(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ１炭素源を最終生成物へと変換するための複数ステージのプロセスであって、
ガス状Ｃ１含有基質を、並行して、前記複数ステージプロセスの、第１のバイオリアクターステージ及び少なくとも第２のバイオリアクターステージに供給する工程と、
第１のステージの液体生成物の少なくとも一部分を、連続して、前記第１のバイオリアクターステージから前記第２のバイオリアクターステージに供給する工程と、を含み、
前記第１のステージの液体生成物が、Ｃ１炭素源を代謝し、前記最終生成物を生成するために、前記第１のバイオリアクターステージにおいて使用されるＣ１固定微生物を含み、
前記プロセスは、少なくとも４つのバイオリアクターステージをさらに含み、前記ガス状Ｃ１含有基質が、前記少なくとも４つのバイオリアクターステージに並行して供給され、前記第１のステージの液体生成物を含む液体生成物が、前記第１のバイオリアクターステージから最終バイオリアクターステージに連続して供給され、その後、前記最終バイオリアクターステージから除去される、プロセス。
【請求項２】
前記第１のステージの液体生成物が、前記Ｃ１固定微生物の分離、及び分離されたＣ１固定微生物の前記第１のバイオリアクターステージへの再循環なしで、前記第２のバイオリアクターステージに供給される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記少なくとも４つのバイオリアクターステージの全体的Ｃ１利用率が、少なくとも６０％である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
最終ステージの液体生成物が、前記最終バイオリアクターステージから除去された後、調節可能な高度へと通され、前記高度が、各バイオリアクターステージ中の液位を決定する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記少なくとも４つのバイオリアクターステージが、大気圧よりも上の２００キロパスカル（ｋＰａ）未満の圧力で操作される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記最終生成物がエタノールであり、かつ、エタノールに加えて、前記Ｃ１固定微生物が代謝物として酢酸を生成する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
最終ステージの液体生成物を、前記複数ステージプロセスの最終バイオリアクターステージから除去することを更に含み、前記最終ステージの液体生成物のバイオマスを含まない液体画分が、少なくとも５０グラム／リットル（ｇ／ｌ）のエタノールを含む、請求項６に記載のプロセス。
【請求項８】
前記最終ステージの液体生成物の前記バイオマスを含まない液体画分が、少なくとも５０：１のエタノール：酢酸の重量比を有する、請求項７に記載のプロセス。
【請求項９】
前記最終生成物が、イソプロパノール、ブタノール、アセテート、アセトン、２−ヒドロキシイソ酪酸、及びイソブチレンからなる群から選択される増殖依存性生成物である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１０】
最終ステージの液体生成物を、前記複数ステージプロセスの最終バイオリアクターステージから除去することを更に含み、前記最終ステージの液体生成物のバイオマスを含まない液体画分が、少なくとも１０グラム／リットル（ｇ／ｌ）のイソプロパノールを含む、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記第１及び第２のバイオリアクターステージが、少なくとも１つの独立して制御可能なプロセス動作変数を有し、当該プロセス動作変数は、液体培養培地の添加速度、ガス状Ｃ１含有基質供給速度、反応器温度、反応器ｐＨ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記第１及び第２のバイオリアクターステージのうちの少なくとも１つが、１０／１未満の長さ／幅の比率を有するバイオリアクターを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記第１及び第２のバイオリアクターステージのうちの少なくとも１つが、循環ループバイオリアクターを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記循環ループバイオリアクターが、連続液相帯域内の内部液体循環を伴って動作する、請求項１３に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記連続液相帯域内で、液体が内部上昇部内で上向きに流動し、１つ以上の内部下降部内で下向きに流動する、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記循環ループバイオリアクターが、前記連続液相帯域よりも上の連続蒸気相帯域内で、対向流ガス及び液体流動を伴って動作する、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記連続液相帯域が、前記循環ループバイオリアクターの長さの下部７５％以内にある、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記連続液相帯域及び連続ガス相帯域が、蒸気−液体接触デバイスを含み、連続液相帯域デバイスが、連続蒸気相帯域デバイスとは異なる、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１９】
外部再循環ループを通して再循環される液体生成物が、連続蒸気相帯域に向かう、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記外部再循環ループを通して再循環される前記液体生成物が、前記循環ループバイオリアクターの温度を制御するための外部熱交換器に通される、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記外部再循環ループを通して再循環される前記液体生成物に、塩基性中和剤が添加されて、前記循環ループバイオリアクターのｐＨが制御される、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項２２】
複数ステージシステムであって、
第１の末端にガス入口を備え、前記第１の末端と反対の第２の末端にガス出口を備える、複数のバイオリアクターであって、前記ガス入口及び出口が、ガス状Ｃ１含有基質を前記複数のバイオリアクターに供給し、並行して、未変換のＣ１炭素源を含むガス状生成物を取り除くことを可能にする、複数のバイオリアクターを備え、
第１のバイオリアクター及び最終バイオリアクターを除く、前記複数のバイオリアクターが、バイオマスを含む上流の液体生成物を隣接する上流のバイオリアクターから受け取り、連続して、バイオマスを含む液体生成物を隣接する下流のバイオリアクターに運搬するための、前記バイオリアクターのそれぞれの第１の末端に近接する別個の液体入口及び出口を備え、
最終ステージの液体生成物を前記最終バイオリアクターから受け取るための、前記最終バイオリアクターの第１の末端に近接する液体生成物出口を備え、
前記液体生成物出口が、前記複数のバイオリアクターの高さに対して高さが調節可能なサイホンブレーカーと流体連通しており、
前記複数ステージシステムに微生物が含まれる、複数ステージシステム。
【請求項２３】
前記ガス入口が、前記複数のバイオリアクターの第１の末端に近接して、前記複数のバイオリアクター内のガススパージャーと流体連通している、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記複数のバイオリアクターが、前記複数のバイオリアクターの前記第１の末端に近接して除去された液体を、前記複数のバイオリアクターの前記第２の末端に近接する連続蒸気相帯域内の液体分配器に再循環させるための外部再循環ループを備える、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記外部液体再循環ループが、塩基性中和剤入口と流体連通しており、前記複数のバイオリアクター内のｐＨを独立して制御するための計測手段を備える、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記外部液体再循環ループが、加熱器または熱交換器と流体連通しており、前記複数のバイオリアクター内の温度を独立して制御するための計測手段を備える、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
ＣＯをエタノールに変換するための複数ステージの生物学的プロセスであって、
前記複数ステージプロセスの複数のバイオリアクターステージの中で並行して、ガス状ＣＯ含有基質を分割する工程と、
連続して、第１のバイオリアクターステージから下流のバイオリアクターステージに、カルボキシド栄養性微生物を含む液体生成物を連続して供給する工程と、
最終バイオリアクターステージから、少なくとも５０グラム／リットル（ｇ／ｌ）のエタノールを含み、かつ少なくとも５０：１のエタノール：酢酸の重量比を有する液体画分を含有する非カルボキシド栄養性微生物を有する最終ステージの液体生成物を除去する工程と、を含み、
前記プロセスが、少なくとも４つのバイオリアクターステージをさらに含む、プロセス。
【請求項２８】
前記複数のバイオリアクターステージのうちの２つ以上が、単一容器内の別個の区分である、請求項２７に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の態様は、複数のバイオリアクターステージを利用して、Ｃ１含有基質を最終生成物に微生物発酵するためのプロセスに関する。代表的なプロセスにおいて、Ｃ１含有基質は、並行して、ガス相処理のためのステージ中で分割される一方で、液体生成物は、連続して、１つのステージから液相処理のための次の連続ステージに通される。
【背景技術】
【０００２】
化石燃料温室効果ガス（ＧＨＧ）排出に対する環境への懸念によって、再生可能エネルギー源にますます重点が置かれるようになっている。結果として、エタノールは、世界中で急速に主要な水素に富む液体輸送燃料となっている。欧州、日本、及び米国、ならびにいくつかの発展途上国においてエタノール生成にますます重点が置かれていることに基づいて、世界市場における燃料エタノール産業に対する成長の継続が、予見可能な将来に予想されている。例えば、米国において、エタノールは、ガソリン中エタノールの１０％混合物であるＥ１０を生成するために使用されている。Ｅ１０ブレンドにおいて、エタノール構成成分は、燃焼効率を改善し、空気汚染物質の生成を低減する酸素化剤としての役割を果たす。ブラジルにおいて、エタノールは、ガソリン中にブレンドされた酸素化剤、及びそれ自体での純粋な燃料の両方として、輸送燃料需要の約３０％を満たす。更に、欧州連合（ＥＵ）は、その構成員の国々のそれぞれに対して、バイオマス由来エタノールなどの持続可能な輸送燃料の消費について目標を命じている。
【０００３】
大多数の燃料エタノールは、サトウキビから抽出されたスクロースまたは穀類作物から抽出されたデンプンなどの作物由来炭水化物を主要炭素源として使用する、伝統的な酵母系発酵プロセスを介して生成される。しかしながら、これらの炭水化物供給ストックの費用は、競合する用途のための（すなわち、ヒト及び動物の両方のための食料源としての）市場におけるそれらの価値によって影響される。更に、エタノール生成のためのデンプンまたはスクロース生成作物の栽培は、全ての地理において経済的に持続可能ではなく、これは、それが、その地方での価値及び気候の両方と相関しているためである。これらの理由から、より低費用かつ／またはより大量に存在する炭素源を燃料エタノールに変換するための技術を開発することが特に対象となる。この点に関して、一酸化炭素（ＣＯ）は、石炭、石油、及び石油由来生成物などの有機材料の不完全燃焼のエネルギーに富む主要な副生成物である。ＣＯに富む廃棄物ガスは、様々な産業プロセスから生じる。例えば、豪州における鋼産業は、年間５００，０００メートルトンを超えるＣＯを生成し、大気中に放出していると報告されている。
【０００４】
より近年では、産業的規模でＣＯからエタノールを生成するための微生物（細菌）系プロセス代替案が、商業的関心及び投資の対象となっている。ＣＯを唯一の炭素源として微生物培養物が増殖する能力は、１９０３年に最初に発見された。この特徴は後に、生物が、独立栄養性増殖のアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）生化学的経路（Ｗｏｏｄｓ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路及び一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチルＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）経路としても知られる）を使用することによるものであることが決定された。以来、カルボキシド栄養性生物、光合成生物、メタン生成生物、及び酢酸生成生物を含む多数の嫌気性生物が、ＣＯを代謝することが示されている。クロストリジウム属のものなどの嫌気性細菌は、アセチルＣｏＡ生化学的経路を介して、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２からエタノールを生成することが知られている。例えば、ガスからエタノールを生成するクロストリジウム・リュングダリイの様々な菌種は、ＷＯ００／６８４０７、欧州特許第１１１７３０９Ａ１号、米国第５，１７３，４２９号、米国第５，５９３，８８６号、米国第６，３６８，８１９号、ＷＯ９８／００５５８、及びＷＯ０２／０８４３８に記載される。細菌クロストリジウム・オートエタノゲナム菌種もまた、ガスからエタノールを生成することが知られている（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１６１：３４５−３５１（１９９４））。
【０００５】
生物の各酵素は、本質的に完全な選択性をもってその指定された生物学的変換を促進するため、微生物合成ルートは、従来の触媒ルートと比較して、より低いエネルギー費用とともにより高い収率を達成することができる。例えば、非選択的副反応から生じる副生成物を、所望される生成物から分離するためのエネルギーの必要性を低減することができる。更に、反応培地中の不純物による、触媒の毒作用に対する懸念が減少する。しかしながら、これらの明らかな利点にも関わらず、当該技術分野は、特に生成率が他の技術と競合することを確保することに関して、ＣＯからのエタノールの微生物合成に現在関連する特定の課題に対処しなくてはならない。それらの炭素源としてＣＯを使用する場合、上述の嫌気性細菌は、発酵によってエタノールを生成するが、それらはまた、少なくとも１つの代謝物、例えば、ＣＯ２、メタン、ｎ−ブタノール、及び／または酢酸も生成する。これらの代謝物のうちのいずれかが形成されると、利用可能な炭素が代謝物（複数可）へと失われ、所望される最終生成物の生成効率が損なわれるため、所与のプロセスの生産性及び全体的な経済的実行可能性に著しく影響を与える潜在性を有する。更に、代謝物（例えば、酢酸）自体が、微生物発酵プロセスのその時間及び場所で価値を有さない限り、それは、廃棄物処分の問題を提起し得る。エタノールを作製するためのＣＯ含有ガスの嫌気性発酵における、所望される最終生成物以外の生成物の形成に対処するための様々な提案は、ＷＯ２００７／１１７１５７、ＷＯ２００８／１１５０８０、及びＷＯ２００９／０２２９２５において議論されている。
【０００６】
所与の発酵プロセスが経済的に魅力的であるかどうかの重要な決定因子であるエタノール生成率は、細菌増殖のための適切な条件の管理に高度に依存する。例えば、ＷＯ２０１０／０９３２６２から、至適な微生物増殖及び／または所望される代謝物生成をもたらす割合で微生物培養物にＣＯ含有基質が提供されなくてはならないことが知られている。不十分な基質が提供された場合、微生物増殖は緩徐となり、発酵生成物の収率はエタノールを犠牲にして酢酸の方へと移動する。過剰な基質が提供された場合、不良な微生物増殖及び／または細胞死がもたらされ得る。これらのプロセスにおける動作パラメータ間の関係性に関する更なる情報は、ＷＯ２０１１／００２３１８に見出される。
【０００７】
ＣＯから、及び特に鋼生成において排出されるガス状溶出物などのＣＯ含有廃棄物流から、エタノールを生成するための生物学的プロセスの当該技術分野は、プロセス経済性、及び故に産業競合性を改善する解決策を絶えず探究している。従来の慣行に従うと、所望される変換を実行するために使用される微生物の分離及び再循環は、連続プロセスにおいて許容される生産性を達成するために必須であると考えられている。バイオリアクターの内部または外部のいずれかにある好適な膜分離システムは、この目的のために効果的であることが知られている。しかしながら、膜、ならびにそれらの関連する収容部、弁、計測手段、及び制御部が、全体的な資本及び運用費用に著しく追加される。膜、及び手動か自動かに関わらず「定置洗浄（ＣＩＰ）」オプションを変更することは、一般に著しい量の操作者時間、化学物質、及び加熱（手動操作の場合）、または極めて高価な資本費用（自動操作の場合）のいずれかを必要とする。例えば、腐蝕性（ＮａＯＨ）溶液での単純な清浄が実際は非効果的であると見出されているため、いくつかのバイオリアクターシステムは、細胞再循環膜を清浄するための高価な酵素溶液を必要としてきた。
【０００８】
全体として、生物学的ＣＯ変換プロセスにおける重要な考慮は、操作柔軟性を増加させ、エタノール生産性及び生成物品質を改善し、かつ／またはＣＯをより効率的に利用する改善を見出すことに関する。資本費用及び運用費用に著しく影響を与えずに、これらの領域のうちのいずれか１つにおいてわずかですら進歩を達成することは、産業規模の運用に著しい意義を有し得る。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の態様は、産業廃棄物ガスなどのＣ１含有基質からのＣ１炭素源を栄養分として利用するＣ１固定微生物の代謝経路を通して生成される、エタノールなどの有用な最終生成物を生成するための、生物学的プロセス及び関連するシステムにおける改善に関する。代表的なプロセス及びシステムは、複数のステージの相互接続されたバイオリアクターを使用する代替的な種類の動作と、特に全体的プロセスにおいて使用されるステージのうちの少なくとも１つに（例えば、ステージのうちの少なくとも１つのバイオリアクターに）、一般にステージのうちのほとんど（例えば、第１のステージ及び／または最後もしくは最終ステージを除く全てのステージ）に、しばしばステージのうちの全てに再循環するためにカルボキシド栄養性微生物を分離する費用及び複雑性なしで済ませることが可能である動作とを伴う。驚くべきことに、そのようなシステム、特に、液体生成物が連続して供給される一方で、Ｃ１含有基質が複数のバイオリアクターに並行して供給されるシステムの使用は、高い全体的エタノール生産性を、それに対応して酢酸などの所望されない代謝物の低い生産性とともにもたらすことが実証されている。効率的な全体的Ｃ１炭素源利用率、ならびにプロセス柔軟性及び制御の改善を含む他の利点もまた、実現される。
【００１０】
本発明の実施形態は、Ｃ１炭素源を最終生成物へと変換するための複数ステージプロセスを対象とする。代表的なプロセスは、例えば、各ステージで受け取られるガス組成物が、同一または実質的に同一であり、かつプロセスに入力されるＣ１含有基質のガス組成物となるように、バイオリアクターステージ中でＣ１含有基質を分割することによって、ガス状Ｃ１含有基質を、並行して、プロセスの第１のバイオリアクターステージ及び少なくとも第２のバイオリアクターステージに供給することを含む。そのようなプロセスは、第１のステージの液体生成物の少なくとも一部分を、連続して、第１のバイオリアクターステージから第２のバイオリアクターステージに供給することを更に含む。この様式において、各ステージで受け取られる液体生成物の組成物、または少なくともそのバイオマスを含まない液体画分（例えば、−Ｃ１固定微生物を含有しない液体ブロスの画分）は、その前の上流のステージから受け取られる出力となり得る。したがって、ガス組成物とは異なり、各ステージで受け取られる液体生成物の組成物は、一般に同一ではなく、実際は所望される最終生成物及び他の代謝物に関連して著しく変動し得る。例えば、所望される最終生成物の濃度は、上流のステージから連続する下流のステージの方向へと、少なくともいくつか、及び好ましくは全てのステージにわたって連続的に増加してもよい。代替的に、または組み合わせて、他の代謝物は、そのようなステージのうちのいくつかまたは全てにわたって連続的に低下してもよい。本発明の実施形態は、Ｃ１含有基質からのＣ１炭素源を所望される最終生成物へと変換するための複数ステージプロセスを対象とし、本複数ステージプロセスは、所望される最終生成物に対するシステムの特異性を増加させる。
【００１１】
更に、上述の代表的なプロセスに従うと、Ｃ１固定微生物の分離及び再循環は、バイオリアクターステージのうちの少なくとも１つにおいて有利に回避される。これは、許容される生産性レベルを得るために細胞再循環を必要とすると理解されている、従来の連続「ケモスタット」生物学的プロセスとは全く対照的である。したがって、少なくとも１つのステージに供給される液体生成物（例えば、第２のステージに供給される第１のステージの液体生成物）は、その前の（例えば、第１の）上流のバイオリアクターステージにおいて使用され、かつ、例えば、この上流のステージにおいて分離または濾過されていない、Ｃ１固定微生物を含み得る。この液体生成物は一般に、その前の上流のステージから受け取られる培養培地、所望される最終生成物、及び他の代謝物を更に含む。したがって、好ましい実施形態に従うと、少なくとも１つのバイオリアクターステージの液体生成物（例えば、第１のステージの液体生成物）は、（１）（例えば、膜分離を使用する）Ｃ１固定微生物の分離、その後、（２）分離された微生物の、それが除去される同一のステージへの再循環に伴う追加の費用及び複雑性なしで、後続するステージに供給される。好ましい実施形態において、プロセスは、Ｃ１固定微生物の、バイオリアクターステージのうちのいずれかからのいかなる分離及び／またはそれへの再循環もなしで実行されるが、最終ステージから除去される液体生成物は、通常はこの様式で分離されて、細胞を含まない液体中に最終生成物（複数可）が回収される。したがって、いくつかの実施形態に従うと、Ｃ１固定微生物及び／または細胞培養培地は、最終ステージの液体生成物から分離され、プロセスに（例えば、バイオリアクターステージのうちの１つ以上に）戻され得る。
【００１２】
本発明の他の実施形態は、複数のバイオリアクターを備える複数ステージシステムを対象とする。これら複数のバイオリアクターは、第１の末端にガス入口を、及び第１の末端と反対の第２の末端にガス出口を備えて、ガス入口及び出口が、ガス状Ｃ１含有基質を複数のバイオリアクターに供給し、並行して、未変換のＣ１炭素源を含むガス状生成物を取り除くことを可能にする。第１のバイオリアクター及び最終バイオリアクターを除く（すなわち、最遠の上流バイオリアクターは別のバイオリアクターから液体生成物を供給されないため、最遠の上流バイオリアクターではなく、また、最遠の下流バイオリアクターから除去される液体生成物は別のバイオリアクターには供給されないため、最遠の下流バイオリアクターではない）これら複数のバイオリアクターは、Ｃ１固定微生物（バイオマス）を含む液体生成物を隣接する上流のバイオリアクターから受け取り、連続して、Ｃ１固定微生物（細胞またはバイオマス）を隣接する下流のバイオリアクターに含む液体生成物を運搬するための、別個の液体入口及び出口を備える。
【００１３】
一般に、液体入口及び出口の両方は、液体生成物が複数のバイオリアクターの下部付近、例えば、反応器の長さの下部２５％以内または下部１０％以内に供給され、かつそこから除去され得るように、第１の末端（すなわち、ガス状Ｃ１含有基質が受け取られる末端）に近接する。最終バイオリアクターから最終液体生成物を受け取るための液体生成物出口は、最終バイオリアクターの第１の末端に同様に近接する。「反応器の長さ」に関して様々な特徴の位置を画定する上で、この長さは、一般に「反応器容積」または「反応器作業容積」と見なされる反応器含有物（反応物と反応生成物との混合物）を含有する区分の長さを指し、この長さは、反応器容積、または反応器を収容するが、いかなる反応器含有物も含有しないカラムもしくは他の容器の区分よりも上または下に伸び得るプロセスライン（例えば、供給入口ラインまたは生成物出口ライン）は含まない。例えば、円柱状反応器の場合、反応器の長さは、円柱の軸の長さを指す。反応器の長さの「下部１０％」とは、反応器の下部から開始し、上向きに反応器の長さの１０％伸びる高さの範囲を指す。反応器の長さの「上部１０％」とは、反応器の上部から開始し、下向きに反応器の長さの１０％伸びる高さの範囲を指す。同様に、反応器の長さの「下部１％〜１０％」とは、反応器の下部よりも上の反応器の長さの１％である高さから開始し、上向きに反応器の下部よりも上の反応器の長さの１０％である高さまで伸びる高さの範囲を指す。反応器の長さの上部「２５％〜４５％」とは、反応器の上部よりも下の反応器の長さの２５％である高さから開始し、下向きに反応器の上部よりも下の反応器の長さの４５％である高さまで伸びる高さの範囲を指す。
【００１４】
本発明の更なる実施形態は、Ｃ１を所望される最終生成物へと変換するための複数ステージの生物学的プロセスを対象とする。本プロセスは、（ｉ）複数ステージプロセスの複数のバイオリアクターステージの中で並行して、ガス状Ｃ１含有基質を分割する工程と、（ｉｉ）連続して、第１のバイオリアクターステージから下流のバイオリアクターステージに、Ｃ１固定微生物を含む液体生成物を連続して供給する工程とを含む。最終ステージにおいて、最終ステージの液体生成物は、最終バイオリアクターステージから除去される。特定の実施形態において、最終ステージの液体生成物は、バイオマスを含まない液体画分（例えば、Ｃ１固定微生物／バイオマスを含有しない液体画分）から除去される。
【００１５】
特定の実施形態において、本発明は、一酸化炭素（ＣＯ）をエタノールに変換するための複数ステージの生物学的プロセスを対象とする。本プロセスは、（ｉ）複数ステージプロセスの複数のステージの中で並行して、ＣＯ含有基質を分割する工程と、（ｉｉ）連続して、第１のバイオリアクターステージから下流のバイオリアクターステージに、カルボキシド栄養性微生物を含む液体生成物を連続して供給する工程とを含む。最終バイオリアクターステージから除去される最終ステージの液体生成物は、少なくとも約５０グラム／リットル（ｇ／ｌ）のエタノールを含み、かつ少なくとも約５０：１のエタノール：酢酸の重量比を有する液体画分を有し得る。特定の実施形態において、最終ステージの液体生成物は、バイオマスを含まない液体画分から除去される。特定のプロセスは、少なくとも４つのバイオリアクターステージを含み得る。この様式の並行ガス／連続液体操作に関連するそのような代表的なプロセスは、最小の副生成物形成をもって高レベルの生産性を有利に達成することができる。他の実施形態において、本発明は、低減されたエタノール生産性をもって一酸化炭素を２，３−ブタンジオールに変換するための複数ステージの生物学的プロセスを対象とする。特定の実施形態において、カルボキシド栄養性微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ラグスダレイ、及びクロストリジウム・リュングダリイからなる群から選択される。
【００１６】
代替的な実施形態において、本発明は、一酸化炭素（ＣＯ）を増殖依存性最終生成物（例えば、イソプロパノール）に変換するための複数ステージの生物学的プロセスを対象とする。本プロセスは、（ｉ）複数ステージプロセスの複数のステージの中で並行して、ＣＯ含有基質を分割する工程と、（ｉｉ）連続して、第１のバイオリアクターステージから下流のバイオリアクターステージに、カルボキシド栄養性微生物を含む液体生成物を連続して供給する工程とを含む。最終バイオリアクターステージから除去される最終ステージの液体生成物、または少なくともそのバイオマスを含まない液体画分は、少なくとも約１０ｇ／ｌのイソプロパノールを含み得る。特定の実施形態において、イソプロパノール生成プロセスにおいて利用されるカルボキシド栄養性微生物は、イソプロパノール生合成経路中に少なくとも１つの異種酵素を有する組み換えクロストリジウム・オートエタノゲナム菌種である。本発明の複数ステージプロセスの使用は、伝統的な二反応器発酵システムと比較して、増殖依存性最終生成物の生産性の増加のためのプロセスを提供する。本発明の一実施形態に従うと、増殖依存性最終生成物は、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、２−ヒドロキシ酪酸（２−ＨＩＢＡ）、及びイソブチレンからなる群から選択される。
【００１７】
全体として、以下により詳細に論じるように、本明細書に記載される複数ステージの生物学的プロセスは、生物変換操作の安定性を改善し、特定の目的に対して各ステージで達成される性能（例えば、最終生成物及び他の代謝物の力価）を個別化するためのより大きな柔軟性を提供することができる。反応器容積に基づくより低い生産性ですら、従来のプロセスと比較して、比較的より単純な構築及び制御システムは、商業的規模で達成される資本費用及び／または運用費用の低減を通して、経済的観点からこれを効果的に補償することができる。更に、「反応器当たり」に基づく生産性の低減は、バイオリアクターの寸法に関して改善された柔軟性を可能にするため、利用可能な貯蔵タンクの寸法により一致する寸法を有する、比較的より短いか、またはより幅広い容器が用いられてもよい。例えば、１つ以上のステージのバイオリアクター（例えば、第１及び第２のバイオリアクターステージのうちの少なくとも１つ、少なくとも４つのバイオリアクターステージ、または全てのバイオリアクターステージ）は、約１０／１（例えば、約５／１〜約１０／１）などの約１５／１（例えば、約２／１〜約１５／１）の長さ／幅（例えば、直径）の比率を有し得る。生産性の低減を可能にすることは、転じて、本明細書に記載されるプロセス／システムにおけるより低い圧力の使用を可能にする。例えば、１つ以上のステージのバイオリアクター（例えば、第１及び第２のバイオリアクターステージのうちの少なくとも１つ、少なくとも４つのバイオリアクターステージ、または全てのバイオリアクターステージ）は、約２００ｋＰａ未満のケージ圧または約１００ｋＰａ未満のケージ圧すらなどの約５００キロパスカル（ｋＰａ）未満のケージ圧（すなわち、大気圧よりも上）の圧力で操作され得る。本明細書に記載される複数ステージプロセス及びシステムはまた、所与の質量移動係数について、そのような従来のプロセスと比較してより大きなガス利用率を有利に達成することができる。
【００１８】
複数ステージプロセスにおいて、本明細書に記載されるバイオリアクターステージまたはそのいくつかの部分は、単一容器内の別個の区分であってもよい。例えば、そのような容器（５０，０００〜３，０００，０００リットルの容積を有する産業標準タンクであり得る）は、個々のバイオリアクターステージとは区別され、本明細書に記載される蒸気流動及び液体流動を配向する内部構造設定を含み得る。例えば、内部構造は、ステージを通して、ガス及び液体をそれぞれ並行かつ連続して流動するように構成され得る。容器内のバイオリアクターステージの使用は、本明細書に記載される特定の動作実施形態、例えば、バイオリアクターステージを出る、未変換のＣ１炭素源を含むガス状生成物の共有流動を伴う動作を促進し得る。一実施形態に従うと、容器内のバイオリアクターステージは、第１のバイオリアクターステージが高度が最も高く、最終バイオリアクターステージが高度が最も低いことにより、重力を利用してステージを通した液体生成物の移動を補助する、積み重ねられた関係性で配向され得る。バイオリアクターを含み得る単一容器内の連結されたバイオリアクターステージの合計数は変動し得、例示的な実施形態において、容器は約４〜約１２のバイオリアクターステージを含み得る。内部構造は、関連するパイプならびに／または図１及び２を参照して本明細書に記載される他の機器（例えば、ガス及び液体入口ならびにそれらの接続部、蒸気及び液体分配器、上昇部、下降部、外部液体再循環ループ、液体培養培地の入口、ならびに他の付加物など）を含み得る。したがって、そのような内部構造は、以下により詳細に記載される、再循環ループを使用する誘導された内部循環及び／または外部循環を含む、所望される流動構成を達成することにより、高い質量移動を達成し、設計されたガス流量で混合するのに必要な水力学的条件を作り出すためのステージ間の全体的な流体連通を提供することができる。そのような容器は、例えば、必ずしも隣接（すなわち、互いのすぐ上流、または互いからすぐ下流）しないバイオリアクターステージ間の液体循環のための、容器全体の外部にある追加の液体循環ループに適合され得る。いくつかの実施形態において、所与の生物学的変換プロセスのために必要とされるバイオリアクターステージの総数は、本プロセスが、２つ以上の容器（その一方または両方が複数（例えば、２つ以上）のバイオリアクターステージを含有する）を利用し得るように、容器内のステージの数を超えてもよい。
【００１９】
本明細書に記載される複数ステージの生物学的プロセスの使用は、発酵パラメータ及びプロセス条件にわたるより大きな制御を提供する。複数ステージプロセスのステージのうちのそれぞれは、所望される最終結果を提供するように異なるプロセス条件で操作され得る。例えば、特定のステージは増殖を促進するように操作されてもよく、他のステージは生産性へと最適化されてもよい。複数ステージの生物学的プロセスの使用は、より良好な生成物力価、所望される最終生成物に対するより大きな特異性、改善されたガス取り込み、及び様々な組成物のＣ１含有基質に対するより大きな柔軟性をもたらし得る。
【００２０】
本発明に関するこれら及び他の実施形態、態様、及び利点は、以下の発明を実施するための形態から明らかである。
【００２１】
本発明の例示的な実施形態及びその利点のより完全な理解は、類似の特徴が類似の参照番号によって特定される（例えば、図１のバイオリアクター１００ａ及び図２のバイオリアクター１００）添付の図面を考慮して、以下の記述を参照することによって得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】単純化するために介在する類似のバイオリアクターを省略して、少なくとも２つの上流のバイオリアクター及び２つの下流のバイオリアクターを利用する代表的なプロセスを描写する。
【図２】図１に示される代表的なバイオリアクターの拡大図を描写し、内部構造及び液体循環に関する追加の詳細を提供する。
【図３】本明細書に記載される生物学的プロセス（６つのバイオリアクターステージを利用）の最終液体生成物から取得した試料中の、４０日以上の動作期間にわたった、エタノール及びカルボキシド栄養性微生物の濃度、ならびに酢酸及び２，３−ブタンジオールの副生成物代謝物を示すグラフである。
【図４】６つのバイオリアクターステージのそれぞれの液体生成物から、４０日以上の動作期間の２３日目に取得した試料中の、エタノールならびに酢酸及び２，３−ブタンジオールの副生成物代謝物の測定濃度のグラフであり、これらの最終液体生成物濃度は、図３に描写される。
【図５Ａ】イソプロパノール発酵の代謝物プロファイルを示すグラフである
【図５Ｂ】イソプロパノール生産率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
図１〜５は、本開示及び／または関連する原理の説明を示すものと理解されるべきである。説明及び理解を促進するために、単純化されたプロセスフロー模式図及び機器を、図１及び２に描写し、これらの図面は、必ずしも縮尺通りには描かれていない。本開示の理解にとって必須ではない、弁、計測手段、ならびに他の機器及びシステムを含む詳細は、示されていない。本開示の知識を有する当業者にとって容易に明らかとなるように、本発明の他の実施形態に従うＣ１含有基質の生物学的変換のための方法は、一部には  それらの特定の用途によって決定される構成及び構成要素を有するだろう。
【００２４】
本発明は、ガス状Ｃ１含有基質中のＣ１炭素源を、使用される複数のバイオリアクターステージに並行して供給して、転じて、これらのステージの液体生成物を連続して処理することによって、所望される最終生成物を生成するためのプロセスに関する。動作中、複数のバイオリアクターのそれぞれは、Ｃ１固定微生物を含有する液体培養培地を含む。所望される最終生成物に加えて、本明細書に記載されるプロセスは、所望されないか、またはそれほど所望されない代謝物を追加で生成する。代表的なＣ１固定微生物は、ムーレラ属、クロストリジウム属、ルミノコッカス属、アセトバクテリウム属、ユーバクテリウム属、ブチリバクテリウム属、オキソバクター属、メタノサルシナ属、メタノサルシナ属、及びデスルホトマキュラム属のものである。クロストリジウム属である微生物の具体的な例としては、クロストリジウム・リュンダリイ（Ｃ．ｌｊｕｎｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ラグスダレイ、及びクロストリジウム・ベエイジェレンキ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｅｎｃｋｅｉ）が挙げられる。
【００２５】
代表的なＣ１含有基質は、ＣＯ、ＣＯ２、及びＣＨ４からなる群から選択される少なくとも１つのＣ１炭素源が、Ｃ１固定微生物の１つ以上の菌種にとって増殖及び／または発酵のために利用可能となり得る、幅広く任意のＣ１炭素源含有ガスを含む。そのようなＣ１含有基質は、好ましくは、そのような汚染物質がＣ１固定微生物の増殖に対して悪影響を有し得る程度まで汚染物質を含まない（例えば、１つ以上の汚染物質（複数可）は、増殖率が、所与の設定の条件下で、同一ではあるが汚染物質（複数可）を有さない条件下での増殖率と比較して、１０％を超えて低減されるような濃度または量では存在しない）。
【００２６】
本明細書に記載される代表的なＣ１含有基質は、幅広く任意のＣ１炭素源を含む。Ｃ１炭素源とは、本発明の微生物にとって部分的または唯一の炭素源としての役割を果たす１つの炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯ及びＣＯ２のうちの一方または両方を含む。基質は、Ｈ２、Ｎ２、または電子などの非炭素構成成分を更に含む。
【００２７】
Ｃ１含有基質は、有意な割合のＣＯ、好ましくは少なくとも約５容積％〜約９９．５容積％のＣＯを含有し得る。そのような基質はしばしば、鋼製造プロセスまたは非二価鉄生成物製造プロセスなどの産業プロセスの廃棄物生成物として生成される。ガス状ＣＯ含有基質が生成される他のプロセスとしては、石油精製プロセス、バイオ燃料生成プロセス（例えば、熱分解プロセス及び脂肪酸／トリグリセリド水素化変換プロセス）、石炭及びバイオマスガス化プロセス、電力生成プロセス、カーボンブラック生成プロセス、アンモニア生成プロセス、メタノール生成プロセス、ならびにコークス製造プロセスが挙げられる。いくつかの化学産業溶出物ならびに様々な基質から生成される合成ガス（ＣＯ及びＨ２の両方を含有する）も同様に、潜在的なＣＯ含有基質としての役割を果たし得る。具体的な例としては、リン酸塩及びクロム酸塩の生成からの溶出物が挙げられる。有利に、これらのプロセスからの廃棄物（例えば、廃棄物ガス）は、本明細書に記載されるように、エタノールなどの有用な最終生成物の有益な生成のために使用することができる
【００２８】
基質及び／またはＣ１炭素源は、産業プロセスの副生成物として、または自動車排気ガスもしくはバイオマスガス化などのいくつかの他の供給源から得られる廃棄物もしくはオフガスであっても、それに由来してもよい。特定の実施形態において、産業プロセスは、二価鉄金属生成物製造（製鋼所での製造、非二価鉄生成物製造、石油精製プロセス、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、及びコークス製造など）からなる群から選択される。これらの実施形態において、基質及び／またはＣ１炭素源は、それが大気に排出される前に、任意の従来の方法を使用して産業プロセスから捕らえられる。
【００２９】
基質及び／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精製所残渣のガス化、バイオマスもしくはリグノセルロース材料のガス化、または天然ガスの改質から得られる合成ガスなどの合成ガスであっても、それに由来してもよい。別の実施形態において、合成ガスは、自治体の固体廃棄物または産業固体廃棄物のガス化から得ることができる。
【００３０】
基質及び／またはＣ１炭素源に関連して、「に由来する」という用語は、何らかの形で改変またはブレンドされている基質及び／またはＣ１炭素源を指す。例えば、基質及び／もしくはＣ１炭素源は、特定の構成成分を添加するか、または取り除くように処理されても、他の基質及び／もしくはＣ１炭素源流とブレンドされてもよい。
【００３１】
基質の組成物は、反応の効率及び／または費用に対して著しい影響を有し得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成物によって、基質を処理、スクラブ、もしくは濾過して、毒素、所望されない構成成分、もしくは粉塵粒子などの任意の所望されない不純物を取り除き、かつ／または所望される構成成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
【００３２】
基質は一般に、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００モル％のＣＯなどの、少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、約２０〜８０、３０〜７０、または４０〜６０モル％のＣＯなどの様々なＣＯを含み得る。好ましくは、基質は、約４０〜７０モル％のＣＯ（例えば、製鋼所ガスもしくは溶鉱炉ガス）、約２０〜３０モル％のＣＯ（例えば、塩基性酸素炉ガス）、または約１５〜４５モル％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態において、基質は、約１〜１０または１〜２０モル％のＣＯなどの比較的低い量のＣＯを含み得る。本発明の微生物は、典型的には、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物へと変換する。いくつかの実施形態において、基質は、ＣＯを含まないか、または実質的に含まない。
【００３３】
基質は、同一の量のＨ２を含み得る。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、または３０モル％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約６０、７０、８０、または９０モル％のＨ２などの比較的高い量のＨ２を含み得る。更なる実施形態において、基質は、Ｈ２を含まないか、または実質的に含まない。
【００３４】
基質は、同一の量のＣＯ２を含み得る。例えば、基質は、約１〜８０または１〜３０モル％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約２０、１５、１０、または５モル％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態において、基質は、ＣＯ２を含まないか、または実質的に含まない。
【００３５】
基質は、典型的にはガス状であるものの、基質はまた、代替的な形態で提供されてもよい。例えば、基質は、微小気泡分散生成器を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和された液体中に溶解されてもよい。更なる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
【００３６】
「微生物」とは、顕微鏡生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または菌である。本発明の微生物は、典型的には細菌である。本明細書で使用される場合、「微生物」の引用は、「細菌」を網羅するものとして考えられるべきである。
【００３７】
本発明の微生物は、機能的特徴に基づいて更に分類することができる。例えば、本発明の微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性菌、酢酸生産菌、エタノール生産菌、カルボキシド栄養性菌、及び／またはメタン栄養性菌であっても、それに由来してもよい。表１は、微生物の代表的な一覧を提供し、それらの機能的特徴を特定する。
【表１】
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１  アセトバクテリウム・ウッディーは、フルクトースからエタノールを生成することができるが、ガスからは生成することができない。
２  アセトバクテリウム・ウッディーは、ＣＯによって増殖し得ると報告されているが、方法論は疑問である。
３  クロストリジウム・マグナムがＣＯによって増殖し得るかどうかは、調査されていない。
４  ムーレラ・サーモアセチカの１つの菌種、ムーレラ菌種ＨＵＣ２２−１は、ガスからエタノールを生成すると報告されている。
５  スポロミューサ・オヴァタがＣＯによって増殖し得るかどうかは、調査されていない。
６  スポロミューサ・シルバセチカがＣＯによって増殖し得るかどうかは、調査されていない。
７  スポロミューサ・スファエロイデスがＣＯによって増殖し得るかどうかは、調査されていない。
【００３８】
「Ｃ１」とは、一炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１−酸素化物」とは、少なくとも１つの酸素原子もまた含む一炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」とは、本発明の微生物にとって部分的または唯一の炭素源としての役割を果たす一炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯ及びＣＯ２のうちの一方または両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。典型的には、本発明の微生物は、Ｃ１固定細菌である。好ましい一実施形態において、本発明の微生物は、表１に特定されるＣ１固定微生物に由来する。
【００３９】
「嫌気性菌」は、増殖に酸素を必要としない微生物である。嫌気性菌は、酸素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応をするか、または死ぬことすらあり得る。典型的には、本発明の微生物は、嫌気性菌である。好ましい一実施形態において、本発明の微生物は、表１に特定される嫌気性菌に由来する。
【００４０】
「酢酸生産菌」は、嫌気性呼吸の生成物としてアセテート（もしくは酢酸）を生成するか、またはそれを生成することができる微生物である。典型的には、酢酸生産菌は、エネルギー保存のため、ならびにアセテートなどのアセチル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡ−由来生成物の合成のための主要機序として、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路を使用する絶対嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８）。酢酸生産菌は、（１）ＣＯ２からアセチル−ＣｏＡを還元合成するための機序として、（２）最終電子受容、エネルギー保存プロセスとして、（３）細胞炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のための機序として、アセチル−ＣｏＡ経路を使用する（Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。全ての天然に存在する酢酸生産菌は、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、かつ非メタン栄養性である。典型的には、本発明の微生物は、酢酸生産菌である。好ましい一実施形態において、本発明の微生物は、表１に特定される酢酸生産菌に由来する。
【００４１】
「エタノール生産菌」は、エタノールを生成するか、またはそれを生成することができる微生物である。典型的には、本発明の微生物は、エタノール生産菌である。好ましい一実施形態において、本発明の微生物は、表１に特定されるエタノール生産菌に由来する。
【００４２】
「独立栄養性菌」は、有機炭素の不在下で増殖することができる微生物である。代わりに、独立栄養性菌は、ＣＯ及び／またはＣＯ２などの無機炭素源を使用する。典型的には、本発明の微生物は、独立栄養性菌である。好ましい一実施形態において、本発明の微生物は、表１に特定される独立栄養性菌に由来する。
【００４３】
「カルボキシド栄養性菌」は、唯一の炭素供給源としてＣＯを利用することができる微生物である。典型的には、本発明の微生物は、カルボキシド栄養性菌である。好ましい一実施形態において、本発明の微生物は、表１に特定されるカルボキシド栄養性菌に由来する。
【００４４】
「メタン栄養性菌」は、唯一の炭素及びエネルギーの供給源としてメタンを利用することができる微生物である。特定の実施形態において、本発明の微生物は、メタン栄養性菌に由来する。
【００４５】
より幅広くは、本発明の微生物は、表１に特定される任意の属または種に由来し得る。
【００４６】
好ましい一実施形態において、本発明の微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、及びクロストリジウム・ラグスダレイを含むクロストリジウムの群に由来する。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４（クロストリジウム・オートエタノゲナム）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３（クロストリジウム・リュングダリイ）、及びＨｕｈｎｋｅ、ＷＯ２００８／０２８０５５（クロストリジウム・ラグスダレイ）によって最初に報告され、特徴付けられた。
【００４７】
これらの３つの種は、多くの類似性を有する。具体的には、これらの種は全て、クロストリジウム属のＣ１固定嫌気性、酢酸生産性、エタノール生産性、かつカルボキシド栄養性のメンバーである。これらの種は、類似した遺伝子型及び表現型、ならびにエネルギー保存及び発酵代謝の様式を有する。更に、これらの種は、９９％超が同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡによってクロストリジウムｒＲＮＡ相同群Ｉに群化され、約２２〜３０モル％のＤＮＡ  Ｇ＋Ｃ含有量を有し、グラム陽性であり、類似した形態及びサイズ（０．５〜０．７×３〜５μｍの間の対数増殖細胞）を有し、中温性（３０〜３７℃で至適に増殖）であり、約４〜７．５の類似したｐＨ範囲（至適ｐＨは約５．５〜６）を有し、チトクロムを欠き、かつＲｎｆ複合体を介してエネルギーを保存する。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６−１０７７，２０１２）。重要なことに、これらの種はまた、全てが、ＣＯ含有ガスによる強い独立栄養性増殖を示し、主要発酵生成物としてエタノール及びアセテート（または酢酸）を生成し、かつ特定の条件下で少量の２，３−ブタンジオール及び乳酸を生成する。
【００４８】
しかしながら、これらの３つの種はまた、いくつかの差異も有する。これらの種は、異なる供給源、つまり、ウサギの腸由来のクロストリジウム・オートエタノゲナム、ニワトリ庭廃棄物由来のクロストリジウム・リュングダリイ、及び淡水堆積物由来のクロストリジウム・ラグスダレイから分離された。これらの種は、様々な糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸、クエン酸）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、及び他の基質（例えば、ベタイン、ブタノール）の利用率において異なる。更に、これらの種は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、一般的な機構、ならびにＷｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の遺伝子及びタンパク質の数が全ての種において同一であることが見出されている（Ｋoｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１）ものの、これらの遺伝子及びタンパク質の核酸及びアミノ酸配列において差異を有する。
【００４９】
したがって、まとめると、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイの特徴の多くは、その種に特異的なものではなく、むしろ、クロストリジウム属のこの群のＣ１固定嫌気性、酢酸生産性、エタノール生産性、かつカルボキシド栄養性のメンバーにとって一般的な特徴である。しかしながら、これらの種は実際には異なるため、これらの種のうちの１つの遺伝子改変または操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果を有さない可能性がある。例えば、増殖、性能、または生成物生成における差異が観察され得る。
【００５０】
本発明の微生物はまた、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリイ、またはクロストリジウム・ラグスダレイの分離菌または変異体に由来してもよい。クロストリジウム・オートエタノゲナムの分離菌及び変異体としては、ＪＡ１−１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、及びＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）が挙げられる。クロストリジウム・リュングダリイの分離菌及び変異体としては、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８，ＡＴＣＣ５５３８３）、ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（米国第５，５９３，８８６号）、Ｃ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（米国第６，３６８，８１９号）、Ｏ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（米国第６，３６８，８１９号）、及びＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が挙げられる。クロストリジウム・ラグスダレイの分離菌及び変異体としては、ＰＩ１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８２６）（ＷＯ２００８／０２８０５５）が挙げられる。
【００５１】
本発明の微生物を培養して、１つ以上の生成物を生成することができる。例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０及びＷＯ２０１２／０５３９０５）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２，３−ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２）、ラクテート（ＷＯ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２−ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２及びＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、リピド（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２−ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２−プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、ならびに１−プロパノール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）を生成するか、またはそれらを生成するように操作され得る。１つ以上の標的生成物に加えて、本発明の微生物はまた、エタノール、アセテート、及び／または２，３−ブタンジオールも生成し得る。特定の実施形態において、微生物バイオマス自体が、生成物であると考えられることもある。
【００５２】
酢酸である酸性代謝物の文脈において、「酢酸」または「アセテート」という用語は、そのアニオン性（解離した）形態（すなわち、アセテートイオンもしくはＣＨ３ＣＯＯ−として）、または遊離分子酢酸の形態（ＣＨ３ＣＯＯＨ）のいずれか（これらの形態の比率はシステムのｐＨに依存する）で、培養培地中に存在する総アセテートを指す。後述のように、水性水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）などの塩基性中和剤を使用して、酢酸を中和することによって、所与のバイオリアクター内の培養培地のｐＨを（例えば、ｐＨ＝４．５〜ｐＨ＝８．０の間の任意の特定のｐＨ弁であり得るｐＨ設定点値に）制御することができる。本明細書に記載されるプロセスを実行するために、バイオリアクターが維持される代表的なｐＨ範囲は、約４．０〜約８．０（約５．０〜約６．５など）である。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「液体生成物」とは、複数ステージプロセスのうちの少なくとも１つのステージに供給される液体流（例えば、第２のステージに供給される第１のステージの液体生成物）を指す。液体生成物は、（ｉ）Ｃ１固定微生物を含有する培養培地、（ｉｉ）所望される最終生成物、及び（ｉｉｉ）他の代謝物を含有する。液体生成物は、溶解したＣ１含有基質を更に含有し得る。本明細書で使用される場合、「最終ステージの液体生成物」は、複数ステージプロセスの最終反応器ステージから除去される液体生成物である。最終ステージの液体生成物は、典型的には、最終ステージのバイオマスを含まない部分の液体画分から除去される。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「最終生成物」または「所望される最終生成物」は、本発明の微生物によって生成される代謝物を指す。本発明の微生物は、エタノール、アセテート、ブタノール、ブチレート、２，３−ブタンジオール、ラクテート、ブタン、ブタンジエン、メチルエチルケトン（２−ブタノン）、エチレン、アセトン、イソプロパノール、リピド、３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）、イソプレン、脂肪酸、２−ブタノール、１，２−プロパンジオール、及び１−プロパノールからなる群から選択される１つ以上の生成物を生成するように培養され得る  本明細書で使用される場合、「増殖依存性生成物」は、バイオマスの生成率に直接比例する生成率を呈する代謝物を指す。増殖依存性生成物の例としては、イソプロパノール、アセテート、アセトン、２−ヒドロキシ酪酸（２−ＨＩＢＡ）、及びイソブチレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
複数ステージ反応器プロセスの利点のうちの１つは、少なくとも１つの所望される最終生成物に向けて発酵プロセスを個別化する能力である。提供されるプロセスパラメータによって、１つの発酵プロセスにおいて所望される最終生成物が、異なるプロセス条件下で操作される異なる発酵プロセスにおいて所望されない代謝物であり得ることが理解されるだろう。例えば、エタノール生成を対象とする複数ステージプロセスにおいては、エタノールが所望される最終生成物であるが、しかしながら、イソプロパノール生成を対象とする複数ステージプロセスにおいては、イソプロパノールが所望される最終生成物であり、エタノールは副生成物代謝物である。
【００５６】
後述のように、本発明の実行において特に有用である特定の種類のバイオリアクターは、上昇部内の比較的低密度の区分と、１つ以上の内部下降部または外部下降部内の比較的高密度の区分との間の密度勾配に依存する循環ループ反応器である。上昇部区分及び下降部区分の両方は、連続液相帯域内に液体培養培地を含むが、ガス状ＣＯ含有基質は、通常上昇部区分の下部へと分配（スパージング）される。上昇ガス気泡は、任意の未消費かつ未溶解のガスが液位の上の連続ガス相帯域（すなわち、蒸気スペースまたはヘッドスペース）へと放出されるまで、連続液相帯域を通したそれらの上向きの移動中にこの区分に閉じ込められる。内部または外部液体下降部を通した下向きの液体循環は、ループポンプによって誘導または補助され得る。しかしながら、場合によっては、ループポンプは複数のバイオリアクターのうちの少なくとも１つには使用されず、しばしば、ループポンプは、これら複数のバイオリアクターのうちのほとんどまたは全てにすら使用されないことにより、密度誘導循環のみに依存し、エネルギー費用を有利に保存する。
【００５７】
「バイオリアクター」及び「バイオリアクターステージ」の一部分として含まれ得る任意のバイオリアクターという用語は、循環ループ反応器に限定されず、本明細書に記載される生物学的プロセス（それらが一般に嫌気的に実行される程度まで、発酵プロセスとも呼ばれ得る）を実行するために使用され得るカルボキシド栄養性微生物を有する培養培地の液体容積を維持するのに好適なあらゆる容器、または容器内の区分をより幅広く含む。特定の種類のバイオリアクターは、二相（ガス−液体）接触に好適なあらゆる容器、例えば、対向流流動反応器（例えば、上向きに流動する蒸気相及び下向きに流動する液相を有するもの）または並流流動反応器（例えば、上向きに流動するガス及び液相を有するもの）を含み得る。そのような二相接触容器において、ガス気泡が液体の移動するカラムを通って流動する場合のように、液相が連続相であることが可能である。さもなければ、蒸気スペースを通って流動する（例えば、液滴の形態で）分散した液体の場合のように、蒸気相が連続層であることが可能である。いくつかの実施形態において、より詳細に後述するように、連続液相及び連続ガス相を含有するために、バイオリアクターの異なる帯域が使用されてもよい。
【００５８】
バイオリアクターの具体的な例としては、連続撹拌タンク反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、移動床型生物膜反応器（ＭＢＢＲ）、気泡カラム、ガスリフト発酵槽、及び膜反応器（中空繊維膜バイオリアクター（ＨＦＭＢＲ）など）が挙げられる。好適なバイオリアクターは、ガス状Ｃ１含有基質を、液体細菌培養培地（例えば、生物学的変換を実行するのに好ましい溶解及び質量輸送動力学を有するもの）と接触させるのに好適な静的ミキサー、または他の容器及び／もしくはデバイス（例えば、タワーもしくはパイプ配置）を含み得る。「複数のバイオリアクター」または「複数のバイオリアクターステージ」内に含まれ得るバイオリアクターという語句は、場合によっては、複数のバイオリアクターは１つの種類であり得る（例えば、循環ループ反応器）ものの、２種類以上のバイオリアクターを含むことが意図される。
【００５９】
本明細書に記載されるいくつかの好適なプロセス流、動作パラメータ、及び生物学的プロセスにおいて使用するための機器は、米国特許出願公開第２０１１／０２１２４３３号に記載され、この特許全体が、これにより参照によって組み込まれる。
【００６０】
本発明は、より具体的には、Ｃ１炭素源を有用な最終生成物に変換するための生物学的プロセスであって、本明細書に記載される並行−ガス、連続−液体処理構成を伴い、複数のバイオリアクターステージを利用する、プロセスの発見に関連する。有利に、非常に低い全体的副生成物形成をもって（例えば、２つ以上のバイオリアクターにわたる）所望される最終生成物の高い全体的生産性を達成しながら、細胞（微生物またはバイオマス）分離のための１つ以上の膜システム、及び所与のバイオリアクターステージへの再循環が回避され得る。
【００６１】
特定の実施例において、本発明は、本明細書に記載される複数ステージプロセスを使用して、ＣＯをエタノールに変換するためのプロセスに関連する。特定の実施形態において、Ｃ１固定微生物は、カルボキシド栄養性微生物である。より具体的には、カルボキシド栄養性微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・ラグスダレイ、及びクロストリジウム・リュングダリイからなる群から選択される。特定の実施形態において、カルボキシド栄養性微生物は、クロストリジウム・オートエタノゲナム菌種ＤＳＭ２３６９３である。他のステージの下流（例えば、最終バイオリアクターステージ）に位置付けられるバイオリアクターステージから除去される、中間ステージの液体生成物または最終ステージの液体生成物中の代表的なエタノール濃度は一般に、少なくとも約４０グラム／リットル（グラム／リットルまたはｇ／ｌ）（例えば、約４０〜約９５ｇ／ｌ）、典型的には少なくとも約５０ｇ／ｌ（例えば、約５０〜約８０ｇ／ｌ）、及びしばしば少なくとも約６０ｇ／ｌ（例えば、約６０〜約７５ｇ／ｌ）である。そのような中間ステージの液体生成物または最終ステージの液体生成物におけるエタノール：酢酸の代表的な重量比は一般に、少なくとも約５０：１（例えば、約５０：１〜約１０００：１）、典型的には少なくとも約７５：１（例えば、約７５：１〜約５００：１）、及びしばしば少なくとも約１００：１（例えば、約１００：１〜約２５０：１）である。液体生成物のこれらの特徴は、より具体的には、中間ステージのバイオリアクターまたは最終ステージのバイオリアクターから除去され、分離（例えば、膜濾過）されてカルボキシド栄養性微生物（細胞またはバイオマス）が取り除かれた後の液体生成物を指し得る。一般に、代謝物の濃度を決定するのに使用される分析方法（例えば、ガスクロマトグラフ（ＧＣ）または高圧液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）は、細胞を含まない試料を必要とする。
【００６２】
最小の全体的副生成物形成をもって高い全体的エタノール生産性を達成することに加えて、本明細書に記載される複数ステージプロセスは、好ましい全体的ＣＯ利用率を更に提供することができる。全体的ＣＯ利用率とは、複数ステージプロセスに入力され（例えば、複数のバイオリアクターへの総ＣＯ入力）、所望される生成物（複数可）（例えば、エタノール）及び微生物の他の代謝物への変換において利用されるＣＯのパーセンテージを指す。プロセスを出る全てのガス流を組み合わせた組成物（すなわち、ガス状生成物）が既知であり、（例えば、流量、及び使用される複数のバイオリアクターのそれぞれを出る個々のガス流（複数可）の組成物に基づいて）計算され得る場合、全体的ＣＯ利用率は、以下のように計算することができる。
１−（複数ステージプロセスを出るＣＯの割合）／（複数ステージプロセスに入力されるＣＯの割合）
【００６３】
全体的ＣＯ利用率は、より高い総利用率の値を提供し得るガス状生成物再循環の使用（及び追加の費用）は考慮に入れずに、「パス当たり」または「ワンススルー（ｏｎｃｅ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」に基づいて決定される。代表的な実施形態に従うと、カルボキシド栄養性微生物によるＣＯ利用率は一般に、少なくとも約３５％（例えば、約３５％〜約８５％）、典型的には少なくとも約５０％（例えば、約５０％〜約８０％）、及びしばしば少なくとも約６０％（例えば、約６０％〜約７５％）である。場合によっては、ＣＯ利用率は、少なくとも約７０％であり得る。
【００６４】
本発明の一実施形態に従うと、複数ステージプロセスの発酵パラメータは、少なくとも１つの増殖依存性生成物の生成を増加させるように調節される。一実施形態において、複数ステージプロセスの発酵パラメータは、イソプロパノールに対するプロセスの特異性を増加させるように調節される。特定の実施例において、本発明は、本明細書に記載される複数ステージプロセスを使用して、ＣＯをイソプロパノールに変換するためのプロセスに関連する。特定の実施形態において、Ｃ１固定微生物組み換えクロストリジウム・オートエタノゲナム菌種。特定の実施形態において、組み換え微生物は、イソプロパノール生合成経路中で少なくとも１つの酵素を発現または過剰発現するように適合される。
【００６５】
本発明の実施形態は、バイオマス（例えば、増殖依存性生成物）の生成率に直接比例する生成率を呈する代謝物の生産性を増加させるための方法に関する。図５Ａ及び５Ｂに実証されるように、アセトン及び／またはイソプロパノールの生成率は、発酵の増殖相に関連付けられる。グラフに実証されるように。図５Ａは、ＣＳＴＲ内での発酵プロセスにおける、アセテート濃度とイソプロパノール濃度との間の強い相関性を示す。アセテート濃度及びイソプロパノール濃度の両方は、発酵の初期増殖相中（１及び２日目）に増加する。増殖相が平坦になり始めると、アセテート濃度及びイソプロパノール濃度の両方は低下する。図５Ｂは、イソプロパノールの生産性と増殖率との関係性を示す。イソプロパノールが、最高の増殖率でその最高の生産性に達することが、はっきりと実証されている。
【００６６】
酵素ＣｔｆＡＢが、アセトアセチル−ＣｏＡからアセテートへのＣｏＡ部分の移動によって、アセトアセテートの形成を触媒し、アセトアセテート及びアセチル−ＣｏＡの形成をもたらすことが示されている。この酵素活性は、アセテートの利用可能性に依存する。アセテートのＣｔｆＡＢのＫｍ値は、２４ｍＭ（１．４ｇ／Ｌ）〜１２００ｍＭ（７１ｇ／Ｌ）のいずれかの値であると報告されている。ＫＭ値は、酵素がその最大割合の半分で機能する基質濃度である。したがって、ＣｔｆＡＢがその最大割合の半分まで活性であるためには、１．４〜７１ｇ／Ｌのアセテートが必要とされる。本発明者らは、アセテートがイソプロパノール発酵プロセスにおいて制限的基質ではないことを確保するためには、細胞中に少なくとも１４ｇ／Ｌのアセテートが必要とされると見積もる。
【００６７】
本発明によって提供される複数ステージバイオリアクタープロセスは、プロセスのより大きな適合性を提供する。複数ステージプロセスの様々なステージに対してプロセスパラメータ調節を行うことによって、所望される結果は変動し得る。例えば、複数ステージプロセスは、所望される最終生成物（例えば、エタノール、もしくは２，３−ブタンジオール、またはイソプロパノールなどの増殖依存性生成物）に対してより大きな生成物特異性を有するように個別化され得る。複数ステージバイオリアクタープロセスを通して制御または調節され得るプロセスパラメータの例としては、Ｃ１含有基質の組成物、Ｃ１含有基質の流量、温度、圧力、細菌希釈率、及び液体培養培地の組成物が挙げられる。
【００６８】
好適な操作の例としては、異なる流量でＣ１含有基質を複数ステージプロセスの異なるステージに提供する工程と、異なる組成物を有するＣ１含有基質を複数ステージプロセスの異なるステージに提供する工程と、異なる組成物を有する液体培養培地を複数ステージプロセスの異なるステージに提供する工程（例えば、限定された組成物を有する液体培養培地を複数ステージプロセスの少なくとも複数のステージに提供すること）と、複数ステージシステムの異なるステージ間の温度を変更する工程（例えば、第１の反応器ステージから後続する反応器ステージの温度を低下させること）と、複数ステージ反応器プロセスのステージ間の細菌希釈率を変更する工程と、（例えば、液体分配デバイスのポンプ速度を変更することによって、または内部反応器設計もしくは寸法のいずれかを改変することによって）複数ステージプロセスの各ステージ内の混合速度を変更する工程と、が挙げられる。
【００６９】
重要なことに、上述のように、上記の性能パラメータは、従来の連続生物学的変換プロセスにおいて実行されるような、１つの（上流の）バイオリアクターの液体生成物において除去され、別の（下流の）バイオリアクターに供給されるカルボキシド栄養性微生物を分離し、再循環することが必要ではない、複数ステージバイオリアクタープロセスにおいて達成され得る。したがって、一般に、上流のバイオリアクターステージから除去され、所与のバイオリアクターステージに供給される液体生成物は、上流の（前の）バイオリアクターステージにおいて使用されたカルボキシド栄養性微生物を含み得るが、これは、この微生物が、１つのステージから連続して次のステージに移動される液体生成物のうちの１つ以上、及び好ましくは全てから分離されないためである。所与のバイオリアクターステージに供給される液体生成物は一般に、上流の（前の）ステージから受け取られる培養培地、所望される最終生成物、及び他の代謝物を更に含む。
【００７０】
したがって、従来の細胞分離及び再循環（例えば、膜）システムの使用を有利に回避する本明細書に記載される実施形態に従うと、上流のバイオリアクターステージから除去された液体生成物は、カルボキシド栄養性微生物の分離、及びそれが除去された上流のバイオリアクターステージへのカルボキシド栄養性微生物の再循環には供されない。しかしながら、本明細書に記載されるプロセス及びのシステムこの特徴的特色は、上流のステージから液体生成物を除去した後かつそれを所与のバイオリアクターステージに供給する前の、様々な中間ステップの使用を排除せず、これらのステップは、液体生成物の組成物に影響を与えても、与えなくてもよい。そのような中間ステップは、例えば、（ｉ）（例えば、分析方法の実行の必要に応じて）任意で分離される部分の濾過と組み合わせて、（例えば、試料採取の目的で）液体生成物の一部分を分離する工程、（ｉｉ）液体生成物を（例えば、培養培地、特定の栄養分、もしくはプロセス添加剤（界面活性など）と）混合する工程、及び／または（ｉｉｉ）液体生成物を（例えば、ｐＨを増加させるために、ＮＨ４ＯＨもしくはＮａＯＨなどの中和剤と）反応させる工程を含む。しかしながら、いくつかの実施形態において、所与のバイオリアクターステージから除去される液体生成物は、上述の（ｉ）、（ｉｉ）、及び／もしくは（ｉｉｉ）を受けることなく、またはこれらのいくつかの組み合わせを受けることなく、所与のバイオリアクターステージに供給されてもよい。
【００７１】
図１は、本開示の特定の実施形態に従う代表的な複数ステージ生物変換プロセスであって、少なくとも４つの相互接続されたバイオリアクターステージ（１０ａ、１０ｂ、…１０ｙ、１０ｚ）（第２のステージ（１０ａ）と第３のステージ（１０ｙ）との間の破線は、１つ以上の追加の中間ステージが、類似の様式で、かつ類似の機器及び接続をもって所与の複数ステージシステムに組み込まれ得ることを示すために使用される）を含む、プロセスを描写する。より詳細に後述するように、ガス状Ｃ１含有基質は、ステージに並行して供給され得る一方で、バイオマスを含み得る液体生成物は、第１のバイオリアクターステージ（１０ａ）から、最終バイオリアクターステージ（１０ｚ）に連続して供給され得、ここから、上述のこの液体生成物における、または少なくともそのバイオマスを含まない画分における代表的な特徴を有する最終ステージの液体生成物が除去され得る。
【００７２】
代表的なプロセスに従うと、ガス状Ｃ１含有基質は、各バイオリアクターステージの垂直に伸びるバイオリアクター（１００ａ、１００ｂ、１００ｙ、１００ｚ）の下部末端に近接して位置付けられるガス入口（１２ａ、１２ｂ、１２ｙ、１２ｚ）を通ってバイオリアクターステージに供給される。例えば、ガス入口は、それらのそれぞれのバイオリアクターの長さの下部２５％以内、及び好ましくは下部１０％以内でそれぞれのバイオリアクターへと伸び得る。ガス入口は通常、それらのそれぞれのバイオリアクターへと、反応器の長さのこれらのパーセンテージ以内に一般に対応する高さでバイオリアクター内中央に配設され得る、ガス分配デバイスに向かって伸びる。特定のガス分配デバイスは、バイオリアクターのうちの１つ以上の中で、それらのそれぞれの第１の末端に近接して、ガス入口が流体連通され得るスパージャー（１４ａ、１４ｂ、１４ｙ、１４ｚ）を含む。未変換のＣ１炭素源、及び生物変換反応において利用されないＣ１含有基質（例えば、Ｈ２）の任意のガス状不純物を含むガス状生成物は、各バイオリアクターから除去され、下部末端と反対のバイオリアクターの上部末端に近接して位置付けられるガス出口（１６ａ、１６ｂ、１６ｙ、１６ｚ）を通って出る。ガス出口は、それらのそれぞれのバイオリアクターの長さの上部２５％以内、及び好ましくは上部１０％以内でそれぞれのバイオリアクターへと伸びても、さもなければ、ガス状生成物は、ガス出口がそれらのそれぞれのバイオリアクターへと全く伸びることなく、それらのそれぞれのバイオリアクターの上部から除去されてもよい。
【００７３】
中間バイオリアクター（１００ｂ、１００ｙ）はそれぞれ、すぐ隣接する上流のバイオリアクターから除去された液体生成物を受け取り、液体生成物をすぐ隣接する下流のバイオリアクターに運搬することができる、液体入口（１８ｂ、１８ｙ）及び液体出口（２０ｂ、２０ｙ）を含む。例えば、第２のステージのバイオリアクター１００ｂは、第１のステージのバイオリアクター１００ａから（例えば、液体出口２０ａを通して）除去された液体生成物を受け取るための液体入口１８ｂ、及び（例えば、その液体入口（図示せず）を通して）液体生成物を第３のステージのバイオリアクター（図示せず）に運搬するための液体出口２０ｂを有する。バイオリアクター１００ａ（すなわち、第１のステージ１０ａのバイオリアクター）は、上流のバイオリアクターを有さないため、隣接する上流のバイオリアクターから液体生成物を特に受け取るためのものである液体入口を欠く。バイオリアクター１００ｚ（すなわち、最終ステージ１０ｚのバイオリアクター）は、下流のバイオリアクターを有さないため、特に液体生成物を隣接する上流のバイオリアクターに運搬するための液体出口を欠く。しかしながら、最終バイオリアクター１００ｚは、例えば、上述のようにその組成物に関して代表的な特徴を有する最終ステージの液体生成物を除去するための、液体生成物出口５０を含む。入口及び出口（２０ａ…２０ｙ及び１８ａ…１８ｚ）を介した連続するステージへの／からの液体生成物（または「ブロス」）の移動は、これらの入口及び出口と流体連通している（例えば、約１ｍｍ〜約１２ｍｍの内径を有する）小口径の開いたパイプを通して生じ得る。
【００７４】
中間ステージのバイオリアクターの液体出口（２０ｂ、２０ｙ）の場合のように、最終ステージのバイオリアクター１００ｚの液体生成物出口５０は、バイオリアクターの下部末端に近接して位置付けられる。バイオリアクター１００ｚから除去された後、液体生成物出口５０において除去される最終ステージの液体生成物は、作業中の非ガス化（ｕｎｇａｓｓｅｄ）液位（すなわち、ガスホールドアップなしで存在し得る液位）に対応する高さＨに通され、任意で高さＨを超えて伸びてもよい。つまり、最終ステージの液体生成物が伸びる最高高度Ｅは、高さＨであっても、それを超えてもよい。高さＨは調節可能であってもよく、サイホンブレーカー７５または他の種類の液体テークオフ点の高さＨに実質的に対応してもよい。したがって、図１の実施形態において、液体生成物出口５０は、複数ステージプロセスのバイオリアクター（１００ａ、１００ｂ…１００ｙ、１００ｚ）に対して高さが調節可能であるサイホンブレーカー７５と流体連通している。高度Ｅ及び高さＨは、最終ステージのバイオリアクター１００ｚ、ならびに好ましくは他のバイオリアクター（それらが水力的に連結され得る程度まで、液体生成物を１つのステージから次のステージに連続して移動させる液体入口及び出口（２０ａ…２０ｙ及び１８ａ…１８ｚ）における液体−充満（または連続液相）条件を妨害せずに）の液位または水頭を決定するように制御され得る。したがって、高度Ｅ及び／または高さＨは、バイオリアクター（１００ａ…１００ｚ）のうちの１つ以上及び好ましくは全てにおける液位を決定し得、特にそれらのそれぞれのバイオリアクターにおけるガス／液体界面（２２ａ…２２ｚ）位を決定し得る。
【００７５】
図１に図示される特定の実施形態において、液体入口（１８ｂ、１８ｙ）及び液体出口（２０ｂ、２０ｙ）は好ましくは、それぞれのガス入口（１２ｂ、１２ｙ）及びスパージャー（１４ｂ、１４ｙ）よりも下の静止状態の区分内に位置付けられて、液体がこの区分または所与のバイオリアクターステージの反応器位置から供給され、除去されることを可能にする。しかしながら、液体生成物の供給及び除去のために所望される位置によって、入口及び出口が、それぞれのバイオリアクターの長さに沿った他の場所に位置付けられることもまた可能である。代替的な一実施形態において、例えば、液体出口は、ガス／液体界面（２２ａ、２２ｂ、２２ｙ、２２ｚ）位、またはその付近に位置付けられても、バイオリアクターステージ間のサイホン効果または液体−充満条件を別の方法で妨害して、１つ以上のバイオリアクターにおける独立した液位制御を可能にしてもよい。
【００７６】
また、図１に示されるように、１つ以上、例えば、全てのバイオリアクター（１００ａ、１００ｂ…１００ｙ、１００ｚ）は、（すなわち、それらのそれぞれのバイオリアクターの外部の）外部液体再循環ループ（２５ａ、２５ｂ…２５ｙ、２５ｚ）を含むことで、所与のバイオリアクター内の混合／均質性を改善し、かつ／または蒸気−液体の質量移動の速度を改善することができる。外部液体再循環ループ（２５ａ、２５ｂ…２５ｙ、２５ｚ）を使用して、培養培地及びＣ１固定微生物を含む液体生成物は、所与のバイオリアクターの下部区分から（例えば、バイオリアクターの長さの下部１０％以内から；スパージャー（１４ａ、１４ｂ、１４ｙ、もしくは１４ｚ）などのガス分配デバイスの下から；及び／または液体入口もしくは液体出口の下から）除去され、バイオリアクターに、バイオリアクターの上部区分に向かって（例えば、バイオリアクターの上部１０％以内に、及び／または連続ガス相帯域と連続液相帯域との間の境界を画定するガス／液体界面（２２ａ、２２ｂ、２２ｙ、もしくは２２ｚ）の上に）外部に再循環され得る。外部反応器液体再循環ループは、所望される速度で、例えば、エネルギー使用と質量移動速度の改善との間の至適トレードオフで外部液体循環を提供するための、それぞれの外部液体再循環ポンプ（３０ａ、３０ｂ、３０ｙ、３０ｚ）を含み得る。
【００７７】
好都合なことに、外部液体再循環ループ（２５ａ、２５ｂ…２５ｙ、２５ｚ）は、バイオリアクター液体試料採取／分析のための位置を提供し、また、バイオリアクター制御のために構成され得る。例えば、第１及び第２のステージのバイオリアクター１００ａ及び１００ｂは、それぞれの外部液体再循環ループ２５ａ及び２５ｂを含み、これらには、塩基性中和剤（ＮＨ４ＯＨまたはＮａＯＨなどの水性塩基）が塩基性中和剤入口３５ａ及び３５ｂを通して添加され得る。所与のバイオリアクター（複数可）に塩基性中和剤を添加すると、例えば、外部液体再循環ループ２５ａ及び２５ｂ内のバイオリアクター液体のｐＨ値を（例えば、連続的または断続的に）測定するｐＨ分析器４０ａ、４０ｂを含む、好適なフィードバック制御ループを使用して、例えば、バイオリアクター１００ａ、１００ｂを別個に制御することができる。そのような制御ループはまた、必須のハードウェア（例えば、制御弁または可変速度供給ポンプ、図示せず）、及び所与のバイオリアクターの設定点値に対して測定されたｐＨ値を比較し、その後、塩基性中和剤の流動を制御して、その設定点を達成または維持するためのソフトウェア（例えば、コンピュータプログラム）を含む。したがって、バイオリアクターのうちの１つ以上（例えば、全て）の外部再循環ループは、それぞれの１つ以上（例えば、全て）の塩基性中和入口と流体連通し、１つ以上（例えば、全て）のそれぞれのバイオリアクター内のｐＨを独立して制御するための計測手段を備え得る。
【００７８】
また、１つ以上のバイオリアクター（１００ａ、１００ｂ…１００ｙ、１００ｚ）の外部液体再循環ループ（２５ａ、２５ｂ…２５ｙ、２５ｚ）は、それぞれのバイオリアクター（１００ａ、１００ｂ…１００ｙ、１００ｚ）の外部液体再循環ループ２５ａ及び２５ｂ内の液体の温度を（例えば、連続的または断続的に）測定する温度トランスミッター（４１ａ、４１ｂ、４１ｙ、４１ｚ）を含んでもよく、そのような温度は、バイオリアクターの操作温度を表すものである。したがって、別個のバイオリアクター温度制御は、温度トランスミッター（４１ａ、４１ｂ、４１ｙ、４１ｚ）に加えて、加熱器または熱交換器（４２ａ、４２ｂ、４２ｙ、４２ｚ）、及び所与のバイオリアクターの設定点温度に対して測定された温度を比較し、加熱器または熱交換器（４２ａ、４２ｂ…４２ｙ、４２ｚ）の動作を制御して、その設定点を達成または維持するための必須のソフトウェア（例えば、コンピュータプログラム）を含む制御ループを使用して達成することができる。特定の種類の熱交換器としては、チューブインチューブ構築及びディンプルジャケット構築を有するものが挙げられる。更に、１つ以上のバイオリアクター（例えば、図１に描写される第１及び第２のステージのバイオリアクター１００ａ及び１００ｂ）の外部液体再循環ループ（２５ａ、２５ｂ…２５ｙ、２５ｚ）は、液体培養培地入口４５ａ及び４５ｂ、または他の液体希釈剤、試薬（例えば、界面活性剤）、及び／もしくは栄養分を１つ以上のバイオリアクターに独立して同一または異なる速度で導入するための入口を含み得る。したがって、バイオリアクターのうちの１つ以上（例えば、全て）の外部再循環ループは、それぞれの１つ以上の加熱器または熱交換器と流体連通し、１つ以上のそれぞれのバイオリアクター内の温度を独立して制御するための計測手段を備え得る。
【００７９】
したがって、バイオリアクターステージのうちの２つ以上（例えば、第１及び第２のバイオリアクターステージ１０ａ、１０ｂ）は、上述の外部液体再循環ループ上のバイオリアクター液体生成物の試料採取／分析を必要とするものを含む、独立して制御可能なプロセス動作変数を有し得る。代表的なプロセス動作変数としては、液体培養培地の添加速度、ガス状ＣＯ含有基質供給速度、反応器温度、反応器ｐＨ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。本明細書に記載される複数ステージプロセスの１つの重要な利点は、Ｃ１固定微生物が連続するバイオリアクターステージに移動する際に、その増殖を独立して制御する能力から生じる。細菌増殖の管理、ならびに最終生成物及び他の代謝物の生成は、所与の処理目的に対して所与のバイオリアクターステージの条件（例えば、上述のプロセス動作変数）を個別化することによって達成することができる。例えば、一実施形態に従うと、高い細菌増殖率を促進し、また残りの複数ステージバイオリアクターシステムのために均一な培養を設定するために、比較的高い割合の液体培養培地が第１のステージのバイオリアクターに添加される。最終生成物の高い生成率を達成するのに好適な、より確立された細胞培養を有する下流のバイオリアクターには、比較的低い液体培養培地が添加され得る。この様式において、細菌増殖を、生成物の生成から有利に分離または分断することができる。全体として、本明細書に記載されるシステムが、Ｃ１固定微生物が連続する各反応器内で増殖の異なる相を通して進むにつれて、その代謝の制御に関して高い自由度を提供することがより一般に理解され得る。これらの制御特徴は、複数ステージの生物学的変換プロセスが、上述の特徴を有する最終ステージの液体生成物によって操作されることを可能にする。
【００８０】
同一の様式において、液位またはガス／液体界面（２２ａ、２２ｂ…２２ｙ、２２ｚ）の高さは、１つ以上のバイオリアクター（１００ａ、１００ｂ…１００ｙ、１００ｚ）において、別個の液位制御機器及び計測手段（例えば、制御弁、液位センサー、及びトランスミッター）の使用を通して独立して制御され得る。しかしながら、例えば、システムの全てのバイオリアクター内の液位を制御する単一液位制御部を有することにより、少なくとも１つのバイオリアクター内の液位が、そのそれぞれの下流のバイオリアクター内の液位に依存するように、複数ステージプロセスを実行することによって、そのような機器及び計測手段を実装する追加の費用及び複雑性を有利に回避することもまた可能である。図１のバイオリアクター（１００ａ、１００ｂ…１００ｙ、１００ｚ）のシステムの操作の特定の一様式に従うと、液体培養培地は、入口４５ａを通して第１のステージのバイオリアクター１００ａに添加され、溢流によって、または（例えば、最終ステージの液体生成物が達するか、もしくは伸びる最高高度Ｅを変動させることによって制御され得る）静水頭によって決定される別の方法で、全ての反応器を通って流動する。
【００８１】
プロセスを開始するための１つの可能な手順に従うと、第１のステージのバイオリアクター１００ａは、最初にＣ１固定微生物が植え付けられても、充填されてもよく、これは、培養物中でのバッチ増殖の期間の後、十分に高い濃度を達成するため、液体培養培地の連続添加の開始が可能となる。その後、第１のステージの液体生成物は、例えば、第１のステージから第２のステージへの溢流によって、その後、第２のステージから第３のステージへの溢流などによって、連続するステージに運搬される。システムの液位は、最終的には除去される最終ステージの液体生成物の液位（最終バイオリアクターステージからの「出液」の液位とも呼ばれる）によって決定され得る。ガス状Ｃ１含有基質は、各反応器に別個に添加されるが、連続液相帯域を出る蒸気が組み合わされる（例えば、積み重ね配置におけるように、２つ以上のバイオリアクターステージが単一容器内に配設される場合）共有ヘッドスペースが可能であり、いくつかの実施形態に従うと、起泡を低減し得る。発酵の所望される最終生成物及び他の代謝物は、最終バイオリアクターステージから除去される最終ステージの液体生成物から回収される。最終ステージの液体生成物を（例えば、膜濾過によって）分離して、最終生成物及び代謝物、ならびにその後、この回収前に、Ｃ１固定微生物及び可能性としては他の固体を取り除くことができる。この分離（またはベース培地）から回収される液体透過物のうちのいくらかまたは全ては、バイオリアクターステージにおいて使用するために再循環されてもよく、例えば、それは、任意で栄養分の添加後、第１のステージのバイオリアクターに添加されてもよい。
【００８２】
図２は、図１に描写されるプロセスを含む複数ステージプロセスのバイオリアクターステージ１０に組み込まれ得る、１つの可能な種類のバイオリアクター１００、すなわち、循環ループバイオリアクターを描写する。同一の特徴のうちの多くは、図１に示される（同一の参照番号によって特定される）通りであるが、特に所望される蒸気及び液体流動特徴、循環、ならびに相間の分配／質量移動を促進するために使用され得る反応器内部構造のうちのいくつかは、例外である。図２によりはっきりと示されるように、バイオリアクター１００は、それらの連続相及び分散相によって区別が可能な２つの帯域によって動作する。連続蒸気相帯域Ａは、外部液体再循環ループ２５から供給される、下向きに流動する液体生成物を（例えば、下向きに広がる円錐型プロファイルで）分散するための複数の開口部を有するシャワーヘッド１１０などの、１つ以上の液体分配デバイスを通してこの帯域（ヘッドスペースとも呼ばれる）に入る液体生成物のおかげで、分散液相を有する。
【００８３】
連続液相帯域Ｂは、ガス入口１２から供給される、上向きに流動するＣ１含有基質を分散するための複数の開口部を有するスパージャー１４などの、１つ以上のガス分配デバイスを通してこの帯域に入るＣ１含有基質のおかげで、分散ガス相を有する。ガス／液体界面２２は、連続ガス相帯域Ａと連続液相帯域Ｂとの間の境界を画定する。連続液相帯域Ｂは、バイオリアクター１００の容積の主要部分を占め得、例えば、それは、反応器の長さの完全に下部９０％以内、下部８０％、または下部７５％以内に配設され得る。したがって、ガス／液体界面２２は、反応器の長さの上部２５％以内、上部２０％以内、または上部１０％以内に位置し得る。場合によっては、気泡の層（図示せず）はガス／液体界面よりも上に存在し得、本開示の目的のために、連続ガス相帯域Ａ内に存在する。
【００８４】
したがって、図２の特定の実施形態に従うと、外部液体再循環ループ２５を通して再循環される液体生成物（または「ブロス」）は、連続蒸気相帯域Ａに導入される。この液体生成物は、上述のように液体生成物が除去されるバイオリアクターの下部区分から、バイオリアクターの上部区分に（例えば、バイオリアクター１００の長さの上部１０％以内に、及び液体生成物が導入されるシャワーヘッド１１０などの液体分配デバイス（複数可）よりも上に）通され得る。図１に関して上述するように、外部液体再循環ループ２５は、液体循環及び液相と蒸気相との間の質量移動を改善することに加えて、プロセス制御機能を実行するように構成されてもよい。例えば、外部再循環ループ２５を通して再循環される液体生成物は、バイオリアクター１００の温度を制御するための（例えば、連続蒸気相帯域Ａに導入される前に）外部熱交換器４２に通されてもよい。さもなければ、例えば、塩基性中和剤入口３５を通して、この液体生成物に塩基性中和剤を添加して、バイオリアクター１００のｐＨを制御してもよい。図１に示される複数のバイオリアクターの場合、バイオリアクターのうちの１つ以上（例えば、全て）の外部再循環ループを使用して、バイオリアクターの１つ以上のそれぞれの第１の末端に近接して除去された液体生成物を、１つ以上のそれぞれの第２の末端（第１の末端の反対に配設される）に近接する１つ以上のそれぞれの連続蒸気相帯域内の液体分配器に再循環してもよい。
【００８５】
スパージャー１４を通して導入されるＣ１含有基質は、連続液相帯域Ｂ内に、例えば、バイオリアクター１００に関して同心円状に配設される上昇部１２０に供給され、上昇するガス気泡をこの帯域の中央領域に閉じ込め得る。上昇部１２０の上部を出た後、連続液相帯域Ｂにおいて溶解または利用されない残りのガスは、上向きに流動し続け、ガス／液体界面２２でこの帯域から係脱させられる。上昇部１２０内のガスの停滞により、上昇部１２０内の全体的密度は、ガス気泡が実質的に係脱させられる下降部１３０内の密度よりも低い。図２に示されるように、下降部１３０は、上昇部１２０に対して環状に配設されてもよいが、連続液相帯域Ｂ内に異なる密度の領域を提供するための他の構成も可能である。例えば、複数の垂直に伸びる下降部は、反応器の長さの下部１％〜１０％以内から反応器の長さの上部２５％〜４５％以内まで伸びるこの帯域を通して、分配されてもよい。また、この帯域において、バルク液体流動方向を示すために矢印を使用して示されるように、バイオリアクター１００は、連続液相帯域Ｂ内の内部液体循環を伴って動作し、これはすなわち、密度の差異によって誘導され、ともにバイオリアクター１００の内部にある上昇部１２０において上向きの液体流動を、及び下降部１３０において下向きの液体をもたらす。いくつかの実施形態に従うと、２つ以上の上昇部及び／または２つ以上の下降部を使用して、液体循環を制御してもよい。
【００８６】
ガス／液体界面２２で係脱させられるガスは、それがシャワーヘッド１１０または他の液体分配デバイスを通してこの帯域に導入される液体生成物と接触させられる、連続蒸気相帯域Ａを通して、（バルクで）上向きに流動し続ける。この様式において、バイオリアクター１００は、連続液相帯域Ｂよりも上に配設され、上述の内部液体循環を伴って動作するこの帯域内で、対向流ガス及び液体流動（上向きに流動するガス及び下向きに流動する液体）を伴って動作する。これらの帯域の両方は、蒸気−液体接触デバイスを備える。これらの帯域内で相間の質量移動がもたらされる方法の差異により、帯域Ａ内の蒸気−液体接触デバイス１２５Ａは、例えば、それらの幾何学的形状（例えば、直径及び／もしくは厚さ）ならびに／または（例えば、サイズ、形状、スペーシング、及び／もしくは総数に関する）それらの開口部の構成に関して、帯域Ｂ内の蒸気−液体接触デバイス１２５Ｂとは異なり得る。いくつかの実施形態に従うと、異なる帯域において、全く異なる種類の蒸気−液体接触デバイス（例えば、穿孔プレート、及びラシヒリングなどのランダム充填材料）が使用されてもよい。同様に、単一帯域内で、異なるかまたは全く異なる種類の蒸気−液体接触デバイスが使用されてもよい。
【００８７】
当業者によって理解され得ように、本明細書を考慮すると、本明細書に記載される複数ステージプロセス及びシステムは、以下のうちのいずれか１つ、任意の組み合わせ、または全てを含むいくつかの動作利点と関連付けられる。（１）低減された複雑性での頑強な発酵（嫌気性生物変換）：従来のプロセスと比較して、本明細書に記載される複数ステージプロセスは、操作がより単純であり、著しくより大きな「動作エンベロープ」つまり動作が実行可能である条件の範囲を有する。これは、各個々のバイオリアクターに対する比較的低い生産性の必要性、及び（第１のステージのバイオリアクター以外の）全ての反応器がすぐ上流の反応器から受け取る連続供給から生じ、発酵を安定化する。これは、当該技術分野における主要な目標のうちの１つ、すなわち、長期間の安定した商業的操作に必要とされる規模での動作の頑強さに有利に対処する。（２）有意な高さの自由度：これは、細菌培養物が各バイオリアクター内で増殖の異なる相を通して進むにつれて、その代謝のより大きな制御を可能にする。各ステージでの条件（例えば、ガス供給速度、温度、及び／またはｐＨ設定点）は、代謝物比率などの発酵出力を制御するように個別化され得る。これは、高くかつ安定した最終生成物力価をもたらし得る。例えば、本発明者らは、高くかつ安定したエタノール力価（連続研究室試験において６０グラム／リットル超）、非常に好ましくかつ安定した最終液体生成物のエタノール：アセテートの重量比（連続研究室試験において１００＋）を実証している。したがって、培養培地、及びアセテート副生成物が直接的再循環に対する主要な妨害である水再循環システムの使用に関して、潜在的に非常に大きな費用節減を実現することができる。（３）生成物の生成から増殖を分離する能力：増殖後のより後のステージで誘導因子が添加され得るプロセスにおいて、これは、遺伝子操作された細胞からの生物学的最終生成物の生成にとって著しい利点である。利点は、残りのシステムに安定した均一な培養を設定する、高い希釈率（すなわち、液体培養培地の添加率）を使用して、第１のバイオリアクターステージにおいて、高い増殖率を有する可能性から生じる。（４）細胞再循環システムの必要性のない、資本費用の大きな節減：この点に関して、膜、収容部、弁、ならびに関連する計測手段及び制御部は、特に商業的規模で、バイオリアクターの総費用の有意な部分となる。細菌細胞の再循環の必要性（例えば、再循環のポンプデューティ）もまた、著しく低減され、（例えば、シャワーヘッドまたは上述の他の液体分配器を通して）外部再循環ループを操作するのに必要とされるわずかなエネルギーのみを必要とし得る。（５）低減された費用での、単純化されかつより頑強な動作：これは、膜分離及び分離した細胞の再循環が、各バイオリアクターステージで必要とされないために生じる。膜の変更及び手動での定置洗浄（ＣＩＰ）に関連する費用は、操作者の時間、ＣＩＰ化学物質、及び加熱に関して非常に高価である。この点に関して、自動でのＣＩＰ選択肢は極めて高価な資本費用を有し、細胞再循環膜を清浄するための酵素溶液は同様に高価であり、単純なＮａＯＨでの清浄手順はしばしば非効果的である。（６）より大きな容積で、より短く、かつよりずんぐりとした（ｓｑｕａｔｔｅｒ）エアリフト型ループ反応器設計：そのような設計は、内部を備える既存の産業標準バルクタンクによって容易に実現することができる。これは、バイオリアクターに対するより低い生産性の必要性から生じ、バイオリアクターにおける実質的な費用節減の可能性を可能にする。いくつかの実施形態に従うと、本明細書に記載されるプロセス及びシステムは、外部再循環またはループポンプを使用することなく、エアリフト循環高価のみによって効果的に動作することができ、結果的に関連する外部再循環パイプ及び機器もなしで済ませることができる。各ステージ間の単純な溢流／液体の頭位の制御を利用する実施形態において、制御弁及びパイプに対する資本支出の更なる低減が可能である。（７）低い操作圧力の使用：これは、個々のバイオリアクターのためのより低い生産性の必要性の追加の利点である。この点について、高いガス停滞は、ガスが加圧されない限り、バイオリアクターへのガス流量を制限する。操作圧力を低減する能力は、圧縮費用を低減する効果を有する。
【００８８】
以下の実施例は、本発明の代表的なものとして明記される。これらの実施例は、本開示及び添付の特許請求の範囲に照らして、これら及び他の等価の実施形態が明らかであるため、本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【００８９】
［実施例１］
（実験設定）
それぞれが１．５リットルの作業容積を有する（このシステムについて９リットルの総反応器容積）、バイオリアクターを含む６つのステージを有する試験リグを使用して、本明細書に記載される複数ステージの生物学的変換プロセスを延長評価した。具体的には、これらのプロセスは、約１．２メートルの高さ及び５０ミリメートルの直径の主要カラムを有し、水力学観察のための透明なＰＶＣプラスチックで構築される、対向流の液体下降流動ループ反応器を使用した。第５及び第６のステージは、いくぶんより高い主要カラムを有した。各カラムの下部に、プラスチックの低圧遠心ポンプ（水族館用、５００〜２０００Ｌ／／時）を使用して、液体を、各カラムの上部にある全円錐型シャワーヘッド液体分配器に再循環した。各シャワーヘッドにわたる圧力低下は、約２０〜４０ｋＰａで、低かった。
【００９０】
ガスは、各バイオリアクターステージに別個に、かつ焼結ステンレス鋼スパージャーを通してカラムの下部付近で入った。未利用かつ未溶解のガスは、シャワーヘッドよりも上の各カラムの上部を出た。６つ全てのステージを、ほぼ大気圧で実行した。各主要カラムの下部で、それらのそれぞれのスパージャーのちょうど下に結合された、小口径のステンレス鋼ライン（１．５ｍｍの内径のチュービング）によって、各ステージを（液体生成物の移動のために）次のステージに流動的に接続した。液体培養培地を第１のステージに供給し、液体ヘッドのみによってバイオリアクターステージのシステムを通して移動させた。高度が調節可能である液体テークオフ点を使用して、システム全体における反応器の液位を制御するために、最終または第６のステージを使用した。各ステージは、別個の投与化学物質ライン及び温度制御部を備えた。最後の２つのステージ（すなわち、第５及び第６のステージ）を除いて、ステージはまた、ｐＨ測定及び制御システムも備えた。
【００９１】
［実施例２］
（初期慣らし操作）
初期操作は、クロストリジウム・オートエタノゲナムを含有する細菌培養培地の存在下で、ガス状ＣＯ含有基質中のＣＯをエタノール及び他の代謝物に生物学的に変換するための、複数ステージバイオリアクターシステムの有効性を試験するように設計した。実施例１に記載した試験リグの単純化されたバージョンを、ヘッドスペースのシャワースプレーなしで（すなわち、連続蒸気相帯域は開いたパイプであった）用いた。いかなるスパージャーも使用されず、すなわち、ガスは、３ｍｍの内径の開いたチューブを通して連続液相帯域へと導入された。第５及び第６のステージのバイオリアクターの温度制御部はなく、液位制御部を単純な溢流液体システム（共有ガス出口）で維持した。生物変換操作は、２週間安定した細菌増殖を達成し、最終的に、第６のステージのバイオリアクターから除去された最終ステージの液体生成物に基づいて、２グラム／リットル未満のアセテート生成をもって４３グラム／リットル超のエタノール生成の動作点に達した。安定したステージの希釈率、または液体培養培地の添加は、約２．５ミリリットル／分（または各バイオリアクターについて約２．３個分の反応器容積／日）であった。いくらかの質量移動生成界面活性剤が、オーバーヘッド液位において初期バイオリアクターステージから取り除かれ、質量移動を低減することが観察されたものの、これらの結果は、本システムの溢流液位制御を確認した。
【００９２】
［実施例３］
（水力学的観察に基づいて改変された操作）
第２の操作において、実質的に実施例１に記載されるように試験リグに達するように改変を行った。実質的２の試験の水力学的評価に基づくこれらの改変は、カラムの下部に結合された、１．５ｍｍの内径のステンレス鋼チュービングを使用して、ステージ間に「液体のみ」の接続を確立することを含んだ。この直径は、培養培地の添加の動作率（希釈率）での逆混合を防ぐのに十分に小さくあるように決定された。反応器の下部でのこれらの液体接続に照らして、第６のバイオリアクターを出る、最終ステージの液体生成物のための調節可能な高さの出口を、システムを通した液位制御のために追加した。また、全円錐型ヘッドスペースシャワースプレーを、液体分配のためにバイオリアクターの全てに追加し、温度制御システムを、最後の２つの反応器ステージの外部液体再循環ループ上に追加した。ガス状生成物を有するのとは対照的に、実施例２に記載されるように組み合わせた未利用のＣＯを含有する別個のガス排気を、６つのバイオリアクターのそれぞれに提供した。
【００９３】
実施例２に記載される生物学的変換反応の４８日間の試験を、安定した動作で実行した。連続条件下、生産性及び生成物品質はともに非常に好ましいものであった。例えば、１０日間の期間にわたって、安定状態の動作パラメータ（例えば、圧力、温度、流量、ｐＨ値など）は、平均で６１グラム／リットルよりも大きい最終ステージの液体生成物のエタノール力価、及び平均で０．６グラム／リットルのみのアセテート（酢酸）力価（約１００：１以上のエタノール／酢酸の重量比率）を達成した。２，３−ブタンジオール力価は、平均で８．４グラム／リットルであった。これらの結果は、約２．５ミリリットル／分の液体培養培地の添加（または各バイオリアクターについて１日当たり約２．３個分の反応器容積の希釈率）によって達成された。重要なことに、３３日間の連続動作にわたって、エタノール力価は一貫して５０グラム／リットルを超え、３日間、７０グラム／リットルを超える驚くほど高い力価を有し、動作中７６グラム／リットルのピーク力価すら有した。最終バイオリアクターにおいて１日当たり３．５個分の反応器容積の希釈率を得るために、第２、第３、及び第４のバイオリアクターステージへの培養培地添加速度が増加すると、最終ステージの液体生成物において５０グラム／リットルを超えるエタノールが得られた。この延長動作にわたって達成された性能を図３に説明し、図３は、微生物（バイオマス）濃度だけでなく、最終ステージの液体生成物中の濃度、ならびにエタノール及び他の代謝物（すなわち、酢酸及び２，３−ブタンジオール）の濃度も提供する。各ステージの液体生成物の代謝物プロファイル（エタノール、酢酸、及び２，３−ブタンジオール濃度）を、操業の２３日目に取得した液体生成物資料に基づいて、図４に説明する。具体的には、図４は、連続するステージで得られる急速に増加するエタノール濃度と同時に、２，３−ブタンジオール濃度の非常にわずかでしかない増加、及びアセテート（酢酸）濃度の低下を示す。この操作からの結果は、安定した動作中の４８日間の試験の開始時の、６５〜７５％の個々のバイオリアクターステージのＣＯ利用率を含み、この利用率は、より高いエタノール生成物力価が達成されるより後の期間で８０〜９０％まで増加した。これらの結果は、この規模のカラム／ループ反応器の非常に高い質量移動係数を示す。
【００９４】
有利に、少なくとも一部には、反応器の下部での液体移動ラインの位置付け、及び反応器ヘッドスペース内への液体分配器の追加を通して、最終生成物エタノールの高い力価、及び例外的に安定した動作が達成された。これは、気泡蓄積、及び液相の上部から出る化学添加剤の優先的移動に関するいくらかの欠点を低減する効果を有した。全体として、実施例２及び３で実行された試験の間に行われた改変の結果として、質量移動及び動作制御の両方が著しく改善された。更に、ガス−液体界面位は、一貫してそれらのそれぞれのカラム／反応器の上部にあり、実際の液体在庫（実際の液体容積）に関わらず、より容易に制御された。したがって、停滞の量は液体在庫によって直接制御することができ、転じて、これを、実施例３で使用される複数ステージバイオリアクターシステムの場合は、外部排出ラインの使用によって制御した。最終バイオリアクターステージの液体生成物を除去するために使用されるこのラインは、調節可能な高さのサイホンブレーカーに接続され、カラム内の液相を任意の所望される液位に設定することを可能にした。反応器の長さのおよそ上部３０〜５０％まで伸びる液体ヘッド高さ（例えば、名目上４０％の停滞）について、特に良好な結果が得られた。
【００９５】
実施例２及び３で得られた結果に基づいて、本明細書に記載されるプロセス及びシステムは、追加のエネルギー入力及び／または資本支出に関する比較的低い必要性、またはそのような必要性なしで、蒸気−液体質量移動を改善させるための例外的に高い潜在性を有する。操作が単純化され、例えば、少なくともいくつかの膜分離システム及び／または液位制御システム（及び関連する流量計、ポンプ、制御弁、ならびに他の計測手段及び機器）に関連する費用なしで済ませることによって費用節減を実現することができる。
【００９６】
全体として、本発明の態様は、複数ステージバイオリアクタープロセスであって、関連するシステムの製造の単純性に加えて、特に所望される最終生成物の高い生産性の達成に関して、いくつかのプロセス利点をもたらす、上述の特定の蒸気及び液体流動構成を利用するプロセスを対象とする。当業者は、本開示から得られた知識によって、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ得ることを認識するだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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