(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タグ付き核酸配列を形成する方法であって、
（ｉ）標的ポリヌクレオチドを固体支持体に固定するステップであって、
（ａ）固体支持体にＲＮＡ分子を捕捉することにより捕捉ＲＮＡを形成するステップと；
（ｂ）前記捕捉ＲＮＡを逆転写し、その後、捕捉ＲＮＡを取り除くことにより、前記固体支持体に固定された標的ポリヌクレオチドを形成するステップと；
を含み、これにより、固定化標的ポリヌクレオチドを形成するステップと；
（ｉｉ）前記固定化標的ポリヌクレオチドに認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み標的ポリヌクレオチドを含む、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済み標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｖ）前記切断済み標的ポリヌクレオチドにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、タグ付き核酸配列を形成するステップであって、前記アダプター核酸配列は、前記固体支持体に共有結合的に結合する第１アンカーポリヌクレオチドの第１増幅核酸配列相補体を含むステップと；
を含む、方法。
【請求項２】
前記固体支持体はビーズ構造を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１増幅核酸配列相補体を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で前記第１増幅核酸配列にハイブリダイズすることにより、前記タグ付き核酸配列を増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成する方法であって、
（ｉ）複数の不均一な標的ポリヌクレオチドを、請求項１に記載のステップ（ａ）および（ｂ）を行うことにより固体支持体に固定し、複数の不均一な固定化標的ポリヌクレオチドを形成するステップと；
（ｉｉ）前記不均一な固定化標的ポリヌクレオチドに複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、複数の認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを切断剤で切断することにより、複数の切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済み標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｖ）前記複数の切断済み標的ポリヌクレオチドにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成するステップであって、前記アダプター核酸配列は、前記固体支持体に共有結合的に結合する第１アンカーポリヌクレオチドの第１増幅核酸配列相補体を含むステップと；
を含む、方法。
【請求項５】
複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドを含む認識オリゴヌクレオチドのライブラリであって、該不均一な認識オリゴヌクレオチドはそれぞれ、請求項１に記載の方法における使用のための縮重核酸配列が隣接する制限酵素認識配列を含む、ライブラリ。
【請求項６】
ｃＤＮＡ配列を増幅する方法であって、
（ｉ）単離細胞から抽出したＲＮＡ分子を固体支持体に固定することにより、固定化リボ核酸配列を形成するステップと；
（ｉｉ）前記固定化リボ核酸配列を逆転写することにより、固定化ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｉｉｉ）前記リボ核酸配列を前記ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、固定化ｃＤＮＡ配列を形成するステップと；
（ｉｖ）前記固定化ｃＤＮＡ配列に認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｖ）前記認識オリゴヌクレオチド：ｃＤＮＡハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド：切断済みｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；
（ｖｉ）前記切断済みｃＤＮＡにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、タグ付きｃＤＮＡ配列を形成するステップであって、前記アダプター核酸配列は、前記固体支持体に共有結合的に結合する第１アンカーポリヌクレオチドの第１増幅核酸配列相補体を含むステップと；
（ｖｉｉ）前記ｃＤＮＡ配列をクローン増幅により増幅するステップと；
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
〔関連出願〕
本出願は、２０１４年５月８日出願の米国仮特許出願第６１／９９０，５９８号および２０１４年１１月１３日出願の同第６２／０７９，４９５号の優先権を主張する。前記２つの優先権出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は、核酸アッセイに関し、本出願は遺伝学、医学、および農学の分野に属する。本明細書で提供する方法および組成物は、不均一な細胞集団における核酸配列決定および遺伝子発現分析に有用である。
【背景技術】
【０００３】
核酸配列決定は、所定の核酸断片のヌクレオチドの並び順を求めるプロセスである。元のチェインターミネーション配列決定法は、修飾ヌクレオチド基質を用いたＤＮＡ合成反応の配列特異的な停止を利用する。ゲノムまたは発現ライブラリといった生体試料の核酸配列を求めるスピードを改善し、そのコストを低減するため、新しい配列決定技法の開発が進められている。このような方法を商業的に適用して、例えば、遺伝性または伝染性の疾患を特定および診断することが可能であり、そして、その治療法を開発できる可能性がある。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、タグ付き核酸配列を形成する方法を提供する。標的ポリヌクレオチドを固体支持体に固定し；認識オリゴヌクレオチドをそれにハイブリダイズし；認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを切断し；そして、切断済み標的ポリヌクレオチドにアダプター核酸をライゲーションすることにより、タグ付き核酸配列を形成する。タグ付き一本鎖ｃＤＮＡを形成する方法；複数の不均一なタグ付き核酸配列を形成する方法；認識オリゴヌクレオチドのライブラリ；および、固体支持体に固定したｃＤＮＡ配列を増幅する方法も提供する。これらの方法および生成物は、集積した単一細胞の配列決定に、単独で、または、組み合わせて用いることが可能であり、そして、マイクロ流体装置またはマイクロ流体デバイスでの使用に適応させることが可能である。
【０００５】
本発明に記載のタグ付き核酸配列を形成する方法は、（ｉ）標的ポリヌクレオチドを固体支持体に固定することにより、固定化標的ポリヌクレオチドを形成するステップと；（ｉｉ）前記固定化標的ポリヌクレオチドに認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み標的ポリヌクレオチドを含む切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済み標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；（ｉｖ）前記切断物にアダプター核酸配列をライゲーションするステップと、を含み得る。
【０００６】
複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成する方法も提供する。これは、（ｉ）複数の不均一な標的ポリヌクレオチドを固体支持体に固定することにより、複数の不均一な固定化標的ポリヌクレオチドを形成するステップと；（ｉｉ）前記不均一な固定化標的ポリヌクレオチドに複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、複数の認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを切断剤で切断することにより、複数の切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済み標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成するステップと；（ｉｖ）前記複数の切断済み標的ポリヌクレオチドにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成するステップと、を含み得る。
【０００７】
タグ付き一本鎖ｃＤＮＡを形成する方法も提供する。これは、（ｉ）標的ｃＤＮＡを固体支持体に固定することにより、固定化標的ｃＤＮＡを形成するステップと；（ｉｉ）前記固定化標的ｃＤＮＡに認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−ｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド−ｃＤＮＡハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済みｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｉｖ）前記切断済みｃＤＮＡにアダプター核酸をライゲーションすることにより、タグ付き一本鎖ｃＤＮＡを形成するステップと、を含み得る。
【０００８】
本発明はさらに、タグ付き核酸配列を形成する方法を提供する。これは、（ｉ）標的リボ核酸を固体支持体に固定することにより、固定化標的リボ核酸（ＲＮＡ）を形成するステップと；（ｉｉ）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することにより、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｉｉｉ）前記ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ｃＤＮＡ切断剤で切断して切断済みＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを生成するステップであって、該ｃＤＮＡはライゲーション可能な末端を含む、ステップと；（ｉｖ）前記ライゲーション可能な末端にアダプターオリゴヌクレオチドをライゲーションするステップと；（ｖ）前記リボ核酸配列を前記ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、タグ付き核酸配列を形成するステップと、を含み得る。
【０００９】
複数の不均一なタグ付き核酸配列を形成する方法も提供する。これは、（ｉ）複数の不均一な標的リボ核酸配列を固体支持体に固定することにより、複数の不均一な固定化標的リボ核酸配列を形成するステップと；（ｉｉ）前記不均一な固定化標的リボ核酸配列を逆転写することにより、複数の不均一なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｉｉｉ）前記複数の不均一なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ＤＮＡ切断剤で切断することにより、複数の切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｉｖ）前記複数の切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにアダプター核酸配列をライゲーションするステップと；（ｖ）前記リボ核酸配列を前記切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、複数の不均一なタグ付き核酸配列を形成するステップと、を含み得る。
【００１０】
このような方法を用いて、複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドを含む認識オリゴヌクレオチドライブラリを調製することが可能であり、該複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドはそれぞれ、縮重核酸配列が隣接する制限酵素認識配列を備える。切断剤は制限酵素とすることができ、ライブラリはマイクロ流体装置の一部として含めることができる。
【００１１】
本発明はさらに、ｃＤＮＡ配列を増幅する方法を提供する。これは、（ｉ）単離細胞から抽出したＲＮＡ分子を固体支持体に固定することにより、固定化リボ核酸配列を形成するステップと；（ｉｉ）前記固定化リボ核酸配列を逆転写することにより、固定化ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｉｉｉ）前記リボ核酸配列を前記ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、固定化ｃＤＮＡ配列を形成するステップと；（ｉｖ）前記固定化ｃＤＮＡ配列に認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｖ）前記認識オリゴヌクレオチド：ｃＤＮＡハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド：切断済みｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｖｉ）前記切断済みｃＤＮＡにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、タグ付きｃＤＮＡ配列を形成するステップと；（ｖｉｉ）前記タグ付きｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で増幅核酸配列にハイブリダイズすることにより、ｃＤＮＡ配列を増幅するステップと、を含み得る。
【００１２】
本開示で提供する別の方法は、ｃＤＮＡ配列を増幅する方法である。これは、（ｉ）単離細胞から抽出したＲＮＡ分子を固体支持体に固定することにより、固定化リボ核酸配列を形成するステップと；（ｉｉ）前記固定化リボ核酸配列を逆転写することにより、固定化ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｉｉｉ）前記ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ＤＮＡ切断剤で切断することにより、切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｉｖ）前記切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにアダプター核酸配列をライゲーションするステップと；（ｖ）前記リボ核酸を前記切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、タグ付きｃＤＮＡ配列を形成するステップと、（ｖｉ）前記タグ付きｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で増幅核酸配列に接触させることにより、前記ｃＤＮＡ配列を増幅するステップと、を含み得る。
【００１３】
一態様では、タグ付き核酸配列を形成する方法を提供する。該方法は、（ｉ）標的リボ核酸を固体支持体に固定することにより、固定化標的リボ核酸（ＲＮＡ）を形成するステップと；（ｉｉ）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成することにより、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｉｉｉ）前記ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ｃＤＮＡ切断剤で切断して、切断済みＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを生成するステップであって、該ｃＤＮＡはライゲーション可能な末端を含む、ステップと；（ｉｖ）前記ライゲーション可能な末端にアダプターオリゴヌクレオチドをライゲーションするステップと；（ｖ）前記リボ核酸配列を前記ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、タグ付き核酸配列を形成するステップと、を含む。このアプローチの一実施形態を図１〜７に示す。
【００１４】
さらなる態様において、タグ付き核酸配列を形成する方法を提供する。該方法は、（ｉ）標的リボ核酸を固体支持体に固定することにより、固定化標的リボ核酸（ＲＮＡ）を形成するステップと；（ｉｉ）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を合成し、前記標的ＲＮＡを取り除くステップと；（ｉｉｉ）前記固定化標的ｃＤＮＡに認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド：ｃＤＮＡハイブリッドを形成するステップと；（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド：ｃＤＮＡハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド：切断済みｄＤＮＡハイブリッドを形成するステップであって、該ｃＤＮＡはライゲーション可能な末端を含む、ステップと；（ｉｖ）前記ライゲーション可能な末端にアダプターオリゴヌクレオチドをライゲーションすることにより、タグ付き核酸配列を形成するステップとを含む。このアプローチの一実施形態を図８および９に示す。
【００１５】
単独で、または、前記生成物および方法と組み合わせて用いることが可能な他の発明の生成物、方法、および特徴を、以下の記載および実施例により明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】固定化核酸配列にタグを付ける方法を段階的に描写した図である。
【図２】アンカーポリヌクレオチドにアニールしたＲＮＡを示す図である。
【図３】第１鎖ｃＤＮＡおよびＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを示す図である。
【図４】制限エンドヌクレアーゼでＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを切断した結果を示す図である。
【図５】切断済みｃＤＮＡ分子の自由3'末端にライゲーションしたアダプターオリゴヌクレオチドを示す図である。
【図６Ａ】ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドの一本鎖オーバーハングをｃＤＮＡ分子によりもたらす、関連アプローチを示す図である。
【図６Ｂ】ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドの一本鎖オーバーハングをＲＮＡ分子によりもたらす、別のアプローチを示す図である。
【図７】ＲＮＡを、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドから取り除いた結果を示す図である。
【図８】固定化核酸配列をタグ付けする別の方法であって、その際ｃＤＮＡ：オリゴヌクレオチドハイブリッドを切断する方法を、段階的に描写した図である。
【図９】固定化核酸配列をタグ付けする別の方法であって、その際ｃＤＮＡを表面で増幅する方法を、段階的に描写した図である。
【図１０】ｃＤＮＡ第２鎖をブリッジ増幅により合成する際の異なるステップを示す図である。
【図１１】ｃＤＮＡ第２鎖をブリッジ増幅により合成する際の異なるステップを示す図である。
【図１２】ｃＤＮＡ第２鎖をブリッジ増幅により合成する際の異なるステップを示す図である。
【図１３】ｃＤＮＡ第２鎖をブリッジ増幅により合成する際の異なるステップを示す図である。
【図１４】配列決定の前に如何に鎖の一つを取り除き、配列決定する一本鎖ローン（a lawn of single strands）をもたらすかを示す図である。
【図１５】ポリアデニル化ｍＲＮＡを、固定化ポリ（Ｔ）配列にハイブリダイズすることにより調製する、いわゆるwildfire増幅を示す図である。
【図１６】ポリアデニル化ｍＲＮＡを、固定化ポリ（Ｔ）配列にハイブリダイズすることにより調製する、いわゆるwildfire増幅を示す図である。
【図１７】ビーズベース配列決定反応を用いたオンチップ（on-chip）配列決定を示す図である。
【図１８】配列決定ビーズ（またはサロゲート）をフィラービーズにより分離すると、個々のビーズからのシグナルを識別可能であることを示す蛍光画像である。
【図１９】フィラービーズがない場合に個々の配列決定ビーズを如何に識別するかを示す、別の蛍光画像である。
【図２０】ｍＲＮＡおよびビーズを、第１チャンバに入れる前に組み合わせ、その後、増幅および配列画像作成を第２チャンバで行うことを示す図である。
【図２１】核酸の表面への取付けに際し起こり得る化学反応を示すチャートである。
【図２２】ガラス表面へのオリゴヌクレオチド結合を段階的に描写した図である。
【図２３】第２チャンバからのシグナルを、カメラを用いて収集する装置の例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書では、核酸配列をタグ付けし増幅するための方法および組成物を提供する。提供する方法および組成物は、特に単一細胞の配列決定手順に有用であり、該方法および組成物を用いて不均一な細胞集団の個々の細胞のＲＮＡ発現プロファイルを決定することができる。
【００１８】
Ｐａｒｔ１は、固定化核酸配列にタグ付けする方法について記載する。
【００１９】
Ｐａｒｔ２は、タグ付き核酸配列の増幅および配列決定について記載する。
【００２０】
Ｐａｒｔ３は、配列決定およびデータ収集のための方法について記載する。
【００２１】
Ｐａｒｔ４は、集積マイクロ流体装置について記載する。
【００２２】
Ｐａｒｔ５は、Ｐａｒｔ１〜４に記載の、ある要素についての追加説明を記載する。
【００２３】
Ｐａｒｔ１：固定化核酸配列にタグ付けする方法
一態様において、本発明は、標的ＲＮＡの固定化、該標的ＲＮＡの少なくとも一部分に対し相補的なｃＤＮＡ配列の生成、該ｃＤＮＡ配列を切断することによる新しい自由末端の生成、および、アダプター配列を該新しい自由末端にライゲーションすることによるｃＤＮＡのタグ付けに関する。
【００２４】
１．第１アプローチ−ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの切断
１．１．ｃＤＮＡの生成
第１アプローチは図１に概要を示し、図２〜６Ｂに図示する。図１〜６は、例示的実施形態であり、発明はこれに限定されることはなく、様々な変形が本明細書の下記で論じられるか、または、読者にとって明らかであろうことが理解されよう。図示する実施形態では、ＲＮＡ２００、典型的にはｍＲＮＡを表面１００に固定化（または「捕捉」）する（図２を参照）。一部の実施形態において、表面１００はビーズである。他の実施形態では、表面は実質的に平面とすることができる。図示するように、ＲＮＡは、表面に固定したアンカーポリヌクレオチド５０にアニールすることにより捕捉することができる。一アプローチでは、ｍＲＮＡのポリＡテール５５を、アンカーポリヌクレオチドのオリゴｄ（Ｔ）部分５１にアニールする。オリゴｄ（Ｔ）部分５１は、ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）反応などを準備するのに適切であり、自由5'末端を含む（図２）。一部の実施形態では、ＲＮＡを、オリゴｄ（Ｔ）以外のアンカーポリヌクレオチドの配列、例えば、転写産物特異的配列にアニールする。一部の実施形態では、ＲＮＡはポリ（Ａ）テールを含まない。簡単にするため、ＲＮＡはｍＲＮＡと呼び、ＲＮＡをアニールする捕捉配列は、オリゴｄ（Ｔ）捕捉配列と呼ぶこととする。
【００２５】
以下でさらに詳細に述べるように、一部の実施形態では、アンカーポリヌクレオチドは、オリゴｄ（Ｔ）捕捉配列に加え、増幅プライマー配列（ＡＰ１’）５３を含む。アンカーポリヌクレオチドはまた、切断部位配列（ＣＳ２）５２を含み得る。切断部位配列は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列とすることができる。
【００２６】
固定化ｍＲＮＡをオリゴｄ（Ｔ）プライマーから逆転写し、表面に固定した第１鎖ｃＤＮＡ３０１およびＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッド３００（図３）を生成する。重合反応の後、逆転写酵素は任意で、例えば加熱により不活性化してよい。
【００２７】
１．２．ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドの切断
ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドを、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）を用いて切断して、自由ＲＮＡ5'末端および自由ＤＮＡ3'末端を生成する（図４）。ＲＥは、ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの制限部位（ＲＳＴ１：ＲＳＴ１’）で切断する。一実施形態では、切断により生じた末端を互い違いにし、粘着末端を生成する（図４）。一実施形態では、ＲＥは平滑末端を生成する。ＲＥの特徴を以下で述べる。切断ステップ後、ＲＥは不活性化（例えば、加熱不活性化）してよい。
【００２８】
１．３．アダプターオリゴヌクレオチドのライゲーション
アダプターオリゴヌクレオチド３１０を、例えばＤＮＡリガーゼを用いて、切断済みｃＤＮＡ分子の自由3'末端にライゲーションする。任意の適切なライゲーション方法を用いることができる。図５に示すように、アダプターオリゴヌクレオチドは、増幅プライマー配列（ＡＰ１’）５３の第２コピーを含む。
【００２９】
一アプローチにおいて、アダプターオリゴヌクレオチドのライゲーションは、部分的に二本鎖であるポリヌクレオチド３２０（その一方の鎖がアダプターオリゴヌクレオチドである）を、ＲＥ切断により生成した粘着末端にアニールするステップを含む。粘着末端の性質は、典型的には、ＲＥの選択により決まるだろう。一アプローチでは、切断済みＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドの一本鎖オーバーハングを、図４に示すようにｍＲＮＡ分子テンプレートによりもたらす。このアプローチでは、部分的に二本鎖であるアダプター構成をＲＮＡにアニールする。該アダプター構成では、突出鎖がＲＮＡ分子の一本鎖オーバーハングに対し相補的である。アダプターの突出鎖の5'末端を切断済みｃＤＮＡの3'末端にライゲーションすることにより、タグ付き核酸分子を生成する。
【００３０】
関連アプローチでは、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドの一本鎖オーバーハングを、図６Ａに示すようにｃＤＮＡ分子によりもたらす。本アプローチでは、部分的に二本鎖であるアダプター構成をｃＤＮＡにアニールする。該アダプター構成では、突出鎖がｃＤＮＡ分子の一本鎖オーバーハングに対し相補的である。アダプターの非突出鎖の5'末端を、切断済みｃＤＮＡの3'末端にライゲーションすることにより、タグ付き核酸分子を生成する。
【００３１】
ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドの一本鎖オーバーハングをＲＮＡ分子によりもたらす別のアプローチでは、図６Ｂに示すように、（部分的に二本鎖の分子ではなく）一本鎖アダプターオリゴヌクレオチドの、ＲＮＡ分子の一本鎖オーバーハングに対し相補的な5'領域を、ＲＮＡにアニールする。一本鎖アダプターオリゴヌクレオチドの5'末端を、切断済みｃＤＮＡの3'末端にライゲーションすることにより、タグ付き核酸分子を生成する。
【００３２】
別の実施形態では、アダプターをｃＤＮＡに直接隣接させてアニールせず、ライゲーションの前にポリメラーゼをギャップ埋めに用いる。
【００３３】
別のアプローチでは、ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの切断により平滑末端を生成する。アダプターオリゴヌクレオチドのライゲーションは、アダプターオリゴヌクレオチド３１０を含む二本鎖ポリヌクレオチドを、平滑末端にライゲーションすることにより達成することが可能である。これは、同様にタグ付けされたｃＤＮＡ分子の不均一な混合物をもたらす。
【００３４】
オリゴヌクレオチドを一本鎖ｃＤＮＡにライゲーションするための例示的リガーゼは、任意でヘキサミン塩化コバルトが存在するところのＴ４ＲＮＡリガーゼ１（Troutt et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:9823-25）である。
【００３５】
ライゲーションステップの後、リガーゼは不活性化（例えば、加熱不活性化）してよい。
【００３６】
１．４．ＲＮＡの除去
ＲＮＡをＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドから取り除く。ＲＮＡは、酵素的、化学的、または熱的に取り除くことができる。一部の実施形態では、ＲＮＡを分解する。結果は、アダプターをタグ付けされた固定化結合一本鎖ｃＤＮＡ（図７）、つまり、タグ付き核酸分子である。一実施形態では、ＲＮＡを、ＲＮアーゼＨなどのリボヌクレアーゼを用いてハイブリッドから取り除く。
【００３７】
１．５．多数のアダプターオリゴヌクレオチド
しばしば、図面に示すように、単一アダプターオリゴヌクレオチド３１０を用いる。しかしながら、一部の実施形態では、２つ以上の異なるアダプターオリゴヌクレオチドを用いる。一アプローチでは、異なるアダプターオリゴヌクレオチドは、異なるＲＥ部位に適合し、ＲＮＡを異なるＲＥ部位と共に同一反応で処理することを可能にする。
【００３８】
別の例では、異なるアダプターオリゴヌクレオチドを、異なるＡＰ１’配列を用いることにより識別する。例えば、第１ＡＰ１’配列５３、第１配列特異的捕捉配列、および第１制限部位を含む第１ｃＤＮＡオリゴヌクレオチドアンカー５０、ならびに第１ＡＰ１’配列を含むアダプターオリゴヌクレオチドを、第２ＡＰ１’配列５３、第１とは異なる第２配列特異的捕捉配列、および第２制限部位を含む第２アンカーオリゴヌクレオチド５０、ならびに第１ＡＰ１’配列を含むアダプターオリゴヌクレオチドと組み合わせて用いることができる。このやり方では、多数の配列特異的捕捉配列を用いて不均一な混合物を生成することが可能であり、ここでは一部の核酸種（例えばｃＤＮＡ）はあるタグでタグ付けされ、一部の核酸種（例えば、ｃＤＮＡ）は別のタグでタグ付けされる。
【００３９】
１．６．追加の処理ステップ
固定化タグ付き核酸分子は、典型的には、以下で記載するように、表面でのクローン増幅および配列決定といった追加の処理ステップにかける。
【００４０】
２．第２アプローチ−ｃＤＮＡ：オリゴヌクレオチドハイブリッドの切断
第２タグ付けアプローチを図８および９に示す。図８および９はある実施形態を示すが発明はこれに限定されることはなく、様々な変形が本明細書の下記で論じられるか、または、読者にとって明らかであろうことが理解されよう。
【００４１】
２．１．ｃＤＮＡの生成
この実施形態では、ポリＡテールを固定化オリゴｄ（Ｔ）含有アンカーポリヌクレオチドにアニールすることにより、ｍＲＮＡ６０を、上記セクション１．１にも記載するように表面（例えばビーズ）６１に固定する。固定化ｍＲＮＡを上記セクション１．１に記載するように逆転写して、第１鎖ｃＤＮＡ６３が表面に固定されているＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッド６２を生成する。
【００４２】
２．２．ＲＮＡの除去
ＲＮＡを、例えば、ＲＮアーゼＨなどのリボヌクレアーゼで処置するといった、化学的、熱的、または酵素的な方法を用いてハイブリッドから取り除き、一本鎖固定化ｃＤＮＡを残す。
【００４３】
２．３．ｃＤＮＡ：認識オリゴヌクレオチドハイブリッドの生成
固定化ｃＤＮＡを、次に、認識オリゴヌクレオチド６４にハイブリダイズする。該認識オリゴヌクレオチド６４はｃＤＮＡの一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ｃＤＮＡの一部を二本鎖にし、制限酵素で消化しやすくする。ｃＤＮＡと認識オチゴヌクレオチドとの間の相補度は、二本鎖領域（例えば、ｃＤＮＡ：オリゴハイブリッド）をもたらすのに十分な程度であり、該二本鎖領域は、オリゴヌクレオチド：ｃＤＮＡハイブリッドを認識しｃＤＮＡを切断する、特異的制限エンドヌクレアーゼにより認識することが可能である。認識オリゴヌクレオチドの長さは典型的には、少なくとも１２塩基、通常は少なくとも１５塩基、時には少なくとも２５塩基であろう。
【００４４】
一部の実施形態では、単一認識オリゴヌクレオチドを用いてアッセイを実行する。一部の実施形態では、多数の異なる認識オリゴヌクレオチドを用いる。異なる認識オリゴヌクレオチドを用いる場合、それらを異なるｃＤＮＡ配列にアニールして、異なる制限エンドヌクレアーゼにより認識される二本鎖領域を生成する。あるいは、それらを異なるｃＤＮＡ配列にアニールして、同一の制限エンドヌクレアーゼにより認識されるものの、（例えば）オリゴ：ｃＤＮＡハイブリッドの安定性を増大する隣接配列を有する、二本鎖領域を生成することができる。これは、非常に不均一な配列集団とともに作用する場合、高い自由度を提供する。これは、ライゲーション可能な末端を生成する異なる制限エンドヌクレアーゼの組み合わせ、または単一の制限エンドヌクレアーゼを用いて、種々の制限部位または隣接配列を有する基質から、ライゲーション可能な末端を生成することができるためである。
【００４５】
一部の場合では、セクション４．２で記載するように、認識オリゴヌクレオチドの縮重集団を用いて、不均一集団のライゲーション可能な末端を生成する。
【００４６】
２．４．ｃＤＮＡ：オリゴヌクレオチドハイブリッドの切断
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むオリゴヌクレオチド：ｃＤＮＡハイブリッドを、固定化ｃＤＮＡを切断する特異的な制限エンドヌクレアーゼにより認識する。ＲＥの作用により自由3'ｃＤＮＡ末端を生成する。認識オリゴヌクレオチドおよび制限エンドヌクレアーゼの選択に応じて、固定化切断生成物は平滑末端または粘着末端は有することが可能である。粘着末端は、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドについての上記セクション１．３で述べたｃＤＮＡ：ＲＮＡ切断生成物に似て、ｃＤＮＡまたは認識オリゴヌクレオチドによりもたらされる一本鎖オーバーハングを含むことが可能である。
【００４７】
２．５．アダプターオリゴヌクレオチドのライゲーション
アダプターオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ：ｃＤＮＡハイブリッドについての上記セクション１．３の記載に類似して、切断済みｃＤＮＡ分子の自由3'末端にライゲーションすることができ、これは、タグ付きｃＤＮＡ、または、より一般的には、不均一なタグ付き固定化ｃＤＮＡ集団を含む一つもしくは複数の表面をもたらす。
【００４８】
２．６．追加の処理ステップ
典型的には、固定化タグ付き核酸分子は、以下で記載するように、表面でのクローン増幅および配列決定といった追加の処理ステップにかける。
【００４９】
３．制限エンドヌクレアーゼ／制限エンドヌクレアーゼ認識部位の選択
３．１．一般的な特性
上記のように、アダプターオリゴヌクレオチドの添加の前に、ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドまたはｃＤＮＡ：認識オリゴヌクレオチドハイブリッドを、制限エンドヌクレアーゼで切断する。本明細書で用いる場合、制限エンドヌクレアーゼは、特異的認識ヌクレオチド配列（制限部位）において、またはその近くで、ＤＮＡを切断する酵素である。例えば、Roberts et al., 2007 “REBASE-enzymes and genes for DNA restriction and modification,” Nucleic Acids Res35 (Database issue): D269-70；http site rebase.neb.comを参照のこと。限定ではなく例示として、本発明で用いる制限酵素には、タイプＩ酵素（EC 3.1.21.3）、タイプＩＩおよびタイプＩＩＰなどのタイプＩＩ酵素（EC 3.1.21.4）、ならびに、タイプＩＩＩ酵素（EC 3.1.21.5）が含まれる。制限酵素は天然で発生し、組み換え生成することができ、そして、（多数の異なるタンパク質に由来する配列を含むような）人工的とすることができる。
【００５０】
一部の実施形態で、ＲＥは3'突出粘着末端を生成する。一部の実施形態では、ＲＥは5'突出粘着末端を生成する。一部の実施形態では、ＲＥは平滑末端を生成する。
【００５１】
一部の実施形態で、ＲＥはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖を切断する。
【００５２】
一部の実施形態では、ＲＥはＢａｅＧ１であり、これは、次の制限部位を認識する。
【００５３】
【化１】
0006716465.tif 000002
【００５４】
一部の実施形態で、ＲＥはタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼであり、これは２〜３０のヌクレオチドを認識部位から切り離す。いくつかのタイプＩＩエンドヌクレアーゼは「カッターそのもの」であり、既知の数の塩基をその認識部位から切り出す。一部の実施形態では、粘着末端のオーバーハングの長さは少なくとも２塩基、少なくとも最低２塩基、少なくとも３塩基、少なくとも４塩基、少なくとも５塩基、少なくとも６塩基、または、少なくとも６超の塩基である。
【００５５】
制限エンドヌクレアーゼの選択、および、ｃＤＮＡ：認識オリゴヌクレオチドハイブリッドの場合、認識オリゴヌクレオチド配列の設計には、いくつかの所望の目標を考慮する。
（ｉ）ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断する第１アプローチでは、酵素はそのようなハイブリッドを切断可能であるべきである。
（ｉｉ）部位は、多数の異なるＲＮＡ種に存在し、その結果、十分な数のｃＤＮＡがタグ付けされるべきである。「十分な数」とは、大部分、ほぼ全て、大多数、または、大多数より少ないサブセットとすることができる。
（ｉｉｉ）固定化切断済みｃＤＮＡの長さは、配列決定目標に十分であり（通常、少なくとも１５〜２０塩基）、配列決定反応を起こすためにそれを固定する基質から十分に離れているべきである。以下で論じるように、多くのＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの配列を特定するのに必要なのは、ｃＤＮＡまたはゲノム配列の一部のみである（例えば、既知の配列データベースを参照することにより特異的ＲＮＡを特定するには、部分配列で十分である）。
（ｉｖ）固定化切断済みｃＤＮＡの長さは、使用する増幅方法と適合すべきである。
【００５６】
３．２．ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの切断
ｃＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断する方法では、適切な酵素がそのようなハイブリッドを認識しよう。例えば、適切な酵素には、AvaII、AvrII、BanI、HaeIII、HinfI、およびTaqIが含まれる（Murray et al., 2010, Sequence-specific cleavage of RNA by Type II restriction enzymes” Nucleic Acids Res. 38:8257-68を参照）が、これらに限定されない。
【００５７】
３．３．切断頻度
一アプローチでは、制限酵素部位は、平均長さが約２５０塩基対、例えば、５０〜５００塩基対、または、１５０〜３５０塩基対の標的ポリヌクレオチドの形成を可能にする頻度で、ソースである生物のＲＮＡ（ｃＤＮＡ）に発生する。好適には、固定化ｃＤＮＡのほとんど（例えば、５０％超、７５％超、８０％超、９０％超、または９５％超）が切断およびタグ付けされ、ほとんど（例えば、５０％超、７５％超、８０％超、９０％超、または９５％超）の固定化タグ付きｃＤＮＡの長さが、少なくとも２５塩基、または少なくとも４０塩基、または少なくとも５０塩基、または少なくとも７５塩基、または少なくとも１００塩基、または少なくとも１５０塩基である。
【００５８】
下記の表１は、ＲＥ選択の特異性を提供し、ヒトゲノムＤＮＡに基づく計算済み均断片長さを提供する（出所：New England BioLabs、www.neb.com/tools-and-resources/selection-charts/frequencies-of-restriction-sites）。ほとんどのＲＮＡサンプルが、ゲノム配列について計算した頻度および長さより逸脱すると予想され得るが、表１は、（個々の、または組み合わせた）酵素が上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の目標を達成するために選択され得ることを示す。表１の酵素のすべてが有用というわけではないであろうこと（例えば、BstEII認識部位は、ほとんどのサンプルで非常に稀な可能性がある）、そして、有用な酵素のすべてが表１に含まれているわけではないこと（例えば、ＢａｅＧ１は表１にない）は、明確に理解されたい。
【００５９】
あるいは、酵素は、該酵素で消化することにより生成したｃＤＮＡの長さについての実証的分析に基づいて選択することが可能である。
【００６０】
【表１−１】
0006716465.tif 000003
【表１−２】
0006716465.tif 000004
【表１−３】
0006716465.tif 000005
B＝CまたはGまたはT；D＝AまたはGまたはT；H＝AまたはCまたはT；K＝GまたはT；
M＝AまたはC；N＝AまたはCまたはGまたはT；R＝AまたはG；S＝CまたはG；V＝AまたはCまたはG；W＝AまたはT；Y＝CまたはT。
【００６１】
４．認識オリゴヌクレオチドの設計
本明細書で提供する方法では、認識オリゴヌクレオチドを固定化標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する。ハイブリッドの形成は、制限酵素による切断と、それに続く、二本鎖「アダプター」構成をライゲーションする自由ＤＮＡ末端の形成を可能にする。
【００６２】
４．１．認識オリゴヌクレオチドの構造
認識オリゴヌクレオチドは、上記セクション３（ａ）（ｉ）〜（ｉｖ）の考察を考慮して設計すべきであることが理解されよう。これは、認識オリゴヌクレオチドおよびＲＥは組み合わさって、ｃＤＮＡのうちどの位置を切断するかを決定するためである。
【００６３】
認識オリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸であり、典型的には、一本鎖ＤＮＡである。認識オリゴヌクレオチドの長さは通常、３００塩基未満であり、より頻繁には、認識オリゴヌクレオチドの長さは約１０〜約９０塩基である。例えば実施形態において、認識オリゴヌクレオチドの長さは約１５〜約８５塩基である。実施形態において、認識オリゴヌクレオチドの長さは、３５〜６５塩基、４０〜６０塩基、１５〜５５塩基、５０〜５５塩基の範囲である。実施形態において、認識オリゴヌクレオチドの長さは、約１２、約１５、約１８、約２０、約２２、約２５、約２６、約２８、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０塩基、約６５塩基、約７０塩基、約７５塩基、または約８０塩基である。実施形態では、認識オリゴヌクレオチドの長さは２６塩基である。
【００６４】
一部の実施形態では、認識オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするｃＤＮＡの配列の一部に対し厳密に相補的である。しかしながら、認識オリゴヌクレオチドと固定化ｃＤＮＡの間でのハイブリダイズは、１００％相補的であることを必要とはしない。特定の結合が望まれる条件下、例えば、部位特異的制限酵素の消化を可能とする条件下で、認識オリゴヌクレオチドが非標的配列に非特異的に結合することを避けるのに十分なほどの相補性がある場合、認識オリゴヌクレオチドおよび固定化標的ポリヌクレオチドはハイブリダイズすることが可能である。典型的には、ＲＥ認識部位で厳密な相補性がある。一部の実施形態では、認識オリゴヌクレオチドは（ｉ）構造5'-An-Xm-Bn-3’（各ｎは独立して５〜４０の整数であり、XはＲＥ認識配列であり、mは４〜１０の整数である）を有し、（ｉｉ）ｃＤＮＡ配列構造5'-A''n-X'm-B''n-3’（AおよびBは配列A''およびB''に相補的または部分的に相補的なヌクレオチド配列であり、XはX'に対し厳密に相補的である）にハイブリダイズする。
【００６５】
４．２認識オリゴヌクレオチドの縮重
一部の実施形態では、認識オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドのライブラリまたは集団であり、ここでは、ある部分が完全に縮重する（つまり、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣを有するオリゴヌクレオチドが示される）、部分的に縮重する（つまり、塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣのうち２つか３つを有するオリゴヌクレオチドが示される）、および／または、デオキシイノシンなどの「ユニバーサル」塩基により示される。
【００６６】
２つのタイプの縮重が考えられる。まず、ＲＥ認識部位の位置における縮重があり得、これは２つ以上の切断配列を有するＲＥの原因を説明する。例えば、ＢａｅＧ１は、5'-GKGCMC-3’（Ｋ＝ＧまたはＴ、および、Ｍ＝ＡまたはＣ）を認識する。ＢａｅＧ１の場合、図示のため、ライブラリは４つの異なるＲＥ認識部位：5'-GGGCAC-3’；5'-GGGCCC-3’；5'-GTGCAC-3’；5'-およびGTGCCC-3'を有する認識オリゴヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されない。
【００６７】
第２のタイプの縮重は、ＲＥ認識部位に隣接する配列における縮重である。一実施形態では隣接配列は完全に縮重し、その結果、認識オリゴヌクレオチドのライブラリからの一部のオリゴヌクレオチドは、適切なＲＥ認識部位を含む任意のｃＤＮＡにハイブリダイズすることが可能である。
【００６８】
４．３．多数の認識オリゴヌクレオチド
一部の実施形態において、ライブラリは、２つ、３つ、または４つの異なる配列といった２つ以上の切断剤認識配列を含む。実施形態において、異なる切断剤認識配列は、異なる切断剤により認識される。
【００６９】
４．４特異的標的
一部の実施形態では、１つまたは複数の特異的な配列サブセットのみに結合するように認識オリゴヌクレオチドを選択する。例えば、アクチンをコードするｃＤＮＡのみをタグ付けするように認識オリゴヌクレオチドを選択することが可能である。
【００７０】
４．５ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡの配列決定
本明細書において、ＲＮＡの特徴を描写する文脈で記載する方法、系、および装置は、本明細書に誘導された当業者には明確であろう修正（例えば、ゲノムＤＮＡを断片化し、個々の断片を配列決定する、一本鎖ＤＮＡをＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖にする）をもって、ＤＮＡ配列決定に用いることが可能であることが理解されよう。
【００７１】
Ｐａｒｔ２：タグ付き核酸配列の増幅および配列決定
下記に示す追加の処理ステップを用いて、タグ付き分子を配列決定することができる。
【００７２】
５．１表面でのクローン増幅
ある実施形態では、タグ付きｃＤＮＡテンプレートを配列決定の前に増幅し、表面（例えば、個々のビーズ上、表面の特定位置など）にテンプレート分子のクローン（二クローン性またはオリゴクローン性の）集団を生成する。クローン増幅法の例には、ブリッジ増幅およびｗｉｌｄｆｉｒｅ増幅が含まれる。しかしながら、本発明は、任意の特定の増幅法に限定されることはない。さらに、増幅は必要ではない。例えば、単一のポリヌクレオチドを特徴付けることができる。
【００７３】
下記に述べるように、個々のタグ付きｃＤＮＡ分子を増幅して同一分子のコピーのクラスタを生成することができ、これはある配列決定方法に有用なアプローチである。一実施形態では、ｍＲＮＡは物理的に異なる表面または表面上の領域（例えば、ビーズ上、ウェル中、アレイ上の位置）に捕捉する。一実施形態では、ｍＲＮＡを捕捉し、その結果、少なくとも一部の物理的に異なる領域は単一のｍＲＮＡ（例えば、１ビーズにつき１つのｍＲＮＡ、または、１ウェルにつき１つのｍＲＮＡ）を捕捉する。一実施形態では、いくつかの物理的に異なる領域はそれぞれ、平均して１つのｍＲＮＡ（物理的に異なる領域１つにつき、平均して０．５〜１．５個のｍＲＮＡ）を含む。
【００７４】
５．１．１．ブリッジ増幅
図１０は、ｃＤＮＡ第２鎖の合成を示す。第２鎖を合成するためのプライマーとして作用する相補的な配列（ＡＰ１）を含む固定化オリゴヌクレオチドに、第１鎖のＡＰ１’タグ配列をハイブリダイズする。ブリッジ増幅の周知のプロセスが、図１１〜１３に示すように続く。図１２は増幅後の表面を示し、これは配列決定用クローンテンプレートをもたらす。図１３は、ＡＰ１’に対し相補的なプライマーを用いたsequencing by synthesis法を示す。図１４は、鎖（つまり、フォワード鎖の集団またはリバース鎖の集団）のうち一つを配列決定前に取り除き、配列決定できる一本鎖のローンをもたらすことができることを示す。
【００７５】
本明細書で以下に示すように、上記ステップは、少数細胞のうちの単一細胞に由来する、ｍＲＮＡ分子集団などの大きくて不均一なｍＲＮＡ分子混合物で実行することができる。
【００７６】
５．１．２Wildfire増幅
「Wildfire」増幅（Ma et al., 2013, Isothermal amplification method for next-generation sequencing” Proc Nat Acad Sci 10:14320-23）は、固相クローン増幅に用いることが可能である。米国特許出願公開第２０１２／０１５６７２８号明細書（Wildfire amplification）および同第２０１３／０２０３６０７号明細書（WildFirePaired-End sequencing）を参照のこと。このアプローチの修正版では、図１５および１６に示すように、ポリアデニル化ｍＲＮＡを固定化ポリ（Ｔ）配列にハイブリダイズし、第１鎖ｃＤＮＡ合成を実行し、そして、ＲＮＡテンプレートを取り除いて固定化第１鎖ｃＤＮＡを残す。ｃＤＮＡは上記のようにタグ付し、その後Ｗｉｌｄｆｉｒｅ法を用いて増幅する。
【００７７】
５．２配列決定
個々の分子の配列決定（単一分子配列決定）またはクローン集団の配列決定は、Solexa（Illumina）シーケンス法、パイロシーケンス（pyrosequencing）（４５４）法、ＳＯＬｉＤシーケンス法、およびPolonatorシーケンス法などの既知の方法を用いて実行することが可能である。例えば、Shendure and Ji, 2008, “Next-generation DNA sequencing” Nature Biotechnology 26:1135-45、特に、図３およびその中で言及された参考文献を参照のこと。Shendureおよび前記参考文献は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。一部の実施形態では、sequencing-by-synthesis法を用いる。一部の実施形態において、配列決定方法はsequencing-by-synthesis法である。一部の実施形態では、可逆的ターミネーター法を用いる。
【００７８】
５．３クローン増幅なしの配列決定
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを直接的に配列決定するか、または、クローン増幅のないｃＤＮＡ合成の後もしくはそれと同時に配列決定する。例えば、Causey et al., 米国特許出願公開第２０１１０１２９８２７号明細書“Methods For Transcript Analysis”；Ozsolak et al., 2010 “Amplification-free digital gene expression profiling from minute cell quantities Nature Methods 7:619-21；Ozsolak et al., 2011 “Single-molecule direct RNA sequencing without cDNA synthesis” Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011 Jul-Aug; 2(4): 565-570； Hebenstreit, 2012, “Methods, Challenges and Potentials of Single Cell RNA-seq” Biology (Basel). 1(3):658-667；Saliba et al., 2014, “Single-cell RNA-seq: advances and future challenges,” Nucleic Acids Res. 42:8845-60を参照のこと。
【００７９】
Ｐａｒｔ３：配列決定およびデータ収集の方法
６．配列決定
ハイスループット配列決定法が既知であり、ここでは、配列決定する核酸テンプレートをビーズ、フローセル表面、または半導体などの固体支持体に固定または位置付けする。さまざまな異なる配列決定アプローチを用いることができる。蛍光または他の光を検出する配列決定法では、異なるテンプレート分子またはクローン集団（例えば、増幅クラスタ）を物理的に分離して配置し、その結果、異なるテンプレートに対応するシグナルを光学的に識別可能であるようにすることが望ましい。本発明のタグ付き核酸分子の配列は、このような方法を用いて決定することができる。配列決定についての例示的アプローチには、ビーズ上での配列決定および平面基質上での配列決定が含まれる。
【００８０】
６．０．ビーズ上での配列決定
一部のアプローチでは、Ｐａｒｔ１に記載の、調製したクローン集団を備えるビーズを含め、ビーズ上のテンプレートを配列決定する。
【００８１】
図１７は、ビーズベース配列決定反応を用いる、別のオンチップ配列決定を示す。本明細書で用いる場合、標的核酸またはその増幅生成物を固定する、または、固定し得るビーズを、「配列決定ビーズ」と言う。図１７に示す実施形態では、１つまたは複数の配列決定前ステップ（例えば、逆転写、切断、ライゲーション、増幅）は、第１チャンバ（左）の配列決定ビーズ上で行うことができ、該配列決定ビーズは、配列決定反応のために第２チャンバ（右）に写し、任意で、追加の配列決定前反応（例えば、増幅）を行う。本文脈では、「配列決定反応」とは、核酸配列情報を提供するシグナルの生成および検出（典型的には、可視光または蛍光放射の検出）を意味する。例えば、Illumina社／Solexaタイプの配列決定の場合、ブリッジ増幅が配列決定前ステップと考えられ、いずれかのチャンバで行うことが可能である。多数の配列決定前チャンバが存在する場合もあり得る。
【００８２】
６．１．光学的に識別可能なシグナルを生成するためのフィラービーズの使用
図１７に示すアプローチでは、配列決定ビーズを第１チャンバから第２チャンバに移す際、それを「フィラービーズ」の導入により「希釈」する。テンプレート核酸がフィラービーズに固定されず、配列決定プロセス中に検出可能なシグナルを生成しないという意味で、フィラービーズは「不活性」である。フィラービーズの添加の効果は、配列決定ビーズを互いに空間的に分離し、その結果、個々の配列決定ビーズからのシグナルを光学的に識別可能にすることである。
【００８３】
通常、配列決定ビーズおよびフィラービーズは略球状である。球形は必要ではないが、限定ではなく単純化のため、ビーズは「直径」を有するものとみなす。ただし、他の形の（球体と同じ体積を有する）ビーズについても検討する。典型的には、フィラービーズは配列決定ビーズよりも小さく、例えば、その直径は配列決定ビーズの直径の約１／３〜１／４０である。一実施形態では、配列決定ビーズの直径は約１〜約３ミクロン（例えば、２．０２ミクロンなど、約２）であり、フィラービーズの直径は約０．０５〜約０．４ミクロン（例えば、０．２８ミクロンなど、約０．３）である。限定ではなく例として、配列決定チャンバにおける、配列決定ビーズのフィラービーズに対する比率は、１：１０６〜１：１０３（ビーズ数）の範囲、および／または、１：２〜１：２０（ビーズ体積）の範囲とすることができる。
【００８４】
一部の実施形態では、配列決定ビーズにより満たされる充填密度（総ビーズ体積またはチャンバ体積の比）は、２０％〜８５％、例えば４０〜７０％、例えば５５％〜６５％の範囲、例えば約６０％である。説明のため、幅１ｍｍ長さ５ｍｍのチャンバ（５×１０６平方ミクロン領域）は６０％充填密度で、１５０万個の配列決定ビーズを収容する。
【００８５】
他のアプローチでは、配列決定ステップおよび検出ステップを同一のチャンバで行い、少なくとも１つの配列決定前ステップの後および検出ステップの前に、フィラービーズを該チャンバに導入して配列決定ビーズを希釈および分離する。
【００８６】
一態様では、本発明はマイクロ流体装置を提供し、該装置は、（１つまたは複数の配列決定前反応を行う）第１チャンバまたは「配列決定前」チャンバ、および、（配列決定反応および検出反応に適した）第２チャンバまたは「配列決定」チャンバを含み、該チャンバは、配列決定ビーズが第１チャンバから第２チャンバへ移動できるように十分大きい直径を有するチャネルで連結している。一実施形態では、チャネルの断面寸法（例えば、直径、幅、深さ）は１ミクロンより小さいことはなく（例えば、直径は１ミクロン以上）、好適には、寸法は２ミクロンより小さいことはなく、より好適には、３ミクロンより小さいことはない。一実施形態では、第１チャネルの寸法は、配列決定ビーズが「単一ファイル」のみで、または、主に「単一ファイル」で流れることができるように、選択する。
【００８７】
一部の実施形態では、図に示すように、フィラービーズは、配列決定チャンバに入れる前に配列決定ビーズと組み合わせる。したがって、一実施形態では、装置は、（ａ）第１チャネルまたは第２チャンバ、および（ｂ）フィラービーズ源と流体連通する、第２マイクロ流体チャネルを含む。第２チャネルの寸法は、フィラービーズの通過が可能であるように選択し、第１チャネルの寸法より小さくてよい。他の実施形態では、フィラービーズおよび配列決定ビーズは、（ｉ）別々の口を通して、および／または、（ｉｉ）別々の回で、配列決定チャンバに入れる。一実施形態では、フィラービーズをまず加え、配列決定ビーズを加えた際に混ぜ合わせる。
【００８８】
図１８は、チャンバからの蛍光シグナルの検出を示す蛍光画像であり、これは、配列決定ビーズ（または、サロゲート）をフィラービーズにより分離すると、個々のビーズからのシグナルを識別可能であることを示す。蛍光ビーズの直径は２．０２ミクロン（１．０５×１０５ビーズ／マイクロリットル）である。フィラービーズの直径は０．２８ミクロン（３．９８×１０９ビーズ／マイクロリットル）である。
【００８９】
図１９は、フィラービーズ（３．１４×１０５ビーズ／マイクロリットル）がない場合に個々の配列決定ビーズを識別することはより難しいが、可能であることを示す。
【００９０】
第１チャンバおよび第２チャンバの寸法は、作業主の要望、選択した配列決定法、および、シグナル検出法により変更することができる。第１チャンバのサイズおよび寸法は、ある程度、増幅前ステップを実行するのに望ましい容量に基づいて選択されよう。
【００９１】
第２（配列決定）チャンバのサイズおよび寸法は、３つの要素を考慮に入れるだろう。第１に、通常、第２チャンバは第１チャンバの反応生成物を処理するのに十分な大きさとなろう。つまり、第２チャンバのサイズは第１チャンバのサイズとともに大きくなる傾向にあろう。第２に、第２チャンバは、フィラービーズを用いる場合にはそれを収容するのに十分なほど大きく、ならびに／または、配列決定テンプレートを物理的（および光学的）に分離するのに十分なほど大きくすべきである。理解されるように、光学的分離では通常、ビーズを、単にＺ次元で分離するのではなく、Ｘ−Ｙ次元で分離することが必要である（ここでシグナル検出はおよそ直角であり、つまりＸ−Ｙ次元に付随する）。簡単に言うと、例えば、Ｚ平面で上下に積み重ねた２つのビーズからシグナルを識別することは難しい。「光学的に識別可能」であるビーズへの言及は、この事実をとらえたものである。
【００９２】
一アプローチでは、配列決定チャンバは、単一ビーズ層のみを収容する。例えば、配列決定チャンバの深さは、配列決定ビーズの直径とほぼ同じとすることができる。
【００９３】
チャンバの表面領域（つまり、Ｘ−Ｙ次元）は、０．１ｍｍ２〜５０ｍｍ２などの、任意の適切な領域とすることができる。一アプローチでは（例えば、単一細胞ｍＲＮＡの配列決定では、５Ｍリードに対し約２０００００個が適切なカバレッジには必要であると想定し、該領域を０．３ｍｍ２〜６ｍｍ２とすることができる。）一部の実施形態では、単一細胞由来のｍＲＮＡを配列決定するため、該領域は１〜２ｍｍ２の範囲とする。
【００９４】
１細胞につき１００〜３００×１０５転写産物があると想定した場合、少なくとも１００万〜３００万個のビーズが必要となろう。しかしながら、ある適用例では、必要となるリードおよびビーズはより少ない。例えば、細胞表現型を区別するには、２０００００個のリードで十分である（そして、場合により不均一性を検出する）。AA Pollen et al., Nat Biotechnol. 2014 Oct;32(10):1053-8。
【００９５】
６．２第２チャンバにおけるビーズの移動の最小化
一部の実施形態では、配列決定ビーズおよびフィラービーズを、第２チャンバに密に充填し、配列決定反応中（例えば、配列決定サイクル間の洗浄ステップ中）の移動を最小化する。ビーズの移動は、シグナルの解釈をより計算的に困難にする。
【００９６】
一アプローチでは、配列決定ビーズおよびフィラービーズを第２チャンバに導入した後、ビーズを（例えば、化学的または物理的な薬剤にさらすことにより）架橋して定位置に固定する。一実施形態では、フィラービーズのみを互いに架橋する。配列決定ステップおよび検出ステップを妨害しない、リンカー、架橋剤、および架橋条件を用いるべきである。
【００９７】
ビーズの移動を最小化する他の方法は、ビーズをナノウェルに導入するか、または、それをチャンバ内の基質に固定することである。
【００９８】
６．３光学的に認識可能なシグナルを生成する他の方法
上記のように、あるビーズベース法では、配列決定チャンバは単一ビーズ層のみを収容する。これはチャンバの深さが理由である。他のビーズベースアプローチでは、（ｉ）ビーズは、チャンバの底にある間隔の空いたコンパートメントまたはパッドに固定することができ；（ｉｉ）リガンド−抗リガンドベースの相互作用によりチャンバ底に束縛することができ（例えば、チャンバ底の別々の位置に点在する抗リガンドが、ビーズのリガンドと相互作用する）；（ｉｉｉ）物理的相互作用により底に束縛することができる（例えば、底に、疎水性表面または不活性表面により分離した、負に帯電した点でパターンを形成し、その結果、核酸に覆われたビーズをその分離した点に固定することができる）。一部の実施形態では、ビーズを、光学的に分離されたシグナルを実現するのに十分なほどの低密度で、チャンバ底にランダムに配置する。これには容量を減少させるという明確な短所がある。
【００９９】
一アプローチでは、ビーズを、基質を含むチャンバに導入する。該チャンバは、単一ビーズを収容できるサイズの反応チャンバ（空所またはウェル）を少なくとも１００００個有する（例えば、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）に類似する。国際公開第２００５／００３３７５号を参照）。ビーズはウェル内で物理的に分離する。
【０１００】
６．４配列決定モジュール
第１チャンバ、第２チャンバ、任意でフィラービーズ源、および連結チャネルの組み合わせを、「配列決定モジュール」ということができる。図示するように、細胞を、配列決定モジュールの外にあるマイクロ流体装置で捕捉、洗浄、および溶解し、その後、細胞溶解物（つまり、ＲＮＡ含有部分）をモジュールの第１チャンバに導入する。第１鎖ｃＤＮＡ合成、ならびに、アダプターオリゴヌクレオチドの切断およびライゲーションを、第１チャンバで実行することができる。
【０１０１】
一実施形態では、ｍＲＮＡとビーズを「第１」チャンバに入れる前に組み合わせる。例えば、ＲＮＡをビーズカラムまたは「プレチャンバ」に捕捉し、ビーズをその後「第１チャンバ」に移す。
【０１０２】
図２０に示すように、増幅および配列決定／画像作成は、第２チャンバで実行することができる。
【０１０３】
６．５ビーズを用いない実施形態
一部の実施形態では、ビーズに固定していないＲＮＡまたはＤＮＡのテンプレートを、配列決定チャンバに移し、実質的に平面の基質に固定する。実施形態では、それは、チャンバ底の上のガラスもしくはＰＤＭＳであるか、または、チャンバ底からなる。このような固定化に対し多数のアプローチが知られ、それを本発明に適用することが可能であろう。一アプローチでは、細胞溶解物をポリｄ（Ｔ）でコーティングした表面に接触させ、その後、逆転写およびｃＤＮＡ配列決定を行う。図２１および２２は、オリゴヌクレオチドを表面に固定する例示的方法を示すが、他の方法も当技術分野で知られている。一アプローチでは、個々のＲＮＡ分子を（そして、結果として、ＲＮＡに由来するクローン集団を）物理的に分離し、そこから生じるシグナルを光学的に識別するのに十分に低密度で捕捉オリゴヌクレオチドのローンを含むチャンバに、ＲＮＡを導入する。配列決定用に、ランダムな、または規則正しいテンプレートアレイを作成する方法は周知である。例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１１６１５３号明細書；C. Adessi et al., Nucleic Acids Res. 2000 Oct 15;28(20):E87；M. Fedurco et al., Nucleic Acids Res. 2006 Feb 9;34(3):e22を参照のこと。
【０１０４】
一実施形態では、細胞溶解およびＲＮＡ捕捉は、同一のチャンバ内で起こる。
【０１０５】
６．６多数サイクルの実行
sequencing-by-synthesis反応には、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似物を組み込みシグナルを検出する、多数のサイクルが含まれる。これは、典型的には、反応物をサイクルのある時点で配列決定チャンバに導入し、次のサイクルの開始前に該反応物およびを生成物を取り除くことにより行う。これは、反応物、反応物溶液、および洗浄溶液等をチャンバに導入し、標準的なマイクロ流体法を用いてそれらを取り除くことにより達成される。一部の実施形態では、マイクロ流体装置には、配列決定前に、配列決定反応物および／または洗浄溶液を予め装填する。
【０１０６】
６．７画像作成および分析
第２チャンバからのシグナルは、カメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）ならびにＦｌｕｉｄｉｇｍ社により開発された光学系、および、当技術分野で既知の光学系を用いて収集することが可能である。例えば、図２３を参照のこと。このような実施形態では、カメラとシグナル源との間の物質は、シグナルに対し透過的であろう。
【０１０７】
他の実施形態では、シグナル検出は、特定のビーズまたはウェルと関連する、光ファイバセンサまたは他のセンサに依存し得る。
【０１０８】
Ｐａｒｔ４：集積マイクロ流体装置
７．集積装置
図２０は、配列決定カセットをマイクロ流体チップに集積可能であることを示す。表示するアプローチでは以下のステップを実行することができ、ステップ２〜９（および、任意でステップ１）は、マイクロ流体装置において実行し、ステップ６〜９は配列決定モジュールにおいて実行する。
【０１０９】
【表２】
0006716465.tif 000006
【０１１０】
図２０および表２は、限定ではなく説明のためであり、多種類のプロセスが可能であることが理解されよう。
【０１１１】
７．１細胞濃縮
細胞濃縮は、マイクロ流体装置、「オフ−チップ（off-chip）」、またはその両方で起き得る。濃縮パラメータには、物理的特性（例えば、サイズ、変形、密度、電荷）および生物学的特性（例えば、マーカータンパク質の発現）が含まれる。
【０１１２】
７．２単一細胞の捕捉
単一細胞の捕捉は、様々な方法を用いて実行することができる。一アプローチでは国際公開第２０１３／１３０７１４号（"Methods, systems, and devices for multiple single-cell capturing and processing using microfluidics"）に記載の特徴を有する単一細胞捕捉マイクロ流体装置を用いて、個々の細胞を単離し、核酸を処理し、該核酸の配列決定をする。所望により、例えば、上記の配列決定モジュールを組み込むといったある修正を所望により加えることは、本明細書に誘導された当業者の技量の内にあるだろう。国際公開第２０１３／１３０７１４号および同第２０１４／１４４７８９号は、チャネル、ポンプなどのマイクロ流体要素についての記載を含め、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１１３】
Ｐａｒｔ５：追加特徴
８．追加特徴
本セクションは、上記のある要素についての追加の記載を提供する。
【０１１４】
８．１アンカーポリヌクレオチド
本明細書で提供するアンカーポリヌクレオチドを用いて、ｍＲＮＡ分子を固体支持体に捕捉する。そのため、アンカーポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ分子を捕捉するためにオリゴｄ（Ｔ）プライマーを含み得る。アンカーポリヌクレオチドはさらに、標的ポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）をアダプター核酸でタグ付けした後、該標的ポリヌクレオチドを増幅する手段を提供する。アンカーポリヌクレオチドは、さらに、制限酵素認識配列を含み、固定化標的ポリヌクレオチドを、増幅および／または配列決定の後に固体支持体から取り除くための手段を提供する。限定ではなく説明のため、アンカーポリヌクレオチドの例を図２に示す。この実施形態では、固体支持体（ビーズ）に付着した２つのアンカーポリヌクレオチドを示す。一方のアンカーポリヌクレオチドを本明細書では「第１アンカーポリヌクレオチド」というが、これは増幅プライマー（ＡＰ１）および制限認識部位（例えば、切断部位１またはＣＳ１）を含む。オリゴｄ（Ｔ）プライマー、ＡＰ１に対し相補的な増幅プライマー（ＡＰ１’）、および制限認識部位（例えば、切断部位２またはＣＳ２）を含むアンカーポリヌクレオチドを、本明細書では「第２アンカーポリヌクレオチド」という。アンカーポリヌクレオチドのさらなる例を図３に示す。図３は、第１アンカーポリヌクレオチドおよび第２アンカーポリヌクレオチドを示し、ここでは、ｍＲＮＡテンプレートが、そのポリＡテールを介して第２アンカーポリヌクレオチドのオリゴｄ（Ｔ）にアニールされている。
【０１１５】
８．２第１アンカーポリヌクレオチド
実施形態では、第１アンカーポリヌクレオチドを固体支持体に固定する。実施形態では、第１アンカーポリヌクレオチドは第１増幅核酸配列を含み、増幅プライマー（「増幅プライマー１」または「ＡＰ１」ともいう）として機能する。実施形態では、第１アンカーポリヌクレオチドは、制限酵素認識部位（「切断部位１」または「ＣＳ１」ともいう）などの第１放出核酸配列を含む。実施形態では、第１放出核酸配列（例えば、ＣＳ１）が、第１増幅核酸配列（例えば、ＡＰ１）を固体支持体に連結する。
【０１１６】
８．３第２アンカーポリヌクレオチド
一部の実施形態では、第２アンカーポリヌクレオチドを固体支持体に固定する。実施形態では、第２アンカーポリヌクレオチドは、第２増幅核酸配列（増幅プライマー２またはＡＰ２ともいう）を含む。実施形態では、第２アンカーポリヌクレオチドは、制限酵素認識部位（切断部位２またはＣＳ２ともいう）などの第２放出核酸配列を含む。実施形態では、第２放出核酸配列（例えば、ＣＳ２）は、第２増幅核酸配列（例えば、ＡＰ２）を固体支持体に連結する。実施形態では、第２増幅核酸配列（例えば、ＡＰ２）は、第２放出核酸配列（例えば、ＣＳ２）を、標的ポリヌクレオチド捕捉配列（例えば、オリゴｄＴＴ２０）に連結する。したがって、本明細書で提供する一本鎖ｃＤＮＡは、デオキシチミン配列（例えば、オリゴｄＴＴ２０）に共有結合的に付着させることにより、固体支持体に固定することができ、ここで、該デオキシチミン配列は第２増幅核酸配列（例えば、ＡＰ２）に連結し、これは、第２放出核酸配列（例えば、ＣＳ２）を通じて固定支持体に結合する。
【０１１７】
上記のように、標的ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）とすることができる。標的ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである場合、該標的ポリヌクレオチドは第２アンカーポリヌクレオチドを通じて固体支持体に連結することができる。第２アンカーポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド捕捉配列を含む。実施形態では、標的ポリヌクレオチド捕捉配列は、デオキシチミン配列であり、これは本明細書ではオリゴｄ（Ｔ）２０ともいう。
【０１１８】
標的ポリヌクレオチドがＲＮＡ（標的リボ核酸）である場合、該標的リボ核酸は、標的ポリヌクレオチド捕捉配列（例えば、オリゴｄ（Ｔ）２０）へのハイブリダイズを通して固体支持体に固定することができる。上記のように、標的ポリヌクレオチド捕捉配列は、本明細書で提供する第２アンカーポリペプチドの一部を形成し得る。標的ポリヌクレオチド捕捉配列がオリゴｄ（Ｔ）２０である場合、標的リボ核酸は、そのポリアデニル化3'末端を通じて標的ポリヌクレオチド捕捉配列にハイブリダイズする。
【０１１９】
８．４アダプター核酸
本明細書に提供する方法では、アダプター核酸配列を、切断済み標的ポリヌクレオチドにライゲーションすることにより、タグ付き核酸配列を形成する。本明細書で提供するアダプター核酸配列は、切断済み標的ポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）にライゲーションすることが可能な任意の核酸とすることができる。アダプター核酸配列は、プライマー増幅配列を含むため、標的ポリヌクレオチドの増幅手段を提供する。一実施形態では、アダプター核酸は増幅プライマー相補体（ＡＰ１’）を含み、これを用いて、第１アンカーポリヌクレオチドの増幅プライマー（ＡＰ１）にアニールすることにより、例えばブリッジＰＣＲにより標的ポリヌクレオチドを増幅する方法を提供する。
【０１２０】
実施形態では、アダプター核酸は、増幅プライマー相補体（ＡＰ１’）を含み、これは増幅プライマー（ＡＰ１）にアニールすることができる。これは固体支持体には付着しないが、反応溶液に加えることにより、本明細書でwildfireＰＣＲともいう等温テンプレートによる標的ポリヌクレオチドの増幅を可能にする。
【０１２１】
実施形態では、アダプター核酸配列は二本鎖核酸である。実施形態では、アダプター核酸配列は一本鎖核酸である。実施形態では、アダプター核酸配列は第１増幅核酸配列相補体を含む。第１増幅核酸配列相補体は、上記の第１増幅核酸配列に対し特異的に相補的な核酸配列である。本明細書で提供する用語の「第１増幅核酸配列」および「第２増幅核酸配列」は、標的核酸配列を認識する単離核酸（第１増幅核酸配列相補体および第２増幅核酸配列相補体）を意味する。第１増幅核酸配列および第２増幅核酸配列は短い核酸分子、例えば、長さが１０ヌクレオチド以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドである。連続相補的オリゴヌクレオチド（例えば、第１増幅核酸配列相補体または第２増幅核酸配列相補体）は、ハイブリダイズを通して第１増幅核酸配列および第２増幅核酸配列へアニールすることができる。ＰＣＲまたは他の当技術分野で既知の核酸増幅法を用いることにより標的ポリヌクレオチドを増幅しながら、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により、連続相補的オリゴヌクレオチドを標的ポリヌクレオチドに沿って伸長することができる。実施形態では、第１増幅核酸配列および第２増幅核酸配列の長さは、独立して、約１５、２０、２５、３０、または５０以上のヌクレオチドである。実施形態において、第１増幅核酸配列および第２増幅核酸配列の長さは、独立して、約１０〜約１００ヌクレオチドである。実施形態において、第１増幅核酸配列および第２増幅核酸配列の長さは、独立して、約１５〜約９５ヌクレオチドである。
【０１２２】
アダプター核酸配列が第１増幅核酸配列相補体を含む場合、第１増幅核酸配列相補体は、第１増幅核酸配列にハイブリダイズすることができる。上記のように、第１増幅核酸配列は本明細書では増幅プライマー１またはＡＰ１ともいい、第１アンカーポリヌクレオチドの一部を形成し、これは固体支持体に固定する。本明細書で提供する方法では、第１アンカーポリヌクレオチドは固体支持体に共有結合的に結合することができる。実施形態では、第１増幅核酸配列相補体を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で第１増幅核酸配列にハイブリダイズし、それにより標的ポリヌクレオチド（つまり、タグ付き核酸配列）を増幅する。実施形態では、ステップ（ｉｖ）のライゲーションの後、タグ付き核酸配列を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で、第１増幅核酸配列に接触させる。実施形態では、第１増幅核酸配列は、第１増幅核酸配列相補体に対し少なくとも部分的に相補的である。実施形態では、第１増幅核酸は固体支持体に付着しない。さらなる実施形態では、第１増幅核酸を第１増幅核酸にハイブリダイズする。
【０１２３】
８．５タグ付きポリヌクレオチドのアレイ
当業者は、本明細書で提供する核酸配列にタグ付けする方法は、複数の核酸配列のタグ付けに適用可能であることを即座に認識しよう。本明細書で提供する方法が、複数の核酸配列にタグ付けするステップを含む場合、標的ポリヌクレオチドはそれぞれ独立して異なる。そのため、標的ポリヌクレオチドは不均一となり得る。実施形態では、該複数の標的ポリヌクレオチドは複数のｃＤＮＡ配列である。実施形態では、該複数の標的ポリヌクレオチドは複数のリボ核酸配列である。該複数の標的ポリヌクレオチドは、単離細胞に由来し得る。本明細書で提供する単離細胞は、該細胞が事前に発生した細胞培養物、組織、臓器、または有機体中のほかの構成要素（細胞）から実質的に分離した、または、精製した細胞である。「単離」した細胞には、標準的な精製方法により精製した細胞が含まれる。
【０１２４】
一態様では、複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成する方法を提供する。該方法によると、（ｉ）複数の不均一な標的ポリヌクレオチドを固体支持体に固定することにより、複数の不均一な固定化標的ポリヌクレオチドを形成する。（ｉｉ）複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドを、前記不均一な固定化標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、複数の認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する。（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド−標的ポリヌクレオチドハイブリッドを、切断剤で切断することにより、複数の切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済み標的ポリヌクレオチドハイブリッドを形成する。（ｉｖ）前記複数の切断済み標的ポリヌクレオチドにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成する。上記のように、同一の定義を、複数の不均一なタグ付きポリヌクレオチドを形成する態様（その実施形態を含む）に適用する。例えば、固体支持体はビーズ構造とすることができる。複数の不均一な標的ポリヌクレオチドは一本鎖ｃＤＮＡ配列とすることができる。切断剤は制限酵素とすることができる。
【０１２５】
８．６ｃＤＮＡタグ付けの実施形態
上記のように、標的ポリヌクレオチドはｃＤＮＡとすることができる。したがって、一態様において、タグ付き一本鎖ｃＤＮＡを形成する方法を提供する。該方法によると、（ｉ）標的ｃＤＮＡを固体支持体に固定することにより、固定化標的ｃＤＮＡを形成する。（ｉｉ）前記固定化標的ｃＤＮＡに認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−ｃＤＮＡハイブリッドを形成する。（ｉｉｉ）前記認識オリゴヌクレオチド−ｃＤＮＡハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済みｃＤＮＡハイブリッドを形成する。（ｉｖ）前記切断済みｃＤＮＡにアダプター核酸をライゲーションすることにより、タグ付き一本鎖ｃＤＮＡを形成する。標的ポリヌクレオチドがｃＤＮＡである場合、該ｃＤＮＡは、当技術分野で一般的に知られる固定化方法、および上記の固定化方法を用いて、固体支持体に固定することができる。例えば、該ｃＤＮＡは、共有結合により、化学的に修正した（官能化した）固体支持体に直接的に固定することができる。他の実施形態では、該ｃＤＮＡは、上記のように第２アンカーポリヌクレオチドを通じて固体支持体に付着する。該ｃＤＮＡが第２アンカーポリヌクレオチドを通して固体支持体に付着する場合、ｍＲＮＡ分子を、該ｍＲＮＡのポリアデニル化3'末端と標的ポリヌクレオチド捕捉配列の核酸配列（例えば、デオキシチミン配列またはオリゴｄＴＴ２０）との間の水素結合により固体支持体にハイブリダイズすることで、固定化ｍＲＮＡを形成する。上記のように、標的ポリヌクレオチド捕捉配列は、第２アンカーポリペプチドの一部を形成する。固定化ｍＲＮＡをその次に逆転写することにより、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをエンドリボヌクレアーゼ酵素（例えばＲＮアーゼＨ）に接触させることにより該ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのｍＲＮＡを分解することで、標的ポリヌクレオチド捕捉配列を通じて固体支持体に付着した一本鎖ｃＤＮＡを形成することができる。固定化一本鎖ｃＤＮＡ（標的ｃＤＮＡ）を、上記のように認識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−ｃＤＮＡハイブリッドを形成することができる。上記のように、認識オリゴヌクレオチドは、縮重核酸配列が隣接する切断剤認識配列（例えば、ＢａｅＧ１認識配列）を含むことができる。認識オリゴヌクレオチド−ｃＤＮＡハイブリッドを切断剤（例えばＢａｅＧ１）で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済みｃＤＮＡハイブリッドを形成することができる。上記のように、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済みｃＤＮＡハイブリッドは、5'オーバーハングを含み得る。上記のアダプター核酸を切断済みｃＤＮＡにライゲーションすることにより、タグ付き一本鎖ｃＤＮＡを形成する。当技術分野で一般的に知られている任意のライゲーション方法およびＤＮＡリガーゼを用いて、アダプター核酸を切断済みｃＤＮＡにライゲーションすることができる。
【０１２６】
８．７ＲＮＡタグ付けの実施形態
上記のように、標的ポリヌクレオチドはリボ核酸とすることができる。したがって、別の態様において、タグ付き核酸配列を形成する方法を提供する。該方法によると、（ｉ）標的リボ核酸を固体支持体に固定することにより、固定化リボ核酸を形成する。（ｉｉ）前記固定化標的リボ核酸を逆転写することにより、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する。（ｉｉｉ）前記ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ＤＮＡ切断剤で切断することにより、切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する。（ｉｖ）前記切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにアダプター核酸をライゲーションする。（ｖ）前記リボ核酸配列を前記ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、タグ付き核酸配列を形成する。標的リボ核酸を固体支持体に固定する場合、前記標的リボ核酸はｍＲＮＡとすることができ、固定化は、上記のように、前記ｍＲＮＡのポリアデニル化配列と、本明細書に記載のポリヌクレオチド捕捉配列との間の水素結合を通して実行することができる。ｍＲＮＡの逆転写によりＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成し、前記ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは切断剤を用いて切断することができる。前記切断剤は、一方の鎖はＤＮＡであり、もう一方の鎖はＲＮＡである、ＤＮＡおよびＲＮＡの二本鎖ハイブリッドを切断することが可能な制限エンドヌクレアーゼとすることができる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを切断する際、5'オーバーハング、3'オーバーハング、または、オーバーハングなしの平滑末端を生成することができる。そのため、切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、5'オーバーハング、3'オーバーハング、または、平滑末端を含むことができ、その後、アダプター核酸にライゲーションすることができる。アダプター核酸をＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにライゲーションしたら、前記ＲＮＡは、上記のようにエンドリボヌクレアーゼを用いて消化することにより取り除くことができ、これはタグ付き核酸配列の形成をもたらす。
【０１２７】
当業者は、即座に、本明細書で提供する核酸配列にタグ付けする方法は、複数の核酸配列のタグ付けに適用可能であると認識しよう。したがって、別の態様では、複数の不均一なタグ付き核酸配列を形成する方法を提供する。該方法によると、（ｉ）複数の不均一な標的リボ核酸配列を固体支持体に固定することにより、複数の不均一な固定化標的リボ核酸配列を形成する。（ｉｉ）前記不均一な固定化標的リボ核酸配列を逆転写することにより、複数の不均一なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する。（ｉｉｉ）前記複数の不均一なＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ＤＮＡ切断剤で切断することにより、複数の切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する。（ｉｖ）前記複数の切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにアダプター核酸配列をライゲーションし、（ｖ）前記リボ核酸配列を前記切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、複数の不均一なタグ付き核酸配列を形成する。
【０１２８】
８．８認識オリゴヌクレオチドライブラリ
別の態様では、複数の不均一な認識オリゴヌクレオチドを含む認識オリゴヌクレオチドライブラリであって、該不均一な認識オリゴヌクレオチドはそれぞれ、縮重核酸配列が隣接した制限酵素認識配列を含むライブラリを提供する。本明細書で提供する縮重核酸配列は、制限酵素認識配列（本明細書では切断剤認識配列ともいう）に隣接し、縮重ヌクレオチドを含む。縮重ヌクレオチドは、異なる標的ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ｃＤＮＡ）に対し相補的、または部分的に相補的とすることができる。用語「部分的に相補的」とは、異なる標的ポリヌクレオチド（各標的ポリヌクレオチドは異なっている）以外にハイブリダイズすることが可能な認識オリゴヌクレオチドを意味する。実施形態では、切断剤認識配列には、縮重核酸配列が隣接する。実施形態では、縮重核酸配列は標的ポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）に対し部分的に相補的である。実施形態では、縮重核酸配列は標的ポリヌクレオチドに対し特異的に相補的である。実施形態では、認識オリゴヌクレオチドは5' An-Xm-Bn 3'の構造を有し、ここにおいて、ＡおよびＢは、標的ポリヌクレオチドを含む配列に対し相補的、または部分的に相補的であるヌクレオチド配列であり、ｎは独立して１０〜４０の整数である。Ｘは切断剤認識配列であり、ｍは４〜１０の整数である。切断剤は、上記のように制限酵素（例えば、ＢａｅＧ１）である。実施形態では、ライブラリはマイクロ流体装置の一部を形成する。
【０１２９】
８．９ＰＣＲ増幅
本明細書で提供するタグ付きポリヌクレオチドを増幅し、続いて配列決定することができる。当技術分野で既知の任意の核酸増幅法を用いることができる。特異的で非限定的な一例では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、本明細書で提供するタグ付きポリヌクレオチドを増幅する。実施形態では、本明細書で提供するタグ付きポリヌクレオチドを、ブリッジＰＣＲを用いて増幅する。したがって、実施形態では、ＰＣＲ増幅はブリッジＰＣＲである。ブリッジＰＣＲの技法は当技術分野で周知であり、例えば、国際公開第２０１３／１３１９６２号に記載されており、これはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。実施形態では、本明細書で提供するタグ付きポリヌクレオチドを、等温テンプレートウォーキング（isothermal template walking）法を用いて増幅する。等温テンプレートウォーキング法は当技術分野で周知の増幅法であり、例えば、Ma Z et al., PNAS 2013;110:14320-14323に記載されており、これはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。実施形態において、該方法は、接触ステップの後、増幅したｃＤＮＡを配列決定するステップを含む。実施形態において、各ステップはマイクロ流体装置で行われる。提供する本発明に有用なマイクロ流体装置の例は、米国特許出願公開第２０１３／０３０２８８３号明細書、同第２０１３／０３０２８８４号明細書、同第２０１３／０２９６１９６号明細書、同第２０１３／０２９５６０２号明細書、および同第２０１３／０３０２８０７号明細書に公開されており、これらはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０１３０】
別の態様では、ｃＤＮＡ配列を増幅する方法を提供する。該方法によると、（ｉ）単離細胞から抽出したＲＮＡ分子を固体支持体に固定することにより、固定化リボ核酸配列を形成する。（ｉｉ）前記固定化リボ核酸配列を逆転写することにより、固定化ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する。（ｉｉｉ）前記リボ核酸配列を、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことにより、固定化ｃＤＮＡ配列を形成する。（ｉｖ）前記固定化ｃＤＮＡ配列に認識オリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより、認識オリゴヌクレオチド−ｃＤＮＡハイブリッドを形成する。（ｖ）前記認識オリゴヌクレオチド−ｃＤＮＡハイブリッドを切断剤で切断することにより、切断済み認識オリゴヌクレオチド−切断済みｃＤＮＡハイブリッドを形成する。（ｖｉ）前記切断済みｃＤＮＡにアダプター核酸配列をライゲーションすることにより、タグ付きｃＤＮＡ配列を形成する。（ｖｉｉ）前記タグ付きｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で増幅核酸配列にハイブリダイズすることにより、ｃＤＮＡ配列を増幅する。実施形態では、増幅核酸配列を前記固体支持体に共有結合的に結合させる。実施形態では、前記増幅ｃＤＮＡを、ステップ（ｖｉｉ）でハイブリダイズした後、配列決定する。当技術分野で既知である任意の配列決定方法を、前記増幅ｃＤＮＡの配列決定に用いることができる。
【０１３１】
別の態様では、ｃＤＮＡ配列を増幅する方法を提供する。該方法によると、（ｉ）単離細胞から抽出したＲＮＡ分子を固体支持体に固定することにより、固定化リボ核酸配列を形成する。（ｉｉ）前記固定化リボ核酸配列を逆転写することにより、固定化ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成することができる。（ｉｉｉ）前記ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをＲＮＡ：ＤＮＡ切断剤で切断することにより、切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを形成する。（ｉｖ）前記切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに、アダプター核酸配列をライゲーションする。（ｖ）前記リボ核酸を前記切断済みＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドから取り除くことによりタグ付きｃＤＮＡ配列を形成し、（ｖｉ）前記タグ付きｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲ増幅を可能とする条件下で増幅核酸配列に接触させることにより、前記ｃＤＮＡ配列を増幅する。実施形態では、前記増幅核酸配列を前記固体支持体（例えば、ＡＰ１）に共有結合的に結合させる。実施形態では、前記増幅ｃＤＮＡを、ステップ（ｖｉ）で接触させた後に配列決定する。実施形態では、ＰＣＲ増幅はＰＣＲブリッジ増幅である。実施形態では、ＰＣＲ増幅は等温テンプレートウォーキングである。実施形態では、単一細胞は、単離細胞の不均一な集団から単離する。実施形態では、本明細書で提供する方法の各ステップは、マイクロ流体装置において行う。
【０１３２】
前記発明を明確にし、理解する目的のために、該発明を詳細に記載してきたが、当業者は、いったん本開示に精通したら、添付の特許請求の範囲の発明の範囲から逸脱することなく、形および詳細について様々な変更を施すことが可能であることを理解しよう。したがって、本発明は、上記の方法論および構成の、厳密な構成要素または詳細に限定されない。プロセス自体に必要な、または固有の範囲を除き、図面を含む本開示に記載の方法またはプロセスのステップまたは段階に対し、特定の順番が意図される、または含意されることはない。多くの場合、記載の方法の目的、効果、または趣旨を変えることなく、プロセスステップの順番を変えることができる。
【０１３３】
本明細書で言及したすべての刊行物および特許文献は、それぞれの刊行物または文献が参照により本明細書に組み込まれることを個別的かつ具体的に意味するように、参照により本明細書に組み込まれるものとする。刊行物および特許文献（特許、公開特許出願、および未公開特許出願）についての言及は、これらのいずれかの文献が関連先行技術であることの承認として意図されるものではなく、同文献の内容または日付についての承認を構成するものでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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