(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が子宮内膜癌腫を有するかどうかを判定する方法であって、
（ａ）前記被験者からのサンプルにおける少なくとも１つの標的遺伝子のメチル化状態を測定する工程であって、前記少なくとも１つの標的遺伝子がＢＨＬＨＥ２２を含む、工程と；
（ｂ）前記少なくとも１つの標的遺伝子が高メチル化されているかどうかを測定する工程と；
（ｃ）前記被験者が前記子宮内膜癌腫を有するかどうかを前記工程（ｂ）の結果に基づき判定する工程であって、前記少なくとも１つの標的遺伝子の高メチル化が前記被験者が前記子宮内膜癌腫を有していることを示す工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの標的遺伝子がさらにＣＤＯ１を含み、前記工程（ａ）がＣＤＯ１のメチル化状態を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つの標的遺伝子がさらにＡＤＡＲＢ２、ＣＤＯ１、ＴＨＹ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２、ＧＡＴＡ４、ＨＯＸＡ９、ＭＴＭＲ７、ＮＴＭ、ＰＲＫＣＤＢＰ、ＴＢＸ５及びＺＮＦ６６２の少なくとも１つを含み、前記工程（ａ）がＡＤＡＲＢ２、ＣＤＯ１、ＴＨＹ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２、ＧＡＴＡ４、ＨＯＸＡ９、ＭＴＭＲ７、ＮＴＭ、ＰＲＫＣＤＢＰ、ＴＢＸ５及びＺＮＦ６６２の少なくとも１つのメチル化状態を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの標的遺伝子がＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１、ＴＨＹ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２、ＧＡＴＡ４、ＮＴＭ、ＰＲＫＣＤＢＰ及びＴＢＸ５を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが前記被験者の子宮内膜組織又は子宮頸部擦過細胞由来である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが前記被験者の子宮頸部擦過細胞由来であり、前記少なくとも１つの標的遺伝子がＢＨＬＨＥ２２、並びにＣＤＯ１、ＣＬＶＳ２、ＴＨＹ１及びＣＥＬＦ４の少なくとも１つを含み、前記工程（ａ）がＢＨＬＨＥ２２、並びにＣＤＯ１、ＣＬＶＳ２、ＴＨＹ１及びＣＥＬＦ４の少なくとも１つのメチル化状態を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記子宮内膜癌腫がＩ型またはＩＩ型子宮内膜癌腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの標的遺伝子がさらにＣＤＯ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２及びＴＨＹ１の少なくとも１つを含み、前記工程（ａ）がＣＤＯ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２及びＴＨＹ１の少なくとも１つのメチル化状態を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はがん診断に関する。より詳細には、本開示発明は選択されたマーカーのメチル化状態に基づきがんを診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
婦人科がんは、女性生殖器に生じる異常細胞の制御されない増殖である。婦人科がんの主な種類には子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜／子宮がん（以下、子宮内膜がん）、膣がん及び外陰がんが挙げられ、いくつかの珍しい婦人科がんとしては妊娠性絨毛性疾患（ＧＴＤ）及び原発性腹膜がんが挙げられる。
【０００３】
子宮内膜がん（ＥＣ）は米国における婦人科がんの主な原因であり、世界で６番目に多く診断された女性のがんである。世界保健機関のＧＬＯＢＯＣＡＮプロジェクトによれば、２０１２年のＥＣ発生及び死亡数はそれぞれ約３１０，０００人及び７６，０００人であり、２０２０年には３８０，０００超の新症例及び９３，０００人のＥＣによる死亡が予想されると推定されている。
【０００４】
多くの子宮内膜がんは更年期である、又は更年期を経験したことがある女性に見出される。しかしながら、何かしらの兆候又は症状を有さない者にとっては、子宮がんを検査する容易で信頼できる方法は無い。症状を示しているか、又は子宮内膜がんのリスクがより高い患者には、子宮がんを診断又は除外するため、子宮内膜生検又は経膣超音波が実施されることがある。
【０００５】
病理組織学的評価により、ＥＣを大きく２つの種類に分類することができる。Ｉ型ＥＣは高〜中分化型（グレード１〜２）類内膜線がんを含む。ＩＩ型ＥＣは漿液型、明細胞、及び低分化型（グレード３）類内膜型形態を含む。多くのＩ型ＥＣは初期段階（ステージＩ又はＩＩ）で診断され、良好な転帰を有するが、ＩＩ型ＥＣは通常進行期に診断され、比較的予後不良である。類内膜型ＥＣの患者の多くは初期段階に診断されるが、後期類内膜ＥＣ患者の１５％は５年生存率が低く、５０％未満である（ステージＩＩＩで４０〜５０％、ステージＩＶで１５〜２０％）。早期発見は依然として転帰を改善する最も良い方法である。しかしながら、現在ＥＣをスクリーニングする満足できる方法はない。
【０００６】
異常子宮出血はＥＣの最も良く見られる症状であるが、多くの他の疾患でも同じ症状が起こる。出血が閉経後の女性に起こる場合でさえ、ＥＣによるものは１０％の症例のみである。理想的な検出手段の選択は、感度、特異度、精度の確率、及び価格次第である。経膣超音波（ＴＶＵ）はＥＣを除外するのに用いられる。しかしながら、血中女性ステロイドホルモンの影響下で子宮内膜厚が変化するため、症状のある閉経前女性及びホルモン置換療法を行っている女性におけるＴＶＵのカットオフ値はより低い。外来診療において、吸引掻把術により得られた子宮内膜サンプルはＴＶＵに比べて感度及び特異度が高い場合がある。しかし、この侵襲的手段の失敗率は５４％までになる場合がある。子宮内膜サンプル採取が診断に不適当であるか又は含まれるのであれば、臨床ガイドラインは麻酔下でのわずかな子宮内容除去術（Ｄ＆Ｃ）を推奨している。従って、患者の多くは不便で、ストレスが多く、高価な子宮内膜サンプル採取又はＤ＆Ｃにより、繰り返し侵襲的評価を受けている。
【０００７】
一方、子宮鏡検査の診断精度は、閉経前及び閉経後両方の女性で、総合感度８６．４％及び特異度９９．２％を達することができる。それにも関わらず、子宮内膜サンプル採取又は子宮鏡検査に値するＴＶＵにより診断される子宮内膜厚の最良のカットオフ値に関する議論がある。ＥＣの有無を検出する非侵襲的方法は、血清及び子宮頸膣のがん抗原１２５（ＣＡ−１２５）濃度の測定である。指標としてＣＡ−１２５を用いる精度は、子宮腺筋症又は子宮筋腫及び子宮内膜症などの良性状態と容易に混同される。子宮頸部擦過物からの細胞診断もＥＣを検出するのに用いられているが、異常結果率はＩ型ＥＣで３２．３から８６．０％、ＩＩ型ＥＣで５７．１から１００％に及ぶ。
【０００８】
上記を考慮し、婦人科腫瘍、特に子宮内膜がんの診断に使用する方法を提供する関連技術の必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
読み手に基本的な知識を提供するため、以下に本開示の簡単な概要を示す。この概要は本開示の広範囲にわたる要約ではなく、本発明の重要／重大な要素を特定せず、又は本発明の範囲を詳述しない。その唯一の目的は、下記のより詳細な説明の前置きとして、簡略化された形態で本明細書に開示されたいくつかの概念を示すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様において、本発明は被験者が子宮内膜がん（ＥＣ）を有するかどうかを判定する方法を対象とする。
【００１１】
本開示の一実施形態によれば、本方法は以下の、
（ａ）被験者からサンプルを得る工程と；
（ｂ）サンプルにおける少なくとも１つの標的遺伝子のメチル化状態を測定する工程であって、少なくとも１つの標的遺伝子がＢＨＬＨＥ２２（配列番号１）もしくはＴＨＹ１（配列番号２）又はその両方である工程と；
（ｃ）少なくとも１つの標的遺伝子が高メチル化されているかどうかを測定する工程と；
（ｄ）被験者がＥＣを有しているかどうかを工程（ｃ）の結果に基づき判定する工程であって、少なくとも１つの標的遺伝子の高メチル化が被験者がＥＣを有していることを示す工程と、を含む。
【００１２】
本開示の様々な実施形態によれば、サンプルは被験者、好ましくはヒトである被験者から得られたサンプル、又は被験者、好ましくはヒトである被験者内に存在するサンプルである。例えば、サンプルは被験者の子宮内膜組織又は細胞サンプル（例えば、子宮頸部擦過細胞）から得られる。
【００１３】
本開示のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの標的遺伝子はさらに下記追加の遺伝子：ＡＤＡＲＢ２（配列番号３）、ＣＤＯ１（配列番号４）、ＣＥＬＦ４（配列番号５）、ＣＬＶＳ２（配列番号６）、ＧＡＴＡ４（配列番号７）、ＨＯＸＡ９（配列番号８）、ＭＴＭＲ７（配列番号９）、ＮＴＭ（配列番号１０）、ＰＲＫＣＤＢＰ（配列番号１１）、ＴＢＸ５（配列番号１２）及びＺＮＦ６６２（配列番号１３）の少なくとも１つを含む。これらの実施形態において、ＢＨＬＨＥ２２及び／又はＴＨＹ１のメチル化状態、並びに追加の遺伝子の少なくとも１つのメチル化状態が測定され、工程（ｄ）において、該選択された遺伝子の高メチル化状態に基づき判定が行われる。
【００１４】
他の実施形態によれば、少なくとも１つの標的遺伝子はＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１、ＴＨＹ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２、ＧＡＴＡ４、ＮＴＭ、ＰＲＫＣＤＢＰ及びＴＢＸ５を含む。
【００１５】
ある実施形態によれば、少なくとも１つの標的遺伝子はＢＨＬＨＥ２２及びＣＤＯ１を含む。他の例においては、少なくとも１つの標的遺伝子はＢＨＬＨＥ２２及びＣＥＬＦ４を含む。あるいは、少なくとも１つの遺伝子はＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１及びＣＥＬＦを含む。これらの例においては、工程（ｂ）で、ＢＨＬＨＥ２２並びにＣＤＯ１及びＣＥＬＦ４の１つ又はその両方のメチル化状態が測定され、工程（ｄ）で、ＢＨＬＨＥ２２並びにＣＤＯ１及びＣＥＬＦ４の１つ又はその両方の高メチル化状態に基づき判定が行われる。本開示の任意の実施形態において、サンプルは被験者の子宮頸部擦過細胞から得られる。
【００１６】
本開示の様々な実施形態によれば、子宮内膜がんはＩ型子宮内膜がんであるが、他の実施形態においては、子宮内膜がんはＩＩ型子宮内膜がんである。
【００１７】
任意に、本開示の上記実施形態に記載されたように、遺伝子のメチル化状態を測定する工程は、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＭＳＰ）、バイサルファイトシークエンス（ＢＳ）、バイサルファイトパイロシークエンス、マイクロアレイ、質量分析、変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）、パイロシークエンス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応一体型メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ又はｍＤＩＰ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降シークエンス（ＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ）又はナノポアシークエンスを実施することにより行うことができる。
【００１８】
別の態様において、本発明は被験者が婦人科癌腫又は大腸癌腫を有するかどうかを判定する方法を対象とする。
【００１９】
本開示の一実施形態によれば、本方法は以下の、
（ａ）被験者からサンプルを得る工程と；
（ｂ）サンプルにおける少なくとも１つの標的遺伝子のメチル化状態を測定する工程であって、少なくとも１つの標的遺伝子がＡＤＡＲＢ２（配列番号３）、ＣＬＶＳ２（配列番号６）、ＨＯＸＡ９（配列番号８）、ＭＴＭＲ７（配列番号９）及びＮＴＭ（配列番号１０）からなる群から選択される工程と；
（ｃ）少なくとも１つの標的遺伝子が高メチル化されているかどうかを測定する工程と；
（ｄ）被験者が婦人科癌腫又は大腸癌腫を有しているかどうかを工程（ｃ）の結果に基づき判定する工程であって、少なくとも１つの標的遺伝子の高メチル化が被験者が婦人科癌腫又は大腸癌腫を有することを示す工程と、を含む。
【００２０】
本開示の様々な実施形態によれば、サンプルは被験者、好ましくはヒトである被験者から得られたサンプル、又は被験者、好ましくはヒトである被験者内に存在するサンプルである。例えば、サンプルは被験者の子宮内膜組織又は細胞サンプル（例えば、子宮頸部擦過細胞）から得られる。
【００２１】
本開示のいくつかの実施形態において、婦人科癌腫はＩ型子宮内膜癌腫、ＩＩ型子宮内膜癌腫、卵巣癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、妊娠性絨毛性疾患（ＧＴＤ）及び原発性腹膜癌腫である。
【００２２】
任意に、本開示の上記実施形態に記載されたように、遺伝子のメチル化状態を測定する工程は、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳＰ）、定量的メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＭＳＰ）、バイサルファイトシークエンス（ＢＳ）、バイサルファイトパイロシークエンス、マイクロアレイ、質量分析、変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ）、パイロシークエンス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応一体型メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ又はｍＤＩＰ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降シークエンス（ＭｅＤＩＰ−ｓｅｑ）又はナノポアシークエンスを実施することにより行うことができる。
【００２３】
さらに別の態様において、本開示は本開示により特定されるバイオマーカーの使用を対象とする。特に、バイオマーカーを、被験者が１つ又は複数のこれらのバイオマーカーに関連する癌腫を有するかどうかを判定する診断キットを調製するのに用いることができる。
【００２４】
理解できるように、該バイオマーカーのメチル化状態を測るのに適当な物質を含む診断キットも本開示の範囲に含まれる。
【００２５】
本開示の多くの付随する特徴及び長所は、添付図と合わせて検討される以下の詳細な説明を参照してより理解されるであろう。
【００２６】
本説明は添付図を検討して記載される以下の詳細な説明からより理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本開示の一実施例によれば、図１のＡは我々のＭＢＤｃａｐ−Ｓｅｑの公開データにおける、組織中の候補遺伝子のメチル化特徴を明らかにする相関行列（パネルＡ）を示し、図１のＢはがんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）の公開データにおける、組織中の候補遺伝子のメチル化特徴を明らかにするヒートマップ（パネルＢ）を示す。
【図２】本開示の一実施例によれば、図２のＡはＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１、ＣＥＬＦ４及びＺＮＦ６６２（パネルＡ）のメチル化状態の分布を示すドットプロットを提供し、図２のＢは該４遺伝子の性能（パネルＢ）を示す。
【図３】本開示の一実施例によれば、図３は子宮内膜がん検出のため、個々の子宮内膜組織を用いて１５遺伝子のＤＮＡメチル化レベルを要約する。
【図４】本開示の一実施例によれば、図４は子宮内膜がん検出のため、個々の子宮頸部擦過物を用いて１遺伝子のＤＮＡメチル化レベルを要約する。
【図５】本開示の一実施例によれば、図５のＡはトレーニングセット（パネルＡ）のサンプルを用いて候補遺伝子の性能を示すプロットを提供し、図５のＢはテストセット（パネルＢ）のサンプルを用いて候補遺伝子の性能を示すプロットを提供する。
【図６】図６は本開示の一実施例によれば、他の大腸、子宮頸又は卵巣癌腫における６候補遺伝子の交差検証の結果を要約する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
添付図と合わせて以下に記載された詳細な説明は本実施例の説明として意図され、本実施例を構成し、又は利用することができる形態のみを表すことを意図しない。本説明は本実施例の機能、及び本実施例を構成及び操作する工程の順番を明記する。しかしながら、同じ又は同等の機能及び順番は異なる実施例により実現することができる。
【００２９】
便宜上、明細書、実施例及び添付のクレームで用いられる特定の用語をここでまとめる。他に定義されない限り、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００３０】
他に文脈から求められない限り、単数の用語は同じものの複数形を含み、複数の用語は単数形を含むことが理解される。具体的には、他に文脈から明らかに示されない限り、本書及びクレームで、単数形「ａ」及び「ａｎ」は複数の指示を含む。また、本書及びクレームで、「少なくとも１つ」及び「１つ又は複数」という用語は同じ意味を有し、１、２、３又はそれ以上を含む。さらに、本明細書及び添付のクレームを通して用いられる「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つ」「Ａ、Ｂ又はＣの少なくとも１つ」並びに「Ａ、Ｂ及び／又はＣの少なくとも１つ」という表現は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ａ及びＢ共に、Ｂ及びＣ共に、Ａ及びＣ共に、並びにＡ、Ｂ及びＣ共に対象とすることを意図する。
【００３１】
本発明の広い範囲を明記する数値範囲及びパラメータは概数であるにも関わらず、具体例に明記された数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、いずれの数値も、それぞれの試験測定値から求められる標準偏差から必ず生じる誤差を本質的に含有する。また、ここで、一般的に「約」という用語は与えられた値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％内を意味する。あるいは、「約」という用語は、当業者により考慮される場合、平均の許容される標準誤差内を意味する。操作／実施例におけるもの以外、又は他に明確に断りがない限り、ここで開示される数値範囲、量、値及び割合のすべて、例えば物質量、持続時間、温度、操作条件、量比などは、「約」という用語によりすべての例において変更されるものとして理解されるべきである。従って、反対に指示されない限り、本開示及び添付のクレームに明記された数値パラメータは、所望の通りに変更することができる概数である。最低でも、各数値パラメータは、報告された有効桁数を考慮して、及び通常の四捨五入方法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。範囲は１つの終点から別の終点まで、又は２つの終点間として、ここで表される場合がある。他に断りがない限り、ここで開示される範囲はすべて終点を含む。
【００３２】
ここで、「診断」という用語は子宮頸部、卵巣、子宮内膜／子宮、膣、外陰、子宮及び子宮を覆う腹膜を含む、様々な婦人科組織起源の新生物などの病理状態、疾患又は病状の特定を指す。いくつかの例において、診断という用語は、悪性及び良性新生物を区別することも指す。他のいくつかの例において、診断という用語は悪性新生物及び正常組織を区別することを指す。
【００３３】
本開示を通して、「新生物」という用語は、細胞の新規及び異常増殖、又は正常よりも速く再生する異常細胞の増殖を指す。新生物は構造化されていない塊（腫瘍）を生じ、良性又は悪性の場合がある。「良性」という用語は非がん性である新生物又は腫瘍を指し、例えばその細胞は周辺組織に浸潤しないか、又は遠位部位に転移しない。一方、「悪性」という用語は転移性であり、隣接組織に浸潤し、又は正常な細胞増殖制御下にない新生物又は腫瘍を指す。
【００３４】
ここで、「がん」という用語は、動物に見出されるすべての種類のがん、又は悪性新生物もしくは腫瘍を指す。本開示の様々な実施形態による方法は婦人科起源の１つ又は複数の癌腫の診断を対象とする。「癌腫」という用語は上皮細胞に由来する悪性腫瘍を指す。本開示の実施形態の例示的な婦人科癌腫としては、卵巣がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん及び原発性腹膜がんが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
ここで、「メチル化」という用語は、遺伝子のコアプロモータ領域におけるＣｐＧジヌクレオチド内シトシンのＣ５位にメチル基が共有結合することを指す。「メチル化状態」という用語は、関心のある遺伝子又は核酸配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−メチルシトシン（５−ｍＣｙｔ）の有無を指す。ここで、「メチル化レベル」という用語は、関心のある遺伝子又は核酸配列の１つ又は複数のコピーにおけるメチル化の量を指す。メチル化レベルは、関心のある遺伝子又は核酸配列内におけるメチル化の絶対基準として計算することができる。また、「相対メチル化レベル」は、存在するＤＮＡ総数に対するメチル化ＤＮＡの量として、あるいは遺伝子又は核酸配列のコピーの総数に対する関心のある遺伝子又は核酸配列のメチル化されたコピー数として測定することができる。さらに、「メチル化レベル」は関心のあるＤＮＡ長におけるメチル化ＣｐＧ部位の割合として測定することができる。
【００３６】
ここで、「メチル化プロファイル」という用語は、関心のあるサンプルにおける１つ又は複数の標的遺伝子のメチル化レベルを表すデータセットを指す。いくつかの実施形態において、メチル化プロファイルは公知の種類のサンプル由来である基準メチル化プロファイルと比較される（例えば、がん性又は非がん性サンプル、あるいは異なるステージのがん由来のサンプル）。
【００３７】
ここで、「示差的メチル化」という用語は、１サンプル又は群における１つ又は複数の標的遺伝子のメチル化レベルを、別のサンプル又は群における該１つ又は複数の標的遺伝子のメチル化レベルと比較した差異を指す。示差的メチル化は、増加したメチル化（「高メチル化」）又は減少したメチル化（「低メチル化」）に分類することができる。ここで、試験サンプルにおける標的遺伝子の「高メチル化」という用語は、基準サンプルにおける標的遺伝子の平均メチル化レベルに対して、少なくとも１０％増加したメチル化レベルを指す。本開示の様々な実施形態によれば、増加したメチル化レベルは少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０％でよい。
【００３８】
理解できるように、ここで記載されるすべての遺伝子又はポリヌクレオチド配列は、それぞれ指定された遺伝子又はポリヌクレオチド配列と少なくとも７５％のヌクレオチド配列同一性を有する変異体を含む。さらに、標的遺伝子配列は、そのバイサルファイト変換ヌクレオチド配列も包含する。従って、他に明確に断りがない限り、ここに記載したすべての遺伝子又はポリヌクレオチド配列は、「及びそのバイサルファイト変換ヌクレオチド配列、並びに該遺伝子又は該バイサルファイト変換ヌクレオチド配列と少なくとも７５％のヌクレオチド配列同一性を有するポリヌクレオチド配列」という表現により、すべての例において変更されるものとして理解されるべきである。
【００３９】
ここで特定されたある遺伝子又はヌクレオチド配列に対する「ヌクレオチド配列同一性パーセント（％）」は、必要であれば最大配列同一性パーセントを実現するため、配列をアラインし、ギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せず、基準ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチド残基と同一である候補配列におけるヌクレオチド残基のパーセントとして定義される。配列同一性パーセントを測定する目的のアライメントを、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを用いて、当技術分野の技術の範囲内の様々な方法で実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大アライメントを実現するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含めた、アライメントを測定する適当なパラメータを決定することができる。特定のポリヌクレオチド配列Ａの基準ポリヌクレオチド配列Ｂに対するヌクレオチド配列同一性パーセント（あるいは基準ポリヌクレオチド配列Ｂに対して、ある一定のヌクレオチド配列同一性％を有する特定のポリヌクレオチド配列Ａとして表すことができる）は以下の式により計算される：
【００４０】
【数１】
0006767512.tif 000002
【００４１】
式中、Ｘは配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴにより、Ａ及びＢのプログラムのアライメントにおいて、完全一致として記録されたヌクレオチド残基数であり、ＹはＡ又はＢのどちらか短い方におけるヌクレオチド残基の総数である。
【００４２】
「被験者」及び「患者」という用語はここで同じ意味で用いられ、本発明の診断方法を受けることができるヒトを含む動物を意味する。従って、「被験者」又は「患者」という用語は本開示の方法から恩恵を受けることができる任意の哺乳動物を含む。「哺乳動物」という用語はヒト、霊長類、及びウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシなどの家畜；並びに動物園で飼育されているか、スポーツ用であるか、ペット用の動物；マウス及びラットなどの齧歯動物を含む哺乳類のすべての動物を指す。「非ヒト哺乳動物」という用語はヒトを除く哺乳類のすべての動物を指す。１つの例示的な実施形態において、患者はヒトである。
【００４３】
ここで用いられる「サンプル」という用語は、患者から得られる任意のサンプルを含む。本開示の実施形態によれば、サンプルはＤＮＡ分子を含有し、そのメチル化レベルは測定されることができる。このような身体サンプルの例としては、血液、スミア、痰、尿、便、髄液、胆汁、消化管分泌物、リンパ液、骨肉腫、骨髄、臓器吸引物、及び器官又は組織生検材料が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に公知の通常の手段により、これらの身体サンプルを患者から得ることができる。さらに、当業者はまた、例えばフェノール／クロロホルムを用いた抽出、又は市販のキットによる抽出など、サンプルからのＤＮＡ単離のための方法及び試薬をよく知っている。
【００４４】
本開示は少なくとも一つには、以下に特定されるような１つ又は複数の標的遺伝子の示差的メチル化（特に高メチル化）が、被験者における腫瘍の進行又は腫瘍が存在しないことに関係するという知見に基づいている。従って、単独又は組み合わせたこれらの標的遺伝子を、新生物を発症している被験者のリスク又は感受性の予測、新生物の悪性度を測定するためのバイオマーカーとして用いることができる。さらに、患者の関連遺伝子のメチル化プロファイルを好適な治療レジメンを個々に調整するためのガイドとして用いることができる。例えば、ここに列挙される１つ又は複数の高メチル化標的遺伝子を有する患者のため、脱メチル化剤又は他のエピジェネティック薬を新生物を治療するために患者に投与することができる。
【００４５】
上記を考慮して、本開示は以下に別々に述べる様々な診断方法を提供する。例えば、すべての方法は少なくとも１つの標的遺伝子のメチル化状態又はメチル化レベルの測定を含む。従って、すべてではないが、殆どの請求項に記載された方法に共通する工程をまず以下の段落で説明する。
【００４６】
本開示の様々な態様及び／又は実施形態によれば、本開示の方法に共通する工程は、少なくとも（ａ）サンプル回収工程、（ｂ）少なくとも１つのメチル化状態測定工程；及び（ｃ）少なくとも１つの高メチル化測定工程を含む。
【００４７】
サンプル回収工程において、生きている被験者に関係する方法については、少なくとも生体サンプルはその被験者から得られる。本開示の様々な実施形態によれば、サンプルは、組織、組織サンプル、又は細胞サンプル（例えば、吸引生検材料、ブラシ生検材料、表面生検材料、針生検材料、パンチ生検材料、切除生検材料、直視下生検材料、切開生検材料、内視鏡下生検材料、子宮頸部擦過細胞、子宮擦過細胞又は膣洗浄などの組織生検材料）、腫瘍、腫瘍サンプル、又は体液（例えば、腹水、血液（血漿を含む）、血清、リンパ液、髄液）を含む、被験者、好ましくはヒトである被験者から得られるサンプル、又は被験者、好ましくはヒトである被験者に存在するサンプルである。本開示のある実施例によれば、サンプルは被験者の卵巣組織、細胞サンプル（例えば、子宮頸部擦過細胞）及び体液（例えば、血清及び血漿）から得られる。組織生検サンプル、子宮頸部擦過細胞、及び体液サンプル（例えば、血液又は尿）など既存の生体サンプルに直接行われる方法については、上述のサンプル採取工程は省略され、その既存のサンプルはその後の分析のために回収される。
【００４８】
工程（ｂ）に関して、下記実施例によれば、メチル化状態はｑＭＳＰ又はバイサルファイトパイロシークエンスを用いて測定される。しかしながら、理解できるように、本方法は上述の方法に限定されず、むしろ請求項に記載の発明の範囲は、特定の遺伝子のメチル化状態又はレベルを量的に測定する他の同等の方法の使用を包含する。理解できるように、上記方法及びその同等のものも下記実施形態に適用でき、従って、簡潔にするために、遺伝子のメチル化状態又はメチル化レベルを測定するのに好適な方法を以下の態様／実施形態において繰り返さない。
【００４９】
高メチル化測定工程において、該少なくとも１つの標的遺伝子の高メチル化の有無を測定する。
【００５０】
第１の態様において、本開示は被験者が子宮内膜がん（ＥＣ）を有するかどうかを判定する方法を提供し、この方法は上述のように、サンプル回収工程、メチル化測定工程；及び判定工程、並びに被験者におけるＥＣの有無が工程（ｃ）の結果に基づき測定される評価工程（ｄ）を含む。具体的に、少なくとも１つの標的遺伝子の高メチル化は、被験者がＥＣを有していることを示す。本開示のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの標的遺伝子の高メチル化が無ければ、被験者がＥＣを有していないことを示す。本開示のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの標的遺伝子の高メチル化が無ければ、被験者が子宮内膜新生物を有していないか、子宮内膜新生物が良性であることを示し、例えば筋腫は一般的な良性の子宮内膜新生物である。
【００５１】
本開示の様々な実施形態によれば、少なくとも１つの標的遺伝子はＢＨＬＨＥ２２もしくはＴＨＹ１又はその両方である。
【００５２】
いくつかの実施形態において、ＢＨＬＨＥ２２及び／又はＴＨＹ１に加えて、標的遺伝子はさらにＡＤＡＲＢ２、ＣＤＯ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２、ＧＡＴＡ４、ＨＯＸＡ９、ＭＴＭＲ７、ＮＴＭ、ＰＲＫＣＤＢＰ、ＴＢＸ５及びＺＮＦ６６２の少なくとも１つを含む。
【００５３】
ある任意の実施形態によれば、少なくとも１つの標的遺伝子はＢＨＬＨＥ２２及びＣＤＯ１を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子はＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１及びＴＢＸ５を含む。いくつかの他の実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子はＢＨＬＨＥ２２、ＴＨＹ１、ＣＤＯ１及びＣＬＶＳ２を含む。さらにいくつかの他の実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子はＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１及びＣＥＬＦ４を含む。別の例として、少なくとも１つの標的遺伝子はＢＨＬＨＥ２２及びＣＥＬＦ４を含む。あるいは、少なくとも１つの標的遺伝子はＴＨＹ１及びＣＤＯ１を含む。さらにあるいは、少なくとも１つの標的遺伝子はＴＨＹ１及びＣＤＯ１、並びにＣＬＶＳ２及びＧＡＴＡ４の１つ又はその両方を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの標的遺伝子はＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１、ＴＨＹ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２、ＧＡＴＡ４、ＮＴＭ、ＰＲＫＣＤＢＰ及びＴＢＸ５を含む。
【００５４】
１つを超える標的遺伝子のメチル化状態を測定する実施形態において、該標的遺伝子の高メチル化の有無に基づき判定を行うことができる。
【００５５】
本開示の様々な実施形態によれば、サンプルは被験者の子宮頸部擦過細胞又は子宮内膜サンプル由来である。
【００５６】
本開示のある実施形態によれば、本方法は被験者が初期段階（国際産婦人科連合の原則によればステージＩ又はＩＩ）の子宮内膜癌腫を有しているかどうかを判定するために用いられる。いくつかの任意の実施形態において、サンプルは被験者の子宮頸部擦過細胞由来であり、ＢＨＬＨＥ２２、並びにＣＤＯ１及びＣＥＬＦ４の少なくとも１つの高メチル化が、被験者が子宮内膜癌腫を有する指標である。本開示の様々な実施形態によれば、子宮内膜癌腫はＩ型又はＩＩ型子宮内膜癌腫でよい。ＩＩ型子宮内膜がんががん発生後期（例えばステージ３又は４）に診断されることが多い従来の診断手段と比較して、本方法は、がんがより悪性段階に進行する前に診断を行うのに特に有利である。
【００５７】
理解できるように、被験者が子宮内膜癌腫を有しているかどうかを判定するための診断手段を調製するため、本開示で特定されたバイオマーカーを用いることができる。
【００５８】
例えば、キットはＢＨＬＨＥ２２、ＴＨＹ１、ＡＤＡＲＢ２、ＣＤＯ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２、ＧＡＴＡ４、ＨＯＸＡ９、ＭＴＭＲ７、ＮＴＭ、ＰＲＫＣＤＢＰ、ＴＢＸ５及びＺＮＦ６６２など、上記特定された１つ又は複数のバイオマーカーのメチル化レベルを測定するために用いることができる物質を含んでよい。
【００５９】
第２の態様において、本開示は被験者が婦人科癌腫又は大腸癌腫を有するかどうかを判定する方法を提供する。本方法はまた、上述のように、共通工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）、並びに被験者における婦人科癌腫又は大腸癌腫の存在を工程（ｃ）の結果に基づき測定する判定工程（ｄ）を含む。特に、少なくとも１つの標的遺伝子の高メチル化は、被験者が婦人科癌腫又は大腸癌腫を有することを示す。本開示のいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの標的遺伝子の高メチル化が無ければ、被験者が婦人科新生物又は大腸新生物を有していないか、あるいは婦人科新生物又は大腸新生物が良性であることを示す。
【００６０】
本開示の様々な実施形態によれば、少なくとも１つの標的遺伝子はＡＤＡＲＢ２、ＣＬＶＳ２、ＨＯＸＡ９、ＭＴＭＲ７及びＮＴＭからなる群から選択される。
【００６１】
本開示のある実施形態によれば、婦人科癌腫はＩ型子宮内膜癌腫、ＩＩ型子宮内膜癌腫、卵巣癌腫、膣癌腫、外陰癌腫、妊娠性絨毛性疾患（ＧＴＤ）及び原発性腹膜癌腫である。
【００６２】
同様に、被験者が婦人科癌腫又は大腸癌腫を有するかどうかを判定する診断手段を調製するため、本開示で特定されるバイオマーカーを用いることができる。
【００６３】
例えば、キットはＡＤＡＲＢ２、ＣＬＶＳ２、ＨＯＸＡ９、ＭＴＭＲ７及びＮＴＭなど、上記特定された１つ又は複数のバイオマーカーのメチル化レベルを測定するために用いることができる物質を含んでよい。
【００６４】
以下の実施例は本発明のある態様を説明し、当業者が本発明を実施するのを助けるために提供される。これらの実施例は本発明の範囲をいかなる方法によっても限定すると見なされるものではない。さらに詳細に述べるまでもなく、当業者はここでの説明をもとに本発明を十分に利用することができると考えられる。ここで引用されるすべての出版物はその全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【００６５】
材料及び方法
１．組織検体
組織検体はすべて、台湾新北市、台北医学大学双和医院で２０１４年１０月から２０１６年５月に採取した。選定基準は、研究参加者が３０〜８０歳の女性であることを規定した。年齢、腫瘍の組織型、国際産婦人科連合のステージ、及び組織学的グレードを各参加者の入院記録から考察した。ヘルシンキ宣言２０００に従い、台北医学大学双和医院の施設内倫理委員会の承認を得て、研究を行った。インフォームドコンセントは本研究における全参加者から得られた。
【００６６】
子宮内膜検体を手術中に得、液体窒素で直ちに凍結し、分析まで−８０℃で保管した。婦人科病理医による組織検査を用いて各サンプルの病理診断を確認した。筋腫患者から正常上皮組織を採取した。
【００６７】
筋腫又は子宮内膜癌腫と診断された患者から子宮頸部擦過細胞を採取し、サンプル採取時に女性患者に卵巣及び子宮頸部疾患はなかった。子宮頸管擦過細胞を以下のように採取した。新しい子宮頸管ブラシを子宮頸管に挿入し、３から５回静かにブラシを回転させて、適当なサンプル採取を確実に行う。その後、ブラシをＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ、ライフテクノロジーズ、米国）２ｍｌを含む遠心分離管（１５ｍｌ）に入れ、遠心分離管のキャップを閉じた。子宮頸管擦過細胞検体を４℃で保管した。１０秒間ボルテックスした後、スワブ細胞含有サンプルを３本の微小遠心分離管（１本当たり１ｍｌ）に分注し、さらなる分析まで−８０℃で保管した。
【００６８】
２．探索及び検証
探索群において、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データ（２７０の悪性子宮内膜腫瘍組織及び２８の正常子宮内膜組織の使用を含む）、Ｅｍ−ＭｅｔｈｙｌＣａｐ−ｓｅｑ（７８の悪性子宮内膜腫瘍組織及び１１の正常子宮内膜組織を含む）、並びにＨＣＬデータ（１０の悪性子宮内膜腫瘍組織及び筋腫である１０の正常子宮内膜組織を含む）の公開データを用いて、メチル化バイオマーカーを特定した。メチル化バイオマーカーを検証するために用いられたサンプルは、２５の子宮内膜悪性腫瘍組織、筋腫である５の正常子宮内膜、並びに子宮内膜悪性腫瘍組織、筋腫及び正常子宮内膜を有する被験者から採取されたそれぞれ１５、１０及び１５の子宮頸部擦過物を含んでいた。
【００６９】
検証群で用いられたトレーニングセットについて、子宮内膜がん、筋腫の被験者、及び健常被験者から採取されたそれぞれサイズ２８の子宮頸部擦過サンプルを用いた。実施例１における検証群のテストセットについて、同じサイズのサンプルを用いた。実施例２における検証群で用いられるテストセットのため、子宮内膜悪性腫瘍組織、筋腫及び正常子宮内膜を有する被験者から採取されたそれぞれ５０、４０及び５６の子宮頸部擦過細胞サンプルを用いた。
【００７０】
３．ゲノム−野生型ＤＮＡメチロミクス分析
３．１．４５０Ｋ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｂｅａｄアレイ
２９８の子宮内膜組織（類内膜型ＥＣ及び２８の周囲正常組織）の第１メチロミクス分析は、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ４５０Ｋ  ＢｅａｄＣｈｉｐアレイ（イルミナ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて実施し、ＥＣの示差的メチル化プロファイルを特定した。ＴＣＧＡデータポータルのレベル３データを用いた。各ＣｐＧのメチル化スコアをβ値として表し、正規化した。がん、癌腫サンプルは≧４０％の新生物細胞密度を示した。我々は性染色体にマッピングされたプローブを除去し、一塩基多型（ＳＮＰ）を覆い、残りの３７９，０５４個のＣｐＧ部位を本研究で分析することに集中した。がん、癌腫サンプルは≧４０％の新生物細胞密度を示した。顕著に異なるメチル化ＣｐＧ部位をマン・ホイットニーのＵ検定及びＰ≦０．００１を用いて分析した。我々はコーディング遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）に最も近い（±１０００ｂｐ）ＣｐＧ部位にさらに集中した。最後に、我々はコーディング遺伝子に≧５個の残りのＣｐＧ部位を有する高メチル化候補を選択した。また、ＥＣ値の読み取り中央値から正常値を引いた上位５％の高メチル化差を選択した。
【００７１】
３．２．ＭｅｔｈｙｌＣａｐシークエンシング
ＭｅｔｈｙｌＭｉｎｅｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（インビトロジェン、カリフォルニア州カールスバッド）を用い、メーカの説明書に従って、メチル化ＤＮＡをゲノムＤＮＡ２μｇから濃縮した。簡単に述べると、ゲノムＤＮＡを約２００ｂｐに超音波切断し、ＭＢＤタンパク質により捕捉し、１Ｍ塩バッファを用いて沈殿させた。イルミナ（カリフォルニア州サンディエゴ）の標準プロトコールに従って、濃縮されたメチル化ＤＮＡを配列決定用のライブラリ作製のために用いた。イルミナＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘシステムを用いてＭｅｔｈｙｌＣａｐ−ｓｅｑライブラリを配列決定した。イルミナの標準経路を用いて画像解析及びベースコールを実施した。ＥＬＡＮＤアルゴリズムを用い、２個までのマスマッチ塩基対で、独自のリード（３６ｂｐリードまで）をヒトの基準ゲノム（ｈｇ１８）にマッピングした。
【００７２】
独自にマッピングされたリードを追加の線形正規化及び示差的メチル化分析に用いた。以下の等式１及び２を用いて、リード数を集積することによりメチル化レベルを計算した。
【００７３】
【数２】
0006767512.tif 000003
【００７４】
Ｎ＿（Ｒｅａｄ，ｉ）はｉ区間で正規化されたリード数であり；Ｕ＿（Ｒｅａｄ，ｉ）はｉ区間で独自にマッピングされたリード数であり、Ｎ＿Ｕは独自にマッピングされたリード総数である。「ＩＮＴ」は要素を負の無限大方向の最も近い整数に丸め、「＾」はべき乗演算を意味する。メチル化レベルの領域は正規化された独自のリードの平均により表される。Ａ及びＢ群（Ｇ＝Ａ又はＢ）の比較のため、平均メチル化レベル（ＡＶＧＲ，Ｇ）を所定の領域Ｒ（ｍ区間サイズを含み、ｓ区間に開始する）において２群で別々に計算した。サンプル数はＡ群でＳ＿Ａ、Ｂ群でＳ＿Ｂである。
【００７５】
【数３】
0006767512.tif 000004
【００７６】
ＡＶＧＲ，ＧはＲ領域でのＧ群の平均メチル化レベルを意味する。ＭＲ，ＧはＲ領域でのＧ群の各サンプルのメチル化レベルである。両側及びマン・ホイットニーのＵ検定（Ｐ≦０．００１）を用いてＲ領域での異なるメチル化の統計的有意性を特定した。症例及び対照サンプル間で特異的にメチル化された部位を分析した。コーディング遺伝子のＴＳＳの１０００ｂｐ上流及び下流にわたる２０００ｂｐ領域のメチル化レベルを分析した。我々は性染色体のＴＳＳ領域を除外し、残りの２３，２１５ＴＳＳ領域を本研究で分析し、ＥＣ値の読み取り中央値から正常値を引いた上位５％の高メチル化差を選択した。
【００７７】
ＴＣＧＡデータポータルは４５０Ｋ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｃｈｉｐアレイを用いて組織サンプルを分析し、このデータポータルは４１７の子宮内膜組織からのデータセットを含んでいた。このうち、≧４０％の新生物細胞密度を有する３７１のがん症例を本研究のために選択した。症例及び対照群間の異なるメチル化ＣｐＧ部位を調査するため、ノンパラメトリック検定を用いた。Ｐ≦０．００１のプローブ及び高β値の上位５％の示差的メチル化をまず選択した。その後、コーディング遺伝子の転写開始部位に対して−１０００から＋１０００にわたる領域内に位置する重要なプローブを特定した。少なくとも５個の特定されたプローブを有する高メチル化遺伝子を我々の選択基準で選択した。
【００７８】
３．３．ＤＮＡメチル化プロファイルのクラスタ解析及び候補の選択
ＭｅＶ４の４．９版の機能におけるマンハッタン距離に基づく凝集型階層的クラスタリングの完全連結法を用いてＤＮＡメチル化プロファイルを得た。各群において、がんのメチル化変化であまり報告されていない１から２候補、及び非ＥＣ参加者における正常子宮内膜の低シグナルを選択した。
【００７９】
４．定量的ＤＮＡメチル化ポリメラーゼ連鎖反応
４．１．ゲノムＤＮＡの調製及びバイサルファイト変換
ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン、ドイツ連邦共和国ヒルデン）を用い、検体からゲノムＤＮＡを抽出した。メーカ推奨により、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ、米国カリフォルニア州）を用いて、ゲノムＤＮＡ（１μｇ）をバイサルファイト修飾し、ヌクレアーゼフリー水７０μＬに溶解した。バイサルファイトＤＮＡをＤＮＡメチル化分析のテンプレートとして用いた。
【００８０】
４．２．ｑＭＳＰ
特異的プローブ及びプライマーを用いる定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）を実施して、非メチル化（ＣＯＬ２Ａ１）総インプットＤＮＡを参照することにより相対ＤＮＡメチル化レベルを特定した。
【００８１】
ＰＣＲ産物をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０用ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ、米国インディアナ州インディアナポリス）で増幅し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０を用いて実施した。２０μｌ反応混合物は、バイサルファイト変換ＤＮＡ２μＬ、各プライマー２５０ｎＭ、及びマスターミックス１０μｌを含有した。以下の９５℃５分、並びに９５℃１０秒、６０℃３０秒及び７２℃３０秒の５０サイクル、７２℃５分の最終伸長の温度プロファイル下、反応をＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０で実施した。同様の試験をすべての検体における各遺伝子に実施した。ＤＮＡメチル化レベルは式：（遺伝子のＣｐ）−（ＣＯＬ２ＡのＣｐ）］を用いてΔＣｐを推定する。ＣＯＬ２ＡのＣｐ値が＞３６である試験結果は検出失敗と定義した。Ｏｌｉｇｏ７．０プライマー解析ソフトウェアによりプライマーを設計した。
【００８２】
５．統計
マン・ホイットニーのノンパラメトリックなＵ検定を用いて、２つのカテゴリ間のメチル化レベル差を特定し、クラスカル−ウォリス検定を用いて、２つを超えるカテゴリ間のメチル化レベル差を特定した。
【００８３】
独立群において、真陽性率（すなわち、感度）を偽陽性率（つまり、１−特異度）に対してプロットして、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を得た。最も優れた精度を判定するため、ＲＯＣの曲線下面積（ＡＵＣ）を用いて２群のサンプルを区別する至適カットオフ値を特定した。最適閾値を「ｃｌｏｓｅｓｔ．ｔｏｐｌｅｆｔ」法及びＲのｐＲＯＣパッケージにおけるブートストラッピングの２００回繰り返しにより計算した。実行した方法において、式は［（１−感度）２＋（１−特異度）２］の最小合計である。ロジスティック回帰を用いてＯＲ及び９５％ＣＩを推定し、各候補遺伝子及び遺伝子組合せのメチル化状態に伴うＥＣリスクを説明する。すべての有意差を両側Ｐ＜０．０５を用いて判断し、上記分析及びプロットをＲの統計パッケージ（３．１．２版）及びＭｅｄＣａｌｃ（１４．１２．０版）を用いて実施した。ペアワイズフィッシャーの正確確率事後検定及び０．０１のアルファ誤差の想定割合を用いて、Ｇ＊Ｐｏｗｅｒ３．１．９．２版により統計的検出力を評価した。
【実施例１】
【００８４】
子宮内膜がんの診断に関連する高メチル化遺伝子の特定
探索群において、ＭｅｔｈｙＣａｐシークエンシング及びｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｂｅａｄ  ｃｈｉｐのデータを用い、子宮内膜がんにおける新規高メチル化遺伝子を特定して、各遺伝子のＴＳＳから±１ｋｂに位置するＤＭＲを特定した。第１の分析段階において、異なるデータベースにおける子宮内膜癌腫及び正常サンプル間の遺伝子のメチル化レベルを比較し、メチル化パターンのコンセンサスクラスタリングにより１８０の遺伝子を特定した。臨床的意義及び機能濃縮の我々の選択基準でフィルタリング後、２３個の遺伝子を選択した（図１パネルＡ参照）。
【００８５】
探索群において特定された２３の候補遺伝子をさらに検証した。正常子宮内膜組織（ｎ＝１５）、筋腫子宮内膜（ｎ＝１０）及び悪性子宮内膜癌腫組織（ｎ＝１５）のプールＤＮＡをｑＭＳＰに付し、１４の遺伝子を特定した。１４の候補遺伝子をさらに検証した。悪性子宮内膜癌腫（ＥＣ、ｎ＝５６）又は筋腫（Ｍｙｏ、ｎ＝４０）と診断された患者、及び正常子宮内膜組織（Ｎｏｒ、ｎ＝５０）を有する被験者からの子宮頸部擦過物のプールＤＮＡをバイサルファイトパイロシークエンスに付した。結果（図２及び表１）は、子宮頸部擦過サンプルを用い、上記９遺伝子が子宮内膜癌腫及び正常又は筋腫子宮内膜組織を有する被験者を区別することもできることを示す。
【００８６】
【表１】
0006767512.tif 000005
【００８７】
特に、図２のパネルＡにおけるドットプロットはＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１、ＣＥＬＦ４及びＺＮＦ６６２のメチル化状態の分布を示す。個々の子宮頸部擦過物を用い、ＤＮＡメチル化状態は正常子宮内膜及び筋腫のサンプルよりもＥＣサンプルで高いことが確認された。プロットの横線は表１に列記されたカットオフ値を表した。Ｐ値はクラスカル・ウォリス検定により計算した。
【００８８】
さらに、図２のパネルＢで説明するように、全４遺伝子は１に近いＡＵＣ値（０．８９〜０．９５）を有する優れた受信者操作特性下面積を示し、より良いクラスタを示した。
【００８９】
遺伝子の組合せの性能も評価され、表１に示すように、結果は単一の遺伝子と比べ、遺伝子の組合せを用いてより良い特異度が実現されることを示した。より具体的には、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＥＬＦ４及びＣＤＯ１の組み合わせた試験は、感度９１．８％、特異度９５．５％であり、任意の２つの陽性試験のリスクは２３６．３倍上昇した（９５％ＣＩ、５６．４〜９８９．６）。これらの結果は初期段階のＥＣの検出と同様であった（感度、８９．５％；特異度、９５．５％；ＯＲ、１７８．５、９５％ＣＩ、４２．２〜７５４．９）。ＩＩ型類内膜がんと診断された一部の患者由来の子宮頸部擦過物における候補遺伝子のメチル化状態を表２に示した。
【００９０】
【表２】
0006767512.tif 000006
【実施例２】
【００９１】
子宮内膜癌腫の診断に関連する高メチル化遺伝子の特定
探索群において、上記で特定されたデータセットを用いて子宮内膜がんにおける新規高メチル化遺伝子を特定した。各遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から±１ｋｂに位置する示差的メチル化領域（ＤＭＲ）を特定した。第１の分析段階において、ＴＣＧＡデータセットの腫瘍及び正常サンプル間の遺伝子のメチル化レベルを比較し、４６遺伝子を特定した。さらに、ＴＣＧＡデータセットの腫瘍及び正常サンプル間の遺伝子のメチル化レベルを比較して、候補遺伝子を特定した。一貫して高メチル化レベルを示す合計１５遺伝子を特定した（図１パネルＢを参照）。
【００９２】
探索群において特定された１５候補遺伝子をさらに検証し、筋腫（ＥｍＮ＿Ｍｙｏ、ｎ＝５）の正常子宮内膜、及び悪性子宮内膜がん組織（ＥＣ、ｎ＝２５）のプールＤＮＡをｑＭＳＰに付した。結果（図３）は全１５候補遺伝子が悪性子宮内膜がん組織において著しい高メチル化を表すことを示す。
【００９３】
候補遺伝子をまたさらに検証し、正常子宮内膜組織を有する被験者（Ｎ＿Ｅｍ、ｎ＝１５）、あるいは悪性子宮内膜腫瘍（ＥＣ、ｎ＝１５）又は筋腫（Ｍｙｏ、ｎ＝１０）と診断された患者の子宮頸部擦過物のプールＤＮＡをｑＭＳＰに付した。結果（図４）は子宮頸部擦過サンプルを用い、１５遺伝子のうちの１１遺伝子が悪性腫瘍及び正常又は筋腫の子宮内膜組織を有する被験者を区別することができることも示す。該１１遺伝子はＡＤＡＲＢ２、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１、ＣＬＶＳ２、ＧＡＴＡ４、ＨＯＸＡ９、ＭＴＭＲ７、ＮＴＭ、ＰＲＫＣＤＢＰ、ＴＢＸ５及びＴＨＹ１である。なお、ＦＯＸＩ２は示差的メチル化を示したが、シグナルは比較的弱く、従って、さらなる検証から除外した。
【００９４】
該１１候補遺伝子、並びに以前に特定された遺伝子ＣＥＬＦ４のメチル化プロファイルをさらに調査した。図５はトレーニングセット（パネルＡ）及びテストセット（パネルＢ）における受信者操作特性曲線下面積を用い、ＥＣ及び非ＥＣサンプルを区別する候補遺伝子の性能を説明する。全分析のＰ値は０．５に等しい面積の比較について＜０．００１であった。閾値には白丸を付け、表３に一覧した。
【００９５】
【表３】
0006767512.tif 000007
【００９６】
表３のデータは６試験遺伝子（ＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２、ＧＡＴＡ４及びＴＨＹ１）が正常な子宮内膜及び筋腫を有する被験者を子宮内膜癌腫の被験者から区別する著しい精度（少なくとも８０％）を表したことを示す。さらに、ＢＨＬＨＥ２２、ＣＤＯ１、ＣＥＬＦ４、ＣＬＶＳ２及びＴＨＹ１のＡＵＣ値は、０．８３から０．９の範囲であり、より良いクラスタを示す。より良い精度を有する遺伝子を遺伝子の組合せの性能に関する次の分析のために選択し、結果を表４に要約する。
【００９７】
【表４】
0006767512.tif 000008
【００９８】
表４のデータは、これらの遺伝子の組合せが総子宮頸部擦過物（表４、５６ＥＣ、５６筋腫及び５６正常）を用いて、任意の単一の遺伝子よりも良い精度を有することを証明する。
【実施例３】
【００９９】
他の婦人科癌腫及び大腸癌腫における候補遺伝子の交差検証
異常婦人科疾患又は大腸癌腫を区別する能力について、ＡＤＡＲＢ２、ＣＬＶＳ２、ＨＯＸＡ９、ＭＴＭＲ７、ＮＴＭ及びＰＲＫＣＤＢＰをさらに調査し、結果を図６に要約する（各記号は５人のプールＤＮＡからのデータを表す）。大腸組織サンプル（Ｃｏ）において、正常大腸組織（１Ｎ）におけるメチル化レベルと比較して、ＡＤＡＲＢ２、ＣＬＶＳ２、ＨＯＸＡ９、ＭＴＭＲ７及びＮＴＭは、大腸がん（Ｃａ）で高いメチル化を示した。卵巣（Ｏｖ）組織において、全７遺伝子は卵巣がんで高いメチル化レベルを示した。各三角及び丸はサンプルの５等量のＤＮＡによりプールされる。
【０１００】
実施形態の上記説明は実施例のためにのみ記載するものであり、当業者により様々な変更を行うことができることが理解されるであろう。上記明細書、実施例、及びデータは本発明の実施形態の構造及び使用を完全に説明する。本発明の様々な実施形態はある程度の特殊性をもって、あるいは１つ又は複数の個別の実施形態を参照して上記に記載されているが、当業者は本発明の趣旨又は範囲を逸脱することなく、開示された実施形態に多くの変化を加えることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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