(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むフラタキシン（ＦＸＮ）をコードする改変された核酸であって、これ以外には同一の細胞中で配列番号２の野生型ＦＸＮの核酸配列の発現レベルと比較してより高いレベルで発現され、改変された核酸が配列番号５〜７に記載の配列からなる群から選択される核酸配列を含み、かつ当該改変された核酸が、
（ａ）少なくとも０．７６、少なくとも０．８６、少なくとも０．９５、または少なくとも０．９８のコドン適応指標（ＣＡＩ）、
（ｂ）少なくとも５５％、少なくとも５７％、少なくとも６１％、または少なくとも６９％であるＧＣ含有量、
（ｃ）１２４以下であるＣｐＧジヌクレオチドの数、
からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、
改変された核酸。
【請求項２】
ＦＸＮをコードする改変された核酸であって、これ以外には同一の細胞中で配列番号２の野生型ＦＸＮの核酸配列の発現レベルと比較してより高いレベルで発現され、改変された核酸が配列番号７に記載の核酸配列を含み、かつ、当該改変された核酸が少なくとも５５％のＧＣ含有量であり、ＣｐＧジヌクレオチドの数が１１７以下であり、ＣＡＩが少なくとも０．８６である、改変された核酸。
【請求項３】
配列番号５または７の核酸配列を含む、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の改変された核酸を含むベクター。
【請求項５】
ベクターが、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
改変された核酸が、自己相補的である、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
ｒＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４−１、ＲＨＭ１５−１、ＲＨＭ１５−２、ＲＨＭ１５−３／ＲＨＭ１５−５、ＲＨＭ１５−４、ＲＨＭ１５−６、ＡＡＶ  Ｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、ＡＡＶ２−ＴＴ、ＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ−Ｓ３１２ＮおよびＡＡＶ−ＬＫ０３のキャプシドからなる群から選択されるキャプシドをさらに含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
キャプシドが、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＬＫ０３およびＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎのキャプシドからなる群から選択される、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
改変された核酸が、少なくとも１つの組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反復配列、エンハンサー、プロモーター、コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ）、終止コドン、およびポリ−アデニル化（ポリＡ）シグナル配列からなる群から選択される少なくとも１つのエレメントをさらに含む、請求項７または８に記載のベクター。
【請求項１０】
ベクターが、２つのＡＡＶの末端反復配列、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチン（ＣＢｈ）プロモーターをコードする配列、およびウシ成長ホルモンのポリ−アデニル化シグナル配列（ｂＧＨポリＡ）を含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
５’から３’に、
（ａ）ＡＡＶ２の末端反復、
（ｂ）配列番号２６の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
（ｃ）配列番号５〜７に記載の配列からなる群から選択される核酸配列を含むＦＸＮをコードする請求項２に記載の改変された核酸、
（ｄ）配列番号２７の配列を含むｂＧＨポリＡシグナル配列、および
（ｅ）ＡＡＶ２の末端反復
を含む核酸を含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１２】
キャプシドが、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ−ＬＫ０３およびＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎのキャプシドからなる群から選択される、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
ＶＰ１が配列番号２９のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎのキャプシドをさらに含み、５’から３’に、
（ａ）ＡＡＶ２の末端反復、
（ｂ）配列番号２６の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
（ｃ）配列番号５、６または７の配列を含む、ＦＸＮをコードする改変された核酸、
（ｄ）配列番号２７の配列を含むｂＧＨポリＡシグナル配列、および
（ｅ）ＡＡＶ２の末端反復
を含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
ＶＰ１が配列番号３３のアミノ酸配列を含むＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎのキャプシドをさらに含み、５’から３’に、
（ａ）ＡＡＶ２の末端反復、
（ｂ）配列番号２６の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
（ｃ）配列番号５、６または７の配列を含む、ＦＸＮをコードする改変された核酸、
（ｄ）配列番号２７の配列を含むｂＧＨポリＡシグナル配列、および
（ｅ）ＡＡＶ２の末端反復
を含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１５】
ベクターがＡＡＶ９のキャプシドを含み、５’から３’に、
（ａ）ＡＡＶ２の末端反復、
（ｂ）配列番号２６の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
（ｃ）配列番号５、６または７の配列を含む、ＦＸＮをコードする改変された核酸、
（ｄ）配列番号２７の配列を含むｂＧＨポリＡシグナル配列、および
（ｅ）ＡＡＶ２の末端反復
を含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１６】
ベクターがＡＡＶ−ＬＫ０３のキャプシドを含み、５’から３’に、
（ａ）ＡＡＶ２の末端反復、
（ｂ）配列番号２６の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
（ｃ）配列番号５、６または７の配列を含む、ＦＸＮをコードする改変された核酸、
（ｄ）配列番号２７の配列を含むｂＧＨポリＡシグナル配列、および
（ｅ）ＡＡＶ２の末端反復
を含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１７】
ＦＸＮをコードする配列の直後に配列番号２５の核酸配列を含むＣＳＳを含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１８】
ＡＡＶ９のキャプシドを含み、核酸配列の５’から３’に、
（ａ）ＡＡＶ２の末端反復、
（ｂ）配列番号２６の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
（ｃ）配列番号７の配列を含む、ＦＸＮをコードする改変された核酸、
（ｄ）配列番号２５の核酸配列を含むＣＳＳ、
（ｅ）配列番号２７の配列を含むｂＧＨポリＡシグナル配列、および
（ｆ）ＡＡＶ２の末端反復
を含み、ベクターがｒＡＡＶベクターである、ベクター。
【請求項１９】
フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）の治療を、それを必要とする患者において行うために使用する請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２０】
フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）の治療を、それを必要とする患者において行うためのｒＡＡＶベクターであって、ＦＸＮをコードする請求項２に記載の改変された核酸を含む、ｒＡＡＶベクター。
【請求項２１】
請求項４〜１８のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項２０に記載のｒＡＡＶベクターを含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項４〜１８のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項２０に記載のｒＡＡＶベクターを含む、ＦＲＤＡ治療剤。
【請求項２３】
前記ｒＡＡＶベクターが、全身に、心臓への直接的な投与により、または頭蓋内への投与により投与される、請求項２２に記載の治療剤。
【請求項２４】
ｒＡＡＶベクターが頭蓋内に投与される、請求項２３に記載の治療剤。
【請求項２５】
ｒＡＡＶベクターが心臓内に直接投与される、請求項２３に記載の治療剤。
【請求項２６】
全身投与が静脈内投与である、請求項２３に記載の治療剤。
【請求項２７】
請求項４〜１８のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項２０に記載のｒＡＡＶベクターを含む、ＦＸＮのレベルの減少により媒介される疾患、障害または状態の治療剤。
【請求項２８】
ＦＸＮをコードする請求項１〜３のいずれか一項に記載の改変された核酸を含む宿主細胞であって、請求項４〜１８のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項２０に記載のｒＡＡＶベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２９】
ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂ−５０またはＢ−５０以外のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ−２、ＨｕＨ７およびＨＴ１０８０からなる群から選択される、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
懸濁培養物中で増殖するように適合させたＨＥＫ２９３細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ１３２７４を有するＨＥＫ２９３細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
複製（Ｒｅｐ）タンパク質、キャプシド（Ｃａｐ）タンパク質、アデノウイルス初期領域１ａ（Ｅ１ａ）タンパク質、Ｅ１ｂタンパク質、Ｅ２ａタンパク質、Ｅ４タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質、およびウイルス関連（ＶＡ）  ＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸を含む、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
細胞中のＦＸＮのレベルの増加に使用するための、ＦＸＮをコードする請求項１〜３のいずれか一項に記載の改変された核酸。
【請求項３４】
細胞中のＦＸＮのレベルの増加に使用するための、ＦＸＮをコードする請求項２に記載の改変された核酸。
【請求項３５】
対象におけるＦＲＤＡの治療に使用するための、請求項２０に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項３６】
対象におけるＦＲＤＡの治療薬を製造するための、請求項４〜１８のいずれか一項に記載のベクターまたは請求項２０に記載のｒＡＡＶベクターの使用。
【請求項３７】
対象におけるＦＲＤＡの治療薬を製造するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＦＸＮをコードする改変された核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変されたフラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子、改変されたＦＸＮ遺伝子を含むベクター、非突然変異型（野生型）ミトコンドリアタンパク質フラタキシンの発現レベルの増加をもたらすことによる、関連する心筋症および／または神経変性疾患を含むフリードライヒ運動失調症の治療における改変されたＦＸＮ遺伝子およびそれらを含有するベクターを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）は、ＦＸＮ遺伝子の発現低下および／またはＦＸＮ遺伝子における突然変異と関連があり、ＦＸＮ遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質のフラタキシンをコードする。ＦＲＤＡは、常染色体劣性疾患であり、このことは、個体が両方の親から、欠陥のある遺伝子を受け継ぐ場合にのみ、個体はこの疾患を発症することを意味する。ＦＸＮ遺伝子における突然変異がＦＲＤＡを引き起こし、その結果、フラタキシンのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの低下が生じる。欠陥のあるフラタキシンの発現は、酸化還元の不均衡およびＡＴＰの欠乏を含めた、決定的に重要な代謝変化を引き起こす。
【０００３】
ＦＲＤＡは、神経変性疾患であり、小児および若年成人に影響を及ぼし、進行性の身体障害および若年死亡をもたらす。神経学的徴候は、感覚神経の変性および抹消神経を通る感覚情報の流れと関連があり、脊髄が重度の影響を受ける。また、小脳および脊髄からの、筋肉を制御するシグナルの一部の機能障害もある。これらの問題は、ＦＲＤＡを特徴付ける、バランス、協調および筋肉強度の進行性の喪失をもたらす。さらに、患者はしばしば、肥大型心筋症も発症し、このことにより、若年死亡を引き起こす可能性が高まる。心臓の肥大、不規則な心拍および心臓病のその他の症状が明らかに認められる。
【０００４】
フラタキシンタンパク質は、ミトコンドリア内部の鉄のレベルを調節すると考えられており、鉄は、エネルギーを発生させるための酸素を使用するのに必要である。フラタキシンは、鉄のための貯蔵所として作用して、ミトコンドリア中の酵素の合成に鉄が必要になる場合にのみ、鉄を放出するようである。したがって、フラタキシンが欠乏すると、その結果、これらの酵素が欠乏し、さらに、ミトコンドリアの機能も低下し、このことにより、フリードライヒ運動失調症が神経系および心臓の細胞に影響を及ぼす理由が説明される可能性が高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現時点では、ＦＲＤＡの望ましくない作用を止めるかまたは遅らせるための治療は存在しない。臨床において使用されているかまたは評価途上にある、治療の現在のアプローチは、症状を緩和し、生活の質を最大化することを狙っている。動きを改善するために、理学療法および言語療法が使用されている。さらに、いくつかの医薬品も、心臓疾患を治療するために使用されている。したがって、ＦＲＤＡと関連がある症状を治療するための治療の新規のアプローチが大いに求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、フラタキシン（ＦＸＮ）をコードする改変された核酸および改変された核酸を含むベクター、ならびにＦＸＮのレベルの減少により媒介される疾患を、改変された核酸または核酸を含むベクターを、それを必要とする患者に投与することによって治療する方法を開示し、例示する。
【０００７】
当業者であれば、本明細書に記載する本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を理解しているか、または日常的な実験を使用するだけでそれらを確認することが可能であると予想される。そのような均等物は、以下の実施形態（Ｅ）により包含されることが意図される。
【０００８】
Ｅ１．ＦＲＤＡの治療をヒト対象において行うための改変されたＦＸＮ遺伝子であって、ＧＣヌクレオチドの含有量を変化させるように、かつ／または低下した数のＣｐＧジヌクレオチドを有するように改変されている、改変されたＦＸＮ遺伝子。
【０００９】
Ｅ２．低下した数のＣｐＧジヌクレオチドが、遺伝子発現のサイレンシングをＣｐＧモチーフのメチル化に起因して抑制するのに十分な量をなす、実施形態１に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００１０】
Ｅ３．ＧＣヌクレオチドの含有量が、野生型遺伝子と比べて、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超である、実施形態１に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００１１】
Ｅ４．＞０．７５、＞０．８０、＞０．８５、＞０．９０、または＞０．９５であるコドン適応指標（ｃｏｄｏｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ）を有する、実施形態３に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００１２】
Ｅ５．配列番号３〜９のいずれか１つから選択される配列を含む、実施形態３に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００１３】
Ｅ６．ＧＣヌクレオチドの含有量が、野生型遺伝子と比べて、１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、または７０％未満である、実施形態１に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００１４】
Ｅ７．ウイルスベクターまたはプラスミド中に含まれる、実施形態１に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００１５】
Ｅ８．ウイルスベクターが、自己相補性のＡＡＶ配列である、実施形態７に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００１６】
Ｅ９．ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ  Ｈｕ．２６、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ｒｈＡＡＶ１０、ｒｈＡＡＶ７４、ＲＨＭ４−１、ＲＨＭ１５−１、ＲＨＭ１５−２、ＲＨＭ１５−３／ＲＨＭ１５−５、ＲＨＭ１５−４、ＲＨＭ１５−６、ＡＡＶ２−ＴＴ、ＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ−Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ならびにそれらの組合せおよびバリアントからなる群から選択される、実施形態８に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００１７】
Ｅ１０．ウイルスベクターが、祖先ＡＡＶのベクターである、実施形態８に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００１８】
Ｅ１１．ウイルスベクターが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８に由来するＡＡＶ骨格の組合せを含み、ＡＡＶ９に由来するガラクトース（Ｇａｌ）結合性フットプリントをさらに含むキメラのＡＡＶである、実施形態８に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００１９】
Ｅ１２．フラタキシンタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列またはその機能性断片を有する、実施形態１に記載の改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００２０】
Ｅ１３．フラタキシンの欠乏と関連がある疾患の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、治療有効量の改変されたＦＸＮ遺伝子を前記対象に投与するステップを含み、改変されたＦＸＮ遺伝子が、ＧＣヌクレオチドの含有量を増加もしくは減少させるように、かつ／またはＣｐＧジヌクレオチドの数を低下させるように改変されている、方法。
【００２１】
Ｅ１４．改変されたＦＸＮ遺伝子が、配列番号１のアミノ酸配列を有するフラタキシンタンパク質をコードする、実施形態１３に記載の方法。
【００２２】
Ｅ１５．改変されたＦＸＮ遺伝子が、標的細胞中で発現され、標的細胞が、心臓細胞または神経細胞である、実施形態１３に記載の方法。
【００２３】
Ｅ１６．改変されたＦＸＮ遺伝子が、ウイルス性または非ウイルス性のベクター中で標的細胞に送達される、実施形態１３に記載の方法。
【００２４】
Ｅ１７．ベクターが、全身性の注射によってか、または心臓もしくは頭蓋内への直接的な注射によって送達される、実施形態１６に記載の方法。
【００２５】
Ｅ１８．フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）の治療を、それを必要とする対象において行う方であって、改変されたＦＸＮ遺伝子を含む少なくとも１つの組換えウイルスベクターを提供するステップであって、改変されたＦＸＮ遺伝子が、ＧＣヌクレオチドの含有量を増加もしくは減少させるように、かつ／またはＣｐＧジヌクレオチドの量を低下させるように改変されている、ステップと、
組換えウイルスベクターを対象に、改変されたＦＸＮ遺伝子が、治療有効量のフラタキシンを対象の心臓組織および／または神経組織中にもたらすレベルで発現するような条件下で投与するステップと
を含む、方法。
【００２６】
Ｅ１９．組換えウイルスベクターが、対象の神経細胞または心筋細胞に投与される、実施形態１８に記載の方法。
【００２７】
Ｅ２０．フラタキシンペプチドまたはその機能性断片をコードする改変されたＦＸＮ遺伝子をトランスフェクトした宿主細胞であって、改変されたＦＸＮ遺伝子が、ＧＣヌクレオチドの含有量を増加もしくは減少させるように、かつ／またはＣｐＧジヌクレオチドの数を低下させるように改変されている、宿主細胞。
【００２８】
Ｅ２１．フラタキシンペプチドまたはその断片を調製するプロセスであって、
宿主細胞に、フラタキシンペプチドまたはその機能性断片をコードする改変されたＦＸＮ遺伝子をトランスフェクトすること、および宿主細胞を、フラタキシンペプチドを発現するのに十分な生物学的条件下で維持すること
を含む、プロセス。
【００２９】
Ｅ２２．改変されたＦＸＮ遺伝子が、配列番号２に記載の、野生型フラタキシンの核酸配列と比較して、ＧＣヌクレオチドのレベルを増加させており、かつ／またはＣｐＧジヌクレオチドのレベルを低下させている、実施形態２１に記載のプロセス。
【００３０】
Ｅ２３．改変されたＦＸＮ遺伝子を含む医薬組成物であって、改変されたＦＸＮ遺伝子が、増加もしくは減少した、ＧＣヌクレオチドの含有量および／または低下した数のＣｐＧジヌクレオチド、ならびに薬学的に許容できる担体を有する、医薬組成物。
【００３１】
Ｅ２４．ＦＲＤＡの治療を行うための方法であって、ＦＸＮ遺伝子をコードする改変されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを、治療を必要とする対象に送達するステップを含み、ＦＸＮ遺伝子が、標的細胞中で発現され、それにより、ＦＲＤＡの治療を対象において行う、方法。標的細胞は、好ましくは、心臓細胞または神経細胞であり、ベクターは、好ましくは、標的細胞に、心臓もしくは頭蓋内への直接的な注射を介して送達される。
【００３２】
Ｅ２５．野生型遺伝子よりも２０％、３０％、４０％、５０％または６０％低い、野生型遺伝子と比べて低下したＧＣ含有量を有し、かつ依然として、野生型と同じ発現レベルを示す、実施形態１に記載の改変された核酸。遺伝子のＧＣ含有量を減少させるために、サイレント突然変異を、コード配列内に導入することができる。
【００３３】
Ｅ２６．低下したレベルのＣｐＧジヌクレオチドを有する、ＦＸＮをコードする改変された核酸。
【００３４】
Ｅ２７．ＦＲＤＡの治療を、それを必要とするヒト対象において行うための、ＦＸＮをコードする改変された核酸（この核酸は、「改変されたＦＸＮ遺伝子」ともまた呼ぶ）であって、配列番号２に記載の、ＦＸＮをコードする野生型の核酸配列と比べて、ＧＣ含有量を増加させ、特定のシスモチーフを低下させるように改変されている、改変された核酸。
【００３５】
Ｅ２８．配列番号２に記載の、ＦＸＮをコードする野生型の核酸配列中に存在するＣｐＧジヌクレオチドの数と比較して低下した数のＣｐＧジヌクレオチドを、遺伝子発現のサイレンシングをＣｐＧモチーフのメチル化に起因して抑制する量として有する改変されたＦＸＮ遺伝子。
【００３６】
Ｅ２９．ＦＲＤＡを対象において治療する方法であって、
実施形態１〜１２、２３および２５〜２８のいずれか１つに記載の改変されたＦＸＮ遺伝子を含む少なくとも１つの組換えウイルスベクターを提供するステップと、組換えウイルスベクターを対象に、改変されたＦＸＮ遺伝子が、治療有効量のフラタキシンを対象の心臓組織および／または神経組織中にもたらすレベルで発現するような条件下で投与するステップと
を含む、方法。
【００３７】
Ｅ３０．フリードライヒ運動失調症の作用の抑制または治療を、それを必要とする対象の神経細胞および心筋細胞において行うための方法であって、タンパク質のフラタキシンをコードする改変されたＦＸＮ核酸を含む組換えウイルスベクターの治療有効量を、前記対象に投与するステップを含む、方法。
【００３８】
Ｅ３１．フリードライヒ運動失調症の治療を、それを必要とする対象において行うための方法であって、配列番号３〜９の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸の投与に基づく遺伝子療法含む、方法。
【００３９】
Ｅ３２．改変されたＦＸＮ遺伝子またはその機能性断片を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物であって、ＡＡＶベクターが、一本鎖ＡＡＶベクターゲノム、二本鎖ＡＡＶベクターゲノム、または自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶベクターゲノムを含む、組成物。
【００４０】
Ｅ３３．改変されたＦＸＮ遺伝子またはその断片を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【００４１】
Ｅ３４．ＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈＡＡＶ１０、ｒｈＡＡＶ７４、ＲＨＭ４−１、ＲＨＭ１５−１、ＲＨＭ１５−２、ＲＨＭ１５−３／ＲＨＭ１５−５、ＲＨＭ１５−４、ＲＨＭ１５−６、ＡＡＶ  Ｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１（配列番号１５）、ＡＡＶ２．５（配列番号１３）、ＡＡＶ６．１（配列番号１７）、ＡＡＶ６．３．１（配列番号１８）、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８（配列番号２９）、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２−ＴＴ（配列番号３１）、ＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ（配列番号３３）、ＡＡＶ３Ｂ−Ｓ３１２Ｎ、およびＡＡＶ−ＬＫ０３からなる群から選択される血清型のキャプシドを含む、実施形態３３に記載のベクター。
【００４２】
Ｅ３５．ＡＡＶ１．１のキャプシド、すなわち、アミノ酸残基２６５が欠失しているキャプシド（配列番号１５）、ＡＡＶ６．１のキャプシド、すなわち、アミノ酸残基２６５が欠失しているキャプシド（配列番号１７）、ＡＡＶ６．３．１のキャプシド、すなわち、アミノ酸残基２６５が欠失しており、アミノ酸残基５３１がＬｙｓからＧｌｕに変化しているキャプシド（配列番号１８）をさらに含む、実施形態３４に記載のベクター。野生型ＡＡＶ１のキャプシドのヌクレオチド配列を（配列番号１４）に示し、野生型ＡＡＶ６のキャプシドのヌクレオチド配列を（配列番号１６）に記載する。
【００４３】
Ｅ３６．実施形態１〜１２、２３および２５〜２８のいずれか１つに記載の改変されたＦＸＮ遺伝子を含み、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８に由来するＡＡＶ骨格と、ＡＡＶ９に由来するガラクトース（Ｇａｌ）結合性フットプリントとの組合せを含むキャプシドをさらに含むキメラのＡＡＶウイルスベクター。具体的には、形質導入の効率を改善するために、ＡＡＶ９に由来するガラクトース（Ｇａｌ）結合性フットプリントが、ヘパリン硫酸結合性の、ＡＡＶの血清２型上にグラフトされている。
【００４４】
Ｅ３７．実施形態１〜１２、２３および２５〜２８のいずれか１つに記載の改変されたＦＸＮ遺伝子を含み、ベクターのキャプシドが、ＡＡＶ１および／またはＡＡＶ６の２６５位における欠失突然変異と組み合わせたチロシン突然変異、ならびにキャプシドタンパク質へのガラクトース結合性フットプリントの付加を含むことをさらに含むキメラのＡＡＶウイルスベクター。
【００４５】
Ｅ３８．実施形態１〜１２、２３および２５〜２８のいずれか１つに記載の改変されたＦＸＮ遺伝子を含み、ＡＡＶのＨＩ構造のループ中にかまたはＡＡＶ２の骨格中の５８５ａａの位置に挿入されている標的指向化ペプチドをさらに含むキメラのＡＡＶウイルスベクター。さらに、祖先ＡＡＶのベクターを使用して、治療のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子療法を行うこともできる。とりわけ、祖先のウイルスの配列からアセンブルされたウイルス粒子の使用により、現在のヒト集団における既存の免疫に対して、現代のウイルスまたはそれらの部分が示す感受性よりも低下した感受性が示される。
【００４６】
Ｅ３９．実施形態１〜１２、２３および２５〜２８のいずれか１つに記載の改変されたＦＸＮ遺伝子を含む宿主細胞。
【００４７】
Ｅ４０．フラタキシンペプチドまたはその断片を調製するプロセスであって、宿主細胞に、実施形態１〜１２、２３および２５〜２８のいずれか１つに記載の改変されたＦＸＮ遺伝子をトランスフェクトすること、および
宿主細胞を、フラタキシンペプチドを発現するのに十分な生物学的条件下で維持すること
を含む、プロセス。
【００４８】
Ｅ４１．フリードライヒ運動失調症の治療における、実施形態１〜１２、２３および２５〜２８のいずれか１つに記載の改変されたＦＸＮ遺伝子の使用。
【００４９】
Ｅ４２．神経および細胞の変性を引き起こすフリードライヒ運動失調症の治療を、ヒト対象の心臓組織において行うための改変されたＦＸＮ遺伝子を含む医薬組成物であって、改変されたＦＸＮ遺伝子が、増加した量のＧＣヌクレオチド、減少した量のＧＣヌクレオチドを有し、かつ／または低下した数のＣｐＧジヌクレオチドを有し；薬学的に許容できる担体を有する、医薬組成物。
【００５０】
Ｅ４３．配列番号３〜９のいずれか１つから選択される核酸配列を含む、フラタキシンをコードする発現最適化核酸。
【００５１】
Ｅ４４．配列番号１に記載のアミノ酸を含むフラタキシンをコードする改変された核酸であって、少なくとも５５％のＧＣ含有量、配列番号２の核酸配列と比較して減少した数のＣｐＧジヌクレオチド、少なくとも０．８のコドン適応指標（ＣＡＩ）を有し、配列番号２の核酸配列を含む野生型フラタキシンの発現レベルと比較してより高いレベルで発現される、改変された核酸。
【００５２】
Ｅ４５．ＣＡＩが、少なくとも０．８６である、実施形態４４に記載の改変された核酸。
【００５３】
Ｅ４６．ＣＡＩが、少なくとも０．９５である、実施形態４４に記載の改変された核酸。
【００５４】
Ｅ４７．ＣＡＩが、少なくとも０．９８である、実施形態４４に記載の改変された核酸。
【００５５】
Ｅ４８．ＧＣ含有量が、少なくとも６１％である、実施形態４４〜４７のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００５６】
Ｅ４９．ＧＣ含有量が、少なくとも６９％である、実施形態４４〜４７のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００５７】
Ｅ５０．ＣｐＧジヌクレオチドの数が、約１１４〜１２４である、実施形態４４〜４９のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００５８】
Ｅ５１．配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むフラタキシン（ＦＸＮ）をコードする改変された核酸であって、配列番号２の野生型ＦＸＮの核酸配列の発現レベルと比較してより高いレベルで発現され、少なくとも５５％のＧＣ含有量、１２４以下のＣｐＧジヌクレオチドの数、および少なくとも０．７６のコドン適応指標（ＣＡＩ）からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、改変された核酸。
【００５９】
Ｅ５２．少なくとも０．８６、少なくとも０．９５、または少なくとも０．９８のＣＡＩ；少なくとも５７％、少なくとも６１％、または少なくとも６９％であるＧＣ含有量；１２４未満であるＣｐＧジヌクレオチドの数；および配列番号３〜９に記載の配列からなる群から選択される核酸配列からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を含む、実施形態５１に記載の改変された核酸。
【００６０】
Ｅ５３．ＦＸＮをコードする改変された核酸であって、配列番号２の野生型ＦＸＮの核酸配列の発現レベルと比較してより高いレベルで発現され、配列番号３〜９からなる群から選択される核酸配列；少なくとも５５％のＧＣ含有量；１１７以下のＣｐＧジヌクレオチドの数；および少なくとも０．８６のＣＡＩのうちの少なくとも１つを含む、改変された核酸。
【００６１】
Ｅ５４．核酸配列が配列番号５および配列番号７からなる群から選択される、実施形態５３に記載の改変された核酸。
【００６２】
Ｅ５５．配列番号７の核酸配列を含む、実施形態４３〜５４のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００６３】
Ｅ５６．少なくとも１つのＡＡＶの末端反復（ＴＲ）をコードする核酸配列をさらに含む、実施形態１〜１２、２３、２５〜２８および４３〜５５のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００６４】
Ｅ５７．一本鎖、二本鎖および／または自己相補性である、実施形態５５に記載の改変された核酸。
【００６５】
Ｅ５８．自己相補性である、実施形態５７に記載の改変された核酸。
【００６６】
Ｅ５９．エンハンサーをさらに含む、実施形態１〜１２、２３、２５〜２８および４３〜５８のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００６７】
Ｅ６０．エンハンサーが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の最初期エンハンサーである、実施形態５９に記載の改変された核酸。
【００６８】
Ｅ６１．プロモーターをさらに含む、実施形態１〜１２、２３、２５〜２８および４３〜６０のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００６９】
Ｅ６２．プロモーターが、構成的または調節的である、実施形態１〜１２、２３、２５〜２８および４３〜６１のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００７０】
Ｅ６３．プロモーターが、調節的である、実施形態６２に記載の改変された核酸。
【００７１】
Ｅ６４．プロモーターが、誘導性または抑制性である、実施形態６３に記載の改変された核酸。
【００７２】
Ｅ６５．コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ）をコードする核酸配列をさらに含む、実施形態１〜１２、２３、２５〜２８および４３〜６４のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００７３】
Ｅ６６．終止コドンをさらに含む、実施形態１〜１２、２３、２５〜２８および４３〜６５のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００７４】
Ｅ６７．ポリ−アデニル化（ポリＡ）シグナル配列をさらに含む、実施形態１〜１２、２３、２５〜２８および４３〜６６のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００７５】
Ｅ６８．プロモーターが、ニワトリのベータ−アクチン（ＣＢＡ）のプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター、ＣＭＶのエンハンサー／ＣＢＡのプロモーター（ＣＢｈ）、および合成のＣＡＧプロモーターからなる群から選択される、実施形態６７に記載の改変された核酸。
【００７６】
Ｅ６９．プロモーターが、ＣＢｈプロモーターである、実施形態６８に記載の改変された核酸。
【００７７】
Ｅ７０．コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ）をコードする核酸配列をさらに含む、実施形態１〜６、１２、２５〜２８および４４〜６９のいずれか１つに記載の改変された核酸。
【００７８】
Ｅ７１．ＦＸＮをコードする、実施形態１〜１２、２３、２５〜２８および４３〜７０のいずれか１つに記載の改変された核酸を含む、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）。
【００７９】
Ｅ７２．ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ２．５（配列番号１３）、ＡＡＶ  ｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、ＲＨＭ４−１、ＲＨＭ１５−１、ＲＨＭ１５−２、ＲＨＭ１５−３／ＲＨＭ１５−５、ＲＨＭ１５−４、ＲＨＭ１５−６、ＡＡＶ２−ＴＴ、ＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ−Ｓ３１２Ｎ、およびＡＡＶ−ＬＫ０３に由来するキャプシドからなる群から選択されるキャプシドを含む、実施形態７１に記載のｒＡＡＶ。
【００８０】
Ｅ７３．キャプシドが、ＡＡＶ２−ＴＴ、ＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ、およびＡＡＶ２ｉ８のキャプシドからなる群から選択される、実施形態７２に記載のｒＡＡＶ。
【００８１】
Ｅ７４．改変された核酸が、配列番号７の配列を含み、キャプシドが、ＡＡＶ２ｉ８のキャプシドおよびＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎのキャプシドから選択される、実施形態７３に記載のｒＡＡＶ。
【００８２】
Ｅ７５．核酸が、２つのＡＡＶの末端反復配列を、ＦＸＮをコードする配列に隣接させてさらに含み、ＣＢｈプロモーターを、ＦＸＮをコードする配列の上流にさらに含む、実施形態７４に記載のｒＡＡＶ。
【００８３】
Ｅ７６．前記核酸が、コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ；配列番号２５）を、ＦＸＮをコードする配列より３’にさらに含む、実施形態７５に記載のｒＡＡＶ。
【００８４】
Ｅ７７．核酸が、ウシ成長ホルモンポリＡ（ｂＧＨポリＡ）シグナル配列を含む、実施形態７１〜７６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶ。
【００８５】
Ｅ７８．ＡＡＶ２ｉ８のキャプシドを含むｒＡＡＶベクターであって、ＶＰ１が、配列番号２９のアミノ酸を含み、５’から３’に、
（ａ）ＡＡＶ２の末端反復（ＴＲ）、
（ｂ）配列番号２６の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
（ｃ）配列番号３〜９からなる群から選択される核酸配列を含む、ＦＸＮをコードする改変された核酸、
（ｄ）配列番号２５の配列を有するＣＳＳ、
（ｅ）配列番号２７の配列を有するｂＧＨポリＡシグナル配列、および
（ｆ）ＡＡＶ２のＴＲ
を含む核酸をさらに含む、ｒＡＡＶベクター。
【００８６】
Ｅ７９．ＡＡＶ２−ＴＴのキャプシドを含むｒＡＡＶベクターであって、ＶＰ１が、配列番号３１のアミノ酸を含み、５’から３’に、
（ａ）ＡＡＶ２のＴＲ、
（ｂ）配列番号２６の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
（ｃ）配列番号３〜９からなる群から選択される核酸配列を含む、ＦＸＮをコードする改変された核酸、
（ｄ）配列番号２５の配列を有するＣＳＳ、
（ｅ）配列番号２７の配列を有するｂＧＨポリＡシグナル配列、および
（ｆ）ＡＡＶ２のＴＲ
を含む核酸をさらに含む、ｒＡＡＶベクター。
【００８７】
Ｅ８０．ＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎのキャプシドを含むｒＡＡＶベクターであって、ＶＰ１が、配列番号３３のアミノ酸を含み、５’から３’に、
（ａ）ＡＡＶ２のＴＲ、
（ｂ）配列番号２６の核酸配列を含むＣＢｈプロモーター、
（ｃ）配列番号３〜９からなる群から選択される核酸配列を含む、ＦＸＮをコードする改変された核酸、
（ｄ）配列番号２５の配列を有するＣＳＳ、
（ｅ）配列番号２７の配列を有するｂＧＨポリＡシグナル配列、および
（ｆ）ＡＡＶ２のＴＲ
を含む核酸をさらに含む、ｒＡＡＶベクター。
【００８８】
Ｅ８１．ＦＸＮをコードする改変された核酸が、配列番号７の核酸配列を含む、実施形態７１〜８０のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
【００８９】
Ｅ８２．フリードライヒ運動失調症の治療を、それを必要とする対象において行うためのｒＡＡＶベクターであって、フラタキシンをコードする、実施形態１〜６、１２、２５〜２８および７１〜８１のいずれか１つに記載の改変された核酸を含む、ｒＡＡＶベクター。
【００９０】
Ｅ８３．実施形態７〜１１、３３〜３９および７１〜８２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクターならびに薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【００９１】
Ｅ８４．ＦＲＤＡの治療を対象において行う方法であって、フラタキシンをコードする、実施形態１〜１２、２３、２５〜２８および４３〜７０のいずれか１つに記載の改変された核酸；実施形態７〜１１、３３〜３９および７１〜８２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター；ならびに実施形態８３に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを投与するステップを含む、方法。
【００９２】
Ｅ８５．実施形態７〜１１、３３〜３９および７１〜８２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクターが、全身に、または心臓もしくは頭蓋内への直接的な投与により投与される、実施形態８４に記載の方法。
【００９３】
Ｅ８６．実施形態７１〜８２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクターが、頭蓋内に投与される、実施形態８５に記載の方法。
【００９４】
Ｅ８７．実施形態７１〜８２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクターが、心臓内に直接投与される、実施形態８５に記載の方法。
【００９５】
Ｅ８８．ＦＸＮをコードする改変された核酸が、配列番号６の核酸配列を含む、実施形態８４に記載の方法。
【００９６】
Ｅ８９．ＦＸＮをコードする改変された核酸が、配列番号７の核酸配列を含む、実施形態８４に記載の方法。
【００９７】
Ｅ９０．ＦＴＸのレベルの減少により媒介される疾患、障害または状態の治療を行う方法であって、フラタキシンをコードする、実施形態１〜６、１２、２５〜２８および４３〜７０のいずれか１つに記載の改変された核酸；実施形態７〜１１、３３〜３９および７１〜８２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター；ならびに実施形態８３に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つを投与するステップを含む、方法。
【００９８】
Ｅ９１．ＦＸＮをコードする、実施形態１〜６、１２、２５〜２８および４３〜７０のいずれか１つに記載の改変された核酸を含む宿主細胞。
【００９９】
Ｅ９２．ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂ−５０または任意のその他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ−２、ＨｕＨ７およびＨＴ１０８０からなる群から選択される、実施形態９１に記載の宿主細胞。
【０１００】
Ｅ９３．懸濁培養物中で増殖するように適合させたＨＥＫ２９３である、実施形態９２に記載の宿主細胞。
【０１０１】
Ｅ９４．ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ１３２７４を有するＨＥＫ２９３細胞である、実施形態９１〜９３のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【０１０２】
Ｅ９５．実施形態７〜１１、３３〜３９および７０〜８２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクターを含むパッケージング細胞であって、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、ＡＡＶのＣａｐタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、およびヘルパー機能をコードする少なくとも１つの核酸をさらに含む、パッケージング細胞。
【０１０３】
Ｅ９６．ｒＡＡＶベクターを生成するための方法であって、実施形態９１〜９５のいずれか１つに記載の細胞を、ｒＡＡＶが生成される条件下で培養するステップを含む、方法。
【０１０４】
Ｅ９７．生成したｒＡＡＶを単離するステップをさらに含む、実施形態９６に記載の方法。
【０１０５】
Ｅ９８．細胞中のフラタキシンのレベルを増加させるための、フラタキシンをコードする、実施形態１〜６、１２、２５〜２８および４３〜７０のいずれか１つに記載の改変された核酸；実施形態７〜１１、３３〜３９および７１〜８２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター；ならびに実施形態８３に記載の医薬組成物のうちの少なくとも１つの使用。
【０１０６】
Ｅ９９．対象におけるフラタキシンのレベルの増加に使用するための、フラタキシンをコードする、実施形態１〜６、１２、２５〜２８および４３〜７０のいずれか１つに記載の改変された核酸；実施形態７〜１１、３３〜３９および７１〜８２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター；ならびに実施形態８３に記載の医薬組成物。
【０１０７】
Ｅ１００．対象におけるフリードライヒ運動失調症の治療に使用するための、フラタキシンをコードする、実施形態１〜６、１２、２５〜２８および４３〜７０のいずれか１つに記載の改変された核酸；実施形態７〜１１、３３〜３９および７１〜８２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター；ならびに実施形態８３に記載の医薬組成物。
【０１０８】
本発明のその他の特徴および利点が、以下の詳細な説明、図面、例示的な実施形態、および特許請求の範囲から明らかになると予想される。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】ＨｅＬａ細胞中での、選択された、ＦＸＮをコードする改変された核酸からのフラタキシンの発現を、野生型核酸（レーン１）と比較した結果を示す図である。以下の改変された核酸を含むＨｅＬａ細胞から得られた抽出物を調べて、細胞中で生成したＦＸＮを検出した。フラタキシンを、ウエスタンブロッティングにより、抗フラタキシン抗体を使用して検出し、検出には、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を用いてコンジュゲート化した二次抗体を使用して、ウエスタンブロットの感光性のフィルムへの露光によって、化学発光検出を行った。フラタキシンをコードする、以下の改変された核酸をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞から得られた抽出物を、レーンにローディングした：レーン１：野生型対照核酸；レーン２：ＩＤＴ２；レーン３：ＩＤＴ５；レーン４：ＪＣＡＴ；レーン５：ＧｅｎｅＡｒｔ；レーン６：Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（対照）；およびレーン７：Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）。
【図１Ｂ】ＨｅＬａ細胞中での、選択された、ＦＸＮをコードする改変された核酸からのフラタキシンの発現を、野生型核酸（レーン１）と比較した結果を示す図である。以下の改変された核酸を含むＨｅＬａ細胞から得られた抽出物を調べて、細胞中で生成したＦＸＮを検出した。フラタキシンを、ウエスタンブロッティングにより、抗フラタキシン抗体を使用して検出し、検出には、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を用いてコンジュゲート化した二次抗体を使用して、ウエスタンブロットの感光性のフィルムへの露光によって、化学発光検出を行った。フラタキシンをコードする、以下の改変された核酸をトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞から得られた抽出物を、レーンにローディングした：レーン１：野生型対照核酸；レーン２：ＩＤＴ２；レーン３：ＩＤＴ５；レーン４：ＪＣＡＴ；レーン５：ＧｅｎｅＡｒｔ；レーン６：Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（対照）；およびレーン７：Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）。
【図２Ａ】自己相補性ｒＡＡＶベクターであるｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＥＧＦＰ−ｂＧＨポリＡへのクローニングのための、多様な改変されたＦＸＮ遺伝子の構築物の配列を示す図である；ＥＧＦＰマーカー遺伝子を、野生型ＦＸＮ遺伝子（配列番号２）またはその改変されたバージョン（例えば、配列番号３〜９）のいずれかで交換した。ＷＴ  ＦＸＮ（図２Ａ）を示す。構築物は、（５’から３’に）ＡｇｅＩ切断部位、ＦＸＮ遺伝子／改変されたＦＸＮ遺伝子、ＡｖｒＩＩ切断部位、コラーゲン安定性配列（ＣＳＳ）、ＳｐｅＩ切断部位、ｂＧＨポリＡシグナル配列およびＭｌｕＩ切断部位を含む。ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＷＴ  ＦＸＮ−ｂＧＨｐｏｌｙＡ構築物（配列番号１９）を示す。配列は、エレメント（例えば、ＡｇｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＣＳＳ、ＳｐｅＩ、ｂＧＨポリＡおよびＭｌｕＩ）を含み、これらを５’から３’に、以下に示す：ＡｇｅＩ切断部位（ＡＣＣＧＧＴ）：太字；ＦＸＮ遺伝子：小文字；ＡｖｒＩＩ切断部位（ＣＣＴＡＧＧ）：下線；コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ）をコードする配列：二重下線；ＳｐｅＩ切断部位（ＡＣＴＡＧＴ）：太字、下線；ウシ成長ホルモンのポリ−アデニル化シグナル配列（ｂＧＨポリＡ）：斜体；およびＭｌｕＩ切断部位（ＡＣＧＣＧＴ）：太字、斜体。構築物中のＦｘｎ遺伝子は、ＡｇｅＩ切断部位の上流のＣＢｈプロモーターの制御下にある。ＣＢｈプロモーターの配列は、図中には示されていないが、配列番号２５に記載されている。
【図２Ｂ】自己相補性ｒＡＡＶベクターであるｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＥＧＦＰ−ｂＧＨポリＡへのクローニングのための、多様な改変されたＦＸＮ遺伝子の構築物の配列を示す図である；ＥＧＦＰマーカー遺伝子を、野生型ＦＸＮ遺伝子（配列番号２）またはその改変されたバージョン（例えば、配列番号３〜９）のいずれかで交換した。改変されたＦＸＮ遺伝子を示す。構築物は、（５’から３’に）ＡｇｅＩ切断部位、ＦＸＮ遺伝子／改変されたＦＸＮ遺伝子、ＡｖｒＩＩ切断部位、コラーゲン安定性配列（ＣＳＳ）、ＳｐｅＩ切断部位、ｂＧＨポリＡシグナル配列およびＭｌｕＩ切断部位を含む。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩＤＴ１（ＩＤＴ１）である改変されたＦＸＮ遺伝子の構築物：ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＩＤＴ１  ＦＸＮ−ｂＧＨポリＡ（配列番号２０）を示す。配列は、エレメント（例えば、ＡｇｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＣＳＳ、ＳｐｅＩ、ｂＧＨポリＡおよびＭｌｕＩ）を含み、これらを５’から３’に、以下に示す：ＡｇｅＩ切断部位（ＡＣＣＧＧＴ）：太字；ＦＸＮ遺伝子：小文字；ＡｖｒＩＩ切断部位（ＣＣＴＡＧＧ）：下線；コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ）をコードする配列：二重下線；ＳｐｅＩ切断部位（ＡＣＴＡＧＴ）：太字、下線；ウシ成長ホルモンのポリ−アデニル化シグナル配列（ｂＧＨポリＡ）：斜体；およびＭｌｕＩ切断部位（ＡＣＧＣＧＴ）：太字、斜体。構築物中のＦｘｎ遺伝子は、ＡｇｅＩ切断部位の上流のＣＢｈプロモーターの制御下にある。ＣＢｈプロモーターの配列は、図中には示されていないが、配列番号２５に記載されている。
【図２Ｃ】自己相補性ｒＡＡＶベクターであるｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＥＧＦＰ−ｂＧＨポリＡへのクローニングのための、多様な改変されたＦＸＮ遺伝子の構築物の配列を示す図である；ＥＧＦＰマーカー遺伝子を、野生型ＦＸＮ遺伝子（配列番号２）またはその改変されたバージョン（例えば、配列番号３〜９）のいずれかで交換した。改変されたＦＸＮ遺伝子を示す。構築物は、（５’から３’に）ＡｇｅＩ切断部位、ＦＸＮ遺伝子／改変されたＦＸＮ遺伝子、ＡｖｒＩＩ切断部位、コラーゲン安定性配列（ＣＳＳ）、ＳｐｅＩ切断部位、ｂＧＨポリＡシグナル配列およびＭｌｕＩ切断部位を含む。改変されたＦＸＮ遺伝子ＩＤＴ３の構築物：ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＩＤＴ３  ＦＸＮ−ｂＧＨポリＡ（配列番号２１）を示す。配列は、エレメント（例えば、ＡｇｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＣＳＳ、ＳｐｅＩ、ｂＧＨポリＡおよびＭｌｕＩ）を含み、これらを５’から３’に、以下に示す：ＡｇｅＩ切断部位（ＡＣＣＧＧＴ）：太字；ＦＸＮ遺伝子：小文字；ＡｖｒＩＩ切断部位（ＣＣＴＡＧＧ）：下線；コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ）をコードする配列：二重下線；ＳｐｅＩ切断部位（ＡＣＴＡＧＴ）：太字、下線；ウシ成長ホルモンのポリ−アデニル化シグナル配列（ｂＧＨポリＡ）：斜体；およびＭｌｕＩ切断部位（ＡＣＧＣＧＴ）：太字、斜体。構築物中のＦｘｎ遺伝子は、ＡｇｅＩ切断部位の上流のＣＢｈプロモーターの制御下にある。ＣＢｈプロモーターの配列は、図中には示されていないが、配列番号２５に記載されている。
【図２Ｄ】自己相補性ｒＡＡＶベクターであるｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＥＧＦＰ−ｂＧＨポリＡへのクローニングのための、多様な改変されたＦＸＮ遺伝子の構築物の配列を示す図である；ＥＧＦＰマーカー遺伝子を、野生型ＦＸＮ遺伝子（配列番号２）またはその改変されたバージョン（例えば、配列番号３〜９）のいずれかで交換した。改変されたＦＸＮ遺伝子を示す。構築物は、（５’から３’に）ＡｇｅＩ切断部位、ＦＸＮ遺伝子／改変されたＦＸＮ遺伝子、ＡｖｒＩＩ切断部位、コラーゲン安定性配列（ＣＳＳ）、ＳｐｅＩ切断部位、ｂＧＨポリＡシグナル配列およびＭｌｕＩ切断部位を含む。改変されたＦＸＮ遺伝子ＩＤＴ４の構築物：ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＩＤＴ４  ＦＸＮ−ｂＧＨポリＡ（配列番号２２）を示す。配列は、エレメント（例えば、ＡｇｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＣＳＳ、ＳｐｅＩ、ｂＧＨポリＡおよびＭｌｕＩ）を含み、これらを５’から３’に、以下に示す：ＡｇｅＩ切断部位（ＡＣＣＧＧＴ）：太字；ＦＸＮ遺伝子：小文字；ＡｖｒＩＩ切断部位（ＣＣＴＡＧＧ）：下線；コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ）をコードする配列：二重下線；ＳｐｅＩ切断部位（ＡＣＴＡＧＴ）：太字、下線；ウシ成長ホルモンのポリ−アデニル化シグナル配列（ｂＧＨポリＡ）：斜体；およびＭｌｕＩ切断部位（ＡＣＧＣＧＴ）：太字、斜体。構築物中のＦｘｎ遺伝子は、ＡｇｅＩ切断部位の上流のＣＢｈプロモーターの制御下にある。ＣＢｈプロモーターの配列は、図中には示されていないが、配列番号２５に記載されている。
【図２Ｅ】自己相補性ｒＡＡＶベクターであるｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＥＧＦＰ−ｂＧＨポリＡへのクローニングのための、多様な改変されたＦＸＮ遺伝子の構築物の配列を示す図である；ＥＧＦＰマーカー遺伝子を、野生型ＦＸＮ遺伝子（配列番号２）またはその改変されたバージョン（例えば、配列番号３〜９）のいずれかで交換した。改変されたＦＸＮ遺伝子を示す。構築物は、（５’から３’に）ＡｇｅＩ切断部位、ＦＸＮ遺伝子／改変されたＦＸＮ遺伝子、ＡｖｒＩＩ切断部位、コラーゲン安定性配列（ＣＳＳ）、ＳｐｅＩ切断部位、ｂＧＨポリＡシグナル配列およびＭｌｕＩ切断部位を含む。改変されたＦＸＮ遺伝子ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの構築物：ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＦＸＮ−ｂＧＨポリＡ（配列番号２３）を示す。配列は、エレメント（例えば、ＡｇｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＣＳＳ、ＳｐｅＩ、ｂＧＨポリＡおよびＭｌｕＩ）を含み、これらを５’から３’に、以下に示す：ＡｇｅＩ切断部位（ＡＣＣＧＧＴ）：太字；ＦＸＮ遺伝子：小文字；ＡｖｒＩＩ切断部位（ＣＣＴＡＧＧ）：下線；コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ）をコードする配列：二重下線；ＳｐｅＩ切断部位（ＡＣＴＡＧＴ）：太字、下線；ウシ成長ホルモンのポリ−アデニル化シグナル配列（ｂＧＨポリＡ）：斜体；およびＭｌｕＩ切断部位（ＡＣＧＣＧＴ）：太字、斜体。構築物中のＦｘｎ遺伝子は、ＡｇｅＩ切断部位の上流のＣＢｈプロモーターの制御下にある。ＣＢｈプロモーターの配列は、図中には示されていないが、配列番号２５に記載されている。
【図２Ｆ】自己相補性ｒＡＡＶベクターであるｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＥＧＦＰ−ｂＧＨポリＡへのクローニングのための、多様な改変されたＦＸＮ遺伝子の構築物の配列を示す図である；ＥＧＦＰマーカー遺伝子を、野生型ＦＸＮ遺伝子（配列番号２）またはその改変されたバージョン（例えば、配列番号３〜９）のいずれかで交換した。改変されたＦＸＮ遺伝子を示す。構築物は、（５’から３’に）ＡｇｅＩ切断部位、ＦＸＮ遺伝子／改変されたＦＸＮ遺伝子、ＡｖｒＩＩ切断部位、コラーゲン安定性配列（ＣＳＳ）、ＳｐｅＩ切断部位、ｂＧＨポリＡシグナル配列およびＭｌｕＩ切断部位を含む。改変されたＦＸＮ遺伝子ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）の構築物：ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）ＦＸＮ−ｂＧＨポリＡ（配列番号２４）を示す。配列は、エレメント（例えば、ＡｇｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＣＳＳ、ＳｐｅＩ、ｂＧＨポリＡおよびＭｌｕＩ）を含み、これらを５’から３’に、以下に示す：ＡｇｅＩ切断部位（ＡＣＣＧＧＴ）：太字；ＦＸＮ遺伝子：小文字；ＡｖｒＩＩ切断部位（ＣＣＴＡＧＧ）：下線；コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ）をコードする配列：二重下線；ＳｐｅＩ切断部位（ＡＣＴＡＧＴ）：太字、下線；ウシ成長ホルモンのポリ−アデニル化シグナル配列（ｂＧＨポリＡ）：斜体；およびＭｌｕＩ切断部位（ＡＣＧＣＧＴ）：太字、斜体。構築物中のＦｘｎ遺伝子は、ＡｇｅＩ切断部位の上流のＣＢｈプロモーターの制御下にある。ＣＢｈプロモーターの配列は、図中には示されていないが、配列番号２５に記載されている。
【図３】ＡｇｅＩ切断部位の上流のＣＢｈプロモーターを含めた、ベクターの多様な制限（切断）部位およびエレメントを示す、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ｅＧＦＰクローニング構築物についてのベクター（プラスミド）マップである。
【図４Ａ】対照マウス、治療突然変異マウスおよび未治療突然変異マウスの雄におけるベースラインの心臓の表現型を示すグラフである。各グループ内で、左から右へ、雄マウス群についてのベースラインの心臓の表現型を示す：対照マウス（丸）；治療突然変異マウス（四角）；および未治療突然変異マウス（三角）。ＥＦ（駆出率）、ＦＳ（短縮率）；ＬＶ  Ｖｏｌ＿ｄ（拡張期左心室容積）およびＬＶ  Ｖｏｌ＿ｓ（収縮期左心室容積）のグループに分かれている。
【図４Ｂ】対照マウス、治療突然変異マウスおよび未治療突然変異マウスの雌におけるベースラインの心臓の表現型を示すグラフである。各グループ内で、左から右へ、雌マウス群についてのベースラインの心臓の表現型を示す：対照マウス（丸）；治療突然変異マウス（四角）；および未治療突然変異マウス（三角）。ＥＦ（駆出率）、ＦＳ（短縮率）；ＬＶ  Ｖｏｌ＿ｄ（拡張期左心室容積）およびＬＶ  Ｖｏｌ＿ｓ（収縮期左心室容積）のグループに分かれている。
【図５Ａ】５週齢時（かつ治療突然変異マウスにおいては、治療の１４日後）に、治療Ｍｃｋ突然変異体マウスにおけるＦＲＤＡの心臓の表現型の反転を、未治療Ｍｃｋ突然変異体マウスにおける心臓の表現型と比較して示すグラフである。ｒＡＡＶ−ＦＸＮ注射の１４日後の、対照雄マウス（丸）、治療突然変異雄マウス（四角）、および未治療突然変異雄マウス（三角）の心臓の表現型を示す。略語を、以下に示す：ＡｏＶ  ＳＶ（大動脈弁一回拍出量）；ＡｏＶ  ＣＯ（大動脈弁心拍出量）；ＦＳ（短縮率）；およびＬＶ  Ｍａｓｓ  ＡＷ（左心室前壁筋重量）。
【図５Ｂ】５週齢時（かつ治療突然変異マウスにおいては、治療の１４日後）に、治療Ｍｃｋ突然変異体マウスにおけるＦＲＤＡの心臓の表現型の反転を、未治療Ｍｃｋ突然変異体マウスにおける心臓の表現型と比較して示すグラフである。ｒＡＡＶ−ＦＸＮ注射の１４日後の、対照雌マウス（丸）、治療突然変異雌マウス（四角）、および未治療突然変異雌マウス（三角）の心臓の表現型を示す。略語を、以下に示す：ＥＳ（駆出率）：ＦＳ（短縮率）；ＡｏＶ  ＳＶ（大動脈弁一回拍出量）；ＡｏＶ  ＣＯ（大動脈弁心拍出量）。
【図６Ａ】治療Ｍｃｋ突然変異体群においてはｒＡＡＶ−ＦＸＮ治療の２８日後となる時点の、雄および雌の対照マウス（丸）、雄および雌の治療突然変異マウス（四角）、ならびに雄および雌の未治療突然変異マウス（三角）における心臓機能を示すグラフである。マウスの３つの群全てについての、連続して数週間にわたる、すなわち、３週齢時（ｒＡＡＶ投与時）、５週齢時（ｒＡＡＶ投与の１４日後）、および７週齢時（ｒＡＡＶ投与の２８日後）における、心エコーによる左心室筋重量（ＬＶＭ）の評価を示す；５週齢時に治療を実施した。データは、１群当たり８匹のマウスの平均±標準誤差である。ｔ検定多重比較（シダック−ボンフェローニの方法）を使用して、Ｍｃｋ突然変異体マウスのデータをＭｃｋ陽性対照群と比較した。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｂ】治療Ｍｃｋ突然変異体群においてはｒＡＡＶ−ＦＸＮ治療の２８日後となる時点の、雄および雌の対照マウス（丸）、雄および雌の治療突然変異マウス（四角）、ならびに雄および雌の未治療突然変異マウス（三角）における心臓機能を示すグラフである。マウスの３つの群全てについての、連続して数週間にわたる、心エコーによる内径短縮率（ＳＦ）の評価を示す；５週齢時に治療を実施した。データは、１群当たり８匹のマウスの平均±標準誤差である。ｔ検定多重比較（シダック−ボンフェローニの方法）を使用して、Ｍｃｋ突然変異体マウスのデータをＭｃｋ陽性対照群と比較した。＊ｐ＜０．０５。
【図６Ｃ】治療Ｍｃｋ突然変異体群においてはｒＡＡＶ−ＦＸＮ治療の２８日後となる時点の、雄および雌の対照マウス（丸）、雄および雌の治療突然変異マウス（四角）、ならびに雄および雌の未治療突然変異マウス（三角）における心臓機能を示すグラフである。マウスの３つの群全てについての、連続して数週間にわたる、心エコーによる心拍出量の評価を示す；５週齢時に治療を実施した。データは、１群当たり８匹のマウスの平均±標準誤差である。ｔ検定多重比較（シダック−ボンフェローニの方法）を使用して、Ｍｃｋ突然変異体マウスのデータをＭｃｋ陽性対照群と比較した。＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用する科学技術用語は全て、本発明が属する技術に関わる当業者が一般に理解する意味を有する。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、そうした用語により、本発明を制限する意図はない。単数の形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、本発明および添付の特許請求の範囲の記載において使用する場合、そうでないことが文脈から明らかに示されない限り、複数の形も含むことが意図される。以下の用語は、ここに示す意味を有する。
【０１１１】
測定可能な値、例として、生物学的活性の量、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の長さ、ＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドの含有量、コドン適応指標、ＣｐＧジヌクレオチドの数、用量、時間、温度等を指す場合の用語「約」は、本明細書で使用する場合、特定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％の変動を、または０．１％の変動さえ包含することを意味する。
【０１１２】
用語「および／または」は、本明細書で使用する場合、列挙した関連する項目のうちの１つまたは複数のあらゆる可能な組合せを指し、包含することに加えて、二者択一の（「または」）として解釈される場合は組み合わされない項目も指し、包含する。
【０１１３】
ＡＡＶの「ｒｅｐ」遺伝子およびＡＡＶの「ｃａｐ」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製タンパク質およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐを、本明細書では、ＡＡＶの「パッケージング遺伝子」と呼ぶ。
【０１１４】
本開示により、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。「ＡＡＶ」は、アデノ随伴ウイルスの略語であり、それを使用して、ウイルス自体またはその誘導株を指すことができる。この用語は、全てのサブタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換えの形態の両方を、そうでないことが求められる場合を除いて網羅する。略語「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えアデノ随伴ウイルスはまた、組換えＡＡＶベクター（もしくは「ｒＡＡＶベクター」）とも、または単に、「ＡＡＶベクター」とも呼ばれる。用語「ＡＡＶ」は、例えば、多様な血清型のＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１型（ＡＡＶ−１）、ＡＡＶ２型（ＡＡＶ−２）、ＡＡＶ３型（ＡＡＶ−３）、ＡＡＶ４型（ＡＡＶ−４）、ＡＡＶ５型（ＡＡＶ−５）、ＡＡＶ６型（ＡＡＶ−６）、ＡＡＶ７型（ＡＡＶ−７）、ＡＡＶ８型（ＡＡＶ−８）、ＡＡＶ９型（ＡＡＶ−９）、ＡＡＶ１０型（ＡＡＶ−１０；ＡＡＶｒｈ１０を含む）、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ１２型（ＡＡＶ−１２）、トリのＡＡＶ、ウシのＡＡＶ、イヌのＡＡＶ、ウマのＡＡＶ、霊長類のＡＡＶ、非霊長類のＡＡＶ、およびヒツジのＡＡＶを含む。「霊長類のＡＡＶ」は、霊長類に感染するＡＡＶを指し、「非霊長類のＡＡＶ」は、非霊長類の哺乳動物に感染するＡＡＶを指し、「ウシのＡＡＶ」は、ウシの哺乳動物に感染するＡＡＶを指す、等である。
【０１１５】
ＡＡＶの多様な血清型は、数々の理由で魅力的であり、中でも最も重要な理由は、ＡＡＶは、非病原性であると考えられ、野生型ウイルスが、そのゲノムをヒト１９番染色体内に部位特異的に組み込むことができる点である（Ｌｉｎｄｅｎら、１９９６、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：１１２８８〜１１２９４）。ヒトゲノム内のＡＡＶの挿入部位は、ＡＡＶＳ１と呼ばれている。部位特異的な組込みは、ランダムな組込みとは対照的に、予測可能な長期の発現プロファイルが得られる可能性が高いと考えられている。
【０１１６】
ＡＡＶの多様な血清型のゲノム配列、ならびにネイティブの末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドのサブユニットの配列が、当技術分野で公知である。そのような配列を、文献、またはＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースに見出すことができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ−００２０７７（ＡＡＶ−１）、ＡＦ０６３４９７（ＡＡＶ−１）、ＮＣ−００１４０１（ＡＡＶ−２）、ＡＦ０４３３０３（ＡＡＶ−２）、ＮＣ−００１７２９（ＡＡＶ−３）、ＮＣ−００１８２９（ＡＡＶ−４）、Ｕ８９７９０（ＡＡＶ−４）、ＮＣ−００６１５２（ＡＡＶ−５）、ＡＦ５１３８５１（ＡＡＶ−７）、ＡＦ５１３８５２（ＡＡＶ−８）、およびＮＣ−００６２６１（ＡＡＶ−８）を参照されたい；これらの開示が、参照により本明細書に組み込まれている。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら、１９８３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：９３９；Ｘｉａｏら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら、１９９６、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅら、１９８６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏら、２００２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓら、２００４、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３：３７５〜３８３；国際特許公開ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；ＷＯ２０１３／０６３３７９；ＷＯ２０１４／１９４１３２；ＷＯ２０１５／１２１５０１、ならびに米国特許第６，１５６，３０３号および第７，９０６，１１１号も参照されたい。
【０１１７】
「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書で使用する場合、ＡＡＶを起源としないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶにとって異種のポリヌクレオチド）、典型的には、目的の配列、すなわち、細胞に遺伝子の形質転換を行うための配列を含むＡＡＶベクターを指す。いくつかの実施形態では、異種のポリヌクレオチドに、少なくとも１つ、時には２つのＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接し得る。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補性（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶのキャプシドタンパク質（典型的には、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質の全て）、およびキャプシドで包まれたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターから構成されるウイルス性の粒子を指す。粒子が、異種のポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶのゲノム以外のポリヌクレオチド、例として、哺乳動物細胞に送達しようとする導入遺伝子）を含む場合には、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶベクター」と呼ばれている。したがって必然的に、ｒＡＡＶ粒子の生成は、ｒＡＡＶベクターの生成を含み、したがって、ベクターは、ｒＡＡＶ粒子の内部に含有される。
【０１１８】
「組換え」は、本明細書で使用する場合、ベクター、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは細胞が生成物であって、自然界において見出される生成物とは明確に異なる構築物をもたらす、（例えば、その中に含まれるポリヌクレオチドもしくはポリペプチドに関する）クローニング、制限もしくはライゲーションのステップの多様な組合せおよび／またはその他の手順によりもたらされる、生成物であることを意味する。組換えのウイルスまたはベクターは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語はそれぞれ、元々のポリヌクレオチド構築物の複製物、および元々のウイルス構築物の子孫を含む。
【０１１９】
「ＡＡＶ  Ｒｅｐ」は、ＡＡＶの複製タンパク質およびそれらの類似体を意味する。
【０１２０】
「ＡＡＶ  Ｃａｐ」は、ＡＡＶのキャプシドタンパク質、すなわち、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、ならびにそれらの類似体を意味する。野生型のＡＡＶウイルスにおいては、３つのキャプシド遺伝子、すなわち、ｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３が、相互にオーバーラップする。ＧｒｉｅｇｅｒおよびＳａｍｕｌｓｋｉ、２００５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１５）：９９３３〜９９４４を参照されたい。単一のＰ４０プロモーターが、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３からそれぞれ、キャプシドタンパク質３つ全てを約１：１：１０の比で発現させ、これはｒＡＡＶの生成で補完される。組換えＡＡＶベクターを生成するためには、ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の比が、約１：１：１〜約１：１：１００の範囲、好ましくは、約１：１：２〜約１：１：５０の範囲、より好ましくは、約１：１：５〜約１：１：２０の範囲にあることが望まれる。ＶＰ１：ＶＰ２の所望の比は、１：１であるが、ＶＰ１：ＶＰ２の比の範囲は、１：５０から５０：１まで変化し得ると予想される。
【０１２１】
公知のＡＡＶの血清型のキャプシドの包括的なリストおよびアミノ酸配列のアラインメントが、Ｍａｒｓｉｃら、２０１４、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２（１１）：１９００〜１９０９により、とりわけｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｆｉｇｕｒｅ  １に提供されている。
【０１２２】
例示の目的で示すに過ぎないが、野生型ＡＡＶ２は、オーバーラップする配列を有する３つのタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）から構成される、ＡＡＶウイルスの正二十面体のキャプシドを少量（２０〜２５ｎｍ）含む（総数６０個のキャプシドタンパク質により、ＡＡＶのキャプシドが構成される）。このキャプシド中には、タンパク質、すなわち、ＶＰ１（７３５ａａ；Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ０３７８０）、ＶＰ２（５９８ａａ；Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ０３７７８）、およびＶＰ３（５３３ａａ；Ｇｅｎｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ０３７７９）が、１：１：１０の比で存在する。換言すれば、ＡＡＶの場合、ＶＰ１は、完全長のタンパク質であり、ＶＰ２およびＶＰ３は、ＶＰ１の漸進的に短縮されたバージョンであり、Ｎ末端のトランケーションが、ＶＰ１と比べて増加している。
【０１２３】
「ＡＡＶのＴＲ」は、ＡＡＶゲノムの末端の、またはＡＡＶゲノムの末端付近の、ほとんど相補的な、対称的に並ぶ配列を含む、回文構造の末端反復配列を意味し、ネイティブのＡＡＶのＴＲの類似体およびそれらの類似体を含む。
【０１２４】
「シス−モチーフ」は、保存されている配列、例として、ゲノム配列の末端に、またはゲノム配列の末端に近いところで見出され、複製の開始のために認識される配列；転写開始、スプライシングまたは終止のために使用される可能性が高い、内部の位置にある潜在プロモーターまたは潜在配列を含む。
【０１２５】
「治療する」または「治療」は、そのような用語が適用される障害もしくは状態の進行の逆転、緩和もしくは阻害、またはそのような障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の逆転、緩和もしくは阻害を意味する。
【０１２６】
「治療有効量」は、治療の利益を対象にもたらすのに必要である、活性な薬剤の最低限の量を意味する。例えば、患者にとっての「治療有効量」は、ある障害に関連するかまたはそうした障害に屈することに対する抵抗性に関連する、病的な症状、疾患の進行または生理学的状態に関して、寛解、安定化、進行の遅延を誘発する、寛解させる、安定化させる、進行を遅延させるかまたは別の点で改善させるような量である。
【０１２７】
「遺伝子」は、転写および翻訳後に特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることが可能な少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを意味する。
【０１２８】
「コード配列」は、特定のタンパク質をコードする配列を意味し、または「コード核酸」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、（作動可能に連結されている）適切な調節配列の制御下に置かれている場合に、転写され（ＤＮＡの場合）、翻訳され（ｍＲＮＡの場合）て、ポリペプチドをもたらす核酸配列を意味する。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンにより決定される。コード配列として、これらに限定されないが、原核生物または真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列を、さらに、合成のＤＮＡ配列も挙げることができる。
【０１２９】
「キメラ」は、ウイルスのキャプシドまたは粒子に関しては、開示の全体が参照により本明細書に組み込まれているＲａｂｉｎｏｗｉｔｚら、米国特許第６，４９１，９０７号に記載されているように、キャプシドまたは粒子が、種々のパルボウイルス、好ましくは、ＡＡＶの種々の血清型に由来する配列を含むことを意味する。また、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（９）：４４２１〜４４３２も参照されたい。ウイルスの特に好ましいキメラのキャプシドは、ＡＡＶ２．５のキャプシドであり、これは、以下の突然変異、すなわち、２６３位におけるＱからＡへの突然変異；２６５位におけるＴの挿入の突然変異；７０５位におけるＮからＡへの突然変異；７０８位におけるＶからＡへの突然変異；および７１６位におけるＴからＮへの突然変異を伴うＡＡＶ２のキャプシドの配列を有する。この場合、そのようなキャプシドをコードするヌクレオチド配列を、配列番号１５に定義し、このことは、ＷＯ２００６／０６６０６６に記載されている。その他の好ましいキメラのＡＡＶとして、これらに限定されないが、ＷＯ２０１０／０９３７８４に記載されているＡＡＶ２ｉ８、ＷＯ２０１４／１４４２２９に記載されているＡＡＶ２Ｇ９およびＡＡＶ８Ｇ９、ならびにＡＡＶ９．４５（Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、２０１１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９（６）：１０７０〜１０７８）が挙げられる。
【０１３０】
その他のエレメントに隣接する配列という場合の「隣接」は、１つまたは複数の隣接するエレメントが、配列に関して上流および／または下流、すなわち、５’および／または３’に存在することを示す。用語「隣接」は、配列が隣に連なることを示すことを必ずしも意図しない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸と隣接するエレメントとの間に介在配列がある場合がある。２つのその他のエレメント（例えば、ＴＲ）に「隣接」する配列（例えば、導入遺伝子）は、一方のエレメントが配列の５’に位置し、他方のエレメントが配列の３’に位置することを示す；しかし、それらの間に介在配列がある場合がある。
【０１３１】
「ポリヌクレオチド」は、リン酸ジエステル連結により接続するヌクレオチド配列を意味する。本明細書では、ポリヌクレオチドを、５’から３’へ向かう方向で示す。本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子またはリボ核酸（ＲＮＡ）分子であり得る。ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である場合には、その分子は、遺伝子またはｃＤＮＡ分子であり得る。本明細書では、ヌクレオチド塩基を、単一文字コード、すなわち、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、イノシン（Ｉ）およびウラシル（Ｕ）により示す。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の標準的な技法を使用して調製することができる。
【０１３２】
ウイルスによる細胞の「形質導入」は、ウイルス粒子から細胞への核酸の移入があることを意味する。
【０１３３】
「改変されたＦＸＮ遺伝子」は、ＦＸＮ（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）をコードする改変された核酸であって、ＦＸＮをコードする野生型核酸（例えば、配列番号２）と比較して少なくとも１つの改変を有する核酸を意味し、この場合、改変として、これらに限定されないが、増加したＧＣ含有量；減少したＧＣ含有量；または低下したＣｐＧ含有量を有するＦＸＮ遺伝子が挙げられる。好ましくは、改変されたＦＸＮ遺伝子が、タンパク質の発現の改善を示し、例えば、そのようにコードされたタンパク質が細胞中で、野生型遺伝子がこれ以外には同一の細胞中でもたらすタンパク質の発現レベルと比較して、検出可能により高いレベルで発現される。
【０１３４】
細胞の「トランスフェクション」は、細胞を遺伝子に関して改変するために、遺伝子材料を細胞内に導入することを意味する。トランスフェクションは、当技術分野で公知の多様な手段、例として、リン酸カルシウム、ポリエチレンイミン、電気穿孔等により行うことができる。
【０１３５】
別段の記載がない限り、「ポリペプチド」は、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
【０１３６】
「遺伝子移入」または「遺伝子送達」は、外来ＤＮＡを宿主細胞内に確実に挿入するための方法またはシステムを指す。そのような方法により、移入された、組み込まれていないＤＮＡの一過性の発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の染色体外での複製および発現、または移入される遺伝子材料の、宿主細胞のゲノムＤＮＡ内への組込みを得ることができる。
【０１３７】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、交換可能に使用し、外因性の核酸が導入されている細胞を指し、これらの用語には、そのような細胞の子孫も含まれる。宿主細胞は、「形質転換体」、「形質転換細胞」および「形質導入細胞」を含む、これらには、形質転換された初代の細胞、および継代の数を問わず、それに由来する子孫が含まれる。
【０１３８】
標的細胞中での発現を含めた、標的細胞への送達のために、ウイルスベクターを含めた、ベクター中に組み込む任意の異種のヌクレオチド配列、およびそれに関連する発現を制御する配列、例として、プロモーターを意味するために、「導入遺伝子」を使用する（標的細胞は、本明細書ではまた、「宿主細胞」とも呼ぶ）。発現を制御する配列は、標的細胞中で導入遺伝子の発現を促進する能力に基づいて選択されると予想されることを当業者は理解している。導入遺伝子の例は、治療用ポリペプチドをコードする核酸である。
【０１３９】
「ベクター」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞内に送達しようとするポリヌクレオチドを含む、組換えのプラスミドまたはウイルスを意味する。
【０１４０】
核酸またはその断片を指す場合の「実質的相同性」または「実質的類似性」は、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を、別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列させる場合に、配列の少なくとも約９５〜９９％に、ヌクレオチド配列の同一性があることを示すことを意味する。
【０１４１】
「組換えウイルスベクター」は、１つまたは複数の異種配列（すなわち、ウイルスを起源としないポリヌクレオチド配列）を含む組換えポリヌクレオチドのベクターを意味する。組換えパルボウイルスのベクターの場合には、組換えポリヌクレオチドに、少なくとも１つ、好ましくは、２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。
【０１４２】
ペプチドに関して使用する「相同」は、２つのペプチド間のアミノ酸配列の類似性を指す。それらのペプチドの両方におけるアミノ酸の位置を、同一のアミノ酸が占める場合に、ペプチドは、その位置において相同である。したがって、「実質的に相同」により、アミノ酸配列であって、その全体ではないが、大部分が相同であり、その配列が相同である配列の活性のほとんどまたは全部を保持するアミノ酸配列を意味する。「実質的に相同」は、本明細書で使用する場合、配列が、参照ペプチドに対して、少なくとも５０％同一であり、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、９５％相同であることを意味する。ペプチドが、未改変のペプチドと実質的に同じ活性または機能を示す限り、ペプチド配列の追加の改変も含まれ、それらの例として、本明細書に開示する配列の軽微な変異形、欠失、置換、またはアミノ酸配列の誘導体化が挙げられる。アミノ酸の誘導体として、これらに限定されないが、トリフルオロロイシン、ヘキサフルオロロイシン、５，５，５−トリフルオロイソロイシン、４，４，４−トリフルオロバリン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｏ−フルオロチロシン、ｍ−フルオロチロシン、２，３−ジフルオロチロシン、４−フルオロヒスチジン、２−フルオロヒスチジン、２，４−ジフルオロヒスチジン、フルオロプロリン、ジフルオロプロリン、４−ヒドロキシプロリン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、セレノシステイン、セレナトリプトファン、４−アミノトリプトファン、５−アミノトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、７−アザトリプトファン、４−フルオロトリプトファン、５−フルオロトリプトファン、６−フルオロトリプトファン、ホモアリルグリシン、ホモプロパルギルグリシン、２−ブチニルグリシン、ｃｉｓ−クロチルグリシン、アリルグリシン、デヒドロロイシン、デヒドロプロリン、２−アミノ−３−メチル−４−ペンテン酸、アジドホモアラニン、アジドアラニン、アジドノルロイシン、ｐ−エチニルフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、およびベンゾフラニルアラニンを挙げることができる。とりわけ、改変されたペプチドは、未改変のペプチドと関連がある活性または機能を保持すると予想される；改変されたペプチドは一般に、未改変の配列のアミノ酸配列と「実質的に相同」であるアミノ酸配列を有すると予想される。
【０１４３】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して、特定のパーセントの「配列同一性」を有し、このことは、それら２つの配列を比較する場合に、整列させると、塩基またはアミノ酸が、そうしたパーセントで同じであることを意味する。配列類似性は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するためには、ワールドワイドウェブ上で、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において利用可能なＢＬＡＳＴを含めた、方法およびコンピュータプログラムを使用して、配列を整列させることができる。別の整列アルゴリズムは、ＦＡＳＴＡであり、これは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、米国で利用可能である。整列を行うためのその他の技法が、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６）Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。特に興味深いのは、配列中のギャップを許容する整列プログラムである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎが、配列アラインメント中のギャップを許容するアルゴリズムの１つのタイプである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３〜１８７（１９９７）を参照されたい。また、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアラインメントの方法を使用するＧＡＰプログラムを利用して、配列を整列させることもできる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０）を参照されたい。
【０１４４】
興味深いのは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局地的相同性アルゴリズム（１９８１、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２〜４８９）を使用して、配列同一性を決定するＢｅｓｔＦｉｔプログラムである。ギャップ生成ペナルティーは、一般に１〜５、通常２〜４の範囲であり、多くの実施形態では３と予想される。ギャップ伸長ペナルティーは、一般に約０．０１〜０．２０の範囲であり、多くの事例では０．１０と予想される。このプログラムは、比較しようとしてインプットする配列により決定されるデフォルトパラメータを有する。好ましくは、プログラムにより決定されるデフォルトパラメータを使用して、配列同一性を決定する。また、このプログラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国から利用可能である。
【０１４５】
興味深い別のプログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．１２７〜１４９、１９８８、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【０１４６】
ＦａｓｔＤＢにより、以下のパラメータ、すなわち、ミスマッチペナルティー：１．００；ギャップペナルティー：１．００；ギャップサイズペナルティー：０．３３；および連結ペナルティー：３０．０に基づいて、パーセント配列同一性が計算される。
【０１４７】
本発明は、改変されたＦＸＮ遺伝子を提供する。本発明はまた、核酸構築物、例として、ベクターも提供し、これらは、それらの配列の部分として、改変されたＦＸＮ遺伝子、例えば、野生型ＦＸＮ遺伝子配列と比較してＧＣヌクレオチドのより高いもしくはより低い量を含む、ＧＣ含有量最適化ＦＸＮ遺伝子配列、および／または野生型ＦＸＮ遺伝子中に存在するＣｐＧジヌクレオチドのレベルと比較してＣｐＧジヌクレオチドのレベルを低下させている、ＦＸＮ遺伝子配列を含む。例えば、本発明は、改変されたＦＸＮ配列を、その他のエレメント、例として、調節エレメントと一緒に含むプラスミドおよび／またはその他のベクターを含む。さらに、本発明は、改変されたＦＸＮ配列を含む、パッケージングされた遺伝子送達ビヒクル、例として、ウイルスのキャプシドも提供する。本発明はまた、改変されたＦＸＮ遺伝子を送達する方法、好ましくは、細胞内に、改変された配列を、細胞中での発現を促進するのに必要なエレメントと一緒に送達することによって、改変されたＦＸＮ遺伝子を発現する方法も含む。本発明はまた、遺伝子療法を行う方法も提供し、この場合、改変されたＦＸＮ遺伝子の配列を、例えば、ベクターの構成成分として、および／またはウイルス遺伝子送達ビヒクルの構成成分としてパッケージングして、対象に投与する。例えば、フラタキシンのレベルを対象において増加させ、フラタキシンの欠乏の治療を対象において行うように、治療は作用し得る。本発明のこれらの態様のそれぞれについて、以下のセクションでさらに論じる。
【０１４８】
フラタキシンの発現のための改変された核酸
本発明は、フラタキシンをコードする改変されたヌクレオチド配列を提供する。改変されたヌクレオチド配列は、１つまたは複数の改変を含む、野生型またはネイティブのＦＸＮ遺伝子の配列を含む。
【０１４９】
一態様では、改変された核酸配列は、細胞中でのフラタキシンの発現を、これ以外には同一の細胞中での配列番号２の野生型の核酸配列からのフラタキシンの発現と比較して、検出可能により高いレベルでもたらす。このことを、「発現最適化」核酸もしくは「発現増強」核酸、または単に、「改変された核酸」と呼ぶことができる。
【０１５０】
本明細書では、「最適化」または「コドン最適化」は、交換可能な表現であり、野生型コード配列（例えば、フラタキシンをコードする配列）と比べて、コード配列の発現を増加させるように最適化されているコード配列を指し、最適化は、例えば、稀なコドンの使用を最小限に留めること、ＣｐＧジヌクレオチドの数を減少させること、潜在的なスプライスドナーまたはスプライスアクセプターの部位を除去すること、コザック配列を除去すること、リボゾーム進入部位を除去すること等によって行われる。
【０１５１】
改変の例として、１つまたは複数のシス作用性モチーフの排除、および１つまたは複数のコザック配列の導入が挙げられる。一実施形態では、１つまたは複数のシス作用性モチーフを排除し、１つまたは複数のコザック配列を導入する。
【０１５２】
排除することができるシス作用性モチーフの例として、内部のＴＡＴＡボックス；カイ部位；リボゾーム進入部位；ＡＲＥ、ＩＮＳおよび／またはＣＲＳ配列エレメント；反復配列および／またはＲＮＡ二次構造；（潜在的な）スプライスドナー部位および／またはスプライスアクセプター部位、分枝点；ならびにＳａｌＩが挙げられる。
【０１５３】
一実施形態では、ＧＣ含有量（例えば、核酸配列中に存在するＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドの数）を、配列番号２の野生型ＦＸＮ遺伝子配列と比べて増強する。ＧＣ含有量は、野生型遺伝子（配列番号２）よりも、好ましくは、少なくとも５％、より好ましくは、少なくとも６％、その上より好ましくは、少なくとも７％、さらにより好ましくは、少なくとも８％、より好ましくは、少なくとも９％、さらにより好ましくは、少なくとも１０％、その上より好ましくは、少なくとも１２％、さらにより好ましくは、少なくとも１４％、その上より好ましくは、少なくとも１５％、より好ましくは、少なくとも１７％、さらにより好ましくは、少なくとも２０％、その上さらに好ましくは、少なくとも３０％、その上より好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、さらにより好ましくは、少なくとも６０％、最も好ましくは、少なくとも７０％多い。
【０１５４】
別の実施形態では、ＧＣ含有量を、配列中のＧ（グアニン）ヌクレオチドおよびＣ（シトシン）ヌクレオチドのパーセントとして表す。換言すると、フラタキシン（配列番号１）をコードする野生型核酸のＧＣ含有量は、約５５％であり、一方、本発明の代表的な改変されたＦＸＮ遺伝子のＧＣ含有量の範囲は、ＩＤＴ−３（配列番号８）の約５７％、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（配列番号６）の５７％、ＧｅｎｅＡｒｔ（配列番号５）の６１％、およびＪＣＡＴ（配列番号４）の６９％に及ぶ。したがって、本発明の改変された核酸は、少なくとも５７％のＧＣ含有量、より好ましくは、少なくとも６１％のＧＣ含有量、さらにより好ましくは、少なくとも６９％のＧＣ含有量を含み、それと比較して、配列番号２に記載の、フラタキシンをコードする野生型の核酸配列のＧＣ含有量は、約５５％である。
【０１５５】
一実施形態では、本発明の改変された核酸のＧＣ含有量は、配列番号２の核酸配列を含む、フラタキシンをコードする野生型核酸のＧＣ含有量よりも多い。当業者であれば、核酸コードの縮重を認識しており、タンパク質をコードする核酸の配列に関わらず、そこから発現するフラタキシンのアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列であることを理解していると予想される。
【０１５６】
一実施形態では、ＦＸＮをコードする本発明の改変された核酸のＧＣ含有量は、野生型ＦＮＸ遺伝子（配列番号２）のＧＣ含有量とほぼ同じ、すなわち、５５％である。
【０１５７】
さらに、フラタキシンをコードする改変された核酸（すなわち、改変されたＦＸＮ遺伝子）のコドン適応指標は、好ましくは、少なくとも０．７４、好ましくは、少なくとも０．７６、さらにより好ましくは、少なくとも０．７７、その上より好ましくは、少なくとも０．８０、好ましくは、少なくとも０．８５、より好ましくは、少なくとも０．８６、その上より好ましくは、少なくとも０．８７、さらにより好ましくは、少なくとも０．９０、その上より好ましくは、少なくとも０．９５、最も好ましくは、少なくとも０．９８である。
【０１５８】
別の実施形態では、改変されたＦＸＮ配列は、ＦＸＮをコードする野生型の核酸配列（例えば、配列番号２）と比較して、低下したレベルのＣｐＧジヌクレオチドを有し、約１０％、２０％、３０％、５０％以上の低下を示す。
【０１５９】
真核生物において、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が、遺伝子発現の調節における重要な役割を果たすことは公知である。具体的には、真核生物におけるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化は本質的に、転写機構を妨げることによって、遺伝子発現のサイレンシングを行うように働く。したがって、ＣｐＧモチーフのメチル化により、遺伝子サイレンシングが誘起されることに起因して、低下した数のＣｐＧジヌクレオチドを有する本発明の核酸およびベクターは、導入遺伝子の高くかつ持続性の発現レベルをもたらすと予想される。
【０１６０】
一実施形態では、改変されたＦＸＮ遺伝子は、野生型ＦＸＮ遺伝子よりも少ない、すなわち、１２８個未満の潜在的なＣｐＧアイランド領域を含む。好ましくは、改変されたＦＸＮ遺伝子は、約１２４個の潜在的なＣｐＧアイランド領域、より好ましくは、約１２３個、さらにより好ましくは、約１１７個、より好ましくは、約１１４個の潜在的なＣｐＧアイランド領域を含む。
【０１６１】
また、改変されたＦＸＮ遺伝子の配列は、隣接する制限部位を含んで、発現ベクター内へのサブクローニングを促進することもできる。多くのそのような制限部位が、当技術分野で周知であり、それらとして、これらに限定されないが、図２Ａ〜図２Ｆに示すもの、および図３に示すもの（ｓｃＡＡＶのプラスミドベクター：ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＥＧＦＰ−ＢＧＨのプラスミドマップ）、ならびに表８（配列番号１９〜２３）に示すもの、例として、ＡｇｅＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳｐｅＩおよびＭｌｕＩが挙げられる。
【０１６２】
本発明はまた、配列番号３〜９の配列のいずれか１つの断片も含み、これらは、フラタキシンの機能的に活性な断片をコードする。「機能的に活性なフラタキシン」または「機能性のフラタキシン」は、断片が、完全長のフラタキシンと同じまたは類似の生物学的活性をもたらすことを示す。換言すると、断片は、同じ活性をもたらし、そうした活性として、これらに限定されないが、Ｆｅ−Ｓクラスターの一次性の欠損を矯正する活性、ミトコンドリアにおける鉄の蓄積（Ｐｕｃｃｉｏら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２７：１８１〜１８６；Ｓｅｚｎｅｃら、２００４、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：１０１７〜１０２４）、およびＰｅｒｄｏｍｉｎｉら、２０１４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２０（５）：５４２〜５４７に論じられているその他の欠乏を減少させる活性が挙げられる。また、ＦＸＮまたはその機能性断片の生物学的活性は、本明細書の他の箇所でＭｃｋマウスにおいて示す、ＦＲＤＡと関連がある心臓の表現型を逆転させるかまたは予防する活性も包含する。
【０１６３】
本発明は、改変されたＦＸＮ遺伝子の配列および多様な調節または制御エレメントを含む核酸ベクターを含む。遺伝子発現にとって有用な調節エレメントの正確な性質は、生物によっても細胞型によっても変化すると予想される。一般に、調節エレメントには、目的の細胞中でＲＮＡの転写の開始を導くプロモーターが含まれる。プロモーターは、構成的または調節的であり得る。構成的プロモーターは、作動可能に連結している遺伝子を本質的に常時発現させるプロモーターである。調節的プロモーターは、活性化または活性解除が可能であるプロモーターである。調節的プロモーターは、通常は「オフ」状態であるが、誘導して、「オン」状態になすことができる誘導性プロモーター、および通常は「オン」状態であるが、「オフ」状態になすことができる「抑制性」プロモーターを含む。多くの異なる調節因子が公知であり、これらには、温度、ホルモン、サイトカイン、重金属および調節タンパク質が含まれる。区別は絶対的なものではなく、構成的プロモーターはしばしば、ある程度調節的であり得る。場合によっては、内在性の経路を利用して、例えば、病的な状態が改善すると、自然に下方制御されるプロモーターを使用して、導入遺伝子の発現を調節することもできる。
【０１６４】
適切なプロモーターの例として、アデノウイルスのプロモーター、例として、アデノウイルスの主要後期プロモーター；異種のプロモーター、例として、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター；呼吸器多核体ウイルスのプロモーター；ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター；アルブミンのプロモーター；誘導性プロモーター、例として、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）のプロモーター；メタロチオネインのプロモーター；熱ショックプロモーター；α−１−アンチトリプシンのプロモーター；Ｂ型肝炎表面抗原のプロモーター；トランスフェリンのプロモーター；アポリポタンパク質Ａ−１のプロモーター；ニワトリのベータ−アクチン（ＣＢＡ）のプロモーター、ＣＢｈプロモーター（配列番号２５）、ならびにＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスの早期エンハンサーエレメントと、ニワトリのベータ−アクチン遺伝子のプロモーター、第１エクソンおよび第１イントロンと、ウサギのベータ−グロビン遺伝子のスプライスアクセプター）（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら、２００８、ＢｉｏＭｅｄ．Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：２）、さらに、ヒトのＦＸＮプロモーターが挙げられる。プロモーターは、組織に特異的なプロモーター、例として、肝臓細胞中で活性を示す、マウスのアルブミンのプロモーター、およびトランスサイレチンのプロモーター（ＴＴＲ）である場合がある。
【０１６５】
別の態様では、ＦＸＮをコードする改変された核酸は、ＦＸＮタンパク質の発現を増加させるために、エンハンサーをさらに含む。多くのエンハンサーが当技術分野で公知であり、それらとして、これに限定されないが、サイトメガロウイルスの主要最初期エンハンサーが挙げられる。より具体的には、ＣＭＶのＭＩＥプロモーターは、３つの領域、すなわち、モジュレーター、ユニークな領域およびエンハンサーを含む（ＩｓｏｍｕｒａおよびＳｔｉｎｓｋｉ、２００３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（６）：３６０２〜３６１４）。ＣＭＶのエンハンサー領域を、その他のプロモーターまたはそれらの一部と組み合わせて、ハイブリッドのプロモーターを形成し、それに作動可能に連結している核酸の発現をさらに増加させることができる。例えば、Ｇｒａｙら（２０１１、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：１１４３〜１１５３）に記載されているように、ニワトリのベータ−アクチン（ＣＢＡ）のプロモーターまたはその一部を、ＣＭＶのプロモーター／エンハンサーまたはその一部と組み合わせて、「ＣＢｈ」プロモーターと呼ばれている、ＣＢＡのバージョンを作製することができ、ＣＢｈは、ニワトリのベータ−アクチンのハイブリッドのプロモーター（ｃｈｉｃｋｅｎ  ｂｅｔａ−ａｃｔｉｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の略である。
【０１６６】
さらに、制御エレメントは、コラーゲン安定化配列（ＣＳＳ）、終止コドン、終結配列、および真核生物のｍＲＮＡの３’末端へのポリ−アデノシンの「テール」の効率的な付加を推進するためのポリ−アデニル化シグナル配列、例として、これに限定されないが、ウシ成長ホルモンのポリＡシグナル配列（ｂＧＨポリＡ）も含むことができる（例えば、ＧｏｏｄｗｉｎおよびＲｏｔｔｍａｎ、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（２３）：１６３３０〜１６３３４を参照されたい）。
【０１６７】
非ウイルス性のベクター
特定の実施形態では、本発明による使用するベクターは、非ウイルス性のベクターである。典型的には、非ウイルス性のベクターは、改変されたＦＸＮ遺伝子またはそのバリアントを示す核酸配列を含むプラスミドであり得る。
【０１６８】
改変されたＦＸＮ配列のパッケージング
改変されたＦＸＮ遺伝子の配列はまた、パッケージングされたウイルスベクターの構成成分としても提供することができる。一般に、パッケージングされたウイルスベクターは、キャプシド中にパッケージングされているウイルスベクターを含む。ウイルスベクターおよびウイルスのキャプシドについては、以下のセクションで論じる。ｒＡＡＶベクター中にパッケージングする核酸は、一本鎖（ｓｓ）、自己相補性（ｓｃ）または二本鎖（ｄｓ）であり得る。
【０１６９】
ウイルスベクター
典型的には、導入遺伝子を担持するウイルスベクターを、導入遺伝子をコードするポリヌクレオチド、適切な調節エレメント、および細胞への形質導入を媒介するウイルスタンパク質を生成するのに必要なエレメントからアセンブルする。ウイルスベクターの例として、これらに限定されないが、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクターが挙げられる。
【０１７０】
本発明の方法による生成するパッケージングされたウイルスベクターのウイルスベクター構成成分は、少なくとも１つの導入遺伝子、例えば、改変されたＦＸＮ遺伝子の配列、および改変されたＦＸＮ遺伝子の配列の発現を制御するための、関連する発現制御配列を含む。
【０１７１】
好ましい実施形態では、ウイルスベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失しており、かつ／または改変されたＦＸＮ遺伝子の配列により交換されている、パルボウイルスのゲノム、例として、ＡＡＶのゲノムの一部、ならびにそれに関連する発現制御配列を含む。典型的には、改変されたＦＸＮ遺伝子の配列は、ウイルスのｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質をコードする核酸の代わりに、ＡＡＶのＴＲまたはウイルスの複製に適切なＴＲエレメント１つまたは２つに近接させて（すなわち、隣接させて）挿入される（Ｘｉａｏら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（２）：９４１〜９４８）。改変されたＦＸＮ遺伝子の配列が標的細胞中で組織特異的に発現するのを促進する点で、使用するのに適切なその他の調節配列もまた含めることができる。
【０１７２】
当業者であれば、導入遺伝子を含み、ウイルスの複製に必要であるウイルスタンパク質（例えば、ｃａｐおよびｒｅｐ）を欠くＡＡＶベクターは複製することができないことを理解していると予想される；その理由は、そのようなタンパク質は、ウイルスの複製およびパッケージングに必要であるからである。さらに、ＡＡＶは、ディペンドウイルスでもあり、これは、ヘルパーウイルスの細胞への同時感染なしでは、ＡＶＶは細胞中で複製することができないからである。ヘルパーウイルスは典型的には、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスを含む。代わりに、下記で論じるように、多様なヘルパーエレメントをコードする１つもしくは複数の核酸を細胞にトランスフェクトすることによることを含めて、ヘルパー機能（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡ  ＲＮＡ）を、パッケージング細胞に提供することができ、かつ／または細胞が、ヘルパータンパク質をコードする核酸を含む場合もある。例えば、ヒト細胞を、アデノウイルス５のＤＮＡを用いて形質転換することによって、ＨＥＫ２９３が生成され、ＨＥＫ２９３は現在、これらに限定されないが、Ｅ１およびＥ３含めた、いくつかのアデノウイルスの遺伝子を発現する（例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７７、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２を参照されたい）。したがって、ＨＥＫ２９のパッケージング細胞は、それらのヘルパー機能を提供することができ、そうした機能を、例えば、それらの機能をコードするプラスミドにより、細胞に供給する必要はない。
【０１７３】
ウイルスベクターは、任意の適切な核酸構築物、例として、ＤＮＡまたはＲＮＡの構築物であり得、一本鎖、二本鎖または二重鎖（すなわち、ＷＯ２００１／９２５５１に記載されているように、自己相補性）であってよい。
【０１７４】
ｒＡＡＶベクターは、「スタッファー」配列または「フィラー」配列（フィラー／スタッファー）をさらに含むことができ、この場合、ＡＡＶのキャプシド内へ核酸を最適にパッケージングするためには、導入遺伝子を含む核酸は、およそ４．１〜４．９ｋｂ未満のサイズであることを、当業者であれば理解していると予想される。ＧｒｉｅｇｅｒおよびＳａｍｕｌｓｋｉ、２００５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１５）：９９３３〜９９４４を参照されたい。換言すると、ＡＡＶベクターは典型的には、一般に、約４ｋｂ〜約５．２ｋｂであるか、または若干より大きい、定義されたサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入を受容する。したがって、より短い配列の場合、ウイルス粒子内にＡＡＶベクターをパッケージングするのに許容できる、ウイルスのゲノム配列の正常なサイズ付近またはそうしたサイズに長さを調節するために、挿入断片中に、フィラー／スタッファーを含める。多様な実施形態では、フィラー／スタッファーの核酸配列は、核酸の非翻訳（タンパク質をコードしない）セグメントである。ｒＡＡＶベクターの特定の実施形態では、異種のポリヌクレオチド配列は、４．７未満Ｋｂの長さを有し、フィラー／スタッファーのポリヌクレオチド配列は、異種のポリヌクレオチド配列と組み合わせる（例えば、ベクター中に挿入される）と、約３．０〜５．５Ｋｂの間、または約４．０〜５．０Ｋｂの間、または約４．３〜４．８Ｋｂの間の全長を有する長さを有する。
【０１７５】
ウイルス粒子内にＡＡＶベクターをパッケージングするための長さを得るために、イントロンはまた、フィラー／スタッファーのポリヌクレオチド配列としても機能し得る。フィラー／スタッファーのポリヌクレオチド配列として機能するイントロンおよびイントロンの断片はまた、発現を増強することもできる。例えば、イントロンのエレメントを含めることによって、イントロンのエレメントが存在しない場合の発現と比較して、発現を増強することができる（Ｋｕｒａｃｈｉら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５２７６〜５２８１）。さらに、フィラー／スタッファーのポリヌクレオチド配列も、当技術分野で周知であり、それらの配列として、これらに限定されないが、ＷＯ２０１４／１４４４８６に記載するものが挙げられる。
【０１７６】
ウイルスのキャプシド
パッケージングされたウイルスベクターのウイルスのキャプシド構成成分は、パルボウイルスのキャプシドであり得る。ＡＡＶのＣａｐおよびキメラのキャプシドが好ましい。パルボウイルスの適切なキャプシド構成成分の例が、パルボウイルス科、例として、自律的パルボウイルスまたはディペンドウイルスに由来するキャプシド構成成分である。例えば、ウイルスのキャプシドは、ＡＡＶのキャプシド（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４−１（ＷＯ２０１５／０１３３１３の配列番号５）、ＡＡＶ２−ＴＴ、ＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ−Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ヘビのＡＡＶ、トリのＡＡＶ、ウシのＡＡＶ、イヌのＡＡＶ、ウマのＡＡＶ、ヒツジのＡＡＶ、ヤギのＡＡＶ、エビのＡＡＶ、および現在公知のまたは後に発見される任意のその他のＡＡＶであり得る。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、ｖｏｌｕｍｅ  ２、ｃｈａｐｔｅｒ  ６９（４ｔｈ  ｅｄ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。キャプシドは、米国特許第７，９０６，１１１号；Ｇａｏら、２００４、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１；Ｍｏｒｉｓら、２００４、Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５；ＷＯ２０１３／０６３３７９；ＷＯ２０１４／１９４１３２に開示されている、ＡＡＶのいくつかの血清型に由来し得、ＷＯ２０１５／１２１５０１に開示されている真性タイプのＡＡＶ（ＡＡＶ−ＴＴ）のバリアント、ならびにＷＯ２０１５／０１３３１３に開示されているＲＨＭ４−１、ＲＨＭ１５−１〜ＲＨＭ１５−６およびそれらのバリアントを含むことができ、当業者であれば、同じまたは類似の機能を有する、まだ同定されていないその他のバリアントがある可能性が高いことを認識していると予想され、２つ以上のＡＡＶキャプシドに由来する構成成分を含めることもできる。ＡＡＶのＣａｐタンパク質の完全な相補体は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む。ＡＡＶのＶＰキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、完全な相補体よりも少ない、ＡＡＶのＣａｐタンパク質を含んでもよく、またはＡＡＶのＣａｐタンパク質の完全な相補体をもたらしてもよい。
【０１７７】
開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、米国特許６，４９１，９０７に記載されているように、ＡＡＶのＣａｐタンパク質の１つまたは複数が、２つ以上のウイルス、好ましくは、２つ以上のＡＡＶに由来するＡＡＶのＣａｐのアミノ酸配列を含む、キメラのタンパク質である場合がある。例えば、ウイルスのキメラのキャプシドは、ＡＡＶ１のＣａｐタンパク質またはサブユニット、およびＡＡＶ２のＣａｐまたはサブユニットの少なくとも１つを含むことができる。キメラのキャプシドは、例えば、ＡＡＶのキャプシドを、１つまたは複数のＢ１９のＣａｐサブユニットを伴って含むことができ、例えば、ＡＡＶのＣａｐタンパク質またはサブユニットを、Ｂ１９のＣａｐタンパク質またはサブユニットで交換することができる。例えば、好ましい実施形態では、ＡＡＶのキャプシドのＶｐ３サブユニットを、Ｂ１９のＶＰ２サブユニットで交換することができる。
【０１７８】
別の実施形態は、合成された、キメラのウイルスの株を含み、これらの株は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８等に由来するＡＡＶ骨格の組合せを、ＡＡＶ９に由来するガラクトース（Ｇａｌ）結合性フットプリントと共に含む。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヘルパー依存性のパルボウイルスであり、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ガラクトース（Ｇａｌ）またはシアル酸（Ｓｉａ）を、細胞表面に結合するための主要な受容体として活用する。例えば、ＡＡＶの血清２型および３ｂ型は、ＨＳを利用する。ＡＡＶ１、ＡＡＶ４およびＡＡＶ５は、Ｓｉａに異なる連結特異性で結合し、ＡＡＶの血清６型は、ＳｉａおよびＨＳの両方を認識し、一方、ＡＡＶ９は、Ｇａｌを活用して、宿主細胞に付着する。具体的には、ＡＡＶ９に由来するガラクトース（Ｇａｌ）結合性フットプリントを、ヘパリン硫酸結合性の、ＡＡＶの血清２型上にグラフトし、オルソゴナルなグリカン結合性フットプリントの単なるグラフト化により、形質導入の効率を改善する。ＡＡＶ９に由来するＧａｌ結合性フットプリントを、ＡＡＶ２のＶＰ３骨格、またはキメラＡＡＶ２ｉ８キャプシドの鋳型内に、構造アラインメントおよび部位特異的変異誘発を使用して組み込むことによって、新しい、二重グリカン結合性の株（ＡＡＶ２Ｇ９）、およびキメラの、筋肉指向性の株（ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９）を生成した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合アッセイおよび形質導入アッセイにより、ＡＡＶ２Ｇ９が、細胞に進入するために、ＨＳ受容体およびＧａｌ受容体の両方を活用していることが確認された。続いて、導入遺伝子の発現の動態およびベクターのゲノムの体内分布プロファイルのｉｎ  ｖｉｖｏでの特徴付けにより、この合理的に遺伝子工学により作製したキメラのＡＡＶ株による、導入遺伝子の迅速な、持続性の、かつ増強された発現が示されている。類似の、改善された形質導入プロファイルが、肝臓に対する標的化が解除された筋肉特異的ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９キメラを用いて観察された（Ｓｈｅｎら、２０１３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８（４）：２８８１４〜２８８２３）。グラフト化のそのような新しい組合せが、ＷＯ２０１４／１４４２２９に十分に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれている。追加の肝臓非標的化ＡＡＶ、例として、ＡＡＶ９．４５が、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａら、２０１１、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９（６）：１０７０〜１０７８に記載されており、その内容は、参照により、あたかも全体が記載されているかのように、本明細書に組み込まれている。
【０１７９】
その上別の実施形態では、本発明は、治療のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子療法において使用するために、祖先ＡＡＶのベクターの使用を提供する。具体的には、インシリコで得られた配列を、新規に合成し、生物学的活性について特徴付けた。この努力は、機能性の仮想の祖先ＡＡＶを９つ生成し、Ａｎｃ８０、すなわち、ＡＡＶの血清１型、２型、８型および９型の予測される祖先を同定するに至った（Ｚｉｎｎら、２０１５、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １２：１０５６〜１０６８）。そのような祖先の配列の予測および合成も、ウイルス粒子へのアセンブルも、ＷＯ２０１５／０５４６５３に記載されている方法を使用して達成することができ、その内容は、参照により本明細書に組み込まれている。とりわけ、祖先のウイルスの配列からアセンブルされたウイルス粒子の使用により、現在のヒト集団における既存の免疫に対して、現代のウイルスまたはそれらの部分が示す感受性よりも低下した感受性が示される。
【０１８０】
パッケージングされたウイルスベクターの生成
本発明は、パッケージング細胞を含み、これらを培養して、本発明のパッケージングされたウイルスベクターを生成することができ、パッケージング細胞は、「宿主細胞」により包含される。本発明のパッケージング細胞は一般に、異種の（１）ウイルスベクター機能、（２）パッケージング機能、および（３）ヘルパー機能を有する細胞を含む。以下のセクションで、構成成分のこれらの機能のそれぞれについて論じる。
【０１８１】
最初に、当業者に公知のいくつかの方法により、ベクターを作製することができる（例えば、ＷＯ２０１３／０６３３７９を参照されたい）。好ましい方法が、内容が全ての目的で参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｒｉｅｇｅｒら、２０１５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２４（２）：２８７〜２９７に記載されている。手短に述べると、ＨＥＫ２９３細胞の効率的なトランスフェクションを、開始点として使用し、この場合、資格要件を満たした臨床用マスター細胞バンクから得られた、接着性のＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＷＡＶＥバイオリアクター中の振とうフラスコ中で、動物構成成分を含有しない懸濁条件下で増殖させる；こうした条件により、迅速かつ拡張可能なｒＡＡＶの生成が可能になる。懸濁ＨＥＫ２９３細胞系は、トリプルトランスフェクションの方法（例えば、ＷＯ９６／４０２４０）を使用して、トランスフェクションの４８時間後に収集する場合に、ベクターゲノム含有粒子を、１×１０５（ｖｇ）／細胞超、または１Ｌの細胞培養物当たり１×１０１４ｖｇ超で生成する。より具体的には、トリプルトランスフェクションとは、３つのプラスミドを、パッケージング細胞にトランスフェクトするという事実を指し、１つのプラスミドは、ＡＡＶのｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードし、別のプラスミドは、多様なヘルパー機能（例えば、アデノウイルスまたはＨＳＶのタンパク質、例として、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ  ＲＮＡ）をコードし、別のプラスミドは、導入遺伝子およびその多様な制御エレメント（例えば、改変されたＦＸＮ遺伝子およびＣＢｈプロモーター）をコードする。
【０１８２】
所望の収率を達成するためには、いくつかの変数を最適化する；例として、増殖およびトランスフェクションの両方を支援する、適合する、血清を含有しない懸濁培地を選択し、トランスフェクション試薬、トランスフェクション条件および細胞密度を選択する。また、精製の普遍的な戦略も、イオン交換クロマトグラフィーの方法に基づいて開発され、それにより、ＡＡＶの血清１〜６型、８型、９型および多様なキメラのキャプシドのベクターのプレップが高い純度で得られた。使い勝手が優れたこのプロセスは、１週間以内に完了させて、空の粒子に対する充填粒子の高い比（＞９０％の充填粒子）を得ることができ、（＞１×１０１３ｖｇ／Ｌ）の精製後の収率および臨床に適用するのに適切な純度が得られ、このプロセスは、全ての血清型およびキメラの粒子に関して普遍的なプロセスである。網膜新血管形成（ＡＡＶ２）、血友病Ｂ（ｓｃＡＡＶ８）、巨大軸索ニューロパチー（ｓｃＡＡＶ９）、および網膜色素変性症（ＡＡＶ２）のための、第一相臨床用ＡＡＶベクターをＧＭＰに則って製造するために、この拡張可能な製造技術は利用されており、これらのＡＶＶベクターは、患者内に投与されている。さらに、トランスフェクション後の多数の時点における培地からのｒＡＡＶの収集が伴う灌流の方法を実行することによって、ベクターの全体的な生成が最低でも５倍増加する。
【０１８３】
ウイルスベクター機能
本発明のパッケージング細胞は、ウイルスベクター機能を、パッケージング機能およびベクター機能と一緒に含む。ウイルスベクター機能は典型的には、パルボウイルスのゲノムの一部、例として、ＡＡＶのゲノムの一部を含み、こうしたゲノムにおいては、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失しており、改変されたＦＸＮ配列およびそれに関連する発現制御配列により交換されている。パッケージングのためのウイルスベクター機能は、ウイルスベクターの複製が生じるのに十分な発現制御配列を含む。典型的には、ウイルスベクターは、パルボウイルスのゲノムの一部、例として、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失しており、導入遺伝子およびそれに関連する発現制御配列により交換されているＡＡＶのゲノムを含む。典型的には、導入遺伝子に、欠失したウイルスのｒｅｐおよびｃａｐのＯＲＦの代わりに、２つのＡＡＶのＴＲが隣接する。適切な発現制御配列、例として、導入遺伝子が標的細胞中で組織特異的に発現するのを促進する点で、使用するのに適切な組織に特異的なプロモーターおよびその他の調節配列が含まれる。導入遺伝子は典型的には、発現して、治療用ポリペプチドまたはマーカーのポリペプチドを生成することができる核酸配列である。
【０１８４】
本明細書では、「二重鎖ベクター」を、「二量体」ベクターまたは「自己相補性」ベクターと交換可能に呼ぶ。二重鎖パルボウイルス粒子は、例えば、ウイルス粒子のＤＮＡ（ｖＤＮＡ）を含有する、パルボウイルスのキャプシドを含むことができる。ｖＤＮＡは、自己相補性であり、したがって、ウイルスのキャプシドから放出されると、ヘアピン構造を形成することができる。二重鎖ｖＤＮＡは、宿主細胞に二本鎖ＤＮＡを提供するようであり、この二本鎖ＤＮＡは、従来のパルボウイルスベクターを用いる場合には必要になる第２の鎖の合成を必要とせずに、宿主細胞により発現され（すなわち、転写され、および任意選択で、翻訳され）得る。二重鎖／自己相補性のｒＡＡＶベクターは、当技術分野で周知であり、例えば、ＷＯ２００１／９２５５１、ＷＯ２０１５／００６７４３、およびその他多くに記載されている。
【０１８５】
ウイルスベクター機能を、二重鎖ベクターの鋳型として適切に提供することができ、このことは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第７，４６５，５８３号に記載されている（二重鎖ベクターに関するその教示について参照することにより、その開示全体が本明細書に組み込まれている）。二重鎖ベクターは、二量体の自己相補性（ｓｃ）ポリヌクレオチド（典型的には、ＤＮＡ）である。二重鎖ベクターのゲノムは、好ましくは、パルボウイルスの選択されたキャプシド（例えば、ＡＡＶのキャプシド）内へのキャプシド形成に十分なパッケージング配列を含有する。当業者であれば、二重鎖ｖＤＮＡは、全ての条件下で二本鎖の形態をとって存在し得るとは限らず、しかし、相補的ヌクレオチド塩基のアニーリングに有利に働く条件下では、そうなる能力を有することを理解していると予想される。「二重鎖パルボウイルス粒子」は、ハイブリッドのウイルス粒子、キメラのウイルス粒子、および標的に送るウイルス粒子を包含する。好ましくは、二重鎖パルボウイルス粒子は、ＡＡＶのキャプシドを有し、さらに、このキャプシドは、上記で記載した、キメラのキャプシドまたは標的に送るキャプシドであり得る。
【０１８６】
ウイルスベクター機能を、二重鎖ベクターの鋳型として適切に提供することができ、このことは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第７，４６５，５８３号に記載されている（二重鎖ベクターに関するその教示について参照することにより、その開示全体が本明細書に組み込まれている）。二重鎖ベクターは、二量体の自己相補性（ｓｃ）ポリヌクレオチド（典型的には、ＤＮＡ）である。例えば、二重鎖ベクターのＤＮＡを、鎖内の塩基対形成に起因して、二本鎖ヘアピン構造を形成するように選択することができる。二重鎖ＤＮＡのベクターの両方の鎖を、ウイルスのキャプシド内にパッケージングすることができる。二重鎖ベクターは、二本鎖ＤＮＡのウイルスベクターと同等の機能を提供し、ウイルスにより通例封入される一本鎖ゲノムに相補的なＤＮＡを標的細胞が合成する必要性を軽減することができる。
【０１８７】
ウイルスベクター中で使用するために選択されるＴＲ（分解可能なＴＲおよび分解不可能なＴＲ）は、好ましくは、ＡＡＶ配列であり、血清１、２、３、４、５および６型が好ましい。ＴＲが、所望の機能、例えば、ウイルスのパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスのレスキュー等を媒介する限り、ＡＡＶの分解可能なＴＲは、野生型のＴＲ配列を有する必要はない（例えば、野生型の配列を、挿入、欠失、トランケーションまたはミスセンスの突然変異により変化させることができる）。ＴＲは、ＡＡＶの逆位末端反復として機能する、合成の配列、例として、「二重Ｄ配列（ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」であり得、このことは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，４７８，７４５号に記載されており、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれている。必然的ではないが典型的には、ＴＲは同じパルボウイルスに由来し、例えば、両方のＴＲ配列がＡＡＶ２に由来する。
【０１８８】
パッケージング機能は、キャプシド構成成分を含む。キャプシド構成成分は、好ましくは、パルボウイルスのキャプシド、例として、ＡＡＶのキャプシドに由来するか、またはキメラのＡＡＶのキャプシド機能に由来する。パルボウイルスの適切なキャプシド構成成分の例が、パルボウイルス科、例として、自律的パルボウイルスまたはディペンドウイルスに由来するキャプシド構成成分である。例えば、キャプシド構成成分は、ＡＡＶのキャプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４−１、ＲＨＭ１５−１、ＲＨＭ１５−２、ＲＨＭ１５−３／ＲＨＭ１５−５、ＲＨＭ１５−４、ＲＨＭ１５−６、ＡＡＶ  Ｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１（配列番号１５）、ＡＡＶ２．５（配列番号１３）、ＡＡＶ６．１（配列番号１７）、ＡＡＶ６．３．１（配列番号１８）、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８（配列番号２９）、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、ＡＡＶ２−ＴＴ（配列番号３１）、ＡＡＶ２−ＴＴ−Ｓ３１２Ｎ（配列番号３３）、ＡＡＶ３Ｂ−Ｓ３１２Ｎ、およびＡＡＶ−ＬＫ０３、ならびにまだ同定されていないものまたは非ヒト霊長類の供給源に由来するもののような、その他の新規のキャプシドから選択することができる。キャプシド構成成分は、２つ以上のＡＡＶキャプシドに由来する構成成分を含むことができる。
【０１８９】
より多く好ましい実施形態では、ＶＰキャプシドタンパク質のうちの１つまたは複数が、２つ以上のウイルス、好ましくは、２つ以上のＡＡＶに由来するアミノ酸配列を含むキメラのタンパク質であり、このことは、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、米国特許第６，４９１，９０７号に記載されている。本明細書では、キメラのキャプシドは、ａ）ウイルスの収率、ｂ）免疫応答、ｃ）標的化、ｄ）標的化解除等を改変するのに十分である別の血清型と組み合わせた、１つの血清型に由来するアミノ酸残基を少なくとも１つ有することを記載する。
【０１９０】
さらに、キメラのタンパク質は、内容が参照により本明細書に組み込まれている、Ｌｉら、２００８、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（７）：１２５２〜１２６０に記載されている指示により作製することもできる。具体的には、ＤＮＡシャフリングに基づくアプローチを使用して、定向進化を通して、細胞型に特異的なベクターが開発された。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の血清１〜９型のキャプシドのゲノムを、ランダムに断片化し、ＰＣＲを使用して再度アセンブルして、キメラのキャプシドのライブラリーが生成された。ＡＡＶ１、２、８および９に由来するゲノム断片を含有する、単一の感染性のクローン（キメラ−１８２９）が、ＡＡＶに対して低い寛容性を示すことが以前に示されていたインテグリンを欠く、ハムスターメラノーマ細胞系から単離された。分子モデル化研究から、ＡＡＶ２は、正二十面体の、対称性の三回転軸における表面ループに寄与し、一方、ＡＡＶ１およびＡＡＶ９はそれぞれ、２回転軸および５回転軸の対称性の相互作用に寄与することが示唆されている。Ｃ末端ドメイン（ＡＡＶ９）は、合理的突然変異誘発を通して、メラノーマ指向性の決定的に重要な構造決定因子であることが同定された。キメラ−１８２９は、ヘパラン硫酸を主要な受容体として利用し、メラノーマ細胞に、いずれの血清型よりも効率的に形質導入する。ＡＡＶまたはその他のウイルスのキャプシド配列を使用する、この技術の代替の細胞／組織型への適用は、ヒト遺伝子移入のためのベクターとしての、生物学的ナノ粒子の新しいクラスをもたらす可能性が高い。
【０１９１】
パッケージングされたウイルスベクターは一般に、改変されたＦＸＮ遺伝子の配列、ならびにベクターＤＮＡのパッケージング、およびそれに続く、形質導入細胞中での改変されたＦＸＮ遺伝子配列の発現をもたらすのに十分な、ＴＲエレメントが隣接する発現制御配列を含み、これらは、本明細書では、「導入遺伝子」または「導入遺伝子発現カセット」と呼ぶ。ウイルスベクター機能は、例えば、プラスミドの構成成分、またはアンプリコンとして細胞に供給することができる。ウイルスベクター機能は、細胞系内で染色体外に存在させる場合、および／または細胞の染色体ＤＮＡ内へ組み入れる場合がある。
【０１９２】
複製およびパッケージングために、ウイルスベクター機能を担持するヌクレオチド配列を細胞宿主内に導入する任意の方法を利用することができ、それらとして、これらに限定されないが、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性のリポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが挙げられる。ウイルスベクター機能を、ウイルスベクターを使用するトランスフェクションにより提供する実施形態では、ウイルス感染を発生させるための標準的な方法を使用することができる。
【０１９３】
パッケージング機能
パッケージング機能は、ウイルスベクターの複製およびパッケージングのための遺伝子を含む。したがって、例えば、パッケージング機能は、ウイルス遺伝子の発現、ウイルスベクターの複製、組入れ状態からのウイルスベクターのレスキュー、ウイルスベクターのウイルス遺伝子の発現、およびウイルスベクターのウイルス粒子内へのパッケージングに必要な機能を、必要に応じて含むことができる。パッケージング機能は、一緒にしてかまたは別個に、遺伝子構築物、例として、プラスミドもしくはアンプリコン、バキュロウイルスもしくはＨＳＶのヘルパー構築物を使用して、パッケージング細胞に供給することができる。パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在させることができるが、好ましくは、細胞の染色体ＤＮＡ内へ組み入れる。例として、ＡＡＶのＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１９４】
ヘルパー機能
ヘルパー機能は、パッケージング細胞の活性な感染を確立するのに必要なヘルパーウイルスエレメントを含み、活性な感染の確立は、ウイルスベクターのパッケージングを開始するのに必要である。例として、ウイルスベクターのパッケージングをもたらすのに十分な、アデノウイルス、バキュロウイルスおよび／またはヘルペスウイルスに由来する機能が挙げられる。例えば、アデノウイルスのヘルパー機能は典型的には、アデノウイルス構成成分であるＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４およびＶＡ  ＲＮＡを含むと予想される。パッケージング機能は、パッケージング細胞に必要なウイルスを感染させることによって供給することができる。パッケージング機能は、一緒にしてかまたは別個に、遺伝子構築物、例として、プラスミドまたはアンプリコンを使用して、パッケージング細胞に供給することができる。例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら、２００２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１に記載されているｐＸＲヘルパープラスミド、およびＧｒｉｍｍら、１９９８、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：２７４５〜２７６０に記載されているｐＤＧプラスミドを参照されたい。パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在させることができるが、好ましくは、細胞の染色体ＤＮＡ内へ組み入れる（例えば、ＨＥＫ２９３細胞中のＥ１またはＥ３）。
【０１９５】
任意の適切なヘルパーウイルス機能を利用することができる。例えば、パッケージング細胞が昆虫細胞である場合には、バキュロウイルスをヘルパーウイルスとして用いることができる。ＡＡＶのパッケージングの方法において、ヘルペスウイルスもまた、ヘルパーウイルスとして使用することができる。ＡＡＶのＲｅｐタンパク質をコードする、ハイブリッドのヘルペスウイルスは、ＡＡＶベクター生成のより拡張可能なスキームを好都合に促進することができる。
【０１９６】
複製およびパッケージングのために、ヘルパー機能を担持するヌクレオチド配列を細胞宿主内に導入する任意の方法を利用することができ、それらとして、これらに限定されないが、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性またはアニオン性のリポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが挙げられる。ヘルパー機能を、ウイルスベクターを使用するトランスフェクション、またはヘルパーウイルスを使用する感染により提供する実施形態では、ウイルス感染を発生させるための標準的な方法を使用することができる。
【０１９７】
パッケージング細胞
当技術分野で公知の任意の適切な、寛容な細胞またはパッケージング細胞を、パッケージングされたウイルスベクターを生成する場合に利用することができる。哺乳動物細胞または昆虫細胞が好ましい。本発明の実行においてパッケージング細胞を生成するのに有用な細胞の例として、例えば、ヒト細胞株、例として、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ２９３細胞（ＥＫ２９３細胞は、構成的プロモーターの制御下で、アデノウイルスの機能性のＥ１を発現する）、Ｂ−５０または任意のその他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ−２、ＨｕＨ７およびＨＴ１０８０細胞系が挙げられる。一態様では、パッケージング細胞は、懸濁培養物中で増殖することが可能であり、より好ましくは、細胞は、血清を含有しない培養物中で増殖することが可能である。一実施形態では、パッケージング細胞は、血清を含有しない培地中で懸濁状態をとって増殖するＨＥＫ２９３である。別の実施形態では、パッケージング細胞は、米国特許第９，４４１，２０６号に記載されており、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ１３２７４として寄託されているＨＥＫ２９３細胞である。これらに限定されないが、ＷＯ２００２／４６３５９に開示されているものを含めて、ｒＡＡＶのパッケージング細胞系が多数、当技術分野で公知である。
【０１９８】
パッケージング細胞として使用するための細胞系は、昆虫細胞系を含む。ＡＡＶの複製を可能にし、培養物中で維持することができる任意の昆虫細胞を、本発明に従って使用することができる。例として、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、具体的には、Ｓｆ９細胞系もしくはＳｆ２１細胞系、ショウジョウバエ属種の細胞系、または蚊の細胞系、例えば、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）に由来する細胞系が挙げられる。好ましい細胞系は、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のＳｆ９細胞系である。以下の参考文献が、異種ポリペプチドの発現のための昆虫細胞の使用、そのような細胞内に核酸を導入する方法、およびそのような細胞を培養物中で維持する方法に関するそれらの教示について、本明細書に組み込まれている：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｒｉｃｈａｒｄ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９５）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；Ｋａｊｉｇａｙａら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４６４６〜４６５０；Ｒｕｆｆｉｎｇら、１９９２、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６９２２〜６９３０；Ｋｉｍｂａｕｅｒら、１９９６、Ｖｉｒｏｌ．２１９：３７〜４４；Ｚｈａｏら、２０００、Ｖｉｒｏｌ．２７２：３８２〜３９３；およびＳａｍｕｌｓｋｉら、米国特許第６，２０４，０５９号。
【０１９９】
本発明によるウイルスのキャプシドは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、バキュロウイルスからの発現により生成することができる（Ｂｒｏｗｎら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９８：４７７〜４８８）。さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、昆虫細胞中で、ｒｅｐ遺伝子／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶの鋳型を送達するためのバキュロウイルスベクターを使用して生成することもでき、このことは、例えば、Ｕｒａｂｅら、２００２、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３：１９３５〜１９４３により記載されている。
【０２００】
別の態様では、本発明は、昆虫細胞中でｒＡＡＶを生成する方法を提供し、この場合、ＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐをコードする領域を担持するように、これらの遺伝子を、遺伝子工学的に操作して、バキュロウイルスベクターのポリヘドリンをコードする領域内にもたらし、宿主細胞内へのトランスフェクションにより、ウイルスの組換え体を生成することによって、バキュロウイルスのパッケージングのシステムまたはベクターを構築することができる。とりわけ、ＡＡＶを生成するためにバキュロウイルスを使用する場合には、好ましくは、ＡＡＶのＤＮＡベクター生成物は、ＡＡＶのＩＴＲへの突然変異を使用しない自己相補性ＡＡＶ様分子となる。これは、機能性のＲｅｐ酵素活性を欠くことによって、自己相補性ＤＮＡ分子をもたらす、昆虫細胞中でのＡＡＶのｒｅｐの非効率的なニッキングの副産物であるようである。宿主細胞は、バキュロウイルス感染細胞であるか、またはその中にバキュロウイルスヘルパー機能をコードする追加の核酸が導入されているか、またはその中にこれらのバキュロウイルスヘルパー機能を含む。これらのバキュロウイルスは、ＡＡＶ構成成分を発現し、続いて、キャプシドの生成を促進することができる。
【０２０１】
一般に、パッケージング細胞には、生成の間に、１つまたは複数のウイルスベクター機能を、ウイルスベクターの複製およびパッケージングをもたらすのに十分なヘルパー機能およびパッケージング機能と一緒に含める。これらの多様な機能は、一緒にしてかまたは別個に、遺伝子構築物、例として、プラスミド、またはアンプリコンを使用して、パッケージング細胞に供給することができ、細胞系内で染色体外に存在させる場合、または細胞の染色体内に組み入れる場合がある。
【０２０２】
細胞を、記述した機能のうちの任意の１つまたは複数をすでに組み込んだ状態で供給することができ、それらは、例えば、１つもしくは複数のベクター機能が、染色体外に組み込まれているか、もしくは細胞の染色体ＤＮＡ内へ組み入れられている細胞系；１つもしくは複数のパッケージング機能が、染色体外に組み込まれているか、もしくは細胞の染色体ＤＮＡ内へ組み入れている細胞系；またはヘルパー機能が、染色体外に組み込まれているか、もしくは細胞の染色体ＤＮＡ内へ組み入れている細胞系である。
【０２０３】
ｒＡＡＶの精製
ｒＡＡＶベクターは、当技術分野の標準的な方法、例として、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配により精製することができる。ｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当技術分野で公知であり、Ｃｌａｒｋら、１９９９、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０（６）：１０３１〜１０３９；ＳｃｈｅｎｐｐおよびＣｌａｒｋ、２００２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６９：４２７〜４４３；米国特許第６，５６６，１１８号、ならびにＷＯ９８／０９６５７に記載されている方法を含む。
【０２０４】
治療方法
フリードライヒ運動失調症関連障害、例として、フリードライヒ運動失調症と関連がある、神経筋の変性障害および／または心筋症の遺伝子療法のために、改変されたＦＸＮ遺伝子を使用することができる。個体が、遺伝子療法を必要とする場合があり、その理由は、ＦＸＮ遺伝子のコード配列における１つまたは複数の突然変異の結果として、ＦＸＮが、不適切に発現し、例えば、誤ったアミノ酸配列を有するか、または間違った組織中でもしくは間違った時期に発現するか、または過小発現するからである。本発明の改変されたＦＸＮ遺伝子を、遺伝子療法として使用して、タンパク質のフラタキシンの生成を増強し、それにより、ミトコンドリアにおけるエネルギーの発生を増加させることができる。例えば、米国特許第９，０６６，９６６号を参照されたい。
【０２０５】
本発明のベクターの標的細胞は、フラタキシンを発現することが可能な細胞、例として、哺乳動物の心臓系の細胞、神経細胞、筋肉細胞、およびフラタキシン活性を有するタンパク質をもたらす前駆体をプロセシングするのに適切な細胞機構を有するその他の細胞である。
【０２０６】
医薬組成物
特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンの発現の減少が媒介するかまたはフラタキシンの発現の減少と関連がある疾患または状態、例えば、フリードライヒ運動失調症を予防または治療するための医薬組成物を提供する。組成物は、改変されたＦＸＮ遺伝子を含むベクターを治療有効量含み、この量により、判定においてＦＸＮの発現レベルを増加させることができる。組成物は、ＦＸＮをコードする核酸であって、改変された、例えば、最適化された核酸を含むベクターを含み、この場合、組成物は、薬学的に許容できる担体および／またはその他の薬用物質、医薬物質、担体、アジュバント、希釈剤等をさらに含む。注射剤の場合には、担体は典型的には液体であると予想される。注射剤用の媒体として、注射用溶液に通常用いる添加剤、例として、安定化剤、塩を含有する水、または生理食塩水および／もしくは緩衝液を使用するのが好ましい。
【０２０７】
例示的な薬学的に許容できる担体として、無菌の、発熱性物質を含有しない水、および無菌の、発熱性物質を含有しないリン酸緩衝溶液が挙げられる。生理学的に許容できる担体は、薬学的に許容できる担体を含む。薬学的に許容できる担体は、換言すると、生物学的にかつ別の点で望ましい担体であり、すなわち、そうした材料の好都合な生物学的作用を上回る望ましくない生物学的作用を引き起こすことなく、材料を対象に投与することができる。
【０２０８】
医薬組成物は、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞のトランスフェクション、またはウイルスベクターもしくは細胞の対象への直接投与において使用することができる。
【０２０９】
改変されたＦＸＮ遺伝子を含む組換えウイルスベクターは、好ましくは、生物学的有効量で細胞に投与する。ウイルスベクターを、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に投与する（例えば、下記に記載するように、ウイルスを対象に投与する）場合は、ウイルスベクターの生物学的有効量は、標的細胞中で導入遺伝子の形質導入および発現をもたらすのに十分である量である。
【０２１０】
一実施形態では、本発明は、核酸を、単独で、またはフラタキシンをコードする改変された核酸を含むベクター（これには、核酸を細胞に提供するためのプラスミド、ウイルス、ナノ粒子、リポソームもしくは任意の公知の方法が含まれる）として、細胞に投与することによって、細胞中のフラタキシンのレベルを増加させる方法を含む。方法は、フラタキシンをコードするｍＲＮＡのレベルおよび／または発現したフラタキシンタンパク質のレベルが、核酸が投与されていないこと以外には同一の細胞中のフラタキシン（ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質）のレベルよりも検出可能に多い方法を含む。当業者であれば、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養するもしくは増殖させること、または生物中に（すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏで）存在させることができることを理解していると予想される。さらに、細胞が、内因性のフラタキシンを発現する場合もあり、したがって、細胞中のフラタキシンのレベルが増加し得、かつ／または細胞が、内因性のフラタキシンであって、野生型フラタキシン、例えば、配列番号２の配列を有するフラタキシンの突然変異体もしくはバリアントである、内因性のフラタキシンを発現する場合もある；後者の場合の理由は、具体的には、ヒトフラタキシンについて、２つ以上の野生型対立遺伝子があり得るからである。したがって、フラタキシンのレベルを、これ以外には同一であるが、治療が行われていない細胞中で発現するフラタキシンのレベルと比較して増加させる。
【０２１１】
本発明のさらなる態様は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、改変された遺伝子を含有するベクターを用いて、対象を治療する方法である。ベクターの、それを必要とするヒト対象または動物への投与は、ウイルスベクターを投与するための、当技術分野で公知の任意の手段によりなすことができる。
【０２１２】
ベクターを、標準治療に加えて投与しても、標準治療に対する補助剤として投与してもよい。換言すると、ベクターは、別の治療剤または化合物と、同時に、同時期に、または当業者により日常的な方法を使用して決定されると予想される、決められた投与間隔で同時投与することができる。
【０２１３】
一態様では、本発明のｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ−ＦＸＮベクターと同じまたは異なるキャプシドタンパク質を含む空のキャプシド（すなわち、核酸分子を含有しないウイルスのキャプシド）と同時投与することができる。これは、当業者であれば理解していると予想されるが、空のキャプシドの同時投与により、本発明のｒＡＡＶに対する免疫応答、例えば、中和応答を減少させる場合があるからである。換言すると、空のキャプシドは、ｒＡＡＶ−ＦＸＮベクターが中和抗体（Ｎａｂ）による免疫応答を回避することを可能にするデコイとして働く場合がある；このことは、例えば、ＷＯ２０１５／０１３３１３に論じられている。
【０２１４】
全身投与の例示的な様式として、これらに限定されないが、静脈内、皮下、皮内、筋肉内および関節内への投与等、および組織または臓器に直接注射することが挙げられる。
【０２１５】
一実施形態では、ベクターを全身投与する。当業者であれば、全身投与により、ＦＸＮをコードする治療用遺伝子を、組織中の低下したレベルのＦＸＮにより影響を受けている、全ての筋肉を含めた、全ての組織に送達することができることを理解していると予想される。
【０２１６】
それにもかかわらず、ベクターは、ＦＸＮの欠乏により影響を受けている領域、すなわち、脳および心臓に直接送達することができることも当業者は理解していると予想される。
【０２１７】
したがって、その他の好ましい実施形態では、改変されたＦＸＮ遺伝子を含む考案のベクターを、心臓または中枢神経系（ＣＮＳ）組織内に直接注射することによって投与する。
【０２１８】
一実施形態では、ＦＮＸをコードする改変された核酸、ベクターまたはベクターを含む組成物を、くも膜下腔内、神経内、脳内、脳室内投与を含めた、頭蓋内に送達する。
【０２１９】
一実施形態では、ＦＮＸをコードする改変された核酸、ベクターまたはベクターを含む組成物を心臓に送達し、これは、小開胸後の心外膜注射、冠内注射、心内膜心筋注射により心筋内に直接投与することによってか、または心臓において有用な別のタイプの注射によって行う。
【０２２０】
また、追加の投与経路は、直接的な可視化下におけるベクターの局所適用、例えば、皮質表面への適用、またはその他の非定位的な適用も含むことができる。また、ベクターの、例えば、くも膜下腔内への送達、脳室内への送達、または静脈内注射による送達を行うこともできる。
【０２２１】
本発明のベクターの標的細胞は、フリードライヒ運動失調症と関連がある心筋症に罹患している対象の心筋細胞である。好ましくは、対象は、ヒト、すなわち、成人または小児である。しかし、獣医学的適用もまた企図する。
【０２２２】
本発明のベクターの標的細胞はまた、ＣＮＳの細胞、好ましくは、神経細胞も含む。フリードライヒ運動失調症の神経変性の態様を治療するための脳への送達は、くも膜下腔内投与によりなすことができる。
【０２２３】
一態様では、ＦＮＸをコードする改変された核酸、ベクターまたはベクターを含む組成物は、ＦＡ関連心筋症および／または当該疾患の神経変性の態様を治療するための全身性、例えば、静脈内からの送達である。
【０２２４】
別の実施形態では、ベクターを、少なくとも２つの経路により投与する。換言すると、ベクターは、全身投与し、かつまた、脳および／もしくは心臓内に直接投与することができ、またはそれらを任意に組み合わせて投与することができる。
【０２２５】
ベクターの投与は、少なくとも２つの経路を介して行う場合には、同時または同時期に行ってもよいが、そうする必要はない。代わりに、異なる経路を介する投与を別個に、それぞれの投与の間に時間的間隔を置いて行うこともできる。それぞれの個々の患者について、治療の最大の利益を達成するために、適切な投与レジメンが、当業者により日常的に決定される。
【０２２６】
一態様では、本発明は、対象においてフラタキシンのレベルを増加させる場合に使用するための、フラタキシンをコードする本発明の改変された核酸であって、これに限定されないが、ベクターまたは医薬組成物中の核酸を含めて、核酸を少なくとも１つを含む。
【０２２７】
一態様では、本発明は、フリードライヒ運動失調症を対象において治療する場合に使用するための、改変された核酸、核酸を含むｒＡＡＶベクター、および核酸またはベクターのいずれかを含む医薬組成物を少なくとも１つ含む。
【０２２８】
使用は、改変された核酸または改変された核酸を含むベクターを、当技術分野で公知のＦＲＤＡのための標準治療に加えて、かつ／またはそうした標準治療と併せて投与することを包含する。
【０２２９】
注射剤を、液状の溶液もしくは懸濁液、注射の前に液体中の溶液もしくは懸濁液となすのに適切な固体の形態として、または乳濁液としてのいずれかの従来の形態に調製することができる。
【０２３０】
改変されたＦＸＮ遺伝子を有するウイルスベクターの投与量は、投与様式、治療しようとする疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターおよび送達しようとする遺伝子に依存し、日常的に決定することができる。治療効果を達成するための例示的な用量は、体重１ｋｇ当たり、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５形質導入単位以上、好ましくは、約１０８〜１０１３形質導入単位、その上より好ましくは、１０１２形質導入単位のウイルス力価である。
【０２３１】
改変されたＦＸＮ遺伝子は、標的細胞中での発現に適切な調節エレメントを有する、ＤＮＡ分子の構成成分として投与することができる。改変されたＦＸＮ遺伝子は、ウイルスのプラスミド、例として、ｒＡＡＶベクターの構成成分として投与することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏで門脈血管構造に直接送達する場合であれ、ｅｘ  ｖｉｖｏで治療する場合であれ、ウイルス粒子を、単独のウイルス粒子として投与することができ、ｅｘ  ｖｉｖｏでの治療は、ベクターウイルス粒子を、治療を受ける動物から得られた細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏで投与し、続いて、形質導入細胞をドナー内に導入して戻すことを含む。
【０２３２】
均等物
明細書の上記の記載内容は、本開示の当業者による実行を可能にするのに十分であると考えている。上記の記載、および実施例により、本開示の特定の例示的な実施形態を詳述する。しかし、いかに詳細に上記の記載が書かれているように見えようとも、本開示は、多くの様式で実行することができること、ならびに本開示は、添付の特許請求の範囲、およびその中の請求項の任意の均等物に従って解釈すべきであることが理解されると予想される。
【０２３３】
特許、特許出願、論文、教科書等を含めた、本明細書に引用する参考文献全て、およびそれらの中に引用されている参考文献は、ここにおいて改めて、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。
【０２３４】
例示的な実施形態
以下の実験実施例を参照することによって、本発明をさらに、詳細に記載する。これらの実施例は、例証の目的で提供するに過ぎず、別段の特定がない限り、本発明を制限するものではない。したがって、本発明は、いかなる場合であっても、以下の実施例に限定されると解釈すべきではなく、しかし、むしろ本明細書に提供する教示の結果として明らかになる、あらゆる変更形態を包含すると解釈すべきである。
【実施例】
【０２３５】
（実施例１）
自己相補性ｒＡＡＶ−ＦＸＮ構築物の生成
材料および方法
ベクターの構築
自己相補性ＡＡＶゲノムをコードするｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＥＧＦＰ−ｂＧＨポリＡ構築物（その図を、図３に示す）を、導入遺伝子発現構築物の骨格として使用した（Ｇｒａｙら、２０１１、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２２：１１４３〜１１５３）。ｐＵＣ５７中への２つのコドン最適化ＦＸＮ遺伝子挿入体、すなわち、ＧｅｎｓｃｒｉｐｔおよびＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔに発注し、これらを使用して、骨格ベクター中のＥＧＦＰを交換した。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（配列番号６）およびＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）（配列番号７）により改変されたＦＸＮ遺伝子をそれぞれ、ＣＢｈプロモーターに作動可能に連結し、これを図３に示す。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＦＸＮ（配列番号６および７）構築物は、Ｎ末端にＡｇｅＩ部位、ＦＸＮ終止コドンの下流にコラーゲン安定性配列（ＣＳＳ）（５’−ＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＣＣＡＡ−３’）、ＣＳＳの下流にウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、およびＢＧＨポリＡの下流にＭｌｕＩ部位を含み、これらはいずれも、図２Ｅ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）および図２Ｆ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ））に示されている。ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＦＸＮ−ｂＧＨポリＡ構築物内に挿入した例示的な挿入体を、図２Ａ〜図２Ｆに示し、表８に記載する。より具体的には、野生型フラタキシン遺伝子（ＷＴ  ＦＸＮ；配列番号２）をクローニングして、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＷＴ  ＦＸＮ−ｂＧＨｐｏｌｙＡ（図２Ａ）を得；改変されたＦＸＮ遺伝子ＩＤＴ１（配列番号１１）をクローニングして、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＩＤＴ１−ｂＧＨポリＡ（図２Ｂ）を得；低発現体である改変されたＦＸＮ遺伝子をコードする核酸ＩＤＴ３（配列番号８）をクローニングして、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＩＤＴ３−ｂＧＨポリＡ（図２Ｃ）を得；改変されたＦＸＮ遺伝子ＩＤＴ４（配列番号１２）をクローニングして、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＩＤＴ４−ｂＧＨポリＡ（図２Ｄ）を得；改変されたＦＸＮ遺伝子Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（対照）（配列番号６）をクローニングして、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ−ｂＧＨポリＡ（図２Ｅ）を得；改変されたＦＸＮ遺伝子Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）（配列番号７）をクローニングして、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）−ｂＧＨポリＡ（図２Ｆ）を得た。ＦＸＮ遺伝子をコードする各挿入体をクローニングして、ベクターを得、その遺伝子には、５’側上にＡｇｅＩ部位、および３’側上にＡｖｒＩＩ切断部位が隣接し、それに、ＡｖｒＩＩ部位後にＣＳＳ配列、ＣＳＳ後にＳｐｅＩ切断部位、ＳｐｅＩ切断部位後にｂＧＨポリＡシグナル配列、およびポリＡシグナル配列後にＭｌｕＩ切断部位が続いた。
【０２３６】
骨格のｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＥＧＦＰ−ｂＧＨポリＡおよびＦＸＮ遺伝子構築物は、ＡｇｅＩおよびＭｌｕＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、それぞれ、Ｒ０５５２ＳおよびＲ０１９８Ｓ）を用いて消化し、ゲル抽出し、ＥｘＴａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＲＲ００１Ａ）を使用してライゲートした。ライゲーション反応物を、ＳＵＲＥ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ、２００２２７）中に形質転換し、ＳＯＣ回収培地（カタログ番号：１５５４４−０３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に３７℃で１時間置き、次いで、アンピシリン（１０ｍｇ／ｍｌ）を有するＬＢプレート上に蒔いた。コロニーに対して配列決定を行い、ウイルスを生成するための増幅を行うために、コロニーを選んだ。ＵＮＣのＶｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅにおいて、（Ｇｒｉｅｇｅｒら、２００６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：１４１２〜１４２８）の記載に従って、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞中で、トリプルトランスフェクションの方法により、ＡＡＶ血清２型キャプシドを有する組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを生成した。代わりに、血清２ｉ８型キャプシド（配列番号２８のアミノ酸配列）を有するｒＡＡＶベクターも同様に生成した。自己相補性ゲノムを含有する、極めて純粋な組換えウイルスを、非イオン性イオジキサノール勾配、それに続く、イオン交換クロマトグラフィーを通すことによって回収した。ピーク画分を、ｑＰＣＲにより決定し、次いで、５％のｄ−ソルビトールを含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）中で透析した。ウイルス力価を、ｑＰＣＲにより決定した（Ｇｒａｙら、２０１０、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８：５７０〜５７８）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの予備試験（下記）の後に、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）を使用して、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）−ｂＧＨポリＡ中、ＦＸＮ終止コドンの前にＨＡタグ、すなわち、ＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴが挿入されている構築物を生成した。
【０２３７】
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＵＮＣ）のＶｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅにおいて、ｒＡＡＶ血清ＴＫ型を有するＦＸＮ−ＨＡ構築物を用いて、ウイルスを生成した。
【０２３８】
ｓｃ  ｒＡＡＶ−ＦＸＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）およびＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中に維持した。細胞増殖培地に、９％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、３．４ｍＭのｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した。細胞を、５％のＣＯ２雰囲気下、３７℃で保った。ディップスティックアッセイ：細胞を、２４ウエルプレート中に、２４時間（ｈ）時におよそ６０％のコンフルエンスに達するように播種し、次いで、模擬処置を細胞に対して行うか、または三つ組で、ｓｃＡＡＶ−ＦＸＮ（交換可能に、本明細書では「ｒＡＡＶ−ＦＸＮ」または「ｒＡＡＶ−ＦＸＮ−ＨＡ」と呼ぶ）を、１０，０００（ＶＧ／細胞）のＭＯＩで、細胞に感染させた。形質導入後の６０時間時（６０ｈｐ．ｔ．）に、細胞は、Ｆｒａｔａｘｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｄｉｐｓｔｉｃｋ  Ａｓｓａｙ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１０９８８１）についての製造元のプロトコールに従った。データを、ＩｍａｇｅＪを使用して処理した。
【０２３９】
ウエスタンブロッティング
細胞を、６ウエルプレート中に、２４時間時におよそ６０％のコンフルエンスに達するように播種し、次いで、模擬処置を細胞に対して行うか、またはｓｃＡＡＶ−ＦＸＮを１０，０００（ＶＧ／細胞）のＭＯＩで細胞に感染させた。形質導入後の６０時間時に、細胞溶解緩衝液（０．０６２５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、１０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、５％の２−メルカプトエタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー）を用いて、細胞を溶解させた。１５μｌのＨｅＬａタンパク質溶解液を、１５〜４％のＴＧＸゲル上でゲル電気泳動により分離し、タンパク質を、ニトロセルロースメンブレン（ＮＣＭ）にエレクトロブロットした。ＰＢＳ−Ｔ中の５％の脱脂粉乳を使用して、ＮＣＭをブロックした。抗フラタキシン抗体（Ａｂｃａｍ、１８Ａ５ＤＢ１）を、５％のミルクを有するＰＢＳ−Ｔ中で使用した。５％のミルクを有するＰＢＳ−Ｔ中の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化二次抗体を使用して、抗フラタキシンの存在を検出した。ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ  ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ａｄｖａｎｓｔａ、Ｋ−１２０４５−Ｄ５０）を使用し、製造元の使用説明に従って検出を行った。
【０２４０】
図１Ａおよび図１Ｂに、ＨｅＬａ細胞中での、ＦＸＮをコードする、最適化されていない、すなわち、野生型の配列（配列番号１）の発現と比較した、多様な最適化された配列の発現の結果を示す。より具体的には、図１Ａおよび図１Ｂの両方に、フラタキシンをコードする挿入体を含む発現ベクターをトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中でのフラタキシン（ＦＸＮ）の発現を示すウエスタンブロットの写真を示す。図１Ａに、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔブロットの１秒間露光したフィルムの写真中の、ＨｅＬａ細胞中でのＦＸＮの発現を示す。図１Ｂに、ＨｅＬａ細胞中でのＦＸＮの発現を実証する図１Ａに示した実験を繰り返した実験を示し、ＦＸＮの発現を、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔブロットの１秒間露光したフィルムの写真として示している。図１Ａおよび図１Ｂ中のゲルの各レーンは、ＦＸＮをコードする野生型の核酸配列からの発現と比較した、本発明の改変されたＦＸＮ遺伝子からのＦＸＮの発現を示す。換言すると、レーン１は、野生型の、ＦＸＮをコードする改変されていない核酸（配列番号２）が推進する発現を示し；レーン２は、改変されたＦＸＮ遺伝子ＩＤＴ２（配列番号３）が推進する発現を示し；レーン３は、改変されたＦＸＮ遺伝子ＩＤＴ５（配列番号９）が推進する発現を示し；レーン４は、改変されたＦＸＮ遺伝子ＪＣＡＴ（配列番号４）が推進する発現を示し；レーン５は、改変されたＦＸＮ遺伝子ＧｅｎｅＡｒｔ（配列番号５）が推進する発現を示し；レーン６は、改変されたＦＸＮ遺伝子Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（対照）（配列番号６）が推進する発現を示し；レーン７は、改変されたＦＸＮ遺伝子Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）（配列番号７）が推進する発現を示し；レーンＧＦＰは、ＦＸＮをコードする核酸の代わりの挿入体によりコードされる、検出可能なマーカーである緑色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子の発現を示す。
【０２４１】
示されているデータから、改変されたＦＸＮ核酸のいくつかの配列、とりわけ、レーン４（ＪＣＡＴ）、レーン５（ＧｅｎｅＡｒｔ）、レーン６（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、およびレーン７（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、低ＣｐＧ）は、ＨｅＬａ細胞中で、野生型の核酸配列（レーン１）と比べて、より高いフラタキシンの発現をもたらしたことが実証されている。各レーン中のアクチンローディング対照は、タンパク質ローディング対照と同様である。
【０２４２】
核酸配列中のＧＣヌクレオチドの含有量は、典型的には、配列中のヌクレオチドの総数のパーセントとして表現され、複数の影響を及ぼすことができ、それらとして、これらに限定されないが、ｍＲＮＡの安定性を増加させたり、二次構造および導入遺伝子に影響をもたらしたりすることが挙げられ、ＧＣ含有量が増加することによって典型的には、二次構造および導入遺伝子は望ましくない影響を受ける。したがって、当業者であれば、改変された核酸のＧＣ含有量は、核酸およびそこから転写されたｍＲＮＡの安定性の増加と、望ましくない作用、例えば、増加したＧＣ含有量により媒介される二次構造に対する作用との間のバランスを反映することを理解していると予想される。
【０２４３】
ＣＡＩ（コドン適応指標）は、同義的コドンの使用の偏りの尺度である。この指標は、ある種に由来する、非常に多く発現する遺伝子の参照セットを使用して、各コドンの相対値を評価し、ある遺伝子についてのスコアを、その遺伝子における、全てのコドンの使用頻度から計算する。この指標により、コドンの使用のパターンを選択する際に、選択された結果が有効である程度が評価される。この指標は、ある遺伝子の発現レベルを予測するため、および異なる生物／種においてコドンの使用を比較するために利用することができる。下記の要因に関してバランスを得るために、フラタキシン遺伝子に対して、ヒトのコドン最適化を実施した。
【０２４４】
転写効率：ＧＣ含有量、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、潜在スプライシング部位等；
【０２４５】
翻訳効率：コドンの使用の偏り、ＧＣ含有量、ｍＲＮＡの二次構造、未熟なポリＡの部位、ＲＮＡ不安定性モチーフ、内部のリボゾーム結合部位；ならびに
【０２４６】
タンパク質リフォールディング：コドンの使用の偏り、コドンとアンチコドンとの相互作用、ＲＮＡの二次構造。
【０２４７】
基本的に、コドン最適化は、これらの変数のバランスを保って、好ましくは、より多くのフラタキシンを発現する遺伝子配列の達成、ならびに（ＧＣ含有量、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方における二次構造を介する）メッセージの安定性の増加等を行う；このことは、当技術分野で周知である。
【０２４８】
ＣｐＧアイランドは、形質導入細胞中でＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）により認識され得、外来（外因性）のＤＮＡに対する免疫応答を惹起することができる。したがって、一実施形態では、本発明は、フラタキシンをコードする改変された核酸であって、フラタキシンをコードする野生型の核酸配列（例えば、配列番号２）中のＣｐＧアイランドモチーフの数と比較して、ＣｐＧアイランドの数が低下している、改変された核酸を包含する。
【０２４９】
本明細書で例示する改変されたＦＸＮ遺伝子それぞれについてのＣＡＩ、パーセントＧＣ含有量、および潜在的なＣｐＧアイランド領域の数を、下記の表１に示す。
【０２５０】
【表１】
0006767483.tif 000002
【０２５１】
換言すると、ＦＸＮをコードする野生型核酸（ＷＴ−ＦＸＮ；配列番号２）の場合、核酸配列は、０．７１のＣＡＩ、および５５％の％ＧＣ含有量を示す。対照的に、改変されたＦＸＮ遺伝子ＪＣＡＴは、０．９８のＣＡＩ、および６９％のＧＣ含有量を示し、これらの両方が、ＷＴ−ＦＸＮについての値よりも実質的に高い。
【０２５２】
潜在的なＣｐＧアイランドは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｓｍｓ２／ｃｐｇ_ｉｓｌａｎｄｓ．ｈｔｍｌに存在する公的に利用可能なソフトウェアを使用して同定した。Ｇａｒｄｉｎｅｒ−ＧａｒｄｅｎおよびＦｒｏｍｍｅｒ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（２）：２６１〜２８２により記載されている方法を使用する、ＣｐＧアイランドのソフトウェアにより、潜在的なＣｐＧアイランド領域が報告された。２００塩基対（ｂｐ）のウィンドウを使用し、配列全体にわたり１ｂｐの間隔で移動させて、計算を行った。ＣｐＧアイランドは、Ｏｂｓ／Ｅｘｐ値が０．６超であり、ＧＣ含有量が５０％超である配列範囲と定義されている。ウィンドウ中のＣｐＧ二量体の予測される数を、そのウィンドウ中の「Ｃ」の数に、ウィンドウ中の「Ｇ」の数を乗算し、ウィンドウの長さで除算して計算した。したがって、核酸配列中に存在する潜在的なＣｐＧアイランドは、問題にする配列を、ソフトウェアが提供する（「下記のテキスト領域内に、未加工の配列または１つもしくは複数のＦＡＳＴＡ配列をペーストしてください。入力できる文字は、１０万個までです。」という指示が示されている）枠内に入力することによって、容易に決定することができる。ＣｐＧアイランドはしばしば、脊椎動物の遺伝子の５’領域中に存在し、したがって、このプログラムを使用して、ゲノム配列中の潜在的な遺伝子を明らかにすることができる。
【０２５３】
改変されたＦＸＮ遺伝子Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）は、高い発現レベル、ならびに高いＧＣ含有量（５５％）、高いＣＡＩ（０．８６）およびＣｐＧジヌクレオチドの低い数（１１７）を示すことから、これを選択して、ｓｃＡＡＶ−２ｉ８ベクターを生成し、これを、下記に記載する動物実験において使用した。
【０２５４】
（実施例２）
フリードライヒ運動失調症マウスモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの治療
当該技術分野において認識されているＦＲＤＡマウスモデル（Ｐｅｒｄｏｍｉｎｉら、２０１４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．２０（５）：５４２）を使用して、ＦＸＮ遺伝子療法が媒介するｒＡＡＶの潜在的な効能を評価した。換言すると、３つの群のマウス、すなわち、未治療Ｍｃｋ陽性対照マウス（Ｍｃｋ−Ｃｒｅ×ＦＸＮ  Ｌ３／ＷＴ）、未治療Ｍｃｋ突然変異マウス（Ｍｃｋ−Ｃｒｅ×ＦＸＮ  Ｌ３／Ｌ−）、およびＦＸＮ遺伝子を含むｒＡＡＶの１回用量を投与した、治療Ｍｃｋ突然変異マウスを調べ、この場合、改変されたＦＸＮ遺伝子は、配列番号７の核酸配列（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ））を含み、上記の記載に従って、ＦＸＮ遺伝子を、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−ＥＧＦＰ−ＢＧＨ構築物中にクローニングして、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）−ｂＧＨポリＡをもたらした。
【０２５５】
マウス研究において使用したｒＡＡＶ−ＦＸＮベクターは、ＡＡＶ２ｉ８のキャプシドをさらに含んでいた。さらに、ｐＴＲｓ−ＫＳ−ＣＢｈ−Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（低ＣｐＧ）−ｂＧＨポリＡ構築物は、検出可能な赤血球凝集素タグをコードする核酸配列もさらに含み（ｒＡＡＶ−ＦＸＮ−ＨＡ）、この場合、ＨＡタグをコードする配列は、改変されたＦＸＮ遺伝子の３’に位置し、したがって、ＨＡの存在を、例えば、抗ＨＡ抗体、例として、抗ＨＡマウスｍＡｂ（ＨＡ．１１クローン１６Ｂ１２、Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）を使用して検出することによって、フラタキシンの発現を容易に検出し、その場所を特定することができた。ベクターは、ｒＡＡＶ−ＦＸＮ−ＨＡと名付けた。
【０２５６】
研究の３つの動物群を、表２に列挙し、記載する。
【０２５７】
【表２】
0006767483.tif 000003
【０２５８】
Ａ．バイオマーカーの研究
方法
血漿中のガレクチン−３およびＨ−ＦＡＢＰの測定
５週齢時（治療の２週間後）および８週齢時（治療の５週間後）に、イソフルラン麻酔の後の後眼窩穿刺により、血液を収集した。
【０２５９】
血漿中のガレクチン−３を、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ製のＭｏｕｓｅ  Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３  Ｅｌｉｓａキットを製造元の使用説明に従って使用して測定した。
【０２６０】
血漿中のＨ−ＦＡＢＰを、ＨｙｃｕｌｔＢｉｏｔｅｃｈ製のＭｏｕｓｅ  Ｈ−ＦＡＢＰ  Ｅｌｉｓａキットを製造元の使用説明に従って使用して測定した。
【０２６１】
心臓ホモジネート中のコハク酸デヒドロゲナーゼ活性の測定
屠殺時に、心臓を収集し、各群４匹のマウスの心臓の半分を、ＳＤＨ活性の測定のために急速凍結した。
【０２６２】
心臓ホモジネート中のＳＤＨ活性の測定を、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ製のＳｕｃｃｉｎａｔｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙキット（カタログ番号：Ｋ６６０−１００）の指示に従って行った。
【０２６３】
組織中のヒトフラタキシンの測定
屠殺時に、心臓（半分）、骨格筋（腓腹筋）および肝臓組織を収集し、フラタキシンの測定のために急速凍結した。
【０２６４】
組織ホモジネート中で、Ｈｕｍａｎ  Ｆｒａｔａｘｉｎ  Ｅｌｉｓａキット（Ａｂｃａｍ；ａｂ１７６１１２）の指示に従って、測定を行った。
【０２６５】
組織学的検査
小脳（歯状核を含む）、性腺、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋（腓腹筋およびヒラメ筋）、脾臓、ならびに頚椎、胸椎および腰椎を、ホルマリン固定した。次いで、椎骨を、ＥＤＴＡ溶液を使用して脱灰した。全ての臓器をパラフィン包埋して、５μｍの厚さの切片を得、椎骨（脊髄および後根神経節の両方を含む）ならびに心臓については、横切片を得た。全ての臓器を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、心臓の線維症を、マッソントリクローム染色を使用して評価した。
【０２６６】
心エコー
麻酔（イソフルラン、１〜２％）を施したマウスにおいて、Ｖｅｖｏ−２１００  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓ音波検査器上で３０ＭＨｚのリニアプローブ（ＭＳ４００）を用いることによって経胸壁心エコー像を得た。
【０２６７】
以下のパラメータを測定して、評価した。
ａ）心臓形態および心室収縮機能（短軸、ＳＡＸ）：左心室拡張末期直径（ＬＶＥＤＤ）および左心室収縮末期直径（ＬＶＥＳＤ）、左心室中隔厚（ＳＷ）および左心室後壁厚（ＰＷ）、左室心筋重量（ＬＶＭ＝１．０５５×［（ＥＤＤ＋ＳＷ＋ＰＷ）３−ＥＤＤ３）］）、駆出率および内径短縮率、ならびに心拍出量；
ｂ）血行動態プロファイル：心内圧変化（ＡｏＶおよびＲＶの機能）を検出するための、肺動脈血流速度および大動脈血流速度ならびに肺動脈圧および大動脈圧。
【０２６８】
マウス
温度および湿度が制御されている動物施設において、マウスを、１２時間の明暗サイクルで、水および標準的なげっ歯類用固形飼料（Ｄ０３、ＳＡＦＥ、Ｖｉｌｌｅｍｏｉｓｓｏｎ−ｓｕｒ−Ｏｒｇｅ、フランス）を自由に与えて飼育した。動物の手順および実験は全て、地域の倫理委員会（Ｃｏｍｉｔｅ  ｄ’Ｅｔｈｉｑｕｅ  ｅｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ａｎｉｍａｌｅ  ＩＧＢＭＣ−ＩＣＳ）により、動物の飼育および使用について（Ｃｏｍ’Ｅｔｈ  ２０１１−００７）承認を得た。
【０２６９】
プロトコールが終了するまで、マウスの臨床的観察を１日２回行い、体重を週１回記録し、食餌の摂取を２日に１回記録した。
【０２７０】
体内分布および遺伝子療法の研究のために、３週齢のマウスに対して、イソフルラン（１〜２％）を用いて麻酔を施し、治療群については、１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量のｒＡＡＶ−ＦＸＮ−ＨＡベクターの、および未治療ＭＣＫ突然変異マウスおよび対照については、同等の体積の生理食塩水の後眼窩静脈内への静脈内注射を行った。
【０２７１】
治療を開始する２日前（ベースラインの表現型）、５週齢時（治療の１４日後）、および７週齢時（治療の２８日後）に、マウスの心臓機能を、イソフルラン麻酔（１〜２％）下で心エコーにより評価した。５週齢および８週齢時に、血液を収集して、本明細書の他の箇所で詳述する心臓型脂肪酸結合タンパク質（Ｈ−ＦＡＢＰ）、ガレクチン−３、およびコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）の濃度を測定した。
【０２７２】
屠殺時に、全ての動物から、体重、身長、心臓、脾臓、腎臓、副腎および肝臓の重量を記録した。１群当たり４匹の動物から、副腎、小脳、頚椎、胸椎および腰椎、性腺（精巣および卵巣）、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、雄の前立腺、骨格筋（腓腹筋およびヒラメ筋）、脾臓、ならびに胸腺を、病理学的評価およびＥＬＩＳＡアッセイのために収集した。
【０２７３】
１群当たりその他の４匹の動物の小脳（歯状核を含む）、頚部、胸部および腰部の後根神経節、心臓、腎臓、肝臓、肺、性腺、膵臓、骨格筋（腓腹筋およびヒラメ筋）、ならびに脾臓を収集し、分子生物学的検査のために即時に急速凍結した。
【０２７４】
結果
見込みのあるバイオマーカーの同定
多様なバイオマーカーのレベルを、３つの群のマウス、すなわち、未治療Ｍｃｋ陽性対照、未治療Ｍｃｋ突然変異マウス、および治療Ｍｃｋ突然変異マウスにおいて決定した；これらのマウスに、ＦＸＮ遺伝子を含み、ＨＡタグペプチドをコードする核酸をさらに含むｒＡＡＶ２ｉ８（ＡＡＶ−ＦＸＮ−ＨＡ）の１回用量を投与した。
【０２７５】
血漿中のガレクチン−３およびＨ−ＦＡＢＰの測定
５週齢時（治療Ｍｃｋ突然変異マウスについては、ＡＡＶ治療の２週間）、および８週齢時（治療Ｍｃｋ突然変異マウス群については、ｒＡＡＶ治療の５週間）に、イソフルラン麻酔の後の後眼窩穿刺により、血液を収集し、ガレクチン−３およびＨ−ＦＡＢＰのレベルを、標準的な方法を使用して測定した。
【０２７６】
ガレクチン−３
５週齢時には、ガレクチン−３のレベルは、未治療Ｍｃｋ陽性対照群および治療Ｍｃｋ突然変異マウス群において、未治療Ｍｃｋ突然変異マウス群と比較してより高くなる傾向があるとしても、３つの群間で同等であった。
【０２７７】
表３に示すように、８週齢時には、ガレクチン−３のレベルは、未治療Ｍｃｋ突然変異群においては、陰性対照群よりも顕著に低かった。ガレクチン−３のレベルは、実験群においては、陰性対照群よりも低くなる傾向があり、一方、実験群と陽性対照群との間では同等であった。
【０２７８】
【表３】
0006767483.tif 000004
【０２７９】
驚くべきことに、未治療Ｍｃｋ陽性対照群のマウスが示したガレクチン−３のレベルは、８週齢時に、５週齢時よりも高く、一方、未治療Ｍｃｋ突然変異マウス群および治療Ｍｃｋ突然変異マウス群については、８週齢時のガレクチン−３のレベルは、５週齢時のレベルと同等であった。
【０２８０】
結論として、Ｍｃｋマウスに対するこの研究のためには、ガレクチン−３は、適切な心臓バイオマーカーでないようである。ガレクチン−３が適切なバイオマーカーであるのであれば予測される、このパラメータの増加を、未治療Ｍｃｋ突然変異マウス群のマウスは示さなかった。
【０２８１】
Ｈ−ＦＡＢＰ
検出の標準的な方法を使用して、同じサンプル群内のマウス間で、Ｈ−ＦＡＢＰレベルの大きな変動が観察された。
【０２８２】
表４に示すように、Ｈ−ＦＡＢＰの血中レベルは、５週齢時および８週齢時の両方において、マウスの３つの群間で同等であった。
【０２８３】
【表４】
0006767483.tif 000005
【０２８４】
各群において、５週齢と８週齢との間で、Ｈ−ＦＡＢＰレベルの顕著な変化は観察されなかった。
【０２８５】
結論として、Ｍｃｋマウスに対するこの研究のためには、Ｈ−ＦＡＢＰは、適切な心臓バイオマーカーでないようである；未治療Ｍｃｋ突然変異群において、このパラメータの予測される増加が観察されず、重要な変動が、同じ群中のマウス間で観察された。
【０２８６】
心臓ホモジネート中のＳＤＨ活性
研究の終了時（８週齢時、治療突然変異マウス群においては、ＡＡＶ治療の５週間）に収集した心臓から得られた心臓ホモジネート中で、ＳＤＨ活性を、標準的な方法を使用して測定した。各群を、４匹のマウスで構成した。
【０２８７】
表５に示す結果から、ＳＤＨ活性が、マウスの３つの群間で同等であったことが示されている。未治療Ｍｃｋ陽性対照群において、未治療Ｍｃｋ突然変異群と比較して、ＳＤＨ活性の減少は観察されなかった。
【０２８８】
【表５】
0006767483.tif 000006
【０２８９】
ＳＤＨ活性の重要な変動が、同じ群中のマウス間で観察された。さらに、未治療Ｍｃｋ陽性対照群において、ＳＤＨ活性の予測される減少も観察されなかった。
【０２９０】
心臓、骨格筋および肝臓のホモジネート中のフラタキシンのレベル
屠殺時に収集した心臓、骨格筋および肝臓から、ヒトフラタキシンタンパク質のレベルを、標準的な方法を使用して測定し、これを、表６に示す。
【０２９１】
未治療Ｍｃｋ陽性対照群および未治療Ｍｃｋ突然変異群の、調べた組織（心臓、骨格筋および肝臓）のいずれにおいても、ヒトフラタキシンは検出可能でなかった（すなわち、レベルが、アッセイの最低検出限界［ＬＬＤ］未満であった）。
【０２９２】
ｒＡＡＶ−ＦＸＮを投与した治療Ｍｃｋ突然変異マウスにおいては、ヒトフラタキシンタンパク質が、心臓ホモジネート中では、３８．３５±１．９９ｎｇ／ｍｇのレベルで検出され、骨格筋中では、より低い濃度、すなわち、４．５７±０．３９ｎｇ／ｍｇで検出された。さらに、肝臓中でも、微量のヒトフラタキシン（０．０７±０．０１ｎｇ／ｍｇのタンパク質）が検出された。
【０２９３】
【表６】
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【０２９４】
これらのデータから、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）のマウスモデルにおいて、ＦＸＮ遺伝子を含むｒＡＡＶベクターを用いる治療により、フラタキシンのレベルを増加させることができることが示されている。さらに、これらのデータから、ｒＡＡＶ−ＦＸＮの全身投与により、ＦＸＮのレベルを、ｉｎ  ｖｉｖｏで増加させることができ、その結果、ＦＸＮのレベルが、心臓において増加し、骨格筋においてより低い程度で増加し、肝臓においてさらにより低いレベルで増加することも示されている。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＸＮのレベルを、影響を受けている組織、例えば、心臓および骨格筋において選択的に増加させることができ、一方、ＦＸＮの送達が必要でない、かつ／または望まれないところ、すなわち、肝臓では、ＦＸＮの送達が最小限に留まることを、これらのデータは示している。
【０２９５】
肉眼所見
未治療Ｍｃｋ陽性対照雄マウスは、未治療Ｍｃｋ突然変異動物および治療Ｍｃｋ突然変異ＡＡＶ動物と比較して有意により長かった（９．３９ｃｍ対８．８９ｃｍ［＋５．６２％］、Ｐ＝０．０１１［ｔ検定］）。その他の顕著な、眼に見える病変は観察されず、とりわけ、雄および雌の両方の心臓重量においては、眼に見える病変も顕著な変化も観察されなかった。
【０２９６】
組織学的検査
心臓
最低限の間質線維症が、１匹の未治療Ｍｃｋ陽性対照動物（５８番）において観察された。未治療Ｍｃｋ陽性対照群のその他の３匹の心臓は全て、正常であった。
【０２９７】
しかし、分析した未治療Ｍｃｋ突然変異動物の４匹全てにおいて、最低限（３８番のマウス）ならびに中等度（４１番、４９番および８１番のマウス）の間質線維症が観察された。この病変は、３８番（最低限）および８１番（若干）のマウスにおいては、心筋細胞の腫大の心内膜病巣に関連していた。線維症は、４１番および４９番のマウスにおいては、中等度のマクロファージの炎症、最低限の散在性の腫大、および心筋細胞の若干の空砲形成に関連していた。４１番および８１番のマウスにおいて、アニチコフ（Ａｎｉｔｓｃｈｋｏｗ）（フクロウの目の形状）の核が観察された。
【０２９８】
未治療Ｍｃｋ突然変異コホートとは全く対照的に、全体的な評価として、ｒＡＡＶ−ＦＸＮ治療Ｍｃｋ突然変異マウスの心臓は、４７番および１３番のマウスにおいて、アニチコフの核がわずかに観察されることを除いて、正常に見えた。
【０２９９】
腎臓
全ての群において、複数の髄質尿細菅の管腔中に、顕著な石灰化が頻繁に観察された。頻度は、未治療Ｍｃｋ陽性対照動物については、４／４であり（とはいえ、これらはＣｒｅ導入遺伝子を発現する）、未治療Ｍｃｋ突然変異動物については、３／４であり、ｒＡＡＶ−ＦＸＮの１回用量を投与した治療Ｍｃｋ突然変異動物については、２／４であった。石灰化の重症度は、ｒＡＡＶ治療Ｍｃｋ突然変異群においては、未治療Ｍｃｋ陽性対照群および未治療Ｍｃｋ突然変異群と比較して減少しているように見えた。尿細管の好塩基球増加（再生）が、未治療Ｍｃｋ陽性対照群の４匹中２匹の動物において、未治療Ｍｃｋ突然変異群の４匹中３匹の動物において、およびＡＡＶ治療Ｍｃｋ突然変異群の１匹の動物において観察された。
肝臓：１匹の未治療Ｍｃｋ陽性対照動物（３８番）において、最低限の門脈周囲の炎症が観察された。
肺：１匹の未治療Ｍｃｋ突然変異動物（４１番）において、若干の気管支周囲の炎症が観察された。
【０３００】
その他の顕著な顕微鏡的病変は観察されなかった。とりわけ、脊髄、後根神経節および小脳は全て正常であった。
【０３０１】
心エコー
治療の前の基礎表現型
心エコーの測定により、未治療Ｍｃｋ突然変異雄マウスにおいて、未治療Ｍｃｋ陽性対照と比較して、左心室機能の低下が示された。心臓のこの機能低下は、左心室（ＬＶ）の収縮性（内径短縮率および駆出率）の減少、ならびに収縮期および拡張期の両方におけるＬＶ体積の増加により特徴付けられる。その段階では、未治療Ｍｃｋ突然変異雌マウスにおいて、心臓の表現型は観察されなかった。
【０３０２】
図４に、（Ａ）雄および（Ｂ）雌の３週齢時の心エコーによる収縮機能およびＬＶ体積の評価のグラフを示す。データは、１群当たり８匹のマウスの平均±標準誤差である。ｔ検定多重比較（シダック−ボンフェローニの方法）を使用して、（治療および未治療の両方の）Ｍｃｋ突然変異マウスのデータを、未治療Ｍｃｋ陽性対照群と比較した。＊ｐ＜０．０５。
【０３０３】
ｒＡＡＶ治療の１４日後（５週齢）の結果
ＦＲＤＡ心筋症の治療のための遺伝子療法のアプローチの可能性を検討するために、３週齢の突然変異マウスに、ＡＡＶ．ＦＸＮ−ＨＡの単回静脈内注射を１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した（治療Ｍｃｋ突然変異群）。注射の１４日後（５週齢時）に、治療Ｍｃｋ突然変異雄において、心エコーの測定により、心臓の血行動態（心拍出量）の改善、およびほぼ正常な形態学的発育（収縮性、ＬＶ筋重量）が示された。対照的に、未治療Ｍｃｋ突然変異マウスにおいては、心臓の機能低下が依然として観察された。驚くべきことに、雌の場合には、治療マウスであれ、未治療マウスであれ、全てのＭｃｋ突然変異マウスにおいて、心臓の収縮性の欠陥が観察された。
【０３０４】
図５Ａおよび図５Ｂに、雄（図５Ａ）および雌（図５Ｂ）の５週齢時の心エコーによる収縮機能およびＬＶ体積の評価を示す。データは、１群当たり８匹のマウスの平均±標準誤差である。ｔ検定多重比較（シダック−ボンフェローニの方法）を使用して、突然変異マウスのデータを、対照群と比較した。＊ｐ＜０．０５。
【０３０５】
ｒＡＡＶ治療の２８日後（７週齢時）の結果
ｒＡＡＶ治療の２８日後（７週齢時）に、治療Ｍｃｋ突然変異雄および治療Ｍｃｋ突然変異雌は、完全に正常化し、それらのマウス間でも未治療Ｍｃｋ陽性対照マウスとも区別できなくなった。治療Ｍｃｋ突然変異マウスにおいて、このこと、すなわち、心臓疾患の完全な矯正（雄）および予防（雌）が示された。対照的に、未治療Ｍｃｋ突然変異マウスにおいては、左心室内径短縮率および心拍出量の著しい減少ならびに左心室肥大を伴って、心臓の機能低下が迅速に進行した。
【０３０６】
図６Ａ〜図６Ｃに、未治療Ｍｃｋ陽性対照ならびに治療および未治療のＭｃｋ突然変異マウスについて、心エコーによる左心室筋重量（ＬＶｍ）、内径短縮率（ＳＦ）および心拍出量の評価を使用して、連続して数週間にわたり得たデータを示すグラフを示す。データは、１群当たり８匹のマウスの平均±標準誤差である。ｔ検定多重比較（シダック−ボンフェローニの方法）を使用して、Ｍｃｋ突然変異マウスのデータを、未治療Ｍｃｋ陽性対照群と比較した。＊ｐ＜０．０５。
【０３０７】
結論
心エコーの結果
この研究では、検出可能な赤血球凝集素タグ（ＨＡ）を任意選択でさらに含むｒＡＡＶ−ＦＸＮベクター（これを、本明細書ではｒＡＡＶ−ＦＸＮ−ＨＡと呼ぶ）の効能を、１×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で評価した。この用量は、同じＭｃｋマウス心臓特異的フリードライヒ運動失調症マウスモデルにおいて、野生型ＦＸＮをコードするｒｒｈＡＡＶ１０ベクターを使用して以前に記載した用量よりもおよそ５倍少なかった（Ｐｅｒｄｏｍｉｎｉら、２０１４、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０（５）：５４２）。
【０３０８】
図５Ａに示すように、３週齢時に、未治療Ｍｃｋ突然変異雄マウスは、左心室（ＬＶ）機能不全を発症し始め、このことは、同じ群の雌の場合には、同じ週齢で観察されなかった（図５Ｂ）。ＡＡＶ．ＦＸＮ−ＨＡ注射の１４日後（５週齢時）に、心臓の表現型の進行性の矯正が、Ｍｃｋ突然変異雄において観察されたが、この矯正は、Ｍｃｋ突然変異雌においてはより低い程度で観察された。いずれかの特定の理論により拘束される意図はないが、この差は、雌の場合には、雄と比較して心臓の表現型の出現が遅れて始まったこと、またはこのプロトコールにおいてこれまでに使用したマウスの数がより少なかったことに起因し得る。
【０３０９】
これらの結果から、ＦＲＤＡのＭｃｋ突然変異マウスモデルにおいて、ｒＡＡＶ−改変ＦＸＮの全身投与は、心臓疾患の表現型を逆転させることが示唆される。さらに、これらの結果から、ｒＡＡＶ−改変ＦＸＮの投与により、ＦＲＤＡの予防および／または逆転を、それを必要とする対象において行うことができることもさらに示唆される。
【０３１０】
ｒＡＡＶ−ＦＸＮ注射の２８日後に、治療Ｍｃｋ突然変異の雄および雌において、心臓機能の完全な回復が観察された；このことから、注射したＦＸＮ導入遺伝子が病態のロバストな矯正をもたらしたことが示唆される。換言すると、図６Ａ〜図６Ｃに示すデータにより、ｒＡＡＶ−ＦＸＮ投与の２８日後までに、ＦＲＤＡの心臓の表現型において矯正が生じたことが示されている。より具体的には、図６Ａは、左心室筋重量（ＬＶｍ）は、治療Ｍｃｋ突然変異マウスと対照（ＷＴ野生型Ｍｃｋ−Ｃｒｅマウス）とでは区別できないが、未治療Ｍｃｋ突然変異マウス（三角）は、有意により高いＬＶｍを示す（＊ｐ＜０．０５）ことを示している。図６Ｂは、ｒＡＡＶ−ＦＸＮ治療の２８日後までに、陽性対照（ＷＴ  Ｌ３Ｍｃｋ−Ｃｒｅマウス；丸）および治療Ｍｃｋ突然変異（Ｌ−）マウス（四角）の両方が、内径短縮率（ＳＦ）の実質的に同一の測定値を示したことを示すデータを示している。対照的に、図６Ｂは、未治療Ｍｃｋ突然変異マウス（三角）は、大幅に減少したＳＦ（＊ｐ＜０．０５）を示したことを示している。加えて、図６Ｃは、ｒＡＡＶを用いる治療の２８日後までに、治療Ｍｃｋ突然変異マウス（四角）は、対照マウス（丸）と区別できない心拍出量を示し、対照的に、未治療Ｍｃｋ突然変異マウス（三角）は、顕著に減少した心拍出量を示した（三角；＊ｐ＜０．０５）ことを示すデータを示している。ｔ検定多重比較（シダック−ボンフェローニの方法）を使用して、全ての（治療および未治療の）Ｍｃｋ突然変異マウスを、対照の未治療マウスと比較した。図６Ａ〜図６Ｃに示す各グラフに、＊＜０．０５を示す。
【０３１１】
これらのデータから、当該技術分野において認識されているＦＲＤＡマウスモデルにおいて、フラタキシンをコードする改変された核酸を含むｒＡＡＶの投与は、Ｍｃｋ表現型の逆転および／または予防を行うことができることが十二分に示されている。したがって、これらのデータは、ｒＡＡＶ−改変ＦＸＮが媒介する治療が、ＦＲＤＡ、または野生型（例えば、機能性）のフラタキシンのレベルの減少により媒介される疾患、障害もしくは状態の治療または予防を、それを必要とする対象において行うのに有用な治療手段となる可能性があり得ることを裏付けている。これらのデータは、全身投与するｒＡＡＶ−改変ＦＸＮにより、ＦＲＤＡの治療または予防を行うことができることを示しているが、これらの結果は、療法はまた、ｒＡＡＶ−ＦＸＮ投与のその他の経路、例えば、より直接的な経路、例として、これらに限定されないが、頭蓋内または心臓への直接的な投与を含むこともさらに裏付けている。換言すると、全身投与が治療をもたらすことが示されたことから、当業者であれば、本明細書に提供する本開示に基づいて、より直接的な投与経路もまた、治療の利益をもたらすことができることを理解していると予想される。
【０３１２】
これらの結果は、改変されたＦＸＮ遺伝子のｒＡＡＶベクターによる送達を使用する遺伝子療法は、ＦＲＤＡを有する患者のための、および野生型／機能性のフラタキシンのレベルの減少を示す対象において、腎臓結石の治療または予防を行うための治療のアプローチとなる可能性があることを強力に裏付けている。
【０３１３】
（実施例３）
フリードライヒ運動失調症マウスモデルにおけるｒＡＡＶ−ＦＸＮのｉｎ  ｖｉｖｏでの投与の組織学的研究
研究デザイン
Ｃ５７ＢＬ６／Ｎの雄および雌のマウス、８週齢、２４匹を評価して、組織病理学的分析を行った。
【０３１４】
８匹のマウスは、遺伝子工学により作製した機能性ヒトフラタキシン対立遺伝子につながるＭｃｋ−Ｃｒｅ導入遺伝子（ＭＣＫ：筋肉クレアチンキナーゼ）を有した（Ｍｃｋ−Ｃｒｅ×ＦＸＮ  Ｌ３／ＷＴ；以下、「Ｍｃｋ陽性対照マウス」と呼ぶ）。１６匹のマウスは、遺伝子工学により作製した不活性なフラタキシン対立遺伝子にこの場合にはつながる同じ導入遺伝子を有した（Ｍｃｋ−Ｃｒｅ×ＦＸＮ  Ｌ３／Ｌ−；以下、「Ｍｃｋ突然変異マウス」と呼ぶ）。Ｍｃｋ突然変異マウスのうち、８匹に、フラタキシンをコードするｒＡＡＶ２ｉ８（ｒＡＡＶ−ＦＸＮ；１０１３ｖｇ／ｋｇ）を注射した（以下、「治療Ｍｃｋ突然変異マウス」）。残りの８匹のＭｃｋ突然変異マウスには、同等の体積の生理食塩水を投与した（以下、「未治療Ｍｃｋ突然変異マウス」）。陽性対照マウス群（Ｍｃｋ−Ｃｒｅ×ＦＸＮ  Ｌ３／ＷＴ）には、生理食塩水を投与した。下記の表７を参照されたい。
【０３１５】
【表７】
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【０３１６】
方法
屠殺時に、全ての動物から、体重、身長、ならびに心臓、脾臓、腎臓、副腎および肝臓の重量を記録した。１群当たり４匹の動物から、副腎、小脳、頚椎、胸椎および腰椎、性腺（精巣および卵巣）、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、雄の前立腺、骨格筋（腓腹筋およびヒラメ筋）、脾臓、ならびに胸腺を、病理学的評価およびＥＬＩＳＡアッセイのために収集した。
【０３１７】
１群当たりその他の４匹の動物の小脳（歯状核を含む）、頚部、胸部および腰部の後根神経節、心臓、腎臓、肝臓、肺、性腺、膵臓、骨格筋（腓腹筋およびヒラメ筋）、ならびに脾臓を収集し、分子生物学的検査のために即時に急速凍結した。
【０３１８】
組織学的検査
小脳（歯状核を含む）、性腺、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋（腓腹筋およびヒラメ筋）、脾臓、ならびに頚椎、胸椎および腰椎を、ホルマリン固定した。次いで、椎骨を、ＥＤＴＡ溶液を使用して脱灰した。全ての臓器をパラフィン包埋して、５μｍの厚さの切片を得、椎骨（脊髄および後根神経節の両方を含む）ならびに心臓については、横切片を得た。全ての臓器を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。心臓の線維症を、マッソントリクローム染色を使用して評価した。
【０３１９】
ＥＬＩＳＡアッセイ
収集の直後に、心臓の半分、肝臓の右葉、ならびにヒラメ筋および腓腹筋を急速凍結した。
【０３２０】
結果
肉眼所見
Ｍｃｋ陽性対照雄マウスは、未治療Ｍｃｋ突然変異マウスおよび治療Ｍｃｋ突然変異マウスと比較して有意により長かった（９．３９ｃｍ対８．８９ｃｍ［＋５．６２％］、Ｐ＝０．０１１［ｔ検定］）。その他の顕著な、眼に見える病変は観察されず、とりわけ、雄および雌の両方の心臓重量においては、眼に見える病変も顕著な変化も観察されなかった。
【０３２１】
組織学的検査
心臓
Ｍｃｋ−Ｃｒｅ×ＦＸＮ  Ｌ３／ＷＴ：最低限の間質線維症が、１匹のＭｃｋ陽性対照動物（５８番）において観察された。その他の３匹の陽性対照マウスの心臓は全て、正常であった。
【０３２２】
未治療Ｍｃｋ−Ｃｒｅ×ＦＸＮ  Ｌ３／Ｌ−：対照的に、分析した未治療Ｍｃｋ突然変異マウスの４匹全てにおいて、最低限（３８番のマウス）ならびに中等度（４１番、４９番および８１番のマウス）の間質線維症が観察された。この病変は、３８番（最低限）および８１番（若干）のマウスでは、心筋細胞の腫大の心内膜病巣に関連していた。線維症は、４１番および４９番のマウスでは、中等度のマクロファージの炎症、最低限の散在性の腫大、および心筋細胞の若干の空砲形成に関連していた。アニチコフ（フクロウの目の形状）の核が、４１番および８１番のマウスにおいて観察された。
【０３２３】
治療Ｍｃｋ−Ｃｒｅ×ＦＸＮ  Ｌ３／Ｌ−：未治療Ｍｃｋ突然変異マウスとは対照的に、ｒＡＡＶ−ＦＸＮ治療Ｍｃｋ突然変異マウスの心臓は、４７番および１３番のマウスにおいて、アニチコフの核がいくつか観察されることを除いて、正常に見えた。
【０３２４】
腎臓
３つの群全てにおいて、複数の髄質尿細菅の管腔中に、顕著な石灰化が頻繁に観察された。石灰化の頻度は、Ｍｃｋ陽性対照動物については、４／４であり、未治療Ｍｃｋ突然変異動物については、３／４であり、ｒＡＡＶ−ＦＸＮ治療Ｍｃｋ突然変異動物については、２／４であった。石灰化の重症度は、ｒＡＡＶ−ＦＸＮ治療Ｍｃｋ突然変異群においては、Ｍｃｋ陽性対照群および未治療Ｍｃｋ突然変異群と比較して減少しているように見えた。尿細管の好塩基球増加（再生）が、Ｍｃｋ陽性対照マウスの４匹中２匹の動物において、未治療Ｍｃｋ突然変異群の４匹中３匹の動物において、およびｒＡＡＶ−ＦＸＮ治療Ｍｃｋ突然変異群の１匹の動物において観察された。
肝臓：１匹のＭｃｋ陽性対照動物（３８番）において、最低限の門脈周囲の炎症が観察された。
肺：１匹の未治療Ｍｃｋ突然変異動物（４１番）において、若干の気管支周囲の炎症が観察された。
【０３２５】
その他の顕著な顕微鏡的病変は観察されなかった。とりわけ、全ての群で、脊髄、後根神経節および小脳は全て正常であった。
【０３２６】
組織学的検査の結果
組織学的検査については、未治療Ｍｃｋ突然変異マウスの心筋細胞中で観察されたフクロウの目の核、腫大および空砲形成は全て、心臓の変性についての目印である。マクロファージの炎症に関連する間質線維症は、心筋細胞の細胞死に対応し得る。したがって、未治療Ｍｃｋ突然変異マウスの心筋細胞が変性し、このことは、細胞が機能の低下を経験し、病態が進化し、細胞死、およびそれに続く、心不全が生じることを意味する。
【０３２７】
目覚しいことに、ｒＡＡＶ−ＦＸＮの全身性の送達により、この表現型が逆転し、ｒＡＡＶ治療Ｍｃｋ突然変異マウス（雄および雌の両方）は、正常に見え、心筋細胞の変性の顕著な徴候を示さなかった。これらのデータは、ｒＡＡＶ−ｈｕＦＸＮの形質導入は、内因性マウスＦｘｎ遺伝子の不活性化作用を逆転させるのに十分に効率的であることを示している。したがって、さらに、これらのデータは、ｒＡＡＶ−改変ＦＸＮが媒介する全身投与は、野生型（機能性）のフラタキシンのレベルの減少により媒介される疾患、障害または状態、例として、これに限定されないが、フリードライヒ運動失調症の逆転および／または予防を、それを必要とする対象において行うことができることも裏付けている。すでに記載したように、当業者であれば、本開示の教示を基に、その他の投与経路、例えば、頭蓋内および心臓内を含めた、より直接的な経路を使用して、治療の利益を、それを必要とする対象にもたらすことができることを理解していると予想される。
【０３２８】
腎臓の分析により、未治療Ｍｃｋ陽性対照動物および未治療Ｍｃｋ突然変異動物の両方の髄質中の腎臓結石の存在が同定された；これは、稀な病変である。これらの動物に対して、特定の飼料が提案されなかったことと動物の年齢を考慮すると、病変の頻度および重症度から、これは、偶発的な病変ではなく、遺伝子型に関連する病変であることが強力に示唆される。興味深いことに、この病変の重症度が、ｒＡＡＶ−ＦＸＮ治療により部分的に低下した；このことから、腎臓結石の発生は、Ｆｘｎの機能および／またはこのタンパク質のレベルの変化に関連することが示唆される。したがって、マウスフラタキシン遺伝子に、（イントロ領域中ではあるが）ｌｏｘＰ配列が隣接する、いわゆるＬ３対立遺伝子は、低形質アレル対立遺伝子である可能性があると予想される。このことは、電解質の経上皮能動輸送を維持するための、これらの細胞中のミトコンドリアの決定的に重要な役割と一貫性があると予想される。出願人らが理解し、信じる限りでは、確かに、今日まで、フリードライヒ運動失調症の臨床的観察においても、ＦＲＤＡのマウスモデルにおいても、これらの病変について報告されたことはない。
【０３２９】
したがって、本発明は、これらに限定されないが、腎臓結石の発生または成長を含めた、腎臓の疾患、障害または状態の治療または予防を、それを必要とする対象において行う方法を包含し、この場合、腎臓の疾患、障害または状態は、対象において、フラタキシン（例えば、機能性および／または野生型のフラタキシン）のレベルの減少により媒介される。
【０３３０】
一実施形態では、本発明は、対象におけるフラタキシンのレベルを評価し；ある対象におけるフラタキシンのレベルと、腎臓結石に罹患していないことが分かっている対象におけるフラタキシンのレベルとの、および／または別の点でも健常な個体について決定したかもしくは当技術分野で公知である「フラタキシンの標準的なレベル」との比較を行い；当該対象におけるフラタキシンのレベルが、別の点でも健常な個体におけるフラタキシンのレベルよりも少ない場合、および／またはフラタキシンの標準的なレベル未満である場合には、ｒＡＡＶ−改変フラタキシンを当該対象に投与し、それにより、腎臓結石の治療および／または予防を対象において行うことを含む。
【０３３１】
最後になるが、ＨＡ染色を使用して、細胞内のｒＡＡＶ−ＦＸＮ−ＨＡを検出することができる。第一点として、心臓機能を修復または維持するために、いくつの細胞がＦＸＮを発現すべきであるかを定量化するのに、このことが重要となると予想される。第二点として、Ｍｃｋ遺伝子（およびしたがって、Ｍｃｋプロモーターが推進するＣｒｅリコンビナーゼ）は、予測では、腎臓においては発現しない。腎臓結石の形成が、髄質のホメオスタシスに対するＨＡ−ＦＸＮの予想外の直接的な作用であるか否かを解明するのに、腎臓におけるｒＡＡＶ−ＦＸＮ−ＨＡの検出の有無を役立てることができる。
【０３３２】
結論
要するに、本明細書に提示したデータは、改変されたＦＸＮ遺伝子をコードするｒＡＡＶの投与は、全身投与でさえ、フラタキシンの減少または不在と関連がある作用の治療（予防および／または逆転）を行うことができることを示している。したがって、ｒＡＡＶが媒介するフラタキシンの、それを必要とする細胞および対象における発現は、フラタキシンの欠如もしくは欠損と関連があるか、またはフラタキシンの欠如もしくは欠損により媒介される疾患または障害、例として、これに限定されないが、フリードライヒ運動失調症の治療を行う有用な治療手段となり得ることを、データは裏付けている。
【０３３３】
開示する教示を、多様な適用例、方法、キットおよび組成物を参照して記載してきたが、多様な変化形態および改変形態を、本明細書の教示および下記の特許請求の範囲から逸脱することなく作製することができることが理解されると予想される。開示する教示をより良好に例証するために、上記の実施例を提供するが、これらの実施例には、本明細書に提示する教示の範囲を制限する意図はない。提示する教示を、これらの例示的な実施形態に関して記載してきたが、過度の実験をせずとも、これらの例示的な実施形態の多数の変更形態および改変形態が可能であることを当業者は容易に理解していると予想される。そのような変更形態および改変形態は全て、現在の教示の範囲に属する。
【０３３４】
特許、特許出願、論文、教科書等を含めた、本明細書に引用する参考文献全て、およびそれらの中に引用されている参考文献は、ここにおいて改めて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。組み込まれている文献および類似の材料の１つまたは複数が、これらに限定されないが、用語の定義、用語の使用法、記載する技法等を含めた、本出願と異なるかまたは矛盾する場合には、本出願が優先する。
【０３３５】
上記の記載および実施例により、本発明の特定の具体的な実施形態を詳述し、発明者らが企図する最もよいモードを記載する。しかし、いかに詳細に上記の記載が書かれているように見えようとも、本発明は、多くの様式で実行することができ、添付の特許請求の範囲およびその中の請求項の任意の均等物に従って解釈すべきであることが理解されると予想される。
【０３３６】
【表８−１】
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【０３３７】
【表８−２】
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【０３３８】
【表８−３】
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【０３３９】
【表８−４】
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【０３４０】
【表８−５】
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【０３４１】
【表８−６】
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【０３４２】
【表８−７】
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【０３４３】
【表８−８】
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【０３４４】
【表８−９】
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【０３４５】
【表８−１０】
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【０３４６】
【表８−１１】
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【０３４７】
【表８−１２】
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【０３４８】
【表８−１３】
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【０３４９】
【表８−１４】
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【０３５０】
【表８−１５】
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【０３５１】
【表８−１６】
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【０３５２】
【表８−１７】
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【０３５３】
【表８−１８】
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【０３５４】
【表８−１９】
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【０３５５】
【表８−２０】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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