(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の数または位置（１個もしくは複数）を決定する方法であって、
（ａ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を膜貫通ポアと、前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポアを通って移動するように接触させるステップ；および
（ｂ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポアに関して移動する際に１つまたは複数の電流測定値を取り、それにより前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数のＰＴＭの数または位置（１個もしくは複数）を決定するステップ
を含み、前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、オリゴヌクレオチドに結合している、
前記方法。
【請求項２】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の２個以上のＰＴＭの数または位置を決定するためである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１個、２個、３個または４個のアミノ酸によって分離されている、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の２個以上のＰＴＭの数または位置を決定するためである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１個または複数のＰＴＭが、疎水性基での修飾、補因子での修飾、化学基の付加、糖化、ビオチン化およびペグ化から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）疎水性基での前記修飾が、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化およびグリピエーションから選択され；
（ｂ）補因子での前記修飾が、リポイル化、フラビネーション、ヘムＣの付着、ホスホパンテテイニル化およびレチニリデンシッフ塩基形成から選択され；
（ｃ）化学基の前記付加が、アシル化、アセチル化、ホルミル化、アルキル化、アミド化、ブチル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ポリシアル酸化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ブロム化；シトルリン化；ヌクレオチド付加、ＡＤＰリボシル化、酸化、リン酸化、アデニリル化、プロピノイル化、ピログルタミン酸形成、Ｓ−グルタチオン付加、ＳＵＭＯ化；Ｓ−ニトロシル化、リジンへのサクシニル基のサクシニル化付加およびセレノイル化およびユビキニル化から選択される、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１個もしくは複数のＰＴＭが１個もしくは複数のリン酸化である、または前記２個以上のＰＴＭが２個以上のリン酸化である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）における前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、そのアミノ（Ｎ）またはカルボキシ（Ｃ）末端を介してオリゴヌクレオチドに共有結合している、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記膜貫通ポアが膜に存在し、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記膜にカップリングしている、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、コレステロールを使用して前記膜にカップリングしている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポアが、膜貫通タンパク質ポア、固体ポアまたはハイブリッド膜固体ポアである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜貫通タンパク質ポアが、溶血素、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）自己輸送体リポタンパク質（ＮａｌＰ）、ＯＭＰおよびＷｚａ由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記膜貫通タンパク質ポアが、（ａ）配列番号２に示す７個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）前記７個のサブユニットの１個または複数が配列番号２に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも８０％相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記膜貫通タンパク質ポアが、（ａ）配列番号４に示す４個の同一のサブユニットおよび配列番号６に示す４個の同一のサブユニットから形成されているγ溶血素、または（ｂ）前記サブユニットの１個または複数が配列番号４に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも８０％相同性を有し、および／または前記サブユニットの１個または複数が配列番号６に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも８０％相同性を有し、前記ポアがポア活性を保持しているその変種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記膜貫通タンパク質ポアが（ａ）配列番号８に示す７個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）前記７個のサブユニットの１個または複数が配列番号８に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも８０％相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
生物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数の異常なＰＴＭに関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定することを補助する方法であって、
（ａ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む前記生物由来の試料に対して請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を実行するステップ；および
（ｂ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数のＰＴＭの数または位置（１個もしくは複数）を決定し、当該決定を、前記生物が前記疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定するために使用するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
前記生物が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なリン酸化に関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定することを補助するための、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患または障害が、がん、慢性炎症性疾患、筋緊張性筋ジストロフィー、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、ブルトンチロシンキナーゼ、ヒルシュスプルング病、常染色体劣性ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、頭蓋骨癒合症、乳頭状腎臓がん、慢性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ポイツ・ジェガーズ症候群、コフィン・ローリー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、リー・フラウメニ症候群、ウイリアムズ症候群、妖精症、糖尿病、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ウォルコット・ラリソン（Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ）症候群またはＸ連鎖筋細管ミオパチーである、請求項１５または１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）を決定する新規方法に関する。本発明は、膜貫通ポアを使用する。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成番号５  Ｒ０１  ＨＧ００３７０９−０８の下の政府資金で行われた。合衆国政府は、本発明に権利を有する。本発明に至る仕事も欧州連合第７次フレームワークプログラム（ＦＰ７／２００７−２０１３）／ＥＲＣ  ｇｒａｎｔ  ａｇｒｅｅｍｅｎｔ  ｎｏ．２９４４４３の下で欧州研究会議から資金提供を受けた。
【背景技術】
【０００３】
大部分のタンパク質の機能特性は、特定の残基の翻訳後修飾（ＰＴＭ）によって制御されている。今日までに、セリン、スレオニンまたはチロシンでのリン酸化が最も頻繁に実験的に決定されたＰＴＭである１（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｌｅｎｅ．ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ．ｅｄｕ／ＰＴＭＣｕｒａｔｉｏｎ）。真核生物ではタンパク質化学種の３０％（出芽酵母（S.cerevisiae））から５０％（マウス）が、リン酸化されている２，３。決定的に重要なタンパク質は、複数のリン酸化部位を有する場合があり、タンパク質を活性化もしくは不活性化する、その分解を促進する、またはタンパク質パートナーとの相互作用を調節することに役立っている４。例えばｐ５３は、少なくとも１８個のリン酸化部位を有する４，５。重要なことに多部位修飾は、さまざまな組合せで生じる場合があり、タンパク質のさまざまな機能形態を導く６。
【０００４】
タンパク質リン酸化の初期の研究は、リン酸基の組み込みによって生じるタンパク質電気泳動移動度および等電点における変化に基づいている２Ｄゲル電気泳動を利用していた７。２Ｄゲル電気泳動は、同じタンパク質内の異なるリン酸化部位を解析できない８，９。近年のリン酸プロテオームの質量分析（ＭＳ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのリン酸化の研究に関して注目されている。プロテアーゼ消化および高分解能ＭＳの使用を通じて、数千のリン酸化タンパク質化学種が同定できる９，１０。さまざまな供給源由来の試料（例えば処置後および対照）が同位元素で差次的に標識される場合、特定のタンパク質中の特定の部位でのリン酸化のレベルにおける変化は推定できる１１。これらの進歩にもかかわらず、個々のタンパク質分子内のリン酸化のパターンの決定は課題のままである２。例えば２個の隣接部位の内の１つで一リン酸化されたタンパク質を識別することは困難である。リン酸化部位の占有性および結合性は、単一分子アプローチが理想的に適している問題である。
【０００５】
操作されたタンパク質ナノポアが、物質と化学的に反応する二価金属カチオン１４から有機分子１５までの溶液中の多種多様な分子１２，１３の確率的検出のために使用されている１６。ナノポア技術は、ＤＮＡおよびＲＮＡの単一分子配列決定のための超高速の低費用プラットホームとして調査されている１７，１８。例えば、１本鎖ＤＮＡは、酵素と共にタンパク質ポアを通って徐々に動くことができ１９〜２２、配列はイオン電流における塩基依存性移行から２８〜３１読まれる２３〜２７。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、ナノポアを通る電流サインの変化を通じてＰＴＭが単一分子レベルで検出され得ることを驚くべきことに実証した。注目すべきことに、タンパク質中の異なる場所での修飾は異なるサインを生じ、修飾部位間の迅速な識別を可能にする。本発明者らは、２個の隣接部位（１残基によって分離されている）の修飾状態：すなわち、未修飾状態、２個の一修飾状態および二重修飾状態を識別および定量できることも驚くべきことに示した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
したがって、本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数のＰＴＭの存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）を決定する方法であって、
（ａ）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を膜貫通ポアと、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアを通って移動するように接触させるステップ；および
（ｂ）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアに関して移動する際に１つまたは複数の電流測定値を取り、それによりペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数のＰＴＭの存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）を決定するステップ
を含む方法を提供する。
【０００８】
本発明は、生物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数のＰＴＭに関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む生物由来の試料に対して本発明の方法を実行するステップ；および
（ｂ）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数のＰＴＭが存在するかどうかを決定し、それにより生物が疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定するステップ
を含む方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】モデル基質中のさまざま部位でのリン酸化の単一分子ナノポア検出を示す図である。（ａ）４種の特徴的なレベルを示すαＨＬポアを通るＴｒｘＳ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０のアンフォールディングおよび移行の電流サイン：レベル１、オープンポア；レベル２、ポアを通されたオリゴヌクレオチドリーダー；レベル３、ポア中のタンパク質基質のＣ末端；レベル４、タンパク質の残部のアンフォールディングおよびポアを通る拡散。（ｂ）この仕事で使用されるＴｒｘ変異体のＣ末端の配列。リン酸化部位は、拡大したＳ（Ｓｅｒ）で記されている。２個の変異体では、リン酸化可能なＳｅｒ残基はＡｌａ（Ａ）で置き換えられている。
【図１−２】モデル基質中のさまざま部位でのリン酸化の単一分子ナノポア検出を示す図である。（ｃ）Ｃ末端伸長（青色棒）でのＰＫＡリン酸化部位を特性とするＴｒｘＳ１１２−Ｐの分子モデル。Ｓｅｒ−１１２の側鎖Ｏ原子は、丸いボールとして示されている。（ｄ）ＴｒｘＳ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０の電流サイン。（ｅ）ＴｒｘＳ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０の電流サイン。（ｆ）ＴｒｘＳ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０およびＴｒｘＳ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０のレベル３における残留電流（ＩＲＥＳ％）およびノイズ（Ｉｎ）の代表的な２Ｄ散布図ならびに関連するヒストグラム（２００事象が記録された）。（ｇ）Ｃ末端αヘリックス（青色）でのＰＫＡリン酸化部位を特性とするＴｒｘＳ１０７−Ｐの分子モデル。Ｓｅｒ−１０７の側鎖Ｏ原子は、丸いボールとして示されている。（ｈ）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０の電流サイン。（ｉ）ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０の電流サイン。（ｊ）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０およびＴｒｘＳ１０７＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０のレベル３における残留電流（ＩＲＥＳ％）およびノイズ（Ｉｎ）の代表的な２Ｄ散布図ならびに関連するヒストグラム（１９９事象が記録された）。（ｋ）Ｃ末端ヘリックス（青色棒）に先行するループ中のＰＫＡリン酸化部位を特性とするＴｒｘＳ９５−Ｐの分子モデル。Ｓｅｒ−９５の側鎖Ｏ原子は、丸いボールとして示されている。（ｌ）ＴｒｘＳ９５−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０の電流サイン。（ｍ）ＴｒｘＳ９５＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０の電流サイン。（ｎ）ＴｒｘＳ９５−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０およびＴｒｘＳ９５＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０のレベル３における残留電流（ＩＲＥＳ％）およびノイズ（Ｉｎ）の代表的な２Ｄ散布図ならびに関連するヒストグラム（２５０事象が記録された）。すべての測定は＋１４０ｍＶで行われた。（ｆ）、（ｊ）および（ｎ）における実験は、３回反復された。
【図２】４個のリン酸化状態の単一分子ナノポア検出を示す図である。（ａ）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０についての代表的なイオン電流トレース。（ｂ）ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０についてのトレース。（ｃ）ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０についてのトレース。（ｄ）ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０についてのトレース。（ｅ）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ａ１１２−オリゴ（ｄＣ）３０についてのトレース。（ｆ）ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ａ１１２−オリゴ（ｄＣ）３０についてのトレース。（ｇ）４個の可能性があるリン酸化状態（記号ａ、ｂ、ｄ、ｆによって示す：ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ａ１１２−オリゴ（ｄＣ）３０およびＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０についてのレベル３における残留電流（ＩＲＥＳ％）およびノイズ（Ｉｎ）の代表的な２Ｄ散布図ならびに関連するヒストグラム。ｇでは、同じポアが全体について使用され、各Ｔｒｘ変種の添加前にｃｉｓコンパートメントを灌流し、合計３４２事象を記録し、いくつかの事象（＜８％）は不完全な灌流のためのキャリーオーバーによる可能性がある。４個の構築物を識別する同じポアの能力は、２回検証された。すべての測定は＋１４０ｍＶで行われた。
【図３】混合したリン酸化状態を含有する試料の単一分子ナノポア検出を示す図である。（ａ）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐのリン酸化の時間依存性。ＩＥＦによって決定された二重リン酸化ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ｓ１１２＋Ｐに転換されたタンパク質画分が示されている。（ｂ）２時間のリン酸化に続く、オリゴ（ｄＣ）３０へのコンジュゲーションおよび＋１４０ｍＶでのαＨＬナノポア分析（２０２事象が記録された）のレベル３における残留電流（ＩＲＥＳ％）およびノイズ（Ｉｎ）の代表的な２Ｄ散布図ならびに関連するヒストグラム。混合物を識別する同じポアの能力は、２回検証された。同じ面積を区切る四角は、図１３に示される。
【図４】αＨＬポア内のＴｒｘＳ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０の共移行アンフォールディングの電圧依存性を示す図である。（ａ）＋１４０ｍＶでの４レベルでの代表的な電流トレース。（ｂ）ＰＫＡ認識配列（青色棒）およびリン酸化部位（丸いボール）を示すチオレドキシン変異体ＴｒｘＳ１１２−Ｐの分子モデル。（ｃ）ステップ２から３への速度の電圧依存性、（Ο）Ｖ５−Ｃ１０９−オリゴ（ｄＣ）３０３７；（□）ＴｒｘＳ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。（ｄ）ステップ３から４への速度の電圧依存性、（Ο）Ｖ５−Ｃ１０９−オリゴ（ｄＣ）３０３７；（□）ＴｒｘＳ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。（ｅ）ステップ４から１への速度の電圧依存性、（Ο）Ｖ５−Ｃ１０９−オリゴ（ｄＣ）３０３７；（□）ＴｒｘＳ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。エラーバーは、それぞれ異なるポアを使用した（ｎ＝３）独立した実験間の標準偏差を表す。
【図５】構築物ＴｒｘＳ１１２、ＴｒｘＳ１０７およびＴｒｘＳ９５のリン酸化前後での陽イオンモードでのＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳを示す図である（デコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）スペクトル）。（ａ）ＴｒｘＳ１１２−Ｐ（予想質量１２２０２）。（ｂ）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ（予想質量１１８３２）。（ｃ）ＴｒｘＳ９５−Ｐ（予想質量１１９１６）。（ｄ）ＴｒｘＳ１１２＋Ｐ。（ｅ）ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ。（ｆ）ＴｒｘＳ９５＋Ｐ。リン酸化後の予想質量増加は、８０Ｄａである。（ｅ）および（ｆ）が非リン酸化タンパク質に対するピークを含有していることに注目されたい。
【図６】αＨＬポア内のＴｒｘ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０の共移行アンフォールディングの電圧依存性を示す図である。（ａ）ステップ２から３への速度の電圧依存性、（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０；（Δ）Ｔｒｘ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。（ｂ）ステップ３から４への速度の電圧依存性、（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０；（Δ）Ｔｒｘ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。（ｃ）ステップ４から１への速度の電圧依存性、（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０；（Δ）Ｔｒｘ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。エラーバーは、それぞれ異なるポアでの（ｎ＝３）独立した実験間の標準偏差を表す。
【図７】レベル３の残留電流（ＩＲＥＳ％）およびノイズ（Ｉｎ）の電圧依存性を示す図である。（ａ）印加された電圧の関数としてのレベル３の残留電流（ＩＲＥＳ％）、（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０；（Δ）Ｔｒｘ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。（ｂ）電圧の関数としてのノイズ（Ｉｎ）。Ｉｎはレベル３でのイオン電流のすべての点のヒストグラムへのガウスフィットの標準偏差である。（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０；（Δ）Ｔｒｘ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。エラーバーは、それぞれ異なるポアでの（ｎ＝３）独立した実験間の標準偏差を表す。
【図８】αＨＬポア内の種々のＴｒｘの共移行アンフォールディングの電圧依存性を示す図である。（ａ）ステップ２から３への速度の電圧依存性、（□）Ｔｒｘ１０７−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（Δ）Ｔｒｘ１０７＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。（ｂ）ステップ３から４への速度の電圧依存性、（□）Ｔｒｘ１０７−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（Δ）Ｔｒｘ１０７＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。（ｃ）ステップ４から１への速度の電圧依存性、（□）Ｔｒｘ１０７−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（Δ）Ｔｒｘ１０７＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。（ｄ）ステップ２から３への速度の電圧依存性、（□）Ｔｒｘ９５−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。（ｅ）ステップ３から４への速度の電圧依存性、（□）Ｔｒｘ９５−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。（ｆ）ステップ４から１への速度の電圧依存性、（□）Ｔｒｘ９５−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（Ο）Ｔｒｘ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。エラーバーは、それぞれ異なるポアでの（ｎ＝３）独立した実験間の標準偏差を表す。
【図９】（Ο）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（□）ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０および（◇）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ａ１１２−オリゴ（ｄＣ）３０についての残留電流（ＩＲＥＳ％）およびノイズ（Ｉｎ）の２Ｄプロットならびに関連するヒストグラムを示す図である。３個すべての構築物は、＋１４０ｍＶで同じαＨＬポア（ｃｉｓコンパートメントは各Ｔｒｘ変種の添加前に灌流された）で検討され、合計３００事象を分析した。レベル３の高伝導度準安定状態（sub-state）はこの図には含まれていない（縮小表示について図１０を参照されたい）。各構築物は、それぞれ異なるポアについて３回の独立した実験でさらに分析された。
【図１０】図９の縮小表示を示す図である。（Ο）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（□）ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０および（◇）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ａ１１２−オリゴ（ｄＣ）３０についての残留電流（ＩＲＥＳ％）およびノイズ（Ｉｎ）の２Ｄプロット。３個すべての構築物は、＋１４０ｍＶで同じＷＴ  αＨＬポア（ｃｉｓコンパートメントは各Ｔｒｘ変種の添加前に灌流された）で検討され、合計３００事象を分析した。高伝導度の準安定状態は、オープンポア値（ＩＯ）のおよそ２４％のＩＲＥＳ％値で観察される。各構築物は、それぞれ異なるポアについて３回の独立した実験でさらに分析された。
【図１１】構築物ＴｒｘＳ１０７／Ｓ１１２、ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２およびＴｒｘＳ１０７／Ａ１１２のリン酸化前後での陽イオンモードでのＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳを示す図である（デコンボリューションスペクトル）。（ａ）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ（予想質量１２３０３）。（ｂ）ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２−Ｐ（予想質量１２２８７）。（ｃ）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ａ１１２（予想質量１２２８７）。（ｄ）ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ｓ１１２＋Ｐ。（ｅ）ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２＋Ｐ。（ｆ）ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２＋Ｐ。一部位でのリン酸化後の予想質量増加は、８０Ｄａである。
【図１２】図２からの残留電流（ＩＲＥＳ％）対ノイズ（Ｉｎ）の２Ｄプロットの縮小表示を示す図である。（Δ）ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（□）ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、（◇）ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ａ１１２−オリゴ（ｄＣ）３０および（Ο）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０。すべての測定は、＋１４０ｍＶで同じＷＴ  αＨＬポア（ｃｉｓコンパートメントは各Ｔｒｘ変種の添加前に灌流された）で検討され、合計３４２事象の測定を含み、いくつかの事象（＜８％）は、不完全な灌流のためのキャリーオーバーによる可能性がある。高伝導度の準安定状態は、オープンポア値（ＩＯ）のおよそ２１から２２％のＩＲＥＳ％値で観察される。各構築物は、それぞれ異なるポアについて３回の独立した実験でさらに分析された。
【図１３】図３ｂにおいて使用されたポアの較正のための残留電流（ＩＲＥＳ％）対電流ノイズ値（Ｉｎ）の２Ｄ散布図である。（ａ）ポアはＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ａ１１２−オリゴ（ｄＣ）３０に曝露された。（ｂ）チャンバーの灌流を伴わずに、ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０、を次いで添加した（２個の集団がこのとき現れる）。（ｃ）ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０は、先の灌流を伴わずにチャンバーに添加された。（ｄ）ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０は、再度灌流を伴わずに添加された。較正は合計１６２事象を含み、図３ｂについてのデータを回収後に同じポアで実施された。同様の較正は、異なる順序で添加されたリン酸化Ｔｒｘで実験前に実施された。同様の結果が得られた。各構築物は、それぞれ異なるポアについて３回の独立した実験でさらに分析された。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
配列表の記載
配列番号１は、野生型α溶血素（ＷＴ  αＨＬ）の１個のサブユニットをコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
【００１１】
配列番号２は、ＷＴ  αＨＬの１個のサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１２】
配列番号３は、γ溶血素のＬｕｋＦサブユニットをコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
【００１３】
配列番号４は、γ溶血素のＬｕｋＦサブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１４】
配列番号５は、γ溶血素のＨｌｇ２サブユニットをコードしているポリヌクレオチド配列を示す。
【００１５】
配列番号６は、γ溶血素のＨｌｇ２サブユニットのアミノ酸配列を示す。
【００１６】
配列番号７は、ＭＳ−Ｂ１変異体ＭｓｐＡ単量体をコードしているコドン最適化ポリヌクレオチド配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠いており、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
【００１７】
配列番号８は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ−Ｂ１変異体の成熟形態のアミノ酸配列を示す。この変異体は、シグナル配列を欠いており、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。
【００１８】
配列番号９から１１は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤのアミノ酸配列を示す。
【００１９】
配列番号１２から１７は、実施例において用いられるタンパク質を示す。
【００２０】
本発明の詳細な記載
開示された産生物および方法のさまざまな適用が、当技術分野における具体的な必要性に適合され得ることは理解される。本明細書において使用される用語は、本発明の具体的な実施形態を記載する目的のためのみであり、限定する目的ではないことも理解される。
【００２１】
付加的に、本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明白に他を示す場合を除いて複数の指示対象を含む。したがって、例えば「ポア（ａ  ｐｏｒｅ）」への言及は２個以上のそのようなポアを含み、「修飾（ａ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」への言及は２個以上のそのような修飾を含み、「ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質（ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ，  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は２個以上のそのようなペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含み、「オリゴヌクレオチド（ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」への言及は２個以上のそのようなオリゴヌクレオチドを含むなど。
【００２２】
本明細書に引用するすべての刊行物、特許および特許出願は、上記または下記に関わらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
本発明の方法
本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数のＰＴＭの存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）を決定する方法を提供する。本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数のＰＴＭの存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）を決定する方法を好ましくは提供する。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアを通って移動するように、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、膜貫通ポアと接触される。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアに関して移動する際に１つまたは複数の電流測定値が取られる。これは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数のＰＴＭの存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）の決定を可能にする。
【００２４】
本発明の方法は、ポアを通る電流サインの変化を通じて単一分子レベルでのＰＴＭの迅速な決定を可能にする。本発明の方法は、ＰＴＭを研究するための従来の方法を超えるいくつかの有利点を有する。それは、迅速で簡単である。それは、単一のＰＴＭと同様に複数のＰＴＭを同定できることから高感度である。隣接ＰＴＭ間も識別できる。方法からの出力はリアルタイムで分析され、十分な情報が得られた場合に停止されるようにする。方法は、最小限の訓練または資質を有する者によって実行され得る。
【００２５】
ＰＴＭの存在、非存在、数または任意の数の位置（１個もしくは複数）、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、１０個以上、１５個以上、１８個以上のＰＴＭなどは本発明により決定され得る。ＰＴＭの数は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のサイズおよびペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中に存在するＰＴＭ部位の数に典型的には依存する。
【００２６】
本発明の方法は、好ましくはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の２個以上のＰＴＭの存在、非存在、数または位置を決定するためである。そのような実施形態では２個以上のＰＴＭは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のどこに位置付けられてもよい。２個以上のＰＴＭは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の反対側の末端にあってよい。２個以上のＰＴＭは、１アミノ酸などの１０個以下のアミノ酸、５個以下のアミノ酸または２個以下のアミノ酸によって好ましくは分離される。ヒトゲノムは５００個のキナーゼを成文化し、１個または複数のリン酸化部位を認識する。２個以上のＰＴＭ部位は、１アミノ酸などの１０個以下のアミノ酸、５個以下のアミノ酸または２個以下のアミノ酸によって好ましくは分離される。ＰＴＭ部位は、２個以上のアミノ酸を含む場合がある。例えば可能性があるリン酸化部位は、これだけに限らないが配列ＲＲＡＳおよびＲＲＮＳを含む（図１ｂ）。これらの配列のＣ末端のセリンは、リン酸化によって修飾されているアミノ酸である。２個以上の修飾アミノ酸（すなわちＰＴＭ部位）は、１アミノ酸などの１０個以下のアミノ酸、５個以下のアミノ酸または２個以下のアミノ酸によって好ましくは分離されている。
【００２７】
１個または複数のＰＴＭの存在または非存在は、下に考察のとおり決定され得る。リン酸化などのＰＴＭの存在または非存在は、下に考察のとおり疾患を診断するために使用され得る。
【００２８】
１個または複数のＰＴＭの存在は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が１個もしくは複数の部位またはアミノ酸で翻訳後に修飾されることを示している。対照実験は、具体的なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数の特異的ＰＴＭの存在に関連する電流サイン（１つまたは複数）を決定するために実行され得る。そのような対照サイン（１個または複数）は、次いで本発明により１個または複数の特異的ＰＴＭの存在を決定するために使用され得る。本発明の方法において対照サイン（１個または複数）の存在は、１個または複数の特異的ＰＴＭの存在を示している。本発明の方法において対照サイン（１つまたは複数）の非存在は、１個または複数の特異的ＰＴＭの非存在を示している。
【００２９】
対照実験も具体的なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数の特異的ＰＴＭの非存在に関連する電流サイン（１つまたは複数）を決定するために実行され得る。そのような対照サイン（１つまたは複数）は、次いで本発明により１個または複数の特異的ＰＴＭの非存在を決定するために使用され得る。本発明の方法において「非存在」対照サイン（１つまたは複数）の存在は、１個または複数の特異的ＰＴＭの非存在を示している。
【００３０】
本発明の方法は、１個または複数の特異的ＰＴＭの数および位置（１個または複数）が決定されるようにする。ＰＴＭの位置（１個または複数）は、ＰＴＭ部位または修飾されるアミノ酸などのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中のそれら／その位置（１個または複数）を指す。２個以上のＰＴＭの位置は、本発明により決定され得る。対照実験は、具体的なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の特定の位置での異なる数のＰＴＭの存在に関連する電流サインを決定するために実行され得る。そのような対照サイン（１つまたは複数）は、次いで本発明により１個または複数の特異的ＰＴＭの数および位置（１個または複数）を決定するために使用され得る。例えば、本発明の方法において特定の位置でのＰＴＭに関連する対照サイン（例えば対照サインＡ）の存在は、これらの位置での２個のＰＴＭの存在を示している。本発明の方法において特定の位置でのＰＴＭに関連する対照サイン（例えば対照サインＢ）の存在は、特定の位置での２個のＰＴＭのうちの１個の存在を示している。本発明の方法において対照サインの非存在（すなわち、例えば対照サインＡおよびＢの非存在）は、これらの位置での２個のＰＴＭの非存在を示す。
【００３１】
上に示すとおり対照実験も、具体的なペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の特定の位置でのさまざま数のＰＴＭの非存在に関連する電流サインを決定するために実行され得る。そのような対照サイン（１つまたは複数）は、次いで本発明により関係する位置での関係する数のＰＴＭの非存在を決定するために使用され得る。
【００３２】
本発明の方法は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアに関して移動する際に１つまたは複数の電流測定値を取ることを含む。これは、下に考察するとおり行われ得る。方法は、平均残留電流（ＩＲＥＳ）および／またはノイズ（Ｉｎ）を測定することを好ましくは含む。これは、実施例に記載のとおり行われ得る。方法は、平均残留電流（ＩＲＥＳ）およびノイズ（Ｉｎ）を測定することをより好ましくは含む。これらは、次いで実施例に記載のとおり所与の電流サインに対して互いにプロットされ得る。
【００３３】
本発明の方法は、同じペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質において実行された代替的ＰＴＭのさまざまな集団の定量を可能にする。これは、各ＰＴＭ組合せを保有する対照シグナルの数を計数することによって単純に行われ得る。これは、関係のある集団中の変化を生物の生理学的または疾患の状態に関連付けることを可能にする。
【００３４】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在してよくまたは天然に存在しなくてもよい。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、それらの中に合成または修飾アミノ酸を含んでよい。アミノ酸への多数の異なる種類の修飾が当技術分野において周知である。好適なアミノ酸およびその修飾は、下に考察されている。本発明の目的のために、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が当技術分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得ることは理解される。
【００３５】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、細胞から分泌されるものであってよい。代替的にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、本発明が実行されるより前に細胞から抽出されるはずであるように細胞内部に存在するものであってよい。それは、抗体の使用によってまたはタンパク質に導入された親和性タグの結合によっての両方で抽出され得る。
【００３６】
ペプチドは、典型的には約２から約５０アミノ酸のポリマーである。ポリペプチドは、典型的にはアミノ酸の長いポリマーである。タンパク質は、典型的には、機能的コンホメーションにフォールドされるまたは機能的複合体の部分を形成するポリペプチドである。
【００３７】
任意のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が本発明の方法において使用され得る。好適なタンパク質は、これだけに限らないが、酵素、抗体、ホルモン、増殖因子または、サイトカインなどの増殖制御タンパク質を含む。
【００３８】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、細菌性、古細菌性、真菌性、ウイルス性または寄生虫由来であってよい。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、植物由来であってよい。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトのものである。
【００３９】
接触および移行
本発明の方法におけるステップ（ａ）および（ｂ）は、好ましくはポアにわたって印加された電位と共に実行される。印加された電位は、典型的にはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をポアを通して移行または移動させる。印加された電位は、電圧電位であってよい。代替的に、印加された電位は、化学的電位であってよい。この例は、両親媒性層にわたる塩グラジエントを使用することである。塩グラジエントはHolden et al., J Am Chem Soc. 2007 Jul 11; 129(27):8650-5に開示されている。
【００４０】
フォールドしたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、Rodriguez-Larrea, D. & Bayley, H. Multistep protein unfolding during nanopore translocation. Nat. Nanotechnol. 8 288-95 (2013)に記載のとおりポアを通って移行され得る。詳細にはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、好ましくはオリゴヌクレオチドなどの荷電ポリマーに共有結合している。代替的にペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、それをポアに駆動するリーダー配列を保有する場合がある。同様に分子モーターは、Nivala, J., Marks, D.B., Akeson M. Unfoldase-mediated protein translocation through an α-hemolysin nanopore. Nat. Biotech. 31 247-50 (2013)のとおりペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をポアを通して引くように使用され得る。より好ましくはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ（Ｎ）またはカルボキシ（Ｃ）末端は、オリゴヌクレオチドなどの荷電ポリマーに共有結合している。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、下に考察の方法のいずれかを使用してオリゴヌクレオチドなどの荷電ポリマーに共有結合していてもよい。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、リンカーを使用してオリゴヌクレオチドなどの荷電ポリマーに共有結合していてもよい。好適なリンカーは、当技術分野において周知である。
【００４１】
オリゴヌクレオチドなどの荷電ポリマーは、印加された電位の影響下でポアを通って移行される。これは、典型的には３つの効果を有する：（１）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のＮまたはＣ末端をポア中へ通すことを促進する；（２）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質アンフォールディングおよびペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質移行の初期段階の両方に対して調節可能な駆動力を提供する；ならびに（３）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の後方への移動を妨げる。
【００４２】
任意のオリゴヌクレオチドが使用され得る。オリゴヌクレオチドは、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下または５個以下のヌクレオチドなどの典型的には５０個以下のヌクレオチドを有する短いヌクレオチドポリマーである。オリゴヌクレオチドは、典型的には１本鎖である。
【００４３】
ヌクレオチドは、ヌクレオベース、糖および少なくとも１個のリン酸基を典型的には含有する。ヌクレオベースは、典型的には複素環である。ヌクレオベースは、これだけに限らないが、プリンおよびピリミジンならびにさらに具体的にはアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）およびシトシン（Ｃ）を含む。糖は、典型的には五炭糖である。ヌクレオチド糖は、これだけに限らないが、リボースおよびデオキシリボースを含む。ヌクレオチドは、典型的にはリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである。ヌクレオチドは、一リン酸、二リン酸または三リン酸を典型的には含有する。リン酸は、ヌクレオチドの５’または３’側に付着されてよい。
【００４４】
ヌクレオチドは、これだけに限らないが、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、チミジン一リン酸（ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（ＴＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルシチジン一リン酸、５−メチルシチジン二リン酸、５−メチルシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン二リン酸、５−ヒドロキシメチルシチジン三リン酸、サイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、サイクリックグアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）およびデオキシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、５−メチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−メチル−２’−デオキシシチジン二リン酸、５−メチル−２’−デオキシチジン三リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン一リン酸、５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシシチジン二リン酸ならびに５−ヒドロキシメチル−２’−デオキシチジン三リン酸を含む。ヌクレオチドは、好ましくはＡＭＰ、ＴＭＰ、ＧＭＰ、ＵＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＧＭＰまたはｄＣＭＰから選択される。ヌクレオチドは、脱塩基（すなわちヌクレオベースを欠いている）であってよい。ヌクレオチドは、追加的修飾を含む場合がある。詳細には、好適な修飾ヌクレオチドは、これだけに限らないが、２’アミノピリミジン（２’−アミノシチジンおよび２’−アミノウリジンなど）、２’−ヒドロキシルプリン（２’−フルオロピリミジンなど（２’−フルオロシチジンおよび２’フルオロウリジンなど）、ヒドロキシルピリミジン（５’−α−Ｐ−ボラノウリジンなどの）、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジンおよび２’−Ｏ−メチルウリジンなど）、４’−チオピリミジン（４’−チオウリジンおよび４’−チオシチジンなど）ならびにヌクレオベース（５−ペンチニル−２’−デオキシウリジン、５−（３−アミノプロピル）−ウリジンおよび１，６−ジアミノヘキシル−Ｎ−５−カルバモイルメチルウリジンなど）の修飾を有するヌクレオチドを含む。
【００４５】
ヌクレオチドは、脱塩基（すなわちヌクレオベースを欠いている）であってよい。ヌクレオチドは、ヌクレオベースおよび糖を欠いていてもよい（すなわちＣ３スペーサーである）。
【００４６】
ＰＴＭ
任意の１個または複数のＰＴＭは、本発明により決定され得る。１個または複数のＰＴＭは、疎水性基での修飾、補因子での修飾、化学基の付加、糖化（糖の非酵素的付着）、ビオチン化およびペグ化から好ましくは選択される。ＰＴＭは、それらが生物工学的または生物医学的目的のために実験室で化学的に修飾された非天然物であってもよい。これは、天然対応物とは対照的な実験室作製ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のレベルのモニターすることを可能にできる。
【００４７】
疎水性基での修飾は、ミリストイル化、Ｃ１４飽和酸ミリスチン酸の付着；パルミトイル化、Ｃ１６飽和酸パルミチン酸の付着；イソプレニル化またはプレニル化、イソプレノイド基の付着；ファルネシル化、ファルネソール基の付着；ゲラニルゲラニル化、ゲラニルゲラニオール基の付着；およびグリピエーション（glypiation）、アミド結合を介するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー形成から好ましくは選択される。
【００４８】
補因子での修飾は、好ましくはリポイル化、リポエート（Ｃ８）官能基の付着；フラビネーション（flavination）、フラビン成分（例えばフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ））の付着；ヘムＣの例えばチオエーテル結合を介するシステインとの付着；ホスホパンテテイニル化（phosphopantetheinylation）、４’−ホスホパンテテイニル基の付着；およびレチニリデン（retinylidene）シッフ塩基形成から選択される。
【００４９】
化学基の付加は、アシル化、例えばＯ−アシル化（エステル）、Ｎ−アシル化（アミド）またはＳ−アシル化（チオエステル）；アセチル化、例えばＮ末端へまたはリジンへのアセチル基の付着；ホルミル化；アルキル化、メチルまたはエチルなどのアルキル基の付加；メチル化、例えばリジンまたはアルギニンへのメチル基の付加；アミド化；ブチル化；ガンマカルボキシル化；グリコシル化、例えばアルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリジン、セリン、スレオニン、チロシンまたはトリプトファンへのグリコシル基の酵素的付着；ポリシアル酸化、ポリシアル酸の付着；マロニル化；ヒドロキシル化；ヨウ素化；ブロム化；シトルリン化；ヌクレオチド付加、上に考察の任意のものなどの任意のヌクレオチドの付着、ＡＤＰリボシル化；酸化；リン酸化、例えばセリン、スレオニンもしくはチロシン（Ｏ結合）またはヒスチジン（Ｎ結合）へのリン酸基の付着；アデニリル化、例えばチロシン（Ｏ結合）へのまたはヒスチジンもしくはリジン（Ｎ結合）へのアデニリル部分の付着；プロピノイル化；ピログルタミン酸形成；Ｓ−グルタチオン化；ＳＵＭＯ化；Ｓ−ニトロシル化；サクシニル化、例えばリジンへのサクシニル基の付着；セレノイル化（selenoylation）、セレニウムの組み込み；ならびにユビキチニル化（ubiquitinilation）、ユビキチンサブユニット（Ｎ結合）の付加から好ましくは選択される。
【００５０】
化学基の付加は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質内の１個または複数のシステイン、リジン、チロシン、アルギニンまたは任意の他の（天然もしくは非天然）残基の任意の非天然化学的修飾に関する場合がある。
【００５１】
本発明の方法は、好ましくは１個もしくは複数のリン酸化または２個以上のリン酸化の存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）を決定するためである。任意のリン酸化は、セリン、スレオニンもしくはチロシンのリン酸化（Ｏ結合）またはヒスチジンのリン酸化（Ｎ結合）を含んで決定され得る。１個または複数のリン酸化は、好ましくはＯ結合である。１個または複数のリン酸化は、より好ましくはセリンの１個または複数のリン酸化である。
【００５２】
膜貫通ポア
膜貫通ポアは、ある程度膜を横断する構造である。それは、印加された電位によって駆動される水和イオンを膜にわたってまたは膜内に流れるようにする。膜貫通ポアは、典型的には膜全体を横断し、それにより水和イオンは、膜の一方の側から膜の他方の側へ流れることができる。しかし膜貫通ポアは、膜を横断しなくてもよい。それは、一方の末端で閉じていてよい。例えばポアは、それに沿ってまたはそれの中に水和イオンが流れることができる膜内のウエルであってよい。膜貫通タンパク質ポアは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアを通して移動できるように、および典型的には膜を横断できるようにする。
【００５３】
任意の膜が本発明により使用され得る。好適な膜は、当技術分野において十分周知である。膜は、好ましくは両親媒性層である。両親媒性層は、少なくとも１個の親水性部分および少なくとも１個の親油性または疎水性部分の両方を有するリン脂質などの両親媒性分子から形成される層である。両親媒性分子は、合成または天然に存在してよい。天然に存在しない両親媒性物質および、単層を形成する両親媒性物質は、当技術分野において周知であり、例えばブロック共重合体を含む（Gonzalez-Perez et al., Langmuir, 2009, 25, 10447-10450）。ブロック共重合体は、２個以上単量体サブユニットが単一のポリマー鎖を作るように共にポリマー化しているポリマー性材料である。ブロック共重合体は、典型的には各単量体サブユニットによって寄与される特性を有する。しかし、ブロック共重合体は、個々のサブユニットから形成されたポリマーが保有していない固有の特性を有する場合がある。ブロック共重合体は、単量体サブユニットの１個が疎水性（すなわち親油性）である、一方で他のサブユニット（１個または複数）は、水性媒体中で親水性であるように操作されてよい。この場合ブロック共重合体は、両親媒性特性を保有でき、生物学的膜を模倣する構造を形成できる。ブロック共重合体は、ジブロック（２個の単量体サブユニットからなる）であってよいが、両親媒性物質として挙動するさらに複雑な配置を形成するように２個より多い単量体サブユニットから構築されてもよい。共重合体は、トリブロック、テトラブロックまたはペンタブロック共重合体であってよい。
【００５４】
両親媒性層は、典型的には平面脂質二重層または支持された二重層である。
【００５５】
両親媒性層は、典型的には脂質二重層である。脂質二重層は、細胞膜のモデルであり、幅広い実験研究のための優れたプラットホームとして役立つ。例えば脂質二重層は、単一チャネル記録による膜タンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ調査のために使用され得る。代替的に脂質二重層は、幅広い物質の存在を検出するためのバイオセンサーとして使用され得る。脂質二重層は、任意の脂質二重層であってよい。好適な脂質二重層は、これだけに限らないが、平面脂質二重層、支持された二重層またはリポソームを含む。脂質二重層は、好ましくは平面脂質二重層である。好適な脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６３号（ＷＯ  ２００８／１０２１２１として公開）、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ  ２００９／０７７７３４として公開）および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ  ２００６／１００４８４として公開）に開示されている。
【００５６】
脂質二重層を形成するための方法は、当技術分野において周知である。好適な方法は、実施例に開示されている。脂質二重層は、モンタルおよびミューラーの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1972; 69: 3561-3566）によって一般に形成され、脂質単層は、界面に垂直である開口部のいずれかの側を超える水溶液／大気界面に続いている。
【００５７】
モンタルおよびミューラーの方法は、それが費用効果が高く、タンパク質ポア挿入のために好適である良質の脂質二重層を形成する比較的直接的な方法であることから一般的である。二重層形成の他の慣用法は、リポソーム二重層のチップディッピング（tip-dipping）、ペインティング二重層（painting bilayer）およびパッチクランピング（patch-clamping）を含む。
【００５８】
好ましい実施形態では脂質二重層は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／００４１２７号（ＷＯ２００９／０７７７３４として公開）に記載のとおり形成される。
【００５９】
別の好ましい実施形態では膜は、固体層である。固体層は、生物学由来ではない。言い換えると固体層は、生物もしくは細胞などの生物学的環境由来ではない、またはそれから単離されず、あるいは生物学的に利用可能な構造の合成的に製造されたバージョンではない。固体層は、これだけに限らないが、マイクロエレクトロニクス材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａ１２Ｏ３およびＳｉＯなどの絶縁材料、ポリアミドなどの有機および無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）または２要素添加硬化シリコンゴムなどのエラストマーなどのプラスチック、ならびにガラスを含む有機および無機の両方の材料から形成され得る。固体層は、グラフェンなどの一原子層、または数原子の厚さだけである層から形成されてよい。好適なグラフェン層は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７号（ＷＯ  ２００９／０３５６４７として公開）に開示されている。別の好ましい実施形態では両親媒性層は、固体ポアにわたってまたはその最上部に形成され得る。これは、当技術分野においてハイブリッドポア形成として記載される場合がある（Hall et al., Nat Nanotechnol., 2010, 5, 874-877）。方法は（ｉ）ポアを含む人工両親媒性層、（ｉｉ）ポアを含む単離された、天然に存在する脂質二重層、または（ｉｉｉ）挿入されたポアを有する細胞を使用して典型的には実行される。方法は、人工脂質二重層などの人工両親媒性層を使用して典型的には実行される。層は、他の膜貫通および／または膜内タンパク質ならびに他の分子をポアに加えて含む場合がある。好適な装置および条件は下に考察される。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで典型的には実行される。
【００６０】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、例えばＰＣＴ／ＧＢ１２／０５１１９１に記載のとおり好ましくは膜にカップリングしている。これは、任意の周知の方法を使用して行われ得る。膜が脂質二重層などの両親媒性層である場合（上に詳細に考察のとおり）、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、膜中に存在するポリペプチドまたは膜中に存在する疎水性アンカーを介して好ましくは膜にカップリングしている。疎水性アンカーは、好ましくは脂質、脂肪酸、ステロール、炭素ナノチューブまたはアミノ酸である。
【００６１】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、膜に直接カップリングしていてもよい。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、好ましくはリンカーを介して膜にカップリングしている。好ましいリンカーは、これだけに限らないが、ポリヌクレオチド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリペプチドなどのポリマーを含む。
【００６２】
カップリングは安定または一過性であってよい。特定の応用のためにカップリングの一過性の性質は好ましい。一過性カップリングは、持続性のブロッキングを最少化し、手作業でポアを脱ブロックすることに時間がかからないことからデータがさらに迅速に蓄積されるようにする。持続性のカップリングが使用される場合、両親媒性層は不安定化される場合があるまたは、ｃｉｓ側に繋がれたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を作る場合があり、それにより実験的平衡を変化させる。これらの効果は、一過性カップリングによって最少化され得る。膜と安定または一過性連結を形成する化学基は、下により詳細に考察される。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、コレステロールまたは脂肪酸アシル鎖を使用して脂質二重層などの両親媒性層に一過性にカップリングしていてもよい。ヘキサデカン酸などの長さ約６個から約３０個の炭素原子を有する任意の脂肪酸アシル鎖が使用され得る。
【００６３】
合成脂質二重層へのカップリングは、種々のさまざまな繋ぐための戦略で既に実行されている。これらは下の表１に要約されている。
【００６４】
【表１】
0006707453.tif 000002
【００６５】
膜貫通ポアは、好ましくは膜貫通タンパク質ポアである。膜貫通タンパク質ポアは、膜の一方の側から膜の他方の側へ水和イオンが流れるようにするポリペプチドまたはポリペプチドの収集物である。本発明では膜貫通タンパク質ポアは、印加された電位によって水和イオンが膜の一方の側から他方へ駆動されるようにするポアを形成できる。膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはヌクレオチドなどの分析物が、脂質二重層などの膜の一方の側から他方へ流れるようにする。膜貫通タンパク質ポアは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアを通って移動されるようにする。
【００６６】
ポアのバレルまたはチャネル（それを通って水和イオンが流れる）は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質がポアを通って移動できる限り任意の幅を有してよい。バレルまたはチャネルは、典型的には１種より多い幅を有する、すなわちバレルまたはチャネルの幅は、その長さに沿って変化してよい。ポアは、当技術分野において狭窄部位として周知である最も狭い部分を有する。これがバレルまたはチャネルの最も狭い部分である。最も狭い部分の場所は、当技術分野において周知の任意の方法を使用して決定され得る。タンパク質ポアの最も狭い部分は、タンパク質モデリング、結晶状態にあるタンパク質のＸ線回折測定（Rupp B (2009).Biomolecular Crystallography：Principles、Practice and Application to Structural Biology. New York: Garland Science.）、溶液中のタンパク質の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル（Mark Rance; Cavanagh, John; Wayne J. Fairbrother; Arthur W. Hunt III; Skelton, Nicholas J. (2007).Protein NMR spectroscopy: principles and practice (2nd ed.). Boston: Academic Press.）または凍結水和状態中のタンパク質のクライオ電子顕微鏡（van Heel M, Gowen B, Matadeen R, Orlova EV, Finn R, Pape T, Cohen D, Stark H, Schmidt R, Schatz M, Patwardhan A (2000). "Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution". Q Rev Biophys. 33: 307-69を使用して同定され得る。上に述べた方法によって決定されたタンパク質の構造情報は、プロテインバンク（ＰＤＢ）データベースから公開されて利用可能である。
【００６７】
タンパク質モデリングはタンパク質構造がホモログ内でタンパク質配列よりもさらに保存されるという事実を利用する。それにより、タンパク質の原子解析モデルを作ることは、クエリー配列の構造に似ていると考えられる１個または複数のタンパク質構造の同定に依存する。タンパク質モデルを構築するための「鋳型」として使用するために好適なタンパク質構造が存在するかどうかを評価するために、検索がプロテインデータバンク（ＰＤＢ）データベース上で実施される。タンパク質構造は、クエリー配列と合理的なレベルの配列同一性を共有する場合に好適な鋳型であると考えられる。そのような鋳型が存在する場合、次いで鋳型配列は、クエリー配列と「配列比較」される、すなわちクエリー配列中の残基が鋳型残基にマッピングされる。配列比較および鋳型構造は、次いでクエリー配列の構造モデルを産生するために使用される。それによりタンパク質モデルの質は、配列比較および鋳型構造の質に依存する。
【００６８】
ポアの最も狭い部分は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質、および存在する場合は荷電ポリマーが、それに進入および移行できるように十分幅広い。
【００６９】
膜貫通タンパク質ポアは、単量体またはオリゴマーであってよい。ポアは、好ましくは６個、７個、８個または９個のサブユニットなどのいくつかの反復サブユニットでできている。ポアは、好ましくは六量体、七量体、八量体または九量体ポアである。
【００７０】
膜貫通タンパク質ポアは、典型的にはイオンがそれを通って流れることができるバレルまたはチャネルを含む。ポアのサブユニットは、典型的には中心軸の周りを囲んでおり、鎖に膜貫通βバレルもしくはチャネルまたは膜貫通αヘリックス束またはチャネルをもたらす。
【００７１】
膜貫通タンパク質ポアのバレルまたはチャネルは、１個または複数のＰＴＭとの相互作用を促進するアミノ酸を典型的には含む。これらのアミノ酸は、バレルまたはチャネルの狭窄にまたは近くになどの、ポアの最も狭い部分にまたは近くに好ましくは位置付けられる。膜貫通タンパク質ポアは、典型的には１個または複数の、アルギニン、リジンもしくはヒスチジンなどの正に荷電したアミノ酸またはチロシンもしくはトリプトファンなどの芳香族アミノ酸を含む。これらのアミノ酸は、典型的にはポアと負に荷電したリン酸基との間の相互作用を促進する。
【００７２】
本発明による使用のための膜貫通タンパク質ポアは、βバレルポアまたはαヘリックス束ポア由来であってよい。βバレルポアは、β鎖から形成されているバレルまたはチャネルを含む。好適なβバレルポアは、これだけに限らないが、α溶血素、炭疽毒素およびロイコシジンなどのβ毒素、ならびにスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリン（Ｍｓｐ）、例えばＭｓｐＡ、ＭｓｐＢもしくはＭｓｐＣなどの細菌の外膜タンパク質／ポリン、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）自己輸送体リポタンパク質（ＮａｌＰ）またはＯｍｐファミリー（例えばＯｍｐＦ、ＯｍｐＧなど）由来のポアを含む。αヘリックス束ポアは、αヘリックスから形成されているバレルまたはチャネルを含む。好適なαヘリックス束ポアは、これだけに限らないが、内膜タンパク質ならびにＷｚａおよびＣｌｙＡ毒素などのα外膜タンパク質を含む。膜貫通ポアは、好ましくはα溶血素（αＨＬ）由来、ロイコシジン由来またはＭｓｐＡ由来である。
【００７３】
ポアは、ホモオリゴマー（すべて同一の単量体単位）またはヘテロオリゴマー（２個以上の異なる種類の単量体）であってよい。ポアは、連結された単量体、例えばポアのオリゴマー構造に会合された二量体を含む場合がある。単量体は、同じポリペプチド鎖に繋がれていて、すなわち遺伝的に融合されていてよい。
【００７４】
ポアは、少なくとも１個の二量体および１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の単量体を含んでよい。ポアは、２個、３個、４個以上の二量体を含んでよい。そのようなポアは、ポアを形成するために十分な単量体をさらに含む。さらなるポアは、二量体だけを含み、例えばポアは、４個、５個、６個、７個または８個の二量体を含む場合がある。本発明による使用のための具体的なポアは、４個の二量体を含む。二量体は、二量体の１個の単量体だけがポアのバレルまたは前庭をもたらすような構造を有するポアにオリゴマー化する場合がある。典型的には構築物の他の単量体は、ポアのバレルまたは前庭の外側にある。例えばポアは、バレルまたは前庭が８個の単量体を含んで、５個、６個、７個または８個の二量体を含む場合がある。
【００７５】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはα溶血素（αＨＬ）由来である。野生型αＨＬポアは、７個の同一の単量体またはサブユニットから形成されている（すなわち七量体である）。膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはαＨＬ由来の７個の単量体を含む。α溶血素（ＷＴ  αＨＬ）の１個の野生型単量体またはサブユニットの配列は配列番号２に示される。膜貫通タンパク質ポアは、好ましくは配列番号２に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個の単量体を含む。配列番号４のアミノ酸１、７から２１、３１から３４、４５から５１、６３から６６、７２、９２から９７、１０４から１１１、１２４から１３６、１４９から１５３、１６０から１６４、１７３から２０６、２１０から２１３、２１７、２１８、２２３から２２８、２３６から２４２、２６２から２６５、２７２から２７４、２８７から２９０および２９４はループ領域を形成する。配列番号２の残基１１３および１４７は、αＨＬのバレルまたはチャネルの狭窄部分を形成する。
【００７６】
ポアは、配列番号２に示す配列またはその変種をそれぞれ含む７個のタンパク質または単量体を好ましくは含む。膜貫通タンパク質は、好ましくは（ａ）配列番号２に示す７個の同一のサブユニットから形成されている、あるいは（ｂ）７個のサブユニットの１個もしくは複数またはすべてが配列番号２の変種であり、ポア活性を保持しているその変種である。サブユニットの１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個は変種であってよい。ポア中の変種は、同じまたは異なっていてよい。７個のサブユニットは、同じ（ホモ七量体）または異なっていて（ヘテロ七量体）よい。
【００７７】
配列番号２の変種は、配列番号２のものから変化しており、そのポア形成活性を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質である。ポアを形成するための変種の能力は、当技術分野において周知の任意の方法を使用してアッセイされ得る。例えば変種は、脂質二重層などの両親媒性層に、他の適するサブユニットと共に挿入されてよく、ポアを形成するようにオリゴマー化するその能力は決定され得る。方法は、脂質二重層などの両親媒性層にサブユニットを挿入することに関して当技術分野において周知である。例えば、サブユニットは、脂質二重層中に拡散し、脂質二重層に結合し、機能的状態に会合することによって挿入されるように、脂質二重層を含有する溶液中に精製された形態で懸濁されていてよい。代替的にサブユニットは、M.A. Holden, H. Bayley. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 6502-6503および国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００６／００１０５７号（ＷＯ  ２００６／１００４８４として公開）に記載の「ピックおよびプレース」法を使用して膜に直接挿入されてよい。
【００７８】
配列番号２の１個の好ましい変種は、置換Ｅ１１１ＮおよびＫ１４７Ｎを含有するα溶血素ＮＮである（Stoddart et al., PNAS, 2009; 106(19): 7702-7707）。
【００７９】
変種は、別の分子への共有結合または相互作用を促進する修飾を含んでよい。変種は、付着を促進する１個または複数の反応性システイン残基を好ましくは含む。例えば変種は、位置８、９、１７、１８、１９、４４、４５、５０、５１、２３７、２３９および２８７の１個または複数におよび／または配列番号２のアミノまたはカルボキシ末端にシステインを含んでよい。好ましい変種は、配列番号２の位置８、９、１７、２３７、２３９および２８７の残基のシステインでの置換を含む（Ａ８Ｃ、Ｔ９Ｃ、Ｎ１７Ｃ、Ｋ２３７Ｃ、Ｓ２３９ＣまたはＥ２８７Ｃ）。変種は、好ましくは、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ  ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ  ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ  ２０１０／０８６６０３として公開）に記載の変種のいずれか１個である。
【００８０】
変種は、生物によって、例えばブドウ球菌（Staphylococcus bacterium）によって天然で発現される天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によって組換え的に発現されてよい。変種は、組換え技術によって産生された天然に存在しない変種も含む。変種は、天然または非天然の化学連結によって導入され得る天然に存在しないアミノ酸または他の分子を含んでよい。変種は、アダプターとしてのシクロデキストリンの使用などの非共有結合修飾も含んでよく；これらの修飾は、ポアに堅固に結合する分子を含む。
【００８１】
配列番号２のアミノ酸配列の全長にわたって、変種は、その配列に対して、アミノ酸同一性に基づいて好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、アミノ酸同一性に基づいて配列全体にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％アミノ酸同一性が、２００個以上、例えば２３０、２５０、２７０または２８０個以上の近接アミノ酸のストレッチにわたってあってよい（「硬い（hard）相同性」）。
【００８２】
当技術分野における標準的方法は、相同性を決定するために使用され得る。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、例えばその初期設定で使用されて相同性を算出するために使用され得るＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性またはラインアップ（line up）配列を算出するために使用され得る（等価残基または対応する配列を同定することなど（典型的にはそれらの初期設定で））、例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S.F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のとおり。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公表されて利用可能である。
【００８３】
アミノ酸置換は、上に考察のものに加えて、例えば１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個または３０個までの置換が配列番号２のアミノ酸配列に作られてよい。保存的置換はアミノ酸を同様の化学的構造、同様の化学的特性または同様の側鎖容積の他のアミノ酸で置き換える。導入されるアミノ酸は、それらが置き換えるアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性または荷電を有してよい。代替的に保存的置換は、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を予め存在する芳香族または脂肪族アミノ酸の位置に導入してよい。保存的アミノ酸変更は、当技術分野において十分周知であり、下の表２に定義の２０個の主なアミノ酸の特性により選択されてよい。アミノ酸が同様の極性を有する場合、表３のアミノ酸側鎖についての疎水性親水性指標尺度を参照して決定されてもよい。タンパク質ポアがその構造および機能を保持しながら非保存的置き換えも作られてよい。
【００８４】
【表２】
0006707453.tif 000003
【００８５】
【表３】
0006707453.tif 000004
【００８６】
配列番号２のアミノ酸配列の１個または複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失されてよい。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれより多くが欠失されてよい。
【００８７】
変種は、配列番号２の断片を含んでよい。そのような断片は、ポア形成活性を保持している。断片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。そのような断片は、ポアを産生するために使用されてよい。断片は、好ましくは配列番号２のポア形成ドメインを含有している。断片は、配列番号２の残基１１９、１２１、１３５、１１３および１３９を典型的には含む。
【００８８】
１個または複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的に（挿入）または追加的に付加されてよい。伸長は、配列番号２のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に提供されてよい。伸長は、非常に短く、例えば長さ約１から約１０アミノ酸であってよい。代替的に伸長は、長く、例えば約５０または約１００アミノ酸までであってよい。
【００８９】
上に考察したとおり変種は、配列番号２のものから変化しており、ポアを形成するその能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与している配列番号２の領域を典型的には含有する。βバレルを含有するαＨＬのポア形成能力は、各サブユニット中のβ鎖によって提供される。このセグメントは、βバレルをさらに短くするが、膜中でポアを形成する能力はまだ保持しているように短縮され得る。配列番号２の変種は、β鎖を形成する配列番号２の中の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号２のアミノ酸は、上に考察されている。１個または複数の修飾は、生じる変種がポアを形成するその能力を保持している限り、β鎖を形成する配列番号２の領域に作られてよい。配列番号２のβ鎖領域に作られ得る具体的な修飾は、上に考察されている。
【００９０】
配列番号２の変種は、置換、付加もしくは欠失などの１個または複数の修飾、をそのαヘリックス、β鎖および／またはループ領域内に好ましくは含む。αヘリックスおよびループを形成するアミノ酸は、上に考察されている。
【００９１】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはロイコシジン由来でもある。ロイコシジンは、２個の異なるサブユニット、１つはクラスＳサブユニットおよびもう１つはＦサブユニットを有するヘテロオリゴマーのポアである。好適なロイコシジンは、これだけに限らないが、ＬｕｋＦ（ＨｌｇＢ）およびＨｌｇ２（ＨｌｇＡ）を含むガンマ溶血素（γＨＬ）、ＬｕｋＦ（ＨｌｇＢ）およびＬｕｋＳ（ＨｌｇＣ）を含むロイコシジン、ＬｕｋＦ−ＰＶおよびＬｕｋＳ−ＰＶを含むロイコシジンＰＶ、ＬｕｋＥおよびＬｕｋＤを含むＬｕｋＥ／ＬｕｋＤポア、ならびにＬｕｋＦ−ＩおよびＬｕｋＳ−Ｉを含むＬｕｋＳ−Ｉ／ＬｕｋＦ−Ｉを含む。
【００９２】
膜貫通タンパク質ポアがロイコシジンである場合、それは好ましくはガンマ溶血素（γＨＬ）由来である。野生型γＨＬポアは、８個のサブユニットから形成され（すなわち八量体である）、ＬｕｋＦの４個のサブユニットおよびＨｌｇ２の４個のサブユニットを含有する。ＬｕｋＦの１個の単量体またはサブユニットの配列は、配列番号４に示されている。Ｈｌｇ２の１個の単量体またはサブユニットの配列は、配列番号６に示されている。膜貫通タンパク質ポアは、配列番号４に示す配列またはその変種をそれぞれ含む４個の単量体、および配列番号６に示す配列またはその変種をそれぞれ含む４個の単量体を好ましくは含む。配列番号４のアミノ酸１０９〜１４７および配列番号６の１０３〜１３９はループ領域を形成する。
【００９３】
γ溶血素ポアは、好ましくは（ａ）配列番号４に示す４個の同一のサブユニットおよび配列番号６に示す４個の同一のサブユニットから形成されているγ溶血素、あるいは（ｂ）サブユニットの１個もしくは複数またはすべてが配列番号４の変種であり、および／またはサブユニットの１個もしくは複数またはすべてが配列番号６の変種であり、ポアがポア活性を保持しているその変種である。そのようなポアは、ヘテロ八量体である。サブユニットの１個、２個、３個または４個は、配列番号４および／または６の変種であってよい。ポア中の変種は、同じまたは異なっていてよい。
【００９４】
配列番号４または６の変種は、配列番号４または６のものから変化しており、そのポア形成能力を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質である。ポアを形成するための変種の能力は、当技術分野において周知の任意の方法を使用してアッセイされ得る。例えば変種は、脂質二重層などの両親媒性層に、他の適するサブユニットと共に挿入されてよく、ポアを形成するようにオリゴマー化するその能力は決定され得る。方法は、脂質二重層などの両親媒性層にサブユニットを挿入することに関して当技術分野において周知である。好適な方法は、上に考察されている。
【００９５】
変種は、別の分子への共有結合または相互作用を促進する修飾を含んでよい。変種は、付着を促進する１個または複数の反応性システイン残基を好ましくは含む。変種は、アダプターとしてのシクロデキストリンの使用などの非共有結合修飾も含んでよく；これらの修飾は、ポアに堅固に結合する分子を含む。
【００９６】
変種は、生物によって、例えばブドウ球菌（Staphylococcus bacterium）によって天然で発現される天然に存在する変種であってよい。代替的に変種は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは大腸菌（Escherichia coli）などの細菌によって組換え的に発現されてよい。変種は、組換え技術によって産生された天然に存在しない変種も含む。配列番号４または６のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、その配列に対して、アミノ酸同一性に基づいて好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種ポリペプチドは、配列全体にわたって配列番号４または６のアミノ酸配列に対して、アミノ酸同一性に基づいて少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％アミノ酸同一性が、２００個以上、例えば２３０、２５０、２７０または２８０個以上の近接アミノ酸のストレッチにわたってあってよい（「硬い相同性」）。相同性は、上に考察したとおり決定され得る。
【００９７】
アミノ酸置換は、上に考察のものに加えて、例えば置換１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個または３０個まで、配列番号４または６のアミノ酸配列に作られてよい。保存的置換は、上に考察したとおり作られて良い。
【００９８】
配列番号４または６のアミノ酸配列の１個または複数のアミノ酸残基は、上に考察のポリペプチドから追加的に欠失されてよい。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれより多くが欠失されてよい。
【００９９】
変種は、配列番号４または６の断片であってよい。そのような断片は、ポア形成活性を保持している。断片は、長さ少なくとも５０、１００、２００または２５０アミノ酸であってよい。断片は、配列番号４または６のポア形成ドメインを好ましくは含む。
【０１００】
１個または複数のアミノ酸は、上に考察のポリペプチドに代替的に（挿入）または追加的に付加されてよい。伸長は、配列番号４もしくは６のアミノ酸配列またはその変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に提供されてよい。伸長は、非常に短く、例えば長さ約１から約１０アミノ酸であってよい。代替的に伸長は、長く、例えば約５０または約１００アミノ酸までであってよい。担体タンパク質は、ポアまたは変種に融合されてよい。
【０１０１】
上に考察したとおり配列番号４または６の変種は、配列番号４または６のものから変化しており、ポアを形成するその能力を保持しているアミノ酸配列を有するサブユニットである。変種は、ポア形成に関与している配列番号４または６の領域を典型的には含有する。βバレルを含有するγＨＬのポア形成能力は、各サブユニット中のβ鎖によって提供される。配列番号４または６の変種は、β鎖を形成する配列番号４または６中の領域を典型的には含む。β鎖を形成する配列番号４または６のアミノ酸は、上に考察されている。１個または複数の修飾は、生じる変種がポアを形成するその能力を保持している限り、β鎖を形成する配列番号４または６の領域に作られてよい。配列番号４または６のβ鎖領域に作られ得る特異的修飾は、上に考察されている。
【０１０２】
配列番号４または６の変種は、置換、付加、挿入もしくは欠失などの１個または複数の修飾を、αヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。αヘリックスおよびループを形成するアミノ酸は、上に考察されている。
【０１０３】
膜貫通タンパク質ポアは、好ましくはＭｓｐ由来、好ましくはＭｓｐＡ由来である。そのようなポアは、オリゴマー化され、典型的にはＭｓｐ由来の７個、８個、９個または１０個の単量体を含む。ポアは、同一の単量体を含むＭｓｐ由来であるホモオリゴマーのポアであってよい。代替的にポアは、他と異なる少なくとも１個の単量体を含むＭｓｐ由来のヘテロオリゴマーのポアであってよい。好ましくはポアは、ＭｓｐＡまたはそのホモログもしくはパラログ由来である。
【０１０４】
Ｍｓｐ由来の単量体は、配列番号８に示す配列またはその変種を典型的には含む。配列番号８は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ（Ｂ１）８変異体である。それは、次の変異：Ｄ９０Ｎ、Ｄ９１Ｎ、Ｄ９３Ｎ、Ｄ１１８Ｒ、Ｄ１３４ＲおよびＥ１３９Ｋを含む。配列番号８の変種は、配列番号８のものから変化しているアミノ酸配列を有し、ポアを形成するその能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。ポアを形成する変種の能力は、上に考察した当技術分野において周知の任意の方法を使用してアッセイされ得る。
【０１０５】
配列番号８のアミノ酸配列の全長にわたって変種は、その配列に対して、アミノ酸同一性に基づいて好ましくは少なくとも５０％相同性である。より好ましくは変種は、配列番号８のアミノ酸配列に対して、アミノ酸同一性に基づいて配列全体にわたって少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％およびより好ましくは少なくとも９５％、９７％または９９％相同性であってよい。少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％または９５％アミノ酸同一性が、１００個以上、例えば１２５、１５０、１７５または２００個以上の近接アミノ酸のストレッチにわたってあってよい（「硬い相同性」）。当技術分野における標準的方法は、上に考察した相同性を決定するために使用されてよい。
【０１０６】
配列番号８は、ＭｓｐＡ単量体のＭＳ（Ｂ１）８変異体である。変種は、ＭｓｐＡと比較してＭｓｐＢ、ＣまたはＤ単量体における変異のいずれかを含む場合がある。ＭｓｐＢ、ＣおよびＤの成熟形態は、配列番号５から７に示されている。詳細には変種は、ＭｓｐＢ中に存在する次の置換を含む場合がある：Ａ１３８Ｐ。変種は、ＭｓｐＣ中に存在する次の置換の１個または複数を含む場合がある：Ａ９６Ｇ、Ｎ１０２ＥおよびＡ１３８Ｐ。変種は、ＭｓｐＤ中に存在する次の変異の１個または複数を含む場合がある：Ｇ１の欠失、Ｌ２Ｖ、Ｅ５Ｑ、Ｌ８Ｖ、Ｄ１３Ｇ、Ｗ２１Ａ、Ｄ２２Ｅ、Ｋ４７Ｔ、Ｉ４９Ｈ、Ｉ６８Ｖ、Ｄ９１Ｇ、Ａ９６Ｑ、Ｎ１０２Ｄ、Ｓ１０３Ｔ、Ｖ１０４Ｉ、Ｓ１３６ＫおよびＧ１４１Ａ。変種は、ＭｓｐＢ、ＣおよびＤから１個または複数の変異および置換の組合せを含む場合がある。変種は、変異Ｌ８８Ｎを好ましくは含む。配列番号８の変種は、ＭＳＢ１のすべての変異に加えて変異Ｌ８８Ｎを有し、ＭＳ（Ｂ２）８と称される。本発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ（Ｂ２）８である。配列番号８の変種は、ＭＳＢ１のすべての変異に加えて変異Ｇ７５Ｓ／Ｇ７７Ｓ／Ｌ８８Ｎ／Ｑ１２６Ｒを有し、ＭＳＢ２Ｃと称される。発明において使用されるポアは、好ましくはＭＳ（Ｂ２）８またはＭＳ（Ｂ２Ｃ）８である。
【０１０７】
アミノ酸置換は、上に考察のものに加えて、例えば置換１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個または３０個までが配列番号８のアミノ酸配列に作られる場合がある。置換は、上に考察したとおり保存的であってよく、表２および３に示されている。
【０１０８】
配列番号８のアミノ酸配列の１個または複数のアミノ酸残基は、上に記載のポリペプチドから追加的に欠失されてよい。１、２、３、４、５、１０、２０または３０残基までまたはそれより多くが欠失されてよい。
【０１０９】
変種は、配列番号８の断片を含んでよい。そのような断片は、ポア形成活性を保持している。断片は、長さ少なくとも５０、１００、１５０または２００アミノ酸であってよい。そのような断片は、ポアを産生するために使用されてよい。断片は、好ましくは配列番号８のポア形成ドメインを含む。断片は、配列番号８の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４の１つを含むはずである。典型的には断片は、配列番号８の残基８８、９０、９１、１０５、１１８および１３４のすべてを含む。
【０１１０】
１個または複数のアミノ酸は、上に記載のポリペプチドに代替的にまたは追加的に付加されてよい。伸長は、配列番号８のアミノ酸配列またはそのポリペプチド変種もしくは断片のアミノ末端またはカルボキシ末端に提供されてよい。伸長は、非常に短く、例えば長さ１から１０アミノ酸であってよい。代替的に伸長は、長く、例えば５０または１００アミノ酸までであってよい。担体タンパク質は、本発明によるアミノ酸配列に融合されてよい。他の融合タンパク質は、下により詳細に考察されている。
【０１１１】
上に考察したとおり変種は、配列番号８のものから変化しており、ポアを形成するその能力を保持しているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変種は、ポア形成に関与している配列番号８の領域を典型的には含有する。βバレルを含有するＭｓｐのポア形成能力は、各サブユニット中のβシートによって提供される。配列番号８の変種は、βシートを形成する配列番号８中の領域を典型的には含む。１個または複数の修飾は、生じる変種がポアを形成するその能力を保持している限り、βシートを形成する配列番号８の領域に作られてよい。配列番号８の変種は、置換、付加または欠失などの１個または複数の修飾をそのαヘリックスおよび／またはループ領域内に好ましくは含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では膜貫通タンパク質ポアは、化学的に修飾される。αＨＬ（すなわち配列番号２またはその変種）、γＨＬ（すなわち配列番号４もしくは６またはその変種）またはＭｓｐＡ（配列番号８またはその変種）由来の単量体は、ポリペプチドがそのような配列を天然では含有しない場合に、例えばヒスチジン残基（Ｈｉｓタグ）、アスパラギン酸残基（ａｓｐタグ）、ストレプトアビジンタグもしくはフラッグタグの付加によって、または細胞からのそれらの分泌を促進するためのシグナル配列の付加によって、それらの同定または精製を補助するように修飾されてよい。遺伝子タグを導入するための代替法は、ポア上の天然のまたは操作された位置にタグを化学的に反応させることである。この一例は、ポアの外側の操作されたシステインにゲルシフト試薬を反応させることである。これは、αＨＬヘテロオリゴマーを分離するための方法として実証されている（Chem Biol. 1997 Jul; 4(7):497-505）。
【０１１３】
αＨＬ、γＨＬまたはＭｓｐＡ由来の単量体は、リビーリング標識（revealing label）で標識されてよい。リビーリング標識は、ポアが検出されるようにする任意の好適な標識であってよい。好適な標識は、これだけに限らないが、蛍光分子、放射性同位元素、例えば１２５Ｉ、３５Ｓ、酵素、抗体、抗原、ポリヌクレオチドおよびビオチンなどのリガンドを含む。
【０１１４】
αＨＬ、γＨＬまたはＭｓｐＡ由来の単量体は、Ｄアミノ酸を使用して産生されてもよい。例えばαＨＬ、γＨＬまたはＭｓｐＡ由来の単量体は、Ｌアミノ酸とＤアミノ酸との混合物を含んでよい。これは、そのようなタンパク質またはペプチドを産生するために当技術分野において一般的である。
【０１１５】
αＨＬ、γＨＬまたはＭｓｐＡ由来の単量体は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との相互作用を促進するために１個または複数の特異的修飾を含有してよい。αＨＬまたはγＨＬ由来の単量体は、それらがポア形成を干渉しない限り他の非特異的修飾も含有してよい。多数の非特異的側鎖修飾が、当技術分野において周知であり、αＨＬ、γＨＬまたはＭｓｐＡ由来の単量体の側鎖に作られてよい。そのような修飾は、例えばアルデヒドとの反応によるアミノ酸の還元アルキル化に続くＮａＢＨ４での還元、メチルアセトイミデートでのアミジン化または無水酢酸でのアシル化を含む。そのような修飾は、配列中に存在する１個または複数のシステイン残基のスルフヒドリル化学による修飾も含む。
【０１１６】
αＨＬ、γＨＬまたはＭｓｐＡ由来の単量体は、当技術分野において周知の標準的方法を使用して産生され得る。単量体は合成的にまたは組換え手段によって作られてよい。例えばポアは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳および転写（ＩＶＴＴ）によって、または天然の化学的連結によって合成されてよい。ポアを産生するための好適な方法は国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６９０号（ＷＯ  ２０１０／００４２７３として公開）、第ＰＣＴ／ＧＢ０９／００１６７９号（ＷＯ  ２０１０／００４２６５として公開）または第ＰＣＴ／ＧＢ１０／０００１３３号（ＷＯ  ２０１０／０８６６０３として公開）において考察されている。ポアを膜に挿入するための方法は考察されている。
【０１１７】
ポアは、当技術分野において周知の標準的方法を使用して産生され得る。ポアをコードするポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的方法を使用して導かれ、複製され得る。ポアをコードしているポリヌクレオチド配列は、当技術分野における標準的技術を使用して細菌宿主細胞において発現され得る。ポアは、組換え発現ベクターからポリペプチドの原位置での発現によって細胞において産生され得る。発現ベクターは、ポリペプチドの発現を調節するために誘導可能プロモーターを任意選択で保有する。これらの方法はSambrook, J. and Russell, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されている。ポアは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写および翻訳によっても産生されてよく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって小規模で精製され得る。
【０１１８】
ポアは、大規模に産生されてよく、タンパク質産生生物からまたは組換え発現後に任意のタンパク質液体クロマトグラフィー系による精製が続く。典型的タンパク質液体クロマトグラフィー系は、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性精製、ＦＰＬＣ、ＡＫＴＡ系、Ｂｉｏ−Ｃａｄ系、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃ系およびＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣ系を含む。
【０１１９】
装置および条件
電気的測定は、Stoddart, D. S., et al., (2009), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, p7702-7707、Lieberman KR et al, J Am Chem Soc. 2010;132(50):17961-72および国際出願第ＷＯ−２０００／２８３１２号に記載の標準的な単一チャネル記録装置を使用して行われてよい。代替的に電気的測定は、例えば国際出願第ＷＯ−２００９／０７７７３４号および国際出願第ＷＯ−２０１１／０６７５５９号に記載の多重チャネル系を使用して行われてよい。
【０１２０】
方法は、ポアが膜に挿入されている膜／ポア系を調査するために好適である任意の装置を使用して実行されてよい。方法は、膜貫通ポアセンシングのために好適である任意の装置を使用して実行されてよい。例えば装置は、水溶液およびチャンバーを２個のセクションに分ける障壁を含むチャンバーを含む。障壁は、ポアを含有する膜が形成される開口部を有する。方法は、液滴界面二重層（ＤＩＢ）を使用して実行されてもよい。２個の水滴は、電極上に置かれ、油／リン脂質混合物に浸漬される。２個の液滴は、接触して置かれ、界面でポアが挿入されるリン脂質膜が形成される。
【０１２１】
方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０８／０００５６２号（ＷＯ  ２００８／１０２１２０）に記載の装置を使用して実行されてよい。
【０１２２】
方法は、ポアを通って流れる電流を測定することを含む。したがって装置は、電位を印加でき、膜とポアとにわたる電気的シグナルを測定できる電気回路も含んでよい。方法は、パッチクランプまたは電圧クランプを使用して実行されてよい。方法は、好ましくは電圧クランプの使用を含む。
【０１２３】
方法は、各アレイが１２８、２５６、５１２、１０２４個以上のウエルを含むウエルのシリコンベースアレイ上で実行されてよい。
【０１２４】
本発明の方法は、ポアを通って流れる電流を測定するステップを含んでよい。膜貫通ポアを通るイオン電流を測定するために好適な条件は、当技術分野において周知であり、実施例に開示されている。方法は、膜およびポアにわたって印加される電圧を伴って典型的には実行される。使用される電圧は、典型的には＋２Ｖから−２Ｖ、典型的には−４００ｍＶから＋４００ｍＶである。使用される電圧は、好ましくは−４００ｍＶ、−３００ｍＶ、−２００ｍＶ、−１５０ｍＶ、−１００ｍＶ、−５０ｍＶ、−２０ｍＶおよび０ｍＶから選択される下限ならびに＋１０ｍＶ、＋２０ｍＶ、＋５０ｍＶ、＋１００ｍＶ、＋１５０ｍＶ、＋２００ｍＶ、＋３００ｍＶおよび＋４００ｍＶから独立に選択される上限を有する範囲内である。使用される電圧は、より好ましくは１００ｍＶから２４０ｍＶの範囲内、最も好ましくは１２０ｍＶから２２０ｍＶの範囲内である。増大させて印加した電位を使用してポアによる異なるＰＴＭ間の識別を向上させることができる。
【０１２５】
方法は、金属塩など、例えばアルカリ金属塩、ハロゲン塩、例えば塩化物塩、アルカリ金属塩化物塩などの任意の電荷担体の存在下で典型的には実行される。電荷担体は、イオン性液体または有機塩、例えばテトラメチル塩化アンモニウム、トリメチルフェニル塩化アンモニウム、フェニルトリメチル塩化アンモニウム、もしくは１−エチル−３−メチルイミダゾリウム塩化物を含んでよい。上に考察の例示的装置では塩は、チャンバー中の水溶液に存在する。塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）またはフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物は、典型的には使用される。ＫＣｌ、ＮａＣｌおよびフェロシアン化カリウムとフェリシアン化カリウムとの混合物は、好ましい。塩濃度は、飽和であってよい。塩濃度は、３Ｍ以下であってよく、典型的には０．１から２．５Ｍ、０．３から１．９Ｍ、０．５から１．８Ｍ、０．７から１．７Ｍ、０．９から１．６Ｍまたは１Ｍから１．４Ｍである。塩濃度は、好ましくは１５０ｍＭから１Ｍである。方法は、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも１．０Ｍ、少なくとも１．５Ｍ、少なくとも２．０Ｍ、少なくとも２．５Ｍまたは少なくとも３．０Ｍなどの少なくとも０．３Ｍの塩濃度を使用して好ましくは実行される。塩濃度は、一方の側で０．１Ｍおよび他方で３Ｍなど膜の両側で異なっていてもよい。膜の各側で使用される塩および組成物も異なっていてもよい。高塩濃度は、高いシグナル対ノイズ比を提供し、通常の電流変動のバックグラウンドに対して、電流が示すＰＴＭを同定可能にする。
【０１２６】
方法は、典型的には緩衝液の存在下で実行される。上に考察の例示的装置では緩衝液は、チャンバー中の水溶液中に存在する。任意の緩衝液が本発明の方法において使用され得る。典型的には緩衝液は、ＨＥＰＥＳである。別の好適な緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。方法は、典型的には４．０から１２．０、４．５から１０．０、５．０から９．０、５．５から８．８、６．０から８．７または７．０から８．８もしくは７．５から８．５のｐＨで実行される。使用されるｐＨは、好ましくは約７．５である。
【０１２７】
方法は、０℃から１００℃、１５℃から９５℃、１６℃から９０℃、１７℃から８５℃、１８℃から８０℃、１９℃から７０℃または２０℃から６０℃で実行されてよい。方法は、典型的には室温で実行される。方法は、任意選択で約３７℃などの酵素機能を支持する温度で実行される。
【０１２８】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、膜のいずれの側でポアと接触されてもよい。
【０１２９】
診断方法
本発明は、生物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数のＰＴＭと関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定する方法も提供する。１個または複数のＰＴＭは、正常または異常であってよい。本発明は、生物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なリン酸化に関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定する方法を好ましくは提供する。
【０１３０】
生物は、典型的には、疾患、障害または表現型を有すると疑われるものである。例えば、疾患または障害を有すると疑われる生物は、疾患または障害の症状を示す場合がある。言い換えると生物は、症候性であってよい。生物は、疾患または障害の遺伝的素因を有する場合がある。しかし生物は、疾患または障害のいずれかの症状を示す必要はない。言い換えると生物は、無症候性であってよい。
【０１３１】
典型的には生物は、ヒトであるが、代替的にウマ、ウシ、ヒツジもしくはブタなどの商業的に飼育されている動物などの別の哺乳動物であってよく、または代替的にネコ、イヌもしくはげっ歯類（特にラットもしくはマウス）などのペットまたは実験動物であってよい。生物は、典型的には個体または患者である。代替的に生物は、植物、菌類または任意の単細胞生物であってよい。
【０１３２】
疾患、障害または表現型を有する生物が１個または複数のＰＴＭを有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を示す場合、疾患、障害または表現型は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数のＰＴＭと関連している。疾患または障害を有する生物が、その１個または複数のＰＴＭが正常な生物において観察されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のものとは異なっている、すなわちその１個または複数のＰＴＭがペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の正常なＰＴＭ（１個または複数）とは異なっているペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を示す場合、疾患、障害または表現型は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数の異常なＰＴＭと関連している。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なＰＴＭは、通常非存在である１個または複数のＰＴＭの存在、通常存在する１個または複数のＰＴＭの非存在、ＰＴＭの数の増加、ＰＴＭの数の減少、ＰＴＭパターンにおける変化またはこれらの組合せである場合がある。
【０１３３】
疾患または障害を有する生物がそのリン酸化が正常な生物において観察されるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のリン酸化と異なっている、すなわちそのリン酸化がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の正常なリン酸化とは異なっているペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を示す場合、疾患または障害は、異常なリン酸化と関連する。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なリン酸化は、通常非存在である１個または複数のリン酸化の存在、通常存在する１個または複数のリン酸化の非存在、リン酸化の数の増加、リン酸化の数の減少、リン酸化パターンの変化またはこれらの組合せである場合がある。
【０１３４】
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なリン酸化に関連する疾患は、当技術分野において十分周知である４５。本発明により診断され得る疾患または障害は、これだけに限らないが、がん、慢性炎症性疾患、筋緊張性筋ジストロフィー、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、ブルトンチロシンキナーゼ、ヒルシュスプルング病、常染色体劣性ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、頭蓋骨癒合症、乳頭状腎臓がん、慢性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ポイツ・ジェガーズ症候群、コフィン・ローリー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、リー・フラウメニ症候群、ウイリアムズ症候群、妖精症、糖尿病、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ウォルコット・ラリソン（Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ）症候群またはＸ連鎖筋細管ミオパチーを含む。
【０１３５】
それぞれの場合において当業者は、どのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が本発明の方法を使用して調査されるかを理解している。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なリン酸化は、生物が関係疾患または障害を有することを示している。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の正常なリン酸化は、生物が関係疾患または障害を有さないことを示している。
【０１３６】
方法は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む生物由来の試料に対して本発明の方法を実行することを含む。試料は、任意の好適な試料であってよい。本発明は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含有することが周知である、または含有すると疑われる試料に対して典型的には実行される。
【０１３７】
試料は、典型的には生物の体液を含む。試料は、尿、リンパ液、唾液、粘液、乳汁または羊水であってよいが、好ましくは血液、血漿または血清である。
【０１３８】
試料は、アッセイされる前に典型的には処理される。試料は、取られてすぐに測定されてよい。試料は、アッセイ前に、好ましくは−７０℃より低くにおいて典型的には保存されてもよい。方法は、試料からの目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の精製（例えば特定の抗体の使用による）および測定可能な量、典型的には１０〜１００ｎＭ以上へのその濃縮（concentration）／富化（enrichment）を含んでよい。さらに、目的のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、当技術分野において記載の方法によってタグ化されてよい。典型的にはＮ末端およびＣ末端基は、それらが異なる化学的反応性を有することから、そのようなタグ化のために好適である。代替的に特定の残基での抗体媒介修飾は、可能である。
【０１３９】
他の応用
本発明の方法は、他の応用のために使用できる。例えば、加齢細胞での細胞周期の際またはシグナル伝達の際のＰＴＭ変化の分析などの、細胞中の生理的条件または変化を分析するために使用され得る。本発明の方法は、医薬品を検査する（それらの有効性をモニタリングするなど）ためにも使用され得る。それは、薬物乱用、毒物、汚染物質などの間接的検査のためにも使用され得る。
【０１４０】
本発明の方法は、生物学的薬物が正確なＰＴＭ（１個または複数）を含有していることを確認するため、または化学的に修飾された生物学的薬物を天然に存在する対応物から識別するためなどの、生物学的薬物の品質管理のためにも使用され得る。
【０１４１】
次の実施例は、本発明を例示する。
【実施例】
【０１４２】
本発明者らは、プロテインキナーゼ基質のさまざまなリン酸化形態を検討することによってこの可能性を実証する。モデルタンパク質、配列に挿入されたプロテインキナーゼリン酸化部位を有するチオレドキシン変種を、オリゴ（ｄＣ）３０を有するＣ末端システインにタグ化した。印加された電位では、ＤＮＡリーダー配列はαＨＬポア中に通され、フォールドしたタンパク質に力を及ぼし、Ｃ末端ドメインのアンフォールディングを生じる。次いでタンパク質の残部は、自発的にアンフォールドし、ポアを通じて拡散する３７（図１ａ）。本発明者らは、Ｃ末端近くのいくつかの場所にプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の触媒サブユニットに対するリン酸化部位を有する変異体チオレドキシンのセットを使用し、本発明者らは、それらをＰＫＡでリン酸化し、リン酸化および非リン酸化形態の両方をオリゴ（ｄＣ）３０でタグ化した。Ｃ末端がポア中に移動する場合のイオン電流における変化を検討することによって、本発明者らは、タンパク質のモノおよびジリン酸化状態を同定し、そのような部位の場所を解析した。
【０１４３】
材料および方法
αＨＬナノポア
野生型（ＷＴ）αＨＬ単量体を大腸菌（E.coli）中でｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）系で発現させ、ウサギ赤血球細胞膜上で七量体ポアを形成するようにオリゴマー形成させた。七量体ポアをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した４１。
【０１４４】
チオレドキシン変異体
チオレドキシン（Ｔｒｘ）Ｖ５−Ｃ１０９遺伝子をｐＥＴ  ３０ａ（＋）プラスミド（ＴｏｐＧｅｎｅ）にクローン化した。Ｔｒｘ変異体を部位特異的変異導入（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）ＩＩ  ＸＬ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって産生し、ＤＮＡ配列決定によって確認した。タンパク質発現を対数増殖期におけるＩＰＴＧでの誘導後に大腸菌（E.coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して実行した。タンパク質を１ｍＭ  ＤＴＴを含むＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬ、Ｔｒｉｃｏｒｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に続く、１ｍＭ  ＤＴＴを含むＴＥ緩衝液、ｐＨ８．３での０〜１Ｍ  ＫＣｌのグラジエントで溶出されるイオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。タンパク質質量をエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳ）３７によって確認した３７。
【０１４５】
プロテインキナーゼＡの触媒サブユニット
プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のヘキサヒスチジング化触媒サブユニットをＴｒｘ変異体の部位特異的セリンリン酸化のために精製した。ｐＥＴ１５ｂ  ＰＫＡ  Ｃａｔプラスミド４２をＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。細胞を３７℃、アンピシリン抗菌薬（５０ｍｇ／ｍＬ）を含有するルリア培地でＯＤ６００＝０．６から０．８まで増殖させた。細胞培養物を最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、１８℃、２４時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって回収し、重力流Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ親和性カラム（Ｑｉａｇｅｎ）にロードする前にＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で溶解させた。リン酸緩衝液（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）での洗浄後、ヘキサヒスチジンタグ化触媒サブユニットをリン酸緩衝液中の５００ｍＭイミダゾールで溶出した。タンパク質の質量をＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳによって確認した。
【０１４６】
チオレドキシン変異体のリン酸化
Ｔｒｘ変異体をＰＫＡの触媒サブユニットを使用してＲＲＸＳ認識配列のセリン残基でリン酸化した。２０ｍＭ  ＭｇＯＡｃを含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中のＴｒｘ変異体（約０．５〜１ｍｇ／ｍＬ）を、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．２ｍＭアデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ、ジナトリウム塩水和物、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および約０．０６ｍｇ／ｍＬ  ＰＫＡでインキュベートした。リン酸化動態をＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳおよび等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル電気泳動によって追跡した。ＴｒｘＳ１１２−Ｐでのリン酸化は、２時間以内に完了した。ＴｒｘＳ１０７−ＰおよびＴｒｘＳ９５−Ｐについて、追加的ＡＴＰおよびＰＫＡをリン酸化の収量を増加させるために添加し、インキュベーション時間を延長した。リン酸化タンパク質を１ｍＭＤＴＴを含有するＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）中でサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬ、Ｔｒｉｃｏｒｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。
【０１４７】
オリゴヌクレオチド−チオレドキシンコンジュゲート
オリゴヌクレオチド−Ｔｒｘコンジュゲートを以前記載のとおり得た３７。簡潔にはＴｒｘ変異体および５’−チオール（ヘキサメチレリンカー）修飾オリゴ（ｄＣ）３０（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を別々に２４時間、ＤＴＴ（１ｍＭ）中で還元した。ＤＴＴを、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することによる緩衝液交換（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０）によって除去し、５’−チオールオリゴ（ｄＣ）３０を２，２’−ジピリジルジスルフィド（アセトニトリル中１０ｍＭ）で活性化し、ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、次いで還元Ｔｒｘ変異体と１６時間、室温で反応させた（タンパク質の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、ｐＨ１０．０への緩衝液交換後）。コンジュゲートを０〜１Ｍ  ＫＣｌ  ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．３）のグラジエントを使用して、イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。濃度をオリゴ（ｄＣ）３０の算出されたモル吸光計数を使用することによって２６０ｎｍでの吸光度から決定した。
【０１４８】
単一チャネル記録およびデータ分析
電気的記録を２１．０±２．０℃で平面脂質二重層で実施した。１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）の二重層をＴｅｆｌｏｎ  ｆｉｌｍ（Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ）の１００μｍ直径の開口部にわたって形成させ、記録装置のｃｉｓおよびｔｒａｎｓコンパートメントを分けた（各１ｍＬ）。両方のコンパートメントを１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２Ｍ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４で満たした。ゲル精製αＨＬ七量体（約０．２μＬ、約１ｎｇ／μＬ）をアースしたｃｉｓコンパートメントに加えた。Ｔｒｘ変異体をｃｉｓコンパートメントに加え、０．１〜０．２μＭの最終濃度を生じさせた。単一ポアの挿入後、さらなる挿入を防ぐためにｃｉｓコンパートメントを新鮮緩衝液で手作業で灌流した。印加された電位によって産生されたイオン電流をパッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に繋いだＡｇ／ＡｇＣｌ電極を使用して測定した。シグナルを５ｋＨｚで低域通過フィルターにかけ、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １４４０Ａ  ｄｉｇｉｔｉｚｅｒ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で２５ｋＨｚでサンプリングした。データ分析をｐＣｌａｍｐソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で実施した。事象を、非常に短い事象（＜１０ｍｓ）および長い遮断（＞１０秒）を排除して、閾値探索によって回収した。レベル３の残留電流値（ＩＲＥＳ％）およびノイズレベル（Ｉｎ）をすべての点のヒストグラム（０．２ｐＡビン）をガウス曲線（ＩＲＥＳ％＝ＩＢ／ＩＯＸ１００４１、Ｉｎ＝フィットの標準偏差）にフィットさせることによって決定した。各構築物についておよそ１００個の個々の事象を２Ｄ  ＩＲＥＳ％対Ｉｎプロットに使用した。レベル１、２および３についての休止時間をビニングされていない（unbinned）累積ヒストグラムとしてプロットし、平均休止時間を得るために単一指数関数（Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ  ６．１２Ａ、ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ）にフィットさせた。各構築物に対するエラーバーは、３回の独立した実験についての標準偏差を表す。
【０１４９】
結果
単一部位でのリン酸化の検出
以前の仕事では本発明者らは、共移行タンパク質アンフォールディングを検討するためにチオレドキシン（Ｔｒｘ）変異体Ｖ５（Ａ２２Ｐ、Ｉ２３Ｖ、Ｃ３２Ｓ、Ｃ３５Ｓ、Ｐ６８Ａ）を使用した。この変異体は、触媒ジスルフィドを欠いており、３個の安定化変異（Ａ２２Ｐ、Ｉ２３Ｖ、Ｐ６８Ａ）を含有する。Ｃ末端（Ｃｙｓ−１０９）のシステイン残基で、Ｔｒｘ  Ｖ５は、移行実験のためのＤＮＡオリゴヌクレオチドとカップリングできる３７。この仕事のために本発明者らは、Ｃ末端にＰＫＡリン酸化部位（ＲＲＡＳ）を有するＴｒｘ  Ｖ５由来の変異体（ＴｒｘＳ１１２−Ｐ；配列番号１２）を作った、ここで下線を引いた標的セリンはＳｅｒ−１１２である（図１ｂ，ｃ）。本発明者らは、ＴｒｘＳ１１２−ＰのＣ末端Ｃｙｓ−１１３をジスルフィド結合を通じてオリゴ（ｄＣ）３０にカップリングさせた。コンジュゲート、ＴｒｘＳ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０を＋１４０ｍＶの印加された電位の下でαＨＬポアに移行させ、以前記載の３７特徴的なイオン電流サインを産生した（図１ａ）（図４）。簡潔には（図１ａ）、オリゴヌクレオチドリーダーはポア（ステップ１←２）に通され、ＤＮＡ上の力はタンパク質のＣ末端領域をアンフォールドし（ステップ２←３）、タンパク質の残部は自発的にアンフォールドし（ステップ３←４）、ポアを通じて拡散し（レベル４）、最終的にｔｒａｎｓコンパートメントに出て行く（ステップ４←１）。ステップ２←３（すなわちレベル２での休止時間）は電圧依存性である一方で、ステップ３←４および４←１は、電圧非依存性である３７。
【０１５０】
本発明者らは、ＡＴＰおよびプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の触媒サブユニットとの一晩のインキュベーションによってＴｒｘＳ１１２−ＰをＳｅｒ−１１２でリン酸化し、ＴｒｘＳ１１２＋Ｐをもたらした。ＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳによって決定されたとおり完全なリン酸化が達成された（図５）。次いでオリゴ（ｄＣ）３０をＣ末端に付着させた。ＴｒｘＳ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０は、ＴｒｘＳ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０と同じ４ステップ経路によって共移行アンフォールディングを受け、同様の移行動態を表した（図６）。しかしリン酸化後、レベル３は、平均残留電流（ＩＲＥＳ）およびノイズ（Ｉｎ）において差異を示した（図１ｄ，ｅ）。個々のＩｎ値は、レベル３におけるイオン電流のすべての点のヒストグラムへのガウスフィットの標準偏差である。典型的実験ではＴｒｘＳ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０は、オープンポア電流のＩＲＥＳ％＝１８７±０．２％、およびＩｎ＝６．０±０．１ｐＡ（ｎ＝１００、ここでｎは移行事象の数である）を生じた。同じポアで、ＴｒｘＳ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０はＩＲＥＳ％＝２０．９±０．２％およびＩｎ＝５．４±０．２ｐＡを生じた（ｎ＝１００）（図１ｆ）。本発明者らは、イオン電流の電圧依存性を検討し＋１４０ｍＶでＴｒｘＳ１１２−ＰとＴｒｘＳ１１２＋Ｐとの間でＩＲＥＳ％およびＩｎの両方に最も大きな差異を見出した（図７）。
【０１５１】
３個の異なる部位での一リン酸化を識別すること
異なる場所でのリン酸化を識別するαＨＬポアの能力を探索するために、本発明者らは、Ｔｒｘ  Ｖ５に基づいて２個の追加的変異体を作った：チオレドキシンのＣ末端αヘリックス中の位置Ｓｅｒ−１０７にリン酸化部位（ＲＲＮＳ）を有するＴｒｘＳ１０７−Ｐ（配列番号１３）（図１ｂ，ｇ）および位置Ｃ末端αヘリックスに直前にあるループ中の位置Ｓｅｒ−９５に部位（ＲＲＬＳ）を有するＴｒｘＳ９５−Ｐ（配列番号１４）（図１ｂ，ｋ）。
【０１５２】
オリゴ（ｄＣ）３０へのカップリング後、３個すべての非リン酸化タンパク質（ＴｒｘＳ９５−Ｐ、ＴｒｘＳ１０７−ＰおよびＴｒｘＳ１１２−Ｐ）は、特徴的な４ステップシグナルをもたらした（図８）。それにもかかわらず、本発明者らがポアの内腔に位置付けられた分子間を識別するナノポアの精巧な能力に帰属させる３９−４１レベル３におけるＩＲＥＳ％およびＩｎの値は異なっていた（図１ｄ，ｈ，ｌ）。
【０１５３】
本発明者らは、ポア間の変動に由来するわずかな差異を回避するために、同じαＨＬポアを有する非リン酸化およびリン酸化タンパク質の対それぞれを検討した（表４下）。
【０１５４】
【表４】
0006707453.tif 000005
【０１５５】
典型的な実験では、Ｃ末端αヘリックスにリン酸化部位を有するＴｒｘＳ１０７−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０は、＋１４０ｍＶでのレベル３についてＩＲＥＳ％＝１６．４±０．２％およびＩｎ＝６．４±０．１ｐＡ（ｎ＝９９、５ｋＨｚフィルター）をもたらした。本発明者らは、ＰＫＡおよびＡＴＰでＴｒｘＳ１０７−Ｐをリン酸化し、ＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳによって推定されるほとんど完全なリン酸化を４８時間後に得た（その際追加的にＰＫＡおよびＡＴＰを加えた）。オリゴ（ｄＣ）３０の付着後、＋１４０ｍＶでのレベル３についてＩＲＥＳ％＝１７．９±０．２％およびＩｎ＝５．５±０．２ｐＡ（ｎ＝１００、５ｋＨｚフィルター）を含む４ステップシグナルが得られた（図１ｉ）。ＴｒｘＳ１０７−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０およびＴｒｘＳ１０７＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０は、したがって多重移行事象を示す２Ｄ  ＩＲＥＳ％対Ｉｎ散布図において２個の別々の集団として容易に識別できる（図１ｊ）。
【０１５６】
同様に、リン酸化前、典型的測定において、ループ中にリン酸化部位を有するＴｒｘＳ９５−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０は、＋１４０ｍＶでＩＲＥＳ％＝２２．５±０．１％およびＩｎ＝４．９±０．１ｐＡ（ｎ＝１００、５ｋＨｚフィルター）を有するレベル３を示した。ＰＫＡおよびＡＴＰでの７２時間処置後（試薬の３回の交換を伴う）、ＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳによって判断された部分的リン酸化が得られた。オリゴ（ｄＣ）３０付着およびαＨＬポアでの検討においてリン酸化および非リン酸化形態は識別できる。ＴｒｘＳ９５＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０は、ＩＲＥＳ％＝２１．６±０．３％およびＩｎ＝３．８±０．１ｐＡ（ｎ＝１５０、５ｋＨｚフィルター）（図１ｌ、ｍ、ｎ）を有するレベル３をもたらす。
【０１５７】
２個の部位でのリン酸化の検出
本発明者らは、次に１つはＣ末端αヘリックス（ＲＲＬＳ、Ｓｅｒ−１０７）中および１つはＣ末端伸長（ＲＲＡＳ、Ｓｅｒ−１１２）中にアラニン残基によって分離された２個のリン酸化部位を有するチオレドキシン構築物、ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ（配列番号１５）を作った（図１ｂ）。第１の場合にはＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−ＰのＳｅｒ−１０７をＡｌａに変異させることによって（ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２−Ｐ；配列番号１６）、第２の場合にはＳｅｒ−１１２をＡｌａに変異させることによって（ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ａ１１２；配列番号１７）、単一のリン酸化部位を含有する２個の対照構築物を作った。３個すべての構築物は、オリゴ（ｄＣ）３０付着のためのＣ末端システイン（Ｃｙｓ１１３）を保持していた。
【０１５８】
再度これらのタンパク質は、αＨＬポアを通る移行のときに特徴的な４ステップシグナルを示した（図２ａ，ｃ，ｅ）。３個すべての場合において、非リン酸化構築物のレベル３は、２個の急速に相互交換する準安定状態を含んだ。リン酸化タンパク質がＩＲＥＳ％値によって判断される低い状態だけを示すことから、最も低いコンダクタンスを有する準安定状態をリン酸化タンパク質との比較のために使用した。＋１４０ｍＶで、非リン酸化タンパク質は、典型的測定において：ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０ＩＲＥＳ％＝１３．０±０．２％、Ｉｎ＝７．９±０．４ｐＡ（ｎ＝１００）；ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０ＩＲＥＳ％＝１２．３±０．２％、Ｉｎ＝８．４±０．６ｐＡ（ｎ＝１００）；ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ａ１１２−オリゴ（ｄＣ）３０ＩＲＥＳ％＝１３．２±０．２％、Ｉｎ＝８．７±０．６ｐＡ（ｎ＝１００）（図９、１０）を生じた。ＩＲＥＳ％およびＩｎにおける検出可能な差異は、ポリペプチド構造におけるわずかな変動を識別するタンパク質ナノポアの能力を例示している（すなわちＳｅｒ←Ａｌａ）。
【０１５９】
本発明者らは、次に各構築物をＰＫＡでリン酸化した。ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２−Ｐの完全なリン酸化が２時間未満で生じた一方で、ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ａ１１２およびＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐは、ほとんど完全なリン酸化を実現するための試薬補充を伴って、４４時間必要であった（図１１）。再度リン酸化構築物は、特有のＩＲＥＳ％およびＩｎ値をレベル３において示した（図２ｂ，ｄ，ｆ）：ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０ＩＲＥＳ％＝１５．２±０．２％、Ｉｎ＝５．７±０．１ｐＡ（ｎ＝９８）；ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０ＩＲＥＳ％１２．６±０．１％、Ｉｎ＝６．２±０．２ｐＡ（ｎ＝１００）；ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０ＩＲＥＳ％＝１３．８±０．２％、Ｉｎ＝６．８±０．２ｐＡ（ｎ＝６５）；ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ａ１１２−オリゴ（ｄＣ）３０、ＩＲＥＳ％＝１４．６±０．２％、Ｉｎ＝５．１±０．２ｐＡ）（ｎ＝７９）（図２ｇ、図１１）。
【０１６０】
２個の部位での不完全なリン酸化
Ｓｅｒ−１０７およびＳｅｒ−１１２での一リン酸化と両方の部位でのリン酸化とを識別する能力に基づいて、本発明者らはＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐの不完全リン酸化を検討した。本発明者らは、等電点電気泳動（ＩＥＦ）によってリン酸化の経時変化をモニターし（図３ａ）、２時間後に、一方は二重リン酸化され、他方は１個だけの部位でリン酸化された、２個のリン酸化タンパク質の集団が存在することを示した。ＩＥＦはＳｅｒ−１１２でのリン酸化からＳｅｒ−１０７でのリン酸化を識別できない。しかし、ＥＳＩ  ＬＣ−ＭＳは、２時間後にＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２−Ｐがほとんど完全にリン酸化され、一方ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ａ１１２は、ＰＫＡおよびＡＴＰのさらなる添加を伴う４８時間後でさえ完全にはリン酸化されないことを示した。したがって、２時間後にＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ由来の２個のリン酸化化学種は、Ｓｅｒ−１１２だけがリン酸化されたものおよび両方の部位がリン酸化されたものであると考えられる。
【０１６１】
２時間のリン酸化後、ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ試料をオリゴ（ｄＣ）３０でタグ化し、混合物が一方はＩＲＥＳ％＝１５．４±０．１％、Ｉｎ＝５．７±０．１ｐＡを有し、他方はＩＲＥＳ％＝１４．３±０．１％、Ｉｎ＝６．７±０．１ｐＡを含有する２個の集団を含有していることを示したナノポア分析に供した（図３ｂ）。ナノポア較正に基づいて（図１３）これらの化学種は、二重リン酸化化学種ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ｓ１１２＋Ｐ（ＩＲＥＳ％＝１５．４±０．２％、Ｉｎ＝５．７±０．１ｐＡ）および、ＴｒｘＡ１０７／Ｓ１１２＋Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０によって表されるＳｅｒ−１１２でリン酸化されたタンパク質（ＩＲＥＳ％＝１４．０±０．３％、Ｉｎ＝６．９±０．３ｐＡ）に対応する。対照的に、ＴｒｘＳ１０７＋Ｐ／Ａ１１２−オリゴ（ｄＣ）３０は、ＩＲＥＳ％＝１４．９±０．１％、Ｉｎ＝５．２±０．１ｐＡを生じ、ＴｒｘＳ１０７−Ｐ／Ｓ１１２−Ｐ−オリゴ（ｄＣ）３０は、ＩＲＥＳ％＝１３．０±０．１％、Ｉｎ＝６．５±０．１ｐＡ）を生じた。ＩＥＦバンド強度から、試料は、３９％二重リン酸化および６１％単一リン酸化チオレドキシンを含有すると推定された。これに一致して、２０２個の単一分子事象に基づいて、本発明者らは、６７分子（３３％）が二重リン酸化され、１２３分子（６１％）がＳｅｒ１１２で単一リン酸化されたことをＳｅｒ１０７で単一リン酸化された１個だけ（０．５％）を含んで見出した。
【０１６２】
考察
ＤＮＡリーダー配列を伴ったモデルタンパク質がαＨＬポアを通って移行でき、同時にアンフォールドされ、特徴的なイオン電流サインを提供する３７という本発明者らの初期の発見に基づいて、本発明者らは、側鎖リン酸化、重要なＰＴＭを電流サインにおける変化を通じて単一分子レベルで検出できることをいまや見出している。注目すべきことに、タンパク質中の異なる場所でのリン酸化が異なるサインを生じ、修飾部位間の迅速な識別を可能にする。本発明者らは、２個の隣接部位（１残基によって分離されている）のリン酸化状態：すなわち、非リン酸化状態、２個の一リン酸化状態および二重リン酸化状態、を識別でき、定量できることも示している。２個の隣接部位の１個でのタンパク質一リン酸化は、ＭＳによって識別することが特に困難であり、本発明者らは、単一のポリペプチド鎖内のリン酸化部位の占有率および結合性は、ナノポア手法に理想的にふさわしい課題であることを示唆している。
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本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）を決定する方法であって、
（ａ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を膜貫通ポアと、前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポアを通って移動するように接触させるステップ；および
（ｂ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポアに関して移動する際に１つまたは複数の電流測定値を取り、それにより前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１個または複数のＰＴＭの存在、非存在、数または位置（１個もしくは複数）を決定するステップ
を含む方法。
［２］
ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の２個以上のＰＴＭの存在、非存在、数または位置を決定するためである、上記［１］に記載の方法。
［３］
１個、２個、３個または４個のアミノ酸によって分離されている、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の２個以上のＰＴＭの存在、非存在、数または位置を決定するためである、上記［１］に記載の方法。
［４］
前記１個または複数のＰＴＭが、疎水性基での修飾、補因子での修飾、化学基の付加、糖化、ビオチン化およびペグ化から選択される、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
［５］
（ａ）疎水性基での前記修飾が、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化およびグリピエーションから選択され；
（ｂ）補因子での前記修飾が、リポイル化、フラビネーション、ヘムＣの付着、ホスホパンテテイニル化およびレチニリデンシッフ塩基形成から選択され；
（ｃ）化学基の前記付加が、アシル化、アセチル化、ホルミル化、アルキル化、アミド化、ブチル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ポリシアル酸化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ブロム化；シトルリン化；ヌクレオチド付加、ＡＤＰリボシル化、酸化、リン酸化、アデニリル化、プロピノイル化、ピログルタミン酸形成、Ｓ−グルタチオン付加、ＳＵＭＯ化；Ｓ−ニトロシル化、リジンへのサクシニル基のサクシニル化付加およびセレノイル化およびユビキニル化から選択される、
上記［４］に記載の方法。
［６］
前記１個もしくは複数のＰＴＭが１個もしくは複数のリン酸化である、または前記２個以上のＰＴＭが２個以上のリン酸化である、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
ステップ（ａ）における前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、オリゴヌクレオチドなどの荷電ポリマーに共有結合している、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
［８］
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が前記膜にカップリングしている、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
［９］
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、コレステロールを使用して前記膜にカップリングしている、上記［８］に記載の方法。
［１０］
前記ポアが、膜貫通タンパク質ポア、固体ポアまたはハイブリッド膜固体ポアである、先行する項目のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
前記膜貫通タンパク質ポアが、溶血素、ロイコシジン、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）、外膜ホスホリパーゼＡ、ナイセリア（Neisseria）自己輸送体リポタンパク質（ＮａｌＰ）、ＯＭＰおよびＷｚａ由来である、上記［１０］に記載の方法。
［１２］
前記膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号２に示す７個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）前記７個のサブユニットの１個または複数が配列番号２に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、上記［１１］に記載の方法。
［１３］
前記膜貫通タンパク質が、（ａ）配列番号４に示す４個の同一のサブユニットおよび配列番号６に示す４個の同一のサブユニットから形成されているγ溶血素、または（ｂ）前記サブユニットの１個または複数が配列番号４に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、および／または前記サブユニットの１個または複数が配列番号６に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、前記ポアがポア活性を保持しているその変種である、上記［１１］に記載の方法。
［１４］
前記膜貫通タンパク質が（ａ）配列番号８に示す７個の同一のサブユニットから形成されている、または（ｂ）前記７個のサブユニットの１個または複数が配列番号８に対して、アミノ酸同一性に基づいて前記配列全体にわたって少なくとも５０％相同性を有し、ポア活性を保持しているその変種である、上記［１１］に記載の方法。
［１５］
生物がペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数の異常なＰＴＭに関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む前記生物由来の試料に対して上記［１］から［１４］のいずれか一項に記載の方法を実行するステップ；および
（ｂ）前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の１個または複数のＰＴＭが存在するかどうかを決定し、それにより前記生物が疾患、前記障害または表現型を有するかどうかを決定するステップ
を含む方法。
［１６］
前記生物が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の異常なリン酸化に関連する疾患、障害または表現型を有するかどうかを決定するための、上記［１５］に記載の方法。
［１７］
前記疾患または障害が、がん、慢性炎症性疾患、筋緊張性筋ジストロフィー、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、ブルトンチロシンキナーゼ、ヒルシュスプルング病、常染色体劣性ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、頭蓋骨癒合症、乳頭状腎臓がん、慢性骨髄単球性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、ポイツ・ジェガーズ症候群、コフィン・ローリー症候群、毛細血管拡張性運動失調症、リー・フラウメニ症候群、ウイリアムズ症候群、妖精症、糖尿病、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ウォルコット・ラリソン（Ｗｏｌｃｏｔｔ−Ｒａｌｌｉｓｏｎ）症候群またはＸ連鎖筋細管ミオパチーである、上記［１５］または［１６］に記載の方法。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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