(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から採取した生体試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する方法であって、
（１）被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合することにより、前記生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体、前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド、及び前記ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドからなる複合体を調製する工程、
（２）前記複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる工程、並びに
（３）酵素活性を測定する工程、
を含み、
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド及び前記ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが同一又は異なって配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨが６．５〜７．５である、方法。
【請求項２】
前記生体試料が、血液、唾液、又は歯肉溝滲出液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記歯周病原菌がポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬であって、前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨが６．５〜７．５である、試薬。
【請求項５】
請求項４に記載の試薬、及び
ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬
を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用キットであって、
ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周病は、歯周病原菌が歯周組織に感染することによって発症する炎症性疾患である。一般に、歯周病の診断は、歯周ポケット検査、触診・出血検査、動揺度検査、Ｘ線写真検査等の結果を総合して行われているが、これらの検査手法は歯科医師等の経験・技能等に基づいて行われるため、検査結果及び診断結果に差異が生じる可能性があり、客観性に欠くという問題がある。そのため、客観的に歯周病の診断を行う手法の開発が望まれている。
【０００３】
客観的に歯周病の診断を行う手法としては、例えば、歯周病原菌に対する血清中のＩｇＧ抗体価を歯周病の感染度又は重篤度の指標とする方法が報告されている（非特許文献１参照）。当該非特許文献１では、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）等の歯周病原菌抗原に対する血清中のＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果、歯周病の治療後において治療前よりもＩｇＧ抗体価が減少することが報告されている。
【０００４】
しかしながら、上記非特許文献１で用いられたＥＬＩＳＡ法は、抗原の固定化、血清中のＩｇＧ抗体との一次抗体反応、及び抗ヒトＩｇＧ抗体との二次抗体反応の一連の操作を手作業で行う必要があるため、高コストかつ操作が煩雑であり、被検体から採取した血清等の生体試料について自動化された機器等により高速処理を行うことが難しいという問題がある。
【０００５】
このような問題点を解決するために、本発明者らは、これまでに、歯周病を高い精度で検査することができ、かつ自動化された機器等により高速処理を行うことが可能な画期的な手法を開発している。本発明者らが開発した手法では、歯周病原菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）から単離された特定の１次構造を有するポリペプチド又はその改変ポリペプチド（歯周病原菌抗原ポリペプチド）を用いることにより、多様な免疫型を有する広範囲の患者の歯周病を高い精度で検査することができ、かつ自動化された機器等により高速処理を行うことが可能となる（特許文献１及び２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０８１３０６号
【特許文献２】特開２０１３−０８７０８７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ，２２，５１０−５１５（１９９５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記した従来技術の現状及び問題点に鑑みてなされたものであり、自動化された機器等による高速処理が可能で、かつ簡便な操作により、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出することができる新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記した課題を解決すべく鋭意検討を重ねる中で、特開２０１０−０４４０８３号公報において提案されている手法を応用することにより、さらなる高速化を図ることができ、かつより簡便な操作により歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出することができるのではないかという着想を得るに至った。なお、当該特開２０１０−０４４０８３号公報では、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体などの測定対象物質と、抗原（アレルゲン）などの当該測定対象物質に特異的に結合する第一の生理活性物質にビオチンなどのリガンドが結合された結合体と、酵素標識された抗ヒトＩｇＥ抗体などの酵素標識された第二の生理活性物質とを特定の条件下で接触させることによりこれらの複合体を形成した後、当該複合体を含む溶液を抗ビオチン抗体などのリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタに滴下し、多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定する方法が提案されている。
【００１０】
本発明者らは、上記特開２０１０−０４４０８３号公報に記載の方法を応用し、健常者又は歯周病患者から採取した血清と、ビオチンが結合された歯周病原菌抗原ポリペプチドと、酵素標識された抗ヒトＩｇＧ抗体とを接触させることによりこれらの複合体を形成した後、当該複合体を含む溶液を抗ビオチン抗体などのリガンド捕捉剤が結合された多孔性フィルタに滴下し、多孔性フィルタに結合した酵素の活性を測定したところ、健常者と歯周病患者との間で測定結果に明確な差が見られないという問題が生じることを見出した（下記参考例参照）。
【００１１】
本発明者らは、上記した問題点を解決すべく、さらに鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、酵素標識された抗ヒトＩｇＧ抗体に替えて、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを用いることにより、健常者と歯周病患者との間で測定結果に有意差が見られるようになることを見出した。本発明者らは、かかる知見に基づきさらなる研究を重ねることにより本発明を完成させるに至った。
【００１２】
即ち、本発明は、代表的には以下の項に記載の主題を包含する。
【００１３】
項１．
被検体から採取した生体試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する方法であって、
（１）被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合することにより、前記生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体、前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド、及び前記ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドからなる複合体を調製する工程、
（２）前記複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる工程、並びに
（３）酵素活性を測定する工程、
を含み、
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド及び前記ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが同一又は異なって配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
項２．
前記生体試料が、血液、唾液、又は歯肉溝滲出液である、上記項１に記載の方法。
項３．
前記歯周病原菌がポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）である、上記項１又は２に記載の方法。
項４．
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨが６．０〜８．０である、上記項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．
酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬であって、前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、試薬。
項６．
前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨが６．０〜８．０である、上記項５に記載の試薬。
項７．
ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬であって、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、試薬。
項８．
上記項５又は６に記載の試薬、及び上記項７に記載の試薬を含む、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の方法によれば、簡便な操作により、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出することができる。また、本発明の方法は、自動化された機器等による高速処理が可能である。さらに、本発明の方法によれば、歯周病の診断を行うにあたって、客観的なデータを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】参考例において形成された、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドとＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体と血清中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体との複合体と、多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体との結合の概略図を示す。図中、「ビオチン標識Ｐｇ抗原」はビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを、「ＡＬＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体」はＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を、「ヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体」は歯周病原菌に対するヒトＩｇＧ抗体を、それぞれ示す。
【図２】実施例１において形成された、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドとＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドと血清中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体との複合体と、多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体との結合の概略図を示す。図中、「ビオチン標識Ｐｇ抗原」はビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを、「ＡＬＰ標識Ｐｇ抗原」はＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを、「ヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体」は歯周病原菌に対するヒトＩｇＧ抗体を、それぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１７】
本発明は、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する方法に関する。なお、以下において、本発明の歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する方法を単に「本発明の方法」と記載する場合がある。
【００１８】
本発明の方法では、被検体から採取した生体試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出する。即ち、被検体から採取した生体試料を対象物とする。
【００１９】
被検体としては、ヒトのみならず、歯周病原菌の感染が起こり得る生体であれば特に制限されず、非ヒト哺乳動物であってもよい。被検体となるヒトとしては特に制限されず、健常者であるか、歯周病に罹患したヒト（歯周病患者）であるかを問わず、また、歯周病の罹患が疑われるヒトであってもよい。また、非ヒト哺乳動物としては、ペット、家畜、実験動物等として飼育される哺乳動物が好ましい。例えば、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ、リャマ等が挙げられる。
【００２０】
生体試料としては、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を含み得る試料であって、かつ上記した被検体から採取可能な試料であれば特に制限されない。採取の容易さ、取扱い易さ等の観点からは、生体試料としては、血液、唾液、又は歯肉溝滲出液が好ましい。血液を生体試料として用いる場合には、血漿又は血清が特に好ましい。被検体から生体試料を採取する方法としては特に制限されず、常法に従って行えばよい。また、被検体から採取した生体試料は、そのまま、後述する被検体から採取した生体試料を含む溶液として用いてもよいし、凍結乾燥等して保存した後、当該凍結乾燥物を後述する適当な溶媒に溶解して後述する被検体から採取した生体試料を含む溶液として用いてもよいし、また、被検体から採取した生体試料を、そのまま冷凍保存した後、あるいは後述する適当な溶媒に溶解する等して冷凍保存した後、使用時に解凍して用いてもよい。さらに、血漿を生体試料として用いる場合には、ろ紙や血漿分離機等により分離された血漿であってもよい。なお、被検体から採取した生体試料を保存する方法、条件等については特に制限されず、常法に従って行うことができる。
【００２１】
本発明の方法は、（１）被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合することにより、前記生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体、前記酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド、及び前記ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドからなる複合体を調製する工程、（２）前記複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる工程、並びに（３）酵素活性を測定する工程を含む。なお、以下において、上記（１）〜（３）の工程を、それぞれ「工程（１）」、「工程（２）」、及び「工程（３）」と記載する場合がある。
【００２２】
工程（１）では、被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合する。
【００２３】
被検体から採取した生体試料を含む溶液は、被検体から採取した生体試料そのものであってもよいし、被検体から採取した後、適当な溶媒に溶解させたものであってもよいし、また、被検体から採取した後、凍結乾燥等して保存してある生体試料を適当な溶媒に溶解させたものであってもよい。溶媒としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ  Ｂｕｆｆｅｒなどを例示することができる。これらの溶媒は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤などを含むものであっても良い。また、これらの溶媒は、亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤を含むものであってもよい。
【００２４】
酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液に含まれる酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドは、後述する歯周病源菌抗原ポリペプチドに酵素が結合されたものである。酵素としては、後述する工程（３）において酵素活性を測定可能なものであれば特に制限されず、例えば、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。なお、歯周病原菌抗原ポリペプチドに酵素を結合させる方法としては、特に制限されず、常法によって行えばよい。
【００２５】
酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドは、歯周病原菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）から単離されたポリペプチド又はその改変ポリペプチドである。具体的には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。これらの中でも、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び１４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、配列番号１、２、３、及び４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドがより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドが特に好ましい。
【００２６】
酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液の溶媒としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ  Ｂｕｆｆｅｒなどを例示することができる。これらの溶媒は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤などを含むものであっても良い。また、これらの溶媒は、亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤を含むものであってもよい。なお、下記の実施例２において記載するように、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液は、当該溶液のｐＨ条件により、保存日数が経過するにつれて試薬ブランクの発光値が上昇する傾向がある。試薬ブランクの発光値が大幅に上昇すると、生体試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出することが困難となる。そのため、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨは、６．０〜８．０程度の範囲とすることが好ましく、６．５〜７．５程度の範囲とすることがより好ましい。
【００２７】
ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液に含まれるビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドは、歯周病源菌抗原ポリペプチドにビオチンが結合されたものである。歯周病原菌抗原ポリペプチドにビオチンを結合させる方法としては、特に制限されず、常法によって行えばよい。
【００２８】
また、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドは、上記した酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドと同様に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）から単離されたポリペプチド又はその改変ポリペプチドである。具体的には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。これらの中でも、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び１４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、配列番号１、２、３、及び４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドがより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドが特に好ましい。なお、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドと、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドとは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００２９】
ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液の溶媒としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ  Ｂｕｆｆｅｒなどを例示することができる。これらの溶媒は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤などを含むものであっても良い。また、これらの溶媒は、亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤を含むものであってもよい。
【００３０】
上記した、被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合する方法及び条件については特に制限されない。例えば、被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合し、４〜５０℃の条件下、好ましくは２５℃から４５℃の条件下、さらに好ましくは３５℃から４２℃の条件下で１０秒〜３０分程度、好ましくは１分〜１５分程度、撹拌あるいは静置する方法などが挙げられる。
【００３１】
被検体から採取した生体試料を含む溶液、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を混合することにより、抗原−抗体反応が起こる結果、生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドからなる複合体が形成される。具体的には、抗原−抗体反応により、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドと生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体とが結合し、かつビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドと生体試料中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体とが結合することにより、当該複合体が形成される。
【００３２】
工程（２）では、上記工程（１）で調製した複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる。
【００３３】
抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体は、多孔質担体に抗ビオチン抗体が固定化されたものである。多孔質担体としては、特に制限されず、無機化合物、ガラス、ポリエチレン等の高分子化合物、セルロース、セルロース誘導体等の多糖類などを材質とする繊維、膜などを用いることができる。中でも、ガラス繊維は、非特異的なタンパク質の吸着が少ないことから好ましい。
【００３４】
多孔質担体に抗ビオチン抗体を担持（固定化）する方法としては、特に制限されず、例えば、多孔質担体としてガラス繊維を用いる場合には、特開２０１０−０４４０８３号公報に記載の方法を適用することができる。具体的に、当該特開２０１０−０４４０８３号公報には、物理的固定化方法として、ガラス繊維の上部から、湿潤用緩衝液、抗ビオチン抗体を含む溶液、ブロッキング溶液、及び安定化剤を含む溶液を添加し、凍結乾燥することにより、ガラス繊維に抗ビオチン抗体を固定化する方法が記載されており、また、化学的固定化方法として、ガラス繊維をアミノアルキルシラン−グルタルアルデヒドで処理し、上記の物理的固定化方法と同様にして各種溶液を添加した後、凍結乾燥することにより、ガラス繊維に抗ビオチン抗体を固定化する方法が記載されている。
【００３５】
また、多孔質担体に抗ビオチン抗体を担持（固定化）する場合、抗ビオチン抗体は多孔質担体に直接固定化されていてもよいし、抗ビオチン抗体に対する抗体などのスペーサーを介して抗ビオチン抗体が固定化されていてもよい。
【００３６】
上記工程（１）で調製した複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる方法としては、特に制限されないが、例えば、複合体を含む溶液を抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体の上部に添加又は滴下する方法が挙げられる。この場合、複合体を含む溶液が適切に多孔質担体を通過するようにするために、多孔質担体の下部に吸収体を備えた容器を用いることが好ましい。具体的には、特開２０１０−０４４０８３号公報に記載されているような、セルロースからなる吸収体を備えた容器が例示される。
【００３７】
また、複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させる際の条件としては特に制限されないが、例えば、４〜５０℃の条件下、好ましくは２５℃から４５℃の条件下、さらに好ましくは３５℃から４２℃の条件下で、複合体を含む溶液を抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体の上部に添加又は滴下した後、５秒〜３０分程度、好ましくは１０秒〜１５分程度、さらに好ましくは３０秒〜５分程度静置する方法などが挙げられる。
【００３８】
複合体を含む溶液と抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体とを接触させることで、抗体抗原反応により、複合体におけるビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド部分のビオチンと多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体とが結合し、多孔質担体上に複合体を捕捉することができる。一方、複合体を含む溶液に含まれる複合体以外の含有成分は、抗原−抗体反応による抗ビオチン抗体との結合が起こらないため、多孔質担体を通過する。
【００３９】
また、複合体と多孔質担体に担持された抗ビオチン抗体との結合以外の非特異的な結合又は吸着等を抑制するために、上記工程（２）に先立って、多孔質担体に対してブロッキング処理を施すことが好ましい。ブロッキング処理において使用するブロッキング液としては特に制限されず、例えば、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチンなどのほか、血液タンパク質または植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などを含む溶液が挙げられる。
【００４０】
さらに、多孔質担体に非特異的に結合又は吸着等した物質などを除去するために、上記工程（２）の後、後述する工程（３）に先立って、多孔質担体の洗浄処理を施すことが好ましい。当該洗浄処理において使用する洗浄液としては、測定対象物質に未結合の標識物を洗浄する機能を実用上保持するものであれば、特に限定されないが、例えば、特許第３８４９８２３号に記載のものなどが挙げられる。この洗浄液を工程（２）後の多孔質担体に２０〜３００μＬ、好ましくは１００〜２５０μＬ、さらに好ましくは１５０〜２２０μＬ程度を一回または複数回に分けて分注すればよい。
【００４１】
工程（３）では、酵素活性を測定する。具体的には、上記工程（２）により多孔質担体に担持された抗ビオチン抗体と結合した複合体における酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド部分の酵素の酵素活性を測定する。
【００４２】
酵素活性の測定方法としては、特に制限されず常法に従って行うことができる。検出に利用する酵素−基質系について、酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を用いる系などが挙げられる。酵素活性の検出に用いる基質も特に限定されない。これらは、市販品であるＣＤＰ−ＳＴＡＲ、ＣＳＰＤ、Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＰＰＤ、Ｌｕｍｉｇｅｎ、ＡＰＳ−５、Ｌｕｍｉｇｅｎ  Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ、Ｇａｌａｃｔｏｎ−Ｐｌｕｓ、ＡＴＴＯＧＬＯＷなどを用いることができる。基質を含む基質液の組成は、その機能を損ねない範囲であれば特に限定されない。例えば、酵素としてアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）を用いる場合には、上記工程（２）の後、前記の基質、好ましくはＣＤＰ−ＳＴＡＲやＬｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５等を必要濃度に調整したものを１０〜１００μＬ、好ましくは、１５〜５０μＬ、さらに好ましくは２０μＬ〜４０μＬ程度、多孔質担体に分注すれば良い。
【００４３】
上記工程（３）により得られる測定値は、被検体から採取した生体試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体の量を反映している。上記非特許文献１にも記載されているように、通常、歯周病患者では体内の歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体量が増加することから、上記工程（３）により得られる測定値に基づいて、生体試料が歯周病患者由来かあるいは健常者由来かを判定することができ、また、医師、歯科医師等は被検体が歯周病に罹患しているか否かを診断することができる。さらに、体内の歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体量は、歯周病の重篤度に応じても増加することから、上記工程（３）により得られる測定値に基づいて、歯科医師等は被検体における歯周病の重篤度を判定又は診断することもできる。
【００４４】
また、本発明は、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬、及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬を包含する。
【００４５】
上記した各試薬に含まれる酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドは、上記した歯周病原菌抗原ポリペプチドと同様に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）から単離されたポリペプチド又はその改変ポリペプチドである。具体的には、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３及び２４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。これらの中でも、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、及び１４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく、配列番号１、２、３、及び４からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸配列を有するポリペプチドがより好ましく、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドが特に好ましい。なお、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドと、酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドにおける歯周病原菌抗原ポリペプチドとは、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００４６】
上記した各試薬に含まれる酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液における溶媒としては、上記と同様である。具体的には、溶媒としては、例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｇｏｏｄ  Ｂｕｆｆｅｒなどを例示することができる。これらの溶媒は、カゼイン、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、血液タンパク質又は植物タンパク質を有効成分とするもの、マウス、ウサギ、ヤギ、牛胎児等の正常動物血液成分、正常ヒト血清成分などのタンパク成分安定化剤；各種防腐剤；界面活性剤などを含むものであっても良い。また、これらの溶媒は、亜鉛やマグネシウム等の金属の塩などの酵素の活性化剤を含むものであってもよい。
【００４７】
上記した各試薬には、必要に応じてその他の成分が含まれていてもよい。その他の成分としては、例えば、各種防腐剤や界面活性剤などが挙げられる。
【００４８】
さらに、本発明は、上記した酵素標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬、及び上記したビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液を含む歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用試薬を含む歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体検出用キットを包含する。
【００４９】
当該キットには、上記した試薬の他、必要に応じてその他の試薬、器具等が含まれていてもよい。例えば、ブロッキング液、Ｂ／Ｆ分離用の洗浄液、発光基質液などがあげられる。
【実施例】
【００５０】
以下、参考例及び実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。
【００５１】
なお、以下の参考例、並びに実施例１及び２では、小型化学発光免疫自動分析装置（商品名：ＰＯＣｕｂｅ、東洋紡社製）を用いた。なお、当該装置は、抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体を有する反応容器（以下、「反応容器」と記載する。）に、ビオチン標識された抗原又は抗体と酵素標識された抗原又は抗体と測定対象試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体との複合体を含む反応溶液を当該反応容器に滴下することにより、当該複合体におけるビオチンと当該多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体との間で抗原−抗体反応させ、当該複合体を選択的に多孔質担体上に固定させた後、酵素基質を滴下して酵素活性を測定するという一連の操作を自動で行うことができる装置である。具体的には、ＰＯＣｕｂｅに添付された操作手順に従い、概ね以下の手順で行った。
【００５２】
（１）液相反応
ＰＯＣｕｂｅ専用試薬カートリッジに、試薬Ｒ１（ビオチン標識された抗原又は抗体を含む溶液）：２５μＬ、試薬Ｒ２（酵素標識された抗原又は抗体）：２５μＬ、及び検体溶液：５０μＬをそれぞれ添加して混合し、４０℃、５分間の条件で抗原−抗体反応（第１反応）を行う。当該操作により、ビオチン標識された抗原又は抗体と酵素標識された抗原又は抗体と測定対象試料に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体との複合体が形成される。また、当該第１反応と並行して、反応容器にＰＯＣｕｂｅ専用ブロック液５０μＬを滴下し、抗ビオチン抗体が担持された多孔質担体をブロッキングする。当該操作により、抗ビオチン抗体の非特異的吸着を抑制することができる。
【００５３】
（２）固相反応
上記の第１反応後の反応溶液７０μＬを、ブロッキング後の反応容器に滴下し、４０℃、５分間の条件で抗原−抗体反応（第２反応）を行う。当該操作により、上記（１）において形成された複合体におけるビオチンと多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体とが結合する。その後、ＰＯＣｕｂｅ専用洗浄液８０μＬを反応容器に滴下し、多孔質担体の洗浄を行う。洗浄操作を２回繰り返した後、試薬Ｒ３（酵素発光基質を含む溶液）：３０μＬを反応容器に滴下する。
【００５４】
（３）酵素活性の測定
４０℃、１分間の条件で、多孔質担体表面の酵素活性（発光強度）を測定する。
【００５５】
また、以下の参考例及び実施例では、歯周病原菌抗原ポリペプチドとして、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを用いた。
【００５６】
参考例：ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体の検出
本例では、血清中に含まれる歯周病原菌に対するヒトＩｇＧ抗体（ヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体）に、ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを結合させて、ＡＬＰ標識されたヒトＩｇＧ抗体と、ヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体と、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドとの複合体を形成させることにより、血清中に含まれる歯周病原菌に対するヒトＩｇＧ抗体の検出を試みた。具体的には、上記（１）〜（３）の操作手順に従って、多孔質担体表面の酵素活性（発光強度）を測定した。なお、本例では、試薬Ｒ１として、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドをＰＯＣｕｂｅ専用Ｒ１希釈液に溶解した溶液を、試薬Ｒ２として、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識された抗ヒトＩｇＧ抗体をＧｏｏｄ  ＢｕｆｆｅｒにてｐＨ６．５に調整した１％のＢＳＡを含む溶液に溶解した溶液を、試薬Ｒ３として、市販のＡＬＰ発光基質（商品名：Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５、Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）を、それぞれ用いた。また、検体溶液として、歯周病患者から採取した血清（凍結血清）をトリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液で１００倍希釈した溶液を用い、対照として、健常者から採取した血清（凍結血清；Ｎ群及びＩ２群の２種）をトリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液で１００倍希釈した溶液を用いた。また、ブランクとして、トリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液を用いた。
【００５７】
なお、参考として、上記（１）〜（２）の操作手順において形成された、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドとＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体と血清中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体との複合体と、多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体との結合の概略図を図１に示す。
【００５８】
結果を下記表１に示す。
【００５９】
【表１】
0006716241.tif 000002
【００６０】
上記表１から明らかなように、健常者においてシグナル値が高く、健常者と歯周病患者との間で測定結果の差は明確とはならなかった。限定的な解釈を望むものではないが、これは、ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた場合には、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体だけでなく、血清中に含まれるすべてのＩｇＧ抗体との間で抗原−抗体反応が起こるため、目的とする歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体以外のＩｇＧ抗体との競合反応により、多孔質担体の孔径よりも大きなサイズの凝集物が多数形成され、当該凝集体が多孔質担体表面に残存することにより、健常者と歯周病患者との間で測定値に明確な差が確認されなかったものと考察される。
【００６１】
実施例１：ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを用いたヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体の検出
本例では、血清中に含まれる歯周病原菌に対するヒトＩｇＧ抗体（ヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体）に、ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチド及びビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを結合させて、ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドと、ヒト抗Ｐｇ−ＩｇＧ抗体と、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドとの複合体を形成させることにより、血清中に含まれる歯周病原菌に対するヒトＩｇＧ抗体の検出を試みた。具体的には、上記（１）〜（３）の操作手順に従って、多孔質担体表面の酵素活性（発光強度）を測定した。なお、本例では、試薬Ｒ２として、ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体に替えて、ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドをＧｏｏｄ  ＢｕｆｆｅｒにてｐＨ６．５に調整した１％のＢＳＡを含む溶液に溶解した溶液を用いたこと、さらに、検体溶液として、歯周病患者から採取した血清（凍結血清；Ｐ１群、Ｐ２群、及びＰ３群の３種）をトリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液で１００倍希釈した溶液を用い、対照として、健常者から採取した血清（凍結血清；Ｎ群、Ｉ２群、Ｉ４群、及びＩ６群の４種）をトリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液で１００倍希釈した溶液を用いたこと以外は、上記参考例と同様にして行った。
【００６２】
なお、参考として、上記（１）〜（２）の操作手順において形成された、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドとＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドと血清中に含まれる歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体との複合体と、多孔質担体上に担持された抗ビオチン抗体との結合の概略図を図２に示す。
【００６３】
結果を下記表２に示す。
【００６４】
【表２】
0006716241.tif 000003
【００６５】
上記表２から明らかなように、ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体に替えてＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを用いた場合には、健常者と歯周病患者との間で測定値に明確な差が確認された。具体的には、歯周病患者においては、測定値が健常者よりも高い測定値が観測された。以上のことから、ＡＬＰ標識された抗ヒトＩｇＧ抗体に替えてＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを用いることにより、歯周病原菌に対するＩｇＧ抗体を検出することができ、被検試料が歯周病患者由来であるか、あるいは健常者由来のものであるかを判定する指標を提供することができることが分かった。
【００６６】
実施例２：試薬の安定性の検討
上記（１）〜（３）の操作手順に従って、多孔質担体表面の酵素活性（発光強度）を測定した。なお、本例では、試薬Ｒ１として、ビオチン標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドをＰＯＣｕｂｅ専用Ｒ１希釈液に溶解した溶液を、試薬Ｒ２として、ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドをＧｏｏｄ  ＢｕｆｆｅｒにてｐＨ６．０、６．２５、６．５、６．７５、７．０、７．２５、及び７．５にそれぞれ調整した１％のＢＳＡを含む溶液に溶解した溶液を０日（調製後）、７日、１４日、２１日、２８日、４２日、及び５６日間保存したものを、試薬Ｒ３として、市販のＡＬＰ発光基質（商品名：Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＡＰＳ−５、Ｌｕｍｉｇｅｎ社製）を、それぞれ用いた。また、検体溶液として、トリス緩衝液でｐＨ８．５に調整した溶液（ブランク）を用いた。
【００６７】
結果を表３に示す。なお、表３における括弧内の数値は０日目の測定値に対する割合（％）を示す。
【００６８】
【表３】
0006716241.tif 000004
【００６９】
上記表３から明らかなように、ＡＬＰ標識された歯周病原菌抗原ポリペプチドを含む溶液のｐＨが６．０及び６．２５である場合には、日数が経過するにつれて測定値（ブランク値）が大幅に上昇する傾向にあることが分かった。特に、４２日目以降では、０日目に対して測定値が６０％以上上昇することが分かった。これに対して、溶液のｐＨを６．５〜７．５の間に調整した場合には測定値の大幅な変化は認められず、測定値の変動幅を±３０％程度に抑制することができることが分かった。
【図１】
0006716241.tif 000005
【図２】
0006716241.tif 000006
【配列表】
0006716241000001.app