(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子を血漿試料から精製する方法であって、
ａ）免疫グロブリンである標的分子を含む血漿試料を提供すること
ｂ）荷電密度が６００〜１２００μｍｏｌ／ｇのアニオン交換基に調節されている、アニオン交換基を有するポリビニルエーテルマトリクス上のイオン交換クロマトグラフィーに前記血漿試料を供し、それによって精製された免疫グロブリンである標的分子がマトリクスから溶出されることによる前記方法。
【請求項２】
マトリクスが群ａ）からの少なくとも１つの化合物と群ｂ）からの少なくとも１つの化合物との共重合によって得ることができるコポリマーであることを特徴とし、
ａ）が式Ｉ
【化１】
0006769695.tif 000009
式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、互いに独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはＨまたは−ＣＨ３であり得、
およびＲ４は少なくとも１つのヒドロキシル基を有するラジカルである、
で表される、少なくとも１つの親水性置換されたアルキルビニルエーテルであり、
および
ｂ）が式ＩＩおよび／またはＩＩＩおよび／またはＩＶに従う少なくとも１つの架橋剤であり、
【化２】
0006769695.tif 000010
式中Ｘは、２〜５個のＣ原子、好ましくは２または３個のＣ原子を有する二価のアルキルラジカルであり、ここで、隣接せず、およびＮのすぐ近傍に位置していない１または２以上のメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えてもよく、およびメチレン基の１または２以上のＨ原子は、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキル−ＯＨによって置換されてもよい、および
【化３】
0006769695.tif 000011
式中式ＩＩＩおよびＩＶにおけるＹ１およびＹ２は、互いに独立して、
Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはシクロアルキルであり、ここで１または２以上の隣接していないメチレン基、またはＮのすぐ近傍に位置していないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えてもよく、およびメチレン基の１または２以上のＨは、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキル−ＯＨによって置換されてもよい、
または、Ｃ６〜Ｃ１８アリールであり、ここでアリールシステムにおける１または２以上のＨは、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキル−ＯＨによって置換されてもよく、および
Ａは、２〜５個のＣ原子、好ましくは２または３個のＣ原子を有する二価のアルキルラジカルであり、ここで１または２以上の隣接していないメチレン基またはＮのすぐ近傍に位置していないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えてもよく、およびメチレン基の１または２以上のＨは、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキル−ＯＨによって置換されてもよい、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マトリクスが、１，４−ブタンジオールモノビニルエーテル、１，５−ペンタンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテルまたはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテルおよびジビニルエチレン尿素（１，３−ジビニルイミダゾリン−２−オン）の群から架橋剤として選択される親水性置換されたアルキルビニルエーテルの共重合によって得ることができることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
セリウム触媒グラフト重合にポリビニルエーテルマトリクスを供することによってイオン性基がマトリクスに付加されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ポリビニルエーテルマトリクスが、７００〜１１００μｍｏｌ／ｇの正に荷電したアニオン交換基を有するグラフトポリマーを有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
アニオン交換基が、トリメチルアンモニウムアルキルであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
イオン交換クロマトグラフィーが、フロースルーモードにおいて行われることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
標的分子が、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミン、および第ＸＩａ因子から分離されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）におけるマトリクスが、ｐＨ４〜７．４を有するバッファーで溶出されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
試料が、試料においてリットルのマトリクス当たり２５〜１５０ｇのタンパク質の量でマトリクスに適用されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）におけるマトリクスのローディングおよび溶出が、０．００５〜１Ｍの酢酸を含む酢酸バッファーで行われることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
マトリクスが、２０〜２５０μｍの平均粒径を有する粒子から作られることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
後続ステップｃ）におけるマトリクスからの標的分子の溶出後、マトリクスがステップｂ）において使用されるバッファーのｐＨより低いｐＨを有するバッファーで溶出され、それによってＩｇＡ、ＩｇＭおよび第ＸＩａ因子がマトリクスから溶出されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿からの免疫グロブリンのような標的分子の精製に関する。親水性の化学的に安定なポリビニルエーテル樹脂に基づくイオン交換体の所定の種類の使用は、とりわけ高収量の標的分子もたらす。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
ヒトおよび動物の血液は例えば治療特性を有する多くのタンパク質および酵素を含む。これらのタンパク質のいくつかは、赤血球において見出され得る一方、他は血漿または血清の溶液において見出される。かかるタンパク質は、ヒト治療剤としての使用のためのタンパク質の精製および標準化を目的とした大規模かつ特異的な単離のための標的である。治療使用のために単離された突出した血液タンパク質の例：アルブミン、免疫グロブリンＧ、第ＩＸ因子、第ＶＩＩＩ因子およびアルファ−１−プロテイナーゼインヒビター。これらのタンパク質のいくつかは、年間数千ｋｇ（アルブミンおよびＩｇＧ）の規模で製造される一方、他は年間グラム〜キログラム規模のみで製造される。しかしながら、世界的な規模では、年間数百万リットルの血液がこれらのタンパク質を単離する目的のために処理される。
【０００３】
血液、血漿および血清は、関心のタンパク質（単数または複数）または酵素（単数または複数）以外の 多くの他の種類の化合物を含む、極めて複雑なタンパク質含有溶液である。この種類の試料からの特異的な標的分子の単離は、洗練されかつ多くの場合に多段階の精製手順を必要とする。
【０００４】
とりわけ免疫グロブリンＧの現在の製造方法の１つの共通の課題は、出発材料の総ＩｇＧ含有量の少なくとも３０％〜３５％と推定される、精製方法間の免疫グロブリンＧの実質的な損失である。一度の負荷は、ウイルス不活性化の質および副反応を引き起こし得る不純物の欠如を維持する一方、ＩｇＧの収量を増大させる。現在のＩｇＧの製造レベルでは、収量の小さな増加と考えられ得るものは実際に極めて重要である。効率の２％の増加でさえ、収量および生産性の顕著な増加を生じるであろう。
したがって、ＩｇＧ製品を製造するための改善されかつより効率的な方法について需要が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の簡潔な説明
所定の種類のクロマトグラフィー材料またはマトリクスは、血漿試料からの標的分子のアニオン交換精製のために極めて効果的に使用できることが見出されている。マトリクスは、６００〜１２００μｍｏｌ／ｇのアニオン基を有する親水性のポリビニルエーテルである。標的分子は、極めて高収量および優れた純度で得ることができる。
【０００６】
本発明は、したがって、
ａ）標的分子を含む血漿試料を提供すること
ｂ）６００〜１２００μｍｏｌ／ｇのアニオン交換基を有するポリビニルエーテルマトリクス上のイオン交換クロマトグラフィーに対して前記血漿試料を供し、それによって精製された標的分子がマトリクスから溶出されること
によって血漿試料から標的分子を精製するための方法を対象とする。
【０００７】
好ましい態様において、マトリクスは、群ａ）およびｂ）からの少なくとも１つの化合物の共重合によって形成されるコポリマーであって、
ａ）が、式Ｉ
【化１】
0006769695.tif 000002
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３は、互いに独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはＨまたは−ＣＨ３であり得、
およびＲ４は、少なくとも１つのヒドロキシル基を有するラジカルである、
で表される少なくとも１つの親水性置換されたアルキルビニルエーテルであり、
ならびに
【０００８】
ｂ）が、式ＩＩおよび／またはＩＩＩおよび／またはＩＶに従う少なくとも１つの架橋剤であり、
【化２】
0006769695.tif 000003
ここでＸは、２〜５個のＣ原子、好ましくは２または３個のＣ原子を有する二価のアルキルラジカルであり、式中、Ｎに隣接しておらずかつＮのすぐ近傍に位置していない１または２以上のメチレン基が、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えてもよく、およびメチレン基の１または２以上のＨ原子は、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ＮＨ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキル−ＯＨによって置換されてもよい、ならびに
【０００９】
【化３】
0006769695.tif 000004
ここで式ＩＩＩおよびＩＶにおけるＹ１およびＹ２は、互いに独立して、
Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはシクロアルキルであり、ここで１または２以上の隣接していないメチレン基またはＮのすぐ近傍に位置していないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えてもよく、およびメチレン基の１または２以上のＨは、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ５〜Ｃ１０−アリール、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６−アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキル−ＯＨによって置換されてもよい、
【００１０】
またはＣ６〜Ｃ１８アリールであり、ここでアリールシステムにおける１または２以上のＨは、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキル−ＯＨによって置換されてもよい、および
Ａは、２〜５個のＣ原子、好ましくは２または３個のＣ原子を有する二価のアルキルラジカルであり、式中、１または２以上の隣接していないメチレン基またはＮのすぐ近傍に位置していないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えてもよく、およびメチレン基の１または２以上のＨは、互いに独立してヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキル−ＯＨによって置換されてもよい。
【００１１】
式ＩにおけるＲ４は、典型的には、アルキルラジカル、シクロ脂肪族ラジカルまたは少なくとも１つのヒドロキシル基を有するアリールラジカルである。
極めて好ましい態様において、マトリクスは、１，４−ブタンジオールモノビニルエーテル、１，５−ペンタンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテルまたはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテルの群から選択される用いた親水性置換されたアルキルビニルエーテルの共重合によって形成され、および
架橋剤としてジビニルエチレン尿素（１，３−ジビニルイミダゾリン−２−オン）である。
好ましい態様において、イオン性基は、ポリビニルエーテルマトリクスをセリウム触媒グラフト重合に供することによってマトリクスに付加される。これは好ましくはＵＳ  ５４５３１８６の第９頁の例８によって行われ、ここで好ましくは荷電した基は正に荷電したトリメチルアンモニウムアルキル基である。
【００１２】
好ましい態様において、イオン交換基は、正に荷電したトリメチルアンモニウムアルキル基である。
好ましい態様において、イオン交換クロマトグラフィーは、フロースルーモードにおいて行われる。
好ましい態様において、標的分子は、免疫グロブリン、好ましくはヒト免疫グロブリン、最も好ましくはヒト免疫グロブリンＧである。
別の態様において、標的分子は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミン、トランスフェリンおよび第ＸＩａ因子から分離される。
【００１３】
別の態様において、ステップｂ）におけるマトリクスは、ｐＨ４〜７．４を有するバッファーで溶出される。
一態様において、試料は、リットルのマトリクス当たりの試料において、２５〜１５０ｇのタンパク質の量のマトリクスに適用される。
好ましい態様において、ステップｂ）におけるマトリクスのローディングおよび溶出は、０．００５〜１Ｍ酢酸を含む酢酸バッファーで行われる。
一態様において、マトリクスは、２０〜２５０μｍの平均粒径を有する粒子から作られる。
【００１４】
マトリクスの孔径（例えば、孔半径）は、表面改質反応前の粒子の孔径を指し、逆サイズ排除クロマトグラフィーによって決定される。決定のための手順は、文献（Journal of Chromatography A, Volume 1037, Issues 1-2, Pages 273-282）に記載されている。
一態様において、孔半径は３０〜１５０ｎｍである。
【００１５】
一態様において、ステップｂ）におけるマトリクスからの標的分子の溶出後、後続ステップｃ）においてマトリクスは、ステップｂ）において使用されたバッファーのｐＨよりも低いｐＨを有するバッファーで溶出され、それによって産物を含有するＩｇＭはマトリクスから溶出される。
一態様において、ステップｂ）におけるマトリクスからの標的分子の溶出後、後続ステップｃ）において、マトリクスは、ステップｂ）において使用されたバッファーのｐＨよりも低いｐＨを有するバッファーで処理され、それによってＩｇＡ、ＩｇＭ、および第ＸＩａ因子はマトリクスから溶出される。
【００１６】
定義
本発明を詳細に説明する前に、本発明は特定の組成物または方法ステップに限定されるものではないこと（それらが変化し得るため）を理解すべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとおり、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り複数のものを含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「リガンド」を指すことは、複数のリガンドを含み、「抗体」を指すことは複数の抗体などを含む。
特に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、一般的に、本発明が関連する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。以下の用語は、本明細書に記載されるとおり、本発明の目的について定義される。
【００１７】
本明細書で使用されるとおり、用語「標的分子」は、試料における１または２以上の他の構成成分、例えば不純物などから単離、分離または精製されなければならないあらゆる分子、物質または化合物を指す。標的分子の例は、抗体、フラグメント 抗原結合(Fab)、フラグメント定常領域(Fc)、タンパク質、 ペプチド、組換えタンパク質、他の天然化合物である。好ましい態様において、標的分子はタンパク質である。極めて好ましい態様において、標的分子は抗体である。とりわけ好ましい態様において、標的分子は免疫グロブリンである。製造および／または精製方法において、標的分子は、典型的には液体に存在する。液体は水、バッファー、エタノールのような非水性溶媒、またはそれらのあらゆる混合物であってもよいだろう。標的分子に加えて、前記液体は、１または２以上の不純物を含んでもよい。液体の組成物は、行われる方法ステップに依存して製造および／または精製の間に変化し得る。クロマトグラフィーステップ後、液体は、典型的には、クロマトグラフィーステップにおいて溶離液を使用するため、それ以前の他の溶媒を含む。標的分子は、典型的には極めて最後の精製ステップ後にのみ最終的な剤形を製造するために乾燥させてもよい。
【００１８】
用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。「抗体」または「ＩｇＧ」は、分析物（抗原）に特異的に結合し、認識する、免疫グロブリン遺伝子（単数）または免疫グロブリン遺伝子（複数）によって実質的にコードされるポリペプチド、またはそのフラグメントをさらに指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、それぞれ順番に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを定義する。
【００１９】
代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、ポリペプチド鎖の２つのペア、各ペアは１つの「軽」（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有し、前記鎖は例えば、鎖間ジスルフィド結合によって安定化している、から構成されている。各鎖のＮ末端は抗原認識に主に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。用語、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）はこれらの軽鎖および重鎖をそれぞれ指す。
【００２０】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよく、モノマーまたはポリマーの形態で存在してもよく、例えば、五量体の形態で存在するＩｇＭ抗体および／またはモノマー、ダイマーまたは多量体の形態で存在するＩｇＡ抗体である。抗体は、それらがリガンド特異的な結合ドメインを含むように保持するか、または改変される限り、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントもまた含んでもよい。用語「フラグメント」は、無処理もしくは完全な抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む、抗体もしくは抗体鎖の一部もしくは部分を指す。フラグメントは、無処理もしくは完全な抗体または抗体鎖の化学的または酵素的処理を介して得ることができる。フラグメントは、組換え手段によって得ることもできる。組換えで製造されるとき、フラグメントは、単独または融合タンパク質と称されるより大きなタンパク質の部分として発現してもよい。代表的なフラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃおよび／またはＦｖフラグメントを含む。代表的な融合タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質を含む。本発明によって、融合タンパク質もまた用語「抗体」によって包含される。
【００２１】
いくつかの態様において、抗体は、タンパク質、例えば免疫グロブリンを含有するＦｃ領域である。いくつかの態様において、タンパク質を含有するＦｃ領域は、別のポリペプチドまたはそのフラグメントに融合された免疫グロブリンのＦｃ領域を含む組換えタンパク質である。代表的なポリペプチドは、例えば、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンα−鎖；インスリンβ−鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、およびフォン・ヴィレブランド因子など；抗凝固因子、例えばタンパク質Ｃなど；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼまたは組織種類プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）など；ボンベシン；トロンビン；
【００２２】
造血成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T- cell expressed and secreted）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミンなど；ミュラー管阻害物質；リラキシンα−鎖；リラキシンβ−鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えばβ−ラクタマーゼなど；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）（例えばＣＴＬＡ−４）；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）など、または神経成長因子、例えばＮＧＦ−βなど；
【００２３】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えばαＦＧＦおよびβＦＧＦなど；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−アルファおよび、ＴＧＦ−βｌ、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含む、ＴＧＦ−βなど；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（ｌ−３）−ＩＧＦ−Ｉ（ｂｒａｉｎ  ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、およびＣＤ４０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；
【００２４】
インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、および−γなど；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−Ｉ〜ＩＬ−ＩＯ；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの部分など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤｌ  Ｉａ、ＣＤｌ  Ｉｂ、ＣＤｌ  Ｉｃ、ＣＤ  １８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭなど；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体など；および上記に列記したあらゆるポリペプチドのフラグメントおよび／または変形を含む。さらに、本発明による抗体は、上記に列記したあらゆるポリペプチドに特異的に結合する、あらゆるタンパク質またはポリペプチド、フラグメントまたはその変形である。
【００２５】
本明細書で使用されるとおり、および特に明記しない限り、用語「試料」は、標的分子を含有するあらゆる組成物または混合物を指す。試料は、生物学的または他のソースに由来してもよい。生物学的ソースは、動物またはヒトのような真核生物的ソースを含む。好ましい試料は、哺乳動物に由来する血液または血漿試料である。試料は、標的分子とともに混合されて見出される希釈剤、バッファー、洗剤、および汚染種（contaminating species）などもまた含んでもよい。試料は、「部分的に精製され」（すなわち、１または２以上の精製ステップ、例えば濾過または遠心分離ステップなどに供され）てもよく、または標的分子を産生する生体から直接的に得てもよい。血漿試料は、血漿または血漿の部分を含むあらゆる試料である。
【００２６】
用語「不純物」または「汚染物質」は、本明細書で使用されるとおり、生物学的高分子、例えば、１または２以上の異質または好ましくない分子から分離される標的分子を含有する試料に存在し得る、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１または２以上の宿主細胞タンパク質、核酸、エンドトキシン、脂質、合成起源の不純物および１または２以上の添加剤などを含む、あらゆる異質または好ましくない分子を指す。また用語「不純物」または「汚染物質」は、本明細書で使用されるとおり、患者にアレルギー反応を引き起こす免疫グロブリンＡならびに免疫グロブリンＭのような標的分子から分離される必要がある所定の免疫グロブリンに適用することもできる。さらに、かかる不純物は、製造および／または精製方法のステップに使用されるあらゆる試薬を含んでもよい。
【００２７】
用語「精製する」、「分離する」または「単離する」は、本明細書で交換可能に使用されるとおり、標的分子および１または２以上の他の構成成分、例えば不純物を含む組成物または試料からそれを分離することによって標的分子の純度を増加させることを指す。典型的には、組成物から少なくとも１つの不純物を除去する（完全にまたは部分的に）ことによって標的分子の純度は増加する。
【００２８】
用語「クロマトグラフィー」は、混合物に存在する他の分子から関心の分析物（例えば標的分子）を分離するあらゆる種類の技術を指す。通常、標的分子は、混合物の個々の分子が移動相の影響下で、または結合および溶出方法において静置（stationary）培地またはマトリクス中を移動する速度の相違の結果として他の分子から分離される。クロマトグラフィー分離方法の例は、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび混合モードクロマトグラフィーである。
【００２９】
「バッファー」は、その酸塩基コンジュゲート構成成分の作用によるｐＨの変化に耐える溶液である。例えば、バッファーの所望のｐＨに依存して用いることができる様々なバッファーは、Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975)に記載されている。バッファーの非限定的な例は、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ホスファート、酢酸、シトラート、スクシナート、およびアンモニウムバッファー、ならびにこれらの組み合わせを含む。
【００３０】
用語「マトリクス」または「クロマトグラフィーマトリクス」は、本明細書で交換可能に使用され、分離方法において、混合物に存在する他の分子から標的分子（例えば、例えば免疫グロブリンなどのタンパク質を含有するＦｃ領域）を分離する、あらゆる種類の粒状吸着剤、樹脂または固相を指す。通常、標的分子は、混合物の個々の分子が移動相の影響下で、または結合および溶出方法においてマトリクス中を移動する速度の相違の結果として他の分子から分離される。樹脂粒子からなるマトリクスは、カラムまたはカートリッジに入れることができる。典型的には、マトリクスは１または２以上の種類のリガンドを有する。
【００３１】
「リガンド」は、クロマトグラフィーマトリクスに付加され、マトリクスの結合特性を決定する官能基である。「リガンド」の例は、イオン交換基、疎水性相互作用基、親水性相互作用基、チオ親和性（thiophilic）相互作用基、金属アフィニティー基、アフィニティー基、生体アフィニティー基、および混合モード基（上記の組み合わせ）を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用することのできる好ましいリガンドは、強アニオン交換基、例えばトリメチルアンモニウムクロリドなどであるが、これらに限定されない。
【００３２】
用語「イオン交換」および「イオン交換クロマトグラフィー」は、混合物中の標的分子（例えば、標的タンパク質を含有するＦｃ領域）がイオン交換マトリクスに（例えば共有結合などによって）結合した荷電した化合物と相互作用し、それによって標的分子が、混合物中の溶質不純物または汚染物質より多くまたは少なく荷電した化合物と非特異的に相互作用する、クロマトグラフィー方法を指す。標的分子よりも速いまたは遅い、イオン交換材料のカラムからの混合物溶出液の不純物は、標的分子に対して相対的に樹脂に結合するか、または樹脂から除外される。「イオン交換クロマトグラフィー」は、具体的にはカチオン交換、アニオン交換、および混合モードイオン交換クロマトグラフィーを含む。アニオン交換クロマトグラフィーは、標的分子（例えば、標的タンパク質を含有するＦｃ領域）に結合し次いで溶出することができるか、または不純物に主に結合することができる一方で標的分子はカラムを「フロースルーする」。好ましくは、アニオン交換クロマトグラフィーステップはフロースルーモードで行われる。
【００３３】
用語「イオン交換マトリクス」は、負に荷電した（すなわち、カチオン交換樹脂）または正に荷電した（すなわちアニオン交換樹脂）クロマトグラフィーマトリクスを指す。電荷は、マトリクスに１または２以上の荷電したリガンドを付加することによって、例えば共有結合によって提供してもよい。代替的に、またはさらに、電荷はマトリクスの固有の特性であってもよい。
【００３４】
用語「アニオン交換マトリクス」は、正に荷電した、例えば、１または２以上の正に荷電したリガンド、例えばそこに付加された第四級アミノ基などを有するクロマトグラフィーマトリクスを参照するために本明細書で使用される。
結合および溶出モードで分離カラムに「ローディング」するとき、バッファーは、標的分子（例えば、標的タンパク質を含有するＦｃ領域）および１または２以上の不純物を含む試料または組成物をクロマトグラフィーカラム（例えば、イオン交換カラム）にロードするために使用される。バッファーは、標的分子がクロマトグラフィーマトリクスに結合する導電率および／またはｐＨを有し、一方、理想的にはすべての不純物は結合せずにカラムをフロースルーする。
【００３５】
標的分子を「フロースルー」するために分離カラムに「ローディング」するとき、バッファーは、標的分子（例えば、標的タンパク質を含有するＦｃ領域）および１または２以上の不純物を含む試料または組成物をクロマトグラフィーカラム（例えば、イオン交換カラム）にロードするために使用される。バッファーは、標的分子がクロマトグラフィーマトリクスに結合せずにカラムをフロースルーする導電率および／またはｐＨを有し、一方、理想的にはすべての不純物はカラムに結合する。
典型的には、試料がマトリクスにロードされるバッファーは、ローディングバッファーまたは試料バッファーと称される。
用語「平衡化」は、標的分子をローディングする前にクロマトグラフィーマトリクスを平衡化するバッファーの使用を指す。典型的には、ローディングバッファーは平衡化のために使用される。
【００３６】
「洗浄」またはクロマトグラフィーマトリクスを「洗浄する」は、適切な液体、例えばバッファーをマトリクス中またはマトリクス上を通過させることを意味する。典型的には、洗浄は、標的分子を溶出する前にマトリクスから弱く結合した汚染物質を除去するために、および／またはローディング後に非結合のまたは弱く結合した標的分子を除去するために使用される。
この場合、典型的には、洗浄バッファーおよびローディングバッファーは同一である。ウイルス不活性化バッファーを使用する場合、それは、標的分子を溶出する前に、所定の存在するウイルスを不活性化するために使用される。この場合、典型的には、ウイルス不活性化バッファーは、それが洗剤（単数）／洗剤（複数）を含有するか、または種々の特性（ｐＨ／導電率／塩およびそれらの量）を有してもよいため、ローディングバッファーとは異なる。
【００３７】
洗浄は、標的分子の溶出後マトリクスから汚染物質を除去するために使用することもできる。これは、適切な液体、例えばバッファーを、標的分子の溶出後マトリクス中またはマトリクス上で通過させることによって行われる。この場合、典型的には、洗浄バッファーはローディングバッファーとは異なる。それは、洗剤（単数）／洗剤（複数）を含有してもよいか、または種々の特性（ｐＨ／導電率／塩およびそれらの量）を有してもよい。洗浄バッファーは、例えば酸性バッファーである。
【００３８】
クロマトグラフィーマトリクスから分子（例えば、免疫グロブリンＧまたは不純物のような関心のポリペプチド）を「溶出」させることは、そこから分子を除去することを意味する。溶出は、標的分子がローディングバッファーの溶媒先端で溶出されたとき、またはローディングバッファーとは異なるバッファーがクロマトグラフィー樹脂上のリガンド部位の関心の分子と競合するように溶液条件を変更することによって、フロースルーモードで直接的に生じ得る。非限定的な例は、バッファーがイオン交換材料上の荷電した部位の分子と競合するようにイオン交換材料を囲むバッファーのイオン強度を変更することによってイオン交換樹脂から分子を溶出することである。
【００３９】
用語「平均粒径」またはｄ５０は、累積粒子サイズ分布の５０％における平均粒子サイズ分布値を意味する。粒子サイズは、レーザー回折によって決定され、好ましくはＭａｌｖｅｒｎ  ‘Ｍａｓｔｅｒ  Ｓｉｚｅｒを用いる。
用語「平均孔径」は、累積孔径分布の５０％における平均孔径分布値を意味する。
用語「フロースルー方法」、「フロースルーモード」および「フロースルー操作」は、本明細書で交換可能に使用されるとおり、試料中に１または２以上の不純物とともに含有された少なくとも１つの標的分子（例えば、タンパク質または抗体を含有するＦｃ領域）が、通常１または２以上の不純物に結合するクロマトグラフィーマトリクスをフロースルーすることが意図された分離技術、ここで標的分子は通常結合せず（すなわち、フロースルーし）、ローディングバッファーでマトリクスから溶出される、を参照する。
【００４０】
用語「結合および溶出モード」および「結合および溶出方法」は、本明細書で使用されるとおり、試料（例えば、タンパク質を含有するＦｃ領域）中に含有される少なくとも１つの標的分子が、好適なクロマトグラフィーマトリクス（例えば、イオン交換クロマトグラフィー媒体）に結合し、かつ次いでローディングバッファーとは異なるバッファーで溶出される分離技術を指す。
【００４１】
本発明の詳細な説明
本精製方法の出発材料は、精製された標的分子を含むあらゆる試料であり得る。典型的には、試料は、血液または血漿から得られるか、または得られたものである。有利には、それは免疫グロブリンを含有する血漿タンパク質フラクションである。このための出発材料は、通常のヒト血漿であり得、または高力価の特異的な抗体を有するドナーに由来してもよく、例えば過免疫血漿である。
【００４２】
本発明の方法によって、標的分子を含むかかる試料は、試料がアニオン交換官能基を含むクロマトグラフィー マトリクス上にロードされる少なくとも１つの精製ステップに供される。
本発明による所定の種類のクロマトグラフィーマトリクスの使用は、例えばＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｑのようなメタクリラートコポリマーベースの強アニオン交換体またはＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦのようなセファロースベースのアニオン交換体と比較して、とりわけ、より高い純度の標的分子と組み合わせて５〜１０％のより高い収量をもたらすことが見出された。例えば、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦと比較して、ＩｇＧ標的フラクションにおけるＩｇＡおよびＩｇＭの合計として表現される純度は、典型的には５倍高く、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｑと比較して標的タンパク質ＩｇＧの収量は、典型的には７．７％高い。参考のために表１を参照。
【００４３】
この顕著な効果は、６００〜１２００μｍｏｌ／ｇアニオン基を有する親水性ポリビニルエーテルマトリクスを使用することによって達成される。
使用されるマトリクスは、好ましくは、
ａ）式Ｉ
【化４】
0006769695.tif 000005
ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、互いに独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはＨまたは−ＣＨ３であり得、
およびＲ４は少なくとも１つのヒドロキシル基を有するラジカルである、
で表される少なくとも１つの親水性置換されたアルキルビニルエーテル
ならびに
【００４４】
ｂ）式ＩＩおよび／またはＩＩＩおよび／またはＩＶに従う少なくとも１つの架橋剤であって、
【化５】
0006769695.tif 000006
ここでＸは、２〜５個のＣ原子、好ましくは２または３個のＣ原子を有する二価のアルキルラジカルであり、式中、Ｎに隣接せず、およびＮのすぐ近傍に位置していない１または２以上のメチレン基が、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えてもよく、およびメチレン基の１または２以上のＨ原子が、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって互いに独立して置換されてもよく、および
【００４５】
【化６】
0006769695.tif 000007
ここで式ＩＩＩおよびＩＶにおけるＹ１およびＹ２は、互いに独立して、
Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはシクロアルキルであり、ここで、１または２以上の隣接していないメチレン基またはＮのすぐ近傍に位置していないメチレン基が、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えてもよく、およびメチレン基の１または２以上のＨが、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって互いに独立して置換されてもよく、
【００４６】
または、Ｃ６〜Ｃ１８アリールであり、ここでアリールシステムにおける１または２以上のＨが、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって互いに独立して置換されてもよく、ならびに
【００４７】
Ａは、２〜５個のＣ原子、好ましくは２または３個のＣ原子を有する二価のアルキルラジカルであり、式中、１または２以上の隣接していないメチレン基またはＮのすぐ近傍に位置していないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨまたはＮによって置き換えてもよく、およびメチレン基の１または２以上のＨはヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって互いに独立して置換されてもよい、
を少なくとも含むコポリマーに基づく親水性架橋ポリマーに基づく。
式ＩにおけるＲ４は、典型的には、少なくとも１つのヒドロキシル基を有する、アルキルラジカル、シクロ脂肪族ラジカルまたはアリールラジカルである。
【００４８】
これは、ポリマーが式Ｉで表される親水性置換されたアルキルビニルエーテルの群からの少なくとも１つの化合物と、式ＩＩおよび／またはＩＩＩおよび／またはＩＶで表される架橋剤の群からの少なくとも１つの化合物との共重合によって形成されることを意味する。好ましくは、式Ｉで表される親水性置換されたアルキルビニルエーテルの群からのただ１つの化合物および式ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶで表される架橋剤の群からの１つの化合物が用いられる。
【００４９】
好ましい態様において、式ＩにおけるＲ４は、
直鎖または分枝のＣ１〜Ｃ１０アルキルラジカル、式中、１または２以上の隣接していないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨ、Ｎによって置き換えてもよく、および／または、式中、１または２以上のＨ原子は、互いに独立してＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって置換されていてもよく、および、式中、少なくとも１つのＯＨ基がＣ１〜Ｃ１０アルキルラジカルまたは置換基のいずれかに存在する、
【００５０】
または、シクロ脂肪族ラジカル、典型的には５〜１０個のＣ原子を有し、式中、１または２以上の隣接していないメチレン基は、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＳＯ２、ＮＨ、ＮＯＨ、Ｎによって置き換えてもよく、および／または、式中、シクロ脂肪族ラジカルの１または２以上のＨ原子は、互いに独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシもしくはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって置換されてもよく、ここで少なくとも１つのＯＨ基は、シクロ脂肪族環または側鎖もしくは置換基のいずれかに存在する、または
【００５１】
Ｃ６〜Ｃ１８アリールラジカル、ここでアリールラジカルにおける１または２以上のＨ原子は、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシもしくはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって置換されてもよく、ここで少なくとも１つのＯＨ基は、アリールラジカルまたは側鎖もしくは置換基のいずれかに存在する、または
Ｃ５〜Ｃ１８ヘテロアリールラジカル、ここでヘテロアリールラジカルにおける１または２以上のＨ原子は、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、ハロゲン、ＮＨ２、ＮＨ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル、Ｎ（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル２、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシもしくはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって置換されてもよく、ここで少なくとも１つのＯＨ基は、ヘテロアリールラジカルまたは側鎖もしくは置換基のいずれかに存在する、
である。
【００５２】
特に好ましい態様において、式ＩにおけるＲ４は、
直鎖または分枝のＣ１〜Ｃ１０アルキルラジカル、式中、１または２以上の隣接していないメチレン基は、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２またはＮＨによって置き換えてもよく、および／または、式中、１または２以上のＨ原子は、互いに独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって置換されてもよく、および、式中、少なくとも１つのＯＨ基はＣ１〜Ｃ１０アルキルラジカルまたは置換基のいずれかに存在する、
または、典型的には５〜１０個のＣ原子を有するシクロ脂肪族ラジカル、式中、１または２以上の隣接していないメチレン基は、Ｏ、Ｓ、ＳＯ２またはＮＨによって置き換えてもよく、および／または、式中、シクロ脂肪族ラジカルの１または２以上のＨ原子は、互いに独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって置換されてもよく、ここで少なくとも１つのＯＨ基は、シクロ脂肪族環または側鎖もしくは置換基のいずれかに存在する、または
【００５３】
Ｃ６〜Ｃ１４アリールラジカル、ここでアリールラジカルにおける１または２以上のＨ原子は、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって置換されてもよく、ここで少なくとも１つのＯＨ基は、アリールラジカルまたは側鎖もしくは置換基のいずれかに存在する、または
Ｃ６〜Ｃ１４ヘテロアリールラジカル、式中、少なくとも１つのＮ原子がヘテロ原子として存在し、およびここでヘテロアリールラジカルにおける１または２以上のＨ原子が、互いに独立して、ヒドロキシル基、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ５〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたはＣ１〜Ｃ６アルキルＯＨによって置換されてもよく、ここで少なくとも１つのＯＨ基はヘテロアリールラジカルまたは側鎖もしくは置換基のいずれかに存在する。
【００５４】
好ましい態様において、親水性置換された用いたアルキルビニルエーテルは、式Ｉ、式中、Ｒ４はヒドロキシル基を有するラジカルである、で表される化合物である。
【００５５】
好ましい態様において、親水性置換された用いたアルキルビニルエーテルは、１，２−エタンジオールモノビニルエーテル、１，３−プロパンジオールモノビニルエーテル、１，４−ブタンジオールモノビニルエーテル、１，５−ペンタンジオールモノビニルエーテル、１，６−ヘキサンジオールモノビニルエーテルまたはジエチレングリコールモノビニルエーテルであり、および用いたシクロ脂肪族ビニルエーテルは、シクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテル、特に好ましくは１，４−ブタンジオールモノビニルエーテル、１，５−ペンタンジオールモノビニルエーテル、ジエチレングリコールモノビニルエーテルまたはシクロヘキサンジメタノールモノビニルエーテルである。
【００５６】
用いた架橋剤は、好ましくは、式ＩＩで表される化合物である。ジビニルプロピレン尿素（１，３−ジビニルテトラヒドロピリミジン−２−オン）の使用が好ましく、またはジビニルエチレン尿素（１，３−ジビニルイミダゾリン−２−オン）が特に好ましい。
ポリマーの重量に関する親水性置換されたアルキルビニルエーテルの割合は、アルキルビニルエーテルがホモ重合しない場合、二官能性架橋剤に基づき、典型的には、１（重量）％〜９０（重量）％であるか、または、２：１のモル比に相当するアルキルビニルエーテルの最大重量割合である。親水性置換されたアルキルビニルエーテルの割合は、好ましくは１０〜８０％（重量％）、特に好ましくは３５〜６０％である。したがって、架橋剤の割合は、１０〜９９（重量％）、好ましくは２０〜９０％、特に好ましくは４０〜６５％である。
【００５７】
別の好ましい態様において、ポリマーは、２〜２００ｎｍ、より好ましくは３０〜１５０ｎｍの孔径を有する多孔性である。
別の態様において、ポリマーは、２５〜２５０μｍ、最も好ましくは３０〜９０μｍの平均粒径直径を有する粒子の形態である。
ポリマーは、アニオン交換基を含むリガンドを有する。
好ましい態様において、ポリマーは、グラフト重合によってポリマーに付加された構造によって誘導体化されている。
好ましい態様において、ポリマーは、セリウム（ＩＶ）触媒反応でのグラフト重合によって、好ましくはＵＳ５４５３１８６の第９頁の例８によって、ポリマーに付加された構造によって誘導体化され、ここで好ましくは荷電した基は、正に荷電したトリメチルアンモニウムアルキル基である。
【００５８】
本発明の方法において使用される材料について、およびその製造についてのさらなる詳細は、ＷＯ  ２００７／０１４５９１に見出すことができる。
リガンドは、クロマトグラフィーの分野において当業者に知られている。リガンドは、基礎材料の合成間においてできるだけ早く、または基礎材料の合成に次いで、支持材料へ導入することができる置換基であり、支持材料の表面特性に影響を及ぼす。特に、支持材料のリガンドによる標的化された誘導体化は、所定のクロマトグラフィー特性を有する支持材料を製造する。特に、本発明において使用されるリガンドは、以下の末端基：
イオン性またはイオン化可能な基、例えば
−ＮＲ７Ｒ８または−ＮＲ７Ｒ８Ｒ９、
式中
Ｒ７およびＲ８、互いに独立して、
Ｈ、１〜５個のＣ原子を有するアルキル、
および
Ｒ９は、１〜５個のＣ原子を有するアルキル、
ただし、Ｘ＝−ＮＲ７Ｒ８Ｒ９である場合、Ｒ７およびＲ８はＨになり得ない、
−グアニジニウム、
を有することができる。
【００５９】
好ましい態様において、本発明の方法におけるマトリクスとして使用されるポリマーは、触手のような構造でグラフト重合することによって誘導体化され、順番に相当するリガンドを有することができるか、または後者によって官能化することができる。グラフティングは、好ましくはＥＰ  ０  ３３７  １４４の第１２頁の例８またはＵＳ  ５４５３１８６の第９頁の例８にしたがってＮ−（２−トリメチルアンモニウムエチル）アクリルアミドを使用して行われる。用いた重合触媒はセリウム（ＩＶ）イオンである。これは、この触媒がモノマーのグラフト重合が開始される基礎材料の表面においてフリーラジカル部位を形成するためである。
【００６０】
重合は、セリウム塩に関する終了反応によって終了させる。このため、（平均）鎖長は、基礎材料、開始剤およびモノマーの濃度比に影響され得る。さらに、均一なモノマーまたは種々のモノマーの混合物もまた用いることができる；後者の場合、グラフト化されたコポリマーが形成される。
グラフトポリマーの製造のための好適なモノマーおよびグラフティング手順についてのさらなる詳細は、例えば、ＷＯ  ２００７／０１４５９１、ＥＰ  ０３３７  １４４、とりわけ第１２頁、例８およびＵＳ  ５４５３１８６の第９頁の例８に開示されている。
【００６１】
好ましくはマトリクスは、グラフト重合によるイオン性基で誘導体化され、それによって得られた、基礎ポリマーマトリクスにおいてグラフト化（graft）された鎖は、２〜１００、好ましくは５〜６０、特に１０〜３０のモノマー単位（各単位が典型的には１つのイオン性基を有する）の長さを有する。
好ましいイオン性基は、正に荷電したトリメチルアンモニウムエチル基である。
マトリクスは、アニオン交換基に加えて疎水性または親水性基のような追加の他の官能基を有してもよいが、あらゆる場合において、それはアニオン交換基を有する。
【００６２】
本発明において使用されるアニオン交換マトリクスのイオン容量は、典型的には６００〜１２００μｍｏｌ／ｇ、好ましくは７００〜１０００μｍｏｌ／ｇ、最も好ましくは８００〜１０００μｍｏｌ／ｇである。
【００６３】
本発明の方法において使用される好適な材料は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、ドイツからのＥｓｈｍｕｎｏ（Ｒ）ＱＰＸおよびＥｓｈｍｕｎｏ（Ｒ）ＱＰＸ  Ｈｉｃａｐである。それらの樹脂は、ＷＯ  ２００７／０１４５９１において開示された手順によって合成されたポリビニルエーテルビーズを含み、これに対してＥＰ  ０３３７  １４４の第１２頁の例８およびＵＳ  ５４５３１８６の第９頁の例８によるグラフティング技術を用いることによってポリマー構造がグラフト化され、および正に荷電したトリメチルアンモニウムエチル基を有する表面ポリマー構造（ここでＥｓｈｍｕｎｏ  ＱＰＸおよびＥｓｈｍｕｎｏ  ＱＰＸ  Ｈｉｃａｐ樹脂の場合における荷電密度が、６００〜１２００μｍｏｌ／ｇに調節される）を生成する。
【００６４】
本発明の方法を行うために、試料はアニオン交換クロマトグラフィーに供され、それによってクロマトグラフィーマトリクスは上記のとおりアニオン交換基で官能化された親水性ポリビニルエーテルである。
試料は、好ましくは、免疫グロブリンＧ、好ましくはＩｇＧの７５〜９９重量％を含む予備精製された血漿試料である。試料は、好ましくは、免疫グロブリンＧの少なくとも８０重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、とりわけ好ましくは９０重量％より大きい、最も好ましくは９２〜９８重量％を含む。「重量％」は、この場合、乾燥血漿試料の質量に関する。
【００６５】
試料をマトリクスに適用する前に、マトリクスを洗浄および／または平衡化することができる。
洗浄は、任意に塩、例えばＮａＣｌを有する、酢酸バッファーのような適度に酸性のｐＨ４．０〜５．５のバッファーによって行うことができる。バッファーは、典型的には、２００〜１０００ｍＭ／ｌの濃度を有する。
平衡は、ｐＨ４〜７．４の平衡バッファーで行われる。好ましくは、平衡バッファーのｐＨは、試料のｐＨと同一である。平衡バッファーの濃度は、典型的には０．００５〜２Ｍｏｌ／ｌの範囲、好ましくは０．００５〜０．０５Ｍｏｌ／ｌの範囲である。
【００６６】
平衡バッファーは、典型的には試料バッファーと同一である。
平衡バッファーでマトリクスを洗浄および／または平衡化する前に、１０より大きい、好ましくはおよそ１４のｐＨを有する基礎の水溶液でマトリクスを処理することができる。かかる処理は当業者に知られている。マトリクスから潜在的な不純物を除去することが好適である。好適な液体は、ナトリウムヒドロキシド水溶液またはカリウムヒドロキシド水溶液である。基礎の水溶液は、平衡バッファーで、または酢酸バッファーのように微酸性の水性洗浄バッファーで、好ましくは、例えば、２００〜１０００ｍＭ／ｌの酢酸濃度で、直接的にマトリクスから除去することができる。
【００６７】
試料は、典型的には、バッファー（ローディングバッファーまたは試料バッファーとも称される）におけるクロマトグラフィーマトリクスに適用される。バッファーは、好ましくは、４．０〜７．４のｐＨを有する。好適なバッファーは、炭酸／ケイ酸バッファー、酢酸バッファー、シトラートバッファー、ホスファートバッファー、グリシンバッファーおよび／または２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）バッファーである。酢酸バッファーが最も好ましい。
バッファーは、典型的には、５〜５００ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは５〜１００ｍｍｏｌ／ｌ、最も好ましくは５〜５０ｍｍｏｌ／ｌの濃度において使用される。
試料フィードにおけるＩｇＧ濃度は、典型的には１〜５０ｇ／ｌに調節される。
マトリクスにロードされる試料の量は、広範囲において可変である。
【００６８】
マトリクスは、極めて少量の試料、例えばマトリクス体積の１リットル当たり１０ｇの試料などでロードすることができる。マトリクス体積のリットル当たり１５０ｇの試料までロードすることもできる。好ましくは、２５ｇ／ｌマトリクス体積より上、最も好ましくは２５〜１００ｇ／ｌをロードする。
【００６９】
試料のクロマトグラフィー精製は、結合および溶出モードまたは好ましくはフロースルーモードで行うことができる。フロースルーモードにおいて、標的分子は、本質的にマトリクスに結合または吸着しない。これは、標的分子が本質的に溶媒先端、すなわちローディングバッファーの先端でマトリクス中を動き、本質的に溶媒先端とともにマトリクスから回収されることを意味する。マトリクスの体積に関して、フロースルーモードにおいて本発明によるマトリクスを使用するとき、標的分子を５倍、好ましくは３倍、極めて好ましくは２倍の溶離液の体積でマトリクスから典型的に溶出できることが見出されている。溶離液は、この場合、ローディングバッファーと同一である。不純物はマトリクスで保持される。フロースルーモードによって、標的分子の少なくとも８０％、好ましくは９０％より上、最も好ましくは９５％より上をマトリクスから回収することができる。
【００７０】
マトリクスに対する不純物の結合は、マトリクスがローディングバッファーで溶出される限り極めて安定であることがさらに見出されている。これは、標的分子の溶出のために使用されるローディングバッファーの体積を、必要である場合、マトリクスの５倍より大きい体積まで増加させる可能性も提供し、したがって標的分子をほぼ完全に溶出することができる（約９７％収量）、一方その純度は依然として極めて高い（典型的には＞９９．５％）。
フロースルーモードにおいて行われる本発明の方法は、ＩｇＡ、ＩｇＭ、アルブミンおよび第ＸＩａ因子のようなセリンプロテアーゼのような不純物から免疫グロブリンＧを標的分子として分離することにとりわけ好適である。
【００７１】
しかし、それはＩｇＭを含有する産物の単離またはＩｇＡ、ＩｇＭおよび／または第ＸＩａ因子の単離にもまた好適である。フロースルーモードでクロマトグラフィー精製を行うとき、免疫グロブリンＧは、本質的に溶媒先端で溶出されることが見出されている。ＩｇＧの溶出後、溶出バッファー（ＩｇＧの溶出のためのものであり、ローディングバッファーと同一である）を変更し、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび第ＸＩａ因子のようなさらなる第二の標的分子の溶出を支持することができる。例えば、第二の標的分子は、ＩｇＡおよびＩｇＭの混合物であってもよい。このため、溶出バッファーの酸性は、典型的には増加する。好ましくは、本願の溶出バッファーは、ｐＨ４〜５．５を有し、それによってｐＨはあらゆる場合においてローディングバッファーのｐＨよりも低い。典型的には、ＩｇＡ、ＩｇＭおよび／または第ＸＩａ因子を溶出するために使用されるバッファーのｐＨは、ローディングバッファーのｐＨよりも０．５〜２ｐＨ単位低い。
【００７２】
その結果、本発明の方法は、例えばＩｇＧのような１つの標的分子を精製することを可能にするだけでなく、ＩｇＧならびにＩｇＡ、ＩｇＭおよび／または第ＸＩａ因子、例えばＩｇＧならびにＩｇＡおよびＩｇＭの混合物のような２または３以上の標的分子を精製することも可能にする。
本発明の方法は、単独の分離精製ステップとして使用できるが、好ましくは本発明の方法の前または後で行われる他の精製ステップと組み合わせることもまたできる。
【００７３】
本発明の方法で精製される好ましい標的分子はＩｇＧである。ＩｇＧの精製のための既知の手順は、典型的には沈殿、濾過およびクロマトグラフィーステップを含むいくつかのステップを含む。かかる方法は、例えば“Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use”, edited by J. Bertolini, N. Goss, J. Curling; John Wiley and sons Inc., 2013に開示されており、例えば第１３章を参照されたい。
本発明の方法は、既知の方法の１または２以上の精製ステップを置換するために良好に適用することができる。
【００７４】
好ましくは、粗血漿試料は、非ＩｇＧタンパク質の大部分、とりわけより大きい分子量のそれら、凝集した免疫グロブリンおよび他の凝集したタンパク質ならびに潜在的に感染性の粒子が、モノマーＩｇＧの実質的な沈殿なしに沈殿する沈殿ステップにまず供される。これは例えばフラクションＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩまたはフラクションＩＩ＋ＩＩＩまたはフラクションＩＩと称されるＩｇＧ濃縮中間体を産生するエタノール沈殿によって達成することができる。酸沈殿および濾過ステップ後、アニオン交換クロマトグラフィーのフィードを得ることができる。
【００７５】
追加のクロマトグラフィーステップを行うこともまた可能である。
アニオンクロマトグラフィー後、精製されたＩｇＧは典型的にはナノ濾過され、配合される。
予想外なことに、クロマトグラフィーマトリクスの所定の種類の使用が、簡単なフロースルーイオン交換クロマトグラフィーで＞９５％の収量で極めて効果的にＩｇＧのような標的分子を精製する可能性を提供するだけでなく、２５ｍｇ／Ｌより低いＩｇＡ、２５ｍｇ／Ｌより低いＩｇＭ、アルブミン（検出限界より低い）および第ＸＩａ因子（検出限界より低い）からのＩｇＧの分離を保証することも見出されている。これらの物質からのＩｇＧの極めて良好な分離は、極めて良好な純度および収量で１または２以上のそれらの物質をさらに単離するためにさらに使用することができる。
【００７６】
本発明にしたがって使用されるクロマトグラフィーマトリクスで達成することができる純度および収量は、異なるマトリクスの同等なアニオン交換ステップと比較してより良好である。既知の手順が、多くの場合、アニオン交換精製ステップを連続するカチオン交換研磨ステップと組み合わせる一方、かかる研磨ステップは、典型的には、アニオン交換精製が本発明にしたがって行われるときに必要ではない。
本明細書中に引用されたすべての出願、特許、および刊行物の全開示、ならびに２０１４年８月１５日に出願されたＥＰ  １４００２８５２．３に相当するものは、本明細書中に引用によって組み込まれる。
【００７７】
例
例１  ＩｇＧの精製
クロマトグラフィーマトリクス（Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＱＰＸ  Ｈｉｃａｐ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）は、５００ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．５）で平衡化され、次いで２５ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．５）で処理される。試料は、以下の不純物：２５ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ６．５）中のＩｇＡ（１０００ｍｇ／ｌ）およびＩｇＭ（５００ｍｇ／ｌ）および第ＸＩａ因子（５０ｐＭ／ｌ）を有する、１５ｇ／ｌのＩｇＧを含む溶液である。
【００７８】
試料は、１３０ｃｍ／ｈにおいて７５ｇ／ｌのマトリクスのタンパク質ローディングに同等なマトリクスに適用される。マトリクスは、次いでＩｇＧが完全にマトリクスから溶出されるまでｐＨ６．５の２５ｍＭ酢酸バッファーで溶出される。ＩｇＧは、９５％より大きい収量で回収し、それによって精製されたＩｇＧは、２５ｍｇ／ｌ未満のＩｇＭおよびＩｇＡを含む。第ＸＩａ因子の量は、０．０ｐＭまで低減することができる。ＩｇＭおよびＩｇＡは、酸性バッファー（ｐＨ４．５の３００ｍＭ酢酸バッファー）で溶出することによって、マトリクスから、９５％より大きい純度および９５％より大きい収量でさらに取得することができる。すべてのステップは１３０ｃｍ／ｈの線速度で行われる。
【００７９】
例２  様々なマトリクスにおけるＩｇＧの精製
一般的な手順：
フィード組成物：ｐＨ６．５の２５ｍＭ酢酸バッファー中の２０ｇ／ｌのＩｇＧおよび１ｇ／ｌのＩｇＡおよび１ｇ／ｌのＩｇＭ。
予備平衡：ｐＨ６．５の５００ｍＭ酢酸バッファー
平衡：ｐＨ６．５の２５ｍＭ酢酸バッファー
ローディング／溶出：ｐＨ６．５の２５ｍＭ酢酸バッファー
流速：＞１３０ｃｍ／ｈ
ローディング：５ｇ／Ｌ（ＩｇＭおよびＩｇＡの合計）
洗浄：ｐＨ４．５の２５０ｍＭ酢酸バッファー
【００８０】
表１は、収量、純度（不純物の濃度）および回収データを示す。
【表１】
0006769695.tif 000008