(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルツハイマー病（ＡＤ）またはパーキンソン病（ＰＤ）のバイオマーカーを同定する方法であって、
（ａ）ＡＤまたはＰＤについて陽性である哺乳動物から得られた第１の試料から、ヘパリン結合親和性を有する第１の分子を単離する工程；および
（ｂ）ＡＤまたはＰＤと診断された哺乳動物に特徴的である別のバイオマーカーに対して、ＡＤまたはＰＤのバイオマーカーとして第１の分子を検証する工程
を含み、
前記第１の分子をバイオマーカーとして検証する工程が、
Ｉ．ＡＤまたはＰＤについて陽性である哺乳動物から得られた第１の試料において、ヘパリン結合親和性を有する第１の分子のレベルを同定する工程；
ＩＩ．第１の試料中に存在するＡＤまたはＰＤと診断された哺乳動物に特徴的である前記別のバイオマーカーのレベルを同定する工程；
ＩＩＩ．工程（Ｉ）で同定された第１の分子のレベルと、工程（ＩＩ）で同定された前記別のバイオマーカーのレベルとを比較して、第１の分子のレベルと、工程（ＩＩ）で同定された前記別のバイオマーカーのレベルとの統計的に有意な関係を同定する工程；
ＩＶ．対照から得られた第２の試料において工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を繰り返して、第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されるかどうかを決定する工程；
Ｖ．第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されない場合、第１の分子がＡＤまたはＰＤのバイオマーカーであると結論付ける工程
を含む、方法。
【請求項２】
（ａ）第１の試料から、第１の分子のアイソフォームであるヘパリン結合親和性を有する第２の分子を単離および第２の分子のレベルを同定する工程、
（ｂ）第１および第２の分子のレベルの間の比を作成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で作成された比と、第１の試料中に存在するＡＤまたはＰＤと診断された哺乳動物に特徴的である別のバイオマーカーのレベルとを比較して、工程（ｂ）の比と前記別のバイオマーカーのレベルとの統計的に有意な関係を同定する工程、
（ｄ）対照から得られた第２の試料において工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返して、第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されるかどうかを決定する工程、
（ｅ）第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されない場合、前記比がＡＤまたはＰＤのバイオマーカーであると結論付ける工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＤまたはＰＤと診断された哺乳動物に特徴的である前記別のバイオマーカーが、新皮質アミロイドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＤまたはＰＤと診断された哺乳動物に特徴的である前記別のバイオマーカーが脳において検出されるアミロイドベータの存在を特異的に認識する放射性トレーサーのレベルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
放射性トレーサーがピッツバーグ化合物Ｂ（ＰｉＢ）、フロルピラミンＦ−１８、Ｆｌｏｒｂｅｔａｂｅｎ、Ｆｌｏｒｂｅｔａｐｉｒ、ＦｌｕｔｅｍａｔａｍｏｌおよびＮＡＶ４６９４を含む群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記別のバイオマーカーがＰｉＢ−ＰＥＴ  ＳＵＶＲスコアである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＡＤまたはＰＤの診断、示差的診断および／または予後診断のためのバイオマーカーであって、バイオマーカーが、ＡＤのための、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、ＡｐｏＪ、またはＰＤのための、アルファ−１−ミクログロブリンの、アイソフォームからなる群から選択される、バイオマーカー。
【請求項８】
アイソフォームが、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、またはＡｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩからなる群から選択される、請求項７に記載のバイオマーカー。
【請求項９】
アイソフォームが、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、またはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢまたはＪ、ＡｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥまたはＧからなる群から選択される、請求項７または８に記載のバイオマーカー。
【請求項１０】
アイソフォームが、
分子がＡＴＩＩＩである場合、比が少なくともアイソフォームＡ、Ｂ、ＣとＪの間で作成されるか；または
分子がＳＡＰである場合、比がアイソフォームＦとＪの間で作成されるか；
分子がＡｐｏＪである場合、比がアイソフォームＡ、ＢとＤの間で作成されるか；または
分子がアルファ−１−ミクログロブリンである場合、比がアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥまたはＧの間で作成される
ように選択される、請求項７〜９のいずれか一項に記載のバイオマーカー。
【請求項１１】
分子がＡＴＩＩＩであり、比がＡ／Ｊ、Ｂ／ＪもしくはＣ／Ｊの間で作成される、請求項１０に記載のバイオマーカー。
【請求項１２】
ＡＤまたはＰＤを発症するリスクがある患者を決定するための方法であって、
（ａ）患者から得られた第１の試料において請求項７〜１１のいずれか一項に記載のバイオマーカーのレベルを決定する工程；および
（ｂ）バイオマーカーのレベルが、ＡＤまたはＰＤを発症するリスクを有さない患者から得られた対照試料におけるバイオマーカーのレベルと比較して有意に異なるとき、またはバイオマーカーのレベルが、ＡＤまたはＰＤを発症するリスクを有する患者から得られた対照試料におけるバイオマーカーのレベルと比較して有意に異ならないとき、患者をＡＤまたはＰＤを発症するリスクがある患者であると決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項１３】
ＡＤまたはＰＤを発症するリスクがある患者を決定するための方法であって、
（ａ）患者から得られた試料から、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法に従って検証されたバイオマーカーのアイソフォームを単離および同定する工程；
（ｂ）工程（ａ）に由来するアイソフォームのレベルを決定する工程；
（ｃ）工程（ａ）で同定されたバイオマーカーのアイソフォームのレベル間の比を作成する工程；
（ｄ）工程（ｃ）で作成された比と参照比との統計的に有意な関係があるとき、患者をＡＤまたはＰＤを発症するリスクがある患者であると決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項１４】
ＡＤまたはＰＤを発症するリスクがある患者を決定するための方法であって、
（ａ）ヘパリン結合親和性を有する第１および第２のバイオマーカーのレベルを、患者から得られた第１の試料から単離および同定する工程であり、第１および第２のバイオマーカーはアイソフォームであり、第１および第２のバイオマーカーは請求項１〜６のいずれか一項に記載のＡＤまたはＰＤのためのバイオマーカーとして検証される、工程；
（ｂ）第１および第２のバイオマーカーのレベルの間の比を作成して、作成比を提供する工程；
（ｃ）対照から得られた第２の試料において工程（ａ）〜（ｂ）を繰り返して、参照比を提供する工程；
（ｄ）第１の試料において同定された作成比と、第２の試料において同定された参照比とを比較する工程；
（ｅ）作成比と参照比との差異があるとき、患者をＡＤまたはＰＤを発症するリスクがある患者であると決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項１５】
哺乳動物におけるＡＤまたはＰＤの進行を決定するための方法であって、
（ａ）ＡＤまたはＰＤについて以前に評価された哺乳動物から得られたさらなる試料において、哺乳動物において以前に評価された請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって確認されたヘパリン結合親和性を有する少なくとも２つのバイオマーカーのアイソフォームのレベルを定量化する工程；
（ｂ）工程（ａ）における少なくとも２つのバイオマーカーのアイソフォームのレベル間の比を作成して、作成比を提供する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の作成比と、参照比とを比較する工程であり、参照比は、少なくとも１つの対照哺乳動物から得られた試料において工程（ａ）および（ｂ）の同じバイオマーカーのアイソフォームのレベルを定量化した後に作成され、少なくとも１つの対照哺乳動物は、ＡＤまたはＰＤについて陽性または陰性であってもよい、工程；および
（ｄ）工程（ｂ）の作成比が、ＡＤまたはＰＤについて以前に作成された哺乳動物の比から少なくとも１つの対照哺乳動物についてＡＤまたはＰＤに特徴的であると以前に定義された範囲の参照比に変化するとき、ＡＤまたはＰＤの進行を決定する工程
を含む、前記方法。
【請求項１６】
参照比が、より早い期間から哺乳動物から得られた試料において工程（ａ）の同じバイオマーカーのアイソフォームのレベルを定量化した後に作成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＤまたはＰＤを発症するリスクがある哺乳動物を階層化または同定するための方法であって、
（ａ）哺乳動物から得られた試料において、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって確認されたヘパリン結合親和性を有する少なくとも２つのバイオマーカーのアイソフォームのレベルを定量化する工程；
（ｂ）工程（ａ）における少なくとも２つのバイオマーカーのアイソフォームのレベルの間の比を作成して、作成比を提供する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の作成比と、参照比とを比較する工程であり、参照比は、少なくとも１つの対照哺乳動物から得られた試料において工程（ａ）の同じバイオマーカーのアイソフォームのレベルを定量化した後に作成され、少なくとも１つの対照哺乳動物は、ＡＤまたはＰＤについて陽性または陰性であってもよい、工程；
（ｄ）工程（ｂ）の作成比と少なくとも１つの対照哺乳動物についてＡＤまたはＰＤに特徴的であると以前に定義された範囲の参照比との間で統計的に有意な関係があるとき、哺乳動物においてＡＤまたはＰＤ状態の重症度が高いと決定する工程；ならびに
（ｅ）工程（ｄ）の結論に基づいて、哺乳動物においてＡＤまたはＰＤの重症度に基づいて異なるクラスのＡＤまたはＰＤに哺乳動物を選別する工程
を含む、前記方法。
【請求項１８】
バイオマーカーが、ＡＤについて、ＡＴＩＩＩ、ＳＡＰ、ＡｐｏＪ、もしくはそれらのアイソフォームからなる群から選択される、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
バイオマーカーが、ＰＤについて、アルファ−１−ミクログロブリンもしくはそのアイソフォームである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
アイソフォームが、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ＡｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、またはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩからなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
アイソフォームが、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、もしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢもしくはＪ、ＡｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥもしくはＧからなる群から選択される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
アイソフォームが、
分子がＡＴＩＩＩである場合、比が少なくともアイソフォームＡ、Ｂ、ＣとＪの間で作成されるか；または
分子がＳＡＰである場合、比がアイソフォームＦとＪの間で作成されるか；または
分子がＡｐｏＪである場合、比がアイソフォームＡ、ＢとＤの間で作成されるか；
分子がアルファ−１−ミクログロブリンである場合、比がアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥまたはＧの間で作成される
ように選択される、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
分子がＡＴＩＩＩであり、比がアイソフォームＡ／Ｊ、Ｂ／ＪもしくはＣ／Ｊの間で作成される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１２〜２３のいずれか一項に記載の方法において使用されるときの、患者におけるＡＤまたはＰＤをインビトロで診断するためのキットであって、
（ａ）患者試料から、ヘパリン結合親和性を有する分子を単離するための第１の試薬のパネル；
（ｂ）ＡＤのためのＡＴＩＩＩ、ＳＡＰ、ＡｐｏＪ、またはＰＤのためのアルファ−１−ミクログロブリンの、アイソフォームからなる群から選択される、バイオマーカーのレベルを決定するための、第２の試薬のパネル
を含む前記キット。
【請求項２５】
第１の試薬のパネルがヘパリンセファロースカラムである、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
第２の試薬のパネルが、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ＡｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、もしくはＧ、またはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩからなる群から選択されるアイソフォームのレベルを定量化するための試薬を含む、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカーの発見に関する。特に、本発明は、神経疾患の同定のためのバイオマーカーを提供する。より特には、本発明は、神経疾患のバイオマーカーを同定する方法ならびに神経疾患の診断、示差的診断および／または予後診断のためのバイオマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経疾患の発症および進行は、社会に対して大きな感情的および財政的負担をかける。
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、西洋において６２５人に約１人が罹患する一般的な神経変性疾患である。この数字は、８０歳を超える集団では４％に上昇する。高齢者集団に関しては、ＰＤの管理は、神経学者および一般医にとって、医療業務のますます重要で能力が試される側面である可能性がある。
【０００４】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、オーストラリアにおいては全ての認知症のうちの最も一般的なものであり、死因の第３位である。アルツハイマー病の財政的コストは、オーストラリアにおいては年に４０億ドルを超えると見積もられるが、世界では認知症のコストは６０００億ドルを超えると見積もられている。
【０００５】
ＰＤなどの他の神経疾患と同様、アルツハイマー病はゆっくりと進行し、症状が現れるのに何年もかかることがあるため、この疾患の臨床診断は難しいプロセスである。従って、アルツハイマー病の臨床診断は、通常、記憶および認知機能が患者の日常生活に影響する点まで低下した後の疾患の比較的後期に行われる。
【０００６】
アルツハイマー病のための唯一の確定診断は、剖検時の組織学的検査によるものである。
【０００７】
死後の診断は別として、現在利用できる分子的診断アプローチはたったの２つである。第１に、ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）は、脳におけるアミロイド斑に結合するマーカーをイメージングするために用いられ、第２はＡβ、全Ｔａｕおよびリン酸化Ｔａｕタンパク質の測定を含む、脳脊髄液（ＣＳＦ）の評価である。しかしながら、ＰＥＴおよびＣＳＦは、幅広い臨床業務における使用にとって実行可能ではないと考えられる。
【０００８】
ＡＤをイメージングするために、アミロイド沈着物に対する高い親和性および血液脳関門を通過する高い浸透性を示すアミロイドイメージング剤および放射性トレーサーとして、チオフラビンＴの一連の非荷電誘導体が開発されてきた。チオフラビンによって示されるこれらのアミロイドイメージング剤の広範囲に及ぶインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）試験により、それらがポジトロン放射断層撮影試験中に検出可能なものに典型的な濃度でアミロイド沈着物に特異的に結合することが示唆される。
【０００９】
最良に検証されたこれらのアミロイドイメージング剤は、アミロイド結合色素チオフラビンＴのアナログである、ピッツバーグ化合物Ｂ（ＰｉＢ）である。アルツハイマー病におけるＰｉＢ−ポジトロン放射断層撮影（ＰｉＢ−ＰＥＴ）試験により、ＰｉＢのアミロイド斑との強固な皮質結合が示された。これは、おそらく究極の判断基準と考えられる、有望な早く、かつ正確な検出マーカーを提供する。近年、Ａｖｉｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）により製造されるＡＶ−４５（フロルピラミンＦ−１８）（別にＦ−１８  ＡＶ−４５としても知られる）、Ｆｌｏｕｂｅｔａｂｅｎ、Ｆｌｏｒｂｅｔａｐｉｒ、ＦｌｕｔｅｍａｔａｍｏｌおよびＮＡＶ４６９４などの他の化合物が、アミロイドベータを標的とするＰｉＢの類似する機能性に基づいて調査されている。
【００１０】
ＰｉＢ放射性トレーサーシグナルまたはアウトプットを、アミロイドベータのレベルと相関させたいくつかの研究があり、これはＰｉＢ陽性およびＰｉＢ陰性の用語をもたらした。典型的には、ＰｉＢアウトプット、またはトレーサーの取込みの正規化により、対象間および対象内比較を行うことができる。臨床業務においては、放射性用量および患者の質量または体積［別に標準摂取率（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｖａｌｕｅ）（ＳＵＶ）としても知られる］に関する正規化が実施される。この正規化はまた、標準摂取率比（ＳＵＶＲ）を提供するための（通常は）罹患していない小脳に関する標準化も含む。これは、高い新皮質量（ＰｉＢ陽性）のものと、低い量（ＰｉＢ陰性）のものとを識別するための閾値の決定をもたらした。
【００１１】
アルツハイマー病のための診断試験として、ピッツバーグ化合物Ｂ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ−Ｂ）ポジトロン放射断層撮影（ＰｉＢ−ＰＥＴ）イメージングの使用は、高い特異度を提供する。しかしながら、約２０分の１１Ｃ−ＰｉＢの半減期のため、各患者は、新しく合成された化合物を必要とし、このイメージング技術の使用をサイクロトロンなどの、包括的放射化学基盤を装備した設備に限定する。１１Ｃの短い半減期は、１８Ｆを用いて合成されるフッ素化化合物の組込みによって一部対処することができる。しかしながら、置き換えるための長寿命の放射性リガンドの欠如およびＰｉＢ−ＰＥＴイメージングに関する患者あたりの高いコスト（一人当たり２０００〜３０００ドル）により、一般医にとってＰｉＢ−ＰＥＴの臨床的利用性は限られている。
【００１２】
脳脊髄液（ＣＳＦ）中のバイオマーカーは、イメージングによる診断が実施されたいくつかの神経疾患の確認評価を提供することがわかっている。従って、アルツハイマー病などの神経疾患のためのバイオマーカーの研究は、一般に、脳脊髄液（ＣＳＦ）に着目してきた。実際、超リン酸化ｔａｕおよびアミロイドベータ１−４２（Ａβ１−４２）のＣＳＦレベルは、ＭＣＩからアルツハイマー病への転換を予測することが示されている。
【００１３】
ＣＳＦを用いる欠点は、それが試料を取得するために侵襲的な腰椎穿刺を必要とすることである。煩わしいことに加えて、ＣＳＦの取得は患者にとって多くの有害な転帰をもたらす可能性がある。これらの制限を考慮すれば、多数の個体から反復的にＣＳＦを取得することは非常に困難である。
【００１４】
従って、アルツハイマー病などの神経疾患またはパーキンソン病などの他の神経疾患の早く、かつ経済的な実現可能な予後診断および／または診断を提供することができる改良されたシステムが必要である。
【００１５】
そのようなシステムは、検出可能な臨床指標の描写の前に初期段階の予後診断および／または診断を達成する際に臨床医への支援を提供することができる。さらに、臨床試験を受けているアルツハイマー病およびパーキンソン病に関する疾患修飾療法（ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｙ）に関して、リスクのある個体において初期段階で疾患の特徴を検出することができるバイオマーカーを同定する社会的および経済的な義務があり、従って、抗アルツハイマー病療法または抗パーキンソン病療法を、疾患の負担が軽度であり、それが機能的および不可逆的な認知欠損を防止するか、または遅延させることができる時に投与することができる。
【００１６】
文献、活動、材料、デバイス、論文などの考察は、単に本発明に関する文脈を提供する目的で本明細書に含まれる。これらの事柄のいずれか、または全部は、本出願の各請求項の優先日の前に存在したという理由で先行技術の基礎の一部を形成したか、または本発明と関連する分野における共通一般知識であったと示唆または指摘されるものではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
神経疾患のためのバイオマーカー、特に、好ましくは臨床症状が生じる前に疾患の開始を示すバイオマーカーを同定する方法が必要である。神経疾患の早期同定は、早期介入によって疾患進行を遅延させるのに役立ち得る。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
従って、本発明のある態様において、
（ａ）神経疾患について陽性である第１の試料から、ヘパリン結合親和性を有する第１の分子を単離すること；および
（ｂ）単離された分子を、神経疾患のバイオマーカーとして検証すること
を含む、神経疾患のバイオマーカーを同定する方法が提供される。
【００１９】
本発明は、ヘパリン結合親和性を有する分子の単離および同定ならびに神経疾患のバイオマーカーとしてのこれらの分子の検証に関する。ヘパリン結合親和性を有する分子の単離は、必要であり、バイオマーカー検証を阻害する高い存在量の分子の影響を低下させる。ヘパリン結合親和性を有する分子のサブセットが神経疾患の検証されたバイオマーカーとの高い相関を示し、ＰｉＢ／ＰＥＴなどの神経疾患の良好に確立された予測因子との高い相関をさらに示すことが、本発明者らによって現在見出されている。
【００２０】
従って、本発明の方法を実施する際に、バイオマーカーとしてのヘパリン結合親和性を有する単離された分子の検証は、
（ａ）神経疾患について陽性である第１の試料中のヘパリン結合親和性を有する第１の単離された分子のレベルを同定する工程；
（ｂ）第１の試料中に存在する神経疾患と診断された哺乳動物に特徴的であると以前に定義された別のバイオマーカーのレベルを同定する工程；
（ｃ）工程（ａ）で同定された単離された分子のレベルと、工程（ｂ）で同定された他のバイオマーカーのレベルとを比較して、単離された分子のレベルと、他のバイオマーカーのレベルとの統計的に有意な関係を同定する工程；
（ｄ）対照から得られた第２の試料において工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返して、第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されるかどうかを決定する工程；
（ｅ）第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されない場合、ヘパリン結合親和性を有する第１の単離された分子が神経疾患のバイオマーカーであると結論付ける工程
をさらに含む。
【００２１】
本特許請求される方法は、ヘパリン結合親和性を有する単離された分子のレベルと、神経疾患に特徴的であると以前に定義された別のバイオマーカーのレベルとの間の関係を同定することを求めるものである。本特許請求される方法を実施する際に、単離された分子のレベルと、神経疾患に特徴的であると以前に定義された別のバイオマーカーのレベルとを比較することにより、ある関係が同定される。関係の同定は、単離された分子のレベルもまた神経疾患のバイオマーカーであってもよいことを示す。対照試料に対して比較した場合、これをさらに確認することができる。
【００２２】
本特許請求される方法を実施する際に、同定された任意の関係を、対照試料において同じ分析を実施することによってそれが神経疾患を示すか、または神経疾患にとって独特であるかどうかを決定するために評価する必要がある。従って、単離された分子とバイオマーカーのレベルを対照試料において同定し、そのレベルを比較して、関係が対照試料において同定されるかどうかを決定する。関係が対照試料において同定されない場合、これは、単離された分子が神経疾患のバイオマーカーである可能性があることを示す。
【００２３】
従って、別の実施形態においては、本特許請求される方法は、
（ａ）第１の試料から、第１の単離された分子と関連する、ヘパリン結合親和性を有する第２の分子のレベルを単離および同定する工程、
（ｂ）第１および第２の単離された分子のレベルの間の比を作成する工程、
（ｃ）工程ｂ）で作成された比と、第１の試料中に存在する神経疾患と診断された哺乳動物に特徴的であると以前に定義された別のバイオマーカーのレベルとを比較して、工程ｂ）の比と、他のバイオマーカーのレベルとの統計的に有意な関係を同定する工程、
（ｄ）対照から得られた第２の試料において工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返して、第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されるかどうかを決定する工程、
（ｅ）第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されない場合、前記比が神経疾患のバイオマーカーであると結論付ける工程
をさらに含む。
【００２４】
好ましくは、神経疾患の決定のための関連する形態のバイオマーカーは、一例においては、複数のアイソフォームで存在するタンパク質であってよい。従って、分子（例えば、第１および第２の）は、アイソフォームとして関連するのが好ましい。
【００２５】
本発明の別の態様においては、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レヴィ小体認知症（ＤＬＢ）、多発脳梗塞性認知症（ＭＩＤ）、血管性認知症（ＶＤ）、統合失調症および／または抑鬱症を含む群から選択される神経疾患の診断、示差的診断および予後診断を可能とする、神経疾患のためのバイオマーカーが提供される。
【００２６】
最も好ましくは、ＡＤのためのバイオマーカーは、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖またはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択される。最も好ましくは、ＡＤのためのバイオマーカーは、抗トロンビンＩＩＩまたはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームである。好ましくは、アイソフォームはＡＴＩＩＩのＢまたはＪである。
【００２７】
最も好ましくは、ＰＤのためのバイオマーカーは、アルファ−１−ミクログロブリン［アルファ−１−ミクログロブリン／ビクニン前駆体（ＡＭＢＰ）のアミノ酸２０〜２０３］またはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームである。好ましくは、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームは、ＥおよびＧである。
【００２８】
本発明の別の態様においては、
（ａ）患者から第１の試料を取得する工程；
（ｂ）第１の試料から、ヘパリン結合親和性を有する分子を単離および同定する工程であり、前記分子は、本明細書に記載の神経疾患のためのバイオマーカーとして検証される、工程；
（ｃ）工程ｂ）で同定された分子のレベルに基づいて、患者が神経疾患を有すると診断される、示差的に診断される、および／または予後診断されるかどうかを決定する工程
を含む、患者における神経疾患の診断、示差的診断および／または予後診断のための方法が提供される。
【００２９】
別の態様においては、
（ａ）患者から試料を取得する工程；
（ｂ）試料から、本明細書に記載の方法に従って検証された少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーを単離および同定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）に由来するバイオマーカーのレベルを決定する工程；
（ｄ）工程（ｂ）で同定された２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルの間の比を作成する工程；
（ｅ）哺乳動物が、参照比と比較した比の値に基づいて神経疾患を有すると診断される、示差的に診断される、および／または予後診断されるかどうかを、工程（ｄ）で作成された比から結論付ける工程
を含む、患者における神経疾患の診断、示差的診断および／または予後診断のための方法が提供される。
【００３０】
従って、本発明はさらに、本明細書に記載されるように同定された、哺乳動物が神経起源の疾患を有するか、もしくはそれを発症する可能性があるかどうかを決定するため、または認知機能低下について哺乳動物を評価するために用いることができる、バイオマーカーならびにその天然の誘導体およびアイソフォームの使用に関する。
【００３１】
本発明に関連があると考えられる神経疾患は、特に限定されるものではないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レヴィ小体認知症（ＤＬＢ）、多発脳梗塞性認知症（ＭＩＤ）、血管性認知症（ＶＤ）および／または抑鬱症を含むものである。本発明の方法の使用により診断される、示差的に診断される、および／または予後診断され得る好ましい疾患は、ＡＤまたはＰＤである。
【００３２】
本発明のさらに好ましい実施形態においては、本方法は、
（ａ）患者から第１の試料を取得する工程；
（ｂ）第１の試料から、ヘパリン結合親和性を有する第１および第２のバイオマーカーのレベルを単離および同定する工程であり、第１および第２のバイオマーカーは関連しており、第１および第２のバイオマーカーは本明細書に記載される神経疾患のためのバイオマーカーとして検証される、工程；
（ｃ）第１および第２のバイオマーカーのレベルの比を作成して、作成比を提供する工程；
（ｄ）対照から得られた第２の試料において工程（ｂ）〜（ｃ）を繰り返して、参照比を提供する工程；
（ｅ）第１の試料において同定された作成比と、第２の試料において同定された参照比とを比較する工程；
（ｆ）作成比と参照比との差異に基づいて神経疾患の状態を結論付ける工程
をさらに含む。
【００３３】
本発明の方法において、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリンまたはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームなどの１つまたは複数の神経疾患と関連する少なくとも２つのバイオマーカーを、哺乳動物の神経疾患状態を指摘するための比の作成において定量する。
【００３４】
本発明のさらなる態様においては、哺乳動物における神経疾患の進行をモニタリングするための方法；神経疾患を発症するリスクのある哺乳動物を階層化もしくは同定するための方法；ならびに神経疾患と関連するバイオマーカーと相互作用する、および／またはその発現もしくは活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングするための方法が提供される。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、哺乳動物における、１つもしくは複数の神経疾患の診断および／もしくは予後診断のため、または１つもしくは複数の神経疾患を発症するリスクのある哺乳動物を同定するために用いることができるキットを提供する。
【００３６】
本発明の他の態様は、本発明の特定の実施形態の以下の説明を再検討すれば当業者には明らかとなるであろう。
【００３７】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書において（特許請求の範囲を含む）用いられる場合、それらは記述された特徴、整数、工程または構成要素の存在を特定するものであり、１つまたは複数の他の特徴、整数、工程もしくは構成要素、またはその群の存在を除外するのではないと解釈されるべきである。
【００３８】
本発明の態様および利点のさらなる理解のために、添付の図面と共に、以下の詳細な説明を参照するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本出願を通じて用いられる暫定的な命名法と共にタンパク質分析物の２Ｄゲル分析を示す。抗トロンビンＩＩＩは、強調された抗トロンビンＩＩＩシリーズ（Ａ−ＡＨ）における全ての変異体を指すために「ＡＴ」と省略され、抗トロンビンＩＩＩおよび他のタンパク質に由来する全ての可能な変異体を含む。「ＡｐｏＪ」とは、関連する、強調され、同定されていないタンパク質変異体Ａ〜Ｇを指す。「ＳＡＰ」とは、関連する、強調された血清アミロイドタンパク質変異体Ａ〜Ｋを指す。
【図２】図２は、２−ＤＧＥ試験を示す。臨床分類−抗トロンビンＩＩＩアイソフォームＡとＪとの平均比の比較は、ＡＤと対照との高い有意差を示す。抗トロンビンＩＩＩの最も塩基性のアイソフォームＡとアイソフォームＪとの比は、認知的に正常な個体と比較して軽度の認知機能障害およびアルツハイマー病と臨床的に診断された患者において有意に上昇している（Ａｎｏｖａ  Ｔｕｋｅｙポストホック、平均±ｓｔｄｅｖ）。
【図３】図３は、ＰｉＢ−ＳＵＶＲ−ＡＴＩＩＩＡ／Ｊ比血漿（ｔ検定、平均±ｓｔｄｅｖ）による分類を示す。ＡＩＢＬ試験（Ａ）に含まれる７３の対象の脳における、ピッツバーグ化合物Ｂ（ＰｉＢ）ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）に関する抗トロンビンＩＩＩアイソフォームと標準摂取率比（ＳＵＶＲ）との相関。
【図４】ＭＡＲＳ１４枯渇後の６つのＲＰサブ画分からの代表的なゲル画像。矢印はＡＤプールにおけるタンパク質変化を示す。
【図５】整列されていないＦ２多重ゲルの偽色画像オーバーレイ。Ｈｐｔの３つの鎖を右上の画像において卵形で示す。
【図６】Ａ．低ＡｐｏＥ４含有プールおよびＢ．高ＡｐｏＥα４含有プールを代表する多重ゲル画像からの詳細。±１ＡＣＴアイソフォームは３４ｋＤａのＡｐｏＥα４プロキシスポットと相関し、これらの画像の右手下側角に示される。回帰分析相関：ａ−ｐ＝０．０１２、Ｒ２＝０．４５；ｂ−ｐ＝０．００２、Ｒ２＝０．６１；ｃ−ｐ＝０．００３、Ｒ２＝０．５６；ｄ−ｐ＝０．００２、Ｒ２＝０．６１；ｅ−ｐ＝０．００７、Ｒ２＝０．５１；ｆ−ｐ＝０．００３、Ｒ２＝０．５８。±１ＡＣＴスポットはいずれも、プールされた実験においてＨＣからＡＤを有意に識別しなかった。対照プールからＡＤを有意に識別した±１ＡＴスポット（３．３倍、ｐ＜０．０２）を、下側の画像に示す。
【図７】右側の表に性特異的変化と共に示される無傷の、および切断されたＶＤＢＰ。Ａ．無傷（上のスポットトレイン）および切断されたＶＤＢＰ（Ａ、Ｂ、Ｃ）。無傷のＶＤＢＰスポットを飽和させ、早熟分析からマスクした。Ｂ．切断されたＶＤＢＰ（Ａ〜Ｍ）。Ｃ．切断されたＶＤＢＰ（Ａ〜Ｅ）。
【図８】ＡＤバイオマーカー（ＡＴＩＩＩ、ＡｐｏＪおよびＳＡＰ）はＰＤ血漿において上昇しない。
【図９】ＡｐｏＪはＡβと相関する。
【図１０】アルファ−１−ミクログロブリン（ＡＭＢＰ）のレベルは、パーキンソン病血漿において上昇する。対照（ｎ＝３７）試料とＰＤ（ｎ＝４４）試料との間のＡＭＢＰのレベル（左上の平均、ＳＴＤＥＶ）は、ＰＤ血漿において有意に上昇する（ｐ＜０．０００１）。破線は、個体がＰＤを有すると考えられるカットオフ値を示す。ＡＭＢＰレベルのＲＯＣ分析を、右上に示す。下の図面は、ＡＭＢＰレベルと、臨床統合パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）との相関である。統計分析を、Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０ｆを用いて行った。用いた統計的検定は、ｔ検定であった。０．０５より大きいｐ値を、有意と考えた。アイソフォームＥの強度を、この図面に示す。同様の結果がＡＭＢＰのアイソフォームＧについて得られる。
【図１１】ＡＭＢＰの２Ｄスポットマップ。
【図１２】ＰＤと対照との比１９３／１６６（Ｇ／Ｅ）の比較。破線は、検定の８０％特異度を表し、カットオフ値での個体は５．０のオッズ比を有する（ｎ＝３１対照ｎ＝５１ＰＤ）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
表の説明
表１は、ＡＤバイオマーカーのＲＯＣ分析の概要を示す。
表２は、ＡＤと対照、対照とＣＲＰアイソフォームとの間の変化に関する試験対象患者基準を満たす少なくとも１つのアイソフォームを有していたタンパク質を示す。ハプトグロビンを、非還元複合体の分取ゲルから同定した。ＮＳ−有意でない。
表３は、質量分析を用いて発見された脳アミロイドのためのバイオマーカーを示す。
【００４１】
本発明は、哺乳動物から得られた試料から、ヘパリン結合親和性を有する分子を単離することにより、認知機能低下を予測する神経疾患の診断、示差的診断および／または予後診断のためのバイオマーカーを同定する方法を提供する。これらのバイオマーカーは、アミロイド量と関連し、これと相関する。本発明において同定されるバイオマーカーを用いて、脳中のアミロイドを診断するか、または脳中のアミロイドレベルの変化を検出することができる。一度同定されたら、そのマーカーを、脳中のアミロイドに関する高効率診断または予後診断試験において用いることができる。
【００４２】
従って、本発明の態様においては、神経疾患のバイオマーカーを同定する方法であって、
（ａ）神経疾患について陽性である第１の試料から、ヘパリン結合親和性を有する第１の分子を単離すること；および
（ｂ）単離された分子を、神経疾患のバイオマーカーとして検証すること
を含む、方法が提供される。
【００４３】
本発明は、ヘパリン結合親和性を有する分子の単離および同定ならびに神経疾患のバイオマーカーとしてのこれらの分子の検証に関する。ヘパリン結合親和性を有する分子の単離は、必要であり、バイオマーカー検証を阻害する高存在量の分子の影響を低下させる。ヘパリン結合親和性を有する分子のサブセットが神経疾患の検証されたバイオマーカーとの高い相関を示し、ＰｉＢ／ＰＥＴなどの神経疾患の良好に確立された予測因子との高い相関をさらに示すことが、本発明者らによって現在見出されている。
【００４４】
当業者によって理解されるように、バイオマーカーは、特定の哺乳動物、または患者、または対象または個体の生物学的状態の指示因子として見なされる。「哺乳動物」、「患者」、「対象」または「個体」などの用語はまた、文脈において、本発明において互換的に用いることができる用語でもあると考えられる。さらに、用語「個体」および「対象」は、バイオマーカーの存在について検査または分析され、神経疾患の状態の決定において評価される同じ試験対象を指すように互換的に用いることができると考えられる。
【００４５】
さらに、バイオマーカーは、個々の分子である必要はない。バイオマーカーは単一の分子であってもよいが、それは複数の分子であってもよい。バイオマーカーを複数の分子と考える場合、バイオマーカーは分子間の関係の表示と関連してもよい。例えば、関係は比であってもよい。さらに、複数の分子は、神経疾患を示す分子シグナチャーを表していてもよい。より特には、シグナチャーは複数のタンパク質またはタンパク質アイソフォームの発現レベルにより定義することができる。
【００４６】
バイオマーカーを、例えば、哺乳動物における治療的介入に対する正常な生物学的プロセス、病理学的プロセス、または薬理学的応答の指標として客観的に測定し、評価することができる特定の特徴であるとさらに見なすことができる。しばしば、単一のバイオマーカーの使用が、哺乳動物が神経疾患を有するか、または神経疾患が存在しないかを完全に決定することができない場合、２つ以上のバイオマーカーの存在および／または非存在が、哺乳動物に関する生物学的状態の適切な誘導にとって必要であり得る。
【００４７】
バイオマーカーは、単独で、または組み合わせて、哺乳動物がある表現型状態または別のものに属する相対的リスクの尺度も提供することができる。従って、バイオマーカーは、哺乳動物が疾患を発症する（予後）、疾患を有する（診断）または薬物の治療有効性［セラノスティック（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）］および薬物毒性を確認する可能性を示すのに従来通り有用である。
【００４８】
また、バイオマーカーは、必ずしも限定されるものではないが、哺乳動物または対照集団に由来する試料中のレベル（例えば、濃度、発現および／または活性）が、生物学的状態、例えば、神経疾患の診断を示す生物試料中に存在するタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび／または代謝物を含むとも考えられる。さらに、本発明の方法内に企図されるバイオマーカーはまた、必ずしも限定されるものではないが、免疫グロブリン、ペプチド、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、低分子非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、消化されたタンパク質断片、酵素、脂質、代謝物、炭水化物、グリコシル化ポリペプチド、および金属を含んでもよい。
【００４９】
本特許請求される方法は、新皮質アミロイドの増加と関連する神経疾患におけるバイオマーカーを同定することができる。本発明の好ましい実施形態においては、本発明に関連があると考えられる神経疾患は、特に限定されるものではないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レヴィ小体認知症（ＤＬＢ）、多発脳梗塞性認知症（ＭＩＤ）、血管性認知症（ＶＤ）、統合失調症および／または抑鬱症を含むものである。本発明の方法の使用によるＡＤおよびＰＤなどの神経疾患の診断および予後診断が特に望ましい。また、同定および／または単離されたバイオマーカーが脳におけるＰｉＢ量を反映することも望ましい。
【００５０】
本特許請求される方法を実施する際に、分子はそのヘパリン結合親和性、そのヘパリンに対する親和性またはヘパリンに結合する分子とのその会合に基づいて単離される。本発明の文脈においては、取得すること、抽出すること、精製することおよび除去されるなどの用語は、単離することという用語と同義である。さらに、「ヘパリン結合親和性」または「ヘパリンに対する親和性」などの用語は、本発明において互換的に用いることができる用語であると考えられる。本発明の文脈においては、親和性は、それらの会合または結合を惹起する分子間の引力または力と定義される。従って、本特許請求される方法により単離される分子は、ヘパリンに対するそのような引力を有する。従って、ヘパリン結合親和性を有する分子は、ヘパリンと直接会合するか、またはヘパリンに引き付けられた他の分子と会合する、結合する、もしくは複合体化する分子を含む。
【００５１】
出願人は、ヘパリンに対する親和性を有する分子が、限定されるものではないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レヴィ小体認知症（ＤＬＢ）、多発脳梗塞性認知症（ＭＩＤ）、血管性認知症（ＶＤ）、統合失調症および／または抑鬱症などの神経疾患を示すことができると同定した。より好ましくは、分子は、ＡＤおよび／またはＰＤを示すことができる。従って、これらの分子は、これらの神経疾患のためのバイオマーカーとして提供することができる。
【００５２】
以下の説明は、一般に、ＡＤおよびＰＤに関するものである。しかしながら、本明細書に記載の方法は、他の神経疾患およびこれらの神経疾患のためのバイオマーカーの同定にも同等に適用可能である。
【００５３】
分子のヘパリン結合親和性は、非ヘパリン結合分子の混合物もしくは試料またはヘパリンに対する親和性を有さない分子から特定の分子を選出するか、または単離するために用いられる。従って、本発明の文脈においては、分子は、ヘパリンに対する親和性を有さない分子の試料または混合物から単離されるのに十分なヘパリン結合親和性を有するだけでよい。
【００５４】
ヘパリン結合親和性を有する分子の単離において、分子はヘパリンに非共有的または共有的に結合することができる。例として、ヘパリンを、ヘパリンに対する親和性を有さない分子を試料中に残すそのヘパリン結合親和性に基づいて試料から分子を選択または単離するために固定することができる。他の例においては、ヘパリン結合親和性を有する分子を、抗体、ペプチドアレイ、分子インプリンティング、または化学的親和性マトリックスを用いることによって単離することができる。
【００５５】
当業者によって理解されるように、固定されたヘパリンの形式は広く変化してもよい。例えば、ヘパリンを、被覆された表面上に固定するか、またはクロマトグラフィー樹脂中に含有させることができる。
【００５６】
分子を、固定されたヘパリンとのその会合もしくは結合によって単離するか、またはヘパリンに引き付けられた別の分子に会合、結合もしくは複合体化させることができる。あるいは、固定されたヘパリンは、大容量陽イオン交換体として作用し得る。この使用は、ヘパリンの多数の硫酸陰イオン基を利用するものである。これらの基は、全体として正電荷を有する分子またはタンパク質を捕捉すると予想される。ヘパリンに対するその親和性に基づいて分子を単離するための方法および装置は、当業者には公知である。好ましくは、ヘパリンに対する親和性を有する分子を結合させるための遊離ヘパリンを提供する装置またはアッセイが、本特許請求される方法において用いられる。より好ましくは、ヘパリン−セファロース精製カラムがヘパリン結合親和性を有する分子を単離するために用いられる。
【００５７】
分子はヘパリンに結合した後、変化したｐＨもしくは塩濃度などの様々な緩衝条件の使用と共に、または塩もしくはｐＨ勾配などの勾配の使用によりヘパリンから選択的に解離させることができる。
【００５８】
当業者であれば理解できるように、単離されたタンパク質を、カラムのｐＨを変化させることによって、ヘパリン−セファロース精製カラムを用いて試料から選択的に単離することができる。従って、別の態様において、ヘパリン−セファロースカラムを、少なくとも約ｐＨ３、少なくとも約ｐＨ４、少なくとも約ｐＨ５、少なくとも約ｐＨ６、少なくとも約ｐＨ７、少なくとも約ｐＨ８、少なくとも約ｐＨ９、少なくとも約ｐＨ１０で溶出させる。より好ましくは、ヘパリンセファロースカラムを、ｐＨ６〜ｐＨ８で、より好ましくはｐＨ７またはｐＨ８で溶出させる。
【００５９】
あるいは、ヘパリンを、試料中に溶解し、試料中でヘパリン結合親和性を有する分子に選択的に結合させることができる。次いで、ヘパリンに結合した分子のその後の精製を用いて、試料からこれらの分子を単離することができる。次いで、単離された分子を、そのレベルを同定する前にヘパリンから選択的に解離させることができる。
【００６０】
当業者であれば理解できるように、親和性は、少なくとも２つの分子間の非共有的分子間相互作用によって影響され得る。従って、解離定数を用いて、ある分子とヘパリンとの間の親和性（すなわち、ある分子がどれぐらい緊密にヘパリンに会合または結合するか）を記述することができる。従って、変化する程度のヘパリン結合を示す分子を、潜在的なバイオマーカーとして単離することができる。
【００６１】
あるいは、特許請求される発明を実施する際に、ヘパリン結合ドメインなどの公知のヘパリン結合領域の配列をコードする分子に基づいて、分子を単離することができる。例えば、そのような選択肢において、ヘパリン結合ドメインを指向するＰＣＲプライマーを、そのような領域を含有するか、またはコードする分子を増幅するように設計することができる。これらの分子を精製および分析して、その発現レベルを決定することができる。
【００６２】
当業者であれば理解できるように、ヘパリンは、主要な糖単位として２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−イズロン酸、２−デオキシ−２−スルファミノ−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコース、β−Ｄ−グルクロン酸、２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコース、およびα−Ｌ−イズロン酸を有する直鎖状陰イオン性多糖の混合物である。これらの糖単位の存在および頻度は、ヘパリンが抽出される組織源に応じて変化する。しかしながら、本発明の実施は、ヘパリンの特定のアイソフォーム、サブタイプまたは種に限定されることを意図されない。従って、本発明の文脈において用いられるヘパリンを、様々な種に由来する様々な細胞または組織試料から単離および精製することができる。あるいは、ヘパリンを、培養細胞から取得することができる。あるいは、ヘパリンは半合成または合成のものであってもよい。
【００６３】
別の好ましい実施形態においては、第１の試料を予備処理して、ヘパリン結合親和性を有する分子を単離する前にプロテオミック分析を阻害する高存在量のタンパク質の影響を除去または低減することができる。例として、試料を、試料から少なくとも最も豊富なタンパク質を除去する、複数の親和性除去システム−１４（ＭＡＲＳ）で処理することができる。次いで、これは、潜在的なバイオマーカーのヘパリン結合親和性を用いる改善された富化プロセスを提供する。
【００６４】
本発明において用いられる試料は、生物学的試料であることが企図される。本発明の文脈においては、試料を哺乳動物から取得することができる。試料は、限定されるものではないが、血液（全血を含む）、血漿、血清、血液溶解物、リンパ液、滑液、髄液、尿、脳脊髄液、精液、糞便、痰、粘液、羊水、涙液、嚢胞液、汗腺分泌物、胆汁、乳汁、涙または唾液からなる群から選択される様々な生物学的材料を含んでもよい。好ましくは、生物学的試料は、血液（全血を含む）、血漿、または血清である。
【００６５】
さらに、当業者であれば、本特許請求される方法を、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を含有する任意の取得された生物学的材料において用いることができることを知っている。
【００６６】
より好ましくは、単離される分子は、免疫グロブリン、ペプチド、ｍＲＮＡ、低分子非コードＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、消化されたタンパク質断片、酵素、代謝物、炭水化物、グリコシル化されたポリペプチド、または金属からなる群から選択される。
【００６７】
本発明の方法を介して検査される哺乳動物は、ヒト哺乳動物または非ヒト哺乳動物であってもよい。非ヒト哺乳動物は、必ずしも限定されると考えられるものではないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サル、ウサギ、野ウサギ、イヌ、ネコ、マウスまたはラットであってもよい。一実施形態においては、哺乳動物は霊長類である。好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトであり、より好ましくは、哺乳動物はヒト成人である。
【００６８】
また、本発明の方法を、例えば、バイオマーカー同定のインビボモデルにおける使用のために、ヒト疾患を表す動物モデルにおいて用いることもできる。そのような実施形態においては、動物モデルにおける動物は、マウス、ラット、サル、ウサギ、両生類、魚類、ミミズ、またはハエである。
【００６９】
神経疾患のバイオマーカーを同定する本特許請求される方法を実施する際に、哺乳動物から得られた試料は、神経疾患について陽性であるか、または潜在的に陽性である。好ましくは、臨床および／または分子診断を用いて、試料が得られた哺乳動物が神経疾患について陽性であることを確認することができる。これは、認知的に正常であるが、脳中のアミロイド量（好ましくは、ＰＥＴイメージングにより決定される）などの神経疾患を示すマーカーのレベルの変化を示す哺乳動物を含む。これらの哺乳動物は、神経疾患について潜在的に陽性であり、本発明の範囲に含まれる。
【００７０】
哺乳動物が神経疾患について陽性であるか、または潜在的に陽性であるかどうかを決定するために用いられる臨床決定は、必ずしも限定されるものではないが、記憶および／または心理試験、言語機能障害および／または他の重要な認知障害（失行、計算不能症および左右識別障害など）の評価、判断機能低下および一般問題解決困難の評価、進行性の消極性から顕著な動揺までの人格変化の評価を含む評価に関連すると考えられることが当業者には理解される。
【００７１】
さらに、高新皮質アミロイドの存在を確認するためのアミロイド量またはアミロイドレベルの決定などの、哺乳動物の疾患状態の陽性の診断を、正当ならば検証または確認することができる。互換的に用いられることが多い、アミロイド量もしくはアミロイドレベル、またはアミロイドおよびアミロイド断片の存在という用語は、（老人）斑の主要構成要素であるアミロイド−ベータペプチドである、脳に沈着した脳アミロイドベータ（Ａβまたはアミロイド−β）の濃度またはレベルを指す。
【００７２】
また、哺乳動物を、ＰＥＴおよびＭＲＩなどのイメージング技術を用いて、またはＰＥＴと共に用いられる場合、ＰｉＢなどの診断ツールを援用して（そうでなければＰｉＢ−ＰＥＴとも呼ばれる）、神経疾患について陽性であると確認することもできる。好ましくは、神経疾患について陽性である哺乳動物は、ＰｉＢ陽性である。より好ましくは、哺乳動物は、高い新皮質アミロイド量（ＰｉＢ陽性）と一致する標準摂取率比（ＳＵＶＲ）を有する。例えば、現在の実務は、ＳＵＶＲに関するものであり、１．５は脳中の高レベルを反映し、１．５以下は脳中の低レベルの新皮質アミロイド量を反映し得る。当業者であれば、高レベルまたは低レベルの新皮質アミロイド量と考えられるものを決定することができる。当業者であれば理解できるように、哺乳動物を、ＣＳＦに由来するアミロイドベータおよびタウを測定することにより、神経疾患について陽性であることを確認することもできる。
【００７３】
神経疾患のバイオマーカーを同定するために、ＡＤおよびＰＤなどの神経疾患と診断された患者から得られる陽性と同定された、また、アミロイドレベルも決定することができた試料のライブラリーから、試料を取得することができる。好適なライブラリーは、Ｔｈｅ  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ（ＡＩＢＬ）Ｆｌａｇｓｈｉｐ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＡｇｉｎｇまたはＴｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＡＤＮＩ）を含んでもよい。
【００７４】
現在まで、ＡＩＢＬは、ニューロイメージング、バイオマーカー、精神測定、および生活スタイル因子などの４つの次元にわたって約１，１１２人のボランティアを評価することを含んでいた。ＡＩＢＬ試験は、８年の期間にわたって１８カ月間隔で血液採取を行う長期試験である。それは、アミロイドイメージング剤、ピッツバーグ化合物Ｂ（ＰｉＢ）を用いるポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）を含む世界で最大の試験である。ＡＩＢＬが他の同様の試験を超える１つの利点は、血液試料の採取および保存（液体Ｎ２）のための標準化された手順である。これは変化した採取および保存プロトコールを有するか、または−２０℃で試料を保存する他の試験と比較して有意な利点である。ＡＩＢＬ試験は、ＡＤ、軽度認知障害（ＭＣＩ）、および障害がない年齢適合対照対象からの良好に特性評価された血液試料の豊富な資源を提供し、ＡＤおよびＰＤの診断のために用いることができるバイオマーカーの発見のための優れた資源を提供する。
【００７５】
ＡＤＮＩは、血液、脳脊髄液、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）およびポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）イメージングからのバイオマーカーの使用を検証するために設計されたＡＤの試験である。ＡＤＮＩは、ＡＩＢＬと同様、参加者上で長期的血液試料および一連の神経精神測定データを収集してきた。
【００７６】
当業者であれば理解できるように、単離された分子は、そのレベルが、単独で、もしくは組み合わせて、統計的に関連すると考えられる場合、または他の以前に特性評価されたバイオマーカーとのその関係が表現型状態を識別する場合、バイオマーカーとして検証される。特定の分子が偶然にバイオマーカーとして同定された確率が所定の値よりも小さい場合、疾患状態を決定するための同定されたバイオマーカーの有用性は統計的に有意であると考えられる。そのような確率を算出する方法は、バイオマーカーのレベルを比較するために用いられる正確な方法に依存する。
【００７７】
従来のｔ検定などの、有意に変化するバイオマーカーを同定するためのいくつかの統計検定がある。しかしながら、一般に、ＳＡＭまたはＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（ＰＡＭ）（http://www-statstanford.edu/.about.tibs/PAM/index.html）、またはＲａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓなどの、より洗練された技術を用いることがより好都合であり、適切であり、および／または正確であり得る。そのような統計的有意性について評価するための一般的な検定としては、特に、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙおよびオッズ比が挙げられる。
【００７８】
本発明の方法を実施する際に、一実施形態においては、ヘパリン結合親和性を有する単離された分子の検証は、神経疾患について陽性であるか、または潜在的に陽性である試料間のヘパリン結合親和性を有する単離された分子のレベルにおける統計的有意差と、対照とを比較することを含んでもよい。
【００７９】
従って、別の実施形態においては、本発明の方法を実施する際に、ヘパリン結合親和性を有する単離された分子をバイオマーカーとして検証することは、
（ａ）神経疾患について陽性であるか、または潜在的に陽性である第１の試料におけるヘパリン結合親和性を有する第１の単離された分子のレベルを同定する工程；
（ｂ）第１の試料中に存在する神経疾患と診断された哺乳動物に特徴的であると以前に定義された別のバイオマーカーのレベルを同定する工程；
（ｃ）工程（ａ）で同定された単離された分子のレベルと、工程（ｂ）で同定された他のバイオマーカーのレベルとを比較して、単離された分子のレベルと、他のバイオマーカーのレベルとの統計的に有意な関係を同定する工程；
（ｄ）対照から得られた第２の試料において工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返して、第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されるかどうかを決定する工程；
（ｅ）第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されない場合、ヘパリン結合親和性を有する第１の単離された分子が神経疾患のバイオマーカーであると結論付ける工程
をさらに含む。
【００８０】
本特許請求される方法を実施する際に、単離された分子およびバイオマーカーのレベルを同定しなければならない。当業者には理解できるように、単離された分子または以前に同定されたバイオマーカーのレベル（例えば、濃度、発現および／または活性）を定性化または定量化することができる。好ましくは、単離された分子またはバイオマーカーのレベルを、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、炭水化物、金属またはタンパク質発現のレベルとして定量する。この好ましい実施形態においては、本発明は、神経疾患と診断された哺乳動物にとって特徴的であると以前に定義されたバイオマーカーのレベルとの統計的に有意な関係を有するその対応する発現レベルに基づいて、単離された分子をバイオマーカーとして検証することを求めるものである。
【００８１】
多数の定性化および定量化技術を用いて、単離された分子およびバイオマーカーのレベルを同定することができることが明らかである。これらの技術は、２Ｄ  ＤＧＥ、多反応モニタリング質量分析（ＭＲＭ−ＭＳ）などの質量分析（ＭＳ）、リアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ、核酸アレイ；ＥＬＩＳＡ、機能的アッセイ、酵素アッセイ、様々な免疫学的方法、またはキャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー、２次元液相電気泳動（２−Ｄ−ＬＰＥ）もしくはゲル電気泳動におけるその移動パターンなどの生化学的方法を含んでもよい。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、複雑な混合物からタンパク質を分離するための広く用いられているアプローチである。
【００８２】
しかしながら、単離された分子およびバイオマーカーのレベルを同定するために用いられる適切な技術は分子の特徴に依存することが、当業者には明らかである。例えば、単離された分子がタンパク質である場合、２Ｄ  ＤＧＥまたは質量分析を用いて、単離された分子のレベルを定量することができる。
【００８３】
好ましくは、バイオマーカーのレベルの定量化を、１または２次元（２−Ｄ）構成で実施することができる。あまり複雑でないタンパク質調製物については、１次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥがより単純であるため、２−Ｄゲルよりも好ましい。好ましい実施形態においては、第１の次元においては等電点電気泳動（ＩＥＦ）を含み、第２の次元においてはＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む２−Ｄゲル電気泳動が用いられ、電荷およびサイズによるバイオマーカーの分離をもたらす。
【００８４】
バイオマーカーのレベルの決定を、例えば、バイオマーカーがポリペプチドであった場合、２−Ｄゲル電気泳動上などでのその等電点（ｐＩ）およびその分子量（ＭＷ）に基づくバイオマーカーの特性評価に従うことによって行うこともできる。この例においては、試料中に存在するバイオマーカーの量を、２−Ｄゲル上でのポリペプチドスポットの強度を測定することなどによる、視覚的分析によって決定することができる。
【００８５】
一例においては、バイオマーカーがポリヌクレオチドバイオマーカーであった場合、バイオマーカーの量を評価するために、当業者であればＲＴ−ＰＣＲなどの定量技術を考えられる限りで用いることができる。別の例においては、特定のバイオマーカーがポリペプチドまたはタンパク質であった場合、バイオマーカーのレベルを、ポリペプチドバイオマーカーに特異的なタグ付抗体などの二次検出試薬を用いるＥＬＩＳＡ技術により決定することができる。
【００８６】
バイオマーカーがタンパク質である非限定例においては、タンパク質またはタンパク質アイソフォームのレベルを、イムノアッセイにより検出することもできる。当業者であれば、イムノアッセイは、抗原（すなわち、タンパク質またはタンパク質アイソフォーム）に特異的に結合する抗体を用いるアッセイと見なすことができる。かくして、イムノアッセイは、抗体へのタンパク質またはタンパク質アイソフォームの特異的結合の検出を特徴とする。タンパク質またはタンパク質アイソフォームを検出するためのイムノアッセイは、競合的または非競合的であってもよい。非競合的イムノアッセイは、捕捉された分析物（すなわち、タンパク質またはタンパク質アイソフォーム）の量が直接測定されるアッセイである。競合的アッセイにおいては、試料中に存在する分析物（すなわち、タンパク質またはタンパク質アイソフォーム）の量は、試料中に存在する分析物（すなわち、タンパク質またはタンパク質アイソフォーム）によって捕捉剤（すなわち、抗体）から置き換えられた（または競合除去された）添加された（外因性）分析物の量を測定することによって間接的に測定される。
【００８７】
競合アッセイの一例においては、既知量の（外因性）タンパク質またはタンパク質アイソフォームを試料に添加した後、試料を抗体と接触させる。抗体に結合した添加された（外因性）タンパク質またはタンパク質アイソフォームの量は、外因性タンパク質またはタンパク質アイソフォームが添加される前の試料中のタンパク質またはタンパク質アイソフォームの濃度に反比例する。別のアッセイにおいては、例えば、抗体を、それらが固定される固相基質に直接結合させることができる。次いで、これらの固定された抗体は、試験試料中に存在する対象のタンパク質またはタンパク質アイソフォームを捕捉する。他の免疫学的方法としては、限定されるものではないが、液体またはゲル沈降反応、免疫拡散（単一または二重）、凝集アッセイ、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、リポソームイムノアッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイまたはイムノＰＣＲが挙げられる。
【００８８】
あるいは、第２の測定プロセスを、所与の試料中のバイオマーカーの決定のために用いることができることが企図される。例えば、バイオマーカーが酵素的特性を有するタンパク質である場合、おそらく酵素活性の測定をバイオマーカーのレベルの決定において用いることができる。同様に、バイオマーカーがポリペプチドであった場合、バイオマーカーのレベルを、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの尺度により作製することができると考えられる。また、定性データを、一次測定値から誘導または取得することもできる。
【００８９】
あるいは、単離された分子がｍｉＲＮＡである場合、ＲＴ−ＰＣＲを用いることができる。好ましい例においては、単離された分子はタンパク質であり、その発現は２Ｄ  ＤＧＥを用いて測定される。この好ましい実施形態においては、分子は、分子の発現レベルを定量する前に、アミン反応性またはチオール反応性双性蛍光色素Ｚｄｙｅを用いて標識される。
【００９０】
試料中に存在するバイオマーカーを定量して、個々の多色示差的ゲル中電気泳動（ＤＧＥ）を用いることによりレベルを得ることができる。２−Ｄゲル上でのＤＧＥ検出は、それが各ゲル上での内部標準の含有によってゲル間の変動の問題を回避し、はるかに少ないゲルを用いて実行することができるという利点を有する。さらに、従来の２−Ｄゲルと同程度に多くのタンパク質を単一の試料から分解することができる技術は少ない。
【００９１】
単離された分子のレベルを定量する際に、ヘパリン結合親和性を有する分子の単離の前または後に、試料を処理して２Ｄゲルおよび質量分析などの定量アッセイに関する精度を改善することができる。ヘパリンセファロースカラムからの富化されたタンパク質を、限定されるものではないが、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）および４−ビニルピリジンなどの還元剤およびアルキル化剤を用いて還元およびアルキル化した後、トリプシンを用いて酵素的消化（好ましくは、約３７℃で一晩）を行うことができる。多反応モニタリングのためのペプチドを、ＭＳデータ、Ｓｋｙｌｉｎｅ資源ならびに限定されるものではないが、ａｐｏＥ、ａｐｏＪ、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、フィブリノゲンおよびＡβなどのヘパリン結合親和性を有するペプチドの定量測定のためのペプチド遷移を用いて決定することができる。これらのタンパク質に加えて、アクチン、ゲルソリンおよびａｐｏＥなどの他のものを測定することができる。
【００９２】
Ｓｋｙｌｉｎｅは、定量的ＭＳの開発にとって好適であるペプチドの迅速な選択を補助するソフトウェア資源である。消化されたタンパク質を連続希釈し、検出限界、イオン化効率、再現性およびクロマトグラフィー挙動を、ｎａｎｏ−ＬＣ−ＭＲＭ（Ｑ−ｔｒａｐ  ６５００、ＡＢＳｃｉｅｘ）を用いて決定する。定量アッセイのために、ペプチドを、アイソトープ標識されたリシンまたはアルギニンアミノ酸を用いて合成することができる。アイソトープ標識されたペプチド（重いペプチド）を、１３Ｃおよび１５Ｎで標識して、８〜１０Ｄａの質量シフトをもたらすことができる。質量分析装置は、質量の差異に基づいて、そうでなければ同一のペプチドを分解することができる。重いペプチドは、試料中のペプチドと化学的に同一であるため、真の内部標準として働く；これは、ＭＲＭ−ＭＳの主な利点の１つである。アミノ酸分析を用いて、ペプチド濃度を決定する。
【００９３】
理論によって限定されるものではないが、本発明は、ヘパリン結合親和性を有する分子のレベルが、同じ神経疾患を有さないと決定された哺乳動物から得られた試料中の同じ分子のレベルと比較した場合、神経疾患を有すると決定された哺乳動物から得られた試料中で変化するという知見に基づくものである。さらに、これらの変化は、神経疾患と診断された哺乳動物にとって特徴的であると以前に定義されたバイオマーカーのレベルと相関する。
【００９４】
従って、特許請求される方法を実施する際に、単離された分子のレベルを、高新皮質アミロイドの存在と相関する既知のバイオマーカーと比較することができる。好ましくは、この比較は、脳中のアミロイドベータの存在を特異的に認識する放射性トレーサーのレベルを用いて行われる。そのような放射性トレーサーは、ピッツバーグ化合物Ｂ（Ｐｉｔｓｂｕｒｇ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｂ）（ＰｉＢ）またはフロルピラミンＦ−１８であってもよい。より好ましくは、比較は、神経疾患に特徴的であるＰｉＢ−ＰＥＴレベルを用いて行われる。
【００９５】
神経疾患と診断された哺乳動物に特徴的であるバイオマーカーはまた、神経疾患状態を有する試料に由来するバイオマーカーの予め決定された比（参照比）であってもよい。例えば、比較を、１．５より大きいＳＵＶＲまたは当業者によって決定される高いか、もしくは低いアミロイド量を反映する任意の他の決定された値を用いて行うことができる。この量を超えるアミロイド量を高い、および低いと考えることができ、それを低いと考えることができる。しかしながら、この適用はこの値に限定されない。
【００９６】
あるいは、単離された分子のレベルを、限定されるものではないが、アミロイドβペプチド、タウ、ホスホ−タウ、シヌクレイン、Ｒａｂ３ａ、および神経糸（ｎｅｕｒａｌ  ｔｈｒｅａｄ）タンパク質などの、神経疾患の１つまたは複数のさらなる公知のバイオマーカーのいずれかのレベルと比較することができる。さらに、比較を、生物試料のセットが得られた臨床認知症評価（ＣＤＲ）または体格指数などの臨床バイオマーカー値に対して行うことができる。
【００９７】
本発明の方法の実施において理解されるように、比較は、神経疾患に特徴的な単一のバイオマーカーに必ずしも限定されない。比較におけるさらなるバイオマーカーの含有は、偽陽性バイオマーカー同定のリスクを軽減することができる。従って、特許請求される方法の好ましい特徴において、神経疾患に特徴的なさらなるバイオマーカーを、単離された分子のレベルと比較して、関係を同定することもできることが企図される。
【００９８】
本特許請求される方法は、ヘパリン結合親和性を有する単離された分子のレベルと、神経疾患に特徴的であると以前に定義された別のバイオマーカーのレベルとの関係を同定することを求めるものである。本特許請求される方法を実施する際に、単離された分子のレベルと、神経疾患に特徴的であると以前に定義された別のバイオマーカーのレベルとを比較することにより、関係が同定される。関係の同定は、単離された分子のレベルが、神経疾患のバイオマーカーでもあり得ることを示す。対照試料に対して比較した場合、これをさらに確認することができる。
【００９９】
関係を対照比較から理解することができる。例えば、単離された分子のレベルは、既知のバイオマーカーに関して類似するか、または関連する規模または方向で変化してもよい。好ましくは、関係は、相関である。当業者であればデータセット間の相関を同定するための特定の手段および方法を知っているが、相関方法の例としては、Ｐｅａｒｓｏｎの相関ならびにＳｐｅａｒｍａｎおよびＫｅｎｄａｌｌのタウなどの順位相関係数が挙げられる。さらに、相関は、線形である必要はなく、または直線関係を規定する必要もない。関係はまた、非線形であってもよく、データセットでグラフ的に分析する時に明らかであってもよい。
【０１００】
より特には、本発明の方法は、哺乳動物の新皮質中の、ベータアミロイドなどのアミロイドおよび／またはアミロイド断片の存在の増大との関係または相関に基づいて単離された分子をバイオマーカーとして検証することを求めるものである。
【０１０１】
より特には、本発明は、ＰｉＢ−ＰＥＴ試験またはＡＶ−４５測定から得られた測定値とのその関係または相関に基づいて単離された分子をバイオマーカーとして検証する。ＰｉＢ−ＰＥＴ試験はまた、アミロイドおよび／またはアミロイド断片の存在の減少と相関する高ＰｉＢ対低ＰｉＢに関してアミロイドおよび／またはアミロイド断片の存在の増大を定義することもできる。好ましくは、本特許請求される方法を実施する際に、および単離された分子をバイオマーカーとして検証する際に、単離された分子のレベルは、高いＰｉＢ測定値と相関する。
【０１０２】
本特許請求される方法を実施する際に、同定される任意の関係を評価して、対照試料において同じ分析を実施することにより、それが神経疾患を示すか、または神経疾患にとって独特なものであるかを決定する必要がある。従って、単離された分子およびバイオマーカーのレベルを対照試料中で同定し、そのレベルを比較して、関係が対照試料において同定されるかどうかを決定する。関係が対照試料において同定されない場合、これは、単離された分子が神経疾患のバイオマーカーである可能性があることを示す。
【０１０３】
単離された分子が神経疾患のバイオマーカーであるかどうかを結論付けるためには、神経疾患について陽性である試料において同定された関係は、対照試料においては同定されないか、または存在しない。従って、その関係は、神経疾患について陽性である哺乳動物から得られた試料を示し、対照試料を示さない。
【０１０４】
概して、本特許請求される方法を実施する際に、実験試料から得られた結果を、対照試料に対して比較する。本発明の文脈においては、実験試料は、神経疾患について陽性である哺乳動物から得られた試料を表す。
【０１０５】
対照試料は、神経疾患について陽性または陰性である生物試料であってもよい。しかしながら、当業者であれば理解できるように、対照試料は、それが、単離された分子を神経疾患のバイオマーカーとして検証するための必要な比較を提供しなければならない点で実験試料によって決まる。例えば、実験試料が神経疾患について陽性である場合、対照試料は、理想的には神経疾患について陰性である。神経疾患について陰性である場合、対照試料は神経疾患の症状を有さない健康な哺乳動物に由来するものであってもよい。あるいは、対照試料は、別の神経疾患を有する哺乳動物に由来するものであってもよい。例えば、ＡＴバイオマーカーを検証する場合、対照試料はＰＤ試料であってもよい。
【０１０６】
さらに、実験試料および対照試料は、実験群および対照群を形成する複数の試料からなってもよい。従って、単離された分子をバイオマーカーとして検証する際に、第１の単離された分子および他のバイオマーカーのレベルを、実験群を含む試料群および対照群を含む別の試料群において同定することができる。実験群および対照群に関する試料のサイズは等しいものである必要はない。
【０１０７】
さらに、対照群は、試料が実験群から区別される限り、同じ試料を含む必要はない。例えば、対照群は、神経疾患を有さない健康な哺乳動物および対照群とは別の神経疾患を有する哺乳動物に由来する試料からなっていてもよい。例えば、実験群はＰＤを有する哺乳動物に由来する試料を含有してもよく、対照群は神経疾患を有さない健康な哺乳動物に由来する試料およびＡＤを有する哺乳動物に由来する試料を含有してもよい。
【０１０８】
本発明者らは、比を提供する、神経疾患について陽性である哺乳動物から得られた試料中でのヘパリン結合親和性を有するさらなる単離された分子のレベルの比較が、神経疾患のバイオマーカーを提供することができることを見出した。これらのバイオマーカーは、個々の分子のレベルの使用と比較した場合、神経疾患を診断する際に増大した特異度および感度を有してもよい。
【０１０９】
従って、別の実施形態においては、本特許請求される方法は、
（ａ）第１の試料から、第１の単離された分子と関連する、ヘパリン結合親和性を有する第２の分子のレベルを単離および同定する工程、
（ｂ）第１および第２の単離された分子のレベルの間の比を作成する工程、
（ｃ）工程ｂ）で作成された比と、第１の試料中に存在する神経疾患と診断された哺乳動物に特徴的であると以前に定義された別のバイオマーカーのレベルとを比較して、工程ｂ）の比と、他のバイオマーカーのレベルとの統計的に有意な関係を同定する工程、
（ｄ）対照から得られた第２の試料において工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返して、第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されるかどうかを決定する工程、
（ｅ）第１の試料において同定された関係が第２の試料において同定されない場合、前記比が神経疾患のバイオマーカーであると結論付ける工程
をさらに含む。
【０１１０】
本発明において考慮される通り、神経疾患のバイオマーカー比の検証は、少なくとも１つの単離された分子のレベルを測定すること、そのレベルを、少なくとも１つの他の関連する単離された分子のレベルと相関させること、および次の数的関係を決定することを含む。
【０１１１】
次いで、前記比を、神経疾患に特徴的であると以前に定義されたバイオマーカーのレベルと比較して、関係を同定する。続いて、この関係を対照試料において評価して、比が神経疾患のバイオマーカーであるかどうかを結論付ける。
【０１１２】
本特許請求される方法において、第２の分子または第２の単離された分子などの関連する形態の分子は、ある程度の類似性を有するものである、同じ起源分子から誘導することができる、および／または第１の分子もしくは第１の単離された分子などの別の分子との共有される特性もしくは属性のため、一緒にグループ化することができる。例えば、ポリペプチドの文脈においては、疾患状態を示す関連するバイオマーカーは、同じ親分子に基づくか、またはそれから誘導されるポリペプチド（例えば、転写後のＤＮＡ、もしくは翻訳後のｍＲＮＡなどの同じポリヌクレオチドからコードされる、または酵素的切断などの翻訳後改変）を含んでもよい。
【０１１３】
従って、哺乳動物における神経疾患の存在に関して特定の生物学的状態を示すものと認識される関連する形態の分子は、互いに関連すると見られるが、当業界で公知の手段によってその検出を可能にすることができるある程度の変動を有するものである。好ましくは、神経疾患の決定のための関連する形態のバイオマーカーは、一例においては、複数のアイソフォーム中に存在するタンパク質であってもよい。従って、分子（例えば、第１および第２の）はアイソフォームとして関連するのが好ましい。
【０１１４】
当業界で用いられる場合、タンパク質アイソフォームとは、同じ遺伝子によりコードされるが、その等電点（ｐＩ）もしくは分子量（ＭＷ）、またはその両方などの特定の属性に関して差異を有するポリペプチドの変異体を指す。本明細書で用いられるタンパク質アイソフォームは、予想された／野生型ポリペプチドと、その任意の天然の変異体との両方を含むとさらに考えられる。そのようなアイソフォームは、そのアミノ酸組成における差異のため生じてもよく（例えば、選択的ｍＲＮＡもしくはプレｍＲＮＡプロセシング、例えば、選択的スプライシングもしくは限定的タンパク質分解の結果として）、さらに、またはあるいは、示差的翻訳後改変（例えば、グリコシル化、アシル化、リン酸化）から生じてもよく、または代謝的に変化してもよい（例えば、断片化される）。アイソフォームは、単独で、または組み合わせて存在してもよく、またはＡβなどの別の分子と複合体化してもよい。
【０１１５】
タンパク質アイソフォームはまた、タンパク質アイソフォームと類似するか、または同一の機能を有するポリペプチドを含んでもよいが、そのタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列と類似するか、もしくは同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそのタンパク質アイソフォームのものと類似するか、もしくは同一である構造を有する必要は必ずしもないことが企図され得る。
【０１１６】
本明細書で用いられる場合、ポリペプチドのアミノ酸配列は、それが以下の基準：（ａ）ポリペプチドがタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも３０％（より好ましくは、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を有する；（ｂ）ポリペプチドが、タンパク質アイソフォームの少なくとも５アミノ酸残基（より好ましくは、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、もしくは少なくとも１５０アミノ酸残基）をコードするヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるか；または（ｃ）ポリペプチドが、タンパク質アイソフォームをコードするヌクレオチド配列と少なくとも３０％（より好ましくは、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％）同一であるヌクレオチド配列によりコードされる、のうちの少なくとも１つを満たす場合、タンパク質アイソフォームのものと「類似する」か、または関連する。本明細書で用いられる場合、タンパク質アイソフォームのものと類似する構造を有するポリペプチドは、そのタンパク質アイソフォームのものと類似する二次、三次または四次構造を有するポリペプチドを指す。ポリペプチドの構造を、限定されるものではないが、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴、および結晶電子顕微鏡観察などの、当業者には公知の方法によって決定することができる。
【０１１７】
従って、複数の関連する形態の分子が存在する場合、これらのものを、同じ特定の親分子から誘導される多数のアイソフォームであると見ることができる、および／または同じ親分子との高い程度の類似性を有することができると企図され得る。本発明において提供されるバイオマーカーはいずれも、その遺伝子およびタンパク質同義語をも含むと考えられる。
【０１１８】
分子の比を決定する様式の例においては、２つの個々の分子を画像分析により定量化し、２Ｄゲルからの特定のタンパク質スポットの強度の測定を提供する。そのような例においては、分子レベルの定量化されたレベルに基づく比を、
（分子１のレベル／分子２のレベル）＝分子の比
として表すことができる。
【０１１９】
次いで、調査される哺乳動物から得られる分子レベルの比を、神経疾患と診断された哺乳動物に特徴的であると定義された以前に決定されたバイオマーカーと比較して、理想的には比の間の統計的に有意な関係を同定することができる。
【０１２０】
バイオマーカーを検証するため、またはそれを診断剤もしくは予後診断剤として使用するために本発明の方法を適用する際に、哺乳動物における神経疾患の存在または性質に関する臨床的な、またはほぼ臨床的な決定を、検証されたバイオマーカーのレベルまたは比に基づいて行うことができると考えられる。しかしながら、臨床決定は、確定診断に関して結論的なものであっても、またはなくてもよい。当業者であれば、診断が、可能性のある疾患または障害を決定または同定することを試みるプロセス、およびこのプロセスによって到達した意見を指すことを理解できる。
【０１２１】
さらに、バイオマーカーの診断能力を特徴付ける際に、当業者はバイオマーカーに関する診断カットオフを算出することができる。このカットオフは、値、レベルまたは範囲であってもよい。診断カットオフは、可能性のある疾患または障害を決定または同定することを試みるプロセスを補助する値、レベルまたは範囲を提供するべきである。
【０１２２】
例えば、バイオマーカーのレベルは、そのレベルが診断カットオフよりも上である場合、疾患にとって診断的であってもよい。あるいは、当業者であれば理解できるように、バイオマーカーのレベルは、そのレベルが診断カットオフよりも下である場合、疾患にとって診断的であってもよい。
【０１２３】
それぞれの潜在的なバイオマーカーに関する診断カットオフを、当業者には公知のいくつかの統計分析ソフトウェアプログラムを用いて誘導することができる。例として、診断カットオフを決定する一般的な技術は、正常な個体の平均を決定すること、ならびに例えば、規定の感度および特異度の値を用いる±２ＳＤおよび／またはＲＯＣ分析を用いることを含む。典型的には、８０％を超える感度および特異度が許容されるが、これはそれぞれの疾患状況に依存する。診断カットオフの定義は、試験が開発されたものと異なる臨床設定において用いられる場合、再誘導する必要があってもよい。これを達成するために、対照個体を測定して、平均±ＳＤを決定する。当業者であれば、対照個体から得られた測定値の外側にあるか、またはそれから離れた±２Ｄを用いて、正常範囲の外側の個体を同定することができることを理解できる。正常範囲の外側にある個体は、疾患について陽性であると考えることができる。次いで、新しい臨床設定において得られた値を、歴史上の値と比較して、古い診断基準が統計検定によって判定されるように依然として適用可能であるかどうかを決定することができる。疾患状態を有することが知られる個体もまた、分析に含有させることができる。疾患状態と対照状態の試料の両方が利用可能である状況では、選択された感度および特異度、典型的には８０％を示すＲＯＣ分析方法を選択して、疾患を示す診断値を決定することができる。また、診断カットオフの決定を、当業者には公知の統計モデルを用いて決定することもできる。
【０１２４】
また、尤度比は受信者操作特性（ＲＯＣ）分析から得られ、以下のように算出される：
尤度比＝感度／（１．０−特異度）。
【０１２５】
比は、所与の値を有する個体が何倍多く疾患を有する可能性があるかを示すものである。例えば、ある人が３の尤度比を有する場合、彼らは試験で陰性を示したある人よりも疾患を有する可能性が３倍高い。同様に、バイオマーカーに適用される通り、高い尤度比は、マーカーが神経疾患のためのバイオマーカーである可能性が高いことを示す。
【０１２６】
同様に、本発明の方法により同定されたバイオマーカーを、神経疾患の予後診断における補助を提供するのに用いることができ、神経疾患の存在、または性質に関する前臨床決定の評価を行うのを補助すると考えられる。これは、哺乳動物が神経疾患を発症する有意に増大した確率を有することを見出すことを指すと考えられる。
【０１２７】
本発明の方法により同定されたバイオマーカーを、神経疾患の存在の予後評価を提供する際に当業界で公知の神経疾患の臨床評価の他の方法と組み合わせて用いることもできることが企図される。
【０１２８】
神経疾患を有すると疑われる哺乳動物の疾患状態の確定診断を、ＰＥＴおよびＭＲＩなどのイメージング技術などによるか、または例えば、ＰＥＴと共に用いられる場合、ＰｉＢなどの診断ツールを援用して（そうでなければＰｉＢ−ＰＥＴと呼ばれる）、正当ならば検証または確認することができる。
【０１２９】
試料において同定された第１および第２の単離された分子を、Ａβ、アミロイド前駆体タンパク質、セルピンファミリーのタンパク質の任意のメンバー、リポタンパク質ファミリーの任意のメンバー、または急性期炎症応答と関連するタンパク質を含む群から選択することができる。しかしながら、第２の単離された分子は、第１の単離された分子の関連する形態である。好ましくは、哺乳動物に由来する試料において同定された第１または第２の単離された分子を、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖またはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択することができる。好ましくは、アイソフォームまたはその天然の誘導体は、抗トロンビンＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）のアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧまたはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩを含む群から選択される。より好ましくは、アイソフォームは、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、ＢもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢもしくはＪまたはａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥもしくはＧを含む群から選択される。
【０１３０】
あるいは、第１または第２の単離された分子は、Ａβと複合体化する。この選択肢においては、好ましくは、第２の単離された分子は、Ａβと共に、またはそれとの複合体にある、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖またはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択される。好ましくは、アイソフォームまたはその天然の誘導体は、抗トロンビンＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）のアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧまたはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩを含む群から選択される。より好ましくは、アイソフォームは、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、ＢもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢもしくはＪまたはａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥもしくはＧを含む群から選択される。
【０１３１】
本発明の別の態様においては、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レヴィ小体認知症（ＤＬＢ）、多発脳梗塞性認知症（ＭＩＤ）、血管性認知症（ＶＤ）、統合失調症および／または抑鬱症を含む群から選択される神経疾患の診断、示差的診断および予後診断を行うことができる、神経疾患のためのバイオマーカーが提供される。好ましくは、バイオマーカーは、アルツハイマー病（ＡＤ）またはパーキンソン病（ＰＤ）の診断、示差的診断および予後診断を行うことができる。バイオマーカーを、Ａβ、アミロイド前駆体タンパク質、セルピンファミリーのタンパク質の任意のメンバー、リポタンパク質ファミリーの任意のメンバー、または急性期炎症応答と関連するタンパク質を含む群から選択することができる。しかしながら、第２の単離された分子は、第１の単離された分子の関連する形態である。好ましくは、哺乳動物に由来する試料において同定された第１または第２の単離された分子を、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖またはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択することができる。好ましくは、アイソフォームまたはその天然の誘導体は、抗トロンビンＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）のアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧまたはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩを含む群から選択される。より好ましくは、アイソフォームは、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、ＢもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢもしくはＪまたはａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥもしくはＧを含む群から選択される。
【０１３２】
最も好ましくは、ＡＤのためのバイオマーカーは、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ、アルファ−１−ミクログロブリンまたはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択される。最も好ましくは、ＡＤのためのバイオマーカーは、抗トロンビンＩＩＩまたはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームである。好ましくは、アイソフォームは、ＡＴＩＩＩのＢまたはＪである。
【０１３３】
最も好ましくは、ＰＤのためのバイオマーカーは、アルファ−１−ミクログロブリンまたはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームである。好ましくは、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームは、アイソフォームＥまたはＧである。
【０１３４】
様々な実施形態において、神経疾患を予後診断するか、またはその診断を補助するための本特許請求される方法により同定される検証されたバイオマーカーおよび／または臨床マーカーにより達成される感度は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％である。様々な実施形態においては、神経疾患を予後診断するか、またはその診断を補助するための方法におけるバイオマーカーのセットの使用により達成される特異度は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％である。様々な実施形態においては、神経疾患を予後診断するか、またはその診断を補助するための方法における検証されたバイオマーカーから達成される全体の精度は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％である。いくつかの実施形態においては、感度および／または特異度は、神経疾患の臨床診断に対して測定される。
【０１３５】
第１の分子を神経疾患のバイオマーカーとして検証する際に、第１と第２の分子のレベルの間で比を作成することができる。好ましくは、この比は、第２の分子が第１の分子の関連する形態である場合、第１の分子のアイソフォームの間で作成される。第１の分子が抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖またはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択される場合、比は、抗トロンビンＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）のアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧまたはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩを含む群から選択されるアイソフォームの間で作成される。より好ましくは、アイソフォームは、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、ＢもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢもしくはＪまたはａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、またはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥもしくはＧを含む群から選択される。
【０１３６】
好ましくは、第１の分子がＡＴＩＩＩである場合、比は、限定されるものではないが、Ａ／Ｊ、Ｂ／ＪまたはＣ／Ｊなどの、少なくともアイソフォームＡ、Ｂ、ＣとＪの間で作成される。
【０１３７】
好ましくは、第１の分子がＳＡＰである場合、比は、好ましくはアイソフォームＦとＪの間で作成される。
【０１３８】
好ましくは、第１の分子がＡｐｏＪである場合、比は、好ましくはアイソフォームＡ、ＢとＤの間で作成される。
【０１３９】
好ましくは、第１の分子がアルファ−１−ミクログロブリンである場合、比は、好ましくはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥまたはＧの間で作成される。
【０１４０】
本発明の別の態様においては、
（ａ）患者から第１の試料を取得する工程；
（ｂ）第１の試料から、ヘパリン結合親和性を有する分子を単離および同定し、前記分子を本明細書に記載の神経疾患のためのバイオマーカーとして検証する工程；
（ｃ）工程ｂ）で同定された分子のレベルに基づいて、患者が神経疾患を有すると診断される、示差的に診断される、および／または予後診断されるかどうかを決定する工程
を含む、患者における神経疾患の診断、示差的診断および／または予後診断のための方法が提供される。
【０１４１】
さらに別の態様においては、
（ａ）患者から試料を取得する工程；
（ｂ）試料から、本明細書に記載の方法に従って検証された少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーを単離および同定する工程；
（ｃ）工程（ｂ）からバイオマーカーのレベルを決定する工程；
（ｄ）工程（ｂ）で同定された２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルの間の比を作成する工程；
（ｅ）参照比と比較した比の値に基づいて、哺乳動物が神経疾患を有すると診断される、示差的に診断される、および／または予後診断されるかどうかを、工程（ｄ）で作成された比から結論付ける工程
を含む、患者における神経疾患の診断、示差的診断および／または予後診断のための方法が提供される。
【０１４２】
従って、本発明は、本明細書に記載のように同定された、哺乳動物が神経起源の疾患を有するか、もしくは発症する可能性があるかどうかを決定するため、または認知機能低下について哺乳動物を評価するために用いることができるバイオマーカーならびにその天然の誘導体およびアイソフォームの使用にさらに関する。特に、本発明は、哺乳動物の新皮質における、ベータアミロイドなどのアミロイドおよび／またはアミロイド断片の存在の増大との関係を有する神経疾患の診断、示差的診断および／または予後診断にとって有用である。より特には、本発明は、ＰｉＢ−ＰＥＴ試験またはＡＶ−４５測定から得られた測定値と相関する方法を提供する。
【０１４３】
本発明の方法はまた、神経疾患について哺乳動物を評価するために予備スクリーニングまたは予後診断様式で用いることもでき、正当ならば、さらなる確定診断を、例えば、ＰｉＢ−ＰＥＴを用いて行うことができる。さらに、本発明の方法により同定されるバイオマーカーは、以前に検証された診断試験、特に、ＰｉＢ−ＰＥＴ評価を用いる臨床評価のための患者を選択するのに有用であってもよい。
【０１４４】
本発明に関連があると考えられる神経疾患は、特に限定されるものではないが、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、レヴィ小体認知症（ＤＬＢ）、多発脳梗塞性認知症（ＭＩＤ）、血管性認知症（ＶＤ）および／または抑鬱症を含むものである。本発明の方法の使用により診断する、示差的に診断する、および／または予後診断することができる好ましい疾患は、ＡＤまたはＰＤである。
【０１４５】
本発明の方法を適用する際に、哺乳動物における神経疾患の存在または性質に関する臨床決定またはほぼ臨床決定を行うことができ、これは確定診断に関して結論的なものであっても、またはなくてもよいと考えられる。当業者であれば、診断とは、可能性のある疾患または障害を決定または同定することを試みるプロセス、およびこのプロセスによって到達される意見を指すことを理解できる。
【０１４６】
同様に、本発明の方法は、神経疾患の予後診断における補助を提供する際に用いることができ、神経疾患の存在、または性質に関する前臨床決定の評価を行うのを補助すると考えられる。これは、哺乳動物が神経疾患を発症する有意に増大した確率を有すると見出すことを指すと考えられる。
【０１４７】
当業者であれば、神経疾患の存在についての臨床決定は、必ずしも限定されるものではないが、記憶および／または心理試験、言語機能障害および／または他の重要な認知障害（失行、計算不能症および左右識別障害など）の評価、判断機能低下および一般問題解決困難の評価、進行性の消極性から顕著な動揺までの人格変化の評価を含む評価に関連すると考えられることを理解できる。本発明の方法はまた、神経疾患の存在の予後的評価を提供する際に当業界で公知の神経疾患の臨床評価の他の方法と組み合わせて用いることもできることが企図される。
【０１４８】
神経疾患を有すると疑われる哺乳動物の疾患状態の確定診断を、ＰＥＴおよびＭＲＩなどのイメージング技術などによるか、または例えば、ＰＥＴと共に用いられる場合、ＰｉＢなどの診断ツールを援用して（そうでなければＰｉＢ−ＰＥＴと呼ばれる）、正当ならば検証または確認することができる。従って、本発明の方法を、予備スクリーニングまたは予後診断様式で用いて、神経疾患について哺乳動物を評価することができ、正当ならば、さらなる確定診断を、例えば、ＰｉＢ−ＰＥＴを用いて行うことができる。
【０１４９】
本発明は、特定のバイオマーカーのレベルまたは相関が、同じ神経疾患を有さないと決定された哺乳動物から得られた試料における同じバイオマーカーのレベルまたは相関と比較した場合に神経疾患を有すると決定された哺乳動物から得られた試料において有意に変化するという知見に基づくものである。
【０１５０】
本発明の方法により検査される、診断される、示差的に診断される、または予後診断される哺乳動物は、ヒト哺乳動物または非ヒト哺乳動物であってもよい。非ヒト哺乳動物は、必ずしも限定されると考えられないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サル、ウサギ、野ウサギ、イヌ、ネコ、マウスまたはラットである。一実施形態においては、哺乳動物は霊長類である。好ましい実施形態においては、哺乳動物はヒトであり、より好ましくは、哺乳動物はヒト成人である。
【０１５１】
本発明の方法の適用における特定の対象となるバイオマーカーは、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖またはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームから誘導することができる、またはそれと類似する関連する形態のバイオマーカーである。好ましくは、アイソフォームまたはその天然の誘導体は、抗トロンビンＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、血清アミロイドＰのアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧまたはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩを含む群から選択される。好ましくは、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリンのタンパク質およびアイソフォームまたはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームが、本発明の方法に従って用いられる。
【０１５２】
神経疾患の存在の評価を提供する際に、試料は問い合わせのために哺乳動物から得られる。本発明の実施において理解される試料とは、一般に、生物材料の任意の供給源、例えば、体液、脳抽出物、末梢血またはバイオマーカーの存在の問い合わせのために得ることができる生物材料の他の任意の供給源を指す。
【０１５３】
従って、これは、例えば、哺乳動物から取得することができ、予後診断、診断またはモニタリング様式で用いることができる様々な試料型を含んでもよい。これらのものとしては、必ずしも限定されるものではないが、血液（全血を含む）、血漿、血清、血液溶解物、リンパ液、滑液、髄液、尿、脳脊髄液、精液、糞便、痰、粘液、羊水、涙液、嚢胞液、汗腺分泌物、胆汁、乳汁、涙または唾液が挙げられる。バイオマーカーについて問い合わせることができる試料のさらなる例としては、培養された細胞、組織、細菌およびウイルスの培地上清ならびに細胞、組織、細菌またはウイルスから得られる溶解物が挙げられる。細胞および組織を、上記の任意の単細胞型または多細胞型生物から誘導することができる。
【０１５４】
好ましくは、バイオマーカーを本発明の実施において決定する試料は、哺乳動物から得られる生物試料である。本発明のより好ましい実施形態においては、試料は哺乳動物に由来する血液である。
【０１５５】
血液試料は、例えば、血小板、リンパ球、多形核細胞、マクロファージ、赤血球などの血液中に存在する様々な細胞型を含んでもよく、全血または当業者には周知のその画分の誘導体を含んでもよい。かくして、血液試料はまた、様々な分画形態の血液を含むか、または特定のアッセイにおける保存または加工を容易にするために添加される様々な希釈剤または界面活性剤を含んでもよい。そのような希釈剤および界面活性剤は当業者には周知であり、様々なバッファー、保存剤などを含む。これは、試薬を用いる処理、可溶化、またはある特定の成分（タンパク質もしくはポリヌクレオチドなど）の富化などの、その調達後に任意の方法で操作された試料を含むと考えられる。
【０１５６】
本発明の方法を用いて神経疾患の存在について哺乳動物を評価する際に、試料中のバイオマーカーのレベルを得るために、哺乳動物に由来する試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの量の定量化が必要である。
【０１５７】
バイオマーカーのレベルを決定する前に、試料は、本明細書に記載のようにヘパリン結合親和性を有するバイオマーカーとして作用する分子を同定するために加工される。本発明者らは、ヘパリン結合親和性を有する分子を測定して、神経疾患を診断する、示差的に診断する、または予後診断することができると同定した。一度、本明細書に記載のように、分子が同定され、バイオマーカーとして決定されたら、そのバイオマーカーまたは分子を分析して、哺乳動物が神経疾患を有するかどうかを決定することができる。
【０１５８】
一般に、特定のバイオマーカーのレベルは、問い合わされる試料中の特定のバイオマーカーの量に対する参照であると考えられる。例えば、バイオマーカーのレベルを、一次測定技術により決定および定量することができ、それはバイオマーカー自体の量または濃度の直接的測定値であってもよい。従って、バイオマーカーの量を、哺乳動物に由来する試料中の特定の分子の数を検出することにより評価することができる。バイオマーカーまたは分子のレベルを、本明細書に記載のように決定することができる。
【０１５９】
従って、神経疾患と関連するバイオマーカーを、当業者には公知の任意の方法によって検出し、可能である場合、定量することができると考えられる。これらの方法は、本明細書に記載される。
【０１６０】
別の態様において、
（ａ）患者から第１の試料を取得する工程、
（ｂ）第１の試料から、ヘパリン結合親和性を有する第１および第２のバイオマーカーのレベルを単離および同定する工程であり、第１および第２のバイオマーカーは関連しており、第１および第２のバイオマーカーが本明細書に記載の神経疾患のためのバイオマーカーとして検証される、
（ｃ）第１および第２の単離された分子のレベルの間の比を作成して、作成比を提供する工程、
（ｄ）対照から得られた第２の試料において工程（ｂ）〜（ｃ）を繰り返して、参照比を提供する工程、
（ｅ）第１の試料において同定された作成比と、第２の試料において同定された参照比とを比較する工程、
（ｆ）作成比と参照比との差異に基づいて神経疾患状態を結論付ける工程
を含む、患者における神経疾患の診断、示差的診断および／または予後診断のための方法が提供される。
【０１６１】
哺乳動物が神経疾患を発症する可能性があるかどうかを認識する能力は、試料中の少なくとも２つの特定の関連する形態のバイオマーカーのそれぞれのレベルの定量、および比較を、哺乳動物の新皮質アミロイド量の指示を与えるように行うことができるという本発明者らによる同定から得られる。
【０１６２】
本発明において定量および比較されるバイオマーカーは、同じ試料から取得することができるバイオマーカーである。従って、同じ試料に由来するバイオマーカーレベルを比較することによる、少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーのこの同時的比較によって、相対的比較が行われ、バイオマーカーレベルの内部検証が確保される。これは、哺乳動物間に存在し得る、試料中のバイオマーカーレベルの内部標準化と見なすことができるバイオマーカーのレベル間のサンプル間変動性などの側面を除去すると見られる。
【０１６３】
少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーのそれぞれのレベルを比較することによって、比を作成することができる。この比を、２つを超える関連する形態のバイオマーカーから作成することができる。それらを、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０の関連する形態のバイオマーカーから作成することができる。次いで、特定のバイオマーカー間で作成される比を用いて、例えば、参照比を提供するのと類似する様式で得られた対照哺乳動物に由来する比に対してさらに比較することにより、哺乳動物が神経疾患を有するか、または神経疾患が存在しないかどうかを予後診断的または診断的に評価することができる。
【０１６４】
当業者であれば、用語「比」または「複数の比」が、評価されるバイオマーカーのレベルの間の関係および検査されるバイオマーカーのレベルの相対割合の差異を明示的に示す関係を指すことを理解できると考えられる。そのようなものとして、比または複数の比という用語は、第２のバイオマーカーのレベルと比較した場合の１つのバイオマーカーの相対レベルまたは比例レベルを表す。
【０１６５】
従って、例として、ある形態の関連するバイオマーカーと別の関連する形態のバイオマーカーのレベル間の関係または比は、親形態のバイオマーカーのレベルと、親バイオマーカーから誘導されるその後の断片のレベルとの差異であってもよい。一例においては、これは、親バイオマーカーの総レベルと、一例においては、全タンパク質および酵素的消化の下でそれから切断されるポリペプチド断片などの、その親バイオマーカーに由来する切断された断片のレベルとの差異と関連してもよい。好ましくは、関連する形態のバイオマーカーのレベル間の比は、タンパク質アイソフォーム間の関係であってよく、親タンパク質およびその親タンパク質から誘導されるアイソフォームの総量の間の差異である。好ましい実施形態においては、比は、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖およびそれらの天然の誘導体を含む群から選択されるタンパク質から誘導されるアイソフォームと、親タンパク質である抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖またはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームとの間のものである。好ましくは、アイソフォームまたはその天然の誘導体は、抗トロンビンＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）のアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧまたはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩを含む群から選択される。より好ましくは、アイソフォームは、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、ＢもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢもしくはＪまたはａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥもしくはＧを含む群から選択される。
【０１６６】
好ましくは、分子がＡＴＩＩＩである場合、比は、限定されるものではないが、Ａ／Ｊ、Ｂ／ＪまたはＣ／Ｊなどの少なくともアイソフォームＡ、Ｂ、ＣおよびＪの間で作成される。
【０１６７】
好ましくは、分子がＳＡＰである場合、比は、好ましくはアイソフォームＦとＪの間で作成される。
【０１６８】
好ましくは、分子がＡｐｏＪである場合、比は、好ましくはアイソフォームＡ、ＢおよびＤの間で作成される。
【０１６９】
好ましくは、第１の分子がアルファ−１−ミクログロブリンである場合、比は、好ましくはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥまたはＧの間で作成される。
【０１７０】
かくして、特定のバイオマーカーのレベルの測定に基づく作成比のシフトまたは変化は、比の作成において比較される少なくとも２つの形態のバイオマーカーの１つのレベルの増加または減少（全非存在を含む）によるなど、１つのバイオマーカーのレベルの変化により起こると予測することができる。
【０１７１】
哺乳動物が神経疾患を有するかどうかを識別することができる比を提供することができる本発明において同定されるバイオマーカーは、対照哺乳動物の様々な群から得られる試料中のバイオマーカー間に存在する比を評価した後、これを比較することによって初めて同定された。これにおいて、神経疾患を有する哺乳動物（陽性対照哺乳動物を代表すると考えられる）から得られる試料中の様々な形態のバイオマーカーの比を、神経疾患を有さない哺乳動物（陰性対照哺乳動物を代表すると考えられる）から得られる試料中の同じ形態のバイオマーカーの比と比較する。
【０１７２】
哺乳動物が神経疾患を有するか、または発症する可能性があることの指示は、新皮質アミロイド量のレベルが増加していないと決定された哺乳動物（陰性対照哺乳動物）と比較した場合、新皮質アミロイド量のレベルが増加した哺乳動物（陽性対照哺乳動物）に由来する試料における特定の形態の関連するバイオマーカーのレベルの評価に基づくものである。特定の関連するバイオマーカーの異なるレベルのこの評価は、哺乳動物における理論的新皮質アミロイド量に基づく予後診断試験の開発のため、診断試験のため、および／または神経疾患の示差的診断のための基礎である。
【０１７３】
哺乳動物が神経疾患を有するかどうかの評価を、バイオマーカーに関する診断カットオフおよび本明細書に記載のマーカーについて決定される尤度比により決定することができる。
【０１７４】
対照哺乳動物から得られる試料に由来する少なくとも２つの形態の関連するバイオマーカーの間の比を決定することにより、神経疾患状態に特徴的な比を作成し、参照比を提供することができる。関連するバイオマーカー間の比を定量および作成する際に、試料が最初に得られた対照哺乳動物の適切な選択に応じて、神経疾患の様々な段階または状態を示すことができる一連の比または一定範囲の比を得ることができると考えられる。従って、そのような評価から得られる比を、哺乳動物における特定の疾患状態に特徴的である以前に定義された比と見なすことができる。当業者であれば、所与のバイオマーカー比について、対照哺乳動物から神経疾患に罹患している哺乳動物を識別するのに好適なカットオフ値を確立する方法も知っている。
【０１７５】
対照哺乳動物から得られた試料に由来する関連する形態のバイオマーカーに関する比を決定する際に、この情報が一連の参照レベル範囲を作成しに行くことができることがさらに理解される。これらの参照レベル範囲は、対照哺乳動物から提供される比に基づいて哺乳動物の特定の疾患状態に特徴的であってもよい。従って、当業者であれば、比の好適な参照範囲、または対照哺乳動物もしくは神経疾患に罹患している哺乳動物に特徴的な範囲を、本発明の方法によって提供することもできることを理解できる。
【０１７６】
好ましくは、新皮質アミロイド量と関連する神経疾患の哺乳動物における診断および／または予後診断のための方法における使用のための比の作成は、哺乳動物に由来する試料中の少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルを測定すること、およびバイオマーカーのレベルの比を決定することにより提供される。特に、本発明の方法に従って定量されるバイオマーカーを、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖またはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択することができる。好ましくは、ＡＤについて、バイオマーカーは、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、およびａｐｏＪ（クラステリン）またはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択される。ＰＤについては、バイオマーカーは、アルファ−１−ミクログロブリンまたはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームであってもよい。好ましくは、アイソフォームまたはその天然の誘導体は、抗トロンビンＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）のアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧまたはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩを含む群から選択される。より好ましくは、アイソフォームは、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、ＢもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢもしくはＪまたはａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥもしくはＧを含む群から選択される。
【０１７７】
好ましくは、分子がＡＴＩＩＩである場合、比は、限定されるものではないが、Ａ／Ｊ、Ｂ／ＪまたはＣ／Ｊなどの少なくともアイソフォームＡ、Ｂ、ＣおよびＪの間で作成される。
【０１７８】
好ましくは、分子がＳＡＰである場合、比は、好ましくはアイソフォームＦとＪの間で作成される。
【０１７９】
好ましくは、分子がＡｐｏＪである場合、比は、好ましくはアイソフォームＡ、ＢおよびＤの間で作成される。
【０１８０】
好ましくは、第１の分子がアルファ−１−ミクログロブリンである場合、比は、好ましくはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥまたはＧの間で作成される。
【０１８１】
本発明において考慮されるように、比の作成は、少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを測定すること、そのレベルと、少なくとも１つの他の関連するバイオマーカーのレベルとを比較すること、および次の数的関係を決定することを含む。かくして、バイオマーカー比は、例えば、さらなる検査を実施することができる出発点または同等の所定の比との相互参照を行うことができる点を提供することができるため、バイオマーカー比は本発明において考慮される様々な使用において広く適用可能である。測定されるバイオマーカーが同じ試料に由来するものである場合に正常化効果を提供する固有の能力のため、バイオマーカー比は、そのバイオマーカー比が個体間に存在し得る食い違いに対して脆弱ではないことを意味する。
【０１８２】
哺乳動物の神経疾患状態を示すと特徴付けられる参照比を、未知の神経疾患状態を有する哺乳動物における神経疾患の診断または予後診断において用いることができる。試料が未知の神経疾患状態を有する哺乳動物から採取され、特定の神経疾患または疾患状態に特徴的な比が作成される（作成比）場合、これは可能である。従って、哺乳動物に由来するこの作成比を、以前に定義された比（参照比）と比較して、未知の疾患状態の哺乳動物が疾患を有するかどうかの指示を提供することができる。かくして、前記哺乳動物に由来する作成比と、対照哺乳動物に由来する以前に定義された比（参照比）であるものとの相関は、疾患状態の可能性を示す。
【０１８３】
次いで、調査される哺乳動物から得られるバイオマーカーレベルの比を、調査される哺乳動物の疾患状態の診断的または予後診断的評価に達する対照に基づいて、以前に決定された参照比の範囲と比較することができる。次いで、予後診断または診断の下にある哺乳動物について得られる比を、この比の参照範囲と比較することもでき、この比較に基づいて、哺乳動物が罹患している神経疾患に関して結論を引き出すことができる。
【０１８４】
神経疾患状態を有する対照哺乳動物に由来するバイオマーカーの以前に決定された比（参照比）に基づいて、バイオマーカー間の比を用いて、哺乳動物に存在する新皮質アミロイドの量を予測するのを補助することもできる。従って、哺乳動物に由来する試料中のバイオマーカー比を、一定範囲の以前に決定された比と比較して、対象の哺乳動物における新皮質アミロイド量の予想されるレベルを外挿することもできる。哺乳動物に由来する試料中に存在するバイオマーカーの比に基づく新皮質アミロイド量の外挿されたレベルは、従って、診断された対照哺乳動物について得られた比と比較して哺乳動物の神経疾患状態を分類することができる。
【０１８５】
好ましくは、哺乳動物における神経疾患の存在または非存在の評価のための比の作成は、哺乳動物から得られた試料における、単独で、または組み合わせた、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖ならびにそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択されるタンパク質から誘導されるタンパク質およびアイソフォームのレベルの定量化により行う。特定の好ましい実施形態においては、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリンのタンパク質およびアイソフォームまたはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームのレベルに基づく比の作成を用いて、哺乳動物が神経疾患を有するかどうかを診断および／または予後診断することができる。好ましくは、アイソフォームまたはその天然の誘導体は、抗トロンビンＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）のアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧまたはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩを含む群から選択される。より好ましくは、アイソフォームは、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、ＢもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢもしくはＪまたはａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥもしくはＧを含む群から選択される。
【０１８６】
好ましくは、分子がＡＴＩＩＩである場合、比は、限定されるものではないが、Ａ／Ｊ、Ｂ／ＪまたはＣ／Ｊなどの少なくともアイソフォームＡ、Ｂ、ＣおよびＪの間で作成される。
【０１８７】
好ましくは、分子がＳＡＰである場合、比は、好ましくはアイソフォームＦとＪの間で作成される。
【０１８８】
好ましくは、分子がＡｐｏＪである場合、比は、好ましくはアイソフォームＡ、ＢおよびＤの間で作成される。
【０１８９】
好ましくは、第１の分子がアルファ−１−ミクログロブリンである場合、比は、好ましくはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥまたはＧの間で作成される。
【０１９０】
本発明の方法においては、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖またはそれらの天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む、１つまたは複数の神経疾患と関連する少なくとも２つのバイオマーカーを、哺乳動物の神経疾患状態を示すための比の作成において定量化する。２つのバイオマーカーの同時的評価による予測力を、少なくとも１つ（ａｄｄ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）のさらなるバイオマーカーを追加することによって改善することができると考えられる。２つを超えるバイオマーカーの適切な組合せの検出は、方法の特異度および感度を増大させることが多い。従って、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のバイオマーカーの組合せを、本発明の方法において検出することができる。
【０１９１】
従って、上記方法のいずれかにおいて、少なくとも２つのバイオマーカーの検出を、限定されるものではないが、アミロイドβペプチド、タウ、ホスホ−タウ、シヌクレイン、Ｒａｂ３ａ、および神経糸タンパク質などの、神経疾患のための１つまたは複数のさらなる公知のバイオマーカーの検出と適宜組み合わせて、哺乳動物が神経疾患を有するかどうかの予測評価を改善することができる。
【０１９２】
本発明の方法の実施において理解されるように、神経疾患の予後の評価は変化することがあり、感度を増大させることができる場合には改善し得る。神経疾患の従来の予後は、医療専門家には公知であり、認識され、使用される臨床神経心理学または行動評価などの任意の１つまたは複数の公知の臨床基準に従って決定または確認できる。
【０１９３】
従って、少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルの定量化の後、哺乳動物における神経疾患を決定する特異度を潜在的に改善し得るさらなるバイオマーカーを追加することができることが企図される。例えば、本発明の予測能力または診断能力を、ＣＤＲ（臨床認知症評価）または体格指数などの哺乳動物のさらなる臨床マーカー値から得られた追加データを含有させることにより改善することができる。
【０１９４】
従って、本発明の方法は、少なくとも２つの関連する形態の本明細書に記載のバイオマーカーの比を比較することをさらに考慮し、生物試料のセットが得られた個体のＣＤＲまたは体格指数などの臨床マーカー値をさらに含んでもよい。
【０１９５】
様々な実施形態においては、神経疾患の予後診断または診断補助のための方法におけるバイオマーカーおよび／または臨床マーカーのセットの使用により達成される感度は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％である。様々な実施形態においては、神経疾患の予後診断または診断補助のための方法におけるバイオマーカーのセットの使用により達成される特異度は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％である。様々な実施形態においては、神経疾患の予後診断または診断補助のための方法におけるバイオマーカーのセットの使用により達成される全体の精度は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％である。いくつかの実施形態においては、感度および／または特異度は、神経疾患の臨床診断に対して測定される。
【０１９６】
本発明のさらなる態様において、哺乳動物における神経疾患の進行をモニタリングするための方法であって、
（ａ）神経疾患について以前に評価された哺乳動物から得られたさらなる試料において、哺乳動物において以前に評価されたヘパリン結合親和性を有する少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルを定量化する工程；
（ｂ）工程（ａ）における少なくとも２つの形態の関連するバイオマーカーのレベル間の比を作成して、作成比を提供する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の作成比と、神経疾患と診断された哺乳動物に特徴的であると以前に定義された参照比とを比較する工程であり、参照比は、少なくとも１つの対照哺乳動物から得られた試料において工程（ａ）の同じ関連するバイオマーカーのレベルを定量化した後に作成され、少なくとも１つの対照哺乳動物は、神経疾患について陽性または陰性であってもよい、工程；および
（ｄ）工程（ｂ）の作成比を、少なくとも１つの対照哺乳動物について神経疾患に特徴的であると以前に定義された範囲の参照比と相関させることによって、神経疾患について以前に評価された哺乳動物の神経疾患状態が変化したかどうかを、工程（ｃ）における比較から結論付ける工程
を含む、前記方法が提供される。
【０１９７】
任意の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルの変化を、哺乳動物の新皮質アミロイド量の任意の変化について評価するのに有用であり得る比を決定する際にさらに用いることができる。従って、哺乳動物に由来する試料中のバイオマーカーのレベルのモニタリングにおいて、長期間にわたって哺乳動物における神経疾患の存在についてモニタリングするか、または哺乳動物における疾患進行を追跡することが可能である。
【０１９８】
従って、哺乳動物に由来する生物試料に由来する任意の１つまたは複数のこれらのバイオマーカーのレベルの変化を用いて、認知機能を評価する、神経疾患を診断するか、またはその予後診断もしくは診断を補助する、および／あるいは患者における神経疾患をモニタリングする（例えば、哺乳動物における疾患進行を追跡する、および／または哺乳動物における医学的もしくは外科的療法の効果を追跡する）ことができる。
【０１９９】
バイオマーカーのレベルの変化は、対照哺乳動物と比較した、ある特定の神経疾患を有する哺乳動物における検査下でのバイオマーカーの出現もしくは消失または検査下でのバイオマーカーの増加もしくは減少と関連することが企図される。さらに、それは同じ哺乳動物について以前に採取された試料と比較したレベルの変化とも関連すると企図され得る。
【０２００】
バイオマーカーのレベルを、１つより多い時点で哺乳動物から取得することもできることが企図される。そのような連続的サンプリングは、哺乳動物における神経疾患の進行のモニタリングと関連する本発明の方法により実現可能であると考えられる。連続的サンプリングを、毎月、年４回（すなわち、３カ月毎）、半年毎、１年毎、２年毎、またはそれ以下の頻度などの任意の所望の予定表上で実施することができる。測定されたレベルと所定の比との比較を、新しい試料が測定される各時点で実行するか、またはレベルに関するデータをより低い頻度の分析のために保持することができる。
【０２０１】
本発明のさらなる態様において、神経疾患を発症するリスクがある哺乳動物を階層化または同定するための方法であって、
（ａ）哺乳動物から得られた試料において、本明細書に記載のヘパリン結合親和性を有する少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルを定量化する工程；
（ｂ）工程（ａ）における少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルの間の比を作成して、作成比を提供する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の比と、神経疾患と診断された哺乳動物に特徴的であると以前に定義された参照比とを比較する工程であり、参照比は、少なくとも１つの対照哺乳動物から得られた試料において工程（ａ）の同じ関連するバイオマーカーのレベルを定量化した後に作成される、工程；
（ｄ）工程ｂ）の作成比を、少なくとも１つの対照哺乳動物について神経疾患に特徴的であると以前に定義された範囲の参照比と相関させることによって、哺乳動物が神経疾患と診断される、示差的に診断される、および／または予後診断されるかどうかを、工程ｃ）における比較から結論付ける工程；ならびに
（ｅ）工程ｄ）の結論に基づいて、哺乳動物において示差的に診断された、および／または予後診断された神経疾患の重症度に基づいて異なるクラスの神経疾患に哺乳動物を選別する工程
を含む、前記方法が提供される。
【０２０２】
従って、任意の１つまたは複数の形態の関連するバイオマーカーのレベルの変化を用いて、哺乳動物を階層化する（すなわち、神経疾患の推定診断を有するか、または神経疾患と診断された哺乳動物を、異なるクラスの疾患に選別する）ことができる。哺乳動物の階層化は、典型的には、神経疾患に特徴的な特性に基づく哺乳動物の異なるクラスまたは階層への選別を指すと考えられる。例えば、神経疾患を有する哺乳動物の集団の階層化は、疾患の重症度に基づいて哺乳動物を割り当てることを含む。
【０２０３】
さらに、任意の１つまたは複数の関連するバイオマーカーのレベルの変化における評価を、神経疾患を発症するリスクがあり得る哺乳動物を同定する様式として用いることができる。哺乳動物が神経疾患を発症する可能性があると同定されたら、神経疾患を発症する素因を停止させるか、または減弱させることができる場合、それらを評価すべき潜在的な治療的介入としてさらに考慮することができると考えられる。神経疾患の進行または発症における介入の有効性を、神経疾患状態を示す比を作成するために用いられる関連するバイオマーカーの間の比の変化についてモニタリングすることにより可能とすることができる。
【０２０４】
本発明の方法を、治療モニタリングとも呼ばれる、哺乳動物に投与された療法の効果のモニタリング、および患者管理のためにさらに用いることができる。上記のように同定され、１つまたは複数の神経疾患と関連するバイオマーカーのレベルの変化を用いて、薬物処置に対する哺乳動物の応答を評価することもできる。このように、処置の開始後に哺乳動物におけるバイオマーカーのレベルおよび比を検査することにより、新しい処置レジメンを開発することもできる。
【０２０５】
さらなる態様において、本発明は、神経疾患と関連するバイオマーカーと相互作用する、および／またはその発現もしくは活性をモジュレートする薬剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）本明細書に記載のヘパリン結合親和性を有するバイオマーカーまたはバイオマーカーの一部を、薬剤と接触させる工程；
（ｂ）少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルを定量化する工程；
（ｃ）工程（ｂ）における少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルの間の比を作成して、作成比を提供する工程；
（ｄ）工程ｃ）の比と、薬剤の非存在下でバイオマーカーに特徴的であると以前に定義された参照比とを比較する工程であり、参照比は、薬剤の非存在下で工程（ｂ）の同じ関連するバイオマーカーのレベルを定量化した後に作成される、工程；
（ｅ）工程ｃ）の作成比を、バイオマーカーに特徴的であると以前に定義された範囲の参照比と相関させることにより、薬剤が神経疾患と関連するバイオマーカーと相互作用する、および／またはその発現もしくは活性をモジュレートするかどうかを、工程ｄ）における比較から結論付ける工程
を含む、前記方法が提供される。
【０２０６】
潜在的な治療分子と見られる薬剤は、必ずしも限定されるものではないが、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、炭水化物、脂質、タンパク質、ペプチド、低分子および他の薬物を含んでもよいことが企図される。また、薬剤を、生物ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相もしくは液相ライブラリー、または合成ライブラリー法などの、当業界で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数の好適な手法のいずれかを用いて取得することもできる。例えば、ライブラリー化合物を、溶液中で、ビーズ、チップ、細菌、胞子、プラスミド、またはファージ上で提供することができる。
【０２０７】
作成比に影響する任意の１つまたは複数のバイオマーカーのレベルの変化を、医学的もしくは外科的療法の効果または神経疾患を処置することを求める際の治療薬介入の有効性を追跡する様式として評価することもできる。
【０２０８】
かくして、本発明の方法は、例えば、神経疾患のためのある特定の療法の評価のために臨床試験をモニタリングするのを補助することができる。例えば、化合物を、神経疾患を有する哺乳動物におけるバイオマーカーのレベルを、対照哺乳動物において見出されるレベルにまで正常化するその能力について試験することができる。処置される哺乳動物において、化合物を、対照哺乳動物に見られるレベルまたはそれに近いレベルにバイオマーカーのレベルを維持するその能力について試験することができる。
【０２０９】
本発明のさらなる態様において、例えば、医師および研究者が、哺乳動物において神経疾患を特性評価および／または定量化するために用いることができるコンピュータソフトウェアプログラムなどの、システムの形態での本明細書に記載の方法の実施が提供される。
【０２１０】
従って、例えば、医師および研究者が、対象または対象群について神経疾患を特性評価および／または定量化するために用いることができるコンピュータソフトウェアプログラムなどの、システムの形態での本明細書に記載の方法の実施が提供される。
【０２１１】
哺乳動物が神経疾患を発症するかどうかを評価するための本発明の方法は、上記の方法を実施することができる任意のデバイスを用いて実施することができると考えられる。用いることができるデバイスの例としては、必ずしも限定されるものではないが、あらゆる型のコンピュータなどの電子計算デバイスが挙げられる。本出願に記載される方法がコンピュータ中で実施される場合、本方法の工程を実行するためのコンピュータを構成するのに用いることができるコンピュータプログラムを、そのコンピュータプログラムを含有することができる任意のコンピュータで読取り可能な媒体中に含有させることができる。用いることができるコンピュータで読取り可能な媒体の例としては、限定されるものではないが、ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ならびにその他のメモリおよびコンピュータ記憶デバイスが挙げられる。本方法の工程を実行するためのコンピュータを構成するのに用いることができるコンピュータプログラムを、電子ネットワーク、例えば、インターネット、ワールドワイドウェブ、イントラネット、または他のネットワーク上に提供することもできる。
【０２１２】
一例においては、本明細書に記載の方法を、プロセッサと、本出願に記載の方法の工程をシステムに実行させるためのプログラムコード手段を含むコンピュータで読取り可能な媒体とを含むシステム中で実施することができる。プロセッサは、本方法の実施にとって必要とされる操作を実行することができる任意のプロセッサであってもよい。プログラムコード手段は、システム中で実施した場合、システムに本出願に記載の方法の工程を実行させることができる任意のコードであってもよい。プログラムコード手段の例としては、限定されるものではないが、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ、もしくはＦｏｒｔｒａｎなどの高レベルコンピュータ言語で書かれた本出願に記載の方法を実行するための命令；アセンブリー言語などの低レベルコンピュータ言語で書かれた本出願に記載の方法を実行するための命令；またはコンパイルおよびリンクされた機械語などのコンピュータで実行可能な形態の本出願に記載の方法を実行するための命令が挙げられる。
【０２１３】
関連バイオマーカーの検出により作成されるデータを、プログラム可能なデジタルコンピュータを使用して分析することができる。コンピュータプログラムは、検出されるバイオマーカーの数、および適宜、シグナルの強度またはレベルおよび検出されるそれぞれのバイオマーカーの決定される分子量を示すデータを分析する。データ分析は、バイオマーカーのシグナル強度またはレベルを決定する工程、および所定の統計分布から逸脱するデータを除去する工程を含んでもよい。例えば、いくつかの参照に対してそれぞれのピークの高さを算出することにより、観察されるピークを正規化することができる。参照は、スケールを０に設定したエネルギー吸収分子などの、装置および化学物質により生成されたバックグラウンドノイズであってもよい。
【０２１４】
バイオマーカーレベルの分析は、少なくとも２つのバイオマーカーのレベルと、所定の予測比または関連する値もしくは比のセットのものとを比較することをさらに含んでもよい。一実施形態においては、関連する比のセットは、本明細書に記載の方法に従って得られる。コンピュータ処理を用いて、バイオマーカーレベルの分析に分類分析またはアルゴリズムを容易に適用することができる。例えば、神経疾患の疾患分類と相関する本明細書に記載のバイオマーカーレベルを反映する参照３Ｄ等高線プロットを作成することができる。任意の所与の哺乳動物について、比較可能な３Ｄプロットを作成し、そのプロットを参照３Ｄプロットと比較して、対象が神経疾患を示すバイオマーカー比を有するかどうかを決定することができる。分類ツリー分析などの分類分析は、グラフ表示に特に適しており、解釈が容易であるため、バイオマーカーレベルを分析するのに適している。しかしながら、異なる哺乳動物から、または参照試料および哺乳動物からの複数のバイオマーカーレベルを比較し、本明細書に記載のような哺乳動物の疾患分類を示す出力を提供する任意のコンピュータに基づくアプリケーションを用いることができることが理解される。コンピュータは、得られるデータを、表示のための様々な形式に変換することができる。
【０２１５】
また、哺乳動物における神経疾患状態を示し、対照哺乳動物から誘導されるバイオマーカーの比をシステムに入力して、哺乳動物における新皮質アミロイド量のレベルを予測するためのモデルを作成することもできると考えられる。従って、哺乳動物における新皮質アミロイド量に関する理論値を決定して、前記哺乳動物における神経疾患の状態または可能性のある状態を予測するのを補助することができる。
【０２１６】
状態を正確に予測する診断または予後診断モデルまたは試験の力は、一般に、アッセイの感度、アッセイの特異度またはＲＯＣ（受信者操作特性）曲線下の面積として測定される。感度は、陽性であると試験により予測される真陽性のパーセンテージであるが、特異度は陰性であると試験により予測される真陰性のパーセンテージである。ＲＯＣ曲線は、特異度の関数としての試験の感度を提供する。ＲＯＣ曲線下面積が大きいほど、試験の予測値はより強力になる。試験の有用性の他の有用な尺度は、陽性予測値および陰性予測値である。陽性予測値は、陽性として試験される実際の陽性のパーセンテージである。陰性予測値は、陰性として試験される実際の陰性のパーセンテージである。
【０２１７】
ＲＯＣ法は、ある特定のマーカーがある人を割り当てられたクラスに正確に分類することができる基準を定義するための精度の測定のための手段として主に用いられてきた。ＲＯＣ分析は複数の転帰を提供し、その１つは、モデル性能を評価するための有用な尺度である曲線下面積（ＡＵＣ）である。
【０２１８】
神経疾患の存在または非存在は、従って、試料中の少なくとも２つの形態の関連するバイオマーカーのレベルを取得すること、次いで、その値を作成されたモデルに入力することによってその値を統計分析にかけること、および予測新皮質アミロイド量を取得することによって決定することもできる。次いで、予測新皮質アミロイド量は、予測新皮質アミロイド量が、例えば、高いか、または低いかどうかに基づいて、対象を、神経疾患の特定のリスクレベルと関連付けることができる。
【０２１９】
本発明の方法を用いるシステムの適用の例において、それぞれの対象について、哺乳動物に関する情報（例えば、年齢、性別）を、少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーの定量されたレベルと共に入力する。あるいは、アッセイされる哺乳動物に由来する試料を、個体に由来する２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルの測定および定量化を行うことができるシステムに提供する。次いで、ソフトウェアは、神経疾患と診断された哺乳動物に特徴的であると定義される予測比と比較した、哺乳動物に由来する２つの関連するバイオマーカーの定量されたレベルに基づくスコアを算出することができる。
【０２２０】
このシステムのさらなる例においては、システムはアッセイされる哺乳動物に関する理論的アミロイド量を戻すことができ、それはまた、アッセイされる哺乳動物の理論的アミロイド量と、ＰｉＢ状態が以前に実施された対照哺乳動物に由来する参照レベルとを比較することにより、哺乳動物がＰｉＢ陽性またはＰｉＢ陰性であるとの指示を戻すこともできる。
【０２２１】
次いで、スコアリングまたはＰｉＢ陽性もしくはＰｉＢ陰性状態を用いて、哺乳動物の疾患状態のさらなる診断を助ける、処置の有効性を評価する（処置が有効である場合、スコアは下がるべきである）、または哺乳動物群の平均スコアを算出して、新しい療法または群の特異的な特徴（例えば、遺伝子突然変異）を試験することができる。
【０２２２】
さらなる例においては、処置の有効性を、特定の対象上で測定されたＳＵＶＲスコアの低下によって評価することができる。当業者であれば、ＳＵＶＲスコアのこの低下は、神経疾患に向かう哺乳動物の進行を反映することを理解できる。それは、単一の時点での哺乳動物の定量的な、またはほぼ定量的な評価を提供し、所与の対象、または集団上での疾患進行のモニタリングを可能とする。
【０２２３】
哺乳動物におけるアミロイド量を、参照比と比較した場合に前記哺乳動物に由来する２つの関連する形態のバイオマーカーから作成された比の比較により得られるＰｉＢスコアと関連させることもできる。当業者であれば、アミロイド量がＳＵＶＲスコアに対して正規化されることを理解できる。さらなる例において、ＳＵＶＲスコアは、所定の値よりも大きいか、または小さくてもよく、算出された新皮質アミロイド量に基づいてアッセイされた哺乳動物における神経疾患の可能性のある状態を示してもよく、対照哺乳動物に由来する生物試料に由来するバイオマーカーの比較により得られる対照哺乳動物に由来する測定された参照比に基づくものである。
【０２２４】
そのような例においては、所定の値より小さいＳＵＶＲスコアは健康な人に対応し、所定の値か、またはそれより高いＳＵＶＲスコアは神経疾患を有する可能性があるか、または発症する可能性があると考えられる人に対応してもよい。このさらなる例においては、ＳＵＶＲスコアはまた、年齢、性別などの対象の人口統計を考慮に入れてもよい。さらなる例においては、ＳＵＶＲ閾値は、データの測定または変換のための適切な環境に応じて、より小さいものであってもよいことが想定され得る。
【０２２５】
従って、本発明の方法を、哺乳動物に由来する試料に由来する少なくとも２つの関連する形態のバイオマーカーのレベルを定量化すること、２つの関連する形態のバイオマーカー間の比を得ること、およびシステムにおけるこれらのものを、対照哺乳動物に由来する規定の比または既知の神経状態を示す試料から作成された参照比と比較することにより、哺乳動物における神経疾患の進行をモニタリングするためのシステムにおいて適用することができる。例えば、その哺乳動物に由来する比の減少または増加は、哺乳動物における神経疾患の進行（例えば、重症度の増大）を示すか、または示唆する。一例においては、哺乳動物の神経疾患状態のモニタリングを、２つの関連する形態のバイオマーカーの値の測定によってモニタリングして、神経疾患状態が、ＳＵＶＲより大きいもの（陽性の神経疾患状態の可能性を示す）からＳＵＶＲより小さいもの（正常または陰性の神経疾患状態ではない可能性を示す）への変化などの、実際の、予測された、または理論的なＳＵＶＲスコアにより確認される（ａｓ  ａｓｃｅｒｔａｉｎｅｄ）かどうかを決定することができる。さらなる例においては、哺乳動物における神経疾患の状態をモニタリングして、神経疾患状態が、ＳＵＶＲより小さいもの（正常または陰性の神経疾患状態ではない可能性を示す）から、ＳＵＶＲより大きいもの（陽性の神経疾患状態の可能性を示す）に変化するように、神経疾患状態が悪化するかどうかを決定することができる。
【０２２６】
さらなる態様においては、本発明は、１つもしくは複数の神経疾患の哺乳動物における診断および／もしくは予後診断のため、または１つもしくは複数の神経疾患を発症するリスクがある哺乳動物を同定するために用いることができるキットを提供する。
【０２２７】
従って、本発明は、哺乳動物における神経疾患の診断もしくは予後診断のために、神経疾患を発症するリスクがある哺乳動物を同定するために、または神経疾患を有する哺乳動物に投与される療法の効果をモニタリングするために、本発明の方法に従って用いることができるキットを提供する。
【０２２８】
考えられるキットは、必ずしも限定されるものではないが、本発明のバイオマーカーに特異的であるポリペプチド、タンパク質、および／またはオリゴヌクレオチドを含んでもよい試薬のパネルを含んでもよい。従って、キットの試薬を用いて、対象が高いアミロイド量と関連する神経疾患を有することを示す可能性があるバイオマーカーのレベルを決定することができる。例えば、検査下で本明細書に記載の方法により同定されるタンパク質またはタンパク質アイソフォームバイオマーカーを認識する任意の抗体を用いることができることが想定される。
【０２２９】
好ましくは、本発明の方法を実行するためのキットは、個体における新皮質アミロイドベータ量の存在を検出またはモニタリングするための試薬のパネルを含み、用いられる試薬は、本発明の方法に従って比を得るために少なくとも２つの形態の関連するバイオマーカーのレベルを決定することができる。そのような診断キットは、神経疾患を有する哺乳動物に投与される療法の効果のモニタリングのためにさらに用いることができる。
【０２３０】
好ましい実施形態においては、本発明は、神経疾患の哺乳動物におけるスクリーニング、診断または予後診断のための方法における使用のための試薬のキットであって、キットが哺乳動物に由来する試料中での少なくとも１つのバイオマーカーのレベルを定量化するための試薬のパネルを提供し、バイオマーカーが抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖またはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択される、前記キットを提供する。好ましくは、アイソフォームまたはその天然の誘導体は、抗トロンビンＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）のアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧまたはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩを含む群から選択される。より好ましくは、アイソフォームは、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、ＢもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢもしくはＪまたはａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥもしくはＧを含む群から選択される。
【０２３１】
患者は分析のための試料を提供することが想定される。試料を、本発明に従って加工し、ヘパリン結合親和性を有する分子を試料中で単離および同定することができる。好ましくは、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖、またはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームを含む群から選択されるバイオマーカーを分析することができる。対照試料を、同じ方法を用いて患者試料と同時に加工することができる。バイオマーカーのレベルを、本発明に従って決定および分析することができる。特に、バイオマーカーのアイソフォーム間の比を決定することができる。好ましくは、この比を、抗トロンビンＩＩＩ、血清アミロイドＰ、ａｐｏＪ（クラステリン）、アルファ−１−ミクログロブリン、ＡＮＴ３＿ＨＵＭＡＮ抗トロンビンＩＩＩ、ＡＰＯＨ＿ＨＵＭＡＮベータ２糖タンパク質、ＦＩＢＢ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンベータ鎖、ＦＩＢＡ＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンアルファ鎖、Ｃ９ＪＣ８４＿ＨＵＭＡＮフィブリノゲンガンマ鎖、ＩＴＩＨ２＿ＨＵＭＡＮインターアルファトリプシン阻害因子重鎖Ｈ２、ＨＲＧ＿ＨＵＭＡＮヒスチジンリッチ糖タンパク質、Ｂ０ＵＺ８３＿ＨＵＭＡＮ補体Ｃ４ベータ鎖、ＣＦＡＨ＿ＨＵＭＡＮ補体因子Ｈ、ＨＥＰ２＿ＨＵＭＡＮヘパリンコファクター２、およびＥ９ＰＢＣ５＿ＨＵＭＡＮ血漿カリクレイン重鎖、またはその天然の誘導体もしくはそのアイソフォームのアイソフォーム間で決定する。より好ましくは、この比を、抗トロンビンＩＩＩのアイソフォームＡ、Ｂ、ＣもしくはＪ、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）のアイソフォームＢ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＪ、ａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧまたはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩを含む群から選択されるアイソフォームまたはその天然の誘導体の間で決定する。より好ましくは、アイソフォームは、ＡＴＩＩＩのアイソフォームＡ、ＢもしくはＪ、ＳＡＰのアイソフォームＦ、ＢもしくはＪまたはａｐｏＪのアイソフォームＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦもしくはＧ、アルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥもしくはＧを含む群から選択される。
【０２３２】
好ましくは、分子がＡＴＩＩＩである場合、比は、限定されるものではないが、Ａ／Ｊ、Ｂ／ＪまたはＣ／Ｊなどの、少なくともアイソフォームＡ、Ｂ、ＣとＪの間で作成される。
【０２３３】
好ましくは、分子がＳＡＰである場合、比は、好ましくはアイソフォームＦとＪの間で作成される。
【０２３４】
好ましくは、分子がＡｐｏＪである場合、比は、好ましくはアイソフォームＡ、ＢとＤの間で作成される。
【０２３５】
好ましくは、第１の分子がアルファ−１−ミクログロブリンである場合、比は、好ましくはアルファ−１−ミクログロブリンのアイソフォームＥまたはＧの間で作成される。
【０２３６】
参照試料と比較した患者試料の作成比値の比較により、１つまたは複数の神経疾患の哺乳動物における診断および／もしくは予後診断が可能となるか、または１つもしくは複数の神経疾患を発症するリスクがある哺乳動物を同定することが可能となる。
【実施例１】
【０２３７】
アルツハイマー病（ＡＤ）のためのバイオマーカーの同定および検証
ａ）富化
血漿は、入手可能な最も複雑なマトリックスの１つである。かくして、プロテオミクス分析を阻害する高存在量のタンパク質の影響を低減させる必要がある。ヘパリンセファロースカラムを用いる親和性精製を含むタンパク質富化の方法が開発された。タンパク質富化のこの技術は、アルブミン、ハプトグロビンＩｇＧおよび補体Ｃ３などの高存在量タンパク質を除去するものである。富化プロセス全体で血漿中の総タンパク質の９０％を超えるタンパク質を枯渇させる。このプロセスは再現性が高く（ＣＶ＜５％、データは示さない）、１０μＬほどの血漿でも行うことができる。
【０２３８】
ｂ）定量的２Ｄゲル電気泳動
本実施例は、血液中のタンパク質が脳の中で起こる病理学的変化を反映し得ることを示すものである。特に、本発明者らは、個体の血漿中のタンパク質が臨床症状の１０〜２０年前に脳の中で起こるアミロイド蓄積を反映し得ることを示す。血漿からタンパク質を富化し、最近開発されたＺｄｙｅ（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｅｄ  Ｄｒａｔｚにより提供される）を用いて２Ｄ示差的ゲル電気泳動を実施することにより、アミロイドの蓄積が示された。異なる等電点条件（ｐＨ３〜１１＆ｐＨ４〜７）を用いるいくつかの異なる分析を実施したところ、狭いｐＨ範囲４．７〜５．９を用いた場合に診断マーカー；ＡＴ患者における抗トロンビンＩＩＩ：Ａβ、ａｐｏＪ：Ａβおよび血清アミロイドＰ（図１）ならびにＰＤ患者におけるアルファ−１−ミクログロブリン（図１１）を測定するための最良の結果が得られることが示された。
【０２３９】
ｃ）バイオマーカーは脳中のアミロイドと相関する
ＡＩＢＬは、長期的にＰｉＢ−ＰＥＴイメージングされた個体の最大のコホートの１つを有する。対応するＰｉＢ−ＰＥＴスキャンと共にＡＩＢＬベースラインコホートからの７３の個体のプロテオームを分析した。プロテオミックデータを、標準摂取率比（ＳＵＶＲ）と比較した。ＳＵＶＲは、脳中のＰｉＢの滞留を決定するために用いられる測定基準である。このデータベースにおいて、１．５より大きいＳＵＶＲを示す個体は、高い脳アミロイドおよびＡＤの前駆症状を有すると考えられる。プロテオミック分析により、５％の偽発見率に関する補正後のＡＮＯＶＡにより１．３より大きい倍数変化および０．０５未満のｐ値を有する３０を超える潜在的なバイオマーカーが得られた（原稿準備中）。タンパク質ａｐｏＪ、抗トロンビンＩＩＩおよび血清アミロイドＰは、診断にとって最良の性能であり、全て、高アミロイド個体と低アミロイド個体との間で１．３〜２．３の倍数変化（ｐ＜０．０１）を示すいくつかのアイソフォームを有していた。このデータは、血漿バイオマーカーとＰｉＢ−ＰＥＴ  ＳＵＶＲとの間の前例のない相関を示している（表１）。結果はまた、ＡｐｏＪとＡβの純粋な血漿レベルとの相関も示す（図９）。
【０２４０】
ｄ）血漿タンパク質および潜在的なバイオマーカー
ヘパリンセファロース富化プロセス、感受性Ｚｄｙｅ（ＡＩ  Ｄｒａｔｚにより提供される）、およびＡＩＢＬからの試料の組合せは、抗トロンビンＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｊ（ａｐｏＪ）、および血清アミロイドＰ（表１）およびアルファ−１−ミクログロブリン（図１０）を含む診断値を有するタンパク質の解明を可能にした。
【０２４１】
タンパク質を、質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＢＳｃｉｅｘ  ５６００  ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦおよびマトリックス支援レーザー脱離飛行時間、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｆｌｅｘｔｒｅｍｅ  ＩＩＩ）と組み合わせたインゲルトリプシン消化のための標準的なプロトコールを用いて同定した。２Ｄゲルからタンパク質を特性評価するプロセスの間に、ゲルソリン、アクチン、抗トロンビンＩＩＩ、アルファ−１−ミクログロブリンおよびａｐｏＪ（クラステリンとしても知られる）がＡβと複合体化したアイソフォームを有することが発見された。Ａβを、質量分析、１３５〜３３０の範囲のＡβに関するＭａｓｃｏｔスコアを用いて直接的に配列決定した。４０を超えるＭａｓｃｏｔスコアは、陽性の同定を示す。Ａβとこれらのタンパク質との存在を、２つの独立した事例において検証した。重要なことに、診断マーカーであるａｐｏＪと抗トロンビンＩＩＩは両方とも、Ａβと複合体化することがわかる。これは、これらのタンパク質がＡβのクリアランスに関与することと一致している。さらに、他のタンパク質と複合体化したＡβの存在は、ＥＬＩＳＡなどの抗体に基づく技術による検出からＡβエピトープを塞ぐ。これは、血漿中のＡβを測定することにより見出される診断的有用性の欠如に寄与し得る。この分析方法は、Ａβ：バイオマーカー複合体を直接測定するものであり、エピトープ排除の問題を回避する。
【０２４２】
【表１】
0006758184.tif 000002
【実施例２】
【０２４３】
脳における血漿バイオマーカー（ａｐｏＪ、抗トロンビンＩＩＩおよび血清アミロイドＰ）とアミロイド沈着との関係の決定ならびに潜在的なバイオマーカーの同定
血漿中のタンパク質は、脳中のアミロイド量を反映し、従って、脳アミロイドが蓄積するにつれて変化すると提唱されている。病理的には、最終的にアルツハイマー病をもたらすプロセスは、臨床兆候が生じる約１５年前に始まる。本発明者らは、脳中のアミロイドの存在を反映する、血漿中のタンパク質シグナチャーを発見した。さらに、これらのバイオマーカーは、高い脳アミロイドを有する個体を診断する能力を示す（表１）。
【０２４４】
Ａ）試料の採取および加工
ｉ）試料
試料を、神経疾患について陽性である参加者または対照から取得する。個体を、脳中のアミロイド量を反映するピッツバーグ化合物Ｂ（ＰｉＢ）ポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ）標準摂取率比（ＳＵＶＲ、高い＞１．５＜低い）に基づいて分離する。
【０２４５】
全血を、静脈穿刺により一晩絶食した参加者から採取した。試料を数回反転させ、血漿調製の前に室温で約１５分間、実験室オービタルシェーカー上でインキュベートした。全血を、プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）（Ｓａｐｐｈｉｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、３３．３ｎｇ／ｍＬ）をチューブに予め添加した、２つのＳａｒｓｔｅｄｔ  ｓ−ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）Ｋ３Ｅ（０１．１６０５．００８）７．５ｍＬチューブ中に採取した（使用前に４℃で保存）。
【０２４６】
次いで、全血を１５ｍＬのポリプロピレンチューブ中に混合し、ブレーキを用いずに２００ｘｇ、２０℃で１０分間回転させた。上清（血小板に富む血漿）を新鮮な１５ｍＬチューブに注意深く移し、境界面の５ｍｍ周辺を除去して、赤血球ペレットが動揺しないことを確保した。次いで、血小板に富む血漿を、ブレーキを用いて８００ｘｇ、２０℃で１５分間回転させた。次いで、血小板枯渇した血漿を１ｍＬのＮｕｎｃ  ｃｒｙｏｂａｎｋポリプロピレンチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に、０．２５ｍＬアリコートでアリコートし、すぐにドライアイス上のラックに移した後、アッセイに必要となるまで液体窒素蒸気タンクに移した。
【０２４７】
ｉｉ）ヘパリン結合親和性を有する分子の単離
材料：
ＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ  １ｍＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
バッファーＡ：５０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＮａＣｌ
バッファーＢ：５０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．０、１．５Ｍ  ＮａＣｌ。
【０２４８】
４５μＬのＥＤＴＡ血漿を、１８０μＬのバッファーＡと混合した。２００μＬの混合物を、０．５ｍＬ／ｍｉｎでＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰ  １ｍＬカラム（ヘパリンセファロースカラム）上にロードした。カラムを５倍カラム容量のバッファーＡ（０．５ｍＬ／ｍｉｎ）で洗浄した。タンパク質（分析物）を、１ステップ勾配を用いて１００％のバッファーＢにカラムから溶出させた後、４倍カラム容量のバッファーＢ（１００％のバッファーＢの最終洗浄に向かう各洗浄中の増大する勾配）で洗浄した（１ｍＬ／ｍｉｎ）。バッファーＢを用いる各洗浄後のカラムから溶出した材料を、１つの１．５〜２ｍＬ画分中に収集した。タンパク質の溶出を、２８０ｎｍでの吸光度を用いてモニタリングした。バッファーＢでカラムを４回洗浄した後、カラムを５倍カラム容量のバッファーＡで平衡化させた。平衡化後、次の２００μＬの試料（１８０μＬのバッファーＡと混合した４５μＬのＥＤＴＡ血漿）をカラムに添加した。
【０２４９】
ｉｉｉ）溶出した材料の加工
（ａ）還元、アルキル化および沈降
１０ｍＭのＴＣＥＰ［トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、Ｐｉｅｒｃｅ結合破壊剤中性ｐＨ  ５００ｍＭ］および２０ｍＭの４−ビニルピリジン（Ｓｉｇｍａ）を、ヘパリンセファロースカラムから溶出したタンパク質画分に添加した。次いで、タンパク質画分を室温で１時間、揺らしながらインキュベートした。インキュベーション後、４倍容量の冷アセトンを添加した［例えば、２ｍＬ画分＋８ｍＬ冷アセトン（Ｓｉｇｍａ  ＨＰＬＣ等級）］。
【０２５０】
アセトンを含有する画分を、反転により簡潔に混合した後、−２０℃で一晩（１６〜２０時間）インキュベートした。一晩インキュベートした後、試料を４℃で３０ｍｉｎ、スウィング型ローター中、４℃で遠心分離した。次いで、アセトンをデカンテーションにより除去し、残存するタンパク質ペレットを０．５〜１ｍＬのアセトンで洗浄した。次いで、アセトンをデカンテーションにより除去し、ペレットを室温で約１５分間、層流フード中で空気乾燥した。
【０２５１】
次いで、２５μＬの８Ｍ尿素（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、４％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ）を、乾燥したタンパク質ペレットに添加し、ペレットが溶解するまで試料をボルテックスした。試料を、２０００ｘｇで５〜１０秒間遠心分離した後、−２０℃で保存した。
【０２５２】
（ｂ）２Ｄゲル分析
再懸濁されたタンパク質ペレット試料を、氷上で約１時間解凍し、製造業者の説明書（Ｓｉｇｍａ）に従ってＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いてタンパク質濃度を決定した。２０〜７５μｇのタンパク質を０．５ｎモルのアミン反応性蛍光色素（ＺｄｙｅまたはＣｙｄｙｅ）を用いて室温で３０分間標識した。５０ｍＭリシンを添加し、室温で１５分間インキュベートすることにより、反応をクエンチした。次いで、標識されたタンパク質を、０．５％両性電解質（ｐＨ４．７〜５．９、ＢｉｏＲａｄ）を含有する再水和バッファー（７Ｍ尿素、２Ｍチオウレア、２％ＣＨＡＰＳ、微量のブロモフェノルブルー）中に希釈した。
【０２５３】
希釈された試料を、室温で一晩の受動的再水和により、乾燥等電点ストリップ（２４ｃｍ  ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ  ＩＰＧ、ＢｉｏＲａｄ）上にロードした。次いで、ストリップを合計９０〜１１０ｋＶｈにわたって泳動した。泳動後、ストリップを−２０℃で保存した。次いで、凍結したストリップを室温に持って行き、６Ｍ尿素、４％ドデシルセファロースナトリウム（ＳＤＳ）、３０％グリセロール、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ８．８を用いて２回平衡化させた（各洗浄は室温で１５分間のインキュベーションからなっていた）。次いで、ストリップを、色素の前部がゲルの底部になるまで、大規模フォーマット（２４ｃｍ）の１１％ＳＤＳ−ポリアクリルイミドゲル電気泳動を用いて第２のＳＤＳ次元において泳動した。
【０２５４】
（ｃ）ゲルイメージング
ゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ９５００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてイメージングした。ゲル画像を加工し、製造業者の説明書に従ってＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓプログラム（ＮｏｎＬｉｎｅｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ、ｖ４．５）を用いて、タンパク質スポットの存在量を比較した。Ａｎｏｖａ統計検定を用いて、タンパク質間に有意差があるかどうかを決定した。０．０５未満のｐ値は、有意な変化であると考えられる。ＰｉＢ−ＰＥＴにより決定された脳中のアミロイド量のため、どのタンパク質が変化したかを決定するために、１．５を超えるＳＵＶＲを有する個体と、１．５未満のＰｉＢ−ＰＥＴを有する対照個体とを比較した。
【０２５５】
最近開発されたＺｄｙｅ（共同研究者Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｅｄ  Ｄｒａｔｚにより提供された）を用いて２Ｄ示差的ゲル電気泳動を実施することにより、アミロイドの蓄積を示すことができる。異なる等電点条件（ｐＨ３〜１１＆ｐＨ４〜７）を用いるいくつかの異なる分析を実施したところ、狭いｐＨ範囲４．７〜５．９を用いた場合、診断マーカー；抗トロンビンＩＩＩ：Ａβ、ａｐｏＪ：Ａβおよび血清アミロイドＰを測定するための最良の結果が得られることが示された（図１）。
【０２５６】
（ｄ）マーカーとＰｉＢ／ＰＥＴとの相関
高ＰｉＢ−ＰＥＴ対低ＰｉＢ−ＰＥＴにおいて有意に変化することが見出されたタンパク質のレベルを、個体のＰｉＢ−ＰＥＴ  ＳＵＶＲ値に対してグラフ化して、相関が存在するかどうかを決定した。
【０２５７】
（ｅ）ＡＤ／ＰＤのためのマーカーとしてのマーカーの検証
パーキンソン病患者から上記のように採取された血漿の分析により、マーカーはアルツハイマー病に特異的であると決定された。１０人のＰＤ患者からの血漿を加工および分析し（上記の試料の採取および加工に記載のように）、健康な対照と比較した。タンパク質が低ＰｉＢ−ＰＥＴと比較して高ＰｉＢ−ＰＥＴ  ＡＤ患者において有意に変化することが見出され、高ＰｉＢ−ＰＥＴ  ＰＤ患者において有意な変化が観察されなかった場合、マーカーはＡＤに特異的であると考えられた。
【０２５８】
（ｆ）ＰＤ血漿に対するＡＤのためのマーカーとしてのマーカーの検証
パーキンソン病患者から上記のように採取された血漿の分析により、マーカーはアルツハイマー病に特異的であると決定された。ＰＤ患者からの血漿を加工および分析し（上記の試料の採取および加工に記載のように）、ＰＤ血漿に由来するマーカー（ＡＴＩＩＩ、ＡｐｏＪおよびＳＡＰ）を比較した。ＡＤ血漿中ではこれらのマーカーの有意な変化があったが、これらの同じＡＤマーカーはＰＤ血漿中では上昇しなかった（図８）。
【０２５９】
Ｂ）ＡＤに対する決定されたバイオマーカー
（ｉ）血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）
血清アミロイドＰは、アミロイドフィブリルに結合することが知られるタンパク質であり、ＡＤ斑および神経原線維変化などのアミロイド沈着の普遍的成分である。本明細書に記載のデータは、ＰｉＢ−ＰＥＴ−ＳＵＶＲとの負の相関を示し（表１）、脳中のアミロイドが多いほど、血漿中の血清アミロイドＰは少なく、以前の報告と一致することを示している。
【０２６０】
個々のＳＡＰアイソフォームとＰｉＢ−ＰＥＴ  ＳＵＶＲとの比較はまた、ＰｉＢ−ＰＥＴ  ＳＵＶＲとの強力で有意な相関を示した（表１）。７９％の感度および７２％の特異度を示すＲＯＣ曲線が、アイソフォームＢについて観察された；８１％の感度および６５％の特異度を示すＲＯＣ曲線がアイソフォームＦについて観察された（表１）。
【０２６１】
さらに、６７２２１３±３１８５８５の診断強度カットオフ値がアイソフォームＢについて観察された。従って、６７２２１３を超えるＳＡＰアイソフォームＢスポット強度を示す個体は、ＡＤを有する可能性が２．９倍高い。５１５０１９±２３０７０２の診断強度カットオフ値がアイソフォームＦについて観察された。従って、５１５０１９を超えるＳＡＰアイソフォームＦスポット強度を示す個体は、ＡＤを有する可能性が２．２倍高い。
【０２６２】
ＳＡＰアイソフォームＢとアイソフォームＦとの比の比較により、ＰｉＢ−ＰＥＴ  ＳＵＶＲとの強力で有意な相関が示された。７５％の感度および６８％の特異度を示すＲＯＣ曲線が観察された（表１）。さらに、５１８７０３の診断カットオフ比が観察された。従って、５１８７０３を超えるＳＡＰアイソフォーム比を示す個体はＡＤを有する可能性が２．４倍高い（表１）。
【０２６３】
ＳＡＰ（アイソフォームＢ）スポット強度とＡｐｏＪ（アイソフォームＥ）スポット強度との比を用いた場合、ＡＤと対照との分離がさらにより顕著になる。
【０２６４】
ＳＡＰアイソフォーム（Ｂ）とＡｐｏＪアイソフォームＥとの比の比較により、ＰｉＢ−ＰＥＴ  ＳＵＶＲとの強力で有意な相関が示された。７７％感度および８２％特異度を示すＲＯＣ曲線が観察された（表１）。さらに、０．３６の診断カットオフ比が観察される。従って、０．３６を超えるＳＡＰアイソフォーム比を示す個体は、ＡＤを有する可能性が４．３倍高い（表１）。
【０２６５】
（ｉｉ）抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）
抗トロンビンＩＩＩは、トロンビンの生理学的阻害因子であり、線維素溶解および凝集プロセスの重要な成分である。抗トロンビンＩＩＩとＡＤの役割に関する調査は限定的であった。本明細書に記載のデータは、初めて、抗トロンビンＩＩＩの血漿レベルがＡＤにおいて上昇し、脳中のアミロイドの沈着と相関することを示す（表１）。また、抗トロンビンＩＩＩがＡβに結合することができることも初めて示される。
【０２６６】
ＡＴＩＩＩアイソフォームの強度レベルを、高ＰｉＢ  ＡＤ患者からの試料において評価し、低ＰｉＢの対照におけるＡＴＩＩＩアイソフォームの強度レベルと比較した。このプロテオミック分析により、ＡＴＩＩＩ（アイソフォームＡ）は低ＰｉＢ対照と比較して高ＰｉＢ  ＡＤ患者において１．７倍高いことが同定された（ｐ値＝６．００ｘ１０−９）（表１）。プロテオミック分析により、高ＰｉＢ  ＡＤ患者におけるＡＴＩＩＩアイソフォームＢ（１．７倍増加；ｐ値＝６．００ｘ１０−１０）、Ｃ（１．５倍増加；ｐ値＝２．００ｘ１０−７）およびＡＴＩＩＩ  Ｊ（１．６倍増加；ｐ値＝６．００ｘ１０−９）は低ＰｉＢの対照と比較して高いことも同定された（表１）。
【０２６７】
また、ＡＴＩＩＩアイソフォームの強度レベルを、総ＡＴＩＩＩスポット強度と比較して、タンパク質発現比を得た。この比較により、抗トロンビンＩＩＩ塩基性アイソフォームと総ＡＴＩＩＩスポット強度との比が、認知機能が正常である個体と比較して、軽度の認知障害（ＭＣＩ）およびＡＤと臨床的に診断された患者において有意に上昇することが示された（図２および図３）。
【０２６８】
ＡＴＩＩＩアイソフォームＡタンパク質強度とＡＴＩＩＩアイソフォームＪタンパク質強度との比を用いた場合、ＡＤと対照との分離がさらにより顕著になる（表１）。診断剤としてのＡＴＩＩＩ（アイソフォームＡ）とＡＴＩＩＩ（アイソフォームＪ）単独の相関は、アイソフォームＡおよびアイソフォームＪについて、それぞれ０．８８および０．８４から、アイソフォームＡ／Ｊ比について０．９までの改善を示すＲＯＣ分析により証明される通り改善する（表１）。
【０２６９】
診断剤としてのＡＴＩＩＩ（アイソフォームＢ）とＡＴＩＩＩ（アイソフォームＪ）単独の相関も、アイソフォームＡおよびアイソフォームＪについて、それぞれ０．８９および０．８４から、アイソフォームＢ／Ｊ比について０．９までの改善を示すＲＯＣ分析により証明される通り改善する（表１）。
【０２７０】
同様に、診断剤としてのＡＴＩＩＩ（アイソフォームＣ）とＡＴＩＩＩ（アイソフォームＪ）単独の相関は、アイソフォームＣおよびアイソフォームＪについて、それぞれ０．８４および０．８４から、アイソフォームＣ／Ｊ比について０．８９までの改善を示すＲＯＣ分析により証明される通り改善する（表１）。
【０２７１】
さらに、診断剤としてのＡＴＩＩＩ（アイソフォームＡ、ＢおよびＣ）とＡＴＩＩＩ（アイソフォームＪ）単独の相関は、それぞれ、アイソフォームＡ、ＢおよびＣについて、０．８８、０．８９および０．８４およびアイソフォームＪについて、０．８４から、アイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ／Ｊ比について０．８９６６までの改善を示すＲＯＣ分析により証明される通り改善する（表１）。
【０２７２】
（ｉｉｉ）ＡｐｏＪ（クラステリン）
ゲノムワイド関連試験により、ａｐｏＪをコードする遺伝子であるクラステリンの単一ヌクレオチド多型が、ＡＤと関連することが示された。しかしながら、Silajdzic et al.は、ａｐｏＪの血漿レベルは上昇せず、診断値を提供しないと報告している。文献における相違は、疾患特異的タンパク質を富化することがＡＤにおける血漿ａｐｏＪの本発明者らの理解に対して有する影響を示している。このデータは、ａｐｏＪ（アイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）を測定する場合、ａｐｏＪの診断値がＲＯＣ分析において最良に捕捉されることを示している（表１）。
【０２７３】
従って、本発明者らは、ＡＤにおけるアミロイド蓄積に関する早期診断試験のための基礎を確立することができる３つの血漿バイオマーカーを見出した。２Ｄゲルおよび質量分析を用いる研究により、抗トロンビンＩＩＩおよびａｐｏＪ（図９）を血漿中に見出すことができ、Ａβに結合することが示された。ＰｉＢ−ＰＥＴイメージングは、脳におけるアミロイド量を報告する。
【実施例３】
【０２７４】
Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＡＤＮＩ、ＵＳＡ）からの独立試料を用いる診断マーカーの精度の相互検証
同定されたバイオマーカーは、独立国際コホートにおいて脳中のアミロイドに関する診断精度を維持する。血漿バイオマーカーは、それらが脳中の高いアミロイド（１．５より大きいＳＵＶＲ）を示す個体を予測することができることを示す。臨床実務への診断試験の翻訳に対する重要な工程は、いくつかの国際コホートにおける検証である。バイオマーカーを相互検証する第１の工程として、診断精度をＡＤＮＩ試験において試験することができる。
【０２７５】
ＡＤＮＩは、８００のＰｉＢ−ＰＥＴイメージングされた個体および血漿を提供する。採血およびＰｉＢ−ＰＥＴイメージングのためのプロトコールはＡＩＢＬにより用いられるものとは異なり、参加者のライフスタイルおよび遺伝的因子はＡＩＢＬコホートと比較して変化するため、これはバイオマーカーの妥当性および強固性を試験する。
【０２７６】
ａ）血漿試料
これらの試料を６つの別々の出荷でＡＤＮＩから出荷して（次いで、１５０試料／出荷のバイオマーカーを抽出することができる）、出荷中に試料を喪失するリスクを最小化することができる。試料をカタログ化し、分析まで−８０℃で保存した。タンパク質を上記のように加工した。試料を２Ｄゲルプロトコールおよび上記のようなＭＲＭ−ＭＳアッセイを用いて測定することができる。これにより、ＡＩＢＬからの２ＤゲルおよびＭＲＭ−ＭＳの結果と、ＡＤＮＩのものとの直接的な比較が可能になる。
【０２７７】
ｂ）統計分析
受信者操作特性分析を、Ｐｒｉｓｍ  ｖ．５．０ｂを用いて行う。全ての２Ｄゲル統計分析を、偽発見率の補正および一元配置ＡＮＯＶＡを含むＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓソフトウェア（非線形力学）を用いて行った。さらなる統計分析および支援は、ＡＩＢＬの一部である生物統計支援チームにより提供された。ＡＩＢＬ生物統計チームは、年齢、アミロイド量の変化、遺伝子型、および臨床神経心理測定基準などのモデリング変数を含む。
【実施例４】
【０２７８】
診断試験の使用
この診断試験の臨床使用は、以下の説明に概略されるように行うことができる。
【０２７９】
シナリオ１−臨床使用
脳中のアミロイドの存在について試験される対象は、症状を有している必要はないが、脳中のアミロイドの存在は６０〜７０歳の年齢の集団の１０〜２０％に存在するため、この年齢にある可能性がある（Rowe et al. 2010、Braak et al. 1996、Sugihara, 1995、Davies 1998）。かくして、患者は、臨床症状がないか、または認知障害もしくは自覚的記憶症状もしくは認知性能における他の欠陥を有する６０歳を超える年齢で診療所に提示する。抗凝固剤ＥＤＴＡを用いて個体から採血し、分析のために血漿を回収する。実施例２に上記されたプロセスを用いて分析を実施し、１つまたは複数のバイオマーカーを測定する。特定のタンパク質アイソフォームと各バイオマーカーの総レベルの比を、標準的な対照範囲と比較する。試験が、個体が脳中のアミロイドの存在について陽性であると示す場合、いくつかの選択肢が利用可能である：
ａ．イメージング技術または脳脊髄液試験により脳中のアミロイドの存在を確認するために個体を参照する。
ｂ．実行可能な処置が利用可能である場合、個体は処方された処置を有することができる。
ｃ．症状は存在するが、試験は陰性である場合、他の形態の認知症を試験することができる。
【０２８０】
シナリオ２−治療試験
アミロイドの蓄積は、臨床症状を呈する１５〜２０年前に脳中に生じ始め（Rowe et al. 2010）、疾患を検出することができるのが早いほど、アルツハイマー病の開始を防止する機会が多くなる。次いで、バイオマーカー試験は、新しい療法の有効性を試験するために脳中にアミロイドを有する個体を選択するための費用効果的な方法を表す。
【０２８１】
シナリオ３−パーキンソン病
パーキンソン病または他の運動障害と一致する症状を有することが疑われる個体は、抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いて採取された血液試料を有する。血漿中に存在するバイオマーカーを、本出願に記載のプロセスを用いて測定し、ＰＤ特異的バイオマーカーのレベルを正常範囲と比較することができる。
【０２８２】
シナリオ４−バイオマーカー発見
本出願に記載のプロセスを適用して、他の神経変性疾患の生物学的マーカーを発見することができる。そうすることを望む人であれば、本出願に概略されるプロトコールに従い、神経疾患試料と正常対照とを比較して、適切なバイオマーカーを決定することができる。
【０２８３】
実施例６
血漿タンパク質のディーププロテオミクス（ｄｅｅｐ−ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）スクリーンは、ＭＡＲＳ１４カラムを用いるアルツハイマー病のためのバイオマーカーを示す−比較例
加齢に関するオーストラリア人のイメージングおよびバイオマーカーライフスタイル（ＡＩＢＬ）主要試験を用いて、マーカーを検索し、ＡＤ病理の機構を解明した。血漿タンパク質を免疫枯渇させ、スペクトル分解された蛍光色素（ＺｄｙｅｓＴＭ）を用いる２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に予備分画して、ＡＤおよび健康な対照の血漿プロテオームを比較した。最近開発されたＺｄｙｅを用いて、無傷のタンパク質アイソフォームおよびその切断生成物のプロテオミクススクリーンを行った。
【０２８４】
この試験において、Ｎ＝７２の推定散在性ＡＤ患者およびＮ＝７２の健康な対照の性別を一致させたコホートの初期スクリーンからのプールされた血漿試料を用いた。
【０２８５】
材料および方法
免疫枯渇およびサブ分画化
エチレンジアミン四酢酸血漿の３つの独立したプールを、実施例２に概略されたように、男性のＡＤ（ｍＡＤ）、女性のＡＤ（ｆＡＤ）、男性の健康な対照（ｍＨＣ）および女性の健康な対照（ｆＨＣ）のそれぞれについてＮ＝１２の対象から調製した。プールされた血漿試料を、製造業者の説明書に従って複数の親和性除去システム（ＭＡＲＳ）１４カラム（ＭＡＲＳ−１４、４．６ｘ１００ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて免疫枯渇させた。流出物である低存在量タンパク質を収集し、Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｈｉｇｈ−ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｍａｃｒｏ−ｐｏｒｏｕｓ  ４．６ｍｍＸ５０ｍｍ）を用いて６つのサブ画分に分画した。
【０２８６】
サブ画分を凍結乾燥し、２つのスペクトル分解された蛍光色素（Ｚｄｙｅ  ＬＬＣ）を用いて標識化のために再懸濁した。フォワードおよびリバース標識化を用いて、色素の偏りを防止した。標識された試料を、２４ｃｍのｐＨ３〜１１のＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（商標）Ｄｒｙｓｔｒｉｐｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および１１％アクリルアミドゲル上で分解した。ゲルを、Ｔｙｐｈｏｏｎ（商標）Ｔｒｉｏスキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて蛍光についてスキャンした。偽色画像を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて生成した。ゲル画像ファイルを、加工、アラインメントおよび分析のためにＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＳａｍｅＳｐｏｔｓソフトウェア（非線形力学）中にインポートした。
【０２８７】
対象のタンパク質の同定
変化するタンパク質変異体を同定するために、対象のスポットを、インゲル消化（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈプロテオミクス等級ブタトリプシン）のために、分画されたタンパク質の分析または分取ゲルから手動で切り出した。
【０２８８】
結果
ヒト血漿のディーププロテオミクス調査
免疫枯渇およびＲＰサブ分画化戦略により、２ＤＧＥによる比較のために６つのサブ画分のタンパク質を生成した。６つのＲＰサブ画分のそれぞれの代表的な分析ゲル画像を、図４に示す。１より多い画分中に溶出したタンパク質を構成する総スポット計数を１０％で補正した後、約３，４００個のユニークな変異体をこの方法により分析することが見積もられた。これを、ＭＡＲＳ−１４免疫枯渇したが、分画されていない血漿から調製されたゲル中の約６１０個のスポットと比較する。大きくは異なる疎水性を有する多くの同時に移動する高ＭＷポリペプチドはＲＰ−ＨＰＬＣにより分離され、ゲルの分析における相互干渉を低減するため、サブ画分の数と共にタンパク質スポットの量の大まかに直線的な増加が生じる。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣはタンパク質を富化し、より少ない存在量の種を、共有的タンパク質色素標識反応においてより重度に標識することができる。
【０２８９】
上記の試験対象患者基準を満たしたスポットを、表３に列挙し、図４中に矢印で示す。
【０２９０】
試験対象患者基準に従って対照からＡＤを識別した８つのタンパク質の変異体、サブユニットまたは切断生成物を同定した：
（ｉ）亜鉛α２−糖タンパク質（ＺＡＧ）、
（ｉｉ）ヒスチジンリッチ糖タンパク質（ＨＲＧ）断片、
（ｉｉｉ）ハプトグロビン（Ｈｐｔ）、
（ｉｖ）ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、
（ｖ）補体因子Ｉ（ＣＦＩ）、
（ｖｉ）インター−αトリプシン阻害因子（ＩＴＨＩ）、
（ｖｉｉ）α−１抗トリプシン（α１ＡＴ）および
（ｖｉｉｉ）アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）。
【０２９１】
【表２】
0006758184.tif 000003
【０２９２】
本実施例は、ＡＤのための異なるセットのバイオマーカーを、本発明のヘパリン−セファロースカラム手法と比較して血漿試料を免疫枯渇させ、サブ分画化するためにＭＡＰ−１４を用いるプロセスから得ることができることを示す。ＭＡＲＳ−１４カラムは、枯渇のために血清アルブミン、トランスフェリン、ハプトグロビン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、α１ー抗トリプシン、フィブリノゲン、α２−マクログロブリン、α１−酸糖タンパク質、補体Ｃ３、ＩｇＭ、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＡＩＩおよびトランスサイレチンを標的とする。
【０２９３】
実施例７
パーキンソン病におけるバイオマーカー発見−アルファ−１−ミクログロブリン
全試料を、上記の実施例に記載のように加工した。
【０２９４】
この試験の目標は、ヘパリン結合を用いるバイオマーカーワークフローを適用して、パーキンソン病（ＰＤ）のための診断用血液に基づくバイオマーカーを発見することであった。タンパク質アルファ−１−ミクログロブリン（ＡＭＢＰ、ＡＭＢＰ遺伝子のアミノ酸２０〜２０３）は、上記のヘパリンセファロース富化プロセスを用いた場合、ＰＤ血漿中で上昇することが見出された。ＡＭＢＰのレベルは、ＰＤの重症度と共に増加する（図１０）。
【０２９５】
２Ｄゲル分析を用いた場合、アルファ−１−ミクログロブリンのためのマーカーが明らかである（図１１）。この図面はまた、アルファ−１−ミクログロブリンの様々なアイソフォームも示す。
【０２９６】
比の分析を、本明細書に記載のように行った。アルファ−１−ミクログロブリンの２つのアイソフォームＧおよびＥの比は、それがアイソフォーム単独よりも良好な診断精度を有することを示す（図１０は、アイソフォームＥのみのＲＯＣ分析を示す）。ＲＯＣ分析により、０．８６（９５％ＣＩ  ０．７８〜０．９４）の曲線下面積および０．０００１未満のｐ値が得られる。しかしながら、ＰＤと対照とのスポット数またはアイソフォーム１９３／１６６（Ｇ／Ｅ）の比の比較を、図１２に示す。破線は、試験の８０％の特異度を表し、カットオフ値にある個体は５．０のオッズ比を有する（ｎ＝３１の対照、ｎ＝５１のＰＤ）。
【０２９７】
実施例８
アルツハイマー病の認知症状が起こる前の脳におけるアミロイドの検出のためのバイオマーカー
（ｉ）試料の調製
ＥＤＴＡ血漿試料を、ＰＥＴイメージングにより評価された場合に脳アミロイドについて陰性であったか、または脳アミロイドについて陽性であった認知的に正常な個体から、実施例１に記載のように収集した（ｎ＝６の陰性およびｎ＝７の陽性）。４００μＬの媒体からなるヘパリンセファロースＨＰ（ＧＥ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のミニスピンカラムを用いて、試料をタンパク質富化した。試料を、実施例２に記載のようにバッファーＡで希釈した。タンパク質を、実施例２に記載のようにヘパリンセファロースから溶出させた。
【０２９８】
試料を、上記の実施例に記載のように調製した。しかしながら、この点での唯一の相違は、ミニスピンカラムと、予備包装されたカラムおよびＨＰＬＣとの使用であった。
【０２９９】
固体尿素を、ヘパリンセファロースから溶出したタンパク質に添加して、最終濃度８Ｍの尿素を達成した。タンパク質を、１０ｍＭジチオトレイトールで還元（１ｈ、３７℃）した後、４０ｍＭヨードアセタミドでアルキル化（１ｈ、３７℃）した。次いで、試料を５０ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ８で８倍希釈し（例えば、１００μＬの試料＋７００μＬのバッファー）、プロテオミクス等級のトリプシンを１：１００の比（トリプシン：タンパク質）で添加し、静置して３７℃で一晩消化した。最終濃度１％となるようにギ酸を添加することにより消化を停止させた。次いで、製造業者の説明書（Ｗａｔｅｒｓ、１ｃｃ）に従ってＣ１８固相抽出カートリッジを用いて、ペプチドを脱塩した。次いで、脱塩したペプチドを遠心減圧濃縮装置中で乾固まで濃縮した。液体クロマトグラフィー分析の直前に、ペプチドを３％アセトニトリルと共に水中の０．１％ギ酸に再懸濁した。５００ｎｇのペプチドを、ＱＥｘａｃｔｉｖｅ  ｐｌｕｓと組み合わせたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅａｓｙ−ｎＬＣ  １０００ＨＰＬＣシステム上で分析した。
【０３００】
（ｉｉ）ペプチド分離
最初に、試料を、８００ｂａｒの最大圧力設定でＴｈｅｒｍｏ  Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８捕捉逆相カラム（７５μｍｘ２ｃｍのｎａｎｏｖｉｐｅｒ、３μｍの粒径）上にロードした。３５℃で７５μｍｘ２５ｃｍのＰｅｐＭａｐ  ＲＳＬＣ  Ｃ１８（２μｍの粒径）Ｅａｓｙ−Ｓｐｒａｙ  Ｃｏｌｕｍｎを用いる勾配溶出のために移動相としてバッファーＡ（水中の０．１％ギ酸）およびバッファーＢ（アセトニトリル中の０．１％ギ酸）を用いて、３００ｎＬ／分で分離を達成した。
【０３０１】
ペプチド溶出は、３〜８％アセトニトリル勾配を１０ｍｉｎ用いた後、１０〜４０％アセトニトリル勾配を３０ｍｉｎ用いた。９５％アセトニトリル洗浄および再平衡化を含む、総獲得時間は６２分であった。Ｃ１８カラムから溶出したペプチドを、ｎａｎｏＥＳＩを介して質量分析計に導入し、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。電子スプレー電圧は１．８ｋＶであり、イオン導入管温度は３２０℃であった。割り付けられていない種および＋１電荷種を含まない上から１５のデータ依存的ＭＳ２獲得方法を用いて、７００００の質量分解能（ｍ／ｚ  ２００）でｍ／ｚ  ４００〜１６００の範囲にわたってＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析装置中で完全ＭＳスキャンを獲得した。標的の値は３．００Ｅ＋０６であった。２以上の電荷状態を有する１５の最も強いピークを、１．４ｍ／ｚの単離ウィンドウを用いて単離し、２７％の正規化衝突エネルギーを用いてＨＣＤ衝突セル中で断片化した。タンデム質量スペクトルを、ｍ／ｚ２００で１７，５００の質量分解能を有するＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析装置中で獲得した。自動獲得対照標的値は、２．０Ｅ＋０５に設定した。イオン選択閾値は２．００Ｅ＋０４計数に設定した。最大許容イオン蓄積時間は完全ＭＳスキャンについては３０ｍｓであり、タンデム質量スペクトルについては５０であった。全ての実験について、力学的排除時間は１０ｓに設定した。
【０３０２】
（ｉｉｉ）ペプチド分析
データベース検索を、最初は非冗長ヒトデータベースに対する検索のためにＳＥＱＵＥＳＴ  ＨＴを用いて、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ１．４（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。また、対応する逆転データベースに対するデータベース検索を実施して、ペプチド同定の偽発見率（ＦＤＲ）を評価した。ＳＥＱＵＥＳＴ  ＨＴ検索パラメータは、前駆体のイオン質量許容差１０ｐｐｍおよび生成物のイオン質量許容差０．０８ｍ／ｚ単位を含んでいた。システインカルバミドメチル化を固定修飾として設定したが、Ｍ酸化、Ｃ末端アミド化および脱アミド化（ＮＱの）ならびにＮ末端のＧｌｎからピロ−Ｇｌｕを可変修飾として設定した。全てのデータベース検索について、２回までの間違った切断を示すトリプシン消化を、消化パラメータについて特定した。示差分析を、Ａ対Ｂの示差実験モデルと共に、ＳＥＩＶＥ２．１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて行った。
【０３０３】
（ｉｖ）結果
脳アミロイドについて陰性の６つの健康な対照（ＰＥＴイメージングにより決定）と、脳アミロイドについて陽性の７つの認知的に正常な対照とのこの比較は、本発明のヘパリンセファロースタンパク質富化を用いることにより、健康な対照の脳におけるアミロイド量のため、バイオマーカーが上昇することが示されたということを示す。以前の文献は、対照とＡＤ患者との比較に注目してきた。
【０３０４】
結果を、表３に示す。
【０３０５】
【表３】
0006758184.tif 000004
【０３０６】
表３において、タンパク質の名称の後に、測定されたトリプシンペプチドの数、タンパク質存在量の変化、その変化の標準偏差およびｔ検定からのｐ値が記載される。所与のタンパク質について分析されたそれぞれ個々のペプチドの変化から、比を平均した。１．０より大きい比は、タンパク質存在量の増加を示す。
【０３０７】
タンパク質の比に関して、データは、これらのものが潜在的に診断的であることを示す。これらの潜在的なバイオマーカーは、高い脳アミロイドを有する個体において変化する。かくして、比は、バイオマーカーの診断能力を改善し、ＭＳからのこのデータを、例えば、抗トロンビンＩＩＩなどの１つのバイオマーカーからの２つのペプチドの比の測定を用いてさらに分析することができる。同じタンパク質からの２つのペプチドの比の使用は、試料の保存および取り扱いを制御するための多くの利点を有する。
【０３０８】
これは、タンパク質またはペプチドの分離前の試料の加工におけるヘパリンセファロースの使用は、アルツハイマー病の認知症状が生じる前でも、ＡＤのための高感度診断剤の基礎を形成することができる潜在的な診断バイオマーカーへのアクセスを提供することを示す。
【０３０９】
このデータは、いくつかがＤＧＥとＭＳなどの両方の技術の間で同じであるバイオマーカー（すなわち、抗トロンビンＩＩＩ）を発見するための異なるプロテオミクス技術［質量分析（ＭＳ）］を示す。従って、これは、ＡＴＩＩＩがＡＤのための診断マーカーとしての可能性を示すことを検証する。
【０３１０】
本発明の前記の記載により、当業者であればその最良の様式であると現在考えられるものを作製および使用することができるが、当業者であれば、本明細書に記載の特定の実施形態、方法、および実施例の変化、組合せ、および等価物の存在を理解および認識できる。従って、本発明は、上記の実施形態、方法、および実施例によっては限定されないが、本明細書に広く記載される本発明の範囲および精神の範囲内の全ての実施形態および方法によって限定されるべきである。
【図１】
0006758184.tif 000005
【図２】
0006758184.tif 000006
【図３】
0006758184.tif 000007
【図４】
0006758184.tif 000008
【図５】
0006758184.tif 000009
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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