(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合パターンがキメラ化によって失われ、その結果プロアポトーシス活性が損失したヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）キメラ抗体のプロアポトーシス活性を増加させる方法であって、前記キメラ抗体のヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させることによって、または前記ヒトＣＨ１γ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）もしくはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）由来のＣＨ１ドメインにより置換する工程によって、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復する工程を含み、
前記変異させる工程において、ヒトＣＨ１γ１ドメインは、１３３または１３４位のアミノ酸がシステインで置換されている、
方法。
【請求項２】
前記方法は、前記ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復するように前記ＩｇＧ１キメラ抗体由来のヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒトＣＨ１γ１ドメインは、１３３位のアミノ酸がシステインで置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復するように前記ＩｇＧ１キメラ抗体由来のヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる工程は、
ａ）ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）キメラ抗体のＣＨ１ドメインを含む核酸配列であって、好ましくは前記抗体の重鎖をコードする、核酸配列を単離することと、
ｂ）コドンを変異させ、好ましくはアミノ酸残基システイン（Ｃ）をコードするように前記ＣＨγ１ドメインの１３３または１３４位をコードするコドンを変異させて、変異核酸配列を提供することと、
ｃ）前記変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
ｄ）適切な宿主中で前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列と前記変異核酸を同時発現し、それにより変異ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）キメラ抗体を提供することと、
ｅ）任意に、変異ＩｇＧ１キメラ抗体を単離することと
によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、前記ヒトＣＨ１γ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）またはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）のＣＨ１ドメインにより置換する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩｇＧ１キメラ抗体のヒトＣＨ１γ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）またはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）のＣＨ１ドメインにより置換する工程は、
ａ）ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）キメラ抗体のＣＨ１ドメインを含む核酸配列であって、好ましくは前記抗体の重鎖をコードする、核酸配列を単離することと、
ｂ）前記ＣＨ１γ１核酸配列を、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）またはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）のＣＨ１ドメインをコードする核酸配列により置換して変異核酸配列を提供することと、
ｃ）前記変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
ｄ）適切な宿主中で前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列と前記変異核酸を同時発現し、それにより変異ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）キメラ抗体を提供することと、
ｅ）任意に、変異ＩｇＧ１キメラ抗体を単離することと
によって行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヒンジとＣＨ２ドメインとの間の対合パターンがキメラ化によって失われた前記ＩｇＧ１キメラ抗体のヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを変異させることによって、または前記ヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４のヒンジドメインにより置換することによって、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスに特有のヒンジとＣＨ２ドメインとの間の対合を修復する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスに特有のヒンジとＣＨ２ドメインの間の対合を修復するように前記ＩｇＧ１キメラ抗体由来のヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを変異させる工程は、前記ヒトヒンジＩｇＧ１の配列の５番目の位置におけるシステイン残基を、別の残基、好ましくはセリンにより置換することによって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４サブクラスに特有のヒンジとＣＨ２ドメインの間の対合を修復するように前記ＩｇＧ１キメラ抗体のヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを変異させる工程は、
ａ）ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）キメラ抗体のヒンジドメインを含む核酸配列であって、好ましくは前記抗体の重鎖をコードする、核酸配列を単離することと、
ｂ）別のアミノ酸残基、好ましくはセリン残基をコードするように前記ヒンジＩｇＧ１ドメインの５位におけるアミノ酸残基システイン（Ｃ）をコードするコドンを変異させて、変異核酸配列を提供することと、
ｃ）前記変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
ｄ）適切な宿主中で前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列と前記変異核酸を同時発現し、それにより変異ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）キメラ抗体を提供することと、
ｅ）任意に、変異ＩｇＧ１キメラ抗体を単離することと
によって行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＩｇＧ１キメラ抗体のヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒンジドメインにより置換する工程は、
ａ）ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）キメラ抗体のヒンジドメインを含む核酸配列であって、好ましくは前記抗体の重鎖をコードする、核酸配列を単離することと、
ｂ）前記ＩｇＧ１ヒンジドメイン核酸配列を、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のヒンジドメインをコードする核酸配列により置換して、変異核酸配列を提供することと、
ｃ）前記変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供することと、
ｄ）適切な宿主中で前記抗体の軽鎖をコードする核酸配列と前記変異核酸を同時発現し、それにより変異ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）キメラ抗体を提供することと、
ｅ）任意に、変異ＩｇＧ１キメラ抗体を単離することと
によって行われる、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本国際特許出願は、２０１３年１１月１２日に出願された仮出願ＵＳ６１／９０２，９２６号の優先権を主張し、その出願は本明細書に参照として援用される。
【０００２】
本発明は、新規抗体および治療におけるその使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
抗体は、標的分子（抗原）に対する高い結合活性および結合特異性、ならびに血液中で高い安定性を有するタンパク質分子であるので、種々のヒト疾患のための診断、予防および治療剤へのそれらの適用が試みられている。抗体は一般に非ヒト動物に対する抗原を投与（免疫化）することによって産生されるが、非ヒト動物から得た抗体は種に特異的なアミノ酸配列を有し、抗体がヒトの体内において外来物質と認識されるので副作用が引き起こされる。したがって、ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体が遺伝子組換え技術を使用してヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体から調製されている。
【０００４】
ヒトキメラ抗体およびヒト化抗体は、マウス抗体などの非ヒト動物抗体が有する問題（例えば高い免疫原性、低いエフェクター機能および短い血中半減期）を解決しているので、モノクローナル抗体の医薬製剤への適用がそれらを使用することによって可能になった。米国において、例えば、複数のヒト化抗体が、がん治療のための抗体として既に承認されており、市販されている。
【０００５】
これらのヒトキメラ抗体およびヒト化抗体は実際に臨床レベルにおいてある程度まで効果を示すが、より高い効果を有する治療抗体が要求されている。例えば、ＣＤ２０に対するヒトキメラ抗体であるリツキサン（ＩＤＥＣ／Ｒｏｃｈｅ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって製剤される）の単回投与の場合、第ＩＩＩ相臨床試験における再発性低悪性度の非ホジキンリンパ腫の患者に対するその反応の割合は４８％以下（完全寛解６％、部分的寛解４２％）であり、反応のその平均期間は１２ヶ月であることが報告されている。ＨＥＲ２に対するヒト化抗体であるハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによって製造される）の単回投与の場合、第ＩＩＩ相臨床試験における転移性乳がんの患者に対するその反応の割合は１５％のみであり、反応のその平均期間は９．１ヶ月であることが報告されている。
【０００６】
ヒト抗体分子はまた、免疫グロブリン（本明細書以下でＩｇと称する）とも呼ばれており、その分子構造に基づいてＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのサブクラスに分類される。４種のヒトＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）は、ヒンジが多種多様を示していることを除いて、Ｈ鎖定常領域のアミノ酸配列が互いに高度に相同している。しかしながら、これらのアイソタイプは異なる強さのエフェクター活性を誘導する。一般に、ＡＤＣＣ活性は以下の順：ＩｇＧ１＞ＩｇＧ３＞ＩｇＧ４＝ＩｇＧ２で減少するのに対して、ＣＤＣ活性は以下の順：ＩｇＧ３≧ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２≒ＩｇＧ４で減少する。
【０００７】
ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ３は優れたＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を有するサブクラスであるが、ヒトＩｇＧ３抗体は他のヒトＩｇＧサブクラスより短い血中半減期を有するので、投与後に血液から急速に消失することが知られている。ヒトＩｇＧ３は、他のヒトＩｇＧサブクラスと異なり、プロテインＡ結合活性を有さないことも知られている。工業規模で抗体を産生する際に、プロテインＡを使用する精製プロセスが優勢であり、例えばプロテインＧを使用する他のプロセスは、高い精製コストなどのいくつかの問題がある。
【０００８】
上記に基づいて、ヒトＩｇＧ１抗体が抗体薬物として最も適したサブクラスであると言われ得る。なぜならそれは、他のサブクラスより高いＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性を有し、プロテインＡを使用して精製でき、長い血中半減期を示し、製造コストの観点からメリットがあるからである。ヒトＩｇＧ１抗体は上記のように実際に薬物として利用されているが、既存の抗体薬物により示される薬物効果はいまだに不十分である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、改善された効果を有する抗体薬物が必要とされている。
【００１０】
多くの修飾が、その一部をスワッピングすることによってヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列に導入されている。しかしながら、天然に存在していないアミノ酸配列の置換により調製されたこのような抗体は、ヒトの体内において外来物質と認識されるので、上記の非ヒト動物抗体と同様の副作用を誘導する危険性を有する。他方で、ヒトサブクラス間のアミノ酸配列をスワッピングすることによって調製された抗体のアミノ酸配列は、ヒトが生来的に保有している抗体のアミノ酸配列の組み合わせである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ここで、本発明者らは、驚くべきことに、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復するキメラ抗体（ｃ８Ｂ６）のＣＨ１γ１における特定の変異、またはヒトＣＨ１γ３によるその置換の結果、親マウスＩｇＧ３  ８Ｂ６抗体のプロアポトーシス活性の修復を生じることを示し、この特性はほとんどのＩｇＧ３抗体に固有である。
【００１２】
したがって、ＣＨ１ドメインにおけるシステインの不在のために、ヒトＩｇＧ１におけるヒンジとＣＬドメインとの間の非定型対合は、ＩｇＧ１抗体で観察される低いプロアポトーシス活性に関連しているようである。
【００１３】
したがって、本発明は、ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体、その誘導体または機能的断片の治療効果を増加させる方法であって、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復するように前記抗体由来のヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる工程、または前記ヒトＣＨ１γ１ドメインを、ヒト非ＩｇＧ１サブクラス由来ＣＨ１ドメイン、例えばＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）由来、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）由来またはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）由来ＣＨ１ドメインに置換する工程を含む、方法に関する。
【００１４】
本発明の方法によって得られるＩｇＧ１由来抗体はＩｇＧ１固有の特性と増加したプロアポトーシス活性の組み合わせを示し、可能性のある治療効果をもたらす。
【００１５】
本発明はまた、このような方法によって得られ得る抗体またはその機能的断片に関し、前記抗体は、
ａ）以下のアミノ酸配列：
ｉ）抗原に特異的な軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、および
ｉｉ）ヒトカッパ（κ）定常（ＣＬ）ドメイン
を含む軽鎖と、
ｂ）以下のアミノ酸配列：
ｉ）前記抗原に特異的な重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、
ｉｉ）ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびに
ｉｉｉ）他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復するように変異されるか、またはヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインにより置換される、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメイン
を含む重鎖とを含む。
【００１６】
本発明はまた、このような抗体および薬学的に許容可能な担体の少なくとも１つを含む医薬組成物に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、がんを治療する方法であって、少なくとも１つの前記抗体または少なくとも１つのその機能的断片を含む、このような医薬組成物を、それを必要とする患者に提供する工程を含む、方法に関する。
【００１８】
最後に、本発明は、がんを治療および／または予防するための医薬を調製するための少なくとも１つのこのような抗体または少なくとも１つのその機能的断片の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ｃ８Ｂ６抗体の軽鎖および重鎖配列を示す。
【図２】３０１．１４ａ抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。
【図３】３０１．１４ｂおよび３１１．１４ｂ抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。
【図４】３０１．１５および３１１．１５抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。
【図５】３０１．１６抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。
【図６】３０１．１７抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。
【図７】３０１．１８抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。
【図８】３０１．１９抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。
【図９】３０１．１５ｂ抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。
【図１０】３０１．２０抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。
【図１１】３０１．２１抗体のＣＨ１ドメインおよびヒンジドメイン配列を示す。
【図１２】ヨウ化プロピジニウムによる抗ＯａｃＧＤ２抗体の直接細胞毒性を示す。
【図１３】ヨウ化プロピジニウムによる抗ＧＤ２抗体の直接細胞毒性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
第１の態様において、本発明は、ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体、その誘導体または機能的断片の治療効果を増加させる方法であって、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復するように前記抗体由来のヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる工程、または前記ヒトＣＨ１γ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）もしくはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）由来のＣＨ１ドメインに置換する工程を含む、方法に関する。
【００２１】
治療効果を増加させる前記方法は前記抗体のプロアポトーシス活性を増加させる工程を含む。
【００２２】
抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続される４つのポリペプチド鎖、２つの同一の重（Ｈ）鎖（完全長のとき約５０〜７０ｋＤａ）および２つの同一の軽（Ｌ）鎖（完全長のとき約２５ｋＤａ）を含む四量体に対応する免疫グロブリン分子である。軽鎖はカッパおよびラムダと分類される。
【００２３】
重鎖はＩｇＧについてγと分類される。各々の重鎖は、Ｎ末端重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲと省略する）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のヒンジドメインと共に、ＩｇＧについて３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される。
【００２４】
各々の軽鎖は、Ｎ末端軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲと省略する）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変領域にさらに細分され得る。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの各々は、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配列している３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。アミノ酸の各ドメインへの割り当ては周知の慣習（ＩＭＧＴ、Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ＬＥＦＲＡＮＣら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．２７、ｐ：２０９−２１２、１９９９）に従う。特定の抗原に結合する抗体の機能的能力は各々の軽／重鎖対の可変領域に依存し、大部分がＣＤＲによって決定される。
【００２５】
本明細書に使用される場合、「ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体の誘導体」という表現は、キメラまたはヒト化抗体を指す。このような誘導体抗体は、
ｉ）ヒトＩｇＧ１由来の軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）、ならびに
ｉｉ）ヒトＩｇＧ１由来ではない軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）または対応するＣＤＲ
を含む。
【００２６】
本明細書に使用される場合、「機能的断片」という用語は、Ｏ−アセチル化−ＧＤ２ガングリオシドに特異的に結合し、ＣＨ１ドメインを含む抗体断片を指す。このような断片は当業者によって簡単に識別でき、一例として、Ｆａｂ断片（例えばパパイン消化による）、Ｆａｂ’断片（例えばペプシン消化および部分的還元による）、Ｆ（ａｂ’）２断片（例えばペプシン消化による）、Ｆａｃｂ（例えばプラスミン消化による）を含み、また、Ｆｄ（例えばペプシン消化、部分的還元および再凝集による）断片も本発明に包含される。
【００２７】
このような断片は、当該分野において公知であるおよび／または本明細書に記載される、酵素的切断、合成または組換え技術によって産生できる。抗体はまた、１つ以上の停止コドンが天然の停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使用して様々な切断型で産生できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計されてもよい。抗体の種々の部分は従来の技術によって化学的に一緒に結合されてもよいか、または遺伝子操作技術を使用して連続的なタンパク質として調製されてもよい。
【００２８】
第１の好ましい実施形態において、本発明の方法は、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復するように前記抗体由来のヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる工程を含む。
【００２９】
ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインは当業者に周知である。例として、ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメインは配列番号２１に対応する。
【００３０】
本明細書に使用される場合、「他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復するようにヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる」工程とは、アミノ酸がシステイン残基により置換されており、好ましくは１３３または１３４位のアミノ酸がシステインであり、さらに好ましくは１３３位のアミノ酸がシステインである、ヒトＣＨ１γ１ドメインを指す。定常領域の番号付けはＫａｂａｔら（１９９１、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎ°９１−３２４２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＡ）に記載されるＥＵインデックスのものである。第１の例として、このようなヒトＣＨ１γ１ドメインとは、１３３位のセリン残基がシステインにより置換されているアミノ酸配列の配列番号１を指す。第２の例として、このようなヒトＣＨ１γ１ドメインとは、１３４位のセリン残基がシステインに置換されているアミノ酸配列の配列番号２２を指す。ＣＨ１配列の１３３または１３４位のシステイン残基は本発明の抗体の軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合を修復する。
【００３１】
【表１】
0006633520.tif 000002
【００３２】
有益には、他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復するように前記抗体由来のヒトＣＨ１γ１ドメインを変異させる工程は、
ａ）ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体のＣＨ１ドメインを含む核酸配列を単離する工程であって、前記核酸配列は好ましくは抗体の重鎖をコードする、工程と、
ｂ）コドンを変異させる工程、好ましくはアミノ酸残基システイン（Ｃ）をコードするように前記ＣＨ１ドメインの１３３位または１３４位をコードするコドンを変異させて、変異核酸配列を提供する工程と、
ｃ）変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供する工程と、
ｄ）適切な宿主中で抗体の軽鎖をコードする核酸配列と変異核酸を同時発現し、それにより変異ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体またはその誘導体もしくは機能的断片を提供する工程と、
ｅ）任意に、変異抗体、その誘導体または断片を単離する工程と
によって行われる。
【００３３】
第２の好ましい実施形態において、本発明の方法は、前記ヒトＣＨ１γ１ドメインをヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）またはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）由来のＣＨ１ドメインにより置換する工程を含む。
【００３４】
ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインは当業者に周知である。例として、ヒトＩｇＧ２由来のＣＨ１ドメインは配列番号２３に対応し、ヒトＩｇＧ３由来のＣＨ１ドメインは配列番号２に対応し、ヒトＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインは配列番号２４に対応する。
【００３５】
【表２】
0006633520.tif 000003
【００３６】
有益には、前記抗体由来のヒトＣＨ１γ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）またはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）由来のＣＨ１ドメインにより置換する工程は、
ａ）ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体のＣＨ１ドメインを含む核酸配列を単離する工程であって、前記核酸配列は好ましくは抗体の重鎖をコードする、工程と、
ｂ）前記ＣＨ１γ１核酸配列を、ヒトＩｇＧ２（ＣＨ１γ２）、ＩｇＧ３（ＣＨ１γ３）またはＩｇＧ４（ＣＨ１γ４）由来のＣＨ１ドメインをコードする核酸配列により置換して変異核酸配列を提供する工程と、
ｃ）変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供する工程と、
ｄ）適切な宿主中で抗体の軽鎖をコードする核酸配列と変異核酸を同時発現し、それにより変異ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体またはその誘導体もしくは機能的断片を提供する工程と、
ｅ）任意に、変異抗体、その誘導体または断片を単離する工程と
によってなされる。
【００３７】
さらに好ましい実施形態において、本発明の方法は、他のＩｇＧサブクラスに特有のヒンジドメインとＣＨ２ドメインとの間の対合を修復するように前記抗体由来のヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを変異させる工程、または前記ヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくはその誘導体由来のヒンジドメインにより置換する工程をさらに含む。
【００３８】
ヒトＩｇＧ１由来のヒンジドメインは当業者に周知であり、例として配列番号３に対応する。
【００３９】
本明細書に使用される場合、「他のＩｇＧサブクラスに特有のヒンジドメインとＣＨ２ドメインとの間の対合を修復するように前記抗体由来のヒトヒンジドメインを変異させる」工程とは、ヒンジ配列の５番目の位置におけるシステイン残基が別の残基、好ましくはセリンにより置換されているヒトＩｇＧ１ヒンジドメインを指す。実際に、前記変異により、特有のＩｇＧ構造の修復が生じる。このような誘導体の例として、配列番号４を挙げることができる。
【００４０】
【表３】
0006633520.tif 000004
【００４１】
有益には、他のＩｇＧサブクラスに特有のヒンジとＣＨ２との間の対合を修復するように前記抗体由来のヒトヒンジドメインを変異させる工程は、
ａ）ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体のヒンジドメインを含む核酸配列を単離する工程であって、前記核酸配列は好ましくは抗体の重鎖をコードする、工程と、
ｂ）別のアミノ酸残基、好ましくはセリン残基をコードするように前記ヒンジドメインの５位におけるアミノ酸残基システイン（Ｃ）をコードするコドンを変異させて、変異核酸配列を提供する工程と、
ｃ）変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供する工程と、
ｄ）適切な宿主中で抗体の軽鎖をコードする核酸配列と変異核酸を同時発現し、それにより変異ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体、その誘導体または機能的断片を提供する工程と、
ｅ）任意に、変異抗体、その誘導体または断片を単離する工程と
によってなされる。
【００４２】
ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のヒンジドメインは当業者に周知であり、例としてＩｇＧ３について配列番号５に対応する。ヒトＩｇＧ３の誘導体もまた、当業者に周知であり、例として配列番号６〜９、好ましくは配列番号９に対応する。
【００４３】
【表４】
0006633520.tif 000005
【００４４】
さらに有益には、前記抗体由来のヒトヒンジＩｇＧ１ドメインを、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはその誘導体由来のヒンジドメインにより置換する工程は、
ａ）ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体のヒンジドメインを含む核酸配列を単離する工程であって、前記核酸配列は好ましくは抗体の重鎖をコードする、工程と、
ｂ）前記ＩｇＧ１ヒンジドメイン核酸配列を、ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４または誘導体由来のヒンジドメインをコードする核酸配列により置換して、変異核酸配列を提供する工程と、
ｃ）変異核酸配列に作動可能な発現エレメントを提供する工程と、
ｄ）適切な宿主中で抗体の軽鎖をコードする核酸配列と変異核酸を同時発現し、それにより変異ヒト免疫グロブリンＧクラス１（ＩｇＧ１）抗体、誘導体または機能的断片を提供する工程と、
ｅ）任意に、変異抗体、その誘導体または断片を単離する工程と
によってなされる。
【００４５】
第２の態様において、本発明は、本発明の方法によって得られ得る、抗体またはその機能的断片に関し、前記抗体は、
ａ）以下のアミノ酸配列：
ｉ）抗原に特異的な軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、および
ｉｉ）ヒトカッパ（κ）定常（ＣＬ）ドメイン
を含む軽鎖と、
ｂ）以下のアミノ酸配列：
ｉ）前記抗原に特異的な重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、
ｉｉ）ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、ならびに
ｉｉｉ）他のＩｇＧサブクラスに特有のＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間の対合を修復するように変異されるか、またはヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインにより置換されるヒトＩｇＧ１由来のＣＨ１ドメイン
を含む重鎖とを含む。
【００４６】
本明細書に使用される場合、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体自体を指す。モノクローナル抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であってもよい。
【００４７】
ヒトカッパ（κ）ＣＬドメインは当業者に周知であり、例として配列番号１０に対応する。
【００４８】
【表５】
0006633520.tif 000006
【００４９】
ヒトＩｇＧ１由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインは当業者に周知であり、例として配列番号１１に対応する。
【００５０】
【表６】
0006633520.tif 000007
【００５１】
本発明に有用な抗体は、適切な特異性を有する典型的にマウスまたは他の非ヒト抗体の操作が、それらをヒト化形態に変換するために必要とされるので組換え的に産生される。抗体はグリコシル化されていても、されていなくてもよいが、グリコシル化抗体が好ましい。抗体は周知のようにジスルフィド結合により適切に架橋される。
【００５２】
好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はキメラ抗体である。「キメラ抗体」という表現は、マウス免疫グロブリン由来の可変領域およびヒト免疫グロブリンの定常領域から構成される抗体を意味する。この改変は単にマウス定常領域をヒト抗体の定常領域に置換することからなり、それにより薬学的用途に許容可能であるように十分に低い免疫原性を有し得るヒト／マウスキメラが生じる。本発明に関して、前記キメラ抗体はヒト軽鎖および重鎖由来の定常領域を含む。このようなキメラ抗体を産生する多くの方法が既に報告されているので、当業者の一般的知識の一部を形成する（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと）。
【００５３】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はヒト化抗体である。
【００５４】
「ヒト化抗体」とは、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体の配列を変えることによってヒト抗体生殖細胞系列に由来するアミノ酸配列から部分的または完全になる抗体を意味する。抗体の可変領域および最終的にＣＤＲのこのヒト化は当該分野において現在周知である技術によってなされる。
【００５５】
一例として、英国特許出願２１８８６３８Ａ号および米国特許第５，５８５，０８９号は、置換される抗体の部分のみが相補性決定領域、すなわち「ＣＤＲ」である、組換え抗体が産生されるプロセスを開示している。ＣＤＲグラフト技術が、マウスＣＤＲならびにヒト可変領域フレームワークおよび定常領域からなる抗体を生成するために使用されている（例えば、ＲＩＥＣＨＭＡＮＮら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．３３２、ｐ：３２３−３２７、１９８８を参照のこと）。これらの抗体はＦｃ依存性エフェクター機能に必要なヒト定常領域を保持するが、抗体に対して免疫反応を誘発する可能性はほとんどない。
【００５６】
一例として、可変領域のフレームワーク領域は対応するヒトフレームワーク領域によって置換され、非ヒトＣＤＲを実質的にインタクトなままにするか、またはさらにＣＤＲをヒトゲノムに由来する配列と置き換える。完全なヒト抗体は、免疫系がヒト免疫系に対応するように変化されている、遺伝子操作されたマウスにおいて産生される。上述のように、一本鎖形態を表す断片を含む、抗体の免疫学的に特異的な断片を利用することが、本発明の方法における使用に十分である。
【００５７】
再び、ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク、非ヒト抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲを含み、存在する任意の定常領域は、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約８５または９０％、好ましくは少なくとも９５％同一である、抗体を指す。それ故、場合によりＣＤＲを除いて、ヒト化抗体の全ての部分は、１つ以上の天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。例えば、ヒト化免疫グロブリンは典型的に、キメラマウス可変領域／ヒト定常領域抗体を含まない。
【００５８】
ヒト化抗体は、ヒトの治療に使用するための非ヒト抗体およびキメラ抗体より少なくとも３つの潜在的な利点を有する：
１）エフェクター部分はヒトであるので、それはヒト免疫系の他の部分と良好に相互作用できる（例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって標的細胞をより効果的に破壊する）。
２）ヒト免疫系はヒト化抗体のフレームワークまたはＣ領域を異種と認識するはずはないので、このような注射抗体に対する抗体反応は、全体に異種の非ヒト抗体または部分的に異種のキメラ抗体に対するより少ないはずである。
３）注射される非ヒト抗体は、ヒト循環においてヒト抗体の半減期より非常に短い半減期を有すると報告されている。注射されるヒト化抗体は、天然に存在するヒト抗体と本質的に同一である半減期を有し、与えられる投与頻度をより少なくできる。
【００５９】
例として、ヒト化免疫グロブリンの設計は以下のように実施され得る：アミノ酸が以下のカテゴリーに入る場合、使用されるヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリン）のフレームワークアミノ酸は、ＣＤＲを与える非ヒト免疫グロブリン（ドナー免疫グロブリン）由来のフレームワークアミノ酸と置き換えられる：（ａ）アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域内のアミノ酸はその位置においてヒト免疫グロブリンにとってまれであるが、ドナー免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸はその位置においてヒト免疫グロブリンに特有である；（ｂ）アミノ酸の位置はＣＤＲの１つに直接隣接する；または（ｃ）フレームワークアミノ酸の任意の側鎖原子は三次元免疫グロブリンモデルにおけるＣＤＲアミノ酸の任意の原子の約５〜６Å（中心間）内にある（ＱＵＥＥＮら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ．８８、ｐ：２８６９、１９９１）。アクセプター免疫グロブリンのヒトフレームワーク領域におけるアミノ酸およびドナー免疫グロブリンにおける対応するアミノ酸の各々がその位置においてヒト免疫グロブリンにとってまれである場合、そのようなアミノ酸はその位置においてヒト免疫グロブリンに特有のアミノ酸と置き換えられる。
【００６０】
別の好ましい実施形態によれば、前記抗体またはその断片は、免疫調節性、感染性または腫瘍性抗原に対して誘導される。
【００６１】
このような抗原に特異的な軽鎖および重鎖可変領域（ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ）は、その一般的知識を考慮して簡単に当業者によって識別できる。
【００６２】
本明細書に使用される場合、「免疫調節性抗原」とは、活性化インデューサー免疫細胞、例えばＴおよび／もしくはＮＫ細胞によって、または活性化サプレッサー細胞のいずれかによって発現される抗原を指す。
【００６３】
活性化サプレッサー細胞によって発現される抗原の例として、１９８７年に発見されたＣＴＬ−Ａ４（ＣＤ１５２とも指定されている、細胞傷害性リンパ求関連抗原）を挙げることができる（ＢＲＵＮＥＴら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ．３２８、ｐ：２６７−２７０、１９８７）。
【００６４】
活性化インデューサー免疫細胞によって発現される抗原の例として、Ｔ細胞活性化の間に誘導され、Ｔｈ２細胞ではなく、Ｔｈ１細胞上で発現を持続している、ＣＤ２７２としても知られているＢＴＬＡ（ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター）を挙げることができる。
【００６５】
本明細書に使用される場合、「感染性抗原」とは、細菌またはウイルスなどの微生物によって感染した細胞において産生される抗原物質を指す。
【００６６】
本明細書に使用される場合、「腫瘍性抗原」とは、腫瘍細胞において産生される抗原物質を指す。多くの腫瘍性抗原は当業者に周知であり、非限定的な例として、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＥＰＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ−１９、ＧＭ１、ＣＡＩＸ、ホスファチジルセリンなどのリン脂質抗原またはＧＤ２、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化もしくはＧＤ３などのガングリオシドを挙げることができる。
【００６７】
好ましくは、前記抗原はＧＤ２−Ｏ−アセチル化に対応しない。
【００６８】
ＣＤ−２０は、初期のｐｒｅ−Ｂ細胞発生の間に発現され、形質細胞分化まで存在する非グリコシル化リンタンパク質である。具体的には、ＣＤ２０分子は、細胞周期開始および分化に必要とされる活性化プロセスの停止を調節でき、通常、新生物（「腫瘍性」）Ｂ細胞において非常に高いレベルで発現される。定義により、ＣＤ２０は、「正常」Ｂ細胞および「悪性」Ｂ細胞の両方に存在する。したがって、ＣＤ２０表面抗原はＢ細胞リンパ腫の「ターゲティング」のための候補として機能する可能性を有する。
【００６９】
ＣＤ２０に特異的な対応する軽鎖および重鎖可変領域（ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ）を得るためにＣＤ２０に対する抗体を考慮すると、リツキシマブ（「ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）」）（米国特許第５，７３６，１３７号）；「Ｙ２Ｂ８」と指定されるイットリウム−［９０］−標識化２Ｂ８マウス抗体または「イブリツモマブチウキセタン」ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（米国特許第５，７３６，１３７号）；「１３１Ｉ−ＢＩ」抗体（ヨウ化物１３１トシツモマブ、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標））（米国特許第５，５９５，７２１号）を生成するために任意に１３１Ｉで標識化される「トシツモマブ」とも呼ばれる、マウスＩｇＧ２ａ「ＢＩ」；およびヒト化２Ｈ７；オファツムマブ、ＣＤ２０  ｈｕＭａｘ−ＣＤ２０上の新規エピトープに対して完全にヒト化されたＩｇＧ１（国際公開第２００４／０３５６０７）を挙げることができる。それらの中で、リツキシマブ、イブリツモマブ、チウキセタンおよびトシツモマブは特定のリンパ腫の治療のために販売の承認を受けており、オファツムマブは特定の白血病の治療のために販売の承認を受けている。好ましくは、ＣＤ２０に対する前記抗体はリツキシマブであり、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ；配列番号２５〜３１）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ；配列番号３２〜３７）について以下の表に示される配列に対応する。
【００７０】
抗ＣＤ２０（リツキシマブ）可変重鎖：
【表７】
0006633520.tif 000008
【００７１】
抗ＣＤ２０（リツキシマブ）可変軽鎖（ｋ鎖）：
【表８】
0006633520.tif 000009
【００７２】
さらに好ましくは、リツキシマブのＣＨ１配列およびヒンジ配列は配列番号３８に対応する。
【００７３】
【表９】
0006633520.tif 000010
【００７４】
ＣＥＡ（がん胎児性抗原）糖タンパク質は細胞接着に関与する腫瘍マーカーである。ＣＥＡに特異的な対応する軽鎖および重鎖可変領域（ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ）を得るためにＣＥＡに対する抗体を考慮すると、アルシツモマブ（ＩＭＭＵＮＯＭＥＤＩＣＳ）を挙げることができる。
【００７５】
ＥｒｂＢ受容体は、上皮、間葉および神経起源の種々の組織において発現される。正常な条件下で、ＥｒｂＢ受容体の活性化は、成長因子のＥＧＦファミリーのメンバーである、それらのリガンドの空間的および時間的発現により制御される。ＥｒｂＢ受容体とのリガンド結合は、受容体ホモおよびヘテロ二量体の形成ならびに固有キナーゼドメインの活性化を誘導し、細胞質尾部内の特定のチロシンキナーゼ残基においてリン酸化を生じる。これらのリン酸化残基は種々のタンパク質のためのドッキング部位として機能し、その動員は細胞内シグナル伝達経路の活性化を導く。ＥｒｂＢ受容体の中で、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２は細胞増殖および分化を調節する際に本質的な役割を果たすことが知られている。それらは、細胞外成長因子が結合すると、ホモおよび／またはヘテロ二量体内で他のＨＥＲ受容体と凝集する強力な性質を有し、それにより、種々の形態のシグナル伝達経路活性化を生じ、アポトーシス、生存または細胞増殖を導く。
【００７６】
ＥＧＦＲに特異的な対応する軽鎖および重鎖可変領域（ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ）を得るためにＥＧＦＲに対する抗体を考慮すると、マツズマブ（ｈＭＡｂ  ４２５、米国特許第５，５５８，８６４号、欧州特許第０５３１４７２号）としても指定されるヒト化モノクローナル抗体４２５、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）、米国特許第７，０６０，８０８号）としても指定されるキメラモノクローナル抗体２２５（ｃＭＡｂ２２５）、完全なヒト抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）、米国特許第６，２３５，８８３号）を挙げることができる。それらの中で、セツキシマブおよびパニツムマブは、インビボでヒト大腸腫瘍を阻害することが実証されており、その両方は販売の承認を受けている。
【００７７】
Ｈｅｒ２に特異的な対応する軽鎖および重鎖可変領域（ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ）を得るためにＨｅｒ２に対する抗体を考慮すると、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ  ＨＥＲ２、トラスツズマブまたはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（米国特許第５，８２１，３３７号）として指定されているマウス抗体４Ｄ５の組換えヒト化型（米国特許第５，６７７，１７１号）を挙げることができる。この抗体は、腫瘍がＥｒｂＢ２タンパク質を過剰発現する転移性乳がんを有する患者を治療するために１９９８年に販売の承認を受けている。好ましくは、Ｈｅｒ２に対する前記抗体はトラスツズマブであり、それぞれ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ；配列番号３９〜４５）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ；配列番号４６〜５１）について以下の表に示される配列に対応する。
【００７８】
抗Ｈｅｒ２（トラスツズマブ）可変重鎖：
【表１０】
0006633520.tif 000011
【００７９】
抗Ｈｅｒ２（トラスツズマブ）可変軽鎖（ｋ鎖）：
【表１１】
0006633520.tif 000012
【００８０】
さらに好ましくは、トラスツズマブのＣＨ１およびヒンジ配列は配列番号３８に対応する。
【００８１】
ＧＤ２は、神経芽細胞腫および黒色腫を含む神経外胚葉起源の腫瘍で発現されるジシアロガングリオシドである。ＧＤ２に特異的な対応する軽鎖および重鎖可変領域（ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ）を得るためにＧＤ２に対する抗体を考慮すると、神経芽細胞腫の治療に使用されている、マウスＩｇＧ３モノクローナル抗体３Ｆ８および１４．１８、もしくはキメラモノクローナル抗ＧＤ２抗体ｃｈ１４．１８（マウス抗ＧＤ２抗体１４．１８の可変領域およびヒトＩｇＧ１の定常領域から構成される）、またはＧＤ２のＯ−アセチル化形態に特異的であるマウスＩｇＧ３モノクローナル抗体８Ｂ６（国際公開第２００８／０４３７７７号）を挙げることができる。好ましくは、ＧＤ２に対する前記抗体はｃｈ１４．１８であり、それぞれ重鎖可変領域（ＨＣＶＲ；配列番号５２〜５７）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ；配列番号５８〜６３）について以下の表に示される配列に対応する。
【００８２】
抗ＧＤ２（ｃｈ１４．１８）可変重鎖：
【表１２】
0006633520.tif 000013
【００８３】
抗ＧＤ２（ｃｈ１４．１８）可変軽鎖（ｋ鎖）：
【表１３】
0006633520.tif 000014
【００８４】
さらに好ましくは、ｃｈ１４．１８のＣＨ１およびヒンジ配列は配列番号３８に対応する。
【００８５】
本明細書に使用される場合、「腫瘍性抗原」とはまた、腫瘍新血管形成または腫瘍細胞外マトリクス抗原を指してもよい。
【００８６】
本明細書に使用される場合、「腫瘍新血管形成に関連する抗原」とは、腫瘍に存在する新たに合成された血管によって発現される抗原を指す。
【００８７】
このような抗原の例として、フィブロネクチンのＥＤＡおよびＥＤＢドメイン、Ｅｎｄｏｓａｌｉｎ／ＴＥＭ１、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ／１０５、ＰＳＭＡまたはＢ７−Ｈ４を挙げることができる。
【００８８】
本明細書に使用される場合、「腫瘍細胞外マトリクスに関連する抗原」とは、腫瘍に存在する細胞外マトリクスにおいて発現される抗原を指す。
【００８９】
このような抗原の例として、ラミニン−３３２のＧ４５断片を挙げることができる（ＲＯＵＳＳＥＬＬＥら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．６８（８）、ｐ：２８８５−９４、２００８）。
【００９０】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、アミノ酸がシステイン残基により置換されており、好ましくは１３３または１３４位のアミノ酸がシステインであり、さらに好ましくは１３３位のアミノ酸がシステインである、ヒトＣＨ１γ１ドメインを含む。定常領域の番号付けは、Ｋａｂａｔら（１９９１、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎ°９１−３２４２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＡ）に記載されているＥＵインデックスのものである。例として、このような変異ヒトＣＨ１γ１ドメインとは、１３３位のセリン残基がシステインにより置換されている配列番号１のアミノ酸配列を指す。ＣＨ１配列の１３３または１３４位のシステイン残基は本発明の抗体の軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合を修復する。
【００９１】
さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明の抗体はヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインを含み、好ましくは、前記ドメインはＩｇＧ３由来のＣＨ１ドメイン、例えば配列番号２の配列である。
【００９２】
本発明の抗体はヒトＩｇＧ１由来のヒンジドメインを含んでもよいが、それはまた、特有のＩｇＧ対合を修復するように変異されるヒトヒンジＩｇＧ１であるか、またはヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくはそれらの誘導体由来のヒンジドメインである、ヒトヒンジドメインを含んでもよい。
【００９３】
「特有のＩｇＧ対合を修復するように変異されるヒトヒンジＩｇＧ１」とは、その配列の５番目の位置のシステイン残基が別の残基、好ましくはセリンにより置換されているＩｇＧ１ヒンジドメインを指す。実際に、前記変異により、特有のＩｇＧ構造の修復が生じる。このような誘導体の例として、配列番号４を挙げることができる。
【００９４】
ヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のヒンジドメインは当業者に周知であり、例としてＩｇＧ３について配列番号５に対応する。ヒトＩｇＧ３の誘導体もまた、当業者に周知であり、例として配列番号６〜９、好ましくは配列番号９に対応する。
【００９５】
好ましくは、その配列の１３３もしくは１３４位においてシステイン残基を提示するヒトＩｇＧ１由来の変異ＣＨ１ドメインによるか、またはヒトＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４由来のＣＨ１ドメインによる本発明の抗体内のシステイン残基の導入は、以前に別のシステイン残基に連結されたいかなる遊離チオール基も解放しない。
【００９６】
本発明の抗体は免疫複合体を含む。
【００９７】
本明細書に使用される場合、「免疫複合体」という用語は、第２の分子、好ましくは細胞傷害剤または放射性同位体に結合した少なくとも１つのキメラ抗体またはその機能的断片を含む複合体分子を指す。好ましくは、前記抗体またはその機能的断片は共有結合により前記第２の分子に結合する。
【００９８】
一実施形態において、本発明の抗体は免疫複合体である。
【００９９】
特定の実施形態において、本発明の抗体は免疫複合体であり、前記免疫複合体は本発明の抗体またはその機能的断片と細胞傷害剤とを含む。
【０１００】
別の特定の実施形態において、本発明の抗体は免疫複合体であり、前記免疫複合体は本発明の抗体またはその機能的断片と放射性同位体とを含む。
【０１０１】
第３の態様によれば、本発明は、治療に使用するための、本明細書に記載される少なくとも１つの抗体または少なくとも１つのその機能的断片と、薬学的に許容可能な担体とを含む組成物、好ましくは医薬組成物に関する。
【０１０２】
前記組成物は、がん、自己免疫疾患または感染を治療するのに特に有用である。
【０１０３】
前記組成物は、限定されないが、液剤、懸濁剤、凍結乾燥粉末、カプセル剤および錠剤を含む、患者への投与に適した任意の医薬形態であってもよい。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は、任意の薬学的に許容可能な希釈剤、賦形剤または補助剤をさらに含んでもよい。
【０１０５】
本発明の医薬組成物は、注射、例えば局所注射、経粘膜的投与、吸入、経口投与および所望の治療を達成するために当業者が適切であると判断する、より一般的な任意の形態で製材化されてもよい。
【０１０６】
本発明の抗体は、意図する目的を達成するのに有効な量、および選択される投与経路に適した投薬量で前記医薬組成物に含まれる。
【０１０７】
より具体的には、治療有効量は、がんまたは感染症を患っている対象の症状を予防、軽減または改善するのに有効な化合物の量を意味する。
【０１０８】
意図する適用に応じて、本発明のキメラ抗体はさらなる構成要素をさらに含んでもよい。例として、本発明のキメラ抗体は免疫複合体に対応し得る。
【０１０９】
本発明の第４の態様は、がんまたは感染症を治療する方法であって、本明細書に記載される少なくとも１つの抗体または少なくとも１つのその機能的断片を含む、有効量の本明細書に記載される組成物を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法に関する。
【０１１０】
本明細書に使用される場合、「患者」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【０１１１】
本発明の他の実施形態および利点は以下の非限定的な実施例に例示される。
【実施例】
【０１１２】
１−インビトロでの抗ＯＡｃＧＤ２抗体のプロアポトーシス活性
最初の工程において、キメラ抗ＯＡｃＧＤ２抗体、ｃ８Ｂ６が、その定常領域をヒトＩｇＧ１、κの定常領域に置換することによって８Ｂ６から設計される。その配列は図１（配列番号１２および配列番号１３）に表される。
【０１１３】
この抗体の構造は、軽鎖において２つの分子内ジスルフィド結合（Ｃｙｓ２３−Ｃｙｓ９３およびＣｙｓ１３９−Ｃｙｓ１９９）、および重鎖において４つの分子内ジスルフィド結合（Ｃｙｓ２２−Ｃｙｓ９８、Ｃｙｓ１４６−Ｃｙｓ２０２、Ｃｙｓ２６３−Ｃｙｓ３２３およびＣｙｓ３６９−Ｃｙｓ４２７）を含む。鎖内ジスルフィド結合に関与するシステイン残基はアスタリスク（＊）によって示される。構造全体は３つの分子間ジスルフィド結合によって安定化される：軽鎖は、軽鎖の最後のシステイン残基と上流ヒンジ領域のシステイン残基との間の１つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ２１９−Ｃｙｓ２２２）によって重鎖に接続され、重鎖は中間ヒンジにおけるシステインを接続する２つのジスルフィド結合（Ｃｙｓ２２８−Ｃｙｓ２２８およびＣｙｓ２３１−Ｃｙｓ２３１）によって接続される。鎖間ジスルフィド結合に関与するシステイン残基は矢印（↑）によって示される。
【０１１４】
８Ｂ６  ＬＣＶＲは、ヒトＩｇＧ１のＣＬドメインと融合するようにｐＥｖｉベクター内のクローニングしたＮｏｔＩ−ＫａｓＩである。
【０１１５】
８Ｂ６  ＨＣＶＲドメインは、ヒトＩｇＧ１の重鎖の定常ドメインと融合するようにｐＥｖｉ’ベクター内のクローニングしたＮｏｔＩ−ＮｈｅＩである。
【０１１６】
このように、ＣＨＯ  Ｋ１細胞は両方のベクターによって共トランスフェクトされる。
【０１１７】
トランスフェクション後、ＣＨＯ  Ｋ１細胞を数日間、無血清培地中に維持する。
【０１１８】
各日に、培養培地を収集し、−８０℃で凍結する。細胞生存率が７０〜８０％未満になるまで、新たな培地をトランスフェクト細胞に加える。
【０１１９】
収集した培養培地をプールし、セファロースマトリクスに固定したプロテインＡを使用して抗体を精製する。
【０１２０】
ＣＨＯにおけるｃ８Ｂ６の産生を、還元および非還元条件の両方の下で電気泳動によって分析した。非還元条件下で、ｃ８Ｂ６抗体は全抗体に対応する１５０ｋＤにて１つのバンドを示したという結果が示される。一方、還元条件下で、ＨＣについて５０ｋＤにおけるバンドおよびＬＣについて２５ｋＤにおけるバンドを観察した。ＳＵＰＥＲＤＥＸカラムでのゲル濾過により、１５０ｋＤに対応する１２．３ｍｌにて主要ピーク（純度９９．０％）を有するクロマトグラムプロファイルが示された。最後に、プロテインＡカラムでの精製後のキメラｃ８Ｂ６についての産生収量は上清の約３１５ｍｇ／Ｌであった。
【０１２１】
その標的との抗体の結合を、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドを発現するＩＲＭ５細胞でのフローサイトメトリーによって確認した。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に結合したヤギ抗ヒトＩｇＧによって結合が明らかになった。これらの実験により、ＧＤ２−Ｏ−アセチル化に結合する、この抗体の機能性が確認された。
【０１２２】
次いで、ｃ８Ｂ６抗体の直接細胞毒性をＭＴＴアッセイによって評価した。
【０１２３】
これらのアッセイにおいて、１×１０４ＩＭＲ５細胞を、９６ウェルマイクロプレートにおいて３７℃にて２４時間インキュベートする。８０〜０．１５μｇ／ｍＬの抗体を加え、３７℃にて２４時間インキュベートした。次いで５０μｇのＭＴＴを各ウェルに加え、３７℃にて少なくとも４時間インキュベートし、その後、細胞を１０％ＳＤＳで可溶化し、３７℃にてＯ．Ｎ．でインキュベートした。次いで吸光度を５７０および６５０ｎｍにて読み取った。６５０ｎｍにおける生成物の吸光度を５７０ｎｍにおける吸光度から差し引いて（Ａｂｓ５７０−Ａｂｓ６５０）、色素の全変換率を算出した。２０μｇのエトポシドで処理した細胞を有する４つの対照ウェルは、０％の生存率を考慮して吸光度についてのブランクを与える。生存率の阻害（％）は未処理の細胞と比較してパーセンテージとして表し、各値は四連で平均±ＳＥＭとして表す。
【０１２４】
抗体ｃ８Ｂ６は、マウス定常ＩｇＧ３ドメインからヒトＩｇＧ１定常ドメインに移行するキメラ化工程後、８Ｂ６の直接細胞毒性を損失したという結果が示される。その上、抗体は親ＩｇＧ３  ８Ｂ６の共同性をさらに損失した。
【０１２５】
最後に、キメラ化の異なる手段を試行する多くの実験は、少しのプロアポトーシス活性を回復するだけであり、結合の共同性は観察されなかった。
【０１２６】
驚くべきことに、キメラ化についてのＣＨ１定常ドメインの特定の修飾の結果、プロアポトーシス活性について大きな変化を生じる。
【０１２７】
これらの結果は、以前の構築物に基づいて設計した抗体３０１．１４ａ、３０１．１４ｂ、３０１．１５、３０１．１５ｂ、３０１．１６、３０１．１７、３０１．１８、３０１．１９、３０１．２０および３０１．２１で得た。
【０１２８】
抗体３０１．１４ａは、図２（配列番号１４）に表されるようにヒトヒンジγ１ドメインを有する変異ヒトＣＨ１γ１（下線を引いた変異Ｓ１３３Ｃ）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１１）ならびにκＣＬドメイン（配列番号１０）に対応する。
【０１２９】
抗体３０１．１４ｂは、図３（配列番号１５）に表されるように変異ヒトヒンジγ１ドメイン（下線を引いた変異Ｃ２２２Ｓ）を有する変異ヒトＣＨ１γ１（下線を引いた変異Ｓ１３３Ｃ）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１１）ならびにκＣＬドメイン（配列番号１０）に対応する。
【０１３０】
抗体３０１．１５は、図４（配列番号１６）に表されるようにヒトヒンジγ１ドメインを有するヒトＣＨ１γ３（その同類ＣＨ１γ１と置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１１）ならびにκＣＬドメイン（配列番号１０）に対応する。
【０１３１】
抗体３０１．１５ｂは、図９（配列番号６６）に表されるように変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換、Ｃ２２２Ｓに対応する下線を引いた変異）を有するヒトＣＨ１γ３（その同類ＣＨ１γ１と置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。
【０１３２】
抗体３０１．１６は、図５（配列番号１７）に表されるようにヒトヒンジγ３ドメイン（その同類ヒンジγ１と置き換えている）を有する変異ヒトＣＨ１γ１（下線を引いた変異Ｓ１３３Ｃ）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１１）ならびにκＣＬドメイン（配列番号１０）に対応する。
【０１３３】
抗体３０１．１７は、図６（配列番号１８）に表されるようにヒトヒンジγ３ドメイン（その同類ヒンジγ１を置き換えている）を有するヒトＣＨ１γ３（その同類ＣＨ１γ１を置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１１）ならびにκＣＬドメイン（配列番号１０）に対応する。
【０１３４】
抗体３０１．１８は、図７（配列番号１９）に表されるように短縮された（１７アミノ酸）ヒトヒンジγ３ドメインを有する変異ヒトＣＨ１γ１（下線を引いた変異Ｓ１３３Ｃ）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１１）ならびにκＣＬドメイン（配列番号１０）に対応する。
【０１３５】
抗体３０１．１９は、図８（配列番号２０）に表されるように短縮された（１７アミノ酸）ヒトヒンジγ３ドメインを有するヒトＣＨ１γ３（その同類ＣＨ１γ１を置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号１１）ならびにκＣＬドメイン（配列番号１０）に対応する。
【０１３６】
抗体３０１．２０は、図１０（配列番号２３）に表されるようにヒトヒンジγ１ドメインを有するヒトＣＨ１γ２（その同類ＣＨ１γ１を置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。
【０１３７】
抗体３０１．２１は、図１１（配列番号２４）に表されるようにヒトヒンジγ１ドメインを有するヒトＣＨ１γ４（その同類ＣＨ１γ１を置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにκＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。
【０１３８】
ｍｕＩｇＧ３対照はマウス８Ｂ６  ＩｇＧ３に対応し、ここでＣＨ１  ＩｇＧ３は配列番号６４に対応し、１３４位のシステイン残基はセリン残基に置換され、２２４位のセリン残基はシステイン残基に置換されている。
【０１３９】
【表１４】
0006633520.tif 000015
【０１４０】
前記抗体のＧＤ２−Ｏ−アセチル化ガングリオシドへの結合を以前のように確認した。
【０１４１】
次いで、前記抗体の潜在的なプロアポトーシス活性を以前に述べたように決定した。
【０１４２】
結果を以下の表にまとめ、ここで溶解のパーセンテージは８０μｇ／ｍｌの抗体濃度について得たものである。
【０１４３】
ＩＭＲ５細胞に対する抗ＯａｃＧＤ２  ３０１．１４ａ、３０１．１４ｂ、３０１．１５、３０１．１６、３０１．１７、３０１．１８および３０１．１９抗体の直接細胞毒性：
【０１４４】
【表１５】
0006633520.tif 000016
【０１４５】
この結果により、予想外に、変異ヒトＣＨ１γ１  δまたはヒトＣＨ１γ３を含むキメラ抗体がプロアポトーシス活性を有することが示され、このことは、直接細胞毒性の損失がヒトＩｇＧ１の構造に起因し得ることを意味する。さらに、これらの抗体の全ては開始抗体８Ｂ６のものより大きいＥＣ５０を示す。
【０１４６】
また、この結果により、最大溶解率％に関して、より高い細胞毒性効果を与えた構築物は、（ｉ）ヒトＣＨ１γ３およびヒトヒンジγ１の融合物（３０１．１５構築物）または（ｉｉ）ヒトＣＨ１γ１（Ｓ１３３Ｃで変異）またはヒトＣＨ１γ３および短縮ヒトヒンジγ３の融合物（３０１．１８および３０１．１９構築物）に対応することが示される。最後のこれら２つに関して、元のｃ８Ｂ６と比較して親和性の増加が観察された。
【０１４７】
最後に、さらに驚くべきことに、３０１．１５抗体は、修復した結合共同性に対応する競合曲線において集合プロファイルを示した唯一のものであった。
【０１４８】
ＩＭＲ５、ＳＵＭ１５９ＰＴおよびＨ１８７細胞に対する抗ＯａｃＧＤ２  ３０１．１５ｂ、３０１．２０および３０１．２１抗体の直接細胞毒性：
【０１４９】
【表１６】
0006633520.tif 000017
【０１５０】
この結果により、予想外に、ヒトＣＨ１γ２またはＣＨ１γ４を含むキメラ抗体は、ＩＭＲ５細胞に対してプロアポトーシス活性を有することが示され、このことは、直接細胞毒性の損失がヒトＩｇＧ１の構造に起因し得ることを意味する。さらに、ヒトＣＨ１γ３および変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換（Ｃ２２２Ｓ）に対応する下線を引いた変異）を含むキメラ抗体はＩＭＲ５細胞に対してプロアポトーシス活性を有する。
【０１５１】
また、この結果により、ヒトＣＨ１γ１（Ｓ１３３Ｃでの変異）および変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換（Ｃ２２２Ｓ）に対応する下線を引いた変異）の融合物（３０１．１４ｂ構築物）またはヒトＣＨ１γ３およびヒトヒンジγ１の融合物（３０１．１５構築物）に対応する構築物は、ＳＵＭ１５９ＰＴおよびＨ１８７細胞の両方に対してプロアポトーシス活性を有することが示される。
【０１５２】
３０１．１４ｂおよび３０１．１５抗体の直接細胞毒性もまた、ヨウ化プロピジウムアッセイにより評価した。
【０１５３】
このアッセイにおいて、１５０，０００ＩＭＲ５細胞を、３７℃にて２４時間、２４ウェルプレートに播種し、次いで３７℃にて２４時間、４０μｇ／ｍＬの各抗体で処理した。その後、死細胞をヨウ化プロピジウム（１２．５μｇ／ｍｌ）により標識した。全ての試料をＬＳＲＩＩ  ＦＡＣＳ（ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ）においてフローサイトメトリーにより分析した。
【０１５４】
この結果を以下の表にまとめ、図１２により例示する。
【０１５５】
【表１７】
0006633520.tif 000018
【０１５６】
この結果により、ヒトＣＨ１γ１（Ｓ１３３Ｃでの変異）および変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換（Ｃ２２２Ｓ）に対応する下線を引いた変異）の融合物（３０１．１４ｂ構築物）またはヒトＣＨ１γ３およびヒトヒンジγ１の融合物（３０１．１５構築物）に対応する構築物がＩＭＲ５細胞に対してプロアポトーシス活性を有することが確認された。同時に、この結果により、ＩｇＧ１構造を模倣するようなマウスＩｇＧ３  ８Ｂ６における変異がプロアポトーシス活性の損失を生じることが確認された。
【０１５７】
非ＩｇＧ１抗体に特有のＣＨ１と軽鎖との間の対合を再構成することにより、プロアポトーシス活性を修復できる。このような再構成は、非ＩｇＧ１サブクラスに特有のＣＨ１システインを修復することによって、または非ＩｇＧ１ドメインに置換することによって得られ得る。
【０１５８】
まとめると、本発明者らは、維持されたプロアポトーシス活性を有する８Ｂ６抗体のキメラ化に成功し、そのプロアポトーシス活性は２つの抗体に対して均一に増加し、その１つはまた、元の抗体のような協同的結合を示す。
【０１５９】
２−インビトロでの抗ＧＤ２抗体のプロアポトーシス活性
ｃｈ１４．１８抗体の直接細胞毒性をＭＴＴアッセイにより評価した。
【０１６０】
このアッセイにおいて、１×１０４のＩＭＲ５細胞（１００μｌ）を９６ウェルマイクロプレート中でインキュベートし、３７℃にて２４時間インキュベートした。５０μｌの培地中の８０〜０．１５μｇ／ｍＬの抗体を加え、３７℃にて２４時間インキュベートした。５０μｇのＭＴＴを加え、３７℃にて４時間インキュベートし、細胞を可溶化し、一晩後、吸光度を５７０および６５０ｎｍにて読み取った。６５０ｎｍにおける生成物の吸光度を５７０ｎｍにおける吸光度から差し引き（Ａｂｓ５７０−Ａｂｓ６５０）、色素の全変換率を算出する。２０μｇのエトポシドで処理した細胞を含む４つの対照ウェルは、０％の生存率を考慮して吸光度についてのブランクを与える。生存率の阻害（％）を未処理の細胞に対する割合として表した。
【０１６１】
３１１．１４ｂおよび３１１．１５抗体で得た結果を以下の表にまとめ、溶解率は８０μｇ／ｍｌの抗体濃度で得たものである。
【０１６２】
抗体３１１．１４ｂは、図３（配列番号１５）に表されるように、変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換に対応する下線を引いた変異、Ｃ２２２Ｓ）を有する変異ヒトＣＨ１γ１（下線を引いた変異Ｓ１３３Ｃ）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにカッパＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。
【０１６３】
抗体３１１．１５は、図４（配列番号１６）に表されるようにヒトヒンジγ１ドメインを有するヒトＣＨ１γ３（その同類ＣＨ１γ１を置き換えている）に対応する。他の定常ドメインは、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（配列番号９）ならびにカッパＣＬドメイン（配列番号８）に対応する。
【０１６４】
ＩＭＲ５細胞に対する抗ＧＤ２  ３１１．１４ｂおよび３１１．１５抗体の直接細胞毒性：
【０１６５】
【表１８】
0006633520.tif 000019
【０１６６】
この結果は、予想外に、変異ヒトＣＨ１γ１  δまたはヒトＣＨ１γ３を含むキメラ抗体がプロアポトーシス活性を有することを示し、直接細胞毒性の損失がヒトＩｇＧ１の構造に起因し得ることを意味する。さらに、これらの抗体の全ては最初の抗体１４．１８のものと同様のＥＣ５０を示す。
【０１６７】
３１１．１４ｂおよび３１１．１５抗体の直接細胞毒性もヨウ化プロピジウムアッセイによって評価した。
【０１６８】
このアッセイにおいて、１５０，０００個のＩＭＲ５細胞を、３７℃にて２４時間、２４ウェルプレートに播種し、次いで３７℃にて２４時間、４０μｇ／ｍＬの各抗体で処理した。その後、死細胞をヨウ化プロピジウム（１２．５μｇ／ｍｌ）により標識した。全ての試料をＬＳＲＩＩ  ＦＡＣＳ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）においてフローサイトメトリーにより分析した。
【０１６９】
この結果を以下の表にまとめ、図１３に例示する。
【０１７０】
【表１９】
0006633520.tif 000020
【０１７１】
この結果により、ヒトＣＨ１γ１（Ｓ１３３Ｃで変異）および変異ヒトヒンジγ１ドメイン（システイン２２２のセリン残基による置換に対応する下線を引いた変異、Ｃ２２２Ｓ）の融合物（３１１．１４ｂ構築物）またはヒトＣＨ１γ３およびヒトヒンジγ１の融合物（３１１．１５構築物）に対応する構築物がＩＭＲ５細胞に対してプロアポトーシス活性を有することが確認された。
【０１７２】
非ＩｇＧ１抗体に特有のＣＨ１と軽鎖との間の対合を再構成することにより、プロアポトーシス活性を修復できる。このような再構成は、非ＩｇＧ１サブクラスに特有のＣＨ１システインを修復することによって、または非ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインを置換することによって得ることができる。
【０１７３】
まとめると、本発明者らはプロアポトーシス活性を維持する１４．１８抗体のキメラ化に成功し、そのプロアポトーシス活性はさらに２つの抗体について増加し、その１つはまた、元の抗体のように協同的結合も示した。
【０１７４】
３−インビボでの抗ＯＡｃＧＤ２抗体効果
マウス神経芽細胞腫モデル
５週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランス）から購入した。
【０１７５】
ヒト神経芽細胞腫ＩＭＲ５腫瘍を免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて成長させた。マウスの右脇腹に腫瘍細胞（１×１０６個のＩＭＲ５細胞）を皮下注射した。腫瘍移植後、皮下腫瘍成長を式［体積ｍｍ３＝（長さ）×（幅２）×０．５］を使用して測定した。ＩＭＲ５ヒト神経芽細胞腫保有ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、腫瘍体積が０．１ｃｍ３に等しくなったとき、抗体（５００μｇ／マウス）をｉ．ｖ．で与えた。
【０１７６】
マウスは８Ｂ６（ｍｕＩｇＧ３）ｍＡｂもしくはｃ．８Ｂ６（ｈｕＩｇＧ１）ｍＡｂ、または二重変異ｈｕＩｇＧ１  ｍＡｂもしくはｈｕＩｇＧ３  ＣＨ１により置換されたｈｕＩｇＧ１  ＣＨ１を受けた。
【０１７７】
４−インビボでの抗ＧＤ２抗体効果
マウス神経芽細胞腫モデル
５週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスはＣＨＡＲＬＥＳ  ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランス）から購入した。
【０１７８】
ヒト神経芽細胞腫ＩＭＲ５腫瘍を免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて成長させた。マウスの右脇腹に腫瘍細胞（１×１０６個のＩＭＲ５細胞）を皮下注射した。腫瘍移植後、皮下腫瘍成長を式［体積ｍｍ３＝（長さ）×（幅２）×０．５］を使用して測定した。ＩＭＲ５ヒト神経芽細胞腫保有ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、腫瘍体積が０．１ｃｍ３に等しくなったとき、抗体（５００μｇ／マウス）をｉ．ｖ．で与えた。
【０１７９】
マウスは１４．１８（ｍｕＩｇＧ３）ｍＡｂもしくはｃｈ１４．１８（ｈｕＩｇＧ１）ｍＡｂ、または二重変異ｈｕＩｇＧ１  ｍＡｂもしくはｈｕＩｇＧ３  ＣＨ１により置換されたｈｕＩｇＧ１  ＣＨ１を受けた。
【０１８０】
５−インビボでの抗ＣＤ２０抗体効果
マウスリンパ腫モデル
５週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランス）から購入した。
【０１８１】
ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓリンパ腫Ｒａｊｉ腫瘍を免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて成長させた。マウスの右脇腹に腫瘍細胞（１×１０７個のＲａｊｉ細胞）を皮下注射した。腫瘍移植後、皮下腫瘍成長を式［体積ｍｍ３＝（長さ）×（幅２）×０．５］を使用して測定した。Ｒａｊｉヒトリンパ腫保有ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、腫瘍体積が０．１ｃｍ３に等しくなったとき、抗体（５００μｇ／マウス）をｉ．ｖ．で与えた。
【０１８２】
マウスはリツキシマブｃｈＩｇＧ１  ｍＡｂ、または二重変異ｃｈＩｇＧ１  ｍＡｂ、またはｈｕＩｇＧ３  ＣＨ１により置換されたｈｕＩｇＧ１  ＣＨ１を有するｃｈＩｇＧ１  ｍＡｂを受けた。
【０１８３】
６−インビボでの抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）抗体効果
マウス乳がんモデル
５週齢のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランス）から購入した。
【０１８４】
ヒト乳がんＳＫＢＲ−３腫瘍を免疫不全ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスにおいて成長させた。マウスの右脇腹に腫瘍細胞（２×１０６個のＳＫＢＲ−３細胞）を皮下注射した。腫瘍移植後、皮下腫瘍成長を式［体積ｍｍ３＝（長さ）×（幅２）×０．５］を使用して測定した。ＳＫＢＲ−３ヒト乳がん保有ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、腫瘍体積が０．１ｃｍ３に等しくなったとき、抗体（５００μｇ／マウス）をｉ．ｖ．で与えた。
【０１８５】
マウスはトラスツズマブヒト化ＩｇＧ１  ｍＡｂまたは二重変異ヒト化ＩｇＧ１  ｍＡｂまたはｈｕＩｇＧ３  ＣＨ１により置換されたｈｕＩｇＧ１  ＣＨ１を有するヒト化ＩｇＧ１  ｍＡｂを受けた。
【図１】
0006633520.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006633520.tif 000030
【図１１】
0006633520.tif 000031
【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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