(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的結合物質Ａを含み、光重合または熱重合開始能を有する複合体を調製する工程１、
工程１で得られた複合体と、前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃとを結合させる工程２、
工程２で得られた系中で、前記光重合または熱重合開始能を有する部位により反応し、かつ、重合することで着色または発光するモノマーまたはオリゴマーを光重合または熱重合させる工程３、および、
前記モノマーまたはオリゴマーを光重合または熱重合することで生じる、着色または発光により前記物質Ａまたは物質Ｃを測定する工程４を含む、
前記物質Ａまたは物質Ｃの測定方法。
【請求項２】
前記複合体における光重合または熱重合開始能を有する部位が、重合開始剤または増感剤由来である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
前記モノマーまたはオリゴマーが、ラジカル重合性基を有する凝集誘起発光性の化合物である、請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項４】
前記モノマーがラジカル重合性基を有するテトラフェニルエチレンまたはその誘導体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項５】
前記テトラフェニルエチレンまたはその誘導体が下記式（１）で表される、請求項４に記載の測定方法。
【化１】
0006769749.tif 000013
［式（１）中、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ独立して、水素原子、有機基、水溶性基、反応性基または有機金属基であり、ａ〜ｄはそれぞれ独立して、１〜５の整数である。但し、Ｒ1〜Ｒ4のうち、少なくとも１つはラジカル重合性基である。なお、ａが２以上の場合、複数のＲ1は同一であっても異なっていてもよく、複数のＲ1が互いに結合して環を形成していてもよい。ｂ〜ｄが２以上の場合も同様である。さらに、Ｒ1とＲ2、Ｒ2とＲ4、Ｒ3とＲ4、Ｒ3とＲ1がそれぞれ結合して環を形成していてもよい。］
【請求項６】
前記物質Ａが、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、抗体、抗原、酵素、ホルモン、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ビタミン類、脂質、薬剤、基質、ホルモン類、神経伝達物質、イミノジ酢酸、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオンおよびこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
前記工程３における光重合または熱重合の際に架橋剤を用いる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項８】
特異的結合物質Ａを含み、光重合または熱重合開始能を有する複合体と、
前記光重合または熱重合開始能を有する部位により反応し、かつ、光重合または熱重合することで着色または発光するモノマーまたはオリゴマーとを含む、
前記物質Ａまたは前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃを測定するためのキット。
【請求項９】
さらに、前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
さらに、物質Ｃと特異的に結合する物質Ａ以外の物質Ａ'を含む、請求項８または９に記載のキット。
【請求項１１】
特異的結合物質Ａを含み、かつ、光重合または熱重合開始能を有する、
前記物質Ａまたは前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃを測定するための複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象物質の測定方法、キット、複合体および化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床診断分野では、迅速および正確に測定されるべき目的物質の種類、ならびに、測定方法の双方に関して、近年広範に拡大している。そして、この分野では、検体中に低濃度で存在する物質を検出するための簡便で高感度な手段が望まれている。しかし、これらの低濃度物質は、１０-12モル未満の濃度で検体中に存在していることがあり、低濃度のこれら物質の検出は困難とされている。
【０００３】
従来、微量の抗原または抗体等を測定するための技術として、酵素免疫測定方法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が知られている。酵素免疫測定方法の技術としては、例えば、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、ウエスタンブロッティング法等が広く用いられている（例えば、特許文献１参照）。しかし、大部分の酵素免疫測定法は、複雑な手技を必要とし、熟練者とそうでない者との間では、その精度に大きな格差が存在する。さらに、大部分の酵素免疫測定法は、感度が不良であり、感度が良くてもダイナミックレンジが小さく（アナライトの濃度差：２〜１００倍）、多くの場合、複雑で特別な装置の使用が必要になる（例えば特許文献２）。そこで、より高い感度、大きいダイナミックレンジ（アナライトの濃度差：１０3〜１０4倍）および、より安定な試薬を用いる簡便な測定法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００−８８８５０号公報
【特許文献２】米国特許出願公開２０１２／０３１６０７９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、特異的結合性を有する被検物質を容易に測定することができる測定方法、ならびに、該方法に好適に用いることができるキット、複合体および化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題は、例えば以下の手段により解決することができる。
なお、本発明において、数値範囲を表す「ａ〜ｂ」等の表記は、ａ以上、ｂ以下と同義であり、ａおよびｂをその範囲内に含むものとする。
【０００７】
［１］  特異的結合物質Ａを含み、重合開始能を有する複合体を調製する工程１、
工程１で得られた複合体と、前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃとを結合させる工程２、
工程２で得られた系中で、前記重合開始能を有する部位により反応し、かつ、重合することで着色または発光するモノマーまたはオリゴマーを重合させる工程３、および、
前記モノマーまたはオリゴマーを重合することで生じる、着色または発光により前記物質Ａまたは物質Ｃを測定する工程４を含む、
前記物質Ａまたは物質Ｃの測定方法。
【０００８】
［２］  前記複合体における重合開始能を有する部位が、重合開始剤または増感剤由来である、［１］に記載の測定方法。
【０００９】
［３］  前記モノマーまたはオリゴマーが、反応性基を有する凝集誘起発光性の化合物である、［１］または［２］に記載の測定方法。
［４］  前記モノマーが反応性基を有するテトラフェニルエチレンまたはその誘導体である、［１］〜［３］のいずれかに記載の測定方法。
［５］  前記テトラフェニルエチレンまたはその誘導体が下記式（１）で表される、［４］に記載の測定方法。
【００１０】
【化１】
0006769749.tif 000002
［式（１）中、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ独立して、水素原子、有機基、水溶性基、反応性基または有機金属基であり、ａ〜ｄはそれぞれ独立して、１〜５の整数である。但し、Ｒ1〜Ｒ4のうち、少なくとも１つは反応性基である。なお、ａが２以上の場合、複数のＲ1は同一であっても異なっていてもよく、複数のＲ1が互いに結合して環を形成していてもよい。ｂ〜ｄが２以上の場合も同様である。さらに、Ｒ1とＲ2、Ｒ2とＲ4、Ｒ3とＲ4、Ｒ3とＲ1がそれぞれ結合して環を形成していてもよい。］
【００１１】
［６］  前記物質Ａが、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、抗体、抗原、酵素、ホルモン、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ビタミン類、脂質、薬剤、基質、ホルモン類、神経伝達物質、イミノジ酢酸、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオンおよびこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の測定方法。
【００１２】
［７］  前記工程３における重合の際に架橋剤を用いる、［１］〜［６］のいずれかに記載の測定方法。
【００１３】
［８］  特異的結合物質Ａを含み、重合開始能を有する複合体と、
前記重合開始能を有する部位により反応し、かつ、重合することで着色または発光するモノマーまたはオリゴマーとを含む、
前記物質Ａまたは前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃを測定するためのキット。
【００１４】
［９］  さらに、前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃを含む、［８］に記載のキット。
［１０］  さらに、物質Ｃと特異的に結合する物質Ａ以外の物質Ａ'を含む、［８］または［９］に記載のキット。
【００１５】
［１１］  特異的結合物質Ａを含み、かつ、重合開始能を有する、
前記物質Ａまたは前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃを測定するための複合体。
【００１６】
［１２］  下記式（１）で表される反応性基を有するテトラフェニルエチレンまたはその誘導体。
【００１７】
【化２】
0006769749.tif 000003
［式（１）中、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ独立して、水素原子、有機基、水溶性基、反応性基または有機金属基であり、ａ〜ｄはそれぞれ独立して、１〜５の整数である。但し、Ｒ1〜Ｒ4のうち、少なくとも１つは反応性基である。なお、ａが２以上の場合、複数のＲ1は同一であっても異なっていてもよく、複数のＲ1が互いに結合して環を形成していてもよい。ｂ〜ｄが２以上の場合も同様である。さらに、Ｒ1とＲ2、Ｒ2とＲ4、Ｒ3とＲ4、Ｒ3とＲ1がそれぞれ結合して環を形成していてもよい。］
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、特異的結合性を有する被検物質を容易に測定することができる測定方法、ならびに、該方法に好適に用いることができるキット、複合体および化合物（誘導体）を提供することができる。
また、本発明によれば、従来と比べ、短時間、高感度で被検物質を測定、定量等することができる。従って、本発明によれば、高感度の検出や診断等を行うことができ、次世代高感度検出・診断装置等に好適に利用できると考えられる。
【００１９】
さらに本発明によれば、蛍光色素などの着色ラベルを用いた従来の測定方法では必要であった、未反応の着色ラベルを取り除くための洗浄工程が不要であるため、操作が簡便となり、さらに洗浄の程度によらず、シグナルのバックグラウンドノイズが低い。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、実施例１における、ビオチン濃度に対する蛍光強度の関係を示す図である。
【図２】図２は、実施例２における、ビオチン濃度に対する蛍光強度の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
≪被検物質の測定方法≫
本発明に係る被検物質の測定方法（以下「本方法」ともいう。）は、
特異的結合物質Ａを含み、重合開始能を有する複合体を調製する工程１、
工程１で得られた複合体と、前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃとを結合させる工程２、
工程２で得られた系中で、前記重合開始能を有する部位により反応し、かつ、重合することで着色または発光するモノマーまたはオリゴマー（以下「モノマー等」ともいう。）を重合させる工程３、および、
前記モノマー等を重合することで生じる、着色または発光により前記物質Ａまたは物質Ｃを測定する工程４を含む。
なお、本発明における被検物質とは、具体的には、前記物質Ａまたは物質Ｃのことである。
【００２２】
本方法は、臨床診断分野に特に好適に用いられ、次世代高感度検出・診断装置等に好適に利用できると考えられる。
また、本方法は、ＥＬＩＳＡ法、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）、イムノクロマト法等における増感方法としても使用できる。
【００２３】
本方法は、前記用途に好適に用いることができる等の点から、水系媒体（例：ＰＢＳ）中で行うことが好ましい。
【００２４】
＜工程１＞
本方法は、特異的結合物質Ａを含み、重合開始能を有する複合体を調製する工程１を含む。
本方法では、この工程１で得られた複合体を用いることで、具体的には、この複合体上または複合体付近において、重合することで着色または発光するモノマー等を重合させることで、短時間、高感度で被検物質を測定、定量等することができる。
【００２５】
（特異的結合物質Ａ）
前記物質Ａは、特異的結合性を有する物質であれば特に制限されず、具体的には、前記物質Ｃと特異的に結合する物質である。
前記物質Ａは、複合体を構成する成分であり、本方法の使用態様により、被検物質ともなる成分でもある。
なお、本発明において、「結合」とは、吸着等を含む概念である。
【００２６】
前記物質Ａとしては、例えば、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、抗体、抗原、酵素、ホルモン、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖類、ビタミン類、脂質、薬剤、基質、ホルモン類、神経伝達物質、イミノジ酢酸、２−アミノフェニル硼素酸、４−アミノベンズアミジン、グルタチオンおよびこれらの誘導体が挙げられる。
物質Ａは、１種単独でもよく、２種以上の混合物でもよい。
【００２７】
前記タンパク質としては、特に制限されず、アミノ酸のみで構成される単純タンパク質；糖鎖を含む糖タンパク質、脂質を含むリポタンパク質、リン原子を含むリンタンパク質、核酸を含む核タンパク質，金属原子を含む金属タンパク質などのアミノ酸以外の成分を含む複合タンパク質等が挙げられる。
より具体的には、免疫グロブリン、サイトカイン、ホルモン、アルブミン、グロブリン、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパク、（ストレプト）アビジン、レクチン、濾胞刺激ホルモンなどの蛋白ホルモン、これらの機能性変異体等が挙げられる。
【００２８】
前記ペプチドとしては、インシュリン、Ｃ−ペプチド（ＣＰＲ）、ナトリウム利尿ペプチド（ＮＰ）、Ｉ型コラーゲン−Ｃ−テロペプチド（Ｉ ＣＴＰ）、可溶性メソテリン関
連ペプチド等が挙げられる。
【００２９】
前記抗体としては、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれを用いてもよい。
なお、前記抗体としては、いずれのイムノグロブリンクラスおよびサブクラスでもよく、さらには抗体断片でもよい。抗体断片とは、前述の抗体の一部分を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｆｖ、ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびその重合体等がこれにあたる。
【００３０】
前記抗原としては、血液の抗原、細菌等の菌類、カビ、原虫またはウィルスなどの微生物、これらの一部、癌抗原、代謝産物、農薬、汚染物質、細胞表面の抗原等が挙げられる。
前記核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＧＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡ、プラスミド、ファージ、合成オリゴヌクレオチド等が挙げられる。
前記糖類としては、ヘパリン、ルイスＸ、ガングリオシド、グルコース等の糖類または多糖類が挙げられる。
前記ビタミン類としては、ビオチン等が挙げられる。
前記脂質としては、レシチンを含む物質が挙げられ、具体的には、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン等が挙げられる。
【００３１】
前記薬剤としては、特に制限されないが、アルカロイド、ステロイド、バルビツール酸塩などの５または６環員のラクタム類、アンフェタミンなどの炭素原子２〜３個のアルキルを有するアミノアルキルベンゼン、オキシアゼパムなどのベンズ複素環類、プリン類、カンナビノールなどのマリファナ誘導体、チロキシンなどのホルモン類、プロスタグランジン類、イミプラミンなどの３環式の抗うつ剤、メトトレキサートなどの抗新生物剤、ペニシリンなどの抗生物質等が挙げられる。
【００３２】
前記基質としては、デンプン等が挙げられる。
前記ホルモン類としては、チロキシン等が挙げられる。
前記神経伝達物質としては、グルタミン酸、ドーパミン、セロトニン、ノルアドレナリン、アセチルコリン、グリシン、ペプチド性神経伝達物質等が挙げられる。
【００３３】
また、前記物質Ａとしては、特異的結合性を有する物質を含む試料（例：尿、血液、血漿、血清、唾液）に含まれたものであってよい。該試料はそのまま本方法に用いてもよいし、特異的結合性を有する物質を分離するなどの前処理をして本方法に用いてもよい。
【００３４】
これらの中でも、物質Ａとしては、診断薬用等に適したリガンド結合固相担体が得られる等の点から、抗体または抗原が好ましい。
【００３５】
（複合体）
前記複合体は、前記物質Ａを含み、かつ、重合開始能を有すれば（重合開始能を示す部位を有すれば）特に制限されない。
重合開始能を有する部位は、複合体を調製する際に用いる化合物等の原料と反応した別の物質から間接的に生じる部位（基）でもよいが、複合体を調製する際に用いる化合物等の原料由来の部位（基）であることが好ましく、重合開始剤または増感剤由来の重合開始能を有する部位（基）であることがより好ましい。
【００３６】
前記重合開始能を有する部位により開始される重合は、ラジカル重合性でもイオン重合性でもよいが、特にラジカル重合性であることが好ましい。
【００３７】
前記重合開始剤としては、熱重合開始剤や光重合開始剤を用いることができるが、得られる複合粒子を臨床診断分野などに用いる場合には、熱重合により重合系が悪影響を受けることがあるため、特に光開始剤が好ましい。
また、前記増感剤としては、光増感剤が好ましい。
前記重合開始剤および増感剤はそれぞれ、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもよく、重合開始剤および増感剤を併用してもよい。
【００３８】
本方法において、重合開始剤由来の重合開始能を示す部位を有する複合体を用いる場合、該複合体上で前記モノマー等が重合するため、該複合体が存在するその場所で着色または発光が生じる。このように、該複合体を用いることで、着色または発光が生じる場所が特定の場所に定まるため、イムノクロマト法などの被検物質が流動する場合でも、ＥＬＩＳＡ法などの被検物質が流動しない場合でも、該複合体は好適に用いることができるが、特に、イムノクロマト法などの被検物質が流動する被検物質の測定方法において、より効果が発揮される。
【００３９】
一方、本方法において、増感剤由来の重合開始能を示す部位を有する複合体を用いる場合、トリエチルアミン等を用いることにより発生されるラジカルや、酸素と反応することにより発生される一重項酸素などにより、該複合体付近で前記モノマー等が重合し、該複合体が存在する付近で着色または発光が生じる。このため、イムノクロマト法などの被検物質が流動する被検物質の測定方法に該複合体を用いてもよいが、ＥＬＩＳＡ法などの被検物質が流動しない被検物質の測定方法に該複合体は好適に用いられる。
【００４０】
前記熱重合開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウムなどの過硫酸塩、過酸化水素、ｔ−ブチルハイドロパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシマレイン酸、コハク酸パーオキサイド、２，２’−アゾビス〔２−Ｎ−ベンジルアミジノ〕プロパン塩酸塩などの水溶性開始剤；ベンゾイルパーオキサイド、クメンハイドロパーオキサイド、ジイソプロピルパーオキシジカーボネート、クミルパーオキシネオデカノエート、クミルパーオキシオクトエート、アゾビスイソブチロニトリルなどの油溶性開始剤等が挙げられる。
【００４１】
前記光重合開始剤としては、１−ヒドロキシシクロヘキシルフェニルケトン、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、キサントン、フルオレノン、ベンズアルデヒド、フルオレン類、アントラキノン、トリフェニルアミン、カルバゾール類、３−メチルアセトフェノン、４−クロロベンゾフェノン、４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、４，４’−ジアミノベンゾフェノン、ミヒラーケトン、ベンゾインプロピルエーテル、ベンゾインエチルエーテル、ベンジルジメチルケタール、１−（４−イソプロピルフェニル）−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−１−オン、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニルプロパン−１−オン、チオキサントン、ジエチルチオキサントン、２−イソプロピルチオキサントン、２−クロロチオキサントン、２−メチル−１−〔４−（メチルチオ）フェニル〕−２−モルホリノ−プロパン−１−オン、２，４，６−トリメチルベンゾイルジフェニルフォスフィンオキサイド、ビス−（２，６−ジメトキシベンゾイル）−２，４，４−トリメチルペンチルフォスフィンオキシド；ＩＲＧＡＣＵＲＥ１８４、３６９、６５１、５００、９０７、２９５９、ＣＧＩ１７００、ＣＧＩ１７５０、ＣＧＩ１８５０、ＣＧ２４−６１；Ｄａｒｏｃｕｒｅ１１１６、１１７３、ＬｕｃｉｒｉｎＴＰＯ（以上、ＢＡＳＦ社製）；ユベクリルＰ３６（ＵＣＢ社製）等が挙げられる。
【００４２】
前記光増感剤としては、ローダミンやフルオレセインのようなキサンテン系色素をはじめとして、フタロシアニン系色素、クマリン系色素、シアニン系色素、ポルフィリン系色素、アゾ系色素、アクリジン系色素などが挙げられる。また、これら以外の他の光増感剤の例としては、N.F. Turroの「Molecular Photochemistry」, p 132, W.A. Benjamin Inc., NY. 1965に記載されている化合物が挙げられる。
【００４３】
前記複合体における重合開始剤または増感剤由来の重合開始能を有する部位（基）の割合は、該複合体上または該複合体付近で前記モノマー等の重合が容易に起こり、該複合体上または該複合体付近でより確実に着色または発光が生じる等の点から、複合体１物質量（ｍｏｌ）に対し、好ましくは１〜１０００等量、より好ましくは、２〜１００等量である。
【００４４】
前記複合体は、例えば、前記物質Ａと重合開始剤または増感剤とを結合させることで得ることができる。このような結合は、常法に従い行えばよいが、共有結合法で行うのが好ましい。例えば、前記物質Ａがアミノ基を有する抗体であれば、該抗体のアミノ基と、重合開始剤または増感剤の一部とを化学的に結合させたものが挙げられる。
【００４５】
なお、このような結合としては、前記物質Ａと重合開始剤または増感剤とが直接結合していてもよいし、何らかを介して結合していてもよい。
このような例としては、前記物質Ｃと特異的に結合する一次抗体と該一次抗体に結合した二次抗体とを含む複合体であって、該二次抗体に重合開始剤または増感剤が結合した複合体や、前記物質Ｃと特異的に結合する抗原と該抗原に結合した抗体とを含む複合体であって、該抗体に重合開始剤または増感剤が結合した複合体が挙げられる。
【００４６】
また、前記複合体は、アガロース、マイクロタイタープレート内面、メンブレン、ラテックス粒子、各種素材によるビーズ等の臨床診断分野で通常用いられる固相担体を含んでいてもよい。このような固相担体を含む複合体としては、該固相担体に前記物質Ａが結合し、該物質Ａに重合開始剤または増感剤等が結合した複合体や、前記物質Ａと重合開始剤または増感剤等とが前記固相担体を介して結合した複合体が挙げられる。
【００４７】
なお、前記結合の際には、従来公知の縮合剤、例えば、１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ， ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅなどを用いてもよい。
【００４８】
＜工程２＞
本方法は、工程１で得られた複合体と、前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃとを結合させる工程２を含む。
前記物質Ｃとしては、前記物質Ａと特異的に結合すれば特に制限されず、その具体例としては、前記物質Ａとして例示した物質と同様の物質が挙げられる。
【００４９】
この工程２で得られる複合体と物質Ｃとの結合体は、固定化された状態であることが好ましい。具体的には、抗原を含む複合体を用い、前記物質Ｃとして抗体を用いる場合には、予め抗体をマイクロタイタープレート内面やメンブレンなどの前記固相担体上に固定し、そこに複合体が結合した結合体であってもよく、予め複合体をマイクロタイタープレート内面やメンブレンなどの前記固相担体上に固定し、そこに抗体が結合した結合体であってもよい。
このように、前記複合体と物質Ｃとの結合体が固定化されることで、例えば、イムノクロマト法などにおいて、所定の場所、例えば、着色または蛍光ライン等により、被検物質を測定することができる。
【００５０】
前記複合体と物質Ｃとを結合させる方法としては、用いる複合体および物質Ｃに応じて適宜選択すればよく、例えば、抗原を含む複合体を用い、前記物質Ｃとして抗体を用いる場合には、抗原抗体反応により結合させればよい。
また、前記複合体と物質Ｃとを結合させる際には、複合体をＰＢＳ等の臨床診断分野等で通常用いられる液に溶解させた溶液を用いてもよい。
【００５１】
なお、前記複合体と物質Ｃとを結合させる際には、前記複合体と物質Ｃとが直接結合していてもよいし、何らかを介して結合していてもよい。例えば、物質Ａとして抗体を含む複合体を用い、前記物質Ｃとして抗原を用いる場合には、予め抗原を前記固相担体上に固定し、そこに複合体を直接結合させてもよいし、予め複合体を前記固相担体上に固定し、そこに抗原を直接結合させてもよいし、予め物質Ｃと特異的に結合する物質Ａ以外の物質Ａ'として抗体を前記固相担体上に固定し、そこに物質Ｃとして抗原を結合させ、さらにそこに複合体を結合させてもよい。
前記物質Ａ、Ａ'、Ｃ、複合体および固相担体はそれぞれ、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもよい。
【００５２】
前記物質Ａ'としては、前記物質Ｃと特異的に結合する物質Ａ以外の物質であれば特に制限されず、その具体例としては、前記物質Ａとして例示した物質と同様の物質が挙げられる。
【００５３】
なお、前記固相担体上に前記物質Ａ、Ａ'、Ｃまたは複合体を結合させた後は、必要により、洗浄工程やブロッキング工程を行うことが好ましい。
前記洗浄工程を行うことで、所望の場所以外の場所に存在する遊離の物質Ａ、Ａ'、Ｃまたは複合体を除去することができ、該遊離の物質により、被検物質の誤測定を抑制することができる。
また、前記ブロッキング工程を行うことで、前記物質Ａ、Ａ'、Ｃまたは複合体を前記固相担体上等にトランスファー（ブロッティング）した後に、非特異的な結合部位を予め飽和させておくことで、被検物質を測定する際のバックグラウンドが高くなることを抑制することができる。
【００５４】
＜工程３＞
本方法は、工程２で得られた系中で、前記重合開始能を有する部位により反応し、かつ、重合することで着色または発光するモノマー等を重合させる工程３を含む。
前記重合は、複合体が存在する場所またはその付近においてのみ起こる。
【００５５】
（モノマー等）
前記モノマー等としては、重合することで着色または発光するモノマーまたはオリゴマーであれば特に制限されない。モノマー等は、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもよい。
なお、本発明において、「重合することで着色または発光する」とは、重合する前は、着色しておらず、または、光（例：紫外線）を照射しても発光せず、重合することで初めて着色する、または、光を照射すると発光する、好ましくは、蛍光を生じることをいう。
【００５６】
本方法では、前記複合体が存在する場所またはその付近においてのみ、前記モノマー等の重合が起こり、そこで、着色または発光する。このように、前記モノマー等を用いる場合には、重合が起こった場所以外では着色または発光しないため、蛍光色素などの着色ラベルを用いた従来の測定方法では必要であった、未反応の着色ラベルを取り除くための洗浄工程などを行わなくても、被検物質の誤測定を抑制することができ、高感度で正確な被検物質の測定が可能となる。
【００５７】
前記モノマー等としては、反応性基を有する凝集誘起発光性の化合物（以下「凝集発光物」ともいう。）であることが好ましく、重合性基を有する凝集誘起発光性の化合物であることがより好ましい。
凝集発光物は、モノマーの段階では蛍光を発することはなく、重合により凝集すると光照射により蛍光を生じ、さらに凝集しても濃度消光しないため、前記工程４において、高蛍光強度のシグナルを得ることができ、該蛍光強度をもとに被検物質を定量することもできる。
【００５８】
前記反応性基としては、２分子間を架橋できる基であることが好ましく、重合性基がより好ましい。重合性基としては、ラジカル重合性基、カチオン重合性、アニオン重合性などのイオン重合性基、配位重合性基等が挙げられ、中でもラジカル重合性基がさらに好ましく、ラジカル重合性のエチレン性不飽和基が特に好ましい。
該ラジカル重合性のエチレン性不飽和基としては、（メタ）アクリロイル基、ビニル基、アリル基を含む基が好ましい。
また、前記イオン重合性基としては、エポキシ基を含む基等が挙げられる。
【００５９】
前記重合性基と、凝集誘起発光性の化合物とは、直接結合していても、多価の有機基を介して結合していてもよく、二価の有機基を介して結合していることが好ましく、炭素数１〜１０の有機基を介して結合していることが好ましい。
【００６０】
前記凝集発光物としては、特に制限されないが、水溶性の化合物が好ましい。水溶性であるとは、２５℃における水１００ｇに対する凝集発光物の溶解量が１ｇ以上であることをいい、前記凝集発光物としては、前記溶解量が、好ましくは２ｇ以上、より好ましくは３ｇ以上の化合物が挙げられる。前記凝集発光物として、このような水溶性の化合物を用いることで、有機溶剤等を使用しなくても被検物質を測定することができるため好ましい。
【００６１】
前記凝集発光物は、例えば、反応性基を有さない従来公知の凝集誘起発光性を示す化合物（以下「非反応凝集発光物」ともいう。）に反応性基を導入することや、従来公知の凝集誘起発光性を示す化合物を合成しながら反応性基を導入することで得ることができる。
反応性基を導入する方法としては特に制限されず、従来公知の方法、反応性基を有する化合物を用いて、該化合物由来の基を導入する方法が挙げられる。
なお、本発明における反応性基は、反応性基を有する化合物由来の、反応性基を含む基であってもよい。
【００６２】
前記非反応凝集発光物としては、凝集誘起発光性を示す化合物として公知の化合物であればよく特に制限されないが、炭化水素芳香族系の化合物、ヘテロ芳香族系の化合物、シロール系の化合物、ローダミン系の化合物等が挙げられる。具体的な例としては、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ，２０１５，１１５，ｐ１１７１８−１１９４０、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ，２０１０，４６，ｐ９０１３−９０１５または特開２０１３−１６３７６７号公報に記載の化合物が挙げられる。
【００６３】
前記非反応凝集発光物としては、市販品を用いてもよく、従来公知の方法、例えば、米国特許出願公開第２０１２／２９９４７４号明細書に記載の方法で合成した化合物、米国特許出願公開第２０１３／１７７９９１号明細書や、特開２０１４−１２６５４号公報に記載されたテトラフェニルエチレンの誘導体を用いてもよい。
【００６４】
前記凝集発光物としては、反応性基を有するテトラフェニルエチレンまたはその誘導体が好ましい。
前記テトラフェニルエチレンの誘導体とは、テトラフェニルエチレン骨格を有する化合物のことをいう。
前記反応性基を有するテトラフェニルエチレンまたはその誘導体としては、下記式（１）で表される化合物が好ましい。
【００６５】
【化３】
0006769749.tif 000004
【００６６】
前記式（１）中、Ｒ1〜Ｒ4はそれぞれ独立して、水素原子、有機基、水溶性基、反応性基または有機金属基であり、ａ〜ｄはそれぞれ独立して、１〜５の整数である。Ｒ1〜Ｒ4のうち、少なくとも１つは反応性基である。なお、ａが２以上の場合、複数のＲ1は同一であっても異なっていてもよく、複数のＲ1が互いに結合して環を形成していてもよい。ｂ〜ｄが２以上の場合も同様である。さらに、Ｒ1とＲ2、Ｒ2とＲ4、Ｒ3とＲ4、Ｒ3とＲ1がそれぞれ結合して環を形成していてもよい。
【００６７】
前記有機基としては、炭素数１〜１０の有機基が挙げられ、炭素数１〜６の有機基が好ましい。該有機基としては、炭化水素基が挙げられる。斯かる炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基および芳香族炭化水素基を包含する概念である。また、該有機基は後述する水溶性基を有していてもよい。
前記ａ〜ｄはそれぞれ独立して、１または２が好ましく、１がより好ましい。
【００６８】
前記Ｒ1〜Ｒ4における反応性基としては、前記と同様の反応性基が挙げられ、ラジカル重合性のエチレン性不飽和基を含む基が好ましく、（メタ）アクリロイル基を含む基がより好ましい。反応性基は少なくとも１つの反応性基を含む基であればよい。
【００６９】
前記水溶性基としては、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基およびその塩、スルホ基およびその塩、リン酸基およびその塩、ボロン酸基等が挙げられ、リン酸基が好ましい。
【００７０】
前記オリゴマーとしては、着色しておらず、または、光（例：紫外線）を照射しても発光しない化合物であり、重合することで初めて着色する、または、光を照射すると発光する化合物であれば、その分子量等は特に制限されない。
【００７１】
前記モノマー等の添加量は、重合することで着色する、または、光を照射すると発光する程度であれば特に制限されないが、十分に着色または発光する重合体が得られる等の点から、前記複合体１物質量（ｍｏｌ）に対し、好ましくは１〜１０００等量、より好ましくは２〜１００等量である。
【００７２】
（架橋剤）
前記工程３の際には、より短時間で被検物質を測定、定量等することができる等の点から、さらに、架橋剤を用いることが好ましい。
架橋剤は、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもよい。
【００７３】
前記架橋剤としては、架橋体が得られれば特に制限されず、従来公知の架橋剤を用いることができる。
前記架橋剤としては、例えば、多官能重合性不飽和基含有化合物が挙げられ、特開２０１６−１９９７３号公報に記載の化合物等を用いることができる。
これらの中でも、Ｎ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ−［トリス（３−アクリルアミドプロポキシメチル）メチル］アクリルアミド等の多官能（メタ）アクリルアミド化合物が好ましい。
【００７４】
前記架橋剤の添加量は、特に制限されないが、より短時間、高感度で被検物質を測定できる等の点から、前記モノマー等１００質量部に対し、好ましくは１〜２００００質量部、より好ましくは２００〜１００００質量部である。
【００７５】
前記モノマー等を重合する方法は、公知の方法で行うことができ、重合反応による着色または発光が生じる条件であり、かつ、物質ＡやＣ等に影響がなければ、特に限定されない。
前記複合体中の重合開始能を有する部位が光重合開始剤または光増感剤由来の部位である場合には、光照射、具体的には放射線照射により重合することができる。
この場合であって、ｉ線を含む放射線を用いる場合、低濃度の被検物質を高感度で測定できる等の点から、露光量としては、好ましくは１０〜２００００ｍＪ／ｃｍ2、より好ましくは２０〜２０００ｍＪ／ｃｍ2である。
【００７６】
＜工程４＞
本方法は、前記モノマー等を重合することで生じる、着色または発光により、好ましくは蛍光により、前記物質Ａまたは物質Ｃを測定する工程４を含む。
本方法では、被検物質である前記物質Ａまたは物質Ｃが存在する場合にのみ着色または発光（好ましくは蛍光）が生じ、該着色または発光を測定することで、被検物質を測定、診断、定量等することができる。
具体的には、本方法では、前記複合体が存在する場所またはその付近においてのみ、前記モノマー等の重合が起こり、そこで、着色または発光する。そして、該複合体が存在する場所は、前記物質Ａまたは物質Ｃが存在する場所でもあるため、前記着色または発光を測定することで、被検物質である物質Ａまたは物質Ｃを検出、定量等することができる。
【００７７】
前記着色は、目視や色差計などで確認することができる。
また、前記発光は、蛍光であることが好ましく、該蛍光は、重合体に光を照射することで生じる蛍光をマルチラベルリーダーＡＲＶＯ  Ｘ５などを用いて確認することができる。
【００７８】
≪キット≫
本発明のキットは、前記物質Ａまたは前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃを測定するためのキットであり、本方法に好適に用いられる。
該キットは、特異的結合物質Ａを含み、重合開始能を有する複合体と、
前記重合開始能を有する部位により反応し、かつ、重合することで着色または発光するモノマー等とを含む。
さらに、該キットは、前記物質Ａと特異的に結合する物質Ｃ含んでもよく、物質Ｃと特異的に結合する物質Ａ以外の物質Ａ'を含んでもよい。
また、該キットは、臨床診断分野等で用いられる従来公知の部材、例えば、前記固相担体等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例、比較例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
【００８０】
［合成例］
４−ヒドロキシベンゾフェノン０．９９１ｇ（５ｍｍｏｌ）、金属亜鉛末８１７ｍｇ（２．５当量、１２．５ｍｍｏｌ）を、ジムロート冷却器装着の３つ口フラスコに入れ、窒素置換後、テトラヒドロフラン１２０ｍｌを加えた。ドライアイス−アセトンでフラスコを冷却し、ここに四塩化チタン２．３７ｇ（２．５当量、１２．５ｍｍｏｌ）を５分間かけ滴下した。滴下終了から３０分後、反応容器の冷却を止め、室温で１２時間撹拌した。次いで、６０℃に加温し、７時間反応させた。溶媒を留去し、残渣を一度酢酸エチルに溶解させ、シリカゲルカラムで粗くろ過することで、粗生成物を得た。次いで、この粗生成物を再度、シリカゲルカラムで分離（酢酸エチルとヘキサンとの混合液。体積比で５０：５０）し、化合物（Ａ）５３５ｍｇ（収率５９％）を得た。なお、本合成例によってＥ体、Ｚ体の異性体が約１：１の割合の混合物として得られた。
【００８１】
化合物（Ａ）のＮＭＲ測定の結果を以下に示す。なお、本発明において、ＮＭＲ測定は、日本電子（株）製のＥＣＸ４００Ｐを用いて行った。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ6−Ａｃｅｔｏｎｅ）化学シフトσ：７．１〜７．０ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、８Ｈ）、６．９〜６．８ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、約４Ｈ）、６．６〜６．５ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、約４Ｈ）
【００８２】
化合物（Ａ）である４，４'−（１，２−Ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｔｅｎｅ−１，２−ｄｉｙｌ）ｄｉｐｈｅｎｏｌ  ６００ｍｇ（１．６５ｍｍｏｌ）にジクロロメタン１２ｍｌを加えた（この段階では懸濁状態）。次いで、ここにトリエチルアミン３６６ｍｇ（２．２当量，３．６３ｍｍｏｌ）を加えたところ、液は均一となった。次いで、窒素雰囲気で氷冷し、ここにクロロりん酸ジエチル２８４ｍｇ（１．０当量、１．６５ｍｍｏｌ）を滴下し、１時間撹拌後、室温で更に撹拌した。反応溶液に水を加え酢酸エチルで抽出し、水洗した後、溶媒を留去することで粗生成物を得た。ここで得た粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分離し、化合物（Ｂ）を３３２ｍｇ（収率４０％）、化合物（Ｃ）を２７８ｍｇ（収率２６％）得た。
【００８３】
化合物（Ｂ）のＮＭＲ測定の結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ6−Ａｃｅｔｏｎｅ）化学シフトσ：７．２〜７．０ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、１２Ｈ）、６．９〜６．８ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、約２Ｈ）、６．６〜６．５ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、約２Ｈ）、４．２〜４．０ｐｐｍ（−ＣＨ2−ＣＨ3、４Ｈ）、１．３〜１．１ｐｐｍ（−ＣＨ2−ＣＨ3、６Ｈ）
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ6−Ａｃｅｔｏｎｅ）化学シフトσ：−５．９ｐｐｍ
【００８４】
化合物（Ｃ）のＮＭＲ測定の結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ6−Ａｃｅｔｏｎｅ）化学シフトσ：７．２〜７．０ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、１６Ｈ）、４．２〜４．０ｐｐｍ（−ＣＨ2−ＣＨ3、８Ｈ）、１．３〜１．１ｐｐｍ（−ＣＨ2−ＣＨ3、１２Ｈ）
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ6−Ａｃｅｔｏｎｅ）化学シフトσ：−５．９ｐｐｍ
【００８５】
化合物（Ｂ）であるＤｉｅｔｈｙｌ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−１，２−ｄｉｐｈｅｎｙｌｖｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １１０ｍｇ（０．２２０ｍｍｏｌ）に塩化メチレン３ｍｌを加え、０．１％の４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌ（塩化メチレン溶液）１１０ｍｇおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン４２ｍｇ（１．５当量、０．３３ｍｍｏｌ）を加え溶解させ、ドライエアー雰囲気下で氷冷した。そこに、メタクリル酸クロライド２９ｍｇ（１．３当量、０．２８６ｍｍｏｌ）を塩化メチレンに溶解させた溶液を滴下し、氷冷下、室温で反応させた。反応液を酢酸エチルで抽出し、次いで、水洗した後、有機層を減圧留去することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物（Ｄ）１１３ｍｇ（収率９０％）を得た。
【００８６】
化合物（Ｄ）のＮＭＲ測定の結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ6−Ａｃｅｔｏｎｅ）化学シフトσ：７．２〜６．９ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、１６Ｈ）、６．２ｐｐｍ（メタクリル基オレフィン水素、１Ｈ）、５．７ｐｐｍ（メタクリル基オレフィン水素、１Ｈ）、４．２〜４．０ｐｐｍ（−ＣＨ2−ＣＨ3、４Ｈ）、１．９ｐｐｍ（メタクリル基メチル水素、３Ｈ）、１．３〜１．１ｐｐｍ（−ＣＨ2−ＣＨ3、６Ｈ）
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ6−Ａｃｅｔｏｎｅ）化学シフトσ：−５．９ｐｐｍ
【００８７】
化合物（Ｄ）である（４−（２−（４−Ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）ｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ）−１，２−ｄｉｐｈｅｎｙｌｖｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ  ５０ｍｇ（０．０８８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン３ｍｌに溶解させ、そこに４−Ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｏｌを０．３ｍｇ添加した。そこに、氷冷下、ドライエアー雰囲気で、２０％ヨードトリメチルシラン（ＴＭＳＩ）塩化メチレン溶液０．２２ｇ（２．５当量）を滴下し、１週間程度そのまま反応させた。反応溶液を減圧留去することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール−クロロホルム）で分離し、化合物（Ｅ）を４５ｍｇ（収率４９％）得た。
【００８８】
化合物（Ｅ）のＮＭＲ測定の結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3）化学シフトσ：７．２〜６．７ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、１６Ｈ）、６．３ｐｐｍ（メタクリル基オレフィン水素、１Ｈ）、５．７ｐｐｍ（メタクリル基オレフィン水素、１Ｈ）、１．９ｐｐｍ（メタクリル基メチル水素、３Ｈ）
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3）化学シフトσ：−６．８ｐｐｍ
【００８９】
化合物（Ｃ）である４−（２−４−Ｄｉｅｔｈｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ）ｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ−１，２−ｄｉｐｈｅｎｙｌｖｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ  ｄｉｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ  １１３ｍｇ（０．１７９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン６ｍｌに溶解させ、氷冷下、窒素雰囲気で、２０％ＴＭＳＩ塩化メチレン溶液０．８８ｇ（５当量）を滴下した。３日間室温（２５℃）で撹拌後、反応溶媒を減圧留去することで粗生成物を得た。粗生成物をＯＤＳカラム（ナカライテイスク（株）製ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ７５Ｃ）で精製し、アセトン−酢酸エチル留分より、化合物（Ｆ）４５ｍｇ（収率４９％）を得た。
【００９０】
化合物（Ｆ）のＮＭＲ測定の結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ6−Ａｃｅｔｏｎｅ）化学シフトσ：７．２〜６．９ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、１６Ｈ）
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ6−Ａｃｅｔｏｎｅ）化学シフトσ：−３．２ｐｐｍ
【００９１】
【化４】
0006769749.tif 000005
【００９２】
テトラキス（４−ヒドロキシフェニル）エチレン  ２．５ｇ（６．３ｍｍｏｌ）にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド３０ｍｌを加え、ドライエアー中で撹拌した。そこにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン４．１ｇ（５当量、３１．５ｍｍｏｌ）加え、撹拌した。次いで、氷冷し、メタクリル酸クロライド０．７９（１．２当量、７．５６ｍｍｏｌ）加え、撹拌した後、室温で数時間撹拌した。反応溶液に水を加え、クロロホルムで抽出し、溶媒を留去することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラム（酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）で分離し、化合物（Ｉ）を９０５ｍｇ（収率３１％）得た。
【００９３】
化合物（Ｉ）のＮＭＲ測定の結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ6−Ａｃｅｔｏｎｅ）化学シフトσ：７．１〜７．０ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、２Ｈ）、７．０〜６．９ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、２Ｈ）、６．８〜６．７ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、６Ｈ）、６．７〜６．６ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、６Ｈ）、６．２ｐｐｍ（メタクリル基オレフィン水素、１Ｈ）、５．７ｐｐｍ（メタクリル基オレフィン水素、１Ｈ）、１．９ｐｐｍ（メタクリル基メチル水素、３Ｈ）
【００９４】
化合物（Ｉ）１００ｍｇ（０．２１５ｍｍｏｌ）に塩化メチレン３０ｍｌを加え、ドライエアー中で撹拌した。そこにＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン２７７ｍｇ（１０当量、２１．５ｍｍｏｌ）およびｄ4−Ｍｅｔｈａｎｏｌ  １ｍｇを加え、氷冷下で撹拌した。ここにクロロりん酸ジエチル２９７ｍｇ（８当量、１．７２ｍｍｏｌ）を滴下し、３０分間そのまま撹拌した後、室温（約２５℃）まで昇温した。引き続き、反応容器を連続７日間、室温（約２５℃）で撹拌した。反応溶液に水を加え、酢酸エチルで抽出し、溶媒を留去することで粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラム（酢酸エチル−ｎ−ヘキサン）で分離し、化合物（ＩＩ）を１６１ｍｇ（収率８６％）得た。
【００９５】
化合物（ＩＩ）のＮＭＲ測定の結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3）化学シフトσ：７．０〜６．９ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、１６Ｈ）、６．３ｐｐｍ（メタクリル基オレフィン水素、１Ｈ）、５．７ｐｐｍ（メタクリル基オレフィン水素、１Ｈ）、４．３〜４．１ｐｍ（−ＣＨ2−ＣＨ3、１２Ｈ）、２．０ｐｐｍ（メタクリル基メチル水素、３Ｈ）、１．３〜１．１ｐｐｍ（−ＣＨ2−ＣＨ3、１８Ｈ）
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ＣＤＣｌ3）化学シフトσ：−５．９ｐｐｍ
【００９６】
化合物（ＩＩ）１５６ｍｇ（０．１７９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン６ｍｌに溶解させ、そこに２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ｐ−クレゾールを０．５ｍｇ添加した。次いで、氷冷下、ドライエアー雰囲気で２０％ＴＭＳＩ塩化メチレン溶液１．３４ｇ（２．５当量、０．４４８ｍｍｏｌ）を滴下し、２４時間室温で反応させた。反応溶液を減圧留去することで粗生成物を得た。粗生成物をＯＤＳカラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ７５Ｃ）で精製し、メタノール留分より、化合物（ＩＩＩ）３１ｍｇ（収率２５％）を得た。
【００９７】
化合物（ＩＩＩ）のＮＭＲ測定の結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ4−Ｍｅｔｈａｎｏｌ）化学シフトσ：７．０〜６．８ｐｐｍ（ベンゼン環上水素、１６Ｈ）、６．２ｐｐｍ（メタクリル基オレフィン水素、１Ｈ）、５．７ｐｐｍ（メタクリル基オレフィン水素、１Ｈ）、２．０ｐｐｍ（メタクリル基メチル水素、３Ｈ）
31Ｐ−ＮＭＲ（溶媒：ｄ4−Ｍｅｔｈａｎｏｌ）化学シフトσ：−４．８ｐｐｍ
【００９８】
【化５】
0006769749.tif 000006
【００９９】
［実施例１］
（ビオチン−光開始剤複合体の作製）
アミン末端を有するビオチンであるＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ａｍｉｎｅ−ＰＥＧ2−ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）  ３７．５ｍｇ、光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９（ＢＡＳＦ社製）  ８９．６ｍｇおよびＷＳＣ［１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ， ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ］（（株）同仁化学研究所製）  １９１．７ｍｇを、０．１Ｍ ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）１０ｍｌに溶解させ、室温で１２時間反応させた。その後、カラムにより、未反応のビオチンを除去し、ビオチン−光開始剤複合体を作製した。
【０１００】
（ビオチン化合物の検出）
ストレプトアビジン結合ＥＬＩＳＡプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）のウェルに、作製したビオチン−光開始剤複合体を、２ｎｍｏｌ、４ｎｍｏｌ、８ｎｍｏｌ、１６ｎｍｏｌ、３２ｎｍｏｌまたは６４ｎｍｏｌとなるようにＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）５０μｌに溶解させた溶液を添加した。次いで、室温で２時間放置した後、ＰＢＳ  ３００μｌで３回洗浄し、プレートへ複合体を結合させた。そこに、合成例で作製した化合物（ＩＩＩ）０．０２ｍｇと、架橋剤であるＮ−［トリス（３−アクリルアミドプロポキシメチル）メチル］アクリルアミド（和光純薬工業（株）製）０．４ｍｇとをＰＢＳ  ５０μｌに溶解させた溶液を添加した。そして、プレートをマルチラベルリーダーＡＲＶＯ  Ｘ５（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）に設置し、励起波長を３５５ｎｍに設定することでＵＶを照射し、重合を開始した。そして、ＵＶを照射し始めた時を０秒として、ＵＶを照射しながら、７５秒後、１００秒後、１５０秒後、２００秒後または３００秒後の各ウェルの蛍光強度（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ）を測定した。その結果、表１に示す通り、露光時間が長くなるにつれ、蛍光強度が増加した。前記複合体が存在する場所で重合が起こり、該重合により、蛍光が発せられるため、蛍光を確認することで、複合体、さらにはビオチンの存在を確認することができる。また、露光量を調整することで、低濃度の前記複合体を用いても蛍光を測定でき、低濃度の複合体、低濃度のビオチンまで検出することができる。
【０１０１】
なお、３００秒露光した時のビオチン濃度に対する蛍光強度の関係を図１に示す。この図１から、ビオチン濃度と蛍光強度とが比例関係にあることが分かる。この図１のような検量線を予め作成しておくことで、複合体を形成する際のビオチンの濃度が不明であっても、前記方法によれば、低濃度から高濃度までのビオチンを定量することができる。
【０１０２】
【表１】
0006769749.tif 000007
【０１０３】
［実施例２］
（ビオチン−色素複合体）
光開始剤Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９をエオシンイソチオシアネート（ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）２８２ｍｇに変更した以外は、実施例１と同様にして、ビオチン−色素複合体を作製した。
【０１０４】
（ビオチン化合物の検出）
実施例１と同様にして、ストレプトアビジン結合ＥＬＩＳＡプレートに、ビオチン−色素複合体を、１０ｐｍｏｌ、２０ｐｍｏｌ、４０ｐｍｏｌ、８０ｐｍｏｌ、１６０ｐｍｏｌまたは３２０ｐｍｏｌとなるようＰＢＳ  ５０μｌに溶解させた溶液を添加した。そこへ、化合物（ＩＩＩ）０．０２ｍｇ、Ｎ−［トリス（３−アクリルアミドプロポキシメチル）メチル］アクリルアミド０．４ｍｇおよびジメチルアミノエタノール０．００２ｍｇをＰＢＳ  ５０μｌに溶解させた溶液を添加した。続いて、実施例１と同様にマルチラベルリーダーＡＲＶＯ  Ｘ５を用いて、５０５ｎｍの波長の光を照射し、重合を開始した。そして、光照射し始めた時を０秒として、光を照射しつつ、７５秒後、１００秒後、１５０秒後、２００秒後または３００秒後の各ウェルの蛍光強度（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ）を測定した。その結果、表２に示す通り、実施例１と同様に、露光時間が長くなるにつれ、蛍光強度が増加した。露光量を調整することで、低濃度のビオチンまで検出することができることが分かる。
なお、３００秒露光した時のビオチン濃度に対する蛍光強度の関係を図２に示す。
【０１０５】
【表２】
0006769749.tif 000008
【０１０６】
［実施例３］
（色素標識抗体（複合体）の作製）
抗ＰＳＡ抗体  ３３ｍｇ、エオシンイソチオシアネート  １４．１ｍｇおよびＷＳＣ  １９．２ｍｇを０．１Ｍ ＭＥＳ  １０ｍｌに溶解させた以外は、実施例１と同様にして、色素標識抗体を作製した。作製した色素標識抗体の５２０ｎｍにおける吸光度から、抗体１分子あたりの色素標識数を算出すると、平均１０分子であった。
【０１０７】
（検体中の抗原検出）
ＥＬＩＳＡプレート  ＭＡＸＩＳＯＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）に、２０μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳで希釈した未標識の抗ＰＳＡ抗体を、５０μＬずつウェルに入れ、４℃で一晩放置し、プレートへ吸着させた。次にブロッキングバッファー（１質量％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）および５０ｍＭのＰＢＳの混合液、ｐＨ：７．４）を２００μｌずつウェルに入れ、３７℃で５時間放置し、ブロッキングした。
【０１０８】
得られたＥＬＩＳＡプレートを、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）を０．０１％含むトリスバッファーで３回洗浄後、検体希釈緩衝液（１質量％ＢＳＡ、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０および５０ｍＭのＰＢＳの混合液、ｐＨ：７．４）で希釈したスタンダード溶液（ＰＳＡ抗原含有液  ０、１０、５０、１００、１０００または１００００ｎｇ／ｍｌ）を１００μｌずつ各ウェルに入れ、３７℃で１時間反応させた。反応後、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．０１％含むトリスバッファーで３回洗浄後、作製した色素標識抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で含む溶液を、標識抗体希釈緩衝液（１質量％ＢＳＡ、０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０、および５０ｍＭのＰＢＳの混合液、ｐＨ：７．４）を用いて調製し、１００μｌずつウェルに入れ、３７℃で１時間反応させた。反応後、再び、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．０１％含むトリスバッファーで３回洗浄した。
【０１０９】
次いで、実施例２と同様に、化合物（ＩＩＩ）０．０２ｍｇ、Ｎ−［トリス（３−アクリルアミドプロポキシメチル）メチル］アクリルアミド０．４ｍｇおよびジメチルアミノエタノール０．００２ｍｇを５０μｌのＰＢＳに溶解した溶液を各ウェルに添加し、５０５ｎｍの波長の光を照射することで、重合を開始させた。そして、光照射し始めた時を０秒として、光を照射しつつ、７５秒後、１００秒後、１５０秒後、２００秒後または３００秒後の蛍光強度（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６５ｎｍ）を測定した。その結果、表３に示す通り、実施例２と同様に、露光時間が長くなるにつれ、蛍光強度が増加した。露光量を調整することで、低濃度の抗原まで検出することができることが分かる。
【０１１０】
【表３】
0006769749.tif 000009
【０１１１】
［実施例４］
Ｎ−［トリス（３−アクリルアミドプロポキシメチル）メチル］アクリルアミドを用いない以外は、実施例３と同様にして、抗原の検出を試みた。その結果、蛍光を検出できるまでの光照射時間が伸びてしまったが、実施例３と同様に、露光時間が長くなるにつれ、蛍光強度が増加した。露光量を調整することで、低濃度の抗原まで検出することができることが分かる。
【０１１２】
【表４】
0006769749.tif 000010
【０１１３】
［実施例５］
（免疫クロマト用メンブレン作製）
ニトロセルロースからなるメンブレン（メルクミリポア社製、商品名：ＨＦ１２０、２５０ｍｍ×２５ｍｍ）上に、抗ＰＳＡモノクローナル抗体および抗Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧモノクローナル抗体を１ｍｍの幅で別々の場所に塗布し、５０℃で３０分間乾燥した後、室温で一晩乾燥させ、メンブレン上に抗ＰＳＡ抗体塗布部（検出ライン）、抗Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ抗体塗布部（コントロールライン）をそれぞれ設けた。
【０１１４】
（抗原検出）
得られたメンブレンに、濃度既知のＰＳＡ抗原（０μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌ）を含むＰＳＡスタンダード溶液１００μｌを展開した後、実施例３と同様に作製した色素標識抗体を１μｇ／ｍＬの濃度で含む溶液を展開し、続いて化合物（ＩＩＩ）０．０２ｍｇ、Ｎ−［トリス（３−アクリルアミドプロポキシメチル）メチル］アクリルアミド０．４ｍｇおよびジメチルアミノエタノール０．００２ｍｇを５０μｌのＰＢＳに溶解した溶液を展開した。
【０１１５】
次いで、得られたメンブレンに、波長交換式ツインアームＬＥＤ照射装置（オプトコード（株）製）を用いて、５０５ｎｍの光を５分間照射し、３６５ｎｍの光の照射下で、ラインの検出を試みた。その結果、ＰＳＡ抗原を含まないＰＳＡスタンダード溶液を展開したメンブレンでは、コントロールラインしか検出されなかったのに対し、ＰＳＡ抗原の濃度が１０μｇ／ｍｌであるＰＳＡスタンダード溶液を展開したメンブレンでは、検出ラインおよびコントロールライン共に、蛍光ラインを検出することができた。
【０１１６】
［比較例１］
化合物（ＩＩＩ）の代わりに化合物（Ｆ）を用いた以外は、実施例３と同様にして、抗原の検出を試みた。その結果、蛍光を検出することはできず、抗原を検出できなかった。結果を表５に示す。
【０１１７】
【表５】
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【０１１８】
［比較例２］
化合物（ＩＩＩ）の代わりにフルオレセインメタクリレートを用い、蛍光検出の際の励起波長を４８８ｎｍ、蛍光波長を５３５ｎｍとした以外は、実施例３と同様にして、抗原の検出を試みた。
しかし、フルオレセインメタクリレートは蛍光色素であるため、重合の有無によらず、蛍光強度が検出された。その結果、全てのサンプル、全ての反応時間にて、同程度の蛍光強度を検出した。すなわち、抗原を検出できなかった。結果を表６に示す。
【０１１９】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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