(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
Ａ）抗原提示細胞における、
−  少なくとも１つの抗原またはその断片、
−  前記抗原のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  前記抗原のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質の発現、ならびに
Ｂ）前記抗原提示細胞によって発現される前記抗原に特異的な抗原特異的Ｔリンパ球を活性化するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのステップＡ）の前記抗原提示細胞へのＴリンパ球を含む細胞集団の曝露
を含み、
前記融合タンパク質が、少なくとも２つの抗原またはその断片を含む、ヒト抗原特異的Ｔリンパ球を生成する方法。
【請求項２】
Ｃ１）以下のステップ：
（ａ）活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む前記細胞集団を、活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する結合分子または所望の抗原のエピトープを提示するＭＨＣ分子と接触させるステップ、
（ｂ）前記結合分子または前記所望の抗原のエピトープを提示する前記ＭＨＣ分子が結合しているＴリンパ球を単離するステップ
を含む活性化および／または抗原特異的Ｔリンパ球の富化
のステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現されるマーカータンパク質が、Ｏｘ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＩＬ−２受容体、インターフェロンγ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｃ２）以下のステップ：
ａ）
（ｉ）ステップＡ）において定義される抗原提示細胞、および
（ｉｉ）対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む前記細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベーション、
ｂ）各細胞クローンについての（ｉ）および（ｉｉ）との前記インキュベーションの活性化プロファイルの比較、
ｃ）ｂ）の前記比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Ｔリンパ球の同定
のステップをさらに含み、（ｉｉ）ではなく（ｉ）による前記活性化が、前記細胞クローンが抗原特異的であることを示す、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＲ移行シグナル配列が、エンドソーム／リソソーム関連タンパク質に由来し、前記エンドソーム／リソソーム関連タンパク質が、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＤ６８およびＣＤ１ｂからなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む前記膜貫通および細胞質ドメインが、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰに由来する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＲ移行シグナル配列がヒトであり、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む前記膜貫通および細胞質ドメインがヒトである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記抗原提示細胞が抗原提示細胞の異なる集団を含み、各集団が異なる抗原融合タンパク質を発現する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原提示細胞が、以下のステップ：
ｉ）単球の準備、
ｉｉ）ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉ）の前記単球のインキュベーション、
ｉｉｉ）成熟カクテルと組み合わせたＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉｉ）の前記単球のインキュベーションであって、前記成熟カクテルはＩＬ−β、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２およびＴＬＲ３アゴニストの組合せを任意選択で含む、インキュベーション
を含む方法によって生成される成熟樹状細胞である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｔリンパ球を含む細胞集団が、分離されていない末梢血リンパ球の集団である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｔリンパ球を含む前記細胞集団が、Ｔリンパ球について富化される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法のステップを含み、前記活性化抗原特異的リンパ球からＴＣＲを単離するステップをさらに含む、抗原特異的ＴＣＲを生成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト抗原特異的Ｔリンパ球を生成する方法を企図する。この方法は、ＲＮＡコードタンパク質のＭＨＣクラスＩおよびＩＩ提示を得るために抗原またはその断片と融合したＭＨＣクラス−ＩＩターゲティングシグナルを利用する。したがって、本発明は、ＭＨＣクラス−ＩＩターゲティングシグナルおよび少なくとも１つの抗原またはその断片を含む発現ベクターならびに抗原特異的Ｔリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成のためのその使用に関する。腫瘍抗原またはウイルス抗原に特異的なＴ細胞クローンおよびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）も記載される。
【背景技術】
【０００２】
養子Ｔ細胞移入は慢性ウイルス感染および腫瘍を制御するためにＴ細胞ベースの細胞傷害応答を使用する。患者のがんに対して天然または遺伝子操作された反応性を有するＴ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され、次いで患者に移入して戻される。自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入が進行性腫瘍を有する患者を首尾良く治療するために使用されている。臨床における広範な用途についてのＴＩＬ療法の主な制限は、しばしば、腫瘍の不十分な免疫原性および自己抗原特異性を有するＴ細胞を効果的に欠失する胸腺における陰性Ｔ細胞選択の機構である。したがって、多くの場合、腫瘍特異的抗原に対して高い親和性を有するＴ細胞も、所望の特異性を有するＴ細胞も、患者の血液または腫瘍切除から単離することができない。このために、遺伝的にリダイレクトされた末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の移入がこれらの制限を克服する可能性を与える。
【０００３】
さらに、がん性および慢性感染において、Ｔリンパ球は機能を喪失し、枯渇する。
【０００４】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子療法を用いて、数百万の腫瘍反応性Ｔ細胞が患者の血液から迅速に生成され得る。ＴＣＲ遺伝子療法は、増殖可能であり、機能的に有望なＴ細胞亜集団に腫瘍特異性を移入する柔軟な方法への道を開く。それは、必要とされる抗原特異性をＴリンパ球が備えるように、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーの受容Ｔリンパ球への、定義された抗原特異的Ｔ細胞クローンの単離されたＴＣＲ遺伝子の移入を含む。
【０００５】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を用いた養子Ｔ細胞療法はがん性またはウイルス性疾患のための有望な免疫療法である。臨床応答を増加させるために、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の補足的移入がＣＤ８＋ＣＴＬ応答を増強する可能性を与える。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、ＣＤ８＋  ＣＴＬに極めて重要な支援を提供すること、および長期のＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の生成に対して重要な効果を有することが知られている。したがって、腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の迅速および効果的な単離ならびに特徴付けが重要である。
【０００６】
多くの腫瘍はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞由来のＴＣＲがこれらの腫瘍を直接攻撃するのに特に有用である。
【０００７】
より迅速に成長する腫瘍または慢性ウイルス性疾患を有する患者を治療するために養子細胞療法（ＡＣＴ）を使用する能力を拡張するために、正常組織の重度の攻撃を回避しながらウイルスまたは腫瘍細胞を効果的に攻撃するためにそれらのリガンド特異性について選択されている富化されたペプチド特異的エフェクターＴ細胞（ＣＤ４  Ｔヘルパー細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球の両方）を移入することが目標である。それらの細胞はｅｘ  ｖｉｖｏで多数まで急速に増殖し、次いでＡＣＴのために使用される。あるいは、このようなリガンド特異的Ｔ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、十分に成長し、正常な宿主組織を攻撃する能力を有さない定義された特異性を有する受容末梢血リンパ球または活性化Ｔ細胞クローンのいずれかを使用して、活性化リンパ球においてＴＣＲ導入遺伝子としてクローニングされ、発現され得る。
【０００８】
結果として、抗原特異的ＴＣＲおよびそれらのＴＣＲを単離するための効果的な方法が必要とされる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、抗原特異的ＴＣＲを有するＴ細胞を単離するための有効な方法を提供することである。ＣＤ４  ＴＣＲおよび／またはＣＤ８  ＴＣＲを生成する方法を提供することが望まれる。さらに、本発明の目的は、ＣＤＲ３領域などのＴＣＲまたはその機能的部分を提供することである。腫瘍抗原に対して高いおよび／または最適な親和性を示すＴＣＲを得ることは有益である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様は、以下のステップ：
Ａ）抗原提示細胞における、
−  少なくとも１つの抗原またはその断片、
−  抗原のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  抗原のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質の発現、ならびに
Ｂ）抗原提示細胞によって発現される抗原に特異的な抗原特異的Ｔリンパ球を活性化するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのステップＡ）の抗原提示細胞へのＴリンパ球を含む細胞集団の曝露
を含む、ヒト抗原特異的Ｔリンパ球を生成する方法を企図する。
【００１１】
特にＥＲ移行シグナル配列と組み合わせたターゲティング配列の、所望の抗原またはその断片との融合により、通常、ＭＨＣクラス−Ｉ複合体を介して提示される細胞タンパク質のためでもある、ＭＨＣクラス−ＩＩ複合体の効果的な負荷が可能となる。また、ＭＨＣクラス−Ｉ複合体の負荷も上記の方法によって達成される。したがって、この方法により、ＣＤ４＋ＴＣＲおよびＣＤ８＋ＴＣＲの生成が可能となる。
【００１２】
ステップＡ）における少なくとも１つの融合タンパク質の発現は、例えば、少なくとも１つの融合タンパク質のためのｉｖｔ−ＲＮＡコードを導入することによる一過性発現または安定発現、好ましくは一過性発現であってもよい。ｉｖｔ−ＲＮＡの発現は、品質管理されたｉｖｔ−ＲＮＡを迅速に生産することができ、免疫原性タンパク質夾雑物を保有しないという点で有益である。
【００１３】
特定の実施形態において、融合タンパク質は少なくとも２つの抗原またはそれらの断片を含んでもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態において、方法は、活性化Ｔリンパ球の富化のステップをさらに含んでもよい。この富化ステップは典型的に以下のステップ：
（ａ）活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団を、活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現される少なくとも１つのマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも１つの結合分子と接触させるステップ、
（ｂ）少なくとも１つの結合分子が結合しているＴリンパ球を単離するステップ
を含む。好ましい実施形態において、活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現される少なくとも１つのマーカータンパク質は、Ｏｘ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＩＬ−２受容体、インターフェロンγ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αを含む群から選択される。さらに、ステップ（ａ）において、細胞を、ＣＤ４と特異的に結合する結合分子および／またはＣＤ８と特異的に結合する結合分子とさらに接触させてもよい。
【００１５】
特定の実施形態において、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞を選択するステップは、以下のステップ：
（ａ１）抗原提示細胞および抗原特異的Ｔリンパ球のＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの間の相互作用を遮断し、Ｔリンパ球の表面にＣＤ４０Ｌを蓄積するために、ステップＢ）の細胞集団を、ＣＤ４０に対する抗体と接触させるステップ、
（ａ２）活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団を、抗ＣＤ４０Ｌ抗体と接触させるステップ、
（ｂ）抗ＣＤ４０Ｌ抗体および抗ＣＤ４抗体によりマークしたＴリンパ球を単離するステップ
を含む。
【００１６】
別の実施形態は、
Ｃ２）以下のステップ：
ａ）
（ｉ）ステップＡ）において定義される抗原提示細胞、および
（ｉｉ）対照抗原提示細胞との
活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベーション、
ｂ）各細胞クローンについての（ｉ）および（ｉｉ）とのインキュベーションの活性化プロファイルの比較、
ｃ）ｂ）の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Ｔリンパ球の同定
のステップをさらに含み、（ｉｉ）ではなく（ｉ）による活性化が、細胞クローンが抗原特異的であることを示し、（ｉ）および（ｉｉ）による活性化が、細胞クローンが抗原非特異的であることを示し、（ｉ）にも（ｉｉ）にもよらない活性化が、細胞クローンが活性化されないことを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
【００１７】
ステップＢ）において、抗原提示細胞は、少なくとも１回、または少なくとも２回、または少なくとも３回、または３回、Ｔリンパ球を含む細胞集団に加えられる。抗原提示細胞の反復される添加の間の時間間隔は、７〜２１日、１２〜１６日、または１３〜１５日、または１４日であってもよい。
【００１８】
ＥＲ移行シグナル配列はエンドソーム／リソソーム関連タンパク質に由来する。エンドソーム／リソソーム関連タンパク質は、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＤ６８またはＣＤ１ｂからなる群から選択されてもよく、好ましくはエンドソーム／リソソーム関連タンパク質はＬＡＭＰ１である。好ましくは、ＥＲ移行シグナル配列はヒトである。特定の実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は配列番号３３の配列またはその断片を含む。より特定の実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は以下の配列番号３３の配列からなる。
【００１９】
エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来してもよい。好ましくはエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒトである。
【００２０】
典型的に、抗原提示細胞は、樹状細胞、活性化Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞系、好ましくは樹状細胞、より好ましくは単球由来の樹状細胞から選択される。
【００２１】
通常、Ｔリンパ球を含む細胞集団は末梢血リンパ球の集団である。Ｔリンパ球を含む細胞集団は分離されていない末梢血リンパ球の集団であってもよい。細胞集団は、当業者に公知の手段によってＴリンパ球、好ましくはＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球について富化されてもよい。
【００２２】
本出願の別の態様は、本明細書に記載される方法によって得ることができるＴリンパ球である。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、
−  ヒト小胞体（ＥＲ）移行シグナル、ならびに
−  エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメイン
を含む発現ベクターを指す。
【００２４】
ベクターはｉｎ−ｖｉｔｒｏでのｍＲＮＡ転写のためのプロモーターを含んでもよい。ＥＲ移行シグナル配列は、エンドソーム／リソソーム関連タンパク質、例えばＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＤ６８、ＣＤ１ｂ、最も好ましくはＬＡＭＰ１に由来する。好ましくは、ＥＲ移行シグナル配列はヒトである。特定の実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は配列番号３３の配列またはその断片を含む。より特定の実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は以下の配列番号３４の配列からなる。
【００２５】
エンドソーム／リソソームターゲティング配列は、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来してもよい。エンドソーム／リソソームターゲティング配列は典型的に膜貫通および細胞質ドメインの一部である。したがって、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来してもよい。好ましくは、エンドソームおよび／またはリソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒトである。典型的に、エンドソーム／リソソームターゲティング配列は、モチーフＹ−ＸＸ（Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸を表す）、その後に疎水性アミノ酸（配列番号３８）を含む。好ましくは、エンドソーム／リソソームターゲティング配列はＹＱＲＩ（配列番号３９）である。エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号５４の配列またはその断片を含んでもよい。例えば、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号３５の配列またはその断片を含んでもよい。
【００２６】
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ＥＲ移行シグナル配列と、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に制限部位をさらに含む。他の実施形態において、ベクターは、ヒト小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列と、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に挿入される少なくとも１つの抗原またはその断片をさらに含む。
【００２７】
特定の実施形態において、ベクターは少なくとも２つの抗原またはその断片をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは抗原の完全長アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。あるいは、ベクターは抗原のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片を含む。
【００２８】
典型的に、抗原は腫瘍抗原またはウイルス抗原である。腫瘍抗原は、ウイルス腫瘍抗原、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞において発現される抗原からなる群から選択されてもよい。腫瘍抗原は腫瘍関連抗原であり、好ましくは腫瘍関連抗原はがん／精巣抗原（Ｃ／Ｔ抗原）である。Ｃ／Ｔ抗原は、ＭＡＧＥファミリーメンバー、例えばＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、これらに限定されないが、単一点突然変異、ＮＹ−ＥＳＯ１、腫瘍／精巣抗原１Ｂ、ＧＡＧＥ−１、ＳＳＸ−４、ＸＡＧＥ−１、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＣＰ−１、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＣＴＺ９、ＣＴ１０、ＳＡＧＥおよびＣＡＧＥを含む腫瘍抗原を含む群から選択されてもよい。好ましくはＣ／Ｔ抗原は、ＧＡＧＥ−１、ＳＳＸ−４およびＸＡＧＥ−１からなる群から選択されてもよい。
【００２９】
本発明の別の態様は、抗原特異的Ｔリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成のための本明細書に記載される発現ベクターの使用を指す。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載される方法によって生成されたＴリンパ球を哺乳動物に投与するステップを含むがんを予防または治療する方法に使用するためのＴリンパ球を指す。
【００３１】
別の態様は、上記の方法のステップを含み、本明細書に記載される方法によって生成された活性化抗原特異的リンパ球からＴＣＲを単離するステップをさらに含む抗原特異的ＴＣＲを生成する方法を指す。
【００３２】
別の態様は、ＧＡＧＥ−１、ＳＳＸ−４およびＸＡＧＥ−１のそれぞれに特異的なＴＣＲを指す。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化および単離のための標的化ＭＨＣクラス−ＩＩ提示を示す図である。（ａ）ＣｒｏｓｓＴＡｇ−シグナルの機能性および必要性を検証するために使用される種々のＥＢＮＡ−３Ｃ構築物の概略図。ＯＲＦ（ＡＴＧから終止）、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−シグナルの異なる成分（ＬＡＭＰ１およびＤＣ−ＬＡＭＰ）、ＨＬＡ−ＤＲ１１拘束性ＥＢＮＡ−３Ｃエピトープ（３Ｈ１０）ならびにポリＡ１２０ストレッチを示す。（ｂ）ＣｒｏｓｓＴＡｇ−シグナルは効果的なＭＨＣクラス−ＩＩ交差提示を促進する。ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトＡＰＣ（３日間で調製した単球由来ＤＣ（３ｄ−ｍＤＣ）またはミニエプスタイン・バール・ウイルス（mini-Epstein-Barr virus）（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞系（ｍＬＣＬ））との１６時間の共培養におけるＥＢＮＡ−３Ｃ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン３Ｈ１０のＩＦＮ−γ分泌。値は３連の平均＋ＳＤとして提示する。（ｃ）活性化マーカーＣＤ４０Ｌの発現は抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離に適している。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレットにより標識化した３Ｈ１０細胞を減少させている濃度で自己ＰＢＬと混合し、自己ドナーのＥＢＮＡ−３Ｃ−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトｍＤＣ（ＡＰＣ）と共培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞上での活性化誘発性ＣＤ４０Ｌ発現を６時間の共培養において評価した。
【図２】分離されていないＰＢＬからのＣ／Ｔ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘発および富化を示す図である。（ａ）Ｃ／Ｔ抗原によりプライミングしたＰＢＬ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞上の活性化誘発性ＣＤ４０ＬおよびＣＤ１３７表面発現。活性化マーカー発現は、１３日目および２７日目のそれぞれにＰＢＬ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養の特異的再刺激の６時間後に測定した。（ｂ）バルクＣＤ４０Ｌ陽性およびＣＤ４０Ｌ陰性ＣＤ４＋Ｔ細胞系の増殖能の直接比較。２８日目に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、それらのＣＤ４０Ｌ発現に応じてプライミングしたＰＢＬ培養から分離した。ＦＡＣＳ分離後（０日）、および特異的再刺激後（１４日）の１４日間隔の終わりに総細胞数を評価した。０日に対するｘ倍の増殖を示す。（ｃ）抗原特異的再刺激後の誘発したサイトカイン分泌の比較。バルクＣＤ４０Ｌ陽性およびＣＤ４０Ｌ陰性ＣＤ４＋Ｔ細胞系のＩＦＮ−γ分泌を、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−抗原ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトｍＤＣとの１６時間の共培養において測定した。値は３連の平均＋ＳＤとして提示する。
【図３】Ｃ／Ｔ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンについてのスクリーニングを示す図である。（ａ）例示的なクローンのスクリーニングデータはＣ／Ｔ抗原によりプライミングしたＰＢＬ培養から導いた。ＩＦＮ−γ分泌を、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−抗原ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトｍＤＣ（４個の抗原の混合物）との１６時間の共培養において評価した。棒は単一の値を表す。（ｂ）選択したＴ細胞クローンのＣ／Ｔ抗原反応性の検証。サイトカイン分泌（ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦ）を、ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトｍＬＣＬ（４個の抗原の混合物）との共培養後に評価した。データは単一の値として示す。（ｃ）ＣＤ４共受容体発現の確認。例示的なクローンを示す。
【図４】抗原特異性の評価を示す図である。ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンについての例示的なデータにより、単一のＣ／Ｔ抗原特異性を示すことが見出された。ＩＦＮ−γ分泌を、ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトｍＬＣＬとの共培養後に測定した。値は２連の平均＋ＳＤとしてまたは示した単一のデータ点（＊）として提示する。
【図５】ＣｒｏｓｓＴＡｇ−シグナルおよびタンパク質認識の必要性を示す図である。（ａ）ｉｖｔ−ＲＮＡベースのＣＤ４＋Ｔ細胞クローン活性化についてのＣｒｏｓｓＴＡｇ−シグナルの必要性。（ｂ）生理的にプロセシングされた外因性組換えタンパク質の認識。特有のＴＣＲを保有する単離したＣＤ４＋Ｔ細胞クローンのＩＦＮ−γ分泌によって測定した、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−シグナルを欠く抗原−ｉｖｔ−ＲＮＡをトランスフェクトしたｍＬＣＬ（ａ）または組換えタンパク質を負荷したｍＬＣＬ（ｂ）との直接比較における抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトＡＰＣ（ｍＬＣＬ）の刺激能。偽ＡＰＣおよびＴ細胞のみを対照として与えた。値は３連の平均＋ＳＤとして提示する。
【図６】ＭＨＣクラス−ＩＩエピトープコア配列の定義を示す図である。直接的なＭＨＣクラス−ＩＩエピトープ同定（ＤＥＰＩ）によって見出されるペプチド断片（破線による囲み）を、短いＣｒｏｓｓＴＡｇ−ｉｖｔ−ＲＮＡ構築物を使用して検証した。ＧＡＧＥ−１−ＴＣＲ−２トランスジェニック３Ｈ１０Ｔ細胞（ａ）またはＸＡＧＥ−１−ＴＣＲ−１および−ＴＣＲ−２Ｔ細胞（ｂ）を、重複する短いＣｒｏｓｓＴＡｇ−ｉｖｔ−ＲＮＡ構築物（黒色の棒として示した）または完全長抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトＡＰＣ（ｍＬＣＬ）のいずれかと共培養した。ＩＦＮ−γ分泌を１６時間の共培養において評価し、認識したエピトープコア配列を示す（実線による囲み）。偽トランスフェクトＡＰＣまたはＴ細胞のみとの共培養を対照として与える。値は３連の平均＋ＳＤとして提示する。
【図７】Ｃ／Ｔ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞受容体のトランスジェニック発現を示す図である。３Ｈ１０Ｔ細胞に、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンＧＡＧＥ−１−ＴＣＲ−１、ＸＡＧＥ−１−ＴＣＲ−１または−ＴＣＲ−２の対応するＴＣＲ−αおよび−β鎖をコードするｉｖｔ−ＲＮＡをトランスフェクトした。ＴＣＲ−トランスジェニック３Ｈ１０細胞を、抗原が負荷されたＡＰＣ（ｍＬＣＬ）と共培養し、ＩＦＮ−γ分泌を１６時間の共培養において検出した。偽トランスフェクトＡＰＣまたはＴ細胞のみとの共培養を対照として与えた。値は３連の平均＋ＳＤとして提示する。
【図８】ＣｒｏｓｓＴＡｇシグナルは細胞内部［内因性］提示経路を介してＭＨＣクラス−ＩＩ負荷を促進することを示す図である。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１陽性およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１陰性ＤＣに、ＥＢＮＡ−３Ｃ−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ｉｖｔ−ＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトおよび非トランスフェクトＤＣを全ての可能な組合せにおいて共培養し、１２時間後、ＥＢＮＡ−３Ｃ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン３Ｈ１０と共培養した。３Ｈ１０細胞のＩＦＮ−γ分泌を、ＤＣとの１６時間の共培養において測定した。値は３連の平均＋ＳＤとして提示する。
【図９】ＰＢＬプライミングのための３ｄ  ｍＤＣの特徴付けを示す図である。（ａ）モノクローナル抗体（白色の曲線）および適合したアイソタイプ対照（灰色で充填した曲線）による染色によって検出された表面マーカー発現。（ｂ）ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトｍＤＣの抗原ｍＲＮＡレベル。非トランスフェクトｍＤＣと関連した抗原ｍＲＮＡコピー数のｘ倍の増加を示す。抗原特異的プライマーを使用したｑＲＴ−ＰＣＲによって抗原ｍＲＮＡコピー数を評価した。
【図１０】Ｃ／Ｔ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＤ４０Ｌベースの選別についてのゲーティングストラテジーを示す図である。リンパ球をそれらの前方（ＦＳＣ；ＦＳＣ−Ａ：前方散乱面積；ＦＳＣ−Ｈ：前方散乱高さ）および側方散乱（ＳＳＣ−Ａ）に従って選択した。死細胞を除去するためにＤＡＰＩを使用した。続いて単一細胞画分のＣＤ４陽性細胞（ＦＳＣ−Ａ／ＦＳＣ−Ｈ）をそれらのＣＤ４０Ｌ発現に従って選別し、バルクＣＤ４０Ｌ陽性およびＣＤ４０Ｌ陰性ＣＤ４＋Ｔ細胞系として樹立した。さらに、ＣＤ４０Ｌ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞を単一細胞ベースで９６ウェルプレートへと選別した。
【図１１】代替のＥＲ移行シグナル配列を示す図である（ａ）ｉｖｔ−ＲＮＡ産生のために使用したベクター構築物の概略図。特徴付けたＣＤ４＋Ｔ細胞クローン３Ｈ１０の標的抗原（ＥＢＮＡ−３Ｃ特異的、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１拘束性）を、ヒトＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＤ６８またはＣＤ１ｂ（抗原配列に対して５’）のＥＲ移行シグナルおよびヒトＤＣ−ＬＡＭＰ（抗原配列に対して３’）のエンドソーム／リソソームターゲティング配列、ＤＣ−ＬＡＭＰのみのエンドソーム／リソソームターゲティング配列または移行なしおよびターゲティング配列の組合せを含むｐＧＥＭベクター系にクローニングした。さらに、予測ペプチダーゼ切断部位を示す、利用したシグナルペプチド配列（ＥＲ移行シグナル）のアミノ酸配列を示す。（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン３Ｈ１０の細胞を、単一のｉｖｔ−ＲＮＡ種トランスフェクトＡＰＣ（ｍＬＣＬ）と共培養した。偽トランスフェクトＡＰＣとの共培養を対照として与えた。ＩＦＮ−γ分泌を、共培養の開始から１６時間後に標準的なＩＦＮ−γＥＬＩＳＡによって検出した。値は３連の平均＋ＳＤとして提示する。
【図１２】ＣｒｏｓｓＴＡｇターゲティングシグナルを使用した同時ＭＨＣクラス−ＩＩおよびＭＨＣクラス−Ｉ提示を示す図である。（ａ）ｉｖｔ−ＲＮＡ産生のために使用したベクター構築物の概略図。特徴付けたＣＤ４＋Ｔ細胞クローン３Ｈ１０（ＥＢＮＡ−３Ｃ特異的、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１拘束性）および特徴付けたＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＩＶＳＢ（チロシナーゼ特異的、ＨＬＡ−Ａ２＊０１：０１拘束性）の標的抗原を、ＣｒｏｓｓＴＡｇターゲティング配列を有するか、または有さないｐＧＥＭベクター系にクローニングした。ＥＢＮＡ−３Ｃを、全遺伝子配列の１ｋｂ断片（ａａ４２１−７８０）としてクローニングし、クローン３Ｈ１０についてのエピトープを含有する。ＩＶＳＢ−３Ｈ１０（エピトープ）−ＣｒｏｓｓＴＡｇ構築物の生成のために、全抗原配列の代わりに、クローン３Ｈ１０（ＥＢＮＡ−３Ｃ、ａａ６２８−６４１、ＶＶＲＭＦＭＲＥＲＱＬＰＱＳ；配列番号３６）のエピトープを含むミニ遺伝子およびクローンＩＶＳＢ（チロシナーゼ、ａａ３６９−３７７、ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ；配列番号３７）を、ｐＧＥＭ−ＣｒｏｓｓＴＡｇベクターバックボーンに連続的にクローニングした。細胞質内の転写したｉｖｔ−ＲＮＡ種の安定化を促進するために、全てのｐＧＥＭベクター構築物は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の１２０アデニン塩基対（ポリ−Ａ１２０）３’を含むポリ−Ａ尾部を保有する。（ｂ）ＨＬＡ−Ａ２＊０１：０１−、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１−二重陽性ドナーの成熟ＤＣ（ｍＤＣ）の別の画分に、（ａ）に記載した単一のｉｖｔ−ＲＮＡ種をトランスフェクトした。トランスフェクションの７時間後、異なるｍＤＣ集団の１＊１０５個の細胞を、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン３Ｈ１０またはＣＤ８＋Ｔ細胞クローンＩＶＳＢ（１：１比）の１＊１０５個の細胞と共培養した。偽トランスフェクトｍＤＣ（Ｈ２Ｏ）またはＴ細胞のみとの共培養を対照として与えた。ＩＦＮ−γ分泌を、共培養の開始から１６時間後に標準的なＩＦＮ−γＥＬＩＳＡによって検出した。値は３連の平均＋ＳＤとして提示する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明をその好ましい実施形態のいくつかに対して詳細に記載する前に、以下の一般的定義を提供する。
【００３５】
以下に例示的に記載される本発明は、適切には、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（複数も含む）、制限（複数も含む）の不在下で実施されてもよい。
【００３６】
本発明は、特定の実施形態に対して、および特定の図面を参照して記載されるが、本発明はそれらによって限定されず、請求項によってのみ限定される。
【００３７】
「含む」という用語が本説明および請求項に使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために、「からなる」という用語は、「構成する」という用語の好ましい実施形態であるとみなされる。本明細書以下において、グループが少なくとも特定の数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態のみからなるグループを開示することが理解され得る。
【００３８】
不定または定冠詞が単数名詞、例えば「一つの（a）」、「一つの（an）」または「その」を参照して使用される場合、これは、何か他のことが明確に述べられない限り、複数のその名詞を含む。
【００３９】
本明細書に使用される場合、「発現」という用語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて産生されるプロセスを指す。したがって、「発現された」タンパク質またはポリペプチドという用語は、限定されないが、細胞内、膜貫通および分泌タンパク質またはポリペプチドを含む。
【００４０】
専門用語はそれらの一般的な意味によって使用される。特定の意味が特定の用語に伝えられる場合、用語の定義は、以下においてその用語が使用される文脈において与えられる。
【００４１】
本発明の一態様は、以下のステップ：
Ａ）抗原提示細胞における、
−  少なくとも１つの抗原またはその断片、
−  抗原のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  抗原のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質の発現、ならびに
Ｂ）抗原提示細胞によって発現される抗原に特異的な抗原特異的Ｔリンパ球を活性化するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのステップＡ）の抗原提示細胞へのＴリンパ球を含む細胞集団の曝露
を含む、ヒト抗原特異的Ｔリンパ球を生成する方法を指す。
【００４２】
断片は、この抗原に特異的である抗原の配列であってもよく、すなわち哺乳動物、特にヒトの別のタンパク質またはペプチドに存在しない。断片は抗原の配列より短くてもよく、例えば抗原より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％短い。断片は、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５またはそれより多いアミノ酸の長さを有してもよい。
【００４３】
一実施形態において、融合タンパク質は少なくとも２個の抗原またはその断片を含む。融合タンパク質は、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個の抗原またはそれらの断片を含んでもよい。融合タンパク質は、１００個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満の抗原またはそれらの断片を含んでもよい。
【００４４】
「抗原特異的Ｔリンパ球を活性化する」という用語は、ナイーブＴ細胞の活性化（デノボ誘導）およびメモリーＴリンパ球の活性化（再活性化）を指す。
【００４５】
典型的に、Ｔリンパ球を含む抗原提示細胞および細胞集団は同じドナー由来である。また、欧州特許第１９１０５２１号明細書に記載されている同種拘束された（allorestricted）設定も企図され、ＭＨＣ分子をコードする核酸が、移入される前記ＭＨＣ分子に対応するＭＨＣ遺伝子を保有しないドナーの抗原提示細胞において発現される。
【００４６】
ステップＡ）における少なくとも１つの融合タンパク質の発現は、一過性発現であってもよいか、または安定発現であってもよい。好ましい実施形態において、発現は、例えば、少なくとも１つの融合タンパク質をコードするｉｖｔ−ＲＮＡを導入することによる一過性発現である。ｉｖｔ−ＲＮＡの発現は、品質管理されたｉｖｔ−ＲＮＡを迅速に産生することができ、免疫原性タンパク質夾雑物を保有しないという点で有益である。
【００４７】
プライミングとも呼ばれるＴリンパ球の曝露によって、多くの異なる活性化されたリンパ球集団がｉｎ  ｖｉｔｒｏで出現する。典型的に、ステップＢ）における曝露はＴリンパ球を含む細胞集団との抗原提示細胞の共培養である。抗原提示細胞のＭＨＣ：エピトープ複合体を認識するＴ細胞が活性化され、その画分はステップＡ）において発現される抗原のエピトープを提示するＭＨＣ分子の複合体に特異的である。これらの非常に望まれるＴ細胞は、ステップＡ）において発現される抗原に由来しないエピトープを提示するペプチドまたはＭＨＣ分子と関係なくＭＨＣ分子を認識するＴ細胞から分離されなければならない。
【００４８】
ステップＢ）における抗原提示細胞の曝露のために、抗原提示細胞はＴリンパ球を含む集団に少なくとも１回加えられる。抗原提示細胞の１回目の添加もまた、プライミングと呼ばれる。抗原提示細胞は、数回、例えば、少なくとも２回または少なくとも３回加えられてもよい。抗原提示細胞の２回目および全ての後の添加はまた、再刺激とも呼ばれる。なぜならそれらのステップにおいて、既に活性化されたＴリンパ球はさらなる増殖のためのさらなる刺激を受けるからである。特定の実施形態において、抗原提示細胞は１回加えられる。他の実施形態において、抗原提示細胞は２回加えられる。別の実施形態において、抗原提示細胞は３回加えられる。さらなる実施形態は、抗原提示細胞が３回またはそれ以上の回数加えられる方法に関する。新たなＡＰＣは、７〜２１日毎、または１２〜１６日毎、または１３〜１５日毎、または１４日毎にＴ細胞培養に加えられてもよい。当業者は、定期的に補足サイトカインを含有する新鮮な培養培地が細胞に提供されることを理解する。
【００４９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原提示細胞へのＴリンパ球を含む細胞集団の曝露とは、曝露が哺乳動物などの生物において起こらないが、曝露がｉｎ  ｖｉｔｏｒｏ細胞培養において行われることを意味する。細胞培養条件は当業者に公知であり、サイトカイン、例えば、生成されるＴ細胞の種類に応じて、とりわけＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７および／またはＩＬ−１５の添加を含む（Schendel, DJ. et al. Human CD8+ T lymphocytes. 1997. In: The Immunology Methods Manual. (I. Lefkovits, Ed.) pp 670-690.; Regn, S., et al. 2001. The generation of monospecific and bispecific anti-viral cytotoxic T lymphocytes (CTL) for the prophylaxis of patients receiving an allogeneic bone marrow transplant. Bone Marrow Transplant. 27: 53-64; Su, Z. et al. Antigen presenting cells transfected with LMP2a RNA induce CD4+ LMP2a-specific cytotoxic T lymphocytes which kill via a Fas-independent mechanism. Leuk. Lymphoma 43(8): 1651-62.）。
【００５０】
いくつかの実施形態において、方法は、活性化および／または抗原特異的Ｔリンパ球の富化のステップをさらに含んでもよい。この富化ステップは典型的に以下のステップ：
（ａ）活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団を、活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも１つの結合分子または所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも１つのＭＨＣ分子と接触させるステップ、
（ｂ）少なくとも１つの結合分子または所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも１つのＭＨＣ分子が結合しているＴリンパ球を単離するステップ
を含む。
【００５１】
特定の実施形態において、方法は、活性化Ｔリンパ球の富化のステップを含んでもよい。この富化ステップは典型的に以下のステップ：
（ａ）活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団を、活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも１つの結合分子と接触させるステップ、
（ｂ）少なくとも１つの結合分子が結合しているＴリンパ球を単離するステップ
を含む。
【００５２】
他の特定の実施形態において、方法は、所望の抗原に特異的であるＴリンパ球の富化のステップを含んでもよい。この富化ステップは典型的に以下のステップ：
（ａ）活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団を、所望の抗原のエピトープを提示するＭＨＣ分子と接触させるステップ、
（ｂ）所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも１つのＭＨＣ分子が結合しているＴリンパ球を単離するステップ
を含む。
【００５３】
活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現されるマーカータンパク質に基づいた活性化Ｔリンパ球の富化は、拘束および特異的エピトープと関係なく広範囲の活性化Ｔ細胞を富化することを可能にする。マーカータンパク質と特異的に結合する結合分子は、限定されないが、抗体、抗体の誘導体、抗体の断片、またはさらなる分子との上述のコンジュゲートであってもよい。結合タンパク質は、例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳなどの選別手順を容易にするために標識化されてもよい。
【００５４】
活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現されるマーカータンパク質は、活性化Ｔリンパ球によって発現され、非活性化Ｔリンパ球によって実質的に発現されない任意の表面タンパク質または分泌タンパク質であってもよい。好ましい実施形態において、活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現される少なくとも１つのマーカータンパク質は、Ｏｘ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＩＬ−２受容体、インターフェロンγ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αを含む群から選択される。これらのマーカーを使用することにより、ＴＣＲによって提示される特異的エピトープから独立して活性化Ｔリンパ球の富化が可能となる。この方法は、選択された抗原の全ての潜在的な免疫原性エピトープを認識するＴ細胞の単離を容易にし、例えば、明らかに定義されていない抗原に特に有用である。
【００５５】
富化ステップにおいて、選択された細胞は亜集団にプールされてもよいか、または単一細胞クローンとして直接単離されてもよい。特定の実施形態において、細胞は第１の富化ステップにおいてプールされ、さらなる富化ステップにおいて単一クローンに分離される。単一クローン分離は、限定されないが、限界希釈またはＦＡＣＳもしくはＭＡＣＳを利用した自動単一細胞選別によって行われてもよい。好ましくは単一細胞選別はＦＡＣＳによって実施される。
【００５６】
特定の実施形態において、活性化ＣＤ４  Ｔ細胞を選択するステップは、以下のステップ：
（ａ１）抗原提示細胞および抗原特異的Ｔリンパ球のＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの間の相互作用を遮断し、Ｔリンパ球の表面にＣＤ４０Ｌを蓄積するために、ステップＡ）の少なくとも１つの融合タンパク質を発現する抗原提示細胞を、ＣＤ４０に対する抗体と接触させるステップ、
（ａ２）活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団を抗ＣＤ４０Ｌ抗体と接触させるステップ、
（ｂ）抗ＣＤ４０Ｌ抗体および抗ＣＤ４抗体によりマークしたＴリンパ球を単離するステップ
を含む。
【００５７】
分泌タンパク質による活性化Ｔ細胞の選択を利用するために、例えば、サイトカイン様インターフェロン−γ、Ｔ細胞表面マーカーを認識する二重特異性分子および標的化サイトカインは、Ｂｅｃｋｅｒら（Becker, C et al. 2001. Adoptive tumor therapy with T lymphocytes enriched through an IFN capture assay. Nature Med. 7(10): 1159-1162.）に記載されているように標識化した検出抗体によって後で検出され得る細胞表面において分泌サイトカインを捕捉する。
【００５８】
さらに、ステップ（ａ）において、細胞を、ＣＤ４と特異的に結合する結合分子および／またはＣＤ８と特異的に結合する結合分子とさらに接触させてもよい。
【００５９】
あるいは、富化は、所望の抗原（すなわちステップＡの抗原提示細胞によって外因的に発現される抗体）のエピトープを提示するＭＨＣ分子を利用することによって実施されてもよい。ＭＨＣ分子は、例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳなどの選別手順を容易にするために標識化されてもよい。ＴＣＲと対応するペプチド：ＭＨＣ複合体との間の低い親和性相互作用は、限定されないが、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体または八量体などの、Ｗｉｌｄｅら（Dendritic cells pulsed with RNA encoding allogeneic MHC and antigen induce T cells with superior antitumor activity and higher TCR functional avidity. Blood 114(10): 2131-2139; 2009）に記載されているようにペプチド：ＭＨＣ分子の可溶性多量体の構築によって克服され得る。さらに、ＴＣＲと可逆的に結合し、したがって機能的変化または活性化誘発性細胞死を誘発するリスクがなく、高親和性ＴＣＲの単離を可能にする、いわゆるペプチド：ＭＨＣストレプタマー（streptamer）が利用されてもよい（Knabel et al. (2002) Reversible MHC multimer staining for functional isolation of T-cell populations and effective adoptive transfer. Nature Medicine, 8(6), 631-7.）。Ｔ細胞：ストレプタマー相互作用の可逆的特性は、ストレプタマーの骨格として作用するストレプトアビジン（ストレプタクチン（strep-tactin））の修飾型に基づく。
【００６０】
この手法により、特定の拘束があるエピトープ特異的ＴＣＲの標的化された富化が可能となる。
【００６１】
活性化および／または抗原特異的Ｔリンパ球の単離は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって実施されてもよい。ＦＡＣＳに関して、マーカータンパク質または所望の抗原のエピトープを提示するＭＨＣ分子と特異的に結合する結合分子は蛍光染料により標識化される。ＦＡＣＳは高純度で少数の単離に特に有用である。ＭＡＣＳに関して、マーカータンパク質または所望の抗原のエピトープを提示するＭＨＣ分子と特異的に結合する結合分子は、磁性ビーズなどの磁性粒子により標識化される。ＭＡＣＳはバルク培養物の迅速な選別に特に適している。
【００６２】
さらに、ステップ（ａ）において、細胞を、ＣＤ４をさらに富化するためにＣＤ４と特異的に結合する結合分子および／またはＣＤ８と特異的に結合する結合分子とさらに接触させてもよい。
【００６３】
別の実施形態は、
Ｃ２）以下のステップ：
ａ）
（ｉ）ステップＡ）において定義される抗原提示細胞、および
（ｉｉ）対照抗原提示細胞との、
活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベーション、
ｂ）各細胞クローンについての（ｉ）および（ｉｉ）とのインキュベーションの活性化プロファイルの比較、
ｃ）ｂ）の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Ｔリンパ球の同定
のステップをさらに含み、（ｉｉ）ではなく（ｉ）による活性化が、細胞クローンが抗原特異的であることを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
【００６４】
抗原特異的Ｔリンパ球のステップＣ２）の同定は、活性化Ｔリンパ球のステップＣ１）の富化後に実施されてもよいか、または代替として、富化ステップＣ１）を行わずにＴリンパ球を含む細胞集団を抗原提示細胞に曝露するステップＢ）の後に実施されてもよい。
【００６５】
さらなる実施形態は、
Ｃ２）以下のステップ：
ａ）
（ｉ）ステップＡ）において定義される抗原提示細胞、および
（ｉｉ）対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団の細胞の少なくとも１つの画分のインキュベーション、
ｂ）細胞の少なくとも１つの画分についての（ｉ）および（ｉｉ）とのインキュベーションの活性化プロファイルの比較、
ｃ）ｂ）の比較に基づいた抗原特異的である細胞の画分の同定
を含む、抗原特異的Ｔリンパ球の同定
のステップをさらに含み、（ｉｉ）ではなく（ｉ）による活性化が、細胞の画分が抗原特異的であることを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
【００６６】
別の実施形態は、
Ｃ２）以下のステップ：
ａ）
（ｉ）ステップＡ）において定義される抗原提示細胞、および
（ｉｉ）対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団の増殖したＴ細胞クローンのインキュベーション
ｂ）各細胞クローンについての（ｉ）および（ｉｉ）とのインキュベーションの活性化プロファイルの比較、
ｃ）ｂ）の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Ｔリンパ球の同定
のステップをさらに含み、（ｉｉ）ではなく（ｉ）による活性化が、細胞クローンが抗原特異的であることを示す、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法を指す。
【００６７】
Ｔリンパ球の活性化プロファイルは、例えば、活性化誘発性サイトカイン遊離または抗原指向性（antigen-directed）死滅能力を測定することによって決定され得る。
【００６８】
活性化誘発性サイトカイン分泌を測定するために、Ｔ細胞は抗原が負荷されたＡＰＣと共培養されてもよい。異なるエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比が利用されてもよい。対照抗原提示、すなわち偽トランスフェクトＡＰＣとインキュベートした、または刺激細胞の不在下でインキュベートしたＴ細胞が陰性対照として使用されてもよい。培養上清は標準的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって評価される。マーカーの例は、限定されないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α分泌である。抗原遭遇時にＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ−α分泌は、増強した抗腫瘍機能と相関し、したがってＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の抗原誘発性サイトカイン分泌を測定する場合、特に有用である。さらに、ＩＦＮ−γおよび顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー−１（Ｔｈ１）−極性Ｔ細胞クローンを評価するための明確に定義されたサイトカインである。
【００６９】
多重抗原が、初代Ｔ細胞誘導のために同時に使用される場合、各々のプライミング抗原を発現する個々のＡＰＣ集団は均等な割合で混合され、Ｔ細胞共培養に使用されてもよい。したがって、特異性を評価するために実施される初期スクリーニングアッセイのみにより、全ての展開した標的抗原に対する全体の抗原反応性の予測が可能となる。単一の抗原特異性の評価は、一種類のｉｖｔＲＮＡトランスフェクトＡＰＣとの抗原反応性Ｔ細胞の後の共培養を必要とする。
【００７０】
さらに個々のＴ細胞クローンの細胞傷害活性は、例えばクロム遊離アッセイによって測定され得る。このようなアッセイにおいて、標的細胞は放射性クロムにより標識化され、Ｔ細胞に曝露される。死滅すると、放射性クロムは上清に遊離し、共培養の開始後４時間以内に検出可能になる。特定のクロム遊離は、エフェクター細胞の不在下で標的細胞をインキュベートすることによって評価される自然遊離に正規化される。したがって、上清中の多量のクロムは優れた細胞傷害性Ｔ細胞活性と相関する。クロム遊離アッセイは好ましくは腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をスクリーニングするために実施される。
【００７１】
抗原特異的Ｔリンパ球の同定における使用に適した抗原提示細胞は、例えば、所望の抗原および必要とされるＭＨＣ分子を発現する腫瘍細胞系、一般的なＭＨＣ分子を発現する樹立抗原提示細胞系、またはＴリンパ球を含む集団と同じドナーに由来する抗原提示細胞であってもよい。
【００７２】
樹立抗原提示細胞系の一例は、不完全な固有エピトープ提示を示し、短いペプチド、例えば合成ペプチドを外部から負荷され得る、高頻度のＨＬＡ−Ａ＊０２：０１アレルを発現するヒトリンパＴ２細胞系である：この細胞系は、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１拘束性ＣＤ８＋Ｔリンパ球をスクリーニングするために使用され得る。別の例は、ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ発現を欠失しているヒトＫ５６２細胞系であり、その細胞系において目的の任意のＨＬＡ分子が安定にまたは一過性に導入されてもよく、したがってＣＤ８＋Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔリンパ球の両方のスクリーニングに役立ち得る。
【００７３】
ドナー由来の抗原提示細胞は、例えば、樹状細胞に成熟する、単離された単球であってもよい。成熟した樹状細胞は最適な活性化能力を示す。
【００７４】
有用なドナー由来のＡＰＣについてのさらなる例は、エプスタイン・バール・ウイルス（Epstein-Barr virus）（ＥＢＶ）−不死化Ｂリンパ球、いわゆるリンパ芽球様細胞系（ＬＣＬ）である。ＬＣＬは天然にＢ細胞に由来するので、これらのＡＰＣは抗原プロセシングおよび提示における優れた機能を特徴とする。さらに、ＬＣＬは、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）のような共刺激分子ならびにそれらの刺激能力を増強するのに役立つ適切な接着分子を発現する。ゲノム低減突然変異ＥＢＶ（ミニＥＢＶ）株が、大部分の溶菌サイクル遺伝子を欠失し、したがってＴリンパ球のＥＢＶ依存性活性化を低減させるミニＥＢＶ形質転換Ｂ細胞（ｍＬＣＬ）を生成するために使用されてもよい（Kempkes, B.et al. (1995) Immortalization of human B lymphocytes by a plasmid containing 71 kilobase pairs of Epstein-Barr virus DNA. J Virol 69(1): 231-238., 1995; Moosmann, et al. (2002) B cells immortalized by a mini-Epstein-Barr virus encoding a foreign antigen efficiently reactivate specific cytotoxicT cells. Blood 100(5): 1755-1764）。
【００７５】
ドナー由来のＬＣＬ／ｍＬＣＬは、特に多数の単離されたＴ細胞クローンが評価されることを必要とする場合、Ｔ細胞特異性を評価するために使用されてもよい。ＬＣＬ／ｍＬＣＬの抗原負荷は、例えばレトロウイルス形質導入ｉｖｔＲＮＡトランスフェクションおよび外部ペプチドまたはタンパク質供給によって達成され得る。
【００７６】
抗原特異的Ｔリンパ球の単離は、（ｉ）所望の抗原を発現する抗原提示細胞と、および（ｉｉ）対照抗原提示細胞と、または抗原提示細胞の不在下でインキュベートしたＴリンパ球の活性化プロファイルの比較に基づく。
【００７７】
（ｉｉ）対照抗原提示細胞または抗原提示細胞の不在下ではなく、（ｉ）所望の抗原を発現する抗原提示細胞による活性化は、Ｔ細胞クローンが抗原特異的であることを示す。非活性化と比較して活性化は、所望の抗原を発現する抗原提示細胞とインキュベートしたＴリンパ球の値（すなわちＩＦＮ−γ分泌）の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％の低下が存在することを意味する。
【００７８】
ＥＲ移行シグナル配列はエンドソーム／リソソーム関連タンパク質に由来してもよい。
【００７９】
開示された方法に使用されるＥＲ移行シグナル配列は、エンドソーム／リソソーム局在タンパク質の選別配列であってもよい。本明細書に使用される場合、エンドソーム／リソソーム局在タンパク質とは、細胞のエンドソームおよび／またはリソソームの膜または管腔に局在するタンパク質を指す。
【００８０】
エンドソームまたはリソソーム局在タンパク質の例は、アルファ−ガラクトシダーゼＡ／ＧＬＡ、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ／Ｅｎｄｏ  Ｈ、アルファ−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ／ＮＡＧＡ、ガラクトシルセラミダーゼ／ＧＡＬＣ、アルファ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ／ＮＡＧＬＵ、グルコシルセラミダーゼ／ＧＢＡ、アルファ−ガラクトシダーゼ／ａ−Ｇａｌ、ヘパラナーゼ／ＨＰＳＥ、アルファ−Ｌ−フコシダーゼ、ヘパリナーゼＩ、組織アルファ−Ｌ−フコシダーゼ／ＦＵＣＡ１、ヘパリナーゼＩＩ、ベータ−ガラクトシダーゼ−１／ＧＬＢ１、ヘパリナーゼＩＩＩ、ベータ−グルクロニダーゼ／ＧＵＳＢ、ヘキソサミニダーゼＡ／ＨＥＸＡ、ベータ（１−３）−ガラクトシダーゼ、ヒアルロナンリアーゼ、ベータ（１−４）−ガラクトシダーゼ、ヒアルロニダーゼ１／ＨＹＡＬ１、キチナーゼ３様１、ヒアルロニダーゼ４／ＨＹＡＬ４、キチナーゼ３様２、アルファ−Ｌ−イズロニダーゼ／ＩＤＵＡ、キチナーゼ３様３／ＥＣＦ−Ｌ、キトビアーゼ／ＣＴＢＳ、キトトリオシダーゼ／ＣＨＩＴ１、ラクターゼ様タンパク質／ＬＣＴＬ、コンドロイチンＢリアーゼ／コンドロイチナーゼＢ、リソソームアルファ−グルコシダーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、ＭＢＤ４、コンドロイチナーゼＡＣ、ＮＥＵ−１／シアリダーゼ−１、細胞質ベータ−グルコシダーゼ／ＧＢＡ３、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ／ＯＧＡ、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ１／Ｅｎｄｏ  Ｆ１、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＦ３／Ｅｎｄｏ  Ｆ３、ＳＰＡＭ１などのグリコシダーゼ；ＡＭＳＨ／ＳＴＡＭＢＰ、カテプシンＨ、カテプシン３、カテプシンＫ、カテプシン６、カテプシンＬ、カテプシン７／カテプシン１、カテプシンＯ、カテプシンＡ／リソソームカルボキシペプチダーゼＡ、カテプシンＳ、カテプシンＢ、カテプシンＶ、カテプシンＣ／ＤＰＰＩ、カテプシンＸ／Ｚ／Ｐ、カテプシンＤ、ガラクトシルセラミダーゼ／ＧＡＬＣ、カテプシンＦ、オエグマイン（oegumain）／アスパラギニルエンドペプチダーゼなどのリソソームプロテアーゼ；アリールスルファターゼＡ／ＡＲＳＡ、イズロン酸−２−スルファターゼ／ＩＤＳ、アリールスルファターゼＢ／ＡＲＳＢ、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ／ＧＡＬＮＳｖ、アリールスルファターゼＧ／ＡＲＳＧ、スルファミダーゼ／ＳＧＳＨ、グルコサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ／ＧＮＳ、スルファターゼ−２／ＳＵＬＦ２などのスルファターゼ；またはＢＡＤ−ＬＡＭＰ／ＬＡＭＰ５などの他のリソソームタンパク質；ヒアルロニダーゼ１／ＨＹＡＬ１；ＣＤ６３；ＬＡＭＰ１／ＣＤ１０７ａ；ＣＤ−Ｍ６ＰＲ；ＬＡＭＰ２／ＣＤ１０７ｂ；クラスリン重鎖１／ＣＨＣ１７；Ｒａｂ２７ａ；クラスリン重鎖２／ＣＨＣ２２；ＵＮＣ１３Ｄ、ＣＤ６８、ＣＤ１ｂまたはＤＣ−ＬＡＭＰである。
【００８１】
ＥＲ移行シグナル配列はエンドソーム／リソソーム関連タンパク質に由来する。エンドソーム／リソソーム関連タンパク質は、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＤ６８またはＣＤ１ｂ、好ましくはＬＡＭＰ１であってもよい。好ましくは、ＥＲ移行シグナルはヒトである。ＥＲ移行シグナル配列は、配列番号３３、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４６のうちの少なくとも１つの配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は、配列番号３４、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７からなる群から選択される配列のうちの１つからなってもよい。特定の実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は配列番号３３の配列またはその断片を含む。より特定の実施形態において、ＥＲ移行シグナル配列は以下の配列番号３４の配列からなる。
【００８２】
エンドソーム／リソソームターゲティング配列は、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来してもよい。エンドソーム／リソソームターゲティング配列は典型的に膜貫通および細胞質ドメインの一部である。したがって、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来してもよい。好ましくは、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒトである。典型的にエンドソーム／リソソームターゲティング配列は、モチーフＹ−ＸＸ、続いて疎水性アミノ酸を含む。好ましくは、エンドソーム／リソソームターゲティングシグナル配列はＹＱＲＩである。エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号５４の配列またはその断片を含んでもよい。例えば、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号３５の配列またはその断片を含んでもよい。
【００８３】
疎水性アミノ酸という用語は当業者に周知である。疎水性アミノ酸についての例は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓである。
【００８４】
典型的に、抗原提示細胞は、樹状細胞、活性化Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞系、好ましくは樹状細胞、より好ましくは単球由来樹状細胞から選択される。
【００８５】
抗原提示細胞は抗原提示細胞の異なる集団を含んでもよく、各集団は異なる抗原融合タンパク質を発現する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は、以下のステップ：ｉ）単球の準備、ｉｉ）ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉ）の単球のインキュベーション、ｉｉｉ）成熟カクテルと組み合わせたＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉｉ）の単球のインキュベーションを含む方法によって生成される成熟樹状細胞である。成熟カクテルは、ＩＬ−β、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２およびＴＬＲ３アゴニストまたはそれらの組合せからなる群から選択される成分のうちの少なくとも１つを含んでもよい。例えば、ＴＬＲ７／８アゴニストはＲ８４８であってもよく、および／またはＴＬＲ３アゴニストはポリ（Ｉ：Ｃ）であってもよい。ステップｉｉ）のインキュベーションは少なくとも２日間継続してもよい。ステップｉｉｉ）のインキュベーションは、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間継続してもよい。
【００８７】
通常、Ｔリンパ球を含む細胞集団は末梢血リンパ球の集団である。Ｔリンパ球を含む細胞集団は分離されていない末梢血リンパ球の集団であってもよい。細胞集団は、Ｔリンパ球、好ましくはＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球について富化されてもよい。
【００８８】
本発明のさらなる態様は、
−  ヒト小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメイン
を含む発現ベクターを指す。
【００８９】
ベクターはｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｍＲＮＡ転写のためのプロモーターを含んでもよい。ＥＲ移行シグナル配列は、エンドソーム／リソソーム関連タンパク質、例えば、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＤ６８、ＣＤ１ｂ、好ましくはＬＡＭＰ１に由来する。好ましくは、ＥＲ移行シグナルはヒトである。特定の実施形態において、ＥＲ移行シグナルは配列番号３３の配列またはその断片を含む。より特定の実施形態において、ＥＲ移行シグナルは以下の配列番号３４の配列からなる。
【００９０】
エンドソーム／リソソームターゲティング配列は、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来してもよい。エンドソーム／リソソームターゲティング配列は典型的に膜貫通および細胞質ドメインの一部である。したがって、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来してもよい。好ましくは、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインはヒトである。
【００９１】
典型的にエンドソーム／リソソームターゲティング配列は、モチーフＹ−ＸＸ、続いて疎水性アミノ酸を含む（Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸を表す）。好ましくは、エンドソーム／リソソームターゲティングシグナルはＹＱＲＩである。エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号５４の配列またはその断片を含んでもよい。例えば、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインは配列番号３５の配列またはその断片を含んでもよい。
【００９２】
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ＥＲ移行シグナルと、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に制限部位をさらに含む。他の実施形態において、ベクターは、ヒト小胞体（ＥＲ）移行シグナルと、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に挿入される少なくとも１つの抗原またはその断片をさらに含む。
【００９３】
特定の実施形態において、ベクターは少なくとも２個の抗原またはそれらの断片をコードする配列を含む。ベクターは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個の抗原またはそれらの断片をコードする配列を含んでもよい。ベクターは、１００個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満の抗原またはそれらの断片をコードする配列を含んでもよい。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ベクターは抗原の完全長アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。あるいは、ベクターは抗原のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片を含む。図１２に示されるように、２個の異なる抗原の断片を含むベクターが導入されている抗原提示細胞は、２個の抗原に特異的な異なるＴＣＲの活性化を誘発し得る。
【００９５】
典型的に、抗原は腫瘍抗原またはウイルス抗原である。腫瘍抗原は、ウイルス腫瘍抗原、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞において発現される抗原からなる群から選択されてもよい。
【００９６】
発がんウイルス抗原とも呼ばれるウイルス腫瘍抗原は、発がんＤＮＡウイルスなどの発がんウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスなどのウイルス、ならびにパピローマウイルスおよび発がんＲＮＡウイルスの抗原である。腫瘍特異的抗原とは、腫瘍細胞によってのみ発現される腫瘍関連突然変異を指す。腫瘍関連抗原の群は、例えば、組織特異的がん／精巣抗原またはＭＡＲＴ−１、チロシナーゼもしくはＣＤ２０などの組織分化抗原を含む。好ましくは腫瘍抗原は腫瘍関連抗原であり、より好ましくは腫瘍関連抗原はがん／精巣抗原（Ｃ／Ｔ抗原）である。Ｃ／Ｔ抗原は、ＭＡＧＥファミリーメンバー、例えばＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、これらに限定されないが、単一点突然変異、ＮＹ−ＥＳＯ１、腫瘍／精巣抗原１Ｂ、ＧＡＧＥ−１、ＳＳＸ−４、ＸＡＧＥ−１、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＣＰ−１、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＣＴＺ９、ＣＴ１０、ＳＡＧＥおよびＣＡＧＥを含む腫瘍抗原を含む群から選択されてもよい。好ましくはＣ／Ｔ抗原は、ＧＡＧＥ−１、ＳＳＸ−４およびＸＡＧＥ−１からなる群から選択されてもよい。好ましくは患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞において発現される抗原は患者の非がん性細胞において発現されない。
【００９７】
本発明の別の態様は、
−  少なくとも１つの抗原またはその断片、
−  抗原のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  抗原のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質を発現する、抗原提示細胞、特に樹状細胞を指す。
本発明の別の態様は、抗原特異的Ｔリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成のための本明細書に記載される発現ベクターの使用を指す。
【００９８】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載される方法によって生成されたＴリンパ球を哺乳動物に投与するステップを含むがんを予防または治療する方法に使用するためのＴリンパ球を指す。
【００９９】
別の態様は、上記の方法のステップを含み、本明細書に記載される方法によって生成された活性化抗原特異的リンパ球からＴＣＲを単離するステップをさらに含む抗原特異的ＴＣＲを生成する方法を指す。
【０１００】
ＴＣＲの単離およびその後の配列分析は、例えばＳｔｅｉｎｌｅら（In vivo expansion of HLA-B35 alloreactive T cells sharing homologous T cell receptors: evidence for maintenance of an oligoclonally dominated allospecificity by persistent stimulation with an autologous MHC/peptide complex. The Journal of Experimental Medicine, 181(2), 503-13; 1995）に記載されている。配列分析は、例えばＰＣＲまたは次世代シーケンシング法によって実施されてもよい。核酸の配列を同定する方法は当業者に周知である。
【０１０１】
ＴＣＲは２つの異なるタンパク鎖、ａおよびｂから構成される。ＴＣＲα鎖は可変（Ｖ）、結合（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲα鎖は可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、結合（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖の両方の再配列されたＶ（Ｄ）Ｊ領域は、超可変領域（ＣＤＲ、相補性決定領域）を含有し、その中でＣＤＲ３領域は特異的エピトープ認識を決定する。
【０１０２】
本発明の一態様はＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲを指す。一実施形態において、ＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲは、配列番号４８および配列番号４９またはそれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを特異的に認識する。断片は、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５またはそれ以上のアミノ酸の長さを有してもよい。ＴＣＲは、配列番号４８および配列番号４９またはそれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと特異的に結合し得る。
【０１０３】
ＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲは、配列番号７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含んでもよい。
【０１０４】
特定の実施形態は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号８のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖を含む、ＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体に関する。
【０１０５】
さらに、本出願は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む、ＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号３の配列を有するＣＤＲ３を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号４の配列を有するＣＤＲ３を含む、
ＴＣＲ受容体に関連する。
【０１０６】
特定の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む、ＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号７と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号３の配列を有するＣＤＲ３を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号８と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号４の配列を有するＣＤＲ３を含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０１０７】
特定の実施形態は、配列番号５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲα鎖および配列番号６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲβ鎖を含む、ＧＡＧＥ−１に特異的であるＴＣＲ受容体を指す。
【０１０８】
特定の実施形態は、配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲα鎖および配列番号６のヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲβ鎖を含む、ＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体に関する。
【０１０９】
さらに、本出願は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む、ＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲ受容体に関連する。
【０１１０】
特定の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む、ＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０１１１】
本出願の別の態様は、配列番号１５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号１６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含むＳＳＸ−４に特異的なＴＣＲを指す。
【０１１２】
特定の実施形態は、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号１６のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖を含むＳＳＸ−４に特異的なＴＣＲ受容体に関する。
【０１１３】
さらに、本出願は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＳＳＸ−４に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号１５と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１１の配列を有するＣＤＲ３を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号１６と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１２の配列を有するＣＤＲ３を含む、
ＴＣＲ受容体に関連する。
【０１１４】
特定の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＳＳＸ−４に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号１５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１１の配列を有するＣＤＲ３を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号１６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１２の配列を有するＣＤＲ３を含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０１１５】
特定の実施形態は、配列番号１３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲα鎖および配列番号１４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲβ鎖を含むＳＳＸ−４に特異的なＴＣＲ受容体を指す。
【０１１６】
特定の実施形態は、配列番号１３のヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲα鎖および配列番号１４のヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲβ鎖を含むＳＳＸ−４に特異的なＴＣＲ受容体に関する。
【０１１７】
さらに、本出願は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＳＳＸ−４に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号１３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号９に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲ受容体に関連する。
【０１１８】
特定の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＳＳＸ−４に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号１３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号９に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号１４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０１１９】
本発明の一態様は、ＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲを指す。一実施形態において、ＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲは、配列番号５０および配列番号５１またはそれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを特異的に認識する。断片は、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５またはそれ以上のアミノ酸の長さを有してもよい。ＴＣＲは、配列番号５０および配列番号５１またはそれらの断片からなる群から選択されるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと特異的に結合し得る。
【０１２０】
ＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲは、配列番号２３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号２４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含んでもよい。
【０１２１】
特定の実施形態は、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号２４のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体に関する。
【０１２２】
さらに、本出願は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号２３と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１９の配列を有するＣＤＲ３を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号２４と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２０の配列を有するＣＤＲ３を含む、
ＴＣＲ受容体に関連する。
【０１２３】
特定の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号２３と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１９の配列を有するＣＤＲ３を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号２４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２０の配列を有するＣＤＲ３を含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０１２４】
特定の実施形態は、配列番号２１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲα鎖および配列番号２２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体を指す。
【０１２５】
特定の実施形態は、配列番号２１のヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲα鎖および配列番号２２のヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体に関する。
【０１２６】
さらに、本出願は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号２１と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号２２と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲ受容体に関連する。
【０１２７】
特定の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号２１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号２２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０１２８】
本出願の別の態様は、配列番号３１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号３２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲを指す。
【０１２９】
特定の実施形態は、配列番号３１のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号３２のアミノ酸配列を含むＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体に関する。
【０１３０】
さらに、本出願は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号３１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２７の配列を有するＣＤＲ３を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号３２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２８の配列を有するＣＤＲ３を含む、
ＴＣＲ受容体に関連する。
【０１３１】
特定の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号３１と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２７の配列を有するＣＤＲ３を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号３２と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２８の配列を有するＣＤＲ３を含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０１３２】
特定の実施形態は、配列番号２９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲα鎖および配列番号３０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体を指す。
【０１３３】
特定の実施形態は、配列番号２９のヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲα鎖および配列番号３０のヌクレオチド配列によってコードされるＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体に関する。
【０１３４】
さらに、本出願は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号２９と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号３０と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲ受容体に関連する。
【０１３５】
特定の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ受容体であって、
−  ＴＣＲα鎖は、配列番号２９と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含み、
−  ＴＣＲβ鎖は、配列番号３０と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、
ＴＣＲ受容体に関する。
【０１３６】
本出願はまた、上記に定義されるＴＣＲをコードする核酸分子に関する。
【０１３７】
核酸配列全体における有用な変化はコドン最適化であり得る。発現されたアミノ酸配列内の保存的置換を引き起こす変更がなされてもよい。これらの変異は、機能に影響を及ぼさないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定および非相補性決定領域においてなされてもよい。通常、付加および欠失はＣＤＲ３領域において実施されるべきではない。
【０１３８】
「保存的アミノ酸置換」の概念は当業者によって理解され、好ましくは、正電荷を持つ残基（Ｈ、ＫおよびＲ）をコードするコドンは正電荷を持つ残基をコードするコドンにより置換され、負電荷を持つ残基（ＤおよびＥ）をコードするコドンは負電荷を持つ残基をコードするコドンにより置換され、中性極性残基（Ｃ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹ）をコードするコドンは中性極性残基をコードするコドンにより置換され、中性非極性残基（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、ＶおよびＷ）をコードするコドンは中性非極性残基をコードするコドンにより置換されることを意味する。これらの変異は、自然発生的に生じ得るか、ランダム突然変異誘発によって導入され得るか、または定方向突然変異誘発によって導入され得る。それらの変化はこれらのポリペプチドの本質的特徴を破壊せずになされ得る。当業者は、これらの変異が当該技術分野において公知の方法によってリガンド結合能力を実質的に低減させるか、または破壊するかどうかを決定するためにバリアントアミノ酸および／またはそれらをコードする核酸を容易におよび慣用的にスクリーニングすることができる。
【０１３９】
エピトープタグは、特異的抗体が惹起し得るアミノ酸の短いストレッチであり、そのエピトープタグにより、いくつかの実施形態において、生物または培養細胞に加えられているタグ化タンパク質を特異的に同定し、追跡することができる。タグ化分子の検出は複数の異なる技術を使用して達成され得る。そのような技術の例には、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット法（「ウェスタン」）、およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。エピトープタグは、既知およびしばしば高親和性抗体の結合を提供し、それによって生物または培養細胞に加えられているタグ化タンパク質を特異的に同定し、追跡することができるように、対象タンパク質上に既知のエピトープ（抗体結合部位）を加える。
【０１４０】
本発明の文脈において、「機能的」ＴＣＲα−および／またはβ−鎖融合タンパク質は、例えば、少なくとも実質的な生物活性を維持する、アミノ酸の付加、欠失または置換によって修飾されるＴＣＲまたはＴＣＲバリアントを意味する。ＴＣＲのα−および／またはβ−鎖の場合、これは、両方の鎖が、特に前記ＴＣＲの特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体と結合する、その生物学的機能、および／または特異的ペプチド：ＭＨＣ相互作用時に機能的シグナル伝達を与えるＴ細胞受容体（非修飾α−および／もしくはβ−鎖または別の発明の融合タンパク質α−および／もしくはβ−鎖のいずれかを有する）を形成できるままであることを意味するものとする。
【０１４１】
特定の実施形態において、ＴＣＲは、機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α−および／またはβ−鎖融合タンパク質であるように修飾されてもよく、前記エピトープ−タグは、６から１５の間のアミノ酸、好ましくは９から１１の間のアミノ酸の長さを有する。別の実施形態において、ＴＣＲは、機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α−および／またはβ−鎖融合タンパク質であるように修飾されてもよく、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α−および／またはβ−鎖融合タンパク質は、離れているか、または直接並んでいる２つ以上のエピトープ−タグを含む。融合タンパク質の実施形態は、融合タンパク質がその生物活性（複数も含む）（「機能的」）を維持する限り、２、３、４、５またはさらにそれ以上のエピトープ−タグを含有してもよい。
【０１４２】
本発明による機能的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α−および／またはβ−鎖融合タンパク質が好ましく、前記エピトープ−タグは、限定されないが、ＣＤ２０もしくはＨｅｒ２／ｎｅｕタグ、またはｍｙｃ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、Ｔ７−タグ、ＨＡ（赤血球凝集素）−タグ、Ｈｉｓ−タグ、Ｓ−タグ、ＧＳＴ−タグ、またはＧＦＰ−タグなどの他の従来のタグから選択される。ｍｙｃ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰタグは既存の分子に由来するエピトープである。対照的に、ＦＬＡＧは高い抗原性に設計されている合成エピトープタグである（例えば、米国特許第４，７０３，００４号明細書および同第４，８５１，３４１号明細書を参照のこと）。好ましくはｍｙｃタグが使用されてもよい。なぜなら高品質試薬がその検出のために使用可能であるからである。エピトープタグは、もちろん、抗体による認識以外に１つまたは複数のさらなる機能を有してもよい。これらのタグの配列は文献に記載されており、当業者に周知である。
【０１４３】
本発明の別の態様は、上記に定義されるＴＣＲを発現するＴ細胞を対象とする。
【０１４４】
さらに、本発明は、上記に定義されるＴＣＲをコードする核酸配列の１つまたは複数を含むベクターを指す。ベクターは、好ましくは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたは遺伝子療法に使用される粒子および／もしくはベクターである。
【０１４５】
「ベクター」は、コードされたポリペプチドの合成が行われ得る適切な宿主細胞内に核酸配列を保有する能力を有する任意の分子または組成物である。典型的におよび好ましくは、ベクターは、所望の核酸配列（例えば本発明の核酸）を組み込むために、当該技術分野において公知である組換えＤＮＡ技術を使用して操作されている核酸である。ベクターはＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでもよく、および／またはリポソームを含んでもよい。ベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたは遺伝子療法に使用される粒子および／もしくはベクターであってもよい。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞内で複製することができる核酸配列を含んでもよい。ベクターはまた、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および当業者に公知の他の遺伝要素を含んでもよい。ベクターは、好ましくは、核酸の発現を可能にする配列に作動可能に連結している本発明による前記核酸を含む発現ベクターである。
【０１４６】
本発明の別の態様において、上記のＴＣＲをコードする上記の核酸配列が導入されている細胞が提供される。Ｔ細胞において、上記のＴＣＲをコードする核酸配列を含む上記のベクターが導入されてもよいか、または前記ＴＣＲをコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡが導入されてもよい。細胞はＴ細胞などの末梢血リンパ球であってもよい。ＴＣＲのクローニングおよび外因性発現の方法は、例えばＥｎｇｅｌｓら（Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013）に記載されている。
【０１４７】
本出願の別の態様は、医薬として使用するための上記に定義されるＴＣＲまたはＴＣＲを発現する細胞に関する。したがって、本出願はまた、上記のＴＣＲまたはＴＣＲを発現する細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を企図する。特定の実施形態は、ＧＡＧＥ−１、ＳＳＸ−４、ＸＡＧＥ−１、またはそれらの混合物を発現する悪性細胞に関与する疾患を治療する際に使用するための上記に定義されるＴＣＲまたはＴＣＲを発現する細胞を指す。したがって、本出願はまた、がんの治療に使用するための上記に定義されるＴＣＲを指す。したがって、本出願は、養子細胞療法を必要とする患者を治療する方法であって、本明細書に定義される医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、前記方法を対象とする。患者は、ＧＡＧＥ−１、ＳＳＸ−４、ＸＡＧＥ−１、またはそれらの混合物を発現する悪性細胞に関与する疾患に罹患している可能性がある。
【０１４８】
本発明のこれらの活性成分は、好ましくは、疾患が治療または少なくとも軽減され得る、許容される担体または担体材料と混合された用量において、このような医薬組成物中に使用される。このような組成物は、（活性成分および担体に加えて）充填材料、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤および最先端の公知である他の材料を含んでもよい。
【０１４９】
「薬学的に許容される」という用語は、活性成分の生物活性の有効性を妨げない非毒性材料を定義する。担体の選択は用途に応じる。
【０１５０】
医薬組成物は、活性成分の活性を増強するか、または治療を補うさらなる成分を含有してもよい。このようなさらなる成分および／または要因は、相乗効果を達成するか、または有害もしくは望ましくない作用を最小化するために医薬組成物の一部であってもよい。
【０１５１】
本発明の活性成分の製剤化または調製のための技術および適用／薬剤は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, Mack Publishing Co., Easton, PA、latest editionに公開されている。適切な適用は、非経口適用、例えば筋肉内、皮下、髄内（intramedular）注射および髄腔内、直接心室内、静脈内、節内（intranodal）、腹腔内または腫瘍内注射である。静脈内注射が患者の好ましい治療である。
【０１５２】
好ましい実施形態によれば、医薬組成物は注入または注射である。
【０１５３】
注射可能な組成物は、少なくとも１種の活性成分、例えば、ＴＣＲを発現する増殖したＴ細胞集団（例えば治療される患者に対して自己または同種異系）を含む薬学的に許容される流体組成物である。活性成分は、通常、生理的に許容される担体中に溶解または懸濁され、組成物は、乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤などの、少量の１つまたは複数の非毒性補助物質をさらに含んでもよい。本開示の融合タンパク質との使用に有用であるこのような注射可能な組成物は慣用されており、適切な製剤は当業者に周知である。
【実施例】
【０１５４】
ＣｒｏｓｓＴＡｇベクターによる効果的なＭＨＣクラス−ＩＩ交差提示の検証
ＲＮＡによりコードされたタンパク質のＭＨＣクラス−ＩＩ交差提示を得るために、選択した抗原ＤＮＡ配列をＭＨＣクラス−ＩＩターゲティングシグナル（ＣｒｏｓｓＴＡｇ）と結合した。この目的のために、ヒトリソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）５’のＥＲ移行シグナルを、ヒトＤＣ−ＬＡＭＰの膜貫通および細胞質ドメインと融合した。これらの２つのシグナル成分を、ＣｒｏｓｓＴＡｇを有するフレーム内の選択した抗原配列の組み込みを可能にする特有の制限部位によって分離した。ＬＡＭＰ−１シグナルペプチドを使用して、ＥＲへの新たに合成されたタンパク質の同時翻訳移行を促進した。移行後、細胞質ＤＣ−ＬＡＭＰターゲティングシグナル（ＹＸＸφモチーフ；Ｘは任意の天然に存在するアミノ酸を表し；φは任意の疎水性アミノ酸を表す；配列番号３８）は、エンドソーム／リソソーム区画への効果的なタンパク質輸送を確実にするはずである。
【０１５５】
本発明者らは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１拘束性であるＥＢＮＡ−３Ｃ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン３Ｈ１０についての公知のエピトープ（Xiaojun Yu, et al.: Antigen-armed antibodies targeting B lymphoma cells effectively activate antigen-specific CD4+ T cells. Blood 2015 Mar 5;125(10):1601-10.; http://www.iedb.org/assayId/2445148に記載されている）を含有する１ｋｂ断片をコードする、エプスタイン・バール・ウイルス（Epstein-Barr virus）核抗原（ＥＢＮＡ）−３Ｃの部分的コード配列を組み込んだ。２つのシグナルのうちの１つのみを含むか、またはいずれも含まないさらなる構築物を使用して、所望のＭＨＣクラス−ＩＩ交差提示についての各配列の必要性を評価した（図１ａ）。続いてＲＮＡを線状化プラスミドからｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写し、必要な拘束要素ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１を発現する異なるＡＰＣ内にトランスフェクトした。クローン３Ｈ１０による特異的抗原認識時のＩＦＮ−γ産生の測定により、ＤＣとの共培養実験において内因的に翻訳され、プロセシングされたタンパク質、ならびにＥＢＮＡ−３Ｃ  ＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡをトランスフェクトしたミニ−ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞系（ｍＬＣＬ）の効果的なＭＨＣクラス−ＩＩ交差提示の検出が可能となった（図１ｂ）。ＬＡＭＰ−１  ＥＲ移行シグナルを含有するｉｖｔ−ＲＮＡのみが検出可能なＴ細胞活性化を引き起こした。ＥＢＮＡ−３Ｃ−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡにより達成した顕著なＭＨＣクラス−ＩＩ提示と比較して、ＬＡＭＰ−１シグナルペプチドのみが少しの交差提示能力を与えた。本発明者らは、ＥＢＶ−抗原ＢＮＲＦ１のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１拘束性エピトープに特異的な１つのさらなるＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを使用してこのデータを確認した（データは示さず）。
【０１５６】
次に、本発明者らは３Ｈ１０Ｔ細胞を使用して、ＣｒｏｓｓＴＡｇシグナルが、１）タンパク質分泌および再取り込みまたは２）細胞内部提示経路を介してＭＨＣクラス−ＩＩ提示を引き起こすかどうかを解明した。このために、本発明者らは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１陽性またはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１陰性ＤＣにＥＢＮＡ−３Ｃ−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトおよび非トランスフェクトＤＣを、全ての可能な組合せ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１陽性／陰性）において共インキュベートし、その後、３Ｈ１０細胞と共培養した。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１陽性ＤＣに抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡをトランスフェクトした場合のみＡＰＣの認識を検出した。潜在的に取り込まれた非トランスフェクトＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１陽性ＤＣ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１陰性ＤＣによって分泌された、プロセシングされた抗原の認識は検出されなかった（図８）。
【０１５７】
抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ誘発性ＣＤ４０Ｌ発現
抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を選択的に富化するための迅速な方法を開発するために、本発明者らは、応答ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＣＤ４０Ｌ発現を誘発する抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡトランスフェクトＤＣの能力を評価した。このために、本発明者らは、蛍光トレーシング染料により３Ｈ１０Ｔ細胞を染色し、それらを総細胞の１０％、５％、１％または０．１％の最終濃度で自己ＰＢＬと混合した（図１ｃ）。これらの異なる画分を、ＥＢＮＡ−３Ｃ−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクト自己ＤＣと共培養し、ＣＤ４０Ｌ発現について染色した。６時間の共培養において、本発明者らは、ＥＢＮＡ−３Ｃ特異的３Ｈ１０細胞上でかなりのＣＤ４０Ｌ発現を検出したが、自己ＰＢＬ上で限界ＣＤ４０Ｌ発現のみを観察した。最低濃度の３Ｈ１０細胞（０．１％）でさえも、ＣＤ４０Ｌ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞の後の選別により、６６％の３Ｈ１０細胞の集団が生じた。
【０１５８】
代替のＥＲ移行シグナル配列
クローン３Ｈ１０による特異的抗原認識時にＩＦＮ−γ産生を測定して、本発明者らは、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡによりタグ化した異なるＥＢＮＡ−３ＣおよびＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡと異なる代替物をトランスフェクトしたＡＰＣとの共培養実験において内因的に翻訳され、プロセシングされたタンパク質の効果的なＭＨＣクラス−ＩＩ交差提示を検出することができた（図１１）。
【０１５９】
効果的なＭＨＣクラス−ＩＩおよびＭＨＣクラス−Ｉ提示
本発明者らは、ＣｒｏｓｓＴＡｇシグナルの使用が、ＭＨＣクラス−ＩＩ提示だけでなく、ＭＨＣクラス−Ｉ提示も促進することを示すことができた（図１２）。
【０１６０】
同じｉｖｔ−ｍＲＮＡ分子によってコードされるいくつかの抗原の効果的な提示
さらに本発明者らは、同じｉｖｔ−ｍＲＮＡによって異なる抗原に由来するいくつかのエピトープを提示する効果的な手法を確立することができた。図１２に示されるように、異なる抗原に由来する２つのエピトープを含む構築物を発現する抗原提示細胞は、ＥＢＮＡ−３Ｃ特異的クローン３Ｈ１０およびチロシナーゼ特異的クローンＩＶＳＢを活性化する。したがって、２つの異なるエピトープを有するｉｖｔ構築物は両方のエピトープの提示を促進する。
【０１６１】
ＲＮＡパルス（RNA-pulsed）ＤＣによるＰＢＬの活性化
ハイスループット手法への途中で、本発明者らは、ＣＤ４＋Ｔ細胞プライミングのために並行して複数の候補抗原を使用する可能性を調査した。したがって、分離されていないＰＢＬに存在するＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−シグナルと融合した４個の異なるＣ／Ｔ抗原（ＧＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＳＸ−４およびＸＡＧＥ−１）をコードするｉｖｔ−ＲＮＡ種をトランスフェクトしたＤＣを使用して活性化した。記載されているように（Javorovic, M.et al. (2008) Inhibitory effect of RNA pool complexity on stimulatory capacity of RNA-pulsed dendritic cells. J Immunother 31(1): 52-62.）、エレクトロポレーションにより各々のｉｖｔ−ＲＮＡを個々にＤＣにトランスフェクトした。本発明者らは、フローサイトメトリーによる共刺激分子発現のレベルによってトランスフェクトしたＤＣの成熟状態を測定した。本発明者らのＤＣは、共刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６）およびＨＬＡクラスＩＩを高発現する成熟表現型を示した（図９ａ）。トランスフェクション効率を評価するために、トランスフェクトしたＤＣから抽出したｍＲＮＡに由来する抗原ｃＤＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。獲得したデータは、エレクトロポレーション後、Ｃ／Ｔ抗原ｍＲＮＡコピー数の１．５＊１０５〜２＊１０７倍の範囲の増加を示した（図９ｂ）。さらに、対照ｅＧＦＰ  ｉｖｔ−ＲＮＡによるトランスフェクションの１２時間後にフローサイトメトリーによって検出されたように、発現されたＤＣの約６８％は緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を増強した（データは示さず）。
【０１６２】
抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ＲＮＡによるトランスフェクション後、４つの別々のＤＣ集団をプールし、同時に使用して、健常ドナーの分離されていない自己ＰＢＬをプライミングした。その後の発現手順は２ラウンドのＡＰＣ刺激を含んだ。開始ＤＣ調製物の凍結したアリコートを解凍し、再刺激培養のために使用した。
【０１６３】
活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離
各々、１４日間隔のＤＣ共培養後、プライミングした自己ＰＢＬは細胞数の３〜４倍の全体的な増加を示した。ＣＤ４：ＣＤ８比の変化を複数の時点において測定して、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の発現を追跡した。さらに、ＰＢＬ試料を、ＣＤ４０遮断抗体の存在下で抗原が負荷されたＤＣと共インキュベートし、続いてＣＤ４、ＣＤ１３７およびＣＤ４０Ｌに対する特異的ｍＡｂを使用してフローサイトメトリーによって分析した（図２ａ）。モニターした期間にわたって、ＣＤ４：ＣＤ８比は０日目に１．７から２７日目に０．７に反転し、これはＣＤ８＋Ｔ細胞の増強した増殖を反映している（データは示さず）。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団内で、ＣＤ４０Ｌ陽性Ｔ細胞のパーセンテージは１３日目に４．６％から２７日目に３０％超に上昇した。対照的に、ＣＤ１３７単一陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞（Schoenbrunn et al., A converse 4-1BB and CD40 ligand expression pattern delineates activated regulatory T cells (Treg) and conventional T cells enabling direct isolation of alloantigen-reactive natural Foxp3+ Treg.J Immunol. 2012;189(12):5985-94.）であると記載されている推定調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数は約３６％低下した。
【０１６４】
３回の刺激サイクルの後、ＣＤ４０Ｌ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＢＬ培養物から富化し、ＦＡＣＳによって９６ウェルプレート内に直接クローニングした（図１０）。クローニングしたＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖させた。クローニング手順からの過剰な細胞を、バルクＣＤ４０Ｌ陽性（ＣＤ４０Ｌｐｏｓ）およびＣＤ４０Ｌ陰性（ＣＤ４０Ｌｎｅｇ）ＣＤ４＋Ｔ細胞系として樹立した。これらの分析により、ＣＤ４０Ｌｐｏｓにより選別したＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｃ／Ｔ抗原特異的再刺激後、１４日の間にほぼ４倍増殖し、ＲＮＡトランスフェクトＡＰＣとの共培養後、ＣＤ４０ＬｎｅｇＴ細胞と比較して顕著に多い量のＩＦＮ−γを遊離したので、Ｃ／Ｔ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球の首尾良い富化が示された（図２ｂ、ｃ）。
【０１６５】
Ｃ／Ｔ抗原反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンについてのスクリーニング
本発明者らは、ＦＡＣＳクローニングの１２日後に開始して、ＩＦＮ−γ遊離アッセイにおいて抗原反応性について９６ウェル培養物中で増殖させたＴ細胞クローンを試験した（図３ａ）。４つ全ての抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ＲＮＡが負荷されたＤＣの混合物を使用した共培養により、非反応性および非特異的Ｔ細胞クローンと一緒に、複数の抗原反応性Ｔ細胞クローンが存在したことが示された。ごくわずかの例外を除いて、抗原反応性Ｔ細胞クローンは、偽トランスフェクトＤＣとの共培養においてバックグラウンド活性化がないことを示した。
【０１６６】
これらの観察結果を検証するために、本発明者らは、ＡＰＣの代替源としてｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトｍＬＣＬを使用して１日後に選択したクローンを再試験した。ＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦ遊離アッセイにより、ＤＣによる以前の結果を確認した（図３ｂ）。さらに、選択したＴ細胞クローンをＣＤ４およびＣＤ８表面発現について染色し、全てがＣＤ４共受容体を発現することを見出した（図３ｃ）。
【０１６７】
抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの分子および機能的特徴付け
抗原反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの個々の抗原特異性を分析するために、本発明者らは、続いて、単一種の抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ＲＮＡをトランスフェクトしたＡＰＣの異なる集団と個々のクローンを共培養した。標準的なＥＬＩＳＡを使用してＩＦＮ−γ分泌により応答を測定した（図４）。本発明者らは、プライミングのために使用した４つのＣ／Ｔ抗原の各々を認識する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを検出した。Ｔ細胞クローンは、偽トランスフェクトＡＰＣによるバックグラウンド活性化も、それらがプライミングの間に曝露される他の抗原との検出可能な、いかなる交差反応もないことを示した。
【０１６８】
ＴＣＲレパートリー分析を使用して、本発明者らは、多数の単離したクローンから４つの特有のＴ細胞受容体配列を同定した。ＭＨＣ拘束アッセイにより、異なるＴ細胞が異なるＭＨＣクラスＩＩアロタイプによって提示されるエピトープを認識したことが示された（データは示さず）。本発明者らは、このシグナルを有さないｉｖｔ−ＲＮＡを備えているＤＣが、単離したＣＤ４＋Ｔ細胞クローンによってＩＦＮ−γ分泌を誘発できなかったという事実によってＣｒｏｓｓＴＡｇシグナルと融合した抗原を有する重要性を実証した（図５ａ）。活性化誘発性ＩＦＮ−γ分泌は、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンが、抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ＲＮＡをトランスフェクトされたＡＰＣと共培養された場合のみ引き起こされた。１つの例外はＧＡＧＥ−１−ＴＣＲ−２を発現するＴ細胞クローンであり、それはまた、実質的に低いレベルではあるが、それぞれの選別シグナルを欠くＲＮＡをトランスフェクトされたＡＰＣを認識した。
【０１６９】
本発明者らの単離したＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの抗原特異性を確認するために、本発明者らは、ＡＰＣに組換えタンパク質を負荷した。ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは、抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ＲＮＡトランスフェクトＡＰＣとの共培養において見られる活性化に匹敵するタンパク質が負荷されたＡＰＣに対する陽性ＩＦＮ−γ分泌を示した（図５ｂ）。
【０１７０】
直接的なＭＨＣクラス−ＩＩエピトープ同定
これらの４つのクローンに関して、ＭＨＣクラス−ＩＩエピトープ（ＤＥＰＩ）を直接マッピングする方法（Milosevic, S.et al. (2006) Identification of major histocompatibility complex class II-restricted antigens and epitopes of the Epstein-Barr virus）を使用して、それらがＭＨＣクラス−ＩＩ分子と関連して認識するエピトープと定義した。本発明者らは、短い重複ＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡ構築物を有する単離した抗原断片の認識を立証し、最小エピトープ配列をさらに引き渡すためにそれらを使用した（図６ａ、ｂ）。これによって、ＧＡＧＥ−１−ＴＣＲ−１は、ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１：０１によって提示されたＧＡＧＥ−１７６−９８エピトープを認識することが見出された。興味深いことに、２つのＸＡＧＥ−１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは、２つの異なるＭＨＣクラス−ＩＩアロタイプ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３：０２およびＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１：０１）によって提示された同一のＸＡＧＥ−１３７−４９エピトープを認識した。
【０１７１】
Ｃ／Ｔ−抗原特異的ＴＣＲのトランスジェニック発現
ＴＣＲレパートリー分析後、本発明者らは、ＴＣＲ発現ベクターを使用して単離したＴＣＲ配列を再構築した。３Ｈ１０クローンのＣＤ４＋Ｔ細胞（ＥＢＮＡ−３Ｃ特異的およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１拘束性）に、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンＧＡＧＥ−１−ＴＣＲ−２、ＸＡＧＥ−１−ＴＣＲ−１またはＴＣＲ−２の対応するＴＣＲ−α−およびβ−鎖をトランスフェクトした。ＴＣＲにより操作した３Ｈ１０細胞をＣ／Ｔ抗原が負荷されたＡＰＣと共培養した（図７）。ＩＦＮ−γ分泌を測定することによって、本発明者らは、全てのＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの特異性が、それらの内因性ＥＢＶ特異的ＴＣＲを損なわずに３Ｈ１０細胞に首尾良く移入したことを示した。したがって、ＴＣＲトランスフェクション後、３Ｈ１０細胞は、ＥＢＮＡ−３Ｃ−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトＡＰＣおよび対応するＣ／Ｔ抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ｉｖｔ−ＲＮＡをトランスフェクトしたＡＰＣを認識した。
【０１７２】
方法
遺伝的構築物
ｐＧＥＭ−ｅＧＦＰ−Ａ１２０ベクターを、ＣｒｏｓｓＴＡｇベクター（Ｓ．Ｍｉｌｏｓｅｖｉｃ）についての開始構築物として使用した。元のｐＧＥＭベクターのこのポリＡ１２０バリアントは転写ＲＮＡをより高い安定性にし、改善されたタンパク質発現を導いた。プラスミドは、ｅＧＦＰ  ｃＤＮＡの５’末端において特有のＡｇｅＩ部位、および３’末端において特有のＥｃｏＲＩ部位をさらに含有した。ポリ−Ａ尾部の後にＳｐｅＩ部位が続き、これはｉｖｔ−ＲＮＡ産生のためのプラスミドの線状化を可能にする。
【０１７３】
ｅＧＦＰを、ＣｒｏｓｓＴＡｇターゲティングシグナルをコードするｃＤＮＡと置き換えることによってｐＧＥＭ−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０プラスミドをクローニングした。ＣｒｏｓｓＴＡｇ配列は、ＤＣ−ＬＡＭＰ（受託：ＮＰ＿０５５２１３、ａａ３７６−４１６）の膜貫通および細胞質ドメインと５’で融合したヒトリソソーム関連膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１、受託：ＮＰ＿００５５５２、ａａ１−２８）のＥＲ移行シグナルからなる。抗原をコードするｃＤＮＡの挿入のために、異なるＣｒｏｓｓＴＡｇ配列を、ＬＡＭＰ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を破壊せずにＮｈｅＩ、ＫｐｎＩおよびＰｓｔＩ制限部位を含有する１８−ｂｐスペーサーによって分離する。コドン最適化Ｃｒｏｓｓ−ＴＡｇ配列を、コンピュータークローニングソフトウェアを使用して仮想的に設計し、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ）によって合成した。続いて完全なＣｒｏｓｓＴＡｇ配列を、ＡｇｅＩ（５’末端）およびＥｃｏＲＩ（３’末端）制限部位を使用してプラスミドＤＮＡから切断し、同様に消化したｐＧＥＭ−Ａ１２０ベクターのＭＣＳ内にライゲーションした。種々のＣ／Ｔ抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ構築物（ｐＧＥＭ−ＧＡＧＥ−１−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０、ｐＧＥＭ−ＭＡＧＥ−Ａ４−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０、ｐＧＥＭ−ＮＹ−ＥＳＯ−１−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０、ｐＧＥＭ−ＳＳＸ−４−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０、ｐＧＥＭ−ＸＡＧＥ−１−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０）のクローニングのために、抗原ｃＤＮＡを、フォワードおよびリバース遺伝子特異的プライマーを使用してＰＣＲ（受託：ＧＡＧＥ−１、Ｕ１９１４２；ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＭ＿００１０１１５５０；ＮＹ−ＥＳＯ１、ＡＪ００３１４９；ＳＳＸ−４、Ｕ９０８４１；ＸＡＧＥ−１、ＡＦ２５１２３７）によってプラスミドから増幅させ、ＮｈｅＩおよびＰｓｔＩ／ＮｏｔＩ制限部位によりライゲーションした。ＰＣＲ反応のために使用したプライマーは要求に応じて全て利用可能である。全ての抗原配列を、開始ＯＲＦを破壊せずにｐＧＥＭ−ＣｒｏｓｓＴＡｇ−Ａ１２０の分割したＣｒｏｓｓＴＡｇシグナルに挿入した。ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの検証のために、相補的オリゴヌクレオチドを合成し（Ｍｅｔａｂｉｏｎ）、アニーリングした。アニーリングにより生成した付着末端を、ＣｒｏｓｓＴＡｇベクターへのこれらの短い抗原配列の直接的なライゲーションのために使用した。
【０１７４】
ｉｖｔ−ＲＮＡの産生
ＳｐｅＩ線状化後、ｐＧＥＭプラスミドを、製造業者の指示書に従って、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して単一種のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ｉｖｔ）−ＲＮＡ産生のための鋳型として使用した。品質管理のために、ｉｖｔ−ＲＮＡ産物の長さをアガロースゲル電気泳動によって分析した。濃度および純度をＮａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。
【０１７５】
細胞培養
単球由来３ｄ  ｍＤＣを、Ｂｕｒｄｅｋら（Journal of Translational Medicine 2010, 8:90）に記載されているように生成し、トランスフェクトした。ｍＤＣおよびミニエプスタイン・バール・ウイルス（mini-Epstein-Barr virus）（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球様細胞系（ｍＬＣＬ）のＲＮＡトランスフェクションを、Ｂｕｒｄｅｋら（Three-day dendritic cells for vaccine development: Antigen uptake, processing and presentation. Journal of Translational Medicine 2010, 8:90）に記載されているようにエレクトロポレーションによって達成した。
【０１７６】
ｍＬＣＬを以前に記載されているようにＬＣＬ培地中で懸濁培養として成長させた（Milosevic, S.et al. (2006) Identification of major histocompatibility complex class II-restricted antigens and epitopes of the Epstein-Barr virus）。ｍＬＣＬのタンパク質負荷を、２５μｇの組換えヒトＧＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＳＸ−４またはＸＡＧＥ−１タンパク質（ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内での発現後、６ｘ−ｃＨｉｓタグにより富化した）の存在下で１６時間、２ｍｌのＬＣＬ培地入りの２４ウェルプレート中で２＊１０６個の細胞を培養することによって達成した。インキュベーション期間の終わりに、ＲＰＭＩ  １６４０を使用して細胞を２回洗浄し、特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンと共培養した。
【０１７７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
トランスフェクトおよび非トランスフェクトＤＣの細胞内ＲＮＡを単離し、対応するｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ用のＦｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）（Ｒｏｃｈｅ）を使用してオリゴ−ｄＴプライマーにより合成した。抗原鋳型数の差を、製造業者のマニュアルに従って、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。ＲＴ−ＰＣＲ反応のために使用した遺伝子特異的プライマー（αＥｎｏｌａｓｅ、ＧＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＳＸ−４およびＸＡＧＥ−１）は要求に応じて全て利用可能である。測定をハウスキーピング遺伝子αＥｎｏｌａｓｅに正規化し、ΔΔＣＰ法に従って分析した。
【０１７８】
Ｔ細胞およびＤＣの表面表現型検査
Ｔ細胞およびＤＣによって発現された表面マーカーを以下の抗体により検出した：ＰＥがコンジュゲートしたＣＣＲ７特異的抗体（３Ｄ１２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｈｚ４５０がコンジュゲートしたＣＤ４特異的抗体（ＲＰＡ−Ｔ４）、Ｈｚ５００がコンジュゲートしたＣＤ８特異的抗体（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＣＤ１４特異的抗体（Ｍ５Ｅ２）、ＰＥがコンジュゲートしたＣＤ４０特異的抗体（５Ｃ３）、ＰＥがコンジュゲートしたＣＤ４０Ｌ特異的抗体（ＴＲＡＰ１）、ＰＥがコンジュゲートしたＣＤ８０特異的抗体（Ｌ３０７．４）、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＣＤ８３特異的抗体（ＨＢ１５ｅ）、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＣＤ８６特異的抗体（２３３１）、ＡＰＣがコンジュゲートしたＣＤ１３７特異的抗体（４Ｂ４−１）、ＦＩＴＣがコンジュゲートしたＤＣ−ＳＩＧＮ特異的抗体（ＤＣＮ４６）、ＰＥがコンジュゲートしたＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体（Ｇ４６−６）（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。洗浄後、細胞を４℃にて３０分間染色し、ヨウ化プロピジウム（propidium iodid）（２μｇ／ｍｌ）を、死細胞を除去するために加えた。全ての表面マーカーの発現をフローサイトメトリーによって分析した（ＬＳＲＩＩ、ＢＤ）。獲得後、ＦｌｏｗＪｏ８ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用してデータ分析を行った。Ｔ細胞上でのＣＤ４０Ｌ表面発現の分析を、２μｇ／ｍｌのαＣＤ４０抗体（Ｍ．Ｆｒｅｎｔｓｃｈ、Ｂｅｒｌｉｎ−Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓによって提供されたクローンＧ２８．５）を使用して記載されるように実施し（Frentsch, M. et al. (2005) Direct access to CD4+ T cells specific for defined antigens according to CD154 expression. Nat Med 11(10): 1118-1124）、Ｔ細胞：ＡＰＣ共培養の開始から６時間後に評価した。
【０１７９】
ＲＮＡトランスフェクトＤＣによるＰＢＬのデノボプライミング
別の集団において、健常ドナーの３ｄ  ｍＤＣに、Ｃ／Ｔ−抗原ＧＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＳＳＸ−４およびＸＡＧＥ−１をコードする２つの単一種のＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡをトランスフェクトした。エレクトロポレーション後、トランスフェクトｍＤＣを採取し、この混合物の混合したｍＤＣを、１：２の比の範囲内で末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と共培養し、それはｍＤＣ生成のプロセスにおいてＰＢＭＣのプラスチック接着の間、非接着性であった。細胞を加湿雰囲気において３７℃にて培養した。インターロイキン−２（ＩＬ−２、２０Ｕ／ｍｌ；Ｃｈｉｒｏｎ  Ｂｅｈｒｉｎｇ）および５ｎｇのＩＬ−７／ｍｌ（Ｐｒｏｍｏｋｉｎｅ）を１日後に加え、次いで１日おきに加えた。ＰＢＬ共培養のために使用しなかった混合したｍＤＣを凍結保存し、デノボ誘発性ＰＢＬ培養の再刺激のために解凍した。
【０１８０】
抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の単離および増殖
プライミングしたＰＢＬを、２：１の比において、記載されているように（Frentsch, M., (2005) Direct access to CD4+ T cells specific for defined antigens according to CD154 expression. Nat Med 11(10): 1118--1124..）、αＣＤ４０抗体の存在下で６時間、ＣｒｏｓｓＴＡｇ−ＲＮＡトランスフェクトｍＤＣ（４つの抗原ミックス）と共培養した。刺激期間の後、細胞をαＣＤ４−およびαＣＤ４０Ｌ−特異的抗体（ＳＫ３およびＴＲＡＰ１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により染色した。死細胞を除去するためにＤＡＰＩを加えた。ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、生ＣＤ４０Ｌ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞を丸底９６ウェルプレートのウェル内に単一細胞として選別した。９６ウェルプレートにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを、抗原−ＣｒｏｓｓＴＡｇ  ｉｖｔ−ＲＮＡトランスフェクトｍＬＣＬ、支持細胞およびＩＬ−２を使用して増殖させた。
【０１８１】
サイトカイン遊離アッセイ
活性化誘発性サイトカイン分泌を測定するために、５＊１０４個のＴ細胞を、加湿雰囲気において３７℃にて、丸底９６ウェルプレート内の２００μｌのＴ細胞培地中で１＊１０５個のｉｖｔ−ＲＮＡが負荷されたＡＰＣ（ＤＣ／ｍＬＣＬ）と共培養した。偽トランスフェクトＡＰＣを有するか、または刺激細胞を有さないＴ細胞を陰性対照として使用した。１６時間の共培養後、上清を採取し、ＯｐｔＥＩＡヒトＩＦＮ−γまたはＧＭ−ＣＳＦ  Ｓｅｔ（両方ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を使用して酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。
【０１８２】
ｉｖｔ−ＲＮＡベースのＴＣＲ遺伝子移入
ＴＣＲ−α−およびＴＣＲ−β−鎖の再配列および配列を、記載されているように（Steinle, A., et al. (1995) In vivo expansion of HLA-B35 alloreactive T cells sharing homologous T cell receptors: evidence formaintenance of an oligoclonally dominated allospecificity by persistent stimulationwith an autologous MHC/peptide complex. J Exp Med 181(2): 503-513.）、ＴＣＲ−Ｖα−およびＴＣＲ−Ｖβ−特異的プライマーのパネルを使用してＰＣＲによって決定した。それらのネズミ対応物による両方のＴＣＲ鎖の定常領域の置換後、コドン最適化ＴＣＲ−α−およびＴＣＲ−β−鎖配列を合成し、ＲＮＡ産生のために発現ベクター内にクローニングした。これらのＴＣＲ配列の特異性を検証するために、Ｔ細胞クローン３Ｈ１０の細胞（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１１：０１拘束性、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ−３Ｃ特異的）をＴＣＲ−α−およびＴＣＲ−β−ｉｖｔ−ＲＮＡと共トランスフェクトし、サイトカイン分泌アッセイのために使用した。
【０１８３】
本出願は以下の実施形態をさらに含む：
【０１８４】
実施形態１：以下のステップ：
Ａ）抗原提示細胞における、
−  少なくとも１つの抗原またはその断片、
−  抗原のＮ末端の前の小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  抗原のＣ末端の後のエンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメイン
を含む少なくとも１つの融合タンパク質の発現、
Ｂ）抗原提示細胞によって発現される抗原に特異的な抗原特異的Ｔリンパ球を活性化するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのステップＡ）の抗原提示細胞へのＴリンパ球を含む細胞集団の曝露
を含む、ヒト抗原特異的Ｔリンパ球を生成する方法。
【０１８５】
実施形態２：ステップＢ）における曝露が、抗原提示細胞を、Ｔリンパ球を含む細胞集団と共培養するステップである、実施形態１に記載の方法。
【０１８６】
実施形態３：ステップＡ）の発現が、一過性発現または安定発現、好ましくは一過性発現である、実施形態１または２に記載の方法。
【０１８７】
実施形態４：一過性発現が、少なくとも１つの融合タンパク質をコードするｉｖｔ−ＲＮＡを導入することによって実施される、実施形態３に記載の方法。
【０１８８】
実施形態５：Ｃ１）活性化および／または抗原特異的Ｔリンパ球の富化のステップをさらに含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１８９】
実施形態６：活性化Ｔリンパ球の富化が、以下のステップ：
（ａ）活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団を、活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現されるマーカータンパク質と特異的に結合する少なくとも１つの結合分子または所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも１つのＭＨＣ分子と接触させるステップ、
（ｂ）少なくとも１つの結合分子または所望の抗原のエピトープを提示する少なくとも１つのＭＨＣ分子が結合しているＴリンパ球を単離するステップ
を含む、実施形態５に記載の方法。
【０１９０】
実施形態７：マーカータンパク質と特異的に結合する結合分子が、抗体、抗体の誘導体、抗体の断片、またはさらなる分子との上述のコンジュゲートである、実施形態６に記載の方法。
【０１９１】
実施形態８：活性化Ｔリンパ球によって特異的に発現される少なくとも１つのマーカータンパク質が、Ｏｘ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、ＩＬ−２受容体、インターフェロンγ、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αを含む群から選択される、実施形態６または７に記載の方法。
【０１９２】
実施形態９：ステップ（ａ）において、細胞を、ＣＤ４と特異的に結合する結合分子とさらに接触させる、実施形態８に記載の方法。
【０１９３】
実施形態１０：ステップ（ａ）において、細胞を、ＣＤ８と特異的に結合する結合分子とさらに接触させる、実施形態８または９に記載の方法。
【０１９４】
実施形態１１：活性化ＣＤ４  Ｔ細胞を選択するステップが、以下のステップ：
（ａ１）抗原提示細胞および抗原特異的Ｔリンパ球のＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの間の相互作用を遮断し、Ｔリンパ球の表面にＣＤ４０Ｌを蓄積するために、ステップＢ）の細胞集団を、ＣＤ４０に対する抗体と接触させるステップ、
（ａ２）活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団を、抗ＣＤ４０Ｌ抗体と接触させるステップ、
（ｂ）抗ＣＤ４０Ｌ抗体および抗ＣＤ４抗体によりマークしたＴリンパ球を単離するステップ
を含む、実施形態６に記載の方法。
【０１９５】
実施形態１２：Ｃ２）以下のステップ：
ａ）
（ｉ）ステップＡ）において定義される抗原提示細胞、および
（ｉｉ）対照抗原提示細胞との、または抗原提示細胞の不在下での、
活性化抗原特異的Ｔリンパ球を含む細胞集団の増殖した細胞クローンのインキュベーション、
ｂ）各細胞クローンについての（ｉ）および（ｉｉ）とのインキュベーションの活性化プロファイルの比較、
ｃ）ｂ）の比較に基づいた抗原特異的細胞クローンの同定
を含む、抗原特異的Ｔリンパ球の同定
のステップをさらに含み、（ｉｉ）ではなく（ｉ）による活性化が、細胞クローンが抗原特異的であることを示す、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
実施形態１３：ステップＢ）において、抗原提示細胞が、少なくとも１回、任意選択で少なくとも２回、任意選択で少なくとも３回、任意選択で３回、Ｔリンパ球を含む細胞集団に加えられる、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
実施形態１４：抗原提示細胞の反復される添加の間の時間間隔が、７〜２１日、好ましくは１２〜１６日、より好ましくは１３〜１５日、さらにより好ましくは１４日である、実施形態１２に記載の方法。
【０１９８】
実施形態１５：ＥＲ移行シグナル配列が、エンドソーム／リソソーム関連タンパク質に由来する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９９】
実施形態１６：エンドソーム／リソソーム関連タンパク質が、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＤ６８およびＣＤ１ｂ、好ましくはＬＡＭＰ１を含む群から選択される、実施形態１５に記載の方法。
【０２００】
実施形態１７：エンドソーム／リソソームターゲティング配列が、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０１】
実施形態１８：エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインが、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０２】
実施形態１９：ＥＲ移行シグナル配列がヒトである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０３】
実施形態２０：エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインがヒトである、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
実施形態２１：ＥＲ移行シグナルが、配列番号３３の配列またはその断片を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
実施形態２２：ＥＲ移行シグナル配列が、配列番号３４の配列からなる、実施形態２０に記載の方法。
【０２０６】
実施形態２３：抗原提示細胞が、樹状細胞、活性化Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＥＢＶ形質転換リンパ芽球様細胞系、好ましくは樹状細胞、より好ましくは単球由来樹状細胞から選択される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０７】
実施形態２４：抗原提示細胞が抗原提示細胞の異なる集団を含み、各集団が異なる抗原融合タンパク質を発現する、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０８】
実施形態２５：抗原提示細胞が、以下のステップ：
ｉ）単球の準備、
ｉｉ）ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉ）の単球のインキュベーション、
ｉｉｉ）成熟カクテルと組み合わせたＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦとのステップｉｉ）の単球のインキュベーション
を含む方法によって生成される成熟樹状細胞である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０９】
実施形態２６：成熟カクテルが、ＩＬ−β、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＰＧＥ２およびＴＬＲ３アゴニストの組合せを含む、実施形態２５に記載の方法。
【０２１０】
実施形態２７：ステップｉｉ）のインキュベーションが少なくとも２日継続する、実施形態２５または２６に記載の方法。
【０２１１】
実施形態２８：ステップｉｉｉ）のインキュベーションが、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間継続する、実施形態２５から２７に記載の方法。
【０２１２】
実施形態２９：ＴＬＲ７／８アゴニストがＲ８４８であり、ＴＬＲ３アゴニストがポリ（Ｉ：Ｃ）である、実施形態２８に記載の方法。
【０２１３】
実施形態３０：Ｔリンパ球を含む細胞集団が、末梢血リンパ球の集団である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２１４】
実施形態３１：Ｔリンパ球を含む細胞集団が、分離されていない末梢血リンパ球の集団である、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２１５】
実施形態３２：細胞集団が、Ｔリンパ球、好ましくはＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔリンパ球について富化される、先行する実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２１６】
実施形態３３：融合タンパク質が少なくとも２つの抗原またはその断片を含む、先行する実施形態のいずれかの方法。
【０２１７】
実施形態３４：実施形態１から３３に記載の方法によって得ることができるＴリンパ球。
【０２１８】
実施形態３５：
−  ヒト小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列、ならびに
−  エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメイン
を含む発現ベクター。
【０２１９】
実施形態３６：ベクターが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｍＲＮＡ転写のためのプロモーターを含む、実施形態１に記載の発現ベクター。
【０２２０】
実施形態３７：ＥＲ移行シグナル配列が、エンドソーム／リソソーム関連タンパク質に由来する、実施形態３５または３６に記載の発現ベクター。
【０２２１】
実施形態３８：エンドソーム／リソソーム関連タンパク質が、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＣＤ６８、ＣＤ１ｂを含む群から選択される、実施形態３５から３７のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２２２】
実施形態３９：エンドソーム／リソソームターゲティング配列が、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来する、実施形態３５から３８のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２２３】
実施形態４０：エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインが、ＬＡＭＰ１またはＤＣ−ＬＡＭＰ、好ましくはＤＣ−ＬＡＭＰに由来する、実施形態３５から３９のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２２４】
実施形態４１：ＥＲ移行シグナル配列がヒトである、実施形態３５から４０のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２２５】
実施形態４２：エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインがヒトである、実施形態３５から４１のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２２６】
実施形態４３：ＥＲ移行シグナル配列が、配列番号３３の配列またはその断片を含む、実施形態３５から４２のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２２７】
実施形態４４：ＥＲ移行シグナルが、配列番号３４の配列からなる、実施形態３５から４３のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２２８】
実施形態４５：エンドソーム／リソソームターゲティング配列が、配列番号３８のモチーフを含む、実施形態３５から４４のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２２９】
実施形態４６：エンドソーム／リソソームターゲティングシグナル配列が、配列番号３９の配列である、実施形態３５から４５のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２３０】
実施形態４７：エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含む膜貫通および細胞質ドメインが、配列番号３５またはその断片などの、配列番号５４の配列またはその断片を含む、実施形態３５から４６のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２３１】
実施形態４８：ＥＲ移行シグナル配列と、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に制限部位をさらに含む、実施形態３５から４７のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２３２】
実施形態４９：ベクターが、ヒト小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列と、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に挿入される少なくとも１つの抗原またはその断片をさらに含む、実施形態３５から４８のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２３３】
実施形態５０：ベクターが、ヒト小胞体（ＥＲ）移行シグナル配列と、エンドソーム／リソソームターゲティング配列を含むヒト膜貫通および細胞質ドメインとの間に挿入される少なくとも２つの抗原またはその断片を含む、実施形態４９のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２３４】
実施形態５１：ベクターが、抗原の完全長アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、実施形態３５から５０のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２３５】
実施形態５２：ベクターが、抗原のアミノ酸配列をコードする核酸配列の断片を含む、実施形態３５から５１のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２３６】
実施形態５３：抗原が腫瘍抗原またはウイルス抗原である、実施形態５２に記載の発現ベクター。
【０２３７】
実施形態５４：腫瘍抗原が、ウイルス腫瘍抗原、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原および患者特異的突然変異を保有し、患者の腫瘍細胞において発現される抗原からなる群から選択される、実施形態５３に記載の発現ベクター。
【０２３８】
実施形態５５：腫瘍抗原が腫瘍関連抗原である、実施形態３５から５４のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２３９】
実施形態５６：腫瘍関連抗原が、がん／精巣抗原（Ｃ／Ｔ抗原）である、実施形態３５から５５のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２４０】
実施形態５７：Ｃ／Ｔ抗原が、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＹ−ＥＳＯ１、腫瘍／精巣抗原１Ｂ、ＧＡＧＥ−１、ＳＳＸ−４、ＸＡＧＥ−１、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＣＰ−１、ＳＳＸ−２、ＳＳＸ−４、ＣＴＺ９、ＣＴ１０、ＳＡＧＥおよびＣＡＧＥを含む群から選択される、実施形態３５から５６のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２４１】
実施形態５８：Ｃ／Ｔ抗原が、ＧＡＧＥ−１、ＳＳＸ−４およびＸＡＧＥ−１からなる群から選択される、実施形態３５から５７のいずれかに記載の発現ベクター。
【０２４２】
実施形態５９：抗原特異的Ｔリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成のための実施形態３５から５８のいずれか１つに記載の発現ベクターの使用。
【０２４３】
実施形態６０：実施形態３４に記載のＴリンパ球を哺乳動物に投与するステップを含む、がんを予防または治療する方法に使用するためのＴリンパ球。
【０２４４】
実施形態６１：実施形態１から３３のいずれか１つに記載の方法のステップを含み、活性化抗原特異的リンパ球からＴＣＲを単離するステップをさらに含む、抗原特異的ＴＣＲを生成する方法。
【０２４５】
実施形態６２：実施形態３４に記載のリンパ球から単離されたＴＣＲ。
【０２４６】
実施形態６３：
−  配列番号５に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含むＴＣＲα鎖、
−  配列番号６に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含むＴＣＲβ鎖
を含む、ＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ。
【０２４７】
実施形態６４：
−  配列番号５と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、ＴＣＲα鎖、
−  配列番号６と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、ＴＣＲβ鎖
を含む、実施形態６３に記載のＧＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ。
【０２４８】
実施形態６５：
−  配列番号１３に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含むＴＣＲα鎖、
−  配列番号１４に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含むＴＣＲβ鎖
を含む、ＳＳＸ−４に特異的なＴＣＲ。
【０２４９】
実施形態６６：
−  配列番号１３と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号９に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、ＴＣＲα鎖、
−  配列番号１４と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、ＴＣＲβ鎖
を含む、実施形態６５に記載のＳＳＸ−４に特異的なＴＣＲ。
【０２５０】
実施形態６７：
−  配列番号２１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含むＴＣＲα鎖、
−  配列番号２２に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含むＴＣＲβ鎖
を含む、ＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ。
【０２５１】
実施形態６８：
−  配列番号２１と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１７に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、ＴＣＲα鎖、
−  配列番号２２と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、ＴＣＲβ鎖
を含む、実施形態６６に記載されるＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ。
【０２５２】
実施形態６９：
−  配列番号２９に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含むＴＣＲα鎖、
−  配列番号３０に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ領域を含むＴＣＲβ鎖
を含む、ＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ。
【０２５３】
実施形態７０：
−  配列番号２９と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２５に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ３領域を含む、ＴＣＲα鎖、
−  配列番号３０と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号２６に示されるヌクレオチド配列によってコードされるＣＤＲ領域を含む、ＴＣＲβ鎖
を含む、実施形態６８に記載のＸＡＧＥ−１に特異的なＴＣＲ。
【０２５４】
実施形態７１：がんを予防または治療する方法に使用するための実施形態６２から７０のいずれか１つに記載のＴＣＲ。
【０２５５】
実施形態７２：実施形態６２から７０のいずれか１つに記載のＴＣＲを哺乳動物に投与するステップを含む、がんを予防または治療する方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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