(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチル3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパノエートを調製するための方法であって、
メチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエート−1，4−ジオキサン塩酸塩（1：1：2）
【化１】
0006787998.tif 000034
を4−イソチオシアナトフェニルトリフルオロメチルエーテル
【化２】
0006787998.tif 000035
と反応させ、
この反応で、メチル3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパノエートが形成される：
【化３】
0006787998.tif 000036
ステップを含む、
方法。
【請求項２】
以下のステップ：
（a）メチル3−（4−フルオロ−3−ニトロフェニル）プロパノエートを（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキサンアミンと反応させて、メチル3−（3−ニトロ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエートを得るステップ
（b）ステップ（a）からのメチル3−（3−ニトロ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエートを還元して、メチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエートを得るステップ
（c）ステップ（b）からのメチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエートを、塩酸/ジオキサン混合物で処理して、メチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエート−1，4−ジオキサン塩酸塩（1：1：2）を得るステップ、
（d）ステップ（c）からのメチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエート−1，4−ジオキサン塩酸塩（1：1：2）を、4−イソチオシアナトフェニルトリフルオロメチルエーテルと反応させて、メチル3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパノエートを得るステップ
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（d）からのメチル3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパノエートをけん化して、3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸を得るステップ、
をさらに含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記けん化を、THF中水酸化ナトリウム水溶液によって行い、その後、塩酸で中和し、前記3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸をイソプロパノールの添加によって晶出させる、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
アルキル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエート−1，4−ジオキサン塩酸塩（1：1：2）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、置換3−（2−アニリノ−1−シクロヘキシル−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸誘導体を調製する方法および置換3−（2−アニリノ−1−シクロヘキシル−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸誘導体を調製するために使用され得る中間体にも関する。本発明はまた、3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸の結晶形、この結晶形を含む医薬組成物、および疾患を治療するための医薬を調製するためのこの結晶形の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
3−（2−アニリノ−1−シクロヘキシル−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸は、公開された明細書国際公開第2015／121210号パンフレットに、変異型イソクエン酸デヒドロゲナーゼIDH1 R132Hの阻害剤として開示されている。
【０００３】
IDH1 R132Hは、クエン酸サイクル、脂質代謝、ヒストンメチル化およびDNAメチル化などの修復過程などの種々の細胞過程に関与している（Prensner，J．R．およびChinnaiyan，A．M．：Metabolism unhinged：IDH mutations in cancer，Nature Medicine 2011、17、291〜293）。IDH1変異の阻害は、腫瘍の治療において有望な療法となる。
【０００４】
国際公開第2010／151441号パンフレットは、4−（1−シクロペンチル−1H−ベンゾ［d］イミダゾール−2−イルアミノ）−N−ヒドロキシベンズアミドおよびこの化合物を調製する方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2015／121210号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2010／151441号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Prensner，J．R．およびChinnaiyan，A．M．：Metabolism unhinged：IDH mutations in cancer，Nature Medicine 2011、17、291〜293
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この先行技術から出発して、目的は、3−（2−アニリノ−1−シクロヘキシル−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸を高収率かつ高純度で得ることができ、工業的製造方法として使用することができる3−（2−アニリノ−1−シクロヘキシル−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸を調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一般式（I）の化合物：
【化１】
0006787998.tif 000002
（式中、
R1は水素原子を表す、またはR1はC1〜C3−アルキル−、C1〜C3−アルコキシ−、C1〜C3−ハロアルキル−およびC1〜C3−ハロアルコキシ−の系列から選択される基を表し、
R2は水素原子またはC1〜C3−アルキル基を表し、
R3は水素原子またはC1〜C3−アルキル基を表し、
R4は場合によりC1〜C3−アルキル基によって1回または複数回置換されたシクロヘキシル基を表し、
R5は水素原子またはC1〜C6−アルキル基を表す）
を調製する方法であって、
一般式（II）の化合物：
【化２】
0006787998.tif 000003
（式中、R4は式（I）の化合物と同じ定義を有し、R6はC1〜C6−アルキル基を表す）または一般式（II）の化合物の塩もしくは溶媒和物もしくは塩の溶媒和物
を一般式（III）の化合物：
【化３】
0006787998.tif 000004
（式中、R1、R2およびR3は式（I）の化合物と同じ定義を有する）
と反応させ、
この反応で、一般式（IV）の化合物が形成される：
【化４】
0006787998.tif 000005
（式中、R1、R2、R3およびR4は式（I）の化合物と同じ定義を有し、R6は式（II）の化合物と同じ定義を有する）
ステップを含む方法
に関する。
【０００９】
「置換された」という用語は、指定された原子または指定された基上の1個または複数の水素が、特定される基からの選択によって置き換えられていることを表すが、当の状況下で指定された原子の通常の原子価を超えない。置換基および／または変数の組み合わせは許容される。
【００１０】
「ハロゲン原子」、という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子、好ましくはフッ素、塩素または臭素原子を指す。
【００１１】
「C1〜C6−アルキル」という用語は、1、2、3、4、5または6個の炭素原子を有する直鎖または分岐の飽和一価炭化水素基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、ペンチル、イソペンチル、2−メチルブチル、1−メチルブチル、1−エチルプロピル、1，2−ジメチルプロピル、ネオ−ペンチル、1，1−ジメチルプロピル、ヘキシル、1−メチルペンチル、2−メチルペンチル、3−メチルペンチル、4−メチルペンチル、1−エチルブチル、2−エチルブチル、1，1−ジメチルブチル、2，2−ジメチルブチル、3，3−ジメチルブチル、2，3−ジメチルブチル、1，2−ジメチルブチルもしくは1，3−ジメチルブチル基、またはこれらの異性体を指す。前記基は、好ましくは1、2、3または4個の炭素原子を有する（「C1〜C4−アルキル」）、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec−ブチルイソブチル、またはtert−ブチル基、とりわけ好ましくは1、2または3個の炭素原子を有する（「C1〜C3−アルキル」）、例えば、メチル、エチル、n−プロピルまたはイソプロピル基である。
【００１２】
「C1〜C3−ハロアルキル」という用語は、「C1〜C3−アルキル」という用語が上に定義される通りであり、かつ水素原子の1個または複数が同じまたは異なるハロゲン原子によって置き換えられている、直鎖または分岐の飽和一価炭化水素基を指す。ハロゲン原子は、好ましくはフッ素である。C1〜C3−ハロアルキル基は、例えば、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、2−フルオロエチル、2，2−ジフルオロエチル、2，2，2−トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、3，3，3−トリフルオロプロピルまたは1，3−ジフルオロプロパン−2−イルである。
【００１３】
「C1〜C3−アルコキシ」という用語は、「C1〜C3−アルキル」という用語が上に定義される通りである式（C1〜C3−アルキル）−O−の直鎖または分岐の飽和一価基、例えば、メトキシ、エトキシ、n−プロポキシまたはイソプロポキシ基である。
【００１４】
「C1〜C3−ハロアルコキシ」という用語は、水素原子の1個または複数が同じまたは異なるハロゲン原子によって置き換えられている、上に定義される直鎖または分岐の飽和一価C1〜C3−アルコキシ基を指す。ハロゲン原子は、特にフッ素である。C1〜C3−ハロアルコキシ基は、例えば、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、2，2，2−トリフルオロエトキシまたはペンタフルオロエトキシである。
【００１５】
「C1〜C3」という用語は、本文で、例えば「C1〜C3−アルキル」、「C1〜C3−ハロアルキル」、「C1〜C3−アルコキシ」または「C1〜C3−ハロアルコキシ」の定義の文脈で使用される場合、1〜3、すなわち1、2または3個の炭素原子に限定される数の炭素原子を有するアルキル基を指す。
【００１６】
値の範囲が列挙されている場合、これは範囲内のすべての個々の値および部分範囲を含む。例えば、「C1〜C6」は、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1〜C6、C1〜C5、C1〜C4、C1〜C3、C1〜C2、C2〜C6、C2〜C5、C2〜C4、C2〜C3、C3〜C6、C3〜C5、C3〜C4、C4〜C6、C4〜C5およびC5〜C6を包含する。
【００１７】
例えば、「脱離基」という用語は、ここで使用される場合、化学反応において安定な種として、結合電子と共に置換される原子または原子群を指す。脱離基は、好ましくはハロゲン化物、特にフッ化物、塩化物、臭化物またはヨウ化物、（メチルスルホニル）オキシ、［（トリフルオロメチル）スルホニル］オキシ、［（ノナフルオロブチル）スルホニル］オキシ、（フェニルスルホニル）オキシ、［（4−メチルフェニル）スルホニル］オキシ、［（4−ブロモフェニル）スルホニル］オキシ、［（4−ニトロフェニル）スルホニル］オキシ、［（2−ニトロフェニル）スルホニル］オキシ、［（4−イソプロピルフェニル）スルホニル］オキシ、［（2，4，6−トリイソプロピルフェニル）スルホニル］オキシ、［（2，4，6−トリメチルフェニル）スルホニル］オキシ、［（4−tert−ブチルフェニル）スルホニル］オキシおよび［（4−メトキシフェニル）スルホニル］オキシを含む群から選択される。
【００１８】
式（II）の化合物と式（III）の化合物とを反応させて式（IV）の化合物を得ることは、好ましくは1−（3−ジメチルアミノプロピル）−3−エチルカルボジイミド塩酸塩（EDCl）などのカップリング試薬を用いて、テトラヒドロフラン（THF）などの溶媒中40℃〜60℃の温度で行う。
【００１９】
式（II）の化合物は、式（V）のニトロ化合物の還元によっても得ることができる：
【化５】
0006787998.tif 000006
【００２０】
還元は、例えば、テトラヒドロフラン（THF）などの適切な溶媒中、パラジウム炭素担体（Pd／C）などの触媒を用いて、10℃〜60℃の範囲の温度で、気体水素により行うことができる。
【００２１】
式（V）のニトロ化合物は、例えば、以下の反応スキームにより求核芳香族置換反応で得ることができる：
【化６】
0006787998.tif 000007
【００２２】
ここで、Xは好適な脱離基、好ましくはフッ素原子である。
【００２３】
求核芳香族置換は、アセトニトリルなどの適切な溶媒中、炭酸カリウム（K2CO3）などの適切な塩基を用いて、還流条件下（約80℃）で行うことができる。
【００２４】
式（III）、（VI）および（VII）の化合物は、大部分が商業的に入手可能である、または公知の化合物から公知の方法によって生成され得る。
【００２５】
式（I）の酸化合物は、以下のスキームによりカルボン酸エステルのけん化によって、式（IV）の化合物から調製することができる：
【化７】
0006787998.tif 000008
（R5は水素原子を表す）。
【００２６】
けん化は、例えば、20℃〜60℃の温度で、テトラヒドロフラン（THF）などの適切な溶媒中、水酸化ナトリウム（NaOH）などの塩基によって行うことができる。
【００２７】
好ましい実施形態では、R2が水素原子であり、R3が水素原子であり、R1がC1〜C3−アルキル−、C1〜C3−アルコキシ−、C1〜C3−ハロアルキル−およびC1〜C3−ハロアルコキシ−の系列から選択される基を表す。
【００２８】
特に好ましい実施形態では、R2が水素原子であり、R3が水素原子であり、R1がメチル、メトキシ、トリフルオロメチルおよびトリフルオロメトキシの系列から選択される基を表す。
【００２９】
とりわけ好ましい実施形態では、R2が水素原子であり、R3が水素原子であり、R1がトリフルオロメトキシ基である。
【００３０】
さらに好ましい実施形態では、R4が場合によりメチル基で一置換、二置換、三置換または四置換されたシクロヘキシル基を表す。
【００３１】
特に好ましい実施形態では、R4が
【化８】
0006787998.tif 000009
（＊は基R4が分子の残りと結合している位置を示す）
の系列から選択される。
【００３２】
さらに好ましい実施形態において、R5が水素原子またはメチル基を表す。
【００３３】
特に好ましい実施形態では、R5が水素原子を表す。
【００３４】
さらに好ましい実施形態では、R6がメチル、エチル、イソプロピルまたはtert−ブチル基を表す。
【００３５】
特に好ましい実施形態では、R6がメチルまたはエチル基を表す。
【００３６】
特に好ましい実施形態では、R6がメチル基を表す。
【００３７】
さらに特に好ましい実施形態では、本発明による方法が、式（Ia）の化合物：
【化９】
0006787998.tif 000010
（式中、
R1は水素原子を表す、またはR1はC1〜C3−アルキル−、C1〜C3−アルコキシ−、C1〜C3−ハロアルキル−およびC1〜C3−ハロアルコキシ−の系列から選択される基を表し、
R2は水素原子またはC1〜C3−アルキル基を表し、
R3は水素原子またはC1〜C3−アルキル基を表し、
R4は場合によりC1〜C3−アルキル基によって1回または複数回置換されたシクロヘキシル基を表し、
R5はC1〜C3−アルキル基を表す）
を調製するのに役立ち、
一般式（IIa）の化合物：
【化１０】
0006787998.tif 000011
（式中、R6はC1〜C6−アルキル基を表す）
または一般式（IIa）の化合物の塩もしくは溶媒和物もしくは塩の溶媒和物
を一般式（III）の化合物：
【化１１】
0006787998.tif 000012
（式中、R1、R2およびR3は式（Ia）の化合物と同じ定義を有する）
と反応させ、
この反応で、一般式（IVa）の化合物が形成される：
【化１２】
0006787998.tif 000013
（式中、R1、R2およびR3は式（Ia）の化合物と同じ定義を有し、R6は式（IIa）の化合物と同じ定義を有する）
ステップを含む。
【００３８】
とりわけ好ましい実施形態では、本発明による方法が、3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸を調製するのに役立ち、式（IIa）の3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパン酸のアルキルエステル
【化１３】
0006787998.tif 000014
（式中、R6はC1〜C6−アルキル基を表す）
または式（IIa）の化合物の塩もしくは溶媒和物もしくは塩の溶媒和物
を4−イソチオシアナトフェニルトリフルオロメチルエーテル
【化１４】
0006787998.tif 000015
と反応させ、
この反応で、式（IVa）の3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸のアルキルエステルが形成される：
【化１５】
0006787998.tif 000016
（式中、R6は式（IIa）の化合物と同じ定義を有する）
ステップを含む。
【００３９】
さらに好ましい実施形態では、使用される式（IIa）の化合物がメチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエートの塩酸塩のジオキサン溶媒和物である：
【化１６】
0006787998.tif 000017
【００４０】
この付加物は、各場合で、1分子のメチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエート、1分子のジオキサンおよび2分子の塩酸からなり、THFに溶解したメチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエートを例えばジオキサンおよび塩酸で処理することによって得られる。
【００４１】
メチル3−（3−ニトロ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエートのメチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエートへの還元で生じる副産物および出発化合物からこれを容易に精製および分離することができる。
【００４２】
そのため、本発明はさらに、メチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエート−1，4−ジオキサン塩酸塩（1：1：2）に関する。
【００４３】
そのため、本発明はさらに、出発材料
3−（4−フルオロ−3−ニトロフェニル）プロパン酸のアルキルエステル：
【化１７】
0006787998.tif 000018
（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキサンアミン：
【化１８】
0006787998.tif 000019
および
4−イソチオシアナトフェニルトリフルオロメチルエーテル：
【化１９】
0006787998.tif 000020
（R6はC1〜C6−アルキル基を表す）
から3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸を調製する方法を提供する。
【００４４】
3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸を調製する本発明による方法は、以下のステップを含む：
（a）3−（4−フルオロ−3−ニトロフェニル）プロパン酸のアルキルエステルを（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキサンアミンと反応させて、3−（3−ニトロ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパン酸のアルキルエステルを得るステップ
（b）ステップ（a）からの3−（3−ニトロ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパン酸のアルキルエステルを還元して、3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパン酸のアルキルエステルを得るステップ
（c）ステップ（b）からの3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパン酸のアルキルエステルを、4−イソチオシアナトフェニルトリフルオロメチルエーテルと反応させて、3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸のアルキルエステルを得るステップ
（d）ステップ（c）からの3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸のアルキルエステルをけん化して、3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸を得るステップ。
【００４５】
好ましい実施形態では、ステップ（a）からの生成物を、精製することなくステップ（b）に供給する。
【００４６】
さらに好ましい実施形態では、ステップ（a）からの3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸のアルキルエステルを、塩酸／ジオキサン混合物で処理して、3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパン酸−1，4−ジオキサン塩酸塩（1：1：2）のアルキルエステルを得て、次いで、これをステップ（c）に供給する。
【００４７】
さらに好ましい実施形態では、ステップ（c）からの生成物を、精製することなくステップ（d）に供給する。
【００４８】
さらに好ましい実施形態では、ステップ（d）のけん化を、THF中水酸化ナトリウム水溶液によって行い；次いで、塩酸による中和を行い、3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸をイソプロパノールの添加によって晶出させる。
【００４９】
本発明はさらに、THFに溶解した3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸をイソプロパノールで処理することによって得られる結晶形の3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸（以下、単に「結晶形」とも呼ぶ）を提供する。
【００５０】
THFに溶解した3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸をイソプロパノールで処理することによって形成される結晶形は、国際公開第2015／121210号パンフレットに記載される方法で製造された非晶質形態よりも単純かつ有効に精製することができる。これは、非晶質形態と比較して改善された薬理学的および／または薬物動態学的プロファイルを有する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】結晶形のX線回折図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明はさらに、以下の2θ角でのX線回折図の最大値を特徴とする3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸の結晶形に関する：6．5、8．5、11．2、11．3、11．9、12．1、13．4、14．3、14．8、15．0、15．1、15．2、15．3、15．9、16．4、17．1、17．4、17．6、18．0、18．2、19．1、19．1、19．6、19．9、20．1、20．2、20．8、21．1、21．6、21．8、22．4、22．6、22．9、23．2、23．4、24．0、24．3、24．3、24．7、24．9。
【００５３】
本発明はさらに、指定される結晶形の3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸を含む医薬を提供する。
【００５４】
この結晶形は、ヒトおよび動物の疾患を治療および／または予防するための医薬として使用するのに適している。
【００５５】
IDH1 R132H阻害剤としての結晶形の薬効は、存在する3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸の効果によって説明することができる。
【００５６】
本発明はさらに、障害を治療および／または予防するため、とりわけ腫瘍を治療するための結晶形の使用に関する。
【００５７】
本発明はさらに、腫瘍を治療および／または予防する方法に使用するための結晶形を提供する。
【００５８】
本発明はさらに、障害を治療および／または予防するため、とりわけ腫瘍を治療するための医薬を製造するための結晶形の使用に関する。
【００５９】
本発明はさらに、薬学的有効量の結晶形を用いて、障害を治療および／または予防する、とりわけ腫瘍を治療する方法を提供する。
【００６０】
本発明により治療することができる固形腫瘍は、例えば、乳房、気道、脳、生殖器、胃腸管、泌尿生殖路、眼、肝臓、皮膚、頭頸部、甲状腺、副甲状腺、骨および結合組織の腫瘍、ならびにこれらの腫瘍の転移である。
【００６１】
治療することができる血液学的腫瘍は、例えば、
多発性骨髄腫、
リンパ腫または
白血病
である。
【００６２】
治療することができる乳房腫瘍は、例えば：
ホルモン受容体陽性状態の乳癌
ホルモン受容体陰性状態の乳癌
Her2陽性乳癌
ホルモン受容体およびHer−2陰性乳癌
BRCA関連乳癌
炎症性乳癌
である。
【００６３】
治療することができる気道の腫瘍は、例えば、
非小細胞気管支癌、例えば、扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌および
小細胞気管支癌
である。
【００６４】
治療することができる脳の腫瘍は、例えば、
神経膠腫、
神経膠芽腫、
星状細胞腫、
髄膜腫および
髄芽腫
である。
【００６５】
治療することができる男性生殖器の腫瘍は、例えば：
前立腺癌、
悪性精巣上体腫瘍
悪性精巣腫瘍および
陰茎癌
である。
【００６６】
治療することができる女性生殖器の腫瘍は、例えば：
子宮内膜癌
子宮頸癌
卵巣癌
膣癌
外陰癌
である。
【００６７】
治療することができる胃腸管の腫瘍は、例えば：
結腸直腸癌
肛門癌
胃癌
膵臓癌
食道癌
胆嚢癌
小腸癌
唾液腺癌
神経内分泌腫瘍
胃腸間質腫瘍
である。
【００６８】
治療することができる泌尿生殖路の腫瘍は、例えば：
膀胱癌
腎細胞癌
腎盂および下部尿路の癌腫
である。
【００６９】
治療することができる眼の腫瘍は、例えば：
網膜芽細胞腫
眼内黒色腫
である。
【００７０】
治療することができる肝臓の腫瘍は、例えば：
肝細胞癌
胆管細胞癌
である。
【００７１】
治療することができる皮膚の腫瘍は、例えば：
悪性黒色腫
基底細胞腫
棘細胞腫
カポジ肉腫
メルケル細胞癌
である。
【００７２】
治療することができる頭頸部の腫瘍は、例えば：
喉頭癌
咽頭癌および口腔癌
中央線構造の癌腫（例えば、NMC、C．A．French、Annu．Rev．Pathol．2012、7：247〜265）
である。
【００７３】
治療することができる肉腫は、例えば：
軟部組織肉腫
骨肉腫
である。
【００７４】
治療することができるリンパ腫は、例えば：
非ホジキンリンパ腫
ホジキンリンパ腫
皮膚リンパ腫
中枢神経系のリンパ腫
エイズ関連リンパ腫
である。
【００７５】
治療することができる白血病は、例えば：
急性骨髄性白血病
慢性骨髄性白血病
急性リンパ性白血病
慢性リンパ性白血病
ヘアリーセル白血病
である。
【００７６】
結晶形は全身的および局所的に作用することができる。この目的のために、これらを適当な様式で、例えば、経口、非経口、肺、経鼻、舌下、舌、頬側、直腸、真皮、経皮、結膜もしくは耳経路により、またはインプラントもしくはステントとして投与することができる。
【００７７】
結晶形をこれらの投与経路に適した投与形態で投与することができる。
【００７８】
経口投与に適した投与形態は、先行技術により作用し、結晶形を迅速にかつ修正された様式で放出することができるもの、例えば、錠剤（非コーティングあるいは例えば、結晶形の放出を制御する、胃液抵抗性または遅延溶解または不溶性コーティングによるコーティング錠）、口腔で急速に崩壊する錠剤またはフィルム／ウエハー、フィルム／凍結乾燥物、カプセル剤（例えば、硬質または軟質ゼラチンカプセル）、糖衣錠、顆粒剤、ペレット剤、散剤、乳剤、懸濁剤またはエアゾール剤である。
【００７９】
非経口投与は、（例えば、静脈内、動脈内、心臓内、髄腔内もしくは腰椎内経路により）吸収ステップを回避して、または（例えば、筋肉内、皮下、皮内、経皮もしくは腹腔内経路により）吸収を含めて達成することができる。非経口投与に適した投与形態には、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥物または滅菌散剤の形態の注射および注入用製剤が含まれる。
【００８０】
他の投与経路に適した投与形態は、例えば、吸入用医薬形態（粉末吸入器、ネブライザーを含む）、点鼻薬またはスプレー、舌、舌下または頬側投与のための錠剤、フィルム／ウエハーまたはカプセル剤、坐剤、耳または眼用製剤、膣カプセル剤、水性懸濁剤（ローション、振盪混合物）、親油性懸濁剤、軟膏、クリーム、経皮治療システム（例えば、パッチ）、ミルク、ペースト、フォーム、粉剤、インプラントまたはステントがある。
【００８１】
結晶形を言及する投与形態に変換することができる。これは、不活性で、非毒性の、薬学的に適当な補助剤と混合することによって、それ自体は既知の様式で達成することができる。これらの補助剤には、担体（例えば、微結晶セルロース、乳糖、マンニトール）、乳化剤および分散剤または湿潤剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシソルビタンオレエート）、結合剤（例えば、ポリビニルピロリドン）、合成および天然ポリマー（例えば、アルブミン）、安定剤（例えば、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸）、着色剤（例えば、無機顔料、例えば、酸化鉄）ならびに香味および／または臭気修正剤が含まれる。
【００８２】
本発明はさらに、典型的には1種または複数の不活性で、非毒性の、薬学的に適当な補助剤と共に結晶形を含む医薬、および上記目的のためのその使用を提供する。
【００８３】
医薬製剤は、1種または複数の活性化合物を医薬製剤で慣用的な賦形剤を用いて所望の投与形態に変換することにより、それ自体公知の方法で製剤化される。
【００８４】
使用される賦形剤は、例えば担体物質、充填剤、崩壊剤、結合剤、保水剤、滑剤、吸収剤および吸着剤、希釈剤、共溶媒、乳化剤、矯味剤、着色剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、浸透圧を修正するための塩または緩衝剤であり得る。Remington’s Pharmaceutical Science、第15版Mack Publishing Company、East Pennsylvania（1980）を参照されたい。
【００８５】
医薬製剤は
固体形態で、例えば錠剤、糖衣錠、丸剤、坐剤、カプセル剤、経皮システムとして、
または半固体形態で、例えば軟膏、クリーム、ゲル、坐剤、乳剤として、
または液体形態で、例えばチンキ剤、懸濁剤または乳剤として
存在し得る。
【００８６】
本発明の文脈における補助剤は、例えば塩、糖類（単糖、二糖、三糖、オリゴ糖および／または多糖）、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、脂肪、ろう、油、炭化水素およびその誘導体であり得、補助剤は天然起源のものであってもよく、または合成もしくは部分的合成手段によって得られてもよい。
【００８７】
経口または経口的投与のための有用な形態は、とりわけ錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、パステル錠、懸濁剤または乳剤である。
【００８８】
非経口投与に有用な形態は、とりわけ懸濁剤および乳剤である。
【００８９】
結晶形は、単独で、または必要に応じて、1種または複数の他の薬理学的に活性な物質と組み合わせて使用することができ、ただし、この組み合わせは望ましくないおよび許容できない副作用をもたらさない。そのため、本発明はさらに、とりわけ上記障害を予防および／または治療するための、結晶形と、1種または複数のさらなる活性化合物とを含む医薬を提供する。
【００９０】
例えば、結晶形は、新生物障害の治療に使用される公知の抗過剰増殖性、細胞増殖抑制性または細胞傷害性物質と組み合わせることができるが、同時に、支持もしくは構成特性を有する物質と組み合わせることもできる、または血管新生に正の効果を示す化合物と組み合わせることもできる。
【００９１】
組み合わせに有用な適切な薬理学的活性物質には、網羅的な一覧ではないが、例えば、
131I−chTNT、アバレリクス、アビラテロン、アクラルビシン、アフリバーセプト、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムルビシン、アムサクリン、アナストロゾール、アルグラビン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、アザシチジン、バシリキシマブ、ベロテカン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ビサントレン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブレンツキシマブ、ブセレリン、ブスルファン、カバジタキセル、カボザンチニブ−s−マレート、ホリナートカルシウム、レボホリナートカルシウム、カペシタビン、カルボプラチン、カルフィルゾミブ、カルモフール、カルムスチン、カツマキソマブ、セレコキシブ、セルモロイキン、セジラニブ、セツキシマブ、クロラムブシル、クロルマジノン、クロルメチン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロン酸、クロファラビン、コパンリシブ、クリサンタスパーゼ、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダルベポエチンα、ダサチニブ、ダウノルビシン、デブラフェニブ、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デスロレリン、塩酸デクスラゾキサン、塩化ジブロスピジウム、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドキソルビシン＋エストロン、エクリズマブ、エドレコロマブ、酢酸エリプチニウム、エルトロンボパグ、エンドスタチン、エノシタビン、エンザルタミド、エピルビシン、エピチオスタノール、エポエチンα、エポエチンβ、エプタプラチン、エリブリン、エルロチニブ、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、ファドロゾール、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォルメスタン、フォテムスチン、フルベストラント、硝酸ガリウム、ガニレリクス、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、グルカルピダーゼ、グルトキシム、ゴセレリン、ヒスタミン二塩酸塩、ヒストレリン、ヒドロキシカルバミド、I−125種、イバンドロン酸、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イミキモド、インプロスルファン、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、イピリムマブ、イリノテカン、イキサベピロン、ランレオチド、ラパチニブ、レナリドミド、レノグラスチム、レンチナン、レトロゾール、リュープロレリン、ロイコボリン、レバミソール、リスリド、ロバプラチン、ロムスチン、ロニダミン、マソプロコール、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メピチオスタン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、アミノレブリン酸メチル、メチルテストステロン、ミファムルチド、ミルテホシン、ミリプラチン、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトラクトール、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ネダプラチン、ネララビン、ニロチニブ、ニルタミド、ニモツズマブ、ニムスチン、ニトラクリン、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマセタキシン・メペサクシネート、オメプラゾール、オプレルベ���ン、オキサリプラチン、オゾガマイシン、p53遺伝子治療、パクリタキセル、パリフェルミン、パラジウム103種、パロノセトロン塩酸塩、パミドロン酸、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パゾパニブ、ペグアスパラガーゼ、PEG−エポエチンβ（メトキシPEG−エポエチンβ）、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンα−2b、ペメトレキセド、ペンタゾシン、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ペルツズマブ、ピシバニル、ピラルビシン、プレリキサフォル、プリカマイシン、ポリグルサム、リン酸ポリエストラジオール、ポリサッカリドK、ポマリドミド、ポマチニブ、ポルフィマーナトリウム、プララトレキサート、プレドニムスチン、プレドニソン、プロカルバジン、キナゴリド、塩化ラジウム223、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、ラニムスチン、ラゾキサン、ラファメチニブ、ラゴラフェニブ、リセドロン酸、リツキシマブ、ロミデプシン、ロミプロスチム、ロニシクリブ、ルキソリチニブ、サルグラモスチム、シプロイセルT、シゾフィラン、ソブゾキサン、グリシジダゾールナトリウム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、タラポルフィン、タルク、タミバロテン、タモキシフェン、タソネルミン、テセロイキン、テガフール、テガフール＋ギメラシル＋オテラシル、テモポルフィン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、テトロフォスミン、タリドミド、チオテパ、チマルファシン、チオグアニン、トシリズマブ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、I131トシツモマブ、トラメチニブ、トラベクテジン、トラスツズマブ、トレオスルファン、トレチノイン、トリロスタン、トリプトレリン、トロホスファミド、トリプトファン、ウベニメクス、バルルビシン、バンデタニブ、バプレオチド、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ビスモデギブ、ボリノスタット、ボロゾール、イットリウム90ガラスミクロスフェア、ジノスタチン、ジノスタチンスチマラマー、ゾレドロン酸、ゾルビシンが含まれる。
【００９２】
一般に、以下の目的を、結晶形と他の細胞増殖抑制剤または細胞傷害活性剤との組み合わせによって追求することができる：
個々の有効成分による治療と比較して、腫瘍の成長を遅くし、そのサイズを縮小し、またはそれを完全に排除する有効性の改善；
単独療法の場合よりも低投与量で使用される化学療法剤を使用する可能性；
個々の投与と比較してより少ない副作用でのより耐容性のある療法の可能性；
より広範囲の新生物障害の治療の可能性；
療法に対するより高い反応率の達成；
現在の標準療法と比較してより長い患者の生存時間。
【００９３】
さらに、結晶形を放射線療法および／または外科的介入と組み合わせて使用することもできる。
【００９４】
実験節
実施例
実施例1
メチル3−（3−ニトロ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエート（V）の調製
アセトニトリル3．0L中溶液としてのメチル3−（4−フルオロ−3−ニトロフェニル）プロパノエート（VI）402g（1．77mol）に、最初に炭酸カリウム367g（2．66mol）を装入し、（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキサンアミン300g（2．12mol）を添加した。混合物をジャケット温度100℃で還流下で12時間撹拌した。20℃に冷却した後、水3．6Lを混合物に添加した。相分離を改善するために、飽和塩化ナトリウム溶液1．0Lを添加した。下部の水相を除去した。有機相を減圧下（約50mbar）ジャケット温度50℃で濃縮して、油状残渣を得た。収量：高粘性橙色油640．5g（理論値の104％）。
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．75−0．87（m，2H），0．89（d，3H），0．93（s，3H），1．02（s，3H），1．10（t，1H），1．34−1．39（m，1H），1．68−1．83（m，2H），1．99−2．02（m，1H），2．58−2．62（m，2H），2．75−2．79（m，2H），3．57（s，3H），3．73−3．82（m，1H），7．07（d，1H），7．44（dd，1H），7．79（br．d．，1H），7．89（d，1H）．
【００９５】
実施例2
メチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエート二塩酸塩ジオキサン溶媒和物（IIa）の調製
テトラヒドロフラン3．2L中溶液としての3−（3−ニトロ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエート（実施例1からの粗生成物）640．5g（1．77mol）に、最初にパラジウム触媒32g（5重量％；0．05当量、32g、88．5mmol）を水素化反応器中で装入し、混合物を水素雰囲気下（1．5bar正圧）25℃で10時間撹拌した。反応混合物を加圧フィルタ（Seitz K300フィルタプレート）を通して濾別し、濾液を減圧下（約50mbar）ジャケット温度50℃で濃縮して油状残渣を得た。残渣をジオキサン1．3Lに溶解し、これにジオキサン中4N HCl（4．4mol HCl）560mLを内温20℃で20分間にわたって添加した。この過程で、生成物が晶出した。これを2時間撹拌し、濾別し、それぞれMTBE500mLで2回洗浄した。湿った生成物を真空下、乾燥キャビネット中温度40℃で4時間乾燥させた。
収量：淡黄色固体のメチル3−（4−フルオロ−3−ニトロフェニル）プロパノエートの使用に基づいて785g（理論値の91％）。
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．72−0．84（m，1H），0．85−1．05（m，10H），1．19−1．28（m，1H），1．31−1．35（m，1H），1．59−1．71（m，2H），1．90−1．97（m，1H），2．56−2．62（m，2H），2．72−2．78（m，2H）3．51−3．54（m，1H），3．55（s，3H），3．57（s，8H，dioxane），6．28−6．37（br．m．，5H），6．69（br．d．，1H），6．70（s，1H），7．01（br．d．，1H）．
【００９６】
実施例3
3−（2−｛［4−（トリフルオロメトキシ）フェニル］アミノ｝−1−［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］−1H−ベンズイミダゾール−5−イル）プロパン酸（I）の調製
メチル3−（3−アミノ−4−｛［（1R，5R）−3，3，5−トリメチルシクロヘキシル］アミノ｝フェニル）プロパノエート二塩酸塩ジオキサン溶媒和物（IIa）500g（1．043mol）のTHF3．0L中懸濁液に、N，N−ジイソプロピルエチルアミン296．5g（2．29mol）を温度20℃で添加し、混合物を30分間撹拌した。4−（トリフルオロメトキシ）フェニルイソチオシアネート252g（1．15mol）を添加し、温度を50℃で1時間維持した。その後、EDCI300g（1．56mol）を添加し、混合物を還流下でジャケット温度80℃で4時間撹拌した。混合物を20℃に冷却し、20％クエン酸水溶液1．5Lを添加し、混合物を30分間撹拌し、MTBE1．5Lを添加し、混合物をさらに15分間撹拌した。下部の水相を除去した。有機相をそれぞれ4．8％炭酸水素ナトリウム水溶液1．5Lで2回抽出した。有機相を減圧下（約50mbar）ジャケット温度50℃で濃縮して油状残渣を得て、その後、これに、THF3Lおよび3．7％水酸化ナトリウム溶液2L（1．56mol）を添加し、混合物を温度50℃で3時間撹拌した。20℃に冷却した後、混合物を10％塩酸水溶液でpH4に調整し、飽和塩化ナトリウム溶液500mLを添加し、水相を除去した。有機相をジャケット温度80℃で濃縮して油状残渣を得て、次いで、これにイソプロパノール4Lを添加し、ジャケット温度100℃で約2．5Lを留去した。同時に水900mLを内部温度80℃で20分間にわたって添加した。この過程で、生成物が熱混合物から晶出した。20℃に冷却した後、生成物を濾別し、イソプロパノール500mLおよび水500mLで連続的に洗浄した。湿った生成物を真空下、乾燥キャビネット中温度60℃で16時間乾燥させた。
収量：白色結晶性固体（融点：248℃）398g（理論値の77％）。
1H−NMR（400MHz，DMSO−d6）：δ［ppm］＝0．93（s，3 H），0．96（s，3 H），1．03（s，3 H），1．04−1．12（m，1H），1．35−1．44（m，2H），1．70−1．92（m，3H），2．03（t，1H），2．43−2．60（m，2H），2．85（t，2H），4．63（t，1H），6．90（d，1H），7．24（s，1H），7．32（d，2H），7．42（d，1H），7．79（d，2H），8．98（br．s．，1H），12．06（br．s．，1H）．
【００９７】
X線粉末回折図
図1は、本発明による結晶形のX線回折図を示す。
【００９８】
X線回折図を記録するために、自動STOE粉末回折計を、ゲルマニウム単色化CuKα1線を用いた透過モードで使用した。銅陽極を有するX線管を40kVおよび40mAで動作させた。2θスキャンを、2°≦2θ≦40°（ステップサイズ0．5°）で記録した。ソフトウェアSTOE WinXpowを使用してデータを評価した。
【００９９】
2θ値の最大値を表1に列挙する。
【０１００】
【表１Ａ】
0006787998.tif 000021
【表１Ｂ】
0006787998.tif 000022
【０１０１】
生化学アッセイにおけるIDH1 R132Hの阻害
IDH1 R132Hは、α−ケトグルタル酸（α−KG）の（2R）−2−ヒドロキシグルタル酸（2−HG）へのNADPH依存性還元を触媒する。NADPH消費を発光によって決定する。
【０１０２】
各場合で反応体積41μLおよび以下の緩衝液条件：50mM Tris pH7．5、100mM NaCl、20mM MgCl2、0．05％BSA、0．01％Brij、1μM NADPHおよび250μMα−KG下で、384ウェルタイタープレート中32℃で生化学的反応を行った。IDH1 R132H酵素を1．5nMの最終濃度で使用した。試験化合物を0．002〜10μMの濃度範囲でアッセイした。最終DMSO濃度は2．4％であった。
【０１０３】
反応混合物を30分間インキュベートし、その後、検出混合物40μL（0．75μg／mlルシフェラーゼ、0．02U／mlオキシドレダクターゼ、4μg／mL FMN、2μL／mlデカナール／エタノール、50mM Tris pH7．5、0．5％グリセロール、0．01％Tween 20、0．05％BSA）を添加した。発光を発光読み取り装置（10秒測定時間、1秒積分期間、30％感度）を用いて測定した。発光の低下はmIDH1活性に比例する。相対発光対阻害剤濃度のプロットからの内挿によってIC50値を決定した。結果を表2にまとめる。
【０１０４】
【表２Ａ】
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【表２Ｂ】
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【表２Ｃ】
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【表２Ｄ】
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【表２Ｅ】
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【表２Ｆ】
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【０１０５】
細胞アッセイ
（2R）−2−ヒドロキシグルタル酸（2HG）の濃度を、変異型イソクエン酸デヒドロゲナーゼタンパク質を過剰発現している細胞株の培地で測定した。mIDHは、α−ケトグルタル酸の2−HGへのNADPH依存性還元を触媒する。細胞（LN229 R132H、Mohrenzら、Apoptosis（2013）18：1416〜1425）を、10％FCSを含むDMEMで培養した。細胞を、トリプシンを用いて得て、96−ウェルタイタープレートに入れた。細胞を5％CO2中37℃で一晩インキュベートした。翌日、試験化合物を細胞に添加した。DMSOの最終濃度は0．1％であり、DMSO対照を使用した。次いで、タイタープレートをインキュベーターに24時間入れた。
【０１０６】
Balssら（Acta Neuropathol（2012）124：883〜891）によって公開された方法を用いて2−HGを測定した。HClO4を各ウェルに添加し、タイタープレートを遠心分離した。一定分量を取り出し、ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ（HGDH）、ジアホラーゼ、NAD＋およびレサズリンとインキュベートした。レサズリンのレゾルフィンへの変換を励起540nm発光600nmで蛍光分光法によって測定した。蛍光シグナルの増加は、2−HGの形成に比例する。相対蛍光対阻害剤濃度のプロットからの内挿によってIC50値を決定した。結果を表3にまとめる。
【０１０７】
【表３Ａ】
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【表３Ｂ】
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【表３Ｃ】
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【表３Ｄ】
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【表３Ｅ】
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【図１】
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