(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板活性化ヘパリン誘発性血小板減少症抗体を検出する方法であって、
ａ）血小板第４因子を血小板サンプルと共にインキュベートして、ＰＦ４処理血小板サンプルを得る工程；
ｂ）ヘパリン誘発性血小板減少症であると疑われる患者からの患者血液サンプルと、前記ＰＦ４処理血小板サンプルとを接触させて、合わせたサンプルを作成する工程；および
ｃ）前記合わせたサンプル中のＰＦ４処理血小板の活性化を測定する工程を含み、
工程ｂ）において、正常な血液サンプルが前記患者血液サンプルに置換された場合の血小板活性化と比べた、前記合わせたサンプルにおける血小板活性化の増加が、前記患者がヘパリン誘発性血小板減少症であることを示す、方法。
【請求項２】
血小板上のｐ−セレクチンの発現の増加；血小板に対する免疫グロブリンの結合の増加；血小板に対するアネキシンＶの結合の増加；血小板から放出されたセロトニン、ベータトロンボグロブリン、ピロリン酸塩、フィブロネクチンもしくはフォン・ヴィレブランド因子の増加；血小板膜タンパク質ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）のタンパク質分解切断の増加；血小板形態の変化；血小板細胞質中のイオン化カルシウムレベルの増加；活性化血小板上に見られる１つ以上のＣＤマーカーの発現レベルの変化；血小板凝集；細胞内カルシウムレベル；インテグリンのコンフォメーション；セロトニン、ＡＴＰ、ＡＤＰもしくはＶＷＦなどの血小板顆粒内容物の放出；血小板膜電位；または血小板インピーダンスを測定することによって、血小板活性化を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ６２Ｐの発現を測定することによって、血小板活性化を確認する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者血液サンプルが、全血、血漿、血清、多血小板血漿、または血液から精製された抗体のサンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらなるヘパリンまたは、ポリアニオン、ヘパリン誘導体、化学修飾ヘパリン、ヘパリン様グリコサミノグリカン分子、複数のヘパリンまたはグリコサミノグリカン分子を含有するプロテオグリカン、および低分子量ヘパリンからなる群から選択される高い負電荷を有する化合物の存在下で、前記患者血液サンプルを前記ＰＦ４処理血小板サンプルと接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記さらなるヘパリンまたは高い負電荷を有する化合物の最終濃度が、０．０５〜１００単位／ミリリットルである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
患者における血小板活性化ヘパリン誘発性血小板減少症抗体を検出する方法であって、
ａ）有効量の血小板第４因子を血小板サンプルと共にインキュベートして、ＰＦ４処理血小板サンプルを得る工程；
ｂ）ヘパリン誘発性血小板減少症であると疑われる患者からの患者血液サンプルと、前記ＰＦ４処理血小板サンプルとを接触させて、合わせたサンプルを作成する工程；および
ｃ）前記合わせたサンプルにおける血小板に結合した抗体の量を測定する工程を含み、
工程ｂ）において、正常な血液サンプルが前記患者血液サンプルに置換された場合の血小板活性化と比べた、前記合わせたサンプルにおける血小板活性化の増加が、前記患者がヘパリン誘発性血小板減少症であることを示す、方法。
【請求項８】
前記患者血液サンプルが、全血、血漿、血清、多血小板血漿、または血液から精製された抗体のサンプルを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
さらなるヘパリンまたは、ポリアニオン、ヘパリン誘導体、化学修飾ヘパリン、ヘパリン様グリコサミノグリカン分子、複数のヘパリンまたはグリコサミノグリカン分子を含有するプロテオグリカン、および低分子量ヘパリンからなる群から選択される高い負電荷を有する化合物の存在下で、前記患者血液サンプルを前記ＰＦ４処理血小板サンプルと接触させることをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記さらなるヘパリンまたは高い負電荷を有する化合物の最終濃度が、０．０５〜１００単位／ミリリットルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ヘパリン誘発性血小板減少症であると疑われる患者由来の血液サンプルにおける血小板活性化ヘパリン誘発性血小板減少症抗体の存在を決定するためのキットであって、以下の構成要素：
ａ）精製血小板第４因子；
ｂ）血小板活性化またはＰＦ４処理血小板を含む合わせたサンプル及び患者血液サンプル中の血小板への抗体の結合を検出することができる抗体またはプローブ；および
ｃ）使用説明書
からなる、キット。
【請求項１２】
少なくとも５０Ｕ／ｍｌのヘパリンをさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
血小板活性化阻害剤をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記血小板活性化阻害剤がプロスタグランジンＥ１である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
患者における血小板活性化ヘパリン誘発性血小板減少症抗体を検出する方法であって、
ａ）血小板第４因子を血小板サンプルと共にインキュベートして、ＰＦ４処理血小板サンプルを得る工程；
ｂ）患者からの患者血液サンプルと、前記ＰＦ４処理血小板サンプルとを接触させて、合わせたサンプルを作成する工程；および
ｃ）前記合わせたサンプルにおける血小板凝集またはＰＦ４処理血小板の血小板凝固を測定する工程を含み、
工程ｂ）において、正常な血液サンプルが前記患者血液サンプルに置換された場合の血小板凝集または血小板凝固と比べた、前記合わせたサンプルにおける血小板凝集または血小板凝固の増加が、前記患者がヘパリン誘発性血小板減少症であることを示す、方法。
【請求項１６】
血小板第４因子と共にインキュベートした血小板サンプルが、単離血小板または洗浄正常ドナー血小板である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者が、ヘパリン誘発性血小板減少症であると疑われる患者である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
患者における血小板活性化ヘパリン誘発性血小板減少症抗体を検出する方法であって、
ａ）血小板第４因子を、正常血小板サンプルおよびヘパリン誘発性血小板減少症であると疑われる患者からの患者血液サンプルと共にインキュベートし、ＰＦ４処理血小板を含む合わせたサンプルを作成する工程；
ｂ）前記合わせたサンプルにおけるＰＦ４処理血小板の活性化を測定する工程を含み、
工程ａ）において正常な血液サンプルが前記患者血液サンプルに置換された場合に得られた血小板活性化と比べた、前記合わせたサンプルにおける血小板活性化の増加が、前記患者がヘパリン誘発性血小板減少症であることを示す、方法。
【請求項１９】
ＣＤ６２Ｐの発現を測定することによって、血小板活性化を確認する、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１０月２９日に出願された米国仮出願第６１／８９６，９５１号（これは、すべての目的のために参照により組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府支援研究に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって認められた認可ＨＬ−１３６２９の下で政府の支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ヘパリンは、二糖単位の繰り返しからなる高硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。未分画ヘパリンは、１２〜１５キロダルトン（ｋＤ）の平均分子量を有する。ヒト患者への注入のために商業的に調製されたほとんどのヘパリンは、ブタの腸粘膜から単離されたものであり、「未分画ヘパリン」（ＵＦＨ）と称される形態である。様々な方法によってＵＦＨを分画すると、多糖鎖の６０％が８ｋＤ未満の分子量を有する低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）が得られる。ＵＦＨの抗凝固効果は、トロンビンのセリンプロテアーゼ阻害剤である抗トロンビン３（ＡＴＩＩＩ）との相互作用によって媒介される。
【０００４】
抗トロンビンに対するＵＦＨの結合は、ＡＴＩＩＩによる凝固プロテアーゼ、トロンビンおよびＸａ因子の阻害を著しく増加させる。米国だけで、１年間に、手術および他の治療処置を受けている入院患者の約３分の１または１２万人の患者が、血栓症の治療または予防のために、ＵＦＨまたはＬＭＷＨを投与されていると推定される。これらの患者の約１〜５％は、障害「ヘパリン誘発性血小板減少症」（ＨＩＴ）を発症する。
【０００５】
ＨＩＴはヘパリンに対する有害反応であり、罹患患者は血小板活性化抗体を産生して、血小板減少症を発症する。これらの個体の一部は、重症例では致死的であり得る動脈血栓症または静脈血栓症を経験する。専門家は、１年間に最大６００，０００人の人々がＨＩＴを発症すると考えており、これは、毎年診断される乳癌の症例数の２倍であり、米国で毎年診断される新たな狭心症の症例数にほぼ等しい。早期の診断および治療が罹患率を減少させ得るので、ＨＩＴの適時かつ正確な診断を行うことが重要である。ＨＩＴの正確な診断は、臨床所見および臨床検査結果の両方に注意を払う必要がある。
【０００６】
ＨＩＴを有すると疑われる患者の従来の治療は、すべてのヘパリンを即時停止した後に、直接トロンビン阻害剤などの非ヘパリン代替抗凝固剤を急速投与することを含む。このような治療は、さらなる入院、多額の費用、１日当たり１％の大量出血のリスクを伴う。したがって、ＨＩＴの正確な診断および血栓症リスクの特性評価は、有効な患者管理に重要である。
【０００７】
血小板第４因子（ＰＦ４）は、４つの同一の７０アミノ酸サブユニットからなる３２ｋＤの四量体タンパク質であり、活性化血小板のα顆粒から放出され、高い親和性でヘパリンに結合して、ＨＩＴ抗体が認識するＰＦ４エピトープの生成をもたらす。ＰＦ４の１つの生理学的役割は、血管の内皮表面上のヘパリン様分子を中和し、それにより、凝固を促進することであり得る。他の役割は、炎症促進性活性、血管新生の阻害、ならびに巨核球増殖および血小板産生の阻害を含むと思われる。
【０００８】
ＨＩＴは、ヘパリンとの複合体におけるＰＦ４を認識する抗体によって引き起こされる。ＨＩＴ抗体を検出するための利用可能な試験の中では、セロトニン放出アッセイ（ＳＲＡ）がＨＩＴの典型的な臨床像と最も良く相関すると多くの者によって考えられており、ＨＩＴ診断の代わりとして使用されることが多い。しかしながら、放射能の使用、多大な労力、新鮮血小板への依存、およびアッセイの技術的要求を含む課題により、通常、ＳＲＡは、少数の専門研究室においてのみ実施される。広く使用されている別の診断試験であるＰＦ４系ＥＬＩＳＡは、技術的に簡単であり、抗体検出感度が高いが、臨床ＨＩＴを診断するために必要な特異性を欠く。
【０００９】
最近開発された他のＨＩＴアッセイは有望であるが、まだ調査中であり、臨床使用についてまだ検証されていない。一部のヘパリンＰＦ４指向抗体はＨＩＴを引き起こすが、他の多くは引き起こさない理由は依然として不明である。しかしながら、ＳＲＡで試験陽性の抗体は病原性であり、血小板減少症だけではなく、ＨＩＴの最も深刻な合併症である血栓症を引き起こす可能性が最も高いと一般に認められている。
【００１０】
したがって、血小板を活性化する抗体と、血小板を活性化しない抗体とを区別するアッセイであって、典型的な病院研究室が比較的短時間で実施し得るアッセイが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、患者における血小板活性化抗体を検出する方法であって、ａ）ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）を有すると疑われる患者から、血液サンプルを得る工程；ｂ）有効量の血小板第４因子（ＰＦ４）を血小板サンプルと共にインキュベートして、ＰＦ４処理血小板サンプルを得る工程；ｃ）前記患者血液サンプルを前記ＰＦ４処理血小板と接触させる工程；およびｄ）前記患者血液サンプルにおける血小板活性化を測定する工程を含み、正常サンプルと比べた血小板活性化の増加が、前記患者がＨＩＴを有することを示す方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一般に、前記方法で使用するのに最も適切および実用的な血小板は、洗浄正常ドナー血小板であろう。しかしながら、異常血小板、未洗浄血小板、単離血小板、精製血小板または血小板誘導体を使用し得る。一般に、患者サンプルを用いて得られたシグナルの比が、正常サンプルを使用して得られたシグナルを、少なくとも２倍、最も好ましくは少なくとも３倍超える場合、測定値は陽性であるとみなし得る。第１の例において、図１に示されているアッセイでは、正常血清と比べたｐ−セレクチンの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の８０００超の増加は陽性であるとみなし得る。最良の結果のために、適切な数の真に陽性の対照サンプルおよび真に陰性の対照サンプルを使用した検証を実施して、陽性サンプルおよび陰性サンプルの適切なカットオフを定義すべきである。
【００１３】
一実施形態では、本発明の方法は、ヘパリンの非存在下で行われるが、代替的な実施形態では、患者サンプルとＰＦ４処理血小板との接触は、０．０５〜１００単位／ｍｌの範囲の量のさらなるヘパリンまたはヘパリン様化合物の存在下で行われ得る。
【００１４】
本発明はまた、患者における血小板結合抗体を評価することによって、血小板活性化（病原性）ＨＩＴ抗体を検出する方法であって、ａ）ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）を有すると疑われる患者から、血液サンプルを得る工程；ｂ）有効量の血小板第４因子（ＰＦ４）を血小板サンプルと共にインキュベートして、ＰＦ４処理血小板サンプルを得る工程；ｃ）前記患者血液サンプルを前記ＰＦ４処理血小板と接触させる工程；およびｄ）前記患者血液サンプルにおける血小板結合抗体の量を測定する工程を含み、
正常サンプルと比較した、患者サンプルにおける血小板に結合する抗体の評価によって検出された抗体の存在が、前記患者がＨＩＴを有することを示す方法を提供する。一般に、患者サンプルを用いて得られたシグナル（この場合にはＩｇ−血小板結合）の比が、正常サンプルを使用して得られたシグナルを、少なくとも２倍、最も好ましくは少なくとも３倍超える場合、測定値は陽性であるとみなし得る。図２に示されているアッセイでは、サンプルが、正常血清と比べた中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の２５００超の増加、およびＭＦＩの８０％の増加を示す場合、サンプルは陽性であるとみなす。
【００１５】
本発明はまた、患者サンプルにおける血小板活性化抗体の存在を決定するためのキットを提供する。一実施形態ではキットは、前記キットは、ａ）有効量の精製ヒトＰＦ４；ｂ）有効量の少なくとも２つの標識抗ヒト抗体であって、一方が血小板特異的マーカー（例えば、ＣＤ４１）と反応性であり、他方が、血小板活性化の尺度として選択されたマーカー（例えば、ｐ−セレクチン）と反応性である少なくとも２つの標識抗ヒト抗体；ｃ）陽性反応の特異性を確認するのに十分な有効量の高用量ヘパリン；ｄ）有効量の陽性対照ＨＩＴ抗体；ｅ）有効量の陰性対照抗体サンプル；ｆ）アッセイで使用するための血小板を得るための説明書；ならびにｇ）アッセイを実施するための説明書；ｈ）血小板活性化のマーカーを検出するための１つ以上のさらなる試薬（例えば、蛍光標識アネキシンＶまたは抗ｐ−セレクチン抗体）ｇ）ベースライン血小板活性化を最小化するためのプロスタグランジンＥ１を含む。別の実施形態では、前記キットは、ａ）有効量の精製ヒトＰＦ４；ｂ）血小板活性化を測定するための有効量の少なくとも１つの標識抗ヒト抗体（例えば、抗ヒトｐ−セレクチン）；ならびにｃ）アッセイを実施するための説明書を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１。ｐ−セレクチン発現アッセイにおける血小板活性化（ＳＲＡ＋）患者サンプルの正確な検出。図１Ａ左。外因性ＰＦ４を血小板と共にプレインキュベートしなかった場合、ＳＲＡ＋サンプル（ｎ＝２９）は、ｐ−セレクチン発現のごくわずかな増加をもたらした；ＳＲＡ−サンプル（ｎ＝２４）は、ほとんど効果がなかった。縦軸に示されている値は、患者血清を使用して得られた中央値蛍光強度（ＭＦＩ）（ｐ−セレクチン発現の尺度）と、プールした正常血清を用いて得られたＭＦＩとの差を示す。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識ＧｐＩＩｂ特異的抗体を使用して、ＣＤ４１（ＧｐＩＩｂ）陽性に基づいて、血小板特異的な事象をゲーティングする。図１Ａ中央。外因性ＰＦ４を血小板と共にプレインキュベートした場合、すべてのＳＲＡ＋（ＳＲＡ陽性）サンプルは、高レベルのｐ−セレクチン発現をもたらし、ＳＲＡ−（ＳＲＡ陰性）サンプルと明確に区別可能であった。図１Ａ右。高用量ヘパリン（ＨＤ  ＵＦＨ）を追加した場合、ＳＲＡ＋サンプルが、ＳＲＡ−サンプルと比べて、ｐ−セレクチン発現のごくわずかな増加を示したように、ｐ−セレクチン発現は有意に減少した。
【図１Ｂ】疾患分類変数としてＳＲＡを使用して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した（すなわち、ＳＲＡ＋サンプルにおける陽性ｐ−セレクチン発現アッセイは、「真の陽性」を意味するであろう）。ＰＦ４強化ｐ−セレクチンアッセイの曲線下面積（ＡＵＣ）は１．０であったが、これは、このアッセイが、試験サンプルについて完全な診断精度を有していたことを実証している。各サンプルにおいてＳＲＡを少なくとも２回実施したところ、本研究で使用したサンプル（２４個のＳＲＡ−および２９個のＳＲＡ＋）のラン間で、すべての結果が一致していた。水平バーは、各群の平均を示す。アスタリスクは、平均間の有意差を示す［ｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）］。
【図２Ａ】図２。ＩｇＧ−血小板結合アッセイにおける血小板活性化（ＳＲＡ＋）患者サンプルの正確な検出。図２Ａ左。外因性ＰＦ４を血小板と共にプレインキュベートしなかった場合、ＳＲＡ＋サンプル（ｎ＝２９）は、正常血清と比べて、血小板に対するＩｇＧの結合のごくわずかな増加をもたらした；ＳＲＡ−サンプル（ｎ＝２４）は、ほとんど効果がなかった。縦軸は、患者血清を用いて得られたＭＦＩ（ＩｇＧ結合の尺度）と、プールした正常血清を用いて得られたＭＦＩとの差を示す。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識ＣＤ４１特異的抗体を使用して、ＣＤ４１（ＧｐＩＩｂ）陽性に基づいて、血小板特異的な事象をゲーティングする。図２Ａ中央。外因性ＰＦ４を血小板と共にプレインキュベートした場合、ＳＲＡ＋サンプルは、ＳＲＡ−サンプルよりも有意に高レベルのＩｇＧ結合をもたらした。図２Ａ右。高用量ヘパリン（ＨＤ  ＵＦＨ）を追加した場合、ＳＲＡ＋サンプルがＳＲＡ−サンプルと区別不可能であるように、ＩｇＧ−血小板結合は著しく減少した。
【図２Ｂ】疾患分類変数としてＳＲＡを使用して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を作成した（すなわち、ＳＲＡ＋サンプルにおける陽性ＩｇＧ−血小板結合アッセイは、「真の陽性」を意味するであろう）。本明細書で概説した実験条件を使用したところ、（ＨＬＡ抗体による血小板に対する抗体結合を除外するために）ＰＦ４の追加によって、サンプルが、正常血清と比べた中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の２５００超の増加、およびＭＦＩの８０％の増加を示す場合、サンプルは陽性であるとみなすコンビナトリアル戦略は、ＳＲＡ＋ＨＩＴ抗体とＳＲＡ−ＨＩＴ抗体との区別において、ほぼ完全な精度をもたらす（ＡＵＣ＝０．９４）。これは、このアッセイが、試験サンプルについて高レベルの診断精度を有していたことを実証している。各サンプルにおいてＳＲＡを少なくとも２回実施したところ、本研究で使用したサンプル（２４個のＳＲＡ−および２９個のＳＲＡ＋）のラン間で、すべての結果が一致していた。水平バーは、各群の平均を示す。アスタリスクは、平均間の有意差を示す［ｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）、ｐ＜０．０５（＊）］。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
Ｉ．一般
本明細書および特許請求の範囲において、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は非限定的な用語であり、「限定されないが、、．．．を含む」を意味するものと解釈すべきである。これらの用語は、より限定的な用語「から本質的になる」および「からなる」を包含する。
【００１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、文脈上特に明確な指示がない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」および「少なくとも１つの」は、本明細書では互換的に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「特徴とする」および「有する」も互換的に使用され得ることに留意すべきである。
【００１９】
別段の指定がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の通常の熟練者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で具体的に述べられるすべての刊行物および特許は、本発明に関連して使用される可能性のある刊行物中で報告される化学薬品、器具、統計分析、および方法論に関する記述および開示を含めて、すべての目的に対してそれらの全体が参照により援用される。本明細書で引用されるすべての参考文献は、当技術分野の技術水準を暗示するものと受け取るべきである。本明細書中の何物も、本発明が従来の発明に基づくかかる開示に先立つ資格がないという告白と解釈されるべきではない。
【００２０】
ＩＩ．本発明
一実施形態では、本発明は、ＨＩＴの診断を助けるために、ＨＩＴを有すると疑われる患者における血小板活性化（病原性）ＨＩＴ抗体を検出する方法を提供する。本発明の方法は、ＰＦ４と共にプレインキュベートした血小板を活性化することができる患者抗体を検出する。血小板、患者サンプルおよびＰＦ４を同時に一緒に追加し、次いで、血小板活性化のレベルを検出することもできるが、しかしながら、血小板をＰＦ４と共にプレインキュベートすると、いくつかの患者サンプルについて、最大限の血小板活性化がもたらされるので、好ましい実施形態である。外因性ＰＦ４の使用およびヘパリンの不要は、特許請求の範囲に記載されている方法のユニークな特徴である。本発明の方法は、ヘパリンで治療された患者における血栓症／血小板減少症のリスクを増加させる抗体の、簡便、迅速かつ高感度の検出を可能にする。
【００２１】
一実施形態では、前記方法は、ａ）ＨＩＴを有すると疑われる患者から、血清または血漿サンプルを得ること；ｂ）有効量の血小板第４因子（ＰＦ４）を洗浄正常ドナー血小板と共に室温で２０分間インキュベートして、ＰＦ４処理血小板サンプルを得ること；ｃ）前記患者血液サンプルを前記ＰＦ４処理血小板サンプルと室温で６０分間接触させること；ならびにｄ）前記患者血液サンプルにおける血小板活性化抗体の量を測定することを含み、正常血清による活性化と比較した、患者サンプルによる血小板活性化の評価によって検出された病原性ＨＩＴ抗体の存在は、前記患者がＨＩＴを有することを示す。図１に示されているアッセイでは、正常血清と比べたｐ−セレクチンの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の８０００超の増加は陽性であるとみなし得る。一般に、患者サンプルを用いて得られたシグナル（この場合にはｐ−セレクチン発現）の比が、正常サンプルを使用して得られたシグナルを、少なくとも２倍、最も好ましくは少なくとも３倍超える場合、測定値は陽性であるとみなし得る。
【００２２】
一実施形態では、限定されないが、血小板表面ｐ−セレクチンの増加；血小板表面に対するアネキシンＶの結合の増加；血小板からのセロトニン、ベータトロンボグロブリン、ピロリン酸塩、フィブロネクチンもしくはフォン・ヴィレブランド因子の放出の増加；血小板膜タンパク質ＦｃガンマＲＩＩ（ＣＤ３２）のタンパク質分解切断の増加；血小板形態の変化；または血小板細胞質中のイオン化カルシウムレベルの増加を含む血小板活性化の１つ以上のマーカーを測定することによって、患者サンプルにおける血小板活性化抗体の量を決定する。活性化血小板上に見られる１つ以上のＣＤマーカーの発現レベルの変化；血小板凝集；細胞内カルシウムレベル；インテグリンのコンフォメーション；セロトニン、ＡＴＰ、ＡＤＰもしくはＶＷＦなどの血小板顆粒内容物の放出；血小板膜電位；または血小板インピーダンスを測定することによっても、患者サンプルにおける血小板活性化の量を決定し得る。
【００２３】
図１Ａおよび図２Ａは、エンドポイントとしてｐ−セレクチン発現およびＩｇＧ結合を使用した、血小板活性化抗体の検出の具体例を提供する。測定は、当業者に公知の従来の方法を使用して、特殊な条件下で血小板活性化を検出するのに有用であり得る様々なものを包含する。本発明者らの発見は、ＰＦ４で処理した血小板を活性化するそれらの能力によって、血小板活性化抗体を検出する有用なものである。本発明者らは、この血小板活性化を検出し得るアッセイの２つのこのような例を示したが、他のものも使用し得る。
【００２４】
一実施形態では、患者サンプルにおける血小板活性化（病原性）ＨＩＴ抗体の測定を、血小板に対するヒト免疫グロブリンの結合を測定することによって実施する。
【００２５】
一実施形態では、ヘパリンが少なくとも５０Ｕ／ｍｌのレベルで存在する高用量ヘパリン対照は、反応がベースラインレベルに低下することを示して、血小板活性化がＨＩＴ抗体によって特異的に媒介されたことを証明する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明の方法は、低用量ヘパリン、ヘパリン様分子またはポリアニオン化合物の存在下で実施され得るが、これらの物質は、血小板活性化抗体の量を測定するのに不要である。アッセイにおける低用量ヘパリンの追加は、特許請求の範囲に記載されているアッセイの感度または特異性の改善に対して測定可能な影響を及ぼさないと思われる。
【００２７】
別の実施形態では、当業者に公知の多くの方法の１つにより血小板凝集または血小板凝固の増加を観察することによって、血小板活性化抗体の量を測定し得る。
【００２８】
一実施形態では、本発明の方法は、２つ以上の蛍光標識抗体を追加する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）をさらに含み得る。一実施形態では、一方の抗体は、血小板特異的マーカー、例えばＣＤ４１に特異的であり、別の抗体は、血小板活性化の表面マーカーに特異的であり、例えば、抗ｐ−セレクチン抗体、またはアネキシンＶ結合と、その結合を検出するための抗アネキシンＶ抗体との組み合わせである。
【００２９】
一実施形態では、本発明の方法は、血小板活性化の表面マーカーに特異的な蛍光標識プローブ、例えば抗ｐ−セレクチン抗体、アネキシンＶ結合と、その結合を検出するための標識抗アネキシンＶ抗体との組み合わせを追加する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または直接標識アネキシンＶの使用をさらに含み得る。
【００３０】
別の実施形態では、本発明の方法は、患者における血小板結合抗体を測定することによって、血小板活性化（病原性）ＨＩＴ抗体を検出する方法を含む。前記方法は、ａ）ヘパリン誘発性血小板減少症（ＨＩＴ）を有すると疑われる患者から、患者血液サンプルを得ること；ｂ）有効量の血小板第４因子（ＰＦ４）を血小板サンプルと共にインキュベートして、ＰＦ４処理血小板サンプルを得ること；ｃ）前記患者血液サンプルを前記ＰＦ４処理血小板と接触させること；およびｄ）前記患者血液サンプルにおける血小板結合抗体の量を測定することを含み、正常血清における血小板結合抗体と比較した、患者血液サンプルにおける血小板結合抗体の評価によって検出された病原性ＨＩＴ抗体の存在は、前記患者がＨＩＴを有することを示す。
【００３１】
一実施形態では、フローサイトメトリー分析で血小板をマーキングするのに使用される抗原は、ＣＤ９、ＣＤ２３、ＣＤ３１、ＣＤ３６、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ１０７、ＣＤ１５１、ＣＤ１６５、それらのアイソフォーム、または血小板の外部に存在する任意のマーカーである。血小板はまた、それらの前方散乱特性および側方散乱特性によって、フローサイトメトリーで同定され得る。
【００３２】
具体的には、一実施形態では、本発明者らは、ＨＩＴを有すると疑われる患者の血液サンプルにおける血小板活性化の量を測定する。工程１は、血小板をＰＦ４と共にプレインキュベートすることである；工程２は、患者サンプルをＰＦ４処理血小板と共にインキュベートして、それらの活性化を可能にすることである；工程３は、正常サンプルと比較したＣＤ６２Ｐ発現の上昇を調査することによって、血小板活性化を測定することである。血小板活性化の増加は、患者がＨＩＴを有することを示す。血小板の内部で高レベルのＣＤ６２Ｐを発現するアルファ顆粒は表面に遊走および融合して、その内容物を血流に漏出するので、これが起こる。これは、活性化血小板の表面上のＣＤ６２Ｐの上昇を引き起こす。
【００３３】
一実施形態では、患者血液サンプルにおける血小板結合抗体の量の測定は、ＰＦ４処理血小板に結合する患者抗体の量を測定すること、およびその値と、正常血液サンプルを使用した場合に結合する抗体の量とを比較することを含む。図２に示されているアッセイでは、サンプルが、正常血清と比べた中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の２５００超の増加を示す場合、サンプルは陽性であるとみなす。一般に、患者サンプルを用いて得られたシグナル（この場合にはＩｇ−血小板結合）の比が、正常サンプルを使用して得られたシグナルを、少なくとも２倍、最も好ましくは少なくとも３倍超える場合、測定値は陽性であるとみなし得る。この実施形態では、ＰＦ４で前処理された血小板に結合する患者抗体の検出は、ＨＩＴを示す。この実施形態では、ＰＦ４で血小板を前処理し、次いで、患者血液サンプルと共にインキュベートする。血小板を１回洗浄し、例えば、ヒト免疫グロブリンＧ、ＡまたはＭに特異的な蛍光標識二次抗体を追加することによって、血小板結合抗体の量を測定する。
【００３４】
キット。本発明はまた、患者血清における血小板活性化抗体の存在を決定するためのキットを提供する。一実施形態では、前記キットは、ａ）有効量の精製ヒトＰＦ４；ｂ）血小板活性化のマーカーに対する有効量の少なくとも１つの標識抗ヒト抗体であって、２つを使用する場合には、一方が血小板特異的抗体（例えば、抗ＣＤ４１）と反応性であり得、他方が、血小板活性化のマーカー（例えば、ｐ−セレクチン）と反応性である少なくとも１つの標識抗ヒト抗体；ｃ）陽性反応の特異性を確認するのに十分な有効量の高用量ヘパリン；ｄ）有効量の陽性対照ＨＩＴ抗体；ｅ）有効量の陰性対照抗体血清；ｆ）アッセイで使用するための正常ドナー血小板を得るための説明書；ならびにｇ）アッセイを実施するための説明書；ｈ）血小板活性化のマーカーを検出するための１つ以上のさらなる試薬（例えば、蛍光標識アネキシンＶまたは抗ｐ−セレクチン抗体）ｇ）ベースライン血小板活性化を最小化するためのプロスタグランジンＥ１を含む。反応構成要素がより少ないキットは、ａ）有効量の精製ヒトＰＦ４；ｂ）血小板活性化のマーカーに対する有効量の少なくとも１つの標識抗ヒト抗体（例えば、抗ヒトｐ−セレクチン抗体）、ならびにｃ）使用説明書を含み得る。
【００３５】
定義。「診断」によって、本発明者らは、病状（例えば、癌または前悪性病変）もしくは症候を分類すること、病状の重症度（悪性度または病期）を決定すること、病状の進行をモニタリングすること、ならびに／または病状の転帰および／もしくは回復の可能性を予測することを意味する。
【００３６】
「有効量」によって、本発明者らは、望ましい転帰をもたらすのに十分な化合物の量を意味する。「有効量」は、化合物、使用、担当医師または獣医師の判断、および他の要因に応じて変化するであろう。
【００３７】
「ＨＩＴ」によって、本発明者らは、ヘパリン誘発性血小板減少症を意味し、これは、血小板第４因子（ＰＦ４）とヘパリンとの複合体に結合して、血栓促進症状および血小板減少症状（これは、重症例では致死的であり得る）をもたらす血小板活性化抗体を罹患患者が産生する、ヘパリンに対する有害反応である。
【００３８】
「ヘパリン誘発性」によって、本発明者らは、ヘパリンに対する曝露から生じる抗体、または自然発生ＨＩＴのように、ＨＩＴの指標である、ヘパリンと複合体形成したＰＦ４を認識するものを意味する。
【００３９】
「ヘパリン様化合物」によって、本発明者らは、高い負電荷を有する化合物、例えばポリアニオン、ヘパリン誘導体、化学修飾ヘパリン、ヘパリン様グリコサミノグリカン分子、複数のヘパリンまたはヘパリン様グリコサミノグリカンを含有するプロテオグリカン、低分子量ヘパリン、またはヘパリン様グリコサミノグリカンを意味し、これらはいずれも直接的に、またはスペーサー／リンカー分子を介してコア分子に接続され得る。
【００４０】
「患者」によって、本発明者らは、ＨＩＴを有すると疑われる任意のヒトを意味する。「ＨＩＴを有すると疑われる」によって、本発明者らは、患者が、ＨＩＴを示す臨床所見（例えば、正常未満の血小板数、以前に診断された血塊の拡大もしくは拡張、または体内の他の場所における新たな血塊の発達を含む）を示すことを意味する。ＨＩＴを示すさらなる症候としては、発熱、発疹、悪寒、高血圧、息切れおよび胸痛が挙げられる。
【００４１】
栓球としても公知の「血小板」、によって、本発明者らは、血液凝固、止血および血栓形成に関与する巨核球の無核断片を意味する。通常、ヒト血小板は、限定されないが、血小板アフェレーシス、血小板フェレーシスおよび分画遠心法を含む様々な方法によって単離される。洗浄正常ドナー血小板が適切であるが、しかしながら、未洗浄血小板、単離血小板または精製血小板を含む他の供給源由来の血小板も使用し得る。
【００４２】
「血小板活性化」によって、本発明者らは、活性化を誘発する分子、例えばコラーゲン、トロンボキサンＡ２、ＡＤＰ、トロンビンなどに血小板が遭遇した場合の、血小板の応答を意味する。血小板活性化は、例えば、血小板活性化に関連するマーカーの変化、密顆粒およびα顆粒のエキソサイトーシス、膜酵素ホスホリパーゼＡ２の活性化、形態の変化などを含む血小板の様々な変化をもたらす。
【００４３】
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、血小板活性化レベルを測定し得る（例えば、患者血液サンプルにおける活性化血小板上に見られるか、または前記活性化血小板から放出されるマーカーのレベルを、正常対照サンプルにおける活性化血小板のレベルと比較して測定するなど）。活性化血小板上に見られるか、または活性化血小板から放出されることが公知の任意のマーカー（例えば、活性化血小板上に見られる１つ以上のＣＤマーカー、例えばｐ−セレクチンとしても公知のマーカーＣＤ６２Ｐを含む）を使用して、血小板活性化を測定し得る。加えて、免疫グロブリンの結合の増加、血小板凝集、細胞内イオン化カルシウムレベル、インテグリンのコンフォメーションの変化、血小板顆粒内容物の放出、血小板膜電位もしくは血小板インピーダンスの変化、Ｆｃガンマ受容体２切断断片のレベル、または血小板の形態変化を測定することによって、血小板活性化を測定し得る。
【００４４】
「血小板活性化の増加」によって、本発明者らは、正常血液サンプルにおけるベースライン血小板活性化のものの少なくとも１．５倍の血小板活性化の増加を意味する。一実施形態では、血小板活性化の増加は、正常血液サンプルにおけるベースライン血小板活性化の量の少なくとも２倍または３倍である。正常血液サンプルと比較した患者血液サンプルの「増加」の決定は、試験サンプル、陽性対照サンプルおよび既知の正常サンプルならびに統計的方法の使用、例えば、正常サンプル、または試験もしくは患者サンプルの比較に使用するための試験サンプルの計算された代表値、平均値、中央値または範囲の使用を必要とし得る。
【００４５】
「ＰＦ４」によって、本発明者らは、血小板から精製されたネイティブな血小板因子４（ＰＦ４）または組換え型ＰＦ４のいずれかを意味する。ネイティブなＰＦ４は、四量体状態で存在する。最適には、ＰＦ４は四量体であるが、他の形態のＰＦ４も機能し得る。
【００４６】
「サンプル」によって、本発明者らは、ＨＩＴを有すると疑われるヒトまたは動物患者から得られた検体または培養物を意味する。生物学的サンプルは、患者から得ることができ、流体、固体、組織および気体を包含する。一実施形態では、患者抗体の供給源は、血清であろう。しかしながら、血漿、全血または他の血液産物、例えば多血小板血漿などは十分であろう。好ましくは、約０．２ｍｌのサンプルが試験反応に必要である。しかしながら、このような例は、本発明に適用可能なサンプルの種類を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４７】
「固体表面」によって、本発明者らは、ＰＦ４−ヘパリン複合体（または他の抗原）の固定化に適切な任意の表面を意味する。この技術のための好ましい固体支持体は、ポリスチレンビーズである。他の種類のビーズとしては、磁気ビーズ、微粒子およびナノ粒子が挙げられる。いくつかのナノ粒子は、金属製の内部を有する。他の固体支持体としては、ポリスチレンまたは他のプラスチックから作られたＥＬＩＳＡプレートが挙げられ得る。
【００４８】
「標識抗体」によって、本発明者らは、蛍光色素で標識された任意の抗体、例えばＦｃγ特異的なアロフィコシアニン（ＡＰＣ）結合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、α鎖特異的なフルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＡなどを意味する。加えて、このような抗体の生産のために、限定されないが、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ロバ、ウマ、ウシ、ブタおよびサルを含む様々な種を使用し得る。これらの抗体は、天然ではポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかであり得る。
【００４９】
「使用説明書」によって、本発明者らは、刊行物、記録、図表、または本明細書に記載される目的の１つのために本発明の有用性を伝達するのに使用される任意の他の表現媒体を意味する。前記キットの説明資料は、例えば、本発明を含有する容器に添付され得るか、または本発明を含有する容器と一緒に輸送され得る。
【００５０】
希釈。一実施形態では、患者サンプルの希釈は、１：５（血小板活性化アッセイ）および１：２０（血小板結合アッセイ）である。しかしながら、当業者によって決定されるように、使用者の要求に応じて、未希釈〜１：５００の範囲内の他の希釈も十分であり得る。本明細書で使用される患者サンプルの最も適切な希釈は、血清の１：５〜１：２０希釈であるが、しかしながら、患者における抗体応答の強さに応じて、１：２〜１：１０，０００の範囲内の他の希釈も十分であり得る。最も好ましい種類のサンプルは、血清であろう。しかしながら、本発明者らは、全血または血漿も十分であると予測する。強力な抗体を含有するサンプルの場合、１：５００超の希釈が適切であり得る。
【００５１】
緩衝液。好ましい実施形態では、ＰＢＳ−１％ＢＳＡまたはＴｙｒｏｄｅｓ  ＨＥＰＥＳ−１％ＢＳＡ緩衝液を体抗原反応に使用する。しかしながら、当技術分野で公知のほとんどの等張溶液および生理溶液も十分であろう。
【００５２】
インキュベーション時間。一実施形態では、血小板活性化および抗体抗原反応が５〜１２０分間、最も最適には６０分間起こるようにする（血小板結合アッセイおよび血小板活性化アッセイ）。しかしながら、当業者によって認識されるように、より長いまたはより短いインキュベーションを使用し得る。驚くべきことに、本発明者らは、３７℃ではなく室温でのインキュベーションが、血小板結合抗体および血小板活性化抗体の両方を測定するために最適であることを見出した。
【００５３】
ＰＦ４と血小板とのプレインキュベーション。血小板結合抗体および血小板活性化のレベルを測定するために、ＰＦ４を血小板と共にプレインキュベートすることにより、ＳＲＡ陽性サンプルおよびＳＲＡ陰性サンプルがより明確に区別可能になるようにアッセイ性能が増強された。血小板活性化アッセイおよび血小板結合アッセイは両方とも、統計的有意性でＳＲＡ（−）とＳＲＡ（＋）抗体とを区別する。これは、本発明者らの発見および本発明の好ましい実施形態の重要な実用的特性である。
【００５４】
蛍光色素。一実施形態では、本発明の方法で使用される各抗体は、蛍光標識される。例えば、蛍光色素を使用することを含む、当技術分野で公知の任意の蛍光標識方法を使用し得る。例えば、一実施形態では、当業者であれば、可能な限り重複しないように発光スペクトルを有する抗体を使用するであろう（例えば、ＦＩＴＣ、ＡＰＣおよびＰＥなど）。フローサイトメトリー装置中に存在する検出レーザーを使用することによって、色素の蛍光発光を区別することができるように、蛍光標識二次抗体の置換を使用し得る。色素の発光スペクトルが近ければならない程度に制限はない。しかしながら、異なる検出レーザーを使用する蛍光標識抗体を求めることが一般に認められている。
【００５５】
フローサイトメトリー。フローサイトメトリーは、細胞を流れる流体に懸濁し、電子検出装置によってそれらを通過させることによって、細胞計数、選別、バイオマーカー検出およびタンパク質工学に用いられるレーザー生物物理学的技術である。それは、１秒間当たり最大数千個の粒子の物理的特性および／または化学的特性の同時分析を可能にする。フローサイトメトリーは、健康障害、特に血液癌の診断に日常的に使用されているが、基礎研究、臨床診療および臨床試験における他の多くの用途を有する。一般的な変化は、目的の集団を精製するために、その特性に基づいて粒子を物理的に選別することである。本発明の一実施形態では、細胞に結合した蛍光標識抗体を検出および定量することができるフローサイトメトリーは、このような抗体によって引き起こされる血小板活性化（例えば、ｐ−セレクチン発現）を測定することによって、またはＰＦ４処理血小板に対するこのような抗体の結合を測定することによって、血小板活性化ＨＩＴ抗体を検出して、ＨＩＴの診断を補助するために使用される。しかしながら、当技術分野で公知の蛍光標識抗体を検出する他の方法も使用し得る。例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ型プラットフォームは蛍光色素標識ビーズ検出し、または蛍光を読み取ることができるＥＬＩＳＡプレートリーダーも使用し得る。
【００５６】
当業者であれば、同様に作用する様々な物質または条件を、本明細書に記載されるものの代用とすることができることを認識するであろう。血小板、血小板特異抗原、血小板活性化のマーカー、抗体および抗原の混合物をインキュベートする方法、抗体に使用される希釈範囲、反応に使用される緩衝液、患者抗体の供給源、インキュベーション時間、二次抗体の種、二次抗体と共に使用される標識、ならびに標識抗体の検出フォーマットについて、これらの代用が可能である。
【００５７】
複数の実施形態が開示されるが、当業者であれば、以下の詳細な説明から、本発明のさらに他の実施形態が明らかであろう。明らかであるように、本発明は、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な明白な態様を改変することができる。したがって、詳細な説明は、本質的に例示的なものであり、限定的なものではないとみなされるべきである。
【００５８】
ＩＩＩ．実施例
当然のことながら、以下の実施例は、単に例示目的で示されるものであり、決して本発明の範囲を限定するものではない。実際、本明細書に示され記載されるものに加えて、上記説明および以下の実施例から、本発明の様々な改変が当業者に明らかであり、添付の特許請求の範囲内にある。
【実施例１】
【００５９】
患者および臨床試験。
【００６０】
ＨＩＴを有すると疑われる患者由来の血清サンプル（ｎ＝５３）を、血小板およびＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ（ＢＣＷ）から入手した。選択したサンプルは、ＰＦ４−ＥＬＩＳＡ陽性であり、光学密度（ＯＤ）が０．４超であり、高用量（ＨＤ；１００Ｕ／ｍｌ）未分画ヘパリン（ＵＦＨ）で４９％以上減少した。各サンプルについて、ＳＲＡを少なくとも２回実施したところ、セロトニン放出アッセイ（ＳＲＡ）では、２９個のサンプルが一貫して陽性であり、２４個が陰性であった。研究プロトコールは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ＢｌｏｏｄＣｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎによって承認された。
【実施例２】
【００６１】
ｐ−セレクチンアッセイ。
【００６２】
プロスタグランジンＥ１の存在下で、（ドナー間の血小板変動を最小限にするために）グループＯの血液ドナー２〜３人のクエン酸多血小板血漿から血小板を単離した。反応混合物は、１×１０６個の血小板を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から構成されており、これに、（１）５０μｇ／ｍｌ  ＰＦ４、（２）５０μｇ／ｍｌ  ＰＦ４および高用量（ＨＤ）ＵＦＨまたは（３）緩衝液を室温で２０分間追加した。このアッセイでは、追加するＰＦ４の量を最適化して、血小板活性化を最大化した。次いで、１０マイクロリットルの血清を追加して、５０μｌの最終反応容量を得た。前述のように、ヒトＰＦ４を精製した。
【００６３】
室温で６０分間インキュベートした後、フィコエリトリン（ＰＥ）標識ｐ−セレクチン抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ＧＰＩＩｂ抗体２９０．５を追加した。１５分後、２００μｌのＰＢＳ−１％ＢＳＡで混合物を希釈し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターにおいて、血小板イベントを得た。ＧＰＩＩｂ陽性によってイベントをゲーティングし、ｐ−セレクチンＰＥの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。
【実施例３】
【００６４】
免疫グロブリン−血小板結合アッセイ。
【００６５】
プロスタグランジンＥ１の存在下で、（ドナー間の血小板変動を最小限にするために）グループＯの血液ドナー２〜３人のクエン酸多血小板血漿から血小板を単離した。反応混合物は、１×１０６個の血小板を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）−１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から構成されており、これに、（１）５０μｇ／ｍｌ  ＰＦ４、（２）５０μｇ／ｍｌ  ＰＦ４および高用量（ＨＤ）ＵＦＨならびに（３）緩衝液を室温で２０分間追加した。このアッセイでは、追加するＰＦ４の量を最適化して、血小板に対するＩｇＧ結合を最大化した。次いで、２．５マイクロリットルの血清を追加して、５０μｌの最終反応容量を得た。室温で６０分間インキュベートした後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ＧＰＩＩｂ抗体２９０．５を追加した。３０分後、２００μｌのＰＢＳ−１％ＢＳＡで混合物を希釈し、Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６フローサイトメーターにおいて、血小板イベントを得た。ＧＰＩＩｂ陽性によってイベントをゲーティングし、抗ヒトＩｇＧ  ＦＩＴＣの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。
【００６６】
統計：マンホイットニー検定を使用して、ＳＲＡ＋サンプルおよびＳＲＡ−サンプルの２つの群を比較した（Ｐｒｉｓｍ，Ｇｒａｐｈｐａｄ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。Ａｎａｌｙｓｅ−ｉｔソフトウェア（Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ）を使用して、受信者動作特性曲線を作成した。０．０５未満のｐ値を有意とみなした。
【００６７】
結果
ＳＲＡ陰性ではなくＳＲＡ陽性の患者サンプルは、ＰＦ４で前処理した血小板における血小板ｐ−セレクチン発現を誘導した。ＰＦ４で前処理した血小板におけるｐ−セレクチン発現を誘導する５３メンバーＨＩＴ抗体パネルの能力を特性評価した。図１Ａ（左）に示されているように、未処理の血小板を使用した場合、ＳＲＡ陰性サンプルは、ｐ−セレクチン発現を誘導することができず、ＳＲＡ陽性サンプルは、ごくわずかであるが有意なｐ−セレクチンの増加をもたらした（それぞれＳＲＡ＋サンプル対ＳＲＡ−サンプルについて、中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の平均増加は、正常血清と比べて２２９５対−１１２であった。ｐ＜０．０００１）。
【００６８】
ＰＦ４で前処理した血小板をアッセイで使用した場合、ＳＲＡ陰性サンプルではなくＳＲＡ陽性サンプルによって誘導されるｐ−セレクチン発現は、大きく増加した（図１Ａ、中央；それぞれＳＲＡ＋サンプル対ＳＲＡ−サンプルについて、中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の平均増加は、正常血清と比べて１２，０３７対１４１５であった。ｐ＜０．０００１）。ｐ−セレクチン発現は、高用量ヘパリンによって有意に阻害された（図１Ａ、右）。
【００６９】
ＲＯＣ分析では、曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断精度の尺度を提供する。ｐ−セレクチン発現アッセイは、１．０の完全なＡＵＣ測定値を達成した（図１Ｂ）。これは、非常に高い信頼性で、ｐ−セレクチン発現アッセイをＳＲＡの代わりとして使用し得ることを示唆している。本明細書で使用される用語「ＰＦ４強化ｐ−セレクチン放出アッセイ」、「ｐ−セレクチン発現アッセイ」および「血小板活性化アッセイ」はすべて、本発明の方法を指す。
【００７０】
ＳＲＡ（−）ではなくＳＲＡ（＋）の患者血清中の抗体は、ＰＦ４で前処理した血小板を認識した。図２Ａ（左）に示されているように、ＳＲＡ陰性サンプル由来のＩｇＧは、未処理の血小板に結合することができず、ＳＲＡ陽性サンプルは、ごくわずかであるが有意なＩｇＧ結合の増加をもたらした（それぞれＳＲＡ＋サンプル対ＳＲＡ−サンプルについて、中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の平均増加は、正常血清と比べて５，０４６対２，６６５であった。ｐ＜０．０５）。
【００７１】
対照的に、ＳＲＡ（−）サンプルではなくほとんどのＳＲＡ（＋）患者サンプル中の抗体は、ＰＦ４で前処理した血小板を認識する（図２Ａ、中央；それぞれＳＲＡ＋サンプル対ＳＲＡ−サンプルについて、中央値蛍光強度（ＭＦＩ）の平均増加は、正常血清と比べて２９，５８５対３，３９３であった。ｐ＜０．０００１）。血小板に対するＩｇＧ結合は、高用量ヘパリンによって有意に阻害された（図２Ａ、右）。
【００７２】
血小板結合アッセイは、０．９４のＡＵＣ測定値を達成した（図２Ｂ）。これは、高い信頼性で、本発明の血小板結合アッセイをＳＲＡの代わりとして使用し得ることを示唆している。本明細書で使用される用語「ＰＦ４強化血小板結合アッセイ」、「ＩｇＧ−血小板結合アッセイ」および「免疫グロブリン−血小板結合アッセイ」はすべて、本発明の方法を指す。
【００７３】
上記説明、添付の図面および下記特許請求の範囲は例示的なものであり、本発明を限定するものではない。本明細書に記載される本発明を考慮して、当業者であれば、本発明の多くの主題および変形に想到するであろう。このような主題および変形はすべて、本明細書の企図する範囲内である。例えば、上記様々な例示的な実施形態および下記特許請求の範囲に関して本発明を説明したが、公知のものであるか、または希少なものであるか、または現時点で予期されていないものであり得るかにかかわらず、当業者であれば、様々な代替、改変、変形、改良および／または実質的な均等物が明らかであり得る。本発明の精神および範囲から逸脱せずに、様々な変更を行い得る。したがって、本発明は、これらの例示的な実施形態のすべての公知のまたは今後開発される代替、改変、変形、改良および／または実質的な均等物を包含することを意図する。
【００７４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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