(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ほ乳類の未受精卵への顕微授精に用いられる顕微授精用液体組成物であって、
０〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウムイオンと、
３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌのカリウムイオンと、
５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンと、
０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオンと、
１５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸イオンと、
０〜２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化物イオンと、
５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸イオンと、
５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸イオンを含む水溶液であることを特徴とする顕微授精用液体組成物。
【請求項２】
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）からなる群より選択される緩衝剤を５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度でさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の顕微授精用液体組成物。
【請求項３】
濃度０．３〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸又はその塩をさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の顕微授精用液体組成物。
【請求項４】
濃度２０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの乳酸又はその塩をさらに含むことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の顕微授精用液体組成物。
【請求項５】
０．５〜１重量％の血清アルブミンをさらに含むことを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の顕微授精用液体組成物。
【請求項６】
０〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウムイオンと、
３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌのカリウムイオンと、
５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンと、
０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオンと、
１５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸イオンと、
０〜２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化物イオンと、
５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸イオンと、
５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸イオンと、
ピルビン酸又はその塩と、
乳酸又はその塩を含む水溶液であることを特徴とする未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物。
【請求項７】
ピルビン酸又はその塩の濃度が０．３〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項６に記載の未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物。
【請求項８】
乳酸又はその塩の濃度が２０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項６又は７に記載の未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物。
【請求項９】
Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）からなる群より選択される緩衝剤を５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度でさらに含むことを特徴とする請求項６から８のいずれか１項に記載の未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物。
【請求項１０】
０．５〜１重量％の血清アルブミンをさらに含むことを特徴とする請求項６から９のいずれか１項に記載の未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物。
【請求項１１】
顕微授精に用いられるほ乳類の精子及び未受精卵を準備する工程と、
請求項１から５のいずれか１項に記載の顕微授精用液体組成物を用いて、前記未受精卵内に単一の精子を注入する工程を含む顕微授精方法。
【請求項１２】
ほ乳類の未受精卵、受精卵又は胚を準備する工程と、
請求項６から１０のいずれか１項に記載の未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物を前記未受精卵、受精卵又は胚に注入する工程を含む未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法。
【請求項１３】
未受精卵に単一の精子を注入し、受精卵を調製する工程と、前記未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物を注入する工程を同時に行うことを特徴とする請求項１２に記載の未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な顕微授精用液体組成物、未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物、それらを用いた顕微授精方法並びに未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関の定義によると、「不妊」とは、「避妊なしで十分な頻度の性交渉があるのに１２ヶ月以上にわたって妊娠に至れない状態」をいう。不妊には、男性側に原因がある場合及び女性側に原因がある場合の双方があり、前者を男性不妊、後者を女性不妊という。男性不妊の原因としては、例えば、下記のような要因が考えられる。
（１）造精機能障害：無精子症、乏精子症、精子無力症等で、男性不妊の約９０％を占めると言われている。
（２）その他の要因：精索静脈瘤、閉塞性無精子症、先天性精管欠損、膿精液症、無精液症、逆行性射精、勃起不全（ＥＤ）、膣内射精障害等
【０００３】
また、女性不妊の原因としては、例えば、下記のような要因が考えられる。
（１）排卵障害：中枢性の排卵障害（内分泌不全）、卵巣機能不全、卵巣嚢腫、黄体未破裂卵胞、高プロラクチン血症等
（２）卵管障害：卵管癒着、卵管狭窄、卵管閉塞、卵管水腫等
（３）子宮頸管障害：頸管粘液不全、抗精子抗体の形成、頸管狭窄等
（４）子宮内膜症：チョコレート嚢腫、子宮腺筋症等
（５）着床障害：子宮筋腫、子宮奇形、黄体機能不全、子宮内膜ポリープ等
【０００４】
男性不妊の治療法としては、精液、精管、精巣からの精子の採取と人工授精や顕微授精、ホルモン補充療法等の薬物療法等が挙げられる。このうち、顕微授精は、男性不妊の治療法として１９９２年以来全世界で行われており、我が国でも毎年約１６万件施行されている。顕微授精法（卵細胞質内精子注入法；ＩＣＳＩともいう。）は、１個の未受精卵に１個の精子を人為的に直接注入して受精させる方法で、顕微鏡観察下、培養液中で卵子に刺した注入用ピペットから精子を未受精卵内に直接送り込む。
【０００５】
顕微授精に用いられる培養液としては、細胞外液に近い電解質組成を有する培養液が、世界中で因習的に用いられている。例えば、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）とカリウムイオン（Ｋ＋）は、共にアルカリ金属に属しており、その化学的性質は類似しているが、両者の生理学的機能は大きく異なり、細胞内液と細胞外液（体液）とでは、両者を始めとする無機電解質濃度は大きく相違している。細胞はＡＴＰを消費して細胞内外の電解質の濃度勾配を正常な範囲に維持しており、ナトリウムイオン濃度については、細胞内＜細胞外、カリウムイオン濃度については、細胞内＞細胞外となるように濃度勾配が維持されており（非特許文献１参照）、例えば、ほ乳類細胞における典型的な値として、細胞外ではＮａ＋：１４５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｋ＋：５ｍｍｏｌ／Ｌ、細胞内ではＮａ＋：５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｋ＋：１４０ｍｍｏｌ／Ｌという数値が例示されている（非特許文献２参照）。
【０００６】
細胞外液に近い電解質組成を有する未受精卵用培養液として、例えば、特許文献１には、無機イオン成分が９７〜１１９ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、４〜１１ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウム、０．３〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素カリウム、０．３〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウム、２０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウムであるブタ胚の体外培養用培地が開示されている。特許文献２には、ＩＣＳＩに用いられる培養液における好ましい無機電解質濃度として、塩化ナトリウム７５．０〜１０５ｍｍｏｌ／Ｌ、塩化カリウム３．５〜７．５ｍｍｏｌ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．４〜４ｍｍｏｌ／Ｌ、炭酸水素ナトリウム２．０〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、塩化カルシウム０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌという数値が挙げられている。
【０００７】
特許文献３には、卵子の卵管からの回収および精子注入に用いる培地として、０．１ｍｇ／ｍＬポリビニルアルコールを添加したＨＥＰＥＳ−ＣＺＢ培養液（組成：８１．６２ｍＭ  塩化ナトリウム、４．８３ｍＭ  塩化カリウム、１．７０ｍＭ  塩化カルシウム、１．１８ｍＭ  リン酸二水素カリウム、１．１８ｍＭ  硫酸マグネシウム、５．０ｍＭ  炭酸水素ナトリウム、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−Ｎａ、２３．８０ｍＭ  乳酸ナトリウム、０．２７ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１．０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍｇ／Ｌ  ＰＶＡ、１００ＩＵ／ｍＬ  ペニシリン、５０μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン、０．１１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ）、ＩＣＳＩ操作直前までの精子保存培地として、１２％ポリビニルピロリドンを添加したＨＥＰＥＳ−ＣＺＢ培養液が開示されている。特許文献４には、海産魚類から卵巣を摘出し、摘出した卵巣又は断片化された卵巣をナトリウムイオン濃度が１２０ｍＭ以上２５０ｍＭ以下、カリウムイオン濃度が５ｍＭ以上１０ｍＭ以下である培養液中で培養する海産魚類の卵巣の維持方法が開示されている。
【０００８】
特許文献５には、ＩＣＳＩにも用いることができる第１の培養液において、エネルギー源以外の電解質として、塩化ナトリウムを９５±４７．５ｍＭ、リン酸二水素カリウムを０．７±０．３５ｍＭ、塩化カリウムを２．５０±１．２５ｍＭ、塩化カルシウムを１．７０±０．８５ｍＭ、硫酸マグネシウム七水和物を０．２０±０．１０ｍＭ含むものが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００３−２４０５５号公報（請求項４）
【特許文献２】特表２００３−５１７２７６号公報（段落００３３）
【特許文献３】特開２００５−２５５６５０号公報（段落００２０、００２１）
【特許文献４】国際公開第２０１６／１５２２１５号（請求項７、８）
【特許文献５】国際公開第２００９／１２２５４１号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】P.L. Altman、D.D. Katz 編著、“Cell Biology”、Federation of American Societies for Experimental Biology刊、１９７６年、ｐ．１２２
【非特許文献２】B. Alberts他著、“Molecular Biology of the Cell”、Garland Publishing, Inc.刊、１９８３年、ｐ２８６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
以上述べたように、従来、ヒトを含めたほ乳類の顕微授精は全て、細胞外液に近い電解質組成を有する細胞外液様培養液が用いられている。すなわち、従来のほ乳類の顕微授精においては、細胞外液様培養液中に浮遊させた精子をマイクロピペットに吸引し、このマイクロピペットを細胞外液様培養液中に保持した未受精卵に穿刺し、精子を細胞外液様培養液とともに未受精卵の内部に注入することにより顕微授精が行われている。その結果、細胞内液とは組成の大きく異なる細胞外液様培養液の卵子細胞質内への流入が不可避であるため、流入量が多いと、その後の受精率・胚発育率が低下し、その結果として妊娠率が低下する。
【００１２】
細胞外液様培養液を用いる従来の顕微授精において、妊娠率の低下を阻止するための唯一の解決策は、精子の注入時に卵子細胞質内に注入される細胞外液様培養液の量を少なくするように技術的に熟練することであるのが現状である。しかし、そもそも細胞内液とは著しく異なる細胞外液様の培養液を注入することがかかる課題の根源であるから、細胞外液よりも細胞内液に近い電解質組成を有する培養液を顕微授精用液体組成物として使用することにより、高度の熟練を要求されることなく簡便かつ確実に顕微授精を行うことが可能になると考えられる。
【００１３】
女性は主として卵子の老化による胚発育能低下から３７歳以降急速に妊孕性が低下する（例えば、２０１７年ＡＲＴデータブック(http://plaza.umin.ac.jp/~jsog-art/2017data_20191015.pdf)参照）。現在、日本の生殖補助医療では、３７歳以上の体外受精・顕微授精が総治療周期の６５．０５％を占めており、卵及び胚発育能の低下から妊娠率が不良なため、卵および胚の発育能を改善する治療法は大いに切望されている。ちなみに、未受精卵、受精卵及び胚を賦活する活性を有する液体組成物及びそれを用いた未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法はこれまで知られていない。
【００１４】
本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、細胞毒性等の問題が少なく、確実に顕微授精を行うことが可能で、妊娠成績が向上する顕微授精用液体組成物、未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物、それらを用いた顕微授精方法並びに未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的に沿う本発明の第１の態様は、ほ乳類の未受精卵（減数分裂後の核相ｎの雌性の配偶子で、受精前のものをいう。）への顕微授精に用いられる顕微授精用液体組成物であって、０〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウムイオンと、３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌのカリウムイオンと、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンと、０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオンと、１５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸イオンと、０〜２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化物イオンと、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸イオン（炭酸イオン及び炭酸水素イオンの合計）と、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸イオンを含む水溶液であることを特徴とする顕微授精用液体組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１６】
本発明の第２の態様は、０〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウムイオンと、３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌのカリウムイオンと、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンと、０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオンと、１５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸イオンと、０〜２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化物イオンと、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸イオンと、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸イオンと、ピルビン酸又はその塩と、乳酸又はその塩を含む水溶液であることを特徴とする未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１７】
本発明の第３の態様は、顕微授精に用いられるほ乳類の精子及び未受精卵（減数分裂後の核相ｎの雌性の配偶子で、受精前のものをいう。）を準備する工程と、本発明の第１の態様に係る顕微授精用液体組成物を用いて、未受精卵内に単一の精子を注入する工程を含む顕微授精方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１８】
本発明の第４の態様は、ほ乳類の未受精卵、受精卵又は胚を準備する工程と、本発明の第２の態様に係る未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物を前記未受精卵、受精卵又は胚に注入する工程を含む未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法を提供することにより上記課題を解決するものである。
【００１９】
本発明の第４の態様に係る未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法において、未受精卵に単一の精子を注入し、受精卵を調製する工程と、前記未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物を注入する工程を同時に行ってもよい。
【００２０】
本発明の第１の態様に係る顕微授精用液体組成物が、濃度０．３〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸又はその塩をさらに含んでいることが好ましい。
【００２１】
本発明の第１の態様に係る顕微授精用液体組成物が、濃度２０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌの乳酸又はその塩をさらに含んでいることが好ましい。
【００２２】
本発明の第２の態様に係る未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物中のピルビン酸又はその塩の濃度が０．３〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
【００２３】
本発明の第２の態様に係る未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物中の乳酸又はその塩の濃度が２０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
【００２４】
本発明の第１の態様に係る顕微授精用液体組成物及び本発明の第２の態様に係る未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物が、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）からなる群より選択される緩衝剤を５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度でさらに含んでいてもよい。
【００２５】
本発明の第１の態様に係る顕微授精用液体組成物及び本発明の第２の態様に係る未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物が、０．５〜１重量％の血清アルブミンをさらに含んでいてもよい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によると、細胞毒性等の問題が少なく、確実に顕微授精を行うことが可能で、妊娠成績が向上する顕微授精用液体組成物、および卵細胞を賦活する活性を有し、母体の妊娠率、卵細胞の発育、産児の生産率及び分娩率を向上させることが可能な未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物が提供される。また、本発明によると、それらを用いて、細胞毒性等の問題が少なく、確実に顕微授精を行うことが可能で、妊娠成績を向上させることが可能な顕微授精方法及び卵細胞を賦活させ、母体の妊娠率、卵細胞の発育、産児の生産率及び分娩率を向上させることが可能な未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】前核期胚の胞胚への発育に顕微授精用液体組成物並びに未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物が及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】顕微授精用液体組成物並びに未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物が注入された前核期胚を移植したレシピエントマウスにおける移植胚数あたりの生産仔率と移植匹数あたりの分娩率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
続いて、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
【００２９】
本発明の第１の実施の形態に係る顕微授精用液体組成物（以下、「顕微授精用液体組成物」又は「組成物」と略称される場合がある。）は、ほ乳類の卵細胞への顕微授精に用いられる顕微授精用液体組成物であって、０〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウムイオンと、３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌのカリウムイオンと、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンと、０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオンと、１５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸イオンと、０〜２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化物イオンと、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸イオンと、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸イオンを含む水溶液である。
【００３０】
顕微授精用液体組成物に含まれるナトリウムイオン濃度は、細胞内液中の濃度に近い０〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１０〜３５ｍｍｏｌ／Ｌである。顕微授精用液体組成物に含まれるカリウムイオン濃度は、細胞外液中の濃度よりも高い３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは３５〜４５ｍｍｏｌ／Ｌである。顕微授精用液体組成物に含まれるナトリウムイオン濃度とカリウムイオン濃度の合計値は、好ましくは４０〜７０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは４５〜７０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００３１】
顕微授精用液体組成物に含まれるマグネシウムイオン濃度は５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは７±１ｍｍｏｌ／Ｌである。顕微授精用液体組成物に含まれるカルシウムイオン濃度は０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．８〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００３２】
顕微授精用液体組成物に含まれるリン酸イオン濃度は、細胞内液中の濃度に近い１５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは２０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは２５±１．５ｍｍｏｌ／Ｌである。また、顕微授精用液体組成物は塩化物イオンを含んでいてもよく、その場合において、塩化物イオン濃度は２ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましい。
【００３３】
顕微授精用液体組成物に含まれる炭酸イオン濃度は、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは７〜１２ｍｍｏｌ／Ｌである。また、顕微授精用液体組成物に含まれる硫酸イオン濃度は、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは６〜８ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００３４】
以上述べたように、無機電解質、特にナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、リン酸イオン、塩化物イオン、炭酸イオン及び硫酸イオンの濃度を細胞外液のそれよりも細胞内液のそれに近づけることにより、ＩＳＣＩ操作時に精子と共に組成物が卵子内に流入したとしても、従来の顕微授精用液体組成物よりも細胞毒性が低く、卵子の生理環境に悪影響を及ぼさないため、顕微授精後の受精卵及び胚の健全な発育を阻害せず、ＩＳＣＩ操作の再現性及び妊娠成績を向上させることが可能である。
【００３５】
顕微授精用液体組成物は、ｐＨを安定させるために緩衝剤を含んでいることが好ましい。緩衝剤は、細胞内液のｐＨに近いｐＨ７．２〜７．５付近にｐＫａを有し、卵子及び受精卵の生理機能に悪影響を及ぼさない限りにおいて任意のものを用いることができるが、好ましい緩衝剤の具体例としては、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）が挙げられ、特に好ましいものとしては、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）及び３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）が挙げられる。顕微授精用液体組成物に含まれる緩衝剤の濃度は、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
【００３６】
顕微授精用液体組成物は、血清アルブミンを含んでいてもよい。血清アルブミンの具体例としては、ヒト血清アルブミン、より入手が容易なウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等が挙げられる。顕微授精用液体組成物に含まれる血清アルブミンの濃度は、０．５〜１重量％であることが好ましい。
【００３７】
顕微授精用液体組成物は、上述の各成分以外に、栄養成分、抗生物質等の他の成分を含んでいてもよい。栄養成分の具体例としては、タウリン、可欠アミノ酸、精子の栄養源となるグルコース、卵子の栄養源となるピルビン酸（ナトリウム塩等の塩）、乳酸（ナトリウム塩等の塩）等が挙げられる。ピルビン酸又はその塩（好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩）の濃度は、好ましくは、０．３〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌである。乳酸又はその塩（好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩）の濃度は、好ましくは、２０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００３８】
顕微授精用液体組成物のｐＨは７．２〜７．４であることが好ましい。
【００３９】
顕微授精用液体組成物は、秤量した原料（無機塩、緩衝剤、栄養成分、血清アルブミン等）を滅菌水、超純水等に溶解させることにより調製される。
【００４０】
本発明の第２の実施の形態に係る未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物（以下、「未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物」又は「組成物」と略称される場合がある。）は、ほ乳類の未受精卵、受精卵及び胚を賦活する活性を有する液体組成物であって、０〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウムイオンと、３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌのカリウムイオンと、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンと、０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオンと、１５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸イオンと、０〜２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化物イオンと、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸イオンと、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸イオンと、ピルビン酸又はその塩と、乳酸又はその塩を含む水溶液である。
【００４１】
未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物は、未受精卵、受精卵及び胚の栄養源であるピルビン酸又はその塩及び乳酸又はその塩を必須成分として含む以外は、本発明の第一の実施の形態に係る顕微授精用液体組成物と同様であるため、それらに関する詳細な説明は省略する。ピルビン酸又はその塩（好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩）の濃度は、好ましくは、０．３〜０．４ｍｍｏｌ／Ｌである。乳酸又はその塩（好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩）の濃度は、好ましくは、２０〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００４２】
本発明の第３の実施形態に係るヒトを含むほ乳類の顕微授精方法は、ヒト又はヒト以外のほ乳類に由来する精子及び卵細胞を準備する工程と、上述のとおり調製された本発明の第１の実施の形態に係る顕微授精用液体組成物を用いて、卵細胞内に単一の精子を注入する工程を含んでいる。精子及び卵細胞の準備には、任意の公知の方法を特に制限なく用いることができる。例えば、精子の準備に用いられる方法としては、運動精子回収法により運動精子を回収する方法が挙げられる。卵細胞の準備に用いられる方法の具体例としては、採卵針を卵巣に刺入し、卵胞液と共に成熟した卵細胞を回収し、必要に応じて卵丘細胞の除去等の前処理を行う方法が挙げられる。
【００４３】
得られた卵細胞を液体培地中（顕微授精に用いられる任意の公知のものを特に制限なく用いることができる。）に浮遊させ、顕微授精用液体組成物中に浮遊させた単一の精子を注入する。この操作において用いられる方法としては、ガラス等からなる針状の注入用ピペットを卵細胞の細胞質内に刺入し、精子を注入する卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）が挙げられる。精子の注入を精度よく行うために、固定用ピペットで吸引することによって卵細胞を保持してもよく、通常は顕微鏡下で観察しながら操作を行う。
【００４４】
なお、顕微授精用液体組成物として、先述の未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物と同一の組成のものを用いると、未受精卵、受精卵及び胚が賦活され、妊娠率の向上、産児の分娩率や出産後の発育を向上させることができる。したがって、本発明の第４の実施形態は、ヒト又はヒト以外のほ乳類に由来する未受精卵、受精卵及び胚を準備する工程と、上述のとおり調製された本発明の第２の実施の形態に係る未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物を未受精卵、受精卵及び胚の内部に注入する工程を有する未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法に関するものである。本実施の形態に係る未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法に用いることができる未受精卵、受精卵及び胚としては、任意のほ乳類に由来する未受精卵、受精卵及び胚を特に制限なく用いることができる。
【００４５】
また、本発明のさらに他の実施形態は、上述の方法により顕微授精を行った受精卵又は胚を母胎に導入する工程を含むヒト又はほ乳類の不妊を治療する方法に関するものである。
【実施例】
【００４６】
次に、本発明の作用効果を確認するために行った実施例について説明する。
［１］  顕微授精用液体組成物の調製
下記の表１に示す原料を滅菌水に溶解し、１００ｍＬにメスアップし、７種類の顕微授精用液体組成物（以下、「組成物」と略称する場合がある。）ＩＣＳ−１〜ＩＣＳ−７を調製した。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
各溶液のマグネシウムイオン（Ｍｇ）、ナトリウムイオン（Ｎａ）、カリウムイオン（Ｋ）、カルシウムイオン（Ｃａ）、塩化物イオン（Ｃｌ）、リン酸イオン（リン酸イオン、リン酸水素イオン及びリン酸二水素イオンの合計：phosphate）、炭酸イオン（炭酸イオン及び炭酸水素イオンの合計：carbonate）及び硫酸イオン（sulfate）の濃度（単位：ｍｍｏｌ／Ｌ）は、下記の表２に示すとおりである。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
［２］  マウスモデルを用いた顕微授精用液体組成物の安全性及び有効性の評価（１）
過排卵処理した雌性マウスを雄性マウスと交配し、前核期胚を卵管より回収した。回収した前核期胚を、コントロール群（インジェクターピペットによる穿刺を行うことなく培養する）、穿刺のみ群（穿刺は行うが組成物を注入しない）及び注入群（組成物を注入する）に無作為に割り当てた。組成物の注入には、電動マイクロインジェクタ（エッペンドルフ社製フェムトジェット）を用い、卵子１個（１１３〜２６８ｐＬ）あたり３７ｐＬの組成物ＩＣＳ−２、ＩＣＳ−５〜ＩＣＳ−７、ｍＷ（modified Whitten）培地及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のいずれかを注入した。上記操作後（コントロール群については上記操作を実施しない。）、前核期胚を５日間胚培養し、胞胚（Ｂ）、拡張胞胚（Ｅ）及び孵化胞胚（Ｈ）への発育率を比較した。結果を図１に示す。コントロール群と穿刺のみ群の結果を比較すると、インジェクターピペットによる穿刺が前核期胚の胞胚への発育を阻害することがわかる。更に、図１の結果より、ＩＣＳ−５〜ＩＣＳ−６、ｍＷ（modified Whitten）培地及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のいずれかを注入した群において、前期核胚の胞胚への発育は穿刺のみ群より更に阻害されているが（ＩＣＳ−１、ＩＣＳ−３及びＩＣＳ−４を注入した場合にも同様の結果が得られた。）、ＩＣＳ−２を注入した群では。穿刺のみ群よりも前期核胚の胞胚への発育が促進されていることがわかる。
【００５１】
［３］  顕微授精用液体組成物並びに未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物の調製
上述の前期核胚の胞胚への発育試験において良好な成績が確認されたＩＣＳ−２の組成をベースに、ナトリウムイオン及び精子の栄養源であるグルコース、卵子の栄養源であるピルビン酸のいずれか１又は複数を加え（組成は下記表３及び表４を参照）、顕微授精用液体組成物及び未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物として利用可能な組成物ＩＣＳ−２−Ｎａ、ＩＣＳ−２−Ｎａ＋Ｌａ＋Ｐｙ、ＩＣＳ−２−Ｎａ＋Ｇｌｕ、ＩＣＳ−２−Ｎａ＋Ｌａ＋Ｐｙ＋Ｇｌｕ、ＩＣＳ−２＋Ｌａ＋Ｐｙ、ＩＣＳ−２＋Ｇｌｕ及びＩＣＳ−２＋Ｌａ＋Ｐｙ＋Ｇｌｕを調製した。
【００５２】
【表３】
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【００５３】
【表４】
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【００５４】
［４］  マウスモデルを用いた安全性及び有効性の評価（２）
過排卵処理した雌性マウスを雄性マウスと交配し、前核期胚を卵管より回収した。回収した前核期胚を、コントロール群（インジェクターピペットによる穿刺を行うことなく培養する）、穿刺のみ群（穿刺は行うが組成物を注入しない）及び注入群（組成物を注入する）に無作為に割り当てた。組成物の注入には、電動マイクロインジェクタ（エッペンドルフ社製フェムトジェット）を用い、卵子１個（１１３〜２６８ｐＬ）あたり３７ｐＬの組成物ＩＣＳ−２−Ｎａ＋Ｌａ＋Ｐｙ、ｍＨＴＦ培地及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のいずれかを注入した。上記操作後（コントロール群については上記操作を実施しない。）、前核期胚をレシピエントマウスの卵管に胚移植し、移植胚数あたりの生産仔率、移植匹数あたりの分娩率、産仔の発育を比較した。結果を図２、表５及び表６に示す。これらの結果より明らかなように、ＩＣＳ−２−Ｎａ＋Ｌａ＋Ｐｙは、レシピエントマウスの妊娠率及び分娩数（産仔の生産率）において、コントロール群よりも良好な成績をおさめた。さらに産仔の発育および妊孕性もコントロール群の産仔と差がなかった。この結果は、ＩＣＳ−２−Ｎａ＋Ｌａ＋Ｐｙが、卵細胞及び受精卵（前期核胚）に対する細胞毒性を有しておらず、顕微授精用液体組成物として有効であるのみならず、受精卵を賦活し、レシピエントマウスの妊娠率並びに産仔の分娩数を促進する活性を有していることが確認された。
【００５５】
【表５】
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【００５６】
【表６】
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【要約】
【課題】細胞毒性等の問題が少なく、確実に顕微授精を行うことが可能で、妊娠成績が向上する顕微授精用液体組成物、未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物、それらを用いた顕微授精方法並びに未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法を提供する。
【解決手段】０〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのナトリウムイオンと、３０〜５０ｍｍｏｌ／Ｌのカリウムイオンと、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌのマグネシウムイオンと、０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌのカルシウムイオンと、１５〜３５ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸イオンと、０〜２ｍｍｏｌ／Ｌの塩化物イオンと、５〜１５ｍｍｏｌ／Ｌの炭酸イオンと、５〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸イオンを含む顕微授精用液体組成物、更にピルビン酸又はその塩及び乳酸又はその塩を含む未受精卵、受精卵及び胚賦活用液体組成物、それらを用いた顕微授精方法及び未受精卵、受精卵及び胚の賦活方法。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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