(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）改変生ブタインフルエンザH3N2ウイルス及びb）改変生ブタインフルエンザH1N1ウイルスを含む、免疫原性組成物であって、当該改変生ブタインフルエンザH3N2ウイルスが、A/ブタ/テキサス/4199-2/98由来のHA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M及びNS1-126遺伝子を含み、さらに改変生ブタインフルエンザH1N1ウイルスが、A/ブタ/ミネソタ/37866/1999（H1N1）由来のHA及びNA並びにA/ブタ/テキサス/4199-2/98（H3N2）由来のPB2、PB1、PA、NP、M及びNS1-126遺伝子を含む、
前記免疫原性組成物。
【請求項２】
当該改変生ブタインフルエンザH3N2及びH1N1ウイルスが弱毒化される、請求項1に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
当該改変生ブタインフルエンザH3N2及びH1N1ウイルスが相互に相乗的に作用する、請求項1又は2に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
対象（ヒトを除く）を免疫する方法であって、前記方法が請求項1から3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を当該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項５】
ブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を必要がある対象（ヒトを除く）で治療又は予防する方法であって、前記方法が、請求項1から3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項６】
必要がある対象（ヒトを除く）でウイルス排出（物）を、同じ種の非免疫コントロール群の対象と比較して減少させる方法であって、前記方法が、請求項1から3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項７】
必要がある対象（ヒトを除く）でウイルス排出（物）を、一価の改変生ブタインフルエンザH3N2又はH1N1ウイルスで免疫された同じ種の免疫コントロール群の対象と比較して減少させる方法であって、前記方法が、請求項1から3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項８】
抗SIV抗体を有する対象（ヒトを除く）をワクチン免疫する方法であって、前記方法が、請求項1から3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物のシングル有効用量を当該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項９】
対象（ヒトを除く）で初期SIV感染を予防又は軽減する方法であって、前記方法が、請求項1から3のいずれか1項に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記対象がブタ、ウシ、ネコ及びイヌから成るリストから選択される、請求項4から9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
当該免疫原性組成物が1回投与される、請求項4から10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
当該免疫原性組成物が、生後1カ月齢以内、生後2週齢以内又は生後1週齢以内のブタに投与される、請求項4から11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
当該改変生ブタインフルエンザH3N2及びH1N1ウイルスが相互に相乗的に作用する、請求項4から12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
当該改変生ブタインフルエンザH3N2ウイルスが、異種チャレンジ、H1チャレンジ及び/又はH1N1チャレンジに対する防御を増大させる、請求項4から13のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（配列表）本出願は37 C.F.R 1.821−1.825にしたがい配列表を含む。本出願に付随する配列表は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
（技術分野）
【背景技術】
【０００２】
ブタのインフルエンザ感染は1918年に初めて報告され、最初のブタインフルエンザウイルスは1930年にブタから単離された（Shope, R.E., 1931, J. Exp. Med. 54:373- 385）。ブタインフルエンザ（SI）は、A及びC型インフルエンザウイルスによって引き起こされるブタの急性呼吸器疾患である。その重篤性は、宿主の齢、ウイルス株及び二次感染を含む多くの因子に左右される（Easterday, 1980, Philos Trans R Soc LondB Biol Sci 288:433-7）。1998年以前には、主として“古典的”H1N1 SIウイルス（SIV）が米国でブタから単離された（Kida et al, 1994, J Gen Virol 75:2183-8；Scholtissek, 1994, Eur J Epidemiol 10:455-8；Olsen et al, 2000, Arch Virol. 145:1399-419）。1998年にH3N2亜型のSIVが米国の多くの州で単離された。
SIVの複製は、ブタの上及び下気道、鼻粘膜、篩骨、扁桃、気管並びに肺の上皮細胞に限定され、ウイルスの排出及び伝播はもっぱら呼吸経路を介して生じる。感染性ウイルスはしたがって、記載組織の他に扁桃、気管支肺胞洗浄（BAL）液及び鼻、扁桃又は口咽頭ぬぐい液からも単離され得る（Kristien Van Reeth and Wenjun Ma, 2013, Current Topics in Microbiology and Immunology 370: 173-200）。
【０００３】
インフルエンザビリオンは、一本鎖RNAゲノムを含む内部核タンパク質コア（らせん状ヌクレオカプシド）、及びマトリックスタンパク質（M1）により内側に一列に並んだ外側リポタンパク質エンベロープから成る。セグメントに分割されたインフルエンザAウイルスゲノムは8分子の線状マイナス極性一本鎖RNAから成り、前記は11のポリペプチドをコードする。前記ポリペプチドは以下を含む： RNA依存RNAポリメラーゼタンパク質（PB2、PB1及びPA）及びヌクレオカプシドを形成する核タンパク質（NP）；マトリックス膜タンパク質（M1、M2）；脂質を含むエンベロープから突き出た2つの表面糖タンパク質、ヘマグルチニン（HA）及びノイラミニダーゼ（NA）；非構造性タンパク質（NS1）、核外搬出タンパク質（NEP）；及びアポトーシス促進因子PB1-F2。
A型インフルエンザウイルスは17のH（ヘマグルチニン）及び10のN（ノイラミニダーゼ）亜型に分けられ、それらは可能な多くの組み合わせを生じ得る（H1N1、H1N2、H2N1、H2N2、H5N1、H5N2などと称される）（Tong et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 109: 4269-4274）。ヘマグルチニン（HA）は感染細胞表面へのウイルスの付着に役割を果たし、一方、ノイラミニダーゼ（NA）は感染細胞の子孫ウイルスの放出に役割を果たし、したがってNAはウイルスの拡散で役割を果たす（Wang et al., 2009, Biochem. Biophys. Res. Commun., 386: 432-436）。
【０００４】
インフルエンザウイルスの病原性は多くのウイルス及び宿主因子によって調節される。ウイルス感染と戦う宿主因子のうち、I型インターフェロン（IFN[アルファ]/[ベータ]）系は本来備わっている強力な抗ウイルス防御メカニズムであり、前記は真核生物の進化の比較的初期に確立された（Garcia-Sastre, 2002, Microbes Infect 4:647-55）。インフルエンザAウイルスは感染細胞で非構造性タンパク質、NS1を発現し、前記は細胞のIFN[アルファ]/[ベータ]応答に対抗する（Garcia-Sastre et al., 1998, Virology 252:324-30)）。
以下に記載されているように、NS1の改変を利用して、生弱毒化SIVを作製することができる：Solorzano et al. 2005 J Virol 79:7535-7543；Vincent et al 2012 Journal of Virology 19: 10597−10605及びWO 2006/083286 A2。H3N2 SIV（sw/テキサス/4199-2/98, Tx/98）のNS1切詰めタンパク質であって73、99又は126アミノ酸を有するものを発現する弱毒化SIV（Tx/98 NS1D73、Tx/98 NS1D99、及びTx/98 NS1D126）が逆遺伝学を用いて作製された。
しかしながら、ブタインフルエンザウイルス（SIV）に対して現在利用可能な市場のワクチンは、筋肉内注射のためにH1N1及び/又はH3N2及び/又はH1N2 SIVを土台にした不活化アジュバント添加全ウイルスワクチンである（Kristien Van Reeth and Wenjun Ma, 2013, Current Topics in Microbiology and Immunology 370: 173-200）。ワクチン接種及び/又は自然感染によりSIVに対して高い抗体レベルを有する雌ブタ群では、仔豚のワクチン接種は、母獣由来抗体（MDA）による干渉を回避するために12−16週齢まで延期されるはずである。
【０００５】
死滅ウイルスワクチンによって誘導される免疫応答には2つの主要な弱点が存在する。第一に、そのようなワクチンは血清抗体のみを誘発して粘膜抗体を誘発せず、さらにまた、当該ワクチン誘発血清HI抗体力価は、ブースターワクチン接種後2から6週間の間に急速に低下する。第二に、一般的に不活化ワクチンは抗原提示の内因性経路に進入せず、ウイルス特異的CD8+T細胞又はCTL応答を活性化できない。
さらにまた、コンビネーションワクチンを作製するために種々の抗原を組み合せるとき、単一成分の有効性は干渉と呼ばれる現象によって影響を受けることがある。
大半のSIVワクチンが雌ブタのワクチン接種に用いられ長期持続する母獣SIV抗体を仔豚にもたらすので、さらに別の問題が生じる（Markowska-Daniel et al., 2011, Veterinary Immunology and Immunopathology, 142: 81-86）。これに関して、長期化した母獣免疫のために仔豚のワクチン接種を雌ブタのワクチン接種と組み合わせることは困難となろう。
したがって、高度に有効で幼齢期に投与できるSIVワクチンが希求される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の特徴を述べる前に、本明細書及び特許請求の範囲で用いられるように、単数形“a”、“an”、及び“the”は、文脈が明らかにそうではないことを示さないかぎり複数の対応語を含むことを記さねばならない。したがって、例えば“an antigen（抗原）”と言えば複数の抗原を含み、“virus（ウイルス）”と言えば1つ以上のウイルス及び当業者に公知のその等価物を指すという類である。特段に規定されなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する分野の業者の1人が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び材料に類似するか又はそれらと等価のいずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験に用いることができるが、好ましい方法、装置、及び材料をこれから述べる。本明細書に記載の全ての刊行物は、本発明との関連で用い得る、当該刊行物に報告された細胞株、ベクター、及び方法論を記載及び開示する目的のために参照により本明細書に含まれる。本明細書のいずれも、先発明のためにそのような開示に本発明が先行する資格をもたないということを容認するものと解されるべきではない。
【０００７】
本発明は、従来技術に固有の問題を解決し、最先端技術で明瞭な進歩を提供する。一般的に、本発明は、a）改変された生ブタインフルエンザH3ウイルス、及びb）改変された生ブタインフルエンザH1ウイルスを含む免疫原性組成物を提供する。
都合の良いことに、本発明によって提供される実験データは、本明細書に提供する免疫原性組成物の安全性及び有効性並びにいくつかの利点を開示する。特に、本明細書に提供するデータは、2つの改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルス成分間には干渉が無いことを示している。さらにまた、本明細書に提供する実験データは、2つの改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルス成分は相互に相乗的に作用するという証拠を明確に提供する。
さらにまた、交差防御効果が本発明の二価ワクチンについて観察された。
加えて、本発明によって提供される実験データは、幼齢期の仔豚（数日齢の仔豚）及び母獣由来抗体を有する仔豚に投与されるとき、本明細書に提供する免疫原性組成物の安全性及び有効性を開示する。したがって、本明細書に提供する免疫原性組成物は母獣由来抗体と干渉しないことが観察された。
【０００８】
“免疫原性組成物”という用語は、少なくとも1つの抗原を含む組成物を指し、前記抗原は、当該免疫原性組成物が投与される宿主に免疫学的応答を引き出す。そのような免疫学的応答は、本発明の免疫原性組成物に対する細胞性及び/又は抗体媒介免疫応答であり得る。好ましくは、免疫原性組成物は免疫応答を誘発し、より好ましくは、SIV感染の1つ以上の臨床徴候に対する防御免疫を付与する。宿主はまた“対象動物”と記載される。好ましくは、本明細書に記載又は言及する宿主又は対象動物はいずれも動物である。
通常、“免疫応答”には以下の作用が含まれる（ただしこれらに限定されない）：本発明の免疫原性組成物に含まれる1つの抗原又は複数の抗原に特異的に向けられる、抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、サプレッサーT細胞、及び/又は細胞傷害性T細胞及び/又はガンマ-デルタT細胞の産生又は活性化。好ましくは、宿主細胞は防御的な免疫学的応答又は治療的応答を示す。
“防御的な免疫学的応答”又は“防御免疫”は、感染宿主によって通常示される臨床徴候の軽減又は欠如、より迅速な回復期間、及び/又はより短い感染性持続期間、又は感染宿主の組織若しくは体液又は排泄物中のより低い病原体力価によって示されるであろう。
宿主が防御的な免疫学的応答を示し、新規な感染に対する耐性が強化されるか、及び/又は疾患の臨床的重篤度が軽減される場合に、当該免疫原性組成物は“ワクチン”と記載される。
“感染”又は“感染した”という用語はSIVによる対象動物の感染を指す。
【０００９】
“ブタインフルエンザウイルス”という用語は当業者には公知である。ブタインフルエンザウイルスという用語は、ブタインフルエンザを引き起こすオルトミクソウイルスファミリーのA型及びC型インフルエンザウイルスを指す。オルトミクソウイルスは3つのグループ（A型、B型及びC型）を有するが、A型及びC型インフルエンザウイルスだけがブタに感染する。ブタインフルエンザウイルスの亜型にはH1N1、H1N2、H3N2及びH3N1が含まれる。H9N2及びH5N1もまたブタで見出されることがある。好ましくは、ブタインフルエンザウイルスはブタから単離されたインフルエンザウイルスである。ブタインフルエンザウイルスはブタNS1遺伝子を含む。代表的なブタNS1遺伝子は、公開配列データベース（例えばGenbank）で見いだされ、Genbankアクセッション番号AJ293939（A/ブタ/イタリア/13962/95(H3N2)）及びGenbankアクセッション番号AJ344041（A/ブタ/コート=ダルモール/1121/00(H1N1))が含まれる（ただしこれらに限定されない）。ブタインフルエンザウイルス変種の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：A/ブタ/コロラド/1/77、A/ブタ/コロラド/23619/99、A/ブタ/こーと＝ダルモール/3633/84、A/ブタ/イギリス/195852/92、A/ブタ/フィニステール/2899/82、A/ブタ/香港/10/98、A/ブタ/香港/9/98、A/ブタ/香港/81/78、A/ブタ/イリノイ/100084/01、A/ブタ/イリノイ/100085A/01、A/ブタ/イリノイ/21587/99、A/ブタ/インジアナ/1726/88、A/ブタ/インジアナ/9K035/99、A/ブタ/インジアナ/P12439/00、A/ブタ/アイオワ/30、A/ブタ/アイオワ/15/30、A/ブタ/アイオワ/533/99、A/ブタ/アイオワ/569/99、A/ブタ/アイオワ/3421/90、A/ブタ/アイオワ/8548-1/98、A/ブタ/アイオワ/930/01、A/ブタ/アイオワ/17672/88、A/ブタ/イタリア/1513-1/98、A/ブタ/イタリア/1523/98、A/ブタ/韓国/CY02/02、A/ブタ/ミネソタ/55551/00、A/ブタ/ミネソタ/593/99、A/ブタ/ミネソタ/9088-2/98、A/ブタ/ネブラスカ/1/92、A/ブタ/ネブラスカ/209/98、A/ブタ/オランダ/12/85、A/ブタ/ノースカロライナ/16497/99、A/ブタ/ノースカロライナ/35922/98、A/ブタ/ノースカロライナ/93523/01、A/ブタ/ノースカロライナ/98225/01、A/ブタ/ウーデンローデ/7C/96、A/ブタ/オハイオ/891/01、A/ブタ/オクラホマ/18717/99、A/ブタ/オクラホマ/18089/99、A/ブタ/オンタリオ/01911-1/99、A/ブタ/オンタリオ/01911-2/99、A/ブタ/オンタリオ/41848/97、A/ブタ/オンタリオ/97、A/ブタ/ケベック/192/81、A/ブタ/ケベック/192/91、A/ブタ/ケベック/5393/91、A/ブタ/台湾/7310/70、A/ブタ/テネシー/24/77、A/ブタ/テキサス/4199-2/98、A/ブタ/ウィスコンシン/125/97、A/ブタ/ウィスコンシン/136/97、A/ブタ/ウィスコンシン/163/97、A/ブタ/ウィスコンシン/164/97、A/ブタ/ウィスコンシン/166/97、A/ブタ/ウィスコンシン/168/97、A/ブタ/ウィスコンシン/235/97、A/ブタ/ウィスコンシン/238/97、A/ブタ/ウィスコンシン/457/985、A/ブタ/ウィスコンシン/458/98、A/ブタ/ウィスコンシン/464/98及びA/ブタ/ウィスコンシン/14094/99。
【００１０】
“H1N1”及び“H3N2”という用語は当業者には公知である。しかしながら、一般的には、A型インフルエンザウイルスは17のH（ヘマグルチニン）及び10のN（ノイラミニダーゼ）亜型に分類され、それらは多くの可能な組み合わせを生じ得る（H1N1、H1N2...H2N1、H2N2...H5N1、H5N2などと称される）。したがって、“H1N1”及び“H3N2”という用語は、SIVのヘマグルチニン（HA）及びノイラミニダーゼ（NA）亜型の特定の組み合わせを指す。
“NS1”という用語は当業者には公知である。特に、“NS1”は、インフルエンザの非構造性タンパク質（NS1）をコードする遺伝子を指す。NS1は、インフルエンザA及び他のウイルスのセグメント分割ゲノムによってコードされる8つの分子の1つである。代表的なブタNS1遺伝子は公開配列データベース（例えばGenbank）で見いだされ、Genbankアクセッション番号AJ293939（A/ブタ/イタリア/13962/95（H3N2））及びGenbankアクセッション番号AJ344041（A/ブタ/コート=ダルモール/1121/00（H1N1））が含まれる（ただしこれらに限定されない）。しかしながら、NS1という用語はNS1遺伝子を指すだけではなく、NS1遺伝子によってコードされるNS1遺伝子生成物（例えばRNA又はタンパク質）もまた指す。タンパク質の場合には、NS1遺伝子生成物は完全長であり、野生型NS1活性を有する（例えばインフルエンザA/ブタ/テキサス/4199-2/98に由来するもの）。完全長の野生型ブタNS1タンパク質は217から237アミノ酸の間で変動する。しかしながら、大半の事例で、完全長の野生型ブタNS1タンパク質は219アミノ酸である。さらにまた、“NS1欠失”という用語は、NS1タンパク質内で1つ以上のアミノ酸が欠失していること、及びNS1遺伝子又はヌクレオチド配列内でそれぞれ1つ以上の核酸が欠失していることを意味する。
【００１１】
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9及びN10から成る群から選択されるN（ノイラミニダーゼ）亜型を有する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスはブタインフルエンザH3N2である。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスはブタインフルエンザウイルスH1N1である。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスはNS1遺伝子に1つ以上の変異を有する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスはNS1遺伝子内に欠失を有する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは弱毒化ブタインフルエンザウイルスである。
【００１２】
“弱毒化された”という用語は減弱病毒性を有する病原体を指す。本発明では、“弱毒化”は“非病毒性”と同義語である。本発明では、弱毒化SIVは、ブタインフルエンザ感染の臨床徴候を引き起こさないが、標的哺乳動物で免疫応答を誘発できるように病毒性が減弱されてあるものであるが、前記はまた、非弱毒化SIVに感染しかつ当該弱毒化ウイルスを投与されていない動物である“コントロール群”と比較して、当該弱毒化SIVに感染した動物で臨床徴候が発生率又は重篤度において軽減されることを意味する。この文脈では、“軽減する/軽減される”という用語は、上記に規定したコントロール群と比較して少なくとも10%、好ましくは25%、さらに好ましくは50%、なお好ましくは60%、なお好ましくは70%、なお好ましくは80%、なお好ましくは90%、なお好ましくは95%、もっとも好ましくは100%の軽減を意味する。したがって、弱毒化された、非病毒性SIV株は、改変された生SIVを含む免疫原性組成物に取り込むために適切な株である。
したがって、本発明は、a）弱毒化改変生ブタインフルエンザH3ウイルス及びb）弱毒化改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含む免疫原性組成物を提供する。
好ましくは、本明細書で言う“弱毒化”という用語は、例えばNS1遺伝子又はタンパク質の切詰めによるゲノム配列の遺伝的に操作された変化を特に指し、前記は特に、同じ条件下で及び/又は不完全なIFNアンタゴニスト活性を有する条件下で増殖させたとき、感染宿主で野生型ブタインフルエンザウイルスよりも顕著に低いウイルス増殖又は力価を生じる。
【００１３】
本発明の別の特徴では、本発明のブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは不活化されて全不活化ウイルスを生じる。したがって、本発明はまた、a）不活化ブタインフルエンザH3ウイルス及びb）不活化ブタインフルエンザH1ウイルスを含む免疫原性組成物を指す。好ましくは、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスはブタインフルエンザH3N2であり、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスはブタインフルエンザウイルスH1N1である。
通常的ないずれの不活化方法も本発明の目的に用いることができる。したがって、不活化は、当業者に公知の化学的及び/又は物理的処理によって実施できる。好ましい不活化方法には、2-ブロモエチレンアミンヒドロブロミド（BEA）溶液（前記は二元エチレンアミンに環化されてある）の添加を含む環化二元エチレンイミン（BEI）の添加が含まれる。好ましいさらに別の化学的不活化剤にはトリトンX-100、デオキシコール酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、β-プロピオラクトン、チメロサール、フェノール及びホルムアルデヒド（ホルマリン）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。しかしながら、不活化はまた中和工程を含むことができる。好ましい中和剤にはチオ硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウムなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
好ましいホルマリン不活化条件には、約0.02%（v/v）−2.0%（v/v）、より好ましくは約0.1%（v/v）−1.0%（v/v）、さらに好ましくは約0.15%（v/v）−0.8%（v/v）、なお好ましくは約0.16%（v/v）−0.6%（v/v）、もっとも好ましくは約0.2%（v/v）−0.4%（v/v）のホルマリン濃度が含まれる。インキュベーション時間はH3N2及びH1N1 NS1欠失変異体の耐性に左右される。一般的には、不活化プロセスは、H3N2及びH1N1 NS1欠失変異体の増殖が適切な培養系で検出できなくなるまで実施される。
好ましくは、不活化ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは、好ましくは上記に記載の濃度を用いてホルマリン不活化される。
本発明の不活化ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは、公知の技術、例えば以下に記載された技術を用いてリポソームに取り込むことができる（Nature, 1974, 252, 252-254；又はJournal of Immunology, 1978, 120, 1109-13）。本発明の別の実施態様では、本発明の不活化ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは、適切な生物学的化合物（例えば多糖類、ペプチド、タンパク質など、又は前記の組み合わせ）と複合化できる。
【００１４】
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは変異導入ウイルス又は再集合体である。
“変異導入ウイルス”という用語は変異を有するウイルスを指す。本発明の文脈における“変異”という用語は、ゲノム配列における、特にブタインフルエンザウイルスのRNA配列における変化と理解される。例えば、変異ウイルスは、天然における変動、UV照射への暴露、化学的変異原への暴露によって、非許容宿主での継代によって、再集合によって（すなわち弱毒化されたセグメント分割ウイルスと所望の抗原を有する別の株との共同感染によって）、及び/又は遺伝子操作によって（例えば“逆遺伝学”を用いる）作製できる。
好ましくは、変異はSIVのNS1遺伝子又はタンパク質の欠失である。
“再集合体”という用語は、ゲノムセグメントがブタインフルエンザの別の株又は亜型と交換されてあるブタインフルエンザウイルスを指す。ブタインフルエンザウイルスAはセグメント分割ゲノムを有し、したがって弱毒化表現型は再集合によって別の株に移すことができる（すなわち、弱毒化ウイルスと所望株との共同感染及び両表現型を示す再集合体の選別によって）。したがって、再集合技術を用いて、親のブタインフルエンザウイルス株（天然の変異体、変異導入ウイルス、又は遺伝的に操作されたウイルス）由来の弱毒化表現型を異なるウイルス株（野生型ウイルス、天然の変異体、変異導入ウイルス、又は遺伝的に操作されたウイルス）に移すことができる。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは遺伝的に操作される。
【００１５】
“遺伝的に操作される”という用語は、“逆遺伝学”アプローチを用いることによって変異されてあるブタインフルエンザウイルスを指す。好ましくは、本発明のNS1欠失変異体は遺伝的に操作されてある。逆遺伝学技術は、ブタインフルエンザウイルスRNAの非コード領域を含む合成組換えウイルスRNAの調製を必要とする（前記非コード領域は、ウイルスポリメラーゼによる認識及び成熟ビリオンの生成に必要なパッケージングシグナルに必須である）。組換えRNAは組換えDNA鋳型から合成され、精製ウイルスポリメラーゼ複合体によりin vitroで再構成されて組換えリボ核タンパク質（RNP）を形成する。前記RNPを用いて細胞をトランスフェクトすることができる。合成RNAのin vitro又はin vivo転写時にウイルスポリメラーゼタンパク質が存在するならば、より効率的なトランスフェクションが達成される。合成組換えRNPを感染性ウイルス粒子中にレスキューできる。前述の技術は当業者には周知である。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは障害されたインターフェロンアンタゴニスト表現型を有する。
【００１６】
“障害されたインターフェロンアンタゴニスト表現型”という用語は、細胞のインターフェロン免疫応答の低下又は阻害を示すブタインフルエンザウイルスを指す。好ましくは、ブタインフルエンザウイルスはインターフェロン発現及び/又は活性の低下又は阻害を示す。好ましくは、インターフェロン（IFN）の1つ又は2つのタイプの発現及び/又は活性が低下又は阻害される。本発明のある特徴では、IFN-[アルファ]の発現及び/又は活性が影響を受ける。別の特徴では、IFN-[ベータ]の発現及び/又は活性が影響を受ける。別の特徴では、IFN-[ガンマ]の発現及び/又は活性が影響を受ける。好ましくは、IFN-[ベータ]及び/又はIFN-[ガンマ]の発現及び/又は活性は、IFN-コンピテント系（例えば野生型細胞又は同じ条件下の動物）でコントロール（例えばPBS又はインターフェロンアンタゴニスト活性をもたないタンパク質）と比較したとき、インターフェロンアンタゴニスト活性を有するタンパク質、ポリペプチドなどによって、5−10%、10−20%、20−30%、30−40%、40−50%、50−60%、60−70%、70−80%、80−90%、又はそれより大きく低下する。より好ましくは、IFN-[ベータ]及び/又はIFN-[ガンマ]の発現及び/又は活性は、同じ条件下のIFN-コンピテント系でコントロール（例えばPBS又はインターフェロンアンタゴニスト活性をもたないタンパク質）と比較したとき、インターフェロンアンタゴニスト活性を有するタンパク質、ポリペプチドなどによって、約1から約100倍、約5から約80倍、約20から約80倍、約1から約10倍、又は約1から約5倍、又は約40から約80倍、又は1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100倍低下する。
したがって、本発明の別の特徴では、免疫原性組成物は、a）弱毒化された改変生ブタインフルエンザH3ウイルス及びb）弱毒化された改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含み、ここで両成分は細胞のインターフェロン応答に対抗するNS1遺伝子生成物の能力の低下を示す。
【００１７】
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは、NS1タンパク質のカルボキシ末端に1つ以上の変異を有する。
“カルボキシ末端”という用語は当業者には周知である。カルボキシ末端はまた、カルボキシル末端、C-末端、C-末端テール、C-末端終末部、又はCOOH-末端と称される。タンパク質がメッセンジャーRNAから翻訳されるとき、タンパク質はN-末端からC-末端へ向けて生成される。したがって、カルボキシ末端は、遊離カルボキシル基（-COOH）で終わるアミノ酸鎖（タンパク質又はポリペプチド）の終末部である。
“変異”という用語は既に上記に記載されてある。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスはカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質を有する。
“カルボキシ末端を切り詰められた”という用語は、NS1タンパク質のカルボキシ末端の切詰めを指す。“カルボキシ末端”という用語は上記に既に記載されている。“切り詰められた又は切詰め”という用語は、NS1タンパク質内の1つ以上のアミノ酸の欠失又はNS1遺伝子若しくはヌクレオチド配列内の1つ以上の核酸の欠失を指す。したがって、NS1遺伝子生成物のアミノ末端領域の部分は保持され、一方、NS1遺伝子生成物のカルボキシ末端領域の部分は欠失する。
【００１８】
好ましくは、本発明の弱毒化ブタインフルエンザウイルスはNS1遺伝子に変異を含むゲノムを含み、前記変異は、NS1のカルボキシ末端から5、好ましくは10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、100、105、110、115、119、120、121、125、130、135、140、145、146、147、148、150、155、160、165、170又は175アミノ酸残基から成る欠失、又はカルボキシ末端から5−170、25−170、50−170、100−170、90−160、100−160又は105−160、90−150、5−75、5−50又は5−25のアミノ酸残基の欠失をもたらす。
より好ましくは、本発明の弱毒化ブタインフルエンザウイルスはNS1遺伝子に変異を含むゲノムを含み、前記変異は、アミノ酸残基1−130、アミノ酸残基1−129、アミノ酸残基1−128、アミノ酸残基1−127、アミノ酸残基1−126、アミノ酸残基1−125、アミノ酸残基1−124、アミノ酸残基1−123、アミノ酸残基1−122、アミノ酸残基1−121、アミノ酸残基1−120、アミノ酸残基1−115、アミノ酸残基1−110、アミノ酸残基1−100、アミノ酸残基1−99、アミノ酸残基1−95、アミノ酸残基1−85、アミノ酸残基1−80、アミノ酸残基1−75、アミノ酸残基1−73、アミノ酸残基1−70、アミノ酸残基1−65、アミノ酸残基1−60（ここでアミノ末端アミノ酸が番号1である）を除くNS1遺伝子生成物の全アミノ酸残基の欠失をもたらす。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスはカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質を含み、前記タンパク質はNS1アミノ酸1から124、1から125、1から126、1から127、又は1から128を含む（ここでアミノ末端アミノ酸が番号1である）。
【００１９】
したがって、本発明の別の特徴では、免疫原性組成物は、a）弱毒化された改変生ブタインフルエンザH3ウイルス及びb）弱毒化された改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含み、これにより両ウイルスは、NS1アミノ酸1から124、1から125、1から126、1から127、又は1から128を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質を有する（ここでアミノ末端アミノ酸が番号1である）。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは、NS1アミノ酸1から126を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質を有する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスはカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質を有し、前記はNS1のカルボキシ末端から91、92、93又は94アミノ酸残基の欠失をもたらす。
カルボキシ末端の欠失は、NS1タンパク質のカルボキシ末端から85から100、より好ましくは90から95、さらに好ましくは91から94アミノ酸残基から成る欠失を含む。もっとも好ましくは、NS1タンパク質のカルボキシ末端から91、92、93又は94アミノ酸残基が欠失する。より好ましくは、NS1タンパク質のカルボキシ末端から93アミノ酸残基が欠失する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは、A/ブタ/テキサス/4199-2/98由来のNS1遺伝子又はタンパク質を有する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、NS1アミノ酸1から124、1から125、1から126、1から127、又は1から128を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードす（ここでアミノ末端アミノ酸が番号1である）る。
本発明の別の特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、NS1アミノ酸1から126を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードする（ここでアミノ末端アミノ酸が番号1である）。
【００２０】
本発明の別の特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスはカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードし、前記タンパク質はNS1のカルボキシ末端から91、92、93又は94アミノ酸残基の欠失をもたらす。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスはA/ブタ/テキサス/4199-2/98である。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスはTX/98/del 126である。
“TX/98/del 126”という用語は、A/ブタ/テキサス/4199-2/98株であって、NS1アミノ酸1から126で構成されるカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードするNS1欠失変異体を有するものを指す（ここでアミノ末端アミノ酸が番号1である）。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、A/ブタ/テキサス/4199-2/98由来のHA、NA、PB2、PB1、PA、NP及びMを含み、NS1-126遺伝子はA/ブタ/テキサス/4199-2/98由来である。
“HA、NA、PB2、PB1、PA、NP及びM”という用語は、ブタインフルエンザウイルスの遺伝子セグメント又は遺伝子を指す。一般的に、インフルエンザAゲノムは、11のタンパク質をコードする8つの遺伝子セグメントを含む。これらのタンパク質には、RNA依存RNAポリメラーゼタンパク質（PB2、PB1及びPA）及びヌクレオカプシドを形成する核タンパク質（NP）；マトリックス膜タンパク質（M1、M2）；脂質を含むエンベロープから突き出た2つの表面糖タンパク質、ヘマグルチニン（HA）及びノイラミニダーゼ（NA）；非構造性タンパク質（NS1）、核外搬出タンパク質（NEP）；及びアポトーシス促進因子PB1-F2が含まれる。
【００２１】
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、WO 2006/083286 A2に記載されているTX/98/del126と称されるブタインフルエンザウイルスのH3N2 NS1欠失変異体である。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、
a．そのcDNAが配列番号:1又は配列番号:2に示される核酸配列と少なくとも70%同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又は
b．配列番号:3又は配列番号:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又は
c．配列番号:3又は配列番号:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含む。
好ましくは、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、配列番号:1又は配列番号:2に示されるNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むことを特徴とするか、又は配列番号:3又は配列番号:4に示されるアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むことを特徴とするか、又は配列番号:3又は配列番号:4に示されるアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含むことを特徴とする。
しかしながら、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスはまたブタインフルエンザウイルスの変種を包含するであろう。そのような変種は、上記の特徴を有する（配列番号:1から4を特徴とする）特定の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスと本質的に同じ免疫学的特性を有する。インフルエンザAウイルスのHA及びNA表面糖タンパク質はワクチン誘発免疫に関係し、それぞれ免疫学的特性を保有する。“本質的に同じ免疫学的特性を有する”という用語は、前記変種が、下記に記載するブタインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる臨床徴候の治療若しくは予防において又は下記に記載する有効性パラメーターの改善において本質的に有効であること（ただし前記に限定されない）を含蓄する。
【００２２】
さらにまた、本発明でいう変種は、以下を含む改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含むであろうとことは理解されよう：
a．そのcDNAが配列番号:1又は配列番号:2に示される核酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列、又は
b．配列番号:3又は配列番号:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列、又は
c．配列番号:3又は配列番号:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質。
【００２３】
“遺伝子又は遺伝子セグメント”という用語は当業者には周知である。しかしながら、上記で説明したように、インフルエンザAのゲノム（例えばSIVのゲノム）は、11のタンパク質をコードする8つの遺伝子セグメントを含む。
“NA及びHA”という用語は上記で既に規定されている。HA（ヘマグルチニン）及びNA（ノイラミニダーゼ）は、インフルエンザAウイルス（例えばSIV）の表面糖タンパク質である。さらに、NAは中和抗体の主要な抗原標的である。
“核酸配列”という用語は、DNA分子、RNA分子、cDNA分子又は前記の誘導体を含むポリヌクレオチドを指す。当該用語は一本鎖とともに二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。本発明の核酸は、単離ポリヌクレオチド（すなわちその天然の環境から単離されたポリヌクレオチド）及び遺伝的改変形を包含する。さらにまた、化学的に改変されたポリヌクレオチドもまた含まれ、前記には、天然に存在する改変ポリヌクレオチド（例えばグリコシル化又はメチル化ポリヌクレオチド）又は人工的に改変されたポリヌクレオチド（例えばビオチン化ポリヌクレオチド）が含まれる。さらにまた、上述のNA及びHAタンパク質は、縮退遺伝子暗号のために多数のポリヌクレオチドによってコードされ得ることは理解されよう。さらに、“核酸”及び“ポリヌクレオチド”という用語は相互に用いることができ、任意の核酸を指す。“核酸”及び“ポリヌクレオチド”という用語はまた特に、5つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の他の塩基で構成される核酸を含む。
“cDNA”という用語は相補性DNAを指し、前記は、逆転写酵素によって触媒される反応でメッセンジャーRNA（mRNA）鋳型から合成される。しかしながら、“cDNA”という用語は当業者には周知である。
“アミノ酸配列”、“ポリペプチド”及び“タンパク質”という用語は互換的に用いられる。“アミノ酸配列”という用語は、天然に存在するアミノ酸とともにその誘導体で構成されるアミノ酸の配列を指す。天然に存在するアミノ酸は当業界では周知であり、生化学の標準的なテキストに記載されている。アミノ酸配列内では、アミノ酸はペプチド結合によって結び付けられる。さらに、アミノ酸配列の2つの終末は、カルボキシル末端（C-末端）及びアミノ末端（N-末端）と称される。
【００２４】
“同一性”という用語は当業界で公知であり、2つ以上のポリペプチド配列又は2つ以上のポリヌクレオチド配列（すなわち参照配列）と当該参照配列と比較するために与えられる1つの配列との間の関係を指す。配列同一性は、当該与えられた配列を当該参照配列と、それら配列を最適にアラインメントし、そのような配列の鎖間の一致によって決定される最高度の配列類似性を達成した後で比較することによって決定される。そのようなアラインメントに際して、配列同一性は位置毎に1つずつ確認される。例えば、特定の位置でヌクレオチド又はアミノ酸残基が同一であるならば、配列は当該位置で“同一”である。そのような位置同一の総数を参照配列中のヌクレオチド又は残基の総数で割ることによって、％配列同一性が与えられる。配列同一性は公知の方法によって容易に計算できる。前記方法には以下に記載の方法が含まれる（ただしこれらに限定されない）：Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press, 1987；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991；及びCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073, 1988（これら文献の教示は参照により本明細書に含まれる）。配列同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列間で最大の一致をもたらすように設計される。配列同一性を決定する方法は、与えられた配列間の配列同一性を決定する公開コンピュータプログラムで集大成されている。そのようなプログラムの例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：GCGプログラムパッケージ（Devereux, J., et al.  Nucleic Acids Research, 12(1):387, 1984）、BLASTP、BLASTN及びFASTA（Altschul, S. F. et al.  J. Molec. Biol., 215:403-410, 1990）。BLASTXプログラムはNCBI及び他の供給源（BLAST Manual, Altschul, S. et al.  NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al.  J. Molec. Biol., 215:403-410, 1990（前記の教示は参照により本明細書に含まれる））から公開されている。これらのプログラムは、与えられた配列と参照配列との間で最高レベルの配列同一性を生じるために、デフォルトギャップウエイトを用いて最適に配列をアラインメントする。参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも例えば85%、好ましくは90%、さらに好ましくは95%の“配列同一性”を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを例にとれば、与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、当該与えられたポリヌクレオチド配列が当該参照ヌクレオチド配列の100ヌクレオチド毎に15まで、好ましくは10まで、さらに好ましくは5までの点変異を含み得ることを除いて、当該参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と比べて少なくとも例えば85%、好ましくは90%、さらに好ましくは95%の同一性を有するポリヌクレオチドでは、当該参照配列のヌクレオチドの15%まで、好ましくは10%まで、さらに好ましくは5%までが欠失若しくは別のヌクレオチドで置換され得るか、又は当該参照配列中の総ヌクレオチドの15%まで、好ましくは10%まで、さらに好ましくは5%までの数のヌクレオチドが当該参照��列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、当該参照配列の5’若しくは3’末端の位置又はそれら末端の位置の間の任意の位置に存在するか、参照配列のヌクレオチドの間に個々に分散されるか、又は参照配列内の1つ以上の連続するグループとして存在し得る。同様に、参照アミノ酸配列に対して少なくとも例えば85%、好ましくは90%、さらに好ましくは95%の“配列同一性”を有する与えられたアミノ酸配列を有するポリペプチドを例にとれば、与えられたポリペプチドのアミノ酸配列は、当該与えられたポリペプチド配列が当該参照アミノ酸配列の100アミノ酸毎に15まで、好ましくは10まで、さらに好ましくは5までのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、当該参照配列と同一であることが意図される。換言すれば、参照配列と少なくとも85%、好ましくは90%、さらに好ましくは95%の配列同一性を有する与えられたポリペプチド配列を得るためには、参照配列のアミノ酸残基の15%まで、好ましくは10%まで、さらに好ましくは5%までが欠失若しくは別のアミノ酸で置換され得るか、又は当該参照配列中のアミノ酸残基の総数の15%まで、好ましくは10%まで、さらに好ましくは5%までの数のアミノ酸残基が当該参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は、当該参照アミノ酸配列のアミノ若しくはカルボキシ末端の位置又はそれら末端の位置の間の任意の位置に存在するか、参照配列の残基の間に個々に分散されるか、又は参照配列内の1つ以上の連続するグループとして存在し得る。好ましくは、同一ではない残基の位置は保存的アミノ酸置換によって相違する。しかしながら、保存的置換は、配列相同性を決定するときには一致として含まれない。
パーセント（%）で上記に列挙した配列同一性値は、好ましくは配列全体にわたって決定されるべきことは理解されよう。しかしながら、パーセント（%）で上記に列挙した配列同一性値は、上述の核酸配列のいずれか1つの少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも250、少なくとも500の連続するヌクレオチドを含むフラグメントにわたって、又は上述のアミノ酸配列のいずれか1つの少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも80、少なくとも100、少なくとも150の連続するアミノ酸を含むフラグメントにわたって決定され得る。
【００２５】
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスはキメラウイルスである。
“キメラウイルス”という用語は、改変生ブタインフルエンザH1ウイルス又はH1N1ブタインフルエンザウイルスの1つ以上のヌクレオチド配列又は遺伝子セグメント、及び改変生ブタインフルエンザH1ウイルス又はH1N1ブタインフルエンザウイルスには由来しないが別のウイルスに由来する1つ以上のヌクレオチド配列又は遺伝子セグメントを含むウイルスを指す。好ましくは、当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルス又はH1N1 NS1欠失変異ブタインフルエンザウイルスは、H1N1亜型由来のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ遺伝子セグメントを含むが、他の全ての遺伝子セグメントは異なる（非H1N1）HA及びNA亜型を有する別のブタインフルエンザウイルスに由来する。より好ましくは、前記他のウイルスはH3N2ブタインフルエンザウイルスである。
特に、再集合技術を用いて、親のブタインフルエンザウイルス株由来の弱毒化表現型（例えば上記に記載のH3N2 SIV株のカルボキシ末端切詰めNS1）を異なるウイルス株（例えばH1N1野生型ウイルス）に移すことができる。したがって、前記技術によって、ゲノムセグメントがブタインフルエンザウイルスの別の株又は亜型と交換されてあるブタインフルエンザウイルスゲノムを作製することができる。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスは、H3 SIV株のカルボキシ末端切詰めNS1、好ましくはH3N2 SIV株のカルボキシ末端切詰めNS1を含む。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスは、NS1アミノ酸1から124、1から125、1から126、1から127又は1から128を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードする（ここで当該アミノ末端アミノ酸が番号1である）。
本発明の別の特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスは、NS1アミノ酸1から126を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードする。
【００２６】
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスは、NS1のカルボキシ末端から91、92、93又は94アミノ酸残基の欠失をもたらすカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードする。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスはA/ブタ/テキサス/4199-2/98である。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスは、H1N1亜型由来のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ遺伝子セグメントを含む。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスは、A/ブタ/ミネソタ/37866/1999由来のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ遺伝子セグメントを含む。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスは、A/ブタ/ミネソタ/37866/1999（H1N1）由来のHA及びNA、並びにA/ブタ/テキサス/4199-2/98（H3N2）由来のPB2、PB1、PA、NP、Mを含み、NS1-126遺伝子はA/ブタ/テキサス/4199-2/98（H3N2）由来である。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスは、A/ブタ/ミネソタ/37866/1999及びTX/98/del 126のキメラである。
【００２７】
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスは、
a．そのcDNAが配列番号:5又は配列番号:6に示される核酸配列と70%を超える同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又は
b．配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と70%を超える同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又は
c．配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と70%を超える同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含む。
好ましくは、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスは、配列番号:5又は配列番号:6に示されるNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むこと特徴とするか、又は配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子の核酸配列を含むことを特徴とするか、又は配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含むことを特徴とする。
しかしながら、改変生ブタインフルエンザH1ウイルスはまたブタインフルエンザウイルスの変種を包含するであろう。そのような変種は、上記の特徴を有する（配列番号:5から8を特徴とする）特定の改変生ブタインフルエンザH1ウイルスと本質的に同じ免疫学的特性を有する。インフルエンザAウイルスのHA及びNA表面糖タンパク質はワクチン誘発免疫に関係し、それぞれ免疫学的特性を保有する。“本質的に同じ免疫学的特性を有する”という用語は、前記変種が、下記に記載するブタインフルエンザウイルス感染によって引き起こされる臨床徴候の治療若しくは予防において又は下記に記載する有効性パラメーターの改善において本質的に有効であること（ただし前記に限定されない）を含蓄する。
【００２８】
さらにまた、本発明でいう変種は、以下を含む改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含むであろうとことは理解されよう：
a．そのcDNAが配列番号:5又は配列番号:6に示される核酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列、又は
b．配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列、又は
c．配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質。
したがって、本発明の別の特徴では、免疫原性組成物は、a）弱毒化された改変生ブタインフルエンザH3N2ウイルス及びb）弱毒化された改変生ブタインフルエンザH1N1ウイルスを含み、これにより両ウイルスは、NS1アミノ酸1から124、1から125、1から126、1から127、又は1から128を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質を有する（ここでアミノ末端アミノ酸が番号1である）。
【００２９】
さらに本発明の別の特徴では、免疫原性組成物は、a）弱毒化された改変生ブタインフルエンザH3N2ウイルス及びb）弱毒化された改変生ブタインフルエンザH1N1ウイルスを含み、これにより改変生ブタインフルエンザH3N2ウイルスはA/ブタ/テキサス/4199-2/98由来のHA、NA、PB2、PB1、PA、NP、Mを含み、NS1-126遺伝子はA/ブタ/テキサス/4199-2/98由来であり、さらにこれにより改変生ブタインフルエンザH1N1ウイルスは、A/ブタ/ミネソタ/37866/1999（H1N1）由来のHA及びNA、並びにA/ブタ/テキサス/4199-2/98（H3N2）由来のPB2、PB1、PA、NP、Mを含み、NS1-126遺伝子はA/ブタ/テキサス/4199-2/98（H3N2）由来である。
さらにまた、1用量の本発明の免疫原性組成物は、そのような免疫原性組成物のそのようなシングル用量の投与後に有効であることが示された。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物はシングル用量の投与のために処方される。
好ましくは、シングル用量は、総体積が約0.2mLから2.5mL、より好ましくは約0.2mLから2.0mL、さらに好ましくは約0.2mLから1.75mL、さらに好ましくは約0.2mLから1.5mL、なお好ましくは約0.4mLから1.25mL、さらに好ましくは約0.4mLから1.0mLで、シングル0.5mL用量又は1.0mL用量が最も好ましい。最も好ましいシングル用量は総体積が0.5mL、1mL又は2mLである。
さらにまた、1用量の本発明の免疫原性組成物は、そのような免疫原性組成物のそのようなシングル用量の投与後に有効であることが示された。
【００３０】
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は鼻内に投与される。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は妊娠中及び授乳中の雌ブタにとって安全である。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は生後2週齢以内のブタにとって安全である。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は生後1週齢以内のブタにとって安全である。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は生後1日齢以内のブタにとって安全である。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は0日齢のブタにとって安全である。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物はさらに医薬的に許容できる担体を含む。
“医薬的に許容できる担体”という用語は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、安定化剤、希釈剤、保存料、抗菌及び抗カビ剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、及び前記の組み合わせを含む。
“希釈剤”には、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれ得る。等張剤にはとりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが含まれ得る。安定化剤にはとりわけアルブミン及びエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が含まれる。
本発明のある特徴では、医薬的に許容できる担体はリン酸緩衝食塩水である。
好ましくは、免疫原性組成物はさらにシュクロースゼラチン安定化剤を含む。
本発明のある特徴では、医薬的に許容できる担体はキトサンである。
キトサンは、甲殻類（例えばエビ、カニ）、昆虫及び他の無脊椎動物のキチン由来の天然の脱アセチル化多糖類である。最近、Rauwら（Rauw et al., Vet Immunol Immunop 134:249-258, 2009）は、キトサンがニューカッスル病生ワクチンの細胞免疫応答を強化しその防御効果を促進することを示した。さらに、Wangら（Wang et al., Arch Virol 157:1451-1461, 2012）は、弱毒化インフルエンザワクチンで使用されるアジュバントとしてのキトサンの潜在能力を明らかにする結果を示した。
【００３１】
好ましくは、免疫原性組成物はさらに、1つ以上の他の免疫調節剤（例えばインターロイキン、インターフェロン又は他のサイトカイン）を含むことができる。本発明の関係で有用なアジュバント及び添加物の量及び濃度を当業者は容易に決定できる。
いくつかの特徴では、本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含む。本明細書で用いられる“アジュバント”には以下が含まれ得る：水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、サポニン（例えばQuil A、QS-21（Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA））、GPI-0100（Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョン。エマルジョンは特に以下を基剤にできる：軽質流動パラフィン油（欧州局方タイプ）；イソプレノイド油（例えばスクアラン又はスクアレン）；アルケン（特にイソブテン又はデセン）のオリゴマー化から生じる油；酸又は直鎖アルキル基を含むアルコール、より具体的には植物油のエステル、オレイン酸エチル、プロピレングリコールdi-(カプリレート/カプレート)、グリセリルtri-(カプリレート/カプレート)又はプロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸又はアルコールのエステル、特にイソステアリン酸エステル。エマルジョンを形成するために油は乳化剤と組み合わせて用いられる。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニドのエステル（例えば無水マンニトールオレエート）、グリコールのエステル、ポリグリセロールのエステル、プロピレングリコールのエステル、並びにオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸（前記は場合によってエトキシル化される）のエステル、及びポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニックの製品、特にL121である（以下を参照されたい：Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants（Ed.Stewart-Tull, D. E. S.）；JohnWiley and Sons, NY, pp51-94, 1995；及びTodd et al., Vaccine 15:564-570, 1997）。例示的なアジュバントは、SPTエマルジョン（以下のテキストの147ページに記載されている：“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995）及びエマルジョンMF59（同書の183ページに記載されている）である。
【００３２】
アジュバントのさらに別の例は、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー及び無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物はアクリル酸又はメタクリル酸のポリマーであり、それらは架橋、特に糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルで架橋される。これらの化合物は、カルボマーの名称で知られている（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者はまた、ポリヒドロキシル化化合物で架橋された前記のようなアクリル酸ポリマーを開示する米国特許2,909,462号を参照することができる。前記ポリヒドロキシル化化合物は、少なくとも3つの（好ましくは8つを超えない）ヒドロキシル基を有し、少なくとも3つのヒドロキシルの水素原子は少なくとも2つの炭素原子をもつ不飽和脂肪族ラジカルによって置き換えられる。好ましいラジカルは、2から4つの炭素原子を含むもので、例えばビニル、アリル及び他のエチレン系不飽和基である。不飽和ラジカルはそれ自体、他の置換基（例えばメチル）を含むことができる。カーボポール（BF Goodrich, Ohio, USA）の名称で販売されている製品が特に適切である。それらは、アリルシュクロース又はアリルペンタエリトリトールで架橋される。とりわけ、カーボポール974P、934P及び971Pを挙げることができる。カーボポール971Pの使用が最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーにはコポリマーEMA（Monsanto）があり、前記は無水マレイン酸とエチレンのコポリマーである。これらのポリマーの水への溶解は、好ましくは生理学的なpHに中和されることとなる酸溶液を生じ、免疫原性、免疫学的又はワクチン組成物それ自体がその中に取り込まれるアジュバント溶液が得られる。
更なる適切なアジュバントにはとりわけ以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：RIBIアジュバント系（Ribi Inc.）、ブロックコポリマー（CytRx, Atlanta GA）、SAF-M（Chiron, Emeryville CA）、モノホスホリル脂質A、アブリジン脂質-アミンアジュバント、易熱性大腸菌内毒素（組換え又はそれ以外）、コレラ毒素、IMS 1314又はムラミルジペプチド、又は天然に存在するか若しくは組換えサイトカイン若しくは前記のアナローグ、又は内因性サイトカイン放出の刺激物質。
アジュバントは約100μgから約10mg/用量の量で、より好ましくは約500μgから約5mg/用量の量で、さらに好ましくは約750μgから約2.5mg/用量の量で、もっとも好ましくは約1mg/用量の量で添加できると期待される。また別には、アジュバントは、最終生成物の体積で約0.01から50%の濃度で、好ましくは約2%から30%の濃度で、より好ましくは約5%から25%の濃度で、なお好ましくは約7%から22%の濃度で、もっとも好ましくは10%から20%の濃度であり得る。
【００３３】
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は、2から8log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から8log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は、2から6log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から6log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は、2から4log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から4log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物はワクチンである。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は二価ワクチンである。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は、SIVによって引き起こされる臨床徴候の治療及び/又は予防において必要がある対象動物で有効である。
“治療及び/又は予防”という用語は、群れにおける個々のSIV感染の発生率の低下、又は個々のSIV感染によって引き起こされるか若しくは前記に随伴する臨床徴候の重篤度の軽減をいう。したがって、“治療及び/又は予防”という用語はまた、本明細書で提供する免疫原性組成物を投与されなかった動物群と比較して、個々のSIVに感染した群れの動物の数の減少（＝個々のSIV感染の発生率の低下）、又はそのような免疫原性組成物の有効な量を投与された動物群におけるSIV感染に通常随伴するか若しくはSIV感染によって引き起こされる臨床徴候の重篤度の軽減を指す。
“治療及び/又は予防”は一般的には、そのような治療/予防を必要としている又はそのような治療/予防から利益を受け得る対象動物又は対象動物の群れに、本発明の免疫原性組成物の有効量を投与することを必要とする。“治療”という用語は、いったん群れの対象動物又は少なくともいくらかの動物が既にSIVに感染し、さらにそのような動物がそのようなSIV感染によって引き起こされるか又はそのようなSIV感染に随伴する何らかの臨床徴候を既に示してから免疫原性組成物の有効量を投与することを指す。“予防”という用語は、そのような対象動物のSIVによる一切の感染に先駆ける投与、又は少なくともそのような動物若しくは動物群のいずれもそのようなSIVによる感染によって引き起こされるか又は感染に随伴する臨床徴候を全く示さない場合の投与を指す。“予防（prophylaxis）”及び“予防する（preventing）”は本出願では互換的に用いられる。
【００３４】
本明細書で用いられる“有効な量”という用語は、対象動物で免疫応答を引き出すか又は引き出すことができる抗原の量を意味する（ただし前記に限定されない）。そのような有効量は、群れにおける個々のSIV感染の発生率を低下させるか、又は個々のSIV感染の臨床徴候の重篤度を軽減させることができる。
好ましくは、臨床徴候は、本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で治療されていない対象動物又は治療されたがその後で個々のSIVに感染した対象動物と比較して、発生率又は重篤度において少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、なお好ましくは少なくとも60%、なお好ましくは少なくとも70%、なお好ましくは少なくとも80%、なお好ましくは少なくとも90%、なお好ましくは少なくとも95%、もっとも好ましくは100%低下する。
本明細書で用いられる“臨床徴候”という用語は、SIVに起因する対象動物の感染の徴候を指す。感染の臨床徴候は選択される病原体に左右される。そのような臨床徴候の例には、呼吸困難、耳炎、脱脂被毛、微熱、抑うつ状態、及び食欲減退が含まれる（ただし前記に限定されない）。しかしながら、臨床徴候はまた生きている動物から直接観察できる臨床徴候を含むが、ただしに前記に限定されない。生きている動物から直接観察できる臨床徴候の例には、鼻汁及び涙液、無気力、咳、喘鳴、動悸、高熱、体重減少、脱水、跛行、衰弱、皮膚蒼白、発育不全などが含まれる。
好ましくは、本発明前に利用可能であった免疫原性組成物で治療されなかったか、又は治療されたがその後で個々のSIVに感染した対象動物と比較して、治療対象動物で発生率又は重篤度が低下する臨床徴候は、体重減少の縮小、ウイルス負荷の低下、肺病巣の縮小、排出（物）減少、直腸温度の下降、又は前記の組み合わせが該当する。
【００３５】
“対象動物”という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、サル、又はウシ、さらに人間もまた該当する。より好ましくは、対象動物はブタである。
本明細書で用いられる“必要とする”又は“必要がある”という用語は、当該投与/治療が、本発明の免疫原性組成物を投与される動物の健康若しくは臨床徴候又は任意の他の前向きな医学的効果の後押し又は改善と密接に関係することを意味する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは相互に相乗的に作用する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスの濃度は、一価の免疫原性組成物のブタインフルエンザH3ウイルスの濃度及び一価の免疫原性組成物のブタインフルエンザH1ウイルスの濃度と比較して減少する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは異種チャレンジに対する防御を増大させ、交差防御効果を提供する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、H1チャレンジに対する防御を増大させる。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、H1N1チャレンジに対する防御を増大させる。
本発明のある特徴では、改変生H3ウイルスは、H3N2ウイルス、好ましくは本明細書に記載のブタインフルエンザウイルスのH3N2 NS1欠失変異体である。
【００３６】
本発明はまた対象動物を免疫する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物のいずれかを対象動物に投与する工程を含む。
“免疫する”という用語は、免疫原性組成物を免疫されるべき対象動物に投与し、それによってそのような免疫原性組成物に含まれる抗原に対して免疫学的応答を引き起こす能動免疫に関する。
好ましくは、免疫は、群れにおける個々のSIV感染の発生率の低下、又は個々のSIV感染によって引き起こされるか又は当該感染に随伴する臨床徴候の重篤度の軽減をもたらす。
さらにまた、必要とする対象動物の本明細書提供の免疫原性組成物による免疫は、SIV感染による対象動物の感染の予防をもたらす。さらに好ましくは、免疫は、SIV感染に対して有効で長期持続する免疫学的応答をもたらす。前記期間は、2カ月を超えて、好ましくは3カ月を超えて、より好ましくは4カ月を超えて、より好ましくは5カ月を超えて、より好ましくは6カ月を超えて持続するであろうということは理解されるであろう。免疫される全ての対象動物で免疫が有効であるとは限らないことは理解されよう。しかしながら、当該用語は、群れの相当な部分の対象動物が有効に免疫されることを要求する。
好ましくは、この文脈では、通常（すなわち免疫されない）対象動物群は、SIV感染によって通常引き起こされるか又は随伴する臨床徴候を進行させるであろうと推察される。群れの対象動物が有効に免疫されたか否かを、当業者は更なる骨折りを行うことなく決定できる。好ましくは、免疫は以下の場合に有効である：免疫されなかったか、又は本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で免疫されたがその後で個々のSIVに感染した対象動物と比較して、臨床徴候が、免疫を実施された群れの対象動物の少なくとも33%で、少なくとも50%で、少なくとも60%で、少なくとも70%で、少なくとも80%で、少なくとも90%で、さらに好ましくは少なくとも95%で、もっとも好ましくは100%で、発生率又は重篤度において少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも40%、なお好ましくは少なくとも50%、なお好ましくは少なくとも60%、なお好ましくは少なくとも70%、なお好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、もっとも好ましくは100%低下する。
【００３７】
本発明はまた、必要がある対象動物でブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を治療又は予防する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む。
“治療又は予防する”、“臨床徴候”、“対象動物”“必要がある”及び“有効な量”という用語は別のところで規定されている。
本発明はまた、必要がある対象動物でのウイルス排出（物）を、非免疫コントロール群の同じ種の対象動物と比較して減少させる方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む。
“減少させる”という用語は、治療されずに（免疫されずに）その後で個々のSIVに感染した対象動物と比較して、排出（物）が、少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも40%、なお好ましくは少なくとも50%、なお好ましくは少なくとも60%、なお好ましくは少なくとも70%、なお好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、もっとも好ましくは100%減少することを意味する。
本発明はまた、必要がある対象動物でのウイルス排出（物）を、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスを含む免疫原性組成物で免疫された同じ種の免疫コントロール群の対象動物と比較して減少させる方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む。
【００３８】
“減少させる”という用語は、一価のブタインフルエンザNS1欠失変異体ウイルスを含む免疫原性組成物で免疫されたがその後で個々のSIVに感染した対象動物と比較して、排出（物）が、少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも40%、なお好ましくは少なくとも50%、なお好ましくは少なくとも60%、なお好ましくは少なくとも70%、なお好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、もっとも好ましくは100%減少することを意味する。ウイルス排出（物）をどのように測定するかは当業者の一般的な知識である。
“排出（物）（shedding）”という用語は、分泌物（例えば鼻汁）、さらには咳又はくしゃみによって生じる煙霧質を指す。したがって、排出（物）は、鼻スワブのウイルス力価又は肺のウイルス力価を試験することによって決定できる。“排出（物）”という用語は、さらにウイルスの感受性動物（すなわち見張り番）への移転を包含する。ウイルス排出（物）をどのように測定するかは、当業者の一般的な知識である。
“一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルス”という用語は、H3及びH1を有しかつ改変生ウイルスである任意のSIVを指す。好ましくは、“一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルス”という用語は、NS1タンパク質に欠失を有する任意のSIVウイルスを指す。さらに、一価という用語は単価と同等であり、多価ワクチン（例えば二価又は三価ワクチン）と比較してただ一種のSIV NS1欠失変異体を指す。好ましくは、一価改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスは、本明細書に記載のブタインフルエンザウイルスのH1N1又はH3N2欠失変異体である。最も好ましくは、一価のブタインフルエンザウイルスNS1欠失変異体は本明細書に記載のブタインフルエンザウイルスのH1N1欠失変異体である。
【００３９】
本発明のある特徴では、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスは、ブタインフルエンザウイルスのH1N1 NS1欠失変異体である。
本発明のある特徴では、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスは、本明細書に記載のブタインフルエンザウイルスのH1N1 NS1欠失変異体である。
本発明のある特徴では、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスは、ブタインフルエンザウイルスのH3N2 NS1欠失変異体である。
本発明のある特徴では、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスは、本明細書に記載のブタインフルエンザウイルスのH3N2 NS1欠失変異体である。
本発明は従来技術の欠陥を克服し、SIVに対するブタの防御増加をもたらす新規な方法を提供する。特に、本発明は、雌ブタ及び/又は生後数日以内の若い仔豚に免疫学的に有効な量のワクチンを投与して、SIVに対してそれらを免疫する方法を提供する。
本発明はまた、抗SIV抗体を有する対象動物をワクチン免疫する方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物のシングル有効用量を前記動物に投与する工程を含む。
“抗SIV抗体”という用語は、SIVに対して特異的な抗体を指す。そのような抗SIV抗体の例には、SIVワクチンで雌ブタをワクチン免疫したことによる母獣由来抗体、又は雌ブタのSIV感染による母獣由来抗体が含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらに、仔豚の抗SIV抗体は、仔豚のSIV感染に応答して既に上昇している可能性がある。“抗SIV抗体”という用語はさらにまた、検出可能な抗SIV抗体力価を有するか又は前記に暴露されている（母獣抗体の受動的移転）仔豚を意味する（ただし前記に限定されない）。前記検出可能な抗SIV抗体力価は、好ましくは少なくとも1：10、より好ましくは1：20を超える、さらに好ましくは1：40を超える、さらに好ましくは1：80を超える、さらに好ましくは1：160を超える、さらに好ましくは1：320を超える、もっとも好ましくは1：640を超える。好ましくは、当該抗SIV抗体力価は、特異的な抗SIV免疫アッセイで検出できかつ定量できる。
【００４０】
好ましくは、仔豚の抗SIV抗体は仔豚のSIV感染に応答して既に上昇している。しかしながら、より好ましくは、それら抗SIV抗体は、SIVワクチンによる雌ブタのワクチン免疫に応答して、又は雌ブタのSIV感染に応答して上昇した母獣由来抗体である。母獣由来抗体は、初乳及び乳汁を介して受動的に仔豚に移転される。
母獣由来抗体とワクチン抗原との干渉は、不活化ワクチンと同様に生ワクチンに対する免疫応答を低下させるか、免疫応答を排除さえする。ワクチン誘発免疫応答の母獣由来抗体による様々な程度の干渉が、非複製ワクチン（すなわち不活化又はサブユニットワクチン）と同様に生ワクチンで報告されている（Markowska-Daniel et al., 2011, Veterinary Immunology；及びImmunopathology, 142: 81-86）。最適には、動物のワクチン免疫は、まさに母獣抗体の消失時に開始されるべきであるが、このアプローチは、個体間の高度な変動性のために実際的ではあり得ない（Monteil et al., 1997）。
したがって、SIVに対する免疫のための従来のワクチン免疫戦略は、2から3週齢以上のブタにワクチンを投与することを必要とする。なぜならば、前記週齢より若い仔豚は、雌ブタの以前の暴露免疫又はワクチン免疫によりSIV陽性母獣抗体を有し得るからである。本発明の前には、母獣抗体又は他の乳汁原性因子の存在は、そのような仔豚のワクチン免疫の有効性に潜在的に干渉し得ると考えられていた。なぜならば、母獣抗体は、仔豚の免疫系がワクチンを認識しそれ自体の抗体を分泌し始める前には当該ワクチンを中和する能力を有するからである。したがって、母獣免疫を考えて若い仔豚のワクチン免疫は避けられていた。
この問題に直面して、いくつかのワクチン免疫戦略は、若い動物のために以下の2ショットワクチン免疫レジメンを予想している：第一のワクチン接種は、低い母獣由来抗体を有する動物の防御のために幼齢期に与えられる。この第一のワクチン接種は、高い母獣由来抗体力価を有する動物ではワクチン抗原との干渉のために有効ではない可能性があることを容認している。これらの動物もまた防御するために、高い母獣由来抗体レベルが下降したことが予想されるときに第二のワクチン接種が要求される。
都合の良いことに、本発明によって提供される実験データは、母獣由来抗体を有する数日齢の仔豚に投与するときの本明細書に提供する免疫原性組成物の安全性及び有効性を開示する。実際、生後数日以内にワクチン接種された仔豚では、本明細書に記載するように、非ワクチン接種仔豚と比較して当該疾患に随伴する臨床徴候は軽減された。
【００４１】
本発明はまた対象動物で早期SIV感染を予防又は減ずる方法に関し、前記方法は、本明細書に記載の免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む。
都合の良いことに、本発明によって提供される実験データは、数日齢の仔豚に投与されかつ仔豚が母獣由来抗体を有するときの、本明細書に提供する免疫原性組成物の安全性及び有効性を開示する。しかしながら、SIVに対する免疫のための従来のワクチン免疫戦略は、2から3週齢以上のブタにワクチンを投与することを必要とする。なぜならば、この週齢より若いグループの仔豚は、以前の雌ブタの暴露免疫又はワクチン免疫のためにSIV陽性母獣抗体を有する可能性があるからである。したがって、本発明はさらに早期のSIV感染を対象動物で予防又は減ずる方法に関する。
好ましくは、免疫されるブタは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、20又は21日齢である。より好ましくは、前記免疫されるブタは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、20又は21日齢である。もっとも好ましくは、前記免疫されるブタは、1、2、3、4、5、6又は7日齢である。
しかしながら、数日齢の仔豚のワクチン接種後、当該仔豚の免疫系がSIV感染に対して免疫を構築するために数日を要することは理解されよう。したがって、好ましくは、仔豚は生後24時間以内に免疫される。
しかしながら、より好ましくは、妊娠雌ブタは少なくとも出産前に1回本明細書に記載の免疫原性組成物でワクチン接種され、さらに産出仔豚は、本明細書に記載の免疫原性組成で数日以内に（好ましくは生後1週齢以内又は生後24時間以内に）ワクチン接種される。したがって、仔豚は既に母獣由来免疫によって防御され、さらにワクチン誘発免疫で防御されるであろう。
【００４２】
“早期SIV感染”という用語は、ブタの幼齢期SIV感染を指す。幼齢期SIV感染は、生後4週齢以内、より好ましくは生後3週齢以内、もっとも好ましくは生後2週齢の間にSIV感染を有する動物を指す。
“減ずる”という用語は、早期SIV感染が、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して少なくとも10%、より好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、なお好ましくは少なくとも60%、なお好ましくは少なくとも70%、なお好ましくは少なくとも80%、なお好ましくは少なくとも90%、もっとも好ましくは少なくとも95%、もっとも好ましくは100%減少することを意味する。
本発明の別の特徴では、前記対象動物はブタ、ウシ、ネコ及びイヌから成るリストから選択される。
本発明のある特徴では、免疫原性組成は1回投与される。
シングル用量はただ1回投与されることは理解される。実施例に示すように、本明細書で提供する免疫原性組成物は、必要がある対象動物にシングル用量を投与した後で有効であることが立証された。
好ましくは、シングル用量は、総体積が約0.2mLから2.5mL、より好ましくは約0.2mLから2.0mL、さらに好ましくは約0.2mLから1.75mL、さらに好ましくは約0.2mLから1.5mL、なお好ましくは約0.4mLから1.25mL、さらに好ましくは約0.4mLから1.0mLで、シングル0.5mL用量又は1.0mL用量が最も好ましい。最も好ましいシングル用量は総体積が0.5mL、1mL又は2mLである。
【００４３】
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は2用量以上で投与される。
しかしながら、免疫原性組成物は2用量以上で投与でき、1回目の用量は2回目（ブースター）の用量の投与前に投与される。好ましくは、2回目の用量は1回目の用量の少なくとも15日後に投与される。より好ましくは、2回目の用量は1回目の用量の15から40日後に投与される。さらに好ましくは、2回目の用量は1回目の用量の少なくとも17日後に投与される。さらに好ましくは、2回目の用量は1回目の用量の17から30日後に投与される。さらに好ましくは、2回目の用量は1回目の用量の少なくとも19日後に投与される。さらに好ましくは、2回目の用量は1回目の用量の19から25日後に投与される。もっとも好ましくは、2回目の用量は1回目の用量の少なくとも21日後に投与される。2回投与レジメンの好ましい特徴では、免疫原性組成物の1回目及び2回目の用量はともに同じ量で投与される。好ましくは、各用量は上記に指定した好ましい量を有し、1回目及び2回目の用量について1mLの用量が最も好ましい。1回目プラス2回目用量レジメンに加えて、また別の実施態様は更なる後続用量を含む。例えば、これらの特徴では3回目、4回目又は5回目用量を投与することができよう。好ましくは、後続の3回目、4回目及び5回目用量レジメンは1回目用量と同じ量で投与され、用量間の時間枠は、上記に述べた1回目と2回目用量の間のタイミングと同じである。
【００４４】
本発明の別の特徴では、前記免疫原性組成物は鼻内に投与される。
免疫原性組成物は、好ましくは局所的に又は全身的に投与される。通常的に用いられる適切な投与ルートは、経口又は非経口投与、例えば鼻内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、とともに吸入である。しかしながら、化合物の性質及び作用様式に応じて、免疫原性組成物は他のルートでも同様に投与され得る。しかしながら、最も好ましくは、免疫原性組成物は鼻内に投与される。
本発明のある特徴では、対象動物はブタインフルエンザウイルス母獣抗体陰性である。
母獣由来抗SIV抗体をどのように測定するかは当業者の一般的な知識である。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は、妊娠中及び授乳中の雌ブタに投与される。
都合の良いことに、本発明によって提供される実験データは、妊娠ブタにおける免疫原性組成物の有効性及び安全性を開示する。
したがって、本発明のSIVワクチンを妊娠雌ブタに出産前に少なくとも1回、好ましくは出産前に2回、もっとも好ましくは出産前に3回（“反復用量”）投与することによって、SIVに対してブタをワクチン免疫する方法が提供される。しかしながら、好ましくは、妊娠雌ブタは、本発明のSIVワクチンを用い出産前に前記ワクチンのシングル用量で1回ワクチン免疫される。しかしながら、ワクチンが雌ブタに3回投与されるときは、1回目の投与は、出産前の50から60日の間に、好ましくは出産前の52から58日の間に、もっとも好ましくは出産前の54から56日の間に実施されるべきである。2回目の投与は、出産前の30から40日の間に、好ましくは出産前の32から38日の間に、もっとも好ましくは出産前の34から36日の間に実施されるべきである。最後の投与は、出産前の10から20日の間に、好ましくは出産前の12から18日の間に、もっとも好ましくは出産前の14から16日の間に実施されるべきである。
さらにまた、母獣免疫は、予想に反して生後間もない仔豚の首尾よいワクチン免疫に干渉しないことが見出され、実際、生後約1か月以内にワクチン接種された仔豚は、本明細書に記載するように、非ワクチン接種仔豚と比較して当該疾患に随伴する臨床徴候の軽減を示した。特に、仔豚の首尾よいワクチン免疫に干渉しないことは、生後3週齢以内、生後1週齢以内、1日齢及び生後24時間齢以内に仔豚をワクチン免疫したときに示された。
【００４５】
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は生後1カ月齢以内にブタに投与される。
好ましくは、免疫されるブタは、1日齢から40日齢、1日齢から30日齢、1日齢から21日齢である。より好ましくは、免疫される前記対象動物は、1日齢から10日齢、さらに好ましくは1日齢から9日齢、さらに好ましくは1日齢から8日齢、さらに好ましくは1日齢から7日齢、さらに好ましくは1日齢から6日齢、さらに好ましくは1日齢から5日齢、さらに好ましくは1日齢から4日齢、さらに好ましくは1日齢から3日齢、さらに好ましくは1日齢から2日齢、もっとも好ましくは1日齢から0日齢である。
より好ましくは、免疫される前記ブタは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21日齢である。
都合の良いことに、本発明によって提供される実験データは、約3週齢以下の仔豚における免疫原性組成物の有効性を開示する。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は生後2週齢以内のブタに投与される。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は生後1週齢以内のブタに投与される。
本発明の別の特徴では、免疫原性組成物は1日目齢のブタに投与される。
都合の良いことに、本発明によって提供される実験データは、1日目齢の仔豚における免疫原性組成物の有効性を開示する。
本発明の別の特徴では、免疫原性組成物は生後24時間齢以内のブタに投与される。
都合の良いことに、本発明によって提供される実験データは、生後24時間齢以内のブタにおける免疫原性組成物の有効性を開示する。
生後24時間齢以内のブタは24時間齢以下であることは理解されよう。好ましくは、免疫される前記ブタは、1時間齢から24時間齢、2時間齢から24時間齢、4時間齢から24時間齢、6時間齢から24時間齢、8時間齢から24時間齢、10時間齢から24時間齢、12時間齢から24時間齢、14時間齢から24時間齢、16時間齢から24時間齢、18時間齢から24時間齢、20時間齢から24時間齢、22時間齢から24時間齢である。より好ましくは、免疫される前記ブタは1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間又は24時間齢である。
本発明のある特徴では、対象動物はブタインフルエンザウイルス母獣抗体陽性である。
母獣由来抗SIV抗体をどのように測定するかは当業者の一般的な知識である。
【００４６】
好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス又はH1N1 SIVを約102から約108pfu（プラーク形成単位）/用量、好ましくは約103から約107pfu/用量の量で、さらに好ましくは約104から約107pfu/用量の量で、もっとも好ましくは約104から約106pfu/用量の量で含む。より好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス又はH1N1 SIVを約102、5ｘ102、103、5ｘ103、104、5ｘ104、105、5ｘ105、106、5ｘ106、107、107、5ｘ107、又は108pfu/用量の量で含む。
好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH3ウイルス又はH3N2 SIVを約102から約108pfu（プラーク形成単位）/用量、好ましくは約103から約107pfu/用量の量で、さらに好ましくは約104から約107pfu/用量の量で、もっとも好ましくは約104から約106pfu/用量の量で含む。より好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH3ウイルス又はH3N2 SIVを約102、5ｘ102、103、5ｘ103、104、5ｘ104、105、5ｘ105、106、5ｘ106、107、107、5ｘ107、又は108pfu/用量の量で含む。
好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルス又はH1N1及びH3N2 SIVの両方を一緒に、各々の成分の約102から約108pfu（プラーク形成単位）/用量、好ましくは各々の成分の約103から約107pfu/用量の量で、さらに好ましくは各々の成分の約104から約107pfu/用量の量で、もっとも好ましくは各々の成分の約104から約106pfu/用量の量で含む。より好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルス又はH1N1及びH3N2 SIVの両方を一緒に、各々の成分の約102、5ｘ102、103、5ｘ103、104、5ｘ104、105、5ｘ105、106、5ｘ106、107、107、5ｘ107、108pfu/用量の量で含む。
【００４７】
好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス又はH1N1 SIVを約1から約10log10 FAID50/mL(蛍光抗体感染性用量)/用量、好ましくは約2から約8log10 FAID50/mL/用量の量で、好ましくは約2から約7log10 FAID50/mL/用量の量で、より好ましくは約2から約6log10 FAID50/mL/用量の量で、さらに好ましくは約2から約5log10 FAID50/mL/用量の量で、もっとも好ましくは約2から約4log10 FAID50/mL/用量の量で含む。より好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス又はH1N1 SIVを約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、又はlog10 FAID50/mL/用量の量で含む。
好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH3ウイルス又はH3N2 SIVを約1から約10log10 FAID50/mL(蛍光抗体感染性用量)/用量、好ましくは約2から約8log10 FAID50/mL/用量の量で、好ましくは約2から約7log10 FAID50/mL/用量の量で、より好ましくは約2から約6log10 FAID50/mL/用量の量で、さらに好ましくは約2から約5log10 FAID50/mL/用量の量で、もっとも好ましくは約2から約4log10 FAID50/mL/用量の量で含む。より好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH3ウイルス又はH3N2 SIVを約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、又はlog10 FAID50/mL/用量の量で含む。
好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルス又はH1N1及びH3N2 SIVの両方を一緒に、各々の成分の約1から約10log10 FAID50/mL(蛍光抗体感染性用量)/用量、好ましくは各々の成分の約2から約8log10 FAID50/mL/用量の量で、好ましくは各々の成分の約2から約7log10 FAID50/mL/用量の量で、より好ましくは各々の成分の約2から約6log10 FAID50/mL/用量の量で、さらに好ましくは各々の成分の約2から約5log10 FAID50/mL/用量の量で、もっとも好ましくは各々の成分の約2から約4log10 FAID50/mL/用量の量で含む。より好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルス又はH1N1及びH3N2の両方を一緒に、各々の成分の約1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、又はlog10 FAID50/mL/用量の量で含む。
【００４８】
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は、2から8log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から8log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は、2から6log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から6log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む。
本発明のある特徴では、免疫原性組成物は、2から4log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から4log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む。
本発明のある特徴では、前記方法は、体重減少の縮小、ウイルス負荷の低下、肺病巣の縮小、排出（物）の減少、直腸温度の下降、又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターで、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して改善をもたらす。
“縮小”、“低下”、“減少”又は“下降”という用語は、有効性パラメーター（体重減少、ウイルス負荷、肺病巣、排出（物）、直腸温度）が、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、もっとも好ましくは100%軽減されることを意味する。
都合の良いことに、本発明によって提供される実験データは、ウイルス負荷の低下、肺病巣の縮小及び排出（物）の減少によって免疫原性組成物の有効性を開示する。
本発明のある特徴では、前記方法は、体重減少の縮小、ウイルス負荷の低下、肺病巣の縮小、排出（物）の減少、直腸温度の下降、又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターで、一価の改変生H3又はH1インフルエンザウイルスで免疫された同じ種の対象動物と比較して改善をもたらす。
【００４９】
“ウイルス負荷”という用語は当業者には周知である。ウイルス負荷という用語は、本明細書ではウイルス力価という用語と相互に用いることができる。ウイルス負荷又はウイルス力価は活動的ウイルス感染の重篤度の測定であり、当業者に公知の方法で決定できる。当該決定は、ウイルスタンパク質の検出（例えばウイルスタンパク質と結合する抗体及びさらに別の検出によって）に基づくか、或いはまた別には増幅方法（例えばRT-PCR）によるウイルス核酸の検出による。核酸増幅方法による血漿中のビリオン結合ウイルスRNAのモニタリングは、レトロウイルス疾患の状況及び進行の査定、並びに予防的及び治療的介入の有効性の評価に広く用いられるパラメーターである。例示すれば、ウイルス負荷又はウイルス力価は、関与する体液中の生存ウイルス量（例えば血漿1mL当たりのRNAコピー数）を概算することによって計算できる。
本発明のある特徴では、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスは、ブタインフルエンザウイルスH1N1 NS1欠失変異体である。
本発明のある特徴では、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスは、本明細書に記載のブタインフルエンザウイルスH1N1 NS1欠失変異体である。
本発明のある特徴では、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスは、ブタインフルエンザウイルスH3N2 NS1欠失変異体である。
本発明のある特徴では、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスは、本明細書に記載のブタインフルエンザウイルスH3N2 NS1欠失変異体である。
【００５０】
本発明のある特徴では、治療又は予防は、同じ種の非治療コントロール群の動物と比較したときウイルス負荷期の短縮をもたらす。
本発明のある特徴では、治療又は予防は、チャレンジ又は感染後5日目から排出（物）の減少をもたらす。
本発明のある特徴では、治療又は予防は、チャレンジ又は感染後1日目から排出（物）の減少をもたらす。
本発明のある特徴では、治療又は予防は、チャレンジ又は感染後2日目から排出（物）の減少をもたらす。
都合の良いことに、本発明によって提供される実験データは、本明細書に記載の免疫原性組成物を投与されたブタのチャレンジ後SIVウイルス排出（物）の減少を開示する。
好ましくは、SIVウイルス排出（物）は、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して、SIVによるチャレンジ又は感染後5日目から、より好ましくはチャレンジ又は感染後4日目から、より好ましくはチャレンジ又は感染後3日目から、もっとも好ましくはチャレンジ又は感染後1又は2日目から減少する。
“排出（物）の減少”という用語は、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して、排出（物）が、少なくとも10%、好ましくは少なくとも20%、より好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも40%、さらに好ましくは少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも60%、さらに好ましくは少なくとも70%、さらに好ましくは少なくとも80%、さらに好ましくは少なくとも90%、さらに好ましくは少なくとも95%、もっとも好ましくは100%減少することを意味する。排出（物）の減少をどのように測定するかは当業者の一般的な知識である。
【００５１】
本発明の別の特徴では、対象動物は、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスで免疫される同じ種の対象動物と比較して、より低い濃度の本明細書に記載の免疫原性組成物で免疫される。
“より低い濃度”という用語は、本発明の二価免疫原性組成物中の本明細書記載の改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルス又はH1N1及びH3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体の濃度が、一価の改変生ブタインフルエンザH3若しくはH1ウイルス又は一価のNS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体と比較したとき、約1から約100倍、約5から約80倍、又は約20から約80倍、又は1、2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100倍減少することを意味する。ウイルスの濃度をどのように測定するかは当業者の一般的な知識である。例は、プラーク形成単位アッセイ、フォーカス形成アッセイ、終末点希釈アッセイ（例えばTCID50又はFAID50）、タンパク質アッセイ、血球凝集アッセイ、ビシンコニン酸アッセイ、一元放射免疫拡散アッセイ、透過型電子顕微鏡法、調節性抵抗パルスセンシング、フローサイトメトリー、ポリメラーゼ連鎖反応定量、酵素結合免疫吸着アッセイなどである。
好ましくは、本発明の二価免疫原性組成物は、本発明の改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルス又はH1N1 NS1及びH3N2 NS1欠失SIV変異体を各々、約1から約4log10 FAID50/mL(蛍光抗体感染性用量)/用量、約2から約4log10 FAID50/mL/用量、もっとも好ましくは約2から約3log10 FAID50/mL/用量の量で含む。
【００５２】
本明細書に記載の二価免疫原性組成物は、i）本明細書に記載の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス又はH1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体及びii）本明細書に記載の改変生ブタインフルエンザH3ウイルス又はH3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を、病毒性SIV株によるその後のチャレンジに対して対象動物で防御を誘発するために有効な量で含む相乗性組合せ物である。特に、一価の改変生ブタインフルエンザH3若しくはH1ウイルス又はNS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体のみを含む免疫原性組成物と比較して、より低い濃度の本明細書に記載の二価免疫原性組成物が対象動物で防御を誘発するために必要とされる。したがって、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルス又はH1N1 NS1及びH3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を含む二価ワクチンは、一価の改変生ブタインフルエンザH3若しくはH1ウイルス又はNS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体よりも強い防御を生じる。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスは互いに相乗的に作用する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスの濃度は、一価免疫原性組成物のブタインフルエンザH3ウイルスの濃度及び一価免疫原性組成物のブタインフルエンザH1ウイルスの濃度と比較して低い。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、異種チャレンジに対する防御を増大させ、交差防御効果を提供する。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、H1チャレンジに対する防御を増大させる。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、H1N1チャレンジに対する防御を増大させる。
本発明のある特徴では、改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である。
本発明のある特徴では、一価の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスは、本明細書に記載のH3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である。
【００５３】
本明細書に提供する実験データは、改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルス又はH1N1 NS1及びH3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を相互に組み合せたものは、驚くべきことに個々の成分の集合効果よりも強力であることを示す。
本発明の二価ワクチンの相乗作用は、一価H1N1ワクチンで要求されるレベルよりもはるかに低い含有レベルで投与されたときに防御を提供する能力によって非常に明瞭に示される。わずかに3.13 log10FAID50/mLの合計用量で投与された本発明の二価ワクチンは、4.99 log10FAID50/mL（二価ワクチンの合計用量よりも約72倍高い）の用量の投与後に同様なレベルの防御を示す一価ワクチンに匹敵する防御を提供した。さらにまた、2012年にVincentら（Vincent et al., J Virol., 19:10597-10605）は、一価H3N2は1ｘ106 TCID50（6log10 FAID50に該当する）（二価ワクチンの合計用量の約741倍高い）で防御を提供することを示した。したがって、二価ワクチンのH1及びH3成分の濃度は、一価ワクチンで必要とされる濃度と比較して劇的に低下する。これは予想に反する驚くべき相乗効果である。
さらにまたチャレンジウイルスの量を考慮するときさらに驚くべき証拠が存在する。一価ワクチンはより高い用量で投与しても、同じチャレンジ単離株の約3倍少ないチャレンジに同じようなレベルの防御しか提供しなかった。
これらの実験で得られたデータからもたらされる結論は、ワクチンが一価生成物として投与される場合と比べてワクチンが二価生成物として投与されるときには、鼻孔から排出されるウイルス量の減少が存在すること、ウイルス単離陽性の肺の減少とともに一次有効性パラメーターの肉眼肺病巣の減少がはるかに低い抗原用量で存在することである。総合すれば、データは、二価ワクチンのシングル鼻内用量は、これらの実験でナイーブブタに用いられたより高い用量の一価ワクチンよりも有効であることを示している。
【００５４】
本発明の相乗性組合せは有害作用の機会が減少するので有利である。加えて、個々の成分より低い濃度を含む二価ワクチンは明らかに製造が容易かつ安価であろう。
さらにまた、上記に記載の相乗的濃度効果に加えてさらに別の有益で驚くべき相乗作用が存在する。H3成分はH1成分と相乗的に作用する。二価ワクチンの相乗作用は、異種H1N2（A/ブタ/ノースカロライナ/001169/2006）SIV単離株に対して防御を提供するその能力によって非常に明確に示される。したがって、交差防御作用が存在する。この作用はさらに相乗的である。なぜならば、本発明の二価ワクチンは、上記に記載の一価ワクチンに要求されるレベルよりもはるかに低い含有レベルで投与されるからである。
本発明のある特徴では、一価NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体は、H1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である。
本発明のある特徴では、一価NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体は、本明細書に記載のH1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である。
本発明のある特徴では、一価NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体は、H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である。
本発明のある特徴では、一価NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体は、本明細書に記載のH3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である。
本発明はまた、対象動物におけるブタインフルエンザウイルス感染の治療及び/又は予防のために本明細書に記載の免疫原性組成物を使用することに関する。
本発明はまた、医薬の製造のために本明細書に記載の免疫原性組成物を使用することに関する。
本発明はまた、医薬として使用される本明細書に記載の免疫原性組成物に関する。
本発明はまた、対象動物でブタインフルエンザウイルス感染を治療及び/又は予防する方法で使用される本明細書に記載の免疫原性組成物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
詳細な説明
本発明は以下の実施態様を提供する。
1．a）改変生ブタインフルエンザH3ウイルス、及びb）改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含む免疫原性組成物。
2．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9及びN10から成る群から選択されるN（ノイラミニダーゼ）亜型を有する、実施態様1の免疫原性組成物。
3．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスがブタインフルエンザH3N2であり、及び/又は当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスがブタインフルエンザウイルスH1N1である、実施態様1又は2の免疫原性組成物。
4．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスがNS1遺伝子に1つ以上の変異を有する、実施態様1から3のいずれか1つの免疫原性組成物。
5．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスがNS1遺伝子内に欠失を有する、実施態様1から4のいずれか1つの免疫原性組成物。
6．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが弱毒化ブタインフルエンザウイルスである、実施態様1から5のいずれか1つの免疫原性組成物。
7．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが変異導入ウイルス又は再集合体である、実施態様1から6のいずれか1つの免疫原性組成物。
8．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが遺伝的に操作される、実施態様1から7のいずれか1つの免疫原性組成物。
9．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが障害されたインターフェロンアンタゴニスト表現型を有する、実施態様1から8のいずれか1つの免疫原性組成物。
10．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが、NS1タンパク質のカルボキシ末端に1つ以上の変異を有する、実施態様1から9のいずれか1つの免疫原性組成物。
11．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスがカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質を有する、実施態様1から10のいずれか1つの免疫原性組成物。
12．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが、NS1アミノ酸1から124、1から125、1から126、1から127又は1から128を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質を有し、ここで当該アミノ末端アミノ酸が番号1である、実施態様1から11のいずれか1つの免疫原性組成物。
13．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが、NS1アミノ酸1から126を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質を有する、実施態様1から12のいずれか1つの免疫原性組成物。
14．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが、NS1のカルボキシ末端から91、92、93又は94アミノ酸残基の欠失をもたらすカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質を有する、実施態様1から11のいずれか1つの免疫原性組成物。
15．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスがA/ブタ/テキサス4199-2/98由来のNS1遺伝子又はタンパク質を有する、実施態様1から14のいずれか1つの免疫原性組成物。
16．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、NS1アミノ酸1から124、1から125、1から126、1から127又は1から128を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードし、ここで当該アミノ末端アミノ酸が番号1である、実施態様1から15のいずれか1つの免疫原性組成物。
17．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、NS1アミノ酸1から126を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードする、実施態様1から16のいずれか1つの免疫原性組成物。
【００５６】
18．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、NS1のカルボキシ末端から91、92、93又は94アミノ酸残基の欠失をもたらすカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードする、実施態様1から15のいずれか1つの免疫原性組成物。
19．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスがA/ブタ/テキサス4199-2/98である、実施態様1から18のいずれか1つの免疫原性組成物。
20．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスがTX/98/del 126である、実施態様1から19のいずれか1つの免疫原性組成物。
21．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、A/ブタ/テキサス/4199-2/98由来のHA、NA、PB2、PB1、PA、NP及びMを含み、当該NS1-126遺伝子がA/ブタ/テキサス/4199-2/98に由来する、実施態様1から20のいずれか1つの免疫原性組成物。
22．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、a）そのcDNAが配列番号:1又は配列番号:2に示される核酸配列と少なくとも70%同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はb）配列番号:3又は配列番号:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はc）配列番号:3又は配列番号:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含む、実施態様1から21のいずれか1つの免疫原性組成物。
23．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、a）そのcDNAが配列番号:5又は配列番号:6に示される核酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はb）配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はc）配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含む、実施態様1から22のいずれか1つのH1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体。
24．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスがキメラウイルスである、実施態様1から23のいずれか1つの免疫原性組成物。
25．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、H3 SIV株のカルボキシ末端切詰めNS1、好ましくはH3N2 SIV株のカルボキシ末端切詰めNS1を含む、実施態様1から24のいずれか1つの免疫原性組成物。
【００５７】
26．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、NS1アミノ酸1から124、1から125、1から126、1から127又は1から128を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードし、ここでアミノ末端アミノ酸が番号1である、実施態様1から25のいずれか1つの免疫原性組成物。
27．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、NS1アミノ酸1から126を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードし、ここでアミノ末端アミノ酸が番号1である、実施態様1から26のいずれか1つの免疫原性組成物。
28．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、NS1のカルボキシ末端から91、92、93又は94アミノ酸残基の欠失をもたらすカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードする、実施態様1から25のいずれか1つの免疫原性組成物。
29．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスがA/ブタ/テキサス/4199-2/98である、実施態様1から28のいずれか1つの免疫原性組成物。
30．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、H1N1亜型由来のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ遺伝子セグメントを含む、実施態様1から29のいずれか1つの免疫原性組成物。
31．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、A/ブタ/ミネソタ/37866/1999由来のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ遺伝子セグメントを含む、実施態様1から30のいずれか1つの免疫原性組成物。
32．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、A/ブタ/ミネソタ/37866/1999（H1N1）由来のHA及びNA、並びにA/ブタ/テキサス/4199-2/98（H3N2）由来のPB2、PB1、PA、NP、Mを含み、当該NS1-126遺伝子がA/ブタ/テキサス/4199-2/98（H3N2）に由来する、実施態様1から31のいずれか1つの免疫原性組成物。
33．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスがA/ブタ/ミネソタ/37866/1999及びTX/98/del 126のキメラである、実施態様1から32のいずれか1つの免疫原性組成物。
34．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、a）そのcDNAが配列番号:5又は配列番号:6に示される核酸配列と70%を超える同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はb）配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と70%を超える同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はc）配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と70%を超える同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含む、実施態様1から33のいずれか1つの免疫原性組成物。
35．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、a）そのcDNAが配列番号:5又は配列番号:6に示される核酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はb）配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はc）配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含む、実施態様1から34のいずれか1つのH1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体。
【００５８】
36．前記免疫原性組成物がシングル用量投与のために処方される、実施態様1から35のいずれか1つの免疫原性組成物。
37．前記免疫原性組成物が鼻内に投与される、実施態様1から36のいずれか1つの免疫原性組成物。
38．当該免疫原性組成物が妊娠中及び授乳中の雌ブタに安全である、実施態様1から37のいずれか1つの免疫原性組成物。
39．当該免疫原性組成物が生後2週齢以内、好ましくは生後1週齢以内のブタに安全である、実施態様1から38のいずれか1つの免疫原性組成物。
40．当該免疫原性組成物が0日目齢のブタに安全である、実施態様1から39のいずれか1つの免疫原性組成物。
41．前記免疫原性組成物がさらに医薬的に許容できる担体を含む、実施態様1から40のいずれか1つの免疫原性組成物。
42．当該免疫原性組成物が、2から8log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から8log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む、実施態様1から41のいずれか1つの免疫原性組成物。
43．当該免疫原性組成物が、2から6log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から6log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む、実施態様1から41のいずれか1つの免疫原性組成物。
44．当該免疫原性組成物が、2から4log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から4log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む、実施態様1から41のいずれか1つの免疫原性組成物。
45．前記免疫原性組成物がワクチンである、実施態様1から44のいずれか1つの免疫原性組成物。
46．前記免疫原性組成物が二価ワクチンである、実施態様1から45のいずれか1つの免疫原性組成物。
47．当該免疫原性組成物が、SIVによって引き起こされる臨床徴候の治療及び/又は予防に必要がある対象動物で有効である、実施態様1から46のいずれか1つの免疫原性組成物。
48．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが相互に相乗的に作用する、実施態様1から47のいずれか1つの免疫原性組成物。
49．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスの濃度が、一価免疫原性組成物の当該ブタインフルエンザH3ウイルスの濃度及び一価免疫原性組成物の当該インフルエンザH1ウイルスの濃度と比較して低下する、実施態様1から48のいずれか1つの免疫原性組成物。
50．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが異種チャレンジに対して防御を増大させる、実施態様1から49のいずれか1つの免疫原性組成物。
51．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスがH1チャレンジに対して防御を増大させる、実施態様1から50のいずれか1つの免疫原性組成物。
52．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスがH1N1チャレンジに対して防御を増大させる、実施態様1から51のいずれか1つの免疫原性組成物。
53．対象動物を免疫する方法であって、前記方法が、そのような対象動物に実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物を投与する工程を含む、前記方法。
54．ブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を必要がある対象動物で治療及び/又は予防する方法であって、前記方法が、実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
【００５９】
55．同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して、ウイルス排出（物）を必要がある対象動物で減少させる方法であって、前記方法が実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
56．一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスで免疫された同じ種の免疫コントロール群の対象動物と比較して、必要がある対象動物でウイルス排出（物）を減少させる方法であって、前記方法が、実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
57．抗SIV抗体を有する対象動物をワクチン免疫する方法であって、前記方法が、実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物のシングル有効用量を前記動物に投与する工程を含む、前記方法。
58．対象動物で早期SIV感染を予防又は減ずる方法であって、前記方法が実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
59．前記対象動物がブタ、ウシ、ネコ及びイヌから成るリストから選択される、実施態様53から58のいずれか1つの方法。
60．当該免疫原性組成物が1回投与される、実施態様53から59のいずれか1つの方法。
61．当該免疫原性組成物が2用量以上で投与される、実施態様53から59のいずれか1つの方法。
62．前記免疫原性組成物が鼻内に投与される、実施態様53から61のいずれか1つの方法。
63．当該対象動物がブタインフルエンザウイルス母獣抗体陰性である、実施態様53から62のいずれか1つの方法。
64．前記免疫原性組成物が妊娠中及び授乳中の雌ブタに投与される、実施態様53から63のいずれか1つの方法。
65．当該免疫原性組成物が生後1カ月齢以内のブタに投与される、実施態様53から64のいずれか1つの方法。
66．当該免疫原性組成物が、生後2週齢以内、好ましくは生後1週齢以内のブタに投与される、実施態様53から65のいずれか1つの方法。
67．当該免疫原性組成物が1日目齢のブタに投与される、実施態様53から66のいずれか1つの方法。
68．当該免疫原性組成物が生後24時間齢以内のブタに投与される、実施態様53から67のいずれか1つの方法。
69．当該対象動物がブタインフルエンザウイルス母獣抗体陽性である、実施態様53から62のいずれか1つの方法。
70．当該免疫原性組成物が、2から8log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から8log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む、実施態様53から69のいずれか1つの方法。
71．当該免疫原性組成物が、2から6log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から6log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む、実施態様53から69のいずれか1つの方法。
72．当該免疫原性組成物が、2から4log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から4log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む、実施態様53から69のいずれか1つの方法。
73．前記方法が、体重減少の縮小、ウイルス負荷の低下、肺病巣の縮小、排出（物）の減少、直腸温度の下降、又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターで、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して改善をもたらす、実施態様53から72のいずれか1つの方法。
74．前記方法が、体重減少の縮小、ウイルス負荷の低下、肺病巣の縮小、排出（物）の減少、直腸温度の下降、又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターで、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスで免疫された同じ種の対象動物と比較して改善をもたらす、実施態様53から72のいずれか1つの方法。
【００６０】
75．当該治療又は予防が、同じ種の非処置コントロール群の動物と比較してウイルス負荷期の短縮をもたらす、実施態様53から74のいずれか1つの方法。
76．当該治療又は予防がチャレンジ又は感染後5日目から排出（物）の減少をもたらす、実施態様53から75のいずれか1つの方法。
77．当該治療又は予防がチャレンジ又は感染後1日目又は2日目から排出（物）の減少をもたらす、実施態様53から76のいずれか1つの方法。
78．当該対象動物が、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスで免疫される同じ種の対象動物と比較して、より低い濃度の実施態様1から52の免疫原性組成物で免疫される、実施態様53から77のいずれか1つの方法。
79．当該一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスが、H1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である、実施態様56、74又は78のいずれか1つの方法。
80．当該H1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、実施態様1から52のH1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である、実施態様79の方法。
81．当該一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスが、H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である、実施態様56、74又は78のいずれか1つの方法。
82．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、実施態様1から52のH3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である、実施態様81の方法。
83．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが相互に相乗的に作用する、実施態様53から82のいずれか1つの方法。
84．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスの濃度が、一価免疫原性組成物のブタインフルエンザH3ウイルスの濃度及び一価免疫原性組成物のブタインフルエンザH1ウイルス濃度と比較して低下する、実施態様53から83のいずれか1つの方法。
85．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、異種チャレンジに対する防御を増大させる、実施態様53から84のいずれか1つの方法。
86．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、H1チャレンジに対する防御を増大させる、実施態様53から85のいずれか1つの方法。
87．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、H1N1チャレンジに対する防御を増大させる、実施態様53から86のいずれか1つの方法。
88．対象動物を免疫する方法で使用される実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物であって、前記方法がそのような対象動物に前記免疫原性組成物を投与する工程を含む、前記使用される免疫原性組成物。
89．ブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を必要がある対象動物で治療又は予防する方法で使用される実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物であって、前記方法が前記免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記使用される免疫原性組成物。
90．同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較してウイルス排出（物）を必要がある対象動物で減少させる方法で使用される実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物であって、前記方法が、前記免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記使用される免疫原性組成物。
91．一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスで免疫された同じ種の免疫コントロール群の対象動物と比較してウイルス排出（物）を必要がある対象動物で減少させる方法で使用される実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物であって、前記方法が、前記免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記使用される免疫原性組成物。
【００６１】
92．抗SIV抗体を有する対象動物をワクチン免疫する方法で使用される実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物であって、前記方法が、前記免疫原性組成物のシングル有効用量を前記動物に投与する工程を含む、前記使用される免疫原性組成物。
93．早期SIV感染を対象動物で予防又は減ずる方法で使用される実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物であって、前記方法が、前記免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記使用される免疫原性組成物。
94．前記対象動物がブタ、ウシ、ネコ及びイヌから成るリストから選択される、実施態様88から93のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
95．当該免疫原性組成物が1回投与される、実施態様88から94のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
96．当該免疫原性組成物が2用量以上で投与される、実施態様88から96のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
97．前記免疫原性組成物が鼻内に投与される、実施態様88から96のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
98．当該対象動物がブタインフルエンザウイルス母獣抗体陰性である、実施態様88から97のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
99．前記免疫原性組成物が妊娠中及び授乳中の雌ブタに投与される、実施態様88から98のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
100．当該免疫原性組成物が生後1カ月齢以内のブタに投与される、実施態様88から99のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
101．当該免疫原性組成物が、生後2週齢以内、好ましくは生後1週齢以内のブタに投与される、実施態様88から100のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
102．当該免疫原性組成物が1日目齢のブタに投与される、実施態様88から101のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
103．当該免疫原性組成物が生後24時間齢以内のブタに投与される、実施態様88から102のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
104．当該対象動物がブタインフルエンザウイルス母獣抗体陽性である、実施態様88から97のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
105．当該免疫原性組成物が、2から8log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から8log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む、実施態様88から104のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
106．当該免疫原性組成物が、2から6log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から6log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む、実施態様88から104のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
107．当該免疫原性組成物が、2から4log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス及び/又は2から4log10の改変生ブタインフルエンザH3ウイルスを含む、実施態様88から104のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
108．前記方法が、体重減少の縮小、ウイルス負荷の低下、肺病巣の縮小、排出（物）の減少、直腸温度の下降、又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターで、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して改善をもたらす、実施態様88から107のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
109．前記方法が、体重減少の縮小、ウイルス負荷の低下、肺病巣の縮小、排出（物）の減少、直腸温度の下降、又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターで、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスで免疫された同じ種の対象動物と比較して改善をもたらす、実施態様88から108のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
【００６２】
110．当該治療又は予防が、同じ種の非処置コントロール群の動物と比較してウイルス負荷期の短縮をもたらす、実施態様88から108のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
111．当該治療又は予防がチャレンジ又は感染後5日目から排出（物）の減少をもたらす、実施態様88から110のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
112．当該治療又は予防がチャレンジ又は感染後1日目又は2日目から排出（物）の減少をもたらす、実施態様88から111のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
113．当該対象動物が、一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスで免疫される同じ種の対象動物と比較して、より低い濃度の実施態様1から52の免疫原性組成物で免疫される、実施態様88から112のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
114．当該一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスが、H1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である、実施態様91、109又は113のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
115．当該H1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、実施態様1から52のH1N1 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である、実施態様114の使用される免疫原性組成物。
116．当該一価の改変生ブタインフルエンザH3又はH1ウイルスが、H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である、実施態様91、109又は113のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
117．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、実施態様1から52のH3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である、実施態様116の使用される免疫原性組成物。
118．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスが相互に相乗的に作用する、実施態様88から117のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
119．当該改変生ブタインフルエンザH3及びH1ウイルスの濃度が、一価免疫原性組成物のブタインフルエンザH3ウイルスの濃度及び一価免疫原性組成物のブタインフルエンザH1ウイルス濃度と比較して低下する、実施態様88から118のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
120．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、異種チャレンジに対する防御を増大させる、実施態様88から119のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
121．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、H1チャレンジに対する防御を増大させる、実施態様88から120のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
122．当該改変生ブタインフルエンザH3ウイルスが、H1N1チャレンジに対する防御を増大させる、実施態様88から121のいずれか1つの使用される免疫原性組成物。
【００６３】
123．医薬として使用される、実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物。
124．対象動物におけるブタインフルエンザウイルス感染の治療及び/又は予防のための、実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物の使用。
125．医薬の製造のための実施態様1から52のいずれか1つの免疫原性組成物の使用。
126．改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
127．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9及びN10から成る群から選択されるN（ノイラミニダーゼ）亜型を有する、実施態様1の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
128．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスがブタインフルエンザH1N1である、実施態様126又は127の改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
129．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスがNS1遺伝子に1つ以上の変異を有する、実施態様126から128のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
130．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスがNS1遺伝子内に欠失を有する、実施態様126から129のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
131．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスがキメラウイルスである、実施態様126から130のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
132．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、H3 SIV株、好ましくはH3N2 SIV株のカルボキシ末端切詰めNS1を含む、実施態様126から131のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
133．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、NS1アミノ酸1から124、1から125、1から126、1から127又は1から128を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードし、ここで当該アミノ末端アミノ酸が番号1である、実施態様126から132のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
134．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、NS1アミノ酸1から126を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードし、ここで当該アミノ末端アミノ酸が番号1である、実施態様126から132のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
135．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、NS1のカルボキシ末端から91、92、93又は94アミノ酸残基の欠失をもたらすカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードする、実施態様126から132のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
136．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスのNS1遺伝子又はタンパク質がA/ブタ/テキサス4199-2/98由来である、実施態様126から135のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
137．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、H1N1亜型由来のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ遺伝子セグメントを含む、実施態様126から136のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
【００６４】
138．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、A/ブタ/ミネソタ/37866/1999由来のヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ遺伝子セグメントを含む、実施態様126から137のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
139．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、A/ブタ/ミネソタ/37866/1999（H1N1）由来のHA及びNA並びにA/ブタ/テキサス/4199-2/98（H3N2）由来のPB2、PB1、PA、NP、Mを含み、当該NS1-126遺伝子がA/ブタ/テキサス/4199-2/98（H3N2）由来である、実施態様126から138のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
140．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、A/ブタ/ミネソタ/37866/1999及びTX/98/del 126のキメラである、実施態様126から139のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
141．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、a）そのcDNAが配列番号:5又は配列番号:6に示される核酸配列と少なくとも70%同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はb）配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はc）配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含む、実施態様126から140のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
142．当該改変生ブタインフルエンザH1ウイルスが、a）そのcDNAが配列番号:5又は配列番号:6に示される核酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はb）配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又はc）配列番号:7又は配列番号:8に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含む、実施態様126から141のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルス。
【００６５】
143．実施態様126から142のいずれか1つの改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含む、免疫原性組成物。
144．当該免疫原性組成物がシングル用量投与のために処方される、実施態様143の免疫原性組成物。
145．当該免疫原性組成物が鼻内に投与される、実施態様143又は144の免疫原性組成物。
146．当該免疫原性組成物が妊娠中及び授乳中の雌ブタに安全である、実施態様143から145のいずれか1つの免疫原性組成物。
147．当該免疫原性組成物が生後2週齢以内、好ましくは生後1週齢以内のブタに安全である、実施態様143から146のいずれか1つの免疫原性組成物。
148．当該免疫原性組成物が生後1日齢以内のブタに安全である、実施態様143から147のいずれか1つの免疫原性組成物。
149．前記免疫原性組成物がさらに医薬的に許容できる担体を含む、実施態様143から148のいずれか1つの免疫原性組成物。
150．当該免疫原性組成物が、2から8log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含む、実施態様143から149のいずれか1つの免疫原性組成物。
151．当該免疫原性組成物が、2から6log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含む、実施態様143から149のいずれか1つの免疫原性組成物。
152．当該免疫原性組成物が、2から4log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含む、実施態様143から149のいずれか1つの免疫原性組成物。
153．当該免疫原性組成物がワクチンである、実施態様143から152のいずれか1つの免疫原性組成物。
154．当該免疫原性組成物が、SIVによって引き起こされる臨床徴候の治療及び/又は予防に必要がある対象動物で有効である、実施態様143から153のいずれか1つの免疫原性組成物。
155．対象動物を免疫する方法であって、前記方法が、そのような対象動物に実施態様143から154のいずれか1つの免疫原性組成物を投与する工程を含む、前記方法。
156．ブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を必要がある対象動物で治療及び/又は予防する方法であって、前記方法が、実施態様143から154のいずれか1つの免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
【００６６】
157．同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して、ウイルス排出（物）を必要がある対象動物で減少させる方法であって、前記方法が実施態様143から154のいずれか1つの免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
158．抗SIV抗体を有する対象動物をワクチン免疫する方法であって、前記方法が、実施態様143から154のいずれか1つの免疫原性組成物のシングル有効用量を前記動物に投与する工程を含む、前記方法。
159．対象動物で早期SIV感染を予防又は減ずる方法であって、前記方法が実施態様143から154のいずれか1つの免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に投与する工程を含む、前記方法。
160．前記対象動物がブタ、ウシ、ネコ及びイヌから成るリストから選択される、実施態様155から159のいずれか1つの方法。
161．当該免疫原性組成物が1回投与される、実施態様155から159のいずれか1つの方法。
162．当該免疫原性組成物が2用量以上で投与される、実施態様155から160のいずれか1つの方法。
163．当該免疫原性組成物が鼻内に投与される、実施態様155から162のいずれか1つの方法。
164．当該対象動物がブタインフルエンザウイルス母獣抗体陰性である、実施態様155から163のいずれか1つの方法。
165．当該免疫原性組成物が妊娠中及び授乳中の雌ブタに投与される、実施態様155から164のいずれか1つの方法。
166．当該免疫原性組成物が生後1カ月齢以内のブタに投与される、実施態様155から165のいずれか1つの方法。
167．当該免疫原性組成物が、生後2週齢以内、好ましくは生後1週齢以内のブタに投与される、実施態様155から166のいずれか1つの方法。
168．当該免疫原性組成物が1又は2日目齢のブタに投与される、実施態様155から167のいずれか1つの方法。
169．当該免疫原性組成物が生後1日齢以内のブタに投与される、実施態様155から168のいずれか1つの方法。
170．当該対象動物がブタインフルエンザウイルス母獣抗体陽性である、実施態様155から163及び165から169のいずれか1つの方法。
171．当該免疫原性組成物が、2から8log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含む、実施態様155から170のいずれか1つの方法。
172．当該免疫原性組成物が、2から6log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含む、実施態様155から170のいずれか1つの方法。
173．当該免疫原性組成物が、2から4log10の改変生ブタインフルエンザH1ウイルスを含む、実施態様155から170のいずれか1つの方法。
174．前記方法が、体重減少の縮小、ウイルス負荷の低下、肺病巣の縮小、排出（物）の減少、直腸温度の下降、又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターで、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して改善をもたらす、実施態様155から173のいずれか1つの方法。
175．当該治療又は予防が、同じ種の非処置コントロール群の動物と比較してウイルス負荷期の短縮をもたらす、実施態様155から174のいずれか1つの方法。
176．当該治療又は予防がチャレンジ又は感染後5日目から排出（物）の減少をもたらす、実施態様155から175のいずれか1つの方法。
177．当該治療又は予防がチャレンジ又は感染後1日目又は2日目から排出（物）の減少をもたらす、実施態様155から176のいずれか1つの方法。
178．対象動物を免疫する方法であって、前記方法が、H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を含む免疫原性組成物を対象動物に生後2週齢以内に投与する工程を含む、前記方法。
179．ブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を必要がある対象動物で治療又は予防する方法であって、前記方法が、H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を含む免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に生後2週齢以内に投与する工程を含む、前記方法。
【００６７】
180．同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して、必要がある対象動物でウイルス排出（物）を減少させる方法であって、前記方法が、H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を含む免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に生後2週齢以内に投与する工程を含む、前記方法。
181．抗SIV抗体を有する対象動物をワクチン免疫する方法であって、前記方法が、H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を含む免疫原性組成物のシングル有効用量を前記動物に生後2週齢以内に投与する工程を含む、前記方法。
182．対象動物で早期SIV感染を予防又は減ずる方法であって、前記方法が、H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を含む免疫原性組成物の治療的に有効な量を当該対象動物に生後2週齢以内に投与する工程を含む、前記方法。
183．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、NS1アミノ酸1から124、1から125、1から126、1から127又は1から128を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードし、ここで当該アミノ末端アミノ酸が番号1である、実施態様178から182のいずれか1つの方法。
184．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、NS1アミノ酸1から126を含むカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードし、ここで当該アミノ末端アミノ酸が番号1である、実施態様178から182のいずれか1つの方法。
185．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、NS1のカルボキシ末端から91、92、93又は94アミノ酸残基の欠失をもたらすカルボキシ末端切詰めNS1タンパク質をコードする、実施態様178から182のいずれか1つの方法。
186．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体の当該NS1遺伝子又はタンパク質がA/ブタ/テキサス4199-2/98由来である、実施態様178から185のいずれか1つの方法。
187．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体がTX/98/del 126である、実施態様178から185のいずれか1つの方法。
188．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、A/ブタ/テキサス/4199-2/98由来のHA、NA、PB2、PB1、PA、NP及びMを含み、当該NS1-126遺伝子がA/ブタ/テキサス/4199-2/98に由来する、実施態様178から185のいずれか1つの方法。
189．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、TX/98/del126と称されるWO 2006/083286 A2に記載のH3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体である、実施態様178から188のいずれか1つの方法。
190．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、そのcDNAが配列番号:1若しくは配列番号:2に示される核酸配列と少なくとも70%同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又は配列番号:3若しくは配列番号:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又は配列番号:3若しくは配列番号:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含む、実施態様178から189のいずれか1つの方法。
191．当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体が、そのcDNAが配列番号:1若しくは配列番号:2に示される核酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又は配列番号:3若しくは配列番号:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質をコードするNA及びHA遺伝子を有する遺伝子セグメントの核酸配列を含むか、又は配列番号:3若しくは配列番号:4に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%同一性を有するアミノ酸配列を有するNA及びHAタンパク質を含む、実施態様178から190のいずれか1つの方法。
【００６８】
192．当該対象動物がブタ、ウシ、ネコ及びイヌから成るリストから選択される、実施態様178から191のいずれか1つの方法。
193．当該免疫原性組成物が1回投与される、実施態様178から192のいずれか1つの方法。
194．当該免疫原性組成物が2用量以上で投与される、実施態様178から192のいずれか1つの方法。
195．当該免疫原性組成物が鼻内に投与される、実施態様178から194のいずれか1つの方法。
196．当該対象動物がブタインフルエンザウイルス母獣抗体陰性である、実施態様178から195のいずれか1つの方法。
197．当該免疫原性組成物が妊娠中及び授乳中の雌ブタに投与される、実施態様178から196のいずれか1つの方法。
198．当該免疫原性組成物が生後1週齢以内のブタに投与される、実施態様178から197のいずれか1つの方法。
199．当該免疫原性組成物が、1又は2日目齢のブタに投与される、実施態様178から198のいずれか1つの方法。
200．当該免疫原性組成物が生後1日齢以内のブタに投与される、実施態様178から199のいずれか1つの方法。
201．当該対象動物がブタインフルエンザウイルス母獣抗体陽性である、実施態様178から195及び197から200のいずれか1つの方法。
202．当該免疫原性組成物が、2から8log10の当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を含む、実施態様178から201のいずれか1つの方法。
203．当該免疫原性組成物が、2から6log10の当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を含む、実施態様178から201のいずれか1つの方法。
204．当該免疫原性組成物が、2から4log10の当該H3N2 NS1欠失ブタインフルエンザウイルス変異体を含む、実施態様178から201のいずれか1つの方法。
205．前記方法が、体重減少の縮小、ウイルス負荷の低下、肺病巣の縮小、排出（物）の減少、直腸温度の下降、又は前記の組み合わせから成る群から選択される有効性パラメーターで、同じ種の非免疫コントロール群の対象動物と比較して改善をもたらす、実施態様178から204のいずれか1つの方法。
206．当該治療又は予防が、チャレンジ又は感染後5日目から排出（物）の減少をもたらす、実施態様178から205のいずれか1つの方法。
207．当該治療又は予防がチャレンジ又は感染後1日目から排出（物）の減少をもたらす、実施態様178から206のいずれか1つの方法。
208．当該方法が異種チャレンジに対する防御を提供する、実施態様178から207のいずれか1つの方法。
209．当該方法がH1チャレンジに対する防御を提供する、実施態様178から208のいずれか1つの方法。
210．当該方法がH1N1チャレンジに対する防御を提供する、実施態様178から209のいずれか1つの方法。
【００６９】
実施例
以下の実施例は単に本発明の例示を目的とする。当該実施例は如何なる態様においても特許請求の範囲を制限しないであろう。
【実施例１】
【００７０】
改変生ワクチン単離株の増殖及び二価ワクチンの処方で用いられる方法
改変生ワクチン単離株の増殖は種々の系を用いて達成できる。本実施例では、抗原及び最終的に二価ワクチンを生成すると評価されている2つの異なる系について材料と方法を記載する。
二価ワクチンの改変生ワクチン単離株の遺伝学的特徴
逆遺伝学を用いて、H1N1 NS1変異体及びH3N2 NS1変異体（各々カルボキシ切詰めNS1タンパク質をコードする）を作製した。H3N2 NS1変異体は既に以下に記載されている：Solorzano et al. 2005, J Virol 79:7535-7543；Vincent et al 2012, Journal of Virology 19: 10597-10605；及びWO 2006/083286 A2。
H1N1については、親H1N1（A/ブタ/ミネソタ/37866/1999）由来のヘマグルチニン（HA）及びノイラミニダーゼ（NA）遺伝子を、A/ブタ/テキサス/4199-2/98由来のPB2、PB1、PA、NP、M及びNS-126遺伝子と組み合わせた。生成されたH1N1 NS1変異体はしたがって、H1N1親由来の2遺伝子及びH3N2親由来の6遺伝子を含んでいた。
H3N2については、A/ブタ/テキサス/4199-2/98（H3N2）由来のHA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M及びNS-126遺伝子を組み合せ、得られたウイルスをTX98 H3N2 NS1 SIVと称した。
発育鶏卵での改変生ワクチン単離株の増殖及び二価ワクチンの処方
一方又は他方の改変生ウイルスを尿嚢液に注射することによって6から7日の発育鶏卵に接種する（尿嚢接種）。別々に予め標識した卵のセットをH1N1 NS1単離株及びH3N2 NS1単離株の増殖に用いる。それぞれのウイルスの接種後、卵を3から4日間インキュベートし、続いて、ウイルス含有尿嚢液を採集する前に少なくとも4時間冷蔵する。高濃度のそれぞれの改変生ウイルスを含む採集尿嚢液のアリコットを作成する。ウイルスを含む全てのアリコットをワクチン処方のために必要とされるまで-40℃以下で保存する。
ワクチンを処方する前に、各ウイルスを含む尿嚢液のアリコットを融解し、タイトレーションを実施して、ワクチン処方計画を実行できるようにウイルス濃度を決定する。ウイルスストックのためのウイルス量が決定されたら、ワクチン免疫の前に2つの単離株をリン酸緩衝食塩水とともに直接混合して動物試験で使用される所望の含有を得ることができる。
【００７１】
細胞系組織培養での改変生ワクチン単離株の増殖及び二価ワクチンの処方
培養液を交換しトリプシン含有培養液を添加した後で一方又は他方の改変生ウイルスを容器に添加することによって、6から8日齢のEVERO細胞を含む容器に接種する。別々に予め標識した容器のセットをH1N1 NS1単離株及びH3N2 NS1単離株の増殖に用いる。それぞれのウイルスの接種後、容器を7日間までインキュベートし続いて採集する。高濃度のそれぞれの改変生ウイルスを含む採集培養液のアリコットを作成する。全てのウイルスアリコットをワクチン処方のために必要とされるまで-40℃以下で保存する。
ワクチンを処方する前に、各ウイルスを含む培養液のアリコットを融解し、タイトレーションを実施して、ワクチン処方計画を実行できるようにウイルス濃度を決定する。ウイルスストックのためのウイルス量が決定されたら、2つの単離株を安定化剤（シュクロースゼラチン安定化剤）及びリン酸緩衝食塩水（必要な場合にのみ）とともに凍結乾燥前に直接混合することができる。将来の動物試験で使用される所望の含有レベルを得るために、各ウイルスストックの体積を管理する。一旦混合したら、二価ワクチン材料を無菌的に滅菌ガラスビンに移し、ビンを凍結乾燥装置に設置する。続いてこの凍結乾燥装置をフリーズドライサイクルの間稼働させて、動物試験で使用するまで4℃で保存されるワクチンを調製する。
ワクチン接種の直前に、ガラスビンに収められた凍結乾燥二価ワクチンを適切な体積のリン酸緩衝食塩水で再水和させて、動物試験で使用される所望の力価を得る。
【実施例２】
【００７２】
母獣免疫陰性1−6日齢のブタの種々の用量のシングル用量鼻内投与は鼻の排出（物）減少、肺からの単離減少及び肺病巣縮小をもたらす
試験設計考察、ワクチン処方、投与情報、及び有効性の要旨
試験1
試験0日目に、仔豚（グループ毎に別々の部屋に収容）に表1に示す含有レベルの卵で増殖させたワクチンウイルスでワクチン免疫した。ワクチン接種前の健康診断によって決定される約1週齢以下の健康な仔豚のみを試験に登録した。各鼻孔に1mLを適用することによって各々対応するワクチンの2mLでブタをワクチン免疫した。給餌比率は、施設の標準的作業手順にしたがい試験動物の齢及び条件について適切であった。水は試験を通して試験動物に自由に提供された。
表1．試験1：ワクチン含有レベル
0006722686.tif 000002
チャレンジ前に、仔豚を離乳させ、チャレンジルームに移し、続いて試験36日目に又はその頃に麻酔下で気管内接種によって仔豚を2mLの異種H1N2（A/ブタ/ノースカロライナ/001169/2006）SIV単離株（力価7.10 log10/mL）でチャレンジした。鼻スワブをチャレンジから毎日剖検まで収集し、続いて剖検時に肺を病巣について採点しさらに肺組織を収集した。ワクチン接種グループで鼻スワブ及び肺組織のウイルス単離数を減少させる能力とともに肺病巣を縮小させる能力によって、ワクチンの有効性を評価した。
表2に示すように、ワクチン接種動物は、高用量及び低用量の両方で異種チャレンジから防御された。前記防御は、ワクチン接種を受けずに後でチャレンジされたブタグループと比較して、鼻スワブ及び肺組織のウイルス単離の減少とともに肺病巣の縮小によって立証された。
表2．試験1：ワクチン有効性の要旨
0006722686.tif 000003
この試験で得られたデータによってもたらされる結論は、鼻孔から排出されるウイルス量の減少があること、肺組織のウイルス負荷の減少とともに肉眼肺病巣一次有効性パラメーターの軽減があることであった。総合すれば、この試験で用いられた2つの含有レベルでのシングル鼻内用量は、1から6日齢以内にワクチン接種されたナイーブブタで有効であることが示されている。
【００７３】
試験2
試験0日目に、仔豚（グループ毎に別々の部屋に収容）に表3に示す含有レベルの再構成凍結乾燥組織培養（EVERO細胞）増殖ワクチンウイルスでワクチン免疫した。ワクチン接種前の健康診断によって決定される約1週齢以下の健康な仔豚のみを試験に登録した。1つの鼻孔に全体積を適用することによって対応するワクチンの1mLで各ブタをワクチン免疫した。給餌比率は、施設の標準的作業手順にしたがい試験動物の齢及び条件について適切であった。水は試験を通して試験動物に自由に提供された。
【００７４】
表3．試験2：ワクチン含有レベル
0006722686.tif 000004
チャレンジ前に、仔豚を離乳させ、チャレンジルームに移し、続いて試験25日目に又はその頃に麻酔下で気管内接種によって仔豚を2mLの異種H1N2（A/ブタ/ノースカロライナ/001169/2006）SIV単離株（力価7.96 log10/mL）でチャレンジした。鼻スワブをチャレンジから毎日剖検まで収集し、続いて剖検時に肺を病巣について採点しさらに肺洗浄液を収集した。ワクチン接種グループで鼻スワブ及び肺洗浄液のウイルス単離数を減少させる能力とともに肺病巣を縮小させる能力によって、ワクチンの有効性を評価した。
表4に示すように、ワクチン接種動物は、全ての用量で異種チャレンジから防御された。前記防御は、ワクチン接種を受けずに後でチャレンジされたブタグループと比較したとき、鼻スワブ及び肺洗浄液のウイルス単離の減少とともに肺病巣の縮小によって立証された。
表4．試験2：ワクチン有効性の要旨
0006722686.tif 000005
この試験で得られたデータによってもたらされる結論は、鼻孔から排出されるウイルス量の減少があること、ウイルス単離陽性肺の減少とともに肉眼肺病巣一次有効性パラメーターの軽減があることであった。総合すれば、この試験で用いられた3つの含有レベルでのシングル鼻内用量は、1から6日齢以内にワクチン接種されたナイーブブタで有効であることが示されている。
【００７５】
試験3
試験0日目に、仔豚（グループ毎に別々の部屋に収容）に表5に示す含有レベルの再構成凍結乾燥組織培養（EVERO細胞）増殖ワクチンウイルスでワクチン免疫した。ワクチン接種前の健康診断によって決定される約1週齢以下の健康な仔豚のみを試験に登録した。1つの鼻孔に全体積を適用することによって対応するワクチンの1mLで各ブタをワクチン免疫した。給餌比率は、施設の標準的作業手順にしたがい試験動物の齢及び条件について適切であった。水は試験を通して試験動物に自由に提供された。
【００７６】
表5．試験3：ワクチン含有レベル
0006722686.tif 000006
チャレンジ前に、仔豚を離乳させ、チャレンジルームに移し、続いて試験30日目に又はその頃に麻酔下で気管内接種によって仔豚を2mLの異種H3N2（A/ブタ/ネブラスカ/97901/2008）SIV単離株（力価6.09 log10/mL）でチャレンジした。鼻スワブをチャレンジから毎日剖検まで収集し、続いて剖検時に肺を病巣について採点しさらに肺洗浄液を収集した。ワクチン接種グループで鼻スワブ及び肺洗浄液のウイルス単離数を減少させる能力とともに肺病巣を縮小させる能力によって、ワクチンの有効性を評価した。
表6に示すように、ワクチン接種動物は、全ての用量で異種チャレンジから防御された。前記防御は、ワクチン接種を受けずに後でチャレンジされたブタグループと比較したとき、鼻スワブ及び肺洗浄液のウイルス単離の減少とともに肺病巣の縮小によって立証された。
表6．試験3：ワクチン有効性の要旨
0006722686.tif 000007
この試験で得られたデータによってもたらされる結論は、鼻孔から排出されるウイルス量の減少があること、ウイルス単離陽性肺の減少とともに肉眼肺病巣一次有効性パラメーターの軽減があることであった。総合すれば、この試験で用いられた3つの含有レベルでのシングル鼻内用量は、1から6日齢以内にワクチン接種されたナイーブブタで有効であることが示されている。
【実施例３】
【００７７】
母獣免疫陰性の3週齢ブタへのシングル用量鼻内投与
試験設計考察、ワクチン処方、投与情報、及び有効性の要旨
試験4
試験0日目に、仔豚（グループ毎に別々の部屋に収容）に表7に示す含有レベルの卵増殖ワクチンウイルスでワクチン免疫した。ワクチン接種前の健康診断によって決定される約3週齢の健康なブタのみを試験に登録した。各鼻孔に2mLを適用することによって4mLのワクチンで各ブタをワクチン免疫した。給餌比率は、施設の標準的作業手順にしたがい試験動物の齢及び条件について適切であった。水は試験を通して試験動物に自由に提供された。
【００７８】
表7．試験4：ワクチン含有レベル
0006722686.tif 000008
試験28日目に又はその頃に、麻酔下で気管内接種によって仔豚を2mLの異種H1N1（A/ブタ/インジアナ/1726/88）SIV単離株（力価6.63 log10/mL）で又は2mLの異種H3N2（A/ブタ/ネブラスカ/97901-10/2008）SIV単離株（力価7.58 log10/mL）でチャレンジした。鼻スワブをチャレンジから毎日剖検まで収集し、続いて剖検時に肺を病巣について採点しさらに肺組織を収集した。ワクチン接種グループで鼻スワブ及び肺組織のウイルス単離数を減少させる能力とともに肺病巣を縮小させる能力によって、ワクチンの有効性を評価した。
表8に示すように、ワクチン接種動物は異種H1N1チャレンジから防御された。前記防御は、ワクチン接種を受けずに後でチャレンジされたブタグループと比較したとき、鼻スワブ及び肺組織のウイルス単離の減少とともに肺病巣の縮小によって立証された。同様な結果（データは示されていない）が、同じワクチンで筋肉内にワクチン免疫されたブタで認められた。さらに表8に示すように、ワクチン接種動物は異種H3N2チャレンジから防御された。前記防御は、ワクチン接種を受けずに後でチャレンジされたブタグループと比較したとき、肺組織のウイルス単離の減少とともに肺病巣の縮小によって立証された。鼻スワブは、チャレンジの日（チャレンジ前）から剖検の日まで収集された。ワクチン接種動物のいずれもH1N1チャレンジ後にウイルスを排出せず、非ワクチン接種動物はチャレンジ後2日で排出を開始したので（データは示されていない）、二価ワクチンは、チャレンジ後2日でワクチン接種ブタのチャレンジウイルス排出を予防した。
【００７９】
表8．試験4：ワクチン有効性の要旨
0006722686.tif 000009
この試験で得られたデータによってもたらされる結論は、H1N1チャレンジ後に鼻孔から排出されるウイルス量の減少があること、いずれのウイルスのチャレンジ後にも肺のウイルス負荷の減少とともに肉眼肺病巣一次有効性パラメーターの軽減があることであった。この試験で用いられた含有レベルで与えられるシングル鼻内用量は、3週齢でワクチン接種されたナイーブブタで有効である。
【実施例４】
【００８０】
妊娠中のシングル用量鼻内投与の安全性
試験設計考察、ワクチン処方、投与情報、及び安全性の要旨
試験5
試験日の前の28日目又はその頃に、8匹の雌若ブタに表9に示す含有レベルの卵増殖ワクチンウイルスでワクチン免疫した。ワクチン接種前の健康診断によって決定される健康な妊娠若ブタのみを試験に登録した。各鼻孔に1mLを適用することによって2mLのワクチンで各雌若ブタをワクチン免疫した。給餌比率は、施設の標準的作業手順にしたがい試験動物の齢及び条件について適切であった。水は試験を通して試験動物に自由に提供された。
表9．試験5：ワクチン含有レベル
0006722686.tif 000010
ワクチン接種後、ワクチン接種雌若ブタの各々について毎日観察し臨床徴候を記録することによってワクチンの安全性を評価した。ワクチン接種時から出産までいずれの雌若ブタについても大きな臨床徴候は報告されなかった。しかしながら、当該雌若ブタの3匹についてはいくつかの小さな臨床徴候が報告されたが、いずれの徴候もワクチン接種後5日目まで観察されたものはなく、いずれの徴候も4日を超えて持続することはなかった。
この試験で得られたデータによってもたらされる結論は、妊娠90日目頃にワクチン接種を実施し、この試験で用いられた含有レベルで雌若ブタに投与されるときは、このワクチンは安全であるということである。
【実施例５】
【００８１】
母獣免疫陽性1−8日齢ブタへのシングル用量鼻内投与
試験設計考察、ワクチン処方、投与情報、及び有効性の要旨
試験5
試験日の前の28日目又はその頃に、8匹の雌若ブタに表1に示す含有レベルで卵増殖ワクチンウイルスによりワクチン免疫して母獣免疫を誘発した。各鼻孔に1mLを適用することによって2mLのワクチンで雌若ブタを各々ワクチン免疫した。試験0日目の前に全ての雌若ブタは出産し、この時点で仔豚を表10に示す含有レベルの卵増殖ワクチンウイルスでワクチン免疫した。ワクチン接種前の健康診断によって決定される健康な約1週齢以下のブタのみを試験に登録した。各鼻孔に1mLを適用することによって2mLの対応するワクチンで各ブタをワクチン免疫した。給餌比率は、施設の標準的作業手順にしたがい試験動物の齢及び条件について適切であった。水は試験を通して試験動物に自由に提供された。
表10．試験5：ワクチン含有レベル
0006722686.tif 000011
チャレンジ前に、仔豚を離乳させ、チャレンジルームに移し、続いて試験42日目に又はその頃に麻酔下で気管内接種によって仔豚を2mLの異種H1N2（A/ブタ/ノースカロライナ/001169/2006）SIV単離株（力価7.61 log10/mL）でチャレンジした。鼻スワブをチャレンジから毎日剖検まで収集し、続いて剖検時に肺を病巣について採点しさらに肺洗浄液を収集した。ワクチン接種グループで鼻スワブ及び肺洗浄液のウイルス単離数を減少させる能力とともに肺病巣を縮小させる能力によって、ワクチンの有効性を評価した。
表11に示すように、二価ワクチン接種動物は異種チャレンジから防御された。前記防御は、ワクチン接種を受けずに後でチャレンジされたブタグループと比較して、鼻スワブ及び肺洗浄液のウイルス単離の減少とともに肺病巣の縮小によって立証された。
表11．試験5：ワクチン有効性の要旨
0006722686.tif 000012
この試験で得られたデータによってもたらされる結論は、鼻孔から排出されるウイルス量の減少があること、肺のウイルス負荷の減少とともに肉眼肺病巣一次有効性パラメーターの軽減があることであった。総合すれば、この試験で用いられた2つの含有レベルでのシングル鼻内用量は、1から8日齢以内にワクチン接種された母獣免疫陽性ブタで有効であることが示されている。
【実施例６】
【００８２】
一価ワクチンを超える二価ワクチンのシングル用量鼻内投与の有益な効果
試験設計の考察、ワクチン処方、投与情報、及び有効性の要旨
試験6及び試験1
2つの対応する試験の試験0日目に、仔豚（グループ毎に別々の部屋に収容）に表12に示す含有レベルの組織培養（EVERO細胞）増殖ワクチンウイルスでワクチン免疫した。ワクチン接種前の健康診断によって決定される約1週齢以下の健康な仔豚のみを試験に登録した。試験1では、各鼻孔に1/2 mLを適用することによって、各ブタは1mLの一価ワクチンでワクチン免疫された。試験6では、左の鼻孔に全体積を適用することによって、各ブタは1mLの二価ワクチンでワクチン免疫された。給餌比率は、施設の標準的作業手順にしたがい試験動物の齢及び条件について適切であった。水は試験を通して試験動物に自由に提供された。
表12．試験1及び6：ワクチン含有レベル
0006722686.tif 000013
N/A＝適用不能
2つの対応する試験でのチャレンジ前に、仔豚を離乳させ、チャレンジルームに移し、続いて試験25日目に又はその頃に麻酔下で気管内接種によって仔豚を2mLの異種H1N2（A/ブタ/ノースカロライナ/001169/2006）SIV単離株（試験6では力価7.44 log10/mL、試験1では力価7.92 log10/mL）でチャレンジした。鼻スワブをチャレンジから毎日剖検まで収集し、続いて剖検時に肺を病巣について採点しさらに肺洗浄液を収集した。ワクチン接種グループで鼻スワブ及び肺洗浄液のウイルス単離数を減少させる能力とともに肺病巣を縮小させる能力によって、ワクチンの有効性を評価した。
表13に示すように、試験6では一価ワクチンによりワクチン免疫された動物は、異種チャレンジから防御される前に4.99 log10FAID50/mLの用量のH1N1ワクチンウイルスを必要とした。防御は、同じ試験内でワクチン接種を受けずに後でチャレンジされたブタグループと比較して、鼻スワブ及び肺洗浄液のウイルス単離の減少とともに肺病巣の縮小によって立証された。
表2に示すように、試験1の動物は、H1N1ワクチンが二価ワクチンとして2.84 log10FAID50/mLのH3N2ワクチンウイルスとともに投与されるときには、2.81 log10FAID50/mLの用量のH1N1ワクチンウイルスを必要としただけであった。防御二価ワクチンに含まれる計算による抗原合計用量は、各抗原の量を一緒に加えるとき3.13 log10FAID50/mLである。防御は、同じ試験内でワクチン接種を受けずに後でチャレンジされたブタグループと比較して、鼻スワブ及び肺洗浄液のウイルス単離の減少とともに肺病巣の縮小によって立証された。
【００８３】
表13．試験1及び6：ワクチン有効性の要旨
0006722686.tif 000014
ここで提供された実験データは、ブタインフルエンザウイルスのH1N1 NS1及びH3N2欠失変異体を一緒にする組み合わせは、驚くべきことに個々の成分の合計効果よりも強力であることを示している。
本発明の二価ワクチンの相乗効果は、一価H1N1ワクチンで必要とされる含有レベルよりもはるかに低い含有レベルで投与されるときに防御を提供するその能力によって非常に明瞭に示される。わずかに3.13 log10FAID50/mLの総用量で投与された本発明の二価ワクチンは、4.99 log10FAID50/mL（二価ワクチンの総用量よりも約72倍高い）で投与された後で同様な防御レベルを示す一価ワクチンに匹敵する防御を提供した。さらにまた、Vincentら（Vincent et al, 2012, Journal of Virology 19: 10597-10605）は、1ｘ106 TCID50（6 log10FAID50に相当する）の一価H3N2（二価ワクチンの総用量よりも約741倍高い）が防御を提供することを示している。したがって、二価ワクチンのH1及びH3成分の濃度は、一価ワクチンで必要とされる濃度と比較して劇的に減少する。これは予想に反する驚くべき相乗効果である。
【００８４】
チャレンジウイルス量を考慮するとき、二価ワクチンの相乗効果をさらにいっそう支持する証拠が存在する。一価ワクチンはより高い用量で投与されても、同じチャレンジ単離株の約3倍低いチャレンジに対して同レベルの防御しか与えなかった。
これらの試験で得られたデータによってもたらされる結論は、ワクチンが二価生成物として投与されるとき、一価生成物として投与されるときと比較してはるかに低い用量の抗原で、鼻孔から排出されるウイルス量の減少があること、ウイルス単離陽性肺の減少とともに肉眼肺病巣一次有効性パラメーターの軽減があることである。総合すれば、データは、二価ワクチンのシングル鼻内用量は、これらの試験でナイーブブタに用いられたより高い用量の一価ワクチンよりも有効であることを示している。
本発明の相乗的組合せは、有害作用の機会を減ずるので有益である。加えて、個々の成分よりも低い濃度を含む二価ワクチンは明らかに製造でも同様に容易かつ安価であろう。
さらにまた、上記に記載した相乗的な濃度効果の他に、さらに別の有益な驚くべき相乗効果が存在する。H3N2成分はH1N1成分と相乗的に作用する。二価ワクチンの相乗効果は、異種H1N2（A/ブタ/ノースカロライナ/001169/2006）SIV単離株に対して防御を提供するその能力によって非常に明確に示される。したがって、交差防御作用が存在する。この作用はさらに相乗的である。なぜならば、本発明の二価ワクチンは、上記に記載の一価ワクチンで要求されるレベルよりもはるかに低い含有レベルで投与されるからである。
【００８５】
本出願に随伴する配列は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
H3N2（A/ブタ/テキサス/4199-2/98）のNAの配列番号:1ヌクレオチド配列
【００８６】
0006722686.tif 000015
【００８７】
H3N2（A/ブタ/テキサス/4199-2/98）のHAの配列番号:2ヌクレオチド配列
【００８８】
0006722686.tif 000016
0006722686.tif 000017
【００８９】
H3N2（A/ブタ/テキサス/4199-2/98）のNAの配列番号:3アミノ酸配列
【００９０】
0006722686.tif 000018
【００９１】
H3N2（A/ブタ/テキサス/4199-2/98）のHAの配列番号:4アミノ酸配列
【００９２】
0006722686.tif 000019
【００９３】
H1N1（A/ブタ/ミネソタ/37866/1999）のNAの配列番号:5ヌクレオチド配列
【００９４】
0006722686.tif 000020
【００９５】
H1N1（A/ブタ/ミネソタ/37866/1999）のHAの配列番号:6ヌクレオチド配列
【００９６】
0006722686.tif 000021
0006722686.tif 000022
【００９７】
H1N1（A/ブタ/ミネソタ/37866/1999）のNAの配列番号:7アミノ酸配列
【００９８】
0006722686.tif 000023
【００９９】
H1N1（A/ブタ/ミネソタ/37866/1999）のHAの配列番号:8アミノ酸配列
【０１００】
0006722686.tif 000024
【配列表】
0006722686000001.app