(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列に少なくとも下記変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質。
ここで、前記変異は、
Ｆ１４９ＴorＳorＡ、
Ｌ１５８ＴorＳorＡ、
Ｈ１６０ＴorＳorＡ、
Ｙ１７４ＴorＳorＡ、
Ｙ１９２ＴorＳorＡ、
Ｋ１１２ＥorＤorＱ、
Ｅ１４７ＫorＲorＱ、
Ｑ１４５ＥorＤ、
Ｋ１６６ＥorＤorＱ、
Ｐ１６２ＬorＶorＩorＡ、
Ｐ２２３ＬorＶorＩorＡ、
Ｎ３７ＳorＡorＧ、
Ｅ１４０ＫorＲorＱ、
Ｋ１８５ＲorＡorＧ、
Ａ１５０／Ｅ１５１／Ｇ１５２→ＰＨＧＰ、及び、
Ｋ１８０ＴorＳである。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列に、さらに下記の変異が導入されたアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の蛍光タンパク質。
ここで、前記変異は、Ｔ１９７ＡorＧである。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸配列の８番目から２３２番目の配列を有する、請求項１又は２に記載の蛍光タンパク質。
【請求項４】
ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、単量体型であり、蛍光色が緑黄色である、請求項１から３のいずれかに記載の蛍光タンパク質。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の蛍光タンパク質のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、単量体型であり、蛍光色が緑黄色である、蛍光タンパク質。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の蛍光タンパク質が融合された融合タンパク質であって、該蛍光タンパク質の部分は、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、単量体型であり、蛍光色が緑黄色の蛍光タンパク質である、融合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２３２番目の配列、或いは、配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２３２番目の配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列に、Ｔ１９７ＡorＧの変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質であって、
ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、二量体型であり、蛍光色が緑黄色であり、光スイッチング型である、蛍光タンパク質。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列の一部又は全部を有し、該タンパク質の蛍光特性を利用する、分子センサ。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質又は請求項８に記載の分子センサをコードする塩基配列を有する核酸。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質又は請求項８に記載の分子センサをコードする塩基配列含む発現カセット。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質又は請求項８に記載の分子センサを発現可能な、或いは、請求項９に記載の核酸又は請求項１０に記載の発現カセットを有する、ベクター。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれかに記載のタンパク質又は請求項８に記載の分子センサを発現する形質転換体（但し、ヒトの形質転換体を除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ｐＨ安定性が高い緑黄色蛍光タンパク質、その光スイッチング変異体、それらの融合タンパク質、それらの分子センサ、ＤＮＡ、発現カセット、ベクター、及び形質転換体に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光タンパク質は、生体内の分子の挙動をリアルタイムで追跡できるマーカーとして、あるいは、イオン濃度若しくは生理活性物質を検出するための蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）型バイオセンサ作製ツールとして（例えば、特許文献１）、汎用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１８７５４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、ほとんどの蛍光タンパク質は酸性環境下で蛍光強度を大きく低下させるため、リソソーム、分泌顆粒、オートファゴソームなどの酸性環境での応用が難しい。現在、ｐＨ安定性の高いシアン色及び赤色の蛍光タンパク質は報告されているが、ｐＨに対して安定な緑黄色蛍光タンパク質の報告はない。【０００５】
そこで、本開示は、一態様において、ｐＨ安定性が高い（ｐＨ感受性が低減された）緑黄色蛍光タンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、一又は複数の実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列に少なくとも下記の変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質（以下、本開示に係る単量体型蛍光タンパク質ともいう。）に関する。
ここで、前記変異は、Ｆ１４９ＴorＳorＡ、Ｌ１５８ＴorＳorＡ、Ｈ１６０ＴorＳorＡ、Ｙ１７４ＴorＳorＡ、及び、Ｙ１９２ＴorＳorＡ、並びにこれらの２〜５個の組合せからなる群から選択される。【０００７】
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２３２番目の配列を有する蛍光タンパク質、或いは、配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２３２番目の配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、二量体型であり、蛍光色が緑黄色である蛍光タンパク質（以下、本開示に係る二量体型蛍光タンパク質）に関する。【０００８】
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係る単量体型蛍光タンパク質及び本開示に係る二量体蛍光タンパク質に、さらに、「光スイッチング型となる変異」が導入された光スイッチング変異型の蛍光タンパク質に関する。【０００９】
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係る蛍光タンパク質を含む融合タンパク質又は分子センサに関する。【００１０】
本開示は、その他の一又は複数の実施形態において、本開示に係る蛍光タンパク質、融合タンパク質若しくは分子センサをコードする塩基配列を含む核酸、又該塩基配列を含む発現カセット、それらを含むベクター又は形質転換体に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本開示によれば、一態様において、ｐＨ安定性が高い（ｐＨ感受性が低減された）緑黄色蛍光タンパク質を提供できる。該蛍光タンパク質によれば、限定されない一又は複数の実施形態において、酸性環境下でのイメージングができ、例えば、リソソーム、分泌顆粒、オートファゴソームなどの酸性細胞環境での細胞イメージングが可能となる。
また、該蛍光タンパク質によれば、限定されない一又は複数の実施形態において、ｐＨ安定性の高いシアン色又は赤色の蛍光タンパク質と組み合わせることで、例えば、酸性環境下で複数種類の蛍光観察が可能となり、また、酸性環境におけるイオン濃度や生理活性物質等を検出するためのバイオセンサ（例えば、ＦＲＥＴ型バイオセンサ、円順列変異技術を利用したバイオセンサ、分割ＧＦＰ技術を利用した分子センサなど）が可能となる。【００１２】
また、本開示によれば、一又は複数の実施形態において、単量体型として、ｐＨ安定性が高い、緑黄色蛍光タンパク質を提供できる。これにより、限定されない一又は複数の実施形態において、他のタンパク質との融合タンパク質にした場合における二量体形成による影響を排除でき、効果的なイメージングや検出が可能となる。【００１３】
また、本開示に係る単量体型蛍光タンパク質及び本開示に係る二量体蛍光タンパク質に、さらに、「光スイッチング型となる変異」が導入された変異体によれば、一又は複数の実施形態において、ｐＨが変動する環境下、又は、酸性環境下における超解像イメージングが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、精製蛍光タンパク質のサイズ除去ゲルろ過クロマトグラフフィーの結果を示す。点線のスペクトルは左から順に１０μＭのＤｓＲｅｄ（四量体）、ｔｄＴｏｍａｔｏ（二量体）、ｍＣｈｅｒｒｙ（単量体）の吸収を示す。実線のスペクトルはｍｆＧＦＰの吸収を示す。
【図２】図２は、精製したｍｆＧＦＰの蛍光特性を測定した結果を示す。
【図３】図３は、ｍｆＧＦＰ又はＥＧＦＰをｐＨ３〜９のバッファーに溶解させて蛍光強度を測定した結果を示す。
【図４】図４は、ｍｆＧＦＰ又はＥＧＦＰの光安定性を測定した結果を示す。
【図５】図５は、ｍｆＧＦＰ又はＥＧＦＰの蛍光団の成熟速度比を測定した結果を示す。
【図６】図６は、ｍｆＧＦＰに様々なオルガネラ・タンパク質への局在シグナルを融合させＨｅＬａ細胞に発現させた結果を示すイメージである。
【図７】図７は、ｍｆＧＦＰ又はＥＧＦＰをＨｅＬａ細胞の細胞質に発現させ、３日間３７℃／５％で培養した後のイメージである。
【図８】図８は、ｐＨ５、６、７、８のバッファーにおけるｍｆＧＦＰ光スイッチング変異体の蛍光強度を測定した結果を示す。
【図９】図９は、ｐＨ５、６、７、８のバッファーにおけるｍｆＧＦＰ光スイッチング変異体の連続光切替の一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、ハナガサクラゲ（学名：Olindias formosa）に由来する緑黄色蛍光タンパク質が、良好なｐＨ安定性（すなわち、低減されたｐＨ感受性）を示す、という知見に基づく。
【００１６】
本開示は、また、ハナガサクラゲからクローニングされた野生型緑黄色蛍光タンパク質（以下、ｄｆＧＦＰともいう、配列番号１）は二量体であり、このｄｆＧＦＰを改変して単量体型の緑黄色蛍光タンパク質（以下、ｍｆＧＦＰともいう、配列番号２）が得られた、という知見に基づく。
【００１７】
本開示において、「緑黄色蛍光タンパク質」とは、蛍光色が緑色又は黄緑色の蛍光タンパク質をいい、一又は複数の実施形態において、発光スペクトルの蛍光強度が最大となる波長が４９５〜５７０ｎｍに含まれるものをいう。
【００１８】
本開示において、「単量体型緑黄色蛍光タンパク質」は、ハナガサクラゲの緑黄色蛍光タンパク質（ｄｆＧＦＰ、二量体型）のアミノ酸配列（配列番号１）を起源とする単量体型緑黄色蛍光タンパク質の変異体の全てを含みうる。
【００１９】
本開示において、蛍光タンパク質が単量体型であるとは、同一種の蛍光タンパク質が重合せず、単体として存在する性質をもつことをいう。また、本開示において、蛍光タンパク質が二量体型であるとは、同一種の蛍光タンパク質どうしが二つ相互作用して安定な複合体を形成する性質をもつことをいう。
【００２０】
本開示において、「アミノ酸配列Ａを有する蛍光タンパク質」とは、一又は複数の実施形態において、アミノ酸配列ＡのＮ末端又はＣ末端の位置にＮ末端のメチオニンなどの他のアミノ酸、シグナルペプチド配列、タンパク質の精製を可能にするアミノ酸配列、及びこれらの組合せを含むことができることを意味する。タンパク質の精製を可能にするアミノ酸配列は、当業者が選択することができる。
【００２１】
本開示において、“Ｘ1ＮＸ2”で表される変異は、一般的な変異の表記方法であって、アミノ酸配列のＮ番目のアミノ酸残基Ｘ1（一文字表記のアミノ酸残基）が、アミノ酸残基Ｘ2（一文字表記のアミノ酸残基）に置換される変異を表す。
本開示において、“Ｘ1ＮＸ2orＸ3orＸ4”で表される変異は、アミノ酸配列のＮ番目のアミノ酸残基Ｘ1（一文字表記のアミノ酸残基）が、アミノ酸残基Ｘ2、Ｘ3又はＸ4（いずれも、一文字表記のアミノ酸残基）に置換される変異を表す。
本開示において、“Ｘ1Ｎ／Ｘ2（Ｎ＋１）／Ｘ3（Ｎ＋２）⇒Ｙ1Ｙ2Ｙ3Ｙ4”で表される変異は、アミノ酸配列のＮから（Ｎ＋２）番目の３アミノ酸残基Ｘ1Ｘ2Ｘ3がＹ1Ｙ2Ｙ3Ｙ4の４アミノ酸残基に置換される変異を表す。また、“Ｘ1Ｎ／Ｘ2（Ｎ＋１）／Ｘ3（Ｎ＋２）⇒Ｙ1Ｙ2Ｙ3”で表される変異は、アミノ酸配列のＮから（Ｎ＋２）番目の３アミノ酸残基Ｘ1Ｘ2Ｘ3がＹ1Ｙ2Ｙ3の３アミノ酸残基に置換される変異を表す。
本開示において、“Ｘ1ＮＸ2orＸ3orＸ4”で表される変異及び“Ｘ1Ｎ／Ｘ2（Ｎ＋１）／Ｘ3（Ｎ＋２）⇒Ｙ1Ｙ2Ｙ3Ｙ4”で表される変異はそれぞれ、１個の変異としてカウントすることがある。
本開示において、“Ｘ1ＮＸ2”等で表されるＸ1及びＮは、特に言及のない場合、配列表の配列番号１のアミノ酸配列のＮ番目のアミノ酸残基Ｘ1、又は、配列表の配列番号１のアミノ酸配列のＮ番目に相当する位置のアミノ酸残基Ｘ1をいう。
【００２２】
本開示において、蛍光タンパク質のｐＨ感受性とは、蛍光タンパク質が存在する媒体のｐＨが塩基性ｐＨから酸性ｐＨになるときの蛍光タンパク質の蛍光強度の減少をいう。本開示において、蛍光タンパク質のｐＨ安定性とは、蛍光タンパク質が存在する媒体のｐＨが塩基性ｐＨから酸性ｐＨになるときの蛍光タンパク質の蛍光強度の減少の少なさをいう。蛍光性タンパク質の「蛍光強度」は、分光蛍光光度計を使用して測定できる。
【００２３】
本開示において、ｐＨ感受性（ｐＫａ）とは、蛍光タンパク質が存在する媒体のｐＨが塩基性ｐＨから酸性ｐＨになるときの、該蛍光タンパク質の蛍光強度が最大値の半分となるｐＨを表す。具体的には実施例の記載の方法で測定できる。
【００２４】
［単量体型緑黄色蛍光タンパク質］
本開示は、一態様において、配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列に単量体型となる変異が導入されたアミノ酸配列を有する単量体型緑黄色蛍光タンパク質に関する。
【００２５】
前記「単量体型となる変異」は、一又は複数の実施形態において、Ｆ１４９ＴorＳorＡ、Ｌ１５８ＴorＳorＡ、Ｈ１６０ＴorＳorＡ、Ｙ１７４ＴorＳorＡ、及び、Ｙ１９２ＴorＳorＡ、並びにこれらの２〜５個の変異の組合せからなる群から選択される変異である。ここで、「Ｆ１４９ＴorＳorＡ」とは、「Ｆ１４９Ｔ、Ｆ１４９Ｓ、又はＦ１４９Ａ」を、「Ｌ１５８ＴorＳorＡ」とは、「Ｌ１５８Ｔ、Ｌ１５８Ｓ、又はＬ１５８Ａ」を、「Ｈ１６０ＴorＳorＡ」とは、「Ｈ１６０Ｔ、Ｈ１６０Ｓ、又はＨ１６０Ａ」を、「Ｙ１７４ＴorＳorＡ」とは、「Ｙ１７４Ｔ、Ｙ１７４Ｓ、又はＹ１７４Ａ」を、「Ｙ１９２ＴorＳorＡ」とは、「Ｙ１９２Ｔ、Ｙ１９２Ｓ、又はＹ１９２Ａ」を、それぞれ、意味する。
【００２６】
したがって、本開示は、一又は複数の実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列に少なくとも下記の変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質に関する。
Ｆ１４９ＴorＳorＡ、Ｌ１５８ＴorＳorＡ、Ｈ１６０ＴorＳorＡ、Ｙ１７４ＴorＳorＡ、及び、Ｙ１９２ＴorＳorＡ、並びにこれらの２〜５個の組合せからなる群から選択される変異。
【００２７】
前記「単量体型となる変異」又は前記「配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列に導入される変異」は、Ｆ１４９ＴorＳorＡ、Ｌ１５８ＴorＳorＡ、Ｈ１６０ＴorＳorＡ、Ｙ１７４ＴorＳorＡ、又は、Ｙ１９２ＴorＳorＡのいずれか１つ、或いは、Ｆ１４９ＴorＳorＡ、Ｌ１５８ＴorＳorＡ、Ｈ１６０ＴorＳorＡ、Ｙ１７４ＴorＳorＡ、及び、Ｙ１９２ＴorＳorＡから選択される２、３、４又は５つの変異の組合せが挙げられる。
前記「変異の組合せ」のうち、２変異の組合せとして、限定されない一実施形態において、Ｙ１７４ＴorＳorＡ及びＹ１９２ＴorＳorＡの組合せが挙げられる。その他の実施形態として、Ｙ１７４Ｔ及びＹ１９２Ａの２変異の組合せが挙げられる。
前記「変異の組合せ」のうち、３変異の組合せとして、限定されない一実施形態において、Ｆ１４９ＴorＳorＡ、Ｌ１５８ＴorＳorＡ、及びＨ１６０ＴorＳorＡの組合せが挙げられる。その他の実施形態として、Ｆ１４９Ｔ、Ｌ１５８Ｔ及びＨ１６０Ｔの３変異の組合せが挙げられる。
前記「変異の組合せ」のうち、５変異の組合せとして、限定されない一実施形態において、Ｆ１４９ＴorＳorＡ、Ｌ１５８ＴorＳorＡ、Ｈ１６０ＴorＳorＡ、Ｙ１７４ＴorＳorＡ及びＹ１９２ＴorＳorＡが挙げられる。その他の実施形態として、Ｆ１４９Ｔ、Ｌ１５８Ｔ、Ｈ１６０Ｔ、Ｙ１７４Ｔ及びＹ１９２Ａの５変異の組合せが挙げられる。
【００２８】
二量体型であるｄｆＧＦＰ（配列番号１）が単量体型になることで、限定されない一又は複数の実施形態において、他のタンパク質との融合タンパク質にした場合における二量体形成による影響を排除でき、効果的なイメージングや検出が可能となる。
【００２９】
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、輝度向上及び／又は溶解度向上の観点から、前記「単量体型となる変異」に加えてさらに、Ｋ１１２ＥorＤorＱ、Ｅ１４７ＫorＲorＱ、Ｑ１４５ＥorＤ、Ｋ１６６ＥorＤorＱ、Ｐ１６２ＬorＶorＩorＡ、Ｐ２２３ＬorＶorＩorＡ、Ｎ３７ＳorＡorＧ、Ｅ１４０ＫorＲorＱ、Ｋ１８５ＲorＡorＧ、Ａ１５０／Ｅ１５１／Ｇ１５２→ＰＨＧＰorＰＨＡ、及び、Ｋ１８０ＴorＳ、並びにこれらの２〜１１個の組合せからなる群から選択される変異が導入されてもよい。なお、これらの変異の位置は、配列番号１を基準としている。輝度向上及び／又は溶解度向上の観点から導入されうる上記変異の数は、一又は複数の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくは１１、又は全部である。
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、輝度向上及び／又は溶解度向上の観点から、前記「単量体型となる変異」に加えてさらに、Ｋ１１２Ｅ、Ｅ１４７Ｋ、Ｑ１４５Ｅ、Ｋ１６６Ｅ、Ｐ１６２Ｌ、Ｐ２２３Ｌ、Ｎ３７Ｓ、Ｅ１４０Ｋ、Ｋ１８５Ｒ、Ａ１５０／Ｅ１５１／Ｇ１５２→ＰＨＧＰ、及びＫ１８０Ｔ、並びにこれらの２〜１１個の組合せからなる群から選択される変異が導入されてもよい。
【００３０】
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、タンパク質のフォールディングの安定性の観点から、配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列のＮ末及びＣ末のそれぞれに、その他の蛍光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ等）のＮ末及びＣ末のアミノ酸配列を付加してもよい。付加するアミノ酸配列の長さは、例えば、６〜８アミノ酸、又は、７アミノ酸である。
【００３１】
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質の限定されない一又は複数の実施形態として、
配列番号２のアミノ酸配列の８番目から２３２番目の配列を有する蛍光タンパク質、
配列番号２のアミノ酸配列の２番目から２３２番目の配列を有する蛍光タンパク質、
配列番号２のアミノ酸配列の８番目から２３９番目の配列を有する蛍光タンパク質、
配列番号２のアミノ酸配列の２番目から２３９番目の配列を有する蛍光タンパク質、
配列番号２のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質、
が挙げられる。
【００３２】
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質のｐＨ感受性（ｐＫａ）は、４．０以下であり、好ましくは、４．０未満であり、より好ましくは３．９以下である。
【００３３】
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下の単量体型緑黄色蛍光タンパク質の機能を維持できる範囲で、上述の変異以外の変異を有していてもよい。該変異としては、１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加が挙げられ、「１から数個」とは、一又は複数の実施形態において、１〜４、１〜３、１〜２、又は１個を含む。
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列の８番目から２３２番目の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の同一性を示すアミノ酸配列を有し、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下である単量体型緑黄色蛍光タンパク質である。
【００３４】
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、化学合成により合成したタンパク質であってもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質であってもよい。遺伝子組み換え技術による組み換えタンパク質の作製としては、一又は複数の実施形態において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて作製する方法、或いは、無細胞系で作製する方法が挙げられる。
【００３５】
［光スイッチング変異体］
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、さらに、「光スイッチング型となる変異」が導入されていてもよい。前記「光スイッチング型となる変異」としては、Ｔ１９７ＡorＧ、すなわち、「Ｔ１９７Ａ又はＴ１９７Ｇ」が挙げられる。なおこの変異の位置、配列番号１のアミノ酸配列を基準としている。配列番号２のアミノ酸配列を基準とすると、前記「光スイッチング型となる変異」は、Ｔ２０４ＡorＧとなる。
したがって、本開示に係る光スイッチング変異型単量体型緑黄色蛍光タンパク質の限定されない一又は複数の実施形態として、
配列番号２のアミノ酸配列の８番目から２３２番目の配列を有する蛍光タンパク質、
配列番号２のアミノ酸配列の２番目から２３２番目の配列を有する蛍光タンパク質、
配列番号２のアミノ酸配列の８番目から２３９番目の配列を有する蛍光タンパク質、
配列番号２のアミノ酸配列の２番目から２３９番目の配列を有する蛍光タンパク質、
配列番号２のアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質、
であって、配列番号２のアミノ酸配列においてＴ２０４ＡorＧの変異を有するもの、
が挙げられる。
本開示に係る光スイッチング変異型単量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、Ｔ２０４ＡorＧの変異を有する配列番号２のアミノ酸配列の８番目から２３２番目の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の同一性を示すアミノ酸配列を有し、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、光スイッチング型の単量体型緑黄色蛍光タンパク質である。
【００３６】
本開示において、光スイッチング型の蛍光タンパク質とは、可逆的に蛍光性を光切り替え可能な蛍光タンパク質（Reversibly Photo-Switchable Fluorescent Protein, RSFP）をいう。本開示において「光切替型の可逆的に光切替可能な蛍光タンパク質」とは、一又は複数の実施形態において、蛍光のonとoffを波長の異なる２つの光照射によって制御ができ、かつ、onとoffの切り替えが繰り返し行うことができる蛍光タンパク質をいう。
上述した「光スイッチング型となる変異」を有する本開示に係る光スイッチング変異型単量体型緑黄色蛍光タンパク質は、蛍光励起しない特定の波長の光照射によって無蛍光性から蛍光性になり、蛍光励起のための光照射によって蛍光性から無蛍光性になるネガティブ光切替型のＲＳＦＰである。
【００３７】
本開示において、単に「本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質」という場合には、光スイッチング変異型の単量体型緑黄色蛍光タンパク質を含みうる。
【００３８】
［融合タンパク質］
本開示は、その他の態様において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質が他のタンパク質又はペプチドと融合した融合タンパク質であって、該蛍光タンパク質の部分が、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下の単量体型緑黄色蛍光タンパク質として機能可能な融合タンパク質である。
【００３９】
本開示に係る融合タンパク質において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質に結合（融合）されるタンパク質は、限定されない一又は複数の実施形態において、シグナル配列、発現タグ、又は、タンパク質（必要に応じてリンカー配列）が挙げられる。前記シグナル配列及び前記タンパク質としては、一又は複数の実施形態において、イメージングをする観点から、細胞膜、細胞内の細胞骨格（マイクロフィラメント、中間径フィラメント、微小管）や細胞小器官（核、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、エンドソーム、リソソーム等）に局在化できるシグナル配列やタンパク質が挙げられる。
【００４０】
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質及び融合タンパク質は、単量体型であり、また、ｐＨ感受性が低減されているため、一又は複数の実施形態において、リソソーム、分泌顆粒、オートファゴソームなどの酸性細胞環境における蛍光性機能指示薬、若しくは蛍光マーカーとして利用でき、或いは細胞イメージング（例えば、in vivoイメージングなど）に利用できる。
【００４１】
［分子センサ］
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質及び融合タンパク質は、ｐＨ安定性の高い緑黄色蛍光タンパク質であるため、限定されない一又は複数の実施形態において、ｐＨ安定性の高いシアン色又は赤色の蛍光タンパク質と組み合わせることで、例えば、酸性環境下で複数種類の蛍光観察が可能となり、また、酸性環境におけるイオン濃度や生理活性物質等を検出するためのバイオセンサが可能となる。
したがって、本開示は、その他の態様において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質又は融合タンパク質のアミノ酸配列の一部又は全部を有し、該タンパク質の蛍光特性を利用する分子センサに関する。
本開示に係る分子センサは、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質又は本開示に係る融合タンパク質の蛍光特性を利用する分子センサの全てを含みうる。
本開示に係る分子センサ−としては、限定されない一又は複数の実施形態として、ＦＲＥＴ型バイオセンサ、円順列変異技術を利用したバイオセンサ、分割ＧＦＰ技術を利用した分子センサなどが挙げられる。
【００４２】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）型バイオセンサとしては、ＦＲＥＴに使用される少なくとも一方の蛍光タンパク質成分が、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質であるＦＲＥＴ型バイオセンサが挙げられる。本開示に係る分子センサは、タンパク質若しくはペプチドから構成されている形態であってもよく、タンパク質以外の物質に本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質又は融合タンパク質が結合している形態であってもよい。
【００４３】
円順列変異技術を利用したバイオセンサとしては、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質の円順列変異体を含むバイオセンサが挙げられる。本開示において円順列変異（circular permutation）とは、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質の内部に新たにＮ末とＣ末を作製し（すなわち、該タンパク質を内部で２分し）、オリジナルのＣ末とＮ末とを適当なリンカー配列により繋ぐ変異をいう。蛍光蛋白質における円順列変異は、従来から行われており、例えば、Ｂａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol96, pp11241-11246 1999）等を参照できる。本開示における円順列変異技術を利用したバイオセンサとしては、一又は複数の実施形態において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質の円順列変異体のＮ末及びＣ末にペプチド又はタンパク質が結合した構成が挙げられる。前記ペプチド又はタンパク質としては、感知する対象に応じて適宜選択されうる。
【００４４】
分割ＧＦＰ技術を利用した分子センサとしては、２つに分割された本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質を利用するバイオセンサが挙げられる。分割方法については従来の分割ＧＦＰ技術を参照できる。本開示における分割ＧＦＰ技術を利用したバイオセンサとしては、一又は複数の実施形態において、２分割された本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質のそれぞれにペプチド又はタンパク質が結合した構成が挙げられる。前記ペプチド又はタンパク質としては、感知する対象に応じて適宜選択されうる。
【００４５】
［核酸］
本開示は、一態様において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質、本開示に係る融合タンパク質、又は本開示に係る分子センサをコードする核酸に関する。本開示において、核酸は、合成ＤＮＡ，ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡから選択される一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、並びにこれらのＤＮＡの転写生成物が挙げられる。
本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の一例が、配列番号３で示される塩基配列である。
【００４６】
［発現カセット］
本開示は、一態様において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質、融合タンパク質、又は分子センサをコードする核酸を含む発現カセットに関する。該発現カセットにおいて、前記核酸は、導入する宿主細胞に応じた発現調節配列が作動的に連結されている。発現調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター等が挙げられ、その他には、開始コドン、イントロンのスプライシングシグナル、及び停止コドンなどが挙げられる。
【００４７】
［ベクター］
本開示は、一態様において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質、融合タンパク質、又は分子センサを発現可能なベクターに関する。本開示は、その他の態様において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質、本開示に係る融合タンパク質、又は本開示に係る分子センサを発現可能なベクターに関する。本開示に係るベクターは、一又は複数の実施形態において、本開示に係る核酸又は発現カセットを有する発現ベクターである。
【００４８】
本開示に係るベクターは、発現させたい細胞（宿主）に応じた発現ベクター系を適宜選択して使用できる。限定されない一又は複数の実施形態として、プラスミド、コスミド、ＹＡＣＳ、ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、エピソームＥＢＶなど）ベクター及びファージベクターが挙げられる。
【００４９】
［形質転換体］
本開示は、一態様において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質、融合タンパク質、又は分子センサを発現する形質転換体に関する。本開示の形質転換体は、一又は複数の実施形態において、開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質、融合タンパク質、又は分子センサを発現する細胞、又は、該細胞を含む組織、器官、生体である。また、本開示は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る核酸又はベクターを有する形質転換体に関する。本開示の形質転換体は、一又は複数の実施形態において、本開示の核酸、発現カセット又はベクターを宿主に導入することによって作成することができる。宿主としては、動物細胞、ヒト生体を含まない動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、微生物等が挙げられる。
【００５０】
［イメージング方法］
本開示は、一態様において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質、融合タンパク質、又は分子センサを用いるイメージング方法に関する。本開示のイメージング方法は、一又は複数の実施形態において、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質、融合タンパク質、又は分子センサを細胞等に導入すること、及び、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質、融合タンパク質、又は分子センサの蛍光シグナルを検出することを含む。なお、本態様の一又は複数の実施形態において、ヒト生体に対するイメージング方法は含まれない。
【００５１】
［光スイッチング変異体を用いたイメージング方法］
本開示は、一態様において、本開示に係る光スイッチング変異型単量体型緑黄色蛍光タンパク質、その融合タンパク質、又はそれらを用いた分子センサを用いるイメージング方法に関する。なお、本態様の一又は複数の実施形態において、ヒト生体に対するイメージング方法は含まれない。本開示のイメージング方法は、一又は複数の実施形態において、本開示の光スイッチング変異型単量体型緑黄色蛍光タンパク質を細胞等に導入すること、前記光スイッチング変異型蛍光タンパク質の光切替を行って蛍光性をon/offすること、及び／又は、前記光スイッチング変異型蛍光タンパク質の蛍光シグナルを検出することを含む。本開示のイメージング方法は、一又は複数の実施形態において、超解像イメージング若しくは超解像ライブイメージングであって、一又は複数の実施形態において、PALM（photoactivated localization microscopy）、STORM（stochastic optical reconstruction microscopy）、RESOLFT（reversible saturable optical fluorescence transition）、NL-SIM (Nonlinear structured illumination microscopy) 又は、SOFI（stochastic optical fluctuation imaging）が挙げられる。
【００５２】
［二量体型緑黄色蛍光タンパク質］
本開示は、その他の態様において、ハナガサクラゲ（学名：Olindias formosa）からクローニングされた野生型の二量体型緑黄色蛍光タンパク質（ｄｆＧＦＰ、配列番号１の２番目から２３２番目の配列）、及び、このｄｆＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号１）を起源とするｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下である二量体型緑黄色蛍光タンパク質の変異体に関する。
【００５３】
本開示に係る二量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下の二量体型緑黄色蛍光タンパク質の機能を維持できる範囲で、上述の変異以外の変異を有していてもよい。該変異としては、１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加が挙げられ、「１から数個」とは、一又は複数の実施形態において、１〜４、１〜３、１〜２、又は１個を含む。
本開示に係る二量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２３２番目の配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の同一性を示すアミノ酸配列を有し、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下である二量体型緑黄色蛍光タンパク質である。
【００５４】
本開示に係る二量体型緑黄色蛍光タンパク質は、一又は複数の実施形態において、さらに、「光スイッチング型となる変異」が導入されていてもよい。前記「光スイッチング型となる変異」としては、Ｔ１９７ＡorＧ、すなわち、「Ｔ１９７Ａ又はＴ１９７Ｇ」が挙げられる。なおこの変異の位置、配列番号１のアミノ酸配列を基準としている。本開示において、単に「本開示に係る二量体型緑黄色蛍光タンパク質」という場合には、光スイッチング変異型の二量体型緑黄色蛍光タンパク質を含みうる。
【００５５】
本開示は、また、本開示に係る二量体型緑黄色蛍光タンパク質に関する融合タンパク質、分子センサ、核酸、発現カセット、ベクター、及び形質転換体、又はそれらを用いた分子センサを用いるイメージング方法に関する。これらについては、本開示に係る単量体型緑黄色蛍光タンパク質と同様とすることができる。
【００５６】
本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕  配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列に少なくとも下記変異が導入されたアミノ酸配列を有する蛍光タンパク質。
ここで、前記変異は、Ｆ１４９ＴorＳorＡ、Ｌ１５８ＴorＳorＡ、Ｈ１６０ＴorＳorＡ、Ｙ１７４ＴorＳorＡ、及び、Ｙ１９２ＴorＳorＡ、並びにこれらの２〜５個の組合せからなる群から選択される。
〔２〕  配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列に、さらに下記の変異が導入されたアミノ酸配列を有する、〔１〕記載の蛍光タンパク質。
ここで、前記変異は、Ｋ１１２ＥorＤorＱ、Ｅ１４７ＫorＲorＱ、Ｑ１４５ＥorＤ、Ｋ１６６ＥorＤorＱ、Ｐ１６２ＬorＶorＩorＡ、Ｐ２２３ＬorＶorＩorＡ、Ｎ３７ＳorＡorＧ、Ｅ１４０ＫorＲorＱ、Ｋ１８５ＲorＡorＧ、Ａ１５０／Ｅ１５１／Ｇ１５２→ＰＨＧＰorＰＨＡ、及び、Ｋ１８０ＴorＳ、並びにこれらの２〜１１個の組合せからなる群から選択される。
〔３〕  配列番号２のアミノ酸配列の８番目から２３２番目の配列を有する、〔１〕又は〔２〕に記載の蛍光タンパク質。
〔４〕  ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、単量体型であり、蛍光色が緑黄色である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の蛍光タンパク質。
〔５〕  〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の蛍光タンパク質のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、単量体型であり、蛍光色が緑黄色である、蛍光タンパク質。
〔６〕  〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の蛍光タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の同一性を示すアミノ酸配列を有し、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、単量体型であり、蛍光色が緑黄色である、蛍光タンパク質。
〔７〕  〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の蛍光タンパク質が融合された融合タンパク質であって、該蛍光タンパク質の部分は、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、単量体型であり、蛍光色が緑黄色の蛍光タンパク質である、融合タンパク質。
〔８〕  配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列に、Ｔ１９７ＡorＧの変異が導入されたアミノ酸配列を有する、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の蛍光タンパク質。
〔９〕  蛍光励起しない特定の波長の光照射によって無蛍光性から蛍光性になり、蛍光励起のための光照射によって蛍光性から無蛍光性になる蛍光タンパク質として機能可能な、〔８〕記載の蛍光タンパク質。
〔１０〕  〔８〕又は〔９〕に記載の蛍光タンパク質が融合された融合タンパク質であって、該蛍光タンパク質の部分は、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、単量体型であり、蛍光色が緑黄色であり、蛍光励起しない特定の波長の光照射によって無蛍光性から蛍光性になり、蛍光励起のための光照射によって蛍光性から無蛍光性になる蛍光タンパク質として機能可能である、融合タンパク質。
〔１１〕  〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列の一部又は全部を有し、該タンパク質の蛍光特性を利用する、分子センサ。
〔１２〕  〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のタンパク質又は〔１１〕に記載の分子センサをコードする塩基配列を有する核酸。
〔１３〕  〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のタンパク質又は〔１１〕に記載の分子センサをコードする塩基配列含む発現カセット。
〔１４〕  〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のタンパク質又は〔１１〕に記載の分子センサを発現可能な、或いは、〔１２〕に記載の核酸又は〔１３〕に記載の発現カセットを有する、ベクター。
〔１５〕  〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載のタンパク質又は〔１１〕に記載の分子センサを発現する形質転換体。
〔１６〕  配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２３２番目の配列を有する蛍光タンパク質。
〔１７〕  ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、二量体型であり、蛍光色が緑黄色である、〔１６〕に記載の蛍光タンパク質。
〔１８〕  配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２３２番目の配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、二量体型であり、蛍光色が緑黄色である、蛍光タンパク質。
〔１９〕  〔１６〕から〔１８〕のいずれかに記載の蛍光タンパク質のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、二量体型であり、蛍光色が緑黄色である、蛍光タンパク質。
〔２０〕  〔１６〕から〔１８〕のいずれかに記載の蛍光タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の同一性を示すアミノ酸配列を有し、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、二量体型であり、蛍光色が緑黄色である、蛍光タンパク質。
〔２１〕  〔１６〕から〔２０〕のいずれかに記載の蛍光タンパク質が融合された融合タンパク質であって、該蛍光タンパク質の部分は、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、二量体型であり、蛍光色が緑黄色の蛍光タンパク質である、融合タンパク質。
〔２２〕  配列番号１のアミノ酸配列の２番目から２２５番目の配列に、Ｔ１９７ＡorＧの変異が導入されたアミノ酸配列を有する、〔１６〕から〔２０〕のいずれかに記載の蛍光タンパク質。
〔２３〕  蛍光励起しない特定の波長の光照射によって無蛍光性から蛍光性になり、蛍光励起のための光照射によって蛍光性から無蛍光性になる蛍光タンパク質として機能可能な、〔２２〕記載の蛍光タンパク質。
〔２４〕  〔２２〕又は〔２３〕に記載の蛍光タンパク質が融合された融合タンパク質であって、該蛍光タンパク質の部分は、ｐＨ感受性（ｐＫａ）が４．０以下であり、単量体型であり、蛍光色が緑黄色であり、蛍光励起しない特定の波長の光照射によって無蛍光性から蛍光性になり、蛍光励起のための光照射によって蛍光性から無蛍光性になる蛍光タンパク質として機能可能である、融合タンパク質。
〔２５〕  〔１６〕から〔２４〕のいずれかに記載のタンパク質のアミノ酸配列の一部又は全部を有し、該タンパク質の蛍光特性を利用する、分子センサ。
〔２６〕  〔１６〕から〔２４〕のいずれかに記載のタンパク質又は〔２５〕に記載の分子センサをコードする塩基配列を有する核酸。
〔２７〕  〔１６〕から〔２４〕のいずれかに記載のタンパク質又は〔２５〕に記載の分子センサをコードする塩基配列含む発現カセット。
〔２８〕  〔１６〕から〔２４〕のいずれかに記載のタンパク質又は〔２５〕に記載の分子センサを発現可能な、或いは、〔２６〕に記載の核酸又は〔２７〕に記載の発現カセットを有する、ベクター。
〔２９〕  〔１６〕から〔２４〕のいずれかに記載のタンパク質又は〔２５〕に記載の分子センサを発現する形質転換体。
〔３０〕  〔１〕から〔１０〕及び〔１６〕から〔２４〕のいずれかに記載のタンパク質、〔１１〕若しくは〔２５〕に記載の分子センサ、〔１２〕若しくは〔２６〕に記載の核酸、〔１３〕若しくは〔２７〕に記載の発現カセット、又は〔１４〕若しくは〔２８〕に記載のベクターが導入された細胞から、前記タンパク質又は前記分子センサの蛍光シグナルを検出することを含む、イメージング方法。
〔３１〕  〔８〕から〔１０〕及び〔２２〕から〔２４〕のいずれかに記載の光スイッチング変異型緑黄色蛍光タンパク質が導入された細胞において、前記光スイッチング変異型蛍光タンパク質の光切替を行って蛍光性をon/offすること、及び／又は、前記光スイッチング変異型蛍光タンパク質の蛍光シグナルを検出することを含む、超解像イメージング又は超解像ライブイメージング方法。
【００５７】
以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００５８】
［ｄｆＧＦＰのクローニング］
ｄｆＧＦＰはハナガサクラゲ（学名：Olindias formosa）由来の蛍光タンパク質である。まずハナガサクラゲより全ＲＮＡ抽出し、ｍＲＮＡをオリゴＴプライマーを用いてＤＮＡへと逆転写し、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。このｃＤＮＡライブラリーをＰＣＲで増幅したのち、バクテリア発現ベクターへと挿入した。これらのプラスミドを大腸菌に形質転換し、蛍光を発するコロニーを選別することで、ハナガサクラゲの蛍光タンパク質ｄｆＧＦＰをコードする遺伝子を同定した。該遺伝子にコードされるｄｆＧＦＰのアミノ酸配列が、配列表の配列番号１である。【００５９】
［ｍｆＧＦＰの作製］
配列表の配列番号１のアミノ酸配列にＦ１４９Ｔ、Ｌ１５８Ｔ、Ｈ１６０Ｔ、Ｙ１７４Ｔ、Ｙ１９２Ａ、Ｋ１１２Ｅ、Ｅ１４７Ｋ、Ｑ１４５Ｅ、Ｋ１６６Ｅ、Ｐ１６２Ｌ、Ｐ２２３Ｌ、Ｎ３７Ｓ、Ｅ１４０Ｋ、Ｋ１８５Ｒ、Ａ１５０／Ｅ１５１／Ｇ１５２→ＰＨＧＰ、及びＫ１８０Ｔの変異を部位特異的に導入し、さらに、配列番号１のＮ末のＭをＥＧＦＰのＮ末端７アミノ酸残基（ＭＶＳＫＧＥＥ）に置換し、かつ、配列番号１のＣ末７アミノ酸残基（ＥＰＳＡＳＡＶ）をＥＧＦＰのＣ末端７アミノ酸残基（ＧＭＤＥＬＹＫ）に置換し、配列表の配列番号２のアミノ酸配列をコードする遺伝子を作製した（配列番号３）。該遺伝子にコードされるｍｆＧＦＰのアミノ酸配列が、配列表の配列番号２である。【００６０】
［ｍｆＧＦＰの精製］
Ｎ末にポリヒスチジンタグを持つｍｆＧＦＰをバクテリア発現ベクターｐＲＳＥＴBに導入し、大腸菌で発現させた。２３℃６５時間ＬＢ培地で培養した後、菌体をフレンチプレスで破砕し、上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティカラム（Ｑｉａｇｅｎ社製）、及びＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）によるゲルフィルトレーションで精製し、さらに、ＡＫＴＡ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムで再精製した。【００６１】
［ｍｆＧＦＰが単量体型であることの確認］
図１に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３０カラムを用いた、サイズ除去ゲルろ過クロマトグラフフィーの結果を示す。溶媒は１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むｐＨ７．４の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液。分子量・分子体積の大きいものほどカラム内を速く流れるため、図中では左側にピークが現れる。
図１の点線のスペクトルは左から順に１０μＭのＤｓＲｅｄ（四量体）、ｔｄＴｏｍａｔｏ（二量体）、ｍＣｈｅｒｒｙ（単量体）の吸収を示す。実線のスペクトルは１０μＭの  ｍｆＧＦＰの吸収を示す。ｍｆＧＦＰのピーク位置はｍＣｈｅｒｒｙのものとほぼ同じなので、ｍｆＧＦＰは単量体であるといえる。【００６２】
［ｍｆＧＦＰの物性１］
精製した蛍光タンパク質の性質を測定した。その結果を図２に示す。蛍光スペクトルメーターを用いた測定により、ｍｆＧＦＰは５０４ｎｍの励起ピーク、５１９ｎｍの蛍光ピークを持つことがわかった。吸収スペクトル測定によりｍｆＧＦＰの吸収ピークにおけるモル吸光係数は８３，０００Ｍ-1・ｃｍ-1、絶対蛍光量子収率の測定によりｍｆＧＦＰの量子収率は０．９０であることがわかった。【００６３】
［ｍｆＧＦＰの物性２：ｐＨ感受性（ｐＫａ）］
３０ｍＭクエン酸ナトリウムと３０ｍＭホウ酸の混合溶液を用いて、ｐＨ３から９のｐＨバッファーを０．５きざみに作製した。ｍｆＧＦＰ又はＥＧＦＰを上記のバッファーに溶解させ、蛍光スペクトルメーターを用いて、蛍光強度を測定した（図３）。得られたデータを下に、ヒルの式上にフィッティングしたところ、ｍｆＧＦＰのｐＫａ（蛍光タンパク質が存在する媒体のｐＨが塩基性ｐＨから酸性ｐＨになるときの、該蛍光タンパク質の蛍光強度が最大値の半分となるｐＨ）としてｐＫａ＝３．５という値が得られた。【００６４】
［ｍｆＧＦＰの物性３］
ｍｆＧＦＰ又はＥＧＦＰをＨｅＬａ細胞の細胞質に発現させ、水銀ランプ光と４４０−４８０ｎｍバンドパスフィルターを用いて光照射した際の光安定性を調べた（図４）。ｍｆＧＦＰとＥＧＦＰの蛍光強度半減時間はそれぞれ１．２分、０．６分であった。この結果は、ｍｆＧＦＰの光安定性はＥＧＦＰの約２倍高いことを示唆している。【００６５】
［ｍｆＧＦＰの物性４］
ｍｆＧＦＰ、ＥＧＦＰそれぞれがもつ蛍光団の成熟速度比を調べた。それぞれの蛍光タンパク質を大腸菌に形質転換、無酸素環境下・３７℃で１日―１．５日培養させることで、蛍光団が非成熟なタンパク質を作成した。タンパク質を空気に暴露することに伴う蛍光強度の時間変化を測定した（図５）。ｍｆＧＦＰとＥＧＦＰの蛍光団成熟にかかる半飽和時間は、それぞれ８．０分、１４．９分であったことから、ｍｆＧＦＰの優れた蛍光団生成能が示唆される。【００６６】
下記表１に、ｍｆＧＦＰとＥＧＦＰの光学特性をまとめた。
【表１】
0006762069.tif 000002
【００６７】
［ｍｆＧＦＰの物性５］
ｍｆＧＦＰに様々なオルガネラ・タンパク質への局在シグナルを融合させＨｅＬａ細胞に発現させた（アクチン、ゴルジ体、リン、パキシリン、ペルオキシソーム、ジキシン、ミトコンドリア、フィブリラリン、ビメンチン、チューブリン、コネキシン４３、ヒストンＨ２Ｂ、ライフアクト、ＶＡＭＰ２、ＬＡＭＰ３．ＣａｔｈｅｐｓｉｎＢ，ＬＣ３）。その結果を図６に示す。
図６に示すように、ｍｆＧＦＰの融合タンパク質は、目的のオルガネラ・タンパク質に正しい局在を示した。中でも局在の難しいチューブリンのラベル化に成功したことは、ｍｆＧＦＰの高い単量体としての性質を示唆している。また。内部が酸性に保たれている分泌小胞・リソソーム（ｐＨ４．５−５，５）内でも高い蛍光強度を示した。【００６８】
［ｍｆＧＦＰの物性６］
ｍｆＧＦＰ又はＥＧＦＰをＨｅＬａ細胞の細胞質に発現させ、３日間３７℃／５％で培養したところ、ｍｆＧＦＰのみリソソーム様の蛍光ドット画像が得られた（図７）。これは、細胞質に存在していた蛍光タンパク質が、非選択的なマクロオートファジーによってリソソームへと運搬された結果だと考えられる。同様に、ｍｆＧＦＰが細胞質からリソソームへ蓄積させる過程をタイムラプスイメージングすることにも成功した（図７）。ＨｅＬａ細胞のリソソームのｐＨは約４．７と低く、ｐＨ感受性の高いＥＧＦＰではこのようなドットは観察されなかった。【００６９】
［ｍｆＧＦＰ光スイッチング変異体］
ｍｆＧＦＰに、Ｔ１９７Ａ（またはＴ１９７Ｇ）アミノ酸変異を導入することで、ｍｆＧＦＰの耐酸性能を保ちながら、その蛍光・非蛍光状態を光波長依存的にコントロールできる変異体（光スイッチング変異体）が得られた。
Ｔ１９７Ａ変異体を大腸菌に発現させ、その抽出物をｐＨ５、６、７、８のバッファーと混合させたところ、蛍光強度が上記範囲のｐＨに影響を受けないことが判明した（図８）。また、同サンプルを顕微鏡下で観察したところ、５００／２４ｎｍ光照射により無蛍光状態へと移行、３７０／３６ｎｍ光照射により蛍光状態に移行することが判明した（図９）。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
配列番号１：ｄｆＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号２：ｍｆＧＦＰのアミノ酸配列
配列番号３：ｍｆＧＦＰの塩基配列
【図１】
0006762069.tif 000003
【図２】
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【図３】
0006762069.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006762069.tif 000009
【図８】
0006762069.tif 000010
【図９】
0006762069.tif 000011
【配列表】
0006762069000001.app