(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)少なくとも1つのカチオン性及び/又はpH応答性脂質と、
(ii)少なくとも1つの水溶性の、免疫療法に有用である治療有効化合物と、
(iii)少なくとも1つの抗原をコードするRNA(前記抗原が、好ましくは、疾患に関連する抗原であるか、又は疾患に関連する抗原、若しくは疾患に関連する抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する)と
を含み、
1列当たり2〜40のラメラを含むラメラ状の内部組織を含む、
脂質粒子。
【請求項２】
治療有効化合物が、γδ T細胞、好ましくはVγ9Vδ2 T細胞を刺激する薬剤である、請求項1に記載の粒子。
【請求項３】
γδ T細胞を刺激する薬剤がビスホスホネート、好ましくは窒素含有ビスホスホネート(アミノビスホスホネート)である、または、
γδ T細胞を刺激する薬剤が、ゾレドロン酸、クロドロン酸、イバンドロン酸、パミドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、オルパドロン酸、アレンドロン酸、インカドロン酸及びこれらの塩からなる群から選択される、
請求項2に記載の粒子。
【請求項４】
少なくとも1つのヘルパー脂質、好ましくは中性脂質又は負電荷を帯びた脂質を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項５】
少なくとも1つのカチオン性脂質が、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMEPC)、1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)及び/又は1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項６】
少なくとも1つのヘルパー脂質が、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、コレステロール(Chol)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)及び/又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)を含む、請求項4または5のいずれか一項に記載の粒子。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の粒子、並びに1つ又は複数の医薬的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含む、治療用途のための医薬組成物。
【請求項８】
前記用途が、非経口投与、好ましくは静脈内投与、皮下投与、皮内投与又は動脈内投与を含む、請求項7に記載の用途のための医薬組成物。
【請求項９】
少なくとも1つのアジュバントを更に含む、請求項7または8に記載の用途のための医薬組成物。
【請求項１０】
免疫応答、好ましくはがんに対する免疫応答を誘導又は増強するための、請求項7〜9のいずれか一項に記載の用途のための医薬組成物。
【請求項１１】
抗原が関与する疾患、好ましくはがん疾患の予防的及び/又は治療的処置に使用するための、請求項7〜10のいずれか一項に記載の用途のための医薬組成物。
【請求項１２】
脾臓の抗原提示細胞に抗原を送達するための、又は抗原提示細胞に抗原を発現させるための医薬の調製のための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の粒子又は請求項7〜11のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
抗原提示細胞が樹状細胞及び/又はマクロファージである、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
対象において免疫応答を誘導又は増強するための医薬の調製のための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の粒子又は請求項7〜11のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１５】
前記免疫応答が腫瘍抗原に対する免疫応答である、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
対象においてT細胞を刺激、初回刺激及び/又は増幅するための医薬の調製のための、請求項1〜6のいずれか一項に記載の粒子又は請求項7〜11のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１７】
がん疾患を処置又は防止するための医薬の調製における、請求項1〜6のいずれか一項に記載の粒子又は請求項7〜11のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
請求項1〜6のいずれか一項に記載の粒子を製造する方法であって、
(i)少なくとも1つのカチオン性脂質及び少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含むコロイド状脂質分散体を準備する工程と、
(ii)少なくとも1つのカチオン性脂質及び少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含む脂質分散体にRNAを添加する工程と
を含む、方法。
【請求項１９】
少なくとも1つのカチオン性脂質及び少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含むコロイド状脂質分散体が、少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含む水相に、脂質のエタノール溶液を注入することによって準備される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
カチオン性脂質に由来する正電荷の数を、RNAに由来する負電荷の数で除したものが、0.025〜4の間である、請求項18又は19に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RNA及び1つ又は複数の治療有効化合物を含む脂質粒子、並びにRNA及び治療有効化合物の両方を非経口投与後に標的器官又は標的細胞に送達するためのこのような粒子を含む医薬組成物に関する。より詳細には、本粒子は、少なくとも1つのカチオン性脂質及びRNA及び1つ又は複数の水溶性の治療有効化合物、例えばビスホスホネートを含む、RNAリポプレックス(lipoplex)を含む。RNA及び治療有効化合物は細胞によって取り込まれ、RNAは好ましくはペプチド又はタンパク質に翻訳され、治療有効化合物はその生理活性を示す。本発明の医薬組成物は、免疫応答を誘導又は増強するために適用することができる。また、この医薬組成物は、タンパク質等の抗原が関与する疾患の予防的及び/又は治療的処置にも有用である。更に、本発明は、RNA及び1つ又は複数の治療有効化合物を含む前記脂質粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬活性化合物を送達するための注射用医薬製剤の開発は、がん又は他の重篤な疾患の処置のような、様々な治療用途で必要とされているが未だ満足のいく状況ではない。このような目的のために、薬物送達用の様々なタイプのナノ粒子製剤が開発されている。典型的には、担体粒子は、送達される薬物の分子特性に応じて最適化される。
【０００３】
ナノ粒子製剤に関する典型的な取り込み機構はエンドサイトーシスであり、この場合、摂取された粒子はまずエンドソームに封入される。治療的応用においては、多くの場合、カーゴがエンドソームからサイトゾルに放出されることが必要である。水溶性化合物に関する薬物送達製剤の医薬開発における主たる障害は、細胞取り込み前に起こるカーゴの望ましくない放出、並びにエンドソーム内腔からサイトゾルへの非効率的な放出である。
【０００４】
ある特定の水溶性化合物の送達は、活性分子を完全封入することによって標的部位への輸送を保護する小胞性脂質小胞を使用することによって達成することができる。このような小胞担体は、カーゴの早期放出を回避し、完全な小胞の細胞取り込みを支持するためには十分に安定していなければならない。したがって、トランスフェクションに一般に使用されるような流動体様脂質は、このような目的には不適である。
【０００５】
また当技術分野では、DNA又はRNAがカチオン性脂質又はリポソームに結合されて注射用ナノ粒子製剤を形成する、いわゆるリポプレックス製剤によってDNA及びRNAが送達され得ることも知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許出願US2009004213
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】「A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)」、H.G.W. Leuenberger、B. Nagel及びH. Kolbl編、Helvetica Chimica Acta、CH-4010 Basel、Switzerland、(1995)
【非特許文献２】Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、J. Sambrook等編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 1989
【非特許文献３】Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.社(A. R Gennaro編、1985)
【非特許文献４】Andersen等  2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy、57(11): 1735〜1743頁
【非特許文献５】Quoix等、2011: Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer: a controlled phase 2B trial. Lancet Oncol. 12(12): 1125〜33頁
【非特許文献６】Liseth等、2010: Combination of intensive chemotherapy and anticancer vaccines in the treatment of human malignancies: the hematological experience. J Biomed Biotechnol. 2010: 6920979
【非特許文献７】Hirooka等、2009: A combination therapy of gemcitabine with immunotherapy for patients with inoperable locally advanced pancreatic cancer. Pancreas 38(3): e69〜74
【非特許文献８】Baskar等、2012: Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int. J Med Sci. 9(3): 193〜199頁
【非特許文献９】Gadri等、2009: Synergistic effect of dendritic cell vaccination and anti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma. J Immunother. 32(4): 333〜40頁
【非特許文献１０】Lechner等、2011: Chemokines, costimulatory molecules and fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors. Immunotherapy 3 (11)、1317〜1340頁
【非特許文献１１】Zhang等、2009: Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nature Reviews Cancer 9、28〜39頁
【非特許文献１２】van Duin等、2005: Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology、27(1):49〜55頁
【非特許文献１３】Schoenfeld及びDranoff 2011: Anti-angiogenesis immunotherapy. Hum Vaccin. (9):976〜81頁
【非特許文献１４】Sorensen及びThompsen 2007: Virus-based immunotherapy of cancer: what do we know and where are we going? APMIS 115(11):1177〜93頁
【非特許文献１５】Buonaguro等、2011: Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseases and cancer. Expert Rev Vaccines 10(11):1569〜83頁
【非特許文献１６】Guillen等、2010: Virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants: application to chronic disease, cancer immunotherapy and infectious disease preventive strategies. Procedia in Vaccinology 2 (2)、128〜133頁
【非特許文献１７】2007: Vaccination of metastatic colorectal cancer patients with matured dendritic cells loaded with multiple major histocompatibility complex class I peptides. J Immunother 30: 762〜772頁
【非特許文献１８】Castle等、2012: Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 72 (5):1081〜91頁
【非特許文献１９】Rapoport等、2011: Combination immunotherapy using adoptive T-cell transfer and tumor antigen vaccination on the basis of hTERT and survivin after ASCT for myeloma. Blood 117(3):788〜97頁
【非特許文献２０】Yamada 2011: Peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer, bladder cancer, and malignant glioma. Nihon Rinsho 69(9): 1657〜61頁
【非特許文献２１】Castella, B.、Riganti, C.、Fiore, F.、Pantaleoni, F.、Canepari, M. E.、Peola, S.、Foglietta, M.、Palumbo, A.、Bosia, A.、Coscia, M.、Boccadoro, M.、Massaia, M. (2011)、The Journal of Immunology 187(4)、1578〜90頁
【非特許文献２２】Mitrofan, L.M.、Pelkonen, J.、Monkkonen, J.、(2009)、Bone、45、1153〜60頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
実質的分子量を有する核酸及び水溶性低分子の両方の送達について記載されている系の要件は、相反する傾向がある。水溶性低分子の送達については、リポソーム又はカプセル等の小胞担体が望ましくない放出を防止するのに十分安定していることから好ましい。しかし、このような小胞担体は、RNA又はDNA等の中分子量又は高分子量を有する生物高分子電解質の運搬には、理想的には適していない。その理由は、封入効率が低い場合が多く、核酸と担体粒子の脂質膜との静電的相互作用によって裂け目及び穴等の欠陥が生じ、封入された低分子の漏出及び早期放出が起こりやすくなる可能性があるからである。このため、低分子量の水溶性化合物と核酸の異なる分子特性は、両分子の共同薬物送達にとっては不都合である。更に、薬物送達製剤は、送達されたDNA/RNAがタンパク質に翻訳され得るものでなければならない。
【０００９】
したがって、治療的に有効な低分子及び核酸を標的細胞に送達するための改良された製剤を提供することが必要とされている。更に、このような製剤は、含有されている核酸がコードしているペプチド又はタンパク質に引き続き翻訳されることが可能でなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
驚いたことに、本発明者らは、本明細書に記載の脂質粒子が上記の要件のすべてを満たすことを見出した。
【００１１】
第1の態様では、本発明は、
(i)少なくとも1つのカチオン性及び/又はpH応答性脂質と、
(ii)少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物と、
(iii)RNAと
を含む脂質粒子に関する。
【００１２】
一実施形態では、脂質は、少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物及びRNAを受容する構造を形成する。
【００１３】
一実施形態では、本発明の粒子は、ラメラ状の内部組織を含む。一実施形態では、ラメラ状の内部組織は、1列当たり2〜40、好ましくは2〜20、より好ましくは2〜10、特に3〜8のラメラを含む。
【００１４】
一実施形態では、RNAは医薬活性であるか、又は少なくとも1つの医薬活性ペプチド若しくはタンパク質、例えば、免疫活性ペプチド若しくはタンパク質をコードする。一実施形態では、RNAは少なくとも1つの抗原をコードする。一実施形態では、抗原は、疾患に関連する抗原であるか、又は疾患に関連する抗原、若しくは疾患に関連する抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する。
【００１５】
一実施形態では、治療有効化合物は、1000Da未満の分子量を有する。一実施形態では、治療有効化合物は免疫療法に有用である。一実施形態では、治療有効化合物はγδ T細胞、好ましくはVγ9Vδ2 T細胞を刺激する薬剤である。一実施形態では、γδ T細胞を刺激する薬剤はビスホスホネート、好ましくは窒素含有ビスホスホネート(アミノビスホスホネート)である。一実施形態では、γδ T細胞を刺激する薬剤は、ゾレドロン酸、クロドロン酸、イバンドロン酸、パミドロン酸、リセドロン酸、ミノドロン酸、オルパドロン酸、アレンドロン酸、インカドロン酸及びこれらの塩からなる群から選択される。
【００１６】
一実施形態では、本発明の粒子は、少なくとも1つのヘルパー脂質を含む。一実施形態では、ヘルパー脂質は、中性脂肪又は負電荷を帯びた脂質である。一実施形態では、少なくとも1つのヘルパー脂質は、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、コレステロール(Chol)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)及び/又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)を含み、好ましくは、DOPC、DOPE及び/又はCholを含む。
【００１７】
一実施形態では、少なくとも1つのカチオン性脂質は、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMEPC)、1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)及び/又は1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)を含み、好ましくは、DOTAP及び/又はDOTMAを含む。
【００１８】
一実施形態では、本発明の粒子は、約50nm〜約1000nmの範囲の平均直径を有する。一実施形態では、粒子は、約300nm〜約800nmの範囲の平均直径を有する。一実施形態では、粒子は、約200nm以下の平均直径を有する。約300nm〜約800nmの範囲の平均直径を有する粒子は好ましくは、抗原提示細胞、好ましくは脾臓の抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞等のプロフェッショナル抗原提示細胞を標的とするために有用である。約200nm以下の平均直径を有する粒子は、好ましくは、腫瘍細胞を標的とするために有用である。
【００１９】
一実施形態では、粒子は、
(i)200nm未満、又は
(ii)約200nm〜約1000nm、好ましくは約200nm〜約800nm、より好ましくは約300nm〜約600nmの範囲
の平均直径を有する。
【００２０】
一実施形態では、本発明の粒子は、負のゼータ電位を有する。
【００２１】
一実施形態では、本発明の粒子は、少なくとも1つのカチオン性脂質及び少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含むコロイド状脂質分散体にRNAを添加することによって得られる。一実施形態では、少なくとも1つのカチオン性脂質及び少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含むコロイド状脂質分散体は、少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含む水相に、少なくとも1つの水混和性有機溶媒中の脂質(少なくとも1つのカチオン性脂質を含む)の溶液、例えば、脂質のエタノール溶液を注入することによって得ることができる。
【００２２】
第2の態様では、本発明は、第1の態様の粒子を含む医薬組成物に関する。
【００２３】
一実施形態では、粒子を全身投与した後に、RNAの少なくとも一部、及び治療有効化合物の少なくとも一部は、標的細胞、好ましくは同じ標的細胞に送達される。一実施形態では、RNAの少なくとも一部及び治療有効化合物の少なくとも一部は、標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、RNAはペプチド又はタンパク質をコードするRNAであり、RNAは標的細胞によって翻訳されてペプチド又はタンパク質を産生する。一実施形態では、標的細胞は脾臓細胞、好ましくは抗原提示細胞、より好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞、より好ましくは樹状細胞である。したがって本発明の粒子は、RNA及び治療有効化合物を、このような標的細胞に送達するために使用できる。したがって、本発明はまた、RNA及び治療有効化合物を含む本発明の粒子を対象に全身投与する工程を含む、対象における標的細胞、好ましくは同じ標的細胞にRNA及び治療有効化合物を送達する方法に関する。一実施形態では、RNA及び治療有効化合物は、標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、RNAはペプチド又はタンパク質をコードするRNAであり、RNAは標的細胞によって翻訳されてペプチド又はタンパク質を産生する。一実施形態では、標的細胞は脾臓細胞、好ましくは抗原提示細胞、より好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞、より好ましくは樹状細胞である。
【００２４】
一実施形態では、粒子を全身投与した後に、脾臓におけるRNA蓄積及び/又はRNA発現が起こる。したがって本発明の粒子は、脾臓でRNAを発現させるために使用できる。
【００２５】
一実施形態では、粒子を全身投与した後に、肺及び/又は肝臓におけるRNA蓄積及び/又はRNA発現は起こらない、又は実質的に起こらない。
【００２６】
一実施形態では、粒子を全身投与した後に、脾臓におけるRNA蓄積及び/又はRNA発現は、肺及び/又は肝臓におけるRNA蓄積及び/又はRNA発現の量の少なくとも5倍である。
【００２７】
一実施形態では、粒子を全身投与した後に、脾臓の抗原提示細胞、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞におけるRNA蓄積及び/又はRNA発現が起こる。したがって本発明の粒子は、このような抗原提示細胞にRNAを発現させるために使用できる。
【００２８】
一実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞及び/又はマクロファージである。
【００２９】
一実施形態では、全身投与は、非経口投与により、好ましくは静脈内投与、皮下投与、皮内投与又は動脈内投与による。
【００３０】
一実施形態では、医薬組成物は、1つ又は複数の医薬的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤を更に含む。一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも1つのアジュバントを更に含む。
【００３１】
一実施形態では、医薬組成物は、全身投与用に製剤化されている。
【００３２】
第3の態様では、本発明は、第1の態様の粒子、又は免疫応答、好ましくはがんに対する免疫応答を誘導又は増強するための第2の態様の医薬組成物に関する。
【００３３】
第4の態様では、本発明は、第1の態様の粒子、又は抗原が関与する疾患、好ましくはがん疾患の予防的及び/又は治療的処置に使用するための第2の態様の医薬組成物に関する。
【００３４】
第5の態様では、本発明は、脾臓の抗原提示細胞、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を送達するための、又は脾臓の抗原提示細胞、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞に抗原を発現させるための方法であって、第1の態様の粒子又は第2の態様の医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法に関する。この態様では、抗原又はその一部は、好ましくは、本発明の粒子中のRNAによってコードされる。
【００３５】
一実施形態では、抗原提示細胞は樹状細胞及び/又はマクロファージである。
【００３６】
第6の態様では、本発明は、対象において免疫応答、好ましくはがんに対する免疫応答を誘導又は増強するための方法であって、第1の態様の粒子、又は第2の態様の医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００３７】
第7の態様では、本発明は、対象においてT細胞を刺激、初回刺激及び/又は増幅するための方法であって、第1の態様の粒子、又は第2の態様の医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法に関する。
【００３８】
第8の態様では、本発明は、対象において、抗原が関与する疾患、好ましくはがん疾患を処置又は防止する方法であって、第1の態様の粒子、又は第2の態様の医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法に関する。この態様では、抗原又はその部分は、好ましくは、小胞コアの少なくとも一部の上に親水性シェルを形成する粒子中のRNAによってコードされる。
【００３９】
第9の態様では、本発明は、第1の態様の粒子を製造する方法であって、
(i)少なくとも1つのカチオン性脂質及び少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含むコロイド状脂質分散体を準備する工程と、
(ii)少なくとも1つのカチオン性脂質及び少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含む脂質分散体にRNAを添加する工程と
を含む方法に関する。一実施形態では、本方法は、コロイド状脂質分散体を透析する工程を含む。
【００４０】
一実施形態では、少なくとも1つのカチオン性脂質及び少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含むコロイド状脂質分散体は、少なくとも1つの水溶性の治療有効化合物を含む水相に、少なくとも1つの水混和性有機溶媒中の脂質(少なくとも1つのカチオン性脂質を含む)の溶液、例えば、脂質のエタノール溶液を注入することによって準備される。
【００４１】
一実施形態では、カチオン性脂質に由来する正電荷の数を、RNAに由来の負電荷の数で除したものは、0.025〜4の間である。
【００４２】
カチオン性脂質、治療有効化合物、RNA及び/又は製造される粒子の実施形態は、上記の通りである。
【００４３】
より一層好ましい一実施形態では、カチオン性脂質に由来する正電荷の数を、RNAに由来する負電荷の数で除したものは、0.025〜4の間であり、好ましくは0.025、0.125、0.250、0.375、0.500、0.625、0.750、0.875、1、2、3又は4である。
【００４４】
この本発明の概要は、必ずしも本発明の全特徴を記述するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】コロイド状脂質分散体における開始ZA(ゾレドロン酸)濃度の関数としてのゾレドロン酸(ZA)の保持を示す図である。使用した脂質組成物のDOTMA/DOPEモル比は、66.66/33.33(=2/1)であった。ZAを20mg/mlの濃度で100mMのHEPES緩衝液に溶解させ、NaOHを用いてpHを約4に調整した。脂質濃度は、約12mMであった。封入された及び遊離のゾレドロン酸をHPLCによって定量した。明らかなように、ZAの保持は、4mg/mlまでのZAの開始濃度の増加に伴い着実に上昇する。
【図２】コロイド状脂質分散体中のDOTMA濃度の関数としてのゾレドロン酸(ZA)の保持を示す図である。様々な総モル分率の脂質組成である、ZAを含むコロイド状脂質分散体を調製した。試験したコロイド状脂質分散体組成物は、2/1モル比のDOTMA/DOPEを含み、それぞれ、3mM、6mM又は12mMのDOTMAを含有していた。ZAを20mg/mlの濃度で100mMのHEPES緩衝液に溶解させ、NaOHを用いてpHを約4に調整した。保持された及び放出されたZAは、HPLCによって定量した。この図は、保持されたZAの絶対量がDOTMA、及びコロイド中の総脂質濃度に比例することを示している。
【図３】RNAに結合した後のZAコロイド状分散体からのZAの放出を示す図である。脂質の総モル分率が異なる、ZAを含むコロイド状脂質分散体を、対照としてのPBS、RNA又はTriton x100と混合した。脂質組成は、2/1モル比のDOTMA/DOPEであった。ZA/脂質分散体は、計算された体積のZAを含む脂質分散体を計算された体積のRNAと、2mM、4mM及び6mMの3つの異なる脂質濃度で混合することによって調製した。ZA/脂質分散体及びRNAは、1:1の比(v/v)で混合した。カチオン性脂質/RNA電荷比は、カチオン性脂質/RNA(モル/塩基)=1/2であった。PBS及びTriton x100については、計算されたRNA体積を、10%の生理学的PBS又はTriton x100水溶液で置き換えた。ZA及びRNAを含むLNPは、30分室温でインキュベートした。その後、遊離のZAは、HPLCによって上述のようにして決定した。この結果は、RNAを含むZAコロイド状分散体の複合体形成がZAをほぼ保持すること;それぞれ、2、4及び6mg/mlの総脂質濃度に関して、保持されたZAは0%、23%及び22%というわずかなパーセンテージしか放出されなかったことを示唆している。この所見は、保持されたZAを100%放出させる、(陰性対照としての)Triton x100でRNAを置き換えることによって確認された。IPPの蓄積が腎臓及び骨髄において検出されたin vivoでの結果は、これらの結果を支持している。
【図４】ZA及びRNAを含むLNPのクライオ透過型電子顕微鏡(クライオTEM)を示す図である。LNPの脂質組成は2/1モル比のDOTMA/DOPEであり、これらは正/負(カチオン性脂質/RNAヌクレオチド)比1.3:2でRNAを含有していた。最終脂質濃度は、0.3mMであった。アセンブリー後、クライオTEM測定前に製剤を室温で30分間インキュベートした。全ての画像から明らかであるように、粒子は、サイズが約200nm〜400nmであり、ラメラ状の内部組織を有していた。組織化されたラメラの数は様々であり、2〜10ユニットの範囲にあると推定される。
【図５】in vitroで裸のRNAと比較した、ZA含有LNPとインキュベーションした後のDCにおけるルシフェラーゼIVT-RNAの発現を示す図である。ルシフェラーゼ発現は、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンの代謝速度をカウント/秒(cps)で示す発光を介して評価した。合計で2ドナーのiDCを個別に試験し、平均値を、SDも含めて示してある。ZA含有LNPとのインキュベーションは、DCにおいて顕著な発現をもたらす。
【図６】陽性対照(IL-4、GM-CSF、IL-1β、TNF-α、IL-6及びPGE-2を含む成熟カクテル)と比較した、in vitroでのZA含有LNP(RNA有り又は無し)と樹状細胞のインキュベーション後の成熟マーカーの相対的発現を示す図である。ここでは、CD83(A)、CD86(B)及びHLA-DR(C)の相対的発現を示してある。発現データは、刺激無しの対照に対して規格化した。合計で4ドナーを個別に試験し、平均値を、SDも含めて示してある。
【図７】in vitroでの樹状細胞における成熟マーカーの相対的発現を示す図である。LNP(すなわち、コロイド状ZA/脂質分散体に結合しているRNA)による、in vitroでの樹状細胞(DC)の成熟への影響を測定するために、陽性対照(IL-4、GM-CSF、IL-1β、TNF-α、IL-6及びPGE-2を含む成熟カクテル)、裸のRNA及びコロイド状ZA/脂質分散体(すなわち、コロイド状分散体に封入したゾレドロン酸(ZA))と比較した。樹状細胞を、24時間及び48時間、3つの異なるZA濃度(0.5μM、5μM及び50μM)のZA含有LNPとインキュベートした。ここでは、成熟マーカーCD80(A)、CD83 (B)、CD86(C)及びHLA-DR(D)の相対的発現を示した。合計で2ドナーを個別に試験し、平均値を、SDも含めて示してある。
【図８】ZA細胞取り込みの尺度としてのin vitroでのDCにおけるIPP蓄積を示す図である。樹状細胞は、0.1〜125μMの用量範囲の遊離ZAを意味する、又はLNP中に製剤化されたZAを意味する、異なるZAの製剤で一晩インキュベートした。このアッセイにおいて、ZAは、細胞内で利用可能である場合にのみ、IPP濃度の上昇が予測される。ZA及びRNAを含むLNPを、遊離ZAと比較して試験した。遊離ZA並びにLNP中に製剤化されたものは、IPPの蓄積に関して用量依存性を示したが、LNP中にZAが含まれる場合、IPP値の上昇に必要であったのは極めて低用量(少なくとも1桁)であった。このことは、LNPが担体として機能し細胞のサイトゾルへのZA取り込みを提供したことを示唆している。
【図９】ZA及びルシフェリンをコードするRNAを含むLNPのin vivo活性及び効果を示す図である。ZA及びルシフェリンをコードするRNAを含むLNPをi.v.注射した6時間後、LNPは、脾臓組織を特異的に標的とし、in vivoで検出可能な生物発光シグナルをもたらすことができる(A)。更に、注射した24時間後に分析したところ、脾細胞集団は、eGFP-R Aと複合体を形成したZAを含むLNPが、主として、抗原提示細胞、例えば樹状細胞(DC)、マクロファージ(mΦ)及び単球等を標的とすること(B)、また、無処置マウス(cntr)と比較して、脾臓DC及びマクロファージにおける成熟マーカーCD86の発現を上方制御することができること(C)を示した。
【図１０】RNA及びZAを含むLNPをマウスに投与した後の組織IPPレベルを示す図である。ルシフェリンをコードするRNAと複合体化させたZAを含むLNPを、注射するマウス当たり1.5μgゾレドロン酸(ZA)の用量でi.v.注射した6時間後、24時間後及び48時間後、無処置マウスの組織と比較して、処置マウスの肺、肝臓及び脾臓におけるIPPレベルの増加が観察される。24時間後、及び脾臓組織(動物一匹/時点)において、最高のIPPレベルが観察される。このことは、ZA及びRNAを含むLNPが標的細胞のサイトゾル区画にZAを送達することができることを示唆している。
【図１１】3つの異なる濃度のゾレドロン酸及び(Luc)RNAを封入しているLNPをDCとインキュベーションした後のイソペンテニルピロリン酸(IPP)の蓄積を示す図である。対照的に、無処置群又は遊離ZAの適用では、IPP値は増加しなかった。
【図１２】ゾレドロン酸は、脾臓>肺>肝臓でイソペンテニルピロリン酸(IPP)を蓄積した。ゾレドロン酸及び(Luc)RNAを封入しているLNPを適用すると、脾臓>肺>肝臓でイソペンテニルピロリン酸(IPP)が蓄積した。対照的に、無処置群ではIPP値は増加しなかった。バーは、i.v.投与した24時間後の動物3匹の平均IPP値を表す。
【図１３】パネルAは、in vivoでのLNP(LNP2-4)の生体内分布を示すin vivo画像の描写を示す図である。パネルBは、ここでは脾臓の位置である、目的の領域で測定したルシフェラーゼシグナルのグラフ(「定量化」)を示す図である。パネルCは、LNP2-4を注射した24時間後に抽出された脾臓DC細胞の活性化(成熟)状態を示す図である。
【図１４】ここでは、図5に従い、in vitroで異なるZA含有LNPとインキュベートした後のDCにおけるルシフェラーゼIVT-RNAの発現を示す図である。ルシフェラーゼ発現は、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンの代謝速度をカウント/秒(cps)で示す発光によって評価した。合計で2ドナーのiDCを個別に試験し、平均値を、SDも含めて示してある。LNP-4とは異なり、他のZA含有LNP、LNP-2及びLNP-3を用いた他のZA含有LNPインキュベーションは、DCにおいて顕著な発現をもたらす。
【図１５】ここでは、図7に従い、in vitroでの樹状細胞における成熟マーカーの相対的発現を示す図である。異なるLNP(すなわち、コロイド状ZA/脂質分散体に結合しているRNA)による、陽性対照(IL-4、GM-CSF、IL-1β、TNF-α、IL-6及びPGE-2を含む成熟カクテル)と比較した、in vitroでの樹状細胞(DC)の成熟への影響を測定するために、樹状細胞を、24時間及び48時間、3つの異なるZA濃度(0.5μM、5μM及び50μM)の様々なZA含有LNPとインキュベートした。ここでは、成熟マーカーCD80(A)、CD83(B)、CD86(C)及びHLA-DR(D)の相対的発現を示した。合計で2ドナーを個別に試験し、平均値を、SDも含めて示してある。
【図１６】ZAを負荷したiDCを凍結保存したPBLと共培養した後のγ9δ2 T細胞の頻度を示す図である。保持された化合物ZAが依然として機能的であるか否かを決定するため、iDCを異なるZA含有LNPで24時間負荷し、続いて、7日間PBLと共培養した。頻度の増加を意味するγ9δ2 T細胞の増幅は、フローサイトメトリーによって最終的に評価した。独立して試験した異なる2ドナーでは、異なる全てのLNP中の保持化合物ZAは依然として機能的であり、遊離ZAと比較して、より高い頻度のγ9δ2 T細胞をもたらすことが観察された。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下に本発明を詳細に記述するが、方法論、プロトコール及び試薬は変更してもよいので、この発明は、本明細書に記述する特定の方法論、プロトコール及び試薬に限定されない点は理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記述することのみを目的とするのであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を、限定することを意図するものではない点も理解されたい。別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。
【００４７】
以下に本発明の要素を記述する。これらの要素は、特定の実施形態と共に列挙してあるが、これらを任意の様式及び任意の個数で組み合わせて、追加の実施形態を創案することができる点は理解されたい。様々な形で記述された例及び好ましい実施形態は、本発明を、明示的に記述された実施形態のみに限定するものと解釈すべきではない。この明細書は、明示的に記述された実施形態を、任意の個数の開示されている及び/又は好ましい要素と組み合わせた諸実施形態を支持し、包含するものと理解されたい。更には、この出願に記述された全要素のあらゆる並べ替え及び組合せも、文脈上別段の指定がない限り、本出願の本明細書によって開示されるものとみなすものとする。例えば、好ましい一実施形態で、本発明の粒子が、水溶性の治療有効化合物を含み、且つ好ましい別の実施形態で、本発明の粒子が、少なくとも1つの抗原をコードするRNAを含む場合、本発明の粒子が、水溶性の治療有効化合物と、少なくとも1つの抗原をコードするRNAとを含むことは、検討される好ましい実施形態である。
【００４８】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)」、H.G.W. Leuenberger、B. Nagel及びH. Kolbl編、Helvetica Chimica Acta、CH-4010 Basel、Switzerland、(1995)に記載の通りに規定される。
【００４９】
本発明を実施するには、別段の指定がない限り、当分野の文献に説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学及び組換えDNA技術の通常の方法を用いることになる(例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、J. Sambrook等編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor 1989を参照されたい)。
【００５０】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈上別段の要求がない限り、「含む(comprise)」という語、並びに「含む(comprises)」及び「含んでいる(comprising)」等のバリエーションは、指定された構成要素、整数若しくは工程、又は構成要素、整数若しくは工程の群を包含することを意味し、しかし他のいかなる構成要素、整数若しくは工程、又は構成要素、整数若しくは工程の群を排除することを意味しないものと理解されたい。本発明を説明する文脈で(特に特許請求の範囲の文脈で)使用される「1つの(a)」及び「1つの(an)」及び「その(the)」という用語並びに類似の指示は、本明細書で別段の指定があるか又は文脈上明確に否定されているのでない限り、単数及び複数の双方を包含するものと解釈されたい。本明細書での値の範囲の列挙は、範囲内の別個の値それぞれを個別に指す簡略な方法として用いることを目的とするに過ぎない。本明細書で別段の指定がない限り、個々の値はそれぞれ、本明細書で個別に列挙したとみなせる形で本明細書に組み込んである。本明細書に記述する方法はいずれも、本明細書で別段の指定があるか又は文脈上明確に否定されているのでない限り、適切な任意の順番で実行することができる。本明細書における、ありとあらゆる例又は例示的言い回し(例えば、「等」)の使用は、本発明を更にうまく説明することを目的とするに過ぎず、これらの使用がなければ請求されていた本発明の範囲に対し、限定を設けるものではない。本明細書中のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠な何らかの非請求要素を指示するものと解釈すべきではない。
【００５１】
この明細書の文章全体にわたって幾つかの文書が引用されている。本明細書で引用されている各文書は(あらゆる特許、特許出願、科学的公表資料、製造業者による仕様書、取扱説明書等を含め)、前掲か後掲かを問わず、参照により本明細書にその全体が組み込まれている。本明細書には、先行発明の理由から、このような開示に先立つものとしての資格を本発明が欠くことの承認と解釈すべき箇所はない。
【００５２】
以下では、本発明の全態様に適用される定義を与える。
【００５３】
本発明の文脈では、「粒子」という用語は、分子又は分子複合体によって形成される構造体に関する。一実施形態では、「粒子」という用語は、ミクロサイズ又はナノサイズの構造、例えば、ミクロサイズ又はナノサイズのコンパクト構造に関する。
【００５４】
本発明の文脈では、「脂質粒子」という用語は、脂質、特にカチオン性脂質を含有する粒子に関する。
【００５５】
一実施形態では、本発明の粒子は、約50nm〜約1000nm、例えば約100nm〜約900nm、約200nm〜約800nm、約200〜約700nm、約300〜約600nm、約300nm〜約500nm、又は約300nm〜約400nmの範囲の平均直径を有する。
【００５６】
一実施形態では、本発明の粒子は、少なくとも約50nm、少なくとも約60nm、少なくとも約70nm、少なくとも約80nm、少なくとも約90nm、少なくとも約100nm、少なくとも約150nm、少なくとも約200nm、少なくとも約250nm、少なくとも約300nm、少なくとも約400nm、少なくとも約500nm、少なくとも約600nm、少なくとも約700nm、少なくとも約800nm、少なくとも約900nmの平均直径を有し、且つ/又は本発明の粒子は、約1000nm以下、約900nm以下、約800nm以下、約700nm以下、約600nm以下、約500nm以下、約400nm以下、約300nm以下、約250nm以下、約200nm以下、約150nm以下、約100nm以下、約90nm以下、約80nm以下、約70nm以下、約60nm以下の平均直径を有する。
【００５７】
好ましい一実施形態では、本発明の粒子は、(i)約50nm〜約400nm、好ましくは約50nm〜約200nmの範囲、又は(ii)約200nm〜約1000nm、好ましくは約200nm〜約800nm、より好ましくは約300nm〜約600nmの範囲の平均直径を有する。
【００５８】
本発明の粒子は、治療有効化合物を受容可能及び/又は保持可能であり、好ましくは脂質構造に含まれているカチオン性脂質にRNAを結合させることによってRNAを受容可能及び/又は保持可能である、脂質構造を含み得る。言い換えると、脂質構造の内部は、治療有効化合物がそこに負荷（ロード、積み込み）されるように構造化することができる。このような脂質構造は、高脂質含量を有し得る。本発明によると、「脂質」という用語は、リオトロピック脂質相、より優先的にはラメラ状のリオトロピック相を形成することが可能な、あらゆる脂肪酸誘導体又は他の両親媒性化合物を指す。特に、「脂質」という用語は、脂質分子の疎水性部分が二重層の側を向き、一方、親水性部分が水性相の側を向くように二重層を形成することができるあらゆる脂肪酸誘導体を指す。「脂質」という用語は、中性、アニオン性又はカチオン性脂質を含意する。脂質は、少なくとも1つ、好ましくは2つのアルキル鎖又はコレステロール部分を有する疎水性ドメインと、極性頭部基とを含むことが好ましい。脂質の疎水性ドメイン内の脂肪酸のアルキル鎖は、特定の長さ又は二重結合数に限定されない。とは言っても、脂肪酸は、10〜30炭素原子、好ましくは14〜25炭素原子の長さを有することが好ましい。脂質は、異なる2つの脂肪酸を含んでもよい。
【００５９】
脂質は、リン脂質若しくはその誘導体、スフィンゴ脂質若しくはその誘導体、又は糖脂質若しくはその誘導体を含んでもよい。リン脂質はグリセロリン脂質であってもよい。グリセロリン脂質の例としては、それだけに限らないが、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)を含めたホスファチジルグリセロール(PG);卵黄ホスファチジルコリン及びジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)を含めたホスファチジルコリン(PC);ホスファチジン酸(PA)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルセリン(PS)及びスフィンゴミエリン(SM)及びその誘導体が挙げられる。
【００６０】
「カチオン性脂質」という用語は、正味の電荷が正である脂質を指す。カチオン性脂質は、カチオン性の、つまり正電荷を帯びた頭部基を含むことが好ましい。カチオン性脂質の疎水性ドメインは、好ましくは、中性又はアニオン性脂質と異ならない。カチオン性脂質の極性頭部基は、好ましくは、アミン誘導体、例えば第一級、第二級及び/又は第三級アミン、第四級アンモニウム、様々な組合せのアミン、アミジニウム塩又はグアニジン及び/若しくはイミダゾール基、並びにピリジニウム、ピペリジン(piperizine)及びアミノ酸頭部基、例えばリシン、アルギニン、オルニチン及び/又はトリプトファンを含む。より好ましくは、カチオン性脂質の極性頭部基はアミン誘導体を含む。最も好ましくは、カチオン性脂質の極性頭部基は第四級アンモニウムを含む。カチオン性脂質の頭部基は、複数のカチオン性電荷を有してもよい。カチオン性脂質の頭部基は、1つのカチオン性電荷を含むことが好ましい。モノカチオン性脂質としては、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DMEPC)、1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)及び/若しくは1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、1,2-ジミリストイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DMTAP)、2,3-ジ(テトラデコキシ)プロピル-(2-ヒドロキシエチル)-ジメチルアザニウムブロミド(DMRIE)、ジドデシル(ジメチル)アザニウムブロミド(DDAB)、1,2-ジオレイルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DORIE)、3β-[N-(N\N'-ジメチルアミノ(dimethylarnino)-エタン)カルバモイル]コレステロール(DC-Chol)又はジオレイルエーテルホスファチジルコリン(DOEPC)が挙げられるが、これらに限定されない。カチオン性脂質は単独で、又はコレステロールとの組合せで、中性リン脂質又は他の既知の脂質集合体成分と共に使用してもよい。本明細書に記載する正電荷を帯びた脂質構造は、小胞の形成に通常使用される他の成分(例えば安定化のために)を含んでもよい。このような他の成分の例としては、それだけに限らないが、表面電荷、膜流動性に影響を与え、脂質集合体に脂質が組み込まれるのを助ける脂肪アルコール、脂肪酸、及び/若しくはコレステロールエステル又は他のあらゆる医薬的に許容される賦形剤が挙げられる。ステロールの例としては、コレステロール、コレステリルヘミスクシネート(cholesteryl hemisuccinate)、コレステリルサルフェート(cholesteryl sulfate)又は他のあらゆるコレステロール誘導体が挙げられる。好ましくは、少なくとも1つのカチオン性脂質はDMEPC及び/又はDOTMAを含む。
【００６１】
本発明によると、「カチオン性脂質」という用語は、pH応答性脂質も含む。「pH応答性脂質」という用語は、リオトロピックな脂質相を形成することができ、pH5とpH7.5との間のpKa値を有する、あらゆる脂肪酸誘導体又は他の両親媒性化合物を指す。これは、脂質がpKa値より上のpHでは非荷電であり、pKa値より下のpHでは正荷電であることを意味する。「pH応答性脂質」は、例えば、低pHでRNAを脂質又は脂質混合物に結合させることによって、カチオン性脂質に加えて、又はその脂質の代わりに使用することができる。pH応答性脂質としては、1,2-ジオレイルオキシ-3-ジメチルアミノ-プロパン(DODMA)が挙げられるが、これに限定されない。
【００６２】
「ヘルパー脂質」という用語は、カチオン性脂質をベースとする粒子等の、脂質をベースとする粒子を標的に、好ましくは細胞内に送達する有効性を上げることができる脂質を指す。ヘルパー脂質は中性であっても、正電荷を帯びていても、又は負電荷を帯びていてもよい。好ましくは、ヘルパー脂質は中性であるか、又は負電荷を帯びている。ヘルパー脂質の例としては、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、コレステロール(Chol)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)及び1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、少なくとも1つのヘルパー脂質は、DOPE及び/又はCholを含む。
【００６３】
一実施形態では、少なくとも1つのカチオン性脂質はDOTMAを含み、且つ少なくとも1つのヘルパー脂質はDOPE若しくはDOPC又はそれらの誘導体、或いはコレステロール又はそれらの誘導体を含む。
【００６４】
本明細書では、「ラメラ状構造」又は「ラメラ状組織」という用語は、ラメラ（層板）状形態の層の形成を意味する。
【００６５】
「エタノール注入法」という用語は、脂質を含むエタノール溶液を、注射針を通じて水溶液に迅速に注入する方法を指す。この操作によって脂質が溶液全体に分散され、脂質構造形成、例えば、リポソーム形成等の脂質小胞形成が促進される。
【００６６】
エタノール注入法を使用して、治療有効化合物を含むコロイド性脂質分散体は、好ましくは以下のように形成する:DMEPC、DOTMA及びDOTAPのようなカチオン性脂質等の脂質、並びにヘルパー脂質を含むエタノール溶液を、治療有効化合物、例えばビスホスホネート、特に、ゾレドロン酸のようなアミノビスホスホネートを含む水溶液に、例えば撹拌しながら注入する。
【００６７】
本発明の粒子は、治療有効化合物を含むコロイド性脂質分散体にRNAを添加することによって得ることができる。一実施形態では、本発明の粒子は、粒子を押出成形する工程及び/又は粒子を凍結乾燥する工程を含む方法によって得ることができる。好ましくは、粒子は、例えば濾過によって、0.02〜1μm、好ましくは0.3〜0.6μm、又は0.02〜0.2μmの間の直径の孔を有する膜を通過させて押出成形する。孔のサイズは、所望の粒子サイズに応じて選択されることは理解されたい。膜はポリカーボネート膜又はセルロースエステル膜であることが好ましい。保持されなかった治療有効化合物は、好ましくは、透析により除去する。
【００６８】
別の実施形態では、本発明の粒子は、押出成形の工程を行うことなく得ることができる。
【００６９】
「押出成形する」又は「押出成形」という用語は、固定された断面プロファイルを有する粒子等の物体を作製することを指す。この用語は特に、画定された孔を有するフィルターに粒子を押し通すことによる、粒子、好ましくはリポソームの小型化を指す。
【００７０】
「凍結乾燥する」又は「凍結乾燥」という用語は、粒子を冷凍し、次いで周囲圧力を下げて、粒子中の冷凍された媒体を固相から気相に直接昇華させることによる、粒子の冷凍乾燥を指す。
【００７１】
「治療有効化合物」という用語は、個体に投与すると治療に有効であるあらゆる化合物に関する。「治療有効化合物」という用語は更に、前記化合物の投与を含む治療介入において、所与の疾患及びその合併症の臨床的発現を変化させる、好ましくは治癒させる、軽減する又は部分的に停止するあらゆる薬剤に関する。
【００７２】
一実施形態では、本発明の粒子中の治療有効化合物は水溶性である。治療有効化合物の親水性は、その負荷効率を改善し、望ましくない放出を防止する可能性がある。治療有効化合物は、正味の電荷が負であることが好ましい。治療有効化合物は、2つの負電荷を帯びていることがより好ましい。一実施形態では、治療有効化合物は低分子である。化合物のサイズが小さいことにより、封入効率が更に改善する可能性がある。低分子化合物は、多様な標的に対する優れたアンタゴニスト、アゴニスト又はアロステリックモジュレーターとして作用すると記述されている。
【００７３】
本発明の文脈では、「処置」、「処置する」又は「治療的介入」という用語は、疾患又は障害等の状態と闘うことを目的とする、個体の管理及び看護に関する。この用語は、症状若しくは合併症を軽減する、疾患、障害若しくは状態の進行を遅らせる、症状及び合併症を軽減若しくは緩和する、及び/又は疾患、障害若しくは状態を治癒させる若しくは除去する、並びに状態を防止するための、治療有効化合物の投与等、個体の患う所与の状態に対する処置の全範囲を包含することを意図する。ここで防止とは、疾患、状態又は障害と闘うことを目的とする、個体の管理及び看護のことであると理解されるべきであり、症状又は合併症の発症を防止するため活性化合物の投与を含む。処置しようとする個体は、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。本発明の文脈では、化合物の「治療有効量」という用語は、化合物の投与を含む治療介入において、所与の疾患及びその合併症の臨床的発現を治癒させる、軽減する又は部分的に停止するのに十分な量を意味する。疾患又は状態の治療にとって、所望の反応は、その疾患又は状態の出現が遅れる又は阻害されることであってもよい。本発明の化合物の治療有効量は、状態又は疾患、疾患の重症度、年齢、生理的状態、身長及び体重を含めた個体の各パラメータ、処置の長さ、任意選択で付随する治療の種類、特定の投与経路、並びに類似した因子によって決まる。
【００７４】
本発明の文脈では、「RNA」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは、全体的又は実質的にリボヌクレオチド残基から構成される分子に関し、本明細書に記載の全てのRNAのタイプを含む。「リボヌクレオチド」という用語は、β-D-リボフラノシル基の2'位に水酸基を有するヌクレオチドに関する。「RNA」という用語は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、部分的又は完全に精製されたRNA等の、単離されたRNA、実質的に純粋なRNA、合成RNA、並びに1つ又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び/又は改変により天然RNAと異なっている修飾RNA等の、組換えにより作製されたRNAを含意する。このような改変には、RNAの末端に対する又は内部における、例えばRNAの1つ又は複数のヌクレオチドでの、非ヌクレオチド物質の付加が含まれ得る。RNA分子のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド又は化学合成されたヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチド等の、非標準的なヌクレオチドを含んでいてもよい。これらの改変されたRNAは、アナログ、特に、天然RNAのアナログと称することがある。本発明に従って使用するRNAは、既知の組成を有することもあれば、RNAのその組成は部分的に又は全く未知であることもある。「mRNA」という用語は「メッセンジャーRNA」を意味し、鋳型DNAを使用して生成され、ペプチド又はタンパク質をコードする転写物に関する。通常、mRNAは5'-UTR、タンパク質コード領域、及び3'-UTRを含む。mRNAは、in vitro転写によって鋳型DNAから生成できる。in vitro転写法は、当業者に知られている。例えば様々なin vitro転写キットが市販されている。「アンチセンスRNA」という用語は、mRNAに相補的なリボヌクレオチド残基を含む一本鎖RNAに関する。「siRNA」という用語は、好ましくは20〜25塩基対を含む二本鎖RNA分子のクラスである「低分子干渉RNA」を意味する。好ましくは、siRNAはmRNA分子の一部に特異的に結合することができる。この結合は、mRNA分子の前記一部が切断され、それにより前記mRNA分子の遺伝子発現が阻害される過程を誘導する。「マイクロRNA」という用語は、好ましくは20〜25塩基対を含むノンコーディング一本鎖RNA分子を指す。好ましくは、マイクロRNAはmRNA分子の一部に特異的に結合することができる。この結合は、前記mRNA分子の翻訳が、そしてそれにより前記mRNA分子の遺伝子発現が阻害される過程を誘導する。RNAを5'キャップ又は5'キャップアナログによって修飾することができ、これは例えば、前記5'キャップ又は5'キャップアナログ存在下における鋳型DNAのin vitro転写によって実現される。このin vitro転写においては、前記5'キャップが転写と同時に、生成するRNA鎖に組み込まれるか、又はRNAを例えばin vitro転写によって生成し、転写後に、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用してRNAに5'キャップを付加することもできる。RNAは更なる修飾を含んでもよい。例えば、本発明で使用するRNAの更なる修飾は、天然のポリ(A)テールの延長若しくはトランケーションであっても、又は5'若しくは3'非翻訳領域(UTR)の改変、例えば、前記RNAのコード領域と無関係なUTRの導入等であってもよい。
【００７５】
本発明の文脈では、「転写」という用語は、DNA配列中の遺伝暗号がRNAに転写される過程に関する。続いてRNAはタンパク質に翻訳され得る。本発明によると、「転写」という用語は「in vitro転写」を含意し、ここでこの「in vitro転写」という用語は、無細胞系で、好ましくは適切な細胞抽出液を使用して、RNA、特にmRNAをin vitro合成する方法に関する。好ましくは、転写物を生成するためにクローニングベクターを利用する。これらのクローニングベクターは一般に転写ベクターと称し、本発明によると、「ベクター」という用語によって包含される。本発明によると、本発明で使用するRNAは、好ましくはin vitro転写されたRNA (IVT-RNA)であり、適切な鋳型DNAのin vitro転写によって得ることができる。転写をコントロールするためのプロモーターは、任意のRNAポリメラーゼに対する任意のプロモーターであってよい。in vitro転写用の鋳型DNAは、核酸、特にcDNAをクローニングし、in vitro転写用の適切なベクターに導入することによって得ることができる。cDNAは、RNAの逆転写によって得ることができる。
【００７６】
cDNAを含む鋳型ベクターは、様々なcDNAインサートを有するベクターを含んでもよく、これは転写後に、場合によって様々なペプチド又はタンパク質を発現することができる様々なRNA分子の集団を生ずる。或いはcDNAを含む鋳型ベクターは、1種類だけのcDNAインサートを有するベクターを含んでもよく、これは転写後に、1つのペプチド又はタンパク質のみを発現することができる1種類のRNAの集団を生ずるだけである。このように、単一のペプチド若しくはタンパク質のみを発現することができるRNAを製造することも、又は2つ以上のペプチド若しくはタンパク質、例えば諸ペプチド若しくは諸タンパク質からなる組成物を発現することができる様々なRNAからなる組成物を製造することも可能である。
【００７７】
「発現」という用語は、本明細書ではその最も広い意味で使用され、RNA、又はRNA及びタンパク質の産生を含意する。RNAについては、「発現」又は「翻訳」という用語は、特にペプチド又はタンパク質の産生に関する。発現は一過性であっても又は安定なものであってもよい。
【００７８】
本発明によると、RNAはコーディングRNA、すなわち、ぺプチド又はタンパク質をコードするRNAであってよい。前記RNAは、コードされるペプチド又はタンパク質を発現し得る。例えば、前記RNAは、抗原又は(抗原をコードしない)免疫活性化合物をコード及び発現するRNAであってもよい。代わりに、RNAは、アンチセンスRNA、マイクロRNA (miRNA)又はsiRNA等のノンコーディングRNAであってもよい。
【００７９】
「医薬活性RNA」は、医薬活性ペプチド若しくはタンパク質をコードするRNAであるか、又はそれ自体が医薬的に活性である。例えば、「医薬活性RNA」は、医薬活性タンパク質について記述されている医薬活性等の、1つ又は複数の医薬活性を有する。例えば、RNAは、RNA干渉(RNAi)の1本又は複数本のRNA鎖であってよい。このような薬剤としては、標的転写物、例えば対象の、疾患と関係がある内在性転写物の転写物を標的とする短鎖干渉RNA (siRNA)若しくは短鎖ヘアピンRNA (shRNA)、又はsiRNA若しくはマイクロRNA様のRNAの前駆体が挙げられる。
【００８０】
「医薬活性ペプチド又はタンパク質」は、対象に治療有効量を投与した場合に、対象の状態又は病状に対して正の、又は有利な効果を有する。好ましくは、医薬活性ペプチド又はタンパク質は、根治的又は対症的性質を有し、疾患又は障害の1つ又は複数の症状を改善する、軽快させる、軽減する、元に戻す、症状の発症を遅らせる、又は症状の重症度を減ずるために投与することができる。医薬活性ペプチド又はタンパク質は予防的性質を有することもあり、疾患の発症を遅らせるか、又はこのような疾患又は病態の重症度を減ずるために使用することができる。「医薬活性ペプチド又はタンパク質」という用語は、全長タンパク質又はポリペプチドを含意し、又その医薬的に活性な断片を指すこともある。この用語は、ペプチド又はタンパク質の医薬的に活性なアナログも包含する。「医薬活性ペプチド又はタンパク質」という用語は、抗原であるペプチド及びタンパク質を包含する。すなわち、これらのペプチド又はタンパク質を対象に投与すると、治療的、又は部分的若しくは完全に防御的な可能性のある免疫応答が、対象において誘発される。
【００８１】
医薬活性タンパク質の例としては、それだけに限らないが、免疫活性化合物等のサイトカイン及び免疫系タンパク質(例えば、インターロイキン、コロニー刺激因子(CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子(TNF)、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレチン(seletin)、ホーミング受容体、T細胞受容体、免疫グロブリン、可溶性主要組織適合複合体抗原、免疫的に活性な抗原、例えば細菌、寄生虫又はウイルスの抗原、アレルゲン、自己抗原、抗体)、ホルモン(インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、刺激ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチン等)、成長ホルモン(例えば、ヒト成長ホルモン(human grown hormone))、増殖因子(例えば、上皮増殖因子、神経成長因子、インスリン様成長因子等)、増殖因子受容体、酵素(組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成(biosynthestic)酵素又は分解酵素、ステロイド産生(steriodogenic)酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、デヒドロゲナーゼ、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、チトクロム、アデニル酸シクラーゼ又はグアニル酸(guanylaste)シクラーゼ、ノイラミダーゼ(neuramidase)等)、受容体(ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体)、結合タンパク質(成長ホルモン結合タンパク質又は増殖因子結合タンパク質等)、転写因子及び翻訳因子、腫瘍増殖抑制タンパク質(例えば、血管新生を阻害するタンパク質)、構造タンパク質(コラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン及びミオシン等)、血液タンパク質(トロンビン、血清アルブミン、第VII因子、第VIII因子、インスリン、第IX因子、第X因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、プロテインC、フォンヴィレブランド因子、アンチトロンビンIII、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)又は改変第VIII因子、抗凝固因子等が挙げられる。
【００８２】
一実施形態では、本発明による医薬活性タンパク質は、リンパ球のホメオスタシスの制御に関与するサイトカインであり、好ましくは、T細胞の発生、初回刺激、増幅、分化及び/又は生存に関与し且つ好ましくはそれらを誘導又は増強するサイトカインである。一実施形態では、サイトカインはインターロイキンである。一実施形態では、本発明の医薬活性タンパク質は、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15及びIL-21からなる群から選択されるインターロイキンである。
【００８３】
本発明の特に好ましい一実施形態では、粒子中のRNAは、T細胞の発生、初回刺激、増幅、分化及び/又は生存に関与し且つ好ましくはそれらを誘導又は増強するサイトカイン、好ましくは、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15及びIL-21からなる群から選択されるインターロイキン等のインターロイキンをコードし、粒子中に保持されている少なくとも1つの、治療有効化合物は、ゾレドロン酸等の、γδ T細胞を刺激する薬剤を含む。
【００８４】
本発明によると、「ペプチド」という用語はオリゴペプチド及びポリペプチドを含意し、ペプチド結合によって共有結合的に連結された2個以上、好ましくは3個以上、好ましくは4個以上、好ましくは6個以上、好ましくは8個以上、好ましくは10個以上、好ましくは14個以上、好ましくは16個以上、好ましくは21個以上、且つ好ましくは8個、10個、20個、30個、40個又は50個、特に100個までのアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチドを指し、好ましくは100個超のアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書では互換的に使用される。
【００８５】
本発明によると、「をコードするRNA」という用語は、そのRNAが、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合に、翻訳の過程においてアミノ酸のアセンブリーを誘導して、コードされるタンパク質又はペプチドが産生されるようにできることを意味する。好ましくは、本発明のRNAは、細胞の翻訳装置と相互作用して、タンパク質又はペプチドの翻訳が起こるようにすることができる。
【００８６】
「粒子の正味の電荷」という用語は、正電荷及び負電荷等の電荷の総和に関する。例えば粒子が、正電荷より多くの数の負電荷を含むなら、粒子の正味の電荷は負である。粒子が、負電荷より多くの数の正電荷を含むなら、粒子の正味の電荷は正である。粒子が、正電荷及び負電荷を同数含むなら、粒子の正味の電荷は中性、特に電気的に中性である。このように、本発明の粒子の正味の電荷は、負、正又は中性であり得る。好ましくは、粒子の正味の電荷は負である。
【００８７】
「平均直径」という用語は、粒子の平均の直径を指し、各粒子の直径の和を、粒子の総数で除することによって計算できる。「直径」という用語は、通常は、球状の物体の中心を通り、その周縁部上の2点を結ぶ線分の最大長を指すが、本明細書では、実質的に球状の形又は他の形を有する粒子の中心を通り、その周縁部上の2点を結ぶ線分の最大長を指すためにも使用される。
【００８８】
「抗原」という用語は、免疫応答をそれに対して生じさせようとしているエピトープを含む薬剤に関する。「抗原」という用語は、とりわけタンパク質、ペプチド、多糖、核酸、特にRNA及びDNA並びにヌクレオチドを包含する。「抗原」という用語は、転換を受けて(例えば、分子内での転換を介して、又は体内タンパク質に補完されて)初めて抗原性になり、且つ感作性にもなる薬剤も包含する。抗原は、好ましくは、樹状細胞又はマクロファージのような抗原提示細胞等の免疫系細胞によって提示可能である。加えて、抗原又はそのプロセシング産物は、好ましくは、T若しくはB細胞受容体によって、又は抗体等の免疫グロブリン分子によって認識可能である。好ましい一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原等の、疾患に関連する抗原である。
【００８９】
「腫瘍抗原」という用語は、細胞質、細胞表面及び細胞核に由来する可能性がある、がん細胞の構成成分を指す。特に、この用語は、細胞内で又は腫瘍細胞の表面抗原として、産生する、好ましくは大量に産生するこれらの抗原を指す。腫瘍抗原の例としては、HER2、EGFR、VEGF、CAMPATH1抗原、CD22、CA-125、HLA-DR、ホジキンリンパ腫又はムチン1が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
「ウイルス抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち、個体において免疫応答を誘発することができるあらゆるウイルス成分を指す。ウイルス抗原は、ウイルスリボ核タンパク質又は外被タンパク質であってもよい。
【００９１】
「細菌抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち、個体において免疫応答を誘発することができるあらゆる細菌成分を指す。細菌抗原は、細菌の細胞壁又は細胞質膜由来であってもよい。
【００９２】
「疾患に関連する抗原」という用語はその最も広い意味で使用されて、疾患に関連するあらゆる抗原を指す。疾患に関連する抗原は、宿主の免疫系を刺激して、疾患に対する抗原特異的細胞性免疫応答及び/又は体液性抗体応答を生ずるエピトープを含む分子である。疾患に関連する抗原はしたがって治療目的に使用することができる。疾患に関連する抗原は、好ましくは、微生物による感染に、典型的には微生物抗原に関連するか、又はがんに、典型的には腫瘍に関連する。
【００９３】
「疾患」という用語は、個体の身体に影響する異常状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状及び徴候に関連する医学的状態と解釈される。疾患は、感染症等、外的起源の因子によって引き起こされることも、自己免疫疾患等、内的な機能不全によって引き起こされることもある。ヒトの場合、「疾患」はしばしばより概略的に使用されて、それに苦しむ個体に疼痛、機能不全、苦痛、社会問題、若しくは死を、又はその個体と接触のある諸個体に対し類似の問題を引き起こすあらゆる状態を指す。このより概略的意味では、「疾患」は時として傷害、能力障害、障害、症候群、感染、孤発性の症状、異常行動、並びに非定型の構造及び機能を包含するが、一方、他の文脈及び他の目的では、これらは区別され得るカテゴリーであるとみなすことがある。疾患は通常、身体的にだけでなく精神的にも個体に影響を与える。多くの疾患に罹りながら生活することは、その個体の、人生における展望及び性格を変えてしまう可能性があるからである。
【００９４】
「抗原が関与する疾患」という用語は、抗原が関わるあらゆる疾患、例えば抗原の存在により特徴付けられる疾患を指す。抗原が関与する疾患は、感染症、自己免疫疾患若しくはがん疾患であることも、又は単純にがんであることもある。上述の通り、抗原は、腫瘍に関連する抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原等の、疾患に関連する抗原であり得る。
【００９５】
「感染症」という用語は、個体から個体へと、又は生物から生物へと伝播し得る、微生物因子(例えば感冒)によって引き起こされるあらゆる疾患を指す。感染症は当技術分野で知られており、例えば、疾患がウイルス、細菌及び寄生体によってそれぞれ引き起こされるウイルス性疾患、細菌性疾患又は寄生性疾患を包含する。これについては、感染症は例えば肝炎、性行為感染症(例えばクラミジア又は淋病)、結核、HIV/後天性免疫不全症候群(AIDS)、ジフテリア、B型肝炎、C型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群(SARS)、トリインフルエンザ及びインフルエンザであり得る。
【００９６】
「自己免疫疾患」という用語は、身体がそれ自身の組織の幾つかの構成成分に対して免疫原性(すなわち免疫系)の応答を生ずるあらゆる疾患を指す。換言すれば、免疫系が、一部の体内組織又は器官系についてそれを自己と認識するその能力を失い、外来物であるかのように標的として攻撃する。自己免疫疾患は、主に1つの器官が冒されるもの(例えば溶血性貧血及び抗免疫性の甲状腺炎)と、自己免疫疾患の過程が多くの組織に広まっているもの(例えば全身性エリテマトーデス)とに分類できる。例えば多発性硬化症は、脳及び脊髄の神経線維を覆う鞘をT細胞が攻撃することによって引き起こされると考えられている。これは協調の減少、衰弱及び霧視をもたらす。自己免疫疾患は当技術分野で知られており、例えば橋本甲状腺炎、グレーブス病、ループス、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫性の甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬等を包含する。
【００９７】
「がん疾患」又は「がん」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖により特徴付けられる、個体の生理的状態を指し、又はそれについて述べている。がんの例としては、それだけに限らないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病を挙げられる。より詳細には、このようながんの例としては、骨がん、血液がん、肺がん、肝がん、膵がん、皮膚がん、頭部又は頸部のがん、皮膚又は眼球内の黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、性器及び生殖器の癌腫、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、膀胱がん、腎がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)の新生物、神経外胚葉性のがん、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫及び下垂体腺腫が挙げられる。本発明の「がん」という用語は、がん転移も包含する。
【００９８】
「免疫応答」という用語は免疫系の反応、例えば、細菌若しくはウイルス等の免疫原性の生物、細胞、又は物質に対する免疫系の反応に関する。「免疫応答」という用語は、自然免疫応答及び適応免疫応答を包含する。好ましくは、免疫応答は、免疫細胞の活性化、サイトカイン生合成及び/又は抗体産生の誘導に関する。
【００９９】
本発明の粒子によって誘導される免疫応答は、樹状細胞及び/又はマクロファージ等の抗原提示細胞が活性化される段階と、抗原又はその断片が前記抗原提示細胞によって提示される段階と、この提示によって細胞傷害性T細胞が活性化される段階とを含むことが好ましい。
【０１００】
「免疫活性化合物」という用語は、好ましくは、免疫細胞の成熟を誘導及び/若しくは抑制することによって、サイトカイン生合成を誘導及び/若しくは抑制することによって、並びに/又はB細胞による抗体産生を刺激することにより液性免疫を変化させることによって、免疫応答を変化させるあらゆる化合物に関する。免疫活性化合物は、それだけに限らないが、抗ウイルス及び抗腫瘍活性を含めた強力な免疫賦活活性を持ち、又免疫応答の他の側面を下方制御することもできる。例えば免疫応答離をTH2免疫応答から移行させることであり、これは、TH2によって媒介される広範な疾患を処置するために有用である。免疫活性化合物は、ワクチンアジュバントとして有用なことがある。一実施形態では、本発明の粒子中のRNAは、免疫活性化合物をコードする。前記化合物は好ましくは抗原をコードしない。
【０１０１】
「免疫細胞」という用語は、個体の身体を防御することに関与する免疫系の細胞を指す。「免疫細胞」という用語は、マクロファージを含めた白血球、単球(マクロファージの前駆細胞)、好中球等の顆粒球、好酸球及び好塩基球、樹状細胞、マスト細胞、並びにB細胞、T細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞等のリンパ球を含めた、特定のタイプの免疫細胞及びその前駆細胞を包含する。マクロファージ、単球(マクロファージの前駆細胞)、好中球、樹状細胞及びマスト細胞は貪食細胞である。
【０１０２】
「貪食細胞」という用語は、有害な外来粒子、細菌、及び死んでいるか又は死にかけている細胞を取り込む(貪食する)ことによって、個体の身体を防御する細胞を指す。
【０１０３】
「マクロファージ」という用語は、単球の分化によって生じる貪食細胞のサブグループを指す。炎症、免疫サイトカイン、又は微生物による生成物によって活性化されたマクロファージは、外来病原体を非特異的に飲み込み、マクロファージ内で、加水分解及び酸化による攻撃で病原体を分解に導くことによって死滅させる。分解されたタンパク質由来のペプチドは、マクロファージ細胞表面に呈示(displayed)される。そこでペプチドはT細胞によって認識可能であり、それらはB細胞表面の抗体と直接相互作用することができる。結果としてT細胞及びB細胞は活性化し、免疫応答は更に刺激される。マクロファージは、抗原提示細胞のクラスに属する。好ましくは、マクロファージは脾臓のマクロファージである。
【０１０４】
「樹状細胞」(DC)という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する貪食細胞の別のサブタイプを指す。好ましくは、樹状細胞は、造血性の骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初は未熟樹状細胞へと変化する。これらの未熟細胞は、高い貪食活性及び低いT細胞活性化能により特徴付けられる。未熟樹状細胞は絶えず、ウイルス及び細菌等の病原体がないか、周囲環境からサンプリングしている。未熟樹状細胞は、提示可能な抗原に接触すると活性化されて成熟樹状細胞になり、脾臓又はリンパ節へと遊走を開始する。未熟樹状細胞は病原体を貪食し、そのタンパク質を小片に分解し、成熟するとこれらの断片を、MHC分子を用いてその細胞表面に提示する。同時に未熟樹状細胞は、CD80、CD86及びCD40等の、T細胞活性化の共役受容体として働く細胞表面受容体を上方制御し、T細胞を活性化する自身の能力を大きく増強する。未熟樹状細胞は、樹状細胞が血流を通って脾臓へと、又はリンパ系を通ってリンパ節へと移動することを誘導する走化性受容体であるCCR7も上方制御する。ここでは、未熟樹状細胞は抗原提示細胞として働き、ヘルパーT細胞及びキラーT細胞並びにB細胞に、抗原特異的でない共刺激シグナルと共に抗原を提示することによって、これらの細胞を活性化する。このように、樹状細胞は、T細胞又はB細胞と関係がある免疫応答を活発に誘導することができる。好ましくは、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。
【０１０５】
「抗原提示細胞」(APC)という用語は、その細胞表面の上に(又はその細胞表面において)少なくとも1つの抗原又は抗原性断片を呈示、獲得及び/又は提示することができる様々な細胞うちの1つの細胞のことである。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞とノンプロフェッショナル抗原提示細胞とに区別できる。
【０１０６】
「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブT細胞との相互作用に必要とされる主要組織適合複合体クラスII(MHCクラスII)分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。T細胞が、抗原提示細胞の膜上のMHCクラスII分子複合体と相互作用すると、抗原提示細胞は、T細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞には、樹状細胞及びマクロファージが含まれる。
【０１０７】
「ノンプロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、インターフェロン-ガンマ等の特定のサイトカインによって刺激されない限り、MHCクラスII分子を構成的には発現しない抗原提示細胞に関する。例示的なノンプロフェッショナル抗原提示細胞としては、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵ベータ細胞又は血管内皮細胞が挙げられる。
【０１０８】
「成熟」という用語は、本明細書では、その表現型及び/又は機能の修飾をもたらす、未熟で非常に貪食性の樹状細胞及びマクロファージによる作用として定義される。特に、樹状細胞の場合、この付随する表現型の修飾の代表的なものとしては、CD40、CD80、CD86、CD83、MHCクラスI及びII分子の細胞表面での発現の増加、並びに/又はCD14分子の細胞表面での発現の減少が挙げられる。機能上の変化は、貪食性の低下、遊走能の獲得、同種異系T細胞刺激効率の上昇、並びにサイトカイン及びケモカイン発現プロファイルの変化、特にIL-12分泌の増加であり得る。DCによるIL-12産生は、このサイトカインがin vivoにおいて免疫応答をTh1経路へと偏らせると示されていることから、DCのin vivoにおける機能にとって不可欠である。Th1型の免疫応答は、抗原特異的Tリンパ球CD8+の刺激を伴う免疫応答であると考えられ、一方、Th2型の免疫応答はむしろ、抗体応答の刺激、及び最終的には細胞障害性リンパ球の抗原に対する無応答性を伴う。
【０１０９】
本明細書に記述する粒子を使用して免疫応答を誘導又は増強することが、本発明にとって望ましい場合、免疫応答は、粒子内に保持されている治療有効化合物によって誘発又は増強してもよい。例えば、治療有効化合物は、T細胞等の特定の免疫細胞を刺激し得る。好ましくは、前記T細胞はγδ T細胞、より好ましくはVγ9Vδ2 T細胞である。代わりに又は加えて、免疫応答は、粒子中のカチオン性脂質に結合しているRNAによって誘発又は増強してもよい。例えば、RNAによってコードされたタンパク質若しくはペプチド又はそのプロセシング産物は、抗原提示細胞上に発現する主要組織適合複合体(MHC)タンパク質によって提示され得る。するとMHCペプチド複合体は、T細胞又はB細胞等の免疫細胞により認識されて、それらの細胞の活性化につながる可能性がある。
【０１１０】
「T細胞」又は「Tリンパ球」という用語は、細胞媒介性免疫において中心的役割を担う、リンパ球の諸タイプに関する。T細胞又はTリンパ球は、細胞表面におけるT細胞受容体(TCR)の存在によって、B細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞等の他のリンパ球から区別できる。T細胞又はTリンパ球は、抗原提示特性を有さない(しかしむしろB細胞又はNK細胞を、その抗原提示特性故に必要とする)。これらは胸腺で成熟するので、T細胞と呼ばれる。T細胞は、抗原が抗原提示細胞の表面又はマトリックス上に、1つ又は複数のMHC分子又は1つ又は複数の非古典的MHC分子と共に呈示された場合に抗原を認識することができる。
【０１１１】
「γδ T細胞」(ガンマデルタT細胞)という用語は、独特なT細胞受容体(TCR)をそれらの表面に持つ、T細胞のサブセットに関する。大部分のT細胞は、α-及びβ-TCR鎖と呼ばれる2本の糖タンパク質鎖から構成されるTCRを有する。対照的にγδ T細胞では、TCRは、1本のγ鎖及び1本のδ鎖でできている。このグループのT細胞は、通常、αβ T細胞よりもはるかに少数である。ヒトγδ T細胞は、感染症及び自己免疫のようなストレス監視応答において重要な役割を担う。腫瘍における、トランスフォームしたことによって誘導された変化も、γδ T細胞によって媒介されるストレス監視応答を引き起こし、抗腫瘍免疫を増強することが示唆されている。重要なことには、病変部位において、抗原結合後、活性化されたγδ T細胞は、他のエフェクター細胞の動員を媒介するサイトカイン(例えばINFγ、TNFα)及び/又はケモカインを供給し、細胞傷害性(細胞死受容体及び細胞溶解性顆粒経路を介する)及びADCC等の即時のエフェクター機能を示す。
【０１１２】
末梢血中の大部分のγδ T細胞はVγ9Vδ2 T細胞受容体(TCRγδ)を発現する。「Vγ9/Vδ2 T細胞」という用語は、ヒト末梢血中の主要なγδ T細胞集団を構成する細胞に関する。Vγ9Vδ2 T細胞はヒト及び霊長類に特有であり、侵入する病原体による「危険」を感知する上で、初期における不可欠な役割を担うと想定される。例えば結核、サルモネラ症、エーリキア症、ブルセラ症、野兎病、リステリア症、トキソプラズマ症及びマラリアにおけるように、多くの急性感染症で病原体は劇的に増幅し、数日のうちに他の全てのリンパ球を圧倒してしまう可能性があるからである。
【０１１３】
γδ T細胞は、細菌で合成されるピロホスフェート、及び哺乳類細胞でメバロン酸経路により産生するイソペンテニルピロリン酸(IPP)等の小さな非ペプチド性リン酸化抗原(ホスホ抗原)に応答する。正常細胞でのIPP産生は、γδ T細胞の活性化に十分でないが、腫瘍細胞でのメバロン酸経路の調節不全は、IPP蓄積及びγδ T細胞活性化をもたらす。IPPは、メバロン酸経路の酵素であるファルネシルピロリン酸シンターゼ(FPPS)を阻害するアミノビスホスホネートによって、治療的に増加させることもできる。とりわけ、ゾレドロン酸(ZA、ゾレドロネート、Zometa (商標)、Novartis社)はこのようなアミノビスホスホネートの典型であり、既に、骨粗鬆症及び転移性骨疾患(metastasic bone disease)の処置のために患者に臨床的に投与されている。PBMCをin vitroで処理すると、ZAは特に単球によって取り込まれる。IPPは単球内に蓄積し、単球は、γδ T細胞の発生を刺激する抗原提示細胞に分化する。この実験設定では、活性化されたγδ T細胞に対する増殖及び生存因子としてインターロイキン-2(IL-2)を添加することが好ましい。最後になるが、ある特定のアルキル化アミンがVγ9Vδ2 T細胞をin vitroで活性化すると報告されているが、これは、ミリモル濃度においてだけである。
【０１１４】
本発明によると、「γδ T細胞を刺激する薬剤」という用語は、in vitro及び/又はin vivoにおいて、特にγδ T細胞の活性化及び増幅を誘導することによって、γδ T細胞、特にVγ9Vδ2 T細胞の発生を刺激する化合物に関する。好ましくは、この用語は、in vitro及び/又はin vivoにおいて、好ましくはメバロン酸経路の酵素であるファルネシルピロリン酸シンターゼ(FPPS)を阻害することによって、哺乳類細胞で産生されるイソペンテニルピロリン酸(IPP)を増加させる化合物に関する。
【０１１５】
γδ T細胞を刺激する化合物の特定の1グループは、ビスホスホネート、特に窒素含有ビスホスホネート(N-ビスホスホネート;アミノビスホスホネート)である。本発明によると、ゾレドロン酸(INN)又はゾレドロネート(Zometa、Zomera、Aclasta及びReclastの商品名でNovartis社から市販されている)は、特に好ましいビスホスホネートである。Zometaは、多発性骨髄腫及び前立腺がん等のがんを有する患者で骨折を防止するために、並びに骨粗鬆症を処置するために使用される。Zometaは、悪性腫瘍における高カルシウム血症を処置するためにも使用でき、又骨転移からくる痛みを処置する助けにもなり得る。
【０１１６】
「T細胞を刺激する」又は「T細胞の刺激」という用語は、T細胞抗原受容体を介した抗原-MHCクラスII複合体との相互作用等の一次シグナルによる、T細胞応答の誘導又は活性化を指す。この用語は、T細胞の共刺激、例えばサイトカイン(例えばCD80又はCD86タンパク質)による共刺激も包含する。T細胞は、T細胞により免疫応答を開始する一次シグナリングイベントを受けると活性化される。
【０１１７】
「T細胞を初回刺激（プライミング）する」という用語は、T細胞の、その特異的抗原との最初の接触(例えば、T細胞に抗原を提示する樹状細胞による)の誘導を指す。この接触は、T細胞をエフェクターT細胞(例えば、細胞傷害性T細胞又はヘルパーT細胞)に分化させる。
【０１１８】
「T細胞を増幅する（expand）」又は「T細胞の増幅」という用語は、T細胞の、好ましくは抗原を特異的に認識するT細胞の個数の増加を指す。抗原、例えば、本発明の粒子を修飾するRNAにコードされる抗原、又はその抗原のプロセシング産物を特異的に認識するT細胞の個数が増加することが好ましい。抗原又はその抗原のプロセシング産物は、好ましくはMHC分子によって、例えば、樹状細胞又はマクロファージのような抗原提示細胞の表面上等に提示される。
【０１１９】
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導、増強又は抑制することによる疾患又は状態の処置に関する。免疫応答を誘発又は増幅するように設計された免疫療法は活性化免疫療法に分類され、一方、免疫応答を低減又は抑制する免疫療法は抑制免疫療法(suppression immunotherapy)に分類される。「免疫療法」という用語は、抗原免疫若しくは抗原ワクチン接種、又は腫瘍免疫(tumor immunization)若しくは腫瘍ワクチン接種を包含する。「免疫療法」という用語は、リウマチ性関節炎、アレルギー、糖尿病又は多発性硬化症等の自己免疫疾患の状況において、不適切な免疫応答が調節されてより適切な免疫応答となるように、免疫応答を操作することにも関する。
【０１２０】
「免疫(immunization、免疫付与ともいう)」又は「ワクチン接種」という用語は、例えば治療又は予防上の理由から、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を投与する方法について述べている。
【０１２１】
「治療的処置」という用語は、個体の健康状況を改善する、及び/又は寿命を延ばす(延長させる)あらゆる処置に関する。前記処置は、個体の疾患を除去する、個体の疾患の進展を停止する若しくは遅らせる、個体の疾患の進展を阻害する若しくは遅らせる、個体の症状の頻度若しくは重症度を減少させる、及び/又は疾患を現在有する若しくは過去に有していた個体での再発を減少させる可能性がある。
【０１２２】
「予防的処置」又は「防止処置」という用語は、疾患が個体に出現することを防止する目的のあらゆる処置に関する。「予防的処置」又は「防止処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０１２３】
「保護する」、「防止する」、「予防的」、「防止用」又は「保護的」という用語は、個体における疾患、例えば腫瘍が出現する及び/又は広がることの防止及び/又は処置に関する。例えば、免疫療法の予防的投与は、例えば本発明の医薬組成物を投与することによって、投与した個体を腫瘍の発生から保護することができる。例えば、免疫療法の治療的投与は、例えば本発明の医薬組成物を投与することによって、疾患の進展を停止し、例えば腫瘍の進行/成長の阻害をもたらすことができる。これには、腫瘍の進行/成長の減速、特に、好ましくは腫瘍の除去に至る、腫瘍の進行の妨害が含まれる。免疫療法の治療的投与は、例えば既存の腫瘍の播種又は転移から、個体を保護し得る。
【０１２４】
「水溶性化合物」という用語は、水に溶解し得るあらゆる化合物を指す。一般に、その基礎をなす溶媒和は、その化合物の正電荷及び負電荷と、H2O分子の部分的負電荷及び部分的正電荷間とがそれぞれ引き合うことによって生じる。水に溶解する化合物は「親水性」(「水を愛する」)とも称する。水溶解度としても知られる水溶性(SW)とは、所与の温度及び圧力で、平衡において物質が水に溶解し得る最大量のことである。一般に、限界量は溶解度積によって与えられる。ヨーロッパ薬局方による溶解度の定義に従うと、「やや溶けにくい(sparingly soluble)」とは、溶質1グラム当たりの溶媒のおよその体積がミリリットルにおいて30〜100であることを意味し(15℃〜25℃の間の温度で)、「可溶性(soluble)」とは、溶質1グラム当たりの溶媒のおよその体積がミリリットルにおいて10〜30であることを意味し(15℃〜25℃の間の温度で)、「溶けやすい(freely soluble)」とは、溶質1グラム当たりの溶媒のおよその体積がミリリットルにおいて1〜10であることを意味し(15℃〜25℃の間の温度で)、「極めて溶けやすい(very soluble)」とは、溶質1グラム当たりの溶媒のおよその体積がミリリットルにおいて1未満であることを意味する(15℃〜25℃の間の温度で)。本発明の目的にとって、RNAは親水性化合物であると考えられ、RNAによって形成されるシェルは「親水性シェル」であると考えられる。
【０１２５】
「低分子化合物」という用語は、本明細書では、生物学的過程に影響するように作用することができる低分子量の分子を指す。低分子としては、現在知られ、使用されている治療剤をいくらでも挙げることができる。或いは低分子は、生物学的機能をスクリーニングする目的のためのこのような分子のライブラリーとして合成された低分子であってもよい。低分子化合物は通常、500Da以下等の1,000Da以下の分子量を有する。低分子化合物は好ましくは、酵素基質、アンタゴニスト、又はアロステリックに活性化する若しくはアロステリックに阻害する分子等の、生物学的過程の制御分子として働く。この分子は、タンパク質、核酸又は多糖等の別の分子に結合でき、且つ他の分子の活性を変化させることでエフェクターとして作用できることが好ましい。
【０１２６】
「個体」及び「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、疾患又は障害(例えば、がん)に苦しむ又は罹りやすい可能性があるが、疾患又は障害を有していることも又は有していないこともあるヒト又は別の哺乳動物(例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ又は霊長類)を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。別段の記述がない限り、「個体」及び「対象」という用語は特定の年齢を指さず、したがって成体、年配者、子供及び新生児を包含する。本発明の好ましい実施形態では、「個体」又は「対象」は「患者」である。
【０１２７】
「患者」という用語は、処置する個体又は対象、特に、疾患を有する個体又は対象を意味し、これには、ヒト、ヒト以外の霊長類又は別の動物、特に、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、若しくはマウス及びラット等のげっ歯類等の哺乳動物が含まれる。本発明の特に好ましい実施形態では、患者はヒトである。
【０１２８】
本発明の粒子は、適切な任意の医薬組成物の形態で投与することができる。「医薬組成物」という用語は、治療有効薬剤又はその塩を、好ましくは、緩衝液、保存剤及び浸透圧調節剤等の医薬品賦形剤と共に含む製剤に関する。前記医薬組成物は、前記医薬組成物を個体に投与することによって、疾患又は障害を処置する、防止する又はその重症度を低減するために有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても知られている。医薬組成物は、局所又は全身に、好ましくは全身に投与することができる。本発明の文脈では、医薬組成物は本発明の粒子を含む。この粒子は治療的に有効である。
【０１２９】
「全身投与」という用語は、薬剤が相当量、個体の体内に広く分布し、生物学的効果を発現するように、治療有効薬剤を投与することを指す。例えば、薬剤は、その所望の効果を血液中で発現する、及び/又は血管系を通ってその所望の作用部位に達する可能性がある。典型的な全身投与経路としては、薬剤を血管系に直接導入することによる投与、又は薬剤が吸収され、血管系に入り、血液経由で1つ若しくは複数の所望の作用部位へと運ばれる、経口、肺内若しくは筋肉内投与が挙げられる。
【０１３０】
本発明によると、全身投与は非経口投与によることが好ましい。「非経口投与」という用語は、薬剤が腸を通過しないように、治療有効薬剤を投与することを指す。「非経口投与」という用語は、静脈内投与、皮下投与、皮内投与又は動脈内投与を包含するが、これらに限定されない。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、少なくとも1つのアジュバントを含む。「アジュバント」という用語は、抗原又は抗原ペプチドとの組合せで個体に投与された場合、免疫応答を長期化させる又は増強する若しくは加速させる化合物に関する。アジュバントは、1つ又は複数の機構によってそれらの生物活性を発揮すると想定され、これには、抗原の表面積の増加、体内における抗原保持の長期化、抗原放出の遅延、マクロファージへの抗原の標的化、抗原の取り込みの増加、抗原プロセシングの促進、サイトカイン放出の刺激、B細胞、マクロファージ、樹状細胞、T細胞等の免疫細胞の刺激及び活性化、並びに免疫細胞の非特異的活性化が含まれる。アジュバントは、オイルエマルション(例えば、フロイントアジュバント)、ミネラル化合物(ミョウバン等)、細菌による産生物(百日咳菌毒素等)、又は免疫刺激複合体等の化合物の異種混合のグループを含む。アジュバントの例としては、サポニン、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、トコフェロール又はミョウバンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は、一般に、「医薬的に有効な量」で、「医薬的に許容される調製物」として適用される。
【０１３３】
「医薬的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の無毒性を指す。
【０１３４】
「医薬的に有効な量」という用語は、単独で又は更なる投与と一緒になって、所望の反応又は所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患を処置する場合、所望の反応は、好ましくは、疾患の経過の阻害に関する。これには、疾患の進行を遅くすること、特に、疾患の進行を邪魔し、元に戻すことが含まれる。疾患の処置における所望の反応は、前記疾患又は前記状態の発症の遅延、又は発症の防止であることもある。本明細書に記述する粒子又は組成物の有効量は、処置しようとする状態、疾患の重症度、年齢、生理的状態、体の大きさ及び体重を含めた患者の各パラメータ、処置の長さ、付随する治療の種類(もしあれば)、特定の投与経路、並びに類似した因子によって決まる。したがって、本明細書に記述する粒子又は組成物が投与される用量は、このような様々なパラメータによって決まることがある。初回用量での患者における反応が十分でない場合には、より高い用量(又は、より局所的な別の投与経路によって達成される、実効的により高い用量)を使用してもよい。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、塩、緩衝液、保存剤、担体、及び場合によっては他の治療剤を含有することがある。好ましくは、本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される1つ又は複数の担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含む。
【０１３６】
「賦形剤」という用語は、結合剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、保存剤、乳化剤、緩衝液、香味剤又は着色剤等、有効成分ではない、医薬組成物中のあらゆる物質を指すことを意図する。
【０１３７】
「希釈剤」という用語は、希釈する及び/又は薄めるための作用物質に関する。更に、「希釈剤」という用語は、1つ又は複数の任意の流動体、液体若しくは固体懸濁液及び/又は混合用の媒体を包含する。
【０１３８】
「担体」という用語は、ヒトに投与するのに適した、1つ又は複数の適合性の固体若しくは液体の充填剤又は希釈剤に関する。「担体」という用語は、活性成分の適用を促進するために活性成分と組み合わされる、天然又は合成の有機又は無機の成分に関する。好ましくは、担体成分は、水又は油等の無菌液体であり、これには、鉱物油、動物又は植物に由来するもの、例えばピーナッツ油、ダイズオイル、ゴマ油、サンフラワーオイル等が含まれる。塩溶液並びに水性デキストロース及びグリセリン溶液を水性担体化合物として使用してもよい。
【０１３９】
治療用途の医薬的に許容される担体又は希釈剤は医薬分野でよく知られており、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.社(A. R Gennaro編、1985)に記述されている。適切な担体の例としては、例えば炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、バター状ココア等が挙げられる。適切な希釈剤の例としては、エタノール、グリセリン及び水が挙げられる。
【０１４０】
医薬担体、賦形剤又は希釈剤は、所期の投与経路及び標準的薬剤業務を考慮して選択することができる。本発明の医薬組成物は、担体、賦形剤若しくは希釈剤として又はそれらに加え、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤及び/若しくは可溶化剤を含むことがある。適切な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、天然の糖、例えばグルコース、無水ラクトース、易流動性ラクトース、β-ラクトース、トウモロコシ甘味料、天然及び合成ガム、例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース及びポリエチレングリコールが挙げられる。適切な滑沢剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。保存剤、安定剤、色素、更には香味剤ですら、医薬組成物に含めてもよい。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁剤を使用してもよい。
【０１４１】
「低減する」若しくは「阻害する」という用語又は類似した句は、レベル、例えば発現レベルに関して、特に対照との比較で、好ましくは少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも80%、又は少なくとも100%の全体的減少を引き起こす能力に関する。「低減」若しくは「阻害」という用語又は類似した句は、完全な又は本質的に完全な低減又は阻害、すなわち、特に対照との比較で、ゼロ又は本質的にゼロになるまでの低減又は阻害を包含する。
【０１４２】
「増加させる」若しくは「増強する」という用語又は類似した句は、レベル、例えば発現レベルに関して、特に対照との比較で、好ましくは少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも80%、又は少なくとも100%の全体的増加又は増強を引き起こす能力に関する。
【０１４３】
「RNA蓄積」という用語は、その最も広い意味での、RNAの濃縮を指す。好ましくは、濃縮は、身体、器官、組織、細胞種、細胞小器官又は細胞区画における局所的濃縮である。「RNA蓄積」という用語は、好ましくは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも80%、又は少なくとも100%の濃度上昇に関する。本発明によると、「RNA蓄積」という用語は、個体、器官、組織、細胞種、細胞小器官又は細胞区画におけるRNAの経時的な濃度上昇(例えば、処置前後のRNA濃度の変化)を意味することも、又は異なる個体、器官、組織、細胞種、細胞小器官又は細胞区画の間での濃度の差(例えば、肺と脾臓との間でのRNA濃度の差)を指すこともある。
【０１４４】
一実施形態では、本発明の粒子中のRNAは、全身投与した後に、脾臓への送達及び/又は脾臓における発現がなされることが好ましい。
【０１４５】
一実施形態では、本発明の粒子は、脾臓抗原提示細胞を活性化するために脾臓へと送達される。したがって、本発明の粒子を全身投与した後に、抗原提示細胞におけるRNA送達及び/又はRNA発現が起こることが好ましい。抗原提示細胞は、好ましくは、プロフェッショナル抗原提示細胞又はノンプロフェッショナル抗原提示細胞である。より好ましくは、プロフェッショナル抗原提示細胞は樹状細胞及び/又はマクロファージ、より一層好ましくは脾臓樹状細胞及び/又は脾臓マクロファージである。
【０１４６】
好ましい一実施形態では、本発明の粒子を全身投与すると、脾臓樹状細胞及び/又は脾臓マクロファージ等の樹状細胞及び/又はマクロファージにおいて、少なくとも1つの成熟マーカーの発現が上昇する。好ましくは、成熟マーカーは、CD40、CD80、CD86、CD83、HLA-DR等のMHCクラスI及びII分子からなる群から選択される。より好ましくは、成熟マーカーは、CD40、CD86及びMHCクラスII分子からなる群から選択される。より一層好ましくは、成熟マーカーは、CD40、CD86及びHLA-DRからなる群から選択される。
【０１４７】
「約」という用語は、指定された値又は値域よりも、その指定された値の10分の1大きい又は小さいことを意味するが、いずれの値又は値域も限定することを意図しない。例えば約30%の濃度値は、27%〜33%の間の濃度を意味する。「約」という用語が先行する各値又は値域は、その指定された絶対的な値又は値域の実施形態を包含することも意図する。
【０１４８】
「一部」という用語は、ある部分を指す。特定の構造に関し、「その一部」という用語は、その連続的又は非連続的部分を意味することがある。一部は、少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、好ましくは少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より一層好ましくは少なくとも80%、より一層好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは100%を含むことがある。
【０１４９】
本明細書で提供する薬剤及び組成物は、単独で、又は外科手術、放射線照射、化学療法及び/若しくは骨髄移植(自家移植、同系間移植、同種異系移植又は非血縁者間移植)等の従来の治療レジメンと組み合わせて使用することができる。
【０１５０】
とりわけ、がんの処置は、併用戦略が特に望ましい分野の典型である。2つ、3つ、4つ又はそれよりも更に多い数の制がん薬/がん治療の組み合わさった作用は、単独治療アプローチの効果よりもかなり強い相乗効果を生ずることがしばしばあるからである。したがって、本発明の別の実施形態では、本発明の粒子を使用したがん処置は、効果的に他の様々な薬物と組み合わせることができる。これらには例えば、従来の腫瘍療法、マルチエピトープ戦略、追加の免疫療法、及び血管新生又はアポトーシスを標的とした処置アプローチとの組合せがある(総説については、例えばAndersen等  2008: Cancer treatment: the combination of vaccination with other therapies. Cancer Immunology Immunotherapy、57(11): 1735〜1743頁を参照されたい)。様々な薬剤を順番に投与すると、がん細胞増殖を様々なチェックポイントで阻害する可能性がある。一方、他の薬剤は、例えば新血管新生(neo-angiogenesis)、悪性細胞の生存又は転移を阻害する可能性があり、これは場合によってはがんを慢性疾患に転換する。以下の一覧に、本発明と組み合わせて使用することができる抗がん薬及び治療の非限定的な例を幾つか示す。
【０１５１】
1. 化学療法
化学療法は、複数種のがんに対する管理の標準的なものである。最も一般的な化学療法剤は、がん細胞の主な性質の1つである急速な分裂を行う細胞を死滅させることによって作用する。したがって、例えばアルキル化剤、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、及び細胞分裂又はDNA合成のいずれかに影響する他の抗腫瘍剤等の従来の化学療法薬との組合せは、サプレッサー細胞を除去することによって本発明の治療効果を顕著に改善することも、又は腫瘍細胞を、免疫により媒介される殺傷に対しより感受性にすることによって、若しくは免疫系の細胞を更に活性化することによって免疫系を再活性化することもある。化学療法薬と、ワクチン接種に基づく、免疫療法の薬物との相乗的抗がん作用は、複数の研究で実証されている(例えばQuoix等、2011: Therapeutic vaccination with TG4010 and first-line chemotherapy in advanced non-small-cell lung cancer: a controlled phase 2B trial. Lancet Oncol. 12(12): 1125〜33頁を参照されたい; Liseth等、2010: Combination of intensive chemotherapy and anticancer vaccines in the treatment of human malignancies: the hematological experience. J Biomed Biotechnol. 2010: 6920979も参照されたい; Hirooka等、2009: A combination therapy of gemcitabine with immunotherapy for patients with inoperable locally advanced pancreatic cancer. Pancreas 38(3): e69〜74も参照されたい)。基本的に併用治療に適した数百の化学療法薬が入手可能である。本発明と組み合わせることができる化学療法薬の幾つかの(非限定的な)例はカルボプラチン(パラプラチン)、シスプラチン(プラチノール、プラチノールAQ)、シクロホスファミド(シトキサン、ネオサール)、ドセタキセル(タキソテール)、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、エルロチニブ(タルセバ)、エトポシド(ベプシド)、フルオロウラシル(5-FU)、ゲムシタビン(ジェムザール)、メシル酸イマチニブ(グリーベック)、イリノテカン(カンプトサール)、メソトレキセート(フォレックス(Folex)、メキセート(Mexate)、アメトプテリン)、パクリタキセル(タキソール、アブラキサン)、ソラフィニブ(ネクサバール)、スニチニブ(スーテント)、トポテカン(ハイカムチン)、ビンクリスチン(オンコビン、ビンカサールPFS)及びビンブラスチン(ベルバン(Velban))である。
【０１５２】
2. 外科手術
がんの外科手術は、腫瘍を除去する手術であるが、これは依然としてがん処置の基礎となっている。外科手術は、残存する腫瘍細胞を全て除去するために、他のがん処置と組み合わせることができる。外科的方法を、それに続く免疫療法処置と組み合わせることは、数え切れない程繰り返し実証されてきた有望なアプローチである。
【０１５３】
3. 放射線
放射線治療は依然としてがん処置の重要な要素であり、全がん患者の約50%がその疾患経過において放射線治療を受けている。放射線治療の主な目的は、がん細胞からその増殖(細胞分裂)能を奪うことである。がんを処置するために使用される種類の放射線は、光子放射線(X線及びガンマ線)及び粒子放射線(電子、プロトン及び中性子ビーム)である。放射線をがんの箇所に照射する2つの方法がある。外部ビーム放射線は、体の外部から、高エネルギー光線(光子、プロトン又は粒子放射線)を腫瘍の箇所に向けることによって照射される。内部放射線又はブラキセラピーは、体の内部から、直接腫瘍部位内へ、カテーテル又はシード内に封入された放射線源によって照射される。本発明と組み合わせて適用され得る放射線治療法は、例えば分割法(分割レジメンで照射される放射線治療、例えば、1.5から3Gyの一日分割量が数週にわたり施される)、3次元原体放射線治療(3DCRT;肉眼的腫瘍体積への放射線の照射)、強度変調放射線治療(IMRT;複数の放射線ビームのコンピュータ制御による強度の変調)、画像誘導放射線治療(IGRT;補正を可能にする放射線治療前イメージングを含む手法)、及び体幹部定位放射線治療(SRBT、僅か数回の処置に分割して、各回で非常に高い線量を照射する)である。放射線治療の総説については、Baskar等、2012: Cancer and radiation therapy: current advances and future directions. Int. J Med Sci. 9(3): 193〜199頁を参照されたい。
【０１５４】
4. 抗体
抗体(好ましくは、モノクローナル抗体)は、様々な機構によって、がん細胞に対しその治療効果を上げる。抗体は、アポトーシス又はプログラム細胞死を生ずる上で直接的な効果を有し得る。抗体は、例えば成長因子受容体等のシグナル伝達経路の成分をブロックし、腫瘍細胞の増殖を効果的に停止させることができる。モノクローナル抗体は、それを発現する細胞において、抗イディオタイプ抗体形成を起こすことがある。間接的な効果には、単球及びマクロファージ等の細胞傷害性を有する細胞を動員することが含まれる。このタイプの抗体媒介性の細胞殺傷は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)と呼ばれる。抗体は又、補体に結合し、補体依存性細胞傷害性(CDC)として知られる直接的な細胞障害性をもたらす。外科的な方法を、免疫療法の薬物又は方法と組み合わせることは、例えばGadri等、2009: Synergistic effect of dendritic cell vaccination and anti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma. J Immunother. 32(4): 333〜40頁に実証されているように、成功したアプローチである。以下の一覧に、本発明と組み合わせて使用することができる抗がん抗体、及び抗体の標的候補(括弧内)の非限定的な例を幾つか示す:アバゴボマブ(CA-125)、アブシキシマブ(CD41)、アデカツムマブ(EpCAM)、アフツズマブ(CD20)、アラシズマブ(Alacizumab)ペゴル(VEGFR2)、ペンテト酸アルツモマブ(CEA)、アマツキシマブ(MORAb-009)、アナツモマブ・マフェナトクス(Anatumomab mafenatox) (TAG-72)、アポリズマブ(HLA-DR)、アルシツモマブ(CEA)、バビツキシマブ(ホスファチジルセリン)、ベクツモマブ(CD22)、ベリムマブ(BAFF)、ベバシズマブ(VEGF-A)、ビバツズマブ(Bivatuzumab)・メルタンシン(CD44 v6)、ブリナツモマブ(CD19)、ブレンツキシマブ・ベドチン(CD30 TNFRSF8)、カンツズマブ・メルタンシン(ムチンCanAg)、カンツズマブ・ラブタンシン(MUC1)、カプロマブ・ペンデチド(前立腺癌細胞)、カルルマブ(CNTO888)、カツマキソマブ(EpCAM、CD3)、セツキシマブ(EGFR)、シタツズマブ・ボガトクス(Citatuzumab bogatox) (EpCAM)、シクスツムマブ(IGF-1受容体)、クローディキシマブ(Claudiximab) (クローディン)、クリバツズマブ・テトラキセタン(MUC1)、コナツムマブ(TRAIL-R2)、ダセツズマブ(CD40)、ダロツズマブ(インスリン様増殖因子I受容体)、デノスマブ(RANKL)、デツモマブ(detumomab) (Bリンパ腫細胞)、ドロジツマブ(DR5)、エクロメキシマブ(GD3ガングリオシド)、エドレコロマブ(EpCAM)、エロツズマブ(SLAMF7)、エナバツズマブ(PDL192)、エンシツキシマブ(NPC-1C)、エプラツズマブ(CD22)、エルツマキソマブ(HER2/neu、CD3)、エタラシズマブ(インテグリンαvβ3)、ファーレツズマブ(葉酸受容体1)、FBTA05(CD20)、フィクラツズマブ(SCH 900105)、フィギツムマブ(IGF-1受容体)、フランボツマブ(糖タンパク質75)、フレソリムマブ(TGF-β)、ガリキシマブ(CD80)、ガニツマブ(IGF-I)、ゲムツズマブ・オゾガマイシン(CD33)、ゲボキズマブ(IL-1β)、ギレンツキシマブ(カルボニックアンヒドラーゼ9(CA-IX))、グレンバツムマブ・ベドチン(GPNMB)、イブリツモマブ・チウキセタン(CD20)、イクルクマブ(VEGFR-1)、イゴボマ(Igovoma) (CA-125)、インダツキシマブ(Indatuximab)・ラブタンシン(SDC1)、インテツムマブ(CD51)、イノツズマブ・オゾガマイシン(CD22)、イピリムマブ(CD152)、イラツムマブ(CD30)、ラベツズマブ(CEA)、レクサツムマブ(TRAIL-R2)、リビビルマブ(Libivirumab) (B型肝炎表面抗原)、リンツズマブ(CD33)、ロルボツズマブ・メルタンシン(CD56)、ルカツムマブ(CD40)、ルミリキシマブ(CD23)、マパツズマブ(TRAIL-R1)、マツズマブ(EGFR)、メポリズマブ(IL-5)、ミラツズマブ(CD74)、ミツモマブ(GD3ガングリオシド)、モガムリズマブ(CCR4)、モキセツモマブ・パスドトクス(pasudotox) (CD22)、ナコロマブ・タフェナトクス(Nacolomab tafenatox) (C242抗原)、ナプツモマブ・エスタフェナトクス(5T4)、ナルナツマブ(RON)、ネシツムマブ(EGFR)、ニモツズマブ(EGFR)、ニボルマブ(IgG4)、オファツムマブ(CD20)、オララツマブ(PDGF-R  α)、オナルツズマブ(ヒト散乱因子(scatter factor)受容体キナーゼ)、オポルツズマブ・モナトクス(Oportuzumab monatox) (EpCAM)、オレゴボマブ(CA-125)、オキセルマブ(OX-40)、パニツムマブ(EGFR)、パトリツマブ(HER3)、ペムツモマ(Pemtumoma) (MUC1)、ペルツズマブ(HER2/neu)、ピンツモマブ(Pintumomab) (腺癌抗原)、プリツムマブ(Pritumumab) (ビメンチン)、ラコツモマブ(Racotumomab) (N-グリコリルノイラミン酸)、ラドレツマブ(Radretumab) (フィブロネクチンのエキストラドメイン-B)、ラフィビルマブ(Rafivirumab) (狂犬病ウイルス糖タンパク質)、ラムシルマブ(VEGFR2)、リロツムマブ(HGF)、リツキシマブ(CD20)、ロバツムマブ(IGF-1受容体)、サマリズマブ(CD200)、シブロツヅマブ(Sibrotuzumab) (FAP)、シルツキシマブ(IL-6)、タバルマブ(BAFF)、タカツズマブ・テトラキセタン(アルファ-フェトプロテイン)、タプリツモマブ・パプトクス(Taplitumomab paptox) (CD19)、テナツモマブ(Tenatumomab) (テネイシンC)、テプロツムマブ(CD221)、チシリムマブ(Ticilimumab) (CTLA-4)、ティガツズマブ(TRAIL-R2)、TNX-650 (IL-13)、トシツモマブ(CD20)、トラスツズマブ(HER2/neu)、TRBS07 (GD2)、トレメリムマブ(CTLA-4)、ツコツズマブ・セルモロイキン(EpCAM)、ウブリツキシマブ(Ublituximab) (MS4A1)、ウレルマブ(4-1BB)、ボロシキシマブ(インテグリンα5β1)、ボツムマブ(腫瘍抗原CTAA16.88)、ザルツムマブ(EGFR)、ザノリムマブ(CD4)。
【０１５５】
5. サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、融合タンパク質
抗原をコードする本発明の医薬組成物等の本発明の医薬組成物を、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子及び/又はその融合タンパク質と組み合わせて使用して、有益な免疫調節又は腫瘍阻害効果を誘発することは、本発明の別の実施形態である。免疫細胞の腫瘍への浸潤を増加させ、抗原提示細胞の腫瘍排出リンパ節への移動を促進するために、C、CC、CXC及びCX3C構造を有する種々のケモカインを使用してもよい。幾つかの最も有望なケモカインは、例えばCCR7並びにそのリガンドのCCL19及びCCL21、更にはCCL2、CCL3、CCL5及びCCL16である。他の例はCXCR4、CXCR7及びCXCL12である。更には、例えばB7リガンド(B7.1及びB7.2)等の共刺激分子又は制御分子が有用である。他のサイトカイン、例えば、特にインターロイキン(例えばIL-1からIL17)、インターフェロン(例えばIFNアルファ1からIFNアルファ8、IFNアルファ10、IFNアルファ13、IFNアルファ14、IFNアルファ16、IFNアルファ17、IFNアルファ21、IFNベータ1、IFNW、IFNE1及びIFNK)、造血因子、TGF (例えばTGF-α、TGF-β、及びTGFファミリーの他のメンバー)、最後に、それだけに限らないが、4-1BB、4-1BB-L、CD137、CD137L、CTLA-4GITR、GITRL、Fas、Fas-L、TNFR1、TRAIL-R1、TRAIL-R2、p75NGF-R、DR6、LT.ベータ.R、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn114、Troy/Trade、TAJ、TNFRII、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40、GITR、GITRL、TACI、BAFF-R、BCMA、RELT及びCD95 (Fas/APO-1)、糖質コルチコイドにより誘導されるTNFR関連タンパク質、TNF受容体関連アポトーシス媒介タンパク質(TNF receptor-related apoptosis-mediating protein) (TRAMP)及び細胞死受容体6 (DR6)を含めた、腫瘍壊死因子ファミリーの受容体及びそれらのリガンドのメンバー並びに他の刺激性分子等も有用である。特にCD40/CD40L及びOX40/OX40Lは、T細胞の生存及び増殖に直接影響するので、併用免疫療法の重要な標的である。総説については、Lechner等、2011: Chemokines, costimulatory molecules and fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors. Immunotherapy 3 (11)、1317〜1340頁を参照されたい。
【０１５６】
6. 細菌による処置
研究者達は、クロストリジウム・ノビイ（Clostridium novyi）等の嫌気性菌を使用して、低酸素腫瘍の内部を食べ尽くさせてきた。嫌気性菌はその後、腫瘍の酸素がある側に接触すると死滅するはずで、つまり、身体の他の部分にとっては無害である。別の戦略は、無毒性プロドラッグを毒性薬物に変換できる酵素で形質転換しておいた嫌気性菌を使用することである。腫瘍の壊死性及び低酸素の領域で細菌が増殖することで、酵素は腫瘍でのみ発現する。こうして、全身適用されたプロドラッグは、腫瘍においてのみ、毒性薬物へと代謝される。これが効果的であることは、非病原性嫌気性菌のクロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）を用いて実証されている。
【０１５７】
7. キナーゼ阻害剤
相補的がん治療における標的候補の別の大きなグループにはキナーゼ阻害剤が含まれる。がん細胞の増殖及び生存は、キナーゼ活性の脱制御と密接に連動しているからである。正常なキナーゼ活性を回復し、ひいては腫瘍成長を低減するために、広範な阻害剤が使用されている。標的となるキナーゼのグループには、受容体チロシンキナーゼ、例えばBCR-ABL、B-Raf、EGFR、HER-2/ErbB2、IGF-IR、PDGFR-α、PDGFR-β、c-Kit、Flt-4、Flt3、FGFR1、FGFR3、FGFR4、CSF1R、c-Met、RON、c-Ret、ALK、細胞質チロシンキナーゼ、例えばc-SRC、c-YES、Abl、JAK-2、セリン/スレオニンキナーゼ、例えばATM、オーロラA&B、CDK、mTOR、PKCi、PLK、b-Raf、S6K、STK11/LKB1及び脂質キナーゼ、例えばPI3K、SK1が含まれる。低分子キナーゼ阻害剤は、例えばPHA-739358、ニロチニブ、ダサチニブ、並びにPD166326、NSC 743411、ラパチニブ(GW-572016)、カネルチニブ(CI-1033)、セマキシニブ(SU5416)、バタラニブ(PTK787/ZK222584)、スーテント(SU11248)、ソラフェニブ(BAY 43-9006)及びレフルノミド(SU101)である。更なる情報については、例えばZhang等、2009: Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nature Reviews Cancer 9、28〜39頁を参照されたい。
【０１５８】
8. Toll様受容体
Toll様受容体(TLR)ファミリーのメンバーは、自然免疫と適応免疫とを繋ぐ重要な因子であり、多くのアジュバントの効果が、TLRの活性化に依存する。多数の確立された、がんに対するワクチンに、ワクチン応答をブーストするために、TLRのリガンドが組み込まれている。TLR2、TLR3、TLR4に加え、特にTLR7及びTLR8が、受動免疫療法アプローチのがん治療のために検討されてきた。密接に関連するTLR7及びTLR8は、免疫細胞、腫瘍細胞及び腫瘍微小環境に影響することによって抗腫瘍応答に寄与し、又ヌクレオシドアナログ構造によって活性化され得る。TLRは全て、単独型の免疫療法又はがんワクチンアジュバントとして使用されてきており、本発明の製剤及び方法と相乗的に組み合わせることができる。更なる情報については、van Duin等、2005: Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology、27(1):49〜55頁を参照されたい。
【０１５９】
9. 血管新生阻害剤
腫瘍により媒介される回避機構及び免疫抑制の影響を受ける免疫調節受容体を標的とする治療に加え、腫瘍環境を標的とする治療もある。血管新生阻害剤は、腫瘍が生存のために必要とする、広範囲にわたる血管成長(血管新生)を妨げる。その増加する栄養需要及び酸素需要を満たすために腫瘍細胞によって促進される血管新生は、例えば、様々な分子を標的とすることによってブロックできる。本発明と組み合わせることができる、血管新生を媒介する分子又は血管新生阻害剤の非限定的な例は、可溶性VEGF (VEGFアイソフォームのVEGF121及びVEGF165、受容体のVEGFR1、VEGFR2、並びに共役受容体のニューロピリン1及びニューロピリン2) 1及びNRP-1、アンジオポエチン2、TSP-1及びTSP-2、アンジオスタチン及び関連する分子、エンドスタチン、バソスタチン、カルレティキュリン、血小板因子-4、TIMP及びCDAI、Meth-1及びMeth-2、IFN-α、IFN-β及びIFN-γ、CXCL10、IL-4、IL-12及びIL-18、プロトロンビン(クリングルドメイン-2)、アンチトロンビンIII断片、プロラクチン、VEGI、SPARC、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質、レスチン、並びに薬物、例えばベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、TNP-470、CM101、IFN-α、血小板因子-4、スラミン、SU5416、トロンボスポンジン、VEGFRアンタゴニスト、血管新生抑制ステロイド+ヘパリン、軟骨由来の血管新生阻害因子、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、2-メトキシエストラジオール、テコガラン(tecogalan)、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン、プロラクチンα  Vβ3阻害剤(prolactinα  Vβ3 inhibitor)、リノミド、タスキニモドである。総説については、Schoenfeld及びDranoff 2011: Anti-angiogenesis immunotherapy. Hum Vaccin. (9):976〜81頁を参照されたい。
【０１６０】
10. 低分子標的治療薬
低分子標的治療薬は、一般に、がん細胞内で変異し過剰発現した、元来は不可欠であったタンパク質の酵素ドメインの阻害剤である。重要な非限定的な例は、チロシンキナーゼ阻害剤のイマチニブ(グリーベック/グリベック)及びゲフィチニブ(イレッサ)である。低分子、例えば、幾つかのキナーゼを標的とするリンゴ酸スニチニブ及び/又はトシル酸ソラフェニブの、がん治療用のワクチンと組み合わせた使用も、過去の特許出願US2009004213に記述されている。
【０１６１】
11. ウイルスをベースとしたワクチン
併用治療アプローチにおいて本発明の製剤と共に使用できる、ウイルスをベースとした幾つかのがんワクチンが入手可能又は開発中である。このようなウイルスベクターを使用する利点の1つは、ウイルス感染の結果として炎症反応が起き、免疫活性化に必要な危険シグナルを生ずる形で免疫応答を開始するという、ウイルスベクター本来の能力である。理想的ウイルスベクターとは安全であり、且つ抗腫瘍性の特異的応答をブーストできるように、抗ベクター免疫応答を導入しないウイルスベクターのことである。組換えウイルス、例えばワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びアビポックスウイルスは、動物腫瘍モデルで使用されてきており、その有望な結果に基づき、ヒト臨床試験が開始されている。ウイルスをベースとした特に重要なワクチンは、ウイルス様粒子(VLP)、つまり、ウイルスの外側のコートに由来するある特定のタンパク質を含有する小型粒子である。ウイルス様粒子は、ウイルス由来の遺伝物質を一切含有しないので感染を引き起こすことはできないが、それらのコート上に腫瘍抗原を提示するように構築することはできる。VLPは、種々のウイルス、例えばB型肝炎ウイルス、又はパルボウイルス科(例えばアデノ随伴ウイルス)、レトロウイルス科(例えばHIV)及びフラビウイルス科(例えばC型肝炎ウイルス)を含めた他のウイルスファミリーから派生させることができる。一般的な総説については、Sorensen及びThompsen 2007: Virus-based immunotherapy of cancer: what do we know and where are we going? APMIS 115(11):1177〜93頁を参照されたい;がんに対するウイルス様粒子は、Buonaguro等、2011: Developments in virus-like particle-based vaccines for infectious diseases and cancer. Expert Rev Vaccines 10(11):1569〜83頁;及びGuillen等、2010: Virus-like particles as vaccine antigens and adjuvants: application to chronic disease, cancer immunotherapy and infectious disease preventive strategies. Procedia in Vaccinology 2 (2)、128〜133頁に総説されている。
【０１６２】
12. マルチエピトープ戦略
マルチエピトープの使用により、ワクチン接種に関し有望な結果が示されている。迅速な配列決定技術が知的アルゴリズムシステムと組み合わさると、腫瘍のミュータノームの利用が可能になり、本発明と組み合わせることができる個別に変更されたワクチンのためのマルチエピトープを得ることが可能となる。更なる情報については、2007: Vaccination of metastatic colorectal cancer patients with matured dendritic cells loaded with multiple major histocompatibility complex class I peptides. J Immunother 30: 762〜772頁;更にCastle等、2012: Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res 72 (5):1081〜91頁を参照されたい。
【０１６３】
13. T細胞養子移入
例えば、腫瘍抗原ワクチン接種とT細胞移入との組合せは、Rapoport等、2011: Combination immunotherapy using adoptive T-cell transfer and tumor antigen vaccination on the basis of hTERT and survivin after ASCT for myeloma. Blood 117(3):788〜97頁に報告されている。
【０１６４】
14. ペプチドをベースとした標的治療
ペプチドは、細胞表面受容体、又は腫瘍の周りの、影響を受けた細胞外マトリックスに結合し得る。これらのペプチド(例えば、RGD)に結合させた放射性核種はいずれ、その核種が近傍で崩壊した場合にはがん細胞を死滅させる。特に、これら結合モチーフのオリゴマー又はマルチマーは、腫瘍特異性及びアビディティーの増強をもたらすことがあるので大変興味深い。非限定的な例については、Yamada 2011: Peptide-based cancer vaccine therapy for prostate cancer, bladder cancer, and malignant glioma. Nihon Rinsho 69(9): 1657〜61頁を参照されたい。
【０１６５】
15. 他の治療
相乗効果を得るために本発明と組み合わせることができるがん治療が、他にも多数ある。非限定的な例は、アポトーシス、高熱を標的とする処置、ホルモン療法、テロメラーゼ療法、インスリン強化療法、遺伝子治療及び光線力学的治療である。
【０１６６】
以下の図及び実施例を用いて本発明を詳細に記述するが、これらは説明のみを目的として用いるのであって、限定を意図するものではない。これらの記述及び実施例によって、本発明に同じく包含される更なる実施形態も、当業者ならば利用可能である。
【実施例】
【０１６７】
(実施例1)
材料及び方法
エタノール注入法及び更なる処理によるZAを含むコロイド状脂質分散体の調製
1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)は、Avanti Polar Lipids社(アラバスター、アラバマ)から購入した。コレステロール(純度99%)は、Sigma社(セントルイス、ミズーリ)から入手した。ゾレドロン酸は、CHEMOS GmbH社(レーゲンスタウフ、ドイツ)から入手した。RNAseフリーのリン酸緩衝食塩水、hepes緩衝液は、Ambion社(ダルムシュタット、ドイツ)から購入した。RNAseフリー水は、B-Braun社(メルスンゲン、ドイツ)から購入した。全ての試薬は分析グレードであった。コロイドは、改変されたエタノール注入法によって、以下のプロトコールに従い調製した:
・HEPES緩衝液100mM、pH4.0中のゾレドロン酸水溶液(0.66、1.33、2.0、3.33、6.67、10.0、20mg/ml)1.5mlを、50mlガラスビーカーに移した。ビーカーをマグネティックスターラーに載せ、溶液を、IKA big squidモデルのスターラー(IKA社、ケーニッヒスヴィンター、ドイツ)を使用して400rpmで撹拌した。
・エタノール中の脂質溶液(DOTMA/DOPE;2:1モル比、並びにDOTMA及びDOPEの全脂質濃度はそれぞれ270mM及び135mM)0.492mlを、無水エタノールで0.666mlに更に希釈し(DOTMA及びDOPEについて、それぞれ200mM及び100mM)、シリンジ(シリンジのタイプ: Omnifix(登録商標)-F 1ml滅菌プラスチックシリンジ、B. Braun社;メルズンゲン、ドイツ、針: 27Gのサイズの微細針)で、撹拌中のゾレドロン酸溶液に注入した。
・脂質注入後、懸濁液を10分撹拌した。
・10分後、RNAseフリー水3mlをコロイドに添加した。脂質及びZAの分散体を20分撹拌した。
【０１６８】
コロイドの濾過
・得られたコロイド状分散体の粗分散体は、Minisart 0.45μm CE膜(Sartorius Stedim Biotech GmbH社、ゲッティンゲン、ドイツ)を通過させた。
【０１６９】
コロイドの透析
遊離のゾレドロン酸及びエタノール残渣を除去するために、濾過されたコロイドを以下のように透析した:
・各1mlのコロイドを、RNAsesフリーSlide-A-Lyzer 10K透析カセット(Thermo Fisher Scientific GmbH社、ドライアイヒ、ドイツ)を使用して、200mlのPBSに対して透析した。
・透析は室温で24時間、400rpmの撹拌速度で行った。コロイドを、更なる物理化学的キャラクタリゼーションのために滅菌ファルコンチューブに回収した。
【０１７０】
コロイド中のゾレドロン酸(ZA)の保持
保持されたゾレドロン酸は、HPLCによって定量した。HPLCシステムは、G1311Bクォータナリポンプ、G4212B DAD (ダイオードアレイ検出器)検出器、G1367EオートサンプラAS Hip、G1330Bカラムオーブンサーモスタット及びLC用ChemStationリビジョンB.04.02 (Agilent technologies社、コロラド、USA)からなっていた。固定相はxSelect CSH (C18)カラム(150mm×4.6mm×3.5μm) (Waters社、エシュボルン、ドイツ)であった。移動相は、メタノール(20%)と、5mMテトラブチルアンモニウムブロミド(TCI Deutschland GmbH社、エシュボルン、ドイツ)含有リン酸緩衝液30mM (80%)との、pH7.2に調整した混合物とした。移動相のpHの決定には、inoLab pH 7310P pHメーター(WTW社、ヴァイルハイム、ドイツ)を使用した。流速及びカラムオーブン温度は、1mL/分及び50℃とした。検出波長は215nmとした。注入体積は25μlに達した。遊離のゾレドロン酸は、再生セルロース膜を備え、MWCOが30KDの高回収率ウルトラセル(Millipore社、シュヴァルバッハ/Ts.、ドイツ)を使用し、以下の工程に従って測定した:
・0.1M NaOH溶液、続いてPBSを、濾過により膜を通過させて、あらゆる保存剤を除去する。
・500μlのコロイド試料を0.5mLウルトラセルチューブに移す。
・試料を、40゜固定角ローター遠心分離機Pico 21 (Thermoscientific社、オスターオーデ、ドイツ)を使用して室温で14000×g、15分遠心分離する。
・定量するために濾液をHPLCガラスバイアルに回収する。
・HPLCによって、濾液におけるゾレドロン酸濃度を上述のように測定する。
【０１７１】
保持効率%の計算
保持効率%=[(透析したコロイドにおけるZAの合計-透析したコロイドにおける遊離のZA/透析したコロイドにおけるZAの合計]×(100)。
【０１７２】
ZA及びRNAを含むLNPの形成
必要とされるカチオン性脂質/RNA(モル/塩基)の比に応じて、計算された体積のZA/脂質コロイドを、計算された体積のRNA/PBSに添加した。混合物を少なくとも15分インキュベートして、LNPを形成させた。
【０１７３】
コロイド状脂質分散体における開始ZA濃度の関数として示すゾレドロン酸(ZA)の保持
コロイド状脂質分散体を、上記のエタノール注入法によって調製した。脂質組成は、2/1モル比のDOTMA/DOPEであった。ZAを20mg/mlの濃度で100mMのHEPES緩衝液に溶解させ、5MのNaOHを用いてpHを約4に調整した。脂質濃度は、約12mMであった。保持された及び遊離のゾレドロン酸をHPLCによって定量した。遊離のゾレドロン酸は、再生セルロース膜を備え、MWCOが30KDの高回収率ウルトラセルを使用して測定した。試料は、40゜固定角ローター遠心分離機Pico 21を使用して室温で15分、4000×gで遠心分離した。濾液は、定量するためにHPLCバイアルに回収した。
【０１７４】
ゾレドロン酸及びRNAを含むLNPにおけるZAの保持
脂質のモル分率が異なるZAを含むコロイド状脂質分散体を、対照としてのPBS、RNA及びTriton x100と混合した。脂質組成は、2/1モル比のDOTMA/DOPEであった。ZA/脂質分散体は、計算された体積のZAを含む脂質分散体を計算された体積のRNAと、2mM、4mM及び6mMの3つの異なる脂質濃度で混合することによって調製した。ZA/脂質分散体及びRNAは、1:1の比(v/v)で混合した。カチオン性脂質/RNA電荷比(モル/塩基)は、1:2であった。PBS及びTriton x100については、計算されたRNA体積を、10%の生理学的PBS又はTriton x100水溶液で置き換えた。ZA及びRNAを含むLNPは、30分室温でインキュベートした。その後、0.1M NaOH溶液、続いてPBSを、濾過により膜を通過させて、事前にあらゆる保存剤を除去した0.5mLのウルトラセルチューブにこれらを移した。試料は、40゜固定角ローター遠心分離機Pico 21 (Thermoscientific社、オスターオーデ、ドイツ)を使用して、室温で15分、4000×gで遠心分離した。濾液は、定量するためにHPLCガラスバイアルに回収した。濾液におけるゾレドロン酸濃度の測定は、HPLCによって上述のように行った。
【０１７５】
ゾレドロン酸及びRNAを含むLNPのクライオ透過型電子顕微鏡(クライオTEM)
LNPの脂質組成は2:1モル比のDOTMA/DOPEであり、正/負(カチオン性脂質/RNAヌクレオチド)比が1.3:2であるRNAを含有していた。最終脂質濃度は、0.3mMであった。アセンブリー後に、クライオTEM測定前に、製剤をRTで30分インキュベートした。グロー放電した穴あきカーボン支持フィルム3mm EMグリッド(銅、300メッシュ、3.5ミクロン穴/1ミクロンフィルム、Quantifoil、Plano社、イエナ、ドイツ)に3μlの試料を適用した。適用直後に、試料をブロットし(1.5秒、ブロット力-1、単一ブロッティング、湿度90%、15℃)、自動プランジ凍結システム(Vitrobot, Mark II, FEI社、アイントホーフェン、オランダ)によって液体エタン中で凍結させた。ガラス状試料は、液体窒素中で保存した。低温移送は、単一の傾斜液体窒素凍結移送ホルダー(model 626、Gatan社、プレザントン、USA)によって行った。加速電圧300kVに調整されたTecnai F30顕微鏡(FEI社、アイントホーヴェン、オランダ)が低線量の透過型クライオ電子顕微鏡検査に使用されている。データの収集は、UltraScan US4000 CCDカメラ(Gatan社、プレザントン、USA)で実施した。ピクセルサイズは、標本レベルの0.15〜1nmの間であった。画像は、Digital Micrographソフトウェア(Gatan社、プレザントン、USA)によって取得し、更なるデータ処理を行うことなく示した。
【０１７６】
PBMC細胞
提供されたバフィーコートを、Universitatsmedizin Mainzの「Transfusions-Zentrale」から得、フィコール-ハイパック密度勾配での密度遠心分離によって末梢血単核球(PBMC)を単離した。
【０１７７】
単離後、PBMCは、CD14マイクロビーズ及びLSカラム(Miltenyi Biotec社)を使用して更に処理し、CD14+単核細胞を得た。精製したCD14+細胞を用い、GM-CSF (1000U/mL)及びIL-4 (1000U/mL)が添加された標準培地で5日間培養することによって、通常の未熟樹状細胞(iDC)を得た。CD14を除去した細胞、つまり末梢血リンパ球(PBL)を、後に共培養実験に使用するために液体窒素で冷凍した。
【０１７８】
標準培地は、10%FCS、2mM L-グルタミン、100U/mL及び100mg/mLを含有するRPMI 1640とした。
【０１７９】
フローサイトメトリー
以下のモノクローナル抗体(mAb)を使用した:FITC標識抗CD83(HB15e、BD Pharmingen社)、PE標識抗CD86(IT2.2、BD Pharmingen社)、APC標識抗HLA-DR(G46-6、BD Pharmingen社)。固定可能な生細胞染色色素(fixable viability dye) eFluor506 (eBioscience社)を使用して、生細胞率を常に評価した。
【０１８０】
フローサイトメトリーのデータは全て、FACSCanto IIフローサイトメーター(BD Biosciences社)を使用して取得し、FlowJo-ソフトウェア(Tree Star社)で解析した。
【０１８１】
γ9δ2 T細胞増殖(proliferation)/増幅
保持した化合物、ZAの機能性を確認するために、ZAを負荷したiDCを、凍結保存してあったPBLと共培養した後、γ9δ2 T細胞の増幅を評価した。
【０１８２】
γ9δ2 T細胞のex vivoにおける頻度を評価するために、単離したばかりのPBMCを抗CD3、抗TCR-Vδ2のmABで染色し、フローサイトメトリーによって解析した。そこで、iDCは、指定した通りに24時間、5μMのZAを含有する標準培地中(1×106個/mL)でインキュベートした。iDCは、ZAを負荷した後に遠心分離し、PBSで洗浄した。iDCのPBLとの共培養は、ex vivoにおいて、iDC対γ9δ2 T細胞の比が20:1になるように設定した。培地には10U/mLのIL-2(プロロイキン)を添加した。7日間のインキュベーション後に細胞を回収、洗浄し、抗CD3、抗TCR-Vδ2のmABによって染色して、γ9δ2 T細胞の頻度及びその増幅を、フローサイトメトリーにより評価した。解析では、増幅率は、7日間培養の前又は後におけるその全細胞量で除することによって決定した。
【０１８３】
RNA発現
RNAがLNP中で結合していても完全な状態のままであるかどうか、ルシフェラーゼをコードするRNAの翻訳を生物発光によって調べた。ここでは、2×10^5個のiDCを96ウェルプレートに播種し、24時間指定した通りにインキュベートした。インキュベーション後、試料を遠心分離し(300g、5分)、上清を廃棄した。ルシフェラーゼアッセイ系(Bright Glo(商標)、Promega社)では、細胞ペレットを100μLの標準培地(Pen/Strepを含まない)に再懸濁し、100μLのアッセイ基質溶液を各ウェルに添加した。発光は、10分インキュベートした後に発光読み取り装置(Tecan Infinite M200)で測定した。
【０１８４】
DC成熟
製剤/物質が、インキュベーション後にDCの成熟をもたらすか否かを評価するために、フローサイトメトリー解析を行った。そこで、iDCを、指定した通りに48ウェルプレート中の標準培地に播種し(1mL及び1ウェル当たり1×10^6個のDC)、一晩、約20時間、又は24時間並びに48時間インキュベートした。インキュベーション後に細胞を回収、洗浄し、抗CD83、抗CD86及び抗HLA-DRのmABによって染色した。成熟についての陽性対照として、以下のサイトカインを含有するいわゆる「成熟カクテル」を使用した:IL-4(500U/mL)、GM-CSF(800U/mL)、IL-1β(10ng/mL)、TNF-a(10ng/mL)、IL-6(1000U/mL)及びPGE-2(1μg/mL)。解析では、これらのマーカーの発現は陰性対照、つまり刺激無し(標準培地のみにおける細胞)に対して規格化した。
【０１８５】
IPP蓄積
また、LNPが標的細胞のサイトゾル区画にZAを送達し、続いてIPPの蓄積をもたらすかどうかについても評価した。そこで、1mL(標準培地)当たり1×10^6個のiDCを、指定した通りに播種し、細胞培養物中の最終ZA濃度について0.1〜125μMの用量範囲で一晩、約20時間インキュベートした。インキュベーション後に、試料の細胞を回収、洗浄した。抽出するため、乾燥細胞ペレットに氷冷アセトニトリル(300μL)及び水(200μL)を添加した。5〜10分後に、試料を遠心分離にかけた(13,000×g、1分)。次いで、可溶性上清を新しいチューブに移し、真空遠心機で乾燥させた。IPPのマススペクトロメトリー分析まで、試料を-20℃で保存した。
【０１８６】
in vivo実験用の動物
メスの6〜12週齡Balb/cマウスを、ヨハネス・グーテンベルク大学マインツのZentrale Versuchtiereinrichtung(ZVTE)の施設内飼育から得、通常の実験室条件において概日明暗サイクルの下、標準的なマウス用固形飼料及び水道水に自由にアクセスできるように飼った(地域議会の動物実験倫理委員会(コブレンツ/ラインラント-プファルツ、ドイツ、G 12-1-081)によって承認を受けている)。マウスはイソフルオランで麻酔し、指定した溶液を後眼窩に注射した。
【０１８７】
生物発光イメージングにより解析したRNA発現
ルシフェラーゼ(Luc)をコードするRNAの取り込み及び翻訳の評価は、IVIS Spectrumイメージングシステム(Caliper Life Sciences社、アラメダ、カリフォルニア、USA)を使用した非侵襲性のin vivo生物発光イメージングによって行った。指定した溶液を注射した6時間後に、マウスにD-ルシフェリンの水溶液を腹腔内投与した(150mg/kg体重)。5分後、放射された光子を1分間集光した。関心領域(ROI)で測定された生物発光シグナルは、Living Imageソフトウェア(Caliper Life Sciences社)を使用して定量し、マウスのグレースケール写真上にカラースケールのイメージとして重ねて表示した。定量では、それぞれの器官又は組織から取得された生物発光シグナルは、シグナルを放射していない領域からのバックグラウンドの発光を差し引くことによって規格化した。
【０１８８】
FACSアッセイにより解析した脾臓DCの成熟
指定した溶液を注射した24時間後に、マウスを頚椎脱臼により安楽死させ、脾臓を取り出した。脾細胞は、脾臓をコラゲナーゼ(1mg/ml; Roche社)で5分間消化し、続いて、1mlシリンジのプランジャーを使用して脾臓を70μmナイロンセルストレーナー(BD Biosciences社、ハイデルベルク、ドイツ)に通すことによって得た。メッシュをPBSによって洗浄し、1500rpmで5分間の遠心分離工程の後、細胞は、室温で5分間、赤血球溶解(RBC)させ、ペレットは低浸透圧性緩衝液(KHCO3/NH4Cl/EDTA)に懸濁した。そして追加の遠心分離工程の後、細胞を10mlのPBS/5%FCSに懸濁した。脾細胞試料は、蛍光体標識モノクローナル抗体(mAb)のF4-80、CD40、CD86、NK1.1、CD11c、CD8(全てBD Pharmingen社、ハイデルベルク、ドイツから)と4℃で30分インキュベートし、PBSで洗浄し、300μlのPBS/5%FCSに懸濁した。0.75×106個の細胞に関するフローサイトメトリーのデータを、FACSCalibur解析用フローサイトメーター(BD Biosciences社)により取得し、FlowJo (Tree Star社)ソフトウェアで解析した。
【０１８９】
イソペンテニルピロリン酸(IPP)蓄積の試験
指定した溶液を注射した24時間後に、マウスを屠殺し、指定した組織(例えば脾臓)を採取した。脾細胞は、FACSアッセイによる脾臓DC成熟測定用プロトコールに従い、赤血球溶解せずに調製した。イソペンテニルピロリン酸(IPP)の分解を防ぐために氷冷アセトニトリル(300μl)、並びに0.25nmol/LのNaF及びNa3VO4を含有する水(200μl)を使用して、5×106個の脾細胞を抽出した(5分)。13,000×gで1分間の遠心分離の後、可溶性上清の抽出物を新しいエッペンドルフチューブに移し、真空遠心機で乾燥させ、続いてIPPのマススペクトメトリー(MS)分析まで-20℃で保存した。
【０１９０】
マススペクトメトリーによるIPPの分析
試料は、2%メタノール中の0.28%(v/v)ヘキシルアミンに溶解させた。細胞抽出液中のIPPのモル量は、6490トリプル四重極マススペクトロメーターを備えたAgilent 1290 Infinity UHPLC(JetStream Technology社、陰イオンエレクトロスプレーイオン化)によって決定した。IPPは非常に親水性が高い化合物であるため、逆相カラム中にこの化合物を保持するためには、ヘキシルアミンをイオンペア剤として使用する必要があった。HPLC分離は、Poroshell 120 EC-C18カラム(2.1×50mm、2.7μm)、並びに2.8% (v/v)ヘキシルアミン、メタノール中の1%酢酸(1:50で水中、溶離液A)及びアセトニトリル(溶離液B)からなる溶離液系を使用して行った。流速は0.4mL/分、注入体積は20μLとした。HPLC分離後、IPPの陰イオンマススペクトルは、エレクトロスプレーイオン化(ESI)源を備えた6490トリプル四重極マススペクトロメーター(Agilent technologies社、コロラド、USA)を使用して取得した。選択反応モニタリング(SRM)を使用して試料中の化合物を分析し、特徴的なフラグメントイオンに基づいて定量した。標準曲線は、合成IPPを使用して作成した。試料の濃度は、SRMクロマトグラムのピーク面積及び標準曲線を用いて決定した。
【０１９１】
(実施例2)
治療的に活性な物質及びRNAを含む脂質粒子の形成及びキャラクタリゼーション
コロイドにおけるZAの形成及び保持
ZAを含むコロイド状脂質分散体をエタノール注入法によって調製した。この方法では、脂質のエタノール溶液が針を通過して水性媒体中に速やかに滴下され、媒体全体にリン脂質が分散され、小胞形成が促進される。この非限定的な実施例では、コロイド状組成物は、2:1モル比のDOTMA/DOPEであった。エタノール性脂質溶液をHEPES緩衝液pH4のZA溶液に注入するとコロイドが形成された。水相中の総脂質濃度は12mMであったが、開始ZA濃度は、それぞれ0.4、1、2、3、4及び6mg/mlであった。得られた粗分散体は、0.45μm CE(セルロースエステル)膜を通して濾過した。それ以上の濾過又は押出成形は実施しなかった。続いて、遊離のZAを除去するため、コロイドを透析した。その結果、初発のZA濃度の増加に伴い、ZAの絶対量の増加が保持された(図1)。
【０１９２】
別の実験では(図2)、総脂質濃度(3mM、6mM及び12mMの間のDOTMA濃度)を変化させた。ここでは、保持されたZAの絶対量は、3mM、6mM及び12mMの間でDOTMA濃度が増加するに伴い、上昇する。
【０１９３】
これらのコロイド状脂質/ZA製剤は、更なる処理を行うことなく、RNAリポプレックス形成に使用した。これらの調製物から、RNA添加時のZAの保持を測定した。保持に関する陰性対照及び陽性対照として、PBS、及びTriton x100の添加も調査した。ZAを含む脂質コロイドにRNAを添加すると、ZAはリポプレックスによってかなりの程度まで保持された。図3は、ZAコロイド状分散体とRNAとの複合体形成がZAをほぼ保持すること;それぞれ、2、4及び6mg/mlの総脂質濃度に関して、保持されたZAの0%、23%及び22%のわずかなパーセンテージしか放出されなかったことを示している。この所見は、保持されたZAの100%放出をさせる(陰性対照としての)Triton x100でRNAを置き換えることによって確認された。IPP蓄積が腎臓及び骨髄で検出されたin vivoでの結果(ZAがリポプレックスと共にサイトゾル区画に標的細胞まで送達されたことを示す)は、これらの結果を支持している。
【０１９４】
ゾレドロン酸及びRNAを含むLNPのクライオ透過型電子顕微鏡(クライオTEM)
RNA及びZAを含むLNPのサイズ、厚さ、及び顕微鏡組織を視覚化及び決定するために、クライオ透過型電子顕微鏡(クライオTEM)イメージングを使用した。とりわけ、LNPは、カチオン性脂質/RNA電荷比1.3/2で、ZA分率0.01mg/mlで形成され、調査した。カチオン性ZAコロイド状分散体にRNAを複合体形成させた後に得られた製剤は、図4に示すような組織化されたラメラ状構造を形成する。200〜400nmの範囲のLNPの合計サイズが確認され、(多数の画像を分析した際に)1列に約2〜20のラメラを有する明確なラメラ状の内部組織が識別可能であった。1列に組織化されたラメラの平均数は、5〜15の間であった。RNA及びZAは、このラメラ状構造によって保持され得る。
【０１９５】
(実施例3)
治療的に活性な物質及びRNAを含む脂質粒子中のRNA及び治療的活性な物質の機能性
ZA及びRNAを含むLNP製剤とインキュベーションした後の樹状細胞(DC)におけるin vitro転写(IVT)されたルシフェラーゼ(Luc) RNAの発現
抗原等のタンパク質をコードし、ZAコロイド状分散体に結合しているRNAが完全なままであり、樹状細胞(DC)において、抗原等の機能的なタンパク質に翻訳され得たか否かを決定した。酵素ルシフェラーゼ(Luc)をコードするRNAを、ZAコロイド状分散体とインキュベートした。生じたルシフェラーゼRNA及びZAを含むLNPを樹状細胞とインキュベートし、ルシフェラーゼの発現を、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンの代謝速度を秒当たりのカウント(cps)で示すことで、発光を介して評価した。LNP(すなわち、ZAコロイド状分散体に結合しているルシフェラーゼ(Luc) RNA)又は裸のRNA(すなわち、ZAコロイド状分散体に結合していないルシフェラーゼRNA)とインキュベートした樹状細胞における発光測定の結果の通り、LNPとインキュベートした樹状細胞のみがルシフェラーゼシグナルを示した。図5は、RNAの結合後のLNP製剤とのインキュベーション後のDCにおけるルシフェラーゼIVT-RNAの発現を示す。両方の場合において、RNAのトランスフェクション効率が有意に改善され、完全なRNAがLNPによって標的細胞に送達され、そこで取り込まれ、タンパク質(ここではルシフェラーゼ)に翻訳されることが実証されている。このことから、樹状細胞は、ZAコロイド状分散体に結合しているRNAを壊さずにLNPを取り込み得ること、及びLNPは、タンパク質(ここではルシフェラーゼ)をコードするRNAが翻訳され得るほど十分に安定であったことが示される。このように、LNP、したがって本発明の粒子は、樹状細胞において、選んだ抗原等のタンパク質の翻訳を誘導するために使用できる。このことにより、LNP、したがって本発明の粒子は、免疫療法、例えば腫瘍ワクチン接種のために使用できることが更に示される。
【０１９６】
LNP製剤とインキュベートした後の樹状細胞における成熟マーカーの相対的発現
LNP(すなわち、ZAコロイド状分散体に結合しているRNA)による、in vitroでの樹状細胞(DC)の成熟への影響を、陽性対照(IL-4、GM-CSF、IL-1β、TNF-α、IL-6及びPGE-2を含有する成熟カクテル)、裸のRNA及びZAコロイド状分散体(すなわち、コロイド状分散体に封入されたゾレドロン酸(ZA))と比較して決定した。成熟マーカーCD83、CD86及びHLA-DRの相対的発現を、フローサイトメトリーを使用して決定し、LNPによって誘導された樹状細胞の成熟を評価した。相対的発現を解析するために、CD83、CD86及びHLA-DRの発現を陰性対照(標準培地中の細胞)に対して規格化した。その結果、LNPは、裸のRNA及びZAコロイド状分散体と比べて、CD83、CD86及びHLA-DRの発現をはっきりと増加させるとをもたらす。CD86及びHLA-DRに関しては、LNPによって誘導された発現は、陽性対照と同等であった。LNPによって誘導された相対的発現について測定された上昇は、CD83では1.5倍〜3倍の間、CD86では2.0倍〜3.5倍の間、HLA-DRでは1.5倍〜2.0倍の間であった。このことから、LNPは樹状細胞の成熟を誘導し、したがって免疫応答を調節できることが示される。
【０１９７】
図6に、ZA含有コロイド(ZAリポソーム)単独、及び陽性対照と比較した、ZA及びRNAを一緒に含むLNPを投与した後のDCの成熟マーカーの正規化された発現を示した。CD83 (A)、CD86 (B)、及びHLA-DR (C)の相対的発現を示す。発現データは、刺激無しの対照に正規化した。合計で4ドナーを個別に試験し、平均値を、SDも含めて示してある。全てのマーカーが上方制御されたので、DCの成熟は両方の場合において確認することができた。RNAとZAを一緒に含む製剤については、その効果はより更に顕著であった。
【０１９８】
図7に、ZA含有リポソームがDCの成熟をもたらすことを実証する、成熟マーカーの相対的発現の測定からの結果を示す。樹状細胞は、3つの異なるZA濃度(0.5μM、5μM及び50μM)のLNPと、24時間及び48時間インキュベートした。ここでは、成熟マーカーCD80 (A)、CD83 (B)、CD86 (C)、及びHLA-DR (D)の相対的発現が示されている。全ての成熟マーカーの発現は、IVT-RNAで修飾されたLNPとインキュベーションした後に樹状細胞において上方制御された。合計で2ドナーが個別に試験され、平均値を、SDも含めて示してある。ZA及びRNAを含有するLNPは、DCの用量依存性成熟をもたらすことが示され得る。DCに対するこの効果は、インキュベーションの48時間後により更に顕著であった。
【０１９９】
LNP製剤とインキュベートした未熟樹状細胞(iDC)、及び末梢血リンパ球(PBL)の共培養の後の、保持されたゾレドロン酸(ZA)の機能性
保持された治療剤が送達後も機能的なままか否かを試験するために、LNPによって送達されたゾレドロン酸(ZA)の機能性を評価した。特に、ゾレドロン酸がVγ9Vδ2 T細胞の増幅を誘導する能力を試験した(Castella, B.、Riganti, C.、Fiore, F.、Pantaleoni, F.、Canepari, M. E.、Peola, S.、Foglietta, M.、Palumbo, A.、Bosia, A.、Coscia, M.、Boccadoro, M.、Massaia, M. (2011)、The Journal of Immunology 187(4)、1578〜90頁)。LNPによる、Vγ9Vδ2細胞の増幅率への影響を調べるために、ゾレドロン酸(ZA)を負荷した未熟樹状細胞を、Vγ9Vδ2 T細胞を含む末梢血リンパ球と共培養した。7日間共培養した後、抗CD3抗体及び抗TCR-Vδ2抗体により細胞を染色して、Vγ9Vδ2細胞の頻度及びそれらの増幅をフローサイトメトリーにより評価した。LNP(すなわち、ZAコロイド状分散体に結合しているRNA)、ZAコロイド状分散体(すなわち、コロイド状分散体に封入されたZA)、及び遊離のゾレドロン酸(ZA)は、陰性対照(ゾレドロン酸(ZA)無し)と比べて、Vγ9δ2 T細胞の割合の増加をもたらす。解析では、Vγ9δ2 T細胞の増幅率は、7日間の培養期間前におけるVγ9δ2 T細胞の全細胞量を、7日間の培養期間後におけるVγ9δ2 T細胞の全細胞量で除することによって決定した。LNPによる処置は、約60倍のVγ9δ2 T細胞の増幅率を生じ、ZAコロイド状分散体処置は、約40倍のVγ9δ2 T細胞の増幅率を生じ、遊離のゾレドロン酸(ZA)処置は、約15倍のVγ9δ2 T細胞の増幅率を生じた。したがって、LNPにより誘導されるVγ9δ2 T細胞の増幅は非常に効率が高く、保持されたゾレドロン酸が非常に機能的であること、及びゾレドロン酸の送達特性が良好であることが示唆される。
【０２００】
(実施例4)
治療的に活性な物質及びRNAを含む脂質粒子のin vivoでの機能性
LNPを適用すると脾臓においてルシフェラーゼ(Luc)が発現する
in vitroの結果をin vivoで検証するために、ルシフェラーゼ(Luc)をコードするRNAを含有するLNP(20μg RNA/マウスに相当)をBalb/cマウスに注射した。LNP中のルシフェラーゼ(Luc) RNAの翻訳は、ルシフェリンの存在下で生物発光イメージングを使用して検出した。LNP(すなわち、ZAコロイド状分散体に結合しているルシフェラーゼ(Luc) RNA)を適用すると、脾臓においてルシフェラーゼが発現した。LNP(すなわち、ZAコロイド状分散体に結合しているルシフェラーゼ(Luc) RNA)を注射すると、裸のルシフェラーゼ(Luc) RNAを注射した場合よりも、有意に強い発光シグナルが誘導された。このことから、捕捉されたゾレドロン酸(ZA)は、in vivoでのRNA取り込み及び翻訳に負の影響を及ぼさないことが示される。捕捉されたゾレドロン酸(ZA)はむしろ、抗原等のタンパク質をコードするRNAの発現を増強する。
【０２０１】
LNPを適用すると、脾臓樹状細胞(DC)及びマクロファージ(mΦ)細胞集団においてCD40及びCD86発現が上方制御される
in vivoで、LNPを注射すると脾臓樹状細胞及びマクロファージ細胞が成熟するか否かを試験するために、LNP処置したマウスの脾細胞を調製した。続いて、樹状細胞及びマクロファージにおける成熟マーカーCD40及びCD86の表面発現の量を、フローサイトメトリーによって測定した。陰性対照(処置無し)と比べたCD40及びCD86のシグナルの増加は、ルシフェラーゼ(Luc)、又はゾレドロン酸コロイド状分散体に結合されたインフルエンザヘマグルチニンA (InfHA) RNA (LNP Luc-RNA又はLNP infHA-RNA)、及びルシフェラーゼ(Luc)、又はコロイド状分散体に結合されたインフルエンザヘマグルチニンA (InfHA) RNA(すなわち、ZA無し)(空のコロイド状分散体+Luc-RNA又は空のコロイド状分散体+InfHA-RNA)の存在下での樹状細胞において及びマクロファージ細胞集団においてのみ検出された。これと対照的に、陰性対照(処置無し)と比べたCD40及びCD86のシグナルの増加は、ZAコロイド状分散体、空のコロイド状分散体又は遊離のRNA (遊離のLuc-RNA若しくは遊離のInfHA-RNA)の存在下での樹状細胞において及びマクロファージ細胞集団においては検出されなかった。これらの結果から、in vivoで、LNP(すなわち、ZAコロイド状分散体に結合しているRNA)による処置が、樹状細胞及びマクロファージの成熟を誘導することが示唆される。インフルエンザヘマグルチニンAをコードするRNA (InfHA-RNA)のみならず、ルシフェラーゼをコードするRNA (Luc-RNA)も、樹状細胞及びマクロファージの成熟を誘導したことから、成熟誘導は、コードされるタンパク質とは独立であると考えられる。したがって、脾臓樹状細胞及びマクロファージの成熟を誘導するために、あらゆるRNAをコロイド状分散体に結合させることができる。これは、脾臓樹状細胞及びマクロファージの成熟を一般的に誘導するための、並びに脾臓樹状細胞及びマクロファージに抗原を導入するための有用な方法になり、これは特に、ワクチン接種又は他の免疫療法アプローチにとって有用である。
【０２０２】
ゾレドロン酸は、脾臓におけるイソペンテニルピロリン酸(IPP)の蓄積をもたらす。
LNPによって供給されたRNAは機能的に活性であることを示した後に、LNPに保持されたゾレドロン酸の機能をin vivoで試験した。ゾレドロン酸は、in vitroで種々の細胞株において、及びin vivoで腫瘍組織においてイソペンテニルピロリン酸(IPP)の蓄積を誘導することが示されており、別の起源のがんの臨床アウトカムの改善と直接関連している可能性がある(Mitrofan, L.M.、Pelkonen, J.、Monkkonen, J.、(2009)、Bone、45、1153〜60頁)。したがって、脾臓におけるIPP蓄積について、LNP製剤の注射後、マススペクトメトリーを用いて調べた。ゾレドロン酸(ZA)コロイド状分散体及びZAコロイド状分散体に結合しているルシフェラーゼ(Luc) RNA(Luc-RNA LNP)で処理すると、陰性対照(処置無し)、遊離のルシフェラーゼ(Luc) RNA(遊離のRNA)、空のコロイド状分散体及びルシフェラーゼ(Luc)をコードするRNAに結合している空のコロイド状分散体と比べて、脾臓におけるIPP濃度が有意に増加した。このことから、LNPによって送達されたゾレドロン酸は、in vivoでの送達後も機能的なままであることが示唆される。したがって、in vivoデータはin vitroデータの結果を裏付けるものであり、これから、ZAコロイド状分散体粒子に結合しているRNAを薬物送達に使用できることが示される。要約すると、ZAコロイド状分散体に結合しているRNAは、個体における免疫応答を誘導/調節するための、抗原等のタンパク質をコードするRNAの導入、及び薬物送達に有用である。
【０２０３】
(実施例5)
エタノール注入法及び更なる処理によるZAを含むコロイド状脂質分散体の調製
(実施例5.1)
1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)は、Avanti Polar Lipids社(アラバスター、アラバマ)から購入した。コレステロール(純度99%)はSigma社(セントルイス、ミズーリ)から入手した。ゾレドロン酸はCHEMOS GmbH社(レーゲンスタウフ、ドイツ)から入手した。RNAseフリーのリン酸緩衝食塩水はAmbion社(ダルムシュタット、ドイツ)から購入した。RNAseフリー水はB-Braun社(メルスンゲン、ドイツ)から購入した。試薬は全て分析グレードであった。コロイドは、改変されたエタノール注入法によって、以下のプロトコールに従い調製した:
・50mlガラスビーカーで、ゾレドロン酸20mg/mlのPBS緩衝液、pH7.4中の水溶液0.25mlを、スクロース10%水溶液1.25mlに添加した。
・ビーカーをマグネティックスターラーに載せ、溶液を、IKA big squidモデルのスターラー(IKA社、ケーニッヒスヴィンター、ドイツ)を使用して、400rpmで撹拌した。
・エタノール中の脂質溶液(DOTMA/DOPE;2:1モル比、並びにDOTMA及びDOPEの全脂質濃度はそれぞれ200mM及び100mM)0.600mlを、シリンジ(シリンジのタイプ: Omnifix(登録商標)-F 1ml滅菌プラスチックシリンジ、B. Braun社;メルズンゲン、ドイツ、針: 27Gのサイズの微細針)で、撹拌中のゾレドロン酸溶液に注入した。
・脂質注入後、懸濁液を10分撹拌した。10分後、RNAseフリー水3mlをコロイドに添加した。脂質及びZAの分散体を20分撹拌した。
【０２０４】
(実施例5.2)
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)は、Avanti Polar Lipids社(アラバスター、アラバマ)から購入した。コレステロール(純度99%)はSigma社(セントルイス、ミズーリ)から入手した。ゾレドロン酸はCHEMOS GmbH社(レーゲンスタウフ、ドイツ)から入手した。RNAseフリーのリン酸緩衝食塩水、hepes緩衝液は、Ambion社(ダルムシュタット、ドイツ)から購入した。RNAseフリー水はB-Braun社(メルスンゲン、ドイツ)から購入した。試薬は全て分析グレードであった。コロイドは、改変されたエタノール注入法によって、以下のプロトコールに従い調製した:
・HEPES緩衝液100mM、pH4.0中のゾレドロン酸水溶液(0.5、1、2.0、4、8、10.0、20mg/ml)1.5mlを、50mlガラスビーカーに移した。ビーカーをマグネティックスターラーに載せ、溶液を、IKA big squidモデルのスターラー(IKA社、ケーニッヒスヴィンター、ドイツ)を使用して400rpmで撹拌した。
・エタノール中の脂質溶液(DOTAP/DOPE;2:1モル比、並びにDOTAP及びDOPEの全脂質濃度はそれぞれ180mM及び90mM)0.500mlを、無水エタノールで0.600mlに更に希釈し(DOTAP及びDOPEについて、それぞれ200mM及び100mM)、シリンジ(シリンジのタイプ: Omnifix(登録商標)-F 1ml滅菌プラスチックシリンジ、B. Braun社;メルズンゲン、ドイツ、針: 27Gのサイズの微細針)で、撹拌中のゾレドロン酸溶液に注入した。
・脂質注入後、懸濁液を10分撹拌した。
・10分後、RNAseフリー水3mlをコロイドに添加した。脂質及びZAの分散体を20分撹拌した。
【０２０５】
(実施例5.3)
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOEPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)は、Avanti Polar Lipids社(アラバスター、アラバマ)から購入した。コレステロール(純度99%)はSigma社(セントルイス、ミズーリ)から入手した。ゾレドロン酸はCHEMOS GmbH社(レーゲンスタウフ、ドイツ)から入手した。RNAseフリーのリン酸緩衝食塩水、hepes緩衝液は、Ambion社(ダルムシュタット、ドイツ)から購入した。RNAseフリー水はB-Braun社(メルスンゲン、ドイツ)から購入した。試薬は全て分析グレードであった。コロイドは、改変されたエタノール注入法によって、以下のプロトコールに従い調製した:
・HEPES緩衝液100mM、pH4.0中のゾレドロン酸水溶液(0.5、1、2.0、4、8、10.0、20mg/ml)1.5mlを、50mlガラスビーカーに移した。ビーカーをマグネティックスターラーに載せ、溶液を、IKA big squidモデルのスターラー(IKA社、ケーニッヒスヴィンター、ドイツ)を使用して400rpmで撹拌した。
・エタノール中の脂質溶液(DOEPC/DOPC;2:1モル比、並びにDOEPC及びDOPCの全脂質濃度はそれぞれ200mM及び100mM)0.500mlを、無水エタノールで0.600mlに更に希釈し(DOEPC及びDOPCについて、それぞれ200mM及び100mM)、シリンジ(シリンジのタイプ: Omnifix(登録商標)-F 1ml滅菌プラスチックシリンジ、B. Braun社;メルズンゲン、ドイツ、針: 27Gのサイズの微細針)で、撹拌中のゾレドロン酸溶液に注入した。
・脂質注入後、懸濁液を10分撹拌した。
10分後、RNAseフリー水3mlをコロイドに添加した。脂質及びZAの分散体を20分撹拌した。
【０２０６】
(実施例6)
エタノール注入法及び更なる処理によるZAを含むコロイド状脂質分散体の調製
(実施例6.1)
1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)は、Avanti Polar Lipids社(アラバスター、アラバマ)から購入した。コレステロール(純度99%)はSigma社(セントルイス、ミズーリ)から入手した。ゾレドロン酸はCHEMOS GmbH社(レーゲンスタウフ、ドイツ)から入手した。RNAseフリーのリン酸緩衝食塩水はAmbion社(ダルムシュタット、ドイツ)から購入した。RNAseフリー水はB-Braun社(メルスンゲン、ドイツ)から購入した。試薬は全て分析グレードであった。コロイドは、改変されたエタノール注入法によって、以下のプロトコールに従い調製した:
・HEPES緩衝液100mM、pH4.0中のゾレドロン酸20mg/mlの水溶液0.5mlを、1mlのHEPES緩衝液100mM、pH7.0と混合し、50mlガラスビーカーに移した。ビーカーをマグネティックスターラーに載せ、溶液を、IKA big squidモデルのスターラー(IKA社、ケーニッヒスヴィンター、ドイツ)を使用して400rpmで撹拌した。
・エタノール中の脂質溶液(DOTMA/DOPE;1:1モル比、並びにDOTMA及びDOPEの全脂質濃度はそれぞれ135mM及び135mM)0.492mlを、シリンジ(シリンジのタイプ: Omnifix(登録商標)-F 1ml滅菌プラスチックシリンジ、B. Braun社;メルズンゲン、ドイツ、針: 27Gのサイズの微細針)で、撹拌中のゾレドロン酸溶液に注入した。
・脂質注入後、懸濁液を10分撹拌した。
・10分後、RNAseフリー水3mlをコロイドに添加した。脂質及びZAの分散体を20分撹拌した。
【０２０７】
コロイドの濾過
・得られたコロイド状分散体の粗分散体は、Minisart 0.45μm CE膜(Sartorius Stedim Biotech GmbH社、ゲッティンゲン、ドイツ)を通過させた。
【０２０８】
コロイドの透析
遊離のゾレドロン酸及びエタノール残渣を除去するために、濾過されたコロイドを以下のように透析した:
・各1mlのコロイドを、RNAsesフリーSlide-A-Lyzer 10K透析カセット(Thermo Fisher Scientific GmbH社、ドライアイヒ、ドイツ)を使用して、200mlのPBSに対して透析した。
・透析は室温で24時間、400rpmの撹拌速度で行った。コロイドを、更なる物理化学的キャラクタリゼーションのために滅菌ファルコンチューブに回収した。
【０２０９】
コロイドにおけるゾレドロン酸(ZA)の保持
保持されたゾレドロン酸は、HPLCによって定量した。HPLCシステムは、G1311Bクォータナリポンプ、G4212B DAD (ダイオードアレイ検出器)検出器、G1367EオートサンプラAS Hip、G1330Bカラムオーブンサーモスタット、及びLC用ChemStationリビジョンB.04.02 (Agilent technologies社、コロラド、USA)からなっていた。固定相はxSelect CSH (C18)カラム(150mm×4.6mm×3.5μm) (Waters社、エシュボルン、ドイツ)であった。移動相は、メタノール(20%)と、5mMテトラブチルアンモニウムブロミド(TCI Deutschland GmbH社、エシュボルン、ドイツ)含有リン酸緩衝液30mM (80%)との、pH7.2に調整した混合物とした。移動相のpHの決定には、inoLab pH 7310P pHメーター(WTW社、ヴァイルハイム、ドイツ)を使用した。流速及びカラムオーブン温度は、1mL/分及び50℃とした。検出波長は215nmとした。注入体積は25μlに達した。遊離のゾレドロン酸は、再生セルロース膜を備え、MWCOが30KDの高回収率ウルトラセル(Millipore社、シュヴァルバッハ/Ts.、ドイツ)を使用し、以下の工程に従って測定した:
・0.1M NaOH溶液、続いてPBSを、濾過により膜を通過させて、あらゆる保存剤を除去する。
・500μlのコロイド試料を0.5mLウルトラセルチューブに移す。
・試料を、40゜固定角ローター遠心分離機Pico 21 (Thermoscientific社、オスターオーデ、ドイツ)を使用して室温で15分、4000×gで遠心分離する。
・定量するために濾液をHPLCガラスバイアルに回収する。
・HPLCによって、濾液におけるゾレドロン酸濃度を上述のように測定する。
【０２１０】
保持効率%の計算
保持効率%=[(透析したコロイドにおけるZAの合計-透析したコロイドにおける遊離のZA/透析したコロイドにおけるZAの合計]×(100)。
【０２１１】
ZA及びRNAを含むLNPの形成
必要とされるカチオン性脂質/RNA(モル/塩基)の比に応じて、計算された体積のZA/脂質コロイドを、計算された体積のRNA/PBSに添加した。混合物を少なくとも15分インキュベートして、LNPを形成させた。
【０２１２】
コロイド状脂質分散体における開始ZA濃度の関数として示すゾレドロン酸(ZA)の保持
コロイド状脂質分散体を、上記のエタノール注入法によって調製した。脂質組成は、2/1モル比のDOTMA/DOPEであった。ZAを20mg/mlの濃度で100mMのHEPES緩衝液に溶解させ、5MのNaOHを用いてpHを約4に調整した。脂質濃度は、約12mMであった。保持された及び遊離のゾレドロン酸をHPLCによって定量した。遊離のゾレドロン酸は、再生セルロース膜を備え、MWCOが30KDの高回収率ウルトラセルを使用して測定した。試料は、40゜固定角ローター遠心分離機Pico 21を使用して室温で15分、4000×gで遠心分離した。濾液は、定量するためにHPLCバイアルに回収した。
【０２１３】
ゾレドロン酸及びRNAを含むLNPにおけるZAの保持
脂質のモル分率が異なるZAを含むコロイド状脂質分散体を、対照としてのPBS、RNA及びTriton x100と混合した。脂質組成は、2/1モル比のDOTMA/DOPEであった。ZA/脂質分散体は、計算された体積のZAを含む脂質分散体を計算された体積のRNAと、2mM、4mM及び6mMの3つの異なる脂質濃度で混合することによって調製した。ZA/脂質分散体及びRNAは、1:1の比(v/v)で混合した。カチオン性脂質/RNA電荷比(モル/塩基)は、1:2であった。PBS及びTriton x100については、計算されたRNA体積を、10%の生理学的PBS又はTriton x100水溶液で置き換えた。ZA及びRNAを含むLNPは、30分室温でインキュベートした。その後、0.1M NaOH溶液、続いてPBSを、濾過により膜を通過させて、事前にあらゆる保存剤を除去した0.5mLのウルトラセルチューブにこれらを移した。試料は、40゜固定角ローター遠心分離機Pico 21 (Thermoscientific社、オスターオーデ、ドイツ)を使用して、室温で15分、4000×gで遠心分離した。濾液は、定量するためにHPLCガラスバイアルに回収した。濾液におけるゾレドロン酸濃度の測定は、HPLCによって上述のように行った。
【０２１４】
(実施例6.2)
1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)は、Avanti Polar Lipids社(アラバスター、アラバマ)から購入した。コレステロール(純度99%)はSigma社(セントルイス、ミズーリ)から入手した。ゾレドロン酸はCHEMOS GmbH社(レーゲンスタウフ、ドイツ)から入手した。RNAseフリーのリン酸緩衝食塩水、hepes緩衝液は、Ambion社(ダルムシュタット、ドイツ)から購入した。RNAseフリー水はB-Braun社(メルスンゲン、ドイツ)から購入した。試薬は全て分析グレードであった。コロイドは、改変されたエタノール注入法によって、以下のプロトコールに従い調製した:
・HEPES緩衝液100mM、pH4.0中のゾレドロン酸20mg/mlの水溶液0.5mlを、1mlのHEPES緩衝液100mM、pH7.0と混合し、50mlガラスビーカーに移した。ビーカーをマグネティックスターラーに載せ、溶液を、IKA big squidモデルのスターラー(IKA社、ケーニッヒスヴィンター、ドイツ)を使用して400rpmで撹拌した。
・エタノール中の脂質溶液(DOTAP/DOPE;2:1モル比、並びにDOTAP及びDOPEの全脂質濃度はそれぞれ180mM及び90mM)0.492mlを、シリンジ(シリンジのタイプ: Omnifix(登録商標)-F 1ml滅菌プラスチックシリンジ、B. Braun社;メルズンゲン、ドイツ、針: 27Gのサイズの微細針)で、撹拌中のゾレドロン酸溶液に注入した。
・脂質注入後、懸濁液を10分撹拌した。
・10分後、RNAseフリー水3mlをコロイドに添加した。脂質及びZAの分散体を20分撹拌した。
【０２１５】
コロイドの濾過
・得られたコロイド状分散体の粗分散体は、Minisart 0.45μm CE膜(Sartorius Stedim Biotech GmbH社、ゲッティンゲン、ドイツ)を通過させた。
【０２１６】
コロイドの透析
遊離のゾレドロン酸及びエタノール残渣を除去するために、濾過されたコロイドを以下のように透析した:
・各1mlのコロイドを、RNAsesフリーSlide-A-Lyzer 10K透析カセット(Thermo Fisher Scientific GmbH社、ドライアイヒ、ドイツ)を使用して、200mlのPBSに対して透析した。
・透析は室温で24時間、400rpmの撹拌速度で行った。コロイドを、更なる物理化学的キャラクタリゼーションのために滅菌ファルコンチューブに回収した。
【０２１７】
コロイドにおけるゾレドロン酸(ZA)の保持
保持されたゾレドロン酸は、HPLCによって定量した。HPLCシステムは、G1311Bクォータナリポンプ、G4212B DAD(ダイオードアレイ検出器)検出器、G1367EオートサンプラAS Hip、G1330Bカラムオーブンサーモスタット、及びLC用ChemStationリビジョンB.04.02(Agilent technologies社、コロラド、USA)からなっていた。固定相はxSelect CSH(C18)カラム(150mm×4.6mm×3.5μm)(Waters社、エシュボルン、ドイツ)であった。移動相は、メタノール(20%)と、5mMテトラブチルアンモニウムブロミド(TCI Deutschland GmbH社、エシュボルン、ドイツ)含有リン酸緩衝液30mM (80%)との、pH7.2に調整した混合物とした。移動相のpHの決定には、inoLab pH 7310P pHメーター(WTW社、ヴァイルハイム、ドイツ)を使用した。流速及びカラムオーブン温度は、1mL/分及び50℃とした。検出波長は215nmとした。注入体積は25μlに達した。遊離のゾレドロン酸は、再生セルロース膜を備え、MWCOが30KDの高回収率ウルトラセル(Millipore社、シュヴァルバッハ/Ts.、ドイツ)を使用し、以下の工程に従って測定した:
・0.1M NaOH溶液、続いてPBSを、濾過により膜を通過させて、あらゆる保存剤を除去する。
・500μlのコロイド試料を0.5mLウルトラセルチューブに移す。
・試料を、40゜固定角ローター遠心分離機Pico 21(Thermoscientific社、オスターオーデ、ドイツ)を使用して室温で15分、4000×gで遠心分離する。
・定量するために濾液をHPLCガラスバイアルに回収する。
・HPLCによって、濾液におけるゾレドロン酸濃度を上述のように測定する。
【０２１８】
保持効率%の計算
保持効率%=[(透析したコロイドにおけるZAの合計-透析したコロイドにおける遊離のZA/透析したコロイドにおけるZAの合計]×(100)。
【０２１９】
ZA及びRNAを含むLNPの形成
必要とされるカチオン性脂質/RNA(モル/塩基)の比に応じて、計算された体積のZA/脂質コロイドを、計算された体積のRNA/PBSに添加した。混合物を少なくとも15分インキュベートして、LNPを形成させた。
【０２２０】
コロイド状脂質分散体における開始ZA濃度の関数としてのゾレドロン酸(ZA)の保持
コロイド状脂質分散体を、上記のエタノール注入法によって調製した。脂質組成は、2/1モル比のDOTMA/DOPEであった。ZAを20mg/mlの濃度で100mMのHEPES緩衝液に溶解させ、5MのNaOHを用いてpHを約4に調整した。脂質濃度は、約12mMであった。保持された及び遊離のゾレドロン酸をHPLCによって定量した。遊離のゾレドロン酸は、再生セルロース膜を備え、MWCOが30KDの高回収率ウルトラセルを使用して測定した。試料は、40゜固定角ローター遠心分離機Pico 21を使用して室温で15分、4000×gで遠心分離した。濾液は、定量するためにHPLCバイアルに回収した。
【０２２１】
ゾレドロン酸及びRNAを含むLNPにおけるZAの保持
脂質のモル分率が異なるZAを含むコロイド状脂質分散体を、対照としてのPBS、RNA及びTriton x100と混合した。脂質組成は、2/1モル比のDOTMA/DOPEであった。ZA/脂質分散体は、計算された体積のZAを含む脂質分散体を計算された体積のRNAと、2mM、4mM及び6mMの3つの異なる脂質濃度で混合することによって調製した。ZA/脂質分散体及びRNAは、1:1の比(v/v)で混合した。カチオン性脂質/RNA電荷比(モル/塩基)は、1:2であった。PBS及びTriton x100については、計算されたRNA体積を、10%の生理学的PBS又はTriton x100水溶液で置き換えた。ZA及びRNAを含むLNPは、30分室温でインキュベートした。その後、0.1M NaOH溶液、続いてPBSを、濾過により膜を通過させて、事前にあらゆる保存剤を除去した0.5mLのウルトラセルチューブにこれらを移した。試料を、40゜固定角ローター遠心分離機Pico 21 (Thermoscientific社、オスターオーデ、ドイツ)を使用して、室温で15分、4000×gで遠心分離した。濾液は、定量するためにHPLCガラスバイアルに回収した。濾液におけるゾレドロン酸濃度の測定は、HPLCによって上述のように行った。
【０２２２】
(実施例6.3)
1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOEPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)は、Avanti Polar Lipids社(アラバスター、アラバマ)から購入した。コレステロール(純度99%)はSigma社(セントルイス、ミズーリ)から入手した。ゾレドロン酸はCHEMOS GmbH社(レーゲンスタウフ、ドイツ)から入手した。RNAseフリーのリン酸緩衝食塩水、hepes緩衝液は、Ambion社(ダルムシュタット、ドイツ)から購入した。RNAseフリー水はB-Braun社(メルスンゲン、ドイツ)から購入した。試薬は全て分析グレードであった。コロイドは、改変されたエタノール注入法によって、以下のプロトコールに従い調製した:
・HEPES緩衝液100mM、pH4.0中のゾレドロン酸20mg/mlの水溶液0.5mlを、1mlのHEPES緩衝液100mM、pH7.0と混合し、50mlガラスビーカーに移した。ビーカーをマグネティックスターラーに載せ、溶液を、IKA big squidモデルのスターラー(IKA社、ケーニッヒスヴィンター、ドイツ)を使用して400rpmで撹拌した。
・エタノール中の脂質溶液(DOEPC/DOPC;2:1モル比、並びにDOEPC及びDOPCの全脂質濃度はそれぞれ180mM及び90mM)0.492mlを、シリンジ(シリンジのタイプ: Omnifix(登録商標)-F 1ml滅菌プラスチックシリンジ、B. Braun社;メルズンゲン、ドイツ、針: 27Gのサイズの微細針)で、撹拌中のゾレドロン酸溶液に注入した。
・脂質注入後、懸濁液を10分撹拌した。
・10分後、RNAseフリー水3mlをコロイドに添加した。脂質及びZAの分散体を20分撹拌した。
【０２２３】
略語
ZA=ゾレドロン酸
LNP=脂質ナノ粒子
Luc=ルシフェラーゼ
infHA=インフルエンザヘマグルチニンA
IPP=イソペンテニルピロリン酸
DOTMA=1,2-ジ-O-オクタデセニル-3-トリメチルアンモニウムプロパン
DOPE=1,2-ジ-(9Z-オクタデセノイル)-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン
DOTAP=1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン
DOEPC=1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン
i.v.=静脈内
DC=樹状細胞
iDC=未熟樹状細胞
PBMC=末梢血単核球
PBL=抹消血リンパ球
mΦ=マクロファージ
Cntr=対照
【図１】
0006716600.tif 000002
【図２】
0006716600.tif 000003
【図３】
0006716600.tif 000004
【図４】
0006716600.tif 000005
【図５】
0006716600.tif 000006
【図６】
0006716600.tif 000007
【図７】
0006716600.tif 000008
【図８】
0006716600.tif 000009
【図９】
0006716600.tif 000010
【図１０】
0006716600.tif 000011
【図１１】
0006716600.tif 000012
【図１２】
0006716600.tif 000013
【図１３】
0006716600.tif 000014
【図１４】
0006716600.tif 000015
【図１５】
0006716600.tif 000016
【図１６】
0006716600.tif 000017