(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体であって、ここで前記ホモ二量体は、第１および第２のモノマーで構成され、または含み、各モノマーは他のモノマーとは独立して、
ｉ．ＨＬＡ−Ｂ２７重鎖、および
ｉｉ．Ｆｃフラグメント、および
ｉｉｉ．任意に、該ＨＬＡ−Ｂ２７重鎖と該Ｆｃフラグメントを繋ぐアミノ酸リンカー
を含む、癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体。
【請求項２】
前記第１および第２のモノマーが同一である、請求項１に記載の癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体。
【請求項３】
さらにペプチドエピトープフラグメントを含む、請求項１又は２に記載の癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体。
【請求項４】
前記モノマーがさらにペプチドエピトープフラグメントを含む、請求項１または２に記載の癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体。
【請求項５】
前記ＨＬＡ−Ｂ２７重鎖が、ＨＬＡ−Ｂ２７α１、α２およびα３ドメインのみで構成される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体。
【請求項６】
前記ＨＬＡ−Ｂ２７重鎖が膜貫通ドメインを含み、および細胞内ドメイン（細胞内尾部）を含まない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体。
【請求項７】
前記ＨＬＡ−Ｂ２７重鎖が、連続する配列番号６から配列番号１７２で番号付けられた配列番号によって同定される配列のいずれか１つに対して、９０％以上の配列同一性を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体。
【請求項８】
２つのモノマーをジスルフィド結合で連結する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体。
【請求項９】
前記Ｆｃフラグメントが、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）、またはＭ型（ＩｇＭ）から選択される重鎖定常領域ＣＨ２およびＣＨ３を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体。
【請求項１０】
前記アミノ酸リンカーが１から５０アミノ酸を含み、ＨＬＡ−Ｂ２７重鎖とＦｃフラグメントとを１つの単一ペプチド鎖として連結する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の癌の治療または予防において使用するための、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体。
【請求項１１】
ａ．請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体、および
ｂ．チェックポイント阻害試薬、
を含む、併用医薬。
【請求項１２】
前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０またはＣＤ８６との相互作用の阻害剤、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用の阻害剤、およびリガンドＴＩＭ−３から選択される、請求項１１に記載の併用医薬。
【請求項１３】
癌の治療または予防において使用するための核酸分子であって、前記核酸分子が、請求項１〜１０のいずれか１つに記載のＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体またはＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質モノマーをコードする、癌の治療または予防において使用するための核酸分子。
【請求項１４】
癌の治療または予防において使用するための、請求項１３に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
【請求項１５】
癌の治療または予防において使用するための、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下で請求項１３に記載の核酸分子を含むウイルス。
【請求項１６】
請求項１３に記載の核酸分子を含むインビトロ遺伝子改変宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予防または治療における使用のための、ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、古典的な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質ファミリーに属する。該ＨＬＡ複合体は、免疫システムがウイルスやバクテリアのような外来侵入者により作られるタンパク質と、自分の体のタンパク質とを区別するの手助けをする。ヒトは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃとして知られる３つの主なＭＨＣクラスＩ遺伝子を持っている。ＨＬＡ遺伝子は多くに変化可能であり、それにより各人の免疫システムが広範囲の外来侵入者に対して反応することが可能となる。あるＨＬＡ遺伝子は数百の同定されたバージョン（対立遺伝子）があり、それぞれに特定の数字（ＨＬＡ−Ｂ２７など）が与えられている。密接に関連する対立遺伝子は、共に分類される；例えば、少なくとも４０の非常に類似した対立遺伝子が、ＨＬＡ−Ｂ２７のサブタイプである。これらのサブタイプは、ＨＬＡ−Ｂ＊２７０１〜ＨＬＡ−Ｂ＊２７４３と指定される。
【０００３】
古典的なＭＨＣ−Ｉ分子（ヒトにおいては、ＨＬＡ−Ｉと指定される）は、β２ミクログロブリン（β２ｍ）および小ペプチドと非共有結合で会合する、３つの細胞外領域（α１、α２およびα３）を有する膜結合重鎖を有する３量体構造である。ＨＬＡ−Ｉ重鎖はβ２ミクログロブリンまたは小ペプチドと会合しない形態で存在してもよい。これらの形態はオープン配座異性体と呼ばれる。
【０００４】
他のすべてのＨＬＡ分子のように、ＨＬＡ−Ｂ２７の主な機能は、適応性免疫応答の一部として、細胞由来のペプチドをＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）へ提示することである。正常な生理学的条件下では、ＨＬＡ−Ｂ２７分子はＢ２７重鎖、β２ミクログロブリン、および、自己タンパク質、ウイルスまたはバクテリア由来のペプチドで構成されるヘテロ三量体複合体を形成する。これに関して、ＨＬＡ−Ｂ２７は他の全てのクラスＩ  ＨＬＡ対立遺伝子と類似している。しかし、ＨＬＡ−Ｂ２７はまたβ２ミクログロブリンおよびペプチドを欠く（ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体とも呼ばれる）遊離重鎖として細胞中に存在し得る。さらに、ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体の生化学的特性は、６７位（Ｃｙｓ６７）および１６４位（Ｃｙｓ１６４）のシステインのジスルフィド結合形成を介してβ２ｍ遊離重鎖ホモ二量体の形成を誘導し得る（アントニューら、ＪＢＣ、２００３、２７９、８８９５−８９０２）。Ｂ２７オープン配座異性体の形成はペプチドの存在によって変化しないので、Ｂ２７オープン配座異性体分子はペプチドに結合して存在してもよいし、ペプチドがなくてもよい。
【０００５】
Ｂ２７オープン配座異性体は＋ＨＬＡ−Ｂ２７患者における脊椎関節症（ＳｐＡ）の発症に関連してきた。ＨＬＡ−Ｂ２７の保有は、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を有する患者の腸内病変、特定の胃腸および尿生殖器感染後の反応性関節炎および、もっともＡＳとして認識されている若年性ＳｐＡを含む関連疾患群に強く関連する。
【０００６】
Ｂ２７オープン配座異性体の細胞表面発現の表示は、免疫調節性白血球受容体はＢ２７オープン配座異性体に特異的に相互作用するかもしれないという提案に導いた。Ｂ２７オープン配座異性体と免疫調節性白血球受容体との相互作用がどのようにＡＳにつながるかは不明なままである。
【０００７】
種々の免疫調節性受容体は（Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えて）Ｂ２７オープン配座異性体を認識できる。これらには、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、マクロファージ、ＤＣおよびＴ細胞を含む多くの型の白血球上で発現するキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲｓ）およびは血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＬＲｓ）が含まれる。
【０００８】
癌は、制御されていないおよび破壊的な成長が起こっている、身体の異常な細胞によって特徴付けられる疾患群である。癌細胞は身体中に広がり、転移して腫瘍を形成する；この成長パターンは悪性腫瘍と呼ばれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】アントニューら著、ＪＢＣ、２００３、２７９、８８９５−８９０２
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｂ２７２−ＴｅｔがＣＤ４＋Ｔ細胞がｉＴｒｅｇへ変換するのを遮断することを示している。Ｂ２７２−Ｔｅｔを未処置のＣＤ４＋Ｔ細胞とインキュベーションすると、ｉＴｒｅｇへの変換（ＦｏｘＰ３）が遮断される。コントロールの四量体によって、ｉＴｒｅｇ誘導におけるＢ２７２の特異的影響が実証される。
【図２】図２は、Ｂ２７２−Ｔｅｔが、用量依存的にマウス及びヒトＴｒｅｇの抑制を弱めることを示す。ａ）Ｂ２７２−Ｔｅｔ（２  μｇ／２００  μＬ）はマウスｉＴｒｅｇの抑制を遮断し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を可能にする。コントロールのＨＬＡ−Ｂ２７およびＢＳＡはｉＴｒｅｇの抑制機能を変化させない。ｂ）Ｂ２７２−Ｔｅｔ  （２  μｇ／２００  μＬ）はヒトｎＴｒｅｇの抑制を遮断し、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を可能にする。ｃ）異なる濃度のＢ２７２−Ｔｅｔ（μｇ／２００  μＬ）における、ｉＴｒｅｇがマウスＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制する割合（％）である。ｄ）異なる濃度のＢ２７２−Ｔｅｔ（μｇ／２００  μＬ）における、ｎＴｒｅｇがヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を抑制する割合（％）である。
【図３】図３は、Ｂ２７２がＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を調節することを示す。ラット由来のＨＬＡ−Ｂ２７ＴｇおよびＷＴ  ＣＤ＋Ｔ細胞はＢ２７２−Ｔｅｔでインキュベーション後にＴＮＦを産生する。Ｂ２７２を遮断する抗体ＨＤ５またはＨＣ１０とプレインキュベーションすることで、ＣＤ４＋Ｔ細胞への相互作用およびＴＮＦの産生を阻害し、Ｂ２７２−Ｔｅｔは単独でＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、サイトカインを産生することができることが示される。
【図４】図４は、ＨＤ５（抗Ｂ２７２抗体）で処置したラットにおける脾臓およびＭＬＮ由来の炎症誘発性ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の減少を示している。Ａ）ＨＬＡ−Ｂ２７ラットを用いたインビボ実験およびＨＤ５注入のタイムスケジュールである。ラットは、１２から１５週間毎週、ＨＤ５抗体をラットあたり１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与（ｉ．ｐ．）した。Ｂ−Ｃ）Ｔｇ−ＨＤ５、Ｔｇ−コントロール及びＷＴ−同腹仔から得られたインビトロで刺激された細胞を、ＴＮＦ（Ｂ）及びＩＬ−１７（Ｃ）を発現する炎症誘発性細胞の存在についてＩＣＳによって評価した。ＭＬＮおよび脾臓細胞を、１５週目（ｎ＝５）および２３週目（ｎ＝５）に得た。結果は、ＴＮＦ、ＩＬ−１７およびＩＦＮ−γについて陽性となっているＣＤ４＋Ｔ細胞に対する割合（％）としてプロットされる。値は平均±ＳＥＭとして表す。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によって、続いて多重比較（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析によって、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５は決定される。
【図５】図５は、Ｂ２７２−Ｆｃおよびβ２ｍのＤＮＡカセットの概略図およびＣＨＯ細胞からのＢ２７２−Ｆｃ分子の発現を示す。Ａ）Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃ複合体は、Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃタンパク質の細胞外産生に必要なヒト−β２ｍベクターと一緒に、ヒトＩｇＧ４−ＦｃベクターカセットにＨＬＡ−Ｂ２７のα１、２および３ドメインを挿入することによって産生された。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞におけるトランスフェクションは、Ｂ２７２−Ｆｃベクターとβ２ｍベクターの両方を用いて、１：３の比率で行った。標準的な抗体精製プロトコールを用いて上清を回収し、Ｂ２７２−Ｆｃ−β２ｍを精製した。
【図６】図６は、Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃ複合体からのβ２ｍの分離および、ＳＥＣまたは透析によってＢ２７２−Ｆｃの精製とリフォールディングを示す。Ａ）ＳＥＣによるＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐグレードカラムで精製したＢ２７２−β２ｍ−ＦｃオリゴマーおよびＢ２７２−β２ｍ−Ｆｃ産物のクロマトグラフィーヒストグラムプロットおよびウエスタンブロット分析は、非変性条件ではβ２ｍが複合体から分離せず、Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃオリゴマーが形成されることを示している。Ｃ）３０ｋＤａ（５）またｈ５０ｋＤａの透析膜を用いた尿素−トリス−ＢＭＥ緩衝液中のＢ２７２−β２ｍ−Ｆｃ  分子の透析により、β２ｍからＢ２７２−Ｆｃ遊離重鎖が分離する。Ｄ）Ｂ２７２−Ｆｃ遊離重鎖のＢ２７２−Ｆｃ分子へのリフォールディングは、リフォールディング緩衝液中で希釈法によって行われ、ＨＣ１０（抗ＨＬＡ遊離重鎖モノクローナル抗体）によって検出する。ＢＭＥ＝β−メルカプトエタノール、Ｂ２７２−Ｆｃのおよその大きさ＝１２５ｋＤａ；Ｂ２７２−Ｆｃ遊離重鎖＝６２ｋＤａ。
【図７】図７は、Ｂ２７２−Ｆｃの注入がＭＣ３８結腸癌マウスモデルにおける腫瘍のサイズを減少させることを示す。Ａ）結腸癌細胞（ＭＣ３８−ＯＶＡｄｉｍ）の注入のタイムポイントおよびＢ２７２−Ｆｃの注入の実験設計である。Ｂ）安楽死後のマウスの腫瘍サイズは、コントロールと比較してＢ２７２−Ｆｃ処理マウスにおける腫瘍の有意な減少がしめされいる。Ｃ）腫瘍に浸潤しているＮＫ細胞の割合（％）はＢ２７２−Ｆｃ処理マウスにおいては有意に高まっていた。Ｄ）Ｔｒｅｇ細胞の腫瘍への浸潤の割合（％）は有意な変化は観測されなかったが、アイソタイプと比較した場合、Ｂ２７２−Ｆｃ処理マウスにおいてＴｒｅｇの減少傾向が観測された。結果は、異なる時点での２つの同一の実験からプロットされる。  値は平均±ＳＥＭとして表す。値は平均±ＳＥＭとして表す。一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によって、続いて多重比較（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析によって、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１は決定される。
【図８】図８は、Ｐａｎ０２マウス膵臓モデル、ＥＭＴ６マウス乳房モデル、およびＥＧ．７マウスリンパ腫モデルの同系モデルを使用して、Ｂ２７２−ＦｃとＣＴＬＡ４またはＰＤ−１抗体との併用を示す。Ａ）Ｐａｎ０２マウス（ｎ＝６）における平均腫瘍体積。Ｂ）ＥＭＴ６マウス（ｎ＝６）における平均腫瘍体積。Ｃ）２つの別の実験からプロットしたＥＧ７マウスにおける平均腫瘍体積。細胞の注入タイムポイントおよび物質の注入の実験設計は以下のとおりである：アイソタイプ（１０  ｍｇ／ｋｇ）Ｑ３Ｄｘ７；Ｂ２７２−Ｆｃ（１０  ｍｇ／ｋｇ）；抗ＣＴＬＡ４  Ｑ３Ｄ×３（第１注入２００  μｇ、第２および第３注入１００  μｇ）；ＰＤ−１  ｂｉｗｋ×３（１００  μｇ）；Ｂ２７２−Ｆｃ＋ＣＴＬＡ４（それぞれＱ３Ｄｘ７およびＱ３Ｄｘ３）、およびＢ２７２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれＱ３Ｄｘ７およびｂｉｗｋ×３）。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によって、続いて多重比較（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ分析によって、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１は決定され、Ｑ＝注入間の日数；Ｄｘ＝注入回数、ｂｉｗｋ＝１週間に２回を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
用語と定義
アミノ酸配列はアミノ末端からカルボキシル末端へ向かって与えられる。配列位置の大文字は１文字コードのＬ−アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３ｒｄ  ｅｄ．ｐ．２１）。
【００１２】
本明細書の文脈において、配列同一性および配列同一性の割合という用語は、ふたつの整列した配列の比較によって決定される値を指す。比較のために配列を整列する方法は、当該技分野において周知である。比較のための配列の整列は、これらに限定されないが、ＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡを含む、スミスとウォーターマン、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  （１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、ニードルマンとウンシュＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のグローバルアライメントアルゴリズム、ピアソンとリップマンＰｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似の検索方法、またはこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施によって、行ってもよい。特にほかに明記しない限り、配列同一性値は、デフォルトパラメーター（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））を用いてプラグラムのＢＬＡＳＴを使用して得られる値をここでは指す。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、例えば、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に利用可能である。アミノ酸配列の比較の１つの例は、以下のようなデフォルト設定を用いるＢＬＡＳＴＰアルゴリズムである：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；  クエリの範囲における最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、拡張１；構成調整：条件付き構成スコアマトリクス調整。核酸配列の比較のための１つのそのような例は、以下のようなデフォルト設定を用いるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムである：期待閾値：１０；ワードサイズ：２８；クエリの範囲における最大一致：０マッチ／ミスマッチスコア：１．−２；  ギャップコスト：リニア。
【００１３】
本明細書の文脈において、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）という用語は細胞生物学および生化学の分野で知られるその意味で使用される；それは、タンパク質の、エピトープとも呼ばれる、特定の断片（ペプチド）を提示する細胞表面分子を指す。ＭＨＣ分子には２つの主要なクラス、クラスＩおよびクラスＩＩがある。
【００１４】
ＭＨＣクラスＩ重鎖分子は通常（すなわち、オープン配座異性体ではない場合）、非ＭＨＣ分子β２ミクログロブリンのユニットと連結されたα鎖として生じる。該α鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、シグナルペプチド、細胞外ドメイン（α１−３、Ｎ末端にα１を有する）、膜貫通領域およびＣ末端細胞質尾部を含む。表示または提示されるペプチドは、α１／α２ドメインの中央領域におけるペプチド結合溝によって固定される。
【００１５】
本明細書の文脈において、β２−ミクログロブリンドメインという用語は、細胞生物学および生化学の分野で知られるその意味で使用される；それは、ＭＨＣクラスＩヘテロ二量体分子の一部である非ＭＨＣ分子を指す。言い換えれば、それは、ＭＨＣクラスＩヘテロ二量体のβ鎖を構成する。
【００１６】
本明細書の文脈において、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）という用語は、細胞生物学および生化学の分野で知られるその意味で使用される；それは、ヒトＭＨＣクラスＩタンパク質をコードする遺伝子座位を指す。ＨＬＡの３つの主要なＭＨＣクラスＩ遺伝子はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃであり、これらの遺伝子はすべて、様々な対立遺伝子数を有する。例えば、ＨＬＡ−Ｂは既知の対立遺伝子３５９０を有する。密接に関連する対立遺伝子は、特定の対立遺伝子のサブグループとグループ分けされる。例えば、対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ２７は、１６０以上の密接に関連した対立遺伝子を有し、それは、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ命名委員会ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０１：００からＨＬＡ−Ｂ＊２７：９９：００とラベル付けされる。全ての既知のＨＬＡ遺伝子およびそれらのそれぞれの対立遺伝子の完全または部分配列は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）のような専門データベースにおいて当業者に利用可能である。
【００１７】
本明細書の文脈において、抗体という用語は細胞生物学および免疫学の分野で知られるその意味で使用される：それは、これに限定されないが、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）またはＭ型（ＩｇＭ）、いずれのフラグメントに結合する抗原またはその単一鎖、および関連するまたは由来する構築物を含む全抗体を指す。全抗体とは、ジスルフィド結合によって内部結合している少なくとも２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。該重鎖定常領域は３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は軽鎖可変領域（ここでは、ＶＬと略す）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。該軽鎖定常領域はひとつのドメイン、ＣＬを含む。該重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介してもよい。
【００１８】
本明細書の文脈において、結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）領域という用語は、細胞生物学および免疫学の分野で知られるその意味で使用される；それは、ジスルフィド結合によって共有結合されたＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む２つの同一の重鎖フラグメントを含む抗体の画分を指す。
【００１９】
本明細書の文脈において、二量体という用語は２つのサブユニットで構成されるユニットを指す。
【００２０】
本明細書の文脈において、ホモ二量体という用語は、サブユニットの同一クラスの、同一または高類似性のメンバーのいずれかの２つのサブユニットで構成される二量体を指す。ホモ二量体の一例としては、ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子のリストから独立して選択された２つのサブユニットから構成される二量体である。一実施態様において、ホモ二量体は、２つの同一ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子で構成される。
【００２１】
本明細書の文脈において、アミノ酸リンカーという用語は、単一鎖ポリペプチドを作製するために２つのポリペプチドを連結するために使用する可変長のポリペプチドを指す。本願明細書で特定される発明の実施について有用なリンカーの例示的な実施態様としては、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０または５０アミノ酸で構成されるオリゴペプチド鎖である。アミノ酸リンカーの非限定的な例としては、ＨＬＡ−Ｂ２７ポリペプチドとＦｃドメインと連結するポリペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号  １７３）である。  
【００２２】
本発明は、癌治療においての使用のためのＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体を提供する。
【００２３】
本発明の側面によれば、単離したＨＬＡ−Ｂ２７タンパク質ホモ二量体（オープン配座異性体タンパク質）は、癌の治療または予防においての使用のために提供される。
【００２４】
一実施態様において、該ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体ホモ二量体は、２つの同一のペプチド鎖を含む。一実施態様において、該ＨＬＡ−Ｂ２７タンパク質ホモ二量体は、２つの異なるＨＬＡ−Ｂ２７ペプチド鎖を含む。
【００２５】
本発明の第１の他の側面によれば、ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体融合タンパク質ホモ二量体は、癌の治療または予防において使用するために提供される。該融合タンパク質ホモ二量体は２つのモノマーを含む、またはそれらで構成され、そして各モノマーは互いに独立して、ＨＬＡ−Ｂ２７鎖、およびインビボでポリペプチドを代謝的に安定化させると知られるポリペプチドドメインを含む。そのような安定化ドメインの一例としては、免疫グロブリンのＦｃ（結晶化可能フラグメント）ドメインである。該ＨＬＡ−Ｂ２７鎖および安定化ドメインは、必要に応じて、アミノ酸リンカーで連結してもよい。該ＨＬＡ−Ｂ２７鎖および免疫グロブリンＦｃフラグメントを含むオープン配座異性体融合タンパク質は、本願明細書では、これ以降は、ＨＬＡ−Ｂ２７Ｆｃオープン配座異性体またはＢ２７２−Ｆｃとうい用語で示す。
【００２６】
一実施態様において、Ｆｃドメインは、溶解性、安定性、結合活性、半減期を高めるために、および技術的観点からは、哺乳類システムにおけるコスト効率のよい産生と精製（タンパク質ＡまたはＧ精製）のために、融合タンパク質として存在する。
【００２７】
一実施態様において、ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体はＦｃ領域が除かれて産生され、ビオチン化認識配列と結合し、培養中の合成中にビオチン化される。得られた生成物はビオチン部分を含む。一実施態様においては、これに限定されないが、ストレプトアビジン被覆ビーズのような基材に複数のＨＬＡ−Ｂ２７を結合させる。この多量体化は、インビトロ試験についてＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体の安定性を増加させる。一実施態様において、４つのてＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体はストレプトアビジン被覆ビーズに結合させることによって、四量体を形成する（Ｂ２７２−Ｔｅｔ）。
【００２８】
一実施態様において、ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体は、さらにペプチドエピトープフラグメントを含む。
【００２９】
本発明の第２の側面によれば、ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体モノマー（すなわち、第２のＨＬＡ−Ｂ２７重鎖ポリペプチドに結合しておらず、β２−ミクログロブリンに結合していないＨＬＡ−Ｂ２７）は、癌の治療または予防において使用するために提供される。この側面の一実施態様においては、ＨＬＡ−Ｂ２７モノマーはさらにペプチドエピトープフラグメントを含む。
【００３０】
本側面は、以下の項目で要約することができる。
項目１：癌の治療または予防において使用するための、関連するβ２ミクログロブリンを本質的に含まない単離された単一のＨＬＡ−Ｂ２７重鎖ポリペプチドモノマー。
項目２：前記モノマーがペプチドエピトープ断片をさらに含む、項目１に記載の癌の治療または予防において使用するための単離された単一のＨＬＡ−Ｂ２７重鎖ポリペプチドモノマー。
項目３：前記ＨＬＡ−Ｂ２７鎖がＨＬＡ−Ｂ２７α１、２および３ドメインのみからなる、項目１または２に記載の癌の治療または予防において使用するための単離された単一ＨＬＡ−Ｂ２７重鎖ポリペプチドモノマー。
項目４：ＨＬＡ−Ｂ２７鎖が膜貫通ドメインを含み、細胞内ドメイン（細胞質尾部）を含まない、前記項目のいずれか１項に記載の癌の治療または予防において使用するための単離された単一のＨＬＡ−Ｂ２７重鎖ポリペプチドモノマー。
項目５：ＨＬＡ−Ｂ２７鎖が、連続して番号を付した配列番号００６から配列番号１７２によって同定される配列のいずれか１つに対して、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上または９８％以上、または１００％の配列同一性を有する、上記項目のいずれか１項に記載の癌の治療または予防において使用するための単離された単一ＨＬＡ−Ｂ２７重鎖ポリペプチドモノマー。  
項目６：
ａ．項目１〜５のいずれか１項に記載の単離された単一のＨＬＡ−Ｂ２７重鎖ポリペプチドモノマー、および
ｂ．チェックポイント阻害剤、
を含む併用薬剤。
項目７：前記チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０またはＣＤ８６との相互作用の阻害剤、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用の阻害剤、およびリガンドＴＩＭ−３から、特にＣＴＬＡ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＴＩＭ−３のいずれか１つに対する抗体、より特にヒトＣＴＬＡ４またはＰＤ−１に対するモノクローナル抗体から選択される、項目６に記載の併用薬剤。
【００３１】
上記の本発明の側面のいずれか１つの一実施態様において、該ペプチドエピトープフラグメントはＨＬＡ−Ｂ２７ペプチド鎖の抗原提示ドメイン内のペプチドへ非共有結合で結合する。
【００３２】
上記の本発明の側面のいずれか１つの一実施態様において、ＨＬＡ−Ｂ２７鎖は細胞外ＨＬＡ−Ｂ２７α１、２および３ドメインのみを含む。これらの実施態様において、組換え細胞において該分子の細胞外発現を可能にするためにＨＬＡ−Ｂ２７鎖の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは含まれていない。
【００３３】
上記の本発明の側面のいずれか１つの一実施態様において、ホモ二量体のＨＬＡ−Ｂ２７鎖は、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０４、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０３、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０７、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０８、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１０、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１３、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１４、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１５、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１９、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：２３、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：２４、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：２５またはＨＬＡ−Ｂ＊２７：４９から選択される。  
【００３４】
上記の本発明の側面のいずれか１つの一実施態様において、ＨＬＡ−Ｂ２７鎖はＨＬＡ−Ｂ２７α１、２および３のみを含み、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０５、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０４、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０３、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０７、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０８、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１０、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１３、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１４、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１５、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１９、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：２３、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：２４、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：２５またはＨＬＡ−Ｂ＊２７：４９から選択される配列の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは含まない。
【００３５】
ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０５は最も広く分布している疾病関連対立遺伝子である。しかし、これに限定されないが、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０２（地中海人種）およびＨＬＡ−Ｂ＊２７：０４（中国および他のアジアの人種）、およびさらにＨＬＡ−Ｂ＊２７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０３、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０７、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：０８、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１０、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１３、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１４、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１５、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：１９、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：２３、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：２４、ＨＬＡ−Ｂ＊２７：２５およびＨＬＡ−Ｂ＊２７：４９を含む他の一般的な疾病関連サブタイプは、本発明での使用が考えられる。これらのタイプは、これらのサブタイプを有する少なくとも１つ以上脊髄関節炎患者に観測されたとして、疾病に関連していると知られている。
【００３６】
上記の本発明の側面のいずれか１つの一実施態様において、ＨＬＡ−Ｂ２７鎖は、配列番号００６から配列番号１７２のいずれかひとつに対して７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上または９８％以上、または１００％の配列同一性を有する。
【００３７】
一実施態様において、ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体ホモ二量体またはＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体は、上記ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子から独立して選択される２つのサブユニットで形成される。
【００３８】
一実施態様において、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体はＦｃドメインを含む。特定の一実施態様において、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）またはＭ型（ＩｇＭ）から選択される重鎖定常領域ＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【００３９】
一実施態様において、ＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質ホモ二量体は、安定化ドメイン、特にＦｃドメインをＨＬＡポリペプチドへ結合させるアミノ酸リンカーを含む。特定の一実施態様において、該アミノ酸リンカーは、ＨＬＡ−Ｂ２７鎖をＦｃドメインへ１つの単一ポリペプチド鎖となるように結合させる、１から５０アミノ酸、特に５から４０アミノ酸、より特に１０から３０アミノ酸、さらに特に１５から２５アミノ酸を含む。
【００４０】
本発明の第３の側面によれば、本発明の上記側面に記載のＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体、または融合タンパク質モノマーをコードする核酸分子が、癌の治療または療法において使用するために提供される。インビボにおける該核酸分子からの融合タンパク質の発現は二量化後に本発明の融合タンパク質ポリペプチドをもたらす。患者の体内でそれらをコードする核酸から薬学的に活性なポリペプチドを発現させるという概念は周知であり、患者に大きな利益を与えることができる。
【００４１】
一実施態様において、核酸分子は、ペプチドエピトープフラグメントを含むＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質モノマーをコードする。一実施態様において、核酸分子は、細胞外ＨＬＡ−Ｂ２７α１、２および３ドメインのみを含むＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質モノマーをコードする。一実施態様においては、核酸分子は、細胞外ＨＬＡ−Ｂ２７α１、２および３ドメイン、ならびにペプチドエピトープフラグメントのみを含むＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質モノマーをコードする。
【００４２】
一実施態様において、核酸分子はアミノ酸リンカーおよび／またはＦｃ（結晶化フラグメント）ドメインを含むＨＬＡ−Ｂ２７融合タンパク質をコードし、ならびに癌の治療または療法において使用される。
【００４３】
本発明の第４の側面によれば、本発明の第３の側面に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクターは、癌の治療または療法において使用されるために提供される。
【００４４】
一実施態様においては、組換え発現ベクターは、哺乳類細胞、特にヒト細胞において作動可能なプロモーターを含むプラスミドである。該プロモーターは本発明の核酸分子と作動可能な状態で結合している。
【００４５】
本発明の他の側面によれば、本発明の第３の側面に記載の核酸分子を含むウイルスは、癌の治療または療法において使用するために提供される。該核酸分子は、哺乳類細胞、特にヒト細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下にある。一実施態様においては、該ウイルスはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスまたはレンチウイルスである。
【００４６】
本発明の別の側面によれば、本発明の第３の側面に記載の核酸分子を含むインビトロ遺伝子改変宿主細胞が提供される。
【００４７】
本発明の別の側面は、癌の治療または予防のための薬剤の製造において、本発明の第１および第２の側面に記載のＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体ホモ二量体または融合タンパク質ホモ二量体の使用について提供する。
【００４８】
さらに別の側面によれば、該発明はそれを必要とする患者へ本発明の第１および第２の側面に記載のＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体の投与を含む癌の治療方法を提供する。
【００４９】
本発明の別の側面によれば、併用薬剤が提供され、ここで、該併用薬剤は、
−  上記本発明の側面または実施態様のいずれか１つに記載のＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体ホモ二量体または融合タンパク質、および
−  ＣＤ８０またはＣＤ８６と細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４；ＣＤ１５２としても知られている）との相互作用の阻害剤、プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ−１；ＣＤ−２７９としても知られている）とそのリガンドＰＤ−１との相互作用の阻害剤、ならびにＴ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（ＴＩＭ−３）のリガンドから選択される免疫チェックポイント阻害剤、
を含む。
【００５０】
一実施態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０またはＣＤ８６との相互作用の阻害剤である。
【００５１】
一実施態様において、免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ；  ＣＡＳ  Ｎｏ．４７７２０２−００−９）である。
【００５２】
一実施態様においては、ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体ホモ二量体または融合タンパク質ＨＬＡ−Ｂ２７ホモ二量体は、非経口剤形として、特に注射用として提供される。一実施態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、非経口剤形として、特に注射用として提供される。一実施態様において、ＨＬＡ−Ｂ２７ホモ二量体および免疫チェックポイント阻害剤の両方が同一の投与形態として存在する。
【００５３】
さらに別の側面において、本発明は、組換えＨＬＡ重鎖ポリペプチドを生産する方法に関する。該方法は、以下の項目に要約する。
項目Ａ：組換えバイオテクノロジーの方法により、ヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドを産生するための方法であって、ここで、前記方法は以下の工程を含む：
ａ．発現工程：
ｉ．細胞において、特に真核細胞、より特に哺乳類細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下の、少なくともＨＬＡ重鎖のα１鎖、α２鎖およびα３鎖をコードする、ＨＬＡコード核酸配列、および
ｉｉ．前記細胞（項目１．ａ．と同じ細胞）において作動可能なプロモーター配列の制御下のヒトＨＬＡβ２ミクログロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ６１７６９）をコードする、β２ミクログロブリンコード核酸配列、
を哺乳類細胞（「産生細胞株」）において共発現する工程；
ｂ．精製工程：得られたＨＬＡ−重鎖／β２ミクログロブリン複合体を哺乳動物細胞（産生細胞株）から精製する工程；
ｃ．  解離工程：精製ＨＬＡ−重鎖／β２−ミクログロブリン複合体を適切な条件下で解離させ、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをβ２ミクログロブリンポリペプチドから分離する工程；
ｄ．リフォールディング工程：分離されたＨＬＡ重鎖ポリペプチドを、（生理的に活性なＨＬＡオープン配座異性体分子において見られるそれらの天然のタンパク質三次構造の）リフォールディングに至る条件下でインキュベートする工程。
項目Ｂ：前記ＨＬＡをコードする核酸配列が、ポリペプチドのＮ末端からＣ末端にかけてα１鎖、α２鎖、α３鎖および安定化配列をコードする配列を含む、項目Ａに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの産生方法。
項目Ｃ：前記安定化配列が、ウシ血清アルブミンおよび免疫グロブリン定常フラグメント（Ｆｃ）、特に免疫グロブリンＧ定常フラグメント、より特にＩｇＧ４Ｆｃから選択される、項目ＡまたはＢに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの産生方法。
項目Ｄ：前記ＨＬＡをコードする核酸配列およびβ２ミクログロブリンをコードする核酸配列が、同一の核酸ベクター分子（特に、ＤＮＡ発現プラスミド）上に存在する、前記項目のいずれかに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドを産生する方法。
項目Ｅ：前記ＨＬＡをコードする核酸配列およびβ２ミクログロブリンをコードする核酸配列は、異なる核酸ベクター分子（特に異なるＤＮＡ発現プラスミド）上に存在する、項目ＡからＣのいずれかに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの産生方法。
項目Ｆ：前記ＨＬＡをコードする核酸配列を含む核酸ベクターが、β２−ミクログロブリンをコードする核酸配列を含む核酸ベクターに対して約１〜５倍過剰、特に１．５〜５倍過剰で、特に約３倍過剰で存在する、項目Ｅの方法。
項目Ｇ：前記ＨＬＡをコードする核酸配列が安定化配列として免疫グロブリンＦｃ断片を含み、および前記精製工程は、組換えＨＬＡ重鎖ポリペプチドをプロテインＡに結合された表面に吸着させることによって行われる、前記項目のいずれかに記載の方法。
項目Ｈ：前記解離工程は、酸性条件下、特に約ｐＨ２での処理、および還元条件下での透析によって行われる、前記項目のいずれかに記載の方法。
項目Ｉ：前記リフォールディング工程は、中性条件下の処理で行われる、前記項目のいずれかに記載の方法。
【００５４】
例えば、対立遺伝子またはコード配列のような単一の分離可能な特徴についての代替物が本明細書において「実施態様」として示されている場合、このような代替物は、本明細書に開示される本発明の別個の実施態様を形成するために自由に組み合わせられ得る。
【００５５】
本発明は、以下の実施例および図面によりさらに説明され、それからさらなる実施形態および利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しており、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００５６】
本発明者らは、驚くべきことに、ＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体が、特にＦｃ免疫グロブリンフラグメントを含む融合タンパク質として存在する場合、癌治療において有用であり得ることを見出した。Ｂ２７２−Ｆｃ分子は、単独で、または他の癌治療法学と組み合わせて使用してもよい。
【００５７】
インビトロ試験
Ｂ２７２−Ｔｅｔ分子は、インビトロにおいて、Ｔｒｅｇ抑制への作用およびＴ細胞活性化を通して、ヒトとげっし類の両方において免疫応答を調節する（図１〜３）。
【００５８】
Ｂ２７２−ＴｅｔはマウスＣＤ４＋Ｔ細胞のｉＴｒｅｇへの変換を遮断する
ｉＴｒｅｇの変換について、ＨＬＡ分子とナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞との作用を解析した。０．５  μｇ／ｍＬのＢ２７２四量体、ＨＬＡ−Ｂ２７四量体、ＨＬＡ−Ｂ８四量体を、ｉＴｒｅｇ変換について最適な培養条件でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞とインキュベートした。Ｂ２７２−ＴｅｔはＦｏｘＰ３の誘導を下方調節することが示された（図１）。
【００５９】
Ｂ２７２−ＴｅｔはＴｒｅｇによるマウスおよびヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の抑制を減少させる
応答細胞として、紫色にラベルしたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を用いて、マウスおよびヒトのＴｒｅｇ細胞の抑制機能を決定した（図２）。ＴｒｅｇはＨＬＡ四量体およびＢＳＡ四量体と共培養し、９６時間後のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を測定した。ＣＤ８＋Ｔ細胞単独では、期待通り強い増殖を示し、そしてＴｒｅｇ細胞は、コントロール四量体（ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ８およびＢＳＡ）とインキュベートしたときはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制した。驚くべきことに、Ｂ２７２四量体の存在によるＴｒｅｇの抑制機能の大幅な減少はマウス（図２Ａ）およびヒト（図２Ｂ）の両方の抑制アッセイにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な増殖によって示された。Ｂ２７２−Ｔｅｔの効果は、マウス（図２Ｃ）およびヒト（図２Ｄ）の両方で量依存的であった。
【００６０】
Ｂ２７オープン配座異性体ホモ二量体に対する抗体は、エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を減少させ、及びトランスジェニック＋ＨＬＡ−Ｂ２７ラットにおける、Ｂ２７オープン配座異性体ホモ二量体の免疫調製効果を示す
インビボ疾患におけるＢ２７オープン配座異性体ホモ二量体の関与を実証するために、Ｂ２７オープン配座異性体ホモ二量体に特異的な抗体（ＨＤ５）を作製した。インビボモデルとして、発明者らは、炎症誘発性リンパ球（Ｔｈ１、Ｔｈ１７、ＴＮＦ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞）の数の増加で、ヒトＳｐＡ症状に似た疾患へ進行するＳｐＡのＨＬＡ−Ｂ２７ラットモデルを用いた。ＨＬＡ−Ｂ２７ラットリンパ球からのエクスビボデータは、Ｂ２７２−Ｔｅｔの唯一の存在がＣＤ４＋Ｔ細胞由来の炎症誘発性サイトカインの発現を誘導できることを示した（図３）。さらに、抗Ｂ２７オープン配座異性体ホモ二量体抗体（ＨＤ５）（図４Ａ〜Ｃ）を注入することによって得られたインビボの結果は、インビボでＢ２７オープン配座異性体ホモ二量体分子を遮断することによって免疫応答が調節され、そして異なる器官においてＴＮＦ  ＣＤ４＋Ｔ細胞（図４Ｂ）およびＴｈ１７細胞（図４Ｃ）の増殖が有意に減少することを示した。
【００６１】
癌における治療分子としてのＢ２７２−Ｆｃの概念を証明するために、検証済みの前臨床同系マウス結腸癌モデルを用いた実験を実施した。
【００６２】
ＣＨＯ細胞におけるヒトＦｃ融合タンパク質としてのＢ２７オープン配座異性体の産生
有効な戦略は、治療の観点でいうと、安定した状態でＨＬＡ−Ｂ２７オープン配座異性体タンパク質を産生し、溶解性、安定性、結合活性、半減期を向上させることであり、技術的観点でいうと、哺乳類システムにおけるコスト効率の良い産生および精製である。Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃ複合体の産生は、ＨＬＡ−Ｂ２７のα１、２および３ドメインを、Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃタンパク質の細胞外産生に必要なヒトβ２ｍベクターと一緒に、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃベクターカセット（図５Ａ）へ挿入することによって成功した（図５Ａ、Ｂ）。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞におけるトランスフェクションは、Ｂ２７−Ｆｃベクターとβ２ｍベクターの両方を１：３の比率で用いて行った。標準的な抗体精製プロトコール（組換えタンパク質精製ハンドブック、原理および方法、２００９．ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１８−１１４２−７５）を用いて上清を回収し、Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃを精製した（図５Ｂ）。Ｂ２７−Ｆｃ遊離重鎖からのβ２ｍの分離は、変性条件でＳＥＣまたは透析法によって行った（図６）。Ｂ２７２−Ｆｃのリフォールディングは、リフォールディング緩衝液中の希釈法を用いて行い、ウエスタンブロットにより分析した（図６Ｄ）。
【００６３】
Ｂ２７２−Ｆｃの毒性試験
毒性試験は６週齢のＣ５７ＢＬ／６ワイルドタイプマウスにおいて行った。Ｂ２７２−Ｆｃを０、０．１  ｍｇ／ｋｇ、１  ｍｇ／ｋｇ、１０  ｍｇ／ｋｇ  の用量で３週間にわたって週２回、腹腔内投与した。ＰＢＳ群と処置群とを比較すると、健常群に変化はなかった（麻痺、ストレス、不安、無力感、感染の徴候、腹部呼吸、腰掛けまたは毛皮のフリル、体重および便）。リンパ球集合は群間で一定であり、ナイーブおよびエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ、Ｂ細胞ならびに単球は群間の数に変化を示さなかった。このデータに基づいて、本発明者らは同系癌マウスモデルにおけるインビボ試験について、Ｂ２７２−Ｆｃを１０  ｍｇ／ｋｇで試験を進めることとした。
【００６４】
同系結腸癌マウスモデルにおけるＢ２７２−Ｆｃ単剤療法の前臨床試験
Ｂ２７２−Ｆｃ分子（１０ｍｇ／ｋｇ）の注射を治療計画（図７Ａ）において行った。確立されたプロトコールに従って、ＭＣ３８−ＯＶＡｄｉｍ断片腫瘍を同系マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍が１００  ｍｍ３（腫瘍の注射後１〜２週間）に達すると、Ｂ２７２−Ｆｃを腹腔内注射した。３週間にわたって週に２回（図７Ａ）、腫瘍のサイズを測り、リンパ球の浸潤について分析した（図７Ｂ〜Ｅ）。
【００６５】
結果は、コントロールと比較した場合、Ｂ２７２−ＦｃがＭＣ３８−ＯＶＡｄｉｍマウスにおける腫瘍発生を有意に減少させることができることを示した（図７Ｂ）。コントロールと比較して、腫瘍へのＮＫ細胞の有意な浸潤によって、Ｂ２７２−Ｆｃ作用様式の機構的効果が観察され（図７Ｃ）、これはＮＫ細胞が腫瘍増殖の調節において重要な役割を果たすというメカニズムを示している。アイソタイプと比較した場合、Ｔｒｅｇの数の減少傾向が観察されたが有意ではなかった（ｐ＜０．１）（図７Ｅ）。結果は２つの別々の実験からプロットしている。
【００６６】
同系癌モデルにおけるＣＴＬＡ４およびＰＤ−１抗体を用いたＢ２７２−Ｆｃの前臨床併用療法試験
確立されたプロトコールに従って、Ｐａｎ０２を１×１０６細胞、ＥＭＴ６を１×１０６細胞およびＥＧ．７を１×１０６細胞、同系マウス群の脇腹にそれぞれ皮下注射した。マウスは腫瘍体積（Ｐａｎ０２およびＥＭＴ６）または体重（ＥＧ．７）に従ってグループ分けした。Ｂ２７２−Ｆｃを３日間ごとに７回腹腔内注射し（Ｑ３Ｄｘ７）、ＣＴＬＡ４  を選択した間隔で３回注射し（Ｑ３Ｄｘ７）（図８）、ＰＤ−１を週２回計６回（ｂｉｗｋ×３）、注射した（図８）。
【００６７】
結果は、ＣＴＬＡ４単独療法およびアイソタイプコントロール群と比較した場合、Ｂ２７２−ＦｃとＣＴＬＡ４抗体との併用が、ＣＴＬＡ４抗体の治療効果を増強し、Ｐａｎ０２膵臓およびＥＭＴ６乳癌モデルにおける腫瘍発生を有意に減少させることができることを示した。アイソタイプまたはビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）（ｐ＜０．０１）と比較した場合、ＰＤ−１抗体による併用アプローチの結果は、Ｂ２７２−ＦｃがＥＧ．７リンパ腫モデルにおけるＰＤ−１抗体の治療効果を増強しているが、ＰＤ−１単独療法と比較した場合では増強していないことを示した。アイソタイプまたはビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）と比較した場合、ＰＤ−１単独療法は有意な差はなかった。
【００６８】
結論
癌と戦うＢ２７２−Ｆｃ分子の使用についての原理は、単独療法またはＣＴＬＡ４もしくはＰＤ−１抗体との併用療法のいずれかとして、異なる同系癌マウスモデルにおける前臨床実験で証明された。
【００６９】
毒性試験によって、Ｂ２７２−Ｆｃ治療が毒性の兆候を誘導しなかったことを実証され、インビボ実験中、マウスの生存は治療の任意の時点で処置群と変わらなかった。
【００７０】
ＭＣ３８−ＯＶＡｄｉｍにおいて、本発明者らは、Ｂ２７２−Ｆｃ処置マウスにおいて腫瘍微小環境へのＮＫ細胞の浸潤が上昇することを見出した。このデータは、ＮＫ細胞がＢ２７２の活性化を通して抗腫瘍応答に積極的に関与しているというメカニズムを指す。  以後、Ｂ２７２−Ｆｃが開発され、癌治療の管理における新規クラスの薬物としてさらに試験されるであろう。
【００７１】
Ｂ２７２−Ｆｃは新規なクラスの免疫調節薬となる。インビトロおよびインビボのデータは、Ｂ２７２−Ｆｃ分子が抗腫瘍免疫の活性化のためのスイッチオン機構として作用することであり、免疫チェックポイントに関連する機構の改変またはＤＣ、ＮＫおよび／またはＴ細胞の耐性を崩すことにより機能する機構であることを示している。
【００７２】
理論に拘束されることを望まないが、発明者らは、Ｂ２７オープン配座異性体とＤＣ、Ｔ細胞およびＮＫ細胞との相互作用が、免疫応答に関与し悪化させる細胞の生存／増殖を助長する、変化した細胞シグナリングをもたらすと仮定している。
【００７３】
材料と方法  
動物と細胞株
ｉＴｒｅｇアッセイのためのＦｏｘＰ３（ｅＧＦＰ）レポーターマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｆｏｘｐ３ｔｍ２Ｔｃｈ／Ｊ）はジャクソン研究所から購入し、スイス医科大学動物施設で飼育した。ＨＬＡ−Ｂ２７／ｈβ２ｍトランスジェニック（３３−３系統）（Ｔｇ）および野生型（ＷＴ）Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｆ３４４雄ラットをＴａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＮＹ）から入手し、スイス医科大学動物施設で飼育した。野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを繁殖させ、バーゼル大学病院動物施設で維持した。ＭＣ３８−ＯＶＡｄｉｍは、マウス由来の結腸癌腫瘍細胞株である。
【００７４】
インビボ治療
ＨＬＡ−Ｂ２７／ｈβ２ｍトランスジェニック（３３−３系統）（Ｔｇ）および野生型（ＷＴ）Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｆ３４４雄ラットを３群に分け、それに応じてランダムにＨＤ５  ｍＡｂ（抗Ｂ２７２）または抗Ｈｅｒ２ｎｅｕで処置した：ａ．ＷＴ−同腹子（ｎ＝８）、ｂ．  Ｔｇ−ＨＤ５（ｎ＝１０）、ｃ．Ｔｇ−コントロール（抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ）コントロール群（ｎ＝１０）。各Ｔｇラットに、１５週齢または２３週齢までＨＤ５または抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ（コントロール）（１０  ｍｇ／ｋｇ）を毎週腹腔内（ｉ．ｐ．）注入した。ＷＴ−同腹仔は治療を受けなかった。
【００７５】
毒性試験は６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスで行った。Ｂ２７２−Ｆｃ０、０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１０および２０ｍｇ／ｋｇの用量を１週間に２回、３週間にわたって、マウスに腹腔内注射した。
【００７６】
ＭＣ３８−ＯＶＡｄｉｍ腫瘍フラグメントを６週目に同系雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が±５０ｍｍ３に達したら、個々の腫瘍体積の大きさに従って動物を分配し、それらの間に統計的差異を示さない群に分けた。Ｐａｎ０２膵臓癌マウスモデルでは、同系雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に１×１０６個のＰａｎ０２細胞を注入し、腫瘍体積±１０ｍｍ３に応じて動物を分配し、それらの間に統計的差異を示さない群に分けた。ＥＭＴ６乳癌マウスモデルでは、５×１０６個のＥＭＴ６細胞を同系雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの脇腹に注射し、腫瘍体積±４０ｍｍ３に応じて動物を分配し、それらの間に統計的差異を示さない群に分けた。ＥＧ．７リンパ腫マウスモデルでは、同系雌Ｃ５７ＢＬ／  ６マウスの脇腹に１×１０６個のＥＧ．７細胞を注射し、動物を体重に従って分配し、それらの間に統計的に差異を示さない群に分けた。腫瘍直径をキャリパーを用いて測定し、Ｄ／  ２×ｄ２式に従って体積を計算した。ここで、Ｄおよびｄはそれぞれ腫瘍の最長および最短直径である。
【００７７】
細胞の注入時点および物質の注入の実験的設計は、以下のようにして確立した：ビヒクル（ＰＢＳ２００μＬ）；アイソタイプ（１０  ｍｇ／ｋｇ）Ｑ３Ｄｘ７；  Ｂ２７２−Ｆｃ（１０  ｍｇ／ｋｇ）；抗ＣＴＬＡ４  Ｑ３Ｄｘ３（１回目の注射２００  μｇ、２回目および３回目の注射１００μｇ）。ＰＤ−１  ｂｉｗｋ×３（１００  μｇ）。Ｂ２７２−Ｆｃ  ＋  ＣＴＬＡ４（それぞれ、Ｑ３Ｄｘ７およびＱ３Ｄｘ３）およびＢ２７２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれＱ３Ｄｘ７およびｂｉｗｋｘ３）。腫瘍は、サイズを決定し、およびＭＣ３８−ＯＶＡｄｉｍモデルにおけるフローサイトメトリー分析によってリンパ球の浸潤について分析した。
【００７８】
動物実験は、動物保護に関するスイスの連邦法および州法に従って実施された。
【００７９】
抗体
マウスのリンパ球集合を、ＣＤ４（ＦＩＴＣ−ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦｏｘＰ３  ＋（ｅｆｌｕｏｒ  ４５０−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＰＥ−Ｃｙ７−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５（ＰｅｒＣＰ−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＰＥ−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ  ＣＤ１１ｂ（ＦＩＴＣ−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１１ｃ（ＦＩＴＣ−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＴｅｒ１１９（ＦＩＴＣ−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。
【００８０】
ラットのリンパ球集合を、ＣＤ３（ＡＰＣ−Ｃｙ７−ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４（ＰＥ−Ｃｙ７−ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＩＬ−１７Ａ（ｅＢｉｏ１７Ｂ７−ＡＰＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＴＮＦ（ＰＥ−Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。
【００８１】
ヒトのリンパ球集合を、ＣＤ４（ＰＥ−Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦｏｘＰ３（ｅＦｌｕｏｒ  ４５０−ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３（ＡＰＣ−Ｃｙ７−Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。
【００８２】
ＨＬＡ−Ｂおよび−Ｃ対立遺伝子のβ２ｍ遊離重鎖およびＢ２７２に結合するＨＣ１０  ｍＡｂ（ＩｇＧ２ａ）は、ハイド  プロ−博士（ＭＩＴ、ＭＡ）から贈与された。Ｂ２７オープン配座異性体ホモ二量体に対するＨＤ５  ｍＡｂ（所内の）抗体。マウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。抗Ｈｅｒ２ｎｅｕ  ｍＡｂ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｒｏｃｈｅ）。ウェスタンブロットによりヒトβ２ｍを検出するための抗β２ミクログロブリン抗体（Ａｂｃａｍ）。
【００８３】
白血球のフローサイトメトリー
ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の検出のための細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を、１％パラホルムアルデヒドを用いて行い、ＦＡＣＳ緩衝液中０．１％サポニンで浸透させ、一次抗体（ＦｏｘＰ３、ＣＤ４およびＣＤ３）で染色した。
【００８４】
白血球を刺激するための細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下、５時間、ホルボールミリスチン酸トアセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシン（両方とも０．５μｇ／ｍＬ）で行った。
【００８５】
フローサイトメトリー分析はＦＡＣＳ  ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行い、データはＦｌｏｗＪｏバージョン７．６．４を用いて分析した。
【００８６】
インビトロ試験のためのＨＬＡ複合体の産生
インフルエンザ核タンパク質ＮＰ３８３−３９１ペプチドエピトープＳＲＹＷＡＩＲＴＲ（配列番号１７４）またはＥＢＶ  ＥＢＮＡ３ＣエピトープＲＲＩＹＤＬＩＥＬ（配列番号１７５）の存在下で、β２ｍ有りまたは無しでの制限希釈により、ＨＬＡ−Ｂ＊２７０５オープン配座異性体ホモ二量体およびヘテロ三量体複合体をリフォールディングした。コントロールＨＬＡ−Ｂ８ヘテロ三量体複合体をｈＣＭＶｐｐ６５（ＴＰＲＴＧＧＧＡＭ；配列番号１７６）でリフォールディングした。ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン−ＰＥ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＬＡ−テトラマーを構築した。ビオチン化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）をコントロール四量体およびＨＬＡ複合体と組み合わせて使用した。
【００８７】
Ｔｒｅｇの生成
マウスＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３の発現を誘導するために、Ｆ３４４ＦｏｘＰ３ＥＧＦＰマウスからの脾臓細胞を回収した。脾細胞を選別してＣＤ４＋Ｔナイーブ細胞を得た。  次いで、５μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ｍＡｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、２μｇ／ｍＬの可溶性抗ＣＤ２８  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、１０μｇ／ｍＬ ＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）および１００  ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした９６ウェルプレート内で、細胞を１０５細胞／２００μＬ／ウェルで９６時間培養した。
【００８８】
ヒトｎＴｒｅｇを増幅するために、まずフィコール抽出によって血軟膜からＰＢＭＣを単離した。次いで、調節Ｔ細胞Ｄｙｎａｂｅａｄｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を単離し、マニュアルの指示に従ってヒトＴｒｅｇ  Ｅｘｐａｎｄｅｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてさらに増幅した。細胞を完全ＲＰＭＩ中で８日間培養し、２日毎に５００  ＩＵのＩＬ−２を添加した。
【００８９】
Ｂ２７２四量体の存在下でのｉＴｒｅｇ誘導
ｉＴｒｅｇ変換の最適培養条件におけるマウスナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、０．５μｇのＢ２７２−Ｔｅｔ、ＨＬＡ−Ｂ２７−ＴｅｔおよびＨＬＡ−Ｂ８−Ｔｅｔの存在下で７２時間インキュベートした。ｉＴｒｅｇ変換をフローサイトメトリーにより測定した。
【００９０】
抑制アッセイ
ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ−エフェクター細胞を、マウスまたはヒトのいずれか（マウスナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット−、Ｅａｓｙ  Ｓｅｐ；Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＦｌｏｗＣｏｍｐＴＭマウスＣＤ８−、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ８  ヒト−、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から精製し、１０μＭ  細胞トレースバイオレット増殖染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（３μｇ／ｍＬ）および可溶性ＣＤ２８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（１μｇ／ｍＬ）抗体が被覆された９６ウェルＵ底プレートにおいて、Ｔｒｅｇｓ（２．５×１０４）細胞およびＴ−エフェクター細胞（２．５×１０４）を９６時間インキュベートした。ＦＡＣＳ  ｃａｎｔｏ  ＩＩを用いてＴ−エフェクター細胞の増殖を測定し、ＦｌｏｗＪｏバージョン７．６．４の増殖分析ソフトウェアを用いてデータを分析した。
【００９１】
Ｂ２７２−Ｆｃの産生、精製およびリフォールディング
ヒトＩｇＧ４−Ｆｃベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）およびヒトβ２ミクログロブリン（β２ｍ）にＨＬＡ−Ｂ２７のα１、２および３ドメインを別々のベクターに挿入することにより、Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃの組換え産物の産生を行った。組換えＢ２７２−β２ｍ−Ｆｃの産生は、Ｂ２７−Ｆｃ−ベクターおよびβ２ｍ−ベクターのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞への同時トランスフェクションによって行った。Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃの産生は、Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧに委託した。
【００９２】
Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃの精製は、抗体精製のための従来のプロトコールを用いて行った。  Ｂ２７２−Ｆｃの産生は、Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃ複合体からβ２ｍを除去するための変性工程を加えて行った。
【００９３】
端的に述べると、Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃの回収ステップは、タンパク質−Ｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に上清（５ｍＬ／分）を通してに行った。中間精製工程は、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．０）を用いてプロテインＧ−カラムからＢ２７２−β２ｍ−Ｆｃを溶出し、８Ｍ尿素、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および５ｍＭβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）において画分を回収した。第１の洗練工程は、スーパーデックス２００プレップグレードまたはセファクリルＳ−１００ＨＲ（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）またはＡＫＴＡシステム（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）のいずれかによってβ２ｍからＢ２７−Ｆｃ遊離重鎖画分を分離し、または３０ＫＤａまたは５０ＫＤａの細孔サイズ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の膜を用いた透析により分離した。両方のプロトコールから回収されたＢ２７遊離重鎖を、１００倍量のリフォールディング緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８、５００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１％スクロース、０．０１％ポリソルベート−８０，１ｍＭ  ＧＳＨ、および０．１ｍＭ  ＧＳＳＨ）中で８時間の間隔で３回、Ｂ２７遊離重鎖のパルセイションの後に希釈法によりリフォールディングした。ＳＥＣによる第２の洗練工程は、さらなる不純物を除去し、Ｂ２７２−Ｆｃ分子の新たに回収された画分を希釈緩衝液（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ  ｐＨ８．０、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、１％スクロースおよび０．０１％ポリソルベート−８０）に交換して実施した。Ｂ２７２−Ｆｃの精製溶液を０．２μｍメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濾過滅菌した。
【００９４】
画分Ｂ２７２−β２ｍ−Ｆｃ複合体およびＢ２７２−Ｆｃを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびＨＣ１０（ＨＬＡフリー重鎖特異的）抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。β２ｍウエスタンンブロットは変性条件（１０ｍＭ  ＤＴＴ）で行った。
【００９５】
チェックポイント阻害剤抗体ＣＴＬＡ４クローン９Ｈ１０（ＥＧ．７およびＥＭＴ６同系モデルで試験）、ＣＴＬＡ４クローン９Ｄ９（Ｐａｎ０２同系モデルで試験）、およびＰＤ−１クローンＲＭＰ１−１４はＢｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏ．から購入した。
【００９６】
ＨＬＡ−Ｂ２７対立遺伝子の完全配列および部分配列
Ｎ末端からＣ末端までの完全長ＨＬＡ−Ｂ２７α鎖の機能的ドメインは：シグナルペプチド、α１、α２、α３（αドメイン１〜３は下線、α２は太字）、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部である。
【００９７】
例えば配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．）８は以下を含む：
【表１】
0006792559.tif 000002
0006792559.tif 000003
0006792559.tif 000004
0006792559.tif 000005
0006792559.tif 000006
0006792559.tif 000007
0006792559.tif 000008
0006792559.tif 000009
0006792559.tif 000010
0006792559.tif 000011
0006792559.tif 000012
0006792559.tif 000013
0006792559.tif 000014
0006792559.tif 000015
0006792559.tif 000016
0006792559.tif 000017
配列番号００１から配列番号１７２の完全配列および部分配列は付属の配列プロトコルにおいて提供される。
【図１】
0006792559.tif 000018
【図２】
0006792559.tif 000019
【図３】
0006792559.tif 000020
【図４】
0006792559.tif 000021
【図５】
0006792559.tif 000022
【図６】
0006792559.tif 000023
【図７】
0006792559.tif 000024
【図８】
0006792559.tif 000025
【配列表】
0006792559000001.app