(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便又は腸内容物の分析方法であって、アミノ酸のうちの少なくとも１のアミノ酸のＤ体及び／又はＬ体の量を測定する工程、
前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の量に基づき腎障害の病態指標値を算出する工程、
を含む、分析方法。
【請求項２】
前記腎障害の病態指標値が、前記少なくとも１のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の合計量である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記腎障害の病態指標値が、前記少なくとも１のアミノ酸のＤ体及びＬ体の量の和に対するＤ体の量の比、Ｄ体の量に対するＬ体の量の比、又はＬ体の量に対するＤ体の量の比である、請求項１に記載の分析方法。
【請求項４】
前記少なくとも１のアミノ酸が、セリン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸、アロスレオニン、アラニン、プロリン、メチオニン、バリン、アロイソロイシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、リジン、及びチロシンからなる群から選ばれる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分析方法。
【請求項５】
前記少なくとも１のアミノ酸が、ヒスチジン、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸、アロスレオニン、アラニン、プロリン、メチオニン、バリン、アロイソロイシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、リジン、及びチロシンからなる群から選ばれる場合、腎障害が慢性腎障害である、請求項４に記載の分析方法。
【請求項６】
前記少なくとも１のアミノ酸が、ヒスチジン、アロスレオニン、及びリジンからなる群から選ばれる、請求項５に記載の分析方法。
【請求項７】
前記少なくとも１のアミノ酸が、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、リジン、アルギニン及びプロリンからなる群から選ばれる場合、腎障害が腎障害急性期又は虚血を原因とする腎障害である、請求項４に記載の分析方法。
【請求項８】
記憶部と、入力部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含む、被検体の糞便又は腸内容物の試料分析システムであって、
前記記憶部は、入力部から入力された腎障害と判別する病態指標値の閾値を記憶し、
前記分析測定部は、前記被検体の糞便又は腸内容物中のアミノ酸のうちの少なくとも１のアミノ酸のアミノ酸立体異性体を分離し定量し、
前記データ処理部は、前記少なくとも１のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の量に基づき腎障害の病態指標値を算出し、
前記データ処理部は、記憶部に記憶された閾値と比較することにより、腎障害を判別し、
前記病態情報出力部が被検体の腎障害についての病態情報を出力する、前記試料分析システム。
【請求項９】
前記腎障害の病態指標値が、前記少なくとも１のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の合計量である、請求項８に記載の試料分析システム。
【請求項１０】
前記腎障害の病態指標値が、前記少なくとも１のアミノ酸のＤ体及びＬ体の量の和に対するＤ体の量の比、Ｄ体の量に対するＬ体の量の比、又はＬ体の量に対するＤ体の量の比である、請求項８に記載の試料分析システム。
【請求項１１】
前記少なくとも１のアミノ酸が、セリン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸、アロスレオニン、アラニン、プロリン、メチオニン、バリン、アロイソロイシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、リジン、及びチロシンからなる群から選ばれる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の試料分析システム。
【請求項１２】
前記少なくとも１のアミノ酸が、ヒスチジン、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸、アロスレオニン、アラニン、プロリン、メチオニン、バリン、アロイソロイシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、リジン、及びチロシンからなる群から選ばれる場合、腎障害が慢性腎障害である、請求項１１に記載の試料分析システム。
【請求項１３】
前記少なくとも１のアミノ酸が、ヒスチジン、アロスレオニン、及びリジンからなる群から選ばれる、請求項１２に記載の試料分析システム。
【請求項１４】
前記少なくとも１のアミノ酸が、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、アルギニン、リジン及びプロリンからなる群から選ばれる場合、腎障害が腎障害急性期又は虚血を原因とする腎障害である、請求項１１に記載の試料分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糞便又は腸内容物からＤ体及びＬ体のアミノ酸量に基づき腎障害の病態指標値を算出する工程を含む分析方法、腎障害の検査方法、並びに腎障害についての病態情報を出力する試料分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、血液からの老廃物や余分な水分を濾過し、尿として排出することで、体液の恒常性を維持することを主な役割とする臓器である。腎臓は、免疫系の異常や薬に対するアレルギー、高血圧、糖尿病、出血や急激な血圧低下、感染症、熱傷に伴う脱水などの要因により障害を受け、腎機能が低下する。腎障害により腎機能が約６０％以下に低下した場合に腎不全と呼び、腎機能低下の進行速度の違いにより、急性腎不全（ＡＫＩ）と慢性腎不全（ＣＫＤ）に大別される。
【０００３】
急性腎不全（ＡＫＩ）は、発症までの期間として数時間から数週間である腎不全をいう。急性腎不全は、虚血、薬剤、エンドトキシンショックなどの原因によって腎機能が急激に低下した状態であり、体内代謝産物である尿素窒素やクレアチニンの血中濃度上昇、電解質代謝の異常及びアシド-シスなどの症状が認められ、一般に血清クレアチニン値の急上昇により急性腎不全と診断される。急性腎不全は、治療により回復が期待されるため、より早期の急性腎不全を判別できる診断マーカーの開発が望まれている。しかしながら、一般に用いられている血清中クレアチニン濃度は、年齢、性別、筋肉量及び服用する医薬等の条件により変動するので、特異的な診断マーカーとはいえず（非特許文献１）、また好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）、腎障害分子（ＫＩＭ−１）、肝脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰｓ）、シスタチンＣ等のタンパク質と、ホモバニリン酸硫酸、トリメチルアミン−Ｎ−オキシド等の代謝低分子化合物などが報告されているが、より早くより正確に病態を検出できる診断マーカーの開発が期待されている。
【０００４】
慢性腎不全（ＣＫＤ）は、各種腎障害により、糸球体濾過量で表される腎機能の低下があるか、もしくは腎臓の障害を示唆する所見が慢性的（３カ月以上）に持続する腎不全をいう。慢性腎不全は、日本国の成人人口の約１３％に相当する１，３３０万人が罹患する疾患で、末期腎不全（ＥＳＫＤ）に至るリスクが高く、国民の健康を脅かしている。慢性腎不全に有効な治療法はなく、慢性腎不全が進行して腎機能低下が進むと尿毒症の危険があり、人工透析や腎移植が必要となり、医療経済上大きな負担となる（非特許文献２）。慢性腎不全は、自覚症状がないまま病状が進行するため、慢性腎不全の早期発見及び進行抑制のためには、腎不全の早期診断マーカーによる診断が必要である。しかし、糸球体濾過量で表される腎機能の変化が起こるより早い時期から腎障害の進行を正確に反映する診断マーカーとして満足できるものは、現在の所いまだ存在しない。
【０００５】
急性腎不全のみならず慢性腎不全の場合であっても、早期の診断マーカーが得られていない理由として、腎臓が障害を受けた場合であっても、腎機能がある程度、例えば３０％程度損なわれるまでは、障害を受けていない糸球体が通常以上に働くことで、十分な腎機能（すなわち、血液からの老廃物や余分な水分を濾過機能）を発揮できることが考えられる。例えば尿へと排出される老廃物であるクレアチニンや尿素窒素（ＢＵＮ）は、腎不全マーカーの一つであるが、腎機能がある程度失われるまでは、正常に尿に排出されることで、血中のクレアチニン値やＢＵＮ値は増加することはない。近年開発されたＮＧＡＬやＫＩＭ−１などは、炎症細胞により発現されるタンパク質であるため、診断マーカーとして期待されているが、上述の通り満足できるマーカーは未だ存在していない。
【０００６】
従来、哺乳類の生体には存在しないと考えられていたＤ-アミノ酸が、様々な組織において存在することが明らかにされてきており、何らかの生理機能を担うことが予測されていた。また、血清中のＤ−アミノ酸のうち、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、Ｄ−プロリン、Ｄ−セリン、Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−アスパラギン酸の濃度が、腎不全の診断マーカーとして機能しうることが示されてきている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。さらに、Ｄ−セリン、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アラニン、Ｄ−アスパラギン、Ｄ−アロ-スレオニン、Ｄ−グルタミン、Ｄ−プロリン及びＤ−フェニルアラニンからなるグループから選択される１種類又は２種類以上のアミノ酸が、腎臓病の病態指標値とすることができることが開示されており（特許文献１）、この文献では、試料に用いられる生物学的材料として、血液、血漿、尿などの体液と、糞便、汗、鼻汁等の排泄物、体毛、爪、皮膚組織、内臓組織などの体組織を挙げているが、実際に糞便中のＤ体のアミノ酸を診断マーカーとして用いたことについては、何ら示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１４０７８５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｌｏｃｕｍ，  Ｊ．  Ｌ．ら、Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ．  １５９：２７７  （２０１２）
【非特許文献２】ＫＤＩＧＯ  ２０１２  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  １  （２０１３）
【非特許文献３】Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  １８：  １１３０（１９９５）
【非特許文献４】Ｎａｇａｔａ．Ｙ  Ｖｉｖａ  Ｏｒｉｇｉｎｏ  Ｖｏｌ．１８（Ｎｏ．２）  （１９９０）第１５回学術講演会講演要旨集
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｄａら、北里医学  ２３：５１〜６２  （１９９３）
【非特許文献６】Ｙｏｎｇ  Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｕｌｌ．  ２１：（２）１５６-１６２（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
糸球体濾過量及び血清中クレアチニン濃度などの既存の腎不全の診断マーカーより早期から変動する腎不全の診断マーカーを同定し分析する技術、並びにそれにより、初期の腎不全を正確に判定、検査又は診断する技術の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、初期の腎不全を再現することができる早期腎障害の実験動物モデルを用いて、腎不全の早期診断マーカーを探索した。具体的には、腎動脈・静脈クリッピングを行い、虚血性腎障害をマウスに誘導した。この虚血性腎障害誘導マウスの腎臓組織において炎症が生じていることを確認できる一方で（図１及び２）、慣用される腎障害の診断マーカーの一つである血清クレアチニン濃度、ＫＩＭ−１やＮＧＡＬが変化しない軽度腎障害動物モデルを作成した。このような軽度の腎障害動物モデルにおいて、糞便中のＤ−アミノ酸が変化していることを見出した（図３及び４）。このようにして見出された糞便中のＤ−アミノ酸の変化が、腎障害と関与していることを確認し、本発明に至った。
【００１１】
さらに、本発明者らは、慢性腎不全患者群及び健常者群において、糞便中のアミノ酸についてＤ体及びＬ体を分けて計測したところ、健常者群に比較して慢性腎不全患者群では幾つかのキラルアミノ酸が有意に変動することを見いだし、本発明に至った。
【００１２】
したがって、本発明は糞便又は腸内容物の分析方法であって、
少なくとも１のアミノ酸のＤ体及び／又はＬ体の量を測定する工程、
前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の量に基づき腎障害の病態指標値を算出する工程、
を含む、分析方法に関する。
【００１３】
本発明の別の態様では、糞便又は腸内容物を試料とする腎障害の検査方法であって、
少なくとも１のアミノ酸のＤ体及び／又はＬ体の量を測定する工程、
前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の量に基づき腎障害の病態指標値を算出する工程、
腎障害の病態指標値と、腎障害の病態とを関連づける工程
をさらに含む、前記検査方法に関する。かかる検査方法は、予め決められた病態指標値の閾値に基づいて腎障害の病態を決定することができる。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明の分析方法を実施することができる試料分析システムに関する。このような試料分析システムは、記憶部と、入力部と、分析測定部と、データ処理部と、病態情報出力部とを含んでおり、糞便又は腸内容物の試料を分析し、病態情報を出力することができる。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明の試料分析システムにインストールされうるプログラム及び当該プログラムを格納する記憶媒体にも関する。
【発明の効果】
【００１６】
糞便又は腸内容物を試料とし、試料中のＤ−アミノ酸量、Ｌ体の量、又はＤ−アミノ酸量及びＬ−アミノ酸量に基づき算出された病態指標値は、血中クレアチニン等の既知の腎不全マーカーとは異なる作用機構により腎不全を検出できる。それにより、血中クレアチニンなどの既知マーカーよりも早期の腎不全を検出できる診断マーカーとして用いることができる可能性がある。また、試料として用いられる糞便又は腸内容物は、非侵襲的に、容易に取得できる。このように早期の腎不全を検出できる診断マーカーであること、及び容易に取得可能な試料であることから、診断において本発明の分析方法を採用することで、腎不全及び/又は腎障害の早期発見が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、腎障害誘導群のマウスの腎臓に対しＰＡＭ染色をすることにより、壊死細胞を染色して示す写真である。図１Ｂは、図１Ａの図において壊死細胞の割合を測定し、対照群と比較したグラフである。
【図２】図２Ａは、腎障害誘導群のマウスの腎臓に対しＦ４／８０染色をすることにより、炎症細胞（マクロファージ及び単球）を染色して示す写真である。図２Ｂは、図２Ａの図において炎症細胞の割合を測定し、対照群と比較したグラフである。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａは、対照群（Ｓｈａｍ）のマウスと、腎障害誘導後２日目及び１０日目のマウスから採取された糞便中のＤアミノ酸＋Ｌアミノ酸の変動を示すグラフである。図３Ｂは、対照群のマウスと、腎障害誘導後２日目及び１０日目のマウスから採取された糞便中のＤアミノ酸の変動を示すグラフである。
【図３Ｃ−Ｄ】図３Ｃは、対照群（Ｓｈａｍ）のマウスと、腎障害誘導後２日目及び１０日目のマウスから採取された糞便中のＬアミノ酸の変動を示すグラフである。図３Ｄは、対照群のマウスと、腎障害誘導後２日目及び１０日目のマウスから採取された糞便中のＤアミノ酸／Ｌアミノ酸の比の変動を示すグラフである。
【図３Ｅ】図３Ｅは、対照群（Ｓｈａｍ）のマウスと、腎障害誘導後２日目及び１０日目のマウスから採取された糞便中のＤアミノ酸／（Ｄアミノ酸＋Ｌアミノ酸）の比の変動を示すグラフである。
【図３Ｆ】図３Ｆは、図３Ａ〜３Ｅに示したデータ間の統計的有意差の評価結果である。表中「＜ＬＯＱ」は定量限界以下であることを表す。
【図４】図４は、対照群（Ｓｈａｍ）のマウスと、腎障害誘導後２日目及び１０日目のマウスから採取された糞便中の、セリン、アルギニン、及びアラニンについての（Ａ）Ｄアミノ酸、（Ｂ）Ｄアミノ酸／Ｌアミノ酸比、及び（Ｃ）Ｄアミノ酸／（Ｄアミノ酸＋Ｌアミノ酸）の比の変動を示すグラフである。また血清中のＤセリン、Ｄアルギニン、及びＤアラニンの変動を示した（Ｄ）。
【図５】図５Ａは、腎障害誘導マウスにおいて、野生群、無菌群、及び植菌群のマウスの腎臓に対しＰＡＭ染色をすることにより、壊死細胞を比較して示す写真である。図５Ｂは、図５Ａの図において壊死細胞の割合を測定し、比較したグラフである。
【図６】図６Ａは、腎障害誘導マウスにおいて、野生群、無菌群、及び植菌群のマウスの腎臓に対しＦ４／８０染色をすることにより、炎症細胞（マクロファージ及び単球）を比較して示す写真である。図６Ｂは、図６Ａの図において炎症細胞の割合を測定し、比較したグラフである。
【図７】図７Ａは、腎障害誘導群のマウスの２日目及び１０日目における腸内細菌叢のＤＮＡを断片化後電気泳動した図である。図７Ｂは、腎障害誘導群のマウスの術後２日目及び１０日目における腸内細菌の種類及び数を比較した図である。
【図８】図８は、本発明の試料分析システムの構成図である。
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ−Ｂは、病態指標値を決定するための動作の例を示すフローチャートである。
【図９Ｃ−Ｄ】図９Ｃ−Ｄは、病態指標値及び又は病態情報を決定するための動作の例を示すフローチャートである。
【図１０Ａ−Ｂ】図１０Ａは、健常者と、慢性腎障害患者から採取された糞便中のＤアミノ酸＋Ｌアミノ酸（総アミノ酸）の量を示すグラフである。図１０Ｂは、健常者と、慢性腎障害患者から採取された糞便中のＬアミノ酸の量を示すグラフである。
【図１０Ｃ−Ｄ】図１０Ｃは、健常者と、慢性腎障害患者から採取された糞便中のＤアミノ酸の量を示すグラフである。図１０Ｄは、健常者と、慢性腎障害患者から採取された糞便中のＤアミノ酸／Ｌアミノ酸の比を示すグラフである。
【図１１】図１１は、慢性腎障害患者における推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）と、糞便中の各アミノ酸との量との相関関係を調べた表である。相関係数が、０．７超の場合高い相関ということができ、０．４〜０．７の場合に相関があるということができ、０．２〜０．４の場合に低い相関があるということができる
【図１２】図１２は、Ｌ−Ｌｙｓ量についての、慢性腎障害患者と健常者における量を示すグラフ（Ａ）、慢性腎障害患者と健常者におけるＲＯＣ曲線を示すグラフ（Ｂ）、慢性腎障害患者における推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）とＬ−Ｌｙｓ量との散布図（Ｃ）、及び慢性腎障害患者における血清クレアチニンとＬ−Ｌｙｓ量との散布図（Ｄ）を示す。
【図１３】図１３は、Ｄ−Ｌｙｓ量についての、慢性腎障害患者と健常者における量を示すグラフ（Ａ）、慢性腎障害患者と健常者におけるＲＯＣ曲線を示すグラフ（Ｂ）、慢性腎障害患者における推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）とＤ−Ｌｙｓ量との散布図（Ｃ）、及び慢性腎障害患者における血清クレアチニンとＤ−Ｌｙｓ量との散布図（Ｄ）を示す。
【図１４】図１４は、Ｄ−Ｌｙｓ／Ｌ−Ｌｙｓ比についての、慢性腎障害患者と健常者における量を示すグラフ（Ａ）、慢性腎障害患者と健常者におけるＲＯＣ曲線を示すグラフ（Ｂ）、慢性腎障害患者における推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）とＤ−Ｌｙｓ／Ｌ−Ｌｙｓ比との散布図（Ｃ）、及び慢性腎障害患者における血清クレアチニンとＤ−Ｌｙｓ／Ｌ−Ｌｙｓ比との散布図（Ｄ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係る糞便又は腸内容物の分析方法は、以下の：
少なくとも１のアミノ酸のＤ体及び／又はＬ体の量を測定する工程、
前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の量に基づき腎障害の病態指標値を算出する工程、
を含む。当該分析方法は、医師が診断を行うためのデータの提供を行うことができ、診断の予備的方法ということもできる。この分析方法は、腎障害の病態指標値と、腎障害の病態とを関連づける工程をさらに含んでいてもよい。このような分析方法は、分析会社や分析技術者により行われて、腎障害の病態と関連づけられた結果が提供されてもよい。
【００１９】
本発明において分析される試料は、糞便又は腸内容物である。したがって、排出された糞便であってもよいし、腸内に滞留している宿便であってもよい。腸内容物は、腸カテーテルにより採取することができ、糞便の他、腸内細菌叢を直接採取したものであってもよい。採取の簡便性や検査の容易性の観点から、検便により採取された糞便を試料として用いることが好ましい。採取された試料は、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ホウ酸ナトリウム水溶液、トリフルオロ酢酸などの溶媒中に溶解又は混合後、すぐに分析に供されてもよいし、常温下又は冷蔵下で貯蔵後に分析に供されてもよい。試料は、溶媒に溶解後、１回又は複数回濾過及び/又は沈殿を行うことで、不溶物を取り除いた後に、分析に供されてもよい。試料に供した糞便又は腸内容物の質量を計測しておくことで、単位試料質量あたりのアミノ酸量を計測することが可能になる。また、試料に供した糞便又は腸内容物の質量が計測できない場合には、試料を溶媒中に溶解後に、吸光度などを基準として、試料の量を一定にするようにさらに溶媒を加えて希釈することができる。試料の量を一定にして計測を行う場合、本発明におけるアミノ酸の量は、質量やモルで表されてもよいし、濃度で表されてもよい。
【００２０】
本発明において、腎不全マーカーとして用いられるアミノ酸は、立体異性体を有するアミノ酸である。より好ましくは、α−アミノ酸であり、さらにより好ましくはタンパク質構成アミノ酸である。かかるアミノ酸としては、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシンが挙げられる。ここで、不斉炭素を二つ有するイソロイシン、スレオニンについては、アロ体が存在することから、Ｌ−イソロイシンの立体異性体としては、Ｄ-イソロイシン、Ｄ−アロ-イソロイシン、及びＬ−アロ-イソロイシンが挙げられ、Ｌ−スレオニンの立体異性体としては、Ｄ−スレオニン、Ｄ−アロ-スレオニン、及びＬ−アロ-スレオニンが挙げられる。本明細書において、イソロイシン及びスレオニンについては、「Ｄ体」は、Ｄ体のアミノ酸の他、Ｄアロ体のアミノ酸、及びＬアロ体のアミノ酸から選択される１以上を用いるものとする。これらのアミノ酸のうちの少なくとも１のアミノ酸について、Ｄ体アミノ酸の量、Ｌ体アミノ酸の量、又はＤ体及びＬ体アミノ酸の量を測定し、測定値に基づき腎障害の病態指標値を算出することができる。アミノ酸は１つであってもよいし、複数、例えば２〜１９のアミノ酸の組合せであってもよい。感度の高い病態指標値を得る観点から、アミノ酸は、セリン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、及びプロリンからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を用いることが好ましく、セリン、アルギニン、及びアラニンからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を用いることが好ましい。上述のアミノ酸は、早期腎障害の実験動物モデルを用いて選択されたアミノ酸であり、ヒトにおいても早期の腎障害のマーカーとなりうる。さらに別の態様では、ヒトの腎障害、特に慢性腎障害において感度の高い病態指標値を得る観点から、ヒスチジン、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸、アロスレオニン、アラニン、プロリン、メチオニン、バリン、アロイソロイシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、リジン、及びチロシンからなる群から選ばれる少なくとも１のアミノ酸を用いることが好ましい。ヒトの腎障害、特に慢性腎障害において感度の高い病態指標値を得る観点から、ヒスチジン、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸、アロスレオニン、アラニン、プロリン、バリン、アロイソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、及びリジンがより好ましく、最も好ましくはヒスチジン、アロスレオニン、及びリジンが使用される。腎障害急性期又は虚血を原因とする腎障害の病態指標値を得る観点から、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、アルギニン、リジン及びプロリンが使用される。
【００２１】
本発明の一の態様では、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）との相関性の観点から、Ｄ＋Ｌ−ヒスチジン、Ｄ＋Ｌ−アロ−スレオニン、Ｄ＋Ｌ−アスパラギン、Ｄ＋Ｌ−アルギニン、Ｄ＋Ｌ−アロイソロイシン、Ｄ＋Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ＋Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ＋Ｌ−メチオニン、Ｄ＋Ｌ−バリン、Ｄ＋Ｌ−イソロイシン、Ｄ＋Ｌ−ロイシン、Ｄ＋Ｌ−リジン、Ｄ＋Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−リジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アロスレオニン、Ｄ−リジン、Ｄ−アロイソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ／Ｌ−ヒスチジン、Ｄ／Ｌ−リジン、Ｄ／Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ／Ｌ−アラニン、Ｄ／Ｌ−プロリン、Ｄ／Ｌ−バリン、及びＤ／Ｌ−フェニルアラニンからなる群から選ばれる少なくとも１を、病態指標値として用いることができる（|ｒ|＞０．２）。ｅＧＦＲとの相関性がより高い（|ｒ|＞０．４）という観点から、Ｄ＋Ｌ−ヒスチジン、Ｄ＋Ｌ−アロ−スレオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アロスレオニン、Ｄ−リジン、Ｄ／Ｌ−ヒスチジン、及びＤ／Ｌ−リジン、Ｄ＋Ｌ−アスパラギン、Ｄ＋Ｌ−アルギニン、Ｄ＋Ｌ−アロイソロイシン、及びＤ＋Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−リジン、Ｄ−アロイソロイシン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ／Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ／Ｌ−アラニン、Ｄ／Ｌ−プロリン、Ｄ／Ｌ−バリン、及びＤ／Ｌ−フェニルアラニンからなる群から選ばれる少なくとも１を、病態指標値として用いることがより好ましい。ｅＧＦＲとの相関性がより高い（|ｒ|＞０．７）という観点から、Ｄ＋Ｌ−ヒスチジン、Ｄ＋Ｌ−アロ−スレオニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、Ｄ−アロスレオニン、Ｄ−リジン、Ｄ／Ｌ−ヒスチジン、及びＤ／Ｌ−リジンからなる群から選ばれる少なくとも１を、病態指標値として用いることがさらにより好ましい。なお、本発明において、Ｄ＋Ｌ−アミノ酸は、アミノ酸のＤ体とＬ体の合計を意味し、Ｄ／Ｌ−アミノ酸は、Ｄ体とＬ体の比を意味する。
【００２２】
本発明における試料中のＤ−アミノ酸量の測定は、当業者に周知ないかなる方法を用いて実施しても構わない。例えば、予めｏ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−システイン（Ｂｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ）その他の修飾試薬で立体異性特異的にＤ−及びＬ−アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡのような分析カラムを用いて１００ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）とアセトニトリルの混液をグラジエント溶離して分離する方法が、アミノ酸のＤ−体及びＬ−体の同時測定に用いることができる。また、予め４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ−Ｆ）のような蛍光試薬でＤ−及びＬ−アミノ酸を誘導体化し、その後、ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡ、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８ＧＰ等のような分析カラムを用いて立体異性非特異的に各アミノ酸を分離した後、Ｐｉｒｋｌｅ型キラル固定相カラム（例えばＳｕｍｉｃｈｉｒａｌ  ＯＡ−２５００Ｓ又はＲ）を用いて光学分割する方法が、タンパク質を構成するアミノ酸の微量測定に用いることができる（浜瀬健司及び財津潔、分析化学、５３巻、６７７−６９０（２００４））。本明細書における光学分割カラム系は、少なくとも光学分割カラムを用いる分離分析系をいい、光学分割カラム以外の分析カラムによる分離分析を含む場合がある。より具体的に、光学異性体を有する成分を含む試料を、移動相としての第一の液体と共に、固定相としての第一のカラム充填剤に通じて、前記試料の前記成分を分離するステップ、前記試料の前記成分の各々をマルチループユニットにおいて個別に保持するステップ、前記マルチループユニットにおいて個別に保持された前記試料の前記成分の各々を、移動相としての第二の液体と共に、固定相としての光学活性中心を有する第二のカラム充填剤に流路を通じて供給し、前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を分割するステップ、及び前記試料の成分の各々に含まれる前記光学異性体を検出するステップを含むことを特徴とする光学異性体の分析方法を用いることにより、試料中のＤ-／Ｌ-アミノ酸濃度を測定することができる（特許第４２９１６２８号）。代替的には、アミノ酸の光学異性体を識別するモノクローナル抗体、例えばＤ−ロイシン、Ｄ−アスパラギン酸等に特異的に結合するモノクローナル抗体を用いる免疫学的手法によってＤ−アミノ酸を定量することができる（特願２００８−２７６５０明細書）。
【００２３】
本発明において、腎障害とは、腎臓に生じる障害の全てを指し、腎不全のみならず、腎不全には至っていない変化を含む。腎不全とは、腎機能が正常時より低下した状態であり、通常の意味で用いられる腎臓の障害の全てを含むものとする。限定されるものではないが、一般的に腎不全とは、腎機能が正常時の３０％を下回った状態をいい、急性腎不全と慢性腎不全に大別される。腎機能が低下する原因としては、免疫系の異常や薬に対するアレルギー、高血圧、糖尿病や、出血や急激な血圧低下、感染症、熱傷に伴う脱水など複数の因子があげられる。急性腎不全（ＡＫＩ）は、ＲＩＦＬＥ分類、ＡＫＩＮ分類、ＫＤＩＧＯ分類といった病期の分類が提唱されており、急性腎不全を、Ｒｉｓｋ（ステージ１）、Ｉｎｊｕｒｙ（ステージ２）、Ｆａｉｌｕｒｅ（ステージ３）、さらには持続期間に応じてＬｏｓｓとＥｎｄ  ｓｔａｇｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｄｉｓｅａｓｅに分類した。これらの分類は、どれも血清クレアチニンの量と尿量とを指標としており、例えばＲｉｓｋ（ステージ１）では、血清クレアチニンがベースラインから１．５〜２．０倍に上昇すること又は０．５ｍｌ/ｋｇ/時未満の尿量が６時間以上であること、Ｉｎｊｕｒｙ（ステージ２）では、血清クレアチニンがベースラインから２．０〜３．０倍に上昇すること又は０．５ｍｌ/ｋｇ/時未満の尿量が１２時間以上であること、Ｆａｉｌｕｒｅ（ステージ３）では、血清クレアチニンがベースラインから３．０倍以上に上昇すること又は０．３ｍｌ/ｋｇ/時未満の尿量が２４時間以上であることを判断基準としている。一方で、これらの分類は、他の指標、例えばＧＦＲの変化量を併用することでより正確に急性腎不全の分類を可能にする。慢性腎不全（ＣＫＤ）は、日本腎臓学会のガイドライン（２００９）で病期ステージ１（腎障害を有するが腎機能は正常、ｅＧＦＲ≧９０）〜ステージ５（腎不全、ｅＧＦＲ＜１５）の診断基準が示されている。ここで指標となっている推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）は血清クレアチニン値と年齢、性別より算出されるもので腎臓が老廃物を尿に排出する能力を示している。本発明の分析・検査方法では、これまでの腎機能マーカーよりも高感度で腎機能の低下を検出することが可能になる。したがって、従前のマーカーでは腎不全に分類されなかったようなより早期の腎障害のリスク群に分類することも可能になり、例えば、上述の原因のようなＡＫＩ、ＣＫＤの危険因子を有するが、血清クレアチニンやＧＦＲにおいて明確な変動の見られないリスク群においても腎機能の低下を検出することが可能になる。特に、早期腎障害の実験動物モデルを用いて選択されたアミノ酸については、ヒトにおいて、より早期の腎障害のマーカーとなりうる。
【００２４】
本発明において腎障害の病態指標値の算出は、アミノ酸のＤ体の量及び／又はＬ体の量に基づいて行われる。また別の態様では、アミノ酸のＤ体及びＬ体の量に基づいて病態指標値が算出されることができる。
【００２５】
本明細書において、病態指標値とは、個々のバイオマーカー分子の量であってもよいし、複数のバイオマーカーの量に基づいて計算可能な数値をいう。本明細書において用いられる病態指標値は、あるアミノ酸のＤ体の量であってもよいし、Ｌ体の量であってもよいし、あるアミノ酸とその立体異性体との量の比、例えば、あるアミノ酸のＬ体の量に対するＤ体の量の比と、あるアミノ酸のＤ体の量に対するＬ体の量の比と、Ｄ体及びＬ体の量の和に対するＤ体の量の比であってもよい。病態指標値として、あるアミノ酸の立体異性体との量比を用いた場合、試料の量や体積による補正が不要になるという利点がある。病態指標値の算出には、腎障害の診断マーカーとして用いられる限りにおいて、任意の定数や年齢、体重、性別、ＢＭＩ、ｅＧＦＲなど、キラルアミノ酸量に影響しうる任意の変数を加算、減算、積算、及び/又は除算してもよい。
【００２６】
本発明の分析方法及び検査方法では、予め健常者群及び腎障害の患者群において測定された病態指標値に基づいて決定された病態指標基準値に基づき、被検体の病態指標値と、腎障害の病態と関連づけることができる。当該病態指標基準値は、閾値であってもよい。当業者であれば、健常者群や腎不全患者群の病態指標値から、閾値を適宜設定することができる。閾値としては、例えば健常者群又は腎不全患者群の平均値、中央値、Ｘパーセンタイル値を使用することができるがこれらに限定されるものではない。ここでＸは任意の数値を選択することができ、３、５、１０、１５、２０、３０、４０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７を適宜使用することができる。閾値は１つであってもよいし、腎不全の種類（急性、慢性）や原因（例えば、薬剤性腎症、糖尿病性腎症、IgA腎症、膜性腎症、腎硬化症など）、状態（早期、中期、後期）、並びに使用するアミノ酸若しくはその組合せに応じて複数設定することもでき、重篤度に応じて病態を分類することもできる。予め設定された閾値と、被験者の病態指標値とを比較することにより、被験者の腎不全の病態を判定、決定又は診断することが可能になる。さらに別の態様では、健常者群と各ステージの腎障害の患者群との間でＲＯＣ解析を行うことで、閾値（カットオフ値）を決定することもできる。
【００２７】
本発明の別の態様では、本発明は、糞便又は腸内容物を試料とする腎障害の検査方法に関する。この検査方法は、以下の工程を含む：
タンパク質構成アミノ酸のうちの少なくとも１のアミノ酸のＤ体及び／又はＬ体の量を測定する工程、
前記少なくとも１種類のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の量に基づき腎障害の病態指標値を算出する工程、
腎障害の病態指標値と、腎障害の病態とを関連づける工程をさらに含む。本発明の検査方法は、分析会社や分析技術者により行われて、腎障害の病態と関連づけられた結果が提供されてもよい。検査方法において用いられる試料、関連づけられる腎障害の病態、行われる各工程は、分析方法において定義されたものと同じであってよい。
【００２８】
図８は、本発明の試料分析システムの構成図である。図８に示す本発明の試料分析システム１０は、本発明の分析方法及び検査方法を実施することができるように構成される。このような試料分析システム１０は、記憶部１１と、入力部１２、分析測定部１３と、データ処理部１４と、出力部１５とを含んでおり、糞便又は腸内容物の試料を分析し、病態情報を出力することができる。より具体的に、本発明の試料分析システム１０において、
記憶部１１は、入力部１２から入力された腎障害を判別するための病態指標値の閾値を記憶し、
分析測定部１３は、前記被検体の糞便又は腸内容物中のタンパク質構成アミノ酸のうちの少なくとも１のアミノ酸のアミノ酸立体異性体を分離定量し、
データ処理部１４は、前記少なくとも１のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の量に基づき腎障害の病態指標値を算出し、
データ処理部１４は、記憶部１１に記憶された閾値と比較することにより、腎障害の病態情報を判別し、
出力部１５が被検体の腎障害についての病態情報を出力することができる。
【００２９】
記憶部１１は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリ等のメモリ装置、ハードディスクドライブ等の固定ディスク装置、又はフレキシブルディスク、光ディスク等の可搬用の記憶装置などを有する。記憶部は、分析測定部で測定したデータ、入力部から入力されたデータ及び指示、データ処理部で行った演算処理結果等の他、情報処理装置の各種処理に用いられるコンピュータプログラム、データベースなどを記憶する。コンピュータプログラムは、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体や、インターネットを介してインストールされてもよい。コンピュータプログラムは、公知のセットアッププログラム等を用いて記憶部にインストールされる。
【００３０】
入力部１２は、インターフェイス等であり、キーボード、マウス等の操作部も含む。これにより、入力部は、分析測定部１３で測定したデータ、データ処理部１４で行う演算処理の指示等を入力することができる。また、入力部１２は、例えば分析測定部１３が外部にある場合は、操作部とは別に、測定したデータ等をネットワークや記憶媒体を介して入力することができるインターフェイス部を含んでもよい。
【００３１】
分析測定部１３は、溶媒に懸濁された糞便又は腸内容物の試料におけるアミノ酸のＤ体及びＬ体の量の測定工程を行う。したがって、分析測定部１３は、アミノ酸のＤ体及びＬ体の分離及び測定を可能にする構成を有する。アミノ酸は、１つずつ分析されてもよいが、一部又は全ての種類のアミノ酸についてまとめて分析することができる。分析測定部１３は、以下のものに限定されることを意図するものではないが、例えば試料導入部、光学分割カラム、検出部を備えた高速液体クロマトグラフィーシステムであってもよい。分析測定部１３は、試料分析システムとは別に構成されていてもよく、測定したデータ等をネットワークや記憶媒体を用いて入力部１２を介して入力してもよい。
【００３２】
データ処理部１４は、測定された各アミノ酸のＤ体、又はＤ体及びＬ体の量から、腎障害の病態指標値を算出し、そして記憶部１１に記憶された閾値と比較することにより、腎障害を判別するように構成される。データ処理部１４は、記憶部に記憶しているプログラムに従って、分析測定部１３で測定され記憶部１１に記憶されたデータに対して、各種の演算処理を実行する。演算処理は、データ処理部に含まれるＣＰＵによりおこなわれる。このＣＰＵは、分析測定部１３、入力部１２、記憶部１１、及び出力部１５を制御する機能モジュールを含み、各種の制御を行うことができる。これらの各部は、それぞれ独立した集積回路、マイクロプロセッサ、ファームウェアなどで構成されてもよい。
【００３３】
出力部１５は、データ処理部で演算処理を行った結果である病態指標値及び／又は病態情報を出力するように構成さる。出力部１５は、演算処理の結果を直接表示する液晶ディスプレイ等の表示装置、プリンタ等の出力手段であってもよいし、外部記憶装置への出力又はネットワークを介して出力するためのインターフェイス部であってもよい。
【００３４】
図９Ａ−Ｂは、本発明のプログラムによる病態指標値を決定するための動作の例を示すフローチャートであり、図９Ｃ−Ｄは、本発明のプログラムによる病態指標値及び又は病態情報を決定するための動作の例を示すフローチャートである。
具体的に、本発明のプログラムは、入力部、出力部、データ処理部、記憶部とを含む情報処理装置に病態指標値及び/又は病態情報を決定させるプログラムである。本発明のプログラムは、以下の：
入力部から入力された少なくとも１のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の量の値を記憶部に記憶させ、
記憶部に記憶された値に基づきデータ処理部に病態指標値を算出させ、
算出された病態指標値を記憶部に記憶させ、そして
記憶された病態指標値を出力部に出力させる
ことを前記情報処理装置に実行させるための指令を含む。本発明のプログラムは、記憶媒体に格納されてもよいし、インターネット又はＬＡＮ等の電気通信回線を介して提供されてもよい。
【００３５】
情報処理装置が、分析測定部を備える場合、入力部から少なくとも１のアミノ酸のＤ体の量、Ｌ体の量、又はＤ体及びＬ体の量の値を入力させる代わりに、分析測定部が、糞便試料から当該値を測定し記憶部に記憶させることを情報処理装置に実行させるための指令を含んでもよい。
【００３６】
病態情報の決定には、さらに、
記憶された病態指標値と、予め記憶部に記憶された閾値とをデータ処理部に比較させることで、腎障害の病態を判別させ、
判別された病態情報を記憶部に記憶させ、そして
記憶された病態情報を出力部に出力させる
ことを情報処理装置に実行させるための指令を含んでもよい。
【００３７】
本発明において、被験者は、ヒトに限定されず、実験動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルなどを包含しうる。したがって、被験者は、被検体として表されてもよい。
【００３８】
本発明の分析方法は、慢性及び/又は急性腎不全の診断方法のための予備的なデータを収集するために使用することができる。このような予備的データを用いて医師が慢性及び/又は急性腎不全診断することができるが、かかる分析方法は、医師ではない医療補助者などにより行われてもよいし、分析機関などが行うこともできる。したがって、本発明の分析方法は、診断の予備的方法と言うこともできる。
【００３９】
本発明の分析方法及び検査方法の結果を参照し、さらに治療方針を決定することができる。以下のものに限定されるものではないが、例えば慢性腎不全と判定された場合には、生活習慣の改善、食事指導、血圧管理、血糖値管理、脂質管理などの治療をさらに行うことが必要となる。生活習慣の改善としては、例えば禁煙やＢＭＩ値の低下のための運動が推奨される。食事指導として、高血圧の改善を目的として塩分摂取の低下が推奨される。血圧管理としては、高血圧の改善を目的として、ＡＣＥ阻害剤やＡＲＢの投与が推奨される。血糖値管理としては、ＨｂＡ１ｃの低下を目的として、インスリン投与が推奨される。脂質管理としては、ＬＤＬコレステロールの低下を目的として、高脂血症薬の投与が推奨される。これらの治療方針は、キラルアミノ酸量に基づいて、医師との問診を受けた上で決定される。したがって、本発明の別の態様では、本発明の分析方法及び検査方法を実施し、さらに腎障害の治療行うことを含む、腎障害の治療方法に関する。
【００４０】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
【００４１】
以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
【実施例】
【００４２】
材料及び方法
研究倫理
全ての実験は施設のガイドラインに従って実施され、該施設の動物実験委員会の承認を得て行われた。
【００４３】
材料
アミノ酸のエナンチオマー及びＨＰＬＣ級のアセトニトリルはナカライテスク（京都）から購入された。ＨＰＬＣ級のメタノール、トリフルオロ酢酸、ホウ酸等は和光純薬（大阪）から購入された。水はＭｉｌｌ−ＱグラジエントＡ１０システムを用いて精製された。
【００４４】
腎動脈・静脈クリッピングによる軽度急性腎障害動物モデルの作成
６週齢のC57BL/6JJic雄マウス（日本クレア）に、麻酔下で皮膚及び腹膜を切開した。腎動脈及び静脈クリッピングを４０分間行い、その間３７℃のヒートプレート上で保温した。クリッピングを外し、腹膜及び皮膚を縫合した。腎動脈及び静脈クリッピングにより、虚血性腎障害が誘導された。虚血性腎障害の誘導に供した腎障害誘導群と、偽手術のみを行った対照群を実験に用いた。
【００４５】
虚血性腎障害についての組織切片の評価
虚血性腎障害の誘導後２日目に、マウスを屠殺し、腎臓組織を回収した。回収した腎臓組織に対し、固定処理を行った。固定された腎臓組織から切片を取得し、ＰＡＳ染色を行った。さらに別の切片に対しＦ４／８０染色を行った。ＰＡＳ染色結果を図１（Ａ）に示す。図１Ａの染色結果に基づいて壊死細胞の割合を評価した。その結果を図１（Ｂ）のグラフに示す。Ｆ４／８０染色結果を図２（Ａ）に示す。図２（Ａ）の染色結果に基づいて壊死細胞の割合を評価した。その結果を図２（Ｂ）のグラフに示す。
【００４６】
虚血性腎障害のマーカーによる評価
虚血性腎障害の誘導後２日目に、マウスから採血及び採尿を行った。採血された血液試料をベクトン・ディッキンソン（ＢＤ）マイクロテーナー中で１５００×ｇ、１０分間遠心により血清を分離した。血清クレアチニンは、ＦｕｊｉＤＲＩ−ＣＨＥＭ４０００システム（富士フィルム、東京）を用いて測定された。次に、尿中のＫＩＭ−１及びＮＧＡＬを、Ｒ＆Ｄシステムズ社製のマウスＥＬＩＳＡキットを用いて定量した。
【００４７】
これらの結果により、本実施例で行った腎動脈・静脈クリッピングは、従来の腎不全マーカーでは感知できない程度の腎障害を誘導していることが示された。
【００４８】
軽度急性腎障害動物モデルにおける、糞便試料のアミノ酸分析
虚血性腎障害の誘導後２日目、及び１０日目の対照群（Ｓｈａｍ）及び腎障害誘導群のマウスの大腸から採取された糞便をメタノールに溶解し、財津らが開発したＤ、Ｌ−アミノ酸一斉高感度分析システム（特許第４２９１６２８号）によるアミノ酸立体異性体分析系に供した。各アミノ酸の分析条件の詳細は、ＭｉｙｏｓｈｉＹ．、ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，  ８７９：３１８４（２０１１）及びＳａｓａｂｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０９：６２７（２０１２）に説明される。簡潔には、糞便中のアミノ酸は、ＮＢＤ−Ｆ（４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール、東京化成工業株式会社）で誘導体化され、ＨＰＬＣシステム（ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ  ＳＩ−２、株式会社資生堂、の補足情報を参照せよ。）に供された。簡潔には、逆相分離用分析カラムは、自社製のモノリシックＯＤＳカラム（内径０．５３ｍｍ×５００ｍｍ）が用いられた。蛍光検出は、励起波長４７０ｎｍ、検出波長５３０ｎｍで実行された。逆相分離の後、光学分割カラムに移された。エナンチオマー分離には、キラルセレクターとして（Ｓ）−ナフチルグリシンを用いるスミキラルＯＡ−２５００Ｓカラム（１．５ｍｍ×２５０ｍｍ、自家充填、材料は株式会社住化分析センター製）が使用された。各アミノ酸についての、総アミノ酸量、Ｄ−アミノ酸量、Ｌ−アミノ酸量、Ｄ／Ｌアミノ酸比、Ｄ／（Ｄ＋Ｌ）アミノ酸比を、それぞれ図３Ａ〜Ｅに示す。
【００４９】
統計処理
本明細書及び図面に記載の全ての数値は、平均±標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表示される。実験の統計学的解析には、ステューデントのｔ両側検定、一元配置分散分析（ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、テューキーの多重比較検定（Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｅｓｔ）等の統計学的手法が利用された。また、これらの検定におけるＰ値が０．０５未満のとき、有意性があると評価された。全ての解析はＰｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州、ラホヤ）が用いられた。
【００５０】
結果
Ｄ−アミノ酸量の変化
糞便におけるＤ−アミノ酸量の変化についての分析結果を図３Ｂに示す。対照群（Ｓｈａｍ）に比較して、腎障害誘導群でＤ−アミノ酸含量の有意な変化が見られたのは、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン及びプロリンであった。このうち、セリンとプロリンでは、対照群（Ｓｈａｍ）と比較して、術後２日目及び１０日目の両方で高く、２日目より１０日目の方が高かった。アスパラギン酸とアラニンでは、対照群（Ｓｈａｍ）と比較して、術後２日目で低下するものの、１０日目では対照群よりも高かった。グルタミン酸では、２日目では変化が見られないものの、１０日目で増加した。変化のパターンは一定ではないものの、セリン、アスパラギン酸、アラニン、プロリンについては、腎障害極期の２日目で差が出ており、軽度の腎障害の検出マーカーとして機能しうる。より詳細に解析すると、セリン及びプロリンでは、２日目でＤ体が増加していることから、糞便又は腸内容物においてこれらのＤ−アミノ酸が、閾値よりも高い場合に、軽度の腎障害と判定することが可能になる。また、アスパラギン酸及びアラニンでは、腎障害極期の２日目で減少していることから、糞便又は腸内容物においてこれらのＤ−アミノ酸が、閾値よりも低い場合に、軽度の腎障害と判定することが可能になる。しかしながら、母数を増やすことで、有意差の有無が変化する可能性があり、その場合、本発明において軽度の腎障害の検出に用いることができるため、必ずしも上で列挙したアミノ酸に限定されることを意図するものではない。
【００５１】
Ｄ−アミノ酸／Ｌ−アミノ酸比の変化
糞便におけるＤ−アミノ酸／Ｌ−アミノ酸比の変化についての分析結果を図３Ｄに示す。対照群（Ｓｈａｍ）に比較して、腎障害誘導群でＤ−アミノ酸／Ｌ−アミノ酸比の有意な変化が見られたのは、セリン、アルギニン、及びアスパラギン酸であった。このうち、セリンとアルギニンでは、対照群と比較して、術後２日目及び１０日目の両方で高く、２日目より１０日目の方が高かった。一方、アスパラギン酸では、対照群（Ｓｈａｍ）と比較して、術後２日目及び１０日目の両方で低く、２日目と１０日目にはほとんど差がなかった。より詳細に解析すると、セリン及びアルギニンでは、２日目でＤ体／Ｌ体比が増加していることから、糞便又は腸内容物においてこれらのアミノ酸のＤ体／Ｌ体比が、閾値よりも高い場合に、軽度の腎障害と判定することが可能になる。また、アスパラギン酸では、腎障害極期の２日目で減少していることから、糞便又は腸内容物においてこれらのＤ−アミノ酸が、閾値よりも低い場合に、軽度の腎障害と判定することが可能になる。しかしながら、母数を増やすことで、有意差の有無が変化する可能性があり、その場合、本発明において軽度の腎障害の検出に用いることができるため、必ずしも上で列挙したアミノ酸に限定されることを意図するものではない。特にＤ体／Ｌ体比では、有意差はでていないものの、ヒスチジン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシンにおいて、腎障害極期の２日目で対照とは異なる動きをしていることから、軽度腎障害の診断に有用でありうる。
【００５２】
Ｄ−アミノ酸／（Ｄ−アミノ酸＋Ｌ−アミノ酸）比の変化
糞便におけるＤ−アミノ酸／（Ｄ−アミノ酸＋Ｌ−アミノ酸）比の変化についての分析結果を図３Ｅに示す。また、図３Ａ〜３Ｅに示したデータ間の統計的有意差を評価した。その結果を図３Ｆの表に示す。
【００５３】
マーカーとして特に有用と考えられたセリン、アルギニン、及びアラニンについて、糞便中のＤ−アミノ酸量、Ｄ／Ｌアミノ酸比、及びＤ／（Ｄ＋Ｌ）アミノ酸比の変化についての分析結果を図４（Ａ）〜（Ｃ）に示す。図４（Ｄ）には、参考として、これらのアミノ酸について、血中でのＤ体の変動を示した。
【００５４】
腸内細菌と炎症との関係
上述の軽度急性腎障害動物モデルにおいて、虚血再還流に供するマウスを、通常の条件下で飼育された野生群、無菌下での飼育された無菌群、及び無菌下で飼育された後に、植菌された植菌群に分けた。通常の条件下で飼育し、偽手術を行ったマウスを対照群とした。虚血性腎障害の誘導後２日目に、マウスを屠殺し、腎臓組織を回収した。回収した腎臓組織に対し、固定処理を行った。固定された腎臓組織から切片を取得し、ＰＡＳ染色を行った。さらに別の切片に対しＦ４／８０染色を行った。ＰＡＳ染色結果を図５（Ａ）に示す。図５Ａの染色結果に基づいて壊死細胞の割合を評価した。その結果を図５（Ｂ）に示す。Ｆ４／８０染色結果を図６（Ａ）のグラフに示す。図６（Ａ）の染色結果に基づいて壊死細胞の割合を評価した。その結果を図６（Ｂ）のグラフに示す。
【００５５】
軽度腎障害による腸内細菌の変化
対照群（Ｓｈａｍ）及び腎障害誘導群において、術後２日目及び１０日目に腸内細菌叢を取得し、ＲＡＰＤ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ後のバンドについて電気泳動を行った結果を図７Ａに示す。また、術後２日目及び１０日目で取得した腸内細菌叢を、培養することにより、含まれる細菌の種類及び数を決定した（図７Ｂ）。
【００５６】
結果
図５及び６の結果により、無菌群では、軽度腎障害に対して、炎症を誘導しやすくなる一方で、腸内に植菌することで炎症性を低下させることができた。したがって、腸内細菌と、腎障害における炎症とが関係性を有することが示された。
図７では、虚血再還流を行った野生群と、偽手術を行った対照群とでは、ＲＡＰＤ−ＰＣＲのバンドパターンが変化しており（図７Ａ）、含まれる細菌数及び/又は種類に変化が生じたことが示された。また、図７Ｂの結果から、術後２日目において、一部の細菌について、有意に数が変化しており、１０日目では、有意差はないものの、その細菌の数の違いが現れることが示された。
これにより、軽度の腎障害であっても、腸内細菌の種類や数を変化させることが示された。理論により制限されることを意図するものではないが、糞便中のＤアミノ酸は、腸内細菌により産生されるものと考えられることから、腎障害が、腸内細菌の数や種類を変化させ、その結果としてＤ−アミノ酸の量が変化すると考えられる。これにより糞便中のＤ−アミノ酸の変化を調べることで、腎障害を鋭敏に感知できると考えられる。
【００５７】
実施例２
材料及び方法
研究倫理
本発明者らは、金沢大学附属病院において、８名の慢性腎不全患者及び３名健常者の糞便試料及び血液試料を取得した。これらの被験者に対し、インフォームドコンセントを取得し、金沢大学医学倫理審査委員会により承認された試験に従って実験を行った。
【００５８】
材料
アミノ酸のエナンチオマー及びＨＰＬＣ級のアセトニトリルはナカライテスク（京都）から購入された。ＨＰＬＣ級のメタノール、トリフルオロ酢酸、ホウ酸等は和光純薬（大阪）から購入された。水はＭｉｌｌ−ＱグラジエントＡ１０システムを用いて精製された。
【００５９】
８名の慢性腎不全患者及び３名健常者のから採取された糞便をメタノールに溶解し、財津らが開発したＤ、Ｌ−アミノ酸一斉高感度分析システム（特許第４２９１６２８号）によるアミノ酸立体異性体分析系に供した。各アミノ酸の分析条件の詳細は、ＭｉｙｏｓｈｉＹ．、ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ，  ８７９：３１８４（２０１１）及びＳａｓａｂｅ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０９：６２７（２０１２）に説明される。簡潔には、糞便中のアミノ酸は、ＮＢＤ−Ｆ（４−フルオロ−７−ニトロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール、東京化成工業株式会社）で誘導体化され、ＨＰＬＣシステム（ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ  ＳＩ−２、株式会社資生堂、の補足情報を参照せよ。）に供された。簡潔には、逆相分離用分析カラムは、自社製のモノリシックＯＤＳカラム（内径０．５３ｍｍ×５００ｍｍ）が用いられた。蛍光検出は、励起波長４７０ｎｍ、検出波長５３０ｎｍで実行された。逆相分離の後、光学分割カラムに移された。エナンチオマー分離には、キラルセレクターとして（Ｓ）−ナフチルグリシンを用いるスミキラルＯＡ−２５００Ｓカラム（１．５ｍｍ×２５０ｍｍ、自家充填、材料は株式会社住化分析センター製）が使用された。各アミノ酸についての、総アミノ酸量、Ｌ−アミノ酸量、Ｄ−アミノ酸量、及びＤ／Ｌアミノ酸比を、それぞれ図１０Ａ〜Ｄに示す。
【００６０】
８名の慢性腎不全患者及び３名健常者のから採取された血液試料中の血清クレアチニンを酵素方法により計測した。計測された血清クレアチニン値と年齢に基づいて推定糸球体濾過量（eGFR)を決定した。eGFRの決定式は以下の通りである：
【数１】
0006762529.tif 000002
｛式中、年齢の単位は年であり、ＳＣｒの単位はｍｇ／ｄＬであり、そして糸球体濾過量（ＧＦＲ）の単位は、ｍＬ／min/1.73m2体表面である｝。
女性患者には、数式の計算値に補正係数０．７３９をかけた。
被験者のeGFR値と、２０種類の各アミノ酸についてD-アミノ酸及びL-アミノ酸の合計量、L−アミノ酸量、D−アミノ酸量、及びDアミノ酸／Lアミノ酸比との間の相関係数を測定した。その結果を図１１に示す。
【００６１】
Ｄ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸の合計量については、ヒスチジン、アロ−スレオニンにおいて高い相関が見られ（|ｒ|＞０．７）、アスパラギン、アルギニン、アロイソロイシン、及びフェニルアラニンにおいて相関が見られ（|ｒ|＞０．４）、そしてアスパラギン酸、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、及びチロシンにおいて低い相関がみられた（|ｒ|＞０．２）。
【００６２】
Ｌ−アミノ酸の量については、ヒスチジンにおいて高い相関が見られ（|ｒ|＞０．７）、アスパラギン、アルギニン、フェニルアラニン、及びリジンにおいて相関が見られ（|ｒ|＞０．４）、そしてアスパラギン酸、アラニン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、及びチロシンにおいて低い相関がみられた（|ｒ|＞０．２）。
【００６３】
Ｄ−アミノ酸の量については、ヒスチジン、アロスレオニン、及びリジンにおいて高い相関が見られ（|ｒ|＞０．７）、アロイソロイシン、ロイシン、及びフェニルアラニンにおいて相関が見られた（|ｒ|＞０．４）。
【００６４】
Ｄアミノ酸／Ｌアミノ酸比については、ヒスチジン、及びリジンにおいて高い相関が見られ（|ｒ|＞０．７）、アスパラギン酸、アラニン、プロリン、バリン、及びフェニルアラニンにおいて相関が見られた（|ｒ|＞０．４）。
【００６５】
ｅＧＦＲと正の相関又は負の相関が見られたアミノ酸については、腎不全の診断マーカーとして使用できる。相関が高いほど、腎不全の診断に有用であると考えられる。
【００６６】
Ｌ−リジン量（Ｌ−Ｌｙｓ）、Ｄ−リジン量（Ｄ−Ｌｙｓ）、及びＤ−リジン／Ｌ−リジン（Ｄ／Ｌ−Ｌｙｓ）比について、それぞれ健常者及び慢性腎不全患者を分けてプロットした（図１２Ａ〜図１４Ａ）。また健常者及び慢性腎不全患者におけるＬ−リジン量、Ｄ−リジン量、及びＤ−リジン／Ｌ−リジン比に基づき、ＲＯＣ解析を行い、ＲＯＣ曲線を得た（図１２Ｂ〜図１４Ｂ）。慢性腎不全患者におけるの合計量、Ｌ−リジン量、Ｄ−リジン量、及びＤ−リジン／Ｌ−リジン比と、推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）をプロットして散布図を作成し相関係数を調べた（図１２Ｃ〜図１４Ｃ）。慢性腎不全患者におけるＤ−リジン及びＬ−リジンの合計量、Ｌ−リジン量、Ｄ−リジン量、及びＤ−リジン／Ｌ−リジン比と、血清クレアチニン値をプロットして散布図を作成し相関係数を調べた（図１２Ｄ〜図１４Ｄ）。
【００６７】
Ｌ−Ｌｙｓと、ｅＧＦＲや血清クレアチニンとの相関性は低かった（図１２Ｃ及びＤ）。また、Ｌ−Ｌｙｓについての慢性腎不全患者の診断能に関するＲＯＣ解析の結果、ＡＵＣ＝０．３７５であり、診断能も低かった。そのカットオフ値は７８１．４ｎｍｏｌ／ｇであった（図１２Ｂ）。
【００６８】
Ｄ−Ｌｙｓと、ｅＧＦＲや血清クレアチニンとの相関性は高かった（図１３Ｃ及びＤ）。また、Ｄ−Ｌｙｓについての慢性腎不全患者の診断能に関するＲＯＣ解析の結果、AUC＝０．９３８であり、診断能が極めて高く、そのカットオフ値は２４．２ｎｍｏｌ／ｇであった（図１３Ｂ）。
【００６９】
Ｄ／Ｌ−Ｌｙｓと、ｅＧＦＲや血清クレアチニンとの相関性は高かった（図１４Ｃ及びＤ）。また、Ｄ／Ｌ−Ｌｙｓについての慢性腎不全患者の診断能に関するＲＯＣ解析の結果、ＡＵＣ＝０．９３８であり、診断能が極めて高く、そのカットオフ値は２４．２であった（図１４Ｂ）。
【００７０】
ＲＯＣ曲線に基づき、カットオフ値を算出することができ、Ｌ−Ｌｙｓの場合、７８１．４ｎｍｏｌ／ｇ、Ｄ−Ｌｙｓの場合２４．２ｎｍｏｌ／ｇ、Ｄ／Ｌ−Ｌｙｓの場合２４．２をカットオフ値とすることで、高い感度で慢性腎不全患者を判別することができる（図１２Ｂ〜図１４Ｂ）。
【図１】
0006762529.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ−Ｂ】
0006762529.tif 000005
【図３Ｃ−Ｄ】
0006762529.tif 000006
【図３Ｅ】
0006762529.tif 000007
【図３Ｆ】
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【図４】
0006762529.tif 000009
【図５】
0006762529.tif 000010
【図６】
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【図７】
0006762529.tif 000012
【図８】
0006762529.tif 000013
【図９Ａ−Ｂ】
0006762529.tif 000014
【図９Ｃ−Ｄ】
0006762529.tif 000015
【図１０Ａ−Ｂ】
0006762529.tif 000016
【図１０Ｃ−Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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