(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心房細動を呈する被験体の治療法の決定を容易にする方法であって、前記方法が、被験体からのサンプル中のpitx2c発現のレベルを測定することを含み、および測定されたpitx2c発現のレベルが、治療法の選択のために用いられ、
pitx2c発現のレベルが低下しているか、または所定の閾値より低いことが測定された場合に、前記測定されたpitx2c発現のレベルがナトリウムチャネル遮断薬による治療の選択のために用いられる、
方法。
【請求項２】
前記ナトリウムチャネル遮断薬がタイプ1の抗不整脈薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ナトリウムチャネル遮断薬がフレカイニドまたはプロパフェノンである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが、尿、唾液、血液、痰、精液、便、鼻腔拭い液、涙液、膣拭い液、直腸拭い液、頸管スミア、組織生検、および尿道拭い液の少なくとも１つを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが血液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
pitx2c発現のレベルが、pitx2cタンパク質レベルまたはmRNAレベルを測定することによって直接的に決定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
pitx2c発現のレベルが、pitx2c発現のレベルを示すバイオマーカーのレベルの測定によって間接的に決定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実行すること、および
pitx2c発現のレベルが低下しているか、または所定の閾値より低いことが測定された場合、ナトリウムチャネル遮断薬を前記被験体に投与すること
を含む方法に使用するための、ナトリウムチャネル遮断薬。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に使用するためのアッセイシステムであって、
pitx2c発現を測定する測定装置と；
前記測定装置からpitx2c発現データを得て、データ変換を行い、測定されたレベルがpitx2c発現の基準値もしくは正常値より高いかまたは低いか否かを計算する、データ変換装置
とを備えるアッセイシステム。
【請求項１０】
データをユーザーに出力するためのユーザーインターフェース出力装置を更に備える、請求項９に記載のアッセイシステム。
【請求項１１】
治療情報のデータベースを更に備え、前記データ変換装置が、測定されたpitx2cのレベルに対するデータベース中の治療情報を特定し、ユーザーインターフェース出力装置に治療情報を出力する、請求項１０に記載のアッセイシステム。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法に使用するためのキットであって、pitx2c mRNAもしくはタンパク質、またはpitx2c発現を示すバイオマーカーに特異的に結合することができる、少なくとも１つの抗体、プローブおよび／またはプライマー、ならびに使用説明書を含むキット。
【請求項１３】
少なくとも１つの抗体、プローブおよび／またはプライマーが、検出可能な標識で標識化される、請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心房細動を患う被験体に対する適切な治療法を選択的に決定する方法、ならびに被験体に抗不整脈薬を投与する方法、および心房細動患者の特定のコホートを治療するための、ナトリウムチャネル遮断薬、例えばフレカイニドまたはプロパフェノンなどの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心房細動（AF）は、欧州において、および世界中で、脳卒中、死亡、心不全、および入院の一般的な原因である。現在の管理戦略は、これらの不整脈の合併症を予防するのに十分ではない。リズムコントロール療法、すなわち、正常洞調律の回復は、症状のある患者にしばしば用いられ、将来的にAFの管理において予後判定の役割を得るかもしれない。カテーテルアブレーションは、比較的有効であるが非常に侵襲的な洞調律を維持する方法として出現した一方で、抗不整脈薬は、AF患者におけるリズムコントロールの治療の主流である。現在のところ、効果的な抗不整脈薬を選択する指針はない。どちらかというと、その選択は、現在の安全性への考慮に従っている（心房細動におけるESC（欧州心臓病学会）ガイドラインのCammら、EurHJ 2010およびCammら、EurHJ 2012参照）。このような薬物における比較的高いAFの再発率を考慮し、また、まれであるが可能性のある治療の危険な副作用を考慮すると、抗不整脈薬療法に反応する患者を特定する明確な必要性がある。
【０００３】
全ゲノム相関解析は、染色体4q25上、pitx2遺伝子付近に、心房細動と関連する単一ヌクレオチド多型を相次いで同定した。他のグループは、抗不整脈薬への反応が、染色体4q25上の最も一般的な多型のまれな対立遺伝子の保因者において異なることを発表した（Parvezら、JACC 2012）。Kirchhofら（2011）は、pitx2c発現レベルの低下したマウス（pitx2c+/-マウス）は心房細動を発症する可能性が高いことを示した。これは、他のグループによって確認されている（Wang PNAS 2010）。
【０００４】
しかし、どのようにPitx2cの発現レベルが抗不整脈薬療法への反応と関連しうるかについてのなんらかの提言は、これまでにまだない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、本発明者らによって行われた、pitx2c発現の低下が抗不整脈薬療法への反応に対して持っている影響についての研究に基づく。
【０００６】
第一の態様では、本発明は、心房細動を呈する被験体の治療の決定を容易にする方法を提供し、その方法は、被験体からのサンプル中のpitx2c発現のレベルを測定すること、およびpitx2c発現のレベルに基づいて治療法を選択することを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、pitx2cのレベルが所定の閾値より低いことが測定された場合、ナトリウムチャネル遮断薬による治療が選択される。
【０００８】
更なる態様では、心房細動を呈する被験体への治療の決定を容易にする方法が提供され、その方法は、被験体からのサンプル中のpitx2c発現のレベルを測定すること、およびpitx2c発現のレベルが低下しているか、または所定の閾値より低い場合、ナトリウムチャネル遮断薬による治療法を選択することを含む。
【０００９】
これに関連して、心房細動を治療する方法に使用するためのナトリウムチャネル遮断薬もまた提供され、ここで、治療される被験体は、pitx2c発現のレベルの低下、または所定の閾値より低いpitx2cのレベルを示す。
【００１０】
治療を必要とする被験体に抗不整脈薬を投与する方法もまた提供され、それは、
心房細動を有する治療を必要とする被験体を特定するステップ；
被験体のpitx2c発現のレベルを測定し、そのレベルが基準レベルと比較して上昇している、およそ同一である、または低下しているかどうかを特定するステップ；ならびに
基準レベルと比較してpitx2c発現レベルの低下を伴う被験体にナトリウムチャネル遮断性抗不整脈薬を投与するステップ（または、基準レベルと比較して上昇した、もしくはおよそ同一のpitx2c発現レベルを有する被験体に別のクラスの抗不整脈薬（例えば、ソタロールのようなカリウムチャネル遮断薬）を投与するステップ）を含む。
【００１１】
更に、心房細動を呈する被験体に抗不整脈薬を投与する方法が提供され、それは、
心房細動を呈する被験体のpitx2c発現のレベルを測定するステップ；および
pitx2c発現レベルの低下を伴う被験体、または所定の閾値より低いpitx2c発現レベルを有する被験体にナトリウムチャネル遮断性抗不整脈薬を投与するステップ（あるいは、pitx2c発現レベルの低下を示さない被験体、または所定の閾値とおよそ同一もしくはより高いpitx2c発現レベルを有する被験体に別のクラスの抗不整脈薬（例えば、ソタロールのようなカリウムチャネル遮断薬）を投与するステップ）を含む。
【００１２】
更に、被験体の心房細動の治療のために抗不整脈薬を投与する方法が提供され、それは、
基準レベルまたは所定の閾値と比較してpitx2c発現レベルの低下を示す被験体に、心房細動の治療のための抗不整脈薬としてナトリウムチャネル遮断薬を投与することを含む。
【００１３】
更に、心房細動を呈する被験体からのサンプル中のpitx2c発現のレベルを測定すること；および心房細動を治療する方法に使用するための抗不整脈薬を選択することを含む方法が提供され、ここで、pitx2c発現レベルが低下しているか、もしくは所定の閾値レベルより低い場合、抗不整脈薬はナトリウムチャネル遮断薬であり；またはpitx2c発現レベルが上昇している、所定の閾値レベルとおよそ同一もしくはより高い場合、カリウムチャネル遮断薬である。
【００１４】
便利には、生物学的サンプルは、被験体から得られる任意の適切な体液または組織サンプルでありうる。例えば、生物学的サンプルは、尿、唾液、血液、痰、精液、便、鼻腔拭い液、涙液、膣拭い液、直腸拭い液、頸管スミア、組織生検、および尿道拭い液からなる群の少なくとも１つを含みうる。適切には、生物学的サンプルは、容易に個体から得られるもの、例えば、尿、唾液、血液および痰など、個体が介助の必要なしに自分自身から採取し得るものである。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは血液である。
【００１５】
同様に、当技術分野において既知の任意の方法によって、心房細動を呈していない被験体からのサンプルが得られる。pitx2c発現の基準レベル、すなわち「正常な」pitx2c発現のレベルを提供するために、試験されている被験体のpitx2c発現レベルが、「正常な」すなわち心房細動を呈していない被験体より高いもしくは低いかどうかの決定に使用するために、測定または提供される。
【００１６】
pitx2c発現が直接的に、またはpitx2c依存性遺伝子もしくは遺伝子産物によって間接的に測定されうることは、当然理解されるであろう。
【００１７】
pitx2c発現の「基準レベル」は、本明細書において用いられる場合、所定の値より低いもしくは高いpitx2c発現レベルを有する被験体が決定され得るように、決定または提供され、被験体は、所定の値より高いもしくは低いもしくはおよそ同一のpitx2c発現レベルを有する患者より、特定の治療に対して多かれ少なかれ望ましい臨床転帰を経験する可能性があり、その逆もありうる。本発明によると、正常より低いpitx2c発現レベルは、被験体が本明細書において定義されるようなナトリウムチャネル遮断薬によって治療された際の、好ましい臨床転帰と関連している。
【００１８】
「より低い」または「より高い」（すなわち、低下したまたは上昇した）発現とは、対照サンプルにおけるpitx2cの発現レベルと比較して、増加したもしくは減少した発現を指す。１つの態様では、対照サンプルは、発病していない被験体から採取され、または、正常なpitx2c発現と予想される既刊文献の値である。１つの態様では、より高いまたはより低い識別的発現は、対照サンプルでの発現レベルもしくは発表された値より、約0.5倍、1倍、1.5倍、あるいは約2.0倍、あるいは約2.0倍、あるいは約3.0倍、あるいは約5倍、あるいは約10倍、あるいは約50倍、更には約100倍を超えてより高いまたはより低いことがありうる。あるいは、pitx2cは、「過剰発現した」または「低発現した」と呼ばれうる。あるいは、pitx2cはまた、「上方制御された」または「下方制御された」とも呼ばれうる。
【００１９】
pitx2cの発現レベルは、本明細書に記載されるような治療の選択の根拠として用いられる。発現レベルは、治療の前および／または治療の間に測定され、得られた値は、臨床医によって下記のいずれかの評価、すなわち、（a）個体が最初に治療を受けることへの適合の可能性もしくは見込み；（b）個体が最初に治療を受けることへの不適合の可能性もしくは見込み；（c）治療に対する反応性；（d）個体が治療を受け続けることへの適合の可能性もしくは見込み；（e）個体が治療を受け続けることへの不適合の可能性もしくは見込み；（f）用量の調整；（g）臨床的有効性の見込みの予測；または（h）毒性の評価において使用されうる。当業者によってよく理解されるように、臨床背景におけるpitx2c発現レベルの測定は、明確な指標であり、このパラメーターは、本明細書に記載される治療の投与の開始、継続、調整および／または停止の根拠として用いられた。
【００２０】
ナトリウムチャネル遮断薬は、一般的にタイプ1の抗不整脈薬であり、より好ましくはタイプ1 cの抗不整脈薬である。ナトリウムチャネル遮断薬は、フレカイニド、プロパフェノン、ラノラジン、ベルナカラントもしくはキニジン、またはそれらの誘導体でありうる。好ましいナトリウムチャネル遮断薬は、フレカイニドおよびプロパフェノンである。
【００２１】
測定されるpitx2c発現レベルは、タンパク質レベルまたはmRNAレベルでありうる。従って、本発明は、単に遺伝子型の決定に関する方法とは区別される。タンパク質発現レベルの評価は、当技術分野における通常の方法である。例えば、タンパク質レベルを測定する１つの方法は、pitx2cに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングまたは免疫組織化学による。本発明者らは、pitx2cの発現レベルと、個体がナトリウムチャネル遮断薬による治療に反応する見込みとの間に直接的な相関関係があることを観察した。そのため、タンパク質アッセイの感度は特に重要である。従って、ラジオイムノアッセイ（RIA）、酵素結合免疫吸着検査法（ELISA）、フローサイトメトリー、またはpitx2cを測定する他の任意のより感度の高い定量法が、定量性の低い方法の代わりに好んで用いられる。好ましい実施形態では、発現レベルは、免疫学的方法によって、好ましくは固相抗体、ELISAまたはELISPOTアッセイを用いて測定される。
【００２２】
他の実施形態では、mRNA発現レベルが、核酸ハイブリダイゼーション（ノーザンブロッティング）または核酸増幅によって測定されうる。好ましい実施形態では、核酸ハイブリダイゼーションは、固相核酸分子アレイを用いて行われる。他の好ましい実施形態では、核酸増幅方法は、逆転写酵素PCR（RT-PCR）である。RT-PCRにおいて産物を検出するための２つの一般的な方法は、（1）任意の二本鎖DNAにインターカレートする非特異的な蛍光色素、および（2）プローブがその相補配列とハイブリダイゼーションした後にのみ検出を可能にすることによってメッセンジャーRNA（mRNA）を定量化する、蛍光リポーターで標識されたオリゴヌクレオチドからなる配列特異的DNAプローブである。RT-PCRに関する更なる詳細は、当業者にとって既知であり、一般的な実験書（例えば、SambrookおよびRussell, Molecular Cloning: A laboratory Manual, CSHL Press, 2001）に見出される。
【００２３】
pitx2c発現のレベルは、直接的に（すなわち、pitx2cタンパク質もしくはmRNAレベルの測定によって）または間接的に、pitx2c発現のレベルを示すバイオマーカーのレベルの測定によって、測定されうる。
【００２４】
従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、被験体から得られたサンプル中のバイオマーカーのレベルを測定することを含み、バイオマーカーのレベルがpitx2c発現のレベルを示す。いくつかの実施形態では、その方法は、バイオマーカーのレベルに基づいて治療法を選択することを含みうる。いくつかの実施形態では、その方法は、バイオマーカーレベルが所定の閾値より低い場合、ナトリウムチャネル遮断薬による治療法を選択することを含みうる。いくつかの更なる実施形態では、その方法は、バイオマーカーのレベルに基づいてpitx2c発現レベルを決定または予測することを含みうる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、その方法は、
バイオマーカーのレベルを測定すること、
任意選択で、バイオマーカーのレベルに基づいてpitx2cレベルを決定すること、および
所定の閾値より低いバイオマーカーのレベルを示す被験体、または基準レベルもしくは所定の閾値と比較して低下したpitx2c発現レベルを有すると決定された被験体に、ナトリウムチャネル遮断性抗不整脈薬を投与することを含みうる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーはccl21である。
【００２７】
本発明に従って、アッセイシステムが提供される。アッセイシステムは、pitx2c発現のレベルに関するデータを提供するために、（直接的にpitx2c mRNAもしくはタンパク質を測定することによって、または間接的に適切なバイオマーカーを測定することによって）pitx2c発現を測定する測定装置を含む。そのシステムはまた、測定装置からpitx2c発現データを得て、データ変換を行い、測定されたレベルがpitx2c発現の基準値もしくは正常値より高いまたは低いか否かを計算するデータ変換装置をも含む。
【００２８】
他の実施形態では、アッセイシステムはまた、データをユーザーに出力するためのユーザーインターフェース出力装置をも含む。他の実施形態では、アッセイシステムはまた、治療情報のデータベースをも含み、装置は、測定されたpitx2cのレベルに対するデータベース中の治療情報を特定し、ユーザーインターフェース出力装置に治療情報を出力する。
【００２９】
AFを呈する被験体の治療を決定する装置は、pitx2c発現を測定するための測定装置、またはこのような測定装置を備えたアッセイシステムを含みうる。その装置は、治療する地点、例えば、医院や患者のベッドサイドでの使用に好適でありうる。便利には、その装置は携帯可能でありうる。
【００３０】
更なる態様では、本方法に使用するためのキットが提供される。そのキットは、pitx2c mRNAもしくはタンパク質、またはpitx2c発現を示すバイオマーカーに特異的に結合することができ、例えば、蛍光または発光標識で標識化されうる、少なくとも１つの抗体、プローブおよび／あるいはプライマー、ならびに使用説明書を含み得る。少なくともpitx2cの一部、またはそのバイオマーカーを増幅するための好ましいキットは、２つのプライマーを含む。
【００３１】
キットに含まれるオリゴヌクレオチドは、プローブとして用いられてもプライマーとして用いられても、検出可能に標識され得る。標識は、直接的に、例えば蛍光標識のように、または間接的に検出され得る。間接的な検出は、ビオチン-アビジン相互作用、抗体結合などを含む、当業者にとって既知の任意の検出方法を含み得る。蛍光標識されたオリゴヌクレオチドはまた、消光分子をも含み得る。オリゴヌクレオチドまたは抗体は、表面に結合され得る。１つの実施形態では、好ましい表面は、シリカまたはガラスである。別の実施形態では、表面は金属電極である。
本開示は、以下の実施形態を含む。
［１］
心房細動を呈する被験体の治療の決定を容易にする方法であって、前記方法が、被験体からのサンプル中のpitx2c発現のレベルを測定すること、およびpitx2c発現のレベルに基づいて治療法を選択することを含む方法。
［２］
pitx2c発現のレベルが低下しているか、または所定の閾値より低いことが測定された場合、ナトリウムチャネル遮断薬による治療が選択される、［１］に記載の方法。
［３］
前記サンプルが、尿、唾液、血液、痰、精液、便、鼻腔拭い液、涙液、膣拭い液、直腸拭い液、頸管スミア、組織生検、および尿道拭い液の少なくとも１つを含む、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
前記サンプルが血液である、［３］に記載の方法。
［５］
pitx2c発現のレベルが、pitx2cタンパク質レベルまたはmRNAレベルを測定することによって直接的に決定される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］
pitx2c発現のレベルが、pitx2c発現のレベルを示すバイオマーカーのレベルの測定によって間接的に決定される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［７］
前記バイオマーカーがccl21である、［６］に記載の方法。
［８］
心房細動を治療する方法に使用するためのナトリウムチャネル遮断薬であって、治療される被験体は、pitx2c発現のレベルの低下、または所定の閾値より低いpitx2cのレベルを示す、ナトリウムチャネル遮断薬。
［９］
前記ナトリウムチャネル遮断薬がタイプ1の抗不整脈薬である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法、または方法に使用するための［８］に記載のナトリウムチャネル遮断薬。
［１０］
前記ナトリウムチャネル遮断薬がフレカイニドまたはプロパフェノンである、［１］〜７のいずれか１項に記載の方法、または方法に使用するための［８］に記載のナトリウムチャネル遮断薬。
［１１］
［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法に使用するためのアッセイシステムであって、
pitx2c発現を測定する測定装置と；
前記測定装置からpitx2c発現データを得て、データ変換を行い、測定されたレベルがpitx2c発現の基準値もしくは正常値より高いかまたは低いか否かを計算する、データ変換装置
とを備えるアッセイシステム。
［１２］
データをユーザーに出力するためのユーザーインターフェース出力装置を更に備える、［１１］に記載のアッセイシステム。
［１３］
治療情報のデータベースを更に備え、前記装置が、測定されたpitx2cのレベルに対するデータベース中の治療情報を特定し、ユーザーインターフェース出力装置に治療情報を出力する、［１１］または［１２］に記載のアッセイシステム。
［１４］
［１］〜［７］のいずれか１ 項に記載の方法に使用するためのキットであって、pitx2c mRNAもしくはタンパク質、またはpitx2c発現を示すバイオマーカーに特異的に結合することができる、少なくとも１つの抗体、プローブおよび／またはプライマー、ならびに使用説明書を含むキット。
［１５］
少なくとも１つの抗体、プローブおよび／またはプライマーが、検出可能な標識で標識化される、［１４］に記載のキット。
［１６］
心房細動を呈する被験体に抗不整脈薬を投与する方法であって、
心房細動を呈する被験体のpitx2c発現のレベルを測定するステップ；および
pitx2c発現レベルの低下を伴う被験体、または所定の閾値より低いpitx2c発現レベルを有する被験体に、ナトリウムチャネル遮断性抗不整脈薬を投与するステップ、
あるいは、
pitx2c発現レベルの低下を示さない被験体、または所定の閾値とおよそ同一もしくはより高いpitx2c発現レベルを有する被験体に、別のクラスの抗不整脈薬を投与するステップ
を含む方法。
［１７］
治療を必要とする被験体に抗不整脈薬を投与する方法であって、
心房細動を有する、治療を必要とする被験体を特定するステップ；
被験体のpitx2c発現のレベルを測定し、そのレベルが基準レベルと比較して上昇しているか、およそ同一であるか、または低下しているかどうかを特定するステップ；ならびに
基準レベルと比較してpitx2c発現レベルの低下を伴う被験体に、ナトリウムチャネル遮断性抗不整脈薬を投与するステップ、または、
基準レベルと比較して上昇した、もしくはおよそ同一のpitx2cタンパク質発現レベルを有する被験体に、別のクラスの抗不整脈薬を投与するステップ
を含む方法。
［１８］
他のクラスの抗不整脈薬がカリウムチャネル遮断薬である、［１７］に記載の方法。
［１９］
被験体の心房細動の治療のために抗不整脈薬を投与する方法であって、
基準レベルまたは所定の閾値と比較して低下したpitx2c発現のレベルを示す被験体に、心房細動の治療のための抗不整脈薬としてナトリウムチャネル遮断薬を投与することを含む方法。
詳細な説明
本発明の実施形態は、ここから、例として、添付の図面と関連して記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、Pitx2c+/-マウスの心臓から記録された電気生理学的シグナル、すなわち、心房の単相性活動電位（上段の波形、MAP）、心房から記録された心内電位図（中段の波形）および右心室から記録された電位図（下段の波形）の実例である。プログラム刺激はベースラインでは心房細動を誘発したが（上段の波形）、ナトリウムチャネル遮断薬フレカイニドによる灌流の間は誘発しない（下段の波形）。
【図２】図２は、フレカイニド灌流の存在下または非存在下において、単発心房早期刺激によって引き起こされる誘発性の心房性不整脈を有するPitx2c+/-および野生型（WT）の心臓の数を示すグラフである。野生型の心臓は、誘発性の不整脈に違いを示さない。Pitx2c+/-の心臓では、フレカイニドは心房性不整脈を完全に抑制する。
【図３】図３は、異なるペーシング周期でのPitx2c+/-およびWTの心臓において、単相性活動電位カテーテルによって測定された平均活動電位持続時間（APD）を示すプロットである。
【図４】図４は、３つの異なるペーシング周期（80 - 100 - 120 ms）で、フレカイニドによる灌流の前後での、Pitx2c+/-およびWTの心臓における平均活動電位持続時間（APD）を示すプロットである。
【図５】図５は、フレカイニド灌流後の、Pitx2c+/-およびWTの心臓における心房内興奮時間の変化を示すグラフである。フレカイニドは、pitx2c+/-マウスの興奮時間に顕著な影響を与えるが、野生型マウスでは、はるかに影響が少ない。
【図６】図６は、フレカイニド灌流後の、Pitx2c+/-およびWTの心臓における有効不応期（ERP）の変化を示すプロットである。フレカイニドは、Pitx2c+/-マウスにおいて、野生型マウスよりはるかに有効不応期を増加させる。
【実施例】
【００３３】
[実施例１]
野生型マウスおよびpitx2c発現の低下を有するマウスの心臓に対する抗不整脈薬の影響の比較
実施例１．１：フレカイニド
方法
本発明者らは、野生型マウスおよびPitx2c遺伝子のヘテロ接合型欠失を有するマウスの単離された拍動している心臓において、ナトリウムチャネル遮断薬フレカイニドの影響を研究した。このマウスモデル（Nigel Brown, St George's Londonによって提供された）は、Pitx2 mRNA発現の低下に関する確立されたモデルであり、AF を起こしやすい。PITX2c+/-マウスでは、pitx2c mRNA発現は、左心房においてWTレベルの約60％に減少することが見出された（Kirchhofら、Circ Cardiovasc Genet. 2011;4:123-133）。
単離された心臓における電気生理学的研究
PITX2c+/-およびWTの心臓（3〜4月齢）を迅速に摘出し、ランゲンドルフ灌流を行って、左心房（LA）の単相性活動電位持続時間を記録した。この標本では、拍動している心臓は、（mmol/lで）NaCl 118；NaHC03 24.88；KH2PO 1.18；グルコース5.55；ピルビン酸ナトリウム5；MgS04 0.83；CaCl2 1.8；KCl 3.52を含有する温めた酸化素改変クレブスヘンゼライト溶液（95％ O2-5％ C02、pH 7.4）を用いて、一定の灌流圧（100±5 mmHg）および冠血流量（4±0.5ml/分）で灌流される。
【００３４】
これによって、拍動し、機能している完全な心臓において（灌流液温度37℃、灌流量3〜5 mL/分）、詳細な電気生理学的測定を1〜2時間取ることができる（Fabritzら、Basic Res Cardiol 2003;98:25-32）。octapolarマウス電気生理学カテーテル（0.5 mm電極間隔、CIB'ER MOUSE, NuMED, Hopkinton, N.Y., USA）を、ペーシングのために右心房（RA）および右心室に挿入した。心房電位図および心室電位図ならびに左心房からの単相性活動電位（MAP）を同時に記録した。計装後、心臓に10分間の安定化期間を与えた後、5分間自発的な洞調律の観察を続けることによって、再分極関連不整脈を誘発した。その後、心拍数あたり1.5分間のペーシングで、右心房を一定の生理的心拍数（80-120 ms ペーシング周期）にペーシングし、定常状態の活動電位持続時間を記録し、8拍の連続に続く2 msステップでの早期刺激を用いて早期右心房刺激を行うことによって、有効不応期（ERP）および不整脈の誘発性を決定した。1秒より長い不整脈をカウントした。灌流液に酢酸フレカイニド（1μm）を添加した後、ペーシング手順を繰り返した。
【００３５】
実験は、それらが公表されている質的基準を満たし、且つMAPが安定していた場合、活動電位持続時間および興奮時間の分析を許された。mVより大きいシグナルが、活動電位および興奮時間の分析のために許容され、0.5 mV振幅より大きいシグナルが、不整脈の評価のために許容された。記録は、不整脈について手作業でスクリーニングされた。心房細動は、洞調律周期より短い周期を有する5回より多い密接に連結した多形性の連続的な心房異所性拍動として定義された。
単離され表面灌流された左心房における膜電位記録
3 M KCLで満たされたホウケイ酸ガラス微小電極（先端抵抗15〜30 MΩ）を用いて、単離され表面灌流された左心房から膜活動電位を記録した。電圧シグナルは、増幅され（Axoclamp 2B; Molecular Devices, USA）、デジタル化され、spike2ソフトウェア（Cambridge Electronic Design, UK）を用いて20kHzのサンプリング周波数で表示された。LAは、異なる周期で、2 msのパルス幅、2×拡張期閾値で、双極白金電極によってペーシングされた。APDはオフラインで分析された（spike 2, CED, UK）。平衡化のために15分間ペーシングした後、引き続き0.5〜10 Hzまで増加する周波数で、各周波数200拍で標本をペーシングし、記録に先立って定常状態を確保した。
増加した静止膜電位の電気生理学的影響のモデリング
心房細胞に関するCourtemanche-Ramirez-Nattelのヒト心房モデルを用いることによって、0.5〜1μMフレカイニドの影響を評価した。Pitx2c欠損マウスモデルにおいて観察される脱分極した静止膜電位およびより短い活動電位持続時間を再現するために、最大Ik1 コンダクタンスを25％まで減少させ、IKrコンダクタンスを倍にした。最大INaコンダクタンスを50％および40％に減少させることによって、ナトリウムチャネルに対するフレカイニドの影響をシミュレーションした。シミュレーションは、100興奮性エレメントの心房細胞ストランド（「細胞」；直径100μm）において実行された。定常状態に達するように、ストランドの左端の5細胞を、2分間、1000および500 msのペーシング周期でペーシングした（S1）。早期刺激（S2）はERPを決定するために適用され、CVはモデルの細胞25〜75から測定された。静止膜電位は、S2刺激から生じる電位に先立つ周期の最小電位として測定された。他のすべてのパラメーターに対する値は50番目の細胞から測定された。再分極後の不応期は、50番目の細胞における拡張期時間の関数として報告される。
統計解析
カテゴリーデータは、Fisherの正確検定を用いて比較された。数値データは、対応のある両側t検定（例えば、フレカイニドまたはソタロールの灌流前後の測定結果など）およびWilcoxonの符号順位検定によって比較された。多重測定データは、反復測定分散分析、全体の検定が有意であった場合、それに続く多重比較法（Bonferroniのt検定）によって解析された。データは、両側p値＜0.05で有意差があると見なされた。データが箱ひげ図として示される場合、箱および箱の上下限は、データ範囲の平均および標準誤差を示す。ひげは、各データの最小値および最大値を示す。個々の測定結果は、箱ひげ図に点として示される。
結果
図１および２は、pitx2c+/-の心臓において誘発された心房細動の短い発現および同一の心臓におけるフレカイニドでの灌流による心房細動の抑制の実例を提供する。図２に示されたように、フレカイニドは、ベースラインで心房細動を示したすべてのpitx2c+/-の心臓（8/21）において、心房細動を抑制した。フレカイニドは、正常なPitx2c発現を有するマウスでは心房細動を抑制しなかった（野生型の心臓、ベースラインで不整脈を有する心臓は4/16、フレカイニドでは4/11）。これは、フレカイニドがpitx2c+/-マウスにおいて誘発性心房不整脈を抑制することを示す。
【００３６】
Pitx2c+/-マウスは、早いペーシング周期では、それらの野生型の同腹仔より短い活動電位持続時間を有する（図３）。
【００３７】
活動電位持続時間（APD）に対するフレカイニドの影響において、野生型とPitx2c+/-マウスとの間に違いは観察されなかった（図４）。これは、フレカイニドが、WTとPITX 2c+/-の心臓のいずれにおいても心房のAPDを変化させないことを示す。しかし、フレカイニドは、Pitx2c+/-マウスでは心房興奮時間に著しい影響を与えることが見出されたが、一方、野生型マウスではごくわずかな影響しかない（図５）。
【００３８】
図６に示されたように、フレカイニドは、WTマウス（例えば、80 msのペーシング周期で7.5 ms）と比較して、Pitx2c+/-マウス（80 msのペーシング周期で12 ms）において、より長い再分極後の不応期（すなわち、活動電位の終了を超えた不応期の延長）を引き起こす。再分極後の不応期は、大型動物において（Kirchhof Fabritzら、Circulation 1998; Kirchhofら、JPET 2003; KirchhofP. ら、Heart Rhythm. (2012); Milberg P. ら、Europace. (2013); Milberg P. ら、Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 18:658-664 (2007); Kirchhof P,ら、J Pharmacol Exp Ther. 305:257-263 (2003)）および心房細動を有する患者において（Kirchhof Pら、Basic Res Cardiol. 100:112-121 (2005)）、抗不整脈作用の強力なメディエーターである。
【００３９】
ベースラインでは、pitx2c+/-とWTの心房との間に、活動電位持続時間および不応期のわずかな違いしかないが、これらの違いは、フレカイニドによる灌流の間により顕著である（下側パネル）：不応期は劇的に延長され、著しい再分極後の不応期をもたらす。
【００４０】
上述の分析は、最初は盲検で行われた。非盲検にした後、上記で議論された異なる影響が同定された。
【００４１】
総合すると、これらの発見は、ナトリウムチャネル遮断薬フレカイニドが、正常なpitx2cレベルを有する心房と比較して、低下したpitx2c発現を有する心房において、大きく異なる作用を有することを示す。フレカイニドが、低下したpitx2c発現を有するマウスでの心房細動の減少にはるかに有効であることが発見されただけでなく、低下したpitx2c発現を有する心房でのフレカイニドの電気生理学的作用において、いくつかの関連性のある相違点、例えば、より長い再分極後の不応期（図６）も同定された。
【００４２】
Pitx2c+/-左心房は、表面灌流された左心房標本内に挿入された鋭い電極によって測定された際、実験されたすべての周期で有意に（p＜0.05）より脱分極した静止膜電位を有し、例えば、100msのペーシングCLでは野生型（-70±0.7mV, n＝30細胞）と比較して-68±0.7 mV（n＝31細胞）であった。フレカイニドは、いずれの遺伝子型でも静止膜電位を変化させなかった。ナトリウムチャネル遮断薬の結合は、電気的拡張期の間に、より脱分極した細胞において促進されるので、これは、ナトリウムチャネル遮断薬への反応の変化を説明できるかもしれない。
【００４３】
より正の静止膜電位がヒト心房筋細胞のCourtemancheモデルにおいて再現された際、フレカイニドは静止膜電位を変化させなかったが、ナトリウムチャネルはより長く閉鎖状態のままであり、これはフレカイニドの存在下、迅速なペーシングの際に、より明白であった。フレカイニドはまた、静止膜電位が参照モデルと比較して増加した際、PRR延長に対して強められた作用を有した。このように、ヒト心房組織のモデリングは、マウスでの本発明者らの発見を再現した。
実施例１．２：ソタロール
更なる実験は、カリウムチャネル遮断薬d,lソタロールの抗不整脈作用がPitx2c+/-心臓では失われることを示唆した：上述の同じ実験手順を用いて研究された3対のマウスでは、ソタロール（10μM）は、WTの心臓では心房APDを延長したが、Pitx2c+/-の心臓では心房APDを変化させなかった。これらの初回観察は、なぜソタロールのようなカリウムチャネル遮断薬が、心房pitx2c mRNA発現の低下を伴う患者において有効な抗不整脈薬になりえないのかの説明を提供し、心房細動を有する患者における抗不整脈薬の選択を補助するためのpitx2c mRNAレベルの測定を更に支持する。
結論
本発明者らは、抗不整脈薬フレカイニドの効果が、野生型のマウスと比較して低下したpitx2c発現を有するマウスの左心房において大きく変化することを発見した。有効不応期は、PITX2c+/-の心臓においてはるかに高い値に延長され、最も重要なことに、フレカイニドは、野生型の心臓と比較してPITX2c+/-マウスの心臓においてAFの予防により効果的であった。これらの観察は、低下したpitx2c mRNA発現を有する患者はフレカイニドのようなナトリウムチャネル遮断性抗不整脈薬による治療に適している一方、他の患者はおそらく別の薬剤、例えばソタロールのようなカリウムチャネル遮断薬による治療が有効でありうることを示す。
【００４４】
PITX2c+/-左心房は、いくつかのカリウムチャネル遺伝子の発現の低下を示すことが発見され、それは、より高い静止膜電位およびより短い活動電位持続時間に寄与するかもしれない。この作用は、ヒトの活動電位のコンピューターモデルにおいて実証されたように、ナトリウムチャネル遮断薬への反応の変化を説明できる。
【００４５】
本発明は、このような治療の開始の時点で、心房細動の防止における抗不整脈薬の種類の有効性を決定できるようにする試験を、初めて提供する。本発明の方法は、ナトリウムチャネル遮断薬による治療が有効である患者の特定を可能にし、それによって、臨床医の最も適切な薬剤の選択を補助する。
[実施例２]
ヒト心房におけるPITX2発現レベル
Qiagen RNeasy fibrous mini-kitおよびQuiagen QiaShredder Columnsを用いてRNAを調製した。cDNAを生成し、遺伝子特異的プライマーおよびSYBR Green（Life Technologies）を用いて、ABI 7500 Fast機器においてRT-PCR反応を行った。
【００４６】
本発明者らは、ヒトの左心房および右心房のPITX2 mRNAの発現レベルを評価し、PITX2 mRNAが主に左心房において発現することを確認できた。ヒト左心房のPITX2 mRNAの発現レベルには明らかな差異（最大100倍まで）が観察された。すなわち、いくつかの左心房では、PITX2発現は検出されなかった。多くの場合、PITX2発現レベルは、アクチンレベルの1％〜4％の間であった。一部の患者では、左心房PITX2発現は、アクチン発現の最大10％に達する。これらのデータは、明らかに、左心房のPITX2発現が患者によって異なることを示し、PITX2レベルに基づく治療の選択を、心房細動の患者の治療にとって有効なものにする。
[実施例３]
心房細動の治療法を選択するためのpitx2cレベルの使用
心房細動を呈する被験体から得られた生物学的サンプル（例えば血液）を分析し、pitx2c mRNAのレベルを測定する。サンプル中のpitx2c mRNAレベルを所定の基準レベルと比較する。測定されたサンプル中のpitx2c mRNAレベルが、所定の基準レベルより高いか、低いか、またはおよそ同じであるかに応じて、適切な抗不整脈薬を選択して、被験体に投与する。
【００４７】
pitx2c mRNAが低下している（すなわち、測定されたpix2c mRNAレベルが基準レベルより低い）ことが決定され、被験体が、低下したpitx2c発現と関連した心房細動を有すると認められるような場合、ナトリウムチャネル遮断薬（フレカイニドなど）が投与され得る。pitx2c mRNAレベルが基準レベルと比べて低下していないことが決定された場合、カリウムチャネル遮断薬（例えばソタロール）が被験体に投与され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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