(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリテルペノイドを含む植物由来原料に対して、少なくとも水、および、第１族元素或いは第２族元素の水酸化物の何れか一方を含有する抽出液を添加する工程を含む、トリテルペノイドの抽出方法であって、
前記トリテルペノイドが、ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸およびベツリン酸からなる群から選択される少なくとも１つであるトリテルペノイドの抽出方法。
【請求項２】
前記水酸化物が、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムの少なくとも何れか一方である請求項１に記載のトリテルペノイドの抽出方法。
【請求項３】
前記水酸化ナトリウムの濃度が０．２〜５％である請求項２に記載のトリテルペノイドの抽出方法。
【請求項４】
前記抽出液に、含水アルコールを含む請求項１〜３の何れか一項に記載のトリテルペノイドの抽出方法。
【請求項５】
前記含水アルコールのアルコール量を３０％以下とした請求項４に記載のトリテルペノイドの抽出方法。
【請求項６】
前記植物由来原料が、カキ、リンゴ、ナシ、ブドウからなる群から選択される少なくとも１つの果物の果皮である請求項１〜５の何れか一項に記載のトリテルペノイドの抽出方法。
【請求項７】
トリテルペノイドおよびカロテノイドを含む植物由来原料に対して、
含水アルコール、および、第１族元素或いは第２族元素の水酸化物の何れか一方を含有する抽出液を添加する工程を有することにより、トリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法であって、
前記トリテルペノイドが、ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸およびベツリン酸からなる群から選択される少なくとも１つであるトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法。
【請求項８】
前記水酸化物が、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムの少なくとも何れか一方である請求項７に記載のトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法。
【請求項９】
前記水酸化ナトリウム濃度が０．５〜１．０％であり、前記含水アルコールが、３０〜６０％である請求項８に記載のトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法。
【請求項１０】
前記植物由来原料が、カキ、リンゴ、ナシ、ブドウからなる群から選択される少なくとも１つの果物の果皮である請求項７〜９の何れか一項に記載のトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリテルペノイドおよびカロテノイドを含む植物由来原料に対して、トリテルペノイドを抽出する方法、および、トリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般にトリテルペノイドとは、５個の炭素からなるイソプレン単位が６個結合して３０個の炭素原子からなる脂質性の化合物群のことをいう。トリテルペノイドは、例えばカキ果皮等多くの植物に含まれており、多くの生理活性が報告されていることから、トリテルペノイドの利用は人々の健康増進等に繋がることが期待される。生理活性として、特に五環性トリテルペノイドには、抗エイズウイルス作用や抗腫瘍効果などの種々の生理活性があることで注目されている。
【０００３】
特許文献１には、種々の五環性トリテルペノイドを検討したところ、特定の五環性トリテルペノイドが脂肪細胞の脂肪蓄積及びＧＰＤＨの活性を抑制することについて記載してある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１５−１８９６９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１では、五環性トリテルペノイドとして、ポモル酸等が記載してある。当該ポモル酸の抽出は、以下のようにして行うことが記載してある。即ち、凍結乾燥したカキ果皮をミルサーで粉砕後、アセトンを添加して得られた抽出液をロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、得られた濃縮物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで展開した後、ポモル酸を含む画分を得ている。この画分をロータリーエバポレーターで濃縮乾固した後、エタノールに溶解し、分取用液体クロマトグラフィを用いてポモル酸を精製することが記載してある。
【０００６】
このように、ポモル酸等のトリテルペノイドを利用するには、カキ果皮などからの抽出工程が必要となる。通常、トリテルペノイドは脂溶性であることから、有機溶媒の大量使用が必要であると考えられている。当該トリテルペノイドを、例えば医薬品の形態で使用したり、飲食品の態様で使用したりする場合、安全性やコスト面から、アセトンやエタノールといった有機溶剤の使用量をできるだけ抑制することが望まれる。
【０００７】
一方、β−カロテンなどのカロテノイドは、植物などに含まれる天然色素である。当該カロテノイドは、黄色ないし赤色の色素（カロテノイド色素）で、多数の共役二重結合を含む脂肪族または脂環式のポリエン類を総称するものである。
【０００８】
カキ果皮などのように、トリテルペノイドおよびカロテノイドを共に含有する植物由来原料の場合、上述した有機溶剤を使用した抽出ではトリテルペノイドおよびカロテノイドの分離が難しく、トリテルペノイドにカロテノイドが混入した状態で抽出されてしまうという問題点があった。
【０００９】
用途によってトリテルペノイドのみを抽出したい場合は、トリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する必要がある。このとき、不要なカロテノイドを、特殊な吸着剤等を使用してこれらを分離する分離工程が必要となるため煩雑であり、コストも嵩むこととなる。
【００１０】
従って、本発明の目的は、できるだけ有機溶剤の使用量を抑制できるトリテルペノイドの抽出方法、および、簡便にトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するための本発明に係るトリテルペノイドの抽出方法の第一特徴構成は、トリテルペノイドを含む植物由来原料に対して、少なくとも水、および、第１族元素或いは第２族元素の水酸化物の何れか一方を含有する抽出液を添加する工程を含み、前記トリテルペノイドを、ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸およびベツリン酸からなる群から選択される少なくとも１つとした点にある。
【００１２】
本構成によれば、抽出液にはエタノール等のアルコールが含まれない場合は（有機溶剤０％）、有機溶剤を使用しないトリテルペノイドの抽出方法とすることができる。そのため、抽出したトリテルペノイドを、例えば医薬品の形態で使用したり、飲食品の態様で使用したりする場合、特に安全性やコスト面で優れた態様で使用することができる。
また、本構成によれば、主要なトリテルペノイドを抽出することができる有用なトリテルペノイドの抽出方法とすることができる。
【００１３】
本発明に係るトリテルペノイドの抽出方法の第二特徴構成は、前記水酸化物を、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムの少なくとも何れか一方とした点にある。
【００１４】
本構成によれば、水酸化物のうち、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および水酸化カリウム（ＫＯＨ）を使用するのが、入手の容易さやコスト的にも優れている。
【００１５】
本発明に係るトリテルペノイドの抽出方法の第三特徴構成は、前記水酸化ナトリウムの濃度を０．２〜５％とした点にある。
【００１６】
本構成によれば、後述の実施例１で示すように、水酸化ナトリウム濃度を０．２〜５％であれば、トリテルペノイドを効率よく抽出することができる。
【００１７】
本発明に係るトリテルペノイドの抽出方法の第四特徴構成は、前記抽出液に、含水アルコールを含む点にある。
【００１８】
本構成によれば、抽出液に、水に他の溶媒として含水アルコールを混入させた場合、抽出液として、含水アルコールおよび水酸化ナトリウムを使用することとなる。後述の実施例で示すように、含水アルコール（含水エタノール）の濃度は低く抑制できるため、有機溶剤の使用量を抑制できるトリテルペノイドの抽出方法とすることができる。そのため、抽出したトリテルペノイドを、例えば医薬品の形態で使用したり、飲食品の態様で使用したりする場合、安全性やコスト面で優れた態様で使用することができる。
また、抽出液に、エタノール等の含水アルコールを含む場合、入手の容易な含水アルコールを使用することができる。
【００１９】
本発明に係るトリテルペノイドの抽出方法の第五特徴構成は、前記含水アルコールのアルコール量を３０％以下とした点にある。
【００２０】
本構成によれば、後述の実施例２，３で示すように、抽出液に含まれる含水アルコールの濃度は３０％以下であるため、有機溶剤の使用量を抑制できるトリテルペノイドの抽出方法とすることができる。そのため、抽出したトリテルペノイドを、例えば医薬品の形態で使用したり、飲食品の態様で使用したりする場合、安全性やコスト面で優れた態様で使用することができる。
【００２１】
本発明に係るトリテルペノイドの抽出方法の第六特徴構成は、前記植物由来原料を、カキ、リンゴ、ナシ、ブドウからなる群から選択される少なくとも１つの果物の果皮とした点にある。
【００２２】
本構成によれば、植物由来原料を、カキ、リンゴ、ナシ、ブドウといった果物の果皮とすることができる。これら果物は、一般に果実のみを利用することが多い。この場合、果実のみを利用した後、利用されなかった果皮は殆どが破棄されている。しかし、これら果物の果皮を本発明に係るトリテルペノイドの抽出方法の植物由来原料とすることで、これら果物の果皮を有効利用することができる。
【００２５】
本発明に係るトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法の第一特徴構成は、トリテルペノイドおよびカロテノイドを含む植物由来原料に対して、含水アルコール、および、第１族元素或いは第２族元素の水酸化物の何れか一方を含有する抽出液を添加する工程を有し、前記トリテルペノイドを、ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸およびベツリン酸からなる群から選択される少なくとも１つとした点にある。
【００２６】
本構成によれば、トリテルペノイドおよびカロテノイドを含む植物由来原料に対して、抽出液として、含水アルコールおよび第１族元素或いは第２族元素の水酸化物の何れか一方を使用することで、従来必要とされていたトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する特殊な分離工程を行うことなく、トリテルペノイドおよびカロテノイドを簡便に分離することができる。
また、本構成によれば、主要なトリテルペノイドを抽出することができる有用なトリテルペノイドからカロテノイドを分離することができる。
【００２７】
本発明に係るトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法の第二特徴構成は、前記水酸化物を、水酸化ナトリウムおよび水酸化カリウムの少なくとも何れか一方とした点にある。
【００２８】
本構成によれば、水酸化物のうち、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および水酸化カリウム（ＫＯＨ）を使用するのが、入手の容易さやコスト的にも優れている。
【００２９】
本発明に係るトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法の第三特徴構成は、前記水酸化ナトリウム濃度を０．５〜１．０％とし、前記含水アルコールを３０〜６０％とした点にある。
【００３０】
本構成によれば、後述の実施例５で示すように、水酸化ナトリウム濃度が０．５〜１．０％であり、含水アルコールが３０〜６０％であれば、トリテルペノイドおよびカロテノイドを効率よく分離することができる。
【００３１】
本発明に係るトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法の第四特徴構成は、前記植物由来原料を、カキ、リンゴ、ナシ、ブドウからなる群から選択される少なくとも１つの果物の果皮とした点にある。
【００３２】
本構成によれば、植物由来原料を、カキ、リンゴ、ナシ、ブドウといった果物の果皮とすることができる。これら果物は、一般に果実のみを利用することが多い。この場合、果実のみを利用した後、利用されなかった果皮は殆どが破棄されている。しかし、これら果物の果皮を本発明に係るトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法の植物由来原料とすることで、これら果物の果皮を有効利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】乾燥カキ果皮に対して、抽出液（含水エタノール２５％、水酸化ナトリウム０．１〜５％）によって抽出されたトリテルペノイド（ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸）濃度をＨＰＬＣで測定した結果を示すグラフである。
【図２】乾燥カキ果皮に対して、抽出液（含水エタノール０〜２５％、水酸化ナトリウム１％）によって抽出された３種類のトリテルペノイドの抽出率を調べた結果を示したグラフである。
【図３】乾燥カキ果皮に対して、水酸化ナトリウム添加の有無によって、含水エタノール濃度を種々変化（２０〜９０％）させた場合における３種類のトリテルペノイドの抽出率の変化について調べた結果を示したグラフである。
【図４】水酸化ナトリウム添加の有無、および、含水エタノール濃度を種々変化（１０〜９０％）させた場合におけるカロテノイド（β−カロテン）抽出率の変化について調べた結果を示したグラフである。
【図５】β−カロテン濃度をＨＰＬＣで測定した結果を示した図である。
【図６】水酸化ナトリウム１％とし、含水エタノール濃度を２０〜９０％まで変化させた場合におけるトリテルペノイドの抽出率の変化（実施例３：図３）と、含水エタノール濃度を２０〜９０％まで変化させた場合におけるβ−カロテンの抽出率の変化（実施例４：図４）を組み合わせたグラフを示したグラフである。
【図７】ナシ果皮からトリテルペノイドの抽出率を調べた結果を示したグラフである。
【図８】ブドウ果皮からトリテルペノイドの抽出率を調べた結果を示したグラフである。
【図９】リンゴ果皮からトリテルペノイドの抽出率を調べた結果を示したグラフである。
【図１０】β−カロテン濃度をＨＰＬＣで測定した結果を示した図である（ナシ果皮）。
【図１１】β−カロテン濃度をＨＰＬＣで測定した結果を示した図である（ブドウ果皮）。
【図１２】β−カロテン濃度をＨＰＬＣで測定した結果を示した図である（リンゴ果皮）。
【図１３】乾燥カキ果皮に対して、抽出液（含水エタノール２５％、水酸化カリウム０．１〜５％）によって抽出されたトリテルペノイド（ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸）濃度をＨＰＬＣで測定した結果を示すグラフである。
【図１４】乾燥カキ果皮に対して、抽出液（含水エタノール３０〜６０％、水酸化カリウム１％）によって抽出された３種類のトリテルペノイドの抽出率を調べた結果を示したグラフである。
【図１５】β−カロテン濃度をＨＰＬＣで測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
本発明は、トリテルペノイドを含む植物由来原料に対して、少なくとも水、および、第１族元素或いは第２族元素の水酸化物の何れか一方を含有する抽出液を添加する工程を含む、トリテルペノイドを抽出する方法である。
【００３７】
本発明で抽出するトリテルペノイドは、ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸およびベツリン酸からなる群から選択される少なくとも１つである。ポモル酸は下記の式（Ｉ）、オレアノール酸は下記の式（ＩＩ）、ウルソール酸は下記の式（ＩＩＩ）およびベツリン酸（下記の式（ＩＶ））で示される。トリテルペノイドは、これらに限らず、コロソリン酸、ヘデラゲニン、マスリン酸、エキノシスト酸、ボスウェリン酸などなど、他のトリテルペノイドであってもい。
【００３８】
【化１】
0006643951.tif 000002
【００３９】
【化２】
0006643951.tif 000003
【００４０】
【化３】
0006643951.tif 000004
【００４１】
【化４】
0006643951.tif 000005
【００４２】
トリテルペノイドを含む植物由来原料とは、例えばカキ、リンゴ、ナシ、ブドウ等の果物の果皮が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、トリテルペノイドを含むことが知られている他の果実の果皮であれば使用できる。カキ、リンゴ、ナシ、ブドウの品種は特に限定されるものではない。
【００４３】
カキは、例えば甘柿である富有、次郎、西村早生等が挙げられ、渋柿である平核無柿（ひらたねなしがき）、刀根早生等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
リンゴは、津軽、ふじ、ジョナゴールド、王林、世界一、北斗、シナノレッド等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ナシは、幸水、豊水、二十世紀、ゴールド二十世紀、新高梨、新興梨、愛宕梨等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ブドウは、巨峰、ロザリオビアンコ、ピオーネ、ナガノパープル、ベリーＡ、デラウェア、甲斐路、マスカットアレキサンドリア、シャインマスカット、レッドグローブ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
本発明のトリテルペノイドを抽出する方法で使用する抽出液は、少なくとも水、および、第１族元素或いは第２族元素の水酸化物の何れか一方を含有する。
【００４５】
「少なくとも水」とは、水以外の溶媒や溶質を含まないもの、および、水に他の溶媒や溶質を混入させたものをいう。
【００４６】
本明細書で使用する水は、適当な公知のフィルターで濾過した水であってもよいし、不純物を含まないか殆ど含まない純度の高い純水、逆浸透膜を通過させたＲＯ水、イオン交換膜等によってイオンを除去した脱イオン水、蒸留器で蒸留した蒸留水などが利用できるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
水に他の溶媒を混入させる場合、他の溶媒はエタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等のアルコールとするのがよい。当該アルコールは水にアルコールを特定の比率で混合させた含水アルコールとするのがよい。この場合、抽出液は「少なくとも水」として含水アルコールを含むこととなる。本実施形態では他の溶媒のみを混入させた場合について説明し、当該溶媒としては、アルコールとしてエタノールを使用する場合について説明する。
【００４８】
また、本発明のトリテルペノイドを抽出する方法で使用する抽出液は、第１族元素或いは第２族元素の水酸化物の何れか一方を含有するように構成すればよい。
【００４９】
第１族元素の水酸化物は、周期表において第１族に属する水素以外の元素であるリチウムＬｉ、ナトリウムＮａ、カリウムＫ、ルビジウムＲｂ、セシウムＣｓ、フランシウムＦｒが挙げられる。これらのうち、ナトリウムの水酸化物（水酸化ナトリウム：ＮａＯＨ）およびカリウムの水酸化物（水酸化カリウム：ＫＯＨ）が好ましい。
【００５０】
第２族元素の水酸化物は、周期表において第２族に属する例えばマグネシウムＭｇ，カルシウムＣａ，ストロンチウムＳｒ，バリウムＢａ，ラジウムＲａが挙げられる。これらのうち、マグネシウム或いはカルシウムの水酸化物が好ましい。
【００５１】
例えば工業的には、上記水酸化物のうち、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および水酸化カリウム（ＫＯＨ）を使用するのが、入手の容易さやコスト的にも優れている。本実施形態では、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を使用する場合について説明する。
【００５２】
抽出液に、水および水酸化ナトリウムを使用する場合、後述の実施例で示すように、水酸化ナトリウム濃度は０．２〜５％とするのがよく、好ましくは０．５〜５％とするのがよい。
【００５３】
この場合、抽出液にはエタノール等のアルコールは含まれない（有機溶剤０％）ため、有機溶剤を使用しないトリテルペノイドの抽出方法とすることができる。そのため、抽出したトリテルペノイドを、例えば医薬品の形態で使用したり、飲食品の態様で使用したりする場合、特に安全性やコスト面で優れた態様で使用することができる。
【００５４】
抽出液に水酸化ナトリウムを使用することで、トリテルペノイドが有するカルボキシ基の親水性が上昇する。また、トリテルペノイドが有する水酸基の水素が離脱して水溶性が向上する。そのため、本発明のトリテルペノイドを抽出する方法で使用する抽出液を使用することで、トリテルペノイドの抽出率が向上すると考えられる。
【００５５】
また、抽出液に、水に他の溶媒として含水アルコールを混入させた場合、抽出液として、含水エタノールおよび水酸化ナトリウムを使用することとなる。後述の実施例で示すように、含水アルコール（含水エタノール）の濃度は３０％以下とするのがよい。
【００５６】
この場合、抽出液に含まれる含水アルコールの濃度は３０％以下であるため、有機溶剤の使用量を抑制できるトリテルペノイドの抽出方法とすることができる。そのため、抽出したトリテルペノイドを、例えば医薬品の形態で使用したり、飲食品の態様で使用したりする場合、安全性やコスト面で優れた態様で使用することができる。
【００５７】
尚、後述の実施例で示すように、抽出液に含まれる含水アルコールの濃度は３０％以上（例えば４０〜１００％）であってもトリテルペノイドは抽出できる。しかし、本発明では、できるだけ有機溶剤の使用量を抑制できるトリテルペノイドの抽出方法を実現するため、本発明者らは、抽出液の条件を鋭意検討し、含水アルコールの濃度を３０％以下としたものである。
【００５８】
本発明のトリテルペノイドを抽出する方法では、トリテルペノイドを含む植物由来原料に対して上述した抽出液を添加し、室温付近の温度で数時間振盪して抽出液を得る。当該抽出液には、上述したトリテルペノイドが含有されているため、所望のトリテルペノイドを得るには、公知の手法で精製する精製工程を行えばよい。
【００５９】
上述したように、トリテルペノイドを含む植物由来原料として、例えばカキ、リンゴ、ナシ、ブドウ等の果物の果皮を例示した。これらの果皮には、β−カロテンなどのカロテノイド（黄色ないし赤色のカロテノイド色素）が含まれることが知られている。
【００６０】
カキ果皮などのように、トリテルペノイドおよびカロテノイドを共に含有する植物由来原料の場合、上述した有機溶剤ではトリテルペノイドおよびカロテノイドの分離が難しい。そのため、従来、不要なカロテノイドを、吸着剤等を使用してトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する特殊な分離工程を行っていた。
【００６１】
本発明のトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法では、トリテルペノイドおよびカロテノイドを含む植物由来原料に対して、含水アルコール、および、第１族元素或いは第２族元素の水酸化物の何れか一方を含有する抽出液を添加する工程を有する。
【００６２】
含水アルコールは、水にエタノール、メタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等のアルコールを混合したものである。本実施形態ではエタノールを使用する場合について説明する。
【００６３】
第１族元素については、上述したように、リチウムＬｉ、ナトリウムＮａ、カリウムＫ、ルビジウムＲｂ、セシウムＣｓ、フランシウムＦｒが挙げられる。これらのうち、ナトリウムの水酸化物（水酸化ナトリウム：ＮａＯＨ）およびカリウムの水酸化物（水酸化カリウム：ＫＯＨ）が好ましい。
【００６４】
第２族元素の水酸化物については、上述したように、例えばマグネシウムＭｇ，カルシウムＣａ，ストロンチウムＳｒ，バリウムＢａ，ラジウムＲａが挙げられる。これらのうち、マグネシウム或いはカルシウムの水酸化物が好ましい。
【００６５】
本実施形態では、上記水酸化物については、水酸化ナトリウムを使用する場合について説明する。
【００６６】
本発明のトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法では、抽出液として、含水アルコール（含水エタノール）および水酸化ナトリウムを使用することとなる。後述の実施例で示すように、水酸化ナトリウム濃度は０．５〜１．０％とするのがよく、含水アルコール（含水エタノール）の濃度は３０〜６０％、好ましくは３０〜５０％とするのがよい。
【００６７】
トリテルペノイドおよびカロテノイドを含む植物由来原料は、カキ、リンゴ、ナシ、ブドウからなる群から選択される少なくとも１つの果物の果皮である。
【００６８】
本発明のトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法では、抽出液として、含水アルコールおよび水酸化ナトリウムを使用することで、従来必要とされていたトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する特殊な分離工程を行うことなく、トリテルペノイドおよびカロテノイドを簡便に分離することができる。
【００６９】
尚、トリテルペノイドおよびカロテノイドの分離は、カロテノイドを完全に含まないように分離するのが望ましいが、工業的にはカロテノイドを１％程度まで含む場合であっても実用的には許容される場合がある。
【実施例】
【００７０】
〔実施例１〕
平核無柿の凍結乾燥カキ果皮１gに対して抽出液１０ｍＬを加えて２５℃、３時間振とう抽出し、抽出液中の３種類のトリテルペノイド（ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸）濃度をＨＰＬＣで測定した。当該抽出液は、含水エタノール２５％、および、水酸化ナトリウム０．１〜５％（ｗ/ｖ）まで種々変更したものを使用した（ｐＨ約１３）。
尚、ＨＰＬＣの条件は、濾過した抽出液を１ｍＬ採取して塩酸で中和後、水とジエチルエーテルを加えて、分液操作により、トリテルペノイドとカロテノイドをエーテル層に溶解し全量回収した。乾固後、抽出物をエタノール１ｍＬに溶解して濾過した後、ＨＰＬＣ試料とした。分析条件はカラム：Ｃ３０カラム（ＹＭＣ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径３μｍ）、カラム温度：３７℃、移動相：水：アセトニトリル＝１：４（０．１％酢酸添加）、検出波長：２００ｎｍとした。
【００７１】
結果を図１に示した。縦軸の濃度比（％）は、無水エタノールで抽出した場合のトリテルペノイドの抽出液中濃度を１００％とした場合に対する、各トリテルペノイドの濃度比を示した。この結果、３種類の各トリテルペノイドは、水酸化ナトリウム０．２％で抽出され、０．５％程度で３種類の各トリテルペノイドの濃度は最大となると認められた。水酸化ナトリウム０．５％から５％までは、略同じ抽出量であると認められた。
【００７２】
具体的には、ポモル酸は、水酸化ナトリウム０．２％で濃度比約２０％、水酸化ナトリウム０．５％で濃度比約８７％であった。オレアノール酸は、水酸化ナトリウム０．２％で濃度比約１０％、水酸化ナトリウム０．５％で濃度比約７５％であった。ウルソール酸は、水酸化ナトリウム０．２％で濃度比約５％、水酸化ナトリウム０．５％で濃度比約７３％であった。
【００７３】
従って、水酸化ナトリウム濃度は、０．２〜５％とするのがよく、好ましくは０．５〜５％とするのがよいことが判明した。
【００７４】
〔実施例２〕
実施例１で使用した乾燥カキ果皮に対して、抽出液１０ｍＬを加えて２５℃、３時間振とう抽出し、抽出液中の３種類のトリテルペノイド（ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸）濃度をＨＰＬＣで測定した。当該抽出液は、含水エタノール０〜２５％まで種々変更したものを使用し、水酸化ナトリウムは１％とした。ＨＰＬＣの条件は実施例１に準じて行った。比較例として１００％エタノールで抽出した場合の結果も示した。
【００７５】
結果を図２に示した。縦軸の抽出率（％）は、１００％エタノール（水酸化ナトリウムは未添加）で抽出した場合のトリテルペノイドの抽出率を１００％とした場合に対する、各トリテルペノイドの抽出率を示した。この結果、含水エタノール０〜２５％までの低濃度エタノールの場合であっても、３種類の各トリテルペノイドは抽出できると認められた。
【００７６】
具体的には、含水エタノール０％（アルコール０％）の場合は、ポモル酸の抽出率は３２％、オレアノール酸は２１％、ウルソール酸は２０％であった。従って、本発明のトリテルペノイドを抽出する方法では、抽出液に水酸化ナトリウムを添加し、エタノール等のアルコールを含まない（アルコール０％）場合であっても、トリテルペノイドを抽出することができる方法であると認められた。
【００７７】
また、ポモル酸は含水エタノール５〜２５％において抽出率は５５〜９０％であった。オレアノール酸は含水エタノール５〜２５％において抽出率は４１〜７８％であった。さらに、ウルソール酸は含水エタノール５〜２５％において抽出率は３８〜７５％であった。従って、本発明のトリテルペノイドを抽出する方法では、水酸化ナトリウムを添加し、低濃度エタノール（含水エタノール５〜２５％）の場合であっても、トリテルペノイドは抽出できるため、有機溶剤の使用量を抑制できるトリテルペノイドの抽出方法であると認められた。
【００７８】
〔実施例３〕
水酸化ナトリウム添加の有無によって、含水エタノール濃度を種々変化させた場合におけるトリテルペノイドの抽出率の変化について調べた。水酸化ナトリウムは１％とした。含水エタノール濃度は２０〜９０％まで変化させ、１００％エタノールで抽出した場合と比較した。
実施例１で使用した乾燥カキ果皮に対して、抽出液１０ｍＬを加えて２５℃、３時間振とう抽出し、抽出液中の３種類のトリテルペノイド（ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸）濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣの条件は実施例１に準じて行った。
【００７９】
結果を図３に示した。縦軸の抽出率（％）は、１００％エタノールで抽出した場合のトリテルペノイドの抽出率を１００％とした場合に対する、各トリテルペノイドの抽出率を示した。
【００８０】
この結果、水酸化ナトリウムを添加しない場合は、含水エタノール濃度２０〜３０％のときには各トリテルペノイドは抽出されないと認められた。このとき、含水エタノール濃度は４０％以上とすれば各トリテルペノイドは抽出されると認められた（例えば含水エタノール濃度４０％では、ポモル酸１．６％、オレアノール酸２．２％、ウルソール酸０．４％）。
【００８１】
一方、水酸化ナトリウムを添加した場合は、含水エタノール濃度２０〜３０％のときには、ポモル酸の抽出率は８５．７〜９２．０％であり、オレアノール酸の抽出率は５７．３〜８０．５％であり、ウルソール酸の抽出率は５５．３〜７９．８％であった。従って、従って、本発明のトリテルペノイドを抽出する方法では、水酸化ナトリウムを添加し、低濃度エタノール（含水エタノール濃度２０〜３０％）の場合であっても、トリテルペノイドは抽出できるため、実施例２の結果（含水エタノール５〜２５％）と合せれば、有機溶剤の使用量を３０％程度まで抑制できるトリテルペノイドの抽出方法であると認められた。
尚、水酸化ナトリウムを添加した場合、含水エタノール濃度が４０〜９０％まで高くなった場合であっても各トリテルペノイドは９０％以上抽出されると認められた。
【００８２】
上述した実施例ではカキ果皮に対して行った結果を示したが、当該カキ果皮以外に、ナシ果皮、ブドウ果皮、リンゴ果皮を使用した場合であっても同様の結果が得られた（結果は示さない）。
【００８３】
〔実施例４〕
トリテルペノイドおよびカロテノイドを分離するため、以下の実験を行った。
水酸化ナトリウム添加の有無、および、含水エタノール濃度を種々変化させた場合におけるカロテノイド（β−カロテン）抽出率の変化について調べた。水酸化ナトリウムは１％とした。含水エタノール濃度は１０〜９０％まで変化させ、１００％エタノールで抽出した場合と比較した。実施例１で使用した乾燥カキ果皮に対して、抽出液１０ｍＬを加えて２５℃、３時間振とう抽出し、抽出液中のβ−カロテン濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣ試料は実施例１と同じ方法で調製した。ＨＰＬＣ分析条件は以下のようにして行った。
カラム：Ｃ３０カラム（ＹＭＣ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径５μｍ）、カラム温度：３５℃、移動相Ａ：メタノール：ｔ−メチルブチルエーテル：水＝８１：１５：４（１％酢酸アンモニウム添加）、移動相Ｂ：メタノール：ｔ−ブチルメチルエーテル＝１：９（１％酢酸アンモニウム添加）、グラジエント条件：０分（Ｂ：０％）→４５分（Ｂ：７５％）→４５．５分（Ｂ：１００％）→５５分に分析終了、あるいは、０分（Ｂ：０％）→１０分（Ｂ：０％）→４０分（Ｂ：５０％）→５０分（Ｂ：１００％）→６０分に分析終了、検出波長：４５０ｎｍ。
【００８４】
結果を図４，５に示した。図４の縦軸の抽出率（％）は、１００％エタノールで抽出した場合のβ−カロテンの抽出率を１００％とした場合に対する、β−カロテンの抽出率を示した。図５はＨＰＬＣの結果を示した（矢印がβ−カロテンのピークを示す：矢印部分には保持時間/ピーク面積値が記載してある）。その結果、水酸化ナトリウムを添加した場合、含水エタノール濃度３０〜５０％において、β−カロテンは全く検出されないと認められた。
尚、工業的或いは用途によっては、カロテノイドを１％程度まで含む場合であっても実用的には許容される場合がある。この場合、図４の結果から、含水エタノールの濃度を６０％（β−カロテンの抽出率０．１０％）、即ち含水エタノールの濃度を３０〜６０％とすることができる。
【００８５】
一方、含水エタノール濃度２０％および７０％では、β−カロテンの抽出率は何れも１％以上となっており、β−カロテンの許容範囲外であると認められた。
【００８６】
実施例３の図３で示したように、水酸化ナトリウムは１％とし、含水エタノール濃度を２０〜９０％まで変化させた場合におけるトリテルペノイドの抽出率の変化と、本実施例４の含水エタノール濃度を２０〜９０％まで変化させた場合におけるβ−カロテンの抽出率の変化を組み合わせたグラフを図６に示した。
【００８７】
これより、本発明のトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法では、抽出液として、含水アルコール（３０〜６０％）および水酸化ナトリウムを使用することで、従来必要とされていたトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する特殊な分離工程を行うことなく、トリテルペノイドおよびカロテノイドを簡便に分離することができると認められた。
【００８８】
〔実施例５〕
本発明のトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法において、水酸化ナトリウムおよび含水アルコールの濃度を種々変更した場合におけるβ−カロテンの抽出率について調べた。水酸化ナトリウム濃度は０〜１％まで、含水アルコール濃度は２０〜９０％まで変更した。結果を表１に示した。抽出率（％）は、１００％エタノールで抽出した場合のβ−カロテンの抽出液中濃度を１００とした場合に対する、β−カロテンの抽出率を示した。
【００８９】
【表１】
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【００９０】
この結果、水酸化ナトリウム濃度が０．５〜１．０％であり、含水アルコールが、３０〜６０％、好ましくは３０〜５０％である場合に、β−カロテンの抽出率が０〜１％程度であり、この抽出液の条件であれば工業的（実用的）には許容されるものを認められた。
【００９１】
〔実施例６〕
上述した実施例では、植物由来原料として、平核無柿の乾燥カキ果皮を使用した場合について説明した。本実施例では、当該カキ果皮以外に、ナシ果皮（幸水ナシ）、ブドウ果皮（巨峰）、リンゴ果皮（サン津軽リンゴ）を使用し、これらに対して本発明のトリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法が有効であるかどうかを調べた。
【００９２】
抽出液として、水酸化ナトリウム１％および５０％エタノールとしたものを使用した。凍結乾燥した上記３種類の各果皮１gに対して当該抽出液１０ｍＬを加えて２５℃、３時間振とう抽出し、抽出液中の４種類のトリテルペノイド（ポモル酸、ベツリン酸、オレアノール酸、ウルソール酸）濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣの条件は実施例１に準じて行った。
【００９３】
４種類のトリテルペノイドの抽出結果を図７〜９（図７：ナシ果皮、図８：ブドウ果皮、図９：リンゴ果皮）に示した。縦軸の濃度比（％）は、１００％エタノールで抽出した場合のトリテルペノイドの抽出率を１００％とした場合に対する、各トリテルペノイドの濃度率を示した。
【００９４】
この結果、図７のナシ果皮の結果では、ポモル酸、ベツリン酸、オレアノール酸、ウルソール酸の４種類のトリテルペノイドが８０％以上抽出できたと認められた。また、図８のブドウ果皮の結果ではオレアノール酸の１種類のトリテルペノイドが９５％以上抽出できたと認められた（ブドウ果皮はトリテルペノイドとしてオレアノール酸しか含有していないと考えられた）。さらに、図９のリンゴ果皮の結果では、ポモル酸、ベツリン酸、オレアノール酸、ウルソール酸の３種類のトリテルペノイドが７０％以上抽出できたと認められた。
【００９５】
また、図１０〜１２には、β−カロテン濃度をＨＰＬＣで測定した結果を示した図である（図１０：ナシ果皮、図１１：ブドウ果皮、図１２：リンゴ果皮）。ＨＰＬＣの条件は実施例１に準じて行った。図１０〜１２の各上段のデータは、１００％エタノールで抽出した場合のβ−カロテンの抽出結果を示した（矢印がβ−カロテンのピークを示す：矢印部分には保持時間/ピーク面積値が記載してある）。図１０〜１２の各下段のデータは、抽出液として、水酸化ナトリウム１％および５０％エタノールとしたものを使用したときのβ−カロテンの抽出結果を示した。
【００９６】
この結果、１００％エタノールで抽出した場合は全てβ−カロテンが抽出されたと認められたが（図１０〜１２の各上段のデータ）、抽出液として、水酸化ナトリウム１％および５０％エタノールとしたものを使用したときには、β−カロテンは抽出されないものと認められた（図１０〜１２の各下段のデータ）。
【００９７】
従って、植物由来原料として、カキ果皮以外の果物の果皮においても、トリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法について有効であると認められた。
【００９８】
〔実施例７〕
上述した実施例では、抽出液は、含水エタノール２５％、および、水酸化ナトリウム０．１〜５％まで種々変更したものを使用した。本実施例では、水酸化ナトリウムに替えて、水酸化カリウムを使用した場合の結果について説明する。
【００９９】
平核無柿の凍結乾燥カキ果皮１gに対して抽出液１０ｍＬを加えて２５℃、３時間振とう抽出し、抽出液中の３種類のトリテルペノイド（ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸）濃度をＨＰＬＣで測定した。当該抽出液は、含水エタノール２５％、および、水酸化カリウム０．１〜５％（ｗ/ｖ）まで種々変更したものを使用した。ＨＰＬＣの条件は、実施例１に記載の方法に準じて行った。
【０１００】
結果を図１３に示した。縦軸の濃度比（％）は、無水エタノールで抽出した場合のトリテルペノイドの抽出液中濃度を１００％とした場合に対する、各トリテルペノイドの濃度比を示した。この結果、３種類の各トリテルペノイドは、水酸化カリウム０．５％で抽出され、０．９％程度で３種類の各トリテルペノイドの濃度は最大となると認められた。
【０１０１】
具体的には、ポモル酸は、水酸化カリウム０．５％で濃度比約５８％、水酸化カリウム０．９％で濃度比約９５％、水酸化カリウム５％で濃度比約８５％であった。
オレアノール酸は、水酸化カリウム０．５％で濃度比約４０％、水酸化カリウム０．９％で濃度比約８５％、水酸化カリウム５％で濃度比約７８％であった。
ウルソール酸は、水酸化カリウム０．５％で濃度比約２３％、水酸化カリウム０．９％で濃度比約８２％、水酸化カリウム５％で濃度比約７５％であった。
【０１０２】
従って、水酸化カリウム濃度は、０．５〜５％とするのがよく、好ましくは０．５〜０．９％とするのがよいことが判明した。
【０１０３】
各トリテルペノイドの濃度が最大となるまでは、水酸化カリウムの濃度（モル濃度）に依存していると考えられた。尚、水酸化カリウムの場合、０．１％＝０．０１７８Ｍであり、水酸化ナトリウムの場合、０．１％＝０．０２５Ｍである。
【０１０４】
〔実施例８〕
実施例７で使用した乾燥カキ果皮に対して、トリテルペノイドおよびカロテノイドを分離するため、以下の実験を行った。抽出液１０ｍＬを加えて２５℃、３時間振とう抽出し、抽出液中の３種類のトリテルペノイド（ポモル酸、オレアノール酸、ウルソール酸）濃度をＨＰＬＣで測定した。当該抽出液は、含水エタノール３０〜６０％まで種々変更したものを使用し、水酸化カリウムは１％とした。ＨＰＬＣの条件は実施例１に準じて行った。
【０１０５】
結果を図１４に示した。縦軸の抽出率（％）は、１００％エタノール（水酸化カリウムは未添加）で抽出した場合のトリテルペノイドの抽出率を１００％とした場合に対する、各トリテルペノイドの抽出率を示した。この結果、含水エタノール３０〜６０％までのエタノールの場合、３種類の各トリテルペノイドは約８０〜１００（７８．５〜１０４．３）％抽出できると認められた。
【０１０６】
抽出液中のβ−カロテン濃度をＨＰＬＣで測定した。ＨＰＬＣの条件は実施例４に準じて行った。図１５にＨＰＬＣの結果を示した（矢印がβ−カロテンのピークを示す）。その結果、水酸化カリウムを添加した場合、含水エタノール濃度４０〜５０％において、β−カロテンは全く検出されないと認められた。
【０１０７】
尚、上述したように、工業的にはカロテノイドを１％程度まで含む場合であっても実用的には許容される場合がある。図１５の結果における含水エタノール濃度３０および６０％において、β−カロテン抽出率はそれぞれ０．０４％、０．１２％となった。
そのため、水酸化カリウムを添加した場合、含水エタノールの濃度を３０〜６０％とすることができる。
【０１０８】
尚、水酸化カリウムは０．７〜５％（０．１２５〜０．８９Ｍ）、好ましくは０．７〜１％の範囲であれば、同様の結果が得られた（結果は示さない）。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、トリテルペノイドおよびカロテノイドを含む植物由来原料に対して、トリテルペノイドを抽出する方法、および、トリテルペノイドおよびカロテノイドを分離する方法に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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