(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ)のＣ末端ドメインであって、
前記Ｃ末端ドメインが、配列番号３３又は配列番号３４によって表わされるアミノ酸配列から構成されるペプチドを含む、Ｃ末端ドメイン。
【請求項２】
ＨＲＦ受容体に対する結合又はＨＲＦの活性化に関与する、請求項１に記載のＣ末端ドメイン。
【請求項３】
アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数の疾患の予防または治療に対する医薬組成物であって、
ＨＲＦの、配列番号１〜配列番号４によって表わされるアミノ酸配列のうちの１つのアミノ酸配列、又は、配列番号５〜配列番号１０からなる群より選ばれるヌクレオチド配列の何れか１つによりコードされるアミノ酸配列を含むＦＬドメイン、配列番号１１若しくは配列番号１２で表わされるアミノ酸配列、又は、配列番号１３〜配列番号１５よりなる群より選ばれるヌクレオチド配列の何れか１つによりコードされるアミノ酸配列を含むＨ２ドメイン、及び配列番号３３又は配列番号３４によって表わされるアミノ酸配列から構成されるペプチドを含むＣ末端ドメインからなる群より選択される１以上のペプチド、又は、該ペプチドをコードする１以上のポリヌクレオチド、
又は、
有効成分としての、前記ペプチドに特異的に結合する抗体、
若しくは前記ペプチドに特異的に結合する免疫学的に活性なフラグメント、
を含有する医薬組成物。
【請求項４】
ＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子である二量体型のＴＣＴＰ（翻訳的に制御された腫瘍タンパク質）と、細胞膜に存在するその受容体との結合を阻害する、
請求項３に記載のアレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数の疾患の予防または治療に対する医薬組成物。
【請求項５】
活性型の前記ＴＣＴＰがホモ又はヘテロ二量体型であり、ＦＬドメイン又はＨ２ドメインがＴＣＴＰ二量体型ＨＲＦの構造のうちＨＲＦ受容体に結合する領域であり、前記ＴＣＴＰ二量体型ＨＲＦが全長又はＮ末端が欠失したＴＣＴＰ二量体である、
請求項３又は４に記載のアレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数の疾患の予防または治療に対する医薬組成物。
【請求項６】
ＨＲＦのＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン及びＣ末端ドメインからなる群より選ばれる１以上のドメインに結合する抗体、又は免疫学的に活性なフラグメントからなる群より選ばれる１以上の物質であって、
ＦＬドメインとＨＲＦ受容体との結合、
及び／又は、Ｈ２ドメインとＨＲＦ受容体との結合を正確に阻害可能な、
請求項３〜５の何れか１項に記載のアレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数の疾患の予防または治療に対する医薬組成物。
【請求項７】
前記アレルギー性疾患が、鼻炎、喘息、アナフィラキシ−及びアトピーからなる群から選択される１又は複数の疾患を含む、
請求項３〜５の何れか１項に記載のアレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数の疾患の予防または治療に対する医薬組成物。
【請求項８】
前記アレルギー性疾患が関節リウマチを含む、
請求項３〜５の何れか１項に記載のアレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数の疾患の予防または治療に対する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二量体型のＴＣＴＰ（翻訳的に制御された腫瘍タンパク質：Translationally Controlled Tumor Protein）であるＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子とその受容体との間の結合阻害剤、及び該結合阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＣＴＰ（翻訳的に制御された腫瘍タンパク質）は、ＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）とも呼ばれ、好塩基球からヒスタミン放出を誘導することによって遅発相アレルギー反応を誘導することが知られている（非特許文献１）。Bheekha-Escuraらは、ＨＲＦは特定の細胞膜受容体に結合すると提案したが、ＨＲＦとその受容体との間の結合の正確な機構はまだ開示されていない（非特許文献２）。
【０００３】
したがって、本発明者らは、二量体型のＴＣＴＰ（翻訳的に制御された腫瘍タンパク質）であるＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子とその受容体との間の結合について調べ、その結果、本発明者らは、活性型ＨＲＦ、すなわちＴＣＴＰ二量体のヘリックスドメイン中の天然変性タンパク質（ＩＵＰ：Intrinsically unfolded protein）のドメインである可動性ループ（ＦＬ）ドメイン及びヘリックス２（Ｈ２）ドメインが細胞膜上でその受容体に対して特異的結合を担う領域であることを確認した。さらに、本発明者らは、ＨＲＦ受容体結合ドメインが結合阻害剤、並びに様々な炎症性疾患、アレルギー性疾患、及びマラリアの治療に対する予防薬の開発に効率的に使用可能であることを確認して、本発明の完成に至った。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】MacDonald et al., Science, 269, 688-690, 1995
【非特許文献２】Bheekha-Escura et al., Blood, 96, 2191-2198, 2000
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ＴＣＴＰ（翻訳的に制御された腫瘍タンパク質）二量体型ＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子であるＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子と、細胞膜に存在するその受容体との間の結合阻害剤を有効成分として含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数の疾患の診断、予防、又は治療に対する医薬組成物を提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は、ＴＣＴＰ二量体型ＨＲＦと細胞膜に存在するその受容体との間の結合に関する領域としてＦＬドメイン及びへリックス２ドメインを調べ、該二量体の形成又は該受容体の活性化に関与するＣ末端ドメインを更に調べることによって、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択されるＨＲＦ関連疾患に対する治療剤を作製する方法、上記と関連して、該治療剤をスクリーニングする方法、診断キットを作製する方法、並びに抗体を作製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するために、本発明は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数の疾患の診断、予防、又は治療に対する医薬組成物であって、ＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子と細胞膜に存在するその受容体との間の結合阻害剤を有効成分として含む、医薬組成物を提供する。
【０００８】
また、本発明は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数のＨＲＦ関連疾患の診断、予防、又は治療に対する候補物質をスクリーニングする方法であって、
１）ＨＲＦのＦＬドメイン及びＨ２ドメイン、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される１又は複数の物質と試験試料とを、ＨＲＦ受容体と共に接触させる工程と、
２）上記ドメイン、それらのアナログ、又はそれらのフラグメントと上記ＨＲＦ受容体との間の結合強度を測定する工程と、
３）上の工程１を経なかった対照と比較して、上の結合を減少することが確認された上記試験試料を選択する工程と、
を含む、方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数のＨＲＦ関連疾患の診断、予防、又は治療に対する候補物質をスクリーニングする方法であって、
１）ＨＲＦのＦＬドメイン及びＨ２ドメイン、それらのアナログ、並びにそれらのフラフメントからなる群から選択される１又は複数の物質と試験試料とを、ＨＲＦ受容体を発現する細胞と共に接触させる工程と、
２）上の工程１）の細胞を培養する工程と、
３）上の工程１）を経なかった対照のレベルと比較して、工程２）の培養溶液中にヒスタミン、ＩＬ−８、又はＧＭ−ＣＳＦを含む活性物質の低分泌を示す試験試料を選択する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００１０】
また、本発明は、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＨＲＦのＣ末端ドメインからなる群から選択される１又は複数の物質を結合する抗体を構築する工程と、上記より試験試料を処理する工程と、対照の結合強度と比較して、上の抗体とＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインとの間の結合強度を増すことが確認された試験試料を選択する工程とによるアレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択されるＨＲＦ関連疾患の治療に対する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、ＦＬ、Ｈ２及びＣ末端のドメインを含むＨＲＦの発現を測定する工程と、対照と比較してＨＲＦ発現を減少することが確認された試験試料を選択する工程とを含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択されるＨＲＦ関連疾患の治療に対する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【００１２】
また、本発明は、ＨＲＦのＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインからなる群から選択される１若しくは複数の物質に結合する抗体を使用して、ＦＬドメイン又はＨ２ドメインとＨＲＦ受容体との間の結合強度を測定するか、又は該受容体の活性を測定する工程と、対照と比較して結合強度を増すことが確認された試験試料を選択する工程とを含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択されるＨＲＦ関連疾患を診断する方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、ＨＲＦのＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメイン、それらのアナログ、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される１又は複数の物質とＨＲＦ受容体との間の結合を検出することができる物質を備える、アレルギー性疾患、炎症性疾患、又はマラリアの診断に対するキットを提供する。
【００１４】
また、本発明は、特徴的にＨＲＦ受容体に結合する又はＨＲＦ受容体に対する結合に関与するＦＬドメイン、特徴的にＨＲＦ受容体に結合する又はＨＲＦ受容体に対する結合に関与するＨ２ドメイン、及びＨＲＦ受容体に対する結合又はＨＲＦの活性化又はＨＲＦ二量体の形成に関与するＣ末端ドメインを提供する。
【００１５】
また、本発明は、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインからなる群から選択される１又は複数の物質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換え発現ベクター、並びに該発現ベクターによって形質移入された形質転換体を提供する。
【００１６】
また、本発明は、上記のＦＬドメインに特異的に結合するペプチド、抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを提供する。
【００１７】
また、本発明は、上記のＨ２ドメインに特異的に結合するペプチド、抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを提供する。
【００１８】
また、本発明は、上記のＨＲＦのＣ末端ドメインに特異的に結合するペプチド、抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを提供する。
【００１９】
また、本発明は、ＨＲＦ、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインからなる群から選択される１又は複数の物質を有効成分として含む、ヒスタミン放出誘導剤を提供する。
【００２０】
また、本発明は、ＦＬドメインに対するペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを作製する方法であって、
１）ヒト以外の動物モデルにおいて配列番号１〜配列番号４によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列で構成されるＦＬドメインペプチドを抗原として使用することにより免疫応答を誘導して、ＦＬドメイン特異的なペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを産生する工程と、
２）上の工程１）において産生された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントが上記抗原に特異的に結合可能であったかどうかを確認する工程と、
３）工程２）において上記抗原に特異的に結合することが確認された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントを分離及び精製する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、Ｈ２ドメインに対するペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを作製する方法であって、
１）ヒト以外の動物モデルにおいて配列番号１１〜配列番号１２によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列で構成されるＨ２ドメインペプチドを抗原として使用することにより免疫応答を誘導してＨ２ドメインに特異的なペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを産生する工程と、
２）上の工程１）で産生された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントが上記抗原に特異的に結合可能であったかどうかを確認する工程と、
３）工程２）で上記抗原に特異的に結合することが確認された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントを分離及び精製する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００２２】
また、本発明は、ＨＲＦのＣ末端ドメインに対するペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを作製する方法であって、
１）ヒト以外の動物モデルにおいてＨＲＦのＣ末端ドメインペプチドを抗原として使用することにより免疫応答を誘導してＨＲＦのＣ末端ドメインに特異的なペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを産生する工程と、
２）上の工程１）で産生された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントが上記抗原に特異的に結合可能であったかどうかを確認する工程と、
３）工程２）で上記抗原に特異的に結合することが確認された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントを分離及び精製する工程と、
を含む、方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用分析を行う工程を含む、ＨＲＦ特異的受容体を同定する方法を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明者らは、細胞膜に存在するＨＲＦ受容体に結合することができたＦＬドメイン及びＨ２ドメインを本発明のＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）の構造部分として確認し、また、上記受容体への結合又はＨＲＦの活性化にＨＲＦのＣ末端ドメインが関与することを確認した。本発明者らは、ＦＬ及びＨ２のドメインが、ＨＲＦ受容体に結合することによってＩＬ−８の分泌を阻害可能であったことを更に確認した。それゆえ、ＨＲＦ受容体に結合するＨＲＦのＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン及びＣ末端ドメインを、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹（皮膚の掻痒）、花粉症、結膜炎及びアナフィラキシー等のアレルギー性疾患；気管支炎、肺炎、関節炎、腎炎、乾癬、皮膚炎、クローン病、腸炎、歯肉炎、動脈硬化、冠動脈炎、肝炎、ベーチェット病、膀胱癌、前立腺炎、腎盂腎炎、糸球体腎炎、骨髄炎、甲状腺炎、ブドウ膜炎、腹腔内炎症、髄膜炎、肺線維症及び関節リウマチ等の炎症性疾患；並びにマラリアを含むＨＲＦ関連疾患の診断、予防及び治療に対する薬剤の開発に効果的に使用することができる。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態の応用は、添付の図面を参照することによって最もよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞における様々な濃度での処理による、ｆ−ＴＣＴＰ（単量体ＴＣＴＰ）、Δ−ｄＴＣＴＰ（ＦＬ欠失二量体ＴＣＴＰ）、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ（Ｎ末端欠失二量体ＴＣＴＰ、ＨＲＦ）のＩＬ−８誘導能力の比較を説明するグラフである。
【図２】ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞における様々な濃度での処理による、ｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰのＧＭ−ＣＳＦ誘導能力の比較を説明するグラフである。
【図３】ＥＬＩＳＡによって調査された、ペプチドｄＴＢＰ２（ｄＴＣＴＰ結合ペプチド２）に対するｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰの親和性を説明するグラフである。
【図４】ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰに対するＦＬドメイン、ヘリックス２、又はヘリックス３の阻害効果を説明するグラフである。
【図５】ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰに対するＦＬドメインを認識する抗体の阻害効果を説明するグラフである。
【図６】ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰに対するＨ２ドメインを認識する抗体の阻害効果を説明するグラフである。
【図７】ｆ−ＴＣＴＰ  Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を説明する図である。３７℃で２．５時間に亘る過剰発現、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのローディングの順番：超音波処理後の上清（Ｓ）、ペレット（Ｐ）、Ｈｉｓ  ｔｒａｐローディング後の非結合（Ｕｎｂ）、ｄｕｍｐ、マーカー（Ｍ）、画分Ａ１、画分Ａ２、画分Ａ３、画分Ａ４、マーカー（Ｍ）、画分Ａ５、画分Ａ６、マーカー（Ｍ）、画分Ａ８、画分Ａ１０。マーカーサイズ：２４０−１４０−１００−７０−５０−３５−２５−２０−１５−７ｋＤａ。
【図８】ｆ−ＴＣＴＰ  Ｑ（陰イオン交換カラム）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を説明する図である。図７で得られた画分のうち、５ｍｌの画分Ａ２及び画分Ａ６を１０倍希釈した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのローディングの順番：Ｑ（陰イオン交換カラム）ローディング後の非結合（Ｕｎｂ）、画分Ａ１、画分Ａ２、画分Ａ３、マーカー（Ｍ）、画分Ａ４、画分Ａ５、画分Ａ６、画分Ａ７、マーカー（Ｍ）、画分Ａ８、画分Ａ９、画分Ａ１０。マーカーサイズ：２４０−１４０−１００−７０−５０−３５−２５−２０−１５−７ｋＤａ。
【図９】Δ−ＴＣＴＰ  Ｈｉｓ  Ｔｒａｐ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を説明する図である。３７℃で２．５時間に亘る過剰発現、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのローディングの順番：過剰発現前（前）、過剰発現後（後）、超音波処理後の上清（Ｓ）、マーカー（Ｍ）、ペレット（Ｐ）、Ｈｉｓ  ｔｒａｐローディング後の非結合（Ｕｎｂ）、ｄｕｍｐ、マーカー（Ｍ）、画分Ａ１、画分Ａ２、画分Ａ３、マーカー（Ｍ）、画分Ａ４、画分Ａ５、画分Ａ６。マーカーサイズ：２４０−１４０−１００−７０−５０−３５−２５−２０−１５−７ｋＤａ。
【図１０】Δ−ＴＣＴＰ  Ｑ（陰イオン交換カラム）ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を説明する図である。図９で得られた画分のうち、３ｍｌの画分Ａ２〜画分Ａ４を１０倍希釈した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのローディングの順番：Ｑ（アニオン交換カラム）ローディング後の非結合（Ｕｎｂ）、画分Ａ２、マーカー（Ｍ）、画分Ａ３、画分Ａ４、画分Ａ５、マーカー（Ｍ）、画分Ａ６、画分Ａ７、マーカー（Ｍ）、画分Ａ８、画分Ａ９。マーカーサイズ：２４０−１４０−１００−７０−５０−３５−２５−２０−１５−７ｋＤａ。
【図１１】ＮＭＲによって同定されたｆ−ＴＣＴＰ（緑色）、Δ−ＴＣＴＰ（ピンク色）、及びＴＣＴＰ（２ＨＲ９、青緑色）の構造の比較を説明する図である。
【図１２】ジスルフィド結合によって形成されたｆ−ｄＴＣＴＰ（緑色）及びΔ−ｄＴＣＴＰ（ピンク色）の構造の比較を説明する図である。
【図１３】ジスルフィド結合によって形成されたｆ−ｄＴＣＴＰ（緑色）及びΔ−ｄＴＣＴＰ（ピンク色）の構造の比較、並びにモデルＨＲＦ（青緑色）を説明する図である。
【図１４】ＨＲＦとその受容体との間の結合モデル、及びＨＲＦとｄＴＢＰ２ペプチドとの間の結合モデルを説明する図である。
【図１５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を説明する図であり、ここでは、ＨＲＦ受容体結合ドメインに特異的に結合する抗体が構築され、アフィニティークロマトグラフィーによってＩｇＧが得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに進んだ。図中、１〜３はＦＬに結合する抗体を示し（１：０．５μｇ、２：１μｇ、３：２μｇ）、４又は５はＢＧＧを示し（４：０．５μｇ、５：１μｇ）、６〜８はＨ２に結合する抗体を示す（６：０．５μｇ、７：１μｇ、８：２μｇ）。
【図１６】構築された喘息及び鼻炎の疾患モデルに対するペプチドの投与に関するプロトコル及び免疫化スケジュールを説明する図である。
【図１７ａ】喘息及び鼻炎の疾患モデルに対してＰＢＳ、ＦＬドメイン（２０ｍｇ／ｋｇ）、及びＨ２ドメイン（２０ｍｇ／ｋｇ）が投与された場合の気管支肺胞洗浄液中に浸潤した炎症性細胞の数の比較を説明するグラフである。
【図１７ｂ】喘息及び鼻炎の疾患モデルに対してＰＢＳ、ＦＬドメイン（２０ｍｇ／ｋｇ）、及びＨ２ドメイン（２０ｍｇ／ｋｇ）が投与された場合の気管支肺胞洗浄液中に浸潤した炎症性細胞の数の比較を説明するグラフである。
【図１７ｃ】喘息及び鼻炎の疾患モデルに対してＰＢＳ、ＦＬドメイン（２０ｍｇ／ｋｇ）、及びＨ２ドメイン（２０ｍｇ／ｋｇ）が投与された場合の気管支肺胞洗浄液中に浸潤した炎症性細胞の数の比較を説明するグラフである。
【図１８】喘息及び鼻炎の疾患モデルにおけるＰＢＳ、ＦＬドメイン（２０ｍｇ／ｋｇ）、及びＨ２ドメイン（２０ｍｇ／ｋｇ）の気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−５分泌に対する抑制効果の比較を説明するグラフである。
【図１９】喘息及び鼻炎の疾患モデルにおけるＰＢＳ及びＦＬドメイン（２０ｍｇ／ｋｇ）のＯＶＡ特異的ＩｇＥ分泌に対する抑制効果の比較を説明するグラフである。
【図２０ａ】喘息及び鼻炎の疾患モデルにおけるＰＢＳ及びＦＬドメインの濃度による気管支肺胞洗浄液中に浸潤した炎症性細胞の数の比較を説明するグラフである。
【図２０ｂ】喘息及び鼻炎の疾患モデルにおけるＰＢＳ及びＦＬドメインの濃度による気管支肺胞洗浄液中に浸潤した炎症性細胞の数の比較を説明するグラフである。
【図２０ｃ】喘息及び鼻炎の疾患モデルにおけるＰＢＳ及びＦＬドメインの濃度による気管支肺胞洗浄液中に浸潤した炎症性細胞の数の比較を説明するグラフである。
【図２１】喘息及び鼻炎の疾患モデルにおける様々な濃度での治療による気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−５分泌に対するＰＢＳ及びＦＬドメインの阻害効果、並びにＨＲＦを検出する免疫ブロッティングの結果を説明する図である。
【図２２】喘息及び鼻炎の疾患モデルの肺組織における様々な濃度での治療によるＩκＢαリン酸化に対するＰＢＳ及びＦＬドメインの阻害効果を調べる免疫ブロッティングの結果を説明する図である。
【図２３】喘息及び鼻炎の疾患モデルにおける血漿中の様々な濃度での治療によるＯＶＡ特異的ＩｇＥ分泌に対するＰＢＳ及びＦＬドメインの阻害効果の比較を説明するグラフである。
【図２４】ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰに対するＣ末端ドメインを認識する抗体の阻害活性を説明するグラフである。
【図２５】喘息及び鼻炎の疾患モデルにおいて気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−５分泌に対する、免疫前（pre-immune）血清及びＦＬドメイン又はＣ末端ドメインに対する抗血清の阻害効果を説明するグラフである。
【図２６】図１６の喘息及び鼻炎の疾患モデルへの免疫前ＩｇＧ及び抗Ｃ末端ＩｇＧ抗体の投与のプロトコルを説明する図である。
【図２７】喘息及び鼻炎の疾患モデルへの免疫前ＩｇＧ及び抗Ｃ末端ＩｇＧ抗体の点鼻投与又は腹膜投与による気管支肺胞洗浄液中に浸潤した炎症性細胞の数の比較を説明する図である。
【図２８ａ】免疫前ＩｇＧ及びそれに対する抗Ｃ末端ＩｇＧ抗体の点鼻投与又は腹膜投与による喘息及び鼻炎の疾患モデルにおける気管支肺胞洗浄液中に浸潤した白血球（ＷＢＣ）の数の比較を説明するグラフである。
【図２８ｂ】免疫前ＩｇＧ及びそれに対する抗Ｃ末端ＩｇＧ抗体の点鼻投与又は腹膜投与による喘息及び鼻炎の疾患モデルにおける気管支肺胞洗浄液中に浸潤した好中球（ＮＥ）の数の比較を説明するグラフである。
【図２８ｃ】免疫前ＩｇＧ及びそれに対する抗Ｃ末端ＩｇＧ抗体の点鼻投与又は腹膜投与による喘息及び鼻炎の疾患モデルにおける気管支肺胞洗浄液中に浸潤したリンパ球（ＬＹ）の数の比較を説明するグラフである。
【図２８ｄ】免疫前ＩｇＧ及びそれに対する抗Ｃ末端ＩｇＧ抗体の点鼻投与又は腹膜投与による喘息及び鼻炎の疾患モデルにおける気管支肺胞洗浄液中に浸潤した単球（ＭＯ）の数の比較を説明するグラフである。
【図２８ｅ】免疫前ＩｇＧ及びそれに対する抗Ｃ末端ＩｇＧ抗体の点鼻投与又は腹膜投与による喘息及び鼻炎の疾患モデルにおける気管支肺胞洗浄液中に浸潤した好酸球（ＥＯ）の数の比較を説明するグラフである。
【図２８ｆ】免疫前ＩｇＧ及びそれに対する抗Ｃ末端ＩｇＧ抗体の点鼻投与又は腹膜投与による喘息及び鼻炎の疾患モデルにおける気管支肺胞洗浄液中に浸潤した好塩基球（ＢＡ）の数の比較を説明するグラフである。
【図２９】免疫前ＩｇＧ及びそれに対する抗Ｃ末端ＩｇＧ抗体の点鼻投与又は腹膜投与による喘息及び鼻炎の疾患モデルにおける気管支肺胞洗浄液中に分泌されたＩＬ−５濃度の比較を説明する図である。
【図３０】関節リウマチモデルにおける関節リウマチの予防に対する７−ｍｅｒペプチドであるｄＴＢＰ２の効果を説明するグラフである。
【図３１】関節リウマチモデルにおける関節リウマチの治療に対するｄＴＢＰ２の効果を説明するグラフである。
【図３２ａ】裸眼で観察されたアトピー性皮膚炎モデルにおけるｄＴＢＰ２の改善効果を説明する図である。
【図３２ｂ】アトピー性皮膚炎モデルにおけるｄＴＢＰ２の改善効果を説明するグラフである。
【図３３】アトピー性皮膚炎モデルにおけるＨＲＦの増加を説明する図である。
【図３４ａ】アトピー性皮膚炎モデルにおけるｄＴＢＰ２の効果を組織学的に評価するためのＨ＆Ｅ染色の結果を説明する図である。
【図３４ｂ】アトピー性皮膚炎モデルにおける皮膚厚さに対するｄＴＢＰ２の効果を説明するグラフである。
【図３４ｃ】アトピー性皮膚炎モデルにおける肥満細胞の浸潤に対するｄＴＢＰ２の組織学的効果を説明する図である。
【図３４ｄ】アトピー性皮膚炎モデルにおける肥満細胞の浸潤に対するｄＴＢＰ２の効果を説明するグラフである。
【図３５】リンパ節アッセイによって確認されたｄＴＢＰ２の効果を説明する図である。
【図３６】ＨＲＦの阻害により生じるｄＴＢＰ２の抗アレルギー活性を示すヒスタミンレベルを説明するグラフである。
【図３７ａ】アトピー関連Ｔｈ２細胞サイトカインであるＩＬ−４のｍＲＮＡレベルを説明するグラフである。
【図３７ｂ】アトピー関連Ｔｈ２細胞サイトカインであるＩＬ−１３のｍＲＮＡレベルを説明するグラフである。
【図３８】Ｔｈ１７Ａの減少に対するｄＴＢＰ２の効果を説明するグラフである。
【図３９】関節リウマチの進行によるＴＣＴＰの増加を説明するグラフである。
【図４０】ＩＨＣ（免疫組織化学）の結果の顕微鏡観察によって確認された関節リウマチ患者の関節内のＴＣＴＰ分布を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本発明は、ＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）と細胞膜に存在するその受容体との間の結合阻害剤を有効成分として含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数の疾患の診断、予防、又は治療に対する医薬組成物を提供する。
【００２９】
ＴＣＴＰは、分泌小胞（small secretory vesicle）に滞在した後に不規則な経路によって細胞の外に分泌される固有のタンパク質である。ｐ５３誘導性膜タンパク質であるＴＳＡＰ６がこのプロセスに関与すると報告されている（Amzallag et al., J Biol Chem, 279, 46104-46112, 2004）。分泌されたＨＲＦは、ＩｇＥで感作された好塩基球を刺激してヒスタミン及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）の放出を促進し、アレルギー性鼻炎、喘息、及びアトピー性皮膚炎等の遅発相アレルギー性疾患をもたらす（非特許文献１）。
【００３０】
本明細書におけるアレルギー性疾患は、好ましくは喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹（皮膚の掻痒）、花粉症、結膜炎及びアナフィラキシー、より好ましくは喘息、鼻炎又はアトピー性皮膚炎からなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００３１】
本明細書における炎症性疾患は、好ましくは関節リウマチ、気管支炎、肺炎、関節炎、腎炎、乾癬、皮膚炎、クローン病、腸炎、歯肉炎、動脈硬化、冠動脈炎、肝炎、ベーチェット病、膀胱癌、前立腺炎、腎盂腎炎、糸球体腎炎、骨髄炎、甲状腺炎、ブドウ膜炎、腹腔内炎症、髄膜炎及び肺線維症、より好ましくは関節リウマチからからなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００３２】
ＨＲＦによって上方制御され得るＩＬ−８は、様々なアレルギー性疾患に関与し、好ましくは喘息又は気管支炎（Chanez et al., Int Arch Allergy Immunol, 111, 83-88, 1996）、慢性閉塞性肺疾患（Nocker et al., Int Arch Allergy Immunol, 109, 183-191, 1996）、気管支拡張症（Simpson et al., Thorax, 62, 211-218, 2007）、鼻炎（Benson et al., Pediatr Allergy Immunol, 10, 178-185, 1999; Kuna et al., J Allergy Clin Immun, 97, 104-112, 1996）、アトピー性皮膚炎（Kimata & Lindley, Arch Dis Child 70,119-122, 1994）、蕁麻疹（皮膚の掻痒、Choi et al., J Clin Immunol, 28, 244-249, 2008）、花粉症（Ciprandi  et al., Otolaryngol Head Neck Surg, 133, 429-435, 2005）、結膜炎（Miyoshi et al., Cornea, 20, 743-747, 2001）、及びアナフェラキシーによって例示されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００３３】
ＩＬ−８は様々な炎症性疾患に関与し、好ましくは、慢性気管支炎等の慢性炎症性気管支疾患（Richman-Eisenstat et al., Am J Physiol, 264, L413-418, 1993）、肺炎等の炎症性肺疾患（Erger and Casale, Eur Respir J, 11, 299-305, 1998; Pease & Sabroe, Am J Respir Med, 1, 19-25, 2002）、関節炎又は腎炎（Harada et al., J Leukoc Biol, 56, 559-564, 1994）、乾癬（Schulz et al., J Immunol, 151, 4399-4406, 1993; Bruch-Gerharz et al., J Exp Med, 184, 2007-2012, 1996）、皮膚炎（Sticherling et al., Arch Dermatol Res, 284, 82-85, 1992）、クローン病（Izutani et al., Inflamm Bowel Dis, 1, 37-47, 1995）、炎症性腸疾患（Mitsuyama et al., Clin Exp Immunol, 96, 432-436, 1994）、歯肉炎（Haake & Huang, Clinical Periodontology, 9th Edition. Philadelphia: W.B.Saunders Co. 2002. page 162）、動脈硬化症及び冠動脈疾患等の心血管疾患（Apostolakis et al., Cardiovasc Res, 84, 353-360, 2009; Boekholdt et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol,24, 1503-1508, 2004）、慢性肝疾患（Zimmermann et al., PLoS ONE, 6, e21381, 2011）、ベーチェット病（Katsantonis et al., Dermatology, 201, 37-39, 2000）、膀胱癌、前立腺炎、腎盂腎炎、又は骨髄炎（Shahzad et al., Int arch med, 3, 11, 2010）、甲状腺疾患（Kobawala et al., J Thyroid Res, 8, 270149, 2011）、ブドウ膜炎（Klok et al., Br J Ophthalmol, 82, 871-874, 1998）、糸球体腎炎、腹膜炎、髄膜炎、及び肺線維症（Harada et al., Mol Med Today, 2, 482-489, 1996）によって例示されるが、必ずしもこれらに限定されない。したがって、肺疾患、関節リウマチ、炎症性腸疾患、乾癬及び掌蹠膿疱症等の慢性炎症性皮膚疾患、眼炎症等の他の炎症性疾患（Mukaida, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 284, L566-L577, 2003; Skov et al., J Immunol, 181, 669-679, 2008; Harada et al., J Leukoc Biol, 56, 559-564, 1994）等の疾患を治療するための効率的な戦略としてＩＬ−８阻害剤を使用することが提案される。ＩＬ−８ブロッキング抗体又はＩＬ−８受容体をコードする遺伝子の抑制もまた、炎症の治療において有効である（Harada et al., Mol Med Today, 2, 482-489, 1996）。例えば、炎症は、慢性炎症性皮膚疾患を有する患者にＩＬ−８に対する抗体を投与することにより減少された（Skov et al., J Immunol, 181, 669-679, 2008）。ＨＲＦによって上方制御されるＧＭ−ＣＳＦもまた、様々な炎症性疾患に関与するため（Hamilton, Trends Immunol, 23, 403-408, 2002）、ＧＭ−ＣＳＦもまた、関節リウマチを含む炎症性疾患の治療に対する標的として提案される（Cornish et al., Nat Rev Rheumatol, 5, 554-559, 2009）。本発明者らは、ＨＲＦ受容体結合阻害剤がＩＬ−８分泌の阻害に関与することを確認し、本発明のＨＲＦ受容体結合阻害剤が上に述べられる疾患の予防及び治療に有用な可能性があることが示唆された。
【００３４】
抗マラリア剤であるアルテミシニンがマラリアのタンパク質ＨＲＦに結合することが１９９８年に開示された（Bhisutthibhan et al., J Biol Chem, 273, 16192-16198, 1998）。また、ＩＬ−８はマラリアを有する患者で分泌され（Friedland et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 87, 54-55, 1993）、以前の報告によればマラリアＨＲＦはＩＬ−８分泌を促進する（MacDonald et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 10829-32, 2001）。したがって、ＨＲＦ活性を抑制するためＨＲＦの受容体結合を阻害することによって、アルテミシニンと同じように本発明のＨＲＦ受容体結合阻害剤をマラリアの予防及び治療に有利に使用することができる。
【００３５】
ＴＣＴＰ（翻訳的に制御された腫瘍タンパク質）二量体は活性型である。ＴＣＴＰ二量体型ＨＲＦの構造のうち、可動性ループ（ＦＬ）ドメイン又はヘリックス２（Ｈ２）ドメインは、ＨＲＦ受容体と結合するための領域である。本明細書では、ＴＣＴＰは天然起源由来又は人工的な産生によって作製されることが好ましく、全長であるか、又は可動性ループ（ＦＬ）の欠失、ヘリックス２（Ｈ２）の欠失、Ｃ末端の欠失、若しくはＮ末端の欠失のいずれかを有する。
【００３６】
上記ＴＣＴＰ二量体型ＨＲＦは、全長、若しくはＦＬ、Ｈ２、Ｎ末端若しくはＣ末端の欠失型のいずれかの二量体型であってもよく、又はホモ若しくはヘテロであってもよい。
【００３７】
上記ＴＣＴＰ二量体型ＨＲＦは、脊椎動物に由来してもよい。
【００３８】
上記結合阻害剤は、ＨＲＦ受容体と、可動性ループ（ＦＬ）ドメイン及びヘリックス２（Ｈ２）ドメインのうち１つ又はそれらの両方との間の結合を阻害するように機能し得る。
【００３９】
ＴＣＴＰ二量体型ＨＲＦ構造において、可動性ループ（ＦＬ）ドメインは、天然変性タンパク質（ＩＵＰ）構造部分として細胞膜に存在するＨＲＦ受容体に結合することができるが、必ずしもこれに限定されない。
【００４０】
上記ＦＬドメインは、以下の（Ｘ）ｎ−（Ｓ又はＴ）−ＲＴＥＧ−（Ａ、Ｎ、又はＱ）−ＩＤＤＳＬＩＧＧＮＡＳＡＥＧＰＥＧＥＧＴＥ−（Ｓ又はＡ）−ＴＶ−（Ｖ又はＩ）−Ｔ−（Ｘ）ｎのアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つを含むことが好ましく、式中、Ｘは無作為のアミノ酸であり、ｎは０〜５の整数である。
【００４１】
上記ＦＬドメインは、以下の表１に列挙される配列番号１〜配列番号４によって表されるアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つを含むことが好ましい。
【００４２】
上のＦＬドメインは、それ自体をコードする遺伝子によってコードされてもよい。
【００４３】
上のＦＬドメインは、以下の表１に列挙される配列番号５〜配列番号１０によって表されるヌクレオチド配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントのいずれかのＤＮＡによってコードされてもよい。
【００４４】
上記ＴＣＴＰ二量体型ＨＲＦは、細胞膜に存在するＨＲＦ受容体に結合するヘリックス２（Ｈ２）ドメインを有してもよい。
【００４５】
上記Ｈ２ドメインは、以下の（Ｘ）ｎ−ＴＫＥ−（Ａ又はＳ）−ＹＫＫＹＩＫＤＹＭＫ−（Ｓ又はＡ）−（Ｌ又はＩ）−Ｋ−（Ｇ又はＡ）−（Ｋ又はＲ）−ＬＥＥ−（Ｑ又はＨ）−（Ｋ又はＲ）−Ｐ−（Ｘ）ｎのアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つを含むことが好ましく、式中、Ｘは無作為のアミノ酸であり、ｎは０〜５の整数である。
【００４６】
上記Ｈ２ドメインは、以下の表１に列挙される配列番号１１〜配列番号１２によって表されるアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つを含むことが好ましい。
【００４７】
上のＨ２ドメインは、それ自体をコードする遺伝子によってコードされてもよい。
【００４８】
上のＨ２ドメインは、以下の配列番号１３〜配列番号１５によって表されるヌクレオチド配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つによってコードされてもよい。
【００４９】
上記Ｃ末端ドメインは、以下の配列番号３３〜配列番号３４によって表されるアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つで構成されることが好ましく、該アミノ酸配列は１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有してもよい。
【００５０】
上のＣ末端ドメインはそれ自体をコードする遺伝子によってコードされてもよい。
【００５１】
上のＣ末端ドメインは、以下の配列番号３５〜配列番号３７によって表されるヌクレオチド配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つによってコードされてもよい。上記Ｃ末端ドメインは、以下の配列番号３３〜配列番号３４によって表されるアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つで構成されることが好ましく、該アミノ酸配列は１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有してもよい。
【００５２】
【表１】
0006643329.tif 000002
【００５３】
ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、又はＣ末端ドメインのアミノ酸配列は、当業者に既知の従来の方法によって修飾されてもよい。例えば、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、又はＣ末端ドメイン中のアミノ酸の数は、増加されてもよく、減少されてもよい。また、修飾は、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、又はＣ末端ドメインの活性が減少されない限り、上のアミノ酸配列中の順番又は特定の残基を変更することによって行われてもよい。上記アミノ酸は、天然のＬ−α−アミノ酸のみならず、β、γ、δのアミノ酸またＤ−α−アミノ酸誘導体に変更されてもよい。
【００５４】
したがって、当業者は、そのＨＲＦ阻害活性が維持され、増加され、又は減少されない限り、従来の技法を使用してＦＬ、Ｈ２ドメイン、又はＣ末端ドメインを修飾することができる。その場合、修飾されたものもまた、本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
上記ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、Ｃ末端ドメインは、脊椎動物に由来してもよい。
【００５６】
ＨＲＦ受容体結合ドメイン及びその機構が本発明によって開示されることから、当該技術分野の知識を有する者はだれでも、ラット、マウス、ヒト、ウサギ、及びニワトリにおいてＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインを容易に同定することができる。したがって、ラット、マウス、ヒト、ウサギ、及びニワトリのＨＲＦ受容体結合ドメインもまた、本発明の範囲に含まれる。
【００５７】
ＴＣＴＰの全長アミノ酸は、様々な真核生物において高度に保存され、配列アラインメントによって確認された（Thaw et al., Nat Struct Biol, 8, 701-704, 2001）。三次元構造もまた、高い類似性を有する（Hinojosa-Moya et al., J Mol Evol, 66, 472-483, 2008）。したがって、ＴＣＴＰの全長配列のみならず、受容体結合ドメインであるＦＬ、Ｈ２、及びＣ末端もまた、脊椎動物において非常に相同であり、受容体結合、二量体形成において、又は活性化のための部位として同等に作用し得る。
【００５８】
上の結合阻害剤は、ＨＲＦ受容体への結合に関与するドメインに特異的に結合し、ＨＲＦとその受容体との間の結合を阻害して受容体活性を阻害するか、又は二量体形成を阻害するように機能することが好ましい。
【００５９】
上の結合阻害剤は、以下のＨＲＦのＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインの１又は複数に結合し、ＦＬドメイン又はＨ２ドメインのいずれか又はそれらの両方とＨＲＦ受容体との間の結合を阻害し得る。
【００６０】
上の結合阻害剤は、以下のＨＲＦのＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインの１又は複数に対する抗体、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される１又は複数の物質を含んでもよい。
【００６１】
上の結合阻害剤は、アミノ酸配列（Ｘ）ｎ−（Ｓ又はＴ）−ＲＴＥＧ−（Ａ、Ｎ又はＱ）−ＩＤＤＳＬＩＧＧＮＡＳＡＥＧＰＥＧＥＧＴＥ−（Ｓ又はＡ）−ＴＶ−（Ｖ又はＩ）−Ｔ−（Ｘ）ｎ、それらのアナログ、又はそれらのフラグメントを認識する抗体又はそのフラグメントであってもよいが、必ずしもこれらに限定されず、ＦＬドメインを認識することができる任意の抗体が許容され得る。式中、Ｘは無作為のアミノ酸であり、ｎは０〜５の整数である。
【００６２】
上の結合阻害剤は、アミノ酸配列（Ｘ）ｎ−ＴＫＥ−（Ａ又はＳ）−ＹＫＫＹＩＫＤＹＭＫ−（Ｓ又はＡ）−（Ｌ又はＩ）−Ｋ−（Ｇ又はＡ）−（Ｋ又はＲ）−ＬＥＥ−（Ｑ又はＨ）−（Ｋ又はＲ）−Ｐ−（Ｘ）ｎ、それらのアナログ、又はそれらのフラグメントを認識する抗体又はそのフラグメントであってもよいが、必ずしもこれらに限定されず、Ｈ２ドメインを認識することができる任意の抗体が許容され得る。式中、Ｘは無作為のアミノ酸であり、ｎは０〜５の整数である。
【００６３】
上の結合阻害剤は、配列番号３３又は配列番号３４によって表されるアミノ酸配列、それらのアナログ、若しくはそれらのフラグメントを認識する抗体若しくはそのフラグメント、又はそのフラグメントであってもよく、該アミノ酸配列は、配列中に１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有してもよいが、必ずしもこれらに限定されず、ＨＲＦのＣ末端ドメインを認識することができる任意の抗体が許容され得る。
【００６４】
上の結合阻害剤は、ＨＲＦ受容体に結合してＨＲＦの機能を抑制する。Ｃ末端ドメインは、ＴＣＴＰ二量体形成、又はＨＲＦ若しくはＨＲＦ受容体の活性化を阻害することが好ましい。
【００６５】
本発明におけるＨＲＦ機能の阻害は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の分泌、ＩＬ−８の分泌、及び酸化ストレス活性の阻害をもたらすことが好ましい。
【００６６】
上の結合阻害剤は、ＨＲＦ受容体を競合的に、非競合的に、又は不競合的に阻害し得る。
【００６７】
上の結合阻害剤は、ＨＲＦのＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、Ｃ末端ドメイン、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントからなる群から選択される１又は複数の物質を有効成分として含むＨＲＦ受容体結合阻害剤を含んでもよい。
【００６８】
上の結合阻害剤は、ＨＲＦのＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、Ｃ末端ドメイン、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントからなる群から選択される１又は複数の物質を含んでもよい。
【００６９】
配列番号１〜配列番号４によって表されるアミノ酸配列の１つを含むＦＬドメインは、ＩｇＥ依存性ヒスタミン放出因子（ＨＲＦ）と細胞膜に存在するＨＲＦ受容体との間の結合阻害剤として作用し得る。
【００７０】
配列番号１１又は配列番号１２によって表されるアミノ酸配列を含むＨ２ドメインは、上の結合阻害剤として作用し得る。
【００７１】
配列番号３３又は配列番号３４によって表されるアミノ酸配列を含むＣ末端ドメインは、上の結合阻害剤として作用し得る。
【００７２】
また、上のＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、又はＣ末端ドメイン及びＨＲＦドメインと接合された融合タンパク質は、上の結合阻害剤として作用し得る。
【００７３】
上記ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインの様々な配列の組み合せを有するＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインは、結合阻害剤としても作用し得る。
【００７４】
結合阻害剤は、上のＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインと相同性を有する類似の配列又はそのフラグメントを含んでもよい。
【００７５】
上の結合阻害剤は、以下の（Ｘ）ｎ−（Ｓ又はＴ）−ＲＴＥＧ−（Ａ、Ｎ又はＱ）−ＩＤＤＳＬＩＧＧＮＡＳＡＥＧＰＥＧＥＧＴＥ−（Ｓ又はＡ）−ＴＶ−（Ｖ又はＩ）−Ｔ−（Ｘ）ｎのアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つを含むことが好ましく、式中、Ｘは無作為のアミノ酸であり、ｎは０〜５の整数である。
【００７６】
上の結合阻害剤は、表１に列挙される配列番号１〜配列番号４によって表されるアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つを含んでもよい。
【００７７】
上の結合阻害剤は、以下の（Ｘ）ｎ−ＴＫＥ−（Ａ又はＳ）−ＹＫＫＹＩＫＤＹＭＫ−（Ｓ又はＡ）−（Ｌ又はＩ）−Ｋ−（Ｇ又はＡ）−（Ｋ又はＲ）−ＬＥＥ−（Ｑ又はＨ）−（Ｋ又はＲ）−Ｐ−（Ｘ）ｎのアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つを含むことが好ましく、式中、Ｘは無作為のアミノ酸であり、ｎは０〜５の整数である。
【００７８】
結合阻害剤は、表１に列挙される配列番号１１〜配列番号１２によって表されるアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントからなる群から選択される物質の１つで構成されることが好ましい。
【００７９】
結合阻害剤は、以下の配列番号３３〜配列番号３４によって表されるアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つで構成されることが好ましく、該アミノ酸配列は１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有してもよい。
【００８０】
上の結合阻害剤は、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及びＨＲＦからなる群から選択される１又は複数の物質の発現を抑制する発現阻害剤を有効成分として含んでもよい。
【００８１】
ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、Ｃ末端ドメイン、及びＨＲＦからなる群から選択される１又は複数の物質の発現を抑制する発現阻害剤は、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、ＦＬドメイン及びＨ２ドメイン、Ｃ末端ドメイン、又はＨＲＦ  ｍＲＮＡに結合するアンチセンスヌクレオチド、短干渉ＲＮＡ、短ヘアピンＲＮＡ、並びに低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択され得る。
【００８２】
上の結合阻害剤は、ＨＲＦのＣ末端ドメイン、そのアナログ、又はその免疫学的に活性なフラグメントに特異的に結合する抗体を含んでもよい。
【００８３】
上の結合阻害剤は、７個のアミノ酸で構成されるペプチド（ここで、第１のアミノ酸はＡ、Ｌ及びＷからなる群から選択され、第２のアミノ酸はＶ、Ｙ、Ｅ及びＡからなる群から選択され、第３のアミノ酸はＴ、Ｖ、Ｆ、及びＡからなる群から選択され、第４のアミノ酸はＹ、Ｐ、及びＡからなる群から選択され、第５のアミノ酸はＰ、Ｇ、及びＫからなる群から選択され、第６のアミノ酸はＡ、Ｌ、Ｓ、及びＷからなる群から選択され、第７のアミノ酸はＡ、Ｐ、及びＭからなる群から選択される）、それらのアナログ、又はそれらのフラグメントであってもよい。
【００８４】
上の結合阻害剤は、配列番号２３〜配列番号３２によって表されるアミノ酸、それらのアナログ、又はそれらのフラグメントの１つで構成されるペプチドであってもよい。
【００８５】
７個のアミノ酸又はそれらのアナログで構成されるペプチドは、ＨＲＦに結合することができ、より好ましくはＨＲＦのＨ２ドメインに結合することができる。
【００８６】
上の７個のアミノ酸又はそれらのアナログで構成されるペプチドは、最終的に、ＨＲＦにそれ自体を結合することによってＨＲＦとその受容体との間の結合を阻害することにより免疫応答誘導物質の分泌を妨げる。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態では、ｆ−ＴＣＴＰ（単量体ＴＣＴＰ）、Δ−ｄＴＣＴＰ（ＦＬ欠失二量体ＴＣＴＰ）、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ（Ｎ末端欠失二量体ＴＣＴＰ、ＨＲＦ）のＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの分泌に対する効果を調べた。そうするため、ｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰの活性をＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ＡＴＣＣ）におけるＩＬ−８分泌と比較した。その結果、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰは、ｆ−ＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰがなし得たよりも更にＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの分泌を増加した（図１及び図２を参照されたい）。Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰは、活性な二量体を形成することによってＩＬ−８分泌を誘導する能力を示したが、ＦＬ欠失Δ−ｄＴＣＴＰは、二量体を形成してもＩＬ−８分泌を誘導し得なかった不活性な形態であることが確認された。したがって、ＦＬドメインは、その特異的受容体へのＴＣＴＰ二量体の結合に関与することが確認され、サイトカイン分泌活性に対する重要な部分であることが示唆された。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態では、ｄＴＢＰ２（ｄＴＣＴＰ結合ペプチド２）に対するｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰの親和性を調べた。詳しくは、ビオチンをｄＴＢＰ２のＣＯＯＨ末端に接合し、精製して固定化した。その後、ｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰをそれに添加した後、結合強度を調べた。その結果、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰはｆ−ＴＣＴＰ又はΔ−ｄＴＣＴＰよりも高いｄＴＢＰ２に対する親和性を有した（図３を参照されたい）。Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰと異なり、ＦＬドメイン欠失Δ−ｄＴＣＴＰは、二量体を形成できたにもかかわらず、ｄＴＢＰ２ペプチドに対する低い親和性を示した。したがって、ＦＬドメインはｄＴＢＰ２と活性ＨＲＦ型Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰとの間の結合プロセスにおいて重要な役割を果たし、そのためＦＬドメインなしでは二量体が形成されたとしてもｄＴＢＰ２結合が阻害されることが確認された。結論として、ＦＬドメインは受容体に結合して構造変化をもたらし、それによりＨＲＦはｄＴＢＰ２に結合することができる。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、ＦＬドメイン、ヘリックス２ドメイン、及びヘリックス３ドメインがＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰと受容体との間の結合を阻害し得るかどうかを更に調べた。そうするため、各ドメインのペプチドを合成し、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰの阻害を調べるため使用した。ＦＬドメイン、ヘリックス２ドメイン、及びヘリックス３ドメインのペプチドをＮＨ２末端のアセチル化及びＣＯＯＨ末端のアミド化によって合成した後、精製した（peptron）。その結果、ＦＬドメイン及びヘリックス２ドメインは、ヘリックス３ドメインよりも良好にＩＬ−８の分泌を阻害した（図４を参照されたい）。
【００９０】
本発明の好ましい実施形態では、ＦＬドメイン及びヘリックス２ドメインを認識するポリクローナル抗体のＩＬ−８阻害効果を調べた。詳しくは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を種々の濃度の抗ＦＬ抗体及び抗Ｈ２抗体で処理した後、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰによって誘導されるＩＬ−８の抑制を調べた。その結果、ＩＬ−８分泌は抗体単独で処理された陰性対照（ＮＣ）群では観察されなかった。Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ単独で処理された細胞では、ＩＬ−８の分泌は増加した。ＦＬドメインを特異的に認識する抗体で処理された細胞では、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰによるＩＬ−８の分泌は減少した（図５を参照されたい）。また、Ｈ２ドメインを特異的に認識する抗体で処理された細胞でも、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰによるＩＬ−８分泌は減少し、本発明の抗体がＩＬ−８放出に対して阻害効果を有することを示唆した（図６を参照されたい）。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、Ｘ線構造結晶学によってＦＬドメインの存在下又は不在下でのＴＣＴＰ受容体結合のモデリングを行った。そうするため、単量体型のｆ−ＴＣＴＰ（ＦＬドメインを含む）及びΔ−ＴＣＴＰ（ＦＬドメイン欠失）を作製した後、ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰを構築するため二量体形成を行った。結晶化の後、構造を同定した。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態では、ｆ−ｄＴＣＴＰ（ＦＬドメインを含む）を構築するため、単量体型のｆ−ＴＣＴＰ（ＦＬドメインを含む）タンパク質をクローニングして発現させた。ＨｉｓＴｒａｐカラム（図７を参照されたい）を使用して分離されたｆ−ＴＣＴＰを、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｑカラムを使用するイオン交換クロマトグラフィーによって精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図８を参照されたい）。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態では、Δ−ｄＴＣＴＰ（ＦＬドメイン欠失）を構築するため、単量体型のΔ−ＴＣＴＰ（ＦＬドメイン欠失）タンパク質をクローニングして発現させた。ＨｉｓＴｒａｐカラム（図９を参照されたい）を使用して分離されたΔ−ＴＣＴＰを、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｑカラムを使用するイオン交換クロマトグラフィーによって精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１０を参照されたい）。
【００９４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、ターシャリーブチルヒドロペルオキシドで処理することにより上で発現され、精製されたｆ−ＴＣＴＰ及びΔ−ＴＣＴＰの二量体の形成を誘導した。その結果、ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰのタンパク質を得た。
【００９５】
本発明の好ましい実施形態では、ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰのタンパク質結晶の作製に対する最適条件をスクリーニングした。詳しくは、結晶化をハンギングドロップ蒸気拡散法又はシッティングドロップ蒸気拡散法により誘導した。シンクロトロンからの情報を収集するため、安定化されたクライオ条件（cryo-condition：低温条件）をスクリーニングした。結晶化されたｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰのタンパク質のＸ線データを安定化されたクライオ条件において収集した。ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの結晶構造を調べた。その結果、結晶構造の構造は、試験モデルとして使用される本来のＴＣＴＰのものと類似した（図１１を参照されたい）。二量体型のｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの三次元構造は対称蝶形であり、二量体構造はＣｙｓ１７２によって介在されることが確認された（図１２を参照されたい）。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、そのループの可動性によりｆ−ｄＴＣＴＰのＦＬドメイン自体を特定することが困難であったことから、ＦＬドメインを含むｆ−ｄＴＣＴＰの構造のモデリングを行った。ＦＬドメインのモデリングを極小化エネルギーによって行った。その結果、ＦＬと接合されたｆ−ｄＴＣＴＰ構造において、ＦＬは独立しており、ＨＲＦの本体から離れていたため、ＨＲＦ構造全体はＦＬの存在によって影響を受けなかった（図１３を参照されたい）。また、本発明者らは、ｆ−ｄＴＣＴＰとその受容体との間の結合モデル、及びｆ−ｄＴＣＴＰとｄＴＢＴＰ２ペプチドとの間の結合モデルを構築した（図１４を参照されたい）。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態では、本発明者らは、ＨＲＦ受容体に結合する領域であるＨＲＦのＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインに特異的に結合することによってＨＲＦ活性を阻害する抗体を構築するため、抗原としてＨＲＦ受容体結合ドメインペプチドを使用してニュージーランドホワイトのウサギにおいて免疫応答を誘導して特異的なポリクローナル抗体を産生した。産生された抗体が上記抗原に特異的に結合することができたかどうかを調べた。また、本発明者らは、抗原特異的アフィニティークロマトグラフィー（図１５及び実施例８を参照されたい）により受容体結合ドメインであるＦＬ、Ｈ２、及びＣ末端に結合するＩｇＧを分離、精製した後、免疫応答誘導物質に対する阻害効果及びその抗炎症効果の試験を行った。
【００９８】
さらに、本発明の別の好ましい実施形態では、本発明者らは、ＨＲＦ親和性アッセイによってＨＲＦに結合することができた７−ｍｅｒのペプチドを分離し、７個のアミノ酸で構成される７−ｍｅｒペプチドの配列を分析した（配列番号２３〜配列番号３２を参照されたい）。その結果、上のペプチドは、Ｈ２ドメイン等のＨＲＦの特定の領域に結合してＨＲＦとその受容体との間の結合を阻害することができ、したがって、免疫応答誘導物質の分泌を妨げ得ることを確認した。
【００９９】
本発明者らは、ＨＲＦ構造の一部として細胞膜に存在する、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインが、ＨＲＦ受容体を結合することができたことを確認し、上記に結合する抗体及びＨＲＦに結合する７−ｍｅｒペプチドを更に同定した。それゆえ、ＨＲＦに結合する上記のＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン及びＣ末端ドメイン、並びにそれらの抗体及び７−ｍｅｒペプチドを、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹（皮膚の掻痒）、花粉症、結膜炎及びアナフィラキシー等のアレルギー性疾患；気管支炎、肺炎、関節炎、腎炎、乾癬、皮膚炎、クローン病、腸炎、歯肉炎、動脈硬化、冠動脈炎、肝炎、ベーチェット病、膀胱癌、前立腺炎、腎盂腎炎、糸球体腎炎、骨髄炎、甲状腺炎、ブドウ膜炎、腹腔内炎症、髄膜炎、肺線維症及び関節リウマチ等の炎症性疾患；並びにマラリアを含むＨＲＦ関連疾患の診断、予防及び治療のための薬剤の開発に効果的に使用することができる。
【０１００】
本発明の組成物は、ＨＲＦ受容体結合阻害剤に加えて、ＨＲＦ受容体結合阻害剤と同じ又はそれに類似する機能を有する１又は複数の成分を含んでもよい。
【０１０１】
本発明の組成物を経口投与又は非経口投与することができ、非経口投与には、腹腔内注射、直腸内注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、子宮内注射、脳血管内注射、胸腔内注射、関節内注射、硬膜外注射、髄腔内注射、心内膜注射、動脈内注射、骨内注射、鼻腔内投与、直腸内投与、気管内投与、経皮投与、点眼及び噴霧があるが、必ずしもこれらに限定されない。本発明の組成物を一般的な形態の医薬配合物において使用することができる。
【０１０２】
本発明の組成物を単独で投与してもよく、外科手術、ホルモン療法、化学療法、及び生物学的制御因子と共に処理してもよい。
【０１０３】
上記組成物の有効量は、１日当たり０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、投与頻度は１日１回、又は好ましくは１日数回である。上記組成物の有効量は、体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、及び疾患の重症度に応じて決定され得る。
【０１０４】
本発明の組成物は、一般的に使用される希釈剤又は賦形剤、例えば充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤と混合することによって経口投与又は非経口投与用に調製することができる。非経口投与のための配合物は、滅菌水溶液、不水溶性賦形剤、懸濁液、乳液、凍結乾燥調製物及び坐剤であるが、必ずしもこれらに限定されない。不水溶性賦形剤及び懸濁液は、活性化合物（単数又は複数）に加えて、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射用エステル等を含有することができる。坐剤は、活性化合物（単数又は複数）に加えて、ウイテプゾール、マクロゴール、ｔｗｅｅｎ  ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等を含有することができる。
【０１０５】
また、本発明は、ＨＲＦとその受容体との間の結合阻害剤を有効成分として含む薬学的有効量の化合物を被験体に投与する工程を含む、ＨＲＦ関連疾患を予防又は治療する方法を提供する。
【０１０６】
本明細書における疾患は、喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹（皮膚の掻痒）、花粉症、結膜炎及びアナフィラキシー等のアレルギー性疾患；気管支炎、肺炎、関節炎、腎炎、乾癬、皮膚炎、クローン病、腸炎、歯肉炎、動脈硬化、冠動脈炎、肝炎、ベーチェット病、膀胱癌、前立腺炎、腎盂腎炎、糸球体腎炎、骨髄炎、甲状腺炎、ブドウ膜炎、腹腔内炎症、髄膜炎、肺線維症及び関節リウマチ等の炎症性疾患；並びにマラリアからなる群から選択することができるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１０７】
本明細書では、薬学的有効量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇを指すが、必ずしもこれらに限定されない。投与量は、体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与期間、投与方法、除去速度、及び疾患の重症度等に応じて調整され得る。
【０１０８】
本発明の組成物を経口投与又は非経口投与することができ、非経口投与には、腹腔内注射、直腸内注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、子宮内注射、脳血管内注射、胸腔内注射、関節内注射、硬膜外注射、髄腔内注射、心内膜注射、動脈内注射、骨内注射、鼻腔内投与、直腸内投与、気管内投与、経皮投与、点眼及び噴霧があるが、必ずしもこれらに限定されない。本発明の組成物を一般的な形態の医薬配合物において使用することができる。
【０１０９】
本明細書では、被験体は、ヒト、哺乳動物、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、イヌ、及びネコ等の試験動物、並びにチンパンジー及びゴリラ等の類人猿を含む脊椎動物からなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１１０】
本発明は、ＴＣＴＰ二量体構造である活性なＨＲＦにおいて可動性ループＦＬドメイン及びＨ２ドメインが、細胞膜に存在するそれらの受容体に特異的に結合する領域であることを確認した。それゆえ、本発明は、ＨＲＦと上記のＦＬドメイン及びＨ２ドメインを標的とする受容体との間の結合阻害剤をＨＲＦ関連疾患の阻害剤の開発に効果的に使用することができることを示唆し、この場合、上記疾患として喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹（皮膚の掻痒）、花粉症、結膜炎及びアナフィラキシー等のアレルギー性疾患；気管支炎、肺炎、関節炎、腎炎、乾癬、皮膚炎、クローン病、腸炎、歯肉炎、動脈硬化、冠動脈炎、肝炎、ベーチェット病、膀胱癌、前立腺炎、腎盂腎炎、糸球体腎炎、骨髄炎、甲状腺炎、ブドウ膜炎、腹腔内炎症、髄膜炎、肺線維症及び関節リウマチ等の炎症性疾患；並びにマラリアが例示される。
【０１１１】
また、本発明は、
１）ＦＬドメイン及びＨ２ドメイン、ＨＲＦのＦＬドメインとＨ２ドメインとの両方、それらのアナログ、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される１又は複数の物質を、ＨＲＦ受容体と共に試験試料と接触させる工程と、
２）上記ドメイン、それらのアナログ、又はそれらのフラグメントと上記ＨＲＦ受容体との間の結合強度を測定する工程と、
３）上の工程１を経ていない対照と比較して、上の結合を減少することが確認された上記試験試料を選択する工程と、
を含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数のＨＲＦ関連疾患の診断、予防、又は治療に対する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１１２】
本明細書におけるアレルギー性疾患は、好ましくは喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹（皮膚の掻痒）、花粉症、結膜炎及びアナフィラキシーからなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１１３】
本明細書における炎症性疾患は、好ましくは関節リウマチ、気管支炎、肺炎、関節炎、腎炎、乾癬、皮膚炎、クローン病、腸炎、歯肉炎、動脈硬化、冠動脈炎、肝炎、ベーチェット病、膀胱癌、前立腺炎、腎盂腎炎、糸球体腎炎、骨髄炎、甲状腺炎、ブドウ膜炎、腹腔内炎症、髄膜炎及び肺線維症からなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１１４】
工程３）の試験試料は、好ましくはペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド物質、合成物質、化学物質、核酸、天然物質、天然化合物、半合成物質、発酵生成物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物及び血漿からなる群から選択される１又は複数の物質であるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１１５】
また、本発明は、
１）ＦＬドメイン及びＨ２ドメインのいずれか又はそれらの両方、それらのアナログ、並びにそれらのフラグメントからなる群から選択される１又は複数の物質を、ＨＲＦ受容体を発現する細胞と共に、試験試料と接触させる工程と、
２）上の工程１）の細胞を培養する工程と、
３）上の工程１）経ていない対照のレベルと比較して、工程２）の培養溶液中にヒスタミン、ＩＬ−８、又はＧＭ−ＣＳＦを含む活性物質の低分泌を示す試験試料を選択する工程と、
を含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択される１又は複数のＨＲＦ関連疾患の診断、予防、又は治療に対する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１１６】
本明細書におけるアレルギー性疾患は、好ましくは喘息、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患、気管支拡張症、鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹（皮膚の掻痒）、花粉症、結膜炎及びアナフィラキシーからなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１１７】
本明細書における炎症性疾患は、好ましくは関節リウマチ、気管支炎、肺炎、関節炎、腎炎、乾癬、皮膚炎、クローン病、腸炎、歯肉炎、動脈硬化、冠動脈炎、肝炎、ベーチェット病、膀胱癌、前立腺炎、腎盂腎炎、糸球体腎炎、骨髄炎、甲状腺炎、ブドウ膜炎、腹腔内炎症、髄膜炎及び肺線維症からなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１１８】
工程３）の試験試料は、好ましくはペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド物質、合成物質、化学物質、核酸、天然物質、天然化合物、半合成物質、発酵生成物、細胞抽出物、植物抽出物、動物組織抽出物及び血漿からなる群から選択される１又は複数の物質であるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１１９】
また、本発明は、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＨＲＦのＣ末端ドメインからなる群から選択される１又は複数の物質を結合する抗体を構築する工程と、上記で試験試料を処理する工程と、対照と比較して、上の抗体とＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインとの間の結合強度を増すことが確認された試験試料を選択する工程とによる、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択されるＨＲＦ関連疾患の治療に対する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１２０】
また、本発明は、ＦＬ、Ｈ２、及びＣ末端のドメインを含むＨＲＦの発現を測定する工程と、対照と比較して、ＨＲＦ発現を減少することが確認された試験試料を選択する工程とを含む、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択されるＨＲＦ関連疾患の治療に対する候補物質をスクリーニングする方法を提供する。
【０１２１】
また、本発明は、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＨＲＦのＣ末端ドメインからなる群から選択される１又は複数の物質を結合する抗体と、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、又はＨＲＦのＣ末端ドメインとの間の結合強度を測定する工程と、対照の結合強度と比較して、上の抗体とＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインとの間の結合強度を増すことが確認された試験試料を選択する工程とによって、アレルギー性疾患、炎症性疾患、及びマラリアからなる群から選択されるＨＲＦ関連疾患を診断する方法を提供する。
【０１２２】
細胞膜に存在するその受容体への結合を担う、また該受容体に結合することにより最終的にＩＬ−８分泌を阻害することができるＨＲＦ構造中のＦＬドメイン及びＨ２ドメインが本発明において同定されたことから、ＨＲＦ受容体結合ドメインを使用するスクリーニング方法を適用して様々な炎症性疾患、アレルギー性疾患、及びマラリアに対する治療剤をスクリーニングすることができる。
【０１２３】
また、本発明は、ＨＲＦのＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、Ｃ末端ドメイン、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントからなる群から選択される１又は複数の物質と、ＨＲＦ受容体との間の結合を検出する物質を備える、アレルギー性疾患、炎症性疾患、又はマラリアを診断するキットを提供する。
【０１２４】
ＨＦＲ受容体と、ＨＲＦのＦＬドメイン及びＨ２ドメインのうち１つ又はそれらの両方との間の結合を検出することができる物質を調べるため、上のドメインに特異的に結合するプライマー、プローブ（正：probe）、又はアンチセンスヌクレオチドを使用することができるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１２５】
ＨＲＦ受容体と、ＨＲＦのＦＬドメイン及びＨ２ドメインのうち１つ又はそれらの両方との間の結合を検出することができる物質は、ドメイン特異的抗体であってもよい。
【０１２６】
本明細書では、アレルギー性疾患、炎症性疾患、又はマラリアの診断をするキットは、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）キット、ＤＮＡチップキット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）キット、サンドイッチＥＬＩＳＡキット、プロテインチップキット、迅速キット（rapid kit）、又はＭＲＭ（多重反応モニタリング）キットであってもよいが、必ずしもこれらに限定されず、当業者によく知られている任意のキットを選択してもよい。
【０１２７】
本発明のＨＲＦ関連疾患を診断するキットは、ＨＲＦ構造の一部として、細胞膜に存在するＨＲＦ受容体に結合するＦＬドメイン又はＨ２ドメイン認識することができ、ＨＲＦ又は受容体の活性化に関与するＣ末端ドメインを認識し、また、ＨＲＦ受容体にＦＬ又はＨ２のドメインを結合することによって、ＩＬ−８分泌の阻害を確認することができる。したがって、ＨＲＦ受容体結合ドメインを使用する上記キットを、様々な炎症性疾患、アレルギー性疾患、及びマラリアの診断に対する疾患診断キットとして有効に使用することができる。
【０１２８】
また、本発明は、配列番号１〜配列番号４によって表されるアミノ酸配列の１つで構成されるＦＬドメインに特異的に結合する抗体、又はその免疫学的に活性なフラグメントを提供する。
【０１２９】
また、本発明は、配列番号１１〜配列番号１２によって表されるアミノ酸配列の１つで構成されるＨ２ドメインに特異的に結合する抗体、又はその免疫学的に活性なフラグメントを提供する。
【０１３０】
また、本発明は、配列番号３３〜配列番号３４によって表されるアミノ酸配列の１つで構成されるＣ末端ドメインに特異的に結合する抗体、又はその免疫学的に活性なフラグメントを提供する。
【０１３１】
本明細書における抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、マウス抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体からなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１３２】
本明細書では、ポリクローナル抗体は、本発明の１つのタンパク質マーカーを試験動物に注射する工程と、該動物から血液を抜き取って抗体を含有する血清を得る工程とで構成される従来の方法によって産生され得る。ポリクローナル抗体は、当該分野でよく知られている任意の方法によって精製されてもよく、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、サル、ウマ、ブタ、ウシ、及びイヌ等の宿主から産生され得る。
【０１３３】
本明細書では、モノクローナル抗体は、任意の従来技法によって産生され、ハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法、及びＥＢＶハイブリドーマ技法によって例示される、連続細胞培養により抗体分子を提供することができる（Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975、Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985、Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983、及びCole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984）が、必ずしもこれらに限定されない。
【０１３４】
本明細書では、キメラ抗体として、可変領域配列が１つの種を起源とし、可変領域配列がマウス抗体を起源とし、定常領域がヒト抗体を起源とし、定常領域配列が別の種を起源とするような抗体が挙げられ得る。
【０１３５】
本明細書では、ヒト化抗体として、マウス又は他の哺乳動物の生殖系列を起源とするＣＤＲ配列がヒトフレームワーク領域に接合されている抗体が挙げられる。該フレームワーク領域の更なる修飾を、哺乳動物生殖系列を起源とするＣＤＲ配列のみならず、ヒトフレームワーク領域においても行うことができる。
【０１３６】
本明細書では、免疫学的に活性なフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、及びジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択されることが好ましいが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１３７】
また、本発明は、特徴的にＨＲＦ受容体に結合するか、又はＨＲＦのその受容体への結合に関与するＦＬドメインを提供する。上記ＦＬドメインは、以下の（Ｘ）ｎ−（Ｓ又はＴ）−ＲＴＥＧ−（Ａ、Ｎ又はＱ）−ＩＤＤＳＬＩＧＧＮＡＳＡＥＧＰＥＧＥＧＴＥ−（Ｓ又はＡ）−ＴＶ−（Ｖ又はＩ）−Ｔ−（Ｘ）ｎのアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つを含むことが好ましい。
【０１３８】
また、本発明は、特徴的にＨＲＦ受容体に結合するか、又はＨＲＦのその受容体への結合に関与するＨ２ドメインを提供する。上記Ｈ２ドメインは、以下の（Ｘ）ｎ−ＴＫＥ−（Ａ又はＳ）−ＹＫＫＹＩＫＤＹＭＫ−（Ｓ又はＡ）−（Ｌ又はＩ）−Ｋ−（Ｇ又はＡ）−（Ｋ又はＲ）−ＬＥＥ−（Ｑ又はＨ）−（Ｋ又はＲ）−Ｐ−（Ｘ）ｎのアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つを含むことが好ましい。
【０１３９】
また、本発明は、ＨＲＦ受容体へのＨＲＦの結合、ＨＲＦの活性化、又はＨＲＦ二量体の形成に関与するＣ末端ドメインを提供する。本明細書では、Ｃ末端ドメインは、以下の配列番号３３〜配列番号３４によって表されるアミノ酸配列、それらのアナログ、及びそれらのフラグメントの１つを含むことが好ましく、該アミノ酸配列はその中の１又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は付加を有してもよい。
【０１４０】
また、本発明は、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインからなる群から選択される１又は複数の物質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換え発現ベクター、並びに該発現ベクターによって形質移入された形質転換体を提供する。
【０１４１】
また、本発明は、上のＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、又はＣ末端ドメインに特異的に結合するペプチド、抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを提供する。
【０１４２】
また、本発明は、ＦＬドメイン、Ｈ２ドメイン、及びＣ末端ドメインからなる群から選択される１又は複数の物質を有効成分として含む、ヒスタミン放出誘導剤を提供する。
【０１４３】
また、本発明は、ＦＬドメインに対するペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを作製する方法であって、
１）ヒト以外の動物モデルにおいて配列番号１〜配列番号４によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列で構成されるＦＬドメインペプチドを抗原として使用することにより免疫応答を誘導して、ＦＬドメイン特異的なペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを産生する工程と、
２）上の工程１）において産生された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントが上記抗原に特異的に結合可能であったかどうかを確認する工程と、
３）工程２）において上記抗原に特異的に結合することが確認された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントを分離及び精製する工程と、
を含む、方法を提供する。
【０１４４】
また、本発明は、Ｈ２ドメインに対するペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを作製する方法であって、
１）ヒト以外の動物モデルにおいて配列番号１１〜配列番号１２によって表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列で構成されるＨ２ドメインペプチドを抗原として使用することにより免疫応答を誘導してＨ２ドメインに特異的なペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを産生する工程と、
２）上の工程１）で産生された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントが上記抗原に特異的に結合可能であったかどうかを確認する工程と、
３）工程２）で上記抗原に特異的に結合することが確認された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントを分離及び精製する工程と、
を含む、方法を提供する。
【０１４５】
また、本発明は、ＨＲＦのＣ末端ドメインに対するペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを作製する方法であって、
１）ヒト以外の動物モデルにおいてＨＲＦのＣ末端ドメインペプチドを抗原として使用することにより免疫応答を誘導してＨＲＦのＣ末端ドメインに特異的なペプチド若しくは抗体、それらのアナログ、又はそれらの免疫学的に活性なフラグメントを産生する工程と、
２）上の工程１）で産生された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントが上記抗原に特異的に結合可能であったかどうかを確認する工程と、
３）工程２）で上記抗原に特異的に結合することが確認された上記ペプチド、上記抗体、それらの上記アナログ、又はそれらの免疫学的に活性な上記フラグメントを分離及び精製する工程と、
を含む、方法を提供する。
【０１４６】
また、本発明は、タンパク質−タンパク質相互作用分析を行う工程を含む、ＨＲＦ特異的受容体を同定する方法を提供する。このとき、タンパク質−タンパク質相互作用分析は、同時精製、酵母ツーハイブリッド法、又はプロテインチップ法によって行われるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１４７】
上記同時精製は、
１）ＨＲＦ−ＨＲＦ受容体複合体を分離する工程と、
２）分離された複合体を精製する工程と、
３）上の精製された複合体から上記受容体を確認する工程と、
で構成されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１４８】
上記プロテインチップ法は、
１）その機能が開示される又は開示されていない様々なタンパク質が統合されたプロテインチップに対して、本発明の欠失型ＨＲＦ、又はホモ若しくはヘテロＴＣＴＰ二量体を処理する工程と、
２）上記欠失型ＨＲＦ又はＴＣＴＰ二量体特異的抗体の存在下又は不在下で上に言及されたアッセイ方法を使用することにより上記タンパク質−タンパク質相互作用を確認する工程と、
で構成されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１４９】
以下の実施例に示すように、本発明の実際に現在好ましい実施形態を説明する。
【０１５０】
しかし、当業者であれば、本開示を考慮した上で本発明の趣旨及び範囲内の変更及び改善がなされ得ることが理解されるだろう。
【０１５１】
実施例及び実験例で使用される様々な種類のＴＣＴＰ構造は以下の通り区別される。
【０１５２】
詳しくは、ｆ−ＴＣＴＰは全長ＴＣＴＰであり、Δ−ＴＣＴＰはＦＬドメイン欠失ＴＣＴＰであり、ｆ−ｄＴＣＴＰは二量体型ｆ−ＴＣＴＰであり、Δ−ｄＴＣＴＰは二量体型ＦＬドメイン欠失ＴＣＴＰであり、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰは二量体型アミノ末端欠失ＴＣＴＰである。
【実施例】
【０１５３】
実施例１：ｆ−ＴＣＴＰ及びΔ−ＴＣＴＰの構築
＜１−１＞単量体型のｆ−ＴＣＴＰタンパク質及びΔ−ＴＣＴＰタンパク質のクローニング
ＦＬドメインが存在するか欠失されるＨＲＦの活性を測定し、Ｘ線結晶構造を特性評価するのに有用なタンパク質を発現し、抽出するため、表２に列挙される配列を使用してコンストラクトを設計した。
【０１５４】
【表２】
0006643329.tif 000003
【０１５５】
上のタンパク質を作製するため、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Novagen）を使用してｆ−ＴＣＴＰ及びΔ−ＴＣＴＰをクローニングした。ｆ−ＴＣＴＰのクローニングを表３に列挙されるプライマーを使用して行った。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてΔ−ＴＣＴＰ遺伝子を発現するため、コドンの最適化を行った。ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩの制限酵素部位を使用してｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターに挿入された、コドン最適化Δ−ＴＣＴＰ全長配列をBioneerによって作製した。
【０１５６】
【表３】
0006643329.tif 000004
【０１５７】
＜１−２＞単量体型ｆ−ＴＣＴＰタンパク質の発現及び精製
１５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Generay Biotech）で補足したＬＢ（ルリア−ベルターニ）寒天プレート上で実施例＜１−１＞でクローニングしたｆ−ＴＣＴＰベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３−ＧＥＮ−Ｘ）を形質移入した。コロニーを収集し、それを用いて凍結細胞ストックを作製した。細胞を、５ｍｌのＬＢ培地中で一晩培養し、それを新たなＬＢ培地１０００ｍｌ中に希釈した。３１０Ｋ振蕩培養器（N-Biotek）でＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで細胞を培養した。ＯＤ６００が０．６〜０．８に達したら、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、Gold Biotechnology）を最終濃度１ｍＭでそこに添加し、その後、３１０Ｋ振蕩培養器で２．５時間更に培養した。細胞を採取するため、２７７Ｋ高速冷却遠心機（Hanil、Ｓｕｐｒａ  ２２Ｋ）を使用して７６５０ｇ（６５００ｒｅｖ／分）で１０分間遠心分離を行った。採取した細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０、Georgiachem）、１００ｍＭのＮａＣｌ（USB）、１０ｍＭのイミダゾール（USB）、１ｍＭのＰＭＳＦ（Sigma）、１０ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ  Ｉ、及びＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（米国インディアナ州インディアナポリスのRoche Applied Science）を含有するバッファー２５ｍｌに溶かした後、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ５０（米国コネチカット州ダンベリーのBranson Ultrasonics Co.）を使用して溶解した。溶解した細胞を２７７Ｋ高速冷却遠心機において２４９００ｇ（１５０００ｒｅｖ／分）で３０分間遠心分離した。ＨｉｓＴｒａｐカラムを使用するＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（米国ニュージャージー州ピスカタウェイのGE Healthcare）により上清を親和性精製した。表４及び図７に示されるように、ｆ−ＴＣＴＰは、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）及び１００ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーを使用して１０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度のイミダゾールにより勾配溶離されて溶離に至った。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図７）。
【０１５８】
【表４】
0006643329.tif 000005
【０１５９】
ＨｉｓＴｒａｐカラムによって上で分離されたｆ−ＴＣＴＰは、次に、５ｍｌのＨｉ−Ｔｒａｐ  Ｑカラムを使用するイオン交換クロマトグラフィーへと進んだ。表５及び図８に示されるように、ｆ−ＴＣＴＰは、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）を含有するバッファーを使用して０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度のＮａＣｌにより勾配溶離され、溶離に至った。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図８）。
【０１６０】
【表５】
0006643329.tif 000006
【０１６１】
＜１−３＞単量体型Δ−ＴＣＴＰタンパク質の発現及び精製
１５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Generay Biotech）で補足したＬＢ（ルリア−ベルターニ）寒天プレート上で実施例＜１−１＞でクローニングしたΔ−ＴＣＴＰベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３−ＧＥＮ−Ｘ）を形質移入した。コロニーを収集し、それを用いて凍結細胞ストックを作製した。細胞を、５ｍｌのＬＢ培地中で一晩培養し、それを新たなＬＢ培地１０００ｍｌ中に希釈した。３１０Ｋ振蕩培養器（N-Biotek）でＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまで細胞を培養した。ＯＤ６００が０．６〜０．８に達したら、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、Gold Biotechnology）を最終濃度１ｍＭでそこに添加し、その後、３１０Ｋ振蕩培養器で２．５時間更に培養した。細胞を採取するため、７６５０ｇ（６５００ｒｅｖ／分）で１０分間、２７７Ｋ高速冷却遠心機（Hanil、Ｓｕｐｒａ  ２２Ｋ）を使用して遠心分離を行った。採取した細胞を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０、Georgiachem）、１００ｍＭのＮａＣｌ（USB）、１０ｍＭのイミダゾール（USB）、１ｍＭのＰＭＳＦ（Sigma）、１０ｍｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ  Ｉ、及びＲｏｃｈｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（米国インディアナ州インディアナポリスのRoche Applied Science）を含有するバッファー２５ｍｌに溶かした後、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ５０を使用して溶解した。溶解した細胞を２４９００ｇ（１５０００ｒｅｖ／分）で３０分間、２７７Ｋ高速冷却遠心機において遠心分離した。上清を、ＨｉｓＴｒａｐカラムを使用するＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムによって親和性精製した。表６及び図９に示されるように、Δ−ＴＣＴＰを、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）及び１００ｍＭのＮａＣｌを含有するバッファーを使用して１０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度のイミダゾールで勾配溶離し、溶離に至った。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図９）。
【０１６２】
【表６】
0006643329.tif 000007
【０１６３】
ＨｉｓＴｒａｐカラムによって上で分離されたΔ−ＴＣＴＰは、次に５ｍｌのＨｉ−Ｔｒａｐ  Ｑカラムを使用するイオン交換クロマトグラフィーに進んだ。表７及び図１０に示されるように、Δ−ＴＣＴＰを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）を含有するバッファーを使用して０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度のＮａＣｌにより勾配溶離し、溶離に至った。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１０）。
【０１６４】
【表７】
0006643329.tif 000008
【０１６５】
＜１−４＞二量体型のｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰのタンパク質の形成
実施例＜１−２＞及び＜１−３＞においてクロマトグラフィーによって分離されたｆ−ＴＣＴＰ及びΔ−ＴＣＴＰを濃縮し、１ｍＭのターシャリーブチルヒドロペルオキシドにより処理して二量体化を誘導した。その結果、ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰが構築された。
実施例２：ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの結晶化、並びにデータ収集
ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰのタンパク質の結晶化に対する最適条件をスクリーニングして決定し、またシンクロトロンから情報を収集するため安定化されたクライオ条件をスクリーニングした。結晶化されたｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰのタンパク質のＸ線データを安定化されたクライオ条件において収集した。
＜２−１＞ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの結晶化
結晶化に対するｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの最適濃度を沈降実験により決定したところ５０ｍｇ／ｍｌであった。初期の結晶化を、スクリーニングキット（Ｓｃｒｅｅｎ  Ｉ＆ＩＩ，Ｉｎｄｅｘスクリーン試薬、米国カリフォルニア州ラグナニゲルのHampton Research）を使用してスパース行列式理論（Jancarik & Kim, J Appl Cryst, 24, 409-411, 1991）に基づいて手動又は自動でハンギングドロップ蒸気拡散法又はシッティングドロップ蒸気拡散法により行った。Ｈｙｄｒａ  ｅ−Ｄｒｏｐ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのThermo Scientific）を介して本発明者らによって確立されたハイスループット結晶化システムにより自動式試験を行った。ｆ−ｄＴＣＴＰタンパク質の結晶化に対する最適条件は、次の通りであり、すなわち、２５％のＰＥＧ  ３３５０及び０．１ＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ（ｐＨ５．５）で構成される結晶化溶液（母液）を各ウェルに充填した（２００μｌ／ウェル）。結晶化溶液とタンパク質（５０ｍｇ／ｍｌ）とを１：１の比率で混合することにより作製された２μｌのハンギングドロップをカバーガラスに置き、蒸気拡散法により結晶を形成した。Δ−ｄＴＣＴＰタンパク質の結晶化に対する最適条件は、次の通りであり、すなわち３０％のＰＥＧ  ３００及び０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ６．５）で構成される結晶化溶液を各ウェルに充填した（２００μｌ／ウェル）。結晶化溶液とタンパク質（５０ｍｇ／ｍｌ）とを１：１の比率で混合することにより作製された２μｌのハンギングドロップをカバーガラスに置き、ハンギングドロップ蒸気拡散法により結晶を形成した。
＜２−２＞ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰのクライオ条件のスクリーニング
安定化されたクライオ条件を見出すプロセスは、シンクロトロンにおけるデータ収集のプロセスに必須である。シンクロトロン放射の強度は非常に強いため、結晶中のタンパク質は容易に酸化される。その結果、タンパク質骨格が損傷されるため、確実なデータ収集ができない。したがって、本発明者らは、結晶を急速凍結するためのクライオ条件を見出した。ＬＶ  ｃｒｙｏ−ｏｉｌ（ニューヨーク州イサカのMiTeGen）をｆ−ｄＴＣＴＰの結晶化に使用した。ｆ−ｄＴＣＴＰ結晶を含有する液滴を混合物（溶液及びＬＶ  ｃｒｙｏ−ｏｉｌ、１：１、体積／体積）に添加し、マウンティングループを使用して結晶をすくい取った後、急速凍結した。１００％のＰＥＧ３００をΔ−ｄＴＣＴＰに使用した。Δ−ｄＴＣＴＰ結晶を含有する液滴を混合物（ウェル溶液及び１００％のＰＥＧ３００、１：１、体積／体積）に添加し、マウンティングループを使用して結晶をすくい取った後、急速凍結した。
＜２−３＞ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰのＸ線データの収集
ｆ−ｄＴＣＴＰのＸ線データを、ポハン光源（ＰＬＳ）（Pohang Accelerator Laboratory（PAL））から最大２．７Åまで収集し、これを表８に示す。検出器はＡＤＳＣ  Ｑ３１５ｒであった。Δ−ｄＴＣＴＰのＸ線データをスイス光源から最大１．７９Åまで収集した。このとき、ｐｈｉｌａｔｕｓを検出器として使用した。
【０１６６】
【表８】
0006643329.tif 000009
【０１６７】
実施例３：ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの結晶構造の分析
＜３−１＞分子置換によるｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの結晶構造の同定
ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの結晶構造を、分子置換を使用することにより位相問題を解決して同定した。タンパク質間の構造類似性が予想されたため、既知の構造を用いて分子置換によって位相問題を解決する方法を使用した。高速回転関数（fast rotation function）を使用して分子配向を検索し、並進関数、Ｒファクター検索、及び相関関係検索を使用して分子配置（molecular location）を検索した。得られたおおよその配向及び配置を剛体リファインメント又はＲファクター極小化によって精密化した後、原子位置の精密化及びモデルリビルディングを行った。分子置換を完成するため、ＣＮＳ（Brunger et al., Acta Cryst, D54, 905-921, 1998）、ＡＭｏＲｅ（Navaza, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 49, 588-591, 1993）、ＥＰＭＲ（Kissinger et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 57, 1474-1479, 2001）、及びＰＨＡＳＥＲ等のプログラムを使用した。ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの結晶構造を開示するため、ヒトＴＣＴＰ構造（ＰＤＢ  ＩＤ：２ＨＲ９）をＥＰＭＲ用試験モデルとして使用した。ヒトＴＣＴＰモデルを使用する分子置換によりΔ−ｄＴＣＴＰの相を得た。グラフィックソフトウェアＣＯＯＴ（Emsley & Cowtan, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 60, 2126-2132, 2004）を使用して一次モデルを構築し、ＣＮＳを使用してエネルギー極小化を行った。ＰＨＥＮＩＸにより最終モデルを得た（Adams et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 213-221, 2010）。最終モデルの精密化値（正：values）を以下の表９に示す。
【０１６８】
【表９】
0006643329.tif 000010
【０１６９】
＜３−２＞単量体型のｆ−ＴＣＴＰ及びΔ−ＴＣＴＰの三次元結晶構造の同定
ｆ−ＴＣＴＰ及びΔ−ＴＣＴＰの構造の試験結果より、単量体型のｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰでは、構造は上の試験モデルのものに類似することが確認された（図１１）。
＜３−３＞二量体型のｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの三次元結晶構造の同定
ターシャリーブチルヒドロペルオキシドの存在下で構築されたΔ−ｄＴＣＴＰは、予想通り、Ｃ末端システイン間のジスルフィド架橋によって作られた二量体型であった。Ｎ末端残基が欠失されていなくても二量体構造として形成され得たことはこの構造に独特であった。ＦＬの不在により、二量体界面での衝突の問題が消え、パッキングが良好であったため、Δ−ｄＴＣＴＰの結晶はｆ−ｄＴＣＴＰのものよりも更に大きく、回折分解能は良好であった。しかしながら、ＦＬの可動性のため、ＦＬの電子密度はｆ−ｄＴＣＴＰではわからなかった。同定されたｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの三次元構造では、各単量体は試験モデルとして使用された本来のＴＣＴＰと非常に一致した。予想通り、二量体型のｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの三次元構造は対称蝶形であり、二量体構造はＣｙｓ１７２によって介在されることが確認された（図１２）。
【０１７０】
興味深いことに、ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの三次元構造は互いに類似していた。電子密度は、ＦＬの可動性のためｆ−ｄＴＣＴＰでは検出されず、その構造は表面に露出されるため、構体（body structure）と衝突することも構体に影響を及ぼすこともなかった。ｆ−ｄＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰの三次元構造をｆ−ＴＣＴＰ及びΔ−ＴＣＴＰのものと比較した。その結果、異なる表面構造のため、単量体及び二量体の生理学的作用に関与するパートナータンパク質は異なる役割を果たした。
【０１７１】
本発明者らによる先の研究では、抗体のＦｃ領域を使用して作製された二量体型の野生型ＴＣＴＰは、サイトカイン分泌活性を有し、一旦ＴＣＴＰが二量体を形成すると、Ｎ末端の欠失を伴わなくてもＨＲＦによって活性化されることが確認された（Kim et al., PLoS one, 4, e6464, 2009）。したがって、ＴＣＴＰ二量体の形成は、ＨＲＦの活性に重要であることが確認された。
実施例４：モデリングによって形成されたＦＬを含む野生型ｆ−ｄＴＣＴＰの構築
ＦＬの可動性のためｆ−ｄＴＣＴＰの電子密度を得ることができなかった。したがって、ＦＬを含むｆ−ｄＴＣＴＰの構造をモデリングによって構築した。エネルギー極小化によるＦＬドメインのモデリングの結果、ｆ−ｄＴＣＴＰ構造中のＦＬはＨＲＦの本体から離れていたため、ＨＲＦ構造が全体としてＦＬの存否によってそれほど影響を受けないことが確認された。
＜４−１＞ＦＬを含む野生型ｆ−ｄＴＣＴＰ構造のモデリングプロセス
ＦＬの可動性のためｆ−ｄＴＣＴＰの構造が観察されなかったことから、ｆ−ｄＴＣＴＰ構造をＦＬの存在下でのモデリングによって構築した。ＦＬの構造は、試験モデルとして使用されたＮＭＲの構造に基づいた。ＦＬドメインは、ＴＩＮＫＥＲ  ６．０パッケージを使用してエネルギー極小化された。全てのプログラムに対し、力場としてＣｈａｒｍｍ２２を使用した。
【０１７２】
最初に、ＴＩＮＫＥＲパッケージのＰＤＢＸＹＺプログラムを使用して精密化のための構造（structure to refine）をｐｄｂファイルからｘｙｚファイルへと変換した。ｘｙｚファイルは、ＴＩＮＫＥＲの全てのプログラムに対し、デフォルトファイルフォーマットとして直角座標システムを使用する。ｘｙｚファイルは、構造中の各原子に対する全ての名称及びＸ−Ｙ−Ｚ座標、力場、原子の種類、原子の数、並びに原子結合情報を含む。ｐｄｂファイルをｘｙｚファイルへと変換した後、ＴＩＮＫＥＲパッケージの極小化プログラムを使用してタンパク質構造を極小化した。
【０１７３】
上記タンパク質構造極小化プログラムは、直角座標においてをＪｏｒｇｅ  Ｎｏｃｅｄａｌアルゴリズムの修正版を使用する制限付きメモリＬ−ＢＦＧＳ極小化を可能とした。ＦＬドメイン単独を極小化するため、ＦＬドメインの原子数は、アクティブコマンド後のキーファイルに書き込まれた。鎖１の３７Ｓｅｒ〜６９Ｇｌｙ及び鎖２の２１３Ｓｅｒ〜２４５Ｇｌｙの領域に対応するｘｙｚファイルの原子数５９４〜１０１９及び３３８２〜３８０７が、アクティブコマンドの後に書き込まれた（アクティブ５９４、アクティブ５９５、アクティブ５９６等々）。極小化はＭｉｎｉｍｉｚｅ．ｘによって実行された。このとき、自乗平均根（正：Root mean square）（ＲＭＳ）勾配の値は０．１であった。ＲＭＳ勾配は、どの程度エネルギーを極小化することができるかを決定するための基準として使用されるエネルギーの微分係数である。例えば、ＲＭＳが０である場合、そのエネルギーが完全に極小化されるまで極小化が起こる。しかしながら、現実には、ＲＭＳは０になり得ないため、標準的な極小化値が必要である。極小化の完了により、タンパク質構造を得るためｘｙｚファイルは、ＸＹＺＰＤＢプログラムを使用してｐｄｂファイルに再び変換される。エネルギー極小化の前及び後のタンパク質構造の安定性を調べるため、総位置エネルギー及びその構成要素並びに大きな個々の相互作用の一覧を、ＡＮＡＬＹＺＥプログラムを使用して調べた。
＜４−２＞モデリングによるＦＬを含むｆ−ｄＴＣＴＰ構造の同定
最初に、ＦＬを極小化する前に、総位置エネルギーを調べ、結果を下記表１０に示す。
【０１７４】
【表１０】
0006643329.tif 000011
【０１７５】
ＦＬ構造エネルギーを極小化した後、総位置エネルギーも調べ、結果を表１１に示す。上記エネルギーを極小化した後、エネルギーの減少により構造が更に安定化された。
【０１７６】
【表１１】
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【０１７７】
ＦＬの可動性によりｆ−ｄＴＣＴＰの構造を特定することができなかったため、ＦＬを含むｆ−ｄＴＣＴＰの構造を上に記載されるＴＩＮＫＥＲを使用するモデリングによって構築した。
【０１７８】
結果より、図１３に示されるように、ＦＬはＨＲＦの本体から離れているため、全体的な一般構造に影響を及ぼさないことが確認された（図１３）。
実施例５：ＨＲＦに結合するｄＴＢＰ２（ｄＴＣＴＰ結合ペプチド２）がどのようにしてｆ−ｄＴＣＴＰの活性を制御するのかについての根本的な機構の調査
＜５−１＞ＨＲＦに結合する七量体（７ｍｅｒ）の構築及び分離
ＨＲＦをプラスチックのウェルに固定化した。ＨＲＦに結合することができるペプチドを７−ｍｅｒの無作為ペプチドライブラリの親和性選択によって単離した（米国のNew England Biolabs）。
【０１７９】
詳しくは、ＨＲＦを２０μｇ／ｍｌの濃度でコーティングバッファー（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．６）に溶解し、それをポリスチレンマイクロタイタープレート（５０μｌ／ウェル）に充填した後、４℃で一晩コーティングを行い、ＢＳＡで非特異的結合をブロッキングした。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ／ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で６回洗浄した。１０μｌのファージディスプレイペプチドライブラリストック溶液を４０μｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳに希釈し、上に添加した。プレートを室温で１時間置いた。ＴＢＳＴをそれに添加し、プレートを５分間置いた後、洗浄した。１回目のパニングの後、１回洗浄を行い、２回目及び３回目のパニングの後５回洗浄を行い、４回目のパニングの後１０回洗浄を行った。５０μｌのグリシン／ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．２）をそれに添加し、５分間置いた。その後、ファージを溶離した後、８μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１）で中和を誘導した。溶離したファージ溶液を２０ｍｌのＥＲ２５３７培養培地（ＯＤ６００＝０．５〜１）に添加した後、３７℃において振蕩培養器（ｒｐｍ＝２００）で２時間培養した。１００ｍｌのＳＢ培地をそれに添加した後、振蕩（２５０ｒｐｍ）しながら一晩培養した。培養溶液を１００００ｒｐｍ（４℃）で１５分間遠心分離した。１００ｍｌの得られた上清を３０ｍｌの５×ＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ＰＥＧ（重量／体積）、１５％ＮａＣｌ（重量／体積））と共に添加した後、５分間溶解させた。その後、混合物を３０分間氷中に置いた。混合物を１００００ｒｐｍ（４℃）で２０分間遠心分離し、上清を廃棄した。得られたペレットを１ｍｌの３％ＢＳＡ／ＴＢＳに懸濁した。１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った後、上清を得て、パニングに使用した。親和性精製及びファージ複製を４回繰り返した後、ファージを溶離した。溶離したファージの適切なプレートから各ファージクローンを得た後、ＥＬＩＳＡを行った。ＨＲＦに対して特異的な親和性を示すそれらのファージクローンを分離した後、ペプチド配列を確認するためシーケンシングを行った。ＨＲＦに対して優占的な結合を示すそれらのファージディスプレイペプチドを選択し、以下に列挙する。
ｐｈ１（ｐ１）のアミノ酸配列：ＬＶＴＹＰＬＰ（配列番号２３）、
ｐｈ２（ｐ２）のアミノ酸配列：ＷＹＶＹＰＳＭ（配列番号２４）、
ｐｈ３（ｐ３）のアミノ酸配列：ＳＹＬＰＹＰＹ、及び、
ｐｈ４（ｐ４）のアミノ酸配列：ＷＥＦＰＧＷＭ（配列番号２５）。
【０１８０】
上で得られたファージの結合親和性をＥＬＩＳＡによって比較した。
【０１８１】
すなわち、各ファージプラークを、ＳＢ培地で培養された１ｍｌのＥＲ２５３７培養培地（ＯＤ６００＝０．５〜１）に添加した後、３７℃のインキュベーター（ｒｐｍ＝２５０）で５時間培養した。１００μｌの各培養溶液を９００μｌのＳＢ培地に添加した後、一晩培養した。１４０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を２回行い、得られた上清をＥＬＩＳＡに使用した。
【０１８２】
上で分離された各ファージ溶液を等容量の６％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈し、５０μｌの希釈された溶液をＨＲＦ又はＢＳＡ（対照）で被覆されたプラスチックウェルプレートの各ウェルに添加し、２時間置いた。そのプレートをＰＢＳＴで５回洗浄した後、３％ＢＳＡ／ＰＢＳで希釈された（１：５０００）ＨＲＰ接合抗Ｍ１３抗体（Pharmacia）をそれに添加し（１００μｌ／ウェル）、それを１時間置いた。そのプレートをＰＢＳＴで６回、ＰＢＳで１回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質溶液をそれに添加した後（１００μｌ／ウェル）、ＯＤ４０５をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。その結果、本発明のファージｐｈ１、ｐｈ２、及びｐｈ４、特にｐｈ２及びｐｈ４はＨＲＦに特異的に結合することが確認された。
【０１８３】
ＨＲＦを２０μｇ／ｍｌの濃度から各々１／５倍に連続的に希釈し（２０μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、０．８μｇ／ｍｌ、０．１６μｇ／ｍｌ、及び０．０３２μｇ／ｍｌ）、それをプラスチックウェル中で固定した（５０μｌ／ウェル）。各々１／５倍に連続的に希釈されたファージ２溶液（ストック溶液の１／２、１／１０、１／５０、１／２５０、及び１／１２５０）をそれに添加した後、ＥＬＩＳＡを行ってＯＤ４０５を測定した。その結果、本発明のファージｐｈ２クローンは、ＨＲＦが０．４μｇ／ｍｌ、０．０８μｇ／ｍｌ、０．０１６μｇ／ｍｌ、及び０．０３２μｇ／ｍｌまで希釈されてもＨＲＦに対する結合力を維持することが確認された。
【０１８４】
本発明の七量体ペプチドのＨＲＦ結合親和性に関与した残基を確認するため、ｐ２のアミノ酸配列をアラニン（Ａ）で置換し、ｍ５のみをリジン（Ｋ）で置換した。その結果、以下の配列が確立された。
七量体ペプチドｍ１のアミノ酸配列：ＡＹＶＹＰＳＭ（配列番号２６）、
七量体ペプチドｍ２のアミノ酸配列：ＷＡＶＹＰＳＭ（配列番号２７）、
七量体ペプチドｍ３のアミノ酸配列：ＷＹＡＹＰＳＭ（配列番号２８）、
七量体ペプチドｍ４のアミノ酸配列：ＷＹＶＡＰＳＭ（配列番号２９）、
七量体ペプチドｍ５のアミノ酸配列：ＷＹＶＹＫＳＭ（配列番号３０）、
七量体ペプチドｍ６のアミノ酸配列：ＷＹＶＹＰＡＭ（配列番号３１）、及び、
七量体ペプチドｍ７のアミノ酸配列：ＷＹＶＹＰＳＡ（配列番号３２）。
【０１８５】
上記ペプチドのＨＲＦ結合親和性をＥＬＩＳＡによって測定した結果、ＨＲＦ結合親和性はｐ２、ｍ６＞ｍ７＞ｍ３＞ｍ２＞ｆｍ５＞Ｍ１＞ｍ４であった。
＜５−２＞どのようにしてｄＴＢＰ２がｆ−ＴＣＴＰの活性を調節するかの根本的な機構の調査
モデリングに由来する構造によって同定されたｆ−ｄＴＣＴＰの受容体結合モデルでは、７−ｍｅｒペプチドであるｄＴＢＰ２（実施例＜５−１＞ｐ２）によるｆ−ｄＴＣＴＰ活性の調節はＦＬによって影響を受けた。単量体型ｆ−ＴＣＴＰの場合、ＦＬは自由に動くため、ｄＴＢＰ２の結合を遮る場合がある。二量体型ｆ−ｄＴＣＴＰの場合、ＦＬは方向性を有するため、ｄＴＢＰ２のＨ２ヘリックスとの結合を補助し得る（図１４、赤色のヘリックス部分）。ｆ−ｄＴＣＴＰ構造では、ＦＬドメイン及びＨ２ドメインは受容体に直接結合すると予想された。モデリング構造に示されるように、ｄＴＢＰ２−ｆ−ｄＴＣＴＰ結合はＦＬドメイン及びＨ２ドメインによって媒介された。一方、ＦＬ及びＨ２によるｆ−ｄＴＣＴＰの受容体への結合は、阻害されたドメインであった。したがって、ＦＬドメイン及びＨ２ドメインはシグナル伝達に対する阻害活性を呈すると予測することができる。そのため、本発明の結合阻害剤は、Ｈ２ドメイン又はｄＴＢＰ２等のＨＲＦの他の領域への結合による、ＨＲＦとその受容体の間の結合の間接的な阻害剤も含む。
実施例６：ＦＬドメイン及びＨ２ドメインを認識し、それらに結合する抗体の構築
本発明者らは、ＨＲＦ受容体結合ドメインであるＦＬドメイン又はＨ２ドメインに結合することによってＨＲＦ活性を阻害する抗体を構築した。ＦＬドメイン及びＨ２ドメインを認識し、それらに特異的に結合する抗体を従来法に従ってAbClonにより構築した。ウサギ（ニュージーランドホワイト）を抗原として受容体結合ドメインペプチドによって免疫化し、特異的ポリクローナル抗体を産生した。産生された抗体は抗原特異的であることを試験した。受容体結合ドメインであるＦＬ及びＨ２に結合するＩｇＧを、抗原特異的アフィニティークロマトグラフィーによって精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図１５）。
実施例７：オボアルブミンによって誘発される喘息及び鼻炎の動物モデルの構築
本発明者らは、ＨＲＦ受容体結合ドメインであるＦＬ及びＨ２、並びにそれらの抗体の喘息及び鼻炎に対する効果を評価するため、オボアルブミンを使用して喘息及び鼻炎の動物モデルを構築した。
【０１８６】
詳しくは、５週齢の特定病原体除去ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（体重：およそ２０ｇ）をOrientbio Inc.（韓国ソウル）から購入した後、動物実験室で１週間安定化した。１．３ｍｇの水酸化アルミニウム（Sigma、Ａ８２２２）及び１００μｇのオボアルブミン（Sigma、Ａ５５０３）を含有する２００μｌのＰＢＳを、マウスに１週間間隔で２回腹腔内に注射した後、感作した。その後、そこに溶解された２００μｇのオボアルブミンを含有する２０μｌのＰＢＳを１４日目、１６日目、及び１８日目に鼻腔内滴下注入により投与して免疫応答を誘導した。陽性対照にＰＢＳを投与し、ＦＬドメイン及びＨ２ドメイン、並びにそれらの抗血清又は抗体を抗原投与の１０分前に腹腔内注射によって投与した。１５日目、１７日目、及び１９日目に、抗原投与を含まない腹腔内投与を行った。１９日目、投与の２時間後に動物を屠殺した（図１６）。１４日目、１６日目及び１８日目の抗原投与の３０分前に、５０μｇの抗Ｃ末端ＩｇＧを鼻腔内滴下注入又は腹腔内注射によって投与した。最後の投与から２４時間後に動物を屠殺した（図２６）。
実施例８：Ｃ末端ドメインを認識し、それに結合する抗体の構築
本発明者らは、ＨＲＦ構造のＣ末端ドメインに結合することによってＨＲＦの活性を阻害するための抗体を構築した。
【０１８７】
詳しくは、Ｃ末端ドメインを特異的に認識してそれに結合する抗体を従来法に従ってPeptronにより作製した。Ｃ末端ペプチド（Ａｃ−ＦＦＫＤＧＬＥＭＥＫＣ−ＮＨ２）を抗原として使用して免疫応答を誘導することにより、特異的ポリクローナル抗体をウサギ（ニュージーランドホワイト）で産生した。産生された抗体が抗原特異的であるかどうかを確認した。プロテインＡを使用して抗血清からＩｇＧを分離し、精製した。
実験例１：ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰによって媒介されるＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの分泌の分析
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰのＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの分泌活性を調べるため、本発明者らはＢＥＡＳ−２Ｂ細胞におけるＩＬ−８の分泌を測定することによって、ｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰの活性を比較した。
【０１８８】
詳しくは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を培養密度が７０％に達するまで４８ウェルプレートで培養した。その後、細胞を１％ペニシリン−ストレプトマイシン／ＢＥＢＭ（Clonetics）で２回洗浄した。本発明の実施例１で分離されたΔ−ｄＴＣＴＰの各組換えタンパク質、並びに韓国特許出願公開第２００６−０００７６６３号に記載される方法によって構築されたｆ−ＴＣＴＰ及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰを、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、又は１０μｇ／ｍｌの濃度でそれに添加した。２４時間後、上清を得て、放出されたＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦをＥＬＩＳＡによって定量した。
【０１８９】
その結果、図１及び図２に示されるように、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰは、ＩＬ−８及びＧＭ−ＣＳＦの分泌においてｆ−ＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰよりもまさることが確認された（図１及び図２）。
実験例２：ｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰのｄＴＢＰ２に対する親和性の分析
本発明のｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰのｄＴＢＰ２に対する親和性を調べるため、ＨＲＦに結合することが知られているｄＴＢＰ２のＣＯＯＨ末端にビオチンを接合させた後、精製した。精製タンパク質をストレプトアビジンで被覆したプラスチックウェルに固定化し、それにｆ−ＴＣＴＰ、Δ−ｄＴＣＴＰ、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰを添加した。その後、各タンパク質の結合強度を調べた。
【０１９０】
詳しくは、０．０１μｍ、０．１μｍ、１μｍ、及び１０μｍの種々の濃度でバッファー（ＴＢＳ［２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２］、０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）に溶解された５０μｌのビオチン化ｄＴＢＴＰ２をＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄストレプトアビジン被覆ポリスチレンプレート（PIERCE）に添加した後、室温で２時間反応させた。該プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。ｆ−ＴＣＴＰ、△−ｄＴＣＴＰ、及びＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰの各々を０．２μｇ／ｍｌの濃度でＴＢＳに溶解した。６０μｌの混合物を上記プレートの各ウェルに添加した後、１時間反応させた。該プレートを洗浄バッファーで３回洗浄した。バッファーに希釈した（１：２０００）１００μｌの抗ＨＲＦウサギ抗体（Bio-Rad）を上記プレートの各ウェルに添加し、室温で３０分間置いた。該プレートを洗浄バッファーで３回、ＴＢＳで１回洗浄し、それにＨＲＦ接合抗ウサギ抗体（１：２０００）を添加し（１００μｌ／ウェル）、室温で３０分間置いた。プレートを洗浄バッファーで３回、ＴＢＳで１回洗浄し、それにペルオキシダーゼ基質溶液であるＴＢＳ（PIERCE）を添加した（１００μｌ／ウェル）。ＥＬＩＳＡリーダー（Bio-Rad）を使用して４５０ｎｍ及び５７０ｎｍで発色を測定し、その差によって親和性を特定した。
【０１９１】
その結果、図３に示されるように、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰは、ｆ−ＴＣＴＰ及びΔ−ｄＴＣＴＰよりも高いｄＴＢＰ２親和性を有することが確認された（図３）。
実験例３：ＦＬドメイン、ヘリックス２ドメイン、及びヘリックス３ドメインのＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ阻害活性の分析
ＦＬドメイン、ヘリックス２ドメイン、及びヘリックス３ドメインのＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰに対する阻害効果を調べるため、本発明者らは、ＮＨ２末端アセチル化及びＣＯＯＨ末端アミド化によって作製された合成ペプチドを使用してＦＬドメイン（Ａｃ−ＳＲＴＥＧＡＩＤＤＳＬＩＧＧＮＡＳＡＥＧＰＥＧＥＧＴＥＳＴＶＶＴ−ＮＨ２）（配列番号１）、ヘリックス２ドメイン（Ａｃ−ＴＫＥＡＹＫＫＹＩＫＤＹＭＫＳＬＫＧＫＬＥＥＱＫＰ−ＮＨ２）（配列番号１１）、及びヘリックス３ドメイン（Ａｃ−ＫＰＥＲＶＫＰＦＭＴＧＡＡＥＱＩＫＨＩＬＡＮＦＮ−ＮＨ２）（配列番号２２）を合成した後、精製を行った。
【０１９２】
詳しくは、実験例１に記載されるのと同じ方法によりＢＥＡＳ−２Ｂ細胞をＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ（７０ｎＭ）で処理した。このとき、合成されたＦＬドメイン、ヘリックス２ドメイン、及びヘリックス３ドメインを種々のモル比（０〜１）で細胞に処理した後、３０分間反応させた。その後、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰをそれに添加した。２４時間後、上清を得て、放出されたＩＬ−８をＥＬＩＳＡによって定量した。
【０１９３】
その結果、図４に示されるように、ＦＬドメイン、ヘリックス２ドメイン、及びヘリックス３ドメインの存在下でＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰによって媒介されるＩＬ−８分泌の阻害を比較すると、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰによって誘導されるＩＬ−８分泌は、ヘリックス３ドメインよりもＦＬドメイン及びヘリックス２ドメインによってより強く阻害することが確認された（図４）。
実験例４：ＦＬドメイン及びＨ２ドメインを認識するポリクローナル抗体のＩＬ−８放出に対する阻害効果の分析
本発明の実施例６で構築されたＦＬドメイン及びＨ２ドメインを認識する抗体によるＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ媒介ＩＬ−８分泌に対する阻害効果を、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に上記抗体を処理することによって調べた。
【０１９４】
詳しくは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を種々の濃度の抗ＦＬ抗体及び抗（正：anti-）Ｈ２抗体で処理した。その後、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ誘導性ＩＬ−８分泌を比較した。４８ウェルプレートで培養されたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を１％ペニシリン−ストレプトマイシン／ＢＥＢＭ（Lonza）で２回洗浄した後、血清飢餓を７時間行った。１ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに希釈した抗体を７０μＭのＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰと３７℃で２時間反応させた。反応混合物で上の細胞を処理した。２０時間後、上清を得て、そこに放出されたＩＬ−８をＥＬＩＳＡにより定量した。
【０１９５】
その結果、図５に示されるように、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰを含まない１０ｎｇ／ｍｌの抗体で処理されたＮＣ（陰性対照）群において、ＩＬ−８分泌は検出されなかった。Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ単独で処理された細胞群では、ＩＬ−８の分泌は増加した。１ｎｇ／ｍｌ及び１０ｎｇ／ｍｌの濃度でＦＬドメインを特異的に認識する抗体によって処理された群では、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ媒介ＩＬ−８分泌は減少した。したがって、上の抗体のＩＬ−８分泌に対する阻害効果が確認された（図５）。
【０１９６】
図６に示されるように、上に記載されるのと同じ方法によりＨ２ドメインを特異的に認識する抗体を使用して別の実験を行った。その結果、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ媒介ＩＬ−８分泌は減少し、この抗体がＩＬ−８の分泌も阻害し得ることが示唆された（図６）。
実験例５：喘息及び鼻炎のモデルにおけるＦＬドメイン及びＨ２ドメインの抗炎症効果の調査
実施例７で構築した喘息及び鼻炎のモデルを２０ｍｇ／ｋｇの濃度のＦＬ及びＨ２ドメインで処理することで、これら２つのＨＲＦ受容体結合ドメインが喘息及び鼻炎の病態生理学的病変を抑制し得るかどうかを調べた。
＜５−１＞気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）の分析
ＦＬドメイン及びＨ２ドメインで処理された喘息及び鼻炎の動物モデルの気管支肺胞洗浄液中に浸潤した炎症性細胞を調べるため、以下の実験を行った。
【０１９７】
詳しくは、実施例７で構築した動物モデルにおける心臓血液の採血の後、気管支肺胞洗浄を行った。気道を開いて、２０ゲージの血管内チューブカテーテルを開放された気道を通して挿入し、そのカテーテルを通して２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ  ０．８ｍｌを３回ゆっくりと注入した後、回収した。回収率は少なくとも８０％であり、回収された洗浄溶液を４℃で１５分間、１０００×ｇで遠心分離した。得られた上清をＩＬ−５等のサイトカインの検出又はＴＣＴＰタンパク質の検出に使用した。一方、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ  １００μｌに沈殿物を再懸濁した。洗浄溶液中に浸潤した炎症性細胞の数をＨＥＭＡＶＥＴ  ９５０ＦＳ（Drew Scientific）を使用して計数した。
【０１９８】
その結果、図１７及び図１８に示されるように、ＯＶＡによって誘発された気管支肺胞中の炎症性細胞浸潤は、ＰＢＳ単独で処理された陽性対照群においてより頻繁であったのに対し、ＦＬドメインで処理された群では、総細胞数及び白血球数が両方とも有意に少ないことが確認された（図１７ａ）。また、陽性対照と比較して、Ｈ２ドメインで処理された群では総細胞数が減少したことが確認された（図１７ｂ及び図１７ｃ）。
【０１９９】
代表的なＴｈ２サイトカインであるＩＬ−５のレベルは、陽性対照では高かったが、ＦＬドメイン及びＨ２ドメインで処理されたいずれの群でも減少した（図１８）。
【０２００】
上の結果より、ＦＬドメインは特異的に有効であったことが確認された。後に、ＦＬドメインを１ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇの濃度で喘息及び鼻炎の動物モデルに注射した後、ＦＬドメインの抗炎症効果が用量依存的であるかどうかを調べた。
【０２０１】
その結果、図２０に示されるように、気管支肺胞洗浄液中に浸潤した炎症性細胞は、ＦＬドメイン用量依存的に減少した（図２０ａ）。また、総細胞数及び白血球のレベルも２０ｍｇ／ｋｇのＦＬドメインで処理された群で有意に減少した（ｐ＜０．０１、図２０ｂ及び図２０ｃ）。気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−５のレベルを測定した。その結果、ＦＬドメインは、１ｍｇ／ｋｇの低濃度であってもＩＬ−５分泌を阻害可能であることが確認された（図２１）。
【０２０２】
さらに、ＦＬドメインの抗炎症効果と細胞外に分泌されたＴＣＴＰとの関係を試験するため、ＴＣＴＰ特異的抗体を使用して気管支肺胞洗浄液を用いて免疫ブロッティングを行った。その結果、陽性対照では、ＴＣＴＰ二量体（およそ４５ｋＤａ）が３匹全ての試験動物において検出された。一方、ＦＬドメインで処理された群では、ＴＣＴＰ二量体のレベルは減少した（図２１）。
＜５−２＞血漿中のオボアルブミン特異的ＩｇＥの評価
喘息及び鼻炎の動物モデルの血漿中のオボアルブミン特異的ＩｇＥのレベルを確認するため、血液サンプリング及び血漿単離を以下の通り行った。
【０２０３】
詳しくは、実施例７の実験の完了の際、動物を屠殺するため、ゾレチル（２５０ｍｇ／ｋｇ）及びロムプン（５０ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹腔内注射によってマウスに投与した。０．７ｍＬ〜０．８ｍＬの血液を心臓から収集し、ヘパリン添加チューブに入れた。血液試料を室温で３０分間〜１時間置いた後、１０００×ｇで１５分間遠心分離して血漿を得た。血漿中のオボアルブミン特異的ＩｇＥのレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。１００μｇのオボアルブミンを０．０５Ｍの炭酸バッファー（ｐＨ９．６）に溶解し、それを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに分けた後、４℃で一晩コーティングを行った。該プレートを、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳと室温で３０分間反応させることによって非特異的反応をブロックした。血漿試料を希釈（１：１００）した後、室温で１時間反応させ、その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳで洗浄した。ＨＲＦ接合抗マウスＩｇＥ（SouthernBiotech）を希釈（１：８０００）した後、室温で１時間反応させた。その後、混合物を洗浄した。室温にてＴＭＢでそれを処理した。１０分後、０．２ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止した。その後、ＥＬＩＳＡリーダーによりＯＤ４５０を測定した。
【０２０４】
その結果、図１９に示されるように、血漿中のオボアルブミン特異的ＩｇＥのレベルは陽性対照では高かったが、ＦＬドメインで処理された群では減少したことが確認された（図１９）。
【０２０５】
血漿中のオボアルブミン特異的ＩｇＥのレベルは陽性対照において最も高く、ＦＬドメインの処理により用量依存的に減少したことから、抗原特異的ＩｇＥ分泌に対するＦＬドメインの阻害効果が確認された（図２３）。
＜５−３＞肺組織の分析
喘息及び鼻炎の動物モデルにおける肺組織を分析するため、以下の実験を行った。
【０２０６】
詳しくは、実施例７で構築した喘息及び鼻炎の動物モデルから気管支肺胞洗浄液を収集した。胸部を切開し、肺を摘出して、４℃のＰＢＳで洗浄した。肺を適切な大きさに切った。幾つかの肺小片を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含有するＰＢＳ中、室温で一晩の固定により固定した。次の日、固定した組織を脱水してパラフィンブロックを作製した。その後、パラフィンを除去し、５μｍの厚さの連続切片をスライド上に作製した後、杯細胞を染色するため過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を行った。残りの肺組織を液体窒素中で急速凍結した。リシスバッファーを使用して組織中のタンパク質を抽出した後、免疫ブロッティングを行って肺組織中のホスホＩκＢα分子を検出した。
【０２０７】
その結果、図２２に示されるように、肺における炎症改善効果を評価するためにタンパク質を肺組織から抽出すると、陽性対照群においてホスホＩκＢαが最も豊富に検出された。ＦＬドメイン処理群では、ホスホＩκＢαは減少した。したがって、本発明のペプチドは、ＩκＢαリン酸化に対する阻害効果を有することが確認された（図２２）。
実験例６：ＩＬ−８放出に対するＣ末端ドメインを認識するポリクローナル抗体の阻害活性の分析
抗体がＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ媒介ＩＬ−８分泌を阻害し得るかどうかを調べるため、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を実施例８で構築したＣ末端ドメインを認識する抗体で処理した。
【０２０８】
詳しくは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、実験例４に記載されるのと同じ方法によりＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ（１μｇ／ｍＬ）で処理した。このとき、４０ｎＭの濃度でＰＢＳ中に希釈された抗体を１μｇ／ｍＬのＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰと室温で混合した後、１０分間反応させた。反応混合物を上の細胞に処理した。２０時間後、上清を得て、そこに分離されたＩＬ−８をＥＬＩＳＡによって定量した。
【０２０９】
その結果、図２４に示されるように、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰを含まないＰＢＳ又は４０ｎＭの抗体単独で処理された群では、ＩＬ−８の分泌は低かった。ＰＢＳと共にＤｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰで処理された群では、ＩＬ−８分泌は増加した。Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰと共にＣ末端ドメインを特異的に認識する抗体で処理された群では、Ｄｅｌ−Ｎ１１ｄＴＣＴＰ媒介ＩＬ−８分泌は５７．５％まで減少し、本発明の抗体がＩＬ−８分泌に対して阻害効果を有することを示唆した（図２４）。
実験例７：喘息及び鼻炎の動物モデルにおけるＦＬドメイン及びＣ末端ドメインに対する抗血清の抗炎症効果の分析
実施例７で構築された喘息及び鼻炎の動物モデルをＦＬドメイン及びＣ末端ドメインに対する抗血清で処理してＴＣＴＰ二量体の作用を抑制した後、喘息及び鼻炎の病態生理学的な病変がそれによって阻害されるかどうかを調べた。
【０２１０】
その結果、気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−５のレベルは、陰性対照群において高かった。一方、ＦＬドメイン及びＣ末端ドメインに対する抗血清で処理された群は、ＩＬ−５レベルの減少を呈し、本発明の抗血清がＩＬ−５分泌に対する阻害効果を有することを示唆した（図２５）。
実験例８：喘息及び鼻炎の動物モデルにおける抗Ｃ末端ＩｇＧの抗炎症効果の分析
実施例７で構築された喘息及び鼻炎の動物モデルに、鼻腔内（ｉ．ｎ）投与又は腹腔内（ｉ．ｐ）投与によりＣ末端ドメインに対するＩｇＧ抗体を投与した。上の２つの異なる経路による投与により、喘息及び鼻炎の病態生理学的な病変を免疫前ＩｇＧで処理された対照のものと比較した。
【０２１１】
その結果、図２６に示されるように、ＯＶＡによって誘発される炎症性細胞の浸潤は、免疫前ＩｇＧが注入された陰性対照と比較して抗Ｃ末端ドメインＩｇＧ抗体で処理された群の気管支肺胞において減少した。２つの異なる投与経路を比較すると、炎症性細胞の浸潤は、腹腔内投与群［Ｃ末端（腹腔内）］と比較して、鼻腔内投与群［Ｃ末端（鼻腔内）］において著しく減少した（図２６〜図２８）。
【０２１２】
気管支肺胞洗浄液中のＩＬ−５レベルは、Ｃ末端ドメインに対するＩｇＧ抗体で処理された群において減少した。気管支肺胞中に分泌されたＩＬ−５のレベルは、鼻腔内投与群において６３．６％、腹腔内投与群で１３．３％であり、腹腔内投与経路がＩＬ−５の減少により効果的であることを示唆した（図２９）。
実験例９：ＣＩＡ（コラーゲン誘発関節炎）マウスモデルにおけるｄＴＢＰ２による関節リウマチに対する予防効果の確認
本発明の七量体ペプチド（７−ｍｅｒペプチド）であるｄＴＢＰ２（配列番号２４によって表されるｐ２）は、ＨＲＦに結合することによってＨＲＦの活性を阻害し、関節リウマチに対する予防効果をもたらすことが本発明において確認された。
【０２１３】
詳しくは、ＣＩＡを誘発させるため、２６匹の７週齢の雄性ＤＢＡ１／ｊマウスを購入し、少なくとも１週間順応させた。ウシ２型コラーゲン（２ｍｇ／ｍｇ、Chondrex）と完全フロイントアジュバント（２ｍｇ／ｍｌの結核菌を含有するＣＦＡ、Chondrex）とを１：１の比率で混合した。１５０μｌの混合物を、尾の付け根の下２ｃｍに皮内注射によってゆっくりと注入した（０日目）。３週間後、２回目の注射を行った。このとき、ＣＦＡに代えて不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）をウシ２型コラーゲン溶液と１：１の比率で混合した。１００μｌの混合物を、尾の付け根に皮内注射によってゆっくりと注入した。９匹のマウスにビヒクル単独を投与し、８匹のマウスに５ｍｇのｄＴＢＰ２を投与し、９匹のマウスに２５ｍｇのｄＴＢＰ２を投与した。投与のため１．５ｍｇのｄＴＢＰ２を１ｍｌのＰＢＳに溶解した。関節炎が発症する２１日前から、投与を１週間に３回行った。毎週２回各足について関節炎臨床スコア０ポイント〜４ポイント（合計０ポイント〜１６ポイント）を判断した。同時に、電子ノギスを使用して両足関節の厚さを測定し、厚さの変化を最初の測定における厚さに対する相対パーセントとして提示した。
【０２１４】
その結果、図３０に示されるように、関節リウマチの発症は、ビヒクル単独又は５ｍｇのｄＴＢＰ２のいずれかで処理された群よりも２５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群においてより有意に阻害された。３１日目、ビヒクル単独又は５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群と比較して、２５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群において発症率が少なくとも５０％阻害された。４６日目、ビヒクル単独又は５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群と比較して、２５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群において発症率が少なくとも７０％阻害された。関節炎の臨床症状インデックスである関節厚さの測定の結果より、関節厚さは、ビヒクル単独又は５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群において４１日目まで持続的に増加し、４１日目から４６日目に急速に増加した。一方、関節厚さは２５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群において４６日目まで正常な関節厚さとほぼ同じであり、本発明のｄＴＢＰ２が関節リウマチに対して予防効果を有することを示唆した（図３０）。
実験例１０：ＣＩＡマウスモデルを使用する関節リウマチにおけるｄＴＢＰ２の治療効果の確認
七量体ペプチド（７−ｍｅｒペプチド）である本発明のｄＴＢＰ２がＨＲＦに結合した場合、ＨＲＦ活性化を抑制し、関節リウマチに対する治療効果をもたらすことが確認された。
【０２１５】
詳しくは、実験例９に記載されるのと同じ方法によって、ＤＢＡ１／ｊマウスにおいてＣＩＡを誘発した。平均関節炎臨床スコア５に基づいて、ｄＴＢＰ２を４１日目から投与した。このとき、４匹のマウスにビヒクル単独を投与し、５匹のマウスに５ｍｇのｄＴＢＰ２を投与し、５匹のマウスに２５ｍｇのｄＴＢＰ２を投与した。投与のため１．５ｍｇのｄＴＢＰ２を１ｍｌのＰＢＳに溶解した。投与を１週間に３回行い、測定を１週間に２回行った。
【０２１６】
その結果、図３１に示されるように、ビヒクル単独又は５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群と比較して、２５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群において臨床スコアは低くなりつつあり、上記症状が改善されたことが示唆され、したがって関節リウマチに対する治療効果が確認された。臨床症状インデックスである関節厚さの測定より、厚さは、４１日後、継続的に２５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群で減少したのに対し、ビヒクル単独又は５ｍｇのｄＴＢＰ２で処理された群では、関節厚さは継続して増加したことが確認され、本発明のｄＴＢＰ２が関節リウマチに対する治療効果を有することを示唆した（図３１）。
実験例１１：アトピー性皮膚炎マウスモデルにおけるアトピー性皮膚炎に対するｄＴＢＰ２の効果の確認
本発明のｄＴＢＰ２は、ＨＲＦに結合することによって、ＨＲＦとその受容体との間の結合、又はその活性化を阻害することができ、それにより（正：so that）アトピー性皮膚炎を治療することができることが本発明において確認された。
【０２１７】
詳しくは、５週齢の特定病原体除去の雌性ＮＣ／ＮｇａマウスをOrientbio Inc.（韓国ソウル）から購入し、１週間順応させた。脱毛剤で脱毛した後、Ｂｉｏｓｔｉｒ（商標）  ＡＤ軟膏（日本のBiostir）を使用して背部の皮膚にアトピー性皮膚炎を誘発させた。すなわち、マウスの背部から毛を除去し、そこにＰＢＳ中に溶解した４％のＳＤＳ  １５０μｌを塗布した。２時間〜３時間自然乾燥させた後、１００ｍｇのＢｉｏｓｔｉｒ（商標）  ＡＤクリームをマウス背部の皮膚及び耳の皮膚に均一に塗布した。１週間に２回、３週間で合計６回、クリームを塗布した。マウスの表皮層は厚くなり、背部皮膚にケラチンが形成されたことを確認した。
【０２１８】
アトピー性皮膚炎誘発マウスにおけるアトピー性皮膚炎に対するｄＴＢＰ２の効果を調べるため、陽性対照にＰＢＳを投与し、比較実験群にプロトピック軟膏（米国のAstellas Pharma Manufacturing Inc.）を投与し、実験群をｄＴＢＰ２で処理した。０日目、ＰＢＳ（皮下注射、２５ｍｇ／ｋｇ）、プロトピック軟膏（皮膚塗布、１００ｍｇ／マウス）、及びｄＴＢＰ２（皮下注射、２５ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれ適用した。１日目、１００ｍｇのＢｉｏｓｔｉｒ（商標）  ＡＤクリームをそこに塗布した。２日目及び３日目、０日目に行われたのと同じ方法でＰＢＳ、プロトピック軟膏、及びｄＴＢＰ２をそこに処理した。４日目、１００ｍｇのＢｉｏｓｔｉｒ（商標）  ＡＤクリームをそこに塗布した。５日目、０日目に行われたのと同じ方法でＰＢＳ、プロトピック軟膏、及びｄＴＢＰ２をそこに処理した。
【０２１９】
その結果、図３２ａに示されるように、プロトピック軟膏及びｄＴＢＰ２で処理されたマウスは、対照群よりも程度の低いアトピーを有することが視覚的に確認された（図３２ａ）。
【０２２０】
アトピー性症状を観察し、紅斑、乾燥、掻破痕、浮腫、及びびらん等のアトピー性インデックスに従うポイントとして提示して、それに基づいてグラフを作成した（図３２ｂ、０：症状なし、１：弱い症状、２：中間の症状、３：強い症状）。アトピーは、対照と比較して、プロトピック軟膏及びｄＴＢＰ２で処理された群において軽微であることがグラフから確認された。
【０２２１】
ヒスタミン放出因子であるｄＴＣＴＰ（４６ｋＤａ）は、Ｂｉｏｓｔｉｒ  ＡＤクリームを使用するアトピー性アレルギーによって誘導された陽性対照群、ＰＢＳで処理された群、プロトピック軟膏で処理された群、及びｄＴＢＰ２で処理された群の皮膚組織において著しく増加したことが、ウェスタンブロットによって確認された（図３３）。
【０２２２】
アトピー性アレルギーが誘発されると、角質層及び表皮層が厚くなり、炎症性細胞の浸潤が増す。組織学的評価のため、ヘマトキシリン／エオシン染色及びトルイジンブルー染色を行った。皮膚の厚さ及び免疫関連炎症性細胞の浸潤を顕微鏡下で観察した。その結果、ＰＢＳ単独で処理された対照群と比較して、プロトピック軟膏及びｄＴＢＰ２で処理された群において、厚い角質層を含むアトピー性症状が改善された（図３４ａ及び図３４ｂ）。また、肥満細胞の浸潤は、陽性対照群と比較して、プロトピック軟膏及びｄＴＢＰ２で処理された群において有意に減少した（図３４ｃ及び図３４ｄ）。
【０２２３】
リンパ節重量の変化を観察することによって抗原又は薬物の効果を試験するリンパ節アッセイを行って、皮膚の感作物質によって誘発される炎症反応を調べた。ＰＢＳで処理された群のリンパ節は、正常なリンパ節と比較して重量及び大きさの両方が増加し、プロトピック軟膏又はｄＴＢＰ２で処理された群のリンパ節は、ＰＢＳ処理群よりも重量及び大きさがいずれも小さかった（図３５）。
【０２２４】
ヒスタミンレベルの調査より、ｄＴＣＴＰを阻害することによってｄＴＢＰ２が抗アレルギー活性を有することが確認された。ヒスタミンレベルは、ＰＢＳ処理群よりもプロトピック軟膏又はｄＴＢＰ２で処理された群において低かった（図３６）。
【０２２５】
代表的なアトピー関連Ｔｈ２細胞サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−１３を、ｍＲＮＡレベルで測定した。その結果、ＩＬ−４及びＩＬ−１３は、ＰＢＳで処理された群と比較して、ｄＴＢＰ２及びプロトピック軟膏で処理された群でその順で有意に減少した（図３７ａ及び図３７ｂ）。
【０２２６】
Ｔｈ１７細胞もまたアトピー性アレルギーに関与し、Ｔｈ２細胞サイトカインのうちＴｈ１７Ａがアトピーに密接に関係することを示す最近の報告により、Ｔｈ１７Ａに対するｄＴＢＰ２の効果を調べた。その結果、Ｔｈ１７Ａのレベルは、ＰＢＳで処理された群と比較して、ｄＴＢＰ２及びプロトピック軟膏で処理された群においてその順で低下し、本発明のｄＴＢＰ２がＴｈ１７Ａに対する阻害効果も同様に有することを示唆した（図３８）。
実験例１２：関節リウマチに対するｄＴＣＴＰ（ＨＲＦ）の効果の確認
ＴＣＴＰが関節リウマチ（ＲＡ）に関与するかどうかは最近非常に関心が持たれている。本発明者らは、ＴＣＴＰ二量体（ｄＴＣＴＰ：ＨＲＦ）がアレルギー反応を引き起こすヒスタミン放出因子であることを最初に開示したことから、本発明者らは、慢性炎症性疾患の１つである関節リウマチにｄＴＣＴＰ（ＨＲＦ）が関与するという予測に基づいて更に以下の実験を行った。
【０２２７】
詳しくは、正常な（陰性の）人々、変形性関節炎（ＯＡ）患者、初期の関節リウマチ（ＥＲＡ）患者、及び後期の関節リウマチ（ＬＲＡ）患者から関節液を得た。炎症反応に関与するｄＴＣＴＰ（ＨＲＦ）のレベルを調べるため、ＴＣＴＰ欠失ＥＬＩＳＡ（抗体−タンパク質−ＥＬＩＳＡキット、米国カリフォルニア州のMYBioSource）を上で得られた関節液を用いて行った。ｄＴＣＴＰ（ＨＲＦ）自体を検出することは困難であった。しかしながら、ＴＣＴＰ単量体がＴＣＴＰ二量体であるｄＴＣＴＰを形成する構成要素の１つであることから、ＴＣＴＰ単量体の増加は、二量体型であるｄＴＣＴＰの増加をもたらす。
【０２２８】
上の見解に基づいて、実験を行った。その結果、正常な人々及び変形性関節炎の患者から得られた試料においてＴＣＴＰはほとんど検出されなかった。一方、ＴＣＴＰのレベルは、初期関節リウマチ患者及び後期関節リウマチ患者において疾患が進行するにつれて増加した（図３９）。
【０２２９】
さらに、ＩＨＣ（免疫組織化学）に基づいて、各患者の関節におけるＴＣＴＰ局在及び発現を顕微鏡下で観察した。図４０に示されるように、褐色に染色された領域がＴＣＴＰを表す。ＴＣＴＰは、変形性関節炎（ＯＡ）患者の関節組織よりも後期関節リウマチ（ＲＡ）患者の関節組織でより豊富であった（図４０）。
製造例１：医薬配合物の調製
＜１−１＞粉末の調製
ＨＲＦ受容体結合阻害剤                                ２ｇ
ラクトース                                            １ｇ
粉末を、上記の成分を全て混合することにより作製した。この粉末を、従来の粉末調製方法に従い気密パックに充填した。
【０２３０】
＜１−２＞錠剤の調製
ＨＲＦ受容体結合阻害剤                            １００ｍｇ
コーンスターチ                                    １００ｍｇ
ラクトース                                        １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                              ２ｍｇ
錠剤を、従来の錠剤調製方法に従って上記の成分を全て混合することにより作製した。
【０２３１】
＜１−３＞カプセルの調製
ＨＲＦ受容体結合阻害剤                            １００ｍｇ
コーンスターチ                                    １００ｍｇ
ラクトース                                        １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                              ２ｍｇ
カプセルを上記の成分を全て混合することによって作製し、そのカプセルを従来のカプセル調製方法に従いゼラチンカプセルに充填した。
【０２３２】
＜１−４＞ピルの調製
ＨＲＦ受容体結合阻害剤                                  １ｇ
ラクトース                                          １．５ｇ
グリセリン                                              １ｇ
キシリトール                                        ０．５ｇ
ピルを、従来のピル調製方法に従い上記の成分を全て混合することによって作製した。ピルはそれぞれ混合物を４ｇ含有した。
【０２３３】
＜１−５＞顆粒の調製
ＨＲＦ受容体結合阻害剤                              １５０ｍｇ
大豆抽出物                                            ５０ｍｇ
グルコース                                          ２００ｍｇ
デンプン                                            ６００ｍｇ
上記の全ての成分を混合し、これに１００ｍｇの３０％エタノールを添加した。混合物を６０℃にて乾燥させ、調製した顆粒をパックに充填した。
【０２３４】
当業者であれば、上記の明細書に開示された概念及び具体的な実施形態が、本発明と同じ目的で実施される他の実施形態を改変又は設計する基礎として容易に利用し得ることが理解されるだろう。当業者であれば、このような同等の実施形態が添付の特許請求の範囲に記載の本発明の趣旨及び範囲から逸脱することがないことも理解されるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２８ｃ】
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【図２８ｄ】
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【図２８ｅ】
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【図２８ｆ】
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【図２９】
0006643329.tif 000050
【図３０】
0006643329.tif 000051
【図３１】
0006643329.tif 000052
【図３２ａ】
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【図３２ｂ】
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【図３３】
0006643329.tif 000055
【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【図３４ｃ】
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【図３４ｄ】
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【図３５】
0006643329.tif 000060
【図３６】
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【図３７ａ】
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【図３７ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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