(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非角化歯肉に注入又は塗布して口腔粘膜上皮を角化歯肉に角化誘導するための角化歯肉誘導剤であって、
薬理学的に許容される担体１ｇに対してＬａｍｉｎｉｎ３３２を０．１μｇ〜１ｍｇ含む角化歯肉誘導剤を非角化歯肉に注入又は塗布により投与されるように用いられることを特徴とする角化歯肉誘導剤。
【請求項２】
請求項１記載の角化歯肉誘導剤からなる角化歯肉治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角化歯肉誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
健全な歯の周囲には、粘膜上皮が角化した角化歯肉と非角化組織である歯槽粘膜が存在するが、なかでも角化歯肉は、コラーゲン繊維が豊富な肥厚性組織であり、細菌、ブラッシング、食物の刺激に抵抗性を示し、歯周組織を長期間安定した状態に維持するために必要不可欠と考えられている。歯周病等で角化歯肉を喪失して辺縁歯肉が歯槽粘膜のみとなった場合、角化歯肉の再獲得には、遊離歯肉弁移植などの外科的手法が唯一の方法であるため、侵襲が少なく簡便な治療法が望まれている。
【０００３】
特許文献１には、歯肉上皮細胞の培養において、細胞外マトリックスがコートされた培養器を用いる歯肉上皮細胞の培養方法であって、細胞外マトリックスが、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、パールカン（ｐｅｒｌｅｃａｎ）、テネイシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）、ＦＡＤ１０４（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３Ｂ）、フィブリリン（ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ）、ｎｅｕｇｒｉｎ、ニドジェン（ｎｉｄｏｇｅｎ）、アグリン（ａｇｒｉｎ）、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）のいずれかひとつ以上であることが記載されている。しかしながら、角化歯肉と非角化歯肉において、その性質が異なることについての記載はなく、特に、Ｋｅｒａｔｉｎ１（Ｋ１）とＫｅｒａｔｉｎ１０（Ｋ１０）の発現量に差があることや、ＬＡＭα３等の発現量に差があること等についての記載もなかった。
【０００４】
非特許文献１には、角化上皮において、Ｋｅｒａｔｉｎ１（Ｋ１）とＫｅｒａｔｉｎ１０（Ｋ１０）が発現していることが記載されており、非角化口腔上皮の結合組織に高発現しているｅｌａｓｔｉｎが、非角化口腔上皮の維持に重要であるとされている。しかしながら、非特許文献１には、Ｌａｍｉｎｉｎ３３２についての記載はなく、また、角化歯肉への誘導を示唆するものでもなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−７８３２６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hsieh P-C et al., J. Clin. Periodontol., 2010, Vol.37, p.705-711
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、侵襲が少なく、組織再生の簡便な治療に有効に用いることのできる角化歯肉誘導剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題は、口腔粘膜上皮を角化誘導するための角化歯肉誘導剤であって、薬理学的に許容される担体１ｇに対してＬａｍｉｎｉｎ３３２を０．１μｇ〜１ｍｇ含む角化歯肉誘導剤を非角化歯肉に注入又は塗布により投与されるように用いられることを特徴とする角化歯肉誘導剤を提供することによって解決される。
【０００９】
口腔粘膜上皮を再生させるために用いられる、角化歯肉誘導剤からなる角化歯肉治療剤が本発明の好適な実施態様である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の角化歯肉誘導剤は、口腔粘膜上皮を角化誘導することが可能であるため、侵襲が少なく、組織再生の簡便な治療に有効に用いることができる。したがって、角化歯肉治療剤として好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、角化歯肉と非角化歯肉における各遺伝子の発現量の結果を示した図である。
【図２】実施例１において、角化歯肉と非角化歯肉における各遺伝子の発現量の結果を示した図である。
【図３】実施例１において、角化歯肉と非角化歯肉における細胞接着能、細胞増殖能及び細胞遊走能の結果を示した図である。
【図４】実施例１において、角化歯肉と非角化歯肉における各遺伝子の発現量の結果を示した図である。
【図５】実施例１において、Laminin332が上皮細胞の角化に与える影響の検討結果を示した図である。
【図６】実施例２において、間葉系線維芽細胞が上皮細胞の角化に与える影響の検討結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の角化歯肉誘導剤は、口腔粘膜上皮を角化誘導するための角化歯肉誘導剤であって、薬理学的に許容される担体１ｇに対してＬａｍｉｎｉｎ３３２を０．１μｇ〜１ｍｇ含む角化歯肉誘導剤を非角化歯肉に注入又は塗布により投与されるように用いられることを特徴とするものである。
【００１３】
角化歯肉と非角化歯肉は連続しているにも関わらず、組織学的には異なっており、また、後述する実施例からも分かるように、角化歯肉由来線維芽細胞と非角化歯肉由来線維芽細胞とでは、各遺伝子の発現量や、細胞接着能、細胞増殖能、細胞遊走能等に差があり、性質の異なる細胞群であることが本発明者らにより確認された。そして、Ｌａｍｉｎｉｎ３３２を一定量含む角化歯肉誘導剤を口腔粘膜上皮細胞に加えることにより、Ｋｅｒａｔｉｎ１（Ｋ１）とＫｅｒａｔｉｎ１０（Ｋ１０）が有意に発現しており、したがって、本発明の角化歯肉誘導剤により、口腔粘膜上皮を角化誘導することが可能であることが確認された。
【００１４】
本発明の角化歯肉誘導剤は、薬理学的に許容される担体１ｇに対してＬａｍｉｎｉｎ３３２を０．１μｇ〜１ｍｇ含むものである。Ｌａｍｉｎｉｎ３３２の含有量が０．１μｇ未満の場合、口腔粘膜上皮を角化誘導することが困難となり、０．２μｇ以上であることが好適である。一方、Ｌａｍｉｎｉｎ３３２の含有量が１ｍｇを超える場合、コスト高となり、５００μｇ以下であることが好適であり、１００μｇ以下であることがより好適である。
【００１５】
本発明で使用される薬理学的に許容される担体としては特に限定されず、蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等の溶媒；デンプン、デキストリン、ゼラチン等の結合剤；殺菌剤；界面活性剤；ｐＨ調整剤；乳化剤；酸化防止剤；増粘剤等が挙げられ、これらを適宜組み合わせて使用することも好適な実施態様である。
【００１６】
本発明の角化歯肉誘導剤を投与する方法としては、非角化歯肉に注入又は塗布により投与する方法であれば特に限定されない。例えば、注射器等を用いて該当箇所に注入する方法であってもよいし、ブラシ、綿棒、スポンジ等のアプリケーターを用いて該当箇所に塗布する方法であってもよい。また、歯をブラッシングすることにより投与される方法であってもよく、かかる観点から、角化歯肉誘導剤からなる歯磨材であることが本発明の好適な実施態様である。
【００１７】
前述のとおり、本発明の角化歯肉誘導剤により、口腔粘膜上皮を角化誘導することが可能であることが本発明者らにより確認された。したがって、本発明の角化歯肉誘導剤は、侵襲が少なく、組織再生の簡便な治療に有効に用いることができるため、口腔粘膜上皮を再生させるために用いられる、角化歯肉誘導剤からなる角化歯肉治療剤が本発明の好適な実施態様である。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例を用いて本発明を更に具体的に説明する。
【００１９】
実施例１
（１）角化歯肉と非角化歯肉におけるKeratin1（K1）とKeratin10 (K10)の発現解析
（Ａ）定量性RT-PCR
Wistar系ラットをイソフル（登録商標）2.0 %の吸引麻酔で全身麻酔を施し、頸椎脱臼により屠殺した。口腔粘膜をヨード（イソジン（登録商標））にて染色し、実体顕微鏡下で角化歯肉と非角化歯肉を分離し採取した。採取した角化歯肉と非角化歯肉からそれぞれmRNAを回収し、定量性RT-PCRによりKeratin1（K1）、Keratin10(K10)の遺伝子発現量を確認した。用いたプライマーは以下のとおりである。内部標準遺伝子として、Ribosomal protein S29 (rat)遺伝子（配列番号１、２）を用いた。得られた結果を図１に示す。
S29 sense：AAGGACATAGGCTTCATTAAGTTG（配列番号１）
S29 anti-sense：AGGGTAGACAGTTGGTTTCAT（配列番号２）
K1 sense：TGCTCAGATTAGGCTTATTTCC（配列番号３）
K1 anti-sense：GCTCTTCGTGGTTCTTCTTC（配列番号４）
K10 sense：ATCAAGGAGTGGTACGAGAA（配列番号５）
K10 anti-sense：AGCAGGACATTGGCATTG（配列番号６）
【００２０】
（Ｂ）免疫組織化学染色
また、採取した角化歯肉と非角化歯肉からSuper Cryoembedding Medium（SECTION-LAB Co. Ltd.）を用いて凍結包埋し、凍結切片を作製した。１次抗体としてK1（ab8068，1:10，Abcam）、K10（ab9026，1:50，Abcam）を使用し、２次抗体としてAlex Fluor（登録商標）488 goat anti-mouse IgG[H+L]（Life technologiesTM）又はAlex Fluor（登録商標）488 goat anti-rabbit IgG[H+L]（Life technologiesTM）を使用して免疫組織化学染色を行った。得られた結果を図１に示す。
【００２１】
（２）角化歯肉と非角化歯肉における間葉系線維芽細胞の採取とその性質
（Ａ）定量性RT-PCR
上記（１）と同様にして、ラット口腔粘膜から角化歯肉と非角化歯肉を採取した。10%ウシ胎仔血清（Fetal bovine serum; FBS，Life technologiesTM）、2mM L-glutamine（Life technologiesTM）、100 units/mL penicillin（SIGMA）含有High Glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium（D-MEM）培地（Life technologiesTM）を用い、Out Growth法にて約20日間培養し、角化歯肉と非角化歯肉における線維芽細胞を分離して採取した。採取した角化歯肉と非角化歯肉からそれぞれmRNAを回収し、定量性RT-PCRにより各遺伝子の発現量を確認した。用いたプライマーは以下のとおりである。内部標準遺伝子として、Ribosomal protein S18 (rat)遺伝子（配列番号７、８）を用いた。得られた結果を図２に示す。
S18 sense：CTTCGCTATCACTGCCATT（配列番号７）
S18 anti-sense：CGTCCTTCTGTCTGTTCAAG（配列番号８）
Col1a1 sense：GACAATTTCACATGGACTTTGG（配列番号９）
Col1a1 anti-sense：ACGTTCAGTTGGTCAAAGATAA（配列番号１０）
Fibronectin sense：TGTCCTCCTTCCATCTTCTTA（配列番号１１）
Fibronectin anti-sense：CCCTGAGCATCTTGAGTG（配列番号１２）
Tenascin C sense：TTCTCAGTGCTCAGTGGAT（配列番号１３）
Tenascin C anti-sense：GATGTTGATGCGGTGTGT（配列番号１４）
【００２２】
（Ｂ）細胞接着能の評価
線維芽細胞培養培地を用いて、角化歯肉または歯槽粘膜由来線維芽細胞を96 well plateに5.0×103個/wellの濃度で播種し、培養後30分後の接着細胞数をCellTiter 96 Aqueous（登録商標） One Solutionを用いて測定することにより、細胞接着能を評価した。得られた結果を図３に示す。
【００２３】
（Ｃ）細胞増殖能の評価
線維芽細胞培養培地を用いて、角化歯肉または歯槽粘膜由来線維芽細胞を96 well plateに5.0×103個/wellの濃度で播種し、培養後3日目の生細胞数をCellTiter 96 Aqueous（登録商標） One Solutionを用いて測定することにより、細胞増殖能を評価した。得られた結果を図３に示す。
【００２４】
（Ｄ）細胞遊走能の評価
24 well plate用Boyden chamber（poresize 8 μm：BD）に5×104個/wellの濃度で線維芽細胞を播種した。培養24 時間後にフィルター下面に遊走した細胞を4’,6-diamidino-2-phenylindole（DAPI：Life technologiesTM）にて染色し、蛍光顕微鏡（Biozero BZ-X700，株式会社キーエンス）下でランダムに4箇所を選択し、細胞数をカウントすることにより、細胞遊走能を評価した。得られた結果を図３に示す。
【００２５】
（３）角化歯肉と非角化歯肉におけるLamα3、Lamβ3及びLamγ2の発現解析
（Ａ）免疫組織化学染色
角化歯肉と非角化歯肉の部位を確認するため、ラット上顎組織を4 % paraformaldehyde（PFA）で固定後、ギ酸・クエン酸ナトリウム水溶液（22.5 %ギ酸，10 %（W/V）クエン酸ナトリウム）を用いて脱灰した。通常の方法に従ってパラフィン包埋し、厚さ5 μmの切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）を行い、組織学的に評価した。また、LAMα3の発現を確認するため、上記と同様の方法で作製したパラフィン切片を用い、1次抗体として、LAMα3（bs-1969R，1：50，Bioss）を使用し、2次抗体として、Alex Fluor（登録商標） 488 goat anti-mouse IgG［H+L］（Life technologiesTM）もしくはAlex Fluor（登録商標） 488 goat anti-rabbit IgG［H+L］（Life technologiesTM）を使用して、免疫組織化学染色を行った。得られた結果を図４に示す。
【００２６】
（Ｂ）定量性RT-PCR
上記と同様にして、採取した角化歯肉と非角化歯肉からそれぞれmRNAを回収し、定量性RT-PCRにより各遺伝子の発現量を確認した。用いたプライマーは以下のとおりである。内部標準遺伝子として、Ribosomal protein S29 (rat)遺伝子（配列番号１、２）を用いた。得られた結果を図４に示す。
Lamα3 sense：TACCACCTCTGAACACCAA（配列番号１５）
Lamα3 anti-sense：AAGAGCCAGGAAGGAGTC（配列番号１６）
Lamβ3 sense：GGCGTGTGCTGTACTATG（配列番号１７）
Lamβ3 anti-sense：CAGACTATGCTATCAATGGTATCC（配列番号１８）
Lamγ2 sense：AGTCCTGCTGCTATGTCA（配列番号１９）
Lamγ2 anti-sense：CCATTACTACTGTCTCACTATGC（配列番号２０）
【００２７】
（４）Laminin332が上皮細胞の角化に与える影響の確認
（Ａ）定量性RT-PCR
上部chamberである24 well plate用Thin Cert 細胞培養インサート（株式会社グライナー・ジャパン）に5×105個/wellのTR146（DSファーマバイオメディカル株式会社）から購入したヒト口腔扁平上皮癌（頸部リンパ節）細胞を播種し、上皮細胞培養培地（10 % FBS，2 mM L-glutamine（DSファーマバイオメディカル株式会社）含有F-12 Nutrient Mixture（Ham‘s F-12）培地（Life technologiesTM））にて1日間培養した。下部chamberにも、上皮細胞培養培地を加えた。TR146が細胞培養インサートに接着したのを確認した後、上部chamberには培地を加えず、下部chamberに0、300および1000 ng/mLのrecombinant human Laminin332（rhLAM332）（株式会社リプロセル）含有上皮細胞培養培地を加え、4日毎に培地交換を行い、20日間培養した。その後、上部chamberの細胞からtotal RNAを回収し、定量性RT-PCRによりK1とK10の遺伝子発現量を確認した。用いたプライマーは以下のとおりである。内部標準遺伝子として、Ribosomal protein S29 (human)遺伝子（配列番号２１、２２）を用いた。得られた結果を図５に示す。
S29 sense：TCTCGCTCTTGTCGTGTCTGTTC（配列番号２１）
S29 anti-sense：ACACTGGCGGCACATATTGAGG（配列番号２２）
K1 sense：CTTACTCTACCTTGCTCCTACT（配列番号２３）
K1 anti-sense：AAATCTCCCACCACCTCC（配列番号２４）
K10 sense：ACACCGCACAGAACCACCACTC（配列番号２５）
K10 anti-sense：GGCAGGCACAGGTCTTGATGAAC（配列番号２６）
【００２８】
（Ｂ）免疫組織化学染色
上部chamberのメンブレンと一緒に、4 % paraformaldehyde（PFA）で固定後、通常の方法に従ってパラフィン包埋し、厚さ5 μmの切片を作製した。1次抗体としてK1（ab8068，1：10，Abcam）、K10（ab9026，1：50，Abcam）を使用し、2次抗体としてAlex Fluor（登録商標） 488 goat anti-mouse IgG［H+L］（Life technologiesTM）又はAlex Fluor（登録商標） 488 goat anti-rabbit IgG［H+L］（Life technologiesTM）を使用して、免疫組織化学染色を行った。得られた結果を図５に示す。
【００２９】
実施例２
（１）角化歯肉由来と非角化歯肉由来の間葉系線維芽細胞が角化に与える影響の確認
（Ａ）定量性RT-PCR
実施例１の（２）と同様にして、角化歯肉と非角化歯肉における間葉系線維芽細胞を分離して採取した。上皮細胞と線維芽細胞の共培養実験を行うため、上部chamberであるThin Cert 細胞培養インサートに1×105個/wellの角化歯肉または歯槽粘膜由来線維芽細胞を播種し、線維芽細胞培養培地にて1日間培養した。線維芽細胞が細胞培養インサートに接着したのを確認した後、5×105個/wellのTR146を播種し、さらに1日間培養した。TR146が細胞培養インサートに接着したのを確認した後、上部chamberには培地を加えず、下部chamberにのみ上皮細胞培養培地を加え、4日毎に培地交換を行い、28日間培養した。その後、total RNAを回収し、定量性RT-PCRにより各遺伝子の発現量を確認した。用いたプライマーは以下のとおりである。内部標準遺伝子として、Ribosomal protein S29 (human)遺伝子（配列番号１９、２０）を用いた。Keratin1（K1）とKeratin10(K10)のプライマーは、配列番号２３〜２６のものを用いた。得られた結果を図６に示す。
Lamα3 sense：AGTCTGAATGGTTGTCCTGA（配列番号：２７）
Lamα3 anti-sense：TGGTTTGTGTCCTAATTGAAGAA（配列番号：２８）
Lamβ3 sense：GACAGTTACACTTGACAGACA（配列番号：２９）
Lamβ3 anti-sense：CCAGCTTCCTTGACTTGAG（配列番号：３０）
Lamγ2 sense：TCTGTGCTGATGGCTACT（配列番号：３１）
Lamγ2 anti-sense：CGGCTGTGTTGTGGATAC（配列番号：３２）
【００３０】
（Ｂ）免疫組織化学染色
実施例１と同様にして、1次抗体としてLAMα3（bs-1969R，1：50，Bioss）、K1（ab8068，1：10，Abcam）、K10（ab9026，1：50，Abcam）を使用し、2次抗体として、Alex Fluor（登録商標） 488 goat anti-mouse IgG［H+L］（Life technologiesTM）もしくはAlex Fluor（登録商標） 488 goat anti-rabbit IgG［H+L］（Life technologiesTM）を使用して、免疫組織化学染色を行った。得られた結果を図６に示す。
【図１】
0006792852.tif 000002
【図２】
0006792852.tif 000003
【図３】
0006792852.tif 000004
【図４】
0006792852.tif 000005
【図５】
0006792852.tif 000006
【図６】
0006792852.tif 000007
【配列表】
0006792852000001.app