(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
5'から3'方向でタンデム位置に配置された三つの対のvegAプロモータ（vegA）及びlacオペレータ（lacO）と、バシラス−サティリス（B. subtilis）・コンセンサス・リボゾーム結合部位（RBS）と、ATG開始コドンと、ティラピア成長ホルモン（tiGH）をコードするDNA配列と、6ヒスチジン残基（6×Hisタグ）をコードするDNAオリゴヌクレオチド配列とを含む、組換えDNAカセットを調製するステップと；
前記DNAカセットをバシラス−サティリス又は大腸菌（E.coli）のシャトル・ベクターに挿入することで、3vegAtiGHH6の組換えコンストラクトを形成するステップと；
前記DNAカセットをバシラス−サティリス・ホスト内に形質転換させるステップと；
前記バシラス−サティリス・ホストを培養して成長させて、前記ティラピア成長ホルモン（tiGH）を細胞内で発現させるステップと；
前記バシラス−サティリス・ホストを溶解させることにより、前記ティラピア成長ホルモン（tiGH）を放出させるステップと；
を含む、前記バシラス−サティリス・ホストにおいて前記ティラピア成長ホルモン（tiGH）をコードする遺伝子を発現させる方法。
【請求項２】
少なくとも一対のvegAプロモータ（vegA）及びlacオペレータ（lacO）と、バシラス−サティリス（B. subtilis）・コンセンサス・リボゾーム結合部位と、ATG開始コドンと、ティラピア成長ホルモン（tiGH）をコードするDNA配列と、6ヒスチジン残基（6×His tag）をコードするDNAオリゴヌクレオチド配列とを含む組換えDNAカセットを調製するステップと；
前記DNAカセットを、バシラス−サティリス又は大腸菌（E.coli）のシャトル・ベクター中に挿入するステップと；
前記DNAカセットをバシラス−サティリス・ホスト中に形質転換させるステップと；
前記バシラス−サティリス・ホストを培養して成長させて前記ティラピア成長ホルモン（tiGH）を細胞内で発現させるステップと；
前記ティラピア成長ホルモン（tiGH）を放出させるステップと；
を含み、
前記組換えDNAカセットが、複数の一対のvegAプロモータ（vegA）及びlacオペレータ（lacO）を含むときに、前記複数の一対のvegAプロモータ（vegA）及びlacオペレータ（lacO）がタンデムに配置される、前記バシラス−サティリス・ホストにおいて前記ティラピア成長ホルモン(tiGH)をコードする遺伝子を発現させる方法。
【請求項３】
前記ティラピア成長ホルモン（tiGH）が22kDaの単一のポリペプチドである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えDNAカセットが、5'から3'に向かって、タンデム位置に配置された三つの対の前記vegAプロモータ（vegA）及び前記lacオペレータ（lacO）と、前記バシラス−サティリス・コンセンサス・リボゾーム結合部位と、前記ATG開始コドンと、前記ティラピア成長ホルモン（tiGH）をコードするDNA配列と、前記6ヒスチジン残基（6×His tag）をコードするDNAオリゴヌクレオチド配列とを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記シャトル・ベクターが6.62-kb のサイズのpMTLBs72を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
形質転換後の前記バシラス−サティリス・ホストを、IPTG誘導剤及び／又はクロラムフェニコール抗生剤の存在下で後期対数期又は静止期まで成長させる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記ティラピア成長ホルモン（tiGH）を回収するために前記バシラス−サティリス・ホストの細胞を遠心分離して沈降させるステップを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記ティラピア成長ホルモン（tiGH）を放出させる前記ステップが、前記ティラピア成長ホルモン（tiGH）を、フランス式圧力細胞ホモジナイザーを用いることで、前記バシラス−サティリス・ホストから機械的に達成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
前記方法は、オレオクロミス・ホルノラム（Oreochromis hornorum）の魚成長ホルモンを発現させる方法である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の方法を含む、魚飼料を調製する方法。
【請求項１１】
作動可能に連結された、少なくとも一対のvegAプロモータ（vegA）及びlacオペレータ（lacO）と、コンセンサス・リボゾーム結合部位（RBS）と、ティラピア成長ホルモン（tiGH）をコードする遺伝子と、6-ヒスチジンコドン（6×His tag）をコードする配列とを有するコーディング配列を含む操作されたプラスミド。
【請求項１２】
請求項１１に記載された操作されたプラスミドを含む組換えバシラス-サティリス。
【請求項１３】
請求項１２に記載された組換えバシラス-サティリスの細胞、そのライセート、又はそこから発現されたたんぱく質、を含む動物飼料又は飼料添加剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の交差参照
本出願は、引用をもってその内容全文をここに援用することとする２０１５年１２月９日付提出の香港特許出願第１５１１２１３６．３の優先権又は利益を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は魚の成長を促進するための生物技術的手段及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
成長速度は、成長能力と収率（よって利益）との間には直接的関係があるため、養魚場にとっては最も重要な考察上の焦点の一つである。従って、この産業において魚の成長速度を促進しようとする様々な試みがなされてきた。
【０００４】
魚成長ホルモン（FSH）は、魚の成長を促進するための使用が提案されてきた。魚の成長を促進する上でFSHを用いる方法の一つは、FSHを溶解させた水槽に魚を浸す方法である。しかしながら、供給に制限がある。例えばこの太陽でFSHを用いることは非効率であり、費用もかかり、大規模では実用的ではない。第二に、多くの魚はこの態様ではFSHをうまく吸収することができない。
【０００５】
もう一つの制限は、このようなFSHで処置された魚が安全に消費され得るかどうかが明らかでないことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記の問題に対処すること、又は少なくとも有用な代替策を大衆に提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明の一番目の態様に従って、
5'から3'方向でタンデム位置に配置された三つの対のvegAプロモータ（vegA）及びlacオペレータ（lacO）と、B.サティリス（原語：B. subtilis ）・コンセンサス・リボゾーム結合部位（RBS）と、ATG開始コドンと、tiGHをコードするDNA配列と、6ヒスチジン残基（6×Hisタグ）をコードするDNAオリゴヌクレオチド配列とを含む、組換えDNAカセットを調製するステップと；
前記DNAカセットをB.サティリス又はE.coliのシャトル・ベクターに挿入することで、3vegAtiGHH6の組換えコンストラクトを形成するステップと；
前記DNAカセットをB.サティリス・ホスト内に形質転換させるステップと；
前記B.サティリス・ホストを細胞培養株中で成長させて、tiGHを細胞内で発現させるステップと；
フランス式圧力ホモジナイザーを用いて前記B.サティリス・ホストを機械的に溶解させることにより、tiGHを放出させるステップと；
を含む、B.サブティリス・ホストにおいてオレオクロミス・ホルノラム（原語：Oreochromis hornorum (tiGH)）の魚成長ホルモンをコードする遺伝子を発現させる方法が提供される。
【０００８】
本発明の二番目の態様に従うと、
少なくとも一対のvegAプロモータ（vegA）及びlacオペレータ（lacO）と、B.サティリス・コンセンサス・リボゾーム結合部位と、ATG開始コドンと、tiGHをコードするDNA配列と、6ヒスチジン残基（6×His tag）をコードするDNAオリゴヌクレオチド配列とを含む組換えDNAカセットを調製するステップと；
前記DNAカセットを、B.サティリス又はE.コリのシャトル・ベクター中に挿入することで、3vegAtiGHH6の組換えコンストラクトを形成するステップと；
前記DNAカセットをB.サティリス・ホスト中に形質転換させるステップと；
前記B.サティリス・ホストを細胞培養株中で成長させて前記tiGHを細胞内で発現させるステップと；
前記tiGHを放出させるステップと；
を含む、B.サティリス・ホストにおいてオレオクロミス・ホルノラム（tiGH）の魚成長ホルモンをコードする遺伝子を発現させる方法が提供される。
【０００９】
好ましくは、前記tiGHは22kDaの単一のポリペプチドであってよい。組換えDNAカセットには、5'から3'に向かって、タンデム位置に配置された三つの対のvegAプロモータ（vegA）及びlacオペレータ（lacO）と、B.サティリス・コンセンサス・リボゾーム結合部位と、ATG開始コドンと、tiGHをコードするDNA配列と、6ヒスチジン残基（6×His tag）をコードするDNAオリゴヌクレオチド配列とが含まれてもよい。シャトル・ベクターは6.62-kb のサイズのpMTLBs72を有してもよい。形質転換後のB.サティリス・ホストを、IPTG誘導剤及び／又はクロラムフェニコール抗生剤の存在下で後期対数期又は静止期まで成長させてもよい。
【００１０】
いくつかの実施態様では、tiGHを、例えばフランス式圧力細胞ホモジナイザーを用いるなどして、B.サティリス・ホストから機械的に放出させてもよい。
【００１１】
本方法は、tiGHを回収するためにB.サティリス・ホストの細胞を遠心分離して沈降させるステップを含んでもよい。
【００１２】
本発明の三番目の態様によれば、上述した通りにB.サティリス・ホスト中でオレオクロミス・ホルノラム（tiGH）の魚成長ホルモンをコードする遺伝子を発現させる方法を含む、魚飼料を調製する方法が提供される。
【００１３】
好ましくは、細胞溶解物から作製された細胞ライセートを、市販の魚飼料ペレット上に被覆するか、又は混合するとよい。
【００１４】
いくつかの実施態様では、本方法は、寒天溶液1ml当り、概ね55.56 μl の前記細胞ライセートで溶液を調製するステップと含んでよく、但しこのとき、前記細胞ライセートは、当該細胞ライセートが調製された元の概ね1.112 mlの細胞培養株から調製されるとよい。寒天溶液は、概ね0.5%のショ糖及び1%の寒天を含有してよく、概ね50℃の温度で調製してよい。混合されたペレットをその後、室温で乾燥させてもよい。魚飼料には、試料1g当り概ね1μgの前記tiGHを含めてもよい。
【００１５】
本発明の四番目の態様によれば、コーディング配列を含む操作されたプラスミドが提供され、但しこのとき前記コーディング配列は、以下：
（ａ）少なくとも一対のvegAプロモータ（vegA）及びlacオペレータ（lacO）；
（ｂ）コンセンサス・リボゾーム結合部位（RBS）；
（ｃ）ティラピア成長ホルモン（tiGH）をコードする遺伝子；及び
（ｄ）6-ヒスチジンコドン（6×His tag）をコードする配列
を含む。
【００１６】
好ましくは、当該のプラスミドは5'から3'に向かって、作動可能に連結された少なくとも三つの対のvegAプロモータ（vegA）及びlacオペレータ（lacO）を含んでもよい。tiGHは、オレオクロミス-ホルノラムの成長ホルモンであってよい。tiGHを、6-ヒスチジン・コドンと一緒にコーディング配列の3'末端に作動可能に連結してもよい。
【００１７】
本発明の五番目の態様によれば、記載した通りにプラスミドを取り入れたホストから発現させた組換えたんぱく質が提供される。好ましくは、当該たんぱく質はバシラス-サティリス（原語：Bacillus subtilis）に発現させてもよい。
【００１８】
本発明の六番目の態様によれば、上述した通りにプラスミドを操作するステップを含む組換えバシラス-サティリスが提供される。当該の組換えバシラス-サティリスを、遺伝子操作された動物飼料又は飼料添加剤を生成するように構成してもよい。当該の組換えバシラス-サティリスを、そこから発現したtiGHの検出及び精製が容易になるように構成してもよい。
【００１９】
本発明の七番目の態様によれば、記載した通りの組換えバシラス-サティリスの細胞、そのライセート、及び／又は、そこから発現させたたんぱく質を含む、動物飼料又は飼料添加剤が提供される。当該の動物飼料又は飼料添加剤は、それぞれ魚飼料又は魚飼料添加剤であってよい。当該の動物飼料又は飼料添加剤は、当該細胞、ライセート及び／又はたんぱく質で被覆されることにより、当該細胞、ライセート、及び／又はたんぱく質を含んでよい。当該の動物飼料又は飼料添加剤は、組換えバシラス-サティリスが懸濁した培養株のライセートと、融解寒天溶液とを概ね１：１８の比で含んでよく、但しこのとき、前記融解寒天溶液は概ね0.5%（w/v）のショ糖を含む。当該の動物飼料又は飼料添加剤を、日本の鯉の成長を促進するために同鯉に与えるよう、構成してもよい。
【００２０】
本発明の八番目の態様によれば、上述した通りのプラスミドを野生型バシラス-サティリスに取り入れるステップを含む、組換えバシラス-サティリスを作成する方法が提供される。
【００２１】
本発明の九番目の態様によれば、上述した通りの組換えバシラス-サティリスを中で成長させた培養株からライセートを調製するステップを含む、培養株ライセートを作製する方法が提供される。
【００２２】
本発明の十番目の態様によれば、上述した通りの動物飼料又は飼料添加剤を魚に与えるステップを含む、魚の成長速度を促進する方法が提供される。当該の成長速度には、全体重又は全体長あるいは両者を含めてよい。当該の魚は日本の鯉であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明の詳細及びいくつかの実施態様を以降、添付の図面を参照しながら説明するが、同図面において：
【図１】図１は、本発明による組換えDNAコンストラクトの一実施例を示す概略図である。
【図２】A及びBを含む図２は、本発明による魚飼料又は飼料添加剤の調製法の一実施例を示す写真画像及び図である。
【図３】A及びBを含む図３は、本発明に従って得られた例示的なB.サティリス-細胞ライセートのウェスタン-ブロット分析からの画像である。
【図４】A及びBを含む図４は、本発明に従って作製された組換え成長ホルモンの一実施例を加えた、及び加えてない飼料で処置された魚の実験結果を示すグラフである。
【図５】A及びBを含む図５は、本発明による方法又は手段の一実施態様で処置された、及び処置されていない魚の成長を示すグラフである。
【図６】図６は、それぞれ本発明による成長のための方法及び手段で処置された、及び処置されていない二群の魚の平均の重量増を示すグラフである。
【図７】A及びBを含む図７は、本発明による成長ホルモンの一実施態様を加えた飼料ペレットの効果を示すグラフである。
【図８】A及びBを含む図８は、本発明による魚飼料又は魚添加剤の一実施態様で処理された、及び未処置の魚の体長に対する効果を示すグラフである。
【図９】図９は、それぞれ本発明による成長のための方法及び手段で処置された、及び処置されていない二群の魚の全体的な平均的体長増を示すグラフである。
【図１０】図１０は、それぞれティラピア、ます、金魚、及びスカラー（原語：scalar）に対する成長ホルモン処置及び未処置の結果の比較を示す画像である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の実施態様の詳細な説明
本発明は、魚の成長速度を向上させるための魚成長ホルモン（FGH）の適用に関する。様々な理由から、ティラピア（オレオクロミス-ホルノラム）成長ホルモン（tiGH）は本発明の焦点の一つである。本発明につながる研究は、組換え型のtiGHが、ティラピアのテ硬骨魚種だけでなく、例えばベニザケ、ティラピアの幼魚、金魚、ます、並びに鯉及びエンゼルフィッシュの若齢魚など、他の魚の成長を促進することができることを示している。より具体的には、本発明の経過中の実験は、操作されたバシラス-サティリス（つまりGRAS）系は、そのB.サティリス・ホストの細胞質中、そのC末端(rtiGH)に6-ヒスチジンtagを含有する活性かつ機能的な組換えtiGH（rtiGH）を効果的かつ有効に発現することができることを実証している。実験を行って、生成されたrtiGHの種類を、特にウェスタン・ブロット解析及び質量分光法により、確認した。更に本発明は、rtiGHを含むB.サティリスの全細胞ライセートを用いて生成されたrtiGHを用いた、魚飼料の簡便な調製法も提案する。検査を行って、日本の鯉を魚モデルの一例として利用して、無作為コントロール研究で、魚成長の促進において補助剤付加した飼料の効験を、通常の飼料のそれと確認した。４か月間の研究期間にわたって、処置群（それぞれ40.38g 及び 2.17cm）とコントロール群（それぞれ31.58g 及び1.61cm） との間の魚の体重及び体長を比較した。処置群の魚はコントロール群の魚よりも著しく速く成長したと結論付けられた。補助剤添加した飼料を与えた魚は、健康的かつ身体的にも良好に発達し、いずれの時点でも飼料に対して活発かつ熱心であることが示された。図１０例を参照されたい。
【００２５】
以下の図及び実験は、本発明を詳細に実証したものである。
【実施例】
【００２６】
材料及び方法
最近株及び培養基
ｅｔｉＧＨ発現のためのホストとして用いられたＢ．サティリス株１Ａ７５１（ｅｇｌＳΔ１０２、  ｂｇｌＴ／ｂｇｌＳΔＥＶ、ｎｐｒ、ａｐｒ、ｈｉｓ）は、オハイオ州のバシラス−ジェネティックス・ストック・センターから得られた。組換えＤＮＡ実験の中間ホストとして用いられたＥ．コリ株  ＪＭ１０１  （ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、Δｌａｃ−ｐｒｏＡＢ  （Ｆ’、ｔｒａ３６、ｐｒｏＡＢ＋、ｌａｃＩｑＺΔＭ１５））は、前に記載されている。
【００２７】
B.サティリス形質転換体を10.5 mg l-1 のクロラムフェニコール (Fluka社製)を補った2x LB 培地(20 g l-1 ディフコ社製トリプトン、10 g l-1 ディフコ社製酵母抽出物、20 g l-1 NaCl)中で３７℃で成長させた。固体培地については、Bacto 寒天を1.5% (w/v)の濃度で加えた。組換えプラスミドによるE.コリ及びB.サティリスの形質転換は、それぞれ塩化カルシウム法と、スピジゼンにより解説された方法を用いて行われた。
【００２８】
魚の種及び供給源
６乃至８か月齢の１８匹の用語の日本鯉 (18-25 cm 長；過半数：赤色及び白色)を、負の実験を設定するときに使用するために購入（香港、マーメイド鯉センター社） した。他方、４４匹の１０か月齢の日本鯉若齢魚（主に赤色及び白色）は、生物活性についてrtiGHの評価用の無作為化制御研究で用いるためにイースト・リバー・フィッシング・リミテッド（中国、ガンドン郡）のご厚誼で寄付された。更に、８匹の鯉（それらのうち７匹は１０か月齢であり；１匹は２２か月齢だった）をガラス製水槽(150 cm x 43 cm x 63 cm) で別々に育て、rtiGHを補った飼料を与えた。それらの行動及び外見上の特徴を５か月間にわたって観察した。
【００２９】
プラスミド及び組換えtiGHの発現
6.62-kb B. サティリスE.コリ・シャトル・ベクターの pMTLBs72をバシラス-ジェネティックス・ストック・センターから得た。プラスミドpMTLBs72 は、B. サティリス pBS72 プラスミドの一部分と、E. コリpBR322 配列の部分とから成る。それはB.サティリス中で低コピー数で安定なプラスミドであり、１染色体当り約６コピーである。改良されたプラスミド 3vegAcenAは、pMTLBs72 をベクター（データは未公開）として用いて予め構築された。3vegAcenAを用いて、 プラスミド3vegAtiGHH6 は以下の通りに構築された。まず中間体を 14オリゴ・プライマー：P1-P14 （SEQ ID NO. 1-14を示した配列表を参照されたい）を用いたPCR重複伸長により合成され；その結果得られた生成物をSpeI 及び SmaIで切断した後、同じ二つの酵素で制限したベクター3vegAcenA で連結して3vegAtiGHH6を形成した。図１を参照されたい。
【００３０】
rtiGHを発現させるために、新鮮なB.サティリス1A751(3vegAtiGHH6) 形質転換体をクロラムフェニコールを補った50 ml の2x LB 中で３７℃で８時間、成長させた。次に培養株全てをクロラムフェニコールを加えた500 ml の 2x LB 培地中に接種し、A600 値が1.0に等しくなるまで３７℃で成長させた後、0.1 mMの最終濃度までIPTGを加えた。２０時間、細胞培養を継続させた。その後、培養株を遠心分離し、細胞ペレットを溶解させた。
【００３１】
細胞溶解
保存された細胞ペレットを 25ml のリン酸緩衝液 (PB; 1.44 g l-1 Na2HPO4 及び 0.24 g l-1 KH2PO4; pH 7.4)に溶解させ、該再懸濁液を圧力細胞ホモジナイザー（スタンスフェッド・フルイド・パワー社、英国）で三回、処理した。このライセートを解析及び飼料調製用に保存した。
【００３２】
rtiGHの解析
12% (w/v) トリシン-SDS-ポリアクリルアミドゲル上に溶解させたたんぱく質飼料を、クーマシー・ブリリアント・ブルーR250で染色した。たんぱく質のウェスタン・ブロット解析をHis-プローブ抗体 (H-3) (Santa Cruz、sc-8036)を用いて行った。rtiGHの種類を前述したようにMascot検索により液体クロマトグラフィー・タンデム質量分光法により、確認した。
【００３３】
細菌培養株ライセートを補った魚飼料の調製
rtiGHを含有する（濃度100 mg l-1で）50μlの細胞ライセートと一緒の0.9 ml 寒天溶液（0.5% ショ糖、1% 寒天；50 °C）の混合液は、２０秒間という短時間で5gの魚飼料（qua master、鯉飼料、小麦胚芽、サイズS）上に均一に良好に吸着されることが示された。
【００３４】
rtiGHを補った魚飼料を調製するために、1gの飼料は1 μg rtiGHを含有すると判定されたため；50 μl rtiGH ライセートを用いて 0.9 ml の寒天溶液と混合した。誘導された1A751(3vegAtiGHH6) 培養株のライセートを検定すると、100 mg l-1 のrtiGHを含有することが判明した。1A751 (3vegAtiGHH6) lライセートのたんぱく質濃度は9.93 g l-1だと判定されたが、ホスト・ライセート（陰のコントロール）のそれは 9.78 g l-1だった。同じ濃度のライセート・たんぱく質を用いて多様な飼料を調製したため、1gのコントロール飼料を較正して10 μl のホスト・ライセートを含有するようにした。培養株ライセートが補われた飼料を調製する概略的詳細を図２に示す。最後に、被覆された飼料を室温で３日間、空気乾燥した。
【００３５】
rtiGHの生物活性に関する評価
同じ寸法（168 cm x 64 cm x 16 cm）を持つ２個の灰色プラスチック製水槽を用いて、（被処置及びコントロール）を育てた。二つのタンクの可変値はすべて同じに維持された。それらの水中の通気は2,200 l h-1に設定されたQmaxで再循環システムを用いて促された。二つの水槽中の水条件は以下の通り一定に維持された：温度は23 °C、pH は 6 で溶解酸素は6.3 mg l-1。
【００３６】
負の実験においては、魚には通常の飼料ペレットか、又はrtiGH活性のないB.サティリス細胞ライセートを補った飼料ペレットを与えた。無作為化コントロール研究においては、魚には通常の飼料ペレット（コントロール群）又はrtiGHを含有する細胞ライセートを補った飼料ペレット（処置群）を与えた。所定の時間間隔で各魚飼料を写真撮影し（識別のため）、体重計測し、その体長も測定された。
【００３７】
結果
B.サティリス中のティラピア魚成長ホルモンの発現
遺伝子アセンブリで得られたティラピア魚成長ホルモン（tiGH）をコードするDNA配列を3VegAcenA ベクター（未公開データ）中にクローンして、rtiGHを発現するコンストラクト、3VegAtiGHH6 （図１を参照されたい）を形成した。IPTG誘導すると、バシラス-サティリス1A751 (3VegAtiGHH6) 培養株は、高レベルの細胞内rtiGHを発現していることが示された。1A751 (3VegAtiGHH6) の細胞ライセートをSDS-PAGEで解析すると、rtiGHの予測されたサイズ(22.6 kDa) を有する顕著なバンドが明らかになった（図３を参照されたい）。次に、このバンドを質量分光法で tiGHであることを確認した（データは図示せず）。 rtiGH の収率はほぼ100 mg l-1であることが推定された。
【００３８】
B.サティリス細胞ライセートを被覆した魚飼料ペレットの調製
魚成長ホルモン（FGH）を添加した飼料ペレットの一般的使用は新しくはない。本発明の新規性の一つは、魚飼料の調製への、B.サティリス・ライセートの具体的な適用に関する。GRASとみなされたにも関わらず、B.サティリス培養株は不快な臭いを生ずる。B.サティリス・ライセートが魚に不快な臭いを与えかねないという問題に対処するために、本発明の別の態様は、細胞ライセート中に懸濁させたrtiGHを魚ペレット上にしっかりとコーティングする効果的な方法に関する。rtiGHの良好な回収と、ゲル上でそのインタクトなバンドが明らかになったこと（図３を参照されたい）は、高圧による細胞溶解法は実際的なアプローチであるという結論を裏付けた。B.サティリス・ライセートの不快な臭いと、このライセートをペレット上に被覆する効率の低さとを克服するために、低レベルのショ糖と一緒の軟質寒天の加工性に対処した。この手法により、当該細菌ライセートはペレット上に均一かつ良好に被覆された（図２を参照されたい）。
【００３９】
魚モデルとしての日本鯉の選択
日本の鯉（鯉）は、中国及び日本で最も人気のある観賞魚の一つである。鯉は、以下の観点に基づき、本実験の魚モデルとして採用された。鯉は簡単に入手でき、その飼料に関して選好性でなく、速く成長し、そして実質的に観賞用に飼われる。
【００４０】
鯉にB.サティリス・ライセートを被覆した飼料ペレットと、rtiGHを含有するB.サティリス・ライセートで被覆した飼料ペレットを与えた場合、魚は、両方の種類の飼料を喜んだようであり、それらが通常の飼料ペレットを与えられたのと同じ行動をした。
【００４１】
日本鯉の成長に対するB.サティリス・ライセートの効果
rtiGHのないB.サティリス・細胞ライセートが鯉の成長に対して何らかの刺激効果を有するかどうかを判定するために、3VegA 発現ベクター（データは図示せず）のみ、B.サティリス 1A751(3VegA)を含有する形質転換体を得た。次に、B.サティリス 1A751(3VegA) の培養株ライセートを調製し、飼料ペレット上に被覆するのに用いて、比較のための負のコントロール（未処置ペレット）を作製した。１８匹の日本鯉を二つの群に分割し、一方の群には未処置のペレットを与え、他方の群には通常の飼料ペレットを与えた。二つの魚群について給餌スケジュール（１日に二回及び１匹当り0.5 g ）は同じであり、この研究は５０日間、継続した。調査の終了時には、５０日間での魚の全体重及び全長の変化で評価したときに（データは図示せず）成長能力に大きな違いはなく、こうして、rtiGH活性に欠けるB.サティリス・ライセートは、日本の鯉の成長に対して何の刺激効果も有さないと結論付けられた。
【００４２】
rtiGHの成長刺激活性
rtiGHの成長刺激効果を、以下の二つの鯉群に対する給餌を通じて検定した。処置群にはB.サティリス 1A751(3VegAtiGHH6) 培養株ライセートで被覆した飼料ペレットを与え、コントロール群には通常のペレットを与えた。各個々の鯉の成長パラメータ（体重及び体長）の測定は、一か月間隔で行われた（図４、図７を参照されたい）。調査の最初の二か月間での両群における大半の個体の体重消失（図４を参照されたい）は、多様な馴化効果に対する魚の負の応答の結果かも知れない。その後、両群中のほぼ全ての魚を体重及び体長測定値の両方の増分を記録した。４か月の実験の終了時までには、処置群の魚はコントロール群の魚よりも体重及び体長増分において著しく良好な能力を示した（図５、図８を参照されたい）。処置群の体重における全体的な平均的増加は、コントロール群のそれよりも２７．９％高く（図６を参照されたい）、他方、前者の体長における全体的な平均的増加は、後者のそれよりも３４．８％、高かった（図９を参照されたい）。
【００４３】
rtiGHを補った飼料ペレットを与えた日本鯉の外観
rtiGHを含有するB.サティリス・ライセートを補った飼料ペレットを与えた日本鯉（処置群）の行動及び外見上の特徴に関する何らかの意見を得るために、８匹の個体を２番目の魚バッチ（材料及び方法）から、その到着時にすぐに分離した。その後、これらの魚をガラス製水槽（材料及び方法）中で別々に育て、処置群と実質的に同じ態様で、rtiGHのみを補った飼料を与えた。
【００４４】
５か月間の給餌後、全ての魚は健康で、肉付きよく（そしていくつかはずんぐりしているともみなし得た）、鮮やかな明るい色をしていた。魚は近くに立った観察者に怯えることなく、水槽内を活発に泳いでいた。より重要なことに、それらはしじゅう空腹に見え、誰かが水槽の横を通るときは常に、給餌に対してとても虎視眈々としているままだった。
【００４５】
たんぱく質含量の高い魚用飼料が入手できるかどうかは、養魚業で考察する主たるコスト因子である。しかしながら、養魚業での飼料転換効率（FCE）は高いため、例えば鮭を養殖するには、FCEは、1kgの鮭当り、1.1kgの飼料の範囲であると推算されてきた。このように、魚の成長能力を促進するには、魚飼料中のたんぱく質含量を向上させることにより、FCEを上げるとよいだろうと当業者は想到するであろう。魚飼料中のたんぱく質含量を上げるのに通常用いられてきた成分には、魚たんぱく質加水分解物、アルテミア-サリーナ、スクイッド-ビセラ（原語：squid viscera）、大豆及び藍藻がある。
【００４６】
同じ研究分野に沿った科学的努力において、バイオテクノロジーでの最近の進歩のおかげで、関連する魚種を遺伝的に変異させて、魚の成長速度を促進するための内因性の成長ホルモンを過剰発現させたようなトランスジェニック・フィッシュ、又は遺伝子改変（GM）フィッシュの開発が可能になった。ヒトの消費に向けたGMフィッシュの使用をFDAは認可したにも関わらず、この問題は大きな議論を呼んできた。魚成長ホルモン（FGH）の応用に対する良好な妥協は、魚飼料中の飼料補助剤としてそれを利用することであるように思われた。
【００４７】
様々な魚種の組換えFGH（rFGH）が成功裏に発現させられ、特定の条件下で成長を促進するそれらの能力の評価に向けて、魚モデルに対して注射、浸漬槽、口腔内温値、及び食餌送達を含む多様なアプローチを用いて導入されてきた。しかしながら、実際の世界では、養魚業は大量の育成を扱うため、最初の三つのアプローチは非実用的に思われる。四番目の方法である、rFGHを補った飼料ペレットを魚に給餌することを言う食餌送達は技術的に実施可能であるが、但し、関連する飼料を作製する費用効果的な方法が利用できることが条件となる。凍結乾燥させた、ヒラメのrFGHを発現する藍藻であるシネコシスティス（原語：Synechocystis）を補った魚飼料は、ターボットの成長を促進したことを示したことが以前、報告されている。しかしながら、成長能力に対する、このような飼料の正の影響にも関わらず、ヒトの蛍光に対する、シネコシスティスに存在する毒素ミクロシスチンの潜在的有害効果については、この報告は対処していなかった。この重要な問題は、最終的な添加剤を調製するのに必要な比較的に長時間と相まって、養魚業において幅広い用途に向けて利用することになる前記の給餌プロセスにとって、難しい課題となる。
【００４８】
反対に、本発明に関して、rFGH発現ホストであるB.サティリスは、応用にとって「GRAS」生物として評判がよい。更に、そのよく特徴付けられた遺伝的特質、比較的に短い倍加時間（１２０分）、簡単かつ単純な操作プロセス、そして最も重要なことに、規模拡大及び対費用効果的な生産の容易さは、すべて、組換え用途でB.サティリスをホストとして用いる実現可能性の裏付けとなる。実際、rtiGHを発現するB.サティリスの全細胞ライセートを補った魚飼料の調製プロセス（図２を参照されたい；材料及び方法）は手ごろなだけでなく、容易に規模拡大可能だった。小規模又は大規模のどちらで送達が行われるかに関係なく、補われた飼料は、その通常の飼料と同様に、手早い処理が便利にでき、与えられる魚にも容易に捕食可能である。
【００４９】
実験前に、（負の実験に費やされた最初の二か月間を除外する）４か月間という比較的に長い時間が実験に企画された。その後、観察下の魚は、新しい環境及び測定操作が原因で不安な反応を示し得ないため、それらの食欲に影響し、研究における食餌の組成と成長能力との間に描かれる解釈の結果が誤ったものになるかも知れないと判断された。予想通り、処置群（rtiGHを補った飼料を与えたもの；図４Ａを参照されたい）及びコントロール群（通常の飼料を与えたもの；図４Ｂを参照されたい）の両方で大半の個体が、それらが新たな到着時、及び／又は、測定値判定後に、望ましくない応答を示すようであった。興味深いことに、これらの副作用は両群の魚において体重にのみ影響し（図４を参照されたい）、体調には影響しなかった（図７を参照されたい）。更に、魚における体重喪失が顕れたのは、研究の一か月目及び二か月目で最も明白だった。その後、魚はそれらの周囲に馴化し、飼料への興味を取り戻したように思われ、飼料の消費と、魚の体重／体長の増加との間の相関関係が我々にも描けるようになった。
【００５０】
上に論じた結果は以下の結論を裏付けている。第一に、両群の鯉にとって、環境に馴化するにも、及び／又は、それらに新しく導入された操作上のプロセスに馴化するにも、ある程度の時間がかかった。第二に、各魚は、新たな環境及び／又は新たな操作上のプロセスに様々に反応するため、個々の魚の応答を観察する必要がある。第三に、馴化には時間が必要であるため、研究の最初の二か月間で、飼料消費と、魚の体重／体調増加との間の信頼できる相関関係を描くのは難しかった。第四に、両方の群の魚の体長は、馴化の影響をあまり受けないようだった。しかしながら、研究の三か月目及び四か月目においては、体長変化と体重変化は相互に密接に一致したため、飼料消費と、魚の体重／体長増加との間に信頼できる相関関係を描くことができた。
【００５１】
研究の最初の二か月間で処置群及びコントロール群の両方の魚で体重消失を惹起しかねない周囲の因子が存在する可能性に関係なく（図３を参照されたい）、二つの群の魚の体重及び体長における全体的な平均的増加の違いは、通常の魚飼料と、rtiGHを補われた飼料との間の能力を区別する結論的な裏付け証拠となった。両群の魚のメンバーはすべて、研究の４か月間にわたって体重及び体長で増加を示していったが（図５及び図８を参照されたい）、それぞれ 40.38 g （図６を参照されたい）及び2.17 cm（図９を参照されたい）という、処置群での体重及び体長の両方での全体的な平均的増加は、それぞれ31.58 g （図６を参照されたい）及び1.61 cm （図９を参照されたい）という未処置群での数値よりも明らかに高い。実際問題、体重における全体的な平均的増加の 27.9%と（図６を参照されたい）、体長における全体的な平均的増加の34.8% （図９を参照されたい）という二組のデータ間の違いは、両者とも有意に異なる！
【００５２】
従って、本論文で提示した我々の結果は、B.サティリスで発現させてrtiGHは、 日本鯉の成長を促進する上で生物学的に活性であるという結論を裏付けている。更に、B.サティリスの全細胞ライセートを取得する上での利便性により、rtiGHを補った魚飼料の調製にとって容易な手段がもたらされる。B.サティリスのtiGH発現、たんぱく質含有量及び成長密度や、大規模生産の条件を向上させようという継続的な努力があれば、本アプローチは、養魚業において大規模応用にとって対費用効果の高いプロセスであることが立証されよう。
【００５３】
成長能力と収益率との間には直接的な関係があるため、成長速度は、養魚場が考慮する最も重要な点の一つである。魚成長ホルモン（FGH）は、脳下垂体が産生する22kDaの一本鎖ポリペプチドであり、成長に対して正の影響を有するのみでなく、環境ストレス及び感染など、悪条件下で良好に適応するために魚にとって必須な多形質発現性機能も持つ。
【００５４】
多様な種のFGHがよく特徴付けられており、それらの組換え均等物が研究用に様々な微生物ホストで発現させられてきた。多様なFGHの仲でも、海水や真水で増殖できる、成体ティラピアの一つ、オレオクロミス-ホルノラムは、本発明の焦点の一つである。ティラピアの天然FGH（tiGH）は187アミノ酸のポリペプチドであり、まぐろ及びブリのFGHに対して高レベル（84%を超える）のホモロジーを有し、ます及び鮭のそれとは66%、同一である。tiGHはまた、エシェリヒア-コリ及びピチア-パストリスでも組換え型で発現させられている。入手可能性が向上したことで、魚の成長速度に影響させる際に組換えtiGHの効験が精力的に調査されてきた。一例では、tiGHとます及び鮭のFGHとの間に同一性のレベルは比較的に低い（66%）にも関わらず、E.コリ由来の精製済み組換えtiGHは、テレオスト種のティラピア、オレオクロミス-モサムビカス（原語：Oreochromis mossambicus）だけでなく、ベニザケ、オンコルヒンカス-ネルカ（原語：Oncorhynchus nerka ）の成長も促進することが報告されている。別の例では、ピチア-パストリス（原語： Pichia pastoris ）から調製された組換えtiGHが、養魚の成長、生存率、及び品質を促進したり、例えばティラピア、金魚、及びますなど、いくつかの幼魚や若齢魚や、鯉及びエンゼルフィッシュの若齢魚において免疫を促進したりすることが示された。
【００５５】
興味深いことに、FGHの投与は、その哺乳動物の相対物とは異なり、魚の成長能力を高めるために経口的に行い得ることが示されている。この戦略は、テレオスト魚の腸管上皮が高分子量のたんぱく質を吸収することができるため、それらにおいて良好に働く。予想通り、生活性tiGHは、魚の腸管で良好に吸収されて体成長を促進することが示されている。加えて、FGHの経口投与は、ギンザケ、ヒラメ・パラリクティス-オリバセウス（原語：Paralichtys olivaceus）、パーチ・ペルカ-フィウビアティリス（原語：Perca fiuviatilis ）及びメコンオオナマズを含む、他の種の魚における成長促進と関連付けられてきた。より重要なことに、投与から９０分後には魚の血液、腸、筋肉、又は肝臓に、経口投与されたFGHは微量すら、検出されなかった。このように、FGHの経口投与は、魚の成長能力を向上させる安全なアプローチになるようである。
【００５６】
魚標本をFGHで処置する方法の一つは、FGHを溶解させた緩衝溶液中に魚を浸漬する方法を通じたものである。処置済みの魚は、単純な緩衝溶液に浸漬したコントロール相対物よりも速く成長したようだったが、この投与アプローチは、大規模で行なうには非効率であり、労働集約型で、実行不可能である。
【００５７】
我々の研究室は、産業用途に向けた組換えたんぱく質生産用の効率的な微生物系操作に関わってきた。よく特徴付けられたグラム陰性細菌、Ｅ．コリに加えて、Ｅ．コリほどは充分には研究されていないグラム陽性細菌であるバシラス-サティリスが、多才な組換えホスト系として開発するには大きな可能性を有すると我々は考える。B.サティリスは、外側細胞膜がないため、異種たんぱく質の分泌生産に向けた操作に向くよう、良好に適合されている。他方、外側の細胞膜がないために、B.サティリスはエンドトキシンを持たず、従って使用にとって概ね安全（GRAS）だとみなされている。
【００５８】
本発明は、ヒト上皮成長因子及び細胞誘拐性細菌セルロモナス-フィミ（原語：Cellulomonas fimi）のエンドグルカナーゼを含む有用なたんぱく質の組換え生産のためのB.サティリス分泌系を開発するパイオニアとなった。次に、B.サティリスのveg Iプロモータの誘導体が構築され、それらがE.コリにおいて機能的に活性であることが実証された。
【００５９】
明確化のために別々の実施態様又は実験の文脈で解説された、本発明のいくつかの特徴は、単一の実施態様と組み合わせても提供されることも留意されねばならない。反対に、簡潔化のために、単一の実施態様の文脈で解説された、本発明の多様な特徴は、別々に、又はいずれかの適した下位の組合せでも提供され得る。本実施態様のいくつかの特徴は、非限定的な例で描写されることに留意されねばならない。更に、当業者であれば、簡潔化のために上で説明されていない従来技術も知るところであろう。この従来技術のいくつかは下に示され、それらの内容全体をここに編入する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００６０】
【非特許文献１】１．  Acosta J, Estrada MP, Carpio Y, et al. (2009) Tilapia somatotropin polypeptides: potent enhancers of fish growth and innate immunity. Biotecnol Apl 26(3): 267-272.
【非特許文献２】２．  Rentier-Delrue F, Swennen D, Philippart JC, et al. (1989) Tilapia growth hormone: molecular cloning of cDNA and expression in Escherichia coli. DNA 8(4): 271-278.
【非特許文献３】３．              Liu B, Zang XN, Liu XF, et al. (2012) Stable cell-surface expression of Japanese flounder growth hormone in yeast Saccharomyces cerevisiae and growth-promoting effect on juvenile fish by oral administration. Fish Sci 78: 99-107.
【非特許文献４】４．              Sciara AA, Vigliano FA, Somoza GM, et al. (2011) Muscular hypertrophy and growth-promoting effects in juvenile pejerrey (Odontesthes bonariensis) after oral administration of recombinant homologous growth hormone obtained by a highly efficient refolding process. Aquacult Res 42: 844-857.
【非特許文献５】５．              Acosta J, Carpio Y, Besada V, et al. (2008) Recombinant truncated tilapia growth hormone enhances growth and innate immunity in tilapia fry (Oreochromis sp.). Gen Comp Endocr 157: 49-57.
【非特許文献６】６．              Sivakesava S, Su ZN, Chen YH, Hackett J, et al. (1999) Production of excretion human epidermal growth factor (hEGF) by an efficient recombinant Escherichia coli system. Process Biochem 34: 893-900.
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【非特許文献２９】２９．         Vareli K, Jaeger W, Touka A, et al. (2013) Hepatotoxic Seafood Poisoning (HSP) Due to Microcystins: A Threat from the Ocean? Marine Drugs 11: 2751-2768.
【非特許文献３０】３０．         Olmos J and Paniagua-Michel J. (2014) Bacillus subtilis a potential probiotic bacterium to formulate functional feeds for aquaculture. J Microb Biochem Technol 6(7): 361-365.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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