(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源（１０１）と、
第１のポート、第２のポート、第３のポート、および第４のポートを有する光カプラ（１１２）であって、前記光源（１０１）からの光出力が前記第１のポートに連結されて第１の光ビームおよび第２の光ビームへと分かれ、前記第１の光ビームは前記第２のポートに対する出力であり、前記第２の光ビームは前記第３のポートに対する出力であり、前記第４のポートが分光計の入力に連結される、光カプラ（１１２）と、
前記第１の光ビームを、前記光カプラ（１１２）の前記第２のポートから試料へと、ダイクロイック・ミラー（１０８）および顕微鏡対物レンズ（１０３）を通じて向かわせるための第１の光コリメータ（１０６）であって、前記試料が、調整型顕微鏡検査ステージ（１０２）によって支持される基板上に載せられる、第１の光コリメータ（１０６）と、
前記第２の光ビームを、前記光カプラ（１１２）の前記第３のポートから再帰反射体（１１１）へと向かわせるための、第２の光コリメータ（１１０）と
を備える、オートフォーカス装置であって、
前記試料から反射した前記第１の光ビームが、前記第２のポートに戻って前記第４のポートから出るように導かれ、前記再帰反射体（１１１）から反射した第２の光ビームが、前記第３のポートに戻って前記第４のポートから出るように導かれ、
前記分光計が、前記反射された第１および第２の光ビームからの干渉信号の中で識別される３点のピークの放物線適合方法に基づき、前記調整型顕微鏡検査ステージ（１０２）を制御するための制御信号を出力する、オートフォーカス装置。
【請求項２】
前記再帰反射体の位置が、前記第２の光ビームの光路と前記第１の光ビームの光路とが整合するように調整される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記調整型顕微鏡検査ステージが、電動Ｘ−Ｙステージと、Ｚ軸ピエゾ・ステージとを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記光カプラが、５０：５０ファイバ・カプラである、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記分光計が、回折格子へと光を向けるファイバ・コリメータと、前記回折された光をカメラ上にフォーカスする対物レンズとを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記第１の光コリメータ以降に前記試料へと向かう前記第１の光ビームを遮るために閉鎖するメカニカル・シャッタをさらに備える、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
オートフォーカス装置を自動的に動作させるための方法であって、
光カプラ（１１２）を、第１のポートにおいて光源（１０１）の光信号出力に連結し、第２のポートにおいて第１の光コリメータ（１０６）に連結し、第３のポートにおいて第２の光コリメータ（１１０）に連結することと、
前記光カプラ（１１２）の前記第２のポートからの第１の光ビームを、前記第１の光コリメータ（１０６）により、ダイクロイック・ミラー（１０８）および顕微鏡対物レンズ（１０３）を通じて、試料へと誘導することであって、前記試料が、調整型顕微鏡検査ステージ（１０２）によって支持される基板上に載せられる、誘導することと、
前記光カプラ（１１２）の前記第３のポートからの第２の光ビームを、再帰反射体（１１１）へと誘導することと、
前記基板で反射した前記第１の光ビームを捕捉し、分光計へ向けて、前記第１の光コリメータ（１０６）を経由し、前記光カプラ（１１２）の前記第２のポートに入り第４のポートから出るように送出することと、
前記再帰反射体（１１１）で反射した前記第２の光ビームを捕捉し、分光計へ向けて、前記第２の光コリメータ（１１０）を経由し、前記光カプラ（１１２）の前記第３のポートに入り前記第４のポートから出るように送出することと、
前記調整型顕微鏡検査ステージ（１０２）の位置を、前記反射された第１および第２の光ビームからの干渉信号の中で識別される３点のピークの放物線適合方法に基づいて移動させるための制御信号を生成することと
を含む、方法。
【請求項８】
前記再帰反射体の位置を、前記第２の光ビームの光路と前記第１の光ビームの光路とが整合するように調整することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記分光計が、回折格子へと光を向けるファイバ・コリメータと、前記回折された光をカメラ上にフォーカスする対物レンズとを備える、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の光コリメータ以降に前記試料へと向かう前記第１の光ビームを遮るためのメカニカル・シャッタを閉鎖することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
１つのピークに対応する前記試料の位置を設定点として設定することと、
前記試料の前記位置を監視することと、
誤差値を得るために、前記設定点から前記試料の現在位置を減算することと、
前記誤差値を最小化するために、前記調整型顕微鏡検査ステージの前記位置を移動させることと
をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／９７８，０８７号、および、２０１４年６月３日に出願された米国仮特許出願第６２／００６，９７２号の利益を主張するものである。米国仮特許出願第６１／９７８，０８７号および同第６２／００６，９７２号の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、概して顕微鏡検査装置に関し、より詳細には、適正なフォーカスを得るためのステージ位置の自動調整技法に関する。
【背景技術】
【０００３】
すべての光学システムと同様に、顕微鏡もまた、撮像レンズ（対物レンズ）の倍率およびＮＡ（開口数）が大きくなると、被写界深度は浅くなる。顕微鏡の使用時、使用者は、試料の適正なフォーカスを得るために、対物レンズを基準に、この試料を移動させる必要がある。顕微鏡検査が自動化され、使用者がもはや各画像の観察に関与しない場合、自動でフォーカスする方法が必要となる。当技術分野では、フロント・レンズと、コンテナ（たとえば、スライドやウェル・プレートなど）の底部との距離を計測することにより、オートフォーカスを達成する技法が開示されている。こうした技法は、第１の表面からの光ビームの反射と、その反射の測定に基づくものである。ただし、試料を載せるコンテナが、プラスチック製品の大半がそうであるように、その厚みに一貫性のないものであれば、得られる画像は、基板の歪み量だけフォーカスが外れたものとなり得る、という欠陥が、かかる技法には存在する。
【０００４】
細胞撮像は、ガラス、またはプラスチック基板の底における、細胞増殖に依拠したものである。細胞は、基板の表面、および、その細胞を基板に付着させる分泌タンパク質に対し、平行に増殖する。細胞増殖を継続させるには、細胞を養い、適正な生理学的条件を維持するための、高養分液状媒体が添加される。このシナリオでは、プラスチックの表面が水溶液で覆われる。この水溶液は、細胞の位置を検出するのに利用可能なものである。プラスチックと液体の間での屈折率変化は、低雑音、高感度の反射光設定を用いて、特定することが可能である。
【発明の概要】
【０００５】
一実施形態では、オートフォーカス顕微鏡装置が提供される。この装置は、光源と、第１のポート、第２のポート、第３のポート、および第４のポートを有する光カプラであって、光源からの光出力が第１のポートに連結されて第１の光ビームおよび第２の光ビームへと分かれ、第１の光ビームは第２のポートに対する出力であり、第２の光ビームは第３のポートに対する出力であり、第４のポートが分光計の入力に連結される、光カプラと、第１の光ビームを、光カプラの第２のポートから試料へと、ダイクロイック・ミラーおよび顕微鏡対物レンズを通じて向かわせるための第１の光コリメータであって、試料が、調整型顕微鏡検査ステージによって支持される基板上に載せられる、第１の光コリメータと、第２の光ビームを、光カプラの第３のポートから再帰反射体へと向かわせるための、第２の光コリメータとを備え、試料から反射した第１の光ビームが、第２のポートに戻って第４のポートから出るように導かれ、再帰反射体から反射した第２の光ビームが、第３のポートに戻って第４のポートから出るように導かれ、分光計が、反射された第１および第２の光ビームからの干渉信号に基づき、調整型顕微鏡検査ステージを制御するための制御信号を出力する。
【０００６】
別の実施形態では、顕微鏡検査装置を動作させるための方法が提供される。この方法は、光カプラを、第１のポートにおいて光源の光信号出力に連結し、第２のポートにおいて第１の光コリメータに連結し、第３のポートにおいて第２の光コリメータに連結することと、光カプラの第２のポートからの第１の光ビームを、光コリメータにより、ダイクロイック・ミラーおよび顕微鏡対物レンズを通じて、試料へと誘導することであって、試料が、調整型顕微鏡検査ステージによって支持される基板上に載せられる、誘導することと、光カプラの第３のポートからの第２の光ビームを再帰反射体へと誘導することと、基板で反射した第１の光ビームを捕捉し、分光計へ向けて、第１の光コリメータを経由し、光カプラの第２のポートに入り第４のポートから出るように送出することと、再帰反射体で反射した第２の光ビームを捕捉し、分光計へ向けて、第２の光コリメータを経由し、光カプラの第３のポートに入り第４のポートから出るように送出することと、調整型顕微鏡検査ステージの位置を、反射された第１および第２の光ビームからの干渉信号に基づいて移動させるための制御信号を生成することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】一実施形態による、オートフォーカス装置を示す図である。
【図２】一実施形態による、オートフォーカス・アルゴリズムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本開示は、本発明の実施に関し、現在想定される最良の形態を記述するものである。本記述は、限定的な意味で理解されることを意図したものではないが、本発明の利点および構造にかかわる当業者に対する教示のため、添付図面を参照することで例示のみを目的に提示される、本発明の実施例を提供している。各図面において、同様の参照記号は、同様または類似の部分を示している。すべての光ファイバ・システムは、空間にとらわれない均等物に置換え可能であることを留意されたい。
【０００９】
顕微鏡検査において、検査対象の試料体は、スライドに載せられ、スリップ・カバーによって被覆される。顕微鏡の対物レンズは、拡大された物体にフォーカスした視界が得られるように調整される。第１の屈折率を持つ第１の媒体の中を進む光が、第２の屈折率を持つ第２の媒体へと入る際、この２つの媒体の境界において、反射が発生する。境界で反射する光量、および、境界を通過する光量は、２つの媒体の屈折率に依存する。顕微鏡検査においては、たとえば、空気−ガラス、ガラス−水、水−ガラス、ガラス−空気、など、多種多様な境界が存在するのが通例であり、したがって、これらの境界に対応した、様々な屈折率が存在する。
【００１０】
一実施形態によるデバイスは、顕微鏡上の試料位置を検出することが可能である。この試料は、顕微鏡スライドとカバースリップの間に固定された標本、または、ウェル・プレート内の標本となり得る。デバイスは、フレネル反射を通じて屈折率境界を識別することにより、試料の位置を追跡する。屈折率の変化は、カバースリップの上面と底面、スライドの上面、ウェル・プレートの底面、または、ウェル・プレート内のウェル底と対応し得る。光干渉断層撮影法（ＯＣＴ）を使用することにより、これらの反射は、対物レンズを基準とした、これら表面の位置を導く、試料の前後走査を行うために利用される。デバイスは、対物レンズの焦平面からの試料位置に変動があれば、それを補償することにより、オートフォーカス・システムとして機能する。
【００１１】
デバイスは、以下に示す５つの主要な構成要素を備えている。
１．顕微鏡。Ｚ軸ピエゾ・ステージ上に固定された試料を撮像するのに使用する。
２．試料アーム。位置検出に必要な干渉信号の生成に用いる２本のアームの片方である。顕微鏡において、チューブ・レンズの前または後に挿入することができる。
３．参照アーム。干渉信号の生成に用いる、第２のアームである。このアームは、対物レンズの違いがもたらす経路長の違いを補償し、自己相関信号のために物質的特徴を分離させるためにも使用される。
４．ベース・ユニット。ＯＣＴの使用を通じた表面検出を可能にする。このベース・ユニットには、試料からの前後走査を行い、分析するのに必要な要素が含まれる。
５．コンピュータ。信号の取得と分析に用いる、ＮＩ−ＤＡＱカードおよびソフトウェアを含む。ソフトウェア内で得られた測定値に基づき、補正信号をＺ軸ピエゾ・ステージに適用することで、試料を対物レンズの焦平面内に留めることが可能となる。
【００１２】
図１には、顕微鏡および試料アームが、撮像経路および試料アーム経路とともに示されている。撮像経路には、半導体レーザ・ダイオード（ＳＬＤ）などの光源１０１が含まれ、この光源が、試料ステージ１０２に載せられた試料に対し、照明を提供する。試料ステージは、Ｘ、Ｙ、およびＺ方向に移動させることができる。たとえば、試料ステージは、電動Ｘ−Ｙステージと、Ｚ軸ピエゾ・ステージとを備える。対物レンズ１０３は、特定の視界を得るのに必要な、様々な型や倍率のものとすることができる。チューブ・レンズ１０４は、試料撮影のため、光をカメラ１０５（ＣＣＤなど）へと向ける。
【００１３】
一実施形態では、試料アームが、ベース・ユニットからの７８０ＨＰ  ＡＦＣ  Ｎｕｆｅｒｎファイバ、パドル偏光コントローラ、調整型ＡＦＣコリメータ１０６、平凹レンズ１０７、および、可視光を透過させＩＲは反射するダイクロイック・ミラー１０８を備える。ダイクロイック・ミラーは、カメラとチューブ・レンズの間、もしくは、チューブ・レンズと対物レンズの間に挿入することができる。後者の場合、平凹レンズは不要である。図１には、シャッタ１０９も示されている。
【００１４】
一実施形態では、参照アームが、ベース・ユニットからの７８０ＨＰ  ＡＰＣ  Ｎｕｆｅｒｎファイバ、パドル偏光コントローラ、固定フォーカスＡＰＣコリメータ１１０、および、再帰反射体１１１までの経路長を変更するための電動ステージを備える。
【００１５】
一実施形態では、ベース・ユニットが、超輝度光源を備える。たとえば、この光源は、出力電力が２．５ｍＷ、中心波長が９３０ｎｍ、スペクトル領域が９０ｎｍであると好ましい。ベース・ユニットはまた、５０：５０ファイバ・カプラ１１２を備える。この５０：５０ファイバ・カプラ１１２は、その第１のポートを通じてＳＬＤに、第２のポートを通じて試料アームに、第３のポートを通じて参照アームに、第４のポートを通じて分光計に向かうコリメータに連結されている。一実施形態では、ベース・ユニットはまた、駆動電子素子を備える。この駆動電子素子により、ＳＬＤ用定電流ドライバ、サーボ・ループ制御型ペルチェ・クーラ、ヒータ・ドライバ、および、分光計画像センサ・ドライバが提供される。一実施形態では、分光計が、ファイバ・コリメータ１１３、回折格子１１４、対物レンズ１１５、および、カメラ１１６を備える。一実施形態では、システム・コンピュータが、ＮＩ−ＰＣＩｅ−６３５１  ＤＡＱコントローラと、信号の検出および制御を実行するように構成された、アプリケーション・ソフトウェアとを備える。
【００１６】
図２は、一実施形態による、オートフォーカス・システムの動作フローを示している。ステップ２０１において、カメラのピントに合うように、画像が調整される。ステップ２０２において、試料アームの光路長と整合するように、参照アームが走査される。ピークが見えると、同参照アームは、最も強いピークがＡ走査上の視界に来るよう走査される。ステップ２０３は撮像処理であり、ここで信号がデチャープされ、ＤＣスペクトルが除去され、スペクトルが４０サイクルにわたって平均化される。
【００１７】
次いで、アポダイゼーションが実行される。ステップ２０４において、コリメータ以降の試料アーム内のレーザを遮るために、メカニカル・シャッタが閉じられる。ステップ２０５において、ソフトウェアを通じて、スペクトルがアポダイズされる。
【００１８】
次いで、分散補償が実行される。ステップ２０６において、最大ピークがスペクトル上で識別される。この場合、位置分解能は、ピクセル幅（３．３５１μｍ）が限界となる。ステップ２０７において、サブピクセル分解能を提供するため、最大データ点および隣接する２つのデータ点に放物線が合わされる。ステップ２０９において、ピーク幅が測定される。ステップ２０９において、数的な２次分散係数が、ピーク幅に対してインクリメントおよびプロットされる。ステップ２０１において、ピーク幅が最小となるように、分散係数が設定される。
【００１９】
次いで、試料ピーク検出が実行される。ステップ２１１において、３つの最大ピークが識別される。ステップ２１２において、上記３つのピークすべてに対し、放物線適合方法が適用される。
【００２０】
次いで、ピーク追跡が実行される。ステップ２１３において、使用者が対物レンズを調整して、カメラの画像にフォーカスする。使用者は、スライド上面の現在位置（Ａ走査における第３のピーク）を追跡するよう、ソフトウェアに命令する。この位置は設定点となる。ステップ２１４において、スライドの上面位置が監視される。この位置は処理変数となる。誤差値を得るために、この処理変数が設定点から減算される。
【００２１】
ピーク位置が変化すると、誤差も変化して、対物レンズの焦平面からの試料の変位が反映される。ステップ２１５において、Ｚピエゾ・ステージまでの誤差に基づいて電圧を供給するため、ＰＩＤ制御ループが使用される。電圧は、試料の位置を変化させるとともに、誤差値を最小化するように変更される。誤差を最小化することにより、試料の位置を、対物レンズの焦平面内に留めることが可能となる。
【００２２】
本発明について、いくつかの実施形態の記述に関し、ある程度の長さにわたって幾分入念に説明したが、こうした細目や実施形態、すなわち特定の実施形態に本発明が限定されることは意図しておらず、むしろ、添付される特許請求の範囲を参照することにより、かかる請求について、先行技術も勘案したうえで考えられ得る最も広義な解釈が与えられ、したがって、本発明の意図する範囲が効果的に包含されるように読み取られたい。さらに、以上の記述は、本発明者が予見し、実施可能要件を充足する記載が利用可能であった、実施形態を用いて本発明を説明したものであるが、本発明に関す非実質的な修正形態もまた、現時点では予見されないものの、本発明の均等物を示し得るものとなる。
【図１】
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【図２】
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