(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌による大豆の発酵物の蛋白加水分解物を有効成分とする皮膚外用剤。
【請求項２】
大豆の発酵物が熱水抽出物の発酵物である請求項１記載の蛋白加水分解物を有効成分とする皮膚外用剤。
【請求項３】
請求項１乃至２のいずれかの蛋白加水分解物を有効成分とするしわ改善促進剤。
【請求項４】
請求項１乃至２のいずれかの蛋白加水分解物を有効成分とするたるみ改善促進剤。
【請求項５】
請求項１乃至２のいずれかの蛋白加水分解物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ１遺伝子発現阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の産生を抑制し、しわ改善効果、たるみ改善効果等に有効な製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）は、皮膚の真皮細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンを分解する酵素として知られている。
その発現は紫外線の照射により大きく増加し、コラーゲンの減少・変性の一因となり、皮膚のシワの形成、弾力性の低下等の大きな要因となると考えられている。したがって、ＭＭＰ−１の活性を阻害することは、皮膚の老化症状を予防・改善する上で重要である。
また、マトリックスメタロプロテアーゼは真皮細胞外基質の代謝をコントロールしているだけでなく、細胞の浸潤やサイトカイン等の生理活性分子の活性化にも深く関与しており、種々の疾患との関連性が報告されている。例えば、皮膚においては、種々のサイトカインや成長因子、細胞の相互作用等により一過的にマトリックスメタロプロテアーゼが過剰に産生されること、創傷、火傷、潰瘍性、日光による皮膚損傷、水疱性、苔癬性、肉芽性等の各種皮膚疾患に関与していることが知られている。
また、関節炎、関節痛の予防や治療にも有効である。
さらにＭＭＰ−１は、がん細胞の浸潤・転移において重要な役割を果たしている。がん細胞の浸潤・転移には、細胞外基質を分解して組織に侵襲していくことが重要な過程となる。がん細胞はＭＭＰを過剰発現し分泌するので、がん細胞の浸潤・転移に深く関与している。特に、基底膜を通り抜けたがん細胞は、ＭＭＰ−１を分泌して、主としてタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩコラーゲンで構成されている細胞外基質を破壊し、血管あるいはリンパ管に到達すると血管の基底膜を破壊して血管内に侵入し、他の臓器などに転移することが知られている。
ＭＭＰはそのほとんどが不活性の前駆体として産生され、他のＭＭＰ等のプロテアーゼによって活性化される。例えば、ＭＭＰ−１はＭＭＰ−２を活性化する働きを有している（非特許文献３）ことから、ＭＭＰ−１の作用を抑制すれば、ＭＭＰ−２の活性化も阻害され、その結果、これらのＭＭＰ‐２による作用も抑制することができる。（特許文献１、非特許文献１〜３）
【０００３】
紫外線、特に長波長紫外線（ＵＶＡ）の照射により真皮線維芽細胞において促進されるMMP-1産生阻害剤で、スルフヒドリル基を有する化合物及びジスルフィド結合を有する化合物より選択した１種又２種以上を含有してなる、Ｉ型マトリクスメタロプロテアーゼ産生阻害剤が開示されている。（特許文献２） 
トウキ及びその近縁植物、ニオイウド、クチナシ及びその同属植物、ワレモコウの各植物抽出物、リポ酸、その塩及びその誘導体より成る群から選択した１種又は２種以上を含有して成るマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が開示されている。（特許文献３）
【０００４】
歯周病予防あるいは治療に用いることを特徴とする、ブドウ種子エキスを含有してなるマトリックスメタロプロテアーゼ阻害物口腔剤組成物が開示されている。（特許文献４）   細胞のコラーゲン合成促進効果及び細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有する、ブドウ種子エキス、ビタミンＣ及びビタミンＥを含有する歯周病予防または治療用の喫煙者乃至受動喫煙者向け食品組成物あるいは口腔用組成物が開示されている。（特許文献５）
【０００５】
（Ａ）天然ポリフェノールを含む抽出物から選ばれる１種又は２種以上、並びに、（Ｂ）ビタミンＣ及びその塩、ビタミンＥ、ビタミンＡ並びにベータカロチンからなる群より選ばれる１種又は２種以上を含有する、ニコチン刺激による歯周組織細胞由来マトリックスメタロプロテアーゼ産生の抑制作用を有する、喫煙者に特に有用な歯周病予防又は治療用食品組成物が開示されている。（特許文献６）
柑橘類に由来するフラボノイドを含有するマトリクスメタロプロテアーゼまたはその前駆体の賛成を阻害するための薬剤が開示されている。（特許文献７）
しかしながら、従来のマトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤は、阻害活性が十分ではないものや不安定なものもあり、色や臭いの点で化粧品の素材として用いるには不向きなものもあった。
【０００６】
また、豆乳発酵物は化粧品原料として利用されている。（特許文献８）
しかしながら、大豆の発酵物に含有される分子量の大きい蛋白によるアレルギーの発生が懸念され、化粧品の素材として用いるには不向きなものもあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１４−２２１７５８号公報
【特許文献２】特開２００２−４７１７８号公報
【特許文献３】特開２０００−３１９１５５号公報
【特許文献４】特開２０００−１９１４８７号公報
【特許文献５】特開２００２−２９９５３号公報
【特許文献６】特開平１１−３０２１４２号公報
【特許文献７】特開２０００−８００３５号公報
【特許文献８】特開２００３−３１０１５４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ、ＮＯ．４４１、１３７−１４０、１９９８、Ｓｃｏｔｔ ＫＡ ｅｔ ａｌ
【非特許文献２】がん研究のいま〜(2)がん細胞の生物学、高井義美・秋山徹 編集／東京大学出版会／2006
【非特許文献３】Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｎｏ.６、１９９−２１３、１９９７、Ｋａｈｒｉ Ｖ−Ｍ．ｅｔ ａｌ.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＭＭＰ−１遺伝子発現を抑制し、皮膚のシワを抑制し、弾力性の低下を防ぎ皮膚のタルミを防ぐ。さらに、創傷、火傷、潰瘍性、日光による皮膚損傷、水疱性、苔癬性、肉芽性等の各種皮膚疾患にも有効であり、皮膚以外にも、関節炎、関節痛の予防や治療にも有効であるより安全性の高い製剤を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが鋭意検討した結果、大豆の発酵物の蛋白加水分解物にＭＭＰ−１遺伝子の発現を抑制する作用があり、なおかつ安全性が高いことがわかった。
以下に詳細を記す。
【００１１】
大豆を粉砕、煮沸、溶解等の適切な処理を施した後、菌を加えて発酵させる。発酵に用いる菌は麹菌、酵母、乳酸菌、枯草菌、アオカビ等、食品等の発酵に用いられている菌種であればどれでも用いることが出来る。
しかしながら、乳酸菌による発酵が有効であった。
【００１２】
得られた大豆発酵物を殺菌し、加熱や撹拌を加え、蛋白加水分解する。蛋白加水分解の前処理として、洗浄、脱脂、粉砕等を行うと、蛋白加水分解がスムーズに進むので、必要に応じて加える。
蛋白加水分解には、酸加水分解、蛋白分解酵素等いずれかを用いるが、そのいくつかを併用することも可能である。
まず、酸加水分解の方法を記載する。
ここで、用いられる酸を例示すると、塩酸、硝酸、硫酸、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸等があげられるが、分解の程度、加水分解物の濃度、さらには、加水分解物の用途によって１つ以上の無機酸を選択する。
【００１３】
加水分解が終了したら、必要に応じて冷却後、加水酸化物を撹拌しつつ徐々に加えて中和する。
ここで、用いられる水酸化物を例示すると、水酸化リチウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化ストロンチウム、水酸化バリウムがあげられが、分解の程度、加水分解物の濃度、さらには、加水分解物の用途によって１つ以上の水酸化物を選択する。
中和すると沈殿ができるので、場合によってはこれを除去する。デカンテーション、遠心分離、濾過等で沈殿を除去する。
また、必要に応じて、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコール、グリセリン、トリメチロールプロパン、１．３ブチレングリコール、アセトン、メチルエチルケトン等の親水性有機溶媒を１つ以上選択し加えることによって、可溶化した中和塩を沈降させることができる。
【００１４】
これを室温または低温（０〜１０℃）で静置して後、デカンテーション、遠心分離、濾過等の任意の方法の１つ以上を選択し、沈殿物や浮遊物を除去した。
その後、親水性有機溶媒の一部または全部にエタノール、プロパノール等の揮発性の高い親水性有機溶媒を使用した場合、その加水分解物の利用方法によっては、減圧や加熱、その組み合わせで、親水性有機溶媒の一部又は全部を除去することもできる。
さらに水分も除去し、乾燥物として利用することも可能で、減圧や加熱、その組み合わせ、凍結乾燥等を実施する。
【００１５】
蛋白加水分解酵素を用いる方法は、植物起源の蛋白加水分解酵素としては、パパイン、ブロメリン、フィシン等が挙げられ、動物起源の酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、カリクレイン、パンクレアチン等が挙げられ、とくにトリプシン、α−キモトリプシンが好ましく、単用ないし２種以上併用できる。微生物起源の酵素としては、アスペルギルス属菌、枯草菌、放線菌等が生産する蛋白加水分解酵素が単用ないし２種以上併用できる。
酵素の種類に応じたｐＨにした大豆の発酵物に、酵素の種類に応じた量と温度を選択し、加水分解したのち、加熱、遠心分離、濾過等を加え、酵素の失活や除去を行う。
【００１６】
上記のような操作により得た大豆の発酵物の蛋白加水分解物或いはその溶液を、医薬品、食品、化粧品に用いることができる。特に化粧品等の皮膚外用剤に用いる場合には、塩濃度の低さや分子量の大きいタンパク質によるアレルギーの発生がなく、特に有効である。
【００１７】
これらの加水分解物の他に、医薬品、食品、化粧品に利用できる原料とともに、製剤を作成するか、既存の医薬品、食品、化粧品にこれらを加えて利用することもできる。   利用できる原料を例示すれば、
アボガド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等の各種油脂類。
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等のロウ類。
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油。
【００１８】
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の脂肪酸類。
エタノール、イソピロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等のアルコール類。
エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、ガラクチトール、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール等の多価アルコール類。
【００１９】
ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等のエステル類。
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛等の金属セッケン類。
アラビアゴム、グアヤク脂、カラヤゴム、トラガントゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン(Ｃ２〜Ｃ４)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(Ｃ２〜Ｃ４)キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等のガム質、糖類又は水溶性高分子化合物。
アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩、カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤等のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤。
【００２０】
レチノール、レチナール、デヒドロレチナール、カロチン、リコピン、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ又はその誘導体、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類等の各種ビタミン類又はその誘導体。
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等の各種アミノ酸類。
【００２１】
赤芽柏、地黄、木通、地胆頭、一薬草、イチョウ、ウーロン茶、ウイキョウ、ウコン、夏枯草、陳皮、エゾウコギ、決明子、オウレン、白朮、オオバナサルスベリ、オクラ、オタネニンジン又はトチバニンジン (人参)、オリーブ、オレガノ、オレンジ、カミツレ又はローマカミツレ、カムカム、ガラナ、厚朴、ギョリュウ、グースベリー、クララ、クランベリー、グレープフルーツ、クローブ、コブシ、モクレン、威霊仙、サクラ、升麻、サンシチニンジン、山茱萸、山椒、サンズコン、シクンシ、シソ紫蘇、紫蘇、シャクヤク、スイカズラ、セイヨウトチノキ、セロリ、センキュウ、センブリ、ダイオウ、タチジャコウソウ、チクセツニンジン、テングサ、甜茶、テンダイウヤク、トクサ、ドクダミ、トチュウ、トネリコ、ナツメ、桂皮、五倍子、ノイバラ、ノバラ、ハトムギ、バラ、菱実、ビワ、ブラックベリー、プルーン、ホウノキ、ボウフウ(防風)、ホオノキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マオウ、マカ、マカデミアナッツ、桑白皮、苦参、マンネンタケ、枳実、ミロバラン、ムクロジ、ムラサキ、益母草、メマツヨイグサ、メリッサ、メリロート、モッコウ、ヤーコン、 ユーカリ、ユキノシタ、ユッカ、ユズ、ユリ、ヨロイグサ、ヨモギ、ラベンダー、レモン、レモングラス、ローズマリー、地楡、クロレラ、クロレラ、コンブ、ワカメ、ジャイアントケルプ、ヒジキ、ヒバマタ、キリンサイ、アサクサノリ、スサビノリ、スピルリナ、イシゲ、イロロ、フクロノリ等の植物、海藻、藻類の各種抽出物。
【００２２】
馬又は豚の胎盤抽出物、シルク蛋白及びその分解物又はそれらの誘導体、牛乳、カゼイン及びその分解物又はそれらの誘導体、脱脂粉乳及びその分解物又はそれらの誘導体、ラクトフェリン又はその分解物、鶏卵成分、魚肉分解物、核酸関連物質（リボ核酸、デオキシリボ核酸）等の動物系原料由来物質。
海洋成分深層水、海水塩、海水乾燥物、死海又は大西洋又は太平洋の海より得た無機塩、海泥等の海洋産物。
酵母菌抽出エキス、細菌代謝物、細菌抽出エキス、カビ又は放線菌代謝物、カビ又は放線菌抽出エキス、納豆菌代謝物、納豆抽出エキス、米発酵エキス、米糠（赤糠、白糠）発酵エキス、生乳又は脱脂粉乳の乳酸発酵物、マメ科植物の乳酸菌発酵物、ココヤシ属植物の乳酸菌発酵物等の菌類由来物質。
グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等のα-ヒドロキシ酸類。
無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミン等の無機顔料。
ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ウロカニン酸誘導等の紫外線吸収または遮断剤。
【００２３】
パラアミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、ニコチン酸誘導体、コウジ酸又はその誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン、胎盤エキス、エラグ酸、ルシノール等の美白剤。
イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、d-カンフル、dl-カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸又はその塩、グリチルレチン酸又はその塩の抗炎症剤。
アクリノール、イオウ、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン等の抗菌・殺菌・消毒薬。
ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カルダモン精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、シダーウッド精油、ジャスミン精油、バラ精油、ベルガモット精油、ラベンダー精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油等の動植物性香料、その他合成香料等。
感光素１０１号、感光素２０１号、感光素４０１号、感光素３０１号、ヒノキチオール、パントテン酸又はその誘導体、アラントイン、ペンタデカン酸グリセリド、尿素、グアニジン等の各種薬剤。
その他ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００２４】
これらより、種々選択し、任意の形態にして利用に供する。形態の例としては、カプセル、粉末、顆粒、固形、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等が挙げられる。
【００２５】
実施例１
大豆２００ｇに等量の水を加え、室温で１２時間浸漬した後、臼ですり潰し、5分間煮沸した。
冷却後、濾過により固形分を除去したろ液を高圧殺菌後した後、乳酸菌を接種し３７℃で５日間培養した。
培養液を高圧殺菌し、大豆発酵物３００ｇを得た。
大豆発酵物 ３００ｇを冷却器の付いたフラスコに入れ、硫酸３０ｇを加え、１１０℃で24時間加温した。
冷却後、水酸化カルシウム２０ｇを徐々に加えて１時間撹拌した。
更に徐々に水酸化カルシウムを加えてｐＨを７．５にした。
この液を遠心分離（３０００ｒｐｍｘ１５分間）し、上澄みを得た。これにエタノールを２倍量加え撹拌した。
４℃で１４日間静置した後、濾過し、ろ液を得た。
これをエバポレートして後、凍結乾燥した。
【００２６】
実施例１について以下の実験を行った。
6ウェルプレートへヒト正常線維芽細胞（クラボウ）を播種し、予備培養として10%ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で３日間培養した。培養後、実施例を加え、３時間培養した。なお、対照として実施例を添加しない系でも試験を実施した。
【００２７】
ＲＮＡの抽出
細胞からのＴｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用い、添付マニュアルに従い調整した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて算出した。
【００２８】
ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ
抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使い、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて、添付マニュアルに従いＲＴ反応を行った。
リアルタイムＰＣＲは、７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて実施した。
詳細には、前述のＲＴ産物と、ＭＭＰ−１および内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨのＴａｑＭａｎ（登録商標）  プライマー（ライフテクノロジーズ・ジャパン）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて、ΔΔＣＴ法により遺伝子発現量の比較を行った。
【００２９】
結果を図１に示す。
【００３０】
また、実施例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、皮膚のシワを抑制し、弾力性の低下を防ぎ皮膚のタルミを防ぐ製剤が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例の結果を示す図である。
【図１】
0006716278.tif 000002