(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
チリメンアオジソのエタノール抽出物又は熱水抽出物を有効成分とする、アミロイドβタンパク質の凝集活性を阻害するための組成物。
【請求項２】
チリメンアオジソのエタノール抽出物又は熱水抽出物の分子量範囲が１００〜２０００である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
飲食品組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シソの抽出物を有効成分とするアミロイドβタンパク質の凝集阻害用組成物、及びこれを含むアミロイドーシスを治療及び／又は予防するための医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会の進展に伴う認知症の増加は、社会保障費の増大のみならず身近で介護を行う者の疲弊を伴う。持続可能な社会を実現するためには健康寿命の延伸が重要であり、そのためには認知症の半数以上の原因を占めるといわれるアルツハイマー病の予防及び治療が欠かせない。
【０００３】
アルツハイマー病は、アミロイドと呼ばれる線維状タンパク質が沈着して臓器の機能障害を引き起こす疾患であるアミロイドーシスの一種である。アルツハイマー病の発症メカニズムとしては、アミロイドβ痴呆発症カスケード仮説が有力である。この仮説によると、アミロイド前駆体タンパク質からのプロセシングによる４０又は４２アミノ酸残基のアミロイドβタンパク質の生成、凝集及びアミロイド線維の形成、アミロイド線維の脳内蓄積による老人斑の形成、高リン酸化Ｔａｕタンパク質の凝集及び蓄積による神経原線維変化が段階的に生じ、その結果として神経機能不全、神経細胞死が引き起こされ、アルツハイマー病の発症に至る。
【０００４】
現在、使用されているアルツハイマー治療薬は、コリンエステラーゼ阻害薬及びＮＭＤＡ阻害薬である。これらはいずれも症状の進行を抑えるための医薬であり、アルツハイマー病を根治するものではない。そこで、アルツハイマー病発症のきっかけとなるアミロイドβタンパク質（Ａβ）の凝集阻害が、根本的な予防又は治療のための創薬ターゲットとして注目されている。
【０００５】
本発明者らは、Ａβの凝集阻害物質を探索するため、量子ドットナノプローブを用いた微量ハイスループットスクリーニングシステムを開発した。同システムを用いて５２種の香辛料について凝集阻害活性を評価したところ、タイム、サマーサボリー、スペアミント等のシソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）に属する香辛料が高い凝集阻害活性を有することを見出した（非特許文献１）。
【０００６】
また、この他に、Ａβの凝集阻害活性を有する植物由来抽出物として、ブドウ種子抽出物（特許文献１）、ウコン抽出物（特許文献２）、ウンカリア・トメントーサ抽出物（特許文献３）、緑茶抽出物（特許文献４）等が知られている。
【０００７】
上記の植物由来抽出物のほか、Ａβをターゲットとしたアルツハイマー治療薬として、ワクチン、ヒト化抗体、γ−セクレターゼ阻害剤等の開発が進められている（非特許文献２）。しかしながら、依然として、アルツハイマー病及び他のアミロイドーシスを予防及び治療するための医薬に対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１１−５２０８１４号公報
【特許文献２】特表２００９−５３０３０５号公報
【特許文献３】特表２００４−５１４６７９号公報
【特許文献４】特表２００３−５１９１９２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇａｋｉ  Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（８）：ｅ７２９９２，２０１３
【非特許文献２】Ｐｏｔｔｅｒ  ＰＥ，Ｊ．Ａｍ．Ｏｓｔｅｏｐａｔｈ．Ａｓｓｏｃ．２０１０  Ｓｅｐ；１１０（９  Ｓｕｐｐｌ  ８）：Ｓ２７−３６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、アルツハイマー病及び他のアミロイドーシスを予防及び／又は治療することができる、新たなＡβ凝集阻害用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、シソの抽出物が強力なＡβ凝集阻害を有することを見出し、下記の各発明を完成させた。
【００１２】
（１）シソの抽出物を有効成分とする、アミロイドβタンパク質の凝集阻害用組成物。
（２）シソの抽出物が、シソのエタノール抽出物又は熱水抽出物である、（１）に記載のアミロイドβタンパク質の凝集阻害用組成物。
（３）シソの抽出物が、シソのエタノール抽出物又は熱水抽出物であって、その分子量範囲が１００〜２０００である、（１）又は（２）に記載のアミロイドβタンパク質の凝集阻害用組成物。
（４）シソの抽出物が、シソをエタノール又は熱水で抽出した後、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製して得られる抽出物である、（１）又は（２）に記載のアミロイドβタンパク質の凝集阻害用組成物。
（５）シソが、チリメンジソ、チリメンアオジソ、アオジソ又はカタメンジソである、（１）から（４）のいずれかに記載のアミロイドβタンパク質の凝集阻害用組成物。
（６）（１）から（５）のいずれかに記載のアミロイドβタンパク質の凝集阻害用組成物を含む、アミロイドーシスを治療及び／又は予防するための医薬。
（７）アミロイドーシスが脳アミロイドーシスである、（６）に記載の医薬。
（８）アミロイドーシスがアルツハイマー病である、（６）に記載の医薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、アミロイドーシス、特にアルツハイマー病の予防及び／又は治療のためのＡβ凝集阻害用組成物、並びにこれを含む医薬が提供される。食用植物であるシソの抽出物は安全性が高く、したがって医薬のみならず食品、健康補助食品、サプリメントとしても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１のシソ抽出物（チリメンジソのエタノール又は熱水抽出物）のＡβ凝集阻害を示す写真である。
【図２】実施例１のシソ抽出物（チリメンアオジソのエタノール又は熱水抽出物）のＡβ凝集阻害を示す写真である。
【図３】実施例１のシソ抽出物について、使用する品種及び部位ごとにＡβ凝集阻害のＥＣ５０値を比較したグラフである。
【図４】チリメンアオジソ葉のエタノール抽出物を各種溶媒で分配して得られた各画分のＡβ凝集阻害を示す写真である。
【図５】チリメンアオジソ葉のエタノール抽出物に含まれる活性成分の精製を示す図である。
【図６】チリメンアオジソ葉のエタノール抽出物を精製して得られた２つの画分のＡβ凝集阻害のＥＣ５０値を、比較例であるロスマリン酸のＥＣ５０値と比較したグラフである。
【図７】実施例６のシソ抽出物（カタメンジソのエタノール抽出物）のＡβ凝集阻害活性を示すグラフである。
【図８】収穫時期の異なるチリメンアオジソ葉のエタノール抽出物のロスマリン酸含有量（横軸）及びＡβ凝集阻害活性（縦軸）を示す図である。図中の線はロスマリン酸標準物質を用いた検量線である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一態様は、シソの抽出物を有効成分とする、Ａβの凝集阻害用組成物に関する。
【００１６】
本発明で用いられるシソは、シソ科シソ属に属するペリラ・フルテセンス変種クリスパ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ）である。シソには、例えば、チリメンジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ  ｆ．ｃｒｉｓｐａ）、チリメンアオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ’Ｖｉｒｉｄｉ−ｃｒｉｓｐａ’）、アオジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ  ｆ．ｖｉｒｉｄｉｓ、いわゆる大葉）、マダラジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ  ｆ．ｒｏｓｅａ）、アカジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ  ｆ．ｐｕｒｐｕｒｅａ）、カタメンジソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ｖａｒ．ｃｒｉｓｐａ’Ｄｉｓｃｏｌｏｒ’）などの多くの品種があることが知られている。本発明で抽出に用いるシソは、これらのいずれであってもよいが、チリメンジソ、チリメンアオジソ、アオジソ又はカタメンジソを抽出原料として用いるのが好適である。
【００１７】
原料となるシソの栽培方法、採取方法に制限はなく、通常農産物として栽培、流通しているシソを用いることができる。原料のシソは、そのまま、すなわち生の状態で直ちに抽出処理してもよく、乾燥保存、冷蔵又は冷凍保存した後に抽出処理してもよい。また、使用するシソの部位は、地上部である葉、茎、花、実のいずれを用いてもよいが、入手容易性の観点から、葉を抽出原料とするのが好ましい。
【００１８】
シソの抽出物は、シソを抽出溶媒に浸漬して有効成分を抽出することにより調製することができる。具体的には、抽出は、原料であるシソをそのままの形状で、又は抽出効率を上げるために細砕した後に、抽出溶媒に浸漬することにより行われる。
【００１９】
抽出溶媒は、天然物からの有用成分の抽出に通常使用される溶媒であればよく、例えば、水、アルコール、アセトン、酢酸エチル、トリクロロメタン等を用いることができる。抽出効率を考慮した場合、使用する溶媒は、特に水、又はメタノール、エタノール、ブタノール等のアルコールが好ましく、最も好ましいのは水又はエタノールである。また、抽出溶媒の量は、原料のシソ１００ｇ（湿重量）に対して１００ｍＬ〜３０００ｍＬ、好ましくは２００ｍＬ〜１５００ｍＬ、より好ましくは４００ｍＬ〜８００ｍＬである。
【００２０】
浸漬は、室温又はそれより高い温度で行われる。一般に温度が高い方がより効率的な抽出が可能であり、特に抽出溶媒として水を用いる場合は、８０℃以上の熱水を用いることが好ましい。また、抽出中のシソ浸漬液は、そのまま静置してもよく、又は適度な撹拌を伴ってもよい。
【００２１】
浸漬時間は、溶媒の種類、量及び温度、撹拌条件、原料シソ中の有効成分含量等に応じて適宜設定することができるが、常温、静置の条件下で浸漬を行う場合は３時間〜１４日間程度、加温条件下で浸漬を行う場合は５分間〜１２時間程度の浸漬時間を取ればよい。
【００２２】
このようにして得られた浸漬液は、そのまま本発明によるシソ抽出物として用いることもでき、又は固形分をろ過、遠心分離等の分離手段を用いて除去した後の液体を回収し、これをそのまま、若しくは溶媒を蒸発させた濃縮物の状態で用いることもできる。
【００２３】
さらに、浸漬液、これから回収される液体又は濃縮物を、公知の精製手段、例えば溶媒分配、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等によりさらに精製して得られる精製画分もまた、本発明において好適に用いることができる。
【００２４】
溶媒分配は、本発明によるシソ抽出物を適当な第一の溶媒に溶解又は懸濁させた後、第一の溶媒と層分離可能な第二の溶媒を分配溶媒として用いることにより、行うことができる。第一の溶媒が水である場合、第二の溶媒として、例えば、クロロホルム、酢酸エチル、ブタノール等を用いることができる。
【００２５】
なお、後述の実施例において示すように、逆相カラムを用いたカラムクロマトグラフィーによる精製を行うとＡβ凝集阻害活性が低下することがある。したがって、精製手段としてカラムクロマトグラフィーを用いる場合、逆相カラムクロマトグラフィー以外のカラムクロマトグラフィー、とりわけゲルろ過カラムクロマトグラフィーを使用するのが好ましい。
【００２６】
ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに使用する充填剤としては、ヒドロキシプロピルデキストラン系充填剤、非極性ポリスチレン系充填剤、メタクリレート系充填剤等が挙げられる。これらは、例えば、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社のＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、バイオ・ラッド社のバイオビーズＳＭ−２、東ソー株式会社のＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−４０として販売されている。溶媒としては、これらのカラム充填剤に対して通常使用される溶媒、例えばメタノール、エタノールなどのアルコール系溶媒、水、水−アルコール系混合溶媒、緩衝液、アセトン、酢酸エチル、トリクロロメタン等を用いることができる。当業者は、これらのカラム及び移動相を用いて、適切な温度及び流速条件の下で、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーを実施することができる。
【００２７】
ゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより得られた各画分についてＡβ凝集阻害活性を評価することで、目的の有効成分を含有する画分が決定される。このようにして得られたシソ抽出物を精製した画分もまた本発明の一部を構成するものであり、この例としては、後述の実施例において示されるような、シソ抽出物中の分子量範囲が１００〜２０００である画分、好ましくは２００〜１５００である画分が挙げられる。
【００２８】
Ａβは、普遍的な細胞外タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質がセクレターゼにより分解されて生じる４０又は４２アミノ酸残基のフラグメントである。単量体のＡβが集合し、βシート構造形成による重合反応を繰り返すことで、アミロイド線維と呼ばれる凝集体が生じる。この凝集体が脳内に沈着して生じるのが、アルツハイマー病の特徴である老人斑（アミロイド斑）である。Ａβ、特に４２アミノ酸残基からなるＡβ４２は、特にオリゴマーの形態で強い細胞毒性を発揮する。
【００２９】
Ａβの凝集阻害活性は、例えば、単量体のＡβを被験物と混合した後のＡβの凝集を測定するインビトロの系、アルツハイマー病モデル神経細胞を被験物と接触させてＡβの凝集・蓄積を評価する細胞評価系、アルツハイマーモデル動物に被験物を投与して脳におけるＡβの凝集・蓄積を評価する動物評価系などを用いて評価することができる。インビトロの系としては、凝集したＡβと結合することにより励起波長及び蛍光波長がシフトして蛍光強度が増加するチオフラビンＴ（ＴｈＴ）を用いた系（例えば、コスモ・バイオ株式会社のＳｅｎｓｏＬｙｔｅ（登録商標）ＴｈＴ  Ａβ４２＆Ａβ４０凝集キットなど）、本発明者らが開発した非特許文献１に記載の蛍光性半導体ナノ結晶（量子ドット、ＱＤ）を用いたＡβ蛍光ラベル法を用いた評価系等が挙げられる。非特許文献１に記載の方法は、ごく微量の試料での活性測定が可能である点で有利である。
【００３０】
本発明の別の態様は、上述のＡβ凝集阻害用組成物を含む、アミロイドーシスを治療及び／又は予防するための医薬に関する。
【００３１】
アミロイドーシスは、線維構造を有する不溶性タンパク質であるアミロイドが臓器に沈着することで機能障害を引き起こす疾患である。アミロイドーシスは、全身の様々な臓器にアミロイドが沈着する全身性アミロイドーシス、及び特定の臓器に限局した沈着を示す限局性アミロイドーシスに大きく分けられる。以下に、各アミロイドーシスの臨床病名、括弧内にその原因タンパク質を例として挙げる。
【００３２】
全身性アミロイドーシス：ＡＡアミロイドーシス（血清アミロイドＡ）、ＡＬアミロイドーシス（免疫グロブリンＬ鎖）、ＡＨアミロイドーシス（免疫グロブリンＨ鎖）、透析アミロイドーシス（β２−ミクログロブリン）、老人性全身性アミロイドーシス（トランスサイレチン）、家族性アミロイドポリニューロパチー（トランスサイレチン、アポリポ蛋白ＡＩ、ゲルゾリン）など。
【００３３】
限局性アミロイドーシス：アルツハイマー病（Ａβ）、脳アミロイドアンギオパチー（Ａβ）、クロイツフェルト・ヤコブ病等のプリオン病（プリオン蛋白）、限局性心房アミロイド（心房ナトリウム利尿因子）等の内分泌アミロイドーシス、限局性結節性アミロイドーシス（免疫グロブリンＬ鎖）、角膜アミロイドーシス（ケラトエピセリン、ラクトフェリン）など。
【００３４】
本発明による医薬は、アミロイドーシス、好適には、脳でのアミロイド蓄積が認められる脳アミロイドーシスの治療及び／又は予防のために用いることができる。脳アミロイドーシスとしては、例えばアルツハイマー病、脳アミロイドアンギオパチー、プリオン病、パーキンソン病、ハンチントン病などが挙げられる。より好適な適用疾患は、アルツハイマー病である。
【００３５】
本明細書において用いられる用語「治療」は、疾患の治癒、一時的寛解などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的介入を包含する。また用語「予防」は、疾患への罹患又は発症の防止又は抑制などを目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的介入を包含する。すなわちアミロイドーシスの治療及び／又は予防とは、アミロイドーシスの進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００３６】
本発明の一態様である医薬は、有効量のＡβ凝集阻害用組成物を含み、かかる有効量は、Ａβ凝集阻害活性の強さ、投与経路、対象とする疾患の種類、症状の重症度、患者その他の医学的要因によって適宜調節される。好ましい態様において、Ａβ凝集阻害用組成物の有効量は、Ａβ凝集阻害活性を有する他の公知の物質、例えばポリフェノール類など（Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１７５（６），２００９：２５５７−２５６５）の有効量を参照して設定することができる。有効量は、例えば、経口投与の場合、投与される個体の体重１ｋｇあたり５ｍｇ〜２０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜５００ｍｇ、より好ましくは２５ｍｇ〜２００ｍｇであり、これを１日に１回又は複数回に分けて投与することができる。
【００３７】
さらに、本発明により提供される医薬は、当業者に公知の任意の薬学的に許容される賦形剤、担体、補助剤又はその他の成分と共に医薬組成物を形成し、又は製剤化することができる。このような医薬組成物及び製剤も、本発明に包含される。
【００３８】
薬学的に許容される賦形剤、担体、補助剤又はその他の成分は当業者において公知又は周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００３９】
賦形剤、担体又は補助剤の例としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、でん粉、ショ糖、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軟質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ろう、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等を挙げることができる。
【００４０】
本発明において用いられる製剤は、任意の剤型をとることができる。剤形の例としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒、内服液、散剤及びシロップ剤等の内服剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、スプレー剤及びローション剤等の外用剤、液体製剤、懸濁剤、注射剤等を挙げることができる。これらの製剤は、当業者が常法に従って調製することができる。
【００４１】
本発明により提供される医薬組成物又は製剤は、当業者に公知の任意の投与経路、例えば、経口投与、局所投与又は静脈内投与といった非経口投与等により投与することができる。このような医薬組成物又は製剤の製造は、それぞれ当業者に公知又は周知である一般的な方法を用いて行えばよい。
【００４２】
また、本発明によるＡβ凝集阻害用組成物は、食品、健康補助食品又はサプリメント等の形態で利用することもできる。これらは有効量のＡβ凝集阻害用組成物を含有する。
【００４３】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の理解を助けるためのものであって、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４４】
＜実施例１＞シソ抽出物の調製
チリメンジソ及びチリメンアオジソの植物体から、葉、茎及び花を手作業で分離した（花はチリメンジソのみ）。洗浄後の各部位を試料として、試料１００ｇあたり５００ｍＬ〜７００ｍＬ程度のエタノール又は熱水を用いた抽出処理を以下のように行った。
エタノール抽出処理：エタノールを加えた後、暗所で約１週間静置して抽出。
熱水抽出処理：熱水中に試料を加えた後、１０分間煮沸を続けて抽出。
抽出後の液体をろ過してろ液を回収し、溶媒を減圧蒸留により除去することで、シソ抽出物を得た。原料シソ１００ｇ（湿重量）あたりの抽出物の収量を以下の表１に示す。
【表１】
0006707251.tif 000002
【００４５】
＜実施例２＞シソ抽出物のＡβ凝集阻害活性の評価
実施例１で調製したシソ抽出物について、非特許文献１に記載の方法に従って、Ａβ凝集阻害活性を評価した。簡潔には、まずＱｄｏｔ  ６５５  ＩＴＫ  Ａｍｉｎｏ（ＰＥＧ）  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＡβ４０を標識し、蛍光標識ＡβであるＱＤＡβを調製した。実施例１の各シソ抽出物をＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０％エタノール、１×ＰＢＳ）で希釈率０．２％〜０．００００２％まで１０倍段階希釈した試料１容量に対し、Ａβ溶液（６０μＭ  Ａβ４２、６０ｎＭ  ＱＤＡβ、１×ＰＢＳ）１容量を加えた後、１０，０００×ｇで２分間遠心した。対照として、希釈試料の代わりにＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ１容量に対し、Ａβ溶液１容量を加えたものを同様に処理した。得られた上清５μＬを１５３６ウェルプレートに分注し、プレートをシールして１，５３０×ｇで５分間遠心後、３７℃で１日間インキュベートし、Ａβを凝集させた。インキュベーションの前後に、倒立型蛍光顕微鏡下、ＱＤ６５５フィルター、４×対物レンズを用いて各ウェルの観察を行い、蛍光画像を撮像した。
各画像の中央、１００×１００ピクセルの範囲の蛍光強度の標準偏差をＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）のＨｉｓｔｇｒａｍツールを用いて測定した。希釈倍率ごとに３点の測定を行い、平均値をその希釈倍率での標準偏差とした。インキュベート前の対照の標準偏差を０％、インキュベート後の対照の標準偏差を１００％とした場合の各希釈試料の凝集阻害曲線を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）の５パラメータロジスティック関数を使用したカーブフィッティングにより作成し、標準偏差値５０％と交わる試料濃度であるＥＣ５０値を算出した。ＥＣ５０値は、値が小さいほど凝集阻害活性がより高いことを意味する。なお以降の実施例において、ＥＣ５０値は、Ａβ凝集反応系に含まれる抽出物の固形分濃度（ｍｇ／ｍＬ）、又は抽出物の希釈率（％）のいずれかで表す。
【００４６】
実施例１のシソ抽出物のＡβ凝集阻害を表す蛍光画像（撮像したウェル画像の中央、１００×１００ピクセルの範囲を拡大したもの）を図１（チリメンジソ）及び図２（チリメンアオジソ）に、蛍光画像から算出したＥＣ５０値のグラフを図３に示す。図１及び図２中、図上端のパーセンテージは、シソ抽出物の濃度（希釈率）を表す。また図３の左側のタイム、サマーサボリー、スペアミントのＥＣ５０値は、非特許文献１に記載されたものである。
図１〜３の結果より、チリメンジソ及びチリメンアオジソのエタノール又は熱水抽出物は、非特許文献１に記載された高活性のシソ科香辛料と同等以上のＡβ凝集阻害活性を有することが明らかとなった。チリメンアオジソ、特にチリメンアオジソ葉のエタノール抽出物は活性が高く、そのＥＣ５０値は０．０００４８±０．０００２４ｍｇ／ｍＬであった。これは非特許文献１中で最も活性が高かったスペアミントＥＣ５０値の約１／４０である。
【００４７】
＜実施例３＞シリカゲルカラムクロマトグラフィー及び逆相カラムクロマトグラフィーによるチリメンアオジソ抽出物の精製
実施例１のチリメンアオジソ葉のエタノール抽出物を水に懸濁し、クロロホルム、酢酸エチル、ｎ−ブタノールの順に分液操作を行うことで、クロロホルム、酢酸エチル、ｎ−ブタノール及び水のそれぞれの可溶画分に分配し、各分配画分のＡβ凝集阻害活性を実施例２と同様の方法で評価した。Ａβ凝集阻害を表す蛍光画像（撮像したウェル画像の中央、１００×１００ピクセルの範囲を拡大したもの）を図４に示す。阻害活性が最も高かったのはｎ−ブタノール画分であり、そのＥＣ５０値は０．０００２１２±０．０００１６８％であった。
このｎ−ブタノール画分（３．５ｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、計７つのフラクションに分画した。阻害活性が高かったフラクション６（２．３ｇ）をさらに逆相カラムクロマトグラフィーに供し、４つのフラクションを得た。阻害活性の高かったフラクション３（０．７４３ｇ）をさらにシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、４つのフラクションを得た。各カラムクロマトグラフィーの条件は下の通りであった。
【００４８】
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１回目）
充填剤：
シリカゲル  フジシリシアＰＳＱ６０Ｂ（１００ｇ）
溶出及び分画条件：
クロロホルム（０．５Ｌ）、１０％メタノール／クロロホルム（０．５Ｌ）、２０％メタノール／クロロホルム（０．５Ｌ）、３０％メタノール／クロロホルム（０．５Ｌ）、４０％メタノール／クロロホルム（０．５Ｌ）、５０％メタノール／クロロホルム（１Ｌ）、メタノール（１Ｌ）で順次溶出し、フラクション１（はじめの０．３Ｌ）、フラクション２（つぎの０．４Ｌ）、フラクション３（つぎの０．３Ｌ）、フラクション４（つぎの０．７Ｌ）、フラクション５（つぎの０．４Ｌ）、フラクション６（つぎの１．５Ｌ）、フラクション７（つぎの０．８Ｌ）をそれぞれ得た。
【００４９】
逆相カラムクロマトグラフィー
充填剤：
分取用逆相Ｃ１８充填剤（ナカライテスクＣＯＳＭＯＳＩＬ７５Ｃ１８−ＯＰＮ）２００ｇ
溶出及び分画条件：
５％アセトニトリル／水（０．５Ｌ）、１０％アセトニトリル／水（０．５Ｌ）、アセトニトリル（０．５Ｌ）で順次溶出し、フラクション１（はじめの２００ｍＬ）、フラクション２（つぎの４００ｍＬ）、フラクション３（つぎの４００ｍＬ）、フラクション４（つぎの５００ｍＬ）をそれぞれ得た。
【００５０】
シリカゲルカラムクロマトグラフィー（２回目）
充填剤：
シリカゲル  フジシリシアＰＳＱ６０Ｂ（１０ｇ）
溶媒：
４０％メタノール／クロロホルム（０．１Ｌ）、４５％メタノール／クロロホルム（０．１Ｌ）、メタノール（０．０５Ｌ）で順次溶出し、フラクション１（はじめの０．０３Ｌ）、フラクション２（つぎの０．０７Ｌ）、フラクション３（つぎの０．０５Ｌ）、フラクション４（つぎの０．１Ｌ）をそれぞれ得た。
【００５１】
上記精製の手順図、並びに各フラクションの収量及びＥＣ５０値を図５に示す。特に逆相カラムクロマトグラフィー後のフラクションで阻害活性の低下が認められた。また、２回目のシリカゲルカラムクロマトグラフィー後のフラクション３及び４のＡβ凝集阻害活性を、非特許文献１においてサマーサボリーから単離したロスマリン酸のそれと比較した結果を図６に示す。フラクション３及び４は、ロスマリン酸の約１／２０という低いＥＣ５０値、すなわち高い阻害活性を有していた。
【００５２】
＜実施例４＞アオジソ抽出物の調製及びそのＡβ凝集阻害活性の評価
市販のアオジソの葉を用いて、実施例１と同様の方法でエタノール抽出処理を行い、原料のアオジソ葉１００ｇ（湿重量）あたり、１．９５ｇのエタノール抽出物を得た。この抽出物について、実施例２と同様の方法でＡβ凝集阻害活性を評価した。
アオジソ葉のエタノール抽出物のＥＣ５０値は０．０００８４３ｍｇ／ｍＬであり、実施例１のチリメンアオジソ葉のエタノール抽出物と同程度の強い阻害活性を有していた。
【００５３】
＜実施例５＞ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによるアオジソ抽出物精製画分の調製
実施例４のアオジソ葉のエタノール抽出物のうち１．０ｇをゲルろ過カラムクロマトグラフィーに供し、計８のフラクションに分画した。阻害活性が高かったフラクション７（０．１２ｇ）のうち０．０５ｇをさらにゲルろ過カラムクロマトグラフィーに供し、８つのフラクションを得た。各カラムクロマトグラフィーの条件は下の通りであった。
【００５４】
ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（１回目）
充填剤：
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（６００ｍＬ）
溶出及び分画条件：
メタノール１．６Ｌで溶出し、フラクションを１２ｍＬずつ分取した。類似物質が含まれるフラクションをまとめ、フラクション１（はじめの０．１２Ｌ）、フラクション２（つぎの０．７２Ｌ）、フラクション３（つぎの０．２Ｌ）、フラクション４（つぎの０．０９６Ｌ）、フラクション５（つぎの０．１３２Ｌ）、フラクション６（つぎの０．１２Ｌ）、フラクション７（つぎの０．４３２Ｌ）、フラクション８（つぎの０．９２４Ｌ）をそれぞれ得た。
【００５５】
ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（２回目）
充填剤：
Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（６２ｍＬ）
溶出及び分画条件：
メタノール２３０Ｌで溶出し、フラクションを２ｍＬずつ分取した。類似物質が含まれるフラクションをまとめ、フラクション１（はじめの０．０５Ｌ）、フラクション２（つぎの０．０２Ｌ）、フラクション３（つぎの０．００４Ｌ）、フラクション４（つぎの０．００８  Ｌ）、フラクション５（つぎの０．０２８Ｌ）、フラクション６（つぎの０．０２２Ｌ）、フラクション７（つぎの０．０１８Ｌ）、フラクション８（つぎの０．１００Ｌ）をそれぞれ得た。
【００５６】
１回目のゲルろ過カラムクロマトグラフィー後の各フラクションのＡβ凝集阻害活性を実施例２に記載の方法で測定したところ、最も阻害活性が高かったフラクション７のＥＣ５０値は０．０００１０６ｍｇ／ｍＬであった。
【００５７】
このフラクション７に含まれる物質の分子量の範囲は、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー及びＴＯＦ−ＭＳ（Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）を接続したＢｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＴｒｅｍｅＴＯＦ／ＴＯＦ  質量分析計を用いたマトリクス支援レーザー脱離イオン化法、マトリクス：２，５−ヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢＡ））による質量分析の結果から、１００〜２０００であることが推測された。
【００５８】
＜実施例６＞カタメンジソ抽出物の調製及びそのＡβ凝集阻害活性の評価
カタメンジソの植物体から葉、茎及び根を分離し、これらをそのまま、または乾燥させた後、実施例１と同様の方法でエタノール抽出処理を行って抽出物を得た。この抽出物について、実施例２と同様の方法でＡβ凝集阻害活性を評価した。
結果を図７に示す。カタメンジソのエタノール抽出物はいずれもＡβ凝集阻害活性を示し、特に新鮮な葉及び根からの抽出物の活性が高かった。
【００５９】
＜実施例７＞収穫時期によるＡβ凝集阻害活性の変化
チリメンアオジソ葉を６月（双葉、間引き時）、７月、８月、９月（開花時）に採取し、実施例１と同様の方法でエタノール抽出処理を行って抽出物を得た。この抽出物について、実施例２と同様の方法でＡβ凝集阻害活性を評価した。また、これらの抽出物中のロスマリン酸含有量を、高速液体クロマトグラフィー法（Ｃａｎｅｌａｓら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，８４（９），１５０２−１５０４（２００７）に記載された方法の改良法）により測定した。
結果を図８に示す。Ａβ凝集阻害活性は９月の試料では他の月に採取した試料の約４倍に上昇していた。一方、ロスマリン酸含有量が増加した７月の試料ではＡβ凝集阻害活性の上昇は認められなかった。
【００６０】
シソにはＡβ凝集阻害活性のあるロスマリン酸が含まれることが知られており、実施例において使用したシソ中のロスマリン酸含有量は最大で３１．８ｍｇ／ｇ（チリメンアオジソ葉部、ＨＰＬＣによる実測値）であった。しかしながら、ロスマリン酸のＡβ凝集阻害活性（ＥＣ５０値）は０．００１１ｍｇ／ｍＬ〜０．００３６ｍｇ／ｍＬ程度（市販のロスマリン酸（和光純薬株式会社）を使用して測定）であること、及び実施例７において９月に採取したチリメンアオジソ葉はロスマリン酸含有量が他の月と変わらないにもかかわらず高いＡβ凝集阻害活性を示したことから、上述の実施例において得られたシソ抽出物及びその精製物は、ロスマリン酸を遙かにしのぐ強力なＡβ凝集阻害活性を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のＡβ凝集阻害用組成物及びこれを含む医薬は、安価かつ容易に入手可能であり、十分な食経験を有するシソの抽出物を有効成分とする。したがって本発明によると、安全性が高く、医薬及び食品として広く利用可能な、アルツハイマー病を含むアミロイドーシスを予防及び／又は治療する手段を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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