(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸配列と少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列の機能的光活性黄色タンパク質（ＰＹＰ）誘導体を含むポリペプチドであって、
前記機能的光活性黄色タンパク質（ＰＹＰ）誘導体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の９４〜１０１位のアミノ酸領域またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列の対応する位置におけるアミノ酸領域に少なくとも３つのアミノ酸置換を含み、
前記３つのアミノ酸置換は、９４位のトリプトファン、９７位のプロリン、９６位のイソロイシン、バリン、およびロイシンから選択される、分枝脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基であり、
前記ポリペプチドが、
２５℃の温度で測定した場合に０．０５〜１０μＭの範囲のＫＤ、および／または
２５℃の温度で測定した場合に１〜５０ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
２５℃の温度で測定した場合に０．１×１０７〜５０×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴う（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−４−オン（ＨＢＲ）および／または（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−３−メチル−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（またはＨＢＭＲ）と可逆的に結合する、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５からなる群から選択される配列の機能的ＰＹＰ誘導体を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記機能的ＰＹＰの誘導体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の９４〜１０１位またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列の対応する位置におけるアミノ酸領域において更なるアミノ酸置換を含み、前記更なるアミノ酸置換が、
９８位のスレオニン
である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記機能的ＰＹＰ誘導体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８からなる群から選択されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の９４〜１０１位におけるアミノ酸領域またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列の対応する位置におけるアミノ酸領域を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の９４〜１０１位のアミノ酸領域またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列の対応する位置におけるアミノ酸領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３のアミノ酸領域である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記機能的ＰＹＰ誘導体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記機能的ＰＹＰ誘導体が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
関心対象のタンパク質に融合した、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項８に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
関心対象のいずれかの固体または液体の試料、細胞、または組織、または生物におけるタンパク質の活性、タンパク質の局在性、タンパク質−タンパク質相互作用、および／またはタンパク質の再配置を定量化および／または検出するための、関心対象の組織はヒトの組織ではない、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項８に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項１２】
表面または粒子、タンパク質を蛍光的に標識または着色する方法であって、
前記表面または粒子に請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチドを結合するステップと、
蛍光発生発色団を提供するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
試料中のタンパク質を順次標識する方法であって、
２５℃の温度で測定した場合に０．０５〜１０μＭの範囲のＫＤ、および／または
２５℃の温度で測定した場合に１〜５０ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
２５℃の温度で測定した場合に０．１×１０７〜５０×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴う（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−４−オン（ＨＢＲ）及び／または（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−３−メチル−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（またはＨＢＭＲ）と結合する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の機能的光活性黄色タンパク質（ＰＹＰ）誘導体または請求項８に記載の２つの融合タンパク質を含む、少なくとも２つのポリペプチドの使用を含み、
前記方法が、
第１の蛍光発生発色団と前記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
前記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
第２の蛍光発生発色団と前記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
前記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
各蛍光発生発色団を用いて前のステップを反復することと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の蛍光標識の分野に関する。特に本発明は、粒子、たとえばタンパク質または表面を蛍光的に標識するための、光活性黄色タンパク質（ＰＹＰ）の機能的な誘導体またはそのフラグメントに関する。これらの蛍光は、非毒性蛍光発生リガンドの付加または除去により、自由にオンおよびオフにすることができる。一部の実施形態では、本発明の機能的な誘導体は、式（Ｉ）の蛍光発生発色団を可逆的に結合でき、複合化形成すると上記蛍光発生発色団の輝度を上げることができ、その助色団基のイオン化を介して上記蛍光発生発色団のスペクトルシフトを誘導することができ、明らかな光安定性を呈するのに適した更新時間で上記蛍光発生発色団を結合する。
【背景技術】
【０００２】
生命体を理解するには、空間および時間の両方において非常に高い解像度で、リアルタイムの細胞タンパク質の動態を観察できることが必要である。この観点で、蛍光は、生存細胞または生物におけるタンパク質を観察または検出するための選択肢から外されている。
【０００３】
蛍光顕微鏡による関心対象のタンパク質の選択的な検出は、造影剤として作用する蛍光プローブの存在を必要とする。このプローブは、内因性、すなわち天然のタンパク質の一部とすることができ、または外因性、すなわちタンパク質に特異的に結合することができる。ほとんどの場合、関心対象のタンパク質は、蛍光イメージングに固有の光学的なサインを得ることができる特異的な内因性プローブを有さない。よって、試験下の生物学系に存在しない光物理的特性を表す蛍光プローブでのタンパク質の機能付与は、特定の光学的な特徴を確実にする。生細胞における特異的な標識を入手するための選択方法は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）におけるようなフルオロフォアを生ずる自己触媒プロセスにより蛍光性となることができる、またはフルオロフォアの特異的かつ密接（共有的または非共有的）な結合のアンカーとして作用できる追加的なポリペプチド、いわゆるタグに、関心対象のタンパク質を融合することである。
【０００４】
この文脈では、理想的な蛍光性タンパク質ベースのプローブは、（ｉ）天然のタンパク質のフォールディング全体と干渉しないこと、タンパク質の局在化と干渉しないこと、パートナーとの相互作用を変化しないことを含む、結合しているタンパク質の機能を乱してはならなく、（ｉｉ）たとえｐＨまたは酸化還元条件が何であってもタンパク質が作用する細胞区画において、および試験下での細胞または生物の生存条件で、機能的でなければならず、（ｉｉｉ）生物学的なプロセスの中で見いだされる時間尺度と適合性のある時間分解能でタンパク質のイメージングを可能にしなければならない。この後者の点は、理想的には、タンパク質ベースの蛍光性プローブが、（ｉ）融合タンパク質がタンパク質の寿命の初期に関してレポートするように折りたたまれるとすぐに蛍光性でなければならず、（ｉｉ）ゆっくりとした動的細胞プロセスに関与したタンパク質の定量的な観察を可能にするように長期間光安定性でなければならないことを意味する。この後者の点は、蛍光顕微鏡による蛍光標識したタンパク質の定量的な観察が多くの場合フルオロフォアの光退色により限定されているため、特に重要である。実際に、有機フルオロフォアは、光化学的に破壊される前の限定された数のみの光子の生成をもたらす限定した数の励起−発光光周期のみを経ることができるため、数秒または数分よりも長い連続した観察が、蛍光顕微鏡では一般的に不可能であり、特に長期間の追跡または単分子のイメージングに問題がある。
【０００５】
生細胞における関心対象のタンパク質の特異的な蛍光標識は、一般に、関心対象のタンパク質に融合した追加的なポリペプチド、いわゆるタグの使用を介して達成される。これは、現在入手可能なＤＮＡ組み換え技術を用いて容易に行われている。追加的なポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、関心対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むフレームにクローン化されている。得られたＤＮＡ配列は、２つのポリペプチドの融合からもたらされるキメラタンパク質をコードする。
【０００６】
既知の技術の中で、追加的なペプチドタグは、自己触媒プロセスを介してそれ自体が蛍光性となることがある。これは、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）で同定された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の場合である。ＧＦＰの共有結合性発色団、パラヒドロキシベンジリデン−５−イミダゾリノン（ｐ−ＨＢＩ）は、タンパク質骨格における三連構造のＧｌｙ／Ｔｙｒ／Ｓｅｒの環化／脱水／酸化からもたらされる。この手法は、発色団がＧＦＰのペプチド配列から形成するため、フルオロフォアの完全に遺伝的なコード化から利益を得る。よって、蛍光性プローブとしてＧＦＰを使用する場合、蛍光標識の絶対的な特異性が存在する。いくつかのＧＦＰ様タンパク質が、可視スペクトル全体の光物理的な特性を含むＧＦＰ様タンパク質の集団を得るために見出され、または人工操作されている。しかしながら、この手法には、いくつかの制限がある。まず、タンパク質のβバレル内のフルオロフォアの自己触媒の成熟は、ほとんどの蛍光性タンパク質で４０分〜２時間の半減時間を含むゆっくりとした複数のステップのプロセスである（Ｃｈｕｄａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）：よってタンパク質のフォールディングの終了と蛍光性の外観との間に時間のずれが存在しており、これはタンパク質寿命の初期の試験を妨げている。第２の制限は、分子Ｏ２がフルオロフォアの形成に関与した酸化ステップの間に必要であることであることであり、これは、Ｏ２を含む（＞３μＭ）環境で、このようなＧＦＰ様蛍光性タンパク質を利用することを制限し（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、無酸素性または低酸素性の生物学的な系においてはレポーターとしてのこれらの使用が妨げられている。第３の制限は、ＧＦＰ様蛍光性タンパク質の光安定性である。一般的なＧＦＰ様蛍光性タンパク質の光退色の半減期（蛍光性タンパク質あたり１，０００光子／ｓの最初の発光比率から５０％への発光比率の減少を必要とする）は、概して５〜２００ｓである（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。最後に、２５〜３０ｋＤａを含むＧＦＰ様蛍光性タンパク質の大きさは、場合によっては、これに融合するタンパク質の機能を変えることが示されている。
【０００７】
内因性蛍光発生補助因子を強力に共有結合または非共有結合する小さなアポタンパク質に応じた代替的な蛍光性タンパク質もまた、使用されている。この結合は、補助因子の輝度の上昇をもたらす。蛍光性の上昇は、特定の立体構造、好ましい放射性脱励起の中に蛍光発生補助因子を限定することからもたらされる。内因性補助因子の結合への依存は、酸素分子への必要性を克服することができ、無酸素性条件下での作用を可能にする。さらに、ほとんどの既知の補助代替的な因子ベースの蛍光性タンパク質はＧＦＰよりもずっと小さく、試験タンパク質の機能を妨害するリスクを最小限にする利点がある。
【０００８】
代替的な蛍光性タンパク質のうち、ビリベルジンを共有結合するバクテリオフィトクロムが、ＩＦＰ１．４（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、ｉＲＦＰ（Ｆｉｌｏｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）、およびＷｉ−Ｐｈｙ（Ａｕｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）などの近赤外線蛍光性タンパク質に人工操作された。しかしながらこれらのタンパク質は、ビリベルジン補助因子の共有結合を必要とするため、長い成熟期間（半減期２時間）を有する。さらにこれらは多量体であり、試験タンパク質の機能および位置を変える可能性がある。最後に、これらは、５０〜４５０ｓの光安定性半減時間を示し、これは、ＧＦＰ様蛍光性タンパク質と同一の桁の大きさである。
【０００９】
フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）結合性緑色蛍光タンパク質は、ＬＯＶ（Ｌｉｇｈｔ−ｏｘｙｇｅｎ−ｖｏｌｔａｇｅ−ｓｅｎｓｉｎｇ）ドメインから人工操作された（Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｄｒｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。これらのタンパク質は、ナノモル濃度以下の親和性でＦＭＮと非共有結合する。これらは、嫌気的な条件の試験における良好なＧＦＰの代替物であることが示されている。
【００１０】
近年、ＵｎａＧと呼ばれる緑色蛍光性タンパク質がｕｎａｇｉ（ウナギ）から同定された（Ｋｕｍａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。この蛍光性は、ナノモル濃度以下の親和性でビリルビンの密接な非共有結合からもたらされる。この蛍光性タンパク質の形成は迅速であり、酸素を必要としない。
【００１１】
これらの開発と並行して、ハイブリッドの概念が、蛍光団活性化タンパク質（ＦＡＰ）として作用する人工操作した単一鎖抗体に基づき提案されており、このＦＡＰは、よく知られた合成蛍光団（ほとんどが分子ローターおよびシアニン）を非共有的に結合する（Ｏｚｈａｌｉｃｉ-  Ｕｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｓｈａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９；  Ｓｚｅｎｔ−Ｇｙｏｒｇｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。しかしながら弱い蛍光性のチアゾールオレンジおよびマラカイトグリーンからの蛍光を生じる単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）レポーターは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりｓｃＦｖライブラリーをスクリーニングすることにより、単離されている（Ｓｚｅｎｔ−Ｇｙｏｒｇｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。しかしながら、ＳｃＦｖベースのＦＡＰは、ジスルフィド結合を含み、よって、細胞表面および分泌器官などの非還元環境での使用にのみ適合する。
【００１２】
しかしながら、生細胞および多細胞生物における、蛍光性タグに融合した関心対象のタンパク質を含む融合タンパク質のイメージングのための調節可能なタンパク質ベースのレポート系であって、上記レポート系は、蛍光団に高い動的な結合を課すことにより、蛍光団を付加または除去することにより蛍光をオンおよびオフに迅速に切り替えることができ、マルチプレックスのイメージングに新規の機会を切り開く、レポート系が未だに当該分野で必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
よって本発明は、機能的光活性黄色タンパク質（ＰＹＰ）誘導体を含むポリペプチドまたはその機能的なフラグメントであって、
約２５℃の温度で測定した場合に約０．０５〜約１０μＭの範囲、好ましくは約０．１〜約２μＭの範囲、より好ましくは約０．１３〜約１．０２μＭの範囲のＫＤ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約１〜約５０ｓ−１、好ましくは約５〜約２０ｓ−１、より好ましくは約６．３〜約１７ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約０．１×１０７〜約５０×１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは約１×１０７〜約１０×１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約３×１０７〜約６．３×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴う蛍光発生発色団を可逆的に結合する、
ポリペプチドまたはそのフラグメントに関する。
【００１４】
一実施形態では、このポリペプチドは、式（Ｉ）の蛍光発生発色団
【化１】
0006707472.tif 000002
であって、式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が同一または異なるものであってもよく、それぞれが、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
Ｒ３が、非結合二重項（すなわち遊離電子対）または、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、またはハロアルキルから選択される少なくとも１つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
Ｒ４が、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、Ｈ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基から選択される少なくとも１つの基により任意に置換されている、Ｓ、Ｏ、またはＮ原子により中断または終結された単結合または二重結合であり、
Ｘが、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＲ７、またはＮ（Ｒ７）２であり、Ｒ７が、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択されている少なくとも１つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり、
ＹがＯ、ＮＨ、またはＳであり、
上記ポリペプチドが、これに複合体形成した後、上記蛍光発生発色団の輝度を高め、
上記ポリペプチドが、その助色団基のイオン化を介して蛍光発生発色団のスペクトルシフトを誘導し、
上記ポリペプチドが、明らかな光安定性を表すのに適している更新時間で上記蛍光発生発色団を結合する、
式（Ｉ）の蛍光発生発色団を、可逆的に結合する。
【００１５】
特定の実施形態では、蛍光発生発色団は、式（ＩＩ）
【化２】
0006707472.tif 000003
を有する。
【００１６】
特定の実施形態では、上記蛍光発生発色団と上記ポリペプチドの解離定数（ＫＤ）は、約０．１μＭ〜約１０μＭ、好ましくは約０．５μＭ〜約５μＭ、好ましくは１μＭ〜約２μＭの範囲にある。
【００１７】
一実施形態では、蛍光発生発色団は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、または（ＶＩＩＩ）：
【化３】
0006707472.tif 000004
0006707472.tif 000005
を有し、好ましくは上記蛍光発生発色団は、式（ＩＩ）（ＨＢＲ）または式（ＶＩＩＩ）（ＨＭＢＲ）を有する。
【００１８】
特定の実施形態では、上記ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１を含む群から選択される配列を有するＰＹＰの機能的な誘導体またはそれらの機能的なフラグメントを含む、または当該機能的な誘導体またはそれらの機能的なフラグメントであり、好ましくは、上記ポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の誘導体である。
【００１９】
特定の実施形態では、上記ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８を参照して、アミノ酸領域５２〜５３、６５〜６９、および／または９４〜１０１のうちの少なくとも１つにおいて、少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、機能的なＰＹＰ誘導体またはその機能的なフラグメントを含む。
【００２０】
特定の実施形態では、上記ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８を参照して、アミノ酸領域９４〜１０１における少なくとも１つのアミノ酸の置換、付加、または欠失を含む、機能的なＰＹＰ誘導体またはその機能的なフラグメントを含む。
【００２１】
特定の実施形態では、上記ポリペプチドは、機能的なＰＹＰ誘導体またはその機能的なフラグメントであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８を参照して、
９７位のプロリン、
９４位のトリプトファン、
９６位の、分枝脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくはイソロイシン、バリン、もしくはロイシン、および／または
９８位のスレオニン
のうちの少なくとも１つを含む機能的なＰＹＰ誘導体またはその機能的なフラグメントを含む。
【００２２】
特定の実施形態では、上記ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８を参照して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８のアミノ酸領域９４〜１０１、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８を参照して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３のアミノ酸領域９４〜１０１を含む、機能的なＰＹＰ誘導体を含む。
【００２３】
特定の実施形態では、上記ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７を含む群から選択されるアミノ酸配列、またはそれらの機能的なフラグメント、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３またはその機能的なフラグメントを含む、またはからなる。
【００２４】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドを含む蛍光性レポーターに関する。
【００２５】
さらに本発明は、関心対象のタンパク質に融合した上述のポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。
【００２６】
さらに本発明は、関心対象のいずれかの固体または液体の試料、細胞、または組織、または生物における、タンパク質の活性、タンパク質の局在化、タンパク質−タンパク質の相互作用、および／またはタンパク質の再配置を定量化かつ／または検出するための、本発明のポリペプチドまたは本発明の融合タンパク質の使用に関する。
【００２７】
さらに本発明は、式（Ｉ）
【化４】
0006707472.tif 000006
であって、式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｘ、およびＹが上述に定義されており、粒子、好ましくはタンパク質または表面を可逆的に着色するための、
式（Ｉ）を有する蛍光発生発色団の使用に関する。
【００２８】
特定の実施形態では、本発明の使用のための蛍光発生発色団は、式（ＩＩ）
【化５】
0006707472.tif 000007
を有する。
【００２９】
さらに本発明は、本発明に係るポリペプチドおよび蛍光発生発色団により形成される複合体に関する。
【００３０】
さらに本発明は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００３１】
さらに本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３２】
さらに本発明は、表面または粒子、好ましくは関心対象のタンパク質を蛍光的に標識または着色する方法であって、（ｉ）上記表面または粒子に本発明のポリペプチドを結合させるステップと、（ｉｉ）蛍光発生発色団、好ましくは本発明の蛍光発生発色団を提供するステップとを含む、方法に関する。
【００３３】
本発明の別の目的は、タンパク質（好ましくは細胞中のタンパク質）を順次標識する方法であって、
約２５℃の温度で測定した場合に約０．０５〜約１０μＭの範囲、好ましくは約０．１〜約２μＭの範囲、より好ましくは約０．１３〜約１．０２μＭの範囲のＫＤ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約１〜約５０ｓ−１、好ましくは約５〜約２０ｓ−１、より好ましくは約６．３〜約１７ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約０．１×１０７〜約５０×１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは約１×１０７〜約１０×１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約３×１０７〜約６．３×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴う少なくとも２つの蛍光発生発色団に結合した少なくとも２つのポリペプチド（好ましくは２つの本発明のＰＹＰ誘導体、または２つの本発明の融合タンパク質）の使用を含み、
本発明の方法が、
第１の蛍光発生発色団と上記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
上記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
第２の蛍光発生発色団と上記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
上記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
各蛍光発生発色団を用いて前のステップを反復することと
を含む、方法である。
【００３４】
本発明の別の目的は、
約２５℃の温度で測定した場合に約０．０５〜約１０μＭの範囲、好ましくは約０．１〜約２μＭの範囲、より好ましくは約０．１３〜約１．０２μＭの範囲のＫＤ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約１〜約５０ｓ−１、好ましくは約５〜約２０ｓ−１、より好ましくは約６．３〜約１７ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約０．１×１０７〜約５０×１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは約１×１０７〜約１０×１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約３×１０７〜約６．３×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴う蛍光発生発色団に結合できるＰＹＰ誘導体を同定する方法であって、
上記方法が、
ＰＹＰ配列（ＰＹＰ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８〜８１、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８から選択される）を無作為に変異させる（たとえば飽和変異によるなど）ことと、
上記蛍光発生発色団と変異したＰＹＰの結合の速度定数を測定することと、
特定のＫＤ、ｋｏｎ、および／またはｋｏｆｆを有する変異したＰＹＰを選択することと
を含む、方法である。
【００３５】
さらに本発明は、式（ＩＩＩ）または（Ｖ）
【化６】
0006707472.tif 000008
を有する蛍光発生発色団に関する。
【００３６】
定義
本明細書中で使用されるように、タンパク質の「誘導体」という用語は、当該タンパク質のフラグメントまたは変異体を表し得る。
【００３７】
本明細書中で使用されるように、用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを意味する。好ましいハロ基はフルオロおよびクロロである。
【００３８】
本明細書中で使用されるように、用語「ヒドロキシル」は、−ＯＨ官能基を表す。
【００３９】
本明細書中で使用されるように、用語「アリール」は、概して５〜１２個の原子、好ましくは６〜１０個の原子を含み、少なくとも１つの環が芳香族である、単環（すなわちフェニル）、またはともに融合（たとえばナフチル）または共有結合した複数の芳香環を有するポリ不飽和芳香族ヒドロカルビル基を表す。芳香環は、任意に１〜２個の、芳香環に融合した追加的な環（シクロアルキル、ヘテロシクリルまたはヘテロアリール）を含んでもよい。アリールはまた、本明細書中に記載の炭素環系の部分的に水素付加した誘導体を含むように意図されている。アリールの非限定的な例として、フェニル、ビフェニリル、ビフェニレニル、５−または６−テトラリニル、ナフタレン−１−または−２−イル、４−、５−、６または７−インデニル、１−２−、３−、４−または５−アセナフチレニル、３−、４−または５−アセナフテニル、１−または２−ペンタレニル、４−または５−インダニル、５−、６−、７−または８−テトラヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、１，４−ジヒドロナフチル、１−、２−、３−、４−または５−ピレニルが挙げられる。
【００４０】
本明細書中使用されるように、用語「アルキル」は、式中ｎが１以上の数である式ＣｎＨ２ｎ＋１のヒドロカルビルラジカルを表す。一般的に、本発明のアルキル基は、１〜１２個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を含む。アルキル基は、直鎖状または分枝鎖状であってもよく、本明細書中に記載されるように置換されていてもよい。適切なアルキル基として、メチル、エチル、プロピル（ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル）、ブチル（ｉ−ブチル、ｓ−ブチルおよびｔ−ブチル）、ペンチルおよびそのアイソマー（たとえばｎ−ペンチル、イソ−ペンチル）、ならびにヘキシルおよびそのアイソマー（たとえばｎ−ヘキシル、イソ−ヘキシル）が挙げられる。
【００４１】
本明細書中使用されるように、用語「シクロアルキル」は、環状のアルキル基、すなわち、１〜２個の環状構造を有する一価、飽和または不飽和のヒドロカルビル基を表す。シクロアルキルは、単環または二環のヒドロカルビル基を含む。シクロアルキル基は、その環に３個以上の炭素原子を含んでもよく、一般的に、本発明では、３〜１０個、より好ましくは３〜８個の炭素原子、さらにより好ましくは３〜６個の炭素原子を含む。シクロアルキル基の例として、限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。
【００４２】
本明細書中使用されるように、用語「ヘテロアルキル」は、炭素または水素ではなく、好ましくはＮ、Ｓ、Ｐ、またはＯから選択される少なくとも１つの原子を有するアルキル基を表す。
【００４３】
本明細書中使用されるように、用語「ヘテロシクロアルキル」は、炭素または水素ではなく、好ましくはＮ、Ｓ、Ｐ、またはＯから選択される少なくとも１つの原子を有するシクロアルキルを表す。
【００４４】
本明細書中使用されるように、用語「オキソ」は、−Ｃ＝Ｏ官能基を表す。
【００４５】
本明細書中使用されるように、用語「ニトロ」は、−ＮＯ２官能基を表す。
【００４６】
本明細書中使用されるように、用語「アミド」は、式中のＲが−Ｈまたはアルキル基であり得る−ＮＲ−ＣＯ−官能基を表す。
【００４７】
本明細書中使用されるように、用語「カルボキシ」は、−ＣＯＯＨ官能基を表す。
【００４８】
本明細書中使用されるように、用語「アミノ」は、脂肪族または芳香族の有機基と１つまたは２つの水素原子の置換による、−ＮＨ２基またはそれに由来するいずれかの基を表す。好ましくは−ＮＨ２に由来する基は、アルキルアミノ基、すなわちモノアルキルアミノおよびジアルキルアミノを含むＮ−アルキル基である。特定の実施形態では、用語「アミノ」は、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、またはＮＭｅ２を表す。
【００４９】
本明細書中使用されるように、用語「シアノ」は、−Ｃ≡Ｎ官能基を表す。
【００５０】
本明細書中使用されるように、用語「ハロアルコキシ」は、１つまたは複数のハロ基により置換されたいずれかのアルコキシ基を表す。
【００５１】
本明細書中使用されるように、用語「アルコキシ」は、いずれかのＯ−アルキル基を表す。
【００５２】
本明細書中使用されるように、用語「ハロアルキル」は、１つまたは複数のハロ基により置換されたいずれかのアルキル基を表す。好ましいハロアルキル基の例として、ＣＦ３、ＣＨＦ２、およびＣＨ２Ｆがある。
【００５３】
本明細書中使用されるように、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によりともに結合した５０個未満のアミノ酸である、アミノ酸の直鎖ポリマーを表す。さらに、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、他に明記されていない限り互換可能に使用してもよい。一実施形態では、「ポリペプチド」は、ペプチド結合によりともに結合した少なくとも５０個のアミノ酸の直鎖ポリマーを表し、タンパク質は、具体的には、１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチド、および任意に非ポリペプチド補助因子から形成された機能的な実体を表す。
【００５４】
本明細書中使用されるように、ある数字の前にある用語「約」は、当該数値の±１０％を意味する。
【００５５】
本発明の文脈の中では、「蛍光発生発色団」は、環境上の変化により有意に輝度を高めることができる発色団を意味する。本発明の蛍光発生発色団は、遊離形態下では溶液中で実質的に非蛍光性であるが、その立体構造を制限し、その励起状態の非蛍光性脱励起を排除する環境に置くと明るくなる。本発明の特定の実施形態では、遊離色素（すなわち蛍光発生発色団）は、溶液中でほぼ不可視であり、タンパク質のキャビティに蛍光発生化合物を入れるタンパク質スキャフォールドの結合が行われると蛍光性となる。
【００５６】
「蛍光量子収率」は、蛍光発生発色団により吸収される光子の数に対する、発光した光子の数の比率を意味する。
【００５７】
「フルオロフォア」は、光の励起後に再度光を発することができる蛍光性化学化合物を意味する。
【００５８】
詳細な説明
よって本発明は、機能的光活性黄色タンパク質（ＰＹＰ）誘導体またはその機能的なフラグメントを含むポリペプチドであって、
約２５℃の温度で測定した場合に約０．０５〜約１０μＭの範囲、好ましくは約０．１〜約２μＭの範囲、より好ましくは約０．１３〜約１．０２μＭの範囲のＫＤ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約１〜約５０ｓ−１、好ましくは約５〜約２０ｓ−１、より好ましくは約６．３〜約１７ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約０．１×１０７〜約５０×１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは約１×１０７〜約１０×１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約３×１０７〜約６．３×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴う蛍光発生発色団を可逆的に結合する、ポリペプチドに関する。
【００５９】
ＫＤ、ｋｏｎ、およびｋｏｆｆ定数を測定する方法は、当該分野でよく知られており、たとえばＳｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ５１：６６０  （１９４９））によって記載された方法が挙げられる。一実施形態では、ＫＤ、ｋｏｎ、およびｋｏｆｆ定数は、たとえば実施例に記載されるものなどの一連のストップトフロー型の実験を使用して決定する。
【００６０】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、蛍光発生発色団を可逆的、すなわち非共有性相互作用を介して結合する。
【００６１】
好ましくは、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドが関心対象のタンパク質に融合し得ることにより関心対象のタンパク質の検出を可能にすることを意味するタグである。
【００６２】
さらに本発明は、本発明のポリペプチドに融合した関心対象のタンパク質を含む人工的に操作した融合タンパク質に関する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、関心対象のタンパク質のＮ末端に融合されている。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、関心対象のタンパク質のＣ末端に融合されている。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、リンカーを介して関心対象のタンパク質に融合されている。使用し得るリンカーの例は、当業者によく知られており、限定するものではないが、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、またはいずれかのＸｎ配列が挙げられ、ここではＸはいずれかのアミノ酸であり、ｎは好ましくは１〜２５の範囲である。
【００６３】
一実施形態では、上記ポリペプチドは、蛍光発生発色団と複合体形成すると蛍光発生発色団の輝度を高める。本発明の範囲内では、「輝度を高める」は、本発明の蛍光発生発色団が本発明のポリペプチドまたは他のいずれかの適切なポリペプチドと複合体形成すると、高い蛍光性を示すことを意味する。特定の実施形態では、高い蛍光性は、蛍光発生発色団を、励起状態からの非蛍光性脱励起を防止する特定のタンパク質スキャフォールドに入れることからもたらされる。特定の実施形態では、輝度の上昇は、蛍光発生発色団のフェノラート形態の安定化からもたらされる。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明のタンパク質キャビティに入れられた蛍光発生発色団の蛍光量子収率は、１％〜１００％、好ましくは約１〜約５０％、より好ましくは約６〜約３３％の範囲である。
【００６５】
別の実施形態では、蛍光発生発色団の存在下での本発明のポリペプチドの輝度は、約２０００〜約２００００Ｍ−１ｃｍ−１、好ましくは約２５００〜約１５０００Ｍ−１ｃｍ−１の範囲である。
【００６６】
好ましくは、遊離蛍光発生発色団が溶液中ほぼ不可視であるとの事実は、洗浄の必要性を回避しており、よって本発明の蛍光発生発色団の存在下で本発明のポリペプチドでタグ化された物体（好ましくは関心対象のタンパク質）の即時的な標識を可能にする。
【００６７】
別の実施形態では、上記ポリペプチドは、その助色団基のイオン化を介して上記蛍光発生発色団のスペクトルシフトを誘導する。本発明の範囲内で、「スペクトルシフトを誘導すること」は、上記ポリペプチドが、蛍光発生発色団の特定のイオン化を維持するのに適した電荷分布または水素結合のネットワークを含むことを意味する。結果として、上記蛍光発生発色団の天然の色のパターンが、イオン化状態の変化により変化し、よって蛍光発生発色団の助色団基のイオン化が、深色性のシフト（「赤いシフト」とも呼ばれる）に対応する正のスペクトルシフトをもたらす。イオン化状態が変化すると、本発明に使用するための蛍光発生発色団の吸収および／または発光は、赤色の方にシフトする。本発明の特定の実施形態では、誘導された蛍光発生発色団のスペクトルシフトをもたらすイオン化状態の変化は、タンパク質スキャフォールドのキャビティ、より好ましくは本発明の人工操作されたＰＹＰ誘導体またはそのフラグメントのキャビティにおける、発色団の特異的な結合からもたらされる。
【００６８】
好ましくは、本発明の誘導されたスペクトルシフトは、細胞成分を妨げることによる蛍光団の非特異的な固定化からの、本発明の人工操作したタンパク質に結合した蛍光発生発色団由来のシグナル間を区別することを可能にする。人工操作したタンパク質スキャフォールドに結合した蛍光発生発色団は、ある波長範囲を吸収し、結合していないまたは非特異的に結合した蛍光団は、これを吸収しないため、蛍光発生発色団は、適切な励起波長を選択することにより特異的に励起され得る（図１参照）。よって本発明のタンパク質タグは、蛍光団を活性化し、シフトするタグ（ＦＡＳＴ）、特にＹ−ＦＡＳＴ（黄色の、蛍光団を活性化し、シフトするタグ：Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｉｆｔｉｎｇ  Ｔａｇ）と呼ばれる。
【００６９】
一実施形態では、本発明のポリペプチドにより誘導される蛍光発生発色団のスペクトルシフトは、少なくとも５０ｎｍのレッドシフト、好ましくは少なくとも６０ｎｍのレッドシフト、より好ましくは約７０ｎｍのレッドシフトである。
【００７０】
別の実施形態では、上記ポリペプチドは、明らかな光安定性を呈するのに適した更新時間を伴う蛍光発生発色団を結合する。本発明の範囲内で、「明らかな光安定性を呈するのに適した更新時間を伴う結合」は、本発明のポリペプチドが、良好な特異性を有するが、本発明のポリペプチドのキャビティ内に結合した蛍光発生発色団の連続した更新を可能にする親和性を有する蛍光発生発色団を結合することを意味する。本発明の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドと複合体形成した蛍光発生発色団の更新時間は、約１ｍｓ〜約１０ｓ、好ましくは約１０ｍｓ〜約１０００ｍｓ、より好ましくは約５０ｍｓ〜約２００ｍｓである。
【００７１】
よって、非共有結合した蛍光発生発色団が局所的な照射により光破壊される場合、溶液を構成する外部のリザーバーからの新鮮な発色団の交換により、明確な光安定性のある、本発明のポリペプチドのおよび蛍光発生発色団の組み合わせがもたらされることとなる。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明の蛍光発生発色団と本発明のポリペプチドの解離定数（ＫＤ）は、１０ｎＭ〜２５μＭの範囲であり、好ましくは約０．１μＭ〜約１０μＭ、好ましくは約０．１μＭ〜約５μＭ、好ましくは約０．１μＭ〜約１μＭの範囲である。一実施形態では、本発明の蛍光発生発色団と本発明のポリペプチドの解離定数（ＫＤ）は、約１μＭ〜約２μＭの範囲である。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドと複合体形成した蛍光発生発色団の更新時間は、溶液中の蛍光発生発色団の濃度が本発明のポリペプチドのＫＤと実質的に同一である場合に、１ｍｓ〜１０ｓである。結果として、本発明のポリペプチドおよび蛍光発生発色団は、好ましくは、表面および対象、より具体的にはタンパク質を、通常のフルオロフォアの光損傷からもたらされる光退色を回避する際に蛍光的に標識することができるため、当該分野で長い間必要と思われている解決策を提供する。
【００７４】
好ましくは、上記蛍光発生発色団は、式（Ｉ）
【化７】
0006707472.tif 000009
であって、式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、およびＲ６が同一または異なるものであってもよく、それぞれが、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
Ｒ３が、非結合二重項（すなわち遊離電子対）または、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基を表し、
Ｒ４が、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択される少なくとも１つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、Ｈ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基から選択される少なくとも１つの基により任意に置換されている、Ｓ、Ｏ、またはＮ原子により中断または終結された単結合または二重結合であり、
Ｘが、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＲ７、またはＮ（Ｒ７）２であり、Ｒ７が、ハロ、ヒドロキシル、オキソ、ニトロ、アミド、カルボキシ、アミノ、シアノ、ハロアルコキシ、ハロアルキルから選択されている少なくとも１つの基により任意に置換されている、飽和型または不飽和型、直鎖または分枝鎖の、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、アリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、またはヘテロシクロアルキル基であり、
ＹがＯ、ＮＨ、またはＳである、
式（Ｉ）を有する。
【００７５】
特定の実施形態では、溶液中の蛍光発生発色団の酸性および／または塩基性の形態の蛍光量子収率は、０．５％未満、好ましくは０．３％未満、好ましくは０．１％未満、より好ましくは０．０５％未満である。蛍光量子収率を測定する方法は当該分野でよく知られている。
【００７６】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドにより結合されている蛍光発生発色団は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、または（ＶＩＩＩ）：
【化８】
0006707472.tif 000010
0006707472.tif 000011
の蛍光団を含む群から選択されている。
【００７７】
さらに本発明は、式（ＩＩＩ）または（Ｖ）：
【化９】
0006707472.tif 000012
の蛍光団に関する。
【００７８】
一実施形態では、蛍光発生発色団は式（ＩＩ）を有し、４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニンまたは（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−４−オン（またはＨＢＲ）に対応している。
【化１０】
0006707472.tif 000013
【００７９】
特定の実施形態では、ＨＢＲは、以下の方法
【化１１】
0006707472.tif 000014
により調製されている。
【００８０】
別の実施形態では、蛍光発生発色団は、式（ＩＶ）を有し、（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−３−メチル−２−チオキソチアゾリジン−４−オン（またはＨＢＭＲ）に対応する。
【化１２】
0006707472.tif 000015
【００８１】
別の実施形態では、蛍光発生発色団は、式（ＶＩＩ）を有し、（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（またはＨＢＡＡＲ）に対応する。
【化１３】
0006707472.tif 000016
【００８２】
別の実施形態では、蛍光発生発色団は、式（ＶＩ）を有し、（Ｚ）−５−（２，４−ジヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−４−オン（またはＤＨＢＲ）に対応する。
【化１４】
0006707472.tif 000017
【００８３】
別の実施形態では、蛍光発生発色団は、式（Ｖ）を有し、（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジリデン）−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−４−オン（またはＨＭＯＢＲ）に対応する。
【化１５】
0006707472.tif 000018
【００８４】
別の実施形態では、蛍光発生発色団は、式（ＶＩＩＩ）を有し、（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシ−３−メチルベンジリデン）−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−４−オン（またはＨＭＢＲ）に対応する。
【化１６】
0006707472.tif 000019
【００８５】
一実施形態では、ＨＢＭＲ、ＨＢＡＡＲ、ＤＨＢＲ、ＨＭＯＢＲ、およびＨＭＢＲは、ＨＢＲを調製するために記載された上述の方法と等価の方法により、調製されている。
【００８６】
好ましくは、本発明の蛍光発生発色団は、ＨＢＲまたはＨＭＢＲである。
【００８７】
一実施形態では、蛍光発生発色団はＨＢＲであり、本発明のポリペプチドは、
約２５℃の温度で測定した場合に約０．１〜約１０μＭの範囲、好ましくは約０．５〜約２μＭの範囲、より好ましくは約０．５９〜約１．０２μＭの範囲のＫＤ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約１〜約５０ｓ−１、好ましくは約５〜約２０ｓ−１、より好ましくは約８〜約１７ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約０．１×１０７〜約５０×１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは約１×１０７〜約１０×１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約３×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴うＨＢＲを可逆的に結合する。
【００８８】
別の実施形態では、蛍光発生発色団はＨＭＢＲであり、本発明のポリペプチドは、
約２５℃の温度で測定した場合に約０．０５〜約１０μＭの範囲、好ましくは約０．１〜約１μＭの範囲、より好ましくは約０．１３μＭの範囲のＫＤ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約１〜約５０ｓ−１、好ましくは約５〜約１０ｓ−１、より好ましくは約６．３ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約０．１×１０７〜約５０×１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは約５×１０７〜約１０×１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約６．３×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴うＨＭＢＲを可逆的に結合する。
【００８９】
本発明の範囲内では、「光活性黄色タンパク質」または「ＰＹＰ」は、たとえば紫色の光合成細菌エクトチオロドスピラ・ハロフィラ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ）（ハロロドスピラ・ハロフィラ（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ））から単離された光受容体タンパク質を意味する。ＰＹＰは比較的小さなタンパク質（１４ｋＤａ）であり、よって他のタンパク質を標識するためのタンパク質タグとして好ましく使用することができる。野生型のＰＹＰでは、ｐ−クマル酸により形成される発色団は、チオエステル結合を介してその６９番目のシステイン残基にＰＹＰを結合する。
【００９０】
本発明の範囲内で、「機能的なＰＹＰ誘導体」は、本発明の蛍光発生発色団の上記に開示されたファミリーを受け入れるために調製されているＰＹＰ変異体を意味する。本発明のＰＹＰ誘導体は、特に、上述のＫＤ、ｋｏｎ、および／またはｋｏｆｆを有する上記に定義された蛍光発生発色団を特異的かつ可逆的に結合する能力を有する人工操作したタンパク質スキャフォールドから構成されている。
【００９１】
これらの変異体は、たとえば、上述のポリペプチドと同一の活性を有し、上述のポリペプチドのアミノ酸配列において１つまたは複数の欠失、置換、挿入、および／または付加したアミノ酸を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを含む。欠失、置換、挿入、および付加から選択される２またはそれ以上の種類の修飾は、同時に行われてもよい。
【００９２】
また本発明のＰＹＰ変異体は、ＰＹＰの「部分的なペプチドまたはポリペプチドを含む。ＰＹＰの部分的なペプチドまたはポリペプチドは、ＰＹＰのアミノ酸配列の一部が途切れていないアミノ酸配列を含む部分的なペプチドまたはポリペプチドにより例証でき、ここで部分的なペプチドまたはポリペプチドは、好ましくは上記ＰＹＰと同一の活性を有する。このような部分的なペプチドまたはポリペプチドは、ＰＹＰのアミノ酸配列における少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０個のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列により例証することができる。このペプチドまたはポリペプチドは、好ましくは、ＰＹＰの活性に関与する領域に対応するアミノ酸配列を含む。さらに、本発明で使用される部分的なペプチドまたはポリペプチドは、このペプチドの修飾により得られる部分的なペプチドまたはポリペプチドであってもよく、ここでは、１つまたは複数のアミノ酸残基（たとえば約１〜２０個、より好ましくは約１〜１０個、さらにより好ましくは約１〜５個）が、このアミノ酸配列から欠失、このアミノ酸配列において置換、このアミノ酸配列に挿入、かつ／またはこのアミノ酸配列に付加されている。また、本発明に使用される部分的なペプチドまたはポリペプチドは、抗体産生のための抗原としても使用することができる。
【００９３】
一実施形態では、ＰＹＰの変異体は、ＰＹＰのうち、少なくとも８個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも１０、２０、または少なくとも５０、または少なくとも１００、または少なくとも１２５個の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列である。
【００９４】
別の実施形態では、ＰＹＰの変異体は、ＰＹＰのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリペプチドである。
【００９５】
２つ以上のポリペプチドの配列間の関係に使用する場合の用語「同一性」または「同一の」は、２つ以上のアミノ酸残基の鎖間の一致数により決定される、ポリペプチド間の配列の関連性の度合いを表す。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）により提示されるギャップアライメント（任意）を有する２つ以上の配列のうちより小さな配列に合わせた配列間の同一性の一致のパーセントを測定する。関連するポリペプチドの同一性は、既知の方法により容易に計算することができる。このような方法として、限定するものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ．  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１；  ａｎｄ  Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．  ４８，  １０７３  （１９８８）に記載される方法が挙げられる。同一性を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最大の一致を提供するように設計されている。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定する好ましいコンピュータプログラム方法として、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．  ＼２，  ３８７  （１９８４）；  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５，  ４０３−４１０  （１９９０））を含むＧＣＣプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  ２０８９４；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ）から公開されている。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用してもよい。
【００９６】
本発明の範囲内では、「機能的なフラグメント」は、上記に定義したＫＤ、ｋｏｎ、および／またはｋｏｆｆを有する上記に開示した蛍光発生発色団を特異的かつ可逆的に結合する能力を保持した不完全なＰＹＰまたは不完全なＰＹＰ誘導体を意味する。一実施形態では、上記機能的なフラグメントは、上述の機構により、その輝度およびスペクトルシフトを上げることができる。
【００９７】
本発明の一実施形態では、フラグメントは、少なくとも８個のアミノ酸（好ましくは連続したアミノ酸）、好ましくは少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０個のアミノ酸（好ましくは連続したアミノ酸）のアミノ酸配列である。
【００９８】
本発明の一実施形態では、ＰＹＰのフラグメントまたはその変異体は、アミノ酸７０〜１２５、８０〜１２０、９０〜１１０、または９４〜１０１を含む（アミノ酸配列のナンバリングは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列を参照して作製されている）。
【００９９】
別の実施形態では、ＰＹＰのフラグメントまたはその変異体は、アミノ酸１〜１０１、１０〜１０１、２０〜１０１、３０〜１０１、４０〜１０１、５０〜１０１、６０〜１０１、７０〜１０１、８０〜１０１、９０〜１０１、９０〜１１０、９０〜１２０、または９０〜１２５を含む（アミノ酸配列のナンバリングは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列を参照して作製されている）。
【０１００】
本発明の特定の実施形態では、本発明に係るポリペプチドは、ハロロドスピラ・ハロフィラ（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ）、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｂｏｌｉｖｉｅｎｓｉｓ  ＬＣ１、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＦＡＪ−１、Ｒｈｅｉｎｈｅｉｍｅｒａ  ｓｐ．  Ａ１３Ｌ、Ｉｏｄｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ、Ｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｓｉｂｉｒｉｃａ  ＡＴＣＣ  ７００５８８、Ｒｈｏｄｏｔｈａｌａｓｓｉｕｍ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ  ｃｅｒｖｉｃａｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ４９９５７、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｗｏｌｂａｃｈｉｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｃｅｎｔｅｎｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｖａｎｔｈｉｅｌｉｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｔｅｒｐｓｔｒａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｉｆｌｅｘａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｐａｔｏｃ  ｓｔｒａｉｎ‘Ｐａｔｏｃ  １（Ｐａｒｉｓ）’、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｍｅｙｅｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｙａｎａｇａｗａｅ、Ｓａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｂｅｒ  ＤＳＭ  １３８５５、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ  ＰｓＪＮ、Ｐｈａｅｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ  ＳＭ−１、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＯＲ５−３、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｅｎｅｒａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ３０１、Ｌｅｐｔｏｔｈｒｉｘ  ｃｈｏｌｏｄｎｉｉ  ＳＰ−６、Ｃａｅｎｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓａｌｉｎａｒｕｍ、Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ  ＤＷ４／３−１、Ｍａｓｓｉｌｉａ  ｔｉｍｏｎａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌｉｓ  ＦＡＭ  ５、Ｓｐｉｒｏｓｏｍａ  ｌｉｎｇｕａｌｅ  ＤＳＭ  ７４、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｓｔｒｉｓ  ＢｉｓＢ５、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ  ‘Ｓｏ  ｃｅ  ５６’、またはＲｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｖａｎｎｉｅｌｉｉ  ＡＴＣＣ  １７１００からなる群から選択される種由来のＰＹＰの機能的な誘導体を含む。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１からなる群から選択される配列を有するＰＹＰの機能的な誘導体または機能的なフラグメントを含む。
【０１０２】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ハロロドスピラ・ハロフィラ（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ ｈａｌｏｐｈｉｌａ）のＰＹＰのＣ６９Ｇ配列に対応するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列を有するＰＹＰ由来の機能的な誘導体を含む。
【０１０３】
本発明の特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８〜８１からなる群から選択されるＰＹＰ由来の機能的な誘導体、またはその機能的なフラグメントを含み、ここで少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、好ましくはすべてのアミノ酸が、アミノ酸配列５２〜５３、６５〜６９および／または９４〜１０１のうちの少なくとも１つ、２つ、またはすべてにおいて、欠失、置換、または付加されている（アミノ酸配列のナンバリングは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列を参照して作製されている）。
【０１０４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸５２〜５３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９〜５５、６８、７０、７２および７９のアミノ酸５２〜５３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、５７、５９、および７７のアミノ酸５１〜５２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０のアミノ酸４５〜４６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、７３、７４、７６、７８および８１のアミノ酸４９〜５０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５のアミノ酸５３〜５４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および６１のアミノ酸４１〜４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２〜６５および６９のアミノ酸４７〜４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７のアミノ酸３８〜３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１のアミノ酸３９〜４０、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０のアミノ酸３５〜３６に、対応する。
【０１０５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸６５〜６９は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、５０〜５５、６８、７０、７２および７９のアミノ酸６５〜６９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、５７、５９、および  ７７のアミノ酸６４〜６８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０のアミノ酸５８〜６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６、７３、７４、７６、７８および８１のアミノ酸６２〜６６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５のアミノ酸６６〜７０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および６１のアミノ酸５４〜５８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２〜６５および６９のアミノ酸６０〜６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７のアミノ酸５１〜５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１のアミノ酸５２〜５６、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０のアミノ酸４８〜５２に、対応する。
【０１０６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸９４〜１０１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、５０〜５５、７０、７７および７９のアミノ酸９４〜１０１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８のアミノ酸９４〜９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、５７、および５９のアミノ酸９３〜１００、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３および７６のアミノ酸９２〜９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２〜６５および６９のアミノ酸８９〜９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７５のアミノ酸９５〜１０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４のアミノ酸９０〜９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および８１のアミノ酸９１〜９８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および６１のアミノ酸８３〜９０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および７８のアミノ酸８７〜９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７および８０のアミノ酸７７〜８４、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１のアミノ酸７８〜８５に、対応する。
【０１０７】
さらなる特定の実施形態では、ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８〜８１からなる群で選択されるＰＹＰ由来の機能的な誘導体、またはそのフラグメントであって、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも６つ、好ましくは少なくとも７つ、好ましくはすべてのアミノ酸が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列を参照して、アミノ酸配列９４〜１０１で欠失、置換、または付加されている、ＰＹＰ由来の機能的な誘導体またはそのフラグメントを含む。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８〜８１からなる群で選択されるＰＹＰ由来の機能的な誘導体、またはその機能的なフラグメントであって、
９７位のプロリンによるアミノ酸置換、
９４位のトリプトファンによるアミノ酸置換、
９６位の、分枝脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくはイソロイシン、バリン、もしくはロイシンによるアミノ酸置換、および／または
９８位のスレオニンによるアミノ酸置換
からなる群から選択される修飾のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくはすべてを含み、
アミノ酸配列のナンバリングが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列を参照して作製されている、
ＰＹＰ由来の機能的な誘導体、またはその機能的なフラグメントを含む。
【０１０９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸９４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、５０〜５５、６８、７０、７７および７９のアミノ酸９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、５７、および５９のアミノ酸９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３および７６のアミノ酸９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２〜６５および６９のアミノ酸８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７５のアミノ酸９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４のアミノ酸９０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および８１のアミノ酸９１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および６１のアミノ酸８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および７８のアミノ酸８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７および８０のアミノ酸７７、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１のアミノ酸７８に、対応する。
【０１１０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸９６は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、５０〜５５、６８、７０、７７および７９のアミノ酸９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、５７、および５９のアミノ酸９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３および７６のアミノ酸９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２〜６５および６９のアミノ酸９１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７５のアミノ酸９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４のアミノ酸９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および８１のアミノ酸９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および６１のアミノ酸８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および７８のアミノ酸８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７および８０のアミノ酸７９、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１のアミノ酸８０に、対応する。
【０１１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸９７は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、５０〜５５、６８、７０、７７および７９のアミノ酸９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、５７、および５９のアミノ酸９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３および７６のアミノ酸９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２〜６５および６９のアミノ酸９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７５のアミノ酸９８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４のアミノ酸９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および８１のアミノ酸９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および６１のアミノ酸８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および７８のアミノ酸９０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７および８０のアミノ酸８０、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１のアミノ酸９１に、対応する。
【０１１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のアミノ酸９８は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９、５０〜５５、６８、７０、７７および７９のアミノ酸９８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６、５７、および５９のアミノ酸９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３および７６のアミノ酸９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２〜６５および６９のアミノ酸９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２および７５のアミノ酸９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４のアミノ酸９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６および８１のアミノ酸９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８および６１のアミノ酸のアミノ酸８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０および７８のアミノ酸９１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７および８０のアミノ酸８１、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１のアミノ酸８２に、対応する。
【０１１３】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列を参照した、アミノ酸配列９４〜１０１を有し、以下の配列：ＷＸ１ＩＰＴＸ２Ｘ３Ｘ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）であって、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４が、それぞれ独立していずれかのアミノ酸である、配列を有する、ＰＹＰの機能的な誘導体を含む。
【０１１４】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２８からなる群で選択された、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８の配列を参照した、アミノ酸配列９４〜１０１を有するＰＹＰの機能的な誘導体またはフラグメントを含む。
【０１１５】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７からなる群で選択される配列、またはその機能的なフラグメントを含む、またはからなる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む、またはからなる。
【０１１６】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、上述の配列、特にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７から選択される配列であって、環状（または環式）の順序の並べ替えが行われており、すなわちアミノ酸の順序が、本発明のポリペプチドの３次元構造に影響を与えることなく、アミノ酸配列において変化している、配列を含む。
【０１１７】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、以下の領域：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７から選択される配列のＣ末端−任意のリンカー−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７から選択される配列のＮ末端を含む。
【０１１８】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端までの）：第１のメチオニン−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１１５〜１２５（またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４７のいずれかの等価領域）−任意のリンカー−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸２〜１１４（またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２〜４７のいずれかの等価領域）を含む。
【０１１９】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは単量体であり、すなわち本発明のポリペプチドは、固有のアミノ酸配列としてコードされている。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは多量体、特にはヘテロ多量体（たとえば２つの単量体を含むものなど）であり、ここでは単量体のそれぞれが、独立して発現され、単量体は、本発明のポリペプチドを形成するように相互作用する。言い換えると、一実施形態では、本発明のポリペプチドの３次元構造は、単一のアミノ酸鎖のフォールディングからもたらされ、対して別の実施形態では、本発明のポリペプチドの３次元構造は、少なくとも２つのアミノ酸鎖の独立したフォールディングおよびその相互作用からもたらされる。
【０１２０】
さらに本発明は、上記に定義される本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明の別の目的は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【０１２１】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、さらに関心対象のタンパク質に融合されることにより、本発明の人工操作したタンパク質を構築する。本発明のＰＹＰ誘導体に融合する関心対象のタンパク質は、タンパク質または酵素の活性、分析物の濃度、タンパク質−タンパク質の相互作用、および膜電位のうちのいずれか１つのモニタリングを可能にする関心対象のいずれかのポリペプチドを含む。
【０１２２】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、読み取りとして蛍光を使用した、関心対象のいずれかの固体または液体の試料、およびいずれかの細胞または組織または生物におけるタンパク質の活性、タンパク質の局在性、タンパク質−タンパク質の相互作用、および／またはタンパク質の再配置を定量化および／または検出するために、特に使用されてもよい。
【０１２３】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、（ｉ）タンパク質の局在性、タンパク質の運動性、およびタンパク質の代謝回転を試験するためのタンパク質の標識、（ｉｉ）オルガネラの構造、オルガネラの融合、オルガネラの分裂、またはオルガネラの代謝回転を試験するためのオルガネラの標識、（ｉｉｉ）細胞の形態を試験し、細胞の移動を追跡するための細胞の標識、（ｉｖ）身体全体のイメージングおよびトランスジェニクスの検出のための生物の標識に基づく構造上の試験に、使用することができる。
【０１２４】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、（ｉ）標的プロモーターの活性化、阻害、またはコアクチベーションを試験するためのアッセイ、（ｉｉ）プロモーターの活性化、タンパク質の代謝回転、または光学的なバイオセンサーに基づく薬剤設計のアッセイを含む、機能的なアッセイの設計に、使用することができる。
【０１２５】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、分子生物学、細胞生物学、発生生物学、神経生物学、免疫学、および生理学を含む生物学的な研究に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで使用してもよい。関心対象のタグ化したタンパク質の検出は、落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、超解像顕微鏡、分光蛍光分析、蛍光相関分光法、およびフローサイトメトリーを含む、当該分野で知られている蛍光性定量化を可能にするいずれかの方法により行われてもよい。
【０１２６】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、本発明の人工操作したキメラポリペプチドをコードする本発明に係るポリヌクレオチドを挿入（トランスフォーメーション、トランスフェクションなどを介して）することにより、目的の細胞または宿主生物内の関心対象のいずれかのタンパク質と融合して発現することができる。
【０１２７】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、粒子、油滴、ポリマーのスキャフォールド、ビーズ、チップ、プレート、スライド、シート、フィルム、繊維、医療機器、外科器具、インプラント、生物学的な組織、または他の構造を含む表面に、固定することができる。このような機能付加した表面を使用して、ナノテクノロジー（たとえばナノ粒子の検出）、生物医科学（たとえば外科的なインプラント）に応用するための、追跡可能な物体を設計することができる。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、粒子、油滴、ポリマーのスキャフォールド、ビーズ、チップ、プレート、スライド、シート、フィルム、紙、髪、皮膚、織物繊維、医療機器、外科器具、インプラント、生物学的な組織、または他の構造を含む様々な種類の表面の可逆的な着色および蛍光の発光に、使用してもよい。特定の実施形態では、入れ墨を元に戻せるという観点で、確実ではあるが一時的に表面を標識または装飾するために、このような機能付加した表面を使用することができる。
【０１２９】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、粒子、油滴、ポリマーのスキャフォールド、ビーズ、チップ、プレート、スライド、シート、フィルム、紙、織物繊維、医療機器、外科器具、インプラント、生物学的な組織、または他の構造を含む様々な種類の表面上の潜在印刷（ｌａｔｅｎｔ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）に使用してもよい。特定の実施形態では、偽造防止印刷の観点で、このような機能付化した表面は、適切なインクで明らかになる情報を潜在的に暗号化するために使用することができる。
【０１３０】
さらに本発明は、ＦＲＥＴの実験に使用するための本発明のポリペプチドの使用に関する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、たとえばＣＦＰなどのドナーと対をなすアクセプターの役割を果たす。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、たとえばｍＣｈｅｒｒｙなどのアクセプターと対をなすドナーの役割を果たす。
【０１３１】
さらに本発明は、粒子または表面を可逆的に着色するために上述の式（Ｉ）の蛍光発生発色団の使用に関する。
【０１３２】
特定の実施形態では、本発明は、粒子または表面を可逆的に着色するための、上述の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、または（ＶＩＩＩ）の蛍光発生発色団の使用に関する。
【０１３３】
特定の実施形態では、本発明は、粒子または表面を可逆的に着色するための式（ＩＩ）の蛍光発生発色団（ＨＢＲ）の使用に関する。
【０１３４】
特定の実施形態では、本発明は、粒子または表面を可逆的に着色するための式（ＶＩＩＩ）の蛍光発生発色団（ＨＭＢＲ）の使用に関する。
【０１３５】
本発明の特定の実施形態では、上記蛍光発生発色団は、関心対象のタンパク質を可逆的に着色するために使用されている。
【０１３６】
本発明の特定の実施形態では、記載される蛍光発生発色団の使用は、蛍光発生発色団を可逆的に結合でき、さらにその移動の制限を介して上記蛍光発生発色団の輝度を上げることができ、その助色団基のイオン化を介して上記蛍光発生発色団のスペクトルシフトを誘導することができる、ポリペプチドの使用をさらに含む。
【０１３７】
特定の実施形態では、記載される使用は、本発明のポリペプチドの存在をさらに含む。
【０１３８】
さらに本発明は、本発明に係る蛍光発生発色団と本発明に係るポリヌクレオチドにより形成される複合体に関する。
【０１３９】
最終的に本発明は、表面または粒子、好ましくはタンパク質を蛍光的に標識または着色する方法であって、表面または粒子に本発明のポリペプチドを結合するステップと、本発明の蛍光発生発色団を提供するステップとを含む、方法に関する。
【０１４０】
さらに本発明は、
約２５℃の温度で測定した場合に約０．０５〜約１０μＭの範囲、好ましくは約０．１〜約２μＭの範囲、より好ましくは約０．１３〜約１．０２μＭの範囲のＫＤ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約１〜約５０ｓ−１、好ましくは約５〜約２０ｓ−１、より好ましくは約６．３〜約１７ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約０．１×１０７〜約５０×１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは約１×１０７〜約１０×１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約３×１０７〜約６．３×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴う蛍光発生発色団を結合することができるＰＹＰ誘導体を同定する方法であって、
ＰＹＰ配列（上記ＰＹＰ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８〜８１、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８から選択される）を無作為に変異（たとえば飽和変異により変異）させることと、
蛍光発生発色団と変異したＰＹＰの結合の速度定数を測定することと、
上述のＫＤ、ｋｏｎ、および／またはｋｏｆｆを有する変異したＰＹＰを選択することと
を含む、方法に関する。
【０１４１】
さらに本発明は、タンパク質（好ましくは細胞中のタンパク質）を順次標識する方法であって、
約２５℃の温度で測定した場合に約０．０５〜約１０μＭの範囲、好ましくは約０．１〜約２μＭの範囲、より好ましくは約０．１３〜約１．０２μＭの範囲のＫＤ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約１〜約５０ｓ−１、好ましくは約５〜約２０ｓ−１、より好ましくは約６．３〜約１７ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約０．１×１０７〜約５０×１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは約１×１０７〜約１０×１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約３×１０７〜約６．３×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴う少なくとも２つの蛍光発生発色団に結合した少なくとも２つのポリペプチド（好ましくは上述の２つのＰＹＰ誘導体）の使用を含み、
本発明の方法が、
第１の蛍光発生発色団と上記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
上記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
第２の蛍光発生発色団と上記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
上記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
各蛍光発生発色団を用いて前のステップを反復することと
を含む、方法に関する。
【０１４２】
さらに本発明は、タンパク質（好ましくは細胞中のタンパク質）を順次標識する方法であって、
約２５℃の温度で測定した場合に約０．０５〜約１０μＭの範囲、好ましくは約０．１〜約２μＭの範囲、より好ましくは約０．１３〜約１．０２μＭの範囲のＫＤ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約１〜約５０ｓ−１、好ましくは約５〜約２０ｓ−１、より好ましくは約６．３〜約１７ｓ−１の範囲のｋｏｆｆ、および／または
約２５℃の温度で測定した場合に約０．１×１０７〜約５０×１０７Ｍ−１ｓ−１、好ましくは約１×１０７〜約１０×１０７Ｍ−１ｓ−１、より好ましくは約３×１０７〜約６．３×１０７Ｍ−１ｓ−１の範囲のｋｏｎ
を伴う少なくとも２つの蛍光発生発色団に結合した少なくとも１つのポリペプチド（好ましくは２つの、上述のＰＹＰ誘導体）、ならびに
少なくとも１つの光により切り替え可能なポリペプチド（たとえばＤｒｏｎｐａなど）
の使用を含み、
本発明の方法が、
光により切り替え可能なポリペプチドを視覚化することと、
蛍光を測定することと、
光により切り替え可能なポリペプチドをオフに切り替えることと、
蛍光発生発色団と上記試料を接触させることと、
蛍光を測定することと、
上記試料を洗浄して蛍光をオフにすることと、
各蛍光発生発色団および／または各光により切り替え可能なポリペプチドを用いて前のステップを反復することと
を含む、方法に関する。
【０１４３】
一実施形態では、試料は、人工操作したタンパク質を含み、上記人工操作したタンパク質は、標識する関心対象のタンパク質と上述の蛍光発生発色団に結合したポリペプチドとの間の融合タンパク質である。
【０１４４】
一実施形態では、洗浄ステップは、たとえば約１０秒、２０秒、３０秒、４０秒、５０秒、または６０秒などの持続期間の、１分以下の洗浄ステップである。
【０１４５】
よって本発明のタンパク質タグは、以下の利点を提示する：
蛍光発生リガンドの付加または除去により自在に、黄色の蛍光をオンおよびオフにすることができる；
吸収レッドシフトは、励起波長の選択を介して遊離した蛍光団および結合した蛍光団を区別することにより特異性を上げることができる；
微生物から、哺乳類の細胞およびゼブラフィッシュの胚に至る様々な宿主のタンパク質の効率的な標識を可能にする；
ほぼリアルタイムで迅速なプロセス（たとえばタンパク質の合成など）をモニタリングすることができる；
マルチプレックスの実験に使用し得る。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】光退色の標準的な問題を避ける際に関心対象のタンパク質を蛍光標識するための、ＦＡＳＴ（蛍光団を活性化し、シフトするタグ）およびその使用の一般的な機構を示す図である。開示される蛍光団は、本発明の蛍光発生発色団に対応し、開示されている、関心対象のタンパク質に融合した、蛍光団を活性化し、シフトするタンパク質タグは、本発明のポリペプチドに対応する。
【図２】ＨＢＲのプロトン化状態および非プロトン化状態の構造（上）、ｐＨ６．９および１０．１の溶液中のＨＢＲの吸収スペクトル（左下）、ｐＨに対して３９７ｎｍおよび４４９ｎｍの吸光度のプロット（右下）を表す図およびグラフの組み合わせである。
【図３】ｐＨ６．８および９．５の溶液中のＨＢＲの蛍光スペクトルを表すグラフ（励起波長４１７ｎｍ、等吸収点）である。
【図４】酵母ディスプレイライブラリー作製のための方針を表す図である。
【図５】蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）による酵母ディスプレイライブラリーをスクリーニングするために使用したプロトコルを表す図である。
【図６】２０μＭのＨＢＲを含む（＋）または含まない（−）いずれかのＰＹＰ−Ｃ６９Ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）を細胞表面で発現する（＋）または発現しない（−）酵母細胞のフローサイトメトリー解析を表すグラフである。このプロットは、ＨＢＲの結合および活性化による５３０ｎｍでの集団の蛍光を示す（励起４８８ｎｍ）。
【図７】２０μＭのＨＢＲを含む（＋）または含まない（−）いずれかの本発明のＨＢＲに結合するＰＹＰ誘導体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のクローン４）を細胞表面で発現する（＋）または発現しない（−）酵母細胞のフローサイトメトリー解析を表すグラフである。このプロットは、ＨＢＲの結合および活性化による５３０ｎｍでの集団の蛍光を示す（励起４８８ｎｍ）。
【図８】同定した４７個の蛍光性ＨＢＲ結合性ＰＹＰ変異体（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４７）のうち変異した残基９４〜１０１を表す図である。またこの図は、フローサイトメトリーにより対応するモノクローナル酵母の集団を解析する場合に観察される相対的な蛍光の増加をも示す。
【図９】５つの蛍光性ＨＢＲ結合性ＰＹＰ変異体（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２、３、４、５、および６のクローン２、３、４、５、および６）の解離定数を決定するために使用した滴定曲線を表すグラフを表す。データ＝３回の実験の平均値±ＳＤ。
【図１０】溶液（ｐＨ７．４のＰＢＳ）中のＨＢＲおよびＹ−ＦＡＳＴ（ＨＢＲ＋ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のクローン３）の吸収スペクトルおよび発光スペクトルを表すグラフを表す。［ＨＢＲ］＝２μＭ、［ａｐｏ−Ｙ−ＦＡＳＴ］＝４０μＭ。
【図１１】２０μＭのＨＢＲの存在下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のａｐｏ−Ｙ−ＦＡＳＴまたはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のＰＹＰ−Ｃ６９Ｇ（陰性対照）のいずれかを発現する酵母細胞の共焦点顕微鏡画像を表す写真を表す。Ａｐｏ−Ｙ−ＦＡＳＴおよびＰＹＰ−Ｃ６９Ｇは、Ａｌｅｘ６３３結合抗体で免疫標識するためのｍｙｃタグを有する。緑色のチャネル（Ｅｘ  ４８８ｎｍ&#8211;Ｅｍ  ５００〜６００ｎｍ）は、４８８ｎｍのレーザーを用いたＹ−ＦＡＳＴの励起からもたらされた特定の蛍光を示す。赤色のチャネル（Ｅｘ  ６３３ｎｍ&#8211;Ｅｍ  ６５０〜７５０ｎｍ）は、６３３ｎｍのレーザーを用いたＡｌｅｘａ６３３の励起からもたらされた蛍光を示す。
【図１２】Ｙ−ＦＡＳＴの存在下でのＨＢＲ類似体（ｂ）の蛍光スペクトル（ａ）を表す。ＨＢＲ類似体（２μＭ）を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中Ｙ−ＦＡＳＴ（４０μＭ）と共にインキュベートした。直接比較するために正確に同一の状況で、２５℃（Ｅｘ  ４７０ｎｍ）でスペクトルを記録した。
【図１３】ＨＭＢＲに関するＹ−ＦＡＳＴの親和性を示すグラフである。このグラフは、ＨＭＢＲの濃度に対する、平衡での結合分率の発展を示す。滴定実験を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中２５℃で行った。データは、４回の反復の平均値±ｓｅｍを表す。最少二乗適合（線）から、解離定数ＫＤを得た。
【図１４】Ｙ−ＦＡＳＴが、光活性黄色タンパク質から人口操作した、黄色の蛍光活性化および吸収シフトタグであることを示す一連のグラフおよび画像である（ａ〜ｃ）。ＨＭＢＲ±Ｙ−ＦＡＳＴ（ａ−ｂ）ならびにＨＢＲおよびＨＭＢＲを含むＹ−ＦＡＳＴの吸収スペクトル（ａ）および蛍光スペクトル（ｂ〜ｃ）。ＨＢＲ、ＨＭＢＲおよびＹ−ＦＡＳＴは、それぞれ、２５℃、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で、２μＭ、２μＭ、および４０μＭであった。（ｄ）２０μＭのＨＢＲまたは５μＭのＨＭＢＲ（Ｈ（Ｍ）ＢＲ：Ｅｘ／Ｅｍ  ４８８／４９３〜５７５ｎｍ；ｍＣｈｅｒｒｙ：Ｅｘ／Ｅｍ  ５４３／５７８〜７９７ｎｍ；スケールバー１０μｍ）で標識したｍＣｈｅｒｒｙ−Ｙ−ＦＡＳＴまたはｍＣｈｅｒｒｙ−ＰＹＰを発現するヒーラ生細胞の共焦点顕微鏡画像。蛍光強度を直接比較するための正確に同一の状況を使用して、画像を記録した。プロットは、ｎ＝１５〜３０個の細胞の蛍光定量化を示す。
【図１５】フローサイトメトリー（ａ、ｂ）および共焦点顕微鏡（ｃ〜ｆ）による、ＨＢＲおよびＨＭＢＲでの、酵母（ａ、ｃ、ｄ）および細菌（ｂ、ｅ、ｆ）におけるＹ−ＦＡＳＴの標識の特異性の解析を示す一連のグラフおよび画像である。
【図１６】２０μＭのＨＢＲ（ＨＢＲ：Ｅｘ／Ｅｍ  ４８８／４９３〜５７５ｎｍ；ｍＣｈｅｒｒｙ：Ｅｘ／Ｅｍ  ５４３／５７８〜７９７ｎｍ；スケールバー  １０μｍ）で標識したｍＣｈｅｒｒｙ−Ｙ−ＦＡＳＴまたはｍＣｈｅｒｒｙ−ＰＹＰを発現するＨＥＫ２９３生細胞の一連の共焦点顕微鏡画像である。蛍光強度を直接比較するための正確に同一の状況を使用して、画像を記録した。
【図１７】５、１０、および２０μＭのＨＢＲおよびＨＭＢＲの溶液で５時間インキュベートしたヒーラ細胞の生存率アッセイの結果を示す一連の画像である。細胞生存率を、カルセインＡＭおよびＥｔｈＤ１（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞毒性アッセイキット）を使用することにより試験した。カルセインＡＭは、生細胞に緑色の蛍光性ポリアニオン性カルセインを放出する細胞内エステラーゼにより切断された細胞浸透性の前蛍光団である。ＥｔｈＤ１（エチジウムホモダイマー１）は、損傷した膜を有する細胞のみに入り、核酸に結合すると蛍光が高まることにより、死細胞に明赤色の蛍光を生成する、非細胞浸透性核酸赤色蛍光性染色である。色素と共にインキュベートしていない（左上、生存対照）または１％の過酸化水素とともに１時間インキュベートした（右上、死亡対照）ヒーラ細胞を用いた対照実験が示されている。細胞の蛍光を、共焦点顕微鏡により評価した。この実験は、ＨＢＲおよびＨＭＢＲが、イメージングに使用した濃度ではヒーラ細胞に非毒性であることを示す。
【図１８】哺乳類の細胞のＹ−ＦＡＳＴの輝度および光抵抗性を示す一連のグラフおよび画像である。（ａ、ｂ）４８８ｎｍで励起した後のヒーラ細胞で発現したＥＧＦＰ、ＵｎａＧ、Ｙ−ＦＡＳＴ（５μＭのＨＭＢＲで標識）およびＶｅｎｕｓの蛍光輝度の比較。（ａ）代表的な細胞の共焦点顕微鏡画像（Ｅｘ／Ｅｍ  ４８８／４９３〜７９７ｎｍ；スケールバー１０μｍ）。スライドごとの画像を、蛍光強度を直接比較するために同一の状況を使用して、記録した。（ｂ）異なるタンパク質の蛍光輝度の定量化（ｎ＝１５〜３０個の細胞）。（ｃ）高出力の４８８ｎｍのレーザー励起（光パワー９０ｋＷ×ｃｍ−２、ｐｉｘｅｌ  ｄｗｅｌｌ  １．５８μｓ）を用いた長期間の観察におけるＥＧＦＰ、Ｙ−ＦＡＳＴ（５μＭのＨＭＢＲでの標識）を発現するヒーラ細胞の蛍光レベル。プロットは、共焦点顕微鏡の数の関数として蛍光強度的を示す。
【図１９】Ｙ−ＦＡＳＴが様々な細胞内位置における融合タンパク質の特異的な標識を可能にすることを示す、一連の画像である（ａ〜ｃ）。（ａ）核移行シグナル（ＮＬＳ）、（ｂ）膜標的化配列（Ｌｙｎ１１）、および（ｃ）微小管結合タンパク質Ｅｎｓｃｏｎｓｉｎに融合したＹ−ＦＡＳＴ（５μＭのＨＭＢＲで標識）を発現するヒーラ生細胞の共焦点顕微鏡画像。Ｄｒｏｎｐａベースの構築物を発現する細胞の画像が、比較として示されている（Ｅｘ／Ｅｍ  ４８８／４９３〜７９７ｎｍ）。（ｄ）抑制性シナプスで集積するｍＣｅｒｕｌｅａｎ−ゲフィリン（Ｅｘ／Ｅｍ  ４２７／４７２±１５ｎｍ；左のパネル）およびＹ−ＦＡＳＴタグ化ゲフィリン構築物（Ｅｘ／Ｅｍ  ５０４／５４２±１４ｎｍ；中心）で同時にトランスフェクトした脊髄ニューロンの樹状部分の落射蛍光顕微鏡画像。１０μＭのＨＭＢＲと共に１０秒間インキュベートした後、Ｙ−ＦＡＳＴの蛍光を、黄色の発光範囲で検出した（Ｅｘ／Ｅｍ  ５０４／５４２±１４ｎｍ；右のパネル）。スケールバーは１０μｍである。
【図２０】Ｙ−ＦＡＳＴがほぼリアルタイムでタンパク質の合成の追跡を可能にすることを示す図およびグラフの組み合わせである。（ａ）Ｙ−ＦＡＳＴに融合したｍＣｈｅｒｒｙは、２５℃の２０μＭのＨＢＲの存在下で無細胞ＰＵＲＥシステムにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現した。（ｂ）それぞれＹ−ＦＡＳＴおよびｍＣｈｅｒｒｙの発光に対応する５４０ｎｍ（Ｅｘ  ４７０ｎｍ）および６１０ｎｍ（Ｅｘ  ５８７ｎｍ）の蛍光発光の経時的な発展。（ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙに融合したＹ−ＦＡＳＴ（ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｙ−ＦＡＳＴ）をコードする遺伝子は、３７℃の５μＭのＨＭＢＲの存在下で、無細胞ＰＵＲＥシステムにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現した。このライン１は、Ｙ−ＦＡＳＴの発光の経時的な発展を示し、ライン２は、ｍＣｈｅｒｒｙの発光の経時的な発展を示す。経時的なＹ−ＦＡＳＴの発光の低下が、主にｍＣｈｅｒｒｙを成熟するためのエネルギーの移動を反映していることに留意されたい。またこのプロットは、ＥＧＦＰ（緑色の破線）、５μＭのビリルビンの存在下でのＵｎａＧ（シアン色の破線）、Ｖｅｎｕｓ（黄色の破線）、およびルシフェリンの存在下でのホタルルシフェラーゼ（黒色の破線）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの合成の間の経時的な発光の発展をも示す。すべての実験では、遺伝子は、同一のＴ７プロモーターの制御下にあった。データは、３つの反復物の平均値を表す。
【図２１】蛍光発生リガンドの付加および除去によりＹ−ＦＡＳＴの蛍光をオンおよびオフに切り替えることができることを示す一連のグラフおよび画像である。（ａ、ｂ）ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｙ−ＦＡＳＴを発現するヒーラ細胞を、マイクロ流体チャネルで増殖させ、ＨＭＢＲ含有培養培地を用いて２０秒間、およびＨＭＢＲフリー培養培地を用いて４０秒間繰り返しインキュベートした。多機能的な流体制御機は、数サイクルの標識／非標識を可能にした。ＨＭＢＲの濃度は５μＭであった。（ａ）２サイクルの標識／非標識を示す共焦点のタイムラプス（Ｅｘ／Ｅｍ  ４８８／４９３−５７５ｎｍ）。（ｂ）ＨＭＢＲの付加（＋）および除去（−）の後の細胞の蛍光の経時的な発展。（ｃ）Ｄｒｏｎｐａのオン／オフの光切り替えで挿入したＹ−ＦＡＳＴの経時的なオン／オフの標識のため、核のＤｒｏｎｐａおよび膜に固定されたＹ−ＦＡＳＴの経時的なイメージングを示す、Ｄｒｏｎｐａ−ＮＬＳ（核）およびｌｙｎ１１−Ｙ−ＦＡＳＴ（膜）を発現するヒーラ生細胞の共焦点顕微鏡画像（Ｅｘ／Ｅｍ  ４８８／４９３−７９７ｎｍ）。ＨＭＢＲの濃度は５０μＭであり、スケールバーは１０μｍであった。
【図２２】Ｙ−ＦＡＳＴが、発現レベルとは無関係に標識した蛍光性の密度の制御を可能にすることを示す一連のグラフおよび画像である。様々な濃度のＨＭＢＲと共にインキュベートしたＹ−ＦＡＳＴに融合したｍＣｈｅｒｒｙを発現するヒーラ生細胞の共焦点顕微鏡画像（ＨＭＢＲチャネル：Ｅｘ／Ｅｍ  ４８８／４９３〜５７５ｎｍ、ｍＣｈｅｒｒｙチャネル：Ｅｘ／Ｅｍ  ５４３／５７８〜７９７ｎｍ；スケールバー  １０μｍ）。プロットは、濃度に対して標識のパーセンテージを示す。データは平均値±ＳＤを表す（ｎ＝１５）。
【発明を実施するための形態】
【０１４７】
実施例
本発明を、さらに以下の実施例により例証する。
【０１４８】
材料および方法
蛍光団／タンパク質の複合体の熱動力学的な特性の測定
【０１４９】
モデル
蛍光団およびポリペプチドが蛍光性複合体を提供するように相互作用することを考慮して、本出願人は、相互作用の熱力学および動力学を解析するために、２状態モデルを採用した。蛍光団、ポリペプチド、および複合体は、それぞれＡ、Ｂ、およびＡＢを意味し、相互作用
【数１】
0006707472.tif 000020
は、正反応および逆反応にそれぞれ関連した速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆ、ならびに比率ｋｏｎ／ｋｏｆｆに相当する結合熱力学定数Ｋ（＝１／ＫＤ）を特徴とする。
【０１５０】
平衡状態の計算
ＡｔｏｔおよびＢｔｏｔは、ＡおよびＢの総濃度を意味し、平衡時の３種のＡ、Ｂ、およびＢの濃度Ａｆｉｎ、Ｂｆｉｎ、およびＡＢｆｉｎは、
【数２】
0006707472.tif 000021
であって、本発明の一連の実験でＡｔｏｔ≫Ｂｔｏｔである場合、式（２〜４）は、
【数３】
0006707472.tif 000022
となる。
【０１５１】
結合定数Ｋの測定
観察可能な実験は蛍光性の発光である。空のポリペプチドＢの輝度を無視すると、蛍光強度ＩＦは、それぞれＱＡおよびＱＡＢの輝度を有する蛍光団Ａおよびその複合体ＡＢの寄与からもたらされ、これにより、
【数４】
0006707472.tif 000023
となる。
熱力学定数Ｋを、一定のタンパク質濃度Ｂｔｏｔで、蛍光団の総濃度Ａｔｏｔへの蛍光強度ＩＦの依存性を解析することにより決定した。まず本出願人は、ＡＢｆｉｎ＝Ｂｔｏｔとなるように、（ｉ）遊離蛍光団の寄与（ＱＡＡｔｏｔ）からＩＦ（Ａｔｏｔ）を補正すること、および（ｉｉ）十分に大きなＡｔｏｔの濃度で上限値
【数５】
0006707472.tif 000024
により、得られた補正した蛍光強度ＩＦ，ｃｏｒｒ（Ａｔｏｔ）を除算することにより、ＡＢｆｉｎ／Ｂｔｏｔに相当する結合分率を推定した。その後、本出願人は、式（８）から派生した式（９）を用いて結合分率のＡｔｏｔへの依存性を適合して、Ｋを得た。
【数６】
0006707472.tif 000025
【０１５２】
結合定数Ｋの温度への依存性
ＨＢＲおよびＨＭＢＲの結合定数Ｋを、２５〜４５℃の範囲の異なる温度で決定して、反応（１）に関連したエンタルピーΔＨ０およびエントロピーΔＳ０を得た。本出願人は、二状態モデルがその後の解析に有効であったことを確認するために考慮した温度範囲でＹ−ＦＡＳＴが安定であったことを、円二色性により検証したことに留意されたい。
【０１５３】
本出願人は、式（１０）で得た１／Ｔにおける１ｎＫの線形の依存性から、反応（１）に関連したエンタルピーΔＨ０およびエントロピーΔＳ０を推定した。これは、考慮した温度範囲内の温度でΔＨ０およびΔＳ０が温度に依存しないことを仮定してもたらされた。
【数７】
0006707472.tif 000026
【０１５４】
濃度の時間的発展の計算
次に本出願人は、ストップトフロー実験を使用して、３種のＡ、Ｂ、およびＡＢの濃度Ａ、Ｂ、およびＡＢの時間的発展から、速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを推定した。
【０１５５】
迅速に混合した後のキュベット中のそれぞれの最初の濃度がＡｔｏｔおよびＢｔｏｔであるように、２つの供給シリンジがそれぞれＡおよびＢを含むことを考慮すると、キュベットにおけるＡ、Ｂ、およびＡＢの瞬間的な濃度Ａ、Ｂ、およびＡＢは、式（２〜４）で得られる平衡濃度Ａｆｉｎ、Ｂｆｉｎ、およびＡＢｆｉｎに向けて単調に発展する。
【０１５６】
濃度Ａ、Ｂ、およびＡＢの時間的発展を決める微分方程式は、
【数８】
0006707472.tif 000027
【０１５７】
以前に報告されている発展（Ｂｏｕｒｄｏｎｃｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２８，  １１０９４−１１１０５，  ２００６）に続き、本出願人は、
【数９】
0006707472.tif 000028
を得た。ここでは、
【数１０】
0006707472.tif 000029
である。
【０１５８】
速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆの測定
所定の温度での速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆの推定を、一連のストップトフロー実験における蛍光強度の時間的依存性を解析することにより行った。まず本出願人は、式（８、１２、１３）から式（１６）を得た。
【数１１】
0006707472.tif 000030
【０１５９】
予備的な適合およびシミュレーションの後に
【数１２】
0006707472.tif 000031
であることに留意して、本出願人は、適合式をさらに単純化し、式（１７）を最終的に採用して、緩和時間τを抽出することができた。
【数１３】
0006707472.tif 000032
【０１６０】
２５℃超では、緩和時間τは、この一連の実験を行うための初期の濃度ＡｔｏｔおよびＢｔｏｔの関連する条件下で、本出願人のストップトフロー器具の時間的な分解能を下回ることが見いだされた。よって本出願人は、より低い温度で緩和時間および速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを測定し、その後速度定数ｋｏｎ（Ｔ）およびｋｏｆｆ（Ｔ）の時間依存性を説明するためにアレニウスの式
【数１４】
0006707472.tif 000033
（式中、ＡｏｎおよびＡｏｆｆ、ならびにＥａ，ｏｎおよびＥａ，ｏｆｆは、それぞれ、頻度因子、ならびに正反応および逆反応（１）に関連した活性化エネルギーを意味する）を採用してより高い温度でのこれらの値を推定することを考慮した。
【０１６１】
本出願人は、緩和時間τから速度定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを推定するため、２つの異なる手法を使用した：
最初に、本出願人は、本出願人が様々な初期の濃度ＡｔｏｔおよびＢｔｏｔを使用した一連の実験において、１５℃でτを測定した。この一連の実験は、１５℃で独立してｋｏｎおよびｋｏｆｆを推定することを可能にした。本出願人は、ＨＢＲおよびＨＭＢＲで、それぞれ（２．５±０．４）×１０７Ｍ&#8211;１ｓ&#8211;１および４．１±０．７ｓ&#8211;１、および（２．０±０．５）×１０７Ｍ&#8211;１ｓ&#8211;１および２．１±０．５ｓ&#8211;１を見出した。
次に、本出願人は、本出願人が様々な初期の濃度ＡｔｏｔおよびＢｔｏｔを使用した一連の実験で、１０〜２５℃の範囲の様々な温度範囲でτを測定した。後者のばらつきは、上述のようにｋｏｎおよびｋｏｆｆを独立して推定するには狭すぎるため、本出願人は、考慮した温度範囲における緩和時間τから式Ｋ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ、ならびに結合定数Ｋの温度依存性によってｋｏｎおよびｋｏｆｆの値を推定した。特に、１５℃で推定したｋｏｎおよびｋｏｆｆの値は、先に決定した値とほぼ一致していた。
【０１６２】
化学的な合成
市販のロダニン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、３−メチルロダニン（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ロダニン−３−酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ）、４−ヒドロキシベンズアルデヒド（Ａｃｒｏｓ）、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（Ａｌｄｒｉｃｈ）、４−ヒドロキシ−２−メトキシベンズアルデヒド（Ｆｌｕｋａ）、４−ヒドロキシ−３−メチルベンズアルデヒド（Ａｃｒｏｓ）を、さらなる精製を行うことなく出発物質として使用した。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）：Ｍｅｒｃｋのシリカゲル６０  Ｆ−２５４でプレコーティングしたプレート：ＵＶ（２５４ｎｍ）による検出。ＮＭＲスペクトルを、１Ｈで３００ＭＨｚおよび１３Ｃで７５．５ＭＨｚのＡＣ  Ｂｒｕｋｅｒ分光計で記録した；化学シフトを、内部参照としてプロトン化溶媒を用いてｐｐｍで報告し（１Ｈ、ＣＤ３ＳＯＣＤ３中のＣＨＤ２ＳＯＣＤ３  ２．５２ｐｐｍ、ＣＤ３ＣＯＤ中のＣＨＤ２ＯＤ  ３．３４ｐｐｍ；１３Ｃ、ＣＤ３ＳＯＣＤ３中の１３ＣＤ３ＳＯＣＤ３  ４０．４ｐｐｍ）、結合定数ＪをＨｚで報告する。質量スペクトル（化学イオン化およびＮＨ３を用いた電子衝撃）を、ＰａｒｉｓＴｅｃｈ化学質量分析サービス（Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｄｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｅ  ｄｅ  Ｍａｓｓｅ  ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ  ＰａｒｉｓＴｅｃｈ）により行った。微量分析を、ジフシュルイヴェット微量分析（Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏａｎａｌｙｓｅｓ  ｄｅ  Ｇｉｆ  ｓｕｒ  Ｙｖｅｔｔｅ）により行った。
【０１６３】
（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−４−オン（ＨＢＲ）−水１１０ｍＬ中のロダニン（２０２ｍｇ；１．５２ｍｍｏｌ）および４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１９５ｍｇ；１．６０ｍｍｏｌ）を含む溶液を、１０日間６５〜８０℃で攪拌した。室温に冷却し、一晩静置した後、沈殿物を、ガラスフィルターを介してろ過した。Ｐ２Ｏ５で乾燥させた後、ＨＢＲを、暗黄色の粉末として得た（２３５ｍｇ；６５％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＣＤ３ＯＤ）  δ（ｐｐｍ）  ７．５７  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．４５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．７  Ｈｚ，  ２  Ｈ），  ６．９４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．７  Ｈｚ，  ２  Ｈ）。
【０１６４】
（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−３−メチル２−チオキソチアゾリジン−４−オン（ＨＢＭＲ）−ＨＢＲと同一。３−メチルロダニン（２００ｍｇ；１．３６ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１７４ｍｇ；１．４２ｍｍｏｌ）、水（１１０ｍＬ）：８日間６５℃で攪拌。黄色の粉末としてのＨＢＭＲ（２８６ｍｇ；８４  ％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ（ｐｐｍ）  ７．７６  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  ２  Ｈ），  ６．９５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  ２  Ｈ），  ３．４１  （ｓ，  ３  Ｈ）。
【０１６５】
（Ｚ）−２−（５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−４−オキソ−２−チオキソチアゾリジン−３−イル）酢酸（ＨＢＡＡＲ）&#8211;ＨＢＲと同一。ロダニン−３−酢酸（２０２ｍｇ；１．０６ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１３６ｍｇ；１．１１ｍｍｏｌ）、水（１１０ｍＬ）；８日間６５℃で攪拌。黄色の粉末としてのＨＢＡＡＲ（１２７ｍｇ；４１％）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ（ｐｐｍ）  １０．５７  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．８３  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．７  Ｈｚ，  ２  Ｈ），  ６．９７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．７  Ｈｚ，  ２  Ｈ），  ４．７５  （ｓ，  ２  Ｈ）。
【０１６６】
（Ｚ）−５−（２，４−ジヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソ１，３−チアゾリジン−４−オン（ＤＨＢＲ）３，５，６−ＨＢＲと同一。ロダニン（２００ｍｇ；１．５０ｍｍｏｌ）、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（２１６ｍｇ；１．５６ｍｍｏｌ）、水（１１０ｍＬ）；８日間６５℃で攪拌。褐色の粉末としてのＤＨＢＲ（１３８ｍｇ；３６％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ（ｐｐｍ）  １０．６６  （ｓ，  １  Ｈ），  １０．３４  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．８２  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．１７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １  Ｈ），  ６．４４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，  １  Ｈ），  ６．４３  （ｓ，  １  Ｈ）；  １３Ｃ−ＮＭＲ  （７５．５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ（ｐｐｍ）  １９６．２，  １７０．１，  １６２．９，  １６０．３，  １３１．６，  １２８．５，  １１９．２，  １１２．３，  １０９．３，  １０３．０；  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃ  （ＣＩ／ＮＨ３）  ［Ｍ＋Ｈ＋］：  ２５４．０；Ｃ１０Ｈ７ＮＯ３Ｓ２のＡｎａｌ  ｃａｌｃ．，  ０．２９  Ｈ２Ｏ  （ＭＷ：  ２５３＋５；水は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルに存在した）  Ｃ：  ４６．６９  ％  ，  Ｈ：  ２．９５％，  Ｎ：  ５．４２  ％  ，  Ｓ  ２４．８１  ％；  実測値  Ｃ：  ４６．７２  ％  ，  Ｈ：  ２．８０  ％  ，  Ｎ：  ５．４５  ％  ，  Ｓ  ２６．２５  ％。
【０１６７】
（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジリデン）−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−４−オン（ＨＭＯＢＲ）−ＨＢＲと同一。ロダニン（２００ｍｇ；１．５０ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ−２−メトキシベンズアルデヒド（２３７ｍｇ；１．５６ｍｍｏｌ）、水（１４０ｍＬ）；８日間６５℃で攪拌。暗黄色の粉末としてのＨＭＯＢＲ（２３９ｍｇ；６０％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ（ｐｐｍ）  １０．５７  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．７７  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．２６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １  Ｈ），  ６．５７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚおよび３．６Ｈｚ，  １  Ｈ），  ６．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．６  Ｈｚ，  １  Ｈ），  ３．８７  （ｓ，  ３  Ｈ）；  １３Ｃ−ＮＭＲ  （７５．５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ（ｐｐｍ）  １９６．３，  １７０．１，  １６３．２，  １６０．９，  １３２．２，  １２８．０，  １２０．８，  １１３．３，  １０９．５，  ９９．９，  ５６．２；  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃ  （ＣＩ／ＮＨ３）  ［Ｍ＋Ｈ＋］  ：  ２６８．０；Ｃ１１Ｈ９ＮＯ３Ｓ２のＡｎａｌ  ｃａｌｃ．（ＭＷ：  ２６７）  Ｃ：  ４９．４２  ％  ，  Ｈ：  ３．３９  ％  ，  Ｎ：  ５．２４  ％  ，  Ｓ  ２３．９９  ％；  実測値  Ｃ：  ４９．１５  ％  ，  Ｈ：  ３．４７  ％  ，  Ｎ：  ５．３０  ％  ，  Ｓ  ２４．２１  ％。
【０１６８】
（Ｚ）−５−（４−ヒドロキシ−３−メチルベンジリデン）−２−チオキソ−１，３−チアゾリジン−４−オン（ＨＭＢＲ）−ＨＢＲと同一。ロダニン（２００ｍｇ；１．５０ｍｍｏｌ）、４−ヒドロキシ−３−メチルベンズアルデヒド（２１３ｍｇ；１．５６ｍｍｏｌ）、水（１３０ｍＬ）、８日間６５℃で攪拌。黄色の粉末としてのＨＭＢＲ（１９８ｍｇ；５３％）。１Ｈ−ＮＭＲ  （３００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ（ｐｐｍ）  １０．３９  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．５４  （ｓ，  １  Ｈ），  ７．３５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ２．７  Ｈｚ，  １  Ｈ），  ７．３３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚおよび２．７Ｈｚ，  １  Ｈ），  ６．９６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  １  Ｈ），  ２．１９  （ｓ，  ３  Ｈ）；  １３Ｃ−ＮＭＲ  （７５．５  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ（ｐｐｍ）  １９６．１，  １７０．０，  １５９．２，  １３４．１，  １３３．２，  １３１．１，  １２６．０，  １２４．３，  １２１．２，  １１６．１，  １６．４；  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃ  （ＣＩ／ＮＨ３）  ［Ｍ＋Ｈ＋］  ：  ２５２．０；Ｃ１１Ｈ９ＮＯ２Ｓ２のＡｎａｌ  ｃａｌｃ．（ＭＷ：  ２５１）  Ｃ：  ５２．５７  ％，  Ｈ：  ３．６１  ％，  Ｎ：  ５．５７  ％，  Ｓ  ２５．５２  ％；  実測値  Ｃ：  ５２．６８  ％，  Ｈ：  ３．６４  ％，  Ｎ：  ５．５８  ％，  Ｓ  ２５．５８  ％。
【０１６９】
クローニング
コドンを酵母での発現に最適化したハロロドスピラ・ハロフィラ（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ）ＰＹＰ−Ｃ６９Ｇの遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９）、コドンを酵母での発現に最適化したＹ−ＦＡＳＴの遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）、およびコドンをヒトの細胞での発現に最適化したＹ−ＦＡＳＴの遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された。酵母の細胞表面での発現のためＡｇａ２ｐに融合したＰＹＰ−Ｃ６９Ｇの発現を可能にするプラスミドｐＡＧ１４を、ｐＣＴＣＯＮ２ベクターのＮｈｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉの制限部位の間にＰＹＰ−Ｃ６９Ｇの遺伝子（コドンを酵母での発現に最適化した配列）を挿入することにより、得た。クローン２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、クローン３（＝Ｙ−ＦＡＳＴ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、クローン４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、クローン５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、クローン６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、およびＮ末端Ｈｉｓタグを含むＰＹＰ−Ｃ６９Ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）のそれぞれの細菌での発現を可能にするプラスミドｐＡＧ８６、ｐＡＧ８７、ｐＡＧ８８、ｐＡＧ８９、ｐＡＧ９０、ｐＡＧ９１およびｐＡＧ９５を、ｐＥＴ２８ａベクターのＮｈｅ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉの制限部位の間にＥＮＬＹＦＱＧ&#8211;クローンＸをコードする遺伝子（酵母ディスプレイにより選択された配列）（Ｘ＝２〜６）（またはＰＹＰ−Ｃ６９Ｇ）を挿入することにより、得た（この配列ＥＮＬＹＦＱＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８）は、ＴＥＶプロテアーゼにより認識される配列に対応し、ＴＥＶ消化によるＨｉｓタグの除去を可能にする）。Ｙ−ＦＡＳＴまたはＰＹＰ−Ｃ６９Ｇに融合したｍＣｈｅｒｒｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９）の哺乳類での発現を可能にするプラスミドｐＡＧ９６およびｐＡＧ９７を、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＢｇｌ  ＩＩおよびＮｏｔ  Ｉの制限部位の間にｍＣｈｅｒｒｙ&#8211;ＧＧＧＳ&#8211;Ｙ−ＦＡＳＴをコードする配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５０）（またはＰＹＰ−Ｃ６９Ｇ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１）をクローニングすることにより、得た。ＥＧＦＰ、Ｙ−ＦＡＳＴ、Ｙ−ＦＡＳＴ−ＮＬＳ、Ｌｙｎ１１&#8211;Ｙ−ＦＡＳＴ、Ｅｎｓｃｏｎｓｉｎ&#8211;Ｙ−ＦＡＳＴ、Ｄｒｏｎｐａ−ＮＬＳ、Ｌｙｎ１１−Ｄｒｏｎｐａのそれぞれの哺乳類での発現を可能にするプラスミドｐＡＧ２９、ｐＡＧ１０４、ｐＡＧ１０５、ｐＡＧ１０６、ｐＡＧ５５およびｐＡＧ５９を、ｐＩＲＥＳベクターのＢｇｌ  ＩＩおよびＮｏｔ  Ｉの制限部位の間にＥＧＦＰ−ＧＧＧＳＧＧＧＳＰＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）、Ｙ−ＦＡＳＴ&#8211;ＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）、Ｙ−ＦＡＳＴ&#8211;ＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＧＡ  ＰＫＫＫＲＫＶＰＫＫＫＲＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３２）、ＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳＡＧＧＧＳ&#8211;Ｙ−ＦＡＳＴ−ＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３３）、Ｅｎｓｃｏｎｓｉｎ−ＳＡＧＧ  ＧＳ&#8211;Ｙ−ＦＡＳＴ&#8211;ＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）、Ｄｒｏｎｐａ&#8211;ＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＧＡＰＫＫＫＲＫＶＰＫＫ  ＫＲ��（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５）、およびＭＧＣＩＫＳＫＧＫＤＳＡＧＧＧＳ&#8211;Ｄｒｏｎｐａ−ＧＳＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）をコードする配列を挿入することにより、得た。ゼブラフィッシュの注入のためのｍＣｈｅｒｒｙ−Ｐ２Ａ−Ｙ−ＦＡＳＴおよびｍＣｈｅｒｒｙ&#8211;Ｐ２Ａ&#8211;ＰＹＰ−Ｃ６９ＧをコードするｍＲＮＡの合成を可能にするプラスミドｐＡＧ１１３およびｐＡＧ１１４を、ｐＣＳ２の改変版のＢａｍＨ  ＩおよびＳｎａＢ  Ｉの間にｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＳＲＧＧＧＳ−Ｙ−ＦＡＳＴをコードする配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７）（またはＰＹＰ−Ｃ６９Ｇ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３８）を挿入することにより、得た。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質合成のためのＴ７プロモーターの制御下でのｍＣｈｅｒｒｙ&#8211;Ｙ  ＦＡＳＴの発現を可能にするプラスミドｐＡＧ１０１を、ｐＥＴ２８ａベクターのＮｈｅ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉの制限部位の間のｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＳＳＳＥＮＬＹＦＱＧ−Ｙ−ＦＡＳＴをコードする配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２）を挿入することにより、得た。
【０１７０】
物理化学的な実験
ｐＨの測定を、Ｃｒｉｓｏｎ  ５２０８電極（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，  Ｓｐａｉｎ）を備える標準的なｐＨメーター  ＰＨＭ２１０（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）（ｐＨ４および７または１０の水性バッファーで較正）で行った。ＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルを、ダイオードアレイＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｒｒａｙ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上の１ｃｍ×１ｃｍの石英のキュベット（Ｈｅｌｌｍａ）中で記録した。１光子励起において較正した蛍光スペクトルを、ペルチェセルホルダー（ＴＬＣ５０，  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ，  Ｓｈｏｒｅｌｉｎｅ，  ＷＡ）を備えたＰｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ  ＱＭ−１分光蛍光光度計（ＰＴＩ，  Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，  ＮＪ）で記録した。１光子励起後の全発光量子収率φを、１つの光子励起φを、関係式
【数１５】
0006707472.tif 000034
であって、式中、下付きのｒｅｆは標準試料を意味する、関係式から計算された。Ａ（λｅｘｃ）は、励起波長λｅｘｃでの吸光度であり、Ｄは、積分した発光スペクトルであり、ｎは、溶媒の屈折率である。φの実験値の不確実性は、±２０％と推定された。量子収率の測定のための標準フルオロフォアは、φｒｅｆ＝０．９２である、０．１Ｍの水酸化ナトリウム中のフルオレセインであった。熱力学定数の決定に使用した滴定実験を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）プレートリーダー上で行った。オンおよびオフの速度定数を、ＲＸ２０００  ｒａｐｉｄ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｐｐｅｄ  ｆｌｏｗ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ，  Ｌｅａｔｈｅｒｈｅａｄ，  ＵＫ）を使用したストップトフロー実験により決定した。円二色性スペクトルを、Ｊ−８１５円二色性分光偏光計（Ｊａｓｃｏ）で記録した。フォトブリーチング実験を、ペルチェセルホルダー（ＴＬＣ５０，  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ，  Ｓｈｏｒｅｌｉｎｅ，  ＷＡ）を備えたＰｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ  ＱＭ−１分光蛍光光度計（ＰＴＩ，  Ｍｏｎｍｏｕｔｈ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，  ＮＪ）で行った。
【０１７１】
酵母ディスプレイ
ライブラリーの構築
酵母ディスプレイライブラリーを、ＮＮＫ縮重プライマーを使用した飽和変異によりＰＹＰ−Ｃ６９Ｇの遺伝子から構築した。５２、５３、６５、６６、６７、６８、６９位で無作為化したライブラリー１を、以下のように構築した。２つのＰＣＲフラグメントを、プライマー対ＡＧ４２／ＡＧ４３およびＡＧ４４／ＡＧ４６を使用して作製し、次に、ＡＧ４２／ＡＧ４６を使用したＰＣＲによりまとめた（プライマーは以下に列挙されている）。ＰＣＲ産物を、Ｎｈｅ  ＩおよびＢａｍＨ  Ｉで消化し、次にＮｈｅ  Ｉ／ＢａｍＨ  Ｉ制限部位を使用してｐＣＴＣＯＮ２に連結した。ＤＨ１０Ｂ  Ｅ．  ｃｏｌｉの細胞のエレクトロポレーションにより行った大規模な形質転換は、７×１０７個の形質転換体をもたらした。次にＤＮＡをミニプレップし、大規模な高効率の形質転換プロトコルを使用してＥＢＹ１００酵母株に再度形質転換し、８×１０７個の形質転換体を得た。９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１位で無作為化したライブラリー２を、以下のように構築した。ＰＣＲ産物を、プライマー対ＡＧ４２／ＡＧ４５を使用して作製した。ＰＣＲ産物を、Ｎｈｅ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉで消化し、次にＮｈｅ  Ｉ／Ｓｔｙ  Ｉ制限部位を使用してｐＡＧ１４において連結した。ＤＨ１０Ｂ  Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞におけるエレクトロポレーションにより行われた大規模な形質転換は、３×１０７個の形質転換体をもたらした。次にＤＮＡをミニプレップし、大規模な高効率の形質転換プロトコルを使用してＥＢＹ１００酵母株において再度形質転換して、８×１０６個の形質転換体を得た。５２、５３、６５、６６、６７、６８、６９、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１位で無作為化したライブラリー３を、以下のように構築した。２つのＰＣＲフラグメントを、プライマー対ＡＧ４２／ＡＧ４３およびＡＧ４４／ＡＧ４５を使用して作製し、次にＡＧ４２／ＡＧ４５を使用してＰＣＲによりまとめた。ＰＣＲ産物をＮｈｅ  ＩおよびＳｔｙ  Ｉで消化し、次にＮｈｅ  Ｉ／Ｓｔｙ  Ｉ制限部位を使用してｐＡＧ１４において連結した。ＤＨ１０Ｂ  Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞におけるエレクトロポレーションにより行われた大規模な形質転換は、１．５×１０７個の形質転換体をもたらした。次にＤＮＡをミニプレップし、大規模な高効率の形質転換プロトコルを使用してＥＢＹ１００酵母株において再度形質転換し、８×１０７個の形質転換体を得た。
【化１７】
0006707472.tif 000035
【０１７２】
選択
ライブラリー（概して１×１０１０個の細胞）を、ＳＤ（２０ｇ／Ｌのデキストロース、６．７ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、トリプトファンを含まない１．９２ｇ／Ｌの酵母合成ドロップアウト、７．４４ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４および１０．２ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン１０，０００Ｕ／ｍＬ）１ｌ中で一晩（３０℃、２８０ｒｐｍ）増殖させた。次に、１×１０１０細胞の酵母細胞を回収し、１ＬのＳＧ（２０ｇ／Ｌのガラクトース、２ｇ／Ｌのデキストロース、６．７ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、トリプトファンを含まない１．９２ｇ／Ｌの酵母合成ドロップアウト、７．４４ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４、１０．２ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１％のペニシリン−ストレプトマイシン  １０，０００Ｕ／ｍＬ）中で、３６時間（２３℃、２８０ｒｐｍ）で増殖させた。次に、６×１０８個の誘導した細胞を、遠心（２５℃、３分、２，５００ｇ）によりペレット状にし、１０ｍＬのＤＰＢＳ−ＢＳＡ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、４．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）で洗浄し、ＤＰＢＳ−ＢＳＡ中の１／２５０の一次抗体のニワトリ抗−ｃ−Ｍｙｃ  ＩｇＹ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液２００μＬ中で、室温で３０分間インキュベートした。次に細胞を１０ｍＬのＤＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄し、氷上で、ＤＰＢＳ−ＢＳＡ中１／１００の二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７−ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液２００μＬ中で３０分間インキュベートした。ＤＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄した後、２０μＭのＨＢＲを補充したＤＰＢＳ−ＢＳＡ１０ｍＬ中で細胞をインキュベートし、４８８ｎｍおよび６３３ｎｍのレーザーを備えたＭｏＦｌｏ（商標）ＸＤＰ高速セルソーターで選別した。選別した細胞をＳＤに回収し、一晩増殖させ（３０℃、２４０ｒｐｍ）、ＳＤプレート（１８２ｇ／Ｌのソルビトール、１５ｇ／Ｌの寒天を補充したＳＤ）に広げた。プレートを３０℃で６０時間インキュベートした。細胞の菌叢を、３０％のグリセロールを補充したＳＤに回収し、アリコートし、凍結または次のラウンドに直接使用した。
【０１７３】
タンパク質の発現および精製
発現ベクターをＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  Ｅ．  ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換した。細胞を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した溶原ブロス（ＬＢ）培地中で、０．６のＯＤ６００ｎｍとなるまで３７℃で増殖させた。１ｍＭの最終濃度となるまでイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、発現を４時間誘導した。細胞を、遠心（４℃で１５分間、６，０００ｇ）することにより回収し、凍結した。細胞のペレットを溶解バッファー（リン酸緩衝液５０ｍＭ，ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２．５ｍＭ、プロテアーゼ阻害剤、ＤＮａｓｅ、ｐＨ７．４）に再度懸濁し、超音波処理した（２０％の振幅、５分）。ライセートを４℃で２時間インキュベートし、ＤＮａｓｅによるＤＮＡの消化を可能にした。細胞フラグメントを、遠心（１５，０００ｇ、１時間、４℃）により除去した。１０ｍＭのイミダゾールを補充したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（リン酸ナトリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ  １５０ｍＭ、ｐＨ７．４）中のＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズとのゆっくりとした攪拌下で、上清を４℃で一晩インキュベートした。２０ｍＭのイミダゾールを補充した２０容量のＰＢＳ、および４０ｍＭのイミダゾールを補充した５容量のＰＢＳを用いて、ビーズを洗浄した。Ｈｉｓタグ化タンパク質を、０．５Ｍのイミダゾールを補充した５容量のＰＢＳで溶出した。大規模な透析により、ＰＢＳとバッファーを交換することを可能にした。Ｈｉｓタグを、Ｈｉｓ−タグ化ＴＥＶ（ＴＥＶプロテアーゼ；Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）とタンパク質試料の、１８℃、１８時間のインキュベーションにより、切断した。Ｎｉ−ＮＴＡビーズを使用したＴＥＶプロテアーゼの除去の後、タンパク質の試料を、その後の凍結乾燥のための２．５ｍＭのリン酸ナトリウムに対して最終的に大規模に透析した。凍結乾燥したタンパク質を４℃で保存した。
【０１７４】
分析用サイズ排除クロマトグラフィーを、ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ５／１５０  ＧＬカラムを備え、ブルーデキストラン、フェリチン、コンアルブミン、炭酸脱水素酵素、アルドラーゼ、オボアルブミン、およびリボヌクレアーゼで較正したＡｅｋｔａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、１６℃で行った。カラムの前平衡を、ｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸ナトリウム５０ｍＭ、ＮａＣｌ１５０ｍＭ）で行った。溶出の速度を、０．２ｍｌ／分に設定した。
【０１７５】
無細胞タンパク質合成
無細胞タンパク質合成を、製造社のプロトコルにしたがってＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質の合成キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して行った。発光を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５ｅプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して経時的に追跡した。
【０１７６】
哺乳類の細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞およびヒーラ細胞を、フェノールレッド、Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ、１０％のウシ胎仔血清、および１％のペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭにおいて、５％のＣＯ２雰囲気内、３７℃で培養した。顕微鏡のイメージングのために、細胞を、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたμＤｉｓｈ  ＩＢＩＤＩ（Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）に接種した。製造社のプロトコルにしたがいＧｅｎｅｊｕｉｃｅ（Ｍｅｒｃｋ）を使用して、細胞を一時的にトランスフェクトした。イメージングの前に、細胞をＰＢＳで洗浄し、意図した濃度（最終的なＤＭＳＯ含有量０．０３３％）のＨＢＲまたはＨＭＢＲを補充したフェノールレッドを含まないＤＭＥＭでインキュベートした。
【０１７７】
ニューロンの培養
分離した脊髄ニューロンの培養物を、先に記載されたようにスプラーグドーリーラット（胎生期１４日目）から調製した。ニューロンを、Ｂ２７、２ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ、５Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中、３６℃および５％のＣＯ２で維持し、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＹ−ＦＡＳＴ−ゲフィリンおよびｍＣｅｒｕｌｅａｎ−ゲフィリンプラスミドＤＮＡでｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＩＶ１５の日に同時にトランスフェクトし、ＤＩＶ１７に実験に使用した。ニューロンを、フェノールレッドを用いず、３３ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、およびＢ２７を含むＭＥＭ培地中で、３５℃でイメージングした。ＨＭＢＲを、イメージングバッファー中で１０μＭの最終濃度で、バス適用により添加した。
【０１７８】
ゼブラフィッシュの実験
ゼブラフィッシュを、Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄにしたがい維持し、ステージ分類した。実験を、標準的なＡｂ野生型株を使用して行った。胚を２８℃でインキュベートした。行われるすべての実験に関して、動物施設は、フランスの農水省から同意を得たものであった（同意番号Ｃ  ７５−０５−１２）。ｍＲＮＡの合成を、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ）を使用して行った。当量の１００ｎｇ／ｍｌのｍＲＮＡを、１細胞期胚に注入した。胚を、イメージングまでボルビックのミネラルウォーターで増殖させた。
【０１７９】
蛍光解析
フローサイトメトリー解析を、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。共焦点顕微鏡画像を、Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３ｘ／１．４  ＮＡ油浸対物レンズを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０  レーザー走査型顕微鏡で得た。Ｚｅｎソフトウェアを使用して、データを収集した。画像を、Ｉｍａｇｅ  Ｊで解析した。スピニングディスク共焦点顕微鏡画像を、４ｘ／０．１５  Ｎ．Ａ対物レンズおよびｃｏｏｌＳｎａｐ  ＨＱ２／ＣＤＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を備えたＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ顕微鏡で得た。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ  ｐｒｅｍｉｅｒ  ７．６ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、データを収集した。
【０１８０】
マイクロ流体制御オン／オフ標識
迅速な試作技術を、装置の製作に使用した。デジタル切断機（Ｇｒａｐｈｔｅｃ，  ＣＥ６０００）を使用して、厚さ５０μｍのプラスチックフィルムにより担持されている、厚さ０．５ｍｍのシリコーン層に０．５ｍｍの広いマイクロ流体チャネルを生成した。プラスチックフィルムを除去し、酸素プラズマ処置を行った後、シリコーン層を、平坦なシリコンウエハ上に１０：１ｗ／ｗの比率でＲＴＶ６１５（ＧＥ，  Ｆｒａｎｃｅ）のＡおよびＢの成分の混合物を成形し、これを８０℃で２時間硬化させることにより調製した厚さ５ｍｍのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の層に結合させた。次に、入口および出口の孔を、接続のため金属のチューブで穿孔した。その後、シリコーン−ＰＤＭＳ複合体を、酸素プラズマ処置の後に、厚さ１６０μｍのカバースライドに結合した。最終的に、装置全体を、８０℃のオーブンに１０分間入れた。細胞の接種の前に、装置を３０分間超のＵＶ曝露下で滅菌した。０．１ＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８）中５０μｇ／ｍｌの濃度のフィブロネクチンの溶液を、チャネルに注入し、３７℃で３０分間インキュベートした。チャネルをＰＢＳ溶液で３回洗浄し、次に細胞密度１００，０００個の細胞／ｍｌの細胞懸濁液２００μＬを装置に導入し、システム全体を３７℃で１時間インキュベートした。細胞染色―イメージングプロセスの動的制御を、多機能流体制御機（ＦＣ−ＰＶＬ−ＩＩ，ＭｅｓｏＢｉｏＳｙｓｔｅｍ）を使用して達成した。通常の培養培地、ＨＭＢＲ含有培養培地のどちらかのマイクロ流体チャネルへの注入を、制御機にダウンロードしたホームメイドのプロジェクト（ｈｏｍｅ−ｍａｄｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ）を用いて制御することにより、細胞染色−イメージングプロセスの全体を自動的に行うことができる。
【０１８１】
蛍光共鳴エネルギー移動実験
Ｙ−ＦＡＳＴを、ｍＣｈｅｒｒｙとのＦＲＥＴ対にドナーとして、そのスペクトルの特性を考慮して理論に基づいて使用することができる。これを例証するために、本出願人は、吸収および発光スペクトルの両方を記録するための条件を一定に保持した一連のキュベットの実験を行うことにより、融合タンパク質Ｙ−ＦＡＳＴ−ｍＣｈｅｒｒｙにおける電子励起の蛍光共鳴エネルギー移動の収率を決定した。
【０１８２】
本出願人は、２５０ｎＭのＨＭＢＲの不存在下および存在下で、１．５μＭのＹ−ＦＡＳＴ−ｍＣｈｅｒｒｙの吸収および発光（λｅｘｃ＝４７０ｎｍ）スペクトルを記録した。第２のステップで、本出願人は、２５０ｎＭのＨＭＢＲの存在下で、１．５μＭのＹ−ＦＡＳＴの吸収および発光スペクトル（λｅｘｃ＝４７０ｎｍ）を記録した。
【０１８３】
１、２、および３が、種Ｙ−ＦＡＳＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨＭＢＲ：Ｙ−ＦＡＳＴ−ｍＣｈｅｒｒｙ、およびＨＭＢＲ：Ｙ−ＦＡＳＴを意味し、εｉ（λｅｘｃ）およびＩｉ（λｅｘｃ，λｅｍ）が、λｅｘｃでのモル吸収係数を意味し、種のλｅｍでの蛍光発光の強度がｉを意味すると、電子励起の蛍光共鳴エネルギー移動の収率φＥＴは、記載される一連の実験の結果からの２つの異なる方法により、推定された。
最初に、本出願人は、ドナーＨＭＢＲ：Ｙ−ＦＡＳＴの蛍光発光の変分からφＥＴを推定した。よって、本出願人は、
【数１６】
0006707472.tif 000036
を書き出し、φＥＴ＝０．５±０．１と見出した。
あるいは、本出願人は、アクセプターｍＣｈｅｒｒｙの蛍光発光の変分からφＥＴを推定した。よって、本出願人は、
【数１７】
0006707472.tif 000037
を書き出し、φＥＴ＝０．２５±０．１５と見出した。この第２の導出は、多数の実験からの誤差を伝搬するため、明らかに信頼性が低い。
【０１８４】
いったんφＥＴが決定されると、次に本出願人は、蛍光共鳴エネルギー移動がＦｏｅｒｓｔｅｒ機構により支配されると考え、ＨＭＢＲおよびｍＣｈｒｒｙ発色団の間の平均距離Ｒの大きさの桁を推定した。よって本出願人は、
【数１８】
0006707472.tif 000038
であって、式中、Ｒ０（ｉｎ  ｎｍ）が、
【数１９】
0006707472.tif 000039
（式中、κ２は配向因子（次に、ドナーおよびアクセプターがすべての配向をとると考え、２／３に相当するとみなす）であり、Φ３は、ＨＭＢＲ：Ｙ−ＦＡＳＴの蛍光量子収率であり（Φ３＝０．３３）、ｎは、スペクトルの重複が有意である波長範囲における培地の平均屈折率であり（ｎ＝１．３３）、Ｉ３（λ）は、
【数２０】
0006707472.tif 000040
となるように正規化したＨＭＢＲ：Ｙ−ＦＡＳＴの蛍光スペクトルであり、ε１（λ）は、Ｙ−ＦＡＳＴ−ｍＣｈｅｒｒｙのモル吸収係数（Ｍ−１ｃｍ−１）であり、λは波長（ｎｍ）である）として定義されるＦｏｅｒｓｔｅｒ距離を意味する、式（４）を書き出した。本出願人は、Ｙ−ＦＡＳＴ（直径〜２ｎｍの球としてモデル化）、長さ〜３ｎｍのＧＳＳＳＥＮＬＹＦＱＧリンカー（残基あたり〜０．３ｎｍを考慮）、およびｍＣｈｅｒｒｙ（直径〜２ｎｍおよび高さ〜４ｎｍのシリンダーとしてモデル化）を含む本出願人の構築物において、２つの発色団の距離と良好に一致する、Ｒ＝５±１ｎｍを見出した。
【０１８５】
実施例１：新規蛍光発生発色団の設計−ＨＢＲの同定
タンパク質のキャビティなどの動かない環境で固定化した場合に高い蛍光の増大を示すことができ、助色団基のイオン化後に吸収のシフトを呈する蛍光発生発色団を設計した。
【０１８６】
ＧＦＰ、すなわちパラヒドロキシベンジリデン―５−イミダゾリノン（ｐ−ＨＢＩ）の発色団が、タンパク質がフォールディングされていない場合に非常に低い蛍光量子収率を呈するが、上記蛍光量子収率が、樽状のタンパク質の三次構造において１０４倍増大することは、当業者に知られている（Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｔｓｉｅｎ，  １９９８）。さらに、ｐ―ＨＢＩのプロトン化形態は、３９７ｎｍで吸収し、その脱プロトン化形態は、４７５ｎｍで吸収する。これらのｐ−ＨＢＩの光物理的特性は、その典型的なドナー−アクセプター結合構造からもたらされ、ここでフェノール／フェノラートは、電子供与性基として作用し、イミダゾリジノン環は電子求引性基として作用する。
【０１８７】
新規の蛍光発生発色団を、ＧＦＰ発色団のヒドロキシベンジリデン部位を保持した後に、幅広い範囲の電子吸引性を呈する他の頭部基によりチオエステル基を置換する際に、設計した。イオン化可能な電子供与性基として作用するフェノール環は、二重結合を介して様々な電子吸引性基と結合した。さらに新規の蛍光発生発色団を、立体障害が、ＰＹＰのキャビティと包括的に適合性があるままであるように設計した。選択した頭部基に応じて、得られた蛍光発生発色団を、異なる吸収波長を有すると予測し、フェノラート状態を、人工操作したタンパク質（好ましくはＰＹＰ）のタンパク質キャビティ内でのみ生ずることができるが、外部の媒体では生ずることができないように、フェノール基のｐＫ値を調節した。
【０１８８】
ｐ−ＨＢＩの誘導体を、他の電子吸引性部位と、電子吸引性イミダゾリジノンを置換することにより、調製した。新規の蛍光発生発色団を、１つまたはいくつかのベンゼン環（ｂｅｎｚｅｎｉｃ）の位置におそらくは置換されるｐ−ヒドロキシ−ベンズアルデヒド上での、活性化メチレン基を含む頭部基の縮合により、良好な収率で合成した。
【０１８９】
合成した化合物の安定性を、ｐＨが中性の水溶液中で評価した。不安定および／または不溶性の化合物は、さらには試験しなかった。よって、残りの化合物の光化学的な特性および酸−塩基性の特性を解析した。酸―塩基性の滴定を、ｐＨに対して吸収スペクトルおよび発光スペクトルを記録することにより、水溶液中で行った。すべての試験した化合物は、３３０〜４５０ｎｍの範囲のフェノラート状態でより高い吸収波長を有する、おおよそ中性のｐＫを呈した。
【０１９０】
次に、解析で、フェノールおよびフェノラート状態の光物理的特性を、運動の制限の効果をアッセイするために低い温度で非常に粘性の高いグリセロール溶液中で解析した、最も高い波長で吸収する候補化合物に、焦点を当てた。
【０１９１】
同定した化合物は、４−ヒドロキシベンジリデン−ロダニン（ＨＢＲ）とも呼ばれる５−（４−ヒドロキシベンジリデン）−２−チオキソチアゾリジン−４−オンに対応することが示された。ＨＢＲは、特に、ロダニンとも呼ばれる電子吸引性の２−チオキソチアゾリジン−４−オン部位に、二重結合を介して結合した電子供与性フェノールを特徴とする。ＨＢＲは、その酸性および塩基性形態の励起状態の寿命の間、蛍光団の運動を限定すると、有意に輝度が高まることを示した。
【０１９２】
ＨＢＲのプロトン化フェノール状態は、紫色の光（最大吸収波長３９７ｎｍ）を強力に吸収し、フェラート状態は、青色の光（最大吸収波長４４９ｎｍ）を強力に吸収することを確かに示した（図２）。イオン化の後の吸収のレッドシフトは、陰性に帯電したフェノラートのより強力な電子供与により、説明することができる。潜在的なＨＢＲの蛍光の増加を、ＨＢＲの蛍光発光に関する培地の粘度の影響をモニタリングする際にその動きを制限することにより、評価した。８．４±０．１のｐＫＡを有するＨＢＲは、主に、生理的なｐＨでプロトン化されており、改変タンパク質のキャビティ内で結合誘導性の脱プロトン化の後の特定のレッドシフトを経ると予測することができた。水溶液では、ＨＢＲの酸性および塩基性状態の両方で、蛍光性が弱く（図３）、それぞれ０．０２％および０．３％の蛍光量子収率で４７０ｎｍおよび５４５ｎｍを発光する。蛍光量子収率の６倍および３倍の増加を、それぞれ、グリセロール含有量が０％から４０％（ｖ／ｖ）に増加した際にＨＢＲの酸性状態および塩基性状態で観察し、動きの制限がＨＢＲの蛍光性を高め得ることを例証した。
【０１９３】
これらの結果から、生理的なｐＨで青色の光により励起される場合、遊離ＨＢＲは、ほぼ非蛍光性（プロトン化されており、よってこの波長領域の光をほとんど吸収しないため）であるが、その塩基性形態に相補的なタンパク質キャビティに結合したＨＢＲは、イオン化（レッドシフトした光の吸収をもたらす）および運動の制限（蛍光量子収率の増加）の両方により強力に蛍光性となると、結論付けることができる。
【０１９４】
さらなる実験により、ＨＢＲが、水中で４−ヒドロキシベンズアルデヒドと、ロダニンまたは２−チオキソチアゾリジン−４−オンの縮合により、１つのステップで合成できることが示された。
【０１９５】
実施例２：ＰＹＰ誘導体の設計
蛍光性ＨＢＲ結合性タンパク質を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のハロロドスピラ・ハロフィラ（Ｈａｌｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ）由来のＣ６９Ｇ光活性黄色タンパク質（ＰＹＰ）の活性部位をリモデリングすることにより、設計した。
【０１９６】
ＰＹＰは、１４ｋＤａの単量体ジスルフィドフリーの青色光受容体であり、この光検知の挙動は、Ｃｙｓ６９に共有結合したパラ−ヒドロキシシンナモイル（ＨＣ）発色団の光異性化に依存する。ＰＹＰの単量体状態および小さな大きさは、新規のタンパク質タグを設計するためには非常に魅力的である。
【０１９７】
その塩基性の青色吸収状態および蛍光性を高める際にＨＢＲを結合することができるキャビティを得るために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８のａｐｏ−ＰＹＰ−Ｃ６９Ｇの発色団ポケットをリモデリングするため、酵母ディスプレイに基づき、ＰＹＰの指向性進化の方針を計画した。出発スキャフォールドとしてのａｐｏ−ＰＹＰの選択は、ＨＢＲの構造およびＰＹＰの天然のＨＣ発色団の類似性によりなされる。さらに、ａｐｏ−ＰＹＰの結合ポケットが、その脱プロトン化形態のＨＣ発色団を収容する際、本出願人は、脱プロトン化青色吸収形態の結合したＨＢＲを安定化するこの好ましいキャビティから利益を得ることを望むものであった。
【０１９８】
入手可能なＰＹＰ結晶構造（Ｂｏｒｇｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）を使用して、ＨＣ発色団と近接したループおよび残基を同定し、次に飽和変異により無作為化した（Ａｉｒａｋｓｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｈｏｖｉ，  １９９８；  Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６；  Ｍｉｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ａｒｎｏｌｄ，  １９９９；  Ｓｔｅｆｆｅｎｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ２００７；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｚｈｅｎｇ，  ２００４）。３つの異なるライブラリーを、ａｐｏ−ＰＹＰ−Ｃ６９Ｇをコードする配列から構築した。ライブラリー１は、ａｐｏ−ＰＹＰ−Ｃ６９Ｇのループ５２〜５３および６５〜６９の無作為化で入手し、ライブラリー２は、ａｐｏ−ＰＹＰ−Ｃ６９Ｇのループ９４〜１０１の無作為化で入手し、ライブラリー３は、３つのループ５２〜５３、６５〜６９、および９４〜１０１の無作為化で入手した（図４）。
【０１９９】
３つのライブラリーを、酵母ディスプレイｐＣＴＣＯＮ２ベクター（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）にクローン化し、Ａｇａ１ｐに対するジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に結合する酵母凝集素タンパク質Ａｇａ２ｐの接着サブユニットに融合するように、ＰＹＰ変異体を発現させた（図４）。ＥＢＹ１００酵母株における高効率の形質転換（Ｇｉｅｔｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，  ２００７）から、１０７〜１０８の多様性を伴う大きな酵母ディスプレイライブラリーを得た。
【０２００】
蛍光性ＨＢＲ結合性ＰＹＰ変異体を、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）（Ｓｈａｐｉｒｏ，  ２００３）により、構築した酵母ディスプレイライブラリーを選別することにより同定した（図５）。この酵母の集団を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中のＨＢＲの存在下で選別した（ＦＡＣＳは、流体力学的な流れの絞り込み（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｆｌｏｗ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）に基づくものであるため、細胞は、検出ステップまで、ＨＢＲの存在下で保持することができる）。
【０２０１】
励起のための４８８ｎｍのレーザー線および蛍光発光を選択するための５４０±３０ｎｍフィルターを、蛍光性細胞を選択するために使用した。３回の濃縮を、別々のライブラリーで行い、次に、濃縮して得た細胞の集団をまとめて集め、さらに３回の濃縮を混合物で実現させた。
【０２０２】
この濃縮ステップの後、１４４の個別のクローンをＨＢＲに特異的な蛍光性に関して試験した。
【０２０３】
対応するモノクローナル酵母の集団の蛍光性を、フローライトメトリーによりＨＢＲの存在下または非存在下で解析し、ＨＢＲに特異的な蛍光性を示す８０個のクローンを同定した（図６および７）。ＤＮＡのシークエンスに加え、これらの８０個のクローンは、４７の別々の変異体に対応することが示された（図８＋ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４７）。同定した蛍光性ＨＢＲ結合性ＰＹＰ変異体のすべてが、ループ９４〜１０１（結合ポケットの入口を開閉する）を無作為化することにより得たライブラリー２に属することが示された。コンセンサス配列ＷｘＩＰＴｘｘｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９）の発生により、選択プロセスの集束を確認した。
【０２０４】
変異Ｄ９７Ｐは、すべての変異体に存在するように思われる。
【０２０５】
さらに、変異Ｙ９４Ｗは、１つ以外のすべての変異体で同定された。
【０２０６】
９６位では、ａｐｏ−ＰＹＰに存在する芳香族フェニルアラニンは、常に、分枝脂肪族側鎖を有する残基により置換されることが示された。イソロイシン、バリン、およびロイシンは、それぞれ３６、９、および２倍現れる。
【０２０７】
９８位では、変異Ｙ９８Ｔは、１３倍観察された。
【０２０８】
より具体的には、この変異体は、最も高い蛍光上昇を誘導する１０個のクローンのうち９個で確認された。
【０２０９】
同定された変異体の一部を、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴づけた。変異タンパク質は、Ｒｏｓｅｔｔａ−ＤＥ３  Ｅ．  ｃｏｌｉ株のＨｉｓタグ融合物として発現し、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。Ｈｉｓタグを、最終的に、タンパク質分解性の切断により除去した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、異なる変異体の単量体状態を検証することができた。
【０２１０】
次に、ＨＢＲに関して選択した変異体の親和性を、複合体形成をアッセイするために、蛍光上昇を使用した滴定実験により、評価した（図９）。１〜２μＭの範囲の解離定数（ＫＤ）を、異なる蛍光性タンパク質（以下の表１参照）で入手し、特異的なＨＢＲの結合を確認した。
【表１】
0006707472.tif 000041
表１は、５つの蛍光性ＨＢＲ結合ＰＹＰ変異体（クローン２、３、４、５、および６）の解離定数を表す。
【０２１１】
人工操作した蛍光性タンパク質の光物理的な特性を、より正確に特徴づけた。ｐＨ７．４のＰＢＳ中で紫色の光（最大吸収波長３９７ｎｍ）を強力に吸収したＨＢＲとは異なり、５つの蛍光性ＨＢＲ結合性ＰＹＰ変異体は、青色光（最大吸収波長４７０ｎｍ）を強力に吸収することが示された（図１０および以下の表２）。この吸収の７０ｎｍのレッドシフトは、ＨＢＲが、脱プロトン化状態のＰＹＰ変異体キャビティ内に結合していることによるものであった。この結合後の吸収のレッドシフトはまた、５４０ｎｍでの大きな蛍光性の増大に付随するものであった（図１０および以下の表２）。５つの蛍光性ＨＢＲ結合性ＰＹＰ変異体は、６〜９％の蛍光量子収率を呈し、２５００Ｍ−１ｃｍ−１〜４０００Ｍ−１ｃｍ−１の輝度が得られ、この値は、単量体ＤｓＲｅｄおよびｍＰｌｕｍなどのいくつかのＧＦＰ様蛍光性タンパク質の値と比較可能であった（以下の表２参照）。
【０２１２】
最も良好な蛍光性ＨＢＲ結合性ＰＹＰ変異体（この結果ではクローン３とも表される）は、ＦＡＳＴ５４０またはＹ−ＦＡＳＴと名付けられており、ここでＦＡＳＴは、蛍光団を活性化し、シフトするタグを意味し、５４０は、得られた蛍光性タンパク質の発光波長を表す。
【表２】
0006707472.tif 000042
ａ参照：  ＮＣ  Ｓｈａｎｅｒ，  ＰＡ  Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，  ＲＹ  Ｔｓｉｅｎ  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈ．  １２，  ９０５  （２００５）
表２：５つの蛍光性ＨＢＲ結合性ＰＹＰ変異体（クローン２、３、４、５、および６）の吸収および発光の特性を表す。
【０２１３】
Ｙ−ＦＡＳＴへのＨＢＲの付加の直後に（眼による）、蛍光性複合体が形成された。オンおよびオフの速度定数の決定は、この迅速な複合体の形成を定量化することを可能にし（結合の緩和時間は、［ＨＢＲ］＝ＫＤである場合に２５℃で３０ｍｓである）、結合状態のＨＢＲの短い滞留時間を示し（オフの速度定数の逆数は、２５℃で６０ｍｓである）、結合が迅速なだけでなく、非常に力強いことを例証した（表３）。
【表３】
0006707472.tif 000043
＊２５℃での速度定数は、動的パラメータから推定した。§速度定数は、実験的に２０℃で決定した。
表３：２５℃でのＹ−ＦＡＳＴおよびＨＢＲまたはＨＭＢＲの間の複合体の熱動力学的特性および光物理的特性（ＫＤ：解離定数；ｋｏｎ：オンの速度定数；ｋｏｆｆ：オフの速度定数；λａｂｓ：最大吸収波長；λｅｍ：最大発光波長；ε：λａｂｓでのモル吸収係数；φ：蛍光量子収率；εφ：輝度）。バッファー：ｐＨ７．４のＰＢＳ。
【０２１４】
システムの蛍光特性を改善するために、次に本出願人は、蛍光団に関する小さな改変を導入した（図１２）。芳香環に追加的なメチル基を有するＨＭＢＲは、５倍高い親和性でＹ−ＦＡＳＴを結合する（表３および図１３）。得られた複合体は、未だレッドシフトした吸収を呈し、３３％の改善した蛍光量子収率を呈し（図１４、表３）、よって、一般的な蛍光性タンパク質の蛍光特性に達することとなった。オンおよびオフの速度定数の決定（表３）は、親和性が増加したにも関わらず、結合は未だ迅速であり（緩和時間は［ＨＭＢＲ］＝ＫＤである場合に２５℃で７０ｍｓである）、遊離状態および結合状態の間での迅速なＨＭＢＲ交換を伴う（滞留時間は２５℃で１６０ｍｓである）ことを示した。
【０２１５】
Ｙ−ＦＡＳＴが、蛍光顕微鏡による融合タンパク質のイメージングに使用できることを示すために、Ａｇａ２ｐに融合したＹ−ＦＡＳＴを、酵母細胞の細胞表面に発現させた。
【０２１６】
この酵母細胞を、共焦点顕微鏡を用いてＨＢＲの存在下でイメージングし、細胞表面タンパク質の特異的な標識が示され（図１１）、生細胞におけるタンパク質検出のための蛍光性タグとして作用するＹ−ＦＡＳＴの能力を例証した。
【０２１７】
次に、細胞においてＨＢＲおよびＨＭＢＲでのＹ―ＦＡＳＴの標識を、３つの異なる発現系：酵母、大腸菌、および哺乳類細胞（ヒーラ細胞）におけるフローサイトメトリーにより解析した。蛍光性を、野生型の細胞または野生型ＰＹＰを発現する細胞と比較した。この解析は、ＨＢＲおよびＨＭＢＲが、（ｉ）野生型の細菌、酵母、および哺乳類細胞において、蛍光性のバックグラウンドを作製しない、またはごくわずか生じ（図１５ａ、ｂおよび図１６）、かつ（ｉｉ）野生型ＰＹＰを結合しないことを示し、これにより、生細胞におけるＹ−ＦＡＳＴの標識の高い選択性を例証した（図１５ａ、ｂおよび図１６）。またこの解析は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験から予測されるように、ＨＭＢＲが、生細胞におけるＹ−ＦＡＳＴの蛍光標識に関してＨＢＲよりも優れていることを示した。哺乳類細胞、酵母、および細菌におけるＹ−ＦＡＳＴ標識の特性および選択性を、さらに共焦点顕微鏡により確認した（図１４ｄおよび図１５ｃ〜ｆおよび図１６）。またＨＢＲおよびＨＭＢＲは、イメージングに必要とされる濃度で非毒性であることが示され（図１７）、これにより、Ｙ−ＦＡＳＴが、哺乳類細胞での長期間のイメージングを可能にすることが示唆された。
【０２１８】
４８８ｎｍでの青色の励起後の哺乳類細胞におけるＹ−ＦＡＳＴの蛍光が、緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰおよびＵｎａＧの蛍光と比較可能であり、最も明るい蛍光性タンパク質のうちの１つである黄色蛍光性タンパク質Ｖｅｎｕｓの蛍光性より２倍低いことが示された（図１８ａ）。５１４ｎｍでの緑色の励起の後、Ｙ−ＦＡＳＴは、Ｖｅｎｕｓよりも５倍少ないにもかかわらず未だ有意に蛍光している（図１８ａ）。またＹ−ＦＡＳＴは、細胞において良好な光安定性を呈することが示された。４８８ｎｍの励起下で、Ｙ−ＦＡＳＴは、ＵｎａＧおよびＶｅｎｕｓよりも安定であるが、ＥＧＦＰよりも安定しなかった（図１８ｂ）、しかしながら、５１４ｎｍで励起すると、Ｙ−ＦＡＳＴは、４８８ｎｍでの励起後よりも同様の退色を示すＶｅｎｕｓと異なりほとんど光退色しなかった（図１８ｂ）、この挙動は、キュベット内の実験により確認された（データ不図示）。
【０２１９】
次に、Ｙ―ＦＡＳＴが、様々な細胞の局在においてタンパク質を標識するのに良好に適していることが示された。核移行シグナル（ＮＬＳ）、内部膜標的化配列（Ｌｙｎ１１）、および微小管結合タンパク質Ｅｎｓｃｏｎｓｉｎに融合した、Ｙ−ＦＡＳＴを発現する細胞の標識は、蛍光性タンパク質Ｄｒｏｎｐａと類似の融合と比較することにより示されるように、様々な融合の正確な位置を明らかにした（図１９ａ〜ｃ）。より限局した細胞区画においてタンパク質を標識するのに使用できることをさらに示すために、Ｙ−ＦＡＳＴを、分離した脊髄ニューロンの抑制性シナプスを視覚化するためのシナプススキャフォールドタンパク質ゲフィリンに融合させた。Ｙ−ＦＡＳＴ−ゲフィリンの落射蛍光イメージングは、ゲフィリンのｍＣｅｒｕｌｅａｎタグ化版との同時局在化により確認されるように、抑制性シナプスでのゲフィリンの後シナプスクラスターに対応するＨＭＢＲ付加の後の点状の標識を示した。（図１９ｄ）。
【０２２０】
次に、Ｙ−ＦＡＳＴの標識を、多細胞生物のモデルとしてのゼブラフィッシュの胚で検証した。ゼブラフィッシュの胚に、ｍＣｈｅｒｒｙ&#8211;Ｐ２Ａ&#8211;Ｙ−ＦＡＳＴをコードするｍＲＮＡをマイクロ注入した。ここでのＰ２Ａペプチドは、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＹ−ＦＡＳＴの１：１の同時発現を可能にする同時翻訳リボソームのスキッピングを媒介する。胚を、原腸形成の間または受精後２４時間にＨＭＢＲと共にインキュベートし、スピニングディスク顕微鏡によりイメージングした。Ｙ−ＦＡＳＴの標識は、ｍＣｈｅｒｒｙの標識と同一の発現パターンを明らかにし（データ不図示）、Ｙ−ＦＡＳＴ標識がｉｎ  ｖｉｖｏで特異的であったことを示した。さらに、５０％の被包から２４ｈｐｆまでの発生の間ＨＭＢＲと共にインキュベートした胚の適合性の評価は、ＨＭＢＲが、発生において死亡率またはかく乱を全く誘導しなかったことを示し（データ不図示）、ＨＭＢＲが、ゼブラフィッシュの胚に非毒性であることを示し、Ｙ−ＦＡＳＴがゼブラフィッシュでの長期間のイメージングを可能にすることを示唆している。
【０２２１】
Ｙ−ＦＡＳＴは、ＨＭＢＲがすでに存在する場合にはほぼ瞬間的に蛍光性であるため、本出願人は、Ｙ−ＦＡＳＴが、リアルタイムでのタンパク質合成などの迅速なプロセスをモニタリングするために、ＧＦＰ様蛍光性タンパク質よりも優れているとすることができると予測した。一部のＧＦＰ様蛍光性タンパク質では、その蛍光性の見かけの比率がタンパク質合成自体に依存するだけでなく、発色団の翻訳後の形成にも依存するため、リアルタイムでのタンパク質合成に関してレポートすることができない。この文脈でのＹ−ＦＡＳＴの利点を示すために、本出願人は、その蛍光性を同時にモニタリングすることにより、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＹ−ＦＡＳＴの融合構築物の無細胞発現を観察した（図２０）。単一タンパク質が合成されたにも関わらず、本出願人は、Ｙ−ＦＡＳＴおよびｍＣｈｅｒｒｙの蛍光性に関する見かけの２つの異なる比率を観察した。Ｙ−ＦＡＳＴは、９０分以内に飽和に達するタンパク質合成の開始から１０分後になるやいなやすでに検出することができるが、ｍＣｈｅｒｒｙシグナルは、５０分後にのみ現れ始め、その発色団のゆっくりとした成熟の結果として飽和に達するのに４時間かかった。次に本出願人は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれぞれ１０分および４０分以内に成熟すると報告されているＥＧＦＰおよびＶｅｎｕｓ、ビリルビン誘導可能なＵｎａＧ、ならびに多くの場合、タンパク質合成のレポーターとして使用されるホタルルシフェラーゼの発現とｍＣｈｅｒｒｙ−Ｙ−ＦＡＳＴの発現とを比較した。異なるタンパク質の発現を同一のＴ７プロモーターにより制御し、よって、同一の比率で発生するはずだが、本出願人は、様々な比率の蛍光性の見かけを観察した（図２０）。本出願人の実験は、Ｙ−ＦＡＳＴが、ほぼリアルタイムでのタンパク質の合成に関してレポートすることに、ＶｅｎｕｓおよびｍＣｈｅｒｒｙよりも明らかに優れており、ホタルルシフェラーゼ、ＥＧＦＰ、およびＵｎａＧとほぼ同一の動的情報を提供することを示した。
【０２２２】
Ｙ−ＦＡＳＴのスペクトル特性は、ＣＦＰと対をなしたアクセプターまたはｍＣｈｅｒｒｙと対をなしたドナーの役割を果たすことができるため、Ｙ−ＦＡＳＴはＦＲＥＴの実験に良好に適している。ＦＲＥＴ実験のＹ−ＦＡＳＴの可能性を示すために、本出願人は、Ｙ−ＦＡＳＴとｍＣｈｅｒｒｙとの間の融合におけるＦＲＥＴの有効性を特徴づけた。本出願人は、ＦＲＥＴの有効性が、５ｎｍのドナーアクセプターの距離と一致して、〜５０％であったことを示した。
【０２２３】
最終的に、本出願人は、Ｙ−ＦＡＳＴの蛍光が非常に調節可能であったことを示した。エミッタの密度は、蛍光団の濃度を調節することによりタンパク質の発現レベルとは無関係に制御することができる（図２２）。細胞における滴定は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果と良好に一致し、まず、環境内のＨＭＢＲの濃度が細胞内レベルを反映したことを示し、第２に、１μＭのＨＭＢＲが、細胞における完全な標識に十分であったことを示す。さらに、本出願人は、ＨＭＢＲの迅速な付加または除去により、哺乳類細胞におけるＹ−ＦＡＳＴのオンおよびオフの迅速な切り替えを可能にすることを示した。これを示すために、本出願人は、多機能流体制御機に結合したマイクロ流体デバイスを使用した。ＨＭＢＲでの標識は、ＨＭＢＲの良好な細胞の透過性および複合体の即時形成と一致して、約１０秒以内に起こる（図２１ａ、ｂ）。ＨＭＢＲフリー培地とＨＭＢＲ含有培地を迅速に交換することは、ＨＭＢＲの短い滞留期間と一致して、同様の時間尺度でタンパク質を標識しなかった（図２１ａ、ｂ）。多機能流体制御機により、Ｙ−ＦＡＳＴの標識および未標識は、溶液の標識および溶液の洗浄の間を迅速に切り替えることにより、１０回超反復することができた（図２１ａ、ｂ）。
【０２２４】
蛍光発生リガンドの付加および除去による蛍光のオンおよびオフを切り替える能力は、連続した蛍光発生標識、イメージング、および蛍光団の除去により、スペクトルに基づき区別がつかない標的をイメージングすることを可能にする。この戦略を例証するために、本出願人は、哺乳類細胞におけるＹ−ＦＡＳＴ（膜の固定のためのＬｙｎ−１１に融合）および光により切り替え可能な蛍光性タンパク質Ｄｒｏｎｐａ（核移行シグナルに融合）を発現させた（図２１ｃ）。まず、本出願人は、ＨＭＢＲの非存在下で細胞をイメージングし、核のＤｒｏｎｐａを可視化し、次に、４８８ｎｍの励起によりＤｒｏｎｐａをオフに切り替え、Ｙ−ＦＡＳＴを標識するためにＨＭＢＲを添加した。次に、本出願人は、Ｙ−ＦＡＳＴの膜の局在を選択的に観察することができた。ＨＭＢＲを未標識のＹ−ＦＡＳＴから洗い流し、Ｙ−ＦＡＳＴからのどんな汚染も伴うことなくＤｒｏｎｐａ（４０５ｎｍで励起することにより光活性）を選択的に可視化することが再度可能となる。このプロセスは、Ｄｒｏｎｐａをオフに切り替え、ＨＭＢＲでＹ−ＦＡＳＴを標識することにより、反復することができた（図２１ｃ）。
【０２２５】
文献
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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