(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．５ｇ／ｄＬ以上１．５ｇ／ｄＬ以下の濃度のヒアルロン酸が０．０５Ｍ以上０．１５Ｍ以下の濃度の架橋剤と反応する、随伴する架橋及び沈殿工程を含み、前記ヒアルロン酸は、２５０，０００以上１５００，０００以下の分子量を有し、前記架橋剤は、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）をジアミン化合物と反応させることによって調製されることを特徴とするヒアルロン酸マイクロスポンジを製造する方法。
【請求項２】
前記ヒアルロン酸が、５００，０００Ｄａ以上１０００，０００Ｄａ以下の平均分子量を有し、前記架橋工程中、前記ヒアルロン酸の濃度が０．８ｇ／ｄＬ以上１．０ｇ／ｄＬ以下であり、前記架橋剤の濃度が０．０５Ｍ以上０．１０Ｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記架橋剤が、開裂可能な官能基を有する鎖を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ジアミン化合物が、開裂可能な官能基を有する鎖を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
平均直径が１．５μｍ以上１０．０μｍ以下であり、平均細孔径が１０ｎｍ以上４００ｎｍ以下であり、架橋度が０．００１ｍｏｌ／ｃｍ３以上０．０１ｍｏｌ／ｃｍ３以下であることを特徴とするヒアルロン酸マイクロスポンジ。
【請求項６】
平均直径が４．０μｍ以上８．０μｍ以下であり、平均細孔径が１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下であり、架橋度が０．００５ｍｏｌ／ｃｍ３以上０．００８ｍｏｌ／ｃｍ３以下であることを特徴とする請求項５に記載のヒアルロン酸マイクロスポンジ。
【請求項７】
正電荷を有する分子、高分子、及びナノ粒子が内部に組み込まれたものであることを特徴とする請求項５又は６に記載のヒアルロン酸マイクロスポンジ。
【請求項８】
医療又は化粧用途に使用される、請求項５から請求項７のいずれか一項に記載のヒアルロン酸マイクロスポンジ。
【請求項９】
請求項５から請求項７のいずれか一項に記載のヒアルロン酸マイクロスポンジを含むものであることを特徴とする医療用又は化粧用化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸からなるマイクロスポンジ及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンからなる二糖類繰り返し単位から構成される非分枝状の直鎖状多糖類であり、ヒトの結合組織の基本成分の一つである。特に、ヒアルロン酸は、眼の硝子体液、滑液、皮膚、軟骨、腱、臍帯、及び大動脈壁にみられる。
【０００３】
ヒアルロン酸の医療用途への使用は、長い間知られている。実際、ヒアルロン酸は、しわを除去し、皮膚の老化を防ぐために外科及び美容皮膚科で、穿孔された鼓膜の再生としての耳科手術で、白内障及び網膜手術、眼内レンズのインプラント、網膜剥離手術、角膜移植手術、硝子体切除術及び外傷性眼科手術における人工涙液を生成するために眼科手術で、抗炎症潤滑剤及び関節の滑液の保存剤として関節学で使用される。また、ヒアルロン酸は口の炎症及び潰瘍性病変に対しても使用される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヒアルロン酸の適用において遭遇する問題の１つは、その急速分解である。この問題は、ヒアルロン酸の治療効果がその投与時から短い寿命を有することを意味する。また、ヒアルロン酸の適用は、性質上しばしば侵襲的であり、したがって、高い頻度で繰り返すことができない。
【０００５】
そのため、ヒアルロン酸は、その急速分解を防止し、ひいては、単回投与後の医療効果のより長い寿命を保証するような形態で適用する必要があった。
【０００６】
驚くべきことに、本発明者らは、架橋剤と特定の範囲の平均分子量を有するヒアルロン酸との反応により、医療分野で一般的に使用されるヒアルロン酸よりもはるかに低い分解速度を有する均一なヒアルロン酸マイクロスポンジが得られることを見出した。この分野の当業者にとって明らかであるように、より低い分解速度は、インビボ実験から検証できるように、必然的により長い持続をもたらす。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の目的は、その本質的特徴が請求項１に示され、好ましい特徴及び／又は補助的特徴が請求項２〜４に記載される、ヒアルロン酸マイクロスポンジを調製する方法である。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、その本質的特徴が請求項５に示されるヒアルロン酸マイクロスポンジからなる。
【０００９】
以下において、本発明をより良く理解するため、単なる例示であり限定するものではないが、添付の図１（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を用いて、実在例を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】異なる解像度で撮影された本発明の目的とするマイクロスポンジの画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（架橋剤の調製）
１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）３０ｍｇ及びシスタミン２０ｍｇを無水ＤＭＳＯ２００μｌに溶解し、得られた溶液を室温で５時間撹拌し続けた。この段階で、ＣＤＩはシスタミンと反応し、架橋剤が得られる。特に、シスタミンはそのアミノ基を介してＣＤＩと反応する。
【００１２】
これに代わって、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）３０ｍｇ及びシスタミン２０ｍｇを水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）２００μｌに溶解し、架橋剤を可溶化するために溶液のｐＨを４〜５とした。
【００１３】
（架橋／ヒアルロン酸の沈殿）
平均分子量８００ｋＤａのヒアルロン酸１ｇ／ｄＬの水溶液を調製した。この溶液を一晩撹拌し続けた。
【００１４】
本明細書で与えられる平均分子量は、国際標準ＩＳＯ  １１３４４の方法により算出される。
【００１５】
上記の架橋剤の溶液をヒアルロン酸水溶液０．５ｍｌに添加した。得られた溶液を室温で一晩攪拌し、ヒアルロン酸と架橋剤の反応を促進した。このような反応により、ヒアルロン酸の架橋と、実質的に球状で多孔質のマイクロスポンジの沈殿が生じた。この架橋剤とヒアルロン酸の反応は、後者のヒドロキシル基及びカルボキシル基が関与する。
【００１６】
ヒアルロン酸は、そのヒドロキシル基及びカルボキシル基を介して架橋剤と反応することに加えて、架橋剤のナノ結晶の形成のための核形成機能の役割も果たす。実際、ヒアルロン酸の存在により、架橋剤の結晶の大きさ及び均質性を制御することが可能であり、さもなければ結晶は大きく不規則となることが確認された。
【００１７】
架橋反応中、ポロゲン剤として作用するＣＯ２が生成されることが確認された。
【００１８】
マイクロスポンジを遠心分離によって回収し、蒸留水で数回洗浄し、次いで４℃の水性懸濁液中で保存した。
【００１９】
マイクロスポンジの形態学的特徴付けは、ＳＥＭ技術によって行った。マイクロスポンジの損傷を抑えるため、高解像ＳＥＭ顕微鏡（ＦＥＧ−ＳＥＭ、ＬＥＯ３５）を０．５ｋＶ−２．０ｋＶの低電圧で使用した。
【００２０】
外側及び内側の構造を調べるために、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）でマイクロスポンジを観察し、ガリウムの液体金属イオン源を有するデュアルビームＦＩＢ（ＥＩＦ−Ｈｅｌｉｏｓ  Ｎａｎｏｌａｂ  ６００）を用いて断面化した。これらの画像は、本明細書に添付されている図１のＡ〜Ｄに示される。
【００２１】
このようにして製造されたヒアルロン酸マイクロスポンジは、平均直径約４．２μｍの球状であることが測定された。特に、ヒアルロン酸マイクロスポンジは、水の非存在下で３．３±０．９μｍの平均直径を有し、水の存在により膨潤した場合、４．２±０．９μｍの平均直径を有することが分かった。さらに、上記のように製造したヒアルロン酸マイクロスポンジは、平均架橋度が０．００７２ｍｏｌ／ｃｍ３、平均密度が１．０４ｇ／ｃｍ３、細孔径が１３０ｎｍ以上２７０ｎｍ以下であった。
【００２２】
（分解試験）
上記の方法で製造したヒアルロン酸マイクロスポンジを、分解条件をシミュレートするのに適した環境に浸漬し、その分解時間を観察した。
【００２３】
分解条件は、ｐＨ７のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のヒアルロニダーゼ（０．５ｍｇ／ｍＬ）溶液を用いて行った。上記の条件下で、マイクロスポンジの１０％の分解が最初の２４時間で観察され、次の９日間にわたって２０％の分解しか観察されなかった。これらの結果を適切に理解するためには、一般的に使用される形態のヒアルロン酸は、上記の条件でわずか８時間後に完全に分解されることを念頭に置かなければならない。
【００２４】
上記の結果は、本発明によるヒアルロン酸マイクロスポンジの構造がいかに酵素分解を防止することができるかを実証している。
【００２５】
本発明者らは、低分解を確実にするため、ヒアルロン酸マイクロスポンジは、１０ｎｍ以上６００ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以上３００ｎｍ以下の範囲の細孔径を有し、０．００１ｍｏｌ／ｃｍ３以上０．０１ｍｏｌ／ｃｍ３以下、好ましくは０．００５ｍｏｌ／ｃｍ３以上０．００８ｍｏｌ／ｃｍ３以下の範囲の架橋度を有すべきであることを見出した。
【００２６】
本発明を実現するため、ヒアルロン酸の分子量は、２５０，０００Ｄａ以上１，５００，０００Ｄａ以下、好ましくは５００，０００Ｄａ以上１０００，０００Ｄａ以下であり、架橋剤及びヒアルロン酸の濃度は、それぞれ０．０５Ｍ以上０．１５Ｍ以下（好ましくは０．０５Ｍ以上０．１Ｍ以下）及び０．５ｇ／ｄＬ以上１．５ｇ／ｄＬ以下（好ましくは０．８ｇ／ｄＬ以上１．０ｇ／ｄＬ以下）である。
【００２７】
上記より低い分子量を有するヒアルロン酸を使用すると、均一な球状構造を達成することができず、より長い反応時間を必要とし、上記より大きい分子量を有するヒアルロン酸を使用すると、ヒアルロン酸溶液の粘度が増加し、反応混合物の不均一性が生じることが実験的に立証された。
【００２８】
ヒアルロン酸が０．５ｇ／ｄＬより低い濃度を有する場合、得られるマイクロスポンジは均一ではなく多分散であり、ヒアルロン酸が５ｇ／ｄＬより高い濃度を有する場合、得られる溶液の粘度が高すぎるため、本発明の方法が正しく実現されないことが実験的に分かった。
【００２９】
好ましくは、架橋剤は、例えば加水分解又は酸化還元反応によって「開裂可能な」基を有する鎖を含む。このようなものであれば、ヒアルロン酸マイクロスポンジ内に物質を組み込み、その後、結果として生じるマイクロスポンジの可溶化と共に、開裂可能な基の分解により、生理学的環境への放出を引き起こすことが可能となる。本発明の目的とするマイクロスポンジ内に組み込むことができる物質は、正電荷を有する分子、高分子、及びナノ粒子に関連する。
【００３０】
最後に、本発明のヒアルロン酸マイクロスポンジは、好ましくは１ミクロン以上３ミクロン以下、より好ましくは０．８ミクロン以上２ミクロン以下の大きさの孔を有する。
【００３１】
本発明のヒアルロン酸マイクロスポンジは、医療用途で一般的に使用されるヒアルロン酸よりもはるかに低い分解速度を有するという大きな利点を提供する。この利点は、ヒアルロン酸が投与された際の長期的な医療効果をもたらす。
【００３２】
本発明のヒアルロン酸マイクロスポンジは、ヒアルロン酸を人体に使用する全ての用途において、特にヒアルロン酸を人体又は動物の体に注射する必要がある場合に、好ましくかつ有利である。実際、これらの場合のヒアルロン酸の緩慢な分解は、頻繁な注射の必要性を回避する。この用途は、特に美容外科及び関節学の分野に適する。
【図１】
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