(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
並行した２段以上の平面流路と、
前記平面流路に設置されたポリマー多孔質膜と、
前記各平面流路の一端に設置された培地供給手段と、
前記各平面流路の他端に配置された培地排出手段と、
最上段の平面流路の上部に配置されたヘッド槽と、
前記ヘッド槽から各平面流路に培養液を配分する培地配分手段と、
前記培地排出手段から排出された培養液を回収する培地回収手段と
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
ここで、前記培地供給手段から平面流路を通じて培地排出手段に連続的に培養液が流れることを特徴とする、細胞培養装置。
【請求項２】
逆並行した２段以上の平面流路と、
前記平面流路に設置されたポリマー多孔質膜と、
前記各平面流路の一端に設置された培地供給手段と、
前記各平面流路の他端に配置された培地排出手段と、
最上段の平面流路の上部に配置されたヘッド槽と、
前記ヘッド槽から最上段の平面流路に培養液を配分する培地配分手段と、
最下段から排出された培養液を回収する培地回収手段と
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
ここで、前記培地供給手段から平面流路を通じて培地排出手段に連続的に培養液が流れ、さらに、前記培地排出手段から排出された培養液が次段の平面流路に設置された培地供給手段に注がれることを特徴とする、動物細胞を培養するための細胞培養装置。
【請求項３】
前記平面流路が、水平面からの角度が０〜２０°である、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記培地回収手段の排出口と連通した培地排出ラインと、
前記ヘッド槽の上部に配置された供給口で連通した培地供給ラインと
をさらに備え、
ここで、前記培地排出ラインの他端部が、前記培地供給ラインの他端部とポンプを介して連通されており、培養液が循環可能である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養液装置。
【請求項５】
前記培地配分手段が、ミスト供給ノズルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記平面流路が、各々、薄層バッグ内部に設置されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれて、
ｉｉ）ロール状に巻き込まれて、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結されて、
ｉｖ）縄状に結ばれて、及び／又は
ｖ）２以上が積層されて、
前記平面流路に設置されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜は、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものであって、
ここで、前記ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜が、前記平面流路に設置されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記ポリマー多孔質膜の平均膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１３に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１３又は１４に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置に関する。また、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を使用した細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、治療やワクチンに用いられる酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ウイルス（ウイルスタンパク質）等のタンパク質が培養細胞を用いて工業的に産生されている。しかし、こうしたタンパク質の生産技術はコストが高く、それが医療費を引き上げていた。そのため、大幅なコスト削減を目指して、高密度に細胞を培養する技術や、タンパク質の産生量を増大させるような革新的な技術が求められていた。【０００３】
タンパク質を産生させる細胞として、培養基材に接着する足場依存性の接着細胞が用いられることがある。こうした細胞は、足場依存的に増殖するため、シャーレ、プレート又はチャンバーの表面に接着させて培養する必要がある。従来、こうした接着細胞を大量に培養するためには、接着するための表面積を大きくする必要があった。ところが、培養面積を大きくするには、空間を必然的に増大させる必要があり、それがコストを増大させる要因となっていた。【０００４】
培養空間を小さくしつつ、接着細胞を大量に培養する方法として、微小多孔を有する担体、特に、マイクロキャリアを用いた培養法が開発されている（例えば、特許文献１）。マイクロキャリアを用いた細胞培養系は、マイクロキャリアが互いに凝集しないようにするために十分に攪拌・拡散される必要がある。そのため、マイクロキャリアを分散させた培地を十分に攪拌・拡散することができるだけの容積が必要となるため、培養できる細胞の密度には上限がある。また、マイクロキャリアと培地とを分離するためには、細かな粒子を分別できるフィルターで分離させる必要があり、それがコストを増大させる原因ともなっていた。こうした状況から、高密度の細胞を培養する革新的な細胞培養の方法論が希求されていた。【０００５】
＜ポリイミド多孔質膜＞
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献２〜４は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。【０００６】
細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０５４１７４号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０３８８７３号
【特許文献３】特開２０１１−２１９５８５号公報
【特許文献４】特開２０１１−２１９５８６号公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／０１２４１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を提供することを目的とする。また、本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を使用した細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、所定の構造を有するポリマー多孔質膜が、細胞を大量に培養可能な最適な空間を提供するのみならず、乾燥に強い湿潤環境を提供することを見出し、細胞を気相暴露して培養する装置及びそれを使用する培養方法を完成させた。すなわち、限定されるわけではないが、本発明は好ましくは以下の態様を含む。【００１０】
［１］  並行した２段以上の平面流路と、
前記平面流路に設置されたポリマー多孔質膜と、
前記各平面流路の一端に設置された培地供給手段と、
前記各平面流路の他端に配置された培地排出手段と、
最上段の平面流路の上部に配置されたヘッド槽と、
前記ヘッド槽から各平面流路に培養液を配分する培地配分手段と、
前記培地排出手段から排出された培養液を回収する培地回収手段と
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
ここで、前記培地供給手段から平面流路を通じて培地排出手段に連続的に培養液が流れることを特徴とする、細胞培養装置。
［２］  逆並行した２段以上の平面流路と、
前記平面流路に設置されたポリマー多孔質膜と、
前記各平面流路の一端に設置された培地供給手段と、
前記各平面流路の他端に配置された培地排出手段と、
最上段の平面流路の上部に配置されたヘッド槽と、
前記ヘッド槽から最上段の平面流路に培養液を配分する培地配分手段と、
最下段から排出された培養液を回収する培地回収手段と
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
ここで、前記培地供給手段から平面流路を通じて培地排出手段に連続的に培養液が流れ、さらに、前記培地排出手段から排出された培養液が次段の平面流路に設置された培地供給手段に注がれることを特徴とする、細胞培養装置。
［３］  前記平面流路が、水平面から０〜２０°傾斜している、［１］又は［２］に記載の細胞培養装置。
［４］  前記培地回収手段と一端部で連通した培地排出ラインと、
前記ヘッド槽と一端部で連通した培地供給ラインと
をさらに備え、
ここで、前記培地排出ラインの他端部が、前記培地供給ラインの他端部とポンプを介して連通されており、培養液が循環可能である、［１］〜［３］のいずれかにに記載の細胞培養液装置。
［５］  前記培地配分手段が、ミスト供給ノズルである、［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［６］  前記平面流路が、各々、薄層バッグ内部に設置されている、［１］〜［４］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［７］  前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれて、
ｉｉ）ロール状に巻き込まれて、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結されて、
ｉｖ）縄状に結ばれて、及び／又は
ｖ）２以上が積層されて、
前記平面流路に設置されている［１］〜［６］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［８］  前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜は、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものであって、
ここで、前記ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜が、前記平面流路に設置されている、［１］〜［７］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［９］  前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、［１］〜［８］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［１０］  前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［１］〜［９］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［１１］  前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１］〜［１０］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［１２］  前記ポリマー多孔質膜の平均膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［１１］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［１３］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［１４］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１３］に記載の細胞培養装置。
［１５］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１３］又は［１４］に記載の細胞培養装置。
［１６］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の細胞培養装置。
［１７］  ［１］〜［１６］のいずれかに記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、細胞培養担体としてポリマー多孔質膜を用いることにより、培養スペースや培地の量が少ない条件下でも、簡便かつ効率的な連続型細胞培養を可能とする。また、本発明のポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養装置と比較しても極めて少量の培地でも、細胞の生存及び増殖を達成することができる。また、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても培養が可能であるため、細胞に対して効率的な酸素供給を行うことができ、大量の細胞を培養することができる。【００１２】
本発明によれば、ポリマー多孔質膜を設置した平面流路（水平面に対して０〜１０°の傾斜を有する）で培養液を連続供給するシステムを、並行又は逆並行に繰り返し、ここに培養液を還流的に流すことで、小さな体積中に大量の細胞を安定的かつ長期間培養することができる。また、培養液を貯留する液溜（ヘッド槽）は、細胞と乖離されているため、例えば、ｐＨ調整やグルコース注加等の調整において、強撹拌や発泡等の細胞に対する忌避も使用可能となり、化学工学的側面での優位性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施形態におけるパラレル型細胞培養装置を示す図である。
【図２】図２は、パラレル型細胞培養装置の一態様を示す図である。
【図３】図３は、カスケード型細胞培養装置の一態様を示す図である。
【図４】図４は、ポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照しながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。
【００１５】
１．ポリマー多孔質膜
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１〜１５０μｍ、０．０１〜１００μｍ、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜１５μｍである。
【００１６】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、２０μｍ〜１００μｍである。
【００１７】
ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
【数１】
0006787402.tif 000002
（式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）
【００１８】
表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。
【００１９】
ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
【００２０】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。
【００２１】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
【００２２】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である
【００２３】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
【数２】
0006787402.tif 000003
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
【００２４】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
【００２５】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
【００２６】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である。
【００２７】
１−１．ポリイミド多孔質膜
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
【００２８】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
【００２９】
一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３０】
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
【００３１】
ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
【００３２】
ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
【００３３】
本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
【００３４】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
【００３５】
着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
【００３６】
炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。
【００３７】
また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３８】
着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
【００３９】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００４０】
これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
【００４１】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
【００４２】
これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
【００４３】
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
【００４４】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
【００４５】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
【００４６】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
【００４７】
例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１−２１９５８５号公報、又は特開２０１１−２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
【００４８】
１−２．ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
【００４９】
アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
【００５０】
二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
【００５１】
ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
【００５２】
ポリエーテルスルホンの対数粘度は、多孔質ポリエーテルスルホン膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
【００５３】
また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
【００５４】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
【００５５】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
【００５６】
本発明の細胞培養装置に用いられる、細胞培養担体としての上述のポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養担体を用いる細胞培養装置と比較して、極めて少量の培地でも細胞の生存及び増殖を達成することができる。また、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても培養が可能であるため、細胞に対して効率的な酸素供給を行うことができ、大量の細胞を培養することができる。
【００５７】
本発明によれば、用いる培地の量が極めて少なく、また、培養担体であるポリマー多孔質膜を気相に露出することができるため、細胞への酸素供給は拡散によって十分に行われる。したがって、本発明では特に酸素供給装置を必要としない。
【００５８】
２．細胞培養装置
本発明は、並行又は逆並行した２段以上の平面流路と、平面流路に設置されたポリマー多孔質膜と、平面流路の一端に設置された培地供給手段と、平面流路の他端に配置された培地排出手段と、最上段の平面流路の上部に配置されたヘッド槽と、ヘッド槽から平面流路に培養液を配分する培地配分手段と、培地排出手段から排出された培養液を回収する培地回収手段とを備えた細胞培養装置に関する。該細胞培養装置を構成する平面流路に設定されたポリマー多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有することを特徴とする。本発明の細胞培養装置は、平面流路の並べ方により、パラレル型細胞培養装置及びカスケード型細胞培養装置の態様を含むが、本明細書において、概して、これらの細胞培養装置を「本発明の細胞培養装置」とも呼ぶ。以下に本発明の細胞培養装置の実施態様について、図を示しながら説明する。
【００５９】
図１は、本発明のパラレル型細胞培養装置の典型例を示す図である。平面流路１１には、ポリマー多孔質膜１２が設定され、該平面流路１１は、培地排出手段１４を備える。一態様では、培地供給手段１３は、平面流路１１に備えられてもよく、又は培地配分手段１６に接続されていてもよい。平面流路１１は、水平に設置されてもよく、又は傾斜されてもよく、好ましくは水平面から０〜２０°、例えば、０〜１５°、５〜２０°、５〜１５°、１０〜１５°の範囲、又は０°、１°、２°、３°、４°、５°、６°、７°、８°、９°、１０°、１１°、１２°、１３°、１４°、１５°、１６°、１７°、１８°、１９°、２０°のいずれかであり得る。本明細書の細胞培養措置に使用される平面流路１１の段数は、培養装置の構造上、２段以上であれば限定されないが、好ましくは２〜３００段、より好ましくは２〜２００段、さらにより好ましくは２〜１００段であり、例えば、２段以上９０段、８０段、７０段、６０段、５０段、４０段、３０段、２０段、１０段、５段、４段、３段以下であってもよい。また、平面流路１１の位置及び大きさは、目的に応じて適宜設計を変更してもよい。なお、平面流路１１は、各々、その全体が薄相バック内部に設置されてもよい。
【００６０】
ヘッド槽１５に貯留された培養液は、培地配分手段１６を介して、培地供給手段１３から平面流路１１の全体に供給されるが、該培地配分手段１６は、ヘッド槽１５に接続された管であってもよく、又は図２に示されるような斜面板２０４であってもよい。また、ヘッド槽１５から培地配分手段１６を経由して、培地供給手段１３から平面流路１１全体に送り出される培養液の流量を調節するための調節部（図示せず）をヘッド槽１５、各培地配分手段１６、又は各培地供給手段１３に備えてもよい。培地供給手段１３から供給された培養液は、平面流路１１上に設置されたポリマー多孔質膜を浸し、培地排出手段１４に向かう。なお、上記の培地供給手段１３は、図示されないが、培養液を微小液滴の状態で供給可能なミスト供給ノズルであってもよい。本発明において、ミスト供給ノズルは、培地が液滴の状態で供給される手段であればよく、ノズルの数及び配置、並びに供給される液滴のサイズは限定されない。
【００６１】
培地排出手段１４から排出された培養液は、培養液を回収するための培地回収手段１７に直接滴下されて回収されてもよく、又は培地回収手段１７の底部に設置され、各培地排出手段１４に接するようにされた滴り棒１８（余液の戻り棒）を伝って培地回収手段１７に回収されてもよい。
【００６２】
一態様では、細胞培養装置は、培地回収手段１７の排出口１９で連通した培地排出ラインと、ヘッド槽１５の上部に配置された供給口２０で連通した培地供給ラインとをさらに備えてもよく、排出ラインの他端部は、培地供給ラインの他端部とポンプを介して連通されており、培養液が循環可能であってもよい。培養液を汲み上げるためのポンプの種類は、特に限定されないが、例えば流量を調節可能なペリスタポンプ等が使用可能である。また、培地供給ラインから供給された培養液がヘッド槽１５から溢れるのを防ぐために、ヘッド槽１５にオーバーフローライン２１を備えてもよい。
【００６３】
図２は、パラレル型細胞培養装置の一態様を示す概念図であるが、平面板２０１、培地供給板２０２、培地排出板２０３、及び斜面板２０４は、図１中の平面流路１１、培地供給手段１３、培地排出手段１４、及び培地配分手段１６に対応する。
【００６４】
図３は、本発明のカスケード型細胞培養装置の概念図である。このカスケード型細胞培養装置は、１つの平面板３０１に設置された培地排出板３０３から排出された培養液が次段の平面板３０１に設置された培地供給板３０２に注がれることを特徴とする。当業者であれば、パラレル型細胞培養装置を構成するポリマー多孔質膜、平面流路、ヘッド槽、培地回収手段、各種ライン、ポンプをカスケード型細胞培養装置に適宜使用可能であることを承認し得る。
【００６５】
本発明の実施形態で使用されるポリマー多孔質膜は、例えば、ｉ）折り畳んで、ｉｉ）ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、及び／又は、ｉｖ）縄状に結んで、平面流路上に適用されてもよい。また、本発明の実施形態で使用されるポリマー多孔質膜は、ｖ）２以上が積層されて、平面流路上に適用されてもよい。ｉ）〜ｖ）のように形状を加工することにより、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリマー多孔質膜を入れることができる。
【００６６】
本発明の実施態様で使用されるポリマー多孔質膜は、モジュール化されたポリマー多孔質膜（以下、「モジュール化ポリマー多孔質膜」という。）が使用されてもよい。本明細書において「モジュール化ポリマー多孔質膜」とは、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜をいう。
【００６７】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜が備えるケーシングは、２以上の細胞培地流出入口を有し、該細胞培地流出入口によって培地がケーシングの内外へ流出入する。該ケーシングの細胞培地流出入口の径は、ケーシングの内部へ細胞が流入可能であるように、前記細胞の径よりも大きいことが好ましい。また、細胞培地流出入口の径が、該細胞培地流出入口よりポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さいことが好ましい。ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい径は、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜の形状、大きさによって適宜選択可能である。例えば、ポリマー多孔質膜がひも状である場合、該ポリマー多孔質膜の短辺の幅より小さく、該ポリマー多孔質膜が流出しない適度の径であれば特に限定されない。該細胞培地流出入口の数は、細胞培地がケーシング内外へ供給及び／又は排出されやすいように、出来るだけ多く設けられていることが好ましい。好ましくは、５以上、好ましくは１０以上、好ましくは２０以上、好ましくは５０以上、好ましくは１００以上である。細胞培地流出入口は、ケーシングの一部又は全部が、メッシュ状の構造を有していてもよい。また、該ケーシング自体がメッシュ状であってもよい。本発明において、メッシュ形状の構造とは、例えば、縦、横、及び／又は斜めの格子状の構造を有するものであって、各目開きが、流体が通過出来る程度に細胞培地流出入口を形成するものであるが、これに限定されない。
【００６８】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜のケーシングは、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレートなどが挙げられるが、細胞の培養に影響を与えない素材であれば特に限定されない。
【００６９】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜は、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
該ケーシング内に収容されたものであって、該モジュール化ポリマー多孔質膜を平面流路へ適用することが可能である。
【００７０】
本明細書において、「ケーシング内に２以上の独立した該ポリマー多孔質膜が集約されて収容されている」とは、互いに独立した２以上のポリマー多孔性膜が、ケーシングで囲まれた一定空間内に集約されて収容されている状態を指す。本発明において、２以上の独立した該ポリマー多孔質膜は、該ポリマー多孔質膜の少なくとも１カ所と該ケーシング内の少なくとも１カ所とを任意の方法によって固定され、該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態に固定されたものであってもよい。また、２以上の独立したポリマー多孔質膜は、小片であってもよい。小片の形状は、例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形をとりうるが、好ましくは、正方形が好ましい。本発明において、小片の大きさは、任意の大きさをとりうるが、正方形である場合、長さは任意の長さでよいが、幅は、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは３０ｍｍ以下がよく、より好ましくは１０ｍｍ以下がよい。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止される。
【００７１】
本明細書において、「折り畳まれたポリマー多孔質膜」とは、該ケーシング内にて折り畳まれていることで、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔質膜である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、ポリマー多孔膜に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。
【００７２】
本明細書において、「ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜」とは、ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔性膜をいう。また、本発明おいて、縄状に編み込まれたポリマー多孔質膜とは、例えば短冊状の複数のポリマー多孔質膜を、任意の方法によって縄状に編み込み、ポリマー多孔質膜同士の摩擦力によって互いに動かない状態のポリマー多孔質膜をいう。（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が集約されたポリマー多孔質膜、（ｉｉ）折り畳まれたポリマー多孔質膜、（ｉｉｉ）ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜、及び（ｉｖ）縄状に結ばれたポリマー多孔質膜、が、組み合わせられてケーシング内に収容されていてもよい。
【００７３】
本明細書において、「該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態」とは、該モジュール化ポリマー多孔質膜を細胞培養培地中で培養する場合に、該ポリマー多孔質膜が継続的に形態変化しない状態になるようにケーシング内に収容されている状態をいう。換言すれば、該ポリマー多孔質膜自体が、流体によって、継続的に波打つ動きを行わないように抑制された状態である。ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態を保つため、ポリマー多孔質膜内で生育されている細胞にストレスが加えられることが防止され、細胞が死滅されることなく安定的に細胞が培養可能となる。
【００７４】
３．細胞培養装置を使用した細胞培養方法
【００７５】
＜細胞をポリマー多孔質膜へ適用する工程＞
本発明で使用される細胞のポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
【００７６】
（Ａ）細胞を前記ポリマー多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
（Ｂ）前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
（Ｃ）前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
【００７７】
（Ａ）の態様は、ポリマー多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリマー多孔質膜を細胞縣濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。
【００７８】
ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞はポリマー多孔質膜に接着する。ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。
【００７９】
（Ｂ）の態様において、ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せる。ポリマー多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませることにより、細胞縣濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリマー多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の細胞縣濁液が装填された箇所に細胞が吸い込まれて播種される。
【００８０】
あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリマー多孔質膜に細胞縣濁液を装填してもよい。この場合、細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。
【００８１】
例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリマー多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリマー多孔質膜の全体において、細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。
【００８２】
（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより細胞縣濁液中の細胞の濃度を濃縮する、細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。
【００８３】
（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。
【００８４】
限定されるわけではないが、好ましくは、ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。
【００８５】
態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。
【００８６】
【表１】
0006787402.tif 000004
【００８７】
さらに、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある接着性細胞をポリマー多孔質膜と縣濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の方法において、細胞をポリマー多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリマー多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリマー多孔質膜の性質から、細胞はポリマー多孔質膜に接着しうる。よって、生来浮遊培養に適さない細胞であっても、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、細胞は、ポリマー多孔質膜に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞がポリマー多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。
【００８８】
上述した細胞のポリマー多孔質膜への適用は、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）〜（Ｃ）のうち、２つ以上の方法を組み合わせてポリマー多孔質膜に細胞を適用してもよい。細胞を担持させたポリマー多孔質膜を、上述の細胞培養装置における、平面流路へ適用して、培養することが可能である。
【００８９】
その他、予め、ポリマー多孔質膜が設置された平面流路に、懸濁された細胞が含まれる培地を、細胞供給手段より滴下して播種してもよい。
【００９０】
本明細書において、「懸濁された細胞」とは、例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素によって、接着細胞を強制的に浮遊させて培地中に懸濁して得られた細胞や、公知の馴化工程によって、培地中に浮遊培養可能となった接着細胞などを含んでいる。
【００９１】
本発明に利用し得る細胞の種類は、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
【００９２】
本発明に利用しうる動物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。
【００９３】
本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第２００９／１２３３４９号（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
【００９４】
「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。
【００９５】
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
【００９６】
「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。
【００９７】
細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ−６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）、ＢＨＫ細胞（新生児ハムスター腎臓細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。
【００９８】
本明細書において、「接着細胞」とは、一般に、増殖のために適切な表面に自身を接着させる必要がある細胞であって、付着細胞又は足場依存性細胞ともいわれる。本発明のいくつかの実施形態では、使用する細胞は接着細胞である。本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、より好ましくは、培地中に懸濁した状態でも培養可能な細胞である。懸濁培養可能な接着細胞とは、公知の方法によって、接着細胞を懸濁培養に適した状態へ馴化させることによって得ることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などや、これらの細胞から派生して得られた細胞株が挙げられる。
【００９９】
ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図４に示す。図４は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の細胞の培養方法では、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の細胞の培養方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。例えば、ポリマー多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。
【０１００】
本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図４参照）。そして、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。
【０１０１】
本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
【０１０２】
つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。
【０１０３】
本発明の細胞の培養方法において、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、５．０×１０8個以上、１．０×１０9個以上、２．０×１０9個以上、または５．０×１０9個以上となるまで培養することをいう。
【０１０４】
なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数を、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、ＣＣＫ８を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ  Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１〜３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。
【０１０５】
また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０5個以上、２．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、または５．０×１０8個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。
【実施例】
【０１０６】
以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１０７】
以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は６μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４６μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７３％であった。【０１０８】
（実施例１）
パラレルフローリアクターによるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法（図１）
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．５×１０６になるまで培養を継続した。１０ｃｍ径シャーレ５枚に上記浮遊培養液を夫々１２ｍｌ注加した後、２．８ｃｍ×２ｃｍ角の長方形ポリイミド多孔質膜各６枚を各シャーレに浸漬させ、インキュベータ内で４時間放置した。４時間後のシャーレ内細胞数密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は、夫々、３．１×１０５、１．５×１０５、１．６×１０５、１．４×１０５、２．２×１０５になっており、夫々安定して、懸濁液より約９０％の細胞数が減少していた。図１に示すパラレルフローリアクターの各段に、シャーレ毎の６枚ずつの部材を乗せ、液溜めには、１５０ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分１０ｍｌの速度で循環させた。５日後に培地交換を行い、８日目に培養を終了した。細胞数の測定結果は表２に示す。酸素供給装置を使用しない簡便かつ小型の培養装置で高効率かつ高密度の細胞培養が実践された。【０１０９】
【表２】
0006787402.tif 000005
【０１１０】
（実施例２）
カスケードリアクターによるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法（図３）
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの細胞数が、６．０×１０５になるまで培養を継続した。１０ｃｍ径シャーレに上記浮遊培養液１２ｍｌを注加した後、１．８ｃｍ×２ｃｍ角の長方形ポリイミド多孔質膜２０枚を浸漬させ、インキュベータ内で終夜放置した。翌日のシャーレ内細胞数密度（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）は２．１×１０５になっており、約６５％の細胞数が減少していた。図３に示すカスケード型小型リアクターに、各段のシートが５枚ずつになる様にステージに乗せ、液溜めには、１５０ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分１０ｍｌの速度で循環させた。６日後に培地交換を行い、９日目にフィード培地（ＢａｌａｎＣＤ  Ｆｅｅｄ１）１０ｍｌと０．５規定水酸化ナトリウム水溶液１ｍｌを注加した。１２日目に培養を停止し、ＣＣＫ８を用いて、細胞数の測定を行なった。総細胞数は１．３×１０８個で、細胞密度は１平方センチメートル当り１．８×１０６個であった。
【符号の説明】
【０１１１】
１    パラレル型細胞培養装置（その１）
１１    平面流路
１２    ポリマー多孔質膜
１３    培地供給手段
１４    培地排出手段
１５    ヘッド槽
１６    培地配分手段
１７    培地回収手段
１８    滴り棒
１９    排出口
２０    供給口
２１    オーバーフローライン
２    パラレル型細胞培養装置（その２）
２０１    平面板
２０２    培地供給板
２０３    培地排出板
２０４    斜面板
３    カスケード型細胞培養装置
３０１    平面板
３０２    培地供給板
３０３    培地排出板
【図１】
0006787402.tif 000006
【図２】
0006787402.tif 000007
【図３】
0006787402.tif 000008
【図４】
0006787402.tif 000009