(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を免疫抑制薬の毒性から保護するためのインビトロの方法であって、
前記免疫抑制薬が、タクロリムス、シクロスポリン又はこれらの組合せであり、
ａ）単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、式ＩＩＩ：
【化１】
0006801934.tif 000024
の化合物と接触させるステップを含む方法。
【請求項２】
前記単離膵臓細胞が、単離α細胞、単離β細胞、単離δ細胞、単離γ細胞、ε細胞又はこれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離膵臓細胞が、単離β細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫抑制薬が、タクロリムスである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、ヒト対象である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記単離膵臓細胞が、生体ドナー、死体ドナー又はこれらの組合せに由来するものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記単離膵臓細胞を接触させるステップが、０．０１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの式ＩＩＩの前記化合物との接触である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記単離膵臓細胞を接触させるステップが、１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの式ＩＩＩの前記化合物との接触である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
移植を必要とする対象への移植のための、請求項１に記載の方法による調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方。
【請求項１０】
移植を必要とする対象における移植前の単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の、免疫抑制薬の毒性からの保護剤であって、
前記免疫抑制薬が、タクロリムス、シクロスポリン又はこれらの組合せであり、
式ＩＩＩ：
【化２】
0006801934.tif 000025
の化合物を含む、剤。
【請求項１１】
前記単離膵臓細胞が、単離α細胞、単離β細胞、単離δ細胞、単離γ細胞、ε細胞又はこれらの組合せである、請求項１０に記載の剤。
【請求項１２】
前記単離膵臓細胞が、単離β細胞である、請求項１０に記載の剤。
【請求項１３】
前記免疫抑制薬が、タクロリムスである、請求項１０に記載の剤。
【請求項１４】
前記対象が、ヒト対象である、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の剤。
【請求項１５】
前記単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方が、生体ドナー、死体ドナー又はこれらの組合せから単離される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、２０１４年６月４日出願の米国特許仮出願第６２／００７，６２６号の優先権を主張するものであり、その明細書は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
（ａ）分野
[0002]開示される主題は、一般には抗老化グリコペプチドの使用に関する。より詳細には、主題は、ヒト膵臓細胞の生着を高める抗老化グリコペプチドの使用に関する。
【０００３】
（ｂ）関連する先行技術
[0003]不凍生体化合物、特に糖タンパク質は自然環境に存在している。これらの化合物は、例えば一部の魚類に存在しており、一部の魚類はこれらの化合物により低温環境（すなわち、ほぼ０度又は氷点下の温度）において生存することができる。科学者は、自然環境（魚類、両生類、植物、昆虫等）から採取した不凍化合物がどのようにこれらの現象に影響を及ぼすのかについて研究してきた。十分に安定的であり、商業的用途について、その活性が天然分子の活性に対して少なくとも同等又はそれ以上である類似化合物の合成に研究の焦点が当てられてきた。
【０００４】
[0004]不凍タンパク質（ＡＦＰ）によって、様々な条件下の細胞を保護する不凍タンパク質の能力に対する関心が高まっている。不凍タンパク質は、北極魚及び南極魚並びに寒冷気候に住む他の無脊椎動物において天然に見出され、細胞及び組織が氷点下の温度で機能するように維持する役割を担っている。ＡＦＰは１９５０年代に単離することに成功し、氷晶と結合することにより体液の凍結温度を非束一的に低下させる能力が実証されている。
【０００５】
[0005]臓器及び組織の移植の分野におけるこれらの化合物を用いた初期の実験は有望な結果を示し、それにより、これらの化合物は、回収−保存−再灌流のプロセスに関連する有害な条件から細胞を保護する魅力ある治療候補になった。さらに、ランゲルハンス島をはじめとする様々な細胞の低温保存中、低温安定状態（ｃｒｙｏｓｔａｓｉｓ）の間にＡＦＰを補充したときに細胞の生存度及び機能が有意に高められるというさらなる利点も実証されている。本発明で使用する抗老化グリコペプチド（ＡＡＧＰ（商標））は、不凍糖タンパク質の類似体を得ようとする試みに由来するものである。
【０００６】
[0006]抗老化グリコペプチド（ＡＡＧＰ（商標））化合物は、栄養欠乏、高温及び低温保存、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）による酸化ストレス、ＵＶ照射並びに炎症などの過酷な細胞ストレス下で適用可能性を有することが提案されてきたｇｅｍジフルオロ化Ｃ−グリコペプチドである。
【０００７】
[0007]β細胞移植は、ドナー膵臓からの単離β膵島細胞の別のヒトへの移植である。β細胞移植は、１型糖尿病の実験的治療である。移植されると、膵島β細胞はインスリンを産生し始め、血中のグルコースレベルを積極的に調節する。膵島移植の分野で著しい進歩があったが、現在膵島移植の広範囲の応用を妨げる多くの障害が残っている。最も重要な制限のうちの２つは、膵島の拒絶反応を防ぐための手段が現在のところ不十分であること、及び移植のためのβ膵島細胞の供給が制限されていることである。現在の免疫抑制レジメンはβ膵島細胞不全を数カ月から数年間にわたって防ぐことができるが、これらの処置で使用される薬剤は高価であり、特定の悪性疾患及び日和見感染症のリスクを高めることがある。加えて、やや皮肉なことであるが、最も一般的に使用されている薬剤［ダクリズマブ（ゼナパックス（Ｚｅｎａｐａｘ）（商標））、シロリムス（ラパミューン（Ｒａｐａｍｕｎｅ）（商標））及びタクロリムス（プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）（商標））を含む］は、正常なβ膵島細胞機能及び／又はインスリン作用を障害することも知られている。
【０００８】
[0008]膵島移植の長期結果は高度に専門化した中心施設において著しく改善してきており、５年インスリン非依存率は５０％を超える。釣り合いをとるためには、遅れた時点でのインスリン療法の再導入が必要である。多くの要因が、特に門脈内注入後の初期段階における実質的移植片喪失の原因であり、膵島質量が不十分であることにより患者の永続的な血糖コントロールが制限されることがある。急性の移植片喪失につながる１つの要因は低酸素症であり、移植直後、十分な血管新生が回復する前に多くの膵島が死滅する。移植片喪失の他の理由としては、即時血液媒介炎症反応、同種免疫、自己免疫の再発及び糖尿病誘発性免疫抑制薬への慢性曝露が挙げられる。これらの要因が即時及び初期の膵島喪失のうちの約６０％の原因であり、結果として、機能的移植を維持するには不十分な膵島質量となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[0009]この証拠を踏まえて、健康科学において、特に移植の分野で、ＡＦＰ、及びＡＦＰ使用の可能性に現在大きな注目が寄せられている。しかし、膵島移植における潜在的影響を反映したデータが不足しており、膵島移植において大きな初期移植片喪失は避けられないように思われる。このＡＡＧＰ（商標）化合物の細胞保護効果を、初期膵島質量の保存の指標として、常温培養条件に維持され、毒素に曝露され、免疫不全マウスモデルに移植された単離ヒト膵島において試験した。
【００１０】
[0010]したがって、単離膵島細胞の供給を改善する方法が求められている。
【００１１】
[0011]単離した細胞の健康及び生存を改善する方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[0012]一実施形態によれば、単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の生着を高めるためのインビトロの方法であって、
ａ）移植を必要とする対象における移植の前に、単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、一般式Ｉ：
【化１】
0006801934.tif 000002
［式中、
Ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ４  ＝  Ｈ、ＡＡ１又はＡＡ１−ＡＡ２であり、
Ｒ５  ＝  ＯＨ、ＡＡ１又はＡＡ１−ＡＡ２であり、
ＡＡ１及びＡＡ２は、独立して、非極性側鎖を有するアミノ酸を表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、独立した基であり、ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの２つは、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２又はＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のうちの残りは、
【化２】
0006801934.tif 000003
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−グリコシド基又はＣＨ２−ＯＧＰであり、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ１  ＝  Ｒ２  ＝  Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２又はＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である場合、
Ｒ３  ＝  
【化３】
0006801934.tif 000004
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−グリコシド基又はＣＨ２−ＯＧＰであり、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ１  ＝  Ｒ３  ＝  Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２又はＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である場合、
Ｒ２  ＝  
【化４】
0006801934.tif 000005
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−グリコシド基又はＣＨ２−ＯＧＰであり、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ２  ＝  Ｒ３  ＝  Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２又はＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である場合、
Ｒ１  ＝  
【化５】
0006801934.tif 000006
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−グリコシド基又はＣＨ２−ＯＧＰであり、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］である］
のｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００１３】
[0013]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓β細胞のインスリン分泌機能を改善するためのインビトロの方法であって、
ａ）単離膵臓β細胞を、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００１４】
[0014]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を免疫抑制薬の毒性から保護するためのインビトロの方法であって、
ａ）単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００１５】
[0015]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の炎症応答を減少させるためのインビトロの方法であって、
ａ）単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触させるステップを含む方法が提供される。
【００１６】
[0016]別の実施形態によれば、単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、移植を必要とする対象に移植する方法であって、
ａ）単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触させるステップと、
ｂ）ステップａ）の処理された単離膵臓細胞を、移植を必要とする前記対象に移植するステップとを含む方法が提供される。
【００１７】
[0017]上記方法は、ステップａ）の前のステップａ’）、すなわちａ’）膵臓細胞、膵臓前駆細胞又は両方を単離するステップをさらに含み得る。上記方法は、ステップｂ）の前のステップｂ’）ステップａ）の単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を免疫抑制薬と接触させるステップもさらに含み得る。
【００１８】
[0018]本発明の方法において、単離膵臓細胞は、単離α細胞、単離β細胞、単離δ細胞、単離γ細胞、ε細胞又はこれらの組合せであり得、単離膵臓細胞は単離β細胞であり得ることが好ましい。
【００１９】
[0019]免疫抑制薬は、ダクリズマブ、シロリムス、タクロリムス、シクロスポリン又はこれらの組合せのうちの１つであり得る。
【００２０】
[0020]対象はヒト対象であり得る。
【００２１】
[0021]単離膵臓細胞は、生体ドナー、死体ドナー又はこれらの組合せから単離され得る。
【００２２】
[0022]本発明の方法において、式Ｉの化合物は、式ＩＩ：
【化６】
0006801934.tif 000007
［式中、
Ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、独立した基であり、ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの２つは、Ｈ、ＣＨ３から選択され、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの残りは、
【化７】
0006801934.tif 000008
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−ＯＧＰから選択され、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’、ＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ１  ＝  Ｒ２  ＝  Ｈ又はＣＨ３である場合、
Ｒ３  ＝  
【化８】
0006801934.tif 000009
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−ＯＧＰから選択され、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’、ＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ１  ＝  Ｒ３  ＝  Ｈ又はＣＨ３である場合、
Ｒ２  ＝  
【化９】
0006801934.tif 000010
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’、ＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、Ｂｎ、トシレート、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２−ＯＧＰから選択され、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ２  ＝  Ｒ３  ＝  Ｈ又はＣＨ３である場合、
Ｒ１  ＝  
【化１０】
0006801934.tif 000011
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２−ＯＧＰから選択され、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］である］
の化合物であってもよい。
【００２３】
[0023]式Ｉの化合物の薬学的に許容される酸付加塩は、式ＩＩＩ：
【化１１】
0006801934.tif 000012
の化合物であってもよい。
【００２４】
[0024]単離膵臓細胞を接触させるステップは、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの前記化合物、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの前記化合物とであってもよい。
【００２５】
[0025]別の実施形態によれば、本発明の方法に従って調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方が提供される。
【００２６】
[0026]別の実施形態によれば、単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、移植を必要とする対象に移植する方法であって、
ａ）本発明の方法に従って調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、移植を必要とする前記対象に移植するステップを含む方法が提供される。
【００２７】
[0027]別の実施形態によれば、糖尿病を治療する方法であって、
ａ）本発明の方法に従って調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、移植を必要とする前記対象に移植するステップを含む方法が提供される。
【００２８】
[0028]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象への移植のための、本発明の方法に従って調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の使用が提供される。
【００２９】
[0029]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における糖尿病の治療のための、本発明の方法に従って調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の使用が提供される。
【００３０】
[0030]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象への移植のための、本発明の方法による調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方が提供される。
【００３１】
[0031]別の実施形態によれば、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触している単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方が提供される。
【００３２】
[0032]上記の通りの一般式Ｉの化合物は、上記の通りの式ＩＩの化合物であってもよい。また、上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される酸付加塩は、上記の通りの式ＩＩＩの化合物であってもよい。
【００３３】
[0033]単離膵臓細胞は、単離α細胞、単離β細胞、単離δ細胞、単離γ細胞、ε細胞又はこれらの組合せであり得、単離膵臓細胞は単離β細胞であり得ることが好ましい。
【００３４】
[0034]単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの前記化合物、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの前記化合物と接触していてもよい。
【００３５】
[0035]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の生着を高めるための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物の使用が提供される。
【００３６】
[0036]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓β細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方のインスリン分泌機能を改善するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物の使用が提供される。
【００３７】
[0037]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を免疫抑制薬の毒性から保護するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物の使用が提供される。
【００３８】
[0038]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の炎症応答を減少させるための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物の使用が提供される。
【００３９】
[0039]単離膵臓細胞は、単離α細胞、単離β細胞、単離δ細胞、単離γ細胞、ε細胞又はこれらの組合せであり得、単離膵臓細胞は単離β細胞であり得ることが好ましい。
【００４０】
[0040]免疫抑制薬は、ダクリズマブ、シロリムス、タクロリムス、シクロスポリン又はこれらの組合せのうちの１つであり得る。
【００４１】
[0041]対象はヒト対象であり得る。
【００４２】
[0042]単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方は、生体ドナー、死体ドナー又はこれらの組合せから単離され得る。
【００４３】
[0043]上記の通りの一般式Ｉの化合物は、上記の通りの式ＩＩの化合物であってもよい。また、上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される酸付加塩は、上記の通りの式ＩＩＩの化合物であってもよい。
【００４４】
[0044]単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの前記化合物、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの前記化合物と接触していてもよい。
【００４５】
[0045]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の生着を高めるのに使用するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物が提供される。
【００４６】
[0046]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓β細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方のインスリン分泌機能を改善するのに使用するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物が提供される。
【００４７】
[0047]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を免疫抑制薬の毒性から保護するのに使用するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物が提供される。
【００４８】
[0048]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の炎症応答を減少させるのに使用するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物が提供される。
【００４９】
[0049]単離膵臓細胞は、単離α細胞、単離β細胞、単離δ細胞、単離γ細胞、ε細胞又はこれらの組合せであり得、単離膵臓細胞は単離β細胞であり得ることが好ましい。
【００５０】
[0050]免疫抑制薬は、ダクリズマブ、シロリムス、タクロリムス、シクロスポリン又はこれらの組合せのうちの１つであり得る。
【００５１】
[0051]対象はヒト対象であり得る。
【００５２】
[0052]単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方は、生体ドナー、死体ドナー又はこれらの組合せから単離され得る。
【００５３】
[0053]上記の通りの一般式Ｉの化合物は、上記の通りの式ＩＩの化合物であってもよい。また、上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される酸付加塩は、上記の通りの式ＩＩＩの化合物であってもよい。
【００５４】
[0054]単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの前記化合物、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの前記化合物と接触していてもよい。
【００５５】
[0055]以下の用語は、下記のように定義される。
【００５６】
[0056]本明細書で使用される用語「組成物」は、特定量の特定成分を含む生成物、及び特定量の特定成分の組合せから直接的又は間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図されている。医薬組成物又は一般的な他の組成物に関係するこのような用語は、活性成分（複数可）及び担体を構成する不活性成分（複数可）を含む生成物、並びに任意の２つ若しくは複数の成分の組合せ、錯体形成若しくは凝集から、又は１つ若しくは複数の成分の解離から、又は１つ若しくは複数の成分の他のタイプの反応若しくは相互作用から直接的若しくは間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図されている。したがって、本発明の医薬組成物又は一般的な他の組成物は、本発明の化合物及び薬学的に許容される担体を混合することにより作製される任意の組成物を包含する。「薬学的に許容される」又は「許容される」とは、担体、希釈剤又は賦形剤が、製剤の他の成分と適合し、且つそのレシピエントに対して有害でないものでなければならないことを意味する。
【００５７】
[0057]用語「膵臓細胞」、「単離膵臓細胞」、「膵島細胞」又は「単離膵島細胞」は、公知のプロトコールによって及び／又は本明細書で以下に記載した通りに単離した生体又は死体ドナーからの膵臓からのランゲルハンス島由来の細胞、並びにインビボ、エキソビボ及び／又はインビトロで成長した膵臓起源の細胞を意味することが意図されている。ランゲルハンス島の細胞は、ホルモングルカゴンを産生し、膵島細胞の約１５〜２０％に相当するα細胞、ホルモンインスリン及びアミリンを産生し、膵島細胞の約６５〜８０％に相当するβ細胞、ホルモンソマトスタチンを産生し、膵島細胞の約３〜１０％に相当するδ細胞、ホルモン膵臓ポリペプチドを産生するＰＰ細胞（γ細胞としても公知である）（膵島細胞の３〜５％）、及びホルモングレリンを産生し、膵島細胞の＜１％に相当するε細胞を含む。
【００５８】
[0058]用語「膵臓β細胞」及び「単離膵臓β細胞」は、公知のプロトコールによって及び／又は本明細書で以下に記載した通りに単離した生体又は死体ドナーからの膵臓由来の細胞、並びにインビボ、エキソビボ及び／又はインビトロで成長した膵臓起源のβ細胞を意味することが意図されている。
【００５９】
[0059]用語「膵臓前駆体」及び「単離膵臓前駆体」は、インビボ、エキソビボ又はインビトロで自然に又は公知のプロトコールによって膵臓前駆細胞に分化した又は分化させる胚性幹細胞（ヒト又は他の起源の）などの任意の適切な供給源由来の細胞を意味することが意図されている。単離膵臓前駆細胞は、インビボ、エキソビボ又はインビトロで、自然に又は公知のプロトコールを用いる処理により、さらなる分化を通じて膵臓β細胞になる可能性がある。例えば、単離膵臓前駆細胞を、分化プロトコールによってインビトロで得、分化プロトコールによってインビトロで膵臓β細胞にさらに分化させることができる。また、単離膵臓前駆細胞を、分化プロトコールによってインビトロで得、移植を必要とする患者への埋め込み／移植後にインビボで膵臓β細胞にさらに分化させることができる。
【００６０】
[0060]「アルキル」、並びにアルコキシ及びアルカノイルなどの接頭辞「アルク（ａｌｋ）」を有する他の基は、炭素鎖について別に定義されない限り、直鎖又は分枝鎖、及びこれらの組合せであり得る炭素鎖を意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−及びｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニルなどが挙げられる。特定数の炭素原子が許容される場合、例えばＣ３〜１０の場合、アルキルという用語は、シクロアルキル基、及びシクロアルキル構造と組み合わせた直鎖又は分岐鎖アルキル鎖の組み合わせも含む。炭素原子の数が特定されていない場合、Ｃ１〜６が意図される。
【００６１】
[0061]「シクロアルキル」は、アルキルのサブセットであり、特定数の炭素原子を有する飽和炭素環を意味する。シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなどが挙げられる。別段の記載がない限り、シクロアルキル基は一般に単環式である。別段の定義がない限り、シクロアルキル基は飽和である。
【００６２】
[0062]用語「アルコキシ」は、炭素原子の数が特定されている（例えば、Ｃ１〜６アルコキシ）又はこの範囲内の任意の数［すなわち、メトキシ（ＭｅＯ−）、エトキシ、イソプロポキシなど］の直鎖又は分枝鎖アルコキシドを指す。
【００６３】
[0063]用語「アルキルチオ」は、炭素原子の数が特定されている（例えば、Ｃ１〜６アルキルチオ）又はこの範囲内の任意の数［すなわち、メチルチオ（ＭｅＳ−）、エチルチオ、イソプロピルチオなど］の直鎖又は分岐鎖アルキルスルフィドを指す。
【００６４】
[0064]用語「アルキルアミノ」は、炭素原子の数が特定されている（例えば、Ｃ１〜６アルキルアミノ）又はこの範囲内の任意の数［すなわち、メチルアミノ、エチルアミノ、イソプロピルアミノ、ｔ−ブチルアミノなど］の直鎖又は分岐鎖アルキルアミンを指す。
【００６５】
[0065]用語「アルキルスルホニル」は、炭素原子の数が特定されている（例えば、Ｃ１〜６アルキルスルホニル）又はこの範囲内の任意の数［すなわち、メチルスルホニル（ＭｅＳＯ２−）、エチルスルホニル、イソプロピルスルホニルなど］の直鎖又は分岐鎖アルキルスルホンを指す。
【００６６】
[0066]用語「アルキルスルフィニル」は、炭素原子の数が特定されている（例えば、Ｃ１〜６アルキルスルフィニル）又はこの範囲内の任意の数［すなわち、メチルスルフィニル（ＭｅＳＯ−）、エチルスルフィニル、イソプロピルスルフィニルなど］の直鎖又は分枝鎖アルキルスルホキシドを指す。
【００６７】
[0067]用語「アルキルオキシカルボニル」は、炭素原子の数が特定されている（例えば、Ｃ１〜６アルキルオキシカルボニル）又はこの範囲内の任意の数［すなわち、メチルオキシカルボニル（ＭｅＯＣＯ−）、エチルオキシカルボニル若しくはブチルオキシカルボニル］の本発明のカルボン酸誘導体の直鎖又は分枝鎖エステルを指す。
【００６８】
[0068]「アリール」は、炭素環原子を含有する単環式又は多環式芳香族環系を意味する。好ましいアリールは、単環式又は二環式６員〜１０員芳香族環系である。フェニル及びナフチルが好ましいアリールである。最も好ましいアリールはフェニルである。
【００６９】
[0069]「ヘテロシクリル」は、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含有し、酸化形態の硫黄、すなわちＳＯ及びＳＯ２をさらに含む飽和又は不飽和の非芳香族環又は環系を指す。複素環の例には、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジヒドロフラン、１，４−ジオキサン、モルホリン、１，４−ジチアン、ピペラジン、ピペリジン、１，３−ジオキソラン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピロリン、ピロリジン、テトラヒドロピラン、ジヒドロピラン、オキサチオラン、ジチオラン、１，３−ジオキサン、１，３−ジチアン、オキサチアン、チオモルホリン、２−オキソピペリジン−１−イル、２−オキソピロリジン−１−イル、２−オキソアゼチジン−１−イル、１，２，４−オキサジアジン−５（６Ｈ）−オン−３−イルなどが挙げられる。
【００７０】
[0070]「ヘテロアリール」は、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される少なくとも１個の環ヘテロ原子を含有する芳香族又は部分的に芳香族の複素環を意味する。したがって、ヘテロアリールは、アリール、シクロアルキル及び芳香族ではない複素環などの他の種類の環と縮合しているヘテロアリールを含む。ヘテロアリール基の例には、ピロリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、ピリジル、オキサゾリル、オキサジアゾリル（特に、１，３，４−オキサジアゾール−２−イル及び１，２，４−オキサジアゾール−３−イル）、チアジアゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、フリル、トリアジニル、チエニル、ピリミジル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、インドリニル、ピリダジニル、インダゾリル、イソインドリル、ジヒドロベンゾチエニル、インドリジニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ナフチリジニル、カルバゾリル、ベンゾジオキソリル、キノキサリニル、プリニル、フラザニル、イソベンジルフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、キノリル、インドリル、イソキノリル、ジベンゾフラニルなどが挙げられる。ヘテロシクリル及びヘテロアリール基については、３〜１５個の原子を含有する環及び環系が含まれ、１〜３個の環を形成する。
【００７１】
[0071]「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を指す。塩素及びフッ素が一般に好ましい。ハロゲンがアルキル又はアルコキシ基に置換している場合、フッ素が最も好ましい（例えばＣＦ３Ｏ及びＣＦ３ＣＨ２Ｏ）。
【００７２】
[0072]本発明を詳細に説明する前に、いくつかの用語を定義する。本明細書で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、別段文脈で明確に指示しない限り、複数の参照対象が含まれる。
【００７３】
[0073]「好ましくは」、「一般に」及び「典型的に」などの用語は、特許請求されている本発明の範囲を限定するために、又は特定の特徴が、特許請求されている本発明の構造若しくは機能にとって決定的、必要不可欠、若しくは重要でさえあることを暗に示すために本明細書において利用されるものではないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本発明の特定の実施形態において利用され得るか又は利用され得ない代替的又は追加的特徴を強調することを単に意図するものである。
【００７４】
[0074]本発明を説明及び規定する目的のために、用語「実質的に」は、本明細書において、任意の定量的な比較、値、測定値又は他の表現に起因し得る固有の不確実性の程度を表すために利用されることに留意されたい。用語「実質的に」はまた、本明細書において、定量的表現が、問題となっている主題の基本的機能に変化をもたらすことなく、記載された基準から変動し得る程度を表すために利用される。
【００７５】
[0075]本明細書の主題の特徴及び利点は、添付の図面に図示されているような、選択された実施形態の以下の詳細な説明を踏まえるとより明らかになるであろう。理解されるように、開示及び特許請求される主題は、すべて特許請求の範囲から逸脱することなく、様々な点において修正が可能である。したがって、図面及び説明は、制限的なものと考えられるべきではなく、本質的に例示的なものと考えられるべきであり、主題の全範囲は、特許請求の範囲に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ヒトβ細胞の健康を高めるためのＡＡＧＰ（商標）の使用を例示する図である。（Ａ）ＡＡＧＰ（商標）がある場合とない場合の２４時間後のβ膵島細胞回復率（１群当たりｎ＝６）；（Ｂ）ＡＡＧＰ（商標）がある場合とない場合の２４時間後のβ膵島細胞生存度（Ｓｙｔｏ（登録商標）緑色／ＥＢで測定）（１群当たりｎ＝６）；及び（Ｃ〜Ｄ）ＡＡＧＰ（商標）がある場合とない場合のグルコース刺激インスリン放出（１群当たりｎ＝３）。
【図２】ヒトβ膵島細胞の健康膵島をタクロリムス（Ｔａｃ）毒性から保護するためのＡＡＧＰ（商標）の使用を例示する図である。（Ａ）ＡＡＧＰ（商標）がある場合とない場合のＴａｃ曝露後のβ膵島細胞の回復率（１群当たりｎ＝６）、（Ｂ〜Ｄ）ＡＡＧＰ（商標）がある場合とない場合のＴａｃ曝露後のβ膵島生存度（Ｓｙｔｏ（登録商標）緑色／ＥＢで測定）（１群当たりｎ＝６）；及び（Ｅ〜Ｆ）ＡＡＧＰ（商標）がある場合とない場合のＴａｃ曝露後のグルコース刺激インスリン放出（１群当たりｎ＝６）。
【図３】移植転帰を改善するためのＡＡＧＰ（商標）の使用を例示する図である。（Ａ〜Ｄ）ＡＡＧＰ（商標）がある場合とない場合の２４時間後の移植片機能（それぞれｎ＝４及び５）、（Ｅ〜Ｆ）ＡＡＧＰ（商標）がある場合とない場合の２４時間後の移植片機能（グルコース負荷試験）及び（Ｇ）ＡＡＧＰ（商標）ありで処理した場合となしで処理した場合のβ膵島細胞の移植後６０日間の正常血糖の百分率（ｎ＝４及び５）。
【図４】ＡＡＧＰ（商標）補充がある培養とない培養におけるヒト膵島のインビトロ評価を例示する図である。（Ａ）２４時間の培養後の膵島回復率の差（ｐ＝０．０２）。（Ｂ）グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を比較する灌流曲線による機能評価。（Ｃ）灌流曲線に対応する曲線下面積の差。データ点は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１を表す。
【図５】ＡＡＧＰ（商標）補充及びタクロリムス曝露がある培養とない培養におけるヒト膵島のインビトロ評価を例示する図である。（Ａ）培養及びタクロリムス曝露後の膵島回復率の差。（Ｂ）異なる培養条件についてグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を比較する灌流曲線による機能評価。（Ｃ）灌流曲線に対応する曲線下面積の差。データ点は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝６、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１を表す。
【図６】（Ａ）ＡＡＧＰ（商標）なしでタクロリムスに曝露したヒト膵島における増加した細胞外反応性酸素種（ＲＯＳ）を例示する図である。酸化ストレスは、Ａｃｒｉｄａｎ  Ｌｕｍｉｎｏｇｅｎ  ＰＳ−３アッセイで分析した細胞外ＲＯＳの倍数増加により測定した（ｎ＝３）。ＡＡＧＰ（商標）及びタクロリムスを培地から洗い流した後、膵島をさらに３日間保持した。ＧＳＩＳ静的アッセイ及び細胞内インスリン含量を、異なる群について３日目（Ｔａｃが存在）及び７日目（Ｔａｃなし）に測定した。（Ｂ）Ｔａｃ＋群の刺激指数（ＳＩ）は、Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）と比較して３日目に有意に減少した。７日目のＳＩは同様であり、Ｔａｃがもはや存在しなくなると機能回復が見られた。機能の変化にもかかわらず、ベースライン時（Ｃ）、並びに３日目及び７日目（Ｄ）に測定したインスリンの細胞内含量に有意な変化は見られなかった。データ点は、２つの異なる調製物から３つの組で、平均±ＳＥＭを表す。
【図７】ＡＡＧＰ（商標）の効果がタクロリムスの直接的な薬物阻害の結果ではないことを例示する図である。（Ａ〜Ｃ）同種異系混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いて、直接的な薬物阻害を評価した。結果は、タクロリムス、ＡＡＧＰ（商標）及び両方の組合せの存在下でのＴ細胞増殖の有意な減少を示し、したがってＡＡＧＰ（商標）によるタクロリムスの直接的な阻害がないことが証明された。データ点は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝６、＊＊＊ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１を表す。
【図８】タクロリムスへの急性曝露はカルシウムの細胞内含量には影響しないが、エキソサイトーシスを減少させることを例示する図である。膵島内カルシウム濃度は、実験的介入にもかかわらず不変のままである。（Ａ）比較細胞内カルシウム濃度並びに（Ｂ）残りの群と比較した場合のＴａｃ＋の累積静電容量、及びそれらの対応する曲線下面積の減少（Ｃ）対応する曲線下面積（２つの異なる調製物のｎ＝１０〜１６個の膵島）。静電容量測定を実施してエキソサイトーシスの差（Ｄ）を機能的に同定し、それによりエキソサイトーシス中間群において有意差が示された。データ点は、２回の単離から１群当たりｎ＝１００個の膵島を３つの群で、平均±ＳＥＭを表す。
【図９】移植後（２４時間）に急性発現する炎症誘発性サイトカイン及びケモカインを例示する図である。ＩＬ−１β（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、ＴＮＦ（Ｃ）及びケラチノサイトのケモカイン（ＫＣ）（Ｄ）の濃度を、均質化により局所的に移植片に対して測定した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びケラチノサイトのケモカイン（ＫＣ）の濃度は、ＡＡＧＰ（商標）で予め処理した生着した膵島において有意により低かった。サイトカインを、均質化により局所的に移植片に対して測定した（組織１グラム当たりに正規化、ｎ＝３）。データ点は、ｐｇ／ｍＬに対する平均±ＳＥＭ、組織１グラム当たりに正規化、ｎ＝３、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１を表す。
【図１０】移植２４時間後に急性測定したアポトーシスを例示する図である。（Ａ）インスリン（赤色）、ＴＵＮＥＬ（緑色）及び核（青色）についての多重染色を示す代表的なスライド。（Ｂ）ＴＵＮＥＬ陽性細胞の百分率を測定し、Ｔａｃ＋群において有意により高いという結果になった。（Ｃ）均質化後に移植片に局所的に発現した切断カスパーゼ−３の濃度によっても、Ｔａｃ＋群におけるより高い細胞死亡率が確認された。結果は、ナイーブ腎臓組織に対する倍率変化の増加として表す。結果は、ナイーブ腎臓組織に対する倍率変化の増加として表す。移植後に急性測定したアポトーシスの発現としての異なる研究群におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の百分率。データ点は、組織１グラム当たりで調整した平均±ＳＥＭ、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１を表す。
【図１１Ａ】最小ヒト膵島質量（約１０００ＩＥＱ）の移植を受けた免疫不全マウスにおける移植後の移植片機能を例示する図である。膵島をＡＡＧＰ（商標）及びタクロリムスで予め適宜処理した。（Ａ）長期移植片機能（６０日間）を実証するプールされた血中グルコースプロファイル。点線は、６０日目の移植片回収腎摘出術を示す。
【図１１Ｂ】（Ｂ）グルコースボーラス投与後の代謝応答を評価する腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）。
【図１１Ｃ】（Ｃ）残留膵島質量の指標としての移植の６０日後の取り出された移植片のインスリン含量。データ点は、組織１グラム当たりで調整した平均±ＳＥＭ（Ｔａｃ−  ｎ＝６、Ｔａｃ＋  ｎ＝３及びＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）  ｎ＝７）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１を表す。
【図１１Ｄ】（Ｄ）及び（Ｅ）同系全質量（約５００ＩＥＱ）膵島移植を受けたマウスにおける移植後の移植片機能。ＡＡＧＰ（商標）を移植の１時間前に培養培地に添加し、タクロリムスを皮下浸透圧ポンプ（同じ手順の間に埋め込んだ）により１ｍｇ／ｋｇ／日の持続定量で投与した。（Ｄ）Ｔａｃが存在する間のＴａｃ＋膵島に対する明確な機能障害を伴う４０日間にわたる動物のプールされた血中グルコースプロファイル。垂直点線は、タクロリムス処置中止を示し、Ｔａｃ＋移植片の緩やかな回復の印となる。ｙ  ＝  １１の水平連続線は、正常血糖の限界を示す。移植片回収腎摘出術を３０日目に再度実施した。
【図１１Ｅ】（Ｄ）及び（Ｅ）同系全質量（約５００ＩＥＱ）膵島移植を受けたマウスにおける移植後の移植片機能。ＡＡＧＰ（商標）を移植の１時間前に培養培地に添加し、タクロリムスを皮下浸透圧ポンプ（同じ手順の間に埋め込んだ）により１ｍｇ／ｋｇ／日の持続定量で投与した。（Ｅ）より早期に糖尿病を逆転させるＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）マウスを示す移植後の正常血糖までの平均時間（ｐ＜０．００１、ログランク、Ｍａｎｔｅｌ−ｃｏｘ検定）。
【図１１Ｆ】（Ｆ）及び（Ｇ）最後に、マウスにタクロリムスを投与（７日間）した場合及びレシピエントがＣＮＩなしである場合、グルコース負荷試験はＴａｃ＋に対する移植片応答において有意差を示した。これらの差はＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）群においては観察されなかった。
【図１１Ｇ】（Ｆ）及び（Ｇ）最後に、マウスにタクロリムスを投与（７日間）した場合及びレシピエントがＣＮＩなしである場合、グルコース負荷試験はＴａｃ＋に対する移植片応答において有意差を示した。これらの差はＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）群においては観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
［詳細な説明］
[0087]β細胞移植は、ドナー膵臓からの単離β膵島細胞の別のヒトへの移植である。β細胞移植は、１型糖尿病の実験的治療である。移植されると、膵島β細胞はインスリンを産生し始め、血中のグルコースレベルを積極的に調節する。
【００７８】
[0088]膵島は、通常、患者の肝臓に注入される。細胞が遺伝的に同一のドナーに由来しない場合、患者の身体が細胞を外来性であると認識し、全ての移植拒絶反応と同様に、免疫系が細胞を攻撃し始める。これを防ぐために、免疫抑制薬が用いられる。膵島移植の分野で著しい進歩があったが、現在膵島移植の広範囲の応用を妨げる多くの障害が残っている。最も重要な制限のうちの２つは、膵島の拒絶反応を防ぐための手段が現在のところ不十分であること、及び移植のためのβ膵島細胞の供給が制限されていることである。現在の免疫抑制レジメンはβ膵島細胞不全を数カ月から数年間にわたって防ぐことができるが、これらの処置で使用される薬剤は高価であり、特定の悪性疾患及び日和見感染症のリスクを高めることがある。加えて、やや皮肉なことであるが、最も一般的に使用されている薬剤［ダクリズマブ（ゼナパックス（商標））、シロリムス（ラパミューン（商標））、シクロスポリン及びタクロリムス（プログラフ（商標））を含む］は、正常なβ膵島細胞機能及び／又はインスリン作用を障害することも知られている。
【００７９】
[0089]第１の実施形態において、単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の生着を高めるためのインビトロの方法であって、
ａ）移植を必要とする対象における移植の前に、単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、一般式Ｉ：
【化１２】
0006801934.tif 000013
［式中、
Ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ４  ＝  Ｈ、ＡＡ１又はＡＡ１−ＡＡ２であり、
Ｒ５  ＝  ＯＨ、ＡＡ１又はＡＡ１−ＡＡ２であり、
ＡＡ１及びＡＡ２は、独立して、非極性側鎖を有するアミノ酸を表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、独立した基であり、ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの２つは、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２又はＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３のうちの残りは、
【化１３】
0006801934.tif 000014
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−グリコシド基又はＣＨ２−ＯＧＰであり、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ１  ＝  Ｒ２  ＝  Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２又はＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である場合、
Ｒ３  ＝  
【化１４】
0006801934.tif 000015
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−グリコシド基又はＣＨ２−ＯＧＰであり、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ１  ＝  Ｒ３  ＝  Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｐｈ、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２又はＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である場合、
Ｒ２  ＝  
【化１５】
0006801934.tif 000016
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−グリコシド基又はＣＨ２−ＯＧＰであり、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ２  ＝  Ｒ３  ＝  Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２又はＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３である場合、
Ｒ１  ＝  
【化１６】
0006801934.tif 000017
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−グリコシド基又はＣＨ２−ＯＧＰであり、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］である］
のｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触させるステップを含む方法が開示される。
【００８０】
[0090]第２の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓β細胞のインスリン分泌機能を改善するためのインビトロの方法であって、
ａ）単離膵臓β細胞を、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触させるステップを含む方法が開示される。
【００８１】
[0091]第３によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を免疫抑制薬の毒性から保護するためのインビトロの方法であって、
ａ）単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触させるステップを含む方法が開示される。
【００８２】
[0092]第４の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の炎症応答を減少させるためのインビトロの方法であって、
ａ）単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触させるステップを含む方法が開示される。
【００８３】
[0093]第４の実施形態によれば、単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、移植を必要とする対象に移植する方法であって、
ａ）単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触させるステップと、
ｂ）ステップａ）の処理された単離膵臓細胞を、移植を必要とする前記対象に移植するステップとを含む方法が開示される。
【００８４】
[0094]一実施形態によれば、本発明の移植する方法は、ステップａ）の前のステップａ’）、すなわちａ’）膵臓細胞、膵臓前駆細胞又は両方を単離するステップをさらに含み得る。
【００８５】
[0095]別の実施形態によれば、本発明の移植する方法は、ステップｂ）の前のステップｂ’）：ステップａ）の単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を免疫抑制薬と接触させるステップもさらに含み得る。
【００８６】
[0096]実施形態において、移植手順は、任意の公知及び適切な移植手順、並びに本発明の細胞型に適切に適合する将来の移植手順に従って実施することができる。一実施形態によれば、移植手順は「エドモントンプロトコール」であってもよい。「エドモントンプロトコール」として公知の膵島細胞移植手順は、患者の肝門脈への死体膵島細胞の移植を伴う。移植の同種異系の性質のため、タクロリムスなどのカルシニューリン阻害剤の使用による免疫抑制が施される。移植された細胞が無血管で且つ厳しいストレス下にある生着プロセス中の移植後期間があり、この期間中に生着の失敗が起こりやすい。腎被膜下及び皮下をはじめとする移植のための他の部位が使用されてきた。実施形態によれば、膵島又はβ前駆細胞の移植の場合、所望の効果を達成するのに多数の細胞が必要とされるため、主な移植部位は依然として門脈である。
【００８７】
[0097]別の実施形態によれば、本発明の方法において、単離膵臓細胞は、単離α細胞、単離β細胞、単離δ細胞、単離γ細胞、ε細胞又はこれらの組合せであり得、単離膵臓細胞は単離β細胞であることが好ましい。
【００８８】
[0098]上記の本発明の方法において、免疫抑制薬は、ダクリズマブ、シロリムス、タクロリムス、シクロスポリン又はこれらの組合せのうちの１つであり得る。
【００８９】
[0099]実施形態によれば、対象はヒト対象であり得、単離膵臓細胞は、生体ドナー、死体ドナー又はこれらの組合せから単離され得る。
【００９０】
[00100]一実施形態によれば、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物は一般式ＩＩ：
【化１７】
0006801934.tif 000018
［式中、
Ｎは、１〜５の整数であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、独立した基であり、ここで、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの２つは、Ｈ、ＣＨ３から選択され、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３のうちの残りは、
【化１８】
0006801934.tif 000019
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−ＯＧＰから選択され、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’、ＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ１  ＝  Ｒ２  ＝  Ｈ又はＣＨ３である場合、
Ｒ３  ＝  
【化１９】
0006801934.tif 000020
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２−ＯＧＰから選択され、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’、ＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ１  ＝  Ｒ３  ＝  Ｈ又はＣＨ３である場合、
Ｒ２  ＝  
【化２０】
0006801934.tif 000021
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  ＝  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’、ＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、Ｂｎ、トシレート、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２−ＯＧＰから選択され、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子Ｈ、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］
であり、
Ｒ２  ＝  Ｒ３  ＝  Ｈ又はＣＨ３である場合、
Ｒ１  ＝  
【化２１】
0006801934.tif 000022
［式中、
ｎは、３〜４の整数であり、
Ｙ、Ｙ’は、独立した基であり、
ここで、Ｙ、Ｙ’  Ｈ、ＯＲ、Ｎ３、ＮＲ’Ｒ’’又はＳＲ’’’であり、
ここで、Ｒ  ＝  Ｈ、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基であり、
Ｒ’、Ｒ’’は、独立して＝  Ｈ、アルキル、アリル、ベンジル、トシレート基、Ｃ（＝Ｏ）−アルキル又はＣ（＝Ｏ）−Ｂｎであり、
Ｒ’’’  ＝  Ｈ、アルキル又はアセテート基であり、
Ｒ６は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２−ＯＧＰから選択され、ここで、ＧＰは、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から選択される保護基であり、
Ｒ７  ＝  ＯＨ、ＯＧＰ’、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＧＰ’又はＮＧＰ’ＧＰ’’であり、ここで、ＧＰ’及びＧＰ’’は、アルキル、ベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル又はアセテート基から独立して選択され、
Ｒ８は、水素原子、又は遊離アルコール官能基若しくは保護されたアルコール官能基である］である］
の化合物であってもよい。
【００９１】
[00102]別の実施形態によれば、好ましい一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物の薬学的に許容される酸付加塩は、ＡＡＧＰ（商標）とも命名された式ＩＩＩ：
【化２２】
0006801934.tif 000023
の化合物である。
【００９２】
[00103]別の実施形態によれば、本発明の方法に従って調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方が開示される。
【００９３】
[00104]別の実施形態によれば、単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、移植を必要とする対象に移植する方法であって、
ａ）本発明の方法に従って調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、移植を必要とする前記対象に移植するステップを含む方法が開示される。
【００９４】
[00105]別の実施形態によれば、糖尿病を治療する方法であって、
ａ）本発明の方法に従って調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を、移植を必要とする前記対象に移植するステップを含む方法が開示される。
【００９５】
[00106]別の実施形態によれば、単離膵臓細胞は、単離α細胞、単離β細胞、単離δ細胞、単離γ細胞、ε細胞又はこれらの組合せであり得、単離膵臓細胞は単離β細胞であることが好ましい。
【００９６】
[00107]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象への移植のための、本発明の方法に従って調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の使用が開示される。
【００９７】
[00108]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における糖尿病の治療のための、本発明の方法に従って調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の使用が開示される。
【００９８】
[00109]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象への移植のための、本発明の方法による調製された単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方が開示される。
【００９９】
[00110]別の実施形態によれば、単離膵臓細胞は、単離α細胞、単離β細胞、単離δ細胞、単離γ細胞、ε細胞又はこれらの組合せであり得、単離膵臓細胞は単離β細胞であることが好ましい。
【０１００】
[00111]別の実施形態によれば、一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物と接触している単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方が開示される。
【０１０１】
[00112]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の生着を高めるための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物の使用が開示される。
【０１０２】
[00113]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓β細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方のインスリン分泌機能を改善するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物の使用が開示される。
【０１０３】
[00114]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を免疫抑制薬の毒性から保護するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物の使用が開示される。
【０１０４】
[00115]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の炎症応答を減少させるための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物の使用が開示される。
【０１０５】
[00116]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の生着を高めるのに使用するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物が開示される。
【０１０６】
[00117]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓β細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方のインスリン分泌機能を改善するのに使用するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物が開示される。
【０１０７】
[00118]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方を免疫抑制薬の毒性から保護するのに使用するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物が開示される。
【０１０８】
[00119]別の実施形態によれば、移植を必要とする対象における移植の前に単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方の炎症応答を減少させるのに使用するための、上記の通りの一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物、又は上記の通りの一般式Ｉの化合物の薬学的に許容される、塩基、酸付加塩、水和物若しくは溶媒和物の使用が開示される。
【０１０９】
[00120]別の実施形態によれば、式Ｉの化合物は、式ＩＩの化合物であってもよい。また、式Ｉの化合物の薬学的に許容される酸付加塩は、式ＩＩＩの化合物であってもよい。
【０１１０】
[00121]別の実施形態によれば、単離膵臓細胞、単離膵臓前駆細胞又は両方は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの前記化合物、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの式Ｉ、式ＩＩ若しくは式ＩＩＩの前記化合物と接触していてもよい。
【０１１１】
[00122]上記の本発明の使用において、免疫抑制薬は、ダクリズマブ、シロリムス、タクロリムス、シクロスポリン又はこれらの組合せのうちの１つであり得る。
【０１１２】
[00123]上記の使用及び化合物によれば、対象はヒト対象であり得、単離膵臓細胞は、生体ドナー、死体ドナー又はこれらの組合せから単離され得る。
【０１１３】
[00124]別の実施形態によれば、単離膵臓細胞は、単離α細胞、単離β細胞、単離δ細胞、単離γ細胞、ε細胞又はこれらの組合せであり得、単離膵臓細胞は単離β細胞であることが好ましい。
【０１１４】
[00125]本発明は示された通りの化合物を含み、また（可能な場合には）化合物の個々のジアステレオマー、エナンチオマー及びエピマー、並びにラセミ混合物を含むそのジアステレオマー及び／又はエナンチオマーの混合物も含む。本明細書に開示されている特定の立体化学が好ましいが、ジアステレオマー、エナンチオマー、エピマー及びこれらの混合物をはじめとする他の立体異性体も有用であり得る。不活性な又はより活性の低いジアステレオ異性体及びエナンチオマーは、標的及び／又は活性化メカニズムに関する科学研究に有用である。
【０１１５】
[00126]本明細書に開示されている化合物は、（ａ）化合物（複数可）又は薬学的に許容されるその塩及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に使用することができる。化合物は、１種又は複数の他の活性医薬成分を含む医薬組成物に使用することができる。化合物はまた、式Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩの化合物又は薬学的に許容されるその塩が唯一の活性成分である医薬組成物に使用することもできる。
【０１１６】
[00127]構造式Ｉ、構造式ＩＩ及び／又は構造式ＩＩＩの化合物は、１個又は複数の不斉中心を含んでいてもよく、したがって、ラセミ体及びラセミ混合物、単一のエナンチオマー、ジアステレオマー混合物及び個々のジアステレオマーとして生じ得る。本発明は、構造式Ｉ、構造式ＩＩ及び／又は構造式ＩＩＩの化合物の全てのこのような異性体形態を包含するものとする。
【０１１７】
[00128]構造式Ｉ、構造式ＩＩ及び／又は構造式ＩＩＩの化合物は、例えば、適切な溶媒、例えばメタノール若しくは酢酸エチル又はそれらの混合物からの分別結晶によるか、或いは光学活性固定相を用いるキラルクロマトグラフィーにより、化合物の個々のジアステレオ異性体に分離することができる。絶対立体化学は、必要に応じて、絶対配置が公知である不斉中心を含む試薬で誘導体化された結晶生成物又は結晶中間体のＸ線結晶構造解析により決定することができる。
【０１１８】
[00129]或いは、一般構造式Ｉ、構造式ＩＩ及び／又は構造式ＩＩＩの化合物の任意の立体異性体は、絶対配置が公知である光学的に純粋な出発物質又は試薬を使用する立体特異的合成により得ることができる。
【０１１９】
[00130]所望の場合、化合物のラセミ混合物は、個々のエナンチオマーが単離されるように分離することができる。分離は、化合物のラセミ混合物をエナンチオマー的に純粋な化合物とカップリングさせてジアステレオマー混合物を形成させ、続いて個々のジアステレオマーを分別結晶又はクロマトグラフィーなどの標準的な方法により分離するなど、当該技術分野において周知の方法により行うことができる。上記カップリング反応は、多くの場合、エナンチオマー的に純粋な酸又は塩基を使用する塩の形成である。次いで、ジアステレオマー誘導体は、付加されたキラル残基を切断することにより純粋なエナンチオマーに変換することができる。化合物のラセミ混合物は、キラル固定相を利用するクロマトグラフィー法により直接分離することもでき、この方法は当該技術分野において周知である。
【０１２０】
[00131]本明細書に記載されている化合物のいくつかは、オレフィン二重結合を含有しており、別段の指定がない限り、Ｅ及びＺ幾何異性体の両方を含むものとする。
【０１２１】
[00132]本明細書に記載されている化合物のいくつかは、１個又は複数の二重結合シフトに付随して起こる水素の異なる結合点を有する互変異性体として存在し得る。例えば、ケトン及びそのエノール型はケト−エノール互変異性体である。個々の互変異性体及びその混合物は、本発明の化合物に包含される。
【０１２２】
[00133]一般式Ｉ、式ＩＩ及び／又は式ＩＩＩの化合物において、原子はその天然同位体存在度を呈するものであってもよく、又は原子のうちの１個若しくは複数は、同じ原子番号を有するが、天然で主として見出される原子質量若しくは質量数とは異なる原子質量若しくは質量数を有する特定の同位体が人工的に濃縮されていてもよい。本発明は、一般式Ｉ、式ＩＩ及び／又は式ＩＩＩの化合物のすべての適切な同位体変形物を含むものとする。例えば、水素（Ｈ）の異なる同位体型としては、プロチウム（１Ｈ）及び重水素（２Ｈ）が挙げられる。プロチウムは、天然で見出される主な水素同位体である。重水素を濃縮することにより、インビボ半減期の増加若しくは投与必要量の低減などのある特定の治療上の利点をもたらすことができ、又は生体試料の特性決定のための標準物質として有用な化合物を提供することができる。一般式Ｉ、式ＩＩ及び／又は式ＩＩＩの範囲内の同位体濃縮化合物は、当業者に周知の従来技術により、過度の実験を行わずに調製することができる。
【０１２３】
塩及び製剤
[00134]本明細書で使用される場合、構造式Ｉ、式ＩＩ及び／又は式ＩＩＩの化合物に対する言及には、薬学的に許容される塩も含まれ、且つ遊離化合物若しくはその薬学的に許容される塩に対する前駆体として又は他の合成操作において使用される場合には薬学的に許容されない塩も含まれることは理解されるであろう。用語「薬学的に許容される塩」は、無機又は有機の塩基及び無機又は有機の酸を含む、薬学的に許容される非毒性の塩基又は酸から調製される塩を指す。用語「薬学的に許容される塩」に包含される塩基性化合物の塩は、遊離塩基と適切な有機又は無機の酸とを反応させることにより一般に調製される本発明化合物の非毒性塩を指す。代表的な本発明の塩基性化合物の塩としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、二酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、カムシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、エデト酸、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジド及び吉草酸塩。さらに、本発明の化合物が酸性部分を有する場合、適切な薬学的に許容されるその塩として、限定されるものではないが、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン、第一マンガン（ｍａｎｇａｍｏｕｓ）、カリウム、ナトリウム、亜鉛などを含む無機塩基から誘導される塩が挙げられる。アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム及びナトリウム塩が特に好ましい。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩として、第一、第二及び第三アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの塩が挙げられる。
【０１２４】
[00135]また、本発明の化合物にカルボン酸（−ＣＯＯＨ）又はアルコール基が存在する場合、メチル、エチル若しくはピバロイルオキシメチルなどの薬学的に許容されるカルボン酸誘導体のエステル、又はアセチル、ピバロイル、ベンゾイル及びアミノアシルなどのアルコールのアシル誘導体を用いることができる。徐放製剤又はプロドラッグ製剤として使用するために溶解性又は加水分解特性を修飾するための当該技術分野において公知のエステル及びアシル基が含まれる。
【０１２５】
[00136]構造式Ｉ、式ＩＩ及び／又は式ＩＩＩの化合物の溶媒和物、特に水和物も同様に本発明に含まれる。
【０１２６】
[00137]一実施形態によれば、構造式Ｉ、式ＩＩ及び／又は式ＩＩＩの化合物は、医薬品として使用するための様々な製剤に含まれ得る。
【０１２７】
[00138]水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合した活性物質を含有する。そのような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムであり；分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであってもよい。水性懸濁液は、一種又は複数の保存剤、例えばエチル又はｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエート、一種又は複数の着色剤、一種又は複数の香味剤、及び一種又は複数の甘味剤、例えばスクロース、サッカリン又はアスパルテームも含有し得る。
【０１２８】
[00139]油性懸濁液は、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油に、又は鉱油、例えば流動パラフィンに活性成分を懸濁させることにより製剤化することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、ミツロウ、硬質パラフィン又はセチルアルコールを含有し得る。上述の甘味剤などの甘味剤、及び香味剤を添加して、口当たりのよい経口製剤を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存することができる。
【０１２９】
[00140]水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性の散剤又は顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び１種若しくは複数の保存剤と混合した活性成分を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、既に上述したものにより例示されている。追加の賦形剤、例えば甘味剤、香味剤及び着色剤も存在してもよい。
【０１３０】
[00141]本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油相は、植物油、例えばオリーブ油若しくはラッカセイ油、又は鉱油、例えば流動パラフィン、又はこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、天然に存在するホスファチド、例えばダイズ、レシチン、並びに脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導されるエステル又は部分エステル、例えばモノオレイン酸ソルビタン、並びに前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであってもよい。エマルジョンはまた、甘味剤及び香味剤を含有していてもよい。
【０１３１】
[00142]医薬組成物は、無菌注射用の水性又は油性懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上述した適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して公知の技術に従って製剤化することができる。無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば、１，３−ブタンジオール中溶液であってもよい。用いることができる許容されるビヒクル及び溶媒には、水、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の不揮発性油が溶媒又は懸濁媒体として従来から用いられている。この目的のために、合成のモノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に使用されている。
【０１３２】
[00143]一実施形態によれば、細胞を、その調製について当該技術分野で公知の方法を使用して単離する。例えば、コラゲナーゼＩ及びコラゲナーゼＩＩ、サーモリシン、非クロストリジウム性中性プロテアーゼ又はこのような目的に使用される他の酵素などの酵素の混合物を使用して、細胞をドナー（生体又は死体ドナー）から単離することができる。次いで、単離された細胞は、標準組織培養フラスコ内において通常の組織培養条件下で培養することができる。
【０１３３】
[00144]一実施形態によれば、細胞、膵臓前駆細胞又は両方は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ；又は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ；又は約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ；又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ；又は約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ；又は約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、又は約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、又は約１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、又は約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ；又は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ；又は約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ；又は約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌ；又は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌ；又は約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．１ｍｇ／ｍｌ；又は約３ｍｇ／ｍｌの様々な濃度の一般式Ｉのｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物−好ましくは式ＩＩの化合物、最も好ましくは式ＩＩＩの化合物で処理することができる。実施形態によれば、上記の量は本発明の目的のために治療上有効な量であると考えられる。
【０１３４】
[00145]別の実施形態によれば、細胞の生存度及び生存率に改善をもたらすのに十分な時間にわたって、細胞をｇｅｍ−ジフルオロ化Ｃ−グリコペプチド化合物と接触させる。実施形態によれば、十分な時間は、約１２時間〜１２０時間、又は約１２時間〜約９６時間、又は約１２時間〜約７２時間、又は約１２時間〜約４８時間、又は約１２時間〜約２４時間、又は約１２０時間、又は約９６時間、又は約７２時間、又は約４８時間、又は約２４時間、又は約１２時間であり得る。
【０１３５】
[00146]別の実施形態において、薬学的に許容される担体中の、本発明の方法に従って調製された細胞調製物が開示される。一実施形態によれば、上記細胞調製物は、細胞移植のための医薬品の調製に使用することができる。別の実施形態によれば、上記細胞調製物は細胞移植に使用することができる。
【０１３６】
[00147]別の実施形態において、本発明の細胞調製物を、移植を必要とする対象に移植するステップを含む移植の方法が開示される。上記対象は、哺乳動物、好ましくはヒトであり得る。
【０１３７】
[00148]本発明は、本発明の範囲を限定するためではなく本発明を例示するために提供される以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【０１３８】
実施例１
ヒトβ細胞の健康を高めるためのＡＡＧＰ（商標）の利用
初期特性決定
実験方法
[00149]研究グレードのヒト膵島調製物を以下の群に分けて２４時間培養する：
[00150]１）ＡＡＧＰ（商標）補充膵島細胞；及び
[00151]２）対照群（非補充膵島細胞）。
【０１３９】
[00152]膵島は、標準組織培養フラスコを用いて、３７℃の９５％空気及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気中において２００ＩＥ／ｍＬの密度で培養する。ＡＡＧＰ（商標）濃度は３ｍｇ／ｍＬである。膵島単離後１日目に、膵島回復、膜完全性生存度染色（Ｓｙｔｏ（登録商標）ＥＢ）及びグルコース刺激インスリン放出を含むいくつかの試験を実施する。結果は図１Ａ〜Ｄに示す。
【０１４０】
実施例２
タクロリムス毒性からヒトβ細胞を保護するためのＡＡＧＰ（商標）の利用
実験方法
[00153]研究グレードのヒト膵島調製物を以下の群に分けて４８時間培養する：
[00154]１）タクロリムスなし（Ｔａｃ−）で処理したβ膵島細胞；
[00155]２）タクロリムスあり（Ｔａｃ＋）で処理したβ膵島細胞；及び
[00156]３）タクロリムスあり（Ｔａｃ＋）で処理した＋ＡＡＧＰ（商標）補充のβ膵島細胞。
【０１４１】
[00157]４８時間後、タクロリムス（１０ｎｇ／Ｌ）を群２及び３に添加した。
【０１４２】
[00158]膵島は、標準組織培養フラスコを用いて、３７℃の９５％空気及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気中において２００ＩＥ／ｍＬの密度で培養する。ＡＡＧＰ（商標）濃度は３ｍｇ／ｍＬである。膵島単離後Ｄ１に、膵島回復、膜完全性生存度染色（Ｓｙｔｏ  ＥＢ）及びグルコース刺激インスリン放出を含むいくつかの試験を実施する。結果は図２Ａ〜Ｆに示す。
【０１４３】
実施例３
移植転帰を改善するための抗老化グリコペプチドの利用
実験方法
[00159]２つの研究グレードのヒト膵島調製物を以下の群に分けて２４時間培養する：
[00160]１）ＡＡＧＰ（商標）＋補充膵島細胞；及び
[00161]２）対照群（非補充膵島）
【０１４４】
[00162]膵島は、標準組織培養フラスコを用いて、３７℃の９５％空気及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気中において２００ＩＥ／ｍＬの密度で培養する。ＡＡＧＰ（商標）濃度は３ｍｇ／ｍＬである。２４時間後、腎皮膜下膵島移植を免疫不全マウス（Ｒａｇ１）に最小膵島質量（約１０００ＩＥＱ）で実施して、移植の有効性を評価する（ｎ＝４及び５、それぞれ対照及びＡＡＧＰ（商標））。結果は図３Ａ〜Ｇに示す。
【０１４５】
結論
[00163]ＡＡＧＰ（商標）製剤は、ヒト膵島細胞に毒性を示さない。
[00164]ＡＡＧＰ（商標）は、培養における膵島の生存を高めるように思われる。
[00165]ＡＡＧＰ（商標）は、インビトロでタクロリムスに曝露した膵島を保護する。
[00166]最小膵島質量での移植研究では、ＡＡＧＰ（商標）は移植された膵島に利点をもたらすように思われるが、結論は出なかった。
【０１４６】
実施例４
膵島単離及び精製
[00167]すべての実験において、ヒト膵島が使用される。膵島は、アルバータ大学の臨床膵島移植プログラム内の臨床適正製造基準（ＧＭＰ）施設において死亡ドナーから単離される。簡単に説明すると、膵臓は、多臓器の死亡ドナーから入手し、ヒスチジン−トリプトファン−ケトグルタレート（ＨＴＫ、Ｃｕｓｔｏｄｉｏｌ．Ｍｅｔａｐｈａｒｍ、Ｂｒａｎｄｆｏｒｄ、ＯＮ、カナダ）溶液又は静的保存溶液（ＳＰＳ−１、Ｉｔａｓｃａ、ＩＬ、ＵＳＡ）中に保存される。次いで、腺をリベラーゼＭＴＦ  Ｃ／Ｔ  ＧＭＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｈｅｉｍ、ドイツ）で膨張させ、ＣＩｚｙｍｅコラゲナーゼ及びＣＩｚｙｍｅサーモリシン（Ｖｉｔａｃｙｔｅ  ＬＬＰ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を補充し、Ｒｉｃｏｒｄｉチャンバー内で消化する。遊離膵島は、連続密度勾配遠心分離（Ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｓｈａｈｉｄｕｌ．Ｍ（編）、Ｔｈｅ  ｉｓｌｅｔｓ  ｏｆ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２０１０）を用いて、細胞プロセッサー（モデル２９９１；Ｃｏｂｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＣＯ、ＵＳＡ）でさらに精製する。
【０１４７】
実施例５
インビトロ評価
[00168]膵島は、培養の開始時及び終了時に光学グラティキュールを使用してジチゾン染色（最終濃度３ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＯＮ、カナダ）で計数する。膵島の総数を、膵島当量（ＩＥＱ）（１５０μｍの直径に標準化）に変換する（Ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｓｈａｈｉｄｕｌ．Ｍ（編）、Ｔｈｅ  ｉｓｌｅｔｓ  ｏｆ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２０１０；及びＲａｎｕｎｃｏｌｉ  Ａら、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０００；９（３）：４０９〜４１４）。
【０１４８】
[00169]初期特性決定のために、３つの異なる調製物からの膵島を２つの群に分け、３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度にて、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン（１００ｍｇ／ｌ）、ペニシリン（１１２ｋＵ／ｌ）、ストレプトマイシン（１１２ｍｇ／ｌ）及びＨＥＰＥＳ（２５ｍｍｏｌ／ｌ）；ＮａＯＨでｐＨ７．４）を補充した培地（ＣＭＲＬ−１０６６、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）で培養する。１つの群には、ＡＦＰの合成類似体であるＡＡＧＰ（商標）（ＰｒｏｔｏＫｉｎｅｔｉｘ）も３ｍｇ／ｍＬで補充する。ＡＡＧＰ（商標）は、すべての培地において溶解性が高く、天然ＡＦＰに匹敵する高い生物活性特性を保持しながらより安定していることが証明されている。他の群は、対照として役立った。
【０１４９】
[00170]２４時間の培養後、膵島を回復、生存度及び機能について評価する。回復率は、各条件の初期カウントと比較して、２４時間培養後の生存膵島の百分率として計算される。生存度は、対比染色ｓｙｔｏ緑色／臭化エチジウム（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＯＮ）を用いる蛍光膜完全性アッセイを使用して評価する（Ｉｓｌｅｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｓｈａｈｉｄｕｌ．Ｍ（編）、Ｔｈｅ  ｉｓｌｅｔｓ  ｏｆ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２０１０；Ｒａｎｕｎｃｏｌｉ  Ａら、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０００；９（３）：４０９〜４１４；Ｒｉｃｏｒｄｉ  Ｃら、Ａｃｔａ  ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ  ｌａｔｉｎａ  １９９０；２７（３）：１８５〜１９５；及びＢａｒｎｅｔｔ  ＭＪら、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００４；１３（５）：４８１〜４８８）。
【０１５０】
[00171]膵島分泌機能は、Ｃａｂｒｅｒａら、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００８；１６（１０）：１０３９〜１０４８により記載されている通りに、連続グルコース刺激中のインビトロインスリン分泌プロファイルを監視することにより評価する。このインビトロ灌流アッセイは、交互に切り替わる正常血糖環境及び高血糖環境で膵島にストレスを与えて生理学的膵島応答をモデル化する連続グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）試験の一様式である。灌流アッセイの上清を収集し、インスリンレベルを、市販のＥＬＩＳＡキット（インスリンＥＬＩＳＡキット、Ｍｅｒｃｏｄｉａ  Ｉｎｃ．、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用して判定する。結果は、１００ＩＥＱについて正規化して低（２．８ｍＭｏｌ）グルコース刺激ベースラインと比較したインスリン分泌の倍率変化として表す。
【０１５１】
実施例６
タクロリムス毒性
[00172]ＡＡＧＰ（商標）の細胞保護能力をタクロリムス誘発毒性に対して評価する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＪＤら、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００９；１８（８）：８３３〜８４５）。６つの異なる研究グレードのヒト膵島調製物からの膵島を、３つの群：１つのＡＡＧＰ（商標）補充群及び２つの非補充対照群に分ける。膵島を同様の培養条件に２４時間保持し、続いてＡＡＧＰ（商標）群及び対照群のうちの１つ（陽性対照）においてタクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ、Ａｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．、Ｍａｒｋｈａｍ、ＯＮ、カナダ）を添加する。タクロリムスを臨床関連用量の１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加し、すべての群をさらに２４時間培養し、続いて灌流させ、炎症誘発性サイトカイン、酸化ストレス及びアポトーシスを判定する。結果は図？？に示す。
【０１５２】
実施例７
炎症誘発性サイトカイン及びケモカイン
[00173]タクロリムスに２４時間曝露後、すべての群の培養培地からの試料を凍結させ、関連するサイトカイン及びケモカイン（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ケラチノサイト由来ケモカイン（ＫＣ）及びＴＮＦ−α）を、マルチスポットヒト炎症誘発性７−Ｐｌｅｘ超高感度キット（Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ  Ｈｕｍａｎ  ＰｒｏＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ７−Ｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｋｉｔ）（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して測定し、ＳＥＣＴＯＲ（商標）Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）で分析する。結果は絶対値（ｐｇ／ｍＬ）として表し、単独のＣＭＲＬ培養培地は比較のための対照として使用する。
【０１５３】
実施例８
ＲＯＳ分析
[00174]すべての群からの凍結した試料を利用し、Ａｃｒｉｄａｎ  Ｌｕｍｉｇｅｎ（商標）ＰＳ−３アッセイ（Ａｍｅｒｓｈａｎ  ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ  ｋｉｔ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｏｔｔａｗａ、ＯＮ、カナダ）を使用して、培養培地における反応性酸素種（ＲＯＳ）を判定する（１８）。このアッセイにおいて、Ａｃｒｉｄａｎ  Ｌｕｍｉｇｅｎ（商標）ＰＳ−３は、過酸化水素の存在下で反応性酸素及び窒素種（ＲＮＳ）により励起され、４３０ｎｍの化学発光を引き起こす。培地試料を液体窒素で急速凍結し、アッセイを実施するまで保存される。単独のＣＭＲＬ培養培地を対照として使用し、結果は対照培地と比較した倍率変化の増加として表す。
【０１５４】
実施例９
アポトーシス分析
[00175]アポトーシスは、切断カスパーゼ−３分光光度アッセイ及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色を使用して、すべての群において測定する。すべての判定は１００ＩＥＱの正規化群及びそれらの対応する培養培地で行う。
【０１５５】
[00176]凍結した培地試料を使用し、分光光度アッセイ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、切断カスパーゼ−３の増加を判定する。再度、添加剤入りで細胞なしの単独のＣＭＲＬ培養培地を対照として使用し、結果は対照培地と比較した倍率変化の増加として表す。
【０１５６】
[00177]ＴＵＮＥＬ染色（ＤｅａｄＥｎｄ（商標）アポトーシス検出システム、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のために、膵島をホルマリンに固定し、処理し、パラフィンに包埋する。共染色を実施して、移植片（インスリン）、アポトーシス細胞及びフィールドに存在するすべての核を同定する。アポトーシスは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、陽性ＴＵＮＥＬ染色領域の百分率により定量する。
【０１５７】
実施例１０
移植
[00178]８〜１２週齢の免疫不全マウス（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から入手し、食餌及び水に自由にアクセスできる特定病原体除去条件下で飼育する。動物はカナダ動物管理協会のガイドラインに従って世話をし、アルバータ大学の動物福祉委員会から倫理的承認を得る。
【０１５８】
[00179]糖尿病を、１８０ｍｇ／ｋｇの用量でのストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＯＮ、カナダ）の腹腔内注射により化学的に誘発する。２回連続で血中グルコース測定が≧１８ｍｍｏｌ／Ｌを記録した後、動物は糖尿病であると判断される。
【０１５９】
[00180]１群当たり１０匹の動物が、前述の通り、左腎被膜下に約１，０００ＩＥＱのヒト膵島の移植を受けた（１９）。
【０１６０】
実施例１１
２４時間時点での移植腎摘出術
[00181]１群当たり３匹のマウスに腎摘出術を行い、移植の２４時間後に安楽死させて、移植片領域の炎症誘発性サイトカイン、切断カスパーゼ−３及びＴＵＮＥＬの急性判定を実施する。すべての場合において、膵島移植片を腎臓から切除し、秤量し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存する。その後、組織試料を、２００ｍｇの組織当たり１ｍｌの溶解緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭトリス−ＨＣＬ、０．１％ＳＤＳ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭデオキシコール酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）を使用して溶解させる。次いで、溶解物に、氷上での均質化（ＰｏｗｅｒＧｅｎ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＯＮ、カナダ）を３０秒間×２回繰り返し、氷上にて１０回の迅速なパルスで超音波処理をした（ＶｉｒＳｏｎｉｃ、ＶｉｒＴｉｓ、ＮＹ、ＵＳＡ）。細胞破片を４℃にて１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによりペレット化し、得られた上清を収集し、１ｍｌの溶解物当たり１０μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｃｏ．、Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、カナダ）（１：１００）を含有する微小遠心管に入れる。
【０１６１】
[00182]移植片試料を、前述の通り、炎症誘発性サイトカイン／ケモカイン、カスパーゼ−３及びＴＵＮＥＬ染色についてアッセイする（対応するマウスキットを使用）。すべての判定は組織１グラム当たりで調整する。
【０１６２】
実施例１２
長期移植片機能
[00183]携帯型グルコメーター（Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ  ２、ＬｉｆｅＳｃａｎ、カナダ）を使用して、非空腹時血中グルコースを１群当たり残りの７匹のマウスで６０日間にわたって週３回監視する。２回連続で読み取り値が１１．３ｍｍｏｌ／Ｌ未満であるとき、正常血糖と定義する。
【０１６３】
[00184]腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を移植の６０日後に実施して、一晩絶食させた後にグルコースボーラス（３ｇ／ｋｇ）に応答する膵島の能力を評価する。血中グルコースレベルをベースラインで監視する（注射後０、１５、３０、６０、９０及び１２０分の時点）。すべての結果を、ナイーブ対照マウスの血中グルコースプロファイルと比較する。
【０１６４】
[00185]回復腎摘出術を６５日目にすべての動物に実施して、移植片依存性の正常血糖であることを実証する。非空腹時血中グルコースレベルを、腎摘出術後１週間にわたって記録する。同様に、天然膵臓を末端終端で切除し、１０％ホルマリンに固定し、免疫組織化学で分析して、マウスインスリン染色がないことを確認し、よって天然膵臓β細胞機能の残留又は再生を除外する。
【０１６５】
[00186]次いで、保存された移植片を前述の通りに処理し、生存膵島の尺度として、残留インスリン含量を、ヒトインスリンＥＬＩＳＡを使用して判定する。
【０１６６】
実施例１３
統計分析
[00187]データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。曲線下面積をＧＳＩＳ及びＩＰＧＴＴについて計算し、群間差を一元配置ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙのポストホック検定で分析する。ｐ値＜０．０５は有意であると判断され、すべての分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施する。
【０１６７】
実施例１４
ＡＡＧＰ（商標）は培養における膵島の保存性を高める
[00188]３つの異なる調製物からの単離ヒト膵島を、ＡＡＧＰ（商標）あり又はなしで補充した培地で２４時間培養して、膵島質量保存及び機能変化を評価する。２４時間の培養後に膵島を計数し、膵島回復において有意差があるという結果になる。膜完全性アッセイによれば細胞の生存度に差はない（データは示されていない）が、ＡＡＧＰ（商標）補充群でより多くの生存膵島が観察される（７６．６２±７．４％対５０．６３±６．２％、ｐ＝０．０２９）（図４Ａ）。
【０１６８】
[00189]これら２つの群のインビトロ機能（ＧＳＩＳ）を比較する場合、灌流曲線に示されるように、第２の分泌期中にＡＡＧＰ（商標）補充膵島からのインスリン分泌において有意な増加が観察される（ｐ＜０．００１）（図４Ｂ）。得られた曲線下面積により、ＡＡＧＰ（商標）補充膵島からの全体的に増加したインスリン放出が確認された（ＡＵＣ、１４９．５±０．５対７５．５±０．５、ｐ＜０．００１）（図４Ｃ）。
【０１６９】
実施例１５
ＡＡＧＰ（商標）はタクロリムス関連損傷から膵島を効果的に保護する
[00190]カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）、特にタクロリムスの公知の糖尿病誘発効果に基づいて、毒性膵島アッセイを実施し、ＡＡＧＰ（商標）の細胞保護能力を評価する。再度、６つの異なる調製物からの単離ヒト膵島を、ＡＡＧＰ（商標）あり又はなしで補充した培地で２４時間培養し、続いて臨床関連用量の１０ｎｇ／ｍＬのタクロリムスに２４時間曝露させる。ＡＡＧＰ（商標）の細胞保護効果を検査するため、膵島を、培養培地のみ（Ｔａｃ−）、タクロリムスのみ（Ｔａｃ＋）又はタクロリムスを有するＡＡＧＰ（商標）（Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標））の存在下で培養する。定められた培養期間の後、すべての群をインビトロ生存、生存度、機能及び酸化ストレスについて特性決定する。
【０１７０】
[00191]ＡＡＧＰ（商標）を補充することは、公知のβ細胞毒性薬剤、タクロリムスが存在するにもかかわらず、培養後の膵島の生存増加につながった。Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）群は、タクロリムスに曝露していない膵島と同様の回復率を示した。しかし、生存は、Ｔａｃ＋群と比較した場合有意に増加している（６７．６５％対３１．５５％、ｐ＜０．００１）（図５Ａ）。膜完全性染色によると細胞の生存度に差はない（データは示されていない）が、ＧＳＩＳ灌流はＴａｃ＋とＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）との間でインスリン分泌において著しい差があるという結果になった。ＡＡＧＰ（商標）補充群は、タクロリムスに曝露していない対照膵島と同様の、グルコースに対する二相インスリン応答を示した。逆に、Ｔａｃ＋群は高度に障害された応答という結果になった（ＡＵＣ：Ｔａｃ−対Ｔａｃ＋、１５８．８対８．２２、ｐ＜０．００１；Ｔａｃ−対Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）、１５８．８対１２９．３、ｐ＝０．２３１．；Ｔａｃ＋対Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）、８．２２対１２９．３、ｐ＝０．００３）（図５Ｂ、５Ｃ）。
【０１７１】
[00192]培養され、タクロリムスに曝露される間にヒト膵島に生じる酸化ストレスへのＡＡＧＰ（商標）の影響可能性を、細胞外ＲＯＳの倍数増加により測定する。タクロリムス曝露の２４時間後、培地試料を各群から採取し、Ａｃｒｉｄａｎ  Ｌｕｍｉｎｏｇｅｎ  ＰＳ−３アッセイで分析する。予期した通り、酸化ストレスはすべての試料に生じたが、タクロリムスに曝露させることによりＲＯＳが大幅に増加するという結果になった（図６Ａ）。しかし、この現象はＡＡＧＰ（商標）の存在下では寛解する（ｐ＝０．０１２）。
【０１７２】
[00193]６つの異なる調製物からの単離ヒト膵島を、ＡＡＧＰ（商標）あり又はなしで補充した培地で２４時間培養し、さらに２４時間タクロリムスを補充した。合計４８時間の培養期間の後、すべての群をインビトロ生存、生存度、機能及び酸化ストレスについて特性決定した。
【０１７３】
[00194]予期した通り、酸化ストレスはすべての試料に生じたが、タクロリムスに曝露させることによりＲＯＳが大幅に増加するという結果になった（図６Ａ）。しかし、この現象はＡＡＧＰ（商標）の存在下では寛解した（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。
【０１７４】
[00195]同様の実験条件を再現し（ＡＡＧＰ（商標）あり及びなしで培養し、タクロリムスに曝露させたヒト膵島）、３日目に約１００ＩＥＱのアリコートを、ｓ−ＧＳＩＳアッセイを受けるそれぞれの対応する群及び同時細胞内インスリン含量について収集した。次いで、膵島を広範に洗浄してタクロリムスを除去し、さらに４日間培養したままにし、７日目に試料採取及び比較試験を繰り返した。
【０１７５】
[00196]初期評価と同様に、Ｔａｃ＋群は著しく障害されたインスリン分泌を３日目に示したが、これはＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）系列では観察されなかった（刺激指数１．４対９．７、ｐ＜０．０１、図６Ｂ）。しかし、インスリン分泌のこの減少は一過性のもので、タクロリムスがもはや存在しない７日目までに群間差は消失しており、培養期間の終了時の予期された全体的に低下した膵島活性について調整がされている。インスリン分泌プロファイルに差があるにもかかわらず、細胞内インスリン含量はすべての群にわたって安定的及び同程度であったが、これはβ細胞におけるインスリンの生合成に変化がないことを示している（図６Ｃ及び６Ｄ）。
【０１７６】
実施例１６
ＡＡＧＰ（商標）はタクロリムスの免疫抑制能力を阻害しない
[00197]ＡＡＧＰ（商標）がタクロリムスのＴ細胞増殖抑制を阻害しないことを確認するため、マウス脾細胞を使用する混合リンパ球反応を実施した。アッセイはＣＦＳＥ染色のレベルによりＴ細胞増殖応答を測定する。予期した通り、Ｔ細胞増殖は、ＩｇＧ対照と比較してタクロリムスの存在下で有意に減少した（ｎ＝４、ｐ＜０．００１）。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋陽性Ｔ細胞の増殖も、単独の又はＡＡＧＰ（商標）と組み合わせたタクロリムスの存在下で有意に減少した（いずれの場合もｎ＝４、ｐ＜０．００１）。しかし、単独のＡＡＧＰ（商標）に曝露した場合、Ｔ細胞の増殖に有意な減少はなかった（図７）。
【０１７７】
実施例１７
膵島の細胞内カルシウム含量及びエキソサイトーシスに対するタクロリムスの効果。
[00198]様々な電気生理学研究をヒト膵島について実施して、ＣＮＩ関連損傷及びその回避を特性決定することにより、ＡＡＧＰ（商標）についての潜在的な作用機序を明らかにした。群間でカルシウム流入における有意差は見出されず（図８Ａ、８Ｃ）、可能性のある作用機序はインスリン経路のさらに下流にあることが示された。
【０１７８】
[00199]高グルコース刺激時のエキソサイトーシスの間接的な指標として、補足的な静電容量研究をこれらの同じ条件で実施した。結果は、他の群と比較してＴａｃ＋群の累積静電容量が減少していること、及びＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）群と比較した場合に曲線下面積が有意に低いことを示す（ＡＵＣ：３９．０８対６８．０１、ｐ＜０．０１）（図８Ｂ、８Ｄ）。
【０１７９】
実施例１８
ＡＡＧＰ（商標）は、移植直後の炎症応答を寛解する
[00200]さらにインビボ試験を実施して、発明者のインビトロ知見を補足する。同じ研究群（Ｔａｃ−、Ｔａｃ＋及びＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標））を用いて、最小質量（約１，０００ＩＥＱ）膵島移植を、化学的に誘発した糖尿病の免疫不全マウスに実施する（１群当たりｎ＝１０）。局所的移植後炎症応答に対するＡＡＧＰ（商標）の効果の可能性を測定するために、各群３匹の動物からの回収移植片（移植後２４時間）を均質化し、炎症誘発性サイトカイン及びケモカインについて特性決定する。
【０１８０】
[00201]ＩＬ−１βの急性レベルは、ナイーブマウスのものに対して、すべての群で増加している。Ｔａｃ＋群のレベルは有意により高いが、ＡＡＧＰ（商標）の添加によりこのサイトカイン排出はかなり減衰した（１７．８１対４．９４ｐｇ／ｍＬ／ｇ−組織、ｐ＜０．００１）（図９Ａ）。ＩＬ−６レベルを測定する場合に同様の効果が観察され、ＡＡＧＰ（商標）が存在する場合に有意に減少するという結果になる（１４７．８対５４．４ｐｇ／ｍＬ／ｇ−組織、ｐ＜０．００１）（図９Ｂ）。しかし、タクロリムスに曝露した群の間ではＴＮＦ−αレベルに識別できる差はなかった（１．６３対１．３４ｐｇ／ｍＬ／ｇ−組織）（図９Ｃ）。
【０１８１】
[00202]移植後に急性測定されるケモカインの中でも、好中球動員に関与しているＫＣ分泌は、主な分泌変化に関連する。ＩＬ−１β及びＩＬ−６と同様に、ＫＣはＴａｃ＋群で有意に過剰発現し、再度、ＡＡＧＰ（商標）の存在下で有意に低減する（９．７９対３．５８ｐｇ／ｍＬ／ｇ−組織、ｐ＜０．００１）（図９Ｄ）。インビトロのサイトカイン及びケモカインの発現を比較する場合、群間で有意差は観察されなかった（データは示されていない）。
【０１８２】
実施例１９
ＡＡＧＰ（商標）は移植後膵島アポトーシスを低減させる
[00203]急性除去した移植片（移植後２４時間）も、移植片内のアポトーシスについて分析する。切断カスパーゼ−３のレベルにおける倍率変化の増加を、ナイーブマウスの腎臓における基底レベルに対して判定する。Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）に対してＴａｃ＋群におけるカスパーゼ−３のレベルに有意な増加があり、本質的に、タクロリムスに曝露していない膵島のものと非常に類似したレベルを示した（３．１４対１．４６、ｐ＜０．００１）（図１０Ｂ）。残りの移植片切片を、ＴＵＮＥＬアッセイを使用してアポトーシスについてさらに分析し、Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）及び対照と比較した場合にＴａｃ＋群においてＴＵＮＥＬ陽性細胞の百分率が支配的であるという一貫した結果が示される（５３．３％対２４．０％対１４．９％、ｐ＜０．０２３）（図１０Ａ、１０Ｃ）。
【０１８３】
実施例２０
タクロリムス曝露にもかかわらず改善されたインビボＡＡＧＰ（商標）補充膵島機能
[00204]残りの移植マウス（１群当たりｎ＝７）を移植後６０日まで追跡調査して、移植の有効性を判定し、長期移植片機能を評価する。血中グルコースを定期的に監視して、正常血糖の割合を判定する。この辺縁膵島塊モデルで予期される通り、生着遅延が観察される。血中グルコースは、すべてのマウスが６０日目の終了までずっと高血糖のままであったＴａｃ＋群とは対照的に、Ｔａｃ−及びＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）群において経時的に改善した（図１１Ａ）。
【０１８４】
[00205]移植後６０日の研究群にＩＰＧＴＴを行って、膵島移植機能を評価した。Ｔａｃ−及びＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）群は両方とも適切に応答したが、Ｔａｃ＋は１２０分まで高度な糖尿病のままであった（ＡＵＣ：Ｔａｃ−対Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）、９２．６３対９１．２０、ｐ＝０．０９５；Ｔａｃ−対ナイーブ、９２．６３対７１．４３、ｐ＝０．４３４；Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）対ナイーブ、９１．２０対７１．４３、ｐ＝０．４２３、及びＴａｃ＋対Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）、１４９．８対９１．２、ｐ＝０．０２１）（図１１Ｂ）。
【０１８５】
[00206]移植された膵島が、観察された正常血糖の唯一の原因であることを実証するため、移植片回収腎摘出術を６０日目に実施する。すべてのマウスが以前の糖尿病状態に戻り、このことはそれらのマウスの天然膵臓の弱いインスリン染色によっても確認された（データは示されていない）。
【０１８６】
[00207]移植片回収時に、移植の６０日後の残留膵島質量の指標としてインスリン含量を判定する。図１１Ｃは、タクロリムスに曝露した移植片で大幅なインスリン含量低減がある、群間での著しい差を示す。再度、ＡＡＧＰ（商標）の存在は、タクロリムスへの曝露にもかかわらず膵島保護に有益である（Ｔａｃ＋対Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）、３０．８６対１００．８ｎｇ／ｍＬ、ｐ＜０．０１）。
【０１８７】
[00208]これらの知見をさらに裏付けるため、移植実験を、臨床診療に類似するようにタクロリムスで連続処置しながら同系糖尿病マウス移植モデルにおいて実施した。インビトロ設定と同様に、タクロリムス（この場合マウスのタクロリムス代謝の差を説明するためにより高濃度である）に曝露した移植された膵島は、効果的にインスリン分泌すること及び動物を正常血糖状態に戻すことができなかった。しかし、ＡＡＧＰ（商標）が存在することにより膵島は正常に機能することでき、正常血糖が達成される期間は対照群と同様であった（図１１Ｄ、１１Ｅ、ｐ＜０．００１）。
【０１８８】
[00209]これらの知見は、他の群と比較した場合にＴａｃ＋群では明らかに効果がない調節となっているタクロリムス処置下の初期腹腔内グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）を比較する場合にも観察された（図１１Ｆ、ＡＵＣ：１０１対５４．６９及び５９．２６、ｐ＜０．０１）
【０１８９】
[00210]タクロリムス処置を中止すると、膵島はその正常機能を取り戻し、動物はその研究上の対照物と同様に正常血糖になった。終了点（３０日間）での反復ＩＰＧＴＴにおいて、差はなくなり、すべての動物は高グルコースボーラスでチャレンジされた場合に同様の挙動を示した（図１１Ｇ）。
【０１９０】
考察
[00211]本明細書では、強力なＡＦＰであるＡＡＧＰ（商標）を膵島培養培地に添加することにより、ヒト膵島生存及びインビトロ機能がかなり保護されることが実証される。さらに、ＡＡＧＰ（商標）は、生着、並びに急性炎症、アポトーシス及び長期移植片機能のマーカーを含むインビボでの利点とともに、タクロリムス関連損傷からヒト膵島を保護した。
【０１９１】
[00212]膵島培養により臨床移植にかなりの融通性をもたらされるとしても、ドナー及び単離プロセス由来の複数の要因により、１４〜２０％の膵島損失は日常的に観察される（Ｋｉｎ  Ｔら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００８；２１（１１）：１０２９〜１０３５）。培養培地にＡＡＧＰ（商標）が補充される場合、膵島回復及び機能の有意な改善は様々なヒト膵島調製物で一貫して観察される。
【０１９２】
[00213]ＡＦＰが低体温下で細胞を保護する機序は、理解しにくいままである。様々な著者らは、低温で起こる制御不能なイオン移動を防ぐこれらの分子の膜安定化の役割により細胞破壊のリスクが低減されることを報告している（２２）。不規則な膜透過が常温条件でも低酸素症及び虚血−再灌流の結果として起こり得ることを考えると、この機序を本発明者らの実験計画に適用できる可能性は十分にある（Ｋａｒｌｅ  Ｃら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｌｕｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２００４；２８６（６）：Ｌ１１５４〜１１６０；Ｗｅｉｒ  ＥＫら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００６；７１（４）：６３０〜６４１；Ｂｅｌｌｉａｒｄ  Ａら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２０１３；３０４（１）：Ｈ９４〜１０３）。
【０１９３】
[00214]タクロリムスは、膵島移植の分野で広く使用されている免疫抑制剤であり、急性、慢性拒絶反応及び再発性自己免疫のリスクを低減させるために日常的に用いられている重要な要素である（Ｓｈａｐｉｒｏ  ＡＭら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０００；３４３（４）：２３０〜２３８）。しかし、この及び他のＣＮＩの長期使用は、副作用、主に腎毒性及び移植後糖尿病と関連付けられてきた（Ｃｈａｎｄ  ＤＨら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００１；５（１）：３２〜３６）。実際に、タクロリムス及びシクロスポリンの両方に関連する損傷が膵島において報告されており、カルシニューリン／活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）シグナル伝達阻害（Ｏｅｔｊｅｎ  Ｅ、ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００３；６３（６）：１２８９〜１２９５）、インスリン遺伝子抑制（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｆｉｓａｃ  Ｉら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００７；７（１１）：２４５５〜２４６２）、ミトコンドリアの停止（Ｒｏｓｔａｍｂｅｉｇｉ  Ｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０１１；９１（６）：６１５〜６２３）及び移植後血管新生の減少（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｒら、ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１３；８（４）：ｅ５６７９９）を含むいくつかの機序により特徴付けられている。
【０１９４】
[00215]本明細書に示される通り、臨床関連用量のタクロリムスのインビトロ存在は、培養における生存を減少させ且つインスリン分泌を抑制することによりヒト膵島に著しく有害であったが、ＡＡＧＰ（商標）の添加によってヒト膵島はこの毒性から明らかに保護されていた。
【０１９５】
[00216]膵島は、培養及び門脈内移植を通じた提供から生じる低酸素症に対して高感受性である。この現象は主に膵島の高い酸素要求量及びサイズに起因し、培養中の播種密度に応じて有害なｐＯ２勾配が生成される原因となっている（Ｐａｐａｓ  ＫＫら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ２００５；３７（８）：３４１２〜３４１４）。膵島は抗酸化能の減少のために酸化ストレスを受けやすい（Ｓｋｌａｖｏｓ  ＭＭら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２０１０；５９（７）：１７３１〜１７３８）。これらの要素は、培養中及び移植後の膵島損失の一因となっている。知見は、培養培地における細胞外ＲＯＳの増加により実証される通り、Ｔａｃ＋群における酸化ストレスの増加を示す。
【０１９６】
[00217]インビボ実験は、すべてのインビトロ知見を補足するため、及びＡＡＧＰ（商標）の補充を早期炎症、細胞死、生着及び長期有効性と相関させるために実施する。急性安楽死させたマウスの移植片特性決定は、研究化合物の抗炎症能の明確な証拠を示した。ＡＡＧＰ（商標）補充膵島は、培養におけるタクロリムスへの曝露にもかかわらず、ケラチノサイトのケモカインの分泌減少とともにＩＬ−１β及びＩＬ−６の発現の有意な低下を示した。これらのサイトカイン及びケモカインは、ＴＮＦ−αとともに、移植後炎症応答及びその後の適応免疫活性化における重要な関与物質である（Ｋａｎａｋ  ＭＡ  ＴＭら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２０１４）。
【０１９７】
[00218]タクロリムスは、膵島における細胞死の増加とも関連付けられてきた（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＪＤら、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２００９；１８（８）：８３３〜８４５）。本実験では、アポトーシスの指標として移植片における切断カスパーゼ−３の倍率変化を測定し、続いて同じ移植片のＴＵＮＥＬ染色を行った。結果は、タクロリムスに曝露していないナイーブヒト膵島と同様のレベルでのＡＡＧＰ（商標）補充群におけるアポトーシス減少を一貫して示した。
【０１９８】
[00219]研究の終了時に再度実施されたグルコース負荷試験は、Ｔａｃ−及びＴａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）群について同様のグルコース正常化率を示したが、これはナイーブマウスと有意差がないものである。これらの結果は、最終インスリン含量として表される残留移植片質量と相関していた。他方、ＡＡＧＰ（商標）を伴わないタクロリムス曝露の有害な影響は、生着期中の膵島を障害するには十分であるように思われ、グルコースボーラスでのチャレンジ後に血中グルコースは低減せず、グルコース正常化ができなかった。
【０１９９】
[00220]本発明者らの実験をさらに臨床的に関連性があるものにするため、新たなインビボ同系マウス移植モデルを、皮下浸透圧ポンプによる連続処置としてのタクロリムスとともに実施した。移植された膵島の機能障害がＣＮＩの投与開始直後に発生し、全処置期間（７日間）中続くことが観測された。免疫抑制を止めると、移植片機能は徐々に正常化し、終了点までにすべての群が同程度になった。
【０２００】
[00221]しかし、ＡＡＧＰ（商標）で処理した膵島は、高用量のＣＮＩの存在には影響されていないように思われ、対照群と同様に完全に機能した。
【０２０１】
[00222]これらの知見により、薬物を除去した場合に逆転することがあるタクロリムスの一時的で有害な影響を示す先のインビトロ実験が裏付けられる。明らかに、タクロリムスの中止は、現在の臨床設定において可能でないことがある。ＡＡＧＰ（商標）分子を患者に投与する前にさらなる調節毒性研究が必要であるが、おそらく、解決策は、これらの個体を同時にＡＡＧＰ（商標）で処置して細胞保護効果を延長することなのかもしれない。
【０２０２】
[00223]膵島に対するＡＡＧＰ（商標）の有益な効果の圧倒的な証拠が集まっているにもかかわらず、この薬物についての明確な作用機序又はタクロリムス毒性を回避する機械的なプロセスは知られていない。これらの実験中、タクロリムス抗増殖効果にＡＡＧＰ（商標）の干渉がないＭＬＲアッセイを実施することにより、ＡＡＧＰ（商標）の存在時にタクロリムスの直接的薬理学的阻害はないことが実証された。
【０２０３】
[00224]さらに、タクロリムスもＡＡＧＰ（商標）も、β細胞におけるインスリン合成−分泌機序の重要な要素である膵島のカルシウム濃度に影響を与えないことも見出された。この情報は、分泌経路のさらに下流にある潜在的なタクロリムス機械的部位を指摘する最近公表された証拠（Ｕｃｈｉｚｏｎｏ  Ｙら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ２００４；１４５：２２６４〜２２７２）の裏付けとなる。実際に、膵島に対する静電容量測定は、Ｔａｃ＋群とＴＡＣ＋ＡＡＧＰ（商標）群との間で有意差を示した。これらの知見は、Ｔａｃ＋ＡＡＧＰ（商標）では観察されないエキソサイトーシス障害の指標として解釈することができる。
【０２０４】
[00225]結論として、培養中にヒト膵島にＡＡＧＰ（商標）を補充することにより、最終調製物の品質及び収量が改善し、膵島毒性薬剤タクロリムスの存在下でも、改善された生着に変換された。このアプローチは、単一ドナー膵島移植に向けた潜在的戦略として、潜在的に臨床移植に改善をもたらす可能性がある。上記アプローチはまた、細胞、組織及び臓器保存における研究の他の有望な道筋を切り開く可能性もある。
【０２０５】
[00226]好ましい実施態様を上に記載し、添付の図面に図示してきたが、本開示から逸脱することなく修正がなされ得ることは当業者には明らかであろう。このような修正は、本開示の範囲内に含まれる可能な変形と考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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