(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不均一な細胞培養液混合物由来のバイオ医薬生体高分子生成物を、連続的に、微生物を減少させて生産および／または処理する方法であって、以下の工程：
（ａ）生成物流（２６）の形態の、粒子を含有しない、前記生成物を含有する不均一な細胞培養液混合物由来の流体を提供することであって、前記粒子を含有しない流体がろ過および遠心分離から選択される少なくとも１つの好適な分離法を経ているものであること、
（ｂ）少なくとも１回ろ過し、ろ液を提供すること、
（ｃ）前記生成物を精製するために、少なくとも２回クロマトグラフィー工程を行うこと、
（ｄ）好適な酸によるｐＨ調節、溶剤または洗浄剤処置、および、ＵＶまたは熱処理からなる群から選択されるウイルス減少を少なくとも１回行うこと、
（ｅ）工程（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）の生成物流（２６）を、少なくとも１回限外ろ過および／または少なくとも１回ダイアフィルトレーションすること
を含んでなり、
工程（ｃ）による前記少なくとも２回のクロマトグラフィー工程は少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム（４）および／または膜吸着器（５）を介する精製を含んでなり、かつ前記方法は閉鎖式およびモジュラー式で実施され、かつ
前記方法において、少なくとも１つのフィルター（１３）を含んでなる少なくとも１回のろ過工程が工程（ａ）〜（ｅ）の間および／またはそれらの後に実施され、
前記少なくとも１つのフィルター（１３）が微生物減少条件下において自動的に交換され、前記自動フィルター交換が以下の工程：
（ｉ）流路の閉鎖に伴う非ろ液側の圧力センサ（１８）において閾値が超過し、使用済みフィルター（１７）における前記生成物がろ液側へと気体または液体によって押し込まれる場合、または前記流路における前記使用済みフィルター（１７）の最長時間が超過する場合、または前記使用済みフィルター（１７）を介したろ液の最大量が超過する場合、新規フィルター（１６）へ流路を切り替えること、
（ｉｉ）供給ポンプ（２１）により前記新規フィルター（１６）内に生成物を運搬することを伴い、前記新規フィルター（１６）のガス抜き弁（２０）において、０．２５μｍ以下の孔径を有するエアフィルター（１９）を介して前記新規フィルター（１６）のガス抜きを行うこと、
（ｉｉｉ）前記圧力センサ（１８）または充填レベルセンサ（２２）または天秤（２３）または液体検出装置（２８）により、前記非ろ液側の前記新規フィルター（１６）のガス抜きの完了を検出すること、
（ｉｖ）弁（２４）によりろ液出口を開放しかつ前記ガス抜き弁（２０）と前記エアフィルター（１９）との間の前記流路を閉鎖すること、ならびに、
（ｖ）前記使用済みフィルター（１７）と新規フィルター（１６）とを交換すること
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不均一な細胞培養液混合物由来の生成物を、連続的に、微生物を減少させて生産および／または処理するモジュラーシステムおよび方法に関する。
【０００２】
生物工学的生産において、たんぱく質は通常、バッチごとに精製される。これは、個別の生産サイクルがバッチ式の方法で非連続的に処理され、生成物全体が生産サイクルの完了後に取り除かれることを意味する。したがって、再度生産するためには、別々の新しい生成物サイクル／バッチを開始する必要がある。
【０００３】
近年、連続的な製法もまた生物工学的生産において実施することができることが、益々実証されてきている。この製法ではバッチ処理とは対照的に、処理が絶え間なく実行される。
【０００４】
高度に調節された薬剤生産は、時間、技術、および人員の点において、清潔で滅菌されたバイオリアクターの提供および無菌生成物の保証のために多大な労力を要する。多目的システムまたは２つの生成物バッチ間において生成物を切り替える場合における相互汚染を確実に避けるため、洗浄とは別に必要とされることとは、非常に複雑な洗浄バリデーションであって、もし適用できるのであれば、プロセス適合の場合には必ず繰り返されなければならない。
【０００５】
これは、上流プロセス（ＵＳＰ）、すなわち発酵槽内での生物由来物質の生産と、および下流プロセス（ＤＳＰ）、すなわち醗酵生成物の精製との両方に適用される。
【０００６】
醗酵の場合は特に、無菌環境が培養の成功には不可欠である。バッチ発酵槽またはフェドバッチ発酵槽の無菌化には、ＳＩＰ技術(SIP=sterilization-in-place)が一般的に用いられる。
【０００７】
必要な洗浄および滅菌手順によるリアクターの休止時間は、特に、使用期間が短い場合および頻繁に生成物を変える場合では、リアクター稼働率の有意な占有率を有し得る。これは、例えば、生物工学的生産のＵＳＰにおける培地調製および醗酵の工程段階、ならびに可溶化、凍結、解凍、ｐＨ調整、生産分離（例えば、クロマトグラフィー、沈殿、または結晶化を介する生産分離）、ＤＳＰにおける緩衝液の調整およびウイルス不活化に影響を及ぼす。
【０００８】
下流プロセスでは、微生物減少プロセスの管理の調節が必要とされる。したがって、バッチ操作については無菌処理の必要がない。しかしながら、連続的なプロセスにおけるたんぱく質の精製は、もしも洗浄工程なしに行うことができるのであれば、比較的長い期間実施される。これは、好ましくは精製のあいだ滅菌工程を伴わずに生じる。微生物汚染のリスクが単純なバッチ操作の場合におけるリスクよりも数倍高くても、このような状況となる。
【０００９】
国際公開第２０１２／０７８６７７号には、生産システム、特に使い捨て可能システムにおける、クロマトグラフィーおよびその統合によるバイオ医薬生成物を連続的に処理するためのプロセスおよびシステムが記載されている。国際公開第２０１２／０７８６７７号はバイオ医薬および生物由来物質の連続的な生産に対するアプローチを提供するものの、開示されている解法は実際の利用に適していない。国際公開第２０１２／０７８６７７号はまた、滅菌クロマトグラフィーカラムの使用を開示していない。
【００１０】
米国特許出願公開第２０１４／０２５５９９４号明細書は、治療用たんぱく質を生産するための統合された連続的プロセスを開示している。しかしながら、米国特許出願公開第２０１４／０２５５９９４号は、滅菌クロマトグラフィーカラムがそのようなプロセスで使用され得るという特徴を開示していない。
【００１１】
欧州特許出願公開第２１８２９９０号明細書は、クロマトグラフィーカラムを高温の水蒸気によって滅菌するプロセスを開示している。
【００１２】
初めに、いくつかの用語をより詳細に定義する。
【００１３】
本発明において、連続的なプロセス(Verfahren)とは、連続して実行される少なくとも２つのプロセス工程に対するあらゆるプロセスを意味する。前記プロセスにおいて、上流工程の出力ストリームは下流工程へと運ばれる。下流工程は上流工程が完了する前に生成物流の処理を開始する。典型的に、連続的なプロセスでは、生成物流の一部は常に生産システム内で運ばれ続け、「連続生成物流(kontinuierlicher Produktstrom)」と称される。したがって、上流ユニットから下流ユニットへの生成物流の連続的な運搬または移動とは、上流ユニットの動作が終了する前に下流ユニットはすでに動作していることを意味する（すなわち、連続して接続された２つのユニットは、それらを流れる生成物流を同時に処理する）。
【００１４】
本発明において、用語「微生物の減少（keimreduziert）」とは、微生物数が減少した状態（すなわち単位面積または単位体積ごとの微生物数が実質的にゼロである）を意味する。この状態は、前記微生物減少方法が、ガンマ線照射、ベータ線照射、加圧滅菌、エチレンオキシド（ＥＴＯ）処理、および「定置蒸気滅菌（ＳＩＰ）」処理から選択可能な、適切な微生物減少方法によって達成可能である。
【００１５】
本発明において、用語「使い捨て物品」とは、生成物と接触する当該物品、特に、器具、タンク、フィルター、および接続要素が、使用後に処分する１度きりの使用に好適であることを意味する（前記タンクはプラスチック製および金属製のどちらでもよい）。本発明において、この用語はまた、再利用可能な物品（例えば、本発明のプロセスにおいて１回だけ使用され、その後のプロセスでは使用されないように作成された物品）も包含する。本発明において、例えば金属製である前記再利用可能な物品は、したがって「使い捨て物品として使用される物品」とも称される。そのような使用済み使い捨て物品はまた、本発明のプロセスにおいて、各々「使い捨て」または「単回使用（Single-Use）」物品（「ＳＵ技術」）とも称することができる。これらの物品は本発明および本発明のモジュラーシステムに基づくプロセスの微生物減少状態をさらに改善する。
【００１６】
本発明において、用語「生成物流」とは、産物を含有する不均一な細胞培養液／細胞液混合物由来の粒子を含有しない流体、および本発明のプロセスの各々のその他の工程段階の結果、すなわち、ろ過後の生成物流、クロマトグラフィー後の生成物流、ウイルス減少後の生成物流、限外ろ過後の生成物流、ダイアフィルトレーション後の生成物流、または本発明のプロセスのさらなる工程後の生成物流を意味する。したがって、前記生成物流は異なる濃度および純度を有することもあり得る。
【００１７】
本発明において、用語「ウイルスの減少(Virenabreicherung)」とは、処理される液体中に存在するウイルスの不活化および／または除去の完了後すぐの、処理される液体の単位体積ごとにおける活性ウイルスの濃度の減少を意味する。
【００１８】
本発明において、用語「殺菌剤(Mikrobizid)」とは、微生物の成長を遅延させる、または完全に阻害することができる物質を意味する。本発明のプロセスでは、前記殺菌剤を殺菌剤含有緩衝液の形で、特に限外ろ過のあいだ使用することができる。
【００１９】
本発明において、用語「気泡トラップ」とは、当該液体が脱気されているあいだ、同時に気泡を収集する装置（気泡トラップが作動している際に脱気される当該液体を伴う）を意味する。
【００２０】
本発明において、用語「モジュラー」とは、本発明のプロセスの個々の工程が互いに接続された別々のモジュールで実施することができるということを意味する。モジュールは事前に設定され、微生物が減少され、ならびにそれらのモジュールは閉鎖式および異なる組合せで互いに接続することができる。
【００２１】
本発明において、用語「モジュラーシステム」とは、液体（「生成物流」）を運ぶことができる一連のモジュール（「ユニット」）を意味する。この一連のモジュールは、少なくとも２つの下流工程および／または上流工程を実施するため互いに接続される。本発明によれば、ユニットは工程を連続的に実施するのに好適であり、連続した液体の流れ（「生成物流」）によって操作することができる。これに関連して、「モジュラーシステム」の個々のモジュールはあらゆる組合せで互いに接続することができる。本発明におけるモジュールの例として、ろ過モジュール２、クロマトグラフィーモジュール３、限外ろ過モジュール６、ダイアフィルトレーションモジュール７、および透析モジュール８が挙げられる。
【００２２】
本発明において、用語「閉鎖（geschlossen）」とは、本発明のプロセスの操作方法、および本発明のモジュラーシステムの操作方法を意味する。これらの方法は、前記プロセスおよび前記モジュラーシステムにより生産された生成物および／または処理された生成物が室内環境に曝されないように操作される。材料、物体、緩衝液、および同様のものは、外部から本発明の閉鎖プロセス、および本発明の対応する閉鎖モジュラーシステムへと添加することができるが、しかしながら、この添加は生産された生成物および／または処理された生成物が室内環境へ曝されることを避けるような方法で行われる。
【００２３】
先行技術に基づくプロセスは不利益な範囲も有する。以下の通りに対処されたい。
【００２４】
バイオ医薬および生物由来物質を生産する既知のプロセスは、典型的に以下の生産工程（互いに連続している）：
１．灌流培養
２．細胞保持システム
（工程１および工程２の代替プロセスとして、フェドバッチ培養もまた使用してもよい）
３．細胞除去
４．緩衝液または培地交換（好ましくは濃縮を伴う）
５．生物汚染度低下（好ましくは除菌ろ過による）
６．キャプチャークロマトグラフィー
を含んでなる。
【００２５】
典型的に、さらなる工程、特に：
７．ウイルス不活化
８．中和、および、
９．随意に、さらなる深層ろ過、生物汚染度低下（除菌ろ過）
が生成物流のさらなる精製のため実施される。
【００２６】
バイオ医薬生産における高品質基準を考慮し、以下の工程：
１０．クロマトグラフによる中間および高品質精製
１１．生物汚染度低下（例えば、除菌ろ過）
１２．ウイルスろ過
１３．緩衝液交換、および好ましくは濃縮、ならびに、
１４．除菌ろ過
が典型的にさらに実施される。
【００２７】
上記の生産において、栄養液を含有する発酵槽内の細胞は、生物由来物質、例えばたんぱく質、例えば治療用たんぱく質を生産する。栄養液はまた、バクテリアおよび胞子といった微生物にとって理想的な増殖培地である。その様な微生物のこうした成長は望ましくないため、これらの状況から問題が生じる。プロセスの実行時間が増加するにつれ微生物が指数的増殖に至るまで、結果として生産される生物由来物質のバッチの全損失に至るまで栄養液が次第に汚染されるため、微生物の前記望まれない成長は比較的長い実行時間の場合において特に問題となる。
【００２８】
最高の精浄度および無菌性を保ちながら生産システムへの迅速で柔軟な再加重（Neubeschicken）に対する需要へ対処するために、連続的な生産（好ましくは使い捨て可能な技術を用いる）という概念が市場において絶えずより大きな関心をひきつけている。
【００２９】
その様なプロセスの比較的長い実行時間（数日から数週間に渡って２時間以上）に対して、例えば、１ＭのＮａＯＨによる衛生化といった慣習的な「定置洗浄（Clean-in-Place）」（ＣＩＰ）基準などの慣習的衛生化基準は、しかしながら不十分である。したがって、２時間以上の実行時間の場合、その様な慣習的プロセスおよびシステムには、汚染の可能性および／または微生物生育の可能性に対して高度に影響を受けやすいという不利益がある。
【００３０】
したがって、不均一な細胞培養液混合物由来の生成物を連続的に精製するプロセスに対する要求が存在する。これは、プロセスの微生物減少状態が数週間に渡る連続的な操作モードを可能にするためである。
【００３１】
したがって、生成物、例えばたんぱく質、が数時間から最大数週間という期間に渡って連続的に精製されうるプロセスおよび対応するシステムを開発するのが本発明の目的である。
【００３２】
本発明はこの目的を、不均一な細胞培養液混合物由来のバイオ医薬生体高分子生成物を、連続的に、微生物を減少させて生産および／または処理する方法（プロセス）であって、以下の工程：
（ａ）生成物流の形態の、生成物を含有する不均一な細胞培養液混合物由来の粒子を含有しない流体を提供すること、
（ｂ）少なくとも１回ろ過し、ろ液を提供すること、
（ｃ）生成物を精製するために、少なくとも２回クロマトグラフィー工程を行うこと、
（ｄ）少なくとも１回ウイルスを減少させること、
（ｅ）工程（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）の生成物流を、少なくとも１回限外ろ過および／または少なくとも１回ダイアフィルトレーションすること、
を含んでなり、工程（ｃ）による少なくとも２回のクロマトグラフィー工程が少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器を介する精製を含んでなり、かつ当該方法は閉鎖式およびモジュラー式で実施されることを特徴とする、方法（プロセス）を提供することによって達成する。
【００３３】
本発明の方法の基本は４つの核となる原則であり、したがって以下の核となる特徴：
１．連続的
２．微生物の減少
３．閉鎖式、および、
４．バイオ医薬生体高分子生成物のモジュラー生産、
である。
【００３４】
これら４つの特徴は共に、通常発生する微生物の望まれない生育という問題を大幅に減少させ、最大８週間の連続モード操作における本発明のプロセス操作時間を可能にする。
【００３５】
工程（ａ）で提供される、不均一な細胞培養液混合物由来の粒子を含有しない流体は好ましくは、例えば、細胞培養もしくは組織培養、または灌流リアクターといった連続的な灌流および醗酵プロセスにより生じ得る。１つ以上の灌流リアクター（例えば２つの灌流リアクター）を同時に操作することもまた可能である。
【００３６】
まず液体は好適な細胞保持システム、例えば傾斜したプレート分離器（沈殿槽)を通じて連続的に放出することができ、これによって細胞の大半を保持することができる。次に、液体中に存在する粒子をその後のろ過および／もしくは遠心分離工程、またはバイオ医薬生体高分子生成物を含有する粒子を含有しない流体を産生するその他の好適な分離法によって液体から取り除くことができる。
【００３７】
ろ過工程（ｂ）は、例えば、工程（ａ）の後に得られた粒子を含有しない流体をろ過し、ろ液を産生してもよい。しかしながら、本発明のプロセスはまた、プロセスの好適な時点でさらなるろ過工程を含んでなってもよい。
【００３８】
ろ過工程（ｂ）は、好適なフィルター法、例えば、０．２μｍフィルター、または同時に操作される２つ以上のフィルターによって達成することができる。ろ過工程に好適なフィルターとして例えばＳａｒｔｏｇｕａｒｄ  ＮＦ  ０．２μｍフィルターが挙げられ、２つ以上のフィルターを同時に操作することができる。
【００３９】
本発明の方法のさらなる実施態様において、ろ過工程（ｂ）は、ＤＮＡ、たんぱく質Ａ、ＨＣＰといった混入物を減少させるさらなる可能性を有するデプスフィルターを含んでなる。これらは充分なゼータ電位を有するデプスフィルター（３Ｍ社製Ｚｅｔａｐｏｒ、Ｐａｌｌ社製Ｐｏｓｉｄｙｎｅ）、または活性炭素を有するデプスフィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ）であってもよい。
【００４０】
工程（ｃ）の生成物を精製する少なくとも２回のクロマトグラフィー工程は、各々の場合において少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器を介した精製を含んでなる。これに関して、クロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器は、例えば、リガンドに対する生成物の親和性、イオン相互作用、金属キレート結合、疎水性相互作用、またはファンデルワールス力といった、あらゆる好適な結合原理を示し得る。例えば、少なくとも２回のクロマトグラフィー工程の第１のクロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、生成物に対して親和性を有するリガンド（例えば、たんぱく質Ａ、たんぱく質Ｇ、たんぱく質Ｌ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびたんぱく質Ａ、たんぱく質Ｇ、たんぱく質Ｌ、ＩｇＭ、ＩｇＧとは異なり生成物に対して親和性を有する組換えたんぱく質など））であり得る。この工程には次に、例えばイオン相互作用を介したクロマトグラフィーといったさらなる（第２の）クロマトグラフィー工程が続く。
【００４１】
工程（ｃ）において、本発明の方法はフレキシブルであり、達成される生成物の純度および生成物の濃度に応じたあらゆる順序でのあらゆる好適なクロマトグラフィー原理を含んでなり得る。
【００４２】
工程（ｃ）に基づく少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器を介した少なくとも２回のクロマトグラフィー工程を使用する技術的効果は、個々のクロマトグラフィー工程が一般的に、例えば、宿主細胞不純物、凝集物、ＤＮＡ、たんぱく質Ａなどといった混入物の充分な除去を確実にすることはできないということである。
【００４３】
さらに、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器は未精製の生成物を添加することもができるのに対し、少なくとも１つの別のクロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器は再生または溶出することができ、プロセスに対して連続的で効果的な操作モードの達成を可能とするため、１回のクロマトグラフィー工程における連続的な生産が可能となる。
【００４４】
本発明の方法のさらなる実施態様において、ｐＨ調節および／または伝導率調節および／またはろ過工程および／または濃縮工程および／または緩衝液交換のための１回以上のさらなる工程が、（ｃ）中の少なくとも２回のクロマトグラフィー工程の間および／または工程（ｄ）におけるウイルス不活化後に実施される。これは条件に適用可能なプロセスのための操作モードを可能とする。
【００４５】
工程（ｄ）の少なくとも１回のウイルス減少は特に、粒子を含有しない流体のｐＨ値を、好ましくは４．０以下に調節することによって実施することができる。粒子を含有しない流体のｐＨ値を不活化のため４．０以下まで調節することは、例えばＨＣｌ溶液を添加することによって達成できる。添加は典型的に、ウイルス減少用装置へ前もって行われる。典型的に、ウイルス減少を終了させるため、ｐＨ値は例えば水酸化ナトリウム溶液（ＮａＯＨ）などの塩基を用いて４よりも大きな値に調節される。
【００４６】
しかしながら、工程（ｄ）の少なくとも１回ウイルスを減少させることはまた、ウイルス減少が溶剤／洗浄剤により達成されるような溶剤／洗浄剤工程によって実施することもできる。
【００４７】
さらなる実施態様において、ウイルスの減少はまた、ＵＶ処理および／または熱処理によって達成することもできる。
【００４８】
工程（ｄ）の少なくとも１回のウイルスの減少は特に、分割された生成物流を導入することができる滞留セクション内で行われる。
【００４９】
本発明の方法のさらなる実施態様において、工程（ａ）から工程（ｅ）で使用される、生成物と接触する全ての要素は、適切な微生物減少方法による微生物減少に供される。
【００５０】
好ましくは、微生物減少方法は、ガンマ線照射、ベータ線照射、加圧滅菌、エチレンオキシド（ＥＴＯ）処理、オゾン処理（Ｏ３）、過酸化水素処理（Ｈ２Ｏ２）、および定置蒸気滅菌（ＳＩＰ）処理からなる群から選択することができる。
【００５１】
したがって、本発明のプロセスで使用される、生成物流と接触するモジュールの物体および要素は、好ましくは微生物減少に供するおよび／もしくは滅菌することができ、好ましくは加圧滅菌することができ、ガンマ線照射することができ、エチレンオキシド（ＥＴＯ）で洗浄することができ、オゾン（Ｏ３）で処理することができ、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で処理することができ、または定置蒸気滅菌（ＳＩＰ）処理で処理することができ、本発明のプロセスの微生物減少または無菌的操作も可能にする。
【００５２】
本発明の方法のさらなる実施態様において、ろ過工程（ｂ）以降に使用された、生成物と接触する全ての要素は、使い捨て物品であるか、または使い捨て物品として使用される。したがって、そのような使い捨て物品はまた、本発明のプロセスにおいて「単回使用」物品（「ＳＵ技術」）と称することができる。単回使用物品はプロセスの微生物減少状態を改善する。
【００５３】
本発明の方法のさらなる実施態様において、全ての入口流体は、例えばＳａｒｔｏｒｉｕｓ社より入手可能なＳａｒｔｏｇｕａｒｄ  ＮＦフィルターといった微生物減少フィルターを通じてろ過される。
【００５４】
これに関連して、好ましくは全ての出口が微生物の後方成長(Ruckwachstum)を妨げるため微生物バリアによって保護されていてもよい。例えば本発明において、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社より入手可能なＳａｒｔｏｇｕａｒｄ  ＮＦフィルターを微生物バリアとして使用することもまた可能である。微生物バリア１１のさらなる信頼性はフィルターおよび／または廃棄ラインの切り替え開閉によって達成することができる。微生物減少条件を確実にするさらなる基準は、好ましくはろ過の後、例えばＮａＯＨ溶液を用いて廃棄ラインを定期的に衛生化することによって、達成することができる。さらなる可能な方法は、紫外線照射および熱処理である。
【００５５】
さらなる実施態様において、本発明の方法のモジュラープロセス工程は、好ましくは互いに接続されているモジュールで実施される。
【００５６】
好ましくは、モジュールは溶着または無菌コネクタによって互いに接続されていてもよい。モジュールを溶着するには、例えば、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社より入手可能な「ＴＣ  Ｗｅｌｄｅｒ」機器を使用することができる。
【００５７】
本発明の方法のさらなる実施態様において、使用した全ての液体、気体、および固体は、工程（ａ）から工程（ｅ）において微生物減少に供される。これに関連して微生物減少は、好ましくは０．４５μｍ以下の孔径を有するフィルターを通じたろ過によって、好ましくは達成される。この場合、プロセス内の滅菌(Inprocess-Sterilisierung)はプロセスの間は実施されないことが好ましい。他の実施態様において、０．２０μｍ以下の孔径を有するフィルターを通じたろ過によって微生物減少を実施することもまた可能である。
【００５８】
本発明の方法のさらなる好ましい実施態様において、少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムに流出する全ての液体の脱気は、クロマトグラフィー工程（ｃ）の前に実施される。好ましくは、脱気は、少なくとも１つの気泡トラップによって、および／または真空を介する少なくとも１つの疎水性精密ろ過膜によって、および／または超音波を用いた処理によって、および／または例えばヘリウムといった難溶性ガスを用いたスパージングによって達成される。
【００５９】
これに関連して、真空を介する疎水性精密ろ過膜の使用は、気泡トラップと比較して特に有利であることが見出されたため、本発明のプロセスおよび本発明のシステムの連続的な実行において無菌性を保持するのに好ましい。使用した疎水性精密ろ過膜は特に、Ｍｅｍｂｒａｎａ社より入手可能なＭｉｃｒｏＭｏｄｕｌｅであり得る。
【００６０】
本発明の方法の特に好ましい実施態様において、工程（ａ）より得られる粒子を含有しない流体は、殺菌剤含有緩衝液に対する少なくとも１回の限外ろ過に供される。限外ろ過の結果として、液体中で微生物／細菌が液体中で生育する条件を取り除くため、液体中に存在する栄養素は殺菌剤含有緩衝液と置換される。これにより、プロセスの微生物減少はさらに改善される。
【００６１】
これに関連して使用した殺菌剤または１つ以上の殺菌剤は、好ましくは、イミダゾール、安息香酸、ソルビン酸、パラヒドロキシ安息香酸エステル、亜硫酸塩、二亜硫酸塩、アジド、オルトフェニルフェノール、ナイシン、ナタマイシン、ヘキサメチレンテトラミン、二炭酸ジメチル、亜硝酸塩、硝酸塩、酢酸、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、Ｌ−乳酸、プロピオン酸、ホウ酸、およびリゾチームからなる群から選択されてもよい。
【００６２】
殺菌剤含有緩衝液中に存在する殺菌剤はさらに、以下：
・Ｅ２１０からＥ２１３：安息香酸およびその塩、酸性環境下の溶液中０．０５〜０．１％、溶液中２〜３ｇ／ｋｇ；
・Ｅ２００からＥ２０３：ソルビン酸およびその塩、３００〜２０００ｍｇ／ｋｇ；
・Ｅ２１４からＥ２１９：ＰＨＢエステル（パラヒドロキシ安息香酸エステル、パラベン）、ブチルパラベン、およびプロピルパラベン；
・Ｅ２２０からＥ２２８：亜硫酸塩および二亜硫酸塩；
・Ｅ２３１およびＥ２３２：オルトフェニルフェノール、１２ｍｇ／ｋｇ；
・Ｅ２３４：ナイシン；
・Ｅ２３５：ナタマイシン；
・Ｅ２３９：ヘキサメチレンテトラミン、２５ｍｇ／ｋｇ；
・Ｅ２４２：二炭酸ジメチル；
・Ｅ２４９−Ｅ２５２：亜硝酸塩および硝酸塩、３００ｍｇ／ｋｇ；
・Ｅ２６０：酢酸、０．５〜３％；
・Ｅ３００−Ｅ３０２：アスコルビン酸、３００ｍｇ／ｋｇ；
・Ｅ３１５−Ｅ３１６：イソアスコルビン酸、１５００ｍｇ／ｋｇ；
・Ｅ２６１−Ｅ２６３：アセテート；
・Ｅ２７０：Ｌ−乳酸；
・Ｅ２８０からＥ２８３：プロピオン酸およびその塩、１〜３ｇ／ｋｇ；
・Ｅ２８４およびＥ２８５：ホウ酸、最高４ｇ／ｋｇ；
・Ｅ１１０５：リゾチーム；ならびに、
・アジド、
からなる群からの１つ以上の殺菌剤であり得る。
【００６３】
本発明の方法の好ましい実施態様において、バイオ医薬生体高分子生成物は、モノクローナル抗体、ポリクロナール抗体、組換えたんぱく質、およびワクチンからなる群から選択されるたんぱく質またはペプチドであり、好ましくはＤＮＡおよびＲＮＡワクチンである。
【００６４】
工程（ｃ）で使用されたクロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器は、例えば、リガンドに対する生成物の親和性、イオン相互作用、金属キレート結合、疎水性相互作用、または純粋なファンデルワールス力といった、あらゆる好適な結合原理を示し得る。例えば、少なくとも２回のクロマトグラフィー工程の第１のクロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、生成物に対して親和性を有するリガンド（例えば、たんぱく質Ａ、たんぱく質Ｇ、たんぱく質Ｌ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびたんぱく質Ａ、たんぱく質Ｇ、たんぱく質Ｌ、ＩｇＭ、ＩｇＧとは異なり生成物に対して親和性を有する組換えたんぱく質など）であり得る。この工程には次に、例えばイオン相互作用を介したクロマトグラフィーといったさらなる（第２の）クロマトグラフィー工程が続く。
【００６５】
この段階において、本発明の方法はフレキシブルである。工程（ｃ）は、原理が達成される生成物の純度および生成物の濃度に応じたあらゆる順序でのあらゆる好適なクロマトグラフィー原理を含んでなり得る。
【００６６】
本発明の方法の特に好ましい実施態様において、工程（ｃ）の少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器は、好ましくは、たんぱく質Ａ、たんぱく質Ｇ、たんぱく質Ｌ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ならびに組換えたんぱく質（たんぱく質Ａ、たんぱく質Ｇ、たんぱく質Ｌ、ＩｇＭ、およびＩｇＧとは異なり、生成物に対して親和性を有する）からなる群から選択されるリガンドを含んでなる。
【００６７】
本発明の方法の好ましい実施態様において、工程（ａ）〜（ｅ）のプロセスは、少なくとも４時間、好ましくは少なくとも８時間、好ましくは少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、より好ましくは少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも４週間、および特に好ましくは少なくとも８週間の実行時間を有することを特徴とする。その様な２週間以上といった長い実行時間の連続操作は、プロセスの閉鎖式、モジュラー式、および特に、微生物減少式操作でのみ実行可能である。
【００６８】
本発明の方法の好ましい実施態様において、少なくとも１つのフィルターを含んでなる少なくとも１回のろ過工程は、工程（ａ）〜（ｅ）の間および／またはそれらの後に実施される。
【００６９】
本発明の方法の特に好ましい実施態様において、フィルターは微生物減少条件下において自動的に交換され、自動フィルター交換は好ましくは以下の工程：
（ｉ）流路の閉鎖に伴う非ろ液側の圧力センサにおいて閾値が超過し、使用済みフィルターにおける生成物が好ましくはろ液側へと気体または液体によって押し込まれる場合、
または流路における使用済みフィルターの最長時間が超過する場合、または使用済みフィルターを介したろ液の最大量が超過する場合、新規フィルターへ流路を切り替えること、
（ｉｉ）供給ポンプにより新規フィルター内または微生物減少様式で接続された密閉袋内に生成物を運搬すること(Beforderung)を好ましくは伴い、新規フィルターのガス抜き弁において、好ましくは０．２５μｍ以下の孔径を有するエアフィルターを介して新規フィルターのガス抜きを行うこと(Entluften)、
（ｉｉｉ）圧力センサまたは充填レベルセンサまたは天秤または液体検出装置により、非ろ液側の新規フィルターのガス抜きの完了を検出すること、
（ｉｖ）弁によりろ液出口を開放することおよびガス抜き弁とエアフィルターとの間の流路を閉鎖すること、ならびに、
（ｖ）古いフィルターと新規フィルターとを交換すること、
を含んでなる。
【００７０】
新規フィルター内への生成物の同時または下流への運搬は、例えば、供給ポンプによって達成することができる。
【００７１】
本発明の方法のさらなる実施態様において、これはフィルター交換（使用済みフィルターエレメントから新しいフィルターエレメントへの切り替え）が自動的に行われることを意味する。ここで問題視されることとはフィルターのガス抜きである。しかしながらフィルターのガス抜きは必要であり、現在利用可能なフィルターの場合において、必ず手作業で行われる。まずフィルターは、例えば、ＥＴＯ、加圧滅菌、またはガンマ線照射といった適切な手段によって微生物減少に供され、続いてプロセスに加えられる。その後、ガス抜き弁が開放されている間、フィルターは非ろ液側へ設置することができる。この弁はガス抜きが成功した後、実際のろ過が実行できるように必ず閉じられなければならない。バッチ操作において、非ろ液側での厳密な微生物減少操作は必要ない。これはバッチ操作が短期間のみ実行される場合である。したがって単に、可能な限り微生物減少されているろ液を得ることが重要である。しかしながら、連続的なプロセスでは、プロセスの微生物汚染を防ぐために非ろ液側の厳密な、微生物を含有しない操作もまた必要とされる。先行技術においては、実際のろ過を実行できるように、フィルターを充填後ガス抜き弁は回転運動によって手動で必ず閉じられなければならない。前記回転運動の自動化は困難であり、また回転体の軸方向への運動を必要とする。シールを添付した回転体を回転運動すると、結果として境界がずれてしまう。もしガス抜き弁の前記手動閉鎖より前に、ガス抜き弁が閉じていながらも微生物減少を実行すれば、微生物境界（Keimgrenze）はガス抜き弁を開く際にずれてしまう。これは微生物減少領域へ微生物含有領域を導入し、そして微生物減少を台無しにする。開放位置は定位置を有さず簡単に弁を損傷させる可能性があるため、フィルター弁が開いた状態での微生物減少は推奨されない。加えて、開放位置は常に不安定であって、微生物境界のずれが通常のフィルター操作で発生する可能性がある。
【００７２】
自動フィルターガス抜きの場合において、簡便な基準でガス抜きを単に実行することができるため、初期運転の間のガス抜き弁の回転運動は避けた方が有利である。したがってガス抜き弁は、密閉状態でも透過性を有するが、依然として確かに環境を密閉するように変更することができる。結果として、弁は、締まりばめを特徴とする、安全な状態で「密閉」される。操作中は弁本体が非常に不安定であり境界のずれを招くため、「開放」状態は通常、明確に定義されない。疎水性が０．２μｍ以下であるエアフィルターを両端に装着した管１本が、回転体のノズルへ接続される。この配置はしたがって、ＥＴＯ、ガンマ線照射、加圧滅菌、もしくはオゾン（Ｏ３）処理によって、または過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）処理によって、微生物減少へ供するのに好ましい。それゆえ、ガス抜き弁上のエアフィルターまでの非ろ液側全体は微生物が減少されるか、または低微生物数である。ガス抜き弁とエアフィルターとの間では、管は、管を確実にはさむことができる管ピンチ弁内へ挿入される。このようにして、ガス抜きは完全に自動かつ低微生物数方法で達成することができる。フィルターは、ガス抜き弁および管によってエアフィルターへ液体が侵入するまで充填される。疎水性ガス抜きフィルターは液体を遮断する。同時に、プロセスシステムがろ液側の弁によって生成物流を遮断するため、フィルター正面の圧力が上昇する。前記圧力上昇は好適なセンサによって検出される。一定の限界圧力を超過する場合は、ガス抜き管のピンチ弁が閉鎖され、ろ液側の弁が開放される。この手順を介することで、変更されたガス抜き弁を使用する手作業が介入することなく、自動的にフィルターを変更することが可能となる。
【００７３】
この自動フィルター交換は図２にて例として示す。図２は、使用済みフィルター１７と新規フィルター１６の溶着による置換を伴う、プロセスおよびシステムのろ過工程の作動原理を模式的に図示する。
【００７４】
プロセスの最後に、最終精製された不均一な細胞培養液混合物由来のバイオ医薬生体高分子生成物を、好ましくは０．２μｍの孔径を有するフィルターを通じて最後に一度最終ろ過することができる。最終ろ過は、例えば、ガンマ線照射Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２カプセル（Ｍｉｄｉｃａｐ、サイズ７、０．０５ｍ２）を通ってガンマ線照射５リットルＧＥ社製ＲｅａｄＣｉｒｃｕｉｔバッグ内へ入ることで達成することができる。最終バッグの充填レベルが許容値まで達した場合、続いて前記バッグは溶着から外され（dann kann dieses Bag abgeschweibt werden）、新規バッグがプロセスへ溶着されることができる。
【００７５】
本発明はさらに前記目的を、不均一な細胞培養液混合物由来のバイオ医薬生体高分子生成物を、連続的に、微生物を減少させて生産および／または処理するモジュラーシステムであって、以下のモジュール：
（ａ）少なくとも１つのろ過モジュール、
（ｂ）少なくとも２つのクロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器を含んでなる、少なくとも１つのクロマトグラフィーモジュール、
（ｃ）少なくとも１つの限外ろ過モジュールおよび／または少なくとも１つのダイアフィルトレーションモジュールおよび／または少なくとも１つの透析モジュール、ならびに、
（ｄ）連続的ウイルス減少のための少なくとも１つのモジュール、
を含んでなり、前記モジュラーシステムは閉鎖され、微生物が減少されていることを特徴とするものを提供することによって達成する。
【００７６】
しかしながら、少なくとも１つのクロマトグラフィーモジュールはまた、２つ以上のクロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器、例えば３つもしくは４つのクロマトグラフィーカラムおよび／または膜吸着器を含んでなることができる。
【００７７】
本発明のモジュラーシステムのさらなる実施態様において、生成物と接触し、モジュール（ａ）〜（ｄ）で使用される全ての要素は、微生物減少方法によって微生物減少に供され、微生物減少方法は好ましくは、ガンマ線照射、ベータ線照射、加圧滅菌、エチレンオキシド（ＥＴＯ）処理、オゾン処理（Ｏ３）、過酸化水素処理（Ｈ２Ｏ２）、および定置蒸気滅菌（ＳＩＰ）処理からなる群から選択される。
【００７８】
好ましくは、モジュラーシステムそのもの、およびまた生成物流と接触するモジュールの全ての要素は、好ましくは微生物減少に供するおよび／もしくは滅菌することができ、好ましくは加圧滅菌することができ、ガンマ線照射することができ、エチレンオキシド（ＥＴＯ）で洗浄することができ、オゾン（Ｏ３）で処理することができ、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）で処理することができ、または定置蒸気滅菌（ＳＩＰ）処理で処理することができ、本発明のシステムの低微生物数または無菌的操作も可能にする。
【００７９】
本発明のモジュラーシステムのさらなる実施態様において、モジュール（ａ）からモジュール（ｄ）に使用される、生成物と接触する全ての物体は、使い捨て物品であるか、または使い捨て物品として使用される。これに関連して、モジュールは好ましくは溶着または無菌コネクタによって互いに接続される。例えば、ＧＥ社より入手可能な無菌「ＲｅａｄｙＭａｔｅ」コネクタは、本発明のモジュラーシステムにおいて好ましく使用される無菌コネクタである。
【００８０】
好ましくは、すぐに使える(ready-to-use)使い捨て物品はガンマ線照射要素として使用される。
【００８１】
本発明のモジュラーシステムの好ましい実施態様において、全ての入口流体は微生物減少フィルターを通過する（全ての出口は好ましくは後方成長を妨げる微生物バリアによって保護されている）。
【００８２】
モジュラーシステムの最後に、最終精製された不均一な細胞培養液混合物由来のバイオ医薬生体高分子生成物を、好ましくは０．２μｍの孔径を有するフィルターを通じて最後に一度最終ろ過することができる。最終ろ過は、例えば、ガンマ線照射Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２カプセル（Ｍｉｄｉｃａｐ、サイズ７、０．０５ｍ２）を通ってガンマ線照射５リットルＧＥ社製ＲｅａｄＣｉｒｃｕｉｔバッグ内へ入ることで達成することができる。最終バッグの充填レベルが許容値まで達した場合、続いて前記バッグは溶着から外され、新規バッグがプロセスへ溶着されることができる。
【００８３】
好ましい実施態様を包含する本発明は、以下の図および実施例にてより詳細に解説するが、これらに限定されるものではない。実施態様は、矛盾がその内容から明らかとならない場合、所望の通りに互いに組み合わせてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
以下を示す：
【００８５】
【図１】図１は、本発明のプロセスの一実施態様のプロセス図を模式的に示す。括弧内の数字は実施例１および表１に記載の通り、質量平衡に関する。
【図２】図２は、使用済みフィルター１７と新規フィルター１６の溶着による置換を伴う、プロセスおよびシステムのろ過工程の作動原理を模式的に示す。
【図３】図３は、ウイルス不活化および中和の２つの工程段階（加圧滅菌され残りはガンマ線照射されるｐＨプローブｐＨ０５０１およびｐＨ０５０２を有する、モジュラー式に組まれた２つのユニット）を例示する。したがって、ｐＨプローブ（ｐＨ０５０１およびｐＨ０５０２）は構造体内へ溶着される。バッグは無菌ＧＥ社製ＲｅａｄｙＭａｔｅ（商標）コネクタを介して接続される。Ｐｒｏｔ−Ａへの接続およびろ過ユニットへの接続は、最初に溶着で密閉され（zugeschweibt）、その後種々のユニットに対して溶着される。
【図４】図４は、システムのモジュラー構造を例示する（全ての入口流および出口流が微生物バリア１０、１３を介して環境へ接続されている）。例示的なモジュラーシステム１は、交互に操作する２つのフィルター１３を各々が有する３つのろ過モジュール２、２つのクロマトグラフィーカラム４または２つの膜吸着器５を有する２つのクロマトグラフィーモジュール３、ウイルス減少工程（例えば、ウイルス不活化９、限外ろ過モジュール６、およびダイアフィルトレーションモジュール７）からなる。気泡は疎水性フィルター１５または気泡トラップ１４を介して緩衝液から取り除かれる。
【００８６】
表１は、図１中に示した位置の平均流量および抗体濃度を示す。
【００８７】
使用した参照番号は以下の通りである：
１＝モジュラーシステム
２＝ろ過モジュール
３＝クロマトグラフィーモジュール
４＝クロマトグラフィーカラム
５＝膜吸着器
６＝限外ろ過モジュール
７＝ダイアフィルトレーションモジュール
８＝透析モジュール
９＝ウイルス減少
１０＝微生物減少フィルター
１１＝微生物バリア
１２＝無菌コネクタ
１３＝好ましくは０．４５μｍ以下の孔径を有するフィルター
１４＝気泡トラップ
１５＝疎水性精密ろ過膜
１６＝新規フィルター
１７＝使用済みフィルター
１８＝圧力センサ
１９＝エアフィルター（好ましくは０．２５μｍ以下の孔径）
２０＝新規フィルター１６のガス抜き弁
２１＝供給ポンプ
２２＝充填レベルセンサ
２３＝天秤
２４＝弁
２５＝廃棄流
２６＝生成物流
２７＝緩衝液
２８＝液体検出装置
２９＝バッグ
【実施例】
【００８８】
実施例１
不均一細胞培養液／流体混合物から連続的な微生物減少様式でたんぱく質を精製するために、以下のモジュールおよび付随するプロセス工程を有するミニプラントを組んだ：
特に断りがない限り、ＥａｓｙＬｏａｄ  ＩＩ揚程を有するＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ蠕動ポンプをプロセスでは使用した。使用した管はＭａｓｔｅｒｆｌｅｘ  ＬＳ１６またはＣｆｌｅｘまたはＳａｎｉｐｕｒｅであった。生成物と接触する、全ての使用した構成要素は２５ｋＧｙのガンマ線照射に供した。物質によりガンマ線照射が実行できなかった例外においては、構成要素は１２１℃にて２０分間加圧滅菌した（例えば、ｐＨプローブまたはウイルスフィルターを有する構成機器）。可能な場合、既成品である使い捨て物品はガンマ線照射モジュールとして使用した。例外なく、全てのバッグに対してはこのようにした。前記バッグは通常、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ（ＧＥ）社から入手可能なＲｅａｄｙＭａｔｅ（商標）コネクタを用いるモジュールに接続した。各モジュール間において、単回使用ガンマ線照射バッグ（ＲｅａｄｙＣｉｒｃｕｉｔ、１リットル、ＧＥ社）をモジュールｎ−１の出口流とモジュールｎの入口流との補正タンクとして設置した。通常、各モジュールのその時点には入口流および出口流が存在した。生成物の液体のガス抜きが有利であった場合、タンクは疎水性０．２μｍフィルターを介して環境から密封された。
【００８９】
Ａ．上流
（ｉ）灌流リアクター
ＩｇＧモノクローナル抗体を連続的に生産するため、１０リットルの灌流リアクターを使用した。生存可能な細胞密度は定常状態で６０，０００，０００〜７０，０００，０００細胞／ｍｌであった。力価は１１５ｍｇ／ｌ以下であった。生産は２つの平行する灌流リアクターを用いて２８日間実施した。
【００９０】
（ｉｉ）細胞保持システム
生成物は傾斜したプレート分離器（沈殿槽）を通じて連続的に放出した。これにより、細胞の大半を保持した。
【００９１】
Ｂ．下流ＤＳＰ−１
（ｉ）細胞清澄
清澄はＳａｒｔｏｇｕａｒｄ  ＮＦ  ０．２μｍフィルター（Ｔ−ｓｔｙｌｅ、ＭａｘｉＣａｐ、０．６５ｍ２）を同時に操作して実施した。図２は、密閉低微生物数プロセスがどのようにして実現化されたかを示す。フィルターおよび管アセンブリの両方をガンマ線照射した。入口ラインおよび出口ラインを、無菌コネクタを介してガンマ線照射バッグ（ＧＥ社、ＲｅａｄｙＣｉｒｃｕｉｔ、１リットル）に接続した。これらのラインは変動流量への補正体積として使用した。ガス抜きの目的のために、フィルターを疎水性０．２μｍエアフィルターと連結し、結果として、モジュールは本発明における意味合いで密閉された（図２）。エアフィルターは、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．より入手可能なＥｍｆｌｏｎ  ＩＩまたはＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍより入手可能なＭｉｄｉｓａｒｔ  ２０００のいずれかであった。したがってガス抜き弁は、密閉状態でも透過性を有するが、依然として確かに環境を密閉するように調節した。この目標のため、Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ  ＮＦにおいてガス抜き弁の内側シールリングを取り除き、弁をガンマ線照射の前に閉じた。前記弁をさらに、開口しないよう補強した。結果として、弁は、締まりばめを特徴とする、安全な状態で「密閉」された。ガス抜き弁を、管を介してエアフィルターと接続した。ガス抜き弁とエアフィルターとの間で、管ピンチ弁内へ管を挿入した。フィルターを、ガス抜き弁および管によってエアフィルターへ液体が侵入するまで充填した。その後、疎水性ガス抜きフィルターが液体を遮断した。同時に、プロセスシステムがろ液側の弁によって生成物流を遮断したため、フィルター正面の圧力が上昇した。前記圧力上昇はＰｅｎｄｏｔｅｃｈ圧力センサによって検出した。０．５バールの閾値を超過した場合、ガス抜き管のピンチ弁が閉鎖され、ろ液側の弁が開放された。
【００９２】
（ｉｉ）濃縮およびリバッファリング
（ｉ）細胞清澄からのろ液をまず、限外ろ過中空繊維膜（ＧＥ社製Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＲｅａｄｙｔｏＰｒｏｃｅｓｓ社、０．２ｍ２、ガンマ線照射済み）を用いて１０倍に連続的に濃縮した。使用した循環ポンプは使い捨て可能なＱｕａｔｔｒｏＦｌｏｗ  １２００  ＳＵポンプであった（このポンプの揚程はガンマ線照射の前に管アセンブリへ統合した）。
【００９３】
その後、濃縮した生成物の培地成分を５０ｍＭのイミダゾール／ＮａＣｌ緩衝液とＧａｍｂｒｏ  Ｒｅｖａｃｌｅａｒ  ３００透析膜を通じて交換した。モジュールは製造者により滅菌包装され提供されており、生物学的安全キャビネット内のガンマ線照射管アセンブリに接続した。濃縮による浸透水および培地含有廃棄流をガンマ線照射２００リットルＳａｒｔｏｒｉｕｓ社製Ｆｌｅｘｂｏｙへ伝導した。ＦｌｅｘｂｏｙはＳａｒｔｏｒｉｕｓ溶着機を用いて再度溶着により交換した。
【００９４】
０．２μｍろ過
充填の前に、生成物を２００リットルのＦｌｅｘｂｏｙへガンマ線照射Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ  ＮＦフィルター（ＭａｘｉＣａｐ、サイズ８）を交互に操作して連続的にろ過した。構成および操作は「Ｂ．下流ＤＳＰ−１−（ｉ）細胞清澄」と同様であった。
【００９５】
Ｃ．下流ＤＳＰ−ＩＩ
０．２μｍろ過
保存した後、下流クロマトグラフィーカラムを粒子から保護するためにＤＳＰ−Ｉからの生成物を再びろ過した。
【００９６】
１．キャプチャークロマトグラフィー
Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ社）をＰｒｏｔ−Ａ樹脂として使用して、ＩｇＧを単離した。ＩｇＧを１０倍に濃縮し、混入物の大半を除去した。Ｔａｒｐｏｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社より入手可能な連続的ＢｉｏＳＭＢシステムを１２本のカラム（内径１６ｍｍ、長さ８０ｍｍ）と共に使用した（うち８本のカラムは積載ゾーンにあった（２本のカラムが直列、４本のカラムが並列））。カラムを包含する流路全体を衛生化またはガンマ線照射によって微生物減少させた。サイクルごとの添加は、カラム１本につき３２カラム体積であった。使用した緩衝液は、異なるモル濃度、ｐＨ値、および伝導率を有する酢酸緩衝液であった。全ての緩衝液はガンマ線照射または加圧滅菌した０．２μｍフィルターを用いてガンマ線照射バッグへろ過した。緩衝液バッグの出口管をＢｉｏＳＭＢシステムの入口へ溶着した。前記システムはその各入口にガンマ線照射脱ガス膜（Ｍｅｍｂｒａｎａ社製Ｌｉｑｕｉｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍｏｄｕｌｅ）を有していた。同様に、生成物ラインをＢｉｏＳＭＢシステムの入口に、その様な脱ガス機を介して溶着した。その後、全ての入口流を真空ポンプにより５０ｍｂａｒでガス抜きした。
【００９７】
１．ウイルス不活化および中和
ウイルス不活化および中和は３つのモジュールからなり、キャプチャークロマトグラフィーと０．２μｍろ過との間に位置していた：（ａ）蠕動ポンプＭ０５０２による均質化ループ；（ｂ）螺旋状の管として模式的に示した滞留時間ループ；（ｃ）ｐＨ値が７．５に調節され得た中和バッグ。モジュールは個別に組み立て、図３における溶着点に沿ってガンマ線照射した（各場合において、両端は溶着によって密封した）。
【００９８】
ｐＨプローブを有するラインセグメント（この場合、ｐＨ０５０１およびｐＨ０５０２）を加圧滅菌した。その後、ｐＨプローブをアセンブリに溶着した。示した通り、バッグは無菌ＧＥ  ＲｅａｄｙＭａｔｅ（商標）コネクタを介して接続した。Ｐｒｏｔ−Ａ溶出ラインおよびろ過モジュールへの接続は、まず溶着により密封し、その後種々のモジュールへと溶着した。
【００９９】
０．２μｍろ過
たんぱく質はｐＨ変化の後に沈殿させることが可能であったため、沈殿したたんぱく質をろ別した。
【０１００】
クロマトグラフィー（中間および仕上げ）
上述の０．２μｍのろ過の生成物を、２回のクロマトグラフィー工程を介して２．５ｍｌのＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅｓ（２．５ｍｌ、ＧＥ社）を用いた手段により経時的に４回（４−ＰＣＣ）精製し、その後２０ｍｌのアニオン交換体（Ｐａｌｌ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌ  ＳｔａｒＡＸ）を用いて交代で２回精製した。この精製では、ろ過可能Ｐｒｏｔ−Ａ（Ｐｒｏｔ−Ａ  ｌｅａｃｈａｂｌｅｓ）、ＤＮＡ、ＨＣＰ、および凝集物を除去した。２回のクロマトグラフィー工程はガンマ線照射バッグ（ＧＥ社、ＲｅａｄｙＣｉｒｃｕｉｔ（商標）、１リットル）を介して互いに接続した。伝導率はアニオン交換体の必要性に伴いライン中へ水を供給することによって、７．５ｍＳ／ｃｍに調節した。
【０１０１】
カラムを包含する流路全体を衛生化またはガンマ線照射した。サイクルごとの添加は、カラム１本につき３２カラム体積であった。使用した緩衝液は、異なるモル濃度、ｐＨ値、および伝導率を有する酢酸緩衝液であった。全ての緩衝液はガンマ線照射または加圧滅菌した０．２μｍフィルターを用いてガンマ線照射バッグへろ過した。緩衝液バッグの出口管をＢｉｏＳＭＢシステムの入口へ溶着した。前記システムはその各入口にガンマ線照射脱ガス膜（Ｍｅｍｂｒａｎａ社Ｌｉｑｕｉｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍｏｄｕｌｅ）を有していた。同様に、０．２μｍ以上の生成物ラインをＢｉｏＳＭＢシステムの入口に、その様な脱ガス機を介して溶着した。その後、全ての入口流を真空ポンプにより５０ｍｂａｒでガス抜きした。廃棄流はガンマ線照射した２００リットルのＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｆｌｅｘｂｏｙへ伝導した。ＦｌｅｘｂｏｙはＳａｒｔｏｒｉｕｓ溶着機を用いて再度溶着することにより交換した。
【０１０２】
生成物流をガンマ線照射生成物バッグ（ＧＥ社、ＲｅａｄｙＣｉｒｃｕｉｔ、１リットル）中へ再び集めた。
【０１０３】
予備ろ過
仕上げのクロマトグラフィーの生成物バッグより、生成物溶液をまず、０．１μｍのカプセル（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２、ＭｉｄｉＣａｐ、サイズ９、０．２ｍ２）を用いて予備ろ過した。手順および構成は「Ｂ．下流ＤＳＰ−１−（ｉ）細胞清澄」と同様であった。
【０１０４】
ウイルスろ過
予備ろ過からの出口ラインは、蠕動ポンプを介して「Ｃ．下流ＤＳＰ−ＩＩ」からのウイルスろ過の入口へ溶着によって直接繋いだ。別の手段では、「Ｃ．下流ＤＳＰ−ＩＩ」からのウイルスろ過の構成および操作は「Ｃ．下流ＤＳＰ−ＩＩ−０．２μｍろ過」と同様であった。しかしながら、使用済みウイルスフィルターはＶｉｒｏｓａｒｔ  ＣＰＶフィルター（ＭｉｄｉＣａｐ、サイズ９、０．２ｍ２）であった。使用済みフィルターはすすぎ、製造者の指示に従って加圧滅菌した。フィルターはもう一度アセンブリに溶着した。生成物流は再度ガンマ線照射生成物バッグ（ＧＥ社、ＲｅａｄｙＣｉｒｃｕｉｔ、１リットル）中に詰めた。
【０１０５】
最終濃縮およびリバッファリング
最終濃縮およびリバッファリングは前述の「Ｂ．ＤＳＰ−Ｉ−（ｉｉ）濃縮およびリバッファリング」と同様に構成したが、加圧滅菌ＵＶ細胞を生成物濃縮のモニターのために濃縮ループ中へ統合した点においてだけ異なった。リバッファリングは５０ｍＭのリン酸緩衝液を用いて、前述の「Ｂ．ＤＳＰ−Ｉ−（ｉｉ）濃縮およびリバッファリング」と同様に実施した（今回使用したｐＨ値は７．５であった）。生成物流は再度ガンマ線照射生成物バッグ（ＧＥ社、ＲｅａｄｙＣｉｒｃｕｉｔ、１リットル）中に詰めた。
【０１０６】
０．２μｍろ過
最終ろ過は、上に記載の「Ｂ．ＤＳＰ−１（ｉ）」においてガンマ線照射Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ２カプセル（Ｍｉｄｉｃａｐ、サイズ７、０．０５ｍ２）を通って、ガンマ線照射５リットルＧＥ社製ＲｅａｄＣｉｒｃｕｉｔバッグへ入るように実施した。最終バッグの充填レベルが許容値まで達した場合、前記バッグは溶着から外し、新規バッグを上記プロセスに溶着した。
【０１０７】
実施例１にて説明したように、本発明のプロセスが定期的に実施される実行時間は、微生物生育なしで３日間であった（クロマトグラフィーカラムは４０％イソプロパノール＋０．５ＭのＮａＯＨによって滅菌した）。本発明のプロセスに関して３日間を超える実行時間の場合は、クロマトグラフィーカラムはガンマ線照射した。
【０１０８】
図１中に示した位置の平均流速および抗体濃度を、表１にて概説する。
【０１０９】
【表１】
0006794372.tif 000002
【０１１０】
本明細書につながる研究は、“Bio.NRW:MoBiDiK - Modulare Bioproduktion - Disposable und Kontinuierlich” [Bio.NRW:MoBiDiK - modular bioproduction - disposable and continuous]に基づき欧州地域開発基金（ＥＲＤＦ）の合意の下により資金調達された。
［１］
不均一な細胞培養液混合物由来のバイオ医薬生体高分子生成物を、連続的に、微生物を減少させて生産および／または処理する方法であって、以下の工程：
（ａ）生成物流（２６）の形態の、前記生成物を含有する不均一な細胞培養液混合物由来の粒子を含有しない流体を提供すること、
（ｂ）少なくとも１回ろ過し、ろ液を提供すること、
（ｃ）前記生成物を精製するために、少なくとも２回クロマトグラフィー工程を行うこと、
（ｄ）少なくとも１回ウイルスを減少させること、
（ｅ）工程（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）の生成物流（２６）を、少なくとも１回限外ろ過および／または少なくとも１回ダイアフィルトレーションすること
を含んでなり、工程（ｃ）による前記少なくとも２回のクロマトグラフィー工程は少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム（４）および／または膜吸着器（５）を介する精製を含んでなり、かつ前記方法は閉鎖式およびモジュラー式で実施される、方法。
［２］
ｐＨ調節および／または伝導率調節および／またはろ過工程および／または濃縮工程および／または緩衝液交換のための１回以上のさらなる工程が、（ｃ）中の少なくとも２回のクロマトグラフィー工程の間および／または工程（ｄ）におけるウイルス不活化後に実施される、［１］に記載の方法。
［３］
前記生成物と接触する工程（ａ）〜（ｅ）で使用される全ての要素が、適切な微生物減少方法を介して微生物減少に供される方法であって、前記微生物減少方法が好ましくは、ガンマ線照射、ベータ線照射、加圧滅菌、エチレンオキシド（ＥＴＯ）処理、オゾン処理（Ｏ３）、過酸化水素処理（Ｈ２Ｏ２）、および定置蒸気滅菌（ＳＩＰ）処理からなる群から選択される、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
工程（ｂ）以降に使用され、かつ生成物と接触する全ての要素が、使い捨て物品であるか、または使い捨て物品として使用される、［１］〜［３］に記載の方法。
［５］
全ての入口流体が微生物減少フィルター（１０）を通じてろ過され、かつ全ての出口が後方成長を妨げる微生物バリア（１１）によって好ましくは保護される、［１］〜［４］に記載の方法。
［６］
モジュラープロセス工程が複数のモジュールにおいて実行され、前記複数のモジュールは互いに接続され、前記複数のモジュールが好ましくは溶着または無菌コネクタ（１２）によって互いに接続される、［１］〜［５］に記載の方法。
［７］
工程（ａ）〜（ｅ）で使用される全ての液体、気体、および固体が微生物減少に供され、前記微生物減少が好ましくは０．４５μｍ以下の孔径を有するフィルター（１３）を介したろ過によって好ましくは達成され、かつプロセス内の滅菌が好ましくは前記プロセスの間には実施されない、［１］〜［６］のいずれか一つに記載の方法。
［８］
少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム（４）に流出する全ての液体の脱気が工程（ｃ）の前に行われ、前記脱気が好ましくは、少なくとも１つの気泡トラップ（１４）、および／または少なくとも１つの真空を介する疎水性精密ろ過膜（１５）、および／または超音波による処理、および／またはヘリウムを用いたスパージングによって達成される、［１］〜［７］に記載の方法。
［９］
工程（ａ）由来の前記粒子を含有しない流体が殺菌剤含有緩衝液に対して少なくとも１回の限外ろ過に供され、前記殺菌剤が好ましくは、イミダゾール、安息香酸、ソルビン酸、パラヒドロキシ安息香酸エステル、亜硫酸塩、二亜硫酸塩、アジド、オルトフェニルフェノール、ナイシン、ナタマイシン、ヘキサメチレンテトラミン、二炭酸ジメチル、亜硝酸塩、硝酸塩、酢酸、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、Ｌ−乳酸、プロピオン酸、ホウ酸、およびリゾチームからなる群から選択される、［１］〜［８］に記載の方法。
［１０］
前記バイオ医薬生体高分子生成物が、たんぱく質もしくはペプチドであるか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡを含んでなり、前記たんぱく質またはペプチドが、モノクローナル抗体、ポリクロナール抗体、組換えたんぱく質、およびたんぱく質ワクチンからなる群から選択され、前記ＤＮＡまたはＲＮＡが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡワクチンの一部である、［１］〜［９］のいずれか一つに記載の方法。
［１１］
工程（ｃ）の前記少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム（４）および／または膜吸着器（５）が、親和性の原理に従って、イオン相互作用を介して、金属キレート結合を介して、疎水性相互作用を介して、またはファンデルワールス力を介して、生成物と結合し、前記少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム（４）および／または膜吸着器（５）が、前記親和性の原理に従って結合する場合において、たんぱく質Ａ、たんぱく質Ｇ、たんぱく質Ｌ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ならびに、たんぱく質Ａ、たんぱく質Ｇ、たんぱく質Ｌ、ＩｇＭ、およびＩｇＧとは異なり前記生成物に対して親和性を有する組換えたんぱく質からなる群から好ましくは選択されるリガンドを含んでなる、［１］〜［１０］のいずれか一つに記載の方法。
［１２］
工程（ａ）〜（ｅ）の前記方法が、少なくとも４時間、好ましくは少なくとも８時間、好ましくは少なくとも１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、より好ましくは少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも４週間、および特に好ましくは少なくとも８週間の実行時間を有する、［１］〜［１１］のいずれか一つに記載の方法。
［１３］
少なくとも１つのフィルター（１３）を含んでなる少なくとも１回のろ過工程が、工程（ａ）〜（ｅ）の間および／またはそれらの後に実施される、［１］〜［１２］のいずれか一つに記載の方法。
［１４］
前記フィルター（１３）が微生物減少条件下において自動的に交換され、前記自動フィルター交換が好ましくは以下の工程：
（ｉ）流路の閉鎖に伴う非ろ液側の圧力センサ（１８）において閾値が超過し、使用済みフィルター（１７）における前記生成物が好ましくはろ液側へと気体または液体によって押し込まれる場合、または前記流路における前記使用済みフィルター（１７）の最長時間が超過する場合、または前記使用済みフィルター（１７）を介したろ液の最大量が超過する場合、新規フィルター（１６）へ流路を切り替えること、
（ｉｉ）供給ポンプ（２１）により前記新規フィルター（１６）内にまたは微生物減少様式で接続された密閉袋（２９）内に生成物を運搬することを好ましくは伴い、前記新規フィルター（１６）のガス抜き弁（２０）において、好ましくは０．２５μｍ以下の孔径を有するエアフィルター（１９）を介して前記新規フィルター（１６）のガス抜きを行うこと、
（ｉｉｉ）前記圧力センサ（１８）または充填レベルセンサ（２２）または天秤（２３）または液体検出装置（２８）により、前記非ろ液側の前記新規フィルター（１６）のガス抜きの完了を検出すること、
（ｉｖ）弁（２４）により前記ろ液出口を開放しかつ前記ガス抜き弁（２０）と前記エアフィルター（１９）との間の前記流路を閉鎖すること、ならびに、
（ｖ）前記使用済みフィルター（１７）と新規フィルター（１６）とを交換することを含んでなる、［１３］に記載の方法。
［１５］
不均一な細胞培養液混合物由来のバイオ医薬生体高分子生成物を、連続的に、微生物を減少させて生産および／または処理するモジュラーシステム（１）であって、以下のモジュール：
（ａ）少なくとも１つのろ過モジュール（２）、
（ｂ）少なくとも２つのクロマトグラフィーカラム（４）および／または膜吸着器（５）を含んでなる、少なくとも１つのクロマトグラフィーモジュール（３）、
（ｃ）少なくとも１つの限外ろ過モジュール（６）および／または少なくとも１つのダイアフィルトレーションモジュール（７）および／または少なくとも１つの透析モジュール（８）、ならびに、
（ｄ）連続的ウイルス減少（９）のための少なくとも１つのモジュール
を含んでなり、前記モジュラーシステム（１）は閉鎖され、微生物が減少されている、モジュラーシステム。
［１６］
前記生成物と接触するモジュール（ａ）〜（ｄ）で使用される全ての要素が、微生物減少方法によって微生物減少に供されるモジュラーシステムであって、前記微生物減少方法が好ましくは、ガンマ線照射、ベータ線照射、加圧滅菌、エチレンオキシド（ＥＴＯ）処理、オゾン処理（Ｏ３）、過酸化水素処理（Ｈ２Ｏ２）、および定置蒸気滅菌（ＳＩＰ）処理からなる群から選択される、［１５］に記載のモジュラーシステム（１）。
［１７］
前記生成物と接触するモジュール（ａ）〜（ｄ）で使用される全ての前記要素が、使い捨て物品であるか、または使い捨て物品として使用され、かつ前記複数のモジュールが好ましくは溶着または無菌コネクタによって互いに接続される、［１５］または［１６］に記載のモジュラーシステム。
［１８］
全ての入口流体が微生物減少フィルター（１０）を通過し、かつ全ての出口が微生物の後方成長を妨げる微生物バリア（１１）によって好ましくは保護される、［１５］〜［１７］に記載のモジュラーシステム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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