(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スフェロイド形成を促進する方法であって、
（１）細胞試料と促進剤を混合した混合物を調製する工程と、
（２）前記工程（１）により得られた混合物を、スフェロイド形成培養用容器内で培養する工程と、
を有し、
前記工程（２）の前に、前記工程（１）により得られた混合物中の細胞に外力を加え、
前記促進剤が、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−イズロン酸、及びＤ−ガラクトースからなる群より選択される１種以上が重合した高分子であり、
前記外力が、遠心力であることを特徴とする、スフェロイド形成促進方法。
【請求項２】
前記工程（１）を複数回繰り返した後、前記工程（２）を行う、請求項１に記載のスフェロイド形成促進方法。
【請求項３】
前記細胞試料に含まれている細胞数が、１×１０３〜１×１０６個である、請求項１又は２に記載のスフェロイド形成促進方法。
【請求項４】
前記細胞試料が、動物から採取された細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスフェロイド形成促進方法。
【請求項５】
前記細胞試料が、ヒトから採取された細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスフェロイド形成促進方法。
【請求項６】
前記促進剤が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はデルマタン硫酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスフェロイド形成促進方法。
【請求項７】
前記促進剤が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、又はヒアルロン酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスフェロイド形成促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞からのスフェロイド形成を促進する方法、及び当該方法に用いられるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉＰＳ細胞技術等を代表とした細胞・組織工学は目覚しい発展を遂げ、再生医療を含む医療分野を中心に応用化が進められている。例えば再生医療分野では、患者から採取された細胞から形成したシートが、人工皮膚、人工網膜として既に認可を受け、臨床の現場へ供給されている。また、細胞から形成されたシートを積層し、さらにシート内に血管網を構築することにより、生体内組織様の３次元組織構造を形成する手法についても報告されている（例えば、特許文献１及び２参照。）。
【０００３】
より生体に近い三次元構造を保持した組織を形成する手法の一つとして、元来から、接着系細胞本来の凝集反応を利用したスフェロイド(細胞凝集体)培養法が知られている（例えば、非特許文献１〜３参照。）。スフェロイド培養法では、接着系細胞を非接着性足場上で又は足場を用いることなく培養することにより、スフェロイドを形成させる。形成されたスフェロイドは、足場に付着させた単層の細胞層よりも生体組織に近く、このため、スフェロイドを用いることにより、例えば、薬剤の生体組織に対する効果をより簡便に評価することができる。
【０００４】
スフェロイド培養法において、スフェロイドを形成させるための専用培養容器が既に幾つか報告されている。当該専用培養容器としては、例えば、非接着性足場を実現する為に機能性分子をコートした培養容器や、細胞非接着性のゲルを表面に付着させた培養容器、微小液滴中で培養する容器（微小液中培養容器）等が市販されている。また、最小内径が３μｍ以下のセルを複数連続して形成された細胞接着面として機能する凹凸構造を有する培養容器も報告されている（例えば、特許文献３参照。）。この微細なセル内で細胞を培養することにより、増殖した細胞が単層に広がるのではなく、スフェロイドが形成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５３２２３３２号公報
【特許文献２】特許第５３２２３３３号公報
【特許文献３】特許第４１５９１０３号公報
【特許文献４】特許第５８２２２１７号公報
【特許文献５】特許第５５７８６４８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Davis，Journal of Embryology & Experimental Morphology，1978，vol.44, p.297〜302.
【非特許文献２】Folkman，et al.，The Journal of Experimental Medicine，1973，vol.138(4)，p.745〜753．
【非特許文献３】Sutherland, et al.，International Journal of Radiation Biology，  1970，vol.18(5)，p.491〜495.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、スフェロイド培養法では、細胞種によっては形成できないものもあり、また、形成されたスフェロイドの組織均一性にばらつきが出易く、非常に制御が困難である。臨床現場などの患者検体を用いた薬剤感受性試験等では、用いることのできる検体の量も限られているため、スフェロイド形成における不安定性は、常に懸念材料として挙げられている。
【０００８】
また、スフェロイド培養法では、細胞本来の接着力を駆動力としているが故に、スフェロイド形成に要する時間も長い。細胞数、細胞腫にもよるが、例えば、スフェロイド形成に３〜７日程度要する場合もある。スフェロイド形成に要する時間を短縮しうる方法については、これまでに報告された例は少ない。
【０００９】
特許文献４、５には、イカ、タコ、ゲンゲ等の頭足類や魚類の体液を用いた方法が報告されているが、天然物由来であるため、安価で安定したスフェロイドの作製には不向きであった。
【００１０】
本発明に係るスフェロイド形成促進方法は、下記［１］〜［７］である。
［１］  スフェロイド形成を促進する方法であって、
（１）細胞試料と促進剤を混合した混合物を調製する工程と、
（２）前記工程（１）により得られた混合物を、スフェロイド形成培養用容器内で培養する工程と、
を有し、
前記工程（２）の前に、前記工程（１）により得られた混合物中の細胞に外力を加え、
前記促進剤が、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−イズロン酸、及びＤ−ガラクトースからなる群より選択される１種以上が重合した高分子であり、
前記外力が、遠心力であることを特徴とする、スフェロイド形成促進方法。
［２］  前記工程（１）を複数回繰り返した後、前記工程（２）を行う、前記［１］のスフェロイド形成促進方法。
［３］  前記細胞試料に含まれている細胞数が、１×１０３〜１×１０６個である、前記［１］又は［２］のスフェロイド形成促進方法。
［４］  前記細胞試料が、動物から採取された細胞を含む、前記［１］〜［３］のいずれかのスフェロイド形成促進方法。
［５］  前記細胞試料が、ヒトから採取された細胞を含む、前記［１］〜［３］のいずれかのスフェロイド形成促進方法。
［６］  前記促進剤が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はデルマタン硫酸である、前記［１］〜［５］のいずれかのスフェロイド形成促進方法。
［７］  前記促進剤が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、又はヒアルロン酸である、前記［１］〜［５］のいずれかのスフェロイド形成促進方法。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係るスフェロイド形成促進方法は、下記［１］〜［８］である。
［１］  スフェロイド形成を促進する方法であって、
（１）細胞試料と促進剤を混合した混合物を調製する工程と、
（２）前記工程（１）により得られた混合物を、スフェロイド形成培養用容器内で培養する工程と、
を有し、
前記工程（２）の前に、前記工程（１）により得られた混合物中の細胞に外力を加え、
前記促進剤が、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−イズロン酸、及びＤ−ガラクトースからなる群より選択される１種以上が重合した高分子であることを特徴とする、スフェロイド形成促進方法。
［２］  前記工程（１）を複数回繰り返した後、前記工程（２）を行う、前記［１］のスフェロイド形成促進方法。
［３］  前記外力が、遠心力である、前記［１］又は［２］のスフェロイド形成促進方法。
［４］  前記細胞試料に含まれている細胞数が、１×１０３〜１×１０６個である、前記［１］〜［３］のいずれかのスフェロイド形成促進方法。
［５］  前記細胞試料が、動物から採取された細胞を含む、前記［１］〜［４］のいずれかのスフェロイド形成促進方法。
［６］  前記細胞試料が、ヒトから採取された細胞を含む、前記［１］〜［４］のいずれかのスフェロイド形成促進方法。
［７］  前記促進剤が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はデルマタン硫酸である、前記［１］〜［６］のいずれかのスフェロイド形成促進方法。
［８］  前記促進剤が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、又はヒアルロン酸である、前記［１］〜［６］のいずれかのスフェロイド形成促進方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るスフェロイド形成促進方法及びスフェロイド形成促進用キットを用いて特定の高分子からなる促進剤を用いることにより、培養容器によらず、簡便な工程で迅速、かつ、安定的にスフェロイドを形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１において、２４時間培養後に形成されているＨＴ２９細胞のスフェロイドの透過光写真図である。
【図２】実施例２において、２４時間培養後に形成されているスフェロイドの透過光写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係るスフェロイド形成促進方法は、スフェロイド形成を促進する方法であって、下記工程（１）及び（２）を有することを特徴とする。
（１）細胞試料と促進剤を混合した混合物を調製する工程。
（２）前記工程（１）により得られた混合物を、スフェロイド形成培養用容器内で培養する工程。
【００１５】
本発明に係るスフェロイド形成促進方法では、特定の構造を有する高分子からなる促進剤を用いる。当該促進剤を細胞と混合することにより、細胞が本来有する接着力のみを駆動力として形成するよりも、より迅速かつ安定的にスフェロイドを形成することができる。当該促進剤によりこのような効果が得られる理由は明らかではないが、細胞の表面に促進剤が付着し、形成された促進剤層によって細胞同士の凝集又は組織化がより高速かつ安定化するためと推察される。
【００１６】
本発明に係るスフェロイド形成促進方法では、促進剤によるスフェロイド形成促進効果により、細胞同士の凝集力が弱い細胞であっても、安定してスフェロイドを形成することができる。つまり、本発明に係るスフェロイド形成促進方法により、スフェロイドが形成し難い細胞であっても、スフェロイドを安定して形成させることができる。また、本発明に係るスフェロイド形成促進方法により形成されたスフェロイドは、真球に近い形状であり、かつ大きさが比較的揃っている。形状や大きさが比較的均質なスフェロイドが形成可能である理由は明らかではないが、細胞表面に形成された促進剤層同士の相互作用により、系内の細胞間に働く接着力や凝集力がほぼ一定に揃うためと推察される。
【００１７】
本発明において用いられる促進剤は、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−イズロン酸、及びＤ−ガラクトースからなる群より選択される１種以上が重合した高分子からなる。Ｄ−グルコサミン等は、グリコサミノグリカン（ムコ多糖類）の構成成分であり、当該高分子は、少なくとも一部分にグリコサミノグリカンの構造を有する。すなわち、当該高分子は、多数の硫酸基とカルボシキル基を有しており、負に帯電している電解質である。グリコサミノグリカンは、生体内において細胞の組織化等に深く寄与している因子として知られている高分子である。
【００１８】
本発明において用いられる促進剤としては、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルクロン酸、Ｌ−イズロン酸、及びＤ−ガラクトースからなる群より選択される１種以上のみが重合したグリコサミノグリカンであってもよく、当該グリコサミノグリカンに、Ｄ−グルコサミン等以外の分子が結合した高分子であってもよい。Ｄ−グルコサミン等以外の分子としては、Ｄ−グルコサミン等以外の糖類やウロン酸、糖鎖、アミノ酸、ペプチド、脂肪酸、脂質等が挙げられる。
【００１９】
本発明において用いられる促進剤としては、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はデルマタン硫酸が挙げられ、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、又はヒアルロン酸が好ましく、スフェロイド形成促進効果が高く、かつ汎用性も高い点から、ヘパリンがより好ましい。
【００２０】
本発明においては、まず、工程（１）として、スフェロイドを形成させる細胞を溶媒に懸濁させた細胞試料と促進剤を混合する。細胞試料と促進剤を混合することにより、細胞試料中の細胞の表面に促進剤が付着する。細胞試料と混合する促進剤は、１種類のみであってもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
【００２１】
本発明において用いられる細胞試料に含まれる細胞は、接着性細胞であればよく、動物から採取された細胞であってもよく、動物から採取された細胞を培養した細胞であってもよく、動物から採取された細胞に各種処理を施した細胞であってもよく、培養細胞株であってもよい。細胞試料に含まれる細胞が動物から採取された細胞の場合、採取部位は特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液などに由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよく、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。また、細胞試料に含まれる細胞の由来する動物の種類は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の動物に由来する細胞を用いることができる。動物から採取された細胞を培養した細胞としては、初代培養細胞であってもよく、継代培養細胞であってもよい。また、各種処理を施した細胞としては、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）や、分化誘導後の細胞が挙げられる。
【００２２】
本発明において用いられる細胞試料は、１種類のみの細胞を含んでいてもよく、２種類以上の細胞を含む懸濁物であってもよい。１種類の細胞を含む細胞試料を用いることにより、１種類の細胞のみからなるスフェロイドを形成することができ、複数種類の細胞を含む細胞試料を用いることにより、複数種類の細胞からなるスフェロイドを形成することができる。
【００２３】
本発明において用いられる細胞試料に含まれる細胞としては、いずれの細胞周期にある細胞であってもよく、未分化の細胞であってもよく、分化後の細胞であってもよい。また、正常な細胞であってもよく、癌組織等の病理組織から採取された細胞であってもよい。当該細胞試料に含まれる細胞としては、具体的には神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、肝癌細胞等の癌細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。例えば、癌細胞を含む細胞試料を用いることにより、当該癌細胞のスフェロイドを迅速かつ安定して形成することができる。また、例えば、ヒト由来の癌細胞、繊維芽細胞、血管細胞等の２種類以上の細胞を含む懸濁物を用いることにより、生体内組織を模した混合系スフェロイドを形成することもできる。
【００２４】
本発明において用いられる細胞試料に含まれる細胞の数は、特に限定されるものではなく、形成する目的のスフェロイドの大きさを考慮し、培養環境によって任意に設定することができる。例えば、当該細胞試料に含まれている細胞数を１×１０３〜１×１０６個にすることにより、薬剤等の評価試験に使用するために充分な大きさのスフェロイドが形成することができる。なお、細胞試料に含まれる細胞の数が、目的の大きさのスフェロイドを形成するためには不足している場合には、工程（１）を行う前に、必要な細胞数となるまで培養して増殖させてもよい。
【００２５】
工程（２）で培養する細胞試料と促進剤の混合物は、細胞懸濁液である。このため、細胞試料は、細胞を溶媒中で懸濁させた懸濁液であることが好ましいが、促進剤と混合した状態で細胞懸濁液となっていればよく、ペレット状の細胞試料を、促進剤を含む溶液と混合して、工程（２）で培養する細胞懸濁液を調製してもよい。細胞懸濁液を調製するための溶媒としては、細胞に対する毒性がなく、増殖性や機能を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、水、バッファー、細胞の培養培地等を用いることができる。当該バッファーとしては、例えば、リン酸生理食塩水（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｈａｎｋｓバッファー等が挙げられる。培養培地としては、Ｄ−ＭＥＭ、Ｅ−ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２等が挙げられる。
【００２６】
細胞試料と混合する促進剤の量は、スフェロイド形成促進効果が得られるために充分な量であればよく、細胞試料と促進剤の混合物中の細胞の種類、構成細胞数、培養環境に応じて任意に設定することができる。例えば、細胞試料と混合する促進剤の量は、細胞試料と促進剤の混合物中における促進剤の濃度が０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬとなる量であることが好ましく、０．１〜１ｍｇ／ｍＬとなる量であることがより好ましい。混合物中の促進剤の濃度が前記範囲内であれば、混合物中の細胞と促進剤が接触しやすく、多くの細胞の表面に促進剤が付着する結果、スフェロイド形成促進効果が充分に得られる。
【００２７】
促進剤は、粉末状等の固形物の状態で細胞試料に混合してもよいが、溶媒に溶解又は懸濁させた状態で細胞試料に混合することが好ましい。促進剤を溶解又は懸濁させる溶媒としては、細胞懸濁液を調整するための溶媒と同様のものを用いることができる。
【００２８】
本発明に係るスフェロイド形成促進方法においては、工程（１）を複数回繰り返した後、工程（２）を行ってもよい。
【００２９】
工程（１）の後、工程（２）として、工程（１）により得られた混合物を、スフェロイド形成培養用容器内で培養する。当該混合物をスフェロイド形成培養用容器内で培養することにより、細胞表面に付着した促進剤の作用によって迅速にスフェロイドが形成される。工程（１）における混合物の調製は、スフェロイド形成培養用容器内で行ってもよく、その他の容器内で行った後、得られた混合物をスフェロイド形成培養用容器内に投入して工程（２）を行ってもよい。
【００３０】
本発明において用いられるスフェロイド形成培養用容器としては、細胞−細胞間以外の接着が抑制されている容器であればよく、一般的なスフェロイド培養法で細胞培養に用いられる容器を用いることができる。当該容器としては、例えば、非接着性足場を実現する為に機能性分子をコートした培養容器、細胞非接着性のゲルを表面に付着させた培養容器、微小液中培養法で使用されるような微小液中培養容器等が挙げられる。スフェロイド形成培養用容器の素材としては、ガラス、ステンレス、プラスチックなどが挙げられるが、これらに限定されない。スフェロイド形成培養用容器としては、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、プレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
スフェロイド形成培養用容器内での培養条件は、用いる細胞種に適した環境であればよく、例えば使用する細胞種の培養において推奨されている市販の培養培地を用いて、使用する細胞種の培養において推奨されている温度条件等にすることができる。また、培養時間についても、用いられる細胞種、細胞数、目的とするスフェロイドの大きさによって任意に設定することができる。
【００３２】
例えば、ヒト由来癌細胞のペレットを、ヘパリンを含有する溶液と混合して懸濁液を調製し、癌細胞とヘパリンとを当該懸濁液中で接触させ、細胞表面にヘパリンを付着させる。次に、ヘパリンを付着させた細胞を含む懸濁液を、微小液中培養容器に規定量添加し、癌細胞培養に適した環境下、例えば、５％ＣＯ２ガス、３７℃環境下で任意の時間保持する。これにより、迅速にスフェロイド形成を達成しうる。なお、当該懸濁液中には、培養培地等の細胞培養に適した環境となる成分が含まれていることが好ましい。
【００３３】
本発明に係るスフェロイド形成促進方法においては、工程（２）の前に、工程（１）により得られた混合物中の細胞に外力を加えることが好ましい。外力によって、混合物中で広く拡散している細胞が一定の領域に集められ、細胞同士の距離が短くなる結果、より迅速にスフェロイドを形成することができる。当該外力としては、混合物中の細胞に一定の方向に移動するように働く外力であれば特に限定されるものではなく、例えば、遠心力、圧力、磁力等が挙げられる。
【００３４】
遠心力及び圧力をかける条件は、スフェロイド形成培養用容器中において細胞の状態を保持しつつ、細胞が一定の領域に集められる条件であればよく、使用する細胞種、細胞数、又は目的とするスフェロイドの大きさによって任意に設定することができる。遠心力の場合は、例えば、ウェルプレート型の培養容器をプレート遠心装置で任意の時間遠心力を十分に加えればよい。また、圧力の場合は、例えば、ウェルプレート型の培養容器を加圧式又は減圧式の装置で圧力を十分に加えればよい。また、磁力を用いる場合は、例えば、細胞と特異的に結合又は接着できる構造又は機能を有する磁性体を用いて、細胞−磁性体複合体を形成し、磁力を用いて当該複合体をスフェロイド形成培養用容器底面等に集める方法等により行うことができる。
【００３５】
例えば、ヒト由来癌細胞のペレットを、ヘパリンを含有する溶液と混合して懸濁液を調製し、癌細胞とヘパリンとを当該懸濁液中で接触させ、細胞表面にヘパリンを付着させる。次に、ヘパリンを付着させた細胞を含む懸濁液を、低細胞接着表面を有する培養容器に規定量添加し、外力を加える。その後、癌細胞培養に適した環境下、例えば、５％ＣＯ２ガス、３７℃環境下で任意の時間保持する。これにより、迅速にスフェロイド形成を達成しうる。なお、当該懸濁液中には、培養培地等の細胞培養に適した環境となる成分が含まれていることが好ましい。
【００３６】
本発明に係るスフェロイド形成促進用キットは、前記促進剤を含むことを特徴とする。当該キットとしては、前記スフェロイド形成培養用容器を含むものが好ましい。その他、細胞懸濁液を調製するためのバッファー、細胞培養培地等を含んでいてもよい。このように、本発明に係るスフェロイド形成促進方法に必要な試薬等をキット化することにより、より簡便かつ短時間でスフェロイド形成を行うことができる。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３８】
［実施例１］
１種類の細胞からなるスフェロイドを形成した。
細胞としては、スフェロイドを形成し易い細胞としてヒト結腸直腸腺がん細胞株ＨＴ２９（ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）のＨＴＢ−３８（登録商標））、スフェロイドを形成しにくい細胞としてヒト乳腺がん細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣのＨＴＢ−２２（登録商標））の２種を用いた。培養容器としては、微小液中培養容器であるＰＥＲＦＥＣＴＡ  ３Ｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ  Ｈａｎｇｉｎｇ  Ｄｒｏｐ  Ｐｌａｔｅ（３Ｄ  Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ社製、ＮＴ−ＨＤＰ１０９６）を用い、培養培地としては、Ｄ−ＭＥＭ（和光純薬社製  ０４３−３００８５）に１０ｖｏｌ／ｖｏｌ％ウシ血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製  ＃３５−０１０−ＣＶ）と１ｖｏｌ／ｖｏｌ％ペニシリン／ストレプトマイシン（和光純薬社製  １６８−２３１９１）を含有させた血清培養培地を用いた。促進剤としては、ヘパリン（ＳＩＧＭＡ社製、Ｈ３１４９）を用いた。
【００３９】
具体的には、まず、各細胞についてそれぞれ、細胞とヘパリンを、ヘパリン濃度が１ｍｇ／μＬ、細胞濃度が１×１０４個／５０μＬとなるように血清培養培地に添加して混合し、細胞懸濁液を調製した。
【００４０】
次いで、調製した細胞懸濁液を、微小液中培養容器の３つのウェルにそれぞれ、１ウェル当たり５０μＬずつ（ウェル当たりの細胞数が１×１０４個となる。）添加し、３７℃、５％ＣＯ２ガス環境下で７２時間培養し、スフェロイド形成の有無を経時的に評価した。また、７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しの条件についても同様に実施した。
【００４１】
スフェロイド形成の評価は、培養開始から２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、４８、７２時間後の１０点において、細胞懸濁液に対して、倒立型顕微鏡を用いた直接観察による画像解析を行い、３段階で評価した。評価値１は、スフェロイド形成無し（分散状態である。）、評価値２は、スフェロイド形成の兆候あり（アイランド形状等の不均一な凝集体ができている。）、評価値３は、スフェロイド形成有り（球状様形状で均一な形状のスフェロイドができている。）とした。評価方法は実施例で共通である。
【００４２】
細胞の生存率は、生細胞数解析により行った。具体的には、培養７２時間経過後の細胞懸濁液にトリパンブルー溶液を添加し、染色された細胞数を、ライフテクノロジーズ社製セルカウンター（ＣｏｕｎｔｅｓｓII）を用いてカウントして評価した。
【００４３】
各細胞について、ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表１に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表２に示す。
【００４４】
【表１】
0006792777.tif 000002
【００４５】
【表２】
0006792777.tif 000003
【００４６】
表１に示す通り、ＭＣＦ７細胞の場合、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３に至らなかったのに対して、促進剤有りの細胞懸濁液では、７２時間後には３つのウェルのうち２つのウェルでは評価値３に至っていた。また、ＨＴ２９細胞の場合は、評価値３に至るまでに、促進剤無しの細胞懸濁液では４８〜７２時間要していたのに対して、促進剤有りの細胞懸濁液では６〜８時間しか要しておらず、スフェロイド形成時間が約１／８に短縮できていた。一方で、表２に示す通り、いずれの細胞についても生存率は、促進剤無しの場合と促進剤有りの場合で同程度であり、促進剤が細胞の生存性を損なっていないことが確認された。
【００４７】
また、図１に、ＨＴ２９細胞において、２４時間培養後に形成されているスフェロイドの透過光写真図を示す。図中、左側２図が、促進剤無しの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイド（上図：Ｎ１ウェル、下図：Ｎ２ウェル）であり、右側２図が、促進剤有りの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイド（上図：Ｎ１ウェル、下図：Ｎ２ウェル）である。図に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドは、形状がいびつなものが大半であったのに対して、促進剤有りの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドは、球形で大きさも大体同程度であり、形成されたスフェロイドは、形状と大きさが比較的均質であった。
【００４８】
［実施例２］
３種類の細胞からなるスフェロイドを形成した。
細胞としては、実施例１でも用いたＨＴ２９細胞と、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞（Ｌｏｎｚａ社製、ＣＣ−２５０９  Ｎｏｒｍａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＮＨＤＦ）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｌｏｎｚａ社製、ＣＣ−２５１７Ａ  Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）の３種を用いた。
【００４９】
具体的には、細胞として、ＨＴ２９細胞とＮＨＤＦ細胞とＨＵＶＥＣ細胞とを２００００：１２０００：８０００（細胞数）で混合した細胞混合物を用いた以外は、実施例１と同様にして、ヘパリンと混合した細胞懸濁液を調製し、これを微小液中培養容器で７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しの条件についても同様に実施した。
【００５０】
ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表３に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表４に示す。
【００５１】
【表３】
0006792777.tif 000004
【００５２】
【表４】
0006792777.tif 000005
【００５３】
表３に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らなかったのに対して、促進剤有りの細胞懸濁液では、２４時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。また、表４に示す通り、促進剤無しの場合に比べて、促進剤有りの場合には、生細胞数は約１．５倍、生存率は約１．５倍であった。
【００５４】
また、図２に、２４時間培養後に形成されているスフェロイドの透過光写真図を示す。図中、左側２図が、促進剤無しの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドであり、右側２図が、促進剤有りの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドである。図に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドは、形状がいびつなものが大半であったのに対して、促進剤有りの細胞懸濁液中に観察されたスフェロイドは、球形で大きさも代替同程度であり、形成されたスフェロイドは、形状と大きさが比較的均質であった。
【００５５】
［実施例３］
促進剤添加後培養前に外力を与える条件で、１種類の細胞からなるスフェロイドを形成した。
細胞としては、実施例１でも用いたＭＣＦ７を用いた。培養容器としては、細胞低吸着プレートＧｒａｖｉｔｙＴＲＡＰ（登録商標） ＵＬＡ Ｐｌａｔｅ（Ｉｎｓｐｈｅｒｏ社製、ＩＳＰ−０９−００１）を用いた。培養培地としては、実施例１でも用いた血清培養培地を用い、促進剤としては、実施例１でも用いたヘパリンを用いた。
【００５６】
具体的には、まず、実施例１と同様にして、ヘパリンと細胞を血清培養培地に混合して細胞懸濁液を調製した。次いで、調製した細胞懸濁液を、細胞低吸着プレートの３つのウェルにそれぞれ、１ウェル当たり５０μＬずつ（ウェル当たりの細胞数が１×１０４個となる。）添加した後、当該細胞低吸着プレートを４００×ｇで１分間遠心処理した。その後、当該細胞低吸着プレートを、３７℃、５％ＣＯ２ガス環境下で７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件と、促進剤有りであるが、遠心処理を行わなかった条件についても同様に実施した。
【００５７】
ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表５に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表６に示す。表５及び表６中、「促進剤無」は促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件の結果を、「促進剤有」は促進剤有りであるが、遠心処理を行わなかった条件の結果を、「促進剤・外力有」は促進剤有りであり、かつ遠心処理も行った条件の結果を、それぞれ示す。
【００５８】
【表５】
0006792777.tif 000006
【００５９】
【表６】
0006792777.tif 000007
【００６０】
表５に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らず、促進剤有りの細胞懸濁液では、７２時間培養後にようやく３つのウェルのうち２つのウェルで評価値３に至っていたのに対して、促進剤を添加し、かつ培養前に外力をかけた細胞懸濁液では、１０時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。これらの結果から、細胞培養前の細胞懸濁液に外力をかけることにより、スフェロイド形成がさらに促進されることがわかった。一方で、表６に示す通り、細胞の生存率は、いずれの条件でも同程度であり、促進剤や外力の付加によって細胞の生存性が損なわれていないことが確認された。
【００６１】
［実施例４］
促進剤添加後培養前に外力を与える条件で、３種類の細胞からなるスフェロイドを形成した。
細胞としては、実施例２でも用いたＨＴ２９細胞とＮＨＤＦ細胞とＨＵＶＥＣ細胞とを用い、培養容器としては、実施例３でも用いた細胞低吸着プレートを用いた。培養培地としては、実施例１でも用いた血清培養培地を用い、促進剤としては、実施例１でも用いたヘパリンを用いた。
【００６２】
具体的には、細胞として、ＨＴ２９細胞とＮＨＤＦ細胞とＨＵＶＥＣ細胞とを２００００：１２０００：８０００（細胞数）で混合した細胞混合物を用いた以外は、実施例３と同様にして、ヘパリンと混合した細胞懸濁液を調製し、これを細胞低吸着プレートのウェルに添加した。その後、実施例３と同様にして、当該細胞低吸着プレートに対して遠心処理を行い、さらに７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件と、促進剤有りであるが、遠心処理を行わなかった条件についても同様に実施した。
【００６３】
ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表７に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表８に示す。表７及び表８中、「促進剤無」、「促進剤有」、「促進剤・外力有」は表５と同じである。
【００６４】
【表７】
0006792777.tif 000008
【００６５】
【表８】
0006792777.tif 000009
【００６６】
表７に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らず、促進剤有りの細胞懸濁液では、２４時間培養後にようやく全てのウェルで評価値３に至っていたのに対して、促進剤を添加し、かつ培養前に外力をかけた細胞懸濁液では、１０時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。これらの結果から、複数種類の細胞からスフェロイドを形成する場合でも、細胞培養前の細胞懸濁液に外力をかけることにより、スフェロイド形成がさらに促進されることがわかった。一方で、表８に示す通り、促進剤を添加し、かつ培養前に外力をかけた場合の生存率は、促進剤を添加し、培養前に外力をかけていない場合とほぼ同等であり、本実施例において行った外力付加によって細胞の生存性が損なわれていないことが確認された。
【００６７】
［実施例５］
促進剤として３種類のグリコサミノグリカンを用いて、スフェロイドを形成させた。
細胞としては、実施例１でも用いたＭＣＦ７を用い、培養容器としては、実施例３でも用いた細胞低吸着プレートを用い、培養培地としては、実施例１でも用いた血清培養培地を用いた。促進剤としては、実施例１でも用いたヘパリンと、コンドロイチン硫酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社製、Ｃ３７８８）と、ヒアルロン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ社製、Ｈ１８７６）を用いた。
【００６８】
具体的には、まず、実施例１と同様にして、各促進剤をそれぞれ細胞に添加し、ヘパリン濃度が１ｍｇ／μＬ、細胞濃度が１×１０４個／５０μＬである細胞懸濁液と、コンドロイチン硫酸ナトリウム濃度が１ｍｇ／μＬ、細胞濃度が１×１０４個／５０μＬである細胞懸濁液と、ヒアルロン酸ナトリウム濃度が１ｍｇ／μＬ、細胞濃度が１×１０４個／５０μＬである細胞懸濁液と、をそれぞれ調製した。次いで、実施例３と同様にして、各細胞懸濁液をそれぞれ、細胞低吸着プレートのウェルに添加した後、当該細胞低吸着プレートに対して遠心処理を行い、さらに７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件についても同様に実施した。
【００６９】
各促進剤を添加した細胞懸濁液について、ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表９に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表１０に示す。表９及び表１０中、「コンドロイチン」はコンドロイチン硫酸ナトリウムを添加した細胞懸濁液の結果を、「ヒアルロン」はヒアルロン酸ナトリウムを添加した細胞懸濁液の結果を、それぞれ示す。
【００７０】
【表９】
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【００７１】
【表１０】
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【００７２】
表９に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らなかったのに対して、ヘパリンを添加した細胞懸濁液では１０時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っており、コンドロイチン硫酸ナトリウムを添加した細胞懸濁液では７２時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っており、ヒアルロン酸ナトリウムを添加した細胞懸濁液でも７２時間培養後には３つのウェルのうち２つのウェルで評価値３に至っていた。これらの結果から、コンドロイチン硫酸とヒアルロン酸でも、ヘパリンと同様にスフェロイド形成促進効果が得られることがわかった。また、表１０に示す通り、細胞の生存率は、いずれの細胞懸濁液でも同程度であり、促進剤の付加によって細胞の生存性が損なわれていないことが確認された。
【００７３】
［実施例６］
細胞懸濁液中の促進剤の濃度によるスフェロイド形成に対する影響を調べた。
細胞としては、実施例１でも用いたＭＣＦ７を用い、培養容器としては、実施例３でも用いた細胞低吸着プレートを用い、培養培地としては、実施例１でも用いた血清培養培地を用い、促進剤としては、実施例１でも用いたヘパリンを用いた。
【００７４】
具体的には、細胞懸濁液中の最終濃度が０．０１、０．１、１、１０ｍｇ／ｍＬとなるようにヘパリンを添加した以外は、実施例３と同様にして、ヘパリンと混合した細胞懸濁液を調製し、これを細胞低吸着プレートのウェルに添加した。その後、実施例３と同様にして、当該細胞低吸着プレートに対して遠心処理を行い、さらに７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件についても同様に実施した。
【００７５】
各細胞懸濁液について、ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表１１及び１２に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表１３に示す。表１１〜表１３中、「０．０１ｍｇ／ｍＬ」、「０．１ｍｇ／ｍＬ」、「１ｍｇ／ｍＬ」、「１０ｍｇ／ｍＬ」は、それぞれヘパリンを０．０１、０．１、１、１０ｍｇ／ｍＬとなるように含有する細胞懸濁液の結果を示す。
【００７６】
【表１１】
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【００７７】
【表１２】
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【００７８】
【表１３】
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【００７９】
表１１及び１２に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らなかったのに対して、ヘパリン０．０１ｍｇ／ｍＬを添加した細胞懸濁液では２４時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っており、ヘパリン０．１ｍｇ／ｍＬを添加した細胞懸濁液とヘパリン１ｍｇ／ｍＬを添加した細胞懸濁液では１０時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っており、ヘパリン１０ｍｇ／ｍＬを添加した細胞懸濁液では１８時間培養後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。また、表１３に示す通り、細胞の生存率は、いずれの細胞懸濁液でも同程度であった。
【００８０】
［実施例７］
細胞懸濁液中の細胞数によるスフェロイド形成に対する影響を調べた。
細胞としては、実施例１でも用いたＭＣＦ７を用い、培養容器としては、実施例３でも用いた細胞低吸着プレートを用い、培養培地としては、実施例１でも用いた血清培養培地を用い、促進剤としては、実施例１でも用いたヘパリンを用いた。
【００８１】
具体的には、細胞数が１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６個／５０μＬとなるように細胞懸濁液を調製した以外は、実施例３と同様にして、ヘパリンと混合した細胞懸濁液を調製し、これを細胞低吸着プレートのウェルに添加した。その後、実施例３と同様にして、当該細胞低吸着プレートに対して遠心処理を行い、さらに７２時間培養した。また、実施例１と同様にして、経時的に細胞懸濁液のスフェロイド形成を評価し、さらに７２時間培養後の細胞の生存率を調べた。比較のため、促進剤無しであり、かつ遠心処理も行わなかった条件についても同様に実施した。
【００８２】
各細胞懸濁液について、ウェルごと（「Ｎ１」、「Ｎ２」、「Ｎ３」）のスフェロイド形成の評価結果を表１４及び１５に示す。また、生細胞数解析により得られた生細胞数と生存率（％）について、３つのウェルの平均値を表１６及び１７に示す。表１４〜表１６中、「１×１０３個」、「１×１０４個」、「１×１０５個」、「１×１０６個」は、それぞれ細胞数が１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６個／５０μＬである細胞懸濁液の結果を示す。
【００８３】
【表１４】
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【００８４】
【表１５】
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【００８５】
【表１６】
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【００８６】
【表１７】
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【００８７】
表１４及び１５に示す通り、促進剤無しの細胞懸濁液では、７２時間培養後でも評価値３には至らなかったのに対して、ヘパリンを添加した細胞懸濁液ではいずれの細胞数でも４８時間後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。特に、細胞数が１×１０３個／５０μＬと１×１０４個／５０μＬの細胞懸濁液では、１０時間後には全てのウェルにおいて評価値３に至っており、１×１０５個／５０μＬの細胞懸濁液では１８時間後には全てのウェルにおいて評価値３に至っていた。また、表１６及び１７に示す通り、いずれの条件でも、促進剤有りの細胞懸濁液の細胞の生存率は、促進剤無しの細胞懸濁液の生存率以上であり、特に、細胞数が１×１０３個／５０μＬと１×１０５個／５０μＬと１×１０６個／５０μＬの細胞懸濁液では、促進剤有りの細胞懸濁液の細胞の生存率は、促進剤無しの細胞懸濁液の生存率よりも有意に高かった。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明に係るスフェロイド形成促進法では、促進剤を用いることにより、簡便な工程で迅速かつ安定的にスフェロイドを形成することができる。このため、例えば臨床現場において、患者から採取した細胞からスフェロイドを迅速かつ安定して形成できるため、患者由来の細胞の薬剤感受性試験等における労力や時間を大幅に削減でき、また、これまでスフェロイド形成が上手くできず、分析困難であった症例についても分析を可能にすることができる。
【図１】
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【図２】
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