(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）単離された腸上皮間リンパ球を、腸陰窩オルガノイドと共に、細胞外マトリクスに包埋する工程Ａ：及び、
（Ｂ）前記腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液中で、前記細胞外マトリクスに包埋した腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイドを共培養する工程Ｂ： 
を含むことを特徴とし、
前記腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液が、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む、腸上皮間リンパ球をインビトロで維持・増殖させる方法。
【請求項２】
（Ａ）単離された腸上皮間リンパ球を、腸陰窩オルガノイドと共に、細胞外マトリクスに包埋する工程Ａ：及び、
（Ｂ）前記腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液中で、前記細胞外マトリクスに包埋した腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイドを共培養する工程Ｂ： 
を含むことを特徴とし、
前記腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液が、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドの製造方法。
【請求項３】
腸陰窩オルガノイドが小腸陰窩オルガノイドである場合は、小腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液が、分裂促進増殖因子、Ｗｎｔアゴニスト及びＢＭＰ阻害物質を含む培養液であり、腸陰窩オルガノイドが大腸陰窩オルガノイドである場合は、大腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液が、血清アルブミン、Ｗｎｔ３ａ、及び、Ｒ−スポンジン１を含有し、かつ、血清を含有しない培養液であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分裂促進増殖因子がＥＧＦであり、ＷｎｔアゴニストがＲ−スポンジン１及び／又はＷｎｔ−３ａであり、ＢＭＰ阻害物質がＮｏｇｇｉｎであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
大腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及び、Ｎｏｇｇｉｎからなる群から選択される１種又は２種以上をさらに含有することを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
腸陰窩オルガノイドが小腸陰窩オルガノイドである場合は、細胞外マトリクスが、マトリゲルであり、腸陰窩オルガノイドが大腸陰窩オルガノイドである場合は、細胞外マトリクスがコラーゲンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸上皮間リンパ球をインビトロで維持・増殖させる方法や、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドの製造方法や、該製造方法により製造される、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド等に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸内において、最も内側の表面を覆う上皮層は、物質通過の部位としてだけでなく、宿主防御の最前線を構成する免疫応答の活性部位としても機能する。上皮は、陰窩上皮構造の底部に存在する成人幹細胞から生じる異なる種類の腸上皮細胞（ＩＥＣ）から構成されている。腸上皮組織には、異なる系統の細胞の豊富な集団である、腸上皮間リンパ球（ＩＥＬ）も存在している。ＩＥＬは、例えば小腸で、ＩＥＣ５〜１０個あたり、ＩＥＬ１個の密度で分散しており、ＩＥＣの基底側の表面と密接に接触している。ＩＥＬは、不均一な（heterogeneous）Ｔ細胞であり、他の末梢Ｔ細胞区画よりも多くのγd＋Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）Ｔ細胞を含んでいる。ＩＥＬは、それらの表面マーカー発現に基づいて、タイプａとタイプｂのサブセットに分類され、γδＴ ＩＥＬは、タイプｂのＩＥＬの主要な分画を構成する。γδＴ ＩＥＬは、上皮バリア機能（非特許文献１及び２）及び粘膜恒常性（非特許文献３）において重要な役割を有することが知られている。αβＴ ＩＥＬは、不均一な集団を依然として代表しているものの、宿主防御機構にも貢献している（非特許文献４）。
【０００３】
ＩＥＬは、単離されると、アポトーシスに対する感受性が非常に高くなり（非特許文献５）、それまでの通常のインビトロ培養法では２〜３日間くらいしか維持することができなかったため、ＩＥＬの機能に関するインビトロ研究は、長い間妨げられていた。そこで、ＩＥＬをインビトロで維持・増殖できる方法の開発が試みられてきた。例えば、前述の非特許文献５には、単離されたγδ ＩＥＬをインビトロで培養する際の培養液に、ＩＬ−２又はＩＬ−１５を添加して培養を行ったところ、ＩＬ−１５を添加した場合の方が、より多くのγδ ＩＥＬが得られた旨が記載されている。さらに非特許文献５には、単離されたγδ ＩＥＬを、ＩＬ−１５を添加した培養液で培養したところ、該γδ ＩＥＬが６日目まで増殖した旨が記載されている（非特許文献５の図５Ａ）。しかし、培養から６日目を超えると、生きたγδ ＩＥＬ数は減少すると共に（非特許文献５の図５Ａ）、アポトーシス率（％）はさらに高くなることから（非特許文献５の図５Ｃ）、その後は生きたγδ ＩＥＬ数が急速に低下していくことが予想される点で、まだ十分実用的とは言えなかった。また、非特許文献５の方法では、γδ ＩＥＬは増殖させることができているものの、αβ ＩＥＬは増殖させることができていない（非特許文献５の図１Ｂ）。加えて、ＩＥＬの遊走のインビボ解析ではＩＥＬが腸上皮間などを活発に遊走していることが知られているところ（非特許文献６）、非特許文献５の方法で増殖して得られたγδ ＩＥＬは、そのような活発な遊走を示さないと考えられる。一方、例えば、非特許文献７には、マウス由来の単離ＩＥＬを、マウス角化細胞株と共培養することによって、該ＩＥＬを維持する方法が開示されている。しかし、非特許文献７の方法では、ＩＥＬを維持できるのはせいぜいＤａｙ６くらいまでであり、また、ＩＥＬを増殖させることもできていない（非特許文献７の図４等）。また、非特許文献７では、マウス由来の単離ＩＥＬをマウス腸上皮細胞株と共培養したり、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含有する上皮細胞培養液でマウス由来ＩＥＬを培養する等しているが、いずれの培養でも、ＩＥＬを７日以上維持できてはいない。このように、非特許文献７の方法では、実用レベルでＩＥＬを維持、増殖することはできなかった。
【０００４】
一方、近年の技術の進展により、小腸及び大腸の上皮幹細胞の長期培養が可能になった（非特許文献８〜１０及び特許文献１及び２）。例えば、かかる技術により、マウス小腸のＩＥＣは、絨毛様区画により並んだ中央内腔（central lumen）を取り囲む陰窩様隆起領域を含む三次元腸内オルガノイドとして、ほぼ永遠に増殖させることができる（非特許文献８）。この方法により増殖したＩＥＣは、同系マウスに戻し移植したときに、通常の小腸上皮を再構成することができることが示され、このことから、かかる培養工程が小腸上皮細胞本来の特徴の維持に有害でないことが示された（非特許文献１１）。
【０００５】
また、前述のように小腸陰窩オルガノイドや大腸陰窩オルガノイドは知られていたが、これらの腸陰窩オルガノイドをＩＥＬの維持や増殖に利用することや、ＩＥＬが増加した腸陰窩オルガノイドについては、これまでに報告はなされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１２−２５４０８１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１３／０６１６０８号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Boismenu, R., and W.L. Havran. 1994. Modulation of epithelial cell growth by intraepithelial gamma delta T cells. Science 266: 1253-1255
【非特許文献２】Chen, Y., K. Chou, E. Fuchs, W.L. Havran, and R. Boismenu. 2002. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proc Natl Acad Sci USA 99:14338-14343
【非特許文献３】Ismail, A.S., C.L. Behrendt, and L.V. Hooper. 2009. Reciprocal interactions between commensal bacteria and gamma delta intraepithelial lymphocytes during mucosal injury. J Immunol 182:3047-3054
【非特許文献４】Muller, S., M. Buhler-Jungo, and C. Mueller. 2000. Intestinal intraepithelial lymphocytes exert potent protective cytotoxic activity during an acute virus infection. J Immunol 164:1986-1994
【非特許文献５】Chu, C.L., S.S. Chen, T.S. Wu, S.C. Kuo, and N.S. Liao. 1999. Differential effects of IL-2 and IL-15 on the death and survival of activated TCR gamma delta+ intestinal intraepithelial lymphocytes. J Immunol 162:1896-1903
【非特許文献６】Edelblum, K.L., L. Shen, C.R. Weber, A.M. Marchiando, B.S. Clay, Y. Wang, I. Prinz, B. Malissen, A.I. Sperling, and J.R. Turner. 2012. Dynamic migration of γδ intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proc Natl Acad Sci USA 109:7097-7102
【非特許文献７】Chennupati, Y., T. Worbs, X. Liu, F.H. Malinarich, S. Schmitz, J.D. Haas, B. Malissen, R. Forster, and I. Prinz. 2010. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. J Immunol 185:5160-5168
【非特許文献８】Sato, T., R.G. Vries, H.J. Snippert, M. van de Wetering, N. Barker, D.E. Stange, J.H. van Es, A. Abo, P. Kujala, P.J. Peters, and H. Clevers. 2009. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 459:262-265
【非特許文献９】Sato, T., D.E. Stange, M. Ferrante, R.G. Vries, J.H. Van Es, S. Van den Brink, W.J. Van Houdt, A. Pronk, J. Van Gorp, P.D. Siersema, and H. Clevers. 2011. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology 141:1762-1772
【非特許文献１０】Yui, S., T. Nakamura, T. Sato, Y. Nemoto, T. Mizutani, X. Zheng, S. Ichinose, T. Nagaishi, R. Okamoto, K. Tsuchiya, H. Clevers, and M. Watanabe. 2012. Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5+ stem cell. Nat Med 18:618-623
【非特許文献１１】Fukuda, M., T. Mizutani, W. Mochizuki, T. Matsumoto, K. Nozaki, Y. Sakamaki, S. Ichinose, Y. Okada, T. Tanaka, M. Watanabe, and T. Nakamura. 2014. Small intestinal stem cell identity is maintained with functional Paneth cells in heterotopically grafted epithelium onto the colon. Gelles Dev 28:1752-1757
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、腸上皮間リンパ球をインビトロで維持・増殖させる方法や、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドの製造方法や、該製造方法により製造される、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
背景技術に記載されているように、単離されたＩＥＬをインビトロで維持・増殖させる（維持及び／又は増殖させる）方法には、不十分な点があった。本発明者らは、上記の背景技術の状況下で鋭意研究を行った結果、以下の（Ｈ）〜（Ｌ）などの知見を見いだし、本発明を完成させるにいたった。
（Ｈ）単離したＩＥＬを、小腸陰窩オルガノイドと共に細胞外マトリクスに包埋し、次いで、該小腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液中で共培養すると、ＩＬ−２やＩＬ−７やＩＬ−１５を用いない従来の方法と比較して、ＩＥＬをより長い期間維持することができること。かかる共培養において、培養液中にＩＬ−７及びＩＬ−１５のいずれかを添加すると、ＩＬ−２やＩＬ−７やＩＬ−１５を用いない従来の方法と比較して、ＩＥＬをより長い期間維持する、又は、ＩＥＬをより多く増殖させることができること。特に、かかる共培養において、培養液中にＩＬ−２（好ましくはＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５のすべて）を添加すると、ＩＬ−２やＩＬ−７やＩＬ−１５を用いる従来の方法と比較しても、ＩＥＬをより長い期間維持する、又は、ＩＥＬをより多く増殖させることができること。
（Ｉ）上記（Ｈ）の共培養方法は、共培養の始めに用いたＩＥＬと同様の多様性（γδ型とαβ型の割合など）をおおむね維持しつつ、ＩＥＬを維持及び／又は増殖させることができること。
（Ｊ）単離したＩＥＬを、大腸陰窩オルガノイドと共に細胞外マトリクスに包埋し、次いで、該大腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液（但し、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む）中で共培養すると、ＩＥＬの増加の程度は小腸陰窩オルガノイドと共培養した場合と比較して若干劣るものの、依然として、ＩＥＬを培養・維持するための優れた方法であること。
（Ｋ）上記（Ｈ）の共培養方法により得られたＩＥＬについてイメージング解析を行ったところ、ＩＥＬの遊走のインビボ解析に関する非特許文献６に報告されていたように、活発な遊走を示したこと。すなわち、上記（Ｈ）の共培養方法によれば、従来の方法により得られたＩＥＬよりも、インビボにおけるＩＥＬにより近い動態を示すＩＥＬを維持・増殖させることができること。
（Ｌ）上記（Ｈ）や（Ｊ）の共培養方法によれば、ＩＥＬが増加した小腸陰窩オルガノイドや大腸陰窩オルガノイドを製造することができること。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）単離された腸上皮間リンパ球を、腸陰窩オルガノイドと共に、細胞外マトリクスに包埋する工程Ａ：及び、（Ｂ）前記腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液中で、前記細胞外マトリクスに包埋した腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイドを共培養する工程Ｂ： を含むことを特徴とする、腸上皮間リンパ球をインビトロで維持・増殖させる方法や、
（２）（Ａ）単離された腸上皮間リンパ球を、腸陰窩オルガノイドと共に、細胞外マトリクスに包埋する工程Ａ：及び、（Ｂ）前記腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液中で、前記細胞外マトリクスに包埋した腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイドを共培養する工程Ｂ： を含むことを特徴とする、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドの
製造方法や、
（３）腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液が、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５から選択される１種又は２種以上を含む、上記（１）又は（２）に記載の方法や、
（４）腸陰窩オルガノイドが小腸陰窩オルガノイドである場合は、小腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液が、分裂促進増殖因子、Ｗｎｔアゴニスト及びＢＭＰ阻害物質を含む培養液であり、腸陰窩オルガノイドが大腸陰窩オルガノイドである場合は、大腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液が、血清アルブミン、Ｗｎｔ３ａ、及び、Ｒ−スポンジン１を含有し、かつ、血清を含有しない培養液であることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法や、
（５）分裂促進増殖因子がＥＧＦであり、ＷｎｔアゴニストがＲ−スポンジン１及び／又はＷｎｔ−３ａであり、ＢＭＰ阻害物質がＮｏｇｇｉｎであることを特徴とする上記（４）に記載の方法や、
（６）大腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液が、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及び、Ｎｏｇｇｉｎからなる群から選択される１種又は２種以上をさらに含有することを特徴とする上記（４）又は（５）に記載の方法や、
（７）腸陰窩オルガノイドが小腸陰窩オルガノイドである場合は、細胞外マトリクスが、マトリゲルであり、腸陰窩オルガノイドが大腸陰窩オルガノイドである場合は、細胞外マトリクスがコラーゲンであることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法や、
（８）上記（２）〜（７）のいずれかに記載の製造方法により製造される、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、腸上皮間リンパ球をインビトロで維持・増殖させることができる。本発明の方法は、Ｌ−２やＩＬ−７やＩＬ−１５を用いない従来の方法又はＬ−２やＩＬ−７やＩＬ−１５を用いる従来の方法と比較して、ＩＥＬをより長期間維持すること又はＩＥＬをより多く増殖させることができる。また、本発明によれば、γδ ＩＥＬだけでなく、αβ ＩＥＬも増殖させることができる。さらに、本発明によれば、ＩＥＬが増加した腸陰窩オルガノイドを製造することができる。かかる腸陰窩オルガノイドは、腸上皮間リンパ球の運動性に与える影響を評価する方法に利用することができる。本発明によれば、従来のインビトロ培養法で維持・増殖させるよりも、インビボにおけるＩＥＬにより近い動態を示すＩＥＬを維持・増殖させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａには、小腸陰窩オルガノイドの培養後１日目におけるＣｄｈ１（カドヘリン）とＣＤ３（上皮間リンパ球［ＩＥＬ；Intraepithelial Lymphocytes］）のｚ軸スライス蛍光画像３枚を示す。スケールバーは５０μｍを示す。図１Ｂの上段には、ＩＥＬを小腸陰窩オルガノイドと共培養後３日目におけるＣＤ３（ＩＥＬ）とＤＡＰＩ（細胞核）のｚ軸スライス蛍光画像３枚を示し、図１Ｂの下段には、ＩＥＬを小腸陰窩オルガノイドと共培養後３日目におけるＥＧＦＰ（ＩＥＬ）とＤＡＰＩ（細胞核）のｚ軸スライス蛍光画像３枚を示す。なお、図１Ｂの上段のパネルとその真下の下段のパネルは、同一サンプルの同一のｚ軸スライス画像において、取得する蛍光シグナルのみが異なる。また、図１Ａ及びＢ中の蛍光画像における矢頭は、小腸陰窩オルガノイドに組み込まれたＩＥＬを示し、図１Ｂ中の蛍光画像における矢印は、小腸陰窩オルガノイドの外側に存在するＩＥＬを示す。スケールバーは５０μｍを示す。
【図２】図２Ａの上段には、ＩＥＬを、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５存在下で小腸陰窩オルガノイドと共培養後１日目、３日目、及び７日目におけるＥＧＦＰ（ＩＥＬ）の蛍光画像を示し、図２Ａの中段には、図２Ａの上段の蛍光画像と、それぞれに対応する位相差画像（ＰＣ）とを重ね合わせた画像を示し、図２Ａの下段には、図２Ａの中段の画像における点線で囲った領域の拡大画像を示す。図２Ｂの上段には、ＩＥＬをＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５存在下で小腸陰窩オルガノイドと共培養後７日目におけるＣＤ３（ＩＥＬ）とＤＡＰＩ（細胞核）のｚ軸スライス蛍光画像を示し、図２Ｂの下段には、ＩＥＬをＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５存在下で小腸陰窩オルガノイドと共培養後７日目におけるＥＧＦＰ（ＩＥＬ）とＤＡＰＩ（細胞核）のｚ軸スライス蛍光画像３枚を示す。なお、図２Ｂの上段のパネルとその真下の下段のパネルは、同一サンプルの同一のｚ軸スライス画像において、取得する蛍光シグナルのみが異なる。また、図２Ｃの左上には、ＩＥＬをＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５存在下で小腸陰窩オルガノイドと共培養後１４日目におけるＥＧＦＰ（ＩＥＬ）の蛍光画像を示し、図２Ｃの右上には、左上図における点線で囲った領域の拡大画像を示し、図２Ｃの左下には、左上図に位相差画像（ＰＣ）を重ね合わせた画像を示し、図２Ｃの右下には、左下図における点線で囲った領域の拡大画像を示す。
【図３】図３Ａは、ＩＥＬをＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５存在下で小腸陰窩オルガノイドと共培養後１日目、７日目、及び１４日目におけるＩＥＬ数を測定した結果を示す図である。棒グラフは、平均値±標準偏差（ＳＥＭ）で表す。図３Ｂは、ＩＥＬをＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５存在下で小腸陰窩オルガノイドと共培養後１日目及び７日目におけるＴＣＲαβ＋及びＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団の比率を測定した結果を示す図である。図３Ｃは、ＩＥＬをＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５存在下で小腸陰窩オルガノイドと共培養後１日目及び７日目におけるＴＣＲαβ＋及びＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団について、Ｋｉ−６７の発現レベルを解析した結果を示す図である。図３Ｄは、ＩＥＬをＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５存在下で小腸陰窩オルガノイドと共培養後１４日目におけるＴＣＲαβ＋及びＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団の比率を測定した結果を示す図である。図３Ｅは、ＩＥＬをＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５存在下で小腸陰窩オルガノイドと共培養後１４日目におけるＴＣＲαβ＋及びＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団について、Ｋｉ−６７の発現レベルを解析した結果を示す図である。
【図４】図４Ａは、ＩＥＬをＩＬ−２、ＩＬ−７又はＩＬ−１５存在下、又は、これら３種のＩＬの存在下で、小腸陰窩オルガノイドと共培養後１日目及び７日目におけるＩＥＬ数を測定した結果を示す図である。棒グラフは、平均値±標準偏差（ＳＥＭ）で表す。図４Ｂは、ＩＥＬを、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５存在下で、大腸陰窩オルガノイドと共培養後１日目及び７日目におけるＩＥＬ数を測定した結果を示す図である。棒グラフは、平均値±標準偏差（ＳＥＭ）で表す。
【図５】小腸陰窩オルガノイドと共培養したＩＥＬの運動解析の結果を示す図である。図５Ａには、ＥＧＦＰ−ｔｇマウス由来のＩＥＬと、野生型マウス由来の小腸陰窩オルガノイドとを共培養後３日目に、タイムラプス蛍光イメージング（Time-lapse fluorescent Imaging）により解析した結果を示す。上皮細胞単層の基底側に沿った活発な動きを示す代表的なＩＥＬの画像（図５Ａ上段）、及び小腸陰窩オルガノイド内部と外部への遊走を示すＩＥＬの画像（図５Ａ下段）を示す。スケールバーは１０μｍを示す。図５Ｂには、Ｒ２６−Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰマウス由来のＩＥＬと、野生型マウス由来の小腸陰窩オルガノイドとを共培養後３日目に、タイムラプス蛍光イメージングにより解析した結果を示す。上皮細胞単層に沿って遊走するＩＥＬの画像（図５Ｂ上段）、及び小腸陰窩オルガノイド内側と外側への遊走を示すＩＥＬの画像（図５Ｂ下段）を示す。スケールバーは１０μｍを示す。なお、図５Ａ、Ｂの各蛍光画像の右下の数値表示は、イメージングの開始からの経過時間を示す。図５Ｃには、Ｒ２６−Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰマウス由来のＩＥＬと、野生型マウス由来の小腸陰窩オルガノイドとを共培養後３日目に、ＩＥＬ運動解析した結果を示す。代表的なデータセットの初期（図５Ｃ上左図）及び最後（図５Ｃ上右図）の静止画像において、ＩＥＬの細胞核（白色の小さい球）及びその軌跡を４Ｄイメージで示す。点線で囲った領域の拡大画像を下段に示す。スケールバーは５０μｍを示す。図５Ｄには、Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰレポーターマウスからＴＣＲαβ＋及びＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団をそれぞれ独立して単離し、野生型マウス由来の小腸陰窩オルガノイドと共培養後３日目に、５μＭ ＰＤ１８４３５２で前処理をし（図５Ｄ上段）、又は前処理せず（図５Ｄ下段）に、ＩＥＬ運動解析した結果を示す。スケールバーは１０μｍを示す。図５Ｅには、Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰレポーターマウスからＴＣＲαβ＋及びＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団をそれぞれ独立して単離し、野生型マウス由来の小腸陰窩オルガノイドと共培養後３日目に、ＩＥＬ内におけるリン酸化ＥＲＫタンパク質（phospho-ERK）の発現をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜１．腸上皮間リンパ球をインビトロで維持・増殖させる方法＞
本発明の「腸上皮間リンパ球をインビトロで維持・増殖させる方法」（以下、単に「本発明の維持・増殖方法」とも表示する。）としては、
（Ａ）単離された腸上皮間リンパ球を、腸陰窩オルガノイドと共に、細胞外マトリクスに包埋する工程Ａ：及び、
（Ｂ）前記腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液中で、前記細胞外マトリクスに包埋した腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイドを共培養する工程Ｂ：
を含んでいる限り特に制限されない。
【００１４】
（単離された腸上皮間リンパ球）
上記工程Ａにおける「単離された腸上皮間リンパ球」としては、哺乳動物の腸上皮間リンパ球であって、かつ、単離された腸上皮間リンパ球である限り特に制限されず、哺乳動物の腸の上皮から直接単離された腸上皮間リンパ球であってもよいし、かかる腸上皮間リンパ球を維持又は増殖することにより得られた腸上皮間リンパ球であってもよい。また、本発明における「単離された腸上皮間リンパ球」とは、腸上皮間リンパ球を含むそのままの生体組織ではないことを意味し、腸上皮間リンパ球のみから構成され、他の種類の細胞を一切含まない状態の他、腸上皮間リンパ球が生体組織の状態よりも濃縮された細胞混合物も含まれる。かかる細胞混合物としては、腸上皮間リンパ球の含有比率（細胞の個数の割合）が１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、８０％以上のものを例示することができる。
【００１５】
本明細書における「腸上皮間リンパ球」としては、小腸上皮間リンパ球、大腸上皮間リンパ球が挙げられ、小腸上皮間リンパ球が好ましく挙げられる。本明細書において「哺乳動物」としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等が好適に挙げられ、中でもヒトがより好適に挙げられる。
【００１６】
腸上皮間リンパ球は、哺乳動物の大腸組織や小腸組織から、公知の方法（例えば、Kohyama et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96:7451-7455）により単離することができる。より具体的には以下の単離方法が挙げられる。
哺乳動物から採取した腸組織をＰＢＳ等の緩衝液で洗い流し、パイエル板を除去した後、薄い（例えば５ｍｍ程度の）切片に切断する。その後、Ｃａ、Ｍｇを含まないハンクス平衡塩液に２〜８ｍＭ（好ましくは５ｍＭ）のエチレン−ジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ）及び０．３〜２ｍＭ（好ましくは１ｍＭ）の１，４−ジチオ−Ｄ−トレイトール（ＤＴＴ）を含む容器中で２０〜４０℃（好ましくは３７℃）、１０分間〜１時間（好ましくは３０分間）、５０〜２５０ｒｐｍ（好ましくは１５０ｒｐｍ）で振盪しながらインキュベートする。次いで、容器内の内容物を、目開き１００〜５００μｍ（好ましくは３００μｍ）のナイロンメッシュフィルター及びグラスウールのカラムに通した後、回収された細胞を２０〜４０％（好ましくは３０％）パーコールに懸濁し、１０〜３０分間（好ましくは２０分間）、６００〜１０００ｇ（好ましくは８００ｇ）で遠心分離する。ＩＥＬは、３０分間８００ｇ、４０／７０％パーコール勾配の遠心分離で単離できる。単離したＩＥＬは、洗浄し、細胞を計数した後、アッセイに用いてもよい。
【００１７】
上記工程Ａに用いる「単離された腸上皮間リンパ球」の数や、「腸陰窩オルガノイド」の数としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されず、前述の「単離された腸上皮間リンパ球」の数としては例えば１．０×１０２個〜１．０×１０８個の範囲内、１．０×１０３個〜１．０×１０７個の範囲内、１．０×１０４個〜１．０×１０６個の範囲内が好ましく挙げられ、前述の「腸陰窩オルガノイド」の数としては例えば１０〜１００００個の範囲内、５０〜２００個の範囲内、７０〜１５０個の範囲内が好ましく挙げられる。また、上記工程Ａに用いる「単離された腸上皮間リンパ球」の数と、「腸陰窩オルガノイド」の数との比率としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、腸陰窩オルガノイド１個に対して、ＩＥＬを１０個〜１０万個の範囲内、１００個〜１万個の範囲内、５００〜２０００個の範囲内が好ましく挙げられる。
【００１８】
（腸陰窩オルガノイド）
上記工程Ａにおける「腸陰窩オルガノイド」としては、哺乳動物の腸陰窩オルガノイドである限り特に制限されない。本明細書において「腸陰窩オルガノイド」とは、腸上皮により内面が覆われている中心内腔、及び、外面に突出する複数の陰窩様部位を有する組織構造体を意味する。本明細書における「腸陰窩オルガノイド」として、具体的には、小腸陰窩オルガノイド、大腸陰窩オルガノイドが挙げられ、小腸陰窩オルガノイドが好ましく挙げられる。
【００１９】
腸陰窩オルガノイドは、公知の方法により作製することができる。小腸陰窩オルガノイドの作製方法は例えば特許文献１（特開２０１２−２５４０８１号公報）に詳細に記載されており、大腸陰窩オルガノイドの作製方法は例えば特許文献２（国際公開第２０１３／０６１６０８号パンフレット）に詳細に記載されている。
【００２０】
小腸陰窩オルガノイドの作製方法は、前述のように、例えば特許文献１に詳細に記載されているが、以下に簡単に説明する。哺乳動物の小腸から、鉗子等を利用して、陰窩を含む小腸組織を採取する。かかる小腸組織から、公知の方法にしたがって、陰窩を単離することができる。例えば、キレート剤（基底膜および間質細胞型とのそれらのカルシウムおよびマグネシウム依存性相互作用から細胞を解放する）と、採取した小腸組織を恒温放置することによって、陰窩を単離することができる。この小腸組織を洗浄した後、硝子スライドで上皮細胞層を粘膜下層から剥離し、細切する。この後、続いて、トリプシンまたは、より好ましくはＥＤＴＡおよび／またはＥＧＴＡ中で恒温放置し、例えばろ過および／または遠心段階を用いて、未消化の小腸組織断片と陰窩由来の単一細胞とを分離する。トリプシンの代わりに、その他のタンパク質分解酵素、例えばコラゲナーゼおよび／またはディスパーゼＩを使用することができる。
【００２１】
分離して得られた、小腸陰窩由来の複数種の単一細胞を含む細胞集団は、小腸上皮幹細胞を含んでいる。かかる細胞集団を培養することにより、小腸陰窩オルガノイドを作製することができるが、より効率良く小腸陰窩オルガノイドを作製する観点から、前述の細胞集団から単離した小腸上皮幹細胞を培養することが好ましい。かかる小腸上皮幹細胞は、腸の成体幹細胞のマーカーであるＬｇｒ５及び／Ｌｇｒ６を指標に単離することができる。
【００２２】
小腸上皮幹細胞又は、該小腸上皮幹細胞を含む細胞集団は、細胞外マトリクスに包埋して、３次元的に培養することが好ましい。かかる細胞外マトリクスとしては、後述の工程Ａにおいて、腸上皮間リンパ球として小腸上皮間リンパ球を用い、腸陰窩オルガノイドとして小腸陰窩オルガノイドを用いる場合に利用する細胞外マトリクスと同様のものが好ましく挙げられる。また、細胞外マトリクスへの包埋方法は、後述の工程Ａにおける包埋方法と同様の方法を用いることができる。
【００２３】
小腸陰窩オルガノイドを作製する際の培養液としては、後述の工程Ｂに用いる培養液のうち、「小腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液」が好ましく挙げられる。ただし、小腸陰窩オルガノイドを作製する際の培養液は、後述の「さらなる任意成分」を含んでいてもよいが、含んでいなくてもよく、製造コストの観点から、含んでいない方が好ましい。
【００２４】
小腸陰窩オルガノイドを作製する際の培養条件としては、小腸陰窩オルガノイドを作製し得る限り特に制限されないが、培養温度として、例えば３０〜４０℃の範囲内、好ましくは３６〜３８℃の範囲内、より好ましくは３７℃を好適に例示することができる。また、培養期間としては例えば４〜１２日間が挙げられ、５〜１０日間が好ましく挙げられ、６〜７日間がより好ましく挙げられる。培養液の交換は適当な時期に行うことが好ましい。培養液の交換頻度としては、小腸陰窩オルガノイドを作製し得る限り特に制限されないが、例えば１〜５日間経過毎、好ましくは２〜３日間経過毎とすることができる。
【００２５】
一方、大腸陰窩オルガノイドの作製方法は、前述のように、例えば特許文献２に詳細に記載されているが、以下に簡単に説明する。哺乳動物の大腸から、鉗子等を利用して、陰窩を含む大腸組織を採取する。かかる大腸組織から、公知の方法にしたがって、陰窩を単離することができる。例えば、キレート剤（基底膜および間質細胞型とのそれらのカルシウムおよびマグネシウム依存性相互作用から細胞を解放する）と、採取した大腸組織を恒温放置することによって、陰窩を単離することができる。この大腸組織を洗浄した後、硝子スライドで上皮細胞層を粘膜下層から剥離し、細切する。この後、続いて、トリプシンまたは、より好ましくはＥＤＴＡおよび／またはＥＧＴＡ中で恒温放置し、例えばろ過および／または遠心段階を用いて、未消化の大腸組織断片と陰窩由来の単一細胞とを分離する。トリプシンの代わりに、その他のタンパク質分解酵素、例えばコラゲナーゼおよび／またはディスパーゼＩを使用することができる。
【００２６】
分離して得られた、大腸陰窩由来の複数種の単一細胞を含む細胞集団は、大腸上皮幹細胞を含んでいる。かかる細胞集団を培養することにより、大腸陰窩オルガノイドを作製することができるが、より効率良く大腸陰窩オルガノイドを作製する観点から、前述の細胞集団から単離した大腸上皮幹細胞を培養することが好ましい。かかる大腸上皮幹細胞は、腸の成体幹細胞のマーカーであるＬｇｒ５及び／Ｌｇｒ６を指標に単離することができる。
【００２７】
大腸上皮幹細胞又は、該大腸上皮幹細胞を含む細胞集団は、細胞外マトリクスに包埋して、３次元的に培養することが好ましい。かかる細胞外マトリクスとしては、後述の工程Ａにおいて、腸上皮間リンパ球として大腸上皮間リンパ球を用い、腸陰窩オルガノイドとして大腸陰窩オルガノイドを用いる場合に利用する細胞外マトリクスと同様のものが好ましく挙げられる。また、細胞外マトリクスへの包埋方法は、後述の工程Ａにおける包埋方法と同様の方法を用いることができる。
【００２８】
大腸陰窩オルガノイドを作製する際の培養液としては、後述の工程Ｂに用いる培養液のうち、「大腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液」が好ましく挙げられる。ただし、大腸陰窩オルガノイドを作製する際の培養液は、後述の、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５から選択される１種又は２種又は３種を含んでいてもよいが、含んでいなくてもよく、製造コストの観点から、含んでいない方が好ましい。
【００２９】
大腸陰窩オルガノイドを作製する際の培養条件としては、大腸陰窩オルガノイドを作製し得る限り特に制限されないが、培養温度として、例えば３０〜４０℃の範囲内、好ましくは３６〜３８℃の範囲内、より好ましくは３７℃を好適に例示することができる。また、培養期間としては例えば４〜１２日間が挙げられ、５〜１０日間が好ましく挙げられ、６〜７日間がより好ましく挙げられる。培養液の交換は適当な時期に行うことが好ましい。培養液の交換頻度としては、大腸陰窩オルガノイドを作製し得る限り特に制限されないが、例えば１〜５日間経過毎、好ましくは２〜３日間経過毎とすることができる。
【００３０】
本発明に用いる腸陰窩オルガノイドは、初代培養により得られる腸陰窩オルガノイドであってもよいし、初代培養の培養物（例えば腸陰窩オルガノイド）から採取した細胞を継代培養して得られる腸陰窩オルガノイドであってもよいし、継代培養の培養物（例えば腸陰窩オルガノイド）から採取した細胞を継代培養して得られる腸陰窩オルガノイドであってもよい。継代の時期や頻度としては、腸陰窩オルガノイドを作製し得る限り特に制限されないが、腸上皮幹細胞等の集団（好ましくは腸陰窩オルガノイド）が大きくなってきたタイミングで適宜行うことができ、例えば、４〜１２日間経過後又は経過毎、好ましくは６〜１０日間経過後又は経過毎とすることができる。継代の方法としては、腸上皮幹細胞等を維持又は増幅し得る限り特に制限されず、細胞外基質から分離した腸上皮幹細胞等（例えば腸陰窩）を、新たな細胞外基質と共存させる方法を例示することができ、中でも、半固形化した細胞外基質（好ましくはマトリゲルやコラーゲン）を分解酵素（好ましくはコラゲナーゼなど）等により分解又は冷却により解重合して分離して得られた腸上皮幹細胞等（例えば腸陰窩）を、新たな細胞外基質に包埋させる方法を好適に例示することができる。
【００３１】
（本発明における工程Ａ）
本発明における工程Ａとしては、単離された腸上皮間リンパ球を、腸陰窩オルガノイドと共に、細胞外マトリクスに包埋する工程である限り特に制限されず、例えば、ウェル等の培養容器内において、単離された腸上皮間リンパ球、腸陰窩オルガノイド及び細胞外マトリクスを共存させつつ、細胞外マトリクスを重合させる方法が好ましく挙げられ、中でも、単離された腸上皮間リンパ球と腸陰窩オルガノイドの混合物を、ウェル等の培養容器内に入れた後、該培養容器内に細胞外マトリクスを添加し、該細胞外マトリクスを重合させる方法がより好ましく挙げられる。
【００３２】
好ましい態様として、上記工程Ａより前に、単離された腸上皮間リンパ球と、腸陰窩オルガノイドとを、腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液（好ましくはＤＭＥＭ培養液）中で１０分間〜２時間、好ましくは２０分間〜１時間、培養することが好ましい。
【００３３】
（本発明における工程Ｂ）
本発明における工程Ｂとしては、腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液中で、「細胞外マトリクスに包埋した腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイド」を共培養する工程である限り特に制限されない。
【００３４】
本発明の工程Ｂにおける共培養の培養条件としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、培養温度として、例えば３０〜４０℃の範囲内、好ましくは３６〜３８℃の範囲内、より好ましくは３７℃を好適に例示することができる。また、培養期間としては特に制限されないが、例えば４〜１４日間が挙げられ、腸上皮間リンパ球を増殖させる場合は、より多くの腸上皮間リンパ球を得る観点から７〜１４日間が好ましく挙げられ、８〜１３日間がより好ましく挙げられる。また、後述するように、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドを製造する場合は、工程Ｂの培養期間として３〜７日間が好ましく挙げられ、５〜７日間がより好ましく挙げられる。
【００３５】
本発明の工程Ｂにおける共培養において、培養液の交換は適当な時期に行うことが好ましい。培養液の交換頻度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば１〜５日間経過毎、好ましくは２〜３日間経過毎とすることができる。
【００３６】
本発明の工程Ｂにおける共培養において、腸陰窩オルガノイドは交換しなくてもよいが、腸上皮間リンパ球をより長期間維持し又はより多く増殖させる観点から、あるいは、腸上皮間リンパ球がより多く増加した腸陰窩オルガノイドを得る観点から、適当な時期に交換することが好ましい。腸陰窩オルガノイドの交換頻度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば５〜８日間毎、好ましくは６〜７日間毎とすることができる。
【００３７】
腸陰窩オルガノイドを交換する方法としては特に制限されないが、例えば、共培養物中のＩＥＬを単離した後、かかるＩＥＬを、別途培養した腸陰窩オルガノイドと共に細胞外マトリクスに包埋して、腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液中で共培養を継続する方法が挙げられる。なお、共培養物中のＩＥＬを単離する方法としては以下のような方法が挙げられる。共培養中の「細胞外マトリクスに包埋した腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイド」を培養液中から取りだした後、細胞外マトリクスを冷却やコラゲナーゼ等で解重合や分解などして、腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイドを分取する。遠心分離後、上清画分（画分１）を回収する。また、沈殿物を氷上の緩衝液中でインキュベートし、しばらく静置した後、上清画分（画分２）を回収する。さらに、その沈殿物を激しいピペット操作などで破壊し、メッシュフィルター（例えば目開き４０μｍ）を通過させたものを画分３とする。画分１〜３はいずれもＩＥＬを含む懸濁液である。画分１〜３のいずれかを用いてもよいが、画分１〜３を合わせることにより、共培養物中からＩＥＬをより効率良く単離することができる。
【００３８】
（工程Ｂの培養液）
本発明の工程Ｂにおける培養液（以下、単に「工程Ｂの培養液」とも表示する。）としては、腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液である限り特に制限されない。工程Ｂにおける培養液は血清を含有していてもよいし、含有していなくてもよいが、含有していないことが好ましい。本発明によれば、血清を用いずとも、ＩＥＬを長期間維持でき、又はＩＥＬをより多く増殖することができる。
【００３９】
工程Ｂの培養液は、基本培養液成分（糖類などの炭素源、アミノ酸などの窒素源、無機塩）に加えて、以下の必須成分を含む。かかる必須成分は、腸陰窩オルガノイドが小腸陰窩オルガノイドである場合は、分裂促進増殖因子、Ｗｎｔアゴニスト及びＢＭＰ阻害物質（以下、これら３成分をまとめて、単に「小腸必須３成分」とも表示する。）であり、腸陰窩オルガノイドが大腸陰窩オルガノイドである場合は、血清アルブミン、Ｗｎｔ３ａ、及び、Ｒ−スポンジン１（以下、これら３成分をまとめて、単に「大腸必須３成分」とも表示する。）である。
【００４０】
上記の基本培養液成分としては、培養する腸上皮間リンパ球や腸陰窩オルガノイドが同化し得る糖類等の炭素源や、かかる腸上皮間リンパ球や腸陰窩オルガノイドが消化し得るアミノ酸等の窒素源や、無機塩などを好適に例示することができる。かかる基本培養液成分は当業者に公知のものや、市販のもの（例えば、Invitrogen社製のもの）を使用することができ、具体的には、ＭＥＭ（Minimum Essential Medium）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、 ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）、ＥＭＥＭ（Eagle's minimal essential medium）、ＩＭＤＭ（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、ＧＭＥＭ（Glas- gow's MEM）、Ｆ１２（Ham's F12 Medium）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ１６４０、ＢＭＯＣ-３ （Brinster's BMOC-3 Medium）、ＣＭＲＬ−１０６６、Ｌ−１５（Leibovitz's L-15 medium）、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、Ｍｅｄｉａ １９９、ＭＥＭ αＭｅｄｉａ、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、Williams’ medium E、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＭＥＭ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ１６４０、などの培養液を用いることができる。本発明においては、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Invitrogen社製）などを好適に例示することができる。また、上記のアミノ酸としては、グルタミンを好適に例示することができる。
【００４１】
（小腸必須３成分）
腸上皮間リンパ球（すなわち、小腸上皮間リンパ球又は大腸上皮間リンパ球、好ましくは小腸上皮間リンパ球）と小腸陰窩オルガノイドを共培養する場合、工程Ｂの培養液は、小腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液である。小腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液は、小腸必須３成分（分裂促進増殖因子、Ｗｎｔアゴニスト及びＢＭＰ阻害物質）を含有する。
【００４２】
小腸必須３成分のうちの１つである上記の分裂促進増殖因子としては、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、及び、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）からなる群から選択される１種又は２種以上の分裂促進増殖因子が好ましく挙げられ、中でも、ＥＧＦやＦＧＦがより好ましく挙げられ、中でも、ＥＧＦが最も好ましく挙げられる。なお、ＦＧＦとしては、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ７（ケラチン生成細胞増殖因子（ＫＧＦ）とも呼ばれる）及びＦＧＦ１０から選択される１種又は２種以上が好ましく挙げられ、ＦＧＦ７及び／又はＦＧＦ１０がより好ましく挙げられる。分裂促進増殖因子の好ましい組合せとしては、「ＥＧＦ単独」や、「ＥＧＦ及びＦＧＦ７」や、「ＥＧＦ及びＦＧＦ１０」が挙げられる。
【００４３】
腸上皮間リンパ球と小腸陰窩オルガノイドを共培養する場合の工程Ｂの培養液における分裂促進増殖因子の濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、ＥＧＦの場合、例えば、５〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは１０〜２５０ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは２０〜１２５ｎｇ／ｍＬの範囲内、さらに好ましくは３０〜７０ｎｇ／ｍＬの範囲内が挙げられる。同様の濃度をＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ１０やＦＧＦ７）に対して適用することができる。複数種のＦＧＦを使用する場合は、ＦＧＦの前述の濃度範囲は、使用するＦＧＦの総濃度を示す。上記工程Ｂの培養中、１〜３日ごと（好ましくは２日ごと）に分裂促進増殖因子を培養液に添加することが好ましい。
【００４４】
小腸必須３成分のうちの１つである上記のＷｎｔアゴニストとは、細胞中でＴＣＦ／ＬＥＦ介在性の転写を活性化する物質を意味する。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、Ｗｎｔタンパク質がFrizzled受容体ファミリーの細胞表面受容体に結合し、該受容体にDishevelledファミリータンパク質を放出させることで始まる。Dishevelledファミリータンパク質は通常、β-カテニンシグナル分子を促進するアキシン（Axin）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）及びＡＰＣ（Adenomatous polyposis coli）タンパク質を含む分子の複合体を抑制する。この複合体が抑制されるとβ−カテニンが安定化して核へ入ることが可能となり、核へ入った該β−カテニンはＴＣＦ／ＬＥＦファミリー転写因子によって転写を促進する。よって、上記のＷｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔファミリータンパク質のありとあらゆるものを含むFrizzled受容体ファミリーメンバーに結合し、活性化する作用を有する物質（狭義のＷｎｔアゴニスト）、細胞内β−カテニン分解の阻害物質、及び、ＴＣＦ／ＬＥＦの活性化物質からなる群から選択される１種又は２種以上のＷｎｔアゴニストが挙げられる。Ｗｎｔアゴニストが細胞においてＷｎｔ活性を向上させる程度としては特に制限されないが、そのＷｎｔアゴニストの存在下でのＷｎｔ活性のレベルが、そのＷｎｔアゴニストの非存在下でのＷｎｔ活性のレベルに対して、割合として１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％以上の向上であることが好適に挙げられる。Ｗｎｔ活性は、公知の方法により測定することができ、例えばpTOPFLASH及びpFOPFLASH Tcfルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって、Ｗｎｔの転写活性を測定することにより調べることができる（Korinek et al.,1997.Science 275:1784-1787）。
【００４５】
上記のＷｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔ−１／Ｉｎｔ−１；  Ｗｎｔ−２／Ｉｒｐ（Ｉｎｔ−１関連タンパク質）；  Ｗｎｔ−２ｂ／１３、Ｗｎｔ−３／Ｉｎｔ−４；  Ｗｎｔ−３ａ（例えばR&D systems社製）；  Ｗｎｔ−４；  Ｗｎｔ−５ａ；  Ｗｎｔ−５ｂ；  Ｗｎｔ−６（Kirikoshi H et al.2001. Biochem Biophys Res Com 283:798-805）；  Ｗｎｔ−７ａ（R&D systems社製）;  Ｗｎｔ−７ｂ；  Ｗｎｔ−８ａ／８ｄ；  Ｗｎｔ−８ｂ；  Ｗｎｔ−９ａ／１４；  Ｗｎｔ−９ｂ／１４ｂ／１５；  Ｗｎｔ−１０ａ；  Ｗｎｔ−１０ｂ／１２；  Ｗｎｔ−１１及びＷｎｔ−１６からなる群から選択される１種又は２種以上のＷｎｔタンパク質が挙げられる。Ｗｎｔタンパク質は、分泌糖タンパク質である。ヒトＷｎｔタンパク質の概要については、「THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS」、R&D Systems Catalog、2004）で提供される。さらに、Ｗｎｔアゴニストは、分泌タンパク質のＲ−スポンジン（R-Spondin）ファミリー（これは、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化および制御に関わり、４種類のメンバー（Ｒ−スポンジン１（NU206,Nuvelo,San Carlos,CA）、Ｒ−スポンジン２（（R&D systems社製）、Ｒ−スポンジン３およびＲ−スポンジン−４）からなる）及び、高親和性でFrizzled-4受容体に結合し、Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化を誘導するという点でＷｎｔタンパク質のように機能する分泌性制御タンパク質であるノリン（Norrin、ノリー病タンパク質（Norrie Disease Protein）又はＮＤＰとも呼ばれる）（R&D systems社製）を含む（Kestutis Planutis et al.（2007）BMC Cell Biol.8:12）。Ｗｎｔシグナル伝達経路の小分子アゴニスト、アミノピリミジン誘導体が最近同定されたが、これもまたＷｎｔアゴニストとして明確に含まれる（Liu et al.（2005）Angew Chem Int Ed Engl.44,1987-90）。
【００４６】
ＧＳＫ−３阻害活性を有する既知の物質としては、低分子干渉ＲＮＡ（siRNA、Cell Signaling）、リチウム（Sigma社製）、ケンパウロン（Biomol International；Leost,M et al.（2000）Eur J Biochem.267, 5983-5994）、６−ブロモインジルビン−３’−アセトキシム（Meijer,L et al.（2003）Chem Biol.10,1255-1266）、SB216763及びSB415286（Sigma-Aldrich社製）、及び、「ＦＲＡＴ−ファミリーメンバー及びアキシンとのＧＳＫ−３の相互作用を阻止するＦＲＡＴ由来ペプチド」が挙げられる。概要は、Meijer et al.（2004）Trends in Pharmacological Sciences 25,471-480により提供される。ＧＳＫ−３阻害活性のレベルを調べるための方法及びアッセイは当業者にとって公知であり、例えば、Liao et al. 2004, Endocrinology, 145（6）:2941-9）に記載のような方法およびアッセイが挙げられる。
【００４７】
好ましい態様において、Ｗｎｔアゴニストとしては、Ｗｎｔファミリーのタンパク質、Ｒ−スポンジン１〜４、ノリン及びＧＳＫ−３阻害物質からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられる。さらに好ましい態様において、Ｗｎｔアゴニストは、Ｒ−スポンジン１を含むか、又は、Ｒ−スポンジン１からなる。腸上皮間リンパ球と小腸陰窩オルガノイドを共培養する場合の工程Ｂの培養液におけるＲ−スポンジン１の濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、５０〜５０００ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは１００〜２５００ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは２００〜１２５０ｎｇ／ｍＬの範囲内、さらに好ましくは３００〜８５０ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは４００〜６２５ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは４５０〜５５０ｎｇ／ｍＬの範囲内、最も好ましくは５００ｎｇ／ｍＬが挙げられる。上記工程Ｂの培養中、好ましくは２日ごとにＷｎｔファミリーのタンパク質を培養液に添加し、また、好ましくは４日ごとに培養液を新鮮なものに交換する。
【００４８】
好ましい態様において、Ｗｎｔアゴニストは、Ｒ−スポンジン（好ましくはＲ−スポンジン１）、Ｗｎｔ−３ａ及びＷｎｔ−６からなる群から選択される１種又は２種以上であり、さらに好ましくはＲ−スポンジン（好ましくはＲ−スポンジン１）及びＷｎｔ−３ａの両者が挙げられる。この組み合わせは、驚くべきことにオルガノイド形成に対して相乗効果を有するので、特に好ましい。腸上皮間リンパ球と小腸陰窩オルガノイドを共培養する場合の工程Ｂの培養液におけるＲ−スポンジン（好ましくはＲ−スポンジン１）の好ましい濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、５０〜５０００ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは１００〜２５００ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは２００〜１２５０ｎｇ／ｍＬの範囲内、さらに好ましくは３００〜８５０ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは４００〜６２５ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは４５０〜５５０ｎｇ／ｍＬの範囲内、最も好ましくは５００ｎｇ／ｍＬが挙げられる。また、工程Ｂの培養液におけるＷｎｔ−３ａの好ましい濃度としては、１０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは２０〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは４０〜２５０ｎｇ／ｍＬの範囲内、さらに好ましくは６０〜１７０ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは８０〜１２５ｎｇ／ｍＬ、さらに好ましくは９０〜１１０ｎｇ／ｍＬの範囲内、最も好ましくは１００ｎｇ／ｍＬが挙げられる。
【００４９】
小腸必須３成分のうちの１つである上記のＢＭＰ阻害物質は、二量体リガンドとして２種類の異なる受容体セリン／スレオニンキナーゼ、Ｉ型及びII型受容体からなる受容体複合体に結合する。II型受容体はＩ型受容体をリン酸化し、その結果、この受容体キナーゼが活性化される。このＩ型受容体は、続いて特異的な受容体基質（ＳＭＡＤ）をリン酸化し、その結果、シグナル伝達経路によって転写活性が導かれる。
【００５０】
ＢＭＰ阻害物質には、ＢＭＰ分子に結合して複合体を形成することによって、ＢＭＰ分子のＢＭＰ受容体への結合を阻止又は阻害する物質や、ＢＭＰ受容体に結合することによって、ＢＭＰ分子のＢＭＰ受容体への結合を阻止又は阻害する物質が含まれる。後者の阻害物質には、ＢＭＰ受容体のアンタゴニストやインバースアゴニストが含まれ、より具体的には、ＢＭＰ受容体に結合することによって、ＢＭＰ分子のＢＭＰ受容体への結合を阻止又は阻害する抗体が挙げられる。
【００５１】
上記のＢＭＰ阻害物質が細胞においてＢＭＰ活性を阻害する程度としては特に制限されないが、そのＢＭＰ阻害物質の存在下でのＢＭＰ活性のレベルが、そのＢＭＰ阻害物質の非存在下でのＢＭＰ活性のレベルに対して、割合として９０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、さらに好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％までの阻害であることが好適に挙げられる。ＢＭＰ活性は、公知の方法により測定することができ、例えばZilberberg et al.,2007.BMC Cell Biol.8:41に記載されているように、ＢＭＰの転写活性を測定することによって、ＢＭＰ活性を調べることができる。
【００５２】
ＢＭＰ阻害物質としては、ノギン（Noggin）（Peprotech社製）、コーディン（Chordin）、コーディンドメインを含むコーディン様タンパク質（R&D systems社製）、ホリスタチン（Follistatin）、ホリスタチンドメインを含むホリスタチン関連タンパク質（R&D systems社製）、ＤＡＮタンパク質、ＤＡＮシステイン−ノットドメイン（DAN cysteine-knot domain）を含むＤＡＮ様タンパク質（R&D systems社製）、スクレロスチン/SOST（R&D systems社製）、デコリン（R&D systems）、及び、α−２マクログロブリン（R&D systems社製）からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられ、中でも、ノギン、ＤＡＮタンパク質、及び、ＤＡＮ様タンパク質（サーベラス（Cerberus）及びグレムリン（Gremlin）（R&D systems）を含む）からなる群から選択される１種又は２種以上が好ましく挙げられ、ノギンがより好ましく挙げられる。これらのＢＭＰ阻害物質は、ＢＭＰリガンドに結合することによって、ＢＭＰリガンドがシグナル伝達物質受容体へ結合することを阻害することができる。
【００５３】
腸上皮間リンパ球と小腸陰窩オルガノイドを共培養する場合の工程Ｂの培養液におけるＢＭＰ阻害物質の濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、ＢＭＰ阻害物質がノギンである場合、例えば、例えば、１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは１０〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは３０〜３００ｎｇ／ｍＬの範囲内、さらに好ましくは５０〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは７０〜１３０ｎｇ／ｍＬの範囲内が挙げられる。上記工程Ｂの培養中、好ましくは２日ごとにＢＭＰ阻害物質（好ましくはノギン）を培養液に添加し、また、好ましくは４日ごとに培養液を新鮮なものに交換する。
【００５４】
（大腸必須３成分）
腸上皮間リンパ球（すなわち、小腸上皮間リンパ球又は大腸上皮間リンパ球、好ましくは大腸上皮間リンパ球）と大腸陰窩オルガノイドを共培養する場合、工程Ｂの培養液は、大腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液である。大腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液は、大腸必須３成分（血清アルブミン、Ｗｎｔ３ａ、及び、Ｒ−スポンジン１）を含有する。
【００５５】
大腸必須３成分のうちの１つである上記の血清アルブミンは、哺乳動物の血清に含まれるアルブミンである限り特に制限されず、かかる血清アルブミンとしては、哺乳動物の血清から精製したもの、化学的あるいは生化学的に合成したもの、市販のもの（例えばSigma社製のＢＳＡ）のいずれを用いてもよい。血清アルブミンの由来としては、哺乳動物である限り特に制限されないが、ヒト血清アルブミン（human serum albumin；ＨＳＡ）や、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を好適に例示することができ、中でもＢＳＡをより好適に例示することができる。また、培養する腸上皮間リンパ球や大腸陰窩オルガノイドが由来する哺乳動物種と同種の哺乳動物に由来する血清アルブミンを用いることも好ましい。
【００５６】
腸上皮間リンパ球と大腸陰窩オルガノイドを共培養する場合の工程Ｂの培養液における血清アルブミンの濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、前述の工程Ｂの培養液において、上限として、３０重量％以下（例えば２０重量％以下、１０重量％以下、５％重量％以下など）が挙げられ、下限として、０．０１重量％以上（例えば０．０５重量％以上、０．１重量％以上、０．３％以上）が挙げられる。より好ましい濃度としては、０．３％以上３％以下の範囲を挙げることができる。
【００５７】
大腸必須３成分のうちの１つである上記のＷｎｔ３ａは、哺乳動物のＷＮＴ３Ａ遺伝子によりコードされるタンパク質である限り特に制限されず、かかるＷｎｔ３ａとしては、例えばパネート細胞などのＷｎｔ３産生細胞が産生するものを用いてもよいし、遺伝子工学的に作成した当該遺伝子発現細胞が産生するものを用いてもよいし、化学的あるいは生化学的に合成したもの、市販のもの（例えば、R&D Systems社製のＷｎｔ３ａ）のいずれを用いてもよい。Ｗｎｔ３ａの由来としては、哺乳動物である限り特に制限されないが、ヒトＷｎｔ３ａ（ｈＷｎｔ３ａ）や、マウスＷｎｔ３ａ（ｍＷｎｔ３ａ）を好適に例示することができ、中でも、ｍＷｎｔ３ａをより好適に例示することができる。また、培養する腸上皮間リンパ球や大腸陰窩オルガノイドが由来する哺乳動物種と同種の哺乳動物種と同じＷｎｔ３ａを用いることも好ましい。
【００５８】
腸上皮間リンパ球と大腸陰窩オルガノイドを共培養する場合の工程Ｂの培養液におけるＷｎｔ３ａの濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、前述の工程Ｂの培養液において、上限として、３ｍｇ／ｍＬ以下（例えば、５００μｇ／ｍＬ以下、１００μｇ／ｍＬ以下、３０μｇ／ｍＬ以下、３μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下など）が挙げられ、下限として、３００ｐｇ／ｍＬ以上（例えば、１ｎｇ／ｍＬ以上、３ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上）が挙げられる。より好ましい最終濃度としては、３０ｎｇ／ｍＬ以上を挙げることができる。
【００５９】
大腸必須３成分のうちの１つである上記のＲ−スポンジン１は、哺乳動物のＲＳＰＯ１遺伝子によりコードされるタンパク質である限り特に制限されず、かかるＲｓｐｏ１としては、遺伝子工学的に作成した当該遺伝子発現細胞などのＲｓｐｏ１産生細胞が産生するものを用いてもよいし、化学的あるいは生化学的に合成したもの、市販のもの（例えば、R&D Systems社製のR-Spondin1）のいずれを用いてもよい。Ｒｓｐｏ１の由来としては、哺乳動物である限り特に制限されないが、ヒトＲｓｐｏ１（ｈＲｓｐｏ１）や、マウスＲｓｐｏ１（ｍＲｓｐｏ１）を好適に例示することができ、中でも、ｍＲｓｐｏ１をより好適に例示することができる。また、培養する腸上皮間リンパ球や大腸陰窩オルガノイドが由来する哺乳動物種と同種の哺乳動物に由来するＲ−スポンジン１を用いることも好ましい。
【００６０】
腸上皮間リンパ球と大腸陰窩オルガノイドを共培養する場合の工程Ｂの培養液におけるＲ−スポンジン１の濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、前述の工程Ｂの培養液において、上限として、５ｍｇ／ｍＬ以下（例えば、１ｍｇ／ｍＬ以下、２００μｇ／ｍＬ以下、４０μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下など）であることが挙げられ、下限として、５００ｐｇ／ｍＬ以上（例えば、５ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、２５０ｎｇ／ｍＬ以上）であることが挙げられる。
【００６１】
（大腸任意３成分）
腸上皮間リンパ球（すなわち、小腸上皮間リンパ球又は大腸上皮間リンパ球、好ましくは小腸上皮間リンパ球）と大腸陰窩オルガノイドを共培養する場合、工程Ｂの培養液は、基本培養液成分、及び、大腸必須３成分のみを含んでいてもよいが、それらの成分に加えて、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及び、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）からなる群から選択される１種、好ましくは２種、より好ましくは３種の成分（以下、かかる３成分を「大腸任意３成分」とも表示する。）をさらに含有することを好適に例示することができる。
【００６２】
大腸任意３成分のうちの１つである上記のＥＧＦとしては、哺乳動物のＥＧＦ遺伝子によりコードされるタンパク質である限り特に制限されず、かかるＥＧＦとしては、遺伝子工学的に作成した当該遺伝子発現細胞などのＥＧＦ産生細胞が産生するものを用いてもよいし、化学的あるいは生化学的に合成したもの、市販のもの（例えば、Peprotech社製のＥＧＦ）のいずれを用いてもよい。ＥＧＦの由来としては、哺乳動物である限り特に制限されないが、ヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）や、マウスＥＧＦ（ｍＥＧＦ）を好適に例示することができ、中でも、ｍＥＧＦをより好適に例示することができる。また、培養する腸上皮間リンパ球や大腸陰窩オルガノイドが由来する哺乳動物種と同種の哺乳動物に由来するＥＧＦを用いることも好ましい。
【００６３】
腸上皮間リンパ球と大腸陰窩オルガノイドを共培養する場合の工程Ｂの培養液におけるＥＧＦの濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、前述の工程Ｂの培養液において、上限として、２００μｇ／ｍＬ以下（例えば、４０μｇ／ｍＬ以下、８μｇ／ｍＬ以下、２μｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、４０ｎｇ／ｍＬ以下など）であることが挙げられ、下限として、１ｐｇ／ｍＬ以上（例えば、８ｐｇ／ｍＬ以上、１００ｐｇ／ｍＬ以上、１ｎｇ／ｍＬ以上、１０ｎｇ／ｍＬ以上）であることが挙げられる。また、ＥＧＦのより好ましい濃度としては、１ｎｇ／ｍＬ以上４０ｎｇ／ｍＬ以下の範囲が挙げられる。
【００６４】
大腸任意３成分のうちの１つである上記のＨＧＦとしては、哺乳動物のＨＧＦ遺伝子によりコードされるタンパク質である限り特に制限されず、かかるＨＧＦとしては、遺伝子工学的に作成した当該遺伝子発現細胞などのＨＧＦ産生細胞が産生するものを用いてもよいし、化学的あるいは生化学的に合成したもの、市販のもの（例えば、R&D Systems社製のＨＧＦ）のいずれを用いてもよい。ＨＧＦの由来としては、哺乳動物である限り特に制限されないが、ヒトＨＧＦ（ｈＨＧＦ）や、マウスＨＧＦ（ｍＨＧＦ）を好適に例示することができ、中でも、ｍＨＧＦをより好適に例示することができる。また、培養する腸上皮間リンパ球や大腸陰窩オルガノイドが由来する哺乳動物種と同種の哺乳動物に由来するＨＧＦを用いることも好ましい。
【００６５】
腸上皮間リンパ球と大腸陰窩オルガノイドを共培養する場合の工程Ｂの培養液におけるＨＧＦの濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、前述の工程Ｂの培養液において、上限として、５００μｇ／ｍＬ以下（例えば、１００μｇ／ｍＬ以下、２０μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、１００ｎｇ／ｍＬ以下など）であることが挙げられ、下限として、５０ｐｇ／ｍＬ以上（例えば、５００ｐｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、２５ｎｇ／ｍＬ以上）であることが挙げられる。また、ＨＧＦのより好ましい濃度としては、５ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下の範囲が挙げられる。
【００６６】
大腸任意３成分のうちの１つである上記のノギンとしては、哺乳動物のＮＯＧ遺伝子によりコードされるタンパク質である限り特に制限されず、かかるノギンとしては、遺伝子工学的に作成した当該遺伝子発現細胞などのノギン産生細胞が産生するものを用いてもよいし、化学的あるいは生化学的に合成したもの、市販のもの（例えば、R&D Systems社製のＮｏｇｇｉｎ）のいずれを用いてもよい。ノギンの由来としては、哺乳動物である限り特に制限されないが、ヒトノギン（ｈＮｏｇｇｉｎ）や、マウスノギン（ｍＮｏｇｇｉｎ）を好適に例示することができ、中でも、マウスノギンをより好適に例示することができる。また、培養する腸上皮間リンパ球や大腸陰窩オルガノイドが由来する哺乳動物種と同種の哺乳動物に由来するノギンを用いることも好ましい。
【００６７】
腸上皮間リンパ球と大腸陰窩オルガノイドを共培養する場合の工程Ｂの培養液におけるノギンの濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、前述の工程Ｂの培養液において、上限として、５００μｇ／ｍＬ以下（例えば、１００μｇ／ｍＬ以下、２０μｇ／ｍＬ以下、４μｇ／ｍＬ以下、５００ｎｇ／ｍＬ以下、１００ｎｇ／ｍＬ以下など）であることが挙げられ、下限として、５０ｐｇ／ｍＬ以上（例えば、５００ｐｇ／ｍＬ以上、５ｎｇ／ｍＬ以上、２５ｎｇ／ｍＬ以上）であることが挙げられる。また、ノギンのより好ましい濃度としては、５ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下の範囲を挙げることができる。
【００６８】
（さらなる任意成分）  
工程Ｂの培養液は、腸上皮間リンパ球（すなわち、小腸上皮間リンパ球又は大腸上皮間リンパ球、好ましくは小腸上皮間リンパ球）と小腸陰窩オルガノイドを共培養する場合であっても、腸上皮間リンパ球（すなわち、大腸上皮間リンパ球又は小腸上皮間リンパ球、好ましくは大腸上皮間リンパ球）と大腸陰窩オルガノイドを共培養する場合であっても、さらなる任意成分を含まなくてもよいが、腸上皮間リンパ球をより長期間維持し又はより多く増殖させる観点から、あるいは、腸上皮間リンパ球がより多く増加した腸陰窩オルガノイドを得る観点から、さらなる任意成分を含むことが好ましい。さらなる任意成分としては、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、Ｒｈｏキナーゼ阻害物質、Notchアゴニスト、抗生物質から選択される１種又は２種以上が挙げられ、中でも、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５から選択される１種又は２種以上（好ましくは３種）が好ましく挙げられ、中でも、「ＩＬ−２」、「ＩＬ−２及びＩＬ−７」、「ＩＬ−２及びＩＬ−１５」及び「ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５」から選択されるいずれかがより好ましく挙げられ、「ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５」が最も好ましく挙げられる。特に、ＩＬ−２は、腸上皮間リンパ球をより長期間維持し又はより多く増殖させる点や、腸陰窩オルガノイドにおける腸上皮間リンパ球をより多く増加させる点できわめて優れているため、工程Ｂの培養液は、任意成分として、少なくともＩＬ−２を含むことが特に好ましく挙げられる。また、上記のＲｈｏキナーゼ阻害物質や、上記のNotchアゴニストは、細胞の生存率や増殖効率を改善する点で好ましい。
【００６９】
上記のＩＬ−２（インターロイキン２）としては、哺乳動物のＩＬ−２である限り特に制限されないが、培養する腸上皮間リンパ球や腸陰窩オルガノイドが由来する哺乳動物種と同種のＩＬ−２が好ましく挙げられる。かかる哺乳動物のＩＬ−２としては、市販されているＩＬ−２（例えば、Ｒｏｃｈｅ社製）を用いてもよいし、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列データベースに開示されているＩＬ−２遺伝子のヌクレオチド配列やアミノ酸配列に基づいて化学的に合成したＩＬ−２を用いてもよいし、前述の配列に基づき、遺伝子組換え技術を利用して作製したＩＬ−２を用いてもよい。
【００７０】
工程Ｂの培養液におけるＩＬ−２の濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、１〜１万Ｕ／ｍＬの範囲内、好ましくは１０〜１０００Ｕ／ｍＬの範囲内、より好ましくは３０〜３００Ｕ／ｍＬの範囲内、さらに好ましくは５０〜２００Ｕ／ｍＬの範囲内、より好ましくは７０〜１３０Ｕ／ｍＬの範囲内が挙げられる。
【００７１】
上記のＩＬ−７（インターロイキン７）としては、哺乳動物のＩＬ−７である限り特に制限されないが、培養する腸上皮間リンパ球や腸陰窩オルガノイドが由来する哺乳動物種と同種のＩＬ−７が好ましく挙げられる。かかる哺乳動物のＩＬ−７としては、市販されているＩＬ−７（例えば、Peprotech社製）を用いてもよいし、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列データベースに開示されているＩＬ−７遺伝子のヌクレオチド配列やアミノ酸配列に基づいて化学的に合成したＩＬ−７を用いてもよいし、前述の配列に基づき、遺伝子組換え技術を利用して作製したＩＬ−７を用いてもよい。
【００７２】
工程Ｂの培養液におけるＩＬ−７の濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、０．１〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは３〜３０ｎｇ／ｍＬの範囲内、さらに好ましくは５〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは７〜１３ｎｇ／ｍＬの範囲内が挙げられる。
【００７３】
上記のＩＬ−１５（インターロイキン１５）としては、哺乳動物のＩＬ−１５である限り特に制限されないが、培養する腸上皮間リンパ球や腸陰窩オルガノイドが由来する哺乳動物種と同種のＩＬ−１５が好ましく挙げられる。かかる哺乳動物のＩＬ−１５としては、市販されているＩＬ−１５（例えば、Peprotech社製）を用いてもよいし、ＧｅｎＢａｎｋ等の配列データベースに開示されているＩＬ−１５遺伝子のヌクレオチド配列やアミノ酸配列に基づいて化学的に合成したＩＬ−１５を用いてもよいし、前述の配列に基づき、遺伝子組換え技術を利用して作製したＩＬ−１５を用いてもよい。
【００７４】
工程Ｂの培養液におけるＩＬ−１５の濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、０．１〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは３〜３０ｎｇ／ｍＬの範囲内、さらに好ましくは５〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは７〜１３ｎｇ／ｍＬの範囲内が挙げられる。
【００７５】
上記工程Ｂの培養液として、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５から選択される１種又は２種以上（好ましくは３種）を含む培養液を用いる場合、かかるインターロイキンを１〜３日ごと（好ましくは２日ごと）に培養液に添加することが好ましい。
【００７６】
さらなる任意成分の１つである上記のＲｈｏキナーゼ阻害物質としては、Sigma-Aldrich社製のY-27632（(R)-(+)-trans-4-(1-アミノエチル)-N-(4-ピリジル)シクロヘキサンカルボキサミド二塩酸塩 一水和物）や、Tocris Bioschience社製のH 1152 dihydrochloride（(S)-(+)-2-Methyl-1- [(4-methyl-5-isoquinolinyl)sulfonyl]-hexahydro-1H-1,4-diazepine dihydrochloride）が挙げられ、中でもY-27632が好ましく挙げられる。工程Ｂの培養液におけるＲｈｏキナーゼ阻害物質の濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、前述の工程Ｂの培養液において、２〜５０μＭの範囲内、好ましくは５〜２０μＭの範囲内が挙げられる。
【００７７】
さらなる任意成分の１つである上記のNotchアゴニストとしては、Jagged 1タンパク質、Delta 1タンパク質、ＤＳＬペプチド（Dontu et al.,2004、Breast Cancer Res 6:R605-R615）などが挙げられ、中でも、ＤＳＬペプチドが好ましく挙げられる。工程Ｂの培養液におけるNotchアゴニストの濃度としては、「本発明の維持・増殖方法」や、後述の「本発明の製造方法」に用い得る限り特に制限されないが、例えば、前述の工程Ｂの培養液において、１０〜１００μＭの範囲内が挙げられる。
【００７８】
さらなる任意成分の１つである上記の抗生物質としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなどが挙げられる。
【００７９】
上記工程Ｂの培養液として、Ｒｈｏキナーゼ阻害物質、Notchアゴニスト、抗生物質から選択される１種又は２種以上を含む培養液を用いる場合、それ又はそれらを１〜３日ごと（好ましくは２日ごと）に培養液に添加することが好ましい。
【００８０】
上記工程Ｂの培養液の調製方法としては、上記の基本培養液成分及び必須３成分（小腸必須３成分又は大腸必須３成分）の他、必要に応じて、大腸任意３成分及び／又はさらなる任意成分を、水やＰＢＳなどの液体溶媒に配合させる方法や、基本培養液成分を含む培養液に、上記の必須３成分（小腸必須３成分又は大腸必須３成分）の他、必要に応じて、大腸任意３成分及び／又はさらなる任意成分を配合させる方法を例示することができる。
【００８１】
（共培養物からのＩＥＬの単離）
本発明の維持・増殖方法は、工程Ｂにより得られた共培養物からＩＥＬを単離する工程をさらに含んでいなくてもよいが、該工程を含んでいることが好ましい。共培養物からＩＥＬを単離する方法としては以下のような方法が挙げられる。共培養中の「細胞外マトリクスに包埋した腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイド」を培養液中から取りだした後、細胞外マトリクスを冷却やコラゲナーゼ等で解重合や分解などして、腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイドを分取する。遠心分離後、上清画分（画分１）を回収する。また、沈殿物を氷上の緩衝液中でインキュベートし、しばらく静置した後、上清画分（画分２）を回収する。さらに、その沈殿物を激しいピペット操作などで破壊し、メッシュフィルター（例えば目開き４０μｍ）を通過させたものを画分３とする。画分１〜３はいずれもＩＥＬを含む懸濁液である。画分１〜３のいずれかを用いてもよいが、画分１〜３を合わせることにより、共培養物中からＩＥＬをより効率良く単離することができる。
【００８２】
（本発明の維持・増殖方法により得られる腸上皮間リンパ球）
本発明の維持・増殖方法により得られる「腸上皮間リンパ球」（小腸上皮間リンパ球又は大腸上皮間リンパ球）は、哺乳動物の小腸や大腸の上皮内や、該上皮と粘膜固有層との間などに投与することによって、腸上皮のバリア機能の向上、腸粘膜の恒常性の向上、腸における宿主（哺乳動物）防御機構の向上を図ることができると考えられる。なお、腸上皮のバリア機能の向上や、腸粘膜の恒常性の向上は、腸上皮間リンパ球のうち、主にγδＴ ＩＥＬの投与により実現することができ、腸における宿主防御機構は、主にαβＴ ＩＥＬの投与により実現することができる。
【００８３】
＜２．腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドの製造方法＞
本発明の「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドの製造方法」（本明細書において、単に「本発明の製造方法」とも表示する。）としては、
（Ａ）単離された腸上皮間リンパ球を、腸陰窩オルガノイドと共に、細胞外マトリクスに包埋する工程Ａ：及び、
（Ｂ）前記腸陰窩オルガノイドを増殖し得る培養液中で、前記細胞外マトリクスに包埋した腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイドを共培養する工程Ｂ：
を含んでいる限り特に制限されない。
【００８４】
本発明の製造方法における上記工程Ａ及び工程Ｂは、特に言及がない限り、前述の本発明の維持・増殖方法における上記工程Ａ及び工程Ｂとそれぞれ同じ工程である。本発明の製造方法により、「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」をインビトロで製造することができる。
【００８５】
本発明の製造方法は、工程Ｂにより得られた共培養物から「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」を単離する工程をさらに含んでいなくてもよいが、該工程を含んでいることが好ましい。共培養物から「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」を単離する方法としては特に制限されないが、共培養中の「細胞外マトリクスに包埋した腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイド」を培養液中から取りだした後、細胞外マトリクスを冷却やコラゲナーゼ等で解重合や分解などして、腸上皮間リンパ球及び腸陰窩オルガノイドを分取する方法を挙げることができる。
【００８６】
＜３．腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド＞
本発明の「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」（以下、単に「本発明の腸陰窩オルガノイド」とも表示する。）としては、本発明の製造方法により製造される「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」である限り特に制限されない。本明細書において、「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」とは、単離された腸上皮間リンパ球を用いないこと以外は本発明の製造方法と同じ方法で製造した腸陰窩オルガノイドと比較して、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドであることを意味する。かかる「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」として具体的には、工程Ｂの培養開始から３日目において、腸陰窩オルガノイド１個あたりの腸上皮間リンパ球の数が、腸上皮間リンパ球と共培養しない場合の腸陰窩オルガノイド１個あたりの腸上皮間リンパ球の数に対して、割合で好ましくは８倍以上、より好ましくは１６倍以上、さらに好ましくは３２倍以上に増加している腸陰窩オルガノイドを好適に挙げることができる。なお、これらの割合の上限は特に制限されないが、例えば２００倍以下、１００倍以下などが挙げられる。また、本明細書における「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」には、工程Ｂの培養開始から３日目において、腸陰窩オルガノイド１個あたりの腸上皮間リンパ球の数が、好ましくは２個以上、より好ましくは４個以上、さらに好ましくは６個以上である腸陰窩オルガノイドを好適に挙げることができる。なお、腸陰窩オルガノイド１個あたりの腸上皮間リンパ球の数の上限は特に制限されないが、例えば３６個以下、１８個以下などが挙げられる。
【００８７】
腸陰窩オルガノイド中の腸上皮間リンパ球の数は、例えば、蛍光標識した抗リンパ球抗体を用いた免疫組織化学染色法によって測定することができる。標識した蛍光の検出は、市販の蛍光イメージング装置を用いて行うことができる。
【００８８】
また、本発明の製造方法により製造される「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」は、哺乳動物（好ましくはヒト）の腸（小腸又は大腸）に移植して用いる腸疾患の予防・治療剤（予防及び／又は治療剤）として利用することができる。本発明の「腸疾患の予防・治療剤」（以下、単に「本発明の予防・治療剤」とも表示する。）としては、本発明の製造方法で製造される「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」を含有している限り特に制限されない。
【００８９】
かかる腸疾患として具体的には、潰瘍性大腸炎、クローン病などの炎症性腸疾患や、化学療法による腸管傷害や、放射線腸炎等を例示することができる。かかる本発明の予防・治療剤を投与すると、「腸（小腸又は大腸）上皮間リンパ球が増加した腸（小腸又は大腸）陰窩オルガノイド」が腸（小腸又は大腸）上皮に生着し、腸（小腸又は大腸）上皮の傷害を予防・治療することができる。
【００９０】
本明細書における「腸疾患の予防・治療効果」とは、腸（小腸又は大腸）疾患の予防効果、若しくは、腸（小腸又は大腸）疾患の治療効果、又は、腸（小腸又は大腸）疾患の予防及び治療効果を含み、腸（小腸又は大腸）疾患の予防効果としては、腸（小腸又は大腸）疾患の発症を予防する効果や、腸（小腸又は大腸）疾患の発症を遅延する効果などを含み、腸（小腸又は大腸）疾患の治療効果としては、腸（小腸又は大腸）疾患の症状を改善する効果や、腸（小腸又は大腸）疾患の症状の悪化を防止若しくは遅延する効果などを含む。なお、本発明の「腸疾患の予防・治療剤」における「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」は、通常の腸陰窩オルガノイドとは異なり、腸上皮間リンパ球が増加しているため、通常の腸陰窩オルガノイド（例えば、特許文献２における通常の大腸陰窩オルガノイド）を用いた場合と比較して、腸上皮のバリア機能、腸粘膜の恒常性、及び、腸における宿主（哺乳動物）防御機構から選択される１種又は２種以上（好ましくは３種）の点について向上を図ることができると考えられる。
【００９１】
本発明の予防・治療剤の投与対象としては、哺乳動物である限り特に制限されず、中でもヒトをより好適に例示することができる。本発明の予防・治療剤に含有させる「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」が由来する哺乳動物種は、投与対象の哺乳動物種と同種であることが好ましい。
【００９２】
本発明の予防・治療剤の投与方法としては、腸疾患を予防・治療し得る限り特に制限されないが、経腸投与、経静脈投与などを例示することができ、中でも、小腸や大腸への経肛門的注腸投与を好適に例示することができる。本発明の予防・治療剤の投与量としては、腸疾患の種類、症状の度合い、投与対象の体重、年齢等にもよるが、１×１０〜１×１０１０／ｋｇの細胞（１〜複数回に分けて投与してもよい）を挙げることができる。
【００９３】
本発明の予防・治療剤の調製方法としては、特に制限されず、本発明の製造方法により製造される「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」に、薬学的に許容される通常の担体、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、生理的食塩水等の水溶性溶剤、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等の等張化剤、ヒト血清アルブミン等の安定化剤、メチルパラベン等の保存剤、ベンジルアルコール等の局麻剤などの各種調剤用配合成分を配合する方法を例示することができる。また、本発明の予防・治療剤には、投与対象の腸（小腸又は大腸）上皮への生着効率を向上させる観点から、Ｉ型〜VIII型の各種コラーゲンやマトリゲルといった細胞外基質成分を、より好ましくはマトリゲルを、配合することが好ましい。この他、本発明の予防・治療剤には、本発明の製造方法により得られる「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」の他に、他の腸疾患の予防・治療剤を併用することもできる。
【００９４】
＜４．腸上皮間リンパ球の運動性に与える影響を評価する方法＞
本発明の「腸上皮間リンパ球の運動性に与える影響を評価する方法」（以下、単に「本発明の評価方法」とも表示する。）としては、
（Ｐ）本発明の製造方法により製造される「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」（好ましくは小腸陰窩オルガノイド）に被検物質を接触させる工程Ｐ：
（Ｑ）工程Ｐの後に、前記腸陰窩オルガノイドにおける前記腸上皮間リンパ球の運動性を解析する工程Ｑ：
（Ｒ）工程Ｑの解析で得られた運動性を、被検物質を接触させなかった場合の腸陰窩オルガノイドにおける腸上皮間リンパ球の運動性と比較する工程Ｒ：
（Ｓ）工程Ｒの比較の結果、工程Ｑの解析で得られた運動性の方が高い場合は、その被検物質を、腸上皮間リンパ球の運動性を向上させる活性を有する物質であると評価し、工程Ｑの解析で得られた運動性の方が低い場合は、その被検物質を、腸上皮間リンパ球の運動性を低下させる活性を有する物質であると評価する工程Ｓ：
を含んでいる限り特に制限されない。
【００９５】
上記工程Ｐとしては、本発明の製造方法により製造される「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」に被検物質を接触させる工程である限り特に制限されず、例えば、該腸陰窩オルガノイドを培養する培養液に被検物質を添加する方法が挙げられる。
【００９６】
上記工程Ｑとしては、工程Ｐの後に、前記腸陰窩オルガノイドにおける前記腸上皮間リンパ球の運動性を解析する工程である限り特に制限されず、例えば、市販の蛍光イメージングにより、腸上皮間リンパ球の運動性を解析する方法が挙げられる。
【００９７】
上記工程Ｒとしては、工程Ｑの解析で得られた運動性を、被検物質を接触させなかった場合の腸陰窩オルガノイドにおける腸上皮間リンパ球の運動性と比較する工程である限り特に制限されない。
【００９８】
上記工程Ｓとしては、工程Ｒの比較の結果、工程Ｑの解析で得られた運動性の方が高い場合は、その被検物質を、腸上皮間リンパ球の運動性を向上させる活性を有する物質であると評価し、工程Ｑの解析で得られた運動性の方が低い場合は、その被検物質を、腸上皮間リンパ球の運動性を低下させる活性を有する物質であると評価する工程である限り特に制限されない。
【００９９】
腸上皮間リンパ球の運動性を向上させる活性を有する物質は、例えば、腸内の宿主防御機構を活性化させる可能性のある物質等と評価することができ、腸上皮間リンパ球の運動性を低下させる活性を有する物質は、例えば、腸内の宿主防御機構を不活性化させる可能性のある物質等と評価することができる。また、本発明の評価方法は、腸上皮と、腸上皮間リンパ球との動的相互作用（腸上皮と、腸上皮間リンパ球との相互作用であって、かつ、腸上皮間リンパ球の運動性に影響を与える相互作用）を解析するためにも用いることができる。
【０１００】
（本発明のその他の態様）
本発明には、「腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドを、哺乳動物に投与することを特徴とする、腸疾患の予防及び／又は治療方法」、「腸疾患の予防及び／又は治療のための、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイド」、「腸疾患の予防及び／又は治療剤の製造における、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドの使用」も含まれる。
【０１０１】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、インビトロで培養を開始した日にちを、培養後１日目とする。
【実施例１】
【０１０２】
１．材料と方法
１−１  実験マウス
ＥＧＦＰがニワトリβ−アクチンプロモーター及びサイトメガロウイルスエンハンサーの制御下で恒常的に発現するＥＧＦＰ組換えＣ５７ＢＬ６マウス（ＥＧＦＰ−ｔｇマウス）（文献「Okabe et al., FEBS Lett 1997, 407:313-319.」参照）は、大阪大学から提供された。また、ＲＯＳＡ２６遺伝子座内のヒストンＨ２ＢのＣ末端側に融合したＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子が挿入されたＲ２６−Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰマウス（文献「Abe et al., Genesis 2011, 49:579-590.」参照）は、理化学研究所（RIKEN）から提供された（アクセッション番号ＣＤＢ０２０３Ｋ）。Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンドのマウス及び野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスは、東京医科歯科大学（ＴＭＤＵ）の動物施設で飼育、維持された。全ての動物実験は、東京医科歯科大学の動物実験委員会の承認を得て行った。
【０１０３】
１−２  小腸陰窩オルガノイドの調製
小腸陰窩を、非特許文献９記載の方法にしたがって１０〜１５週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスから単離し、R-spo1（Ｒ−スポンジン１）、ＥＧＦ及びNogginの存在下で培養した。すなわち、約３００個の小腸陰窩を、３０μＬ マトリゲル（BD Biosciences社製）に懸濁し、２４ウェルプレートに置き、室温でマトリゲルを重合させた後、５００ｎｇ／ｍＬ ｍＲｓｐｏ１（R&D Systems社製）、２０ｎｇ／ｍＬ ｍＥＧＦ（Peprotech社製）及び１００ｎｇ／ｍＬ ｍＮｏｇｇｉｎ（R&D Systems社製）を含む５００μＬ Advanced DMEM/F12培養液（Life Technologies社製）（以下、「小腸陰窩オルガノイド培養用培養液」と表示する。）を加えた。なお、培養液は、以下の実験で使用する直前まで２日毎に新しい培養液と交換した。
【０１０４】
１−３  小腸由来のＩＥＬの単離
小腸由来ＩＥＬは、文献（Kohyama et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96:7451-7455）に記載の方法にしたがって単離した。すなわち、１０〜１５週齢のＥＧＦＰ−ｔｇマウス、又はＲ２６−Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰマウスの小腸を、ＰＢＳで洗い流し、パイエル板を除去した後５ｍｍの切片に切断した後、Ｃａ、Ｍｇを含まないハンクス平衡塩液に５ｍＭのエチレン−ジニトリロ四酢酸（ＥＤＴＡ）及び１ｍＭの１，４−ジチオ−Ｄ−トレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍＬコニカルチューブ中で３７℃、３０分間、１５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートし、目開き３００μｍナイロンメッシュフィルター及びグラスウールのカラムに通した後、回収された細胞を３０％パーコールに懸濁し、２０分間８００ｇで遠心分離した。ＩＥＬは、３０分間８００ｇ、４０／７０％パーコール勾配の遠心分離で単離した。単離したＩＥＬは、洗浄し、細胞を計数した後、アッセイに用いた。なお、マウス１個体当たり、５〜１０×１０６個の生存ＩＥＬが得られた。また、ＴＣＲαβ＋のＩＥＬ集団と、ＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団は、単離した全ＩＥＬを抗マウスＴＣＲ−β―ＰＥ抗体（BioLegend社製）、抗マウスＴＣＲ−δ―ＰＥＣy７抗体（BioLegend社製）及び抗マウスＣＤ３ε−ＡＰＣ抗体（Becton Dickinson社製）で染色した後、ＦＡＣＳ ＡＲＩＡII(Becton Dickinson社製)にてソートすることにより調製した（純度＞９９％）。
【０１０５】
１−４  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養
上記「１−２  小腸陰窩オルガノイドの調製」の項目に記載の方法にしたがって調製した小腸陰窩オルガノイドを２日間培養した後、Cell Recovery Solution（Corning社製）を添加し、氷上で３０分間インキュベートすることにより全マトリゲルを解重合させ、小腸陰窩オルガノイドをマトリゲルから回収し、洗浄した後、小腸陰窩オルガノイド１００個と、上記「１−３  小腸由来のＩＥＬの単離」の項目に記載の方法にしたがって単離したＩＥＬ １．０×１０５個とを、２４ウェルプレート上の４００μＬ ＤＭＥＭ培養液中で混合した。３７℃で３０分間インキュベートした後、前記混合物を回収し、１分間２００ｇで遠心分離した後、沈殿物（ペレット）を３０μＬのマトリゲルに懸濁し、２４ウェルプレート上に移した。室温でマトリゲルを重合させた後、小腸陰窩オルガノイド培養用培養液５００μＬ、又は１００Ｕ／ｍＬ 組換えヒトＩＬ−２（Roche社製）、１０ｎｇ／ｍＬ マウスＩＬ−７（Peprotech社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ マウスＩＬ−１５（Peprotech社製）を含有する小腸陰窩オルガノイド培養用培養液（以下、「＋ＩＬ−２／ＩＬ−７／ＩＬ−１５小腸陰窩オルガノイド培養用培養液」と表示する。）５００μＬをウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間培養を行った。なお、培養液は、２日毎に新しい培養液と交換した。
【０１０６】
１−５  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬとの共培養物からのＩＥＬの単離
上記「１−４  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養」の項目に記載の方法にしたがって小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養を行った後、Cell Recovery Solution（Corning社製）を添加し、氷上で３０分間インキュベートすることにより全マトリゲルを解重合させ、小腸陰窩オルガノイドをマトリゲルから回収した後、５００ｇで５分間の遠心分離後、上清画分（画分１）を回収した。また、沈殿画分中に含まれるＩＥＬを回収するために、沈殿物を１０分間氷上で５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ中でインキュベートし、さらに１分間静置することにより沈殿物を堆積させた後、上清画分（画分２）を回収した。さらに、その後に得られた沈殿画分中に含まれるＩＥＬを回収するために、沈殿物を激しいピペット操作を行って機械的に破壊し、その後４０μｍのナイロンメッシュフィルターを通過させたものを画分３とした。画分１〜３を合わせたものをＩＥＬ懸濁液とした。なお、７日目以降のＩＥＬの培養は、７日目のＩＥＬ懸濁液中に含まれるＥＧＦＰ陽性（＋）のＩＥＬを、血球計により計数した後、上記「１−４  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養」の項目に記載の方法にしたがって小腸陰窩オルガノイドと共培養することにより行った。
【０１０７】
１−６  免疫組織染色及び小腸陰窩オルガノイドの三次元イメージング解析
上記「１−４  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養」の項目に記載の方法等にしたがって得られた小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養物を、４％ パラホルムアルデヒド溶液中で４０分間固定処理し、０．２％ Triton-X含有ＰＢＳ溶液中で３０分間透過処理した後、２％ ＢＳＡ及び０．２％ Triton-Xを含むＰＢＳ溶液中で４０分間ブロッキング処理を行った（全て室温で処理した）。一次抗体（マウス抗ＣＤ３ε抗体［Becton Dickinson社製］、及びマウス抗Ｃｄｈ１抗体［Santa Cruz Biotechnology社製］）を一晩４℃でインキュベートし、一次抗体を認識する蛍光物質で標識した二次抗体（抗マウスAlexa Fluor 488抗体、及び抗マウスAlexa Fluor 594抗体［すべてLife Technologies社製］）による抗体反応処理を１．５時間室温で行った。細胞核は、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）で染色し、免疫染色試料はその後Vectashield Mounting Medium（Vector Laboratories社製）で封入し、顕微鏡により観察した。小腸陰窩オルガノイドの三次元イメージング解析は、室温でFluoview FV10i システム（Olympus社製）で行い、蛍光画像は、０．８５μｍのｚステップでOlympus 60x対物レンズ（１．３５Ｎ．Ａ．）を用いて取得した。なお、観察できる最大の深さは２５０μｍであったので、培養又は共培養の開始後２日間培養したオルガノイド全体をカバーするのに十分であった。また、ｚ−スタック画像は、必要に応じてAdobe Photoshopソフトウェアで加工した。
【０１０８】
１−７  フローサイトメトリー
上記「１−３  小腸由来のＩＥＬの単離」及び「１−５  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬとの共培養物からのＩＥＬの単離」の項目に記載の方法にしたがって単離したＩＥＬを、０．２％ ＦＣＳ含有ＰＢＳ溶液中に５×１０５細胞の濃度で懸濁し、室温で１０分間、０．２％ ＦＣＳ含有ＰＢＳ溶液に１：１００で希釈した抗ＣＤ１６/ＣＤ３２抗体（BioLegend社製）中でＦｃＲブロッキング処理を行った後、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏII（BD Biosciences社製）によるフローサイトメトリー解析を行った。前方散乱光（ＦＳＣ）及び側方散乱光（ＳＳＣ）の環境（setting）を用いて、サイズ及び粒度に基づいたリンパ球（ＩＥＬ）と腸上皮細胞（ＩＥＣ）の分離を行った。また、ＴＣＲαβ＋のＩＥＬ集団（サブセット）と、ＴＣＲγδ＋のＩＥＬサブセットを定義するために、抗ＴＣＲ−β−ＰＥ抗体及び抗ＴＣＲ−δ−ＰＥＣｙ７抗体を、最適濃度で使用した。
【０１０９】
また、細胞内染色は、４％ パラホルムアルデヒド溶液中で細胞を固定処理し、Perm II試薬（Becton Dickinson社製）で透過処理した後、抗Ｋｉ-６７-６６０eFluor抗体（eBioscience社製）又は抗ホスホ-ＥＲＫ−Alexa６４７抗体（Cell Signaling社製）存在下で１時間、室温で抗体反応処理を行った。なお、細胞表面染色の場合は、上記抗体反応処理は、４℃で２０分間行った。
【０１１０】
１−８  タイムラプス（Time-lapse）蛍光イメージング
タイムラプス蛍光イメージングは、Insight SSI光源を有する蛍光顕微鏡IX-71（Olympus社製）が組み込まれたDeltaVisionシステム（Applied Precision社製）を用いて行った。すなわち、タイムラプス蛍光イメージングは、細胞を含むガラスボトムディッシュ（glass-bottom culture dish）を、チャンバーで覆われた上記顕微鏡のステージ上に置き、５％ ＣＯ２及び９５％ airからなる加湿した既混合ガスが注入され、かつ３７℃で温度制御された条件下で行った。イメージングを開始する前に、細胞核を３０分間、１μｇ／ｍＬ Hoechst３３３４２（Nacalai Tesque社製）で染色した。また、５μＭ ＰＤ１８４３５２は、イメージングを開始する１時間前に培養液に添加した。核及びＥＧＦＰの蛍光画像は、CoolSnap ES2デジタルカメラ（Roper Scientific社製）上のUplansApo 20x 対物レンズ（０．７５Ｎ．Ａ.）により取得した。単一面イメージングは、２時間、２０秒間隔で行った。多面イメージングは、１０分間、３０秒間隔で行い、一度に５μｍステップでｚスタックを取得した。これらのｚスタックの最大強度の投影データを得るためにSoftWorx ソフトウェア（Applied Precision社製）を使用した。
【０１１１】
１−９  ＩＥＬ運動解析
イメージングデータをImaris 7.5（Bitplane社製）ソフトウェアにインポートした。ＩＥＬの核は、その後Imarisのスポット追跡特徴（spot tracking feature）を使用して個別に判定し、サイズ予測（size estimate）は１０μｍであった。核の遊走は、ソフトウェアの「自己回帰運動」追跡アルゴリズムによって分析した。１つのトラック（track：軌跡）が、期間全体を通して同じ核に続くことを確認するために、トラックを視覚的に確認した。データセットは、３Ｄマトリゲル領域（データ獲得スペース）から得た情報からなるものであるが、スポット（核）の判定は、このデータ獲得スペースの表面に達するために十分に近い場合に不正確であることが多かった。このような周辺効果を避けるために、Imarisのフィルタリング機能を使用して外側データ獲得空間よりも１０μｍ短いｘｙｚ方向に沿ったエッジを有するより小さい直方体（内側直方体；inner cuboid）を規定した。観察期間の８０％を超えてこのInner cuboid内に留まった核のみを統計分析に使用した。平均速度（Mean Speed）、最大速度（Max Speed）、トラックの長さ（track length）、及び核の転位（Displacement of nuclei）の計算は、Imarisソフトウェアを使用して行った。
【０１１２】
１−１０  大腸陰窩オルガノイドの調製
大腸陰窩を、特許文献２（国際公開第２０１３／０６１６０８号パンフレット）記載の方法にしたがって、７〜９週齢の野生型ＥＧＦＰ−ｔｇマウスから単離し、血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｗｎｔ３ａ、Ｒ−スポンジン１、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、及び、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）の存在下で培養した。すなわち、２０００個の大腸陰窩をＩ型コラーゲン溶液（Nitta Gelatin Inc.社製）２００μｌに懸濁し、４８ウェルプレートに載置した。コラーゲンの重合後、各ウェルに、１％ＢＳＡ（Sigma社製）、３０ｎｇ／ｍｌのｍＷｎｔ３ａ（R&D Systems社製）、５００ｎｇ／ｍｌのマウス（ｍ）Ｒｓｐｏ１（R&D Systems社製）、２０ｎｇ／ｍｌのｍＥＧＦ（Peprotech社製）、５０ｎｇ／ｍｌのｍＨＧＦ（R&D Systems社製）及び５０ｎｇ／ｍｌのｍＮｏｇｇｉｎ（R&D Systems社製）を含有する５００μｌのアドバンストＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えた（以下、「ＴＭＤＵ培養液」とも表示する。）。この培養液を２日毎に交換した。継代を行うため、ＸＩ型コラゲナーゼを含有するＤＭＥＭにおいて全ゲルを３７℃で５分間消化し、回収した大腸陰窩オルガノイドをＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄した。この大腸陰窩オルガノイド沈殿物を２ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳに懸濁し、激しく振盪した。これにより脱凝集した大腸陰窩オルガノイド小塊をＩ型コラーゲン溶液と混合して継代培養に使用した。単一細胞から複数細胞よりなる細胞塊までの継代培養に用いる細胞塊の大きさは、顕微鏡下で観察しながらＥＤＴＡ処理時間を調節した。細胞増殖後の最初の２日間、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２を１０μＭとなるように培養液に加えた。杯細胞の分化を誘導する場合には、γ−セクレターゼ阻害剤ＬＹ−４１１，５７５（１００ｎＭ）で大腸オルガノイドを所定期間にわたり処理した。
【０１１３】
１−１１  大腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養
上記「１−１０  大腸陰窩オルガノイドの調製」の項目に記載の方法にしたがって調製した大腸陰窩オルガノイドを２日間培養した後、ＸＩ型コラゲナーゼを培養液に添加して全ゲルを３７℃で５分間消化し、大腸陰窩オルガノイドをコラーゲンから回収した。大腸陰窩オルガノイドをＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄した後、かかる大腸陰窩オルガノイド１００個と、上記「１−３  小腸由来のＩＥＬの単離」の項目に記載の方法にしたがって単離したＩＥＬ １．０×１０５個とを、２４ウェルプレート上の４００μＬ ＤＭＥＭ培養液中で混合した。３７℃で３０分間インキュベートした後、前記混合物を回収し、１分間２００ｇで遠心分離した後、沈殿物（ペレット）をＩ型コラーゲン溶液（Nitta Gelatin Inc.社製）２００μｌに懸濁し、２４ウェルプレート上に移し、コラーゲンが重合するまで静置した。前述のＴＭＤＵ培養液にＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を添加して、１００Ｕ／ｍＬ 組換えヒトＩＬ−２（Roche社製）、１０ｎｇ／ｍＬ マウスＩＬ−７（Peprotech社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ マウスＩＬ−１５（Peprotech社製）を含有するＴＭＤＵ培養液（以下、「＋ＩＬ−２／ＩＬ−７／ＩＬ−１５ＴＭＤＵ培養液」とも表示する。）を調製した。前述のコラーゲンが重合した後、２４ウェルプレートの各ウェルに、「＋ＩＬ−２／ＩＬ−７／ＩＬ−１５ＴＭＤＵ培養液」を５００μＬずつに加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で７日間培養を行った。なお、培養液は、２日毎に新しい培養液と交換した。
【０１１４】
１−１２  大腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養物からのＩＥＬの単離
上記「１−１１  大腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養」の項目に記載の方法にしたがって大腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養を行った後、ＸＩ型コラゲナーゼを培養液に添加して全ゲルを３７℃で５分間消化し、大腸陰窩オルガノイドをコラーゲンから回収した。この後のＩＥＬの単離処理及び計数処理は、上記「１−５  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬとの共培養物からのＩＥＬの単離」の項目に記載の方法にしたがって行った。このようにして、大腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養物からＩＥＬを単離し、及び、ＩＥＬを計数した。
【０１１５】
２．結果及び考察
２−１  小腸陰窩オルガノイド中に存在するＩＥＬのインビトロ培養
小腸陰窩オルガノイド存在下で、ＩＥＬをインビトロで培養・維持する方法の開発を行うために、本発明者らは先ず、従来の小腸陰窩オルガノイドの培養方法によって、該小腸陰窩オルガノイドに存在するＩＥＬを培養・維持できるかどうかを確認した。上記「１−２  小腸陰窩オルガノイドの調製」の項目に記載の方法にしたがって小腸陰窩オルガノイドを単離・培養し、上記「１−６  免疫組織染色及び小腸陰窩オルガノイドの三次元イメージング解析」の項目に記載の方法にしたがって免疫組織染色を行ったところ、培養後１日目の小腸陰窩オルガノイドにおいてＣＤ３＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）が検出された（図１Ａの矢頭参照）。小腸陰窩オルガノイドにおけるＩＥＬ数を計測したところ、小腸陰窩オルガノイド１個当たりのＩＥＬ数は０．２１±０．０６（ｎ＝９０）であり、ＩＥＬが検出された小腸陰窩オルガノイドの割合は１６％（ｎ＝９０）であった。一方、培養後３日目及び７日目についても同様に解析したが、小腸陰窩オルガノイドにおいてＣＤ３＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）は検出されなかった。これらの結果は、従来の小腸陰窩オルガノイドの培養方法では、小腸陰窩オルガノイドに存在するＩＥＬを中長期的に培養・維持することはできないことが示された。したがって、通常の当業者であれば、小腸陰窩オルガノイドを、ＩＥＬの培養・維持に用いるという発想は持つことができなかった。しかし、本発明者らは、通常の当業者の発想にはとらわれずに自由な発想で検討を重ねた結果、小腸組織からＩＥＬを単離し、該ＩＥＬを小腸陰窩オルガノイドと共培養するなどすれば、ＩＥＬを中長期的に培養・維持できる可能性があるのではないかと考えた。
【０１１６】
２−２  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬとの共培養
小腸組織からＩＥＬを単離し、小腸陰窩オルガノイドと共培養した場合に、ＩＥＬを培養・維持できるかどうか検討した。上記「１−４  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養」の項目に記載の方法にしたがって小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養を小腸陰窩オルガノイド培養用培養液中で行い、培養後３日目において上記「１−６  免疫組織染色及び小腸陰窩オルガノイドの三次元イメージング解析」の項目に記載の方法にしたがって免疫組織染色を行ったところ、ＥＧＦＰ＋ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）が検出された（図１Ｂの矢頭及び矢印参照）。また、小腸陰窩オルガノイド１個当たりのＩＥＬ数は６．９±０．８（ｎ＝２４）であり、ＩＥＬが検出された小腸陰窩オルガノイドの割合は１００％（ｎ＝２４）であった。この結果は、単離したＩＥＬを小腸陰窩オルガノイドと共培養すると、培養後少なくとも３日目までは効率よくＩＥＬを培養・維持できることを示している。また、興味深いことに、ＥＧＦＰ＋ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）は、小腸陰窩オルガノイド内部だけでなく、小腸陰窩オルガノイドと接触しない状態で小腸陰窩オルガノイド外部に存在していた（図１Ｂの矢印参照）。一方で、単離したＩＥＬのインビトロでの生存期間は、サイトカインの補充やＴＣＲ刺激がない条件下では、４８時間未満の期間に制限されることが報告されている（「Brunner et al., Cell Death Differ 2001, 8:706-714」、及び「Lai et al., J Immunol 1999, 163:5843-5850」参照）。かかる報告と、上記本実施例の結果（培養後少なくとも３日目までは効率よくＩＥＬを培養・維持することができた）を総合的に考慮すると、単離したＩＥＬを小腸陰窩オルガノイドと共培養する方法は、ＩＬ−２やＩＬ−７やＩＬ−１５を用いない従来の方法と比較して、ＩＥＬをより長い期間維持することができることが示された。また、小腸陰窩オルガノイド外部でもＩＥＬが生存・維持できることから、一見接触しては見えないこれらＩＥＬも、同一培養内に共存する小腸陰窩オルガノイドから生存・維持に関与する作用を受けている可能性が考えられる。
【０１１７】
小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養をその後７日目まで行ったものの、検出されるＩＥＬの割合は減少した。一方、様々なサイトカインがＩＥＬの生存及び増殖に関与することが報告されており、特に、ＴＣＲαβ＋のＩＥＬ集団、及びＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団をＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５の存在下で培養すると、様々なメカニズムを介してこれらＩＥＬ集団の生存期間が延びることが報告されている（非特許文献５、「Inagaki-Ohara et al., Eur J Immunol 1997, 27:2885-2891」、「Lai et al., J Immunol 1999, 163:5843-5850」、「Yada et al., Cell Immunol 2001, 208:88-95」参照）。そこで、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５存在下でＩＥＬと小腸陰窩オルガノイドの共培養を行った場合に、ＩＥＬの生存期間が延びるかどうか検討した。上記「１−４  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養」の項目に記載の方法、及び、上記「１−５  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬとの共培養物からのＩＥＬの単離」の項目に記載の方法にしたがって小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養を１４日目まで「＋ＩＬ−２／ＩＬ−７／ＩＬ−１５小腸陰窩オルガノイド培養用培養液」中で行い、培養後１〜１４日において上記「１−６  免疫組織染色及び小腸陰窩オルガノイドの三次元イメージング解析」の項目に記載の方法にしたがって免疫組織染色を行ったところ、少なくとも７日目又は１４日目までＥＧＦＰ＋ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）集団の割合は増加したことが示された（図２Ａ〜Ｃ参照）。例えば図２Ａには、１日目、３日目、７日目と、培養日数が経過するにつれて、ＩＥＬのＥＧＦＰ蛍光（図２Ａの白い小さな白っぽい点）が増加したことが示されている。また、図２Ｂには、７日目において、ＣＤ３の蛍光（図２Ｂ上段）とＥＧＦＰの蛍光（図２Ｂ下段）の位置が一致しており、ＩＥＬが、オルガノイドの上皮の細胞間などに存在していることが示されている。また、図２Ｃには、培養後１４日目において、ＩＥＬのＥＧＦＰ蛍光（図２Ｃの白い小さな白っぽい点）が増加したことが示されている。なお、７日目の小腸陰窩オルガノイドは、三次元イメージング解析するには大きすぎたので、上記「１−５  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬとの共培養物からのＩＥＬの単離」の項目に記載の方法にしたがってＩＥＬを単離し、上記「１−７  フローサイトメトリー」の項目に記載の方法にしたがってＥＧＦＰ＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）数を測定したところ、６〜７日間でＩＥＬの数が約２倍となることが明らかとなった（図３Ａ参照）。この結果は、ＩＥＬをＩＬ−２、ＩＬ−７、及びＩＬ−１５存在下で小腸陰窩オルガノイドと共培養すると、少なくとも１４日間は、ＩＥＬが増殖・維持されることを示すとともに、小腸陰窩オルガノイドとの共培養開始後１４日目でＩＥＬの数を約４倍まで増殖できることを示している。
【０１１８】
次に、小腸陰窩オルガノイドとの共培養により、ＩＥＬ集団に含まれる特定の細胞集団ではなく、ＩＥＬ集団全体が増殖することを確認するために、ＴＣＲαβ＋のＩＥＬ集団と、ＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団の増殖を解析した。上記「１−７  フローサイトメトリー」の項目に記載の方法にしたがって、小腸陰窩オルガノイドとの共培養後１日目及び７日目におけるＴＣＲαβ＋及びＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団の比率を測定したところ、１日目と、７日目及び１４日目において、これらＩＥＬ集団の比率に大きな変化は認められなかった（図３Ｂ及びＤ参照）。また、ＴＣＲαβ＋及びＴＣＲγδ＋のＩＥＬ集団において、細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７の発現を解析したところ、いずれのＩＥＬ集団においてもその大部分がＫｉ−６７陽性であった（図３Ｃ及びＥ参照）。これらの結果は、小腸陰窩オルガノイドとの共培養により、ＩＥＬ集団に含まれる特定の細胞集団ではなく、ＩＥＬ集団全体が増殖することを示している。
【０１１９】
以上の結果は、ＩＥＬ集団の多様性に影響を及ぼすことなく、ＩＥＬ集団をインビトロで増殖・維持できる新規培養システムが開発されたことを示している。
【０１２０】
次に、単離したＩＥＬを小腸陰窩オルガノイドと共培養して、ＩＥＬを培養・維持する際に用いるＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５のうち、ＩＥＬの培養・維持にいずれが必須かを検討した。上記「１−４  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養」の項目に記載の方法にしたがって小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養を小腸陰窩オルガノイド培養用培養液中で行った。ただし、３種のＩＬのうち、いずれか１種のＩＬを用いた実験や、いずれのＩＬも用いない実験も行った。これらの実験におけるＩＬの濃度は、上記「１−４  小腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養」の項目に記載の方法における濃度にしたがった。培養後１日目及び７日目において、上記「１−７  フローサイトメトリー」の項目に記載の方法にしたがってＥＧＦＰ＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）数を測定した。その結果を図４Ａに示す。
【０１２１】
図４Ａの結果から分かるように、３種のＩＬのうち、ＩＬ−７やＩＬ−１５を単独で用いた場合は、培養後７日目（Ｄａｙ７）でＩＥＬ数はＤａｙ１より減少するものの、３種のＩＬのいずれをも添加しない場合にＩＥＬが全く生存できないのと比べ、生存ＩＥＬ数の改善が見られた。また、３種のＩＬのうち、ＩＬ−２を単独で用いた場合は、培養後７日目のＩＥＬ数が、培養後１日目のＩＥＬ数に対して、約１．８倍にまで増加した。この結果から、３種のＩＬともにＩＥＬの生存や増殖を促進する作用を有し、中でもＩＬ−２にこの作用が強いことが示された（図４Ａ）。実際に、３種のＩＬ（ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５）を併用した場合は、培養後７日目のＩＥＬ数が、培養後１日目のＩＥＬ数に対して、約３倍にまで増加した（図４Ａ）。すなわち、３種のＩＬ（ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５）を併用した場合は、ＩＬ−２を単独で用いた場合に対して、培養後７日目のＩＥＬ数が、約１．７倍にまで増加した（図４Ａ）。これらの結果から、単離したＩＥＬを小腸陰窩オルガノイドと共培養して、ＩＥＬを培養・維持すること等のためには、３種のＩＬのうち、少なくともＩＬ−２を用いることが特に好ましく、ＩＬ−２に加えてさらにＩＬ−７及びＩＬ−１５を併用すると、ＩＥＬの増殖効率の点で顕著な効果が得られることが示された。
【０１２２】
２−３  大腸陰窩オルガノイドとＩＥＬとの共培養
小腸組織から単離したＩＥＬ（すなわち、小腸上皮間リンパ球）を、小腸陰窩オルガノイドと共培養した場合だけでなく、大腸陰窩オルガノイドと共培養した場合であっても、ＩＥＬを培養・維持できるかどうか検討した。
【０１２３】
上記「１−１１  大腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養」の項目に記載の方法にしたがって大腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養を「＋ＩＬ−２／ＩＬ−７／ＩＬ−１５ＴＭＤＵ培養液」中で行った。培養後１日目及び７日目にそれぞれ、上記「１−１２  大腸陰窩オルガノイドとＩＥＬの共培養物からのＩＥＬの単離」の項目に記載の方法にしたがってＩＥＬを単離し、上記「１−７  フローサイトメトリー」の項目に記載の方法と同様の方法にしたがってＥＧＦＰ＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）数を測定した。その結果を図４Ｂに示す。意外なことに、小腸上皮間リンパ球は、大腸陰窩オルガノイドと共培養した場合であっても、培養・維持できることが示された。６〜７日間でＩＥＬの数が約１．８６倍となることが明らかとなった（図４Ｂ）。ＩＥＬ数のこの増加の程度は、小腸陰窩オルガノイドと共培養した場合（図３Ａの７日目）と比較すると若干劣るものの、かかる方法は、ＩＥＬを培養・維持するための優れた方法であることが示された。
【０１２４】
２−４  小腸陰窩オルガノイドにおけるＩＥＬの運動性解析
次に、上記「１−８  タイムラプス（Time-lapse）蛍光イメージング」及び「１−９  ＩＥＬ運動解析」の項目に記載の方法にしたがって共培養後３日目におけるＩＥＬと小腸陰窩オルガノイド間の動的相互作用について解析したところ、大部分のＥＧＦＰ＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）は、高い運動性を有することが示された（図５Ａ参照）。この単一面イメージングでは、正確な三次元的情報を取得することはできなかったものの、焦点が合った画像でも焦点が外れた状態でも移動を示したことから、多くのＥＧＦＰ＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）がｚ軸に沿って遊走することが示された。また、小腸陰窩オルガノイドに接触するＩＥＬは、上皮単分子層の基底側に沿ってランダム方向に、その細胞形状を連続的かつ大規模に変化させながら遊走することが示された（図５Ａの上段参照）。これらのＩＥＬは、その細胞質突起又は構造全体を、上皮細胞間に挿入し、上皮細胞の外側面との接触を可能にした（図５Ａの上段参照）。また、小腸陰窩オルガノイドの外側にとどまるＩＥＬも運動性を有することが示された。これらのＩＥＬのいくつかが、小腸陰窩オルガノイドに向かって遊走し、小腸陰窩オルガノイドと直接接触し、その中に一時的にとどまり、その後出ていく様子が観察された（図５Ａの下段参照）。これらの結果は、本発明者らが開発した共培養システムにおいて、ＩＥＬは、高い運動性を有し、多くのＩＥＣと接触することを示している。さらに、ＩＥＬが、この共培養システムにおいて、小腸陰窩オルガノイドに進入し及び小腸陰窩オルガノイドから退出することができ、ＩＥＣとの接触状況を変化させることが示された。これは、ＩＥＬとＩＥＣの接触が、ＩＥＬの生存期間を伸ばしたり、ＩＥＬの増殖を刺激したりすることにより、ＩＥＬの全体的な増殖を導くことに関与していることが考えられる。
【０１２５】
次に、ＩＥＬの遊走活動を定量的に解析した。ＥＧＦＰ−ｔｇマウス由来のＥＧＦＰ＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）を用いた場合には、かかるＥＧＦＰ＋Ｔ細胞の非対称で変形した形状、及び量の多さは、特に２つのＥＧＦＰ＋Ｔ細胞が極めて接近したときに、適切に個別の細胞の中心を定義することができなかった。このため、融合パートナーヒストンＨ２Ｂが局在している核だけがＥＧＦＰで標識されるＲ２６−Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰマウスに由来するＥＧＦＰ＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）を用いて、ＩＥＬと小腸陰窩オルガノイド間の動的相互作用について解析を行うことにした（図５Ｂ参照）。その結果、Ｈ２Ｂ−ＥＧＦＰ＋Ｔ細胞（ＩＥＬ）を野生型オルガノイドと共培養し、１０分間、３０秒間隔でイメージングを行い、一度に約２０枚のｚスタック画像を取得したところ、ｚスタック画像の最大値投影（maximum intensity projection）により、個々の細胞核はこの方法で明確に検出できることが示された（図５Ｃ参照）。その結果、小腸陰窩オルガノイドの上皮層に沿って遊走するＩＥＬを観察でき、小腸陰窩オルガノイド内や外へと動的に遊走するＩＥＬも観察できた。
【０１２６】
三次元データを復元して、画像処理ソフトウェアを使用してＩＥＬの遊走パラメーターを測定した。実際には、空間の表面に達した核の正確でない追跡を避けるために、より小さい空間を定義し、観察期間の８０％を超える間その中にとどまった細胞だけを分析した。その結果を図５Ｂに示す。図５ＢにおけるＩＥＬの遊走の平均速度は５．０７±０．２７μｍ／分であり、最大速度は９．６７±０．６０μｍ／分であった（図５Ｃ、及び表１参照）。
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
一方、共焦点顕微鏡を用いてＴＣＲγδ＋のＩＥＬの運動性パラメーターをインビボで評価したところ、平均速度及び最大速度はそれぞれ３．８±０．１μｍ／分及び７．７μｍ／分であることが報告されている（非特許文献６）。本実施例で得られた結果は、上記インビトロでの結果を支持することが示された。また、ＴＣＲαβ＋のＩＥＬと、ＴＣＲγδ＋のＩＥＬの遊走について両者を比較して解析したところ、両者に顕著な違いは認められなかった（図５Ｄの上段、及び表１参照）。この結果は、ＴＣＲαβ＋のＩＥＬが、本質的にＴＣＲγδ＋のＩＥＬと同等の運動性を有することを示している。
【０１２９】
ＩＥＬとＩＥＣの相互作用に影響を与える因子や要因については、依然として不明な点が多い。インビボ実験において、ＴＮＦ−αの投与が、ＴＣＲγδ＋のＩＥＬの遊走や上皮組織内における滞留を変更することが報告されている（非特許文献６）。ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で前処理し、ＩＥＬの運動解析を行ったところ、ＩＥＬの動態に変化は認められなかった。一方、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２の阻害剤であるＰＤ１８４３５２で前処理した上で、ＩＥＬの運動解析を行ったところ、ＴＣＲαβ＋のＩＥＬの遊走は約２０％減少したのに対して、ＴＣＲγδ＋のＩＥＬの遊走については変化が認められなかった（図５Ｄの下段、及び表１参照）。興味深いことに、フローサイトメトリーによる解析から、ＥＲＫのリン酸化は、ＴＣＲαβ＋のＩＥＬと、ＴＣＲγδ＋のＩＥＬの両方のサブセットで同レベルで生じることが示された（図５Ｅ参照）。これらの結果は、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２が同様に全ＩＥＬ集団で活性化されていても、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２−ＥＲＫカスケードが、細胞間遊走活性に関与しているかどうかは、細胞の種類に依存することを示唆している。このように、本発明者らが開発した共培養システムは、ＩＥＬとＩＥＣのインビトロの相互作用を制御するメカニズムを解析するための有用なツールとなることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明は、腸上皮間リンパ球をインビトロで維持・増殖させる方法や、腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドの製造方法や、該製造方法により製造される腸上皮間リンパ球が増加した腸陰窩オルガノイドを提供することができる。  
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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