(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の雄受胎能を高める製剤を製造するための、ラクトバシルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＣＥＣＴ  ８３６１株とビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＣＥＣＴ  ７３４７株を組み合わせての使用。
【請求項２】
ラクトバチルス・ラムノサスとビフィドバクテリウム・ロングムの比が約５０：５０である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記製剤が医薬製剤または機能性栄養製剤である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬製剤が、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいる、請求項３に記載の使用
【請求項５】
前記医薬製剤が、経口投与用に開発されたものである、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
前記機能性栄養製剤が、食品または栄養補助食品である、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
前記食品が、乳製品、肉製品、植物性製品、動物飼料および飲料からなる群より選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記対象が、魚類または哺乳動物、好ましくはヒト、ブタ、ウマ、ウサギ、およびウシからなる群より選択される哺乳動物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記製剤中に含まれる前記ラクトバチルス・ラムノサス株およびビフィドバクテリウム・ロングム株の微生物が、１０6〜１０12ｃｆｕ／日の用量で、好ましくは１０9ｃｆｕ／日の用量で投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記製剤の前記用量が、少なくとも１日１回である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７株が、抗炎症活性を示す、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株およびビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７株を含み、その組み合わせが雄受胎能を高めるものである、製剤。
【請求項１３】
前記ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１とビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７との比が約５０：５０である、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
前記製剤が医薬製剤または機能性栄養製剤である、請求項１２または１３に記載の製剤。
【請求項１５】
前記医薬製剤が、薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいる、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
前記医薬製剤が、経口投与に適している、請求項１４または１５に記載の製剤。
【請求項１７】
前記栄養製剤が、機能性食品または栄養補助食品である、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１８】
前記食品が、乳製品、肉製品、植物性製品、動物飼料および飲料からなる群より選択される、請求項１７に記載の製剤。
【請求項１９】
前記製剤中に含まれる前記ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株およびビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７株の微生物の総濃度が、１０6〜１０12ｃｆｕの間、好ましくは１０9ｃｆｕである、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２０】
前記ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株が、他のラクトバチルスの株よりも高い抗酸化活性を示す、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項２１】
前記ビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７株が、抗炎症活性を示す、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロバイオティクス能を有する２つの微生物種、すなわちラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）およびビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）を含有している、雄受胎能を向上させるための製剤の使用に関する。そのため本発明は、医薬および農業食品業界の双方で使用される、ヒトおよび動物の生殖の分野に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスとは、適量を摂取したときに、利用者の健康に利益をもたらす生きた微生物のことである。これらは基本的に、機能性食品または栄養補助剤に使用されており、それ故、農業食品業界と医薬業界のそれぞれで大きな関心をもたれてきた。現在までに使用されてきたプロバイオティクスのほとんどが、消化管に有効な傾向を示しており、また、大腸炎、便秘症または小腸炎などのような消化器系障害に良い影響を及ぼす。また、一部の科学文献では、プロバイオティクスを膣感染症、皮膚疾患、さらには肥満または自閉症に使用した例についても言及されている。
【０００３】
ヒトの生殖分野でのプロバイオティクスの使用は限定的であり、主に、女性側の要因および前述したような膣感染症の例に焦点を当てている。この点に関しては、プロバイオティクスを細菌性膣炎の治療に用い、臨床試験でポジティブな結果が得られた研究がある（マストロマリノ（Ｍａｓｔｒｏｍａｒｉｎｏ）ら、２０１３。イタリア医薬微生物学会誌（Ｎｅｗ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）３６（３）：２２９−３８；ボルゲス（Ｂｏｒｇｅｓ）ら、２０１４。ドイツ産婦人科学会誌（Ａｒｃｈ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｂｓｔｅｔ．）、２８９（３）：４７９−８９）。逆にいえば、プロバイオティクスがヒト雄受胎能に及ぼす影響に関する記載はない。ゼブラフィッシュ動物モデルでは、プロバイオティクスの摂取によって、生殖の質に関連がある分子マーカーが有意に増えたことが見いだされた（リエスコ（Ｒｉｅｓｃｏ）ら、２０１３。プロバイオティクスを含む餌がゼブラフィッシュの精子の質に及ぼす影響（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  ｄｉｅｔ  ｏｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｓｐｅｒｍ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｍａｒｋｅｒｓ．）、第４回国際魚類生殖ワークショップ（４th  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｇａｍｅｔｅｓ）、（アルブフェイラ、ポルトガル）。しかしながら、今日まで、プロバイオティクスの摂取がヒトの精子の質に関する指標にどう影響を及ぼすかを評価した科学的出版物、または、これら栄養補助製剤の摂取と、精子の運動性に相関があるかを評価した科学的出版物はない。
【０００４】
さらに、乳酸菌およびビフィドバクテリアの酸化防止効果についても動物での研究はあるが、ヒト精子の質との関連では研究されていない（リエスコら、２０１３。前段で引用）。過去数十年の間に我々は、男性の精子指標ならびに彼らの女性パートナーにおける受精またな妊娠率を改善するための酸化防止剤処置の有効性を確立するための臨床研究を開発してきた。共通して試験した酸化防止剤は、ビタミンＣ、ビタミンＥ、セレン、グルタチオン、亜鉛、Ｎ−アセチル−システイン、およびＬ−カルニチンである（ガラゴズルー（Ｇｈａｒａｇｏｚｌｏｏ）ら、２０１１。ヒトの生殖（Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ）、２６（７）：１６２８−１６４０；コー（Ｋｏ）およびサバネイ（Ｓａｂａｎｅｇｈ）、２０１２。男性病学雑誌（Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ）３３（３）：２９２−３０８；ショウエル（Ｓｈｏｗｅｌｌ）ら、２０１３。コクランデータベース・システムレビュー（Ｃｏｃｈｒａｎｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｙｓｔ  Ｒｅｖ）、５；８：ＣＤ００７８０７）。このような研究のいくつかでは、これら抗酸化剤（凍結保護溶液に添加剤として加えた）の効果をインビトロアッセイで評価し、これらの添加剤には、凍結融解プロトコル中に生成された酸化分子にから精子を保護するための有効性があると結論づけられている（ワルチャック−ジェドルゼジョウスカ（Ｗａｌｃｚａｋ−Ｊｅｄｒｚｅｊｏｗｓｋａ）ら、２０１３。中欧泌尿器学会誌（Ｃｅｎｔ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ  Ｕｒｏｌ．）６６（１）：６０−７）。他の研究では、経口抗酸化物質が精子パラメーターに及ぼす影響が評価されている。例えば、２０１０年に、ロス（Ｒｏｓｓ）ら（ロスら、２０１０、生殖生体医学オンライン（Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ）、２０（６）：７１１−２３）は、抗酸化剤を経口摂取することの精子パラメーターに及ぼす有効性について概説している。スペイン特許第ＥＳ２２２５６２５号には、亜鉛源のうちの少なくとも１つ、ならびに、必要に応じてビタミンＢ１２、マグネシウム、ベタイン、コリン、ＳＡＭ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６を含むヒト精子の質を改善するための処方が記載されている。同様に、スペイン特許ＥＳ２３９７６５７には、有効成分であるＬ−カルニチン、補酵素Ｑ、ビタミンＥ、亜鉛源、ビタミンＢ、セレン源、グルタチオン、Ｌ−アルギニンまたはそれらの塩もしくは誘導体の組み合わせを含む、精子の質を改善するための処方が記載されている。しかしながら、これらの治療の効果は、時間が経つと必ずしも持続するわけではなく、精子の質において最も重要なパラメーターの１つである精子ＤＮＡの断片化が低減するかどうかは不明である。
【０００５】
したがって、当該分野の状況には開きがあり、上記の欠点を示さない、精子の質を改善し、雄受胎能を高めるための代替方法に対するニーズがある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）株とビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）株とを合わせて投与することにより、雄受胎能が向上することを見出した。特定の実施形態では、菌株はラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ８３６１およびビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７である。実施例１に示すように、試験参加者にラクトバチルス・ラムノサスとビフィドバクテリウム・ロングムを組み合わせて含む製剤を摂取させると、精子の質の評価において２つの重要なパラメーターである精子の運動性と精子ＤＮＡの断片化において、精子の運動性が向上し、精子ＤＮＡの断片化の低減がみられた。したがって、これらのプロバイオティクス菌株を組み合わせて摂取することで、精子の質が改善され、その結果、雄受胎能が向上する。加えて、この受精能の向上は、製剤を最後に摂取してから６週間後まで維持され、効果が長く持続する。これらの結果は、ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株の抗酸化能力と、ビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７株の抗炎症能とを組み合わせることによって、精子の運動性が向上し、精子ＤＮＡの断片化が低減したのだろうということで説明可能である。したがって本明細書に記載の発明は、補助を使った生殖または自然の生殖に先立って、さらには将来的な授精を見据えた精子提供を行う前に、雄受胎能を高めるという治療に対処するプロバイオティクス特性を有する細菌株の使用を支持するものである。
【０００７】
この発見に基づいて、我々は、以下に詳述する、数多くの発明的側面を開発した。
【０００８】
対象雄受胎能を高めるための、ラクトバチルス・ラムノサスおよびビフィドバクテリウム・ロングム種の菌株の併用投与
【０００９】
本発明者らは、ラクトバチルス・ラムノサス株とビフィドバクテリウム・ロングム株とを合わせて投与することにより、雄受胎能が向上することを見出した。しかしながら、ラクトバチルス・ラムノサス、特にＬ．ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１の抗酸化能力は他のラクトバシラス種と比較して顕著なので、雄受胎能を高めるための医薬製剤を調整するのに、ラクトバチルス・ラムノサスを単独で使用することも除外すべきではない。精子膜、ＤＮＡの完全性および精子の運動性は活性酸素種によって変化する場合があるが、本発明者らは、ラクトバチルス・ラムノサス、特にＬ．ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株の抗酸化能によって、活性酸素種による変化から精子が保護されると考えている。したがって、本発明者らは、この株の抗酸化能力が精液の質を高めると考えている。特に、精子の運動性を高め、精子のＤＮＡ断片化を低減させ、最終的には雄受胎能が向上する。さらに、ビフィドバクテリウム・ロングム、特にビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７の抗炎症能により、本発明は、ビフィドバクテリウム・ロングム単独で、特にビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７を別個に使用して雄受胎能を高めることも可能にする。本発明の著者らは、炎症性ＴＮＦαレベルを低下させ、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０産生を増加させるビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７の能力により、精子が酸化ストレスから保護されると考えている。したがって本明細書では、対象雄受胎能の向上に関し、少なくともＬ．ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１とビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７を含む製剤の使用も提供する。
【００１０】
本発明は一側面において、対象の雄受胎能を高める製剤（以下、「本発明の製剤」）を製造するために、ラクトバシルス・ラムノサスをビフィドバクテリウム・ロングムと組み合わせて使用することに関する。
【００１１】
ラクトバチルス・ラムノサス細菌は、主にヨーグルトおよび他の乳製品においてプロバイオティクスとして多く使用されている。ラクトバチルス・ラムノサスの科学的分類は、細菌界、フィルミクテス門、バチルス綱、ラクトバチルス目、ラクトバチルス科、ラクトバチルス属、ラクトバチルス・ラムノサス種である。さらに、ビフィドバクテリウム・ロングムは、カタラーゼ陰性で丸い形状のグラム陰性菌であり、乳酸が産生される胃腸管に分布している。ビフィドバクテリウム・ロングムの科学的分類は、細菌界、フィルミクテス門、アクチノバクテリア綱、ビフィドバクテリウム目、ビフィドバクテリア科、ビフィドバクテリウム属、ビフィドバクテリウム・ロングム種である。
【００１２】
本明細書において、対象における「雄受胎能の向上」という用語は、対象の精液の質を改善し、それにより、女性の受精能および妊娠の可能性を高めることを意味する。当業者であれば理解できるように、本発明の菌株を摂取すると、本発明の菌株を摂取する前の同じ対象の精液品質と比較して、所与の対象の精液の質が改善される。対象の精液の質は、例えば、精子の運動性、精子の生存率、精子の形態、精子膜組成、精子濃度、射精容積および精子ＤＮＡの完全性などを含むがこれらには限定されない多くのパラメーターによって測定することができる。これらのパラメーターを測定するためのいくつかの方法が従来技術に記載されており、それらの使用は当業者にとって日常的な行為である。ＴＵＮＥＬアッセイ（ターミナルトランスフェラーゼｄＵＴＰニックエンドラベリング）、精子クロマチン構造アッセイ（ＳＣＳＡ）、コメットアッセイおよび精子クロマチン分散（ＳＣＤ）試験のような、精子ＤＮＡの完全性を評価するものもある。他の検査には、アクリジンオレンジおよびクロモマイシンＡを併用したトルイジンブルー染色による、精子クロマチンパッケージングの欠陥の特定がある。さらに、種々のタイプのＲＮＡ（ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡなど）などの、複数の分子マーカーがある。これらの分子マーカーは、精液の質がより高いことと関連している可能性があるが、臨床診療において日常的に行われている操作ではない。
【００１３】
したがって、特定の態様において雄受胎能の向上には、精子の運動性の向上、精子の生存率の向上、精子膜組成の改善、形態学的に正常な精子濃度の増加および／または精液中の精子の総数の増加が含まれ、および／または、精子ＤＮＡの断片化の低減および精子クロマチンの完全性の改善が含まれる。
【００１４】
精子ＤＮＡ断片化の低減によって、運動性および受精能の不全が回避され、初期胚発生および子孫において異常が生じる可能性が減少する。
【００１５】
本明細書では、精子ＤＮＡがコンパクトかつ安定に配置され、ＤＮＡが確実に受精の適切な時点で放出され、損傷を受けていないＤＮＡが伝搬するのを可能にするような物理化学的形態で遺伝物質がパッケージングされている時に、精子クロマチンの完全性が改善されたと理解される。
【００１６】
本明細書において「対象」という用語は、「個人」という用語と同等であり、この２つの用語は、本明細書において同じ意味で使用される場合がある。「対象」という用語は、再生のための配偶子を産生するあらゆる種（ヒトを含むが、これに限定されない）に属する任意の個体を意味する。対象の例にとしては、魚類（マス、イワシ、コイ、サケなど）、家禽（ニワトリ、ダチョウ、ニワトリ、ガチョウ、ウズラなど）、ウサギ、ノウサギ、ペット（犬、猫など）、家畜としてのヒツジおよびヤギ（ヒツジ、ヤギなど）、家畜としてのブタ（イノシシ、ブタなど）、家畜としてのウマ（ウマ、ポニーなど）、または家畜としてのウシ（種牛、牛など）、狩猟目的の動物（すなわち、シカ、トナカイなどの獲物）、環境上関心をもたれている動物、（すなわち絶滅の危機に瀕している動物またはその個体数が少ない動物、例えば、白虎、サイ、パンダ、クーガー、ヤマネコなど）、およびヒトが挙げられるがこれらには限定されない。しかしながら、特定の態様では、対象は魚類または哺乳動物であり、好ましくはヒト、ブタ、ウマ、ウサギ、ウシおよび種牛（ｏｘｅｎ  ａｎｄ  ｂｕｌｌｓ）からなる群から選択される哺乳動物である。
【００１７】
本明細書に記載されている使用は、受精能が低下しているか（不妊気味）、または受精能がない（不妊）かどうかにかかわらず、受精能を向上させるためにあらゆる男性対象に適用可能である。不妊の男性対象においては、受精能の向上は、生殖能を高めるために関心をもたれるだろう。さらに、妊娠確率の向上を望むヒトの夫婦では、妊娠見込みの改善も一般的な関心事であり得る。不妊気味の雄の個体では、本発明の製剤は、受精能の低下を治療するために、すなわち、受精が成功する可能性を高めるために使用することができる。
【００１８】
別の有効な使用法では、本発明の製剤を、哺乳動物のオスの固体、特にヒト男性に、前記オスの個体が不妊気味かまたは不妊であるかが事前に分かっていなくても、投与することができる。この態様には、例えば、なかなか妊娠しないカップルの男性対象に、検査を実施する必要性を除くためにおよび／または検査を行う前に、本発明の製剤を投与することが含まれるが、これに限定されない。このことは、検査システムの特異度や感度が様々であり、精子の量や質が変動する可能性があるため、精子検査には費用がかかること、対象の個人の気分を害してしまう可能性があるため、重要です。
【００１９】
本発明の製剤はまた、ここでも予備試験の実施を回避しながら、妊娠を望んでいるカップルの男性対象に、妊娠の可能性を高めおよび／または生じている可能性のある雄性不妊の問題に対処するために使用することができる。
【００２０】
本発明の製剤はまた、周期的な変動が、生殖に関する精子の量および質に及ぼす長期にわたる影響を予防するまたは相殺するために使用することもできる。
【００２１】
さらにこの製剤を、泌尿生殖器路障害のリスクがあるもしくは泌尿生殖器路障害になっている対象、および／または精子の質に影響を及ぼす可能性のある他の機能不全を有する対象に（例えば、薬物治療を受けている（もしくは受けるはずの）男性対象に）、ならびに薬物療法または放射線治療を受けている対象に、精子の質の低下を予防するために、予防的に使用することもできる。さらに、本発明の製剤および／または調製物は、例えば、栄養失調、環境因子および／または有害物質への曝露などの要因からの影響を受けた精子の質を改善するために、使用することができる。
【００２２】
ビフィドバクテリウム・ロングム株に対するラクトバチルス・ラムノサス株の割合は、大幅に変化し得る。本発明の製剤に含まれるラクトバチルス・ラムノサスとビフィドバクテリウム・ロングムの比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：０５などであるがこれらには限定されない。しかしながら特定の態様では、ラクトバチルス・ラムノサスとビフィドバクテリウム・ロングムの比は約５０：５０である。
【００２３】
当業者に理解されるように、本発明の製剤は、医薬投与用に、すなわち、対象によって消費または摂取される他の医薬品の一部を形成する形で、または食事での投与用に、すなわち、対象の食事に含まれ、食品の一部として消費される形で調製され得る。したがって、特定の態様において本発明の製剤は、医薬製剤または機能性栄養製剤である。
【００２４】
医薬製剤は、少なくとも、任意の濃度の本発明の菌株によって形成され、さらに、一定の生物学的、薬理学的および／または獣医学的活性を有する１種以上の成分または化合物、特に、対象に経口投与されたときに前記生物学的活性を発揮し得る成分または化合物をさらに含んでいる場合もある、成分のセットである。これらさらなる化合物は、それ自体が、男性の対象またはある種、特に哺乳動物種の個体に（経口で）投与した場合、男性対象の受精能および／または精子の質に有益な効果を有することが分かっている１種以上の化合物であってよく、および／または対象に投与すると、本発明の株の活性をさらに高め、増強し、および／または促進し得ることが分かっている、１種以上の化合物であってよい。当業者に理解されるように、さらなる化合物は本発明の株と適合しなければならない。したがって、本発明の文脈において「医薬製剤」という用語は、獣医製剤も含む。
【００２５】
さらなる化合物とは、精子形成を確実にするための１種以上の化合物、または任意のプロセスおよび／または精子形成の一部であり得る。これらの化合物の非限定的な例には、これらに限定されないが、
・マグネシウム、すなわち、例えば生物利用可能なマグネシウム塩（例えば、クエン酸マグネシウム）などの生物利用可能なマグネシウム源；
・１種以上のビタミン類、特にビタミンＢ１２および／またはビタミンＢ２；
・メチオニン、ベタインおよび／またはコリンのようなメチル基の適切な供給源；後者は、例えば、ホスファチジルコリンとして；またはレシチンのようなその適切な供給源；
・Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）などの適切なメチル化剤；
・グルコースの供給源；
・またはそれらの適切な組み合わせ、
が挙げられる。
【００２６】
これらさらなる化合物は、精子（の低下した）グルタチオンレベルを改善する１種以上の化合物であってもよい。このタイプの化合物の非限定的な例にはビタミンＢ６があり、ビタミンＢ６は、ピリドキサール（ピリドキサール）またはピリドキサミンなどのピリドキシン（安定性）またはその誘導体の形態で存在または投与され得る。精子のグルタチオンの状態を高めることはとりわけ、精子の寿命の延長、その運動性および／または卵子を受精させる能力を含む、精子の質を改善する。本発明の製剤および調製物に使用するのに適した他の成分としては、硫酸銅（ＩＩ）、炭酸銅（ＩＩ）またはクエン酸銅（ＩＩ）のような銅の供給源、特にＣｕ2+イオンの供給源が挙げられ得る。
【００２７】
雄受胎能を高めるのに役立つその他の化合物の例としては、葉酸、亜鉛、グルタチオン、アルギニンおよびα−リポ酸が挙げられるが、これらには限定されない。
【００２８】
特定の態様において医薬製剤は、薬理学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含む。
【００２９】
「賦形剤」という用語は、この製剤に含まれている任意の成分、すなわち本発明の菌株、の吸収を増強する、もしくは前記成分を安定化する、および／または医薬製剤になめらかさと風味を提供してより口当たりを良くするように、医薬製剤の調製を補助するあらゆる材料を指す。したがって賦形剤は、成分同士（例えば、デンプン、糖またはセルロース）を結合させる；甘味を付与する；着色する；活性成分を保護する（例えば、空気および／または湿気から遮断する）；丸薬、カプセルもしくは任意の形状において増量剤として機能する；崩壊を助け、成分の溶解を促す；などの作用をし得るが、この段落に列挙されていない他の賦形剤を排除するものではない。したがって、「賦形剤」という用語は、最終的な剤形に組み込まれる材料であり、活性成分または関連する成分に添加されて、それらの調製および安定化を容易にし、医薬製剤および生物学的利用能の官能特性または物理化学的特性を改変するものと定義される。「薬学的に許容可能な」賦形剤は、医薬製剤の成分の活性を阻害してはならない、すなわち、本発明の菌株と適合しなければならない。
【００３０】
「生薬製剤」または「剤形」は、活性成分および賦形剤を、製剤または薬物を製造するのに適応させる原理を指す。これは、医薬製剤が製造業者によって製造される形態と、それがどのように投与されるかの組み合わせによって定義される。
【００３１】
「担体」または「薬物送達媒体」は、不活性物質であることが好ましい。担体／媒体の機能は、他の化合物の取り込みを容易にし、用量および投与を改善し、および／または稠性を付与して医薬製剤に形成することである。したがって、担体／媒体は、本発明の医薬製剤に含まれる任意の成分を所与の体積または重量に希釈するために薬物中で使用される物質であり；またはこれらの成分を希釈しないが、良好な投与量および投与を可能にし、および／または薬物に対する一貫性および形態を与えるものである。形態が液体である場合、薬学的に許容可能な担体は希釈剤である。
【００３２】
さらに、賦形剤および担体／担体は、薬学的に許容可能でなければならない。すなわち賦形剤および担体は、投与される対象に無害であることが示されていなければならない。
【００３３】
それぞれの場合において、医薬製剤のフォーマットは、投与形態に合わせられる。したがって製剤は、溶液または任意の他の臨床的に許容される投与形態の形態であってよく、かつ、治療に有効な量であり得る。本発明の医薬製剤は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液、坐剤、ゲルまたはマイクロスフェアなどの固体、半固体または液体製剤として製剤化することができる。特定の態様において医薬製剤は、経口投与に適した形態である。
【００３４】
経口投与に適した形態とは、経口投与が可能な物理的状態を指す。経口投与に適した前記形態は、ドロップ、シロップ、ハーブティー、エリキシル、懸濁液、即時懸濁液、飲用バイアル、錠剤、カプセル、顆粒、でんぷんカプセル、丸剤、錠剤、ロゼンジ、トローチおよび凍結乾燥物からなるがこれらには限定されない群から選択される。
【００３５】
加えて前述のように、本明細書では、本発明の製剤が他の化合物と一緒に対象に投与され得るという可能性もまた提供されるが、これらは本発明の製剤の一部ではない。このような化合物の例は前述している。
【００３６】
したがって、対象は、本発明の製剤と同時にまたは連続して前記化合物を摂取する場合がある。
【００３７】
本発明の製剤が機能性栄養製剤として開発される場合、前記栄養製剤は、食物であってもよく、またはヒトの摂食を意図した食品もしくは食料品および／または動物飼料に組み込まれてもよい。したがって、特定の態様では、機能的性栄養製剤は、食品（特定の栄養目的のための食品または薬用食品または機能性食品であり得る）または栄養補助食品のいずれかから選択される。
【００３８】
本発明の「機能性食品製剤」または「機能性栄養製剤」という用語は、栄養素を対象に提供するかどうかにかかわらず、生物の１つまたは複数の機能に有益な効果を発揮し、健康の向上をもたらす食品である。本明細書では、前記機能性栄養製剤は、雄受胎能を改善することを目的としている。
【００３９】
「サプリメント」という用語は、「栄養補助食品」、「栄養サプリメント」または「食品サプリメント」のいずれかと同義語であり、食事を補う成分を指す。栄養補助食品の例としては、これらには限定されないが、ビタミン、ミネラル、植物性物質、アミノ酸、および酵素や腺抽出物などの食品成分が挙げられる。これらは、従来の食品の代替物、または食事や食べ物の単一成分として意図されてはいない、栄養補助食品である
【００４０】
ラクトバチルス・ラムノサス株およびビフィドバクテリウム・ロングム株を含み得る食品、または前段で説明したようなそれらを含む製剤の例としては、動物飼料、乳製品、植物性製品、肉製品、スナック、チョコレート、飲料、ベビーフード、シリアル、フライドポテト、ベーカリー製品、クッキーなどが挙げられるが、これらには限定されない。乳製品の例としては、発酵乳製品（ヨーグルトまたはチーズなどであるが、これに限定されない）または非発酵製品（例えば、クリーム、バター、マーガリンまたはホエーなどが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるがこれらには限定されない。植物性製品は、例えば、シリアル（任意の形態、発酵もしくは非発酵）、またはスナックであるが、これらには限定されない。飲料は、非発酵乳であってもよいが、これに限定されない。しかし、特定の態様では、食品は、乳製品、肉製品、植物性製品、動物飼料および飲料からなる群から選択される。
【００４１】
別の特定の態様では、本発明の製剤は、食事によって対象に投与される。
【００４２】
当業者に理解されるように、生物のラクトバチルス・ラムノサスおよびビフィドバクテリウム・ロングムを、対象に投与したときに雄受胎能を高める効果を発揮させるために、治療上有効量で本発明の製剤中に含めなければならない。本明細書において「治療上有効量」という用語は、医薬製剤中に含まれる成分の、対象に投与したときに効果を発揮するのに十分な量を意味する。医薬製剤に含まれる前記成分とは本発明の菌株を指す。治療上有効な量は、例えば、対象の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事、ならびに投与の様式および時間、排泄速度または薬物の組み合わせによって変化する。したがって、特定の態様では、製剤に含まれる微生物菌株であるラクトバチルス・ラムノサスおよびビフィドバクテリウム・ロングムの総濃度は、１０6〜１０12ｃｆｕ、好ましくは１０9ｃｆｕである。別の特定の態様では、製剤中の微生物ラクトバチルス・ラムノサスおよびビフィドバクテリウム・ロングムの投与量は、１０6〜１０12ｃｆｕ／日、好ましくは１０9ｃｆｕ／日であり、別のより特定の態様では、投与量は、少なくとも１日１回、具体的には１日２回、より具体的には１日３回、書く食事（朝食、昼食、夕食）ごとに１回である。
【００４３】
特定の態様において、ラクトバチルス・ラムノサスの株はラクトバチルス・ラムノサス株ＣＥＣＴ  ８３６１またはそれに由来する株、および／またはビフィドバクテリウム・ロングムの株はビフィドバクテリウム・ロングム株ＣＥＣＴ  ７３４７またはそれ由来の株である。本発明のこの特定の実施形態について、以降で詳細に説明する。
【００４４】
本発明の製剤ＩＩ
別の側面では、本発明は、ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１とビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７、またはそれらに由来する菌株を含む製剤（以下、「本発明の製剤ＩＩ」という）に関し、この菌株の組み合わせは、雄受胎能を高める能力を有する。
【００４５】
ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株を、生後３ヶ月未満の健康な授乳児の便から単離した。この株は２０１３年５月２７日、ブダペスト条約に従って、国際寄託当局（エディフィシオ（Ｅｄｉｆｉｃｉｏ）３  ＣＵＥ、バレンシア大学サイエンスパーク（Ｐａｒｃ  Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  ｄｅ  Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カテドラティコ・アグスティン・エスカルディノ（Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃｏ  Ａｇｕｓｔｉｎ  Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ）、９、４６９８０パテルナ（バレンシア）スペイン）に寄託され、受託番号ＣＥＣＴ  ８３６１（以下、「本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株」または「ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１」）が割り当てられた。本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株の科学的分類は、細菌界、フィルミクテス門、バチルス綱、ラクトバチルス目、ラクトバチルス科、ラクトバチルス属、ラクトバチルス・ラムノサス種である。
【００４６】
本発明の菌株ＣＥＣＴ  ８３６１を単離している間に、本発明者らは、ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１がラクトバチルス属から単離された他の菌株よりも驚くほど高い抗酸化活性を示すこと、すなわち、酸化ストレスから細胞をより保護することを発見した。したがって、特定の態様においてラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株は、ラクトバチルスの他の株よりも高い抗酸化活性を示す。そのため本発明者らは、この株の抗酸化能力が、最終的に雄受胎能を向上させる精液の質の向上、特に精子の運動性の向上および精子ＤＮＡの断片化の低減を説明できることに関連していると考えている。
【００４７】
ビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７株を、生後３ヶ月未満の健康な授乳児の便から単離し、２００７年１２月２０日、ブダペスト条約に従って、国際寄託当局のスペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（バレンシア、スペイン）に寄託した。この株には、受入番号ＣＥＣＴ  ７３４７（以下、「本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株」または「ビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７」）が割り当てられた。  本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株の科学的分類は、細菌界、フィルミクテス門、アクチノバクテリア綱、ビフィドバクテリウム目、ビフィドバクテリア科、ビフィドバクテリウム属、ビフィドバクテリウム・ロングム種である。本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株は、抗炎症活性を示す。
【００４８】
本明細書ではまた、本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株および本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株由来の微生物または細菌であって、精液質を改善し、および／または精子ＤＮＡ断片化を低下させ、およびクロマチンの完全性を改善することによって雄受胎能を高める能力を保持している微生物または細菌も提供する。本発明の株に由来する株または微生物の例は、本発明の株のゲノムと比較してそのゲノムに変化を有する変異体であってもよく、ここで前記変化は株の、雄受胎能を高める能力には影響しない変化である。したがって本明細書では、本発明の株由来の変異株であって、受精能を高める能力を保持する変異株も提供される。そのため、別の側面において本発明は、対象に併用投与した場合に雄受胎能を高める能力を有する、本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株および本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株に由来する株に関する。
【００４９】
本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株および本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株に由来する株は、当業者に知られている突然変異誘発法によって天然にまたは意図的に形成することができる。そのような突然変異誘発法には例えば、これらに限定されるものではないが、突然変異誘発剤またはストレッサーの存在下で親株を生育させること、もしくは遺伝子工学的に特定の遺伝子を改変、欠失および／または挿入することが挙げられる。したがって、本明細書ではまた、雄受胎能を高める能力を保持している、本発明の株由来の遺伝子改変生物も提供される。
【００５０】
さらに、本明細書では、本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株および本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株、または本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株および本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株に由来する株が分泌する細胞成分、代謝産物および分子、ならびにこれらの化合物を含む製剤および雄受胎能を高めるためのそれらの使用に言及する。細菌の細胞成分は、細胞壁の成分（ペプチドグリカンなどであるが、これに限定されない）、核酸、膜成分など、例えばタンパク質、脂質および炭水化物およびそれらの組み合わせ（リポタンパク質、糖タンパク質または糖脂質）であってよい。代謝産物としては、細菌が成長している間の代謝活動によって、技術的な過程における使用によって、または製品を保存している間に、細菌によって生じたもしくは変化したあらゆる分子が挙げられる。これら代謝産物の例としては、有機酸および無機酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、酵素、脂質、炭水化物、リポタンパク質、糖脂質、糖タンパク質、ビタミン、塩、金属または核酸が挙げられるが、これらに限定されない。分泌された分子には、細菌の成長によって、技術的な過程（例えば食品の加工もしくは薬剤）において使用したことによって、または製品を保存している間に、細菌によって環境中に分泌もしくは放出されたいかなる分子をも含む。これら分子の例としては、有機酸および無機酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、酵素、脂質、炭水化物、リポタンパク質、糖脂質、糖タンパク質、ビタミン、塩、金属または核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書では、１種の株または株の組合せは、対象が摂取した後にこの株が対象の精液の質を改善し、それにより、女性の受精可能性と妊娠の可能性が高まる場合に、「雄受胎能を高める」能力を有すると理解される。
【００５１】
本発明の製剤に含まれる本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株および本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株の割合は、大きく変化し得る。本発明の製剤に含まれるのラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１とビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７の比は、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：０５などであるが、これらには限定されない。しかし、特定の一態様では、ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１とビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７の比は約５０：５０である。
【００５２】
雄受胎能を高めるための本発明の製剤の使用に関して前述したように、本発明の製剤ＩＩは、医薬投与または栄養投与のために開発することができ、したがって、特定の態様において製剤は、医薬製剤または機能性栄養製剤である。
【００５３】
医薬製剤は、少なくとも、任意の濃度の本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株および本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株によって形成された成分のセットであり、このセットは、一定の生物学的、薬理学的および／または獣医学的活性を有する１種以上の成分または化合物を、特に、対象に経口投与したときに同様の生物学的活性を発揮し得る化合物を、さらに含む場合がある。これらのさらなる化合物は、それ自体が、ある種の、特に哺乳動物種の対象または雄個体に（経口）投与した場合に、雄個体の受精能および／または精子の質に有益な影響を有することが知られている１種以上の化合物であり得、および／または対象に投与した際に、本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株およびＣＥＣＴ  ７３４７株の活性をさらに高める、増強するおよび／または促進し得る１種以上の成分であり得る。当業者に理解されるように、さらなる化合物は本発明の菌株と適合しなければならない。したがって、本発明の文脈において、「医薬製剤」という用語は、獣医製剤も包含する。
【００５４】
さらなる化合物は、精子形成または精子形成の任意の部分および／または過程を確実にする１種以上の化合物であり得る。これらの化合物の非限定的な例については、前述した発明の側面において記載されており、また、本発明の製剤ＩＩに使用可能である。
【００５５】
特定の態様において医薬製剤は、薬学的に許容可能な担体／媒体および／または賦形剤を含む。「担体」、「媒体」、「賦形剤」および「薬学的に許容可能な」という用語は、本明細書において既に定義されており、本発明の側面に適用可能である。
【００５６】
それぞれの場合において、医薬製剤のフォーマットは、投与形態に合わせられる。本発明の医薬製剤は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液、坐剤、ゲルまたはマイクロスフェアなどの固体、半固体または液体製剤として製剤化することができる。特定の態様において医薬製剤は、経口投与に適した形態である。経口投与の例は、既に説明している。
【００５７】
加えて、本明細書ではまた、本発明の製剤が他の化合物と共に対象に投与され得る可能性も提供する。そのような化合物の例は前述した通りである。したがって対象へのこれらの化合物の投与は、本発明の製剤と同時にまたは連続して実施することができる。
【００５８】
本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株および本発明のＣＥＣＴ  ７３４７株を含む製剤が機能性栄養製剤として処方される場合、前記栄養製剤は食物であってもよく、またはヒトが摂取することを目的とした食品／食材および／または動物飼料に組み込むことができる。したがって、特定の態様において機能的栄養製剤は、食品（特定の栄養目的のための食品または医薬品であり得る）または栄養補助食品のいずれかから選択される。「機能性栄養製剤」、「サプリメント」および本発明の株または本発明の製剤ＩＩを含み得る食品の例については前述している。しかしながら、特定の態様において食品は、乳製品、肉製品、植物性製品、動物飼料および飲料からなる群から選択される。別の特定の態様では、本発明の製剤は、食事を介して対象に投与される。
【００５９】
当業者に理解されるように、本発明の株は、対象に投与したときに雄受胎能を高める効果を発揮させるために、治療上有効量で本発明の製剤中に含めなければならない。「治療上有効な量」という用語は、既に説明しており、本発明の文脈において使用することが可能な経路、用量および投与計画を有する。特定の態様では、本発明の製剤に含まれるラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１およびビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７微生物の総濃度は、１０6〜１０12ｃｆｕ、好ましくは１０9ｃｆｕである。
【００６０】
対象の雄受胎能を高める方法
別の側面において本発明は、雄受胎能を高める方法、以降「本発明の方法」と呼ぶ、に関し、この方法は、治療上有効量のラクトバチルス・ラムノサスとビフィドバクテリウム・ロングム、特にラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１とビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７を含む製剤を対象に投与することを含む。
【００６１】
当業者は、ラクトバチルス・ラムノサスおよびビフィドバクテリウム・ロングムの使用に関して前述した全ての特定の態様を、すなわち、投与形態、フォーマット、剤形、用量、治療することのできる対象等を、本発明の方法に適用できることを理解するであろう。
【００６２】
明細書および特許請求の範囲を通じて、「含む」という単語およびその変形は、その他の技術的特徴、添加剤、構成要素または段階を排除することを意図しない。当業者であれば、本発明の他の目的、利点および特徴は、部分的には明細書の記載から、部分的には本発明の実施から理解できる。以下の実施例および図面は、説明のために提供するものであり、本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、実験デザイン全体を通じた、運動性精子（％）の変動を示す棒グラフである。Ｃ（対照；ｎ＝９）、Ｔ１（処置１；ｎ＝８）、Ｔ２（処置２；ｎ＝７）、Ｌ１（休薬期間１；ｎ＝８）、Ｌ２（休薬期間２；ｎ＝７）。アスタリスクで示した値（平均±誤差）は、関連試料に関するスチューデントのｔ検定による統計分析で、対照と有意な差を示したものである（ｐ＜０．０５）。
【図２】図２は、実験デザイン全体を通じた、精子ＤＮＡ断片化指数（％）の変動を示す棒グラフである。Ｃ（対照；ｎ＝９）、Ｔ１（処置１；ｎ＝９）、Ｔ２（処置２；ｎ＝７）、Ｌ１（休薬期間１；ｎ＝８）、Ｌ２（休薬期間２；ｎ＝６）。アスタリスクで示した値（平均±誤差）は、関連試料に関するスチューデントのｔ検定による統計分析で、対照と有意な差を示したものである（ｐ＜０．０５）。
【図３】図３は、線虫におけるラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１の抗酸化能を示す棒グラフである。線虫における抗酸化活性を試験するために、本発明の２人の出願人のうちの１人、すなわちビオポリス、ＳＬのコレクションに含まれていたラクトバチルス属に属する２０の分離株に関してスクリーニングを行った。この図は、対照条件（大腸菌ＯＰ５０）を与えた線虫の生存率と比較した、各分離株を与えられた線虫の生存率を示している。正の値は抗酸化活性を示し、負の値は潜在的な酸化促進効果を示している。
【実施例】
【００６４】
これより本発明を、本発明の製剤の有効性を実証する、本発明者らによって行われた実験によって説明する。
実施例１：ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株およびビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７株を対象に同時投与した後の精子の質の向上
【００６５】
この試験を行うために、ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株およびビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７株を選択した。これらは、ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株が示した高い抗酸化活性、およびビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７株について既に記載のある抗炎症活性により、選択された。
【００６６】
両方の微生物、それぞれ５０％ずつの組み合わせを含有するカプセルの形態で投与した。用量は毎日１カプセルで、これは、１０9ｃｆｕ／日を摂取することに相当した。
【００６７】
レオン大学の生命倫理委員会よる承認の元、投薬治療を受けておらず、かつ、似通った食生活の精子無力症の男性が、ヘルシンキ宣言に準じ、スペインの州法に則ったインフォームドコンセントに署名した後、試験に参加した。
【００６８】
志願者は、３日間の性的禁欲の後、世界保健機関ハンドブック（ＷＨＯ、２０１０）に記載されているように無菌容器を使用して、精液試料を提供した。試料は採取直後に提供され、すぐに研究室で処理された。
【００６９】
提供者から要求された生物学的試料は、対照、Ｃ（プロビオティクス摂取開始前）、処置１、Ｔ１（プロビオティクス摂取３週間後）；処置２、Ｔ２（プロビオティクス摂取６週間後）；休薬期間１、Ｌ１（プロビオティクス摂取完了３週間後）；および休薬期間２、Ｌ２（プロビオティクス摂取完了６週間後）であった。プロビオティクスは、１日１カプセルを毎日摂取するものとし、各カプセルは、１０9ｃｆｕ／カプセルの濃度のラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１およびビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７両菌株を含有するものであった。
【００７０】
１×ＰＢＳ緩衝液を用い、最終濃度が１０〜２０×１０6細胞／ｍＬになるように精子を希釈した。この希釈物を３７℃で、１０μｍのマクラー（Ｍａｋｌｅｒ）計数チャンバーに載せた。同様に各試料の精子の運動性を、三眼位相差顕微鏡、３７℃の加熱プレートおよびバスラー（Ｂａｓｌｅｒ）Ａ３１２ｆｃデジタルカメラを備えたコンピューター支援精子分析（ＣＡＳＡ）を用い、１０倍の逆位相対物レンズを使って評価した。画像を、コンピューター運動性分析器を用い、ヒト精子用に設定して収集・分析した。全体として、システムからは、（１）運動している精子のパーセンテージ、（２）進行している精子のパーセンテージ、および（３）静的な精子のパーセンテージの３つのパラメーターが提供された。
【００７１】
ＤＮＡの断片化を評価するためにＳＣＳＡ（Ｓｐｅｒｍ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｓｓａｙ）（エベンソン（Ｅｖｅｎｓｏｎ））技術を実施した。試料の一部分量を使ってアクリジンオレンジ（ＡＯ）による異染性染色を行った。この分子は、変性させたＤＮＡと組み合わされると赤色のバンド幅内で蛍光を発し、損傷を受けていない二重らせんと組み合わされると緑のバンド幅内で蛍光を発する。射精液をＴＮＥ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）緩衝液で希釈して最終細胞濃度を約１〜２×１０6細胞／ｍＬとした。試料を処理するまで液体窒素中で直ちに凍結させた。続いて、試料を３７℃の温浴中で解凍し、２００μｌの酸性洗剤液（０．０８Ｎ  ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５トライトンＸ１００、ｐＨ１．４）と混合した。酸性洗剤液に３０秒間暴露した後、緩衝液１ｍｌあたりＯＡを６ｇ含有する１．２ｍＬの染色溶液（０．０３７Ｍ  クエン酸、０．１２６Ｍ  Ｎａ2ＨＰＯ4、０．００１１Ｍ  ＥＤＴＡ（二ナトリウム）０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）を添加することによってアクリジンオレンジで洗浄した。厳密に３分間染色した後、試料を、４８８μｍに設定された標準的な光学機器とアルゴンレーザーを備えたフローサイトメーターで分析した。細胞の流速を約２００細胞／秒に維持し、各サンプルについて５０００事象を計数した。粒子の赤色蛍光（ＦＬ３光検出器；６７０ロングパスフィルター）および緑色蛍光（ＦＬ１光検出器；５３０／３０バンドパスフィルター）に対応するデータを記録し、無料のソフトウェアであるウィーゼル（Ｗｅａｓｅｌ）３．１で分析した。主なパラメーターであるＤＮＡ断片化指数（ＤＦＩ）を分析した。これは、赤色蛍光と全蛍光（赤色および緑色）との比に相当する。
【００７２】
統計分析は、ＳＰＳＳバージョン２０を用いて行った。データは、全ての場合において、平均±ＳＥとして示す。スチューデントのｔ検定を用いて、各変数の平均値を関連試料と比較した（ｐ＜０．０５）。
【００７３】
提供者精子の運動性の状態を対照試料で確認し、志願者が、世界保健機関（ＷＨＯ、２０１０）の基準によって精子無力症と分類された。この試料に関して記録された運動細胞の値は、５．５６±２．５１％（平均値±ＳＥＭ）であった。プロビオティクス投与の３週間後（Ｔ１）、運動性精子の割合は、前回の試料採取と比較して約５倍増加し、３１．８８±６．０１％（平均値±誤差）の値に達した。この増加は、プロビオティクス投与の６週間後（Ｔ２）およびプロビオティクス投与が完了して３週間後および６週間後（Ｌ１およびＬ２）の両方のサンプルで維持されていた。得られたデータは、それぞれ、２８．１４±８．７９；３３．２５±６．３８および３９．５７±８．５２％であった（平均±ＳＥＭ）（図１）。統計解析を行ったところ、対照試料と他の試料との間に有意差が見られた（関連試料のスチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。図１を参照のこと。
【００７４】
図２は、実験デザイン中の各キーポイントで得られたＤＮＡ断片化指数の平均パーセンテージを示している。対照試料（Ｃ）におけるＤＦＩ（精子ＤＮＡ断片化指数）の最高値は２５．７４±０．５９％であった。プロビオティクスを６週間投与すると、、損傷ＤＮＡの割合は２１．１１±１．００および２１．５８±０．９４％（それぞれ、Ｔ１およびＴ２）に減少した。この傾向は、第１の休薬期間（Ｌ１）中でも継続し、平均ＤＦＩは２１．６４±１．７３％であった。菌株による処置が完了してから６週間後、それまでの試料採取で記録された改善は、休薬期間２（Ｌ２）において変化し始めた。Ｌ２においてはＴ１、Ｔ２およびＬ１と比較してより高いＤＦＩが記録され、フラグメンテーション指数は２３．０９±１．２８％であり、傾向が変化した。Ｔ１、Ｔ２およびＬ１では、対照試料と比較して有意差が見られた（関連試料についてのスチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【００７５】
この結果は、ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１株およびビフィドバクテリウム・ロングムＣＥＣＴ  ７３４７株が、機能性栄養製剤として摂取されたときに精子の運動性を刺激する役割を果たすことを示している。さらにこの結果から、処置後の精子ＤＮＡ断片化の有意な減少が確認できた。
【００７６】
実施例２．ラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１の抗酸化活性
線虫における抗酸化活性に基づいて、本発明の２つの出願人のうちの１人、すなわちビオポリス、ＳＬのコレクションに含まれるラクトバチルス属に属する２３の分離株をスクリーニングした。この研究で用いた菌株は、３ヶ月未満齢の授乳児の便から単離されたものである。
【００７７】
図３は、ラクトバチルス株を使った試験から得られた結果を示す。データは、標準条件（大腸菌ＯＰ５０株を与えた）で維持した線虫と比較した、各分離株を与えられた動物モデル（線虫）の生存率の増加を示している。図に示すように、ラクトバチルス・ラムノサスと同定された分離株１は、過酸化水素による酸化ストレスを与えた後の線虫の生存率が、最も高かった（対照条件と比較して生存率が２７％増加した）。
【００７８】
１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の配列を決定し、その後、ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）のＢＬＡＳＴオンライン（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用して、公的データベースに寄託された全遺伝子配列と得られた配列を比較したことによって、分離株１を間違いなく同定した。本発明のＣＥＣＴ  ８３６１株は、この種に属す、公開されている配列と最も高い相同性（１００％）を示したことから、ラクトバチルス・ラムノサスであると同定された。この株を、ＣＥＣＴ  ８３６１として、スペイン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＥＣＴ）に寄託した。
【００７９】
配列番号１−１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列決定によって得られたラクトバチルス・ラムノサスＣＥＣＴ  ８３６１の配列。
ＧＴＣＧＡＡＣＧＡＧＴＴＣＴＮＡＴＴＡＴＴＧＡＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＣＡＴＣＴＴＧＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＡＣＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＧＣＣＣＴＴＡＡＧＴＧＧＧＧＧＡＴＡＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＡＡＡＴＣＣＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＧＣＧＴＡＡＧＣＴＡＴＣＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＡＣＣＣＧＣＧＧＣＧＴＡＴＴＡＧＣＴＡＧＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＧＧＣＴＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＧＴＡＧＣＣＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＧＴＴＧＡＴＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＣＡＣＧＧＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧＧＡＣＧＣＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＧＣＴＴＴＣＧＧＧＴＣＧＴＡＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＧＧＣＡＧＡＧＴＡＡＣＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＧＴＧＡＣＧＧＴＡＴＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＴＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＣＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＧＴＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＧＧＣＴＴＡＡＣＣＧＡＧＧＡＡＧＴＧＣＡＴＣＧＧＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＣＴＴＧＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＧＡＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＡＮＧＣＧＧＣＴＧＴＣＴＧＧＴＣＴＧＴＡＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＮＧＣＴＣＧＡＡＡＧＣＡＴＧＧＧＴＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＮＮＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＮＡＣＣＧＣＡＡＧＧＮＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＴＧＮＡＧＣＡＴＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＡＧＣＡＮＣＮＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＮＧＧＴＣＴＴＧＡＣＮＴＣＴＴＴＴＧＡＴＣＡ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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