(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡に組織支持スライドガラス（１１４）を配置したことを検出するためのスライドガラスホルダ（１００）であって、
長さ、幅、および高さを有する水平な底辺部（１０２）と、
反対側の水平な底辺部（１０４）に向かって延在し、前記水平な底辺部（１０２）と共に、上側の平面（１０６）および下側の平面（１０８）を有する、開いている画像化領域（１０１）が内部に形成された状態の周囲の３次元フレームを形成する、少なくとも２つの側壁部（１０３）と、
前記周囲の３次元フレーム内にスライドガラス（１１４）を位置付けるための第２の平面を形成する、前記上側の平面（１０６）にあるエッチングされた溝（１１５）と、
引っ込めることが可能な調整部（１１３）によって前記周囲の３次元フレームに固定され、スライドガラス（１１４）を位置付けるための支持部（１０５、１０５ａ）に隣接している、１つ以上の配置用スライダ（１１２）であって、前記引っ込めることが可能な調整部（１１３）と前記支持部（１０５、１０５ａ）が前記スライドガラス（１１４）を前記周囲の３次元フレームの前記第２の平面の限界内に固定する配置用スライダ（１１２）と、
前記第２の平面に構成された少なくとも２つの切り欠き（１１６、１１７）であって、第１の切り欠き（１１６）は該第１の切り欠き（１１６）上に位置する前記スライドガラス（１１４）の側縁部（１１８）の第１の位置の下側からの画像化視認性を提供し、第２の切り欠き（１１７）は前記スライドガラスホルダ（１００）が画像化顕微鏡用ステージに位置付けられるときに、該第２の切り欠き（１１７）上に位置する前記スライドガラス（１１４）の隅（１１９）で第２の位置の下側からの画像化視認性を提供する切り欠き（１１６、１１７）と
を含むスライドガラスホルダ（１００）。
【請求項２】
前記スライドガラス（１１４）が、倒立顕微鏡によって下側から画像化されるように構成された、請求項１に記載のスライドガラスホルダ（１００）。
【請求項３】
前記第１および第２の位置は、前記スライドガラス（１１４）の平行移動の片寄りおよび回転角を含む前記スライドガラス（１１４）の向きの判定を可能とする、請求項１または２に記載のスライドガラスホルダ（１００）。
【請求項４】
前記切り欠き（１１６、１１７）が前記第２の平面の開口溝である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載のスライドガラスホルダ（１００）。
【請求項５】
前記側縁部（１１８）及び前記隅（１１９）はそれぞれ、前記第１の切り欠き（１１６）及び前記第１の切り欠き（１１７）を介して前記スライドガラスホルダ（１００）の下側から露出されている、請求項４に記載のスライドガラスホルダ（１００）。
【請求項６】
顕微鏡に組織支持スライドガラス（１１４）を配置したことを検出するためのスライドガラスホルダ（１００）を使用する方法であって、
長さ、幅、および高さを有する水平な底辺部（１０２）と、
反対側の水平な底辺部（１０４）に向かって延在し、前記水平な底辺部（１０２）と共に、上側の平面（１０６）および下側の平面（１０８）を有する、開いている画像化領域（１０１）が内部に形成された状態の周囲の３次元フレームを形成する、少なくとも２つの側壁部（１０３）と、
前記周囲の３次元フレーム内にスライドガラスを位置付けるための第２の平面を形成する、前記上側の平面（１０６）にあるエッチングされた溝（１１５）と、
引っ込めることが可能な調整部（１１３）によって前記周囲の３次元フレームに固定され、スライドガラス（１１４）を位置付けるための支持部（１０５、１０５ａ）に隣接している、１つ以上の配置用スライダ（１１２）であって、前記引っ込めることが可能な調整部（１１３）と前記支持部（１０５、１０５ａ）が前記スライドガラス（１１４）を前記周囲の３次元フレームの前記第２の平面の限界内に固定する配置用スライダ（１１２）と、
前記第２の平面に構成された少なくとも２つの切り欠き（１１６、１１７）であって、第１の切り欠き（１１６）は該第１の切り欠き（１１６）上に位置する前記スライドガラス（１１４）の側縁部（１１８）の第１の位置の下側からの画像化視認性を提供し、第２の切り欠き（１１７）は前記スライドガラスホルダ（１００）が画像化顕微鏡用ステージに位置付けられるときに、該第２の切り欠き（１１７）上に位置する前記スライドガラス（１１４）の隅（１１９）で第２の位置の下側からの画像化視認性を提供する切り欠き（１１６、１１７）
を含むスライドガラスホルダ（１００）を提供するステップ、
前記スライドガラスホルダ（１００）が前記画像化顕微鏡用ステージに位置付けられたときに前記スライドガラス（１１４）の前記側縁部（１１８）の前記第１の位置を判定して、前記スライドガラス（１１４）の前記隅（１１９）の前記第２の位置を判定するステップ、
前記第１および第２の位置を用いてスライドガラスの位置の角度を計算するステップ、および
スライドガラスの原点（１２５）を判定するステップ
を含む方法。
【請求項７】
前記第１の位置を判定し、前記第２の位置を判定するステップは、第１ラウンドの前記スライドガラス（１１４）の初期の画像を提供することを含み、前記第１の切り欠き（１１６）および前記第２の切り欠き（１１７）が、（ｘ１，ｙ１）という前記第１の位置で前記スライドガラス（１１４）の前記側縁部（１１８）へのアクセスを、（ｘ２，ｙ２）という前記第２の位置で前記スライドガラス（１１４）の前記隅（１１９）にそれぞれアクセスを提供する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｘ１，ｙ１）という前記第１の位置と（ｘ２，ｙ２）という前記第２の位置は、それぞれ、前記スライドガラス（１１４）の前記側縁部（１１８）と前記スライドガラス（１１４）の前記隅（１１９）の画像とを理想的な真っ直ぐな縁部の平行移動、回転された画像に相関させることによって判定され、
前記第１の位置および前記第２の位置は、場合により、離散的なラドン変換、ハフ変換、または対数極座標でのフーリエ変換のうちの１つ以上を利用して判定される、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
角度を計算するステップにおいて、スライドガラス長（Ｌ）およびスライドガラス幅（Ｗ）を含む寸法が、角度（ａ１、ａ２、ａ３）を判定し、前記スライドガラス（１１４）の斜辺を計算するために、コンピュータプロセッサによって実行されるときに、次の計算で利用され、角度が
【数１】
0006662527.tif 000006
により規定される請求項６乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｘ０，ｙ０）におけるスライドガラスの原点（１２５）を判定するステップが、
ｘ０＝ｘ２−ｒ  ｃｏｓ  ａ３
であることを特徴とする、前記スライドガラス（１１４）の水平な縁部（１２０）の配置、および、
ｙ０＝ｙ２−ｒ  ｓｉｎ  ａ３
であることを特徴とする、前記スライドガラス（１１４）の上側の縁部および下側の縁部の配置によって判定される請求項６乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で開示される主題は、マルチプレックスの適用例に関し、特に、光学的画像化の間に顕微鏡にスライドガラスを配置すること、および組織試料または組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌、感染症、生理学的障害などの様々な生理学的状態で、検出とモニタリングは、一部、患者から得られる生物学的検体の分析に基づくことがある。例えば、疾患または障害の指標となる場合のある、異常な数または種類の存在している細胞および／または生物を検出するために、試料を分析することがある。このような分析のため、様々な種類の顕微鏡検査を用いることができる。さらに、疾患または障害の検出または診断を補助する可能性のある種々の構造、化学物質、または環境を視覚化できるようにするために、この分析の一部として様々な染色剤および染色プロトコルを使用することができる。
【０００３】
癌生物学での診断のために、マルチプレックスの適用例では、１細胞当たり１７５を超える異なるタンパク質および疾患のマーカーの発現を調べることによって、単一細胞レベルで腫瘍の試料を分析する。複数の染色剤を腫瘍切片に加えることができる。蛍光によって、該当するタンパク質を対象とする腫瘍抗体を測定し、定量化するのである。単一の検査で複数の染色剤およびマーカーを測定するので、提供される試料組織の量を問題にする必要がない。１枚のスライドガラスを使用すると、時間が節約され、使用する組織が大幅に少なくなり、かなり一貫した結果が得られる。
【０００４】
すべての細胞がデジタルマップで処理され、腫瘍組織のタンパク質の発現のグラフィック表現が作り出される。このデータは、腫瘍の特徴や予後に関する情報を提供するために、他の腫瘍における既知のタンパク質発現プロファイルと適合させ、比較することができる。病理学者は、ソフトウェアを使用して発現パターンを同定し、タンパク質のプロファイルに関するクラスター分析を行い、相関を同定し、腫瘍の挙動を理解している。
【０００５】
そのような病理学または組織学的試料の分析を容易にするために、画像取得プロセスの様々な局面を自動化する自動顕微鏡使用システムが開発されてきた。特に、デジタル式光学顕微鏡をこのような自動システムで使用して、各々の取得のためにデジタル式の画像出力を提供することができる。ある種のそのようなシステムは、走査型顕微鏡を使用するものである。これは、一連の位置のずれた画像が取得され、対象の試料の領域の複合体を形成するために一緒に関連付けられる（例えば、共に「タイル（ｔｉｌｅｄ）」または「ステッチ（ｓｔｉｔｃｈｅｄ）」する）。例えば、病理学および組織学的な画像化操作をする状況において、組織試料のスライドガラスは、画像化を経て、高い倍率および／または解像度で小さな隣接または重複している領域のデジタル画像を取得する。次いで、隣接または重複している画像を結合または関連させて、より大きな画像を形成でき、それをデジタル表示装置でナビゲートすることができる。このようにして、試料の合成画像またはモザイク画像を生成し、表示し、レビューアがナビゲートする。
【０００６】
画像を生成および再検討するプロセスでの複雑な要因は、試料が複数の染色の操作を経るプロトコルに起因する可能性がある。そのような例では、各染色ステップは、スライドガラスを顕微鏡用ステージから取り外すこと、試料を処理して既存の染色剤を除去すること、次の染色剤を塗布すること、および新しい染色剤の付いた試料を画像化するために顕微鏡用ステージのスライドガラスを置き換えることに関連する。しかし、顕微鏡用ステージにあるスライドガラスを取り外して交換する行為から、スライドガラスが画像化の各ラウンドで、わずかに異なる位置にくることが概して生じる。その結果、各ラウンドの画像化から得られる対応する画像の位置が合っていないことがある。さらに、各ラウンドの画像化で生成した合成画像は、互いに対する位置がずれていることもある。その結果、様々な染色剤を用いて取得した画像で行われる分析または比較が困難になるか、さもなければ阻害される。
【０００７】
マルチプレックス（「ＭｕｌｔｉＯｍｙｘ」）のプロセスでは、異なる時点で単一のスライドガラスから得られた画像を、すべて単一ピクセル内にレジストレーションすることが重要である。スライドガラスがこれらの時点の間は物理的に顕微鏡から離れている場合があるので、染色や漂白などの生じる様々な操作を可能にするには、スライドガラスの画像の位置を合わせるよう、機械での位置合わせとソフトウェアに基づく画像レジストレーションをすることが必要である。スライドガラスを顕微鏡に載せ直す際、スライドガラスをスライドガラスホルダに挿入する。しかし、スライドガラスをスライドガラスホルダに正しく挿入していない（すなわち、回転したり片寄ったりする）ときに、問題が生じる。これは、使用者の過誤のため、および／またはホルダとスライドガラスの縁部のいずれかにデブリが蓄積されているための双方で、生じる可能性がある。
【０００８】
第１ラウンド以外の画像化ラウンドの場合、既存のアプローチでは、確実にスライドガラスは、ホルダに載せて、初期の画像化ラウンドから得られるスライドガラスの位置と良好に位置合わせして顕微鏡に配置される。このアプローチは、参照チャネルの画像（例えば、通常はＤＡＰＩ（４’，６’ジアミノ−２−フェニルインドール・２ＨＣｌでの染色を用いる）を比較することに依存する。これは、核を染色し、ラウンドからラウンドまで、例えば現在のラウンドと初期のラウンドの間で変化しないものである。画像配置における変化を検出することによって、１セットの線形変換を判定し、現在のスライドガラスの位置を初期のスライドガラスの位置に関連付ける。これは後続のラウンドではうまくいくが、初期の画像化ラウンドでは比較のために他の画像セットを利用することができない。初期の画像化ラウンドがベースラインであるためである。これにより、プロセスは、この初期の画像化ラウンドで不適切に載せたスライドガラスに起因する過誤の影響を受けやすい。例えば、操作者が変わり、プロセス中に複数の者たちが動いてスライドガラスを交換している場合、そのような操作者らは、臨床上の設定のシフトを変え、プロセスを可能な限り同期し続けようと試みる。
【０００９】
さらに、現在存在する技術は、第１ラウンドに対して後続の画像化ラウンドで適切に位置合わせすることを保証するものが不足している。第１ラウンドで位置合わせの不良を検出する方法は、これまで実現しなかった。後のラウンドは、初期のラウンドでのこのスライドガラスの初期配置次第である。過誤が生じた場合、後のラウンドでもスライドガラスが第１ラウンドで位置付けたのと同じように不適切に載せられた場合にのみ、後のラウンドで画像化することができる。これは、スライドガラスを正しく載せる様式が１つであるのに対し、スライドガラスを誤って載せる様式が数多くあるため、非常に困難であることがわかる。
【００１０】
限定するのではなく、例示的な目的で、臨床的な状況でのＭｕｌｔｉＯｍｙｘ対象試験におけるホジキンリンパ腫の研究のうち、いくつかの試験が、スライドガラスの配置の不良によって失敗した。これらの不良には、第１ラウンドの画像化における不完全な位置合わせによって、画像化の第２ラウンド後のプロセスでスライドガラスが機能しなかった場合（症例の約１％以下）が含まれている。これらの事例では、組織ブロックから切って、ＭｕｌｔｉＯｍｙｘプロセスへ送るために、第２のスライドガラスを利用しなければならなかった。なぜなら、第２ラウンドになってようやく不良を検出することができ、第２ラウンドの後には不可逆的な処理がスライドガラスにおいて既に生じていたからである。ＭｕｌｔｉＯｍｙｘは、組織の供給が制限されている場合に利点のある技術として位置付けられているため、第１ラウンドの位置合わせが失敗した場合に新しいスライドガラスを切る機会はない。さらに、組織が利用可能であるとき、プロセスを通して第２のスライドガラスを実行すると、分析を完了するのに遅延とコストの両方加わる。初期の画像化ラウンド中にこの不完全な位置合わせを検出することによって、手でスライドガラスを再配置したり、位置合わせ情報を重ねて（ｆｏｌｄ）、観察された位置合わせの過誤に対して進行する取得をデジタルで補正したりすることで、補正を行うことができる。
【００１１】
これまでの試みの大半は、機械上正確なスライドガラスホルダを製作しようとすることが伴っていた。多くの代替の設計が使用されてきたが、依然として全体の人的過誤かスライドガラス自体の汚れのいずれかの影響に曝されやすい。例えば、スライドガラスを基準の隅へと押す複雑な機械的機構を備えていても、バーコードがスライドガラスに誤って適用されて突き出した場合、バーコードを含む基準点を用いても、スライドガラスは依然として隅へと押される。バーコードを後の処理ラウンドで交換するとき（すなわち、現在のＭｕｌｔｉＯｍｙｘのプロセスでは、バーコードを追加し、染色の前に除去する）、またスライドガラスを再度載せるとき、これは異なる基準点に位置することになる（突き出したバーコードがもはやその場所には存在していないため）。さらに、今日のＭｕｌｔｉＯｍｙｘの分野以外の適用例では、後に画像化するためにスライドガラスをイメージャに正確に再配置することは重要ではない。したがって、ほとんどの場合、たとえスライドガラスの位置合わせで多少の差異があっても問題はない。さらに、カバーガラスの縁部を検出してカバーガラスの下に画像化を限定する作業も、上記の問題に対処するものではない。
【００１２】
したがって、初期の画像化ラウンドでスライドガラスを不適切に載せたことを検出する技術を有する必要性が存在する。この技術は、スライドガラスの角度と片寄りを特徴づけることによってスライドガラスを適切に載せることに対処し、一方で限界値と比較をすることをさらに可能にする。本発明は、画像化技術の光学的性質および性能に対処し、進行中の臨床プロセスに従うようにするために、これらの必要性に取り組むものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第０２／４０９７７号
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、概して、顕微鏡に組織支持スライドガラスを配置したことを検出するためのスライドガラスホルダであって、長さ、幅、および高さを有する水平な底辺部と、反対側の水平な底辺部に向かって延在し、水平な底辺部と共に、上側の平面および下側の平面を有する、開いている画像化領域が内部に形成された状態の周囲の３次元フレームを形成する、少なくとも２つの側壁部と、周囲の３次元フレーム内にスライドガラスを位置付けるための第２の平面を形成する、上側の平面にあるエッチングされた溝と、引っ込めることが可能な調整部によって周囲の３次元フレームに固定され、スライドガラスを位置付けるための支持部に隣接している、１つ以上の配置用スライダであって、引っ込めることが可能な調整部と支持部がスライドガラスを周囲の３次元フレームの第２の平面の限界内に固定する配置用スライダと、第２の平面に構成された少なくとも２つの切り欠きであって、第１の切り欠きはスライドガラスの側縁部の第１の位置の画像化視認性を提供し、第２の切り欠きはスライドガラスホルダが画像化顕微鏡用ステージに位置付けられるときに、スライドガラスの隅で第２の位置の画像化視認性を提供する切り欠きとを含むスライドガラスホルダに関する。
【００１５】
１つの実施形態で、スライドガラスホルダ内に位置付けられるスライドガラスは、倒立顕微鏡によって下側から画像化される。本発明の態様は、第１および第２の位置が、スライドガラスの平行移動の片寄りおよび回転角を含むスライドガラスの向きを判定することを可能にする。１つの実施形態で、切り欠きは第２の平面の開いているチャネルである。開いているチャネルは、上に画像化フィルタが配置される。
【００１６】
本発明の実施形態は、顕微鏡に組織支持スライドガラスを配置したことを検出するためのスライドガラスホルダを使用する方法であって、第２の平面に構成された少なくとも２つの切り欠きであって、第１の切り欠きはスライドガラスの側縁部の第１の位置の画像化視認性を提供し、第２の切り欠きはスライドガラスホルダが画像化顕微鏡用ステージに位置付けられるときに、スライドガラスの隅で第２の位置の画像化視認性を提供する切り欠きを含む上記のようなスライドガラスホルダを提供するステップ、スライドガラスホルダが画像化顕微鏡用ステージに位置付けられたときにスライドガラスの側縁部の第１の位置を判定して、スライドガラスの隅の第２の位置を判定するステップ、第１および第２の位置を用いてスライドガラスの位置の角度を計算するステップ、およびスライドガラスの原点を判定するステップを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明の１つの実施形態で、第１の位置を判定し、第２の位置を判定するステップの間に、スライドガラスの初期の画像が、第１ラウンドで提供され、第１の切り欠きおよび第２の切り欠きが、（ｘ１，ｙ１）という第１の位置でスライドガラスの側縁部へのアクセスを、（ｘ２，ｙ２）という第２の位置でスライドガラスの隅にそれぞれアクセスを提供する。
【００１８】
本発明の様々な態様で、（ｘ１，ｙ１）という第１の位置と（ｘ２，ｙ２）という第２の位置は、それぞれ、スライドガラスの側縁部とスライドガラスの隅の画像を理想的な真っ直ぐな縁部の平行移動、回転された画像に相関させることによって判定される。したがって、離散的なラドン変換、ハフ変換、または対数極座標でのフーリエ変換のうちの１つ以上を利用して、相関させることを実行できる。
【００１９】
該方法は、スライドガラス長（Ｌ）およびスライドガラス幅（Ｗ）を含む寸法を使用して角度を計算するステップをさらに詳述し、次の計算で利用され、角度（ａ１、ａ２、ａ３）を判定し、スライドガラスの斜辺を計算するために、コンピュータプロセッサによって実行され、角度が
【００２０】
【数１】
0006662527.tif 000002
【００２１】
により規定される。
【００２２】
１つの実施形態で、（ｘ０，ｙ０）におけるスライドガラスの原点を判定するステップが、ｘ０＝ｘ２−ｒ  ｃｏｓ  ａ３であることを特徴とする、スライドガラスの水平な縁部の配置、および、ｙ０＝ｙ２−ｒ  ｓｉｎ  ａ３であることを特徴とする、スライドガラスの上側の縁部および下側の縁部の配置によって決定される。
【００２３】
さらに、限界値が予め決定され、限界値を超えた場合に、自動的に使用者に警告するように設定されることが可能である。このような過誤の通知または位置合わせ確認は、使用者が望むように選択および実行する。
【００２４】
本発明のこれらのおよび他の特徴、態様および利点は、以下の詳細な説明を添付の図面を参照して読むと、よりよく理解されるであろう。図面では、同様の符号が図面全体で同様の部分を表す。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のスライドガラスホルダの実施形態の透けた斜視図である。
【図２Ａ】スライドガラスホルダを顕微鏡のステージに位置付けて、下側から画像化するときに視覚化される、本発明の実施形態のスライドガラスホルダの下側からの斜視図を示す。
【図２Ｂ】スライドガラス側縁部の視認性を備える、溝が作られた第２の平面の中にある、スライドガラスホルダの第１の切り欠きの拡大図である。
【図２Ｃ】スライドガラスホルダの下側から見て得られる、スライドガラスの隅の視認性を備える、第２の切り欠きの拡大図である。
【図３】顕微鏡用ステージであるｚ軸に関して、スライドガラスホルダのｘ軸とｙ軸に沿って、スライドガラスの計算された位置付けと位置を記述するための、本発明の実施形態の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
特許請求された本発明の主題をより明瞭かつ簡潔に記載し、指摘するために、以下の説明および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語について、以下の定義を提供する。
【００２７】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、他に文脈で明確に指示されていない限り、複数の指示対象を含む。明細書と特許請求の範囲を通してここで使用される、近似する言い回しは、任意の定量的表現を修飾するために適用し得る。それは、関連する基本的な機能に変化をもたらさずに、許容可能な程度に変化し得る。したがって、「約（ａｂｏｕｔ）」などの用語によって修飾された値は、指定された正確な値に限定されていない。他に示さない限り、本明細書と特許請求の範囲で使用される角度、方向などの量または特性を表す数字は、すべての場合において「約（ａｂｏｕｔ）」という用語によって修飾されるものとして理解するべきである。したがって、反対に示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは近似値であり、本発明により得ることが求められる所望の特性に応じて変化し得る。まさに少なくとも、各数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らし合わせ、通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
【００２８】
本発明の実施形態では、イメージャにおけるスライドガラスの位置合わせが、最後に取り込まれるセットを含めた１セットの多数ラウンド画像が、コンピュータによる画像レジストレーションによって位置合わせされることを保証する。スライドガラスの縁部を画像化で利用できるようにするために、スライドガラスホルダ１００が、縁部の視覚的利用を可能にするために、本発明の態様で修正されてきた。これは図１に示すように描写されている。
【００２９】
図１に示すように、本発明のスライドガラスホルダ１００の実施形態は、スライドガラスホルダの斜めから見た、透けている斜視図で描写されている。１つの実施形態で、ここで示すように、スライドガラスホルダは２枚のスライドガラスのホルダである。別の態様で、スライドガラスホルダは任意の数のスライドガラスのための余地を有し、本発明の特徴を統合している場合がある。ここに示すスライドガラスホルダ１００は、水平な底辺部１０２と、反対側の水平な底辺縁部／部１０４に向かって延在する２つの側面／側部１０３とを備え、スライドガラスホルダ１００の中央領域内にある、開いている画像化領域１０１を有する長方形の装置の形をなしている。２つの側面１０３は、高さ、あるいは厚さを備え、スライドガラスホルダの上側の平面１０６と下側の平面１０８を接続する。配置用ねじ１１１によって付着されるカバープレート１１０は、調整部１１３によって固定される配置用スライダ１１２を保持する。配置用スライダ１１２は引っ込めることができるので、スライドガラス１１４を支持壁１０５に隣接して位置付け、切り欠き１１６、１１７を介してスライドガラスの側縁部１１８と隅１１９に視覚的利用をもたらす、エッチングされた溝１１５に水平に位置することが可能となる。さらに、支持部１０５ａは、第２のスライドガラスを、スライドガラスホルダの代替的な第２の位置に位置付けるのを補助する、隣接した物理学的ストッパを提供する。
【００３０】
側縁部１１８で、スライドガラスが画像化顕微鏡用ステージに位置付けられるときに、スライドガラス１１４の指定された点（ｘ１，ｙ１）が利用可能で目に見え（図２Ｂ参照）、切り欠き１１７が位置（ｘ２，ｙ２）で隅１１９に視覚的利用をもたらす（図２Ｃ参照）。スライドガラスホルダの下側から見た図（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃを参照）により、使用者とイメージャによって視覚化されるように、スライドガラスの曝されている特徴、それぞれ切り欠き１１６を経る側縁部１１８、切り欠き１１７を経る隅１１９、片寄りと回転角を含むスライドガラスの位置が判定される。
【００３１】
１つの態様で、切り欠き１１６と１１７は、一体の構成要素としてスライドガラスホルダの溝１１５内へと機械で作られる。スライドガラスホルダ１００は、図１で描写しているように、スライドガラス１１４の第１ラウンドの位置合わせで利用され、上に生物学的試料が位置付けられるスライドガラスを、正確に置き、位置付け、視覚化する。１つの態様では、スライドガラスが第１画像化ラウンドの間にホルダ１００で不完全に位置合わせされているとき、過誤モードまたはデジタルの検証１３０（例えば、ここでは、位置合わせ確認表示として示される）が指定される。過誤モードがなければ、これは後続の自動位置合わせの不良に至る可能性がある。ステージに対してスライドガラス１１４がどのようにホルダ１００に位置しているか判定することによって、位置合わせはいっそう確定的かつ正確になる。図１で示しているように、スライドガラス１１４の側縁部１１８、隅１１９、および長手方向の縁部１２０の視覚的利用が、今や可能である。縁部と隅は、突き出しているカバーガラスか、スライドガラスの縁部の隅にあるバーコードのいずれかによる誤った画像を検出するのを避けるよう、およびスライドガラスの縁部として誤って検出するのを回避するように選択される。本発明の１つの態様で、選択された縁部１１８は、カバーガラスが存在している場合、スライドガラスを平面から傾け、そのため過誤モードを指定するように適合させている。当技術分野で公知のように、傾き検出方法により、不適切に載せたスライドガラスの検出と通知ができる。さらに、本発明の本使用で、使用者は、画像化が起こる前に、それぞれ不完全な位置合わせ、または位置合わせの確認について警告される。
【００３２】
図２は、スライドガラスホルダ１００の下側から見た斜視図を示す。それ自体、２枚のスライドガラスホルダの下側の平面１０８は、（図１に示すように）上側の平面１０６内に配置され、溝１１５に位置する１枚のスライドガラス１１４を有する。その溝の中で、切り欠き１１６が、位置（ｘ１，ｙ１）でのスライドガラスの側縁部１１８の視覚的利用をもたらし、スライドガラスホルダの切り欠き１１７が、位置（ｘ２，ｙ２）でのスライドガラス１１４の隅１１９の視覚的利用をもたらす。
【００３３】
スライドガラスの寸法の特徴と共に、種々のスライドガラスの縁部の場所を判定するためのエッジ検出アルゴリズムを利用することによって、スライドガラスホルダ１００のスライドガラス１１４の縁部１１８の線形の片寄りと、顕微鏡用ステージであるｚ軸に対するスライドガラス１１４の任意の回転との両方を判定し得る。図３を参照されたい。不完全な位置合わせを検出できることにより、多数ラウンドの画像の最後に取り込まれるセットが、コンピュータによる画像レジストレーションを介して位置合わせされることが確実になる。本発明の実施形態は、後続の画像化ラウンドが第１ラウンド、つまり前に可能でなかった態様に対して、適切に位置合わせすることを可能にする。
【００３４】
スライドガラスがスライドガラスホルダに存在し、イメージャに載せられた途端（図示していない）に、ステージは、様々な露出した特徴の画像を取り込むために、コンピュータ処理された指令に基づき、スライドガラスホルダ１００の機械で作られた特徴に応じて、事前に決定されている位置に動かされる。高めの倍率を含め、いかなる倍率でも利用し得るが、画像化は、低倍率の対物レンズを使って行われる。１つの態様で、スライドガラスはむき出しのガラスのコントラストを可能にするように、上方に照らされる。ただし、照明の他の選択肢が同様に利用できる。
【００３５】
図３は、顕微鏡用ステージであるｚ軸に対して、スライドガラスホルダのｘ軸とｙ軸に沿って、スライドガラス１１４の計算された位置付けと位置を記述するための、本発明の実施形態の図である。倒立顕微鏡を用いて、さらにスライドガラスの底面または下面から画像化しながら、スライドガラスの側縁部１１８と隅１１９を含めた曝された特徴が、それぞれ切り欠き１１６と１１７を介して（図２Ａ、２Ｂ、２Ｃに示すように）視覚化されている。次いで、座標の位置がｘ軸とｙ軸内で決定される。
【００３６】
特に、いったん画像が取り込まれると、エッジ発見ルーチンは、スライドガラス１１４の水平な縁部１２０と垂直な縁部１１８の場所の双方を特定することを可能にする。ここではそれらを各々（ｘ１，ｙ１）と（ｘ２，ｙ２）と称する。これらの場所、（ｘ１，ｙ１）と（ｘ２，ｙ２）、さらにスライドガラスの幾何学的形状（例えばスライドガラスの長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）、および９０度の角度）を知ることから、スライドガラスの（ｘ０，ｙ０）の原点１２５が、顕微鏡用ステージに対する回転角（「ａ１」、「ａ２」、「ａ３」）と共に判定される。これらの計算は、次のように記述される：
式中、スライドガラスの寸法によって決定されるように、ｒは中間の値（例えば斜辺、あるいはスライドガラスを横切っている最も長い直線部分）に等しい。
【００３７】
【数２】
0006662527.tif 000003
【００３８】
１つの実施形態では、ハフ変換を利用して、スライドガラスの縁部を見出す。しかし、望ましくは、縁部の場所を特定するために、様々な変換を利用し得る。限定するのではなく、例示的な目的で、本発明の１つの態様では、どのような縁部と隅が特定されるかに応じて、特定の縁部（例えば垂直と水平のいずれか）を探す。
【００３９】
片寄りと回転の値について、いくつかの選択肢がそのとき利用可能である。最も簡易な選択肢は、限界値のセットを設け、値を超えたとき、使用者に警告することである。どの程度の機械の不完全な位置合わせが後のラウンドで許容されるかについて、限界が考慮のうえ設定され得るが、それでも画像ベースの位置合わせが機能するのを可能にする。限定するのではなく、例示的な目的で、決定された量または視界が、補正を判定するため、初期の画像化ラウンドと現在の画像化ラウンドの間で共通している。
【００４０】
もう１つの選択肢には、初期のラウンドでのスライドガラスの平行移動と回転を説明することが含まれる。また、スライドガラスが正しく載せられていれば取得されていたものに取得画像を変換し直すとき、双方の画像化の場所を相殺する。この態様では、アプローチはいっそう強固であり、使用者はスライドガラスを載せ直す必要がない。
【００４１】
プロセスの第１のステップは、縁部１１８と隅１１９でのスライドガラスの位置を使い、スライドガラスの原点（ｘ０，ｙ０）とスライドガラスの位置の角度（ａ１、ａ２、ａ３）を判定することを含む。限界値が予め決定されており、規定した限界値を超えた場合に使用者に警告するように設定されている。図３に示すように、スライドガラスの水平な縁部１２０の配置が次のように特徴づけられる：
ｘ０＝ｘ２−ｒ  ｃｏｓ  ａ３
スライドガラスの上側の縁部と下側の縁部が以下のように特徴づけられる：
ｙ０＝ｙ２−ｒ  ｓｉｎ  ａ３
スライドガラスの位置の角度（ａ１、ａ２、ａ３）は、以下により規定される：
【００４２】
【数３】
0006662527.tif 000004
【００４３】
次いで、スライドガラスの斜辺によって特徴づけられるものとして、ｒを判定するために、長さ（Ｌ）と幅（Ｗ）を有するスライドガラスを利用する。
【００４４】
本発明は、イメージャのスライドガラスの位置合わせを（スライドガラスに載せる際の使用者の過誤か、ホルダまたはスライドガラスの汚れのいずれかのために）測定することを可能にする方法と装置である。ラウンド間の位置合わせによりＭｕｌｔｉＯｍｙｘのプロセスが可能になるため、この不完全な位置合わせを検出できることは、多数ラウンドの画像の後続および最後に取り込まれるセットがコンピュータによる画像レジストレーションによって位置合わせできることを確実にする。そのため、これは、後続の画像化ラウンドが第１ラウンドに対して適切に位置合わせされるように、技術を改善して、第１ラウンドでの位置合わせ不良を検出するための方法をさらに作り出す。これは、スライドガラスホルダにスライドガラスを最初および次に配置する際それぞれにおいて、スライドガラスを正確に配置することを容易にする。
【００４５】
本発明の実施形態は、スライドガラスの種々の縁部の場所を判定するためのエッジ検出アルゴリズムを利用することによって機能する。本発明の態様は、画像におけるスライドガラスの縁部を、Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｃｏｒｓｓ、Ｓｏｂｅｌ、あるいは離散的なＬａｐｌａｃｉａｎのような手法で画像を強化することによって、特定することを可能にする。縁部が検出された途端に、検出は、最も近い適切な直線を見出すことによって、洗練される。線を見つけるための適切な技法には、ハフ変換、離散的なラドン変換、および対数極座標でのフーリエ変換が含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態は、対数極でのフーリエ変換を使用して、実際のスライドガラスの縁部の画像と、理想的な真っ直ぐな縁部の平行移動、回転した画像との間の相関を最大にしている。この相関が見出された途端に、カメラから中心の最も近くにある理想的な縁部の点が、検出された点として報告される。これらの縁部から、また特有のスライドガラスの寸法を理解していることで、ホルダにおけるスライドガラスの縁部の線形の片寄りと、顕微鏡用ステージである軸に対するスライドガラスの任意の回転との両方が判定される。
【００４６】
特に、本発明の装置とプロセスを使った臨床的状況でなされたＭｕｌｔｉＯｍｙｘ対象試験でのホジキンリンパ腫の研究は、スライドガラスの配置で正確性と精密度が改善している。第１ラウンドの画像化における配置の改善により、先行の過誤と不良に関し、画像化の第２ラウンドや後続のラウンドで、スライドガラスを処理することが可能になった。したがって、さらに組織を切って第２のスライドガラスを調製する必要がないため、組織の使用が最小限に抑えられ、また、さらなる再処理がないので時間を失うことを防ぐ。このことは、コスト削減を含む効率化を実現する。初期の画像化ラウンドでの不完全な位置合わせを検出することによって、不完全な位置合わせは、スライドガラスを手で再配置するか、観察された位置合わせの過誤に対し位置合わせ情報を重ねる（ｆｏｌｄｉｎｇ）ことによって、進行する取り込みをデジタルで補正することによって、補正される。換言すれば、実際の位置合わせが第１ラウンドでわかると、スライドガラスは不完全な位置合わせを補正するために改めて載せるか、その代わりに、後のラウンドでスライドガラスの位置合わせをするとき、第１ラウンドの観察された不完全な位置合わせをデジタル方式で埋め合わせて、後のラウンドで適切に載せられたスライドガラスの位置合わせを実現することができる。
【００４７】
しかし、さらなる実施形態では、作業が自動操作で進むときに、位置合わせの過誤のためデジタル方式で補正することができる。自動化された作業の流れで、人間がスライドガラスを置き直すのを待つと、スライドガラスが作業の流れを通じて進んでいくことが妨げられるが、一方デジタル方式で補正できると、スライドガラスが継続することが可能になる。
【００４８】
本発明の装置とプロセスの実施形態は、機械的に、またデジタル方式で正確なスライドガラスホルダを提供する。スライドガラスホルダは人的過誤を防ぎ、画像化と処理の自動化をいっそう最適化する。さらに、スライドガラスホルダは、バーコードまたはカバーガラスが干渉することなく、スライドガラスホルダにスライドガラスを成功裏に正確に配置することをもたらす。バーコードが取り去られて、後の処理ラウンドで取り換えられるとき（すなわち、ＭｕｌｔｉＯｍｙｘプロセスでは染色する前に取り外される）、スライドガラスを再度載せることはやはり正確であって、スライドガラスがスライドガラスホルダ内で共通の基準点に位置することを確実にする。１つの態様で、スライドガラスの寸法を測定および記録することで、スライドガラスの適切な位置合わせと位置付けにより後続の過誤を防ぐことが可能になる。
【００４９】
本発明の実施形態は、カバーガラスを配置するときなどで、直接スライドガラス自体に別個の特性、または十字線を刻印する（ｉｍｐｒｉｎｔ）スライドガラスを実現している。さらに、これらの刻印された（ｉｍｐｒｉｎｔ）特徴の場所を判定することによってスライドガラスの位置合わせを計算するために、画像処理技術を利用することができる。しかし、これにより、特定のスライドガラスのタイプに使用が限定される。他方、画像化の前にスライドガラスに特徴の印を付けることと、特徴を位置合わせを判定するために使うことはまた、本明細書で説明された本発明の装置とプロセスで実行し得る。
【００５０】
さらに、スライドガラスの縁部を見出すための任意選択の検出以外に、他の手段が利用できる。例えば、静電容量センサまたは磁気センサを使用することが挙げられる。センサは、スライドガラスの縁部、面に実装されるか、あるいは組成物と一体であってもよい。この手法は位置合わせでより高い精密度と正確性のために、新しい構成要素を読取り部に統合する。限定するのではなく、例示的な目的で、スライドガラスの縁部付近にあるいくつかの場所にセンサを置くことによって、縁部の位置は、記載された手段（すなわち静電容量、光学、または磁気）を通して定めることができる。そのため、スライドガラスの縁部のいくつかの場所の位置を知ることによって、スライドガラスの平行移動と回転の両方を同じ方法で計算できる。しかし、より正確性が高いことが望ましく、またそれは画像取得方法次第である。
【００５１】
本発明の特定の特徴のみが本明細書に図示され、記載されているが、多くの修正および変更が当業者に思い浮かぶであろう。限定するのではなく、例示的な目的で、当技術分野で利用されているスライドガラスホルダは、いくつかの切り欠きを平面の中へ切り込むことによって、配置されたスライドガラスの縁部がそこを経て検出されるように修正することができる。そのような修正は、エッジ発見法を組み込み、本発明のアルゴリズムを利用する。したがって、本明細書で説明するスライドガラスホルダのサイズ、形状、および寸法は、任意の画像化装置に位置するように修正および設計することができる。上側のイメージャまたは下側のイメージャ用の照明を実装してもよく、画像が取り込まれる画像化装置も同様のことがあてはまる。したがって、スライドガラスホルダの上側および下側が任意のイメージャとの一体化のために可逆および／または対称になるように、本発明の設計を修正していくことは明らかであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神に含まれるすべてのそのような修正および変更を包含するように意図されていることが理解されるべきである。
［実施態様１］
顕微鏡に組織支持スライドガラス（１１４）を配置したことを検出するためのスライドガラスホルダ（１００）であって、
長さ、幅、および高さを有する水平な底辺部（１０２）と、
反対側の水平な底辺部（１０４）に向かって延在し、前記水平な底辺部（１０２）と共に、上側の平面（１０６）および下側の平面（１０８）を有する、開いている画像化領域（１０１）が内部に形成された状態の周囲の３次元フレームを形成する、少なくとも２つの側壁部（１０３）と、
前記周囲の３次元フレーム内にスライドガラス（１１４）を位置付けるための第２の平面を形成する、前記上側の平面（１０６）にあるエッチングされた溝（１１５）と、
引っ込めることが可能な調整部（１１３）によって前記周囲の３次元フレームに固定され、スライドガラス（１１４）を位置付けるための支持部（１０５、１０５ａ）に隣接している、１つ以上の配置用スライダ（１１２）であって、前記引っ込めることが可能な調整部（１１３）と前記支持部（１０５、１０５ａ）が前記スライドガラス（１１４）を前記周囲の３次元フレームの前記第２の平面の限界内に固定する配置用スライダ（１１２）と、
前記第２の平面に構成された少なくとも２つの切り欠き（１１６、１１７）であって、第１の切り欠き（１１６）は前記スライドガラス（１１４）の側縁部（１１８）の第１の位置の画像化視認性を提供し、第２の切り欠き（１１７）は前記スライドガラスホルダ（１００）が画像化顕微鏡用ステージに位置付けられるときに、前記スライドガラス（１１４）の隅（１１９）で第２の位置の画像化視認性を提供する切り欠き（１１６、１１７）と
を含むスライドガラスホルダ（１００）。
［実施態様２］
前記スライドガラス（１１４）が、倒立顕微鏡によって下側から画像化される、実施態様１に記載のスライドガラスホルダ（１００）。
［実施態様３］
前記第１および第２の位置は、前記スライドガラス（１１４）の平行移動の片寄りおよび回転角を含む前記スライドガラス（１１４）の向きを判定する、実施態様１または２に記載のスライドガラスホルダ（１００）。
［実施態様４］
前記切り欠き（１１６、１１７）が前記第２の平面の開いているチャネルである、実施態様１乃至３のいずれか１項に記載のスライドガラスホルダ（１００）。
［実施態様５］
前記開いているチャネルは、上に画像化フィルタが配置される、実施態様４に記載のスライドガラスホルダ（１００）。
［実施態様６］
顕微鏡に組織支持スライドガラス（１１４）を配置したことを検出するためのスライドガラスホルダ（１００）を使用する方法であって、
長さ、幅、および高さを有する水平な底辺部（１０２）と、
反対側の水平な底辺部（１０４）に向かって延在し、前記水平な底辺部（１０２）と共に、上側の平面（１０６）および下側の平面（１０８）を有する、開いている画像化領域（１０１）が内部に形成された状態の周囲の３次元フレームを形成する、少なくとも２つの側壁部（１０３）と、
前記周囲の３次元フレーム内にスライドガラスを位置付けるための第２の平面を形成する、前記上側の平面（１０６）にあるエッチングされた溝（１１５）と、
引っ込めることが可能な調整部（１１３）によって前記周囲の３次元フレームに固定され、スライドガラス（１１４）を位置付けるための支持部（１０５、１０５ａ）に隣接している、１つ以上の配置用スライダ（１１２）であって、前記引っ込めることが可能な調整部（１１３）と前記支持部（１０５、１０５ａ）が前記スライドガラス（１１４）を前記周囲の３次元フレームの前記第２の平面の限界内に固定する配置用スライダ（１１２）と、
前記第２の平面に構成された少なくとも２つの切り欠き（１１６、１１７）であって、第１の切り欠き（１１６）は前記スライドガラス（１１４）の側縁部（１１８）の第１の位置の画像化視認性を提供し、第２の切り欠き（１１７）は前記スライドガラスホルダ（１００）が画像化顕微鏡用ステージに位置付けられるときに、前記スライドガラス（１１４）の隅（１１９）で第２の位置の画像化視認性を提供する切り欠き（１１６、１１７）と
を含むスライドガラスホルダ（１００）を提供するステップ、
前記スライドガラスホルダ（１００）が前記画像化顕微鏡用ステージに位置付けられたときに前記スライドガラス（１１４）の前記側縁部（１１８）の前記第１の位置を判定して、前記スライドガラス（１１４）の前記隅（１１９）の前記第２の位置を判定するステップ、
前記第１および第２の位置を用いてスライドガラスの位置の角度を計算するステップ、および
スライドガラスの原点（１２５）を判定するステップ
を含む方法。
［実施態様７］
前記第１の位置を判定し、前記第２の位置を判定するステップは、前記第１ラウンドの前記スライドガラス（１１４）の初期の画像を提供することを含み、前記第１の切り欠き（１１６）および前記第２の切り欠き（１１７）が、（ｘ１，ｙ１）という前記第１の位置で前記スライドガラス（１１４）の前記側縁部（１１８）へのアクセスを、（ｘ２，ｙ２）という前記第２の位置で前記スライドガラス（１１４）の前記隅（１１９）にそれぞれアクセスを提供する、実施態様６に記載の方法。
［実施態様８］
（ｘ１，ｙ１）という前記第１の位置と（ｘ２，ｙ２）という前記第２の位置は、それぞれ、前記スライドガラス（１１４）の前記側縁部（１１８）と前記スライドガラス（１１４）の前記隅（１１９）の画像とを理想的な真っ直ぐな縁部の平行移動、回転された画像に相関させることによって判定される、実施態様７に記載の方法。
［実施態様９］
前記第１の位置および前記第２の位置は、離散的なラドン変換、ハフ変換、または対数極座標でのフーリエ変換のうちの１つ以上を利用して判定される、実施態様８に記載の方法。
［実施態様１０］
角度を計算するステップにおいて、スライドガラス長（Ｌ）およびスライドガラス幅（Ｗ）を含む寸法が、角度（ａ１、ａ２、ａ３）を判定し、前記スライドガラス（１１４）の斜辺を計算するために、コンピュータプロセッサによって実行されるときに、次の計算で利用され、角度が
【００５２】
【数４】
0006662527.tif 000005
【００５３】
により規定される実施態様６乃至９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１１］
（ｘ０，ｙ０）におけるスライドガラスの原点（１２５）を判定するステップが、
ｘ０＝ｘ２−ｒ  ｃｏｓ  ａ３
であることを特徴とする、前記スライドガラス（１１４）の水平な縁部（１２０）の配置、および、
ｙ０＝ｙ２−ｒ  ｓｉｎ  ａ３
であることを特徴とする、前記スライドガラス（１１４）の上側の縁部および下側の縁部の配置によって判定される実施態様６乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１２］
限界値が予め決定され、前記限界値を超えた場合に自動的に使用者に警告するように設定される、実施態様１１に記載の方法。
【符号の説明】
【００５４】
１００  スライドガラスホルダ
１０１  開いている画像化領域
１０２  水平な底辺部
１０３  ２つの側面／側部
１０４  水平な底辺縁部、水平な底辺部
１０５  支持壁
１０５ａ  支持部
１０６  上側の平面
１０８  下側の平面
１１０  カバープレート
１１１  配置用ねじ
１１２  配置スライダ
１１３  調整部
１１４  スライドガラス
１１５  溝
１１６  切り欠き
１１７  切り欠き
１１８  側縁部
１１９  隅の縁部、隅
１２０  縁部
１２５  原点
１３０  デジタルの検証
【図１】
0006662527.tif 000007
【図２Ａ】
0006662527.tif 000008
【図２Ｂ】
0006662527.tif 000009
【図２Ｃ】
0006662527.tif 000010
【図３】
0006662527.tif 000011