(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的特異的抗体にカップリングされた式（Ｖ）
0006762296.tif 000033
（式中、
「オリゴ」は、１から約５０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から３２個の炭素原子を有し；
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有し；
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され；
Ｒは、末端基であり；
Ｔは、末端反応性部分を有する基であり；
ｘは、１又は２であり；
ｙは、１又は２であり；
ｚは、１から１８の整数であり；
ｍは、０、１又は２であり；
ｎは、１又は２であり；
ａは、１から８の整数であり；
ｂは、１又は２である）
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得；且つ
ｍが０の場合、［リンカー］が結合である、
ポリマーの少なくとも一を含む抗体コンジュゲートであって、
「スペーサー」が式（ＶＩＩ）
0006762296.tif 000034
（式中、ｄ及びｅは、１から３２の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ４のアルキル基、Ｆ、Ｃｌ、Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）又は第４級アミンであり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである）
の構造を有する、抗体コンジュゲート。
【請求項２】
Ｒａ及びＲｂがＨであり；ＱがＯであり；ｄが１から４であり；ｅが２から８である、請求項１に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項３】
「スペーサー」が正味の正電荷を有する、請求項１に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項４】
標的特異的抗体にカップリングされた式（Ｖ）
0006762296.tif 000035
（式中、
「オリゴ」は、１から約５０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から３２個の炭素原子を有し；
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有し；
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され；
Ｒは、末端基であり；
Ｔは、末端反応性部分を有する基であり；
ｘは、１又は２であり；
ｙは、０、１又は２であり；
ｚは、１から１８の整数であり；
ｍは、１又は２であり；
ｎは、１又は２であり；
ａは、１から８の整数であり；
ｂは、１又は２である）
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得；且つ
ｙが０の場合、［スペーサー］が結合であり、［リンカー］が直接又は任意の基を介して［オリゴ］に結合する、
ポリマーの少なくとも一を含む抗体コンジュゲートであって、
「リンカー」が式（ＶＩＩ）
0006762296.tif 000036
（式中、ｄ及びｅは、１から３２の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ４のアルキル基、Ｆ、Ｃｌ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである）
の構造を有する、抗体コンジュゲート。
【請求項５】
標的特異的抗体にカップリングされた式（Ｖ）
0006762296.tif 000037
（式中、
「オリゴ」は、１から約５０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から３２個の炭素原子を有し；
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有し；
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され；
Ｒは、末端基であり；
Ｔは、末端反応性部分を有する基であり；
ｘは、１又は２であり；
ｙは、０、１又は２であり；
ｚは、１から１８の整数であり；
ｍは、１又は２であり；
ｎは、１又は２であり；
ａは、１から８の整数であり；
ｂは、１又は２である）
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得；且つ
ｙが０の場合、［スペーサー］が結合であり、［リンカー］が直接又は任意の基を介して［オリゴ］に結合する、
ポリマーの少なくとも一を含む抗体コンジュゲートであって、
「リンカー」がポリ（アルキレン）グリコールに由来する、抗体コンジュゲート。
【請求項６】
標的特異的抗体にカップリングされた式（Ｖ）
0006762296.tif 000038
（式中、
「オリゴ」は、１から約５０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から３２個の炭素原子を有し；
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有し；
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され；
Ｒは、末端基であり；
Ｔは、末端反応性部分を有する基であり；
ｘは、１であり；
ｙは、１又は２であり；
ｚは、３から１８の整数であり；
ｍは、０、１又は２であり；
ｎは、１又は２であり；
ａは、１又は２であり；
ｂは、１又は２である）
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得；且つ
ｍが０の場合、［リンカー］が結合である、
ポリマーの少なくとも一を含む抗体コンジュゲート。
【請求項７】
ａが２であり；ｍ、ｎ、及びｂが１であり、「標識」がフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体であり、「オリゴ」が４から１８ヌクレオチドを含み、「リンカー」が４から１２個の炭素原子を含む、請求項６に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項８】
ａが１であり；ｍ、ｎ、及びｂが１であり、「標識」がジ−ニトロフェニルであり、「オリゴ」が４から１８ヌクレオチドを含み、「リンカー」が４から１２個の炭素原子を含む、請求項６に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項９】
標的特異的抗体にカップリングされた式（Ｖ）
0006762296.tif 000039
（式中、
「オリゴ」は、４から１８ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から３２個の炭素原子を有し；
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１２個の炭素原子を有し；
「標識」は、ジ−ニトロフェニルであり；
Ｒは、末端基であり；
Ｔは、末端反応性部分を有する基であり；
ｘは、１であり；
ｙは、０であり；
ｚは、３から９の整数であり；
ｍは、１又は２であり；
ｎは、１又は２であり；
ａは、１又は２であり；
ｂは、１又は２である）
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得；且つ
［スペーサー］が結合であり、［リンカー］が直接又は任意の基を介して［オリゴ］に結合する、
ポリマーの少なくとも一を含む、抗体コンジュゲート。
【請求項１０】
標的特異的抗体にカップリングされた式（Ｖ）
0006762296.tif 000040
（式中、
「オリゴ」は、１から約５０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から３２個の炭素原子を有し；
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有し；
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され；
Ｒは、末端基であり；
Ｔは、末端反応性部分を有する基であり；
ｘは、１又は２であり；
ｙは、０、１又は２であり；
ｚは、１から１８の整数であり；
ｍは、０、１又は２であり；
ｎは、１又は２であり；
ａは、１から８の整数であり；
ｂは、１又は２である）
のポリマーであって、
「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得；且つ
ｙが０の場合、［スペーサー］が結合であり、［リンカー］が直接又は任意の基を介して［オリゴ］に結合し；ｍが０の場合、［リンカー］が結合である、
ポリマーの少なくとも一を含む抗体コンジュゲートであって、
ａ：ｂの比が２：１又は３：１であり、ポリマー当たりの存在する「標識」基の数が３から９である、抗体コンジュゲート。
【請求項１１】
「標識」がジ−ニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン若しくはそれらの誘導体又はローダミンからなる群から選択される、又は「標識」がオキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン又はシクロリグナンからなる群から選択される、又は「標識」が５−ニトロ−３−ピラゾール  カルバミド、２−（３，４−ジメトキシフェニル）キノリン−４−カルボン酸）、３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルバミド、２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−５−カルバミド、及び２−アセトアミド−４−メチル−５−チアゾールスルホンアミドからなる群から選択される、請求項１〜６、９、及び１０のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項１２】
Ｔの末端反応性部分がアミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル基である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項１３】
少なくとも一のポリマーが抗体のＦｃ領域又はヒンジ領域の一つにカップリングされる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項１４】
少なくとも二のポリマーが標的特異的抗体にカップリングされる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲートと、試料中の標識を検出するための検出試薬とを含むキット。
【請求項１６】
標識を検出するための検出試薬が標識に特異的な抗体であり、前記標識に特異的な抗体が検出可能な部分を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲートと試料を接触させること、及び標識を用いて標的を検出することを含む、試料中の標的を検出する方法。
【請求項１８】
試料が二以上の異なる抗体コンジュゲートと接触され、各抗体コンジュゲートは異なる標的に特異的な抗体及び異なる標識を含み、試料を異なる標識を検出するための検出試薬と接触させる工程をさらに含み、任意に試料が前記二以上の異なる抗体コンジュゲートと同時に又は連続的に接触される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
異なる標識を検出するための検出試薬が異なる標識のそれぞれに特異的な抗標識抗体であり、各抗標識抗体が検出可能な部分を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体コンジュゲートの標識がハプテンであり、ハプテンを検出するための特異的試薬が、異なる抗体コンジュゲートのそれぞれに特異的な抗ハプテン抗体であり、各抗ハプテン抗体が検出可能な部分を含み、任意にハプテンがジ−ニトロフェニル、フルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びローダミンからなる群より選択され、任意に抗体コンジュゲートの第一のハプテンがジ−ニトロフェニルであり、第一の抗ハプテン抗体が抗ジ−ニトロフェニル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
標識が酵素であり、検出試薬が各酵素に特異的な基質であり、又は抗体コンジュゲートの標識がフルオロフォアであり、直接検出される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／０５９０７３号及び２０１５年９月１日に出願された米国仮特許出願第６２／２１２８７９号の出願日の利益を主張するものである。以上の仮出願の開示内容は、本明細書中に参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
免疫組織化学（ＩＨＣ）及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析（ＩＳＨ）を含む細胞染色法は、組織学的診断及び組織形態学の研究における有用なツールである。ＩＨＣは、組織試料中に存在し得る目的の抗原を検出するために、特異的結合剤又は部分、例えば抗体を使用する。ＩＨＣは、特定の疾病状態又は病状を診断するなどの臨床及び診断用途に広く使用されている。例えば、特定のがん型は、被験体から得られた試料中の特定のマーカー分子の存在に基づいて診断することができる。ＩＨＣはまた、異なる組織におけるバイオマーカー分布及び局在を理解するための基礎研究において広く使用されている。生物学的試料はまた、銀ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、発色ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、及び蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）などの、まとめてＩＳＨと呼ばれるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術を用いて調べることができる。ＩＳＨは組織中の核酸を検出するが、ＩＨＣはタンパク質を検出する点で、ＩＳＨはＩＨＣとは異なる。
【０００３】
生物のゲノムによって発現される複数のタンパク質の特徴付け及び定量化は、プロテオミクスの中心である。マルチプレックス免疫組織化学（ＭＩＨＣ）は、研究及び診断において幅広い用途を持ち、パラフィン包埋ホルマリン固定組織中の多変量タンパク質標的を検出及び分析するための、主要な未達成の技術的ニーズを代表するものである。マルチプレックス免疫組織化学（ＭＩＨＣ）技術では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織における多変量タンパク質標的の検出及び分析のニーズに対応しようとする試みがなされている。効果的なＭＩＨＣ技術は、研究及び診断において幅広い用途を有する。しかしながら、組織中の複数の（例えば５以上）２５のタンパク質標的の同時及び定量的検出を可能にする効率的且つ再現可能な方法は、たとえあるとしても、ごくわずかでしかない。
【０００４】
組織及び細胞学的試料のＩＨＣアッセイ及びＩＳＨアッセイなどのｉｎ  ｓｉｔｕアッセイ、特に前記試料の多重アッセイの場合、バックグラウンド干渉なしに望ましい結果を提供する方法を同定及び開発することが非常に望ましい。そのような方法の一つは、特許を受けた触媒レポーター堆積（ＣＡＲＤ）に基づくＴｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＳＡ）の使用を伴う。「触媒作用によるリポーター堆積の増強(Enhanced catalyzed reporter deposition)」と題された米国特許第６５９３１００号は、標識フェノールコンジュゲートを酵素と反応させることによりＣＡＲＤ又はＴＳＡ法で酵素の触媒作用を増強することを開示しており、この反応は増強試薬の存在下で行われる。
【０００５】
生体分子コンジュゲートイムノアッセイは、試料中の特定の標的分子を検出するために有用である。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、この一般的な領域における、「分子コンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」と題された米国特許第１１／６０３４２５号；「ハプテン、ハプテンコンジュゲート、それらの組成物並びにそれらの調製及び使用のための方法(Haptens, Hapten Conjugates, Compositions Thereof and Method for their Preparation and Use)」と題された米国実用特許出願第１１／９８２６２７号；及び「免疫組織化学及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのポリマー担体(Polymeric Carriers for Immunohistochemistry and in situ hybridization）」と題された米国特許第８４８６６２０号含む多くの特許及び出願の譲受人である。これらの先行出願及び特許の各々は、参照により本明細書に援用される。ハプテン及び対応するハプテン−担体コンジュゲートは、高感度の定量的及び定性的イムノアッセイの開発に不可欠であった。ハプテンコンジュゲートの設計において、担体に付着したハプテンの量が新たに作製された抗原決定基に向けられた応答の強度に影響を及ぼす可能性があるため、ハプテン、担体、カップリング方法、及びハプテン密度を考慮する必要がある。しかしながら、特定のコンジュゲートが、例えば立体効果、適切な機能に重要な反応性官能基の不活性化、溶解度の変化、バックグラウンドノイズ等を通してアッセイを妨げる可能性があると考えられている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示の一態様において、式（Ｖ）：
0006762296.tif 000002
（式中、「オリゴ」は、１から約５０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から３２個の炭素原子を有し；「リンカー」は、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよ、く、４から１８個の炭素原子を有する分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり；「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、及び量子ドットからなる群から選択され；Ｒは、末端基であり（非限定的な例は水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む）；Ｔは、末端反応性部分を有する基であり；ｘは、１又は２であり；ｙは、０、１又は２であり；ｚは、１から１８の整数であり；ｍは、０、１又は２であり；ｎは、１又は２であり；ａは、１から８の整数であり；ｂは、１又は２である）のポリマーであって、「オリゴ」、「スペーサー」、「リンカー」又は「標識」のいずれも、相互に直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して結合され得；ｙが０の場合、［スペーサー］が結合であり、ｍが０の場合、［リンカー］が結合である）
のポリマーがある。式（Ｖ）のポリマーのいくつかの実施態様において、Ｔの末端反応性部分は、アミノ基、カルボキシル基若しくはスルフヒドリル基又は特異的結合実体にカップリングし得る他の基である。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、２から約５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、２から約２４ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、４から約２４ヌクレオチドを含み；ｘは、１であり；ｙは、１であり；且つａは、１又は２である。ｙがゼロで［スペーサー］が結合である実施態様では、［リンカー］は、存在する場合、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］にカップリング又は結合されている。ｍがゼロで［リンカー］が結合である実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［スペーサー］にカップリング又は結合されている。ｙがゼロであり、ｍもゼロである実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］に結合されている。
【０００７】
いくつかの実施態様では、「スペーサー」は、式（ＶＩＩ）：
0006762296.tif 000003
（式中、ｄ及びｅは、１から３２の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ４のアルキル基、Ｆ、Ｃｌ、Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである）
の構造を有する。いくつかの実施態様では、Ｒａ及びＲｂは、Ｈであり；Ｑは、Ｏであり；ｄは、１から４であり；ｅは、２から８である。いくつかの実施態様では、Ｒａ及びＲｂは、Ｈであり；Ｑは、Ｏであり；ｄは、２であり；ｅは、２から８である。いくつかの実施態様では、「スペーサー」は、正味の正電荷を有する。
【０００８】
いくつかの実施態様では、「リンカー」は、式（ＶＩＩ）：
0006762296.tif 000004
（式中、ｄ及びｅは、１から３２の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ４のアルキル基、Ｆ、Ｃｌ、Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである）
の構造を有する。いくつかの実施態様では、「リンカー」は、ポリ（アルキレン）グリコールに由来する。
【０００９】
いくつかの実施態様において、「標識」は、ジ−ニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン若しくはそれらの誘導体又はローダミンからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、「標識」は、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン又はシクロリグナンからなる群から選択される。他の実施態様において、「標識」は、５−ニトロ−３−ピラゾール  カルバミド、２−（３，４−ジメトキシフェニル）キノリン−４−カルボン酸）、３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルバミド、２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−５−カルバミド、及び２−アセトアミド−４−メチル−５−チアゾールスルホンアミドからなる群から選択される。
【００１０】
式（Ｖ）のポリマーの他の実施態様では、ｘは、１であり；ｙは、１又は２であり；ａは、１又は２であり；ｚは、３から１８である。いくつかの実施態様では、ｘは、１であり；ｙは、１であり；ａは、１又は２であり；ｚは、３から９である。いくつかの実施態様では、ａは、２であり；ｍ、ｎ、及びｂは、１である。いくつかの実施態様では、「標識」は、フルオレセインである。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、４から１８ヌクレオチドを含み、「リンカー」は４から１２個の炭素原子を含む。
【００１１】
式（Ｖ）のポリマーのさらに他の実施態様では、ｘは、１であり；ｙは、１であり；ａは、１であり；ｍ、ｎ、及びｂは、１である。いくつかの実施態様では、「標識」は、ジ−ニトロフェニルである。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、４から１８ヌクレオチドを含み、「リンカー」は４から１２個の炭素原子を含む。
【００１２】
式（Ｖ）のポリマーのいくつかの実施態様では、ｘは、１であり；ｙは、０であり；ａは、１又は２であり；ｚは、３から９である。いくつかの実施態様では、「標識」は、ジ−ニトロフェニルである。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、４から１８ヌクレオチドを含み、「リンカー」は、４から１２個の炭素原子を含む。
【００１３】
式（Ｖ）のポリマーのいくつかの実施態様では、ａ：ｂの比は、２：１又は３：１であり、ポリマー当たりの「標識」基の数は、３から９である。
【００１４】
本開示の別の態様では、約２から約４のポリマーがカップリングしている標的特異的抗体を含む組成物があり、各ポリマーは複数の標識を含み、標的特異的抗体当たりの検出可能な標識の数は、少なくとも６である。いくつかの態様では、各ポリマーは、３から１８個の検出可能な標識を含む。いくつかの態様では、ポリマーは、式（Ｖ）：
0006762296.tif 000005
（式中、「オリゴ」は、１から約３２ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から２４個の炭素原子を有し；「リンカー」は、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有する脂肪族基であり；「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、及び量子ドットからなる群から選択され；Ｒは末端基であり（非限定的な例は水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む）；Ｔは、抗体にカップリングし得る末端反応性部分を有する基であり；ｘは、１又は２であり；ｙは、０、１又は２であり；ｍは、０、１又は２であり；ｎは、１又は２であり；ｚは、１から１８の整数であり；ａは、１から８の整数であり；ｂは、１又は２である）の構造を有し、「オリゴ」、「スペーサー」又は「リンカー」のいずれも、相互に直接、又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して結合され得；ｙが０の場合、［スペーサー］が結合であり、ｍが０の場合、［リンカー］が結合である。ｙがゼロで［スペーサー］が結合である実施態様では、［リンカー］は、存在する場合、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］にカップリング又は結合されている。ｍがゼロで［リンカー］が結合である実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［スペーサー］にカップリング又は結合されている。ｙがゼロであり、ｍもゼロである実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］に結合されている。
【００１５】
いくつかの実施態様では、「スペーサー」又は［スペーサー］ｘは、正味の正電荷を有する。いくつかの実施態様では、各ポリマーにおける連続する「標識」間の距離は、約１０ｎｍ未満である、いくつかの実施態様では、任意の「スペーサー」の少なくとも４個の炭素原子、又は４個の炭素原子とヘテロ原子との組み合わせが、ポリマー骨格の一部を含む。
【００１６】
いくつかの実施態様では、組成物は、式（Ｖ）（式中、ｘは１であり；ｙは１であり；ａは１又は２であり、ｚは３から９であり；「標識」はフルオレセイン（又はフルオレセイン誘導体）であり；「オリゴ」は４から１８ヌクレオチドを含み；「リンカー」は４から１２個の炭素原子を含む）のポリマーを含む。いくつかの実施態様では、ａは、２である。
【００１７】
他の実施態様では、組成物は、式（Ｖ）（式中、ｘは１であり；ｙは１であり；ａは１又は２であり、ｚは３から９であり；「標識」はジ−ニトロフェニルであり；「オリゴ」は４から１８ヌクレオチドを含み；「リンカー」は４から１２個の炭素原子を含む）のポリマーを含む。いくつかの実施態様では、ａは、１である。
【００１８】
本開示の別の態様では、式（ＶＩｄ）：
0006762296.tif 000006
（式中、「オリゴ」は、１から約３２ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から２４個の炭素原子を有し；「リンカー」は、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有する脂肪族基であり；「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、及び量子ドットからなる群から選択され；「特異的結合実体」は、抗体、抗体断片、核酸又は薬物／抗体コンジュゲートであり；Ｒは、末端基であり（非限定的な例は水素、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボニル基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む）；ｘは、１又は２であり；ｙは、０、１又は２であり；ｍは、０、１又は２であり；ｎは、１又は２であり；ｚは、１から１８の整数であり；ａは、１から８の整数であり；ｂは、１から８の整数である）による二以上の異なるコンジュゲートであって、「オリゴ」、「スペーサー」又は「リンカー」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得；ｙが０の場合、［スペーサー］が結合であり；ｍが０の場合、［リンカー］が結合であり、各々が試料内の異なる標的に特異的に結合し、異なる標識を含むコンジュゲートと、ホルマリン固定パラフィン包埋試料（例えば組織試料）とを接触させること；異なる抗体コンジュゲートの標識に特異的で、それぞれが異なる検出可能な部分を含む検出試薬と試料とを接触させること；及び異なる検出可能な部分を用いて複数の標的を検出することを含む、試料中の複数の標的を検出するための方法がある。いくつかの実施態様では、検出試薬の検出可能な部分は、有機染料、フルオロフォア、酵素、量子ドット又はハプテンからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、試料内の異なる標的の量は、検出可能な標識からのシグナル出力に基づいて定量化される。いくつかの実施態様では、この方法は、定量化された標的に基づいて試料をスコアリングする工程をさらに含む。
【００１９】
ｙがゼロで［スペーサー］が結合である実施態様では、［リンカー］は、存在する場合、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］にカップリング又は結合されている。ｍがゼロで［リンカー］が結合である実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［スペーサー］にカップリング又は結合されている。ｙがゼロであり、ｍもゼロである実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］に結合されている。
【００２０】
本開示の別の態様では、式（ＶＩｄ）：
0006762296.tif 000007
（式中、「オリゴ」は、１から約３２ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から２４個の炭素原子を有し；「リンカー」は、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有する脂肪族基であり；「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、及び量子ドットからなる群から選択され；「特異的結合実体」は、抗体、抗体断片、核酸又は薬物／抗体コンジュゲートであり；Ｒは末端基であり（非限定的な例は水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む）；ｘは、１又は２であり；ｙは、０、１又は２であり；ｍは、０、１又は２であり；ｎは、１又は２であり；ａは、１から８の整数であり；ｂは、１又は２であり；ｚは、１から１８の整数である）のコンジュゲートであって、「オリゴ」、「スペーサー」又は「リンカー」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得；ｙが０の場合、［スペーサー］が結合であり；ｍが０の場合、［リンカー］が結合であるコンジュゲートがある。ｙがゼロで［スペーサー］が結合である実施態様では、［リンカー］は、存在する場合、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］にカップリング又は結合されている。ｍがゼロで［リンカー］が結合である実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［スペーサー］にカップリング又は結合されている。ｙがゼロであり、ｍもゼロである実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］に結合されている。いくつかの実施態様では、任意の「スペーサー」の少なくとも４個の炭素原子、又は４個の炭素原子とヘテロ原子との組み合わせが、ポリマー骨格の一部を含む。
【００２１】
いくつかの実施態様では、特異的結合実体は、抗体、核酸又は薬物／抗体複合体／コンジュゲートである。いくつかの実施態様では、特異的結合実体は、抗体である。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、２から約５０ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、２から約２４ヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、４から約２４ヌクレオチドを含み；ｘは、１であり；ｙは、１であり；且つａは、１又は２である。
【００２２】
いくつかの実施態様では、「スペーサー」は、式（ＶＩＩ）：
0006762296.tif 000008
（式中、ｄ及びｅは、１から３２の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ４のアルキル基、Ｆ、Ｃｌ、Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである）
の構造を有する。いくつかの実施態様では、Ｒａ及びＲｂは、Ｈであり；Ｑは、Ｏであり；ｄは、１から４であり；ｅは、２から８である。いくつかの実施態様では、Ｒａ及びＲｂは、Ｈであり；Ｑは、Ｏであり；ｄは、２であり；ｅは、２から８である。いくつかの実施態様では、「スペーサー」は、正味の正電荷を有する。
【００２３】
いくつかの実施態様では、「リンカー」は、式（ＶＩＩ）：
0006762296.tif 000009
（式中、ｄ及びｅは、１から３２の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ４のアルキル基、Ｆ、Ｃｌ、Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである）
の構造を有する。いくつかの実施態様では、「リンカー」は、ポリ（アルキレン）グリコールに由来する。
【００２４】
いくつかの実施態様において、「標識」は、ジ−ニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン若しくはそれらの誘導体又はローダミンからなる群から選択される。他の実施態様において、「標識」は、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン又はシクロリグナンからなる群から選択される。他の実施態様において、「標識」は、５−ニトロ−３−ピラゾール  カルバミド、２−（３，４−ジメトキシフェニル）キノリン−４−カルボン酸）、３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルバミド、２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−５−カルバミド、及び２−アセトアミド−４−メチル−５−チアゾールスルホンアミドからなる群から選択される。
【００２５】
式（ＶＩｄ）のコンジュゲートのいくつかの実施態様では、ｘは、１であり；ｙは、１又は２であり；ａは、１又は２であり；ｚは、３から１８である。いくつかの実施態様では、ｘは、１であり；ｙは、１であり；ａは、１又は２であり；ｚは、３から９である。いくつかの実施態様では、ａは、２であり；ｍ、ｎ、及びｂは、１である。いくつかの実施態様では、「標識」は、フルオレセイン（又はフルオレセイン誘導体）である。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、４から１８ヌクレオチドを含み、「リンカー」は４から１２個の炭素原子を含む。
【００２６】
式（ＶＩｄ）のコンジュゲートの他の実施態様では、ｘは、１であり；ｙは、１又は２であり；ａは、１であり；ｍ、ｎ、及びｂは、１である。いくつかの実施態様では、「標識」は、ジ−ニトロフェニルである。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、４から１８ヌクレオチドを含み、「リンカー」は４から１２個の炭素原子を含む。
【００２７】
式（ＶＩｄ）のコンジュゲートの他の実施態様では、ｘは、１であり；ｙは、０であり；ａは、１又は２であり；ｚは、３から９である。いくつかの実施態様では、「標識」は、ジ−ニトロフェニルである。いくつかの実施態様では、「オリゴ」は、４から１８ヌクレオチドを含み、「リンカー」は４から１２個の炭素原子を含む。
【００２８】
式（ＶＩｄ）のコンジュゲートの他の実施態様では、ａ：ｂの比は、２：１又は３：１であり、ポリマー当たりの存在する「標識」基の数は３から９である。
【００２９】
本開示の別の態様では、式（Ｉ）：
0006762296.tif 000010
の少なくとも二のポリマーを含む、式（ＩＶｂ）：
0006762296.tif 000011
（式中、［Ａ］は、オリゴヌクレオチド配列と任意のスペーサーとを含むポリマー骨格であり；［Ｂ］は、直接又は任意のリンカーを介してポリマー骨格に付着した標識を含み；ａは、１から８の整数であり；ｂは、１から８の整数であり；ｚは、１から２４の整数であり；Ｒは、水素、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボニル基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンであり；特異的結合実体は、抗体、抗体断片、核酸又は薬物／抗体複合体／コンジュゲートである）のコンジュゲートが存在する。いくつかの実施態様では、［Ａ］の長さ又はサイズは、約８ｎｍから約１２ｎｍである。いくつかの実施態様では、前記の長さ又はサイズは、約１０ｎｍ未満である。いくつかの実施態様では、ａは、１又は２であり；ｂは、１又は２であり；ｚは、３、４、５又は９から選択される整数である。いくつかの実施態様では、ａ：ｂの比は、１：１である。他の実施態様では、ａ：ｂの比は、２：１である。さらに他の実施態様では、ａ：ｂの比は、３：１である。いくつかの実施態様では、特異的結合実体当たりのポリマーの数は、約２から約５である。他の実施態様では、特異的結合実体当たりのポリマーの数は、約２から約４である。いくつかの実施態様では、［Ａ］の構成成分及び［Ｂ］に対して［Ａ］が繰り返される回数は、骨格に付着した標識が抗標識抗体である二次抗体の抗原結合部位間の距離に近似する距離を相互に空けるように最適化される。
【００３０】
本開示の別の態様では、試料中の複数の標的について多重診断アッセイを実施する方法又はその自動化された方法が存在する。この実施態様は、典型的には、ホルマリン固パラフィン包埋組織試料を提供すること；自動化システムを使用して、多重標的分析のために組織試料を調製すること；自動システムを使用して、各々が複数の異なる標的に特異的に結合する、式（ＶＩｄ）を有する複数のコンジュゲートで試料を接触させること（ここで、コンジュゲートを構成する各ポリマーは複数の標識を有する）；自動化システムを使用して、各検出試薬が異なる検出可能な部分を含む各コンジュゲートの標識を検出するための検出試薬と試料を接触させること（ここで、各検出試薬は、異なる検出可能な部分を含む）；及び検出可能な標識を用いて標的を検出することを含む。
【００３１】
本開示の別の態様では、式（ＩＶ）の少なくとも一のコンジュゲートと、少なくとも一のコンジュゲートを検出するための検出試薬とを含むキットが存在する。いくつかの実施態様では、キットは、緩衝液などの追加の試薬を含む。
【００３２】
ハプテン化一次抗体は多重ＩＨＣアッセイにおいて魅力的な試薬であるが、本出願人は、抗種抗体染色と比較して弱い抗ハプテン抗体によるＩＨＣ染色をしばしば観察した。同様に、直接蛍光色素標識一次抗体染色は、抗種抗体による間接的なＩＨＣ染色よりも通常弱い。このことを考慮すると、抗体活性の低下を犠牲にして標識化の程度を増加させることがしばしば必要である。
【００３３】
本出願人は、抗体活性に対する有害作用（例えば、抗体の標的に対する結合親和性及び構造への干渉）を防止するために特異的結合実体当たりの標識化の程度が比較的低いコンジュゲート及び前記コンジュゲートを含む組成物を開発した。加えて、本出願人は、標識用の担体としてのポリマー、特にポリマー骨格が制御されたサイズ、長さ、空間配置又は電子配置であるポリマーの使用により、標識が互いに分離され、検出感度が最大化される（例えば検出試薬の立体阻害の防止又は緩和）ことを発見した。全体として、本出願人は、標識用の担体として役立つ新規なポリマーを発見した。このポリマーは、（ｉ）特定の長さ又はサイズを有するオリゴヌクレオチド；（ｉｉ）正確な数の標識；（ｉｉｉ）標識間のスペーサーの任意の組み込み；及び（ｉｖ）標識間の所定の距離を含むように構成されている。図面の簡単な説明。 
【図面の簡単な説明】
【００３４】
以下の図面を参照して、非限定的且つ非網羅的な実施態様を説明する。別段の指定がない限り、様々な図を通して同じ参照番号は、同じ部分又は行為を指す。
【図１】オリゴヌクレオチドポリマー骨格と、リンカーを介してポリマー骨格に付着した標識とを含む抗体コンジュゲートの例を示す。
【図２】骨格がスペーサーと、リンカーを介してポリマー骨格に付着した標識とをさらに含むオリゴヌクレオチドポリマー骨格を含む抗体コンジュゲートの例を示す。
【図３】骨格がスペーサーと、リンカーを介してポリマー骨格に付着した標識とをさらに含むオリゴヌクレオチドポリマー骨格を含む抗体コンジュゲートの例を示す。
【図４】抗体を説明するものであり、抗原結合部位間の距離を示す。
【図５Ａ】コンジュゲート及びコンジュゲートを検出するための二次抗体を使用する第一の検出スキームを示し、二次抗体は酵素を含む。
【図５Ｂ】コンジュゲート及びコンジュゲートを検出するための二次抗体を使用する第一の検出スキームを示し、二次抗体はフルオロフォアを含む。
【図６−７】標的の検出プローブとしてコンジュゲートを使用する方法（単一又は多重）を示すフローチャートを提供する。ここで検出プローブは、検出試薬又は標識コンジュゲート及びシグナル伝達コンジュゲートを用いてを検出される。
【図８】一つのポリマー（一つのオリゴヌクレオチドを含む）を抗体にカップリングしてそれぞれのポリマー−抗体コンジュゲートを形成する一つの方法を示す。
【図９−１１】ネイティブＲｂ  ＨＥＲ２  ４ｂ５抗体及びＨＥＲ２−抗体コンジュゲートが使用されるＩＨＣ染色アッセイの結果を比較する。
【図１２−１６】本開示によるネイティブ抗体及び抗体コンジュゲートが使用されるＩＨＣ染色アッセイの結果を比較する。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
一般に、本開示は、コンジュゲート及びコンジュゲートを含む組成物、並びに生物学的試料中に存在する一又は複数の標的を検出するためのコンジュゲートを使用する方法に関する。いくつかの実施態様では、コンジュゲート又は組成物は、抗体活性に対する有害作用を防止しながら、組織試料内の複数の標的を同時に又は連続的に検出するための多重アッセイにおいて使用される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、単数形「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈から判断して明らかにそうでないと分かる以外は、複数の指示物を含む。同様に、「又は」という語は、文脈から判断して明らかにそうでないと分かる以外は、「及び」を含むことが意図されている。また、本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。したがって、「Ａ又はＢを含む」とは、Ａ、Ｂ、又はＡ及びＢを含むことを意味する。さらに、核酸又はポリペプチド又は他の化合物に対して与えられるすべてのヌクレオチドサイズ又はアミノ酸サイズ及びすべての分子量又は分子量値は近似値であり、説明のために示される。本明細書に記載されているものと類似又は等価な方法及び材料を本開示の実施又は試験に使用することができるが、適切な方法及び材料を下記に記載する。本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法、及び実施例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００３７】
ＡｆｆｉｍｅｒｓＴＭは、抗体の特異性及び結合親和性を模倣する遺伝子操作されたタンパク質であるが、はるかに小さく、約１４ｋＤａの分子量を有する。ＡｆｆｉｍｅｒｓＴＭは高度に安定であり、特定の標的タンパク質に対する高親和性結合表面を提供するペプチドループを示すように操作されていると考えられている。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、所望の生物活性又は結合活性を示す任意の形態の抗体を指す。したがって、それは最も広い意味で使用され、特にモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト化完全ヒト抗体、キメラ抗体、及びラクダ化単一ドメイン抗体を包含するがこれらに限定されない。
【００３９】
本明細書で使用される場合、別途指示がない限り、「抗体断片」又は「抗原結合断片」は、抗体の抗原結合断片、すなわち完全長抗体によって結合された抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体断片、例えば一又は複数のＣＤＲ領域を保持する断片を指す。抗体結合断片の例には、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体；単鎖抗体分子、例えばｓｃ−Ｆｖ；ナノボディ、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「抗原」は、抗体分子又はＴ細胞受容体などの特異的体液性又は細胞性免疫の産物によって特異的に結合され得る化合物、組成物又は物質を指す。抗原は、例えばハプテン、単純中間代謝産物、糖（例えばオリゴ糖）、脂質、及びホルモン、並びに複雑な炭水化物（例えば多糖類）、リン脂質、及びタンパク質などの高分子を含む任意の種類の分子であり得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「アッセイ」は、限定されないが、単一及び多重免疫検出アッセイ、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）、フローサイトメトリー、顕微鏡検査、イメージングｉ、高含有量スクリーニング（ＨＣＳ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、免疫磁気細胞枯渇(immunomagnetic cellular depletion)、細胞磁気免疫捕捉(immunomagnetic cell capture)、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、エリスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）、ビーズアレイ、多重ビーズアレイ、マイクロアレイ、抗体アレイ、セルラーアレイ等のアレイ、溶相捕捉(solution phase capture)、化学発光検出、赤外検出、ブロッティング方法、ウエスタンブロット、サザンブロット、サウスウエスタンブロット、電気泳動システム内の標識化、表面の標識化、アレイ標識化、ＰＣＲ増幅、ＰＣＲ増幅が後続するエロンゲーション、免疫沈降法、免疫共沈降法、クロマチン免疫沈降法、プレターゲティングイメージング、治療剤又はそれらの組み合わせを含む。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」は、より大きなコンストラクトに共有結合した二以上の分子（及び／又はナノ粒子などの物質）を指す。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、例えば一又は複数の他の生体分子などの一又は複数の他の分子に共有結合した一又は複数の生体分子（例えばペプチド、タンパク質、酵素、糖、多糖、脂質、糖タンパク質、及びリポタンパク質）を含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲートは、一又は複数の検出可能な標識（例えばフルオロフォア、発光団、蛍光ナノ粒子、ハプテン、酵素、及びそれらの組み合わせ）に共有結合した一又は複数の特異的結合分子（抗体など）を含む。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「カップリングする又は「カップリング」という用語は、一つの分子又は原子が別の分子又は原子へ接合、結合（例えば共有結合）又は連結することを指す。
【００４４】
ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質（designed ankyrin repeat protein））は、典型的には非常に特異的で高親和性の標的タンパク質結合を示す遺伝子操作された抗体模倣タンパク質である。ＤＡＲＰｉｎは、ネイティブなアンキリンタンパク質に由来し、このようなタンパク質の少なくとも３つ、通常は４つ又は５つの反復モチーフからなる。
【００４５】
「多重」、「多重化（される）」、「多重の」は、試料中の複数の標的を同時に、実質的に同時に、又は連続的に検出することを指す。本開示の実施態様は、複数の異なるコンジュゲートを使用して、試料中の複数の標的を実質的に同時に、又は連続的に、所望通りに検出することを可能にする。多重化は、ペプチド、タンパク質の両者を個々に、またあらゆるすべての組み合わせで同定及び／又は定量化することを含み得る。多重化はまた、その解剖学的状況において、細胞中のメッセンジャー及びタンパク質の二以上を検出することを含み得る。
【００４６】
用語「一次抗体」は、組織試料中の標的タンパク質抗原に特異的に結合する抗体を指す。一般に、一次抗体は、免疫組織化学的手法において使用される第一の抗体である。
【００４７】
反応性基：本出願全体を通しての式は、本明細書に記載のように第一のユニットを第二のユニットにカップリングするのに適した様々な基（例えば官能基）のいずれかであり得る「反応性基」、「反応性官能基」、「末端反応性基」等を指す。例えば、反応性基は、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化スルホニル、アルデヒド、及びグリコールなどの酸塩化物、エポキシド及びオキシラン、カルボネート、アリール化剤、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、並びにそれらの組み合わせなどのアミン反応性基であり得る。適切なチオール反応性官能基は、ハロアセチル及びアルキルハライド、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、ピリジルジスルフィド、ＴＮＢ−チオール、及びジスルフィド還元剤などのチオール−ジスルフィド交換試薬、並びにそれらの組み合わせを含む。適切なカルボキシレート反応性官能基は、ジアゾアルカン、ジアゾアセチル化合物、カルボニルジイミダゾール化合物、及びカルボジイミドを含む。適切なヒドロキシル反応性官能基は、エポキシド及びオキシラン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ、Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート又はＮヒドロキシスクシンイミジルクロロホルメート、過ヨウ素酸酸化化合物、酵素酸化、アルキルハロゲン、及びイソシアネートを含む。アルデヒド及びケトン反応性官能基は、ヒドラジン、シッフ塩基、還元アミノ化生成物、マンニッヒ縮合物、及びそれらの組み合わせを含む。活性水素反応性化合物は、ジアゾニウム誘導体、マンニッヒ縮合物、ヨウ素化反応生成物、及びそれらの組み合わせを含む。光反応性化学官能基は、アリールアジド、ハロゲン化アリールアジド、ベンゾフォノン、ジアゾ化合物、ジアジリン誘導体、及びそれらの組み合わせを含む。
【００４８】
本明細書において用語「二次抗体」は、一次抗体に特異的に結合し、それにより一次抗体と、もしあれば、その後の試薬（例えば標識、酵素など）との間に架橋を形成する抗体を指す。一般に、二次抗体は、免疫組織化学的手法において使用される第二の抗体である。
【００４９】
試料：  用語「試料」は、標的が存在し得る任意の液体、半固体又は固体物質（又は材料）を指す。特に、試料は、生物学的試料又は生体物質から得られた試料であり得る。生物学的試料の例は、末梢血、尿、唾液、組織生検、外科検体、羊水穿刺試料、及び剖検材料を含む、より具体的な例を伴う組織試料及び細胞学的試料を含む。
【００５０】
本明細書で使用される場合、用語「特異的結合実体（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｎｔｉｔｙ）」は、特異的結合対の一方のメンバーを指す。特異的結合対は、互いに結合して、他の分子との結合の実質的排除を特徴とする（例えば、特異的結合対は、生物学的試料において結合対の二つのメンバーのいずれかの、他の分子との結合定数よりも少なくとも１０３Ｍ−１大きい、１０４Ｍ−１大きい、又は１０５Ｍ−１大きい結合定数を有し得る）分子の対である。特異的結合部分の特定の例には、特異的結合タンパク質（例えば抗体、レクチン、ストレプトアビジンなどのアビジン、及びプロテインＡ）が含まれる。特異的結合部分はまた、そのような特異的結合タンパク質によって特異的に結合される分子（又はその一部）を含み得る。
【００５１】
標的：  存在、位置、及び／又は濃度が決定される、又は決定することができる任意の分子。標的分子の例には、タンパク質及びハプテン、例えばタンパク質に共有結合したハプテンが含まれる。標的分子は、典型的には、特異的結合分子及び検出可能な標識の一又は複数のコンジュゲートを用いて検出される。
【００５２】
標識用担体としてのポリマー及びその使用
本開示は、ハプテンなどの標識用担体として役立つ新規なポリマーに関する。開示されたポリマーの一又は複数は、それ自体、本明細書に開示の抗体コンジュゲートなどのコンジュゲートを形成するために、抗体などの特異的結合実体にカップリングされ得る。
【００５３】
一般に、ポリマーは、直接又は間接的に（例えばリンカーを介して）ポリマー骨格に付着した標識を含む。例えば、図１、２、及び３に示す化合物は、ポリマー骨格を形成する任意のスペーサー（図２の「Ｃ１８スペーサー」又は図３の「スペーサー１８」）にカップリングされたオリゴヌクレオチドを含むポリマー骨格を提供する。ポリマー骨格にカップリングされるのが標識であり、標識は、任意のリンカー（図１及び２では「ハプテンＤＮＰ」、図３では「ＴＥＧリンカー」）を介して骨格に接続されている。したがって、少なくとも図１、２、及び３に見られるように、ポリマーは、一又は複数の標識用の担体として役立つ。
【００５４】
ポリマーは、式（Ｉ）：
0006762296.tif 000012
（式中、Ａはオリゴヌクレオチド配列及び任意のスペーサー（「ポリマー骨格」）を含み、Ｂは標識及び任意のリンカーを含み；ａは１から８の整数であり、ｂは１又は２であり、ｚは１から２４の整数である）
の構造を有し得る。式（Ｉ）に示すように、Ａ及びＢは繰り返し基であり、式（Ｉ）のポリマーは末端反応性基（例えばアミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル基）で５’末端で終結してもよく、末端基で３’末端で終結してもよい（末端基の非限定的な例には、水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンが含まれる）。任意の基［Ａ］又は［Ｂ］、あるいは［Ａ］又［Ｂ］を含む任意の成分若しくは構成成分は、相互に直接、又は当業者に知られている任意の基、例えばリン酸基又はホスホジエステル基を介して結合され得る。例えば、「標識」は、スペーサー又は［リンカー］が存在しない場合、［オリゴ］及び［標識］を架橋する基を介して［オリゴ］基に結合され得、このような基は当業者には知られており、限定されないが、リン酸基又はホスホジエステル基を含む。いくつかの実施態様では、式（Ｉ）のａ：ｂの比は、１：１、２：１、１：２又は３：１である。いくつかの実施態様では、［Ａ］のサイズ又は長さは、約８ｎｍから約１２ｎｍである。他の実施態様では、［Ａ］のサイズ又は長さは、約８ｎｍ未満である。他の実施態様では、［Ａ］のサイズ又は長さにより、［Ｂ］を含む標識が、抗体（例えば標識に特異的で、その標識を検出するために使用される二次抗体）の抗原結合部位間の距離に近似する間隔を空けることを可能にする。いくつかの実施態様では、［Ａ］は、正味の中性電荷(neutral charge)（例えば正に荷電したスペーサー成分によりほぼ中和され、負に荷電したオリゴヌクレオチド配列）を含む。
【００５５】
いくつかの実施態様では、ａは１であり、ｂは１である。他の実施態様では、ａは２であり、ｂは１である。いくつかの実施態様では、ｚは１から１８の整数である。他の実施態様では、ｚは２から１６の整数である。さらに他の実施態様では、ｚは２から９の整数である。さらに他の実施態様では、ｚは３から９の整数である。よりさらなる他の実施態様では、ｚは３、４、５又は９のうちのいずれか一つである。
【００５６】
いくつかの実施態様では、［Ａ］は、式（ＩＩ）：
0006762296.tif 000013
（式中、「オリゴ」は、１から約５０ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド配列（例えば一本鎖又は二本鎖）であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基で、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から３２個の炭素原子を有し；ｘは１又は２であり、ｙは０、１又は２である）
の構造を有する。ｙが０である実施態様では、［スペーサー］は結合であり、隣接する［オリゴ］基及び／又は［Ｂ］基（「標識」及び／又は「リンカー」）を［オリゴ］にカップリングすることができる。いくつかの実施態様では、ｘは１であり、ｙは１である。他の実施態様では、ｘは１であり、ｙは１である。さらに他の実施態様ではｘは１であり、ｙは２である。
【００５７】
いくつかの実施態様では、［Ｂ］は、式（ＩＩＩ）：
0006762296.tif 000014
（式中、「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有し、４から１８個の炭素原子を有してもよく；「標識」は、ハプテン、色素原、酵素、フルオロフォア、及び量子ドットからなる群から選択され；ｍは０、１又は２であり、ｎは１又は２である）の構造を有し、ｍが０である場合、［リンカー］は結合であり、その結果「標識」がポリマー骨格［Ａ］．にカップリングし得る。いくつかの実施態様では、ｍは１であり、ｎは１である。
【００５８】
いくつかの実施態様において、式（Ｉ）の少なくとも一のポリマーは、特異的結合実体にカップリングされ、式（ＩＶａ）及び（ＩＶｂ）：
0006762296.tif 000015
（式中、「特異的結合実体」は、用語が本明細書に定義されているような特異的結合実体（例えば抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、核酸）を表し；Ｒは末端基（例えば水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、カチオン、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基）であり；ａ及びｂは、それぞれ独立して１から８の整数であり；ｚは１から２４の整数である）
に示されるようなコンジュゲートを形成する。
【００５９】
いくつかの実施態様では、複数のポリマーが特異的結合実体にカップリングされる。他の実施態様では、式（Ｉ）の約１から約５個のポリマーが単一の特異的結合実体にカップリングされる（式（ＩＶａ）及び（ＩＶｂ）は特異的結合実体への単結合のみを示すが、これは説明の目的のみのためであり、当業者であれば、複数のポリマーがカップリングされて得ることがわかるであろう）。いくつかの実施態様では、特異的結合実体は抗体であり、この場合抗体の任意の部分（例えば抗体のＦｃ部分）にポリマーをカップリングすることができる。いくつかの実施態様では、２から５のポリマーが抗体にカップリングし、各ポリマーは約３から約１８の標識を含む。当業者は、低い数のポリマー（すなわち低度の標識化）が抗体活性への有害作用を防止又は緩和することを理解するであろう。
【００６０】
いくつかの実施態様では、ａは、１であり、ｂは１である。他の実施態様では、ａは、２であり、ｂは１である。さらに他の実施態様では、ｚは、１から１８の整数である。他の実施態様では、ｚは、２から１６の整数である。さらに他の実施態様では、ｚは、２から９の整数である。さらに他の実施態様では、ｚは、３から９の整数である。よりさらなる他の実施態様では、ｚは、３、４、５又は９のうちのいずれか一つである。
【００６１】
いくつかの実施態様では、ポリマーは、式（Ｖ）：
0006762296.tif 000016
（式中、
「オリゴ」は、１から約５０ヌクレオチドを有する一本鎖オリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；
「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有し、４から３２個の炭素原子を有してもよく；
「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有し；
「標識」は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、及び酵素からなる群から選択され；
Ｒは、末端基であり（非限定的例は水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む）；
Ｔは、末端反応性部分を有する基であり；
ｘは、１又は２であり；ｙは、０、１又は２であり；ｚは、１から２４の整数であり；
ｍは、０、１又は２であり；ｎは、１又は２であり；
ａは、１から８の整数であり；ｂは、１又は２である）の構造を有し、
「オリゴ」、「スペーサー」又は「リンカー」のいずれも、相互に直接、又はリン酸基若しくはホスホジエステル基を含むがこれらに限定されない任意の基又は反応性基を介して結合され得、ｙが０の場合、［スペーサー］が結合であり、ｍが０の場合、［リンカー］が結合である。
【００６２】
ｙがゼロで［スペーサー］が結合である実施態様では、［リンカー］は、存在する場合、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］にカップリング又は結合されている。ｍがゼロで［リンカー］が結合である実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［スペーサー］にカップリング又は結合されている。ｙがゼロであり、ｍもゼロである実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］に結合されている。
【００６３】
いくつかの実施態様では、ａは１であり、ｂは１である。他の実施態様では、ａは２であり、ｂは１である。いくつかの実施態様では、ｚは１から１８の整数である。他の実施態様では、ｚは２から１６の整数である。さらに他の実施態様では、ｚは２から９の整数である。さらに他の実施態様では、ｚは３から９の整数である。よりさらなる他の実施態様では、ｚは３、４、５又は９のうちのいずれか一つである。
【００６４】
いくつかの実施態様では、ｘは１であり、ｙは１であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ａは１又は２であり、ｂは１であり、ｚは１から１８の整数である。他の実施態様では、ｘは１であり、ｙは０であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ａは１又は２であり、ｂは１であり、ｚは１から１８の整数である。さらなる実施態様では、ｘは１であり、ｙは２であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ｚは３、４、５又は９であり、標識はフルオレセイン又はルオレセイン誘導体である。他の実施態様では、ｘは１であり、ｙは２であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ｚは３、４、５又は９であり、標識はフルオレセイン又はルオレセイン誘導体であり、スペーサーは４から１２個の炭素原子を含む。なおさらなる実施態様では、ｘは１であり、ｙは１であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ａは１又は２であり、ｂは１であり、ｚは１から１８の整数であり、標識はハプテンである。なおさらなる実施態様では、ｘは１であり、ｙは１であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ａは１又は２であり、ｂは１であり、ｚは１から１８の整数であり、標識はハプテンであり、スペーサーは４から１２個の炭素原子を含む。いくつかの実施態様では、式（Ｖ）のａ：ｂの比は、１：１である。他の実施態様では、式（Ｖ）のａ：ｂの比は、２：１である。さらなる他の実施態様では、式（Ｖ）のａ：ｂの比は、３：１である。いくつかの実施態様では、［オリゴ］は、２から２４ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、［オリゴ］は、２から１２ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施態様では、Ｔは、２から８個の炭素原と、特異的結合部分の適切な官能基（例えばアミノ基）と反応する末端官能基（例えば反応性基）とを含む脂肪族基である。いくつかの実施態様では、Ｔは、特異的結合実体（例えば抗体、核酸、薬物／抗体複合体／コンジュゲート）にカップリング、結合又は付着するのに必要な官能性を有する。他の実施態様では、Ｔは、抗体のアミノ基、スルフヒドリル基又は炭水化物基にカップリングするのに必要な官能性を有する。
【００６６】
他の実施態様では、ポリマーは、以下の式（ＶＩａ）の構造を有する。
0006762296.tif 000017
【００６７】
いくつかの実施態様では、式（ＶＩａ）のポリマーは、２から１２個の炭素原子を有するスペーサーと、ハプテン又はフルオレセインのうちの一つから選択される標識とを含み、ｘは１であり、ｙは１である。他の実施態様では、式（ＶＩａ）のポリマーは、２から１２個の炭素原子を有するスペーサーと、ハプテン又はフルオレセインのうちの一つから選択される標識とを含み、ｘは１であり、ｙは１であり、ａは１又は２であり、ｂは１又は２であり、ｚは３、４、５又は９のうちの一つである。他の実施態様では、式（ＶＩａ）のポリマーは、２から１２個の炭素原子を有するスペーサーと、ハプテン又はフルオレセインのうちの一つから選択される標識とを含み、ｘは１であり、ｙは２である。他の実施態様では、式（ＶＩａ）のポリマーは、２から１２個の炭素原子を有するスペーサーと、ハプテン又はフルオレセインのうちの一つから選択される標識とを含み、ｘは１であり、ｙは２であり、ａは１又は２であり、ｂは１又は２であり、ｚは３、４、５又は９のうちの一つである。いくつかの実施態様では、［オリゴ］は、２から２４ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、［オリゴ］は、２から１２ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
さらに他の実施態様では、ポリマーは、以下の式（ＶＩｂ）の構造を有する。
0006762296.tif 000018
【００６９】
いくつかの実施態様では、式（ＶＩｂ）のポリマーは、２から１２個の炭素原子を有するスペーサーと、ハプテン又はフルオレセインのうちの一つから選択される標識とを含み；ｚは３、４、５又は９のうちの一つである。いくつかの実施態様では、［オリゴ］は、２から２４ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、［オリゴ］は、２から１２ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
さらに他の実施態様では、ポリマーは、以下の式（ＶＩｃ）の構造を有する。
0006762296.tif 000019
【００７１】
いくつかの実施態様では、式（ＶＩｃ）のポリマーは、２から１２個の炭素原子を有するスペーサーと、ハプテン又はフルオレセインのうちの一つから選択される標識とを含み；ｚは３、４、５又は９のうちの一つである。いくつかの実施態様では、［オリゴ］は、２から２４ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、［オリゴ］は、２から１２ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００７２】
無論、式（Ｖ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、及び（ＶＩｃ）のポリマーのいずれの５’末端の末端反応性基も、当該技術分野で知られている合成手順により、特異的結合実体の適切な官能基と反応しカップリングし、それぞれのコンジュゲートを形成し得る。いくつかの実施態様では、Ｔの末端反応性部分は、アミノ基、カルボキシル基又はスルフヒドリル基である。いくつかの実施態様では、Ｒは、水素、ヒドロキシル基、カルボニル基、アミノ基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンから選択される。いくつかの実施態様では、Ｒは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、ＮＨ４＋、Ｈ３Ｏ＋から選択されるものを含むカチオンである。いくつかの実施態様では、Ｒは、カルボン酸である。例にすぎないが、Ｒは、Ｏ−Ｒであってもよく、この場合、Ｒはカチオンである。
【００７３】
いくつかの実施態様では、式（Ｉ）、式（Ｖ）又は式（ＶＩａからＶＩｃ）の少なくとも一のポリマー又はそれらの任意の組合せを特異的結合実体にカップリングさせ、例えば以下の式（ＶＩｄ）
0006762296.tif 000020
（式中、「オリゴ」は、１から約３２ヌクレオチドを有する一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド配列であり、オリゴヌクレオチド配列は７０℃未満のＴｍを有し；「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和脂肪族基であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から２４個の炭素原子を有し；「リンカー」は、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有する脂肪族基であり；「標識」は、ハプテン、酵素、色素原、フルオロフォア、及び量子ドットからなる群から選択され；「特異的結合実体」は、抗体、抗体断片、核酸又は薬物／抗体コンジュゲートであり；Ｒは、末端基であり（非限定的な例は水素、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボニル基、リン酸基、ホスホジエステル基又はカチオンを含む）；ｘは、１又は２であり；ｙは、０、１又は２であり；ｚは、１から８の整数であり；ａは、１から８の整数であり；ｂは、１から８の整数である）に示されるようなコンジュゲートであって、「オリゴ」、「スペーサー」又は「リンカー」のいずれも、相互に直接、又は任意の基を介して結合され得；ｙが０の場合、［スペーサー］が結合であり；ｍが０の場合、［リンカー］が結合であるコンジュゲートを形成することができる。ｙがゼロで［スペーサー］が結合である実施態様では、［リンカー］は、存在する場合、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］にカップリング又は結合されている。ｍがゼロで［リンカー］が結合である実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［スペーサー］にカップリング又は結合されている。ｙがゼロであり、ｍもゼロである実施態様では、［標識］は、直接又は任意の基（例えばリン酸基又はホスホジエステル基）を介して［オリゴ］に結合されている。
【００７４】
いくつかの実施態様では、ｘは１であり、ｙは１であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ａは１又は２であり、ｂは１であり、ｚは１から１８の整数である。他の実施態様では、ｘは１であり、ｙは０であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ａは１又は２であり、ｂは１であり、ｚは１から１８の整数である（この場合［スペーサー］は結合であり、［リンカー］は［オリゴ］にカップリングされている）。さらなる実施態様では、ｘは１であり、ｙは２であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ｚは３、４、５又は９であり、標識はフルオレセイン又はルオレセイン誘導体である。他の実施態様では、ｘは１であり、ｙは２であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ｚは３、４、５又は９であり、標識はフルオレセイン又はルオレセイン誘導体であり、スペーサーは４から１２個の炭素原子を含む。なおさらなる実施態様では、ｘは１であり、ｙは１であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ａは１又は２であり、ｂは１であり、ｚは１から１８の整数であり、標識はハプテンである。なおさらなる実施態様では、ｘは１であり、ｙは１であり、ｍは１であり、ｎは１であり、ａは１又は２であり、ｂは１であり、ｚは１から１８の整数であり、標識はハプテンであり、スペーサーは４から１２個の炭素原子を含む。いくつかの実施態様では、式（Ｖ）のａ：ｂの比は、１：１である。他の実施態様では、式（Ｖ）のａ：ｂの比は、２：１である。さらなる他の実施態様では、式（Ｖ）のａ：ｂの比は、３：１である。いくつかの実施態様では、［オリゴ］は、２から２４ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様では、［オリゴ］は、２から１２ｍｅｒを有するオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００７５】
いくつかの実施態様では、複数のポリマーが特異的結合実体にカップリングされる。他の実施態様では、式Ｖ、ＶＩａ、ＶＩｂ、ＶＩｃ又はＶＩｄ（又はそれらの任意の組み合わせ）の約１から約５のポリマーが単一の特異的結合実体にカップリングされる。いくつかの実施態様では、式（ＶＩｄ）のコンジュゲートは、提供された特異的結合実体によって組織試料中の標的と（例えばコンジュゲート−標的複合体を形成するために）結合する検出プローブとして使用される。無論、当業者であれば、複数の標的（例えば複数の遺伝子発現産物及び／又は複数の標的核酸配列）の検出を容易にするために、式（ＶＩｄ）の複数の異なるコンジュゲートが相互のコンジュゲーションにおいて使用され得ることを認めるであろう。
【００７６】
オリゴヌクレオチド
本開示のポリマーは、本明細書に記載されているように、ポリマー骨格の構成部分としてオリゴヌクレオチドを利用するのであり、ポリマー骨格はポリマーが一又は複数の標識用の担体として役立つことを可能にする。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、約１から約５０ヌクレオチド（「ｍｅｒ」）又は約２から約５０ｍｅｒ（すなわち［オリゴ］ｘの［オリゴ］は１から５０は１〜５０ｍｅｒを含み、この場合ｘは１より大きく、［オリゴ］ｘ基は５０ｍｅｒ超を含有し得る）。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、約７０°Ｃ未満の溶融温度（Ｔｍ）を有する。他の実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、約３７°Ｃ未満の溶融温度（Ｔｍ）を有する。他の実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、３５ｍｅｒ未満を含む。さらに他の実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、２から２４ｍｅｒを含む。なおさらなる実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、２０ｍｅｒ以下を含む。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは六量体である。いくつかの実施態様では、配列は、自己相補的構造を形成しないように選択される。
【００７７】
一般に、オリゴヌクレオチド配列は、限定されず、任意の配列を有し得る。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は均一であり、すなわち単一のヌクレオチド（例えばポリＴ配列）を含む。他の実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は不均一であり、すなわち複数のヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは無作為に又は繰り返し基内に編成することができる。さらに他の実施態様では、この配列は、担体としてのみ機能するのではなく、バーコードなどの特定の情報をコードするように設計することができる。特定の例示的に開示された実施態様は、ビルディングブロックオリゴヌクレオチドとしてＴＡＴＴＴＴを使用することに関し、特定の開示されたオリゴヌクレオチドの実施態様は以下を含む。
２４−ｍｅｒ：  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ    （Ｔｍ  ３６．９℃）
３０−ｍｅｒ：  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ    （Ｔｍ  ４２．５℃）
４２−ｍｅｒ：：  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ    （Ｔｍ  ４８．９℃）
６４−ｍｅｒ：  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ  ＴＡＴＴＴＴ ＴＡＴＴＴＴ    （Ｔｍ  ５２．４℃）
【００７８】
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は一本鎖である。他の実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は二本鎖である。さらに他の実施態様では、オリゴヌクレオチド配列は、化学的に修飾することができる。なおさらなる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、目的の配列に対してアンチセンスである。
【００７９】
オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、天然又は合成であり得る。適切なオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオシドアデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、及びウリジン、修飾ヌクレオシド、置換ヌクレオシド又は無置換ヌクレオシド、プリン又はピリミジン塩基、又はそれらの組み合わせから構成され得る。そのようなプリン及びピリミジン塩基には、限定されないが、天然プリン、及びアデニン、シトシン、チミン、グアニン、ウラシル等のピリミジン、又はイソシトシン、６−メチルウラシル、４，６−ジ−ヒドロキシピリミジン、ヒポキサンチン、キサンチン、２，６−ジアミノプリン、５−アザシトシン、５−メチル  システイン等の他のプリン及びピリミジンが含まれる。ヌクレオシドは、非天然ヌクレオシドであってもよい。ヌクレオシドは、天然に存在するホスホジエステル結合又は修飾結合により接合されていてもよい。ヌクレオシドはまた、ホスホロチオエート結合又はメチルホスホネート結合により接合されていてもよい。
【００８０】
標識
ポリマー骨格にカップリングされた標識（例えば式（Ｉ）参照）は、ハプテン、フルオロフォア、色素原、酵素、リガンド、リン光若しくは化学発光剤、又は量子ドット、又は他の任意の適切な実体から選択することができる。選択する標識の種類は、合成するポリマーと、適切な特異的結合実体へのコンジュゲーション後のポリマーの最終的な役割とによって決まる。例えば、いくつかの実施態様では、標識は、ポリマーを抗体にコンジュゲートする場合、直接検出され得るように選択することができる（例えばフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体若しくは類似体）。他の実施態様では、標識は、ポリマーを抗体にコンジュゲートする場合、間接的に検出され得るように選択することができる（例えばハプテンに特異的な二次抗体を用いることによるハプテン標識の検出。この場合二次抗体は、検出可能な部分にコンジュゲートされる）。様々な目的に適した標識の選択についてのガイダンスが、例えばSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)及びAusubel ら, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987)に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に援用される。
【００８１】
「ハプテン」は、抗体と特異的組み合わせることができる小分子であるが、通常、担体分子との組み合わせの場合を除いて、実質的に免疫原性であり得ない。いくつかの実施態様では、ハプテンは、限定されないが、ピラゾール（例えばニトロピラゾール；ニトロフェニル化合物；ベンゾフラザン；トリテルペン；尿素（例えばフェニル尿素）；チオ尿素（例えばフェニルチオ尿素）；ロテノン及びロテノン誘導体；オキサゾール（例えばオキサゾールスルホンアミド）；チアゾール（例えばチアゾールスルホンアミド）；クマリン及びクマリン誘導体；及びシクロリグナンを含む。ハプテンのさらなる非限定的な例には、チアゾール；ニトロアリール；ベンゾフラン；トリテペン（ｔｒｉｐｅｒｐｅｎｅ）；及びシクロリグナンが含まれる。ハプテンの特定の例には、ジ−ニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、及びフルオレセイン、並びにそれらの任意の誘導体又は類似体が含まれる。他のハプテンは、米国特許第８８４６３２０号；第８６１８２６５号；第７６９５９２９号；第８４８１２７０号；及び第９０１７９５４号に記載されており、これらの開示は全体が参照により本明細書に援用される。ハプテン自体は、直接的な検出に適している場合があり、すなわち検出に適したシグナルを発する場合がある。
【００８２】
フルオロフォアは、クマリン、フルオレセイン（又はフルオレセイン誘導体及び類似体）、ローダミン、レゾルフィン、発光団、及びシアニンを含む複数の一般的な化学クラスに属する。蛍光分子のさらなる例は、オレゴン州ユージーンＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓのＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  -  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに見出すことができる。
【００８３】
標識が酵素を含む場合、発色部分、蛍光発生化合物又は発光化合物などの検出可能な基質（すなわち酵素の基質）を酵素と組み合わせて使用して、検出可能なシグナル（多種多様な前記化合物は、例えばオレゴン州ユージーンのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されている）を発生させることができる。発色性化合物／基質の特定の例には、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリン  スルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ-ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β-ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β-Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチル  カルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、及びテトラゾリウムバイオレットが含まれる。
【００８４】
あるいは、酵素を金属組織学的検出スキームにおいて使用することができる。金属組織学的検出法は、水溶性金属イオン及び酵素の酸化還元不活性基質と組み合わせて、アルカリホスファターゼなどの酵素を使用することを含む。いくつかの実施態様では、基質は酵素によって酸化還元活性剤に変換され、酸化還元活性剤は金属イオンを還元して、検出可能な沈殿物を形成する。（例えば、２００４年１２月２０日に出願された米国特許出願第１１／０１５６４６号，、ＰＣＴ公開第２００５／００３７７７号、及び米国特許出願公開第２００４／０２６５９２２号を参照されたい。なお、これらの各々は参照により本明細書に援用される。）金属組織学的検出法は、水溶性金属イオン、酸化剤、及び還元剤とともに酸化還元酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）を用いて、やはり検出可能な沈殿物を形成することを含む。（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第６６７０１１３号を参照されたい。）
【００８５】
いくつかの実施態様において、「標識」は、ジ−ニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ローダミン又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。他の実施態様において、「標識」は、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリテルペン、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン、シクロリグナン又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。さらなる他の実施態様において、「標識」は、５−ニトロ−３−ピラゾール  カルバミド、２−（３，４−ジメトキシフェニル）キノリン−４−カルボン酸）、３−ヒドロキシ−２−キノキサリンカルバミド、２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−５−カルバミド、及び２−アセトアミド−４−メチル−５−チアゾールスルホンアミドからなる群から選択される。
【００８６】
当業者は、ポリマーへの取り込みのための適切な数の標識を選択することができ、標識の数は、検出が直接的であるか間接的であるかに基づいて変化し得る。いくつかの実施態様では、標識の数は、ポリマー当たり１から３６標識である。他の実施態様では、標識の数は、式（Ｉ）のポリマー当たり３から２４標識である。さらなる他の実施態様では、標識の数は、式（Ｉ）のポリマー当たり３から１８標識である。なおさらなる他の実施態様では、標識の数は、式（Ｉ）のポリマー当たり３から１２標識である。他の実施態様では、標識の数は、式（Ｉ）のポリマー当たり３標識、５標識、９標識、１２標識、及び１８標識から選択される。無論、複数のポリマーが単一の特異的結合部分にカップリングされると、特異的結合部分当たりの標識の数は、ポリマーの数及びポリマーにコンジュゲートした標識の数の関数として増加する。例えば、４つのカップリングされたポリマーを有する抗体に関して、各ポリマーが９つの標識を有する場合、この予見的抗体コンジュゲートは、直接的に検出され得るか又は間接的に検出され得る３６の標識を有する。
【００８７】
スペーサー
ポリマーは、一又は複数のスペーサーを含んでもよい。いくつかの実施態様では、「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和基（例えば脂肪族基）であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から３２個の炭素原子を有する。他の実施態様では、「スペーサー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和基（例えば脂肪族基）であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から２４個の炭素原子を有する。さらなる他の実施態様では、「スペーサー」は、置換又は無置換であり得、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有してもよく、４から２４個の炭素原子を有する線状鎖である。
【００８８】
いくつかの実施態様では、「スペーサー」全体がポリマー骨格の一部を構成する。例えば、「スペーサー」が本明細書の式（ＩＸ）のスペーサーの構造を有すると仮定すると、「スペーサー」の両末端は、［オリゴ］基にカップリングされ、「スペーサー」の他の官能基が［Ｂ］基（［標識］及び／又は［リンカー］）を［スペーサー］にカップリングする。「スペーサー」全体がポリマー骨格の一部を構成するいくつかの実施態様では、［Ｂ］基（［標識］及び／又は［リンカー］）は、「スペーサー」の末端又は３’部分にカップリングされる。
【００８９】
「スペーサー」が分岐している場合、又は「スペーサー」が置換されている場合などの他の実施態様では、「スペーサー」のいくつかの構成部分が骨格［Ａ］の一部を形成することができ、他の構成部分は側鎖を形成するか、又は［Ｂ］基の「スペーサー」へのカップリングを補助する。他の実施態様では、任意の「スペーサー」の少なくとも４個の炭素原子、又は４個の炭素原子とヘテロ原子との組み合わせが、ポリマー骨格の一部を含む（例えば式（Ｉ）の［Ａ］を参照）。他の実施態様では、少なくとも６個の炭素原子、又は６個の炭素原子と任意の「スペーサー」のヘテロ原子との組み合わせが、ポリマー骨格の一部を含む。
【００９０】
いくつかの実施態様では、「スペーサー」は、以下の式（ＶＩＩ）：
0006762296.tif 000021
（式中、ｄ及びｅは、各々独立して１から３２の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒｃ）（Ｒｄ）又は第４級アミン（Ｎ＋Ｈ（Ｒｃ）（Ｒｄ））であり；Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである）
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、ｄ及びｅは、各々独立して２から１８の整数である。いくつかの実施態様では、ｄは１から８の整数であり；ｅは２から１６の整数である。他の実施態様では、ｄは２から８の整数であり；ｅは２から１２の整数である。いくつかの実施態様では、式（ＶＩＩ）の「スペーサー」全体がポリマー骨格［Ａ］内に組み込まれる。
【００９１】
他の実施態様では、「スペーサー」は、以下の式（ＶＩＩＩ）：
0006762296.tif 000022
（式中、ｄ及びｅは、各々独立して１から３２の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨ．である）
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、ＱはＯである。いくつかの実施態様では、ｄは１から８の整数であり；ｅは２から１６の整数である。他の実施態様では、ｄは２から８の整数であり；ｅは２から１２の整数である。いくつかの実施態様では、式（ＶＩＩＩ）の「スペーサー」全体がポリマー骨格［Ａ］内に組み込まれる。
【００９２】
さらなる他の実施態様では、「スペーサー」は、以下の式（ＩＸ）：
0006762296.tif 000023
（式中、ｄ及びｅは、各々独立して１から３２の整数である）
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、ｄは１から４であり；ｅは１から８である。いくつかの実施態様では、ｄは１から８の整数であり；ｅは２から１６の整数である。他の実施態様では、ｄは２から８の整数であり；ｅは２から１２の整数である。いくつかの実施態様では、式（ＩＸ）の「スペーサー」全体がポリマー骨格［Ａ］内に組み込まれる。
【００９３】
本開示の特定の開示された実施態様を実施するために有用な、さらなるヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールスペーサーは、２００６年４月２８日出願の米国特許出願第１１／４１３７７８号の「ナノ粒子コンジュゲート」；２００６年４月２７日出願の米国出願第１１／４１３４１５号の「抗体コンジュゲート」；及び２００５年１１月２３日出願の米国仮特許出願第６０／７３９７９４号の「分子コンジュゲート」を含む、譲受人の同時係属中の出願に記載されており、これらの出願のすべては参照により本明細書に援用される。
【００９４】
いくつかの実施態様では、「スペーサー」の構成成分は、「スペーサー」が正味の正電荷を有するように選択される。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、正味の正電荷を有する「スペーサー」は、典型的にはポリマーのオリゴヌクレオチド配列に関連する正味の負電荷を均衡させることができると考えられる。したがって、［スペーサー］又は［オリゴ］−［スペーサー］の電荷は、ポリマー骨格が特定の電子配置を提供し得るように修飾することができると考えられる。
【００９５】
いくつかの実施態様では、適切なスペーサーは、標識を含むポリマー骨格成分間の立体阻害が最小限に抑えられるような、十分な長さ及び／又はサイズのものである。同様に、特定の官能基は、立体相互作用又は他の化学的及び／若しくは物理的相互作用を最小にするように選択され得る。いくつかの実施態様では、スペーサーは、例えば連続するオリゴヌクレオチド成分又は標識成分間の立体阻害を最小限にするように選択され得る。
【００９６】
いくつかの実施態様では、「スペーサー」及び「オリゴ」成分並びにこれらの成分のそれぞれが繰り返し基ごとに繰り返される回数は、−（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−のサイズ又は長さが最適化されるように選択される。「最適化される」とは、「オリゴ」及び「スペーサー」成分（又はこれらの基の構成部分）及び／又はそれぞれが繰り返される回数が、ポリマー骨格の構造により、そこに付着した標識が抗体（例えば二次抗標識抗体）の抗原結合部位間の距離に近似した間隔を空けてか又はそのような間隔で並ぶような配置（例えば特定の空間配置又は電子配置を有すること）であるように選択される。また、例えば式（Ｉ）に関連して、いくつかの実施態様では、［Ａ］の構成成分及び［Ｂ］に対して［Ａ］が繰り返される回数は、ポリマー骨格に付着した標識が二次抗体の抗原結合部位間の距離に近似する距離を相互に空けるように最適化され、この場合二次抗体は標識の検出のために用いられる抗標識抗体である。無論、−（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−は、サイズ又は長さが抗原結合部位間の距離よりも多くても少なくてもよいが、ポリマー骨格内に「柔軟性」があり、それにより空間適合され、抗原結合部位間の距離に「順応」し得ることを当業者は認めるであろう。
【００９７】
例えば、いくつかの実施態様では、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の構成部分は、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の長さが抗体の抗原結合部位間の距離とほぼ同じであるように選択される（図４参照）。他の実施態様では、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の構成部分は、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の長さが抗体の抗原結合部位間の距離に満たないように選択される。他の実施態様では、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の構成部分は、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の長さが約１２ｎｍ未満であるように選択される。他の実施態様では、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の構成部分は、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の長さが約１０ｎｍ未満であるように選択される。他の実施態様では、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の構成部分は、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の長さが約９．５ｎｍ未満であるように選択される。他の実施態様では、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の構成部分は、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の長さが約８ｎｍから１２ｎｍであるように選択される。さらなる他の実施態様では、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の構成部分は、-（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−の長さがが１ｎｍから約３ｎｍであるように選択される。無論、当業者は、選択された−（［オリゴ］−［スペーサー］ｙ）ａ−の構成部分及び得られる長さが利用される特定の抗体に基づくことを認めるであろう。そのような距離を−（［オリゴ］ｘ−［スペーサー］ｙ）ａ−に導入することにより、最大検出感度及び／又は他の特異的結合実体（例えば二次抗体）による標識の結合のために、標識を最適な位置に置き、最適な間隔を保つことが可能になると考えられている（図４参照）。
【００９８】
リンカー
ポリマーは、一又は複数のリンカーを含んでもよい。いくつかの実施態様では、「リンカー」は、分岐又は非分岐状で置換又は無置換の飽和又は不飽和基（例えば脂肪族基）であり、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を有してもよく、４から１８個の炭素原子を有する。
【００９９】
いくつかの実施態様では、「リンカー」全体がポリマー骨格［Ａ］を架橋して「標識」にカップリングする。例えば、「リンカー」が本明細書の式（ＩＸ）のリンカーの構造を有すると仮定すると、「リンカー」の一方の末端はポリマー骨格［Ａ］にカップリングされており、他方の末端は「標識」にカップリングされており、「リンカー」は、ポリマー骨格［Ａ］又は「標識」のいずれかに直接又はリン酸基若しくはホスホジエステル基を含むがこれらに限定されない任意の基を介してカップリングされてもよい。いくつかの実施態様では、任意の「リンカー」の少なくとも４個の炭素原子、又は４個の炭素原子とヘテロ原子との組み合わせが、ポリマー骨格を「標識」にカップリングしている「架橋」の一部を含む。
【０１００】
いくつかの実施態様では、「リンカー」は、以下の式（ＶＩＩ）：
0006762296.tif 000024
（式中、ｄ及びｅは、各々独立して４から１８の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒａ及びＲｂは、独立してＨ、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである）
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、ｄ及びｅは、各々独立して４から１２の整数である。
【０１０１】
他の実施態様では、「リンカー」は、以下の式（ＶＩＩＩ）：
0006762296.tif 000025
（式中、ｄ及びｅは、各々独立して４から１８の整数であり；Ｑは、結合、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｒｃ）（Ｒｄ）であり；Ｒｃ及びＲｄは、独立してＣＨ３又はＨである）
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、ＱはＯである。
【０１０２】
さらなる他の実施態様では、「リンカー」は、以下の式（ＩＸ）：
0006762296.tif 000026
（式中、ｄ及びｅは、各々独立して４から１８の整数である）
に示す構造を有する。いくつかの実施態様では、ｄは４から８の整数である。
【０１０３】
アルキレンオキシド「リンカー」は、エチレングリコールなどのグリコールを参考にして本明細書に示す。本開示のハプテンコンジュゲートは、「リンカー」の親水性が該コンジュゲートの炭化水素鎖に対して増加している場合に特に有用であることが判明している。結果として、グリコールなどのアルキレンオキシドは、この開示を実施するために有用であることが判明している。当業者であれば、酸素原子の数が増加するにつれて、化合物の親水性もまた増加し得ることを理解するであろう。したがって、本開示の「リンカー」は一般に、Ｑが酸素である式（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、及び（ＩＸ）によって表される構造を有する。本開示の特定の開示された実施態様を実施するために有用な、さらなるヘテロ二官能性ポリアルキレングリコールスペーサーは、２００６年４月２８日出願の米国特許出願第１１／４１３７７８号の「ナノ粒子コンジュゲート」；２００６年４月２７日出願の米国出願第１１／４１３４１５号の「抗体コンジュゲート」；及び２００５年１１月２３日出願の米国仮特許出願第６０／７３９７９４号の「分子コンジュゲート」を含む、譲受人の同時係属中の出願に記載されており、これらの出願のすべては参照により本明細書に援用される。
【０１０４】
ポリマーの例
ポリマーの例１
一つの特定の実施態様において、ポリマーは、以下の式（Ｘａ）：
５’（アミノＣ６）−ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］Ｔ        （Ｘａ）
に示される構造を有し、
上式中、アミノＣ６は、６個の炭素原子を有する末端官能基（例えば反応性基）及び特異的結合実体にカップリングし得る第一級又は第二級アミンを表し；［ＴＡＴＴＴＴ］は、オリゴヌクレオチド配列であり；ＤＮＰはハプテンである。この特定の例では、「スペーサー」は存在せず、ＤＮＰは「リンカー」（図示せず）を介してポリマー骨格にカップリングされている。この例では、オリゴヌクレオチド配列を［ＴＡＴＴＴ］として表しているが、ヌクレオチドの任意の組み合わせを有するより長い又はより短い配列を利用することもできる。この特定の実施態様は、３つの標識及び３つのオリゴヌクレオチド配列を含むものとして示されている。無論、この特定の実施態様は、スペーサーを含むように変更することができる。
【０１０５】
ポリマーの例２
５’（アミノＣ６）−ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］Ｔ        （Ｘｂ）
例２は、４つの標識及び４つのオリゴヌクレオチド配列を含有すること以外は、例１のポリマーと同様である。例１と同様に、この特定の実施態様は、スペーサーを含むように変更することができ、リンカーを介して骨格にＤＮＰをカップリングすることができる。
【０１０６】
ポリマーの例３
別の特定の実施態様において、ポリマーは、以下の式（Ｘｃ）：
５’（アミノＣ６）−ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］Ｔ        （Ｘｃ）
に示される構造を有し、
上式中、アミノＣ６は、特異的結合実体にカップリングし得る末端官能基を表し；［ＴＡＴＴＴＴ］は、オリゴヌクレオチド配列であり；ＤＮＰはハプテンである。この特定の例では、「スペーサー」は存在せず、ＤＮＰは「リンカー」（図示せず）を介してポリマー骨格にカップリングされている。この例では、オリゴヌクレオチド配列を［ＴＡＴＴＴ］として表しているが、ヌクレオチドの任意の組み合わせを有するより長い又はより短い配列を利用することもできる。この特定の実施態様は、５つの標識及び５つのオリゴヌクレオチド配列を含むものとして示されているが、以下の例４で示すように、９つの標識及び９つのオリゴヌクレオチド配列を含む変異体も考えられる。例３及び４は、スペーサーを含むように変更することができる。
【０１０７】
ポリマーの例４
例４は、９つの標識及び９つのオリゴヌクレオチド配列を含有すること以外は、例３のポリマーと同様である。例３と同様に、この特定の実施態様は、スペーサーを含むように変更することができ、リンカーを介して骨格にＤＮＰをカップリングすることができる。
５’（アミノＣ６）−ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］  ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］ＴＡＴＴＴＴ［ＤＮＰ］Ｔ        （Ｘｄ）
【０１０８】
ポリマーの例５
別の特定の実施態様において、ポリマーは、以下の式（Ｘｅ）：
５’（アミノＣ６）−ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＤＮＰ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＤＮＰ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＤＮＰ］
ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＤＮＰ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＤＮＰ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＤＮＰ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＤＮＰ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＤＮＰ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＤＮＰ］Ｔ        （Ｘｅ）
に示される構造を有し、
上式中、アミノＣ６は、特異的結合実体にコンジュゲートし得る末端官能基を表し；［ＴＡ］は、オリゴヌクレオチド配列であり；［ＳＰ〜Ｃ１８］は、少なくとも１８個の原子を含むスペーサーであり；  ＤＮＰはハプテンである。ＤＮＰは、「リンカー」（図示せず）を介してポリマー骨格にカップリングされている。この例では、オリゴヌクレオチド配列を［ＴＡ］として表しているが、ヌクレオチドの任意の組み合わせを有するより長い配列を利用することもできる。この特定の実施態様は、９つの標識、９つのスペーサー、及び９つのオリゴヌクレオチド配列を含むが、５つの標識、５つのスペーサー、及び５つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体；並びに３つの標識、３つのスペーサー、及び３つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体のものも考えられる。
【０１０９】
ポリマーの例６
別の特定の実施態様において、ポリマーは、以下の式：
５’（アミノＣ６）−ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［Ｆｌ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［Ｆｌ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［Ｆｌ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［Ｆｌ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［Ｆｌ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［Ｆｌ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［Ｆｌ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［Ｆｌ］ＴＡ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［Ｆｌ］Ｔ        （Ｘｆ）
（Ｘｆ）により示される構造を有し、
上式中、アミノＣ６は、特異的結合実体にカップリングし得る末端官能基を表し；［ＴＡ］は、オリゴヌクレオチド配列であり；［ＳＰ〜Ｃ１８］は、少なくとも１８個の原子を含むスペーサーであり；［ＦＩ］はフルオレセイン（又はフルオレセイン誘導体）などのフルオロフォアである。ＦＩは、「リンカー」（図示せず）を介してポリマー骨格にカップリングされている。この例では、オリゴヌクレオチド配列を［ＴＡ］として表しているが、ヌクレオチドの任意の組み合わせを有するより長い配列を利用することもできる。この特定の実施態様は、９つの標識、９つのスペーサー、及び９つのオリゴヌクレオチド配列を含むが、５つの標識、５つのスペーサー、及び５つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体；４つの標識、４つのスペーサー、及び４つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体のもの；並びに３つの標識、３つのスペーサー、及び３つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体のものも考えられる。
【０１１０】
ポリマーの例７
別の特定の実施態様において、ポリマーは、以下の式（Ｘｇ）：
５’（アミノＣ６）−Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＦＩ］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＦＩ］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＦＩ］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＦＩ］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＦＩ］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＦＩ］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＦＩ］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＦＩ］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］Ｔ［Ｓｐ〜Ｃ１８］［ＦＩ］Ｔ        （Ｘｇ）
により示される構造を有し、
上式中、アミノＣ６は、特異的結合実体にカップリングし得る末端官能基を表し；［Ｔ］は、オリゴヌクレオチド配列であり；［ＳＰ〜Ｃ１８］は、少なくとも１８個の原子を含むスペーサーであり；［ＦＩ］はフルオレセイン（又はフルオレセイン誘導体）などのフルオロフォアである。ＦＩは、「リンカー」（図示せず）を介してポリマー骨格にカップリングされている。この特定の実施態様では、ポリマー骨格は、２つのオリゴヌクレオチド配列と２つのスペーサーを交互配置で含む。［ＦＩ］基は、このポリマー骨格にコンジュゲートされる。この例では、オリゴヌクレオチド配列を［Ｔ］として表しているが、ヌクレオチドの任意の組み合わせを有するより長い配列を利用することもできる。この特定の実施態様は、９つの標識、９つのスペーサー、及び９つのオリゴヌクレオチド配列を含むが、５つの標識、５つのスペーサー、及び５つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体；４つの標識、４つのスペーサー、及び４つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体のもの；並びに３つの標識、３つのスペーサー、及び３つのオリゴヌクレオチド配列を含む同様の変異体のものも考えられる。
【０１１１】
ポリマーコンジュゲート
いくつかの実施態様では、本明細書に記載のポリマーは、式（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）又は（ＶＩｄ）に示すような特異的結合実体にカップリングすることができる。いくつかの実施態様では、少なくとも一のポリマーが特異的結合実体にカップリングされる。他の実施態様では、式（Ｉ）、（Ｖ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）又は（ＶＩｃ）のいずれかの又は式（ＸａからＸｇ）におけるポリマーを含めた複数のポリマーが特異的結合実体にカップリングされている。いくつかの実施態様では、特異的結合実体は、核酸配列である。他の実施態様では、特異的結合実体は、抗体、例えば一次抗体である。さらなる他の実施態様では、特異的結合実体は、薬物／抗体コンジュゲートである。
【０１１２】
本明細書に開示されるコンジュゲートは、検出プローブとしての役割を果たし、ＩＳＨ、ＩＨＣ、及び他のアッセイ（例えば免疫検出アッセイ、フローサイトメトリー、顕微鏡検査、イメージング、高コントラスト含有量スクリーニング(high contrast content screening)、免疫細胞化学アッセイ、免疫磁気細胞枯渇  アッセイ、免疫磁気細胞捕捉アッセイ、酵素免疫アッセイ、酵素結合免疫アッセイ等）において利用することができる。いくつかの実施態様では、ポリマーコンジュゲートは、多重検出アッセイにおける使用に適している。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のコンジュゲートは、組織試料内の標的を検出できるような検出プローブとして役立つ。例えば、ポリマー−抗体コンジュゲートを使用して、特定の遺伝子発現産物を検出することができる。例えば、ポリマー−抗体コンジュゲートは、がんに関連するタンパク質、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ（又はＨＥＲ２タンパク質）、ｃ−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ、Ａｂｌ、ＥＧＦＲタンパク質、ＴＯＰ２Ａ、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ６、Ｒｂ１、ｐ５３又はｃ−Ｍｅｔ一次抗体を検出する抗体を含んでもよい。本開示のコンジュゲート（抗体コンジュゲート及び核酸コンジュゲートを含む）で検出することができる他の標的は、本明細書にさらに記載される（ただし本明細書に示される例に限定されない）。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、一又は複数のポリマーを一次抗体にカップリングさせて、ポリマー−抗体−コンジュゲート（「コンジュゲート」又は「抗体コンジュゲート」）を形成する。任意の特定の一次抗体にカップリングすることができるポリマーの数は、当然、選択した特定の抗体と、その物理的及び／又は化学的特性に依存する。いくつかの実施態様では、標識化の程度である抗体当たりのポリマーの数は、当該コンジュゲート抗体の吸収スペクトルによって決定され、約２から約４の範囲である。他の実施態様において、標識化の程度は、約２より大きい。他の実施態様において、標識化の程度は、約２．５又は２．３又は２．１である。さらに他の実施態様において、標識化の程度は、約４である。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、比較的低い程度の標識化は、抗体の機能性（例えば標識化抗体の抗原結合性又は長期安定性）への有害作用を防止又は緩和すると考えられる。例えば、特異的結合実体に付着した少数のポリマー（本明細書中に記載の構造を有する）は、立体相互作用を防止又は緩和するのを妨げると考えられる。
【０１１４】
ポリマーは、抗体の任意の部分にカップリングすることができる。抗体における３つの官能基は、共有結合修飾部位である、アミン（−ＮＨ２）、チオール基（−ＳＨ）、及び炭水化物残基である(Shrestha D、et al、2012)。そのため、本明細書に開示のポリマーのいずれも、アミン残基、チオール残基、及び炭水化物残基又はそれらの任意の組み合わせにカップリングすることができる。いくつかの実施態様では、ポリマーは、抗体のＦｃ部分にカップリングされる。他の実施態様では、ポリマーは、抗体のヒンジ領域にカップリングされる。いくつかの実施態様では、ポリマーは、抗体の一又は複数のＦｃ領域及び抗体の一又は複数のヒンジ領域にカップリングされる。実際、任意の組み合わせが、本開示により企図されている。
【０１１５】
抗体中にこれらの部分が豊富であることを主な理油として、アミノ基が一般に好ましい。リジン、アルギニン、及びヒスチジンは、アミン側鎖を含み、全タンパク質組成のほぼ１０％を構成する３つの主要アミノ酸である。しかしながら、アミノ基のランダム性は、抗体が失活する危険性をもたらす。(Adamczyk M, et al, 1999, Bioconjug Chem ; Jeanson A, et al, 1988, J Immunol Methods; Vira S, et al, 2010, Anal Biochem; Pearson JE et al, 1998, J Immunol Methods)。いくつかの実施態様では、一又は複数のポリマーは、抗体のアミノ基とカップリングされている。
【０１１６】
他方、適切な反応条件下で、スルフヒドリル標識化は、ヒンジ領域における抗体の二つの重鎖間のジスルフィド結合の高い特異性を標的とする。ヒンジ領域は抗原結合部位から離れているため、この修飾は抗体の結合親和性をより良好に保持すると考えられる。しかしながら、その欠点は、比較的低いレベルの標識化（例えば通常、抗体当たり３つ未満の標識）である。いくつかの実施態様では、一又は複数のポリマーは、抗体のチオール基とカップリングされている。
【０１１７】
抗体のＦｃ部分に存在する炭水化物部分でのコンジュゲーションは、チオール基のそれと同様であり、その結果抗原結合部位から離れた−ＣＨＯ基で修飾が起こる。ここでもまた、いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、炭水化物でのコンジュゲーションは、抗体の抗原結合親和性に対する負の影響が少ないと考えられる。標識化の程度は、特異的抗体のグリコシル化状態に依存して変化する。しかし、それにもかかわらず、抗体親和性の損失は、Jeanson Aら, 1988, J Immunol Methodsにより報告されている。いくつかの実施態様では、一又は複数のポリマーは、抗体の炭水化物基とカップリングされている。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、（検出プローブとして使用される）複数の異なるポリマー−抗体コンジュゲートを、組織試料内の複数の標的を検出するための多重アッセイにおいて使用することができる。
【０１１９】
いくつかの実施態様では、コンジュゲート及びゆえに標的は、直接検出することができる（フルオレセイン又はフルオレセイン誘導体などの標識）。他の実施態様では、コンジュゲートは、直接検出することができる。
【０１２０】
検出試薬
ポリマーコンジュゲートが間接的に検出される実施態様では、コンジュゲート及びゆえに標的の検出を可能にするために特異的試薬が利用される。いくつかの実施態様では、ポリマーコンジュゲートの標識に特異的な検出試薬が利用される。いくつかの実施態様では、検出試薬は、ポリマーコンジュゲートの標識に特異的な二次抗体を含む。すなわち、二次抗体は抗標識抗体である。二次抗体は、ポリマーコンジュゲートの検出を達成するために「検出可能な部分」にコンジュゲートしてもよい。
【０１２１】
いくつかの実施態様では、検出試薬は、米国特許公開第２０１３／０２６０３７９号に記載されているような「標識コンジュゲート」及び「シグナル伝達コンジュゲート」を含み、その開示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０１２２】
検出可能な部分
「検出可能な部分」は、試料中の標識の存在（すなわち定性分析）及び／又は濃度（すなわち定量分析）を示す、（例えば視覚的に、電子的に又は他の方法で）検出可能なシグナルを生成し得る分子又は材料である。検出可能なシグナルは、光子（無線周波数、マイクロ波周波数、赤外周波数、可視周波数、及び紫外周波数の光子を含む）の吸収、放射、及び／又は散乱を含めた、任意の知られている機構又は未だ発見されていない機構により生成することができる。
【０１２３】
いくつかの実施態様では、検出可能な部分は、本明細書において識別される「標識」として列挙した薬剤から選択され得る。他の実施態様では、検出可能な部分は、発色性、蛍光性、リン光性、及び発光性分子並びに材料、一つの物質を別の物質に変換して、（例えば、無色物質を着色物質に変換するか若しくはその逆によって、又は沈殿物を生成することによって、又は試料の濁度を増加させることによって）検出可能な相違をもたらす触媒（例えば酵素）、追加の検出可能に標識された抗体コンジュゲートを使用し、抗体−ハプテン結合相互作用によって検出することができるハプテン（例えば、本明細書では「標識」として列挙したもの）、並びに常磁性及び磁性分子又は材料を含む。
【０１２４】
他の実施態様において、検出可能な部分は、酵素である。例えば、ポリマーコンジュゲートの標識に特異的であり、それ自体が酵素（例えば標識コンジュゲート）にコンジュゲートしている検出試薬を利用することができる。特定の例として、二次抗体（例えば抗標識抗体）は、二次抗体が標識に特異的である酵素にコンジュゲートすることができる。いくつかの実施態様では、適切な酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｂ−ガラクトシダーゼ、Ｂ−グルクロニダーゼ又はＢ−ラクタマーゼが含むが、これらに限定されない。他の実施態様では、酵素は、オキシドレダクターゼ
又はペルオキシダーゼ（例えばＨＲＰ、ＡＰ）を含む。これらの実施態様では、検出試薬（例えば標識コンジュゲート）にコンジュゲートされた酵素は、発色基質（又はシグナル伝達コンジュゲート）の、標的に近位の試料に又は標的に直接共有結合する反応性部分への変換を触媒する。
【０１２５】
無論、検出可能な部分自体も間接的に検出することができる。例えば、検出可能な部分がハプテンである場合、当業者に知られているように、その検出可能な部分に特異的なさらに別の抗体を検出可能な部分の検出に利用することができる。
【０１２６】
検出キット
いくつかの実施態様では、本開示のコンジュゲートは、「検出キット」の一部である。一般に、いずれの検出キットも、コンジュゲート（検出プローブ）及びコンジュゲートを検出するための検出試薬（検出可能な部分を含む）を含む。
【０１２７】
検出キットは、検出キットを介して標的を検出できるように、コンジュゲート（例えば抗体コンジュゲート）を含む第一の組成物と、その第一の組成物に特異的な検出試薬を含む第二の組成物とを含み得る。いくつかの実施態様では、検出キットは、異なる標的を検出するための複数のコンジュゲートを含み、各キットはキット内に含まれるコンジュゲートのそれぞれに特異的な検出試薬も含む。
【０１２８】
一例として、キットは、第一の標識を有する第一の標的に特異的な抗体コンジュゲート（第一の検出プローブ）と、第二の標識を有する第二の標的に特異的な抗体コンジュゲート（第二の検出プローブ）とを有する第一の標的に特異的な抗体コンジュゲートを含み得る。この特定の実施態様において、第一及び第二の検出プローブの抗体及び標識は変化し得るが、コンジュゲートのオリゴヌクレオチド、スペーサー、及び／又はリンカーの選択は、同じであっても異なっていてもよい。すなわち、各コンジュゲートのポリマー骨格は、同じであっても異なっていてもよい。キットは、検出プローブの各々に特異的な検出試薬をさらに含んでもよい。例えば、標識が酵素である場合、酵素の基質が含まれてもよい。一方、これも一例にすぎないが、標識がハプテンである場合、抗ハプテン抗体は、ハプテンに結合するために任意のキット内に含まれていてもよく、抗ハプテン抗体は、検出のための検出可能な部分を含む（例えば、図５Ａ参照）。
【０１２９】
キットは、手動又は自動の標的検出のために必要に応じて、緩衝液；対比染色剤；酵素不活性化組成物；脱パラフィン溶液等を含めた他の薬剤を含んでもよい。
【０１３０】
検出方法
本開示はまた、本明細書に記載のコンジュゲートのいずれかを用いて標的を検出する方法も企図する。特定の実施態様では免疫組織化学のための抗体又は抗体コンジュゲートの使用に触れているものの、他の特異的結合実体（例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための核酸）も企図されており、当業者に知られている方法に従って使用してもよい。
【０１３１】
本開示はまた、自動多重検出を含む多重検出の方法を提供する。図６及び７には、本開示の方法の特定の実施態様の工程の概要を表すフロー模式図が提供されており、コンジュゲートは、間接的に検出される標識を含む。特に本方法は、工程１において、試料が本明細書に開示のコンジュゲート（検出プローブ）と接触される連続多重検出スキームを記載する。コンジュゲートが試料に導入されると、コンジュゲートはコンジュゲート標的複合体を形成するであろう。続く工程２は、試料を検出試薬と接触させることを含む。検出試薬は、図７の工程３ａ及び３ｂに示すように、標識コンジュゲート及び発色基質又はシグナル伝達コンジュゲートを含むことができる。さらに続く工程４（任意）は、試料を酵素阻害組成物と接触させることを含む。破線は、工程１から４のプロセスが１回以上繰り返されて、組織試料内の標的の連続的な多重検出を提供し得ることを示す。この方法はまた、試料を光で照らす工程５と、工程６で標的を検出することとを含む。図６及び図７は、すべての標的が同時に検出されることを示しているが、これらの標的は、本明細書に開示の多重方法中の任意の時点で検出され得る。さらに、本開示の多重検出アッセイは、同時又は連続的であってもよい。例えば、異なるコンジュゲートの各々は、同時に又は連続して添加してもよいが、それは検出試薬を添加する前である。別の例として、検出試薬を導入する前に、工程１で三のコンジュゲートを連続的に適用してもよい。
【０１３２】
本開示による多重アッセイのさらなる例として、第一の標識を含む第一の標的に特異的な第一の抗体コンジュゲートを試料に導入する。いくつかの実施態様では、第一の抗体コンジュゲートは、検出可能な第一の標的−抗体コンジュゲート複合体を形成する。同時に又はその後に、第二の標識を含む第二の標的に特異的な第二の抗体コンジュゲートを試料に導入し、第二の標的−抗体コンジュゲートを形成する。ここで第一のコンジュゲートの第一の標識は、第二のコンジュゲートの第二の，標識とは異なる。（「ｎ」個の標的抗体−複合体を形成する）他の標的に特異的であり、且つさらに異なる標識を有する第三、第四、及び第ｎのさらなる抗体コンジュゲートを連続的に、又は第一及び／若しくは第二の抗体コンジュゲートと同時に、またさらに導入してもよい。抗体コンジュゲートは、沈着した後、当然コンジュゲートの標識に応じて、直接又は間接的に検出することができる。いくつかの実施態様では、さらなる試薬が標的の検出を可能にするために導入され、そのさらなる試薬は、本明細書に記載の検出可能な部分を含む。いくつかの実施態様では、標識は、直接検出可能なフルオレセイン である。他の実施態様では、標識が酵素である場合、着色沈殿物を検出できるように、酵素の基質（検出可能な部分）を導入することができる。さらに他の実施態様では、抗標識抗体（二次抗体）を導入して検出を誘導する。ここで抗標識抗体は、コンジュゲートの標識に特異的である。例えば、標識がハプテンである場合、ハプテン標識に特異的な抗ハプテン抗体が導入され、抗ハプテン抗体は検出可能な部分を含む。いくつかの実施態様では、抗ハプテン抗体の検出可能な部分は酵素であり、酵素の基質をさらに導入してコンジュゲート及び標的を検出する。
【０１３３】
複数の発色試薬が連続的に検出され、検出で酵素が用いられる多重アッセイの場合、連続する検出工程間の任意の試薬又は内因性酵素を不活性にすることが望ましい。その結果、どれか一つの検出工程に存在する酵素が、後の検出工程において酵素と干渉しないであろうと考えられる。これは、ひいては多重アッセイで使用される異なる検出可能な部分の視覚化及び検出に対する改善になると考えられている。当該技術分野で周知の任意の酵素不活性化組成物をこの目的のために使用することができる。いくつかの実施態様では、酵素不活性化組成物を適用して、各検出工程後に試薬又は内因性酵素を不活性にする。例示的な酵素不活性化組成物は、同時係属中の米国特許出願第６２／１５９２９７号に開示されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１３４】
いくつかの実施態様では、変性工程は、第一の検出試薬セットにおいて使用される酵素が第二の基質に作用するのを妨げる。いくつかの実施態様では、変性剤は、第一の検出試薬セット中の酵素を変性させる物質である。いくつかの実施態様では、変性剤は、例えばホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素若しくは尿素系変性剤、チオウレア、塩酸グアニジン又はそれらの誘導体である。アルキル置換アミドの例には、Ｎ−プロピルホルムアミド、Ｎ−ブチルホルムアミド、Ｎ−イソブチルホルムアミド、及びＮ、Ｎ−ジプロピルホルムアミドが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、変性剤は緩衝液中に提供される。例えば、ホルムアミドは、２０ｍＭの硫酸デキストラン（５０〜５７％の％ホルムアミド（ＵｌｔｒａＰｕｒｅホルムアミドストック）、２×ＳＳＣ（０．３Ｍのクエン酸塩及び３ＭのＮａＣｌ含有２０×ＳＳＣストック）、２．５ｍＭのＥＤＴＡ（０．５ＭのＥＤＴＡストック）、５ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）（１ｍＭのトリス、ｐＨ７．４ストック）、０．０５％のＢｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル含有１０％ストック）（ｐＨ７．４）を含むハイブリダイゼーション緩衝液中に提供されてもよい。いくつかの実施態様では、第一の標的プローブ検出酵素、例えばアルカリホスファターゼを変性させるのに十分な時間及び条件下で、変性剤で試料を処理する。いくつかの実施態様では、試料は、約３７℃で約１５から約３０分間、好ましくは約２０から２４分間変性剤で処理される。いくつかの実施態様では、第二の核酸プローブの標的へのハイブリダイゼーションを維持しながら、標的酵素を変性させるのに十分な時間及び条件下で、変性剤で試料を処理する。
【０１３５】
別の実施態様、及び図５Ｂに関連して図示されている実施態様では、第一の標的としてＣＤ３などの標的を選択することを示す。抗ＣＤ３−ポリマーハプテン１コンジュゲートを試料に添加して、ＣＤ３標的と結合させる。二次抗ハプテン１抗体（検出試薬）を試料に適用して、ハプテン１と結合させる。二次抗ハプテン１はまた、それ（検出可能な部分）にカップリングされた、既知の波長で蛍光を発するフルオロフォアを含み、それにより標的識別子としての役割を果たし、ＣＤ３標的に関連するアセンブリされた抗体−ポリマーハプテン１複合体の可視化が可能になる。図５Ｂの実施態様は４つのハプテンが利用されることを示しているが、本明細書に開示しているように、任意の数のハプテンを組み込むことができる。
【０１３６】
この方法は、多重アッセイで継続することができる。図５Ｂは、ＣＤ８を検出するために抗ＣＤ８−ポリマーハプテン２抗体を；ＣＤ２０を検出するために抗ＣＤ２０−ポリマーハプテン３抗体を；ＣＤ６８を検出するために抗ＣＤ６８−オリゴヌクレオチドハプテン４抗体を；ＦｏｘＰ３を検出するために抗ＦｏｘＰ３−ポリマーハプテン５抗体使用することを図解している。多重アッセイにおける抗体検出可能な部分のアセンブリに必要な試薬は、手動アッセイを用いて、又は自動染色装置を用いて、試料に同時に又は連続的に適用することができる。
【０１３７】
標本処理装置は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．により販売されているＢＥＮＣＨＭＡＲＫ  ＸＴ装置及びＳＹＭＰＨＯＮＹ装置などの自動装置とすることができる。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．は、自動分析を実行するためのシステム及び方法を開示している、米国特許第５６５０３２７号、第５６５４２００号、第６２９６８０９号、第６３５２８６１号、第６８２７９０１号及び第６９４３０２９号、並びに米国特許出願公開第２００３０２１１６３０号及び第２００４００５２６８５号を含めた複数の米国特許の譲受人であり、これらの各々は、全体が参照により本明細書に援用される。あるいは、標本を手動で処理することもできる。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、標本がパラフィン包埋された試料である場合、適切な脱パラフィン液を用いて試料を脱パラフィン化することができる。廃棄物除去剤が脱パラフィン液を除去した後、任意の数の物質を標本に連続的に適用することができる。前記物質は、前処理（例えばタンパク質架橋、核酸の曝露など）、変性、ハイブリダイゼーション、洗浄（例えばストリンジェンシー洗浄）、検出（例えば視覚的又はマーカー分子をプローブに連結する）、増幅（タンパク質、遺伝子などの増幅）、対比染色、カバースリッピングなどのためである。
【０１３９】
標本を処理した後、ユーザは、解析又は他の下流の処理のために標本搭載スライドを画像化装置に移してもよい。例えば、画像化装置は、明視野イメージャスライドスキャナーであってもよい。一つの明視野イメージャは、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．により販売されているｉＳｃａｎ  ＣｏｒｅｏＴＭ明視野スキャナーである。自動化の実施態様では、画像化装置は、画像化システム及び技術(IMAGING SYSTEM AND TECHNIQUES)と題された国際特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２（特許公開番号：  国際公開第２０１１／０４９６０８号）、又は画像化システム、カセット、及びそれらの使用方法（IMAGING SYSTEMS, CASSETTES, AND METHODS OF USING THE SAME）と題された、２０１１年９月９日出願の米国特許出願第６１／５３３１１４号に開示されているようなデジタル病理装置である。国際特許出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２及び米国特許出願第６１／５３３１１４号は、全体が参照により援用される。他の実施態様では、画像化装置は、顕微鏡にカップリングされたデジタルカメラを含む。
【０１４０】
合成
本開示は、ポリマー−抗体コンジュゲートを作製するための方法の例示的な実施態様を提供する。適切なコンジュゲーション方法もまた、当業者に一般的に知られているであろう。例えば、参照により本明細書に援用される米国特許出願第２０１３／０１８４１８４号を参照されたい。特定の例示的な実施態様では、コンジュゲーションは、抗体のヒンジ又はＦｃ領域で達成することができる。抗体のヒンジ領域におけるジスルフィド結合は、典型的にはＤＴＴを使用する穏やかな還元を用いて選択的に減少させることができる。次いで、得られたスルフヒドリル結合を、マレイミド−ｄＰＥＧ８−ハプテンエステルリンカーなどで標識化する。単なる一例として、ポリマー−抗体コンジュゲートを形成するための一つの方法を以下のスキーム１に示す。この方法は一般に、抗体２を５−ＨｙＮｉｃ４と反応させ、５−ＨｙＮｉｃ−抗体コンジュゲート６を形成させることを含む。別個に、（ポリマーの一部である）３’−又は５’−アミノ修飾オリゴヌクレオチド８をＳ−４ＦＢ１０と反応させ、４ＦＢ−ポリマー１２を形成する。次いで、触媒の存在下で５−ＨｙＮｉｃ−抗体コンジュゲート６を４ＦＢ−オリゴ１２にカップリングさせ、ｂｕｓ−アリールヒドラジンによりポリマーのオリゴヌクレオチド部分にカップリングされた抗体を含むコンジュゲート１４を形成する。代替合成スキームを図８に示す。
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【０１４１】
スキーム1：  本開示のポリマーに抗体をカップリングし、ポリマー−抗体コンジュゲートを提供する合成方法。
特定の実施態様では、式（Ｉ）のポリマーにコンジュゲートされる抗体は、目的の特異的抗原に対するモノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、式（Ｉ）のポリマーのようなポリマーにコンジュゲートされ、コンジュゲートを形成し得る。適切な末端反応性基（例えばアミノ基）を有するポリマーは、固相ホスホラミダイト化学を用いて調製することができる。スルホ−スクシンイミジル活性化４−ホルミルベンゾエート（Ｓ−４ＦＢ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、ポリマー（例えばポリマーの［オリゴ］部分）を修飾し、活性化することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドを含むポリマーは、末端４ＦＢホスホラミダイトモノマーを用いた固相ホスホラミダイト化学を用いて調製することができる。ポリマーのオリゴヌクレオチド骨格は、例えば代替的な骨格、塩基又は不活性リンカー又は幾何学構造を組み込むために、異なる長さ、異なる化学的性質を有し得る。さらに、４ＦＢ部分は、複数の代替的な化学によって、又は酵素を用いる生化学的手段によって組み込まれ得る。４ＦＢ部分は、オリゴヌクレオチドの３‘末端又は５’末端のいずれかに、又はその中間に、又はいずれかの末端の近くに配置することができる。
【０１４２】
並行して、スルホ−スクシンイミジル活性化６−ヒドラジノピリジン−３−カルボキシレート（ＳＨｙＮｉｃ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドと第一級アミン（例えばリジンアミノ酸イプシロンアミノ基(Lysine amino acid epsilon amino group)）との反応を介して、抗体又は他のタンパク質、生体分子、核酸又は他のプローブが合成され、タンパク質の表面に多く認められる一又は複数のＨｙＮｉｃ部分を組み込むであろう。抗体の各モル当量に対するＳ−ＨｙＮｉｃの過剰当量を使用することができる。精製された４ＦＢ修飾ポリマー（上記）及びＨｙＮｉｃ修飾抗体は、典型的には抗体に対してモル過剰のポリマーを用いて組み合わされる。ビスアリールヒドラゾン結合が形成され、抗体−ポリマーコンジュゲートが提供される。本明細書に開示しているような複数のポリマーの抗体へのコンジュゲーションは、電気泳動によって決定することができる。この方法は、ＨｙＮｉｃ−修飾抗体、４ＦＢポリマー、及び各抗体にカップリングされた一又は複数のポリマーとの抗体−ポリマーコンジュゲートの混合物を生じる。抗体に対するＳ−ＨｙＮｉｃのモル比、及びＨｙＮｉｃ修飾抗体に対する４ＦＢ修飾ポリマーのモル比を変化させることによって、抗体の本質的にすべて又はほぼすべてをそれぞれのコンジュゲートに変換することができる。抗体−ポリマーコンジュゲートは、例えば磁気親和性ビーズを使用することによって単離され得る。
【０１４３】
抗体−ポリマーコンジュゲートを形成するためのコンジュゲーション反応の化学量論は、１当量の修飾抗体及び少なくとも０．５当量の修飾ポリマーを含むことができる。当業者は、前記化学量論が上記以外、例えば、抗体に対して少なくとも１．０当量、少なくとも１．５当量、少なくとも２．０当量、少なくとも２．５当量、少なくとも３．０当量、少なくとも３．５当量又は少なくとも４．０当量のポリマーであってもよいことを理解するであろう。抗体当たりのポリマーの数も、希望に応じて調節することができる。特定の操作理論に限定されることを望むものではないが、抗体機能を維持するために、抗体当たりのオリゴヌクレオチドの数を制限することによって最良の結果が得られると現在考えられている。
【０１４４】
抗体−ポリマーコンジュゲートは、カラムの固定相内に固定化されたアガロース及び金属イオン（「磁気アガロース」又は「磁気アフィニティービーズ」と呼ばれる）を含むカラムに結合させるなどの任意の適切な手段を用いて精製することができる。抗体−ポリマーコンジュゲートは、固定相に固定化された金属イオンに結合するヒスチジンリッチ領域のような部分を含み得る。この方法は、類似のキレート化様式で金属イオンに結合し得る官能基を有さない過剰の修飾ポリマーを分離するために使用することができる。過剰の修飾ポリマーを連続した溶出により洗浄し、結合した抗体−ポリマー結合体を、例えばＥＤＴＡなどの置換剤で溶出することによって放出させる。
【０１４５】
本開示のポリマーを含むオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の任意の方法に従って調製することができる。例えば、合成中のオリゴヌクレオチドの３’−ヌクレオシドが付着する固相合成を使用することができる。オリゴヌクレオチド合成は、３’塩基から開始する。合成サイクル中、オリゴヌクレオチドは、５’末端に向かって伸長する。各カップリング工程について、ヌクレオチドは、反応性ホスホラミダイト基が３’−ＯＨに位置し、且つ５’−ＯＨがジメトキシトリチル保護基（ＤＭＴ）で修飾されているヌクレオシドホスホラミダイトとして送達される。反応性ホスホラミダイト基は、付着したオリゴヌクレオチドの５’−ＯＨと反応する。一般に、オリゴヌクレオチド合成サイクルは、次の工程：脱トリチル化（ＤＭＴ保護基を元の塩基から開裂し、５’反応性ヒドロキシル官能基を形成する工程）；カップリング（５’−ＯＨ基が次の塩基を有する付加された活性化ホスホラミダイトと反応し、その結果、両方のヌクレオシドが繋ぎ合わさる）；キャッピング（次のヌクレオチドにカップリングしなかった任意の遊離５’−ＯＨ基が次のカップリング工程から除外されなければならず；キャッピング工程でアセチル化を用いてすべての反応性５’−ＯＨ基をブロックする）；及び酸化（ヌクレオチドが、ヨウ素溶液を用いてリン基を酸化するカップリング工程において作られたリン含有結合を介してカップリングされる）を含む。酸化工程の後、新しい合成サイクルを開始し、次のヌクレオチドを付加する。このサイクルは、所望の配列が合成されるまで繰り返される。合成が行われ、所望の長さに達した後、オリゴヌクレオチドは最後の一つの脱トリチル化反応に供する。次いでオリゴヌクレオチドを固体支持体から開裂させ、残りの保護基を開裂させて生物学的に機能的なオリゴヌクレオチドを得る。
【０１４６】
いったん合成されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの活性基を利用するか又はヌクレオチド類似体を作製することによって、いくつかの異なる方法で修飾することができる。オリゴヌクレオチド修飾は、本明細書で提供される適切なスペーサー又は他のポリマー骨格成分へのカップリングにしばしば必要である。最も一般的なオリゴヌクレオチド修飾を以下に示す：
３’及び５’ＯＨ基を利用する末端修飾（例えばＣ６及びＣ７アミノ修飾因子、ビオチン−ＯＴ、ビオチン−ＴＥＧ、コレステロール−ＴＥＧ、フルオレセイン、チオール修飾、リン酸）；
塩基修飾（例えば５−ブロモ−ｄＵ、５−ブロモ−ｄＣ、５−フルオロ−ｄＵ、デオキシイノシン、５−ヨード−ｄＣ、５−ヨードＵ、５−メチル−ｄＣ、５−ニトロインドール、デオキシウリジン）；
配列中のＴ残基を置換するチミジン類似体（例えばＣ２ｄＴ及びＣ６ｄＴアミノ修飾因子、ビオチン−ｄＴ、ダブシル−ｄＴ、フルオレセイン−ｄＴ、ＴＡＭＲＡ−ｄＴ）；
合成後修飾（適切なアミノ修飾因子を選択することにより、該修飾をオリゴヌクレオチドの異なる位置に加えることができる）；
リン酸基の修飾（例えばホスホロチオエート化）；及び
２’修飾（２’−Ｏ−メチルＡ／Ｃ／Ｇ／Ｕ、リボＡ／Ｃ／Ｇ／Ｕ）。
【０１４７】
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド（及び一度完全に合成されたポリマー）が特異的結合実体にコンジュゲートされ得るように、末端５’修飾を行って官能基を組み込む（例えばアミノＣ６基の付加）。同様に、オリゴヌクレオチドがリンカー（標識を含む）又はスペーサーにカップリングされ得るように、末端３’修飾を行って官能基を組み込む。５’及び／又は３’修飾は、オリゴヌクレオチド合成中又は合成後に行うことができる。
【０１４８】
修飾オリゴヌクレオチドは、任意の適切な手段によって調製することができる。例えば、修飾オリゴヌクレオチドは、アミノ−オリゴヌクレオチドを適切な緩衝液中に懸濁させること；例えば吸光光度測定によってオリゴヌクレオチド濃度を決定すること；及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの適切な溶媒を用いて、例えばＳ−４ＦＢと修飾されたオリゴヌクレオチドを反応させることによって調製することができる。反応混合物を濃縮し、修飾オリゴヌクレオチド（４ＦＢ修飾オリゴヌクレオチド）濃度を吸光光度測定によって測定することができる。
【０１４９】
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドの固相合成はまた、固相オリゴヌクレオチド合成中のリンカー又はスペーサーの直接組み込みを含み得る。
【０１５０】
いくつかの実施態様では、標識は、スペーサーを使用することなく、リンカーを介してポリマーのオリゴヌクレオチドにカップリングされる。例えば、ＤＮＰハプテン（リンカーにカップリングされている）は、本明細書のスキーム２及び３に例示される方法によってオリゴヌクレオチドにカップリングすることができる。
0006762296.tif 000028
【０１５１】
スキーム2：  スペーサーがポリマー骨格に組み込まれていない、オリゴヌクレオチドにＤＮＰハプテンを（ＰＥＧリンカーを用いて）カップリングする方法。
0006762296.tif 000029
【０１５２】
スキーム3：  スペーサーがポリマー骨格に組み込まれていない、オリゴヌクレオチドにＤＮＰハプテンを（ＡＣＡリンカーを用いて）カップリングする方法。
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【０１５３】
ハプテン−リンカーコンジュゲートは、ＰＥＧベースのリンカーを用いて形成されている。そのような化合物の一例を下記に示す。以下の構造のカルボン酸官能基は、実施例において他の反応性官能基に変換されてもよい。例えば、カルボン酸官能基は、以下に示すように、ＮＨＳエステルなどの活性エステルに変換することができる。また、活性エステルは、以下に示すように、ヒドラジドなどの他の有用な反応性官能基に変換することができる。
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【０１５４】
スペーサーは、リンカーについて上に示したのと同じ様式で（例えば、同様に官能化されたスペーサーを使用して）オリゴヌクレオチドにカップリングすることができる。他の実施態様では、予め合成されたオリゴヌクレオチド及び予め合成されたスペーサーを、適切な触媒又は熱の存在下で一緒に反応させて、所望の［オリゴ］−［スペーサー］ポリマー骨格を形成することができる（ＰＥＧスペーサーにカップリングされたオリゴヌクレオチドを含む、以下のスペーサー９及びスペーサー１８を参照）。あるいは、以下に示す「スペーサー９」及び「スペーサー１８」骨格を、本明細書で概説した工程を用いて、リンカー／標識成分（上記）にカップリングすることができる。適切な方法は、当業者に知られている。次いで、リンカーにカップリングされた標識を［オリゴ］−［スペーサー］に付着させることができる。
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【０１５５】
試料及び標的
試料は、生物学的成分を含み、一般に一又は複数の目的の標的分子を含むと思われる。標的分子は、細胞の表面上に存在し得、細胞は、懸濁液中又は組織切片中に存在し得る。標的分子はまた、細胞内に存在し得、プローブによる細胞溶解又は細胞侵入の際に検出され得る。当業者は、試料中の標的分子を検出する方法が使用される試料及びプローブの種類に応じて変化することを理解するであろう。試料を収集し調製する方法は、当技術分野で既知である。
【０１５６】
本方法の実施態様において使用するための、また本明細書に開示の組成物と共に使用するための試料（例えば組織又は他の生物学的試料）は、当業者に既知の任意の方法を用いて調製することができる。試料は、常套的なスクリーニングのために被験体から、又は遺伝的異常、感染若しくは新生物などの障害を有すると疑われる被験体から得ることができる。本開示の方法の記載されている実施態様は、「正常」試料と呼ばれる、遺伝的異常、疾患、障害等を有しない試料にも適用することができる。そのような正常試料は、他の試料と比較するためのコントロールなどとして有用である。試料は、さまざまな目的で分析できる。例えば、試料は、科学的研究において、又は疑いのある疾患の診断のために、又は治療の成功、生存等の予後指標として使用することができる。
【０１５７】
試料は、プローブ又はレポーター分子によって特異的に結合され得る複数の標的を含み得る。標的は、核酸配列又はタンパク質であってもよい。本開示を通して、標的タンパク質について言及する場合、そのタンパク質に関連する核酸配列もまた標的として使用できることが理解される。いくつかの例では、標的は、ウイルスゲノムからのような、ウイルス、細菌又は細胞内寄生体等の病原体に由来するタンパク質又は核酸分子である。例えば、標的タンパク質は、疾患に関連する（例えば相関関係、因果関係など）標的核酸配列から産生され得る。
【０１５８】
標的核酸配列は、実質的にサイズが変化し得る。核酸配列は、制限なく、可変数の核酸残基を有し得る。例えば、標的核酸配列は、少なくとも約１０核酸残基、又は少なくとも約２０、３０、５０、１００、１５０、５００、１０００残基を有し得る。同様に、標的ポリペプチドは、実質的にサイズが変化し得る。制限なく、標的ポリペプチドは、ペプチド特異的抗体又はその断片に結合する少なくとも一つのエピトープを含む。いくつかの実施態様では、標的ポリペプチドは、ペプチド特異的抗体又はその断片に結合する少なくとも二つのエピトープを含み得る。
【０１５９】
特定の非限定的な例では、標的タンパク質は、新生物（例えばたん）に関連する標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）によって産生される。新生細胞、特にＢ細胞及びＴ細胞白血病、リンパ腫、乳がん、結腸がん、神経学的がん等のがん細胞において、多数の染色体異常（転座及び他の再構成、増幅又は欠失を含む）が同定されている。したがって、いくつかの例において、標的分子の少なくとも一部は、試料中の少なくとも細胞のサブセットにおいて増幅又は欠失された核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）によって産生される。
【０１６０】
発がん遺伝子は、いくつかのヒト悪性腫瘍の原因であることが知られている。例えば、染色体１８ｑ１１．２のブレークポイント領域に位置するＳＹＴ遺伝子が関与する染色体再編成は、滑膜肉腫軟組織腫瘍に共通する。ｔ（１８ｑ１１．２）転座は、例えば異なる標識を有するプローブを用いて同定され得：第一のプローブは、ＳＹＴ遺伝子から遠位に伸びる標的核酸配列から生成されるＦＰＣ核酸分子を含み、第二のプローブは、ＳＹＴ遺伝子の３′又は近位に伸びる標的核酸配列から生成されるＦＰＣ核酸を含む。これらの標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）に対応するプローブがｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション手順において使用される場合、ＳＹＴ遺伝子領域においてｔ（１８ｑ１１．２）を欠く正常細胞は、ＳＹＴの２つのインタクトなコピーを反映する、二つの融合（近接する二つの標識により生成された）シグナルを示す。ｔ（１８ｑ１１．２）を有する異常細胞は、単一の融合シグナルを示す。
【０１６１】
他の例では、悪性細胞において欠損（喪失）している腫瘍抑制遺伝子である核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）から産生された標的タンパク質が選択される。例えば、染色体９ｐ２１上に位置するｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）、及びＤ９Ｓ１７５２を含む）は、特定の膀胱がんにおいて欠失される。染色体１（例えばＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１、及びＳＨＧＣ−１３２２を包含する）の短腕の遠位領域及び染色体１９（例えばＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２、及びＧＬＴＳＣＲ１を包含する）のペリセントロメア領域（例えば１９ｐ１３〜１９ｑ１３）を含む染色体欠失は、中枢神経系のある種の固形腫瘍の特徴的な分子的特性である。
【０１６２】
上記の例は、説明のためにのみ提供されており、限定することを意図するものではない。腫瘍性形質転換及び／又は増殖と相関する多数の他の細胞遺伝学的異常が、当業者に知られている。新生物形質転換と相関しており、本開示の方法において有用である核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）によって産生される標的タンパク質はまた、ＥＧＦＲ遺伝子（７ｐ１２；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００７、ヌクレオチド５５０５４２１９−５５２４２５２５）、Ｃ−ＭＹＣ遺伝子（８ｑ２４．２１；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００８、ヌクレオチド１２８８１７４９８−１２８８２２８５６）、Ｄ５Ｓ２７１（５ｐ１５．２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子（８ｐ２２；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００８、ヌクレオチド１９８４１０５８−１９８６９０４９）、ＲＢ１（１３ｑ１４；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１３、ヌクレオチド４７７７５９１２−４７９５４０２３）、ｐ５３（１７ｐ１３．１；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１７、補体、ヌクレオチド７５１２４６４−７５３１６４２））、Ｎ−ＭＹＣ（２ｐ２４；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００２、補体、ヌクレオチド１５１８３５２３１−１５１８５４６２０）、ＣＨＯＰ（１２ｑ１３；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１２、補体、ヌクレオチド５６１９６６３８−５６２００５６７）、ＦＵＳ（１６ｐ１１．２；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１６、ヌクレオチド３１０９８９５４−３１１１０６０１）、ＦＫＨＲ（１３ｐ１４；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１３、補体、ヌクレオチド４００２７８１７−４０１３８７３４）の他、例えば：ＡＬＫ（２ｐ２３；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００２、補体、ヌクレオチド２９２６９１４４−２９９９７９３６）、Ｉｇ重鎖、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１１、ヌクレオチド６９１６５０５４．６９１７８４２３）、ＢＣＬ２（１８ｑ２１．３；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１８、補体、ヌクレオチド５８９４１５５９−５９１３７５９３）、ＢＣＬ６（３ｑ２７；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００３、補体、ヌクレオチド１８８９２１８５９−１８８９４６１６９）、ＭＡＬＦ１、ＡＰ１（１ｐ３２−ｐ３１；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００１、補体、ヌクレオチド５９０１９０５１−５９０２２３７３）、ＴＯＰ２Ａ（１７ｑ２１−ｑ２２；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１７、補体、ヌクレオチド３５７９８３２１−３５８２７６９５）、ＴＭＰＲＳＳ（２１ｑ２２．３；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００２１、補体、ヌクレオチド４１７５８３５１−４１８０１９４８）、ＥＲＧ（２１ｑ２２．３；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００２１、補体、ヌクレオ���ド３８６７５６７１−３８９５５４８８）；ＥＴＶ１（７ｐ２１．３；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００７、補体、ヌクレオチド１３８９７３７９−１３９９５２８９）、ＥＷＳ（２２ｑ１２．２；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００２２、ヌクレオチド２７９９４２７１−２８０２６５０５）；ＦＬＩ１（１１ｑ２４．１−ｑ２４．３；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１１、ヌクレオチド１２８０６９１９９−１２８１８７５２１）、ＰＡＸ３（２ｑ３５−ｑ３７；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００２、補体、ヌクレオチド２２２７７２８５１−２２２８７１９４４）、ＰＡＸ７（１ｐ３６．２−ｐ３６．１２；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００１、ヌクレオチド１８８３００８７−１８９３５２１９）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３．３；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１０、ヌクレオチド８９６１３１７５−８９７１６３８２）、ＡＫＴ２（１９ｑ１３．１−ｑ１３．２；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-００００１９、補体、ヌクレオチド４５４３１５５６−４５４８３０３６）、ＭＹＣＬ１（１ｐ３４．２；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００１、補体、ヌクレオチド４０１３３６８５−４０１４０２７４）、ＲＥＬ（２ｐ１３−ｐ１２；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００２、ヌクレオチド６０９６２２５６−６１００３６８２）、及びＣＳＦ１Ｒ（５ｑ３３−ｑ３５；例えばＧＥＮＢＡＮＫＴＭアクセッション番号ＮＣ-０００００５、補体、ヌクレオチド１４９４１３０５１−１４９４７３１２８）を含む。
【０１６３】
他の例において、標的タンパク質は、疾患又は状態に関連するウイルス又は他の微生物から選択される。細胞又は組織試料中のウイルス又は微生物由来標的核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）の検出は、生物の存在を示す。例えば、標的ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質は、発がん性又は病原性ウイルス、細菌又は細胞内寄生体（例えば熱帯熱マラリア原虫及び他のマラリア原虫種、リーシュマニア属（種）、クリプトスポリジウム属パルバム、赤痢アメーバ、及びランブル鞭毛虫、並びにトキソプラズマ属、エイメリア属、タイレリア属、及びバベシア属種）のゲノムから選択され得る。
【０１６４】
いくつかの例において、標的タンパク質は、ウイルスゲノムからの核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）から産生される。例示的ウイルス及び対応するゲノム配列（ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）括弧内はアクセッション番号）は、ヒトアデノウイルスＡ（ＮＣ-００１４６０）、ヒトアデノウイルスＢ（ＮＣ-００４００１）、ヒトアデノウイルスＣ（ＮＣ-００１４０５）、ヒトアデノウイルスＤ（ＮＣ-００２０６７）、ヒトアデノウイルスＥ（Ｎ-００３２６６）、ヒトアデノウイルスＦ（ＮＣ-００１４５４）、ヒトアストロウイルス（ＮＣ-００１９４３）、ヒトＢＫポリオーマウイルス（Ｖ０１１０９；ＧＩ：６０８５１）ヒトボカウイルス（ＮＣ-００７４５５）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＮＣ-００２６４５）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＮＣ-００６５７７）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＮＣ-００５８３１）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＮＣ-００５１４７）、ヒトエンテロウイルスＡ（ＮＣ-００１６１２）、ヒトエンテロウイルスＢ（ＮＣ-００１４７２）、ヒトエンテロウイルスＣ（ＮＣ-００１４２８）、ヒトエンテロウイルスＤ（ＮＣ-００１４３０）、ヒトエリスロウイルスＶ９（ＮＣ-００４２９５）、ヒトフォーミーウイルス（ＮＣ-００１７３６）、ヒトヘルペスウイルス１（単純ヘルペスウイルス１型）（ＮＣ-００１８０６）、ヒトヘルペスウイルス２（単純ヘルペスウイルス２型）（ＮＣ-００１７９８）、ヒトヘルペスウイルス３（水痘帯状疱疹ウイルス）（Ｎｃ-００１３４８）、ヒトヘルペスウイルス４  １型（エプスタイン・バーウイルス１型）（ＮＣ-００７６０５）、ヒトヘルペスウイルス４  ２型（エプスタイン・バーウイルス２型）（ＮＣ-００９３３４）、ヒトヘルペスウイルス５  ＡＤ１６９株（ＮＣ-００１３４７）、ヒトヘルペスウイルス５  Ｍｅｒｌｉｎ株（ＮＣ-００６２７３）、ヒトヘルペスウイルスＡ（ＮＣ-００１６６４）、ヒトヘルペスウイルス６Ｂ（ＮＣ-０００８９８）、ヒトヘルペスウイルス７（ＮＣ-００１７１６）、ヒトヘルペスウイルス８  Ｍ型（ＮＣ-００３４０９）、ヒトヘルペスウイルス８  Ｐ型（ＮＣ-００９３３３）、ヒト免疫不全ウイルス１（ＮＣ-００１８０２）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＮＣ-００１７２２）、ヒトメタニューモウイルス（ＮＣ-００４１４８）、ヒトパピローマウイルス−１（ＮＣ-００１３５６）、ヒトパピローマウイルス−１８（ＮＣ-００１３５７）、ヒトパピローマウイルス−２（ＮＣ-００１３５２）、ヒトパピローマウイルス−５４（ＮＣ-００１６７６）、ヒトパピローマウイルス−６１（ＮＣ-００１６９４）、ヒトパピローマウイルス  ｃａｎｄ９０（ＮＣ-００４１０４）、ヒトパピローマウイルス  ＲＴＲＸ７（ＮＣ-００４７６１）、ヒトパピローマウイルス１０型（ＮＣ-００１５７６）、ヒトパピローマウイルス１０１型（ＮＣ-００８１８９）、ヒトパピローマウイルス１０３型（ＮＣ-００８１８８）、ヒトパピローマウイルス１０７型（ＮＣ-００９２３９）、ヒトパピローマウイルス１６型（ＮＣ-００１５２６）、ヒトパピローマウイルス２４型（ＮＣ-００１６８３）、ヒトパピローマウイルス２６型（ＮＣ-００１５８３）、ヒトパピローマウイルス３２型（ＮＣ-００１５８６）��ヒトパピローマウイルス３４型（ＮＣ-００１５８７）、ヒトパピローマウイルス４型（ＮＣ-００１４５７）、ヒトパピローマウイルス４１型（ＮＣ-００１３５４）、ヒトパピローマウイルス４８型（ＮＣ-００１６９０）、ヒトパピローマウイルス４９型（ＮＣ-００１５９１）、ヒトパピローマウイルス５型（ＮＣ-００１５３１）、ヒトパピローマウイルス５０型（ＮＣ-００１６９１）、ヒトパピローマウイルス５３型（ＮＣ-００１５９３）、ヒトパピローマウイルス６０型（ＮＣ-００１６９３）、ヒトパピローマウイルス６３型（ＮＣ-００１４５８）、ヒトパピローマウイルス６ｂ型（ＮＣ-００１３５５）、ヒトパピローマウイルス７型（ＮＣ-００１５９５）、ヒトパピローマウイルス７１型（ＮＣ-００２６４４）、ヒトパピローマウイルス９型（ＮＣ-００１５９６）、ヒトパピローマウイルス９２型（ＮＣ-００４５００）、ヒトパピローマウイルス９６型（ＮＣ-００５１３４）、ヒトパラインフルエンザウイルス１（ＮＣ-００３４６１）、ヒトパラインフルエンザウイルス２（ＮＣ-００３４４３）、ヒトパラインフルエンザウイルス３（ＮＣ-００１７９６）、ヒトパレコウイルス（ＮＣ-００１８９７）、ヒトパルボウイルス４（ＮＣ-００７０１８）、ヒトパルボウイルスＢ１９（ＮＣ-０００８８３）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＮＣ-００１７８１）、ヒトライノウイルスＡ（ＮＣ-００１６１７）、ヒトライノウイルスＢ（ＮＣ-００１４９０）、ヒトスプーマレトロウイルス(spumaretrovirus)（ＮＣ-００１７９５）、ヒトＴ−リンホトロピックウイルス１（ＮＣ-００１４３６）、ヒトＴ−リンホトロピックウイルス２（ＮＣ-００１４８８）を含む。
【０１６５】
特定の例では、標的タンパク質は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）又はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８）などの発がん性ウイルス由来の核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）から産生される。他の例では、核酸配列（例えばゲノム標的核酸配列）から産生される標的タンパク質は、呼吸器合胞体ウイルス、肝炎ウイルス（例えばＣ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳウイルス）、アデノウイルス、ポリオーマウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）又は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等の病原性ウイルス由来である。
【０１６６】
対比染色
対比染色は、標的の構造が顕微鏡下でより容易に視覚化され得るように、一又は複数の標的を検出するための薬剤で既に染色した後の試料を後処理する方法である。例えば、対比染料をカバースリッピングの前に任意選択的に使用し、免疫組織化学染色をより明瞭にする。対比染料は、一次染料と色が異なる。多くの対比染料、例えばヘマトキシリン、エオシン、メチルグリーン、メチレンブルー、ギムザ、アルシアンブルー、及びニュークリアファストレッド（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ）がよく知られている。
【０１６７】
いくつかの例では、対比染色を生じさせるために一より多い染料を混合することができる。これにより、染料選択能及び融通性がもたらされる。例えば、特定の属性を有するが別の所望の属性を有さない混合物に対して、第一の染料を選択することができる。不足している所望の属性を示す混合物に第二の染料を加えることができる。例えば、トルイジンブルー、ＤＡＰＩ、及びポンタミン（ｐｏｎｔａｍｉｎｅ）スカイブルーを混合して対比染料を形成することができる。
【０１６８】
イメージング
本開示の実施態様のすべて又は特定の態様は、コンピュータ解析及び／又は画像解析システムによって自動化され、容易にされ得る。いくつかのアプリケーションでは、正確な色の比率が測定される。いくつかの実施態様では、画像解析のために光学顕微鏡法が利用される。特定の本開示の実施態様は、デジタル画像を取得することを伴う。これは、デジタルカメラを顕微鏡に連結することにより行うことができる。染色した試料から得られたデジタル画像は、画像解析ソフトウェアを用いて解析する。色は、いくつかの異なる方法で測定することができる。たとえば、色は、赤、青、緑の値；色相、彩度、強度の値として、及び／又はスペクトルイメージングカメラを使用して特定の波長又は波長の範囲を測定することによって測定することができる。
【０１６９】
本開示の一実施態様は、発色染料を用いた明視野イメージングの使用を伴う。可視スペクトルの白色光が染料を透過する。染料は特定の波長の光を吸収し、他の波長を透過する。これは、透過される光の特定の波長に応じて、光を白色から有色に変化させる。
【０１７０】
また、試料を定性的及び半定量的に評価することができる。定性的評価は、染色強度を評価すること、陽性染色細胞及び染色に関与する細胞内区画を同定すること、試料全体又はスライドの品質を評価することを含む。試験試料に対して別々の評価が行われるため、この解析は、試料が異常な状態を表すかどうかを決定するための既知の平均値との比較を含み得る。
【０１７１】
実施例１
アミノ残基上で式Ｘｂのポリマーにより無作為に標識した抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）ウサギ抗体及びＨＥＲ２  ４Ｂ５ウサギ抗体を用いるＨＥＲ２タンパク質の染色をＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ自動染色装置で実施した。簡単に説明すると、厚さ約４ｍｍの未染色の乳房腫瘍切片を切って、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓガラススライドに乗せた。ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ自動染色装置は、約７２℃でのオンライン式脱パラフィン及び抗原回収（約９５℃で約３６分間）を含む。抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）ウサギ抗体（約６μｇ／ｍｌ）又はウサギ抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体を式Ｘｂのポリマー（１μｇ／ｍｌ）により無作為に標識し、約３７℃で約１２分間インキュベートした。抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体の場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された約２５μｇ／ｍｌのヤギ抗ウサギ抗体で抗原検出を行った。アミノ残基上で式Ｘｂのポリマーにより無作為に標識した抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体の場合、約０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌの魚ＤＮＡをブロッキング試薬として塊状にした。抗原検出は、約１０μｇ／ｍｌのマウス抗ＤＮＰ−ＨＲＰ抗体を用いて行った。色素原としてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用い、対比染料としてヘマトキシリンを用いた。次いで、それぞれの別個の組織切片を０〜３＋の強度スケール（１＋＝弱く不完全な膜染色、２＋＝適度に強く且つ完全な膜染色、３＋＝強く／強烈且つ完全な膜染色）で４Ｂ５染色についてスコアをつけた。
【０１７２】
式Ｘｂのポリマーにより無作為に標識したＨＥＲ２  ４Ｂ５−４ＤＮＰは、ネイティブＨＥＲ２  ４Ｂ５抗体よりも弱く染色された（図９参照）。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、標識抗体は、ＣＤＲ内のリジン残基上の無作為標識が原因で低下した親和性を有する可能性がある。
【０１７３】
実施例２
ヒンジ領域のチオール残基上で式Ｘｄのポリマーにより標識した抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）ウサギ抗体及びＨＥＲ２  ４Ｂ５ウサギ抗体を用いるＨＥＲ２タンパク質の染色をＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ自動染色装置で行った。簡単に説明すると、厚さ約４ｍｍの未染色の乳房腫瘍切片を切って、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓガラススライドに乗せた。ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ自動染色装置は、約７２℃でのオンライン式脱パラフィン及び抗原回収（約９５℃で約３６分間）を含む。ヒンジ領域のチオール残基上で式Ｘｄのポリマー（１μｇ／ｍｌ）により標識した抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）ウサギ抗体（約６μｇ／ｍｌ）又はウサギ抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体を約３７℃で約１２分間インキュベートした。抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体の場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＤＡＢ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＫＩＴ、７６０−５００から調製）で標識された約２５μｇ／ｍｌのヤギ抗ウサギ抗体で抗原検出を行った。ヒンジ領域のチオール残基上で式Ｘｄのポリマーにより標識した抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）抗体の場合、約０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌの魚ＤＮＡをブロッキング試薬として塊状にした。約１０μｇ／ｍｌのマウス抗ＤＮＰ−ＨＲＰ抗体（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ抗ＤＮＰ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ＲＵＯ、７６０−４８２１から調製）を用いて抗原検出を行った。色素原としてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用い、対比染料としてヘマトキシリンを用いた。次いで、それぞれの別個の組織切片を０〜３＋の強度スケール（１＋＝弱く不完全な膜染色、２＋＝適度に強く且つ完全な膜染色、３＋＝強く／強烈且つ完全な膜染色）で４Ｂ５染色についてスコアをつけた。
【０１７４】
式Ｘｄのポリマーにより無作為に標識したＨＥＲ２  ４Ｂ５−４ＤＮＰは、ネイティブＨＥＲ２  ４Ｂ５抗体よりも強く染色された（図１０及び１１参照）。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、標識抗体は、ＣＤＲから離れているヒンジ領域内のジスルフィド結合への低度の標識が原因で、その親和性を保持していると考えられる。同じ抗ＤＮＰ検出システムが実施例１及び２において使用されていることから、本出願人は、ヌクレオチドポリマーで標識されたＨＥＲ２抗体によるより強い染色は抗ウサギ抗体（ネイティブＨＥＲ２抗体の場合）と抗ＤＮＰ抗体（ヌクレオチドポリマーで標識されたＨＥＲ２抗体の場合）との差異によるものではないと考える。
【０１７５】
実施例３
ネイティブ抗ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＦｏｘＰ３ウサギ抗体及びヒンジ領域のチオール残基上で式（Ｘｅ）のポリマーで標識したウサギ抗体を用いるＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＦｏｘＰ３タンパク質の染色をＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ自動染色装置で行った。簡単に説明すると、厚さ約４ｍｍの未染色の扁桃切片を切って、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓガラススライドに乗せた。ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  ＵＬＴＲＡ自動染色装置は、約７２℃でのオンライン式脱パラフィン及び抗原回収（約９５℃で約６４分間）を含む。ネイティブなウサギ抗体（約１μｇ／ｍｌ）又はそれぞれの抗体コンジュゲート（約１μｇ／ｍｌ）を約３７℃で約１６分間インキュベートした。ネイティブなウサギ抗体の場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＵＮＩＶＥＲＳＡＬ  ＤＡＢ  ＤＥＴＥＣＴＩＯＮ  ＫＩＴ、７６０−５００から調製）で標識された約２５μｇ／ｍｌのヤギ抗ウサギ抗体で抗原検出を行った。式（Ｘｅ）のポリマーを含むそれぞれの抗体コンジュゲートの場合、約１．０ｍｇ／ｍｌの魚ＤＮＡをブロッキング試薬として塊状にした。約２０μｇ／ｍｌのマウス抗ＤＮＰ−ＨＲＰ抗体（ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ抗ＤＮＰ  ＨＲＰ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ＲＵＯ、７６０−４８２１から調製）を用いて抗原検出を行った。色素原としてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用い、対比染料としてヘマトキシリンを用いた。
【０１７６】
ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ６８、及び式（Ｘｅ）のポリマーにカップリングされたＦｏｘＰ３抗体はすべて、抗ＤＮＰ−ＨＲＰ及びｕＶ  ＧａＲ−ＨＲＰ検出で処理した。抗ウサギ抗体での染色と同様の抗ＤＮＰ抗体での染色は、大部分が、非コンジュゲート抗体ではなく、コンジュゲート抗体−式（Ｘｅ）のポリマーの複合体であることを示唆している。抗ＤＮＰ検出の最適化がなく、抗ＤＮＰ染色を伴うＣＤ３及びＣＤ２０は、ネイティブコントロール染色に近かったが、抗ＤＮＰ染色を伴うＦｏｘＰ３及びＣＤ６８は、ネイティブコントロールより弱かった。
【０１７７】
実施例４
本実施例は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．のＢｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを用いて、ポリハプテニル化(polyhaptenylated)オリゴヌクレオチド−一次抗体コンジュゲートと結合した二次抗体を認識するために量子ドットを用いて扁桃上のＫｉ−６７などの組織エピトープを検出することに関する。パラフィン被覆組織をスライド上で７５℃まで４分間加熱し、ＥＺＰｒｅｐ容積アジャスト(volume adjust)（ＶＭＳＩ）により７５℃で２回処理した後、ＥＺＰｒｅｐ容積アジャストと共に液体カバースリップ（ＶＭＳＩ）を適用する。７５℃で４分後、スライドをすすぎ、ＥＺＰｒｅｐ容積アジャストを液体カバースリップと共に添加し、前記組織を７６℃で４分間脱パラフィンする。スライドを４０℃に冷却し、３回すすいだ後、抗Ｋｉ６７  １５（１００μＬ、ＶＭＳＩ）抗体−ハプテン化ポリマーコンジュゲート（例えば式（Ｉ））、続いて液体カバースリップを添加し、４０℃で１６分間インキュベーベーションを行う。スライドをすすいだ後、組織を抗ハプテン抗体（１００μＬ）、続いて液体カバースリップで処理し、４０℃で８分間のインキュベーションを行う。スライドを緩衝液で２回すすぎ、続いて液体カバースリップを適用する。スライドを緩衝液で３回すすぎ、洗剤洗浄で処理した後、スライドにカバースリップを手動で適用し、その後スライドを顕微鏡で観察する。
【０１７８】
実施例５
本実施例は、発色染色（すなわちＤＡＢのＨＲＰ媒介沈着）又はポリハプテニル化ポリマーとコンジュゲートされた抗体を認識するための量子ドットのいずれかを用いて組織エピトープ、特に扁桃上のＫｉ−６７を検出することに関する。以下は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの適用手順である。パラフィン被覆組織をスライド上で７５℃まで４分間加熱し、ＥＺＰｒｅｐ容積アジャスト（ＶＭＳＩ）により７５℃で２回処理した後、ＥＺＰｒｅｐ容積アジャストと共に液体カバースリップ（ＶＭＳＩ）を適用する。７５℃で４分後、スライドをすすぎ、ＥＺＰｒｅｐ容積アジャストを液体カバースリップと共に添加し、前記組織を７６℃で４分間脱パラフィンする。スライドを４０℃に冷却し、３回すすいだ後、マウス抗Ｋｉ６７（１００μＬ、ＶＭＳＩ）抗体、続いて液体カバースリップを添加し、４０℃で１６分間インキュベーベーションを行う。スライドをすすいだ後、組織をヤギ抗マウス−ポリマー−ＤＮＰ抗体（１００μＬ）、続いて液体カバースリップで処理し、４０℃で８分間のインキュベーションを行う。スライドを緩衝液で２回すすいだ後、液体カバースリップを適用し、６５５ｎｍ  ＱＤｏｔ：抗ＤＮＰ  ＭＡｂコンジュゲート（１００μＬ、２０ｎｍｏｌ）を添加し、３７°Ｃで１６分間のインキュベーションを行う。スライドを緩衝液２０で３回すすぎ、洗剤洗浄で処理した後、スライドにカバースリップを手動で適用し、その後スライドを顕微鏡で観察する。
【０１７９】
実施例６
本実施例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−抗体コンジュゲートを評価すること、特にＳＩＳＨ検出のためのＦｃコンジュゲートポリマー−ビオチンコンジュゲートを用いる様々な組織におけるＨＰＶの評価に関する。以下は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの適用手順である。パラフィン被覆組織をスライド上で７５℃まで４分間加熱し、ＥＺＰｒｅｐ容積アジャスト（ＶＭＳＩ）により７５℃で２回処理した後、ＥＺＰｒｅｐ容積アジャストと共に液体カバースリップ（ＶＭＳＩ）を適用する。７５℃で４分後、スライドをすすぎ、ＥＺＰｒｅｐ容積アジャストを液体カバースリップと共に添加し、前記組織を７６℃で４分間脱パラフィンする。Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ＃２（ＶＭＳＩ）を添加し、スライドを９０°Ｃに加温し、８分間インキュベートする。これにＣｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ＃２の別の適用及び９０℃で１２分間のインキュベーションが続く。スライドをＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＶＭＳＩ）ですすぎ、３７℃に冷却し、ＩＳＨ−プロテアーゼ３（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を添加する。４分間のインキュベーションの後、スライドを３回すすぎ、ｉＶｉｅｗ＋ＨｙｂＲｅａｄｙ（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を適用し、これを４分間インキュベートする。ＨＰＶプローブ（２００μＬ、ＶＭＳＩ）の添加後、３７℃で４分間、９５℃で１２分間及び５２℃で１２４分間のインキュベーションを行う。次いで、スライドを２回すすぎ、７２℃に加温する。この直前の工程をさらに２回繰り返しスライドを３７℃に冷却し、ｉＶｉｅｗ＋Ａｎｔｉ−ＤＮＰ（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を添加する。一次抗体を２０分間インキュベートし、次いでスライドを２回すすいだ後、オリゴヌクレオチド−ビオチン化二次抗体 （例えばヤギ抗ウサギ、１００μＬ、１０μｇ／ｍＬ）を手動で添加する。二次抗体のインキュベーションを８分間行い、スライドを２回すすぐ。次いで、ウサギ抗ビオチン抗体を適用し（１００μＬ）、インキュベーションをさらに２０分間行う。さらに２回のすすぎ工程の後、ＨＲＰ多量体を適用し（１００μＬ、１０μｇ／ｍＬ）、８分間インキュベートする。さらに４回のすすぎ工程に続き、４分間のインキュベーションでＳＩＳＨ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ  Ａ（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を、４分間のインキュベーションでＳＩＳＨ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ  Ｂ（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を、及び４分間のインキュベーションでＳＩＳＨ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎ  Ｃ（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を適用する。スライドを３回すすぎ、ヘマトキシリンＩＩ（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を添加する。対比染色で４分間インキュベートした後、スライドをすすぎ、Ｂｌｕｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（１００μＬ、ＶＭＳＩ）を適用し、４分間インキュベートする。次いで、スライドをさらに３回すすぎ、器具から取り外す。スライドを洗剤洗浄で処理した後、エタノール、アセトン、及びキシレンで脱水し、次にカバースリップをスライドに適用し、その後スライドを顕微鏡で観察する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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