(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
再生不良性貧血の治療において使用するための、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸配列を含む核酸ベクターを含む、薬学的組成物。
【請求項２】
ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３の配列を含む核酸配列によってコードされる、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
ＴＥＲＴは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
ＴＥＲＴをコードする前記核酸配列は、前記コード配列の発現を促進する調節配列に作動可能に連結される、請求項１〜３の
いずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ベクターは、非組み込みベクターである、請求項１〜４のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）系非組み込みベクターである、請求項１〜５のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ベクターは、血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）由来のアデノ随伴ウイルス系ベクターである、請求項１〜６のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記アデノ随伴ウイルス系ベクターのカプシドは、前記血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）のカプシドタンパク質からできており、前記カプシド内に含まれる前記核酸配列は、血清型２アデノ随伴ウイルスに対応する内部末端反復配列と両端で隣接する、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記カプシド内に含まれる前記核酸は、ＴＥＲＴをコードする前記アミノ酸配列をコードする断片を含む、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ベクターは、恒常的プロモータである調節配列を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記調節配列は、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモータである、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学、バイオテクノロジー、および医学の分野に含まれる。より具体的には、本発明は、短テロメア長と関連した病態の治療に有用な組成物および方法に関する。より具体的には、再生不良性貧血と関連した病態の治療に有用な組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テロメアは、ＤＮＡ修復および分解活性から染色体末端を保護する役割を担う、染色体末端の特殊構造である（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，２００１．Ｃｅｌｌ  １０６，６６１−６７３、ｄｅ  Ｌａｎｇｅ，２００５．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９，２１００−２１１０）。哺乳類のテロメアは、シェルタリンとして知られる多タンパク質複合体によって結合されるＴＴＡＧＧＧ反復配列からなる（ｄｅ  Ｌａｎｇｅ，２００５．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９，２１００−２１１０）。ＴＴＡＧＧＧ反復配列の最小長、およびシェルタリン複合体の完全性が、テロメア保護のために必要である（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，２００１．Ｃｅｌｌ  １０６，６６１−６７３、ｄｅ  Ｌａｎｇｅ，２００５．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９，２１００−２１１０）。テロメラーゼは、鋳型（Ｔｅｒｃ、テロメラーゼＲＮＡ構成要素）として関連ＲＮＡ構成要素を使用することにより、染色体端部へのＴＴＡＧＧＧ反復配列のデノボ追加によってテロメア消耗を補い得る細胞逆転写酵素（ＴＥＲＴ、テロメラーゼ逆転写酵素；ＴＰ２、ＴＲＴ、ＥＳＴ２、ＴＣＳｌ、ｈＥＳＴ２としても知られる）である（Ｇｒｅｉｄｅｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，１９８５．Ｃｅｌｌ  ４３，４０５−４１３）。テロメラーゼは、ほとんどの成体幹細胞コンパートメント中に発現するが、これは、テロメアの短縮化がほとんどのヒトおよびマウス組織において、年齢とともに起こるという事実からも明らかなように、テロメア長を維持するのに十分ではない（Ｈａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｎａｔｕｒｅ  ３４５，４５８−４６０、Ｂｌａｓｃｏ，２００７．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．３，６４０−６４９、Ｆｌｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２００８．Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ  ２２，６５４−６６７）。
【０００３】
ＴＥＲＣ遺伝子（テロメラーゼＲＮＡ構成要素）のホモ接合体欠失を持つマウスは、あらゆる検出可能なテロメラーゼ活性を有さず、ヒト細胞において報告された割合と類似した割合で、１つの世代から他の世代へ進行性テロメアの短縮化を示した（Ｂｌａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。後世代のＴＥＲＣ−／−マウスに特有の重度の表現型（例えば、骨髄無形成および早期老化の徴候）は、ＴＥＲＣ遺伝子のコピーを再導入することにより救済することができた（Ｓａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＴＥＲＴ（触媒のテロメラーゼサブユニット）が欠損した条件付マウスモデルにおいて後世代で生じた多組織変性は、老化マウスにおいてさえ、テロメラーゼ再活性で逆戻りさせることができた（Ｊａｓｋｅｌｉｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０００４】
野生型マウスにおいて、広範囲の上皮組織で発現したテロメラーゼ遺伝子の付加的なコピーの導入は、皮膚の創傷治癒能力の上昇をもたらした（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓｕａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。この対立遺伝子が抗腫瘍遺伝的背景（Ｓｐ５３／Ｓｐ１６／ＳＡｒｆ）に導入されたとき、テロメラーゼ導入遺伝子を発現しないマウスと比較して、平均寿命が４０％増加しこれと呼応して加齢の顕著な遅延が観察された（Ｔｏｍａｓ−Ｌｏｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０００５】
ウイルス（ＡＡＶ）に基づいたテロメラーゼ遺伝子治療は、野生型マウスにおける正常な生理学的加齢において、健康寿命を伸ばすのに有益であることが見出された。この利益を調査する研究において、成体および老化マウスが、マウステロメラーゼ（ｍＴＥＲＴ）の触媒サブユニットを広く発現するためのＡＡＶ９−ｍＴＥＲＴ遺伝子治療に供された。いくつかの生理学的パラメータ（グルコースおよびインスリン耐性、骨粗鬆症、神経筋共調性、ロータロッド等）によって示されるように、ＴＥＲＴで治療したマウスの健康寿命は、大幅に増加し、加齢は減速された。さらに、これらの平均寿命は、対照群と比較して、成体および加齢マウスにおいて、それぞれ２４％および１３％増加した。成体マウスにおけるＡＡＶ９−ＴＥＲＴの単回の静脈内投与は、末梢血球におけるテロメア長の増加をもたらした（Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ  ｄｅ  Ｊｅｓｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０００６】
短縮化されたテロメアは、先天性角化異常症、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、およびファンコニー貧血等の多数の疾患と関連している。これらの疾患の重症度、およびこれらを患う患者の予後不良を考えると、短テロメア長と関連した疾患を治療するための新規の治療の必要性が存在する。
【０００７】
再生不良性貧血は、未熟造血幹細胞（ＨＳＣ）および前駆細胞の著しい減少に起因して、骨髄が十分な新しい血球を生成することができない、潜在的に生命を脅かす、まれ、かつ異質の血液の障害である（Ｓｃｏｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。したがって、主な疾患の兆候は、一生のどの時期でも出現し得るが、若者（１０〜２５歳の年齢）および高齢者（６０歳超）においてより頻出する、汎血球減少症および骨髄低形成である（Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。再生不良性貧血は、後天的、または先天的であり得る。後天的に得られるタイプは、主に自己免疫媒介であるが、放射、毒素、およびウイルス暴露等の環境要因によっても引き起こされ得る（Ｎａｋａｏ，１９９７）。先天的な形態はより珍しいが、ＤＮＡ修復、リボソーム生合成、およびテロメア維持経路における機能を持つ３０個超の遺伝子の突然変異、が、これまで特定されている（Ｄｏｋａｌ＆Ｖｕｌｌｉａｍｙ，２０１０）。再生不良性貧血の頻繁に認められる臨床的特徴は、テロメア維持機構における突然変異の非存在下でさえ認められる、末梢血白血球中の短テロメア長である。
【０００８】
脊椎動物染色体の末端であるテロメアは、シェルタリンと称される６つのタンパク質の複合体（ＴＲＦ１、ＴＲＦ２、ＴＩＮ２、ＲＡＰ１、ＴＰ１、およびＰＯＴ１）によって結合されたヘキサヌクレオチド（ＴＴＡＧＧＧ）タンデム反復配列で構成された、高度に特殊化した核タンパク質構造である（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，２００１、ｄｅ  Ｌａｎｇｅ，２００５）。これらの構造は、テロメア融合およびテロメア脆弱性を防ぐことによる染色体の完全性に必要不可欠である。テロメア長は、テロメア上にテロメア配列をデノボ追加することができるリボ核タンパク質酵素テロメラーゼによって制御される。テロメア配列は、すべての細胞分裂の際、自然に失われ（末端複製問題として知られる）、体細胞は、テロメラーゼを非常に低いレベルで発現するか、または全く発現しないため、テロメアは、一生を通じて短くなる。テロメアが決定的に短くなったとき、これらは、保護機能をなくし、テロメアでの持続性ＤＮＡ損傷反応が引き起こされ、これは、延いては細胞老化反応につながる（Ｈａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、Ｆｌｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＨＳＣは、大部分の体細胞とは対照的に、低レベルのテロメラーゼ活性を示す。しかしながら、この活性は、テロメア消耗を止めるのには不十分であり、結果として、ＨＳＣ細胞の再生能力が、老化プロセスの間、制限され得る（Ｈｉｙａｍａ＆Ｈｉｙａｍａ，２００７）。これと同様に、骨髄移植の受容者は、自身の提供者よりも短いテロメア長を有し、生着段階の間に、テロメラーゼが、増加した複製増殖要求に対処できないことを示唆する（Ｗｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。さらに、テロメアは、健康な個人において見られる正常な加齢関連の消耗と比較して、再生不良性貧血を有する患者において、可能性として通常よりも多い回数の細胞分裂に起因して、はるかに早く短くなることが示されている（Ｂａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０００９】
テロメア構成要素またはテロメラーゼ自体の欠損に起因する加速したテロメアの短縮化は、幹細胞コンパートメントにおける組織再生能力に特に影響を与える細胞の増殖力を時期尚早に制限する（Ｈａｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｆｌｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。したがって、造血系等の高増殖指数を有する組織は、通常より低いテロメラーゼレベルによって特に影響を受け、これは再生不良性貧血等の重度障害に最終的につながり得る（Ｖｕｌｌｉａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。例えば、テロメロパシー（ｔｅｌｏｍｅｒｏｐａｔｈｙ）先天性角化異常症は、テロメア維持において重要な機能を有する７つの遺伝子（ＴＥＲＴ、ＴＥＲＣ、ＤＫＣ１、ＴＩＮ２、ＮＯＰ１０、ＮＨＰ２、およびＴＣＡＢ１）中の突然変異と関連付けられ、非常に短いテロメアを特徴とする。先天性角化異常症は、爪ジストロフィー、口腔白板、異常皮膚色素沈着、および小脳低形成等の多様な臨床的特徴を含む多系症候群である（Ｄｏｋａｌ，２０１１）。しかしながら、最も重度の合併症は、過剰なテロメアの短縮化によって臨床的特徴が引き起こされる８０％の事例で、再生不良性貧血の発症であり、最終的には幹細胞予備の枯渇をもたらす（Ｄｏｋａｌ＆Ｖｕｌｌｉａｍｙ，２０１０）。
【００１０】
増殖力とテロメア長との間の因果関係は、決定的に短い長さを超えたテロメア喪失の防止を目的としたテロメラーゼによる治療介入が、短テロメアの存在に起因した限られた血液形成能力と関連する、再生不良性貧血のこれらの形態を治療するための実行可能な戦略で有り得ることを示唆する。この点について、我々は、以前にアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）（ＡＡＶ９）ベクターを使用したテロメラーゼ（Ｔｅｒｔ）遺伝子治療を開発した。興味深いことに、成体野生型(wilt-type)マウスにおけるＡＡＶ９Ｔｅｒｔを使用したテロメラーゼ遺伝子治療は、末梢血単球における加齢関連のテロメア侵食を減じるか、または戻し（Ｂｅｒｎａｒｄｅｓ  ｄｅ  Ｊｅｓｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、短テロメアに関連する血液疾患の治療に有効であり得ることを示唆する。
【００１１】
この仮説を試験するために、我々は、患者において認められた骨髄表現型を再現する、我々の最近生成した再生不良性貧血のマウスモデルを使用した（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。このマウスモデルにおいて、シェルタリン遺伝子Ｔｒｆ１の骨髄特異的枯渇は、重度のテロメアアンキャッピングを引き起こし、ＤＮＡ損傷反応を誘発し、次いでこれは、これらのＨＳＣの早い排出およびＴｒｆ１の前駆細胞欠乏をもたらす。しかしながら、このモデルにおいて、我々は、ＨＳＣおよび前駆細胞の１００％を標的としない頻度で、Ｔｒｆ１欠損を誘発する。したがって、完全なままのＴｒｆ１を保持する細胞は、付加的な周期の代償性増殖に付され早いテロメア消耗をもたらす。したがって、Ｔｒｆ１欠損による幹細胞および前駆細胞コンパートメントの部分的枯渇は、骨髄移植後または自己免疫媒介再生不良性貧血において認められる代償性過剰増殖、ならびにテロメア維持遺伝子における突然変異に起因する、患者における非常に短いテロメアの存在を再現する。興味深いことに、我々のマウスモデルにおいて、骨髄無形成および汎血球減少症の発症の制御を可能にする、Ｔｒｆ１欠損媒介ＨＳＣ枯渇の頻度を通して、テロメア短縮化の速度を調節することができる（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００１２】
本研究で、我々は、最先端の遺伝子治療ベクターを使用したテロメラーゼ活性が、テロメア消耗およびＨＳＣ枯渇を減じ、ひいては骨髄不全を防ぐための有効な治療になり得るかどうかを調査するために、再生不良性貧血のこのマウスモデルを採用する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、短テロメア長と関連した病態の治療および予防に有用な組成物および方法を提供する。
【００１４】
本発明の一態様は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のコード配列を含む核酸ベクターを患者に投与することを含む、短テロメア長と関連した病態を有する患者の治療の方法を提供する。一実施形態において、ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸配列によってコードされる。一実施形態において、ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３の配列を含む核酸配列によってコードされる。一実施形態において、ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３の配列からなる核酸配列によってコードされる。一実施形態において、ＴＥＲＴは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＴＥＲＴは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、ＴＥＲＴは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなる。一実施形態において、ＴＥＲＴをコードする核酸配列は、コード配列の発現を促進する調節配列に作動可能に連結される。一実施形態において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス系非組み込みベクター等の非組み込みベクターである。一実施形態において、ベクターは、血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）由来のアデノ随伴ウイルス系ベクターである。一実施形態において、アデノ随伴ウイルス系ベクターのカプシドは、血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）のカプシドタンパク質からできており、カプシド内に含まれる核酸配列は、血清型２アデノ随伴ウイルスに対応する内部末端反復配列と両端で隣接する。一実施形態において、カプシド内に含まれる核酸は、ＴＥＲＴをコードするアミノ酸配列をコードする断片を含む。一実施形態において、ベクターは、恒常的プロモータである調節配列を含む。一実施形態において、調節配列は、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモータである。一実施形態において、短テロメア長と関連した病態は、テロメア維持に関与する遺伝子（単数または複数）における突然変異を特徴とする。一実施形態において、短テロメア長と関連した病態は、先天性角化異常症、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、ファンコニー貧血からなる群から選択される。
【００１５】
なおさらなる実施形態において、本発明は、以下の組の主題を対象とする。
１．テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のコード配列を含む核酸ベクターを患者に投与することを含む、短テロメア長と関連した病態を有する患者の治療方法。
２．ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸配列によってコードされる、１に記載の方法。
３．ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３の配列を含む核酸配列によってコードされる、１または２に記載方法。
４．ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３の配列からなる核酸配列によってコードされる、１〜３のいずれかに記載の方法。
５．ＴＥＲＴは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、１〜４のいずれかに記載の方法。
６．ＴＥＲＴは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む、１〜５のいずれかに記載の方法。
７．ＴＥＲＴは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなる、１〜６のいずれかに記載の方法。
８．ＴＥＲＴをコードする核酸配列は、コード配列の発現を促進する調節配列に作動可能に連結される、１〜７のいずれかに記載の方法。
９．ベクターは、非組み込みベクターである、１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．ベクターは、アデノ随伴ウイルス系非組み込みベクターである、１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．ベクターは、血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）由来のアデノ随伴ウイルス系ベクターである、１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．アデノ随伴ウイルス系ベクターのカプシドは、血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）のカプシドタンパク質からできており、カプシド内に含まれる核酸配列は、血清型２アデノ随伴ウイルスに対応する内部末端反復配列と両端で隣接する、１１に記載の方法。
１３．カプシド内に含まれる核酸は、ＴＥＲＴをコードするアミノ酸配列をコードする断片を含む、１２に記載の方法。
１４．ベクターは、恒常的プロモータである調節配列を含む、１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである、１４に記載の方法。
１６．短テロメア長と関連した病態は、テロメア維持に関与する遺伝子（単数または複数）中の突然変異体を特徴とする、１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．短テロメア長と関連した病態は、先天性角化異常症、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、ファンコニー貧血、および肺線維症からなる群から選択される、１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．短テロメア長と関連した病態の治療において使用するための、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のコード配列を含む、核酸ベクター。
１９．ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む核酸配列によってコードされる、１８に記載の核酸ベクター。
２０．ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３の配列を含む核酸配列によってコードされる、１８または１９に記載の核酸ベクター。
２１．ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３の配列からなる核酸配列によってコードされる、１８〜２０のいずれかに記載の核酸ベクター。
２２．ＴＥＲＴは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、１８〜２１のいずれかに記載の核酸ベクター。
２３．ＴＥＲＴは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列を含む、１８〜２２のいずれかに記載の核酸ベクター。
２４．ＴＥＲＴは、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列からなる、１８〜２３のいずれかに記載の核酸ベクター。
２５．ＴＥＲＴをコードする核酸配列は、コード配列の発現を促進する調節配列に作動可能に連結される、１８〜２４のいずれかに記載の核酸ベクター。
２６．ベクターは、非組み込みベクターである、１８〜２５のいずれかに記載の核酸ベクター。
２７．ベクターは、アデノ随伴ウイルス系非組み込みベクターである、１８〜２６のいずれかに記載の核酸ベクター。
２８．ベクターは、血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）由来のアデノ随伴ウイルス系ベクターである、１８〜２７のいずれかに記載の核酸ベクター。
２９．アデノ随伴ウイルス系ベクターのカプシドは、血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）のカプシドタンパク質からできており、カプシド内に含まれる核酸配列は、血清型２アデノ随伴ウイルスに対応する内部末端反復配列と両端で隣接する、２８に記載の核酸ベクター。
３０．カプシド内に含まれる核酸は、ＴＥＲＴをコードするアミノ酸配列をコードする断片を含む、２９に記載の核酸ベクター。
３１．ベクターは、恒常的プロモータである調節配列を含む、１８〜３０のいずれかに記載の核酸ベクター。
３２．調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである、３１に記載の核酸ベクター。
３３．短テロメア長と関連した病態は、テロメア維持に関与する遺伝子（単数または複数）中の突然変異体を特徴とする、１８〜３２のいずれかに記載の核酸ベクター。
３４．短テロメア長と関連した病態は、先天性角化異常症、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、ファンコニー貧血、および肺線維症からなる群から選択される、１８〜３３のいずれかに記載の核酸ベクター。
３５．短テロメア長と関連した病態は、先天性角化異常症である、１８〜３４のいずれかに記載の核酸ベクター。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】生存（Ａ〜Ｃ）および血球数（Ｄ〜Ｅ）へのＡＡＶ９−Ｔｅｒｔの影響
【図２】末梢血（Ａ〜Ｃ）および骨髄（Ｄ〜Ｅ）中のテロメア長へのＡＡＶ９−Ｔｅｒｔの影響
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、短テロメア長と関連した病態の治療および予防に有用な組成物および方法を提供する。
【００１８】
「短テロメア長と関連した病態」は、決定的に短いテロメアの蓄積を特徴とするものである。ある特定の実施形態において、そのような病態を患う対象は、組織の再生能の欠陥によって生じる病変の早期発症を呈する。
【００１９】
ある特定の実施形態において、短テロメア長と関連した病態は、テロメア維持に関与する遺伝子（単数または複数）における突然変異を特徴とする。そのような遺伝子に基づく病態の特定の例には、先天性角化異常症、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、ファンコニー貧血、および肺線維症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
先天性角化異常症（ＤＫＣ）は、早期老化症候群の系列である、遺伝子的に異質なヒト疾患である（Ｄｏｋａｌ，２０１１）。ＤＫＣは、テロメア維持に関連する遺伝子における突然変異に起因する短い／機能不全テロメアの存在を特徴とし、最も頻繁に変異するのが、テロメラーゼ複合体（すなわち、ＴＥＲＴ、ＴＥＲＣ、ＮＯＰ１０、ＤＫＣ１、ＮＨＰ２）のタンパク質をコードする遺伝子である（Ｄｏｋａｌ，２０１１、Ｄｏｋａｌ  ａｎｄ  Ｖｕｌｌｉａｍｙ，２０１０、Ｍａｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｓｓｌｅｒ，２０１１、Ｓａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒ，２００８）。さらに、患者の一部は、哺乳類のテロメアを結合させ、保護するシェルタリン複合体の構成要素であるＴＩＮ２（ＴＲＦ１結合タンパク質）をコードする遺伝子中に、突然変異を保因する（Ｄｏｋａｌ，２０１１、Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｏ，２０１１、Ｗａｌｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。機能的テロメラーゼ複合体およびシェルタリンタンパク質による適切なテロメアキャッピング構造の両方が、それぞれ、染色体端部の維持およびキャッピングに必要である。
【００２１】
ＤＫＣを患う患者の臨床的特徴としては、皮膚の異常（すなわち、皮膚の色素過剰）、早期老化の兆候（すなわち、白髪化、爪ジストロフィー、口腔白板等）、癌にかかりやすい素因、ならびに再生不良性貧血および肺線維症を含むいくつかの他の生死に関わる病態が挙げられる（Ａｒｍａｎｉｏｓ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，２０１２）。具体的には、高増殖指数を有する組織は、各細胞分裂の際に起こるテロメアＤＮＡの喪失に起因して最も影響を受ける。これは、なぜＤＫＣ患者が汎血球減少症、および最終的には骨髄不全（ＢＭＦ）につながる骨髄機能障害に特に脆弱であるかを説明する（Ａｒｍａｎｉｏｓ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，２０１２、Ｂｌａｓｃｏ，２００７）。
【００２２】
再生不良性貧血は、骨髄細胞減少および低血球数を特徴とする、生命を脅かす骨髄障害である。後天的再生不良性貧血を有する患者は、年相応の健康な個人よりも大幅に短いテロメアを有する白血球を呈する（Ｃａｒｒｏｌｌ  ａｎｄ  Ｌｙ，２００９）。再生不良性貧血は、しばしば、造血幹細胞に対する自己免疫媒介攻撃によって引き起こされる。しかしながら、最近の研究は、コアテロメラーゼ構成要素ＴＥＲＴおよびＴＥＲＣにおける突然変異が、臨床的に関連する部分母集団において根本原因であることが示されている（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３、Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。コアテロメラーゼ構成要素ＴＥＲＴおよびＴＥＲＣ、ならびにシェルタリン構成要素ＴＩＮ２における突然変異が、この疾患と関係している（Ｓａｖａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００２３】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）は、血球の骨髄クラスの無効産生を特徴とするいくつかの骨髄疾患を包含する。進行性骨髄不全によって引き起こされて、ＤＫＣと同様に、ＭＤＳ患者は、多くの場合重度の貧血および血球減少を報告する。おおよそ３分の１の事例で、この疾患は、すぐに進行し、治療に特に耐性を示す急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）へと変化する。ＭＤＳを有する患者における短縮化されたテロメアが、不十分または障害されたテロメア維持がこの症候群の原因であることを示唆するにも拘らず、過去の研究において、２１０個の事例のうちわずか３例のみがヘテロ接合のＴＥＲＣ突然変異を示した（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。しかしながら、近年公開された研究は、ヒトテロメラーゼ突然変異と、ＭＤＳ、再生不良性貧血、及びＡＭＬとの間の関連性を明確に説明した。（Ｈｏｌｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）は、テロメア維持障害を有する異なる臨床症状の密接な関係を強調する、例えば、祖父がＡＭＬを患い、娘がＭＤＳを患い、孫が再生不良性貧血を患った、テロメラーゼ構成要素ＴＥＲＣおよびＴＥＲＴの突然変異を有する様々な家族を報告した（Ｈｏｌｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００２４】
ファンコニー貧血（ＦＡ）は、ＤＮＡ修復に関与する遺伝子における突然変異によって引き起こされる、異質の遺伝子疾患である。冒された個人は、若年での発症時に、いくつかの先天的な欠損および血液学的欠乏症を示す（Ｋｅｅ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，２０１２）。しかしながら、後者に関連する発現は、この症候群の主な症状であり、疾患が進行に従い、再生不良性貧血、ＭＤＳ、およびＡＭＬを含む前述の症候群になり得る。重要なことには、ＦＡを患う患者は、通常よりも短いテロメアを呈することも示されている（Ｇａｄａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＦＡを引き起こしている突然変異がＤＮＡ損傷反応（ＤＤＲ）の障害を示し、テロメアが複製のストレスに対して特に脆弱という事実は、観察されたテロメア侵食を説明し得る。これの裏付けとして、Ｃａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）は、ＦＡ患者において、複製の短縮化に呼応して認められたテロメア破損の増加が、テロメアの短縮化の主な原因であることを示唆した。
【００２５】
肺線維症は、肺組織の瘢痕化を特徴とする病態を指す。肺線維症は、慢性炎症過程、感染、環境化合物、電離放射線（例えば、胸部の腫瘍を治療するための放射線治療）、慢性内科疾患（尋常性狼瘡、リウマチ性関節炎）を含む多くの要因によって引き起こされ得る。特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、特定可能な原因のない肺線維症を指す。
【００２６】
したがって、本発明は、患者のテロメア長を増加させる活性物質を患者に投与することを含む、短テロメア長と関連した病態を患う患者を治療する方法を提供する。一実施形態において、活性物質は、染色体末端の分解を防ぐ。一実施形態において、活性物質は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の活性を上昇させる。一実施形態において、治療の方法は、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のコード配列を含む核酸ベクターを患者に投与することを含む、遺伝子治療法である。
【００２７】
ある特定の実施形態において、遺伝子治療ベクターで使用されるＴＥＲＴ配列は、対象と同じ種の由来である。例えば、ヒトにおける遺伝子治療は、ヒトＴＥＲＴ配列を使用して行なわれる。マウスにおける遺伝子治療は、実施例に記載されるように、マウスＴＥＲＴ配列を使用して行なわれる。一実施形態において、ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３（ヒトＴＥＲＴ変異体１および２）に記載される核酸配列によってコードされるか、または配列番号１あるいは配列番号３の配列の活性断片または機能的同等物である。配列番号１によってコードされるポリペプチド配列は、配列番号２に記載される。配列番号３によってコードされるポリペプチドは、配列番号４に記載される。本明細書で使用される場合、「機能的同等物」は、ＴＥＲＴ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、またはＴＥＲＴ活性を有するポリペプチドを指す。機能的同等物は、配列番号１または配列番号３によってコードされるＴＥＲＴと比較して、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％以上の活性を示し得る。機能的同等物は、人工または天然型でもよい。例えば、ある集団におけるＴＥＲＴ配列の天然型変異体は、機能的同等物の範囲内に含まれる。他の種由来のＴＥＲＴ配列、具体的には配列番号５に示されるマウスＴＥＲＴ配列もまた、用語「機能的同等物」の範囲に含まれる。特定の実施形態において、機能的同等物は、配列番号１または配列番号３に対して、少なくとも７５％、８０％＞、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸である。さらなる実施形態において、機能的同等物は、配列番号２または配列番号４に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。機能的同等物の場合、配列同一性は、核酸の全長に沿って計算されるべきである。機能的同等物は、配列番号１または配列番号３と比較したとき、１個以上、例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０個以上のヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換を含み得る。用語「機能的同等物」は、配列番号２または配列番号４に記載される配列に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％の配列同一性を有するＴＥＲＴポリペプチドをコードするが、遺伝子コードの縮重のために、配列番号１または配列番号３に示される核酸配列に対して相同性をほとんど示さない核酸配列も包含する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「活性断片」は、ＴＥＲＴ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子、またはＴＥＲＴ活性を有するポリペプチドであって、配列番号１もしくは配列番号３に記載される核酸または配列番号２もしくは配列番号４に記載されるアミノ酸配列の断片を指す。活性断片は、ＴＥＲＴ活性が保持されるのであれば、あらゆるサイズでもよい。断片は、より短い断片と配列番号１〜４との間の長さに沿った整列で、配列番号１〜４に対して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、１００％の同一性を有する。
【００２９】
これらの断片を含む融合タンパク質が、本発明を実施するために必要な核酸ベクター中に含まれ得る。例えば、上記ポリペプチド配列または相同配列からの追加の５、１０、２０、３０、４０、５０、またはさらには１００個のアミノ酸残基が、ポリペプチド断片が正しく折り畳み、生物学的活性を呈する能力を害さずに、Ｃ末端および／もしくはＮ末端のいずれか、または両方に含められてもよい。
【００３０】
配列同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｇｉｓｈ  Ｗ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，Ｍｙｅｒｓ  ＥＷ，Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ（１９９０）．“Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ”．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５（３）：４０３−４１０）およびＦＡＳＴＡ（Ｌｉｐｍａｎ，ＤＪ；Ｐｅａｒｓｏｎ，ＷＲ（１９８５）．“Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈｅｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７（４６９３）：１４３５−４１、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｌｉｓｔ２．ｓｈｔｍｌ）、ならびにこれらの配列プログラムの変形を含む、当分野の様々な方法のうちのいずれか１つによって計算されてもよい。
【００３１】
一実施形態において、治療の方法は、遺伝子治療法であり、かつ／または使用される核酸ベクターは、遺伝子治療ベクターである。遺伝子治療法およびベクターは、当分野で周知であり、概して、治療的活性タンパク質をコードする核酸を対象に送達することを含む。核酸は、プラスミドまたはミニサークル等の裸のＤＮＡの送達、リポソームもしくはカチオンポリマー、または核酸を含む他の加工ナノ粒子、あるいは核酸をカプシドで包んだウイルスベクターの使用を含む、いくつかの手段で送達されてもよい。
【００３２】
さらなる実施形態において、遺伝子治療は、誘導性発現系を用いた、生物の安定した形質転換を使用して達成される。好適な誘導性発現系は、当分野で既知であり、マウスにおいて使用するのに好適なＣＲＥ−ＬＯＸリコンビナーゼに基づく系、およびヒト対象の治療で使用することができるテトラサイクリンで調節されるものを含む。
【００３３】
一実施形態において、遺伝子治療ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルス遺伝子治療ベクターは、当分野で周知である。ベクターは、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）、アルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、およびヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）に基づくもの等の、組み込みおよび非組み込みベクターを含む。
【００３４】
ＡＡＶ等の非組み込みウイルスベクターの使用は、特に有利なようである。これは、一態様において、非組み込みベクターが、あらゆる恒久的な遺伝子改変を引き起こさないためである。第二に、ベクターは、成体組織を標的にし、発達の初期段階から対象を恒常的テロメラーゼ発現の影響下に置くことを回避する。さらに、非組み込みベクターは、ＴＥＲＴ発現細胞の過剰増殖を避けるための安全機構を効果的に組み込む。細胞が急速に増殖し始めると、細胞は、ベクター（及び、結果として、テロメラーゼ発現）を喪失する。
【００３５】
好適な非組み込みベクターの特定の例としては、アデノウイルス（ＡｄＶ）に基づくもの、具体的には、ガットレスアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、インテグラーゼ欠損レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、およびヘルペスウイルスが挙げられる。好ましくは、本発明で使用される非組み込みベクターは、天然アデノ随伴ウイルス粒子と類似した、アデノ随伴ウイルス系非組み込みベクターである。ＡＡＶは、高増殖性の組織よりも癌により耐性を示すと考えられる、有糸分裂後組織を優先的に標的にする。アデノ随伴ウイルス系非組み込みベクターの例には、任意のＡＡＶ血清型、すなわち、ＡＡＶｌ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、および偽型ＡＡＶに基づいたベクターが含まれる。組織特異性は、カプシド血清型によって決定される。ＡＡＶベクターおよびカプシドのトロピズムトロピズム範囲を変えるためのＡＡＶベクターのシュードタイピングおよびカプシド工学は、治療におけるこれらの使用にとって重要である可能性がある。
【００３６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来のベクターは、高効率、低免疫原性、および優れた安全プロフィールで広い範囲の組織を形質導入する能力（Ｍｅｒｔｅｎ，Ｇｅｎｙ−Ｆｉａｍｍａ  ｅｔ  ａｌ．２００５、Ｂｕｎｉｎｇ，Ｐｅｒａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．２００８）、毒性が多くの前臨床モデルにおいて存在しないこと（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ２００９、Ｍａｓ，Ｍｏｎｔａｎｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００６、Ｊｉａｎｇ，Ｌｉｌｌｉｃｒａｐ  ｅｔ  ａｌ  ｂｌｏｏｄ  ２００６、Ｇｈｏｓｈ，Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２００７、Ｔａｆｕｒｏ，Ａｙｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９）を含むこれらの多くの望ましい特性のために、多くの遺伝子導入用途に最適なベクターのうちの１つとして明らかになっている。ＡＡＶベクターは、有糸分裂後細胞を形質導入し、疾患の小動物および大動物モデルの両方において長期間の遺伝子発現を（最大数年）持続することができる（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｈｅｒｚｏｇ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ２００９、Ｍａｓ，Ｍｏｎｔａｎｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００６、Ｊｉａｎｇ，Ｌｉｌｌｉｃｒａｐ  ｅｔ  ａｌ  ｂｌｏｏｄ  ２００６、Ｇｈｏｓｈ，Ｙｕｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２００７、Ｔａｆｕｒｏ，Ａｙｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９）。ＡＡＶ遺伝子導入の安全性および有効性は、ヒトにおいて広く研究され、肝臓、筋肉、ＣＮＳ、および網膜において有望な結果がある（Ｍａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００６、Ｓｔｒｏｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ＡＴＶＢ  ２００８、Ｋａｐｌｉｔｔ，Ｆｅｉｇｉｎ，Ｌａｎｃｅｔ  ２００９、Ｍａｇｕｉｒｅ，Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ  ＮＥＪＭ  ２００８、Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ  ＮＥＪＭ  ２００８）。
【００３７】
ＡＡＶ２は、ヒトおよび実験モデルの両方における遺伝子導入研究の、最もよく特徴がわかっている血清型である。ＡＡＶ２は、骨格筋、ニューロン、血管平滑筋細胞、および肝細胞に対して自然トロピズムを呈する。したがって、ＡＡＶ２は、特に、これらの組織のうちの１つと関連した病態を治療するために本発明の方法またはベクターを使用するとき、これらの組織を標的にするためのベクターの良い選択である。例えば、神経筋変性の治療は、このように骨格筋および／またはニューロンを標的としてもよい。
【００３８】
ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９等の新しく単離された血清型が、前臨床研究においてうまく適合されている（Ｇａｏ，Ａｌｖｉｒａ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ２００２）。限定された免疫反応がＡＡＶカプシドに対してＡＡＶ２またはＡＡＶｌを用いて治療したヒト対象において認められているが（Ｍａｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００６、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００７、Ｂｒａｎｔｌｙ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ２００９、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ  ｂｌｏｏｄ  ２００９）、治療遺伝子の長期発現が、標的組織および投与経路によっては可能である（Ｂｒａｎｔｌｙ  ｅｔ  ａｌ  ＰＮＡＳ  ２００９、Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ  ｍｏｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０）。さらに、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９等の非ヒト血清型の使用は、対象におけるこれらの免疫反応を克服するのに有用であり得、臨床試験が開始されたばかりである（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＮＣＴ００９７９２３８）。要するに、これらの有望なデータは、ＡＡＶベクターが、高い安全性および効率性のよいプロフィールでヒト疾患を治療するのに有用なツールであることを示唆する。
【００３９】
血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）由来のもの等の広いトロピズムのアデノ随伴ウイルスの選択は、短テロメア長と関連した病態を治療するとき、特に有利である。ＡＡＶ９ウイルスは、肝臓、心臓、および骨格筋に対する高いトロピズムで、広い範囲の組織における効率的な形質導入を示し（Ｉｎａｇａｋｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００６）、したがって、遺伝子治療の有益な効果を、より多くの組織において達成することができる。さらに、ＡＡＶ９ベクターは、血液脳関門を通過する特有の能力を有し、成体マウスおよびネコにおいて、静脈内注射をすると脳を標的とする（Ｆｏｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９、Ｄｕｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）。
【００４０】
本発明の一態様は、アデノ随伴ウイルス系ベクターの（ウイルストロピズムを決定するウイルスの部分である）カプシドが、血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）のカプシドタンパク質からできている系を提供する。本発明で使用するためのウイルスベクターの一実施形態において、カプシド内に詰め込められているポリヌクレオチド配列は、アデノ随伴ウイルスの内部末端反復配列（ＩＴＲ）、好ましくは、当分野で広く特徴がわかっている血清型２の内部末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接し、ＩＴＲ間に配置されているコード配列を表す。上述の通り、好ましくは、核酸は、機能性ＴＥＲＴポリペプチドをコードする。一実施形態において、ＴＥＲＴコード配列に作動可能に連結された調節配列は、サイトメガロウイルスプロモータ（ＣＭＶ）であるが、他の好適な調節配列が、当業者に既知である。
【００４１】
短テロメア長と関連した病態を治療するとき、影響を受けた組織に治療を向けることは有利である。したがって、遺伝子治療ベクターのカプシドタンパク質のＡＡＶ血清型の選択は、遺伝子治療の所望の部位に基づいてもよい。標的組織が骨格筋である場合、例えば、神経筋共調性の喪失の治療において、ＡＡＶ１およびＡＡＶ６系ウイルスベクターを使用することができる。これらの血清型の両方とも、他のＡＡＶ血清型よりも筋肉で遺伝子導入がより効果的である。ＡＡＶ３は、遺伝子導入造血細胞に有用である。遺伝子治療のためのＡＡＶ系ベクターの徹底的な再考察は、Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，（２００８）“ＡＡＶ−ｂａｓｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”Ａｍ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：５１−６５に見出すことができる。
【００４２】
あるいは、他のウイルスベクターを本発明で使用することができる。遺伝子治療における使用に適合する任意のベクターを、本発明で使用することができる。Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ＆Ｗｅｇｅｒ（２０１０）Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９７：１４３−７０が、遺伝子治療において有用であるウイルスベクターの再考察を提供する。これまでのすべての考察によれば、遺伝子治療において使用するのに好適なテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のコード配列を含むベクターが、本発明を実現するために重要な点である。好適な遺伝子治療ベクターには、標的細胞においてテロメラーゼ逆転写酵素活性を行う機能性ＴＥＲＴタンパク質の発現を可能にする、プロモータ等の調節エレメントに作動可能に連結されたテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド断片を含む、任意の種類の粒子が含まれる。好ましくは、ＴＥＲＴは、配列番号１または配列番号３に記載される核酸配列によってコードされるか、またはＴＥＲＴの活性断片または機能的同等物である。
【００４３】
用語、遺伝子治療ベクターは、その範囲内にプラスミドまたはミニサークル、すなわち、細菌ＤＮＡ配列を含まない環状ＤＮＡ分子等の裸のＤＮＡ分子を含む。但し、ＴＥＲＴコード配列およびそれに連結された調節エレメントが、ポリヌクレオチド配列がカプシドの起源のウイルスの生来のゲノムのものと類似した様式でカプシド内に詰め込まれることを可能にするサイズで、プラスミド内、並びに少なくともカプシドおよび少なくともポリヌクレオチド配列を含む、ビリオン（ウイルス粒子）の構造を有する粒子等のより複雑な系に挿入される。ポリヌクレオチド配列は、ウイルス粒子が細胞に感染したら、テロメラーゼ逆転写酵素タンパク質がそのポリヌクレオチド配列から発現できるように、ＴＥＲＴコード配列およびそれに連結された調節エレメントが挿入されている領域を含まなければならない。
【００４４】
一実施形態において、本発明で使用されるのに好適な遺伝子治療ベクターは、アデノ随伴ウイルス系非組み込みベクター等の非組み込みベクターである。本発明の目的上、非組み込みベクターの選択は、いずれの恒久的な遺伝子改変も引き起こさないため、特に有利なようである。また、先に述べたように、そのようなベクターは、細胞が急速に増殖し始めた場合、ベクターを喪失する細胞を発現するＴＥＲＴの過剰増殖を避けるための安全機構を組み込む。
【００４５】
血清型９アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ９）由来のアデノ随伴ウイルス系ベクターが、有益な効果をより多くの組織で達成することができるため、好ましい（上を参照されたい）。１つの特定の好ましい実施形態において、ＴＥＲＴコード配列に作動可能に連結された調節配列は、サイトメガロウイルスプロモータ（ＣＭＶ）である。ＴＥＲＴをコードする核酸配列は、コード配列の発現を促進する調節配列に作動可能に連結される。本明細書で使用される場合、用語「調節エレメント」は、プロモータの役目をする核酸配列を意味し、すなわち、プロモータに作動可能に連結された核酸配列の発現を調節する。そのような「調節エレメント」または「プロモータ」は、恒常的、または誘導的のいずれかで、連結された核酸配列の発現を制御することができる。
【００４６】
調節配列は、恒常的プロモータでもよい。恒常的プロモータである調節配列の例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである。
【００４７】
本発明に従った遺伝子治療後のＴＥＲＴの発現は、数カ月から数年の期間、持続する。マウスにおいて、ＴＥＲＴ発現は、５ヶ月後に認めることができた。サルにおいては、ＡＡＶ系ベクターを用いた遺伝子治療後の遺伝子発現は、治療後最大６年認められ、イヌにおいては最大８年認められた（Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｌｏｏｄ  ２００５、およびＮｉｅｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ｂｌｏｏｄ  ２００９）。したがって、本発明の方法およびベクターを使用する治療は、頻繁な繰り返しは必要ない。本発明の一実施形態において、対象は、１回治療される。代替実施形態において、対象は最初に治療され、次いで、ＴＥＲＴ発現レベルが治療の直後に達成したものの約５０％に減少したら、再度治療される。治療は、年齢に関連した障害における減少を管理するために、必要に応じて、例えば、年に１度、または５年に１度、または１０年に１度、同じベクターまたは代替のベクターを用いて反復されてもよい。第２のまたは後続の投与をするとき、異なる遺伝子治療ベクターを使用する必要がある場合があり、例えば、ＡＡＶ系ベクターを使用するとき、第２のおよび後続の投与は、第１の投与のために使用されたものとは異なる血清型由来のカプシドを有するベクターでもよい。対象が第１の遺伝子治療ベクターに対して中和抗体を作り得、２回目、または後続の回に投与されたとき、効果がないものにする可能性がある（Ａｍａｄｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（２１）：２１ｒａｌ６）。
【００４８】
本発明の治療の方法は、短テロメア長と関連した病態を治療し、かつ／または予防する効果がある。したがって、さらなる態様において、本発明は、限定されないが、先天性角化異常症、再生不良性貧血、骨髄異形成症候群、ファンコニー貧血、および肺線維症等の遺伝子に基づく病態を含む、短テロメア長と関連した病態の対象の治療または予防のための、遺伝子治療法または上述の核酸ベクターの使用に言及する。
【００４９】
短テロメア長と関連した病態の治療の有効性は、当分野で既知の様々な方法によって測定することができる。一実施形態において、治療の有効性は、同じ病態を患う、治療を受けていない患者の平均余命と比較して、短テロメア長と関連した病態を患う、治療を受けた患者の余命の増加によって測定することができる。ある特定の実施形態において、余命は、同じ病態を患う患者の平均余命を基準にして、５％、１０％、１５％、２０％以上伸びる。
【００５０】
一実施形態において、治療の有効性は、同じ病態を患う、治療を受けていない患者における骨髄不全の予測される発症と比較して、短テロメアと関連した病態を患う、治療を受けた患者における遅延されたか、または予防された骨髄不全によって測定される。ある特定の実施形態において、短テロメア長と関連した病態を患う、治療を受けた患者の骨髄不全の発症における遅延は、同じ病態を患う、治療を受けていない患者の骨髄不全の予測される発症を基準にして、５％、１０％、１５％、２０％以上、延ばされる。
【００５１】
一実施形態において、治療の有効性は、同じ病態を患う、治療を受けていない患者の全体的適応度と比較して、治療された短テロメア長と関連した病態を患う、治療を受けた患者の全体的適応度の上昇によって測定することができる。全体的適応度は、特定の病態と関連した身体的特徴を測定することにより、決定することができる。そのような身体的特徴の例には、（皮膚の色素過剰等の）皮膚の異常、（白髪化、爪ジストロフィー、口腔白板等の）早期老化、および貧血性蒼白が含まれる。Ｄｏｋａｌ，Ｉ．２０１１．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ，４８０−４８６。したがって、全体的適応度の上昇は、治療を受けた患者が呈する特定の病態と関連した身体的特徴の減少によって判定することができる。全体的適応度は、患者の血球数を決定することによっても測定することができる。一実施形態において、上昇した全体的適応度は、末梢血試料中の白血球、リンパ球、血小板の量を決定することによって測定される。より高い血球数は、上昇した全体的適応度を示す。ある特定の実施形態において、治療を受けた患者における血球数は、同じ病態を患う、治療を受けていない患者の血球数を基準にして、５％、１０％、１５％、２０％以上増加する。
【００５２】
治療の有効性は、患者から採取した試料中のテロメア長を直接決定することによっても、測定することができる。テロメア長は、例えば、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）、定量的蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（Ｑ−ＦＩＳＨ）、または高スループット定量的蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＨＴ  Ｑ−ＦＩＳＨ）等の標準ハイブリダイゼーション法を使用することによって測定することができる。（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓｕａｒｅｚ，Ｓａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１）患者から採取した試料中、テロメア分析に好適な試料には、骨髄組織および血液試料が含まれる。テロメア長は、Ｓｌａｇｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌまたはＣａｎｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７，ＰＮＡＳ  １０４：５３００−５３０５）に記載される通りにも測定することができる。
【００５３】
特定の実施形態において、試料は、治療の過程にわたって絶対テロメア長およびテロメアの短縮化の速度の両方を決定することができるように、治療の過程を通して、治療を受ける患者から採取される。試料は、治療の過程の間、毎日、またはより長い間隔で採取されてもよい。一実施形態において、試料は、週に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間以上に１回、採取される。
【００５４】
テロメア長の比較は、患者から採取された試料中の短テロメアの比率を比較することによって測定することができる。一実施形態において、短テロメアの比率は、ＦＩＳＨまたはＱ−ＦＩＳＨ等のインサイツハイブリダイゼーション法によって測定した、試料の平均強度未満の強度を呈するテロメアの割合である。実施形態において、短テロメアの比率は、試料の平均強度より７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％以上低い強度を呈するテロメアの割合である。１つの特定の実施形態において、短テロメアの比率は、試料の平均強度の５０％以上低い強度を呈するテロメアの割合である。
【００５５】
別の実施形態において、短テロメアの比率は、ある特定の長さ未満、例えば８ｋｂ、７ｋｂ、６ｋｂ、５ｋｂ以下のテロメアの割合である。一実施形態において、短テロメアの比率は、８ｋｂ以下のテロメアの割合である。別の実施形態において、短テロメアの比率は、７ｋｂ以下のテロメアの割合である。別の実施形態において、短テロメアの比率は、６ｋｂ以下のテロメアの割合である。別の実施形態において、短テロメアの比率は、５ｋｂ以下のテロメアの割合である。別の実施形態において、短テロメアの比率は、４ｋｂ以下のテロメアの割合である。別の実施形態において、短テロメアの比率は、３ｋｂ以下のテロメアの割合である。
【００５６】
一実施形態において、治療の有効性は、対照試料と比較して、短テロメア長と関連した病態を患う、治療を受けた患者から採取した試料中の短テロメアの比率の減少によって測定される。一実施形態において、治療を受けた患者から採取された試料中の短テロメアの比率は、対照試料と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％以上減少する。一実施形態において、対照試料は、治療の前に同じ患者から採取されたか、または治療の初期段階で採取された試料である。別の実施形態において、対照試料は、同じ病態を患い、かつ治療が提供されていない患者から採取された試料である。
【００５７】
さらなる態様において、本発明は、上述の本発明に適合する遺伝子治療ベクターのうちのいずれか１つの有効量を含む薬学的組成物を投与することによって、対象に適用される。
【００５８】
「薬学的組成物」は、組成物を試験管内、生体内、または生体外での診断用途または治療用途に好適なものにする、不活性または活性の、担体を有する活性剤の組み合わせを含むことが意図される。
【００５９】
「組成物」は、活性物質と、不活性（例えば、検出可能な物質もしくは標識）または活性の別の化合物または組成物との組み合わせを意味することが意図される。「有効量」は、有益または所望の結果をもたらす十分な量である。有効量は、１回以上の投与、適用、または投与量で投与され得る。
【００６０】
本組成物は、（遺伝子治療ベクター等の）活性構成要素に加えて、構成要素を含み、例えば、本組成物は、典型的に１つ以上の薬学的担体（複数可）および／または賦形剤（複数可）を含む。そのような構成要素の徹底的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２で利用可能である。
【００６１】
組成物は、一般に、水性の形態で対象に投与される。しかしながら、投与前に、本組成物は、非水性の形態でもよい。例えば、一部のウイルスベクターは水性の形態で製造され、次いで、同様に水性の形態で、充填され、分配され、投与されるが、他のウイルスベクターは、製造の間に凍結乾燥され、使用の時点で水性の形態へと戻される。したがって、本発明の組成物は、凍結乾燥製剤等に乾燥されてもよい。組成物は、チオマーサルまたは２−フェノキシエタノール等の保存剤を含んでもよい。しかしながら、本組成物は、実質的に水銀材料を含まない
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例えば、チオマーサル不含であるべきことが好ましい。
【００６２】
等張性を制御するために、ナトリウム塩等の生理食塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約１０＋２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌで存在してもよい。存在してもよい他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウム等が含まれる。
【００６３】
組成物は、一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し、好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に含まれる。
【００６４】
組成物は、１つ以上の緩衝液を含んでもよい。典型的な緩衝液としては、リン酸塩緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、コハク酸塩緩衝液、（特に、水酸化アルミニウムアジュバントを有する）ヒスチジン緩衝液、またはクエン酸塩緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的に、５〜２０ｍＭの範囲に含まれる。
【００６５】
本組成物は、単回投与のための材料を含んでもよいか、または多回投与のための材料を含んでもよい（すなわち、「多投与量」キット）。保存剤の含有は、多投与量構成において好ましい。多投与量組成物中の保存剤に代わるものとして、またはそれに加えて、本組成物は、材料の取り出しのために無菌のアダプタを有する容器の中に含められてもよい。
【００６６】
ヒトにおいて使用するための本発明の組成物は、典型的に約０．５ｍｌの投与量で投与されるが、半投与量（すなわち、約０．２５ｍｌ）が子供に投与されてもよい。
【００６７】
本明細書に記載される治療の方法のみならず、本発明は、治療で使用するためのＴＥＲＴをコードする核酸配列も提供する。本発明は、治療の方法で使用するためのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のコード配列を含む核酸ベクターと、治療の方法で使用するためのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のコード配列を含む遺伝子治療ベクターと、も提供する。具体的には、治療は、短テロメア長と関連した病態を治療または予防し得る。治療の方法に関して記載されるように、ＴＥＲＴ核酸配列は、配列番号１もしくは配列番号３に列挙される配列、またはその断片もしくは機能的同等物でもよい。ＴＥＲＴタンパク質は、配列番号２もしくは配列番号４に列挙される配列、またはその断片もしくは機能的同等物を有してもよい。
【００６８】
用語、「患者」は、哺乳動物を指す。ある特定の実施形態において、患者は、げっ歯類、霊長類、有蹄動物、ネコ、イヌ、または他の家庭ペットもしくは飼いならされた哺乳動物である。ある特定の実施形態において、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、イエネコ、もしくはイヌ、またはヒトである。好ましい実施形態において、患者は、ヒトである。
【００６９】
前述の発明が、理解の明確さの目的のために図および例の手段によっていくらか詳細に記載されているが、説明および例は、本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許および科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
【実施例】
【００７０】
例１  先天性角化異常症のマウスモデル
条件的ＴＲＦ１導入遺伝子（ＴＲＦ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）のホモ接合性担体であり、さらに、内因性Ｍｘ１プロモータおよびインターフェロン誘導性Ｍｘ１プロモータの制御下のＣｒｅリコンビナーゼの遺伝子導入のものであるＣ５７Ｂ６背景のマウスを、先天性角化異常症（ＤＫＣ）を治療するためのテロメラーゼ遺伝子治療の有効性を試験するために使用する。造血コンパートメント内のＴＲＦ１の除去の影響を排他的に研究するために、骨髄を、先に記載されるように、これらのマウスから放射線を照射した野生型マウス内へ移植する（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。移植から一ヶ月後、マウスに、マウスの尾静脈を介して、効力があるサイトメガロウイルスプロモータの制御下で、ｍＴＥＲＴ  ｃＤＮＡを有する４×１０１２ＡＡＶ９ゲノムを注入する（ウイルス産生のため、下記３．３を参照されたい）。類推によって、テロメラーゼ遺伝子を有さない空のＡＡＶ９を、対照群内へ注入する。さらに、経時的ウイルストロピズムおよび導入遺伝子発現を観察するために、動物の別の群にＡＡＶ９−ｅＧＦＰを注入する。ウイルス感染の一週間後、骨髄中のＴｒｆ１欠損を、３日に１回の腹腔内注入を用いて、長期ポリイノシンポリシチジン酸（ｐＩ：ｐＣ）治療によって誘発する。ｐＩ：ｐＣは、免疫賦活薬の役割を果たし、Ｃｒｅ発現を活性化し、次いでこれは、先の述べた結果を伴う、（各注入にあたり）造血細胞のおおよそ５０％におけるＴｒｆ１欠損をもたらす（２を参照されたい）。ｐＩ：ｐＣ治療と対照的に、ＡＡＶ９−ｍＴＥＲＴおよびＡＡＶ９−空に事前に感染させた動物群は、追加の対照群の役目をするために、ｐＩ：ｐＣ治療を受けない。
【００７１】
この実験設計を用いて、テロメラーゼの異所性発現による、ＴＲＦ１を喪失していない残りの造血細胞における代償性増殖に起因する飛躍的なテロメアの短縮化は、低減される。遺伝子治療の有効性を評価するための最も強力な尺度は、遅延または予防された骨髄不全の効力による、延びた余命である（実験の終了点＝動物の死）。さらに、好結果のテロメラーゼ治療は、すなわち、皮膚異常がない、および貧血性蒼白がない等の、動物の全体的適応度に関して改善を示すはずである。後者は、末梢血試料から決定されるより高い血球数（白血球、リンパ球、血小板）と密接に関連している。分子レベルでのテロメラーゼ発現の有効性は、テロメア長測定を含む。骨髄組織切片からのＴｏ  ｓｏ  Ｑ−ＦＩＳＨ分析、および抹消血液試料からの高スループットＱ−ＦＩＳＨ分析を行う。第二として、血液を、実験の過程を通して、３〜４週間に１回採取する。このように、絶対テロメア長だけでなく、経時的なテロメアの短縮化の速度も決定することができる。さらに、減じたか、または消失した複製老化、ならびに造血コンパートメント中の幹細胞および前駆細胞の枯渇を、ベータガラクトシダーゼ活性およびｐ２１タンパク質レベル等の一般的な老化マーカの評価により、監視する。次いで、これらのマーカ、ならびにγＨ２ＡＸおよびホスホ−ＣＨＫ１、複製ストレスに対する分子マーカを、動物のテロメア長および生存と互いに関連付けることができる。
【００７２】
例２  ウイルスの産生
形質導入のためのＡＡＶ系ウイルスベクターを、（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）に記載されるように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のトリプル遺伝子導入により生成する。簡潔に、８０％コンフルエンスまで成長させた細胞を、（１）ＡＡＶ９ウイルスＩＴＲと隣接する発現カセットを有するプラスミド、（２）ＡＡＶｒｅｐ２およびｃａｐ９遺伝子を有するヘルパープラスミド、ならびに（３）アデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミドでトランスフェクトする。発現カセットは、ＣＭＶプロモータ＋３’−ＵＴＲ（ＡＡＶ９−ｍＴＥＲＴ）、ＣＭＶプロモータ（ＡＡＶ９−空）単独の制御下のマウスＴＥＲＴと、ＣＭＶプロモータおよびＳＶ４０ポリＡシグナル（ＡＡＶ９−ｅＧＦＰ）の制御下のｅＧＦＰと、をかくまう。ベクターを、２つの連続した塩化セシウム勾配に基づいて最適化された方法に従って、精製する（Ａｙｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ウイルスゲノム粒子の力価を、定量的リアルアイムＰＣＲによって決定する。ウイルスを、動物の感染まで−８０℃に安定に維持してもよい。
【００７３】
例３  テロメア分析
パラフィン切片のテロメアＱ−ＦＩＳＨ分析
マウスがＰＮＡ−テロメアプローブとハイブリッド形成された、パラフィンを埋め込んだ組織切片のＱ−ＦＩＳＨ決定、およびテロメアの蛍光強度を、記載されるように決定する（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｓｕａｒｅｚ，Ｓａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。定量的画像分析を、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  Ｃｅｌｌソフトウェア（バージンＸＤ１．２、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  ＡＧ）を使用して行う。統計分析のために、両側スチューデントｔ検定を使用して、有意性を評価する（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア）。
【００７４】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
組織からの全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて抜き取る。ＲＮＡ試料は、ＤＮａｓｅ  Ｉで処理され、製造業者のガイドラインに従って、ランダムプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、逆転写反応のための鋳型として使用する。定量的リアルタイムＰＣＲを、ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行う。
【００７５】
プライマーは、以下である。
Ａｃｔｉｎ−Ｆｏｒ：ＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧ（配列番号７）、
Ａｃｔｉｎ−Ｒｅｖ：ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＡＧ（配列番号８）、
ＴＥＲＴ−Ｆｏｒ：ＧＧＡＴＴＧＣＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧ（配列番号９）、
ＴＥＲＴ−Ｒｅｖ：ＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＡＣ（配列番号１０）。
ｐ１６−Ｆｏｒ：ＣＧＴＡＣＣＣＣＧＡＴＴＣＡＧＧＴＧＡＴ（配列番号１１）
ｐ１６−Ｒｅｖ：ＴＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＣＴＡＣＧＴ（配列番号１２）
Ａｘｉｎ２−Ｆｏｒ：ＧＧＣＡＡＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＡＴＣＧＡＣ（配列番号１３）
Ａｘｉｎ２−Ｒｅｖ：ＴＣＧＴＧＧＣＴＧＴＴＧＣＧＴＡＧＧ（配列番号１４）
Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１−Ｆｏｒ：ＴＧＣＧＣＣＣＴＣＣＧＴＡＴＣＴＴＡＣ（配列番号１５）
Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１−Ｒｅｖ：ＡＴＣＴＴＡＧＡＧＧＣＣＡＣＧＡＡＣＡＴＧＣ（配列番号１６）
ＣＤ４４−Ｆｏｒ：ＣＡＧＣＣＴＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＧＡＴＧＡ（配列番号１７）
ＣＤ４４−Ｒｅｖ：ＧＧＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＴＧＡＧＴＣＴＣＧＡ（配列番号１８）
ＫＩｆ４−Ｆｏｒ：ＧＣＧＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＧＧＣＧＡＧＡＡＡＣＣ（配列番号１９）
ＫＩｆ４−Ｒｅｖ：ＴＣＧＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧＡＣＡＣＡ（配列番号２０）
Ｔｉｅｇ１−Ｆｏｒ：ＣＣＣＡＴＴＧＣＣＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧ（配列番号２１）
Ｔｉｅｇ１−Ｒｅｖ：ＴＧＴＧＴＣＣＧＣＣＧＧＴＧＴＣＴＧＧ（配列番号２２）
統計分析（スチューデントのｔ検定）を、先に説明したように、Ｃｔ値に対して行う（Ｍｕｎｏｚ，Ｂｌａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。
【００７６】
例４  再生不良性貧血におけるテロメラーゼ遺伝子治療
マウスおよび動物手順
マウスは、純粋Ｃ５７／ＢＬ６背景のマウスであり、Ｍａｄｒｉｄ，ＳｐａｉｎのＣＮＩＯの特定病原体未感染の（ＳＰＦ）動物小屋で生まれ、そこに収容されていた。Ｔｒｆ１ｌｏｘ／ｌｏｘＭｘ１−ＣｒｅおよびＴｒｆ１ｌｏｘ／ｌｏｘＭｘ１−ｗｔマウスを、先に記載される、生ませた（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）＿ＥＮＲＥＦ＿２０。骨髄移植のために、１０週齢のＴｒｆ１ｌｏｘ／ｌｏｘＭｘ１−Ｃｒｅマウスを、先に記載されるように、８週齢の致死的に（１２Ｇｙ）放射線を照射した野生型マウス内への移植のための骨髄提供者として使用した（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｓａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。合計２００万個の細胞を、１：８の提供者：受容者の比率で、尾静脈注入を介して移植し、マウスを、骨髄を再建させるため、３０日の潜伏期間そのままにした。Ｃｒｅ発現を誘発するために、マウスに、合計５週間の期間、週に３回ポリイノシンポリシチジン酸（ｐＩ：ｐＣ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１５ｕｇ／ｇでの体重）を腹腔内に注入した。マウスを、追加の１週間そのままにした後で、マウスをＡＡＶ９−ＴｅｒｔまたはＡＡＶ９−空遺伝子治療ベクターを用いた治療のために、ランダムに２群に割り当てた。ベクターを、尾静脈注入を介して、１匹のマウス当たり４×１０Ｅ１２のウイルスゲノムの濃度で投与した。
【００７７】
遺伝子治療ベクター産生
ウイルスベクターを先に記載されるように生成し（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、（Ａｙｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）に記載される、精製した。簡潔に、ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔのトリプル遺伝子導入によって生成した。細胞を、８０％コンフルエンスにＦＢＳ（１０％ｖ／ｖ）を補給した、ダルベッコ変法イーグル培地内のローラボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）内で成長させ、次いで、ＡＡＶ２ウイルスＩＴＲと隣接する目的の遺伝子の発現カセットを有するプラスミド−１；ＡＡＶ  ｒｅｐ２およびｃａｐ９遺伝子を有するプラスミド−２；アデノウイルスヘルパー機能を有するプラスミド−３で、トランスフェクトした（プラスミドは、Ｋ．Ａ．Ｈｉｇｈ，Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａから快く提供された）。発現カセットは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータの制御下にあり、ＥＧＦＰのＳＶ４０ポリＡシグナル、およびＣＭＶプロモータ、およびＴｅｒｔのポリＡシグナルとしてＴｅｒｔ遺伝子の３’ＵＴＲを含んだ。ＡＡＶ９粒子を、２つの塩化セシウム勾配を使用して最適化した方法に従って精製し、ＰＢＳに対して透析し、濾過し、使用するまで−８０℃で保管した（Ａｙｕｓｏｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ウイルスゲノム粒子力価を、標準化定量的リアルタイムＰＣＲ法によって決定し（Ａｙｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ＣＭＶ配列に対して特異的なプライマーは、以下である。
ＣＭＶ−Ｆｏｒｗａｒｄ：５’−ＣＡＡＴＴＡＣＧＧＧＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＧＣ（配列番号２３）、
ＣＭＶ−Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＡＴＡＣＧＴＡＧＡＴＧＴＡＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＧＧＡ（配列番号２４）。
【００７８】
組織学
骨髄試料（胸骨または脛骨）を、リン酸塩で緩衝化した４％のホルムアルデヒド中と、脱灰パラフィン包埋後の骨中と、に固定した。５μｍの組織切片を、組織学的骨髄評価のためにＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎで染色した。免疫組織化学的検査を、脱パラフィンした組織切片に対して行った。抗原賦活化試料を、抗ＥＧＦＰ抗体（ウサギ抗ＥＧＦＰ、１：２００、Ａｂｃａｍ、ａｂ２９０）で処理した後。ＥＧＦＰ陽性細胞を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して半自動手段で計数した。
【００７９】
ＦＡＣＳ選別
ＨＳＣの選別のために、全骨髄細胞を、先に記載されるように長骨から抜き取った（ｆｅｍｕｒ＆ｔｉｂｉａ）（Ｓａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。赤血球を、１０ｍｌの赤血球溶解緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）中で１０分間、細胞を培養することにより溶解し、１０ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、５〜１０×１０＾６個の細胞／１００μｌの濃度でＦｃ−ｂｌｏｃｋ（１：４００）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０，３％のＢＳＡ）中で再懸濁させた。細胞を１０分間培養し、ＦＡＣＳ緩衝液中で１回洗浄した。次いで、細胞を２０〜２５×１０＾６個の細胞／ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させ、抗体カクテルを次の通り添加した：抗ｓｃａ−１−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（１：２００）、ｌｉｎカクテル−ｅＦｌｕｏｒ４５０（１：５０）（すべてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、および抗ｃ−ｋｉｔ−ＡＰＣ−Ｈ７（１：１００）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。細胞を、３０分間培養した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、２ＬのＤＡＰＩ（２００ｇ／ｍＬ）を添加し、続いて、細胞をＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩｕ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中で、ＨＳＣ（ｌｉｎ陰性、ｓｃａ１、およびｃ−ｋｉｔ陽性）と、系列陽性（ｌｉｎ陽性）画分とに選別した。
【００８０】
コロニー形成アッセイ
短期コロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）を、製造業者のプロトコルに記載されるように、Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ（メチルセルロース系）媒体（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む３５ｍｍ皿（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に、１×１０４および２×１０４個の新しく単離した単核骨髄細胞（赤血球は、上述の通り溶解させた）を、プレーティングすることにより行った。すべての実験を、２連で行い、形成されたコロニーの数を、３７℃での１２日の培養の後、計数した。
【００８１】
血球数
末梢血を、顔面静脈（約５０μｌ）から抜き取り、抗凝固管（ＥＤＴＡ）内に集めた。血球数を、Ａｂａｃｕｓ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｖｅｔ獣医学血液分析器を使用して決定した。
【００８２】
定量的リアルタイムＰＣＲおよびウエスタンブロット
全骨髄から抜き取ったものまたはＦＡＣＳ選別骨髄細胞からの全ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ’ｓ  ＲＮｅａｓｙミニキットを使用して単離した。任意のＤＮａｓｅＩ消化は、常に行った。定量的リアルタイムＰＣＲを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００またはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ６  Ｆｌｅｘ（共にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。プライマー配列またはＴｅｒｔおよび参照遺伝子Ａｃｔ１およびＴＢＰは、以下の通りである。
Ｔｅｒｔ−Ｆｏｒｗａｒｄ５’ＧＧＡＴＴＧＣＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＧ（配列番号９）、
Ｔｅｒｔ−Ｒｅｖｅｒｓｅ５’ＴＧＣＣＴＧＡＣＣＴＣＣＴＣＴＴＧＴＧＡＣ（配列番号１０）、
Ａｃｔｉｎ−Ｆｏｒｗａｒｄ５’ＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧ（配列番号７）、
Ａｃｔｉｎ−Ｒｅｖｅｒｓｅ５’ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＴＡＧ（配列番号８）、
ＴＢＰ−Ｆｏｒｗａｒｄ５’ＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＡＣＡＧ（配列番号２５）、
ＴＢＰ−Ｒｅｖｅｒｓｅ５’ＣＣＴＴＴＣＴＣＡＴＧＣＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＧ（配列番号２６）。
【００８３】
Ｑ−ＦＩＳＨテロメア分析
骨髄組織切片に対するＱ−ＦＩＳＨ分析を、先に記載されるように行った（Ｓａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。簡潔に、組織切片を、４％のホルムアルデヒド中に５分間後固定し、ＰＢＳ中で３×５分間洗浄し、ペプシン溶液（０．１％のブタペプシン、Ｓｉｇｍａ；０．０１ＭのＨＣｌ、Ｍｅｒｃｋ）中で１５分間、３７℃で培養した。洗浄および固定を反復し、スライドを７０％−９０％−１００％のエタノール系（各５分）中で脱水した。スライドを１０分空気乾燥させ、３０μｌのテロメアプローブミックス（１０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、９ｍＭのクエン酸、８２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、７０％の脱イオンホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）、０．２５％のブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ）、および０．５ｍｇ／ｍｌのテロメアＰＮＡプローブ（Ｐａｎａｇｅｎｅ））を各スライドに添加し、カバーガラスを加え、スライドを、８５℃で３分間、および暗中、湿潤チャンバで２時間、室温で培養した。スライドを激しい振動下、７０％のホルムアミド中の１０ｍＭのＴｒｉｓＣｌ  ｐＨ７、０．１％のＢＳＡ中で２×１５分、次いで、ＴＢＳ０．０８％のＴｗｅｅｎ２０中で３×５分洗浄し、次いで、４０，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）浴（ＰＢＳ中の４ｍｇ／ｍｌの１ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ））中で培養した。試料をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ＶｅｃｔｏｒＴＭ）に載せた。共焦点像を、Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５−ＭＰ共焦点顕微鏡を使用して、各０．５μｍで合計１．５μｍ積み重ねて得て、最大投影をＬＡＳ−ＡＦソフトウェアで行った。テロメアシグナル強度を、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓソフトウェアを使用して定量化した。
【００８４】
末梢血白血球に対する高スループット（ＨＴ）−Ｑ−ＦＩＳＨを、記載されるように行った（Ｃａｎｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７ａ）。簡潔に、１２０〜１５０μｌの血液を、顔面静脈から抜き取った。赤血球を溶解し（赤血球溶解緩衝液、Ｑｉａｇｅｎ）、３００００〜９００００個の白血球を２連で、０．００１％のポリ−Ｌ−リジンで３０分間、事前にコーティングされた透明の底部、黒の壁の９６個のウェルプレート内へプレーティングした。プレートを３７℃で２時間培養し、メタノール／酢酸（３：１、ｖ／ｖ）で２×１０分、および−２０℃で一晩固定させた。固定液を除去し、プレートを少なくとも１時間３７℃で乾燥させ、試料をＰＢＳ中で再水和させた。次いで、プレートを、テロメア特異的ＰＮＡ−ＣＹ３プローブを使用して標準Ｑ−ＦＩＳＨプロトコル（上を参照されたい）に供し、ＤＡＰＩを、使用して、核を染色した。１つのウェル当たり６０枚の画像を、ＯＰＥＲＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）Ｈｉｇｈ−Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを使用して撮った。ＴＬ値を、個々のテロメア点（１つの試料当たり１０，０００個超のテロメア点）を使用して分析した。各試料の平均蛍光強度を、較正基準としてＬ５１７８−ＲおよびＬ５１７８−Ｓ細胞を使用して、キロベースに変換し、これらは、それぞれ７９．７および１０．２ｋｂの安定したＴＬを有する。試料を、２連で分析した。
【００８５】
ＡＡＶ９−Ｔｅｒは、骨髄および造血幹細胞を標的とする
まず、我々は、ＡＡＶ９を形質導入された細胞の位置およびパーセントの決定を可能にする、両方のＡＡＶ９−ＥＧＦＰレポーターウイルスを使用することにより、およびＡＡＶ９−Ｔｅｒｔ治療後の異なる骨髄細胞集団における生体内のＴｅｒｔ  ｍＲＮＡ発現を決定することにより、静脈内注入をして骨髄を形質導入するＡＡＶ９ベクターの能力に取り組むために述べる。この目的を達成するために、我々はまず、尾静脈注入によって１匹のマウス当たり３．５Ｅ１２ウイルスゲノムの濃度で、野生型マウスにＡＡＶ９−ＥＧＦＰ粒子を注入した。特異性抗ＥＧＦＰ抗体を用いた骨髄切片の免疫組織化学分析は、中間骨（ｍｉｄｄｌｅ  ｂｏｎｅ）切片中の２％の明確なＥＧＦＰ発現細胞を示し、これは、最高ＡＡＶ９形質導入を示すものである、関節と隣接した領域内で１０％にまで上昇した。次いで、我々は、野生型マウスに同じ量のＡＡＶ９−Ｔｅｒｔ粒子を注入し、ウイルス注入から２週間および８ヶ月後に単離した全骨髄中のＲＴ−ＰＣＲによるＴｅｒｔ  ｍＲＮＡ発現を決定した。ＡＡＶ９ベクターでの治療から２週間後すぐに、我々は、ＡＡＶ９空ベクターで治療したマウスと比較して、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔで治療したマウスにおいて上昇したＴｅｒｔ  ｍＲＮＡ発現を見出し、この差異は、最初の治療後８ヶ月後にも依然として維持された。次いで、我々は、骨髄の血液形成細胞中で特異的なＴｅｒｔ  ｍＲＮＡ発現を研究した。これを達成するために、我々は、ｃ−ｋｉｔおよびＳｃａ−１陽性ＨＳＣ細胞、ならびにｌｉｎ陽性系列決定済み細胞のＦＡＣＳ選別を行った。我々は、空のベクターで治療したマウスと比較して、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔで治療したマウスにおけるＴｅｒｔ  ｍＲＮＡ中のＨＳＣ（１０倍）および系列決定済み骨髄細胞（３．５倍）の両方で、大幅な上昇を見出し、ＨＳＣ細胞を含む骨髄細胞が、Ｔｅｒｔ遺伝子治療によって標的にされることを示した。我々がＨＳＣ中の上昇したＴｅｒｔ発現を達成したと仮定して、次に我々は、これがＨＳＣの幹細胞潜在力に影響したかどうかに取り組んだ。これを達成するために、我々は、コロニー形成細胞アッセイ（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ）を行った。興味深いことに、我々は、空ベクター対照と比較して、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔマウスにおいて大幅に増加した数のコロニーを認めた。
【００８６】
要約すれば、これらのデータは、高投与量で投与されたＡＡＶ９は、造血細胞を標的にすることができ、これらが造血細胞の増殖能力を向上させることを示す。
【００８７】
再生不良性貧血のマウスモデルにおけるＡＡＶ９−Ｔｅｒｔ治療は、生存をレスキューする
次に我々は、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔを用いた治療が、決定的に短いテロメアに起因する致死再生不良性貧血を注入した生存の増加に、有効であるかどうかを試験した（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。具体的には、我々は、骨髄への影響を排他的に研究するために、我々が野生型マウスに致死的に放射線を照射し、これらのマウスにＴｒｆ１ｌｏｘ／ｌｏｘＭｘ１−Ｃｒｅマウスから単離した骨髄を移植した、我々が近年開発した条件的Ｔｒｆ１マウスモデルを使用した。Ｔｒｆ１欠損は、ｐｌ：ｐＣの投与、およびそれに続くＣｒｅリコンビナーゼの発現によって誘発することができる（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。Ｔｒｆ１が枯渇した細胞は死に、骨髄から迅速に除去する一方で、完全なままのＴｒｆ１を維持する細胞は、急速なテロメアの短縮化、続いて複製老化、および最終的に骨髄不全をもたらすことにつながる細胞分裂の代償性期間を経る。ここでの特定の実験的設定において、我々は、マウスに週３回、合計５週間の期間、ｐＩ：ｐＣを注入することによってＴｒｆ１欠損を誘発し、この時点で、これらのマウスは、再生不良性貧血の徴候を示し始める（Ｂｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。Ｔｒｆ１欠損の誘発を中止した１週間後、マウスを、ＡＡＶ９−ＴｅｒｔまたはＡＡＶ９−空対照ベクターを用いた遺伝子治療に供した。我々は、ＡＡＶ９ベクターでの治療後、１００日間、これらのマウスの生存を監視した。際立ったことに、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔ治療は、空のベクターで治療したマウス（５５％）と比較して、生存を大幅に改善した（８７％）（図１Ａ）。具体的には、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔを注入したわずか４匹のマウスが、この期間に再生不良性貧血を発症した（１３％）一方で、対照群の１６匹のマウス（４４％）が、再生不良性貧血の明らかな徴候を伴って死亡した（図１Ｂ、Ｃ）。貧血症の出現と一致して、これらのマウス（犠牲の上でＡＡＶ９−空およびＡＡＶ９−Ｔｅｒｔから抜き取った血液）からの血球数分析は、再生不良性貧血の徴候のないマウスと比較して、血小板計数およびヘモグロビンレベルにおける大幅な低下を示した（図１Ｄ、Ｅ）。最初の１００日で死亡したマウスからの骨髄切片の死後病理組織学的分析は、再生不良性貧血表現型をさらに確認した。具体的には、マウスは、２つまたは３つすべての血液系列において、重度の骨髄低形成および無形成を呈した。両方の群における死亡の時点での診断が、骨髄不全および無形成であった一方で表現型は、ＡＡＶ９−空群と比較して、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔ群においてより軽度のようであった。
【００８８】
我々の結果は、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔ遺伝子治療が血液形成造血細胞の喪失を防ぐことにより、再生不良性貧血の死亡率を大幅に低減することを示唆する。
【００８９】
テロメラーゼ治療は、末梢血および骨髄におけるテロメア伸長をもたらす
我々のマウスモデルにおける再生不良性貧血表現型は、テロメアの喪失によって引き起こされるため、次に我々は、テロメラーゼで治療したマウスにおけるテロメア長を、対照ベクターを受けるマウスと比較した。まず、我々は、ＨＴ−Ｑ−ＦＩＳＨ技法を使用して（Ｃａｎｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７ｂ）、長手方向様式で末梢血単球中のテロメア長を観察した。そうするために、我々は、骨髄生着後（１）、ｐＩ：ｐＣ治療後（２）、ＡＡＶ９注入から２ヶ月後（３）、およびＡＡＶ９注入から４ヶ月後（４）の、４つの異なる時点で血液を抜き取った。予測した通り、我々は、両グループにおいて、時点１と２との間のテロメア長がｐＩ：ｐＣ治療に起因して、おおよそ１０ｋｂ低下したことを見出した。わずかに短縮化するために連続した時点２と４との間のＡＡＶ９−空群におけるテロメア長である一方で、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔ治療は、１０ｋｂの平均テロメアの純増をもたらした（図２Ａ、Ｂ）。この実験の過程を通して、ＡＡＶ９−空で治療したマウスが１２ｋｂの平均テロメア長喪失を示したのに対し、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔで治療したマウスのテロメアは、ｐＩ：ｐＣ治療前と同様のレベルにまで再伸長された（図２Ｃ）。次に、我々は、骨髄断面に対してＱ−ＦＩＳＨ分析を行った。末梢血中のより長いテロメア長と一致して、我々は、ＡＡＶ９−Ｔｅｒｔで治療したマウスが空のベクターで治療したマウスと比較して、大幅により長いテロメアを有したことを見出した（図２Ｄ、Ｅ）。
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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