(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベータ様細胞を機能的なベータ細胞へとリプログラミングするためのインビトロの方法
であって、ベータ様細胞において組換えエストロゲン関連受容体（ERR）ガンマを発現さ
せ、それによって前記ベータ様細胞を機能的なベータ細胞へとリプログラミングすること
を含む、方法。
【請求項２】
グルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有する細胞を生成するためのインビトロ
の方法であって、ベータ様細胞において組換えエストロゲン関連受容体（ERR）ガンマを
発現させ、それによってグルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有する細胞を生成
することを含む、方法。
【請求項３】
前記ベータ様細胞は、Nkx2.2、NeuroD1、Foxa2、Pax6、HNF4a、Pdx1、MafA、およびNkx
6-1からなる群から選択される1つ以上のβ細胞転写因子を発現する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記ベータ様細胞は、インスリン1、インスリン2、グルカゴン、およびソマトスタチンからなる群から選択される1つ以上のβ細胞マーカーを発現する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
前記ベータ様細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、脂肪細胞由来幹細胞、ヒト臍帯
静脈内皮細胞（Huvec）、またはそれらの前駆細胞もしくは幹細胞から誘導される、請求
項1または2に記載の方法。
【請求項６】
前記ベータ様細胞は、インビトロでERRガンマを発現するように改変される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項７】
前記ベータ様細胞は、ERRガンマをコードするウイルスベクターにより形質導入される
、請求項1または2に記載の方法。
【請求項８】
前記リプログラミングされた細胞はインスリンを発現する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項９】
前記リプログラミングされた細胞は、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌する
、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベータ様細胞は、培養中の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を、アクチビンA、
ウィングレス型MMTV挿入部位ファミリーメンバー3A（Wnt3a）、インスリン増殖因子（IGF）-2、エクステンディン（Ex）-4、線維芽細胞増殖因子（FGF）-2、ニコチンアミド、および／またはB27の内の1つ以上に接触させることにより得られる、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ベータ様細胞は、培養中の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を、3〜4日間に渡り毎日50〜100 ng/mlのアクチビンAに接触させることにより得られる、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベータ様細胞は、培養中の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を、第0日に25 ng/mlのWnt3aに接触させることにより得られる、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベータ様細胞は、培養中の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を、第3日に、50 ng/mlのIGF-2、50ng/mlのEx-4、10 ng/mlのFGF-2、10 mMのニコチンアミド、および1%のB27に接触させることにより得られる、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
得られる前記ベータ様細胞は、Pdx1、インスリン、Mafa、Pax6、NeuroD、GCK、CHGA、V
AMP2、PC1/3、Glut2、Nkx6.1、GCG、SST、およびU36B4からなる群から選択される1つ以上のmRNAを発現する、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベータ様細胞は、インスリン、Pdx1、Mafa、Pax6、Glut2、NeuroD1、グルコキナー
ゼ、グルカゴン、ソマトスタチン、クロモグラニンA、およびVAMP2からなる群から選択される1つ以上のポリペプチドを発現する、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
必要とする対象において高血糖を寛解させるための組成物であって、組換えエストロゲ
ン関連受容体（ERR）ガンマを発現するベータ様細胞を含み、それによって前記対象にお
ける高血糖を寛解させる、組成物。
【請求項１７】
必要とする対象において1型糖尿病または2型糖尿病を治療するための組成物であって、組換えエストロゲン関連受容体（ERR）ガンマを発現するベータ様細胞を含み、それによって前記対象における1型糖尿病または2型糖尿病を治療する、組成物。
【請求項１８】
前記組成物は、前記対象において血中グルコースレベルを低下させる、請求項16または17に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、前記対象において血中グルコースレベルを正常化させる、請求項16または17に記載の組成物。
【請求項２０】
前記対象は獣医学的な対象またはヒト対象である、請求項16または17に記載の組成物。
【請求項２１】
ERRガンマポリペプチドをコードする核酸配列に作用可能に連結されたベータ細胞特異
的プロモーターを含む発現ベクター。
【請求項２２】
前記プロモーターが、インスリン、インスリンII、Pdx1、Mafa、Nkx6-1、Pax4、および
NeuroD1プロモーターからなる群から選択される、請求項21に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
前記発現ベクターがウイルスベクターである、請求項21または22に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター
（AAV）である、請求項23に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
必要とする対象において高血糖を寛解させるための組成物であって、ERRガンマをコー
ドするAAVベクターを有するベータ様細胞を含み、それによって前記細胞がグルコース刺
激によるインスリン分泌の能力を有するようにされており、それによって前記対象におけ
る高血糖を寛解させる、組成物。
【請求項２６】
前記ベータ様細胞は、前記対象に由来するものであるか、または前記対象に由来しない
ものである、請求項25に記載の組成物。
【請求項２７】
請求項21〜24のいずれか１項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２８】
前記細胞は、胚性幹細胞、新生児幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、脂肪細胞由
来幹細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Huvec）、またはそれらの前駆細胞もしくは幹細胞で
ある、請求項27に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
請求項27または28に記載の宿主細胞を含む組織。
【請求項３０】
前記組織は膵性組織である、請求項29に記載の組織。
【請求項３１】
請求項27または28に記載の宿主細胞を含む臓器。
【請求項３２】
請求項27または28に記載の宿主細胞を含むマトリックス。
【請求項３３】
請求項27または28に記載の宿主細胞の有効量を、薬学的に許容される賦形剤中に含む、細胞組成物。
【請求項３４】
a) 請求項27または28に記載の宿主細胞と、
b) 対象における高血糖を寛解させるために前記細胞を使用することについての説明書
とを含む、パッケージ化医薬品。
【請求項３５】
高血糖を治療するためのキットであって、請求項27または28に記載の宿主細胞の有効量と、その使用についての説明書とを含む、キット。
【請求項３６】
前記高血糖は1型糖尿病または2型糖尿病に関連するものである、請求項35に記載のキット。
【請求項３７】
グルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有する細胞を生成するためのインビトロ
の方法であって、ヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）において、組換えエストロゲン関連受容
体（ERR）ガンマおよびPdx1、または、ERRガンマ、Pdx1およびPGC-1アルファを発現させ、それによってグルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有する細胞を生成することを含む、方法。
【請求項３８】
前記hADSCにおいてPax4を発現させることをさらに含む、請求項37に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、2014年3月27日に出願された米国仮出願第61/971,308号、2014年10月17日に出願された米国仮出願第62/065,537号、および2015年1月20日に出願された米国仮出願第62/105,545号に基づく利益を主張し、これらの出願の内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
［連邦政府資金による研究によってなされた発明への権利についての記載］
本発明は、国立衛生研究所により授与されたDK057978、DK090962、HL088093、HL105278、およびES010337の下での米国政府の支援によってなされた。米国政府は本発明に対して所定の権利を有する。
【０００３】
ベータ細胞は1型および2型の糖尿病と関連している。
【背景技術】
【０００４】
1型糖尿病は通常、子供と若年成人において診断され、インスリン産生性の膵臓β細胞の自己免疫性破壊に起因する。インスリン産生の欠乏が血中および尿中のグルコースレベルの劇的な上昇を引き起こし、多尿症（頻尿）、多飲症（口渇の増加）、過食症（空腹感の増加）、および体重減少をもたらす。1型糖尿病はインスリン注射で処置されない限り致死的であり、インスリン注射は治療的（therapeutic）ではあるが、治癒的（curative）ではない。インスリン分泌性β細胞の生成および産生は、長年、1型糖尿病およびある種の2型糖尿病を治癒するための再生医療における主要な目標となってきた。今日まで、完全に「機能的な」β細胞、すなわち、生理的レベルのグルコースに応答して適切にインスリンを分泌することができるインビトロ生成細胞を産生するための方法は存在していない。そのような細胞の産生は、糖尿病を治癒するために最も望まれることである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、完全に機能的なベータ細胞を得るための方法、および、そのような細胞を使用して糖尿病を治療するための方法が緊急に求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
下記において説明するように、本発明は、グルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有するインビトロ生成ベータ細胞を含む組成物、胚性または人工多能性幹細胞に由来するベータ様細胞からベータ細胞成熟を誘導する方法、これらの細胞を対象（たとえばヒト）に移植してグルコース恒常性を回復させる方法、および、インビトロ生成ベータ細胞を使用して1型糖尿病、2型糖尿病、または関連障害を治療する方法を提示する。
【０００７】
一側面において、本発明は、一般的に、ベータ様細胞を機能的なベータ細胞へとリプログラミングするための方法を提供し、この方法は、ベータ様細胞において組換えエストロゲン関連受容体（ERR：estrogen related receptor）ガンマを発現させ、それによってそのベータ様細胞を機能的なベータ細胞へとリプログラミングすることが関わるものである。
【０００８】
別の一側面において、本発明は、グルコース刺激によりインスリン分泌をする能力を有する細胞を生成するための方法を提供し、この方法は、ベータ様細胞において組換えエストロゲン関連受容体（ERR）ガンマを発現させ、それによってグルコース刺激によりインスリン分泌をする能力を有する細胞を生成することが関わるものである。
【０００９】
さらに別の一側面において、本発明は、必要とする対象において高血糖を寛解させる方法を提供し、この方法は、組換えエストロゲン関連受容体（ERR）ガンマを発現するベータ様細胞をその対象に投与して、それによって対象における高血糖を寛解させることが関わるものである。
【００１０】
さらに別の一側面において、本発明は、必要とする対象において1型糖尿病または2型糖尿病を治療する方法を提供し、この方法は、組換えエストロゲン関連受容体（ERR）ガンマを発現するベータ様細胞をその対象に投与して、それによって対象における1型糖尿病または2型糖尿病を治療することが関わるものである。
【００１１】
別の一側面において、本発明は、ERRガンマポリペプチドをコードする核酸配列に作用可能に連結されたベータ細胞特異的プロモーターを含む、発現ベクターを提供する。一実施形態では、そのプロモーターが、インスリン、インスリンII、Pdx1、Mafa、Nkx6-1、Pax4、およびNeuroD1プロモーターからなる群から選択される。別の一実施形態では、その発現ベクターはウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクター（AAV））である。
【００１２】
別の一側面において、本発明は、必要とする対象において高血糖を寛解させる方法を提供し、この方法は、ERRガンマをコードするAAVベクターにベータ様細胞を接触させ、それによってその細胞がグルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有するようにすること、および、対象にその細胞を投与し、それによって対象における高血糖を寛解させることが関わるものである。一実施形態において、ベータ様細胞は、その対象に由来するものであるか、またはその対象に由来しないものである。
【００１３】
別の一側面において、本発明は、前の側面の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、その細胞は、胚性幹細胞、新生児幹細胞、成体幹細胞、人工多能性幹細胞、脂肪細胞由来幹細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Huvec：human umbilical vein endothelial cell）、またはそれらの前駆細胞もしくは幹細胞である。
【００１４】
別の一側面において、本発明は、一般的に、前のいずれかの側面の宿主細胞を含む組織を提供する。一実施形態において、その組織は膵性組織である。
【００１５】
別の一側面において、本発明は、一般的に、前のいずれかの側面の宿主細胞を含む臓器を提供する。
【００１６】
別の一側面において、本発明は、一般的に、前のいずれかの側面の宿主細胞を含むマトリックスを提供する。
【００１７】
別の一側面において、本発明は、一般的に、薬学的に許容される賦形剤中に本発明の宿主細胞の有効量を含む、細胞組成物を提供する。
【００１８】
別の一側面において、本発明は、一般的に、前の側面の宿主細胞と、対象における高血糖を寛解させるためにその細胞を使用することについての説明書とを含む、パッケージ化医薬品を提供する。
【００１９】
別の一側面において、本発明は、一般的に、高血糖を治療するためのキットを提供し、そのキットは、前のいずれかの側面の宿主細胞の有効量と、その使用についての説明書とを含む。一実施形態では、高血糖は1型または2型糖尿病に関連するものである。
【００２０】
別の一側面において、本発明は、一般的に、グルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有する細胞を生成するための方法を提供し、この方法は、ヒト脂肪由来幹細胞（hADSC：human adipose-derived stem cell）において、組換えエストロゲン関連受容体（ERR）ガンマおよびPdx1、または、ERRガンマ、Pdx1およびPGC-1アルファを発現させ、それによってグルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有する細胞を生成することが関わるものである。一実施形態では、本発明は、一般的に、hADSCにおいてPax4を発現させることが関わる。
【００２１】
上記のいずれかの側面または本明細書に記述される本発明の他のいずれかの側面の様々な実施形態において、ベータ様細胞は、Nkx2.2、NeuroD1、Foxa2、Pax6、HNF4a、Pdx1、MafA、およびNkx6-1の内のいずれか1つ以上である1つ以上のベータ細胞転写因子を発現する。上記諸側面の他の実施形態では、ベータ様細胞は、インスリン1、インスリン2、グルカゴン、およびソマトスタチンである1つ以上のベータ細胞マーカーを発現する。上記諸側面の他の実施形態では、ベータ様細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、脂肪細胞由来幹細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Huvec）、またはそれらの前駆細胞もしくは幹細胞である。上記諸側面の他の実施形態では、ベータ様細胞は、インビトロまたはインビボでERRガンマを発現するように改変される。上記諸側面の他の実施形態では、ベータ様細胞は、ERRガンマをコードするウイルスベクターにより形質導入される。上記諸側面の他の実施形態では、リプログラミングされた細胞はインスリンを発現する。上記諸側面の他の実施形態では、リプログラミングされた細胞は、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌する。上記諸側面の他の実施形態では、ベータ様細胞は、培養中の胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を、アクチビンA、ウィングレス（wingless）型MMTV挿入部位ファミリーメンバー3A（Wnt3a）、インスリン増殖因子（IGF）-2、エクステンディン（Ex：extendin）-4、線維芽細胞増殖因子（FGF）-2、ニコチンアミド、および／またはB27の内の1つ以上に接触させることにより得られる。上記諸側面の他の実施形態では、ベータ様細胞は、1〜3、1〜5、または1〜6日間（例えば1、2、3、4、5、または6日間）に渡り毎日50 ng/mlのアクチビンAにより処理される。上記諸側面の他の実施形態では、ベータ様細胞は、第0日に、25 ng/mlのWnt3aで処理される。上記諸側面の他の実施形態では、ベータ様細胞は、第3日に、50 ng/mlのIGF-2、50ng/mlのEx-4、10 ng/mlのFGF-2、10 mMのニコチンアミド、および1%のB27で処理される。上記諸側面の他の実施形態では、得られるベータ細胞は、Pdx1、インスリン、Mafa、Pax6、NeuroD、GCK、CHGA、VAMP2、PC1/3、Glut2、Nkx6.1、GCG、SST、およびU36B4である1つ以上のmRNAを発現する。上記諸側面の他の実施形態では、ベータ様細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞において、Oct4、Nanog、Sox17、FoxA2、Pdx1、Nkx6.1、およびNgn3である1つ以上の転写因子を発現させることにより得られる。上記諸側面の他の実施形態では、ベータ細胞は、インスリン、Pdx1、Mafa、Pax6、Glut2、NeuroD1、GCK（グルコキナーゼ；ヘキソキナーゼ4）、GCG（グルカゴン）、SST（ソマトスタチン）、CHGA（クロモグラニンA；副甲状腺分泌タンパク質1）、およびVAMP2（小胞結合膜タンパク質2（シナプトブレビン2））である1つ以上のポリペプチドを発現する。上記諸側面のさらに別の実施形態では、本方法は対象において血中グルコースレベルを低下させる。上記諸側面の他の実施形態では、本方法は対象において血中グルコースレベルを正常化させる。上記諸側面の他の実施形態では、対象は獣医学的な対象またはヒト対象である。
【００２２】
本発明は、グルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有するインビトロ生成ベータ様細胞を含む組成物、および、1型もしくは2型糖尿病、または関連する代謝障害を有する、あるいはそれらを発症する危険性を有する対象を治療するためにそのような細胞を使用する方法を提供する。本発明のその他の特徴および利点は、詳細な説明から、および特許請求の範囲から、明らかとなるであろう。
【００２３】
［定義］
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特記されない限り、下記においてそれらに割り当てられている意味を有する。
【００２４】
「ベータ様細胞」は、少なくとも1つの膵島ベータ細胞転写因子または少なくとも1つのベータ細胞マーカーを発現する細胞を意味する。ベータ様細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞から誘導され得る。所望により、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞は、例えば、本明細書で後述するように細胞を培養することによって、または、本発明の1つ以上のタンパク質（例えばERRガンマ；ERRガンマおよびPdx1；ERRガンマ、Pdx1およびPGC-1アルファ）を細胞（例えばhADSC）において組換え発現することによって、ベータ様細胞になるように誘導され得る。所望により、ERRガンマ；ERRガンマおよびPdx1；ERRガンマ、Pdx1およびPGC-1アルファと組み合わせて、Pax4も発現される。一実施形態では、ベータ様細胞またはその派生物は、インスリンを発現し、および／または、グルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有する。
【００２５】
「グルコース刺激によるインスリン分泌」は、生理的なレベルのグルコースに応答してインスリンを分泌することを意味する。生理的なレベルのグルコースとは約20mMのグルコースであろう。「エストロゲン関連受容体（ERR）ガンマポリペプチド」は、転写調節活性を有する、NCBI参照番号P62508にて提供されるヒトのエストロゲン関連受容体ガンマ配列に対して少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片を意味する。「ERR3」とも呼ばれるERRガンマの配列を下記に示す：
sp|P62508|ERR3_ヒト  エストロゲン関連受容体ガンマ  OS=ホモ・サピエンスGN
0006707461.tif 000002
【００２６】
「ERRガンマポリヌクレオチド」は、ERRガンマポリペプチドまたはその断片をコードするあらゆる核酸配列を意味する。例示的なERRガンマ核酸配列はNCBI参照番号NM_001438.3にて提供されている：
0006707461.tif 000003
0006707461.tif 000004
【００２７】
「膵臓と十二指腸のホメオボックス-1（Pdx-1：Pancreatic and Duodenal Homeobox-1）ポリペプチド」は、NCBI参照配列NP_000200.1にて提供される配列に対して少なくとも85%の相同性を有し、かつDNA結合活性または転写調節活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。例示的なヒトPDX1アミノ酸配列を下記に示す：
0006707461.tif 000005
【００２８】
「膵臓と十二指腸のホメオボックス-1（Pdx-1）」核酸配列は、PDX-1ポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。例示的なpdx-1核酸配列としてNM_000209が挙げられる：
0006707461.tif 000006
【００２９】
「Pax4ポリペプチド」は、GenBankアクセス番号AAI07151にて提供される配列に対して少なくとも85%の相同性を有し、かつDNA結合活性または転写調節活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。
0006707461.tif 000007
【００３０】
「Pax4核酸分子」は、Pax4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を意味する。例示的なPax4ポリペプチドとしてはBC107150が挙げられ、その配列を下記に示す：
0006707461.tif 000008
【００３１】
「PGC1アルファポリペプチド」は、NCBI参照番号NP_037393.1またはUniProt参照番号Q9UBK2にて提供される配列に対して少なくとも85%の相同性を有するタンパク質またはその断片を意味する。例示的なアミノ酸配列を下記に示す。
0006707461.tif 000009
【００３２】
「PGC1アルファポリヌクレオチド」は、PGC1アルファポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。例示的なPGC1アルファポリヌクレオチド配列を下記に示す：
0006707461.tif 000010
0006707461.tif 000011
0006707461.tif 000012
【００３３】
「外因性」は、細胞において内因的には存在しない核酸分子またはポリペプチドを意味する。従って用語「外因性」は、細胞において発現されるあらゆる組換え核酸分子または組換えポリペプチド、例えば外来性、異種性、および過剰発現の核酸分子およびポリペプチドを包含する。
【００３４】
「改変」は、例えば上述したような標準技術の公知方法により検出される、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルにおける変化（増加または減少）を意味する。本明細書で使用される場合、改変には、発現レベルにおける10%の変化が含まれ、好ましくは発現レベルにおける25%の変化、より好ましくは40%の変化、最も好ましくは50%以上の変化が含まれる。
【００３５】
「類似体」は、基準となるポリペプチドまたは核酸分子の機能を有する構造的に関連したポリペプチドまたは核酸分子を意味する。
【００３６】
「有効量」は、未処置の患者と比べて疾患の症状を寛解させるために必要となる薬剤の量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施する上で使用される活性化合物（複数可）の有効量は、投与の態様、対象の年齢、体重、全般的健康状態によって変動する。究極的には、担当する医師または獣医師が適切量および投与計画を決定するであろう。そのような量が「有効」量と言われる。
【００３７】
「断片」は、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は、好ましくは、基準となる核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%を含む。断片は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100、200、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000個のヌクレオチドあるいはアミノ酸を含み得る。
【００３８】
「機能的ベータ細胞」は、グルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有するベータ細胞を意味する。
【００３９】
「融合タンパク質」は、自然状態では一続きとなることがない少なくとも2つのアミノ酸配列を組み合わせたタンパク質を意味する。
【００４０】
「増加または減少」は、正または負の改変を意味する。そのような改変は、基準となる値の5%、10%、25%、50%、75%、85%、90%の改変、あるいは100%の改変でもありうる。
【００４１】
「単離細胞」は、自然状態で細胞に付随する分子成分および／または細胞成分から分離された細胞を意味する。
【００４２】
「単離核酸分子」は、本発明の核酸分子が由来する生命体の天然のゲノムにおいてその遺伝子に隣接する遺伝子が除かれた状態の核酸（例えばDNA）を意味する。従ってこの用語には、例えば、ベクターに組み入れられた組換えDNA、自律的複製をするプラスミドもしくはウイルスに組み入れられた組換えDNA、もしくは原核生物あるいは真核生物のゲノムDNAに組み入れられた組換えDNA、または、他の配列とは独立した分離分子（例えば、cDNA、または、PCRや制限酵素消化により産生されたゲノムもしくはcDNAの断片）として存在するものが包含される。さらに、この用語は、DNA分子から転写されるRNA分子、そして追加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部をなす組換えDNAも包含する。
【００４３】
「単離ポリペプチド」は、自然状態でそれに付随する成分から分離された、本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、自然状態でそれに付随するタンパク質および天然有機分子から重量にして少なくとも60%除去状態である場合に、そのポリペプチドは単離されていることになる。一実施形態では、調製物の重量にして少なくとも75%、85%、90%、95%、または少なくとも99%が、本発明のポリペプチドである。本発明の単離ポリペプチドは、例えば、天然資源からの抽出、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸からの発現、またはタンパク質を化学合成することによって、取得することができる。純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定され得る。
【００４４】
「マーカー」は、疾患または障害に関連する発現レベルまたは活性の改変を有するあらゆるタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
【００４５】
「マトリックス」は、細胞が包埋される天然または人工の物質を意味する。特定の実施形態では、マトリックスは、細胞外マトリックスの成分（例えばプロテオグリカン、ヘパラン硫酸、インテグリン、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン）を含む。他の実施形態では、マトリックスは、支持的な細胞種（例えば線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞）を含む。
【００４６】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、天然の状態では通常それに付随することが見出される成分から様々な程度において除去されている物質（例えば細胞）を表す。「単離する」は、元々の供給源または周囲からの一定の分離を意味する。「精製する」は、単離よりも高い程度の分離を意味する。「精製された」あるいは「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がそのタンパク質の生物学的特性に実質的に影響したりその他の有害な結果を引き起こしたりしない程度に、他の物質から十分に除去されている。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって産生される場合には、細胞性物質、ウイルス性物質、もしくは培養培地が実質的に含まれていなければ精製されていることになり、あるいは化学合成される場合には、化学的前駆体やその他の化学物質が実質的に含まれなければ精製されていることになる。純度および均一性は、通常、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を使用して決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて実質的に1つのバンドを生じることを意味し得る。例えばリン酸化やグリコシル化のような修飾を受け得るタンパク質に関しては、異なる修飾により異なる単離タンパク質が生じ得、それらは別々に精製され得る。
【００４７】
「天然の（naturally occurs）」は、生命体の細胞において内因的に発現されることを意味する。
【００４８】
「陰性」は、細胞がマーカーを検出不可能なレベルまたは低下したレベルで発現し、その細胞が未選択細胞の集団からネガティブセレクションで区別され得る状態にあることを意味する。
【００４９】
「ポリペプチドを取得する」というような場合の「取得する」とは、そのポリペプチドを合成、購入、あるいはその他の方法で獲得することを意味する。
【００５０】
「作用可能に連結された」は、第1のポリヌクレオチドが第2のポリヌクレオチドの近隣に配置されており、適当な分子（例えば転写活性因子タンパク質）が第2のポリヌクレオチドに結合した場合に第2のポリヌクレオチドが第1のポリヌクレオチドの転写を誘導することを意味する。
【００５１】
「ポリペプチド」は、長さや翻訳後修飾に関わらず、アミノ酸の鎖を意味する。
【００５２】
「発現されるように配置された」とは、本発明のポリヌクレオチド（例えばDNA分子）が、その配列の転写および翻訳を誘導する（すなわち、例えば本発明の組換えポリペプチドあるいはRNA分子の産生を促進させる）DNA配列の近隣に配置されていることを意味する。
【００５３】
「陽性」は、細胞がマーカーを検出可能なレベルで発現することを意味する。
【００５４】
本明細書において使用される場合、「薬剤を取得する」というような場合の「取得する」は、その薬剤を合成、購入、その他の方法で獲得することを包含する。
【００５５】
「ベータ細胞転写因子」は、膵臓組織において発現される転写因子を意味する。例示的な膵臓転写因子としては、ERRガンマ、Pdx-1、Ngn3、Pax4、NeuroD1、Nkx2.2（ヒトC075092、AAH75092）、Nkx6.1（ヒトP78426、NM_006168）Isl1（ヒトNM_002202、NP_002193）、Pax6（ヒトNP_000271、BC011953）、MafA（v-maf筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログA）（ヒトNP_963883、NM_201589）、およびMafB（v-maf筋腱膜線維肉腫癌遺伝子ホモログB）（ヒトNP_005452、NM_005461）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
「プロモーター」は、転写を誘導する上で十分なポリヌクレオチドを意味する。例示的なプロモーターは、翻訳開始部位の上流（例えばすぐ上流）にある100、250、300、400、500、750、900、1000、1250、および1500ヌクレオチドの長さの核酸配列を含む。
【００５７】
「減少させる」は、少なくとも10%、25%、50%、75%、または100%の負の改変を意味する。
【００５８】
「基準」は、標準または対照の状態を意味する。
【００５９】
「基準配列」は、配列比較のための基礎として用いられる規定された配列である。基準配列は、特定された配列のサブセットまたは全体であり得、例えば、全長cDNAもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なcDNAもしくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドについては、基準ポリペプチド配列の長さは一般的には少なくとも約16アミノ酸であり、好ましくは少なくとも約20アミノ酸、より好ましくは少なくとも約25アミノ酸、さらにより好ましくは約35アミノ酸、約50アミノ酸、または約100アミノ酸である。核酸については、基準核酸配列の長さは一般的には少なくとも約50ヌクレオチドであり、好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75ヌクレオチド、さらにより好ましくは約100ヌクレオチドもしくは約300ヌクレオチドまたはその近傍もしくはその間のあらゆる整数である。
【００６０】
「再生する」は、組織または臓器の修復または新規構築に少なくとも1つの細胞を提供する能力を有することを意味する。
【００６１】
「リプログラミング」は、細胞を変化させて、リプログラミング前の細胞において（あるいは対応する対照細胞において）産生されない少なくとも1つのタンパク質産物がそのリプログラミング化細胞において産生されるようにすることを意味する。典型的には、リプログラミング化細胞は改変された転写プロファイルまたは翻訳プロファイルを有し、従ってリプログラミング化細胞は、リプログラミング前の細胞において（あるいは対応する対照細胞において）発現されないタンパク質群を発現する。
【００６２】
「実質的に同一」は、基準のアミノ酸配列（例えば本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか1つ）または核酸配列（例えば本明細書に記載される核酸酸配列のいずれか1つ）に対して少なくとも50%の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、そのような配列は、比較に用いられる配列に対してアミノ酸レベルまたは核酸において少なくとも60%、より好ましくは80%または85%、より好ましくは90%、95%、さらには99%、同一である。
【００６３】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェア（例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705の配列分析ソフトウェアパッケージ、BLAST、BESTFIT、GAP、またはPILEUP/PRETTYBOXプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウェアは、様々な置換、欠損、および／またはその他の改変に相同性の程度を割り当てることにより、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的な置換としては、典型的には、以下の群内の置換が挙げられる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチにおいて、BLASTプログラムが使用され得、e-3とe-100の間の蓋然性スコアが、密接に関係した配列を示す。
【００６４】
「対象」は哺乳類を意味し、これには、ヒト、または例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコのような非ヒト哺乳類が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書に提供される数値範囲は、その範囲内の全ての値についての略記であると解される。例えば、1〜50という範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50からなる群からのあらゆる数、数の組合せ、または部分範囲を包含すると解される。
【００６６】
本明細書で使用される「治療」は、処置を受ける個体または細胞の疾患過程を改変することを試みる臨床的介入を表し、予防のために、あるいは臨床病理過程の間に、実行され得る。治療の治療効果には、疾患の発生または再発を防止すること、症状を軽減すること、疾患の直接的または間接的な病理学的帰結の減少、転移を防止すること、疾患進行の速度の減少、疾患状態の寛解または緩和、および緩解または予後改善が含まれるが、これらに限定されない。疾患または障害を「防止する」ことにより、治療は、罹患もしくは診断された対象またはその障害を有することが疑われる対象において、障害による悪化を防ぐことができるが、治療はまた、その障害のリスクを有する、またはその障害の有することが疑われる対象において、障害の発症または障害の症状を防ぐこともあり得る。
【００６７】
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」、「治療」等は、障害および／またはそれに関連する症状を低減または寛解させることを表す。障害または状態を治療することは、その障害、状態、またはそれらに関連する症状が完全に除去されることを要しない（これらが完全に除去される場合を排除するわけでもない）ことが理解されるであろう。
【００６８】
特に言及されるかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「または」は包含的に解される。特に言及されるかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「a」、「an」および「the」は、単数または複数として解される。
【００６９】
特に言及されるかまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「約」は、本技術分野で通常許容される範囲内のものとして解され、例えば、平均値の2標準偏差以内として解される。約は、言及された値から10%以内、9%以内、8%以内、7%以内、6%以内、5%以内、4%以内、3%以内、2%以内、1%以内、0.5%以内、0.1%以内、0.05%以内、または0.01%以内として理解され得る。文脈に明らかに反しない限り、本明細書で提供される全ての数値は約という用語で修飾される。
【００７０】
本明細書における可変要素の定義における化学基の列挙の記載は、いずれか単一の基または列挙された基の組合せとしてのその可変要素の定義を包含する。本明細書における可変要素または側面についての実施形態の記載は、単一の実施形態、または他の実施形態もしくはその一部分との組合せとしてのその実施形態を包含する。
【００７１】
本明細書で提供される組成物または方法は、本明細書で提供されるそれ以外の組成物および方法のいずれか1つ以上と組み合わされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図1A〜1Fは、出生後に膵島が酸化的な特徴を獲得することを示す。図1Aは、マウス新生仔（＜14日）および成体（＞12週）の膵島において、3mMおよび20mMのグルコースを用いた連続的灌流後の、グルコース刺激によるインスリン分泌を示すグラフである（アッセイ当たり10個の膵島、n=6）。図1Bおよび1Cは、出生後成熟のあいだのC57BL/6J膵島における転写変化のヒートマップである。図1Bは下方調節された遺伝子、図1Cは上方調節された遺伝子の、未処理（Row）Z-スコアを示す。図1Dは、qPCRにより測定された、単離膵島における相対的ERRガンマ（ERRγ）発現を示すグラフである。図1Eは、マウスの心臓、肝臓、白色脂肪組織（WAT）、膵臓全体、および単離膵島における相対的ERRガンマ発現を示す（n=4）。X-gal染色は、ERRガンマ-/-マウス由来の膵島におけるERRガンマ発現を示している（上部パネル）。図1Fは、qPCRにより測定された、出生後膵島成熟のあいだのLdhaおよび選択されたミトコンドリア代謝遺伝子の相対的発現を示す（n=3、データは平均±s.e.m.を表す。*p<0.01ステューデントの独立t検定。2wksは2週、6 wksは6週、12 wksは12週である）。
【００７３】
【図２】図2A〜2Cは、新生仔の膵島と成体の膵島との間の転写変化を示す。図2Aは、2、6、および12週齢のC57BL/6Jマウスからの膵島における膵臓系譜遺伝子の発現変化のヒートマップである。図2Bは、ジーンオントロジー（GO）により決定された、新生仔（2週齢）の膵島において豊富な生物学的経路を示す表である。図2Cは、ジーンオントロジー（GO）により決定された、成体（12週齢）の膵島において豊富な生物学的経路を示す表である。
【００７４】
【図３】図3Aおよび3Bは、出生後のベータ細胞発生のあいだにERRガンマが誘導されることを示す。図3Aは、第2週 および第12週（n=3）のマウスインスリンプロモーターGFP（MIP-GFP）膵島からのFACS選別細胞群における細胞型特異的マーカーの相対的発現を示す棒グラフである。図3Bは、第2週 および第12週（n=3）のマウスインスリンプロモーターGFP（MIP-GFP）膵島からのFACS選別細胞群におけるERRガンマおよび増殖マーカーPdgfRβの相対的発現を示す棒グラフである。
【００７５】
【図４】図4A〜4Dは、ベータ細胞特異的ERRガンマノックアウト（knockout）マウスの表現型決定を示す。図4Aは、qPCRにより測定された、ERRγlox/lox（WT）およびβERRγKOマウスからの単離膵島および組織におけるERRガンマの相対的発現を示す棒グラフである。図4Bは、WT、βERRγKO、およびWT（RIP-Cre）マウスの体重の発生学的変化を記述する棒グラフである。図4Cは、雄マウスにおける自由摂食血中グルコースレベルの発生学的変化を記述する線グラフである。図4Dは、雌マウスにおける自由摂食血中グルコースレベルの発生学的変化を記述する線グラフである。
【００７６】
【図５】図5A〜5Kは、ベータ細胞特異的ERRガンマ欠損マウスはグルコース不耐容であったことを示す。図5Aは、通常固形飼料食餌（NCD：normal chow diet）で飼育されたERRγlox/lox（WT）およびβERRγKOマウスの、腹腔内グルコース負荷試験（IP-GTT：intra-peritoneal glucose tolerance test）の結果を記述する線グラフである（WT n=8、βERRγKO n=6）。図5Bは、高脂肪食餌（HFD：high fat diet）で飼育されたERRγlox/lox（WT）およびβERRγKOマウスの、腹腔内グルコース負荷試験（IP-GTT）の結果を記述する線グラフである（WT n=7、βERRγKO n=9）。図5Cは、NCDで飼育されたERRγlox/lox（WT）およびβERRγKOマウスの、腹腔内インスリン負荷試験（IP-ITT：intra-peritoneal insulin tolerance test）の結果を示す線グラフである（WT n=4、βERRγKO n=5）。図5Dは、NCD給餌マウスのグルコース刺激によるインスリン分泌を記述する線グラフである（WT n=4、βERRγKO n=12）。図5Eは、HFD給餌マウスのグルコース刺激によるインスリン分泌を記述する線グラフである（4週間HFD、WT n=6、βERRγKO n=6）。図5Fは、HFD給餌WT（上部パネル）およびβERRγKO（下部パネル）マウス由来の、インスリン（緑）およびグルカゴン（赤）について染色された単離膵島を示す画像を記載している。図5Gは、単離膵島のインスリン含量を示す棒グラフである（WT n=17およびβERRγKO n=19）。図5Hは、アデノウイルス-EGFP（Ad-EGFP）およびアデノウイルス-Cre（Ad-Cre）で感染させたERRγlox/lox膵島におけるERRγおよびインスリン2（Ins2）の相対的発現を示す棒グラフである。図5Iは、アデノウイルス-EGFP（Ad-EGFP）およびアデノウイルス-Cre（Ad-Cre）で感染させたERRγlox/lox膵島のエクスビボ（生体外）GSISアッセイを記述する棒グラフである。図5Jは、アデノウイルス-EGFP（Ad-EGFP）およびアデノウイルス-Cre（Ad-Cre）で感染させたERRγlox/lox膵島における酸素消費（OCR）を示す線グラフである。図5Kは、ERRγ欠損が、栄養分に応答するインスリン分泌を妨害したことを示す棒グラフである。このグラフは、栄養分（グルコース、ロイシン、およびグルタミン）ならびにKClに応答したERRγlox/lox（WT）およびPERRγKO膵島からのエクスビボインスリン分泌についてのデータを記述している。
【００７７】
【図６】図6A〜6Gは、ベータ細胞特異的ERRガンマの欠損がグルコース不耐性を引き起こしたことを示している（図5A〜5Jに関連する拡張データ）。図6Aは、通常固形飼料食餌（NCD）で給餌されたERRγlox/lox（WT、n=8）、βERRγKO（n= 6）、およびRIP-Cre（WT（RIP-Cre）、n= 3）マウスにおける腹腔内グルコース負荷試験（IP-GTT）の結果を示す線グラフである。図6Bは、高脂肪食餌（HFD）で4週間飼育された後の腹腔内グルコース負荷試験（IP-GTT）の結果を記述する線グラフである。図6Cは、通常固形飼料食餌（NCD；WT、n=4、βERRγKO、n=5）で給餌された、および高脂肪食餌（HFD；WT、n=8、βERRγKO、n=8）で4週間飼育された後の、WTおよびβERRγKOマウスの腹腔内インスリン負荷試験（IP-ITT）を記述する線グラフである。図6Dは、通常固形飼料食餌（NCD；WT n=4、βERRγKO n=12、WT（RIP-Cre）、n=5）下のインビボでのグルコース刺激によるインスリン分泌（GSIS：glucose-stimulated insulin secretion）を記述する線グラフ（左パネル）および棒グラフ（右パネル）を記載している。図6Eは、それぞれ、4週間の高脂肪食餌（HFD；WT n=6、βERRγKO n=6、およびWT（RIP-Cre）、n=6）後のインビボでのグルコース刺激によるインスリン分泌（GSIS）を記述する線グラフ（左パネル）および棒グラフ（右パネル）を記載している。棒グラフは曲線下面積（AUC）を示す。図6Fは、WTおよびタモキシフェン誘導性ベータ細胞特異的ERRガンマKO（βERRγKO ER；ERRγlox/lox x RIP-creER）に由来する単離膵島におけるERRガンマ発現を示すグラフである。図6Gは、タモキシフェン（Tam）処理後のWT（n=9）およびβERRγKO ER（n=11）マウスのIP-GTTの結果を示す線グラフである。データは平均s.e.m.として示されている。
【００７８】
【図７】図7A〜7Dは、膵臓特異的ERRガンマ欠損がグルコース不耐性を引き起こしたことを示している。図7Aは、16週齢の雄のERRガンマlox/lox（WT）および膵臓特異的ERRガンマKO（PERRγKO；ERRγlox/lox x PDX1-Cre）マウスの体重を示す棒グラフである。図7Bは、通常固形飼料食餌（NCD、n=6〜10）で給餌された16週齢の雄のWTおよびPERRγKOマウスの腹腔内グルコース負荷試験（IP-GTT）を示す線グラフである。データは平均±s.e.m.である。*p<0.01ステューデントの独立t検定。図7Cは16週齢の雌のERRγlox/lox（WT）および膵臓特異的ERRガンマKO（PERRγKO；ERRγlox/lox x PDX1-Cre）マウスの体重を示す棒グラフである。図7Dは、通常固形飼料食餌（NCD、n=6〜10）で給餌された16週齢の雌のWTおよびPERRγKOマウスの腹腔内グルコース負荷試験（IP-GTT）の結果を示す線グラフである。データは平均±s.e.m.である。*p<0.01ステューデントの独立t検定。
【００７９】
【図８】図8A〜8Fは、HFD給餌βERRγKO膵島は肥大性であったことを示す。図8Aは、通常固形飼料食餌（NCD）または高脂肪食餌（HFD）で給餌したERRγlox/lox（WT）およびβERRγKOマウス由来の膵島の免疫染色（インスリン、緑、およびグルカゴン、赤）の画像を示す。図8Bは、通常固形飼料食餌（NCD）または高脂肪食餌（HFD）で給餌したERRγlox/lox（WT）およびβERRγKOマウス由来の膵島の、ヘマトキシリンおよびエオシン（H&E）染色の画像を示す。図8Cは、通常固形飼料食餌（NCD）で給餌したWTおよびβERRγKOマウス由来の膵島のインスリン含量を示す棒グラフである。図8Dは、高脂肪食餌（HFD）で給餌したWTおよびβERRγKOマウス由来の膵島のインスリン含量を示す棒グラフである。図8Eは、図8Dからの膵島サイズの平均面積を示す棒グラフである（WT、n=5；βERRγKO、n=5）。図8Fは、図8Dの膵島サイズの頻度分布を示す棒グラフである（WT、n=5；βERRγKO、n=5）。データは平均±s.e.m.である。*p<0.01ステューデントの独立t検定。
【００８０】
【図９】図9A〜9Dは、ERRガンマがINS-1細胞においてGSISおよび生体エネルギー論（bioenergetics）に影響したことを示す。図9Aは、スクランブル化（対照）またはERRガンマ標的化siRNAでトランスフェクトしたINS-1細胞における相対的ERRガンマ発現の棒グラフである。図9Bは、スクランブル化（対照）またはERRガンマ標的化siRNAでトランスフェクトしたINS-1細胞におけるグルコース刺激によるインスリン分泌（GSIS）の棒グラフである。図9Cは、スクランブル化（対照）またはERRガンマ標的化siRNAでトランスフェクトしたINS-1細胞における細胞ATPレベルの棒グラフである。図9Dは、スクランブル化（対照）またはERRガンマ標的化siRNAでトランスフェクトしたINS-1細胞における細胞生体エネルギー論の散布グラフである。*p<0.01ステューデントの独立t検定。
【００８１】
【図１０】図10A〜10Hは、膵島ERRガンマノックアウトが膵島の機能的成熟を妨害したことを示す。図10Aは、ERRγlox/lox（WT）およびβERRγKO（ERRγlox/lox x RIP-Cre）膵島（n=8）からのベータ細胞におけるミトコンドリア形態を示す2つの電子顕微鏡画像を記載する。図10Bは、ERRγlox/lox（WT）およびβERRγKO（ERRγlox/lox x RIP-Cre）膵島（n=8）からのベータ細胞におけるミトコンドリア数を記述する棒グラフである。図10Cは、ERRγlox/lox（WT）およびβERRγKO（ERRγlox/lox x RIP-Cre）膵島（n=8）からのベータ細胞におけるミトコンドリア体積を記述する棒グラフである。図10Dは、ジーンオントロジー（GO）により同定された、βERRγKO膵島における調節不全の生物学的機能カテゴリーの表である。図10Eは、qPCRにより測定された、βERRγKO（左パネル）および膵臓ERRγKO（ERRγlox/lox x PDX1-Cre、PERRγKO、右パネル）膵島における代謝系遺伝子の相対的発現を示す、2組の棒グラフを記載する。図10Fは、膵島の機能的成熟のあいだの遺伝子発現レベル（未処理Z-スコア）のヒートマップを、βERRγKO膵島と比較したものである。図10Gは、βERRγKO膵島における、選ばれた代謝系遺伝子および分泌／エキソサイトーシス経路遺伝子の発現変化のヒートマップである。図10Hは、ERRγKO膵島における改変された遺伝子発現を示す。図10Hは、βERRγKO膵島において発現が変化（未処理Z-スコア）した、471個の階層クラスター化された遺伝子のヒートマップを、WTマウスにおける出生後発生学的変化と比較して記載している。
【００８２】
【図１１】図11は、ERRγ欠損ベータ細胞のゲノム分析の模式図である。ERRγlox/lox（WT、n=3）マウスおよびβERRγKO（n=3）マウスからの膵島間の転写変化を、アデノウイルスEGFPまたはCre感染（n=10）後のWT膵島間の変化と比較した。
【００８３】
【図１２】図12Aおよび12Bは、ERRガンマが出生後膵島成熟を直接制御することを示す。図12Aは、βERRγKO膵島における140個の下方調節遺伝子および149個の上方調節遺伝子において同定されたERR応答エレメントの模式図を記載している。図12Bは、マウスのインスリノーマ細胞株（MIN-6細胞）における、表示された遺伝子についてのChIPアッセイを記述する棒グラフである。*p<0.01ステューデントの独立t検定。
【００８４】
【図１３】図13A〜13Kは、ERRガンマがヒトiPSC由来ベータ様細胞の成熟を促進させることを示す。図13Aは、iPSC由来ベータ様細胞の生成についてのプロトコールを要約した模式図である（ED、内胚葉；PP、膵臓前駆細胞；iβL、iPSC由来ベータ様細胞；iβeta、ERRガンマ発現iPSC由来ベータ様細胞）。図13Bは、iPSC分化のあいだのヒトインスリンの相対的発現を示す棒グラフである。図13Cは、第22日のベータ様（iβL）細胞のヒトインスリンレポーターによるGFP発現（左パネル）および位相差画像（右パネル）の2つの画像を記載する。図13Dは、アデノウイルス感染後のiβL細胞の細胞内（左）および細胞外（右）c-ペプチド濃度の2つの棒グラフを記載する：Ad-EGFP感染、iβLGFP細胞、開放バー、Ad-ERRγ感染、iβeta細胞、赤色バー。図13Eは、iβL細胞、iβLGFP細胞、iβeta細胞、およびヒト膵島における、誘導されたc-ペプチド分泌を示す散布グラフである。図13Fは、ジーンオントロジー（GO）により同定された、iβeta細胞における上方調節遺伝子カテゴリーの機能予測を示す表である。図13Gは、iβLGFPおよびiβeta細胞における、公知ベータ細胞マーカー遺伝子（左）および代謝系遺伝子（右）の発現変化の2つのヒートマップを記載する（未分化iPSCに対するlog2比）。図13Hは、iβLGFPおよびiβeta細胞におけるミトコンドリア形態およびインスリン顆粒（右パネル）を示す2つの電子顕微鏡画像を記載する。図13Iは、酸素消費速度（OCR：oxygen consumption rate）により測定される、iβLGFPおよびiβeta細胞の酸化能を記述する線グラフである。図13Jは、β細胞マーカー発現がERRγから独立していたことを示す4つの線グラフである。これらのグラフは、未分化iPSCs、iβLおよびiβeta（ERRγ発現性）細胞におけるNkx6-1およびMafAの発現を示している。図13Kは。ERRγが代謝系遺伝子の発現を誘導したことを示す11個の散布グラフを有している。qPCRにより決定された、ヒト膵島との比較によるiβLGFP細胞およびiβeta細胞における代謝系遺伝子の発現。
【００８５】
【図１４】図14は、分化中のヒトiPSCにおける14の遺伝子の発現プロファイルを示す一連の棒グラフである。ベータ様細胞への分化の際のiPSCにおける、多能性マーカー（Nanog）、内胚葉マーカー（SOX17）、膵臓前駆細胞マーカー（HNF1β）、初期内分泌マーカー（SOX9）、および内分泌／ベータ細胞マーカー（インスリン、PDX1、MAFA、NEUROD、GCK、PAX6、VAMP2、GCG、SST、CHGA）の相対的発現が記述されている。
【００８６】
【図１５】図15A〜15Hは、iPSC由来ベータ様細胞の機能的特徴付けを記述する。図15Aは、iPSC由来ベータ様（iβL）細胞において、ヒトインスリンレポーターGFP発現（緑、中パネル）および核染色（DAPI青、右パネル）と比較した、PDX1、c-ペプチド、およびPC1/3（赤、左パネル）についての免疫組織化学染色の画像を記載している。図15Bは、第30日のβ様（iβL）細胞の、ヒトインスリンレポーター駆動GFP発現（上パネル）および位相差画像（下パネル）を示す。図15Cは、FACS（n=8）により測定された、ヒトインスリンレポーター駆動GFPを発現するiβL細胞のパーセンテージを示す散布グラフである。代表的なFACS分析を右側に示す。図15Dは、iPSCおよびiβL細胞における、インスリン（GFP）およびグルカゴンの発現の代表的FACS分析を示す2つのグラフを有している。図15Eは、iβL細胞（第22日）およびマウス一次β細胞の代表的な電子顕微鏡分析を記載している（選ばれたミトコンドリアおよびインスリン顆粒を矢印で示す）。図15Fは、iβL細胞からのグルコースおよびカリウム刺激によるc-ペプチド分泌を記述する棒グラフである。図15Gは、ヒト膵島、アデノウイルスEGFP発現を有するベータ様細胞（iβLGFP細胞）、およびアデノウイルスERRガンマ発現を有するベータ様細胞（iβeta細胞）における相対的ERRガンマ発現を示す棒グラフである。図15Hは、iβL細胞において増加したβ細胞マーカー発現を示す、代表的なFACS分析の6つのグラフのセットである。FACSにより測定された、iPSCおよびiβL細胞におけるインスリン（GFPレポーター）およびNkx6-1またはMafAの共発現。IgGを陰性対照として示す。
【００８７】
【図１６】図16は、iβeta細胞において下方調節された経路を示す表（左パネル）およびヒートマップ（右パネル）を記載している。表は、ジーンオントロジー（GO）により同定された、iβeta細胞における下方調節遺伝子カテゴリーの機能予測を記述している。ヒートマップは、細胞周期に関与する、選ばれた遺伝子の発現変化を記述している。
【００８８】
【図１７】図17は、細胞移植実験の模式図である。
【００８９】
【図１８】図18A〜18Eは、iβeta細胞が糖尿病マウスにおいてグルコース恒常性を回復させたことを示す。図18Aは、疑似（mock）移植（n=3）、iβeta細胞移植（n=5）およびマウス膵島移植（200膵島／マウス、n=5）後の、STZ誘導性高血糖NOD-SCIDマウスにおける自由摂食血中グルコースレベルに対する急性の効果を示す線グラフである。図18Bは、疑似移植（n=3）、iβLGFP細胞の移植（n=14/12；2匹のマウスは第2週で死亡した）、iβeta細胞の移植（n=13）、マウス膵島の移植（200膵島／マウス、n=5）、およびヒト膵島の移植（500膵島／マウス、n=2）の後の、自由摂食血中グルコースレベルに対する慢性の効果を記述する線グラフである。（n=4）およびSTZ-NOD-SCIDマウスへのiβeta細胞移植（n=4）。図18Cは、表示された移植後において、グルコース負荷の前および15分後のヒトc-ペプチドレベルを示す棒グラフである。図18Dは、疑似移植（n=4）およびiβeta細胞移植（n=4）STZ-NOD-SCIDマウスの60日後の酸素消費（VO2）、二酸化炭素産生（VCO2）、呼吸交換比（RER：Respiratory Exchange Ratio）、および移動動作（ambulatory motion）（X-ビームブレーク）を示す4つの線グラフを記載している。図18Eは、成体ベータ細胞およびiβeta細胞の機能的成熟を描いた模式図である。
【００９０】
【図１９】図19Aおよび19Bは、インビボ移植実験を示すグラフである。図19Aは、移植後6日間における、疑似移植（n=3）、iβLGFPの移植（n=8）、iβeta細胞の移植（n=7）、およびマウス膵島の移植（200膵島／マウス、n=5）後のSTZ誘導性高血糖NOD-SCIDマウスにおける自由摂食血中グルコースレベルを示す線グラフである。図19Bは、移植後8週に渡る、疑似移植（n=3）、iβLGFPの移植（n=14/12；2匹のマウスは第2週で死亡した）、iβeta細胞の移植（n=13）、マウス膵島の移植（200膵島／マウス、n=5）およびヒト膵島の移植（n=2、#13 & #14ヒト膵島）後のSTZ誘導性高血糖NOD-SCIDマウスにおける自由摂食血中グルコースレベルを示す線グラフである。
【００９１】
【図２０】図20は、iβeta細胞によるグルコース低下効果の多様性を示す散布グラフである。このグラフは、図19Bで記述された個々のマウスの血中グルコースレベルを示している。
【００９２】
【図２１】図21は、移植マウスにおける腎臓の免疫組織化学（IHC：immunohistochemistry）を示す。図21は、インスリン（赤）およびDAPI（青）について染色した、移植後2ヶ月の腎臓の代表的IHCの6つの画像を有している。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
［表の一覧］
表1：図1Bおよび1Cに関係する遺伝子リスト。
表2：新生児および成体の膵島における膵臓系譜特異的遺伝子発現についての遺伝子リスト。
表3：図10D〜10Fに関係する遺伝子リスト。
表4：iβeta細胞において上方調節された経路および下方調節された経路の代表的なもののリスト。
表5：ヒト膵島に関する追加的情報。
表6：プライマー情報。
表7：インスリン産生細胞についてのステップ毎の分化プロトコールおよび小分子情報。
【００９４】
［発明の詳細な説明］
本発明は、グルコース刺激によるインスリン分泌の能力を有するインビトロ生成ベータ細胞を含む組成物、胚性幹細胞もしくは人工多能性幹細胞に由来するベータ様細胞またはヒト脂肪由来幹細胞（ADSC）からベータ細胞成熟を誘導する方法、および、1型糖尿病、2型糖尿病、または関連障害の治療のためにインビトロ生成ベータ細胞を使用する方法を提供する。
【００９５】
本発明は、オーファン核内受容体であるエストロゲン関連受容体（ERR）ガンマがベータ細胞代謝とインスリン分泌を制御するという発見に少なくとも部分的に基づく。下記においてより詳細に報告するように、ERRガンマおよびERRガンマ標的ミトコンドリア遺伝子の発現は、出生後の膵島発生の際に増加する。ベータ細胞特異的ERRガンマノックアウトマウスは、インスリン分泌の減少と共に耐糖能障害を示した。ゲノム全体でのトランスクリプトーム解析は、ERRガンマ欠損が、ベータ細胞成熟の際に増強されるエネルギー代謝に関与する遺伝子調節ネットワークを崩壊させたことを明らかにした。
【００９６】
加えて、ヒトiPSC由来インスリン陽性ベータ様細胞は、インスリンプロモーター活性およびインスリン遺伝子発現の活性化、ならびに他のベータ細胞マーカーの発現を示したが、これらの細胞はグルコース応答性ではなく、ERRガンマあるいはミトコンドリア遺伝子の発現をほとんど示さなかった。強制的なERRガンマ発現は、グルコース刺激によるc-ペプチド分泌を著しく増加させ、iPSC由来ベータ細胞様細胞におけるミトコンドリア活性も増加させた。重要なことに、ヒトiPSC由来β様細胞におけるERRγの過剰発現は、機能的な、グルコース応答性β細胞（iPSC由来β ERRγ移植可能活性細胞、iβeta細胞：iPSC-derived β ERRγ transplantable active cells）を生じた。さらに、これらのiβeta細胞の移植は、1型糖尿病マウスモデルにおいてグルコース恒常性を回復させることができた。これらの結果は、ベータ細胞成熟と関連するグルコース刺激によるインスリン分泌の機能を獲得するうえでの、ERRガンマの重要な役割を明らかにした。
【００９７】
［ベータ細胞成熟］
若齢／新生児のヒトおよびげっ歯類ベータ細胞は、グルコース刺激によるインスリン分泌（GSIS）の機能が乏しい。ベータ細胞成熟の過程で、新生児細胞は、グルコース刺激に応答してインスリンを分泌する能力を発達させる。発生の過程で、ベータ細胞は、グルコースに応答してインスリンを強く分泌する能力を獲得する。従って、ベータ細胞は、機能的ベータ細胞成熟期間のあいだにインスリン分泌を獲得する。完全に機能的なベータ細胞は寿命が長く、インスリン産生および栄養摂取（例えばアミノ酸、遊離脂肪酸、およびグルコースの摂取）に応答した分泌を制御することにより、全身のグルコース恒常性を緊密に制御する。インスリンは、肝臓、骨格筋、および脂肪のような末梢組織において脂質合成およびグルコース取り込みを促進させるので、ベータ細胞機能の喪失が1型および2型の両方の糖尿病につながることは驚きではない。
【００９８】
機能的ベータ細胞は、グルコース、アミノ酸、および脂肪酸の形態による食事摂取に応答してインスリン分泌を促進させるためにミトコンドリアATP産生に対する高い要求を有するため、高度に代謝性の細胞であると考えられる。ベータ細胞グルコース代謝は、以下の特別な特徴を有する：（１）グルコース輸送が律速的でない。このことは、細胞外と細胞内のグルコース濃度の迅速な同等化をもたらす。この同等化は、げっ歯類ではGlut-2、ヒトではGlut-1によって実行される。（２）解糖が、グルコースに対して低い親和性を有するヘキソキナーゼのアイソフォームであるグルコキナーゼ（GK：glucokinase）によって制御される。（３）ベータ細胞のグルコース刺激は、解糖がミトコンドリア代謝と緊密に相関しており、ミトコンドリアへのピルビン酸（解糖により作られる産物）の定量的流入をもたらすことを明らかにする。これは、低いレベルの乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH：lactate dehydrogenase）およびモノカルボン酸トランスポーター（MCT：monocarboxylate transporter）により促進されて、グルコース炭素がピルビン酸に転換されることがもたらされ、そのピルビン酸はクエン酸回路および増強された酸化的リン酸化において主に使用される。すなわち、グルコース刺激によるインスリン分泌は、グルコースに応答した酸化的ATP産生の増加と関連している。
【００９９】
［エストロゲン関連受容体］
核内受容体は、リガンド依存性転写因子の特化されたファミリーであり、発生、成長、および代謝の制御において中心的役割を果たす。それらは、保存されたジンクフィンガーDNA結合ドメインと、複数の調節機能を付与することができるC-末端リガンド結合ドメイン（LBD ：ligand-binding domain）によって定義される。エストロゲン関連受容体は、核内受容体のファミリー内のオーファン核内受容体であり、哺乳類ではERRα（NR3B1、Esrra）、ERRβ（NR3B2、Esrrb）およびERRγ（NR3B3、Esrrg）という3つのパラログにより体現される。これらの受容体に対する天然のリガンドは知られていないが、ERRβは胚性幹細胞維持において重要な役割を果たす。ERRαとERRγは、酸化的トリカルボン酸（TCA：tricarboxylic acid）経路、電子伝達複合体（ETC：electron transport complex）、および酸化的リン酸化（OXPHOS：oxidative phosphorylation）のようなプロセシングに関与する代謝系遺伝子を制御することが知られている。ERRαとERRγは重要なミトコンドリア代謝制御因子である。マウスにおける遺伝学的研究により、ERRαとERRγの異なる役割が示されてきた。全身におけるERRαノックアアウト（ERRαKO）を有するマウスは、著しい発生異常は有さないが、痩身であり、高脂肪食事誘導性肥満に対して抵抗性である。対照的に、全身におけるERRγノックアアウト（ERRγKO）を有するマウスは、出生後最初の週において致死的である著しい発生異常を有する。これらの異常は、ERRγKOマウスが、増加する出生後炭水化物利用に関連する、胎仔から出生後への心臓における代謝転換を経ることができないことに関連している。
【０１００】
ベータ細胞は高いミトコンドリア代謝活性を有しており、これがグルコースおよびその他の形態の栄養分に応答してインスリンを分泌することを可能にすることはよく知られているが、ベータ細胞の代謝およびインスリン分泌を制御する転写ネットワークはほとんど理解されていない。さらに、ヒト多能性幹細胞由来のインスリン産生ベータ様細胞はグルコースに応答してインスリンを分泌しない。今日まで、グルコース応答性ベータ様細胞を産生した者はいなかった。
【０１０１】
下記においてより詳細に報告するように、本発明は、胎児／新生児から成体へのベータ細胞成熟のための代謝制御経路を同定する。ERRガンマおよび関連遺伝子の発現はこの期間のあいだ増加する。ベータ細胞特異的ERRガンマ欠損（βERRγKO）マウスは、グルコース不耐性と共に、通常固形飼料食餌（NCD）および高脂肪食餌（HFDの条件におけるグルコース刺激によるインスリン分泌（GSIS）の減少を示した。βERRγKO膵島では、ATP生合成経路およびOxPhosに関与する遺伝子の制御の崩壊が見られる。重要なことに、ERRガンマの過剰発現は、ベータ様細胞においてグルコースに応答したATP産生を増加させ、ベータ様細胞がミトコンドリア代謝活性を上昇させグルコース刺激によるインスリン分泌を示すこと（機能的ベータ細胞の2つの特徴である）を引き起こした。ベータ様細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC：human induced pluripotent stem cells）から、および、ヒト脂肪由来幹細胞（hADSC：human adipose-derived stem cells）から直接、産生された。これらの結果は、ERRガンマシグナル伝達を介した代謝成熟は、おそらく、ベータ細胞の代謝成熟の要因となる転写経路であることを示唆している。これらの結果は、hiPSC、hADSCおよびその他の幹細胞のような細胞においてERRガンマを過剰発現することによって、そのような細胞から機能的なグルコース応答性ヒトベータ細胞を産生することを提供する。
【０１０２】
［ERRガンマ過剰発現］
本発明は、ベータ様細胞においてERRガンマを過剰発現することによってベータ様細胞をリプログラミングし、ベータ様細胞がグルコース刺激によってインスリンを分泌できるようにするための方法を提供する。典型的には、ERRガンマの過剰発現は、ミトコンドリア代謝活性の上昇にも関連する。
【０１０３】
ウイルス性（例えば、レトロウイルス性、アデノウイルス性、およびアデノ随伴ウイルス性）ベクターを形質導入することは、特にそれらの高い感染効率および安定した組み込みと発現ゆえに（例えばCayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996;およびMiyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997を参照）、細胞でERRガンマを発現させることに使用することができる。例えば、ERRガンマポリペプチド、バリアント、またはその断片をコードするポリヌクレオチドを、レトロウイルスベクター中にクローニングすることができ、その内因性のプロモーターから、またはレトロウイルスの末端反復長配列から、または目的とする標的細胞型（例えば膵島ベータ細胞）に特異的なプロモーターから、発現を駆動することができる。本発明の方法において有用な例示的なプロモーターには、ヒトインスリンプロモーター、インスリンIIプロモーター、ならびに、膵島ベータ細胞のような膵性組織において発現されるPdx1、Mafa、Nkx6-1、Pax4およびNeuroD1のようなその他のプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明の方法において使用し得るその他のウイルスベクターとしては、例えば、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはエプスタイン・バーウイルスのようなヘルペスウイルスが挙げられる（例えば、Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993;およびJohnson, Chest 107:77S-83S, 1995のベクターも参照）。レトロウイルスベクターは特によく開発されており、臨床的設定において使用されてきた（Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson et al., 米国特許第5,399,346号）。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクター（例えばセロタイプ2）を使用してベータ様細胞にポリヌクレオチドを投与し、このベータ様細胞には、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞に由来するもの、または、ベータ様細胞を生じることができるその他の細胞型に由来するものが含まれる。
【０１０５】
多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞に由来するベータ様細胞、または、ベータ様細胞を生じることができるその他の細胞型に由来するベータ様細胞にERRガンマポリヌクレオチドを導入するために、非ウイルス性アプローチを利用することもできる。例えば、リポフェクションの存在下で核酸を投与することによって（Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983）、またはアシアロオロソムコイド-ポリリジン結合体によって（Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989）、または外科的条件下での微量注入によって（Wolff et al., Science 247:1465, 1990）、細胞に核酸分子を導入することができる。一実施形態では、核酸はリポソームおよびプロタミンとの組合せで投与される。
【０１０６】
インビトロのトランスフェクションが関わる非ウイルス性手段を使用して遺伝子導入を達成することもできる。そのような方法としては、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、電気穿孔法、およびプロトプラスト融合の使用が挙げられる。リポソームも、細胞（例えば、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞に由来するベータ様細胞、または、ベータ様細胞を生じることができるその他の細胞型に由来するベータ様細胞）中へのDNAの送達のために潜在的に有利であり得る。エクスビボで培養可能細胞型（例えば自家性もしくは異種性の一次細胞またはその子孫）に通常の核酸を導入し、その後その細胞（またはその子孫）を標的組織（例えば膵臓組織）に注入する、またはカニューレを介して送達することによっても、ERRガンマポリヌクレオチドの移植を達成することができる。ヒト膵島は、セラサイト（Theracyte）（米国セラサイト社）のような免疫反応保護装置を用いてまたは用いないで、皮下皮膚または脂肪および腎臓において生存し得る。細胞は、ヒト膵島移植のためのものと同様の方法を用いて移植され得る。
【０１０７】
ポリヌクレオチド療法における使用のためのcDNA発現は、任意の適当なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（CMV：cytomegalovirus）、サルウイルス40（SV40：simian virus 40）、またはメタロチオネインのプロモーター）から誘導することができ、任意の適切な哺乳類調節エレメントによって調節することができる。例えば、所望であれば、特定の細胞型（例えば、膵臓細胞、ベータ細胞）において優先的に遺伝子発現を誘導することが知られるエンハンサーを使用して核酸の発現を誘導することができる。使用されるエンハンサーには、組織特異的または細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものが含まれ得るが、それらに限定されない。あるいは、治療用コンストラクトとしてゲノムクローンが使用される場合は、同系（cognate）の調節配列によって、または、所望であれば、異種性の供給源に由来する調節配列によって、調節を媒介させることができ、これらには上述したあらゆるプロモーターまたは調節エレメントが含まれる。
【０１０８】
［ベータ様細胞］
本発明の方法において有用な細胞としては、ベータ細胞またはベータ細胞前駆体において典型的に発現されるマーカーを発現する、実質的にあらゆる細胞型が挙げられる。特定の実施形態において、本発明において有用な細胞は、ERRガンマの過剰発現によって、グルコース刺激によるインスリン分泌を獲得するように誘導することができる。
【０１０９】
特定の実施形態において、本発明において有用な細胞には、1つ以上の膵島ベータ細胞マーカー、内分泌マーカー、もしくはベータ細胞転写因子を発現するか、またはそれらを発現するように誘導できる、成体もしくは胚性幹細胞、またはその他の複能性もしくは多能性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。例示的なベータ細胞転写因子としては、Pdx1、Mafa、Mafb、Nkx6.1、NeuroD1、Foxa2、Hnf4a、Nkx2.2、Pax6、およびHNF4aが挙げられる。特定の実施形態において、ベータ細胞転写因子は、新生児膵島細胞と比較して成体膵島細胞においてより高いレベルで発現される因子である。新生児膵島細胞と比較して、成体膵島においてより高いレベルで発現されるベータ細胞転写因子としては、Pdx1、MafA、およびNkx6-1が挙げられる。他の実施形態では、ベータ様細胞は、インスリン1、インスリン2、α-細胞マーカーグルカゴン、およびδ-細胞マーカー、ソマトスタチンを含むがこれらに限定されないベータ細胞マーカーを発現する。他の実施形態では、ベータ様細胞は、インスリン1、インスリン2、グルカゴン、およびソマトスタチンを含むがこれらに限定されない内分泌マーカーを発現する。
【０１１０】
特定の実施形態では、ヒト人工多能性幹細胞はHuvec（iPSC）から、または胚性幹細胞（H9ES）から誘導される。本発明の細胞は、例えば、マトリゲル（BD）コーティング皿上で、その細胞の成長または維持をサポートする実質的にあらゆる培養培地（例えば完全TeSR培地）中で維持され得る。膵臓分化のためには、hPCは、ヒトインスリンレポーターレンチウイルス（pGreenZeroレンチレポーターヒトインスリン、System biosciences）で、またはその他の標準的トランスフェクション方法を使用して、感染される。
【０１１１】
一実施形態では、膵臓分化は、特製TESR（FGF2およびTGFβを含まないTeSR中のアクチビン（例えば50〜100ng/mlヒトアクチビン（シグマ））、Wnt3a（例えば25ng/ml組換えヒトWnt3a（シグマ））で2日間細胞を処理し、それから特製TESR中のアクチビン（例えば100ng/mlヒトアクチビン）でさらに2日間処理することにより誘導される（ステージ1）。
【０１１２】
次に、2% BSA、1% NEAA、1%グルタマックスで補足された培養培地（例えばDMEM）（基礎培地）であって1μMのドルソモルフィン（カルバイオケム）、2μMのレチノイン酸（シグマ）、任意で50ng/mlの組換えヒトFGF10（R&D systems）、および10μMのSB431542を伴うものに、培地を7日間に渡って置き換えた（ステージ2）。それから、例えば10μMのフォルスコリン（シグマ）、10μMのデキサメタゾン（Stemgent）、5μMのTGFβ、RIキナーゼ阻害剤II（カルバイオケム）、10mMのニコチンアミド（シグマ）を含有する基礎培地に、培地を10日間に渡って置き換えた（ステージ1）。培地は、1日毎（ステージ1）、1日毎または2日毎（ステージ2）、および2日毎（ステージ3）に置き換えた。これらの処理方法は、ERRガンマを過剰発現するように改変できるベータ様細胞の産生をもたらす。一実施形態では、ベータ様細胞は、例えばWelgen社から購入されたアデノウイルスERRガンマを用いて、形質導入される。
【０１１３】
本発明は、そのような方法を使用して産生されたベータ様細胞に限定されるのではなく、本技術分野で知られる実質的にあらゆるベータ様細胞を包含する。ベータ様細胞を産生するための方法は本技術分野において知られており、本明細書において記述される（例えば、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞が組換え技術により改変されてOct4、Nanog、Sox17、FoxA2、Pdx1、Nkx6.1、および／またはNgn3のうちのいずれか1つ以上を発現するようにされる場合）。そのような方法により生成されたベータ様細胞は、以下のマーカーのうちの1つ以上を発現する：インスリン、Pdx1、Mafa、Pax6、Glut2、NeuroD1、グルコキナーゼ、グルカゴン、ソマトスタチン、クロモグラニンA、およびVamp2。参照によりその全体が本明細書に組み入れられるPagliuca et al., Dev. 140:2472-2483, 2013も参照のこと。
【０１１４】
下記においてより詳細に報告するように、本研究は、胎生期解糖的（非機能的）ベータ細胞から成熟酸化的グルコース応答性ベータ細胞への正常な10〜12週間成熟過程のあいだの核内受容体（NR：nuclear receptor）ファミリーのメンバーおよびそれらの活性化補助因子の発現を決定した。これは、機能的ベータ細胞の正常な生理的成熟のあいだに発現が増加するいくつかの核内受容体の同定につながり、そこには、ERRガンマ、ERRアルファ、FXR、VDR、ならびにそれらの活性化補助因子PGC-1アルファおよびPGC-1ベータが含まれていた。
【０１１５】
この知見を利用して、これらの受容体と活性化補助因子の組合せを、Pdx1（膵臓と十二指腸のホメオボックス1、膵臓発生およびベータ細胞における公知の支配的調節転写因子）と組み合わせて、ヒト脂肪由来幹細胞（hADSC）で発現させた。このアプローチは、ERRガンマと合わせたPdx1の強制発現がhADSCから「機能的な」グルコース応答性ベータ細胞への直接的なリプログラミングを促進させる、新規2因子プロトコールの開発へとつながった。さらに、Pdx1とERRガンマとを伴ったPGC-1アルファの誘導発現を含む3因子プロトコールは、hADSC由来ベータ細胞におけるグルコース応答性上昇をもたらした。特筆すべきことに、Pax4のようなその他のベータ細胞成熟遺伝子と組み合わされたPdx1を伴うERRガンマの安定的な発現増強も、機能的なグルコース応答性ベータ細胞を産生した。しかしながら、ERRガンマの不存在下では、これらのベータ細胞成熟遺伝子の組合せは機能的なグルコース応答性ベータ細胞を生じることができなかった。これらの結果をまとめると、重要な適格性（competence）因子としてのERRガンマが同定される。これらの発見は、1型糖尿病およびインスリン依存性2型糖尿病の治療のための、免疫学的に適合性であって機能的である多量の膵臓ベータ細胞を産生することができるという点で、医学的および商業的価値の可能性を有している。
【０１１６】
［ERRガンマポリペプチドアナログ］
本発明はさらに、本発明のいずれかの天然ポリペプチドのアナログを包含する。アナログは、本発明の天然ポリペプチドと比べて、アミノ酸配列の違い、翻訳後修飾、またはその両方によって異なり得る。本発明のアナログは、一般的に、本発明の天然ERRガンマアミノ酸配列の全部または一部分と少なくとも85%、より好ましくは90%、そして最も好ましくは95%あるいは99%もの同一性を示すであろう。配列比較の長さは少なくとも5、10、15、または20アミノ酸残基であり、好ましくは少なくとも25、50、または75アミノ酸残基であり、より好ましくは100アミノ酸残基超である。ここでもやはり、同一性の程度を決定する例示的アプローチにおいてBLASTプログラムを使用することができ、e-3とe-100の間の蓋然性スコアが、密接に関係した配列を示す。修飾には、ポリペプチドのインビボおよびインビトロにおける化学誘導体化が含まれ、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、またはグリコシル化が含まれる。そのような修飾は、ポリペプチドの合成もしくはプロセシングの際に、または、単離された修飾酵素を用いた処理の後に、起こり得る。アナログは、一次配列の変化によっても本発明の天然ポリペプチドから異なり得る。これらには、自然の、または誘導された遺伝学的バリアント（例えば、放射線照射もしくはエタンメチルスルフェートへの暴露によるランダム変異誘発からもたらされるもの、または、Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), CSH Press, 1989もしくは上記Ausubel et al.に記述されているように部位特異的変異誘発によるもの）が含まれる。例えばD-アミノ酸または非天然もしくは合成アミノ酸（例えばベータまたはガンマアミノ酸）のような、L-アミノ酸以外の残基を含む環化ペプチド、分子、およびアナログも包含される。
【０１１７】
全長ポリペプチドに加えて、本発明は、本発明のポリペプチドまたはペプチドドメインのいずれか１つの断片も提供する。本明細書で使用される場合、「断片」という用語は、少なくとも5、10、13、または15アミノ酸を意味する。別の実施形態では、断片は、少なくとも20の連続するアミノ酸、少なくとも30の連続するアミノ酸、または少なくとも50の連続するアミノ酸であり、別の実施形態では、少なくとも60〜80、100、200、300またはそれより多数の連続するアミノ酸である。本発明の断片は、当業者に知られる方法により生成されてもよいし、あるいは、通常のタンパク質プロセシング（例えば、新生ポリペプチドからの、生物学的活性に必要とされないアミノ酸の除去、または、選択的mRNAスプライシングもしくは選択的タンパク質プロセシング事象によるアミノ酸の除去）からもたらされてもよい。
【０１１８】
アナログ設計の方法は本技術分野でよく知られており、アナログの合成は、そのような方法に従って、得られたアナログが基準ERRガンマポリペプチドのリプログラミング活性または再生活性を上昇させるように化学構造を改変することにより、行うことができる。これらの化学的改変としては、代替的R基を置換すること、および基準融合ポリペプチドの特定の炭素原子において飽和の程度を変えることが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ERRガンマタンパク質アナログは、インビボ分解に対して比較的抵抗性であり、投与されるとより長期に渡る治療効果をもたらす。機能的活性を測定するためのアッセイとしては、下記実施例に記述されるものが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１９】
［治療的方法］
本発明は、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症の治療、および、ベータ細胞数の欠乏（例えば、膵臓細胞の数の減少）またはベータ細胞の生物学的活性のレベルの不十分さ（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連するその他の代謝性疾患もしくは障害の治療を提供する。例えば、本発明は、インスリン産生性膵臓細胞の数または活性の減少により十分なレベルのインスリンを欠く糖尿病患者の治療のための組成物を提供する。細胞数の欠乏に関連する多くの疾患は、ベータ細胞の消失またはベータ細胞死の増加により特徴付けられる。本発明の方法は、その欠乏を補充することができる細胞（例えばインスリン発現細胞）を生成することにより、そのような1型糖尿病、2型糖尿病、および関連疾患、障害を寛解させる。そのような細胞は、ある細胞を目的の細胞型にリプログラミングすることから（例えばベータ様細胞、胚性幹細胞、人工多能性細胞のリプログラミング）、または、ベータ細胞、膵臓組織、もしくは臓器の再生を促進させることにより、生成される。一般的に、本発明は、細胞をリプログラミングするための方法を提供し、この方法には、その細胞（例えば、人工多能性幹細胞もしくは脂肪細胞由来幹細胞から誘導されるもののようなベータ様細胞、内皮細胞、膵臓細胞、およびそれらの前駆細胞または幹細胞）を、ERRガンマをコードするポリヌクレオチドに接触させ、それによってその細胞をリプログラミングすることが関わる。特定の実施形態では、ベータ様細胞におけるERRガンマの発現は、その細胞における少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、またはそれより多数のポリペプチドの発現レベルを変化させ、および／またはミトコンドリア代謝活性を増加させる。
【０１２０】
一実施形態では、ポリペプチドがインビトロでベータ様細胞に投与され、それからそのポリペプチド（またはそれらをコードする核酸分子）を含有する細胞が患者に投与されて、例えば1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症が寛解され、ベータ細胞数の欠乏（例えば膵臓細胞の数の減少）または不十分なレベルのベータ細胞生物学的活性（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連するその他の代謝性の疾患または障害が治療される。投与は、対象においてインスリン分泌性ベータ細胞の数を増加させるために十分である任意の手段によるものであってよい。様々な実施形態において、ERRガンマ発現細胞は、疾患もしくは損傷の部位への局所的注射によって、持続的点滴によって、または外科的状況下における微量注入によって、投与される（Wolff et al., Science 247:1465, 1990）。他の実施形態では、細胞の再生またはリプログラミングにより回復され得る細胞数欠乏を有する患者の組織または臓器に融合ポリペプチドが全身投与される。
【０１２１】
別のアプローチでは、ERRガンマが、エクスビボで、培養可能な細胞型（例えば自家性もしくは異種性の一次細胞またはその子孫）に導入され、その後その細胞（またはその子孫）が、疾患または損傷の部位において標的組織へと注入される。いくつかの実施形態では、細胞は、その生存、増殖、または生物学的活性を可能にする細胞マトリックス中に存在する。本発明に含まれる別の治療的アプローチには、ERRガンマ融合ポリペプチド（例えば、検出可能部分に融合されたERRガンマ）の投与が関わる。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明の治療性ポリペプチドは、（特にそれらの高感染効率ならびに安定した組込みおよび発現のために）体細胞遺伝子治療のために使用されるウイルス性（例えばレトロウイルス性、アデノウイルス性、およびアデノ随伴ウイルス性）ベクターにより形質導入された細胞において産生される（例えば、Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996; and Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997を参照）。例えば、本発明のERRガンマタンパク質をコードする核酸分子またはその一部分を、レトロウイルスベクター中にクローニングし、その内因性のプロモーターから、またはレトロウイルスの末端反復長配列から、または目的とする標的細胞型（例えば中枢神経系の細胞）に特異的なプロモーターから、発現を駆動することができる。使用され得る他のウイルスベクターとしては、例えば、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、またはエプスタイン・バーウイルスのようなヘルペスウイルスが挙げられる（例えばMiller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993;およびJohnson, Chest 107:77S-83S, 1995のベクターも参照）。レトロウイルスベクターは特によく開発されており、臨床的設定において使用されてきた（Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson et al.,米国特許第5,399,346号）。最も好ましくは、ウイルスベクターを使用して目的遺伝子が全身的に投与されるか、または、細胞リプログラミングもしくは再生の増加が求められる部位における細胞に投与される。
【０１２３】
本発明の選択された細胞は、単離後、治療的または予防的方法において利用され得る。従って、本発明は、例えば1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症を治療する方法、ならびに、ベータ細胞数の欠乏（例えば膵臓細胞の数の減少）もしくは不十分なレベルのベータ細胞生物学的活性（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連するその他の代謝性の疾患もしくは障害またはその症状の治療方法を提供し、それらの方法は、ERRガンマを発現する細胞を含む医薬組成物の治療的有効量を対象（例えばヒトのような哺乳類）に投与することを含む。すなわち、一実施形態は、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症、もしくはそれらの症状を有するまたは有しやすい対象を治療する方法である。この方法は、疾患もしくは障害またはそれらの症状を治療するために十分な治療量の本明細書記載の細胞を、それら疾患または障害が治療される条件下で、哺乳類に投与する工程を含む。
【０１２４】
本明細書記載の方法は、本明細書記載の細胞組成物の有効量、あるいは、そのような効果を生じることが本明細書に記載される組成物を、対象（そのような治療が必要であると特定された対象を含む）に投与することを含む。そのような治療が必要な対象であると特定することは、対象者または医療専門家の判断であり得、主観的（例えば見解）または客観的（例えば検査もしくは診断的方法により測定可能）であり得る。
【０１２５】
本発明の治療的方法（予防的処置を含む）は、一般的に、本明細書に記載される細胞組成物の治療的有効量を、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症、または、ベータ細胞数の欠乏（例えば膵臓細胞の数の減少）もしくは不十分なレベルのベータ細胞生物学的活性（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連する別の代謝性の疾患もしくは障害を有するか、それらを有しやすいか、またはそれらを有する危険性を有する対象、特にヒトに投与することを含む。「危険性を有する」対象の決定は、診断的検査または対象もしくは医療提供者の見解（例えば遺伝学的検査、酵素またはタンパク質のマーカー、マーカー（本明細書で定義されるもの）、家族歴、等）による任意の客観的または主観的決定により行うことができる。
【０１２６】
一実施形態において、本発明は、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症に関連した治療の進行、ならびに、ベータ細胞数の欠乏（例えば膵臓細胞の数の減少）もしくは不十分なレベルのベータ細胞生物学的活性（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連する他の代謝性の疾患もしくは障害の治療を監視する方法を提供する。この方法は、診断的マーカー（「マーカー」という）（例えば、ベータ細胞の数または活性の欠乏に関連する障害またはその症状を有するかまたは有しやすい対象における、本明細書で記述される任意の標的）のレベルを決定する工程を含み、ここで、対象は、疾患またはその症状を治療するために十分な、本明細書記載の細胞組成物の治療量が投与された対象である。この方法において決定されるマーカーのレベルは、健康な正常対照または他の罹患患者のどちらかにおけるマーカーの既知レベルと比較して、対象の疾患状態を確立することができる。好ましい実施形態では、第1のレベルの決定よりも後の時点において、対象のマーカーの第2のレベルが決定され、これら2つのレベルが比較されて、疾患の経過または治療の有効性が監視される。ある好ましい実施形態では、本発明に従った治療を開始する前に、対象における治療前のマーカーのレベルが決定される。この治療前のマーカーのレベルは、その後、治療開始後の対象におけるマーカーのレベルと比較され、治療の有効性を決定することができる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、対象に投与する前の数時間、数日間、あるいは数週間さえにも渡って、選択された細胞を培養状態で維持することが望ましくなり得る。組織培養のための培地および試薬は本技術分野でよく知られている（例えば、Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.を参照）。ERRガンマを発現するベータ様細胞をインキュベート／輸送するための適切な培地の例としては、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、RPMI培地、ハンクス平衡塩溶液（HBSS）、リン酸緩衝食塩水（PBS）、およびL-15培地が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の細胞を培養するための適切な培地の例としては、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、DMEM-F12、RPMI培地、EpiLlfe培地、および培地171が挙げられるが、これらに限定されない。培地は、ウシ胎仔血清（FCS：fetal calf serum）あるいはウシ胎仔血清（FBS：fetal bovine serum）だけでなく、抗生物質、増殖因子、アミノ酸、阻害剤等で補足され得、それは十分に当業者の一般的知識の範囲内である。
【０１２８】
［製剤］
精製された細胞を含む本発明の組成物は、例えば等張性水溶液、懸濁液、乳濁液、分散系、または粘稠性組成物のような、無菌液体調製物として簡便に提供され得、これらは選ばれたpHに緩衝され得る。液体調製物は通常、ゲル、その他の粘稠性組成物、および固形組成物よりも調製することが容易である。加えて、液体組成物は投与（特に注射によるもの）がいくらか簡便である。一方で、粘稠性組成物は、特定の組織との間でより長い接触時間を提供するように適切な粘度範囲内に製剤することができる。液状または粘稠性の組成物は担体を含み得、これは、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒であり得る。
【０１２９】
無菌注射用溶液は、本発明の実施に利用される遺伝子操作ベータ様細胞を、様々な量のその他の所望の成分と共に必要量の適切な溶媒中に組み入れることにより、調製され得る。そのような組成物は、適切な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロース等との混合物であり得る。組成物は凍結乾燥もされ得る。組成物は、投与のルートおよび望まれる調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤のような補助的物質（例えばメチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化添加剤または増粘添加剤、保存剤、香味剤、色素等を含有し得る。参照により本明細書に組み入れられる“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE”, 17th edition, 1985のような標準的テキストを参照して、過度な試行錯誤なしに適当な調製物を調製することができる。
【０１３０】
組成物の安定性および無菌性を高める様々な添加剤（抗菌保存剤、抗酸化剤、キレート化剤、および緩衝剤を含む）が添加され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等により確保することができる。注射用医薬形態の吸収の長期化は、吸収を遅める薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらされ得る。しかしながら、本発明によれば、使用されるいずれの媒体、希釈剤、または添加剤も、遺伝子操作ベータ様細胞またはその前駆細胞もしくは子孫と適合するものでなければならない。
【０１３１】
組成物は等張性であってもよく、すなわち、血液および涙液と同じ浸透圧を有していてもよい。本発明の組成物の望ましい等張性は、塩化ナトリウム、またはその他の薬学的に許容される物質、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、もしくはその他の無機溶質もしくは有機溶質を用いて達成され得る。特にナトリウムイオンを含む緩衝液のためには塩化ナトリウムが好ましい。
【０１３２】
組成物の粘度は、所望であれば、薬学的に許容される増粘剤を用いて、選ばれたレベルに維持され得る。メチルセルロースは、容易にかつ安価に入手可能であり使用しやすいので好ましい。他の適切な増粘剤としては、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が挙げられる。増粘剤の好ましい濃度は、選択される物質に依存する。選択した粘度を達成する量を使用することが重要な点である。明らかなことだが、適切な担体およびその他の添加物の選択は、正確な投与ルート、および液状投与形態のような具体的な投与形態の性質（例えば、組成物が、溶液、懸濁液、ゲルに製剤されるのか、または、徐放形態もしくは液体充填形態のようなその他の液状形態に製剤されるのか）に依存するであろう。
【０１３３】
当業者であれば、組成物の構成成分は化学的に不活性であるように選ばれるべきであって本発明に記述される遺伝子操作細胞の生存性または有効性に影響しないことを理解するであろう。このことは化学および薬学の原理に習熟した者にとっては問題とはならないし、あるいは、本開示および本明細書中に引用する文献からの標準的テキストの参照または単純な実験（過度の試行錯誤が関わらないもの）により容易に問題を回避することができる。
【０１３４】
本発明の遺伝子操作ベータ様細胞の治療的使用に関する一つの考慮点は、至適効果を達成するために必要とされる細胞の量である。投与される細胞の量は、治療を受ける対象に応じて変わるであろう。一実施形態では、104〜108、105〜107、または106〜107の本発明の遺伝子操作ベータ様細胞がヒト対象に投与される。好ましい実施形態では、少なくとも約1 x 107、2 x 107、3 x 107、4 x 107、および5 x 107の本発明の遺伝子操作ベータ様細胞がヒト対象に投与される。何が有効投与量とみなされるかの正確な決定は、各対象に個別である要素（そのサイズ、年齢、性別、体重、およびその特定の対象の状態を含む）に基づき得る。投与量は、本開示および本技術分野における知識から当業者によって容易に確認され得る。
【０１３５】
当業者は、本発明の方法において投与されるべき組成物中の細胞の量、ならびに任意の添加剤、媒体、および／または担体を容易に決定することができる。典型的には、（活性幹細胞（複数可）および／または活性薬剤（複数可）に加えられる）任意の添加剤は、リン酸緩衝食塩水中の0.001〜50（重量）%量の溶液において存在し、活性成分は、マイクログラムからミリグラムの単位で存在し、例えば約0.0001〜約5 wt %、好ましくは約0.0001〜約1 wt %、さらにより好ましくは約0.0001〜約0.05 wt %、または約0.001〜約20 wt %、好ましくは約0.01〜約10 wt %、さらにより好ましくは約0.05〜約5 wt %存在する。言うまでもなく、動物またはヒトに投与されるべきあらゆる組成物に関して、および投与のあらゆる具体的方法に関して、毒性（例えば適切な動物モデル（例えばマウスのようなげっ歯類）における致死量（LD：lethal dose）およびLD50を決定することによるもの）；ならびに、適切な応答を誘発する組成物（複数可）の投与量、その中の成分の濃度、および組成物（複数可）を投与するタイミングを決定することが好ましい。そのような決定は、当業者の知識、本開示、および本明細書で引用される文献から、過度の試行錯誤を要するものではない。また、逐次的投与のための時間も、過度の試行錯誤なく確定することができる。
【０１３６】
［ERRガンマ細胞の投与］
本発明のERRガンマ発現ベータ様細胞またはその前駆細胞／子孫を含む組成物は、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症の治療または予防、および、ベータ細胞数の欠乏（例えば、膵臓細胞の数の減少）またはベータ細胞の生物学的活性のレベルの不十分さ（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連するその他の代謝性疾患もしくは障害の治療のために、対象に全身的または直接的に提供され得る。一実施形態では、本発明の細胞は、問題の臓器（例えば膵臓）に直接注射される。あるいは、本発明のベータ様細胞を含む組成物は、例えば循環系（例えば膵臓脈管構造）への投与によって、問題の臓器へ間接的に提供される。細胞の投与の前、最中、または後に、増殖剤および分化剤を供給して、インビトロまたはインビボでインスリン産生能力を有する細胞の産生を増加させることができる。細胞は生理学的に許容されるあらゆる媒体中において投与され得、通常は血管内に投与されるが、細胞が再生および分化のための適切な場所を見つけ得る都合のよい他の部位に導入されてもよい。
【０１３７】
一つのアプローチでは、少なくとも100,000、250,000、または500,000個の細胞が注射される。他の実施形態では、750,000、または1,000,000個の細胞が注射される。他の実施形態では、少なくとも約1 x105個の細胞が投与され、1 x 106、1 x 107、もしくは1 x 108〜1x1010にいたるまでの数、またはそれより多くの細胞が投与される。本発明の選択された細胞は、ERRガンマを発現する細胞の精製（純化）された集団を含み得る。選択された細胞を含む集団における純度の好ましい範囲は、約50〜約55%、約55〜約60%、および約65〜約70%である。より好ましくは、純度は、少なくとも約70%、75%、または80%の純度であり、より好ましくは、少なくとも約85%、90%、または95%の純度である。いくつかの実施形態では、集団は、少なくとも約95%〜約100%が選択された細胞である。投与量は当業者によって容易に調節され得る（例えば、純度が低下すれば投与量の増加が必要となり得る）。細胞は、注射、カテーテル等によって導入され得る。
【０１３８】
本発明の組成物には、遺伝子操作ベータ様細胞またはその前駆細胞と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が包含される。投与は自家性または異種性であり得る。例えば、ベータ様細胞またはその前駆細胞は、一対象者から得られて、その同じ対象者に投与され得るし、あるいは、別の適合性の対象者に投与され得る。
【０１３９】
本発明の選択された細胞またはその子孫（例えば、インビボ、エクスビボ、またはインビボで誘導されたもの）は、カテーテル投与を含む局所的注入、全身注射、局所的注射、静脈内注射、または非経口的投与により投与され得る。本発明の治療組成物（例えば選択された細胞を含む医薬組成物）を投与する際には、一般的にそれは単位投与量注射用形態（溶液、懸濁液、乳濁液）に製剤される。
【０１４０】
従って、本発明は、例えば1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症、またはベータ細胞数の欠乏（例えば、膵臓細胞の数の減少）もしくはベータ細胞の生物学的活性のレベルの不十分さ（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連するその他の代謝性疾患もしくは障害を有する対象を治療する方法にも関する。この方法は、本明細書で説明されたように単離された幹細胞／前駆細胞またはそのような細胞に由来する細胞抽出物のいずれかの有効量を対象に投与することを含む。
【０１４１】
別の医薬的使用においては、本発明の幹細胞／前駆細胞は、対象への投与に先立って遺伝子操作され得る。この目的のために、その細胞で産生されるべきタンパク質をコードする核酸を用いて細胞を形質転換し得る。核酸は、当業者によく知られる様々な方法のいずれかを使用して本発明の細胞に導入され得、例えば、ウイルスベクターおよび／または脂質含有トランスフェクション組成物、例えばIBAfect（IBA GmbH、ドイツ国ゲッチンゲン）、Fugene（ロシュ）、GenePorter（ジーンセラピーシステムズ）、Lipofectamine（インビトロジェン）、Superfect（キアゲン）、Metafecten（ビオンテックス）、または国際出願WO 01/015755に記述されたものが使用され得る。関連する実施形態では、本発明の細胞は、選ばれたポリペプチドをコードする核酸で形質転換された後に、このポリペプチドを組換え技術で産生することに使用され得る。
【０１４２】
［治療方法］
ここでは、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症の治療または予防、および、対象におけるベータ細胞数の欠乏（例えば、ベータ細胞の数の減少）もしくはベータ細胞の生物学的活性のレベルの不十分さ（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連するその他の代謝性疾患または障害の治療のための方法が提供される。特定の実施形態では、本発明は、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症の治療または予防、および、ベータ細胞数の欠乏（例えば、膵臓細胞の数の減少）もしくはベータ細胞の生物学的活性のレベルの不十分さ（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連するその他の代謝性疾患または障害の治療のための方法を提供する。糖尿病または代謝性障害を有する患者は、一般に、ベータ細胞の活性または機能の低下により同定され、例えば、血液中の血清糖レベルを監視することにより同定される。
【０１４３】
一般的に、本方法は、本発明の選択された細胞を、既存状態の緩和であろうと再発の防止であろうと、その所望の効果を達成するための有効量を投与することを含む。治療については、投与される量は、所望の効果を生じさせるうえで有効な量である。有効量は、一回または一連の投与において提供され得る。有効量は、急速投与において、または連続的灌流において提供され得る。
【０１４４】
「有効量」（あるいは、「治療的有効量」）は、治療の際に有益なまたは所望の臨床的結果をもたらすために十分な量である。有効量は、1つまたは複数の用量において対象に投与され得る。治療に関しては、有効量は、疾患を緩和させ、寛解させ、安定化させ、疾患の進行を逆戻りさせ、もしくは疾患の進行を遅らせる、またはその他のかたちで疾患の病理学的帰結を低減させるために十分な量である。有効量は、一般に、医師によってケースバイケースで決定され、当業者の技量の範囲内である。有効量を達成する適切な投与量を決定する際には、典型的にいくつかの要素が考慮される。これらの要素には、対象の年齢、性別、および体重、治療される状態、状態の重症度、ならびに、投与されるベータ様細胞の形態および有効濃度が含まれる。
【０１４５】
治療に適したヒト対象は、典型的には、臨床的判断基準によって区別され得る2つの治療群を含む。対象は、進行した疾患を有し得、その場合には、治療目的は、疾患進行の軽減もしくは逆転、および／または副作用の寛解を含み得る。対象は、その状態の病歴を有し得、そのために既に治療を受けており、その場合には、治療目的は、再発の危険性の減少または遅延を典型的に含むであろう。
【０１４６】
［キット］
本発明は、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症の治療または予防、および、ベータ細胞数の欠乏（例えば、膵臓細胞の数の減少）もしくはベータ細胞の生物学的活性のレベルの不十分さ（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連するその他の代謝性疾患または障害の治療のためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、ERRガンマを発現する細胞（例えばベータ様細胞）の有効量をユニット投与量形態において含有する治療用または予防用組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットは、治療用または予防用細胞組成物を含有する無菌容器を含む。そのような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスター包装、または本技術分野において知られるその他の適切な容器形態であり得る。そのような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、または医薬を保持することに適したその他の材料で作られ得る。
【０１４７】
所望であれば、本発明の細胞は、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症、またはベータ細胞数の欠乏（例えば、膵臓細胞の数の減少）もしくはベータ細胞の生物学的活性のレベルの不十分さ（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連する代謝性疾患もしくは障害を有するか、またはその発生のリスクを有する対象に細胞を投与するための、説明書と共に提供される。その説明書は、一般に、1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症、またはベータ細胞数の欠乏（例えば、膵臓細胞の数の減少）もしくはベータ細胞の生物学的活性のレベルの不十分さ（例えば、グルコース刺激によるインスリン分泌の欠乏、インスリン産生の欠乏）に関連する代謝性疾患もしくは障害の治療または予防のための組成物の使用に関する情報を含むであろう。別の実施形態では、説明書は、以下のうちの少なくとも1つを含む：細胞の説明；1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病前症、もしくはそれらの症状の治療または予防のための投与スケジュールおよび投与方法；注意書き；警告；適応症；非適応症；過量投与情報；有害反応；動物薬理作用論；臨床治験；および／または参考文献。説明書は、（もし存在する場合は）容器に直接印刷されていてもよいし、または容器に付けられるラベルとして、または容器の中にもしくは容器と共に提供される別個のシート、パンフレット、カード、もしくはフォルダーとしてのものであってもよい。
【０１４８】
本発明の実施は、特に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を利用し、これらは当業者の技量の範囲内に十分収まる。そのような技術は、例えば“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR:  The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology”(Coligan, 1991)のような文献に十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの産生に適用可能であり、従って、本発明の製造および実施において考慮され得る。具体的な実施形態のために特に有用な技術は下記セクションで論ずる。
【０１４９】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、および治療的方法をいかにして作り使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、発明者らが自らの発明であると考えるものの範囲を限定する意図のものではない。
【実施例】
【０１５０】
［実施例1：出生後の膵島は酸化的特徴を獲得した。］
ベータ細胞は出生後に機能的に成熟することが知られており、それには、グルコースに応答して確実にインスリンを分泌する能力の獲得が含まれる。2週齢新生仔マウスから単離された膵島は、未成熟表現形に合致して、グルコース負荷に応答してインスリンを分泌することができなかった（図1A）。グルコース刺激によるインスリン分泌（GSIS）のために必要な重要経路を同定するために、出生後成熟のあいだ、単離膵島のトランスクリプトームを比較した。ベータ細胞の最終分化は出生後には実質的に完了しているということ、および、成体β細胞は幹細胞分化ではなく自己複製により形成されるという事実と合致して（ENREF_13）（Dor et al., 2004, Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature 429, 41-46）、げっ歯類およびヒトにおける膵臓内分泌の発生を制御することが知られる遺伝子の発現は、出生後にはほぼ変化していなかった（図2A、表2、Conrad et al., 2014, Trends in endocrinology and metabolism: TEM, 25(8): 407-414）。
【０１５１】
成熟に伴って、Pdx1、MafA、およびNkx6.1の上昇、ならびにMafB発現の低下が観察されたが（図2A）、これはこれらの遺伝子が成体ベータ細胞機能のために必要であるということ（Conrad et al., 2014, Trends in endocrinology and metabolism: TEM, 25(8): 407-414）と合致している。トランスクリプトームの機能的分析により、膵島成熟の際に細胞増殖に関わる遺伝子（ベータ細胞増殖の既知の正の調節因子であるPdgfrα、Pdgfrβ、Pdgfβ、およびFgfr1を含む）は下方調節されたことが明らかになり（図1B、表1、ならびに図2Bおよび2C）、これは成体膵島におけるクローン性ベータ細胞増殖の減少が観察されたこと（Chen et al., 2011, Nature 478, 349-355; Hart et al., 2000, Nature 408, 864-868; Teta et al., 2005, Diabetes 54, 2557-2567; Dor et al., 2004, Nature 429, 41-46）と一致していた。対照的に、上方調節された遺伝子は、代謝経路、特にグルコース代謝およびATP生合成経路に関連するものであり、これらには電子伝達系（ETC：electron transport chain）、酸化的リン酸化（OxPhos：Oxidative Phosphorylation）、およびイオンチャンネル関連エキソサイトーシスの経路が含まれていた。特定の理論に拘束されるわけではないが、成体ベータ細胞の高いミトコンドリア活性を踏まえると、GSISのためには代謝系遺伝子の誘導が重要なのかもしれない。この仮説と合致して、GSISを制御することが知られるミトコンドリア遺伝子（リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（Mdh1）、ピルビン酸カルボキシラーゼ（Pcx）、ならびに、Cox6a2、Ndufa4およびNdufs2を含むOxPhosの構成因子を含む）（Xu et al., 2008, Diabetologia 51, 2022-2030; Zhao et al., 1998, FEBS letters 430, 213-216）はより高度に発現されていた一方、GSISの抑制因子である乳酸デヒドロゲナーゼ（Ldha）は、新生仔ベータ細胞と比較して成体で発現か低下していた（図1Cおよび1F、表1）。特定の理論に拘束されるわけではないが、これらの結果は、出生後機能成熟の際に膵島ベータ細胞において重要な代謝的変遷が起こることを示している。特筆すべきことに、既知のミトコンドリア遺伝子制御因子であるERRガンマの発現は、膵島成熟のあいだ進行的に誘発されていた（図1Cおよび1D）。ERRガンマ発現のこの誘導は、マウスインスリン-GFP（MIP-GFP）マウスから単離されたベータ細胞においても同様に観察され、そこでは、ERRガンマ発現は新生仔ベータ細胞と比較して成体で約5倍高かった（図3Aおよび3B）。ERRガンマは外分泌細胞よりは内分泌膵島において優勢的に発現されること、および、ERRガンマ-LacZノックイン（knock-in）マウスにおいて膵島が染色陽性であること（Alaynick et al., 2007, Cell metabolism 6, 13-24）と組み合わせると、これらの発見は、ERRガンマが、GSISのために必要とされる内分泌細胞の代謝的変遷を編成するうえで特定の役割を果たしていることを示している（図1E）。
【０１５２】
［実施例2：ERRガンマはグルコース刺激によるインスリン分泌のために必要とされた。］
膵臓ベータ細胞の機能的成熟におけるERRガンマの役割を調査するために、ERRガンマlox/loxマウスをラットインスリン2プロモーター（RIP）-Creマウスと交配することにより、ベータ細胞特異的ERRガンマノックアウト（ベータERRガンマKO）マウスを作製した。βERRガンマKOマウスは、メンデルの法則で予測される頻度で出生し、正常な体重と平均寿命とを示した（図4Aおよび4B）。野生型（wild-type）ERRガンマlox/lox膵島と比べてβERRガンマKOでは、RIP-Creリコンビナーゼが、視床下部ERRガンマ発現に有意な影響を与えることなくERRガンマ発現を選択的に80%減少させたが（図4Aおよび4B）、これは最近出された同様の報告と一致している（Tang et al., 2003, Cell metabolism 18, 883-895）。βERRガンマKOマウスの自由摂食血中グルコースレベルの監視により、雌マウスにおいて8週齢までに消える一時的な上昇が見出された（図4Cおよび4D）。しかしながら、8週齢では、ERRγlox/lox（WT）およびRIP-Cre（WT（RIP-Cre））同齢集団と比べてβERRγKOマウスは雄も雌もグルコース不耐容となった（グルコース負荷試験（GTT：グルコース負荷試験）により決定）（図5Aおよび6A）。インスリン感受性において著しい差は見られなかったが、βERRγKOマウスは、グルコース負荷に応答してインスリン分泌を増加させることができなかった（図5C、5D、ならびに図6Cおよび6D）。注目すべきことに、このβERRγKO表現型は代謝的ストレスによって増大された；4週齢から4週間にわたって高脂肪・高スクロース食餌で給餌されたβERRγKOマウスは、インスリン感受性の有意な変化を伴うことなく、より顕著なグルコース不耐性およびインスリン分泌異常を示した（図5B、5E、ならびに図6Bおよび6E）。
【０１５３】
βERRγKOマウスの、グルコース負荷に応答してインスリンを分泌する能力の欠如は、誘導性ベータ細胞特異的欠失（βERRγKO ER+Tam）および膵臓特異的ERRγKO（PERRγKO）の両方のマウスモデルにおいて表現型模写された。タモキシフェン（tamoxifen）で処理（7日間の連続的i.p.注射）されたβERRγKO ERマウスは、膵島ERRガンマ発現の75%減少を示し、かつ、発生学的βERRγKOマウスにおいて観察されたのと同様のグルコース不耐性を示した（図6Fおよび6G）。さらに、ERRγlox/loxマウスをPDX1-Creマウスと交配することにより作製された、膵臓全体でERRガンマを欠くマウス（PERRγKOマウス）は、WTマウスと比べて耐糖能障害を示した（図7A〜7D）。特定の理論に束縛されるわけではないが、まとめるとこれらの結果は、血中グルコースレベルの上昇の負荷を受けた際の適切なGSIS機能および全身のグルコース恒常性のために膵島ERRガンマ発現が必須であることを示している。
【０１５４】
形態学的には、通常固形飼料食餌で維持されたβERRγKOマウスから単離された膵島は、ヘマトキシリンとエオシン（H&E）の染色および免疫組織学的解析（図8A）に基づいて対照膵島から区別できなかった。しかしながら、高脂肪食餌（HFD）でストレスを受けた場合には、対照膵島と比較してβERRγKO膵島はより大きく、インスリン含量および膵島サイズで測定されるベータ細胞質量の著しい増加を伴っていた（図5F、5G、および8A〜8F）。
【０１５５】
特定の理論に拘束されるわけではないが、上記の観察は、βERRγKOマウスにおけるGSISの欠損を示している。この仮説を試験するために、エクスビボにおいて、GSISに対する過渡的ERRガンマ欠失の影響を調査した。ERRγlox/loxにおけるアデノウイルス誘導性Cre-組換え（Ad-ERRγKO）膵島は、対照アデノウイルスEGFP-ERRγlox/lox（Ad-対照）膵島と比較して、インスリン2（Ins2）発現に影響することなくERRガンマ発現を約75%減少させた（図5H）。注目すべきことに、グルコース負荷に応答してインスリンを分泌するAd-ERRγKO膵島の能力は、エクスビボでほとんど完全に抑止された（図5I）。さらに、全膵臓におけるERRγの欠損（PERRγKOマウス）は、栄養分に応答した膵島インスリン分泌を低減させた（図5K）。ERRガンマは心臓（Alaynick et al., 2007, Cell metabolism 6, 13-24; Dufour et al., 2007, Cell metabolism 5, 345-356）および骨格筋（Zhao et al., 1998, FEBS letters 430, 213-216）におけるミトコンドリアの酸化的リン酸化と代謝を制御することから、ERRガンマが膵島におけるミトコンドリア機能にとって必要であるかどうかを調べた。Ad-対照膵島は、20mMグルコースで刺激された場合に、酸素消費速度（OCR）が2倍上昇し強く応答した。対照的に、Ad-ERRγKO膵島は、グルコース負荷に応答してOCRを上昇させることができなかった（図5J）。これらの結果と合致して、ラットのクローン性ベータ細胞株INS-1におけるERRガンマのノックダウンは、同様に、グルコース負荷に応答したOCR、細胞ATP産生、およびGSIS機能を低下させた（図9A〜9D）。特定の理論に拘束されるわけではないが、これらの結果は、ベータ細胞エネルギー代謝のERRガンマ制御がGSISのために必要であることを示している。
【０１５６】
［実施例3：ERRガンマはベータ細胞の代謝成熟のために必要であった。］
ミトコンドリア機能と形態は密接に相関することから（Tang et al., 2013, Cell metabolism 18, 883-895; Narkar et al., Cell metabolism 13, 283-293）、βERRγKOベータ細胞のミトコンドリアにおいて構造的変化が検出可能かどうかを調べた。電子顕微鏡により、インスリン顆粒およびプロインスリン顆粒、ならびに全般的ミトコンドリア数は、ERRガンマ欠失により影響されなかったことが明らかになった（図10Aおよび10B）。しかしながら、クリステ構造の崩壊を伴うミトコンドリア膨張が、ERRガンマ欠損ベータ細胞において見られ、これは、機能的に欠陥があるミトコンドリアの特徴である、ミトコンドリアの長さ、幅、および体積の著しい増加を伴っていた（図10A〜10C）。
【０１５７】
ベータ細胞機能におけるERRガンマの分子的役割を理解するために、ERRガンマ欠失の転写的帰結を決定した。発生学的に欠失を起こさせたβERRガンマKO膵島において、RNA-Seqにより、4189個の遺伝子の発現が改変され、ほぼ等しい数の遺伝子が下方調節および上方調節されていたこと（それぞれ2008個および2181個の遺伝子；偽陽性率［FDR：false discovery rate］< 0.01、変化倍率［FC：fold change］> 1.5）が明らかになった。過渡的欠失Ad-ERRガンマKO膵島におけるマイクロアレイ分析による同様の比較は、発現の変化を有する2205個の遺伝子を同定し、ここでも、同様の数の遺伝子が下方調節および上方調節されていた（それぞれ1207個および998個の遺伝子；偽陽性率［FDR］< 0.01、変化倍率［FC］> 1.25）。GSISの欠乏はβERRγKO膵島およびAd-ERRγKO膵島の両方で観察されたことから、共通の差次的発現遺伝子（232個の下方調節遺伝子、および239個の上方調節遺伝子）に対してジーンオントロジー（GO：Gene Ontology）分析を行い、ERRガンマ欠失により影響を受ける包括的細胞プロセスを同定した（図11および表3）。糖尿病表現型と合致して、ERRガンマにより制御される遺伝子は、ベータ細胞機能にとって重要なプロセス（ATP生合成、カチオン輸送、酸化的リン酸化、電子伝達、および分泌を含む）と関連していた（図10D）。さらに、プロモーター領域のモチーフ分析では、これら差次的発現遺伝子の半分超でERR応答エレメント（ERRE）が同定された（下方調節遺伝子の62.1%、および上方調節遺伝子の64.6%）。特定の理論に拘束されるわけではないが、これは、ERRガンマによる直接的制御を示唆している（図12A）。この概念を裏付けることに、マウスインスリノーマ細胞株MIN-6において行った従来型ChIPアッセイでは、ERRガンマがAtp2a2およびMdh1のプロモーター領域に直接結合することが確認された（図12B）。βERRγKO膵島およびPERRγKO膵島の両方におけるqPCR分析により、代謝経路に関係する選ばれた遺伝子（Mdh1、Cox6a2、Atp2a2、Ndufs2、およびAtp6v0a2）の発現変化が確認された（表4、ならびに、それぞれ図10Eの左パネルおよび右パネル）。特定の理論に拘束されるわけではないが、これらの結果は、ERRガンマが、膵島ベータ細胞におけるATP生合成および代謝遺伝子の包括的制御因子であることを示している。
【０１５８】
ベータ細胞の機能的成熟におけるERRガンマの役割をさらに明確化するために、膵島における出生後転写変化を、ERRガンマ欠失により誘導されたものと比較した。注目すべきことに、ERRガンマの消失は、出生後ベータ細胞成熟に関連する多数の発生学的変化を抑止した（図10H）。具体的には、成熟の際に通常ならば上方調節される74の遺伝子、および通常ならば下方調節される35の遺伝子の発現のその変化が、βERRガンマKO膵島では失われた（図10F）。これら調節不全の遺伝子には、エネルギー生産（ATP生合成、酸化的リン酸化、およびETC）および分泌／エキソサイトーシス経路に関与する遺伝子が含まれていた（図10G）。特定の理論に拘束されるわけではないが、これらの結果を合わせると、ERRガンマは機能的に成熟したベータ細胞におけるミトコンドリア機能を維持するために重要なだけでなく、これらの細胞の出生後成熟を促進させる転写的変化の多くを直接統制することが示されている。
【０１５９】
［実施例4：ERRガンマは合成ベータ細胞の成熟を促進させる。］
移植可能なベータ細胞を多能性幹細胞から生成することは、幹細胞治療学の主要なゴールである。しかしながら、現在のiPSC由来ベータ様細胞は、グルコース負荷に応答してインスリンを分泌する能力を欠く点で胎生細胞に類似している（Hackenbrock et al., 1966, The Journal of Cell Biology 30, 269-297; Anello et al., 2005, Diabetologia 48, 282-289; Hrvatin et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. 111(8): 3038-3043; D’Amour et al., 2006, Nature Biotechnology 24, 1392-1401; Kroon et al., 2008, Nature Biotechnology 26, 443-452; Schulz et al., 2012, PloS one 7, e37004; Xie et al., 2012, Cell Stem Cell 12, 224-237; Sneddon et al., 2012, Nature 491, 765-768）。ベータ細胞成熟の際の増強される酸化的代謝におけるERRガンマの提唱された制御的役割に基づいて、ERRガンマの過剰発現が、ヒトiPSC由来ベータ様細胞が代謝の観点から成熟したベータ細胞に成熟することを促進させ得るか否かを調査した。この問題に取り組むために、ヒトインスリンプロモーター駆動GFPレポーターをスクリーニングおよび単離のために利用して、ヒトiPSCからインスリン陽性ベータ様細胞を産生するための分化プロトコールを最適化した（Pagliuca et al., 2014, Development 140, 2472-2483; Hrvatin et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 111(8): 3038-3043.）。最適化されたプロトコールでは、ヒト内皮細胞株HUVECに由来するiPSCから、分化開始後18〜21日で、インスリン陽性細胞が生成された（図13A〜13Cおよび図14）。iPSC分化のあいだの発現プロファイリングにより、ベータ様細胞の生成が確認された。具体的には、多能性マーカーNanogの発現が分化開始に際して失われた一方、分化の開始後18〜21日に、ベータ細胞終末分化マーカーであるインスリンが現れた。胚体内胚葉マーカーSOX17、膵臓前駆体マーカーHNF1β、および内分泌前駆体マーカーSOX9は、第7日目、15日目、および18日目頃にそれぞれ一時的に上昇した（図14）。さらに、PDX1、MAFA、PAX6、NEUROD1、GCK、CHGA、およびVAMP2を含む追加のベータ細胞マーカーの発現は、第21日において強く誘導された（図14）。免疫組織化学解析により、この最適化された21日間分化プロトコールが、ベータ細胞マーカーPDX1、c-ペプチド、およびプロホルモンカルボキシラーゼ1/3（PC1/3）を発現するベータ様細胞を生じたことが確認された（図5A）。この最適化分化プロトコールは、インスリン陽性、グルカゴン陰性β様細胞（本明細書においてiβL細胞と定義される）を再現性をもって産生し、電子顕微鏡によりインスリン顆粒の存在が明らかにされた（図13Hおよび図15B〜15E）。さらに、これらiPSC由来ベータ様細胞は、グルコース負荷に応答してc-ペプチドを分泌することはできなかった一方、KClによる直接的細胞脱分極媒介性インスリン分泌には応答性であった（図15F）。このことは、インスリン陽性iβL細胞におけるNkx6-1およびMafAの発現を確認した（図15H）。これらの結果は、ヒトベータ様細胞の生成を確証した。特定の理論に拘束されるわけではないが、これは、ミトコンドリア機能が、β様細胞におけるGSIS機能欠陥の1つの理由かもしれないことを示していた。
【０１６０】
内因性ベータ細胞成熟におけるERRガンマの役割を踏まえ、ERRガンマの過剰発現がiPSC由来ベータ様細胞におけるGSIS機能を救援できるか否かを調べた。この問題に取り組むため、iPSC由来ベータ様細胞（第22〜25日）を、アデノウイルスERRガンマ（Ad-ERRγ）または対照（Ad-GFP）ベクターで感染させた。遺伝子発現分析および機能的分析を第25〜30日に行った。培養培地にはインスリンが広く使用されていることを考慮して、ベータ様細胞由来のインスリンの代用尺度としてc-ペプチドのレベルを使用した。Ad-ERRガンマ感染は、iPSC由来ベータ様細胞においてERRガンマの発現を回復させることに成功したが、その細胞内c-ペプチド含量には有意に影響しなかったことが見出された（図13D左パネル、および図15G）。心強いことに、Ad-ERRガンマ感染は、培養培地中のc-ペプチド濃度を有意に上昇させた（図13D右パネル）。次に、Ad-ERRγ感染iPSC由来ベータ様細胞のGSIS能力を調べた。対照感染iPSC由来ベータ様細胞（iβLGFP細胞として定義される）は、グルコース負荷に応答してc-ペプチドを分泌することができなかった。特筆すべきことに、Ad-ERRγ感染iPSC由来ベータ様細胞（iβeta細胞）は、ヒト単離膵島について見られたのと同様に、グルコース負荷に応答して増強されたc-ペプチド分泌を示した（図13E）。さらに、トランスクリプトーム分析は、iβeta細胞において前駆体代謝物の生成、酸化還元、電子伝達系（ETC）、酸化的リン酸化、およびミトコンドリア組織化に関連する遺伝子の増加、ならびに、細胞周期に関連する遺伝子の減少を同定し、これはベータ細胞系譜特異的遺伝子の発現における有意な増加は伴っていなかった（図13F、13G、13J、13K、図16、および表4）。注目すべきことに、ERRガンマ過剰発現はiβeta細胞においてクリステ構造だけでなくミトコンドリアの呼吸機能も改善させた（図13Hおよび13I）。すなわち、これらの結果は、iPSCからのグルコース応答性合成ベータ細胞の生成を記述している。特定の理論に拘束されるわけではないが、これらの結果は、ERRガンマ制御によるミトコンドリア代謝経路がGSISのために必要とされるという仮説を支持している（図18E）。
【０１６１】
糖尿病の状況でグルコース恒常性を回復させることができる移植可能β細胞を産生する能力は、究極的な治療的目標である。iβeta細胞がインビボで機能するか否かを決定するために、ストレプトゾシン（STZ）誘導性糖尿病NOD-SCIDマウスモデルを利用した。STZで処理（180 mg/kg i.p.注射）したNOD-SCIDマウスの血中グルコースレベルを毎日監視して高血糖を確認した。STZ注射の12日後、Ad-GFP （iβLGFP細胞）またはAd-ERRγ（iβeta細胞）で感染させた1000万のiPSC由来ベータ様細胞を腎臓被膜内に移植した（図17）。ヒト膵島およびマウス膵島も陽性対照として同様に移植した。特筆すべきことに、iβeta細胞投与を受けたマウスの血中グルコースレベルは、移植から数日以内に正常化し始め、これは機能的なヒトまたはマウスの膵島の投与を受けたものと同様であった（図18Aおよび19A）。さらに、移植されたiβeta細胞はレシピエントマウスにおいて長期的に（chronically）血中グルコースレベルを制御し（56日間、図18B、19B、および図20）、長期的治療の後の腎臓においてインスリン陽性細胞が検出された（図21）。重要なことに、長期的治療されたiβeta細胞レシピエントマウスのほぼ半数において、グルコース負荷試験で実証されるグルコース応答性表現型に伴って、血中グルコースレベルが非糖尿病レベル（<250mg/dL）にまで回復し、これはヒト膵島移植を受けたマウスと同様であった（図18C）。さらに、正常化された血中グルコースレベルを有する長期治療されたiβeta細胞レシピエントマウスにおいて、代謝の概日性制御における顕著な改善が観察され（グルコース利用の改善ということと合致する、夜間呼吸交換比（RER）の上昇）、これは夜間活動の増加を伴っていた（図18D）。これらの結果は、遺伝子工学的ERRガンマ発現を利用してベータ様細胞におけるGSIS機能を強められ得ることを実証している。
【０１６２】
本研究は、エストロゲン関連受容体ガンマ（ERRγ）発現が新生児と成体のベータ細胞を区別させ、ERRガンマがグルコース応答性ベータ細胞のために必要であることを示している。ERRガンマは、酸化的代謝およびミトコンドリア生合成の既知活性因子である。特定の理論に拘束されるわけではないが、グルコース応答性を達成し維持するために高エネルギー必要量が必要とされるのかもしれない。これまでiPSCを機能的ベータ細胞に分化させることは可能ではなかったが、本明細書に記述される結果は、ERRガンマ遺伝子ネットワークの活性化がこの代謝的障壁を克服する可能性を有することを示している。事実、ゲノム誘導による代謝成熟は、インビトロでiPSC由来胎性様細胞をグルコース応答性細胞に形質転換するうえで重要なステップであった。おそらくより重要なことに、最適化されたスケールアップおよび精製により、これらの転換された細胞が移植を介して1型糖尿病マウスを効果的に救出することが示されている。重要なことに、これらの実験は、1型および2型糖尿病の治療における療法として幹細胞移植が有用であるということのインビボでの概念実証を提供している。
【０１６３】
本明細書では、酸化的ミトコンドリア代謝の既知制御因子であるERRガンマが、ベータ細胞が機能的に成熟してグルコース応答性かつ移植可能なiPSC由来ベータ細胞（iβeta細胞）を産生するために必要とされるという根幹的発見を活用した。特筆すべきことに、iβeta細胞の移植は、重篤なSTZ誘導性1型糖尿病マウスモデルにおいてグルコース恒常性を回復させただけでなく、基質利用に関する概日代謝周期性も再確立させた。
【０１６４】
このことは重要である。なぜなら、グルコース管理の乏しさは、糖尿病性の網膜症、腎障害、および神経障害を含む長期的な糖尿病性帰結と関連付けられているからである。長時間作用性インスリン製剤およびプログラム可能送達ポンプは治療的有用性を提供するが、これらは膵臓β細胞のグルコース応答性を完全に再現することはできない。ヒト膵島移植はより優れたグルコース管理を提供するが、免疫抑制剤レジメンを必要とするし、移植される細胞の入手可能性およびインビボ生存性によって制限される。膵島移植を介してインスリン非依存性を達成することはできるが、同種移植患者の50%超および実質的に全ての自家移植患者は、5年の後にインスリン療法に戻る。どちらの状況においても、より大きな量の膵島を移植することで前記制約のいくつかが軽減され得る。従って、患者特異的iPSC由来β細胞が、これらの懸念の多くを解決し得、幹細胞補充療法の中心的ゴールの1つであると考えられる。
【０１６５】
ERRγはどのように作用するのだろうか？胎児発生は低酸素分圧および安定した母体グルコースの条件下で起こるため、膵臓を含むほとんどの生理的系は、出生の時点では、態勢は整っているが完全には機能的となっていない状態にある。出生後および成体の状況では、酸化的代謝が支配的となり、間欠的な摂食が、グルコースレベルの劇的変化に膵臓を晒す。最近、離乳が、グルコース刺激による酸化的リン酸化およびインスリン分泌の増強により特徴付けられるβ細胞の成熟ステップの引金となることが報告された（Pagliuca et al. 2014, Cell 159, 428-439）。本研究において開示されたトランスクリプトーム解析は、ベータ細胞におけるERRガンマ発現の上昇が、酸化的代謝遺伝子ネットワークを駆動させる鍵となっていたことを示している。さらに、iPSC由来ベータ様細胞におけるERRガンマ発現の低さが、それらの細胞がインスリンを分泌する能力を制限しているかもしれない。このことは、ERRガンマを発現するiPSC由来ベータ様細胞であるiβeta細胞は酸化的代謝プログラムを活性化させグルコース応答性インスリン産生を示したという観察と合致している。しかしながら、ベータ細胞の重要な特徴は、インビボおよびインビトロでグルコース負荷に応答して繰り返しインスリンを分泌する能力である。重要なことに、iβeta細胞の移植は、重篤なSTZ誘導性1型糖尿病マウスモデルにおいてグルコース恒常性を回復させただけでなく、基質利用に関する概日代謝周期性も再確立させた。
【０１６６】
ES細胞からの機能的ベータ細胞の生成や、インビトロ分化された膵臓前駆細胞のインビボ成熟といった近年の進歩に関わらず、ベータ細胞成熟の根底にある機序は理解が乏しいままである。動的なクロマチンリモデリングおよび交感神経支配刺激の関与が示されてはいるが、ERRガンマが転写プログラムを調整して酸化的代謝の上昇を調節するという発見は、ベータ細胞の機能的成熟についての機序的洞察を提供するものである（図18E）。遺伝学的研究および疫学的研究は、糖尿病の発生におけるERRガンマの関与を示していたが（http://t1dbase.org/page/AtlasHome）、しかしその役割はこれまで理解されていなかった。注目すべきことに、グルコース応答性ベータ細胞の生成のために必要な代謝的成熟の促進におけるERRガンマの役割の理解は、患者自身の細胞からインスリン応答性ベータ細胞を発生させることを加速させる可能性を有する。本明細書において記述した結果は、iβeta細胞が、幹細胞に基づく療法のための新たな機会を表すことを示している。
【０１６７】
上記で記述した実験は、下記の方法を用いて行われた。
【０１６８】
［動物実験］
ベータ細胞特異的ERRガンマノックアウトマウス（βERRγKO）は、純粋なC57BL/6J遺伝学的バックグラウンドにあるERRγlox/loxマウスとRIP-Cre（B6N.Cg-Tg(Ins2-cre)25Mgn/J）マウスとを交配することにより産生した。タモキシフェン誘導可能ベータ細胞特異的ERRガンマノックアウトマウスは、ERRγlox/loxマウスとRIP-CreER（ストックTg (Ins2-cre/Esr1)1Dam/J）マウスとを交配することにより産生した。膵臓特異的ERRガンマノックアウトマウス（PERRγKO）は、ERRγlox/loxとPDX1-Cre（B6.FVB-Tg(PDX1-cre)6Tuv/J）とを交配することにより産生した。インスリンプロモーターGFP（MIP-GFP）マウス（Tg(Ins1-EGFP)1Hara）はジャクソンラボラトリーから購入した。ERRγ-LacZノックインマウスは以前に記述されている（Alaynick et al., 2007, Cell metabolism 6, 13-24）。グルコース負荷試験は、タモキシフェン誘導可能β細胞特異的ERRγノックアウトマウスの処置前（12週齢）および処置3週間後（16週齢）に行った。雄マウスにタモキシフェンを7日間毎日注射した（トウモロコシ油中2mg/kg、腹腔内）。
【０１６９】
動物は、特定病原体除去動物施設（SPF：specific pathogen-free animal facility）において、12時間明暗サイクルの下23℃の環境温度にて維持した。水および食料は自由に摂取させた。全ての動物実験は年齢および性別を一致させたマウスを用いた。動物が関わる全ての手順は、IACUCおよびソーク生物学研究所の動物資源部門（ARD：Animal Resources Department）により認可されたプロトコールに従って行われた。
【０１７０】
［腹腔内グルコース（IP-GTT）またはインスリン（IP-ITT）負荷試験］
IP-GTTは、一晩絶食させたマウスにおいて行った。2 g/kgのグルコースの腹腔内投与の前ならびに15、30、60、および120分後に、グルコースPILOTを使用して血中グルコース値を評価した。グルコースの腹腔内投与の前ならびに5、15、および30分後に、ラット／マウスインスリンELISAキット（ミリポア）を使用して血清インスリンレベルを評価した。IP-ITTアッセイは、6時間の絶食後のマウスにおいて0.75 U/ kgのインスリン（ヒューマリンR、イーライリリー）の注射により行った。
【０１７１】
［単離膵島の実験］
マウス膵島は、ラットについて以前記述されたようにして単離した（Sutton et al., 1986, Transplantation 42, 689-691）。手短に述べると、HBSSバッファー中に希釈した0.5 mg/mlコラゲナーゼP（ロシュ）を総胆管を通して注入し、灌流された膵臓をウォーターバス中で解剖しインキュベートした（37℃、21分間）。消化された外分泌細胞と無傷の膵島とを、ヒストパック1077（シグマ）を使用して遠心分離（900g、15分間）で分離し、無傷の膵島を手で取り出した。全てのヒト膵島は、認可されたプロトコールのもとIntegrated Islets Distribution Program（IIDP）により提供された。ヒト膵島に関する追加的情報を表5に提供する。
【０１７２】
［インスリン分泌アッセイ（マウスおよびヒトの一次膵島ならびにヒトiPSC由来細胞）］
無傷の膵島からのインスリン放出は、バッチインキュベーション法を使用して監視した。一晩培養した単離膵島（10%（v/v）ウシ胎仔血清および1%（v/v）抗菌・抗真菌剤（ギブコ）で補足されたRPMI-1640）を37℃にて30分間、前培養した（129.4 mM NaCl、3.7 mM KCl、2.7 mM CaCl2、1.3 mM KH2PO4、1.3 mM MgSO4、24.8 mM NaHCO3（5% CO2、95% O2、pH7.4で平衡化）、10mM HEPES、および0.2%（v/v）BSA（V画分、シグマ）を含有する（KRBH）クレブスリンゲル炭酸水素バッファー（KRBB）と3 mMグルコース）。それから、インスリン分泌レベルを決定するために膵島を3 mMまたは20 mMのグルコースを伴うKRBHバッファー中にインキュベートした（500μl／10膵島）。30分後、遠心分離により膵島をペレットにして、ELISAによってインスリンレベルを決定した（マウスおよびヒトの膵島について、それぞれ、ラット／マウスインスリンELISAキット（ミリポア）およびヒトインスリンELISAキット（ミリポア））。ヒトiPSC由来細胞については、細胞（24ウェルのウェル当たり1x106細胞）を3mMグルコースKRBHバッファー（500μl／ウェル）中で前培養した。それから、インスリン分泌レベルの指標としてのc-ペプチド分泌レベルを決定するために、細胞を3 mMまたは20 mMのグルコースを伴うKRBHバッファー（200μl／ウェル）中にインキュベートした。30分後、遠心分離により膵島をペレットにして、ヒトc-ペプチドELISAキット（ミリポア）によりc-ペプチドレベルを決定した。
【０１７３】
［INS-1細胞培養、トランスフェクション、およびインスリン分泌アッセイ］
INS-1細胞は、10%（v/v）ウシ胎仔血清、1%（v/v）抗菌・抗真菌剤（ギブコ）、10 mM HEPES、2 mMグルタマックス、1 mMピルビン酸ナトリウム、および50μMβメルカプトエタノールで補足されたRPMI-1640（シグマアルドリッチ）（INS-1用RPMI培地）において、空気中5%のCO2中で37℃にて培養した。INS-1細胞は、Plus試薬（インビトロジェン）を含有するLipofectamine2000でトランスフェクトした。INS-1細胞を、ERRガンマsiRNA（キアゲン）または陰性対照スクランブルsiRNA（キアゲン）で72時間トランスフェクトした。インスリン分泌は、前インキュベーションした細胞（一次膵島についてのインスリン分泌アッセイにおいて記述したように、3 mMグルコースを伴うKRBHにおいて37℃で30分間）において、30分間のグルコース負荷（3 mMまたは20 mMのグルコースを伴うKRBHバッファー）後にラット／マウスインスリンELISAキット（ミリポア）を用いて測定した。
【０１７４】
［定量的RT-PCR分析］
TRIzol試薬（インビトロジェン）およびRNeasyキット（キアゲン）を使用して全RNAを抽出した。逆転写は、SuperScript IIIファーストストランド合成システムキット（インビトロジェン）またはPrimeScript RT試薬キット（タカラ）を用いて行った。リアルタイム定量的RT-PCR（qPCR）はSYBRグリーン（バイオラッド）を用いて行った。PCR分析は、表6に記載したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて行った。
【０１７５】
［クロマチン免疫沈降］
マウスインスリノーマ、MIN-6細胞からクロマチンを調製した。手短に述べると、MIN-6細胞を1%ホルムアルデヒドで10分間架橋し、その後125 mMのグリシンを加えた。クロマチンを酵素で剪断し（CHIP ITエクスプレスキット、アクティブモチーフ）、2μgの抗H3、対照マウスIgG、または抗ERRガンマ抗体で免疫沈降した。ChIP-qPCRプライマーは表6に記載されている。
【０１７６】
［電子顕微鏡］
膵臓試料を1 mm2の切片に切り、2%パラホルムアルデヒドおよび2%グルタルアルデヒドを含む0.1 mMリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.4）中で4℃において36時間に渡り固定した。それからその組織片を洗浄し、段階的なアセトンを用いて脱水し、エポン・アラルダイト中に包埋した。ウルトラミクロトームを使用して超薄切片を調製した。切片化組織を1%トルイジンブルーホウ砂溶液で染色し、銅グリッド上に載せ、酢酸ウラニルで二重染色した後にJEM 100 CX-II電子顕微鏡で調べた。
【０１７７】
［組織学（H&E染色、免疫染色、およびLacZ染色）］
H&E染色はパシフィックパソロジー（サンディエゴ）によって行われた。免疫染色は、膵臓の凍結切片および4% PFA固定化細胞に対して、以下の抗体を使用したZEISS共焦点顕微鏡分析によって可視化した：インスリン（1/100、アブカムab7842）、c-ペプチド（1/100、アブカムab14182）、グルカゴン（1/100、アブカムab10988）、ソマトスタチン（1/100、アブカムab103790）、プロホルモンカルボキシラーゼ1/3（1/100、ミリポアAB10553）、Pdx-1（1/100、アブカムab47267）。核染色のためにDAPI含有マウンティング媒体（蛍光用VECTASHIELDマウンティング媒体）を使用した。ERRγノックインマウス（Alaynick et al., 2007, Cell metabolism 6, 13-24）からの全膵臓はパラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドで固定し、凍結切片をX-galにより染色した。
【０１７８】
［マイクロアレイ分析］
Trizol試薬（インビトロジェン）を使用して、Ad-GFPまたはAd-Creで感染された膵島から全RNAを抽出し、その品質をアジレント2100バイオアナライザーにより決定した。イルミナTotalPrep RNA増幅キット（アンビオン）を使用して、500 ngのRNAをcRNAに逆転写しビオチンUTP標識した。cRNAは、アジレントバイオアナライザー2100を用いて定量化し、標準的プロトコール（イルミナ）を用いてイルミナのマウスRefseq-8v2 Expression BeadChipにハイブリダイズさせた。画像データは、イルミナGenomeStudioを用いて非正規化サンプルプローブプロファイル（unnormalized Sample Probe Profiles）に変換した。データはGeneSpring GXソフトウェアにより分析した。手短に述べると、チップ当たりの正規化は75パーセンタイルに対して設定し、遺伝子当たりの正規化は中央値および特定のサンプルに対して設定した。不在として指定された遺伝子はデータセットから消去され、WTより発現差が2倍の遺伝子を選択した。主にDAVIDソフトウェアを使用して、GO、経路解析、およびクラスター解析による組合せ解析を行った（Huang et al., 2009, Nature protocols 4, 44-57; Huang et al., 2009, Nucleic acids research 37, 1-13）。マイクロアレイデータはNCBI遺伝子発現オムニバスに登録され、GEOシリーズアクセス番号GSE56080によりアクセス可能である。
【０１７９】
［RNA-Seqライブラリー作製］
RNA miniキット（キアゲン）を使用して、RNAlaterで処理された細胞ペレットから全RNAを単離し、室温で30分間 DNaseI（キアゲン）で処理した。配列決定用ライブラリーは、製造会社のプロトコールに従ってTruSeq RNAサンプル調製キットv2（イルミナ）を使用して100〜500ngの全RNAから調製した。手短に述べると、mRNAを精製し、断片化し、ファーストストランドおよびセカンドストランドcDNA合成に使用した後、3’末端をアデニル化した。サンプルを固有のアダプターにライゲートし、PCR増幅した。それからライブラリーを、2100バイオアナライザー（アジレント）を用いて確認し、正規化し、配列決定のためにまとめた。
【０１８０】
［ハイスループット配列決定および解析］
各実験条件について2〜3個の生物学的複製から調製されたRNA-Seqライブラリーを、イルミナHiSeq 2500において、バーコード化マルチプレックスおよび100 bpリード長を使用して配列決定した。画像解析およびベース判定はイルミナCASAVA-1.8.2を用いて行った。これは、サンプル当たり中央値29.9Mの使用可能リードを生じた。RNA-SeqアライナーSTARを使用して、短いリード配列をUCSC mm9参照配列にマッピングした（Dobin et al., 2013, Bioinformatics 29, 15-21）。アライナーにはmm9における既知スプライスジャンクションを供給し、新規のジャンクション発見も許容した。差次的遺伝子発現解析、統計学的検定、およびアノテーションは、Cuffdiff 2を用いて行った（Trapnell et al., 2013, Nature biotechnology 31, 46-53）。転写物の発現は、百万のマッピングされた断片につき1キロベースのエクソンモデルごとの断片（fpkm：fragments per kilobase of exon model per million）の遺伝子レベル相対的存在量として計算し、転写物存在量バイアスについての補正を採用した（Roberts et al., 2011, Bioinformatics 27, 2325-2329）。対象とする遺伝子のRNA-Seq結果はUCSCゲノムブラウザーを使用して視覚的にも探索した。RNA-Seqデータは、NCBI配列リードアーカイブにおいてアクセス番号SRP048600およびSRP048605のもとアクセスすることができる。
【０１８１】
［ヒト人工多能性細胞（hiPSC）のインスリン産生細胞およびグルコース応答性細胞への分化］
Huvecから誘導されたヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）および胚性幹細胞（H9ES）はステムセルコア（ソーク研究所）から入手した。マトリゲル（BD）コーティングディッシュ上にて完全mTeSR培地中で細胞を維持した。膵臓分化のためには、スピンフェクション（800g、1時間）によってhPCをヒトインスリンレポーターレンチウイルス（pGreenZeroレンチレポーターヒトインスリン、System Biosciences）で感染させ、それから培地を2日間、100ng/mlヒトアクチビン（シグマ）、25ng/ml組換えヒトWnt3a（シグマ）を含む分化培地（800ml DMEM/F12、13.28g BSA、10mlグルタマックス、560mg NaHCO3、330mgチアミン、100mg還元グルタチオン、3300 mgビタミンC、14μgセレニウム、10ml NEAA、2mlトレースエレメントB、1mlトレースエレメントC、7μl β-ME、2ml DLC、2ml GABA、2ml LiCl、129.7μg PA、インスリン2mgを1000mlまでにする）に変え、それからさらに2日間、100ng/mlヒトアクチビンを含む分化培地に変えた（ステージ1）。続いて培地を、1μMドルソモルフィン（カルバイオケム）、2μMレチノイン酸（シグマ）、および10μM SB431542を伴う分化培地に7日間置き換えた（ステージ2）。それから培地を、10μMフォルスコリン（シグマ）、10μMデキサメタゾン（ステムジェント）、10μM TGFβRIキナーゼ阻害剤II（カルバイオケム）、10mMニコチンアミド（シグマ）を伴う分化培地に10日間置き換えた（ステージ3）。培地は、毎日（ステージ1）、毎日または2日毎に（ステージ2）、および2日毎に（ステージ3、ベータ様細胞）交換した。
【０１８２】
第22〜25日に、ヒトインスリン遺伝子およびGFPの発現を、qPCRおよび蛍光顕微鏡により定期的に確認した。陽性の細胞を後続の実験に使用した。EGFP-アデノウイルス（Ad-GFP）またはヒトERRガンマアデノウイルス（Ad-ERRγ）を、2% FCSを伴うRPMI-1640中に希釈し、1x108 pfu/ml（MOI 100）を使用して2時間、ベータ様細胞に感染させた。培地を3〜5日間、10μMフォルスコリン（シグマ）、10μMデキサメタゾン（ステムジェント）、10μM TGFβRIキナーゼ阻害剤II（カルバイオケム）、10mMニコチンアミド（シグマ）、10mMニコチンアミド（シグマ）を含有する分化培地に変え、それからGFP発現ベータ様細胞（iGFP細胞）およびERRガンマ発現ベータ様細胞（iβeta細胞）を、RNA-Seq、EM、シーホース（Seahorse）、および移植実験について分析した。分化プロトコールについての追加的情報は表7に記載されている。
【０１８３】
［OCRおよびECARの測定］
酸素消費速度（OCR：Oxygen consumption rate）および細胞外酸性化速度（ECAR：extracellular acidification rate）は、XF96シーホース（Seahorse Biosciences）を使用して96-ウェルプレートにおいて記録した。手短に述べると、70単離膵島／ウェルをXF DMEM培地（pH7.4）および3mMグルコースで1時間前培養し、その後、グルコースを、最終濃度20mMになるまで段階的に追加した。グルコースを追加するあいだ、OCR（3mMグルコースと比較した%変化として報告される）を記録した。
【０１８４】
フローサイトメトリーにより選別したインスリン陽性ベータ様細胞を96-ウェルプレートにおいて3日間培養し（1x105細胞／ウェル）、その後アデノウイルスEGFPまたはERRガンマベクターで感染させた。感染した細胞を、3mMグルコースを伴うXF DMEM培地（pH7.4）中で1時間前培養し、それから培地を、マイトストレス（Mitostress）キット（Seahorse Biosciences）で指示されているように、20mMグルコース、1mMピルビン酸ナトリウム、および適切なミトコンドリアストレス試薬（オリゴマイシン、Fccp、ロテノン、およびアンチマイシンA）を伴うXF DMEM培地（pH7.4）に変えた。
【０１８５】
［ウイルス生成］
レンチウイルスは、HEK293T細胞株において第2世代または第3世代レンチウイルス系を使用して産生した。アデノウイルスEGFPおよびCreはイリノイ大学から購入し、アデノウイルスERRガンマはウェルゲン社から購入した。
【０１８６】
［NOD-SCIDマウス移植実験］
免疫不全NOD-SCIDマウス（NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ）はジャクソンラボラトリーから購入し、ソーク研究所のSPF施設にて、オートクレーブ済みケージ中で飼育し維持した。マウスは、高用量のストレプトゾトシン（STZ；180mg/kg）の腹腔内（i.p.）単一注射により糖尿病にした。STZ注射の1週間後、400mg/dLより高いレベルの血中グルコースを有するマウスを、移植分析のためのレシピエントとして使用した。
【０１８７】
ヒトとマウスの膵島（動物当たり200〜500個の膵島あるいは500〜1000 IEQ）またはヒトiPSC由来インスリン産生細胞（iβLGFPまたはiβeta細胞；動物当たり1000万細胞）を200μlのRPMI-1640培地に再懸濁した。細胞を実験用チューブ（SiLastic, 508-004）中に充填し、1〜2分間400gで遠心分離した。8〜16週齢STZ注入糖尿病マウスにおいて細胞塊を腎臓被膜下に移植した（約30〜50μl）。ケタミン（80mg/kg）およびキシラジン（10mg/kg）を外科麻酔薬として使用し、マウスは37℃ヒートパッド上において回復させた。
【０１８８】
［代謝ケージ分析］
代謝ケージ分析は、包括的実験動物モニタリングシステム（コロンバスインストゥルメンツ）を用いて行った。データを記録する前に少なくとも24時間適応させ、CO2産生、O2消費、呼吸交換比（RER）、およびx-ピークによる歩行カウントを5日連続して昼と夜に決定した。
【０１８９】
［統計学的方法］
結果は、平均±平均の標準誤差（s.e.m.：standard error of the mean）として表現した。統計学的比較はステューデントのt検定を使用して行った。統計学的有意差は*P<0.05として定義した。
【０１９０】
［他の実施形態］
上記説明から、本明細書に記述される発明にバリエーションおよび修飾を施して様々な使用および条件に適応させ得ることが明らかであろう。そのような実施形態も下記特許請求の範囲の範囲内である。
【０１９１】
本明細書における可変物の定義における要素の列挙の記載は、その可変物の単一要素としての定義または列挙された要素の組合せ（もしくは一部組合せ）としての定義を包含する。本明細書における実施形態の記載は、単一実施形態としてのその実施形態またはその他の実施形態もしくはその一部分との組合せにおけるその実施形態を包含する。
【０１９２】
本明細書で言及される全ての特許および刊行物は、各々の独立した特許および刊行物が具体的かつ個別に参照により組み入れられていることが示されているとした場合と同程度において、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９３】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
0006707461.tif 000023
【０１９４】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【０１９５】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【０１９６】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【０１９７】
【表５】
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【０１９８】
【表６−１】
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【表６−２】
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【０１９９】
【表７−１】
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【表７−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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