(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１８のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドは、第２の非相同アミノ酸配列をさらに含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドを含み、実質的に核酸を含んでいない酵素製剤。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のポリペプチド及び洗浄剤を含む酵素製剤。
【請求項５】
前記洗浄剤は、ノニオン性洗浄剤、カチオン性洗浄剤、アニオン性洗浄剤及び両性イオン性洗浄剤からなる群から選択される請求項４に記載の酵素製剤。
【請求項６】
少なくとも０．３５ＭのＫＣｌをさらに含む請求項３〜５のいずれか１項に記載の酵素製剤。
【請求項７】
ｄＵＴＰをさらに含む請求項３〜６のいずれか１項に記載の酵素製剤。
【請求項８】
ＲＮＡをさらに含む請求項３〜７のいずれか１項に記載の酵素製剤。
【請求項９】
前記ＲＮＡは細胞由来である請求項８に記載の酵素製剤。
【請求項１０】
前記ＲＮＡは、合成ＲＮＡアダプターをさらに含む請求項８又は９に記載の酵素製剤。
【請求項１１】
前記ＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子を形成するように連結されている２つのＲＮＡ分子の産物である請求項８〜１０のいずれか１項に記載の酵素製剤。
【請求項１２】
少なくとも２つのプライマーをさらに含む請求項３〜１１のいずれか１項に記載の酵素製剤。
【請求項１３】
少なくとも１つのプライマーは固体支持体に結合している請求項１２に記載の酵素製剤。
【請求項１４】
前記プライマーはサンプル中の標的ＲＮＡにハイブリダイズするための第１の核酸配列、及び標的ＲＮＡの増幅時に前記標的ＲＮＡに関する情報をコードするための第２の核酸配列を含む請求項１２又は１３に記載の酵素製剤。
【請求項１５】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む請求項３〜１４のいずれか１項に記載の酵素製剤。
【請求項１６】
前記したポリペプチドとＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの分子比は、２：１未満である請求項１５に記載の酵素製剤。
【請求項１７】
緩衝液をさらに含む請求項３〜１６のいずれか１項に記載の酵素製剤。
【請求項１８】
前記緩衝液は８．３〜９．３のｐＨを有している請求項１７に記載の酵素製剤。
【請求項１９】
ＲＮＡを請求項１又は２に記載のポリペプチドを含む組成物又は請求項３〜１７のいずれか１項に記載の組成物に暴露することを含むＲＮＡの逆転写方法であって、前記組成物はＲＮＡを逆転写してＤＮＡの相補鎖を生成するために、プライマー、緩衝液及びデオキシリボヌクレオチドを含む、前記方法。
【請求項２０】
同一ＲＮＡをＡＭＶ逆転写酵素又はＭｕＭＬＶ逆転写酵素に同一条件下で暴露することを含む方法と比較して、改善された活性、耐塩性、耐熱性、及び／又はｄＵＴＰ耐性を示す請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
暴露ステップの前にＲＮＡを精製することをさらに含む請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記精製は、固体支持体に結合させた相補的オリゴヌクレオチドにＲＮＡをハイブリダイズさせることを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法を用いることによりＲＮＡを逆転写し、ＤＮＡの相補鎖をプライマー、デオキシリボヌクレオチド及び緩衝液の存在下で、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに暴露することを含むＲＮＡの増幅方法。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、ループ媒介等温増幅によりＤＮＡを増幅する請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２６】
請求項１又は２に記載のポリペプチド、及び１つ以上の別の成分として緩衝液、核酸、デオキシリボヌクレオチド、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、核酸結合色素、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの要素を含むキット。
【請求項２７】
（ａ）ＲＮＡ鋳型を請求項１に記載のポリペプチド及び１つ以上のＤＮＡポリメラーゼを含む組成物と混合し；
（ｂ）前記ＲＮＡ鋳型の一部又は全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させるのに十分な条件下で混合物をインキュベートする；
ことを含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
逆転写酵素（ＲＴ）は、ＲＮＡを鋳型として用いてＤＮＡを合成するＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである。ＲＴは、ＲＮＡを研究するための分子生物学において、またＤＮＡ増幅と一緒に特定のＲＮＡ配列に基づいて生物の身元を調べるための分子診断において不可欠な試薬である。一般的に使用されているＲＴはトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）及びモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、及びその誘導体に由来している。これらのＲＴの各々は特定の用途において利点を有しているが、制限も有している。例えば、分子診断における主な関心事は感度及び反応速度である。感度は、ＲＴにより所与の増幅プラットフォームに対して十分なｃＤＮＡを産生することができることを必要とする。反応速度はどのくらいの速度で所要のｃＤＮＡ産物が産生されるかを決定する。
【０００２】
最近、検出の際の便利さ及び高感度のためにループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）が多くの病原体に対する分子診断に対して採用されている。ＲＴをＬＡＭＰを含めるとき（逆転写−ＬＡＭＰ、ＲＴ−ＬＡＭＰ）、ＲＮＡ標的を検出するために効率的に適用され得、多数のＲＮＡウイルスを高感度で検出するためにうまく使用されている。ＲＴ−ＬＡＭＰの場合、ＲＴによりＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のために最適化された条件下で標的ＲＮＡを用いてＤＮＡを効率的に合成することができることが必須である。多くのＲＴに対する最適反応条件がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅のための最適反応条件に整合しないので、これはＲＴ−ＬＡＭＰにおけるＲＴ選択に実質的に影響を与える高い障害である。ＲＴ−ＬＡＭＰにおいて最も典型的な使用されているＲＴは、適度な感度及び反応速度を与えるのでＡＭＶ由来である。
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はＤＮＡ増幅における重要なプレーヤーである。ＲＴ−ＬＡＭＰと同様に、ＰＣＲ反応にＲＴを含める（ＲＴ−ＰＣＲ）とＲＮＡを検出することができる。慣例上、ＲＴ−ＰＣＲは２ステップで実施する。第１ステップは最適化緩衝液中でのＲＴであり、その後第２ステップはＰＣＲのために最適化された別の緩衝液条件でのＰＣＲである。これらの２つのステップは理論的には組み合わされ得るが、両方のステップに適している１組の反応条件を見つけることは困難である。重大な問題は、増幅ステップのために最適化された条件下でも敏感で迅速なＲＴを見つけることである。
【０００４】
加えて、ＲＴ−ＬＡＭＰまたはＲＴ−ＰＣＲ、或いは他の増幅テクノロジーによるＲＮＡのワンステップ検出で使用するためにＲＴには望ましい幾つかの他の特性がある。これらには、ＲＴの感度及び反応時間、高い塩及び前のＲＮＡサンプル調製物からキャリーオーバーされる恐れがある他の可能性ある阻害剤に対する耐性、及び強化された熱安定性が含まれる。例えば、ＲＴの強化された熱安定性により、より高い温度での逆転写が可能であり、ＲＮＡの二次構造が減り、これにより検出感度及び速度が高まる。分子診断におけるＲＴに対する高い要求のために、産生及び保存の便利さも重要な要件である。例えば、ＡＭＶ  ＲＴは通常ニワトリ胚において産生され、その産生が特定の制限を有していることが公知である。
【発明の概要】
【０００５】
ここで、広範囲の用途のために特に適している特性を有しているＲＴを提供する。ＲＴのうちの本明細書中で「Ｖ３」と称され、図６中の配列番号２または図７中の配列番号１８のアミノ酸配列を有するＲＴは、ＡＭＶ及びＭ−ＭｕＬＶ由来のＲＴに比して各種アッセイにおいて優れていることが立証されている。
【０００６】
従って、１つの態様で、配列番号１８に対して少なくとも９０％同一、または配列番号１８に対して９５％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。或いは、ポリペプチドは、Ｖ３（配列番号６）の最初の４４２個のアミノ酸を含有しているＶ３のヘテロダイマー小単位に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは配列番号１８または配列番号６に対して９５％超同一であり得、例えば配列番号１８に対して少なくとも９６％同一、少なくとも９６．５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９７．５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９８．５％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または１００％同一であり得る。よって、この配列は配列番号１８または配列番号６とたった５６個の残基で異なり得、より少数（例えば、たった２３個、たった２２個、たった２１個、たった２０個、たった１９個、たった１８個、たった１７個、たった１６個、たった１５個、たった１４個、たった１３個、たった１２個、たった１１個、たった１０、たった９個、たった８個、たった７個、たった６個、たった５個、たった４個、たった３個、たった２個、たった１個、または０個）の残基で異なり得る。上記した同一性に加えて、ポリペプチド、または第２の１つ以上のポリペプチドに融合したポリペプチドはアミノ酸の非必須配列の欠失を維持し得る。
【０００７】
配列番号２に対して少なくとも９６％（またはそれ以上、例えば少なくとも９８％）同一であるポリペプチド中に含まれるアミノ酸配列は図６中に配列番号１として同定されている参照配列と異なる。例えば、図７中では、前記アミノ酸配列は、存在し得る他の差異に加えて、配列番号１７（配列番号１７は、１番目の位置のメチオニンがないことを除き、配列番号１と同じである）のアミノ酸３５、１２２、１７７、２０６、２１１、２１４、２４５、２７７、２８６、２９１、２９３、３５６、３５９、３７１、３７６、３９０、４３１、４６０、４６８、４７１、４８３、４９１、５１２、５３４及び５５４に相当する１個以上（例えば、少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、２１、２２、２３、２４、または２５個）の位置で、配列番号１７とは異なり得る。
【０００８】
上記した同一または差異を有するアミノ酸配列に加えて、ポリペプチドは非相同ペプチドまたはポリペプチド配列をさらに含み得る（例えば、融合し得る）。よって、ポリペプチドは常に配列番号２に対して少なくとも９０％同一（例えば、配列番号２または配列番号１８に対して少なくとも９６％または少なくとも９８％同一）のアミノ酸配列を含む。ポリペプチドは場合により１つ以上の追加配列、例えばインビトロ精製を容易にするペプチドタグ、ＤＮＡ結合を強化するペプチドタグ、またはその場でのポリペプチドまたはその基質の検出を容易にするペプチドタグを含み得る。追加のペプチドまたはポリペプチド配列の例には、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｓｓｏ７ＤまたはＳａｃ７Ｄ）、アフィニティー結合ドメイン（例えば、キチン結合ドメイン）、及びポリペプチドを検出するためのアミノ酸配列、例えばＡＧＴ（ＳＮＡＰタグ（Ｒ），Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）が含まれる。
【０００９】
同様に、実施形態は前記ポリペプチドをコードする核酸を提供する。この核酸は少なくとも前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、追加のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、核酸は細胞中での核酸の複製を容易にするプラスミドまたは他のベクターであり得る。代替的または追加的に、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドは細胞中でポリペプチドを発現させるプロモーターと結合し得る。実施形態は前記ポリペプチドを含有する細胞も提供する。
【００１０】
別の態様で、酵素製剤は上記したポリペプチドのいずれかを含有し得る。酵素製剤は、例えば汚染核酸を実質的に含み得ない（すなわち、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、またはＰＣＲ増幅により不検出）。代替的または追加的に、組成物は洗浄剤、例えばノニオン性洗浄剤、カチオン性洗浄剤、アニオン性洗浄剤、及び／または両性イオン性洗浄剤を含む。ノニオン性洗浄剤は、例えば幾つかの逆転写酵素を刺激すると報告されている（Ｗｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４（４）：７８９−９５，１９７５）。例示的ノニオン性洗浄剤には、ポリソルベート２０（「ツイーン２０」としても公知）、トリトンＸ−１００及びＮＰ４０が含まれる。例示的アニオン性洗浄剤には、ポリ（エチレングリコール）４−ノニルフェニル３−スルホプロピルエーテルカリウム塩、ポリ（エチレングリコール）モノラウレート、ポリオキシエチレン（１５０）ジノニルフェニルエーテル、及びノニルノノキシノール−１５ホスフェートが含まれる。例示的両性イオン性洗浄剤には、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルテトラデシルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１４）、３−（４−ヘプチル）フェニル−３−ヒドロキシプロピル）ジメチルアンモニオプロパンスルホネート（Ｃ７ＢｚＯ）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート内部塩（ＳＢ３−１０）、３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート内部塩（ＳＢ３−１２）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクタデシルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１８）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルオクチルアンモニオ）プロパンスルホネート内部塩（ＳＢ３−８）、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート（ＳＢ３−１６）、及び３−［Ｎ，Ｎ−ジメチル（３−ミリストイルアミノプロピル）アンモニオ］プロパンスルホネート（ＡＳＢ−１４）が含まれる。安定化試薬には、米国特許Ｎｏ．８，７１５，９８７に記載されているものが含まれる。
【００１１】
幾つかの実施形態では、酵素製剤は中濃度（例えば、約５０ｍＭ）または高濃度（例えば、少なくとも０．３５Ｍ）で塩化カリウムを含む。幾つかの実施形態では、酵素製剤は少なくとも０．４Ｍ、または少なくとも０．４５Ｍの高濃度で塩化カリウムを含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、組成物（酵素製剤）は緩衝液を含む。緩衝液のｐＨは場合によりアルカリ性、例えば少なくともｐＨ８．３、例えばｐＨ８．３〜ｐＨ９．３である。
【００１３】
幾つかの実施形態では、組成物（酵素製剤）は本明細書中に規定されている中または高濃度で塩化カリウムを含み、ｐＨ８．３〜ｐＨ９．３のｐＨで緩衝されている。
【００１４】
幾つかの実施形態では、組成物（酵素製剤）はデオキシリボヌクレオチド（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰ）を含む。特定の実施形態では、組成物はｄＴＴＰに代えてまたは加えてｄＵＴＰを含む。デオキシリボヌクレオチドの１つ以上は場合により検出可能な標識、例えば蛍光基またはクエンチャーで標識され得る。
【００１５】
幾つかの実施形態では、組成物はＲＮＡ、例えば合成ＲＮＡ、または（細胞または組織サンプル、生体液、環境サンプル等から直接入手される）細胞由来のＲＮＡを含む。例えば、ＲＮＡは、例えばＴ４  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、または末端切断型Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）により１つの単一ＲＮＡ分子を形成するように一緒に連結した２つ以上のＲＮＡ分子の産物であり得る。代替的または追加的に、ＲＮＡは例えば末端切断型Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）により合成ＲＮＡアダプターに結合され得る。
【００１６】
幾つかの実施形態では、組成物は１個以上（例えば、少なくとも２個、４個、６個、８個またはそれ以上）のプライマーを含む。少なくとも１個のプライマーはサンプル中の標的ＲＮＡにハイブリダイズさせるための第１の核酸配列を含み得る。特定実施形態では、少なくとも１個のプライマーはサンプル中の標的ＲＮＡにハイブリダイズさせるための第１の核酸配列、及び標的ＲＮＡにハイブリダイズしないが、代わりに標的ＲＮＡの増幅時に標的ＲＮＡに関する情報をコードする第２の核酸配列を含む。幾つかの実施形態では、組成物中の少なくとも１個のプライマーはプライマーに相補的なＲＮＡ分子についてサンプルを濃縮するのに有用である固体支持体、例えばビーズに結合され得る。プライマーは追加的にバーコードまたはユニークな同定配列を含み得る。
【００１７】
幾つかの実施形態では、組成物は逆転写から生じた相補的ＤＮＡ鎖を増幅させるために有用なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。このＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、例えばＢｓｔ  ２．０（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）、Ｔａｑポリメラーゼ、古細菌ポリメラーゼ、または２個の古細菌ポリメラーゼの古細菌ポリメラーゼ融合産物、例えばフュージョン（Ｒ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ペンシルベニア州ピッツバーグ）またはＱ５（Ｒ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）であり得る。任意に存在するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに対するＲＴポリペプチドの分子比は２：１未満であり得る。例えば、任意に存在するＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに対するＲＴポリペプチドの分子比は３：２未満（例えば、１：１未満、０．７５：１未満、０．５：１未満、０．３：１未満、０．２：１未満、または０．１：１未満）であり得る。
【００１８】
実施形態は、ＲＮＡの逆転写に有用なキットも提供する。このキットは、本明細書中に規定されているＲＴポリペプチドを少なくとも１つの別の成分と一緒に含み、前記成分には緩衝液（例えば、本明細書中に規定されており、場合によりｐＨ８．３〜ｐＨ９．３のｐＨで緩衝される）、核酸（場合により固体支持体に結合している）、デオキシリボヌクレオチド、塩化カリウム（例えば、本明細書中に規定されている中濃度または高濃度で）、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、核酸結合色素、例えばＳＹＴＯ  ９（Ｒ）またはＳＹＢＲ（Ｒ）  Ｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ニューヨーク州グランドアイランド）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＢｓｔ  ２．０、Ｔａｑポリメラーゼ、古細菌ポリメラーゼ、または２個の古細菌ポリメラーゼの古細菌ポリメラーゼ融合産物、例えばフュージョンまたはＱ５）、及びウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼの１つ以上が含まれる。１つの実施形態では、キットは配列番号２に対して少なくとも９６％同一である（例えば、配列番号２に対して少なくとも９８％または１００％同一である）アミノ酸配列を含むＲＴポリペプチドを含む。
【００１９】
別の態様で、実施形態は、ＲＮＡを逆転写するための方法を提供する。この方法は、ＲＮＡを本明細書中に規定されているＲＴポリペプチド、または少なくともＲＴポリペプチド、プライマー、緩衝液及びデオキシリボヌクレオチド、及び場合により１個以上のアダプターを含む上記した組成物またはキットの１つに暴露することを含む。アダプターは、ＲＮＡの配列ソースを認識するバーコード及び／またはユニークな同定配列を含み得る。１つの実施形態では、ＲＴポリペプチドは配列番号２に対して少なくとも９６％同一である（例えば、配列番号２に対して少なくとも９８％または１００％同一である）アミノ酸配列を含む。ポリペプチドはＲＮＡを逆転写してＤＮＡの相補鎖を生成する。好ましくは、この方法は、同一ＲＮＡをＡＭＶ  ＲＴまたはＭｕＭＬＶ  ＲＴに同一条件下で暴露することを含む方法と比較して、改善された活性、耐塩性（例えば、高い塩濃度に対して）、耐熱性（例えば、少なくとも６０℃の温度に対して安定性）、及び／またはｄＵＴＰ耐性の１つ以上を示す。ＲＮＡは粗な調製物由来であり得、または暴露ステップの前に例えばＲＮＡ分子の所望サブセットについてサンプルを選択的に濃縮するために固体支持体に結合させたプライマーを使用することにより精製し得る。
【００２０】
実施形態は、例えば米国特許出願Ｎｏ．１３／３８３，４６６に記載されている方法を用いてアダプター−ダイマー形成を予防する追加ステップを含む。
【００２１】
実施形態は、上記したようにＲＮＡを逆転写し、生じたＤＮＡの相補鎖をプライマー、デオキシヌクレオチド及び緩衝液の存在下でＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼに暴露することによるＲＮＡの増幅方法をも提供する。ＤＮＡ増幅は、例えばＰＣＲ、ＬＡＭＰのような等温方法、転写媒介増幅、またはヘリカーゼ依存性増幅を含み得る。１つの実施形態では、ＤＮＡ増幅はＬＡＭＰを含む。
【００２２】
１つの態様では、（ａ）ＲＮＡ鋳型を請求項１に記載のポリペプチド及び１つ以上のＤＮＡポリメラーゼを含む組成物と混合し、（ｂ）前記混合物をＲＮＡ鋳型の一部または全部に対して相補的なＤＮＡ分子を増幅させるのに十分な条件下でインキュベートすることを含むワンステップＲＴ−ＰＣＲ方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｖ３またはＡＭＶ  ＲＴを用いたときのＬＡＭＰ増幅のシグナル閾値時間と反応温度の関係のグラフ表示である。図１に示すように、ＲＴ−ＬＡＭＰを用いるＲＮＡの増幅率は、標的ＲＮＡを５５℃〜７０℃の温度範囲でバリアントＶ３  ＲＴを用いて逆転写したときＡＭＶ転写酵素と比較して有意に改善される。
【図２】ＬＡＭＰ増幅のシグナル閾値時間とＲＴプレインキュベーション温度の関係のグラフ表示である。図２に示すように、Ｖ３  ＲＴはＲＮＡ基質を添加する前に６５℃で２分間プレインキュベーションした後活性を保持するのに対して、ＡＭＶ  ＲＴは６０℃でその活性の殆どを失う。
【図３】ツーステップＲＴ−ＬＡＭＰにおけるＬＡＭＰ増幅のシグナル閾値時間と塩化カリウム（ＫＣｌ）濃度の関係のグラフ表示である。Ｖ３  ＲＴは、特により高いＫＣｌ濃度でＡＭＶ  ＲＴよりもＫＣｌに対してより耐性である。
【図４】ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の不在（円及び星印）または存在（四角及び三角）下、汚染ＤＮＡ（「キャリーオーバー」）の不在（円及び四角）または存在（星印及び三角）下でのＬＡＭＰ増幅のシグナル閾値時間と鋳型ＲＮＡ（「ジャーカットＲＮＡ」）の量の関係のグラフ表示である。図示されているように、Ｖ３  ＲＴはＵＤＧの存在下でも有効である。
【図５Ａ】３つのＲＴ、すなわちＶ３、プロトスクリプト（Ｒ）ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）及びＭＭｕＬＶ−ＲＴについての定量ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅効率のグラフ表示である。  Ｘ軸はＰＣＲサイクルの数を示し、Ｙ軸はＰＣＲ管中で産生されたＤＮＡの量に対応する記録された蛍光シグナルを示す。Ｖ３  ＲＴ（三角）はＡＣＴＢプライマー対を用いて約２０サイクルでロバストなｑＲＴ−ＰＣＲシグナルを発生したのに対して、プロトスクリプトＩＩ  ＲＴ（円）は僅かなシグナルしか発生せず、ＭＭｕＬＶ−ＲＴ（直線）はいずれのシグナルも発生しなかった。
【図５Ｂ】３つのＲＴ、すなわちＶ３、プロトスクリプト（Ｒ）ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）及びＭＭｕＬＶ−ＲＴについての定量ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅効率のグラフ表示である。  Ｘ軸はＰＣＲサイクルの数を示し、Ｙ軸はＰＣＲ管中で産生されたＤＮＡの量に対応する記録された蛍光シグナルを示す。Ｖ３  ＲＴ（三角）はＢ２Ｍプライマー対を用いて約２０サイクルでロバストなｑＲＴ−ＰＣＲシグナルを発生したのに対して、プロトスクリプトＩＩ  ＲＴ（円）は僅かなシグナルしか発生せず、ＭＭｕＬＶ−ＲＴ（直線）はいずれのシグナルも発生しなかった。
【図６】参照ＲＴ（ｐ６６；配列番号１）、Ｖ３（配列番号２）、及び３つの他のバリアント（配列番号：３−５）の完全長配列を示す。
【図７】アミノ酸配列のアラインメントによるＶ３（配列番号１８）と参照配列（配列番号１７）の差を示す。図７には最初のメチオニン（Ｍ）が含まれていないので、配列番号１７及び配列番号１８についてのここに提示されている変異の位置の番号は、番号は図６中の配列番号１及び２と１個のアミノ酸だけ異なる。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の実施形態に従うポリペプチドは各種条件下でＲＮＡを逆転写して、ＤＮＡの相補鎖を作成し得る。実施形態に従う例示的ポリペプチドはＶ３（配列番号２）である。実施例に示すように、Ｖ３は、他の逆転写酵素と比較して、強化された活性、耐塩性（例えば、少なくとも０．３５ＭのＫＣｌの高濃度に対して）、耐熱性（例えば、少なくとも６０℃の温度に対して）、及び／またはｄＵＴＰに対する耐性を示す。
【００２５】
実施形態は、配列番号１及び／または配列番号２及び／または配列番号１７及び／または配列番号１８及び／または配列番号６（本明細書中に規定されている）と異なる「バリアント」ポリペプチド；及び配列番号２または配列番号６を含むポリペプチド、またはそのバリアントをも含む。
【００２６】
１つの実施形態では、ポリペプチドは配列番号２に対して少なくとも９６％同一であり、本明細書中に記載されている条件下でＲＴ活性を有しているアミノ酸配列を含むか、または前記アミノ酸配列から構成されている。
【００２７】
ポリペプチドの実施形態は非天然であり得、Ｎ末端に１個以上のアミノ酸変異、例えば配列番号１の３５、１２２及び１７７位に１個以上の変異を含み得る。代替的または追加的に、ポリペプチドは中央ドメインに１個以上のアミノ酸変異、例えば配列番号１７の２０６、２１１、２１４、２４５、２７７、２８６、２９１及び／または２９３位に１個以上の変異を含み得る。追加的または代替的に、ポリペプチドはＣ末端に１個以上のアミノ酸変異、例えば配列番号１７の３５６、３５９、３７１、３７６、３９０、４３１、４６０、４６８、４７１、４８３、５１２、５３４及び５５４位に１個以上の変異を含み得る。実施形態では、ポリペプチドはＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメイン、またはＮ末端ドメイン及び中央ドメイン、または中央ドメイン及びＣ末端ドメイン由来の１個以上の変異を含み得る。或いは、ポリペプチドはＮ末端ドメイン、中央ドメイン及びＣ末端ドメイン由来の１個以上の変異を含み得、これらのドメイン中の変異の例は上に挙げられている。
【００２８】
ポリペプチドは、配列番号１または配列番号２または配列番号１７または配列番号１８と少なくとも９６％の配列同一性を有する配列番号３−５に規定されている配列を有するポリペプチドの非天然バリアント、及び天然で認識されていない対応物を有する合成ポリペプチドであり得る。
【００２９】
ポリペプチドの実施形態は上記したタイプのＲＴ活性をさらに有する。好ましくは、変異体のＲＴ活性は配列番号１または配列番号１７に記載されているアミノ酸配列により特徴づけられる野生型ＲＴよりも高い。
【００３０】
ポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のプロモーター上流を有する発現ベクターを用いて組換え産生され得る。
【００３１】
ＲＴ反応は、発明の概要に記載されているポリペプチドまたは組成物を用いて逆転写及び第１鎖ｃＤＮＡ及び場合により第２鎖ｃＤＮＡの産生を可能にする条件下で実施され得る。ＲＴ反応はランダムプライマー、オリゴｄＴ、またはＲＮＡ特異的プライマーを用いて開始され得る。
【００３２】
所望により、反応は、例えばＬＡＭＰまたはＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅をも含み得る。ＬＡＭＰを実施するための技術は、ＰＣＲアッセイを実施するための技術（Ｅｒｉｉｃｈ，ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ，１９８９；Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９０；Ｍａｔｔｉｌａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：４９６７，１９９１；Ｅｃｋｅｒｔら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：１７，１９９１；Ｗａｌｌａｃｅら，Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ｐ．３０７−３２２，１９９６）であるので、当業界で公知である（例えば、Ｎｏｔｏｍｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８（１２）：ｅ６３，２０００を参照されたい）。適切なプライマー配列及びハイブリダイゼーション条件を選択するために各種ガイドラインを使用し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版，１９９９；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９−２０１０を参照されたい）。
【００３３】
本明細書中に記載されているバリアントＲＴは、同一の基質及びプライマー等を用いる同一反応条件下で通常使用されているＲＴ（ＡＭＶ及び／またはＭ−ＭｕＬＶ、及び／または配列番号１または配列番号１７によりコードされるＲＴ）に比して以下の全部またはいずれかを含み得る少なくとも１つの改善を有している：
強化された活性：Ｖ３を含めた本明細書中に記載されているポリペプチドの実施形態はＲＴ反応を各酵素に対する標準の条件下で短い時間枠で、例えば少なくとも２倍短い時間枠で実施し得る。強化された活性は３倍、４倍、５倍高い活性を含む。強化された活性は５００未満の長さの塩基対のポリヌクレオチドで観察された。
【００３４】
耐熱性：本明細書中に記載されているポリペプチドの強化された耐熱性のために、反応は他の方法で可能であるよりも高い温度で実施され得る。Ｖ３を含めた本明細書中に記載されているポリペプチドの実施形態はより高い温度で活性を改善し得るＲＴ活性を有し得る。
【００３５】
ＲＴポリペプチドは少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、または少なくとも６５℃の温度で耐熱性であり得る。これらのＲＴは少なくとも４３℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも６０℃、または少なくとも６５℃の温度で、例えば４３〜６５℃、４５〜６５℃、５０〜６５℃、５５〜６５℃、６０〜６５℃、５５〜７０℃、または６５〜７０℃の範囲の温度でのＲＴ反応において使用され得る。反応をより高い温度で実施すると、鋳型ＲＮＡが逆転写を抑制する恐れがある二次構造を形成するリスクが減る。
【００３６】
塩に対する耐性：ＲＴポリペプチドは０．３５Ｍ以上、例えば少なくとも０．４０Ｍまたは少なくとも０．４５Ｍの塩（例えば、ＫＣｌ）濃度に対して耐性であり得る。本発明の逆転写酵素の実施形態は５０Ｍ〜５００ｍＭの範囲の塩濃度で、例えば５０ｍＭ、１００ｍＭ、１２５ｍＭ、１５０ｍＭ、１７５ｍＭ、２００ｍＭ、２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、または４００ｍＭの塩で活性であり得る。これらのポリペプチドのより高い塩濃度でのＲＴの活性は、同一の基質及びプライマー等を用いる同一の反応条件下で通常使用されているＲＴ（ＡＭＶ及び／またはＭ−ＭｕＬＶ、及び／または配列番号１によりコードされるＲＴ）に比して同一またはより高い。よって、例えば０．３５Ｍ未満の塩濃度が従来の逆転写酵素のために最適である実施形態では、本発明のポリペプチドにより、ＲＴは他の方法で可能である塩濃度よりも少なくとも０．３５Ｍまたはより高い塩濃度でＲＴ反応を実施することができる。
【００３７】
ポリペプチドの実施形態の別の作用効果は、他の逆転写酵素と比較してｄＵＴＰに対する高い耐性を含み得る。
【００３８】
本発明の具体的実施形態の作用効果及び実施は、添付の特許請求の範囲に同定されている本発明を限定すると意図されない図面及び実施例に記載されている。本明細書中に引用されている文献はすべて参照により組み入れる。
【実施例】
【００３９】
実施例１
ヒトアクチンＢ  ｍＲＮＡをＡｃｔＢ２プライマー組（ＡＣＴＢ２−Ｆ３：ＡＧＴＡＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＣＡＣＧ（配列番号７）；ＡＣＴＢ２−Ｂ３：ＡＧＣＣＴＧＧＡＴＡＧＣＡＡＣＧＴＡＣＡ（配列番号８）；ＡＣＴＢ２−ＦＩＰ：ＧＡＧＣＣＡＣＡＣＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＧＴＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡ（配列番号９）；ＡＣＴＢ２−ＢＩＰ：ＣＴＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＧＧＣＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＣ（配列番号１０）；ＡＣＴＢ２−ＬＦ：ＴＧＴＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＣＣＡ（配列番号１１）；ＡＣＴＢ２−ＬＢ：ＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＴＣＡＴＧＴ（配列番号１２））を用いてＲＴ−ＬＡＭＰにより増幅した。ＲＴ−ＬＡＭＰ反応を２５μｌの１×等温増幅緩衝液（２０ｍＭ  トリスＨＣｌ（ｐＨ８．８，２５℃）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＳＯ４、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４を補充した０．１％  ツイーン２０、及びそれぞれ１．４ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）中で実施した。プライマー濃度は０．２μΜのＡＣＴＢ２−Ｆ３またはＡＣＴＢ２−Ｂ３、１．６μΜのＡＣＴＢ２−ＦＩＰまたはＡＣＴＢ２−ＢＩＰ、及び０．４μΜのＬＦまたはＬＢであった。逆転写及び増幅を同一反応容器及び同一温度で行うワンポット反応では、各反応物は５ｎｇのＶ３または０．５ＵのＡＭＶ  ＲＴ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）、８ＵのＢｓｔ  ２．０、及び１ｎｇのジャーカット細胞全ＲＮＡ（アンビオン（Ｒ），Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ニューヨーク州グランドアイランド）を含んでいた。２５ｕｌのＲＴ−ＬＡＭＰ反応物は、２．０：０．２４のＲＴ／Ｂｓｔ質量比を生ずるように０．１２ｕｇ／ｕｌで１ｕｌのＢｓｔ  ２．０及び０．１ｕｇ／ｕｌで０．５ｕｌのＲＴを含んでいた。ＤＮＡ増幅を検出するために２μΜの二本鎖ＤＮＡ特異的結合色素ＳＹＴＯ  ９を含めた。反応物を５５〜７０℃の反応温度に加熱し、直ぐにＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６（ＴＭ）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カリフォルニア州ハーキュリーズ）にかけた。図１に示すように、５５〜７０℃の温度範囲で標的ＲＮＡをバリアントＶ３  ＲＴを用いて逆転写すると、ＲＴ−ＬＡＭＰを用いるＲＮＡの増幅率がＡＭＶ転写酵素と比較して有意に改善される。
【００４０】
実施例２
実施例２はＶ３  ＲＴの強化された耐熱性を立証している。標的ＲＮＡを存在させない以外は実施例１と同様に、５０ｎｇＶ３  ＲＴまたは５ＵのＡＭＶ  ＲＴをＢｓｔ  ２．０  ＤＮＡポリメラーゼを含むＬＡＭＰ反応において５９．４℃〜６５℃で２分間インキュベートした。インキュベートした後、反応物を４℃に冷却し、次いでＲＴ−ＬＡＭＰ反応を６５℃で開始させるために１ｎｇのジャーカット細胞全ＲＮＡを添加した。図２に示すように、ＲＮＡ基質を添加する前に６５℃で２分間プレインキュベーションした後Ｖ３  ＲＴは活性を保持しているのに対して、ＡＭＶ  ＲＴは６０℃を超えるとその活性の殆どを失った。
【００４１】
実施例３
実施例３はＶ３の強化された耐塩性を立証している。ＲＴステップでは、Ｂｓｔ  ２．０を除外し、ＫＣｌを添加した以外は実施例１と同様に、５０ｎｇのＶ３  ＲＴまたは５Ｕ  ＡＭＶ  ＲＴをＬＡＭＰ反応緩衝液中で１０ｎｇのジャーカット細胞全ＲＮＡと一緒に５５℃で１０分間インキュベートした。インキュベートした後、ＲＴを不活化するために反応物を８５℃に加熱し、次いで４℃に冷却した。ＬＡＭＰステップでは、新しいＬＡＭＰ反応に対して１μｌのＲＴ反応物を添加し、６５℃でインキュベートした。Ｖ３  ＲＴは、特に０．３５Ｍ以上のＫＣｌ濃度でＡＭＶ  ＲＴよりもＫＣｌに対して著しく耐性であった。
【００４２】
実施例４
実施例４はＲＴステップ及びＬＡＭＰ増幅ステップにおけるｄＵＴＰの取り込みを伴うキャリーオーバー予防におけるＶ３  ＲＴの適合性を調べた。増幅前に、汚染キャリーオーバーＬＡＭＰアンプリコンをアンタークティック熱不安定性ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＡＴ−ＵＤＧ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）により酵素的に分解した。
【００４３】
ｄＴＴＰの５０％をｄＵＴＰで交換する以外は図１に記載されているように、ワンステップＲＴ−ＬＡＭＰを各種量のジャーカット全ＲＮＡを用いて実施した。２組の反応物（１０〜７キャリーオーバー）は同一条件下で作成したＬＡＭＰ反応物の１０−７希釈物を１μｌ含有していた。これら２組のうちの１つは０．５ＵのＡＴ−ＵＤＧ（１０〜７＋ＵＤＧ）も含有していた。第３組はＡＴ−ＵＤＧ（０．５Ｕ  ＵＤＧ）のみを有していた。各反応物は５０ｎｇのＶ３  ＲＴ及び８ＵのＢｓｔ  ２．０を有していた。反応物を氷上で作成した後、直ちに６５℃のＬＡＭＰ温度とした。
【００４４】
示されているように、Ｖ３  ＲＴはＬＡＭＰキャリーオーバー汚染予防システムと両立する。ＵＤＧの存在はＶ３  ＲＴの活性を実質的に干渉せず、ｄＵＴＰはＶ３  ＲＴによるＤＮＡ合成中基質として効率的に使用された。
【００４５】
図４中のＸ軸はジャーカットＲＮＡの漸増量を示し、Ｙ軸は各反応の閾値時間を反映している。キャリーオーバーが存在しないがＵＤＧが存在している場合には（四角）、ＲＴ−ＬＡＭＰはＵＤＧなし（円）と同一の検出感度を達成したが、反応時間は僅かに延びた。キャリーオーバーの存在下では（＊）、増幅シグナルはキャリーオーバーのみに由来し、素早く閾値時間に達した。ＵＤＧ及びキャリーオーバーの両方を添加したときには（三角）、高レベルの増幅シグナルが除かれ、鋳型なしの対照（ｎｔｃ）反応ではシグナルが観察されなかった。増幅シグナルレベルはキャリーオーバーなしの反応のように鋳型ＲＮＡの量に応じて変動した。キャリーオーバー予防の類似のカイネティックスがＲＴを必要としないＤＮＡ鋳型で観察された。
【００４６】
実施例５
実施例５はＲＴ−ＰＣＲにおけるＶ３の強化された効率を立証している。ＲＴ−ＰＣＲ．ｑＲＴ−ＰＣＲにおいてＶ３  ＲＴ、プロトスクリプトＩＩ及びＭＭｕＬＶ  ＲＴをプライマー対、すなわちアクチンＢ遺伝子を標的とするＡＣＴＢ（ＡＣＴＢ−Ｆ：ＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡ（配列番号１３）；ＡＣＴＢ−ＲＲ（ＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡＣＡＡＣＧＣＡ（配列番号１４））、またはＢ２Ｍ遺伝子を標的とするＢ２Ｍ（Ｂ２Ｍ−Ｆ：ＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＧＴＡＴＣＴ（配列番号１５）Ｂ２Ｍ−Ｒ：ＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＴＡＡＧＴ（配列番号１６）と１０ｎｇのジャーカット細胞全ＲＮＡを用いて実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲを最終３ｍＭ  Ｍｇ＋＋までＭｇＳＯ４、それぞれ４００ｕＭの各ｄＮＴＰ、０．６２５Ｕ  ホットスタートＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）、それぞれ４００ｎＭの順方向及び逆方向プライマー、２μΜ  ＳＹＴＯ  ９を補充した２５μｌの１×サーモポル（Ｒ）緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）中で実施した。ＲＴは、５０ｎｇのＶ３  ＲＴ、１００ＵのプロトスクリプトＩＩ  ＲＴ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）、または１００ＵのＭＭｕＬＶ  ＲＴ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，マサチューセッツ州イプスウィッチ）のいずれかである。反応混合物を５４℃で５分間インキュベートし、次いで９５℃で１０秒間、５８℃で１５秒間、６８℃で３０秒間の温度サイクルにかけた。ＤＮＡ増幅シグナルをＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ９６サーマルサイクラーを用いて獲得した。図５に示すように、Ｖ３  ＲＴは他の酵素よりも非常に迅速にロバストなｑＲＴ−ＰＣＲシグナルを発生した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
0006769869.tif 000008
【図７】
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【配列表】
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