(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の化合物［（Ｅ）−４−（３−ブロモ−４−クロロアニリノ）ピリド［３，４−ｄ］ピリミジン−６−イル］アミノ］−４−オキソブト−２−エニル］ジメチル−［（３−メチル−５−ニトロイミダゾル−４−イル）メチル］アザニウムブロマイドを含有する、治療の必要な患者における、非小細胞肺癌、表皮癌、胃腫瘍、卵巣癌、食道扁平上皮癌、膀胱癌、頭頸部癌、及び膠芽腫からなる群から選択される癌を治療するための組成物であって、当該癌が野生型のＥＧＦＲタンパク質活性を有する、医薬組成物。
【請求項２】
約２０ｍｇ／ｍ2〜約１５０ｍｇ／ｍ2の範囲で前記化合物を含有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
単剤療法としての投与用に調製される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
静脈内投与用に調製される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
３日に約１回の頻度での投与用に調製される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
約１週間〜約６０週間の投与用に調製される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
３日に約１回約２４時間の投与用に調製される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
約１時間〜約６時間の点滴時間にわたる投与用に調製される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記癌が再発性又は難治性であるか、又は前記患者が標準的化学療法に適さない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記癌が非小細胞肺癌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記癌が表皮癌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記癌が胃腫瘍である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記癌が卵巣癌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記癌が食道扁平上皮癌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記癌が膀胱癌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記癌が頭頸部癌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記癌が膠芽腫である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記癌がＥＧＦＲタンパク質においてヘテロ接合性である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記癌が１つの変異ＥＧＦＲ対立遺伝子と１つの野生型ＥＧＦＲ対立遺伝子を有する遺伝型によって特徴付けられる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記癌が、ＥＧＦＲタンパク質の野生型活性においてホモ接合性である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記野生型ＥＧＦＲタンパク質の活性が、過剰発現又は上方制御である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
発現したＥＧＦＲタンパク質が野生型の活性部位を有している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記癌がＥＧＦＲ遺伝子の少なくとも１コピーのエキソン１９によって特徴付けられる、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記化合物が約３２ｍｇ／ｍ2の用量で投与される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記化合物が約２０ｍｇ／ｍ2の用量で投与される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記野生型ＥＧＦＲタンパク質が恒常的に活性化されている、請求項２１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、活性型又はプロドラッグ型のキナーゼ阻害剤を含有する組成物と、そのような組成物を単独で又は他の抗癌剤及び治療法と組み合わせて用いることにより、癌及び他の過剰増殖性疾患状態を治療する方法とを提供する。更に本発明は一般に分析試験に関し、より詳細には癌治療における表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の有効性を予測するための、バイオマーカーとしての遺伝子発現又は血液学プロファイルの分析に関する。更に本発明は、ＥＧＦＲ  ＴＫＩに対する耐性のリスクのある癌患者を同定する際に使用するためのキットに関する。従って本発明は、医学、薬理学、化学、及び生物学の分野に関する。
【０００２】
背景
キナーゼは、癌を含む広範な障害の治療における治療薬としてのキナーゼ阻害剤の開発をもたらした多種多様な細胞プロセスの調節において中心的な役割を果たす。癌の治療は困難である。なぜなら、正常細胞に影響を与えずに又は影響を小さくして癌細胞を死滅させることが困難なためである。癌治療中に正常細胞を死滅させたり又は有害な影響を与えると、患者に副作用を引き起こす可能性がある。エルロチニブ、ゲフィチニブ、及びアファチニブなどのＥＧＦＲ  ＴＫＩは、非小細胞肺癌（例えば、Felip et al. Clinical Cancer Research, 2008, 14: 3867-3874; Smith et al., 2008, Br. J. Cancer, 98:1630-32; Hamilton et al., 2006, Clin. Can. Res. 12: 2166-71 参照）、頭頸部又は皮膚の扁平上皮細胞癌（例えば、Calvo et al. Annals of Oncology, 2007, 18: 761-767 参照）、卵巣癌（例えば、Posada et al., Cancer, 2007, 109: 1323-1330 参照）を含むいくつかの癌の治療のために承認されている。更に、ＡＺＤ９２９１、ＣＯ−１６８６などの野生型ＥＧＦＲを避けながら変異型ＥＧＦＲを標的とするように設計された新薬が、癌性腫瘍の治療のために開発されている（Cross et al., 2014, Can. Discov. 4; 1046）。
【０００３】
しかし、癌細胞はいくつかの正常細胞とはその酸素化レベルが異なり、正常細胞よりも低酸素になり易い。低酸素症は、遺伝子調節及び関連する細胞機能、具体的には表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ；ＨＥＲ１）の変化を誘導することがある（Franovic et al. 2007, PNAS; 104: 13092; Wang et al., 2009, Nature Med., 15: 319; Wang et al., 2010, Carcinogenesis, 31:1202; Minakata et al., 2012, Cancer Sci; 103(11): 1946-1954）。腫瘍低酸素症は、いくつかのＨＩＦ依存性機構を介して、野生型ＥＧＦＲタンパク質及びその同族リガンドＴＧＦαをアップレギュレートする（Curr Pharm Des 2013;19:907）。癌細胞における野生型ＥＧＦＲタンパク質及び同種リガンドのアップレギュレーションの１つの結果は、特定の活性化ＥＧＦＲ変異型に対する優先的阻害活性を示すエルロチニブ、ゲフィチニブ、又はアファチニブなどのチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に対する耐性の誘発である（Yun et al, 2008, Proc Natl Acad Sci;105:2070; Takezawa et al. Cancer Discover 2012; 2: 922-33; Camidge et al. Nat. Rev. Clin. Oncol. 2014; 11: 473-481; Murakami et al. 2014, Plos ONE 9(1):e86459）。ＥＧＦＲ活性化突然変異陽性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）はしばしばヘテロ接合性（Soh J, et al. 2009, PLoS ONE 4(10): e7464; Bai et al., 2013, PLoS ONE 8: e54170）であり、野生型対立遺伝子の存在は、ＴＫＩ治療処方に対する限定された応答に関連している（Taniguchi et al., 2008, Cancer Sci; 99: 929-35）。このＴＫＩ耐性状態を克服するための１つの可能性は、低酸素腫瘍領域において生じる野生型ＥＧＦＲシグナル伝達をサイレンス化することであるが、従来のＥＧＦＲ  ＴＫＩは、皮膚及び消化管中の野生型ＥＧＦＲの機構上の阻害に関連する投薬制限副作用のために、この効果を達成するのに必要な治療指数が欠如している（Hynes et al., 2005, Nat Rev Can 5:341; Sharma et a., Clin. Cancer Res 2006; 12: 4392s-4395s; Sharma et al, Genes Dev. 2007 21: 3214-3231; Sharma et al., 2007 Nat Rev Can 7:169; Janjigian et al. Cancer Discovery 2014, 4: 1-10）。
【０００４】
この分野で進歩がみられているが、利用可能なデータの全体は、ＥＧＦＲ遺伝子多型に起因する顕著な非応答性が癌患者には望ましくないことを示している。従って、特に高リスク患者のために、ＥＧＦＲ遺伝子多型を有するＥＧＦＲ耐性及び非応答性患者に対処する、癌を治療するための新規でより安全でより効果的な方法が必要とされる。
【０００５】
低酸素性癌細胞を標的とすることにより癌を治療するためのいくつかの薬剤が作製されており（例えば、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２０１０／１０４４０６号及びＷＯ２０１１／０２８１３５号、その各々は参照により本明細書に組み込まれる）、これらは、ＥＧＦＲ  ＴＫＩの低酸素活性化プロドラッグ（ＨＡＰ）を開示する。そのようなＨＡＰ  ＥＧＦＲ  ＴＫＩの１つの例はＴＨ−４０００である。ＥＧＦＲ  ＴＫＩ低酸素活性化プロドラッグ（ＨＡＰ）（ＴＨ−４０００により例示される）は、この固有の耐性機構を克服することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌を治療するための組成物及び方法が依然として必要とされている。本発明は、治療におけるキナーゼ阻害剤の低酸素活性化ニトロイミダゾールプロドラッグＴＨ−４０００の使用に関連する組成物及び方法を提供することにより、これらのニーズを満たす。低酸素依存性代謝は、低酸素腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ  ＴＫＩの腫瘍選択的放出を提供する。本発明は、抵抗性の問題を解決し、ＥＧＦＲ遺伝子多型を有する患者におけるＥＧＦＲ治療に対する耐性の危険性がある被験体を決定するための方法を提供する。本発明はこれを満たし、この及び他の必要性を満たす。局所的高濃度は、以下に要約するように、低酸素腫瘍区画における野生型ＥＧＦＲシグナル伝達をサイレンス化するのに必要な治療指数を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ある態様において本発明は、以下に示すＰＲ６１０、ＴＨ−４０００、又はＨｙｐｏｘｉｎとして知られる化合物：
【化１】
0006769962.tif 000002
【０００８】
と、医薬的に許容し得る担体、賦形剤、又は希釈剤、例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンと、を含む医薬的に許容し得る組成物に関する。ＴＨ−４０００は、インビボでチロシンキナーゼ阻害剤ＴＨ−４０００Ｅ（又はＰＲ６１０Ｅ）に変換される：
【化２】
0006769962.tif 000003
【０００９】
別の態様において本発明は、最大で約４０重量％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含む医薬的に許容し得る製剤を提供する。この製剤は、患者に投与する前に希釈することができる（例えば、水性賦形剤を用いて）。
【００１０】
別の態様において本発明は、ＴＨ−４０００の単位用量の医薬的に許容し得る製剤を提供する。１つの実施態様において、この単位用量の医薬的に許容し得る製剤は、約５ｍｇ〜約７００ｍｇ、又は約１０ｍｇ〜約１８０ｍｇ、又は約２０ｍｇ〜約１５０ｍｇのＴＨ−４０００を含む。１つの実施態様において、単位用量は、約１００ｍｇのＴＨ−４０００を含む。
【００１１】
別の態様において本発明は、約９ｍｇ／ｍ2〜約３５０ｍｇ／ｍ2、約１０ｍｇ／ｍ2ｍ２〜２００ｍｇ／ｍ2、約１５ｍｇ／ｍ2〜約１５０ｍｇ／ｍ2、約４０ｍｇ／ｍ2〜約１００ｍｇ／ｍ2の範囲の治療有効量のＴＨ−４０００を、治療の必要な患者に投与することにより、癌を治療する方法を提供する。別の実施態様において本発明は、約８０ｍｇ／ｍ2のＴＨ−４０００を投与することにより癌を治療する方法を提供する。別の実施態様において本発明は、約３２ｍｇ／ｍ2のＴＨ−４０００を投与することにより癌を治療する方法を提供する。１つの実施態様において本発明は、約２０ｍｇ／ｍ2のＴＨ−４０００を投与することにより癌を治療する方法を提供する。１つの実施態様において、ＴＨ−４０００は静脈内（ｉ．ｖ．）投与により投与される。１つの実施態様において、ＴＨ−４０００は腹腔内投与により投与される。１つの実施態様において、治療有効量のＴＨ−４０００は、少なくとも１日に１回、少なくとも週に１回、又は少なくとも月に１回の頻度で投与される。１つの実施態様において、ＴＨ−４０００は、１〜３週間、又は少なくとも３０週間又はそれ以上、少なくとも１日、又は少なくとも１５０日間又はそれ以上の期間にわたって投与され得る。いくつかの実施態様において、より長い期間の投与が用いられる。
【００１２】
１つの実施態様において、治療される癌は、非小細胞肺癌、食道癌、膵臓癌、直腸癌、頭頸部癌、皮膚癌、結腸癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、消化管間質癌（ＧＩＳＴ）、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、子宮癌、前立腺癌、肝臓癌、黒色腫、脳腫瘍、及び中皮腫から選択される。
【００１３】
別の態様において、本発明は、他のチロシンキナーゼ、及び／又はＥＧＦＲ阻害剤、例えば、特に限定されないが、エルロチニブ、ダコミチニブ、ＡＺＤ９２９１、ＣＯ−１６８６、アファチニブ、ゲフィチニブ、ロシレチニブ、セツキシマブ、イコチニブ、ＡＺＤ−８９３１、ラパチニブ、ダコミチニブ、ネラチニブ、ＡＰ−２６１１３、ポジオチニブ、ＡＳＰ−８２７３、ＴＡＳ−１２１、パニツムマブ、ニモツズマブ、カツマキソマブ、デュリゴツズマブ、及びパトリツムマブを含む医薬的に許容し得る製剤を提供する。
【００１４】
これら及び他の態様及び実施態様は、添付図面及び本発明の詳細な説明に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
本発明は、添付図面を参照してより詳細に説明される。
【００１６】
【図１】ＥＧＦＲ突然変異陽性ＮＳＣＬＣにおけるエルロチニブとＨ−４０００の比較を、臨床的に適切なＨＥＤ（ヒト等価用量）で示す。
【図２】ＥＧＦＲ突然変異陽性ＮＳＣＬＣにおけるエルロチニブとＨ−４０００の比較を、臨床的に適切なＨＥＤ（ヒト等価用量）で示す。
【００１７】
【図３】ＴＨ−４０００−血漿と腫瘍ＰＫを比較する。
【００１８】
【図４】ＰＣ９腫瘍を有するヌードマウスにおいてＴＨ−４０００（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）の単回投与後に７日間、ＥＧＦＲリン酸化が阻害されることを示す。
【００１９】
【図５】用量（ｍｇ／ｍ2）の関数としてのＴＨ−４０００のヒト血漿ＡＵＣ0-infを示す。
【００２０】
【図６】ＰＣ９細胞におけるＴＫＩ依存性標的調節のウエスタンブロットを示す。
【００２１】
【図７】エルロチニブ及びＡＺＤ９２９１を用いた、ＰＣ９細胞におけるＴＫＩ依存性標的調節のウェスタンブロットを示す。
【図８】エルロチニブ及びＡＺＤ９２９１を用いた、ＰＣ９細胞におけるＴＫＩ依存性標的調節のウェスタンブロットを示す。
【００２２】
【図９】ＴＨ−４０００オキシック（有酸素）／アノキシック（無酸素）ＩＣ５０を比較する。
【００２３】
【図１０】選択されたＮＳＣＬＣ細胞株におけるＴＨ−４０００の代謝を示す。
【００２４】
【図１１】個々のマウスのＰＣ−９異種移植片における、週１回投与されたＴＨ−４０００と毎日投与されたエルロチニブの効果の比較を示す。
【図１２】個々のマウスのＰＣ−９異種移植片における、週１回投与されたＴＨ−４０００と毎日投与されたエルロチニブの効果の比較を示す。
【図１３】個々のマウスのＰＣ−９異種移植片における、週１回投与されたＴＨ−４０００と毎日投与されたエルロチニブの効果の比較を示す。
【００２５】
【図１４】１４日目からのエルロチニブ（ＨＥＤ  １５０ｍｇ）＋毎週ＴＨ−４０００（ＨＥＤ３２ｍｇ／ｍ2）を比較する。
【００２６】
【図１５】ＴＨ−４０００が、臨床的に適切な用量でＷＴ  ＥＧＦＲ  Ａ４３１異種移植片に対して活性であることを示す。
【００２７】
【図１６】ＴＨ−４０００が、ＨＥＲ２陽性ＮＣＩ−Ｎ８７胃腫瘍異種移植片に対して活性であることを示す。
【００２８】
【図１７】ヒト下咽頭細胞株ＦａＤｕにおける、好気性条件下で５日間連続曝露後のセツキシマブ、エルロチニブ、ＴＨ−４０００、及びＴＨ−４０００Ｅの抗増殖活性を示す。
【００２９】
【図１８】ヒト下咽頭細胞株ＦａＤｕにおける、セツキシマブ、エルロチニブ、ＴＨ−４０００、及びＴＨ−４０００Ｅの抗増殖活性を示す。
【００３０】
【図１９】勾配濃度のＴＨ−４０００Ｅで処理後のＥＧＦＲシグナル伝達軸の種々のメンバーの発現を示す。
【００３１】
【図２０】勾配濃度のセツキシマブで処置後のＥＧＦＲシグナル伝達軸の種々のメンバーの発現を示す。
【００３２】
【図２１】勾配濃度のＴＨ−４０００で処理後のＥＧＦＲシグナル伝達軸の種々のメンバーの発現を示す。
【００３３】
【図２２】有酸素及び低酸素状態でプレコンディショニングした（４８時間）ＦａＤｕ細胞における、種々の濃度のＴＨ−４０００Ｅへの曝露後のＥＧＦＲ発現を示す。
【００３４】
【図２３】有酸素回復期間を伴う／伴わない無酸素曝露期間後のＥＧＦＲ発現を示す。
【００３５】
【図２４】ビヒクル対照（ｑｗ×６）、４８ｍｇ／ｋｇのタルロキソチニブ（tarloxotinib）（ｑｗ×６）、０．２５ｍｇ／マウスのセツキシマブ（ｑ３ｄ×１４）、及びタルロキソチニブとセツキシマブの組合せで処置したＨ１２５腫瘍の平均腫瘍体積（±ＳＥＭ）。
【００３６】
【図２５】ビヒクル対照（ｑｗ×６）、６ｍｇ／ｋｇのアファチニブ（ｑｄ×４２）、０．２５ｍｇ／マウスのセツキシマブ（ｑ３ｄ×１４）、及びアファチニブとセツキシマブの組合せで処置したＨ１２５腫瘍の平均腫瘍体積（±ＳＥＭ）。
【００３７】
【図２６】ビヒクル対照（ｑｗ×６）、４８ｍｇ／ｋｇのタルロキソチニブ（ｑｗ×６）、０．２５ｍｇ／マウスのセツキシマブ（ｑ３ｄ×１４）、タルロキソチニブとセツキシマブの組合せ、６ｍｇ／ｋｇのアファチニブ（ｑｄ×４２）、及びアファチニブとセツキシマブの組合せで処置したＨ１２５腫瘍の平均腫瘍体積（±ＳＥＭ）。
【００３８】
【図２７】ビヒクル対照（ｑｗ×６）、４８ｍｇ／ｋｇのタルロキソチニブ（ｑｗ×６）、０．２５ｍｇ／マウスのセツキシマブ（ｑ３ｄ×１４）、タルロキソチニブとセツキシマブの組合せ、６ｍｇ／ｋｇのアファチニブ（ｑｄ×４２）、及びアファチニブとセツキシマブの組合せで処置した、Ｈ１２５腫瘍を有するＮＩＨ−ＩＩＩマウスにおける平均体重減少（±ＳＥＭ）。
【００３９】
【図２８】ビヒクル対照（ｑｗ×６）、４８ｍｇ／ｋｇのタルロキソチニブ（ｑｗ×６）、０．２５ｍｇ／マウスのセツキシマブ（ｑ３ｄ×１４）、タルロキソチニブとセツキシマブの組み合わせ、６ｍｇ／ｋｇのアファチニブ（ｑｄ×４２）、及びアファチニブとセツキシマブの組合せで処置したＨ１２５腫瘍の個々の腫瘍体積。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明の態様及び実施態様のこの詳細な説明は、以下のセクションに整理される。セクションＩは、本明細書で使用される用語の定義を与える。セクションＩＩは、本発明の医薬的に許容し得る製剤を記載する。セクションＩＩＩは、本発明の治療方法を提供する。この詳細な説明は、読者の便宜のためにのみセクションに整理されており、いずれのセクションにも記載されている開示は、本明細書の他の箇所の開示にも適用可能である。
【００４１】
略語と定義
本明細書で使用される略語は、他に定義されない限り、慣用されているものである。以下の略語が使用される：ｇ＝グラム、Ｈ2Ｏ＝水；ｈ＝時間；ＩＣ50＝インビトロで酵素の５０％阻害に必要な阻害剤の濃度、μＭ＝マイクロモル、μＬ＝マイクロリットル、ｍｇ＝ミリグラム、ｍｍ＝ミリメートル、ｍＭ＝ミリモル、ｍｍｏｌ＝ミリモル、ｍＬ＝ミリリットル、ｍＯＤ／分＝１分当たりのミリ光学密度単位、ｍｉｎ＝分、Ｍ＝モル、ＡＣＬＳ＝二次救命処置（Advanced Cardiovascular Life Support）、ＡＤＬ＝日常生活活動、ＡＥ＝有害事象、ＡＬＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＳＴ＝アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＡＴＣ＝解剖学的治療化学物質、ＡＴＰ＝アデノシン三リン酸、ＡＵＣ＝０〜無限大までの血漿薬物濃度−時間曲線下の面積、ＡＵＣｌａｓｔ＝０〜最終定量濃度時間までの血漿薬物濃度−時間曲線下の面積、ＢＰ＝血圧、ＢＱＬ＝定量限界未満、Ｃｍａｘ＝最大血漿濃度、ＣＦＲ＝米国連邦規制基準、ＣＬ＝クリアランス、Ｃｍａｘ＝ピーク血漿濃度、ＣＮＳ＝中枢神経系、ＣＲ＝完全応答、ＣＲＯ＝臨床研究機関、ＣＴ＝コンピュータ断層撮影、ＣＴＣ＝循環腫瘍細胞、ＣＴＣＡＥ＝有害事象の共通毒性基準、Ｄ５Ｗ＝水中の５％デキストロース、ＤＬＴ＝用量制限毒性、ＤＯＲ＝応答持続時間、ＥＣＧ＝心電図、ＥＣＯＧ＝米国東部癌治療共同研究グループ、ｅＣＲＦ＝電子症例報告書、ＥＧＦＲ＝表皮増殖因子受容体、ＧＩ＝消化管、ＦＤＡ＝米国食品医薬品局、Ｈ＝時間、ＨＡＰ＝低酸素活性化プロドラッグ、ＨＥＤ＝ヒト等価用量、ＨＩＶ＝ヒト免疫不全症ウイルス、ＨＲ＝心拍数、ＨＲＴ＝ホルモン補充療法、ＩＣＦ＝インフォームドコンセントフォーム、ＩＣＨ＝ハーモナイゼーションに関する国際会議、ＩＮＲ＝国際標準比、ＩＲＢ／ＥＣ＝治験審査委員会／倫理委員会、ＩＶ＝静脈内、Ｋｅｌ＝消失速度定数、ＬＬＴ＝下層語、ＬＬＮ＝正常下限、ＭｅｄＤＲＡ＝国際医学用語集、ＭＲＩ＝磁気共鳴イメージング、ＭＴＤ＝最大許容用量、ＮＳＡＩＤ＝非ステロイド系抗炎症薬、ＮＳＣＬＣ＝非小細胞肺癌、ＯＲ＝全体的な応答、ＯＲＲ＝全体の応答率、ＯＳ＝全般生存、ＰＤ＝進行性疾患、ＰＥＴ＝光子放射断層撮影法、ＰＦＳ＝無進行性生存期間、ＰＫ＝薬物動態、ＰＲ＝部分応答、ＰＴ＝プロトロンビン時間又は好ましい用語、ＱＴ＝ＱＴ間隔、ＱＴｃ＝ＱＴ間隔＝心電図の心拍数について補正されたＱＴ間隔、ＱＴｃＢ＝バゼット式を用いるＱＴｃ、ＱＴｃＦ＝フリデシア式を用いるＱＴｃ、ＲＥＣＩＳＴ１．１＝固体腫瘍の応答評価基準バージョン１．１、ＲＲ＝呼吸数、ＳＡＥ＝重篤な有害事象、ＳＤ＝安定性疾患、ＳＯＣ＝器官別大分類、Ｔ１／２＝終末半減期、ＴｄＰ＝トルサード・ド・ポアンツ、ＴＧＦα＝トランスフォーミング増殖因子アルファ、ＴＨ−４０００Ｅ＝ＴＨ−４０００から得られるＴＫ１エフェクター、ＴＫＩ＝チロシンキナーゼ阻害剤、Ｔｍａｘ＝ピーク血漿濃度までの時間、ＵＬＮ＝正常上限、Ｖβ＝分布相後の分布体積、Ｖｓｓ＝定常状態での分布体積、ＷＴ、＝野生型。
【００４２】
以下の定義は読者を助けるために提供される。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記、及び他の科学的若しくは医学的用語又は用語は、化学及び医学分野の当業者により一般的に理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合において、一般的に理解されている意味を有する用語は、明瞭にするために及び／又は容易に参照できるようにするために本明細書に定義されており、そのような定義を包含することは、当該技術分野において一般に理解されている用語の定義に対して実質的な差異を示すと理解すべきではない。
【００４３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。
【００４４】
「約」は、ある量の±２０％を意味し、特に限定されないが、その量の±１５％、±１０％、及び±５％を含む。
【００４５】
患者へ薬剤（及びこの用語の文法上の等価物）を「投与すること」又は「投与」（及びこの用語の文法的同等物）は、直接投与（これは、医療専門家による患者への投与であってもよく、又は自己投与であってもよい）を指し、及び／又は間接的投与（これは、薬物を処方する行為であってもよい）を指す。例えば、患者に薬剤を自己投与するように指示する医師及び／又は薬剤の処方を患者に提供する医師は、患者に薬剤を投与している。
【００４６】
「アンタゴニスト」又は「阻害剤」は、刺激又は活性を阻害又は束縛し、部分的に又は完全に遮断し、活性化又は酵素活性を低下、閉鎖、防止、遅延させ、本発明の受容体の活性を不活性化、感度低下、若しくはダウンレギュレートする薬剤又は分子を指す。本明細書で使用される「アンタゴニスト」は、逆アゴニスト又は反転アゴニストも含む。
【００４７】
「抗癌作用」には、特に限定されないが、抗腫瘍作用、応答率、疾患の進行までの時間、及び生存率が含まれる。「抗腫瘍」作用としては、特に限定されないが、腫瘍増殖の阻害、腫瘍増殖の遅延、腫瘍の退縮、腫瘍の縮小、治療の停止時の腫瘍の再増殖までの時間の延長、及び疾患の進行の遅延が挙げられる。
【００４８】
「癌」は、侵襲により局所的に及び転移により全身的に拡大し得る、無制限に増殖する可能性のある悪性腫瘍を指す。癌の例には、特に限定されないが、非小細胞肺癌、食道癌、膵臓癌、直腸癌、頭頸部癌、皮膚癌、結腸癌、子宮頸癌、膀胱癌、乳癌、消化管間質癌（ＧＩＳＴ）、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、子宮癌、前立腺癌、肝臓癌、黒色腫、脳癌、及び中皮腫が挙げられる。
【００４９】
「併用療法」は、治療における２つ以上の薬物の使用、すなわち、本明細書に記載の低酸素活性化プロドラッグを、血液癌の治療に使用される従来の薬物と一緒に使用することは併用療法である。「併用」の投与とは、２つの薬剤の薬理学的効果が患者に同時に現れる任意の方法で、２つの薬剤（例えば、低酸素活性化プロドラッグと血液癌を治療するために知られている薬剤）を投与することを意味する。従って併用投与は、両方の薬剤の投与のために、単一の医薬組成物、同じ剤形、又は同じ投与経路の使用を必要とせず、又は２つの薬剤を正確に同時に投与することを必要としない。例えば、特に限定されないが、以下の薬剤の１つ以上を、本発明による低酸素活性化プロドラッグと組み合わせて投与できることは想定される。
【００５０】
本明細書で使用される「症状」という用語は、これに対して本発明の化合物、組成物、及び方法が使用される疾患状態を指す。
【００５１】
本明細書で使用される「臨床応答」という用語は、応答、無応答、及び有害な応答（すなわち、副作用）の定量的尺度のいずれか又はすべてを意味する。
【００５２】
本明細書で使用される「臨床試験」という用語は、特定の治療に対する応答に関する臨床データを収集するように計画された任意の研究を意味し、これは、特に限定されないが、第Ｉ相、第ＩＩ相及び第ＩＩＩ相臨床試験を含む。患者集団を定義し、被験体を登録するために、標準的な方法が使用される。
【００５３】
本明細書で使用される「発現」は、特に限定されないが、以下の１つ以上を含む：遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写；成熟ｍＲＮＡを産生するための前駆体ｍＲＮＡのスプライシング及び他のプロセシング；ｍＲＮＡ安定性；成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドン使用及びｔＲＮＡ利用可能性を含む）；及び翻訳産物のグリコシル化及び／又は他の修飾（適切な発現及び機能のために必要とされる場合）。
【００５４】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、ＲＮＡ産物の調節された生合成に関するすべての情報を含むＤＮＡのセグメントを意味し、プロモーター、エクソン、イントロン、及び発現を制御する他の非翻訳領域を含む。
【００５５】
本明細書で使用される用語「遺伝子型」は、個体中の相同染色体の対の遺伝子座における１つ以上の多型部位で見出されるヌクレオチド対の非同期の５’→３’配列を意味するものとする。本明細書で使用される遺伝子型は、完全遺伝子型及び／又は亜型遺伝子型を含む。
【００５６】
本明細書で使用される用語「遺伝子座」は、遺伝子又は物理的若しくは表現型の特徴に対応する染色体又はＤＮＡ分子上の位置を意味するものとする。
【００５７】
「患者」は、癌の治療を必要とする哺乳動物を指す。一般的に、患者はヒトである。患者はまた「温血動物」でもよい。
【００５８】
「医薬的に許容し得る」とは、一般的に安全で非毒性であり、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない医薬組成物の調製において有用であり、獣医学的及びヒトの医薬用途に許容されるものを含むことを意味する。
【００５９】
「医薬的に許容し得る担体、賦形剤、又は希釈剤」とは、一般的に安全で非毒性であり、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない医薬組成物の調製において有用であり、獣医学及びヒトの医薬用途にも許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含むことを指す。「医薬的に許容し得る担体、賦形剤、又は希釈剤」は、そのような担体、賦形剤又は希釈剤の１つ及び２つ以上を含む。
【００６０】
「医薬的に許容し得る塩」は、本明細書に記載の化合物に見られる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸又は塩基で調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含む場合、このような化合物の中性形態を、そのままの又は適度に不活性な溶媒中の十分量の所望の塩基と接触させることにより、塩基付加塩を得ることができる。医薬的に許容し得る無機塩基から誘導される塩の例は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第２鉄、第１鉄、リチウム、マグネシウム、第２マンガン、第１マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛などを含む。製薬上許容される有機塩基から誘導される塩には、置換アミン、環状アミン、天然アミンなど、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペラジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどが挙げられる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合、このような化合物の中性形態をそのままの又は適度に不活性な溶媒中の十分量の所望の酸と接触させることにより、酸付加塩を得ることができる。製薬上許容し得る酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、リン酸一水素、リン酸二水素、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、又は亜リン酸などの無機酸、並びにプロピオン酸、イソ酪酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸などの比較的無毒の有機酸から誘導される塩が挙げられる。また、アルギン酸塩などのアミノ酸の塩、グルクロン酸又はガラクツロン酸などの有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge, S.M., et al, “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19を参照）。本発明のいくつかの特異的化合物は、化合物が塩基付加塩又は酸付加塩のいずれかに変換されることを可能にする塩基性及び酸性官能基の両方を含む。化合物の中性形態は、塩を塩基又は酸と接触させ、親化合物を常法により単離することにより再生することができる。化合物の親形態は、極性溶媒の溶解度のような特定の物理的性質において種々の塩形態とは異なるが、そうでなければ塩は本発明の目的のための化合物の親形態と同等である。
【００６１】
本明細書で使用される用語「多型」は、集団において１％を越える頻度で存在する任意の配列変化体を意味するものとする。配列変化体は、１％より有意に高い頻度、例えば５％又は１０％又はそれ以上の変動で存在し得る。また、この用語は、多型部位において個体で観察される配列変化を指すために使用し得る。多型は、ヌクレオチド置換、挿入、欠失、及びマイクロサテライトを含むが、遺伝子発現又はタンパク質機能の検出可能な差異をもたらす必要はない。
【００６２】
本明細書で使用される用語「多型部位」は、集団において少なくとも２つの代替配列が見出される遺伝子座内の位置を意味し、最も頻度の高いものは９９％以下の頻度を有する。
【００６３】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」は任意のＲＮＡ又はＤＮＡを意味するものとし、これは非修飾又は修飾ＲＮＡ又はＤＮＡでもよい。ポリヌクレオチドは、特に限定されないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又はより典型的には二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。更にポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び主鎖が安定性又は他の理由のために修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡを含む。
【００６４】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は修飾ペプチド結合すなわちペプチド同配体により互いに結合された２つ以上のアミノ酸を含む任意のポリペプチドを意味する。ポリペプチドは一般にペプチド、グリコペプチド、又はオリゴマーと呼ばれる短鎖と、一般にタンパク質と呼ばれる長鎖と、の両方を指す。ポリペプチドは、２０個の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。ポリペプチドには、翻訳後プロセッシングなどの天然のプロセス、又は当技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸配列が含まれる。このような修飾は、基本的な教科書及びより詳細なモノグラフならびに膨大な研究文献に詳細に記載されている。
【００６５】
「プロドラッグ」は、投与後に、少なくとも１つの特性に関して生物学的に活性な化合物又はより活性な化合物（又は薬物）に代謝又は他の方法で変換される化合物を指す。プロドラッグは薬物と比較して、薬物に対して相対的に活性が低いか又は不活性であるように化学的に修飾されるが、化学修飾は、プロドラッグが投与された後に、代謝又は他の生物学的プロセスにより対応する薬物が生成されるようなものである。プロドラッグは活性薬物と比較して、改変された代謝安定性又は輸送特性、より小さい副作用、又はより低い毒性、又は改善された風味を有し得る（例えば、文献 Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, pages 388-392を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）。プロドラッグは、対応する薬物以外の反応物を用いて合成することができる。
【００６６】
症状（及びこの用語の文法的同等物）の「低減」は、症状の重症度又は頻度の低下、又は症状の排除を指す。
【００６７】
「再発性又は難治性」とは、薬剤による治療に耐性であるか、又は薬剤による治療に応答するが、その薬剤に耐性を示さずに戻るか、又は薬剤による治療に応答するがその薬剤に耐性になるタイプの血液癌を指す。
【００６８】
「単一薬剤療法」又は「単剤療法」とは、疾患を治療するために単一薬物を使用すること、すなわち血液癌を治療するための唯一の化学物質として例えばＴＨ−４０００のような低酸素活性化プロドラッグを使用することを指す。疾病を直接治療する以外の目的で緩和剤及び／又はビタミン及び／又は他の薬剤を、単剤療法で投与することができる。単一薬剤療法を受けている患者はまた、放射線療法及び／又は外科手術を受けてもよい。
【００６９】
「標準化学療法」とは、ＦＤＡ医薬品ラベル表示指示及び／又は医薬品臨床試験実施基準に従う薬物による治療を指す。標準的化学療法は、医学分野の当業者に周知である。
【００７０】
本明細書で使用される「ＳＮＰ核酸」は、個体又は個体群の間で本来は同一であるヌクレオチド配列内で異なるヌクレオチド、すなわち対立遺伝子として存在するヌクレオチドを含む核酸配列である。そのようなＳＮＰ核酸は、好ましくは約１５〜約５００ヌクレオチドの長さである。ＳＮＰ核酸は染色体の一部であってもよく、例えばＰＣＲ又はクローニングによる染色体の一部の増幅による、染色体の一部の正確なコピーであってもよい。ＳＮＰ核酸は、以後単に「ＳＮＰ」と呼ばれる。本発明のＳＮＰプローブは、ＳＮＰ核酸に相補的なオリゴヌクレオチドである。
【００７１】
薬物の「治療有効量」とは、癌又は別の過剰増殖性疾患を有する患者に投与された時に、意図された治療効果、例えば患者の癌又は別の過剰増殖性疾患の１つ以上の症状の軽減、改善、緩和、又は排除効果を有する薬物の量を指す。治療効果は、必ずしも１回の投与により生じるわけではなく、一連の用量の投与後にのみ生じる場合もある。従って治療有効量は、１回以上の投与で投与することができる。
【００７２】
症状又は患者「を治療する」又は「の治療」とは、臨床結果を含む有益な又は所望の結果を得るためのステップをとることを指す。本発明の目的において有益な又は望ましい臨床結果には、特に限定されないが、癌又は他の過剰増殖性疾患の１つ以上の症状の軽減又は改善；疾患の程度の減少；疾患の進行の遅延又は減速；疾患状態の改善、緩和、又は安定化；又は他の有益な結果を含む。
【００７３】
薬物の「単位用量」とは、所定の時点での治療有効量の薬物の単一用量を指す。
【００７４】
「温血動物」とは、ヒトに限定されず、ヒト以外の霊長類、例えばチンパンジー及び他の類人猿及びサル種、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、及びブタなどの家畜、ならびにウサギ、イヌ、及びネコなどの家畜；ラット、マウス、及びモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などが含まれる。
【００７５】
医薬的に許容し得る製剤
ある態様において本発明は、ＴＨ−４０００として知られている化合物又はその医薬的に許容し得る塩と、医薬的に許容し得る担体、賦形剤、又は希釈剤とを含む、医薬的に許容し得る製剤に関する。ＴＨ−４０００はＰＣＴ特許出願公報ＷＯ２０１１／０２８１３５に記載されている。水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合されて活性物質を含有する。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、及びアラビアゴムである；分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンでもよい。水性懸濁液はまた、１種以上の保存剤、例えばエチル又はｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１種以上の着色剤、１種以上の香味剤、及び１種以上の甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンを含み得る。
【００７６】
水の添加により水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤、及び１種以上の保存剤との混合物中に活性成分を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤は、既に上記のものにより例示される。さらなる賦形剤、例えば甘味剤、香味剤、及び着色剤もまた存在してもよい。
【００７７】
１つの実施態様において、医薬的に許容し得る製剤は、ＴＨ−４０００と、賦形剤として２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンとを含む。このようなＴＨ−４０００の製剤は、以下の実施例１に記載されている。
【００７８】
１つの実施態様において、医薬的に許容し得る製剤の単位用量は、約５ｍｇ〜約７００ｍｇ、又は約１０ｍｇ〜約１８０ｍｇ、又は約２０ｍｇ〜約１５０ｍｇのＴＨ−４０００を含む。１つの実施態様において、単位用量は、約１００ｍｇのＴＨ−４０００を含む。
【００７９】
別の態様において本発明は、約９ｍｇ／ｍ2〜約３５０ｍｇ／ｍ2、約１０ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2、約１５ｍｇ／ｍ2〜約１５０ｍｇ／ｍ2、約４０ｍｇ／ｍ2〜約１００ｍｇ／ｍ2の範囲の治療有効量のＴＨ−４０００を、治療の必要な患者に投与することにより、癌を治療する方法を提供する。別の実施態様において本発明は、約８０ｍｇ／ｍ2のＴＨ−４０００を投与することにより癌を治療する方法を提供する。別の実施態様において本発明は、約３２ｍｇ／ｍ2のＴＨ−４０００を投与することにより癌を治療する方法を提供する。１つの実施態様において本発明は、約２０ｍｇ／ｍ2のＴＨ−４０００を投与することにより癌を治療する方法を提供する。ＴＨ−４０００の適切な単位用量の医薬的に許容し得る製剤は、以下の実施例に記載されている。
【００８０】
治療法
１つの実施態様において、治療される癌は、選択された非小細胞肺癌、食道癌、膵臓癌、直腸癌、頭頸部の扁平上皮癌、皮膚の扁平上皮癌、神経膠芽腫、大腸癌、子宮頚癌、膀胱癌、乳癌、消化管間質癌（ＧＩＳＴ）、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、子宮癌、及び中皮腫である。
【００８１】
ＴＨ−４０００の治療用量は、おそらく１日当たり１ｍｇ〜３０００ｍｇの範囲であろう。特定の患者のために選択される特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、及び排泄率、薬物の組み合わせ、及び治療を受けている症状の重症度を含む種々の因子に依存するであろう。
【００８２】
別の態様において本発明は、約９ｍｇ／ｍ2〜約３５０ｍｇ／ｍ2、約１０ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2、約１５ｍｇ／ｍ2〜約１５０ｍｇ／ｍ2、約４０ｍｇ／ｍ2〜約１００ｍｇ／ｍ2の範囲の治療有効量のＴＨ−４０００を、治療の必要な患者に投与することにより、癌を治療する方法を提供する。別の実施態様において本発明は、約８０ｍｇ／ｍ2のＴＨ−４０００を投与することにより癌を治療する方法を提供する。別の実施態様において本発明は、約３２ｍｇ／ｍ2のＴＨ−４０００を投与することにより癌を治療する方法を提供する。１つの実施態様において本発明は、約２０ｍｇ／ｍ2のＴＨ−４０００を投与することにより癌を治療する方法を提供する。抗腫瘍効果を有する治療有効量のＴＨ−４０００を示す動物試験は、以下の実施例（例えば、実施例１〜４）に記載されている。ヒト臨床試験のプロトコルは、以下の実施例５に記載される。
【００８３】
投与
本明細書において、被験体又は患者への薬剤又は薬物の投与には、自己投与及び他人による投与が含まれる。
【００８４】
１つの実施態様において、ＴＨ−４０００化合物は、投薬単位製剤での注射により投与することができる。用語「注射による投与」は、静脈内、筋肉内、皮下、及び非経口注射、ならびに注入技術の使用を含む。癌の治療のためのＴＨ−４０００の効果的な静脈内投与は、実施例に記載される。ＴＨ−４０００の効率的な静脈内生物学的利用能は実施例３に記載される。典型的な注入時間は１〜約６時間である。
【００８５】
１つの実施態様において、治療有効量のＴＨ−４０００は、少なくとも１日に１回、少なくとも週に１回、少なくとも２週間に１回、１ヶ月に最大１回の頻度で投与される。１つの実施態様においてＴＨ−４０００は、１〜４０週間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、又は最大少なくとも４０週間の期間にわたって投与される。他の実施態様において、より長期の投与が用いられる。
【００８６】
本発明の方法による効果的な癌治療のためのＴＨ−４０００投与の種々の頻度及び期間は、例えば以下の実施例２〜５に記載される。
【００８７】
１つの実施態様においてＴＨ−４０００は、チロシンキナーゼを調節するもののような別の抗増殖剤と組み合わせて投与される。投与することができる任意の抗増殖剤には、特に限定されないが、エルロチニブ、ダコミチニブ、ＡＺＤ９２９１、ＣＯ−１６８６、アファチニブ、ゲフィチニブ、ロシレチニブ、セツキシマブ、イコチニブ、ＡＺＤ−８９３１、ラパチニブ、ダコミチニブ、ネラチニブ、ＡＰ−２６１１３、ポチオチニブ、ＡＳＰ−８２７３、ＴＡＳ−１２１、パニツムマブ、ニモツズマブ、カツマキソマブ、デュリゴツズマブ、及びパトリツムマブが挙げられる。
【００８８】
特定の実施態様において本発明は、約１０ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2の範囲の量のＴＨ−４０００を患者に投与することにより、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者を治療する方法を提供する。１つの実施態様において、患者はエルロチニブでも治療される。これら及び他の態様及び実施態様は、本発明の図面及び詳細な説明に記載される。
【００８９】
１つの実施態様において本発明は、約１０ｍｇ／ｍ2〜約２００ｍｇ／ｍ2の範囲の量のＴＨ−４０００を患者に投与することにより、転移性癌を治療する方法を提供する。１つの実施態様において、患者はＡＺＤ９２９１でも治療される。
【００９０】
１つの実施態様において本発明は、ＴＨ−４０００以外の低酸素活性化ニトロイミダゾールプロドラッグ及びＷＯ２０１１／０２８１３５に記載のものを含む、本発明の医薬的に許容し得る製剤を投与することにより、癌を治療する方法を提供する。
【００９１】
診断方法及びキット
低酸素マーカー
本発明は、実際に薬物を摂取する前に、患者が薬物治療中に薬物耐性を経験するかどうかを決定する方法を有利に提供する。すなわち本発明は、臨床家が、（１）追加又は代替の併用薬を提供すること、（２）薬剤の用量を変更すること、又は（３）その患者に対してその薬剤を処方しないことを選択することを助けることにより、患者のより安全な治療処方を提供する。
【００９２】
本発明の種々の実施態様において、治療のために患者を選択するために、及び／又は治療に応答する（又は応答しない）患者を特定するために、低酸素症のマーカーが使用される。低酸素症マーカーは、低酸素症がより攻撃的な固形腫瘍表現型を促進し、放射線及び多くの化学療法に対する耐性、ならびに腫瘍浸潤の可能性及び患者の低生存率に関連することを証明する試験中に開発された。特にｐＯ2＜１０ｍｍＨｇの細胞は、放射線療法の電離作用及び化学療法の細胞傷害作用に抵抗する。偽柵状配列腫瘍細胞を伴う低酸素症壊死病巣は、例えば神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）を規定する特徴の１つである。すなわち、異種移植片及び患者の腫瘍における低酸素症の程度を評価するために種々の方法が考案されており、本発明によればこれらの方法は、本明細書に記載のように適切に修飾及び実施され、本発明の方法の特定の実施態様で、患者を選択するために及び治療への応答を評価するために使用される。一般に本発明は、低酸素活性化プロドラッグによる治療に適した患者を同定するための方法であって、ここで、低酸素症のマーカーは、患者の癌が低酸素状態であり、患者が低酸素活性化プロドラッグにより治療されること、すなわち低酸素症の程度が高いほど、患者は低酸素活性化プロドラッグによる治療により応答する可能性が高くなること、を特定するために使用される、上記方法を提供する。当業者は、本開示の観点から、これらの方法が血液癌だけでなく全ての癌において有用であることを理解するであろう。
【００９３】
伝統的に、低酸素を測定するためのゴールドスタンダードは、組織の酸素張力の直接測定を提供するポーラログラフ酸素感受性プローブの使用である。しかしこの方法は、生存活性のある病巣と壊死病巣とを区別できないこと、骨髄の血液悪性腫瘍に関連する腫瘍組織を含む多くの腫瘍組織にアクセスできないこと、及び大規模な技術を適用するための実用的手段がないことなどの限界を有する。ピモニダゾール及びＥＦ５（いずれも２−ニトロイミダゾール化合物である）は低酸素マーカーであり、これらはピモニダゾール又はＥＦ５タンパク質付加物の免疫組織化学的同定により、放射線−生物関連する低酸素症の信頼できる推定値を与え得る。ピモニダゾール（及びＥＦ５）結合が１４マイクロモルを超える酸素濃度で効果的に阻害されるような方法で、分子状酸素は還元性同等物と競合する。この方法は、生存活性のある低酸素性細胞を特異的に確実に同定する（壊死細胞は、ピモニダゾール及びＥＦ５を代謝することができない）。
【００９４】
前臨床試験において同定されている本発明の方法での使用に適した他の低酸素マーカーには、ＧＬＵＴ−１、ＨＩＦ−１ａ、ＣＡ−ＩＸ、ＬＤＨ−Ａ、オステオポンチン、マイクロＲＮＡマーカー（特に限定されないが、ｍｉＲ−２１０を含む）、及びＶＥＧＦが挙げられる。これらのタンパク質又はＲＮＡはそれぞれ、低酸素症ではアップレギュレートされており、腫瘍生検で検出することができる。しかしこれらのマーカーの一部、すなわちＣＡ−ＩＸ  ＬＤＨ−Ａ、オステオポンチン、マイクロＲＮＡマーカー（特に限定されないが、ｍｉＲ−２１０を含む）、及びＶＥＧＦは、患者の血液、血清、又は血漿中で検出可能であり、腫瘍生検の代わりに単純な血液検査を使用して、低酸素活性化プロドラッグ療法の患者を選択することを可能にするであろう。
【００９５】
更に、試験により、免疫組織化学及び［１８Ｆ］−ＦＤＧ及び［１８Ｆ］−ＦＭＩＳＯオートラジオグラフィーにより評価された腫瘍低酸素と、ＰＥＴイメージングとの関係が調べられ、これらの化合物と［１８Ｆ］−ＥＦ５、［１８Ｆ］−ＦＡＺＡ、及び［１８Ｆ］−ＨＸ４のような類似のＰＥＴトレーサーは、本発明の方法に従って用いることができる。オートラジオグラフィー及びＰＥＴイメージングに加えて、低酸素症のＭＲＩイメージング、特に動的造影増強ＭＲＩ（ＤＣＥ−ＭＲＩ）を用いて、低酸素癌を同定し、従って低酸素活性化プロドラッグによる治療に理想的な患者を同定することができる。
【００９６】
静脈内又は経口投与のいずれかで投与された場合、Hypoxyprobe（登録商標）-1（Hypoxyprobe、Inc. により販売されているピモニダゾール塩酸塩）は、脳を含む体内の全ての組織に分配されるが、１４マイクロモル（摂氏３７度で１０ｍｍＨｇのｐＯ2に相当）未満の酸素濃度を有する細胞のみでタンパク質と付加物を形成する。Hypoxyprobe-1 Mab1は、低酸素細胞中のHypoxyprobe-1のタンパク質付加物を検出するマウスＩｇＧ１モノクローナル抗体である。この試薬は典型的には、各組織試料に添加される。次に、本発明に従って発色性又は蛍光性の二次抗体試薬を使用して、低酸素組織中にHypoxyprobe-1付加物が形成された場所を明らかにされる。
【００９７】
低酸素症のこれらのマーカーに加えて、低酸素活性化プロドラッグ療法について患者を選択するために使用できる他のマーカーがある。本発明の低酸素活性化プロドラッグは還元酵素により活性化されるため、患者がＰＯＲ（Ｐ４５０酸化還元酵素）、ＭＴＲＲ（メチオニンシンターゼ還元酵素）、及び／又はＮＯＳ（酸化窒素シンターゼ）のようなより高いレベルの活性化還元酵素を有することを示す生検又は血液検査は、患者が低酸素活性化プロドラッグ療法に応答する可能性がより高いことを証明する。更に、これらの低酸素症活性化プロドラッグにより誘導されるＤＮＡ損傷は、ＨＤＲ（ＨＲとしても知られている）系により修復され、患者の血液又は腫瘍生検試料中に、特に限定されないが、ＢＲＣＡ、ＦＡＮＧ、ＸＰＦ（これはＥＲＣＣ４としても知られている）、ＸＲＣＣ２、及び／又はＸＲＣＣ３を含むこの系のタンパク質のレベルが低いほど、患者が低酸素活性化プロドラッグ療法に応答する可能性が高い。
【００９８】
野生型ＥＧＦＲを有する関連集団は、ＴＨ−４０００の臨床試験において同定することができる。ＥＧＦＲ耐性の有無にかかわらず被験者に特定され、下記のように遺伝子型が決定される。
【００９９】
ある化合物の最大許容量（ＭＴＤ）は、医学及び薬理学の分野で知られている方法及び材料を用いて、例えば用量漸増実験により決定される。１人以上の患者が、最初に低用量の化合物、典型的にはインビトロ細胞培養実験の結果に基づいて治療薬であると予想される用量の１０％で治療される。患者は、毒性の発生を判定するために一定期間観察される。毒性は典型的には、嘔吐、下痢、末梢ニューロパシー、運動失調、好中球減少、又は肝酵素の上昇の１つ又は複数の症状の観察として証明される。毒性が観察されない場合、用量は２倍に増加され、患者は再び毒性の証拠について観察される。このサイクルは、毒性の証拠を示す投与量に達するまで繰り返される。受け入れられない毒性の発症の直前の用量をＭＩＤとする。ＭＴＤの決定は上記に提供される。
【０１００】
野生型対立遺伝子を保有する個体は、当技術分野で周知の種々の技術を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質レベルで検出することができる。同定及び検出のための戦略は、例えば、欧州特許第７３０，６６３号、欧州特許第７１７，１１３号、及びＰＣＴ  ＵＳ９７／０２１０２号に記載されている。野生型を含む対立遺伝子の同定は、標的試料からのＤＮＡの増幅を含み得る。これは、例えばＰＣＲにより達成することができる。総説としては、PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (Erlich 編, Freeman Press, New York, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al.編, Academic Press, San Diego, Calif., 1990) を参照。特定のＤＮＡ配列における野生型の検出は、特に限定されないが、対立遺伝子特異的制限エンドヌクレアーゼ切断に基づく制限断片長の野生型検出（Kan&Dozy, LancetII: 910-912 (1978)）、固定化オリゴヌクレオチド（Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6230-6234 (1969)）又はオリゴヌクレオチドアレイ（Maskos & Southern, Nucl. Acids Res. 21:2269-2270 (1993)）を含む対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（Wallace et al, Nucl. Acids Res. 6:3543-3557 (1978)）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Newton et al., Nucl. Acids Res. 17:2503-2516 (1989)）、ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）（Faham & Cox, Genome Res. 5:474-482 (1995)）、ＭｕｔＳタンパク質の結合(Wagner et al., Nucl. Acids Res. 23:3944-3948 (1995), 変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Fisher & Lerman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:1579-1583 (1983)）、一本鎖コンフォメーション−野生型検出（Orita et al., Genomics 5:874-879 (1983)）、ミスマッチ塩基対でのＲＮＡｓｅ切断（Myers et al., Science 230:1242 (1985)）、ヘテロ二本鎖ＤＮＡの化学的（Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 8Z:4397-4401 (1988)）又は酵素的 （Youil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:87-91 (1995)）切断、対立遺伝子特異的プライマー伸長に基づく方法（Syvanen et al., Genomics 8:684-692 (1990)）、遺伝的ビット解析（ＧＢＡ）（Nikiforov et al., Nucl. Acids Res. 22:4167-4175 (1994)）、オリゴヌクレオチド結合アッセイ（ＯＬＡ）（Landegren et al., Science 241:1077 (1988)）、対立遺伝子特異的結合チェイン反応（ＬＣＲ）（Barrany, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:189-193 (1991)）、gap-LCR（Abravaya et al., Nucl. Acids Res. 23:675-682 (1995)）、当該分野で公知の標準法及びペプチド核酸（ＰＮＡ）アッセイを用いる放射性及び／又は蛍光ＤＮＡ配列決定（Orum et al., Nucl. Acids Res. 21:5332-5356 (1993); Thiede et al., Nucl. Acids Res. 24:983-984 (1996)）により行うことができる。さらなる指針は、Sambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版 (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000) により与えられる。ある実施態様において、遺伝子発現を検出するための方法は、遺伝子チップの使用を含む。遺伝子チップの構築と使用は当該分野で周知されている。米国特許第５，２０２，２３１号；５，４４５，９３４号；５，５２５，４６４号；５，６９５，９４０号；５，７４４，３０５号；５，７９５，７１６号、及び５，８００，９９２号を参照。また、Johnston, M. Curr Biol 8:R171-174 (1998); Iyer V R et al., Science 283:83-87 (1999) 及び Elias P, “New human genome `chip` is a revolution in the offing” Los Angeles Daily News (Oct. 3, 2003) を参照されたい。
【０１０１】
特に好適な実施態様において、遺伝子野生型の検出は、いわゆるＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＳＮＰ遺伝子タイピングアッセイ（Applied Biosystems, Foster City, CA から入手可能）を用いて行うことができる。
【０１０２】
臨床集団に含まれる個体は、関係する医学的症状の存在について等級付けされることが好ましい。潜在的な患者のこの等級付けは、標準的な理学的検査又は１つ以上の臨床検査を使用することができる。あるいは患者の等級付けは、遺伝子発現パターンと疾患の感受性又は重症度との間に強い相関がある状況について、遺伝子発現パターンを使用することができるかも知れない。
【０１０３】
目的の治療処置は試験集団中の各個体に施され、処置に対する各個体の応答は１つ以上の所定の基準を用いて測定される。多くの場合、試験集団はある範囲の応答を示し、研究者は、種々の応答によって構成された応答者グループの数（例えば、低い、中くらい、高い）を選択すると考えられる。
【０１０４】
臨床データと野生型データの両方が得られた後、個体の応答と遺伝子型又はハプロタイプの含量との相関が作成される。相関はいくつかの方法で作成することができる。１つの方法では、個体をその遺伝子型又はハプロタイプ（又はハプロタイプ対）（野生型群とも呼ばれる）でグループ分けし、各野生型群のメンバーにより示される臨床応答の平均及び標準偏差が計算される。
【０１０５】
結果を解析して、野生型群間の臨床応答において観察された変動が統計的に有意であるかどうかを決定する。使用できる統計解析方法は、L. D. Fisher & G. vanBelle, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences (Wiley-Interscience, New York, 1993) に記載されている。
【０１０６】
遺伝子発現パターンと臨床応答との相関を見出すための第２の方法は、誤差最小化最適化アルゴリズムに基づく予測モデルを使用する。多くの可能な最適化アルゴリズムの１つは、遺伝的アルゴリズムである（Reviews in Computational Chemistry, Vol. 10, pp. 1-73, K. B. Lipkowitz and D. B. Boyd 編 (VCH Publishers, New York, 1997)  中の R. Judson, “Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry” ）。シミュレート化アニーリング（Press et al., “Numerical Recipes in C: The Art of Scientific Computing”, Cambridge University Press (Cambridge) 1992, Ch. 10）、中性ネットワーク（E. Rich and K. Knight, “Artificial Intelligence”, 第２版 McGraw-Hill, New York, 1991, Ch. 18）、標準勾配降下法（Press et al., 前出、第10章）、又は他の全体的又は局所的アプローチ（Judson中の考察を参照、前述）も使用することができる。
【０１０７】
応答の変動が、測定され得る１つ以上の特性又は変数により引き起こされるか又はそれと相関するかどうかに関する仮説を試験するために、ＡＮＯＶＡが使用される（Fisher & vanBelle、前出、第１０章）。本発明の方法で使用するための統計学的方法については、Statistical Methods in Biology, 第３版, Bailey N T J, (Cambridge Univ. Press, 1997); Introduction to Computational Biology, Waterman M S (CRC Press, 2000)、及び Bioinformatics, Baxevanis A D & Ouellette B F F 編 (John Wiley & Sons, Inc., 2001)を参照されたい。
【０１０８】
上記の分析から、遺伝子発現パターンの関数として臨床応答を予測する数学的モデルが、当業者により容易に構築される。
【０１０９】
臨床応答と、遺伝子の遺伝子型又はハプロタイプ（又はハプロタイプ対）との関連の特定は、治療に応答するか又は応答しない個体を、又は低レベルで応答し、従ってより多くの治療、すなわちより多くの薬物の投与が必要となる可能性がある個体を決定する診断方法を設計するための基礎となり得るた。診断方法は、いくつかの形態のうちの１つを取ることができる：例えば直接ＤＮＡ検査（すなわち遺伝子発現パターン）、血清学的検査、又は理学的検査測定。唯一の要件は、診断テスト結果とその基礎となる遺伝子型又はハプロタイプとの間の良好な相関であり、それが臨床応答と相関することである。好適な実施態様において、この診断方法は、上記の予測的ハプロタイプ判定方法を使用する。
【０１１０】
コンピュータは、本発明の方法の実施に関与する任意の又はすべての分析的及び数学的操作を実行することができる。更にコンピュータは、表示装置に表示されたビュー（又はスクリーン）を生成し、ユーザがこれと対話して、染色体位置、遺伝子構造、及び遺伝子ファミリー、遺伝子発現データ、野生型データ、遺伝子配列データを含む遺伝子及びそのゲノム変化に関する大量の情報、及び臨床データ集団データ（例えば、１つ以上の集団の民族地理的起源、臨床応答、遺伝子型、及びハプロタイプに関するデータ）を表示して分析することができるプログラムを実行することができる。本明細書に記載される野生型データは、リレーショナルデータベース（例えば、Ｏｒａｃｌｅデータベースの例又はＡＳＣＩＩフラットファイルのセット）の一部として保存されてもよい。これらの野生型データは、コンピュータのハードドライブに保存してもよく、又は例えばＣＤ−ＲＯＭ又はコンピュータによりアクセス可能な１つ以上の他の記憶装置に保存してもよい。例えばデータは、ネットワークを介してコンピュータと通信する１つ又は複数のデータベースに保存してもよい。
【０１１１】
他の実施態様において、本発明は、個体の遺伝子をハプロタイプ判定及び／又は遺伝子型判定するための方法、組成物、及びキットを提供する。この組成物は、野生型部位を含むか又はそれに隣接する１つ以上の標的領域に特異的にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーを含む。本明細書に記載される野生型部位における個体の遺伝子型又はハプロタイプを確立するための方法及び組成物は、タンパク質の発現及び機能により影響を受ける疾患の病因における野生型の影響を試験するために、タンパク質の発現及び機能により影響を受ける疾患を標的とし、この疾患に対する個体の感受性を予測し、遺伝子産物を標的とする薬物に対する個体の応答性を予測するのに有用である。
【０１１２】
更に別の実施態様において、本発明は、遺伝子発現パターンと形質との関連を特定するための方法を提供する。好適な実施態様において、形質は、疾患に対する感受性、疾患の重症度、疾患の病期分類、又は薬物に対する応答である。このような方法は、遺伝子型と治療結果（有効性測定値、ＰＫ測定値、及び副作用測定値を含む）との関連の可能性がある全ての薬理遺伝学的適用のための診断検査及び治療処置の開発に適用可能である。
【０１１３】
本発明はまた、遺伝子について決定された野生型データを記憶して表示するコンピュータシステムを提供する。コンピュータシステムは、コンピュータ処理装置、ディスプレイ；遺伝子発現パターンデータを含むデータベースとを含む。遺伝子発現パターンデータは、参照集団における遺伝子発現パターンを含み得る。好適な実施態様において、コンピュータシステムは、その進化的関係に従って整理された遺伝子発現パターンを示すディスプレイを作製することができる。
【０１１４】
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡにおける多くの他の従来技術が使用される。これらの技術は周知であり、例えば、“Current Protocols in Molecular Biology”, Vols. I-III, Ausubel 編 (1997); Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); “DNA Cloning: A Practical Approach”, Vols. I and II, Glover 編 (1985); “Oligonucleotide Synthesis”, Gait 編 (1984); “Nucleic Acid Hybridization”, Hames & Higgins 編 (1985); “Transcription and Translation”, Hames & Higgins 編 (1984); “Animal Cell Culture”, Freshney 編 (1986); “Immobilized Cells and Enzymes”, IRL Press (1986); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”; the series, Methods in Enzymol., Academic Press, Inc. (1984); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”, Miller and Calos 編, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1987); 及び Methods in Enzymology, Vols. 154 and 155, Wu & Grossman, and Wu 編 にそれぞれ説明されている。
【０１１５】
異なる対照群でこのようにして決定された遺伝子発現産物の標準的対照レベルは次に、所定の患者における遺伝子発現産物の測定レベルと比較される。この遺伝子発現産物は、その特定の遺伝子型群又はその遺伝子型群のポリペプチド遺伝子発現産物に関連する特徴的なｍＲＮＡでもよい。次に患者は、測定されたレベルが所定のグループについての対照レベルとの類似の程度に基づいて、特定の遺伝子型グループに分類又は割り当てられる。
【０１１６】
当業者が理解するように、この決定を行う際にはある程度の不確実性が存在するであろう。従って、対照群レベルの標準偏差を用いて確率的決定が行われ、本発明の方法は、広範囲の確率に基づく遺伝子型群決定に適用可能であろう。すなわち例えば、決して限定するものではないが、１つの実施態様において、遺伝子発現産物の測定レベルが対照群のいずれかの平均の２．５標準偏差内にある場合、その個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。別の実施態様において、遺伝子発現産物の測定レベルが対照群のいずれかの平均の２．０標準偏差内にある場合、その個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。更に別の実施態様において、遺伝子発現産物の測定レベルが対照群のいずれかの平均の１．５標準偏差内にある場合、その個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。更に別の実施態様において、遺伝子発現産物の測定レベルが対照群のいずれかの平均の１．０標準偏差未満である場合、その個体をその遺伝子型群に割り当てることができる。
【０１１７】
従ってこのプロセスは、特定の患者をどのグループに入れるべきかを種々の程度の確率で決定することを可能にし、そのような遺伝子型グループへの割り当ては、個体を入れるべきリスクカテゴリーを決定するであろう。
【０１１８】
ｍＲＮＡレベル及びポリペプチド遺伝子発現産物のレベルを検出及び測定する方法は、当該技術分野で周知であり、ヌクレオチドマイクロアレイ、及び質量分析計及び／又は抗体検出及び定量技術を含むポリペプチド検出方法の使用を含む。また、Human Molecular Genetics, 2nd Edition. Tom Strachan & Andrew, Read (John Wiley and Sons, Inc. Publication, NY, 1999) を参照されたい。
【０１１９】
目的の治療処置を集団の各個体に施し、治療に対する各個体の応答を１つ以上の所定の基準を用いて測定する。多くの場合、集団はある範囲の応答を示し、試験者は種々の応答により構成された応答者グループの数（例えば少ない、中程度、及び多い）を選択することが考えられる。更に、集団中の各個体の遺伝子は、遺伝子型判定及び／又はハプロタイプ判定され、これは、治療を施す前又は後に行うことができる。
【０１２０】
本明細書に記載される本発明の方法は一般に、本発明によるキットの使用を更に含み得ることを理解されたい。一般に本発明の診断方法は、エクスビボで実施することができ、そのようなエクスビボ法は本発明により具体的に企図される。また、本発明の方法がヒト又は動物の体で実施される工程を含む場合、ヒト又は動物の体で実施されない工程のみを含む方法が本発明により具体的に企図される。好適な実施態様において、このようなキットは、ＤＮＡ試料収集手段を含むことができる。
【０１２１】
従って本発明はまた、生物学的試料、例えば、特に限定されないが、血清、血漿、リンパ液、嚢胞液、尿、便、髄液、腹水、又は血液を含む体液、及び生体組織の生検試料などの生物学的試料中の、本発明のマーカーに対応するポリペプチド又は核酸の存在を検出するためのキットを包含する。例えばキットは、生物学的試料中の本発明のマーカーに対応するポリペプチド又はポリペプチドをコードするｍＲＮＡを検出することができる標識化合物又は薬剤を含み、及び試料中のポリペプチド又はｍＲＮＡの量を測定する手段、例えば、ポリペプチドに結合する抗体、又はポリペプチドをコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合するオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。キットは、キットを使用して得られた結果を解釈するための説明書を含むことができる。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドに基づくキットでは、キットは、例えば、１）本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド；又は２）本発明のマーカーに対応する核酸分子を増幅するのに有用な一対のプライマーを含むことができる。
【０１２３】
キットはまた、例えば緩衝剤、保存剤、又はタンパク質安定化剤を含むことができる。キットは更に、検出可能な標識物、例えば酵素又は基質を検出するために必要な成分を含むことができる。キットはまた、対照試料又は一連の対照試料を含むことができ、これをアッセイして試験試料と比較することができる。キットの各成分は、個別の容器に封入することができ、種々の容器のすべてを、キットを用いて実施したアッセイの結果を解釈するための説明書とともに、単一のパッケージ内に入れることができる。
【０１２４】
本発明のキットは、キット容器上又はキット容器内に書かれたものを含むことができる。この書かれたものには、キットに含まれている試薬を使用して、患者が薬物治療中に肝毒性を経験するかどうかを判断する方法が記載されている。いくつかの実施態様において試薬の使用は、本発明の方法に従うことができる。１つの実施態様において、試薬は、遺伝的野生型のＰＣＲ分析を実施するためのプライマー対である。
【０１２５】
要約され詳細に記載された本発明は、本発明のＴＨ−４０００の医薬的に許容し得る製剤を提供し、本発明の方法に従って癌を治療するためのＴＨ−４０００投与の有効性を証明する実施例により例示されるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１２６】
総論
材料：
ＨＣＣ８２７細胞株は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−２８６８）から入手可能である。ＰＣ９細胞株は RIKEN Bio Resource Center, Japan から入手できる。ＴＨ−４０００は、ＰＣＴ特許出願公報ＷＯ２０１１／０２８１３５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、望ましくない反応物質から合成され分離される。エルロチニブ（ＳＮ３１２５４）は、Auckland Cancer Society Research Centre, Medicinal Chemistry Department から提供された。（２−ヒドロキシルプロピル）−β−シクロデキストリンは、Sigma Aldrich（カタログ番号７７８９６６−５００Ｇ）から入手可能である。ポリ（エチレングリコール）４００（ＰＥＧ−４００）は、Sigma Aldrich（カタログ番号Ｐ３２６５−１ＫＧ）から入手可能である。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、ECP Ltd, New Zealand（カタログ番号２２００．１−５００ｍｌ）から入手可能である。注射用水（ＷＦＩ）は DEMO S.A. Pharmaceutical Industry, Greece から入手可能である。
【０１２７】
実施例１
ＴＨ−４０００の単位用量製剤
ＴＨ−４０００は、蒸留又は逆浸透により精製された超純水「ＷＦＩ」及び２０％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン中に製剤化され、単位用量形態のＴＨ−４０００を生成した。
【０１２８】
実施例２
臨床的に適切なヒト等価用量での低酸素腫瘍細胞、特にＥＧＦＲ変異陽性非小細胞肺癌の死滅におけるＴＨ−４０００の有効性の証明
ＨＣＣ８２７及びＰＣ９細胞は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおいてエキソン１９欠失変異を有するＮＳＣＬＣ細胞株である。ＨＣＣ８２７は変異ＥＧＦＲ（１００％突然変異対立遺伝子）に関してホモ接合性であるのに対して、ＰＣ９細胞中の対立遺伝子の割合は野生型ＥＧＦＲ（８７％の変異体及び１３％の野生型）を含み、この点でヘテロ接合性である。この実施例は、変異型ＥＧＦＲ駆動肺癌のインビボ異種移植モデルを用いて、２つの遺伝的背景において臨床的に達成可能な用量レベルでのＴＨ−４０００及びエルロチニブの相対的有効性を評価した。
【０１２９】
ＨＣＣ８２７及びＰＣ９ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞を培地中で調製した。次に、接種物１個あたり１０００万個の細胞を、５〜８週齢のメスのＮＩＨ−ＩＩＩヌードマウス（１８〜２４ｇ）に皮下注射した。ＨＣＣ８２７腫瘍は約２００ｍｍ3で動員され、ＰＣ９腫瘍は約４００ｍｍ3で動員された。腫瘍が所望の体積に達したら、マウスをＡ群〜Ｅ群に無作為に割り当て、以下の表１に詳述するように処置した：
【表１】
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【０１３０】
ＴＨ−４０００を実施例１のように製剤化した。エルロチニブを、４０％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン中の５％ＤＭＳＯ、４０％ＰＥＧ−４００の溶液中で製剤化した。３日ごと又は投与前に体重を記録し、皮下腫瘍の長さ及び幅を３日ごとに電子キャリパーで測定し、長楕円体（π／６×長さ×幅×幅）の式に従って体積を計算した。他の全ての臨床徴候が記録された。
【０１３１】
結果を以下に記載する。確立された皮下腫瘍を有するマウスを、ＦＤＡ承認のヒト用量（１５０ｍｇ、毎日経口投与）と同等の平均血液曝露（ＡＵＣinf ２０，０００ｎｇ＊ｈ／ｍｌ）を与えるエルロチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日経口投与）で治療すると、腫瘍を含有するホモ接合性のＥＧＦＲ変異体のみをうまく制御することができる（図１〜２、表２〜４）。
【表２】
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【表３】
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【表４】
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【０１３２】
対照的に、ＴＨ−４０００は、第Ｉ相臨床試験でＴＨ−４０００の最大安全投与量（１５０ｍｇ／ｍ2）で得られた血漿濃度のわずか１０％〜２０％である血漿濃度で、ホモ接合性及びヘテロ接合性の両方の腫瘍において高度に活性である。ＨＣＣ８２７異種移植片におけるＴＨ−４０００の増殖遅延を、３０、１５、及び７．５ｍｇ／ｋｇ（ｑ３ｄ×８）の３用量で評価した。両方の用量レベルでのすべてのＨＣＣ８２７腫瘍の退行；ＣＲが１００％である。９２％の腫瘍は９０日以内に増殖しなかった。２つのＴＨ−４０００処置群において軽度の体重減少のみ（１．１％〜２．５％）が観察された。
【０１３３】
これらの結果は、低酸素依存性代謝が、低酸素腫瘍細胞におけるＥＧＦＲ  ＴＫＩの腫瘍選択的放出をもたらすという証拠を提供する。高い局所濃度は、低酸素腫瘍区画における野生型ＥＧＦＲシグナル伝達をサイレンス化するのに必要な治療指数を提供する。これらの結果はまた、エキソン１９欠失変異を有するＮＳＣＬＣモデルにおけるＴＨ−４０００の有効性を確立する。従って、ＥＧＦＲ  ＮＳＣＬＣは、ヒト被験体において容易に達成される血漿曝露で、エルロチニブに対する低酸素誘発耐性を克服し得る。ＴＨ−４０００は、ＷＴ  ＥＧＦＲ駆動異種移植モデルにおいてエルロチニブ及びアファチニブと比較してより大きな活性を示し、ヒト被験体において容易に達成される血漿曝露でＨＥＲ２増幅異種移植モデルにおいて良好な活性を有する。
【０１３４】
実施例３
ＰＣ−９腫瘍におけるＴＨ−４０００及びＴＨ−４０００Ｅの薬物動態（ＰＫ）及び薬力学的（ＰＤ）プロファイルの証明
ＰＣ−９腫瘍を有するＮＩＨ−ＩＩＩマウスにおいて、１５ｍｇ／ｋｇのＴＨ−４０００を腹腔内投与した場合の薬物動態及び薬力学的試験を行った。マウスにＰＣ−９細胞を接種した（マウス１匹あたり約８×１０6細胞、合計４２匹のマウス）。ＴＨ−４０００を上記のように製剤化し、マウスを安楽死させ、ＴＨ−４０００投与後の以下の時点で３つの腫瘍を切除した：０．５時間、３時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、及び１６８時間。全腫瘍を（液体窒素を用いて）急速冷凍し、バイオ粉砕した。腫瘍は、集めて腫瘍の増殖速度を標的シャットダウンと相関させるまで、毎日測定された。生物粉砕後、生物粉砕した腫瘍の半分を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＴＨ−４０００及びＴＨ−４０００Ｅ濃度の測定のために処理した。腫瘍の残りの半分は、ｐＥＧＦＲ及び総タンパク質（ＥＧＦＲ、α−チューブリン）のレベルを測定するためのタンパク質抽出及びウェスタンブロッティングのために処理した。
【０１３５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳについては、４容量の氷冷アセトニトリル（０．５μＭのＤ６−ＴＨ−４０００及びＴＨ−４０００Ｅを含む）を腫瘍試料に添加した。試料を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、４０μＬの上清を採取した。上清に０．０１％ＦＡ−水  ８０μＬを添加し、試料を混合した。この試料１０μＬを分析のために注入した。質量分析検出は、マルチモードイオン化（ＭＭＩ）源を備えたAgilent6410 トリプル四重極質量分析計を用いて行った。質量分析計は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いた電子噴霧陽性イオン化モードで操作した。Agilent MassHunter ソフトウェア（ｖ４．０４．００）をデータ収集とクロマトグラフのピーク積分に使用した。
【０１３６】
腫瘍試料のウェスタンブロッティングのために、粉砕した組織を収集し、ドライアイスに埋め込んだエッペンドルフチューブに迅速に移した。いったん全ての試料がバイオ粉砕されると、それらは迅速に計量され、チューブをドライアイスに保ちながら組織重量を記録した。ドラフトチャンバー下で、試料の重量の１０倍に相当する冷１× Laemmli 緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤（希釈１：１００）の量を加え、試料を湿った氷に移した。試料を１分間ボルテックス混合し、崩壊した組織が肉眼で可溶化されていることを確認した。試料をエッペンドルフ Thermomixer Compact 中で３００ＲＰＭで振盪しながら、７０℃で１０分間インキュベートした。残存する未溶解組織を、室温で１３，０００×ｇで５分間遠心分離することにより沈降させた。BioRad プロテイン（Bradford）アッセイを用いてタンパク質濃度を測定するために、２０ｍｌアリコートを取っておいた。試料の残りは−２０℃で凍結した。結果を以下に示す。
【表５】
0006769962.tif 000008
【０１３７】
エルロチニブ（０．１〜１０μＭ）によるＥＧＦＲ自己リン酸化（Ｙ１０６８）の阻害を検出するために、ウェスタンブロッティング法も使用した。ＨＣＣ８２７及びＰＣ９細胞培養物を対数期継代フラスコから準備する。細胞を１ウェルあたり１００万細胞の密度で６ウェルプレートに播種し、酸素正常又は低酸素（１％Ｏ2）条件下で４８時間放置する。エルロチニブ薬物ストック溶液を培地で希釈して、各ウェルの最終濃度（図に示すように）を得る。３時間の薬物曝露の後、細胞を氷冷ＰＢＳで洗浄し、オルトバナジウム酸ナトリウムとフッ化ナトリウムをそれぞれ１ｍＭの最終濃度で含む放射免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液を用いて氷上で３０分間溶解する。細胞破片を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、２分）によりペレット化する。各試料中のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイにより測定される。等量のタンパク質（１０μｇ）を変性させ（９８℃で５分）、タンパク質分離のために４〜２０％のトリス−グリシンタンパク質ゲルにのせる。ニトロセルロース膜に移した後、各膜を５％ウシ血清アルブミン（トリス緩衝化食塩水中）で１時間ブロックした。ｐＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）に対する一次抗体（ウサギ、ポリクローナル）を、５％ウシ血清アルブミン（トリス緩衝化食塩水）中で１：２０００の希釈率で一晩添加した。各膜中の過剰な一次抗体をトリス緩衝化食塩水で洗い流した。二次抗体（ヤギ抗ウサギ）を各膜に１：５０００希釈で２時間添加した。タンパク質検出のために、膜をトリス緩衝化食塩水で洗浄して、添加した過剰の二次抗体及び化学発光基質（Pierce Supersignal West Pico 化学発光基質）を５分間除去した。Fujifilm LAS 4000イメージャを用いて膜を観察した。このインビトロのデータは、ヘテロ接合性ＰＣ−９細胞株のエルロチニブ耐性における低酸素曝露（１％Ｏ2）の役割を示した（図６及び７参照）。
【０１３８】
ヌードマウスにおける１５ｍｇ／ｋｇのＴＨ−４０００の単回投与は、ヒト被験体において３２ｍｇ／ｍ2に相当する血漿ＡＵＣを達成し、これは第Ｉ相試験で定義した最大安全用量（ＭＴＤ＝１５０ｍｇ／ｍ2／週；ＮＣＴ０１６３１２７９）の１／５である。ＴＨ−４０００はマウス血漿から急速に消失した（Ｔ1/2＝０．３７時間）が、ＰＣ９腫瘍では耐久性があり（Ｔ１／2＝３９時間）、有効レベルより上のＴＫＩを７日間放出した（Ｔ1/2β＝８４時間）。これらのＰＫ特性と一致して、ＥＧＦＲシグナル伝達の全体的なシャットダウンは深遠で持続性があり、７日目までに回復しなかった。作用機構を確認するために、我々は、ＴＨ−４０００の物理化学的性質を反映した化学バイオツール（ＣＢＴ）を調製したが、ｌｅ−減少後にＴＫＩを放出しないように設計した。ＴＨ−４０００は、Ｏ2（ＴＫＩ＜０．００２ｎｍｏｌ／ｈｒ／１０6細胞）により阻害されたプロセスである、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株のパネル（ＴＫＩ放出速度０．４〜２．１ｎｍｏｌ／ｈｒ／１０6細胞）を用いて無酸素下で効率的に代謝された。ＣＢＴはすべての条件下で代謝的に不活性であった。細胞の抗増殖及び受容体リン酸化アッセイは、親ＴＫＩに比べてＴＨ−４０００の１４〜８０倍の失活を示したが、ＣＢＴが酸素状態とは無関係に失活されたことを示した。インビボでは、高圧酸素Ｏ2呼吸は、ＴＨ−４０００からのＴＫＩのＰＣ９腫瘍生成を＞８０％（５３８対９９ｎｍｏｌ／ｋｇ；ｐ＜０．０１）抑制したが、ＣＢ−Ｔは有意なＴＫＩ（＜１％）を放出しなかった。これらのデータはまとめると、ＴＨ−４０００が独自の低酸素活性化機構を有し、変異型ＥＧＦＲ  ＮＳＣＬＣのヘテロ接合性モデルにおいて活性であり、ヒト被験体において容易に達成される血漿曝露でエルロチニブに対する低酸素誘発耐性を克服し得ることを示す。
【０１３９】
実施例４
ＰＣ−９異種移植片におけるエルロチニブと併用された癌の治療のためのＴＨ−４０００の有効性の証明
ヘテロ接合性（変異型／野生型）腫瘍におけるＴＨ−４０００の治療的利点を更に調べるために、ＰＣ９異種移植片をエルロチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日経口）で１４日間処理した後、週に１回ＴＨ−４０００（１５ｍｇ／ｋｇ）を導入した。更にＰＣ９異種移植片を、単一薬剤としてエルロチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日経口）で、又は単一薬剤としてＴＨ−４０００（３、７．５、及び１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で、又はエルロチニブとＴＨ−４０００を併用して上記投与量と投与経路で処理した。
【０１４０】
ＴＨ−４０００とエルロチニブを以下のように製剤化した：２０％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含むＷＦＩ中のＴＨ−４０００；４０％の２−ヒドロキシルプロピル−β−シクロデキストリン中４０％の、５％のＤＭＳＯ、４０％のＰＥＧ−４００の溶液中のエルロチニブ。ＰＣ９腫瘍細胞を５〜８週齢のメスのＮＩＨ−ＩＩＩヌードマウス（１７〜２２ｇ）に皮下接種した。腫瘍は約４００ｍｍ3まで増殖していた。腫瘍が４００ｍｍ3であった時、マウスをＡ群〜Ｊ群に無作為に割り当て、以下に詳述するように処置した：
【表６】
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【０１４１】
皮下腫瘍の長さ及び幅を３日ごとに電子キャリパーで測定し、長楕円体（π／６×長さ×幅×幅）の式に従って体積を計算した。体重は、３日毎又は投与前に記録した。他の全ての臨床徴候が記録された。
【０１４２】
ＴＨ−４０００の投与は、即時の腫瘍収縮をもたらした。ＰＣ９細胞では、ＴＨ−４０００の３用量（３、７．５，１５ｍｇ／ｋｇ；ｑｗ×４）にわたる有効性が証明された。腫瘍退縮は、７．５及び１５ｍｇ／ｋｇのＴＨ−４０００を投与されたすべてのマウスで見られた（図１１〜１２）。３ｍｇ／ｋｇのＴＨ−４０００を投与したマウスでは、安定した疾患が達成された（図１３）。１５ｍｇ／ｋｇのＴＨ−４０００の投与後１４日目に始まるＰＣ９腫瘍体積の減少は、マウス宿主における体重減少の欠如により示されるように、いずれの毒性の兆候とも関連していなかった（図１４）。しかし、エルロチニブは、投薬期間（２１日間）にわたって安定した疾患のみを達成した。理論に拘束されるつもりはないが、これらの観察結果は、腫瘍の低酸素区画における野生型ＥＧＦＲシグナル伝達と腫瘍全体にわたる変異体ＥＧＦＲシグナル伝達との両方を、協調してサイレンス化する必要性と一致する。これらはまた、ヘテロ接合性ＥＧＦＲ腫瘍におけるＴＨ−４０００の顕著な治療指数の存在を証明している。
【０１４３】
更に、好気性又は低酸素条件下のホモ接合性細胞株又はヘテロ接合性細胞株のいずれかでのＡＺＤ９２９１の活性を比較するウェスタンブロッティングデータ（図６〜８）は、エルロチニブについて見られたように、ヘテロ接合性ＥＧＦＲにおける腫瘍低酸素の存在下でのＡＺＤ９２９１に対する耐性と一致する。
【０１４４】
上記に示されるようにＴＨ−４０００は、ヒト試験において容易に達成される用量で、エルロチニブ耐性の前臨床ＮＳＣＬＣモデルにおいて顕著な退行を与える。
【０１４５】
実施例５
ＨＥＲ２増幅胃癌の異種移植モデルにおけるＴＨ−４０００の有効性の証明
エルロチニブ、アファチニブ、及びＴＨ−４０００の抗腫瘍活性を、ＷＴ  ＥＧＦＲ発現Ａ４３１異種移植片において、臨床的に適切な用量レベルとスケジュールで比較した。ＮＩＨ−ＩＩＩマウスには、３０ｍｇ／ｋｇのＴＨ−４０００（腹腔内）を投与して、６０．２μｇ＊ｈｒ／ｍＬのＡＵＣを達成し、これは、非結合ＴＨ−４０００についてのヒト被験者で１０４ｍｇ／ｍ2の用量に相当する。毎日の経口エルロチニブ又はアファチニブは、腫瘍の進行を防ぐことができなかった。１週間に１回（Ｑｗ×４）又は週２回（Ｑ３ｄ×８）のＴＨ−４０００（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）のみが、ＷＴ  ＥＧＦＲ駆動のＡ４３１腫瘍異種移植片を制御することができ、１００％腫瘍退縮が得られた。すべての処置は、体重変化が５％未満であり十分に許容された。図１５及び１６に見られるように、ＴＨ−４０００は、ＨＥＲ２陽性ＮＣＩ−Ｎ８７胃腫瘍異種移植片に対して活性であり、体重減少は最小（＜５％）であった。
【０１４６】
実施例６
ＦａＤｕ細胞における種々のＥＧＦＲ標的化薬剤の抗増殖アッセイ
この試験は、種々のＥＧＦＲ標的化薬剤に対する５日間の曝露後のＦａＤｕ細胞の感受性を測定することを目的とした。
評価した薬剤
【０１４７】
この試験で評価した薬剤は以下の通りであった：
試験番号：Ｔｉｔｌｅヒト下垂体ＦａＤｕ細胞を用いた好気的条件下でのセツキシマブ、エルロチニブ、ＴＨ−４０００及びＴＨ−４０００Ｅのｉｎｖｉｔｒｏ抗増殖活性
薬剤はセツキシマブ（ＩＭＣ−Ｃ２２５）
ＴＨ−４０００
ＴＨ−４０００Ｅ
エルロチニブ（ＯＳＩ−７７４）
【表７】
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【０１４８】
細胞株  この試験は、ヒト下咽頭細胞株であるＦａＤｕ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−４３）に注目する。ＦａＤｕ細胞を、日常的な抗生物質（Ｐ／Ｓ）の使用無しで、５％ＦＢＳを補足したαＭＥＭ培地で増殖させた。培養物は、液体窒素中の認証された凍結ストックから２４継代超の又は培養９０日超のいずれか（どちらか早い方）で再樹立された。凍結した細胞ストックは、PCR-ELIZA キット（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いてマイコプラズマが存在しないことを確認した。
【０１４９】
抗増殖アッセイ
ＦａＤｕ細胞を９６ウェルプレートに播種し（５％ＦＣＳを含むαＭＥＭ培地中１５００細胞／ウェル）、２１％Ｏ2で一晩沈降させた。次に、細胞を各試験化合物の１０回連続希釈物（３倍）で処理した。細胞を加湿インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）中で５日間増殖させた。次に、細胞を４０％トリクロロ酢酸で４℃で１時間固定した。次に、細胞をスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）発現について染色した。Biotek ELx808 吸光マイクロプレートリーダーを用いて、細胞密度を測定した。ＩＣ５０値は、細胞密度を５０％低下させるのに必要な値を外挿することにより推定した。
【０１５０】
ＴＨ−４０００Ｅは、５日間の抗増殖アッセイにおいて、セツキシマブよりも１５０倍の用量効力がある。従って、セツキシマブ耐性の頭頸部癌はＴＨ−４０００Ｅに対する感受性を保持し得る。エルロチニブの抗増殖活性は、セツキシマブよりもわずかに優れている（ＩＣ５０値は２倍異なる）。従って、ＦａＤｕ細胞は、セツキシマブ及びエルロチニブの両方に対する相対的な耐性を示す。ＴＨ−４０００Ｅは、エルロチニブより８０倍小さいＩＣ５０値を示す。従って、エルロチニブ耐性細胞は、ＴＨ−４０００Ｅに対する感受性を保持し得る。連続的に５日間曝露されたＦａＤｕ細胞において、プロドラッグＴＨ−４０００の抗増殖活性はＴＨ−４０００Ｅ（エフェクター）より１３倍低く、エフェクターと比較してプロドラッグの失活を示した。
【０１５１】
図１７においてＩＣ５０値は、未処理対照と比較して増殖を５０％低下させるのに必要な薬剤の濃度を表す。ＩＣ５０値は、３つ以上の独立した実験の平均±標準誤差である。ＦａＤｕ細胞は、臨床的に承認されたＥＧＦＲ阻害剤セツキシマブ及びエルロチニブに対して比較的耐性である。セツキシマブ及びエルロチニブに対する耐性にもかかわらず、ＦａＤｕ細胞はＴＨ−４０００Ｅに対して顕著な感受性を示す。プロドラッグＴＨ−４０００は、ＴＨ−４０００Ｅと比べて失活される。
【０１５２】
実施例７
Ｆａｄｕ細胞における種々のＥＧＦＲ標的化薬剤の抗増殖アッセイ
この試験は、無酸素曝露が、種々のＥＧＦＲ標的化薬剤に対するＦａＤｕ細胞の感受性をどのように変化させるかを測定することを目的とした。
評価した薬剤
【０１５３】
この試験で評価した薬剤は以下の通りであった：
【表８】
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【０１５４】
細胞株
この試験は、ヒト下咽頭細胞株であるＦａＤｕ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−４３）に注目する。ＦａＤｕ細胞を、日常的な抗生物質（Ｐ／Ｓ）の使用無しで、５％ＦＢＳを補足したαＭＥＭ培地で増殖させた。培養物は、液体窒素中の認証された凍結ストックから２４継代超の又は培養９０日超のいずれか（どちらか早い方）で再樹立された。凍結した細胞ストックは、PCR-ELIZA キット（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いてマイコプラズマが存在しないことを確認した。
【０１５５】
抗増殖アッセイ
ＦａＤｕ細胞の単層をトリプシン処理により採取し、血球計数器を用いて計数した。有酸素アッセイのために、細胞を９６ウェルプレートに播種し（１５００細胞／ウェル）、加湿インキュベーター（３７℃／５％ＣＯ2）中で２時間沈降させた。次に、各試験化合物の１０回連続希釈物（３倍）により細胞を２４時間処理した。無酸素プレートの場合、全ての供給品を、Ｈ2／パラジウム触媒嫌気性チャンバー（Bactron,, Shellab）中で少なくとも７２時間予備平衡化させて、残留酸素を除去した。実験の日に、細胞を遠心分離（１０００ｒｐｍ、５分）してペレット化した。培地を吸引した。次にペレットを嫌気性チャンバーに取り込み、無酸素平衡培地（αＭＥＭ培地、５％ＦＣＳ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ  ２’−デオキシシチジン、１０ｍｍｏｌ／Ｌグルコース）で希釈して、適切な細胞密度を達成した。細胞は、同一の条件で有酸素プレートに播種した。播種後、細胞を嫌気性チャンバー内の加湿インキュベーター（３７℃）中で２時間沈降させた。無酸素プレートを同様に、各試験化合物の１０段階希釈物（３倍）で処理した。薬物添加の４時間後に無酸素プレートを嫌気性チャンバーから取り出し、加湿インキュベーター（３７℃／５％ＣＯ2）中に更に２０時間置いた。全部で２４時間の薬物曝露後、有酸素プレートと無酸素プレートの両方を新鮮な培地（αＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋Ｐ／Ｓ）で３回洗浄した。細胞を合計５日間増殖させた。その後、細胞を４０％トリクロロ酢酸で４℃で１時間固定した。次に、プレートをスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）発現について染色した。Biotek ELx808 吸光度マイクロプレートリーダーを用いて細胞密度を測定した。ＩＣ５０値は、細胞密度を５０％低下させるのに必要な値の補間により推定した。
【０１５６】
無酸素状態は、ＦａＤｕ細胞のセツキシマブ感受性を低下させた。無酸素ＩＣ５０値は、有酸素相当値よりも４倍高かった。従って、無酸素曝露は、恐らくＥＧＦ受容体の増強された細胞内隔離（膜内部移行）により、ＦａＤｕ細胞中のセツキシマブ耐性を促進するようである。エルロチニブの抗増殖活性は、好気性曝露条件下ではセツキシマブよりもわずかに優れていた（ＩＣ５０値で３倍以上の用量効力）。ＦａＤｕ細胞のエルロチニブ感受性は無酸素の影響を受けなかった。無酸素曝露期間の後、エルロチニブのＩＣ５０値はセツキシマブよりも１３倍低く、セツキシマブの感度の変化を反映していた。無酸素曝露条件下では、ＴＨ−４０００はセツキシマブよりも３０００倍も用量効力があった（相対ＩＣ５０値）。従って、無酸素依存性機構によりセツキシマブ耐性になった頭頸部細胞は、ＴＨ−４０００に対する感受性を保持し得る。ＴＨ−４０００Ｅは、同族のプロドラッグＴＨ−４０００から低酸素条件下で放出される不可逆的なＨＥＲ１／２／４阻害剤である。ＴＨ−４０００Ｅは、エルロチニブより１４００倍大きな用量効力を示す（ＩＣ５０値で測定）。従って、エルロチニブ耐性細胞は、ＴＨ−４０００Ｅに対する感受性を保持し得る。無酸素曝露の期間の後、ＴＨ−４０００は、ＩＣ５０値の変化により測定すると、エルロチニブよりも２４４倍高い用量効力を有した。従って、エルロチニブ耐性の頭頸部細胞はＴＨ−４０００に対する感受性を保持し得る。ＴＨ−４０００は、不可逆的なＨＥＲ１／２／４阻害剤であるＴＨ−４０００Ｅの低酸素活性化プロドラッグである。空気中では、エフェクター（ＴＨ−４０００Ｅ）の抗増殖活性は、プロドラッグ（ＴＨ−４０００）より優れていた。すなわちプロドラッグＴＨ−４０００は、その同種のエフェクターＴＨ−４０００Ｅに対して６２倍不活性化される。ＴＨ−４０００はＦａＤｕ細胞において低酸素選択的増殖抑制活性を示し、４時間の無酸素後に１５倍活性が高かった。
【０１５７】
図１８に関して、無酸素実験ＦａＤｕ細胞を嫌気性条件下で播種した。薬物添加の４時間後、嫌気性チャンバーから無酸素プレートを取り出し、加湿インキュベーター（３７℃／５％ＣＯ2）中に更に２０時間入れた。有酸素実験のために、ＦａＤｕ細胞を播種し、加湿インキュベーター（３７℃／５％ＣＯ2）中で２４時間薬物処理した。ＩＣ５０値は、未処理対照と比較して増殖を５０％低下させるのに必要な薬剤の濃度を表す。ＩＣ５０値は、３つ以上の独立した実験の平均±標準誤差である。
【０１５８】
無酸素状態は、ＦａＤｕ細胞のセツキシマブ感受性を顕著に低下させた。無酸素状態は、エルロチニブ曝露に対するＦａＤｕ細胞の感受性を変化させなかった。無酸素状態は、ＦａＤｕ細胞におけるＴＨ−４０００感受性を顕著に増強した。ＴＨ−４０００Ｅは、ＦａＤｕ細胞においてセツキシマブ又はエルロチニブのいずれよりも実質的に用量効力が高かった。ＴＨ−４０００は、ＴＨ−４０００Ｅと比較して６２倍の失活率を示した。ＴＨ−４０００は、４時間の無酸素対有酸素に続いて、ＦａＤｕ細胞に対して１５倍用量効力があった。
【０１５９】
実施例８
ＦａＤｕ細胞における種々のＥＧＦＲ標的化薬剤による標的の修飾
この試験の目的は、ＥＧＦＲ及びその下流のシグナル伝達物質あるｐＡｋｔとｐＥＲＫの発現に対する種々のＥＧＦＲ標的化薬剤の濃度依存関係を測定することであった。
【０１６０】
細胞株
この試験は、ヒト下咽頭細胞株であるＦａＤｕ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−４３）を使用した。ＦａＤｕ細胞を、日常的な抗生物質（Ｐ／Ｓ）の使用無しで、５％ＦＢＳを補足したαＭＥＭ培地で増殖させた。培養物は、液体窒素中の認証された凍結ストックから２４継代超の又は培養９０日超のいずれか（どちらか早い方）で再樹立された。凍結した細胞ストックは、PCR-ELIZA キット（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いてマイコプラズマが存在しないことを確認した。
【０１６１】
培養条件及び溶解物の調製
ＦａＤｕ細胞を６ウェルプレートに播種し（ウェルあたり７０万個）、一晩沈降させた。次に、細胞を勾配濃度のＴＨ−４０００、ＴＨ−４０００Ｅ、又はセツキシマブ（３倍希釈）で１時間インキュベートした。次に細胞を５０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ（Sigma ＃Ｅ９６４４）で１５分間刺激した。
【０１６２】
ウェスタンブロッティングのための溶解物調製
細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、修飾ＲＩＰＡ緩衝液（ＲＩＰＡ［５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−ＨＣｌ、１％ＮＰ−４０，０．２５％Ｎａ−デオキシコレート、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ］＋１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ3ＶＯ4＋１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ＋１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma ＃Ｐ８３４０））で氷上で３０分間インキュベートして、溶解物を調製した。清澄化後、ＢＣＡアッセイを行って試料のタンパク質濃度を測定した。吸光度の読み取りは５５０ｎｍで行った。
【０１６３】
ウェスタンブロッティング
細胞溶解物をゲル電気泳動により分離し、ＥＧＦＲシグナル伝達軸の種々のメンバーについてイムノブロットした。各ローディング容量は、１０μｇのタンパク質及び２５％ＳＤＳ試料緩衝液（Life Technologies ＃ＮＰ０００７）を含んだ。試料をNuPAGE ４〜１２％ビス−トリス１５ウェルゲル（Life Technologies ＃ＮＰ０３３６）にのせ、ＭＥＳランニング緩衝液（Life Technologies ＃ＮＰ０００２）中で１２０Ｖで約２時間、又は試料がゲルから流れ出るまで（いずれか早い方）流した。次に、試料をニトロセルロース膜上に１００Ｖで８０分間移した（トランスファー緩衝液：２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）。ブロットをＴＢＳ−Ｔ中の５％ＢＳＡ又は５％ホスホブロック（CellBiolabs ＃ＡＫＲ−１０４）で少なくとも１時間ブロックした。使用した一次及び二次抗体は表６及び７に要約されている。簡単に述べると、ブロットを一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄を３回行った後、ブロットを、適切なＨＲＰ結合二次抗体と室温で少なくとも２時間インキュベートした。全ての場合に、ブロットは、Supersignal West Pico 化学発光基質（Life Technologies、＃３４０８０）を用いて Fijifilm LAS4000システム上で画像化された。標的タンパク質（例えば、ｐＥＲＫ及びｐＡｋｔ）がβ−アクチン（対照）と同様のバンドサイズであるため、ブロットをRestore ウエスタンブロットストリッピング緩衝液（Thermofisher Scientific ＃２１０５９）と１５分間インキュベートすることにより、結合抗体を除去した。ＴＢＳ−Ｔで１回洗浄した後、ブロットをβ−アクチン又はα−チューブリンとプローブ結合させた。
【表９】
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【表１０】
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【０１６４】
ＴＨ−４０００Ｅは、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する上でセツキシマブよりも優れていた。ＴＨ−４０００Ｅは、０．１２μＭ以上の濃度でｐＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）及びｐＥＲＫ発現を完全にサイレンス化した。同様に、ｐＡｋｔ発現は、０．１２μＭを超える濃度でほぼサイレンス化された。セツキシマブは、１．１μＭ以上の濃度でｐＥＧＦＲ発現を部分的にサイレンス化したが、これはｐＡｋｔ及びｐＥＲＫを介する下流のシグナル伝達に最小の影響しか及ぼさなかった。最大１０μＭのセツキシマブへの曝露は、ｐＡｋｔ及びｐＥＲＫ活性をサイレンス化させなかった。ＴＨ−４０００Ｅは、ＥＧＦＲ経路シグナル伝達の阻害により判断されるように、セツキシマブよりも少なくとも２５０倍高い用量効力を有した。ＴＨ−４０００Ｅ（ＴＨ−４０００のエフェクター）は、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する上でＴＨ−４０００（プロドラッグ）よりも優れていた。ＴＨ−４０００は、１．１μＭまでｐＥＧＦＲ発現を完全にサイレンス化しました（ＴＨ−４０００Ｅでは０．０４μＭ）。
【０１６５】
ｐＡｋｔ発現は０．３７μＭまで完全にサイレンス化された。ＴＨ−４０００Ｅは、ＥＧＦＲ経路シグナル伝達の阻害により判断されるように、ＴＨ−４０００よりも約２８倍高い用量効力を有した。
【０１６６】
ＴＨ−４０００Ｅは、セツキシマブよりも少なくとも２５０倍高い用量効力を有した。ＴＨ−４０００はＴＨ−４００ＥよりもＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する効率が低く、その作用機序と一致していた。
【０１６７】
実施例９
ＦａＤｕ細胞におけるＴＨ−４０００Ｅ感受性に対する低酸素の影響
この試験の目的は、低酸素プレコンディショニングがＦａＤｕ細胞におけるＴＨ−４０００Ｅ感受性をどのように変化させるかを測定することであった。
【０１６８】
細胞株
この試験は、ヒト下咽頭細胞株であるＦａＤｕ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−４３）を使用した。ＦａＤｕ細胞を、日常的な抗生物質（Ｐ／Ｓ）の使用無しで、５％ＦＢＳを補足したαＭＥＭ培地で増殖させた。培養物は、液体窒素中の認証された凍結ストックから２４継代超の又は培養９０日超のいずれか（どちらか早い方）で再樹立された。凍結した細胞ストックは、PCR-ELIZA キット（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いてマイコプラズマが存在しないことを確認した。
【０１６９】
培養条件及び溶解物の調製
ＦａＤｕ細胞を、０．１％Ｏ2及び２１％Ｏ2下で６ウェルプレートに４８時間播種した（ウェルあたり５０万個）。４８時間の低酸素プレコンディショニングの後、細胞を種々の濃度のＴＨ−４０００Ｅと共に１時間インキュベートした。次に細胞を５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Sigma ＃Ｅ９６４４）で１５分間刺激した。
【０１７０】
ウェスタンブロッティングのための溶解物調製
指定された無酸素曝露期間の後、細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、修飾ＲＩＰＡ緩衝液（ＲＩＰＡ［５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−ＨＣｌ、１％ＮＰ−４０，０．２５％Ｎａ−デオキシコレート、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ］＋１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ3ＶＯ4＋１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ＋１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma ＃Ｐ８３４０））で氷上で３０分間インキュベートして、溶解物を調製した。清澄化後、ＢＣＡアッセイを行って試料のタンパク質濃度を測定した。吸光度の読み取りは５５０ｎｍで行った。
【０１７１】
ウェスタンブロッティング
細胞溶解物をゲル電気泳動により分離し、ＥＧＦＲシグナル伝達軸の種々のメンバーについてイムノブロットした。各ローディング容量は、１０μｇのタンパク質及び２５％ＳＤＳ試料緩衝液（Life Technologies ＃ＮＰ０００７）を含んだ。試料をNuPAGE ４〜１２％ビス−トリス１５ウェルゲル（Life Technologies ＃ＮＰ０３３６）にのせ、ＭＥＳランニング緩衝液（Life Technologies ＃ＮＰ０００２）中で１２０Ｖで約２時間、又は試料がゲルから流れ出るまで（いずれか早い方）流した。次に、試料をニトロセルロース膜上に１００Ｖで８０分間移した（トランスファー緩衝液：２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）。ブロットをＴＢＳ−Ｔ中の５％ＢＳＡ又は５％ホスホブロック（CellBiolabs ＃ＡＫＲ−１０４）で少なくとも１時間ブロックした。使用した一次及び二次抗体は表８及び９に要約されている。簡単に述べると、ブロットを一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄を３回行った後、ブロットを、適切なＨＲＰ結合二次抗体と室温で少なくとも２時間インキュベートした。全ての場合に、ブロットは、Supersignal West Pico 化学発光基質（Life Technologies、＃３４０８０）を用いて Fijifilm LAS4000システム上で画像化された。標的タンパク質（例えば、ｐＥＲＫ及びｐＡｋｔ）がアクチン（対照）と同様のバンドサイズであるため、ブロットをRestore ウエスタンブロットストリッピング緩衝液（Thermofisher Scientific ＃２１０５９）と１５分間インキュベートすることにより、結合抗体を除去した。ＴＢＳ−Ｔで１回洗浄した後、ブロットをβ−アクチン又はα−チューブリンとプローブ結合させた。
【表１１】
0006769962.tif 000014
【表１２】
0006769962.tif 000015
【０１７２】
ＴＨ−４０００Ｅ感受性は、有酸素及び低酸素プレコンディショニング細胞間で同等であった。使用されたＴＨ−４０００Ｅの濃度範囲（１０．０〜０．３７μｍｏｌ／Ｌ）にわたって、ＥＧＦＲシグナル伝達のほぼ完全なサイレンス化が観察された。
【０１７３】
低酸素プレコンディショニングは、使用されたＴＨ−４０００Ｅの希釈でＴＨ−４０００Ｅ感受性を変化させない。
【０１７４】
実施例１０
ＥＧＦＲ誘導の速度論
この試験の目的は、下咽頭細胞株ＦａＤｕにおける低酸素によりＥＧＦＲ発現がどのように変化するかを測定することであった。
【０１７５】
細胞株
この試験は、ヒト下咽頭細胞株であるＦａＤｕ（ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−４３）を使用した。ＦａＤｕ細胞を、日常的な抗生物質（Ｐ／Ｓ）の使用無しで、５％ＦＢＳを補足したαＭＥＭ培地で増殖させｆた。培養物は、液体窒素中の認証された凍結ストックから２４継代超の又は培養９０日超のいずれか（どちらか早い方）で再樹立された。凍結した細胞ストックは、PCR-ELIZA キット（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を用いてマイコプラズマが存在しないことを確認した。
【０１７６】
培養条件
ＦａＤｕ細胞をＴ２５フラスコに播種し（ウェルあたり７０万個）、２１％Ｏ2で一晩沈降させた。培地（αＭＥＭ＋５％ＦＣＳ）を吸引し、フラスコをＨ2／パラジウム触媒嫌気性チャンバー（Bactron, Shellab）に入れた。新鮮な無酸素平衡培地（αＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋Ｐ／Ｓ＋１％添加剤）を各フラスコに添加した。細胞を、有酸素回復有り及び無しで、無酸素状態に種々の時間曝露した（表１３）。
【表１３】
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【０１７７】
ウェスタンブロッティングのための溶解物調製
指定された無酸素曝露期間の後、細胞を氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を、修飾ＲＩＰＡ緩衝液（ＲＩＰＡ［５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−ＨＣｌ、１％ＮＰ−４０，０．２５％Ｎａ−デオキシコレート、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ］＋１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎａ3ＶＯ4＋１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＦ＋１ｘプロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma ＃Ｐ８３４０））で氷上で３０分間インキュベートして、溶解物を調製した。清澄化後、ＢＣＡアッセイを行って試料のタンパク質濃度を測定した。吸光度の読み取りは５５０ｎｍで行った。
【０１７８】
ウェスタンブロッティング
細胞溶解物をゲル電気泳動により分離し、ＥＧＦＲシグナル伝達軸の種々のメンバーについてイムノブロットした。各ローディング容量は、１０μｇのタンパク質及び２５％ＳＤＳ試料緩衝液（Life Technologies ＃ＮＰ０００７）を含んだ。試料をNuPAGE ４〜１２％ビス−トリス１５ウェルゲル（Life Technologies ＃ＮＰ０３３６）にのせ、ＭＥＳランニング緩衝液（Life Technologies ＃ＮＰ０００２）中で１２０Ｖで約２時間、又は試料がゲルから流れ出るまで（いずれか早い方）流した。次に、試料をニトロセルロース膜上に１００Ｖで８０分間移した（トランスファー緩衝液：２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール）。ブロットをＴＢＳ−Ｔ中の５％ホスホブロック（CellBiolabs ＃ＡＫＲ−１０４）又は５％ＢＳＡ中で少なくとも１時間ブロックした。使用した一次及び二次抗体は表１１及び１２に要約されている。簡単に述べると、ブロットを一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで５分間洗浄を３回行った後、ブロットを、適切なＨＲＰ結合二次抗体と室温で少なくとも２時間インキュベートした。全ての場合に、ブロットは、Supersignal West Pico 化学発光基質（Life Technologies、＃３４０８０）を用いて Fijifilm LAS4000システム上で画像化された。標的タンパク質（例えば、ｐＥＲＫ及びｐＡｋｔ）がアクチン（対照）と同様のバンドサイズであるため、ブロットを０．２Ｍ  ＮａＯＨと５分間インキュベートすることにより結合抗体を除去した。ＴＢＳ−Ｔ中の５％ＢＳＡで１回洗浄した後、ブロットをアクチンとプローブ結合させた。
【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【０１７９】
総ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）発現は、１４時間の無酸素状態により変化しなかった。ホスホ−ＥＧＦＲ（Ｙ１０９２）レベルは、ＦａＤｕ細胞において無酸素状態の時間とともに増加した。ホスホ−ＥＧＦＲ（Ｙ１０９２）レベルは、酸素正常状態への再曝露の５時間後に、ＦａＤｕ細胞において上昇したままであった。
【０１８０】
ＦａＤｕ細胞におけるｐＥＧＦＲ（Ｙ１０９２）の一時的誘導が、無酸素培養条件下で観察された。ｐＥＧＦＲ（Ｙ１０９２）レベルは、酸素正常状態への再曝露後、少なくとも５時間持続可能であった。
【０１８１】
実施例１１
野生型ＥＧＦＲ駆動Ｈ１２５非小細胞肺癌異種移植片におけるセツキシマブと組み合わせたＴＨ−４０００対セツキシマブと組み合わせたアファチニブ
この実施例の第１の目的は、Ｈ１２５異種移植片において毎週の単剤タルロキソチニブの有効性を、タルロキソチニブ／セツキシマブの組み合わせの有効性と比較し、Ｈ１２５異種移植片においてタルロキソチニブ／セツキシマブの有効性をアファチニブ／セツキシマブの有効性と比較し、並びにタキソキセチブ／セツキシマブの組合せの毒性をアファチニブ／セツキシマブの毒性と比較して評価することであった。
【０１８２】
すべての薬剤は、ヒトＰＫ等価用量で投与した。ＷＴ  ＥＧＦＲ駆動Ｈ１２５異種移植片において、タルロキソチニブ＋セツキシマブの組み合わせは、アファチニブ＋セツキシマブの組合せより顕著に有効であった（それぞれ６７％及び３７％のＯＲＲ）。単剤のＯＲＲは、タルロキソチニブ、セツキシマブ、及びアファチニブについて、それぞれ２９％、１７％、及び０％であった（表３）。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ％；２７日目）の分析は、タルロキソチニブ／セツキシマブの組み合わせが最も活性であり（ＴＧＩ＝８１％）、次にタルロキソチニブ単独（ＴＧＩ＝６９％）であることを示した。アファチニブ／セツキシマブの組み合わせは中間の活性を示した（ＴＧＩ＝６７％）。アファチニブとセツキシマブ単剤治療群は、不良な転帰を示した（表１）。全ての処置群において、顕著な体重減少は記録されなかった。
【表１７】
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【０１８３】
方法
Ｈ１２５腫瘍担持ＮＩＨ−ＩＩＩマウスを、以下の処置群の１つに無作為化した：
Ａ群：ビヒクル（２０％  ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含むＷＦＩ）、腹腔内、ｑｗ×６
Ｂ群：タルロキソチニブ、４８ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ×６
Ｃ群：セツキシマブ、０．２５ｍｇ／マウス、ｑ３ｄ×１４
Ｄ群：タルロキソチニブ、４８ｍｇ／ｋｇ、ｑｗ×６とセツキシマブ、０．２５ｍｇ／マウス、ｑ３ｄ×１４との組合せ
Ｅ群：アファチニブ、６ｍｇ／ｋｇ、ｑｄ×４２
Ｆ群：アファチニブ、６ｍｇ／ｋｇ、ｑｄｘ４２とセツキシマブ、０．２５ｍｇ／マウス、ｑ３ｄ×１４との組合せ。
【０１８４】
全ての用量及び処置スケジュールは、各薬剤の臨床的に適切な用量及びスケジュールに関して最良の利用可能な情報に基づいていた。ＮＩＨ−ＩＩＩヌードマウスにおけるヒト等価用量のタルロキソチニブ及びアファチニブを、両方の種における血漿タンパク質結合の調整後に社内で測定した。マウス（ＮＩＨ−ＩＩＩ）タルロキソチニブの４８ｍｇ／ｋｇ投与は、ヒトで１５０ｍｇ／ｍ2に相当する遊離薬剤の血漿曝露を引き起こし（試験者のパンフレットＴＨ−ＣＲ−６０１、Threshold Pharmaceuticals, INC）、毎週１回投与された。アファチニブのマウス用量６ｍｇ／ｋｇは、ヒトの４０ｍｇ／ｋｇと等価であることが判明し（Wind et al, 2013, Clin Pharmacokinet; 52:1101-1109）、毎日経口投与された。使用されたセツキシマブの用量は、Luo et al (2005, Cancer Chemother Pharmacol; 56[5]:455) の知見に基づき、マウス１匹あたり０．２５ｍｇの用量はセツキシマブの臨床的に達成可能な用量と等価であった（標的飽和が観察された）。マウスにおける除去半減期がヒト被験者に対して短いこと（それぞれ４０〜４２時間対１１４時間）を補正するために、マウスにおける投与をｑ３ｄ（３日毎）とした。
【０１８５】
タルロキソチニブとセツキシマブの組合せは、単一の薬剤としてのいずれかの治療よりも有効であった。この組合せは、ＰＲ及び２／６ＳＤを達成する４／６（６７％）の評価可能な腫瘍を有する他のすべての治療群と比較して、最も強力な抗腫瘍活性をもたらした。
【０１８６】
アファチニブ／セツキシマブの組み合わせは、アファチニブ又はセツキシマブのいずれか単独よりも活性であった。アファチニブ／セツキシマブの組み合わせで処置した３／８腫瘍（３８％）はＰＲを達成したが、アバチノブ単独薬剤ではＳＤ又はＰＲは達成されなかった。
【０１８７】
タルロキソチニブ／セツキシマブの組み合わせは、ビヒクル処置対照と比較して８１％の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ％、２７日目）をもたらしたが、アファチニブ／セツキシマブの組合せは、６７％のＴＧＩをもたらした。
【０１８８】
全ての処置群における体重減少は＜５％であった。他の毒性徴候は観察されなかったが、アファチニブ／セツキシマブの組合せで処置された１匹のマウス（１３日目）では下痢の単一症例があり、これは４８時間以内に解消した。
【０１８９】
ファーストラインＴＫＩに対する耐性を獲得したＥＧＦＲ突然変異陽性ＮＳＣＬＣ患者におけるアファチニブとセツキシマブの第１ｂ相評価は、アファチニブ／セツキシマブによるＥＧＦＲの二重阻害で達成された用量強度が、下痢や皮膚発疹などの機構上のグレード３／４の毒性に関連していることを証明した（Janjigian et al, 2014, Can Discov, 4:10）。この状況においてタルロキソチニブとセツキシマブとの組み合わせは、治療ウインドウを維持しながら、ＥｒｂＢシグナル伝達を十分に阻害するのに必要な用量強度を与える可能性があると仮定されている。この試験は、野生型（ＷＴ）ＥＧＦＲ駆動ＮＳＣＬＣのモデルにおいて、アファチニブとセツキシマブの組合せと比較して、タルロキソチニブ＋セツキシマブの治療可能性を評価するために行われた。
【０１９０】
タルロキソチニブ／セツキシマブの組み合わせは、ＷＴ  ＥＧＦＲ駆動Ｈ１２５異種移植片におけるアファチニブ／セツキシマブの組み合わせよりも顕著に有効であった。タルロキソチニブとセツキシマブの組合せは耐容性が良好であり、重大な毒性と関連していなかった。
【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【０１９１】
実施例１２
ヒト患者におけるＴＨ−４０００の第Ｉ相臨床試験
この実施例は、癌患者にＴＨ−４０００を投与する非盲検及び多施設第Ｉ相試験を記載する。
【０１９２】
ＴＨ−４０００の製剤及び投与
点滴用のＴＨ−４０００をガラスバイアル中で調製し、注入ポンプを介して１時間にわたって静脈内投与した。開始（レベル１）用量は、１０ｍｇ／ｍ2／週×８であった。改良された加速力価測定計画が用いられた（Simon et al., JNCI, 89:1138-47、参照のため本明細書に組み込まれる）。２７人の患者が初回用量レベルで登録された。疾患進行、介入性疾患、併用薬物療法又は他の非薬物介入とは明らかに関連しない最初の用量制限毒性（ＤＬＴ）又はグレード２毒性が第１サイクル中に生じるまで、用量は連続レベルで１００％増加する。ＤＬＴは次のように定義された：
グレード４  ２００ｍｇ／ｍ2で患者のＱＴｃ間隔の延長（ＤＬＴ）
グレード３  ２００ｍｇ／ｍ2で患者の顔面痛（ＤＬＴ）
グレード３  ２００ｍｇ／ｍ2で患者の前庭障害
【０１９３】
次の投与量レベルに進む前に、医療モニター及び試験責任者は、利用可能な関連する安全性及びＰＫデータを検討し考察した。
【０１９４】
試験集団
進行した固形腫瘍を有する２７人の患者（全て希望者）がこの試験に登録された。この試験の第１の目的は、ＭＴＤ及びＤＬＴを測定することであった。第２の目的は、ＰＫ、安全性、及び有効性試験を含む。ＭＴＤは１５０ｍｇ／ｍ2／ｗに設定された。
【０１９５】
治療期間：
治療のために、患者に毎週１回、ＩＶにより１時間にわたって１０ｍｇ／ｍ2の開始用量を注入した。疾患の評価は第６週と、次に８週間毎に行った。ＴＨ−４０００及びＴＨ−４０００ＥのＰＫ分析をサイクル１及び２で評価した。
用量漸増
従来の３＋３用量漸増計画（≦１００％）が実施された。参加者の連続コホート（４〜６人の参加者／コホート）は、それぞれ固定用量で開始した。最初の２つのコホートについてリアルタイムＰＫを試験した。
【０１９６】
結果
１５人の患者における≦８０ｍｇ／ｍ2（１時間の点滴）のＴＨ−４０００投与は、ざ瘡様皮膚炎又は皮膚そう痒を生じなかった（０／１５）。グレード１／２の斑点状丘疹（４／１５患者）及び下痢（１／１５患者）の発症率は低い。８０ｍｇ／ｍ2の用量の血漿曝露は、４０ｍｇ／ｄで投与されたアファチニブと比較して、ＡＵＣ０〜ｉｎｆ≒毎日連続して約５週を与えた。全身性ＴＨ−４０００−Ｅ曝露はＴＨ−４０００の１％未満であった（中央値０．８８％；範囲０．２９％〜２．４％）。この毒物動態学的関係は、ヒトにおけるＴＨ−４０００の全身的失活と一致する。
【０１９７】
ＴＨ−４０００は、約２．５日の腫瘍半減期及び４日間を超えるｐ−ＥＧＦＲシャットダウンを伴うＴＨ−４０００Ｅの腫瘍選択的用量増強（例えば、ＡＵＣの＞８倍の増加）を示し、これは、６時間未満のｐ−ＥＧＦＲシャットダウンを有するアファチニブよりも優れている。従って、ＴＨ−４０００は、他の治療よりも低酸素環境において、ＨＩＦ２α駆動野生型ＥＧＦＲ及びエンドサイトーシス小胞に隔離された野生型ＥＧＦＲの両方を不可逆的に阻害するという利点を有することが示された。
【０１９８】
実施例１３
ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤で進行する、ＥＧＦＲ変異、Ｔ７９０Ｍ陰性の進行性非小細胞肺癌を有する患者におけるＴＨ−４０００
この実施例は、ＥＧＦＲ変異、Ｔ７９０Ｍ陰性の進行性非小細胞肺癌患者にＴＨ−４０００を投与する片側、非盲検、多施設、２段階の第ＩＩ相試験を記載する。
【０１９９】
ＴＨ−４０００の処方及び投与
ＴＨ−４０００は、４０％の２−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、２０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３〜４）を含有する少なくとも１０ｍＬの無菌の保存剤不含溶液中で少なくとも１２０ｍｇのＴＨ−４０００を含む２０ｍＬバイアル中で、凍結（−２０±５℃）して供給された。ＴＨ−４０００の濃度は１２ｍｇ／ｍＬであった。使用前に室温でＴＨ−４０００バイアルを棚で解凍した。解凍後、ＴＨ−４０００バイアルを水中５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）に１２時間以内に希釈した。ＴＨ−４０００を希釈するためのＤ５Ｗは市販の供給源から得て、室温で保存した。調製したＴＨ−４０００／Ｄ５Ｗ溶液の最終ＴＨ−４０００濃度は約１ｍｇ／ｍＬであった。
【０２００】
点滴用のＴＨ−４０００をガラスバイアル中で調製し、注入ポンプにより１時間にわたって静脈内投与した。開始用量は１５０ｍｇ／ｍ2であり、進行性疾患（ＰＤ）又は許容できない毒性が見られるまで、各２８日サイクルの１、８、１５、及び２２日目に投与した。試験は、最適な Simon ２段階計画を使用した（Simon et al., JNCI, 89:1138-47、参照のため本明細書に組み込まれる）。ＴＨ−４０００に関連する可能性があるとされた毒性について、用量変更規則に従った。その後のＴＨ−４０００の投与の前に、以前の用量で以下の治療関連毒性のうちの１つを経験した患者は、以下の基準を満たさなければならない：
グレード１以下のＱＴｃＦ間隔の延長；
グレード２以下の皮膚発疹；そして
グレード２以下の消化管（ＧＩ）毒性。
他の臨床的に重要なＴＨ−４０００関連毒性は、少なくともグレード１に戻らなければならない。
【０２０１】
ＴＨ−４０００関連毒性のためにＴＨ−４０００の投与が遅れた場合、患者は先の用量から２５％〜５０％の用量減少でＴＨ−４０００のその後の投与を受けた場合がある。
【０２０２】
試験集団
表皮増殖因子（ＥＧＦＲ）変異、Ｔ７９０Ｍ陰性の進行性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する３７人の患者（すべて希望者）をこの試験に登録した。この試験の第１の目的は、ＥＧＦＲ  ＴＫＩで進行するＥＧＦＲ変異、Ｔ７９０Ｍ陰性の進行性ＮＳＣＬＣを有する患者の応答率により決定されるＴＨ−４０００の抗腫瘍活性を評価することであった。第２の目的は、この試験集団におけるＴＨ−４０００の安全性及び耐容性を評価すること；応答の持続（ＤＯＲ）、無進行性生存期間（ＰＦＳ）、及び全生存期間（ＯＳ）を含むＴＨ−４０００の抗腫瘍活性のさらなる尺度を評価すること；この試験集団におけるＴＨ−４０００（プロドラッグ）及びＴＨ−４０００Ｅ（ＴＫＩエフェクター）の薬物動態（ＰＫ）を研究し、潜在的なＰＫ／薬力学的関係を探索すること；及び、ＴＨ−４０００への血漿曝露とその活性代謝物ＴＨ−４０００Ｅとの関連、及び心臓再分極への影響があるかどうかを評価することを含んだ。
【０２０３】
試験期間：
この試験は、以下の３つの段階を伴った：スクリーニング、治療、及びフォローアップ。各患者について試験の活性部分の推定総期間は、以下のように約３０週間であった。
【０２０４】
スクリーニング段階：−２８日
スクリーニング及びベースライン手順は、最初の計画された投与の最大２８日前までであり得る。
【０２０５】
治療段階：１〜２６週（２６週間）
平均６回の２８日間の治療期間（２４週間）の後に、治験薬の最終投与の２週間後の試験治療終了の来院があった。重大な治療関連毒性又は進行性疾患の証拠が得られるまで、患者は試験治療を継続することができた。増加期間は約１２ヶ月であった。
【０２０６】
治療期間：
治療のために、患者に、進行性疾患（ＰＤ）又は容認できない毒性が見られるまで、各２８日間サイクルの１、８、１５、及び２２日目に、１５０ｍｇ／ｍ2の開始用量を１時間にわたって静脈内注射した。ＴＨ−４０００の臨床活性の予測因子の候補を、低酸素ＰＥＴイメージング（例えば、利用可能な部位のみにおける低酸素腫瘍体積及び低酸素画分）、及び腫瘍組織、循環腫瘍細胞、又は血漿の解析に基づいて評価した（例えば、ＷＴ：変異型ＥＧＦＲ対立遺伝子比；ＥＧＦＲ／ｐＥＧＦＲ及びＨＥＲ２／ｐＨＥＲ２タンパク質発現；ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２コピー数の増加；ＥＧＦＲ  ＴＫＩに対する応答の可能性についての Veristrat 血漿アッセイ；及び／又はＴＫＩ耐性に関連する他の既知の分子異常の同定（例えば、ＭＥＴ増幅又はＫＲＡＳ突然変異））。
【０２０７】
サイクル１の１日目の投与前、点滴開始の３０分後、点滴終了時、点滴終了の３０分後、及び点滴終了の１時間（ｈ）後、２時間後、３時間後、５時間後、及び２４時間後の患者について、血漿ＴＨ−４０００及びＴＨ−４０００Ｅのための薬物動態サンプリングを行った。ＴＨ−４０００及びＴＨ−４０００Ｅの濃度は以下のパラメータとともに報告された：ピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）までの最大観察時間（Ｔｍａｘ）；対数濃度の直線回帰の傾きの大きさ（Ｔｍａｘ）；終末期中の除去定数対時間プロファイル（Ｋｅｌ）；終末半減期（Ｔ１／２）、濃度−時間曲線下の面積（ＡＵＣ）、Ｈｒ０から最後の定量化可能な濃度の時間までの曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）、曲線下面積（ＡＵＣ）；クリアランス（ＣＬ）、分配後の期間の分布容量及び（ｃ１）；定常状態での分布容量（Ｖｓｓ）；分布期後の見かけの分布容量（Ｖβ）。
【０２０８】
フォローアップ：初回投与後１年以内
患者は、最初の投与から死亡まで、フォローアップの中止まで、又は試験閉鎖まで、約３ヵ月毎に最大１２ヵ月間、生存及び治験後の治療情報について連絡を受ける。
【０２０９】
実施例１４
頭頸部又は皮膚の再発性又は転移性扁平上皮癌を有する患者におけるＴＨ−４０００
この実施例は、頭頸部又は皮膚の再発性又は転移性の扁平上皮癌を有する患者にＴＨ−４０００を投与する非盲検、多施設、２段階の第ＩＩ相試験を記載する。
【０２１０】
ＴＨ−４０００の処方及び投与
ＴＨ−４０００は、４０％の２−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン、２０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ３〜４）を含有する少なくとも１０ｍＬの無菌の保存剤不含溶液中で少なくとも１２０ｍｇ〜１５０ｍｇのＴＨ−４０００を含む２０ｍＬバイアル中で、凍結（−２０±５℃）して供給された。ＴＨ−４０００の濃度は１２ｍｇ／ｍＬであった。使用前に室温でＴＨ−４０００バイアルを棚で解凍した。解凍後、ＴＨ−４０００バイアルを水中５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）に１２時間以内に希釈した。ＴＨ−４０００を希釈するためのＤ５Ｗは市販の供給源から得て、室温で保存した。調製したＴＨ−４０００／Ｄ５Ｗ溶液の最終ＴＨ−４０００濃度は約１ｍｇ／ｍＬであった。
【０２１１】
点滴用のＴＨ−４０００をガラスバイアル中で調製し、注入ポンプにより１時間にわたって静脈内投与した。開始用量は１５０ｍｇ／ｍ2であり、進行性疾患（ＰＤ）又は許容できない毒性が見られるまで、各２８日サイクルの１、８、１５、及び２２日目に投与した。試験は、最適な Simon ２段階計画を使用した（Simon et al., JNCI, 89:1138-47、参照のため本明細書に組み込まれる）。ＴＨ−４０００に関連する可能性があるとされた毒性について、用量変更規則に従った。その後のＴＨ−４０００の投与の前に、以前の用量で以下の治療関連毒性のうちの１つを経験した患者は、以下の基準を満たさなければならない：
グレード１以下のＱＴｃＦ間隔の延長；
グレード２以下の皮膚発疹；そして
グレード２以下の消化管（ＧＩ）毒性。
他の臨床的に重要なＴＨ−４０００関連毒性は、少なくともグレード１に戻らなければならない。
【０２１２】
ＴＨ−４０００関連毒性のためにＴＨ−４０００の投与が遅れた場合、患者は先の用量から２５％〜５０％の用量減少でＴＨ−４０００のその後の投与を受けた場合がある。
【０２１３】
試験集団
頭頸部又は皮膚の再発性又は転移性の扁平上皮癌を有する３０人の患者をこの試験に登録した。この試験の第１の目的は、頭頸部又は皮膚の再発性又は転移性の扁平上皮癌を有する患者の応答率により決定されるＴＨ−４０００の抗腫瘍活性を評価することであった。第２の目的は、この試験集団におけるＴＨ−４０００の安全性及び耐容性を評価すること；応答の持続（ＤＯＲ）、無進行性生存期間（ＰＦＳ）、及び全生存期間（ＯＳ）を含むＴＨ−４０００の抗腫瘍活性のさらなる尺度を評価すること；この試験集団におけるＴＨ−４０００（プロドラッグ）及びＴＨ−４０００Ｅ（ＴＫＩエフェクター）の薬物動態（ＰＫ）を研究し、潜在的なＰＫ／薬力学的関係を探索すること；及び、ＴＨ−４０００への血漿曝露とその活性代謝物ＴＨ−４０００Ｅとの関連、及び心臓再分極への影響があるかどうかを評価することを含んだ。
【０２１４】
試験期間：
この試験は、以下の３つの段階を伴った：スクリーニング、治療、及びフォローアップ。各患者の試験の活性部分の推定総期間は、以下のように約３０週間であった。
【０２１５】
スクリーニング段階：−２８日
スクリーニング及びベースライン手順は、最初の計画された投与の最大２８日前までであり得る。
【０２１６】
治療期間：１〜２６週（２６週間）
平均６回の２８日間の治療期間（２４週間）の後に、治験薬の最終投与の２週間後の試験治療終了の来院があった。重大な治療関連毒性又は増悪疾患の証拠が得られるまで、患者は試験治療を継続することができた。増加期間は約１２ヶ月であった。
【０２１７】
治療期間：
治療のために、患者に、進行性疾患（ＰＤ）又は容認できない毒性が見られるまで、各２８日間サイクルの１、８、１５、及び２２日目に、１５０ｍｇ／ｍ2の開始用量を１時間にわたって静脈内注射した。ＴＨ−４０００の臨床活性の予測因子の候補を、低酸素ＰＥＴイメージング（例えば、利用可能な部位のみにおける低酸素腫瘍体積及び低酸素画分）、及び腫瘍組織、循環腫瘍細胞、又は血漿の解析に基づいて評価した（例えば、ＷＴ：変異型ＥＧＦＲ対立遺伝子比；ＥＧＦＲ／ｐＥＧＦＲ及びＨＥＲ２／ｐＨＥＲ２タンパク質発現；ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２コピー数の増加；ＥＧＦＲ  ＴＫＩに対する応答の可能性についての Veristrat 血漿アッセイ；及び／又はＴＫＩ耐性に関連する他の既知の分子異常の同定（例えば、ＭＥＴ増幅又はＫＲＡＳ突然変異））。
【０２１８】
サイクル１の１日目の投与前、点滴開始の３０分後、点滴終了時、点滴終了の３０分後、及び点滴終了の１時間（ｈ）後、２時間後、３時間後、５時間後、及び２４時間後の患者について、血漿ＴＨ−４０００及びＴＨ−４０００Ｅのための薬物動態サンプリングを行った。ＴＨ−４０００及びＴＨ−４０００Ｅの濃度は以下のパラメータとともに報告された：ピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）までの最大観察時間（Ｔｍａｘ）；対数濃度の直線回帰の傾きの大きさ（Ｔｍａｘ）；終末期中の除去定数対時間プロファイル（Ｋｅｌ）；終末半減期（Ｔ１／２）、濃度−時間曲線下の面積（ＡＵＣ）、Ｈｒ０から最後の定量化可能な濃度の時間までの曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）、曲線下面積（ＡＵＣ）；クリアランス（ＣＬ）、分配後の期間の分布容量及び（ｃ１）；定常状態での分布容量（Ｖｓｓ）；分布期後の見かけの分布容量（Ｖβ）。
【０２１９】
フォローアップ：初回投与後１年以内
患者は、最初の投与から死亡まで、フォローアップの中止まで、又は試験閉鎖まで、約３ヵ月毎に最大１２ヵ月間、生存及び治験後の治療情報について連絡を受けた。
【０２２０】
本発明をその特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができ、同等物を代用することができることを当業者は理解すべきである。更に、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明により提供される利益を達成するために、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセス工程に適合させるために多くの修正を行うことができる。そのような変更はすべて、添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【０２２１】
本明細書中に引用される全ての刊行物及び特許文書は、そのような刊行物又は文書のそれぞれが、参照により本明細書に組み込まれることを具体的及び個別に示したかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物及び特許書文書の引用は、そのような文書が、関連する先行技術であることを示すものではなく、またその内容又は日付に関する承認を構成することを意図するものでもない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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