(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＴＬＡに結合する抗体であって、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、配列番号１９のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２５のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号２８のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）、および配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ＢＴＬＡに結合する抗体であって、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、配列番号２０のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２６のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号２９のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項５】
配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）、および配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項４または５に記載の抗体。
【請求項７】
ＢＴＬＡに結合する抗体であって、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１、配列番号２７のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２、および配列番号３０のアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含む、抗体。
【請求項８】
配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、および配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖（ＨＣ）、および配列番号１０のアミノ酸配列を有する軽鎖（ＬＣ）を含む、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体と、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１１】
治療で使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
リウマチ、神経、または皮膚疾患の治療において使用するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記リウマチ疾患が、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、または関節リウマチである、請求項１２に記載の抗体または医薬組成物。
【請求項１４】
前記皮膚疾患が、アトピー性皮膚炎または乾癬である、請求項１２に記載の抗体または医薬組成物。
【請求項１５】
前記神経疾患が多発性硬化症である、請求項１２に記載の抗体または医薬組成物。
【請求項１６】
配列番号１、２、５、６、９、または１０のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、ＤＮＡ分子。
【請求項１７】
請求項１６のＤＮＡ分子を含む、哺乳動物細胞。
【請求項１８】
抗体を産生するための方法であって、ａ）前記抗体が発現されるような条件下で請求項１７に記載の哺乳動物細胞を培養すること、次いでｂ）前記発現した抗体を回収することを含む方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法によって得られる抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に属する。より具体的には、本発明は、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）に対する抗体およびその医薬組成物に関する。本発明の抗体は、ループスなどの自己免疫疾患の治療に有用であると期待される。
【背景技術】
【０００２】
ループスは、皮膚、口腔、筋肉および関節、心臓、末梢血、肺、腎臓、生殖器、ならびにＣＮＳの症状を含む不均一な特徴を有する自己免疫疾患である。ループス患者は、重篤で生命を脅かす心血管疾患、腎疾患、および精神神経疾患のリスクがある。標準治療には、多くの好ましくないかつ／または危険な副作用を有する多数のステロイドが含まれる。疾患を管理し、ステロイド使用の低減または排除を可能にする治療法が必要である。
【０００３】
ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ；ＣＤ２７２）は、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーであり、免疫細胞の活性化を負に調節するチェックポイント受容体のファミリーの一部である。ＢＴＬＡは、主にＢ細胞、Ｔ細胞、および樹状細胞に発現する。ＢＴＬＡの天然リガンドは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであるヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ；ＴＮＦＲＳＦ１４）である。
【０００４】
ヒトＨＶＥＭ−Ｆｃは、フローサイトメトリーによって検出された１１２ｎＭのＫＤで、２９３Ｔ細胞に発現されたヒトＢＴＬＡに結合することが報告されている。（Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔ．１３，２００５，１０２：３７；１３２１８−１３２２３）。ＢＴＬＡへのＨＶＥＭの結合は、ＢＴＬＡの細胞質ドメイン上の２つの保存された免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフドメインのチロシンリン酸化をもたらす。このリン酸化は、２つのＳｒｃホモロジー２ドメインを介して、正の細胞受容体シグナル伝達（例えば、Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体シグナル伝達カスケード）を脱リン酸化および下方制御することにより、ＢＴＬＡの阻害活性に影響を与えるタンパク質チロシンホスファターゼの動員につながり、したがって、免疫細胞の活性化の抑制につながる。ループス様疾患を自然発症する傾向があるマウスモデル（ＭＲＬ−ｌｐｒマウス）では、ＢＴＬＡ欠損マウスは、ＢＴＬＡ発現マウスと比較して、唾液腺、肺、膵臓、腎臓、および関節において、より重篤なリンパ球浸潤を有する。したがって、ＢＴＬＡアゴニスト抗体は、ループスなどの自己免疫疾患を有する患者に利益を提供し得る。
【０００５】
ＢＴＬＡに対するアゴニスト抗体は当技術分野で既知である。例えば、米国特許第８，５６３，６９４号（‘６９４特許）は、ＢＴＬＡへのＨＶＥＭの結合をブロックする（Ｍａｂ２１Ｈ６およびＭａｂ１９Ａ７）か、またはブロックしない（Ｍａｂ８Ｄ５およびＭａｂ８Ａ３）ＢＴＬＡアゴニスト抗体を開示している。‘６９４特許は、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ結合を可能にしながら、リンパ球応答におけるＢＴＬＡの阻害的役割を活用する治療を開発する継続的な必要性を記載している。しかしながら、自己免疫疾患の治療のためのＨＶＥＭのＢＴＬＡへの結合を模倣するＢＴＬＡアゴニスト抗体を欠いている。抗体がＨＶＥＭの結合部位と著しく重複するエピトープを有し、抗体とＨＶＥＭとの間に構造的類似性がある場合、抗体はＢＴＬＡへのＨＶＥＭ結合を「模倣」する。また、ヒトＢＴＬＡと結合し、マウスおよびカニクイザルモデルなどの自己免疫疾患のインビボ前臨床モデルを研究するのに役立つＢＴＬＡアゴニスト抗体を欠いている。したがって、代替的なＢＴＬＡアゴニスト抗体の必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の抗体は、代替的なＢＴＬＡアゴニスト抗体の提供を探求する。そのようなＢＴＬＡアゴニスト抗体は、ループスなどの自己免疫疾患の治療に有用であり得る。そのようなＢＴＬＡアゴニスト抗体は、ヒト、カニクイザル、および／またはマウスＢＴＬＡなどの複数の種からのＢＴＬＡに結合することができる。加えて、そのようなＢＴＬＡアゴニスト抗体は、Ｍａｂ８Ｄ５と同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体と比較して、インビトロ活性の増加を示す。本発明の抗体は、これらの望ましい特徴のうちの少なくとも１つを保有する。
【０００７】
そのようなＢＴＬＡアゴニスト抗体の１つは、ヒト、カニクイザル、およびマウスのＢＴＬＡに結合することができる。驚くべきことに、この抗体は、ＢＴＬＡへのＨＶＥＭ結合を模倣するため、この所望の交差反応性を有する。この抗体はまた、ＢＴＬＡを結合するＨＶＥＭと比較して、ＢＴＬＡへのより高い結合親和性を有する。これは、一時的なレベルのＨＶＥＭを有する疾患状態を有する患者に利益を提供し得、患者がＨＶＥＭの低減を有する時間中にＢＴＬＡ模倣アゴニスト抗体を有することが望ましい場合がある。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、ＢＴＬＡと結合し、ＢＴＬＡ媒介シグナル伝達を活性化および／または増強する抗体（ＢＴＬＡアゴニスト抗体）を提供する。本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む抗体を提供し、ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＣＤＲ  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２２であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２５であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２８であり、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１３であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１６であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号１９である。一実施形態では、抗体はＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含み、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号４であり、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号３である。別の実施形態では、抗体は軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、ＬＣのアミノ酸配列は配列番号２であり、ＨＣのアミノ酸配列は配列番号１である。さらに別の実施形態では、抗体は２つのＬＣおよび２つのＨＣを含み、各ＬＣのアミノ酸配列は配列番号２であり、各ＨＣのアミノ酸配列は配列番号１である。
【０００９】
本発明はまた、ＢＴＬＡアゴニスト抗体を提供し、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２３であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２６であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２９であり、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１４であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１７であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２０である。一実施形態では、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号８であり、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号７である。別の実施形態では、ＬＣのアミノ酸配列は配列番号６であり、ＨＣのアミノ酸配列は配列番号５である。さらに別の実施形態では、抗体は２つのＬＣおよび２つのＨＣを含み、各ＬＣのアミノ酸配列は配列番号６であり、各ＨＣのアミノ酸配列は配列番号５である。
【００１０】
本発明はまた、ＢＴＬＡアゴニスト抗体を提供し、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２４であり、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号２７であり、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号３０であり、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号１５であり、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号１８であり、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号２１である。一実施形態では、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号１２であり、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号１１である。別の実施形態では、ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０であり、ＨＣのアミノ酸配列は配列番号９である。さらに別の実施形態では、抗体は２つのＬＣおよび２つのＨＣを含み、各ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１０であり、各ＨＣのアミノ酸配列は配列番号９である。
【００１１】
本発明はまた、ＢＴＬＡに結合する抗体を提供し、抗体は、ウサギをヒトＢＴＬＡのＦｃタグ付き細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ドメインで免疫し、ヒトおよびマウスＢＴＬＡ−Ｆｃタグ付きタンパク質で追加免疫することを含むステップにより生成される。ヒトＢＴＬＡ  ＥＣＤのアミノ酸配列は、配列番号３１のアミノ酸３１〜１５０である。
【００１２】
本発明は、ＢＴＬＡへのＨＶＥＭ結合を模倣するＢＴＬＡアゴニスト抗体を提供する。本発明はまた、ヒト、カニクイザル、およびマウスのＢＴＬＡに結合することができるＢＴＬＡアゴニスト抗体を提供する。
【００１３】
本発明はまた、本発明の抗体および１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの１つまたはそれ以上の治療に使用することができ、そのような治療は、それを必要とする患者に、有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む。いくつかの特定の実施形態では、リウマチ疾患は、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチの少なくとも１つである。他の特定の実施形態では、皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも１つである。他の特定の実施形態では、神経疾患は多発性硬化症である。
【００１４】
本発明はまた、リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの１つまたはそれ以上を有する患者を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の本発明の抗体を投与することを含む、方法を提供する。いくつかのそのような実施形態では、リウマチ疾患は、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチの少なくとも１つである。他の特定の実施形態では、皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも１つである。他の特定の実施形態では、神経疾患は多発性硬化症である。
【００１５】
本発明はまた、治療で使用するための本発明の抗体またはその医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの１つまたはそれ以上の治療に使用するための本発明の抗体またはその医薬組成物を提供する。いくつかのそのような実施形態では、リウマチ疾患は、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチの少なくとも１つである。他の特定の実施形態では、皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも１つである。他の特定の実施形態では、神経疾患は多発性硬化症である。
【００１６】
本発明はまた、リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの１つまたはそれ以上の治療のための薬剤の製造における、本発明の抗体またはその医薬組成物の使用を提供する。いくつかのそのような実施形態では、リウマチ疾患は、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、および関節リウマチの少なくとも１つである。他の特定の実施形態では、皮膚疾患は、アトピー性皮膚炎および乾癬のうちの少なくとも１つである。他の特定の実施形態では、神経疾患は多発性硬化症である。
【００１７】
本発明は、配列番号１、配列番号５、または配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。本発明はまた、配列番号２、配列番号６、または配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００１８】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。本発明はまた、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、および配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号３５であり、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号３６である。
【００１９】
本発明はまた、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。本発明はまた、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、および配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号３７であり、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号３８である。
【００２０】
本発明はまた、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、かつ配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。本発明はまた、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。特定の実施形態では、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号３９であり、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は配列番号４０である。
【００２１】
さらに、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子と、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子とを含む哺乳動物細胞を提供する。本発明はまた、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子含む哺乳動物細胞を提供する。本発明はまた、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子含む哺乳動物細胞を提供する。一実施形態では、哺乳動物細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）またはハムスター胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株である。
【００２２】
本発明はまた、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、および／または配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供し、細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号２のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗体を発現することができる。好ましくは、哺乳動物細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、哺乳動物細胞株は、ＣＨＯまたはＨＥＫ細胞株である。
【００２３】
本発明はまた、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、および／または配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供し、細胞は、配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗体を発現することができる。好ましくは、哺乳動物細胞は、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、哺乳動物細胞株は、ＣＨＯまたはＨＥＫ細胞株である。
【００２４】
本発明はまた、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、および／または配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供し、細胞は、配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＣおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗体を発現することができる。好ましくは、哺乳動物細胞は、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む。一実施形態では、哺乳動物細胞株は、ＣＨＯまたはＨＥＫ細胞株である。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬＣおよび配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣを含む抗体を産生するための方法を提供し、方法は、抗体が発現されるような条件下で、配列番号２のアミノ酸配列を有するＬＣおよび／または配列番号１のアミノ酸配列を有するＨＣをコードするＤＮＡを含む哺乳動物細胞を培養することと、発現した抗体を回収することとを含む。本発明は、直前に記載された本発明の方法によって得られる抗体を含む。
【００２６】
本発明はまた、配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣおよび配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣを含む抗体を産生するための方法を提供し、方法は、抗体が発現されるような条件下で、配列番号６のアミノ酸配列を有するＬＣおよび／または配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣをコードするＤＮＡを含む哺乳動物細胞を培養することと、発現した抗体を回収することとを含む。本発明は、直前に記載された本発明の方法によって得られる抗体を含む。
【００２７】
本発明はまた、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣおよび配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＣを含む抗体を産生するための方法を提供し、方法は、抗体が発現されるような条件下で、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣおよび／または配列番号９のアミノ酸配列を有するＨＣをコードするＤＮＡを含む哺乳動物細胞を培養することと、発現した抗体を回収することとを含む。本発明は、直前に記載された本発明の方法によって得られる抗体を含む。
【００２８】
本発明は、抗体が２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む、抗体を産生するための方法を含み、２つのＨＣのそれぞれのアミノ配列は配列番号１であり、２つのＬＣのそれぞれのアミノ酸配列は配列番号２であり、その方法は、ａ）抗体が発現されるような条件下で、上記の本発明の哺乳動物細胞を培養することと、ｂ）発現された抗体を回収することとを含む。本発明は、直前に記載された本発明の方法によって得られる抗体を含む。
【００２９】
本発明はまた、抗体が２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む、抗体を産生するための方法を含み、２つのＨＣのそれぞれのアミノ配列は配列番号５であり、２つのＬＣのそれぞれのアミノ酸配列は配列番号６であり、その方法は、ａ）抗体が発現されるような条件下で、上記の本発明の哺乳動物細胞を培養することと、ｂ）発現された抗体を回収することとを含む。本発明は、直前に記載された本発明の方法によって得られる抗体を含む。
【００３０】
本発明はまた、抗体が２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む、抗体を産生するための方法を含み、２つのＨＣのそれぞれのアミノ配列は配列番号９であり、２つのＬＣのそれぞれのアミノ酸配列は配列番号１０であり、その方法は、ａ）抗体が発現されるような条件下で、上記の本発明の哺乳動物細胞を培養することと、ｂ）発現された抗体を回収することとを含む。本発明は、直前に記載された本発明の方法によって得られる抗体を含む。
【００３１】
本発明は、配列番号３１の以下の残基：４２位のＡｒｇおよび１２７位のＨｉｓを有する構造的および機能的エピトープでヒトＢＴＬＡと接触する抗体を提供する。本発明はまた、配列番号３１によって定められるアミノ酸配列の４２位のＡｒｇを含む構造的および機能的エピトープでヒトＢＴＬＡと接触する抗体を提供する。
【００３２】
本発明は、配列番号３１の以下の残基：３５位のＡｓｐ、３７位のＧｌｎ、４２位のＡｒｇ、７４位のＬｅｕ、７６位のＧｌｙ、７９位のＣｙｓ、１１４位のＡｒｇ、１１９位のＰｈｅ、１２０位のＧｌｎ、１２２位のＡｓｎ、１２８位のＳｅｒを有する新規構造的エピトープでヒトＢＴＬＡと接触する抗体を提供する。好ましい実施形態では、抗体２２Ｂ３のＨＣＤＲ３はＨＶＥＭと構造的に類似しているため、抗体２２Ｂ３はＢＴＬＡへのＨＶＥＭ結合を模倣すると言われている。好ましくは、ＢＴＬＡ：抗体の結晶構造がＰｙＭＯＬ（商標）などのプログラムでＢＴＬＡ：ＨＶＥＭの結晶構造と整列している場合、抗体のＣＤＲループは、アミノ酸残基６９〜７２（配列番号４１のアミノ酸ＥＬＴＧ）を含むＨＶＥＭループに類似している構造を採用する。
【００３３】
本発明は、配列番号３１の５２位のＡｓｐを有する機能的エピトープでヒトＢＴＬＡと接触する抗体を提供する。抗体は、配列番号３１の以下の残基：４６位のＨｉｓ、５５位のＧｌｕ、１０３位のＧｌｕ、１０４位のＰｒｏ、１０６位のＬｅｕ、１０７位のＰｒｏ、１３４位のＴｈｒ、１３９位のＡｌａを有する新規構造的エピトープと接触する。
【００３４】
本発明は、配列番号３１の６８位にＨｉｓおよび８１位にＬｙｓを有する機能的エピトープでヒトＢＴＬＡと接触する抗体を提供する。一実施形態では、抗体は、配列番号３１の以下の残基：６２位のＴｙｒ、６４位のＡｌａ、６８位のＨｉｓ、８５位のＡｒｇ、９１位のＧｌｕ、９８位のＰｈｅ、１１８位のＡｓｎを有する新規構造的エピトープと接触する。
【００３５】
本発明は、配列番号３１の以下の残基：３５位のＡｓｐ、３７位のＧｌｎ、４２位のＡｒｇ、７４位のＬｅｕ、７６位のＧｌｙ、７９位のＣｙｓ、１１４位のＡｒｇ、１１９位のＰｈｅ、１２０位のＧｌｎ、１２２位のＡｓｎ、１２４位のＩｌｅ、１２８位のＳｅｒを有する新規構造的エピトープでヒトＢＴＬＡと接触する抗体を提供する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された２つのＨＣおよび２つのＬＣを含む免疫グロブリン分子である。各ＬＣおよびＨＣのアミノ末端部分は、中に含まれるＣＤＲによる抗原認識を主に担う約１００〜１２０個のアミノ酸の可変領域を含む。ＣＤＲには、フレーム領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存された領域が散在している。各ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲは、以下のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で、アミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。ＬＣの３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と呼ばれ、ＨＣの３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原と特異的相互作用を形成する残基の大部分を含む。つまり、ＣＤＲは、抗原の残基と接触している（４．５Å以内）残基の大部分を含む。したがって、特定の抗原と結合する抗体の機能的能力は、６つのＣＤＲ内のアミノ酸残基によって大きく影響される。本発明の抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知のＫａｂａｔ番号付け規則（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２−９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））、およびＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ．Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１−１７．Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ，Ｌｅｓｋ  ＡＭ，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  Ａ，Ｌｅｖｉｔｔ  Ｍ，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ  ＳＪ，Ａｉｒ  Ｇ，Ｓｈｅｒｉｆｆ  Ｓ，Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ，Ｄａｖｉｅｓ  Ｄ，Ｔｕｌｉｐ  ＷＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７−８３）に基づく。ＨＣＤＲ１の開始アミノ酸残基はＣｈｏｔｈｉａによって定義され、ＨＣＤＲ１の終了アミノ酸残基はＫａｂａｔによって定義される。ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の開始および終了アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔによって定義される。
【００３７】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、構造的エピトープ（抗体の可変領域と接触している抗原の部位）および／または機能的エピトープ（抗体の可変領域と接触していてもしていなくてもよく、抗体結合に必要な抗原の部位）を指してもよい。構造的エピトープは、結合したＦａｂ上の別の残基の４．５Å以内にあるヒトＢＴＬＡ上の任意の残基が接触部位であるとみなされるＸ線結晶学によって決定される。
【００３８】
本発明の抗体は、既知の方法を用いて調製および精製することができる。例えば、ＨＣ（例えば、配列番号１によって定められるアミノ酸配列）およびＬＣ（例えば、配列番号２によって示されるアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ配列は、クローン化して、ＧＳ（グルタミンシンセターゼ）発現ベクター中に操作され得る。次いで、操作された免疫グロブリン発現ベクターを、ＣＨＯ細胞中に安定してトランスフェクトすることができる。当業者であれば理解されるように、抗体の哺乳動物発現は、典型的には、Ｆｃ領域の高度に保存されたＮ−グリコシル化部位でのグリコシル化をもたらすであろう。安定なクローンは、ＢＴＬＡに特異的に結合する抗体の発現について確認することができる。陽性クローンは、バイオリアクターにおける抗体産生のために無血清培地中で増殖させることができる。抗体が分泌された培地は、従来の技術によって精製され得る。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水のような適合する緩衝液で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  ＡまたはＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラムに便利に適用され得る。カラムを洗浄して、非特異的結合構成成分を除去する。結合した抗体は、例えばｐＨ勾配により溶出され、抗体分画は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって検出され、その後プールされる。抗体は、一般的な技法を用いて濃縮および／または滅菌濾過され得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技法によって効率的に除去することができる。生成物は、例えば−７０℃で直ちに凍結させてもよく、または凍結乾燥させてもよい。
【００３９】
本発明の抗体は、当技術分野で周知の方法によって調製することができ、本発明の抗体および１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物に組み込むことができる。
【００４０】
有効量の本発明の抗体を含む医薬組成物は、親経路（例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または経皮）により、本明細書に記載の疾患または障害のリスクがある、またはそれを示す患者に投与することができる。「有効量」とは、所望の治療結果を達成するために必要な量（投与量および期間および投与手段において）を指す。有効量の抗体は、個人の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個人における所望の応答を誘発する抗体の能力などの要因に応じて変動し得る。有効量はまた、本発明の抗体の任意の毒性効果または有害効果よりも治療的に有益な効果が上回る量である。
【００４１】
本発明の抗体は、患者の治療に使用することができる。より具体的には、本発明の抗体は、リウマチ、神経、および皮膚疾患のうちの１つまたはそれ以上を治療することが期待される。リウマチ疾患は、人の関節、筋肉、および／または臓器に影響を与え得る炎症によって特徴付けられる。そのようなリウマチ疾患の１つは、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
【００４２】
本明細書で交換可能に使用される場合、「治療」および／または「治療すること」および／または「治療する」は、本明細書に記載される障害の進行の緩徐化、妨害、抑止、制御、停止、または逆転が存在し得る全ての方法を指すことが意図されるが、全ての障害の症状の完全な消失を必ずしも示さない。治療は、ＢＴＬＡ活性の増加から利益を得るヒトの疾患または状態の治療のための本発明の抗体の投与を含み、（ａ）疾患のさらなる進行を阻害すること、および（ｂ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患または障害の退縮を引き起こすか、またはその症状もしくは合併症を緩和することを含む。
【００４３】
抗体操作
本発明の抗体は、ウサギをヒトＢＴＬＡのＦｃタグ付き細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ドメインで免疫化し、マウスＢＴＬＡ−Ｆｃタグ付きタンパク質（２５Ｆ７）または代替的にはヒトおよびマウスＢＴＬＡ−Ｆｃタグ付きタンパク質（２２Ｂ３および２３Ｃ８）で追加免疫することによって生成した。交差反応性を特定するために、ヒスチジンタグ付きヒト、マウス、およびカニクイザルＢＴＬＡを使用してスクリーニングを行った。ヒトＢＴＬＡのアミノ酸配列は配列番号３１によって定められ、ＢａｌｂｃマウスＢＴＬＡのアミノ酸配列は配列番号３２によって定められ、Ｃ５７ＢＬ６のアミノ酸配列は配列番号３３によって定められ、カニクイザルＢＴＬＡのアミノ酸配列は配列番号３４によって定められる。次いで、抗体をヒト化し、親和性成熟させた。
【実施例】
【００４４】
操作されたＢＴＬＡアゴニスト抗体の発現および精製
本発明のＢＴＬＡアゴニスト抗体は、本質的に以下の通りに調製および精製することができる。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯなどの適切な宿主細胞は、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比（１：３または１：２など）を用いて抗体を分泌するための発現系、またはＨＣおよびＬＣの両方をコードする単一のベクター系で、一過性でまたは安定的にトランスフェクトすることができる。抗体が分泌された清澄化培地は、多くの一般的に使用される技術のうちのいずれかを用いて精製され得る。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合した緩衝液で平衡化された、Ｆａｂフラグメント用のＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に好都合に適用され得る。カラムは、非特異的結合構成成分を除去するために洗浄され得る。結合抗体は、例えば、ｐＨ勾配（２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．０〜１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０、またはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４〜１００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ３．０など）によって溶出され得る。抗体画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって検出され得、次いで、プールされてもよい。意図する使用に応じて、さらなる精製は任意選択的である。抗体は、一般的な技術を使用して濃縮およびまたは滅菌濾過され得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモーダル、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去され得る。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗体の純度は、約９５％〜約９９％である。生成物は、冷蔵保存するか、すぐに−７０℃で凍結するか、または凍結乾燥してもよい。本発明の例示的な抗体のアミノ酸配列番号を以下に示す。
【表１】
0006790304.tif 000002
【００４５】
結合親和性および動態
ＢＴＬＡに対する本発明のＢＴＬＡアゴニスト抗体（２２Ｂ３、２３Ｃ８、および２５Ｆ７）の結合親和性および動態を、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴により測定する。結合親和性は、約１２０  ＲＵ  ＢＴＬＡタンパク質（ヒト、ラット、ネズミ（ＢａｌｂｃまたはＣ５７ＢＬ６）、またはカニクイザルＢＴＬＡ）をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＣＭ５チップ上のアミンカップリングにより固定化し、２倍連続希釈で５００ｎＭから開始し１５．６ｎＭまで下げ、ＢＴＬＡアゴニスト抗体を流れさせることによって測定する。実験は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＢＲ１００６６９、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中、２５℃で行う。各サイクルで、２５０μＬの抗体試料をフローセル１および２に５０μｌ／分で流し、１０分間解離させる。チップ表面は、１０μＬ／ｍＬの流量でグリシン緩衝液（ｐＨ１．５）の５μＬ注入で再生される。データを１：１のＬａｎｇｍｉｕｒバインディングモデルに適合させてｋｏｎ、ｋｏｆｆを導き出し、ＫＤを計算する。本質的に上に記載される手順に従って、以下のパラメータ（表２に示される）が観察された。以下に示されるデータは、２２Ｂ３のヒト、カニクイザル、ラット、およびマウスの３つの実験の平均である。
【表２】
0006790304.tif 000003
【００４６】
上記の表２に示されるように、本発明のＢＴＬＡアゴニスト抗体はＢＴＬＡに結合する。具体的には、抗体２２Ｂ３は、ヒト、マウス、およびカニクイザルのＢＴＬＡに結合することができる。
【００４７】
初代細胞への結合
本発明のＢＴＬＡ抗体（２２Ｂ３、２３Ｃ８、および２５Ｆ７）が異なる種からの初代細胞と結合する能力は、ＦＡＣＳにより決定される。製造者のプロトコルに従って、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ＃１７−１４４０−０２）およびＳｅｐＭａｔｅチューブ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ＃１５４５０）を使用して、ドナーの血液試料（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ、＃ＬＲＳ−ＷＢＣ）からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離する。カニクイザルＰＢＭＣ（ＷｏｒｌｄＷｉｄｅ  Ｐｒｉｍａｔｅｓ＃ＣＡ−１０）を液体窒素から解凍し、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄する（上記と同じ）。
【００４８】
雄のＣ５７ＢＬ６マウス（ＪＡＸ）または雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）の脾臓を採取し、プールし、１０％熱不活性化ＦＢＳおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを備えたＲＰＭＩ  １６４０ですすぎ、５０ｍＬコニカルチューブ上のセルストレーナーおよびシリンジプランジャーを使用して、単一細胞懸濁液に解離する。細胞をペレット化し、培地を除去し、ペレットを２ｍｌ  ＡＣＫ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｇｉｂｃｏ＃Ａ１０４９２−０１）に約２分間再懸濁することによって完全なＲＰＭＩでクエンチする前に赤血球を溶解する。溶解した細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（３％ＦＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＤＰＢＳ  １Ｘ）で１回洗浄する。
【００４９】
単離された初代細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓセルカウンターを使用して定量化し、ＦＡＣＳ緩衝液にｍｌあたり２ｘ１０６個の細胞で再懸濁した。フローサイトメトリー実験を、細胞単離と同じ日に、５０μｌ（約０．１ｘ１０６）の細胞を９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃６５０１０１）に播種することによって行う。非特異的抗体結合は、洗浄せずに４℃で１５分間、１μｌのＦｃブロック（例えば、ＢＤ＃５５３１４２から）を添加することによって妨げられる。
【００５０】
ＢＴＬＡ抗体結合を、ＦＡＣＳ緩衝液での連続希釈により、様々な濃度で試験する。例えば、異なる濃度で開始する精製された抗体および対照を、最初に３０μｇ／ｍＬに希釈し、開始材料の連続１：３希釈を合計１０回の滴定で行う（さらに未処置の対照）。抗体滴定は、４℃で２０分間、細胞と共にインキュベートし、染色前にＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。特定の細胞型（例えば、ＣＤ１９  Ｂ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、またはＣＤ８  Ｔ細胞）を識別するために蛍光色素複合体化抗体を使用して、またはそのサブセットに結合する抗体の有無を識別するために二次抗体を使用して細胞を染色する。染色は、４℃で２０分間行い、フローサイトメーター上での分析前にＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄する。結果を、標準のＦＡＣＳ分析ソフトウェア（例えば、ＦＡＣＳＤｉｖａ）を使用して分析し、各滴定に対する二次抗体の平均蛍光強度として報告する。結合を示す陽性結果は、バックグラウンドを超える平均蛍光強度染色によって判定される。
【００５１】
本質的に上記の手順に従って、抗体２２Ｂ３は、ヒト、カニクイザル、ラット、およびマウスのＢＴＬＡ発現細胞と結合し、抗体２３Ｃ８は、ヒトおよびカニクイザルのＢＴＬＡ発現細胞と結合し、抗体２５Ｆ７は、ヒト、カニクイザル、およびマウスのＢＴＬＡ発現細胞と結合する。
【００５２】
ＢＴＬＡアゴニスト抗体により誘発されるリン酸化
本発明のＢＴＬＡアゴニスト抗体（２２Ｂ３および２５Ｆ７）のヒトＢ細胞株におけるチロシンリン酸化を誘発する能力を判定するために、ＢＴＬＡ抗体を３７℃で１時間、２４ウェル培養プレートに１０μｇ／ｍＬで結合する。プレートをＰＢＳで洗浄して、任意の結合されていない抗体を除去する。Ｒａｍｏｓ．２Ｇ６．４Ｃ１０ヒトＢリンパ球細胞株（ＡＴＣＣ）などのヒトＢＴＬＡ発現Ｂ細胞株を、１０ｘ１０＾６細胞／ｍＬでウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートしてもよい。細胞を除去し、完全溶解緩衝液（ＭＳＤ）に溶解し、−８０℃で少なくとも３０分間凍結する。
【００５３】
リン酸化ＢＴＬＡを、Ｍｅｓｏ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｓ  ６００によって検出する。ストレプトアビジン検出プレートを、ブロッキング溶液（ＭＳＤ）中に室温で１時間インキュベートすることによって調製する。ビオチン化ＢＴＬＡ捕捉抗体（５Ａ５）をプレート上に室温で１時間コーティングし、その後、３回以上トリス洗浄ステップを行う。細胞溶解物を室温で２時間インキュベートする。総ＢＴＬＡを、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ＢＴＬＡ抗体（ＡＮＣ６Ｅ９）で検出し、リン酸化ＢＴＬＡを、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗ホスホトリオシン抗体（ＰＹ２０、ＭＳＤ）で測定し、その後、３回以上のトリス洗浄ステップを行う。次いで、Ｍｅｓｏ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｓ  ６００を使用する分析の直前に、２ｘ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（ＭＳＤ）の追加をウェルに添加する。
【００５４】
本質的に上記の手順に従って、抗体２２Ｂ３は、陰性対照と比較して、バックグラウンドよりもＢＴＬＡのチロシンリン酸化が２．４１倍増加し、抗体２５Ｆ７は、陰性対照と比較して、バックグラウンドよりもＢＴＬＡのチロシンリン酸化が１．４７倍増加した。これらのデータは、ＢＴＬＡアゴニスト抗体２２Ｂ３および２５Ｆ７がヒトＢ細胞株においてＢＴＬＡリン酸化を誘発できることを示す。
【００５５】
ヒト初代Ｂ細胞増殖の阻害
本発明のＢＴＬＡアゴニスト抗体のインビトロ効力を、ヒト一次Ｂ細胞増殖を阻害する能力により評価する。ヒト初代Ｂ細胞を、ヒトＢ細胞単離キット（ＥａｓｙＳｅｐ）を使用して健康なヒト末梢血単核細胞から単離し、適切なヒト初代細胞培地に再懸濁する。抗ＩｇＭを、アイソタイプ対照またはＢＴＬＡ抗体の滴定と共にプレートにコーティングし、３７℃で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ洗浄ステップを行う。単離されたヒトＢ細胞を各ウェルに添加し、５％ＣＯ２で、３７℃で７２時間インキュベートし、その後、最後の１８時間［３Ｈ］−チミジンパルスを行う。インキュベーション後のプレートを除去し、ドライアイス上に３０分間置き、次いで、採取の準備ができるまで−２０℃で保存する。細胞を解凍することによって溶解し、Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ９６００（Ｔｏｍｔｅｃ）で採取する。ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２  ２４５０  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定することにより、増殖を評価する。
【００５６】
カウントはこのアッセイで相対的な増殖反応を評価するために使用され、阻害パーセントは方程式［阻害％＝（ＡＶＧ最大シグナル−シグナル試料）／ＡＶＧ最大シグナルｘ１００］を使用して計算し、これは、グラフ化ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）  を使用してＩＣ５０値を決定するために使用され得る。
【００５７】
本質的に上記の手順に従って、ＢＴＬＡアゴニスト抗体２２Ｂ３は、０．３２＋／−０．１ｎＭの計算されたＩＣ５０で、インビトロで初代Ｂ細胞の増殖を阻害することができ、抗体２３Ｃ８は、０．１４ｎＭの計算されたＩＣ５０で、インビトロで初代Ｂ細胞の増殖を阻害することができ、抗体２５Ｆ７は、０．１７ｎＭの計算されたＩＣ５０で、インビトロで初代Ｂ細胞の増殖を阻害することができた。同様の実験で、抗体２２Ｂ３は、０．３２ｎＭの計算されたＩＣ５０で初代Ｂ細胞の増殖を阻害することができ、Ｍａｂ８Ｄ５と同じＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを有する抗体（それぞれ、‘６９４特許の配列番号１１および１８）は、６．３８ｎＭの計算されたＩＣ５０で初代Ｂ細胞の増殖を阻害した。これらのデータは、ＢＴＬＡアゴニスト抗体２２Ｂ３、２３Ｃ８、および２５Ｆ７が、インビトロでＢ細胞の増殖を阻害できることと、抗体２２Ｂ３が、Ｍａｂ８Ｄ５と比較してより高いインビトロ活性を有することとを示す。
【００５８】
ＧｖＨＤのヒト化ＮＳＧマウスモデル
ヒトＰＢＭＣ駆動移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の予防は、インビボで決定される。
【００５９】
簡潔には、約８〜１０週齢の雌のＮＳＧマウス（ＪＡＸ  Ｌａｂｓ、品番＃０５５５７）を正規化し、ベースラインの体重測定値に基づいて処置群（処置群あたりｎ＝８マウス）に分割する。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、製造者のプロトコルに従って、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ＃１７−１４４０−０２）およびＳｅｐＭａｔｅチューブ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ＃１５４５０）を使用して、血液ドナープログラム（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ、＃ＬＲＳ−ＷＢＣ）から単離する。ＰＢＭＣを、ＰＢＳ  １ｍｌあたり約１５０×１０６個の細胞で再懸濁する。投与の前に処置群を盲検化する。
【００６０】
１日目に、ＰＢＳ（上記のように）に懸濁した１００μｌ（１５×１０６個の細胞）のＰＢＭＣ（または非生着対照の場合は１００μｌのＰＢＳ）を各マウスの尾に静脈内（ＩＶ）注射する。マウスに、皮下（ＳＱ）注射により、本発明の抗体（２２Ｂ３または２３Ｃ８）またはＰＢＳビヒクル中の様々な濃度の対照を毎週（ＱＷ）投与する。本質的に本明細書に記載されるように、３つの独立した研究が行われる。各研究の投与濃度は、［研究１（抗体２２Ｂ３）：０．１、１．０、５．０、１０．０、および２０．０ｍｇ／ｋｇ；研究２（抗体２２Ｂ３または２３Ｃ８）：０．００１、０．０１、１０．０、および１００ｍｐｋ；および研究３：０．００１、０．００５、０．０１、０．１、０．５、および１．０ｍｐｋ］である。
【００６１】
研究を終了し、アイソタイプ対照動物がベースライン体重の２０％を失う前（研究１および２）または２８日目（研究３）に、マウスを安楽死させる。体重を記録し（研究１および研究２）、サイトカイン分析のために血清を収集し（研究１；分析をＭＳＤ  ＥＬＩＳＡによって行う；分析したサイトカインはＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、およびＩＬ−８である）、脾臓を表現型／薬力学的分析のために採取する（ＣＤ  ８  Ｔ細胞集団の減少により測定；研究１および研究３）。
【００６２】
本質的に上記の手順に従って、以下のデータを得た。
【００６３】
研究１の抗体２２Ｂ３処置動物は、（０．１、１．０、５．０、１０．０、または２０．０ｍｇ／ｋｇの用量の抗体で）（ｉ）非生着対照動物の体重と比較して研究終了時に同様の体重；（ｉｉ）アイソタイプ対照動物と比較してサイトカインＴＮＦα、ＩＬ−１０、ＩＬ−６、ＩＬ−４、およびＩＬ−１２ｐ７０の低減；（ｉｉｉ）アイソタイプ対照動物と比較してＣＤ  ８  Ｔ細胞集団の低減（表現型／薬力学的分析）を示した。
【００６４】
研究２のデータは、０．０１ｍｇ／ｋｇの抗体２２Ｂ３、または１．０、５．０、もしくは１０．０ｍｇ／ｋｇの抗体２３Ｃ８で処置されたマウスが、非生着対照動物の体重と比較して、研究の終了時に同様の体重を有していたことを示す。研究２は、１０．０ｍｇ／ｋｇの体重に対する２２Ｂ３の活性は示さず、これは、このモデルの自然なドナーの変動を反映し得る。研究３では、抗体２２Ｂ３は、０．０１、０．１、０．５、および１．０ｍｇ／ｋｇの抗体用量で、インビボで薬力学的活性を示した。まとめると、これらのデータは、抗体２２Ｂ３および抗体２３Ｃ８がＧｖＨＤをインビボで妨げるのに効果的であったことを示す。
【００６５】
ｍＩＦＮα誘発性ループス腎炎
インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）誘発性ループス腎炎モデルは、ＩＦＮαが、ニュージーランドブラックおよびニュージーランドホワイト（ＮＺＢ／Ｗ）マウスとの交配種における疾患の発症を同期し、進行を加速させるのに使用される、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のマウスモデルである。ＮＺＢ／Ｗマウスモデルは、自発性ループス腎炎の古典的なモデルである。これらのマウスにおける疾患の進行は、アデノウイルスベクターを使用したＩＦＮαの外因性投与により加速し得る。このループス腎炎モデルを使用して、本発明のＢＴＬＡアゴニスト抗体の活性を示す。
【００６６】
研究開始の１日前に、１１週齢の雌のＮＺＢ／Ｗマウスを体重に基づいて無作為に分類する。マウスを以下の処置群：（１）ＬａｃＺアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ＋１０  ｍｇ／ｋｇヒトＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプ対照（ＰＡＡはＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａ変異である）、（２）ＩＦＮα  ＡＡＶ＋１０ｍｇ／ｋｇヒトＩｇＧ４  ＰＡＡアイソタイプ対照、（３）ＩＦＮα  ＡＡＶ＋３ｍｇ／ｋｇ  ２２Ｂ３抗体、（４）ＩＦＮα  ＡＡＶ＋１０ｍｇ／ｋｇ  ２２Ｂ３抗体、または（５）ＩＦＮα  ＡＡＶ＋５０ｍｇ／ｋｇシクロホスファミドに分配する。研究開始日（０日目）に、マウスに、ＬａｃＺ遺伝子を発現するＡＡＶの１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）（非疾患）またはＰＢＳ中のマウスＩＦＮα（疾患）のいずれかを静脈内に１回投与する。群１〜４では、マウスをＰＢＳ中のアイソタイプ対照または２２Ｂ３抗体抗体で０日目から開始して毎週１回皮下投与で処置する。群５では、マウスをＰＢＳ中のシクロホスファミドで１０日ごとに腹腔内投与で処置する。処置開始から６週間後に研究が終了するまで、２週間ごとにマウスから尿試料を収集する。Ｋａｍｉｙａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（商標）マウスマイクロアルブミンＥＬＩＳＡを使用して、尿アルブミンレベルを定量化する。尿中クレアチニンを、酵素クレアチニンアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して測定する。腎機能のバイオマーカーであるアルブミン尿は、尿中に検出されるクレアチニン１ｍｇあたり３００μｇを超えるアルブミンと定義される。
【００６７】
本質的に上記の手順に従って、４週目までに、アイソタイプ処置された疾患群（ＩＦＮα  ＡＡＶ＋ｈＩｇＧ４  ＰＡＡ）のアルブミン尿の発生率は１００％に達し、研究の終了まで上昇し続けたが、ＬａｃＺ  ＡＡＶ処置（非疾患）マウスはアルブミン尿のいかなる発生も示さなかった。急性腎毒性であり得るシクロホスファミドは、疾患マウスのアルブミン尿の一時的な増加を引き起こしたが、シクロホスファミド群のアルブミン尿の発生率は研究終了までにゼロに減少した。３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの抗体２２Ｂ３は、２８日目でアルブミン尿の発生率をそれぞれ５０％および２０％に、４２日目でそれぞれ６０％および７０％に減少させることができた。これらの結果は、抗体２２Ｂ３がモデルの腎機能を維持できたことを示した。
【００６８】
研究中の生存率のカプラン・マイヤープロット（データは示されていない）は、アイソタイプ処置された疾患群の腎不全が２８日目から死亡をもたらすことを示した。研究の終了までに、アイソタイプ処置された疾患群の生存率は６０％であった。非疾患およびシクロホスファミド処置群は１００％の生存率を有した。１０ｍｇ／ｋｇ抗体２２Ｂ３で処置したマウスもまた、研究終了時に１００％の生存率を示したが、３ｍｇ／ｋｇで処置したマウスは８０％の生存率を示した。これらの結果は、抗体２２Ｂ３がこのモデルで疾患関連の死亡を予防できることを示した。
【００６９】
乾癬のイミキモド誘発モデル
ＴＬＲ７／８アゴニストイミキモド（ＩＭＱ）の適用により誘発される乾癬様皮膚炎の重症度を制限する本発明の抗体の能力を試験する。７週齢の雌のＢ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪマウス（ＪＡＸ品番：００２０１４）、またはＨＶＥＭ−／−マウス（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１５：３，７１１−７１７，Ｍａｒｃｈ  ２００５に記載される）に、０日目にそれぞれ３ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇの抗体２２Ｂ３または抗体２５Ｆ７を腹腔内注射し、マウスの背中を剃毛する。ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照を注射した動物は、対照として役立った。１〜３日目に、マウスを吸入イソフルラン（ＶｅｔＯｎｅ）で麻酔し、次いで、５％ＩＭＱクリーム（５０ｍｇ、Ｆｏｕｇｅｒａ）を剃毛した皮膚の特定の領域に塗布した。４日目に、皮膚の処置された部位を切除し、疾患の重症度および炎症関連遺伝子発現について分析する。
【００７０】
本質的に上記の手順に従って、組織学的分析は、ｈＩｇＧ４アイソタイプ対照または１ｍｇ／ｋｇ抗体２２Ｂ３で処置された群で、不全角化および過角化を伴う表皮層の肥厚を示した。３ｍｇ／ｋｇ抗体２２Ｂ３または３ｍｇ／ｋｇ抗体２５Ｆ７で処置されたマウスは、表皮の厚さの著しい低減を示し、いくつかの領域は組織学的に正常に見られた。皮膚での遺伝子発現は、ｉＴａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用したｑＰＣＲによって分析した。３ｍｇ／ｋｇ抗体２２Ｂ３で処置されたマウスは、Ｉ型ＩＦＮ（ＩＦＮα、ＩＦＮβ）およびＩＦＮγの発現、ならびにＩＦＮ応答遺伝子（Ｉｓｇ１５、Ｍｘ１、Ｍｘ２、Ｏａｓ２）の著しい低減を示した。ＩＭＱ誘発性皮膚炎の確立に関与するサイトカインの分析はまた、３ｍｇ／ｋｇ抗体２２Ｂ３処置群でのＩＬ−２２およびＩＬ−２３発現の著しい低減も示した。これらのデータは、乾癬様皮膚炎のマウスモデルにおいて、ＢＴＬＡアゴニスト抗体２２Ｂ３および２５Ｆ７が表皮の厚さを低減することができることを示す。
【００７１】
エピトープ決定
本発明のＢＴＬＡアゴニスト抗体の機能的エピトープはＥＬＩＳＡにより決定し、構造的エピトープはＸ線結晶学により決定する。
【００７２】
方法
ＥＬＩＳＡ：機能的エピトープ
以下の一連のＢＴＬＡの表面変異を、（ヒト）Ｆｃに融合したヒトＢＴＬＡタンパク質に個別に導入した：Ｄ３５Ｒ、Ｑ３７Ｒ、Ｙ３９Ｅ、Ｒ４２Ｄ、Ｑ４３Ａ、Ｅ４５Ｒ、Ｓ４７Ｈ、Ｌ４９Ｒ、Ｄ５２Ｒ、Ｅ５５Ｒ、Ｅ５７Ｒ、Ｄ８４Ｒ、Ｎ６５Ｒ、Ｈ６８Ａ、Ｖ８０Ｒ、Ｋ８１Ｅ、Ｅ８３Ｒ、Ｓ８８Ｈ、Ｋ９０Ｈ、Ｅ９１Ｈ、Ｉ９５Ｒ、Ｅ１０３Ｈ、Ｌ１０６Ｒ、Ｎ１０８Ｒ、Ｒ１１４Ｖ、Ｓ１２１Ｙ、Ｎ１２２Ｒ、Ｅ１２５Ｈ、Ｈ１２７Ｅ、Ｔ１３０Ｒ、Ｙ１３２Ｒ、およびＴ１３４Ｈ。
【００７３】
２２Ｂ３および２３Ｃ８の結合を、ＥＬＩＳＡを使用して決定し、ここで、エピトープマッピングされる抗体を固定化された抗ウサギ抗体によって捕捉し、各ＢＴＬＡ変異体を洗浄した後、捕捉された抗体で４ポイント４倍希釈系列としてインキュベートし、酵素結合抗ヒトＦｃ試薬で検出した。得られたシグナルを、抗体間および対照抗体と比較した。機能的エピトープは通常、１つまたは２つの変異体のシグナルが劇的に低減することによってそれ自体を示した。２５Ｆ７抗体については、サンドイッチＥＬＩＳＡを行い、ここで、ヒト化２２Ｂ３を固定化し、ＢＴＬＡ変異体を捕捉し、ウサギ２５Ｆ７により結合させた。これにより、非常に強いシグナルが得られ、２２Ｂ３エピトープを排除した後、２５Ｆ７エピトープを特定できた。
【００７４】
Ｘ線結晶学：構造的エピトープ
相互作用する界面、したがって様々な抗体のＢＴＬＡ上の物理的エピトープを決定するために、ヒトＢＴＬＡを本発明の抗体のＦａｂ部分と共結晶化し、結晶構造を決定した。結果として得られた結晶構造から、任意の抗体原子の４．５Ａ以内のＢＴＬＡ残基をエピトープの一部としてカウントした（Ｐｙｍｏｌ視覚化ソフトウェアを使用）。４．５オングストロームは、原子中心から原子中心まで測定される。抗体の任意の原子に４．５オングストローム近い少なくとも１つの原子を含む残基は、エピトープの一部である。
【００７５】
２つの２２Ｂ３構造を、ヒトＢＴＬＡとの錯体で決定した。最初は、Ｆｃ融合として発現したヒトＢＴＬＡのＳ４７Ｈ変異体（安定化変異）でタグ付けおよび精製された親ウサギ２２Ｂ３抗体Ｆａｂ、ヒスチジンを利用し、その後、切断および精製した。これら２つのタンパク質をほぼ等モル比で混合し、結晶化のために市販のスクリーンでスクリーニングした。結晶が得られ、回折データをＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅで収集した。このデータを、分子置換によって削減および解析し、２２Ｂ３とＢＴＬＡとの間の錯体の高解像度構造が得られるように精密化した。第２の錯体は、ヒト化２２Ｂ３（Ｆａｂ部分）の親和性成熟バージョン（ＨＣ変異Ｉ５６Ｑ／Ｔ５７Ｈ／Ｇ９８ＡおよびＬＣ  Ｓ９５Ｈ）およびヒトＢＴＬＡの間であった。これらを共発現させ、錯体として精製し、同様にスクリーニングした。結果として得られた構造およびエピトープは、最初の構造と類似していた。
【００７６】
錯体中の２３Ｃ８の構造を、第１の２２Ｂ３錯体と同じ方法で、つまりＨｉｓタグ付きウサギ親Ｆａｂを精製し、単量体Ｓ４７ＨヒトＢＴＬＡと混合し、結晶化することによって得た。
【００７７】
ヒトＢＴＬＡと錯体中の２５Ｆ７の構造を、第２の２２Ｂ３錯体のように、すなわち、共発現、共精製、および結晶化によって得た。ヒトＢＴＬＡへの改善された結合を有するヒト化２５Ｆ７の二重変異体を利用した（エピトープ決定に使用されるヒト化２５Ｆ７はＨＣ  Ｓ３０Ｗ／ＬＣ  Ｅ２７Ｒに変異を有する）。
【００７８】
結果
２２Ｂ３抗体：一連のＢＴＬＡ表面変異体の中で、Ｒ４２ＤおよびＨ１２７Ｅは、ウサギ２２Ｂ３抗体（２２Ｂ３と同じＣＤＲを含むが、ウサギフレームワークを含む）への結合に有意な負の影響を有した。機能的エピトープは、ヒトＢＴＬＡ（配列番号３１）の４２位のＡｒｇおよび１２７位のＨｉｓを含む。ヒトＢＴＬＡとウサギ２２Ｂ３  Ｆａｂとの間の結晶構造錯体の２２Ｂ３の４．５オングストローム以内にあり、かつ構造的エピトープであるＢＴＬＡ残基は、配列番号３１の以下の残基：３５位のＡｓｐ、３７位のＧｌｎ〜４２位のＡｒｇ、位置７４のＬｅｕ、７６位のＧｌｙ〜７９位のＣｙｓ、１１４位のＡｒｇ、１１９位のＰｈｅ、１２０位のＧｌｎ、１２２位のＡｓｎ〜１２８位のＳｅｒである。ヒトＢＴＬＡとヒト２２Ｂ３バリアント（ＨＣ  Ｉ５６Ｑ／Ｔ５７Ｈ／Ｇ９８Ａ  ＬＣ  Ｓ９５Ｈ）Ｆａｂとの間の結晶構造錯体の２２Ｂ３の４．５オングストローム以内にあるＢＴＬＡ残基は、配列番号３１の３５位のＡｓｐ、３７位のＧｌｎ〜４２位のＡｒｇ、７４位のＬｅｕ、７６位のＧｌｙ〜７９位のＣｙｓ、１１４位のＡｒｇ、１１９位のＰｈｅ、１２０位のＧｌｎ、１２２位のＡｓｎ、１２４位のＩｌｅ〜１２８位のＳｅｒである。
【００７９】
同様の研究で、ＢＴＬＡに結合するＨＶＥＭの構造的エピトープは、ＢＴＬＡの以下のアミノ酸：３７位のＧｌｎ〜４２位のＡｒｇ、７４位のＬｅｕ、７６位のＧｌｙ、７７位のＴｈｒ、１１２位のＳｅｒ、１１４位のＡｒｇ、１１８位のＡｓｎ、１２１位のＳｅｒ〜１２８位のＳｅｒ、および１３０位のＴｈｒであった。抗体２２Ｂ３とＨＶＥＭとの間の構造的類似性は、ＢＴＬＡ分子を整列させるＨＶＥＭ：ＢＴＬＡ結晶構造に抗体：ＢＴＬＡ結晶構造を重ね合わせることによって評価した。アミノ酸残基６９〜７２および対応する抗体領域を含むＨＶＥＭ領域のバックボーン二乗平均平方根偏差は、１．４オングストロームであると決定した。
【００８０】
２３Ｃ８抗体：Ｄ５２Ｒは、ＥＬＩＳＡにおいてウサギ２３Ｃ８（２３Ｃ８と同じＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２を含み、ＱＣＴＹＧＧＶＶＧＳＴＳＤＤＮＰのＬＣＤＲ３を有し、ウサギフレームワークを有する）のヒトＢＴＬＡへの結合をブロックする。機能的エピトープは、ヒトＢＴＬＡ（配列番号３１）の５２位のＡｓｐを含む。ヒトＢＴＬＡ（Ｓ４７Ｈ）とウサギ２３Ｃ８  Ｆａｂとの間の結晶構造錯体の２３Ｃ８の４．５オングストローム以内にあり、かつ構造的エピトープであるＢＴＬＡ残基は、配列番号３１の４６位のＨｉｓ〜５５位のＧｌｕ、１０３位のＧｌｕ、１０４位のＰｒｏ、１０６位のＬｅｕ、１０７位のＰｒｏ、１３４位のＴｈｒ〜１３９位のＡｌａである。抗体２３Ｃ８はＨＶＥＭ結合を模倣しない。
【００８１】
２５Ｆ７抗体：一連のＢＴＬＡ表面変異体の中で、Ｈ６８ＡおよびＫ６１Ｅは、ウサギ２５Ｆ７抗体（２５Ｆ７と同じＣＤＲを含むが、ウサギフレームワークを含む）への結合に有意な負の影響を有した。機能的エピトープは、ヒトＢＴＬＡ（配列番号３１）の６８位のＨｉｓおよび８１位のＬｙｓを含む。ヒトＢＴＬＡとヒト化２５Ｆ７  Ｆａｂバリアント（ＨＣ  Ｓ３０Ｗ、ＬＣ  Ｅ２７Ｒ）との間の結晶構造錯体の２５Ｆ７の４．５オングストローム以内にあり、かつ構造的エピトープであるＢＴＬＡ残基は、配列番号３１の６２位のＴｙｒ、６４位のＡｌａ〜６８位のＨｉｓ、８５位のＡｒｇ〜９１位のＧｌｕ、９８位のＰｈｅ、および１１８位のＡｓｎである。抗体２５Ｆ７はＨＶＥＭ結合を模倣しない。
【００８２】
配列
抗体２２Ｂ３のＨＣ（配列番号１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＳＬＳＳＹＧＶＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＳＹＤＧＩＴＹＹＡＳＷＡＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＹＤＤＹＶＹＶＹＡＬＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
抗体２２Ｂ３のＬＣ（配列番号２）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＱＡＳＱＳＩＳＴＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＡＡＳＴＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＧＹＳＳＳＮＬＤＮＶＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
抗体２２Ｂ３のＨＣＶＲ（配列番号３）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＳＬＳＳＹＧＶＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＩＳＹＤＧＩＴＹＹＡＳＷＡＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＤＹＹＤＤＹＶＹＶＹＡＬＤＩＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗体２２Ｂ３のＬＣＶＲ（配列番号４）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＱＡＳＱＳＩＳＴＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＡＡＳＴＬＡＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＧＹＳＳＳＮＬＤＮＶＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
抗体２３Ｃ８のＨＣ（配列番号５）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＩＳＫＹＮＩＱＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＮＹＧＧＳＡＹＹＡＳＲＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＳＮＳＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
抗体２３Ｃ８のＬＣ（配列番号６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＳＴＹＧＧＶＶＧＳＴＳＤＤＮＰＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
抗体２３Ｃ８のＨＣＶＲ（配列番号７）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＤＩＳＫＹＮＩＱＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＦＩＮＹＧＧＳＡＹＹＡＳＲＡＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＫＴＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＳＮＳＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗体２３Ｃ８のＬＣＶＲ（配列番号８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＳＩＳＳＷＬＳＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＳＴＹＧＧＶＶＧＳＴＳＤＤＮＰＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
抗体２５Ｆ７のＨＣ（配列番号９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＳＬＳＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＳＤＤＧＴＴＹＹＡＴＷＡＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＡＧＡＧＧＶＱＤＹＬＴＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
抗体２５Ｆ７のＬＣ（配列番号１０）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＱＡＳＥＮＩＹＮＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＳＡＳＴＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＧＳＳＮＳＮＩＤＮＰＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
抗体２５Ｆ７のＨＣＶＲ（配列番号１１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＦＳＬＳＴＹＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＳＤＤＧＴＴＹＹＡＴＷＡＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＡＧＡＧＧＶＱＤＹＬＴＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗体２５Ｆ７のＬＣＶＲ（配列番号１２）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＱＡＳＥＮＩＹＮＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＳＡＳＴＬＡＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣＱＱＧＳＳＮＳＮＩＤＮＰＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
抗体２２Ｂ３のＨＣＤＲ１（配列番号１３）
ＧＦＳＬＳＳＹＧＶＳ
抗体２３Ｃ８のＨＣＤＲ１（配列番号１４）
ＧＦＤＩＳＫＹＮＩＱ
抗体２５Ｆ７のＨＣＤＲ１（配列番号１５）
ＧＦＳＬＳＴＹＡＭＮ
抗体２２Ｂ３のＨＣＤＲ２（配列番号１６）
ＡＩＳＹＤＧＩＴＹＹＡＳＷＡＫＳ
抗体２３Ｃ８のＨＣＤＲ２（配列番号１７）
ＦＩＮＹＧＧＳＡＹＹＡＳＲＡＫＧ
抗体２５Ｆ７のＨＣＤＲ２（配列番号１８）
ＩＩＳＤＤＧＴＴＹＹＡＴＷＡＫＧ
抗体２２Ｂ３のＨＣＤＲ３（配列番号１９）
ＧＤＹＹＤＤＹＶＹＶＹＡＬＤＩ
抗体２３Ｃ８のＨＣＤＲ３（配列番号２０）
ＧＬＳＮＳＤＬ
抗体２５Ｆ７のＨＣＤＲ３（配列番号２１）
ＤＡＧＡＧＧＶＱＤＹＬＴＬ
抗体２２Ｂ３のＬＣＤＲ１（配列番号２２）
ＱＡＳＱＳＩＳＴＡＬＡ
抗体２３Ｃ８のＬＣＤＲ１（配列番号２３）
ＱＡＳＱＳＩＳＳＷＬＳ
抗体２５Ｆ７のＬＣＤＲ１（配列番号２４）
ＱＡＳＥＮＩＹＮＦＬＡ
抗体２２Ｂ３のＬＣＤＲ２（配列番号２５）
ＡＡＳＴＬＡＳ
抗体２３Ｃ８のＬＣＤＲ２（配列番号２６）
ＲＡＳＴＬＡＳ
抗体２５Ｆ７のＬＣＤＲ２（配列番号２７）
ＳＡＳＴＬＡＳ
抗体２２Ｂ３のＬＣＤＲ３（配列番号２８）
ＱＱＧＹＳＳＳＮＬＤＮＶ
抗体２３Ｃ８のＬＣＤＲ３（配列番号２９）
ＱＳＴＹＧＧＶＶＧＳＴＳＤＤＮＰ
抗体２５Ｆ７のＬＣＤＲ３（配列番号３０）
ＱＱＧＳＳＮＳＮＩＤＮＰ
ヒトＢＴＬＡ（配列番号３１）
ＭＫＴＬＰＡＭＬＧＴＧＫＬＦＷＶＦＦＬＩＰＹＬＤＩＷＮＩＨＧＫＥＳＣＤＶＱＬＹＩＫＲＱＳＥＨＳＩＬＡＧＤＰＦＥＬＥＣＰＶＫＹＣＡＮＲＰＨＶＴＷＣＫＬＮＧＴＴＣＶＫＬＥＤＲＱＴＳＷＫＥＥＫＮＩＳＦＦＩＬＨＦＥＰＶＬＰＮＤＮＧＳＹＲＣＳＡＮＦＱＳＮＬＩＥＳＨＳＴＴＬＹＶＴＤＶＫＳＡＳＥＲＰＳＫＤＥＭＡＳＲＰＷＬＬＹＲＬＬＰＬＧＧＬＰＬＬＩＴＴＣＦＣＬＦＣＣＬＲＲＨＱＧＫＱＮＥＬＳＤＴＡＧＲＥＩＮＬＶＤＡＨＬＫＳＥＱＴＥＡＳＴＲＱＮＳＱＶＬＬＳＥＴＧＩＹＤＮＤＰＤＬＣＦＲＭＱＥＧＳＥＶＹＳＮＰＣＬＥＥＮＫＰＧＩＶＹＡＳＬＮＨＳＶＩＧＰＮＳＲＬＡＲＮＶＫＥＡＰＴＥＹＡＳＩＣＶＲＳ
マウスＢａｌｂｃ  ＢＴＬＡ（配列番号３２）
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マウスＣ５７ＢＬ６  ＢＴＬＡ（配列番号３３）
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カニクイザルＢＴＬＡ（配列番号３４）
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配列番号１の抗体２２Ｂ３重鎖を発現するための例示的なＤＮＡ（配列番号３５）
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配列番号２の抗体２２Ｂ３軽鎖を発現するための例示的なＤＮＡ（配列番号３６）
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配列番号５の抗体２３Ｃ８重鎖を発現するための例示的なＤＮＡ（配列番号３７）
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配列番号６の抗体２３Ｃ８軽鎖を発現するための例示的なＤＮＡ（配列番号３８）
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配列番号９の抗体２５Ｆ７重鎖を発現するための例示的なＤＮＡ（配列番号３９）
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配列番号１０の抗体２５Ｆ７軽鎖を発現するための例示的なＤＮＡ（配列番号４０）
Ｇａｃａｔｃｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃａｇａｃｔｃｃｃｔｇｇｃｔｇｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇｃｇａｇａｇｇｇｃｃａｃｃａｔｃａａｃｔｇｃｃａｇｇｃｃａｇｔｇａｇａａｔａｔｔｔａｃａａｃｔｔｔｔｔｇｇｃｃｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａａｃｃａｇｇａｃａｇｃｃｔｃｃｔａａｇｃｔｇｃｔｃａｔｔｔａｃｔｃｔｇｃａｔｃｃａｃｔｃｔｇｇｃａｔｃｔｇｇｇｇｔｃｃｃｔｇａｃｃｇａｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｃｇｇｇｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｔｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇｃｃｔｇｃａｇｇｃｔｇａａｇａｔｇｔｇｇｃａｇｔｔｔａｔｔａｃｔｇｔｃａａｃａｇｇｇｔｔｃｔａｇｔａａｔａｇｔａａｔａｔｔｇａｔａａｔｃｃｔｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａａｃｇｇａｃｃｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｃ
ヒトＨＶＥＭ（配列番号４１）
ＭＥＰＰＧＤＷＧＰＰＰＷＲＳＴＰＫＴＤＶＬＲＬＶＬＹＬＴＦＬＧＡＰＣＹＡＰＡＬＰＳＣＫＥＤＥＹＰＶＧＳＥＣＣＰＫＣＳＰＧＹＲＶＫＥＡＣＧＥＬＴＧＴＶＣＥＰＣＰＰＧＴＹＩＡＨＬＮＧＬＳＫＣＬＱＣＱＭＣＤＰＡＭＧＬＲＡＳＲＮＣＳＲＴＥＮＡＶＣＧＣＳＰＧＨＦＣＩＶＱＤＧＤＨＣＡＡＣＲＡＹＡＴＳＳＰＧＱＲＶＱＫＧＧＴＥＳＱＤＴＬＣＱＮＣＰＰＧＴＦＳＰＮＧＴＬＥＥＣＱＨＱＴＫＣＳＷＬＶＴＫＡＧＡＧＴＳＳＳＨＷＶＷＷＦＬＳＧＳＬＶＩＶＩＶＣＳＴＶＧＬＩＩＣＶＫＲＲＫＰＲＧＤＶＶＫＶＩＶＳＶＱＲＫＲＱＥＡＥＧＥＡＴＶＩＥＡＬＱＡＰＰＤＶＴＴＶＡＶＥＥＴＩＰＳＦＴＧＲＳＰＮＨ
【配列表】
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