(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫適合型核移植（ＮＴ）細胞由来胚芽幹細胞の保管方法であって、
ａ）複数の寄贈者組織においてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１ハプロタイプの同型接合細胞を単離することを含む、複数の寄贈者組織からＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の同型接合いかんをスクリーニングする工程であって、前記ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１ハプロタイプの同型接合細胞はすべての前記寄贈者組織の間で０．１％以上の頻度を有する、工程と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞を製造する工程と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から胚芽幹細胞を生成する工程と、
ｄ）複数個の胚芽幹細胞を冷凍保存する工程とを含み、
前記ｂ）工程において、ＮＴ細胞の製造は、
ｂ１）卵母細胞を脱核する工程と、
ｂ２）脱核された卵母細胞に同型接合細胞の核を融合させる工程と、
ｂ３）融合された卵母細胞をポスト活性化培地で培養する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記卵母細胞の脱核は、タンパク質リン酸加水分解酵素阻害剤を含む培地でなされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記同型接合細胞の核を融合させる工程は、センダイウイルスまたはセンダイウイルス抽出物を含む培地でなされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポスト活性化培地は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポスト活性化培地は、後成学的調節因子を含んだことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記後成学的調節因子は、ヒストンアセチル基伝達酵素（ＨＡＴ）タンパク質、ヒストン脱アセチル酵素（ＨＤＡＣ）タンパク質、リジンデメチラーゼ（ＫＤＭ）ドメインタンパク質及びタンパク質メチル伝達酵素（ＰＭＴ）ドメインタンパク質を含む群のうちから選択されるいずれか１以上に関与することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｃ）工程において、胚芽幹細胞の製造は、ＮＴ細胞を活性化させた後、胚盤胞を生成する工程と、生成された胚盤胞から内細胞集団（ＩＣＭ）細胞を単離する工程と、分離された内細胞集団細胞を幹細胞に追加して培養する工程と、からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
免疫適合型核移植（ＮＴ）細胞由来胚芽幹細胞の製造方法であって、
ａ）複数の寄贈者組織においてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１ハプロタイプの同型接合細胞を単離することを含む、複数の寄贈者組織からＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の同型接合いかんをスクリーニングする工程であって、前記ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１ハプロタイプの同型接合細胞はすべての前記寄贈者組織の間で０．１％以上の頻度を有する、工程と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞を製造する工程と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から胚芽幹細胞を生成する工程と、を含み、
前記ｂ）工程において、ＮＴ細胞の製造は、
ｂ１）卵母細胞を脱核する工程と、
ｂ２）脱核された卵母細胞に同型接合細胞の核を融合させる工程と、
ｂ３）融合された卵母細胞をポスト活性化培地で培養する工程とを含む、方法。
【請求項９】
前記卵母細胞の脱核は、タンパク質リン酸加水分解酵素阻害剤を含む培地でなされることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記同型接合細胞の核の融合は、センダイウイルスまたはセンダイウイルス抽出物を含む培地でなされることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポスト活性化培地は、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）を含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポスト活性化培地は、後成学的調節因子を含んだことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記後成学的調節因子は、ヒストンアセチル基伝達酵素（ＨＡＴ）タンパク質、ヒストン脱アセチル酵素（ＨＤＡＣ）タンパク質、リジンデメチラーゼ（ＫＤＭ）ドメインタンパク質、及びタンパク質メチル伝達酵素（ＰＭＴ）ドメインタンパク質を含む群のうちから選択されるいずれか１以上に関与することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
免疫適合型核移植（ＮＴ）細胞由来胚芽幹細胞から分化した細胞の製造方法であって、
ａ）複数の寄贈者組織においてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１ハプロタイプの同型接合細胞を単離することを含む、複数の寄贈者組織からＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１の同型接合いかんをスクリーニングする工程であって、前記ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１ハプロタイプの同型接合細胞はすべての前記寄贈者組織の間で０．１％以上の頻度を有する、工程と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞を製造する工程と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から胚芽幹細胞を生成する工程と、
ｄ）前記製造された幹細胞から細胞移植のための分化した細胞を製造する工程と、を含み、
前記ｂ）工程において、ＮＴ細胞の製造は、
ｂ１）卵母細胞を脱核する工程と、
ｂ２）脱核された卵母細胞に同型接合細胞の核を融合させる工程と、
ｂ３）融合された卵母細胞をポスト活性化培地で培養する工程とを含む、方法。
【請求項１５】
前記ｃ）工程後、胚芽幹細胞は、凍結保存される工程、及び凍結保存された細胞を解凍する工程が追加されることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
ｄ）工程の分化した細胞は、造血母細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、泌尿器官細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、血管細胞、網膜細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びニューロン細胞からなる群から選択されたいずれか１以上であることを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１７】
免疫適合型核移植（ＮＴ）細胞由来胚芽幹細胞バンキングシステムであって、
複数の寄贈者組織を収集する手段と；
前記収集された組織から免疫適合型いかんをスクリーニングする手段であって、前記スクリーニングは収集された寄贈者組織においてＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１ハプロタイプの同型接合細胞を単離することを含み、前記ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１ハプロタイプの同型接合細胞はすべての前記寄贈者組織の間で０．１％以上の頻度を有する、前記手段と；
免疫適合型組織からＮＴ細胞を製造する手段であって、
卵母細胞を脱核する手段と、
脱核された卵母細胞に同型接合細胞の核を融合させる手段と、
融合された卵母細胞をポスト活性化培地で培養する手段とを含む手段と；
ＮＴ細胞から胚芽幹細胞を製造する手段と；
胚芽幹細胞を冷凍保存する手段と、を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来胚芽幹細胞バンキングシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＬＡ（human leukocyte antigen）−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲなどの遺伝子において、同型接合（homozygous）遺伝型を有した体細胞核移植（ＳＣＮＴ：somatic cell nuclear transfer）技術を利用して製造された細胞の保管方法、及びそのバンキングシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞治療剤は、疾病治療において、薬物や外科的手術などを介して、制限的に治療が可能であると考えられた部分に対して、細胞、特に、幹細胞を介して、「根本的治療」を可能にし、医薬界の新たなパラダイムとして、急に取り沙汰されている分野である。特に、再生医学（regenerative medicine）分野において、高齢化、疾病、事故などにより、損傷したり機能が低下したりする組織及び臓器を再生させたり交替させたりし、機能を回復されることにより、疾病に対抗する新たな技術分野であり、難治性疾患の治療代案として浮き彫りにされている分野である。
【０００３】
細胞治療剤がさらに幅広く利用されるためには、免疫拒否反応という難題を解決しなければならない。該免疫拒否反応を起こす原因は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ：major histocompatibility antigen complex）とも呼ばれる６種のＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＲ）細胞表面タンパク質であり、ヒトは、父系遺伝子に由来した６種、及び母系遺伝子に由来した６種、すなわち、総６組が発現している。一般体細胞は、ＭＨＣクラスＩに属するＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃの総３組のみ発現し、免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ、いずれも合わせて総６組を発現する。ＨＬＡ表面抗原の役割は、細胞内に存在するタンパク質の断片を細胞表面に展示（display）し、もし生体内で発生したか否かということを知り得ない感染や突然変異が、免疫細胞によって感知されるようにすることであり、かような理由で、抗原提供タンパク質（antigen presenting protein）ともいう。
【０００４】
一方、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）技術は、卵子の核を除去した後、体細胞の核を移植して複製する技術を意味する。体細胞を利用して、体細胞の核を分離し、分離された核を、核が除去された卵子に注入し、体細胞の遺伝的特性をそのまま維持した幹細胞株を製造するのである。この方法は、患者自身の体細胞を利用するという点において、免疫拒否反応をなくすことができるという長所があり、患者誂え型治療を可能にする。核移植（ＮＴ）の技術が発展しているが、これまでのところ、融合された卵母細胞（reconstructed oocytes）から胚盤胞（blastocyst）までの形成率は、非常に低い状態である。従って、この形成率を高めるための多様な試みがなされ、また要求されている。特に、ＮＴ胚芽の最大障害は、胚芽遺伝子の活性化（ＺＧＡ：zygotic gene activation）であり、ヒトを含んだ大型哺乳動物において、４細胞期から８細胞期に現示される。特に、供与者の多様性（variability）と関係なく、成功率を高めるために、既存に存在する後生成障害因子（epigenetic barriers）を除去することが必要である。具体的には、２細胞期、４細胞期、８細胞期から胚盤胞までの首尾よい製造のために、製造上の欠陥や、損失なしにも供与者核の後生成状態を変えることにより、胚盤胞成功率を画期的に高めることが必要である。
【０００５】
前述のところのように、再生医療及び難治性疾患の治療のための細胞治療剤として、免疫拒否反応を解消することができ、可能な限り患者誂え型細胞を提供することができる細胞の製造方法、及びそのバンキングシステムが要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、同型接合型細胞から、免疫拒否反応を起こさない細胞治療剤または移植用細胞を開発し、本発明に至った。
【０００７】
従って、本発明は、同種または異種の多様な疾患に適用が可能なＮＴ細胞由来幹細胞の保管方法を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、ＮＴ細胞由来幹細胞の製造方法、及び製造された細胞のバンキングシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ａ）複数の寄贈者（donation）組織から同型接合いかんをスクリーニングする段階と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞に製造する段階と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から幹細胞を生成する段階と、
ｄ）複数個の幹細胞を冷凍保存する段階と、を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞の保管方法を提供する。
また、本発明は、ａ）複数の寄贈者組織から同型接合いかんをスクリーニングする段階と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞に製造する段階と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から幹細胞を生成する段階と、を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞の製造方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、ａ）複数の寄贈者組織から同型接合いかんをスクリーニングする段階と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞に製造する段階と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から幹細胞を生成する段階と、
ｄ）前記製造された幹細胞から、細胞移植のための分化された細胞に製造する段階と、を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞から分化された細胞の製造方法を提供する。
また、本発明は、ａ）複数の寄贈者組織を収集する手段、ｂ）収集された組織をスクリーニングする手段、ｃ）組織から幹細胞を製造する手段、及びｄ）幹細胞を冷凍保存する手段を含む免疫適合型ＮＴ由来幹細胞のバンキングシステムを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるＮＴ細胞由来幹細胞のバンキングは、多様な疾患または障害の治療を可能にする。糖尿、骨関節炎及びパーキンソン病など多様な疾患の治療のために、移植可能な細胞及び組織材料を提供することができ、特に、細胞種類特異的欠陥を根本的に治療することができる可能性を提示する。特に、本同型接合型細胞は、免疫拒否反応及び免疫寛容の危険を低下させることができる治療的アプローチ方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】現在の臍帯血の管理及び研究に係わる法律により、細胞数７億個未満である場合、廃棄用と分類されることを示した図面であるである。
【図２】実施例１の供与細胞の染色体検査結果を示した図面である。
【図３】実施例３で製造されたＮＴ細胞の染色体検査結果を示した図面である。
【図４】実施例３で製造されたＮＴ細胞の（ａ）genomic ＤＮＡ検査結果、並びに（ｂ）mitochondrial ＤＮＡ検査結果において、供与体細胞及び供与卵母細胞と比較して示す図面である。
【図５】実施例３で製造されたＮＴ細胞の幹細胞マーカーのimmunochemistry分析結果を示す図面である。
【図６】実施例３で製造されたＮＴ細胞の幹細胞マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析結果を示す図面である。
【図７】実施例３で製造されたＮＴ細胞の三胚葉性由来細胞に分化することができる全分化能を確認するための実験結果であり、胚芽体を形成して１４日間培養した後で確認した（ａ）三胚葉性分化マーカーのimmunohistochemistry分析結果、（ｂ）マーカーのＲＴ−ＰＣＲ結果、及び（ｃ）免疫欠乏マウスに注入して形成されたテラトーマの組織分析結果を示す図面である。
【図８】（ａ）胚芽幹細胞由来ＲＰＥ細胞、及び実施例３で製造されたＮＴ由来ＲＰＥ細胞の形態、並びに（ｂ）ＲＰＥ細胞のマーカーを比較した結果として、差がないことを示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
本発明において「免疫適合抗原同型接合」とは、供与者の父系と母系とから受け継いだそれぞれのＨＬＡ（human leukocyte antigen）−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ，ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子の遺伝型が完全に同一であり、６個ではない３個のＨＬＡ遺伝型を有したことを意味する。
【００１５】
本発明において「体細胞（somatic cell）」は、性細胞、またはその前駆体を除いた体内の任意組織細胞を意味する。
【００１６】
本発明において「幹細胞」は、自家再生することができ（未分化状態を維持しながら、多数の細胞分裂周期を通過する能力を有し）、１種以上の多重分化能（１種以上の専門化された細胞に分化する性能）を示すことができる細胞を意味する。
【００１７】
本発明で使用された「長期間培養」は、２ヵ月以上または１０回継代培養以上さらに長い間調節された条件下で細胞を増殖させることを意味する。望ましくは、該長期間培養は、４ヵ月以上、６ヵ月以上または１年以上の間培養される。望ましくは、該長期間培養は、１５回以上の継代培養、１８回以上の継代培養、または２０回以上の継代培養の間継代培養される。長期間培養の持続期間は、個別細胞に主に依存し、細胞株ごとにも異なる。
本発明で使用された「成熟」は、最終的に分化された細胞種類に向けて導く調和した生花学的段階で構成された過程を意味する。
【００１８】
本発明において「分化」は、特定の形態または機能に対する細胞の適応を意味する。
【００１９】
本発明において「分化された細胞」は、本明細書に、その用語が定義されているように、その本来の形態において、多能性ではない任意の体細胞を含む。従って、用語「分化された細胞」は、また部分分化された細胞、例えば、多分化能細胞、または本明細書に記載された任意の組成物及び方法を利用して生成された安定した、非多能性、部分が再プログラミングされたり、部分が分化されたりした細胞である細胞を含む。いくつかの実施例において、分化された細胞は、安定した中間細胞、例えば、非多能性、部分再プログラミングされた細胞である細胞である。培養物中に多くの一次細胞を位置させれば、完全分化された特性を若干消失させるということに留意しなければならない。従って、かような分化されたこと、あるいは体細胞を単に培養することは、該細胞が非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞になるようにしない。分化された細胞（安定した、非多能性、部分再プログラミングされた細胞中間体を含む）の全分化能への転移は、培養物中に位置させるとき、分化された特性を部分消失させる刺激を超える再プログラミング刺激を必要とする。再プログラミングされたいくつかの実施例において、部分再プログラミングされた細胞は、また一般的に培養物中に、ただ制限された数の分裂に対する能力を有するさらに低い発生可能性を有する母細胞に比べ、成長可能性の消失なしに延長された継代培養を経る能力を有する特性を有する。いくつかの実施例において、用語「分化された細胞」は、また（例えば、未分化細胞または再プログラミングされた細胞から）より特殊化されていない細胞類型（すなわち、発生可能性上昇）の細胞（ここで、該細胞は、細胞内分化工程を経る）に由来したさらに特殊化された細胞類型（すなわち、発生可能性低下）の細胞を意味する。
【００２０】
望ましくは、本発明において、造血母細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、泌尿器官細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、血管細胞、網膜細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びニューロン細胞からなる群から選択されるものであるが、それらに制限されるものではない。
【００２１】
本発明において前記「免疫適合型細胞」は、特に以下に制限されるものではないが、ＨＬＡ−Ａ，ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲ遺伝子が同型適合類似で存在する細胞をいい、６組のうちただ３個が同一である全てのＨＬＡ遺伝型組み合わせの受恵者に移植が可能であるという利点を有する。
【００２２】
本発明において「バンク」は、幹細胞の保存場所を意味し、必要により、保存された細胞から治療、臨床または研究の目的で、個人自身や他の個人にそのまままたは分化されても使用される。
【００２３】
本発明において、「投与」は、ある適切な方法により、患者に所定物質を導入することを意味し、該物質の投与経路は、目的組織に逹することができる限り、いかなる一般的な経路を介しても投与される。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与にもなるが、それらに制限されるものではない。また、該投与は、標的細胞に移動することができる任意装置によっても遂行される。
【００２４】
本発明は、ａ）複数の寄贈者（donation）組織から同型接合（homozygous）いかんをスクリーニングする段階と、ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ（nuclear transfer）細胞に製造する段階と、ｃ）製造されたＮＴ細胞から幹細胞を生成する段階と、ｄ）複数個の幹細胞を冷凍保存する段階と、を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞の保管方法を提供する。
【００２５】
該ＮＴを介して製造された細胞は、患者の核の遺伝物質を有することができ、かような点において、個別的な患者に特異的である。従って、自家移植、すなわち、同種での免疫拒否に対して、有意的に低下した危険を有する患者への細胞移植を可能にするのである。さらに、本発明での同型接合細胞は、ＨＬＡ抗原タイプがマッチングされる細胞であり、抗ＨＬＡ抗体がない異種の人に移植が可能である。すなわち、前記ＮＴ由来幹細胞は、同型接合型タイプを有しており、免疫適合型細胞に移植が可能なのである。
【００２６】
従って、前記ａ）段階においてスクリーニングは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの遺伝子が同型接合であるということを選別するのが望ましい。ＨＬＡ遺伝型スクリーニングを介して、互いに異なる免疫適合同型接合を有した供与者１４０人を探し出せば、そこから日本全体人口の９０％以上の人に移植することができる免疫適合細胞株を前もって確保することが可能であると発表されている（A more efficient method to generate integration-free human iPS cells, Nature Methods 8, 409-412 (2011）。
【００２７】
本発明では、一次に、Cha病院寄贈臍帯血銀行のデータを基に、同型接合細胞をスクリーニングした。現在の臍帯血の管理及び研究に係わる法律によれば、細胞数７億個未満の場合、廃棄用であり、保健福祉部臍帯血委員会の承認を受け、必要時、研究に使用するようになっている（図１参照）。
【００２８】
下記表１（International Journal of Immunogenetics (2013) 40: 515-523）は、総４，１２８個の臍帯血を対象に、ＨＬＡ Ａ−Ｂ−ＤＲＢ１ haplotype頻度を調査したものである（０．１％以上だけ示す）。
【００２９】
【表１】
0006707636.tif 000002
【００３０】
従って、本研究に利用される細胞としては、研究用として適する（７億個未満の細胞数を有する）冷凍臍帯血を一次的に使用することができ、それ以外にも、疾病管理本部臓器移植管理センター（ＫＯＮＯＳ）に登録された研究用寄贈臍帯血全部を含む。それ以外にも、造血母細胞寄贈者ネットワーク及びCha病院傘下医療機関で自主的に確保した検体を使用することができる。
【００３１】
また、前記ｂ）段階においてＮＴ細胞製造方法は、卵母細胞を脱核する段階と、脱核された卵母細胞に、体細胞の核を融合させる段階と、融合された卵母細胞をポスト活性化（post activation）培地で培養する段階と、を含むことが望ましい。
【００３２】
ＮＴ由来の幹細胞製造方法は、卵母細胞の核を除去する段階、１以上の供与体細胞の１以上の核を添加することによって核移植された（ＮＴ）卵母細胞を生成する段階、活性化培地でインキュベーションによって、前記ＮＴ卵母細胞を活性化する段階、及び前記活性化されたＮＴ卵母細胞から胚盤胞を生成する段階を含んでもよい。
【００３３】
一例として、卵母細胞の核を除去する段階は、中期ＩＩ（ＭＩＩ）段階での卵子紡錘糸を除去する段階を含む。多様な具体例において、第１極体（１ＰＢＥ）は、除去される。また、他の具体例において、前記方法は、卵丘細胞を成熟完了前に剥皮する段階を含む。一具体例において、卵母細胞は、リアルタイムで１ＰＢＥに対する非ＵＶ光基盤観察に観察される。また、他の具体例において、該観察は、染色製剤またはレべリング製剤、例えば、ヘキスト染色（Hoechst staining）の不在下で行われる。一具体例において、それは、ポロスコープ（poloscope）、例えば、Research Instruments （ＣＲｉ） OosightＴＭイメージシステムの使用を含む。例えば、それは、５４５ｎｍ偏光によって収集されたＭＩＩ卵母細胞での透明帯（zona pellucid）及び紡錘糸の複合体を視覚化する段階を含む。また、他の具体例において、卵母細胞の核を除去する段階は、卵母細胞膜の孔、及び卵母細胞からの１ＰＢＥ除去を可能にする形状を有するマイクロピペット（contoured micropipette）の使用を含む。また、他の具体例において、卵母細胞の核を除去する段階は、圧電ドリル（piezoelectric drill）の使用を含む。他の具体例において、核を除去する段階は、サイトカラシンＢ、及び選択的に、タンパク質ホスファターゼ抑制剤、例えば、カフェインを含む脱核培地で遂行される。該カフェインは、タンパク質リン酸加水分解酵素阻害剤（protein phosphatase inhibitor）であり、迅速な活性化（premature activation）を抑制し、複製胚芽の成長を改善させることにより、結果として、胚盤胞の形成率を上昇させる。従って、望ましくは、前記卵母細胞の脱核は、タンパク質リン酸加水分解酵素阻害剤を含む培地でなされ、前記タンパク質リン酸加水分解酵素阻害剤は、カフェインでもある。
【００３４】
他の具体例において、１以上の供与体細胞の１以上の核を添加することによって核移植された（ＮＴ）卵母細胞を生成する段階は、供与核を移植する段階を含んでもよい。
【００３５】
供与核を移植する段階は、卵母細胞膜構造を変形させる製剤の使用を含む。一具体例において、卵母細胞膜構造を変形させる製剤の使用を介した卵母細胞の核を除去する段階は、体細胞との融合を含む。例えば、供与核を移植する段階は、注入ピペット（例えば、１２μｍ径）で、３ないし４の供与細胞を提供する段階、パラミクソウイルス、またはパラミクソウイルスタンパク質、例えば、センダイウイルス外被タンパク質を含む溶液の一定量中の供与細胞を排出する段階を含んでもよい。その後、線形に配列された供与細胞から一定距離離れ（４ないし５細胞長）、注入ピペットを使用して細胞を回収する段階、ホールディングピペットで卵母細胞をホールディングする段階、供与細胞を有する注入ピペットを卵母細胞に前進させる段階が後に続く。注入ピペットを前進させる段階は、卵黄原形質膜の非破壊を含み、かつ核供与細胞を透明帯下に位置する卵黄原形質膜と接触させるために、卵母細胞の透明帯、及び細胞膜間の空間である囲卵腔（perivitelline space）への１つの核供与細胞の挿入を含む。多様な具体例において、ピペットの回収は、卵黄膜と供与細胞との接触を妨害しない。多様な具体例において、細胞は、供与細胞挿入１，２，３，４、５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５分、またはそれ以上の分後に融合される。多様な具体例において、該細胞は、供与細胞挿入１０分後に融合される。選択的に、前記過程は、成功裏に融合されていない細胞に対して反復される。多様な具体例において、ポロスコープ、例えば、OosightＴＭイメージシステムが全過程において使用される。
【００３６】
一例として、供与核を移植する方法は、直接注入（direct injection）方法による。一具体例において、供与核を移植する段階は、電気的細胞操作、例えば、電気細胞融合（electrofusion）を含んでもよい。他の具体例において、前記方法は、体細胞核供与体、幹細胞核供与体、及び精子細胞核供与体の核を分離する段階を含んでもよい。他の具体例において、前記方法は、ＳＣＮＴのための体細胞核を分離する段階後に、ピペットまたは圧電注入（piezoelectric injection）を介して、一つまたはそれ以上の供与核を挿入する段階を含む。多様な具体例において、供与核は、細胞、例えば、皮膚線維芽細胞、白血球、毛嚢、または他の体細胞核供与体に由来する。また、他の具体例において、本発明は、精子細胞供与体からの核の分離及び製造を含む方法を開示する。異なる具体例において、核の分離は、組織生検、輸血、または組織試料を得るための他の方法、機械的分離、コラーゲナーゼ消化、洗浄、遠心分離基盤密度勾配分離及び／または標準培養培地での培養を介した組織の加工を含む。
【００３７】
望ましくは、前記体細胞の核を融合させる段階は、センダイウイルスまたはセンダイウイルス抽出物を含む培地でなされる。
【００３８】
脱核された卵母細胞に体細胞の核を融合させた後、融合された卵母細胞は、ポスト活性化培地に移されて活性化過程を経る。
【００３９】
前記ｃ）で製造されたＮＴ細胞から幹細胞を生成させる段階は、具体的には、核移植された（ＮＴ）卵母細胞を、活性化培地でインキュベーションによって、ＮＴ卵母細胞を活性化させる段階、前記活性化されたＮＴ卵母細胞から胚盤胞を生成する段階、及び前記胚盤胞から内細胞集団（ＩＣＭ）細胞を単離する段階を含み、前記ＩＣＭ細胞は、ＮＴ−ｈＰＳＣ細胞株として追加して培養することができる。
【００４０】
卵母細胞活性化（artificial oocyte activation）は、自然発生的な精子受精間に起こるカルシウム信号変化の模倣に依存する。正常な卵母細胞の発達は、卵母細胞を中期ＩＩ（ＭＩＩ）段階で遮断する（arrest）ための高レベルの中期促進因子（ＭＦＰ：metaphase promoting factor）活性による。ＭＩＩ卵母細胞の遮断は、精子進入に起因した細胞内カルシウムイオン（Ｃａ２＋）レベル変化によって妨害される。その後、サイクリンＢ（cyclin Ｂ）（ＭＰＦ調節サブユニット）の標的分解が起こり、それは、細胞周期遮断、前核形成、並びに減数分裂及び類似分裂の過程から卵母細胞を解放する。
【００４１】
卵母細胞活性化は、細胞周期遮断から、培養された卵母細胞を解放するための人為的なカルシウム変化戦略による。例示は、カルシウムイオン運搬体、脂質二重層を通過してイオンを伝達する脂溶性分子、例えば、イオノマイシン及びＡ２３８１７の添加を含む。代案的な戦略は、電気的活性、またはイオンの直接的な注入による。
【００４２】
ＮＴと係わるところのように、核移植された（すなわち、再構築された）卵母細胞の再構築後、また、カルシウム変化技法を使用した卵母細胞活性化が起こる。
【００４３】
しかし、かようなカルシウムイオン注入以外に、ＮＴ製造時、例えば、タンパク質ホスファターゼ抑制剤カフェインの羊（sheep）卵母細胞への添加は、成熟促進因子（ＭＰＦ：matruation promoting factor）、及びミトゲン活性化されたタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫｓ）の活性を増大させるということが報告され、類似の利点が猿卵母細胞で報告された一方、胚盤胞形成の頻度は上昇していない。また、カルシウムイオン運搬体、電気的活性化、または直接的な注入を介したカルシウム活性化は、自然発生的な受精であり、同一のタイミング、空間調節またはカルシウム振動を起こさない。さらなる複雑性を加えれば、カルシウムに対する影響は、また種特異的なものであると分かる点である。一部例において、６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ）のようなキナーゼ抑制剤、メタノール及びシクロヘキシイミド（ＣＨＸ）のようなタンパク質合成抑制剤へのさらなる処理の使用は、牛、マウス及び他の動物モデルで知られているように、ＭＰＦ不活性化を増大させるために使用される。ＴＳＡのようなヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、改善されたＮＴ再プログラミングと関係がある。ＴＳＡ処理は、胚盤胞の形成を促進させることができる。
【００４４】
一例において、体細胞の核融合過程及び活性化過程において、電気的刺激（electrical pulse）を加えることができる。電気的活性化は、電気的細胞融合培地での電気的パルスを含む。多様な具体例において、電気的細胞融合培地は、０．１ないし０．５Ｍマンニトール、０．０１ないし１ｍＭＭｇ ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ないし１ｍｇ／ｍｌポリビニルアルコール、１ないし１０ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、０．００５ないし０．５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む。一具体例において、該電気的細胞融合培地は、０．３Ｍマンニトール、０．１ｍＭＭｇ ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ／ｍｌポリビニルアルコール、３ｍｇ／ｍｌヒト血清アルブミン、０．０５ｍＭ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む。
【００４５】
多様な具体例において、核移植卵母細胞は、完全な活性化のために、ポスト活性化培地（post‐activation medium）で処理される。異なる具体例において、活性化された再構築された核移植された卵母細胞は、その後ポスト活性化培地でインキュベーションされる。異なる具体例において、ポスト活性化培地は、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地またはグローバルヒト胚芽培養培地である。異なる具体例において、ポスト活性化培地は、６−ＤＭＡＰ、ピューロマイシン（puromycin）、メタノール、シクロヘキシイミド（ＣＨＸ）、トリコスタチンＡ（trichostatin Ａ）（ＴＳＡ）及び／またはサイトカラシンＢ（cytochalasin Ｂ）（ＣＢ）を含む。異なる具体例において、活性化された卵母細胞は、ポスト活性化培地で、３０分未満、３０ないし４５分未満、４５ないし６０分未満、６０ないし９０分未満、９０ないし１２０分未満、１２０ないし１５０分未満、１５０ないし１８０分未満、１８０ないし２１０分未満、２１０ないし２４０分未満、２４０分未満ないし２７０分未満、３００ないし３３０分未満、３３０ないし３６０分未満、３６０ないし３９０分未満、または３９０分超過の間インキュベーションされる。特定具体例において、活性化された卵母細胞は、２４０，３００または３６０分間インキュベーションされる。多様な具体例において、活性化段階及びポスト活性化段階は、低酸素条件下で遂行される。特定具体例において、低酸素条件は、約８０ないし８５％、８５ないし９０％、９０ないし９５％、９５％またはそれ以上のＮ２、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％またはそれ以上の０２、及び約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％、またはそれ以上のＣＯ２を含む。特定具体例において、低酸素条件は、約９０％のＮ２、約５％のＯ２、及び約５％のＣＯ２を含む。多様な具体例において、ポスト活性化培地は、気体混合物、例えば、約９０％のＮ２、約５％のＯ２及び約５％のＣＯ２において、１，２，３，４，５時間、５時間またはそれ以上の時間の間、例えば、３７℃でインキュベーションされた、卵割培地で、１，２，３，４，５ｍＭ、５ｍＭまたはそれ以上のｍＭの６−ＤＭＡＰを含む。
【００４６】
ポスト活性化培地でのインキュベーション後、ポスト活性化された卵母細胞は、洗浄培地でインキュベーションされる。異なる具体例において、洗浄培地は、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地である。また、他の具体例において、培養培地は、グローバルヒト胚芽培養培地のように、連続の培地交換を要求しない。特定具体例において、洗浄培地は、ＴＳＡを含む。特定具体例において、ポスト活性化された卵母細胞は、ＴＳＡを含む洗浄培地で、２４０，３００または３６０分間インキュベーションされる。一具体例において、ポスト活性化された再構築された核移植された卵母細胞は、洗浄され、さらに培養される。一具体例において、ポスト活性化された再構築された核移植された卵母細胞は、６−ＤＭＡＰ除去培地で洗浄される。他の具体例において、多様な開示された培地、例えば、ＨＥＰＥＳ除去培地、タンパク質除去培地、Ｇ１培地またはＧ２培地、卵割培地、卵割補助培地、ＩＶＦ培地、胚盤胞形成培地またはグローバルヒト胚芽培養培地は、選択的に、成長因子、例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＧＦ１を含む。多様な具体例において、成長因子は、核移植後１，２，３，４、５，６，７日、またはその後の日に添加される。
【００４７】
他の具体例において、活性化及び／またはポスト活性化段階は、精子から分離された因子、その派生物及び抽出物を添加する段階を含む。一具体例において、ヒト精子因子は、記載された注入方法のいずれかを使用して活性化された再構築された卵子に注入される。一具体例において、ヒト精子因子は、記載された注入方法のいずれかを使用して、ポスト活性化された再構築された卵子に注入される。多様な具体例において、約１，２，３または４日後に、ポスト活性化された再構築された核移植された卵母細胞は、卵割培地に移される。特定具体例において、約１日後に、ポスト活性化された再構築された核移植された卵母細胞は、卵割培地に移される。多様な具体例において、精子因子は、例えば、精子細胞の内部または外部に存在する細胞タンパク質から分離された因子を含む。一具体例において、全体精子抽出物は、界面活性剤、及び射精された精子の機械的混合を使用して得られる。また、他の具体例において、全体細胞抽出物は、ＤＮＡａｓｅ Ｉ及びＲＮＡａｓｅで処理される。また、他の具体例において、粗抽出物（crude extract）は、バッファで洗浄されて遠心分離（２時間２０，０００ｇ）される。他の具体例において、新鮮な射精されたヒト精子は集められ、精液血漿を除去するために、１０分間９００ｇで遠心分離した後、５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含むスパームＴＡＬＰ（Sperm−ＴＡＬＰ）でペレットの再懸濁及び設定と同時に遠心分離した後、上澄み液の除去、及び核分離培地（ＮＩＭ：１２５ｍＭ ＫＣｌ、２．６ｍＭ ＮａＣｌ、７．８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、３．０ｍＭ ＥＤＴＡジナトリウム塩；ｐＨ７．４５）で、最終濃度２０×１０８sperm／ｍＬで、ペレットの再懸濁、及びスパームＴＡＬＰを除去するために遠心分離する。スパームＴＡＬＰが除去された後、１ｍＭジチオトレイトール（dithiothreitol）、１００ｍＭロイペプチン（leupeptin）、１００ｍＭアンチパイン（antipain）及び１００ｍｇ／ｍＬ大豆トリプシン阻害剤（soybean trypsin inhibitor）を含むＮＩＭで、同一の体積でペレットを再懸濁した後、２℃５０分間２０，０００Ｘで、密集した精子ペレット形成と共に、４周期の凍結（液体Ｎ２において、各周期当たり５分）、及び解凍（１５℃で、各周期当たり５分）が続く。最終的に、結果上澄み液は、注意深く除去され、アリコートされ、使用されるまで−８０℃に維持される。
【００４８】
多様な具体例において、ポスト活性化された再構築された核移植された卵母細胞は、胚盤胞にさらに培養される。一具体例において、ポスト活性化された再構築された核移植された卵母細胞は、ＳＡＧＥ卵割培地、例えば、クイン培地（Quinn’s medium)でさらに培養される。また、他の具体例において、培地、例えば、３ｉ培地（神経基底培地（neuro basal medium）５０％、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２ ５０％、Ｎ２添加物１／２００ｖ／ｖ、Ｂ２７添加物１／１００ｖ／ｖ、１００ｍＭ Ｌ−グルタミン１／１００ｖ／ｖ、０．１Ｍ β−ＭＥ１／１，０００ｖ／ｖ、ＳＵ５４０２（ＦＧＦＲ抑制剤）２μＭ、ＰＤ１８４３５２（ＥＲＫカスケード抑制剤）０．８μＭ、ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ３抑制剤）３μＭ）、または変形された３ｉ培地（ＰＤ０３２５９０１（ＭＡＰＫ抑制剤）０．４μＭ含む）は、多能性を促進する。一具体例において、さらなる培養は、１，２，３，４、５日、または５日以上の間である。一具体例において、さらなる培養は、リプログラミング因子及び／またはメチル化変形剤を有する培養培地で提供される。多様な具体例において、さらなる培養は、ＣＡＲＭ １及び／またはＥｓｒｒｂが添加されたＧ２培地で、３日間である。例えば、ＣＡＲＭ １及び／またはＥｓｒｒｂは、それぞれ０．５，１，１．５，２，２．５，３，３．５，４，４．５，５μｇ／ｍｌ、またはそれ以上のμｇ／ｍｌの培地における濃度で提供される。一部具体例において、ＣＡＲＭ １及び／またはＥｓｒｒｂは、それぞれ２μｇ／ｍｌの培地における濃度で提供される。
【００４９】
多様な具体例において、胚盤胞へのさらなる培養、及び胚盤胞からの多能性幹細胞（ｐＳＣｓ）の誘導は、透明帯（ＺＰ）を除去するために培養された胚盤胞を、酸性タイロード溶液（acidic Tyrode’s solution）で処理する段階を含む。多様な具体例において、該処理は、何秒間（例えば、１ないし５秒間）である。多様な具体例において、ＺＰの除去後、ＨＥＰＥＳ−ＨＴＦ培地での洗浄が後に続く。多様な具体例において、内部細胞塊（ＩＣＭ）の分離は、胚盤胞の栄養胞（trophoblast）を廃棄する段階を含む。多様な具体例において、ＩＣＭ細胞は、プレーティング１日前に製造されたマウス胚芽フィーダ層（ＭＥＦ：mouse embryonic feeder）にプレーティングされる。一部具体例において、全体胚盤胞は、ＭＥＦｓにプレーティングされる。例えば、該方法は、胚盤胞の透明帯を剥皮する段階を含む。多様な具体例において、前記方法は、Ｈｅｐｅｓ−ＨＴＦ培地で、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％または１％のプロナーゼ（pronase）で、胚盤胞の透明帯を除去する段階を含む。一具体例において、前記方法は、Ｈｅｐｅｓ−ＨＴＦ培地で、０．５％プロナーゼ（pronase）で、胚盤胞の透明帯を除去する段階を含む。また、他の具体例において、前記方法は、１ないし１０秒間、１０ないし２０秒間、２０ないし３０秒間、３０ないし６０秒間、６０ないし１２０秒間、１２０ないし１８０秒間、または１８０秒間以上、ＴＨ３培地（ＳＡＧＥ胚盤胞培地）において、プロナーゼを適用する段階を含む。また、他の具体例において、３０ないし６０秒間ＨＴＦ培地で、０．５％プロナーゼを適用する段階を含む。一具体例において、該胚盤胞は、授与卵母細胞への供与細胞核の体細胞核移植（ＮＴ）から得られた再構築された核移植された卵母細胞に由来する。一具体例において、幹細胞株は、体細胞核移植ヒト多能性ｈＰＳＣ（ＮＴ−ｈＰＳＣ：human pluripotent stem cell）細胞株である。
【００５０】
さらに他の具体例において、栄養外胚葉性細胞（trophectodermal cell）からの内部細胞塊（ＩＣＭ）が機械的拡散（mechanical dispersion）する段階を含む免疫切除術（immunosurgery）のための方法を含む。多様な具体例において、剥皮された胚盤胞は、３７℃で、約１０，２０，２５，３０，３５，４０，４５または６０分間ラビット抗ヒト脾臓血清で処理される。一具体例において、前記方法は、剥皮された胚盤胞をＴＨ３（ＳＡＧＥ胚盤胞培地）で洗浄する段階、３７℃で３０分間ＨＥＣＭ−９（ＳＡＧＥ胚盤胞培地）で再構築されたギニアピッグ補体で、インキュベーションする段階を含む。異なる具体例において、拡張された胚盤胞の透明帯は、ＴＨ３（ｈｅｐｅｓ−ＨＴＦ）培地で、０．５％プロナーゼまたは酸性タイロード溶液への若干の露出（４５ないし６０秒）で除去される。一具体例において、前記方法は、選択的に、栄養外胚葉性細胞から内部細胞塊を分離するために、小孔径ピペッティング（small bore pipetting）、Ｅｈｓｍｓ ｚｉｌｏｓ−ｔｋ unit（Hamilton Thorne）を使用したレーザ補助孵化方法（laser assisted hatching method）を使用して、細胞を機械的に拡散する段階を含む。
【００５１】
本発明において、望ましくは、前記ポスト活性化培地は、ＴＳＡを含む培地からなり、該ポスト活性化培地は、６−ＤＭＡＰを含むのである。さらに望ましくは、ポスト活性化時、６−ＤＭＡＰを含んだ培地で培養した後、追加してＴＳＡが含まれた培地で培養する。
【００５２】
多様な具体例において、成功裏に進められたＮＴ製造率を高めるために、少なくとも１つの供与細胞の核を後成学的調節因子（epigenetic modifying agents）と接触させることによっても変更される。該後成学的調節因子は、具体的には、特定タンパク質またはＤＮＡのメチレーションまたはアセチレーションの状態を変えることにより、転写の効率を上昇させ、結果として、ＮＴ効率を高める。かような後成学的調節因子の標的（target）は、ヒストンアセチル基伝達酵素（ＨＡＴ：histone acetyl transferase）タンパク質、ヒストン脱アセチル酵素（ＨＤＡＣ：histone deacetylase）タンパク質、リジンデメチラーゼ（ＫＤＭ）ドメインタンパク質、タンパク質メチル伝達酵素（ＰＭＴ：protein methyl transferase）ドメインタンパク質などを含み、少なくとも１以上を含む。それら製剤は、small interfering ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子（small molecule）、タンパク質、ペプチド、抗体などを含む。それら製剤は、再プログレミング抵抗部位（reprogramming resistant region）と係わる後生成ターゲットに作用する。ＮＴ卵母細胞は、後生成状態を変更する製剤の存在下に培養される。それら製剤の具体的な例示は、下記の表２ないし表５に記述される。ヒストンアセチル基伝達酵素（ＨＡＴ）タンパク質、ヒストン脱アセチル酵素（ＨＤＡＣ）タンパク質、リジンデメチラーゼ（ＫＤＭ）ドメインタンパク質、タンパク質メチル伝達酵素（ＰＭＴ）ドメインタンパク質は、下記の例示に制限されるものではない。
【００５３】
【表２】
0006707636.tif 000003
【００５４】
【表３】
0006707636.tif 000004
【００５５】
【表４】
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【００５６】
【表５】
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0006707636.tif 000007
0006707636.tif 000008
【００５７】
一般的に、メチル基伝達酵素は、共同基質類似体（co-substrate analogues）によっても抑制される。多種のメチル基伝達酵素を抑制する共同基質類似体としては、３種が知られている。Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ：Ｓ−adenosylmethionone）に構造的に類似の抗生物質化合物であるsinefugin、フィードバック阻害剤として脱メチル化された共同基質ＳＡＨ、及びメチルチオアデノシン（methylthioadenosine）である。リシンメチル基阻害剤としては、最も先に確認されたchaetocinと、Ｇ９ａ（ＫＭＴ１Ｃ）阻害剤であるＢｉｘ−０１２９４とを含む。それらは、ＳＵＶ３９Ｈ１及びＰＲＭ１に選択的である。Ｂｉｘ−０１３３８化合物は、リシンとアルギニンメチル基伝達酵素との間で、選択性なしにやや非選択的な抑制剤であり、Ｇ９ａに対してＩＣ５０ ５ｍＭを示す一方、ＰＲＭＴ１に対しては、ＩＣ５０ ６ｍＭを示した。ＵＮＣ０２２４は、リシンメチル基伝達酵素Ｇ９ａに対して、ＩＣ５０ １５ｍＭを示す新たな阻害剤として提示されている。ＥＰＺ５６７６、ＥＰＺ００５６８７及びＧＳＫ１２６のようなヒストンメチル基伝達酵素の抑制剤は、また多様な癌動物モデルで抗癌活性を示している。
【００５８】
タンパク質アルギニンメチル化は、ＰＲＭＴｓによって行われ、２つのグループに分類される。type Ｉメチル基伝達酵素は、非対称的に置換されたアルギニン残基を形成させ、type ＩＩメチル基伝達酵素は、対称的に置換されたアルギニン残基を形成させる。ＣＡＲＭ１は、ポロリン（proline）−グリシン（Glycine）−メチオニン（methionine）−アルギニン（arginine）（いわゆる、ＰＧＭモチーフ）と親和度（affinity）を示す。ＰＲＭＴ５は、またＰＧＭモチーフをメチレートさせると知られている。sinefunginのような共同基質類似体は、アルギニンメチル基伝達酵素の抑制剤（あるいは、アルギニンメチル基伝達酵素抑制剤として、ＡＭＩｓとして知られる）としても使用される。ＡＭＩ−１は、ＰＲＭＴ１に対して、ＩＣ５０ ９ｍＭで最も活性が高い抑制剤である。allatodapsoneとstilbamidineとの抑制剤は、Ｈ４Ｒ３において、ハイポメチル化（hypomethylation）を誘導する。
【００５９】
後生成ターゲット（epigenetic target）の他の類型であり、ＮＴ効率を高める方法があり得る。ＤＮＡメチル基伝達酵素（ＤＮＭＴｓ：ＤＮＡ mehtyltransferases）は、優先的に、ＤＮＡのＣｐＧヌクレオチド配列をメチレートさせる。哺乳類においては、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ及びＤＮＭＴ３の３つのＤＮＡメチル基伝達酵素が確認されている。一般的に、それらプローモーター部位のメチル化は、転写因子がＤＮＡに結合することを妨害することにより、遺伝子発現を阻止する。追加してメチル化されたＤＮＡは、メチル−ＣｐＧ結合ドメインタンパク質（methyl−ＣｐＧ binding domain protein）によって捕らわれており、それらタンパク質は、ヒストンモデリング酵素（histone modeling enzymes）を引き込み、結果として、クロマチン構造を凝縮させ、遺伝子発現を抑制するメカニズムを誘導する。ＤＮＭＴ inhibitorsは、遺伝子発現が抑制されることを阻止することにより、結果として、ＮＴ効率を上昇させることができる。例示的にいくつの化合物があり、クロロゲン酸（chlorogenic acid）、ミトラマイシン（mithramycin）、azacytide、bisdemethoxycurcumim、decitabine、lomegutatrib、benzylguanine、ソラフェニブ（sorafenib）及びソラフェニブトシル酸塩（sorafenibtosylate）などがある。
【００６０】
さらには、ヒストン脱アセチル酵素（ＨＤＡＣ）は、ヒストンのＮ−アセチルリシンアミノ酸からアセチル基を除去する機能を行い、結果として、さらに多くの正電荷を帯び、負電荷を帯びるＤＮＡに強く結合する。ＤＮＡ構造の凝縮と遺伝的転写は、さらに抑制される。ＨＤＡＣｓは、位置と機能とにより、４個の細部グループに分離され、class Ｉ ＨＤＡＣｓ（１，２，３，８亜型）は、主に核で発見され、ｃｌａｓｓ ＩＩ ＨＤＡＣｓ（４、５、６、７、９、１０）は、核膜を通過して移動することができ、核及び細胞質のいずれでも発見される。type ＩＩＩ ＨＤＡＣｓは、Ｓｉｒ２（silent information regulator ２）と呼ばれ、type ＩＶ ＨＤＡＣｓ（１１亜型）は、核及び細胞質のいずれでも発見され、主に、脳、心臓、筋細胞などに位置する。ＨＤＡＣｓ抑制剤は、他の化学合成薬物と併用投与されたとき、抗癌活性を有する。ＨＤＡＣ inhibitorsは、ＤＮ転写を促進することにより、結果として、ＮＴ効率を上昇させることができる。
【００６１】
ポスト活性化培地に後成学的調節因子、例えば、後成的クロマチン（epigenetic chromatin）及びβヒストン変形剤（histone modification agents）、並びに／またはＤＮＡ変更剤を含んでもよい。特定具体例において、それらは、タンパク質アルギニンメチル−トレンスフォラーゼ（ＰＲＭＴ１）及び共活性化因子関連アルギニンメチルトレンスフォラーゼ１（coactivator-associated arginine methyltransferase １）（ＣＡＲＭ１／ＰＲＭＴ４）、核オーファン受容体エストロゲン（orphan nuclear receptor estrogen）関連受容体β（Ｅｓｒｒｂ）タンパク質のうちからも選択され、またリシン特異的デメチラーゼ４Ａ（Ｋｄｍ４ａ：lysine（Ｋ）−specific demethylase ４Ａ）、リシン特異的デメチラーゼ４Ｂ（Ｋｄｍ４ｂ：lysine（Ｋ）−specific demethylase ４Ｂ）またはリシン特異的デメチラーゼ４Ｄ（Ｋｄｍ４ｄ：lysine（Ｋ）−specific demethylase ４Ｄ）のそれぞれＲＮＡまたはタンパク質のうちからも選択される。特定具体例において、メチル化変更剤及び／またはＤＮＡ変形剤は、変形された組み換えタンパク質として発現される。例えば、ＣＡＲＭ１及びＥｓｒｒｂは、７Ｘアルギニン（７Ｒ）細胞透過ペプチド（ＣＰＰｓ）、または当業者に、細胞膜及び核膜を通過し、タンパク質及びペプチドの透過を増進させ、ＤＮＡとの結合及び／または転写活性化を増大させると知られた他のタンパク質にも変形される。他の具体例において、前記方法は、転写因子基盤再プログラミングを使用し、オクタマー結合転写因子−４（Ｏｃｔ−４：octamer binding transcription factor−４）、性決定部位Ｙ−ボックス−２（Ｓｏｘ−２：sex determining region Ｙ−box−２）、nanog、クルペル類似因子−４（Ｋｌｋ−４：Kruppel−like factor−４）、ＭｙｏＤ、ｃ−Ｍｙｃ、ジンクファインダタンパク質−４２（Ｒｅｘ−１／Ｚｆｐ−４２：zinc finder protein−４２）、レフティＡ（lefty Ａ）、奇形癌腫由来成長因子（Ｔｄｇｆ：teratocarcinoma-derived growth factor）及び／またはテロメア反復結合因子（Ｔｅｒｆ−１：telomeric repeating binding factor）に核供与細胞を後成的に再プログラミングする段階を含む。多様な具体例において、前記方法は、直接的な圧電気注入、ウイルス性注入、リポソーム性注入、または他の方法の細胞質内注入を含む。多様な具体例において、転写因子は、核が除去された卵母細胞への核移植前に適用されるｍＲＮＡ、タンパク質及び／または細胞抽出物の形態で伝達される。他の具体例において、前記方法は、ＨＤＡＣ抑制剤（クラスＩ，ＩＩ及びＩＩＩ）、またはＤＮＭＴ３ａ抑制剤及びＤＮＭＴ３ｂ抑制剤の使用を含んでもよい。
【００６２】
従って、本発明は、望ましくは、ポスト活性化培地は、後成学的調節因子を含んだものである。さらに望ましくは、後成学的調節因子は、ヒストンアセチル基伝達酵素（ＨＡＴ）タンパク質、ヒストン脱アセチル酵素（ＨＤＡＣ）タンパク質、リジンデメチラーゼ（ＫＤＭ）ドメインタンパク質、タンパク質メチル伝達酵素（ＰＭＴ）ドメインタンパク質及びＤＮＡメチル基伝達酵素（ＤＮＭＴｓ：ＤＮＡ mehtyltransferases）を含む群から選択されるいずれか１以上に関与するのである。本発明において望ましくは、ＮＴ細胞由来幹細胞の製造方法は、前記ｃ）段階において、幹細胞の製造は、ＮＴ細胞を活性化させた後、胚盤胞を生成する段階と、生成された胚盤胞から内細胞集団（ＩＣＭ）細胞を単離する段階と、分離された内細胞集団細胞を幹細胞に追加して培養する段階と、を含む。
【００６３】
本発明の幹細胞は、将来使用のためにも冷凍保存される。一実施例において、該冷凍保存剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、グリセロール及びプロパンジオールを含むが、それらに限定されるものではない１以上の冷凍保護剤；ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、及び前述特許の培地を含むが、それらに限定されるものではない１以上の培養培地；スクロース、デキストラン、血清代替物及びＨＥＰＥＳ緩衝剤を含むが、それらに限定されるものではない１以上の追加物質を含む溶液に幹細胞を冷凍保存する。一実施例において、前記溶液は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標名）ＣＳ−１０培地（BioLife Solutions Ｉｎｃ．、米国ワシントン州Bothel所在）を含む。さらに他の実施例において、血清代替物は、ノックアウト（knockout）血清代替物１０８２８−０２８（Invitrogen））である。
【００６４】
製造された幹細胞の凍結保存は、細胞を、調節された速度で凍結するか、あるいは「手動」過程で凍結する。調節された速度凍結手続きは、調節された速度凍結器をオンにし、組織凍結または細胞凍結のための凍結プログラムを設定することによって始まる。調節された速度凍結器は、液体窒素を使用し、内部チャンバ内の温度を低下させる（それにより、前記チャンバの任意内容物の温度を低下させる）。細胞に対する凍結プログラムは、内部チャンバを４℃に冷却させ、前記手続きを続けるように刺激されるまで、前記温度を維持することによって始まる。調節された速度凍結器が冷却される間、細胞は、４℃に冷却された冷凍保存培地に懸濁される。前記細胞懸濁液を冷凍バイアル（cryovial）当たり１ｍｌの量で冷凍バイアル内に分取する。その後、前記冷凍バイアルを標識し、調節された速度凍結器チャンバ内に入れ、プログラムが続くように刺激する。まず、前記チャンバの温度を４℃にさらなる１０分間維持する。次に、温度が−８０℃に逹するまで、前記チャンバを−１℃／分の速度で冷却させる。その後、前記チャンバが−１２０℃の温度に逹するまで、前記チャンバを−５０℃／分の速度で冷却させる。−１２０℃で５分経過後、凍結された細胞の温度は、−１２０℃に平衡化されている。その後、前記凍結された細胞の冷凍バイアルを長期間保存のために、液体窒素デュワー（dewar）に移す。
【００６５】
また、本発明は、ａ）複数の寄贈者組織から同型接合いかんをスクリーニングする段階と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞に製造する段階と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から幹細胞を生成する段階と、を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞の製造方法を提供する。
【００６６】
望ましくは、ａ）段階において、該スクリーニングは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの遺伝子が同型接合であり、ｂ）段階において、該ＮＴ製造は、卵母細胞を脱核する段階と、脱核された卵母細胞に、体細胞の核を融合させる段階と、融合された卵母細胞を、ポスト活性化培地で培養する段階とからなり、さらに望ましくは、前記卵母細胞の脱核は、タンパク質リン酸加水分解酵素阻害剤（protein phosphatase inhibitor）を含む培地でなされる。また、前記体細胞の核を融合させる段階は、センダイウイルスまたはセンダイウイルス抽出物を含む培地でなされ、前記ポスト活性化培地は、ヒストン脱アセチル酵素抑制剤（histone deacetylase inhibitor）を含むことが望ましく、そのうちＴＳＡを含むことがさらに望ましい。前記ポスト活性化培地は、後成学的調節因子を含むことが望ましく、さらに望ましくは、前記後成学的調節因子は、ヒストンアセチル基伝達酵素（ＨＡＴ）タンパク質、ヒストン脱アセチル酵素（ＨＤＡＣ）タンパク質、リジンデメチラーゼ（ＫＤＭ）ドメインタンパク質、タンパク質メチル伝達酵素（ＰＭＴ）ドメインタンパク質を含む群のうちから選択されるいずれか１以上に関与する。
【００６７】
また、本発明は、ａ）複数の寄贈者組織から同型接合いかんをスクリーニングする段階と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞に製造する段階と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から幹細胞を生成する段階と、
ｄ）前記製造された幹細胞から細胞移植のための分化された細胞に製造する段階と、を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞から分化された細胞の製造方法を提供する。
【００６８】
前記ｃ）段階後、選択的に、幹細胞は、凍結保存される段階が追加され、その場合、ｄ）段階以前に凍結保存された細胞を解凍する段階が選択的に追加されてもよい。
【００６９】
分化された細胞は、幹細胞から、造血母細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、泌尿器官細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、血管細胞、網膜細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びニューロン細胞など制限なく、それらからなる群からいずれか１以上の細胞に分化されたものであり、制限なしに細胞移植を介した治療剤として使用される全ての細胞を意味する。凍結保存された細胞バンキングから、異種患者のＨＬＡスクリーニングを介した免疫接合した細胞を選別する段階が追加されてもよい。該免疫接合性は、移植材料として、再生治療の最適供給可能性を高めることにより、バンキングを可能にさせるのである。かようなバンキングシステムは、自家（autologous）細胞を利用したＮＴ製造を交替することにより、新規卵母細胞の持続的供給を低減させることができ、幅広い自家または異種間の細胞移植を可能にするのである。特に、それらバンキングシステムから、異種間の細胞移植のための選別段階、及び選別された幹細胞から特定分化された細胞に製造する段階は、さらに一層多様な細胞治療剤としての使用範囲を拡大するのである。既存に使用されている細胞移植治療分野に多様に接木が可能であり、具体的には、血管内皮細胞への分化を介した血管関連疾患、網膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelial cell）への分化を介した網膜関連疾患、及び神経細胞への分化を介した退行性神経疾患などの治療分野は、限定されるものではない。
【００７０】
また、本発明は、前記免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞の製造方法として製造された免疫適合型幹細胞を含む細胞集団を提供するのである。本発明は、また多種疾患の治療のためのＮＴ細胞由来幹細胞の細胞集団を含む組成物を提供する。
【００７１】
本発明の組成物総重量に対して、本発明の細胞組成物は、０．１ないし９９．９重量％を有効成分として含み、薬剤学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤を含んでもよい。
【００７２】
本発明の組成物は、経口または非経口のさまざまな剤形でもある。製剤化する場合には、一般的に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、かような固形製剤は、１以上の化合物に、少なくとも１以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁液剤、内容液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、繁く使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤なども含まれる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤及び懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油；エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用される。坐剤の基剤としては、ウィテブソル（witepsol）、マクロゴール、トゥイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリンジ、グリセロゼラチンなどが使用される。
【００７３】
前記薬学的に有効な量とは、０．０００１ないし１００ｍｇ／ｋｇであり、０．００１ないし１０ｍｇ／ｋｇであるが、それらに限定されるものではない。投与量は、特定患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与期間、投与方法、除去率、疾患の重度度などによっても変わる。
【００７４】
前記組成物は、臨床投与時、経口または非経口で投与が可能であり、非経口投与時、腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内硬膜注射、脳血管内注射または胸部内注射によっても投与され、一般的な医薬品製剤の形態でも使用される。
【００７５】
本発明の組成物は、単独、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００７６】
また、本発明は、複数の寄贈者組織を収集する手段、
前記収集された組織から免疫適合型いかんをスクリーニングする手段、
免疫適合型組織から幹細胞を製造する手段、及び
幹細胞を冷凍保存する手段を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞バンキングシステムを提供する。
【００７７】
本発明は、個人の多数寄贈者から得られるＮＴ細胞由来幹細胞を保存する幹細胞バンクを提供する。保存された幹細胞は、健康上の理由で、個人生体の特定細胞集団を回復させたり、他個人の治療または臨床で使用したりするための細胞供給源としても使用される。保存された幹細胞は、研究応用にも使用される。保存された幹細胞は、臓器保存された後で解凍され、幹細胞として使用されるか、あるいは特定細胞に分化された後、利用または患者に投与される。
【００７８】
以下、発明の具体的な実施例を介して、発明の作用及び効果についてさらに詳細に説明する。ただし、かような実施例は、発明の例示として提示されたものに過ぎず、それらによって、発明の権利範囲が決められるものではない。
【実施例】
【００７９】
［実施例１］
寄贈者細胞から同型接合細胞のスクリーニング及び供与細胞の選別
Cha病院寄贈臍帯血銀行において、７億個未満の廃棄用臍帯血に対して同型接合細胞をスクリーニングした。ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，ＤＲＢ１ genotypingのために、Gentra PuregeneTM Blood Kits（QIAGEN，Hilden、ドイツ）を使用してgenomic ＤＮＡを抽出した後、SeCore A, B and DRB1 Locus Sequencing Kit（Invitrogen，Brown Deer，ＷＩ、米国）を使用して、sequence-based typingを実施した。特に、ＨＬＡ−ＡとＢとの場合、ｅｘｏｎ ２−４を、ＨＬＡ−ＤＲＢ１の場合、ｅｘｏｎ ２を、キット（kit）に含まれているlocus specific primerを使用して増幅させ、ＡＢＩ３１３０ＸＬ Genetic Analyzer（Applied Biosystems，Foster City，ＣＡ、米国）を利用して形成されたＰＣＲ productに係わるシーケシング（sequencing）を行い、ＨＬＡ ＳＢＴ ｕ−type software ｖ３．０（Invitrogen）及びSequencher（Gene Codes Ｃｏｒｐ．，Ann Arbor，ＭＩ、米国）を使用してデータ分析を実施した。結局、かような方法を介して、寄贈臍帯血から、韓国人に最も頻度数が高いＨＬＡ同型接合供与細胞（Ａ＊３３：０３−Ｂ＊４４：０３−ＤＲＢ１＊１３：０２）（haplotype frequency：４．６％）を見い出し、もしそこからＮＴ細胞を製作する場合、全体人口の約９％を包括することができる。
【００８０】
前記スクリーニングした結果から、ＨＬＡ Ａ−Ｂ−ＤＲＢ１ haplotypeの造血細胞（hemapoietic cell）を供与細胞として選別し、細胞培養フラスコに、５％ ＣＯ２、３７℃条件下で培養した。１０％ ＤＭＳＯ、３０％ ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培養液を凍結液として使用し、cryovialに込めて凍結し、使用時まで液体窒素タンクに保管する。それら細胞は、染色体検査を施行する（図２）。該細胞は、ＮＴ前に解凍し、４ウェルディッシュにconfluencyに培養し、それら細胞は、０．５％ ＦＢＳ ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２日間培養しながら、Ｇ０／Ｇ１段階で同期化した。
【００８１】
［実施例２］
２．１ 卵母細胞の回収及び製造
ＣＨＡＲＭＩ（ＣＨＡ Regenerative Medicine Institute）のＳＣＲＯ（Stem cell Research Oversight）委員会及びＥＩＲＢ（Essex Institutional Review Board）の承認下で進められた。
【００８２】
ウェブ基盤の広告を介して、２０−３２歳の女性を募集し、ＡＳＲＭ（American Society for Reproductive Medicine）ガイドラインによって、前記女性の生殖学的、医学的及び精神学的な健康状態を検査した。前記検査によって、医学及び精神学的な検査をいずれもパスしたＢＭＩ＜２８Ｋｇ／ｍ２の女性を対象に進めた。
【００８３】
卵巣刺激（ovarian stimulation）は、定立された臨床ＩＶＦガイドラインによってなされた（Tachibana et al., 2013）。前記女性に、ルプロン（Lupron）またはｈＣＧを注入した後、３６時間Midazolam ５−７．５ｍｇ（Versed, Roche及びNutley Ｎ．Ｊ．、米国）及びFentanyl ５０−７５μｇ（Abbott Pharmaceutical，Abbott Park，Ｉｌｌ、米国）で鎮静させ、卵母細胞をその後、事前に記載された超音波地図を使用して回収した。ＩＶＦ培地（Ｑｕｉｎｎ’ｓ ＩＶＦ培地、ＳＡＧＥ Biopharma，Bedminster，Ｎ．Ｊ．、米国）において、新鮮に単離された卵球・卵母細胞複合体（ＣＯＣｓ：cumulus-oocyte cell complexs）を集め、１０％血清代用物（ＳＳＳ，Ｑｕｉｎｎｓ Advantage Serum，Cooper Surgical）が補充されたＨＴＦ−Ｈｅｐｅｓ培地（Global Medium）に３７℃条件下で置いた。ＣＯＣｓをヒアルロニダーゼ（１００ＩＵ／ｍｌ，Sigma，Ｓｔ．Louis，Ｍｏ．、米国）で処理した後、成熟程度によって卵母細胞を分類した後、中期ＩＩ（ＭＩＩ）時期の卵母細胞をＮＴのために使用した。
【００８４】
２．２ 卵母細胞の脱核、体細胞の核置換及び活性化
卵母細胞の脱核は、以前に公知された方法によって遂行され（Tachibana et al.， 2013）、卵母細胞の脱核、及び体細胞の核置換は、ステージウォーマ（stage warmer）、ナリシゲマイクロマニピュレータ（Narishige micromanipulator）、OosightＴＭイメージングシステム（poloscopic microscopy）、及びレーザを備えた倒立顕微鏡（inverted microscope）を使用して行った。レーザを備えた倒立顕微鏡の代わりに、ピエゾを備えた倒立顕微鏡が選択的に使用される。
【００８５】
前記卵母細胞を、サイトカラシンＢ（５μｇ／ｍｌ）及びカフェイン（１．２５ｍＭ）を含んだＨＴＦ−Ｈｅｐｅｓ培地（Global Medium）のドロップレット（droplet）に位置させた後、前記ドロップレットを組織培養（tissue culture）オイルで覆い、３７℃条件下で、１０ないし１５分ほど置いた。該カフェインは、タンパク質リン酸加水分解酵素阻害剤であり、迅速な活性化（premature activation）を抑制し、複製胚芽成長を改善させることにより、結果として、胚盤胞形成率を上昇させる。その後、紡錘糸（spindle）が２時ないし４時の方向近くに位置するように、ホールディングピペットで卵母細胞を固定させた後、紡錘糸横にある透明帯（zona pellucida）を、レーザパルスで透過させ、透過された部分を介して注入ピペットを入れた。前記注入ピペットで、原形質膜（plasma membrane）で取り囲まれた少量の細胞質と接触した紡錘糸を吸入させた。前記透明帯には、レーザパルスの代わりに、ピエゾパルスが選択的に利用されてもよい。
【００８６】
その後、供与細胞をマイクロピペットに吸入させ、センダイウイルス外被タンパク質（ＨＪＶ−Eextract、Isihara Sangyo Kaisha）を含む小ドロップ（drop）に移した。その後、前記実施例１の核供与細胞を、第１極体の反対側に位置した卵黄周囲空間（perivitelline space）に挿入した。
【００８７】
かように融合が確認されれば、製造された卵子は、さらにGlobal １０％ ＳＰＳ培地で３０分または２時間培養した。
【００８８】
活性化は、０．１ｍＭ酢酸カリウム、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍｌ脂肪酸がないＢＳＡ（fatty-acid-free ＢＳＡ）を含む０．２５ｍＭ Ｄ−ソルビトール（ｄ−sorbitol）バッファ下で、電気刺激（electrical pulse）（２Ｘ５０μｓ ＤＣ pulses、２．７ｋＶ／ｃｍ）を加えて行った。活性化された細胞は、５％ ＣＯ２、３７℃条件下で、２ｍＭ ＤＭＡＰを含むGlobal Medium（血清除外）で４時間培養し、５％ ＣＯ２、５％ Ｏ２、９０％ Ｎ２、３７℃条件下で、１０％ ＦＢＳ、１２μＭ ＢＭＥ（β−mercaptoethanol）、ＣＡＲＭ（２μｇ／ｍｌ）及び１０ｎＭ ＴＳＡ（trichostatin Ａ）が補充されたGlobal Mediumで１２時間培養した。その後、前核形成（pronuclear formation）を確認し、５％ ＣＯ２、５％ Ｏ２、９０％ Ｎ２、３７℃条件下で、ＴＳＡがなく、１０％ ＦＢＳ及び１２μＭ ＢＭＥが補充されたGlobal Mediumで最大７日間培養した。その後、４細胞期時期に、マイクロインジェクションシステム（micro injection system）を使用して、ＣＡＲＭ ｍＲＮＡを割球に注入する。ＣＡＲＭの代わりに、選択的にＨＤＡＣ１、ＳＩＲＴ２またはＫＤＭ４Ｄが添加されてもよい。
【００８９】
［実施例３］
ＮＴ細胞からのstem cell line製造及びその特性分析
前記実施例２で培養された胚盤胞を、酸性Tyrode溶液（ｐＨ２．０）で数秒間処理し、透明帯（ＺＰ）を除去した。ＺＰ除去後、胚芽をＨｅｐｅｓ−ＨＴＦ培地で強力に（vigorously）洗浄し、微量のTyrode溶液までも除去した。レーザ補助胚盤胞切除システム（Hamilton-Thorne Ｉｎ．。）を利用して、内細胞塊（ＩＣＭ）を分離し、胚盤胞の残余部分（栄養膜）を廃棄し、胚盤胞がそれ以上正常状態ではないということを確認した。プレーティング１日前に準備されたＭＥＦ上に、ＩＣＭをプレーティングし、しかし複製された胚盤胞を区別することができないＩＣＭを有する場合、全体胚芽をプレーティングした。ｈＰＳＣ誘導培地は、血清代替物（serum replacement）（５％ ＳＲ、Invitrogen）、ＦＢＳ（１０％、Hyclone）、plasmamate（５％）、ｂＦＧＦ（３２ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＬＩＦ（２，０００units／ｍＩ，Sigma-Aldrich）が補充されたノックアウトＤＭＥＭを含んでいる。同一培地において、３日間変化なしにＩＣＭを培養した後、４日目、培地の約１／３を交換した。６日目から一日おきに培地の１／２を交換した。プレーティング後７日以内に、最初成長（outgrowth）が確認された。
【００９０】
ＥＳＣ型形状を有するコロニーを、さらなる増殖のために、選択して特性化させ、細胞遺伝学的分析を行った。そして、１２日目以前に、コロニーを拡張させて凍結保存した。細胞特性分析は、染色体検査（karyotype、g−banding）、ＤＮＡ指紋検査及びmitochondrial ＤＮＡ遺伝子型検査を施行した。その結果は、それぞれ図３及び図４に示されている。細胞の全分化能幹細胞マーカーの発現を確認するために、ＡＰ stainingで、アルカラインホスファターゼ（alkaline phosphatase）活性を確認し、immunocytochemistryで、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１を分析したし、ＲＴ−ＰＣＲで、Ｏｃｔ４，Ｎａｎｏｇ，Ｓｏｘ−２マーカーの発現を分析した。その結果は、図５及び図６に示されている。それら結果から導き出された細胞が、幹細胞であるということを確認した。さらに、三胚葉性（３germ layers）由来細胞に分化する全分化能を確認するために、体外で胚芽体（ＥＢ）を形成させ、培養後、Immunochemistry及びＲＴ−ＰＣＲを介して、三胚葉由来分化マーカーの発現を確認した（図７（ａ）及び図７（ｂ））。体内での全分化能確認のために、免疫欠乏マウスの精巣または皮下に幹細胞を注入し、テラトーマ（teratoma）形成を誘導させた後、組織学的に、Ｈ−Ｅ及びspecial stainingを介して分化能を確認した。結果は、図７（ｃ）に示されている。
【００９１】
［実施例４］
ＮＴ細胞凍結保存及びバンキング
実施例３で製造された細胞に対して、同型接合性細胞によって、分類されて保管され、文書またはプログラムに記録されるようにする。特に、細胞供与体の情報が共に保存されるようにする。おって、同種（autologous）または異種（allogenic）の授与者（患者）に、直接に利用されるか、あるいは分化された細胞に利用されるように保存される。
【００９２】
［実施例５］
ＮＴ由来幹細胞から機能性網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）への分化
ＲＰＥへの分化を誘導するために、未分化状態のＮＴ由来幹細胞を、解剖顕微鏡下で、滅菌されたチップを使用して、機械的にさまざまな断片（clump-form of ＮＴ−ＥＳ cells；１断片は、約３００〜６００個の未分化状態の胚芽幹細胞株である）に切る。clump状のＮＴ由来幹細胞は、low attachment ６−ｗｅｌｌ plates（Corning，ＣＡ、米国）に入れ、胚芽体培養液（ＥＢＤＭ；knockoutＴＭ ＤＭＥＭ（Thermo Scientific，ＣＡ、米国）supplemented with １５％（ｖ／ｖ）knockoutＴＭ serum replacement（Thermo）、１％（ｖ／ｖ）ｇｌｕｔａｍａｘ（Thermo）、１％（ｖ／ｖ）ＮＥＡＡ（Thermo）、１％（ｖ／ｖ）penicillin-streptomycin（Thermo）and ０．１ｍＭ β−mercaptoethanol（Thermo））で浮遊状態で４日間培養する。培養された胚芽体は、培養皿に移され、付着した状態でＲＰＥ分化を誘導する。
【００９３】
ＮＴ由来幹細胞から分化された網膜色素上皮細胞の分離
胚芽体は、０．１％ゼラチンコーティングされた６−well培養皿に移し、付着するように、３日間培養器内に静置させた後、２〜３日間隔でＥＢＤＭ培養液を交替しつつ、胚芽体から伸びて育つ細胞のうち、網膜色素上皮細胞が現れるまで、約５０〜５５日間培養した。色素沈着で色が区分されるＲＰＥ cellを分離するために、該細胞は、生理食塩水（ＤＰＢＳ containing Ｃａ２＋Ｍｇ２＋（Thermo））で２回洗浄した後、コラゲナーゼタイプ４が含まれた生理食塩水（type ＩＶ collagenase（Thermo）in ＤＰＢＳ with Ｃａ２＋Ｍｇ２＋（Thermo））で交替し、２時間３７℃、５％ ＣＯ２が維持される培養基で培養した。酵素を除去するために、培養皿から離れ出てくる細胞塊（detached cell clusters）を５０ｍｌチューブに集め、遠心分離機（１，５００ｒｐｍ、５分）を利用して、ＤＭＥＭ−ＦＢＳ培養液で２回洗浄した。細胞塊は、６０ｍｍペトリ皿に移した後、解剖顕微鏡下で、細型のガラスピペットを利用して、網膜色素上皮細胞塊（pigmented cell clusters）を、色素が沈着していない他の細胞塊と区分して収集した。
【００９４】
ＮＴ由来幹細胞から分化された網膜色素上皮細胞の成熟及び増殖
網膜色素上皮細胞塊（pigmented cell clusters）は、単一細胞に分離させて培養するために、カルシウムとマグネシウムとが除去された生理食塩水（ＤＰＢＳ without Ｃａ２＋Ｍｇ２＋（Thermo））で２回洗浄した後、分離酵素液（１：１ mixture of ０．２５％ trypsin−ＥＤＴＡ（Thermo）and Cell Dissociation Buffer（Thermo））を処理して分離した。単一細胞に分離された網膜色素上皮細胞は、遠心分離機（１，５００ｒｐｍ、５分）を利用して、ＤＭＥＭ−ＦＢＳ培養液で洗浄した後、ＥＧＭ２培養液（Lonza，ＰＡ、米国）で細胞を砕き、２００，０００細胞／４ well培養皿１個wellの濃度で、０．１％ゼラチンコーティングされた４ well培養皿に入れ、詰まるまでＥＧＭ−２培養液で培養した。約３〜４日後、培養皿に細胞が詰まれば、網膜色素上皮細胞の形態及び特性（cobble stone morphology and pigmentation）を示すように、ＲＰＥ分化培養液（ＲＧＭＭ；１：１ mixture of ＥＢＤＭ and ＤＭＥＭ−ＦＢＳ media）で培養液を交替して日間培養した。
【００９５】
ＮＴ由来幹細胞から分化された網膜色素上皮細胞は、以上のところと同一分離酵素液を利用して継代培養を行い、ＥＧＭ２培養液を利用した増殖過程と、ＲＧＭＭ培養液を利用した熟成過程とを経て、機能性網膜色素上皮細胞を確保した。２継代と３継代とで得られた網膜色素上皮細胞の一部は、凍結液（９０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（Thermo） and １０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ（Sigma））を利用して、２ million cells／ｍＬ／cryovialの濃度で凍結して使用時まで保管し、一部は、網膜色素上皮細胞特性分析を行った。図８は、胚芽幹細胞由来ＲＰＥ細胞と、前記実施例３で製造されたＮＴ由来幹細胞のＲＰＥ細胞との形態と分化マーカーとに差がないことを示している（図８の（ａ）、（ｂ））。
【００９６】
以上、本発明について、実施例によって詳細に説明した。それら実施例は、ただ本発明について、さらに具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限られるものではないということは、当業界で当業者において自明であろう。
本発明は以下の態様も提供する。
［１］  ａ）複数の寄贈者組織から同型接合いかんをスクリーニングする段階と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞に製造する段階と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から幹細胞を生成する段階と、
ｄ）複数個の幹細胞を冷凍保存する段階とを含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞の保管方法。
［２］ａ）段階において、スクリーニングは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの遺伝子が同型接合であることを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］ｂ）段階において、ＮＴ製造は、卵母細胞を脱核する段階と、脱核された卵母細胞に体細胞の核を融合させる段階と、融合された卵母細胞をポスト活性化培地で培養する段階と、からなることを特徴とする［１］に記載の方法。
［４］前記卵母細胞の脱核は、タンパク質リン酸加水分解酵素阻害剤を含む培地でなされることを特徴とする［３］に記載の方法。
［５］前記体細胞の核を融合させる段階は、センダイウイルスまたはセンダイウイルス抽出物を含む培地でなされることを特徴とする［３］に記載の方法。
［６］前記ポスト活性化培地は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含むことを特徴とする［３］に記載の方法。
［７］前記ポスト活性化培地は、後成学的調節因子を含んだことを特徴とする［３］に記載の方法。
［８］前記後成学的調節因子は、ヒストンアセチル基伝達酵素（ＨＡＴ）タンパク質、ヒストン脱アセチル酵素（ＨＤＡＣ）タンパク質、リジンデメチラーゼ（ＫＤＭ）ドメインタンパク質及びタンパク質メチル伝達酵素（ＰＭＴ）ドメインタンパク質を含む群のうちから選択されるいずれか１以上に関与することを特徴とする［７］に記載の方法。
［９］前記ｃ）段階において、幹細胞の製造は、ＮＴ細胞を活性化させた後、胚盤胞を生成する段階と、生成された胚盤胞から内細胞集団（ＩＣＭ）細胞を単離する段階と、分離された内細胞集団細胞を幹細胞に追加して培養する段階と、からなることを特徴とする［１］に記載の方法。
［１０］ａ）複数の寄贈者組織から同型接合いかんをスクリーニングする段階と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞に製造する段階と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から幹細胞を生成する段階と、を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞の製造方法。
［１１］ａ）段階において、スクリーニングは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの遺伝子が同型接合であることを特徴とする［１０］に記載の方法。
［１２］ｂ）段階において、ＮＴ製造は、卵母細胞を脱核する段階と、脱核された卵母細胞に体細胞の核を融合させる段階と、融合された卵母細胞をポスト活性化培地で培養する段階と、からなることを特徴とする［１０］に記載の方法。
［１３］前記卵母細胞の脱核は、タンパク質リン酸加水分解酵素阻害剤を含む培地でなされることを特徴とする［１２］に記載の方法。
［１４］前記体細胞の核の融合は、センダイウイルスまたはセンダイウイルス抽出物を含む培地でなされることを特徴とする［１２］に記載の方法。
［１５］前記ポスト活性化培地は、ＴＳＡを含むことを特徴とする［１２］に記載の方法。
［１６］前記ポスト活性化培地は、後成学的調節因子を含んだことを特徴とする［１２］に記載の方法。
［１７］前記後成学的調節因子は、ヒストンアセチル基伝達酵素（ＨＡＴ）タンパク質、ヒストン脱アセチル酵素（ＨＤＡＣ）タンパク質、リジンデメチラーゼ（ＫＤＭ）ドメインタンパク質、及びタンパク質メチル伝達酵素（ＰＭＴ）ドメインタンパク質を含む群のうちから選択されるいずれか１以上に関与することを特徴とする［１３］に記載の方法。
［１８］ａ）複数の寄贈者組織から同型接合いかんをスクリーニングする段階と、
ｂ）同型接合細胞から核を分離してＮＴ細胞に製造する段階と、
ｃ）製造されたＮＴ細胞から幹細胞を生成する段階と、
ｄ）前記製造された幹細胞から細胞移植のための分化された細胞に製造する段階と、を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞から分化された細胞の製造方法。
［１９］前記ｃ）段階後、幹細胞は、凍結保存される段階、及び凍結保存された細胞を解凍する段階が追加されることを特徴とする［１８］に記載の製造方法。
［２０］ｄ）段階の分化された細胞は、造血母細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、泌尿器官細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、血管細胞、網膜細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びニューロン細胞からなる群から選択されたいずれか１以上であることを特徴とする［１８］に記載の 製造方法。
［２１］  ［１］に記載の方法によって製造された免疫適合型幹細胞を含む細胞集団。
［２２］複数の寄贈者組織を収集する手段と、
前記収集された組織から免疫適合型いかんをスクリーニングする手段と、
免疫適合型組織から幹細胞を製造する手段と、
幹細胞を冷凍保存する手段と、を含む免疫適合型ＮＴ細胞由来幹細胞バンキングシステム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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