(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバント化学療法の有利または不利を判断するために、乳癌患者を分類する方法であって、乳癌患者の乳腫瘍の分子サブタイプを同定することを含み、分子サブタイプは、
（ａ）腫瘍試料においてヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程、
（ｂ）腫瘍試料においてエストロゲン受容体（ＥＳＲ１）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程、
（ｃ）腫瘍試料においてプロゲステロン受容体（ＰＧＲ）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程、および
（ｄ）腫瘍試料において増殖の指標である抗原Ｋｉ−６７（Ｋｉ６７）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程
を含むインビトロの方法を使用することによって同定され、
試料は腫瘍から抽出されたＲＮＡであり、
ＲＮＡ転写産物の発現量を逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲにより測定し、
ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲ、Ｋｉ６７以外の遺伝子ならびに所望により１つまたは複数の対照遺伝子のＲＮＡ転写産物の発現量は、測定せず、
分子サブタイプは、ルミナルＡおよびルミナルＢを含む群から選択される、
方法。
【請求項２】
ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量の測定は、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量が、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値より低いか、または高いかを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）を、工程（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の前に行う、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｄ）を、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の後に行う、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）を工程（ｂ）の前に行い、工程（ｂ）を工程（ｃ）の前に行い、かつ工程（ｃ）を工程（ｄ）の前に行う、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量；
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＡとして同定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いか、または高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＡとして同定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
分子サブタイプ ルミナルＡが、分子サブタイプ ルミナルＢと関連付けられる処置後の５年遠隔無再発生存率より少なくとも１１％、好ましくは少なくとも１３％高い処置後の５年遠隔無再発生存率に関連し、および／または分子サブタイプ ルミナルＢと関連付けられる処置後の５年生存率よりも少なくとも７％、好ましくは少なくとも９％高い処置後の５年生存率に関連する、請求項６から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
定量的ＰＣＲが蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲである、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
１５〜３０ヌクレオチド長の、配列番号１および２の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＥＳＲ１特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長の、配列番号４および５の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＨＥＲ２特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長の、配列番号７および８の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＫｉ６７特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長の、配列番号１０および１１の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＰＧＲ特異的プライマーの使用を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
２０〜３５ヌクレオチド長の、配列番号３の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＥＳＲ１特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長の、配列番号６の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＨＥＲ２特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長の、配列番号９の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＫｉ６７特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長の、配列番号１２の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＰＧＲ特異的プローブの使用を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
発現量を、腫瘍試料における１つまたは複数の対照遺伝子の（平均）発現量に対して正規化する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
１つまたは複数の対照遺伝子が、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ３７Ａ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＡＰＤＨを含む群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アジュバント化学療法がドセタキセルの投与を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法によってアジュバント化学療法に関して乳癌患者を分類するためのキットであって、
−少なくとも一対のＨＥＲ２特異的プライマーおよび少なくとも１つのＨＥＲ２特異的プローブ、
−少なくとも一対のＥＳＲ１特異的プライマーおよび少なくとも１つのＥＳＲ１特異的プローブ、
−少なくとも一対のＰＧＲ特異的プライマーおよび少なくとも１つのＰＧＲ特異的プローブ、および
−少なくとも一対のＫｉ６７特異的プライマーおよび少なくとも１つのＫｉ６７特異的プローブ
を含む、キット。
【請求項２１】
定量的ＰＣＲが蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
プローブの検出が、増幅依存性のプローブ置換に基づく、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２３】
プローブが、蛍光レポーター部分および蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
逆転写酵素およびポリメラーゼが、１工程逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲを可能にする酵素ミックスの形態で提供される、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
少なくとも一対の対照遺伝子特異的プライマーおよび少なくとも１つの対照遺伝子特異的プローブをさらに含む、請求項２０から２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
対照遺伝子が、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ３７Ａ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＡＰＤＨを含む群から選択される１つまたはそれ以上である、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
少なくとも１つの対照ＲＮＡサンプルをさらに含む、請求項２０から２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
プライマーが１２０ｂｐ未満のアンプリコンサイズを提供する、請求項２０から２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
ＥＳＲ１特異的プライマーが、１５〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号１および２の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＨＥＲ２特異的プライマーが、１５〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号４および５の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＫｉ６７特異的プライマーが、１５〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号７および８の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＰＧＲ特異的プライマーが、１５〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号１０および１１の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む、請求項２０から２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
ＥＳＲ１特異的プローブが、２０〜３５ヌクレオチド長であり、配列番号３の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＨＥＲ２特異的プローブが、２０〜３５ヌクレオチド長であり、配列番号６の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＫｉ６７特異的プローブが、２０〜３５ヌクレオチド長であり、配列番号９の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＰＧＲ特異的プローブが、２０〜３５ヌクレオチド長であり、配列番号１２の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む、請求項２０から３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
腫瘍が固形腫瘍である、請求項２０から３１のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、癌患者の腫瘍の分子サブタイプをインビトロで同定する方法および癌患者を腫瘍の治療のために層別化する方法に関する。本発明はさらに、癌患者の腫瘍の分子サブタイプを同定するのに有用なキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍の予後および治療応答の予測は、腫瘍の分子サブタイプに密接に関連している。現在、癌、例えば乳癌の受容体の状態を検出するのに世界的に適用されている標準的な方法は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検または切除組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）である。現在、内分泌療法または標的化全身療法（targeted systemic treatment）（すなわち、トラスツマブ）は、ほとんどがＩＨＣに基づいている。
【０００３】
ＦＦＰＥサンプルの調製およびその後の特異的抗体を用いた免疫組織化学的染色は、現時点では、病理検査室でのみ行われる技術である。ＦＦＰＥ腫瘍組織の顕微鏡検査から、染色結果の解釈に加えて、病理担当者が、腫瘍生物学および腫瘍の拡大に関するさらに臨床的に重要な情報を導き出す。さらに、ＦＦＰＥ組織検査の病理担当者の解釈は、臨床における意思決定に不可欠な意見であると考えられている。多くの国において、病理担当者は、乳癌の治療意思決定におけるいわゆるケースカンファレンスの不可欠なメンバーである。ＩＨＣは集中型設定では容易に実行することができるが、そうでなくても、試験する病理担当者の個人的意見および経験が、個々のケースの判断において重きを置かれている。
【０００４】
しかしながら、いくつかの研究が、免疫組織化学的結果の４０％もにおいて、観察者間の大幅なばらつきおよび技術的な変動を実証している。さらに、免疫組織化学は、個々の患者の状態に関して、定性的分析のみが可能であり、そして僅かの場合に、半定量的分析が可能であるに過ぎない。
【０００５】
従って、適当な腫瘍治療レジメンの選択（患者層別化）を容易にし、治療成功の予後および予測ならびに腫瘍の遠隔転移に関する患者のリスクの評価を可能にする、腫瘍、例えば乳癌の分子サブタイプ化のための、信頼性の高い、客観的、定量的および再現性のある検査システムが必要とされている。また、かかる検査システムは、かなりの割合の癌患者に適当な分散型検査を可能にするはずである。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
一面において、本発明は、癌患者において腫瘍の分子サブタイプを同定するインビトロの方法であって、該方法が、
（ａ）腫瘍試料においてヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定し、
（ｂ）腫瘍試料においてエストロゲン受容体（ＥＳＲ１）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定し、
（ｃ）腫瘍試料においてプロゲステロン受容体（ＰＧＲ）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定し、ならびに
（ｄ）腫瘍試料において増殖の指標である抗原Ｋｉ−６７（Ｋｉ６７）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定し、および／または
（ｅ）腫瘍試料においてＲａｃＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲＡＣＧＡＰ１）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程
を含む、方法に関する。
【０００７】
一態様において、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲならびにＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量の測定は、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲならびにＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量が、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲならびにＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値より低いか、またはそれより高いかを決定することを含む。
【０００８】
一態様において、工程（ａ）を、工程（ｂ）、（ｃ）ならびに（ｄ）および／または（ｅ）の前に行う。
【０００９】
一態様において、工程（ｄ）および／または工程（ｅ）を、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の後に行う。
【００１０】
一態様において、工程（ａ）を工程（ｂ）の前に行い、工程（ｂ）を工程（ｃ）の前に行い、かつ工程（ｃ）を工程（ｄ）および／または工程（ｅ）の前に行う。
【００１１】
一態様において、分子サブタイプが、ＨＥＲ２陽性、トリプルネガティブ、ルミナルＡおよびルミナルＢを含む群から選択される。
【００１２】
一態様において、ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値より高いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量により、腫瘍の分子サブタイプをＨＥＲ２陽性として同定する。
【００１３】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いか、または高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをトリプルネガティブとして同定する。
【００１４】
一態様において、分子サブタイプがルミナルＡまたはルミナルＢである。
【００１５】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量；
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する。
【００１６】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＡとして同定する。
【００１７】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いか、または高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する。
【００１８】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、；
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する。
【００１９】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＡとして同定する。
【００２０】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する。
【００２１】
一態様において、分子サブタイプ ルミナルＡが、分子サブタイプ ルミナルＢと関連付けられる処置後の５年遠隔無再発生存率より少なくとも１１％、好ましくは少なくとも１３％高い処置後の５年遠隔無再発生存率に関連し、および／または分子サブタイプ ルミナルＢと関連付けられる処置後のよりも少なくとも７％、好ましくは少なくとも９％高い処置後の５年生存率に関連する。
【００２２】
一態様において、方法は工程（ｄ）を含み、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量が、癌患者にとって予後不良の増加したリスク、特に遠隔転移の増加したリスクを示す。
【００２３】
一態様において、方法は工程（ｅ）を含み、ＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量が、癌患者にとって予後不良の増加したリスクを示す。
【００２４】
一態様において、方法は、工程（ｄ）および（ｅ）を含み、
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量、および
−ＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量が、癌患者にとって予後不良の増加したリスクを示す。
【００２５】
一態様において、方法は、工程（ｄ）および（ｅ）を含み、
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量、および
−ＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量が、癌患者にとって予後不良のさらに増加したリスクを示す。
【００２６】
一態様において、予後不良は、生存率、無再発生存率および遠隔無再発生存率の１つまたはそれ以上の相対的な低減を含む。
【００２７】
一態様において、腫瘍は固形腫瘍である。
【００２８】
一態様において、腫瘍は胸部腫瘍であるか、または胸部腫瘍由来である。
【００２９】
一態様において、癌は乳癌である。
【００３０】
一態様において、サンプルは腫瘍から抽出されたＲＮＡである。
【００３１】
一態様において、ＲＮＡ転写産物の発現量を逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲにより決定する。
【００３２】
一態様において、定量的ＰＣＲは蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲである。
【００３３】
一態様において、方法は、１５〜３０ヌクレオチド長の、配列番号１および２の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＥＳＲ１特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長の、配列番号４および５の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＨＥＲ２特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長の、配列番号７および８の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＫｉ６７特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長の、配列番号１０および１１の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＰＧＲ特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長の、配列番号１３および１４の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＲＡＣＧＡＰ１特異的プライマーの使用を含む。
【００３４】
一態様において、２０〜３５ヌクレオチド長の、配列番号３の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＥＳＲ１特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長の、配列番号６の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＨＥＲ２特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長の、配列番号９の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＫｉ６７特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長の、配列番号１２の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＰＧＲ特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長の、配列番号１５の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＲＡＣＧＡＰ１特異的プローブの使用を含む。
【００３５】
一態様において、発現量を腫瘍試料における対照遺伝子の１つまたはそれ以上の（平均）発現量に対して正規化する。
【００３６】
一態様において、１つまたは複数の対照遺伝子が、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ３７Ａ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＡＰＤＨを含む群から選択される。
【００３７】
一態様において、腫瘍の処置に関して癌患者を分類する方法であって、第一工程として、上記のインビトロの方法を用いて該癌患者の腫瘍の分子サブタイプを同定し、第二工程として、該インビトロの方法を用いて同定された分子サブタイプに基づいて腫瘍処置レジメンを選択することを含む。
【００３８】
一態様において、分子サブタイプが、ＨＥＲ２陽性、トリプルネガティブ、ルミナルＡおよびルミナルＢを含む群から選択される。
【００３９】
一態様において、
−分子サブタイプがＨＥＲ２陽性であり、腫瘍処置レジメンが、抗ＨＥＲ２抗体および化学療法剤の投与を含むか、
−分子サブタイプがトリプルネガティブであり、腫瘍処置レジメンが化学療法剤の投与を含むか、
−分子サブタイプがルミナルＡであり、腫瘍処置レジメンが内分泌療法であるか、または
−分子サブタイプがルミナルＢであり、腫瘍処置レジメンが内分泌療法および／または化学療法剤の投与を含む。
【００４０】
一態様において、分子サブタイプがルミナルＢであり、腫瘍処置レジメンが化学療法剤の投与を含む。
【００４１】
一態様において、分子サブタイプがルミナルＢであり、腫瘍処置レジメンが、タキサン、好ましくはドセタキセルの投与を含む。
【００４２】
一態様において、タキサンが、フルオロウラシル、エピルビシンおよびシクロホスファミド（ＦＥＣ）と併用投与される。
【００４３】
一態様において、腫瘍が固形腫瘍である。
【００４４】
一態様において、腫瘍が胸部腫瘍であるか、または胸部腫瘍由来である。
【００４５】
一態様において、癌が乳癌である。
【００４６】
さらなる面において、本発明は、癌の治療法であって、第一工程として、上記のインビトロ方法を用いて腫瘍処置のために癌患者を分類し、第二工程として、癌患者に該選択された腫瘍処置レジメンを提供することを含む、方法に関する。
【００４７】
さらなる面において、本発明は、逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ法により癌患者の腫瘍の分子サブタイプを同定するのに有用なキットであって、
−少なくとも一対のＨＥＲ２特異的プライマーおよび少なくとも１つのＨＥＲ２特異的プローブ、
−少なくとも一対のＥＳＲ１特異的プライマーおよび少なくとも１つのＥＳＲ１特異的プローブ、
−少なくとも一対のＰＧＲ特異的プライマーおよび少なくとも１つのＰＧＲ特異的プローブ、ならびに
−少なくとも一対のＫｉ６７特異的プライマーおよび少なくとも１つのＫｉ６７特異的プローブ、および／または
−少なくとも一対のＲＡＣＧＡＰ１特異的プライマーおよび少なくとも１つのＲＡＣＧＡＰ１特異的プローブを含む、キットに関する。
【００４８】
一態様において、定量的ＰＣＲは、蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲである。
【００４９】
一態様において、プローブの検出は、増幅依存性のプローブ置換に基づく。
【００５０】
一態様において、プローブは、蛍光レポーター部分および蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
【００５１】
一態様において、キットは、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。
【００５２】
一態様において、逆転写酵素およびポリメラーゼは、１工程逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲを可能にする酵素ミックスの形態で提供される。
【００５３】
一態様において、キットが、少なくとも一対の対照遺伝子特異的プライマーおよび少なくとも１つの対照遺伝子特異的プローブをさらに含む。
【００５４】
一態様において、対照遺伝子は、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ３７Ａ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＡＰＤＨを含む群から選択される１つまたはそれ以上である。
【００５５】
一態様において、キットは、少なくとも１つの対照ＲＮＡサンプルをさらに含む。
【００５６】
一態様において、プライマーは、１２０ｂｐ未満のアンプリコンサイズを提供する。
【００５７】
一態様において、ＥＳＲ１特異的プライマーが、１５〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号１および２の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＨＥＲ２特異的プライマーが、１５〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号４および５の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＫｉ６７特異的プライマーが、１５〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号７および８の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＰＧＲ特異的プライマーが、１５〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号１０および１１の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＲＡＣＧＡＰ１特異的プライマーが、１５〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号１３および１４の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む。
【００５８】
一態様において、ＥＳＲ１特異的プローブが、２０〜３５ヌクレオチド長であり、配列番号３の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＨＥＲ２特異的プローブが、２０〜３５ヌクレオチド長であり、配列番号６の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＫｉ６７特異的プローブが、２０〜３５ヌクレオチド長であり、配列番号９の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＰＧＲ特異的プローブが、２０〜３５ヌクレオチド長であり、配列番号１２の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＲＡＣＧＡＰ１特異的プローブが、２０〜３５ヌクレオチド長であり、配列番号１５の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む。
【００５９】
一態様において、腫瘍が固形腫瘍である。
【００６０】
一態様において、腫瘍が胸部腫瘍であるか、または胸部腫瘍由来である。
【００６１】
一態様において、癌が乳癌である。
【００６２】
別の面において、本発明は、癌患者において腫瘍の分子サブタイプを同定するための上記のキットの使用に関する。
【００６３】
別の面において、本発明は、癌患者の遠隔転移のリスクを評価するための上記のキットの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、サブタイプ化の従来の方法（例えば、ＩＨＣ）のためのバックアップとして、および患者の層別化の従来の方法を補完するものとしての本発明の方法の可能な利用法の概要を説明する。
【図２】図２は、乳癌患者の５年生存率について、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲ、Ｋｉ６７およびＲＡＣＧＡＰ１ ｍＲＮＡの発現量の予後および予測値を評価するためのパーティショニングテスト（partitionaing test）を示す。初めに、８５５個の腫瘍から入手可能なデータをＨＥＲ２ ｍＲＮＡ発現量により層別化して、ＨＥＲ２陽性腫瘍を同定した（≧カットオフ値３８）。ＨＥＲ２陰性腫瘍をさらにＥＳＲ１ ｍＲＮＡ発現量により層別化した。Ａ：ＥＳＲ１陽性腫瘍（≧カットオフ値３４）をさらに、Ｋｉ６７ ｍＲＮＡ発現量（カットオフ値３１．７）により層別化し、次いでＰＧＲ ｍＲＮＡ発現量（カットオフ値３０．２）により層別化した。Ｂ：別法として、ＥＳＲ１陽性腫瘍（≧カットオフ値３４）をさらに、ＰＧＲ ｍＲＮＡ発現量（カットオフ値３０．２）により層別化し、次いでＫｉ６７ ｍＲＮＡ発現量（カットオフ値３１．７）により層別化した。これらのデータのカプラン・マイヤー分析を図３および４に示す。Ｃ：Ｋｉ６７陽性腫瘍およびＫｉ６７陰性腫瘍を、ＲＡＣＧＡＰ１ ｍＲＮＡ発現量（カットオフ値３４．２）により層別化した。ＲＡＣＧＡＰ１のさらなる分析のための患者数を増すために、ＰＧＲのデータは図中に示されない。ＰＧＲのさらなる検討は、ＲＡＣＧＡＰ１に関する全体的な結果を変えない。データ（表３参照）は、定義された閾値以下または以上のＲＡＣＧＡＰ１ ｍＲＮＡ発現量が、５年生存率における特に顕著な差異と関連することを示している。
【図３】図３は、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２）、ルミナルＡ（ＬｕｍＡ）、ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）またはトリプルネガティブ（ＴＮＴ）腫瘍を有する乳癌患者の生存のカプラン・マイヤー分析を示し、ここで、腫瘍の分子サブタイプは、本発明によってＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７のｍＲＮＡ発現量に基づいて同定された。本発明者らにより定義されるルミナルＡサブタイプは、５年後の９７％の全生存率と関連している（これに対して、ルミナルＢおよびＨＥＲ２陽性腫瘍については８７％、トリプルネガティブ腫瘍については８４％である）。
【図４】図４は、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２）、ルミナルＡ（ＬｕｍＡ）、ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）またはトリプルネガティブ（ＴＮＴ）腫瘍を有する乳癌患者の遠隔転移なし（“ＤＭＦＳ”；手術後Ｘ年の遠隔再発）の生存のカプラン・マイヤー分析を示し、ここで、腫瘍の分子サブタイプは、本発明によってＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７のｍＲＮＡ発現量に基づいて同定された。本発明者らにより定義されるルミナルＡサブタイプは、５年後の９２％のＤＭＦＳ率と関連している（これに対して、ルミナルＢ、ＨＥＲ２陽性およびトリプルネガティブ腫瘍について７８％である）。
【図５】図５は、免疫組織化学による分子サブタイプ化（Sotiriou et al. (2009), N Engl J Med, 360(8):790−800）を、本発明による方法を用いる、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７のｍＲＮＡ発現量に基づく分子サブタイプ化と比較することによる、ＤＭＦＳの多変量のＣｏｘ回帰分析を示す。該分析は、本発明の方法により得られた結果がＣｏｘ比例ハザードモデルに包含される場合、免疫組織化学的サブタイプがその有意性を失うような、本発明の方法の優位性を明確に示している。
【図６】図６は、患者サンプル１から６およびロット１から３についてのＲＴ−ｑＰＣＲにより決定されるとおり、マーカーＨＥＲ２の４０−ΔΔＣＴ値を示す。
【図７】図７は、患者サンプル１から６およびロット１から３についてのＲＴ−ｑＰＣＲにより決定されるとおり、マーカーＥＳＲ１の４０−ΔΔＣＴ値を示す。
【図８】図８は、患者サンプル１から６およびロット１から３についてのＲＴ−ｑＰＣＲにより決定されるとおり、マーカーＰＧＲの４０−ΔΔＣＴ値を示す。
【図９】図９は、患者サンプル１から６およびロット１から３についてのＲＴ−ｑＰＣＲにより決定されるとおり、マーカーＫｉ６７の４０−ΔΔＣＴ値を示す。
【図１０】図１０は、ルミナルＢ腫瘍を有する患者の全生存率のカプラン・マイヤー分析を示す。Ａ：ＲＴ−ｑＰＣＲにより定義されたとき、ドセタキセル−ＦＥＣで処置されたルミナルＢ腫瘍を有する患者は、ビノレルビン−ＦＥＣで処置されたときよりも顕著に長く生存する（それぞれ、９７％対８９％、ハザード比［ＨＲ］０．２４１；ＣＩ：０．０９０−０．６４２）。Ｂ：ＩＨＣにより腫瘍サブタイプが定義されるとき、ルミナルＢ患者に対するドセタキセルの利益は示され得ない（９５％対９２％、ＨＲ０．６１７；ＣＩ０．２３５−１．６２３）。
【図１１】図１１は、ＳＡＰに指定されている通り、Ｃｏｘ回帰により腫瘍の組織学的タイプに合わせて調整された、ルミナルＢ腫瘍を有する患者の全生存率のカプラン・マイヤー分析を示す。Ａ：ＲＴ−ｑＰＣＲキットによるドセタキセルの利点の予測が重要である（９７％対８８％、ＨＲ０．２３２；ＣＩ０．０８７−０．６２４）。Ｂ：ＩＨＣによるサブタイプ分けは、ドセタキセルの利点を予測するものではない（９６％対９２％、ＨＲ０．５１０；ＣＩ０．１８４−１．４１４）。
【図１２】図１２は、ルミナルＢ腫瘍患者の遠隔転移なしの生存率（ＤＭＦＳ）のカプラン・マイヤー分析を示す。Ａ：ＲＴ−ｑＰＣＲにより定義されるとき、ルミナルＢ患者は、ビノレルビン−ＦＥＣに比べて、ドセタキセル−ＦＥＣで処置したとき、遠隔転移のないままでより高い生存率を有する（それぞれ８９％対７８％、ＨＲ０．４７１；ＣＩ０．２６３−０．８４３）。Ｂ：ルミナルＢ腫瘍がＩＨＣにより定義されるとき、生存率の差は、処置レジメン間で観察されなかった（８７％対８６％、ＨＲ０．９３８；ＣＩ０．４７４−１．８５６）。
【図１３】図１３は、ＳＡＰに指定されているとおり、Ｃｏｘ回帰によりリンパ節転移の数、腫瘍サイズおよび組織学的タイプについて調整された、ルミナルＢ腫瘍を有する患者の遠隔転移なしの生存率のカプラン・マイヤー分析を示す。Ａ：本発明のサブタイピングアッセイの使用により、効果は顕著である（９０％対７８％、ＨＲ０．４０９；ＣＩ０．２１９−０．７６４）。Ｂ：対照的に、腫瘍サブタイプ化がＩＨＣによる場合、影響を受けない（８９％対８５％、ＨＲ０．６７４；ＣＩ０．３０７−１．４８１）。
【図１４】図１４は、ＨＥＲ２陽性腫瘍患者の全生存率のカプラン・マイヤー分析を示す。Ａ：ＲＴ−ｑＰＣＲにより定義されるとき、ＨＥＲ２陽性患者は、ビノレルビンに比べてドセタキセルで処置したとき、より良好な全生存率を有しない（８７％対９１％、ＨＲ１．３２０；ＣＩ０．５５６−３．１３２）。Ｂ：同様の結果が、ＩＨＣによってサブタイプ分けされた腫瘍でも示されている（８６％対８９％、ＨＲ１．１７５；ＣＩ０．５１８−２．６６３）。
【図１５】図１５は、ＨＥＲ２陽性腫瘍の遠隔転移なしの生存率のカプラン・マイヤー分析を示す。Ａ：本発明の方法によって定義されるとき、ＨＥＲ２陽性患者は、ビノレルビンに比べてドセタキセルで処置したとき、遠隔転移なしの生存率に差はない（８０％対８１％、ＨＲ１．０７０；ＣＩ０．５５１−２．０７６）。Ｂ：同様に、ＩＨＣにより定義されたときも、異なる処置をされたＨＥＲ２陽性患者は生存率の差を示さない（７８％対７７％、ＨＲ０．９７５；ＣＩ０．５１６−１．８４３）。
【図１６】図１６は、ルミナルＡ腫瘍の全生存率のカプラン・マイヤー分析を示す。Ａ：ＲＴ−ｑＰＣＲにより定義されるとき、ルミナルＡ患者は、ビノレルビンと比べてドセタキセルで処置されたとき、全生存率が劣っている傾向がある（９５％対９８％、ＨＲ２．４７１；ＣＩ０．４７７−１２．８０９）。Ｂ：対照的に、ＩＨＣによって定義されるとき、ルミナルＡ患者は、ビノレルビンと比較してドセタキセルで処置したとき、弱く、有意ではないが、より高い全生存率の傾向を示す（９７％対９３％、ＨＲ０．４４３；ＣＩ０．１１４−１．７１６）。
【図１７】図１７は、ルミナルＡ腫瘍患者の遠隔転移なしの生存率のカプラン・マイヤー分析を示す。Ａ：ＲＴ−ｑＰＣＲにより定義されるとき、ルミナルＡ患者は、ドセタキセルまたはビノレルビンでの処置による遠隔転移なしの生存率に差はない（９２％対９０％、ＨＲ０．８２６；ＣＩ０．３３６−２．０３３）。Ｂ：ビノレルビンと比較してドセタキセルで処置されたＩＨＣサブタイプされた患者は、弱く、有意ではないが、より高い遠隔転移なしの生存率の傾向を示す（９３％対８８％、ＨＲ０．５５３；ＣＩ０．２２１−１．３８６）。
【図１８】図１８は、ＴＮＢＣ腫瘍患者の全生存率のカプラン・マイヤー分析を示す。Ａ：ＲＴ−ｑＰＣＲにより定義されるとき、ＴＮＢＣを有する患者は、ドセタキセルまたはビノレルビンで処置することにより全生存率の差を示さない（８４％対８３％、ＨＲ０．９４９；ＣＩ０．３３８−２．６６５）。Ｂ：ＩＨＣによって定義されるとき、ＴＮＢＣ患者は、弱く、有意ではないが、より高い全生存率の傾向を示す（８８％対８０％、ＨＲ０．５５２；ＣＩ０．２０７−１．４７２）。
【図１９】図１９は、ＴＮＢＣ腫瘍患者の遠隔転移なしの生存率のカプラン・マイヤー分析を示す。Ａ：異なる処置を受けた、ＲＴ−ｑＰＣＲ−により定義されるＴＮＢＣ患者は、遠隔転移なしの生存率に大幅な違いはない（７４％対７８％、ＨＲ１．２１１；ＣＩ０．５２３−２．８０２）。Ｂ：ＩＨＣにより定義されるＴＮＢＣ患者は、ビノレルビンと比較してドセタキセルで処理されたとき、弱く、有意ではないが、より高い遠隔転移なしの生存率の傾向を示した（８２％対７２％、ＨＲ０．６１５；ＣＩ０．２８４−１．３３３）。
【図２０】図２０Ａは、ＩＨＣ（ｙ軸上の％陽性細胞で示される）およびＲＴ−ｑＰＣＲ（ｘ軸上の４０−ΔΔＣＴで示される）による連続的なＫｉ６７概算値の散布図を示す。線は、統計解析計画の予め定義されたカットオフ値を示す（横軸：ＩＨＣ２０％；縦軸：ＲＴ−ｑＰＣＲ  ３４．８  ４０−ΔΔＣＴ）。Ｂは、ＲＴ−ｑＰＣＲに基づく分類とＩＨＣに基づく分類との一致点および不一致点をまとめたものである（陽性［ｐｏｓ］対陰性［ｎｅｇ］）。Ｃは、該方法間には高度に有意な相関（ｐ＜０．０００１）があるが、中程度の一致であることを明らかにするＫａｐｐａ統計学的値を示す。Ｄは、ＲＴ−ｑＰＣＲ対ＩＨＣによりＫｉ６７を試験するとき、陽性および陰性の割合（それぞれ、ＰＰＡおよびＮＰＡ）の一致を示す。
【図２１】図２１は、エストロゲン受容体陽性腫瘍を有する患者の遠隔転移なしの生存率のカプラン・マイヤー分析を示し、ＲＴ−ｑＰＣＲとＩＨＣとの間で不一致のＫｉ６７の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
発明の他の目的、利点および特徴は、特に、添付の図面と併せて考慮すれば、本発明の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００６６】
発明の詳細な説明
本発明は以下に詳細に記載されるが、本明細書に記載の特定の方法、プロトコールおよび反応材に限定されることなく、これらは変更可能であることが理解されるべきである。また、本明細書で用いる用語は、特定の態様を説明するためのものに過ぎず、後に続く特許請求の範囲によってのみ限定され得る本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。別段の定義がされない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００６７】
以下に本発明の構成要素を説明する。これらの要素は特定の態様で記載されているが、それらを任意の方法かつ任意の数で組み合わせて、さらなる態様を作成してよいことが理解されるべきである。種々の記載される実施例および好ましい態様は、本発明を明示的に記載された態様にのみ限定するものと解釈されるべきではない。本明細書は、明示的に記載する態様を任意の数の開示された要素および／または好ましい要素と組み合わせた態様を裏付け、包含するものであると理解されるべきである。さらに、本出願に記載される要素のあらゆる順序および組み合わせは、文脈中で断らない限り、本出願の記載により開示されているとみなされるべきである。
【００６８】
好ましくは、本明細書で用いる用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms：（IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH−4010 Basel, Switzerland (1995)に記載の通りに定義される。
【００６９】
本発明の実施は、特に断らない限り、当技術分野の文献に説明されている生化学、細胞生物学、免疫学、および組み換えＤＮＡ技術の常套方法を用い得る（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989を参照のこと）。
【００７０】
本明細書および後に続く特許請求の範囲の全体を通して、文脈上特に断る必要がある場合を除き、用語“含む”、ならびに“含んでいる”および“包含する”などの変形は、記載された単数の材料、整数もしくは工程または複数の材料、整数もしくは工程の群を包含することを意味するが、他の単数の材料、整数もしくは工程または複数の材料、整数もしくは工程の群を除くことを意味しないことが理解され得るが、ある態様において、かかる他の単数の材料、整数もしくは工程または複数の材料、整数もしくは工程の群は除外される場合もあり、すなわち、その主旨が、記載された材料、整数もしくは工程または複数の材料、整数もしくは工程の群の包含にあると理解され得る。本発明を記載する文脈において（とりわけ、後に続く特許請求の範囲と関連して）使用される用語“ａ”および“ａｎ”および“ｔｈｅ”ならびに同様の言及は、本明細書に特に断るか、または文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。本明細書中、値の範囲の列挙は、その範囲内に含まれる個々の値について個別に言及する簡略化された方法であることを意図しているに過ぎない。本明細書中に特に断らない限り、それぞれの個々の値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特に断るか、または文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に記載の任意および全ての実施例、または例示的表現（例えば、“のような（などの）”）の使用は、本発明をよりよく説明することを意図しているに過ぎず、特に断らない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の用語は、本発明の実施に不可欠な特許請求の範囲に記載されていない要素を示していると解釈されるべきものはない。
【００７１】
いくつかの文献が本明細書全体を通して引用されている。本明細書に引用される各文献（全ての特許、特許出願、科学文献、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記または下記にかかわらず、その内容全体を引用により本明細書中に包含させる。本発明が先行発明を理由としてそれらの開示に先行する権利がないと認めるものとして解釈すべき文言は、本明細書中にはない。
【００７２】
一面において、本発明は、癌患者において腫瘍の分子サブタイプを同定するインビトロの方法であって、
（ａ）腫瘍試料においてヒト上皮細胞増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定し、
（ｂ）腫瘍試料においてエストロゲン受容体（ＥＳＲ１）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定し、
（ｃ）腫瘍試料においてプロゲステロン受容体（ＰＧＲ）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定し、ならびに
（ｄ）腫瘍試料において増殖の指標である抗原Ｋｉ−６７（Ｋｉ６７）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定し、および／または
（ｅ）腫瘍試料においてＲａｃＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１（ＲＡＣＧＡＰ１）のＲＮＡ転写産物の発現量を測定する工程を含む方法に関する。
【００７３】
一態様において、該方法は、１つまたはそれ以上のさらなる非対照遺伝子の発現量、特にそのＲＮＡ転写産物の発現量の測定を含まない。言い換えると、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲならびにＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１以外の遺伝子ならびに１つまたは複数の対照遺伝子の発現量、特に、そのＲＮＡ転写産物の発現量は、測定しない。
【００７４】
一態様において、該方法は、組織学的グレーディングまたはリンパ節状態の決定などの任意の他の診断手順を含まない。
【００７５】
本明細書で用いる用語“腫瘍”は、悪性または良性の、全ての新生物細胞の成長および増殖、ならびに全ての前癌性細胞および組織ならびに癌性細胞および組織の成長および増殖を意味する。本発明の一態様において、腫瘍は固形腫瘍である。一態様において、腫瘍は胸部腫瘍であるか、または胸部腫瘍から（例えば、転移により）誘導される。
【００７６】
本明細書で用いる用語“癌”には、異常に調節された細胞の成長、増殖、分化、接着および／または遊走を特徴とする疾患が含まれる。本発明の用語“癌”には、白血病、精上皮腫、黒色腫、奇形腫、リンパ腫、神経芽腫、神経膠腫、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、副腎癌、甲状腺癌、血液の癌、皮膚癌、脳の癌、頚部癌、腸の癌、肝臓癌、結腸癌、胃癌、腸癌、頭頸部癌、胃腸癌、リンパ節癌、食道癌、結腸直腸癌、膵臓癌、耳鼻咽喉（ＥＮＴ）の癌、乳癌、前立腺癌、子宮の癌、卵巣癌および肺癌ならびにそれらの転移が包含される。それらの例は、肺癌腫、乳癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓細胞癌腫、頚部癌腫、または上記の癌タイプもしくは腫瘍の転移である。本発明の用語癌はまた、癌転移も包含する。一態様において、癌は乳癌である。
【００７７】
用語“乳癌”は、乳房組織、最も一般的には乳管の内層由来または乳管に乳汁を供給する小葉由来の癌の一種に関する。乳管に由来する癌は乳管癌として知られ、一方、小葉に由来する癌は小葉癌として知られる。時には、乳癌は転移性疾患として出現する。転移の一般的な部位には、骨、肝臓、肺および脳が含まれる。乳癌は、ヒトおよび他の哺乳動物で発生する。ヒトの症例の圧倒的多数が女性で発生するが、男性の乳癌も発生し得る。乳癌の処置は、手術、薬物療法（ホルモン療法および化学療法）、放射線療法および／または免疫療法を含み得る。
【００７８】
本明細書で用いる用語“患者”は、脊椎動物、特に、ヒトおよび別の哺乳動物の両方を含む哺乳動物、例えば、げっ歯動物、ウサギまたはサルなどの動物のような生物を意味する。げっ歯動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはチンチラであり得る。好ましくは、患者はヒトである。
【００７９】
本発明によれば、用語“ＲＮＡ転写産物”は、“メッセンジャーＲＮＡ”を意味する“ｍＲＮＡ”およびペプチドまたはタンパク質をコード化する“転写産物”を包含し、好ましくはそれらに関する。ｍＲＮＡは、典型的に、５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、タンパク質もしくはペプチドをコード化する領域および３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡは、細胞内およびインビトロで制限された半減期を有する。
【００８０】
遺伝子ＨＥＲ２（ＥＲＢＢ２とも言われる；遺伝子座：１７ｑ１２、アノテーション：染色体：１７；ＮＣ＿００００１７．１０）は、受容体チロシンキナーゼの上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体ファミリーのメンバーをコード化する。この遺伝子の増幅および／または過剰発現は、乳癌および卵巣腫瘍を含む多くの癌種で報告されている。ＮＣＢＩデータベースには、２種のタンパク質をコード化するＨＥＲ２の２つのｍＲＮＡ変異体が記載されている。タンパク質およびｍＲＮＡ配列は、受託番号ＮＭ＿００１００５８６２．１（受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２アイソフォームｂ）およびＮＭ＿００４４４８．２（受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２アイソフォームａ前駆体）により特定して見出され得る。ＨＥＲ２遺伝子増幅は、原発乳癌腫の約１０−２０％で起こる。
【００８１】
遺伝子ＥＳＲ１（遺伝子座：６ｑ２５、アノテーション：染色体６、ＮＣ＿０００００６．１１）は、ホルモン結合、ＤＮＡ結合および転写の活性化にとって重要ないくつかのドメインから構成されるリガンド活性化転写因子である、エストロゲン受容体（ＥＲ）をコード化する。エストロゲン受容体は、乳癌、子宮内膜癌および骨粗鬆症を含む病理学的プロセスに関与することが知られている。４つのＥＳＲ１ ｍＲＮＡ変異体が知られており、該転写変異体は、５’ ＵＴＲが異なり、かつ／または異なるプロモーターを用いるが、各変異体は、同じタンパク質をコードしている。全ての乳癌の７０−８０％は、ＥＲ陽性である。
【００８２】
遺伝子ＰＧＲ（ＰＲとも記載される；遺伝子座：１１ｑ２２−ｑ２３、アノテーション：染色体１１；ＮＣ＿００００１１．９）は、プロゲステロン受容体をコード化する。プロゲステロンのようなステロイドホルモンおよびそれらの受容体は、真核遺伝子発現の調節に関与し、標的組織の細胞増殖および分化に影響を与える。この遺伝子は、２つの異なるプロモーターおよび第一エキソンの翻訳開始部位を用いて、２つのｍＲＮＡアイソフォームＡおよびＢを生じる。該２つのアイソフォームは、アイソフォームＢのＮ末端中に見出されるさらなる１６５個のアミノ酸を除いて、同一である。胸部腫瘍の４０％はＰＧＲ陽性である。
【００８３】
遺伝子Ｋｉ−６７（Ｋｉ６７；遺伝子座：１０ｑ２６．２、アノテーション：染色体：１０；ＮＣ＿００００１０．１０）は、細胞増殖に関与し、それに必要とされ得る核タンパク質をコード化している。２つのｍＲＮＡ変異体が既報である。関連する偽遺伝子は、染色体１０上に存在する。胸部腫瘍の約２５％はＫｉ６７陽性である。
【００８４】
遺伝子ＲＡＣＧＡＰ１（遺伝子座：１２ｑ１３．１２、アノテーション：染色体１２；ＮＣ＿００００１２．１１）は、ＲａｃＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質１をコード化する。３つのスプライシング変異体が既報であり、それらの全てが同じタンパク質をコードしている。ＲＡＣＧＡＰ１は、中央紡錘体複合体の一成分であり、増殖関連プロセスおよび分化の制御に重要な役割を果たしている。
【００８５】
本明細書で用いる用語“発現量”は、転写産物および／またはタンパク質を産生するための、特定の遺伝子（すなわち、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲ、Ｋｉ６７またはＲＡＣＧＡＰ１）の発現を意味する。本発明により、発現量は、ＲＮＡ転写産物レベル、特にｍＲＮＡレベル（転写レベル）で、例えば転写されたｍＲＮＡ（例えば、ノーザンブロットによる）の測定、逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲまたはｍＲＮＡの直接的染色（例えば、インサイチュウハイブリダイゼーションによる）によって決定される。
【００８６】
一態様において、用語“腫瘍試料”は、癌患者から単離された腫瘍組織試料（例えば、腫瘍の生検または切除組織）を意味する。好ましい態様において、腫瘍組織試料は、腫瘍組織試料の低温切片であるか、または化学的に固定された腫瘍組織試料である。より好ましい態様において、腫瘍組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。一態様において、腫瘍の試料は、腫瘍組織試料から抽出された（全）ＲＮＡである。特に好ましい態様において、腫瘍の試料は、ＦＦＰＥ腫瘍組織試料から抽出された（全）ＲＮＡである。当業者は、ＲＮＡ抽出法を実行することができる。例えば、ＦＦＰＥ腫瘍組織の５〜１０μｍ厚の切片（ｃｕｒｌ）からの全ＲＮＡは、ハイピュアＲＮＡパラフィンキット（Roche, Basel, Switzerland）または、好ましくは、ＸＴＲＡＫＴ ＲＮＡ抽出キットＸＬ（Stratifyer Molecular Pathology, Cologne, Germany）を用いて抽出することができる。冷凍庫で使用／試験される試料材料を貯蔵し、それぞれの試料材料を解凍した後の適当な時点で本発明の方法をを実施することも可能である。試料は、治療開始前、治療中、および／または治療後に、すなわち、癌療法剤の投与前、投与中または投与後に癌患者から得ることができる。
【００８７】
本明細書で用いる用語“腫瘍の分子サブタイプ”は、異なる分子プロファイル、例えば、遺伝子発現プロファイルにより特徴付けられる腫瘍のサブタイプを意味する。一態様において、分子サブタイプは、ＨＥＲ２陽性、トリプルネガティブ（“ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ”型とも記載される）、ルミナルＡおよびルミナルＢを含む群から選択される。用語“ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ”型は、かかる腫瘍種が、遺伝子発現について、基底上皮細胞のそれと類似性を有するという事実を意味する。用語“ルミナル”は、腫瘍とルミナル上皮との遺伝子発現の類似性に由来する。
【００８８】
分子サブタイプは、臨床転帰および治療に対する反応性が顕著に異なる。一態様において、分子サブタイプ ルミナルＡは、本明細書に定義の通り、少なくとも１１％である治療後の５年遠隔無再発生存率と関係し、好ましくは少なくとも１３％より高い治療後の５年遠隔無再発生存率と関係し、および／または少なくとも７％、好ましくは少なくとも９％より高い治療後の５年生存率が、分子サブタイプ ルミナルＢと関係する。
【００８９】
特に、本明細書で用いる癌の処置に関して、用語“（治療的）処置”とは、患者の健康状態を改善し、および／または寿命を延長（増加）させる、任意の治療に関する。該処置は、癌を排除し、患者における腫瘍の大きさまたは数を低減させ、患者における癌の発症を停止または遅延させ、患者における新規の癌の発症を阻止または遅延させ、患者における症状の頻度または重篤度を低減させ、および／または現在癌を有するか、または以前に癌を有していた患者における再発を低減させ得る。一態様において、用語“処置”および“治療”は、原発腫瘍の外科的切除、化学療法、ホルモン療法、放射線療法および免疫療法／標的療法の１つまたはそれ以上を意味することを意味する。
【００９０】
アジュバント療法は、一次治療、主治療または初期治療に追加して実施される処置である。癌治療に用いられる外科手術および複合型処置レジメンは、アジュバント癌療法を記載するために主に用いられるべき用語である。アジュバント療法の例は、通常、すべての検出可能な疾患が除去されたが、潜在的疾患であるが故の再発の統計的リスクが残存する、外科手術後に行われる（術後の）追加の治療（例えば、化学療法）である。ネオアジュバント療法は、一次治療、主治療または初期治療の前（例えば、術前化学療法）に行われる処置である。
【００９１】
本発明に従い、“ＲＮＡ転写産物の発現量を測定する”工程は、（ｉ）ＲＮＡ転写産物の発現量を測定し、そして（ｉｉ）（例えば、規定の発現閾値のような対照発現量と比較することにより）ＲＮＡ転写産物の測定された発現量を分析する工程を含んでいてよく、ここで、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲならびにＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量を測定する順序は、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲならびにＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の測定された発現量を分析する順序と独立している。
【００９２】
一態様において、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲならびにＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量を測定することは、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲならびにＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量が、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲならびにＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値より低いか、または高いかどうかを決定することを含む。発現量が規定の発現閾値に等しい場合、該発現量は、規定の発現閾値より高い発現量のグループに属すると見なされる。従って、本明細書で用いる用語“規定の発現閾値よりも高い”には、規定の発現閾値よりも高いか、またはそれに等しい発現量が含まれる。“規定の発現閾値よりも高い”発現量は、“発現陽性”とも記載され得て、一方、“規定の発現閾値よりも低い”発現量は、“発現陰性”とも記載され得る。
【００９３】
本明細書で用いる用語“ＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値”は、多数の対象、特に、癌を有する対象から得られた多数のサンプルから計算された平均カットオフ値（略して：カットオフ）を意味し得る。閾値を得るために、多数の対象には、異なる分子サブタイプの腫瘍を有する対象、例えば、ＨＥＲ２陽性腫瘍を有する対象および／またはトリプルネガティブ腫瘍を有する対象および／またはルミナルＡ腫瘍を有する対象および／またはルミナルＢ腫瘍を有する対象が含まれ得る。閾値は、ＲＮＡ転写産物の量または濃度を表し得る。一態様において、閾値はＣＴ（閾値サイクル）値（以下参照）である。一態様において、（相対的）発現量および発現閾値は、４０−ΔＣＴまたは４０−ΔΔＣＴ値として表される（以下参照）。
【００９４】
本明細書で用いる用語“対象”は、脊椎動物、特に、ヒトおよび別の哺乳動物、例えば、げっ歯類動物、ウサギ、またはサルなどの動物、の両方を含む任意の哺乳動物のような任意の生物に関する。げっ歯動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、またはチンチラであり得る。好ましくは、対象はヒトである。一態様において、対象は、疾患、特に癌を有するか、またはそれを有すると予期される対象であって、本明細書中、“患者”とも記載される。平均カットオフ値の決定のために、少なくとも２名の対象、好ましくは少なくとも５名、少なくとも１０名、少なくとも２０名、少なくとも３０名、少なくとも４０名、少なくとも５０名、少なくとも６０名、少なくとも７０名、少なくとも８０名、少なくとも９０名、少なくとも１００名、少なくとも２００名、少なくとも３００名、少なくとも４００名、少なくとも５００名、少なくとも６００名、少なくとも７００名、少なくとも８００名、少なくとも９００名、少なくとも１０００名、少なくとも１５００名、または少なくとも２０００名の対象を試験する。
【００９５】
種々の臨床試験が既に本発明によって使用される遺伝子マーカーを用いて実施されてきたように、トレーニング・テストの設定における一致研究は、“発現陽性”または“発現陰性”なる定量的な結果の二分法のための臨床カットオフ／閾値の定義および検証に十分であり得る。従って、一態様において、カットオフ／閾値は、１つまたはそれ以上の前臨床試験に基づいて定義される。さらに、追加の臨床試験が、カットオフ／閾値の確立および検証のために行われてよい。カットオフ／閾値は、当該分野で公知の技術によって決定／定義されてよい。
【００９６】
一態様において、カットオフ／閾値は、ＩＨＣ−ＩＳＨなどの臨床病理パラメーター、ならびに／またはポーショニングテスト（例えば、ＳＡＳソフトウェアＪＭＰ(登録商標)９．０．０）によるトレーニングコホート（例えば、HE10−97, Pentheroudakis et al. (2009), Breast Cancer Res Treat, 116: 131−143）および独立した臨床試験のコホートでの検証、例えば、ＦｉｎＨＥＲ研究のＦＦＰＥ組織試料（Joensuu et al. (2006), N Engl J Med, 354: 809−820）における、全生存率（ＯＳ）、無病生存率（ＤＦＳ）、および遠隔転移なしの生存率（ＤＭＦＳ）、および疾患特異的生存率（ＤＳＳ）のデータ、に基づいて決定／定義された。
【００９７】
一態様において、４０−ΔＣＴ値は、以下のように計算される。４０−［患者サンプルのそれぞれのバイオマーカー（すなわち、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１）のＣＴ−患者サンプルの対象遺伝子（例えば、ＣＡＬＭ２）のＣＴ］（＝計算方法１）。複数の対照遺伝子が用いられる場合、４０−ΔＣＴ値は以下のように計算される。４０−（患者サンプルのそれぞれのバイオマーカーのＣＴ−患者サンプルの選択された対照遺伝子の平均ＣＴ）（＝計算方法２）。あるいは、４０−ΔΔＣＴ値を用いることができ、ここで該４０−ΔΔＣＴは以下のように計算される。ΔΔＣＴ＝４０−［（患者サンプルのバイオマーカーのＣＴ−対照サンプルのバイオマーカーのＣＴ）−（患者サンプルの対照遺伝子のＣＴ−対照サンプルの対照遺伝子のＣＴ）］（＝計算方法３）；例えば、４０−ΔΔＣＴ＝４０−［（Ｋｉ６７患者サンプルのＣＴ−Ｋｉ６７対照サンプルのＣＴ）−（患者サンプルのＣＡＬＭ２のＣＴ−対照サンプルのＣＡＬＭ２のＣＴ）］。一態様において、ＣＡＬＭ２は対照遺伝子として用いられる。
【００９８】
例示的態様において、平均カットオフ値は、計算方法２による４０−ΔＣＴ値として与えられ、ここで、ＨＥＲ２の平均カットオフ値は、４０−ΔＣＴ値が３８であり、ＥＳＲ１の平均カットオフ値は、４０−ΔＣＴ値が３４であり、ＰＧＲの平均カットオフ値は、４０−ΔＣＴ値が３０．２であり、Ｋｉ６７の平均カットオフ値は、４０−ΔＣＴ値が３１．７であり、そしてＲＡＣＧＡＰ１の平均カットオフ値は、４０−ΔＣＴ値が３４．２である。
【００９９】
別の態様において、バイオマーカーの相対的発現量は、以下のように計算される４０−ΔΔＣＴ値として与えられる。４０−［（患者サンプルのバイオマーカーのＣＴ−患者サンプルの対照遺伝子のＣＴ）−（対照サンプルのバイオマーカーのＣＴ−対照サンプルの対照遺伝子のＣＴ）］（＝計算方法４）；例えば、４０−ΔΔＣＴ＝４０−［（患者サンプルのＫｉ６７のＣＴ−患者サンプルの平均ＣｏｍｂＲｅｆのＣＴ）−（対照サンプルのＫｉ６７のＣＴ−対照サンプルの平均ＣｏｍｂＲｅｆのＣＴ）］。一態様において、ＣＴは、中央値ＣＴである。対照遺伝子のＣＴは、単一の対照遺伝子のＣＴまたは２以上の対照遺伝子の平均ＣＴ（平均ＣｏｍｂＲｅｆとも言う）であり得る。好ましくは、同じ対照サンプル（キャリブレータとも言う）は、すべての分析に使用され、同じＲＴ−ｑＰＣＲ結果またはｑＰＣＲ結果をもたらす。一態様において、対照サンプルは、細胞株ＲＮＡ、インビトロで転写された人工ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドの等モル混合物であり、バイオマーカーｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたはバイオマーカーアンプリコンもしくは一定の比を有するバイオマーカーアンプリコンの一部を示す。一態様において、ＣＡＬＭ２およびＢ２Ｍを対照遺伝子として用い、そして陽性対照（例えば、インビトロで転写された人工ＲＮＡ）を対照サンプル（キャリブレータ）として用いる。
【０１００】
例示的態様において、平均カットオフ値は、計算方法４による４０−ΔΔＣＴ値として与えられ、ここで、Ｖｅｒｓａｎｔ  ｋＰＣＲ装置ＡＤモジュール（Siemens）において、ＨＥＲ２の平均カットオフ値は４０−ΔΔＣＴ値が４０．９０であり、ＥＳＲ１の平均カットオフ値は、４０−ΔΔＣＴ値が３８．２０であり、ＰＧＲの平均カットオフ値は４０−ΔΔＣＴ値が３４．９０であり、そしてＫｉ６７の平均カットオフ値は、４０−ΔΔＣＴ値が３４．８０である。
【０１０１】
別の例示的態様において、平均カットオフ値は、計算方法４により４０−ΔΔＣＴ値として与えられ、ここで、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ(登録商標)４８０装置ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）において、ＨＥＲ２の平均カットオフ値は、４０−ΔΔＣＴ値が４１．１であり、ＥＳＲ１のカットオフ値は、４０−ΔΔＣＴ値が３８．００であり、ＰＧＲのカットオフ値は、４０−ΔΔＣＴ値が５．５０であり、そしてＫｉ６７のカットオフ値は、４０−ΔΔＣＴ値が３５．５０である。
【０１０２】
一態様において、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）ならびに（ｄ）および／または（ｅ）は、無作為順で行われる。一態様において、工程（ａ）は、工程（ｂ）、（ｃ）ならびに（ｄ）および／または（ｅ）の前に行われる。一態様において、工程（ｄ）および／または工程（ｅ）は、工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の後に行われる。一態様において、工程（ａ）は工程（ｂ）の前に行われ、工程（ｂ）は工程（ｃ）の前に行われ、そして工程（ｃ）は工程（ｄ）および／または工程（ｅ）の前に行われる。
【０１０３】
一態様において、ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値より高いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量により、腫瘍の分子サブタイプをＨＥＲ２陽性として同定する。
【０１０４】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いか、または高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをトリプルネガティブとして同定する。
【０１０５】
一態様において、分子サブタイプはルミナルＡまたはルミナルＢである。
【０１０６】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量；
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する。
【０１０７】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＡとして同定する。
【０１０８】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いか、または高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により、
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する。
【０１０９】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、；
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する。
【０１１０】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＡとして同定する。
【０１１１】
一態様において、
−ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、
−ＰＧＲのＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＰＧＲのＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量により
腫瘍の分子サブタイプをルミナルＢとして同定する。
【０１１２】
一態様において、方法は工程（ｄ）を含み、
−ＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＥＳＲ１のＲＮＡ転写産物の発現量、および
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量は、
癌患者の増加した予後不良のリスク、特に増加した遠隔転移のリスクを示す。
【０１１３】
一態様において、方法は工程（ｅ）を含み、ＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量は、癌患者にとって予後不良の増加したリスクを示す（ＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量を有する、腫瘍を有する癌患者のリスクと比較して）。
【０１１４】
Ｋｉ６７およびＲＡＣＧＡＰ１の両方のＲＮＡ転写産物の発現量の決定は、癌患者の臨床的結果に関するより正確な情報を提供し、ここで、一般的に、Ｋｉ６７またはＲＡＣＧＡＰ１の何れかのＲＮＡ転写産物の発現量の増加は、（Ｋｉ６７またはＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７またはＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量を有する、腫瘍を有する癌患者のリスクと比較して）癌患者にとって予後不良の増加したリスクを示す。
【０１１５】
一態様において、方法は工程（ｄ）および（ｅ）を含み、
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量、および
−ＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量は、癌患者にとって予後不良の増加したリスクを示す。
【０１１６】
一態様において、方法が、工程（ｄ）および（ｅ）を含み、
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量、および
−ＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量は、癌患者にとって予後不良のさらに増加したリスクを示す（Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量、およびＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも高いＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量を有する、腫瘍を有する癌患者の増加したリスクと比較して。ここで、好ましくは、さらに増加したとは、少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％の増加を意味する。）。
【０１１７】
用語“臨床的結果”は、疾患の臨床結果、特に処置後の、例えば、症状の緩解または改善として定義される。一態様において、予後不良には、生存率、無再発生存率および遠隔無再発生存率の相対的減少またはそれを超える減少が含まれる。癌に関連する用語“再発”には、原疾患の同じ部位および臓器での腫瘍細胞の再出現、最初の診断および癌治療の数年後に生じ得る転移、または腫瘍細胞の所属リンパ節への浸潤などの局所的事象が含まれる。“遠隔再発”は、癌細胞が、所属リンパ節を越えて身体の離れた部位（すなわち、別の臓器）に拡散（転移）している状況を意味する。無再発生存率は、一般的に、無作為化からの最初の再出現、再発、二次癌、または死亡までの時間として定義される。
【０１１８】
用語“転移”は、身体の別の部位への原発部位からの癌細胞の拡散を意味する。転移の形成は顕著に複雑な工程であり、悪性細胞の原発腫瘍からの剥離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔および血管に入るための内皮基底膜の貫入、その後の、血液による輸送、標的臓器への浸潤による。最後に、標的部位における新たな腫瘍の増殖は血管形成に依存する。腫瘍転移は、腫瘍細胞または成分が残存し、転移の可能性を生じ得るため、原発腫瘍の除去後に起こることもよくある。
【０１１９】
一態様において、“予後不良の増加したリスク”とは、
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量、および
−ＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量を有する、腫瘍を有する癌患者の処置後５年生存率よりも、少なくとも２０％低い、好ましくは少なくとも２５％低い、処置後５年生存率を意味する。
【０１２０】
一態様において、“予後不良のさらに増加したリスク”とは、
−Ｋｉ６７のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＫｉ６７のＲＮＡ転写産物の発現量、および
−ＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の規定の発現閾値よりも低いＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物の発現量を有する、腫瘍を有する癌患者の処置後５年生存率よりも、少なくとも３０％低い、好ましくは少なくとも３５％低い、処置後５年生存率を意味する。
【０１２１】
一態様において、ＲＮＡ転写産物の発現量は、逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）により決定される。ＲＮＡはＰＣＲで直接増幅することができないため、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに逆転写されなければならない。この目的のため、一工程ＲＴ−ｑＰＣＲを利用することができ、これは、逆転写反応とＰＣＲによるＤＮＡ増幅を同じ反応において組み合わせて行う。一工程ＲＴ−ｑＰＣＲにおいて、ＲＮＡテンプレートを、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびプローブ、ｄＮＴＰ、塩および界面活性剤を含む反応混合物中で混合する。最初のＰＣＲ工程では、標的ＲＮＡを、標的特異的リバースプライマーを用いて逆転写酵素により逆転写する。その後、ｃＤＮＡを、プライマー／プローブおよびＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅する。
【０１２２】
一態様において、定量的ＰＣＲは、蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲである。蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲは、蛍光標識したプローブの使用を含む。好ましくは、蛍光標識したプローブは、蛍光レポーター色素およびクエンチャー色素（＝二重標識プローブ）の両方で標識されたオリゴヌクレオチドからなる。好適な蛍光レポーター色素およびクエンチャー色素／部分は当業者に公知であり、それらには、レポーター色素／部分である６−ＦＡＭ(商標)、ＪＯＥ(商標)、Ｃｙ５(登録商標)、Ｃｙ３(登録商標)およびクエンチャー色素／部分であるｄａｂｃｙｌ、ＴＡＭＲＡ(商標)、ＢＨＱ(商標)−１、−２または−３が含まれるが、これに限定されない。プローブ特異的産物の増幅により、プローブの切断が起こり（＝増幅依存性のプローブ置換）、それによりレポーター蛍光の増加が生じる。反応中の蛍光の増加は、標的増幅産物の増加に正比例する。プローブ由来の蛍光を検出するためのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩシステム（Ｒｏｃｈｅ）またはＶｅｒｓａｎｔ ｋＰＣＲシステム（Siemens）またはＭｘ３００５Ｐシステム（Agilent Technologies）または同等のリアルタイム装置を用いることにより、リアルタイムで蛍光の増加を測定することができる。分析の出力は、各標的のＣＴ値である。ＣＴ（閾値サイクル）値は、プローブの蛍光シグナルが任意のバックグラウンドシグナルを超えた後の、ＰＣＲ増幅サイクル数によって決定され、ここで、ＣＴ値は、ＰＣＲ増幅前のサンプル中の標的分子の量の尺度である。好ましくは、ＣＴ値は、好適なソフトウェア（例えば、マイクロソフトエクセル(商標)）または統計ソフトウェアパッケージ（例えば、ＳＡＳ ＪＭＰ(登録商標)９．０．０、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ４、Ｇｅｎｅｄａｔａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ(商標)）を用いてさらに分析される。ＣＴ値は、既知の標的濃度の標準曲線のＣＴ結果に基づいて、標的の絶対分子量（例えば、ｎｇ／μｌまたは分子／μｌ）に変換することができる。あるいは、標的の量を、基準（＝ΔＣＴ）に基づいてｘ倍の減少量または増加量として示し得る。低いΔＣＴ値（小さな差）は、高いΔＣＴ（大きな差）と比較して、基準に対してより多量の標的を示す。一定値（例えば、ＰＣＲサイクル数、例えば４０サイクル）からそれを減算することにより、ΔＣＴを再計算するのに適している。結果は、標的の量と直接的な相関関係を有する値（高い値＝高量）であり、４０−ΔＣＴ値として表され、ここで、１つの整数は、標的の量の倍増を意味する（例えば、値３４は、値３３の量の２倍の量を示す）。システムの所望の再現性および精度に応じて、パネル型マルチプル対照アッセイ、またはキャリブレータ（1 point calibration; Pfaffl (2001), Nucleic Acid Res., 29(9):e45）のΔＣＴとサンプルのΔＣＴを再計算／正規化すること、が可能である。特定のプローブに異なる蛍光を用いることにより、同じ反応において異なる標的アッセイを多重化することも可能である。ＰＣＲの間、マルチプレックス内の各標的は、並行して増幅されたが、別々の蛍光発光を利用して検出された。
【０１２３】
好ましくは、本発明で用いるプライマーは、１５〜３０のヌクレオチド長、特にデオキシリボヌクレオチド長を有する。一態様において、プライマーは、（１）標的のｍＲＮＡ配列（すなわち、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１）に特異的であり、（２）１２０ｂｐ未満（好ましくは、１００ｂｐ未満）のアンプリコンサイズを提供し、（３）既知のタンパク質をコードするスプライシング変異体を全て検出し、（４）既知の多型（例えば、一塩基多型、ＳＮＰ）を含まず、（５）ｍＲＮＡ特異的であり（エクソン／イントロンを考慮する；好ましくは、ＤＮＡの増幅がない）、（６）二量体化する傾向がなく、および／または（７）５８℃から６２℃の範囲の融解温度Ｔｍを有する（好ましくは、Ｔｍは約６０℃である）ように設計される。
【０１２４】
本明細書で用いる用語“ヌクレオチド”には、天然の（天然に存在する）ヌクレオチドが含まれ、それらは、アデニン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）からなる群より選択される含窒素塩基、リボース、アラビノース、キシロースおよびピラノース、およびデオキシリボースの群から選択される糖（一般的に、“ヌクレオシド”と言われる、塩基および糖の組み合わせ）、ならびにヌクレオシジル間のホスホジエステル結合（phosphodiester internucleosidyl linkage）を形成し得る１〜３個のリン酸基を含む。さらに、本明細書で用いる“ヌクレオチド”は、ヌクレオチド類縁体を意味する。本明細書で用いる“ヌクレオチド類縁体”は、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ（何れか適用可能な方）により認識され、ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖（何れか適当な方）に挿入され得る、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵの類縁体を意味し得る（すなわち、ヌクレオチドの類縁体は、塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵを含む）。そのようなヌクレオチド類縁体の例としては、５−プロピニルピリミジン（すなわち、５−プロピニル−ｄＴＴＰおよび５−プロピニル−ｄＣＴＰ）、７−デアザプリン（すなわち、７−デアザ−ｄＡＴＰおよび７−デアザ−ｄＧＴＰ）、アミノアリル−ｄＮＴＰ類、ビオチン−ＡＡ−ｄＮＴＰ類、２−アミノ−ｄＡＴＰ、５−メチル−ｄＣＴＰ、５−ヨード−ｄＵＴＰ、５−ブロモ−ｄＵＴＰ、５−フルオロ−ｄＵＴＰ、Ｎ４−メチル−ｄＣＴＰ、２−チオ−ｄＴＴＰ、４−チオ−ｄＴＴＰならびにアルファ−チオ−ｄＮＴＰ類が含まれるが、これらに限定されない。また、標識された類縁体も含まれ、例えばＤＥＡＣ−プロピレンジアミン（ＰＤＡ）−ＡＴＰなどの蛍光類縁体、モルホリノヌクレオシド類縁体に基づく類縁体ならびにロックト核酸（ＬＮＡ）類縁体が含まれる。
【０１２５】
本発明で使用するプライマーに関連して用いられる用語“標的ｍＲＮＡ配列に特異的な”は、温度および溶液のイオン強度、特にＰＣＲ条件の適当な条件下で、標的ｍＲＮＡ配列のｃＤＮＡにハイブリダイズ（すなわち、アニール）するためのプライマーの能力を意味する。温度および溶液のイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの強度を決定する。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションの強度に依存して、塩基間のミスマッチの可能性があるが、２つの核酸（すなわち、プライマーおよびｃＤＮＡ）が相補的配列を含むことを必要とする。一態様において、“温度および溶液のイオン強度の適当な条件”とは、５８℃から６２℃の範囲の温度（好ましくは、約６０℃の温度）およびＰＣＲ反応混合物に通常用いられる溶液のイオン強度を意味する。一態様において、プライマーの配列は、当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムによって決定されるように、標的ｍＲＮＡ配列のｃＤＮＡの対応する配列に対して８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的である。
【０１２６】
一態様において、プライマーは、ストリンジェントな、または中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的ｍＲＮＡ配列のｃＤＮＡにハイブリダイズする。本明細書で定義されるとおり、“ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”は、５ｘＳＳＣ／５ｘデンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ中、６８℃にてハイブリダイズし、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温にて洗浄する条件であるか、または当業者にそれと等価であると認識される条件（例えば、ハイブリダイゼーションが、２．５ｘＳＳＣバッファー中、６０℃にて行なわれ、その後、３７℃にて低バッファー濃度で数回の洗浄工程が行われ、安定なままである条件）である。本明細書で定義される、“中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件”とは、３ｘＳＳＣ中で４２℃での洗浄、または当業者にそれと等価であると認識される工程を伴う。塩濃度および温度のパラメーターは、プライマーと標的核酸との間の同一性の最適レベルを達成するように変えることができる。そのような条件に関する指針は、当技術分野において利用可能であり、例えば、Sambrookらによる、1989年の、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；および、Ausubelら(編集)の、1995年の、Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley and Sons, N.Y.)である。
【０１２７】
一態様において、本発明の方法は、１５〜３０ヌクレオチド長を有し、配列番号１および２の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＥＳＲ１特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長を有し、配列番号４および５の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＨＥＲ２特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長を有し、配列番号７および８の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＫｉ６７特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長を有し、配列番号１０および１１の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＰＧＲ特異的プライマー、および／または１５〜３０ヌクレオチド長を有し、配列番号１３および１４の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含むＲＡＣＧＡＰ１特異的プライマーの使用を含む。一態様において、特異的プライマーは、上記の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む。
【０１２８】
一態様において、方法は、配列番号１および２の配列を有するＥＳＲ１特異的プライマー、および／または配列番号４および５の配列を有するＨＥＲ２特異的プライマー、および／または配列番号７および８の配列を有するＫｉ６７特異的プライマー、および／または配列番号１０および１１の配列を有するＰＧＲ特異的プライマー、および／または配列番号１３および１４の配列を有するＲＡＣＧＡＰ１特異的プライマーの使用を含む。
【０１２９】
好ましくは、本発明による使用のためのプローブは、２０〜３５ヌクレオチド長を有し、特にデオキシリボヌクレオチドである。一態様において、プローブは、（１）標的ｍＲＮＡ配列（すなわち、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７および／またはＲＡＣＧＡＰ１）に特異的であり、（２）公知の多型（例えば、一塩基多型、ＳＮＰ）を含まず、および／または（３）対応するプライマー（複数）の融解温度Ｔｍより約５℃から８℃高い融解温度Ｔｍを有するように設計されている。
【０１３０】
本発明により使用するためのプローブに関連して用いられる用語“標的ｍＲＮＡ配列に特異的”は、温度および溶液のイオン強度、特にＰＣＲ条件の適当な条件下で、標的ｍＲＮＡ配列の（増幅した）ｃＤＮＡにハイブリダイズ（すなわち、アニール）するためのプローブの能力を意味する。温度および溶液のイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの強度を決定する。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションの強度に依存して、塩基間のミスマッチの可能性があるが、２つの核酸（すなわち、プローブおよびｃＤＮＡ）が相補的配列を含むことを必要とする。一態様において、“温度および溶液のイオン強度の適当な条件”とは、６３℃から７０℃の範囲の温度およびＰＣＲ反応混合物に通常用いられる溶液のイオン強度を意味する。一態様において、プローブの配列は、当技術分野で公知の配列比較アルゴリズムによって決定されるように、標的ｍＲＮＡ配列の（増幅した）ｃＤＮＡの対応する配列に対して８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相補的である。
【０１３１】
一態様において、プローブは、上記で定義したストリンジェントな、または中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的ｍＲＮＡ配列の（増幅した）ｃＤＮＡにハイブリダイズする。
【０１３２】
一態様において、方法は、２０〜３５ヌクレオチド長を有し、配列番号３の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＥＳＲ１特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長を有し、配列番号６の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＨＥＲ２特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長を有し、配列番号９の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＫｉ６７特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長を有し、配列番号１２の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＰＧＲ特異的プローブ、および／または２０〜３５ヌクレオチド長を有し、配列番号１５の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含むＲＡＣＧＡＰ１特異的プローブの使用を含む。一態様において、特定のプローブは、上記の配列の少なくとも２０個連続するヌクレオチドを含む。
【０１３３】
一態様において、方法は、配列番号３の配列を有するＥＳＲ１特異的プローブ、および／または配列番号６の配列を有するＨＥＲ２特異的プローブ、および／または配列番号９の配列を有するＫｉ６７特異的プローブ、および／または配列番号１２の配列を有するＰＧＲ特異的プローブ、および／または配列番号１５の配列を有するＲＡＣＧＡＰ１特異的プローブの使用を含む。
【０１３４】
好ましくは、上記に定義のプローブは、蛍光レポーター部分および蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
【０１３５】
一態様において、発現量は、腫瘍試料中の１つまたは複数の対照遺伝子の（平均）発現量に対して正規化される。本明細書で用いる用語“対照遺伝子”は、試験されているシステム内の、すなわち、癌における、ＲＮＡ転写産物／ｍＲＮＡの発現の比較的不変のレベルを有する遺伝子を意味する。そのような遺伝子は、ハウスキーピング遺伝子と称され得る。一態様において、１つまたは複数の対照遺伝子は、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ３７Ａ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＡＰＤＨを含む群から選択され、好ましくはＣＡＬＭ２および／またはＢ２Ｍである。
【０１３６】
本明細書で用いるＣＡＬＭ２は、カルモジュリン−２、ホスホリラーゼキナーゼ、デルタ（対照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００１７４３）であり、Ｂ２Ｍは、ベータ−２ミクログロブリン（対照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００４０４８）であり、ＲＰＬ３７Ａは、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３７ａ（対照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００９９８）であり、ＧＵＳＢは、ベータ−グルクロニダーゼ（対照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００１８１）であり、ＨＰＲＴ１は、ヒポキサンチン−ホスホリボシル−トランスフェラーゼ１（対照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿０００１９４）であり、そしてＧＡＰＤＨは、グリセリンアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（対照配列（ｍＲＮＡ）：ＮＭ＿００２０４６）である。
【０１３７】
さらなる面において、本発明は、腫瘍の処置のために癌患者を分類するための方法に関し、該方法は、第一段階として、上記に定義のインビトロ方法を用いて癌患者における腫瘍の分子サブタイプを同定し、第二段階として、該インビトロ方法により同定された分子サブタイプに基づいて腫瘍処置レジメンを選択することを含む。
【０１３８】
本発明の“腫瘍の処置のために癌患者を分類する”には、特定の分子の腫瘍サブタイプを有する患者群に対する癌患者の割り付けを含み、それは、その後の、医師による最も適切な腫瘍処置レジメンの選択を可能にする。
【０１３９】
一態様において、該腫瘍の処置のために癌患者を分類する方法は、上記で定義されるインビトロの方法を用いて、癌患者における腫瘍の分子サブタイプを同定する工程に加えて、組織学的グレード分類またはリンパ節状態を決定するような意の他の診断工程を含まない。
【０１４０】
一態様において、分子サブタイプは、ＨＥＲ２陽性、トリプルネガティブ、ルミナルＡおよびルミナルＢを含む群から選択される。
【０１４１】
一態様において、
−分子サブタイプがＨＥＲ２陽性であり、腫瘍処置レジメンが、抗ＨＥＲ２抗体および化学療法剤の投与を含むか、
−分子サブタイプがトリプルネガティブであり、腫瘍処置レジメンが化学療法剤の投与を含むか、
−分子サブタイプがルミナルＡであり、腫瘍処置レジメンが内分泌療法であるか、または
−分子サブタイプがルミナルＢであり、腫瘍処置レジメンが内分泌療法、および要すれば、化学療法剤の投与を含む。
【０１４２】
モノクローナル抗ＨＥＲ２抗体は、トラスツマブ（ハーセプチン(登録商標)）およびペルツズマブ（パージェタ(登録商標)）を含み、それらは単独または組み合わせて投与され得る。トラスツマブは、ＨＥＲ２が過剰発現される癌においてのみ有効である。他のモノクローナル抗体、例えばエルツマキソマブ（ertumaxomab）（Rexomun(登録商標)）は、現在、臨床試験中である。抗ＨＥＲ２抗体はさらに、細胞毒性物質、薬物（例えば、免疫抑制剤）、化学療法剤または放射性核種、または放射性同位体などの治療部分／薬剤を含むように修飾され得る。細胞毒素または細胞毒性物質には、細胞に有害であり、特に細胞を死滅させる、任意の薬剤が含まれる。例としては、メルタンシン（ＤＭ１）、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセン、ジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、アマニチン、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにそれらの類縁体または相同体が含まれる。抗体複合体を形成するための他の好適な治療剤には、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様において、治療剤は、細胞毒性剤または放射物である。別の態様において、治療剤は免疫抑制剤である。さらに別の態様において、治療剤はＧＭ−ＣＳＦである。好ましい態様において、治療剤はドキソルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミドまたはリシンＡである。さらに、治療部分は、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質合成に作用する治療部分を含む。いくつかの転写阻害剤が既知である。例えば、転写阻害剤およびＤＮＡ損傷剤の両方であるアクチノマイシンＤは、ＤＮＡ内にインターカレートし、転写の開始段階を阻害する。フラボピリドールは、転写の伸長期を標的とする。α−アマニチンは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに直接結合し、転写の開始および伸長の両方の阻害をもたらす。抗ＨＥＲ２抗体はまた、放射性同位元素、例えば、ヨウ素−１３１、イットリウム−９０またはインジウム−１１１と結合させて、細胞傷害性放射性医薬品を生成���る。抗ＨＥＲ２抗体の投与に代わるものは、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ(登録商標)またはＴｙｖｅｒｂ(登録商標)）などの、ＨＥＲ２を標的とする低分子化合物の投与である。
【０１４３】
本発明の化学療法剤には、細胞増殖抑制化合物および細胞傷害性化合物が含まれる。伝統的な化学療法剤は、ほとんどの癌細胞の主要な特性の１つである、急速に分裂する細胞を死滅させることにより作用する。本発明によれば、用語“化学療法剤”には、抗体複合体に関連して上記の薬剤を含む、タキサン類、白金化合物、ヌクレオシド類縁体、カンプトテシン類縁体、アントラサイクリンおよびアントラサイクリン類縁体、エトポシド、ブレオマイシン、ビノレルビン、シクロホスファミド、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤およびアルキル化剤、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。本発明によれば、化学療法剤への言及は、該薬剤の複合体のような、エステル、塩または誘導体などの任意のプロドラッグを含む。例としては、該薬剤と担体物質の複合体、例えば、アルブミン結合パクリタキセルなどのタンパク質結合パクリタキセルである。好ましくは、該薬剤の塩は、薬学的に許容される。化学療法剤は、多くの場合、通常、３〜６ヶ月間、組み合わせて投与される。最も一般的な治療剤の１つは、シクロホスファミドとドキソルビシン（アドリアマイシン；アントラサイクリンおよびアントラサイクリン類縁体の群に属する）の組み合わせであり、ＡＣとして公知である。時折、ドセタキセルなどのタキサン薬が加えられ、該レジメンは、ＣＡＴとして公知である。タキサンは、癌細胞において微小管を攻撃する。同等の結果を生じる、別の一般的な治療剤は、シクロホスファミド、代謝拮抗剤であるメトトレキサート、およびヌクレオシドアナログ（ＣＭＦ）であるフルオロウラシルである。別の標準的な化学療法剤には、フルオロウラシル、エピルビシンおよびシクロホスファミド（ＦＥＣ）が含まれ、それらはドセタキセルまたはビノレルビンを追加してもよい。
【０１４４】
内分泌療法（抗ホルモン治療）は、エストロゲンおよび／またはプロゲステロン受容体を阻止／下方制御する薬剤、例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ(登録商標)）またはフルベストラント（Ｆａｓｌｏｄｅｘ(登録商標)）の投与により、あるいは、アロマターゼ阻害剤、例えば、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ(登録商標)）またはレトロゾール（フェマーラ(登録商標)）を用いてエストロゲンの産生を阻止することにより、増殖し続けるためにエストロゲンを必要とする癌を標的とする。しかしながら、アロマターゼ阻害剤は、閉経後の患者にのみ適している。このことは、閉経後の女性で活性なアロマターゼが、閉経前の女性に多い形態とは異なっており、それ故に、これらの薬剤は、閉経前の女性で優勢なアロマターゼを阻害するのに有効ではないためである。
【０１４５】
一態様において、分子サブタイプがルミナルＢであり、腫瘍処置レジメンが化学療法剤の投与を含む。
【０１４６】
一態様において、分子サブタイプがルミナルＢであり、腫瘍処置レジメンがタキサン、好ましくはドセタキセルの投与を含む。
【０１４７】
一態様において、タキサンを、フルオロウラシル、エピルビシンおよびシクロホスファミド（ＦＥＣ）と組み合わせて投与する。
【０１４８】
さらなる面において、本発明は、癌の治療法に関し、該方法は、第一工程として、上記のインビトロの方法を用いて腫瘍処置のために癌患者を分類し、第二工程として、癌患者に選択した腫瘍処置レジメンを提供することを含む。腫瘍処置レジメンは、上記のインビトロの方法によって同定された分子サブタイプに基づいて選択される。
【０１４９】
一態様において、該方法は、アジュバント／ネオアジュバント化学療法の有利または不利の直接的判断をするために上記のインビトロ方法によって得られた定量的な結果を用いることを含む。
【０１５０】
またさらなる面において、本発明は、逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲの手段によって癌患者において腫瘍の分子サブタイプを同定するのに有用なキットに関し、該キットは、
−少なくとも一対のＨＥＲ２特異的プライマーおよび少なくとも１つのＨＥＲ２特異的プローブ；
−少なくとも一対のＥＳＲ１特異的プライマーおよび少なくとも１つのＥＳＲ１特異的プローブ；
−少なくとも一対のＰＧＲ特異的プライマーおよび少なくとも１つのＰＧＲ特異的プローブ；ならびに
−少なくとも一対のＫｉ６７特異的プライマーおよび少なくとも１つのＫｉ６７特異的プローブ；および／または
−少なくとも一対のＲＡＣＧＡＰ１特異的プライマーおよび少なくとも１つのＲＡＣＧＡＰ１特異的プローブを含む。
【０１５１】
一態様において、定量的ＰＣＲは蛍光ベースの定量的リアルタイムＰＣＲである。
【０１５２】
一態様において、プローブの検出は、増幅依存性のプローブ置換に基づく。
【０１５３】
一態様において、プローブは、蛍光レポーター部分および蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
【０１５４】
一態様において、キットはさらに、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む。
【０１５５】
一態様において、逆転写酵素およびポリメラーゼは、１工程逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲを可能にする酵素ミックスの形態で提供される。
【０１５６】
一態様において、キットはさらに、少なくとも一対の対照遺伝子特異的プライマーおよび少なくとも１つの対照遺伝子特異的プローブを含む。一態様において、対照遺伝子は、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ３７Ａ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＡＰＤＨからなる群より選択される１つまたは複数であり、好ましくはＣＡＬＭ２および／またはＢ２Ｍである。
【０１５７】
一態様において、キットはさらに、少なくとも１つの対照ＲＮＡサンプルを含む。一態様において、少なくとも１つの対照ＲＮＡサンプルは、陽性対照および／または対照サンプル（キャリブレーター）として使用され、ここで、好ましくは、少なくとも１つの対照ＲＮＡサンプルは、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲ、Ｋｉ６７、ＲＡＣＧＡＰ１を含む群から選択される１つまたは複数の遺伝子および１つまたは複数の対照遺伝子の１つまたは複数の遺伝子産物（またはその一部）をコード化する合成ｍＲＮＡを含む。一態様において、１つまたは複数の対照遺伝子は、ＣＡＬＭ２、Ｂ２Ｍ、ＲＰＬ３７Ａ、ＧＵＳＢ、ＨＰＲＴ１およびＧＡＰＤＨを含む群から選択され、好ましくはＣＡＬＭ２および／またはＢ２Ｍである。
【０１５８】
一態様において、キットは、ＤＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ反応バッファーをさらに含んでいてよい。
【０１５９】
好ましくは、プライマーおよびプローブは、本発明のインビトロ法と関連して上記にさらに定義される。
【０１６０】
一態様において、プライマーは、１２０ｂｐ未満、好ましくは１００ｂｐ未満のアンプリコンサイズを提供する。
【０１６１】
一態様において、ＥＳＲ１特異的プライマーは、１５〜３０ヌクレオチド長を有し、配列番号１および２の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＨＥＲ２特異的プライマーは、１５〜３０ヌクレオチド長を有し、配列番号４および５の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＫｉ６７特異的プライマーは、１５〜３０ヌクレオチド長を有し、配列番号７および８の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＰＧＲ特異的プライマーは、１５〜３０ヌクレオチド長を有し、配列番号１０および１１の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＲＡＣＧＡＰ１特異的プライマーは、１５〜３０ヌクレオチド長を有し、配列番号１３および１４の配列の少なくとも１０個連続するヌクレオチドを含む。一態様において、特異的プライマーは、上記の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む。
【０１６２】
一態様において、ＥＳＲ１特異的プライマーは配列番号１および２の配列を有し、および／またはＨＥＲ２特異的プライマーは配列番号４および５の配列を有し、および／またはＫｉ６７特異的プライマーは配列番号７および８の配列を有し、および／またはＰＧＲ特異的プライマーは配列番号１０および１１の配列を有し、および／またはＲＡＣＧＡＰ１特異的プライマーは配列番号１３および１４の配列を有する。
【０１６３】
一態様において、ＥＳＲ１特異的プローブは、２０〜３５ヌクレオチド長を有し、配列番号３の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＨＥＲ２特異的プローブは、２０〜３５ヌクレオチド長を有し、配列番号６の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＫｉ６７特異的プローブは、２０〜３５ヌクレオチド長を有し、配列番号９の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＰＧＲ特異的プローブは、２０〜３５ヌクレオチド長を有し、配列番号１２の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含み、および／またはＲＡＣＧＡＰ１特異的プローブは、２０〜３５ヌクレオチド長を有し、配列番号１５の配列の少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む。一態様において、特異的プローブは、上記の配列の少なくとも２０個連続するヌクレオチドを含む。
【０１６４】
一態様において、ＥＳＲ１特異的プローブは配列番号３の配列を有し、および／またはＨＥＲ２特異的プローブは配列番号６の配列を有し、および／またはＫｉ６７特異的プローブは配列番号９の配列を有し、および／またはＰＧＲ特異的プローブは配列番号１２の配列を有し、および／またはＲＡＣＧＡＰ１特異的プローブは配列番号１５の配列を有する。
【０１６５】
好ましくは、上記に定義されるプローブは、蛍光レポーター部分および蛍光クエンチャー部分を含む二重標識プローブである。
【０１６６】
一態様において、腫瘍は固形腫瘍である。一態様において、腫瘍は、胸部腫瘍であるか、または胸部腫瘍に由来する（例えば、転移により）。一態様において、癌は乳癌である。
【０１６７】
本明細書で用いる用語“複数部分のキット（単に、キット）”は、１つまたは複数の容器および要すればデータキャリアを含む、製品を意味する。該１つまたは複数の容器は、上記の手段または反応材の１つまたはそれ以上を充填され得る。さらなる容器が、例えば、希釈剤、緩衝剤およびさらなる反応材、例えばｄＮＴＰを含むキットに含まれていてよい。該データキャリアは、非電子的データキャリア、例えば、情報リーフレット、情報リーフレット、バーコードもしくはアクセスコードのようなグラフィックデータキャリア、または電子的データキャリア、例えばフロッピーディスク、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、マイクロチップもしくは別の半導体ベースの電子化データキャリアであり得る。アクセスコードは、データベース、例えばインターネットデータベース、集中型データベース、または分散型データベースへのアクセスを可能にする。該データキャリアは、本発明の方法におけるキットの使用説明書を含み得る。データキャリアは、ＲＮＡ転写産物、例えばｍＲＮＡの閾値または基準レベルを含み得る。データキャリアがデータベースへのアクセスを許可するアクセスコードを含む場合には、該閾値または基準レベルは、このデータベースに寄託される。加えて、データキャリアは、本発明の方法を実施する方法に関する情報または指示を含んでもよい。
【０１６８】
別の面において、本発明は、癌患者における腫瘍の分子サブタイプを同定するための上記のキットの使用に関する。
【０１６９】
別の面において、本発明は、癌患者の遠隔転移のリスクを評価するための上記のキットの使用に関する。
【０１７０】
本発明は、現在の標準的かつ最先端の診断法である免疫組織化学および最近の方法の主な欠点を克服する。
【０１７１】
本発明は、腫瘍、特に胸部腫瘍の信頼できる分子サブタイプ化を可能にし、その後、医師が最も好適な腫瘍処置レジメンを選択するのを可能にする。
【０１７２】
４つまたは５つのマーカーの評価の優先順のおかげで（好ましくは、ＨＥＲ２のＲＮＡ転写産物の発現量が最初に決定される）、サブタイプ化が階層的クラスター分析や相関分析に基づく場合によく起こる問題である、ルミナルＡおよびＢサブタイプへのＨＥＲ２陽性の誤分類がない(Perou et al. (2000), Nature, 406:747−752; TCGA (Cancer Genome Atlas Network) (2012), Nature, 490:61−70)。さらに、偽陽性および臨床的にＨＥＲ２陰性の腫瘍の誤分類がなく、Perouらによれば、これらの例は、３０％までの確率で起こり得る。
【０１７３】
本発明は、とりわけ以下の乳癌患者群において、ＩＨＣ：ＥＳＲ１／ＰＧＲ陰性（すべての乳癌患者の約３０％）、ＥＳＲ１／ＰＧＲ弱陽性（すべての乳癌患者の約１５％）、ＨＥＲ２  ３＋（腫瘍生検によるＩＨＣ、腫瘍の解剖により確認されていないＩＨＣ；すべての乳癌患者の約１５％）およびＨＥＲ  ２＋（すべての乳癌患者の約２０％）と同定される、免疫化学的分析の不確実な、または相反する結果を再評価／確認するための方法およびキットを提供する。
【０１７４】
本発明の方法およびキットは、Ｋｉ６７−および／またはＲＡＣＧＡＰ１ ＲＮＡ転写産物の確実な検出によりルミナルＡおよびルミナルＢサブタイプを区別するために、ルミナル乳癌におけるアジュバント／ネオアジュバント化学療法の有利または不利を直接的に判断することをを促進する。このことは、特に、ＥＳＲ１／ＰＧＲ陽性であって、グレード２までの腫瘍（すべての乳癌患者の約５０％）を有する患者に有用である。
【０１７５】
本発明は、全生存期間および無遠隔転移生存率が明確に異なる、ルミナルＡおよびルミナルＢ腫瘍の区別を可能にする。ルミナルＢ患者が、特に治療（例えば、手術）後の最初の５年間の、継続的に高い転移のリスクを有するのに対し、ルミナルＡ患者の転移のリスクは、常に明らかにより低い。従って、該方法およびキットは、患者の遠隔転移のリスクの評価もまた可能にする。
【０１７６】
本発明の方法を使用することにより、ＦｉｎＨＥＲ研究（Joensuu et al. (2006), N Engl J Med, 354:809−820）における約７７％のルミナル腫瘍は、低リスク群のルミナルＡに分類され、中程度のリスク群は存在しない。さらに、ルミナルＡおよびルミナルＢへの分類は、腫瘍の予後のために通常非常に重要な２つのパラメーターである、組織学的異型度（grading）およびリンパ節の状態の重要性を低下させる。従って、グレード２の腫瘍の治療に関する不確実性は、臨床的に関連する方法で解決される。
【０１７７】
本発明の方法およびキットはまた、ＥＳＲ１、ＨＥＲ２、Ｋｉ６７および要すればＲＡＣＧＡＰ１のＲＮＡ転写産物発現量の定量的決定のおかげで、全身療法に対する応答の予測を可能にする。このことは、特に、不確実なＩＨＣ（全ての乳癌患者の約４０％）で浸潤性乳癌＞１ｃｍを有する患者にとって有用である。
【０１７８】
本発明の新規性は、乳癌バイオマーカーのｍＲＮＡをベースにした推定だけでなく、サブタイプのアルゴリズムの定義も含む。低Ｋｉ６７に加えて、ルミナルＡ定義に必須のＰＧＲ陽性の包含は、本発明の出願時に、２０１１年のSt. Gallen臨床ガイドラインに含まれていない、元の基準である。加えて、予め定義されたカットオフを超えるＨＥＲ２ ｍＲＮＡ発現を示す腫瘍は、２０１１年の国際的なガイドラインからも外れ、なお未だ有効である、ＥＳＲ１／ＰＧＲ状態に関わらず、ＨＥＲ２陽性として分類される。全てのこれらの新しい面は、本発明のＲＴ−ｑＰＣＲに基づくアプローチおよびキットの予測値に貢献する。実際には、これらの新規な、ＲＴ−ｑＰＣＲに基づくバイオマーカーの推定に関する技術および分類アルゴリズムに関する理論は、最終的に、アジュバント療法の設定におけるドセタキセルの利益についての予測ツールを提供する、ＦｉｎＨｅｒ臨床試験において患者のより正確かつ有意義なサブタイプ化を提供する。
【０１７９】
まとめると、本発明は、全ての乳癌患者の少なくとも５０％で、予後の信頼できる再現性かつ定量的な評価ならびに治療の成功の予測のための、現在、大部分が満たされていない臨床上の要請を満たす（図１も参照のこと）。
【０１８０】
本発明はさらに、本発明の範囲を限定するものとして解釈されない、以下の実施例によって例示される。
【実施例】
【０１８１】
実施例
実施例１：逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）によるｍＲＮＡ発現量の決定
ＲＮＡをホルマリン固定パラフィン包埋組織（＝ＦＦＰＥ組織）から単離した。より具体的には、ＦＦＰＥ腫瘍組織の５〜１０μｍ厚の切片（ｃｕｒｌ）からの全ＲＮＡを、ハイピュアＲＮＡパラフィンキット（Roche, Basel, Switzerland）またはＸＴＲＡＫＴ ＲＮＡ抽出キットＸＬ（Stratifyer Molecular Pathology, Cologne, Germany）を用いて抽出し、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ ＲＮＡ 定量アッセイ（Molecular Probes, Eugene, OR）により定量化し、そして対照遺伝子ＲＰＬ３７Ａのフラグメントのリアルタイム蛍光ＲＴ−ＰＣＲによって修飾した。異なる方法により連続するスライスの標的遺伝子の定量的データを比較したとき、異なる抽出技術間に違いが存在することが認められた。本発明の目的のために、ＸＴＲＡＫＴ ＲＮＡ抽出キットＸＬの使用が好ましかった。一般的に、各修飾抽出物（約５０−１００ｎｇ）の２．５μｌのＲＮＡを、以下に記載のｑＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした。
【０１８２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による遺伝子発現の詳細な分析のために、目的の領域およびその間にハイブリダイズする蛍光標識したプローブを挟むプライマーを利用した。標的特異的プライマーおよびプローブを、ＮＣＢＩプライム設計ツール（www.ncbi.nlm.nih.go）を用いて選択した。ＲＮＡ特異的プライマー／プローブ配列を用いることにより、エキソン／エキソン境界を越えて、プライマー／プローブ配列を配置することによりＲＮＡの特定の測定が可能になった。さらに、既知の多型（ＳＮＰ）を有する配列領域に結合しないプライマー／プローブを選択した。同じ遺伝子の複数のアイソフォームが存在する場合、すべての関連するスプライス変異体を増幅するためにプライマーを選択した。全てのプライマー対は、従来のＰＣＲ反応によりその特異性を調べた。プライマー／プローブのさらなる最適化後、表１に列記したプライマーおよびプローブにより、最適結果を得た。これらのプライマー／プローブは、例えば、特異性および増幅効率の点から、従来技術により公知のプライマー／プローブよりも優れている。サンプルＲＮＡの量を標準化するために、遺伝子ＣＡＬＭ２およびＢ２Ｍを、それらが分析されるサンプル中で差異的に制御されていなかったため、対照遺伝子として選択した。
【０１８３】
【表１】
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【０１８４】
ＴａｑＭａｎ(登録商標) 検証実験を行い、比較ΔＣＴ法による遺伝子発現の相対的定量化のための前提条件である、標的および対照の増幅効率がほぼ等しいことが示された。生物学的サンプル内の関心のある遺伝子の発現分析を行うために、４ｘデュプレックスアッセイ混合物を、２つの特異的アッセイのそれぞれのプライマー／プローブを混合することによって調製した。ＣＴ値の個別の検出のために、アッセイプローブを、異なる蛍光プローブで修飾した。各４ｘアッセイミックスは、２μＭの非修飾フォワードおよびリバースプライマーならびに１．２μＭのプローブを含んだ。各反応のために、ＦＦＰＥ切片から抽出された各２．５μｌの全ＲＮＡ（上記参照）を、９６ウェルの光学反応プレートの１つのウェルにて、２．５μｌのアッセイミックス、２．５μｌの酵素ミックスおよび２．５μｌの水と混合した。ＰＣＲ反応の測定を、適当な条件下（５０℃にて５分、９５℃にて２０秒、９５℃にて１５秒、６０℃にて１分を４０サイクル）で、Ｖｅｒｓａｎｔ ｋＰＣＲ Ｃｙｃｌｅｒ（Siemens）またはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０（Roche）を製造者の説明書に従って行った。これまでに分類されていない生物学的サンプル対照の測定の前に、例えば、細胞株、健常な対照サンプル、規定の分子腫瘍サブタイプのサンプルでの実験を、実験条件の標準化のために使用することができる。
【０１８５】
実施例２：ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲ、Ｋｉ６７、および要すればＲＡＣＧＡＰ１のｍＲＮＡ発現量に基づく腫瘍の分子サブタイプ化
胸部腫瘍の評価のために、ＦｉｎＨＥＲ研究（Joensuu et al. (2006), N Engl J Med, 354:809−820）の１０１０名の乳癌患者のうち８５５名を使用可能であった。平均カットオフ値（４０−ΔＣＴ値として与えられる）を以下に示す。ＨＥＲ２：３８；ＥＳＲ１：３４；ＰＧＲ：３０，２；Ｋｉ６７：３１，７；および、ＲＡＣＧＡＰ１：３４，２。ＨＥＲ２およびＥＳＲ１のカットオフ値は、２６８個のサンプルを使用して、以前の研究の評価に基づいて決定され（Koutras et al. (2008), Brit. J. of Canc., 99:1775−1785; Pentheroudakis et al. (2009), Breast cancer Res Treat 2009, 116:131−143）、ＦｉｎＨＥＲ研究（比例ハザードモデル検証）に適用した。ＣＡＬＭ２を対照遺伝子として使用した。
【０１８６】
ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７のｍＲＮＡ発現量（ｎｅｇ／ｌｏｗは、規定の発現閾値よりも低い発現量を示す；ｐｏｓ／ｉｎｃｒｅａｓｅｄは、規定の発現閾値よりも高い発現量を示す）に基づいて、腫瘍を分子サブタイプ、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２）、ルミナルＡ（ＬｕｍＡ）、ルミナルＢ（ＬｕｍＢ）およびトリプルネガティブ（ＴＮＴ）に分類した。表２に示す通り、本発明による腫瘍の分子サブタイプ化は、従来技術の方法に基づく方法、例えば、免疫組織化学（Goldhirsch et al. (2011), Annals of Oncology, 22:1736−1747, St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011）、および３つのみの遺伝子マーカーの分析（Sotiriou et al. (2009), N Engl J Med, 360(8):790−800）に基づく方法とは異なる。
【０１８７】
【表２】
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【０１８８】
図２は、乳癌患者の５年生存率についてのＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲ、Ｋｉ６７およびＲＡＣＧＡＰ１ ｍＲＮＡの発現量の予後および予測値を評価するためのパーティショニングテストを示す。これらのデータは、以下のＲＡＣＧＡＰ１ ｍＲＮＡ発現量または上記の定義された閾値が、５年生存率において特に重要な相違と関連していることを示している。より具体的には、ＲＡＣＧＡＰ１ ｍＲＮＡ発現量の増加が、有意に生存の確率を減少させる。ＲＡＣＧＡＰ１のｍＲＮＡ発現が増加し、Ｋｉ６７ ｍＲＮＡ発現が低下した場合、生存の可能性はさらに低減する（表３参照）。現在の分析方法では、（異なる種類のフォローアップケア、例えば、特定のイメージング法での検査を必要とする）これらのリスク患者は、まだ発見されていない。
【０１８９】
【表３】
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【０１９０】
カプラン・マイヤー分析を用いて、本発明者らは、それぞれＨＥＲ２陽性、ルミナルＡ、ルミナルＢおよびトリプルネガティブ腫瘍を有する患者の生存率を分析し、ここで、腫瘍の分子サブタイプを、本発明に従って、すなわち、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７の発現量に基づいて同定した。図３に示す通り、本発明者らにより定義されるルミナルＡサブタイプは、９７％の５年後の全体的な生存率と関連していた（対して、ルミナルＢおよびＨＥＲ２陽性腫瘍は８７％、トリプルネガティブ腫瘍は８４％）。
【０１９１】
本発明者らは、さらに、それぞれＨＥＲ２陽性、ルミナルＡ、ルミナルＢおよびトリプルネガティブ腫瘍を有する患者の、無遠隔転移生存率（“ＤＭＦＳ”；手術後Ｘ年の遠隔再発）を分析し、ここで、腫瘍の分子サブタイプは、本発明に従って同定された。図４に示す通り、本発明者らにより定義されるルミナルＡサブタイプは、９２％の５年後の無遠隔転移生存率と関連していた（対して、ルミナルＢ、ルミナルＢ、ＨＥＲ２陽性およびトリプルネガティブ腫瘍は７８％）。
【０１９２】
最も重要な組織病理学的標準パラメーター（腫瘍サイズ、結節状態および組織学的グレーディング）を用いる全生存率の多変量解析では、本発明による分子サブタイプ化がとても有用であることが明らかになったが、一方で、組織学的グレーディングおよびリンパ節状態の両方が、その意義を失った。
【０１９３】
最後に、免疫組織化学により分子サブタイプ化を比較するＤＭＦＳの多変量Ｃｏｘ回帰解析（Sotiriou et al. (2009), N Engl J Med, 360(8):790−800）を、本発明の方法による分子サブタイプ分析を使用して、ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲおよびＫｉ６７のｍＲＮＡ発現量に基づいて、行った（図５）。本発明の方法によって得られた結果が、Ｃｏｘ比例ハザードモデルに含まれているとき、免疫組織化学的サブタイプ化がその重要性を失うように、該解析は、本発明の方法が優れていることを明確に示す。
【０１９４】
実施例３：逆転写（ＲＴ）定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）および分子サブタイプ決定による、バイオマーカー ＨＥＲ２、ＥＳＲ１、ＰＧＲ、Ｋｉ６７のｍＲＮＡ発現量の測定
ＲＮＡをＦＦＰＥ組織から単離した。より具体的には、ＦＦＰＥ胸部腫瘍組織の１０μｍ切片からの全ＲＮＡを、ＸＴＲＡＫＴ ＲＮＡ抽出キット（Stratifyer Molecular Pathology, Cologne, Germany）を用いて抽出した。ＲＮＡ溶出液を、濃度を決定することなく直接用いた。各抽出物の２．５μｌのＲＮＡを、以下に記載のとおりにＲＴ−ｑＰＣＲによりアッセイした。
【０１９５】
ＲＴ−ｑＰＣＲのために、目的の領域に隣接するプライマーおよび５’−蛍光標識した加水分解プローブと３’−ＴＡＭＲＡまたは−Ｄａｂｃｙｌクエンチャーとを、各標的のために使用した。用いたプライマーおよびプローブは表１に記載されている。異なる量のサンプルＲＮＡを補正するために、遺伝子ＣＡＬＭ２およびＢ２Ｍを、発現結果の正規化のための対照遺伝子として用いた。ＲＴ−ｑＰＣＲを、以下の組み合わせ、ＨＥＲ２／ＥＳＲ１、Ｋｉ６７／Ｂ２ＭおよびＰＧＲ／ＣＡＬＭ２でデュプリケートで行った。３つの４ｘアッセイミックスのそれぞれは、２μＭの非修飾のフォワードおよびリバースプライマーならびに１．２μＭのプローブを含んだ。各アッセイのために、反応当たり、２．５μｌのアッセイミックス、２．５μｌの４ｘ酵素ミックス（TaqManFast Virus 1−step MasterMix, Life Technologies）、および２．５μｌの水を含むマスターミックスを調製し、７．５μｌの各マスターミックスを、トリプリケートで、ｋＰＣＲ ９６ウェル反応プレートに分配した。ＦＦＰＥ切片から抽出された２．５μｌの全ＲＮＡ（上記参照）、あるいは、陽性（ＩＶＴ ＲＮＡ）または陰性対照（水）を各ウェルに添加した。３名の患者サンプル由来のＲＮＡ溶出液の分析を、３ロットのアッセイミックスおよび酵素ミックスを用いて行った。１工程ＲＴ−ｑＰＣＲ反応の測定を、以下の熱プロファイルでＶｅｒｓａｎｔ ｋＰＣＲ Ｃｙｃｌｅｒ （Siemens）を製造者の説明書に従って用いて行った：５０℃にて５分、９５℃にて２０秒をそれぞれ１サイクル、そして９５℃にて１５秒、６０℃にて１分を４０サイクル。
【０１９６】
陽性および陰性対照と共に６つの患者サンプルを、３ロットのアッセイミックスを用いて分析した。４０−ΔΔＣＴ値を、上記の通りに計算した（計算方法４）。図６から９は、各マーカー、各サンプルおよびロットについての４０−ΔΔＣＴ値を示す。陽性または陰性におけるバイオマーカーの分類のためのカットオフ値（４０−ΔΔＣＴ値として与えられる）は、以下の通りである：ＨＥＲ２：４０．９０；ＥＳＲ１：３８．２０；ＰＧＲ：３４．９０；Ｋｉ６７：３４．８０。分子サブタイプを表４に示す通りに定義した。
【０１９７】
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【０１９８】
異なる試薬ロット間の結果のわずかな違いを観察することができる。アッセイ性能は、全てのマーカーについて顕著にロバスト(robust)性であり、再現性であった。表５から７は、４０−ΔΔＣＴ値ならびに各マーカーについての陽性または陰性の結果ならびに表４に定義のそれぞれのサブタイプ化を示す（表２も参照のこと）。マーカー結果（ｐｏｓ／ｎｅｇ）およびサブタイプは、３つの異なる試薬ロットを用いて測定した６つ全てのサンプルについて一致していた。
【０１９９】
実施例４：臨床的結果に関する、ＲＴ−ｑＰＣＲおよびＩＨＣによる乳癌サブタイプ化の比較
図１０から１９は、異なる化学療法剤（ドセタキセルまたはビノレルビン）で処置した異なる腫瘍サブタイプ（ルミナルＢ、ＨＥＲ２陽性、ルミナルＡ、およびトリプルネガティブ乳癌［ＴＮＢＣ］）についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示す。本発明のＲＴ−ｑＰＣＲにより定義されるサブタイプをパネルＡに示し、一方、ＩＨＣにより定義されるサブタイプをパネルＢに示す。点線は結果の計算のために５年の時点を示す。
【０２００】
まとめると、図１０から１９に示すデータは、従来のタンパク質ベースのＩＨＣと比較して、ＲＴ−ｑＰＣＲによる乳癌の新規なＲＮＡベースの分類が優れていることを示している。データは、ルミナルＢ腫瘍に対するドセタキセル治療の顕著な利点を示している。これとは対照的に、ＩＨＣに基づくサブタイプ化は、ルミナルＡ、ルミナルＢおよびトリプルネガティブ乳癌患者におけるいくつかの傾向を有する任意のサブタイプでの顕著な利点を示すことができなかった。しかしながら、これらの３つのサブタイプは全ての患者の〜８０％を構成するため、ＩＨＣに基づくサブタイプ化は、任意の臨床的に有用な予測情報を提供しなかった。
【０２０１】
重要なことは、ルミナルＢ腫瘍を有する患者としてＲＴ−ｑＰＣＲにより定義された患者は、フルオロウラシル、エピルビシンおよびシクロホスファミド（ＦＥＣ）との併用療法の際にビノレルビンと比較してドセタキセルにより、統計的に有意かつ排他的な利益を得る。これらの患者は、ドセタキセルで処置されるとき、無転移のまま顕著に長期間生存し、一方、該結果は、ビノレルビンで処置されるとき、明らかに悪化する。２つの化学療法レジメン間のこの結果の違いは、ルミナルＢを除く他の全てのサブタイプで観察された。興味深いことに、ドセタキセルは、ルミナルＡ腫瘍に対して、ビノレルビンにさえ劣るように思われる。この効果は統計的有意に達していないが、ＲＴ−ｑＰＣＲにより同定されるルミナルＢ患者に見られる通り、ルミナルＡ患者におけるドセタキセル処置の可能性のある有益な効果を明らかに排除する。
【０２０２】
対照的に、患者がＩＨＣによってサブタイプ化されるとき、不正確な分類のために、レジメンの種類によって臨床結果に及ぼされる影響ははっきりとしない。このことは、臨床判断に依存し得ない、多くの決定的でない傾向を生じることとなる。結論として、本発明は、ドセタキセルに良好に応答するが、ビノレルビンに応答しない乳癌患者の特定の群を確実に同定し、従って、この特定の設定においてルミナルＢ腫瘍についての予測力を示す。これは、ＦｉｎＨＥＲ臨床試験で示された通り、ドセタキセルが、ビノレルビンよりも有害な影響に関連付けられていること、スケジュールされた開始用量の減少が必要とされる事実を考慮すると、診断アッセイにとってとても重要な特性である。
【０２０３】
従って、本発明は、乳癌における治療の適切な割り付けを補助するために使用できる。特に、無作為化臨床試験の文脈で初めて示されるように、ＲＴ−ｑＰＣＲによる乳癌サブタイプ化は、ドセタキセルを含むレジメンをドセタキセル治療に対してより応答性であるルミナルＢ腫瘍を有する患者に限定し、そして他の腫瘍サブタイプを有する患者には、代替の化学療法剤と使用するのを可能にする。
【０２０４】
実施例５：Ｋｉ６７に対するそれらの感受性の点でのＲＴ−ｑＰＣＲおよび従来のＩＨＣ染色の比較
かなりの件数（１６．５８％）が、ＩＨＣによりＫｉ６７陰性であるが、ＲＴ−ｑＰＣＲによりＫｉ６７陽性である。これは、従来技術のタンパク質ベースの評価と比較して、本発明によるｍＲＮＡの決定の高感度および高ロバスト性を実証している。一部では、これは、ＩＨＣベースの方法の複数の技術的制限（例えば、組織の切断後の分析時間までの、固定によるタンパク質の保存性の欠如および／または抗原の回復の問題など）または染色の解釈の問題（例えば、弱い核染色の解釈）による。
【０２０５】
ＲＴ−ｑＰＣＲによるＫｉ６７のＲＮＡに基づく評価の高い感度のために、Ｋｉ６７のＩＨＣ評価との一致が適度にある（図２０Ａ、Ｃ参照）。また、これは、局所的ＩＨＣ評価を対照法として使用するとき、本発明について低ＮＰＡ（５３．８２％）をもたらす（図２０Ｄ）。ＰＰＡが高いのと対照的に、ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＩＨＣによる陽性の件の大部分を同定する（９４．２％）。結論として、両方法は、有意に相関している（ｐ＜０，０００１）が、穏当に一致するのみである。
【０２０６】
表８は、ＦｉｎＨｅｒ研究集団におけるＲＴ−ｑＰＣＲベースのサブタイプとＩＨＣベースのサブタイプとの相互関係を示す分割表であり、ここで、Ｎは観測数であり、％（ｃｅｌｌ）は１６個の可能性のあるサブタイプの組み合わせの全体的な頻度であり、％（ｃｏｌ．）は、ＩＨＣサブタイプ内のＲＴ−ｑＰＣＲサブタイプの分布であり、そして％（ｒｏｗ）は、本特許出願により定義されるサブタイプ内のＩＨＣサブタイプの分布である。“対照標準”としてＩＨＣサブタイプを設定し、一致は、ＴＮＢＣ（８５．７１％）およびＨＥＲ２陽性（７９．４３％）について最高であり、ルミナルＡ（６５．３８％）およびルミナルＢ（６１．２２％）腫瘍について最低である。
【０２０７】
【表８】
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【０２０８】
実施例６：ルミナルＢ評価におけるＲＴ−ｑＰＣＲベースおよびＩＨＣベースのサブタイプ化の主な違い
Ｋｉ６７のＲＴ−ｑＰＣＲベースの評価の高感度は、ＩＨＣベースの評価と比較するとき、サブタイプ化のためにＥＳＲ１、ＰＧＲ、ＨＥＲ２およびＫｉ６７を組み合わせるのと同じアルゴリズムを使用していながら、ルミナルＡおよびルミナルＢ患者を決定する上での実質的な差異をもたらす。
【０２０９】
ＩＨＣ法によりルミナルＡであると分類された１８９名の乳癌患者のうち、５３．９７％のみが、ＲＴ−ｑＰＣＲによってもルミナルＡであるとして分類されるが、３９．６８％は、ルミナルＢ患者であることが判明した。対照的に、６．３５％のみが、ＨＥＲ２陽性であると再分類され、０％が、トリプルネガティブであることが判明した。さらに、ＩＨＣ法によりルミナルＢであると分類された２５１名の患者のうち、７１．７１％がＲＴ−ｑＰＣＲによってもルミナルＢであると分類されるが、１９．１２％は、ルミナルＡ患者であることが判明する。対照的に、６．７７％はＨＥＲ２陽性であると再分類され、２．３９％が、トリプルネガティブであることが判明した。逆に、ＲＴ−ｑＰＣＲによりルミナルＢであると分類された腫瘍の６１．２２％のみが、従来のＩＨＣによってもルミナルＢであると分類された。
【０２１０】
これらのデータは、主に、ＩＨＣによるＫｉ６７の半定量的評価の限定的感度および／またはロバスト性を原因とする、ドセタキセル感受性ルミナルＢ腫瘍を決定するための２のアッセイ間で観察される若干の一致を説明する。
【０２１１】
実施例７：ＲＴ−ｑＰＣＲにより高Ｋｉ６７が決定され、ＩＨＣにより低Ｋｉ６７が決定されることは、遠隔転移の高いリスクと関係している
本発明の方法は、ＩＨＣによってのみ決定されるＥＲ陽性の場合を含む集団を考慮するとき、さらなる識別力を有することが証明される。この場合において、Ｋｉ６７は、ＩＨＣベースのアッセイとＲＴ−ｑＰＣＲベースのアッセイとの間の不一致であることが見出された。ＲＴ−ｑＰＣＲおよびＩＨＣによるＫｉ６７の決定は、６８６個の利用可能なデータセットのうち５１４個（７４．９２％）で一致したため、ｍＲＮＡベースの評価の優位性を証明するためのサンプル数は限定されている（ｎ＝１７２）。
【０２１２】
しかしながら、サンプル数が少ないにも関わらず、ＲＴ−ｑＰＣＲによるＫｉ６７陽性は、不一致の場合には遠隔転移を発症するリスクが高いことを示す。図２１Ａに示す通り、低Ｋｉ６７ ｍＲＮＡ発現を有するＥＲ陽性患者の５％が術後５年で遠隔転移を発症するが、高Ｋｉ６７ ｍＲＮＡ発現を示す患者の１５％は遠隔転移を生じる（ＨＲ３．３１５）。この傾向は、多変量解析によって影響を受けなかった（図２１Ｂ）。
【０２１３】
これは、本発明の方法のＫｉ６７の評価に関して、より高い感度が、従来のＩＨＣ染色と比較して、さらなる予後情報を提供することを示している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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