(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の候補細胞の中から抗体産生細胞を選択的に分離回収する細胞分離装置であって、
複数のウェルを有する培養器を設置可能に設けられる操作部と、
複数の前記ウェルのそれぞれに保持される培養液に候補細胞を播種する播種手段と、
前記培養液の液温を調温する調温手段と、
複数の前記ウェルに保持されている培養液のそれぞれに抗膜タンパク質抗体を添加する試薬添加手段と、
複数の前記ウェルのそれぞれに保持されている前記培養液を回収する回収手段とを備え、
前記培養器が有するウェルの内壁面には、抗体に対する結合能を有する分子からなるタンパク結合部位と、相転移温度を跨ぐ温度変化によって可逆的に立体構造が変化し、前記タンパク結合部位と抗体との結合親和性を変化させる分子鎖からなる温度応答性部位とが結合しており、
前記播種手段は、複数の前記ウェルのそれぞれに、膜タンパク質を発現する候補細胞を播種し、
前記試薬添加手段は、播種された前記候補細胞が培養された培養液に、前記膜タンパク質に結合可能な抗膜タンパク質抗体を添加し、
前記調温手段は、複数の前記ウェルのそれぞれに保持される前記培養液の液温を、前記候補細胞の培養温度から前記温度応答性部位の相転移温度を超える温度まで変化させ、
前記回収手段は、複数の前記ウェルのそれぞれに保持される前記培養液を回収し、播種された前記候補細胞のうち、前記タンパク結合部位に前記抗膜タンパク質抗体を介して結合している抗体非産生細胞を残して、前記タンパク結合部位に結合して無く培養液中に浮遊している抗体産生細胞を選択的に分離回収することを特徴とする細胞分離装置。
【請求項２】
候補細胞群の中から抗体産生細胞を選択的に分離回収する細胞分離方法であって、
抗体に対する結合能を有する分子からなるタンパク結合部位と、相転移温度を跨ぐ温度変化によって可逆的に立体構造が変化し、前記タンパク結合部位と抗体との結合親和性を変化させる分子鎖からなる温度応答性部位とが内壁面に結合している複数のウェルのそれぞれに、膜タンパク質を発現する候補細胞を播種し、
播種した前記候補細胞を培養し、
複数の前記ウェルのそれぞれに保持される培養液に、前記膜タンパク質に結合可能な抗膜タンパク質抗体を添加すると共に、複数の前記ウェルのそれぞれに保持される前記培養液の液温を、前記候補細胞の培養温度から前記温度応答性部位の相転移温度を超える温度まで変化させて、前記候補細胞が発現している前記膜タンパク質と前記抗膜タンパク質抗体とを結合させると共に、前記タンパク結合部位と前記抗膜タンパク質抗体と、及び、前記タンパク結合部位と前記候補細胞が産生した抗体とをそれぞれ結合させ、
複数の前記ウェルのそれぞれに保持される前記培養液を回収し、播種された前記候補細胞のうち、前記タンパク結合部位に前記抗膜タンパク質抗体を介して結合している抗体非産生細胞を残して、前記タンパク結合部位に結合して無く培養液中に浮遊している抗体産生細胞を選択的に分離回収することを特徴とする細胞分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の候補細胞の中から抗体産生細胞を選択的に分離回収する細胞分離装置及び細胞分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、培養細胞を利用した生化学的な手法により、医薬品、生理活性物質等の有用物質を生産する事例が増えている。有用物質やその産生に関わる所定の遺伝子が、動物細胞、微生物細胞、植物細胞等の各種の宿主細胞に遺伝子導入され、得られる遺伝子組換え細胞が大規模培養されることによって有用物質の効率的な生産が行われている。
【０００３】
従来、遺伝子組換え細胞は、ウイルス、ファージを利用する生物学的方法や、リポフェクション法、高分子ベクター法等に代表される化学的方法や、電気穿孔法、ヒートショック法、パーティクル・ガン法等に代表される物理的方法等の各種の方法によって作出されている。動物細胞については、リポフェクション法や電気穿孔法、細菌細胞については、電気穿孔法やヒートショック法、植物細胞については、パーティクル・ガン法や電気穿孔法やアグロバクテリウムによる形質導入法が主流である。
【０００４】
こうした遺伝子導入方法では、多くの場合、宿主細胞に導入される遺伝子のコピー数にばらつきが生じる。そのため、作出される遺伝子組換え細胞においては、有用物質の産生能についても個体差を生じることが少なくない。そこで、一般には、遺伝子導入操作された複数の候補細胞の中から、有用物質の産生能が高い細胞を選抜するスクリーニングが行われている。
【０００５】
従来、候補細胞群の中から所定の細胞を選抜するにあたって、温度応答性高分子の作用を利用する技術が検討されている。例えば、特許文献１には、温度に応答して細胞接着性の状態と細胞非接着性の状態とが変化する温度応答性高分子が表面に固定された複数の細胞接着領域と、複数の細胞接着領域のそれぞれと対応して設けられた発熱素子を備えているセルアレイソータを用い、発熱素子を発熱させた状態で、細胞接着スポットに細胞を接着して細胞培養を行う工程と、細胞の特性を評価し、回収する細胞を特定する工程と、細胞接着スポットに対応する発熱素子の発熱を停止し、細胞を回収する工程とを備えている細胞ソート方法が開示されている（請求項１８等参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−１０１６２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載される技術のように温度応答性高分子を利用すると、細胞の接着と遊離とを自在に制御することができる。このとき、培養器に接着している細胞を剥離させるにあたってトリプシン等の試薬が不要となるので、候補細胞が試薬等で損傷することも避けることができる。つまり、温度応答性高分子を利用すると、候補細胞群の中から所定の細胞を簡易且つ安全に選抜することができる可能性がある。但し、遺伝子導入操作された候補細胞群の中から有用物質の産生能が高い細胞を選抜するにあたっては、候補細胞群から単一細胞を分取する単離操作や、有用物質の産生能を評価し得る程度にまで候補細胞を増殖させる培養操作や、細胞数、有用物質の産生量等を計測する測定操作等も必要である。
【０００８】
遺伝子導入操作に供され、その後に回収される候補細胞の細胞数は、通常、大多数に及ぶ。そのため、網羅的なスクリーニングが求められる場合には、細胞の単離等の各操作にかかる労力や、細胞の培養に使用する培養液量が膨大になってしまうという問題が生じる。また、各操作は無菌的に行う必要があるし、細胞を単離する都度に培養時間もかかる。そのため、この種のスクリーニングは、時間的にもコスト的にも効率性を欠くものになっている。
【０００９】
また、有用物質の産生量等を測定するに際して、一部の細胞をサンプリングする場合は、サンプリングして産生能を評価した細胞と、実際に有用物質の生産に使用する細胞との同等性を保障する必要がある。そのため、複数系列を培養しておくための追加的な培養操作や、あらかじめマーカー遺伝子を導入する操作等が必要になることが少なくない。こうした追加的な操作も、スクリーニングの効率を減殺する一因となっている。
【００１０】
加えて、近年では、有用物質の中でも、抗体医薬の製造の需要が高まっている。キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等のような抗体の産生には、ＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞等の浮遊細胞も利用されるようになってきている。そのため、特許文献１に記載される技術とは異なり、浮遊細胞の選択的な分離回収に対応したスクリーニングの手段も求められている。
【００１１】
そこで、本発明は、抗体の産生能が高い細胞を候補細胞群の中から簡易な工程で損傷少なく選抜することが可能な細胞分離装置及び細胞分離方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するために本発明に係る細胞分離装置は、複数の候補細胞の中から抗体産生細胞を選択的に分離回収する細胞分離装置であって、複数のウェルを有する培養器を設置可能に設けられる操作部と、複数の前記ウェルのそれぞれに保持される培養液に候補細胞を播種する播種手段と、前記培養液の液温を調温する調温手段と、複数の前記ウェルに保持されている培養液のそれぞれに抗膜タンパク質抗体を添加する試薬添加手段と、複数の前記ウェルのそれぞれに保持されている前記培養液を回収する回収手段とを備え、前記培養器が有するウェルの内壁面には、抗体に対する結合能を有する分子からなるタンパク結合部位と、相転移温度を跨ぐ温度変化によって可逆的に立体構造が変化し、前記タンパク結合部位と抗体との結合親和性を変化させる分子鎖からなる温度応答性部位とが結合しており、前記播種手段は、複数の前記ウェルのそれぞれに、膜タンパク質を発現する候補細胞を播種し、前記試薬添加手段は、播種された前記候補細胞が培養された培養液に、前記膜タンパク質に結合可能な抗膜タンパク質抗体を添加し、前記調温手段は、複数の前記ウェルのそれぞれに保持される前記培養液の液温を、前記候補細胞の培養温度から前記温度応答性部位の相転移温度を超える温度まで変化させ、前記回収手段は、複数の前記ウェルのそれぞれに保持される前記培養液を回収し、播種された前記候補細胞のうち、前記タンパク結合部位に前記抗膜タンパク質抗体を介して結合している抗体非産生細胞を残して、前記タンパク結合部位に結合して無く培養液中に浮遊している抗体産生細胞を選択的に分離回収することを特徴とする。
【００１３】
また、本発明に係る細胞分離方法は、候補細胞群の中から抗体産生細胞を選択的に分離回収する細胞分離方法であって、抗体に対する結合能を有する分子からなるタンパク結合部位と、相転移温度を跨ぐ温度変化によって可逆的に立体構造が変化し、前記タンパク結合部位と抗体との結合親和性を変化させる分子鎖からなる温度応答性部位とが内壁面に結合している複数のウェルのそれぞれに、膜タンパク質を発現する候補細胞を播種し、播種した前記候補細胞を培養し、複数の前記ウェルのそれぞれに保持される前記培養液に、前記膜タンパク質に結合可能な抗膜タンパク質抗体を添加すると共に、複数の前記ウェルのそれぞれに保持される前記培養液の液温を、前記候補細胞の培養温度から前記温度応答性部位の相転移温度を超える温度まで変化させて、前記候補細胞が発現している前記膜タンパク質と前記抗膜タンパク質抗体とを結合させると共に、前記タンパク結合部位と前記抗膜タンパク質抗体と、及び、前記タンパク結合部位と前記候補細胞が産生した抗体とをそれぞれ結合させ、複数の前記ウェルのそれぞれに保持される前記培養液を回収し、播種された前記候補細胞のうち、前記タンパク結合部位に前記抗膜タンパク質抗体を介して結合している抗体非産生細胞を残して、前記タンパク結合部位に結合して無く培養液中に浮遊している抗体産生細胞を選択的に分離回収することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、抗体の産生能が高い細胞を候補細胞群の中から簡易な工程で損傷少なく選抜することが可能な細胞分離装置及び細胞分離方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置の概略構成を示すブロック図である。
【図２】培養器の形状の一例を示す図である。
【図３】培養器が有するウェルの内壁面を拡大して模式的に示す図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る細胞分離方法の原理を示す図である。
【図５】本発明の一実施形態に係る細胞分離方法の原理を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明の一実施形態に係る細胞分離装置及び細胞分離方法について説明する。なお、以下の各図において共通する構成については同一の符号を付し、重複した説明を省略する。
【００１７】
図１は、本発明の一実施形態に係る細胞分離装置の概略構成を示すブロック図である。
図１に示すように、本実施形態に係る細胞分離装置１００は、操作室（操作部）１０１と、培養器用のヒートブロック（調温手段）１０２と、ピペット装置（播種手段）１０３と、吸引ノズル（回収手段）１０４と、培養液回収槽１０５と、供給システム（試薬添加手段）１０６と、培養室１０７と、ガス交換装置１０８と、温度調節装置１０９とを備えている。
【００１８】
細胞分離装置１００は、抗体産生能が未知である複数の候補細胞（候補細胞群）の中から、抗体を産生する能力を有する細胞（抗体産生細胞）を選択的に分離回収することが可能な装置となっている。候補細胞としては、具体的には、抗体遺伝子等を導入する遺伝子導入操作を施した細胞集団等が供される。
【００１９】
遺伝子導入操作は、標的の宿主細胞に所望の遺伝子を導入させる操作であり、一般に、多数の細胞を標的として行われる。抗体遺伝子等の遺伝子導入操作の後に回収される多数の細胞の中には、導入された遺伝子のコピー数や、遺伝子の組み込まれ方や、遺伝子の変異等に起因して、抗体を産生する能力が高い細胞、抗体を産生する能力が低い細胞、抗体を産生する能力を欠く細胞（抗体非産生細胞）等が混在している可能性がある。
【００２０】
細胞分離装置１００では、遺伝子導入操作後に回収されるこのような多数の細胞を対象とした選別を行い、各細胞の抗体産生能に基いて抗体を産生する能力を有する細胞や、抗体を産生する能力が高い細胞の選抜を行う。細胞分離装置１００は、特に、遺伝子導入操作の工程の直後に回収される比較的多数の候補細胞を対象とした一次スクリーニングに適した装置である。
【００２１】
細胞分離装置１００の操作室１０１は、複数のウェルを有する培養器Ｐを設置可能に設けられる。選別の対象となる候補細胞群は、複数のウェルのそれぞれにおいて培養され、操作室１０１における各種操作を経て、個々の抗体産生能に基く選抜をうける。ここで、培養器Ｐと、それを用いた細胞分離方法の原理について説明する。
【００２２】
図２は、培養器の形状の一例を示す図である。図２（ａ）は、培養器の形状の一例を示す斜視図、図２（ｂ）は、培養器が有するウェルを示す図である。
図２（ａ）に示すように、培養器Ｐは、所謂ウェルプレートの形態とされている。培養器Ｐは、平板状の基体９の上面に、複数のウェル１０を有している。各ウェル１０は、互いに同形状且つ同寸法に設けられており、基体９の上面に規則的な配置で配列している。
【００２３】
培養器Ｐは、細胞分離装置１００の操作室１０１に設置可能であり、操作室１０１に備えられるヒートブロック１０２に適合する寸法とされている。図２（ａ）に示す形態の培養器Ｐは、一例として、長さ（Ｌ）が１３０ｍｍ、幅（Ｗ）が８５ｍｍ、高さ（Ｈ）が１０．５ｍｍに設けられている。基体９の上面に形成されているウェル１０の個数は、８×１２の９６穴である。なお、基体９の上面は、ウェル１０の内部の汚染を防止する不図示の蓋体で覆うことができる。
【００２４】
ウェル１０は、基体９の上面に円柱形状の小穴として凹設されている。図２（ｂ）に示す形態のウェル１０は、一例として、内径（φ）が３ｍｍ、深さ（Ｄ）が９．３ｍｍに設けられている。各ウェル１０の底壁１２０ａは、基体９の上面及び下面に対して平行である。培養器Ｐが有する各ウェル１０の内壁（１）、すなわち底壁１２０ａや側壁１２０ｂには、抗体産生細胞の選択的な分離回収を可能にする表面修飾がなされている。つまり、底壁１２０ａや側壁１２０ｂは、表面修飾される後記の分子の支持体（１）となっている（図３参照）。
【００２５】
図３は、培養器が有するウェルの内壁面を拡大して模式的に示す図である。図３（ａ）は、表面修飾された分子が水相に相溶した状態の内壁面を示す図であり、図３（ｂ）は、表面修飾された分子が相分離した状態の内壁面を示す図である。
図３（ａ）及び（ｂ）に示すように、培養器Ｐが有する各ウェル１０の内壁（支持体）１には、タンパク結合部位２と、温度応答性部位３と、親水性部位４とが結合している。
【００２６】
タンパク結合部位２、温度応答性部位３及び親水性部位４は、通常、各ウェル１０の底壁１２０ａ（図２参照）のみに固定化されるが、側壁１２０ｂのみに固定化されていてもよいし、底壁１２０ａと側壁１２０ｂとの両方に固定化されていてもよい。
【００２７】
タンパク結合部位２は、抗体に対する結合能を有する分子からなる。詳細には、タンパク結合部位２の結合能は、抗体に対して特異的であり、抗体以外の物質に対しては結合し難いものである。タンパク結合部位２は、後記するように、抗体産生細胞によって産生される抗体や、培養液に添加される抗膜タンパク質抗体等と特異的に結合することになる。そして、抗膜タンパク質抗体と結合している抗体非産生細胞を水相における浮遊状態からウェル１０の内壁（１）への付着状態となるように捕捉する作用を示す。
【００２８】
温度応答性部位３は、相転移温度を跨ぐ温度変化によって可逆的に立体構造が変化する分子鎖からなる。詳細には、温度応答性部位３は、相転移温度を跨ぐ温度変化に伴って、親水性が高く、水相に相溶する溶解状態と、疎水性が高く、水相から相分離した凝集状態との間で可逆的に相転移することができる。
【００２９】
なお、温度応答性部位３の親水性及び疎水性の変化は、立体構造が可逆的に変化する程度に測定値の変位を生じるものであればよい。親水性及び疎水性を判断するための測定値としては、具体的には、水への溶解度、酸解離定数、水相と有機相との分配比、接触角等を利用することができる。分配比は、一般に、オクタノール相と水相との二相系において、オクタノール相に溶解する物質の濃度を、水相に溶解する物質の濃度で除算することよって表される。
【００３０】
温度応答性部位３は、水相に相溶した状態では、図３（ａ）に示すように所定の安定的な立体構造をとる。このとき、温度応答性部位３の主鎖はウェル１０の内壁（１）から水相側に向けて配向し、タンパク結合部位２は、水相側に露出してリガンド、すなわち抗体に対する結合親和性が高い状態となる。その一方で、相分離した状態では、図３（ｂ）に示すようにウェル１０の内壁（１）の側に凝集する。このとき、タンパク結合部位２は、立体障害を生じ、抗体に対する結合親和性が低い状態となる。つまり、温度応答性部位３は、相転移に伴う立体構造の変化によって、タンパク結合部位２と抗体との結合親和性を相互に変化させる。
【００３１】
一般には、温度応答性高分子として、下限臨界溶液温度（Lower Critical Solution Temperature；ＬＣＳＴ）を示す高分子と、上限臨界溶液温度（Upper Critical Solution Temperature；ＵＣＳＴ）を示す高分子とが知られている。下限臨界溶液温度を示す高分子は、下限臨界溶液温度よりも低い低温域では親水性を示して水相に溶解し、下限臨界溶液温度よりも高い高温域では疎水性を示して不溶化し相分離する性質を持つ。一方、上限臨界溶液温度を示す高分子は、上限臨界溶液温度よりも高い高温域では親水性を示して水相に溶解し、上限臨界溶液温度よりも低い低温域では疎水性を示して不溶化し相分離する性質を持つ。温度応答性部位３としては、これら下限臨界溶液温度を示す高分子、及び、上限臨界溶液温度を示す高分子のいずれも適用可能である。
【００３２】
親水性部位４は、親水基を有する分子や分子鎖によって構成される。親水性部位４は、図３において、温度応答性部位３に側鎖として結合している。親水性部位４は、温度応答性部位３が水相に相溶した状態（図３（ａ）参照）にあるときには、温度応答性部位３の主鎖を囲むように配向する。すなわち、適切な水和状態を形成させることによって温度応答性部位３の立体構造を安定化させて、タンパク結合部位２の抗体に対する結合親和性を向上させる。その一方で、温度応答性部位３が相分離した状態（図３（ｂ）参照）にあるときには、凝集状態の温度応答性部位３を覆うように周囲に分布する。そのため、凝集状態の温度応答性部位３に対して、抗体等が疎水的相互作用を介して非特異的に吸着するのを防止する作用を示す。
【００３３】
図１に示す細胞分離装置１００の操作室１０１においては、このようなタンパク結合部位２と温度応答性部位３と親水性部位４とが内壁面に固定化されている複数のウェル１０を使用して、候補細胞群の中から抗体産生細胞を選抜する処理を行う。細胞分離装置１００において実施される細胞分離方法は、詳細には、細胞播種工程と、細胞培養工程と、抗体添加工程と、温度刺激工程と、培養液回収工程とを経て抗体産生細胞を選択的に分離回収するものである。
【００３４】
図４及び図５は、本発明の一実施形態に係る細胞分離方法の原理を示す図である。図４（ａ）及び（ｂ）は、ウェルに候補細胞を播種した状態、図４（ｃ）及び（ｄ）は、播種した候補細胞を培養した状態、図５（ａ）及び（ｂ）は、温度応答性部位を相転移させると共に抗膜タンパク質抗体を添加した状態、図５（ｃ）及び（ｄ）は、抗膜タンパク質抗体、タンパク結合部位等を結合反応させた状態を示す図である。
【００３５】
なお、図４（ａ）、（ｃ）、及び、図５（ａ）、（ｃ）は、或るウェル１０における過程を時系列で示したものであり、図４（ｂ）、（ｄ）、及び、図５（ｂ）、（ｄ）は、それとは異なるウェル１０における過程を時系列で示したものである。図４（ａ）、図４（ｃ）、図５（ａ）、図５（ｃ）は、抗体非産生細胞が存在しているウェル１０、図４（ｂ）、図４（ｄ）、図５（ｂ）、図５（ｄ）は、抗体産生細胞が存在しているウェル１０にそれぞれ対応している。温度応答性部位３としては、３７℃付近等の培養温度域において水相から相分離し、２０℃から３０℃程度の培養温度よりも低い低温域において水相に相溶するような下限臨界溶液温度を示す分子鎖を例示している。
【００３６】
細胞播種工程では、図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、複数のウェル１０のそれぞれに、膜タンパク質Ｐ１０を発現する候補細胞Ｃを播種する。各ウェル１０は、抗体に対する結合能を有する分子からなるタンパク結合部位２と、相転移温度を跨ぐ温度変化によって可逆的に立体構造が変化し、タンパク結合部位２と抗体との結合親和性を変化させることが可能な分子鎖からなる温度応答性部位３とが、あらかじめ内壁面に固定化されているものである。
【００３７】
細胞播種工程では、詳細には、各ウェル１０に、膜タンパク質Ｐ１０を発現する候補細胞Ｃと所定の培養液とを加える。例えば、抗体遺伝子等を導入する遺伝子導入操作の後に細胞を回収し、回収された多数の候補細胞Ｃの細胞懸濁液を所定量分取して各ウェル１０に注液する。また、各ウェル１０に所定量の培養液を注液する。このとき、ウェル１０における液温は、温度応答性部位３が相分離した状態となる温度、すなわち、下限臨界溶液温度よりも高い高温域としておくことが好ましい。
【００３８】
候補細胞Ｃとしては、例えば、所望の特異性を示すモノクローナル抗体等を産生させるべく遺伝子導入操作を施した細胞であって、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞等に例示される浮遊細胞を播種する。単一のウェル当たりに播種する細胞数は、抗体産生能の正確な評価を行う観点からは、原則として単一細胞とすることが好ましい。つまり、選抜の対象とする細胞数に応じた多数のウェル１０に対して個々の候補細胞Ｃを播種する。
【００３９】
候補細胞Ｃが発現する膜タンパク質Ｐ１０としては、対応する抗膜タンパク質抗体と良好な結合親和性をもって抗原抗体反応することが可能な細胞外ドメインを有しているタンパク質、糖タンパク等であれば生理学的機能等に制限は無い。分離回収の際に候補細胞Ｃの細胞表面に自然に発現している膜タンパク質であってもよいし、遺伝子改変によって人為的に発現させた膜タンパク質であってもよい。また、膜タンパク質は、ヒト、マウス等の適宜の生物種に由来するものであってよい。膜タンパク質の具体例としては、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６等を例示することができる。
【００４０】
培養液としては、候補細胞Ｃの細胞種に応じて適宜の増殖培地を使用することが可能である。但し、抗体産生能の正確な評価を行う観点からは、培養液には抗体があらかじめ含まれていないことが好ましく、抗体非含有の合成培地、無血清培地等を使用することが好ましい。例えば、候補細胞ＣがＣＨＯ細胞である場合、抗体非含有のＣＤ−ＣＨＯ培地等が好適に用いられる。
【００４１】
続いて、細胞培養工程では、図４（ｃ）及び（ｄ）に示すように、複数のウェル１０のそれぞれに播種した候補細胞Ｃをそれぞれ培養する。播種された候補細胞Ｃが抗体の産生能を有していない場合は、そのウェル１０は、図４（ｃ）に示すように、培養液中に抗体が存在しない状態のままである。これに対して、播種された候補細胞Ｃが抗体の産生能を有している場合は、そのウェル１０は、図４（ｄ）に示すように、培養液中に所望の特異性を示す抗体Ａｂが産生された状態となる。
【００４２】
細胞培養工程では、詳細には、温度応答性部位３の相転移温度を超えない培養温度域、例えば、３７℃付近等において候補細胞Ｃの培養を行う。また、二酸化炭素を含むガスを供給することによって、培養器Ｐを５％程度の所定濃度の炭酸ガス雰囲気に維持する。また、培養器Ｐを振とうしてもよいし、所定湿度の雰囲気に調湿してもよい。培養時間は、播種された候補細胞Ｃが、抗体産生能を評価可能な程度にまで増殖しさえすれば適宜の時間とすることができる。例えば、抗体が十分に産生され、生細胞の割合も高く保たれる点で、好ましくは３日以上１０日以下、より好ましくは３日以上５日以下とする。
【００４３】
続いて、抗体添加工程では、図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、複数のウェル１０のそれぞれに保持される培養液に、候補細胞Ｃが発現している膜タンパク質Ｐ１０に特異的に結合することが可能な抗膜タンパク質抗体Ａ１を添加する。播種された候補細胞Ｃが抗体の産生能を有していない場合は、そのウェルは、図５（ａ）に示すように、抗体として抗膜タンパク質抗体Ａ１のみが存在する状態となる。これに対して、播種された候補細胞Ｃが抗体の産生能を有している場合は、そのウェルは、図５（ｂ）に示すように、所望の特異性を有する抗体Ａｂと、添加された抗膜タンパク質抗体Ａ１とが混在した状態となる。つまり、タンパク結合部位２に対する抗体の結合は、産生された抗体Ａｂと、添加された抗膜タンパク質抗体Ａ１との間で競合することになる。
【００４４】
抗体添加工程では、詳細には、各ウェル１０に対して同等となるように所定量の抗膜タンパク質抗体Ａ１を添加する。抗膜タンパク質抗体Ａ１は、添加量が不足すると、産生された抗体Ａｂに対して十分な競合を生じさせることができない。一方、添加量が過剰であると、非特異的な吸着を生じたり、特異的な相互作用の阻害を生じたりする虞がある。そのため、各ウェル１０毎の具体的な添加量は、増殖させた候補細胞Ｃの細胞数、膜タンパク質のＰ１０発現量、タンパク結合部位２の結合量等を勘案して過不足無い適量とすることが好ましい。
【００４５】
抗膜タンパク質抗体Ａ１としては、候補細胞Ｃが発現している膜タンパク質Ｐ１０と抗原抗体反応により特異的に結合する一方で、ウェル１０の内壁（１）や、温度応答性部位３などに対しては結合し難い抗体が好ましい。抗膜タンパク質抗体Ａ１は、具体的には、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２等であってもよいが、膜タンパク質Ｐ１０とタンパク結合部位２とのそれぞれに対する結合性を確保する観点からは、Ｆａｂ領域とＦｃ領域とを有している免疫グロブリンが好ましい。なお、抗膜タンパク質抗体Ａ１としては、候補細胞Ｃが発現する複数種類の膜タンパク質Ｐ１０のそれぞれに対応した複数種を添加してもよいが、一種のモノクローナル抗体を添加することが好ましい。
【００４６】
温度刺激工程では、図５（ａ）及び（ｂ）に示すように、複数のウェル１０のそれぞれに保持される培養液の液温を、播種して増殖させた候補細胞Ｃの培養温度から温度応答性部位３の相転移温度を超える温度まで変化させることにより、温度応答性部位３を相転移させる。すなわち、温度応答性部位３が下限臨界溶液温度を示す場合、３７℃付近等の培養温度域から、温度応答性部位３の相転移温度を超える低温域、例えば、２０℃付近等にまで培養液の液温を低下させる。そして、温度応答性部位３を水相に相溶する状態に変化させて、タンパク結合部位２を抗体と結合可能な状態にする。
【００４７】
抗体添加工程と温度刺激工程とを経ると、図５（ｃ）及び（ｄ）に示すように、候補細胞Ｃが発現している膜タンパク質Ｐ１０と、添加した抗膜タンパク質抗体Ａ１とを結合させることができる。また、このような結合と共に、ウェル１０に固定化されているタンパク結合部位２と添加した抗膜タンパク質抗体Ａ１と、及び、ウェル１０に固定化されているタンパク結合部位２と候補細胞Ｃが産生した抗体Ａｂとをそれぞれ結合させることができる。
【００４８】
そして、候補細胞Ｃが抗体の産生能を有していない場合は、そのウェル１０は、図５（ｃ）に示すように、タンパク結合部位２に対して、抗膜タンパク質抗体Ａ１のみが特異的に結合した状態となる。すなわち、抗体非産生細胞は、膜タンパク質Ｐ１０に結合した抗膜タンパク質抗体Ａ１を介して、ウェル１０の内壁（１）に固定化されているタンパク結合部位２に結合し、水相における浮遊状態から内壁（１）への付着状態に捕捉される。
【００４９】
これに対して、候補細胞Ｃが抗体の産生能を有している場合は、そのウェル１０は、図５（ｄ）に示すように、タンパク結合部位２に対して、候補細胞Ｃが産生した抗体Ａｂと添加された抗膜タンパク質抗体Ａ１とが競合して結合する状態となる。すなわち、一部のタンパク結合部位２に対しては、抗体産生細胞が発現している膜タンパク質Ｐ１０にも結合可能な抗膜タンパク質抗体Ａ１が特異的に結合し得るものの、多くのタンパク結合部位２に対しては、抗体産生細胞が産生し、膜タンパク質Ｐ１０に結合しない性質を有している抗体Ａｂが特異的に結合することになる。その結果、抗体産生細胞は、膜タンパク質Ｐ１０に抗膜タンパク質抗体Ａ１が結合しているにも拘らず、ウェル１０の内壁（１）に固定化されているタンパク結合部位２に結合することができず、培養液中に浮遊状態で残る。
【００５０】
抗体添加工程と温度刺激工程とは、先後を問わず行うことができる。また、抗体添加工程と温度刺激工程とを略同時に併せて行ってもよい。但し、タンパク結合部位２に対する抗体の結合を精密に競合させる観点からは、抗体添加工程を行った後に温度刺激工程を行うことが好ましい。抗膜タンパク質抗体Ａ１やタンパク結合部位２等の結合反応の時間は、１５分以上５時間以下程度を確保することが好ましく、１時間程度以上３時間程度以下とすることが好ましい。適量添加された抗膜タンパク質抗体Ａ１は、膜タンパク質Ｐ１０に対する特異的な結合能を有しているため、所定の反応時間の後に、各ウェル１０に存在している大半の候補細胞Ｃに結合する。
【００５１】
続いて、培養液回収工程では、複数のウェル１０のそれぞれに保持される培養液を回収し、播種された候補細胞Ｃのうち、タンパク結合部位２に抗膜タンパク質抗体Ａ１を介して結合している抗体非産生細胞（図５（ｃ）参照）を残して、タンパク結合部位２に結合して無く、培養液中に浮遊している抗体産生細胞（図５（ｄ）参照）を選択的に分離回収する。例えば、各ウェル１０の培養液を弱い力で吸引すれば、培養液中に浮遊状態で残っている抗体産生細胞のみが培養液と共に回収されるのに対し、ウェル１０の内壁（１）に対して付着状態となっている抗体非産生細胞は回収されること無く排除される。
【００５２】
培養液回収工程において、複数のウェル１０のうちの或る一つのウェル１０から回収された培養液が、多数の細胞を含んでいれば、そのウェル１０に存在している細胞は、タンパク結合部位２によって捕捉されること無く浮遊していた抗体産生細胞であるということになる。図１に示す細胞分離装置１００においては、このような培養器Ｐを利用した選別原理に基いて、複数の候補細胞の中から抗体産生細胞の選択的な分離回収を半自動的に行う。
【００５３】
細胞分離装置１００が備える操作室１０１は、培養器Ｐの搬入出が可能な無菌室とされる。操作室１０１の内部は、ＨＥＰＡフィルタ等を通じて無菌的に給排気がなされるようになっている。操作室１０１には、培養器用のヒートブロック（調温手段）１０２と、ピペット装置（播種手段）１０３と、吸引ノズル（回収手段）１０４とが備えられる。ヒートブロック１０２、ピペット装置１０３、吸引ノズル１０４等の稼働は、コントローラにより自動制御されるようになっている。また、操作室１０１には、各操作毎に室内を滅菌することが可能な、殺菌灯、蒸気滅菌装置等が備えられる。
【００５４】
ヒートブロック１０２は、培養器Ｐの各ウェル１０を、ペルティエ素子により加熱可能且つ冷却可能としている。ヒートブロック１０２には、培養器Ｐの形状寸法に合わせてガイドが設けられており、培養器Ｐは、このガイドに沿ってヒートブロック１０２に着脱自在に装着されるようになっている。ヒートブロック１０２は、少なくとも候補細胞の培養温度域から温度応答性部位３の相転移温度を超える温度までウェル１０の液温を調温することができる。また、ヒートブロック１０２は、揺動可能に設けることができ、装着された培養器Ｐを必要に応じて振とう培養させる。
【００５５】
ピペット装置１０３は、ディスポーザブル型のチップを装着可能な移動式のノズルを有し、定量の液体を自動で吸引可能且つ吐出可能に設けられている。ピペット装置１０３には、チップラックが付随して備えられる。チップラックに用意されている数百μＬ程度の容量のチップは、ノズルに圧入されることによって装着される。そして、チップが装着されたピペット装置１０３は、操作室１０１内を移動して培養器Ｐの各ウェル１０に所定の試薬類の注液を行い、使用済みのチップは操作毎に交換される。
【００５６】
吸引ノズル１０４は、培養器Ｐのウェル１０に対して移動自在に設けられ、各ウェル１０に保持されている液体を自動で吸引可能としている。吸引ノズル１０４は、例えば、培養器Ｐが有するウェル１０の行又は列に対応して、複数のノズルが直線状に並列した多連ノズルを備える。各ノズルは、チューブ等を介して培養液回収槽１０５と個別に連通され、ノズルを介して吸引される培養液等が培養液回収槽１０５に個別に回収されるようになっている。
【００５７】
供給システム１０６は、あらかじめ搬入されて保冷されている細胞懸濁液１１１、培地試薬１１２、抗膜タンパク質抗体試薬１１３、ｐＨ調整試薬１１４等の試薬類を操作室１０１に無菌的に供給可能としている。操作室１０１に供給された試薬類は、自動開栓されてピペット装置１０３に吸引される。そして、培養器Ｐのウェル１０に注液された後、閉栓されて再貯蔵されるようになっている。或いは、操作室１０１に備えられるピペット装置１０３に、ぺリスタポンプ、メンブレンポンプ等によって各試薬類を無菌的に送液する。操作室１０１に供給された試薬類が培養器Ｐのウェル１０へ送液される過程に保温機構があっても良い。
【００５８】
培養室１０７は、操作室１０１との間で培養器Ｐの搬入出が可能な無菌室とされる。培養室１０７と操作室１０１との間には、開閉自在な扉が備えられ、各室それぞれにおける操作、培養等は、互いに隔離された状態で行われる。培養室１０７には、雰囲気ガスを二酸化炭素ガス等に交換するガス交換装置１０８、温度調節装置１０９、加湿皿、温度センサ、湿度センサ、培養器Ｐを載置する培養器ラック等が設置される。培養室１０７は、調温及び調湿可能に設けられると共に、雰囲気が所定濃度の炭酸ガス雰囲気に調節されるようになっており、搬入された培養器Ｐについて所定の雰囲気下に培養が行われる。
【００５９】
細胞分離装置１００は、不図示の制御部を備えている。制御部は、操作状況や、培養室１０７の状態等を表示する表示部や、操作者による指示を入力するキーボード、マウス等で構成される入力部や、分離回収や培養に関する自動動作を制御するプログラム等を格納し、実行するＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メモリ等を備えて構成される。制御部は、操作者が分離回収の始動を支持すると、ＲＯＭに格納されているプログラムにしたがって、ヒートブロック１０２、ピペット装置１０３、吸引ノズル１０４、ガス交換装置１０８、温度調節装置１０９、培養器Ｐの搬送を行うロボットアーム等の制御を行う。
【００６０】
細胞分離装置１００における抗体産生細胞の分離回収では、はじめに、操作室１０１に備えられるヒートブロック１０２に、あらかじめ滅菌処理されている培養器Ｐが装着される。そして、ピペット装置１０３が、制御部による制御にしたがって、供給システム１０６から供給される培地試薬１１２を培養器Ｐの各ウェル１０に所定量注液する。また、ピペット装置１０３は、候補細胞群が懸濁されている細胞懸濁液１１１を所定量吸引し、培養器Ｐが有する複数のウェル１０のそれぞれに候補細胞Ｃを播種する。ウェル１０当たりに播種される候補細胞Ｃの細胞数は、例えば、細胞懸濁液１１１の吸引量及び吐出量によって調節される。
【００６１】
次に、培養器Ｐは、ロボットアーム等によって蓋体で覆われて培養室１０７に搬送される。培養室１０７の雰囲気は、制御部による制御にしたがって、３７℃付近等の培養温度域、所定ガス雰囲気に調節される。そして、各ウェル１０に播種された候補細胞Ｃは、所定の培養温度域、ガス雰囲気の下で所定の細胞数に達するまで培養される。その後、培養器Ｐは、再び操作室１０１に搬送され、温度応答性部位３の相転移温度を超えない温度域に維持されているヒートブロック１０２に再装着される。
【００６２】
次に、ピペット装置１０３は、制御部による制御にしたがって、供給システム１０６から供給される抗膜タンパク質抗体試薬１１３を、候補細胞が培養された培養液に添加する。抗膜タンパク質抗体試薬１１３は、候補細胞が発現している膜タンパク質に結合可能な抗膜タンパク質抗体Ａ１が、ＮａＣｌ等の塩、防腐剤等と共に溶解しているリン酸緩衝液等の溶液である。
【００６３】
次に、ヒートブロック１０２は、制御部による制御にしたがって、培養器Ｐの複数のウェル１０のそれぞれに保持される培養液の液温を、候補細胞の培養温度から温度応答性部位３の相転移温度を超える温度まで変化させる。そして、培養液の液温を温度応答性部位３が相分離した状態となる温度に維持し、抗体非産生細胞（図５（ｃ）参照）を抗膜タンパク質抗体Ａ１を介してタンパク結合部位２に結合させる。すなわち、抗体非産生細胞をウェル１０の内壁（１）に付着した状態に捕捉させる。このとき、ピペット装置１０３は、必要に応じて、供給システム１０６から供給されるｐＨ調整試薬１１４を培養液に添加し、ｐＨ刺激により相転移を促進させるように稼働させてもよい。
【００６４】
次に、吸引ノズル１０４は、制御部による制御にしたがって、複数のウェル１０のそれぞれに保持される培養液を回収し、播種された候補細胞のうち、タンパク結合部位２に抗膜タンパク質抗体Ａ１を介して結合している抗体非産生細胞を残して、タンパク結合部位２に結合して無く培養液中に浮遊している抗体産生細胞を選択的に分離回収する。各ウェル１０に保持されている培養液は、吸引ノズル１０４が有する各ノズルによって同量で一斉に吸引され、チューブ等を通じてウェル毎に培養液回収槽１０５に回収される。
【００６５】
回収された培養液については、顕微観察、濁度測定等によって細胞数が計測される。回収された培養液のうち、浮遊状態の細胞が一定数以上存在している培養液に抗体産生細胞が含まれていることになる。分離回収の操作が完了すると、制御部は、表示部に計測結果等を表示し、制御のプログラムを終了する。
【００６６】
なお、細胞分離装置１００に装着される培養器Ｐは、以上の細胞分離方法の原理を妨げない限り、適宜の形態とすることが可能である。
【００６７】
培養器Ｐは、図２においては、矩形平板状に設けられている。しかしながら、培養器Ｐの形状は、例えば、円板状、楕円板状等のその他の形状に設けることもできる。また、培養器Ｐの寸法は、例えば、５０ｃｍ四方以上２００ｃｍ四方以下、５ｍｍ以上２０ｍｍ以下程度の厚さ等のように適宜の寸法に設けることができる。
【００６８】
培養器Ｐは、例えば、樹脂等の有機材料、ガラス等の無機材料、金属材料等の適宜の材料によって形成することができる。培養器Ｐは、基体９やウェル１０がこれらの各種材料の組み合わせによって形成されてもよいが、通常、複数のウェル１０が凹設された状態に一体成形される。材料の成形性や、共有結合による他分子の修飾性等の観点からは、樹脂材料やガラス材料が好適である。したがって、培養器Ｐ、すなわちウェル１０は、樹脂材料及びガラス材料の少なくとも一方で形成されているものとしてもよい。培養器Ｐは、遮光性及び透光性（透明）のいずれであってもよいし、紫外線等について分光透過性を有していてもよい。
【００６９】
培養器Ｐに適用するガラス材料としては、例えば、ホウケイ酸ガラス、ソーダライムガラス等が挙げられる。また、培養器Ｐに適用する樹脂材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−プロピレン共重合体、ポリメチルペンテン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、アガロース、塩化ビニル、ポリアリレート、ポリサルホン、ポリエーテルサルホン、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド等が挙げられる。
【００７０】
培養器Ｐが有するウェル１０は、図２においては、円柱形状に凹設され、各ウェル１０の底壁１２０ａは、基体９の上面及び下面に対して平行とされている。しかしながら、ウェル１０の形状は、例えば、直方体形状、立方体形状、楕円柱形状等のその他の形状であってもよい。また、ウェル１０の底壁１２０ａは、一方向に向けて傾斜していてもよいし、Ｖ字状等に多方向に向けて傾斜していてもよい。また、ウェル１０の底壁１２０ａは、底壁１２０ａと側壁１２０ｂとが曲面で連なるように半球状、Ｕ字状等に曲率を有していてもよい。また、平坦状又は多孔状であってもよいし、ピラー状、半球状等の構造体が配設されていてもよい。ウェル１０は、例えば、２ｍｍ以上１０ｍｍ以下の内径、４ｍｍ以上１４ｍｍ以下の深さ等のように適宜の寸法に設けることができる。
【００７１】
培養器Ｐが有するウェル１０の個数は、図２においては、８×１２の９６穴とされている。しかしながら、例えば、６×８等の４８穴、８×１４等の１１２穴、１６×２４の３８４穴等の適宜の個数とすることができる。好ましい細胞分離方法の形態では、単一のウェルに単一の候補細胞を播種し、選別された抗体産生細胞をウェル１０単位で回収する。よって、網羅的なスクリーニングは、培養器Ｐ当たりのウェル１０数では無く、ウェル１０ののべ数によって達成される。したがって、複数のウェル１０を複数体の培養器Ｐによって賄わせてもよい。
【００７２】
培養器Ｐが有するウェル１０は、内壁面が表面処理により親水化されていることが好ましい。細胞が産生する抗体や、抗膜タンパク質抗体が、内壁面に非特異的に吸着するのを防止するためである。表面処理は、ウシ血清アルブミン（Bovine serum albumin；ＢＳＡ）等のブロッキング剤によるものであってもよいし、紫外線処理、プラズマ処理等の物理処理によるものであってもよいし、蒸着等のコーティングによるものであってもよい。また、これらの処理が組み合わされていてもよい。
【００７３】
ウェル１０に固定化するタンパク結合部位２としては、免疫グロブリンの定常領域に対して特異的な結合能を有している分子が好ましい。タンパク結合部位が免疫グロブリンの定常領域に結合するものであれば、抗体が持つ特異的な認識力に関わらず、抗体全般をタンパク結合部位２によって捕捉することができる。よって、候補細胞が発現している膜タンパク質に可変領域を介して結合している抗膜タンパク質抗体をも、タンパク結合部位２によって捕捉することができる。その結果、抗体非産生細胞を、タンパク結合部位２により、高い結合親和性をもって確実に捕捉することが可能になり、抗体産生細胞の選択的な分離回収の精度が高められる。
【００７４】
タンパク結合部位２を構成する分子としては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、Ｆｃ受容体、抗抗体（抗ＩｇＧ抗体）等や、これらの結合ドメインを含むペプチド断片、これらの変異体、これらの結合能を模倣しており、抗体に対する結合能を有するミメティック等が挙げられる。抗体に対する結合能を有するミメティックとしては、ペプチドミメティック及び非ペプチドミメティックのいずれであってもよい。
【００７５】
結合ドメインを含むペプチド断片の具体例としては、スタフィロコッカス・アウレウス由来のプロテインＡのＰｈｅ１３２−Ｔｙｒ１３３のジペプチドを含む断片が挙げられる。ペプチドミメティックの具体例としては、ＴＧ−１９３１８、ＴＧ−１９３２０等が挙げられる。また、非ペプチドミメティックの具体例としては、２２／８、ＴＰＮ−ＢＭ、Ａ２Ｐ、Ｂ１４等が挙げられる。タンパク結合部位２を構成する分子としては、特に、プロテインＡ、プロテインＡのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ若しくはこれらの変異体、又は、抗体に対する結合能を有するミメティックが好ましい。
【００７６】
タンパク結合部位２は、図３、図４及び図５において、温度応答性部位３の主鎖の末端に結合している。温度応答性部位３の主鎖の末端に結合することによって、温度応答性部位３が水相に相溶した状態（図３（ａ）参照）にあるときにおいては、水相中に産生ないしは添加される抗体と、タンパク結合部位２との相互作用が生じ易くなっている。その一方で、温度応答性部位３が相分離した状態（図３（ｂ）参照）にあるときにおいては、水相に相溶した状態と比較して、タンパク結合部位２に大きな立体障害が生じ易くなるため、水相中の抗体がタンパク結合部位２に捕捉されるのが防止されるようになっている。しかしながら、タンパク結合部位２は、ウェル１０の内壁面に対して直接的に結合していてもよいし、温度応答性部位３の側鎖として結合していてもよい。また、これらの結合位置のうちの複数に結合していてもよい。
【００７７】
タンパク結合部位２と、ウェル１０の内壁面や他分子との結合は、共有結合及び非共有結合のいずれでもよい。例えば、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、イミン結合、シロキサン結合、マレイミド基による結合、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応による結合、クリック反応による結合、金とチオール基による結合等が挙げられる。また、温度応答性部位３は、ウェル１０の内壁面や他分子に直接的に結合していてもよいし、リンカーを介して間接的に結合していてもよい。例えば、各種シランカップリング剤、ビオチンとアビジンとの結合、ビオチンとストレプトアビジンとの結合等を利用することができる。
【００７８】
温度応答性部位３の好ましい形態は、下限臨界溶液温度を示す分子鎖とする形態である。下限臨界溶液温度を示す温度応答性部位３は、相転移温度が、０℃以上４０℃以下の範囲であることが好ましく、１０℃以上４０℃以下の範囲であることがより好ましく、１０℃以上３０℃以下の範囲であることがさらに好ましい。このような下限臨界溶液温度を示す分子鎖であれば、熱変性等が生じ難い低温域に温度変化させることで、タンパク結合部位２を抗体と結合可能な状態に変化させることが可能であり、その変化の前には、より高温域にタンパク結合部位２を置いておくことができる。つまり、相対的に高い培養温度の下で候補細胞の培養を行った後、同じウェルにおいて引き続き、熱変性など少なくタンパク結合部位２を抗体と結合させることができるという優位性がある。
【００７９】
ウェル１０に固定化する温度応答性部位３は、図３（ａ）に示すように、水相に相溶した状態において螺旋状の立体構造をとる主鎖を有することが好ましい。一般に、高分子の立体構造が、水素結合等の分子内相互作用によって螺旋状に安定化される例が知られている。こうした分子内相互作用は、温度上昇によって比較的容易に切断され、立体構造が崩れ易い傾向がある。よって、螺旋状の立体構造をとる分子鎖は、下限臨界溶液温度を超える温度変化に伴って、タンパク結合部位２の結合能を確実に変化させることができる点で有利である。
【００８０】
温度応答性部位３としては、例えば、ポリアミノ酸、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、ポリビニルカプロラクタム、ポリビニルメチルエーテル、ポリメタクリル酸エステル等を主鎖とすることができる。これらの高分子は、一種の単量体による重合体であってもよいし、これらの各分子鎖を構成する単量体が複数種類組み合わされた共重合体であってもよい。また、共重合体としては、ランダム型、ブロック型及びグラフト型のいずれであってもよい。
【００８１】
温度応答性部位３としては、特に、ポリアミノ酸の主鎖を有することが好ましい。ポリアミノ酸は、一種のアミノ酸による重合体であってもよいし、複数種のアミノ酸による共重合体であってもよい。また、Ｄ体及びＬ体のいずれかのみによる重合体であってもよいし、これらの混成であってもよい。
【００８２】
温度応答部位３を構成するアミノ酸としては、例えば、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、システイン、アラニン、ロイシン、メチオニン等が挙げられる。これらのアミノ酸は、一般に、αへリックスを形成し易く、特にこれらのアミノ酸のＤ体及びＬ体のいずれかのみによる重合体は、温度応答部位３の主鎖を螺旋状の立体構造とするのに好適である。アミノ酸により構成される温度応答部位３の具体例としては、ε−ポリリジン吉草酸アミド、ε−ポリリジン酪酸アミド、Ｎ−ヒドロキシペンチルε−ポリリジン、Ｎ−ヒドロキシブチルε−ポリリジン等が挙げられる。
【００８３】
温度応答性部位３は、数平均分子量が、５ｋＤａ以上であることが好ましく、１０ｋＤａ以上であることがより好ましく、５０ｋＤａ以上であることがさらに好ましい。温度応答性部位３の数平均分子量がこのような範囲であると、培養器Ｐの基体９に対して温度応答性部位３を結合させる反応を行い易い点で有利である。
【００８４】
温度応答性部位３は、図３において、ウェル１０の底壁１２０ａに結合している。ウェル１０の底壁１２０ａに結合することによって、温度応答性部位３が水相に相溶した状態（図３（ａ）参照）にあるときにおいては、温度応答性部位３の主鎖の配向が安定し易くなっている。そのため、水相に相溶した状態と、相分離した状態（図３（ｂ）参照）との間で、立体構造の変化に伴うタンパク結合部位２の結合能の変化が明瞭化し、抗体産生細胞の選択的な分離回収の精度が高められようになっている。しかしながら、温度応答性部位３は、ウェル１０の底壁１２０ａに対して直接的に結合している状態のタンパク結合部位２に結合していてもよい。また、これらの結合位置のうちの両方に結合していてもよい。
【００８５】
温度応答性部位３と、ウェル１０の内壁面や他分子との結合は、タンパク結合部位２とウェル１０の内壁面や他分子との結合においてと同様に、共有結合及び非共有結合のいずれでもよい。また、温度応答性部位３は、ウェル１０の内壁面や他分子に直接的に結合していてもよいし、リンカーを介して間接的に結合していてもよい。例えば、各種シランカップリング剤、ビオチンとアビジンとの結合、ビオチンとストレプトアビジンとの結合等を利用することができる。
【００８６】
親水性部位４を構成する分子や分子鎖としては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸基、リン酸基等の親水基を有する適宜の分子や分子鎖を用いることができる。親水性部位４の具体例としては、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール等のポリオールが縮重合した縮重合体や、リン脂質や、ポリリン酸等が挙げられる。これらの中でも、親水性部位４を温度応答性部位３等に対して容易に結合させることが可能である点で、エチレングリコールを主体とするポリエチレングリコールが特に好適である。
【００８７】
親水性部位４は、平均分子量が、１００以上１０００以下であることが好ましく、２００以上８００以下であることがより好ましく、４００以上６００以下であることがさらに好ましい。また、親水性部位４は、温度応答性部位３の単量体に対するモル比が、５％以上５０％以下であることが好ましく、５％以上３０％以下であることがより好ましく、８％以上１５％以下であることがさらに好ましい。ポリリジンを主鎖とする温度応答性部位３等にこのような親水性部位４を設けると、常温付近で相転移を生じさせることができる。
【００８８】
親水性部位４は、図３、図４及び図５において、温度応答性部位３に側鎖として結合している。しかしながら、親水性部位４は、ウェル１０の内壁面に対して直接的に結合していてもよい。また、これらの結合位置のうちの複数に結合していてもよい。
【００８９】
培養器Ｐが有するウェル１０の内壁面には、図３、図４及び図５においては、タンパク結合部位２と、温度応答性部位３と、親水性部位４とが固定化されている。しかしながら、親水性部位４を備えない形態としてもよいし、親水性部位４の一部又は全部に代えて、疎水性部位を備える形態としてもよい。また、これらの分子ないし分子鎖と共に、例えば、ｐＨ応答部位等の他の機能を示す部位を有していてもよい。
【００９０】
ｐＨ応答部位は、ｐＨ変化によって可逆的に性質が変化する分子や原子団によって構成される。培養液のｐＨ変化によってｐＨ応答部位の局所的な電荷やイオン化状態を変化させることにより、高分子の親水性や疎水性を大きく変化させることができる。具体的には、例えば、カルボキシル基等のプロトン化、アミノ基等の脱プロトン化等によって水和状態を可変させることにより、高分子の水溶性を変化させたり、下限臨界溶液温度や上限臨界溶液温度を上下させたりすることが可能である。すなわち、ｐＨ応答性部位を追加的に備える形態とすることにより、タンパク結合部位２と抗体との結合親和性を迅速に変化させることが可能になる。
【００９１】
ｐＨ応答性部位としては、例えば、アミノ基、イミノ基、ホスファゼン基、グアニジノ基、ピロリル基、ピラジニル基、イミダゾリル基、ピリジニル基、ピリダジニル基、ピリミジニル基、トリアジニル基、インドリル基、イソインドリル基、カルバゾリル基、アザカルバゾリル基等や、これらの置換基を有する分子が挙げられる。また、カルボキシル基、フェノール基、ジヒドロキシボリル基、スルホン酸基、リン酸基、ホスホン酸基、ホスフィン酸基等や、これらの置換基を有する分子が挙げられる。
【００９２】
疎水性部位は、疎水基を有する分子や分子鎖によって構成される。疎水性部位は、温度応答性部位３の凝集性を高め、凝集状態にある温度応答性部位３をエネルギ的に安定化させる。そのため、温度変化によって温度応答性部位３を非凝集状態から凝集状態に相転移させ易くすることができる。
【００９３】
疎水性部位としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基といったアルキル基等や、これらの置換基を有する分子が挙げられる。
【００９４】
培養器Ｐは、分離回収の際に細胞分離装置１００の操作室１０１に、装置外から無菌的に搬入して装着してもよいし、細胞分離装置１００にあらかじめ具備させておいてもよい。例えば、操作室１０１に隣接する収納室に、あらかじめ滅菌されている複数の培養器Ｐを収納しておき、分離回収の際に、ロボットアーム等によって、逐次、ヒートブロック１０２に装着させてもよい。
【００９５】
以上の細胞分離方法や、その原理を利用した細胞分離装置１００によれば、回収される抗体産生細胞は、当初の遺伝子導入操作の後、培養操作と、温度応答性部位３に対する温度刺激等とを受けているだけであるので、マーカー遺伝子の導入等の遺伝子改変を特段受けること無く、損傷が少ない生細胞の状態で回収される。また、候補細胞の無菌的なサンプリングを行う必要が無く、少ない培養液量で多数の候補細胞の網羅的なスクリーニングを行うこともできる。そのため、時間的効率やコスト的効率が良好である。よって、以上の細胞分離装置１００や細胞分離方法によると、候補細胞群の中から抗体の産生能が高い細胞を簡易な工程で損傷少なく選抜することが可能となる。選抜された細胞は、生存状態であり損傷も少ないため、より精密な選抜を行うための二次スクリーニングや、抗体の生産等にそのまま供することもできる。
【００９６】
また、以上の細胞分離装置１００や細胞分離方法によると、複数のウェル毎に、タンパク結合部位の結合量、抗膜タンパク質抗体の添加量等の諸条件が統一されていれば、培養液中に浮遊状態で存在していた細胞数の比率を多数のウェル間で比較することによって、抗体産生能の有無のみならず、抗体産生能の優劣を判定することも可能となる。例えば、ウェルに付着状態で残存している細胞の比率が相対的に低い場合には、抗体の産生量が多かったために、添加した抗膜タンパク質抗体との競合が強まったものと判定することも可能であり、定量的な評価も行うことができる。
【実施例】
【００９７】
以下、本発明の実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれに限定されるものではない。
【００９８】
本発明の実施例として、タンパク結合部位と温度応答性部位とが固定化された培養器を作製し、抗体産生細胞の選択的な分離回収について試験した。
【００９９】
タンパク結合部位としては、下記化学式に示す非ペプチドミメティックを用いた。下記化学式に示す原子団は、プロテインＡの抗体結合能を模倣したものである。また、温度応答性部位としては、ε−ポリリジンを用いた。なお、温度応答性部位は、側鎖としてポリエチレングリコールからなる親水性部位を結合させて用いた。
【０１００】
【化１】
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【０１０１】
培養器は、詳細には、以下の手順にしたがって作製した。はじめに、１−エチル−３−カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びカルボン酸末端のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を純水に溶解させた。次いで、この溶液を４℃に冷却し、撹拌しながらポリリジンを加えた。なお、ポリリジンとしては、種々の分子量が混在している混合物を加えた。そして、常温で２時間にわたって撹拌し、側鎖としてポリエチレングリコールが結合しているＰＥＧ修飾ポリリジンを得た。
【０１０２】
次に、合成したＰＥＧ修飾ポリリジンをポリスチレン製の樹脂プレート上に固定化させた。具体的には、１ｍｏｌ％の濃度のＰＥＧ修飾ポリリジンの水溶液に、１−エチル−３−カルボジイミド（ＷＳＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を加え、表面がアミノ基によってあらかじめ修飾されている樹脂プレート「ＳＵＭＩＬＯＮ  カルボプレート」（住友ベークライト株式会社製）を浸漬させた。そして、室温で２時間にわたって反応させた後、純水で３回洗浄して、ＰＥＧ修飾ポリリジンが固定化されている樹脂プレートを得た。
【０１０３】
次に、樹脂プレートに固定化されているＰＥＧ修飾ポリリジンに非ペプチドミメティックを結合させた。具体的には、樹脂プレートを、炭酸緩衝液によって希釈した２％グルタルアルデヒド溶液に浸漬し、３７℃で２時間にわたって静置させて反応させた。次いで、反応後の樹脂プレートをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。そして、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で０．１質量％の濃度にあらかじめ調整しておいた非ペプチドミメティック溶液に樹脂プレートを浸漬させて、非ペプチドミメティックが結合したＰＥＧ修飾ポリリジンが固定化されている培養器を得た。
【０１０４】
次に、作製した培養器を用いて抗体産生細胞の選択的な分離回収を試験した。候補細胞としては、ＣＲＬ−１６０６細胞とＣＨＯ−Ｓ細胞の２種を用いた。これらの細胞株は、抗体産生能の有無があらかじめ分かっているものである。ＣＲＬ−１６０６細胞は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）に保存されているマウスハイブリドーマであり、抗フィブロネクチン抗体を細胞外に分泌する浮遊細胞である。また、ＣＨＯ−Ｓ細胞は、付着細胞であるＣＨＯ−Ｋ１細胞を遺伝子改変して浮遊細胞化した抗体産生能を有していない細胞株である。
【０１０５】
はじめに、ＣＲＬ−１６０６細胞及びＣＨＯ−Ｓ細胞のそれぞれを、非ペプチドミメティックが結合したＰＥＧ修飾ポリリジンが固定化されている培養器において培養した。ＣＲＬ−１６０６細胞の培養には、所定の無血清培地、ＣＨＯ−Ｓ細胞の培養には、ＣＤ−ＣＨＯ培地（インビトロジェン製）をそれぞれ使用し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で増殖させた。続いて、各培養液に無菌的に抗ＣＤ４４抗体と酸を添加し、培養液の液温を低下させると共にｐＨを６．５とした。そして、室温で１時間にわたって反応させた後、培養器から各培養液を回収した。
【０１０６】
その結果、ＣＲＬ−１６０６細胞を培養した培養液からは、抗体産生能を有するＣＲＬ−１６０６細胞が回収された。その一方で、ＣＨＯ−Ｓ細胞を培養した培養液からは、細胞が回収されず、抗体産生能を有していないＣＨＯ−Ｓ細胞は、培養器に付着状態で残った。すなわち、タンパク結合部位と温度応答性部位とが固定化された培養器において、候補細胞を培養した後、温度応答性部位を相転移させることにより、抗体産生細胞の選択的な分離回収を単槽において簡易な工程で行うことができることが確認された。
【符号の説明】
【０１０７】
１  内壁（支持体）
２  タンパク結合部位
３  温度応答性部位
４  親水性部位
９  基体
１０  ウェル
１００  細胞分離装置
１０１  操作室
１０２  ヒートブロック（調温手段）
１０３  ピペット装置（播種手段）
１０４  吸引ノズル（回収手段）
１０５  培養液回収槽
１０６  供給システム
１０７  培養室
１０８  ガス交換装置
１０９  温度調節装置
１１１  細胞懸濁液
１１２  培地試薬
１１３  抗膜タンパク質抗体試薬
１１４  ｐＨ調整試薬
１２０ａ  底壁
１２０ｂ  側壁
Ａ１  抗膜タンパク質抗体
Ａｂ  抗体
Ｃ  候補細胞
Ｐ  培養器
Ｐ１０  膜タンパク質
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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