドシグナルは、イタリック及び下線付きで示している。hsTNALP部分(配列番号2)は、イタリックとしているが、下線は付していない。Fc部分(配列番号3)は、下線を付しているが、イタリックとはしていない。推定N-グリコシル化部位に相当するアスパラギン(N)残基は、太字及び小文字で標識している。太字の大文字(つまり、LK及びDI)は、それぞれ、hsTNALP部分とFc部分との間及びFc部分とC末端D10との間のリンカーに相当する。これらのリンカーは、cDNA操作の間に導入されたエンドヌクレアーゼ制限部位に由来する。
【図３】図3は、N末端ペプチドシグナルを有しないhsTNALP-FcD10についてのタンパク質配列を表している(配列番号4)。hsTNALP部分(配列番号2)は、イタリックとしているが、下線は付していない。Fc部分(配列番号3)は、下線を付しているが、イタリックとはしていない。推定N-グリコシル化部位に相当するアスパラギン(N)残基は、太字及び小文字で標識している。太字の大文字(つまり、LK及びDI)は、それぞれ、hsTNALP部分とFc部分との間及びFc部分とC末端D10との間のリンカーに相当する。
【図４】図4は、野生型マウス(WT)、Akp2+/-ヘテロ接合性マウス(HET)及びAkp2-/-ホモ接合性マウス(HOM)の脚の骨の石灰化を示すX線画像を表している。様々な程度の石灰化障害(重度の表現型を有するものから非罹患の表現型を有するものまで)が、Akp2-/-ホモ接合性マウスの中で見出された。
【図５】図5は、Akp2-/-ホモ接合性マウスの異なるコロニーの間での表現型分布(X線検査画像スコアリングを使用)の概要を表している。
【図６】図6は、疾患重症度(つまり、重度若しくは軽度の石灰化障害又は非罹患/正常の石灰化を有する)と相関するAkp2-/-ホモ接合性マウス(世代称号:F4)の体重を示している。野生型マウス(Akp2+/+)を対照として使用した。
【図７】図7は、疾患重症度石灰化表現型と相関するAkp2-/-ホモ接合性マウスの体重を示している。データの1番左の2つの群(Akp2-/-)は、様々な(例えば、重度又は非罹患の)疾患重症度を有する全てのAkp2-/-ホモ接合性マウスのデータを表す。野生型及びAkp2+/-ヘテロ接合性マウスを対照として使用した。
【図８】図8は、疾患重症度と相関するAkp2-/-ホモ接合性マウス(世代称号:F10)の骨(大腿骨及び脛骨)の長さを示している。データの1番左の群(Akp2-/-)は、様々な(例えば、重度又は非罹患の)疾患重症度を有する全てのAkp2-/-ホモ接合性マウスのデータを表す。野生型及びAkp2+/-ヘテロ接合性マウスを対照として使用した。
【図９】図9は、様々な石灰化表現型を有するAkp2-/-ホモ接合性マウス間での寿命の比較を表している。全てのAkp2-/-ホモ接合性マウスは、石灰化表現型にかかわらず、顕著に寿命が減少していた。
【図１０】図10は、Akp2-/-ホモ接合性マウスが、脳ガンマ-アミノ酪酸(GABA)濃度の低下を有したが、毎日のALP(sTNALP-FcD10又はアスホターゼアルファ)処置によって修復可能であったことを示している。処置有り又は無しの野生型マウスを対照として使用した。左のパネル: (左から右へ)空のビヒクル対照で9日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「GRP1」)、sTNALP-FcD10(8.2mg/kg)で9日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「GRP2」)及びいずれの処置も行わなかった野生型マウス(「GRP3」)について、GABA濃度を10日目で測定した。右のパネル: (左から右へ)sTNALP-FcD10(8.2mg/kg)で35日目まで毎日処置し、その後、空のビヒクル対照で47日目まで毎日処置した(つまり、処置不連続)ノックアウトマウス(「GRP1」)、sTNALP-FcD10で47日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「GRP2」)、いずれの処置も行わなかった野生型マウス(「GRP3」)、及びsTNALP-FcD10で35日目まで毎日処置し、次いで空のビヒクル対照で47日目まで毎日処置した野生型マウス(「GRP4」)について、GABA濃度を48日目で測定した。
【図１１】図11は、Akp2-/-ホモ接合性マウスが、脳シスタチオニン濃度の顕著な上昇を有したが、毎日のALP(sTNALP-FcD10又はアスホターゼアルファ)処置によって修復可能であったことを示している。処置有り又は無しの野生型マウスを対照として使用した。左のパネル: (左から右へ)空のビヒクル対照で9日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「GRP1」)、sTNALP-FcD10(8.2mg/kg)で9日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「GRP2」)、及びいずれの処置も行わなかった野生型マウス(「GRP3」)について、シスタチオニン濃度を10日目で測定した。右のパネル: sTNALP-FcD10(8.2mg/kg)で35日目まで毎日処置し、その後、空のビヒクル対照で47日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「不連続」)(「GRP1」)、sTNALP-FcD10で47日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「GRP2」)、いずれの処置も行わなかった野生型マウス(「GRP3」)、及びsTNALP-FcD10で35日目まで毎日処置し、次いで空のビヒクル対照で47日目まで毎日処置した野生型マウス(「GRP4」)について、シスタチオニン濃度を48日目で測定した。
【図１２】図12は、Akp2-/-ホモ接合性マウスが、脳セリン濃度の顕著な低下を有したが、毎日のALP(sTNALP-FcD10又はアスホターゼアルファ)処置によって修復可能であったことを示している。処置有り又は無しの野生型マウスを対照として使用した。左のパネル: (左から右へ)空のビヒクル対照で9日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「GRP1」)、sTNALP-FcD10で9日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「GRP2」)、及びいずれの処置も行わなかった野生型マウス(「GRP3」)について、セリン濃度を10日目で測定した。右のパネル: sTNALP-FcD10(8.2mg/kg)で35日目まで毎日処置し、その後、空のビヒクル対照で47日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「不連続」)(「GRP1」)、sTNALP-FcD10で47日目まで毎日処置したノックアウトマウス(「GRP2」)、いずれの処置も行わなかった野生型マウス(「GRP3」)、及びsTNALP-FcD10で35日目まで毎日処置し、空のビヒクル対照で47日目まで毎日処置した野生型マウス(「GRP4」)について、セリン濃度を48日目で測定した。
【図１３】図13は、325ppmの食事性ピリドキシン補助剤が投与されたAkp2-/-ホモ接合性マウス(重度石灰化障害又は正常石灰化を有する)の寿命を比較している。
【図１４】図14は、全て325ppmの食事性ピリドキシン補助剤が投与された、野生型(WT)又は重度石灰化障害(KO-重度)若しくは正常石灰化(KO-正常)を有するAkp2-/-ホモ接合性マウスの脳GABA及びシスタチオニン濃度を比較している。陰影面積が示すプロファイルでは、マウスは比較的低い脳GABA濃度を有する一方、比較的高い脳シスタチオニン濃度を有している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
多くのHPP患者が、特徴的な石灰化障害への付加的症状として、発作を有する。Akp2-/-マウスも、後に致死的となる発作を発症する。Waymireら  1995 Nature Genetics 11:45-51を参照。ビタミンB6(ピリドキシン)は、発作に対する従来的処置であるので、発作を有する多くのHPP患者は、予防的治療としてビタミンB6で処置されている。しかしながら、一部のHPP患者は、ピリドキシン処置に対して非応答性である。ピリドキシン応答性HPP患者であっても、高用量のビタミンB6は、長期的に毒性となりえ、神経損傷、又は究極的には不可逆的となりうる四肢のしびれ及び刺痛がもたらされうる。最も一般的なビタミンB6毒性症状としては、例えば、頭痛、重度疲労、気分変動、神経変動などが挙げられる。ウェブサイト(http://www.mayoclinic.org/drugs-supplements/vitamin-b6/safety/hrb-20058788)上のMayo Clinic Health SystemによるビタミンB6(ピリドキシン)に関する安全性情報によれば、過剰なビタミンB6は、異常な心調律、ざ瘡、アレルギー反応、乳房腫大又はヒリヒリ感、葉酸レベルの変化、筋緊張の低下、眠気又は鎮静、喉のしこり感、皮膚における刺痛感、頭痛、胸焼け、食欲喪失、吐き気、発疹、潰瘍性大腸炎(炎症性腸疾患)の再発、胃部不快感又は胃痛、日光過敏、嘔吐、喘息悪化、低血圧、血糖レベルの変化、及び出血のリスク増加を引き起こしうる。ビタミンB6は、他の医学的処置に干渉する可能性もある。例えば、パーキンソン病を処置するために使用されるレボドパ治療の有効性を減少させうる。Wilson疾患、鉛中毒、腎結石及び関節炎を処置するために使用されるペニシラミンの服用者は、医師の直接的管理の下でのみ、ビタミンB6を服用すべきである。エストロゲン様薬草及び補助剤、例えば、経口避妊薬は、ビタミンB6と相互作用する可能性がある。
【００３８】
本開示は、異常(例えば、欠損)アルカリホスファターゼ(ALP)活性を有する(例えば、ヒトにおけるALPL遺伝子又はマウスにおけるAkp2(ALPLのオルソログ)遺伝子の欠陥対立遺伝子を有する)、又はALP基質(例えば、PPi、PEA、及びPLP)の異常な遺伝子及び/若しくはタンパク質レベルを有する対象の集団を特定する方法を提供する。本明細書で使用するとき、用語「異常な」は、タンパク質(例えば、ALP)又はその生物学的に活性な融合物若しくは断片の発現レベル及び/又は酵素活性が、正常、適正又は予測される過程から逸脱していることを意味する。例えば、「異常な」ALP活性を有する対象(例えば、ヒト又は非ヒト動物、例えば、限定されないが、マウス)は、そのような対象が、例えば、健常対象、又はHPP症状、若しくは少なくとも1つのALP基質(例えば、PPi、PLP及びPEA)の異常なタンパク質レベル及び/又は活性により特徴づけられる疾患若しくは障害状態を有しない対象由来のそのようなALPタンパク質の発現及び/又は活性レベルと比較して、例えばALP遺伝子若しくはタンパク質産物の欠損若しくは不足及び/又はALP遺伝子若しくはタンパク質産物の機能の欠陥若しくは不足によるものでありうる異常なALP活性を有することを意味する。特にALPのタンパク質発現レベル又は活性は、そのような発現レベル又は活性が、健常対象、又はHPP症状、若しくは少なくとも1つのALP基質(例えば、PPi、PLP及びPEA)の異常なタンパク質レベル及び/又は活性により特徴づけられる疾患若しくは障害状態を有しない対象由来のそのようなALPタンパク質の発現又は活性レベルよりも低い(例えば、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％又はそれ未満)とき、欠損、不足、又は欠陥がある。対象の集団は、対象が以前に低ホスファターゼ症(HPP)を有すると診断されたことがあるかにかかわらずに特定されうる。集団は、例えば、ALPタンパク質レベルの不足若しくは減少及び/又は酵素活性が減少若しくは消失した欠陥ALPタンパク質による、減少したALP活性に基づき特定される。ALP活性を減少させる原因としては、例えば、ALPをコードする遺伝子における変異があり、それによりそのような遺伝子の欠陥対立遺伝子、ALPの発現を制御するシグナル伝達分子における欠陥、補因子の異常な発現若しくは制御、及び/又はALPの活性を制御する上流若しくは下流の因子の異常な発現がもたらされる。ALPLの特定の対立遺伝子は、例えば、減少したアルカリホスファターゼタンパク質レベル及び/又はタンパク質機能をもたらしうる。そのような対立遺伝子は、当該分野で公知の方法で特定しうる。特定された集団のメンバーは、疾患進行(HPP)及び他の症状、例えば、発作を測定するためにモニターされるべきである。組換えアルカリホスファターゼは、例えば、発作及び/又は他の症状、例えば、HPP又は減少したALP活性に関連する症状を処置又は防止するために、特定された集団に供給されうる。
【００３９】
用語「個体」、「対象」及び「患者」は、相互に交換可能に使用され、診断、処置又は治療が所望される任意の対象、特にヒトを指す。他の対象としては、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが挙げられうる。本明細書で使用するとき、「リスクのある」対象は、例えば、異常なALP活性と関連する疾患、障害又は症状を発症するリスクを有するとして特定される対象である。
【００４０】
HPP患者は、特徴的な骨及び/又は歯石灰化障害により、従来特定されている。しかしながら、HPP患者は、石灰化障害の程度に関して、非常に重度から検出不能まで様々である。明らかに、石灰化障害が軽症又は無いHPP患者は、誤って診断されやすく、診断されても、例えば、組換えアルカリホスファターゼを用いた処置は遅くなりやすい。骨及び/又は歯石灰化障害が軽症、非罹患又は検出不能であるHPP患者の部分集団を、アルカリホスファターゼ補充処置のために特定するための材料及び方法が本明細書で記載される。そのような患者は、HPPを有すると以前に診断されたが、石灰化障害が軽症、非罹患又は検出不能であることにより、アルカリホスファターゼで処置されていない場合がありうる。本開示は、部分集団におけるそのような対象を、例えば、アルカリホスファターゼ又は内在性アルカリホスファターゼの活性を増加させる薬剤で処置するための材料及び方法を提供することを含む。そのような処置は、例えば、石灰化障害以外の症状を処置若しくは防止し、及び/又は疾患進行によるさらなる石灰化障害を防止しうる。
【００４１】
本明細書において、HPP及び/若しくはHPP関連症状を示すか又はHPP及び/若しくはHPP関連症状を発症するリスクのあるALP欠陥対象の集団を特定する方法を記載する。特定された集団は、HPP又はHPP関連症状を有するとして以前に特定されたことのある対象又は先に診断されていない無症状の対象を含みうる。低下した血清ALP活性は、例えば、アルカリホスファターゼ基質(例えば、ピロリン酸(PPi)、ピリドキサール5'-リン酸(PLP)又はホスホエタノールアミン(PEA))の少なくとも1つのタンパク質レベル及び/又は機能の増加につながる。前記対象の集団を特定するための方法としては、例えば、欠陥アルカリホスファターゼ対立遺伝子の検出(出生前若しくは出生後のいずれか)、in vivoタンパク質発現レベル若しくは機能活性の測定、試料中の関連マーカー分析物の測定、又は当該分野で公知のALP活性を決定するための他の方法が挙げられる。
【００４２】
異常なALP活性を有する特定された集団は、骨及び歯石灰化障害以外の症状を有しうる。しかしながら、石灰化障害が軽症又は無いために、そのような対象が、HPP対象として診断される又は例えば、アルカリホスファターゼで処置される可能性は低い。したがって、本明細書には、異常なALP活性に関連する疾患、障害又は症状を発症するリスクのある対象、特に一部の一般的HPP症状(例えば、骨石灰化障害)を示さない対象を特定及び処置するための材料及び方法が記載される。
【００４３】
本開示は、石灰化障害が軽症、非罹患又は検出不能であるがそれでも寿命が短縮されている、アルカリホスファターゼノックアウト(Akp2-/-)マウスの部分集団を提供する。これらのマウスに対する試験により、アルカリホスファターゼ不足が、哺乳動物の中枢神経系の主要な抑制性神経伝達物質であるガンマ-アミノ酪酸(GABA)のタンパク質レベルを有意に低下させることが示された。脳内GABAの観察された減少は、組換えアルカリホスファターゼ処置により救済された。対象の集団は、欠陥アルカリホスファターゼを有する一方で、石灰化障害は最小又は無いことから、ALP関連疾患、障害又は症状、例えば、発作のリスクがあり、例えば、アルカリホスファターゼ補充療法又はALP活性を増加させる他の治療法に対して応答性である、対象の集団が存在する。
【００４４】
HPP患者がしばしば発作を起こすという事実に加えて、本明細書に記載のデータは、より劇的なHPP症状(例えば、骨石灰化障害)の一部を示さない患者であっても、血清ALP活性の減少又は消失により、発作が導かれることを示す。この集団は、発作、並びに減少若しくは消失したALP活性と関連する他の疾患、障害又は症状を経験するか又は経験するリスクがある(例えば、HPP又はHPP症状を発症するリスクがある)。
【００４５】
本開示の発作は、脳における異常な過剰の又は同調的ニューロン活性による徴候及び/又は症状の短時間のエピソードを含むてんかん性発作と、てんかん性発作に擬態する発作性事象であるが、皮質ニューロンの異常な律動的放電を含まない非てんかん性発作とに大きく分類することができる。発作の外向きの作用は、無制御の筋反射運動(強直間代発作(従前は、大発作として知られた)、しばしば「痙攣」と称される)から、意識の瞬間喪失(発作無し)程度にわずかなものまで様々でありうる(Fisherら、2005 Epilepsia 46:470-2、及びRicker 2003 Differential Diagnosis in Adult Neuropsychological assessment. Springer Publishing Company. p.109. ISBN 0-8261-1665-5)。本明細書で使用するとき、「発作」は、任意の生理学的又は環境的原因による発作又は痙攣事象を指し、限定されないが、てんかん性発作、非てんかん性発作、ビタミンB6応答性発作、B6非応答性発作などを含む。用語「発作」は、しばしば「痙攣」と相互に交換可能に使用される。痙攣は、対象の身体が急速に制御不能にふるえるときに生じる。痙攣の間にヒトの筋肉は収縮及び弛緩を繰り返す。多くの様々な種類の発作がある。一部は軽度の症状で振戦は無い。
【００４６】
アルカリホスファターゼ機能を欠く(例えば、Akp2-/-)マウスは、発作を発症し、後に死に至る(Waymire 1995)。発作は、アルカリホスファターゼによるピリドキサール5'-リン酸(PLP)の代謝の欠陥により生じ、HPP患者においてみられるものと類似している。一般に、ピリドキシン(ビタミンB6)は、3つの異なるビタマー、つまり、PLP、ピリドキサミン-P、及びピリドキシン-グルコシド(Plecko 2009 Can J Neurol Sci 36:S73-S77)として吸収されうる。しかしながら、肝臓において、後の2つは、ピリドキシン(ピリドキサミン)-5-リン酸オキシダーゼ(PNPO)により、活性な補因子PLPにのみ変換される。血液循環中のPLPは、次いでアルカリホスファターゼにより脱リン酸化されてピリドキサール(PL)となる。PLは自由に細胞膜を通過し、ピリドキサールキナーゼにより再リン酸化されて、細胞内PLPとなる。細胞内で、PLPは、アミノ酸及び神経伝達物質代謝における様々な酵素反応、例えば、グルタメートのガンマ-アミノ酪酸(GABA)への変換、グリシン開裂系、ドーパミン、ヒスタミン、D-セリン、硫化水素、並びにセロトニン及びホモバニリン酸合成における芳香酸デカルボキシラーゼなどの反応の補因子である。Akp2-/-マウスでは、欠陥アルカリホスファターゼのために、PLPからPLが生成されず、血漿PLPレベルが増加し、一方で細胞内PLP濃度の低下に至る。細胞内PLPの不足は、下流の代謝、例えば、脳でのグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)によるGABAの産生などを停止させる。
【００４７】
GABAは、脊椎動物の脳において、シナプス前及び後の両方の神経学的プロセスで細胞膜の特定の膜貫通受容体に結合することにより、抑制性シナプスで作用する。この結合によってイオンチャネルが開き、負に荷電した塩化物イオンが細胞の中に入るか又は正に荷電したカリウムイオンが細胞の外に出るかのいずれかの流れが生じる。この作用により、膜電位に負の変化がもたらされ、通常、過分極が生じる。GABA受容体には2つの一般的クラスが知られている。受容体がリガンド開口型イオンチャネル複合体の一部であるGABAA受容体と、中間体を介してイオンチャネルを開閉するGタンパク質結合受容体GABAB代謝調節型受容体である。GABAレベルは、Akp2-/-マウスでは対照同腹仔と比較しておよそ50％低下していることが分かっており、このことは、ノックアウトマウスの寿命が短いことに寄与する(Waymire 1995)。さらに、ビタミンB6(ピリドキサール又はPLであるが、PNでない)を補うことにより、ハイブリッド遺伝的背景を有するAkp2-/-マウスの約67％で発作表現型が救済されたが、救済された動物は、後に欠陥歯列を発症した。残りの33％は、PL注射に対して応答不良であるか又は非応答性であった。対照的に、近交系遺伝的背景を有するAkp2-/-マウスは、全て応答不良であるか、又はさらにPL補助剤に対して非応答性であった。
【００４８】
アルカリホスファターゼ(ALP)
ALPには、4つの公知のアイソザイム、つまり組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP、下記の考察参照)、胎盤型アルカリホスファターゼ(PALP)(NCBI参照配列[NP_112603]及び[NP_001623])、生殖細胞型アルカリホスファターゼ(GCALP)(NCBI参照配列[P10696])、並びに小腸型アルカリホスファターゼ(IALP)(NCBI参照配列[NP_001622])がある。これらの酵素は、非常に類似した三次元構造を有する。それらの触媒部位は、それぞれ酵素活性に必要な金属イオン(2つのZn2+及び1つのMg2+)のための4つの金属結合ドメインを含んでいる。これらの酵素は、リン酸モノエステルの加水分解を触媒し、また、高濃度のリン酸アクセプタの存在下でトランスリン酸化反応を触媒する。例えば、PALPは、TNALPの天然基質として公知のPEA、PPi及びPLP(Whyte, 1995、Zhang, 2004)に対して、生理学的に活性である。
【００４９】
ALP間の構造的類似性に基づいて、一部の機能がそれらに対して同様に重複していることが予測される。例えば、高脂肪食を与えたヒト及び齧歯類は、IALPに由来するALPの循環レベルが上昇していた(Langman 1966及びGould 1944 Biochem. 4:175-181)。したがって、食事性摂取を増加させることはIALPを上昇させ、Akp2-/-マウスにおいて減少した循環PLPによるTNALP機能を代償しうる。同様に、ヒト女性のHPP保有者において妊娠中に発現したPALPは、TNALPへの代償を示した(Whyte 1995 J. Clin. Invest. 95:1440-1445)。
【００５０】
減少した又は消失したALP活性を有する対象の集団の特定は、その後、例えば、治療有効量の組換えTNALP又は他のALPアイソザイムで処置してもよい。異なるアイソザイムは、相互に交換可能に単独で投与されてもよく、又は組み合わせで投与されてもよい。特定された対象は、例えば、組換えTNALP、PALP、IALP及び/又はGCALPにより処置することができる。これらのALPは、哺乳動物(例えば、ヒト)タンパク質、非哺乳動物タンパク質、又は哺乳動物部分の少なくとも1部を含む融合タンパク質でありうる。
【００５１】
TNALP及びバリアント
TNALPは、そのC末端へ糖脂質を介してアンカーされている膜結合タンパク質である(Swiss-Prot、P05186)。このグリコホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーは、疎水性C末端が除去された後に、翻訳後的に付加され、これは、一時的膜アンカー及びGPIの付加のためのシグナルの両方として作用する。本明細書に記載の組換えTNALPは、例えば、TNALPの可溶性部分を含む。より詳細な例としては、疎水性C末端配列の第1のアミノ酸、つまりアラニンがストップコドンに置き換えられているヒトTNALPを含む組換えTNALPが挙げられる。そのように形成された可溶性TNALP(本明細書でsTNALPと称する)は、触媒部位の形成に必要なTNALPの天然アンカー形態の全てのアミノ酸を含んでいるが、GPI膜アンカーは欠いている。公知のTNALPとしては、例えば、ヒトTNALP[NCBI参照配列NP_000469、AAI10910、AAH90861、AAH66116、AAH21289及びAAI26166]、アカゲザルTNALP[XP_001109717]、ラットTNALP[NP_037191]、イヌTNALP[AAF64516]、ブタTNALP[AAN64273]、マウス[NP_031457]、ウシ[NP_789828、NP_776412、AAM 8209、AAC33858]、並びにネコ[NP_001036028]が挙げられる。本開示におけるTNALP又は他の遺伝子若しくはタンパク質に対して使用される用語「野生型」又は「野生型配列」は、正常ヒト、非ヒト哺乳動物又は他の生体生物において天然に存在するそのような遺伝子又はタンパク質の通常の形態を指す。野生型配列は、遺伝子については、遺伝子座での標準の「正常」対立遺伝子、又はポリペプチド若しくはタンパク質については、標準「正常」一次アミノ酸配列(場合により、標準の「正常な」翻訳後修飾及び/又はアミノ残基酸間の鎖内結合及び/若しくは相互作用を有するもの)を指し、非標準「変異」対立遺伝子又はアミノ酸配列/修飾/相互作用によって生成されるものと対比して参照されうる。「変異」対立遺伝子は、大規模に変化する可能性があり、集団内で遺伝的シフトが生じた場合には野生型にさえなる。ほとんど又は全ての遺伝子座(ほとんどのポリペプチド配列について頻度は低いが可能性はある)は、様々な対立遺伝子形態で存在し、その頻度は種の地理的範囲を通じて変化し、統一の野生型は必ずしも存在しない可能性があることが今や認識されている。しかしながら、一般に、最も広く存在する対立遺伝子又はアミノ酸配列、つまり正常な個体のヒト又は他の生物の間で最も頻度が高い対立遺伝子又はアミノ酸配列が、本開示において、野生型と考えられる。本明細書におけるヒト又は他の生物について使用される用語「正常」は、別途特定される場合を除いて、関連遺伝子又はポリペプチド/タンパク質の異常な活性により生じる又は関連する(例えば、遺伝子又はタンパク質産物の欠損若しくは不足、及び/又は遺伝子又はタンパク質産物の機能の欠陥若しくは不足によるものでありうる)、何らかの疾患(例えば、HPP)、障害、及び/又は症状若しくは生理学的帰結(例えば、石灰化障害、発作など)を有しないヒト又は他の生物を指す。正常なヒトについての最も明白な例は、HPP又はHPP症状を有さず、及びHPP関連症状をもたらしうるALPL遺伝子及びALPタンパク質に変異又は修飾を有しないヒトである。ALP機能に着目する別のシナリオにおいて、本開示における「正常」なヒトの範囲は、異常な内在性アルカリホスファターゼ活性(これは、例えば、他の健常又は正常なヒトにおける基質(PPi、PEA及びPLP)レベルによっ���試験され、及び相当する活性と比較されてもよい)を有しない任意のヒトを含むように拡大されてもよい。
【００５２】
本明細書に記載の組換えTNALPは、TNALP配列の1つ以上の位置で、TNALP配列の2以上の位置で、TNALP配列の3以上の位置で、TNALP配列の5以上の位置で、TNALP配列の10以上の位置で、又はTNALP配列の15〜20以上の位置で、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルのいずれかで、配列が置換されている配列を含みうる。置換には、例えば、保存的置換、オルソロガス配列による置き換え、及び/又は破壊的置換(disruptive substitution)が含まれうる。TNALP配列は、欠失又は再配列を有してもよい。
【００５３】
当業者は、保存的置換を、機能的発現生成物をもたらすコーディング配列にヌクレオチドレベルで行いうることを認識している。そのように、TNALP配列及び断片(場合により、エクソン及び制御配列を含む)は、TNALPの野生型配列であってもよく、又は野生型配列と高い相同性を共有するバリアント配列であってもよい。本開示は、所望の野生型配列に対して、少なくとも約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％又は約100％以上同一である配列の使用を提供する。本明細書で使用するとき、用語「約」は、使用される数の数値の+又は-10％を意味する。
【００５４】
用語「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は、2つの配列間の配列関連性を指し、比較の目的で整列させたときの各配列のヌクレオチド位置又はアミノ酸位置を比較することにより決定することができる。用語「相同性」は、2つの核酸又はアミノ酸配列間の関連性を指す。用語「同一性」は、比較した配列が同じである程度を指す。用語「類似性」は、2つの配列が同じであるが、コドンのアミノ酸同一性を変化させずにコドン内で置換されうる中性縮重ヌクレオチドを含む程度を指す。
【００５５】
当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸又は少しの割合のアミノ酸を改変、付加又は欠失させる核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加が「保存的に改変されたバリアント」であることを認識する。そのようなバリアントは、ペプチドの物理的特性を変化させるために、例えば、ペプチドの安定性又は有効性を増加するために有用でありうる。機能的に類似したアミノ酸を示す保存的置換表は、当業者にとって公知である。そのような保存的修飾バリアントは、多形バリアント、種間ホモログ及び代替的対立遺伝子に付加的であり、それらを排除しない。以下の群は、互いに保存的に置換されうるアミノ酸の非限定的な例を示す:1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン(S)、トレオニン(T);及び8)システイン(C)、メチオニン(M)。
【００５６】
理論に限定されないが、本明細書に記載の組換えALPは、ヒトALPアイソザイム及び公知の機能性ALP(例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、マウス、ラット、ウシ、ネコ、イヌ、ブタなどに由来するALP)のALP細胞外ドメイン由来のコンセンサス配列を含む配列を包含する。本明細書で使用するとき、用語「細胞外ドメイン」は、天然タンパク質(例えば、ペプチドシグナル無し)の任意の機能的細胞外部分を指す。元のアミノ酸1〜501(分泌シグナルペプチドを数えるとき18〜501)(Odaら、J. Biochem 126: 694-699、1999)、アミノ酸1〜504(分泌されるとき18〜504)(Berndら、米国特許第6,905,689号)及びアミノ酸1〜505(分泌されるとき18〜505)(Tomatsuら、米国特許出願公開第2007/0081984号)を保持する組換えsTNALPは、酵素的に活性である。さらに、元のTNALPのアミノ酸1〜502(分泌されたとき18〜502)(図3)を保持する組換えsTNALPは、酵素的に活性である(PCT公開第WO2008/138131号参照)。このことは、アミノ酸残基が、酵素活性に影響を与えずに、天然アルカリホスファターゼのC末端から除去しうることを示す。さらに本開示には、野生型ALPのアミノ酸残基に対する少なくとも1つの置換、欠失、付加、及び/又は修飾(例えば、グリコシル化、PEG化、グルタチオン化、ユビキチン化、シアリル化、アセチル化、アミド化、封鎖、ホルミル化、ガンマカルボキシグルタミン酸ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化、ピロリドンカルボン酸及び/又は硫酸化(sulfatation))を含有する任意のALPバリアントも含まれる。本開示にとって有用なそのようなバリアントは、野生型ALPと比較してある程度の(例えば、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約100％、約150％、約200％、約300％若しくはそれ以上、又はこれらの値を超える)in vitro及び/又はin vivo活性のみ保持すればよい。
【００５７】
ALPを含む融合タンパク質
本明細書に記載の方法は、特定された対象集団の処置のために、組換えALP(例えば、TNALP)融合タンパク質を利用することができる。融合タンパク質は、本明細書に開示のALP又はバリアントの全長又は断片を含み、生物学的活性を維持しうる。理論に限定されないが、融合タンパク質は、例えば、アルカリホスファターゼ機能を維持又は改善するために、他の部分、例えば、任意のポリペプチド、脂質、ヌクレオチド、又は他の成分を含んでもよい。例えば、融合タンパク質は、ALPのin vivoの安定性又は保持時間を増加させるために(例えば、より長い半減期を伴う)、断片結晶性領域(Fc)又は他の免疫グロブリンの全長若しくは断片を含んでもよい。同様に、アルブミン融合技術を使用して、循環ALPの半減期を向上させてもよい(Schulte 2011 Thromb Res. 128:S9-12)。さらに、融合タンパク質は、ALPを特定の組織、器官又は細胞に向かわせる標的化部位を含んでもよい。
【００５８】
さらに本開示は、例えば、グリコシル化、PEG化、グルタチオン化、ユビキチン化、シアリル化、アセチル化、アミド化、封鎖、ホルミル化、ガンマ-カルボキシグルタミン酸ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化、ピロリドンカルボン酸及び/又は硫酸化により修飾された翻訳後修飾ALPタンパク質又はその断片を含む融合タンパク質も包含する。
【００５９】
用語「組換えタンパク質」又は「組換えポリペプチド」は、遺伝的に操作された核酸によりコードされたタンパク質を指す。核酸は、一般的に、宿主細胞に適切なベクター、例えば、プラスミド又はウイルス内に置かれる。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞が、本明細書に記載の一部の組換えタンパク質の発現のための宿主として使用されるが、当業者は、いくつかの他の宿主及び発現系、例えば、限定されないが、CHO-DG44及びCHO/dhfr-(CHO duk-とも参照される)を含む改変CHO細胞、HEK293細胞、PerCβ、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、細菌細胞、in vitro系、L細胞、C127細胞、3T3細胞、COS-7細胞などを組換えタンパク質の産生のために使用しうることを理解する。「組換え切断可能」タンパク質又はポリペプチドは、改変された活性を生じさせるために、例えば、組換えタンパク質又はポリペプチドを分泌又は可溶性タンパク質とするために、宿主細胞酵素に切断されうる組換えタンパク質を指す。
【００６０】
断片結晶性領域(Fc)断片
本開示の有用なFc断片としては、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインを含むIgGのFc断片が挙げられる。例えば、IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-3及びIgG-4を使用することができる。本開示のALPを有する融合タンパク質で使用されるFc断片の例示的なアミノ酸配列は、配列番号3に示される。同様に、Fc断片について他のアミノ酸配列、例えば、配列番号3と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又はそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列も、本開示に含まれる。
【００６１】
負に荷電したペプチド
本開示のALP融合タンパク質は、骨標的化ポリペプチド、例えば、負に荷電したペプチドなどを含みうる。負に荷電したペプチドは、D10、D8、D11、D12、D13、D14、D15、D16、E10、E8、E11、E12、E13、E14、E15、及びE16からなる群から選択されるポリアスパルテート若しくはポリグルタメート又は当該分野で公知の任意の他の形式、例えば、PCT公開第WO2008/138131号に記載のものでありうる。
【００６２】
融合タンパク質の形成
本開示は、例えば、HPP患者の特定された対象集団及び部分集団を処置するための、組換えALP構築物又はALP融合タンパク質を提供する。そのような組換えALP構築物又は融合タンパク質は、可溶性ALP(sALP、例えば、sTNALP)イソ酵素及びFc断片の全長又は断片を、負に荷電したペプチドをさらに伴って又は伴わずに含みうる。これらの成分は、5'末端から3'末端へ任意の配列で融合することができ、但し、得られた融合タンパク質がアルカリホスファターゼ活性を維持又は改善することを条件とする。融合タンパク質の例示的な形式としては、例えば、限定されないが、sALP-Fc-D10、sALP-Fc、D10-Fc-sALP、Fc-sALP、D10-sALP-Fc、Fc-sALP-D10、Fc-D10-sALPなどが挙げられる。これらの形式において、D10は、任意の他の負に荷電したペプチド又は標的化部分で任意に置換することができ、Fc断片は、任意の機能性IgG又は免疫グロブリンで置換されうる。
【００６３】
本開示は、発作を、Fc融合物及び/又は負に荷電したペプチドタグを伴って又は伴わずにsALPを含む組換えALP構築物を用いて処置する方法を提供する。負に荷電したペプチドタグ(例えば、D10)が、ALPを骨組織に標的化しうることは当該分野で周知であるが(例えば、PCT公開第WO2008/138131号を参照)、骨標的化sALP-Fc-D10構築物(別名アスホターゼアルファ)が、Akp2-/-マウスの生存を向上させ、発作関連生理学的パラメータを改善、例えば、脳内のGABA及びセリンレベルを回復し、シスタチオニンレベルを低下させるために良好に機能することは驚くべきことである。
【００６４】
スペーサー
ALP融合タンパク質の異なる成分(例えば、断片又は部分)は、隔てているリンカー又はスペーサーを通じて融合してもよい。一部の実施形態では、スペーサーは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9又は10以上のアミノ酸を含む短いポリペプチドでありうる。一実施形態では、sALP(例えば、sTNALP)融合タンパク質におけるFc断片は、タンパク質をより効率的に折り畳ませることができるスペーサーとして作用する。このことは、sTNALP-Fc-D10の発現が、sTNALP-D10の発現よりも高かったという発見により確認された(PCT公開第WO2008/138131号の実施例2)。理論に限定されないが、Fc断片は、sALP配列のC末端にD10配列が付加する強い負の電荷の存在により生じる反発力を軽減するよう作用しうる。他の有用なスペーサーとしては、限定されないが、sALP配列に加えられた強い負に荷電した配列(例えば、D10などのポリアスパルテート)の存在により生じる反発力を軽減することができるポリペプチドが挙げられる。
【００６５】
スペーサーは、例えば、2つのsALPモノマー由来の2つのsALPドメインの相互作用を妨害しうる立体障害を軽減するように設計してもよい。さらに、スペーサーを、必要に応じて、sALP部分とFc部分との間に導入してもよく、例えば、sTNALP-Fc-D10構築物は、図2及び3に例証されるように、sTNALP間にスペーサーを有する。Fc及びD10は、2つのアミノ酸(それぞれ、LK及びDI)を含む。
【００６６】
骨標的化sALP(例えば、sTNALP-Fc-D10)は、1)ポリアスパルテート又はポリグルタメートの下流、及び/又は2)ポリアスパルテートとFc断片との間、及び/又は3)スペーサー、例えば、Fc断片とsALP断片との間に、1つ以上の付加的アミノ酸を場合によりさらに含んでもよい。これは、例えば、骨標的化コンジュゲートを生成するために使用するクローニング戦略が、これらの位置に外来性アミノ酸を導入するときにあてはまる。しかしながら、外来性アミノ酸は付加的GPIアンカーシグナルをもたらさないように選択すべきである。設計配列が宿主細胞のトランスアミダーゼにより開裂される可能性は、Ikezawa(Ikezawa 2002 Biol Pharm. Bull. 25(4):409-417)に記載されるように予測されうる。
【００６７】
sALP又はその融合タンパク質の発現に適した条件は、当業者により認識されるように、最適化することができる。そのような条件には、例えば、sALP又はその融合タンパク質の産生を可能にする培養培地の使用が含まれる。そのような培地は、例えば、炭酸水素塩及び/又はHEPES、塩化物、リン酸塩、カルシウム、ナトリウム、カリウム及び/又はマグネシウムなどを含むイオン、鉄、単糖及び/又はアミノ酸などを含む炭素源、脂質、ヌクレオチド、ビタミン、及び/又は例えばインスリンなどの増殖因子を含むバッファーを用いて調製してもよい。市販の培地、例えば、αMEM、DMEM、Ham's-F12並びに2〜4mMのL-グルタミン及び5％ウシ胎仔血清を補足したIMDMを使用することができる。市販の動物タンパク質不含培地、例えば、Hyclone(商標)SFM4CHO、Sigma CHO DHFR-、2〜4mMのL-グルタミンを補足したCambrex POWER(商標)CHO CDも使用しうる。これらの培地は、選択圧を維持して、安定なタンパク質産物発現を可能にするために、望ましくは、チミジン、ヒポキサンチン、及びL-グリシン無しで調製される。
【００６８】
用語「骨組織」は、本明細書において、骨芽細胞により合成され、主にコラーゲンを含有する有機マトリックスで構成され、ヒドロキシアパタイト結晶の沈着により石灰化された組織を指すために本明細書で使用される。
【００６９】
本開示の骨送達コンジュゲートに含まれる融合タンパク質は、融合タンパク質の有効量を骨に提供することによる骨欠陥状態の治療的処置のために有用である。融合タンパク質は、任意の標準的薬学的に許容される担体で医薬組成物の形態で提供され、標準的手法、例えば、静脈内注射により投与される。
【００７０】
本明細書で使用するとき、用語「HPP表現型」は、別途特定されていない場合には、一般的に、HPPを有する対象の任意の特徴的表現型、例えば、限定されないが、骨又は歯石灰化障害に関係する任意の表現型を指すことが意図される。HPP表現型は、骨石灰化障害に加えて「HPP症候群」、限定されないが、例えば、くる病(成長軟骨板の欠陥)、骨軟化症、無機PPi、PEA又はPLPの血液及び/又は尿レベルの上昇、発作、骨痛、軟骨石灰化症及び早死につながる関節におけるピロリン酸カルシウム二水和物結晶沈着(CPPD)なども含まれうる。限定されないが、HPP表現型は、長骨の長さ(例えば、大腿骨、脛骨、上腕骨、橈骨、尺骨など)の低下による発達遅滞、全骨の平均密度の低下、骨、例えば、大腿骨、脛骨、肋骨及び中足、及び指骨などにおける骨石灰化の低下、歯の石灰化の低下、乳歯の早期喪失(例えば、セメント質の形成不全、低形成又は異形成)などにより実証されうる。限定されないが、骨石灰化障害の修復又は防止は、長骨の長さの増加、骨及び/又は歯における石灰化の増加、脚の内反の修復、骨痛の減少並びに関節におけるCPPD結晶沈着の減少の1つ以上によって観察されうる。
【００７１】
「非HPP対象」は、1)HPPを有するとまだ診断されておらず、HPP表現型を有しない、2)HPPを有しないと診断されている、又は3)異常なアルカリホスファターゼ活性を有しない任意の対象を指すことを意味する。
【００７２】
「処置」は、予防(防止)のため又は患者が罹患している場合には虚弱質又は病弊の症状の治癒若しくは減少のために、患者又は対象に対して、治療剤を投与する又は医学的手法を実行することを指す。異常なALP活性を伴う疾患、障害又は症状の防止は、処置の範囲内に含まれる。本明細書に記載の方法及び組成物又は本明細書に記載の方法により特定された方法及び組成物は、治療有効量で処置レジメンの一部として使用することができる。「治療有効量」は、医学的状態に関連する症状を低下、防止又は改善するために十分な量である。
【００７３】
他の抗発作薬
通常の抗てんかん薬は、ナトリウムチャネルを遮断することができる又はGABA機能を増強しうる。電位開口型ナトリウムチャネル及びGABA系の成分に加えて、他の標的としては、GABAA受容体、GAT-1 GABAトランスポーター及びGABAトランスアミナーゼが挙げられる。さらなる標的としては、電位開口型カルシウムチャネル、SV2A及びα2δが挙げられる。例示的な抗発作薬としては、例えば、アルデヒド(例えば、パラアルデヒド)、芳香族アリルアルコール(例えば、スチリペントール)、バルビツレート(例えば、フェノバルビタール、メチルフェノバルビタール及びバルベキサクロン)、ベンゾジアゼピン(例えば、クロバザム、クロナゼパム、クロラゼペート、ジアゼパム、ミダゾラム、ロラゼパム、ニトラゼパム、テマゼパム及びニメタゼパム)、臭化物(例えば、臭化カリウム)、カルバメート(例えば、フェルバメート)、カルボキサミド(例えば、カルバマゼピン、オクスカルバゼピン及びエスリカルバゼピン酢酸エステル)、脂肪酸(例えば、バルプロエート、ビガバトリン、プロガビド及びチアガビン)、フルクトース誘導体(例えば、トピラメート)、GABA類似体(例えば、ガバペンチン及びプレガバリン)、ヒダントイン(例えば、エトトイン、フェニトイン、メフェニトイン及びホスフェニトイン)、オキサゾリジンジオン(例えば、パラメタジオン、トリメタジオン及びエタジオン)、プロピオネート(例えば、ベクラミド)、ピリミジンジオン(例えば、プリミドン)、ピロリン(例えば、ブリバラセタム、レベチラセタム及びセレトラセタム)、スクシンイミド(例えば、エトスクシミド、フェンスクシミド及びメスクシミド)、スルホンアミド(例えば、アセタゾラミド、スルチアム、メタゾラミド及びゾニサミド)、トリアジン(例えば、ラモトリギン)、ウレア(例えば、フェネツリド及びフェナセミド)、バルプロイルアミド(バルプロエートのアミド誘導体)(例えば、バルプロミド及びバルノクタミド)、並びに他の薬物(例えば、ペランパネル)が挙げられる。
【００７４】
少なくとも1つの通常の抗発作薬を、本明細書に記載の1つ以上の組換えALPと一緒に、発作症状の処置又は軽減のために、対象に同時投与することができる。特にそのような併用療法は、ビタミンB6耐性発作に罹患している対象を処置するために使用することができ、他のHPP様症状を有するか否かにかかわらず、対象が減少したALP活性を示す、本明細書に記載のように特定された集団を処置するために使用することができる。そのような通常の抗発作薬は、組換えALPと(所定の期間)同時に又はALP投与の前若しくは後に投与しうる。
【００７５】
投与の経路
本明細書に記載の治療剤、例えば、組換えALPは、例えば、経口的に、経鼻的に、静脈内に、筋肉内に、皮下に、舌下に、髄腔内に、又は皮内に投与されうる。投与の経路は、様々な因子、例えば、環境及び治療目的などに依存しうる。
【００７６】
例えば、本開示の医薬組成物は、液体、溶液、懸濁液、丸剤、カプセル、錠剤、ゲルキャップ、粉末、ゲル、軟膏、クリーム、噴霧剤、ミスト、微粒化蒸気、エアロゾル又はフィトサムの形態でありうる。本明細書に開示の食事性補助剤は、薬学的に許容される添加剤、例えば、必要に応じて、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル、保存剤、緩衝塩、芳香剤、着色剤及び甘味剤を含むことができる。経口投与のための製剤も、適切に製剤化されて、活性成分を制御放出することができる。
【００７７】
投与量
具体的な投与量は、例えば、投与様式、並びに対象の年齢及び体重などの多くの因子に依存する。通常、単回用量内に含有される骨標的化又はタグ化されていないALPの量は、顕著な毒性を誘導せずに、発作を効果的に防止、遅延又は修復する量である。通常、本開示に従うsALP又はその融合タンパク質は、0.001〜500mg/kg/日の範囲の用量で、より特定の実施形態では、約0.1〜約100mg/kg/日の範囲の用量で、さらに特定の実施形態では、約0.2〜約20mg/kg/日の範囲の用量で投与されうる。アロメトリックスケーリング法(Mahmoodら  2003 Clin. Pharmacol.、43(7):692-7及びMahmood 2009 J. Pharma. Sci.、98(10):3850-3861)を使用して、マウスの用量をヒトに外挿してもよい。投与量は、通常の因子、例えば、疾患の程度及び患者からの異なるパラメータにしたがって、臨床医により適合されてもよい。
【００７８】
sALP又はその融合タンパク質の治療有効量は、直接測定してもよい。有効量は、毎日若しくは毎週与えられてもよく、又は分割して与えられてもよい。典型的には、本明細書に開示の医薬組成物は、1日あたり体重1kgあたり約0.001mg〜最大約500mg(例えば、0.05、0.01、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.8、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、8mg、10mg、15mg、16mg、20mg、30mg、50mg、100mg又は250mg)の量で投与されうる。投与量は、単回又は複数回投与レジメンで提供されうる。例えば、一部の実施形態では、sALP又はその融合タンパク質の有効量は、約0.1〜約100mg/kg/日、1日あたり約0.2mg〜約20mg、1日あたり約1mg〜約5mg、1日あたり約1mg〜約6mg、1日あたり約1mg〜約7mg、1日あたり約1mg〜約8mg、1日あたり約1mg〜約10mg、1週あたり約0.7mg〜約210mg、1週あたり約1.4mg〜約140mg、3日ごとに約0.3mg〜約300mg、2日ごとに約0.4mg〜約40mg、2日ごとに約2mg〜約20mgの範囲の用量である。
【００７９】
これらは単なる指針であり、なぜなら実際の用量は、各患者に固有の臨床因子に応じて担当医により、又は栄養士により、慎重に選択及び用量設定されなければならないからである。最適な1日用量は、当該分野で公知の方法により決定され、上記のような患者の年齢などの因子及び他の臨床的に関連する因子により影響を受ける。さらに患者は、他の疾患又は状態のための医薬を服用しうる。他の医薬は、sALP又はその融合タンパク質を患者に与える間に継続してもよいが、そのような場合には、有害な副作用が生じるかどうかを判断するために低用量で開始することが特に賢明である。
【００８０】
担体/ビヒクル
sALP又はその融合タンパク質を含有する製剤は、薬学的に許容される滅菌水性又は非水性溶媒、懸濁液又はエマルジョンと組み合わせて、患者に提供されてもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、及び注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、水-アルコール溶液、エマルジョン又は懸濁液、例えば、食塩水、並びに緩衝化医学的非経口ビヒクル、例えば塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース溶液、デキストロース+塩化ナトリウム溶液、ラクトース含有リンゲル溶液、又は不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤、例えば、リンゲルデキストロースなどに基づくものが挙げられる。
【００８１】
本明細書に記載の医薬組成物は、制御放出形態で送達されてもよい。一実施形態では、ポリマー材料、例えば、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、架橋両親媒性ブロックコポリマー及びハイドロゲル、ポリヒドロキシ酪酸及びポリジヒドロピランを使用することができ(Smolen and Ball、Controlled Drug Bioavailability、Drug Product Design and Performance、1984、John Wiley & Sons; Ranade and Hollinger、Drug Delivery Systems、pharmacology and toxicology series、2003、2nd edition、CRRC Pressも参照)、別の実施形態では、ポンプが使用されうる(Saudekら、1989、N. Engl. J. Med. 321: 574)。
【００８２】
本開示の治療剤は、希釈剤として適切な賦形剤溶液(例えば、スクロース)を使用する凍結乾燥粉末の形態であってもよい。
【００８３】
さらに、本開示によるヌクレオチドセグメント又はタンパク質は、いくつかの方法で個体に導入することができる。例えば、罹患した個体から骨芽細胞を単離し、本明細書に開示のヌクレオチド構築物で形質転換し、静脈内注射を含むいくつかの方法で、罹患した個体に再導入することができる。代替的に、ヌクレオチド構築物は、罹患した個体に、例えば、注射により、直接投与されてもよい。ヌクレオチド構築物は、ビヒクル、例えば、リポソームを介して送達されてもよく、ビヒクルは、特定の細胞種を標的化するように設計されてもよく、様々な経路を通じて投与されるように改変されてもよい。
【００８４】
本開示の融合タンパク質は、遺伝子治療を通じて有利に送達されうる。有用な遺伝子治療としては、PCT公開第WO2006/060641号、米国特許第7,179,903号、及びPCT公開第WO2001/036620号に記載されている方法、例えば、治療タンパク質のためのアデノウイルスベクターを使用して、タンパク質産生細胞として肝細胞を標的化する方法が挙げられる。
【００８５】
「遺伝子送達ビヒクル」は、宿主細胞へ挿入されるポリヌクレオチドを有しうる任意の分子として定義される。遺伝子送達ビヒクルの例は、リポソーム、生体適合性ポリマー、例えば、天然ポリマー及び合成ポリマー、リポタンパク質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子及び細菌、又はウイルス、例えば、バキュロウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、並びに様々な真核及び原核宿主における発現のために記載され、遺伝子治療及び単純なタンパク質発現のために使用されうる当該分野で通常使用されている他の組換えビヒクルである。「遺伝子送達」、「遺伝子移行」などは、本明細書で使用するとき、導入のために使用される方法にかかわらず、外来性ポリヌクレオチド(しばしば「導入遺伝子」として参照される)の宿主細胞への導入に関する用語である。そのような方法としては、様々な技術、例えば、ベクター媒介遺伝子移行(例えば、ウイルス感染/トランスフェクション、又は様々な他のタンパク質ベース若しくは脂質ベースの遺伝子送達複合体)並びに「裸」のポリヌクレオチドの送達を容易にする技術(例えば、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達及びポリヌクレオチドの導入に使用される様々な他の技術)が挙げられる。
【００８６】
導入されたポリヌクレオチドは、安定に又は一過性に宿主細胞に維持されうる。安定な維持は、通常、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合する複製起点を含有しているか又は宿主細胞のレプリコン、例えば、染色体外レプリコン(例えば、プラスミド)又は核若しくはミトコンドリアの染色体に統合することを必要とする。多数のベクターが、遺伝子の哺乳動物細胞への移行を媒介する能力を有する。
【００８７】
「ウイルスベクター」は、宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含んだ組換え的に生成されたウイルス又はウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター(例えば、PCT公開第WO2006/002203号参照)、アルファウイルスベクターなどが挙げられる。
【００８８】
遺伝子移行が、DNAウイルスベクター、例えば、アデノウイルス(Ad)又はアデノ随伴ウイルス(MV)により媒介される態様において、ベクター構築物は、ウイルスゲノム若しくはその一部及び導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。Adは、比較的良く特徴づけられた均質なウイルスの一群であり、50を超える血清型を含む(WO95/27071)。Adは、増殖しやすく、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。組換えAd由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換え及び生成の可能性を減少させるベクターも構築されている(WO95/00655及びWO95/11984)。プロモーターと、ポリヌクレオチドをその中に操作可能に連結させうるクローニング部位との両方を含有するベクターは、当該分野で公知である。そのようなベクターは、RNAをin vitro又はin vivoで転写することができる。発現及び/又はin vitro転写を最適化するために、クローンの5'及び/又は3'非翻訳部分を除去、付加又は改変して、余分な、潜在的に不適切な代替的翻訳開始コドン、又は転写若しくは翻訳のいずれかのレベルで発現に干渉する若しくは発現を減少させる可能性のある他の配列を消去することが必要な場合がある。
【００８９】
本開示のsALP又はその融合タンパク質は、骨石灰化障害又はHPPの別の有害な症状、例えば、発作を修復するために、少なくとも1つの他の有効成分と組み合わせて使用されてもよい。セメント質の欠陥を修復するために少なくとも1つの他の活性成分と組み合わせて使用されてもよい。
【００９０】
キット
本開示はまた、減少したALP活性を示す対象の集団を特定するため及び/又は特定した集団を処置するためのキットに関する。キットは、例えば、骨石灰化障害を示さない対象を特定することができ、例えば、発作(例えば、組換えTNALPなどの組換えALPなどにより処置されるB6耐性発作)を処置するための治療剤及び製剤を含むことができる。キットは、減少したALP活性に関連する疾患、障害又は症状、例えば、HPP及びHPP関連症状を修復又は防止するために、対象に組成物又はベクターを投与するための指示書をさらに含みうる。
【００９１】
そのようなキットは、対象の表現型を防止又は修復することができる少なくとも1つの他の活性剤(例えば、他の抗発作薬)をさらに含んでもよい。
【００９２】
加えて、本開示における区分化されたキットは、試薬を別個の容器に含有している任意のキットを含む。そのような容器としては、小さいガラス容器、プラスチック容器、又はプラスチック若しくは紙の条片が挙げられる。そのような容器は、1つの区画から別の区画への試薬の効率的な移行を可能にし、試料及び試薬は、相互汚染されず、各容器の薬剤又は溶液を、定量的な様式で1つの区画から別の区画へと添加することができる。
【００９３】
本明細書で引用される全ての参照文献は、参照により、その全体が全ての目的について、あたかも個々の公開文献又は特許又は特許出願が参照によりその全体が全ての目的について詳細に及び個々に示されて組み込まれているのと同程度に、本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれている公開文献及び特許又は特許出願が本明細書に含有されている開示と矛盾する程度に、本明細書は、任意のそのような矛盾する事項に対し、取って代わる及び/又は優先することが意図されている。
【００９４】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件などを表す全ての数値は、全ての場合において、用語「約」により修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対のことが示されていない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本開示により取得されることが求められる所望の特性に依存して変動しうる近似値である。少なくとも及び特許請求の範囲への均等論の適用を制限することなく、各数値パラメータは、有効桁数の数値及び通常の丸め処理に照らして解釈されるべきである。
【実施例】
【００９５】
[実施例1]
組換えsTNALP-FcD10の発現及び精製
組換えTNALPの発現及び精製を容易にするために、TNALPにおけるGPI-アンカー結合を特定する疎水性C末端配列を消去して可溶性分泌酵素とした(Di Mauroら  2002 Journal of Bone and Mineral Research 17:1383-1391)。また、TNALP外部ドメインのコーディング配列を、ヒトIgG1(γ1)(Swiss-Prot P01857)のFc領域で延長させた。これにより、プロテインAクロマトグラフィーにおける組換え酵素の迅速な精製と、驚くべきことに、その発現の増加が可能となった。さらに、組換えTNALPを骨組織へ標的化するために、デカアスパルテート(D10)配列を、Fc領域のC末端に結合させた。sTNALP-FcD10と称される、TNALPのこのキメラ形態は、人工基質p-ニトロフェニルリン酸を使用してpH9.8でアッセイするとき、及び生理学的基質として無機ピロリン酸(PPi)を使用してpH7.4でアッセイするときの両方の全酵素活性を保持している。TNALPの天然形態と同様に、N末端シグナルペプチドは、粗面小胞体にわたるタンパク質の翻訳同時転位の間に切断される。その設計及び構造を、図1に模式的に例証する。融合タンパク質(シグナルペプチドを含む)のアミノ酸配列は、図2に示される。分泌された融合タンパク質(つまり、シグナルペプチドを含まない)のアミノ酸配列を図3に示す。代表的なsTNALP-FcD10融合タンパク質の発現方法及び特徴についての完全な記述については、例えば、PCT公開第WO2008/138131号を参照。
【００９６】
[実施例2]
「非罹患」のHPPマウス部分集団
Akp2-/-マウスは、全体的にヒトHPP患者と類似した生理学的症候を示す。例えば、そのようなマウスは、1)ALP血漿活性がはるかに少なく(例えば、1％未満)、2)出生時には正常にみえるが、(表現型に応じて)6日齢又は11日齢で明らかな骨格疾患を発症し、3)PPi、PLP及びPEAの少なくとも1つの血漿レベルが上昇しており、4)進行性のくる病変化、骨減少症を有し、骨折し易く、5)てんかん性発作及び無呼吸を有し、6)栄養不良及び/若しくは不十分な体重増加を有し、並びに/又は、7)21日齢までに死亡する。しかしながら、Akp2-/-マウスは、様々な程度の表現型発現を有しうる。例えば、Waymire 1995において、Akp2-/-マウスはいずれも石灰化障害がなかった。加えてB6補助剤(ピリドキサール又はPLであるが、PNでない形態)も、発作表現型を救済し、C57BL/6、129/Sv(B6129)ハイブリッド遺伝的背景を有するAkp2-/-マウスの約67％で生存を促進したが、救済された動物は、後に欠陥歯列を発症した。残りの33％は、PL注射に対して応答不良であるか又は非応答性であった。しかしながら、近交系129/Sv遺伝的背景を有するAkp2-/-マウスは全て、PL注射に対して応答不良であるか又は非応答性であった。
【００９７】
本開示は、石灰化表現型の程度が様々であるが、同様に寿命が短い一群のAkp2-/-マウス(Waymire 1995と同じハイブリッド遺伝的背景を有するが、異なる世代由来であるマウス)を提供する。興味深いことに、組換えTNALPは、全てのKOマウスを救済し、B6補助剤無しにGABA、セリン及びシスタチオニンをWTレベルに回復させた。
【００９８】
Akp2-/-マウスの様々な部分集団は、野生型同腹仔と比較して、重度、中等度、軽度、又はさらには非罹患の表現型を有していた。図4は、Akp2-/-マウスの様々な石灰化障害を示す。図5は、同じ遺伝子型を有する様々なマウスコロニーにおいて、表現型重症度の広い分布があったことを示す。各コロニーにおいて約30％のノックアウトマウスが、「非罹患」の表現型(例えば、図4に示すように顕著な骨石灰化障害がなく、図6に示すように顕著な体重欠陥が無く、図8に示すように顕著な骨長欠陥が無い)を示した。驚くべきことに、「非罹患」の(石灰化)表現型を有するノックアウトマウスは、より重度の表現型を有する他のノックアウトマウスと比較して依然として有意に寿命が短縮した(図9は、ほとんど全てのノックアウトマウス(重度及び非罹患のマウス)が出生後25日近くで死んだことを示している)。
【００９９】
Akp2-/-マウスの脳におけるビタミンB6膜貫通輸送に対する組換えTNALPを用いた予防的処置及び離脱の両方の影響を分析した。予防試験において、HPP-M2h_F4繁殖コロニー由来のC57BL/6、129/Sv(B6129)ハイブリッド背景を有するAkp2-/-マウスに8.2mg/kg(8.2mpkともいう)組換えTNALP又はビヒクルのみのいずれかを、出生から開始して9日間、毎日皮下注射した。同じバックグラウンドの野生型マウスは処置せず、参照対照とした。離脱試験では、同じハイブリッド背景及びF4世代のAkp2-/-マウスに、出生から毎日、同じ用量の組換えTNALPを35日間投与し、次いでさらに12日間、ビヒクル(離脱)又は継続的に組換えTNALP処置のいずれかを投与した。対照には、未処置の野生型マウス、並びに組換えTNALPで最初の35日間処置し、次いでビヒクルに変えてさらに12日間処置したマウスの両方を含めた。全てのマウスは、ピリドキシンで補助されていない市販の実験室用齧歯類認可食餌(Charles River Rodent Diet 5075-US)に自由にアクセスできるようにした。剖検にて、脳を回収し、液体窒素で冷凍し、-80℃で保存した。
【０１００】
sTNALP-FcD10の毎日の連続的処置で、Akp2-/-マウス(「非罹患」の表現型を有するマウスを含む)は、未処置のマウスと比較して、より長い寿命を有した。図10〜12の右のパネルに示すように、そのような「非罹患」のノックアウトマウスは、少なくとも48日まで生存した(この時点で全てのマウスを終了させた)。
【０１０１】
この「非罹患」のAkp2-/-マウス部分集団の発見は、ビタミンB6耐性発作を有するが、骨変形を有しないHPP患者部分集団の以前の報告と一致する((例えば、de Rooら、2014 Molecular Genetics and Metabolism 111:404-407及びBaumgartner-Siglら、2007 Bone 40:1655-1661を参照)。明らかに、そのようなHPP患者の部分集団は、医療実務者が、HPPの診断方法を従来的な骨変形又は石灰化障害の検出に限定した場合、タイムリーな及び有効な診断の機会を逃すリスクがある。正常な骨石灰化を有する患者は、他のHPP関連症状を有する可能性について見過ごされるべきでない。患者が、発作及び/又は異常なALPタンパク質レベル/機能を有する場合(例えば、PPi、PLP及びPEAなどのALP基質のレベル増加を有する場合)、そのような患者が「非罹患」の部分集団に属するかを検証し、ALP補助剤を用いた処置を提示するかどうかの決定がなされるべきである。一般に、患者が発作、特にビタミンB6耐性発作を有する場合には、ALP補助剤処置を提示するかどうかを決定するために、患者が欠陥ALP機能を有するか、又はALP基質のレベルが増加しているかどうかを試験するさらなる取り組みがなされるべきである。
【０１０２】
[実施例3]
Akp2-/-マウスは、組換えsTNALP-FcD10の毎日の処置により修復可能な減少した脳ガンマ-アミノ酪酸(GABA)を有する。
アルカリホスファターゼ、例えば、TNALP、PLALP、GALP及びIALPは、それらの基質ホスホエタノールアミン(PEA)、無機ピロリン酸(PPi)及びピリドキサール5'-リン酸(PLP)に対して生理学的に活性である。TNALPノックアウト又は変異対象における減少したアルカリホスファターゼ活性により、細胞外PLP及びPPiの蓄積がもたらされる。全身性PLPの蓄積は、随伴して細胞内PLPの低下をもたらしたが、その理由は、PLPはそのリン酸化状態で細胞膜を通過して細胞に入ることができないためである。PLPは、ビタミンB6の触媒的活性型であり、アミン及びアミノ酸代謝に関与する140を超える様々な酵素反応において補因子として作用する(Percudani、R. & Peracchi、A.、EMBO Rep.、4:850 4、2003)。例えば、細胞内PLPが低いと、CNS GABAの減少につながる可能性があり、これは、発作を導く可能性がある。さらに、高濃度のPPiは、くる病(骨軟化症)、頭蓋骨癒合症、呼吸器不全、腎石灰化症、又は筋力低下をもたらす可能性がある。重症の場合には、これらの合併症により、死に至りうる。低下したアルカリホスファターゼ活性によるアミン及びアミノ酸の代謝異常は、HPPに特徴的な病態形成及び表現型に寄与する。
【０１０３】
脳アミノ酸濃度を測定するために、-80℃の貯蔵物からの全マウス脳を、組織1ミリグラムあたり2.5μLのリン酸緩衝食塩水(pH7.4、プロテアーゼ阻害剤カクテルが追加されたもの、Roche Diagnostics Cat # 05892970001)中でホモジナイズした。組織懸濁液を、15秒間、超音波処理し、21,000×gで15分間、4℃で3回連続して遠心分離することによって清澄化し、細片を除去した。上清抽出物は、アッセイまで-80℃で凍結した。全タンパク質は、Coomassie Plus Bradfordマイクロプレートアッセイ(Thermo Scientific Cat # PI23236)を使用して測定した。
【０１０４】
アミノ酸濃度は、内部標準(ISTD)としてL-ノルロイシン(NORL)(Sigma Cat# N8513)を使用するリチウム高性能プログラムに従ったBiochrom 30+(Biochrom Ltd.、UK)アミノ酸解析により定量した。脳抽出物は、NORL-ISTD及び5-スルホサリチル酸二水和物(SSA)(Sigma Cat# S7422)をそれぞれ最終濃度250μmol/L及び2.5％で含有するマスターミックスに1:4希釈することによって除タンパクした。タンパク質沈殿物を、10,000×g、4℃の2回の連続した遠心分離によって除去した。標準ミックスを、酸性、中性及び塩基性アミノ酸標準(Sigma Cat# A6407及びA6282)並びにNORL-ISTDを添加して、最終体積を(2.5％でSSAを用いて)250μmol/Lとすることにより調製した。40μLの標準ミックス及び除タンパクした試料を分析機にかけ、「Accelerated Analysis of Amino Acids in Physiological Samples」、Biochrom Application Note: 90に概要が説明されているように分離した(製造業者Biochrom Ltd.(Cambridge、UK)の指示による)。アミノ酸濃度(μmol/L)は、EZChromソフトウェアを使用して決定した。最終濃度はμmolアミノ酸/グラム脳湿重量として表した。
【０１０５】
図10の左のパネルで示されるように、Akp2-/-マウスは、野生型マウスと比較して低下したGABA濃度を示し、この低下はsTNALP-FcD10の連続的な毎日の処置により修復された。図10の右のパネルは、そのような連続的処置によるGABA回復が、少なくとも48日目まで続いたことを示し、ノックアウトマウスの寿命の25日を有意に超えていた。しかしながら、35日後のsTNALP-FcD10処置の停止により、Akp2-/-マウスにおけるGABA濃度は再び低下した。
【０１０６】
sTNALP-FcD10(配列番号1)の機能をさらに調べるために、脳シスタチオニン及びセリン(両方ともその産生がPLPにより制御されることが公知である)濃度を測定し、Akp2-/-マウスと野生型マウスとの間で比較した。図11及び12にそれぞれ示されるように、Akp2-/-マウスは、野生型マウスと比較して有意に脳セリンレベルが低下したが、有意に脳シスタチオニンレベルが上昇していた。しかしながら、sTNALP-FcD10の連続的処置により、ノックアウトマウスは、野生型マウスのレベルと比較して、セリンレベルが上昇し、シスタチオニンレベルが低下した。同様に、35日後のsTNALP-FcD10処置の停止により、sTNALP-FcD10による修復は逆転した(図11及び12の右のパネル参照)。
【０１０７】
毎日のsTNALP-FcD10処置により、in vivoアルカリホスファターゼ機能が改善し、脳GABA濃度が増加した。そのような処置は、Akp2-/-マウスにおける異常アミン及びアミノ酸代謝を再調整し、並びに発作及び発作関連表現型に対するそのような処置の有効性を示した。
【０１０８】
興味深いことに、試験した構築物における骨標的シグナルD10は、ノックアウトマウス生存を向上させ、発作関連生理学的パラメータを改善、例えば、脳内のGABA及びセリンレベルを回復させ、シスタチオニンレベルを低下させるその機能は防止しなかった。
【０１０９】
[実施例4]
臨床治験の改善
臨床治験により、hsTNALP-FcD10(アスホターゼアルファ、配列番号1)の処置がHPP患者の発作を改善するかどうかを試験した。ビタミンB6応答性発作の経歴を有する全ての患者は、HPPにより非常に重度の影響を受け、そのうち2人がhsTNALP-FcD10を用いた処置の開始後に死亡した。患者の1人は出生時に発作があり、hsTNALP-FcD10処置の数年後に死亡した。ビタミンB6を患者に与えたが、発作を防止するには不十分であった。次いで、クロナゼパムを投与したが、患者は脳浮腫、発熱、差次的イオン不均衡、及び潜在的心筋症を伴う発作を経験した後に死亡した。
【０１１０】
hsTNALP-FcD10を用いた処置を開始する前にB6予防レジメンを行った、B6応答性発作の経歴を有する6人の患者は、hsTNALP-FcD10処置の間に発作を経験しなかった。B6応答性発作の経歴がある可能性があり、hsTNALP-FcD10処置を開始してすぐにB6を用いた予防を停止した1人のさらなる患者は、発作を経験したが、B6予防の併用を再開したとき、この発作は解消した。別の患者は、B6応答性発作の経歴があり、hsTNALP-FcD10を用いた処置と組み合わせてB6予防を維持し、1年の併用処置後にB6予防を停止して、hsTNALP-FcD10処置のみを維持した。この患者は、B6予防の停止後に発作を経験しなかった。
【０１１１】
予備的臨床データは、hsTNALP-FcD10が、HPP患者における発作を処置したことを示した。臨床データは、hsTNALP-FcD10を用いた単独療法が有効であり、少なくとも、ある特定の期間(例えば、1人の患者において1年間)2つの分子を同時投与した後は、ビタミンB6補助剤が必要でなかったことを示した。B6応答性発作は、通常、B6補助剤により完全には防止できないので(例えば、ビタミンB6補助剤により救済されうるのはAkp2-/-マウスの一部にすぎない)、B6停止後のhsTNALP-FcD10の治療効果が認識される。しかしながら、(B6及びhsTNALP-FcD10の)同時投与工程がない場合(例えば、1人の患者では同時投与していない)又はおそらくは同時投与期間が十分長く持続されない場合、hsTNALP-FcD10処置単独は、B6-応答性発作の再発を継続的に防止するには十分でなかった。
【０１１２】
HPP患者を、後向き自然史研究及びアスホターゼアルファ処置を用いた2つのフェーズII臨床治験で評価した。アスホターゼアルファ処置有り又は無しの様々な治験(くる病胸、呼吸器不全及び/又はビタミンB6応答性発作の経歴については同じ)からの同様の患者(例えば、周産期又は乳児期HPPを有する重度に罹患した乳児及び幼児)についての臨床データを回収し、比較した。48人の患者を、自然史研究から特定し、37人の患者を下記表1に示すような統計を用いてアスホターゼアルファ処置研究から特定した。
【０１１３】
【表１】
0006787894.tif 000002
【０１１４】
これらの患者の研究の開始(つまり、フェーズII研究からの患者に対してアスホターゼアルファ処置の前)での重度HPPについての徴候/症状を記録して、まとめた(表2)。自然史研究からの患者及びフェーズII処置研究からの患者(表2の「被処置」、表1と統一)を、重度HPPの徴候/症状について同様のパーセンテージで選択した。自然史研究の48人の患者のうち10人、及びフェーズII処置研究の37人の患者のうち13人が、ビタミンB6応答性発作を有した。
【０１１５】
【表２】
0006787894.tif 000003
【０１１６】
自然史研究から選択した患者及びフェーズIIアスホターゼアルファ処置から選択した患者の生存率を比較し、表3にまとめた。自然史研究のほとんどの患者(約58％)が1歳まで生存できず、一方で生存率は低下し続け、1歳から3歳6ヶ月の間で約27％の最低ラインに達した。しかしながら、アスホターゼアルファで処置したほとんどの患者(約89％)は、5歳を超えても生存した。
【０１１７】
【表３】
0006787894.tif 000004
【０１１８】
異なる試験からの生存患者を、1歳に達した後の、重度HPPの徴候について分析した。表4に示すように、自然史研究群からの48人の患者のうち、くる病胸を有する患者の33％が生存し(40人中13人)、呼吸器不全を患う患者の18％が生存した(40人中7人)。しかしながらビタミンB6応答性発作を有する患者は1人も生存しなかった(10人中0人)。対照的に、フェーズII処置群では、くる病胸を有する患者の90％(30人中27人)が生存し、呼吸器不全を有する患者の89％(27人中24人)が生存した。特に、ビタミンB6応答性発作を有する患者の85％(13人のうち11人)が生存した。このようにアスホターゼアルファ処置は、ビタミンB6応答性発作を有する患者の生存率を劇的に向上させたが、ビタミンB6単独では(自然史研究群における患者について)、発作の阻害により生存が改善することは滅多になかった。
【０１１９】
【表４】
0006787894.tif 000005
【０１２０】
患者の生存率を分析の一次パラメータに設定し、一方、侵襲的人工呼吸無しの生存率を二次分析パラメータに設定した。表5において、同様に、自然史研究では侵襲的人工呼吸無しで1歳で31％のみの患者が生存したが、一方で侵襲的人工呼吸無しの生存率は低下し続け、1歳から3歳6ヶ月の間で約25％の最低ラインに達した。しかしながら、アスホターゼアルファで処置したほとんどの患者(約83％)は、5歳を超えても生存した。
【０１２１】
【表５】
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【０１２２】
重度にHPPに罹患している乳児に対するアスホターゼアルファ処置は、骨格石灰化を顕著に改善し、これは平均で早くも3ヶ月で生じ、継続し、一般に3年にわたって維持された。患者は、全体の運動スキル、微細運動スキル、及び認知スキルの向上を示した。
【０１２３】
結論として、歴史的対照と比較して、アスホターゼアルファ処置は、周産期及び乳児期HPPを有する重度罹患患者(死亡リスクが高い)の全体的生存率(89％対27％、P<0.0001)及び侵襲的人工呼吸無し生存率の両方の改善を促進した。
【０１２４】
[実施例5]
マウス及びヒトにおける発作の処置
軽症、非罹患又は検出不能の石灰化障害を有するAkp2-/-マウス及び野生型同腹仔を、可溶性組換えALP構築物(例えば、sTNALP、sTNALP-Fc、sTNALP-FcD10又は他の組換えアイソザイム構築物)で処置する。処置前及び処置後の発作を、ビデオカメラ又は他の生理学的方法で記録する。脳GABA、セリン、及びシスタチオニンの濃度(血清又は尿供給源に由来するものでもよい)を、公知の手法で試験し、比較する。組換えALPの治療効果は、Akp2-/-マウスにおける処置後の発作の減少及び/又はGABA/セリン濃度の回復の発見により示される。様々な投与レジメンを試験し、比較する。ビタミンB6単独又は組み合わせ療法も、あらゆる見込まれる相乗的効果のために試験する。
【０１２５】
同様に、軽症、非罹患又は検出不能の石灰化障害を有するHPP患者及び健常志願者を、本開示で開示された可溶性組換えALP構築物で処置する。処置前及び処置後の発作を報告し、比較する。生理学的パラメータ、例えば、血漿及び/又は尿中シスタチオニン(GABA、セリン及び/又はシスタチオニンの脳内濃度)を測定し、記録する。組換えALPの治療効果は、処置後の発作の減少及び/又は血漿/尿中シスタチオニン濃度の回復の発見により示される。ビタミンB6単独又は組み合わせ療法も、あらゆる見込まれる相乗的効果のために試験する。併用療法について様々な長さの時間を試験し、併用療法プロセス及びその後の単独のALP補助療法を最適化する。
【０１２６】
以前にHPPに罹患しているとは診断されなかった患者の新たな部分集団も、遺伝的スクリーニング又は他の公知の方法により、欠陥アルカリホスファターゼタンパク質レベル及び/又は機能を有するとして特定される。そのような患者の部分集団が有する1つの特徴的症状は、ビタミンB6応答性又は非応答性いずれかの発作である。そのような部分集団の患者を、次いで、B6補助剤有り又は無しで、本明細書に開示の組換えALP構築物で処置する。B6補助剤が同時投与される場合、ある特定の期間(各患者の個々の状況に応じて医師又は薬物投与者により決定される)の後に停止され、その後にALP単独療法が続く。
【０１２７】
[実施例6]
患者におけるバイオマーカーのモニタリングによる発作処置の最大化
発作を有する患者の特定の部分集団を、特徴的な、アルカリホスファターゼ基質(例えば、PPi、PEA、及びPLP)の正常を超えるレベルにより特定する。それらの基質の豊富なDNA、RNA、及び/又はタンパク質レベルは、当該分野で公知の通常の方法、例えば、定量PCR、サザンブロット、ノザンブロット、PAGE、SDS-PAGE、ウェスタンブロットなどにより検出する。この特定の患者の部分集団を特定した後、本明細書に開示の組換えALP構築物を、発作症状の緩和のために投与する。場合により、1つ以上の他の抗発作薬、例えば、ビタミンB6ビタマーを、少なくとも一定期間、同時投与してもよい。そのような単独又はALP補充を用いた併用療法のために、患者を、処置前、処置中及び処置後に、内在性バイオマーカーについて密接にモニターする。例えば、ビタミンB6を同時投与するとき、医師又は他の薬物投与者は、レシピエント患者におけるバイオマーカーのレベルをモニターし、好ましくは各患者の個々の状況に基づいて、同時投与するビタミンB6の時点、B6及び/又は組換えALPの投与レジメン、同時投与の期間の長さ、並びにビタミンB6同時投与を停止する時点などを決定する。
【０１２８】
本明細書でのモニタリングのために適切なバイオマーカーとしては、少なくともアルカリホスファターゼ基質(PPi、PEA、及び/又はPLP)、又はこれらのアルカリホスファターゼ基質によって影響を受ける他のバイオマーカー(例えば、GABA、シスタチオニン、セリン、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン、D-セリン及び硫化水素など)が挙げられる。そのようなバイオマーカーは、患者血清若しくは尿を使用して又は当該分野で公知の他の標準的試験法を使用して試験してもよい。
【０１２９】
[実施例7]
ビタミンB6でAkp2-/-マウスにおける発作を処置することの不十分性
ビタミンB6処置は、標準的な発作処置である。しかしながら、多くのHPP患者及びAkp2-/-マウスが、B6耐性発作を有し、この発作は、ビタミンB6投与では修復できず、死に至る可能性もある。Akp2-/-マウスに対するビタミンB6の効果の不足を確認するためのさらなる研究を実施した。この研究において、Akp2-/-マウスを、325ppmの食事性ビタミンB6(ピリドキシン)補助剤で処置した。しかしながら、発作は、正常な骨石灰化又は重度の石灰化障害を有するAkp2-/-マウスにおいて依然として観察された。いずれの石灰化表現型を有するノックアウトマウスも25日を超えて生存しなかった(図13)。
【０１３０】
バイオマーカープロファイルが、Akp2-/-マウスにおいて、ピリドキシン補助剤により修復できないことを確認するために、脳アミノ酸濃度を、実施例3に開示される方法と同様であるが、S-(2-アミノエチル)-L-システイン(AEC)(Sigma Cat# A2636)を(L-ノルロイシン(NORL)に代えて)内部標準(ISTD)として使用し、最終的に、40μLではなく15μLの標準ミックス及び除タンパク試料を分析する方法を使用して測定した。図14に示されるように、食事性ピリドキシン補助剤を受けた17〜19日齢の野生型マウスでは、脳内のGABA濃度が比較的高く、シスタチオニン濃度が低かったが、一方で重度石灰化障害を有するAkp2-/-マウス(つまり、典型的なビタミンB6耐性HPP群、斜線面積のバイオマーカープロファイルを有する)は、325ppmの食事性ピリドキシン補助剤にかかわらず、脳内のGABA濃度が比較的低く、シスタチオニン濃度が高かった(斜線面積で示される)。正常骨石灰化を有するAkp2-/-マウスでは、一部は、ピリドキシン補助剤でGABA及びシスタチオニン濃度が修復可能であったが、ピリドキシン補助剤で修復できないバイオマーカーを有する部分群もあった(斜線面積で示される)。
【０１３１】
結論として、Akp2-/-マウスの部分群は、正常な骨石灰化を有するが、致死性のビタミンB6耐性発作を有すると確認された。対応して、ALP欠陥及び発作を有するが、骨石灰化は正常である同様の患者部分集団も存在する(HPP患者として診断される場合も診断されない場合もある)。したがって、そのような患者の部分集団を特定して、タイムリーな様式でその症状を効果的に処置するための新たな診断プロトコル(ALP機能、例えば、PLP/PPi/PEAレベル又は本明細書に開示のバイオマーカーに基づく)が提案される。加えて、ビタミンB6単独ではなく、むしろALP(例えば、アスホターゼアルファ)補充療法が(単独又はビタミンB6との組み合わせで)、患者のこの部分集団のより良い治療のために投与されるべきである。
【０１３２】
当業者であれば理解するように、本明細書の開示において、その趣旨及び範囲を逸脱することなく、多くの修飾及び変更がなされうる。本明細書に記載の特別な実施形態は、例示としてのみ提供され、いかなる意味でも限定を意図していない。明細書及び実施例は、例示としてのみ考えることが意図されており、本発明の真の範囲及び趣旨は、以下に記載の特許請求の範囲によって示される。本発明は以下の態様も提供する。
[１]異常なアルカリホスファターゼ活性を有する対象における発作を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを対象に投与することを含む、方法。
[２]正常レベルを超える少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質を有する対象における発作を処置する方法であって、治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを対象に投与することを含む、方法。
[３]対象における発作を処置する方法であって、
(i)異常なアルカリホスファターゼ活性を有する、発作を患う又は患うリスクのある対象の集団を特定すること、及び
(ii)治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを、前記集団における対象に投与すること
を含む、方法。
[４]対象における発作を処置する方法であって、
(i)正常レベルを超える少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質を有する、発作を患う又は患うリスクのある対象の集団を特定すること、及び
(ii)治療有効量の少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼを、前記集団における対象に投与すること
を含む、方法。
[５]対象が低ホスファターゼ症(HPP)を有すると診断されており、かつ、対象が軽症又は検出不能の骨石灰化障害を有する、[１]〜[４]のいずれか一項に記載の方法。
[６]対象がHPPを有すると診断されていない、[１]〜[４]のいずれか一項に記載の方法。
[７]アルカリホスファターゼ活性が、ピリドキサール5'-リン酸(PLP)、無機ピロリン酸(PPi)、及びホスホエタノールアミン(PEA)の少なくとも1つに対するアルカリホスファターゼ酵素活性により測定される、[１]又は[３]に記載の方法。
[８]少なくとも1つのアルカリホスファターゼ基質が、PLP、PPi、及びPEAからなる群から選択される、[２]又は[４]に記載の方法。
[９]対象が、増加した血清ピリドキサール5'-リン酸(PLP)を有する、[１]〜[８]のいずれか一項に記載の方法。
[１０]対象が、減少した細胞内ピリドキサール5'-リン酸(PLP)を有する、[１]〜[９]のいずれか一項に記載の方法。
[１１]対象が、減少した脳ガンマ-アミノ酪酸(GABA)及び減少した脳セリンの少なくとも1つを有する、[１]〜[１０]のいずれか一項に記載の方法。
[１２]対象が、増加した脳及び尿中シスタチオニンの少なくとも1つを有する、[１]〜[１１]のいずれか一項に記載の方法。
[１３]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、少なくとも1週間、1ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間又は1年間毎日対象に投与される、[１]〜[１２]のいずれか一項に記載の方法。
[１４]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼの投与が、脳GABAを上昇させる、[１]〜[１３]のいずれか一項に記載の方法。
[１５]治療有効量の少なくとも1つの付加的治療剤が、対象に組み合わせて投与される、[１]〜[１４]のいずれか一項に記載の方法。
[１６]少なくとも1つの付加的治療剤が、抗発作薬である、[１５]に記載の方法。
[１７]少なくとも1つの付加的治療剤と、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼの同時投与を、所定の期間維持すること、及び
対象への少なくとも1つの付加的治療剤の投与は停止するが、少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼの投与は維持すること
をさらに含む、[１５]に記載の方法。
[１８]少なくとも1つの付加的抗発作薬及び少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、対象に、少なくとも1ヶ月間、少なくとも6ヶ月間、又は少なくとも1年間、同時投与される、[１５]に記載の方法。
[１９]少なくとも1つの付加的治療剤が、ビタミンB6(ピリドキシン)及びビタミンB6ビタマーの少なくとも1つである、[１５]〜[１８]のいずれか一項に記載の方法。
[２０]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、組織非特異的アルカリホスファターゼ(TNALP)、胎盤型アルカリホスファターゼ(PALP)、生殖細胞型アルカリホスファターゼ(GCALP)、小腸型アルカリホスファターゼ(IALP)、又はそれらの生物学的に機能的な断片、融合物若しくはキメラ構築物の少なくとも1つを含む、[１]〜[１９]のいずれか一項に記載の方法。
[２１]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、TNALP、PALP、GCALP又はIALPの可溶性断片である、[２０]に記載の方法。
[２２]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、配列番号2に示されたアミノ酸配列を含む、[１]〜[２１]のいずれか一項に記載の方法。
[２３]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、融合タンパク質である、[１]〜[２２]のいずれか一項に記載の方法。
[２４]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、免疫グロブリン分子に融合される、[２３]に記載の方法。
[２５]免疫グロブリン分子が、断片結晶性領域(Fc)である、[２４]に記載の方法。
[２６]Fcが、配列番号3に示されたアミノ酸配列を含む、[２５]に記載の方法。
[２７]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、負に荷電したペプチドに融合される、[１]〜[２６]のいずれか一項に記載の方法。
[２８]負に荷電したペプチドが、D10、D16、E10、及びE16の少なくとも1つである、[２７]に記載の方法。
[２９]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、sALP-Fc-D10の構造を含む、[１]〜[２８]のいずれか一項に記載の方法。
[３０]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、配列番号1又は配列番号4に示されたアミノ酸配列を含む、[２９]に記載の方法。
[３１]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、約0.1mg/kg/日〜約20mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与される、[１]〜[３０]のいずれか一項に記載の方法。
[３２]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、約0.5mg/kg/日〜約20mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与される、[３１]に記載の方法。
[３３]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、約0.5mg/kg/日〜約10mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与される、[３１]に記載の方法。
[３４]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、約0.5mg/kg/日〜約8mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与される、[３１]に記載の方法。
[３５]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、約0.5mg/kg/日〜約5mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与される、[３１]に記載の方法。
[３６]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、約0.1mg/kg/日〜約0.5mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与される、[３１]に記載の方法。
[３７]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、約0.1mg/kg/日〜約1mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与される、[３１]に記載の方法。
[３８]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、約1mg/kg/日〜約5mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与される、[３１]に記載の方法。
[３９]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、約1mg/kg/日〜約8mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与される、[３１]に記載の方法。
[４０]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、約1mg/kg/日〜約10mg/kg/日の投与量、又は同程度の毎週の投与量で投与される、[３１]に記載の方法。
[４１]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、静脈内、筋肉内、皮下、舌下、髄腔内及び皮内経路の少なくとも1つによって投与される、[１]〜[４０]のいずれか一項に記載の方法。
[４２]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、静脈内に投与される、[４１]に記載の方法。
[４３]少なくとも1つの組換えアルカリホスファターゼが、静脈内に投与され、次いで皮下に投与される、[４２]に記載の方法。
[４４]対象がヒトである、[１]〜[４３]のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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