(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における免疫寛容を誘導するための、単離されたインターロイキン−３４（ＩＬ−３４）ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項２】
患者における移植拒絶を予防又は軽減するための、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項３】
移植拒絶が心臓同種移植拒絶である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を予防又は軽減するための、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項５】
患者における自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するための、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
【請求項６】
ＩＬ３４ポリペプチドが、配列番号１を含み若しくは配列番号１からなる配列、又は配列番号１の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＩＬ−３４ポリペプチドが、異種ポリペプチドに融合されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
異種ポリペプチドが、免疫グロブリン定常ドメインである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
免疫抑制薬をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物、又は請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物及び免疫抑制薬を含む、キット。
【請求項１０】
免疫抑制薬が、細胞増殖抑制剤；アルキル化剤（シクロホスファミド）及び代謝拮抗剤（アザチオプリン、メルカプトプリン及びメトトレキサート）；治療用抗体；カルシニューリン阻害剤（シクロスポリン）；グルココルチコイド及びミコフェノール酸モフェチルからなる群より選択される、請求項９に記載の医薬組成物又はキット。
【請求項１１】
免疫抑制薬がラパマイシン（シロリムス）である、請求項１０に記載の医薬組成物又はキット。
【請求項１２】
移植拒絶、自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するための、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物又はキット。
【請求項１３】
患者が移植拒絶、自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答又はアレルギーのリスクがあるかを決定するためのデータを提供するためのin vitro方法であって、前記患者から得られた生物学的サンプルにおけるＩＬ−３４の発現レベルを決定する工程を含み、ＩＬ−３４の存在が、移植拒絶、自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答又はアレルギーのリスクの減少を示す、in vitro方法。
【請求項１４】
前記生物学的サンプルにおけるＩＬ−３４の濃度を測定することによって、ＩＬ−３４の発現レベルを決定する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的サンプルが血液サンプル（血清又は血漿サンプル）である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、免疫療法の分野にある。より具体的には、本発明は、移植拒絶、自己免疫疾患、遺伝子治療の過程で発現されるタンパク質及び／又は治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答（例えば、第ＶＩＩＩ因子、抗体など）並びにアレルギーを予防又は治療するのに使用するための単離されたインターロイキン−３４（ＩＬ−３４）ポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
免疫寛容の誘導は、病理学的状態に関与する免疫応答をコントロールするための強力なツールである。サイトカイン、代謝経路をコントロールする酵素、及び寛容を誘導することができる細胞表面分子が記載されている。これらの知見にもかかわらず、同定されていない他の機構の証拠が存在するので、免疫寛容の新たなメディエーターを同定することが重要である。
【０００３】
臓器移植は、急性拒絶の予防及び治療の両方において非常に重要な改善を示しているが、無症候性エピソード及び慢性移植片機能不全は依然として、中長期移植片生存に大きく影響を与える（１）。新たに登場した治療戦略では、ドナー抗原に対する寛容誘導が、長年にわたる実験モデル研究の後、臨床に移行している（２、３）。自然機構及び寛容誘導戦略では、異なる種類の調節細胞が中でも最も有望である（４）。移植分野ではなく他の病態生理学的状況におけるＣＤ８＋調節性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ）が近年注目されている（５〜８）。サイトカイン、代謝経路をコントロールする酵素、及び寛容を誘導することができる細胞表面分子もまた、免疫寛容の新たなメディエーターとして記載されている。
【０００４】
２００８年、ＩＬ−３４と称される新たなサイトカインが同定された（９）。研究では、ＩＬ−３４はＭ−ＣＳＦと相同性を有し、単球の細胞表面上において発現される共通のレセプターＣＤ１１５（ＣＳＦ−１Ｒとも称される）を介して作用し、脳内では、新たに記載されたレセプター（レセプター型タンパク質チロシンホスファターゼξ（ＰＴＰ−ξ））を介して作用することが示された（１０）。しかしながら、研究では、おそらくはディファレンシャルな空間的及び時間的ＩＬ−３４及びＭ−ＣＳＦ発現により（１２）、ＩＬ−３４及びＭ−ＣＳＦは、異なる生物学的活性及びシグナル活性化を示したことが実証された（１１）。ＩＬ−３４の機能は、これまでは、単球及びマクロファージ（破骨細胞、小膠細胞）並びにＤＣの生存及び機能に主に関連していた（１２）。ｍＲＮＡ及びタンパク質分析では、心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、前立腺、結腸及び小腸、並びに赤脾髄及び破骨細胞における豊富なタンパク質の発現が示された（９）のに対して、ＩＬ−３４プロモーターのコントロール下のＧＦＰを有するマウスは、ケラチノサイト、毛包、ニューロン、近位尿細管細胞及び精細管生殖細胞において陽性を示したので（１２）、休止細胞におけるＩＬ−３４の発現に関するデータは部分的に重複していた。炎症時には、線維芽細胞（１３）、破骨細胞（１４）及び関節滑膜細胞（１３）などの他の細胞は、ＩＬ−３４発現をアップレギュレーションした。これまで、他のリンパ様細胞、特にＴ細胞によるＩＬ−３４の発現は記載及び実証されていない。同様に、ＩＬ−３４欠損マウスにおけるＤＴＨ抗原又はＣＮＳウイルス感染に対する応答の低下は、皮膚及びＣＮＳにおけるそれぞれのランゲルハンス及びミクログリアの欠乏に関連付けられたので、ＩＬ−３４は、ＤＣ又はＴ細胞の免疫機能に対する効果に関連付けられていない（１２）。最後に、移植寛容におけるＩＬ−３４の役割については、これまでに記載されていない。
【０００５】
心臓同種移植のラットモデルでは、ＣＤ４０Ｉｇ処置によるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌの遮断は、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ（ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇと称される）の生成を介して、長期移植片生存を誘導することが以前に示されている（１５）。これらのＣＤ８＋Ｔｒｅｇは、ＩＦＮγ及びフィブリノーゲン様タンパク質２（ＦＧＬ２）の産生（１５、１６）並びに主要ＭＨＣ−ＩＩ由来ドナーペプチドの認識（１７）を部分的に介して、同種寛容を課すことも示されている。ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ対ナイーブラット由来のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇのパンゲノムトランスクリプトーム比較により、ＦＧＬ２発現の増加が示された際に、免疫寛容原性機構としてのＦＧＬ２の潜在的役割が初めて疑われた。同トランスクリプトーム分析により、長期レシピエント由来のＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇでは、ナイーブ動物由来のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗと対比して、ＩＬ−３４が過剰発現していたことが明らかになった。
【０００６】
したがって、移植拒絶の予防の大きな進歩にもかかわらず、このような病状は依然として、高い罹患率及び死亡率に関連しており、移植拒絶並びに自己免疫疾患、遺伝子治療の過程で発現されるタンパク質及び／又は治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答及びアレルギーの予防又は治療に使用するための（又は、移植寛容の誘導に使用するための）、免疫寛容の新たなメディエーター及び（より具体的には、Ｔ細胞応答のダウンレギュレーションによる）新たな寛容誘導戦略が切実に必要である。
【０００７】
また、移植拒絶のリスクを予測する容易に測定可能なバイオマーカーが必要である。したがって、このようなバイオマーカーは、移植患者のモニタリング及び免疫抑制処置の調整に有用であろう。
【０００８】
これまで、ＩＬ−３４が免疫寛容を誘導し得るかを調べて、移植患者が寛容であるか否か（移植拒絶のリスクの増加を示し、したがって適切な免疫抑制処置を必要とするか）を予測した研究はなかった。同様に、ＩＬ−３４は、ＤＣ又はＴ細胞の免疫機能に対する効果に関連付けられておらず、移植におけるその抑制能力が疑われたことも研究されたこともなかった。
【発明の概要】
【０００９】
第１の態様では、本発明は、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導するのに使用するための単離されたインターロイキン−３４（ＩＬ−３４）ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１０】
第２の態様では、本発明は、それを必要とする患者における移植拒絶を予防又は軽減するのに使用するための単離されたＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１１】
第３の態様では、本発明は、それを必要とする患者における自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するのに使用するための単離されたＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
第４の態様では、本発明は、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び免疫抑制薬を含む医薬組成物又はキットオブパーツ組成物に関する。
【００１３】
第５の態様では、本発明は、患者が移植拒絶、自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答又はアレルギーのリスクがあるかを決定するためのin vitro方法であって、前記患者から得られた生物学的サンプルにおけるＩＬ−３４の発現レベルを決定する工程を含み、ＩＬ−３４の存在が、移植拒絶、自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答又はアレルギーのリスクの減少を示すin vitro方法に関する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者に施行された免疫抑制処置を調整するための方法であって、以下の工程（ｉ）上記リスク決定方法を実施すること、及び（ｉｉ）免疫抑制処置を調整することを含む方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ＩＬ−３４が免疫抑制を誘導し、初代Ｔ細胞応答を阻害し、Ｔ細胞寛容を誘導することを実証した。自己免疫、アレルギー、移植、治療用タンパク質による処置及び遺伝子治療の分野では、免疫系による自己又は治療分子／組織の分解を避けるために、このアプローチは関心対象である。
【００１６】
本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの免疫抑制機能におけるＩＬ−３４の関与をin vitroで初めて実証した。骨髄細胞上において専ら発現されるそのレセプターＣＤ１１５の遮断は、ｐＤＣに応じたエフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞増殖に対するＩＬ−３４の抑制効果を回復させたが、これは、ｐＤＣを介したＴ細胞応答の間接的な抑制を示唆している。本発明者らは、ＩＬ−３４の過剰発現が、感染寛容性の調節性細胞を誘導することをin vivoで初めて示した。したがって、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇによる抑制の新たなメディエーターとして、及び同種移植片拒絶を効率的に阻害する寛容原性サイトカインとしてＩＬ−３４を同定した。
【００１７】
本発明者らはまた、ＩＬ−３４及び準最適の短期免疫抑制処置（ラパマイシン）を含む組み合わせが、別個の各処置と対比して、長期移植片生存の相乗的増加を可能にすることを実証した。したがって、本発明者らは、ＡＡＶ媒介性過剰発現を使用して、移植におけるこのサイトカインの免疫調節能力を評価したところ、短い１０日間の準最適用量のラパマイシンにより同種移植片生存が有意に延長し、７５％において不定的な生存をもたらし、同種抗体産生が完全に阻害されることを実証した。
【００１８】
本発明者らは、ＩＬ−３４が、移植拒絶のリスクを予測するためのバイオマーカーとして有用であることをさらに実証した。
【００１９】
治療方法及び用途：
本発明は、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するのに使用するための方法及び組成物（例えば、医薬組成物及びキットオブパーツ組成物）を提供する。
【００２０】
本発明はまた、それを必要とする患者における移植拒絶を予防又は軽減するのに使用するための方法及び組成物を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、その患者における自己免疫疾患、同種免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するのに使用するための方法及び組成物を提供する。
【００２２】
第１の態様では、本発明は、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するのに使用するための単離されたインターロイキン−３４（ＩＬ−３４）ポリペプチドに関する。
【００２３】
本発明はまた、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するのに使用するための単離されたマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）ポリペプチドに関する。
【００２４】
本発明はまた、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するのに使用するための、単離されたＩＬ−３４ポリペプチドと単離されたＭ−ＣＳＦポリペプチドとの組み合わせに関する。
【００２５】
本明細書で使用される「免疫寛容」という用語は、免疫応答を誘発する能力を有する物質又は組織に対する免疫系の応答が無い状態を指す。
【００２６】
本明細書で使用される「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介性及び／又はＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えばサイトカイン産生及び細胞傷害性を含み、加えて、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化よって間接的に影響される免疫応答、例えば抗体産生（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化を含む。免疫応答に関与する免疫細胞としては、リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞）；抗原提示細胞（例えば、樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞）；ナチュラルキラー細胞；骨髄性細胞、例えばマクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球及び顆粒球が挙げられる。
【００２７】
例えば、免疫応答は、移植拒絶だけではなく、このような免疫応答の付随する生理学的結果、例えば間質性線維症、慢性グラフトアテローム性硬化症又は血管炎などに関与する。免疫応答はまた、自己免疫疾患及びこのような免疫応答の付随する生理学的結果、例えばＴ細胞依存性浸潤及び直接的な組織傷害、マクロファージ及び他のエフェクター細胞のＴ細胞依存性動員及び活性化、並びに自己抗体産生をもたらすＴ細胞依存性Ｂ細胞応答に関与する。
【００２８】
したがって、未処置患者と比較して、ＩＬ−３４ポリペプチドによる処置患者は、以下の生理学的特徴を示す：ａ）免疫応答のレベルの低下（特異的又は非特異的）（抗原特異的エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋リンパ球によって少なくとも部分的には媒介されると考えられる）；ｂ）免疫応答（特異的又は非特異的）の発生若しくは進行の遅延；又はｃ）免疫応答（特異的又は非特異的）の発生若しくは進行のリスクの減少。本明細書で使用される「特異的」免疫寛容という用語は、他のものと比較して特定の抗原に対して、免疫寛容が優先的に誘発される場合に現れる。
【００２９】
「それを必要とする患者」は、処置すべき移植拒絶、自己免疫疾患、同種免疫応答又はアレルギーを患っているか又は患いやすい個体を意味する。本発明の枠内で処置すべき個体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００３０】
特定の一実施態様では、それを必要とする患者は、移植を受けている患者である。
【００３１】
第２の態様では、本発明は、それを必要とする患者における移植拒絶を予防又は軽減するのに使用するための単離されたＩＬ−３４ポリペプチドに関する。
【００３２】
本発明はまた、それを必要とする患者における移植拒絶を予防又は軽減するのに使用するための単離されたＭ−ＣＳＦポリペプチドに関する。
【００３３】
本発明はまた、それを必要とする患者における移植拒絶を予防又は軽減するのに使用するための、単離されたＩＬ−３４ポリペプチドと単離されたＭ−ＣＳＦポリペプチドとの組み合わせに関する。
【００３４】
本明細書で使用される「移植拒絶の予防又は軽減」という用語は、免疫移植拒絶の予防又は阻害、及び免疫移植拒絶の発症又は進行の遅延を包含することを意味する。この用語はまた、患者における移植物の生存の延長、又は患者における移植物の失敗の回復を包含することを意味する。さらに、この用語は、例えば、免疫拒絶に関連する免疫学的合併症、例えば間質性線維症、慢性グラフトアテローム性硬化症又は血管炎などの改善を含む、免疫移植拒絶の症候の改善を包含することを意味する。
【００３５】
本明細書で使用される「移植拒絶」という用語は、急性移植拒絶及び慢性移植拒絶の両方を包含する。「急性拒絶」は、移植組織が免疫学的に異物である場合の組織移植レシピエントの免疫系による拒絶である。急性拒絶は、レシピエントの免疫細胞による移植組織の浸潤（これは、それらのエフェクター機能を実行し、移植組織を破壊する）を特徴とする。急性拒絶の発症は急速であり、一般に、ヒトでは移植手術後数週間以内に起こる。一般に、急性拒絶は、ラパマイシン、シクロスポリン、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体などの免疫抑制薬で阻害又は抑制され得る。「慢性移植拒絶」は、一般に、急性拒絶の免疫抑制が成功した場合であっても、ヒトでは移植後数カ月〜数年以内に起こる。線維症は、全ての種類の臓器移植の慢性拒絶における共通因子である。
【００３６】
「移植」という用語及びその変化形は、移植が同系（ドナー及びレシピエントが遺伝的に同一である場合）、同種異系（ドナー及びレシピエントが異なる遺伝的起源のものであるが、同じ種のものである場合）又は異種（ドナー及びレシピエントが異なる種に由来する場合）であるかにかかわらず、レシピエントへの移植物（移植片とも称される）の挿入を指す。したがって、典型的なシナリオでは、宿主はヒトであり、移植片は、同じ又は異なる遺伝的起源のヒト由来の同種移植片である。別のシナリオでは、移植片は、それが移植される種と異なる種に由来し（系統学的に遠く離れている種由来の動物を含む）、例えばヒヒの心臓がヒト宿主に移植される。
【００３７】
一実施態様では、移植物のドナーは、ヒトである。移植物のドナーは、生存しているドナー又は死亡したドナー（すなわち、死体ドナー）であり得る。
【００３８】
一実施態様では、移植物は、臓器、組織又は細胞である。
【００３９】
本明細書で使用される「臓器」という用語は、生物内で特定の機能又は機能群を実行する固体の血管新生臓器を指す。臓器という用語は、限定されないが、心臓、肺、腎臓、肝臓、膵臓、皮膚、子宮、骨、軟骨、小腸又は大腸、膀胱、脳、胸、血管、食道、ファロピウス管、胆嚢、卵巣、膵臓、前立腺、胎盤、脊髄、四肢（上肢及び下肢を含む）、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、子宮を含む。本明細書で使用される「組織」という用語は、ヒト又は動物における任意の種類の組織を指し、限定されないが、血管組織、皮膚組織、肝組織、膵臓組織、神経組織、泌尿生殖器組織、胃腸組織、骨格組織（骨及び軟骨を含む）、脂肪組織、結合組織（腱及び靭帯を含む）、羊膜組織、絨毛組織、硬膜、心膜、筋肉組織、腺組織、顔面組織、眼組織を含む。
【００４０】
特定の実施態様では、移植拒絶は、心臓同種移植拒絶である。
【００４１】
本明細書で使用される「細胞」という用語は、目的の細胞が豊富な組成物、好ましくは、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、特により好ましくは少なくとも６５％の前記細胞を含む組成物を指す。
【００４２】
特定の実施態様では、細胞は、骨髄、末梢血若しくは臍帯血由来の多分化能造血幹細胞；又は異なる細胞系統、例えば心筋細胞、ベータ−膵臓細胞、肝細胞、ニューロンなどの多能性（すなわち、胚性幹細胞（ＥＳ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ））若しくは多分化能幹細胞由来の分化細胞からなる群より選択される。
【００４３】
一実施態様では、細胞組成物は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）に使用されるので、通常は、骨髄、末梢血又は臍帯血由来の多分化能性造血幹細胞を含む。
【００４４】
ＨＳＣＴは、白血病及びリンパ腫を有する患者の治療であり得る。しかしながら、同種ＨＣＴの重要な限界は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症であり、この治療を受けるヒトの約３０〜５０％では重症型で生じる。
【００４５】
本発明のポリペプチドは、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の予防又は軽減に有用である。
【００４６】
したがって、一実施態様では、それを必要とする患者は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）／骨髄増殖性症候群；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）及び多発性骨髄腫からなる群より選択される疾患に罹患している。
【００４７】
第３の態様では、本発明は、その患者における自己免疫疾患、遺伝子治療の過程で発現されるタンパク質又は治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するのに使用するための単離されたＩＬ−３４ポリペプチドに関する。
【００４８】
本発明はまた、その患者における自己免疫疾患、遺伝子治療の過程で発現されるタンパク質又は治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するのに使用するための単離されたＭ−ＣＳＦポリペプチドに関する。
【００４９】
本発明はまた、その患者における自己免疫疾患、遺伝子治療の過程で発現されるタンパク質又は治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するのに使用するための、単離されたＩＬ−３４ポリペプチドと単離されたＭ−ＣＳＦポリペプチドとの組み合わせに関する。
【００５０】
本明細書で使用される「予防する」、「予防すること」及び「予防」という用語は、疾患、障害又は症状の少なくとも１つの症候を最終的に発現する可能性があるがまだ発現していない個体に治療を施行して、個体が、所定の期間にわたって疾患、障害又は症状の症候を発症する可能性を減少させることを指す。このような減少は、例えば、患者における疾患、障害又は症状の少なくとも１つの症候の発症の遅延に反映され得る。
【００５１】
本明細書で使用される「処置する」、「処置すること」又は「処置」という用語は、患者の疾患、異常、障害又は有害症状の症候の頻度及び／又は重症度を軽減するために、個体に治療を施行することを指す。
【００５２】
本明細書で使用される「自己免疫疾患」という用語は、免疫系が、正常宿主の一部である抗原（すなわち、自己抗原）に対する免疫応答（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞応答）を引き起こし、その結果として組織損傷を伴う疾患を指す。自己免疫疾患では、宿主の免疫系は、特定の抗原を「自己」として認識することができず、該抗原を発現する宿主組織に対して免疫応答が起こる。
【００５３】
ヒトが罹患する例示的な自己免疫疾患としては、関節リウマチ、若年性少関節炎、コラーゲン誘発性関節炎、アジュバント誘発性関節炎、シェーグレン症候群、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、自己免疫性胃萎縮症、尋常性天疱瘡、乾癬、白斑、１型糖尿病、非肥満糖尿病、重症筋無力症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性唾液腺炎、全身性エリテマトーデス、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、アジソン病、全身性硬化症、多発性筋炎、皮膚筋炎、後天性血友病、血栓性血小板減少性紫斑病などが挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用される「治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答」という用語は、遺伝子治療の過程で発現されるタンパク質及び／又は治療用タンパク質、例えば第ＶＩＩＩ因子（血友病Ａ）及び他の凝固因子、酵素補充療法、モノクローナル抗体（例えば、ナタリズマブ、リツキシマブ、インフリキシマブ）、ポリクローナル抗体、酵素又はサイトカイン（例えば、ＩＦＮβ）に対する任意の望ましくない免疫応答を指す。
【００５５】
例えば、実際、このアプローチは、免疫応答を抑制するために、特に、対応する遺伝子欠損を有する個体において遺伝子治療によって発現が回復した場合に、特定のタンパク質に対する免疫応答を防止するために適用され得る。したがって、本発明の単離されたＩＬ−３４ポリペプチドは、突然変異により患者において通常存在しないが、遺伝子治療によって再構成が達成されるタンパク質に対する免疫応答を防止するために使用され得る。
【００５６】
また、タンパク質治療は、より普及しており、治療用製品として酵素、抗体又はサイトカインなどのタンパク質を患者に直接適用することを含む医療イノベーションの領域である。このような医薬の送達における主な障害の１つは、治療用タンパク質それ自体に対する免疫応答を含む。タンパク質系治療薬の投与は、免疫抑制剤（これは、より長寿のタンパク質を容易にし、したがって、生物の細胞及び組織へのタンパク質の取り込みの増加を容易にするために使用される）の投与によって達成されることが多い。しかしながら、一般的な免疫抑制剤は、行われる免疫抑制の非特異的性質のために不利であり、望ましくない副作用を患者にもたらし得る。したがって、このアプローチは、患者に投与される治療用タンパク質及びペプチド、例えば治療用抗体、サイトカイン、酵素又は任意の他のタンパク質に対する免疫応答を抑制するために適用され得る。
【００５７】
本明細書で使用される「アレルギー（allergy）」又は「アレルギー（allergies）」という用語は、免疫系の障害（又は不適切な反応）を指す。アレルギー反応は、アレルゲンとして公知の通常無害な環境物質に対して起こる；これらの反応は、後天的、予測可能及び迅速である。厳密に言えば、アレルギーは、過敏症の４つの形態の１つであり、Ｉ型（又は即時型）過敏症と称される。それは、ＩｇＥとして公知の抗体型による、肥満細胞及び好塩基球と称される特定の白血球の過剰な活性化を特徴とし、過度の炎症反応をもたらす。一般的なアレルギー反応としては、湿疹、蕁麻疹、枯草熱、喘息、食物アレルギー、並びに雀バチ及びミツバチなどの刺咬昆虫の毒に対する反応が挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用される「インターロイキン−３４ポリペプチド」又は「ＩＬ−３４ポリペプチド」という用語は当技術分野で周知であり、単球及びマクロファージの増殖、生存及び分化を促進するサイトカインを指す。この用語は、天然に存在するＩＬ−３４アイソフォーム（例えば、Ｑ８１にかかわらず、Ｑ６ＺＭＪ４及びＱ６ＺＭＪ４−２）、変異体（例えば、変異体ｒｓ８０４６４２４及びｒｓ７２０６５０９）及びそれらの改変形態を含む。天然に存在するヒトＩＬ−３４タンパク質は、アクセッションナンバーＱ６ＺＭＪ４でUniProtデータベースに提供されている２４２アミノ酸のアミノ酸配列を有し、以下のように示され（配列番号：１）、又は配列番号：１の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の配列を有するポリペプチドである：
【００５９】
【表１】
0006769948.tif 000002
【００６０】
本明細書で使用される「マクロファージコロニー刺激因子ポリペプチド」又は「Ｍ−ＣＳＦポリペプチド」（「コロニー刺激因子１ポリペプチド」については、ＣＳＦ−１としても公知である）という用語は、マクロファージの産生、分化及び機能をコントロールする任意のネイティブ又は変異体（ネイティブ又は合成にかかわらず）のサイトカインを指す。この用語は、天然に存在するＭ−ＣＳＦ変異体及びその改変型を含む。したがって、選択的ｍＲＮＡスプライシングによって産生される３つの異なる変異体Ｍ−ＣＳＦアイソフォームがそれぞれ記載されており、Ｍ−ＣＳＦ［アルファ］変異体は、アクセッションナンバーＵＰＩ００００Ｄ６１Ｆ８３でUniProt Uniparcデータベースに提供されている２５６アミノ酸のタンパク質を指し、Ｍ−ＣＳＦ［ベータ］変異体は、アクセッションナンバーＮＰ＿０００７４８．３でGenPeptデータベースに提供されている５５４アミノ酸のタンパク質を指し、アクセッションナンバーＮＭ＿０００７５７．５でGenBankデータベースに提供されている核酸配列によってコードされ、Ｍ−ＣＳＦ［ガンマ］変異体は、アクセッションナンバーＮＰ＿７５７３４９．１でGenPeptデータベースに提供されている４３８アミノ酸のタンパク質を指し、アクセッションナンバーＮＭ＿１７２２１０．２でGenBankデータベースに提供されている核酸配列によってコードされる。
【００６１】
一実施態様では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、アクセッションナンバーＵＰＩ００００Ｄ６１Ｆ８３でUniProt/Uniparcデータベースに提供されている２５６アミノ酸のヒトアイソフォームＭ−ＣＳＦ［アルファ］であり、以下のように示され（配列番号：４）、又は配列番号：４の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の配列を有するポリペプチドである：
【００６２】
【表２】
0006769948.tif 000003
【００６３】
一実施態様では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、アクセッションナンバーＮＰ＿０００７４８．３でGenBankデータベースに提供されている５５４アミノ酸のヒトアイソフォームＭ−ＣＳＦ［ベータ］であり、以下のように示され（配列番号：５）、又は配列番号：５の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の配列を有するポリペプチドである：
【００６４】
【表３】
0006769948.tif 000004
【００６５】
一実施態様では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、アクセッションナンバーＮＰ＿７５７３４９．１でGenBankデータベースに提供されている４３８アミノ酸のヒトアイソフォームＭ−ＣＳＦ［ガンマ］であり、以下のように示され（配列番号：６）、又は配列番号：６の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一の配列を有するポリペプチドである：
【００６６】
【表４】
0006769948.tif 000005
【００６７】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、天然又は合成で生産されるかにかかわらず、非特定の長さを有するペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。したがって、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質はポリペプチドの定義に含まれ、これら用語は、本明細書および特許請求の範囲を通して互換的に使用される。ポリペプチドという用語は、限定されないが、リン酸化、アセチル化、グリコシル化などを含む翻訳後修飾を除外するものではない。この用語はまた、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーだけではなく、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００６８】
「単離された」ポリペプチドは、ポリペプチドが生物内、例えば人体内に存在しないことを意図する。しかしながら、単離されたポリペプチドは、組成物又はキットの一部であり得る。単離されたポリペプチドは、好ましくは精製される。このようなポリペプチドは、夾雑細胞成分、例えば炭水化物、脂質、又は天然では該ポリペプチドに付随する他のタンパク質性不純物を本質的に含まない。典型的には、単離されたポリペプチドの調製物は、高度に精製された形態、すなわち少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、９５％超純粋、例えば９６％、９７％又は９８％又はそれ以上純粋、又は９９％超純粋なポリペプチドを含有する。特定のタンパク質調製物が単離されたポリペプチドを含有することを示す一例は、タンパク質調製物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びゲルのクーマシーブリリアントブルー染色後に、単一バンドが出現することである。
【００６９】
「ＩＬ−３４ポリペプチド」という用語は、本明細書では、天然に存在するヒトポリペプチドＩＬ−３４及び該ポリペプチドの天然に存在するアレル変異を含むと定義される。アレル変異は、種集団における天然に存在する塩基変化であり、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸変化をもたらしてもよいし、又はもたらさなくてもよい。加えて、本発明のＩＬ−３４ポリペプチドは、全長ＩＬ−３４及びその変異体を含むか又はこれらからなるポリペプチドだけではなく、それらのフラグメントが生物学的に活性である限り、該フラグメントからなるポリペプチドも包含する。加えて、ポリペプチド及びそのＤＮＡ配列中に人工的改変を含有し得るリコンビナント型及び合成型の両方のポリペプチドＩＬ−３４がこの定義に含まれる。したがって、ＩＬ−３４ポリペプチドという用語は、配列番号：１の配列によってコードされるＩＬ−３４ポリペプチドの機能的等価物を包含することを意図する。
【００７０】
「Ｍ−ＣＳＦポリペプチド」という用語は、本明細書では、天然に存在するヒトポリペプチドＭ−ＣＳＦ及び該ポリペプチドの天然に存在するアレル変異を含むと定義される。アレル変異は、種個体群における天然に存在する塩基変化であり、ポリペプチド又はタンパク質におけるアミノ酸変化をもたらしてもよいし、又はもたらさなくてもよい。加えて、本発明のＭ−ＣＳＦポリペプチドは、全長Ｍ−ＣＳＦ及びその変異体を含むか又はこれらからなるポリペプチドだけではなく、そのフラグメントが生物学的に活性である限り、該フラグメントからなるポリペプチドも包含する。加えて、ポリペプチド及びそのＤＮＡ配列において誘導性改変を含有し得るリコンビナント型及び合成型の両方のポリペプチドＭ−ＣＳＦがこの定義に含まれる。したがって、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドという用語は、配列番号：４、配列番号：５又は配列番号：６の配列によってコードされるＭ−ＣＳＦポリペプチドの機能的等価物を包含することを意図する。
【００７１】
本明細書で使用される「機能的等価物」は、親ポリペプチドの生物学的活性及び特異性を保持する分子（例えば、リコンビナントポリペプチド）を指す。したがって、「ＩＬ−３４ポリペプチドの機能的等価物」という用語は、該機能的等価物が、下記のように参照ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つ、好ましくは全てを示す限り、それが指すポリペプチド（すなわち、ＩＬ−３４ポリペプチド）の変異体及びフラグメントを含む。ＩＬ−３４ポリペプチドの機能的等価物は、以前に記載されている（４０）。「Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの機能的等価物」という用語は、該機能的等価物が、下記のように参照ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つ、好ましくは全てを示す限り、それが指すポリペプチド（すなわち、Ｍ−ＣＳＦポリペプチド）の変異体及びフラグメントを含む。
【００７２】
ポリペプチド「変異体」は、ネイティブ配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを指す。このような変異体としては、例えば、１つ以上のアミノ酸残基が、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端において付加又は欠失されているポリペプチドが挙げられる。通常、変異体は、ネイティブ配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するであろう。
【００７３】
本発明のクエリーアミノ酸配列と例えば少なくとも９５％「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象ポリペプチド配列が、クエリーアミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり最大５アミノ酸の変化を含み得ることを除いて、対象ポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であることを意図する。換言すれば、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列におけるアミノ酸残基の最大５％（１００個のうちの５個）が挿入され、欠失され、又は別のアミノ酸で置換され得る。
【００７４】
本出願の枠内では、同一性の割合は、グローバルアラインメントを使用して計算される（すなわち、２つの配列は、それらの全長にわたって比較される）。２つ以上の配列の同一性及び相同性を比較するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、全長を考慮して２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見出すためにNeedleman-Wunschグローバルアラインメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970 J. Mol. Biol. 48:443-453）を使用する「needle」プログラムが使用され得る。needleプログラムは、例えば、ebi.ac.ukワールドワイドウェブサイトにおいて入手可能である。本発明による同一性の割合は、好ましくは、「Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ」パラメータ＝１０．０、「Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄ」＝０．５及びBlosum62マトリックスのEMBOSS::needle（グローバル）プログラムを使用して計算される。
【００７５】
参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一の」アミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、参照配列と比較して欠失、挿入及び／又は置換などの突然変異を含み得る。参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、参照配列のアレル変異体に対応し得る。例えば、それは、参照配列と比較して置換のみを含み得る。置換は、好ましくは、以下の表に示されている保存的置換に対応する。
【００７６】
【表５】
0006769948.tif 000006
【００７７】
本明細書で使用されるポリペプチド「フラグメント」は、参照ポリペプチドよりも短い生物学的に活性なポリペプチドを指す（すなわち、ＩＬ−３４ポリペプチドのフラグメント又はＭ−ＣＳＦポリペプチドのフラグメント）。したがって、本発明のポリペプチドは、フラグメントが生物学的に活性である限り、ＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦのフラグメントを含むか又はこれからなるポリペプチドを包含する。
【００７８】
本発明の枠内では、生物学的に活性なフラグメントは、例えば、ＩＬ−３４ポリペプチドの少なくとも連続する１７５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０アミノ酸を含み得る。
【００７９】
本発明の枠内では、生物学的に活性なフラグメントは、例えば、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドの連続する少なくとも１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５又は５５０アミノ酸を含み得る。
【００８０】
特定の一実施態様では、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドは、ヒトＭ−ＣＳＦの１５０アミノ酸のポリペプチドを含むか又はこれからなり、以下のように示される（配列番号：７）：
【００８１】
【表６】
0006769948.tif 000007
【００８２】
ＩＬ−３４若しくはその機能的等価物又はＭ−ＣＳＦ若しくはその機能的等価物の「生物学的活性」は、
（ｉ）（実施例のセクションに記載されているように）免疫寛容を（ラットでは少なくとも１２０日間）誘導及び／又は維持する能力；すなわち、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害する能力；及び／又は
（ｉｉ）臓器同種移植モデル（心臓同種移植モデル）における移植拒絶を予防する能力
を意味する。
【００８３】
当業者であれば、ＩＬ−３４ポリペプチドの機能的等価物又はＭ−ＣＳＦポリペプチドの機能的等価物が生物学的に活性であるかを容易に決定し得る。新たに作製したポリペプチドが、ＭＬＲにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を阻害し、及び／又は臓器同種移植モデルにおける移植拒絶を予防するかを調べるために、各ポリペプチドについて、FACS分析又は単一細胞遺伝子発現プロファイリング（実施例のセクションを参照のこと）を実施し得る。また、新たに作製したポリペプチドが移植拒絶を予防するかを調べるために、臓器同種移植モデルを使用し得る（実施例のセクションを参照のこと）。加えて、（例えば、臓器同種移植モデルを使用することによって）in vitro又はin vivoで実施した経時変化及び用量反応は、各ポリペプチドの最適条件を決定するであろう。
【００８４】
一実施態様では、本発明のポリペプチドは、タグを含み得る。タグは、ポリペプチドの精製に有用であり得るエピトープ含有配列である。それは、免疫標識技術を使用して細胞又は組織サンプル内のポリペプチドを位置決定するために、イムノブロッティングなどによってポリペプチドを検出するために、親和性クロマトグラフィーなどの様々な技術によって付加される。当技術分野で一般に用いられるタグの例は、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）タグ、FLAG（商標）タグ、Strep-tag（商標）、Ｖ５タグ、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ（典型的には、６個のヒスチジン残基からなる）などである。
【００８５】
別の実施態様では、本発明のポリペプチドは、その安定性及び／又はそのバイオアベイラビリティを改善する化学的改変を含み得る。このような化学的改変は、in vivoにおける酵素分解からのポリペプチドの保護が強化され、及び／又は膜バリアを通過する能力が強化されたポリペプチドを得、それにより、ポリペプチドの半減期を増加させ、その生物学的活性を維持又は改善することを目的とする。当技術分野で公知の任意の化学的改変が、本発明にしたがって用いられ得る。このような化学的改変としては、限定されないが：
−改変及び／若しくは異常アミノ酸によるアミノ酸の置換（例えば、Ｎｌｅ、Ｎｖａ若しくはＯｒｎのような異常アミノ酸によるアミノ酸の置換）；並びに／又は
−ペプチドのＮ末端及び／若しくはＣ末端の改変（例えば、Ｎ末端のアシル化（好ましくは、アセチル化）若しくは脱アミノ化、又はＣ末端カルボキシル基のアミド若しくはアルコール基への改変）；
−２個のアミノ酸間のアミド結合の改変：２個のアミノ酸を連結するアミド結合の窒素原子若しくはアルファ炭素のアシル化（好ましくは、アセチル化）若しくはアルキル化（好ましくは、メチル化）；
−２個のアミノ酸を連結するアミド結合のアルファ炭素における改変（例えば、２個のアミノ酸を連結するアミド結合のアルファ炭素のアシル化（好ましくは、アセチル化）又はアルキル化（好ましくは、メチル化））；
−キラリティの変化（例えば、１個以上の天然に存在するアミノ酸（Ｌエナンチオマー）の対応するＤ−エナンチオマーによる置換）；
−（Ｃ末端からＮ末端への）アミノ酸鎖のインバージョンと共に、１個以上の天然に存在するアミノ酸（Ｌ−エナンチオマー）が対応するＤ−エナンチオマーで置換されているレトロインバージョン；
−１個以上のアルファ炭素が窒素原子で置換されているアザペプチド；並びに／又は
−１個以上のアミノ酸のアミノ基がα炭素ではなくβ炭素に結合しているベータペプチド
が挙げられる。
【００８６】
薬物のバイアビリティを改善するための別の戦略は、水溶性ポリマーの利用である。様々な水溶性ポリマーが、生体分布を変化させ、細胞取り込みモードを改善し、生理学的バリアの透過性を変化させ、身体からのクリアランス速度を改変することが示されている。ターゲティング又は持続放出効果を達成するために、末端基として、骨格の一部として、又はポリマー鎖におけるペンダント基として薬物部分を含有する水溶性ポリマーが合成されている。
【００８７】
高い生体適合性及び改変容易性を考慮して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が薬物担体として広く使用されている。様々な薬物、タンパク質及びリポソームへの結合が、滞留時間を改善し、毒性を低下させることが示されている。ＰＥＧは、鎖の末端におけるヒドロキシル基を通して、及び他の化学的方法を介して、活性剤にカップリングされ得る；しかしながら、ＰＥＧそれ自体は、１分子当たり多くとも２個の活性剤に限定される。異なるアプローチでは、ＰＥＧの生体適合性を保持するが、１分子当たりの結合点が多数である（より大きな薬物ローディングを提供する）というさらなる利点を有し、様々な用途に適切なように合成的に設計され得る新規生体材料として、ＰＥＧ及びアミノ酸のコポリマーが研究された。
【００８８】
当業者であれば、薬物の有効な改変のためのＰＥＧ化技術を認識している。例えば、ＰＥＧ及び三官能性モノマー（例えば、リジン）の交互ポリマーからなる薬物送達ポリマーが、VectraMed (Plainsboro, N.J.)によって使用されている。ＰＥＧ鎖（典型的には、２０００ダルトン以下）は、安定なウレタン結合を通してリジンのａ−及びｅ−アミノ基に連結される。このようなコポリマーは、ポリマー鎖に沿って厳密にコントロールされた所定の間隔で反応性ペンダント基（リジンのカルボン酸基）を提供すると同時に、ＰＥＧの望ましい特性を保持する。反応性ペンダント基は、誘導体化、架橋又は他の分子とのコンジュゲーションに使用され得る。これらポリマーは、ポリマーの分子量、ＰＥＧセグメントの分子量、及び薬物とポリマーとの間の切断可能な結合を変化させることによって、安定な長時間循環するプロドラッグを生産するのに有用である。ＰＥＧセグメントの分子量は、薬物／連結基複合体の間隔、及びコンジュゲートの１分子量当たりの薬物の量に影響を与える（ＰＥＧセグメントが小さいほど、提供される薬物ローディングが大きい）。一般に、ブロックコポリマーコンジュゲートの全分子量を増加させると、コンジュゲートの循環半減期が増加する。それにもかかわらず、コンジュゲートは、容易に分解可能でなければならず、又は限界糸球体ろ過量未満（例えば、６０kDa未満）の分子量を有しなければならない。
【００８９】
循環半減期及び生体分布の維持において重要なポリマー骨格に加えて、リンカーは、特定のトリガー、典型的には、ターゲット組織における酵素活性によって骨格ポリマーから放出されるまで治療剤をプロドラッグ形態に維持するために使用され得る。例えば、この種の組織活性化薬物送達は、生体分布の特定の部位への送達が必要であり、治療剤を病変部位又はその近くに放出する場合に特に有用である。活性化薬物送達に使用するための連結基ライブラリーは当業者に公知であり、酵素反応速度、活性酵素の保有率、及び選択された疾患特異的酵素の切断特異性に基づき得る。このようなリンカーは、処置用送達のために本明細書に記載するポリペプチドの改変において用いることができる。
【００９０】
さらに別の実施態様では、本発明のポリペプチドは、異種ポリペプチド（すなわち、無関係なタンパク質、例えば、免疫グロブリンタンパク質由来のポリペプチド）に融合され得る。
【００９１】
本明細書で使用される「融合された」及び「融合」という用語は、互換的に使用される。これら用語は、化学的コンジュゲーション又はリコンビナント手段を含むあらゆる手段によって、２つ以上の要素又は成分を互いに連結することを指す。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正確な翻訳リーディングフレームが維持されるように、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を連結して、連続するより長いＯＲＦを形成することを指す。例えば、リコンビナント融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメント（これらのセグメントは、通常、天然ではこのように連結されない）を含有する単一タンパク質であり得る。したがって、リーディングフレームは、融合セグメント全体を通して連続的であるが、該セグメントは、例えば、インフレームリンカー配列によって物理的又は空間的に分離され得る。
【００９２】
本明細書で使用される「ＩＬ−３４融合タンパク質」という用語は、異種ポリペプチドに融合されたＩＬ−３４ポリペプチド又はその機能的等価物を含むポリペプチドを指す。ＩＬ−３４融合タンパク質は、一般に、（上記）ＩＬ−３４ポリペプチドと共通の少なくとも１つの生物学的特性を共有するであろう。
【００９３】
ＩＬ−３４融合タンパク質の例は、ＩＬ−３４イムノアドヘシンである。
【００９４】
本明細書で使用される「Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質」という用語は、異種ポリペプチドに融合されたＭ−ＣＳＦポリペプチド又はその機能的等価物を含むポリペプチドを指す。Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質は、一般に、（上記）Ｍ−ＣＳＦポリペプチドと共通の少なくとも１つの生物学的特性を共有するであろう。
【００９５】
Ｍ−ＣＳＦ融合タンパク質の例は、Ｍ−ＣＳＦイムノアドヘシンである。
【００９６】
本明細書で使用される「イムノアドヘシン」という用語は、異種タンパク質（「アドへシン」）の結合特異性と、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを併せ持つ抗体様分子を意味する。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列（これは、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（すなわち、「異種」である））と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には、レセプター又はリガンドの結合部位を少なくとも含む連続するアミノ酸配列である。イムノアドヘシンにおける免疫グロブリン定常ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られ得る。
【００９７】
免疫グロブリン配列は、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメイン（Ｆｃ領域）であるが必須ではない。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の有用な化学的特性及び生物学的特性の多くを有し得る。イムノアドヘシンは、所望の特異性を有するヒトタンパク質配列であって、適切なヒト免疫グロブリンのヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結されたヒトタンパク質配列から構築され得るので、目的の結合特異性は、全体的にヒト成分を使用して達成され得る。このようなイムノアドヘシンは、患者に対する免疫原性が最低限であり、慢性使用又は反復使用に安全である。一実施態様では、Ｆｃ領域は、ネイティブ配列のＦｃ領域である。別の実施態様では、Ｆｃ領域は、変異体のＦｃ領域である。さらに別の実施態様では、Ｆｃ領域は、機能的Ｆｃ領域である。ＩＬ−３４イムノアドヘシンのＩＬ−３４配列部分及び免疫グロブリン配列部分は、最小リンカーによって連結され得る。免疫グロブリン配列は、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインであるが必須ではない。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ、しかし好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３から得られ得る。
【００９８】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブ配列のＦｃ領域及び変異体のＦｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端に及ぶと定義される。
【００９９】
ＩＬ−３４融合タンパク質又はＭ−ＣＳＦ融合タンパク質の別の例は、ＩＬ−３４ポリペプチド又はＭ−ＣＳＦポリペプチドと、Konterman et al. 2012 AlbudAb（商標）Technology Platform-Versatile Albumin Binding Domains for the Development of Therapeutics with Tunable Half-Livesに記載されているAlbudAb（商標）Technology Platformによるヒト血清アルブミン結合ドメイン抗体（AlbudAbs）との融合物である。
【０１００】
別の実施態様では、本発明のポリペプチドは、治療用タンパク質に適切な薬物送達システムと結合／製剤化され得る。
【０１０１】
使用され得る薬物送達システムの例としては、治療用タンパク質のターゲティング送達のための様々なマイクロキャリア及びナノキャリア、例えばミクロスフェア／マイクロ粒子、リポソーム、ナノ粒子、デンドリマー、ニオソーム及びカーボンナノチューブが挙げられる。特定の実施態様では、このような薬物送達システムは、細胞による薬物送達、特にJain et al., 2013 (42)に記載されている単球及び／又はマクロファージによる薬物送達に適切な薬物送達システムである。
【０１０２】
あるいは、本発明のポリペプチドは、赤血球又はエリスロサイトに封入され得る。欧州特許出願公開第１７７３４５２号に記載されている方法（これは、現在のところベストパフォーマンスを提供する方法であり、再現可能であり、有効成分の封入収率を改善するという利点を有する）を含め、赤血球への有効成分の取り込みを可能にするための様々な方法が記載されている。
【０１０３】
当業者には明らかであるように、本発明のポリペプチドは、任意の適切な手段によって生産され得る。本発明にしたがって使用するための十分な量のＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦポリペプチドを生産するために、本発明のポリペプチドを含有するリコンビナント宿主細胞を適切な条件下で培養することによって、発現が便利に達成され得る。好ましくは、ポリペプチドは、リコンビナント手段によって、コード核酸分子から発現させることによって生産される。様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現系は周知である。
【０１０４】
リコンビナント型で発現させる場合、ポリペプチドは、好ましくは、宿主細胞においてコード核酸から発現させることによって生産される。特定の系の個々の要件に応じて、任意の宿主細胞が使用され得る。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドを発現させるために当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞などが挙げられる。細菌もまた、容易に操作及び増殖させ得るので、リコンビナントタンパク質の生産のための好ましい宿主である。一般的な好ましい細菌宿主は、E. coliである。
【０１０５】
また、タンパク質系バイオ医薬品の大部分は、その治療用途に関連するタンパク質特性に大きな影響を与え得るいくつかの翻訳後修飾を有することに留意すべきである。タンパク質のグリコシル化は、最も一般的な修飾である（ヒトタンパク質の約５０％は、グリコシル化される）。グリコシル化は、組成物内のタンパク質上に様々なグリカン構造を作製することによって、タンパク質組成物に顕著な異種性を導入し得る。このようなグリカン構造は、糖タンパク質が小胞体（ＥＲ）及びゴルジ複合体を通過する際に、グリコシル化機構の多様な酵素の作用によって作られる（グリコシル化カスケード）。タンパク質のグリカン構造の性質は、タンパク質のフォールディング、安定性、寿命、輸送、薬力学、薬物動態及び免疫原性に対して影響を有する。グリカン構造は、タンパク質の主な機能活性に対して大きな影響を有する。グリコシル化は、局所タンパク質構造に影響を及ぼし得、ポリペプチド鎖のフォールディングを指令するのに役立ち得る。グリカン構造の１つの重要な種類は、いわゆるＮ−グリカンである。それらは、初期ポリペプチド鎖のコンセンサス配列ＮＸＳ／Ｔにおけるアスパラギン残基のアミノ（Ｎ）基とオリゴ糖との共有結合によって生成される。Ｎ−グリカンは、さらに、タンパク質の選別又はその最終ターゲットへの方向づけに関与し得る：抗体のＮ−グリカンは、例えば、補体成分と相互作用し得る。Ｎ−グリカンはまた、例えば、その可溶性を増強し、その表面上の疎水性パッチを遮蔽し、タンパク質分解から保護し、鎖内安定化相互作用を指令することによって、糖タンパク質を安定化させる機能を有する。グリコシル化は、例えば、ヒトにおいてタンパク質の半減期をレギュレーションし得、Ｎ−グリカンにおける末端シアル酸の存在は、血流中を循環するタンパク質の半減期を増加させ得る。
【０１０６】
本明細書で使用される「糖タンパク質」という用語は、それに付加された１つ以上のＮ−グリカンを有する任意のタンパク質を指す。したがって、この用語は、糖タンパク質として当技術分野で一般に認識されているタンパク質、及び１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位を含有するように遺伝子操作されているタンパク質の両方を指す。本明細書で使用される「Ｎ−グリカン」及び「グリコフォーム」という用語は互換的に使用され、Ｎ結合型オリゴ糖、例えばアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合によってポリペプチドのアスパラギン残基に付加されたものを指す。Ｎ結合型糖タンパク質は、タンパク質におけるアスパラギン残基のアミド窒素に連結されたＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質に見られる主要糖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｕＮＡｃ）及びシアル酸（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ））である。糖基のプロセシングは、ＥＲの内腔において翻訳と同時に生じ、Ｎ結合型糖タンパク質の場合にはゴルジ装置において翻訳後も継続する。
【０１０７】
このような系の利点を使用するが、グリコシル化に関する不利点を排除するために、いくつかの酵母、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が近年開発中である。タンパク質上に所定のヒト様グリカン構造を作製するために、いくつかの株が遺伝的に開発中である。酵母を遺伝子操作してヒト様Ｎ−グリカンを生産するための方法は、米国特許出願公開第２００４０２３００４２号、米国特許出願公開第２００５０２０８６１７号、米国特許出願公開第２００４０１７１８２６号、米国特許出願公開第２００５０２０８６１７号及び米国特許出願公開第２００６０２８６６３７号に記載されている方法と共に、米国特許第７，０２９，８７２号及び米国特許第７，４４９，３０８号に記載されている。これら方法は、酵母型Ｎ−グリカンの代わりにヒト様複合体又はハイブリッドＮ−グリカンを主に有する治療用糖タンパク質を産生し得るリコンビナント酵母を構築するために使用されている。以前に記載されているように、ヒト様グリコシル化は、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、フコース及び／又はＮ−アセチルノイラミン酸を含有する「複雑な」Ｎ−グリカン構造を主に特徴とする。したがって、いくつかの酵母株は、１つ以上のヒト様複合体又はヒト様ハイブリッドＮ−グリカン、例えばＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む糖タンパク質を産生するように遺伝子操作されている。
【０１０８】
あるいは、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号：１に示されているＩＬ−３４ポリペプチド、又は配列番号：４、５、６及び７に示されているＭ−ＣＳＦポリペプチド）をコードする核酸、又はこのような核酸を含むベクター、又はこのようなベクターを含む宿主細胞が使用され得る。
【０１０９】
したがって、本発明の別の態様は、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するのに使用するための、本明細書における上記配列番号：１若しくは配列番号：４、５、６及び７を含むアミノ酸配列をコードする核酸、又はこのような核酸を含むベクター、又はこのようなベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１１０】
本発明の別の態様は、それを必要とする患者における移植拒絶を予防又は軽減するのに使用するための、本明細書における上記配列番号：１若しくは配列番号：４、５、６及び７を含むアミノ酸配列をコードする核酸、又はこのような核酸を含むベクター、又はこのようなベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１１１】
本発明のさらに別の態様は、その患者における自己免疫疾患、同種免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するのに使用するための、本明細書における上記配列番号：１若しくは配列番号：４、５、６及び７を含むアミノ酸配列をコードする核酸、又はこのような核酸を含むベクター、又はこのようなベクターを含む宿主細胞に関する。
【０１１２】
本発明の核酸は、当技術分野でそれ自体が公知の任意の技術、例えば限定されないが、任意の化学的、生物学的、遺伝学的、又は酵素的技術を単独で又は組み合わせて生産され得る。
【０１１３】
その最も広義の意味において、「ベクター」は、核酸の細胞への移入を促進することができる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの非存在下で生じる分解の程度と比べて少ない分解で核酸を細胞に輸送する。一般に、本発明において有用なベクターとしては、限定されないが、プラスミド、ファージミド、ウイルス、目的の核酸配列の挿入又は組み込みによって操作されているウイルス又は細菌の起源由来の他のビヒクルが挙げられる。ウイルスベクターが好ましい種類のベクターであり、限定されないが、以下のウイルス：レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルス及びマウス肉腫ウイルス）；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ−４０タイプのウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルス）由来の核酸配列が挙げられる。命名されていないが、当技術分野で公知の他のベクターを容易に使用し得る。
【０１１４】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置換されている非細胞変性真核生物ウイルスをベースとする。非細胞変性ウイルスとしては、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、それに続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みが生活環に含まれるレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）が挙げられる。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療治験に承認されている。最も有用なものは、複製欠損性（すなわち、所望のタンパク質の合成を指令することができるが、感染粒子を製造することができない）レトロウイルスである。このような遺伝子改変レトロウイルス発現ベクターは、in vivoにおける高効率な遺伝子トランスダクションに一般的な有用性を有する。複製欠損性レトロウイルスを生産するための標準的なプロトコール（外因性遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドでパッケージング細胞株をトランスフェクションする工程、パッケージング細胞株によってリコンビナントレトロウイルスを生産する工程、組織培養培地からウイルス粒子を回収する工程、及びウイルス粒子をターゲット細胞に感染させる工程を含む）は、KRIEGLER (A Laboratory Manual,“ W.H. Freeman C.O., New York, 1990)及びMURRY (“Methods in Molecular Biology,” vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991)に提供されている。
【０１１５】
特定用途のための好ましいウイルスは、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスであり、これらは、遺伝子療法におけるヒトへの使用について既に認可されている二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損性となるように操作され得、広範囲の細胞型及び種に感染することができる。それはさらに、熱及び脂質溶媒に対する安定性；造血細胞を含む多様な系統の細胞における高いトランスダクション頻度；並びに、重感染阻害の欠如（したがって、複数回のトランスダクションが可能である）などの利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、ヒト細胞ＤＮＡに部位特異的に組み込まれ得るので、レトロウイルス感染に特徴的な挿入突然変異誘発の可能性及び挿入遺伝子発現の変動性が最小限になる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択的圧力の非存在下において、１００継代超にわたって組織培養液中で継続し、これは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外で機能し得る。
【０１１６】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは当技術分野で詳細に記載されており、当業者に周知である。例えば、SANBROOK et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。過去数年間、プラスミドベクターは、抗原をコードする遺伝子をin vivoで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全性の懸念がないので、これに特に有利である。しかしながら、宿主細胞と適合性のプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内の作動的にコードされる遺伝子からペプチドを発現し得る。いくつかの一般に使用されるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドも当業者に周知である。加えて、制限酵素及びライゲーション反応を使用してプラスミドを特注設計して、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去及び付加し得る。プラスミドは、様々な非経口、粘膜及び外用経路によって送達され得る。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、眼、皮内、皮下又は他の経路によって注入され得る。それはまた、鼻腔内スプレー又は液滴、直腸坐剤及び経口によって投与され得る。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面に投与され得る。プラスミドを水溶液に加え、金粒子上で乾燥させ、又は別のＤＮＡ送達システム（限定されないが、リポソーム、デンドリマー及びマイクロカプセル化を含む）と併用し得る。
【０１１７】
本発明によれば、使用され得る宿主細胞の例は、ヒト単球又はマクロファージ（特に、処置すべき被験体から得られるもの）である。
【０１１８】
遺伝子を運ぶベクターを細胞に導入し得る手段としては、限定されないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション若しくはＤＥＡＥ−デキストラン、リポフェクション、リン酸カルシウムを使用するトランスフェクション、又は当業者に公知の他の手段が挙げられる。
【０１１９】
医薬組成物：
本発明は、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び単離されたＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物に関する。
【０１２０】
本発明は、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び免疫抑制薬を含む医薬組成物に関する。
【０１２１】
本発明は、単離されたＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び免疫抑制薬を含む医薬組成物に関する。
【０１２２】
本発明はまた、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するのに使用するための、本明細書に定義されるポリペプチド（又は、それをコードする核酸、上記に定義される発現ベクター又は宿主細胞）及び免疫抑制薬を含む医薬組成物に関する。
【０１２３】
本発明はさらに、それを必要とする患者における移植拒絶を予防又は軽減するのに使用するための、本明細書に定義されるポリペプチド（又は、それをコードする核酸、上記に定義される発現ベクター又は宿主細胞）及び免疫抑制薬を含む医薬組成物に関する。
【０１２４】
本発明は、それを必要とする患者において使用するための、本明細書に定義されるポリペプチド（又は、それをコードする核酸、上記に定義される発現ベクター又は宿主細胞）及び免疫抑制薬を含む医薬組成物に関する。
【０１２５】
本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、ポリペプチドが、意図する目的を達成するのに有効な量で含まれる全ての組成物を含む。加えて、医薬組成物は、活性化合物を薬学的に使用され得る調製物に加工するのを容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な生理学的に許容し得る担体を含有し得る。
【０１２６】
「生理学的に許容し得る担体」という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性に干渉しない任意の担体であって、投与される宿主に対して毒性ではない任意の担体を包含することを意味する。適切な生理学的に許容し得る担体は当技術分野で周知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985)(これは、この分野の標準的な参考書である)に記載されている。例えば、非経口投与の場合、上記有効成分は、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル液などのビヒクル中で、注射用単位剤形に製剤化され得る。
【０１２７】
生理学的に許容し得る担体に加えて、本発明の医薬組成物は、少量の安定剤、賦形剤、緩衝剤及び保存剤などの添加剤を含み得る。本発明の医薬組成物は、免疫抑制薬をさらに含み得る。
【０１２８】
一実施態様では、免疫抑制薬は、細胞増殖抑制剤、例えば哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤及びラパマイシン（シロリムス）；アルキル化剤（シクロホスファミド）及び代謝拮抗剤（アザチオプリン、メルカプトプリン及びメトトレキサート）；治療用抗体（例えば、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体、抗ＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体、抗ＣＤ３モノクローナル抗体、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）及び抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ））；カルシニューリン阻害剤（シクロスポリン）；グルココルチコイド及びミコフェノール酸モフェチルからなる群より選択される。
【０１２９】
一実施態様では、免疫抑制薬は、ラパマイシン（シロリムス）である。
【０１３０】
本発明のポリペプチドは、意図する目的を達成する任意の手段によって投与され得る。例えば、投与は、限定されないが、皮下、静脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、脳内、くも膜下腔内、鼻腔内、経口、直腸内、経皮、頬側、局所、部分的、吸入又は皮下使用を含むいくつかの異なる経路によって達成され得る。非経口及び局所経路が特に好ましい。
【０１３１】
投与すべき投与量は、個体の要求、所望の効果、及び選択される投与経路に依存する。投与される投与量は、レシピエントの年齢、性別、健康及び体重、併用処置、もしあれば処置の頻度、並びに所望の効果の性質に依存すると理解されよう。各処置に必要な総用量は、複数回投与又は単回投与によって投与され得る。
【０１３２】
投与に使用される用量は、様々なパラメータに応じて、特に、使用される投与様式、関連病変、又は望ましい処置期間に応じて適合され得る。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なものよりも低レベルで化合物の投与を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは、当技術分野の技術の範囲内である。しかしながら、ポリペプチドの１日用量は、０．０１〜１，０００mg／成人/日の広範囲で変動し得る。好ましくは、組成物は、処置すべき被験体に対する投与量を対症的に調整するために、有効成分０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgを含有する。医薬は、典型的には、有効成分約０．０１mg〜約５００mg、好ましくは有効成分１mg〜約１００mgを含有する。薬物の有効量は、通常、０．０００２mg/kg体重〜約２０mg/kg体重/日、特に、約０．００１mg/kg体重〜１０mg/kg体重/日の投与量レベルで供給される。
【０１３３】
一実施態様では、免疫抑制薬は、（通常投与される用量と比較して）低用量で、それを必要とする患者に投与される。
【０１３４】
一実施態様では、免疫抑制薬は、準最適用量で、それを必要とする患者に投与される。
【０１３５】
特定の実施態様では、ラパマイシン（シロリムス）は、準最適用量で、それを必要とする患者に投与される。
【０１３６】
一態様では、本発明は、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するための方法であって、治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１３７】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するための方法であって、治療有効量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１３８】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するための方法であって、治療有効量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１３９】
一実施態様では、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するための方法であって、治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び治療有効量の免疫抑制剤を前記患者に投与する工程を含む方法。
【０１４０】
一実施態様では、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するための方法であって、治療有効量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び治療有効量の免疫抑制剤を前記患者に投与する工程を含む方法。
【０１４１】
一実施態様では、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するための方法であって、治療有効量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド、治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び治療有効量の免疫抑制剤を前記患者に投与する工程を含む方法。
【０１４２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者における移植拒絶を予防及び／又は軽減するための方法であって、移植と同時に及び／又は移植の後に、治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１４３】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者における移植拒絶を予防及び／又は軽減するための方法であって、移植と同時に及び／又は移植の後に、治療有効量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１４４】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者における移植拒絶を予防及び／又は軽減するための方法であって、移植と同時に及び／又は移植の後に、治療有効量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１４５】
一実施態様では、それを必要とする患者における移植拒絶を予防及び／又は軽減するための方法であって、移植と同時に及び／又は移植の後に、治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び治療有効量の免疫抑制剤を前記患者に投与する工程を含む方法。
【０１４６】
一実施態様では、それを必要とする患者における移植拒絶を予防及び／又は軽減するための方法であって、移植と同時に及び／又は移植の後に、治療有効量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び治療有効量の免疫抑制剤を前記患者に投与する工程を含む方法。
【０１４７】
一実施態様では、それを必要とする患者における移植拒絶を予防及び／又は軽減するための方法であって、移植と同時に及び／又は移植の後に、治療有効量のＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド、治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及び治療有効量の免疫抑制剤を前記患者に投与する工程を含む方法。
【０１４８】
本明細書で使用される「同時に」という用語は、移植と同じ日に、目的のポリペプチドをレシピエント患者に投与することを意味する。
【０１４９】
本明細書で使用される「後に」という用語は、移植の後に、例えば移植の２日後、３日後、４日後、５日後、６日後又は７日後に、目的のポリペプチドをレシピエント患者に投与することを意味する。
【０１５０】
さらなる態様では、本発明は、移植物の生存を改善するための方法であって、有効量のＩＬ−３４ポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチドを含む培養培地と共に、該移植物を（前）培養する工程を含む方法に関する。
【０１５１】
本明細書で使用される「培養培地」という用語は、哺乳動物細胞、組織又は臓器のex vivo培養に適切な液体培地を指す。
【０１５２】
本発明によって使用される培養培地は、物質、例えば塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質、例えばサイトカイン、成長因子及びホルモン（これらは全て、細胞、組織又は臓器の生存に必要である）の組み合わせを含む水性培地であり得る。
【０１５３】
例えば、本発明の培養培地は、必要な添加剤を補充した合成組織培養培地、例えばヒト用のRPMI (Roswell Park Memorial Institute medium)又はCMRL-1066 (Connaught Medical Research Laboratory)であり得る。
【０１５４】
好ましい実施態様では、本発明の培養培地は、動物由来物質を含まない。好ましい実施態様では、本発明の培養培地は、合成化合物、ヒト起源の化合物及び水から本質的になる。有利には、前記培養培地は、（「ＧＭＰ」条件下で）優れた製造プラクティスにしたがって、細胞を培養するために使用され得る。
【０１５５】
さらなる態様では、本発明は、移植患者（レシピエント）における移植物の生存を改善するための方法であって、治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１５６】
一実施態様では、ＩＬ−３４ポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチドは、移植の非常に早い段階で、患者に投与される。
【０１５７】
さらに別の態様では、本発明は、それを必要とする患者における自己免疫疾患、望ましくない又は抗治療用タンパク質免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するための方法であって、治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチドを前記患者に投与する工程を含む方法に関する。
【０１５８】
一実施態様では、それを必要とする患者における自己免疫疾患、同種免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するための方法であって、治療有効量のＩＬ−３４ポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び治療有効量の免疫抑制剤を前記患者に投与する工程を含む方法。
【０１５９】
「治療有効量」は、処置すべき疾患を予防、治療又は遅延することができるポリペプチドの濃度を達成するのに十分な量を意味する。当業者であれば、このような濃度をルーチンに決定し得る。実際に投与されるポリペプチドの量は、典型的には、処置すべき症状、選択される投与経路、投与される実際の化合物、患者の年齢、体重及び応答、被験体の症候の重症度などを含む関連状況を考慮して、医師又は獣医師によって決定されるであろう。また、当業者であれば、投与量は、投与されるポリペプチドの安定性に依存し得ることを理解するであろう。
【０１６０】
一実施態様では、ＩＬ−３４ポリペプチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチによる処置は、複数サイクルで施行される（すなわち、ＩＬ−３４ポリペプチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチの投与は、少なくとも１回繰り返される）。
【０１６１】
例えば、特定の患者の状態及び応答に応じて、２〜１０サイクル又はそれ以上を施行し得る。間隔（すなわち、その後の２サイクルの開始時点間の期間）は、典型的には数日間である。
【０１６２】
キットオブパーツ組成物：
ＩＬ−３４ポリペプチド及びＭ−ＣＳＦポリペプチドは、１つの製剤中で混合され、同時に投与され得る。したがって、本発明は、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチド及びＭ−ＣＳＦポリペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを含むキットオブパーツ組成物に関する。
【０１６３】
ＩＬ−３４ポリペプチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチド及び免疫抑制薬（immunusuppressive drug）は、１つの製剤中で混合され、同時に投与され得る。しかしながら、それらはまた、別個の組成物を使用して、別個に投与され得る。それらは異なる時点に投与され得ることにさらに留意する。
【０１６４】
したがって、本発明は、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び免疫抑制薬を含むキットオブパーツ組成物に関する。
【０１６５】
本発明はまた、それを必要とする患者における免疫寛容を誘導及び／又は維持するのに使用するためのキットオブパーツ組成物であって、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び免疫抑制薬を含むキットオブパーツ組成物に関する。
【０１６６】
本発明はまた、それを必要とする患者における移植拒絶を予防又は軽減するのに使用するためのキットオブパーツ組成物であって、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び免疫抑制薬を含むキットオブパーツ組成物に関する。
【０１６７】
本発明はさらに、それを必要とする患者における自己免疫疾患、同種免疫応答及びアレルギーを予防又は治療するのに使用するためのキットオブパーツ組成物であって、単離されたＩＬ−３４ポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び／又はＭ−ＣＳＦポリペプチド若しくはそれをコードするポリヌクレオチド及び免疫抑制薬を含むキットオブパーツ組成物に関する。
【０１６８】
本明細書で使用される「キット」、「製品」又は「複合製剤」という用語は、上記に定義される組み合わせパートナーが独立して、又は区別される量の組み合わせパートナーと共に異なる一定の組み合わせの使用によって（すなわち、同時に又は異なる時点で）投与され得るという意味において、特に「キットオブパーツ」を定義する。次いで、キットオブパーツのパーツは、同時に又は時間的にずらして（すなわち、キットオブパーツの任意のパーツについて、異なる時点において、等しい又は異なる時間間隔で）投与され得る。複合調製物で投与される組み合わせパートナーの総量の比は、変動し得る。組み合わせパートナーは、同じ経路で又は異なる経路で投与され得る。投与が逐次である場合、第１のパートナーは、例えば、第２のパートナーの１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前に投与され得る。
【０１６９】
本発明の予後診断方法：
さらなる態様では、本発明は、患者が移植拒絶、自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答又はアレルギーのリスクがあるかを決定するためのin vitro方法であって、前記患者から得られた生物学的サンプルにおけるＩＬ−３４の発現レベルを決定する工程を含み、ＩＬ−３４の存在が、移植拒絶、自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答又はアレルギーのリスクの減少を示すin vitro方法に関する。
【０１７０】
さらなる態様では、本発明は、患者が移植拒絶、自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答又はアレルギーのリスクがあるかを決定するためのin vitro方法であって、前記患者から得られた生物学的サンプルにおけるＭ−ＣＳＦの発現レベルを決定する工程を含み、Ｍ−ＣＳＦの存在が、移植拒絶、自己免疫疾患、治療用タンパク質に対する望ましくない免疫応答又はアレルギーのリスクの減少を示すin vitro方法に関する。
【０１７１】
本明細書で使用される「リスク」という用語は、移植拒絶の発症などのイベントが特定期間に起こる確率を指し、被験体の「絶対」リスク又は「相対」リスクを意味し得る。絶対リスクは、関連時間コホートの実際の測定後観察に関して、又は関連時間追跡した統計的に妥当な歴史コホートから開発された指標値に関して測定され得る。相対リスクは、低リスクコホートの絶対リスク又は平均集団リスク（これは、臨床的リスク因子の評価方法によって変動し得る）のいずれかと比較した、患者の絶対リスクの比を指す。オッズ比（所定の試験結果に関する陽性イベントと陰性イベントとの割合）もまた、無変換に対して一般に使用される（オッズは、式ｐ／（１−ｐ）（式中、ｐはイベントの確率であり、（１−ｐ）はイベントなしの確率である）に従う）。
【０１７２】
本発明との関連では、「リスクの決定」は、イベントが起こり得る確率、オッズ又は可能性を予測することを包含する。リスクの決定はまた、以前に測定された集団に関して絶対的又は相対的な将来の臨床パラメータ、伝統的な実験室リスク因子の値、例えば年齢、性別ミスマッチ、ＨＬＡ試験などの予測を含み得る。本発明の方法は、移植拒絶のリスクのカテゴリー測定を行って、移植拒絶のリスクがあると定義された移植患者のカテゴリーのリスクスペクトルを定義するために使用され得る。
【０１７３】
さらに別の態様では、本発明は、移植患者（レシピエント）が寛容であるかを決定するためのin vitro方法であって、前記移植患者から得られた生物学的サンプルにおけるＩＬ−３４の発現レベルを決定する工程を含み、ＩＬ−３４の存在が寛容を示すin vitro方法に関する。
【０１７４】
さらに別の態様では、本発明は、移植患者（レシピエント）が寛容であるかを決定するためのin vitro方法であって、前記移植患者から得られた生物学的サンプルにおけるＭ−ＣＳＦの発現レベルを決定する工程を含み、Ｍ−ＣＳＦの存在が寛容を示すin vitro方法に関する。
【０１７５】
本明細書で使用される「決定する」という用語は、コントロール又は所定値の参照にかかわらず、定性的及び／又は定量的な検出（すなわち、発現レベルの検出及び／又は測定）を含む。本明細書で使用される「検出する」は、ＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦが生物学的サンプル中に存在するか否かを決定することを意味し、「測定する」は、生物学的サンプルにおけるＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦの量を決定することを意味する。典型的には、発現レベルは、例えば、生体サンプルに対して実施されるＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイによって決定され得る。
【０１７６】
本明細書で使用される「生物学的サンプル」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、in vitro評価の目的のために患者から得られ得る任意のサンプルを指す。好ましい生物学的サンプルは、血液サンプル（例えば、全血サンプル、血清サンプル又は血漿サンプル）である。
【０１７７】
本発明のバイオマーカーの発現レベルを決定するための方法：
ＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦの発現レベルの決定は、様々な技術によって実施され得る。一般に、決定される発現レベルは、相対的発現レベルである。
【０１７８】
例えば、ＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦの発現レベルの決定は、生物学的サンプルを選択的試薬（例えば、抗体）と接触させ、それにより、前記生物学的サンプル中に元々含まれる目的のポリペプチドの存在を検出し、又はその量を測定する工程を含み得る。接触は、任意の適切なデバイス、例えばプレート、マイクロタイターディッシュ、試験管、ウェル、グラス、カラムなどの中で実施され得る。
【０１７９】
一実施態様では、接触は、試薬でコーティングされた基材上で実施される。基材は、固体又は半固体の基材、例えばガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどを含む任意の適切な支持体であり得る。基材は、様々な形態及びサイズのもの、例えばスライド、膜、ビーズ、カラム、ゲルなどであり得る。接触は、試薬と生物学的サンプルのポリペプチドとの間で、検出可能な複合体（例えば、抗体−抗原複合体）が形成されるのに適切な任意の条件下で行われ得る。
【０１８０】
ＩＬ−３４ポリペプチド又はＭ−ＣＳＦポリペプチドの存在は、イムノアッセイ、例えば競合、直接反応又はサンドイッチ型アッセイを含む標準的な電気泳動及び免疫診断技術を使用して検出され得る。このようなアッセイとしては、限定されないが、ウエスタンブロット；凝集試験；酵素標識媒介性イムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降などが挙げられる。反応は、一般に、標識、例えば蛍光、化学発光、放射性、酵素標識若しくは色素分子を明らかにすること、又は抗原と、それと反応した抗体との間の複合体の形成を検出するための他の方法を含む。シグナルを一般に（直接的又は間接的に）提供する標識は、当技術分野で公知である。
【０１８１】
抗体又はアプタマーに関して本明細書で使用される「標識された」という用語は、検出可能な物質、例えば放射性薬剤又はフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）又はフィコエリスリン（ＰＥ）又はインドシアニン（Ｃｙ５））を抗体又はアプタマーにカップリング（すなわち、物理的に連結）することによって、抗体又はアプタマーを直接的に標識すること、並びに検出可能な物質との反応性によって、抗体又はアプタマーを間接的に標識すること（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）を包含することを意図する。抗体又はアプタマーはまた、当技術分野で公知の任意の方法によって、放射性分子で標識され得る。例えば、放射性分子としては、限定されないが、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６及びＲｅ１８８が挙げられる。上記アッセイは、一般に、抗原−抗体複合体が結合している固相支持体から、液相中の未結合タンパク質を分離することを含む。本発明の実施に使用され得る固体支持体としては、基材、例えばニトロセルロース（例えば、膜又はマイクロタイターウェルの形態）；ポリ塩化ビニル（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性ビーズなどが挙げられる。
【０１８２】
より具体的には、試験すべきタンパク質に対する抗体でマイクロタイタープレートのウェルをコーティングするＥＬＩＳＡ法を使用し得る。次いで、バイオマーカーを含有するか又は含有すると疑われる生物学的サンプルを、コーティングウェルに追加する。抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分なインキュベーション期間の後、プレートを洗浄して未結合の部分を除去し、検出可能に標識した二次結合分子を追加し得る。二次結合分子を任意の捕捉サンプルマーカータンパク質と反応させ、プレートを洗浄し、当技術分野で周知の方法を使用して、二次結合分子の存在を検出する。
【０１８３】
選択的試薬は一般に抗体であり、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る。ＩＬ−３４に対するポリクローナル抗体は当業者に周知であり、例えば、Abnovaが市販している抗体PAB16574がある。
【０１８４】
ＩＬ−３４に対するモノクローナル抗体も周知であり、例えば、Abnovaが市販しているモノクローナル抗体MAB10698がある。
【０１８５】
加えて、ＩＬ−３４  ＥＬＩＳＡキットも周知であり、例えば、Abnova(KA2217 Kit)又はR&D Systems (Human IL-34 Quantikine ELISA)が市販しているものがある。
【０１８６】
選択的試薬は一般に抗体であり、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る。Ｍ−ＣＳＦに対するポリクローナル抗体は当業者に周知であり、例えば、Abcamが市販している抗体(ab9693)がある。
【０１８７】
Ｍ−ＣＳＦに対するモノクローナル抗体も周知であり、例えば、MyBioSourceが市販しているモノクローナル抗体(MBS690427)がある。
【０１８８】
加えて、Ｍ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡキットも周知であり、例えば、R&D Systemsが市販しているもの（Human M-CSF Quantikine ELISA）がある。
【０１８９】
特定の実施態様では、ＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦの発現レベルは、前記生物学的サンプルにおけるＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦの濃度を測定することによって決定される。
【０１９０】
したがって、本発明の方法は、血液サンプルを、前記血液サンプルにおけるＩＬ−３４ポリペプチド又はＭ−ＣＳＦポリペプチドと選択的に相互作用することができる結合パートナーと接触させる工程を含む。
【０１９１】
結合パートナーは一般に抗体であり得、ポリクローナル又はモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る。ＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦに対するポリクローナル抗体は、公知の方法にしたがって、適切な抗原又はエピトープを、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ及びマウスなどから選択される宿主動物に投与することによって生じさせ得る。当技術分野で公知の様々なアジュバントを使用して、抗体産生を増強し得る。
【０１９２】
本発明のモノクローナル抗体は、培養液中の継代細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用して調製及び単離され得る。産生及び単離の技術としては、限定されないが、Kohler and Milstein (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Cote et al., 1983）；及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., 1985）が挙げられる。あるいは、単鎖抗体の生産について記載されている技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）を改良して、単鎖抗体を生産し得る。本発明を実施するのに有用な抗体としては、限定されないが、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（これは、インタクトな抗体分子のペプシン消化によって生成され得る）及びＦａｂフラグメント（これは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る）を含むフラグメントも挙げられる。あるいは、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を有するフラグメントの迅速な同定を可能にし得る。例えば、抗体のファージディスプレイを使用し得る。このような方法では、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）又はＦａｂフラグメントは、適切なバクテリオファージ（例えば、Ｍ１３）の表面上に発現される。簡潔に言えば、タンパク質で免疫した適切な宿主（例えば、マウス）の脾臓細胞を取り出す。タンパク質に対する所望の抗体を産生している細胞から、ＶＬ及びＶＨ鎖のコード領域を得る。次いで、これらのコード領域をファージ配列の末端に融合する。ファージを適切なキャリア（例えば、細菌）に挿入したら、ファージは、抗体フラグメントをディスプレイする。抗体のファージディスプレイもまた、当業者に公知のコンビナトリアル法によって提供され得る。次いで、ファージによってディスプレイされた抗体フラグメントをイムノアッセイの一部として使用し得る。
【０１９３】
別の実施態様では、結合パートナーは、アプタマーであり得る。アプタマーは、分子認識に関して、抗体の代替物に相当する分子クラスである。アプタマーは、高い親和性及び特異性で、実質的に任意のクラスのターゲット分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、Tuerk C. and Gold L., 1990に記載されているように、ランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）によって単離され得る。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成により入手可能である。このライブラリーでは、各メンバーは、最終的には化学的に改変される固有配列の線形オリゴマーである。このクラスの分子の可能な改変、使用及び利点は、Jayasena S.D., 1999に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド方法（Colas et al., 1996）によってコンビナトリアルライブラリーから選択されるプラットフォームタンパク質（例えば、E. coliチオレドキシンＡ）によってディスプレイされるコンフォメーション的に制約された抗体可変領域からなる。
【０１９４】
他の実施態様では、ＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦの濃度の測定はまた、タンパク質の分離；タンパク質の分子量に基づく遠心分離；質量及び電荷に基づく電気泳動；疎水性に基づくＨＰＬＣ；サイズに基づくサイズ排除クロマトグラフィー；並びに、使用される特定の固相に対するタンパク質の親和性に基づく固相親和性を含み得る。分離されると、ＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦは、そのタンパク質の公知の「分離プロファイル」（例えば、保持時間）に基づいて同定され、標準的な技術を使用して測定され得る。あるいは、分離されたタンパク質は、例えば、質量分析計よって検出及び測定され得る。
【０１９５】
免疫抑制処置を調整するための方法：
本発明はさらに、個別処置計画を開発するための方法を提供する。上記方法によって得られた情報を使用して、移植レシピエントのための個別処置計画を開発し得る。
【０１９６】
したがって、さらなる態様では、本発明は、それを必要とする患者に施行された免疫抑制処置を調整するための方法であって、以下の工程（ｉ）本発明のリスク決定方法を実施すること、及び（ｉｉ）免疫抑制処置を調整することを含む方法に関する。
【０１９７】
前記方法は、例えば、上記リスク決定方法のいずれかを使用し、得られた結果を考慮して、移植レシピエントのための処置計画を設計することによって行われ得る。ＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦが、目的の患者から得られた生物学的サンプル中に存在しない場合、これは、前記患者が、望ましくない臨床転帰（例えば、移植片拒絶）のリスクがあることを示す。したがって、前記患者は、有効量の免疫抑制処置による（例えば、抗拒絶剤による）処置の候補である。反対に、生物学的サンプル中のＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦの存在は、移植拒絶のリスクの減少を示す。また、ＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦの発現レベル（すなわち、分析した生物学的サンプル中の低レベル又は高レベルのＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦ）に応じて、患者は、標準レジメンよりも積極的若しくは消極的な処置方法を要求し得るか、又は患者が標準レジメンに最適であると決定され得る。例えば、高レベルのＩＬ−３４又はＭ−ＣＳＦを有する患者は、免疫抑制処置及び関連副作用を回避し得る（又は、消極的なレジメンを要求し得る）。
【０１９８】
以下の図面及び実施例によって、本発明をさらに説明する。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定すると決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１９９】
【図１】ＣＤ４０Ｉｇによる処理後の移植片及び脾臓ＣＤ８＋ＴｒｅｇにおけるＩＬ−３４発現の増加。Ａ．ナイーブ又は１２０日齢ＡｄＣＤ４０Ｉｇ処理レシピエント（ｎ＝６）の脾臓由来のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  ＴｒｅｇをFACS Ariaで分取し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現について分析した。移植後５日目（ｎ＝３）及び１２０日目（ｎ＝７）のＡｄＣＤ４０Ｉｇ処理レシピエント由来の心臓移植片（Ｂ）及び脾臓（Ｃ）を、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現について、５日目（ｎ＝８）、７日目（ｎ＝８）及び１２０日目（ｎ＝６）の未処理レシピエント由来の移植片並びにナイーブ動物（ｎ＝７）由来のネイティブな心臓と比較した。（Ｄ）ＣＤ４０Ｉｇ処理ラットの脾臓からＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを分取し、ＰＭＡイオノマイシン（２４μg/mL）で７時間刺激した後、ＩＬ−３４（黒色）の発現について分析した。灰色のヒストグラムは、アイソタイプコントロールの染色を表す。マンホイットニー、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図２】Ｍ−ＣＳＦではなくＩＬ−３４及びＣＤ１１５が、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇ媒介性抑制に関与していた。１：１のエフェクター：サプレッサー比、ＬＥＷ．１Ａ  ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ  Ｔｒｅｇの存在下で６日間培養した後、ドナー  ＬＥＷ．１Ｗ  ｐＤＣで刺激したＣＦＳＥ標識ＬＥＷ．１Ａ分裂ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の相対的割合を分析した。抗ＩＬ−３４−遮断Ａｂ（Ａ）、抗Ｍ−ＣＳＦ遮断Ａｂ（Ｂ）又は抗ＣＤ１１５遮断Ａｂ（Ｃ）の添加後の増殖を評価し、アイソタイプコントロール（ｎ＝４、３回反復）と比較した。結果は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの非存在下における増殖（１００％）と対比して、正規化した増殖率の平均±ＳＥＭとして表される。＊、ｐ＜０．０１。
【図３】ＡＡＶ−ＩＬ−３４を使用したＩＬ−３４の検出、及び同種Ｔ細胞応答の阻害。Ａ．ＡＡＶ−ＩＬ−３４又はＡＡＶ−ＧＦＰトランスダクション細胞の上清を、同種ｐＤＣに応じたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖の抑制について試験し、５日間培養した後、フローサイトメトリーによって、ＣＦＳＥ希釈について分析した。ＣＤ８＋Ｔｒｅｇを、抑制のポジティブコントロールとして使用した。ｎ＝３（３回反復）；結果は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの非存在下における増殖（１００％）と対比して、正規化した増殖率の平均±ＳＥＭとして表される。１回の実験の代表的なヒストグラム；２０％ＡＡＶＧＦＰトランスダクション細胞の上清（灰色）、２０％ＡＡＶ−ＩＬ−３４トランスダクション細胞の上清（黒色の直線）の場合の、ｐＤＣと共に共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖。Ｂ．ＡＡＶ−ＩＬ−３４若しくはＡＡＶ−ＧＦＰ処理ラット又はナイーブ動物由来の血清の連続希釈物を、同種ｐＤＣに応じたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖の抑制について試験し、５日間培養した後、フローサイトメトリーによって、ＣＦＳＥ希釈について分析した。ＣＤ８＋Ｔｒｅｇを、抑制のポジティブコントロールとして使用した。ｎ＝３（２回反復）；結果は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの非存在下における増殖（１００％）と対比して、正規化した増殖率の平均±ＳＥＭとして表される。ナイーブ動物由来の血清に対して、＊、ｐ＜０．０１；＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図４】ＩＬ−３４遺伝子導入は、同種移植片生存を優勢的に延長する。１０１２ｖｇ／ラットのＡＡＶ−ＩＬ−３４若しくは非コードＡＡＶを静脈内投与、又は未処置のレシピエントに、その３０日後、さらに処理せず、又は準最適用量のラパマイシンを組み合わせて移植した（１４日間、開始日を０日目として）。腹壁を通して触診によって、移植片生存を評価した。＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図５】ＩＬ−３４誘導後にＴｒｅｇによって媒介される連続寛容。Ａ．−１日目に、ＬＥＷ．１Ａレシピエントに亜致死的に放射線照射し（４．５Gy）、心臓同種移植片を移植し、０日目に、長期生存レシピエント又はナイーブ動物由来の１，５．１０８個の脾細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。腹部触診によって、移植片生存をモニタリングした。Ｂ．−１日目に、ＬＥＷ．１Ａレシピエントに亜致死的に放射線照射し（４．５Gy）、心臓同種移植片を移植し、０日目に、長期生存レシピエント由来の全脾細胞又は精製亜種（Ｔ細胞：４．１０７個；Ｂ細胞：６．１０７個、ＣＤ１１ｂ／ｃ＋細胞：１，５．１０７個；ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ：４×１０６個；ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴｒｅｇ：４×１０６個）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。腹部触診によって、移植片生存をモニタリングした。ログランク検定、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図６】抗ドナーエフェクターＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞応答のＭ−ＣＳＦ媒介性用量依存的抑制。（Ａ）ナイーブ又は１２０日齢ＡｄＣＤ４０Ｉｇ処理レシピエント（ｎ＝６）の脾臓由来のＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇをFACS Ariaで分取し、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、Ｍ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ発現について分析した。＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）６日間培養した後、ラットＭ−ＣＳＦ（最終濃度０．１〜２／ml）を、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖に対する抑制活性について試験した。ＣＤ８＋Ｔｒｅｇを、抑制のポジティブコントロールとして使用した。ｎ＝３（３回反復）；結果は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの非存在下における増殖（１００％）と対比して、正規化した増殖率の平均±ＳＥＭとして表される。＊、ｐ＜０．０１。
【図７】ＩＬ３４処理後のマクロファージにおける転写産物の蓄積。移植後１５日目のレシピエントの未処理脾臓又はＡＡＶ−ＩＬ３４処理脾臓、血液及び移植片由来の分取したマクロファージに対するリアルタイム定量的ＰＣＲによって、ｍＲＮＡ発現を評価した。結果は、ＨＰＲＴに対して正規化し、２−ｄｄＣＴ＋／−ＳＥＭとして表される。クラスカルワリス及びダンの事後検定、＊、ｐ＜０．０１。
【図８】マクロファージの枯渇は、ＩＬ３４処理後の同種移植片拒絶をもたらした。−３０日目に１０１２ｖｇ／ラットのＡＡＶ−ＩＬ３４若しくは非コードＡＡＶをレシピエントに静脈内投与し又は処理せず、−２５日目〜３日目にクロドロネートリポソームを週１回腹腔内投与し又は投与せず、０日目に準最適用量のラパマイシンと組み合わせて移植した（１０日間、開始日を０日目として）。腹壁を通して触診によって、移植片生存を評価した。ログランク検定、＊＊ｐ＜０．０１。
【図９】ＩＬ３４は、ヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔｒｅｇの抑制活性に関与し、抗ドナー免疫応答を抑制し得る。（Ａ）可溶性ＩＬ３４を、同種Ｔ枯渇ＰＢＭＣに応じたＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖の抑制について試験し、５日間培養した後、フローサイトメトリーによって、ＣＦＳＥ希釈について分析した。ｎ＝２〜５（２回反復）；結果は、分裂ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の相対的割合の平均±ＳＥＭとして表される。（Ｂ）１：１のエフェクター：サプレッサー比、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ又はＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴｒｅｇの存在下で５日間培養した後、同種Ｔ枯渇ＰＢＭＣで刺激したＣＦＳＥ標識分裂ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の相対的割合を分析した。抗ＩＬ−３４−遮断Ａｂの追加後の増殖を評価し、アイソタイプコントロール（ｎ＝５〜６、３回反復）と比較した。同種Ｔ枯渇ＰＢＭＣによるコントロール増殖条件下のＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の割合は、５日目の細胞の約６０％に相当するに過ぎず、各実験で１００の値とした。結果は、分裂ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の相対的割合の平均±ＳＥＭとして表される。
【実施例】
【０２００】
実施例１：移植寛容の新たなＴｒｅｇ特異的サイトカインメディエーターのインターロイキン−３４
材料及び方法
健常志願者の血液採取及びＰＢＭＣの分離：Etablissement Francais du Sang (Nantes, France)において、インフォームドコンセントを得た後に、健常ドナーから血液を採取した。血液をＰＢＳで２倍希釈してから、Ficoll-Paque density-gradient centrifugation (Eurobio)によって、ＰＢＭＣを制動せずに２０００rpm、室温で３０分間単離した。収集したＰＢＭＣを、ＰＢＳ ５０mLによって１８００rpmで１０分間洗浄した。
【０２０１】
動物及び心臓移植モデル：以前に記載されているように（１５）、全ＭＨＣ不適合雄性ＬＥＷ−１Ｗ（ドナー）とＬＥＷ−１Ａ（レシピエント）ラットとの間で、心臓同種移植を実施した。腹壁を通して触診によって、心臓の生存を評価し、心拍を＋＋＋から−に格付けした。実験は、動物実験の地域倫理委員会によって承認された。
【０２０２】
ＩＬ−３４の定量的ＲＴ−ＰＣＲ：ｍＲＮＡの単離及び逆転写、並びにＨＰＲＴ値に対する正規化後のTaqman技術を使用した特定のｍＲＮＡレベルの定量が記載されている（１５）。プローブ配列は、フォワードプライマーについては５’ＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＣＴＡＣＣＣＴＧＡ３’（配列番号：２）であり、リバースプライマーについては５’ＴＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＧＡＴＡＴＧＧＣＡＡ３’（配列番号：３）であった。
【０２０３】
細胞分取、モノクローナル抗体及びフローサイトメトリー：ＴＣＲαβ（Ｒ７／３）及びＴＣＲγδ（Ｖ６５）陰性細胞、ＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ（ＯＸ３３）及びＣＤ１１ｂ／ｃ−ＡＰＣ（ＯＸ４２）陽性細胞について、マクロファージを分取した。以前に記載されているように（１６）、ナイーブＬＥＷ．１Ａ  ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞、ＬＥＷ．１Ｗ  ｐＤＣ及びＬＥＷ．１Ａ  ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇのサブセットを分取した。Ｔ細胞（ＴＣＲαβ、クローンＲ７／３）、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（クローンＯＸ３５及びＯＸ３９）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（クローンＯＸ８）、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ細胞（クローンＯＸ８及びＯＸ２２）及びＣＤ４＋ＣＤ４５Ｒ＋８５Ｃ７＋ｐＤＣ（クローンＨｉｓ２４、ＯＸ３５及び８５Ｃ７）の分取に使用した抗体は、European Collection of Cell Culture (Salisbury, UK)から入手した。ストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ７（BD Biosciences）又はストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ４０５を使用して、全てのビオチン標識ｍＡｂを可視化した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞（クローンＳＫＹ７、Ｌ−２００及びＭＡ２５１）をゲーティングすることによって、ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を分取し、ＣＤ２５ｈｉｇｈ及びＣＤ１２７ｌｏｗ細胞（クローンＨＩＬ７−Ｒ  Ｍ２１）をゲーティングすることによって、ＣＤ４＋Ｔｒｅｇを分取し、ＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ４５ＲＣｌｏｗ細胞（クローンＭＴ２）をゲーティングすることによって、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇを分取した。抗ｍｙｃ抗体（9E10, Sigma）を使用して、ＩＬ−３４−Ｍｙｃを検出した。抗ＩＬ−３４（PAB16574, Abnova）、抗ＣＤ１１５（MCA1898, Serotec）及び抗Ｍ−ＣＳＦ（AB-416-NA, R and D system）抗体で、ＩＬ−３４、ＣＤ１１５及びＭＣＳＦをブロッキングした。ＭＨＣ−ＩＩ（ＯＸ６）、ＣＤ１１ｂ及びＣＤ４５ＲＡ＋Ｂ細胞（ＯＸ３３）に対する抗体を分析して、細胞の表現型を特性評価した。ＣＤ３−ＰｅＣｙ７（SKY7）、ＣＤ４−ＰｅｒｃＰＣｙ５．５（L200）、ＣＤ２５−ＡＰＣＣｙ７（M-A251）、ＣＤ１２７−ＰＥ（HIL7-R M21, BD Bioscience）、ＣＤ４５ＲＣ−ＦＩＴＣ（MT2, IQ Product）、Ｆｏｘｐ３−ＡＰＣ（236A/E7, ebiosciences）及びＩＬ３４−ＰＥ（578416, R&D）に対する抗体を使用して、ヒト細胞の表現型を特性評価した。FACS ARIA I (BD Biosciences, Mountain View, CA)を使用して、細胞を分取した。A Canto II cytometer (BD Biosciences, Mountain View, CA)を使用して蛍光を測定し、FLOWJO software (Tree Star, Inc. USA)を使用してデータを分析した。最初に、形態によって細胞をゲーティングし、ＤＡＰＩ生存細胞を選択することによって死細胞を排除した。
【０２０４】
ＡＡＶの作製並びにin vitro及びin vivoでの使用：Ｑ８１を含有するラットＩＬ−３４の完全ｃＤＮＡ配列（９）又はＧＦＰ（コントロールとして）をＲＳＶプロモーターの下流に配置した。最初に、lipofectamine reagent (Life Technologies, Carlsbad, Nouveau-Mexique)でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、プラスミドを試験した。４８時間後、細胞を、抗ｍｙｃ  ＡｂによるFACSによって、ＧＦＰ及びＩＬ−３４−ｍｙｃ発現について分析した。次いで、プラスミドを使用して、血清型８のＡＡＶベクター（LTG platform, INSERM UMR 1089, Nantes）を生産した。１００００、１０００００〜１００００００ＭＯＩベクターゲノムコピー／細胞のＡＡＶ−ＩＬ−３４又はＡＡＶ−ＧＦＰ及び５０００ＭＯＩのＡｄＬａｃＺで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスダクションした。２４時間後、細胞を回収し、FACSによって、ＩＬ−３４−Ｍｙｃ発現について分析し、上清を、１／１０及び１／５希釈で、同種ｐＤＣに応じたＣＤ４＋Ｔ細胞に対する抑制活性について試験した。移植の１カ月前に、リコンビナントＡＡＶ−ＩＬ−３４及びＡＡＶ−ＧＦＰ（４．５．１０１０、１．１０１２及び２．１０１２ベクターゲノム／ラット）ベクターを４週齢のラットに静脈内（ｉ．ｖ．）注射して、ＡＡＶベクターからの最適な発現を可能にした（２３）。ドナー同種特異的抗体の定量のために、血液サンプルを採取した。
【０２０５】
養子細胞移植：以前に記載されているように（５、８）、FACS Aria (BD Biosciences, Mountain View, CA)によって、ＴＣＲαβ−ＡＰＣ（Ｒ７／３）、ＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ（ＯＸ３３）及びＣＤ１１ｂ／ｃ−ビオチン−ストレプトアビジンＰＥＣｙ７（ＯＸ４２）陽性細胞をゲーティングすることによって、ラット細胞を分取した。ＩＬ３４処理ラット由来の脾細胞を移植したレシピエントを第１移植と定義し、次いで、反復移植を第２〜第３移植と定義した。同日に４．５Gyの全身照射を受けたナイーブＬＥＷ−１Ａレシピエントへの心臓移植の前日に、全脾臓細胞（細胞１．５×１０８個）及びFACS Aria分取ＣＤ４５ＲＡ＋Ｂ細胞（６×１０７個）、Ｔ細胞（４×１０７個）、ＣＤ１１ｂ／ｃ＋細胞（１．５×１０７個）、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＴｒｅｇ（４×１０６個）又はＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ（４×１０６個）を静脈内（ｉ．ｖ．）に養子移植した。
【０２０６】
混合リンパ球反応：以前に記載されているように（１６）、ナイーブＬｅｗｉｓ  １Ａ  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナイーブＬｅｗｉｓ  １Ｗ  ｐＤＣ及びＡｄＣＤ４０Ｉｇ処理Ｌｅｗｉｓ  １Ａ  ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇのサブセットを分取した。ＡＡＶ−ＩＬ−３４処理レシピエント、ＡｄＣＤ４０Ｉｇ処理レシピエント及びナイーブラット由来の血清を共培養物に追加して、最終濃度を３．１２％、６．２５％及び１２．５％にした。抑制活性の試験のために、トランスダクション細胞の上清を１０％〜２０％の最終濃度でＣＤ４＋Ｔ細胞及びｐＤＣに追加した。ラットＩＬ−３４、ＣＤ１１５又はＭ−ＣＳＦ遮断Ａｂ又はアイソタイプコントロールを、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの存在下又は非存在下、１．２５〜３０μg/mlで、遮断活性について試験した。Ｍ−ＣＳＦタンパク質（ab56288, ABCAM）を０．１〜２μg/mlで試験した。６日後に、ＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞の増殖を、フローサイトメトリーによって、生細胞（ＤＡＰＩ陰性）の中のＴＣＲ＋ＣＤ４＋細胞（Ｒ７／３−ＡＰＣ、Ｏｘ３５−ＰＥＣＹ７）をゲーティングすることによって分析した。
【０２０７】
分取したヒトＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を、同種ヒトＴ枯渇ＰＢＭＣと共に、３７℃及び５％ＣＯ２で、それぞれ丸底又は円錐底９６ウェルプレート内の完全ＲＰＭＩ−１６４０培地２００μl中に３重にプレーティングした。ヒトＩＬ３４  Ａｂを５０μg/mlで使用し、不定数のＴｒｅｇを追加した。アイソタイプコントロールＡｂを、各グラフに示されている最高濃度で使用した。Ｍ−ＣＳＦタンパク質（ab56288, ABCAM）を０．１〜２μg/mlで試験した。抑制活性試験のために、可溶性ヒトＩＬ３４（eBiosciences）を１、２又は５μg/mlの濃度で追加した。
【０２０８】
ドナー特異的同種抗体の定量：ドナー脾臓をコラゲナーゼＤによって消化し、ＥＤＴＡ  ０．１mM ４００μlで停止し、赤血球を溶解した。レシピエントの血清を１／８希釈でドナー脾細胞に追加し、抗ラットＩｇＧ−ＦＩＴＣ（Jackson ImmunoResearch Labs INC, Baltimore, USA）、抗ラットＩｇＧ１（MCA 194, Serotec）、抗ラットＩｇＧ２ａ（MCA 278, Serotec）又は抗ラットＩｇＧ２ｂ（STAR114F, Serotec）及び抗Ｍｓ  Ｉｇ−ＦＩＴＣ（115-095-164, Jackson ImmunoResearch）と共にインキュベーションした。FACS Canto (BD Biosciences, Mountain View, CA)を使用して蛍光を測定し、FLOWJO software (Tree Star, Inc. USA)を使用してデータを分析した。試験した血清の蛍光の幾何平均（ＭＦＩ）を、コントロールとして５つのナイーブＬｅｗｉｓ  １Ａ血清のＭＦＩの平均で割った。
【０２０９】
統計分析：一元配置ＡＮＯＶＡクラスカルワリス検定及びダン事後検定をＰＣＲ及び共培養実験に使用し、二元配置ＡＮＯＶＡ検定及びボンフェローニ事後検定をドナー指向性抗体及び脾細胞表現型の特性評価に適用し、マンテルコックス検定を使用して生存曲線を分析した。
【０２１０】
クロドロネートリポソームin vivo処理：マクロファージ枯渇のためのクロドロネートリポソームは、Vrije University, The Netherlands (www.clodronateliposomes.org)から購入し、推奨されているように調製した（５０４１）。簡潔に言えば、−２５日目〜３日目に、懸濁溶液２．５mlを週１回腹腔内投与した。
【０２１１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ：Trizol reagent (Invitrogen)又はRNeasy Mini Kit (Qiagen)を使用して、細胞から全ＲＮＡを単離した。製造業者の説明書（Life Technologies）にしたがってMessageAmpTMII aRNA Amplification Kitを用いて、マクロファージ由来のＲＮＡを増幅し、ランダムプライマー及びＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Life Technologies）を用いて逆転写した。Fast SYBR Green技術を使用して、Master Mix 2X (Life Technologies)１０μL、プライマー（１０μM）０．６μL、ｃＤＮＡ １μL及び水８．４μlを含有する最終反応容量２０μL中で、リアルタイムＰＣＲを行った。Applied Biosystems StepOneTM (Life Technologies)によって、この反応を実施した。熱条件は、以下の通りであった：９５℃で３秒間、６０℃で３０秒間及びＴＭ−５℃で１５秒間（最後の融解曲線段階）。
【０２１２】
結果
ＩＬ−３４は、脾臓ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ及び寛容同種移植片によって発現された：脾臓由来のＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ対ナイーブＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇのＤＮＡマイクロアレイ分析により、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇによる（最もアップレギュレーションされた遺伝子の中でも）ＩＬ−３４のアップレギュレーションが強調された（変化倍率４．０５）。ｑＰＣＲによってこのアップレギュレーションを確認したところ、長期脾臓ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  ＴｒｅｇにおけるＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現は、ナイーブＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと比較して１１倍超であった（ｐ＜０．０５、図１Ａ）。
【０２１３】
臓器全体を見ると、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡは、（Lin et al. (18)によって観察されたように）ナイーブ動物の脾臓及び心臓では内因的に発現されており（図１Ｂ）、脾臓及び移植片の両方では急性同種移植片拒絶の間にわずかに減少していた（ＮＴ、図１Ｂ及び１Ｃ）。最初の１週間の間に、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが移植片に蓄積したという本発明者らの以前の観察結果（１６）と相関して、５日目において、ＡｄＣＤ４０Ｉｇ処理移植片及び脾臓では、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡ発現が有意に増加していた（図１Ｂ及び１Ｃ）。移植の１２０日後において、ＡｄＣＤ４０Ｉｇ処理移植片では、この有意な増加は依然として検出可能であった；しかしながら、脾臓全体では、ＩＬ−３４  ｍＲＮＡレベルは正常に戻った。
【０２１４】
ＩＬ−３４のタンパク質発現を確認するために、本発明者らは、本発明者らが作製したマウス抗ラットＩＬ−３４抗体（Ａｂ）でＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇを標識した。このＡｂを用いて、本発明者らは、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  ＴｒｅｇによるＩＬ−３４の発現が、ナイーブＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと比較して有意であることを確認した（図１Ｄ）。
【０２１５】
まとめると、これらの結果により、ＩＬ−３４は、誘導ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ及び寛容同種移植片によって発現され得ることが初めて実証された。また、移植片及び脾臓におけるＩＬ−３４の初期発現は、急性移植片拒絶の抑制、したがって同種移植片寛容の確立におけるその初期関与を示唆している。
【０２１６】
Ｍ−ＣＳＦではなく、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇによって発現されるＩＬ−３４は、Ｔｒｅｇ媒介性抑制に関与する：本発明者らは、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇが、同種ｐＤＣに応じて、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の抗ドナー増殖をex vivoで抑制することを以前に実証した（１６）。加えて、本発明者らは、このプロセスにおけるＩＦＮγ及びＦＧＬ２の関与を実証した；しかしながら、ＩＦＮγ及びＦＧＬ２の阻害効果の遮断後において、いくらかの抑制が残存していた（１５、１６）。ＩＬ−３４がＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの抑制に関与していたかを解決するために、本発明者らは、抑制ＭＬＲアッセイにおいて中和抗ＩＬ−３４抗体を試験した（図２Ａ）。漸増濃度の遮断抗ＩＬ−３４  Ａｂを追加すると、ＣＤ４＋増殖は、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ媒介性阻害の５９％の回復まで用量依存的に増加した。
【０２１７】
ＩＬ−３４がＭ−ＣＳＦと類似性を有すること、ナイーブＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇと比較したＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  ＴｒｅｇによるＭ−ＣＳＦの有意な発現を本発明者らが観察したこと（図６Ａ）、及び同じレセプターに対して競合すること（１８、１９）を考慮して、本発明者らは、Ｍ−ＣＳＦが、エフェクターＴ細胞の増殖の阻害において役割を果たし得る可能性に取り組もうとしていた。最初に、本発明者らは、以前に記載されているＭＬＲアッセイにおいて、Ｍ−ＣＳＦの抑制能力を試験した。興味深いことに、本発明者らは、Ｍ−ＣＳＦが、ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞増殖を用量依存的に９３．５％まで効率的に抑制したことを観察したが（図６Ｂ）、これは、ＩＬ−３４の場合と同様に、Ｍ−ＣＳＦ媒介性抑制がＣＳＦ１−Ｒ発現ｐＤＣを介して作用することを示唆している（２０、２１）。しかしながら、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇの存在下の共培養抑制アッセイにおいて、遮断抗Ｍ−ＣＳＦ  Ａｂを追加してもＣＤ４＋Ｔ細胞増殖は回復せず、これは、Ｍ−ＣＳＦが、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇ媒介性抑制に関与していなかったことを実証している（図２Ｂ）。
【０２１８】
次に、本発明者らは、単球／マクロファージ、ｃＤＣ及びｐＤＣ（２０、２１）によって発現されるＣＳＦ１−Ｒ（ＩＬ−３４についてこれまでに記載されている唯一の末梢レセプター（１８、１９））の関与を試験した。したがって、本発明者らは、ラット及びマウスの両方においてＭ−ＣＳＦ作用を阻害すると以前に示されている抗ＣＳＦ１−Ｒ遮断Ａｂを使用した（２２）。本発明者らは、ＣＳＦ１−Ｒの遮断が、ｐＤＣの存在下におけるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖に対するＣＤ８＋Ｔｒｅｇ媒介性抑制を有意に低減したことを実証した（図２Ｃ）。
【０２１９】
結論として、本発明者らは、Ｍ−ＣＳＦ／ＣＳＦ１−Ｒ相互作用ではなくＩＬ−３４／ＣＦＳ１−Ｒ相互作用が、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇの抑制効果に関与することを実証した。
【０２２０】
ＩＬ−３４の持続的発現のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの作製：ＩＬ−３４の抑制活性をさらに分析するために、及びリコンビナントＩＬ−３４ラットサイトカインは市販されておらず、in vivo実験のための生産が困難であったので、本発明者らが、他の分子の場合に霊長類（２３）及びラット（２４）において行ったように、本発明者らは、ＩＬ−３４ラット分子をコードするリコンビナントＡＡＶベクターを作製した。このベクターでは、ラットＩＬ−３４  ｃＤＮＡをＣ末端Ｍｙｃタグと融合し、プラスミド（ｐＩＩＬ−３４）及びレンチウイルスの両方を初めて使用して、ＨＥＫ２９３  Ｔ細胞株を安定的にランスフェクション又はトランスダクションした。Ｍｙｃタグのフローサイトメトリーによって、ＩＬ−３４発現が示された。非トランスフェクションＨＥＫ２９３  Ｔ細胞又はＡＡＶ−ＧＦＰトランスダクションＨＥＫ２９３  Ｔ細胞、及びアイソタイプコントロールＡｂで染色したＨＥＫ２９３  Ｔ細胞では、Ｍｙｃ染色は検出不可能であった。しかしながら、ｐＩＩＬ−３４トランスフェクションＨＥＫ２９３  Ｔ細胞、又はＡＡＶ−ＩＬ−３４トランスダクションＨＥＫ２９３  Ｔ細胞は、強い量のＩＬ−３４タンパク質を用量依存的に発現しており、これは、ＩＬ−３４の分泌及びベクターの機能性を実証している。
【０２２１】
次いで、本発明者らは、ＡＡＶ−ＩＬ３４トランスダクションＨＥＫ２９３  Ｔ細胞の培養上清（図３Ａ）及びＡＡＶ−ＩＬ３４処理ラットの血清（図３Ｂ）（これらは両方とも、以前に示されているように多量のＩＬ−３４タンパク質を含有する）の抑制能力を試験した。本発明者らは、ＡＡＶＩＬ−３４トランスダクション細胞由来の上清及びＡＡＶ−ＩＬ３４処理ラット由来の血清が両方とも、コントロールと比較して、同種ｐＤＣによって刺激されるＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖応答を（用量依存的に）有意に阻害したことを観察した（図３Ａ及び３Ｂ）。
【０２２２】
まとめると、これらの結果は、エフェクターＴ細胞増殖の阻害におけるベクターの機能性及びＩＬ−３４の抑制効果を実証しており、したがって、in vivoの移植におけるその可能性を示唆している。
【０２２３】
同種移植片寛容誘導におけるＩＬ−３４の治療効果：治療戦略としてＩＬ−３４のin vivo抑制能力をさらに決定するために、本発明者らは、移植の１カ月前に、ＡＡＶ−ＩＬ−３４  １．１０１２ｖｇ／ラット又はコントロール非コードＡＡＶのいずれかでレシピエントを静脈内（ｉ．ｖ．）処理した。ＩＬ−３４のみによるこのような処理は、非コードＡＡＶを注射したコントロール（１４．２±１．８日間）又は未処理のレシピエント（７．８±０．６日間）と対比して、同種移植片生存の有意な延長をもたらした（平均生存時間３２．６±７．８日間）（図４）。次いで、同種移植片生存を改善するために、ＡＡＶベクターに加えて、準最適用量のラパマイシンでレシピエントを（１４日間）処理した。ラパマイシンのみによる１４日間は、同種移植片生存を有意に延長しなかった（図４、黒丸）。対照的に、本発明者らは、ＡＡＶ−ＩＬ３４及びラパマイシンの併用療法を受けたレシピエントの７５％では、コントロールと比較して、不定的な同種移植片生存を観察した（ｐ＜０．００１、図４）。慢性拒絶の兆候に関する長期生存レシピエントの移植片の分析により、分析した全てのレシピエントの心筋では、血管病変の完全な消失（すなわち、正常な血管構造及び白血球浸潤の消失）が明らかになった。加えて、長期生存レシピエントの血清中の抗ドナー抗体の存在の分析により、非コードＡＡＶで処理したレシピエントと対比して、全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ抗ドナーＡｂの有意な阻害が明らかになった。
【０２２４】
まとめると、本発明者らは、ＩＬ−３４が、ラパマイシンとの組み合わせで有益な寛容誘導治療戦略であり、全ての同種免疫応答の低減をもたらしたことを初めて実証することができた。
【０２２５】
ＩＬ−３４は、感染寛容可能な調節性Ｔ細胞を強力に誘導する：上記で実証したように、ＩＬ３４は、ＣＤ８＋ＣＤ４０Ｉｇ  Ｔｒｅｇによって特異的に産生される。次に、本発明者らは、調節性細胞が、ＩＬ３４処理の状況下で誘導され、ＡＡＶ−ＩＬ３４及びラパマイシンの組み合わせによってもたらされる長期同種移植片生存に関与していたかを評価した。このために、本発明者らは、本発明者らが以前に行ったように（１５）、長期生存レシピエントの脾細胞を使用して、ナイーブ移植放射線照射レシピエントへの養子細胞移植実験を実施した。第２のナイーブ移植放射線照射レシピエントへの１，５．１０８個の脾細胞の第１養子移植は、レシピエントの６０％の同種移植片生存の有意な延長をもたらしたが（図５Ａ）、これは、ＩＬ−３４が調節性細胞を効率的に誘導することを実証している。本発明者らは、第１養子移植した長期脾細胞レシピエントの移植片の解剖病理学的状況を調査したところ、血管病変及び閉塞の完全な消失（すなわち、慢性拒絶の兆候なし）を観察した。次いで、本発明者らは、同種移植片生存のこの延長が、第２及び第３のレシピエントに連続的に承継され得るかを決定したところ、本発明者らは、寛容が、ナイーブ移植放射線照射レシピエントに少なくとも３代連続で承継され得ることを確認した（図５、第２及び第３移植）。
【０２２６】
ＩＬ−３４が調節性マクロファージを誘導することが最近記載されたことを考慮して（２５）、本発明者らは、養子寛容の連続承継を可能にする調節性集団（マクロファージを含む）を調査した。このために、本発明者らは、ＩＬ３４で処理した寛容レシピエントから異なるメインサブセット（Ｂ細胞、Ｔ細胞及びマクロファージ）のサブ集団を精製し、ナイーブ放射線照射移植レシピエントへの養子細胞移植を実施した（図５Ｂ）。驚くべきことに、本発明者らは、他者によって示唆されているように、マクロファージではなくＴ細胞移植の場合にのみ、寛容の承継が達成されたことを観察したが、これは、ＩＬ−３４が調節性Ｔ細胞を誘導し得ること、及び本発明者らのモデルでは、マクロファージは、急性同種移植片拒絶を抑制する効力が十分ではなかったことを初めて実証している。しかしながら、調節性Ｔ細胞はＩＬ−３４レセプターを発現せず、これは、マクロファージが調節性Ｔ細胞の機能に必要な中間体であることを示唆している。どのＴｒｅｇ集団（すなわち、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ又はＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴ細胞）が新たな移植レシピエントに寛容を与え得るかをさらに決定するために、本発明者らは、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ及びＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇを分取し、養子細胞移植を実施した（図５Ｂ）。本発明者らは、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈ及びＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇの養子移植が両方とも、レシピエントにおいて５０％の長期同種移植片生存をもたらしたことを観察したが、これは、両Ｔｒｅｇ集団が、ＩＬ３４改変マクロファージによって等しく増強されたことを示唆している。
【０２２７】
まとめると、これらのin vivo結果は、低炎症及び移植の状況下では、効率的なＴｒｅｇがＩＬ３４処理後に生成されること、及びこれらのＴｒｅｇが連続的な寛容を優勢的に誘導し得ることを実証している。
【０２２８】
Ｔｒｅｇ誘導は、移植片に浸潤するＩＬ３４改変マクロファージによって媒介される：寛容誘導におけるＩＬ−３４誘導性マクロファージの役割をさらに同定するために、本発明者らは、同種移植片に対する寛容誘導との関連で、マクロファージに対するＩＬ３４効果を特性評価した。最初に、本発明者らは、移植後１５日目（すなわち、ＡＡＶ注射後４５日目）のＡＡＶ−ＩＬ３４処理レシピエントの脾臓、血液及び移植片由来のマクロファージ、並びにナイーブラット由来のマクロファージを分取し、ｑＰＣＲによっていくつかの遺伝子を分析した（図７）。興味深いことに、本発明者らは、ＡＡＶ−ＩＬ３４処理レシピエント由来の移植片におけるマクロファージが、ナイーブマクロファージと比較して、アルギナーゼ１及び誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）（これらは両方とも必須アミノ酸の代謝に関与し、Ｔリンパ球の増殖の制限による抑制マクロファージの共通の免疫調節機構として説明されている（３４））を強くアップレギュレーションしたことを観察した。本発明者らはまた、主に移植片においてだがＡＡＶ−ＩＬ３４処理マクロファージの脾臓及び血液においても、ナイーブマクロファージと比較して、ＣＤ１４の発現が増加しており、ＣＤ２３、ＣＤ８６及びＩＬ１０の発現が減少していたことを観察した。最後に、本発明者らは、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＩＬ１、ＴＧＦβ及びＴＮＦγの発現について、有意差を観察しなかった。血液及び移植片中に存在するマクロファージ間に有意差があったことも興味深いが、これは、移植片では、移植の直後に、ＩＬ３４改変調節性マクロファージが遊走及び存在していることを示唆している。本発明者らは、移植前−２５日目から移植後３日目に、クロドロネートをローディングしたリポソームを使用して、マクロファージ集団をさらに枯渇させ、他者によって以前に記載されているように、ＩＬ３４又は非コードＡＡＶ＋準最適用量のラパマイシンで１０日間同時処理した。残念なことに、この治療は同種移植片生存をもたらしたが、この治療を使用して、ＩＬ−３４誘導性マクロファージの役割を明らかにすることはできなかった。このようにして、移植の３０日前に注射したＡＡＶ−ＩＬ３４は、同時に枯渇させたマクロファージを介して作用することができなかった。重要なことに、リポソームの枯渇を開始した時点までに、ＡＡＶ血清型８のほとんどは、肝臓由来の肝細胞に組み込まれていた。本発明者らは、クロドロネートをローディングしたリポソームで処理したレシピエントが、コントロール群と比較して早く移植片を拒絶したことを観察したが、これは、マクロファージが、ＩＬ３４による寛容誘導に必須であることを実証している（図８）。
【０２２９】
ＩＬ３４は、強力な抑制能力を有する：本発明者らは、ヒトにおけるＩＬ３４の抑制能力を疑って、ＡＰＣとしてのＴ細胞枯渇同種ＰＢＭＣの存在下でＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＦＳＥ標識エフェクターＴ細胞を培養したＭＬＲに、様々な用量の可溶性ヒトＩＬ３４を追加した（図９Ａ）。本発明者らは、ＩＬ３４の存在下において、エフェクターＴ細胞増殖の有意な用量依存的阻害を観察したが、これは、抗ドナー免疫応答に対するＩＬ３４の抑制能力を裏付けている。最後に、抗ドナー免疫応答に対するＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ及びＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ媒介性抑制活性におけるＩＬ３４の関与を実証するために、本発明者らは、同種Ｔ枯渇ＰＢＭＣの存在下でＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋ＣＤ２５−エフェクターＴ細胞増殖をＴｒｅｇによって阻害したＭＬＲに、抗ヒトＩＬ３４遮断Ａｂ又はコントロールアイソタイプＡｂのいずれかを追加した（図９Ｂ）。本発明者らは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔｒｅｇでは両方とも、アイソタイプコントロールＡｂと比較して、ＩＬ３４の遮断がＴｒｅｇ媒介性抑制を有意に回復したことを観察したが、これは、Ｔｒｅｇの抑制活性におけるＩＬ３４の重要な役割を実証している。
【０２３０】
まとめると、これらのデータは、本発明者らの知見の妥当性を証明しており、ＩＬ３４がＴｒｅｇ特異的タンパク質であり、抗ドナー免疫応答を操作する際の治療ターゲット候補であるという概念の証拠を提供している。
【０２３１】
討論
これまで、ＩＬ−３４の生物学的関連性はほとんどが依然として不明であり、論争中である。ＩＬ−３４の役割に関する現在の理解は、主に病理学的状況の研究によるものであり、ＩＬ−３４は、Ｍ−ＣＳＦなどの炎症機能を発揮することが見出された。様々な研究により、Ｍ−ＣＳＦの投与は、コラーゲン誘発性ＲＡモデルにおける炎症を増加させること（２６）、及びＩＬ−３４は、ＲＡモデルにおける滑膜炎、炎症の重症度と相関し（１３）、Ｍ−ＣＳＦと同様にＴＮＦαによって誘導され得る（２７）ことが示されている。さらに、ＩＬ−３４及びＭ−ＣＳＦは両方とも、ＩＬ−６、ＩＰ１０／ＣＸＣＬ１０、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８、ＭＣＰ１／ＣＣＬ２のような炎症促進性サイトカインを誘導する（２８）。これらの研究とは対照的に、Ｍ−ＣＳＦ及びより最近ではＩＬ−３４は単独で、又は他のサイトカインと組み合わせて、調節性マクロファージを誘導し得ることも示されている（２５、２９〜３２）。移植では、マウスのＭ−ＣＳＦ前処理はマクロファージを増殖させ、ＧＶＨＤを抑制することが実証されている（３３）。加えて、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＦＮγの組み合わせは、ｉＮＯＳ依存的に心臓同種移植片生存を延長することができる調節性マクロファージの中で単球を識別する（３４）。これらの研究は、ＩＬ−３４の矛盾した役割の基礎となっている。本発明者らの研究では、移植における寛容誘導の複雑な機構を解明するために、本発明者らは、免疫応答及び寛容のマスターレギュレーターとしてのＩＬ−３４の予想外の特性の証拠を初めて提供する。本発明者らはまた、ＩＬ−３４が、寛容同種移植片及びＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇによって発現され得、最も重要なことには、強力な調節性Ｔ細胞を誘導し得るという最初の証拠を提供する。
【０２３２】
本発明者らは、ＣＤ４０Ｉｇをコードするアデノウイルスによる心臓移植レシピエントの処理が、レシピエントの９３％における不定的な同種移植片生存をもたらすこと、及びこの認容性が、ＩＦＮγ、ＩＤＯ及びＦＧＬ２依存的に、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇによって媒介されたことを以前に実証した。より最近では、本発明者らは、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇがバイアス制限Ｖβ１１レパートリーに再結合して、主要ＭＣＨクラスＩＩ由来ペプチドを認識したこと、及びこのペプチドが調節性Ｔｒｅｇを誘導して、寛容を誘導することを実証した（１７）。本明細書では、本発明者らは、ＡｄＣＤ４０Ｉｇ処理レシピエントの寛容移植片によって、重要なことには、同じレシピエント由来の脾臓ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇによっても、ＩＬ−３４が高レベルで発現されたことを示す。さらに、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇ媒介性抑制は、ＩＬ−３４の遮断によって部分的に低減され得る。したがって、ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＣｌｏｗＴｒｅｇによって媒介される抑制のＣＤ４０Ｉｇモデルでは、ＩＬ−３４は、これまでに研究されていなかった免疫抑制特性を有し、ＦＧＬ２、ＩＤＯ及びＩＦＮγと相乗的に作用する。
【０２３３】
本発明者らはまた、このモデルでは、Ｍ−ＣＳＦが関与していなかったことを観察したので、この特性がＩＬ−３４特異的であったことを実証した。累積する証拠は、ＩＬ−３４及びＭ−ＣＳＦが特異的かつ非冗長な特性を示すことを示唆している。これは、ＩＬ−３４及びＭ−ＣＳＦが異なってＣＤ１１５に結合することを示す構造分析比較によって強調されている（１１、１９）。より最近では、第２の別個のＩＬ−３４レセプターの同定がこの解釈を補強する（１０）。ごく最近では、ＩＬ−３４欠損マウスが作製され、ランゲルハンス細胞及びミクログリアなどの特定の細胞サブセットの消失（これは、Ｍ−ＣＳＦ  ＫＯマウスでは観察されていなかった効果である）を示したが（１２）、これは、ＩＬ−３４及びＭ−ＣＳＦでは、時間的及び空間的な発現の役割が異なるだけではなく、機能的な効果も異なることを実証している。
【０２３４】
この分子の治療的価値は、ＩＬ−３４をコードするＡＡＶの作製によって証明された。このベクターを用いて、本発明者らは、in vitro及び最も重要なことにはin vivoにおけるＩＬ−３４の強力な免疫抑制特性を初めて示すことができ、本発明者らは、準最適用量のラパマイシンと組み合わせた場合に、レシピエントの８０％において不定的な同種移植片生存を達成した。本発明者らはまた、このような治療が、全ての同種免疫応答の低減及び寛容の誘導をもたらしたことを実証した。以前の研究では、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−３４は両方とも、調節性マクロファージの中で単球を識別し（２５、３４）、Ｍ−ＣＳＦ及びＩＦＮγによってin vitroで誘導された調節性マクロファージをin vivoで使用して、マウスにおける心臓同種移植片生存を延長し得る（３４）ことが実証された。別の研究では、移植前のＭ−ＣＳＦの投与はマクロファージを増殖させて、ドナーＴ細胞増殖及びＧＶＨＤを制限し得ることがマウスで実証された（３３）。Chenらは、可溶性ＩＬ−３４タンパク質で処理したマウスにおけるＣＤ１１ｂ＋集団の増加を示した（３５）。また、他の研究では、ＣＳＦ−１欠損大理石骨病マウスにおけるｐＤＣ及びｃＤＣの減少（２１）、並びにＤＣ数のＣＦＳ１誘導性増加（２０）が認められた。驚くべきことに、他の研究とは対照的に、投与後のin vivoにおけるＩＬ−３４の寛容原性効果は、調節性Ｔ細胞によって媒介された。実際、本発明者らは、ＡＡＶ−ＩＬ−３４処理レシピエントで得られた寛容が、新たな移植放射線照射レシピエントにおいて、少なくとも３世代にわたって承継され得ること、及びこの効果が、マクロファージによってではなく、（ＣＤ１１ｂ＋細胞集団について観察された増加にもかかわらず）Ｔｒｅｇによって媒介されたことを実証した。しかしながら、ＴｒｅｇはＩＬ−３４レセプターを発現しないので、本発明者らは、調節性マクロファージがＣＤ４エフェクターＴ細胞をアネルギー化し（３６）、Ｔ細胞をＴｒｅｇに変換し（３７）、又は他のＡＰＣの提示を阻害し得る（３８）と文献に示されているように、ＩＬ−３４が、マクロファージを介してＴｒｅｇに対する効果を媒介したと仮説することができる。本発明者らは、本発明者らのモデルにおいて、ＩＬ−３４が調節性マクロファージを誘導すると結論することができなかったが、これらは、ＩＬ−３４誘導性Ｔｒｅｇの必要な中間体である。いくつかの研究では、拒絶された腎臓同種移植片において、マクロファージの増殖及び蓄積を増加させるＭＣＳＦの炎症促進性役割が示されたように（３９）、これらの結果は、ＩＬ−３４及びＭ−ＣＳＦの機能的差異並びにこのトピックに関する論争を強調している。
【０２３５】
結論として、本発明者らは、新たなサイトカインＩＬ−３４の移植寛容における役割を本明細書に記載し、本発明者らは、移植の治療としての、又は移植の予後良好に関連するバイオマーカーとしてのその可能性を明らかにしたが、他の疾患にも拡大される。本発明者らはまた、このサイトカインがＣＤ８＋Ｔｒｅｇによって産生され得、寛容誘導可能なＴｒｅｇを優勢的に誘導し得ることを初めて実証したが、これは、ヒトに移植可能なＴｒｅｇの作製に関する新たな可能性を開くものである。
【０２３６】
参考文献：
本出願を通して、本発明が関係する現状技術が様々な参考文献に記載されている。これらの参考文献の開示は、参照により本開示に組み込まれる。
【０２３７】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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