(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨修復のための移植片足場を製造する方法であって、以下の工程：
−  ゲル化多糖類の水溶液を提供すること；
−  以下の
ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）粒子、軟骨粒子及び哺乳動物細胞；
の少なくとも１つを提供すること；
−  前記ゲル化多糖類の水溶液、前記ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）粒子、軟骨粒子及び哺乳動物細胞の少なくとも１つを混合して印刷ミックスを得ること；
−  前記印刷ミックスを三次元形態で沈着させること
を含み、
前記ゲル化多糖類がジェランガム、アシル化及び／又は硫酸化ジェランガムであり、かつ
前記印刷ミックスは、３．５％（ｗ／ｖ）のゲル化多糖類を含み、
前記ゲル化多糖類の溶液が、２．５％（ｗ／ｖ）又は３．０％（ｗ／ｖ）のアルギン酸塩を含む、
前記移植片足場を製造する方法。
【請求項２】
前記ゲル化多糖類の水溶液が、１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌの間の二価イオンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物細胞と、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）粒子及び軟骨粒子の少なくとも１つとの両方は、前記印刷ミックスを得るために提供される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲル化多糖類の溶液は、単糖類又は二糖類を生理的オスモル濃度で含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
増殖因子及び／又は分裂促進因子は、印刷ミックス内に提供される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記増殖因子及び／又は分裂促進因子は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＦＧＦ−２、及び／又はＩＧＦ−１から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記増殖因子の濃度は、０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、５〜５０ｎｇ／ｍｌ又は５０〜５００ｎｇ／ｍｌである、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞は、軟骨細胞、軟骨幹細胞又は軟骨前駆細胞である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記哺乳動物細胞は、３×１０6 細胞／ｍｌ〜５０×１０6 細胞／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記印刷ミックスは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦベータ３を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記印刷ミックスの三次元形態への沈着は、該印刷ミックスのラインの沈着により行われ、ここで各ラインは、７００〜１１００μｍの幅を有し、且つ該ラインは２０％〜６０％重複する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記三次元形態は、３−Ｄ−印刷法により誘導される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記三次元形態は、積層造形方法により誘導される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記積層造形方法は、インクジェット印刷、押出印刷又は積層方法である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法により得られる移植片足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元移植片、特に頭蓋顔面特徴および損傷した関節の修復のための三次元移植片、及び生体適合性インキを用いた三次元バイオ印刷およびコンピューター支援モデリングを用いた患者特異的移植片の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
局所的に変化する機械的特性および皮膜の重なりを伴う内軟骨構造の複雑な三次元特性のために、患者特異的な方法で鼻および外耳を再建することは、形成外科における最大の課題のいくつかである。耳介の再建は、先天性の奇形、小耳症、黒色腫に関連する組織の犠牲および事故および重度の火傷を含む傷害に適用可能である。耳は、頭部および頸部を含む火傷の約９０％に関与する。米国および欧州連合における総耳介再建のために最も頻繁に使用される標準的な治療は、できる限り限られた量で組織が採取されるように、耳の形状に整形される第６、第７および第８の肋骨から採取された自己肋軟骨を用いた第２から第３ステージの手術法に基づく。十分な量の肋軟骨は、一般的に１０歳で達成され、再建手術が遅れる。耳の再建手術のためのもう一つの再構成方法は、肋軟骨採取の必要性を避けるためにシリコーンインプラントを使用することである。しかし、皮膚の薄い層の下に無細胞足場を置くことは、患者に長期的な合併症の高いリスクを与える。さらに、各患者にカスタマイズされたサイズおよび形状を提供することは不可能であり、再構成された耳は対側の耳のようには成長しないため非対称性につながる。利用可能な再建戦略はいくつかの手術を含み、その結果は再建外科医の専門知識に大きく依存する。ドナー側の罹患率、肋軟骨支持の欠如による腹壁の崩壊および肋軟骨採取に関連する激しい疼痛は一般的な合併症である。
【０００３】
さらに、スポーツ傷害、外傷および変形性関節症などの変性疾患の結果として生じる骨軟骨の病変を修復する大きな臨床的必要性が存在する。これを治療するための現行の方法論は、自己由来または骨バンク由来の骨軟骨移植片の移植を含む。この治療には、ドナー部位の罹患率、ドナー組織の不足、外科手術の困難性、及び移植片は複数の部分で構成されており、それぞれの部分が緩んだり、又は高さがずれていたりする可能性がある事実を含むいくつかの欠点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この従来技術水準に鑑みて、本発明の目的は、上記の従来技術の欠点を改善した患者固有の移植片を提供するための方法および手段を提供することである。この目的は、本明細書の特許請求の範囲の技術的特徴によって達成される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
概要
本発明の第一の側面によれば、特にヒトの患者に使用するための、移植片足場を提供する方法は、以下の工程：
−  粒子及び／又は線維を提供すること；
−  ゲル化多糖類の水溶液を提供すること;
−  哺乳動物細胞を提供すること;
−  前記粒子及び/又は線維、前記ゲル化多糖類の水溶液及び前記哺乳動物細胞を混合して印刷ミックスを得ること;
−  前記印刷ミックスを三次元形態で沈着させること
を含む。
【０００６】
本発明の別の側面によれば、移植片を提供する方法は、以下の工程：
−  本発明の第１の側面による方法、又はその特定の実施形態のいずれかによる移植片足場を提供すること、及び
−  細胞培養工程において、前記無細胞足場を、哺乳動物細胞、特に軟骨細胞、幹細胞又は軟骨前駆細胞を含む細胞培養培地中に沈着させること
を含む。
【０００７】
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の先行する側面のいずれか、又はそれらの特定の実施形態のいずれかによって得られた、又は得られうる移植片は、特に頭蓋顔面又は関節修復の方法に使用するために提供される。
【０００８】
本発明のさらに別の側面によれば、頭蓋顔面又は関節修復の方法は、軟骨特異的印刷ミックスを用いて三次元積層造形のために改変された患者特異的移植片のコンピュータモデルを含み、この軟骨特異的印刷ミックスは、少なくとも１つの細胞適合性ポリマー、少なくとも１つの刻まれた組織、又は他の添加剤粒子及び細胞を含み、架橋は共押し出し材料又は生体インク内部に埋め込まれた反応基及び分子の自発的または外部から誘発された反応によって提供され、これらのタイプの少なくとも１つは、ポリマー、刻まれた組織及び細胞のうちの少なくとも１つに存在し、機能的且つ天然軟骨様組織移植片を再構築する。
【０００９】
本発明の一側面によれば、製造された組織移植片の機械的負荷に対してより適した移植片の内部ポリマー勾配、多孔性および支持領域を作り出す方法が積層造形方法により提供される。
【００１０】
本発明の一側面によれば、犠牲的な外部支持構造を作成し、移植片の張出し形状の印刷に役立つ方法が提供され、ここで、犠牲ポリマーは印刷ミックスと共沈着され、印刷ミックスを重合させるための架橋開始剤のリザーバーとして機能し、そして重合後に除去される。
【００１１】
本発明は以下の図及び非限定的な例を参照してさらに説明され、これらの例は、以下の特定の実施形態を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ）は、患者のＣＴモデルに基づいて作成された三次元モデルであり、内部支持構造が移植片への耐荷重性を高めるために追加された後に作成された三次元モデル、Ｂ）無傷の組織の人工耳構築物の写真、及びＣ）より天然に近い曲げ特性のために耳構造を安定させることができる内部支持構造の写真。画像ＢおよびＣの両方は、三次元バイオプリンティングを利用して製造され、刻まれた軟骨粒子、ジェランガム、及びアルギン酸塩から構成されている。
【図２】図２は、２つの組成物を有するバイオインクのレオロジー架橋速度論および最終剛性を示す。
【図３】図３は、２０ｍＭ塩化ストロンチウム溶液による機械的特性の時間依存性を示しており、各時点の破損時の標本（ｎ＝６）の平均極限応力を引張りで測定した。さらに、カチオン（黒色は塩化カルシウムを示し、及び灰色は塩化ストロンチウムを示す）の濃度は、カチオン供給源にかかわらず架橋に対して同様の効果を有する。機械的性質はカチオン濃度および架橋時間に大きく依存すると結論付けることができる。
【図４】図４は、印刷工程において印刷ミックス材料に埋め込まれた軟骨細胞の代謝活性を示すグラフである。代謝活性アッセイ（プロメガＭＴＳ  ｏｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎアッセイ）をいくつかの時点で行い、プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１、Ｂｉｏｔｅｋ）で分析した。陽性対照はアルギン酸塩１％（薄灰色）、印刷ミックス材料は組織粒子を含まない印刷ミックス材料（灰色）に対応し、且つ印刷ミックス材料＋ＥＣＭ（濃い灰色）は＜１００μｍの直径の軟骨細胞外マトリックス粒子からなる。全ての条件を三重に分析した。
【図５】図５は、架橋カスケードを開始する任意の供給源、酵素、タンパク質又は他の活性化分子由来のカチオンなどの最初の架橋分子を提供する共沈着された支持構造Ａ）、及びこの支持体の溶出後に張出した特徴を有する最終構築物Ｂ）を示す。
【図６】図６は、粒子、ジェランガム、およびアルギン酸塩からなる無傷の天然のサイズの培養鼻構築物の写真である。構築物は、三次元バイオプリンティングを利用して１７分未満で作製された。ラインとラインとの間隔は１ｍｍを表す。
【図７】図７は、３％ジェランガム中１０％ＰＭＭＡ線維配向を示す明視野顕微鏡画像であり、せん断前（左）、コーナーからコーナーの２方向における１軸せん断後（中央）及び垂直方向の１軸せん断後を示す。スケールバーは５０ミクロンである。
【図８】図８は、高アシル化ジェラン（Ａ）及び非アシル化ジェラン（Ｂ）のジェランガム組成を示す。
【図９】図９は、印刷プロセス中の患者固有の三次元モデルを培養鼻組織片への左から右への変換を示す。ライン同士の間隔は１ｍｍを表す。
【図１０】図１０は、Ａ）アルギン酸塩、及びＢ）ジェランガムのポリマー骨格における種々のレベルの硫酸化におけるフーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）の結果を示す。１３００ｃｍ−１における矢印は硫酸化のピークを示す。ポリマー中の硫酸化度が高いほど、増殖因子の結合が増加し、分子のより良好な送達がもたらされる。
【図１１】図１１は、粒子を有するバイオインク組成物及び粒子を含まないバイオインク組成物のレオロジー特性の結果を示す。ａ）は、せん断減粘性を、回転速度で測定したもの、ｂ）は、２サイクルについて１秒のせん断後の振動（１００−ｓせん断速度）におけるせん断回復を示し、ｃ）は、バイオインク単独について種々のカチオン条件でイオン結合により架橋した貯蔵弾性率Ｇ’、及びｄ）は、２０ｍＭ  ＳｒＣｌ２で３０分間架橋させたサンプルの最大貯蔵弾性率Ｇ’を示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１２】図１２は、印刷された構築物の引張および膨潤特性の決定の結果を示す。引張り試験は、印刷されたダンベルの標本に対して行われ、ここでノズルの経路は黒い線で示され、印刷された構造は膨潤した後に示されるａ）。標本の中央部に破損が生じた場合の代表的な応力・歪み曲線ｂ）。化学反応式（２）および（３）に基づいたバイオインク組成物の膨潤挙動により、総保水率ｃ）および架橋後の保水率ｄ）をそれぞれ評価した。定規の最小区画は１ｍｍであり、エラーバーは標準偏差を表す。
【図１３】図１３は、印刷された構築物の細胞生存率の決定および細胞増殖アッセイの結果を示す。ａ）生死の染色で、１層の厚さのディスクを印刷した後の生存率を評価し、ここで印刷後３時間では８０％の生存率が観察され、４日目に９７％まで回復した。大きな構造における生存率を評価するために、若い成人サイズの鼻を印刷し、生存率を、生死染色によって評価した中央のスライス（拡散距離〜５ｍｍ）から評価した。６０％の細胞生存率が観察された。スケールバーは５ｍｍ（左）、及び５０μｍ（右）である。さらに、鋳造されたディスクの細胞数は、ＤＮＡ定量化で評価し、ここで、バイオインク＋軟骨粒子及び両方のＴＧＦ−β３補充組成物に、１日目から２１日目までのＤＮＡについて統計的に有意な増加が観察された。エラーバーは標準偏差を表し、有意水準は（ｐ＜０．０５）であった。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明の第一の側面によれば、特にヒトの患者における、移植片足場を提供する方法に関し、以下の工程：
−  ゲル化多糖類の水溶液を提供すること;
−  以下の
粒子及び／又は線維；
哺乳動物細胞；
の少なくとも１つを提供すること;
−  前記粒子及び/又は線維、前記ゲル化多糖類の水溶液及び前記哺乳動物細胞を混合して印刷ミックスを得ること;
−  前記印刷ミックスを三次元形態で沈着させること
を含む。
【００１４】
ある実施形態では、印刷ミックスはゲル化多糖類の水溶液及び粒子を含む。ある実施形態では、印刷ミックスは、ゲル化多糖類の水溶液及び線維を含む。
【００１５】
線維及び／又は粒子は、特に軟骨組織に由来する場合、移植片内の細胞の増殖を支援するのに役立つ要因を含み得る。
【００１６】
ある実施形態では、印刷ミックスはゲル化多糖類の水溶液、及び粒子と線維との両方を含む。
【００１７】
ある実施形態では、印刷ミックスはゲル化多糖類の水溶液及び細胞を含む。ある実施形態では、印刷ミックスはゲル化多糖類の水溶液及び細胞及び１つ又は複数の増殖因子を含む。本発明者らは、驚くべきことに、軟骨粒子又は線維が存在しなくても、ゲル化材料および細胞を提供することにより、特に増殖因子の存在下で、細胞の生存能力および増殖を維持するために、十分であり得ることを見出した。
【００１８】
ある実施形態では、印刷ミックスは、ゲル化多糖類の水溶液及び粒子及び細胞を含む。ある実施形態では、印刷ミックスは、ゲル化多糖類の水溶液及び粒子及び線維及び細胞を含む。
【００１９】
ある実施形態では、前記粒子は、組織粒子からなるか、又は組織粒子を含む。ある実施形態では、前記粒子は、軟骨粒子からなるか、又は軟骨粒子を含む。ある実施形態では、前記粒子は、凍結乾燥軟骨組織からなる粒子からなるか、またはそれらを含む。ある実施形態では、前記粒子は、ヒト軟骨組織からなるか、またはそれを含む。ある好ましい実施形態では、前記粒子は、自己軟骨組織からなるか、またはそれを含む。ある好ましい実施形態では、粒子は、ＢｉｏＣａｒｔｉｌａｇｅ、Ａｍｎｉｏｆｉｘ、Ａｌｌｏｄｅｒｍ‐Ｃｙｍｅｔｒａ、Ｃｏｏｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉａｌ  Ｍｕｓｃｏｓａ（ＳＩＳ）粒子を含む微粉化したマトリックスの臨床製品であり得る。ある好ましい実施形態では、粒子は、ヒドロキシアパタイト又はリン酸カルシウムであり得る。
【００２０】
ある実施形態では、粒子及び／又は線維は、合成ポリマー、特にポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ゲル形成ポロキサマーＦ１０８，Ｆ１２７,Ｆ６８，Ｆ８８、ポリオキサゾリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリメチルビニルエーテル‐ｃｏ‐無水マレイン酸、ポリラクチド、ポリ‐Ｎ‐イソプロピルアクリルアミド、ポリグリコール酸、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、及びポリアリルアミンからなるポリマー、又はこれらから誘導されるポリマー、又はこれらの共重合体、又はこれらのブロック共重合体からなる群から選択されるポリマーで作製される。
【００２１】
ある実施形態では、粒子及び／又は線維は、刻んだ組織を含み、又は主に、又は専ら、刻んだ組織からなる。ある実施形態において、刻んだ組織は、耳介軟骨、鼻軟骨、髄核、半月板、気管、鼻軟骨、肋軟骨、関節軟骨、滑液、硝子体液、脳、脊髄、筋肉、結合組織、小腸粘膜下組織及び肝臓からなる群から選択された組織に由来する。ある実施形態において、刻まれた組織は、５μｍ〜５０μｍ、５０〜２００μｍ及び２００〜１０００μｍの範囲又はこれらの組合せの範囲内にある。
【００２２】
ある実施形態では、前記ゲル化多糖類は、ジェランガム、アシル化及び／又は硫酸化ジェランガムである。ある実施形態において、前記ゲル化多糖類は、グアーガム、カッシアガム、コンニャクガム、アラビアゴム、ガッティガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、硫酸キサンタンガム、カラギーナン、硫酸カラギーナン、又は前記ゲル化多糖類の上記いずれかの混合物から選択される。
【００２３】
ある実施形態では、ゲル化多糖類の前記溶液は、ゲル化多糖類に加えて、添加剤として細胞適合性ポリマーを含み、特にアルギン酸塩、硫酸アルギン酸塩、硫酸化ジェラン、カラギーナン、硫酸カラギーゲン、グアーガム、カッシアガム、コンニャクガム、アラビアゴム、ガッティガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、硫酸キサンタンガム、ヘパリン、線維素、ヘパリン硫酸、エラスチン、トロポエラスチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化ヒアルロナン、セルロース、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリ‐ｌ‐リジン、キトサン、シルク及びコラーゲンからなる群から選択される細胞適合性ポリマーを含む。
【００２４】
ある実施形態では、添加剤はジェランガム、アシル化及び／又は硫酸化ジェランガムと組み合わせて含まれる。
【００２５】
ジェランガムは、シュードモナス・エロデア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）菌によって生産される水溶性多糖類である。ポリマーの反復単位は、四糖類であり、この四糖類は、Ｄグルコースの２残基及びＬ−ラムノースとＤ−グルクロン酸の各残基の１つからなる。この反復は、以下の構造を有する。：［Ｄ‐Ｇｌｃ（β１→４７Ｄ‐ＧｌｃＡ（β１→４）Ｄｊｈｂｎ‐Ｇｌｃ（β８７７→ｕ８ｉｒ）Ｌ‐Ｒｈａ（α１→３）］ｎ
【００２６】
「アシル化ジェランガム」は、当技術分野で知られている用語であり、グルコース単位の酸素５’位の一部又は全部にアセチル、及び酸素２’位の一部又は全てにグリセリル酸（ｇｌｙｃｅｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）を含むジェランを指す。図８を参照。：アシル化ジェラン（Ａ）は、細菌発酵後のジェラン原産物であり、精製されると、アシル側鎖及びグリセリル側鎖が切断され得る（Ｂ）。これは、ゲル化を促進し、異なる剛性を達成することができる。本発明のある実施形態では、アシル化されたジェランと精製されたジェランとを一緒に組み合わせて、構造に対しより優れた柔軟性を達成する。
【００２７】
ある実施形態では、ゲル化多糖類の溶液は、ゲル化多糖類として、ジェランガム又はアセチル化ジェランガム、又はアシル化ジェランガムの硫酸化生成物、及び、細胞適合性ポリマー添加剤として、アルギン酸塩、硫酸アルギン酸塩、硫酸化ジェラン、カラギーナン、及び／又は硫酸カラギーナンを含む。
【００２８】
ある実施形態では、一価、二価及び／又は三価カチオンを含む塩の水溶液を前記ゲル化多糖類に添加してゲル化させる。
【００２９】
ある実施形態では、前記水溶液は１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌの二価イオンを含む。ある実施形態において、前記水溶液は、ストロンチウムイオン（Ｓｒ２＋）を含む。ある実施形態において、前記水溶液は、バリウムイオン（Ｂａ２＋）を含む。ある実施形態では、前記水溶液はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を含む。
【００３０】
ある実施形態では、前記水溶液は、合計で１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌの二価イオンを含む。 ある実施形態において、前記水溶液は、１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌのストロンチウムイオン（Ｓｒ２＋）、特に１５〜５０ｍｍｏｌ／ｌのＳｒ２＋を含む。ある実施形態において、前記水溶液は、１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌのバリウムイオン（Ｂａ２＋）、特に１５〜５０ｍｍｏｌ／ｌのＢａ２＋を含む。ある実施形態において、前記水溶液は、１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌのカルシウムイオン（Ｃａ２＋）、特に１５〜１００ｍｍｏｌ／ｌのＣａ２＋を含む。
【００３１】
ある実施形態では、前記水溶液は、合計で１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌのＳｒ２＋及びＢａ２＋を含み、特に１５〜５０ｍｍｏｌ／ｌのＳｉ２＋及びＢａ２＋を含む。ある実施形態において、前記水溶液は、合計で１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌのＣａ２＋及びＢａ２＋を含み、特に１５〜５０ｍｍｏｌ／ｌのＣａ２＋及びＢａ２＋を含む。ある実施形態において、前記水溶液は、合計で１０〜１５０ｍｍｏｌ／ｌのＳｉ２＋及びＣａ２＋を含み、特に１５〜５０ｍｍｏｌ／ｌのＳｉ２＋及びＣａ２＋を含む。
【００３２】
ある実施形態では、ゲル化多糖類の前記溶液は、単糖類又は二糖類、特にグルコース、マンノース又はアラビノースを生理的オスモル濃度で含む。この添加は、印刷ミックス中に包埋された細胞の生存能力を保護するために重要であり得る。
【００３３】
ある実施形態では、前記粒子及び／又は線維は、以下からなるか、又は含む。
−  生体適合性又は細胞適合性ポリマー、及び／又は
−  生体吸収性ポリマー、特にＰＬＡ（ポリ乳酸又はポリラクチド）、ＤＬ‐ＰＬＡ（ポリ（ＤＬ‐ラクチド））、Ｌ‐ＰＬＡ（ポリ（Ｌ‐ラクチド））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＧＡ（ポリグリコリド）、ＰＣＬ（ポリ‐ε‐カプロラクトン）、ＰＬＣＬ（ポリラクチド‐ｃｏ‐ε‐カプロラクトン）、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）、アルギン酸塩及びキトサンからなる群から選択されるポリマー、及び／又は
−  合成ポリマー、特にポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポロクサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒｓ）、ポリオキサゾリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリメチルビニルエーテル‐ｃｏ‐無水マレイン酸、ポリラクチド、ポリ‐Ｎ‐イソプロピルアクリルアミド、ポリグリコール酸、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、及びポリアリルアミン由来のポリマー、又はポリマーからなる群から選択されるポリマー、
−  天然線維、特にエラスチン、レジリン、及びシルク及びそれらの誘導体から選択される天然線維；
−  生体適合性導電材料、特に遷移金属タンタル及び導電性ポリマーポリピロール（ＰＰｙ）。
【００３４】
ある実施形態において、粒子は、油乳濁液中で、または沈殿によって、上記のバイオポリマーから形成される。ある特定の実施形態では、そのようなバイオポリマーはアルギン酸塩である。
【００３５】
ある実施形態において、前記組織粒子は、耳介軟骨、鼻軟骨、髄核、半月板、気管、鼻軟骨、肋軟骨、関節軟骨、滑液、硝子体液、脳、脊髄、筋肉、結合組織、小腸粘膜下組織及び肝臓からなる群から選択される組織由来である。
【００３６】
ある実施形態では、細胞適合性ポリマーは天然ポリマーである。
【００３７】
ある実施形態では、細胞適合性ポリマーは、種々のアシル化度を有するジェランガム、特にアシル化が１００％〜１０％の範囲のアシル化を有し、高くて１００％まで有し、場合によりアルギン酸塩、硫酸アルギン酸塩、ヘパリン、線維素、ヘパリン硫酸、エラスチン、トロポエラスチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化ヒアルロナン、セルロース、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリ‐ｌ‐リジン、キトサン、シルク及びコラーゲンの種々のタイプ及びこれらの硫酸化型からなる群から選択される添加剤を含む。
【００３８】
ある実施形態では、前記粒子の≧９０％、≧９５％又は≧９８％は、５μｍ〜１０００μｍ、特に５μｍ〜５０μｍ、５μｍ〜２００μｍ、５０μｍ〜２００μｍ又は２００μｍ〜１０００μｍの範囲にある。
【００３９】
ある実施形態において、前記線維は、長さが、５μｍ〜５０μｍ及び５０〜５００μｍの範囲の大きさであり、そのアスペクト比が、２〜１０００の範囲、特に１０〜５００、より特定的には１００〜５００、１００〜１０００、２００〜１０００又は５００〜１０００の範囲を有する。ある実施形態では、シルク線維は、１μｍ又はそれ未満の直径を有し、且つ５００〜１０００μｍ又はそれより大の長さを有するものが使用される。本明細書の文脈中での用語の使用のために、アスペクト比は、線維の長さ対直径の比として定義される。
【００４０】
ある実施形態において、前記哺乳動物細胞は、軟骨細胞、又は軟骨前駆細胞、又は軟骨前駆細胞又は軟骨細胞に分化することができる幹細胞である。
【００４１】
ある実施形態では、哺乳動物細胞は、原発性自家培養軟骨細胞、原発性同種軟骨細胞、軟骨前駆細胞、軟骨芽細胞、間充織幹細胞、誘導多能性幹細胞及び脂肪由来幹細胞からなる群より選択される。
【００４２】
ある実施形態では、印刷ミックスは：
−  １〜６％（ｗ／ｖ）、特に約３％（ｗ／ｖ）の前記ゲル化多糖類；
−  ０．５〜１０％（ｗ／ｖ）、特に約４％（ｗ／ｖ）の前記粒子、
−  場合により、０．５〜８％（ｗ／ｖ）、特に約２％（ｗ／ｖ）の前記添加剤
を含む。
【００４３】
ある実施形態では、印刷ミックスは：
−  約３％（ｗ／ｖ）のジェランガム；
−  約４％（ｗ／ｖ）の軟骨組織粒子、
−  約２％（ｗ／ｖ）のアルギン酸塩、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＢＦ３
−  １０６〜１０７の軟骨細胞／ｍｌ
を含む。
【００４４】
ある実施形態において、印刷ミックスは、犠牲ポリマーと共に沈着される。
【００４５】
これにより、張り出し構造の生成が可能になり、これは特に鼻および耳の所定の特徴を形成する際に重要である。
【００４６】
ある実施形態において、印刷ミックスは、犠牲ポリマー足場上に沈着される。
【００４７】
ある実施形態では、犠牲ポリマー足場は印刷ミックスと共沈着される。
【００４８】
ある実施形態では、犠牲ポリマー混合物及び／又は足場は、二価カチオン又はゲル化/重合の他の薬剤を含む。
【００４９】
犠牲ポリマー混合物を印刷ミックス中に拡散することによって、これらのカチオン又は他のゲル化/重合剤が足場の三次元構造の迅速な形成を可能にする。
【００５０】
ある実施形態では、三次元形態及び／又は前記犠牲ポリマー足場は、３‐Ｄ‐印刷法、特に前記患者の対側臓器の三次元コンピュータモデルに基づいて誘導される。
【００５１】
ある実施形態では、三次元モデルは、コンピューター断層撮影、磁気共鳴映像法、レーザー走査又は三次元カメラの利用により得られる。
【００５２】
ある実施形態において、コンピュータモデルは、勾配による耐荷重性をサポートし、且つより良好な細胞生存率および多孔性のための内部構造を形成するために作製される。
【００５３】
ある実施形態において、ポリマー足場は、積層造形方法によって誘導される。
【００５４】
ある実施形態では、積層造形方法は、インクジェット印刷、バイオプリンティング、押出印刷又は積層方法（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ）である。
【００５５】
ある実施形態では、ポリマー足場は、内部ポリマー勾配、多孔性および支持領域によって特徴付けられる。
【００５６】
ある実施形態では、インクが一貫して押出され、フィルタ加圧現象により塞がれないように、マトリックス液体粘度を高めるために追加のポリマーが添加される。
【００５７】
ある実施形態において、犠牲ポリマーは、前記細胞培養工程の前または後に除去される。
【００５８】
ある実施形態では、組織粒子及び／又はバイオインクは、特にＢＭＰ‐２、ＢＭＰ‐７、ＴＧＦ‐β１、ＴＧＦ‐β２、ＴＧＦ‐β３、及び／又はＦＧＦ‐２から選択される増殖因子又は増殖因子の組合せを含み、及び／又は分裂促進因子、特にＩＧＦ‐１を含むことにより治癒および再生を促進する。
【００５９】
ある実施形態では、増殖因子をバイオインク混合物に直接的に担持することができる。ある実施形態では、前記増殖因子の濃度は、０．１〜５ｍｇ／ｍｌ、５〜５０ｎｇ／ｍｌ又は５０〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲にある１つの増殖因子又はいくつかの増殖因子の組み合わせである。ある実施形態では、増殖因子は、ＢＭＰ‐２、ＢＭＰ‐７、ＴＧＦ‐β１，２，３、ＩＧＦ‐１及び／又はＦＧＦ‐２から選択される。
【００６０】
ある実施形態では、印刷ミックス、特に粒子は、添加成分、特に増殖因子、抗酸化剤、サイトカイン、薬物および生物製剤から選択される成分を含む。
【００６１】
ある実施形態では、犠牲ポリマーは、架橋を開始させる薬剤を結論付け、この薬剤は、一価、二価及び三価カチオン、酵素、過酸化水素、西洋ワサビペルオキシダーゼ、放射線重合性モノマー、例えばリチウムフェニル‐２，４，６‐トリメチルベンゾイルホスフィン酸塩である。
【００６２】
ある実施形態において、架橋開始基は、印刷ミックス中に存在し、特に光暴露、カチオン媒介架橋及び酵素媒介架橋に関与する基から選択される。
【００６３】
本発明の別の態様は、移植片修復を提供する方法であって、
−  前記の特許請求の範囲のいずれか一項に記載の方法により移植片足場を提供すること、及び
−  細胞培養工程において、哺乳動物細胞、特に軟骨細胞、幹細胞または軟骨前駆細胞を含む細胞培養培地中に、前記無細胞足場を沈着させることを含む方法。
【００６４】
本発明の別の態様は、本発明の前述の方法のいずれか一つに記載の方法、又は特定の実施形態又はこの特定の実施形態によって提供される特徴の組み合わせのいずれかによって得られる、又はそれによって得られうる移植片足場に関する。
【００６５】
本発明は、積層造形方法によって製造された患者固有の頭蓋顔面再建移植片を提供する。軟骨組織移植片は、軟骨採取の必要性を無くし、患者の不快感を減少させ、手術時間を短縮し、且つ形状、サイズ及び機械的柔軟性のより良好な複製を可能にする。さらに、より速い組織再生及び増加した細胞増殖を達成して外科的回復を促進することができる。頭蓋顔面適用のために、この技術は、現在使用されている皮膚増強処置（すなわち、エキスパンダ）又は他の天然又は合成皮膚移植片と組み合わせることができる。
【００６６】
印刷
本発明によれば、患者固有の耳介及び鼻移植片は、積層造形方法、例えばこれに限定されるものではないが、押出印刷、インクジェット印刷及び他の積層沈着方法などを利用することにより、患者からの三次元走査モデルに基づいて製造される。臨床コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、レーザー走査又は三次元カメラのような三次元画像ツール又はこれらの組み合わせを使用して、患者固有のインプラントのコンピューター化モデルを生成する。耳の再建のために、画像を鏡映して、組織移植片作製のために反対側の耳を正確に模倣する計算モデルを生成することができる。耳と鼻の再建のために、移植片モデルのライブラリーを使用して、特に、正常な対側スキャンが実行できない場合に、患者のための移植片の選択を提供することができる。これらの方法は、特定のサイズ縮小ツールを使用して、皮膚層の厚さにより軟骨フレームワークの寸法を減少させて適切なサイズの最終移植片を達成する場合に、より美容的で審美的な結果をもたらすことができる。積層造形方法は、これらの構築物を高精度かつ無菌条件下で作製する際に利用することができる。さらに、大きな構築物における細胞生存のための内部支持構造および多孔性は、患者のニーズに応じて患者固有の形状及び／又は剛性に追加することができる。血管柄付き軟骨は、壊死を防ぐために、皮膚およびそれに近接した他の組織をその上に重ねるための血管構造を宿すように設計することができる。印刷された軟骨フレームワークは、上部組織、放出増殖因子及び他の分泌分子の構築のための生物活性テンプレートとして使用して、隣接する細胞の生存能力を高めることができる。この放出は、混合物中に硫酸化ポリマーを有することにより、増殖因子を細胞の近傍に結合させ、且つ分子をゆっくりと放出させるように特別に設計することができる。
【００６７】
ある実施形態では、３Ｄ形状は、勾配による耐荷重性をサポートし、且つより良好な細胞生存および多孔性のための内部構造を形成するためにコンピュータモデルとして作成することができる。
【００６８】
材料
バイオインク材料は、少なくとも１つの細胞適合性ポリマーと、及び粒子および細胞の少なくとも１つとを含み、架橋は、反応基および分子の自発的または外部的に誘発された反応によって提供され、これらのタイプの少なくとも１つは、ポリマー、刻まれた組織及び細胞の少なくとも１つに存在する。本方法に使用する細胞適合性ポリマー（以下、「ポリマー」と称する）は、必要な細胞適合性を有する任意の適切なポリマーであってよく、すなわち、それらの存在は細胞に対して有害ではない。それらは、天然（バイオポリマー）又は合成材料、又はこれらの組み合わせであってよい。架橋を可能にするために必要な反応基は既にポリマー上に存在していてもよく、又はポリマーはそのような基を含むように修飾されていてもよい。天然ポリマーの非限定的な典型例として、アルギン酸塩、硫酸アルギン酸塩、ヘパリン、線維素、ヘパリン硫酸、エラスチン、トロポエラスチン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化ヒアルロナン、セルロース、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリ‐ｌ‐リジン、キトサン、ゼラチン、様々なアシル化度のジェランガム、硫酸ジェラン、グアーガム、カッシアガム、コンニャクガム、アラビアゴム、ガッティガム、ローカストビーンガム、キサンタンガム、硫酸キサンタンガム、カラギーナン、硫酸カラギーゲン、シルク及び種々のタイプのコラーゲンを含む。これらのポリマーの全ての硫酸化型が含まれる。
【００６９】
合成ポリマーの非限定的な典型例として、以下には限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポロクサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒｓ）、ポリオキサゾリン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリメチルビニルエーテル‐ｃｏ‐無水マレイン酸、ポリラクチド、ポリＮ‐イソプロピルアクリルアミド、ポリグリコール酸、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、及びポリアリルアミン由来のポリマー、又はそれらポリマーが挙げられる。
【００７０】
ポリマー、粒子及び細胞の少なくとも１つに存在する基の「少なくとも１つ」とは、付加された反応基がこれらの実体の全て又はいずれかに存在し得ることを意味する。
【００７１】
ポリマー溶液に組み込まれる粒子は、細胞外マトリックス組織粒子、装填または非装填ビーズ及び線維であって、５〜５００ミクロンの範囲のサイズを有するものからなるがこれに限定されない。
【００７２】
架橋
材料の組み合わせ、粒子及び細胞に基づくヒドロゲルの形成は、一価の、二価の、三価のカチオン、酵素およびラジカル開始剤を含むが、これに限定されない多くの因子または薬剤によって開始することができる。さらに、物理的及び物理的−化学的方法、例えば、製造プロセス中、低ｐＨ溶液又は高ｐＨ溶液及び異なる温度領域での処理を採用することができる。
【００７３】
ある実施形態では、前記印刷ミックス及び前記ポリマー足場のいずれか１つは、前記粒子に共有結合している反応基、特に前記印刷ミックスまたはその構成成分が前記粒子に結合することを促進する反応基を含み、この結合は、自発的または外部的に誘発された反応による架橋によるものであり、ここで反応基はポリマー、刻まれた組織及び細胞の少なくとも１つに存在し、組織移植片のような機能的且つ天然の軟骨様組織移植片を再構築する。
【００７４】
粒子
使用される刻まれた組織のサイズは、任意の適切なサイズであり得るが、特定の実施形態では、５ミクロン〜５００ミクロンであるので、ニードルまたは弁などの分配ユニットを詰まらせることなく押し出すことができる。この方法で使用される刻まれた組織は、任意の適切な組織であり得るが、それは、軟骨の組織と類似または同一の性質の組織であることが有利である。適切な組織の例示的かつ非限定的な例は、関節軟骨、髄核、半月板、気管、鼻軟骨、肋軟骨、耳軟骨、滑液、気管軟骨、硝子体液、脳、肝臓、脊髄、筋肉、結合組織及び皮下脂肪、膝蓋下脂肪体（ｉｎｔｒａｐａｔｅｌｌａｒ  ｆａｔ  ｐａｄ）、小腸粘膜下組織を含む。特定の例は、高含量のエラスチン及びグリコサミノグリカンを有する組織であり、特定の例は、あらゆるタイプの軟骨、髄核及び半月板である。組織は、任意の適切な方法によって刻まれることができ、代表的かつ非限定的な方法として、均質化、凍結粉砕、乾式製粉、切断、チョッピング、破砕およびスライシングを含む。組織は、脱細胞化を受けて、急性炎症応答及びＨＩＶを含む病原体を引き起こし得るエピトープを除去することができる。最近、脱細胞化された組織、すなわち、細胞が殺され、その残骸が除去された組織は、足場が単一の材料からなるより簡単なアプローチに対し足場材料代替物として関心を集めている（Ｈｏｓｈｉｂａら他、「組織工学のための脱細胞化されたマトリックス」、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１０；１０：１７１７−２８）。組織脱細胞化は、機能の再現に必要な高解像度の構造および生物学的合図を保持するので、損傷または病変組織の再生に理想的に適した細胞外マトリックスの足場をもたらす。脱細胞化は、例えば、界面活性剤、過酸化水素、水酸化ナトリウム及び酵素、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼを用いて行うことができる。粒子は、以下に限定されないが、親水性／疎水性相互作用によるコロイド形成、二相エマルションおよび油界面のような方法によって製造することができる。線維は、限定されるものではないが、電界紡糸、線維押出および線維牽引などの方法により製造可能である。あらゆる種類の粒子および線維は、任意の適切な方法、例示的且つ非限定的な方法により刻まれることができ、その方法として均質化、凍結粉砕、乾式粉砕、切断、チョッピング、破砕及びスライシングが挙げられる。これらの付加的な組織片、粒子及び線維は、担体ポリマー又はこれらの材料の組み合わせに結合する官能基でさらに修飾されてもよく、又は架橋のための反応基を露出するように処理されてもよい。さらに、増殖因子、抗酸化剤及び薬物分子は、添加されたポリマー、組織片、粒子及び線維の中または上に担持されてもよい。
【００７５】
細胞
本明細書における用語「細胞」の使用は、個々の細胞、特に哺乳動物細胞、より具体的にはヒト細胞、最も具体的には自己ヒト細胞を包含するが、スフェロイド、ペレットおよび微小組織を形成する上記の細胞の凝集物をも包含し、このことは、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されている。この方法に使用される細胞は、軟骨組織上に存在するものと同様のタイプの細胞であるのが有利である。適切な細胞型の典型的且つ非限定例には、原発性自家培養軟骨細胞、原発性同種軟骨細胞、軟骨前駆細胞、軟骨芽細胞、間充織幹細胞、誘導多能性幹細胞及び脂肪由来幹細胞、神経堤由来幹細胞が含まれる。
【００７６】
印刷ミックス材料
本明細書の文脈における「印刷ミックス」という用語は、以下の主要構成成分を含む押出された集合体を指す：
−  天然の（任意に乾燥した）組織又は線維でできている、又は生体適合性ポリマー、任意に生体吸収性のポリマー、又はポリマーと天然の組織／線維との両方でできている粒子、
−  ゲル化多糖類、特にジェランガム又はその誘導体の水溶液、及び
−  哺乳動物細胞。
【００７７】
印刷ミックス材料の組成は、材料の性質及び最終用途に応じて、広範囲にわたって変化させることができる。ポリマーは、典型的には０．５〜２０％の重量割合で存在する。刻まれた組織、粒子又は線維が存在する場合、それらは、典型的には、乾燥ポリマーの１０〜４０％、又は全重量の１〜２０％の重量割合で存在する。細胞が存在する場合、細胞は典型的には３×１０６細胞／ｍｌ〜５０×１０６細胞／ｍｌの濃度で使用される。
【００７８】
上記の主要成分に加えて、架橋性材料は、材料に特定の特性を付与するために存在する他の材料を含むことができる。１つの具体例は、エラスチンであり、これは耳介及び鼻のＥＣＭに豊富にあり、組織の弾性を提供するものであり、他の例としては、増殖因子、サイトカイン、薬物、生物製剤、低分子干渉ＲＮＡ、ＤＮＡ、ポリフェノールなどの酸化防止剤が高分子溶液内に含まれ、組織の再生を増強することができる。添加された増殖因子は、硫酸化ポリマー又は未修飾ポリマーに結合して、印刷混合物中に存在する細胞の近傍への送達及び有効性を高めることができる。
【００７９】
すぐに使用できる形態の印刷ミックス材料は、熱的に容易にゲル化された状態であり、製造プロセスにおいて所望の形状を得るために容易に適用できる。分子及び凍結乾燥された刻まれた組織の粉末、粒子及び繊維は、別々に保存および滅菌することができる。全ての成分は、包装の前に組み合わせるか、又は使用直前に再水和させて、長期間にわたって増殖因子及びタンパク質を保存することができる。
【００８０】
形状
患者固有の組織移植片は、各患者に合わせて調整されるか、又は患者の画像化が望ましくない又は不可能な状況の場合、ある種のモデルカタログを作成することができる。外耳および鼻のスキャンから得られた三次元モデルは、内部支持構造、多用途の機械的特性のためのポリマー勾配、及び大きな構造物における細胞生存の増強のための多孔性を含むように改変することができる。さらに、領域は、例えば、細胞増殖の領域的変動を誘導するために、剛性、増殖因子混合物及び濃度の点で調整することができる。例えば、軟骨移植片の周囲は、より多孔性でもより軟質であってもよく、より深く構造内へより多くの栄養素を流すことができる。また、領域特異性および組織型は、これらの構築物にみられ、例えば、耳たぶでは脂肪が主な組織であり、及び機械的特性の原因となる。この領域特性及び特定された構造は、積層法で簡単に作成できる。このような階層化アプローチでは、架橋機構は個々の層内だけでなく隣接する層間でも起こるため、完全に一体化した連続構造を形成する。これは、反応分子リザーバーを含む支持構造と接触する構築物の周辺で架橋を開始することによって達成することができる。
【００８１】
サポート
支持構造は印刷ミックス材料と共沈着して、張出し構造を支持し、架橋を開始し、又は沈着中の材料の乾燥を防止することができる。支持材料は、架橋因子を含むことができ、この因子は限定されないが、一価、二価、三価のカチオン、酵素及びラジカル開始剤を含む。さらに、物理的及び物理的‐化学的方法を使用することができ、これは、支持材料相互作用によりｐＨおよび分子濃度を変更する方法である。構築物製造後、支持構造を溶出することができる。溶出は、温度変化、ｐＨ変化又は分解する分子に起因するが、これに限定されない。
【００８２】
結果物は、迅速で、効果的で、長持ちする軟骨修復である。寿命は、細胞の十分なＥＣＭ産生が達成されて天然の軟骨様構造を生成するまで、機械的特性を維持するために、移植片における重要な要素である。
【００８３】
本開示の方法を適用することができる用途の典型的な例には、以下が含まれる：
−  頭蓋顔面欠損の再建；
−  部分的な組織の喪失の補充、再建且つそれらを天然の組織との統合；
−  気管（気管（ｗｉｎｄｐｉｐｅ））、半月板又は肋軟骨を患者固有の移植片で再建;
−  骨軟骨欠損の充填。
【００８４】
本発明の方法は、以下の利点を特徴とする：
−  患者固有の組織移植片を頭蓋顔面および整形外科用途、例えばこれに限定されないが耳、鼻、関節軟骨のために製造する可能性。
−  曲げ特性を調整して足場を天然の組織の物理的パラメータ及び特異的領域に一致させる可能性。
−  よりコンパクトなポリマー及び強化構造の機能的な耐荷重領域を含み移植片の機械的特性を調整する可能性。
−  軟骨採取の必要性を排除することにより、患者のより高い満足度、疼痛レベルの減少の提供。
−  組織特異的細胞外マトリックス成分の複雑な配列を生理学的に正確な割合で既に含有する自家、同種又は異種の天然組織を利用すること。これらの粒子は、主に軟骨細胞を刺激する増殖の合図に関与している。
−  任意の可能なＥＣＭ粒子からの組織断片を、その生化学組成を損なうことなく任意の所望の幾何学的形状を生成するための積層造形目的のためにヒドロゲルブレンドに組み込むことができ、それにより臓器バイオプリンティングの可能性が高まる。
−  足場内に治療因子を組み込む可能性があり、以下に限定されるものではないが、医薬化合物、増殖因子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、及び遺伝子治療ベクターを含む。さらに、足場への宿主細胞の移動を誘導するホーミング分子を含めることができる。
−  積層造形技術を用いて様々な組織／組成物を積層することによって組織構造のゾーン構造を達成する可能性。
【実施例】
【００８５】
実施例１ａ：患者固有の組織移植片のバイオプリンティング
臨床的コンピューター断層撮影撮像を行い、得られた計算上の三次元物体（図１）を得た。その後、患者固有の外耳モデルを対側に対してミラーリングし、新しい３Ｄモデルを生成した。新しいモデルと共に、外部支持構造モデルが、特に印刷中の張出し領域で耳構造を支持するために生成された。支持構造は、架橋を開始し、張出した特徴を支持するために戦略的に重要な場所でインクと接触するように設計された（図５）。支持材料の同時押出により、支持体の溶出後に印刷された形状を正確に保持し、且つ垂れ下がることなく水平なバイオインクラインを保持することが示された。さらに、より高密度のポリマーの内部支持構造は、内部構造においてより良好な力配分が可能となるように調製された（図２、３）。すべてのモデルは、ＳＴＬ‐コンバータ（ＲｅｇｅｎＨＵ）のマシンコードに変換され、印刷プロセスのためにバイオプリンタ（ＢｉｏＦａｃｔｏｒｙ、ＲｅｇｅｎＨＵ）に転写された。
【００８６】
同じ技術を使用して、本発明者らは、半月板、椎間板および鼻を含むいくつかの軟骨構造の印刷を実証した。２成分椎間板移植片は、髄核および線維輪を模倣する２つのバイオインク組成物で印刷することができた。
【００８７】
実施例１ｂ：三次元印刷目的用の軟骨粒子の製造
軟骨の薄層をＰＢＳおよびペニシリン‐ストレプトマイシン１％を含有するペトリ皿へ除去することにより、軟骨を新鮮なウシ関節軟骨又は耳介軟骨から採取した。採取した軟骨をクライオミル（Ｒｅｔｓｃｈ）に移し、３０Ｈｚの強度で３サイクル粉砕した。粉砕した軟骨を収集し、所望の粒度範囲にふるい分けることができる乾燥粉末を得るために凍結乾燥した。これらの粒子は、増殖因子又は他の分子をさらに担持して、増殖率および他の細胞応答を増強することができる。担持後、粒子を凍結乾燥し、且つ凍結保存して、長期貯蔵寿命のために生体分子の利用可能性を最大にした。
【００８８】
実施例１ｃ：印刷ミックス材料の調製および印刷工程
３．５％濃度のジェランガムをアルギン酸塩３％と組み合わせることにより、印刷ミックス材料（「バイオインク」）を製造した。ジェランガムを超純水に対して透析して、材料中のカチオン残留物を最小限に抑えた。透析は７０〜８０℃の超純水で３日間にわたり、水を１日に１〜２回交換しつつ行った。ジェランをさらに凍結乾燥して乾燥粉末を得た。精製されたジェランガムを、脱イオン水を含むグルコースに溶解して細胞適合性を高め、アルギン酸溶液を添加してポリマーの最終濃度を得た。ポリマーブレンドをＥＣＭ粒子及び６×１０６細胞／ｍｌと混合して最終印刷ミックス材料を得た。この印刷ミックス材料は、陽性対照と比較して有意に細胞増殖を刺激した（図４）。軟骨細胞外マトリックス産生を、バイオインク単独、バイオインク＋ＥＣＭに増殖因子ＴＧＦ−β３を加えたもの、及びバイオインク＋ＥＣＭに増殖因子ＴＧＦ−β３がないものについて培地でそれぞれ培養して８週間後の組織構造および免疫染色により評価した。増殖因子のないバイオインク＋ＥＣＭは、バイオインク単独より大きく細胞増殖を刺激し、これはＨ＆Ｅ染色ではっきりと見えた。バイオインク＋軟骨粒子はアルシアンブルー染色でわずかな増加を示し、且つわずかなコラーゲンＩＩ染色が観察されたことから、さらなる増殖因子刺激の必要性を示唆した。細胞は、増殖因子がない粒子の周辺で度々増殖を示す一方で、ＴＧＦ‐β３を含むバイオインク＋軟骨粒子は部位特異的増殖を有さず、これは粒子が細胞分裂促進増殖因子の供給源であることを示唆する。８週間後、足場の肉眼的形態は、ＴＧＦ‐β３を補充したサンプルのサイズおよび不透明な外観に見られるように、増殖因子刺激が軟骨マトリックス産生に明確な効果を有することを示唆した。両方の補充されたバイオインク組成物は、軟骨ＥＣＭ成分の有意な増加を示し、且つ天然軟骨の細胞密度及びＧＡＧ含量に類似し始めた領域を有していた。さらに、増殖因子を補充した条件では移植片全体にわたってコラーゲンＩＩ沈着が強かったのに対し、ＴＧＦ‐β３なしで培養したサンプルでは、細胞周囲染色のみが見られた。コラーゲンＩ型及びアリザリンレッド染色を行い、線維軟骨の産生および石灰化を決定した。コラーゲンＩは、バイオインク＋軟骨粒子及び両ＴＧＦ‐β３補充された条件で見出され、これは、おそらく細胞の継代が原因で、いくらかの線維軟骨産生を示唆する。全ての条件において、石灰化は存在せず、これは軟骨細胞の軟骨表現型が安定していることを示唆する。
【００８９】
印刷ミックス材料を基材上に印刷し、支持ポリマーＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を同時押出しして次の層を充填した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃは２０ｍＭのＳｒＣｌ２を含み、インクとの接触時にバイオインク架橋を開始した。カチオンは、浸透圧バランス及び静電気力によって印刷ミックス材料中に拡散し、架橋を開始した。
【００９０】
構造物は、４１０μｍの針と８００ｍｍ／分の送り速度で生成された。押出シリンジに付される圧力を、１．２〜１．４バールの間で変化させた。所望の形態に材料の積層による沈着の後、犠牲支持体Ｐｌｕｒｏｎｉｃを２０ｍＭのＳｒＣｌ２浴で数分間溶出させた後に、構築物を３７℃の細胞培養培地に移した。図１は耳軟骨内部支持構造を示し、図６は、この技術によって生成された鼻移植片を示す。図２は、高剛性ヒドロゲルに匹敵する架橋後の初期貯蔵弾性率が１００ｋＰａであることを示している。
【００９１】
実施例２：機械的特性および増殖因子保持のために最適化されたバイオインク組成物
バイオインク調製：ジェランを９０℃で超純水を含むＤ‐グルコース（３００ｍＭ）に添加して、８５％が低アシルジェランガムであり、２５％が高アシルジェランガムである３．５％溶液を得た。アルギン酸塩をこの混合物に加えて２．５％溶液を得た。煮沸フラスコを、溶液が均質になるまで、典型的には１時間、撹拌しながら９０℃に保った。均質な溶液を細胞混合の前に３０℃まで冷却した。簡単に説明すると、ウシ軟骨細胞（４×１０６細胞／ｍｌ）をＤＭＥＭ溶液中で混合し、１：１０の体積比で培地中のバイオインクに添加してバイオインクを予備架橋した。溶液が室温に達するまで混合を行い、印刷シリンジを装填した。
【００９２】
高アシル（ＧＧ−ＨＡ）および低アシル（ＧＧ−ＬＡ）のジェランガム組成物（図８）は、最終的なバイオインクの剛性および弾性に寄与する。アシル化形態間の比を変化させることにより、材料をより強固に架橋することができ、より剛性の高いマトリックスを得ることができる一方で、架橋する際にポリマー鎖の緊密な充填を破壊することによって、より弾性のあるマトリックスを生成できる。これらのパラメータは、８５％ＧＧ‐ＬＡ、２５％ＧＧ‐ＨＡの組成物における頭蓋顔面適用に最適であり、この組成物は、極限応力が２３０ｋＰａまで且つ破損時の平均歪み６８％の調整可能な架橋特性を提供する（図３）。バイオインクにおける増殖因子の保持をさらに最適化するために、２％の濃度の硫酸化ジェランガム（ＧＧ‐３％）（図８）をバイオインクに添加した。この組成物は、非硫酸化バイオインクと比較して、担持された増殖因子、この場合はＴＧＦ‐β３およびＦＧＦ‐２をバイオインク内に保持する点で優れていた。
【００９３】
実施例３：任意の印刷材料および支持材料との架橋プロセス
チラミン３％と結合したヒアルロン酸添加剤とベースポリマージェラン３％とを一緒に混合して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及び過酸化水素の存在下で酵素的に架橋可能なヒドロゲルを生成させた。生理的オスモル濃度、特に３００ｍＭで単糖グルコースの存在下で材料を脱イオン水に溶解した。４％（ｗ／ｖ）の濃度のヒドロキシアパタイト粒子をポリマー混合物に添加した。このバイオインク組成物は、ＨＲＰが１単位／ｍｌ濃度のバイオインクと、又は０．００１２％濃度の過酸化水素と共にプルロニックＦ１２７  ３０％混合物とのいずれかに混合された場合に、ＨＲＰおよび過酸化水素の存在下でさらにバイオプリントされた。積層構築された足場は支持構造と接触すると直ちに架橋された。支持構造は低温媒体中で溶出され、細胞の存在下で過酸化水素の負の効果を減少させた。その後の過酸化水素残留物の量を最小にするために、その構造を数回洗浄した。
【００９４】
実施例４：バイオプリンティングのための線維強化材料
ジェラン３％を脱イオン水に溶解し、且つ１０％（ｗ／ｖ）ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）線維をチョップドエレクトロスピン線維としてそのジェラン溶液に添加した。線維を走査型電子顕微鏡法で画像化して、線維の直径を約２ミクロンに決定した。線維強化ジェランをせん断の前に画像化し（図７左）、且つ２分間２つの異なるせん断配向の後に画像化した（図７中央および右）。線維配向はすでに２分後には一軸せん断で大きく増加した。さらに、一軸ではあるが単方向ではないせん断は、せん断方向に対して５０ミクロンより短い線維を配向させ、これにより、マトリックス中に異種の耐荷重構造を形成することを可能にする。しかし、５０ミクロンよりも長い線維は、せん断の方向が変わったときに、せん断の配向を維持することができなかった。押出印刷の間、せん断パターンはノズル内で一方向且つ一軸性であり、したがって線維を流動方向に配向させる。流れを速やかに停止させると、線維の配向を一軸性に保つことができ、構造の耐荷重能力に影響を与える。これらの構造は特性に影響され、例えば関節軟骨のコラーゲンＩＩ線維は異なる軟骨層の配向を変化させる。
【００９５】
実施例４ａバイオインク架橋
典型的なバイオインクは、ヒト微粉化軟骨粒子またはＨＡ粒子（≦４０μｍサイズ）と混合されたアルギン酸塩及びジェランの混合物である。一価、二価または三価のカチオンを添加すると、ゲル化（ゾル‐ゲル転移）が、分子のコイル部分を介して三次元ネットワーク内に連結される接合ゾーンへのヘリックス凝集体として生じる。印刷プロセスは、３つの段階、すなわち、バイオインク印刷前、印刷プロセスおよび印刷後架橋に分けられる。最初に、バイオインクをシリンジに充填し、支持ポリマーを第２のシリンジに充填した。この段階で、少量のカチオンがバイオインクに存在させて粘度を高め、印刷特性を向上させた。印刷プロセスの間、支持体とカチオンとの同時押出物は印刷構造の周囲に拡散して架橋を開始した。最終的な構造が完成した後、支持体を４℃のカチオン添加培地で溶出することができる。
【００９６】
実施例４ｂ：レオロジー解析
カチオンに関連する粘度増強特性および架橋特性は、レオロジーおよび機械的試験によって調べることができる。バイオインク、バイオインク＋ＨＡ、及びバイオインク＋軟骨粒子のレオロジー特性をＡｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＭＣＲ  ３０１（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ、Ｚｏｆｉｎｇｅｎ、スイス）レオメーターで測定し、せん断挙動およびせん断回復を決定した。すべてのバイオインク組成物は、押出しに重要なせん断減粘現象を示した（図１１ａ）。さらに、すべての組成物は、押出前の降伏点（弱いゲル形成）を有し、これはシリンジ中の粒子及び細胞沈降を防止する上で重要である（表１）。
【００９７】
【表１】
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【００９８】
表１．レオロジー測定の概要。降伏点はＨｅｒｓｃｈｅｌ／Ｂｕｌｋｌｅｙ方程式を用いて計算した。＊２番目のせん断シーケンス後１０秒の時点でのせん断回復。
【００９９】
せん断回復曲線（図１１ｂ）は、印刷プロセス後のバイオインク構造の回復を示す。２番目のせん断シーケンス後のせん断回復は、１０秒後に、バイオインク＋軟骨粒子で９８％、バイオインク＋ＨＡで９０％であった。同時にバイオインク単独では元の弾性率の２１％だけが回復した。図１１ｃは、バイオインク単独のカチオン誘導架橋後の貯蔵弾性率Ｇ’を示し、ここでは、カチオン濃度及び供給源が明確な影響を与えた。図１１ｄは、３つのバイオインク組成物の最終貯蔵弾性率を示す。バイオインク＋軟骨粒子（９６ｋＰａ±１ｋＰａ）及びバイオインク＋ＨＡ（１１０ｋＰａ±２ｋＰａ）と比較して、バイオインク単独では、最高の最終貯蔵弾性率（１５２ｋＰａ±３ｋＰａ）を示し、架橋がその供給源にかかわらず粒子によって幾分妨げられることを示唆している。
【０１００】
実施例４ｃ：機械的特性および膨潤挙動
バイオプリントされた軟骨構造の機械的特性を引張りで評価した。細胞と共に、又は細胞がない状態でバイオインク＋ＨＡ粒子を用いて引張ダンベル標本を印刷した。標本のゲージ部におけるノズルの経路（印刷方向）は、引張りの方向と平行になるように選択した（図１２ａ）。ヤング率は、細胞構築物（Ｅ＝１１６ｋＰａ±６．８ｋＰａ）（ｐ＜０．００１）と比較して、無細胞構築物（Ｅ＝２３０ｋＰａ±７．０ｋＰａ）において有意に高く、これは細胞が構築物のコンプライアンスを増加させ、及び／又は架橋を阻害することを示唆する。無細胞構築物（３７％±６．４％）及び細胞構築物（３４％±２．１％）（ｐ＝０．５４）の間では、破壊歪みに差はなかった。
【０１０１】
粒子と共に、又は粒子の無いバイオインクの膨潤を定量化して、ゲルの架橋後の総保水性および保水性を評価した（図１２ｃ〜ｄ）。３７℃で４８時間まで膨潤させると、ヒドロゲルの重量は、サンプルの乾燥重量の２０００〜３８００％で増加し、これは典型的なヒドロゲルであり、ヒドロゲルの架橋重量が２６％〜５４％の間にある。完全に水和された状態は２４時間後に達成され、より具体的にはバイオインク及びバイオインク＋軟骨粒子は５時間後に完全に水和され、これはより速い膨潤速度を示唆する。４８時間後のバイオインク単独と粒子有組成物との膨潤比どうしの比較から、粒子の種類に依存することを示唆した。
【０１０２】
実施例４ｄ：バイオインクとの適合性
粒子と細胞の間のすべての相互作用および増殖の合図を排除するためにバイオインク＋ＨＡを用いて細胞のバイオプリンティングプロセスを調べた。１層の厚いディスクを印刷して印刷後の細胞生存率を評価し（図１３ａ）、これを混合前の細胞の初期生存率と比較した。大きな構造の細胞生存率を調べるために、若い成人サイズの鼻（３．１ｃｍ、２．６ｃｍおよび１．５ｃｍ）を印刷し、構築物の中央の細胞生存率が中央のスライス（最小拡散距離５ｍｍ）から評価されるまで静的培養で維持した。粒子を用いたバイオプリンティングは、印刷後３時間で８０％の生存率を示したが、４日後には細胞生存率は９７％まで回復し、これは実験の終了時まで保たれた。若い成人のサイズの鼻移植片は、足場の中央で生存率が低下し（７日目で６０％生存細胞）、これは周辺部での９６％生存率と比較して低かった（図１３ｂ）。これは、栄養輸送を強化するために、内部多孔性またはチャンネルを組み込む必要性を示唆している。相互接続された多孔性を１．５ｃｍの高さの立方体に導入することにより、構造の中心部の生存率は周辺部と同じく高かった。このような栄養チャンネル又は人工的多孔性は、移植片内に支持ポリマーを押し出すことによってバイオプリント構造に組み込むことができ、その後の洗浄／架橋工程で後に除去することができる。この技術により、複雑な３Ｄ相互接続多孔質ネットワークを作製することができ、栄養豊富な培地で移植片を灌流するために使用される。栄養素の大量輸送をさらに強化するために、移植片はダイナミックバイオリアクター内で事前調整することも可能である。
【０１０３】
軟骨粒子および増殖因子、この場合はＴＧＦ‐β３の細胞増殖に対する補充の影響を、２１日間培養した鋳造ゲルで評価した。バイオインク単独では細胞増殖を刺激しなかった；実際には、７日目にはＤＮＡの消失があり、これは徐々に回復した。一方、バイオインク＋軟骨粒子では、増殖を刺激し、且つ２１日間にわたりＤＮＡにおいて統計学的に有意な増加（ｐ＜０．００１）が生じた。ＴＧＦ‐β３を補充した場合には、７日目に、サンプルを含有する軟骨粒子にＤＮＡの統計的に有意な増加があった（ｐ＜０．００１）。２１日目までに、両方のバイオインクはＤＮＡの増加を示したが、これは互いに統計的に有意ではなかった。
【０１０４】
実施例４ｅ：細胞外マトリックス産生および軟骨形成
軟骨細胞外マトリックス産生を、培養して３週間後及び８週間後に、組織学および免疫染色によりバイオインク単独及びバイオインク＋軟骨粒子において評価した。３週間後の組織学的評価により、ＴＧＦ‐β３（１０ｎｇ／ｍｌ）を補充した両方のバイオインク組成物において、細胞数、ＧＡＧ合成及びコラーゲンＩＩ産生の明らかな増加が示された。さらに、増殖因子のないバイオインク＋軟骨粒子は、バイオインク単独よりも大きく細胞増殖を刺激し、これは３週間および８週間のＨ＆Ｅ染色で、はっきりと見えた。両方の時点で、バイオインク＋軟骨粒子は、アルシアンブルー染色でわずかな増加を示し、８週間の時点でわずかなコラーゲンＩＩ染色が観察され、これはさらなる増殖因子刺激の必要性を示唆する。細胞は、増殖因子の補充がない粒子の周辺で増殖することがしばしば見られ、これは粒子内の増殖因子及び／又は細胞‐粒子の接着が重要であることを示唆する。しかし、ＴＧＦ‐β３サンプルを含むバイオインク＋軟骨粒子では、部位特異的な増殖は観察されなかったため、その結果はむしろ粒子が分裂促進増殖因子の供給源であり、特異的な細胞‐マトリックス接着の合図ではないことを示唆する。８週間後、足場の肉眼的形態は、不透明な外観および大きさの増加が観察されたことから、増殖因子による刺激が軟骨マトリックス産生に明確な効果を有することを示唆した。８週間で、補充されたバイオインク組成物の両方は、軟骨ＥＣＭ成分の有意な増加を示し、且つ天然軟骨の細胞密度及びＧＡＧ含量に類似し始めた領域を有していた。さらに、コラーゲンＩＩの沈着は、増殖因子補充条件下では移植片全体にわたって強かった一方で、ＴＧＦ‐β３なしで培養したサンプルでは、細胞周囲の染色のみが見られた。コラーゲンＩは、バイオインク＋軟骨粒子及び両ＴＧＦ‐β３補給された条件において見出され、これはおそらく細胞の継代に起因して、いくらかの線維軟骨が産生することを示唆する。全ての条件において、石灰化は存在しなかったことから、軟骨細胞の軟骨表現型が安定していたことを示唆する。
【０１０５】
実施例４ｆ：磁気共鳴画像法
印刷された構造の形状保持を評価するために、いくつかのＭＲＩ技術が評価された。印刷された鼻をＰＢＳで２週間保持して、Ｔ２重み付けＭＲ画像前の完全な腫脹を確実にした。これらの画像は閾値処理され、．ＳＴＬファイルに変換して、印刷に使用した元のモデルと、印刷直後の軟骨移植片と比較した。元のモデルと印刷された移植片との比較により、正確な材料押出および詳細な構造を示す。しかしながら、元のモデルと比較して、わずかに厚い鼻孔壁が観察された。さらに、印刷された構造を２週間の膨潤後のＭＲＩモデルに対して比較すると、鼻孔壁のわずかな厚みが観察されたが、形状の劣化または崩壊の徴候は検出されなかった。
【０１０６】
実施例５：バイオプリンティングプロセスパラメータ
再現可能な印刷プロセスの１つの重要な要素は、連続するラインの接続性である。ライン間隔の影響を評価するために、ラインの太さの最適化が行われなければならない。ラインの太さを９００μｍ±５３μｍに標準化するために、圧力、供給速度、および針の直径などの印刷パラメータを試験した。ラインの平均太さの決定後、有効なライン‐ライン接着力は、異なるライン間隔を有する一連の引張り試験をしたダンベルを印刷することによって調査した。ダンベルは破損まで引張り試験を行い、そのデータは、ライン間隔を増加させることによって構造の欠陥の可能性が増したことを示したことから、印刷された構造に対して再現性のある機械的特性を提供するために、ラインは、約４０〜５０％重複すべきことを示している。このデータは、破損時の最終的な応力は、２０％まで重複するラインの量を下げて試験したサンプルにおいて変動はなかったが、一方で、試験に対して安定性が十分でなかったサンプルの数は、ライン間隔の増加に伴い増加したことを示した。このデータによれば、最適なライン間隔は、問題のバイオインクの影響を受けるが、重複を増加させることによって、内部の印刷プロセスに関連する欠陥の確率が減少する。さらに、ラインの太さは、圧力、印刷速度、針の直径などのプロセスパラメータを変更することにより、自由に選択できる。
【０１０７】
新たに設計されたバイオインクについていくつかの機械的試験測定を行い、構造の再現性及び機械的特性に影響を及ぼすパラメータを調べた。印刷方向を変化させ、且つ細胞が担持されたバイオインクを用いて、印刷された標本の引張り評価から、ヤング率、極限応力及び破損歪は、４×１０６の播種密度で細胞を添加することにより変化しないことが示され、これは、細胞の体積分率（約〜１％）が強力な周囲マトリックスによって補われていることを示す。さらに、ダンベル標本を引張りに関して様々な印刷方向に、すなわち、引張りに平行に（０°）、引張りに垂直に（９０°）、及び引張りに対して４５°の角度で（４５°）、印刷された。印刷方向は、これらのグループ間で統計的に有意な差異は示さなかったことから、バイオプリントされた構造は、最終的な構造の推定された機械的荷重に基づいてではなく、印刷及びプロセス関連パラメータに基づいて設計できることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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