(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５５、配列番号６６および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ステムドメインポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のポリペプチド、または請求項２に記載の核酸分子、または請求項３に記載のベクターを含む組成物。
【請求項５】
医薬品として使用される、請求項１に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド、または請求項２に記載の核酸分子、または請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ワクチンとして使用される、請求項１に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド、または請求項２に記載の核酸分子、または請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
インフルエンザＨＡタンパク質に対する免疫応答の誘導において使用される、請求項１に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド、または請求項２に記載の核酸分子、または請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
インフルエンザ感染の予防および／または治療において使用される、請求項１に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド、または請求項２に記載の核酸分子、または請求項４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関する。本明細書において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、ヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する方法、それを含む組成物、それを含むワクチンならびに特にインフルエンザの検出、予防および／または治療におけるそれらの使用方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、主要なヒト病原体であり、無症状感染から死亡をもたらし得る原発性ウイルス肺炎まで重症度に幅がある呼吸器疾患（一般に「インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）」または「インフルエンザ（ｔｈｅ  ｆｌｕ）」と称される）を引き起こす。感染の臨床効果は、インフルエンザ株の病原性ならびに宿主の曝露、既往歴、年齢、および免疫状態により変動する。毎年、世界中で約１０億人の人々がインフルエンザウイルスによる感染を受け、３〜５百万症例の重病および推定３００，０００から５００，０００のインフルエンザ関連死をもたらすことが推定されている。これらの感染の大部分は、Ｈ１またはＨ３ヘマグルチニン亜型を担持するインフルエンザＡウイルスに起因し得、インフルエンザＢウイルスからの寄与は小さく、したがって、３つ全ての代表物は季節性ワクチンに含まれる。現在の予防接種実施は、有効な季節性インフルエンザワクチンの適時産生を可能とするための循環インフルエンザウイルスの早期同定に依存する。次の季節の間に優性となる株の予測の固有の困難性とは別に、抗ウイルス耐性および免疫回避も、現在のワクチンが罹患および死亡を予防することができない一因である。これに加え、病原体保有動物から生じ、ヒトからヒトへの拡散を増加させるようにリアソートされた高度に病原性のウイルス株により引き起こされる流行病の可能性は、グローバルヘルスにとって顕著で現実的な脅威となる。
【０００３】
インフルエンザＡウイルスは、天然に広く分布しており、種々の鳥類および哺乳動物に感染し得る。インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）の科に属するエンベロープＲＮＡウイルスである。これらのゲノムは、１１の異なるタンパク質、１つの核タンパク質（ＮＰ）、３つのポリメラーゼタンパク質（ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２）、２つのマトリックスタンパク質（Ｍ１およびＭ２）、３つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２、およびＰＢ１−Ｆ２）、および２つの外部糖タンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする８つの一本鎖ＲＮＡセグメントからなる。ウイルスは、ＨＡおよびＮＡタンパク質の抗原構造の差に基づき分類され、それらの異なる組合せは、規定のインフルエンザウイルス株にさらに分類されるユニークなウイルス亜型を表す。全ての公知の亜型は鳥類において見出すことができるが、現在循環するヒトインフルエンザＡ亜型は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２である。系統発生分析は、ヘマグルチニンの２つの主群への下位分類を実証した：とりわけ系統発生グループ１におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９亜型およびとりわけ系統発生グループ２におけるＨ３、Ｈ４およびＨ７亜型。
【０００４】
インフルエンザＢ型ウイルス株は、厳密にはヒトである。インフルエンザＢ型ウイルス株内のＨＡにおける抗原変異は、Ａ型株内で観察されるものよりも小さい。２つの遺伝的および抗原的に区別されるインフルエンザＢウイルスの系統は、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａとも称される）およびＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）系統により表わされるとおり、ヒトにおいて循環している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。インフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患のスペクトルは、インフルエンザＡウイルスにより引き起こされるものよりも一般に軽度であるが、インフルエンザＢ感染について入院を要する重病が依然として頻繁に観察される。
【０００５】
インフルエンザを中和する抗体が主としてヘマグルチニン（ＨＡ）に対して指向されることは公知である。ヘマグルチニンまたはＨＡは、ウイルスコートにアンカリングされ、二重の機能を有する三量体糖タンパク質であり：それは細胞表面受容体シアル酸への結合を担い、取り込み後、それはウイルスおよびエンドソーム膜の融合を媒介し、細胞の細胞質ゾル中でのウイルスＲＮＡの放出をもたらす。ＨＡは、大型の頭部ドメインおよびより小型のステムドメインを含む。ウイルス膜への付着は、ステムドメインに連結されたＣ末端アンカリング配列により媒介される。タンパク質は、特定のループで翻訳後開裂されて２つのポリペプチドＨＡ１およびＨＡ２を生じさせる（全配列は、ＨＡ０と称される）。膜遠位頭部領域は、主としてＨＡ１に由来し、膜近位ステム領域は、主としてＨＡ２に由来する（図１）。
【０００６】
季節性インフルエンザワクチンを毎年アップデートしなければならない理由は、ウイルスの大きい変異性である。ヘマグルチニン分子において、この変異は、抗原ドリフトおよびシフトが多数の異なるバリアントをもたらした頭部ドメイン中で特に顕在化される。これは、免疫優性の区域でもあるため、ほとんどの中和抗体はこのドメインに対して指向され、受容体結合を妨げることにより作用する。頭部ドメインの免疫優性および大きい変異の組合せは、なぜ特定の株による感染が他の株に対する免疫をもたらさないかも説明し：第１の感染により誘発される抗体は、一次感染のウイルスと密接に関連する限定数の株を認識するにすぎない。
【０００７】
近年、全てまたは実質的に全てのインフルエンザヘマグルチニン球状頭部ドメインを欠くインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドが記載されており、ステムドメインポリペプチドの１つ以上の保存エピトープに対する免疫応答を生成するために使用されている。ステムドメインポリペプチドのエピトープは、球状頭部ドメインの高度に免疫原性の領域よりも免疫原性でなく、したがってステムドメインポリペプチド中の球状頭部ドメインの不存在がステムドメインポリペプチドの１つ以上のエピトープに対する免疫応答の発現を許容し得ると考えられている（Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。したがって、Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．は、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１９６８（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ１のアミノ酸残基５３から２７６をＨＡ一次配列から欠失させ、これを短いフレキシブル結合配列ＧＧＧＧにより置き換えることにより新規分子を作出した。Ｈ３ＨＫ６８構築物によるマウスのワクチン接種は、グループ１のＨＡと交差反応性の抗血清を誘発しなかった。さらに、ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０４において示されるとおり、ステムドメインポリペプチドは高度に不安定であり、ステム領域中の保存エピトープに結合することが示された抗体の結合の欠落により証明されるとおり、正確な立体構造を採用しなかった。
【０００８】
さらに、Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）は、ＨＡ２のアミノ酸残基１〜１７２、７アミノ酸リンカー（ＧＳＡＧＳＡＧ）、ＨＡ１のアミノ酸残基７〜４６、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡに続くＨＡ１の残基２９０〜３２１を、ＨＡ１中の突然変異Ｖ２９７Ｔ、Ｉ３００Ｅ、Ｙ３０２ＴおよびＣ３０５Ｔとともに含むＨＡ２ベースポリペプチドを記載した。設計は、Ｈ３ＨＡ（Ａ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／１９６８）の配列をベースとした。このポリペプチドは、Ｈ３亜型内の別のインフルエンザウイルス株に対する交差保護を提供したにすぎなかった（Ａ／Ｐｈｉｌ／２／８２に対して提供したが、Ｈ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４に対しては提供しなかった）。Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）によるさらに近年の論文において、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１ＨＡ０ＨＡ６）からのＨＡをベースとするステムドメイン配列が記載されている。このポリペプチドにおいて、残基５５から３０２の相当物が欠失しており、突然変異Ｉ３１１Ｔ、Ｖ３１４Ｔ、Ｉ３１６Ｎ、Ｃ３１９Ｓ、Ｆ４０６Ｄ、Ｆ４０９Ｔ、およびＬ４１６Ｄが作製されている。Ｈ３およびＨＡベースポリペプチドの両方が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現され、したがって、天然存在ＨＡタンパク質の一部であるグリカンを欠く。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される場合、ポリペプチドは、主として高分子量の凝集物および少量のモノマー分画として回収される。ポリペプチドは、２つの見かけの解離定数９および０．２μＭでＣＲ６２６１に結合する。著者らは、マウスが１００μｇのＣｐＧ７９０９によりアジュバントされた２０μｇのタンパク質による免疫化（２回、４週間間隔）後に１ＬＤ９０の同種Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４ウイルスによるチャレンジから生存し得ることを示している。著者は、Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／１９６８由来ポリペプチドについて上記のものと同等の、循環置換ポリペプチドも記載している。これらのポリペプチドは、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／２０／９９またはＨ１Ｎ１Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９からのＨＡに由来し、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（すなわち、同一亜型内）のマウスにおける軽度チャレンジ（１ＬＤ９０）モデルにおける部分保護を提供し得る。これらのポリペプチドにより免疫化されたモルモットからの血清は、中和アッセイにおいて試験された場合に検出可能なレベルの中和を示さなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、強固な広域中和抗体応答の産生を刺激し、広範な現在および将来のインフルエンザウイルス株（季節性および流行性の両方）に対する保護を提供する、特にインフルエンザの有効な予防および治療のために系統発生グループ１および／またはグループ２内の１つ以上のインフルエンザＡウイルス亜型に対する保護を提供する安全で有効なユニバーサルワクチンが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、ステムドメインポリペプチドを提供する方法、それを含む組成物、それを含むワクチンおよびそれらの使用方法が提供される。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、インフルエンザ（ＨＡ）ステムドメインポリペプチドと称される、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインを含み、球状頭部を欠く新規免疫原性ポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、対象、特にヒト対象に投与された場合に免疫応答を誘導し得る。本発明のポリペプチドは、膜近位ステムドメインＨＡ分子の保存エピトープを、膜遠位頭部ドメイン中に存在する優性エピトープの不存在下で免疫系に提示する。この目的のため、頭部ドメインを構成するＨＡ０タンパク質の一次配列の一部を除去し、残留アミノ酸配列を直接的にまたは、一部の実施形態において、短いフレキシブル結合配列（「リンカー」）を導入することにより再連結させてアミノ酸鎖の連続性を回復させる。得られた配列を、ＨＡ０分子の残留部分の天然三次元構造を安定化する規定の突然変異を導入することによりさらに改変する。免疫原性ポリペプチドは、インフルエンザウイルスの全長ＨＡ１および／またはＨＡ２を含まない。
【００１２】
本発明によれば、ポリペプチドは、Ｈ１亜型のインフルエンザＡウイルスのＨＡをベースとする。
【００１３】
本発明は、（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメイン、および（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含むインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドであって、ＨＡ１およびＨＡ２間の連結部におけるプロテアーゼ開裂に耐性であり、ＨＡ２のＡへリックスおよびへリックスＣＤを連結するアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が野生型インフルエンザＨＡ２ドメインと比較して突然変異しているヘマグルチニンステムドメインポリペプチドを提供する。
【００１４】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３３７、３４０、３５２または３５３位、またはＨ１亜型の他のインフルエンザウイルス中の相当位置上の１つ以上の突然変異を含む。突然変異は、規定位置上のアミノ酸が、野生型インフルエンザＨＡ、すなわち、ステムポリペプチドをベースとするインフルエンザウイルスのＨＡ中の対応する位置上に存在しない別のアミノ酸により置換されていることを意味する。
【００１５】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、図１に示されるヘリックスＡのＣ末端残基をヘリックスＣＤのＮ末端残基に連結するＨＡ２アミノ酸配列中の１つ以上の突然変異をさらに含む。
【００１６】
ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１〜ｘを含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜末端（すなわち、ＨＡ１のＣ末端アミノ酸）を含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１セグメントの欠失は、ｘ＋１位におけるアミノ酸からｙ−１位におけるアミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｐ〜ｘを含み、ｐは、成熟ＨＡ分子の最初のアミノ酸である（例えば、配列番号１の場合、ｐ＝１８）。当業者は、シグナルペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１７）を有さない本明細書に記載のポリペプチドを調製することができる。
【００１７】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含まない。ある実施形態において、細胞内および膜貫通配列、例えば、ＨＡ２ドメインの５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはそれらの相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列が除去されている。
【００１８】
本発明のポリペプチドは、全長ＨＡ１を含まない。
【００１９】
ある実施形態において、ポリペプチドは、グリコシル化されている。
【００２０】
ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、ＨＡ０よりも実質的に小型であり、好ましくは、全てまたは実質的に全てのＨＡの球状頭部を欠く。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、３６０アミノ酸長以下、好ましくは、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３０５、３００、２９５、２９０、２８５、２８０、２７５、または２７０アミノ酸長以下である。ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、約２５０から約３５０、好ましくは、約２６０から約３４０、好ましくは、約２７０から約３３０、好ましくは、約２７０から約３３０アミノ酸長である。
【００２１】
ある実施形態において、ポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインがベースとするＨＡのアミノ酸配列と比較してＨＡ１および／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上の追加の突然変異をさらに含む。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、グループ１交差中和抗体ＣＲ６２６１（国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットに開示）および／または抗体ＣＲ９１１４（国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレットに記載）、グループ１およびグループ２インフルエンザＡウイルスの両方、ならびにインフルエンザＢウイルスに結合し、中和し得る抗体の保存ステムドメインエピトープを含む。したがって、前記１つまたは複数の抗体を前記ポリペプチドに結合することにより示されるように、抗体ＣＲ６２６１および／または抗体ＣＲ９１１４に結合するＨＡステムドメインポリペプチドを提供することは、本発明の別の態様である。一実施形態において、ポリペプチドは、ＣＲ８０２０およびＣＲ８０５７（国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載）、Ｈ３インフルエンザウイルスのみに結合するモノクローナル抗体に結合しない。本発明に提供されるインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、複数のインフルエンザウイルスＡおよび／またはＢ株に対する免疫応答を生成し得る免疫原性組成物（例えば、ワクチン）における使用に好適である。一実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、系統発生グループ１および／またはグループ２のインフルエンザＡウイルス株、特に系統発生グループ１およびグループ２の両方のインフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。一実施形態において、ポリペプチドは、同種インフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。一実施形態において、ポリペプチドは、同一およびまたは異なる亜型の異種インフルエンザウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、系統発生グループ１およびグループ２の両方のインフルエンザウイルス株ならびにインフルエンザＢウイルス株に対する免疫応答を生成し得る。
【００２３】
本発明によるポリペプチドは、例えば、インフルエンザウイルス、特に系統発生グループ１もしくは２インフルエンザＡウイルスおよび／もしくはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患または病態のスタンドアロン療法および／もしくは予防および／もしくは診断において、または他の予防および／もしくは治療処置、例えば、（既存または将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／もしくはモノクローナル抗体との組合せで使用することができる。
【００２４】
さらなる態様において、本発明は、インフルエンザＨＡステムドメインポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。さらに別の態様において、本発明は、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に本発明によるポリペプチドおよび／または核酸分子を投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、本発明によるポリペプチドおよび／または核酸分子を含む免疫原性組成物を提供する。本明細書に提供される免疫原性組成物は、対象、例えば、マウス、フェレットまたはヒトへの組成物の投与を可能とする任意の形態であり得る。具体的な実施形態において、免疫原性組成物は、ヒト投与に好適である。ポリペプチド、核酸分子および組成物は、インフルエンザウイルス疾患を予防および／もしくは治療する方法において、ならびに／または診断目的に使用することができる。組成物は、薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含み得る。ある実施形態において、本明細書に記載の組成物は、アジュバントを含み、またはアジュバントとの組合せで投与される。
【００２７】
別の態様において、本発明は、ワクチンとして使用されるポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物を提供する。本発明は、特に、系統発生グループ１および／もしくは２のインフルエンザウイルスＡ亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患または病態の予防および／または治療においてワクチンとして使用される免疫原性ポリペプチド、核酸、および／または免疫原性組成物に関する。
【００２８】
本発明によるポリペプチドの種々の実施形態および使用は、以下の本発明の詳細な説明から明確になる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】天然三量体中に存在する融合前状態のＨＡ単量体のモデルを示す。ＨＡ１を淡灰色で示し、ＨＡ２を暗灰色で示す。へリックスＡ（ＣＲ６２６１のエピトープの重要部分）およびへリックスＣＤ（三量体界面の部分）を示し、ループがそれらの二次構造エレメントを連結する。ＨＡ１のＣ末端およびＨＡ２のＮ末端も示す。融合ペプチドは、ＨＡ２のＮ末端において局在する。
【図２】バイオレイヤー干渉法を使用するモノクローナル抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４への本発明の可溶性ポリペプチドの結合。上段パネルは、変動濃度の本発明の可溶性ポリペプチドに曝露された固定化モノクローナル抗体についての個々の結合曲線を示し、下段パネルは、Ｋｄを推定するために使用された定常状態分析を示す。Ａ：ｓ１２７Ｈ１  配列番号６６。Ｂ：ｓ８６Ｂ４  配列番号６７。Ｃ：ｓ７４Ｈ９  配列番号６５。Ｄ：ｓ６Ｅ１２  配列番号６９。Ｅ：ｓ５５Ｇ７  配列番号６８。
【図３】ＣＲ８０２０、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４のＦａｂ断片の存在および不存在下の本発明の可溶性ポリペプチドのサイズ排除クロマトグラム。本発明の全ての可溶性ポリペプチドについて、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４Ｆａｂ断片について複合体形成が実測されるが、ＣＲ８０２０Ｆａｂ断片については実測されない。Ａ：ｓ１２７Ｈ１  配列番号６６。Ｂ：ｓ８６Ｂ４  配列番号６７。Ｃ：ｓ７４Ｈ９  配列番号６５。Ｄ：ｓ６Ｅ１２  配列番号６９。Ｅ：ｓ５５Ｇ７  配列番号６８。
【図４】致死インフルエンザＨ１Ｎ１Ａ／ＮＬ／６０２／０９チャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドｓ７４Ｈ９、配列番号６５およびｓ８６Ｂ４、配列番号６７の保護効力の評価。Ａ：上段行：陰性（ＰＢＳ）および陽性対照（ＣＲ６２６１）群についての生存率、平均体重変化および臨床スコア中央値。下段行：ｓ７４Ｈ９またはｓ８６Ｂ４により免疫化された実験群についての生存率、平均体重変化および臨床スコア中央値。比較の理由のため、陰性対照ＰＢＳ群も示す。Ｂ：ｓ７４Ｈ９（配列番号６５）およびｓ８６Ｂ４（配列番号６７）の免疫原性。上段行：左側および中央パネル：ＥＬＩＳＡにより決定されたとおり、免疫化は、コグネイト抗原（ｓ７４Ｈ９  左側、ｓ８６Ｂ４  中央パネル）およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からの全長ＨＡ（右側パネル）を認識し得る抗体を誘導する。下段行：誘導された抗体は、競合ＥＬＩＳＡにおいてＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からの全長ＨＡへの結合についてＣＲ９１１４と競合し得る（左側パネル）。比較の理由のため、未標識ＣＲ９１１４（すなわち、自己競合）および非結合モノクローナル抗体ＣＲ８０２０（両方、５μｇ／ｍｌの出発濃度から段階希釈）による競合レベルを別箇のグラフに示す。
【図５】致死インフルエンザＨ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４チャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１（配列番号６６）の保護効力の評価。Ａ：上段行：陰性（ＰＢＳ）および陽性対照（ＣＲ６２６１）群についての生存率、平均体重変化および中央値臨床スコア。下段行：ｓ１２７Ｈ１（配列番号３５）により免疫化された実験群についての生存率、平均体重変化および中央値臨床スコア。比較の理由のため、陰性対照ＰＢＳ群も示す。Ｂ：ｓ１２７Ｈ１（配列番号３５）の免疫原性。上段行：：ＥＬＩＳＡにより決定されたとおり、免疫化は、コグネイト抗原ｓ１２７Ｈ１（配列番号３５）（左側パネル）およびＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からの全長ＨＡ（右側パネル）を認識し得る抗体を誘導する。下段行：誘導された抗体は、競合ＥＬＩＳＡにおいてＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からの全長ＨＡへの結合についてＣＲ９１１４と競合し得る（左側パネル）。比較の理由のため、未標識ＣＲ９１１４（すなわち、自己競合）および非結合モノクローナル抗体ＣＲ８０２０（両方、５μｇ／ｍｌの出発濃度から段階希釈）による競合レベルを別箇のグラフに示す。
【図６】ＣＲ６２６１への改善された結合を示す、セット１配列中の示される位置におけるアミノ酸の実測および予測出現頻度。値は、改善されたＣＲ６２６１結合を示すセット１配列の総数の割合として表現する。予測値は、１００％をそのセット中に含まれるそれぞれの位置における変異アミノ酸の数により割ったものとして計算する。
【図７】セット１からの改善されたＣＲ６２６１結合剤におけるアミノ酸の組合せの出現頻度。ＣＲ６２６１への改善された結合を有する配列を、左側に示される位置におけるアミノ酸の存在に従って分け、それぞれの組合せの頻度は、改善されたＣＲ６２６１結合を示すセット１配列の総数の割合として計算した。より高頻度な組合せを枠により囲った。Ａ．融合ペプチド区域中の組合せ配列の分析。Ｂ．Ｂループ区域の分析。
【図８】ＣＲ６２６１への改善された結合を示す、セット２配列中の示される位置におけるアミノ酸の実測および予測出現頻度。値は、改善されたＣＲ６２６１結合を示すセット２配列の総数の割合として表現する。予測値は、１００％をそのセット中に含まれるそれぞれの位置における変異アミノ酸の数により割ったものとして計算する。
【図９】セット２からの改善されたＣＲ６２６１結合剤におけるアミノ酸の組合せの出現頻度。ＣＲ６２６１への改善された結合を有する配列を、左側に示される位置におけるアミノ酸の存在に従って分け、それぞれの組合せの頻度は、改善されたＣＲ６２６１結合を示すセット２配列の総数の割合として計算した。より高頻度な組合せを枠により囲った。４０２位における変異は、全ての改善された結合配列がこの位置におけるＭｅｔを含有するため、分析に含めなかった一方、３５２位については、ＰｈｅまたはＴｙｒのいずれかを含有する配列のみを考慮した。Ａ．融合ペプチド区域中の組合せ配列の分析。Ｂ．Ｂループ区域の分析。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
本発明において使用される用語の定義を以下に挙げる。
【００３１】
本発明によるアミノ酸は、２０の天然（または「標準」アミノ酸）またはそのバリアント、例えば、Ｄ−プロリン（プロリンのＤ−エナンチオマー）など、またはタンパク質に天然に見出されない任意のバリアント、例えば、ノルロイシンなどのいずれかであり得る。標準アミノ酸は、それらの特性に基づきいくつかのグループに分割することができる。重要な因子は、電荷、親水性または疎水性、サイズおよび官能基である。これらの特性は、タンパク質構造およびタンパク質−タンパク質相互作用にとって重要である。一部のアミノ酸は、特別な特性を有し、例えば、システインは、他のシステイン残基への共有ジスルフィド結合（またはジスルフィド架橋）を形成し得、プロリンは、ポリペプチド骨格への周期性を形成し、グリシンは、他のアミノ酸よりもフレキシブルである。表５は、標準アミノ酸の略語および特性を示す。
【００３２】
用語「アミノ酸配列同一性」は、通常、割合として表現される一対のアラインされたアミノ酸配列間の同一性または類似性の程度を指す。同一性パーセントは、同一（すなわち、アラインメント中の所与の位置におけるアミノ酸残基は、同一残基である）または類似（すなわち、アラインメント中の所与の位置におけるアミノ酸置換は、以下に論じる保存的置換である）の候補配列中のアミノ酸残基と、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント配列相同性を達成した後のペプチド中の対応するアミノ酸残基との割合である。配列相同性、例として配列同一性および類似性の割合は、当分野において周知の配列アラインメント技術を使用して、例えば、目視調査および数学的計算により決定され、またはより好ましくは、比較は、コンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することにより行われる。例示的な好ましいコンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ；Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージバージョン１０．０プログラム、「ＧＡＰ」（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４））である。
【００３３】
「保存的置換」は、あるクラスのアミノ酸の同一クラスの別のアミノ酸による置換を指す。特定の実施形態において、保存的置換は、本発明のポリペプチドの構造もしくは機能、またはその両方を変化させない。保存的置換の目的のためのアミノ酸のクラスには、疎水性（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ）、中性親水性（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、酸性（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）、塩基性（例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）、立体構造破壊物質（例えば、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ）および芳香族（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ）が含まれる。
【００３４】
本明細書において使用される用語「疾患」および「障害」は、対象における病態を指すために互換的に使用される。一部の実施形態において、病態は、ウイルス感染、特にインフルエンザウイルス感染である。具体的な実施形態において、用語「疾患」は、細胞もしくは対象におけるウイルスの存在から生じ、またはウイルスによる細胞もしくは対象の侵襲による病理的状態を指す。ある実施形態において、病態は、免疫原性組成物の投与を介して対象において免疫応答を誘導することにより重症度が減少される対象における疾患である。
【００３５】
治療物を対象に投与する文脈における本明細書において使用される用語「有効量」は、予防および／または治療効果を有する治療物の量を指す。ある実施形態において、治療物を対象に投与する文脈における「有効量」は、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の重症度の低減もしくは改善、例えば、限定されるものではないが、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の持続時間の低減、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の進行の予防、インフルエンザウイルス感染、それに伴う疾患もしくは症状の発現もしくは発症もしくは再発の予防、ある対象から別の対象へのインフルエンザウイルスの拡散の予防もしくは低減、対象の入院および／もしくは入院期間の低減、インフルエンザウイルス感染もしくはそれに伴う疾患を有する対象の生存率の増加、インフルエンザウイルス感染もしくはそれに伴う疾患の排除、インフルエンザウイルス複製の阻害もしくは低減、インフルエンザウイルス力価の低減；および／または別の治療物の予防もしくは治療効果の向上および／もしくは改善を達成するために十分な治療物の量を指す。ある実施形態において、有効量は、インフルエンザウイルス疾患からの完全な保護をもたらさないが、未治療対象と比較してより低い力価または低減数のインフルエンザウイルスをもたらす。インフルエンザウイルスの力価、数または総負荷の低減の利益には、限定されるものではないが、より軽度の感染症状、より少ない感染症状および感染に伴う疾患の期間の低減が含まれる。
【００３６】
本明細書において使用される用語「宿主」は、ベクター、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターが導入された生物または細胞を指すものとする。生物または細胞は、原核または真核であり得る。好ましくは、宿主は、単離宿主細胞、例えば、培養物中の宿主細胞を含む。用語「宿主細胞」は、細胞が本発明のポリペプチドの（過剰）発現のために改変されていることを単に意味するにすぎない。宿主という用語は、特定の対象生物または細胞を指すだけでなく、そのような生物または細胞の子孫も同様に指すものとすることを理解すべきである。ある改変が突然変異または環境的影響のいずれかに起因して後続世代において生じ得るため、そのような子孫は、事実上、親生物または細胞と同一であり得ないが、依然として本明細書において使用される用語「宿主」の範囲内に含まれる。
【００３７】
本明細書において使用される用語「含まれる」または「例として」の後には、語「限定されるものではないが」が続くものとみなされる。
【００３８】
本明細書において使用される用語「感染」は、細胞または対象におけるウイルスの繁殖および／または存在による侵襲を意味する。一実施形態において、感染は、「活性」感染、すなわち、ウイルスが細胞または対象において複製しているものである。このような感染は、ウイルスにより最初に感染された細胞、組織、および／または器官から他の細胞、組織、および／または器官へのウイルスの拡散を特徴とする。感染は、潜伏感染、すなわち、ウイルスが複製していないものでもあり得る。ある実施形態において、感染は、細胞もしくは対象中のウイルスの存在から生じ、またはウイルスによる細胞もしくは対象の侵襲による病理学的状態を指す。
【００３９】
インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルス型：Ａ、ＢおよびＣ属に分類される。本明細書において使用される用語「インフルエンザウイルス亜型」は、ヘマグルチニン（Ｈ）およびノイラミニダーゼ（Ｎ）ウイルス表面タンパク質の組合せを特徴とするインフルエンザＡウイルスバリアントを指す。本発明によれば、インフルエンザウイルス亜型は、それらのＨ番号、例えば、「Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」、「Ｈ３亜型のインフルエンザウイルス」または「Ｈ３インフルエンザ」など、またはＨ番号およびＮ番号の組合せ、例えば、「インフルエンザウイルス亜型Ｈ３Ｎ２」もしくは「Ｈ３Ｎ２」などにより称することができる。用語「亜型」には、具体的には、通常、突然変異から生し、異なる病原プロファイルを示すそれぞれの亜型内の全ての個々の「株」、例として、天然分離株および人工突然変異体またはリアソータントなどが含まれる。このような株は、ウイルス亜型の種々の「分離株」と称することもできる。したがって、本明細書において使用される用語「株」および「分離株」は、互換的に使用することができる。ヒトインフルエンザウイルス株または分離株についての現在の命名法には、ウイルスの型（属）、すなわち、Ａ、ＢまたはＣ、最初の分離の地理的場所、株番号および分離年度に通常括弧内に挙げられるＨＡおよびＮＡの抗原の記載が含まれ、例えば、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／００（Ｈ３Ｎ２）である。非ヒト株には、命名法において起源の宿主も含まれる。インフルエンザＡウイルス亜型は、それらの系統発生グループを参照することによりさらに分類することができる。系統分析は、ヘマグルチニンの２つの主要グループへの下位分類を実証した：とりわけ系統発生グループ１におけるＨ１、Ｈ２、Ｈ５およびＨ９亜型（「グループ１」インフルエンザウイルス）およびとりわけ系統発生グループ２におけるＨ３、Ｈ４、Ｈ７およびＨ１０亜型（「グループ２」インフルエンザウイルス」）。
【００４０】
本明細書において使用される用語「インフルエンザウイルス疾患」は、細胞もしくは対象中のインフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡもしくはＢウイルスの存在またはインフルエンザウイルスによる細胞もしくは対象の侵襲から生じる病理学的状態を指す。具体的な実施形態において、この用語は、インフルエンザウイルスにより引き起こされる呼吸器疾病を指す。
【００４１】
本明細書において使用される用語「核酸」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログが含まれるものとする。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸分子は、化学的もしくは生化学的に改変することができ、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得、それは当業者により容易に認識される。このような改変には、例えば、標識、メチル化、アナログによる天然ヌクレオチドの１つ以上の置換、ヌクレオチド間改変、例えば、未荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、懸垂部分（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレート化剤、アルキル化剤、および改変結合（例えば、アルファアノマー核酸など）が含まれる。核酸配列への言及は、特に記載のない限り、その相補物を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補的配列を有するその相補鎖を包含すると理解すべきである。相補鎖も、例えばアンチセンス療法、ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマーに有用である。
【００４２】
ある実施形態において、本明細書において使用されるＨＡ中のアミノ酸の番号付与は、野生型インフルエンザウイルスのＨＡ０中のアミノ酸の番号付与、例えば、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のアミノ酸の番号付与に基づく。したがって、本発明において使用される語「ＨＡ中の「ｘ」位におけるアミノ酸」は、特定の野生型インフルエンザウイルス、例えば、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１；ＨＡ２ドメインのアミノ酸をイタリックで示した）のＨＡ０中のｘ位におけるアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。他のインフルエンザウイルス株および／または亜型中の相当アミノ酸を多重配列アラインメントにより決定することができることが当業者により理解される。本出願全体にわたり使用される番号付与系において、１は、未成熟ＨＡ０タンパク質（配列番号１）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意されたい。成熟配列は、例えば、配列番号１の１８位上で開始する。産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１７に対応）は一般に、例えば、ワクチンにおいて使用される最終ポリペプチド中に存在しないことが当業者により理解される。したがって、ある実施形態において、本発明によるポリペプチドは、リーダー配列を有さないアミノ酸配列を含み、すなわち、アミノ酸配列は、シグナル配列を有さないＨＡ０のアミノ酸配列をベースとする。
【００４３】
「ポリペプチド」は、当業者により公知のアミド結合により結合しているアミノ酸の重合体を指す。本明細書において使用されるこの用語は、共有アミド結合により結合している単一ポリペプチド鎖を指し得る。この用語は、非共有相互作用、例えば、イオン接触、水素結合、ファン・デル・ワールス接触および疎水性接触により会合している複数のポリペプチド鎖も指し得る。当業者は、この用語には、例えば、翻訳後プロセシング、例えば、シグナルペプチド開裂、ジスルフィド結合形成、グリコシル化（例えば、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化）、プロテアーゼ開裂および脂質改変（例えば、Ｓ−パルミトイル化）により改変されたポリペプチドが含まれることを認識する。
【００４４】
「ステムドメインポリペプチド」は、天然（または野生型）ヘマグルチニン（ＨＡ）のステムドメインを構成する１つ以上のポリペプチド鎖を含むポリペプチドを指す。典型的には、ステムドメインポリペプチドは、単一ポリペプチド鎖（すなわち、ヘマグルチニンＨＡ０ポリペプチドのステムドメインに対応）または２つのポリペプチド鎖（すなわち、ヘマグルチニンＨＡ２ポリペプチドと会合しているヘマグルチニンＨＡ１ポリペプチドのステムドメインに対応）である。本発明によれば、ステムドメインポリペプチドは、野生型ＨＡ分子と比較して１つ以上の突然変異を含み、特に野生型ＨＡの１つ以上のアミノ酸残基が特定の野生型ＨＡ中の対応位置上で天然に生じない他のアミノ酸により置換されていてよい。本発明によるステムドメインポリペプチドは、下記の１つ以上の結合配列をさらに含み得る。
【００４５】
用語「ベクター」は、複製され、一部の場合に発現される、宿主中への導入のために第２の核酸分子を挿入することができる核酸分子を示す。換言すると、ベクターは、それが結合した核酸分子を輸送し得る。クローニングおよび発現ベクターは、本明細書において使用される用語「ベクター」により企図される。ベクターには、限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）ならびにバクテリオファージまたは植物または動物（例として、ヒト）ウイルスに由来するベクターが含まれる。ベクターは、提示される宿主により認識される複製起源および発現ベクターの場合、宿主により認識されるプロモーターおよび他の調節領域を含む。あるベクターは、それらが導入された宿主中で自律複製し得る（例えば、細菌の複製起源を有するベクターは、細菌中で複製し得る）。他のベクターは宿主中への導入時に宿主のゲノム中に組み込むことができ、それによりベクターは宿主ゲノムに沿って複製される。本明細書において使用される、ウイルスの文脈における用語「野生型」は、高頻度であり、天然に循環し、典型的な疾患の蔓延を発生させているインフルエンザウイルスを指す。
【００４６】
詳細な説明
インフルエンザウイルスは、世界規模の公衆衛生に対して顕著な影響を及ぼし、毎年数百万の重病の症例、数千人の死亡、およびかなりの経済的損失を引き起こす。現在の三価インフルエンザワクチンは、ワクチン株および密接に関連する分離株に対する強力な中和抗体応答を誘発するが、ある亜型内のより分岐した株または他の亜型に及ぶことはほとんどない。さらに、適切なワクチン株の選択は多くの困難を提示し、準最適保護を頻繁にもたらす。さらに、次の流行性ウイルスの亜型の予測は、それがいつどこで生じるかを含め、現在では不可能である。
【００４７】
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、中和抗体の主要な標的であるインフルエンザＡウイルスからの主要なエンベロープ糖タンパク質である。ヘマグルチニンは、流入プロセスの間の２つの主要な機能を有する。第１に、ヘマグルチニンは、シアル酸受容体との相互作用を介して標的細胞の表面へのウイルスの付着を媒介する。第２に、ウイルスのエンドサイトーシス後、ヘマグルチニンは、続いてウイルスおよびエンドソーム膜の融合を生んでそのゲノムを標的細胞の細胞質中に放出させる。ＨＡは、宿主由来酵素により開裂されてジスルフィド結合により結合したままの２つのポリペプチドを生成する約５００アミノ酸の大型エクトドメインを含む。大多数のＮ末端断片（ＨＡ１、３２０〜３３０アミノ酸）は、受容体結合部位およびウイルス中和抗体により認識されるほとんどの抗原決定基を含有する膜遠位球状ドメインを形成する。より小型のＣ末端部分（ＨＡ２、約１８０アミノ酸）は、球状ドメインを細胞またはウイルス膜にアンカリングするステム様構造を形成する。亜型間の配列相同性の程度は、ＨＡ１ポリペプチド（３４％〜５９％の亜型間相同性）がＨＡ２ポリペプチド（５１〜８０％の相同性）よりも小さい。ほとんどの保存領域は、開裂部位周囲の配列、特にＨＡ２Ｎ末端２３アミノ酸であり、それは全てのインフルエンザＡウイルス亜型で保存される（Ｌｏｒｉｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。この領域の一部は、ＨＡ前駆体分子（ＨＡ０）中で表面ループとして曝露されるが、ＨＡ０がＨＡ１およびＨＡ２に開裂された場合に接近不可能になる。
【００４８】
ほとんどの中和抗体は、受容体結合部位を包囲するループに結合し、受容体結合および付着を妨げる。これらのループは高度に変異性であるため、それらの領域を標的化するほとんどの抗体は、株特異的であり、なぜ現在のワクチンがそのような限定された株特異的免疫を誘発するかを説明する。しかしながら、近年、広域交差中和効力を有するインフルエンザウイルスヘマグルチニンに対する完全ヒトモノクローナル抗体が生成された。機能および構造分析は、それらの抗体が膜融合プロセスを妨げ、インフルエンザＨＡタンパク質のステムドメイン中の高度に保存されたエピトープに対して指向されることを明らかにした（Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｅｋｉｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット、国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレット、国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレット）。
【００４９】
これらの抗体のエピトープを安定的に提示するステムドメインポリペプチドは、同時係属特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６号明細書に記載されている。本明細書に記載のステムドメインポリペプチドの少なくとも一部は、ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４のエピトープを安定的に提示し、マウスにおいて免疫原性である。本明細書に記載のステムドメインポリペプチドの少なくとも一部は、ＣＲ８０２０のエピトープを安定的に提示し、マウスにおいて免疫原性である。
【００５０】
本発明によれば、これらのエピトープを提示する新たなＨＡステムドメインポリペプチドが設計された。これらのポリペプチドを使用して広範囲のインフルエンザ株に対する保護を誘導するユニバーサルなエピトープベースのワクチンを作出することができる。既に記載されているステムドメインポリペプチドと同様、高度に変異性で免疫優性の部分、すなわち、頭部ドメインを最初に全長ＨＡ分子から除去してｍｉｎｉ−ＨＡとも称されるステムドメインポリペプチドを作出して広域中和抗体についてのエピトープが局在するステムドメインに免疫応答を再指向させる。上記の広域中和抗体を使用して新たに作出された分子の正確なフォールディングを調べ、中和エピトープの存在を確認した。
【００５１】
本発明の新たなステムドメインポリペプチドは、既出のステムポリペプチド（ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６号明細書）への抗体、特にＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４の結合と比較して増加したそれらの抗体の結合を示す。
【００５２】
本発明のステムドメインポリペプチドは、膜近位ステムドメインＨＡ分子の保存エピトープを、膜遠位頭部ドメイン中に存在する優性エピトープの不存在下で免疫系に提示し得る。この目的のため、頭部ドメインを構成するＨＡ０タンパク質の一次配列の一部を除去し、直接的に、または一部の実施形態において、短いフレキシブル結合配列（「リンカー」）を導入することにより再連結させてポリペプチド鎖の連続性を回復させる。得られたポリペプチド配列を、ＨＡ０分子の残留部分の天然三次元構造を安定化する規定の突然変異を導入することによりさらに改変する。
【００５３】
したがって、本発明は、（ａ）ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメイン、および（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含むポリペプチドであって、ＨＡ１およびＨＡ間の連結部におけるプロテアーゼ開裂に耐性であり、ＨＡ１およびＨＡ２ドメイン中の１つ以上のアミノ酸が突然変異しているポリペプチドを提供する。したがって、本発明のポリペプチドにおいて、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインは、ＨＡステムドメインポリペプチドをベースとする野生型インフルエンザヘマグルチニンのＨＡ１およびＨＡ２ドメインと比較して１つ以上の突然変異を含む。
【００５４】
本発明によれば、ステムドメインポリペプチドは、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスのＨＡをベースとする。
【００５５】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３３７、３４０、３５２または３５３位、または他のインフルエンザウイルス中の相当位置上の１つ以上の突然変異を含む。
【００５６】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３５２位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００５７】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３５３位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００５８】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３３７位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００５９】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３４０位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００６０】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、図１に示されるヘリックスＡのＣ末端残基をヘリックスＣＤのＮ末端残基に連結するＨＡ２アミノ酸配列中の１つ以上の突然変異を含む。
【００６１】
ある実施形態において、４０２、４０６、４０９、４１３および４１６位（番号付与は、配列番号１を指す）、または他のインフルエンザウイルス中の相当位置上のアミノ酸の１つ以上。
【００６２】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の４０２位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００６３】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の４０６位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００６４】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の４０９位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００６５】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の４１３位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００６６】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の４１６位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００６７】
本発明のポリペプチドは、全長ＨＡ１を含まない。
【００６８】
ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、ＨＡ０よりも実質的に小型であり、好ましくは、全てまたは実質的に全てのＨＡの球状頭部を欠く。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、３６０アミノ酸長以下、好ましくは、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３０５、３００、２９５、２９０、２８５、２８０、２７５、または２７０アミノ酸長以下である。ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、約２５０から約３５０、好ましくは、約２６０から約３４０、好ましくは、約２７０から約３３０、好ましくは、約２７０から約３３０アミノ酸長である。
【００６９】
ある実施形態において、ポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインが由来するＨＡのアミノ酸配列と比較してＨＡ１および／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上の追加の突然変異をさらに含む。したがって、ステムポリペプチドの安定性はさらに増加される。
【００７０】
本発明によれば、「ＨＡ１Ｎ末端セグメント」は、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）分子のＨＡ１ドメインのアミノ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ポリペプチドセグメントは、ＨＡ１ドメインの１位からｘ位のアミノ酸を含み、ｘ位上のアミノ酸は、ＨＡ１内のアミノ酸残基である。用語「ＨＡ１Ｃ末端セグメント」は、インフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインのカルボキシ末端部分に対応するポリペプチドセグメントを指す。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ポリペプチドセグメントは、ＨＡ１ドメインのｙ位からＣ末端アミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸を含み、ｙ位上のアミノ酸は、ＨＡ１内のアミノ酸残基である。本発明によれば、ｙは、ｘよりも大きく、したがって、ＨＡ１Ｎ末端セグメントおよびＨＡ１Ｃ末端セグメント間、すなわち、ＨＡ１のｘ位上のアミノ酸およびｙ位上のアミノ酸間のＨＡ１ドメインのセグメントが欠失しており、一部の実施形態において、結合配列により置き換えられている。
【００７１】
ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸１〜ｘを含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｙ〜末端を含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１セグメントの欠失は、ｘ＋１位におけるアミノ酸からｙ−１位におけるアミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸配列を含む。
【００７２】
ある実施形態において、ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１のアミノ酸ｐ〜ｘを含み、ｐは、成熟ＨＡ分子の最初のアミノ酸である（例えば、配列番号１の場合、ｐ＝１８）。当業者は、シグナルペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜１７）を有さない本明細書に記載のポリペプチドを調製することができる。
【００７３】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含まない。ある実施形態において、細胞内および膜貫通配列、例えば、ＨＡ２ドメインの５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはその相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列は、除去されている。
【００７４】
本発明によれば、ヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、ＨＡ１およびＨＡ２間の連結部におけるプロテアーゼ開裂に耐性である。ＨＡ１およびＨＡ２に及ぶＡｒｇ（Ｒ）〜Ｇｌｙ（Ｇ）配列は、トリプシンおよびトリプシン様プロテアーゼについての認識部位であり、典型的には、ヘマグルチニン活性化のために開裂されることが当業者に公知である。本明細書に記載のＨＡステムドメインポリペプチドは活性化すべきでないため、本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドはプロテアーゼ開裂に耐性である。したがって、本発明によれば、プロテアーゼ開裂部位が除去され、またはＨＡ１およびＨＡ２に及ぶプロテアーゼ部位がプロテアーゼ開裂に耐性である配列に突然変異される。
【００７５】
ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）またはリジン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端アミノ酸は、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントのＣ末端アミノ酸残基は、グルタミン（Ｑ）である。
【００７６】
ある実施形態において、ポリペプチドはグリコシル化されている。
【００７７】
本発明によれば、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、Ｈ１亜型のインフルエンザウイルスのＨＡをベースとする。「ベースとする」は、ＨＡ１ドメインおよび／またはＨＡ２ドメインのＮ末端セグメント、および／またはＣ末端セグメントが、当業者に公知のまたは後に発見されるＨ１、Ｈ３および／またはＨ５亜型の任意の天然インフルエンザヘマグルチニンのＨＡ１および／またはＨＡ２ドメインの対応するＮ末端および／またはＣ末端セグメントと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。ある実施形態において、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、グループ１インフルエンザＡウイルスのインフルエンザヘマグルチニンをベースとする。
【００７８】
本発明によれば、ポリペプチドは、Ｈ１ＨＡをベースとし、すなわち、ＨＡはＨ１亜型のインフルエンザウイルスからのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス、例えば、下記のインフルエンザウイルスＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号１）からのＨＡからの、またはそれをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含む。Ｈ１亜型のＨＡを含む他のインフルエンザＡウイルスも本発明により使用することができることが当業者により理解される。ある実施形態において、ポリペプチドは、表３から選択されるインフルエンザＡＨ１ウイルスのＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含む。
【００７９】
ある実施形態において、ポリペプチドは、Ｈ１ＨＡドメインの１位からｘ位のアミノ酸を含むＨＡ１Ｎ末端ポリペプチドセグメントを含み、ｘは、４６位上のアミノ酸〜６０位上のアミノ酸の任意のアミノ酸、例えば、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９位上のアミノ酸であり、好ましくは、ｘは、５２、５３、５５または５９である。好ましくは、ポリペプチドは、シグナル配列を有さないＨＡ１Ｎ末端セグメント、すなわち、ＨＡ１ドメインの１８位（例えば、Ｈ１ＨＡについて、例えば、配列番号１）、または他のＨ１インフルエンザウイルス株（例えば、表３を参照）中の相当位置からｘ位のアミノ酸を含むＨＡ１Ｎ末端セグメントを含む。したがって、ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１ドメインのｐ位（配列番号１のＨ１ＨＡについてｐ＝１８、または他のＨ１ＨＡ上の相当位置）からｘ位のアミノ酸を含む。
【００８０】
ある実施形態において、ＨＡ１Ｃ末端ポリペプチドセグメントは、Ｈ１ＨＡ１ドメインのｙ位からＣ末端アミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸を含み、ｙは、Ｈ１ＨＡ１の２９０位上のアミノ酸〜３２５位上のアミノ酸の任意のアミノ酸であり、好ましくは、ｙは、２９１、３０３、３１８、または３２１である。
【００８１】
ある実施形態において、ｘは、５２であり、ｙは、３２１である。
【００８２】
本発明によれば、ステムポリペプチドは、対応する野生型インフルエンザウイルスＨＡ１および／またはＨＡ２ドメイン、すなわち、ステムポリペプチドをベースとするインフルエンザウイルスのアミノ酸配列と比較してＨＡ１ドメインおよび／またはＨＡ２ドメイン中の１つ以上の突然変異、すなわち、アミノ酸置換を含む。
【００８３】
ある実施形態において、ＨＡ０開裂部位（配列番号１中の残基３４３）に近接する１つ以上のアミノ酸残基が突然変異している。ある実施形態において、配列番号１の３３７、３４０、３５２、または３５３位、または他のインフルエンザウイルス中の相当位置上のアミノ酸残基の１つ以上が突然変異しており、すなわち、ステムポリペプチドをベースとする野生型インフルエンザウイルスのＨＡのアミノ酸配列中の対応する位置において生じないアミノ酸により置換されている。表７は、天然存在のアミノ酸変異を示す。
【００８４】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３５２位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００８５】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３５３位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００８６】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３３７位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００８７】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号１の３４０位上、または他のインフルエンザウイルスの相当位置上の少なくとも１つの突然変異を含む。
【００８８】
ある実施形態において、ポリペプチドは、表１に示される突然変異の１つ以上を含む。
【００８９】
ある実施形態において、３３７位（ＨＡ１ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｉ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択される。
【００９０】
ある実施形態において、３４０位（ＨＡ１ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択される。
【００９１】
ある実施形態において、３５２位（ＨＡ２ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｄ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択される。
【００９２】
ある実施形態において、３５３位（ＨＡ２ドメイン）上の突然変異アミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、Ｇ、およびＶからなる群から選択される。
【００９３】
ある実施形態において、突然変異アミノ酸は、例えば、配列番号６中のＩ３４０Ｎについての場合のように、コンセンサスＮ−グリコシル化、例えば、Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ（Ｘは、Ｐを除く任意の天然存在アミノ酸である）を配列中に導入する。
【００９４】
ある実施形態において、突然変異アミノ酸は、同一亜型の配列中に天然に生じないアミノ酸である。
【００９５】
ここでも、アミノ酸の番号付与は、Ｈ１ＨＡ０中のアミノ酸の番号付与、特に、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ株Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）のアミノ酸の番号付与に基づくことに留意されたい。当業者は、他のインフルエンザウイルスのＨＡ中の相当アミノ酸を決定することができ、したがって、相当突然変異を決定することができる、例えば、異なるＨ１インフルエンザウイルスの配列アラインメントについての表３参照。
【００９６】
ある実施形態において、ＨＡ２ドメインは、ヘリックスＡのＣ末端残基をヘリックスＣＤのＮ末端残基に連結するＨＡ２アミノ酸配列（図１）中の１つ以上の突然変異を含む。ヘリックスＡのＣ末端残基およびヘリックスＣＤのＮ末端残基を連結するＨ１ＨＡ２アミノ酸配列は、アミノ酸配列
ＭＮＴＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮ（Ｈ／Ｋ）ＬＥ（Ｋ／Ｒ）（配列番号８）
を含むインフルエンザＨＡの残基４０２〜４１８（配列番号１による番号付与）を含むアミノ酸配列を含む。
【００９７】
ある実施形態において、ヘリックスＡのＣ末端残基をヘリックスＣＤのＮ末端残基に連結するアミノ酸配列、すなわち、血清型Ｈ１のインフルエンザＨＡのアミノ酸残基４０２〜４１８を含む領域（配列番号１による番号付与）は、アミノ酸配列
Ｘ１ＮＴＱＸ２ＴＡＸ３ＧＫＥＸ４Ｎ（Ｈ／Ｋ）Ｘ５Ｅ（Ｋ／Ｒ）（配列番号５２）
を含む。
【００９８】
ある実施形態において、ポリペプチドは、表１に示されるＨ１ＨＡ２ドメイン中の突然変異の１つ以上を含む。
【００９９】
ある実施形態において、４０２、４０６、４０９、４１３および４１６（番号付与は、配列番号１を指す）位上のアミノ酸の１つ以上、すなわち、アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５の１つ以上が突然変異しており、すなわち、ステムポリペプチドをベースとする野生型インフルエンザウイルス中のそれらの位置において生じないアミノ酸を含む。
【０１００】
ある実施形態において、４０２位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ１は、Ｍ、Ｅ、Ｋ、Ｖ、ＲおよびＴからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１０１】
ある実施形態において、４０６位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ２は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｔ、Ｈ、ＬおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、好ましくは、Ｉ、ＬまたはＹである。
【０１０２】
ある実施形態において、４０９位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ３は、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、ＦおよびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり、好ましくは、Ａ、ＩまたはＦである。
【０１０３】
ある実施形態において、４１３位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ４は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり、好ましくは、Ｉ、Ｙ、ＭまたはＶである。
【０１０４】
ある実施形態において、４１６位上の突然変異アミノ酸、すなわち、Ｘ５は、Ｌ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｒからなる群から選択されるアミノ酸であり、好ましくは、Ｉである。
【０１０５】
これらの突然変異の組合せも考えられる。
【０１０６】
ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５２、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８〜５２を含み、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３２１〜３４３を含み、３４３位上のアミノ酸、すなわち、Ｒ３４３は、突然変異しており、Ｒ以外のアミノ酸、好ましくは、グルタミン（Ｑ）である。ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基１〜５２、好ましくは、ＨＡ１のアミノ酸残基１８〜５２からなり、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントは、ＨＡ１のアミノ酸残基３２１〜３４３からなる。
【０１０７】
ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合する。一実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ８０５７に結合しない。一実施形態において、ＣＲ６２６１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；ＣＲ９１１４は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態において、ＣＲ８０５７は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１０８】
上記のとおり、ポリペプチドは、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインを含む。結合配列は、天然ＨＡにおいても野生型ＨＡにおいても生じない。ある実施形態において、リンカーは、１つのアミノ酸残基、２つ以下のアミノ酸残基、３つ以下のアミノ酸残基、４つ以下のアミノ酸残基、５つ以下のアミノ酸残基、１０以下のアミノ酸残基、１５以下のアミノ酸残基、または２０以下のアミノ酸残基または３０以下のアミノ酸残基または４０以下のアミノ酸残基または５０以下のアミノ酸残基を含むペプチドである。具体的な実施形態において、結合配列は、Ｇ、ＧＳ、ＧＧＧ、ＧＳＧ、ＧＳＡ、ＧＳＧＳ、ＧＳＡＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡＧＳ、ＧＳＧＳＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧ、およびＧＳＧＳＧＳＧからなる群から選択される配列である。
【０１０９】
ある実施形態において、ＨＡ１Ｎ末端セグメントは、ＨＡ１Ｃ末端セグメントに直接結合しており、すなわち、ポリペプチドは結合配列を含まない。
【０１１０】
本発明によれば、ＨＡ１およびＨＡ２間の開裂部位の除去は、Ｐ１位におけるＲ（わずかな場合においてＫ）のＱへの突然変異により達成することができる（例えば、開裂部位（配列番号１中の３４３位）の命名法の説明については、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１０参照。Ｑへの突然変異が好ましいが、Ｓ、Ｔ、Ｎ、ＤまたはＥも代替例である。
【０１１１】
本発明によれば、１つ以上のジスルフィド架橋がステムドメインポリペプチド中に、好ましくは、Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）中の３２４および４３６位（またはそれらの相当物）のアミノ酸間に導入される。したがって、ある実施形態において、ポリペプチドは、ＨＡ１ドメイン中の突然変異Ｒ３２４ＣおよびＨＡ２ドメイン中のＴ４３６Ｃをさらに含む。相当位置は、当業者が好適なアルゴリズム、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ、Ｍｕｓｃｌｅなどを使用して配列をアラインすることにより容易に決定することができる。遺伝子操作ジスルフィド架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）、しかし通常、空間的に近い２つの残基をシステインに突然変異させ、それが自発的にまたは活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間の共有結合を形成することにより作出される。
【０１１２】
天然形態のインフルエンザＨＡは、細胞またはウイルス膜上で三量体として存在する。ある実施形態において、分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞中での発現後に生成されるように細胞内および膜貫通配列を除去する。ＨＡの分泌エクトドメインを発現させ、精製する方法は記載されている（例えば、Ｄｏｐｈｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００９；Ｅｋｉｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００９、２０１１；Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００４、２００６；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  １９８１参照）。当業者は、これらの方法を本発明のステムドメインポリペプチドに直接適用して分泌（可溶性）ポリペプチドの発現を達成することもできることを理解する。したがって、これらのポリペプチドも本発明に包含される。
【０１１３】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、細胞内および膜貫通配列、例えば、ＨＡ２ドメインの５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはそれらの相当物）からＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列（配列番号１による番号付与）を除去して細胞中での発現後に可溶性ポリペプチドを産生した。
【０１１４】
ある実施形態において、本発明の可溶性ポリペプチドは、残基５１４（の相当物）からＣ末端（配列番号１による番号付与）のポリペプチド配列の欠失により作出することができる。あるいは、例えば、残基５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３からの配列を欠失させることにより追加の残基を本発明のポリペプチド中に含めることができる。場合により、精製目的のため、ｈｉｓタグ配列（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０）またはＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号２１））を場合によりリンカーを介して連結させて付加することができる。場合により、リンカーは、精製後にｈｉｓタグを酵素的に除去するためのタンパク質分解開裂部位を含有し得る。
【０１１５】
ある実施形態において、本発明の可溶性ポリペプチドは、残基５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１または５３２（配列番号１による番号付与）（の相当物）からのポリペプチド配列の欠失により作出することができる。場合により、精製目的のため、ｈｉｓタグ配列（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０）またはＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号２１））を場合によりリンカーを介して連結させて付加することができる。場合により、リンカーは、精製後にｈｉｓタグを除去するためのタンパク質分解開裂部位を含有し得る。
【０１１６】
可溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、例えば、ｆｏｌｄｏｎ配列（例えば、本明細書に記載のもの）を導入することによりさらに安定化させることができる。上記のとおり得られるポリペプチドも、本発明に包含される。
【０１１７】
天然ＨＡは、細胞表面上の三量体として存在する。三量体を一緒に保持する個々の単量体間の相互作用のほとんどは、頭部ドメイン中に局在する一方、ステムドメイン中では三量体化は三量体コイルドコイルモチーフの形成により媒介される。頭部の除去後、三次構造は脱安定化され、したがって、タンパク質安定性を増加させるために改変が必要とされる。ヘリックスＣＤのヘリカル傾向を強化することにより、より安定的なタンパク質を作出することができる。ある実施形態において、ＧＣＮ４に由来し、三量体化することも公知の配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号５）を４１９〜４３３位（の相当物）において導入する。
【０１１８】
ある実施形態において、ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３）をＨＡ２のＣ末端において場合により、リンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化される。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルによる後の処理のための開裂部位を含有し得る。可溶性形態の精製を容易にするため、タグ配列、例えば、ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０）またはＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号２１））またはＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号２２）またはそれらの組合せを場合により短いリンカーを介して連結させて付加することができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルによる後の処理のためのタンパク質分解開裂部位（の一部）、例えば、ＲＳＬＶＰＲ（配列番号２３）（トロンビン）またはＩＥＧＲ（配列番号２４）（第Ｘ因子）を含有し得る。処理されたタンパク質も本発明に包含される。
【０１１９】
ある実施形態において、５２０〜５６５位からのＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失しており（配列番号１による番号付与）、ＳＧＲＤＹＫＤＤＤＤＫＬＶＰＲＧＳＰＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号４）．により置き換えられている。
【０１２０】
本出願人らは、一部がグループ１インフルエンザウイルスについて特異的（例えば、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレットに記載のＣＲ６２６１）および一部がグループ２インフルエンザウイルスについて特異的（例えば、国際公開第２０１０／１３０６３６号パンフレットに記載のＣＲ８０２０）であったワクチン接種された個体からの一次ヒトＢ細胞から単離された広域中和抗体を既に同定している。これらのモノクローナル抗体の詳細なエピトープの分析により、それらの特異的抗体の交差反応性の欠落の理由が明らかになった。両方の場合、異なる位置上のグループ１またはグループ２ＨＡ分子中のグリカンの存在により、抗体がグループ特異的である事実が少なくとも部分的に説明された。以下に記載の多くのグループ１および２ＨＡ分子と交差反応するＣＲ９１１４様抗体の同定により、ヒト免疫系がインフルエンザウイルスに対する極めて広域の中和抗体を誘発することが可能であることが明らかになった。しかしながら、毎年のワクチン接種スキームの必要性を考慮すると、それらの抗体は、亜型Ｈ１および／またはＨ３の（季節性）インフルエンザウイルスによる感染後にもワクチン接種後にも明らかに誘発されず、または極めて低い程度に誘発されるにすぎない。
【０１２１】
本発明によれば、ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４の特異的エピトープを模倣し、例えば、単独で、または他の予防および／もしくは治療的治療との組合せでインビボで投与された場合、交差中和抗体を誘発するために免疫原性ポリペプチドとして使用することができるポリペプチドが提供される。「交差中和抗体」は、少なくとも２つ、好ましくは、少なくとも３つ、４つ、もしくは５つの系統発生グループ１のインフルエンザＡウイルスの異なる亜型、および／または少なくとも２つ、好ましくは、少なくとも３つ、４つ、もしくは５つの系統発生グループ２のインフルエンザＡウイルスの異なる亜型、および／または少なくとも２つのインフルエンザＢウイルスの異なる亜型、特に、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４により中和される少なくとも全てのウイルス株を中和し得る抗体を意味する。
【０１２２】
本発明のポリペプチドは、全長ＨＡ１を含まない。ある実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、ＨＡ０よりも実質的に小型であり、好ましくは、全てまたは実質的に全てのＨＡの球状頭部を欠く。好ましくは、免疫原性ポリペプチドは、３６０アミノ酸長以下、好ましくは、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３０５、３００、２９５、２９０、２８５、２８０、２７５、または２７０アミノ酸長以下である。一実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、約２５０から約３５０、好ましくは、約２６０から約３４０、好ましくは、約２７０から約３３０、好ましくは、約２７０から約３３０アミノ酸長である。
【０１２３】
ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ６２６１および／またはＣＲ９１１４に選択的に結合する。ある実施形態において、ポリペプチドは、抗体ＣＲ８０５７に結合しない。ＣＲ６２６１は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；ＣＲ９１１４は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み；ＣＲ８０２０は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。ＣＲ８０５７は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１２４】
上記のとおり、ポリペプチドは、ＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインを含む。結合配列は、存在する場合、天然ＨＡにおいても野生型ＨＡにおいても生じない。ある実施形態において、リンカーは、１つのアミノ酸残基、２つ以下のアミノ酸残基、３つ以下のアミノ酸残基、４つ以下のアミノ酸残基、５つ以下のアミノ酸残基、１０以下のアミノ酸残基、１５以下のアミノ酸残基、または２０以下のアミノ酸残基または３０以下のアミノ酸残基または４０以下のアミノ酸残基または５０以下のアミノ酸残基を含むペプチドである。具体的な実施形態において、結合配列は、Ｇ、ＧＳ、ＧＧＧ、ＧＳＧ、ＧＳＡ、ＧＳＧＳ、ＧＳＡＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡＧＳ、ＧＳＧＳＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧ、およびＧＳＧＳＧＳＧからなる群から選択される配列である。
【０１２５】
ある実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列：
【化１】
0006643981.tif 000002
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｒ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１２６】
ある実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列：
【化２】
0006643981.tif 000003
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｒ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１２７】
ある実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列：
【化３】
0006643981.tif 000004
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｒ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、ＭおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１２８】
ある実施形態において、ポリペプチドは、アミノ酸配列：
【化４】
0006643981.tif 000005
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｒ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、ＭおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１２９】
インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、当業者に好適と考えられる任意の技術、例として、下記の技術に従って調製することができる。
【０１３０】
したがって、本発明の免疫原性ポリペプチドは、当分野において公知の標準的方法によりＤＮＡ配列として合成し、当分野において公知の好適な制限酵素および方法を使用してクローニングし、続いてインビトロまたはインビボで発現させることができる。したがって、本発明はまた、上記のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターに関する。ある実施形態において、本発明による核酸分子は、ベクター、例えば、プラスミドの一部である。このようなベクターは、当業者に周知の方法により容易に操作することができ、例えば、原核および／または真核細胞中で複製し得るように設計することができる。さらに、多くのベクターは、直接的に、またはそれから単離された所望の断片の形態で真核細胞の形質転換に使用することができ、全部または一部としてそのような細胞のゲノム中に組み込まれ、所望の核酸をゲノム中に含む安定な宿主細胞をもたらす。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに好適であり、関心対象の核酸の転写に使用することができる任意のベクターであり得る。宿主細胞が使用される場合、ベクターは組込みベクターであることが好ましい。あるいは、ベクターは、エピソーム複製ベクターであり得る。
【０１３１】
当業者は、好適な発現ベクターを選択し、本発明の核酸配列を機能的に挿入することができる。ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を得るため、発現を駆動し得る配列を、ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に結合させ、タンパク質またはポリペプチドを発現可能なフォーマットでコードする組換え核酸分子をもたらすことができることは当業者に周知である。一般に、プロモーター配列が、発現させるべき配列の上流に配置される。多くの発現ベクターが当分野において利用可能であり、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクター系、ＢＤ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのｐＭＳＣＶおよびｐＴＫ−Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔなどであり、それらを使用して好適なプロモーターおよび／または転写終結配列、ポリＡ配列などを得ることができる。関心対象のポリペプチドをコードする配列が、コードされるポリペプチドの転写および翻訳を支配する配列に関して適切に挿入される場合、得られる発現カセットは、関心対象のポリペプチドを産生するために有用であり、それは発現と称される。発現を駆動する配列には、プロモーター、エンハンサーなど、およびそれらの組合せが含まれ得る。これらは、宿主細胞中で機能し得、それによりそれらに機能的に結合している核酸配列の発現を駆動し得るべきである。当業者は、宿主細胞中での遺伝子の発現を得るために種々のプロモーターを使用することができることを把握する。プロモーターは、構成的または調節的であり得、種々の資源、例として、ウイルス、原核、もしくは真核資源から得ることができ、または人工的に設計することができる。関心対象の核酸の発現は、天然プロモーターもしくはその誘導体から、または完全に異種のプロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ，２０００）からのものであり得る。一部の周知で、真核細胞中での発現にかなり使用されるプロモーターは、ウイルス、例えば、アデノウイルスに由来するプロモーター、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するプロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター（本発明においてＣＭＶプロモーターと称される）（例えば、ｐｃＤＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られる）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来するプロモーター（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）などを含む。好適なプロモーターは、真核細胞からも由来し得、例えば、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター（Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ユビキチンＣまたはＵＢ６プロモーター（Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどである。プロモーター機能およびプロモーターの強度についての試験は、当業者の定型事項であり、一般に、例えば、試験遺伝子、例えば、プロモーター配列後方のｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰなどのクローニング、および試験遺伝子の発現試験を包含し得る。無論、プロモーターは、その配列の欠失、付加、突然変異により変え、機能性について試験して新たな、減衰した、または改善されたプロモーター配列を見出すことができる。本発明によれば、最適な真核細胞中で高い転写レベルを付与する強力なプロモーターが好ましい。
【０１３２】
当業者に周知の方法を使用して構築物を真核細胞（例えば、植物、真菌、酵母または動物細胞）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な原核発現系中に形質移入することができる。一部の場合、好適な「タグ」配列（例えば、限定されるものではないが、ｈｉｓ、ｍｙｃ、ｓｔｒｅｐ、またはｆｌａｇタグなど）または完全タンパク質（例えば、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質またはグルタチオンＳトランスフェラーゼなど）を本発明の配列に付加して細胞または上清からのポリペプチドの精製および／または同定を可能とすることができる。場合により、特異的タンパク質分解部位を含有する配列を含めて後でタグをタンパク質分解消化により除去することができる。
【０１３３】
精製ポリペプチドは、当分野において公知の分光法（例えば、円偏光二色分光法、フーリエ変換赤外分光法およびＮＭＲ分光法またはＸ線結晶分析法）により分析してへリックスおよびベータシートなどの所望の構造の存在を調査することができる。以前に記載された広域中和抗体（ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４、ＣＲ８０５７）への本発明のポリペプチドの結合を調査するためにＥＬＩＳＡ、ＯｃｔｅｔおよびＦＡＣＳなどを使用することができる。したがって、正確な立体構造を有する本発明によるポリペプチドを選択することができる。
【０１３４】
本発明はさらに、治療有効量の本発明のポリペプチドおよび／または核酸の少なくとも１つを含む免疫原性組成物に関する。ある実施形態において、組成物は、１つのインフルエンザ亜型のＨＡからの（またはそれをベースとする）、例えば、Ｈ１またはＨ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスのＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含むポリペプチドを含む。ある実施形態において、組成物は、２つ以上の異なるインフルエンザ亜型のＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含むポリペプチドを含み、例えば、組成物は、Ｈ１亜型のＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含むポリペプチドおよびＨ３亜型のＨＡをベースとするヘマグルチニンステムドメインを含むポリペプチドの両方を含む。
【０１３５】
免疫原性組成物は、好ましくは、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。本文脈において、用語「薬学的に許容可能な」は、担体が用いられる投与量および濃度において、それが投与される対象中で不所望な効果も有害効果も引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容可能な担体および賦形剤は、当分野において周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］参照）。用語「担体」は、組成物がともに投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。生理食塩溶液および水性デキストローズおよびグリセロール溶液は、例えば、特に注射溶液のための液体担体として用いることができる。正確な配合は、投与の様式に適合すべきである。ポリペプチドおよび／または核酸分子は、好ましくは、滅菌溶液として配合および投与される。滅菌溶液は、滅菌濾過により、または当分野において自体公知の他の方法により調製される。次いで、溶液は、凍結乾燥または医薬投与容器中に充填することができる。溶液のｐＨは、一般に、ｐＨ３．０から９．５、例えば、ｐＨ５．０から７．５の範囲である。
【０１３６】
本発明はまた、インフルエンザＨＡタンパク質に対する免疫応答の誘導において使用される上記のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド、核酸分子および／またはベクターに関する。本発明はまた、対象において免疫応答を誘導する方法であって、対象に上記のポリペプチド、核酸分子および／または免疫原性組成物を投与することを含む方法に関する。本発明による対象は、好ましくは、感染性疾患惹起作用物質、特にインフルエンザウイルスにより感染され得、またはそうでなければ免疫応答の誘導から利益を受け得る哺乳動物であり、そのような対象は、例えば、げっ歯類、例えば、マウス、フェレット、または家庭もしくは農場動物、または非ヒト霊長類、またはヒトである。好ましくは、対象は、ヒト対象である。したがって、本発明は、特にグループ１および／もしくはグループ２インフルエンザＡウイルス、例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ７および／もしくはＨ１０亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス、ならびに／またはインフルエンザＢウイルスのインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に対する免疫応答を、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物を利用する対象において誘導する方法を提供する。一部の実施形態において、誘導される免疫応答は、グループ１および／もしくはグループ２インフルエンザＡウイルス亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防および／または治療するために有効である。一部の実施形態において、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物により誘導される免疫応答は、インフルエンザＡウイルスの２、３、４、５もしくは６つの亜型および／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされるインフルエンザＡおよび／またはＢウイルス感染を予防および／または治療するために有効である。
【０１３７】
小型タンパク質および／または核酸分子は強力な免疫応答を常に有効に誘導するわけではないことが周知であるため、アジュバントを添加することによりポリペプチドおよび／または核酸分子の免疫原性を増加させることが必要であり得る。ある実施形態において、本明細書に記載の免疫原性組成物は、アジュバントを含み、またはそれとの組合せで投与される。本明細書に記載の組成物との組合せ投与のためのアジュバントは、前記組成物の投与前、投与と同時に、または投与後に投与することができる。好適なアジュバントの例には、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウム；油−エマルション組成物（または水中油型組成物）、例として、スクアレン−水エマルション、例えば、ＭＦ５９（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレット参照）；サポニン配合物、例えば、ＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレット参照）；細菌または微生物誘導体が含まれ、その例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその突然変異体、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ、百日咳毒素ＰＴ、または破傷風トキソイドＴＴ、Ｍａｔｒｉｘ  Ｍ（Ｉｓｃｏｎｏｖａ）である。さらに、公知の免疫強化技術、例えば、免疫応答を向上させることが当分野において公知のタンパク質（例えば、破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７、ｒＣＴＢ、細菌性フラジェリンなど）への本発明のポリペプチドの融合またはビロソーム中へのポリペプチドの包含、またはそれらの組合せを使用することができる。使用することができる他の非限定的な例は、例えば、Ｃｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）により開示されている。
【０１３８】
一実施形態において、本発明のインフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ベクター中に取り込まれる。ＶＬＰは、一般に、典型的には、ウイルスの構造タンパク質に由来するウイルスポリペプチドを含む。好ましくは、ＶＬＰは、複製し得ない。ある実施形態において、ＶＬＰは、ウイルスの全ゲノムを欠き得、またはウイルスのゲノムの一部を含み得る。一部の実施形態において、ＶＬＰは、細胞に感染し得ない。一部の実施形態において、ＶＬＰは、それらの表面上で当業者に公知のウイルス（例えば、ウイルス表面糖タンパク質）または非ウイルス（例えば、抗体またはタンパク質）標的化部分の１つ以上を発現させる。
【０１３９】
具体的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、ビロソーム中に取り込まれる。本発明によるポリペプチドを含有するビロソームは、当業者に公知の技術を使用して産生することができる。例えば、ビロソームは、精製ウイルスを破壊し、ゲノムを抽出し、粒子をウイルスタンパク質（例えば、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド）および脂質とリアソートさせてウイルスタンパク質を含有する脂質粒子を形成することにより産生することができる。
【０１４０】
本発明はまた、特にワクチンとして使用される、インフルエンザＨＡに対する対象における免疫応答を誘導するための上記のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物に関する。したがって、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードする核酸、またはそのような核酸を含むベクターまたは本明細書に記載のポリペプチドは、インフルエンザウイルスに対する、例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのステム領域に対する中和抗体を誘発させるために使用することができる。本発明は特に、系統発生グループ１および／もしくは系統発生グループ２のインフルエンザＡウイルスならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患または病態の予防および／または治療においてワクチンとして使用される上記のポリペプチド、核酸、および／または免疫原性組成物に関する。一実施形態において、ワクチンは、系統発生グループ１および／または２の２、３、４、５、６もしくはそれより多い異なる亜型ならびに／またはインフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患の予防および／または治療において使用することができる。本発明のポリペプチドは、合成後にインビトロで、または好適な細胞発現系、例として、細菌および真核細胞中で使用することができ、またはインビボでそれが必要とされる対象中で、免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を発現させることにより発現させることができる。このような核酸ワクチンは、任意の形態、例として、ネイキッドＤＮＡ、プラスミド、またはウイルスベクター、例として、アデノウイルスベクターを取り得る。
【０１４１】
本発明によるポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物の投与は、標準的な投与経路を使用して実施することができる。非限定的な例には、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、経皮、筋肉内、皮下など、または粘膜投与、例えば、鼻腔内、経口などが含まれる。当業者は、本発明によるポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物を投与して免疫応答を誘導する種々の可能性を決定することができる。ある実施形態において、ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物（またはワクチン）は、２回以上、すなわち、いわゆる同種プライムブーストレジメンで投与される。ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物が２回以上投与されるある実施形態において、第２の用量の投与は、例えば、第１の用量の投与後１週間以上の時間間隔後、第１の用量の投与後２週間以上、第１の用量の投与後３週間以上、第１の用量の投与後１ヵ月以上、第１の用量の投与後６週間以上、第１の用量の投与後２ヵ月以上、第１の用量の投与後３ヵ月以上、第１の用量の投与後４ヵ月以上など、ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物の第１の用量の投与後数年まで実施することができる。ワクチンを第１のプライミング投与後に２回以上のブースト投与が続くように３回以上、例えば、３回、４回など投与することも可能である。他の実施形態において、本発明によるポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物は、１回のみ投与される。
【０１４２】
ポリペプチド、核酸分子、および／または免疫原性組成物は、プライムまたはブーストのいずれかとして、異種プライム−ブーストレジメンで投与することもできる。
【０１４３】
本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、核酸および／または組成物を利用して対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防および／または治療する方法をさらに提供する。具体的な実施形態において、対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防および／または治療する方法は、それが必要とされる対象に有効量の上記のポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物を投与することを含む。治療有効量は、グループ１もしくは２インフルエンザＡウイルス、および／またはインフルエンザＢウイルスによる感染から生じる疾患または病態の予防、改善および／または治療に有効な本明細書に定義のポリペプチド、核酸、および／または組成物の量を指す。予防は、インフルエンザウイルスの拡散の阻害もしくは低減またはインフルエンザウイルスによる感染に伴う症状の１つ以上の発症、発現もしくは進行の阻害もしくは低減を包含する。本明細書において使用される改善は、可視もしくは知覚疾患症状、ウイルス血症、または任意の他の計測可能なインフルエンザ感染の症候の低減を指し得る。
【０１４４】
治療が必要とされる者には、グループ１もしくはグループ２インフルエンザＡウイルス、またはインフルエンザＢウイルスによる感染から生じた病態により既に苦痛を受ける者、およびインフルエンザウイルスによる感染を予防すべき者が含まれる。したがって、本発明のポリペプチド、核酸および／または組成物は、未投薬の対象、すなわち、インフルエンザウイルス感染により引き起こされる疾患を有さない、もしくはインフルエンザウイルス感染により感染されたことがなく、現在も感染されていない対象、またはインフルエンザウイルスにより既に感染され、および／または感染されたことのある対象に投与することができる。
【０１４５】
一実施形態において、予防および／または治療は、インフルエンザウイルス感染を受けやすい患者群において標的化することができる。このような患者群には、限定されるものではないが、例えば、高齢（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは、≧６５歳）、若年（例えば、≦５歳、≦１歳）、入院患者および抗ウイルス化合物により治療されたが、不適切な抗ウイルス応答を示した患者が含まれる。
【０１４６】
別の実施形態において、ポリペプチド、核酸および／または免疫原性組成物は、対象に１つ以上の他の活性剤、例えば、既存または将来のインフルエンザワクチン、モノクローナル抗体および／または抗ウイルス剤、および／または抗菌剤、および／または免疫調節剤との組合せで投与することができる。１つ以上の他の活性剤は、インフルエンザウイルス疾患の治療および／または予防において有益であり得、またはインフルエンザウイルス疾患に伴う症状または病態を改善し得る。一部の実施形態において、１つ以上の他の活性剤は、鎮痛剤、抗発熱薬、または呼吸を緩和もしくは補助する治療物である。
【０１４７】
本発明のポリペプチドおよび／または核酸分子の投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整することができる。好適な投与量範囲は、例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．５〜１５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。用いるべきポリペプチドおよび／または核酸分子の正確な投与量は、例えば、投与経路、および感染またはそれにより引き起こされる疾患の重症度に依存し、医師の判断および各対象の状況に従って決定すべきである。例えば、有効用量は、患者の標的部位、生理学的状態（例として、年齢、体重、健康）に応じて変動し、治療が予防的または治療的であるかを問わない。通常、患者は、ヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例として、トランスジェニック哺乳動物を治療することもできる。治療投与量は、安全性および効力を最適化するように最適に力価測定される。
【０１４８】
本発明のポリペプチドは、潜在的な治療候補物として同定されたモノクローナル抗体の結合を確認するために使用することもできる。さらに、本発明のポリペプチドは、診断ツールとして、例えば、本発明のポリペプチドに結合し得るそのような個体の血清中の抗体が存在するか否かを確認することにより個体の免疫状態を試験するために使用することができる。したがって、本発明はまた、患者におけるインフルエンザ感染の存在を検出するインビトロ診断法であって、ａ）前記患者から得られた生物学的試料を本発明によるポリペプチドと接触させるステップ；およびｂ）抗体−抗原複合体の存在を検出するステップを含む方法に関する。
【０１４９】
本発明のポリペプチドは、新たな結合分子を同定するため、または既存の結合分子、例えば、モノクローナル抗体および抗ウイルス剤を改善するために使用することもできる。
【０１５０】
本発明を以下の実施例および図面においてさらに説明する。実施例は、本発明の範囲を決して限定するものではない。
【実施例】
【０１５１】
実施例１
新規ステムベースポリペプチドの調製
ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０７３７０６号明細書は、インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチド、組成物およびワクチンならびにインフルエンザの予防および／または治療の分野におけるそれらの使用方法を開示している。本明細書において、本発明者らは、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）の全長ＨＡに由来するステムドメインポリペプチドの追加の配列を記載する。新規ステムドメインポリペプチドは、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号２）の部位特異的突然変異により得、ＣＲ６２６１（Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ、２００９；Ｅｋｉｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）および／またはＣＲ９１１４の広域インフルエンザ中和エピトープを提供する。
【０１５２】
Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号２）は、以下のステップを採用することによりＨ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）の全長ＨＡから導いた：
１．ＨＡ０中の開裂部位の除去。この部位における野生型ＨＡの開裂は、ＨＡ１およびＨＡ２をもたらす。除去は、Ｐ１位におけるＲのＱへの突然変異により達成することができる（例えば、開裂部位の命名の説明についてはＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ、２０１０参照（配列番号１の３４３位）。
２．配列番号１からのアミノ酸５３から３２０の欠失による頭部ドメインの除去。配列の残留ＮおよびＣ末端部分は、４残基フレキシブルリンカーＧＧＧＧにより結合させた。
３．改変ＨＡの融合前立体構造の安定性を増加させ、融合後立体構造を脱安定化させるための、Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）中の残基４０２から４１８（の相当物）により形成されるループの溶解度の増加（Ａ−ヘリックスおよびＣＤヘリックス間）。Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号２）中で、突然変異Ｆ４０６Ｓ、Ｖ４０９Ｔ、Ｆ４１３ＧおよびＬ４１６Ｓ（番号付与は、配列番号１を指す）を導入した。
４．Ｈ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７中の３２４位および４３６位におけるアミノ酸間のジスルフィド架橋の導入；これは、突然変異Ｒ３２４ＣおよびＹ４３６Ｃ（番号付与は、配列番号１を指す）を導入することにより達成する。
５．４１９〜４３３位（番号付与は、配列番号１を指す）における、三量体化することが公知のＧＣＮ４由来配列ＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱ（配列番号５）の導入。
【０１５３】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、ＨＡの細胞内配列および膜貫通ドメインを含有する。他の実施形態において、膜貫通および細胞内ドメインの配列は、分泌（可溶性）ポリペプチドが細胞中の発現後に産生されるように、ＨＡ２の５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２６、５２７、５２８、５２９、または５３０位（またはその相当物、配列アラインメントにより決定）からＨＡ２のＣ末端（配列番号１による番号付与）まで欠失している。可溶性ポリペプチドは、三量体構造を形成することが公知の配列、すなわち、ｆｏｌｄｏｎ配列ＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬ（配列番号３）を上記のとおり場合により短いリンカーを介して連結させて導入することによりさらに安定化させることができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルによる後の処理のための開裂部位を含有し得る。可溶性形態の精製および検出を容易にするため、場合により、タグ配列、例えば、ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号２０）またはＨＨＨＨＨＨ（配列番号２１）またはＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号２２）またはそれらの組合せを、場合により短いリンカーを介して連結させて付加することができる。リンカーは、場合により、当業者に周知のプロトコルによる後の処理のためのタンパク質分解開裂部位（の一部）、例えば、ＬＶＰＲＧＳ（配列番号２３）（トロンビン）またはＩＥＧＲ（配列番号２４）（第Ｘ因子）を含有し得る。処理されたタンパク質も本発明に包含される。
【０１５４】
ＦＬＡＧタグ、トロンビン開裂部位、ｆｏｌｄｏｎ、およびＨｉｓ配列を組み合わせるこのようなＣ末端配列の一例は、配列番号４のＦＬＡＧ−トロンビン−ｆｏｌｄｏｎ−Ｈｉｓである。この配列は、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号２）配列の可溶性形態と組み合わせて親配列（配列番号６）を作出し、それを使用して突然変異導入により本発明の新規ポリペプチドを作出した。この配列は、配列番号１および２のアミノ酸１〜１７に対応するリーダー配列を含有しない。
【０１５５】
ステムドメインポリペプチドは、分子の頭部ドメインをコードするヘマグルチニン配列の一部を欠失させ、ＰＣＴ／２０１２／０７３７０６号明細書および上記のとおりリンカーを介して欠失の両側で配列のＮ末端およびＣ末端部分を再連結させることにより作出する。頭部ドメインの除去は、曝露される水性溶媒から既にシールドされた分子の一部を残し、本発明のポリペプチドの構造を潜在的に脱安定化させる。この理由のため、Ｂループ中の残基（特にアミノ酸残基４０６（それぞれ配列番号１および２のＦおよびＳ）、４０９（ＶおよびＴ）、４１３（ＦおよびＧ）および４１６（ＬおよびＳ）を、出発点として親配列の配列番号６を使用して種々の組合せで突然変異させた。配列番号６は、Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４（配列番号２）から、リーダー配列を除去し、残基５２０〜５６５をＦｌａｇ−トロンビン−ｆｏｌｄｏｎ−−ｈｉｓ配列（配列番号４）により置き換えることにより作出した。
【０１５６】
同様に、融合ペプチド周囲の区域中で多数の疎水性残基が溶媒に曝露され、これは、天然全長ＨＡとは異なり、本発明のポリペプチドが開裂され得ず、疎水性融合ペプチドをタンパク質の内部中に埋め込む関連立体構造変化を受けるという事実により引き起こされる。この問題に対処するため、配列番号２の残基Ｉ３３７、Ｉ３４０、Ｆ３５２およびＩ３５３の一部または全部も突然変異させた。
【０１５７】
ＨＡのヘリックスＡは、ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＦＩ６．ｖ３の広域中和エピトープのエピトープの重要な部分である。アミノ酸残基Ｍ４０２（番号付与は、配列番号１を指す）は、このヘリックスのＣ末端終端において位置し、ヘリックス構造をさらに安定化させるため、この残基も標的化して本発明の新規ポリペプチドを作出した。突然変異ポリペプチドの２つの異なるセットを表１に開示する。
【０１５８】
【表１】
0006643981.tif 000006
【０１５９】
実施例２
ポリペプチド発現および広域中和抗体への結合の検出
当業者に周知のプロトコルを使用して本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）中に形質転換し、またはＨＥＫ２９３Ｆ細胞中に形質移入した。哺乳動物細胞中の発現に使用される構築物は、ＨＡリーダー配列（配列番号１および２の残基１〜１７）を含有した一方、ピキア酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）中の発現に使用される構築物中ではＨＡリーダー配列を酵母アルファ因子リーダー配列（配列番号７）により置き換えた。このように、発現タンパク質を細胞培養培地に指向し、こうして本発明のポリペプチドのさらなる精製なしで結合および発現の測定を可能とする。全ての配列は、ＦＬＡＧ−ｆｏｌｄｏｎ−ＨＩＳのＣ末端配列（配列番号４）を含有した。
【０１６０】
本発明のポリペプチドへのモノクローナル抗体結合（ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４、ＣＲ８０２０）は、ＥＬＩＳＡにより測定した。この目的のため、ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体溶液（２０μｌ／ウェル）により４℃において一晩処理した。抗体溶液の除去後、残留表面を脱脂粉乳のＰＢＳ中４％溶液により室温において少なくとも１時間ブロッキングした。プレート洗浄後、２０μｌの細胞培養培地（無希釈または希釈）をそれぞれのウェルに添加し、室温において少なくとも１時間インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、２０μｌの抗ＦＬＡＧ−ＨＲＰ抗体溶液（Ｓｉｇｍａ  Ａ８９５２、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中４％の脱脂粉乳中で２０００倍希釈）を添加した。インキュベーション（室温において１時間）後、プレートをさらに１回洗浄し、２０μｌの発光基質（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃ＃３４０７８）を添加してシグナルを発現させた。あるいは、比色検出法を使用してシグナルを発現させることができる。
【０１６１】
本発明のポリペプチドの発現は、ホモジニアス時間分解蛍光アッセイ（一般的記載については、例えば、Ｄｅｇｏｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００９  ３：２２−３２参照）から測定した。この目的のため、２１０．５μｌの抗ＦＬＡＧ−ＴＢ（原液２６μｇ／ｍｌ）および１．６８ｍｌの抗ＨＩＳ−４８８（原液５０μｇ／ｍｌ）を、培養培地および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ＋０．１％のＢＳＡの８０ｍｌの１対１混合物に添加することにより、テルビウム（Ｔｂ）標識抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（ドナー）およびＡｌｅｘａ４８８標識抗Ｈｉｓモノクローナル抗体（アクセプター）の混合物（ＨＴＲＦ溶液）を調製した。１９μｌのＨＴＲＦ溶液をＥＬＩＳＡプレートそれぞれのウェルに添加し、１μｌの培養培地を添加した。励起時および他の化合物（タンパク質、培地構成要素など）から生じる干渉する短寿命バックグラウンドシグナルの減衰を可能とするための遅延後、５２０および６６５ｎｍにおける蛍光発光の比を測定した。これは、試料中の総タンパク質含有率の尺度であり、それを使用して異なる実験間のｍＡｂ結合シグナルを正規化する。
【０１６２】
表４および５に列記の本発明のポリペプチドは、当業者に周知のプロトコルに従ってピキア酵母（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ）中で発現させた。培養培地を回収し、ステムドメインポリペプチドのＣＲ６２６１結合への結合およびその発現を上記のとおり測定した。結合アッセイ中の応答は発現タンパク質の濃度に対応するため、ＥＬＩＳＡ結合シグナルは、それぞれの発現配列についてＨＴＲＦアッセイにおけるシグナルに対する結合シグナルの比を比較することによりタンパク質発現について正規化した。全ての発現タンパク質は、配列番号６の親配列と比較してＣＲ６２６結合シグナルとＨＴＲＦシグナルとのより高い比を示す。
【０１６３】
表６に列記の本発明のポリペプチドは、当業者に周知のプロトコルに従ってＨＥＫ２９３Ｆ細胞中で発現させた。培養培地を回収し、ステムドメインポリペプチドのＣＲ６２６１結合への結合およびその発現を上記のとおり測定した。ＣＲ６２６１結合とＨＴＲＦシグナルとの比を計算し、親配列の配列番号６について計算された比と比較した。結果を表６に列記し；全ての発現タンパク質は、より高い比を示し、このことは、本発明のステムポリペプチドが増加したＣＲ６２６１の結合を示すことを示す。
【０１６４】
実施例３
本発明のポリペプチドの精製および特性決定
本発明のポリペプチドをさらに特性決定するため、免疫原１２７Ｈ１（配列番号５５）、８６Ｂ４（配列番号５６）、７４Ｈ９（配列番号５７）、６Ｅ１２（配列番号５８）および５５Ｇ７（配列番号５９）を培養し、均一に精製した。本発明のポリペプチドの高度に純粋な調製物を得るため、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、１２７Ｈ１（配列番号５５）、８６Ｂ４（配列番号５６）、７４Ｈ９（配列番号５７）、６Ｅ１２（配列番号５８）および５５Ｇ７（配列番号５９）の可溶性形態をコードする遺伝子を含有する発現ベクターｐｃＤＮＡ２００４により形質移入した。可溶性形態は、この場合、残基５１９〜５６５（番号付与は配列番号１を指す）の配列ＲＳＬＶＰＲＧＳＰＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号６９）による置き換えにより作出した。産生の間にタンパク質の輸送を指向するリーダー配列（またはシグナル配列）（配列番号１のアミノ酸１〜１７に対応）は、分泌される最終ポリペプチド中に存在しないことが当業者により理解される。可溶性分泌タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６５から６９に挙げる。
【０１６５】
本発明のポリペプチドを産生するため、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を３００ｇにおいて５分間スピンダウンさせ、ＳＦ１０００フラスコ当たり３００ｍＬの予熱されたＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地中で再懸濁させることにより１．０＊１０６ｖｃ／ｍＬを播種した。この培養物をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０％のＣＯ２において１１０ｒｐｍにおいて１時間インキュベートした。１時間後、プラスミドＤＮＡを９．９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中で３００ｍＬの培養容積中の１．０μｇ／ｍＬの濃度にピペッティングした。並行して、４４０μＬの２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を９．９ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ培地中でピペッティングし、室温において５分間インキュベートした。５分後、プラスミドＤＮＡ／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物を２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）／Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物に添加し、室温において２０分間インキュベートした。インキュベーション後、プラスミドＤＮＡ／２９３ｆｅｃｔｉｎ（登録商標）混合物を細胞懸濁液に滴加した。形質移入培養物をｍｕｌｔｉｔｒｏｎインキュベーター中で３７℃、１０％のＣＯ２において１１０ｒｐｍにおいてインキュベートした。７日目、細胞を遠心分離（３０００ｇにおいて３０分間）により培養培地から分離した一方、本発明の可溶性ポリペプチドを含有する上清をさらなる処理のために０．２μｍボトルトップフィルター上で濾過した。
【０１６６】
精製目的のため、本発明のポリペプチド１２７Ｈ１（配列番号５５）、８６Ｂ４（配列番号５６）、７４Ｈ９（配列番号５７）、６Ｅ１２（配列番号５８）または５５Ｇ７（配列番号５９）の可溶性形態（上記）をコードする遺伝子により形質移入された細胞からの約１４００ｍｌの培養上清を、洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴＲＩＳ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中で事前に平衡化された２４ｍｌのＮｉ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムにアプライした。洗浄緩衝液中１０ｍＭのイミダゼ（Ｉｍｉｄａｚｅ）による洗浄ステップ後、結合した本発明のポリペプチドを洗浄緩衝液中３００ｍＭのイミダゾールの段階的勾配により溶出させた。溶出ピークを回収し、緩衝液を交換し、濃縮し、さらなる精製のためにサイズ排除カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）にアプライした。分画を溶出の間に回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット（ヒスチジンタグに特異的なモノクローナル抗体を使用）によりタンパク質含有率について分析した。精製された本発明のポリペプチドを含有する分画を回収し、さらに分析に使用した。純度は、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、全ての場合において９０％を上回った。精製手順の特徴を表８に列記する。
【０１６７】
本発明のポリペプチド間の結合反応を分析するため、およびＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４の立体構造エピトープの存在を確認するため、それらの抗体と精製タンパク質との複合体化をバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４、Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ）により試験した。この目的のため、ビオチン化ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４をストレプトアビジンコートセンサ上で固定化し、続いてそれを最初に本発明の精製ポリペプチドの溶液に曝露させて会合速度を計測し、次いで洗浄溶液に曝露させて解離速度を計測した。固定化ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４は両方、本発明のポリペプチドの可溶性形態への曝露後の明確な応答により証明されるとおり、本発明のポリペプチドを認識する。結合相互作用についての解離定数を推定するため、２倍希釈系列を使用して力価測定を実施した。固定化ＣＲ６２６１を含有するセンサは、それぞれ７５０、３７５、１６３、８１、４０、２０および１０ｎＭの濃度の本発明の可溶性ポリペプチドを含有する溶液に曝露させ、但し、精製ｓ５５Ｇ７（配列番号６８）の場合においては２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６３および３１ｎＭの濃度範囲を使用した。同様に、固定化ＣＲ９１１４を含有するセンサは、それぞれ３００、１５０、７５、３８、１９、９および５ｎＭの濃度の本発明の可溶性ポリペプチドを含有する溶液に曝露させた。全ての場合において、４０００秒後の最終応答を記録し、ポリペプチド濃度の関数としてプロットし、定常状態１：１結合モデルへのフィットを実施して見かけの解離定数Ｋｄを計算した（図２ＡからＥ参照）。このように決定された値を表８に列記する。
【０１６８】
本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１（配列番号６６）、ｓ８６Ｂ４（配列番号６７）、ｓ７４Ｈ９（配列番号６５）、ｓ６Ｅ１２（配列番号６９）およびｓ５５Ｇ７（配列番号６８）ならびにＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４および対照ＣＲ８０２０のＦａｂ断片間の結合は、多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）と組み合わせた分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより試験した。この技術により、異なる分子種および／または複合体についての同時分離およびそれらの分子サイズの推定が可能となる。結果を図３ＡからＥに示し、表９にまとめる。データは、本発明のポリペプチドがモノマーであり、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４のＦａｂ断片との１：１複合体を形成するが、ＣＲ８０２０とは形成しないことを示す。このことは、Ｆａｂ断片の結合反応の特異性と一致する。それというのも、ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４は、グループ１に由来するＨＡに結合する一方、ＣＲ８０２０は結合しないためである。
【０１６９】
まとめると、本発明者らは、本発明のポリペプチド１２７Ｈ１（配列番号５５）、８６Ｂ４（配列番号５６）、７４Ｈ９（配列番号５７）、６Ｅ１２（配列番号５８１）および５５Ｇ７（配列番号５９）の可溶性形態を産生し、均一に精製することができることを示した。本発明の精製可溶性ポリペプチドは、広域中和モノクローナル抗体ＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４に高親和性で結合し得、このことは、それらのステムドメインポリペプチド中の対応する中和エピトープの存在を裏付ける。
【０１７０】
実施例４
致死インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドの保護効力の評価
致死インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明のポリペプチドの保護効力を評価するため、１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍによりアジュバントされた３０μｇの精製ｓ８６Ｂ４（配列番号６７）およびｓ７４Ｈ９（配列番号６５）により３週間間隔において３回免疫化した。チャレンジモデルについての陽性対照として、ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に筋肉内投与した一方、ＰＢＳによる免疫化を陰性対照として機能させた。最後の免疫化の４週間後、マウスを２５×ＬＤ５０異種チャレンジウイルス（Ｈ１Ｎ１Ａ／ＮＬ／６０２／０９）によりチャレンジし、３週間毎日モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。チャレンジ前血清を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて免疫化に使用される本発明のポリペプチドへの結合（正確な免疫化を確認するため）、Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７からの可溶性全長ＨＡへの結合、および広域中和抗体モノクローナル抗体ＣＲ９１１４との全長ＨＡへの結合についての競合（誘導された抗体が広域中和ＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか否かを決定するため）について試験する。結果を図４ＡおよびＢに示す。
【０１７１】
結果は、実験が有効であることを示す。それというのも、ＰＢＳ対照群の全てのマウスがチャレンジ後８日以内に感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は、完全に保護されるためである。ＰＢＳ処理マウスとは対照的に、本発明のポリペプチドｓ８６Ｂ４（配列番号６７）またはｓ７４Ｈ９（配列番号６５）により免疫化されたマウス１０匹のうち４匹が致死チャレンジから生存する。このことは、本発明のポリペプチドにより免疫化された群について、ＰＢＳ対照群と比較して増加した生存時間および低減した臨床スコアをもたらす。
【０１７２】
コグネイト抗原（すなわち、ｓ８６Ｂ４またはｓ７４Ｈ９のいずれか）または全長ＨＡのいずれかを抗原として使用するＥＬＩＳＡデータ（図４Ｂ参照）は、本発明のポリペプチドｓ７４Ｈ９およびｓ８６Ｂ４の両方が、免疫原性であり、全長ＨＡを認識し得る抗体を誘導することを示す。
【０１７３】
免疫化に対する免疫学的応答をさらに理解するため、競合結合ＥＬＩＳＡを実施した。この目的のため、プレート結合全長ＨＡを段階希釈された血清試料とインキュベートし、その後に所定濃度のＣＲ９１１４−ビオチンを添加する。さらなるインキュベーション後、結合したＣＲ９１１４−ビオチンの量を定量する。データは、「傾きＯＤ（ｓｌｏｐｅ  ＯＤ）」（ΔＯＤ／１０倍希釈率）として表現されるｌｏｇ希釈率に対するＯＤの線形回帰を使用して分析する。データは、広域中和抗体ＣＲ９１１４と結合について競合し得る抗体が本発明のポリペプチドによる免疫化により誘導されることを示す。比較として、未標識ＣＲ９１１４（すなわち、自己競合）および非結合モノクローナル抗体ＣＲ８０２０（両方とも、５μｇ／ｍｌの出発濃度から段階希釈）により誘導されたレベルを、別個のグラフに示す。
【０１７４】
まとめると、これらのデータは、本発明のポリペプチドｓ８６Ｂ４（配列番号６７）またはｓ７４Ｈ９（配列番号６５）による免疫化がマウスをインフルエンザによる致死感染から保護し得ることを示す。両方のポリペプチドは、免疫原性であり、全長ＨＡに結合し得る抗体を誘導し、それらの抗体の少なくとも一部は、モノクローナル抗体ＣＲ９１１４の広域中和エピトープのエピトープにおいて、またはその近くで結合する。
【０１７５】
実施例５
致死インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明の別のポリペプチドの保護効力の評価
致死インフルエンザチャレンジモデルにおける本発明の別のポリペプチドｓ１２７Ｈ１（配列番号６６）の保護効力を評価するため、１０匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）の群を、１０μｇのＭａｔｒｉｘ−Ｍによりアジュバントされた１０μｇの精製ｓ１２７Ｈ１により３週間間隔において３回免疫化した。チャレンジモデルについての陽性対照として、広域中和抗体モノクローナル抗体ＣＲ６２６１（１５ｍｇ／ｋｇ）をチャレンジ１日前に筋肉内投与した一方、ＰＢＳによる免疫化を陰性対照として機能させた。最後の免疫化の４週間後、マウスを２５×ＬＤ５０異種チャレンジウイルス（Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４）によりチャレンジし、３週間毎日モニタリングした（生存率、体重、臨床スコア）。チャレンジ前血清を、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて免疫化に使用された本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１への結合（正確な免疫化を確認するため）、可溶性Ｈ１Ｎ１Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７全長ＨＡへの結合、および広域中和抗体モノクローナル抗体ＣＲ９１１４との全長ＨＡへの結合についての競合（誘導された抗体が広域中和ＣＲ９１１４エピトープに近接して結合するか否かを決定するため）について試験する。結果を図５ＡおよびＢに示す。
【０１７６】
結果は、実験が有効であることを示す。それというのも、ＰＢＳ対照群の全てのマウスがチャレンジ後７日目に感染により死亡する一方、陽性対照群（１５ｍｇ／ｋｇのＣＲ６２６１、チャレンジ１日前）は、完全に保護されるためである。ＰＢＳ処理マウスとは対照的に、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１（配列番号６６）により免疫化されたマウス１０匹のうち７匹が致死チャレンジから生存する。このことは、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１により免疫化された群について、ＰＢＳ対照群と比較して増加した生存比率、増加した生存時間および低減した臨床スコアをもたらす。
【０１７７】
ｓ１２７Ｈ１または可溶性全長ＨＡを抗原として使用するＥＬＩＳＡデータは、本発明のポリペプチドｓ１２７Ｈ１が、免疫原性であり、全長ＨＡを認識し得る抗体を誘導することを示す（図５Ｂ参照）。免疫化に対する免疫学的応答をさらに理解するため、競合結合ＥＬＩＳＡを実施した。この目的のため、プレート結合全長ＨＡを段階希釈された血清試料とインキュベートし、その後に所定の力価測定濃度のＣＲ９１１４−ビオチンを添加する。さらなるインキュベーション後、当分野において周知のプロトコルに従ってストレプトアビン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｎ）コンジュゲートセイヨウワサビペルオキシダーゼを使用して結合したＣＲ９１１４−ビオチンの量を定量する。データは、「傾きＯＤ」（ΔＯＤ／１０倍希釈率）として表現されるｌｏｇ希釈率に対するＯＤの線形回帰を使用して分析する。データは、図５Ｂに実測される競合の上昇したレベルにより示されるとおり、広域中和抗体ＣＲ９１１４と結合について競合し得る抗体が本発明のポリペプチドによる免疫化により誘導されることを示す。比較として、未標識ＣＲ９１１４（すなわち、自己競合）および非結合モノクローナル抗体ＣＲ８０２０（両方とも、５μｇ／ｍｌの出発濃度から段階希釈）により誘導されたレベルを、別個のグラフに示す。
【０１７８】
まとめると、本発明者らは、本発明のポリペプチド）ｓ１２７Ｈ１（配列番号６６）による免疫化がマウスをインフルエンザによる致死感染から保護し得ることを示した。ポリペプチドは、免疫原性であり、全長ＨＡに結合し得る抗体を誘導し、それらの抗体の少なくとも一部は、モノクローナル抗体ＣＲ９１１４の広域中和エピトープのエピトープにおいて、またはその近くで結合する。
【０１７９】
実施例６
セット１およびセット２からの改善されたＣＲ６２６１結合剤の分析
どの配列が親配列の配列番号６と比較して増加したＣＲ６２６１結合をもたらし得るかをさらに理解するため、表４および５に列記の配列をさらに分析した。この目的のため、それぞれの標的化位置について、改善された結合剤のセット中に存在する変異アミノ酸のそれぞれの相対頻度を計算し、変異アミノ酸のいずれについても優先性が存在しない場合に予測される頻度と比較した（それぞれ、セット１および２の配列について図６および８参照）。データは、改善されたＣＲ６２６１結合を示す配列中のある位置において一部のアミノ酸がより高頻度であることを示す。
【０１８０】
セット１および２の両方において、改善された結合を有する配列中の４０２位（番号付与は配列番号１を指す）におけるＭｅｔについて高い出現度が実測されるが、セット１においてはＶａｌも一部の場合において実測される。同様に、３５２位においては芳香族アミノ酸ＰｈｅおよびＴｙｒの高い出現度、４１６位においてはＳｅｒの増加した出現度（しかし、セット１においてはそれほど強くない）、３３７位についてはＬｙｓの増加した出現度が両方のセットにおいて実測される。４１６位におけるＳｅｒは、推定Ｎ−グリコシル化部位をＡｓｎ４１４において導入することに留意すべきである。さらに、３４０位において、Ａｓｎがセット２における改善されたＣＲ６２６１結合剤中で高度に高頻度である一方、セット１においてＴｈｒがより高頻度であり；両方の突然変異は、推定グリコシル化部位を３４０位において導入し：Ａｓｎは、推定Ｎ−グリコシル化部位をもたらす一方、Ｔｈｒは、推定Ｏ−グリコシル化部位をもたらす。３５３位においては、Ｔｈｒがセット１からの改善された結合剤中で高度に高頻度である一方、セット２からの改善された結合剤中ではＶａｌが最も高頻度であるアミノ酸である。４０６および４０９位においては、改善されたＣＲ６２６１結合剤中で最も高頻度であるアミノ酸は疎水性であり：４０６位においては、ＩｌｅおよびＰｈｅ（セット１）ならびにＰｈｅおよびＬｅｕ（セット２）が最も高頻度であり、４０９位においては、ＩｌｅおよびＶａｌ（セット１）ならびにＰｈｅおよびＩｌｅ（セット２）が最も高頻度である。最後に、４１３位においては、セット１からの改善されたＣＲ６２６１結合剤のうちＰｈｅが最も高頻度なアミノ酸である一方、セット２からの改善された結合剤のうちＧｌｕが最も高頻度である。
【０１８１】
改善されたＣＲ６２６１結合剤の配列を分析してアミノ酸の一部の組合せが改善されたＣＲ６２６１結合剤のうち他の組合せよりも高頻度であるか否かをさらに決定した。この目的のため、アミノ酸の特定の組合せを含有する改善された結合剤配列の数をカウントし、図７Ａ、Ｂ（セット１からの改善された結合剤）および図９Ａ、Ｂ（セット２）に示されるとおりプロットした。このデータを、ポリペプチドの突然変異体セットにおいて対処される異なる区域、すなわち、融合ペプチドの区域（残基番号３３７、３４０、３５２および３５３；それぞれセット１および２からの改善された結合剤については図７Ａおよび９Ａ）およびＢループ（残基番号４０６、４０９、４１３および４１６；図７Ｂおよび９Ｂ）に従って体系化した。４０２位におけるＭｅｔの極めて高度な出現度の観点から、この位置を分析に含めずに高頻度で生じる組合せを検出した。それというのも、他の位置と４０２位とのほぼ全ての組合せがＭｅｔを含有するためである。
【０１８２】
セット１からの改善されたＣＲ６２６１結合剤のうち、３５２位におけるＰｈｅまたはＴｙｒのいずれかと、３５３位におけるＩｌｅまたはＴｈｒとの組合せが最も高頻度である（図７Ａにおける枠の区域）。Ｂループ区域中のアミノ酸の組合せに関して、４０６位におけるＩｌｅと、４１３位におけるＰｈｅまたはＴｙｒ（すなわち、芳香族アミノ酸）のいずれかとの組合せ、および４０６位におけるＴｙｒと４１３位におけるＮとの組合せが、改善されたＣＲ６２６１結合剤のうちで増加した出現度を示す（図７Ｂにおける枠の区域）。
【０１８３】
融合ペプチド区域にフォーカスするセット２からのポリペプチドのうち改善されたＣＲ６２６１結合剤の配列の分析のため、３５２位におけるＰｈｅまたはＴｙｒのいずれかを含有する配列のみを考慮した。３５２位におけるＰｈｅまたはＴｙｒを有する改善されたＣＲ６２６１結合剤のうち、３４０位におけるＡｓｎを有する配列が最も高頻度である（図９Ａにおける枠の区域参照）。４０６位におけるＰｈｅ、ＬｅｕまたはＴｙｒのいずれかを有するＢループ区域配列については、４１３位におけるＧｌｕ、ＭｅｔまたはＶａｌのいずれかとの組合せ（図９Ｂにおける枠の区域）が改善されたＣＲ６２６１結合剤のうち最も高頻度である。
【０１８４】
まとめると、分析は、融合ペプチド区域中で、特に３５２位における芳香族残基（ＰｈｅまたはＴｙｒ）との組合せにおける３５３位におけるＴｈｒの導入が、本発明の可溶性ポリペプチドへのＣＲ６２６１の結合を改善し得ることを示す。さらに、３３７位におけるＬｙｓまたは３４０位におけるＡｓｎの導入による推定Ｎ−グリコシル化部位の導入も、改善されたＣＲ６２６１の結合に寄与し得る。Ｂループ区域中では、大型疎水性残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＬｅｕまたはＩｌｅ）が改善されたＣＲ６２６１の結合に寄与し得る。特に、４０６位におけるＰｈｅ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒと、４１３位におけるＧｌｕ、Ｍｅｔ、またはＶａｌのいずれかとの組合せがＣＲ６２６１の結合を改善し得る。記載位置におけるこれらの残基を含む本発明のポリペプチドは、本発明の好ましい実施形態である。
【０１８５】
【表２】
0006643981.tif 000007
【０１８６】
【表３】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【化１４】
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【０１８７】
【表４】
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【０１８８】
【表５】
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【０１８９】
【表６】
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【０１９０】
【表７】
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【０１９１】
【表８】
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【０１９２】
【表９】
0006643981.tif 000024
【０１９３】
【表１０】
0006643981.tif 000025
【０１９４】
表９．本発明のポリペプチドおよびＣＲ６２６１およびＣＲ９１１４のＦａｂ断片とのそれらの複合体のＳＥＣ−ＭＡＬＳにより測定された分子量。理論（理論）値は、本発明のポリペプチドの配列（モノマーを想定）および付着グリカンの約１０ｋＤａの追加の寄与に基づき推定する。ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４およびＣＲ８０２０のＦａｂ断片の分子量もＳＥＣ−ＭＡＬＳにより測定し、それぞれ４８、４９および４７ｋＤａであった。
【０１９５】
【表１１】
0006643981.tif 000026
以下の態様を包含し得る。
［１］  （ａ）ＨＡ１ドメインのｙ位からＣ末端アミノ酸（そのアミノ酸を含む）のアミノ酸を含むＨＡ１Ｃ末端ステムセグメントに０〜５０アミノ酸残基の結合配列により共有結合しているＨＡ１ドメインの１位からｘ位、好ましくは、ｐ位からｘ位のアミノ酸を含むＨＡ１Ｎ末端ステムセグメントを含むインフルエンザヘマグルチニンＨＡ１ドメインおよび（ｂ）インフルエンザヘマグルチニンＨＡ２ドメインを含むインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ステムドメインポリペプチドであって、ＨＡ１およびＨＡ２間の連結部におけるプロテアーゼ開裂に耐性であり、３３７、３４０、３５２、３５３、４０２、４０６、４０９、４１３および／または４１６位における１つ以上のアミノ酸が、野生型インフルエンザＨＡ中の対応する位置と比較して突然変異しているインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ステムドメインポリペプチド。
［２］  前記ＨＡ１およびＨＡ２ドメインが、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（配列番号１）に由来する、上記［１］に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド。
［３］  ｘが５２であり、ｙ＝３２１およびｐ＝１８である、上記［１］または［２］に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド。
［４］  前記ＨＡ２ドメインの５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２６、５２８、５２９、または５３０位（またはそれらの相当物）から前記ＨＡ２ドメインのＣ末端のアミノ酸配列が除去されている、上記［１］〜［３］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド。
［５］  ３３７位上の前記突然変異アミノ酸が、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
３４０位上の前記突然変異アミノ酸が、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
３５２位上の前記突然変異アミノ酸が、Ｄ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
３５３位上の前記突然変異アミノ酸が、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
４０２位上の前記突然変異アミノ酸が、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｒ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
４０６位上の前記突然変異アミノ酸が、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
４０９位上の前記突然変異アミノ酸が、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
４１３位上の前記突然変異アミノ酸が、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
４１６位上の前記突然変異アミノ酸が、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である、
上記［１］〜［４］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド。
［６］  アミノ酸配列：
【化１４−２】
0006643981.tif 000027
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｒ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である、
上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド。
［７］  アミノ酸配列
【化１４−３】
0006643981.tif 000028
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｒ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、Ｍ、およびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である、
上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド。
［８］  アミノ酸配列：
【化１４−４】
0006643981.tif 000029
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｒ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、ＭおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である、
上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド。
［９］  アミノ酸配列：
【化１４−５】
0006643981.tif 000030
を含み、
Ｘ１は、Ｅ、Ｉ、Ｋ、Ｖ、Ａ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ２は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｆ、Ｎ、ＳおよびＹからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ３は、Ｄ、Ｆ、Ｖ、Ｙ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ４は、Ｉ、Ｋ、Ｒ、Ｔ、Ｅ、ＧおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ５は、Ｅ、Ｋ、Ｍ、Ｖ、Ｒ、およびＴからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ６は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｈ、およびＬからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ７は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｆ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ８は、Ｆ、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、ＭおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘ９は、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｎ、Ｒ、およびＳからなる群から選択されるアミノ酸である、
上記［１］〜［５］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド。
［１０］  配列番号５５〜７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］〜［９］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド。
［１１］  配列番号５５、配列番号６６および配列番号７３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］〜［１０］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド。
［１２］  上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
［１３］  上記［１２］に記載の核酸分子を含むベクター。
［１４］  上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のポリペプチド、および／または上記［１２］に記載の核酸分子および／または上記［１３］に記載のベクターを含む組成物。
［１５］  医薬品として使用され、特にワクチンとして使用される、上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド、上記［１２］に記載の核酸、および／または上記［１４］に記載の組成物。
［１６］  インフルエンザＨＡタンパク質に対する免疫応答の誘導において使用される、上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド、上記［１２］に記載の核酸分子、および／または上記［１４］に記載の組成物。
［１７］  インフルエンザ感染の予防および／または治療において使用される、上記［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡステムドメインポリペプチド、上記［１２］に記載の核酸分子、および／または上記［１４］に記載の組成物。
【０１９６】
参考文献
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Ｓｔｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ３１２：４０４
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Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２８９：３６６
【０１９７】
配列番号１：Ｈ１全長（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）
【化１５】
0006643981.tif 000031
配列番号２：Ｈ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４
【化１６】
0006643981.tif 000032
配列番号３：ｆｏｌｄｏｎ
【化１７】
0006643981.tif 000033
配列番号４：ＦＬＡＧ−トロンビン−ｆｏｌｄｏｎ−ＨＩＳ
【化１８】
0006643981.tif 000034
配列番号５：
【化１９】
0006643981.tif 000035
配列番号６：リーダー配列を有さず、ＦＬＡＧ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｆｏｌｄｏｎ−ＨＩＳを有するＨ１−ｍｉｎｉ２−ｃｌｕｓｔｅｒ１＋５＋６−ＧＣＮ４
【化２０】
0006643981.tif 000036
配列番号７：
【化２１】
0006643981.tif 000037
配列番号８：Ｈ１コンセンサス配列残基４０２〜４１８（配列番号１による番号付与）
【化２２】
0006643981.tif 000038
＞ＳＣ０９−１１４  ＶＨタンパク質（配列番号１１）
【化２３】
0006643981.tif 000039
＞ＳＣ０９−１１４  ＶＬタンパク質（配列番号１２）
【化２４】
0006643981.tif 000040
＞ＣＲ６２６１  ＶＨタンパク質（配列番号９）
【化２５】
0006643981.tif 000041
＞ＣＲ６２６１  ＶＬタンパク質（配列番号１０）
【化２６】
0006643981.tif 000042
＞ＳＣ０８−０５７  ＶＨタンパク質（配列番号１３）
【化２７】
0006643981.tif 000043
＞ＳＣ０８−０５７  ＶＬタンパク質（配列番号１４）
【化２８】
0006643981.tif 000044
＞ＳＣ０８−０２０  ＶＨタンパク質（配列番号１７）
【化２９】
0006643981.tif 000045
＞ＳＣ０８−０２０  ＶＬタンパク質（配列番号１８）
【化３０】
0006643981.tif 000046
配列番号５５：１２７Ｈ１
【化３１】
0006643981.tif 000047
配列番号５６：８６Ｂ４
【化３２】
0006643981.tif 000048
配列番号５９：５５Ｇ７
【化３３】
0006643981.tif 000049
配列番号５７：７４Ｈ９
【化３４】
0006643981.tif 000050
配列番号６０：１１５Ａ１
【化３５】
0006643981.tif 000051
配列番号６１：７１Ｈ２
【化３６】
0006643981.tif 000052
配列番号６２：１８１Ｈ９
【化３７】
0006643981.tif 000053
配列番号５８：６Ｅ１２
【化３８】
0006643981.tif 000054
配列番号６３：２２０Ｃ９
【化３９】
0006643981.tif 000055
配列番号６４：１１３Ｅ７
【化４０】
0006643981.tif 000056
配列番号６５：ｓ７４Ｈ９
【化４１】
0006643981.tif 000057
配列番号６６：ｓ１２７Ｈ１
【化４２】
0006643981.tif 000058
配列番号６７：ｓ８６Ｂ４
【化４３】
0006643981.tif 000059
配列番号６８：ｓ５５Ｇ７
【化４４】
0006643981.tif 000060
配列番号６９：ｓ６Ｅ１２
【化４５】
0006643981.tif 000061
配列番号７２：ｓ７４Ｈ９長鎖
【化４６】
0006643981.tif 000062
配列番号７３：ｓ１２７Ｈ１長鎖
【化４７】
0006643981.tif 000063
配列番号７４：ｓ８６Ｂ４長鎖
【化４８】
0006643981.tif 000064
配列番号７５：ｓ５５Ｇ７長鎖
【化４９】
0006643981.tif 000065
配列番号７６：ｓ６Ｅ１２長鎖
【化５０】
0006643981.tif 000066
【図１】
0006643981.tif 000067
【図２Ａ−１】
0006643981.tif 000068
【図２Ａ−２】
0006643981.tif 000069
【図２Ｂ−１】
0006643981.tif 000070
【図２Ｂ−２】
0006643981.tif 000071
【図２Ｃ−１】
0006643981.tif 000072
【図２Ｃ−２】
0006643981.tif 000073
【図２Ｄ−１】
0006643981.tif 000074
【図２Ｄ−２】
0006643981.tif 000075
【図２Ｅ−１】
0006643981.tif 000076
【図２Ｅ−２】
0006643981.tif 000077
【図３Ａ】
0006643981.tif 000078
【図３Ｂ】
0006643981.tif 000079
【図３Ｃ】
0006643981.tif 000080
【図３Ｄ】
0006643981.tif 000081
【図３Ｅ】
0006643981.tif 000082
【図４Ａ】
0006643981.tif 000083
【図４Ｂ】
0006643981.tif 000084
【図５Ａ】
0006643981.tif 000085
【図５Ｂ】
0006643981.tif 000086
【図６】
0006643981.tif 000087
【図７Ａ】
0006643981.tif 000088
【図７Ｂ】
0006643981.tif 000089
【図８】
0006643981.tif 000090
【図９Ａ】
0006643981.tif 000091
【図９Ｂ】
0006643981.tif 000092
【配列表】
0006643981000001.xml