(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）真核細胞発現系で真核細胞を形質転換して組換え真核細胞を作製することと、
（ｂ）前記組換え真核細胞の生存能、増殖および／または分裂が１種以上のビタミン代謝関連タンパク質の活性に依存している培養培地において前記組換え真核細胞を培養することと、
（ｃ）前記１種以上のビタミン代謝関連タンパク質を発現する組換え真核細胞を選択することであって、前記ビタミン代謝関連タンパク質は、選択された組換え真核細胞を取得するための選択マーカーである、選択することと、
（ｄ）前記選択された組換え真核細胞から、または前記選択された組換え真核細胞を含むその培養培地から、目的のタンパク質を精製することと、
を含む、目的のタンパク質を生産する方法であって、前記（ａ）における真核細胞発現系が：
少なくとも１つの第１の調節配列の制御下にある、少なくとも１つのビタミン代謝関連タンパク質をコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドと、
少なくとも１つの第２の調節配列の制御下にある、少なくとも１つの目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドと、
を含み、
前記少なくとも１つのビタミン代謝関連タンパク質が、ＴＨＴＲ−１、ＴＨＴＲ−２、ＴＰＫ、ＴＰＣおよびナトリウム依存性マルチビタミントランスポーター（ＳＭＶＴ）から成る群から選択されるビタミン輸送タンパク質であり、
前記少なくとも１つの第１のポリヌクレオチド、または前記少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドを制御する第１の調節配列、が優勢変異または劣勢変異を有する真核細胞発現系である、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１つの制限酵素切断部位に挿入されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ビタミン輸送タンパク質がビタミンＢ１、Ｂ５およびＨから選択される可溶性ビタミンを輸送する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ビタミン輸送タンパク質がＳＭＶＴである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記真核細胞発現系が少なくとも１つの発現ベクターである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
１つのベクターが、前記少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドおよび前記少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１および／または第２の調節配列がプロモーター、エンハンサー、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）、足場付着領域（ＳＡＲ）、インスレーターエレメントおよび／または核マトリックス結合ＤＮＡである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地が、制限濃度および／または飽和濃度の少なくとも１種のビタミンを有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記培養培地が、制限濃度および／または飽和濃度のビタミンＢ１、Ｂ５および／またはＨを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ビタミン代謝関連タンパク質は、前記細胞に本来備わっているものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ビタミン代謝関連タンパク質が、ビタミン代謝に干渉する、および／または細胞内のビタミンに結合する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビタミン代謝関連タンパク質が、パントテン酸キナーゼ１、２、および３ならびにチアミンピロリン酸キナーゼから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養培地が、
Ｂ５についての制限培地であるか、または
Ｂ５については飽和培地であるがＨについては制限培地もしくは非制限培地であるか、または
Ｈについては飽和培地であるがＢ５については制限培地もしくは非制限培地である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
組換え真核細胞を培養し、選択するための方法であって、
少なくとも１つの第１の調節配列の制御下にある、少なくとも１つのビタミン代謝関連タンパク質をコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドと；少なくとも１つの第２の調節配列の制御下にある、少なくとも１つの目的産物をコードする少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドと；を含む真核細胞発現系であって、前記少なくとも１つのビタミン代謝関連タンパク質が、ＴＨＴＲ−１、ＴＨＴＲ−２、ＴＰＫ、ＴＰＣおよびナトリウム依存性マルチビタミントランスポーター（ＳＭＶＴ）から成る群から選択されるビタミン輸送タンパク質であり、前記少なくとも１つの第１のポリヌクレオチド、または前記少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドを制御する第１の調節配列、が優勢変異または劣勢変異を有する真核細胞発現系を提供することと、
その生存能、増殖および／または分裂がビタミンの取り込みに依存している真核細胞を提供することと、
前記発現系を前記真核細胞に導入して、前記ビタミン代謝関連タンパク質および前記目的産物を発現する前記組換え真核細胞を作製することと、
細胞培養培地において前記真核細胞を培養することと、
前記目的産物を安定に発現する前記組換え真核細胞を、前記組換え真核細胞の表面上に発現される前記ビタミン代謝関連タンパク質を介して選択することと、
を含む方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１つの制限酵素切断部位に挿入されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ビタミン輸送タンパク質がビタミンＢ１、Ｂ５およびＨから選択される可溶性ビタミンを輸送する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ビタミン輸送タンパク質がＳＭＶＴである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記真核細胞発現系が少なくとも１つの発現ベクターである、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
１つのベクターが、前記少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドおよび前記少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１および／または第２の調節配列がプロモーター、エンハンサー、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）、足場付着領域（ＳＡＲ）、インスレーターエレメントおよび／または核マトリックス結合ＤＮＡである、請求項１５〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地は、
Ｂ５についての制限培地であるか、または
Ｂ５については飽和培地であるがＨについては制限培地である、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
目的産物を安定に発現する組換え真核細胞の選択のための選択マーカーとしてのビタミン代謝関連タンパク質の使用であって、前記細胞の生存能、増殖および／または分裂がビタミンの取り込みに依存し、
前記少なくとも１つのビタミン代謝関連タンパク質が、ＴＨＴＲ−１、ＴＨＴＲ−２、ＴＰＫ、ＴＰＣおよびナトリウム依存性マルチビタミントランスポーター（ＳＭＶＴ）から成る群から選択されるビタミン輸送タンパク質である、
使用。
【請求項２４】
前記培養培地が、１０ｎＭ未満の濃度で、および／または
２０μＭ超の濃度で、
少なくとも１種の必須ビタミンを含む、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１種の必須ビタミンがビタミンＢ１、Ｂ５および／またはＨである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的のタンパク質が治療用タンパク質である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞の増殖および／または分裂が停止され、
前記目的のタンパク質が、増殖が停止されない培地において増殖させた場合に前記細胞によって発現されるタンパク質の最大レベル（ＭＬ、［ｇ／ｌ］）を超える停止時最大レベル（ＭＡＬ、［ｇ／ｌ］）で産生され、
前記ＭＡＬは、前記ＭＬの１．５倍超、前記ＭＬの２倍超、または前記ＭＬの２．５倍超もしくは３倍超である、
請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ビタミン代謝関連タンパク質がビタミンＢ５、Ｂ１および／またはＨを輸送するビタミン輸送タンパク質であり、
前記培養培地が、前記ビタミンのうちの１種以上について制限状態および／または飽和状態である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ビタミン輸送タンパク質がＳＭＶＴであり、
前記培養培地が、Ｂ５についての制限培地であるか、またはＢ５については飽和培地であるがＨについては制限培地である、
請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[背景技術]
［0001］ビタミンは、細胞の成長および増殖を支えるのに必要とされる必須微量栄養素である。哺乳動物細胞はビタミンを合成できず、従って、哺乳動物は、食物からビタミンを得なければならない。対照的に、細菌、真菌および植物はビタミンを合成する。ビタミンの主な機能は、ＴＣＡサイクル、解糖系、アミノ酸合成およびアセチル−ＣｏＡ生合成などの様々な酵素反応において補因子または補酵素として働くことである。
【０００２】
［0002］ビタミン欠乏症は、数多くの疾患と直接関連している。例えば、ヒトにおけるビタミンＢ１の急性欠乏症は、脚気と呼称される疾患をもたらし、これが次に、致命的な神経障害および心血管障害を生じさせる可能性がある。さらに、ビタミンの取り込みに関与する遺伝子を欠いたマウスは、重篤な症状を示す。例えば、ミトコンドリアのビタミンＢ１トランスポーターであるＳｌｃ２５ａ１９のノックアウトは、胚の致死、ＣＮＳ形成異常および貧血を引き起こす（Ｌｉｎｄｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ビタミンＨおよびＢ５（パントテン酸）のトランスポーターを欠いたマウスは、成育遅延、骨密度の低下、骨の長さの減少、および１０週後の致死を示す（Ｇｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ビタミン代謝と関連している可能性がある細胞質またはミトコンドリアの活性の欠乏はまた、細胞または生物の機能を変化させる可能性もある。例えば、マウスのパントテン酸キナーゼ遺伝子（ＰＡＮＫ）のノックアウトは、ミトコンドリアおよび細胞呼吸の欠損ならびに補酵素Ａの欠乏をもたらす（Ｂｒｕｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２；Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０００３】
［0003］  チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、治療用組換えタンパク質の生産のための工業的プロセスにおいて広く使用されている。ＣＨＯ細胞および工業的プロセスで使用される他の真核細胞（ＮＳ０、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）およびヒト胎児腎臓−２９３（ＨＥＫ−２９３））の生存能は、ビタミンの取り込みに依存している。同様に、遺伝子療法または細胞療法のための、および再生医療のための、ヒト細胞などの初代細胞もビタミンの取り込みに依存している。
【０００４】
［0004］  組換えタンパク質のより高い収量を得るために、細胞培養培地および細胞株の最適化が行われることが多い。増殖およびモノクローナル抗体の産生に伴う中央代謝の変化を決定する最近の研究によって、細胞代謝と培地の代謝産物と細胞増殖との間の制御上の関連性が注目された（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。例えば、過剰な細胞増殖および細胞分裂はタンパク質生産の収量に悪影響を及ぼすため、研究は、特定の栄養素を枯渇させることによって、または細胞周期制御因子を直接制御することによって、細胞分裂周期を制御することに焦点を当てている（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４およびその中の参考文献を参照のこと）。しかし、これらの介入は、組換えタンパク質の品質および／または翻訳後プロセシングに対する望ましくない影響を伴うことが多い（Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓａｍｐａｔｈｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｔｒｕｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０００５】
［0005］形質転換された細胞株の選択を改善するための他の取り組みは、毒性のある抗生物質化合物に対するいかなる耐性も必要としない新規の分子マーカーの開発に集中した。例えば、それらのコード配列を発現ベクターに含めることによるヌクレオチドまたはアミノ酸の生合成経路の構成要素（デヒドロ葉酸レダクターゼまたはグルタミンシンターゼなど）の発現の増加が、組換えタンパク質を発現する細胞の代謝性選択（metabolic selection）のために使用されている（Ｃａｃｃｉａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０、Ｂｉｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒａｃｈｅｒ  ２００６、国際公開第２００９／０８０７５９号；本明細書に記載される全ての参考文献と同じく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００３３０５７２号）。例えば、葉酸トランスポーターのコード配列が、増加した導入遺伝子の発現について選択するために使用された（Ｒｏｔｈｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。このアプローチは、薬理学的に価値のあるタンパク質の発現の増加をもたらしているが、いくつかの研究では、例えば、導入遺伝子のコピー数を増幅するために使用された場合に、発現レベルが不安定であることが報告された（Ｓｃｈｌａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｃｈｕｓａｉｎｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【０００６】
［0006］哺乳動物細胞の代謝および増殖はまた、ビタミンの利用可能性に直接依存する可能性もある。従って、一般的には治療用タンパク質の発現の改善を目的として、ビタミンの取り込み、ビタミン代謝関連遺伝子の発現および／または培養培地中の特定のビタミンの濃度を制御することによって培養細胞の代謝および／または増殖を調節することが当技術分野では必要とされている。また、代替的な細胞選択の方法も必要とされている。本発明は、これらの必要性ならびに当技術分野における他の必要性のうちの１つ以上に対処することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】［0007］図１は、哺乳動物細胞および細胞小器官へのビタミンの輸送の概要を提示する。
【図２】［0008］図２Ａ〜Ｂは、非枯渇培地と比べたビタミン枯渇培地におけるＣＨＯ−Ｍの増殖を示す。ビタミンＢ１、Ｂ５またはＨを追加した、または追加していない、５００μｌのＢ−ＣＤｍｉｎ培養培地（表２を参照のこと）に、あるいは完全培地（ＳＦＭ）に、５００００細胞／ｍｌまで細胞を播種した。振盪することなく、表示される時間にわたって２４ウェルプレート中で細胞を培養した。３日間、６日間および１０日間の培養の後に細胞密度（Ａ）および生存能（トリパンブルー排除アッセイ、パネル（Ｂ））を測定した。
【図３】［0009］図３は、ビタミン枯渇培地におけるＣＨＯ−Ｍの増殖を示す。種々の濃度のビタミンＢ１、Ｂ５またはＨ（０〜１×、表２を参照のこと）を含む１５０μｌの培地に細胞（５０００細胞／ｍｌ）を移した。９６ウェルプレートを使用し、９日間の培養の後に、６００ｎｍにおけるＯＤを測定することによって増殖を測定した。（前方に傾いた）斜線のバー、ドット付きの濃いバーおよび（後方に傾いた）斜線のバーは、それぞれＢ１、Ｂ５およびＨの濃度の調節を示す。
【図４】［0010］図４は、抗体を分泌するＣＨＯ−Ｍ細胞クローンの流加培養の細胞の増殖および生存能に対するビタミンＢ５枯渇の影響を示す。トラスツズマブを分泌するＣＨＯ−Ｍ細胞クローンを、両方とも６ｍＭのグルタミンを追加した完全培地（黒四角）またはビタミン枯渇培地（灰色の三角、Ｂ−ＣＤｍｉｎ培地と完全ＣＤ培地の５０００：１（Ｖ：Ｖ）混合物）において増殖させた。３日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目および１３日目に同じ培養培地のフィードを加えた。生細胞密度（ＶＣＤ、実線）および細胞生存率（生細胞の％、点線）について培養物を分析した。
【図５】［0011］図５は、流加培養におけるＣＨＯ−Ｍ細胞クローンの免疫グロブリンの力価に対するビタミンＢ５枯渇の影響を示す。図４の完全培地（黒四角）またはビタミンＢ５枯渇培地（灰色の三角）において増殖させたトラスツズマブを分泌するＣＨＯ−Ｍ細胞クローンを、ダブルサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイによって、培養培地中に分泌された抗体の力価についてアッセイした。
【図６】［0012］図６は、ＣＨＯ−Ｍ安定株におけるＳＬＣ５Ａ６のｍＲＮＡレベルを示す。表示される量のＳｌｃ５ａ６発現ベクターでトランスフェクトした多クローン集団をピューロマイシン耐性について選択し、Ｓｌｃ５ａ６のｍＲＮＡレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって決定した。ＳＬＣ５Ａ６の転写物の蓄積をＧＡＰＤＨのｍＲＮＡのものに対して標準化した。それを、１に設定した対照として使用される非形質転換細胞の内因性のＳＬＣ５Ａ６のｍＲＮＡレベルと比較して表す。０ｎｇは、ＧＦＰ発現ベクターとピューロマイシン耐性発現ベクターだけでトランスフェクトした細胞を示し、一方、Ｃは、非形質転換対照細胞を表す。
【図７】［0013］図７は、ビタミン制限条件におけるＣＨＯ−Ｍの増殖に対するＳＬＣ５Ａ６の影響を示す。表示される量のビタミンＢ５およびＨとＢ１（１×）とを追加したＢ−ＣＤｍｉｎ培地５００μｌに２００００細胞／ｍｌで細胞を播種した。２４ウェルプレートを使用し、６日間の培養の後に、生細胞密度を測定することによって増殖を測定した。アスタリスクは、同じ増殖と培養培地の条件内でのトランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞との間の有意差（ｐ＜０．０５）を表す。
【図８】［0014］図８Ａ〜Ｂは、Ｂ５欠乏培地およびＳＬＣ５Ａ６トランスポーターを用いたＣＨＯ−Ｍトランスフェクト細胞の選択を示す。ＧＦＰプラスミドおよびピューロマイシンプラスミドとともに、量を増加させたＳｌｃ５ａ６ベクターをトランスフェクトした（０、５０、２５０および１０００ｎｇ）。Ｂ５欠乏培地（１０−３×）における安定な多クローン集団の選択の後、全てのＧＦＰ＋発現細胞（灰色のバー：全てのＧＦＰ＋細胞）およびＧＦＰ高発現体（黒のバー、ＧＦＰ高発現体）をＦＡＣＳによって定量化した（Ａ）。同じ細胞についての蛍光の平均値もＦＡＣＳによって定量化した（Ｂ）。Ｃは、対照として使用される非形質転換ＣＨＯ−Ｍ細胞を示す。キャリアＤＮＡ（０ｎｇ）または５０ｎｇのＳｌｃ５ａ６発現ベクターのトランスフェクションの場合には、選択プロセスを生き延びた細胞の数が、定量化するには少なすぎた。
【図９】［0015］図９Ａ〜Ｃは、ＳＬＣ５Ａ６発現プラスミド、ＧＦＰ発現プラスミドおよびピューロマイシン耐性（ｐｕｒｏ）発現プラスミドを同時にトランスフェクトした安定な多クローン細胞集団からの全てのＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ高発現細胞の濃縮を表すＦＡＣＳのグラフを示す。トランスフェクトされた細胞をピューロマイシンによる最初の選択に供した後、過剰なビタミンＢ５濃度（Ｂ５  １０×／Ｈ  １０−４×）または制限ビタミンＢ５濃度（Ｂ５  １０−３×／Ｈ  １０−４×）のいずれかを含む培地における培養による第２の選択を行ったか、または対照として、それらを非選択的培養培地（Ｂ５  １×／Ｈ  １０−４×）で培養した。（Ａ）：表示される通りの種々の濃度のＢ５（１０−３×、１×または１０×）を含む培地において細胞を７日間培養した後の、トランスフェクトされたＣＨＯ−ＭのＧＦＰ蛍光のＦＡＣＳプロファイル。ゲート１は全てのＧＦＰ発現細胞を表し、一方、ゲート２は、ＧＦＰを最も高発現する細胞に限定される。様々な量のＳｌｃ５ａ６発現ベクター（例えば、表示されるような０ｎｇ、１００ｎｇおよび２５０ｎｇ）とＧＦＰベクターおよびピューロマイシン耐性ベクターとを同時にトランスフェクトした多クローン細胞プールについて、ＧＦＰ＋蛍光細胞の濃縮（Ｂ）および細胞のＧＦＰ蛍光の幾何平均（Ｃ）を示す。
【図１０】［0016］図１０は、実験上の細胞選択のワークフローを示す。ＳＬＣ５Ａ６およびＩｇＧ軽鎖のプラスミドとピューロマイシン耐性およびＩｇＧ重鎖のコンストラクトとでＣＨＯ−Ｍ細胞を同時にトランスフェクトした後、培養物を分割し、ピューロマイシンの存在下（条件Ａ）またはビタミン欠乏培養培地（最少培地、条件Ｂ）において、あるいは二重選択（ＡＤおよびＢＤ）によって、選択した。この後に、得られた多クローン細胞プールの免疫グロブリン分泌アッセイを行った。選択の後、細胞の一部を、発現の安定性についての１０週間の試験の間の継代のために非選択的培養培地に（Ａ＋、Ｂ＋）、または流加培養バイオリアクターに（ＡＤ＋およびＢＤ＋）、移した。
【図１１】［0017］図１１は、ピューロマイシンまたはビタミン枯渇を用いて、または両方の選択を用いて、選択された細胞集団の免疫グロブリン分泌を示す。多クローン細胞プール全体を、図１０に示されるように、ピューロマイシンを５μｇ／ｍｌ含む完全培地における増殖によって（Ａ＋）、最少培地において（Ｂ１＋）、または、最少培地における５μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下での二重選択によって（Ｂ１Ｄ＋およびＢ２Ｄ＋）、選択した。２つの独立した細胞集団を、Ｂ１およびＢ２と名付けられたＢ選択レジメンについて分析し、二重選択されたＢ１Ｄ＋集団およびＢ２Ｄ＋集団をそれぞれ得た。２つの独立した集団を、ＢＤ＋選択レジメンについて分析した。選択されたプールを完全培地において増殖させ、３日目および６日目〜１０日目にフィードを加えた。ダブルサンドイッチＥＬＩＳＡによってサンプルを、分泌された抗体の力価について分析した。
【図１２】［0018］図１２は、ピューロマイシンまたはビタミン枯渇を用いて選択された細胞集団の免疫グロブリン分泌を示す。（Ａ）図１０に示される選択レジメンに従った培養の３９日目に細胞を分析した。細胞表面に提示され、分泌される、分泌治療用抗体に結合する蛍光抗体複合体によって細胞分泌を検出した。黒のバーおよび左側の目盛は、多クローン集団における抗体を分泌する細胞のパーセンテージを示す。個々の細胞の分泌レベルを示す細胞表面の蛍光の平均強度は、右側の目盛の任意単位（ＡＵ）で白のバーとして表示される。２つの独立した集団を、Ｂ＋選択レジメン（Ｂ１＋、Ｂ２＋）について分析した。（Ｂ）パネルＡの細胞集団を、ＩｇＧの重鎖（Ｈｃ）と軽鎖（Ｌｃ）のｍＲＮＡレベルまたはビタミンＢ５トランスポーター（ＳＬＣ５Ａ６）のｍＲＮＡレベルについて分析した。
【図１３】［0019］図１３は、ピューロマイシンまたはビタミン枯渇を用いて選択された集団の免疫グロブリン分泌の安定性を示す。ピューロマイシンを用いて（Ａ＋）、またはビタミンＢ５欠乏によって（Ｂ＋）、選択された図８由来の多クローン細胞プールを、発現安定性試験のために、完全培地において維持し、１週間に２回継代した。１細胞あたりの１日あたりの分泌された抗体のピコグラム（ｐｃｄ）で表される細胞集団の比産生能（specific productivity）を１０週間にわたって各継代の後に測定した。
【図１４】［0020］図１４は、ピューロマイシンまたはビタミン枯渇を用いて選択された細胞集団の流加培養についての免疫グロブリン産生アッセイを示す。選択されたプールを流加培養で完全培地において増殖させ、３日目および６日目〜１０日目にフィードを加えた。サンプルを生細胞密度（ＶＣＤ）および生存率（生細胞の％、点線）について分析し（Ａ）、ダブルサンドイッチＥＬＩＳＡによって、分泌された抗体の力価について分析した（Ｂ）。
【図１５】［0021］図１５は、ＣＨＯ−Ｍの種々のビタミン遺伝子のコード配列（ＣＤＳ）を示す。
【図１６】［0022］図１６は、図１５のＣＨＯ−Ｍのビタミン遺伝子のアミノ酸配列を示す。
【図１７】［0023］図１７は、ＳＬＣ５Ａ６ナトリウム依存性マルチビタミントランスポーター（ＳＭＶＴ）の膜貫通領域についてのインシリコ予測を示す（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋのｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓのウェブサイトによって決定；２０１５年３月）。
【図１８】［0024］図１８は、ＳＬＣ５ａ６ビタミントランスポーター用の発現ベクター（右側）を同時にトランスフェクトして選択的ビタミン欠乏培養培地において細胞を培養することによって高発現細胞を選択するためのプロトコルを示す。ＣＨＯ細胞を、ＳＬＣ５ａ６発現ベクター無しで（条件Ａ）、あるいはＳＬＣ５ａ６発現ベクターと共に（条件ＢおよびＣ）、ＧＦＰ発現ベクターまたはＩｇＧの軽鎖と重鎖の発現ベクター、およびピューロマイシン耐性プラスミドで同時にトランスフェクトした。次に、ピューロマイシン存在下で（条件ＡおよびＢ）、あるいは制限ビタミン濃度（Ｂ５  １０−３×／Ｈ  １０−４×）を含むビタミン欠乏培養培地において培養することによって（条件Ｃ）、培養物を選択した。×の入った円は、ＳＬＣ５ａ６発現ベクターでトランスフェクトされていなかった細胞がビタミン欠乏培養培地における選択を生き延びなかったことを示すということに留意されたい。選択の後、得られた多クローン細胞プールのＦＡＣＳまたは免疫グロブリン分泌アッセイによる分析（図１９〜図２０）まで、または単クローン集団の生成および分析（図２０〜図２１）の間、細胞を非選択的培養培地において培養した。
【図１９】［0025］図１９は、図１８に示されるプロトコルに従ってトランスフェクトされたＧＦＰレポータータンパク質を発現する細胞の濃縮を示す。ＧＦＰの蛍光についての細胞蛍光測定による分析（Ａ）は、ビタミン欠乏に基づいた選択の後の高レベルの多クローン集団（丸で囲まれたＣ）を示した。多クローン細胞プールについて、ＧＦＰ陽性の蛍光細胞の濃縮（Ｂ）および細胞のＧＦＰ蛍光の幾何平均（Ｃ）を示す。
【図２０】［0026］図２０は、図１８に示されるプロトコルに従った、ビタミン欠乏に基づいた選択の後の多クローン集団における高レベルの（ＧＦＰではなく）治療用免疫グロブリンを発現する細胞の濃縮を示す。ビタミン欠乏によって選択された細胞（ラベルＣ）の産生レベルは、多クローン細胞プールレベルにおいて（パネルＡ）、および限界希釈により取得し無作為に選択した１０個の細胞クローンにおいて（パネルＢ）、より高い（図１８の説明文も参照のこと）。
【図２１】［0027］図２１は、ビタミン選択により取得したＩｇＧ産生クローンのうちの１つ（クローンＣ＿ａ）に対する細胞表面染色によって高レベルのＩｇＧ分泌（Ａ）を示し、２つのそのようなクローン（クローンＣ＿ａおよびクローンＣ＿ｂ）の産生の安定性（Ｂ）を示すとともに、流加培養条件における当該２つのクローンでは、並行して増殖させた以前に取得された高産生体参照用クローン（ＢＳ０３）に比べて、生細胞密度および産生レベルが高いこと（ＣおよびＤ）を示す。
【図２２】［0028］図２２は、様々な治療用タンパク質（１つは発現が容易な抗体（ＡおよびＢ）であり、１つは発現が困難なタンパク質（インターフェロンβ、パネルＣ）である）を発現する多クローン集団の選択（抗生物質による選択またはビタミン枯渇培地における培養による（「代謝性」）選択）を示す。これは、従来の抗生物質選択に比べて改善されたレベルで目的の治療用タンパク質を産生する細胞の選択のための選択システムの多用途性を示す。
【発明の概要】
【０００８】
［0029］  本発明は、
少なくとも１つの第１の調節配列の制御下にある、少なくとも１つのビタミン代謝関連タンパク質をコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドと、
少なくとも１つの第２の調節配列の制御下にある、少なくとも１つの制限酵素切断部位および／または少なくとも１つの目的産物をコードする少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドと、
を含む真核細胞発現系を目的とする。
［0030］
【０００９】
少なくとも１つのビタミン代謝関連タンパク質は、ビタミン輸送タンパク質であってよい。少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドは、前記少なくとも１つの制限酵素切断部位に挿入されてよい。ビタミン輸送タンパク質は、ビタミンＢ１、Ｂ５および／またはＨなどの可溶性ビタミンを輸送してよい。ビタミン輸送タンパク質は、ＴＨＴＲ−１（チアミントランスポーター−１）、ＴＨＴＲ−２（チアミントランスポーター−１）、ＴＰＣ（チアミンピロリン酸運搬体）、ＴＰＫ（チアミンピロホスホキナーゼ）および／または、特にＳＭＶＴ（ナトリウム依存性マルチビタミントランスポーター）であってよい。発現ベクターは、発現系を含んでよい。特に、１つのベクターが、前記少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドおよび前記少なくとも１つの第２のポリヌクレオチドを含んでよい。
【００１０】
［0031］第１および／または第２の調節配列は、プロモーター、エンハンサー、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）、足場付着領域（ＳＡＲ）、インスレーターエレメントおよび／または核マトリックス結合ＤＮＡ（nuclear matrix-associating DNA）であってよい。
【００１１】
［0032］  本発明はまた、本明細書に開示される真核細胞発現系（特に、１つ以上のベクター上の真核細胞発現系）を１つの容器に含み、前記系の使用法についての説明書を第２の容器に含むキットも目的とする。キットは、細胞培養培地、好ましくは制限濃度および／または飽和濃度の少なくとも１種のビタミン（ビタミンＢ１、Ｂ５および／またはＨなど）を有するもの、をさらに含んでよい。
【００１２】
［0033］  本発明はまた、
本明細書に記載される発現系を含む、および／または
ビタミン代謝関連タンパク質に優勢変異もしくは劣勢変異（up or down mutation）を有し、且つ、目的産物をコードするポリヌクレオチド（第２のポリヌクレオチド）、またはビタミン代謝関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を調節する調節配列、を有し、任意選択で、ビタミン代謝関連タンパク質は、当該細胞に本来備わっているものであってもよい、
組換え真核細胞も目的とする。当該細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であってよい。少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドは、変異していてよい／優勢変異または劣勢変異を含んでよい。ビタミン代謝関連タンパク質は、ビタミン代謝に干渉してよく、および／または細胞内のビタミンに結合してよい。ビタミン代謝関連タンパク質は、パントテン酸１、２および／もしくは３ならびに／またはチアミンピロリン酸キナーゼ（ＴＰＫ１（チアミンピロリン酸キナーゼ１）など）であってよい。
【００１３】
［0034］ビタミン代謝関連タンパク質は、前記組換え真核細胞のための選択マーカーであってよく、前記組換え真核細胞は、前記目的産物を産生してよく、好ましくは分泌してよい。
【００１４】
［0035］  本発明はまた、好ましくは多クローンであり、好ましくは（ｉ）選択マーカーとしてのビタミン輸送タンパク質と（ｉｉ）目的のタンパク質とを発現する、本明細書に開示される組換え真核細胞を含む真核細胞培養培地も目的とする。当該培地は、Ｂ５についての制限培地であってよいか、またはＢ５については飽和培地であるがＨについては制限培地であるものであってよい。
【００１５】
［0036］本発明はまた、組換え真核細胞を培養し、必要に応じて選択するための方法であって、
本明細書に開示されるような発現系を提供することと、
真核細胞を提供することであって、前記真核細胞の生存能、増殖および／または分裂がビタミンの取り込みに依存している、提供することと、
前記発現系を前記真核細胞に導入して、前記ビタミン代謝関連タンパク質および前記目的のタンパク質を発現する前記組換え真核細胞を作製することと、
細胞培養培地（例えば、Ｂ５についての制限培地、またはＢ５については飽和培地であるがＨについては制限培地もしくは非制限培地であるもの、またはＨについては飽和培地であるがＢ５については制限培地もしくは非制限培地であるもの）において前記真核細胞を培養することと、
必要に応じて、前記目的産物を安定に発現する前記組換え真核細胞を、好ましくは前記組換え真核細胞の表面上に発現される、前記ビタミン代謝関連タンパク質を介して選択することと、
を含む方法も目的とする。
【００１６】
［0037］  本明細書に開示されるような選択培地は、Ｂ５についての制限培地、またはＢ５については飽和培地であるがＨについては制限培地もしくは非制限培地であるもの、である可能性がある。
【００１７】
［0038］本発明はまた、目的産物を安定に発現する組換え真核細胞の選択のための選択マーカーとしてのビタミン代謝関連タンパク質およびそのＤＮＡコード配列の使用であって、前記細胞の生存能、増殖および／または分裂がビタミンの取り込みに依存していてよい、使用も目的とする。
【００１８】
［0039］本発明はまた、
１０ｎＭ未満の濃度で、および／または
２０μＭ超の濃度で、
少なくとも１種のビタミンを含む培養培地であって、前記少なくとも１種のビタミンが必須ビタミンである、培養培地も目的とする。
【００１９】
［0040］  少なくとも１種のビタミンは、ビタミンＢ１、Ｂ５および／またはＨであってよい。培養培地は、目的のタンパク質を発現する、好ましくは分泌する、１つ以上の組換え真核細胞を含んでよい。目的のタンパク質は、治療用タンパク質であってよい。細胞の増殖および／または分裂は停止されてよく、目的のタンパク質は、増殖が停止されない培地（好ましくは標準培地）において増殖させた場合に細胞によって発現されるタンパク質の最大レベル（ＭＬ、［ｇ／ｌ］）を超える停止時最大レベル（maximum arrested level）（ＭＡＬ、［ｇ／ｌ］）で産生されてよく、ここで、ＭＡＬは、ＭＬの１．５倍超、ＭＬの２倍超、またはＭＬの２．５倍超もしくは３倍超である。
【００２０】
［0041］本発明はまた、目的のタンパク質を生産する方法であって、
（ａ）本明細書に開示される発現系で真核細胞を形質転換して組換え真核細胞を作製することと、
（ｂ）組換え真核細胞の生存能および／または増殖または分裂が１種以上のビタミン代謝関連タンパク質の活性に依存している培養培地において前記組換え真核細胞を培養することと、
（ｃ）前記１種以上のビタミン代謝関連タンパク質を発現する組換え真核細胞を選択することであって、前記ビタミン代謝関連タンパク質は、好ましくは前記組換え真核細胞が単クローン細胞集団（単一の細胞に由来）の一部である場合に、選択された組換え真核細胞を取得するための選択マーカーである、選択することと、
（ｄ）前記選択された組換え真核細胞から、または前記選択された組換え真核細胞を含むその培養培地から、目的のタンパク質を精製することと、
を含む方法も目的とする。
【００２１】
［0042］ビタミン代謝関連タンパク質は、好ましくはビタミンＢ５、Ｂ１および／またはＨを輸送する、ビタミン輸送タンパク質であってよく、前記培養培地は、前記ビタミンのうちの１種以上について制限状態および／または飽和状態であってよい。ビタミン輸送タンパク質はＳＭＶＴであってよく、培養培地は、Ｂ５についての制限培地、またはＢ５については飽和培地であるがＨについては制限培地であるもの、であってよい。
【００２２】
［0043］本発明はまた、前記ＳＭＶＴタンパク質がＳｌｃ５ａ６遺伝子またはその派生体によってコードされ、かつ／または前記真核細胞が単クローン細胞集団の一部である、本明細書に開示される細胞、方法、系および発現ベクターも目的とする。
【００２３】
［0044］本発明はまた、より一般的には、ビタミン取り込み遺伝子と共発現された場合に真核細胞の厳密なビタミン要求性が形質転換細胞（特に、目的の遺伝子を高レベルで安定に発現する形質転換細胞）のための選択ツールとして使用され得るかどうかを評価することも目的とする。本発明はまた、より一般的には、ビタミン枯渇培養培地または富栄養培養培地を用いて、そのような細胞によるタンパク質産生をさらに改善できるかどうかを評価することも目的とする。
【００２４】
［0045］特定の一実施形態において、本発明は、組換えタンパク質生産の後期においてビタミンＢ５の利用可能性を減少させて細胞分裂を鈍化させ、それにより、バイオリアクターにおいて生産される治療用タンパク質のレベルを増加させることを目的とする。
【００２５】
［0046］他の特定の一実施形態において、本発明はまた、細胞（特にＣＨＯ−Ｍ細胞）内へのビタミンＢ５およびＨの両方の取り込みに関与するマルチビタミントランスポーターＳｌｃ５ａ６（ＳＭＶＴ）のクローニングと発現も目的とする。本発明はまた、Ｂ５制限培地において、非形質転換細胞と比較して、より速い増殖およびより高い生存能がもたらされるようにこのビタミントランスポーターを過剰発現する細胞も目的とする。本発明はまた、より高いレベルの組換えタンパク質産生を伴う細胞株を取得するために選択マーカーとしてＳＬＣ５Ａ６を共発現させることも目的とする。本発明はさらに、非枯渇培養培地においてさえ、より良好な細胞生存率をもたらすように、好ましくは治療用タンパク質のさらにいっそう好ましい発現レベルをもたらすように、細胞においてＳＬＣ５Ａ６を過剰発現させることを目的とする。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
［0047］様々な好ましい実施形態についての考察
定義
本発明に従う真核細胞発現系は、ＣＨＯ細胞（好ましくはＣＨＯ  Ｋ１細胞、好ましくはＣＨＯ−Ｍ細胞）などの真核細胞において目的の遺伝子の発現を可能にする要素を含む。一般的に、真核細胞発現系は、少なくとも１つの発現ベクターを含む。しかし、真核細胞発現系はまた、真核細胞のゲノムの一部であってもよい。系／発現ベクターは、発現系に組み込まれた導入遺伝子の効率的な転写を導く、プロモーター、エンハンサー、遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）、足場付着領域（ＳＡＲ）、インスレーターエレメントおよび／または核マトリックス結合ＤＮＡなどの調節配列を含む。本明細書で言及される任意の他の配列としてのこれらの調節配列は、異種性（すなわち、利用されている宿主細胞にとって外来性；例えば、利用されている宿主細胞とは異なる種に由来）であることが多く、あるいは、同種性（homologous）（すなわち、利用されている宿主細胞にとって内因性）ではあるが、細胞に本来備わっている任意の対応物とは異なったゲノム上の位置（複数可）に存在する（以下では「ヘテロ座位の（heterolocal）」と呼称される）。発現ベクターはまた、複製開始点を含んでもよい。
【００２７】
［0048］組換え真核細胞を作製するために、本発明に従う、少なくとも１つのビタミン代謝関連タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドおよび少なくとも１つの目的産物をコードする第２のポリヌクレオチドが真核細胞に加えられる。真核細胞に本来備わっている遺伝子またはタンパク質は細胞に加えられないが、いかなる形質転換とも無関係に細胞内に存在する。しかし、当業者であれば理解するように、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、本来備わっている遺伝子の複製物（ヘテロ座位の当該遺伝子の複製物）である可能性がある。多くの場合、野生型遺伝子のコードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）の一部または全てが本発明のポリヌクレオチド（少なくとも１つのビタミン代謝関連タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを含む）を構成することが好ましい。
【００２８】
［0049］プラスミドは、最も一般的に使用されるベクター形態であるため、本明細書で使用される場合、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用される。しかし、本発明は、限定されるものではないが同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損型のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）または転移ベクターを含め、発現ベクターのこのような他の形態を包含することが意図される。本明細書では、形質転換は、使用される手段またはベクターのタイプに関係なく、任意の細胞へのベクターＤＮＡの導入を指す。
【００２９】
［0050］  本明細書では「目的産物をコードするポリヌクレオチド」とも呼称される「目的の遺伝子」または「導入遺伝子」は、例えば、「目的のタンパク質（構造タンパク質または調節タンパク質）」をコードする。目的のタンパク質は、多くの場合、治療用タンパク質である。本明細書で使用される場合、「タンパク質」は一般に、約１０個超のアミノ酸を有するペプチドおよびポリペプチドを指す。タンパク質は、宿主にとって「同種性」（すなわち、利用されている宿主細胞にとって内因性）であってよく、あるいは、酵母によって産生されるヒトタンパク質など、「異種性」（すなわち、利用されている宿主細胞にとって外来性）であってよい。タンパク質は、細胞のペリプラズム空間もしくは細胞質における、または細胞外の培地における、不溶性の凝集体として、または可溶性タンパク質として、産生されてよい。治療用タンパク質の例としては、成長ホルモンもしくはエリスロポエチン（ＥＰＯ）などのホルモン、上皮成長因子などの成長因子、エンケファリンのような鎮痛物質、キモトリプシンのような酵素、受容体、または抗体（トラスツズマブモノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＧ））が挙げられる。可視化マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質）として通常使用される遺伝子も、好適な導入遺伝子である。導入遺伝子はまた、例えば、調節性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡなど）をコードしてもよい。同種性のタンパク質またはＲＮＡは、ヘテロ座位のポリヌクレオチドによって産生されてよい。多くの場合、野生型遺伝子のコードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）の一部または全てが本発明のポリヌクレオチド（少なくとも１つの目的産物をコードする第２のポリヌクレオチドを含む）を構成することが好ましい。
【００３０】
［0051］本発明に関連して使用される真核細胞には、限定されるものではないが、上述のＣＨＯ−Ｍ細胞（ＳＥＬＥＸＩＳ  ＳＡから入手可能）、および工業生産の規模でのタンパク質生産に好適な他の細胞、が包含される。これらの細胞は、当業者には周知であり、例えばＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓおよびＣｈｌｏｒｏｃｅｂｕｓ種に由来する。それぞれの細胞株は、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ細胞（サル腎臓（アフリカミドリザル）に由来する細胞株）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザルから抽出された腎臓上皮細胞）、Ｈｅｌａ細胞（この系統は、Ｈｅｎｒｉｅｔｔａ  Ｌａｃｋｓから採取された子宮頸癌細胞に由来した）、ＢＨＫ細胞（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＨＥＫ細胞（ヒト胎児由来腎臓）、ＮＳ０細胞（マウス骨髄腫細胞株）、Ｃ１２７細胞（非腫瘍形成性のマウス細胞株）、ＰｅｒＣ６．ＲＴＭ．細胞（ヒト細胞株、Ｃｒｕｃｅｌｌ）、ＣＡＰ細胞（ＣＥＶＥＣ’ｓ  Ａｍｎｉｏｃｙｔｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）およびＳｐ−２／０細胞（マウス骨髄腫細胞）として知られている。本発明に関連して使用される真核細胞はまた、例えば、骨髄細胞または幹細胞（胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞またはＥＳ細胞もしくはｉＰＳ細胞に由来する分化細胞など）に由来する細胞など、造血幹細胞を含むヒト初代細胞であってもよい。
【００３１】
［0052］本発明に従うビタミン代謝関連タンパク質は、細胞におけるビタミンの利用可能性または使用を低下させるか、または増大させる、タンパク質である。
【００３２】
［0053］  好ましいビタミン代謝関連タンパク質の１つは、一般的には膜結合タンパク質である、培養培地中の利用可能なビタミンを細胞内に輸送するビタミン輸送タンパク質である。表１は、「機能」という見出しの下に、これらのタンパク質の例を提示する。この表から分かるように、２種の細胞質のトランスポーターおよび１種のミトコンドリアのトランスポーター（ＳＬＣ１９Ａ２［配列番号２４］、ＳＬＣ１９Ａ３［配列番号２５］およびＳＬＣ２５Ａ１９［配列番号２７］）がビタミンＢ１について特徴付けられているのに対し、ただ１種の細胞質のトランスポーター（ナトリウム−マルチビタミントランスポーターＳＬＣ５Ａ６［配列番号２１］と呼称される）がＢ５ビタミンおよびＨビタミンの両方について特徴付けられている。
【００３３】
［0054］ビタミン代謝関連タンパク質の他の例としては、ＰＡＮＫ１［配列番号２２］、ＰＡＮＫ２［配列番号２３］およびＰＡＮＫ３［配列番号３５，３６］という遺伝子によってコードされるパントテン酸キナーゼ１、２または３、ならびにＴＰＫ１遺伝子［配列番号２６］によってコードされるＴＰＫ１（チアミンピロリン酸キナーゼ１）が挙げられる。パントテン酸キナーゼは、補酵素Ａ（ＣｏＡ）の生合成における重要な調節酵素であり、ホモ二量体のＴＰＫ１タンパク質は、チアミンのチアミンピロリン酸への変換を触媒する。当業者であれば容易に理解するように、ビタミン代謝に関与する他のタンパク質もまた、本発明の一部である。
【００３４】
［0055］  完全培養培地において増殖する細胞は、全てのビタミンを標準濃度で利用可能であろう。標準濃度は、本明細書では１×と呼称される。Ｂ１、Ｂ５およびＨについての標準濃度（１×）は、それぞれ７．５μＭ、２．５μＭおよび０．５μＭに設定された。Ｂ５は、ＣＨＯ細胞の場合に約１０−４×〜１０−３×（０．２５〜２．５ｎＭ）という増殖制限濃度範囲を有すると決定された一方で、１０−２×以上の濃度は、正常な培養増殖を可能にした。Ｂ１の制限濃度は、ＣＨＯ細胞の場合に１０−５×（１５ｐＭ）〜１０−４×（１５０ｐＭ）であると決定された一方で、Ｈについては、制限濃度は１０−５×（５ｐＭ）未満であった。
【００３５】
［0056］前記ビタミンの制限濃度を有する培地（制限培地または枯渇培地）において、濃度は、完全培地中に存在する各ビタミンの前記標準濃度（１×）に対して、１×未満（例えば、１０−１×、１０−２×、１０−３×、１０−４×、１０−５×）である。ビタミンの濃度は、濃度が標準参照用培地における濃度を超えれば、飽和しているとみなされる（本明細書では「飽和培地」とも呼称される）（例えば、完全培地中に見出される量の２×、３×、４×、５×または１０×）。
【００３６】
［0057］ビタミンの制限濃度および／または飽和濃度を有する細胞培養培地は、本発明の一部である。例えば、培地は、あるビタミンに関しては枯渇しているが別のビタミンに関しては飽和している可能性がある。
【００３７】
［0058］制限培地において、前記細胞の増殖および／または分裂が停止されてよく、目的のタンパク質が停止時最大レベル（「ＭＡＬ」、［ｇ／ｌ］）で産生されてよい。ＭＡＬは、それらの増殖が停止されない培地（標準培地など）において増殖させた場合に同種の細胞によって発現されるタンパク質の最大レベル（「ＭＬ」、［ｇ／ｌ］）を超えてよい。本発明の特定の実施形態において、ＭＡＬは、ＭＬの１．５倍超、ＭＬの２倍超、またはＭＬの２．５倍超もしくは３倍超である。例えば、標準培地において組換え細胞（組換えＣＨＯ細胞など）によって発現される抗体などの目的のタンパク質のＭＬは、約１ｇ／ｌのＩｇＧであるが、標準培地において組換え細胞（組換えＣＨＯ細胞など）によって発現される抗体などの目的のタンパク質のＭＡＬは、約３ｇ／ｌ超のＩｇＧである。
【００３８】
［0059］ビタミン輸送タンパク質を含め、ビタミン代謝関連タンパク質は、完全長の野生型タンパク質であってよく、または、点変異、置換、挿入、付加および／または末端もしくは内部の欠失もしくは逆位を含め、変異していてよい。ビタミン代謝関連タンパク質は、特定の配列と比べて、（ｉ）野生型タンパク質に相当する活性を有する変異（中立変異）を含んでよいが、ビタミン代謝関連／輸送タンパク質は、その変異が（ｉｉ）野生型タンパク質と比較して変化した活性／安定性をもたらす場合、本発明の文脈では、変異していると呼称され、当該変化した活性／安定性には、（例えば、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超または１００％超）増加した活性（「優勢変異」）または（例えば、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満または１００％未満）減少した活性／安定性（「劣勢変異」）が包含される。特定の変異が優勢変異または劣勢変異であるか否かは、当技術分野で利用可能な標準的アッセイによって容易に評価できる。変異したビタミン代謝関連タンパク質は、ビタミン代謝関連タンパク質をコードする少なくとも１つの第１のポリヌクレオチドにおける変異に起因する。同様に、前記第１のポリペプチドの発現を調節する配列における変異は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、前記第１のポリペプチドの発現を調節する配列が当該変異を含まない場合よりも（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または５０％超）多くまたは安定に発現される場合、優勢変異と呼称される。前記第１のポリペプチドの発現を調節する配列における変異は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、前記第１のポリペプチドの発現を調節する配列が当該変異を含まない場合よりも（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または５０％未満）、第１のポリヌクレオチドよりも、少なくまたは不安定に発現される場合、劣勢変異と呼称される。第１のポリペプチドの発現を調節する配列における優勢変異はまた、前記ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現レベルまたは安定性を増加させるためのエンハンサー配列およびプロモーター配列に加えてＭＡＲ、ＳＡＲ、ＬＣＲおよび／またはインスレーターエレメントの付加に該当してもよい。
【００３９】
［0060］ポリペプチドにおける所望の改変または変異は、当技術分野で公知の任意の技術を用いて達成されてよい。そのような変化をタンパク質配列に導入するための組換えＤＮＡ技術は、当技術分野で周知である。特定の実施形態において、改変は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその発現を調節する配列（上記で定義されるような調節配列）の部位特異的変異誘発によってなされる。変異を導入するための他の技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；専門書Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｎｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）で説明されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４０】
［0061］特に、細胞に固有のプロモーターおよび他の調節配列における劣勢変異は周知である。この変異は、プロモーター領域に対する転写因子の親和性を低下させ、転写速度を低下させる。しかし、プロモーター領域における変異はまた、中立変異であってもよいか、または優勢変異をもたらしてもよい。
【００４１】
［0062］本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびタンパク質の配列（特に図１５および図１６に開示されるもの）と５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超または９９％超の配列同一性を有するポリヌクレオチドおよびタンパク質も、単独で、あるいは本明細書に開示される任意の系（例えば、ベクターおよび細胞）、方法およびキットの一部として、本発明の一部である。図１５は特に、それぞれの遺伝子のＣＤＳ（コードＤＮＡ配列）を示し、従って、遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡの、それぞれのタンパク質／アミノ酸配列（図１６を参照のこと）をコードするエキソンから構成される部分を示す。本発明のポリヌクレオチドは、任意の野生型配列と少なくとも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、または１０ヌクレオチド以上、異なってよい。多くの場合、それぞれの遺伝子またはｃＤＮＡのＣＤＳから構成されるポリヌクレオチドが好ましい。
【００４２】
［0063］配列同一性なる用語は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度を指す。一般に、配列は、最上位の一致が得られるように整列される。「同一性」それ自体は、当技術分野で認識される意味を有し、公開されている技術を用いて算出できる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照のこと）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列間の同一性を測定するための方法はいくつか存在するが、「同一性」なる用語は、当業者には周知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ  ４８：１０７３（１９８８））。
【００４３】
［0064］任意の特定の核酸分子が、例えば、ＳＭＴＶの核酸配列［配列番号２１］またはその一部と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、最初の配列アライメントのためのＤＮＡｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｂｒｕｎｏ，  Ｃａｌｉｆ．）とその後の多重配列アライメントのためのＥＳＥＥ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０  ＤＮＡ／ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｃａｂｏｔ＠ｔｒｏｇ．ｍｂｂ．ｓｆｕ．ｃａ）など、公知のコンピュータプログラムを用いて従来通りに決定できる。
【００４４】
［0065］アミノ酸配列が、例えば配列番号２８またはその一部と少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、ＢＥＳＴＦＩＴ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．  ５３７１１）など、公知のコンピュータプログラムを用いて従来通りに決定できる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズム（local homology algorithm）を使用して、２つの配列間の相同性の最良のセグメントを見出す。
【００４５】
［0066］ＤＮＡｓｉｓ、ＥＳＥＥ、ＢＥＳＴＦＩＴまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、本発明に従う参照用配列と９５％同一であるかどうかを決定する場合、同一性のパーセンテージが参照用の核酸またはアミノ酸の配列の全長にわたって算出されるように、および参照用配列中のヌクレオチドの総数の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメータが設定される。
【００４６】
［0067］本発明に従う組換え真核細胞は、上記で定義されるような導入遺伝子を含む真核細胞である。
【００４７】
［0068］本発明に従う必須ビタミンは、細胞の増殖、分裂および／または生存能に必要とされるビタミンである。
【００４８】
［0069］発現系は一般に、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された真核細胞（宿主細胞）の選択を促進する選択マーカー遺伝子を含む。この遺伝子によって発現される選択マーカー（または「選択マーカータンパク質」）は、多くの場合、抗生物質耐性に基づく。例えば、ピューロマイシン耐性選択用発現カセットを使用して、ピューロマイシンの添加により、当該カセットでの形質転換が成功した細胞を特定できる。しかし、抗生物質に対するいかなる耐性も伴わない選択も可能である。この種の選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）である。選択は、例えば代謝産物（例えば、ＤＨＦＲについてはグリシン、ヒポキサンチンおよびチミジン、ならびにＧＳについてはグルタミン）の不在下で、起こる。選択を生き延びた細胞は、細胞のゲノム中に１コピー以上の形質転換プラスミドを含む。本発明に関しては、ビタミン代謝関連タンパク質／ビタミン輸送タンパク質は、単独で、あるいは他の選択マーカーと共に、選択マーカーとして働いてよい。従って、その最も単純な形態では、１種のビタミンが欠乏している培地において、それぞれのビタミン輸送タンパク質を選択マーカーとして発現する組換え真核細胞は、それぞれのビタミン輸送タンパク質を発現しない細胞よりも良好に増殖できる。しかし、本明細書で考察されるように、標準培地においてさえ、ビタミン輸送タンパク質は、増殖上の利点をもたらし、従って、選択マーカーとして使用できる。本発明の発現系は、例えば抗生物質耐性に基づく選択マーカー遺伝子に加えて、ビタミン代謝関連タンパク質（複数可）／ビタミン輸送タンパク質（複数可）を選択マーカーとして含んでよい。
【００４９】
［0070］同様に、前記第１のポリペプチドの発現を調節する配列における変異は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、前記第１のポリペプチドの発現を調節する配列が当該変異を含まない場合よりも（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または５０％超）多く発現されるか安定である場合、優勢変異と呼称される。前記第１のポリペプチドの発現を調節する配列における変異は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、第１のポリヌクレオチドよりも少なく発現されるか、前記第１のポリペプチドの発現を調節する配列が当該変異を含まない場合よりも（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または５０％未満）不安定である場合、劣勢変異と呼称される。
【００５０】
［0071］ポリペプチドにおける所望の改変または変異は、当技術分野で公知の任意の技術を用いて達成されてよい。そのような変化をタンパク質配列に導入するための組換えＤＮＡ技術は、当技術分野で周知である。特定の実施形態において、改変は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはその発現を調節する配列（上記で定義されるような調節配列）の部位特異的変異誘発によってなされる。変異を導入するための他の技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；専門書Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｎｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）で説明されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５１】
［0072］特に、細胞に固有のプロモーターおよび他の調節配列における劣勢変異は周知である。この変異は、プロモーター領域に対する転写因子の親和性を低下させ、転写速度を低下させる。プロモーター領域における変異は、中立変異であってよく、劣勢変異または優勢変異をもたらしてよい。同様に、例えば、ビタミン輸送タンパク質などのビタミン代謝関連タンパク質の遺伝子における変異は、中立変異であってよく、劣勢変異または優勢変異であってよい。
【００５２】
［0073］  １．ＣＨＯ細胞の増殖および組換えタンパク質の発現に対するビタミン輸送の制限の影響
培養される哺乳動物細胞によるビタミンの利用の最初のステップは、培養培地からのそれらの細胞内への取り込みである。ビタミンＢ１（チアミン）、Ｂ５（パントテン酸）およびＨ（Ｂ８またはビオチン）は、細胞質に輸送されてからミトコンドリア内に輸送される可溶性ビタミンであり、ミトコンドリアにおいてそれらは代謝補因子として働く（図１）。２種の細胞質のトランスポーターおよび１種のミトコンドリアのトランスポーター（ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１９Ａ３およびＳＬＣ２５Ａ１９）がＢ１について特徴付けられているのに対し、ただ１種の細胞質のトランスポーター（ナトリウム−マルチビタミントランスポーターＳＬＣ５Ａ６と呼称される）がＢ５ビタミンおよびＨビタミンの両方について特徴付けられている（表１）。
【００５３】
［0074］
【表１】
0006767991.tif 000002
【００５４】
［0075］１．１．増殖を制限するビタミン濃度の決定
細胞増殖に対するビタミン濃度の制限の影響を評価するために、特にビタミンＢ１、Ｂ５およびＨを枯渇させた細胞培養培地（Ｂ−ＣＤｍｉｎと呼称される）を、市販の増殖培地（ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ、ＩＲＶＩＮＥ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＩＮＣ）から得た。Ｂ−ＣＤｍｉｎ培地に播種されたＣＨＯ−Ｍ細胞は、予想通り、細胞分裂を維持できなかった（図２Ａ）。時間と共に細胞のサイズが低下し、このビタミン欠乏培地における６日間の培養の後に、細胞は生存能を失い始めた（図２Ｂ）。次に、一般に使用される完全培地に見出されるような公知の量のビタミン（Ｂ１、Ｂ５およびＨの標準濃度（１×）をそれぞれ７．５μＭ、２．５μＭおよび０．５μＭに設定）でＢ−ＣＤｍｉｎ培地を補完した（表２）。Ｂ５だけが欠乏した培養培地では、Ｂ−ＣＤｍｉｎ培地の場合のように、細胞が分裂せず、６日後に生存能が低下した（図２Ａおよび図２Ｂ）。Ｂ１またはＨのいずれかを枯渇させた場合、細胞は、それぞれ３〜６日間、分裂できたが、但し、Ｈを枯渇させた培地では、完全培地と比較して、培養増殖が全体的に低下した。従って、我々は、Ｂ５が短期間で細胞増殖を最も制限する可能性があると結論付けた。これは、細胞分裂を維持するには培養培地中にＢ５が連続的に存在しなければならないためである。
【００５５】
［0076］
【表２】
0006767991.tif 000003
【００５６】
［0077］低濃度の各ビタミンで別々に枯渇Ｂ−ＣＤｍｉｎ培地を補完して、ＣＨＯ−Ｍの増殖を制限する濃度範囲を決定した。Ｂ５は、ＣＨＯ−Ｍの増殖に必須であり、増殖制限濃度範囲は約１０−４×〜１０−３×（０．２５〜２．５ｎＭ）であったが、１０−２×以上の濃度は正常な培養増殖を可能にした（図３および示されていないデータ）。Ｂ１の制限濃度が１０−５×（１５ｐＭ）〜１０−４×（１５０ｐＭ）に観察されたのに対し、Ｈの場合には、制限濃度は１０−５×（５ｐＭ）未満であった。興味深いことに、低濃度（１０−５×）のＨの存在下では細胞密度が、完全培地で観察される細胞密度よりも僅かに高かった。Ｂ５ビタミンおよびＨビタミンは両方とも、細胞内に入るのに同じトランスポーターを利用するため、およびＢ５は細胞増殖を最も制限するため、Ｈの濃度を飽和レベル未満にまで減少させたことで、Ｂ５に対するトランスポーターの利用可能性が増加した可能性があり、これによりＢ５が、完全培地で増殖させた細胞と比較して、より高い細胞内レベルに達することが可能になる可能性がある。
【００５７】
［0078］１．２．タンパク質の発現および修飾に対する、増殖を制限するＢ５ビタミン濃度の影響
次に、スピンチューブバイオリアクター内で維持される流加培養を用いて、Ｂ５の枯渇時に観察される増殖停止を利用してタンパク質産生条件において細胞分裂を妨げるか鈍化させタンパク質産生をできる限り増加させることができるかどうかを評価した。治療用タンパク質を発現するＣＨＯ−Ｍ由来細胞クローンは、完全培地において増殖させた場合に、８日目まで細胞数の増加を示し、その後、これらの培養条件で通常観察されるように、細胞生存率および生細胞数が低下した（図４）。しかし、ビタミン制限条件では、細胞数は７日目からプラトーに達し、高い細胞生存率が１４日目まで維持された。これは、Ｂ５が増殖制限の要因となる前の限られた回数の細胞分裂のために、培地と自身に内在するＢ５の細胞内プールとに由来する限定的なビタミン利用可能性を細胞が利用したということを示す。
【００５８】
［0079］  細胞培養上清中に分泌された抗体の力価は、完全培地での培養において９日目まで、３ｇ／Ｌまで増加し、その後、上記の細胞生存率の低下（図４）から予想されるように、減少した（図５）。しかし、ビタミン枯渇培地を用いて実施された培養の１５日目まで抗体は蓄積し続け、この場合、抗体は６ｇ／Ｌ超のレベルに達した（図５）。全体的に見て、我々は、ビタミンの欠乏を利用してバイオリアクター内で細胞の増殖を停止させ、細胞の生存能と抗体分泌の持続期間を延長し、従って、非常に高い治療用抗体の力価をもたらすことができると結論付けた。このアプローチは、組換えタンパク質生産を改善するために一般的に適用できる可能性がある。
【００５９】
［0080］１．３．細胞増殖に対するＢ５ビタミン輸送の増加の影響
Ｂ５の欠乏により、共通のトランスポーターに関してＢ５と競合できる高濃度のＨにより、あるいは共通のトランスポーターに関してＨと競合できる高濃度のＢ５により、細胞増殖を阻害できるという発見に基づいて、共通するＳｌｃ５ａ６トランスポーターの過剰発現は、細胞に増殖上の利点をもたらす可能性がある、および／または、より高い生細胞密度をもたらす可能性がある、という仮説が立てられた。従って、我々は、表１に示されるようなマルチビタミンＳｌｃ５ａ６トランスポーターおよび他のビタミンＢ１トランスポーターをコードするＣＨＯ−ＭのｃＤＮＡをクローニングし、強力なＧＡＰＤＨプロモーターとＭＡＲ １−６８エピジェネティックアクティベーターエレメントの制御下となるように、それらをピューロマイシン耐性選択用発現カセットの隣に挿入した。このＳｌｃ５ａ６のコンストラクト、ＧＦＰ発現ベクターおよびピューロマイシン選択用プラスミドでＣＨＯ−Ｍ細胞を同時形質転換し、その後、ピューロマイシン耐性細胞の選択によって安定な多クローン集団を得た。量を増加させた発現ベクターで形質転換されたＣＨＯ−Ｍ細胞の集団では、内因性の発現レベルと比較して、最大で１００倍高いＳｌｃ５ａ６転写物の蓄積が観察された（図６）。
【００６０】
［0081］次に、ＳＬＣ５Ａ６を過剰発現する細胞集団を、様々な濃度のＢ５およびＨを追加したＢ−ＣＤｍｉｎ培地においてピューロマイシン選択無しで増殖させた。上記と同様に、Ｂ５非存在下では、トランスポーターの過剰発現またはビタミンＨの存在とは無関係に、６日間の培養の後に細胞分裂がほぼ停止した（図７）。しかし、トランスポーター発現プラスミドで形質転換された細胞は、Ｂ５の制限条件（１０−３×）および低いＨ（１０−４×）では、有意により高い密度に達した。１００ｎｇのトランスポーター発現ベクターで同時形質転換された細胞で最大の増殖が観察された（図７）。これは、トランスポーターの最適な発現レベルが達成されたことを示唆する。
【００６１】
［0082］興味深いことに、少量のＨの存在下においてＢ５を１０×過剰で加えた場合（１０× Ｂ５；１０−４× Ｈ）、非形質転換細胞の増殖は、完全培地（１× Ｂ５；１０−４× Ｈ）におけるこれらの細胞の培養と比べて、強く阻害された。しかし、最も高いトランスポーターレベルを発現する細胞は、過剰のＢ５の存在下（１０× Ｂ５；１０−４× Ｈ）において、より低いレベルでトランスポーターを発現する細胞よりも有意に多く増殖した。これは、共通のトランスポーターについてのこれら２種のビタミンの競合の発生をさらに示し、ここで、飽和濃度のＢ５は、トランスポーターが過剰発現されない限り、培養培地中の少量のＨの取り込みを阻害し、従って増殖を制限する可能性がある。全体的に見て、ＳＬＣ５Ａ６トランスポーターの過剰発現は制限濃度のＢ５の存在下で、あるいは逆に飽和濃度のＢ５の存在下であるが制限量のＨの場合に、増殖上の利点をもたらすことができると結論付けられた。従って、これは、増加した量のトランスポーターを発現する細胞を、より低いレベルでトランスポーターを発現する細胞から識別するために使用され得る、という仮説が立てられた。
【００６２】
［0083］２．形質転換細胞のための選択マーカーとしてのＳＬＣ５Ａ６（ＳＭＶＴ）トランスポーターの発現の使用
同時形質転換されたＧＦＰベクターからの発現を定量化して、Ｓｌｃ５ａ６トランスポーターの同時形質転換が全体的な導入遺伝子の発現レベルを増加させたかどうかを決定した。そのゲノム中にプラスミドが組み込まれており導入遺伝子を安定に発現する細胞を、Ｂ５制限培地における培養によって、あるいはピューロマイシンの存在下で、選択した。Ｂ５欠乏による選択の後に、まず、ＧＦＰを発現する蛍光細胞のパーセンテージならびに細胞の蛍光強度を評価した。制限量のＢ５（１０−３×）の存在下で選択すると、２５０ｎｇのＳＬＣ５Ａ６発現プラスミドで細胞を同時形質転換した場合に、ＧＦＰ陽性細胞と平均蛍光レベルの両方が最も高い割合で得られた（図８）。より多いプラスミド量（１０００ｎｇ）のＳｌｃ５ａ６ベクターの形質転換は、同様の数のＧＦＰ陽性細胞および僅かに低い蛍光をもたらしたが、より少ないプラスミド量（５０ｎｇ）では、定量に十分なだけの細胞が得られなかった。これにより、少量のＳＬＣ５Ａ６プラスミドを、より多い量の、目的のタンパク質を発現するコンストラクトと共に同時形質転換することによって、このビタミントランスポーター遺伝子の同時形質転換を安定な形質転換のための選択マーカーとして使用できるということが示された（表３）。少量のＳＬＣ５Ａ６プラスミドは、典型的には、１０００ｎｇ、２５０ｎｇ、１００ｎｇまたは１００ｎｇ未満である（例えば、図６、図８および図９を参照のこと）。表３に示されるように、目的のタンパク質を発現するコンストラクトのより多い量は、ビタミン代謝関連タンパク質発現ベクターの量の２倍超〜１５倍超の範囲（３倍超、４倍超、５倍超、６倍超、７倍超、８倍超、９倍超、１０倍超、１１倍超、１２倍超、１３倍超または１４倍超を含む）であってよい。ビタミンＢ１輸送のｃＤＮＡを用いて同様の実験を行うと、Ｂ５はビタミンＢ１よりも制限的であるという事実から予想されるように、あまり好ましくない結果が得られた（データは示さず）。
【００６３】
［0084］
【表３】
0006767991.tif 000004
【００６４】
［0085］Ｂ５を非制限濃度で含む培地においてピューロマイシンによって細胞を選択すると、予想通り、Ｓｌｃ５ａ６の発現とは無関係にＧＦＰ蛍光細胞が得られた。それにもかかわらず、蛍光の最も高い細胞は、多くの場合、２５０ｎｇのＳｌｃ５ａ６発現ベクターの同時形質転換の時に得られた（データは示さず）。これにより、ビタミントランスポーターが非制限培養培地においてさえ、より高いレベルでビタミントランスポーターを発現する細胞に選択上の利点をもたらす可能性があるということが示された。ピューロマイシン選択の後、ビタミンＢ５制限培地においてさらに培養すると、ＳＬＣ５ａ６トランスポーターを過剰発現する細胞の大部分において、非常に高い発現レベルが観察された（図９Ａ）。ＧＦＰ発現細胞（図９Ａのゲート１）または高発現細胞（図９Ａのゲート２）の総パーセンタイルの定量化により、Ｂ５枯渇培地あるいは過剰量のＢ５において細胞を選択する場合には１００または２５０ｎｇのＳｌｃ５ａ６発現プラスミドの形質転換の後に８０％超の細胞が非常に高いレベルでＧＦＰを発現するということが明らかになった（図９Ｂ）。ＧＦＰの発現レベルはまた、ピューロマイシン選択の後にビタミンＢ５選択を行うと、ピューロマイシン選択だけを行う場合と比較して、２倍超増加した（０ｎｇ Ｓｌｃ５ａ６および１× Ｂ５、１０−４× Ｈを１００もしくは２５０ｎｇ ＳＬＣ５Ａ６および１０×Ｂ５；１０−４× Ｈまたは１０−３× Ｂ５；１０−４× Ｈと比較されたい、図９Ｃ）。全体的に見て、これにより、最も高い導入遺伝子の発現レベルを媒介する細胞を優先的に選択するために抗生物質選択と組み合わせてＳｌｃ５ａ６およびビタミンを介した選択を用いることもできるということが示された。
【００６５】
［0086］治療用組換えタンパク質、すなわちトラスツズマブモノクローナル免疫グロブリン（ＩｇＧ）、をコードする導入遺伝子の発現のために、このアプローチを追求した。Ｓｌｃ５ａ６および免疫グロブリン軽鎖の両方をコードするプラスミドとピューロマイシン耐性マーカーおよび免疫グロブリン重鎖を発現する別のベクターとで細胞を同時形質転換した。次に、Ｂ５欠乏またはピューロマイシン処理についての様々なレジメンの下で細胞を選択し（図１０）、分泌されたトラスツズマブＩｇＧを、抗ＩｇＧ蛍光抗体を用いた細胞表面染色によって検出した。
【００６６】
［0087］まず、選択条件のうちのいずれが、流加培養の上清中に最も高いＩｇＧ分泌レベルを示す多クローン細胞集団をもたらすかを評価した。ピューロマイシンだけで選択された細胞は、最も低いレベルの分泌ＩｇＧをもたらした（Ａ＋条件、図１１）。ビタミンＢ５欠乏（Ｂ１＋）により、またはビタミン欠乏に続く最少培地におけるピューロマイシンの添加（Ｂ１Ｄ＋およびＢ２Ｄ＋）により、選択された細胞は、比較的高いＩｇＧレベルをもたらした。ピューロマイシンに続くビタミンＢ５欠乏で選択された細胞は、中程度のＩｇＧ力価をもたらした。ビタミン枯渇に加えてピューロマイシン選択を行ってもＢ５欠乏だけによる選択と比べて有意な増加が得られなかったことを考慮して（図１１、Ｂ１Ｄ＋をＢ１＋と比較されたい）、次の焦点は、ピューロマイシンで選択された細胞を対照として用いる、ビタミン欠乏だけによって選択された細胞の分析に置かれた。
【００６７】
［0088］ビタミン欠乏を用いて選択された多クローン細胞プールの場合に、ＩｇＧを発現する細胞の最も高い割合（８０〜９０％の範囲）および細胞表面の蛍光の最も高いレベルが観察された（図１２Ａ、Ｂ＋条件）。ビタミンＢ５選択の時に、ＩｇＧの重鎖と軽鎖のｍＲＮＡの、高いが釣り合いのとれたレベルが得られ、選択を目的として発現されたＳｌｃ５ａ６トランスポーターのｍＲＮＡレベルはＩｇＧのｍＲＮＡレベルと比べてかなり低いことが見出された（図１２Ｂ）。ＩｇＧの分泌速度は、ビタミン欠乏によって選択された多クローン集団では抗生物質選択と比較して約３倍高いことが見出され、免疫グロブリンの発現は、最も高いレベルで免疫グロブリンが分泌される場合でも、非選択的完全培地における長期培養時に安定であることが見出された（図１３）。完全培養培地を用いた流加培養において、これらの多クローン細胞集団を評価すると、ビタミン欠乏によって選択された集団では８ｇ／Ｌを超える力価が得られたのに対し、ピューロマイシン選択から得られた力価は２ｇ／Ｌであった（図１４）。従って、ビタミン欠乏およびＳＬＣ５ａ６の過剰発現に基づいた多クローン集団の選択は、最も産生能の高い単クローン集団の退屈で時間のかかる選別および選択の後に時折得られるに過ぎないＩｇＧ蓄積の範囲にある、並外れて高いタンパク質力価をもたらした。
【００６８】
［0089］細胞選択のプロセスの例を図１８に示す。ＳＬＣ５ａ６発現ベクター無し（条件Ａ）またはＳＬＣ５ａ６発現ベクター有り（条件ＢおよびＣ）で、ＧＦＰまたはＩｇＧ軽鎖／重鎖のプラスミドおよびピューロマイシン耐性と共にＣＨＯ細胞を同時にトランスフェクトし、その後、ピューロマイシンの存在下で（条件ＡおよびＢ）、あるいは制限ビタミン濃度（Ｂ５  １０−３×／Ｈ  １０−４×）を含むビタミン欠乏培養培地において（条件Ｃ）、培養物を選択した。×の入った円は、ＳＬＣ５ａ６発現ベクターでトランスフェクトされていなかった細胞がビタミン欠乏培養培地における選択を生き延びなかったことを示す。見て取れるように、ここで使用されたＧＦＰプラスミドはＭＡＲ配列も含んだ。選択の後、得られた多クローン細胞プールのＦＡＣＳまたは免疫グロブリン分泌アッセイによる分析（図１９〜図２０）まで、または単クローン集団の生成および分析（図２０〜図２１）の間、細胞を非選択的培養培地において培養した。
【００６９】
［0090］図１８に示されるプロセスにおいて得られたＧＦＰを発現する多クローン細胞集団を非選択的培地において９日間培養し、分析した（図１９）。ＧＦＰの蛍光についての細胞蛍光測定による分析によって、Ｓｌｃ５ａ６、ＧＦＰおよびピューロマイシン耐性（ｐｕｒｏ）の発現プラスミドで同時にトランスフェクトされ、ピューロマイシンと共に培養することにより（条件ＡおよびＢ、図１８を参照のこと）、またはビタミン欠乏培養培地において培養することにより（条件Ｃ）、選択された安定な多クローン細胞集団に由来する全てのＧＦＰ＋細胞およびＧＦＰ高発現細胞の濃縮を表すＦＡＣＳ蛍光プロファイルを得た。図１９のパネルＡに示されるようにゲート分けされた細胞から、全てのＧＦＰ陽性細胞および高蛍光細胞の、細胞の割合および平均蛍光を決定した。ＧＦＰ陽性蛍光細胞の濃縮が図１９のＢに示されており、多クローン細胞プールについて、細胞のＧＦＰ蛍光の幾何平均が示されている（図１９Ｃ）。見て取れるように、ＳＬＣ５ａ６発現ベクターでトランスフェクトした細胞のＢ５選択は、ＧＦＰ高発現細胞の間でのＧＦＰ蛍光細胞の有意な濃縮（図１９Ｂ）およびＧＦＰ蛍光の幾何平均の有意な増加をもたらした。
【００７０】
［0091］図２０では、ピューロマイシンまたはビタミン欠乏を用いて選択された細胞集団の免疫グロブリン比産生能が示されている。図２０Ａでは、治療用ＩｇＧを発現する細胞の全多クローンプールが、図１８の条件Ａ、ＢおよびＣについて示された通りに得られ、ＩｇＧの比産生能がアッセイされた。比産生能は、１細胞あたりの１日あたりの分泌された抗体のピコグラム（ＰＣＤ）で示されている（データは、３つの独立した生物学的実験の結果である。２つのアスタリスク：Ｐ＜０．０５、片側等分散Ｔ検定）。図２０Ｂは、選択条件ＢおよびＣから得られた細胞集団の限界希釈によって無作為に単離された１０個のクローンを用いて得られた結果を示し、ＩｇＧ比産生能が決定された。ここでもやはり、条件Ｃの下での細胞培養物の比産生能は、条件Ｂの下での細胞培養物の比産生能よりも有意に高かった。
【００７１】
［0092］選択された細胞クローンをさらに分析した。特に、ビタミン欠乏を用いて選択された（図１８および図２０の条件Ｃ）ＳＬＣ５Ａ６および治療用ＩｇＧを発現する多クローン細胞プールの限界希釈によって得られた２つのクローン（Ｃ＿ａおよびＣ＿ｂ）を分析した。ＩｇＧに対する蛍光抗体と共にインキュベートすることにより、細胞表面に提示される分泌されたＩｇＧを標識し、図２１Ａに示されるように細胞蛍光測定によって細胞を分析した。最初の多クローン細胞プールＣおよびそれに由来するクローンＣ＿ａの蛍光プロファイルを比較のために示す。図２１Ｂでは、ビタミン枯渇を用いて選択された２つの単クローン集団の免疫グロブリンの発現の安定性が示されている。Ｃ＿ａクローンおよびＣ＿ｂクローンを３０日間、非選択的完全培地において維持し、１週間に２回継代した。１細胞あたりの１日あたりの分泌された抗体のピコグラム（ＰＣＤ）で表した、これらの細胞集団の比産生能を、表示される時間にアッセイした。見て取れるように、クローンは、高い安定性を示した（３０日間、非選択的完全培地において維持し、１週間に２回継代した場合、ＰＣＤレベルは元のレベルから多くても５０％、多くても４０％、多くても３０％、多くても２０％、または多くても１０％もしくは５％、減少する）。図２１Ｃおよび図２１Ｄは、クローンＣ＿ａおよびクローンＣ＿ｂの流加培養の免疫グロブリン産生アッセイを示す。流加培養で完全培地においてこれらのクローンを増殖させ、３日目、６日目、８日目および１０日目にフィードを加えた。生細胞密度について（図２１Ｃ）、および分泌された抗体の力価（ダブルサンドイッチＥＬＩＳＡによる）について（図２１Ｄ）、サンプルを分析した。ＩｇＧを高発現するＢＳ０３クローンおよびトランスフェクトされていない親ＣＨＯ−Ｍ細胞を参照用として用いた。見て取れるように、両方のクローンが、ＩｇＧを高発現するＢＳ０３クローンと比べて良好な性能を示した。
【００７２】
［0093］図２２は、ＳＬＣ５ａ６の同時トランスフェクションおよびビタミン欠乏による選択による、様々な組換えタンパク質を高レベルで産生する細胞集団の選択の実例である。ピューロマイシン選択（「抗生物質」）あるいはビタミン枯渇培地における培養による選択（「代謝性」）の後の、発現が容易なＩｇＧ、すなわちハーセプチン、を発現する細胞の多クローン集団の流加培養から得られた力価を図２２Ａに示す。図２２Ｂでは、コロニーイメージングによる、ハーセプチンを発現する細胞のパーセンテージならびに平均分泌レベルの決定が示されている。抗生物質添加またはビタミン欠乏によって選択された、発現が困難なタンパク質、すなわちインターフェロンβ、を産生する多クローン細胞集団から得られた力価を図２２Ｃに示す。見て取れるように、特に、ビタミン欠乏によって選択された、発現が困難なタンパク質、ここではインターフェロンβ、を産生する多クローン細胞集団から得られた力価は、抗生物質添加によって選択された場合の力価を３〜５倍上回った。
【００７３】
［0094］例えば図１および表１に示されるような、他のビタミン代謝関連遺伝子が同様の目的で過剰発現され得るということが当業者には明らかであろう。Ｂ５およびＳｌｃ５ａ６の場合に得られた結果が例として本明細書に示されているが、他のビタミン（例えばＢ１）のためのトランスポーターの利用または他のビタミンＢ５代謝関連遺伝子（例えばＰＡＮＫ、表１を参照のこと）の利用も可能であり、本発明の範囲内に属する。
【００７４】
［0095］  同様に、さらにいっそう強力な選択特性を有する細胞株を生成するために、より低いレベルでトランスポーターおよび他の遺伝子を発現するように宿主細胞を操作できる。最後に、本研究で使用されたようなビタミンＢ１、Ｂ５もしくはＨまたはそれらの組み合わせを欠乏させた細胞培養培地の使用は、図１４の場合のように１種以上のビタミン代謝関連遺伝子を過剰発現するように細胞が操作されているかどうかにかかわらず、さらには、図５で例示されているようにビタミン遺伝子の発現レベルが改変されていない細胞を用いる場合に、細胞の産生レベルを増加させるために使用され得る一般的なアプローチである。例えばバイオリアクターにおいてＣＨＯ−Ｍ細胞などの培養細胞株を用いてインビトロで、さらには、遺伝子療法または細胞療法のための、ならびに再生医療のための、ヒト細胞などの初代細胞を用いてインビボで、高レベルの治療用タンパク質を生産するためにこのアプローチを使用できるということも当業者には明らかであろうし、本発明の範囲内に属するであろう。
【００７５】
［0096］以上より、選択マーカーとしてビタミン代謝関連タンパク質を発現するコード配列を用いて、均一で非常に高いレベルにて組換えタンパク質を産生する細胞の多クローン集団または単クローン集団を得ることができるということが示される。流加培養バイオリアクターの産生条件の間のビタミン欠乏を用いて細胞クローンの生存能および分泌される組換え治療用タンパク質の力価に関してのそれらの産生能を改善できるということが示された。興味深いことに、これらの効果は、例えばＢ５ビタミンまたはＨビタミンのレベルを低下させることにより、さらには、これらのビタミンのうちの１種のレベルを飽和レベルよりも高くした場合に、得られた。後者の効果は、少量のビタミンＨの存在下で増殖させた際に、通常のレベルを上回るＢ５濃度の上昇が、ＳＬＣ５ａ６選択遺伝子を高レベルで発現する細胞の選択を可能にする場合に認められた。従って、ビタミン濃度の増加によって、または同じ膜トランスポーターを利用する２種のビタミンの相対的レベルを変化させることによって、最適な選択レジメンを設計することもできる。従って、本明細書に記載されるアプローチは、より高く安定なレベルにまで目的のタンパク質を産生する細胞クローンの選択および特定、従ってスクリーニングにかかる時間と労力の低減、ならびに細胞の起源またはビタミン遺伝子の操作とは無関係にタンパク質の産生レベルおよび細胞生存率を増加させること、に関して高い価値がある。
【００７６】
［0097］材料および方法
ビタミン遺伝子の配列およびＤＮＡベクターコンストラクト
ビタミンのゲノム上の配列およびｃＤＮＡの配列を、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴソフトウェアを用いたマウスにおける相同遺伝子ＳＣＬ５Ａ６、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１９Ａ３、ＴＰＫ１、ＳＬＣ２５Ａ１９のアライメントの後に決定した。対応する遺伝子の転写物の配列および蓄積を、ＳＥＬＥＸＩＳ  ＣＨＯ−Ｍ遺伝子発現データベース（SELEXIS CHO-M gene expression database）を用いて決定した。ＣＤＳ（コードＤＮＡ配列）およびタンパク質の配列をそれぞれ図１５および図１６に列挙する。
【００７７】
［0098］Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  ＩＩおよびランダムプライマー（Ｇｏｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＰＲＯＭＥＧＡ）を使用して、１０６個のＣＨＯ−Ｍ細胞から単離（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）  ＲＮＡ  ｋｉｔ；Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）された全ＲＮＡ１μｇから逆転写によってＣＨＯ−Ｍ（ＳＵＲＥ  ＣＨＯ−Ｍ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ（商標）（ＳＥＬＥＸＩＳ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＳＡ））のｃＤＮＡライブラリを増幅した。
【００７８】
［0099］ビタミンのコード配列（ＣＤＳ）をｐＧＡＰＤＨ−ＭＡＲ  １−６８−ＧＦＰベクターに、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を切り出してビタミンのＣＤＳと置き換えることによってクローニングした。ベクターは以下のように構築した：制限部位（ＳＣＬ５Ａ６についてはＨｉｎＩＩＩ／ＸｂａＩ、ＳＬＣ１９Ａ２についてはＨｉｎＩＩＩ／ＦｓｅＩ、ＳＬＣ１９Ａ３についてはＮｃｏＩ／ＸｂａＩ、ＴＰＫ１についてはＨｉｎＩＩＩ／ＸｂａＩ、ＳＬＣ２５Ａ１９についてはＨｉｎＩＩＩ／ＸｂａＩ）を保持するプライマー（表４）を用いてＣＨＯ−ＭのｃＤＮＡライブラリからＰＣＲ（ＰＨＵＳＩＯＮ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ，ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）によってＡＴＧからＳｔｏｐまでＣＤＳを増幅した。次に、対応する制限酵素によってｃＤＮＡ産物およびｐＧＡＰＤＨベクターを二重消化した。最後に、同じ制限酵素による消化の後にＧＦＰの配列が切り出されたｐＧＡＰＤＨ−ＭＡＲ  １−６８ベクターにｃＤＮＡを連結した。
【００７９】
［0100］
【表４】
0006767991.tif 000005
【００８０】
［0101］ｐＧＡＰＤＨ−ＭＡＲ  １−６８−ＧＦＰベクターは以前に説明された（Ｇｉｒｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｈａｒｔ  ａｎｄ  Ｌａｅｍｍｌｉ，１９９８；Ｇｒａｎｄｊｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。その後ろにサルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル、ヒトガストリンターミネーターおよびＳＶ４０エンハンサーが続くコード配列の上流のヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーおよびヒトグリセルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターから構成される真核細胞用発現カセット（Ｌｅ  Ｆｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を用いてＧＦＰタンパク質を発現させた。
【００８１】
ｐＳＶ−ｐｕｒｏベクターは、ｐＲｃ／ＲＳＶプラスミド（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ／ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）に由来するＳＶ４０プロモーターの制御下にあるピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ）を含む。
【００８２】
［0102］免疫グロブリン発現ベクターである１−６８  ｆｉｌｌｅｄ−ＩｇＧ１−Ｌｃおよび１−６８  ｆｉｌｌｅｄ−ＩｇＧ１−Ｈｃは以前に説明された通りであった。
【００８３】
［0103］細胞培養、安定な形質転換および安定な多クローン系統の分析
Ｌ−グルタミン（ＰＡＡ、オーストリア）およびＨＴ補助剤（HT supplement）（ＧＩＢＣＯ，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）を追加したＳＦＭ４ＣＨＯ−Ｍ  Ｈｙｃｌｏｎｅ無血清培地（ＳＦＭ、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））における浮遊培養で浮遊チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｍ）を加湿空気中で３７μＣ、５％ＣＯ２にて維持した。これらの実験のために使用された他の細胞培地は、ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ−Ｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ（Ｂ−ＣＤｆｕｌｌ；Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および、ビタミンＢ１（チアミン塩酸塩；ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ）、ビタミンＢ５（ＤＬ−パントテン酸カルシウム；ＴＣＩ）およびビタミンＨ（ビオチン、ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ）を追加したＤｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＢａｌａｎＣＤ  ＣＨＯ−Ｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ（Ｂ−ＣＤｍｉｎ；Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。
【００８４】
［0104］製造業者の推奨に従ったエレクトロポレーション（ＮＥＯＮＤＥＶＩＣＥＳ，ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）によりＣＨＯ−Ｍ細胞を、ＰｖｕＩで消化したＳＬＣ５Ａ６、ＧＦＰ、ピューロマイシン、ＩｇＧ１−ＨｃまたはＩｇＧ１−Ｌｃの発現ベクター（表３のベクターミックスを参照のこと）で形質転換した。
【００８５】
［0105］さらなる実験のために、Ｓｌｃ５ａ６とＧＦＰまたはＩｇＧとを発現する、ＧＦＰおよびＩｇＧ１を産生する細胞の多クローン系統を以下のように選択した：形質転換の１日前に細胞を、７．５μＭのＢ１（１×）、２５０ｎＭのＢ５（１０−３×）および５μＭのＨ（１０−４×）を追加したＢ−ＣＤｍｉｎ培地であるＢ５選択培地において３０００００細胞／ｍｌに増殖させた。形質転換後、そのまま細胞を２４ウェルプレート中でＢ５選択培地と共に２４時間インキュベートし、その後、実験に応じていくつかのウェルに移した。ピューロマイシン選択については、細胞を２週間、１０ｍｇ／ｍｌのピューロマイシンを追加したＳＦＭ培地に播種し、その後、ＳＦＭ培地を含むウェルに５日間移した後、ＳＦＭ培地を含む５０ｍｌのスピンチューブに移した。
【００８６】
［0106］Ｂ５選択については、細胞を７〜９日間、Ｂ５選択培地に播種し、その後、ピューロマイシン選択の場合と同様にＳＦＭ非選択的培地に移した。
【００８７】
［0107］ピューロマイシンおよびその後のＢ５による細胞の二重選択については、まずピューロマイシンで多クローン性の安定な細胞株を選択した後、細胞を７日間、２４ウェルプレートにおいてＢ５選択培地中に２００００細胞／ｍｌで播種し（陰性対照としてＢ−ＣＤｆｕｌｌ培地を使用した）、その後、ＳＦＭ完全培地のウェルに７日間移した後、ＳＦＭ培地を含むピンチューブ（pin tube）に播種した。
【００８８】
［0108］蛍光細胞のパーセンテージおよびＧＦＰ陽性細胞の蛍光強度は、ＣｙＡｎ  ＡＤＰフローサイトメーター（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いたＦＡＣＳ分析によって決定した。細胞培養上清中の免疫グロブリン濃度は、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。Ｓｌｃ５ａ６、ＧＦＰ、ＩｇＧ１ＬｃおよびＩｇＧ１Ｈｃの転写物の蓄積は、分析前にＲＴ−定量ＰＣＲアッセイによって確認された。表面染色、ＩｇＧ力価および限界希釈は、Ｌｅ  Ｆｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）に従って実施した。
【００８９】
［0109］定量ＰＣＲ分析
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析については、１０６個の細胞から全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ＩｎｃのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ−Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｋｉｔおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ならびに表４に列挙されるプライマー（Ｓｌｃ５ａ６−ｑＲＴ−ＦおよびＳｌｃ５ａ６−ｑＲＴ−Ｒ）を用いたｑＰＣＲによって転写物の蓄積を定量化した。転写物のレベルをＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子のものに対して標準化した。
【００９０】
［0110］統計分析
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。統計分析は、両側スチューデントｔ検定を用いて行った。図のパネル中のアスタリスクは、統計的確率を示す。０．０５未満の統計的確率の値は、有意とみなされる。
【００９１】
［0111］本発明の系（ベクター／細胞等）、方法およびキットは、様々な実施形態の形に組み込むことができ、そのうちのほんのいくつかが本明細書に開示されているということが理解されるであろう。他の実施形態が存在し、これらが本発明の趣旨から逸脱しないということが当業者には明らかであろう。従って、記載された実施形態は例示的なものであり、限定するものとして解釈されるべきではない。
【００９２】
［0112］文献
【表５】
0006767991.tif 000006
0006767991.tif 000007
【図１】
0006767991.tif 000008
【図２Ａ】
0006767991.tif 000009
【図２Ｂ】
0006767991.tif 000010
【図３】
0006767991.tif 000011
【図４】
0006767991.tif 000012
【図５】
0006767991.tif 000013
【図６】
0006767991.tif 000014
【図７】
0006767991.tif 000015
【図８】
0006767991.tif 000016
【図９Ａ】
0006767991.tif 000017
【図９Ｂ】
0006767991.tif 000018
【図９Ｃ】
0006767991.tif 000019
【図１０】
0006767991.tif 000020
【図１１】
0006767991.tif 000021
【図１２】
0006767991.tif 000022
【図１３】
0006767991.tif 000023
【図１４】
0006767991.tif 000024
【図１５−１】
0006767991.tif 000025
【図１５−２】
0006767991.tif 000026
【図１５−３】
0006767991.tif 000027
【図１５−４】
0006767991.tif 000028
【図１５−５】
0006767991.tif 000029
【図１６−１】
0006767991.tif 000030
【図１６−２】
0006767991.tif 000031
【図１６−３】
0006767991.tif 000032
【図１７】
0006767991.tif 000033
【図１８】
0006767991.tif 000034
【図１９】
0006767991.tif 000035
【図２０】
0006767991.tif 000036
【図２１−１】
0006767991.tif 000037
【図２１−２】
0006767991.tif 000038
【図２２−１】
0006767991.tif 000039
【図２２−２】
0006767991.tif 000040
【配列表】
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