(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌を検出する方法であって、
A)検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの少なくとも1つの種をそれぞれが含む1つ以上の懸濁液を用意するステップと;
B)前記1つ以上の懸濁液に、検出される少なくとも1種の細菌種の存在について試験される試料を添加するステップと;
C)得られた反応混合物を濾過し、その際に0.1μｍ〜0.5μmの孔サイズを有するフィルタを使用するステップと;
D)検出される少なくとも1種の細菌種が存在することを条件として、保持液中の細菌-バクテリオファージ複合体を検出するステップであって、前記複合体は、前記検出される少なくとも1種の細菌種の細菌、及びそれに結合した前記試験バクテリオファージの少なくとも1つの種の試験バクテリオファージからなる、ステップと;
E)濾液中の非結合試験バクテリオファージを検出するステップと;
F)ステップD)及びステップE)での検出により生成した受信シグナルをプロセッサ補助処理し、検出結果をユーザに出力するステップと
を含む方法であって、
ここで前記1つ以上の懸濁液が、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、且つ前記試験バクテリオファージとは別個である標識を有する標識された参照バクテリオファージをさらに含み、それにより、標識された参照バクテリオファージもステップ(E)で検出され、又は
検出されるいずれの細菌種にも結合せず、それらの小サイズのためにフィルタを通過できる標識されたナノ粒子が、標識された参照バクテリオファージの代替として使用される、
方法。
【請求項２】
前記検出される細菌種が、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、表皮ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌、肺炎桿菌、大腸菌、エスケリキア・ヘルマニイ、EHEC、エンテロバクター・クロアカ、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェカム、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、バクテロイデス・フラジリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロバクター・アエロゲネス、霊菌、B群β溶血性レンサ球菌、クラミジア・トラコマチス、オウム病クラミジア、ウレアプラズマ・ウレアリチカム、マイコプラズマ・ホミニス、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、シトロバクター・フロインディ、モラクセラ・カタラーリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、パスツレラ・ムルトシダ、アシネトバクター・バウマニ、プロビデンシア・レットゲリ、百日咳菌、炭疽菌、セレウス菌、ウシ流産菌、ブルセラ・メリテンシス、クロストリジウム・ブトリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、破傷風菌、ウェルシュ菌、クラミジア・トラコマチス、ジフテリア菌、野兎病菌、ガードネレラ・バギナリス、リステリア・モノサイトゲネス、モルガン菌、らい菌、結核菌、ノカルディア・アステリオデス、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・エンテリカ、シゲラ属種、コレラ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、ペスト菌、腸炎エルシニア、コクシエラ菌、エロモナス属種、プレジオモナス属種、キサントモナス・マルトフィリア、梅毒トレポネーマ、エイケネラ・コローデンス、スピリルム・ミヌス、発疹チフスリケッチア、ロッキー山紅斑熱リケッチア、リケッチア・コノリイ、クロノバクター属種、カンピロバクター属種、及び在郷軍人病菌を含む群から選択される、請求項1に記載の細菌を検出する方法。
【請求項３】
前記1つ以上の懸濁液がそれぞれ、検出される異なる細菌種にそれぞれ特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの2つ以上の種を含み、前記種の標識群は、互いに別個であるか、又は部分的に重複しており、前記標識は、試験バクテリオファージのそれぞれの種に特有である、請求項1又は2に記載の細菌を検出する方法。
【請求項４】
前記標識が、蛍光若しくは化学発光特性を有する少なくとも1種のレポーター分子、又は二次分子との相互作用によって光を放射する少なくとも1種のレポーター分子を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
【請求項５】
前記標識が、それぞれ、少なくとも1種の蛍光レポーター分子からなり、前記検出が、前記蛍光を測定することによって行われ、少なくとも1種の蛍光レポーター分子の励起は、200〜1000nmの波長範囲で行われる、請求項4に記載の細菌を検出する方法。
【請求項６】
前記少なくとも1種のレポーター分子が、前記バクテリオファージのカプシド領域のタンパク質にカップリングしている、請求項4又は5に記載の細菌を検出する方法。
【請求項７】
前記検出が、光放射の時間分解測定によって行われる、請求項4〜6のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
【請求項８】
前記試料を前記1つ以上の懸濁液と混合し、得られた反応混合物をインキュベートするステップG)をさらに含み、ステップG)は、ステップB)に続くものであり、請求項1〜7のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
【請求項９】
細菌-バクテリオファージ複合体と非結合バクテリオファージを予備分離するステップをさらに含み、前記予備分離は、ステップB)又はステップG)に続くものであり、請求項1〜8のいずれか一項に記載の細菌を検出する方法。
【請求項１０】
細菌を検出するための反応容器であって、
フィルタによって互いに分離された少なくとも2つの区画であって、
フィルタは0.1μｍ〜0.5μmの孔サイズを有し、
1つの区画は、検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの少なくとも1つの種を含む懸濁液を収容するファージリザーバであり、
1つの区画は、前記懸濁液への試料の添加及び前記フィルタを通しての濾過後の濾液を受けるための収集リザーバである、
区画;
前記反応容器を同定するための手段;並びに
少なくとも2つの測定窓であって、
1つの測定窓は、前記ファージリザーバに面するフィルタ表面の領域に配置され、
1つの測定窓は、前記収集リザーバの領域に配置されている、
測定窓
を備え、ここで前記懸濁液が、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、且つ前記試験バクテリオファージとは別個である標識を有する標識された参照バクテリオファージをさらに含むか；又は前記反応容器が、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、それらの小サイズのためにフィルタを通過し得る標識されたナノ粒子を含有する指示薬溶液を収容するさらなる区画を備える、
反応容器。
【請求項１１】
前記懸濁液が、検出される異なる細菌種にそれぞれ特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの2つ以上の種を含み、前記種の標識群は、互いに別個であるか、又は部分的に重複しており、前記標識は、試験バクテリオファージのそれぞれの種に特有である、請求項10に記載の反応容器。
【請求項１２】
少なくとも1つのプレフィルタを収容する、前記ファージリザーバと前記フィルタとの間の区画をさらに含む、請求項10〜11のいずれか一項に記載の反応容器。
【請求項１３】
互いに並列及び/又は直列に配置されている、請求項10〜12のいずれか一項に記載の2つ以上の反応容器を備える、カートリッジであって、
それぞれの並列な反応容器は、検出される異なる細菌種にそれぞれが特異的に結合する、ファージリザーバの懸濁液中の標識された試験バクテリオファージの異なる種を収容する、カートリッジ。
【請求項１４】
前記標識された試験バクテリオファージの異なる種の標識群が、互いに別個であるか、又は部分的に重複している、請求項13に記載のカートリッジ。
【請求項１５】
細菌を検出するための測定デバイスであって、
請求項10〜12のいずれか一項に記載の反応容器又は請求項13若しくは14に記載のカートリッジが挿入されているスロット;
前記の挿入された反応容器又はカートリッジの測定窓の領域にそれぞれが配置されている、少なくとも2つの検出光学素子であって、
前記検出光学素子はそれぞれ、前記バクテリオファージの標識によって放射された光を少なくとも1つのセンサ上に収束させるためのレンズ系を含み、前記少なくとも1つのセンサは、前記放射された光を検出する、検出光学素子；
前記検出光学素子の前記少なくとも1つのセンサにそれぞれ接続されており、受信検出シグナルを処理するプロセッサ;及び
前記検出結果をユーザに出力する、前記プロセッサに接続された出力ユニット
を備える、測定デバイス。
【請求項１６】
前記検出光学素子がそれぞれ、200〜1000nmの波長範囲で光を放射する照明ユニット、及び前記照明ユニットにより放射された光を測定領域上に収束させるためのレンズ系をさらに含み、前記照明ユニットはまた、前記プロセッサに接続されており、前記プロセッサにより制御されている、請求項15に記載の測定デバイス。
【請求項１７】
前記反応容器を同定するための手段を検出し、その検出データを前記プロセッサに転送する統合リーダをさらに備え、それによって前記プロセッサが、前記検出データを処理し、前記出力ユニットを介して同定の結果をユーザに出力する、請求項15又は16に記載の測定デバイス。
【請求項１８】
前記少なくとも1つのセンサが、1つ以上の光学センサ、及び/又は放射フィルタを搭載してもよい1つ以上の分光光度計を備える、請求項15〜17のいずれか一項に記載の測定デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を検出するための方法、特に、特異的な細菌-バクテリオファージ複合体の形成に基づく、細菌性病原体を検出するための促進された高感度な方法に関する。さらに、本発明の方法を行うための反応容器及び測定デバイスが開示される。
【背景技術】
【０００２】
細菌は、重度疾患の病原体としてしばしば特徴付けられる。特に、「病院病原体」としても知られる、多剤耐性細菌株は、病院内の多数の細菌感染の原因である。とりわけ、人口動向及び現代集中治療医学の可能性の点から見て、細菌感染を特に受けやすい高齢患者の数の増加が、集中治療室で見られる。集中治療療法の中心的構成要素の一つは、微生物学的診断である。感染の病原体の迅速で正しい同定は、患者の死亡率に大きく影響するだけでなく、細菌特異的抗生物質の使用も可能にし、その結果、広域スペクトル抗生物質のインフレ使用及び多剤耐性細菌株の付随選択を回避することができる。しかしながら、これまで既存の手順は、通常は多くの時間を要し、また多くの費用も要する。
【０００３】
例えば、血液培養は、今日まで血流感染の診断における主な柱の一つであった。それにより、インキュベーションが、好気性及び嫌気性条件下に培養フラスコで行われる。血液に加えて、無菌液、例えば、点状及び液状試料が、この目的に適している。一般に、10mlの全血がそれぞれ入っている約3〜4個の培養フラスコが室温で診断用に採取される。血液培養フラスコは半自動システムでインキュベートされ、ここで、細菌増殖の増加が、CO2産生の増加又はボトル圧の増加によって測定される。日常のインキュベーションは、ほとんどの場合48〜72時間である。それにより、5〜21日間のインキュベーションを必要とすることがあり、したがって、日常手順で容易に見過ごされる、ゆっくり増殖する細菌は、特定の問題を提起する。同様に、特別の培養培地又は着色過程が、十分で迅速な診断を複雑にし、遅延させる。血液培養フラスコが陽性に検出される場合、それはその系から選択される。試料はこの瓶から採取され、好気性及び嫌気性継代培養液が異なる培養培地で再度調製される。さらに8時間後、付随抗生物質試験による耐性の大まかな決定を行うことができる。
【０００４】
より速い病原体同定が、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitis)、大腸菌(E. coli)及びチフス菌(Salmonella typhi)の抗原の検出のためにラテックス凝集を使用して1〜2時間内に陽性血液培養フラスコから直接達成される。核酸の検出のための方法、例えば、DNAハイブリダイゼーション、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)及び特異的核酸増幅技術(NAT)が、近年に菌血症及び敗血症の診断法のために使用されてきたが、非常に少ない実験室で利用可能なだけである。それにより、病原体は、陽性血液培養フラスコから1〜3時間以内に決定することができる。さらに、一部の臨床実験室は、MALDI-TOF(マトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間型)質量分析計により近年アップグレードされており、これは、ほんの数分以内に細菌の同定を可能にする。しかしながら、上に記載された現代の検出方法は、陽性に検出された血液培養フラスコを依然として必要とする。したがって、陽性血液培養を使用しての細菌性病原体の検出は、通常は試料を採取した24〜36時間後の時間枠内で成功し得るに過ぎない。
【０００５】
一部の場合、PCR診断法が、例えば黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のための、血液培養液のインキュベーションの中間ステップなしに回収血液試料の採取4〜6時間後以内に血液試料からの細菌の検出を可能にする。最新の方法は、マルチプレックス増幅法であり、これは、大部分の一般的な病原体を検出することができる。これらには、LightCycler、SeptiFast及びSepsiTestが含まれる。しかしながら、これらの試験は、混入物質に極めて影響を受けやすく、これは、偽性、又は偽陽性の結果を与える。これらの方法の別の欠点は、PCR診断法が材料だけでなく、適切な専門職員及び適当なインフラも必要とすることから、作業の量及び費用構造である。
【０００６】
さらに、全症例の2〜3%で、陽性に検出された血液培養液は、試料の混入物質又は試料採取後の処理誤差からも生じることが留意されるべきである。その結果は、不必要で時に相当の費用のかかる誤った抗生物質療法であり、これが、細菌性病原体の検出のための迅速で、使いやすく、且つ高感度の方法が望ましい理由である。
【０００７】
高い感度及び特異性の要件に関して、バクテリオファージ(略してファージ)は、有望な出発点を与える。バクテリオファージは、細菌細胞を特異的に標的とし、表面受容体構造を介してそれらを認識し、それらにキーロック様方式で結合し、その後の段階でそれら自体の複製のために細菌の遺伝的及び酵素的装置を使用するウイルスである。感染細菌細胞は、溶解し、多数の新しいファージを放出する。遊離のファージに近づきやすい宿主細菌細胞のすべてが除去されるまで、この生物学的過程鎖は継続する。ファージは、ほとんどの場合、1種の細菌種内の株だけに影響を与え、すなわち、それらは、ある特定の細菌種に非常に特異的である。生物学的原理によれば、多くの細菌種は多数の生息地に遍在的に見出すことができるので、それらの補完ファージもそれらの中に見出されると予測することができる。地球規模では、専門家により推定されるファージの数は、細菌の数の10倍を超える(C. Rohde & J. Sikorski: Bakteriophagen-Vielfalt、Anwendung und ihre Badeutung fur die Wissenschaft vom Leben. Naturwiss. Rundschau(2011年)、64、5〜14頁)。所望のバクテリオファージは、簡単な試料採取及びその後の標的細菌に対するスクリーニングによって、考えられる水性生息地のすべてからしばしば抽出され得る。
【０００８】
それらの非常に高い宿主特異性及び溶解特性のために、ファージは、例えば、細菌感染に対するファージ療法で、臨床研究及び分析において多様な方式で既に使用されている。さらに、Thanki、Malik、Clokieは、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)の同定のための生物発光レポーターファージの開発について記載しており、ここでは、酵素ルシフェラーゼをコードする遺伝子カセットluxA及びluxBが、クロストリジウム・ディフィシレ特異的ファージ中への結合(conjugation)及びファージゲノムへの相同的挿入のためのプラスミド中にクローニングされる(A. Thanki、D. Malik、M. Clokie、The Development of a Reporter Phage for the identification of Clostridium difficile、Bacteriophages(2015年、Abstract、25)。Mosier-Bossらの科学文献には、蛍光標識されたP22ファージを使用してのネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)LT2の特異的検出についてさらに記載されている。ファージの標識は、ファージのDNAに完全に限定されており(SYBR金とのP22の10分間インキュベーション)、これは、感染時の宿主細菌に注入される。特異的ネズミチフス菌-P22ファージ複合体の検出が、蛍光顕微鏡法によってそれらの単離後に行われる。(P.A. Mosier-Bossら、Use of Fluorescently Labelled Phage in the Detection and identification of Bacterial Species、Applied Spectroscopy(2003年)、57、1138〜1144頁)。
【０００９】
細菌の簡単で、信頼性のある検出は、食品産業及び飲料水供給でも重要である。レジオネラ属(Legionella)株は、20〜45℃の温度にて飲料水中で増殖することができ、その結果、飲料水の定期試験が必要とされ、多くの国々でも法的に規定されている。例えば、独国飲料水規則は、レジオネラ属の定期試験を規定している。法規定は、さらに厳しくなることが予想される。したがって、協会及び機関、例えば、飲料水試験所又は健康機関は、レジオネラ属株の細菌の速く、簡単で、感度が高く、安全な検出を行うことを切望している。これは、現在欠けており、改善が望ましい。
【００１０】
他方で、食物媒介細菌性食中毒及び食物毒素感染は、地球規模の問題であり、大変な経済的損害を生じている。再販売まで製品の保存期間が延長されたり、対応する食品はリコールもされ得たりするので、病原体の信頼のある検出が得られるまでの長期間は、相当な経済的損失を意味する。より迅速で、より安全な検出方法は、食品安全性、及び経済的損失の最小限化に著しく寄与し得る。食品セクターにおける恐ろしい病原体には、クロノバクター属種(Cronobacter spp.)、サルモネラ属種(Salmonella spp.)、シゲラ属種(Shigella spp.)、大腸菌、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、ビブリオ属種(Vibrio spp.)、エロモナス属種(Aeromonas spp.)、プレジオモナス属種(Plesiomonas spp.)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、又はセレウス菌(Bacillus cereus)が含まれる。したがって、食品中の病原体の急速排除又は検出は、それらの認可のために不可欠である。
【００１１】
細菌の迅速で、簡単な検出が望ましい他の分野には、農業、獣医学、軍事用途又は災害対策が含まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特に時間の消費、複雑性及び費用度合に関する、最新技術の細菌の検出のための臨床方法の欠点を考慮すると、いくつかの具体的用途を挙げれば臨床、ヒト医薬品若しくは獣医学、農業若しくは軍事用途、又は飲料水分析のために、細菌の適時で、選択的な検出のための新規で、より速く、且つより特異的な診断学に対する必要性がある。したがって、本発明の目的は、細菌性病原体のより迅速で、より信頼性のある同定、簡単化された取り扱い及びより低い費用で高感度を与える細菌検出の改善された検出方法を提供することである。同様に本発明の方法を行うための反応容器及び測定デバイスが提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上述の目的に対する本発明の解決策は、細菌とバクテリオファージとの間の進化的に保存された、非常に特異的な相互作用に基づく。
【００１４】
したがって、本発明は、細菌を検出する方法であって、
A)検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの少なくとも1つの種をそれぞれが含む1つ以上の懸濁液を用意するステップと;
B)1つ以上の懸濁液に、検出される少なくとも1種の細菌種の存在について試験される試料を添加するステップと;
C)得られた反応混合物を濾過するステップと;
D)検出される少なくとも1種の細菌種が存在することを条件として、保持液中の細菌-バクテリオファージ複合体を検出するステップであって、その複合体は、検出される少なくとも1種の細菌種の細菌、及びそれに結合した試験バクテリオファージの少なくとも1つの種の試験バクテリオファージからなる、ステップと;
E)濾液中の非結合試験バクテリオファージを検出するステップと;
F)ステップD)及びステップE)での検出により生成した受信シグナルをプロセッサ補助処理し、検出結果をユーザに出力するステップと
を含む方法を開示する。
【００１５】
さらに、本発明は、細菌を検出する本発明の方法を行うための反応容器であって、
フィルタによって互いに分離された少なくとも2つの区画であって、1つの区画は、検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの少なくとも1つの種を含む懸濁液を収容するファージリザーバであり、1つの区画は、懸濁液への試料の添加及びフィルタを通しての濾過後の濾液を受けるための収集リザーバである、区画;
反応容器を同定するための手段;並びに
少なくとも2つの測定窓であって、1つの測定窓は、ファージリザーバに面するフィルタ表面の領域に配置され、1つの測定窓は、収集リザーバの領域に配置されている、測定窓
を備える、反応容器に言及する。
【００１６】
さらに、本発明は、互いに並列及び/又は直列に配置されている、本発明による2つ以上の反応容器を備える、カートリッジであって、
それぞれの並列な反応容器は、検出される異なる細菌種にそれぞれ特異的に結合する、ファージリザーバの懸濁液中の標識された試験バクテリオファージの異なる種を収容する、カートリッジに関する。
【００１７】
加えて、本発明は、細菌を検出する本発明の方法を行うための測定デバイスであって、
本発明による反応容器又は本発明によるカートリッジが挿入されているスロット;
挿入された反応容器又はカートリッジの測定窓の領域にそれぞれが配置されている、少なくとも2つの検出光学素子であって、検出光学素子はそれぞれ、バクテリオファージの標識によって放射された光を少なくとも1つのセンサ上に収束させるためのレンズ系を含み、その少なくとも1つのセンサは、放射された光を検出する、検出光学素子;
検出光学素子の少なくとも1つのセンサにそれぞれ接続されており、受信検出シグナルを処理するプロセッサ;及び
検出結果をユーザに出力する、プロセッサに接続された出力ユニット
を備える、測定デバイスに関する。
【００１８】
一方で、本発明の有利な効果は、細菌性病原体の迅速で、高感度な同定にある。したがって、血液培養液は、本発明の方法に必要でない。むしろ、特異的細菌種の存在について試験される試料は、試料採取直後に使用され得る。したがって、理想的には、細菌は試料を輸送したり保存したりする必要なしに1時間未満で検出され得る。これは、抗生物質のより速く、より細菌特異的な適用を可能にし、そのようにして、広域スペクトル抗生物質の予防的使用を回避する。加えて、本方法によって、細菌は、1ミリリットル当たり100個未満の細菌の濃度で検出され得る。他方で、本発明の方法は、その取り出し後の試料の即座の使用、及び取り扱いの容易さによって特徴付けされ、それが処理誤差を生じにくくする。さらに、本発明の反応容器及び本発明の測定器を使用して本方法を実施することは、認められた専門職員又は特別のインフラを必要とせず、これは費用を相当に低減させる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】細菌を検出するための本発明の方法の好ましい実施形態の概略図。
【図２】細菌を検出するための本発明の方法の別の好ましい実施形態の概略図。
【図３Ａ】細菌の検出のための本発明の反応容器の好ましい実施形態の概略図。
【図３Ｂ】図3Aの本発明の反応容器を使用する本発明の方法の好ましい実施形態における蛍光の時間分解測定の理論的過程。
【図４Ａ】細菌の検出のための本発明のカートリッジの好ましい実施形態の概略図。a)正面図、b)上面図、及びc)側面図。
【図４Ｂ】図4Aの本発明のカートリッジを使用する本発明の方法の好ましい実施形態における蛍光の時間分解測定の理論的過程。
【図５】一実施形態における本発明の反応容器及び測定デバイスの組み立て概略図。
【図６】本発明の反応容器の同定のための手段としてのRFIDチップ。
【図７】フルオレセイン-NHSエステルによるTB54バクテリオファージの標識化。
【図８】フルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージの励起及び放射スペクトル。
【図９Ａ】細菌-バクテリオファージ相互作用の蛍光顕微鏡画像。
【図９Ｂ】細菌-バクテリオファージ相互作用の明視野画像。
【図１０Ａ】透過光及び蛍光顕微鏡表示での、フルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージが感染した大腸菌細菌の光学断面画像。
【図１０Ｂ】フルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージが感染した大腸菌細菌の三次元再構成。
【図１１Ａ】バクテリオファージの異なる濃度での、フルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージの蛍光スペクトル。
【図１１Ｂ】バクテリオファージの異なる濃度での、図10Aの蛍光スペクトルの520〜530nmの積分値の表示。
【図１２Ａ−Ｃ】それぞれ異なる細菌濃度での、連続希釈した細菌懸濁液の光学密度の測定、保持液中のフィルタ表面上の大腸菌C600-TB54ファージ複合体の検出蛍光シグナルの表示、及び濾液中の非結合TB54ファージの検出蛍光シグナルの表示。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明による方法は、ステップA)において、検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの少なくとも1つの種をそれぞれが含む1つ以上の懸濁液を用意するステップを含む。好ましくは、標識は、標識された試験バクテリオファージのそれぞれの種に特有である。これは、試験バクテリオファージの異なる種にカップリングしている標識が互いに別個であることを意味する。あるいは、標識はまた、部分的に重複していてもよく、それにより、個々の標識のシグナル、及び試験バクテリオファージの異なる種のシグナルは、それぞれ、分光分析法によってスペクトル的に分離することができ、したがって、明確に割り当てることができる。この場合、重複する標識はまた、連続的に検出されてもよい。
【００２１】
好ましくは、懸濁液の体積は、0.5〜5.0mlである。
【００２２】
ファージ力価とも呼ばれる、懸濁液中のバクテリオファージの濃度は、好ましくは103〜1012pfu/ml(pfu=「プラーク形成単位」)、さらに好ましくは104〜1010pfu/mlである。最も好ましいものは、105〜107pfu/mlの懸濁液中ファージ力価である。
【００２３】
検出される細菌種に依存して、この細菌種に特異的に結合する、すなわち、この細菌種に特異的に感染する試験バクテリオファージの種が、懸濁液の調製のために選択される。バクテリオファージの進化的に保存された、非常に高い宿主特異性のために、細菌種内の個別の株を特異的に検出することがさらに可能である。この場合、試験バクテリオファージの種は、懸濁液の調製のために選択され、これにより、細菌種内の特定株に特異的に結合する。それにより、検出される細菌種以外の細菌種への、又は検出される株以外の株への、試験バクテリオファージの選択種の結合は、ほとんど不可能である。結果として、本発明の方法によって偽陽性検出を得る可能性は最小限であり、本発明の検出方法の結果は、極めて信頼できる。いくつかの懸濁液を与える場合、検出される異なる細菌種にそれぞれ特異的に結合する試験バクテリオファージの異なる種は、それぞれの懸濁液が試験バクテリオファージの1つの特定の種を含むようにそれに応じて選択されてもよい。これは、1つの試料内のいくつかの細菌種を検出することを可能にする。少なくとも1つの種の試験バクテリオファージ及びさらなる手順で得られた細菌-バクテリオファージ複合体を検出することを可能にするために、試験バクテリオファージは、標識を有する。好ましくは、標識は、試験バクテリオファージのそれぞれの種について特有であり、すなわち、1つの種の試験バクテリオファージはすべて同じ標識を有し、これは、他の種の標識と区別できる。
【００２４】
懸濁液を調製するために、それぞれの少なくとも1つの種の標識された試験バクテリオファージは、好ましくは水、又は適当な緩衝液若しくは他の水溶液に懸濁される。適当な緩衝液は、好ましくは0.01〜0.3Mリン酸緩衝液、pH6.5〜9.5;0.01〜0.3M炭酸緩衝液、pH6.5〜9.5;リン酸緩衝生理食塩水(PBS)又はそれらの混合物である。さらに好ましいものは、水並びに適当な緩衝溶液が、MgCl2、MgSO4及び/又はCaCl2を含有するものである。MgCl2、MgSO4及びCaCl2の濃度は、好ましくはそれぞれ1〜15mMになる。
【００２５】
本発明の方法のステップB)において、検出される少なくとも1種の細菌種の存在について試験される試料が、1つの懸濁液又はそれより多い懸濁液に添加される。好ましくは、試料は、ヒト又は動物体液、例えば、血液、尿、唾液又は別の体液、ヒト又は動物から採取された綿棒、飲料水系からの又は水溶液中で調製された食品若しくは食品成分の水からなる。試料採取後、試料は、懸濁液に直接、又はさらなる前処理なしに懸濁液に添加される。食品又は食品成分は、水溶液に入れられる。これは、細菌の検出に必要な時間を大幅に減少させ、輸送及び/又は保存中の混入リスクを最小限にする。さらに、本発明の方法は、調製細菌培養液に由来する試料からの細菌の検出も可能にする。
【００２６】
添加前に、試料は好ましくは、その後のステップC)でのフィルタの可能な閉塞が回避され得るように粒子(>0.5μm)によるいかなる汚染も除去するために、0.5〜10.0μmの孔サイズを有する粗フィルタを通して濾過される。あるいは、0.5〜10μmの減少する孔サイズを有する多段階粗フィルタがまた、使用されてもよい。
【００２７】
試料の体積は、好ましくは0.05〜2.5ml、さらに好ましくは0.1〜2.0ml、最も好ましくは0.5〜2.0mlである。前記体積範囲の組合せも可能である。
【００２８】
好ましくは、試料は、ステップB)に続くステップG)で懸濁液と混合され、得られた反応混合物はインキュベートされる。混合は、好ましくは反復旋回又は適度な撹拌によって行われる。得られた反応混合物は、好ましくは2〜30分間、さらに好ましくは5〜15分間、さらにより好ましくは5〜10分間インキュベートされる。インキュベーション中の温度は、好ましくは4〜60℃、さらに好ましくは10〜30℃である。室温(RT、20〜25℃)での反応混合物のインキュベーションが最も好ましい。検出される少なくとも1種の細菌種が存在するという条件で、混合及びインキュベーションは、検出されるそれぞれの細菌が、ステップC)でのその後の濾過前にそれぞれの少なくとも1つの種の標識された試験バクテリオファージに結合又は感染することを確実にするものである。
【００２９】
好ましくは、ステップC)での反応混合物の濾過のために、0.1〜0.5μmの孔サイズを有するフィルタが使用される。使用されるフィルタの孔サイズは、さらに好ましくは0.2〜0.5μmであるが、0.3〜0.5μmの孔サイズが特に好ましく、0.2〜0.4μmの孔サイズが最も好ましい。使用されるフィルタの孔サイズは、検出される少なくとも1種の細菌種、並びに検出される少なくとも1種の細菌及びそれに結合している試験バクテリオファージの少なくとも1つの種の試験バクテリオファージからなる細菌-バクテリオファージ複合体が、保持されフィルタ表面上に固定化されるが、非結合バクテリオファージはフィルタを通過できるように選択される。それにより、検出される細菌種の細菌-バクテリオファージ複合体及び他の存在する可能性がある細菌の、非結合バクテリオファージからの分離が達成される。したがって、使用されるフィルタの孔サイズは、それぞれの検出される細菌種のサイズ及び形態に応じて選択される。
【００３０】
フィルタは、好ましくはメンブレン、フィルム又はマトリックス、例えば、球床、又はフィラメント状若しくは管状の材料(例えば、繊維/中空繊維)のナノ若しくはマイクロ構造化表面から構成される。
【００３１】
好ましくは、フィルタ材料は、合成又は天然ポリマー、例えば、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリプロピレン(PP)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ナイロン、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、デンプン、炭水化物化合物、ラテックス若しくはシリコーン;金属若しくは金属合金(これらは、磁性、常磁性、超常磁性又は非磁性であり得る);ガラス、例えば、ホウケイ酸ガラス;セルロース、例えば、メチルセルロース若しくは再生セルロース、又は他の炭素化合物、例えば、活性化炭素から構成される。
【００３２】
濾過は、好ましくは重力測定法で、真空をかけることによって、又は加圧によって行われる。
【００３３】
ステップD)でのフィルタ表面上の保持液中の細菌-バクテリオファージ複合体の検出だけでなく、ステップE)での濾液中の非結合試験バクテリオファージの検出も、バクテリオファージがそれぞれ提供する標識の検出に基づく。例えば、標識は、蛍光特性を有するレポーター分子から構成されてもよい。レポーター分子の適当な励起後、次いで、放射蛍光シグナルが、センサによって検出され得る。蛍光シグナルは、光学放射フィルタを介して瞬時に統合されて検出され得るか、又は波長スペクトルとして分光光度法で測定され得る。さらに、両方の検出方策を組み合わせることもできる。第1の検出方策の利点は、より高いシグナル対ノイズ比及びより速い測定である。第1の検出方策の欠点は、いくつかの異なる試験バクテリオファージが使用される場合、別個の蛍光標識に対する制限があり得る。分光光度検出方策の利点は、部分的に重複する標識さえも、いくつかの異なる試験バクテリオファージについて使用され得るが、その理由は、これらをスペクトル的に分離し、したがって、下流の処理方法で曖昧でなく割り当てることができるからである。
【００３４】
例えば、それぞれの検出された蛍光シグナル及び/又は蛍光スペクトルのような、ステップD)及びステップE)から受信されたシグナルは、ステップF)でプロセッサにより処理され、検出の結果は、最終的にユーザに出力される。
【００３５】
出力は、好ましくはプロセッサに接続された光学ディスプレイを介して実行される。あるいは、検出結果は、タブレットコンピュータ又は遠隔コンピュータ端末にプロセッサから無線送信され得る。
【００３６】
検出される少なくとも1種の細菌種が試料中に存在する場合、少なくとも1つの種の標識された試験バクテリオファージは、検出される少なくとも1種の細菌種に特異的に結合し、したがって、対応する細菌-バクテリオファージ複合体を形成する。濾過は、非結合バクテリオファージからの他の細菌と一緒にこれらの複合体を分離する。したがって、フィルタ表面上に固定化された複合体は、結合された試験バクテリオファージの標識のために検出され得る。過剰の非結合試験バクテリオファージは、フィルタを通過でき、それらの標識化のために濾液中に検出され得る。試料が、検出されるいずれの細菌種も含まない場合、複合体はまったく形成されず、非結合試験バクテリオファージのみが濾液中に検出される。特にフィルタが(部分的に)閉塞する場合、過剰の非結合試験バクテリオファージはまた、手順中の保持液中にも検出され得る。したがって、保持液中の非結合試験バクテリオファージの測定シグナルはまた、濾液のものに加えて検出に含まれてもよい。
【００３７】
ステップE)での非結合試験バクテリオファージの追加的検出は、フィルタが閉塞する場合、偽陽性シグナルを得るリスクを低減させる。試料が、検出される細菌種を含まず、フィルタが、例えば、反応混合物中の検出不能な細菌種又は他の粒子によって、閉塞する場合、非結合試験バクテリオファージはフィルタを通ることができず、保持液中に残存する。これは、特異的な細菌-バクテリオファージ複合体が形成され得ないが、保持液における検出をもたらす。その結果は、検出される細菌種の偽陽性検出である。ステップE)での濾液中の非結合試験バクテリオファージの検出が可能でない場合、これは、フィルタが塞がれていることを示す。その結果として、ステップE)での非結合試験バクテリオファージの追加的検出は、本発明による検出方法の信頼性を増加させる。
【００３８】
ステップE)での濾液中の非結合試験バクテリオファージの検出の欠如は、あるいは、試験バクテリオファージがすべて、検出される少なくとも1種の細菌種に結合してしまったことにより得る。この可能性は、高いファージ力価のためにありそうもないが、懸濁液は好ましくは、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、且つ本発明による検出方法の信頼性をさらに増加させるために試験バクテリオファージとは別個である標識を有する、標識された参照バクテリオファージをさらに含む。標識化のために、参照バクテリオファージも検出可能である。参照バクテリオファージの標識は、試験バクテリオファージの標識とは別個であり、その結果、参照バクテリオファージは、曖昧でなく且つそれぞれの試験バクテリオファージから独立して検出され得る。参照バクテリオファージは、検出されるいずれの細菌種にも結合しないので、すなわち、それは細菌といずれの複合体も形成しないので、それは、濾過後の濾液中だけに理想的に検出され得る。しかしながら、参照バクテリオファージが濾液中に検出されない場合、これは、フィルタが完全に閉塞していることを示す。
【００３９】
フィルタが手順中に部分的又は完全に塞がれる場合でさえ、参照バクテリオファージの使用は、非常に信頼できる検出結果を与える。この目的のために、保持液中の参照バクテリオファージの全シグナル強度と、濾液中の参照バクテリオファージの全シグナル強度との商が決定され、保持液中の少なくとも1つの種の試験バクテリオファージの全シグナル強度と濾液中の少なくとも1つの種の試験バクテリオファージの全シグナル強度との商と比較される。少なくとも1つの種の試験バクテリオファージについて決定された商が、参照バクテリオファージについて決定された商よりも有意に高い場合、これは、使用された試料中での検出される少なくとも1種の細菌種の存在の明らかな証拠を与える。しかしながら、少なくとも1つの種の試験バクテリオファージのシグナルが、保持液中と濾液中の両方に、しかし参照バクテリオファージと同等の商として、見出される場合、例えば、検出不能な細菌による、手順中のフィルタの非特異的閉塞が仮定され得る。
【００４０】
標識された参照バクテリオファージの代替として、標識されたマイクロ又はナノ粒子が使用され得る。これらは、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、それらの小サイズのためにフィルタを通過し得る。
【００４１】
本発明の方法の別の利点は、ある特定の検出される細菌種に限定されずに、普遍的に利用可能であることである。唯一の要件は、検出される細菌種に補完的であるバクテリオファージの存在である。補完的ファージがまた、それによって細菌種の多くの生息地に存在すると疑われる生物学的原理に従って、それぞれの細菌種について、この細菌種に特異的に感染する少なくとも1つの種のバクテリオファージが存在すると仮定されなければならない。
【００４２】
しかしながら、検出される細菌種は、好ましくは黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA))、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌(Haemophilus parainfluenzae)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸菌、エスケリキア・ヘルマニイ(Escherichia hermannii)、EHEC、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェカム(Enterococcus faecum)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、スタフィロコッカス・サプロフィティカス(Staphylococcus saprophyticus)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、エンテロコッカス・フェシウム(Entercoccus faecium)、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、霊菌(Serratia marcescens)、B群β溶血性レンサ球菌(B-Streptococuus(agalactiae))、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、オウム病クラミジア(Chlamydia psittaci)、ウレアプラズマ・ウレアリチカム(Ureaplasma urealyticum)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundii)、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、アシネトバクター・バウマニ(Acinetobacter baumannii)、プロビデンシア・レットゲリ(Providencia rettgeri)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、炭疽菌(Bacillus anthracis)、セレウス菌、ウシ流産菌(Brucella abortus)、ブルセラ・メリテンシス(Brucella melitensis)、クロストリジウム・ブトリヌム(Clostridium butolinum)、クロストリジウム・ディフィシレ、破傷風菌(Clostridium tetani)、ウェルシュ菌(Clostridium perfringens)、クラミジア・トラコマチス(Clamydia trachomatis)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)、野兎病菌(Francisella tularensis)、ガードネレラ・バギナリス(Gardenella vaginalis)、リステリア・モノサイトゲネス、モルガン菌(Morganella morganii)、らい菌(Mycobacterium leprae)、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)、ノカルディア・アステリオデス(Nocardia asteriodes)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、シゲラ属種(Shigella spp.)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、ペスト菌(Yersinia pestis)、腸炎エルシニア(Yersinia enterocolitica)、コクシエラ菌(Coxiella burnettii)、エロモナス属種(Aeromonas spp.)、プレジオモナス属種(Plesiomonas spp.)、キサントモナス・マルトフィリア(Xanthomonas maltophilia)、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)、エイケネラ・コローデンス(Eikenella corrodens)、スピリルム・ミヌス(Spirillum minus)、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazeki)、ロッキー山紅斑熱リケッチア(Rickettsia rickettsii)、リケッチア・コノリイ(Rickettsia conorii)、クロノバクター属種(Cronobacter spp.)、カンピロバクター属種(Campylobacter spp.)、及び在郷軍人病菌(Legionella pneumophilia)を含む群から選択される。
【００４３】
特に好ましくは、検出される細菌種は、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、特にhaMRSA=院内感染MRSA、caMRSA=市中MRSA、laMRSA=家畜関連MRSA、VRSA=バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティカス亜種サプロフィティカス(Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus)、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ(Streptococcus dysgalactiae)、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、リステリア・モノサイトゲネス、クロストリジウム・ディフィシレ、ウェルシュ菌、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、エンテロバクター・アエロゲネス、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌、モラクセラ・カタラーリス、肺炎桿菌、クレブシエ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、霊菌、アシネトバクター・バウマニ、シトロバクター・フロインディ、緑膿菌、ステノトロホモナス・マルトフィリア、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、モルガン菌、プロビデンシア・レットゲリ、プロビデンシア・スチュアルティイ(Providencia stuartii)、バクテロイデス・フラジリス、クラミジア・トラコマチス、ウレアプラズマ・ウレアリチカム、マイコプラズマ・ホミニス、淋菌、梅毒トレポネーマ亜種パリドゥム(Treponema pallidum ssp. pallidum)、チフス菌、ネズミチフス菌、パスツレラ・ムルトシダ、ソンネ菌(Shigella sonnei)、フレクスナー菌(Shigella flexneri)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、コレラ菌、野兎病菌、百日咳菌、及び在郷軍人病菌(Legionella pneumophilas)からなる群から選択されてもよい。
【００４４】
本発明の方法の一実施形態において、1つ以上の懸濁液は好ましくはそれぞれ、標識された試験バクテリオファージの2つ以上の種を含む。それらの種は、検出される異なる細菌種に特異的に結合する。好ましくは、種の標識群は、互いに別個であるか、又は部分的に重複しており、したがって、試験バクテリオファージのそれぞれの種について特有である。これは、1バッチ中の試料中の2種以上の細菌種の存在の検出を同時に可能にする。好ましくは、1つ以上の懸濁液は、それぞれ標識された試験バクテリオファージの6つまでの異なる種、さらに好ましくは5つまでの異なる種、さらにより好ましくは4つまでの異なる種、最も好ましくは3つまでの異なる種を含有する。
【００４５】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、標識された試験バクテリオファージの異なる種をそれぞれが含む2つ以上の懸濁液で並行して行われ、ここで、種の標識群は、好ましくは互いに別個であるか、又は部分的に重複している。試験される試料は、2つ以上の懸濁液にわたって分配されている。好ましくは、検出される試料は、マイクロ流体システムを介して分配されており、その結果、試料は、懸濁液に個別に添加される必要はないが、マイクロ流体システムのマイクロ流体チャネルを通して同時に添加される。好ましくは、6つの並行懸濁液、さらに好ましくは5つの並行懸濁液、なおさらに好ましくは4つの並行懸濁液、最も好ましくは3つまでの並行懸濁液が、この実施形態で使用される。これは、1つの試料内の2種以上の細菌種の存在の同時検出も可能にする。
【００４６】
別の実施形態において、本方法は、標識されたバクテリオファージが試料の添加前に懸濁液中で検出される、ステップA)に続くステップをさらに含む。このステップは、初期参照としての非結合バクテリオファージの標識に由来するシグナルの全体を取得するのに役立つ。標識が、例えば、蛍光特性を有するレポーター分子である場合、非結合バクテリオファージの全蛍光は、試料が添加されるか、又はその蛍光スペクトルが分光光度計を使用して記録される前に、初期参照として適切な励起後に検出される。
【００４７】
好ましくは、本方法はまた、ステップB)又は濾過前の任意選択のステップG)で得られる反応混合物の検出を含む。
【００４８】
バクテリオファージの標識化は、好ましくは蛍光若しくは化学発光特性を有する少なくとも1種のレポーター分子、又は二次分子との相互作用によって光を放射する少なくとも1種のレポーター分子を含む。さらに好ましいものは、蛍光又は化学発光特性を有する少なくとも1種のレポーター分子である。蛍光特性を有する少なくとも1種のレポーター分子が、特に好ましい。
【００４９】
蛍光特性を有するレポーター分子には、
・有機フルオロフォア、例えば、キサンテン、ローダミン、クマリン、アクリジン誘導体、フルオレセイン、並びにAlex Fluor誘導体、SYBR Green及びSYBR Gold;
・無機フルオロフォア及びそれらのコンポジット、例えば、量子ドット(QD);
・蛍光磁気粒子;並びに
・蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、又はそれらの誘導体
が含まれる。
【００５０】
二次分子との相互作用により光を放射するレポーター分子には、
・対応するマーカー物質の変換によって光を放射する、酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ;及び
・相互作用パートナーとしてのストレプトアビジンに結合することによって光を放射するビオチン(これは、ひいては、蛍光又は化学発光標識を有する)
が含まれる。
【００５１】
有機フルオロフォアは、バクテリオファージの標識化のために最も好ましい。
【００５２】
バクテリオファージは、少なくとも1種のレポーター分子を、ファージのDNA、カプシド領域のタンパク質(頭部エンベロープタンパク質)、又はファージの尾部領域のタンパク質(尾部繊維タンパク質)にカップリングさせることによって標識され得る。バクテリオファージのカプシド領域のタンパク質への少なくとも1種のレポーター分子のカップリングが好ましい。
【００５３】
好ましくは、カップリングは、少なくとも1種のレポーター分子とバクテリオファージとの間の共有結合を形成することによって得られる。この目的のために、
・アミノ基へのカップリングのための、少なくとも1種のレポーター分子の活性エステル、例えば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステル)又はスルホテトラフルオロフェニルエステル(STFPエステル);
・アミノ基へのカップリングのための、少なくとも1種のレポーター分子のイソチオシアネート;
・チオール基へのカップリングのための、少なくとも1種のレポーター分子のマレイミド;
・2段階アジド-アルキン付加環化反応を介してのアルキンへのカップリングのための、少なくとも1種のレポーター分子のアジド;
・非特異的カップリングのための、少なくとも1種のレポーター分子における光反応性基
が使用される。
【００５４】
例としては、活性エステルとして5(6)-カルボキシフルオレセイン-HNS-エステル、イソチオシアネートとしてフルオレセインイソチオシアネート(FITC)、マレイミドとしてAlexa Fluor 488-マレイミド、アジドとして5-アジド-テトラメチルローダミン(5-TAMRA-アジド)、及び光反応性基としてフォトビオチンがある。
【００５５】
本発明の方法の好ましい実施形態において、バクテリオファージの標識化は、少なくとも1種の蛍光レポーター分子から構成される。励起は、好ましくは1つ以上のレーザ又は1つ以上の発光ダイオード(LED)を備える照明ユニットによって、それぞれ行われる。さらに、励起は、200〜1000nmの波長範囲、さらに好ましくは350〜700nmの波長範囲で行われる。保持液中のフィルタ表面上の細菌-バクテリオファージ複合体の検出、及び濾液中の非結合バクテリオファージの検出は、光学センサを使用して光学放射フィルタを介して積分された蛍光を測定することによって、及び/又は蛍光強度スペクトルを測定することによって行われる。蛍光は、好ましくは蛍光顕微鏡法及び/又は光学センサ及び/又は分光光度計を使用して測定される。光学センサは、さらに好ましくは光電子増倍管(PMT)、CCDセンサ(電荷結合素子)及びCMOSセンサ(相補型金属酸化物半導体)からなる群から選択される。分光光度計は、所定の波長間隔、好ましくは20nm刻み、さらに好ましくは10nm刻み、特に好ましくは2〜5nm刻みで蛍光強度の走査を可能にする。
【００５６】
別の好ましい実施形態において、検出は、光放射の時間分解測定によって行われ、すなわち、レポーター分子により放射された光は、ある特定の期間にわたって連続的に検出される。バクテリオファージの標識化が、少なくとも1種の蛍光レポーター分子である場合、励起及び検出は、前の実施形態で記載されたように行われ、但し、蛍光は時間分解方式で測定されることを条件とする。
【００５７】
好ましくは、細菌を検出する本発明の方法は、細菌-バクテリオファージ複合体と非結合バクテリオファージを予備分離するステップをさらに含み、予備分離は、ステップB)又は任意選択ステップG)に続いて行う。反応混合物の予備分離は、好ましくはゲルマトリックスを使用してゲル濾過(ゲル浸透クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィー)の原理に従って行われる。これは、細菌-バクテリオファージ複合体及び非結合バクテリオファージが、それらのサイズの差によって互いに分離され、それにより、より大きい複合体がより小さい非結合バクテリオファージの前にゲルマトリックスを離れることを意味する。ゲルマトリックスは、好ましくは合成又は天然ポリマー、例えば、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリプロピレン(PP)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ナイロン、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、デンプン、炭水化物化合物、ラテックス若しくはシリコーン;金属若しくは金属合金(これらは、磁性、常磁性、超常磁性又は非磁性であり得る);ガラス、例えば、ホウケイ酸ガラス;セルロール、例えば、メチルセルロース若しくは再生セルロース、又は他の炭素化合物から構成される。
【００５８】
ゲルマトリックスは、好ましくは0.01〜5μmの孔サイズを有する。ゲルマトリックスの材料及び孔サイズの選択は、検出される少なくとも1種の細菌種のサイズ及び形態に依存し、その結果、非結合バクテリオファージからの細菌-バクテリオファージ複合体の最適予備分離が達成される。
【００５９】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、ステップC)における濾過前に細菌-バクテリオファージ複合体及び非結合バクテリオファージを濃縮するステップをさらに含む。
【００６０】
濃縮は、機械的又は電磁的に行われてもよい。
【００６１】
さらに好ましくは、少なくとも1つの種の試験バクテリオファージ、及び任意選択の参照ファージは、磁気ビーズで被覆されている。この場合、濃縮は、外部磁場をかけることによって、例えば、電磁石を与えることによって電磁的に達成されてもよい。
【００６２】
予備分離及び濃縮の任意選択のステップは、個別に、又は本発明の方法と組み合わせて行われてもよい。
【００６３】
さらなる実施形態において、本発明の方法は、ステップC)における反応混合物の濾過後にすすぎ洗いステップを含んでもよい。このすすぎ洗いステップにおいて、フィルタは、好ましくは中性溶液ですすぎ洗いされる。中性溶液は、好ましくは水、緩衝液、若しくは任意の他の水溶液から構成されるか、又は前滅菌の濾過試料から構成される。
【００６４】
別の態様において、本発明は、細菌を検出する本発明の方法を行うための反応容器について記載する。
【００６５】
好ましくは、本発明の反応容器は、5〜20mmの長さ、5〜20mmの幅及び50〜100mmの高さを示す。
【００６６】
本発明の反応容器は、フィルタによって互いに分離されている少なくとも2つの区画を備える。フィルタは、好ましくは0.1μm〜0.5μm、より好ましくは0.2〜0.5μmの孔サイズを有する。0.3〜0.5μmの孔サイズが特に好ましく、最も好ましい孔サイズは、0.2〜0.4μmである。本方法について前に記載されたとおりに、使用されるフィルタの孔サイズは、細菌-バクテリオファージ複合体及び恐らくは存在する他の細菌の非結合バクテリオファージからの効率的な分離を達成するために、検出されるそれぞれの細菌種のサイズ及び形態に応じて選択される。
【００６７】
フィルタは、好ましくはメンブレン、フィルム又はマトリックス、例えば、球床、又はフィラメント状若しくは管状の材料(例えば、繊維/中空繊維)のナノ若しくはマイクロ構造化表面から構成される。
【００６８】
好ましくは、フィルタ材料は、合成又は天然ポリマー、例えば、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリプロピレン(PP)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ナイロン、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、デンプン、炭水化物化合物、ラテックス若しくはシリコーン;金属若しくは金属合金(これらは、磁性、常磁性、超常磁性又は非磁性であり得る);ガラス、例えば、ホウケイ酸ガラス;セルロール、例えば、メチルセルロース若しくは再生セルロース、又は他の炭素化合物、例えば、活性炭素から構成される。
【００６９】
反応容器の1つの区画は、検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテレイオファージの少なくとも1つの種を含む懸濁液を収容するファージリザーバである。好ましくは、標識は、試験バクテリオファージのそれぞれの種について特有である。
【００７０】
さらなる実施形態において、ファージリザーバにおける懸濁液は、検出される異なる細菌種にそれぞれ特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの2つ以上の種を含み、ここで、それらの種の標識群は、互いに別個であるか、又は部分的に重複しており、その結果、標識は、試験バクテリオファージのそれぞれの種に特有である。
【００７１】
懸濁液中のバクテリオファージの濃度、懸濁液の体積及び懸濁液の他の明細は、本発明方法について記載された一般情報に対応する。
【００７２】
同様に、標識された試験バクテリオファージ及びそれらの標識化に関しての本方法の一般情報は、本発明の反応容器に必要な変更を加えて適用される。
【００７３】
好ましくは、ファージリザーバ内の懸濁液は、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、且つ試験バクテリオファージとは別個である標識を有する標識された参照バクテリオファージをさらに含む。この実施形態の有益な効果は、本発明の方法について詳細に記載される。
【００７４】
本発明による反応容器の一実施形態において、ファージリザーバは、懸濁液がフィルタと直接接触しいないように圧縮性メンブレンによって密封される。試料の添加の際の圧縮性メンブレンにおける押圧によってのみ、検出される少なくとも1種の細菌種の存在について試験され、得られた反応混合物は、フィルタ上に流れる。
【００７５】
本発明の反応容器の1つの区画は、収集リザーバであり、これは、懸濁液への試料の添加及びその後の濾過後の反応混合物の濾液を収集することが意図される。
【００７６】
さらに、反応容器は、その同定のための手段を含む。
【００７７】
これは、好ましくはRFIDチップ(無線自動識別)又はバーコードである。さらに好ましくは、RFIDチップ(無線自動識別)又はバーコードは、好ましくはシリアル番号、製造日、有効期限、懸濁液のファージ力価、及び/又は検出される細菌種若しくは株に関してのデータを含む。識別のための手段は、反応容器の簡単で、曖昧でない識別を可能にし、これは、反応容器の混同のリスクを最小限にし、したがって、前記反応器で行われる検出方法の信頼性を増加させる。
【００７８】
さらに、本発明の反応溶液は、少なくとも2つの測定窓を備え、ここで、1つの測定窓は、ファージリザーバに面するフィルタ表面の領域に配置されており、1つの測定窓は、収集リザーバの領域に配置されている。これは、本発明の容器を使用して本発明による検出方法を行う場合の、保持液中のフィルタ表面上での細菌-バクテリオファージ複合体の検出及び濾液中の非結合バクテリオファージの検出を可能にする。本発明の反応容器は、測定窓の領域に励起窓を追加的に備えてもよく、これは、蛍光特性を有するレポーター分子の励起を可能にする。あるいは、励起は、測定窓と通して行われてもよい。
【００７９】
好ましい実施形態において、反応容器は、ファージリザーバと、少なくとも1つのプレフィルタを含むフィルタとの間にさらなる区画を備える。少なくとも1つのプレフィルタは、濾過前の反応混合物中での細菌-バクテリオファージ複合体の非結合バクテリオファージからの予備分離を可能にする。
【００８０】
プレフィルタは、さらに好ましくはゲルマトリックスであり、これは、ゲル濾過の原理に従って反応混合物を予備分離させる。ゲルマトリックスは、好ましくは合成又は天然ポリマー、例えば、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリプロピレン(PP)、ポリエーテルスルホン(PES)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアクリルアミド(PAA)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ナイロン、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、デンプン、炭水化物化合物、ラテックス若しくはシリコーン;金属若しくは金属合金(これらは、磁性、常磁性、超常磁性又は非磁性であり得る);ガラス、例えば、ホウケイ酸ガラス;セルロール、例えば、メチルセルロース若しくは再生セルロース、又は他の炭素化合物から構成される。さらに、ゲルマトリックスは、0.01〜5μmの孔サイズを有する。ゲルマトリックスの材料及び孔サイズの選択は、検出される少なくとも1種の細菌種のサイズ及び形態に依存し、その結果、非結合バクテリオファージからの細菌-バクテリオファージ複合体の最適予備分離が達成される。
【００８１】
この実施形態において、反応溶液は、少なくとも1つの前記プレフィルタを含む区画の直下に配置されている1つ以上の測定窓をさらに備える。
【００８２】
好ましくは、反応容器は、濾過前の細菌-バクテリオファージ複合体及び非結合バクテリオファージの濃縮が可能になるように、ファージリザーバからフィルタへの方向に狭くなる。
【００８３】
加えて、反応容器は、好ましくはファージリザーバの領域内の隔壁によって密封される。
【００８４】
反応容器は、好ましくはファージリザーバの領域に配置されているさらなる測定窓を備える。これは、初期参照としての非結合バクテリオファージの標識に由来するシグナルの全体の検出を可能にする。標識が、例えば、蛍光特性を有するレポーター分子である場合、非結合バクテリオファージの全蛍光は、適切な励起後、且つ試料が添加されるか、又はその蛍光スペクトルが分光光度計を使用して記録される前に、初期参照として検出される。
【００８５】
さらに、反応容器は、好ましくは収集リザーバに接続され、その後の濃縮リザーバ(複数可)と称される1つ以上の区画を備える。これらの区画の最後は、廃棄物リザーバと呼ばれる。さらに好ましくは、1つ以上のその後の濃縮リザーバは、0.1μm〜0.5μm、好ましくは0.2〜0.5μm、さらに好ましくは0.3〜0.5μm、最も好ましくは0.2〜0.4μの孔サイズを有するその後のフィルタによって、収集リザーバから又は互いに分離されている。その後の濃縮リザーバは、それら自体の測定窓及び励起窓を備えていることもできる。さらに、その後のフィルタの孔サイズは、収集リザーバから廃棄物リザーバへの方向に減少し得、これは、検出されるそれぞれの細菌種のサイズ及び形態に応じて異なる細菌及び細菌-バクテリオファージ複合体の連続的分離を可能にする。廃棄物リザーバは、収集リザーバから、又は存在する場合1つ以上のその後の濃縮リザーバから、≦0.05μmの孔サイズを有する最終フィルタによって分離されている。すべてのバクテリオファージは最終フィルタによって除去され、その結果、残存する濾液は、安全に且つ低コストで廃棄され得る。あるいは、廃棄物リザーバは、収集リザーバから、又は存在する場合、1つ以上のその後の濃縮リザーバから、濾液を吸収する吸収剤を収容する。
【００８６】
さらなる実施形態において、反応容器は、フィルタとファージリザーバとの間に別の区画を備え、これは、好ましくは隔壁によって他の区画から分離されている。さらに好ましくは、この区画は、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、それらの小サイズのためにフィルタを通過し得る、標識されたマイクロ又はナノ粒子を含有する、指示薬溶液を収容する。したがって、標識されたマイクロ又はナノ粒子を含む指示薬溶液は、参照バクテリオファージの代替として使用でき、メンブレンに穿刺することによって添加される。
【００８７】
本発明の反応容器の異なる実施形態は、相互に排他的でなく、したがって、個別に又は組み合わせて実行され得る。
【００８８】
さらなる態様において、本発明は、互いに並列及び/又は直列に配置された2つ以上の本発明の反応容器を備えるカートリッジであって、それぞれの並列な反応容器は、ファージリザーバの懸濁液中に標識された試験バクテリオファージの異なる種を収容し、これらのそれぞれは、検出される異なる細菌種に特異的に結合する、カートリッジに言及する。これは、1つの試料内の2つ以上の細菌種の存在の検出を同時に可能にする。標識された試験バクテリオファージの異なる種の標識は、好ましくは互いに別個であるか、又は部分的に重複している。反応容器の連続的配置は、検出されるそれぞれの細菌種のサイズ及び形態に応じて異なる細菌及び細菌-バクテリオファージ複合体の分離を可能にする。この場合、下流の反応容器(単数)又は反応容器(複数)のフィルタの孔サイズは、先行する反応容器のフィルタの孔サイズよりも小さい。
【００８９】
カートリッジは、好ましくは6つまでの並列配置反応容器、さらに好ましくは5つまでの並列配置反応容器、なおさらに好ましくは4つまでの並列配置反応容器、最も好ましくは3つまでの並列配置反応容器を備える。
【００９０】
さらに、カートリッジは、好ましくは検出される試料がその中に注入され、試料を並列配置反応容器のファージリザーバにマイクロ流体チャネルを介して案内するマイクロ流体システムを備え、その結果、試料を懸濁液に個別に添加する必要がない。
【００９１】
本発明はまた、細菌を検出する本発明の方法を行うための測定デバイスに関する。
【００９２】
測定デバイスは、本発明の反応容器又は本発明のカートリッジがその中に挿入されているスロットを備える。
【００９３】
さらに、測定デバイスは、挿入された反応容器又はカートリッジの測定窓の領域にそれぞれが配置されている少なくとも2つの検出光学素子、及びプロセッサを備える。
【００９４】
測定デバイスが、反応容器のためのスロットを備える場合、それは、反応容器の実施形態に依存して、すなわち、測定窓の数に応じて、3つ、4つ又はそれを超える検出光学素子を含んでもよい。
【００９５】
他方で、測定デバイスがカートリッジのためのスロットを備える場合、検出光学素子の数は、カートリッジ内に並列及び/又は直列に配置された反応容器の数に依存し、それにより、測定デバイスは、並列に配置された反応容器当たり2〜4つ又はそれを超える検出光学素子を含んでもよい。
【００９６】
検出素子はそれぞれ、バクテリオファージの標識によって放射された光を少なくとも1つのセンサ上に収束させるためのレンズ系を備え、その少なくとも1つのセンサは、放射された光を検出する。検出光学素子のその少なくとも1つのセンサは、好ましくは1つ以上の光学センサ及び/又は1つ以上の分光光度計を備え、これらは、放射フィルタの有無にかかわらず備えられており、それにより、蛍光シグナルのスペクトルの分解を可能にする。光学センサと1つ以上の分光光度計との組合せの場合、検出光学素子は、それが、高いシグナル対ノイズ比を有する速い検出(光学センサにおける全蛍光強度のレンズ焦点化検出)又はスペクトルの仕分けによる遅い検出(分光光度計)との間でスイッチングされ得るように、連続的に制御され得る。本明細書で、分光光度計は、厳格な意味での光学センサとして解釈されない。
【００９７】
好ましくは、光学センサは、光電子増倍管(PMT)、CCDセンサ(電荷結合素子)、及びCMOSセンサ(相補型金属酸化物半導体)からなる群から選択される。
【００９８】
さらに、検出光学素子は、好ましくはそれぞれ、200〜1000nmの波長範囲で光を放射する照明ユニット及び照明ユニットにより放射された光を測定領域上に収束させるためのさらなるレンズ系を備える。それにより、照明ユニットはまた、プロセッサに接続され、及びそれにより制御される。
【００９９】
照明ユニットは、好ましくは350〜700nmの波長範囲で光を放射する。さらに好ましくは、照明ユニットは、レーザ又は1つ以上の発光ダイオード(LED)を備える。
【０１００】
プロセッサは、検出光学素子の少なくとも1つのセンサに接続され、受信した検出シグナルを処理する。
【０１０１】
さらに、測定デバイスは、検出結果をユーザに出力する、プロセッサに接続された出力ユニットを備える。
【０１０２】
出力ユニットは、好ましくは光学ディスプレイを備える。
【０１０３】
さらに好ましくは、出力ユニットは、ラジオインターフェースを含み、それによって、検出結果は、プロセッサからタブレットコンピュータ又は遠隔コンピュータ端末にラジオにより無線で送信することができる。
【０１０４】
好ましくは、測定デバイスは、反応容器を同定するための手段を検出し、検出されたデータをプロセッサに転送する統合リーダをさらに備え、ここで、プロセッサは検出データを処理し、同定の結果は出力ユニットを介してユーザに出力される。
【０１０５】
好ましい実施形態において、測定デバイスは、選択的にスイッチオン及びオフされてもよい電磁石、例えば、リングコイルをさらに備える。電磁石は、さらに好ましくはファージリザーバに面するスロットに挿入された反応容器のフィルタ表面の領域に配置されている。
【０１０６】
以下において、本発明は、図を参照して詳細に記載され、及び様々な実施形態がさらに説明される。
【０１０７】
図1は、本発明の方法の実施形態を示す。検出される細菌種の存在について試験されることになる試料(3)は、パージ可能なファージリザーバ(8)に提供される懸濁液(1)に注入される。試料(3)は、他の検出不能な細菌種を含有してもよい。この実施形態において、懸濁液(1)は、検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージ(2)の1つの種を含有する。標識化は、蛍光特性を有するレポーター分子である。試料(3)を懸濁液(1)と混合し、反応混合物をインキュベートした後、混合物は、0.1μm〜0.5μmの好ましい孔サイズを有するフィルタ(4)上に流れ、重力測定法で、及び/又は外部パンチ圧若しくは真空の作用下で濾過される(「デッドエンド濾過」)。それにより、得られた細菌-バクテリオファージ複合体(5)及び他の検出不能な細菌種は、保持液中でフィルタ表面上に固定化されるが、残存する非結合試験バクテリオファージ(2)は、フィルタ(4)の細孔を通過し、収集リザーバ(9)で濾液として収集される。フィルタ表面上の細菌-バクテリオファージ複合体(5)及び濾液中の非結合試験バクテリオファージ(2)の検出が、使用される蛍光レポーター分子の特異的励起によって、得られた蛍光を測定することによって行われる。通常、励起は、それぞれの蛍光レポーター分子の吸収最大値が見られる波長範囲で行われる。この実施形態において、懸濁液(1)は、標識された参照バクテリオファージ(6)をさらに含有し、これは、検出される細菌種に結合せず、したがってフィルタ(4)の細孔を通過し、これも収集リザーバ(9)で濾液として収集される。参照バクテリオファージ(6)の標識化も、蛍光特性を有するレポーター分子から構成され、ここで、試験バクテリオファージ(2)及び参照バクテリオファージ(6)のレポーター分子は、好ましくは別個である。これは、それぞれの蛍光レポーター分子が、それらが同じ又は異なる励起波長で光を吸収するが、異なる波長で光を放射してもよいように選択されることを意味する。このために、それぞれのレポーター分子、したがって、それぞれのバクテリオファージの放射蛍光シグナルは明瞭に区別することができる。したがって、参照バクテリオファージ(6)も、その蛍光レポーター分子の特異的励起によって、及び得られた蛍光を測定することによって検出される。次いで、保持液及び濾液からの得られた蛍光シグナルは、プロセッサにより処理され、検出の結果は、ユーザに出力される。
【０１０８】
蛍光の分光光度検出では、すなわち、分光光度計がセンサとして使用される場合、調製可能なスペクトル帯域波長範囲にわたるさらなる検出が、放射スペクトルを集めるために行われてもよい。この場合、重複する蛍光のレポーター分子が、これらは多重化法で検出されてもよく、その後にプロセッサによりスペクトル的に分離されてもよいので、別個の蛍光のレポーター分子の代わりに使用されてもよい。
【０１０９】
出力は、プロセッサに、又はタブレットコンピュータ若しくは遠隔コンピュータ端末に無線で接続された光学ディスプレイを介して、行われてもよい。試験バクテリオファージ(2)及び参照バクテリオファージ(6)について、それぞれ計算された、保持液中の測定蛍光の全強度と濾液中の測定蛍光の全強度との商に基づいて、並びにこれらの比較によって、検出方法の信頼できる結果を達成することができる。試験バクテリオファージ(2)について決定された商が、参照バクテリオーファージ(6)について決定された商よりも有意に高い場合、これは、試料中で検出される細菌種の存在の明らかな証拠を与える。しかしながら、試験バクテリオファージ(2)の蛍光シグナルが保持液及び濾液中の両方で、しかし、参照バクテリオファージ(6)のものに匹敵する比で見られる場合、フィルタ(4)が、非特異的に、例えば、検出されることになっていない細菌によって、手順中に閉塞してしまったと仮定することができる。
【０１１０】
本発明の方法の別の実施形態が、図2に示される。ここで、本方法の個別のステップは、3つの異なる懸濁液(1)が並行して使用されるという違いはあるが、図1の上記実施形態と同様に行われる。前記懸濁液(1)はそれぞれ、検出される異なる細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージ(2)の異なる種、及び参照バクテリオファージ(6)を含有する。その後の分離による分光光度検出が可能になる場合、標識は、それぞれ、蛍光レポーター分子であり、これらは、好ましくは互いに別個であるか、又は部分的に重複していてもよい。この好ましい実施形態において、試験される試料(3)は、マイクロ流体システム(24)のマイクロ流体チャネル(25)によって3つの懸濁液(1)に分配され、その添加は同時に行われる。好ましくは別個の、又は部分的に重複している標識群により、1つの試料(3)内で検出される3種の細菌種の特異的検出が、したがって、同時に可能になる。
【０１１１】
図3Aは、本発明による反応容器(7)の好ましい実施形態を示す。それは、4つの区画(a)〜(d)を含む。区画(a)は、検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの少なくとも1つの種を含み、標識は好ましくは試験バクテリオファージのそれぞれの種に特有である懸濁液(1)、を収容するファージリザーバ(8)である。さらに、ファージリザーバ(8)中の懸濁液(1)は、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、且つ試験バクテリオファージとは別個の標識を有する標識された参照バクテリオファージを含有してもよい。ファージリザーバ(8)は、隔壁(23)によって密封される。区画(b)は、プレフィルタとして0.01〜5μmの孔サイズを有するゲルマトリックス(24)を含み、これは、ゲル濾過の原理に従って反応混合物の予備分離を可能にする。したがって、細菌-バクテリオファージ複合体及び検出不能な細菌は、それらのサイズの差によって非結合バクテリオファージから分離され、それによって、より大きな複合体は、より小さい非結合バクテリオファージの前にゲルマトリックス(24)を離れる。区画(c)は、懸濁液(1)への試料の添加及びその後の濾過後に、反応混合物の濾液を収集するように設計される収集リザーバ(9)である。区画(d)は、収集リザーバ(9)から濾液を吸収する吸収剤(26)を収容する廃棄物リザーバ(25)である。区画(a)及び(b)は、0.1μm〜0.5μmの孔サイズを有するフィルタ(4)によって区画(c)及び(d)から分離されている。示される実施形態において、さらに、反応容器は、同定のためのRFIDチップ(10)、及び標識されたマイクロ又はナノ粒子を有する指示薬溶液(28)を収容する、隔壁(27)により他の区画から分離された追加的区画を示す。これらは、検出されるいずれの検出可能細菌種にも結合せず、それらの小サイズのためにフィルタ(4)を通過する。したがって、標識されたマイクロ又はナノ粒子を含有する指示薬溶液(28)は、参照バクテリオファージの代替として使用されてもよく、それは、膜(27)を穿刺することによって反応溶液に添加されてもよい。この実施形態において、反応容器は、フィルタ(4)に向かって狭まり、その結果、細菌-バクテリオファージ複合体及び非結合バクテリオファージの濃縮は、濾過前に可能になる。さらに、示される反応容器(7)は、全部で4つの測定窓(11〜14)を備える。1つの測定窓(11)は、ファージリザーバに面するフィルタ表面の領域に配置されている。別の測定窓(12)は、収集リザーバの領域にある。これは、保持液中でフィルタ表面上に固定化された細菌-バクテリオファージ複合体及び濾液中の非結合バクテリオファージの検出を可能にする。別の測定窓(13)は、ファージリザーバの領域に配置され、バクテリオファージの標識に由来するシグナルの全体が、試験される試料を添加する前の初期参照として検出される。さらに、4番目の測定窓(14)は、反応混合物中の細菌-バクテリオファージ複合体及び非結合バクテリオファージが、濾過前にゲルマトリックス(24)から溶離する場合、それらの検出のためにゲルマトリックスの下にある。示される実施形態において、反応容器(7)は、曝気ニードル(30)及び隔壁(31)から構成される廃棄物リザーバ(25)の領域に統合曝気機構(29)をさらに有する。隔壁(31)が穿刺されると、反応容器は曝気され、重力式濾過が開始される。
【０１１２】
図3Bは、図3Aの本発明の反応容器(7)を使用しての本発明の方法の好ましい実施形態での蛍光の時間分解測定の理論的過程を示す。ここで、検出される細菌種の存在について試験される試料は、隔壁(23)を通ってファージリザーバ(8)内の懸濁液(1)に注入され、多重(3〜5×)旋回によって懸濁液(1)と混合され、室温(RT)で5〜10分間インキュベートされる。懸濁液(1)中の試験バクテリオファージの少なくとも1つの種は、標識として蛍光レポーター分子を示す。統合曝気機構(29)内の隔壁(31)を穿刺することによって、反応容器(7)の4つの測定窓(11〜14)での蛍光強度の時間分解測定が同時に開始される。曝気の結果として、反応混合物は、順次に区画(b)及び(c)を通って流れ、その結果、区画(a)の測定窓13での蛍光は、それがもはや検出できなくなるまで経時的に連続的に低下する。区画(b)のゲルマトリックス(24)では、非結合ファージが、それらのサイズの差のために比較的大きな細菌-バクテリオファージ複合体から分離される。より大きい細菌-バクテリオファージ複合体は、より小さい非結合バクテリオファージの前にゲルマトリックス(24)から溶出する。それにより、測定窓(14)での蛍光は、すべての細菌-バクテリオファージ複合体がこの測定領域を通ってしまうまで初期に増加する。次いで、蛍光は、非結合バクテリオファージがゲルマトリックスを最終的に離れるまで、わずかに低下し、これは、測定窓(14)での蛍光の新たな増加を特徴とする。細菌-バクテリオファージ複合体は、フィルタ(4)上に固定化され、その結果、それらの蛍光シグナルは、検出されない細菌-バクテリオファージ複合体及び細菌種がすべて、それぞれ、フィルタ(4)上に固定化されるまで、測定窓(11)で増加する。非結合バクテリオファージは、フィルタ(4)を通過し、収集リザーバ(9)内の測定窓(12)で増加する蛍光シグナルとして現れる。反応容器を完全に通過してしまった過剰の反応混合物は、区画(d)で収集され、吸収剤(26)によって結合される。
【０１１３】
さらに、図4Aは、a)正面図、b)上面図及びc)側面図での細菌の検出のための本発明のカートリッジ(36)の好ましい実施形態の概略図を示す。本発明によるカートリッジ(36)は、並列に配置された2つの反応容器(I及びII)を備え、それらのぞれぞれは、図3Aに示されるとおりの本発明の反応容器(7)の実施形態に本質的に対応する。並列反応容器(I及びII)はそれぞれ、4つの測定窓(11〜14)を含む。1つの測定窓(11)は、ファージリザーバに面するフィルタ表面の領域に配置されている。別の測定窓(12)は、収集リザーバの領域にある。これは、保持液中でフィルタ表面上に固定化された細菌-バクテリオファージ複合体及び濾液中の非結合バクテリファージの検出を可能にする。別の測定窓(13)は、ファージリザーバの領域にあり、その結果、バクテリオファージの標識に由来するシグナルの全体が、試験される試料の添加前の初期参照として検出されてもよい。加えて、4番目の測定窓(14)は、ゲルマトリックス(24)から溶離の際、及び濾過前の反応混合物中の細菌-バクテリオファージ複合体及び非結合バクテリオファージの検出のためにゲルマトリックスの下にある。示される実施形態において、さらに、並列反応容器(I、II)はそれぞれ、測定窓(11〜14)の領域に4つの励起窓(11a〜14a)を示し、これらは、蛍光特性を有するレポーター分子を励起するのに役立つ。
【０１１４】
図4Bは、図4Aの本発明のカートリッジ(7)を使用しての本発明の方法の好ましい実施形態での蛍光の時間分解測定の理論的過程を示す。これは、検出される細菌種の存在について試験される試料を、反応容器(I)に注入することを伴う。検出される細菌なしの中性溶液が反応容器(II)に注入され、その結果、細菌-バクテリオファージ複合体は形成することができない。両反応容器(I、II)は、中性溶液ですすぎ洗いされる。図3Bの過程について既に詳細に記載されたとおりに、測定窓(13)での蛍光は、それがもはや検出できなくなるまで、両反応容器(I、II)中で経時的に濾過の際に連続的に低下する。反応容器(I)の場合、ゲル濾過による予備分離のために、より大きな細菌-バクテリオファージ複合体は、より小さな非結合バクテリファージの前にゲルマトリックスから溶離する。それにより、測定窓(14)での蛍光は、細菌-バクテリオファージ複合体がすべて、この測定領域を通ってしまうまで初期に増加する。次いで、蛍光は、非結合バクテリオファージがゲルマトリックスを最終的に離れるまでわずかに低下し、それは測定窓(14)での蛍光の新たな増加を特徴とする。試料の添加の欠如のために細菌-バクテリオファージ複合体は反応容器(II)で形成することができないので、測定窓(14)での蛍光の増加は、単に非結合試験バクテリオファージに起因しており;したがって、測定窓(14)での蛍光の強度における「肩」は観察されない。中性溶液ですすぎ洗いする過程で、非結合バクテリオファージ(反応容器(I)の場合、やはりある程度残存する細菌-バクテリオファージ複合体)は、この測定領域から徐々に除去され、測定窓(14)でのゼロに向かっての蛍光の低下をもたらす。反応容器(I)で形成される細菌-バクテリオファージ複合体はフィルタ上に固定化され、測定窓(11)での蛍光シグナルは、細菌-バクテリオファージ複合体がすべてフィルタ上に固定化されるまで増加する。その後、反応容器の測定窓(11)での蛍光のさらなる増加は、観察することができない。むしろ、この測定領域での蛍光は、中性溶液ですすぎ洗いする際でさえも一定のままである。対照的に、反応容器(II)の測定窓(11)での蛍光シグナルも、初期に増加し、しかしながら、これは、フィルタの領域での試験バクテリオファージの一時的蓄積のためである。しかしながら、中性溶液ですすぎ洗いすることによって、すべての試験バクテリオファージはフィルタを通過し、その結果、この測定領域での蛍光は低下するが、一方で反応容器(II)のその後の収集リザーバの領域での測定窓(12)での蛍光強度は増加する。中性溶液でのすすぎ洗いによって、試験バクテリオファージは、廃棄物リザーバに最終的に移される。それにより、反応容器(II)の測定窓(12)での蛍光シグナルは、再び低下する。測定窓(12)での蛍光シグナルの同様の過程は、反応容器(I)についても観察することができる。しかしながら、この蛍光は、残存する、非結合バクテリオファージのみに由来する。
【０１１５】
別の好ましい実施形態における本発明の反応容器(7)及び測定デバイス(15)の組み立て概略図が、図5に示される。示した反応容器(7)は、押しつぶせるメンブレンを有するファージリザーバ(8)を含み、次に、これは、検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージ(2)の少なくとも1つの種を含む懸濁液(1)を収容し、標識は、好ましくは試験バクテリオファージ(2)のそれぞれの種について特有である。さらに、懸濁液(1)は、バージ可能なファージリザーバ(8)内で標識された参照バクテリオファージ(6)を含有してもよく、これは、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、且つ試験バクテリオファージ(2)とは別個である標識を有する。反応容器(7)は、隔壁(23)によって上部で密封され、より大きな懸濁粒子及び任意の不純物を除去するための0.5〜10.0μmの孔サイズを有する粗フィルタ(32)が続く。0.5〜10μmの減少する孔サイズを有する多段階粗フィルタ(32)も使用することができる。試験される試料(3)をファージリザーバ(8)内の懸濁液(1)に注入することによって、ファージリザーバ(8)のメンブレンは押しつぶされる。重力のために、得られた反応混合物は、0.2μmの孔サイズを有するフィルタ(4)の方向に流れ始める。示した実施形態において、反応容器(7)は、下方向に狭まり、その結果、濾過前の細菌-バクアリオファージ複合体(5)及び非結合バクテリオファージ(2、6)の濃縮が可能になる。さらに、濃縮は、均一磁場を選択的にスイッチオン及びオフすることによって電磁的に達成される。この目的のために、測定デバイス(15)は、電磁石としてリングコイル(33)を備え、これは、フィルタ(4)のフィルタ表面の領域に配置されている。さらに、少なくとも1つの種の試験バクテリオファージ(2)のみならず、任意選択の参照バクテリオファージ(6)は、磁気ビーズで被覆される。収集リザーバ(9)が、濾過後の濾液を収集するためにフィルタ(4)に続く。収集リザーバ(9)に別の区画が続き、これは、廃棄物リザーバ(25)と呼ばれ、≦0.05μmの孔サイズを有する最終フィルタ(34)によって収集リザーバ(9)から分離されている。すべてのバクテリオファージは、最終フィルタ(34)によって除去され、その結果、残存する濾液は、安全に且つ低コストで廃棄することができる。この実施形態において、バクテリオファージ(2、6)の標識化も、蛍光特性を有する少なくとも1種のレポーター分子から構成される。したがって、測定デバイス(15)は、反応容器(7)がその中に挿入されているシャフトの脇に、2つの検出光学素子(16)を備え、これらのそれぞれは、挿入反応容器(7)の測定窓(11、12)の領域に配置されている。本実施形態において、これは、1つの検出光学素子(16)が、細菌-バクテリオファージ複合体(5)を検出するためにフィルタ(4)のフィルタ表面での測定領域に配置され、一方で第2の検出光学素子(16)は、非結合バクテリオファージ(2、6)を検出するために最終フィルタ(34)のフィルタ表面での測定領域に配置されていることを意味する。検出光学素子(16)はそれぞれ、照明ユニットとしてLED(19)を含む、これは、使用される蛍光レポーター分子の吸収特性に依存して、200〜1000nm、好ましくは350〜700nmの波長範囲で光を放射する。可能であれば、最大吸収が、等しく強い蛍光シグナルを発生させるために達成されるものとする。さらに、検出光学素子(16)はそれぞれ���LEDによって放射される光を上に記載される測定領域上に収束させるためのレンズ系(20)を、蛍光レポーター分子によって放射される光を少なくとも1つのセンサ(18)、例えば、光学センサとして光電子増倍管、CCDセンサ又はCMOSセンサ上に収束させるためのさらなるレンズ系(17)とともに含む。あるいは又は追加的に、分光光度計(18)が、放射スペクトルを記録するためのセンサとして適用されてもよい。ここで、分光光度計は、厳格な意味で光学センサとして解釈されない。2つの検出光学素子(16)のセンサ(18)はそれぞれ、入射光を検出し、受け取った検出シグナルを、それらセンサに接続されているプロセッサに転送する。プロセッサは、受け取った検出シグナルを最終的に処理し、検出結果をプロセッサに接続されたディスプレイに転送し、これは、それらをユーザ(示さず)に光学的に出力する。さらに、一方又は両方の検出光学素子(16)は、いくつかのカラーチャネルのスペクトル分離のためのビームスプリッタ(35)を含んでもよい。
【０１１６】
図6では、RDIDチップが、本発明による反応容器を同定するための手段についての実施形態として示される。RFIDチップは、シリアル番号、製造日、有効期限、懸濁液中のファージ力価、及び/又は検出される細菌種若しくは株に関するデータを含む。RFIDチップは、反応容器の簡単で曖昧でない同定を可能にし、これは、反応容器の混同のリスクを最小限にし、したがって、このような反応容器で行われる検出手順の信頼性を増加させる。
【実施例】
【０１１７】
実験部分
1.バクテリオファージの単離
バクテリオファージはそれら自体の代謝を有しないので、それらは、適当な宿主細菌で培養し、増殖させることができるだけである。宿主細菌は、それらが最適に増殖し得る培養培地を必要とする。細菌の増殖が良いほど、バクテリオファージの収量はより多くなる。第1のステップにおいて、粉末状培養培地を水に溶解させ、オートクレーブで滅菌する。次いで、滅菌培養培地をオートクレーブから発酵槽中に直接ポンピングし、宿主細菌の増殖のための最適温度(例えば、30℃)に予熱する。培養培地が操作温度に達すると直ぐに、宿主細菌を細菌予備培養液から発酵槽に添加する。これらの細菌は、今や分裂し始めている。短い適応期間後、宿主細菌は、指数関数的に、すなわち、その細菌型に特異的な最高可能増殖速度で、増殖する。
【０１１８】
細菌細胞の増殖は、光度計で600nmの波長での光学密度(OD600)を測定することによってモニターする。予備実験で最適化されている細胞密度、例えば、培養培地1ミリリットル当たり5×108個細菌に到達した時に、バクテリオファージをバクテリオファージ予備培養液から発酵槽に添加する。予備培養液中のバクテリオファージの濃度は、生物活性検出法(例えば、Mnartha R. J. Clokie、Andrew M. Kropinski(編)、Bacteriophages: Methods and Protocols、Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions、vol.501、C 2009 Hnmana Press、a part of Springer Science+Business Media参照)である、古典的滴定法を使用して前もって決定する。その濃度は、理想的には発酵槽中のあらゆる細菌が、少なくとも1つのバクテリオファージによって認識され、感染されるように調整する。成功裏の感染の後、宿主細菌は、今や前のとおりの新たな細菌ではなく、新たなバクテリオファージを産生する。バクテリオファージの増殖は、約1時間かかる。この時間の間に、約100個の新たなバクテリオファージが、細菌細胞1個当たり産生される。
【０１１９】
プロセスの最後に、細菌は溶解し、培養培地中に新たなバクテリオファージを放出する。発酵槽で生成される溶液は、それが、新たなバクテリオファージのみならず、溶解細菌細胞のすべての構成要素(細胞壁の断片、脂質、リボソーム、細菌遺伝子物質など)及び培養培地の当初成分(糖、塩及びタンパク質)を含有するので、非常に粘性である。この理由のために、バクテリオファージは最初に、それらが標識化反応に利用できる前に多段濾過プロセスを使用して精製しなければならない。精製後、滅菌濾過を、例えば、保存容器(樽)中への充填と組み合わせて、Sartorius Stedim Biotech社製の0.2μm Sartobran(登録商標)フィルタカートリッジを使用して行う。
【０１２０】
この形態で、バクテリオファージは安定であり、活性の消失なしに数か月間容易に輸送及び保存することができる。
【０１２１】
2.レポーター分子によるバクテリオファージの標識化
レポーター分子とのカップリング中の副反応、及び不十分なカップリング効率を回避するために、ファージを精製し、緩衝液を調整し、その後、活性化レポーター分子で標識する。タンパク質の単離の際、多くの場合、例えば、異なる緩衝液によるいくつかのクロマトグラフィー法が連続して使用されることになる場合、緩衝液交換を行わなければならない。
【０１２２】
標識化実験に使用されるファージを精製し、必要に応じて、以下の標準法を使用して濃縮する:
・限外濾過(ここで、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は>100kDaであるべきである)
・ポリエチレングリコール/塩化ナトリウム沈殿
・サイズ排除クロマトグラフィー(ゲル濾過)
・イオン交換クロマトグラフィー
・透析
【０１２３】
ファージ溶液からの小過剰分子、例えば、塩、色素又はビオチンの分離除去を、ポリエチレングリコール及び塩化ナトリウムによる沈殿並びにその後の遠心分離によって行う(Jaye, D.L.、Edens, H.A.、Mazzucchelli, L.、Parkos, C.A.、2001年。Novel G protein-coupled responses in leukocytes elicited by a chemotactic bacteriophage displaying a cell type-selective binding peptide. J. Immunol. 166、7250)。
【０１２４】
カップリング反応のインキュベーション後、ファージコンジュゲートをポリエチレングリコール8000(PEG8000)及びNaCl溶液で少なくとも2回沈殿させる。これは、コンジュゲート溶液中の遊離レポーター分子の量を最小限にする。最後に、コンジュゲートペレットを適当な緩衝液に再懸濁させる。MWCO>25kDaを有するデキストランに基づくサイズ排除材料を有するゲル濾過カラムも、使用してもよい。イオン交換クロマトグラフィーベースの精製も、小分子からのコンジュゲートの急速分離を可能にし、ここで、最も適当な勾配及びタイプ並びにイオン交換材料の強度は、適用されるマーカー分子及び特定のファージの性質に依存する。前もってのパラメータの最適化が必要である。
【０１２５】
[実施例1]
1×1011pfuの予め精製及び濃縮したTB54バクテリオファージ(上記参照)を、0.1MのNaHCO3(pH 8.5)を加えた10mlのPBSに再懸濁した。その直後、1×1010pfu当たり100ナノモルの5(6)-カルボキシフルオレセインNHSエステルを添加した。カップリング反応は、暗所で室温にて1時間進行する。図7に概略的に示されるとおりに、5(6)-カルボキシフルオレセイン(2)のNHSエステルは、TB54ファージ(1)の表面でタンパク質の第一級アミノ基と反応し、安定なアミド結合を形成する。
【０１２６】
コンジュゲートを、上に記載されたとおりの沈殿又はクロマトグラフィー法のいずれかによって精製する。その後、コンジュゲートを、UV/可視及び蛍光分光法によって光物理的に特徴付けする。
【０１２７】
図8において、5(6)-カルボキシフルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージの励起スペクトル及び放射スペクトルを示す。スペクトルは、それぞれ、495nmの波長及び520〜530nmの範囲の波長で5(6)-カルボキシフルオレセインの励起最大値及び放射最大値を示す。これらの波長は、細菌-バクテリオファージ相互作用の蛍光顕微鏡による研究のために以下でも使用した。
【０１２８】
[実施例2]
0.1Mの炭酸緩衝液、pH9.0中のフルオレセイン-イソチオシアネート(FTIC)溶液を調製する。適切なアリコートを、実施例1で調製したファージ溶液に添加し、注意深く混合する。ファージ懸濁液を、暗所で室温にて1時間インキュベートする。コンジュゲートの精製及び特徴付けを、実施例1に記載されたとおりに行う。
【０１２９】
3.細菌-バクテリオファージ相互作用の特異性
試験バクテリオファージの標識された種の非常に高い宿主特異性を実証するために、株C600(PTC Phage Technology Center GmbH)、ECOR34(PTC Phage Technology Center GmbH)及びXL10-Gold(Agilent)の大腸菌細菌の一夜培養液を、準備ステップにおいて37℃で標準条件下、10mlのTSB(Tryptic Soy Broth)(Sigma-Aldrich)中で調製した。一夜培養液を翌日に希釈し(TSB中1:10)、37℃でさらに2時間インキュベートした。次いで、このように得られた細菌懸濁液を等量(1:1:1)で混合した。バクテリオファージ-宿主相互作用の蛍光顕微鏡検出のために、大腸菌細菌(C600、ECOR34、XL10-Gold)の10μlの混合細菌培養液を、PBS、pH7.4中の5(6)-カルボキシフルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージの990μlの懸濁液に添加し(細菌力価:約1×106個細胞/ml;ファージ力価:約1×108pfu/ml)、室温(RT)で5分間インキュベートした。次いで、反応混合物から、20μlを顕微鏡スライド上に移し、蛍光顕微鏡(Eclipse Ti、100×対物レンズ、Nikon)で調べた。
【０１３０】
図9Aは、5(6)-カルボキシフルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージとの大腸菌細菌株C600、ECOR34及びXL10-Goldのインキュベーション後に得られた蛍光顕微鏡画像を示す。下の左角の画像セクションは、白色フレームで規定された画像領域の拡大表示を示す。
【０１３１】
図9Bでは、5(6)-カルボキシフルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージとの大腸菌細菌株C600、ECOR34及びXL10-Goldのインキュベーション後の対応する明視野画像が示される。下の左角の画像セクションは、白色フレームで規定された画像領域の拡大表示を示す。白色矢印は、標識されたTB54ファージが感染した大腸菌C600細菌細胞と形態学的に異なる標識されていない細菌を示す。これらの標識されていない細菌は、株ECOR34又はXL10-Goldに割り当てることができる(サイズマーカー:10μm)。
【０１３２】
試験結果は、5(6)-カルボキシフルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージの非常に高い特異性を証明する。これらは、大腸菌C600細菌株にもっぱら結合するが、一方でECOR34及びXL10-Gold株は、感染されない。したがって、大腸菌C600株の細菌のみが、複合体の形成のために、反応混合物における蛍光シグナルを示す。したがって、バクテリオファージの非常に高い宿主特異性のために、本発明の方法は、細菌種の明瞭で信頼できる検出を与える。細菌種内の個別の株を検出することさえも可能である。
【０１３３】
図10Aも、この実験で得られた大腸菌C600-TB54バクテリオファージ複合体の光学断面を示す。光学断面は、0.3μmの距離で調製した(サイズマーカー2μm)。上段において、複合体は、透過光で示されるが、一方で下段は、蛍光顕微鏡像での同じ複合体を示す。
【０１３４】
点状蛍光シグナルの分布は、細菌表面での蛍光レポーター分子(5(6)-カルボキシフルオレセイン)の局在化を示す。
【０１３５】
図10Bは、異なる透視図での受け取った大腸菌C600-TB54バクテリオファージ複合体の三次元再構成を示し、これにより、蛍光レポーター分子の表面局在化が確認される。
【０１３６】
4.手順の感度
細菌の検出方法の感度を決定するために、希釈系列を、PBS、pH7.4を使用して、5(6)-カルボキシフルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージの初期懸濁液(PBS、pH7.4、ファージ力価:約1×108pfu/ml)の連続希釈によって調製した。約1×107pfu/ml、約1×106pfu/ml、約1×105pfu/ml、約1×104pfu/ml及び約1×103pfu/mlのそれぞれの希釈段階について、それぞれ1mlを測定キュベット中に移し、蛍光顕微鏡(Qwave compact USB分光計、RGB laserシステム)で調べた。参照として、標識されたTB54バクテリオファージなしの1mlのPBS緩衝液を使用した。
【０１３７】
得られた蛍光スペクトルを図11Aに示す。すべての希釈段階について、520〜530nmの波長範囲の明確な放射最大値が検出可能であり、これは、5(6)-カルボキシフルオレセインの放射最大値に対応する。したがって、図11Bは、異なるファージ力価についての520〜530nmの波長範囲の蛍光の積分値を示す。それにより、わずか約1〜103pfuのファージの量について得られた蛍光積分値が、依然として参照から明らかに区別されることができ、すなわち、わずか約1×103個バクテリオファージから出発する特異的検出が可能となる。
【０１３８】
感染細菌当たり約1×102個の結合バクテリオファージの平均量に関して、これは、本発明の方法が、わずか約10個の細菌細胞/mlの細菌濃度から出発する特異的検出をもたらすことができることを意味する。したがって、本発明の方法は、非常に特異的であるのみならず、高感度である。
【０１３９】
5.細菌種又は細菌種の株の特異的検出
以下で、異なる細菌濃度での細菌株大腸菌C600の特異的検出が、本発明の方法を使用して記載される。
【０１４０】
この目的のために、細菌株大腸菌C600(PTC Phage Technology Center GmbH)の一夜培養液を、10mlのTSB(Tryptic Soy Broth)(Sigma-Aldrich)中、37℃にて標準条件下で最初に調製した。一夜培養液を翌日に希釈し(TSB中1:10)、37℃でさらに2時間インキュベートした。次いで、希釈系列を、得られた培養液からTSBによる連続希釈によって調製した。連続希釈した細菌懸濁液中の細菌濃度を決定するために、光学密度を600nmで測定した(OD600)。図12Aは、異なる希釈段階についての細菌力価のデータを示す。
【０１４１】
試験される試料の添加前のファージ懸濁液の初期蛍光強度は、5(6)-カルボキシフルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージ及びAlexa532で標識されたTB99バクテリオファージ(10mMのMgCl2と混合したPBS中、約108pfu/ml)の900μlの懸濁液を、100μlのTSB培地と混合し、室温(RT)で5〜10分間インキュベートすることによって決定した。Alexa532で標識されたTB99バクテリオファージは、別個の標識を有する参照バクテリオファージとして役立つ。試験バクテリオファージ(5(6)-カルボキシフルオレセイン-TB54)及び参照バクテリオファージ(Alexa532-TB99)の蛍光シグナルは、プレートリーダ(Perkin Elmer)を使用してその後に測定した。得られたデータは、試験される試料の添加前のファージ懸濁液の初期強度又は100%シグナル強度として定義され、初期強度は、図12B中のグラフで点線として示す。
【０１４２】
さらに、900μlの上記懸濁液をそれぞれ、100μlのそれぞれの連続希釈された大腸菌C600細菌懸濁液(TSB中約104〜107個細胞/ml)と混合し、反応混合物を室温(RT)で5〜10分間インキュベートした。次いで、反応混合物を、それぞれ、0.4μmの孔サイズを有するフィルタ(ミクロ孔膜、ミリポア)に通して濾過した。
【０１４３】
得られた濾液中の蛍光は、それぞれ、プレートリーダ(Perkin Elmer)で測定した。図12Bは、濾液中の非結合の5(6)-カルボキシフルオレセインで標識されたTB54バクテリオファージ(正方形で示す)及びAlexa532で標識されたTB99バクテリオファージ(三角形で示す)の蛍光強度を示す。示された蛍光強度は、初期強度の決定値に対する正規化によってそれぞれ得られ、すなわち、測定蛍光強度は、それぞれ初期強度に関連付けられた。試験バクテリオファージ(正方形として示す5(6)-カルボキシフルオレセイン-TB54)の蛍光強度は、有意に低下することがわかる。これは、試験バクテリオファージが、細菌株大腸菌C600に特異的に感染し、対応する細菌-バクテリオファージ複合体を形成し、これは、濾過により除去されることを実証する。結果として、濾液中の非結合試験バクテリオファージの数は、初期ファージ懸濁液中のものより低く、これは、濾液中の蛍光強度の低下に反映される。
【０１４４】
保持液中の蛍光強度を図12Cに示す。示されたデータは、フィルタ表面を標準対物レンズ(20×、Nikon)で写真複写し、フィルタ表面当たり3枚の画像から平均画像強度を計算することによって、それぞれ蛍光顕微鏡によって決定した(平均値±標準偏差、N=3)。データは、試験バクテリオファージ(5(6)-カルボキシフルオレセイン-TB54)の蛍光強度は、添加試料中の細菌濃度の増加とともに増加するが、一方で参照バクテリオファージ(Alexa532-TB99)の蛍光強度はほとんど変化しないことを示す。したがって、試験バクテリオファージが検出される細菌と特異的に結合し、濾過により最終的にフィルタ表面上に固定化される、形成された細菌-バクテレイオファージ複合体の濃度は、細菌の濃度が増加するにつれて増加すると結論することができる。対照的に、参照バクテリオファージは、検出されるべき細菌種又は株に結合せず、その結果、細菌の濃度は、保持液中の参照バクテリオファージについて測定される蛍光強度に全く影響を与えない。
【０１４５】
実証されたとおりに、本発明の方法は、非常に特異的で且つ高感度な細菌検出を可能にする。本方法は、実施するのが容易であり、非常に信頼できる結果を与える。加えて、手順に必要とされる時間は少なく、その結果、試料の添加以後1時間未満で検出が可能になる。
本発明は以下の態様も提供する。
[1]  細菌を検出する方法であって、
A)検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの少なくとも1つの種をそれぞれが含む1つ以上の懸濁液を用意するステップと;
B)前記1つ以上の懸濁液に、検出される少なくとも1種の細菌種の存在について試験される試料を添加するステップと;
C)得られた反応混合物を濾過するステップと;
D)検出される少なくとも1種の細菌種が存在することを条件として、保持液中の細菌-バクテリオファージ複合体を検出するステップであって、前記複合体は、前記検出される少なくとも1種の細菌種の細菌、及びそれに結合した前記試験バクテリオファージの少なくとも1つの種の試験バクテリオファージからなる、ステップと;
E)濾液中の非結合試験バクテリオファージを検出するステップと;
F)ステップD)及びステップE)での検出により生成した受信シグナルをプロセッサ補助処理し、検出結果をユーザに出力するステップと
を含む方法。
[2]  前記検出される細菌種が、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、表皮ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、化膿レンサ球菌、インフルエンザ菌、パラインフルエンザ菌、肺炎桿菌、大腸菌、エスケリキア・ヘルマニイ、EHEC、エンテロバクター・クロアカ、エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェカム、緑膿菌、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、バクテロイデス・フラジリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロバクター・アエロゲネス、霊菌、B群β溶血性レンサ球菌、クラミジア・トラコマチス、オウム病クラミジア、ウレアプラズマ・ウレアリチカム、マイコプラズマ・ホミニス、肺炎マイコプラズマ、淋菌、髄膜炎菌、シトロバクター・フロインディ、モラクセラ・カタラーリス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、パスツレラ・ムルトシダ、アシネトバクター・バウマニ、プロビデンシア・レットゲリ、百日咳菌、炭疽菌、セレウス菌、ウシ流産菌、ブルセラ・メリテンシス、クロストリジウム・ブトリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、破傷風菌、ウェルシュ菌、クラミジア・トラコマチス、ジフテリア菌、野兎病菌、ガードネレラ・バギナリス、リステリア・モノサイトゲネス、モルガン菌、らい菌、結核菌、ノカルディア・アステリオデス、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・エンテリカ、シゲラ属種、コレラ菌、ボレリア・ブルグドルフェリ、ペスト菌、腸炎エルシニア、コクシエラ菌、エロモナス属種、プレジオモナス属種、キサントモナス・マルトフィリア、梅毒トレポネーマ、エイケネラ・コローデンス、スピリルム・ミヌス、発疹チフスリケッチア、ロッキー山紅斑熱リケッチア、リケッチア・コノリイ、クロノバクター属種、カンピロバクター属種、及び在郷軍人病菌を含む群から選択される、[1]に記載の細菌を検出する方法。
[3]前記1つ以上の懸濁液がそれぞれ、検出される異なる細菌種にそれぞれ特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの2つ以上の種を含み、前記種の標識群は、互いに別個であるか、又は部分的に重複しており、前記標識は、試験バクテリオファージのそれぞれの種に特有である、[1]又は[2]に記載の細菌を検出する方法。
[4]前記1つ以上の懸濁液が、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、且つ前記試験バクテリオファージとは別個である標識を有する標識された参照バクテリオファージをさらに含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の細菌を検出する方法。
[5]前記標識が、蛍光若しくは化学発光特性を有する少なくとも1種のレポーター分子、又は二次分子との相互作用によって光を放射する少なくとも1種のレポーター分子を含む、[1]〜[4]のいずれかに記載の細菌を検出する方法。
[6]前記標識が、それぞれ、少なくとも1種の蛍光レポーター分子からなり、前記検出が、前記蛍光を測定することによって行われ、少なくとも1種の蛍光レポーター分子の励起は、200〜1000nmの波長範囲で行われる、[5]に記載の細菌を検出する方法。
[7]前記少なくとも1種のレポーター分子が、前記バクテリオファージのカプシド領域のタンパク質にカップリングしている、[5]又は[6]に記載の細菌を検出する方法。
[8]前記検出が、光放射の時間分解測定によって行われる、[5]〜[7]のいずれかに記載の細菌を検出方法。
[9]ステップC)で、0.1μｍ〜0.5μmの孔サイズを有するフィルタが使用される、[1]〜[8]のいずれかに記載の細菌を検出する方法。
[10]前記試料を前記1つ以上の懸濁液と混合し、得られた反応混合物をインキュベートするステップG)をさらに含み、ステップG)は、ステップB)に続くものであり、[1]〜[9]のいずれかに記載の細菌を検出する方法。
[11]細菌-バクテリオファージ複合体と非結合バクテリオファージを予備分離するステップをさらに含み、前記予備分離は、ステップB)又はステップG)に続くものであり、[1]〜[10]のいずれかに記載の細菌を検出する方法。
[12]細菌を検出するための反応容器であって、
フィルタによって互いに分離された少なくとも2つの区画であって、
1つの区画は、検出される細菌種に特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの少なくとも1つの種を含む懸濁液を収容するファージリザーバであり、
1つの区画は、前記懸濁液への試料の添加及び前記フィルタを通しての濾過後の濾液を受けるための収集リザーバである、区画;
前記反応容器を同定するための手段;並びに
少なくとも2つの測定窓であって、
1つの測定窓は、前記ファージリザーバに面するフィルタ表面の領域に配置され、
1つの測定窓は、前記収集リザーバの領域に配置されている、測定窓
を備える、反応容器。
[13]前記懸濁液が、検出される異なる細菌種にそれぞれ特異的に結合する標識された試験バクテリオファージの2つ以上の種を含み、前記種の標識群は、互いに別個であるか、又は部分的に重複しており、前記標識は、試験バクテリオファージのそれぞれの種に特有である、[12]のいずれかに記載の反応容器。
[14]前記懸濁液が、検出されるいずれの細菌種にも結合せず、且つ前記試験バクテリオファージとは別個である標識を有する標識された参照バクテリオファージをさらに含む、[12]又は[13]に記載の反応容器。
[15]少なくとも1つのプレフィルタを収容する、前記ファージリザーバと前記フィルタとの間の区画をさらに含む、[12]〜[14]のいずれかに記載の反応容器。
[16]前記フィルタが、0.1μｍ〜0.5μmの孔サイズを有する、[12]〜[15]のいずれかに記載の反応容器。
[17]互いに並列及び/又は直列に配置されている、[12]〜[16]のいずれかに記載の2つ以上の反応容器
を備える、カートリッジであって、
それぞれの並列な反応容器は、検出される異なる細菌種にそれぞれが特異的に結合する、ファージリザーバの懸濁液中の標識された試験バクテリオファージの異なる種を収容する、カートリッジ。
[18]前記標識された試験バクテリオファージの異なる種の標識群が、互いに別個であるか、又は部分的に重複している、[17]に記載のカートリッジ。
[19]細菌を検出するための測定デバイスであって、
[12]〜[16]のいずれかに記載の反応容器又は[17]若しくは[18]に記載のカートリッジが挿入されているスロット;
前記挿入反応容器又はカートリッジの測定窓の領域にそれぞれが配置されている、少なくとも2つの検出光学素子であって、
前記検出光学素子はそれぞれ、前記バクテリオファージの標識によって放射された光を少なくとも1つのセンサ上に収束させるためのレンズ系を含み、前記少なくとも1つのセンサは、前記放射された光を検出する、検出光学素子；
前記検出光学素子の前記少なくとも1つのセンサにそれぞれ接続されており、受信検出シグナルを処理するプロセッサ;及び
前記検出結果をユーザに出力する、前記プロセッサに接続された出力ユニット
を備える、測定デバイス。
[20]前記検出光学素子がそれぞれ、200〜1000nmの波長範囲で光を放射する照明ユニット、及び前記照明ユニットにより放射された光を測定領域上に収束させるためのレンズ系をさらに含み、前記照明ユニットはまた、前記プロセッサに接続されており、前記プロセッサにより制御されている、[19]に記載の測定デバイス。
[21]前記反応容器を同定するための手段を検出し、その検出データを前記プロセッサに転送する統合リーダをさらに備え、それによって前記プロセッサが、前記検出データを処理し、前記出力ユニットを介して同定の結果をユーザに出力する、[19]又は[20]に記載の測定デバイス。
[22]前記少なくとも1つのセンサが、1つ以上の光学センサ、及び/又は放射フィルタを搭載してもよい1つ以上の分光光度計を備える、[19]〜[21]のいずれかに記載の測定デバイス。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｃ】
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