(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に開示されるアミノ酸配列を有する抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質断片を少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌ含む卵黄。
【請求項２】
卵黄を噴霧乾燥した請求項１に記載の卵黄。
【請求項３】
前記噴霧乾燥した卵黄を少なくとも４グラム摂取した後６０〜１２０分の間に、それを必要とする患者に少なくともＡＦ０．５単位を誘導することを更に特徴とする請求項２に記載の卵黄。
【請求項４】
雌鶏を含むキジ類の鳥など、家禽の卵を由来とする請求項１〜３の何れか１項に記載の卵黄。
【請求項５】
浮腫、下痢、脱水症及び炎症からなる群から選択される疾患の何れか１種の治療及び／又は予防に使用するための、請求項１〜４の何れかに記載の卵黄を含む医薬。
【請求項６】
例えば飼料、食物及び／又は補助食品等の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質富化機能性食品の調製のための、請求項１〜４の何れかに記載の卵黄の使用。
【請求項７】
請求項１〜４の何れかに記載の卵黄を含む食物、飼料及び／又は補助食品。
【請求項８】
パンケーキ、オムレツ、アイスクリーム、固茹で又は半熟卵、ソフトドリンク、ヨーグルト、パン、ビスケット、パスタ、穀物、フレーク、粥、雑炊、電解質を含むか又は、含まない飲料組成物、肉および肉製品、脂肪および脂肪製品、乳および乳製品を含む食品調製物、並びにブロック食品（ｆｏｏｄｂａｒ）からなる群から選択される請求項７に記載の食物。
【請求項９】
浮腫、下痢、脱水症及び炎症からなる群から選択される疾患の何れか１種の治療及び／又は予防に使用するための、請求項１〜４の何れかに記載の卵黄及び適切な医薬担体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
適切な薬学的担体が、水及びＰＢＳからなる群から選択される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
配列番号１に開示されたアミノ酸配列を有する、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質断片０．０５ｎｇ／ｍｌを含み、更に、それを必要とする患者内で少なくともＡＦ０．５単位を誘導することを特徴とする請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜４の何れかに記載の卵黄の産生方法であって、
ａ  トリプトファンを１．４〜２ｇ／ｋｇ飼料を含み、かつペレット状の形態で供与する家禽用ＡＦ−１６誘導飼料を少なくとも４週間、家禽類に給餌し、その後
ｂ  前記家禽から採卵し、
ｃ  卵黄と卵白とを分離し、及び、或いは、
ｄ  凍結乾燥、流動床乾燥、粉砕、浸出、抽出、蒸発、膜ろ過、及び／又は前記卵黄の乾燥を含む前記方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の卵黄の産生方法であって、
ｅ  トリプトファンを１．４〜２ｇ／ｋｇ飼料を含み、かつペレット状の形態で供与する家禽用ＡＦ−１６誘導飼料を、少なくとも１２週間、家禽類に給餌することを含む前記方法。
【請求項１４】
前記家禽が、雌鶏を含むキジ類の鳥である、請求項１２又は１３に記載の卵黄の産生方法。
【請求項１５】
浮腫、下痢、脱水症及び炎症からなる群から選択される疾患の何れか１種の治療及び／又は予防に使用するための医薬品を調製するための、請求項１〜４の何れかに記載した卵黄の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、極めて高含量の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特に、配列番号１（ＡＦ−１６）及び／又は配列番号２（ＡＦ−８）で示されるようなアミノ酸配列から本質的になる極めて高含量のＡＦタンパク質断片、を有する卵黄を産生する方法に関し、その方法とは、例えば雌鶏等の家禽に、少なくとも１２週間、遊離トリプトファンを少なくとも０．１４％又は飼料１Ｋｇ当たり１〜２ｇのトリプトファンを含む、家禽用ＡＦ−１６誘導ペレット化飼料を給餌し、その後、家禽から採卵し、卵白と卵黄とを分離し、或るいは、前記卵黄を、噴霧乾燥、流動床乾燥、粉砕、浸出、抽出、蒸発、膜ろ過し、及び／又は凍結乾燥させることを含む。
【０００２】
本発明は、更に、本明細書で記載した方法に従って産生した、極めて高含量の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質及びその断片を有する前記卵黄に関し、及び、例えば、例外的高レベルの体液排出により起こる異常な生理的状態の治療及び予防のための機能性食物製品及び医薬製品の調製のためのそれらの使用に関する。本発明は、又、そのように調製された食物製品及び医薬製品に関する
【０００３】
定義
タンパク質は、ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基によって構成される生物学的高分子である。アミノ酸の線状ポリマーとしてのタンパク質は、また、ポリペプチドとも称する。通常、タンパク質は５０〜８００個のアミノ酸残基を有し、従って約６、０００〜約数十万ダルトン又はそれを超える範囲の分子量を有する。小さなタンパク質は、ペプチド、ポリペプチド、又はオリゴペプチドと称す。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」及び「ペプチド」は、本明細書において互換的に使用し得る。ペプチドは、２〜５０個のアミノ酸残基（ａａ）のような非常に些少のアミノ酸残基を有していても良い。
【０００４】
本明細書において、「医薬組成物」とは、治療的に有効量の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質を、場合により医薬的に有効な賦形剤、例えば担体又はビヒクルと組み合わせて、含む組成物を意味する。前記医薬組成物は、適切な投与経路のために製剤され、患者の状態、並びに年齢又は好ましい選択などの他の要因に応じて変動し得る。抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質を含む医薬組成物は、薬剤送達系として役立て得る。投与された医薬組成物は、ヒト又は動物の身体に有効物質を呈示する。前記医薬組成物は、例えば、錠剤、丸剤、トローチ剤、カプセル化剤、座薬（ｓｔｏｏｌ  ｐｉｌｌｓ）、ゲル剤、溶液剤などの形状でも良いが、これらに限定する訳ではない。
【０００５】
用語「医薬的に有効な塩」とは、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、ペプチド、又はポリペプチドの塩、若しくは、所謂ホフマイザー（Ｈｏｆｍｅｉｓｅｒ）系列に基き、それらから誘導し得る塩の相同体及び／又は断片を意味する。医薬的に有効な塩の他の例としては、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、硫酸塩及び塩化物等を含むが、本発明はそれに限定する訳ではない。
【０００６】
用語「抗分泌性」とは、本明細書において、分泌及び／又は体液移動を阻害又は低減することをを意味する。従って、用語「抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質」とは、体内における液体移動並びに分泌を阻害するか若しくは低減するか、又は、そうでなければ調節できるタンパク質の種類を意味する。
【０００７】
本明細書において、「同等の有効性」とは、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、ペプチド、又はポリペプチド、又は、そのホモログ、誘導体及び／又は断片の生物学的効果、即ち、グリア芽細胞腫の治療に於ける、療法及び／又は使用を改善する能力を意味する。そのような能力を試験し、及び／又は測定するために標準化された例は、当技術分野においては周知である。
【０００８】
本明細書における用語、「抗分泌性因子タンパク質」、「抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質」、「ＡＦ−タンパク質」、ＡＦ、又はそのホモログ、誘導体若しくは断片は、特許文献１に定義されている用語「抗分泌性因子」又は「抗分泌性因子タンパク質」と互換的に使用しても良く、及び、抗分泌性及び／又は同等に機能的、及び／又は類似した、有効性を有する、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質又は、その、ペプチド若しくはホモログ、誘導体及び／又は断片を意味し、又はポリペプチドの機能の変更を伴わないその改変体を意味する。
【０００９】
従って、本明細書における「抗分泌性因子」、「抗分泌性因子タンパク質」、「抗分泌型ペプチド」、「抗分泌型断片」又は「抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質」もまた、その誘導体、相同体又は断片を意味し得る。本発明の明細書において、これらの用語のすべてを、互換可能に使用しても良い。さらに、本明細書において、用語「抗分泌性因子」は、「ＡＦ」と略記しても良い。本明細書中の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質はまた、以前、特許文献１及び２で定義された抗分泌性特性を有するタンパク質を意味する。抗分泌性因子は、又、例えば、特許文献３にも開示されている。以下に、更に記載するように、抗分泌性因子という用語は天然のものを意図し、及び／又は特許文献４及び特許文献２に開示されている抗分泌性因子を富化した卵黄中の自然の、抗分泌性因子をも又、意図している。
【００１０】
以下、用語「ＮＡＳＰ」を「天然抗分泌性タンパク質」（ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｔｉｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に使用する。
【００１１】
用語「ＡＳＰ」は、天然抗分泌性タンパク質に含まれる「抗分泌性タンパク質」（ａｎｔｉｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に使用する。
【００１２】
本明細書では、「機能性食物製品」は、健康を良くする機能を有する、即ち、ヒト又は動物の健康に有益な効果を有する食品を意味する。
【００１３】
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＡＦ：抗分泌性因子
全長ＡＦタンパク質（配列番号１に示した）
ＡＦ−６：ヘキサペプチドＣＨＳＫＴＲ（配列番号２に示した）
ＡＦ−１６：アミノ酸ＶＣＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬから構成されるペプチド（配列番号３に示した）
ＡＦ−８：セプタペプチドＶＣＨＳＫＴＲ（配列番号４に示した）
オクタペプチドＩＶＣＨＳＫＴＲ（配列番号５に示した）
ペンタペプチドＨＳＫＴＲ（配列番号６に示した）。
ＳＰＣ：特別に加工した穀類
ＲＴＴ：ＡＦ（ＡＳＰ）の含有量を測定するために特許文献４に掲載されたラット小腸における標準化された分泌反応を測定する方法。
【００１４】
背景
特許文献５は、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の形成を誘導する食物の生産のための酵素活性を有する製品の使用を開示している。特許文献２は、更に、天然の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質そのもので冨化した食物製品を開示している。
【００１５】
特許文献４から、動物の飼料にある特定の糖、アミノ酸及びアミドを添加することにより、抗分泌性因子又は抗分泌性タンパク質（ＡＳＰ、ＦＩＬとも命名されている）の形成が刺激され得ることが知られている。興味深い量でＡＳＰを形成するために、使用されるこれらの物質の種類及び量は、その特許に開示された方法により決定されている。簡単に言えば、この方法は、ラットの小腸内の標準化された分泌応答の測定を含む。この特許から、誘導されたＡＳＰｓが体液の腸への直接的分泌を形成することが明らかである。前記特許では、天然の抗分泌性タンパク質の含量又は量は、コレラ毒素に暴露された実験用ラットの小腸への液体分泌に及ぼす効果によって定義される。ＡＳＰ１単位（ＦＩＬ単位）は、ＡＳＰを含まない対照と比較して、腸における体液の流量が５０％低減することに相当する。抗分泌性タンパク質は極めて僅少でも有効であり、従って、その質量よりもその効果により、決定する方がより容易である。
【００１６】
ＰＣＴ出願  特許文献６から、ある種の抗分泌性タンパク質の構造が知られており、それらの有効部分の特性が明らかにされている。組換え遺伝子工学又は固相技術によって調製され、明確な構造を有する合成したＡＳＰは、生体細胞膜上を流れる体液を全般的に制御する影響力を有することが示されている。
【００１７】
ＰＣＴ出願  特許文献７から、酵素活性を有する特定種の食物を摂取すると、体内でＡＳＰの形成を誘導し得ることが知られている。誘導効果及びそのためのＡＳＰの形成は、個体及びその症状によって変化し、しかも、その強度及び誘導期間はこれまでのところ、予測できない。然しながら、それらは後で測定出来、前記測定指針を用いて、必要な修正を行うことが出来る。
【００１８】
発明者らが、特許文献４に従って、飼料を調製し、抗分泌性タンパク質の形成を刺激する研究を継続している間は、形成した天然の抗分泌性タンパク質の合成能力及び濃縮は体内で最も不均一に分布していることが知られていた。ある特定の臓器、体の部分又は体液、特に鳥の卵の卵黄内に、極めて高レベルのＮＡＳＰが見出されていた。特許文献８にはこの事実と、その結果を受けた、ＮＡＳＰについて冨化させた卵黄の使用を開示している。特許文献８は、体液の極端な排出によって起こる生理学的に異常な状態の治療及び予防のために、ＮＡＳＰを富化した食料製品及び医薬品の調製を一般的に、開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際特許公開第９７／０８２０２号
【特許文献２】国際特許公開第００／３８５３５号
【特許文献３】国際特許公開第０５／０３０２４６号
【特許文献４】スウェーデン国特許第９００００２８−２号（公開番号４６６，３３１号）
【特許文献５】国際特許公開第９８／２１９７８号
【特許文献６】ＰＣＴ／ＳＥ９６／０１０４９
【特許文献７】ＰＣＴ／ＳＥ９７／０１９１８（国際特許公開第９８／２１９７８号）
【特許文献８】国際特許公開第００８５３５号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
例えば、国際特許公開第００８５３５号に、以前記述された卵黄とは対照的に、本発明で初めて記述する、卵黄は、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の含量が極めて高く、特に、配列番号１（ＡＦ−１６）及び／又は配列番号２（ＡＦ−８）に開示している様なアミノ酸配列を有する前記因子（ＡＦ）タンパク質断片を一定かつ高い含量で有する。本明細書中に開示した卵黄は、配列番号１及び／又は配列番号２（ＡＦ−８）に開示している様なアミノ酸配列を有する抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質断片を少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌ含む。卵黄は、流体形状であってもよいし、或いは噴霧乾燥又は流動床乾燥してもよく、更に、前記凍結乾燥卵黄を少なくとも４グラム摂取した後６０−１２０分の間に、それを必要とする患者に少なくともＡＦ０．５単位を誘導するという特性を有し、これは国際特許公開第００８５３５号に記載されている卵黄により誘導し得る早さの少なくとも２倍の速さである。
【００２１】
本発明による卵黄は、通常、雌鶏のようなキジ類等の家禽からの卵に由来するものでも良い。
【００２２】
本発明による卵黄は、極めて高い含量の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特に配列番号１（ＡＦ−１６）に示す様な、極めて高い含量のＡＦタンパク質断片を有する卵黄を産生する方法によって産生し、その方法とは、例えば雌鶏等の家禽に、少なくとも１２週間、遊離トリプトファンを少なくとも０．４％含む、家禽用ＡＦ−１６誘導ペレット化飼料を給餌し、その後、その家禽から採卵し、卵白と卵黄を分離し、或るいは、前記卵黄を、噴霧乾燥、流動床乾燥、粉砕、浸出、抽出、蒸発、膜ろ過し、及び／又は凍結乾燥させることを含む。
【００２３】
一実施形態では、本発明による卵黄は、極めて高い含有量の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特に配列番号２（ＡＦ−８）に示すような極めて高い含有量のＡＦタンパク質断片を有する卵黄を産生する方法により産生し、その方法とは、例えば雌鶏等の家禽に、少なくとも１２週間、遊離トリプトファンを少なくとも０．４％含む、家禽用ＡＦ−８誘導ペレット化飼料を給餌し、その後、家禽から採卵し、卵白と卵黄を分離し、或るいは、前記卵黄を、噴霧乾燥、流動床乾燥、粉砕、浸出、抽出、蒸発、膜ろ過し、及び／又は凍結乾燥させることを含む。
【００２４】
本発明による卵黄は、極めて高い含有量の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特に配列番号１（ＡＦ−１６）及び／又は配列番号２（ＡＦ−８）に示すような極めて高い含有量のＡＦタンパク質断片を有する卵黄を産生する方法によって産生し、その方法とは、例えば雌鶏等の家禽に、少なくとも１２週間、遊離トリプトファンを少なくとも０．４％含む
、家禽用ＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８誘導ペレット化飼料を給餌し、その後、家禽から採卵し、卵白と卵黄を分離し、或るいは、前記卵黄を、噴霧乾燥、流動床乾燥、粉砕、浸出、抽出、蒸発、膜ろ過し、及び／又は凍結乾燥させることを含む。
【００２５】
本発明の一実施形態では、本発明による方法によって産生した卵黄は医薬品中で使用される。現時点で好ましい実施形態において、前記卵黄は、極端な体液排出により起こる、下痢、炎症性疾患、浮腫、自己免疫疾患、癌、腫瘍、白血病、糖尿病、真性糖尿病、グリア芽細胞腫、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、脳炎、およびメニエール病から成る群から選択される疾患様の状態の治療及び予防に使用されるが、これら疾患に限定する訳ではない。
【００２６】
現時点で、同等に好ましい実施形態では、前記卵黄を、神経保護のために、コンパートメント及び／又は細胞性薬剤の取込みの最適化に用いるために使用する。
【００２７】
本発明は、また、極端な体液排出、下痢、炎症性疾患、癌、グリア芽細胞腫、ＡＤ、及び／又はＰＤにより起こる疾患様の状態の治療及び予防のための医薬を調製するために、本発明の方法により産生する卵黄の使用についても指向している。本発明は、又、コンパートメント及び／又は細胞性薬剤の取込みを最適化するため、及び／又は神経保護のための医薬を調製するために、本発明の方法により産生する卵黄の使用を指向している。
【００２８】
本発明はまた、極端な体液排出、下痢、炎症性疾患、癌、グリア芽細胞腫、ＡＤ、及び／又はＰＤにより起こる疾患様の状態の治療及び予防のための方法を指向し、その方法は、本発明の方法により産生した医薬的に有効量の卵黄をそれを必要とする被験者に投与することを含む。本発明は、又、コンパートメント及び／又は細胞性薬剤の取込みを最適化するための、及び／又は神経保護のための方法を指向し、その方法は本発明の方法により産生した医薬的に有効量の卵黄をそれを必要とする被験体に投与することを含む。
【００２９】
本発明の卵黄は、飼料、食品及び／又は食品補助品等の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質富化機能性食品の調製に使用し得る。結果として、本発明による卵黄を含む前記食物、飼料及び／又は食品補助品も同等に開示される。本発明による卵黄を含むこのような食物は、パンケーキ、オムレツ、アイスクリーム、堅茹卵又は半熟卵及びソフトドリンク、ヨーグルト、ブロック食品（ｆｏｏｄｂａｒ）などからなる群から選択しても良い。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、本発明による卵黄及び適切な医薬担体を含む医薬組成物に関する。通常、適切な医薬担体は、水、ＰＢＳなどからなる群から選択される。
【００３１】
１つの特定の実施形態は、本発明による卵黄を含む医薬組成物に関し、配列番号１に開示されているようなアミノ酸配列を有する抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質断片０．０５ｎｇ／ｍｌを含み、それは、更に、それを必要とする患者に少なくともＡＦ０．５単位を誘導するという特性を有する。
【００３２】
本発明は、極めて高含量の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特に、配列番号１（ＡＦ−１６）及び／又は配列番号２（ＡＦ−８）で示されるアミノ酸配列から本質的になる極めて高含量のＡＦタンパク質断片、を有する卵黄を産生する方法に関し、その方法とは、例えば雌鶏等の家禽に、少なくとも１２週間、遊離トリプトファンを少なくとも０．１４％を含む家禽用ＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８誘導ペレット化飼料を給餌し、その後、その家禽から採卵し、卵白と卵黄とを分離し、或るいは、前記卵黄を、噴霧乾燥、粉砕、浸出、抽出、蒸発、膜ろ過、流動床乾燥、及び／又は凍結乾燥させることを含む。前記家禽は、通常、雌鶏等のキジ類の鳥である。
【００３３】
本発明による卵黄を産生する方法で、ＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８誘導飼料の家禽への給餌は、或いは、少なくとも１５、１６、１７又は１８日週間など、少なくとも１３又は１４週間でも良い。
【００３４】
結果として、本発明は又、本明細書に記載した方法に使用可能な家禽用の、ＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８を誘導する飼料にも関し、前記飼料は、その飼料を摂取後の家禽においてＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８の形成が刺激されるような量及び割合のアミノ酸、糖及びアミド、及び／又は麦芽穀類を更に含んでも良い。
【００３５】
本発明の一実施形態では、家禽用のＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８誘導飼料は、遊離トリプトファンを少なくとも０．１４〜１％、例えば遊離トリプトファンを少なくとも０．７％又は少なくとも０．１４％含み、かつペレット化した形状である。本明細書に記載した方法に従って産生された卵黄は、現時点で好ましい実施形態において、配列番号１に開示されているようなアミノ酸配列を有する抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質断片を少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌ含むという特性を更に有する。  別の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って産生された卵黄は、配列番号２に開示されているアミノ酸配列を有する抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質断片を少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌ含むという特性を更に有する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
卵黄
本明細書に記載の方法で産生した卵黄は、現時点で好ましい実施形態において、配列番号１及び／又は配列番号２に開示しているようなアミノ酸配列を有する抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質断片を少なくとも０．０５ｎｇ／ｍｌ含むという特性を更に有する。
【００３７】
食物と補助食品
本発明は、一般に、極端な体液排出により、起こる異常な生理学的状態の治療及び予防のための、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６を富化した機能性食品、及び医薬品を調整するための、卵黄の使用に関する。
【００３８】
別の態様によれば、本発明は、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８等を含有する特定の栄養目的の、及び医薬品用の糧食を調製するための使用に関する。
【００３９】
「食品」という表現は、本明細書では、ヒト用の食物及び動物用の飼料を含むことを企図している。食物は、パンケーキ、オムレツ、アイスクリームおよび様々な種類のパンなどの製品の形態の物品でも良く、その調製には卵黄が含まれる。卵黄はまた、卵酒又は堅茹で卵、若しくは半熟卵の形態で摂食し得る。食物はまた、パン、ビスケット、パスタ、穀物及びフレーク、粥又は雑炊の形態であってもよく、あるいは電解質を含む又は含まない様々な飲料組成物に混入しても良く、肉及び肉製品、脂肪及び脂肪製品、又はミルク又は特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８のような抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質が濃縮された乳製品を含む食品調製物でも良い。特に、ＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８のような抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質は、多かれ少なかれ精製された形態で食品中に混合しても良い。食品調製物は、熟練者が有する知識を使用して、嗜好性及び食事の変化に関する要件に従い、自由なままに創り上げても良い。
【００４０】
卵黄は、通常、ヒト及び動物の摂取に使用し得る鳥の卵に由来し、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８のような抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質を極めて高い含量で含む。卵は、好ましくは雌鶏の産卵によって産生されるが、例えば家鴨、七面鳥、鶉、及びダチョウから得ても良い。
【００４１】
特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８のような抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質を極めて高い含量で有する食物又は飼料は、その食品を摂取したときに、健康に望ましい価値ある効果を提供する様な濃度の前記タンパク質又はタンパク質断片を含む。
【００４２】
一実施形態では、現在開示している方法により産生した卵黄の少なくとも４ｇを摂取することにより、それを必要とする患者の血液中に少なくともＡＦ０．５単位、即ち、ＦＩＬ単位／血液ｍｌのレベルが０．５ＦＩＬ単位／血液ｍｌを超えて誘導する。健康な人は、通常、血液中のＡＦ単位のレベルとして０〜０．５ＦＩＬ単位／血液ｍｌの間を有する。
【００４３】
抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特に、ＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８産生物等を刺激したとき、驚くべきことにかつ予想外にも、その断片を含む極めて高いレベルの抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８等が鳥の卵の中に誘導し得ることを示した。
【００４４】
医薬組成物
卵黄中で産生される抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質及びその断片、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８は、例えば特定の吸着カラム上で濃縮し、溶離し、回収し、および／または濃縮しても良く、その後、それぞれ飼料または食品と混合し、動物またはヒトに投与しても良く、又は、多かれ少なかれ単離した製品として、医薬品またはその他の健康製品として調製し、及び製剤しても良い。そのような医薬品を、担体及び希釈剤等を含む許容される賦形剤を用いて当業者既知の方法で調製し、企図する投与経路に依存する固体又は液状形態として製剤する。
【００４５】
本明細書で想定している医薬組成物は、好ましくは経口摂取用に製剤され、経口的に投与される。
【００４６】
抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質及び／又はその断片、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８、を富化した食品の調製のために本発明を使用する別の実施形態によれば、卵黄そのまま、若しくは完全な卵での使用がなされ、おそらく、食物若しくは飼料と混合するために、加工形態で使用する。抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６−及び／又はＡＦ−８を富化した卵黄産生品を、食物又は飼料と混合するための実用的な目的に適合させるための加工工程には、粉砕、浸出、抽出、蒸発、限外濾過、乾燥及び他の標準操作を任意に含み得る。
【００４７】
通常、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８等の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質を、噴霧乾燥卵黄粉末４ｇ〜８ｇの用量で１日に１回又は２回投与する。
【００４８】
特定の状態では、更に高用量の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８を要求され得る。そのような場合、卵黄から単離された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８は、任意の食品又は単離された抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８に添加しても良く、錠剤又は懸濁液の形態での摂取のために調製しても良い。
【００４９】
特に好ましい態様は、噴霧乾燥による卵黄粉末の調製を含む。このような製品は、当該食品を摂取することが、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６および／またはＡＦ−８等の有益な効果を達成することが望ましい場合に、種々の食品の工業的工程において、特に好適である。卵黄粉末自体は、ソーセージやアイスクリームのような全く異なる製品によく混合され、そのため、食事の特性について広範なバリエーションを達成し得るだろう。
【００５０】
例えば医薬品を後で調製するために、浸出又は抽出を経て富化又は濃縮した抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８等の産生物の調製を望む場合には、卵黄粉末は中間体として最も適している。
【００５１】
抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、及び特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８等の断片の分子量は相対的に低いために、比較的熱安定性があり、従って、摂取するための同一物を、調製前に食品中に含有させても良い。
【００５２】
本発明の一実施形態では、本発明による医薬組成物は、医薬的に許容される賦形剤をさらに含む。本発明による医薬的に許容される賦形剤及びその使用時の最適濃度は、当業者による実験で容易に選択し決定出来る。本発明に使用する医薬的に許容される賦形剤としては、溶媒、緩衝剤、保存剤、キレート化剤、酸化防止剤、及び安定化剤、乳化剤、懸濁化剤及び／又は希釈剤が挙げられる。本発明の医薬組成物は、従来の医薬的実践書に従って、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”、２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ  ０−７８１７−４６７３−６」又は「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  Ｊ．，
ＩＳＢＮ：０−８２４７−２１５２−７．」により、製剤し得る。医薬的に許容される賦形剤とは、その組成物を投与される個体に対して実質的に無害な物質である。そのような賦形剤は、通常、国の保健当局が付与する要件を満たしている。公的薬局方、例えば、英国薬局方、米国薬局方及び欧州薬局方は、医薬的に許容し得る賦形剤の基準を定めている。
【００５３】
以下は、本発明の医薬組成物において、場合により使用する関連組成物のための概説である。この概説は、特定の投与経路に基づく。然しながら、医薬的に許容し得る賦形剤が異なる剤形又は組成物で使用され得る場合、特定の医薬的に許容し得る賦形剤の適用を、特定の剤形又は賦形剤の特定の機能に限定する訳ではないことは理解されたい。本発明を、以下に述べる組成物の使用に限定すべきではないことは強調しておく。
【００５４】
非経口組成物
全身適用のために、本発明の組成物は、従来の無毒性の、微小球体及びリポソームを含む、医薬的に許容し得る担体及び賦形剤を含み得る。
【００５５】
本発明に使用するための組成物は、あらゆる種類の固体、半固体及び流体組成物を含み得る。
【００５６】
医薬的に許容し得る賦形剤は、溶媒、緩衝剤、保存剤、キレート化剤、抗酸化剤、及び安定化剤、乳化剤、懸濁化剤及び／又は希釈剤を含み得る。
【００５７】
本発明の医薬組成物は、１つの状況では、局所的に又は静脈内の末梢注入を介して、又は筋肉内もしくは患者への皮下注射によって、又は頬側、肺内、鼻内、皮膚又は経口経路を介して投与しても良い。更に、外科的に挿入されたシャントを介して患者の脳室に医薬組成物を投与することも可能である。
【００５８】
一実施形態において、本発明に従って使用される医薬組成物は、眼内、局所、鼻腔内、経口、皮下及び／又は全身投与のために製剤される。選択される投与経路は、治療する患者の状態及び患者の年齢及び性別などに応じて変化する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、懸濁液として、又はより好ましくはスプレー、エアロゾル、吸入器又は噴霧器を用いて鼻及び／又は気道に吸入するための粉末として適用することにより、投与される。
【００５９】
抗分泌性因子を含む粉末の投与は、安定性及び投与量に関して、追加的な利点を有する。本発明による医薬組成物はまた、局所的に、眼に、鼻に、経口的に、皮下に適用しても良く、及び／又は血管を介して、全身的に投与しても良い。好ましい実施形態において、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、局所、経口又は経鼻投与のために製剤する。通常、眼への局所的適用として使用する場合、本発明の組成物中で適用される濃度は、１適用当たり１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは５０〜５００μｇであり、一日あたり単回投与でも、一日あたり数回繰返す（多数回投与）でも良いが、これに限定する訳ではない。
【００６０】
血液に全身投与する場合の用量は、１適用及び、体重ｋｇ当たり０．１μｇ〜１０ｍｇの範囲内であり、例えば、１適用及び体重ｋｇ当たり０．１μｇ〜１ｍｇ、好ましくは１〜５００、例えば１〜１０００μｇ／ｋｇ体重である。抗分泌性因子を富化した卵黄を本発明に従って使用する場合、この製剤は経口投与するのが好ましい。
【００６１】
本発明の一実施形態において、前記医薬組成物は、医薬的に許容し得る賦形剤をさらに含む。このような賦形剤は、特定の目的に適するように選択される任意の好ましい賦形剤でも良い。
【００６２】
抗分泌因子（ＡＦ）
抗分泌性因子は、体内で自然に生じるタンパク質の一種である。抗分泌因子（ＡＦ）は、４１ｋＤａのタンパク質であり、最初に、記載されたのは下痢症及び腸炎症に対しての防護を提供するためであった（概説については、Ｌａｎｇｅ  ａｎｄＬoｎｎｒｏｔｈ、２００１、参照のこと）。抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質は配列決定され、そのｃＤＮＡがクローニングされている。ヒト抗分泌性因子ＡＦタンパク質は、４１ｋＤａのタンパク質であり、脳下垂体から単離した場合、３８２〜２８８個のアミノ酸を含む。本発明のグリア芽細胞腫の治療に及ぼす有益な効果に関する活性部位は、タンパク質のＮ末端に近い領域内のタンパク質に局在化し、特に、配列番号４のアミノ酸１〜１６３に、より具体的には抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質配列上のアミノ酸位置３５〜５０に局在し得る。ＡＦの生物学的効果は、前記コンセンサス配列の少なくとも６個のアミノ酸、配列番号３（ＡＦ−６）、を含む任意のペプチド若しくはポリペプチド、又は、機能を変更すること無く、ポリペプチド及び／又はペプチドを改変したもの、により発現する。
【００６３】
免疫化学的及び免疫組織化学的研究により、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質が存在し、体内のほとんどの組織及び器官により合成され得ることも、明らかにされている。抗下痢症配列を含む合成ペプチドは、既に特性が明らかにされている（国際特許公開第９７／０８２０２号、国際特許公開第０５／０３０２４６号）。
【００６４】
本発明者らは、抗分泌性因子がタンパク質Ｓ５ａや、全ての細胞に支配的な構成要素である２６Ｓプロテアソーム、より具体的には１９Ｓ／ＰＡ７００キャップ、のサブユニットを構成するＲｐｎ１０と、ある程度相同であることを示した。本発明において、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質は、同じ機能的特性を有する相同体タンパク質の一種として定義される。抗分泌性因子はまた、トロンボスポンジン−１に結合し、かつ癌の進行に関連することが知られている、別のイソ型タンパク質であるアンジオシジンとも非常に類似している。
【００６５】
本発明の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質及び／又はペプチドの相同体、誘導体及び断片はすべて類似した生物学的活性を有する。本明細書中の相同体、誘導体及び断片は、天然に存在する抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質のそれらに一致する少なくとも６個のアミノ酸（配列番号２に示される様に）を含み、１種又はそれ以上のアミノ酸を替えることにより、更に改変し、ポリペプチド及び／又はペプチドの本質的機能を変更すること無く、抗分泌性因子の生物学的活性を最適化しても良い。
【００６６】
本明細書中で誘導体とは、本明細書で定義される抗分泌性因子と同等の活性及び／又は機能的同等の活性を有し、他の物質から直接又は改変若しくは部分的置換の何れかにより誘導されるタンパク質を意図し、ここで１種又はそれ以上のアミノ酸は別のアミノ酸、これは改変した若しくは非天然アミノ酸でも良い、で置換されている。例えば、本発明の抗分泌性因子誘導体は、Ｎ末端及び／又はＣ末端保護基を含んでいても良い。Ｎ末端保護基の一例としては、アセチルを含む。Ｃ末端保護基の一例としては、アミドを含む。
【００６７】
更に、少なくとも７０％が同一、例えば少なくとも７２％、７５％、７７％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が本発明の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、ペプチド、相同体、誘導体及び／又は断片のアミノ酸配列と同一である任意のアミノ酸配列も又、本発明の範囲内にあると見なされる。
【００６８】
同一性及び類似性を決定する方法は、公に入手可能なプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊら（１９９４））ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ＳＦら（１９９０））が含まれるが、これに限定する訳ではない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら（１９９０））から公に入手可能である。各配列解析プログラムは、デフォルトスコアリングマトリックス及びデフォルトギャップペナルティーを有する。一般に、分子生物学者は、使用されるソフトウェアプログラムによって確立されたデフォルト設定を使用することが求められている。
【００６９】
本明細書で定義される有効性を同等に有する抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質又はペプチド又は相同体、誘導体及び／又はその断片は、アミノ酸を６個又はそれ以上、例えばアミノ酸６〜１６個、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０個又はそれ以上のアミノ酸を含み得る。他の好ましい実施形態では、抗分泌性因子は、４２、４３、４５、４６、５１、８０、１２８、１２９又は１６３個のアミノ酸からなる。好ましい実施形態では、本発明の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、相同体、誘導体、ペプチド及び／又はその断片は、６、７、８又は１６個のアミノ酸からなる。
【００７０】
特に、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であるか、又は配列番号２のアミノ酸３７〜４２を含む、相同体、誘導体及び／又はその断片である。
【００７１】
ＡＦ−１６は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質の断片であり、従って配列番号２のアミノ酸３７〜４２を含む。
【００７２】
医療適用
特に、ＡＦ−１６のような抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質は、生存細胞膜上を流れる体液を制御して効果を及ぼすことが一般に示され、そのため、下痢の状態のみならず、生理的不均衡による不快感、体液の極端な排出によって起こる炎症、浮腫、関節炎、緑内障及び片頭痛、体内及び体表での火傷及び外傷性傷害等の体内における他の変化をも軽減、治癒または予防出来る。
【００７３】
本発明の食品及び医薬品は、そのような目的に使用出来る。
【００７４】
本発明の食品及び医薬品は、グリア芽細胞腫の治療用補助剤として、及び／又は、抗癌剤、免疫療法、放射線療法などの医薬物質及び／又は製剤の送達及び細胞取込み、又はグリア芽細胞腫腫瘍細胞への遺伝子送達を最適化するために使用しても良い。
【００７５】
抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質およびペプチドは、以前、コレラ毒素に曝露した後の腸内、及び中枢神経系における脈絡叢内において病理学的流体輸送および／または炎症反応を正常化することが開示されている（国際特許公開第９７／０８２０２号）。本発明による食品及び医薬品は、このような目的に使用することができる。
【００７６】
ＡＦの内因性合成、又は添加したＡＦの取り込み、の何れかを誘導する能力を有する食物及び飼料は、国際特許公開第９７／０８２０２号において浮腫、下痢、脱水及び炎症の治療に有用であることが示唆されている。本発明の食品及び医薬品は、このような目的に使用しても良い。
【００７７】
抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質及びその断片はまた、細胞の喪失及び獲得に関連する状態の治療において、神経組織の修復、幹細胞及び前駆細胞及びそれらに由来する細胞の、増殖、アポトーシス、分化、及び／又は移動を改善し（国際公開第０５／０３０２４６号）、及び、眼内高血圧（国際特許公開第０７／１２６３６４号）の治療及び／又は予防において、コンパートメント症候群（国際特許公開第０７／１２６３６３号）に関する治療及び／又は予防と同等に有効であることが示されてきた。本発明の食品及び医薬品は、このような目的に使用しても良い。
【００７８】
その上に、最近、本発明者らは、ＡＦは監視することが可能であり、及び／又は脂質ラフトの構造、分布および複数の機能、膜中の受容体及び／又はカベオラに有益な影響を及ぼし、従って、細胞膜における脂質ラフト及び／又はカベオラの構造的崩壊および機能不全の治療及び／又は予防のために使用出来そうであることを提示した（国際特許公開第０７／１２６３６５号）。本発明の食品及び医薬品は、このような目的に使用しても良い。
【００７９】
更に、最近本発明者らは、同じ抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、ペプチド及びそれらの断片が膜貫通タンパク質の生物学的活性化に介在出来、例えば、ＦＡＫ及びＣＡＰを貫通するＮＫＣＣ１、しかも、それらが病理学的及び／又は撹乱された細胞におけるイオンチャネルの病理学的活性を直接調節出来、前記細胞内の細胞内圧力及び膜貫通タンパク質機能を効果的に正常化し、従って、例えば癌治療に使用する薬剤の取り込みを改善することを証明することが出来た。（国際特許公開第２０１０／０９３３２４号）。本発明の食品及び医薬品は、このような目的に使用しても良い。
【００８０】
国際特許公開第２０１４／０９６３８４号には、更に、抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、ペプチド、相同体及び／又はその断片をグリア芽細胞腫の症候性における、治癒及び緩和のための療法の両方において、使用できることが開示されている。特に、これらは、グリア芽細胞腫の治療における補助剤として使用出来、及び／又は薬剤及び遺伝子送達、並びに化学療法、免疫療法及び放射線療法を最適にする。本発明の食品及び医薬品は、このような目的に使用しても良い。
【００８１】
製法
本発明の１つの態様は、極めて高含量の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質を有する、特に、本質的に配列番号１（ＡＦ−１６）及び／又は配列番号２（ＡＦ−８）で示されるアミノ酸配列からなる極めて高含量のＡＦタンパク質断片を有する鳥類の卵からの卵黄を提供する方法に関し、その方法とは、例えば雌鶏等の家禽に、少なくとも１２週間、遊離トリプトファンを少なくとも０．４％、例として、遊離トリプトファンを少なくとも０．１４％、を含み、ＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８を誘導する、好ましくはペレット化した、家禽用飼料を給餌し、その後、その家禽から採卵し、卵白と卵黄とを分離し、或るいは、前記卵黄を、噴霧乾燥、流動床乾燥、粉砕、浸出、抽出、蒸発、膜ろ過し、及び／又は凍結乾燥させることを含む。
【００８２】
特に、本発明の方法は、本明細書において初めて記載する家禽用のＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８誘導ペレット化飼料を、キジ類の鳥に、少なくとも１２週間、好ましくは１２〜２０週間、例えば１２〜１８週間、例えば少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週間等の間、給餌する時に適用できる。少なくとも１２週間給餌することにより、飼料を介して、アミノ酸、糖及びアミドの極めて高レベルの抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８の、他とは全く異なる組合わせが、鶏に、好ましくは卵黄中に誘導される。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の方法は、本明細書において初めて記載する家禽用のＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８誘導ペレット化飼料を、キジ類の鳥に少なくとも４週間、例えば少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０週間、好ましくは４〜１２週間の間、給餌する時に適用できる。少なくとも４週間、給餌することにより、飼料を介して、アミノ酸、糖及びアミドの極めて高レベルの抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８の、他とは全く異なる組合わせが、鶏に、好ましくは卵黄中に誘導される。
【００８４】
本明細書に示したように、極めて高レベルの抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質、特にＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８が達成されたことは、前例がなく、かつ驚くべきことである。
【実施例】
【００８５】
本発明を以下の実施例により説明するが、これに限定する訳ではない。
【００８６】
ＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８を誘導する家禽用ペレット化飼料
本明細書に記載した極めて高含量の抗分泌性因子（ＡＦ）タンパク質を有する、特に、本質的に配列番号１（ＡＦ−１６）及び／又は配列番号２（ＡＦ−８）で示されるアミノ酸配列からなる極めて高含量のＡＦタンパク質断片を有する鳥類の卵からの卵黄を提供する方法において、その方法とは、例えば雌鶏等の家禽に、少なくとも４週間、例えば少なくとも１２週間、遊離トリプトファンを少なくとも０．１４％、又はトリプトファン１〜２グラム／ｋｇ飼料を含み、ＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８を誘導するペレット化家禽用飼料を給餌することを含む。
【００８７】
本発明の一実施形態では、家禽用のＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８誘導飼料は、少なくとも遊離トリプトファン０．１４〜１％、例えば、少なくとも遊離トリプトファン０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１％を含む。
【００８８】
本発明の一実施形態において、家禽用のＡＦ−１６及び／又はＡＦ−８誘導飼料は、トリプトファンを少なくとも０．５グラム／ｋｇ飼料、例えば、トリプトファンを、少なくとも、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９又は３％／ｋｇ飼料を含む、。
【００８９】
前記飼料はペレット形状が好ましい。本明細書において、「ペレット化飼料」と言う用語は、ペレットに作製した濃縮食物を記載するために使用する。このペレットは、取扱いの容易さ、粉塵及び廃棄物が無いこと、及びペレットの標準組成物を示すという利点を有する。
【００９０】
本明細書において、「飼料」という用語は、動物に給餌する栄養価の材料を記載するために使用する。それぞれの生物種は、その種の消化管に適し、しかも、経済的な理にかない、並びに、栄養価が高く、口に合う、飼料又は飼料材料から構成される普通の食物を摂食する。牧場にいる農業動物は変動性の非常に高い食物を摂食し、そして自然的な栄養障害を被りやすい。
【００９１】
遊離トリプトファン及び他の補助食品及び添加物を供給する１つの方法は、これらの物質の混合物を調製し糧食基本配給量（ｂａｓｉｃ  ｒａｔｉｏｎ）に添加することである。これらの混合物を濃縮物又はプレミックスと称し、そして、この混合物は、通常、穀類の含有量が高いため、穀物のみを含む混合物も濃縮物と称する。本明細書において、このようなプレミックスは、通常、遊離トリプトファンを少なくとも２．５％、デキストロース等の糖７０〜７５％、及び穀類ベースの生地、例えば小麦２５〜３０％を含む。
【００９２】
現に、開示している飼料は、更に、乾草、貯蔵牧草、グリーンチョップ（ｇｒｅｅｎ  ｃｈｏｐ）等の青刈飼料、即ち他の栄養素と比較してセルロース含量の高い任意の飼料を含んでも良い。現に、開示している飼料としては、更に、穀物及び他の穀類等の飼料穀物、及び動物飼料として使用される豆類を含み、小麦、大麦、オート麦、ライ麦、トウモロコシ、エンドウ豆、ラップ、菜種、菜種粕、大豆粕、及びソルガム等を挙げられる。
【００９３】
現に、開示している飼料は飼料用栄養補助剤、即ちそれ自体が飼料材料であり、かつ牧草等の基本的糧食に添加されてミネラル及び芳香族化合物等の不足分を補助する栄養物質を更に含んでも良い。飼料用栄養補助剤は、通常、微量元素及びマクロフィード（ｍａｃｒｏｆｅｅｄｓ）例えば、タンパク質栄養補助剤を含む。
【００９４】
参考文献
１  Ｌａｎｇｅ  Ｓ、腸内毒性下痢の生体内アッセイのためのラットモデル。  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １９８２；１５：２３９−４２。
２  Ｂｊｏｒｃｋ  Ｓ、Ｂｏｓａｅｕｓ  Ｉ、Ｅｋ  Ｅ、Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅ  Ｅ、Ｌｏｎｎｒｏｔｈ  Ｉ、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｅ、Ｌａｎｇｅ  Ｓ。ヒトの炎症性腸疾患の症状を改善し得る食物誘導性抗分泌因子の刺激、コンセプトの研究。Ｇｕｔ  ２０００；４６：８２４−９。
３  Ｇｏｒａｎｓｓｏｎ  Ｌ、Ｌａｎｇｅ  Ｓ、Ｌｏｎｎｒｏｔｈ  Ｉ．食事療法に焦点を絞った、後遺症性下痢。Ｐｉｇｓ  Ｎｅｗｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  １９９５；１６：８９Ｎ−９１Ｎ。
４  Ｌａｎｇｅ  Ｓ、Ｌｏｎｎｒｏｔｈ  Ｉ．抗分泌因子の合成、解剖学的及び細胞分布、実験及び臨床研究における生物学的作用。Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｙｔｏｌ  ２００１；２１０：３９−７５。
５  Ｚａｍａｎ  Ｓ、Ａａｍｉｒ  Ｋ、Ｌａｎｇｅ  Ｓ、Ｊｅｎｎｉｓｃｈｅ  Ｅ、Ｓｉｌｆｅｒｄａｌ  ＳＡ、Ｈａｎｓｏｎ  ＬＡ。効果的かつ安全に小児下痢を停止する抗分泌性因子、プラセボ対照無作為試験。Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  ２０１４；１０３：６５９−６６４。
６  Ｚａｍａｎ  Ｓ、Ｍａｎｎａｎ  Ｊ、Ｌａｎｇｅ  Ｓ、Ｌｏｎｎｒｏｔｈ  Ｉ、Ｈａｎｓｏｎ  ＬＡ。Ｂ  ２２１、小児下痢を軽減する抗分泌性因子を含む医療用食品：プラセボ対照試験。Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  ２００７；９６：１６５５−９。
７  Ｌａｎｇｅ  Ｓ、Ｌｏｎｎｒｏｔｈ  Ｉ、Ｍａｒｔｉｎｓｓｏｎ  Ｋ。卵及び鶏の血漿内における抗分泌因子の濃度。Ｂｒ  Ｐｏｕｌｔ  Ｓｃｉ  １９９４；３５：６１５−６２０。
【００９５】
実験
実験１
ＥＬＩＳＡ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳの使用によるＳａｌｏｖｕｍ（登録商標）におけるＡＦ−１６の検出と相対的定量
方法及び材料
【００９６】
Ｓａｌｏｖｕｍ（登録商標）の製造、技術的側面
ラット結紮ループ法により、インビボで卵黄中のＡＦ活性の適切な抗分泌性濃度を測定した後、卵を回収し、＋４℃で保存した。次に卵黄を卵白から分離し、低温殺菌し、次いで滅菌チャンバーに貯蔵し、次いで、濾過済の空気を有する室内で噴霧乾燥した。全工程は、タンパク質変性を確実に排除した条件下で行った。卵黄は噴霧乾燥した最後の瞬間に、サシェに入れ、卵黄粉末を各々４グラムとした。Ｓａｌｏｖｕｍ（登録商標）は、室温で水又はジュース中に容易に溶解出来、好ましくは、卵の味を完全に消去したパイナップルジュースに入れて投与しても良い。
【００９７】
卵黄−ＡＦの調製
ＡＦを連続して誘導した後のＳａｌｏｖｕｍ（登録商標）卵黄及び対照雌鶏から調製したＡＦ含量の低い卵黄をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解し（卵黄４個分の貯留）１０００ｘｇで５分間遠心し、上清を集めた。親和クロマトグラフィー（Ｂｊｏｒｃｋら、２０００）を用いて、卵黄からＡＦを精製した。つまり、卵黄上清を３ｍｌのアガロースカラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ社製）に通し、ＰＢＳで洗浄した後、アガロースに吸収されたＡＦをメチル−α−Ｄ−グルコシド１Ｍで溶離した。溶離液をＰＢＳに対して４℃で２４時間透析し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。
【００９８】
卵黄中のＡＦ活性のインビボ測定
精製卵黄画分のＡＦ活性を、コレラ毒素（ＣＴ）を分泌促進物質として使用し、ラット内結紮ループ法によって測定した（１）。従って、ラットの空腸ループにおいてＣＴ誘導体液分泌の５０％の阻害を介在するＡＦ調製物に、「ＡＦ単位」０．５の値を割り当てた。ヒト（２）及び動物（３）に関する以前の研究では、ＡＦ値＞０．５ＡＦ単位が下痢分泌の減少と相関することを示している（２）。
【００９９】
ＡＦ−１６抗体
ＡＦペプチド３６−ＶＣＨＳＫＴＲＳＮＰＥＮＮＶＧＬ−５１に対する一次ポリクローナル抗体をウサギ中で産生した（ａＰ８）。このペプチドは、固相上の有機化学合成によって生成し、以下の抗血清の産生は、Ｉｎｎｏｖａｇｅｎ  ＡＢ社（Ｌｕｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）により行った。
【０１００】
免疫原性ＡＦ−１６のＥＬＩＳＡ試験。
卵黄中のＡＦ−１６の含量を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。親和精製した卵黄試料をＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製）で滴定し、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ中ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）０．２％により、３７℃で４５分間遮断した後、プレートをＰＢＳとＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ−Ｔ）０．０５％とで洗浄した。ＡＦペプチドＡＦ−１６、ａＰ８（ＰＢＳ  、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％及びＢＳＡ０．２％の中で１／５００に希釈）に対して産生したポリクローナル抗体を加え、プレートを室温（ＲＴ）下、２時間インキュベートした。洗浄後、アルカリ性リン酸塩（ＡＰ）結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．社製）をＲＴで１時間添加した。洗浄後、ＭｇＣ１2  １ｍＭ  を有するジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）中の基質、４−ニトロフェニルホスフェート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｓｗｅｄｅｎ  ＡＢ社製）をプレートに添加し、結合した酵素を４０５ｎｍの吸光度を読み取ることによって明らかにした。ウサギ免疫前血清をバックグラウンドとして使用し、その値を差引き、正味の吸光度を得た。
【０１０１】
ＡＦ−１６のＭＡＬＤＩ質量分析検出
親和精製した卵黄試料中のＡＦ−１６ペプチドの相対的定量を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって試験した。３００００回及び１００００回の良好なショットによる２種の異なる自動実行法（ＡｕｔｏＸｅｃｕｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、レーザー強度８０％及び六角ラスター移動を用いてＭＡＬＤＩ基準鋼板上に付着した各サンプルからデータを収集した。ＨＣＣＡをマトリックス溶液として使用し、ＡＦ−１６のシグナル強度をマトリックスシグナル５６８．２（３ＨＣＣＡ＋Ｈ）に対して正規化した。この方法を試験するために、親和クロマトグラフィー後の卵黄サンプルにＡＦ−１６の希釈系列を添加し、同様の方法を適用して３００００回の良好なショットを収集した。
【０１０２】
結果
卵黄の生物学的活性試験
ＡＦ活性について、精製した卵黄試料を、ラット結紮ループ法により試験した。内生的に高いＡＦ産生をするように刺激する食餌を雌鶏が摂取している間の卵から毎週、卵黄を集めた。表１の結果は、給餌を摂取した１４−１５週間迄の間はＡＦ活性の増加を示し、その後は、ＡＦ活性のさらなる増加は、インビボ法によっては記録出来なかったことを示した。ＡＦを刺激する飼料を１８週間連続的に摂取した後、最終的な採卵を行った。これらの卵で、１：１０００に希釈した卵黄試料中で有意なＡＦ活性を測定することが出来た（表１）。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
ＥＬＩＳＡによる卵黄の試験
ＡＦ誘導した後の効果を評価するために、異なる時点でＡＦ−１６の含量をａＰ８で測定した。図１に示したように、誘導後調製した試料は、１０週間迄はそのレベルが低いが、１８週間後の増加レベルは２倍以上に達した。
【０１０５】
図１  ａＰ８を用いてＥＬＩＳＡにより試験した親和性精製卵黄中のＡＦ−１６のレベル。貯留卵黄（ｎ＝４）からの試料を分析し、正味の吸光度を測定した。
【０１０６】
図２に見られるように、親和精製した卵黄試料中のＡＦ−１６ペプチドの相対的な定量化をＭＡＬＤＩ−ＭＳを用いて実施した。異なる２種の捕捉方法（各試料から３００００回及び１００００回の良好なショットを集めた）は、同様な結果を与え、３週から５週、５週から９週及び９週から１２週の間で夫々正規化したシグナル強度の増加を示した。マトリックス溶液としてＨＣＣＡを使用したため、ＡＦ−１６のシグナル強度はマトリックスシグナル５６８．２（３ＨＣＣＡ＋Ｈ）に対して正規化した。３〜１２週間の試料ではＡＦ−１６シグナルが約２倍に増加することを観察した。
【０１０７】
図２  各試料から収集した３００００（赤色）及び１００００（青色）の良好なレーザーショットは３〜１２週間の範囲の精製卵黄試料からのＡＦ−１６ペプチドの平均正規化シグナル強度を示す。
【０１０８】
卵黄中のＡＦ−１６ペプチドの相対量を評価するために、ＡＦ−１６ペプチドの希釈系列を親和クロマトグラフィー精製卵黄試料に添加し、ＭＡＬＤＩで分析した。その結果を図３に明らかにした。結果を３種の異なる内部質量ピークに対して正規化し、我々は３種の異なるマトリックスシグナルに正規化することで同様の結果が得られることを観察した。
【０１０９】
図３  ＭＡＬＤＩで分析した卵黄中のＡＦ−１６ペプチドの相対量。結果を３つの異なる内部質量ピークに対して正規化した。
【０１１０】
希釈系列中の正規化されたシグナル強度に基づいて、卵黄試料中のＡｆ−１６ペプチドの相対量を、１２週間後に０．０５ｎｇ／ｍｌの範囲内と推定することが出来た。
【０１１１】
実験２
抗分泌性因子による、副作用のない３時間未満内の下痢止め。
【０１１２】
抗分泌因子（ＡＦ）は、ヒト及び動物における本来の宿主防御システムの一部である。ＡＦはプロテアソーム及びプロテアソーム補体Ｃ３複合体と共に作用し、副作用なく、過剰分泌及び炎症を防止する。
【０１１３】
ＡＦは、卵黄粉末Ｓａｌｏｖｕｍ（登録商標）として経口投与しても良い。
【０１１４】
急性下痢に苦しむパキスタンの小児を、Ｓａｌｏｖｕｍ（登録商標）で治療すると、プラセボ群で１８時間であったのが１０時間以内に、便の回数を減らし、かつ、便の硬さを改善することが以前に示されている。
【０１１５】
従前の製剤より、１００〜１０００倍強力な抗分泌液効果を有するＳａｌｏｖｕｍ（新Ｓａｌｏｖｕｍ）の新製品群を製造し、より更に効果的な下痢治療の達成を試みた。この製品群を、パキスタン国ラホールの小児病院の外来小児科病院で、水様性下痢及び中等度から重度の脱水に苦しむ小児を選択し、その治療に使用した。８人の患者は（新Ｓａｌｏｖｕｍ）のサシェ１袋（４グラム、第１群）による治療を受け、もう一方の８人は（新Ｓａｌｏｖｕｍ）のサシェ２袋（８グラム、第２群）による治療を受けた。
【０１１６】
下痢管理のプロトコールは、（新Ｓａｌｏｖｕｍ）の用量を除き、全ての患者について一律に維持した。全体を含めて、朝以降の平均便通回数は、両群において同様であり、第１群が１５±４．６回、第２群が１３±４．５回であり、ｐ＝０．４２９であった。（新Ｓａｌｏｖｕｍ）を飲用後、第１群は、引続く３時間に平均便通４回（６５％減少、ｐ＜０．００１）を記録し、一方、第２群では平均便通２．７回（６８％減少、ｐ＜０．０００）が見られた。便の硬さは、最初、水様性（８人、即ち１００％）であったものから、水様性（２人、すなわち２５％）又は半固体（６人、すなわち７５％）まで、両群とも同様に改善した。第２群の患者は（新Ｓａｌｏｖｕｍ）摂取後の脱水症状の徴候を示さなかったが、一方で第１群の６人（７５％）は軽度の徴候を示し、２人（２５％）が重度の徴候を示した。
【０１１７】
便通回数の減少及び便の硬さの改善については、第１群が（新Ｓａｌｏｖｕｍ）飲用後９１分以内に、第２群は６８分以内に観察した（ｐ＝０．３３０２）。副作用は認められなかった。
【０１１８】
貧困地域において下痢発症の直後に新Ｓａｌｏｖｕｍを、例えば地域医療看護師が供与するであろうが、病気の発症直後に開始することが好ましい。これにより、より高い資格を有する保健医療を適用する必要性を低減するだろう。小児下痢を新Ｓａｌｏｖｕｍで治療すると、低コストかつ副作用のリスクを伴うこと無く達成出来、子どもの成長と発達を増進し健康の改善をもたらし得る。
【０１１９】
表２  下痢症に罹患した小児における新Ｓａｌｏｖｕｍ治療の用量と反応。全体として、第１群は、サシェ１袋（４グラム）及び第２群はサシェ２袋（８グラム）による治療を受けた。新Ｓａｌｏｖｕｍ治療に対する臨床的応答は、最初の３時間の記録期間の終了時に、この間に記録された変化を記録した。
【０１２０】
【表２】
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【０１２１】
実験３
卵中の天然抗分泌性タンパク質の推定法。
乾燥した卵黄粉末１．７５グラムをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）６．４ｍｌに溶解し、これは卵黄乾燥物質の２０％に相当する。この溶液４ｍｌをＰＢＳ  ６ｍｌに添加した。（元のＮＡＳＰ含有量の５０％）。希釈した試料を２０００ｇで１０分間遠心し、上清をアガロース（セファロース）カラムに移した。吸収したＮＡＳＰをα−メチルグルコシドで溶離し、ＮＡＳＰを含有する溶離液１ｍｌを回収し透析した。（収率１００％）本特許出願は、以下に言明する
【０１２２】
上記のように調製した試料は、ラットの腸管モデルで試験する前に、500倍又は1000倍に希釈してある。コレラ毒素に腸を暴露する前に、希釈試料のアリコート1mlを静脈内に注入する。 FIL-単位の数は、ラットの試験群及び対照群におけるセンチメートル当たりの腸管重量から計算した。
【０１２３】
卵中のＮＡＳＰの含有量は、上記で決定したように、その結果と等しく、逆希釈率を乗じた。
【０１２４】
従って、分析した試料中のＮＡＳＰの含量は、その結果を１０００倍又は２０００倍したものに等しい。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】ａＰ８を用いてＥＬＩＳＡにより試験した親和性精製卵黄中のＡＦ−１６のレベル。貯留卵黄（ｎ＝４）からの試料を分析し、正味の吸光度を測定した。
【図２】各試料から収集した３００００（赤色）及び１００００（青色）の良好なレーザーショットは３〜１２週間の範囲の精製卵黄試料からのＡＦ−１６ペプチドの平均正規化シグナル強度を示す。
【図３】ＭＡＬＤＩで分析した卵黄中のＡＦ−１６ペプチドの相対量。結果を３つの異なる内部質量ピークに対して正規化した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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