(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験体における敗血症の治療において使用するための間葉系脂肪組織由来多能性間質細胞（ASC）を含有する組成物であって、敗血症が炎症性の肺の状態に続発するものであり、組成物が静脈内経路によって投与されるものであり、炎症性の肺の状態が肺炎である、上記組成物。
【請求項２】
ヒト被験体における敗血症を治療するための医薬の製造における間葉系脂肪組織由来多能性間質細胞の使用であって、敗血症が炎症性の肺の状態に続発するものであり、医薬が静脈内経路によって投与されるものであり、炎症性の肺の状態が肺炎である、上記使用。
【請求項３】
敗血症が重症敗血症である、請求項１又は２記載の組成物又は使用。
【請求項４】
肺炎が細菌によって引き起こされる、請求項１〜３のいずれか1項記載の組成物又は使用。
【請求項５】
細胞が、増大した脂肪組織由来間質細胞である、請求項１〜４のいずれか1項記載の組成物又は使用。
【請求項６】
ASCが同種異系である、請求項１〜５のいずれか1項記載の組成物又は使用。
【請求項７】
組成物が被験体の体重1kgあたり約0.25×106細胞〜約5×106細胞を含む、請求項１〜６のいずれか1項記載の組成物又は使用。
【請求項８】
間葉系間質細胞が例えば1日目及び3日目に反復して被験体に投与される、請求項１〜７のいずれか1項記載の組成物又は使用。
【請求項９】
ASCの少なくとも約50％がマーカーCD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90及びCD105の1種以上を発現する、請求項１〜８のいずれか1項記載の組成物又は使用。
【請求項１０】
ASCの少なくとも約50％がマーカー第VIII因子、α-アクチン、デスミン、S-100、ケラチン、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD34、CD45、STRO-1及びCD133を発現しない、請求項１〜９のいずれか1項記載の組成物又は使用。
【請求項１１】
ASCが製薬上許容される担体及び／又は希釈剤中で投与される、請求項１〜１０のいずれか1項記載の組成物又は使用。
【請求項１２】
ASCが1種以上の更なる治療剤と共に投与される、請求項１〜１１のいずれか1項記載の組成物又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体における敗血症を治療するための間葉系間質細胞（MSC）の使用に関する。本発明は、敗血症の治療のための組成物、使用及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
全身性炎症反応症候群（SIRS）は、特定の感染源のない全身の炎症状態である。これは、限定するものではないが、外傷、手術、副腎機能障害、肺塞栓、心筋梗塞、出血、アナフィラキシー、薬剤の過剰投与、免疫不全及び熱傷を含む、多くの要因によって引き起こされ得る。以下に挙げるように、SIRSには4つの主要な診断症状があるが、これらのうちの任意の2つの存在が診断のためには十分である（例えばNystrom(1998) Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 41, Suppl. A, 1-7を参照されたい）。
i)   1分間に90を超える心拍数；
ii)  36℃以下又は38℃以上の体温；
iii) 1分間に20回を超える呼吸数（多呼吸）；及び
iv)  4000細胞/mm3以下、若しくは12000細胞/mm3以上の白血球数、又は10％より多い未成熟の好中球の存在。
【０００３】
SIRSは、急性期の免疫原性タンパク質の広範な活性化を引き起こし、補体系及び凝固経路に影響して、これが血管系並びに内臓器官に障害を引き起こす。続いて様々な神経内分泌の逆調節系が活性化され、これがしばしば問題を悪化させる。
【０００４】
敗血症はSIRSの特定の形態であり、集中治療室における最も一般的な死亡原因である。敗血症は疑われる又は検出された感染症によって引き起こされる。これは内在性の炎症性サイトカインの過活動で均衡の崩れたネットワークによって特徴付けられ、しばしば広範な炎症及び血液凝固を生じ、発赤、高熱、腫れ、疼痛、臓器障害又は臓器不全を生じ得る。敗血症における血液凝固はまた、手足や重要な臓器への血流の低下を引き起こすことがあり、臓器不全又は壊疽の発症に至ることがあり得る。
【０００５】
SIRSと同様に、敗血症はしばしば体中に急性炎症をもたらし、従って発熱及び白血球増加症（白血球数の上昇）と関連する場合がしばしばである。敗血症の背景に関する現在の理論は、感染に対する宿主の免疫応答がSIRSを引き起こし、これが上記の症状を提示するというものである。感染及び敗血症の後、組織かん流及び酸素送達が低下することがあり、敗血症性ショックに到る。敗血症性ショックと診断されるためには、その患者における感染及び難治性低血圧の証拠がなければならない。
【０００６】
SIRS、敗血症及び敗血症性ショックは、重度の医学的状態である。迅速かつ積極的治療を行った場合でさえも、これらの疾患は多臓器不全症候群まで進行し、死に至る場合さえある。
【０００７】
今日までのほとんどの治療的戦略は炎症促進性メディエーターを標的としてきたが、大規模な多施設臨床試験で試験した場合に、患者の生存の改善は見られなかった。例えばTNFα及びIL-1β等の単一のサイトカインをブロックするように設計された治療は、おそらくはこれらの炎症性サイトカインの初期及び一時的な速度論のために、有効性が限定的であることが示された。近年、国際的な救命救急及び感染性疾患の専門家等によって、SIRS、敗血症又は敗血症性ショックに罹患した患者に対する治療を向上させるための管理ガイドラインが開発された。これらのガイドラインは複雑な診断及び治療的判断を簡単な「基幹」業務に変換するためのものであり、他の治療の中から広域抗生物質、ステロイド及びドロトレコギンアルファ（Drotrecogin Alfa）（活性型）の投与を示唆している。
【０００８】
しかしながら、敗血症と関連する死亡率は30％〜50％にとどまり、一方敗血症性ショックのための死亡率はずっと高い50％〜60％であると報告されている。毎年およそ750,000例の新たな敗血症の症例が報告されており、そのうち少なくとも210,000例が死に至っている。薬物療法がより積極的になっているため、SIRS、敗血症及び敗血症性ショックの発症率は増加傾向にあり、従ってこれらの状態に対する新たな信頼できる治療が必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
間葉系間質細胞（MSC）、特にヒト脂肪組織由来間質細胞（hASC）の投与がSIRS、敗血症、重症敗血症及び敗血症性ショックの治療において有用であることが見出されている。例えば、MSC、特にhASCが肺炎と関連する敗血症における死亡に対して防御的であることが見出され、MSCがSIRS、敗血症及び敗血症性ショックの治療において有用であり得るという証拠を提供している。MSCはSIRS、敗血症、重症敗血症及び敗血症性ショックの極めて重要な側面を調節するためにいくつかのレベルで、例えば様々な炎症性サイトカイン及びケモカインの全身レベルの低下によって、また様々な標的臓器中への白血球浸潤の阻害によって、機能することが見出されている。
【００１０】
従って、一態様において、本発明は、肺炎を有するか又は肺炎後の被験体における敗血症の治療における使用のための、例えば、肺炎を有するか又は肺炎後の被験体における敗血症の治療方法において使用するための、間葉系間質細胞（MSC）を含む組成物を提供する。
【００１１】
本発明はまた、肺炎を有するか又は肺炎後の敗血症被験体を治療するための医薬の製造における間葉系間質細胞（MSC）の使用を提供する。
【００１２】
本発明はまた、被験体に間葉系間質細胞（MSC）を投与することを含む、肺炎を有するか又は肺炎後の被験体における敗血症の治療方法を提供する。
【００１３】
本発明のこれら及び他の態様は、以下により詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】感染48時間後の様々な組織における細菌負荷。Ａ及びＢは2回の独立した実験の結果を示す。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置；CFU＝コロニー形成単位。図１は血液の結果を示す。
【図２】感染48時間後の様々な組織における細菌負荷。Ａ及びＢは2回の独立した実験の結果を示す。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置；CFU＝コロニー形成単位。図２は肺ホモジネートの結果を示す。
【図３】感染48時間後の様々な組織における細菌負荷。Ａ及びＢは2回の独立した実験の結果を示す。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置；CFU＝コロニー形成単位。図３は肝ホモジネートの結果を示す。
【図４】感染48時間後の様々な組織における細菌負荷。Ａ及びＢは2回の独立した実験の結果を示す。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置；CFU＝コロニー形成単位。図４は脾ホモジネートの結果を示す。
【図５】感染48時間後の肺ホモジネート中のサイトカイン及びケモカインレベル。Ａ及びＢは2回の独立した実験の結果を示す。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置。図５はTNFαの結果を示す。
【図６】感染48時間後の肺ホモジネート中のサイトカイン及びケモカインレベル。Ａ及びＢは2回の独立した実験の結果を示す。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置。図６はIL1βの結果を示す。
【図７】感染48時間後の肺ホモジネート中のサイトカイン及びケモカインレベル。Ａ及びＢは2回の独立した実験の結果を示す。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置。図７はIL6の結果を示す。
【図８】感染48時間後の肺ホモジネート中のサイトカイン及びケモカインレベル。Ａ及びＢは2回の独立した実験の結果を示す。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置。図８はMip-2の結果を示す。
【図９】感染後の様々な組織における細菌負荷。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置；CFU＝コロニー形成単位。図９は血液の結果を示す。
【図１０】感染後の様々な組織における細菌負荷。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置；CFU＝コロニー形成単位。図１０は肺ホモジネートの結果を示す。
【図１１】感染後の様々な組織における細菌負荷。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置；CFU＝コロニー形成単位。図１１は肝ホモジネートの結果を示す。
【図１２】感染後の様々な組織における細菌負荷。プラセボ＝乳酸リンゲル液による処置；ASC＝ASCによる処置；CFU＝コロニー形成単位。図１２は脾ホモジネートの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
本明細書において使用する場合、以下の用語及び語句は、以下に示す意味を有するものとする。他に定義しない限り、本明細書において使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１６】
冠詞「a」及び「an」は、1個、又は1個より多い（すなわち少なくとも1個の）文法上の対象物品を意味する。例えば、「an element」は、1個の要素（element）、又は1個より多い要素を意味する。
【００１７】
用語「約（about）」は、数値と関連して使用する場合、その数値±10％に関する。
【００１８】
「脂肪組織（adipose tissue）」とは、任意の脂肪組織（fat tissue）を意味する。脂肪組織は、例えば皮下、大網（omental）／内臓、乳腺（mammary）、生殖腺（gonadal）、若しくは他の脂肪組織部位由来の褐色又は白色脂肪組織であり得る。好ましくは、脂肪組織は皮下の白色脂肪組織である。脂肪組織は、初代細胞培養又は不死化細胞株を含み得る。脂肪（adipose）組織は、脂肪（fat）組織を有する任意の生物由来のものであり得る。一部の実施形態において、脂肪組織は哺乳動物由来であり、更なる実施形態において、脂肪組織はヒト由来である。脂肪組織の都合の良い供給源は脂肪吸引手術である。しかしながら、脂肪組織の供給源、及び脂肪組織の単離方法のいずれも、本発明にとって重要なものではないことが理解されるであろう。本明細書に記載される細胞が被験体への自己移植のために望ましい場合、脂肪組織はその被験体から単離されるであろう。
【００１９】
「脂肪組織由来間質細胞（ASC）」とは、脂肪組織、一般的にヒト脂肪組織（hASC）に由来するMSCをいう。
【００２０】
用語「生物学的医薬品」は、典型的には天然の（遺伝子操作されていない）生物学的起源からの直接的な抽出以外の手段によって製造される、治療的用途のためのタンパク質又は核酸ベースの医薬的物質を意味するものと理解されるべきである。
【００２１】
本明細書において使用する用語「細胞/kg」は、患者の体重1kgあたりで投与される細胞（例えばMSC）数を意味するものと理解されるべきである。
【００２２】
用語「構成的」は、いかなる特別な誘導もない遺伝子の発現を意味するものと理解される。
【００２３】
用語「培養」は、培地中での細胞、生物、多細胞物、又は組織の増殖をいう。用語「培養する」は、そのような増殖を達成する任意の方法をいい、複数の段階を含み得る。用語「更に培養する」は、細胞、生物、多細胞物、又は組織を増殖の特定の段階まで培養し、次いで別の培養方法を使用して該細胞、生物、多細胞物、又は組織を増殖の別の段階まで培養することをいう。「細胞培養」とは、in vitroにおける細胞の増殖をいう。そのような培養において、細胞は、増殖するが、それ自体で組織まで構造化しない。「組織培養」は、組織、例えばその構造及び機能を維持するような始原臓器又は成体臓器のin vitroでの移植片の維持又は増殖をいう。「単層培養」は、細胞が互いにまた基質に主として接着しながら好適な媒体中で増殖する培養をいう。更に、「懸濁培養」は、細胞が好適な媒体中に懸濁しながら増殖する培養をいう。同様に、「連続流動培養」は、細胞の増殖、例えば生存を維持するための新鮮な培地の連続流中での細胞又は移植片の培養をいう。用語「条件付き培地」は、細胞によって産生され、培養中に分泌される特定のパラクリン及び／又はオートクリン因子を含むように培地が改変された、培養細胞と接触した一定時間の後に得られる、例えば培養した細胞／組織を含まない上清をいう。「コンフルエント培養」は、全ての細胞が接触し、従って培養容器の全表面がおおわれた細胞培養であり、細胞がその最大密度に達していることも意味するが、コンフルエンスは必ずしも分裂が停止すること、又はその集団が大きくならないことを意味しない。
【００２４】
用語「培養培地」又は「培地」は、当分野において認識されており、一般的に生きた細胞の培養のために使用される任意の物質又は調製物をいう。細胞培養に関連して使用する用語「培地」は、細胞を囲む環境の構成成分を含む。培地は固体状、液体状、気体状又は複数の相及び物質の混合物であって良い。培地には液体増殖培地、並びに細胞増殖を維持しない液体培地が含まれる。培地はまた、寒天、アガロース、ゼラチン及びコラーゲンマトリクス等のゲル状の培地も含む。気体状培地の例としては、ペトリ皿又は他の固体若しくは半固体の支持体上で増殖している細胞が暴露している気相が挙げられる。用語「培地」はまた、細胞とまだ接触していなくても、細胞培養において使用することが意図される物質をもいう。言い換えれば、細菌の培養のために調製された栄養豊富な液体は培地である。同様に、水又は他の液体と混合した場合に細胞培養に適するようになる粉末混合物は「粉末化培地」と呼ぶことがある。「規定培地」は化学的に規定された（通常は精製された）成分からなる培地をいう。「規定培地」は、酵母抽出物及びビーフブロス等の、あまり性状解析されていない生物学的抽出物は含まない。「富栄養培地」は、特定の種のほとんど又は全ての生存形態の増殖を支持するように設計されている培地を含む。富栄養培地はしばしば複雑な生物学的抽出物を含む。「高密度培養の増殖に適した培地」は、他の条件（例えば温度及び酸素移動速度）がそのような増殖を許容する場合に、細胞培養物が3以上のOD600に達することを可能とする任意の培地である。用語「基本培地」は、任意の特定の栄養補給を必要としない、多くの型の微生物の増殖を促進する培地をいう。ほとんどの基本培地は、一般的に4つの基本的な化学物質群：アミノ酸、炭水化物、無機塩、及びビタミンを含有する。基本培地は一般的に、血清、緩衝剤、増殖因子、脂質等の補給物が添加される、より複雑な培地のための基礎として機能する。基本培地の例としては、限定するものではないが、イーグル基本培地、最小必須培地、ダルベッコ改変イーグル培地、培地199、栄養混合物Ham's F-10及びHam's F-12、McCoy's 5A、ダルベッコMEM/F-I 2、RPMI 1640、及びイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）が挙げられる。
【００２５】
用語「含む（comprise）」及び「含有する（comprising）」は、包含的、開いた意味（open sense）で使用され、更なる要素を含めても良いことを意味する。
【００２６】
細胞に関連して本明細書において使用する用語「増大した（expanded）」は、当分野における通常の意味を有するもの、すなわちin vitroで増殖された細胞と理解されるべきである。MSCは、MSCの少なくとも1つの生物学的機能、典型的には標準的な培養条件下でプラスティック表面に接着する能力を保持する細胞の集団を提供するために増大させることができる。細胞の増大した集団は、1以上の細胞型に分化する能力を保持し得る。
【００２７】
用語「〜を含む（including）」は、本明細書において「〜を含むがこれに限定されない」ことを意味するために使用される。「〜を含む」及び「〜を含むがこれに限定されない（限定されるものではないが〜を含む）」は互換的に使用される。
【００２８】
「マーカー」は、その存在、濃度、活性、又はリン酸化状態を検出して細胞の表現型を特定するために使用することができる生物学的分子をいう。
【００２９】
「間葉系間質細胞」（本明細書において「MSC」ともいう）は多能性間質細胞であり、すなわち、複数の異なる型の細胞を生じさせることができる細胞である。
【００３０】
方法によって治療されるべき「患者」、「被験体」又は「宿主」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを意味し得る。
【００３１】
用語「医薬組成物」は、治療において使用することが意図される組成物をいう。本発明の組成物は、SIRS、敗血症、重症敗血症、敗血症性ショック及び敗血症様の状態の治療において使用することが意図される医薬組成物である。本発明の組成物は、MSCに加えて、非細胞性成分を含み得る。そのような非細胞性成分の例としては、限定するものではないが、タンパク質、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、補酵素、抗酸化剤及び金属の1種以上を含み得る細胞培養培地が挙げられる。
【００３２】
用語「製薬上許容される」は、本明細書において、妥当な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合って、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、又は他の問題若しくは合併症なしにヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適な化合物、物質、組成物、及び／又は投与形態をいうために用いられる。
【００３３】
本明細書において使用される用語「製薬上許容される担体」は、ある器官若しくは身体の一部から別の器官若しくは身体の一部に対象化合物を運ぶ又は輸送するのに関わる、液体若しくは固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、又は溶媒カプセル化物質等の、製薬上許容される物質、組成物又はベヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合可能であるという意味で「許容される」ものでなければならず、患者にとって有害なものであってはならない。
【００３４】
用語「表現型」は、大きさ、形態、タンパク質発現等の細胞の観察可能な性質をいう。
【００３５】
「増殖（proliferation）」は、細胞数の増加をいう。「増殖する（proliferating）」及び「増殖」は、有糸分裂をしている細胞をいう。
【００３６】
「抵抗性」は、疾患の治療において使用する場合に、有意な臨床的有益性を有さないこと、例えば症状の有意な改善若しくは軽減がないこと、又は疾患のその後の再発を意味するものと理解されるべきである。
【００３７】
本明細書において使用する場合、用語「溶液」は、本発明において使用するMSCがその中で生存できる製薬上許容される担体又は希釈液を含む。
【００３８】
MSC集団に関して使用する用語「実質的に純粋」とは、細胞の数で少なくとも約75％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、又は少なくとも約95％がMSCである細胞の集団をいう。言い換えると、MSC集団に関して使用する用語「実質的に純粋」とは、系統が拘束された細胞を細胞数で約20％未満、約10％未満、又は約5％未満含有する細胞の集団をいう。
【００３９】
本明細書において使用する「支持体」は、脂肪組織由来間質幹細胞の増殖のための土台若しくはマトリクスとして機能し得る任意のデバイス又は物質をいう。
【００４０】
「治療剤」又は「治療薬」とは、宿主に対して望ましい生物学的効果を有することができる薬剤をいう。化学療法剤及び遺伝毒性物質は、それぞれ、生物製剤とは異なり、化学物質起源であることが一般に知られているか、あるいは特定の作用メカニズムによって治療効果を生じる治療剤の例である。生物学的起源の治療剤の例としては、増殖因子、ホルモン、及びサイトカインが挙げられる。様々な治療剤が当分野において知られており、その効果によって特定され得る。特定の治療剤は細胞増殖及び分化を調節することができる。例としては、化学療法ヌクレオチド、薬剤、ホルモン、非特異的（非抗体）タンパク質、オリゴヌクレオチド（例えば標的核酸配列(mRNA配列等)に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド）、ペプチド、及びペプチド模倣薬が挙げられる。
【００４１】
詳細な説明
本発明は、被験体における敗血症の治療における使用のための、間葉系間質細胞（MSC）を含む組成物を提供する。更なる実施形態において、本発明はまた、被験体における敗血症の治療のための医薬の製造における間葉系間質細胞（MSC）の使用を提供する。別の実施形態において、本発明はまた、被験体に間葉系間質細胞（MSC）を投与することを含む、被験体における敗血症の治療方法を提供する。本発明の文脈における「被験体」は、典型的には治療の必要のある被験体であることが理解されるであろう。従って、本発明はまた、間葉系間質細胞（MSC）を被験体に投与することを含む、肺炎を有するか又は肺炎後の、それを必要とする被験体における敗血症の治療方法を提供する。
【００４２】
好ましくは、上記敗血症は、炎症性の肺の状態、典型的には肺炎と関連するか、それによって引き起こされるか、又はそれに続くものである。一実施形態において、敗血症は肺炎に続発する。好ましくは、上記敗血症は重症敗血症であり、炎症性の肺の状態、典型的には肺炎と関連するか、それによって引き起こされるか、又はそれに続くものである。一実施形態において、敗血症は、肺炎に続発する重症敗血症である。上記肺炎は、真菌、細菌、又はウイルスによって引き起こされ得る。一実施形態において、肺炎は細菌、例えばグラム陰性細菌によって引き起こされる（グラム陰性肺炎）。グラム陰性細菌としては、クレブシエラ（Klebsiella）属、例えばクレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）血清型2等のクレブシエラ・ニューモニエ種が含まれ得る。他の実施形態において、肺炎は肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumonia）によって引き起こされ、別の実施形態においては肺炎はインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumonia）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）又は真菌のニューモシスチス・イロヴェチ（Pneumocystis jiroveci）によって引き起こされる。肺炎は市中肺炎、医療関連肺炎、院内感染肺炎、又は人工呼吸器関連肺炎であり得る。肺炎は大葉性肺炎、気管支肺炎、又は急性間質性肺炎であり得る。
【００４３】
MSCは、特に炎症部位において免疫調節効果を付与することが見出された。外から投与されたMSCは典型的には肺内に留まることが見出された。従って、MSCは、炎症性の肺の状態、例えば肺炎に続発する敗血症の治療において特に有効である。
【００４４】
実施例において、ASCの静脈内投与が、例えば血液及び肺等の様々な臓器内の細菌量を低下させ、かつ肺のサイトカイン及びケモカインレベルを低下させることによって、肺炎関連敗血症の重症度を低下させることが示される。
【００４５】
従って、一実施形態において、本発明は、ヒト被験体における肺炎関連敗血症の治療方法における使用のためのMSC、例えばASCを提供し、MSCの、例えば静脈内注入による投与によって、全身（例えば血中）総細菌負荷量（load）（CFU/ml）が、未処置の被験体における典型的な全身総細菌負荷量と比較して統計的に有意なレベルまで、例えば10倍以上、例えば50倍以上、又は100倍以上低減する。総細菌負荷量は、当業者に周知の方法、例えば半定量的細菌培養又は定量的PCRによって決定することができる。
【００４６】
本発明の細胞
MSCは、他の細胞に分化する能力を有する未分化の間質細胞であり、典型的には結合組織由来であり、従って非造血性細胞である。用語「結合組織」は、間葉由来の組織をいい、それらの細胞が細胞外マトリクス内に含まれているという点で特徴付けられるいくつかの組織を含む。異なるタイプの結合組織の中に、脂肪組織及び軟骨組織が含まれる。一実施形態において、MSCは脂肪組織の間質画分由来である。別の実施形態において、MSCは軟骨細胞由来、例えば硝子軟骨由来である。別の実施形態において、MSCは皮膚から得られる。また別の実施形態において、MSCは骨髄から得られる。MSCの代替的供給源としては、限定するものではないが、骨膜、歯髄、脾臓、膵臓、靭帯、腱、骨格筋、臍帯及び胎盤が挙げられる。
【００４７】
MSCは、任意の好適な起源から、そしてヒトを含む任意の好適な動物から得ることができる。典型的には、上記細胞は、出生後の哺乳動物の結合組織から得られる。好ましい実施形態において、MSCは結合組織の供給源、例えば脂肪組織、硝子軟骨、骨髄、皮膚等の間質画分から得られる。また、特定の実施形態において、MSCは哺乳動物、例えばげっ歯類、霊長類等、好ましくはヒト由来である。典型的には、MSCはヒト脂肪組織の間質画分から得られる。すなわち、それらは脂肪組織由来間質細胞（ASC）である。
【００４８】
MSCは標準的な培養条件下においてプラスティックに接着性を有する。
【００４９】
MSCは、中胚葉細胞（例えば脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞）等の体細胞に、又はその方向に、そして任意に内胚葉及び／若しくは外胚葉細胞型又は系統に、又はその方向に分化する能力を有する未分化多能性細胞である。典型的には、細胞は、脂肪細胞、軟骨芽細胞及び骨芽細胞系統からなる群より選択される少なくとも2種若しくは全ての細胞型に、又はその方向に分化する能力を有する。
【００５０】
一実施形態において、MSCは幹細胞、典型的には脂肪組織由来幹細胞であり得る。典型的には、MSCは(i)APCに特異的なマーカーを発現せず、(ii)IDOを構成的に発現せず、(iii)MHC IIを構成的に有意に発現しない。典型的にはIDO又はMHC IIの発現はIFN-γによる刺激によって誘導され得る。
【００５１】
典型的には、MSCはマーカーCD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90及びCD105の1種以上（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種以上(例えば13種まで)）を発現し得る。例えば、MSCはマーカーCD29、CD59、CD90及びCD105の1種以上（例えば2種、3種又は全て）、例えばCD59及び／又はCD90を発現し得る。
【００５２】
典型的には、MSCはマーカー第VIII因子、α-アクチン、デスミン（desmin）、S-100、ケラチン、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD34、CD45、STRO-1及びCD133の1種以上（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種以上(例えば15種まで)）を発現しない。例えばMSCはマーカーCD34、CD45、CD31及びCD14の1種以上（例えば2種、3種又は全て）、例えばCD31及び／又はCD34を発現しない。
【００５３】
増大したMSC
一実施形態において、MSCは、in vitro培養で増大したMSC、又はin vitro培養で増大したその後代の細胞である（以後、双方を増大したMSC又は「eMSC」と称する）。eMSCの調製方法は、例えばWO2007/039150に記載されているように当分野で公知である。eMSCはMSCの特徴的ないくつかの表現型を保持している。例えばeMSCは標準的な培養条件下でプラスティックに接着し、かつ未分化の表現型を保持する。
【００５４】
eMSCは、中胚葉細胞等の体細胞に分化する能力を有する未分化多能性細胞である。MSCは、限定するものではないが、脂肪細胞、軟骨芽細胞、骨芽細胞系統等の少なくとも1以上の特殊化した細胞系統に向けて分化する能力を有する一方、eMSCでは、典型的にはこの分化能は低下しているか、又はなくなっている場合さえもある。例えばMSCは少なくとも骨形成細胞及び脂肪細胞系統に向けて分化し得る一方、これに由来するeMSCは脂肪細胞系統に向けてのみ分化し得る。このことは、eMSCの予想外で潜在的に有害な分化が生じる可能性が低いことが合理的に予測され得るため、患者に細胞を投与し得る細胞の治療的適用のためには有利であり得る。
【００５５】
一実施形態において、eMSCは幹細胞の後代であり得る。典型的には、eMSCは(i)APCに特異的なマーカーを発現せず；(ii)IDOを構成的に発現せず；(iii)MHC IIを構成的に有意に発現しない。典型的には、IDO又はMHC IIの発現は、IFN-γによる刺激によって誘導され得る。
【００５６】
典型的には、eMSCはマーカーCD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90及びCD105の1種以上（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種以上(例えば13種まで)）を発現し得る。例えば、MSCはマーカーCD29、CD59、CD90及びCD105の1種以上（例えば2種、3種又は全て）、例えばCD59及び／又はCD90を発現し得る。
【００５７】
典型的には、eMSCはマーカー第VIII因子、α-アクチン、デスミン、S-100、ケラチン、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD34、CD45、STRO-1及びCD133の1種以上（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種以上(例えば15種まで)）を発現しない。例えばMSCはマーカーCD34、CD45、CD31及びCD14の1種以上（例えば2種、3種又は全て）、例えばCD31及び／又はCD34を発現しない。更に、MSCは場合によってマーカーSTRO-1を発現しない。
【００５８】
細胞集団
一態様において、本発明は、本明細書に記載される治療的用途のためのMSC及び／又はeMSCの集団を提供するものであり、これらの集団を以下では「本発明の細胞集団」と呼ぶことがある。典型的には、MSCは増大したヒトASCであり、典型的には同種異系の増大したヒトASCである。典型的には、本発明の細胞集団は、均質な、若しくは実質的に均質なMSC及び／又はeMSCの集団である。本発明の細胞集団はMSC及び／又はeMSCを含むか本質的に含むが、本発明の細胞集団は他の細胞型も含み得る。従って、一実施形態において、本発明は、細胞の少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％がMSC及び／又はeMSCである本発明の細胞集団を提供する。
【００５９】
典型的には、本発明の細胞集団は、eMSCを含むか本質的に含むMSCの培養で増大した集団であるが、本発明の細胞集団は他の細胞型を含んでいても良い。従って、一実施形態において、本発明は、細胞の少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％がeMSCである本発明の細胞集団を提供する。一実施形態において、eMSCはeASC、例えばヒトeASCである。特定の実施形態において、細胞は、治療される被験体に対して同種異系である。
【００６０】
典型的には、本発明の細胞集団は、限定するものではないが、脂肪細胞系、軟骨芽細胞系、及び骨芽細胞系等の少なくとも1種又はそれ以上の特殊化した細胞系統に向けて分化する能力を有し得る。一実施形態において、本発明の細胞集団は、脂肪細胞系、軟骨芽細胞系、及び骨芽細胞系からなる群より選択される少なくとも2種又は全ての細胞型に、あるいはその細胞型に向けて分化する能力を有し得る。しかしながら、別の実施形態において、この分化能は、低下しているか、又はなくなっていさえしても良い。例えば、MSCは少なくとも骨形成系及び脂肪細胞系に向けて分化し得る一方、これに由来するeMSC集団は脂肪細胞系に向けてのみ分化し得る。このことは、細胞の治療的応用において、eMSCの予想外で有害となり得る分化が生じる可能性が少ないことが合理的に予想できるために細胞を患者に投与しても良い場合に有利であり得る。
【００６１】
典型的には、本発明の細胞集団は、マーカーCD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90及びCD105の1種以上（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種以上(例えば13種まで)）を発現し得る。例えば、MSCはマーカーCD29、CD59、CD90及びCD105の1種以上（例えば2種、3種又は全て）、例えばCD59及び／又はCD90を発現し得る。従って、一実施形態において、本発明は、細胞の少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％がマーカーCD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90及びCD105の1種以上（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種以上(例えば13種まで)）を発現する本発明の細胞集団を提供する。例えば、MSCはマーカーCD29、CD59、CD90及びCD105の1種以上（例えば2種、3種又は全て）、例えばCD59及び／又はCD90を発現し得る。別の実施形態において、本発明は、マーカーCD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90及びCD105の1種以上（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種以上(例えば13種まで)）の発現レベルが少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％である本発明の細胞集団を提供する。例えば、本発明の細胞集団は、マーカーCD29、CD59、CD90及びCD105の1種以上（例えば2種、3種又は全て）、例えばCD59及び／又はCD90を上記のレベルで発現し得る。
【００６２】
典型的には、本発明の細胞集団は、マーカー第VIII因子、α-アクチン、デスミン、S-100、ケラチン、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD34、CD45、STRO-1及びCD133の1種以上（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種以上(例えば15種まで)）を発現しないものであって良い。例えばMSCはマーカーCD34、CD45、CD31及びCD14の1種以上（例えば2種、3種又は全て）、例えばCD31及び／又はCD34を発現しない。更に、MSCは場合によってマーカーSTRO-1を発現しないものであって良い。
【００６３】
従って、一実施形態において、本発明は、細胞の少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％がマーカー第VIII因子、α-アクチン、デスミン、S-100、ケラチン、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD34、CD45、STRO-1及びCD133の1種以上（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種以上(例えば15種まで)）を発現しない本発明の細胞集団を提供する。例えば、MSCはマーカーCD34、CD45、CD31及びCD14の1種以上（例えば2種、3種又は全て）、例えばCD31及び／又はCD34を発現しないものであって良い。別の実施形態において、本発明は、マーカー第VIII因子、α-アクチン、デスミン、S-100、ケラチン、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD34、CD45、STRO-1及びCD133の1種以上（例えば2種以上、3種以上、4種以上、5種以上、6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、又は10種以上(例えば15種まで)）の発現レベルが少なくとも約35％以下、少なくとも約30％以下、少なくとも約25％以下、少なくとも約20％以下、少なくとも約25％以下、少なくとも約5％以下、少なくとも約1％以下である本発明の細胞集団を提供する。例えば、本発明の細胞集団はマーカーCD34、CD45、CD31及びCD14の1種以上（例えば2種、3種又は全て）、例えばCD31及び／又はCD34を上記のレベルで発現し得る。
【００６４】
一部の実施形態において、MSC又はeMSCは、その増殖能力、移動能力、生存能力、治療効果及び免疫調節性の1以上を増大させるために予め刺激される。典型的には、本発明の細胞集団の少なくとも約40％（例えば少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、又は少なくとも約99％）が、その増殖能力、移動能力、生存能力、治療効果及び免疫調節性の1以上を増大させるために予め刺激される。一部の実施形態において、予め行われる刺激は、MSCをサイトカインと接触させることによって達成され得る。本発明の一部の実施形態において、予め行われる刺激は、MSCをIFN-γと接触させることによって達成され得る。
【００６５】
本発明の組成物
一実施形態において、本発明は、本発明に従う治療方法において使用するための本発明の細胞集団を含む組成物を提供する。上記組成物は医薬組成物であることが好ましい。本発明の組成物はMSC又はeMSCの実質的に純粋な集団、例えばASC又はeASC、例えばヒトeASCの実質的に純粋な集団を含み得る。MSC、eMSC、ASC又はeASCは幹細胞であり得る。本発明の組成物はまた、細胞培養成分、例えば1種以上のアミノ酸、金属及び補酵素因子を含む培養培地を含み得る。組成物は、他の間質細胞の小集団を含み得る。組成物はまた、特定の状況下、例えば移植、連続培養における増殖、又は生体材料若しくは組成物としての使用においてMSCの増殖及び生存を支持し得る他の非細胞成分を含み得る。
【００６６】
本発明の組成物中におけるMSC及び／又はeMSCの濃度は、少なくとも約1×104細胞/mL、少なくとも約1×105細胞／mL、少なくとも約1×106細胞／mL、少なくとも約10×106細胞／mL、又は少なくとも約40×106細胞／mLであり得る。典型的には、濃度は、約1×106細胞／mLから1×107細胞／mLの間、例えば約5×106細胞／mLから1×107細胞／mLの間である。
【００６７】
本発明の組成物は、一般的に製薬上許容される担体及び／又は希釈剤を含むであろう。そうした担体及び希釈剤の例は当分野において周知であり、以下のものが含まれ得る：糖類、例えばラクトース、グルコース及びスクロース；デンプン、例えばトウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；粉末化トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココアバター及び座薬用ワックス；油、例えばピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びダイズ油；グリコール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；エステル類、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質除去水；等張食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；pH緩衝溶液；ポリエステル類、ポリカーボネート類及び／又はポリ無水物（polyanhydride）；及び他の医薬製剤中で用いられる非毒性の適合性物質。典型的には、本発明の組成物は、担体としてDMEMを含有し、これは、場合によって血清（例えばHSA）を例えば約5％まで、約10％まで、約15％まで、約20％まで、約25％まで、約30％までの濃度で添加することができる。
【００６８】
本発明の組成物は、無菌及び／又はシリンジ通過が容易な程度に流動性であり得る。更に、組成物は、製造及び保存の条件下で安定であり得、及び例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸及びチメロサールの使用によって細菌及び真菌等の微生物の汚染から守られ得る。
【００６９】
調製方法
本発明のeMSC及び細胞集団及び本発明の細胞集団を含む組成物を提供するためのMSCの単離及び培養方法は、当分野において公知である。典型的には、細胞集団を含む組成物の調製方法は、以下のステップを含む：
(i)組織からのMSCの単離及び好適な表面、例えばプラスティックへの接着による選択
(ii)eMSCを含む本発明の細胞集団を提供するためのMSCの増殖（expansion）。
【００７０】
場合により、本発明の細胞集団は、増殖ステップ(ii)の間、及び／又は後に、凍結保存することができる。場合により、本発明の細胞集団の表現型を、増殖ステップ(ii)の間、及び／又は後に評価することができる。場合により、本発明の細胞集団を、増殖ステップ(ii)の後に単離し、製薬上許容される担体及び／又は希釈剤中に再懸濁することができる。
【００７１】
本発明において使用するためのMSCは、限定するものではないが、末梢血、骨髄、胎盤、脂肪組織、骨膜、歯髄、脾臓、膵臓、靭帯、皮膚、腱、骨格筋、臍帯及び胎盤等の任意の好適な組織から単離され得る。好ましい実施形態において、MSCは結合組織の供給源、例えば脂肪組織の間質画分、硝子軟骨、骨髄、皮膚等から得られる。
【００７２】
一実施形態において、MSCは脂肪組織の間質画分由来である。別の実施形態において、MSCは軟骨細胞、例えば硝子軟骨から得られる。別の実施形態において、MSCは皮膚から得られる。また、別の実施形態において、MSCは骨髄から得られる。
【００７３】
MSCは、任意の好適な供給源から、及びヒトを含む任意の好適な動物から得ることができる。典型的には、上記細胞は、出生後の哺乳動物の結合組織から得られる。
【００７４】
MSCはまた、被験体と同じか異なる種の任意の生物から単離することができる。MSCを有する任意の生物を本発明で潜在的候補であり得る。一実施形態において、生物は哺乳動物であり得、別の実施形態において、生物はヒトである。
【００７５】
脂肪由来のMSCは、当分野において標準的な任意の手段によって得ることができる。典型的には、上記細胞は、起源の組織（例えば脂肪吸引物又は脂肪組織）から細胞を切り離すことによって、典型的にはコラゲナーゼ等の消化酵素で組織を処理することによって得られる。消化された組織物質は次いで、典型的には約20ミクロンから1mmのフィルターを通してろ過する。次いで、細胞を（典型的には遠心分離によって）単離し、接着表面（典型的には組織培養プレート又はフラスコ）上で培養する。このような方法は、例えば米国特許第6777231号に開示されているように、当分野において公知である。この方法論に従い、脂肪吸引物を脂肪組織から取得し、それ由来の細胞を取得する。この方法論において、細胞を、好ましくはPBSを用いて洗浄し、混入する破片及び赤血球を除去することができる。細胞をPBS中でコラゲナーゼにより（例えば37℃で30分間、0.075％コラゲナーゼ、I型、Invitrogen, Carlsbad, CA）消化する。残存する赤血球を除くために、消化したサンプルを（例えば10％ウシ胎児血清で）洗浄し、160 mmol/L ClNH4で処理し、最後にDMEM完全培地（10％FBS、2 mmol/Lグルタミン及び1％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するDMEM）中に懸濁することができる。細胞は40μmのナイロンメッシュを通してろ過することができる。
【００７６】
細胞は、MSCの接着のために好適な表面、例えばプラスティックを含む好適な組織培養容器中で培養される。非接着細胞は、例えば好適な緩衝液中で洗浄することによって除去され、接着性間質細胞（例えばMSC）の単離された集団が提供される。この方法で単離された細胞を、組織培養フラスコ上にまき（好ましくは2-3×104細胞/cm2）、3-4日毎に培養培地を交換しながら37℃及び5％CO2下で増殖させることができる。細胞は、好ましくは培養物が90％のコンフルエンスに達したところで新しい培養フラスコ（1,000細胞/cm2）に移される。
【００７７】
細胞の単離は、好ましくは無菌下で、又はGMP条件下で実施する。
【００７８】
特定の実施形態において、細胞は、少なくとも約15日間、少なくとも約20日間、少なくとも約25日間、又は少なくとも約30日間培養し得る。典型的には、培養中での細胞の増殖によって、細胞集団中の細胞の表現型の均一性が向上し、実質的に純粋又は均一な集団が得られる。
【００７９】
細胞は、好ましくは培養物が約75％、80％、85％、90％又は95％のコンフルエンスに達したところで接着表面から（例えばトリプシンによって）剥がされ、新しい培養容器に移される（継代される）。
【００８０】
特定の実施形態において、細胞は少なくとも3回の継代培養のために培養中で増加させ、または「少なくとも3回継代される」。別の実施形態において、細胞は少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、又は少なくとも10回継代される。
【００８１】
特定の実施形態において、細胞は、少なくとも3回の集団倍加（population doubling）のために培養中で増大させる。特定の実施形態において、細胞は、少なくとも4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回又は15回の集団倍加のために培養中で増大させる。特定の実施形態において、細胞は、7回未満、8回未満、9回未満、10回未満、又は15回未満の集団倍加のために培養中で増大させる。特定の実施形態において、細胞は、約5〜10回の集団倍加のために培養中で増大させる。
【００８２】
細胞は、間質幹細胞の培養のために当分野で公知の任意の技術によって培養し得る。様々な培養技術、並びにそのスケールアップの議論は、Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4th Edition, Wiley-Liss 2000に見ることができる。細胞は、大規模増殖のために好適な培養フラスコ又はバイオリアクターを用いて増大させることができる。間葉系間質細胞の大規模増殖のために好適なバイオリアクターは市販されており、2D（すなわち実質的に平面状）及び3D増殖用のバイオリアクターの双方が含まれ得る。そのようなバイオリアクターの例としては、限定するものではないが、栓流（plug flow）バイオリアクター、還流バイオリアクター、連続撹拌タンク式バイオリアクター、静止層（stationary-bed）バイオリアクターが挙げられる。
【００８３】
特定の実施形態において、細胞は単層培養によって培養される。組織培養中でMSCを支持することができる任意の培地を使用することができる。MSCの増殖を支持するであろう培地処方としては、限定するものではないが、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、α改変最小必須培地（αMEM）、及びロズウェルパーク記念研究所培地1640（RPMI培地1640）が挙げられる。典型的には、間質細胞の増殖を支持するために、0〜20％のウシ胎児血清（FBS）が上記培地に添加されるであろう。しかしながら、間質細胞及び軟骨細胞のためにFBS中に必須の増殖因子、サイトカイン、及びホルモンが特定され、増殖培地中に適切な濃度で提供されている場合には、規定培地を使用することができるであろう。本発明の方法において有用な培地は、限定するものではないが、抗生物質、間質細胞のための分裂促進又は分化誘導化合物を含む、目的の1種以上の化合物を含有し得る。本発明の細胞は、加湿したインキュベーター中で31℃〜37℃の温度で増殖させることができる。二酸化炭素含量は2％〜10％に維持し、酸素含量は1％〜22％に維持することができる。
【００８４】
培地に添加することができる抗生物質としては、限定するものではないが、ペニシリン及びストレプトマイシンが挙げられる。化学的に規定された培養培地中のペニシリンの濃度は、1mlあたり約10〜約200単位であり得る。化学的に規定された培養培地中のストレプトマイシンの濃度は、約10〜約200μg/mlであり得る。
【００８５】
典型的には、本発明の方法において使用するMSCは、増大した細胞集団であり、好ましくは、細胞は、実質的に純粋な又は均一な集団を提供するために増殖される。
【００８６】
一実施形態において、上記細胞集団は、新たに単離された増大させていない細胞と比較してマーカーCD34の発現が低減するまで増大させる。例えば、細胞集団を、マーカーCD34の発現が集団中の細胞の50％未満、35％未満、30％未満、又は5％未満、例えば35-5％又は20-10％のレベルに低下するまで増大させる。典型的には、細胞集団を、マーカーCD34の発現が集団中の細胞の5％未満のレベルに低下するまで増大させる。従って、本発明のeMSCの集団は、CD34を発現する細胞を50％未満、35％未満、30％未満、又は5％未満、例えば35-5％又は20-10％含有する。
【００８７】
一実施形態において、上記細胞集団は、新たに単離された増大させていない細胞と比較してマーカーSTRO-1の発現が低減するまで増大させる。例えば、細胞集団を、マーカーSTRO-1の発現が集団の細胞の50％未満、35％未満、30％未満、又は5％未満、例えば35-5％又は20-10％のレベルに低下するまで増大させる。典型的には、細胞集団を、マーカーSTRO-1の発現が集団中の細胞の5％未満のレベルに低下するまで増大させる。従って、本発明のeMSCの集団は、STRO-1を発現する細胞を50％未満、35％未満、30％未満、又は5％未満、例えば35-5％又は20-10％含有する。
【００８８】
典型的には、細胞集団は、新たに単離された増大させていない細胞と比較してマーカーCD34及びSTRO-1の発現が低下するまで増大させる。例えば、細胞集団を、マーカーCD34及びSTRO-1の発現が集団の細胞の50％未満、35％未満、30％未満、又は5％未満、例えば35-5％又は20-10％のレベルに低下するまで増大させる。典型的には、細胞集団を、マーカーCD34及びSTRO-1の発現が集団の細胞の5％未満のレベルに低下するまで増大させる。従って、本発明のeMSCの集団は、CD34及びSTRO-1を発現する細胞を50％未満、35％未満、30％未満、又は5％未満、例えば35-5％又は20-10％含有する。
【００８９】
増大したMSC集団（例えばCD34及び／又はSTRO-1の発現が5％以下であるもの）は、新たに単離された細胞よりも低い多能性（multipotency）を示すため、有利である。すなわち、これらは、天然に存在する非増大MSCと比較して、他の細胞表現型に分化する能力が低いか、低下しているか、又はそうした能力がないものであり得る。
【００９０】
当業者には、本発明の組成物の調製方法が限定的なものではなく、任意の方法で調製した本発明の組成物が本発明の範囲内に含まれることを理解するであろう。一実施形態において、本発明は、(a)ドナーから組織を回収し；(b)酵素処理によって細胞懸濁物を取得し；(c)細胞懸濁液を沈殿させ、細胞を培養培地中に再度懸濁し；(d)少なくとも約5日間又は5回の集団倍加の間細胞を培養する、ことを含む、本発明の組成物の調製方法を提供する。
【００９１】
一実施形態において、細胞は、投与前に、例えば増殖中及び／又は増殖の後に凍結保存し得る。従って、本発明はまた、本発明の凍結保存細胞を提供する。細胞の凍結保存のための方法は当分野において公知であり、典型的には好適な凍結保存剤（例えばDMSO）の使用を必要とする。細胞は、単離及び／又は増殖段階の任意の時点で凍結保存し、投与前に融解することができる。典型的には、細胞は3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、12回、15回又はそれ以上の継代の時点で凍結保存して良く、例えば細胞は3〜10回、又は5〜10回の継代の時点で凍結保存し得る。場合によって、細胞は投与前に再度プレーティングし、培養しても良い。
【００９２】
一実施形態において、細胞は、凍結保存及び／又は培養培地から単離され、投与前に製薬上許容される担体及び／又は希釈剤（例えば任意に血清を添加したDMEM）中に再懸濁することができる。
【００９３】
一部の実施形態において、本発明の組成物中の本発明の細胞集団は、その増殖能、移動能、生存能、治療効果及び免疫調節性の1以上を増大させるために予め刺激することができる。一部の実施形態において、予め行う刺激は、MSCをサイトカインと接触させることによって達成し得る。本発明の一部の実施形態において、予め行う刺激は、MSCをIFN-γと接触させることによって達成し得る。
【００９４】
本発明の特定の実施形態において、MSCは、0.1〜100ng/mlの濃度のIFN-γを用いて予め刺激しても良い。更なる実施形態において、MSCは、0.5〜85ng/ml、1〜70ng/ml、1.5〜50ng/ml、2.5〜40ng/ml、又は3〜30ng/mlのIFN-γ濃度を使用して予め刺激することができる。予め行う刺激は、約12時間以上の刺激によって行い得る。予め行う刺激は、約13時間以上、約18時間以上、約24時間以上、約48時間以上、又は約72時間以上の刺激によって行い得る。
【００９５】
一実施形態において、本発明のMSCは、プラスミド、ウイルス又は他のベクター戦略を使用して目的の核酸で安定に若しくは一時的にトランスフェクト又は形質導入することができる。目的の核酸としては、限定するものではないが、修復すべき組織型、例えば腸壁又は膣壁で見られる細胞外マトリクス成分の産生を増大させる遺伝子産物をコードするものが挙げられる。
【００９６】
調節遺伝子を有するウイルスベクターの間質細胞への導入は、限定するものではないが、約10:1〜2000:1の感染多重度（ウイルス単位：細胞）で（例えば塩化セシウムバンド法によって）精製したアデノウイルス、レトロウイルス又はアデノ随伴ウイルスを含むウイルスベクターを用いて実施することができる。細胞は、カチオン性界面活性剤、例えばポリエチレンイミン又はリポフェクタミン（商標）の不存在下若しくは存在下で無血清培地又は血清含有培地中でウイルスに約1時間から約24時間暴露させることができる（Byk T. et al. (1998) Human Gene Therapy 9:2493-2502; Sommer B. et al. (1999) Calcif. Tissue Int. 64:45-49）。
【００９７】
ベクター又はプラスミドの間質細胞への他の好適な導入方法としては、例えば米国特許第5,578,475号; 第5,627,175号; 第5,705,308号; 第5,744,335号; 第5,976,567号; 第6,020,202号; 及び第6,051,429号に記載されたもの等の脂質／DNA複合体が挙げられる。好適な試薬としては、リポフェクタミン、ポリカチオン性脂質2,3-ジオレイルオキシ-N-[2-(スペルミンカルボキシ-アミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（DOSPA）（ケミカルアブストラクト登録名：N-[2-(2,5-ビス[(3-アミノプロピル）アミノ]-1-オキシペンチル}アミノ)エチル]-N,N-ジメチル-2,3-ビス(9-オクタデセニルオキシ)-1-プロパナミン-イウムトリフルオロアセテート）、及び中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）をメンブレンフィルターでろ過した水中に含む3:1(w/w)リポソーム製剤が挙げられる。例としてはリポフェクタミン 2000TM処方（Gibco/Life Technologiesより入手可能、# 11668019）がある。他の試薬としては、FuGENETM 6トランスフェクション試薬（非リポソーム形態の脂質及び他の化合物の80％エタノール中の混合物、Roche Diagnostics Corp.から入手可能、# 1814443）、及びLipoTAXITMトランスフェクション試薬（Invitrogen Corp.からの脂質製剤、# 204110）が挙げられる。間質細胞のトランスフェクションは、例えばM.L. Roach and J.D. McNeish (2002) Methods in Mol. Biol. 185:1に記載されたようにエレクトロポレーションによって実施することができる。安定な遺伝子変化を有する間質細胞の製造のための好適なウイルスベクターシステムは、アデノウイルス及びレトロウイルスに基づくものであって良く、市販のウイルス成分を使用して調製することができる。
【００９８】
調節遺伝子を有するプラスミドベクターのMSCへのトランスフェクションは、リン酸カルシウムDNA沈殿若しくはカチオン性界面活性剤法（リポフェクタミン(商標)、DOTAP）の使用による単層培養中で、又は生体適合性ポリマー中にプラスミドDNAベクターを直接組み込むことによる三次元培養中で達成することができる（Bonadio J. et al. (1999) Nat. Med. 5: 753-759）。
【００９９】
これらの遺伝子によってコードされる機能的タンパク質の追跡及び検出のために、ウイルス又はプラスミドDNAベクターは、容易に検出可能なマーカー遺伝子、例えばいずれも組織化学的手段によって追跡できる緑色蛍光タンパク質又はβ-ガラクトシダーゼ酵素を含み得る。
【０１００】
増殖に続いて、本発明の細胞集団を、特徴的マーカーの発現を決定するためにアッセイしてその表現型を確認することが好ましく、これは伝統的な手段を使用して実施することができる。
【０１０１】
用語「発現」は、細胞内のマーカーの存在を記載するために使用される。発現しているとみなされるためには、マーカーは検出可能なレベルで存在していなくてはならない。「検出可能なレベル」とは、マーカーが、PCR、ブロッティング又はFACS解析等の標準的な実験室の手法の1つを使用して検出できることを意味する。MSCの集団の表現型表面マーカーの解析は、当分野において公知の任意の方法によって実施することができる。限定するものではないが、例として、この表現型の解析は、個々の細胞の染色によって実施することができる。そのような染色は、抗体の使用を介して達成できる。これは、標識抗体を使用する直接的染色であっても、あるいは細胞マーカーに特異的な一次抗体に対する第二の標識抗体を使用する間接的染色であっても良い。抗体の結合は、当分野において公知の任意の方法によって検出することができる。抗体の結合はまた、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法又は放射線撮影によっても検出することができる。
【０１０２】
あるいは、若しくは更に、遺伝子は、30回のPCRサイクルの後に発現が合理的に検出できる場合に、細胞あたり少なくとも約100コピーの細胞内発現レベルに相当し、本発明の集団の細胞によって発現されているとみなされる。用語「発現する」及び「発現」は対応する意味を有する。この閾値以下の発現レベルでは、マーカーは発現していないとみなされる。本発明の成体間質細胞におけるあるマーカーの発現レベルと、別の細胞、例えば胚性幹細胞における同じマーカーの発現レベルとの比較は、好ましくは同じ種から単離された2つの細胞型を比較することによって実施され得る。好ましくはこの種は哺乳動物であり、より好ましくはこの種はヒトである。このような比較は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）実験を使用して都合良く実施することができる。
【０１０３】
細胞表面マーカーは、通常は陽性／陰性選択に基づく任意の好適な伝統的技術によって同定することができる。例えば細胞中でのその存在／不在を確認すべき細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体を使用することができるが、他の技術を使用することもできる。従って、特定の実施形態において、CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90及びCD105の1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種又は全てに対するモノクローナル抗体を、選択された細胞中での上記マーカーの不在を確認するために使用する。また、第VIII因子、α-アクチン、デスミン、S-100、ケラチン、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD34、CD45、STRO-1及びCD133の1種、2種、3種、4種、又は全てに対するモノクローナル抗体を、上記マーカーの少なくとも1種、好ましくは全ての存在又は検出可能な発現レベルを確認するために使用する。
【０１０４】
更なる実施形態において、CD34、CD45、CD31、CD14の少なくとも1種、2種、3種又は全て、例えばCD31及び／又はCD34に対するモノクローナル抗体が、上記マーカーの存在又は検出可能な発現レベルを確認するために使用される。更なる実施形態において、CD34に対するモノクローナル抗体が、選択された細胞における上記マーカーの不在を確認するために使用される。更なる実施形態において、STRO-1に対するモノクローナル抗体が、選択された細胞における上記マーカーの不在を確認するために使用される。更なる実施形態において、CD29、CD59、CD90、CD105の少なくとも1種、2種、3種又は全て、例えばCD59及び／又はCD90に対するモノクローナル抗体が、それらの存在又は検出可能な発現レベルを確認するために使用される。
【０１０５】
上記モノクローナル抗体は公知であり、市販されているか、又は当業者は伝統的な方法で得ることができる。
【０１０６】
選択された細胞におけるIFN-γ誘導性IDO活性は、任意の好適な伝統的アッセイによって決定することができる。例えば、選択された細胞をIFN-γで刺激し、IDO発現についてアッセイすることができ、次いで、IDOタンパク質発現について伝統的なウェスタンブロット分析を実施することができ、選択された細胞のIFN-γ刺激後のIDO酵素活性を、例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析及び読み出し値としての上清中のキヌレニン濃度の光度定量を介したトリプトファンからキヌレニンへの変換によって測定することができる。本発明の細胞は特定の条件下でIDOを発現するため、IFN-γ刺激後のIDO活性の検出を可能とする任意の好適な技術を本発明の細胞を選択するために使用することができる。選択された細胞中のIFN-γ誘導性IDO活性を決定するための好適なアッセイは、WO 2007/039150に開示されている。産生されるIDOの量は平方センチメートル当たりの細胞数に依存し、これは好ましくは5000細胞/cm2以上のレベルであるが、この濃度に限定されず、またIFN-γの濃度は理想的には3ng/ml以上であるが、この濃度に限定されない。記載された条件下で産生されるIDOの活性は、24時間以上後のμM範囲のキヌレニンの検出可能な産生をもたらすであろう。
【０１０７】
投与
一実施形態において、本発明の組成物は全身投与（例えば直腸内、鼻内、口腔内、膣内、移植したレザーバーを介して、又は吸入を介して）のために調製し得る。別の実施形態において、本発明の組成物は局所投与のために調製し得る。本発明の組成物は、非経口経路によって投与し得る。組成物は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内（intrasternal）、髄腔内、病巣内、リンパ管内及び頭蓋内経路によって投与し得る。好ましい投与経路は静脈内投与によるものである。好ましいMSCはASCである。
【０１０８】
従って、本発明は、患者における肺炎に続発する敗血症の治療において使用するためのMSC、例えばASCを提供し、MSCは静脈内経路によって投与される。典型的には、患者はヒトである。
【０１０９】
一実施形態において、本発明は、患者、例えばヒト患者における肺炎に続発する敗血症の治療において使用するためのASCを提供し、ASCは全身投与、例えば静脈内注入等の静脈内経路によって、例えば限定するものではないがリンパ節、最も好ましくは腋窩若しくは鼠径リンパ節を含む末梢リンパ器官等のリンパ器官へのリンパ管内注入によって投与される。これらの実施形態のそれぞれにおいて、MSCはASC、例えばeASCであり得る。本明細書で使用する場合、用語「リンパ系」には、当分野における通常の意味が与えられるべきであり、リンパ管及び毛細リンパ管の伝導系によって接続されたリンパ器官等のリンパ組織をいう。用語「リンパ器官」はリンパ節、最も好ましくは腋窩又は鼠径リンパ節をいう。一実施形態において、ASCは肺に、又は気管内経路によって直接投与されない。一実施形態において、本発明において使用するMSCは、治療される被験体に対して自己のものであり得る。更なる実施形態において、本発明において使用するMSCは、治療される被験体に対して同種又は異種であり得る。ドナー由来の同種脂肪組織由来間質細胞は、理論的にはMHCの不適合にもかかわらず、任意の患者の治療のために使用し得る。
【０１１０】
一実施形態において、本発明の組成物は、治療される被験体の1以上の標的部位に組成物を注入又は移植することによって投与され得る。更なる実施形態において、本発明の組成物は、注入又は移植による被験体への組成物の導入を容易にする送達デバイスに挿入しても良い。一実施形態において、送達デバイスは、カテーテルを含み得る。更なる実施形態において、送達デバイスはシリンジを含み得る。
【０１１１】
投与量
MSC及び任意の更なる治療剤の投与量は、患者の症状、年齢及び体重、治療若しくは予防すべき疾患の性質及び重症度、投与経路、及び更なる治療剤の形態によって変動するであろう。本発明の組成物は、単回用量又は分割用量で投与し得る。MSC及び任意の更なる治療剤の適切な投与量は、公知の技術によって決定し得る。
【０１１２】
典型的には、上記投与量は、被験体の体重1kgあたり約10×106細胞以下、1kgあたり約9×106細胞以下、1kgあたり約8×106細胞以下、1kgあたり約7×106細胞以下、1kgあたり約6×106細胞以下、1kgあたり約5×106細胞以下である。別の実施形態において、上記投与量は、約0.25×106細胞/kg〜約5×106細胞/kg；又はより好ましくは約1×106細胞/kg〜約5×106細胞/kgの間であり得る。従って、別の更なる実施形態において、投与量は、約0.25×106細胞/kg、約0.5×106細胞/kg、約0.6×106細胞/kg、約0.7×106細胞/kg、約0.8×106細胞/kg、約0.9×106細胞/kg、約1.1×106細胞/kg、約1.2×106細胞/kg、約1.3×106細胞/kg、約1.4×106細胞/kg、約1.5×106細胞/kg、約1.6×106細胞/kg、約1.7×106細胞/kg、約1.8×106細胞/kg、約1.9×106細胞/kg、又は約2×106細胞/kgであり得る。投与量は、別の実施形態において、0.1〜1百万細胞/kgの間、1〜2百万細胞/kgの間、2〜3百万細胞/kgの間、3〜4百万細胞/kgの間、4〜5百万細胞/kgの間、5〜6百万細胞/kgの間、6〜7百万細胞/kgの間、7〜8百万細胞/kgの間、8〜9百万細胞/kgの間、又は9〜10百万細胞/kgの間であり得る。
【０１１３】
別の実施形態において、細胞は、患者の体重にかかわらず、固定用量で患者に投与しても良い。典型的には、該投与量は、約10百万細胞〜500百万細胞の間であり、例えば投与量は約10×106細胞、50×106細胞、10×107細胞、50×107細胞である。
【０１１４】
従って、一実施形態において、本発明は、ヒト被験体における肺炎に続発する重症敗血症等の肺炎に続発する敗血症の治療における使用のためのMSC、例えばASCを提供し、ここで、MSCは、被験体の体重1kgあたり約0.25×106細胞〜約5×106細胞の投与量で、静脈内経路、例えば静脈内注入によって、投与される。典型的な投与量は被験体の体重1kgあたり4×106細胞である。敗血症は細菌性肺炎に続発するもの（例えばグラム陰性肺炎）であり得る。
【０１１５】
上記の実施形態と任意に組み合わせることができる別の実施形態において、本発明は、ヒト被験体における肺炎に続発する敗血症、例えば肺炎に続発する重症敗血症の治療における使用のためのMSC、例えばASCを提供し、MSCは繰り返し投与される。すなわち、2回以上の用量、例えば少なくとも3回の用量、少なくとも4回、5回、6回、7回、8回、9回、又は10回の用量が投与される。一実施形態において、2回の用量が投与される。別の実施形態において、3回の用量が投与される。更なる実施形態において、4回の用量が投与される。投与の間隔は1日、1週間、又は1カ月であり得る。典型的には、間隔は1日である。MSCは、1週間以内で（例えば1日の間隔をあけて1日目と3日目、又は1、3及び5日目、又は1、3、5及び7日目に）投与することができる。一実施形態において、MSCの2回の用量が1日の間隔をあけて、すなわち1日目と3日目に投与される（1日目はMSCの最初の投与を示す）。
【０１１６】
所定の患者において最も効果的な治療をもたらす投与の正確な時間及び任意の特定の薬剤の量は、その薬剤の活性、薬物動態、及びバイオアベイラビリティー、患者の生理的状態（年齢、性別、疾患の型及び段階、全身の身体状態、所定の投与量及び薬剤の型に対する応答性を含む）、投与経路等に依存するであろう。本明細書に提示する情報は、治療の最適化、例えば、被験体のモニタリング及び投与量及び／又はタイミングの調整等の慣用の実験の範囲程度を必要とする、投与の最適な時間及び／又は投与量の決定のために使用することができる。被験体が治療されている間、被験体の健康状態を24時間の間の予め決められた時点で関連する1以上の指標を測定することによってモニタリングすることができる。投与量、投与時間及び製剤等の治療レジメンは、そのようなモニタリングの結果に従って最適化することができる。
【０１１７】
治療は、最適用量よりも少ないより少量から開始することができる。その後、最適の治療効果が達成されるまで、投与量を少量ずつ増やすことができる。
【０１１８】
異なる成分の効果の発現及び持続時間は相補的（complimentary）であり得るため、数種の治療薬の併用によって、個々の成分について必要な投与量を低減し得る。このような組合せ治療において、異なる活性剤を一緒に又は別個に、そして同時に又は1日のうちの異なる時間に送達することができる。
【０１１９】
補助療法
一実施形態において、本発明の医薬組成物は、1種以上（又は2種以上、又は3種以上、例えば1種、2種、3種、4種若しくは5種）の更なる治療剤を含有しても良く、あるいは更なる治療剤と組み合わせて投与されても良い。
【０１２０】
一部の実施形態において、MSC及び1種以上の更なる治療剤は、被験体に同時に投与されても良い。他の実施形態において、MSC及び1種以上の更なる治療剤は、被験体に連続して投与されても良い。1種以上の更なる治療剤は、MSCの投与の前若しくは後に投与されても良い。
【０１２１】
上記治療剤としては、以下から選択され得る：鎮痛剤、例えば非ステロイド系抗炎症剤、オピエートアゴニスト又はサリチル酸塩；抗感染薬、例えば駆虫薬、抗嫌気性菌薬、抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、抗真菌性抗生物質、広域抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、マクロライド系抗生物質、β-ラクタム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、キノロン系抗生物質、スルホンアミド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、抗マイコバクテリア薬、抗結核抗マイコバクテリア薬、抗原虫薬、抗マラリア抗原虫薬、抗ウイルス薬、抗レトロウイルス薬、抗疥癬薬、抗炎症剤、コルチコステロイド系抗炎症剤、抗掻痒剤／局所麻酔薬、局所性抗感染薬、抗真菌性局所性抗感染薬、抗ウイルス性局所性抗感染薬；電解及び腎臓作用薬、例えば酸性化剤、アルカリ化剤、利尿薬、炭酸脱水酵素阻害剤利尿薬、ループ利尿薬、浸透圧性利尿薬、カリウム保持性利尿薬、チアジド系利尿薬、電解質置換、及び尿酸排泄薬；酵素、例えば膵酵素及び血栓溶解酵素；胃腸薬、例えば下痢止め薬、制吐薬、胃腸内抗炎症剤、サリチル酸塩胃腸内抗炎症剤、制酸抗潰瘍薬、胃酸-ポンプ阻害性抗潰瘍薬、胃粘膜抗潰瘍薬、H2ブロッカー抗潰瘍薬、胆石溶解薬（cholelitholytic agent）、消化薬、吐剤、便秘薬及び便軟化薬、及び運動促進薬；全身麻酔薬、例えば吸入麻酔薬、ハロゲン化吸入麻酔薬、静脈内麻酔薬、バルビツール酸系静脈内麻酔薬、ベンゾジアゼピン静脈内麻酔薬、及びオピエートアゴニスト静脈内麻酔薬；ホルモン又はホルモン調整剤、例えば妊娠中絶薬、副腎作用薬（adrenal agent）、コルチコステロイド副腎作用薬、アンドロゲン、抗アンドロゲン；免疫生物学的薬剤、例えば免疫グロブリン、免疫抑制剤、トキソイド、及びワクチン；局所麻酔薬、例えばアミド系局所麻酔薬及びエステル系局所麻酔薬；筋骨格作用剤（musculoskeletal agent）、例えば抗痛風抗炎症剤、コルチコステロイド系抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制性抗炎症剤、非ステロイド系抗炎症剤（NSAID）、サリチル酸系抗炎症剤、ミネラル；及びビタミン類、例えばビタミンA、ビタミンB、ビタミンC、ビタミンD、ビタミンE、及びビタミンK。
【０１２２】
別の実施形態において、更なる治療剤は、増殖因子、又は細胞増殖若しくは活性化に影響する他の分子であり得る。更なる実施形態において、増殖因子は最終分化を誘導し得る。別の実施形態において、増殖因子は天然の増殖因子の変異型又は断片であり得る。そのような変異型の製造方法は当分野において周知であり、例えば保存的アミノ酸変化の作製、又は突然変異誘発及び得られた変異型の必要な機能性についてのアッセイを挙げることができる。
【実施例】
【０１２３】
本発明は、以下の実施例によって更に説明される。これらの実施例は例示目的のためにのみ提供されるものであり、限定することを意図するものではない。
【０１２４】
［実施例１  肺炎関連敗血症に対するASC処置の効果］
目的：感染6時間後に投与されたASCの細菌の進行及び伝播、及び肺内の炎症性サイトカインのレベルに対する効果を決定する
マウス：
・8〜12週齢の特定病原体未感染の雌C57BL/6マウス
・マウスをランダム化し、順応のために実験前7日間飼育した
・実験中の動物は1日2回観察した。極度に病的である場合には動物実験倫理委員会（Animal Ethical Committee）に従ってより頻繁な（6×）観察が必要とされ、必須とした。
【０１２５】
肺炎
生きたクレブシエラ・ニューモニエ血清型2（1×104CFU；ATCC 43816；American Type Culture Collection）の鼻内注入によってグラム陰性菌肺炎を誘導した。細菌はトリプチックソイブロス（TSB）培地及び血液寒天（BA）プレート中で培養した。
【０１２６】
-1日目：培養開始
-80℃のクレブシエラ・ニューモニエのストック1粒（one bead）を50mlのTSB培地中に置き、37℃で一晩（16時間）増殖させた。
【０１２７】
0日目：接種物の調製
培養物（-1日目）1mlを100mlの（温）TSB培地中に再懸濁させ、OD=1.0になるまで（±2.5-3時間）増殖させた。10mlの培養物を無菌の冷0.9％NaCl（Baxter）を用い、4℃で4000rpm10分間の遠心分離で洗浄した。上清を除き、上記のようにして更に2回洗浄した。ペレットを10ml NaClに再懸濁し、細菌濃度はおよそ0.4×109 CFU/mlとした。これを2000倍に希釈して約20×104CFU/mlとした。接種物の濃度は3枚のBAプレート上に接種物の102-104倍希釈物50μlをまくことによってチェックした。37℃で一晩培養した後（1日目）にCFUを計数した。マウスに接種した：
接種物：50μl/マウス→1×104 CFU
【０１２８】
幹細胞：
マウスの鼻内接種の6時間後にASC（1×106個の増大させたヒト脂肪組織由来幹細胞）又はプラセボ（乳酸リンゲル液）を静脈内投与した。
【０１２９】
試験設計
T=0時間
・イソフルラン麻酔薬
・全マウス：生きたクレブシエラ・ニューモニエ血清型2（50μl、1×104 CFU）の鼻内注入
T=6時間
・I群：（n=8）200μlのプラセボ（乳酸リンゲル液）を1×静脈内（IV）注射
・II群：（n=8）1×106個のASC（200μl乳酸リンゲル液中）を1×IV注射
T=48時間：マウスを犠牲にする
【０１３０】
試験評価項目
・肺、脾臓、肝臓及び血液中の細菌負荷量（半定量的培養物）
・炎症：肺ホモジネート中のサイトカイン（TNF-α、IL-1β、IL-6）及びケモカイン（MIP-2）
【０１３１】
結果：
図１〜８は、2回の独立した実験（それぞれＡ及びＢとする）の結果を示す。図１〜４に示すように、プラセボと比較して、感染6時間後のASCでの処置により、血液中（図１）及び肺（図２）での細菌負荷量が低下し、また肝臓（図３）又は脾臓（図４）での細菌負荷量も低下した。更に、図５〜８に示すように、炎症性サイトカイン及びケモカインのレベルがプラセボと比較してASC処置後の肺ホモジネート中で低下した。これらの結果から、ASCでの処置によって肺炎関連敗血症の重症度が低下することが実証される。細菌負荷量及び炎症性サイトカイン／ケモカインレベルは、血液及び肺等の肺炎と関連する標的臓器を含む様々な組織で低下した。従って、驚くべきことに、MSC、例えばASCは、肺炎関連敗血症の治療において有用である。
【０１３２】
更なる試験の結果を図９〜１２に示す。これらも肺炎関連敗血症におけるASCの静脈内投与が血液等の様々な臓器中の細菌負荷量を低減することを実証する。
【０１３３】
［実施例２］
重症敗血症又は敗血症性ショックを有する重症肺炎患者で臨床試験を実施する。敗血症の診断から24時間以内の患者を登録する。
【０１３４】
試験に登録された患者の約半数が、乳酸リンゲル液中のドナー由来（同種異系）の増大した脂肪間質細胞（eASC）の懸濁液からなる医薬品での処置を受ける。あとの半分は乳酸リンゲル液の懸濁液からなるプラセボを投与される。処置群の患者は、患者の体重1kgあたり4百万細胞の単回用量の医薬品を投与される。プラセボ群の患者は単回用量のプラセボを投与される。いずれの場合も投与は静脈内注入による。
【０１３５】
医薬品は、健康な個体から脂肪吸引によって得られ、in vitroで増殖された同種異系の脂肪由来間質細胞（eASC）を使い捨てバイアル中の無菌緩衝液中に含む細胞懸濁液である。医薬品は、6mLのバイアルで提供される、病巣内投与のための無菌の透明無色の懸濁液として供給される（ヒト血清アルブミンを含むダルベッコ改変イーグル培地［DMEM］1mLあたり10百万個のeASCの懸濁液）。医薬品は、乳酸リンゲル液に懸濁した後、4ml/分の注入速度で投与される。
【０１３６】
試験のプラセボは、4ml/分の注入速度で病巣内投与するための乳酸リンゲル液である。対応するプラセボの体積（乳酸リンゲル液）がプラセボ群の各被験体に投与される。プラセボの体積は被験体の体重に従って算出される。
【０１３７】
医薬品の調製
同種異系のeASC医薬品は、健康なドナーの皮下脂肪組織から抽出した生きた成体間質細胞の細胞懸濁液からなる。皮下脂肪組織は健康なドナーから脂肪吸引され、GMP製造施設に運ばれる。寄贈、調達、及び試験は、指令2004/23/ECの要件に従い、従って指令2006/17/EC及び2006/83/ECの元で実施される。ASCは、脂肪組織をI型コラゲナーゼで消化し、続いて遠心分離することによって単離される。得られた細胞ペレットを再懸濁し、溶血液で溶解し、遠心分離する。細胞ペレットから生じる間質血管画分（stromal vascular fraction）を、細胞培養容器内の培養培地及び抗生物質中に置き、37℃及び5％CO2及び湿潤雰囲気下でインキュベートする。播種から24-48時間後、培養培地を除去して非接着細胞画分を除く。プラスティックの培養プレートに接着したASCをin vitro条件下で増大させる。90-95％のコンフルエンスに達した後、3-4日毎に培養培地を交換し、トリプシン／EDTAで細胞を剥がし、回収し、遠心分離し、抗生物質を加えずに必要な倍加まで増大させる。次いでこれを回収し、使用時まで凍結保存する。定められた投与日前に十分な数の凍結保存バイアルを融解して投与に必要な量を準備する。ASCは、凍結保存状態から播種及び培養によって回復させ（て生存を確認す）る。バイアルに充填して梱包する日に、培養物をリン酸緩衝液及びトリプシン／EDTAで洗浄した。ASCを選択された賦形剤（ダルベッコ改変イーグル培地及びヒトアルブミン血清）中に速やかに再懸濁させて医薬品を製剤化する。
【０１３８】
eASCは、細胞ベース医薬品のガイドライン（Guideline on Cell-Based Medicinal Products, EMEA/CHMP/410869/2006）及び幹細胞に関するリフレクションペーパー（Reflection Paper on Stem Cells, EMA/CAT/ 571134/2009）に従って、同一性（表現型プロファイル）、純度、効力、形態、生存率、及び細胞増殖動態で特徴付けられる。
本出願は、以下を開示する。
（１）被験体における敗血症を治療するための間葉系間質細胞を含有する組成物。
（２）被験体における敗血症を治療するための医薬の製造における間葉系間質細胞の使用。
（３）被験体に間葉系間質細胞を含有する組成物を投与することを含む、被験者における敗血症の治療方法。
（４）敗血症が重症敗血症である、（１）〜（３）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（５）敗血症又は重症敗血症が炎症性の肺の状態に続発するものである、（１）〜（４）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（６）炎症性の肺の状態が肺炎である、（５）記載の組成物、使用又は方法。
（７）間葉系間質細胞が、脂肪組織由来間質細胞、増大した間葉系間質細胞、又は増大した脂肪組織由来間質細胞である、（１）〜（６）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（８）MSCが同種異系である、（１）〜（７）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（９）組成物が被験体の体重1kgあたり約0.25×106細胞〜約5×106細胞を含む、（１）〜（８）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（１０）間葉系間質細胞が例えば1日目及び3日目に反復して被験体に投与される、（１）〜（９）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（１１）MSCの少なくとも約50％がマーカーCD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90及びCD105の1種以上を発現する、（１）〜（１０）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（１２）MSCの少なくとも約50％がマーカー第VIII因子、α-アクチン、デスミン、S-100、ケラチン、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD34、CD45、STRO-1及びCD133を発現しない、（１）〜（１１）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（１３）MSCが製薬上許容される担体及び／又は希釈剤中で投与される、（１）〜（１２）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（１４）MSCが全身投与され、場合により間葉系間質細胞が脂肪組織由来間質細胞である、（１）〜（１３）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（１５）MSCが皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内（intrasternal）、リンパ管内、髄腔内、病巣内、又は頭蓋内経路を介して投与される、（１）〜（１４）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
（１６）MSCが1種以上の更なる治療剤と共に投与される、（１）〜（１５）のいずれか記載の組成物、使用又は方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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