(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
【化１】
0006794560.tif 000096
（式中、ｎが０〜３であり、
Ｒ１が、−Ｈ、−Ｆ、−ｇｅｍ−ジフルオロ、−ｇｅｍ−ジメチル、
−Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨＦ２、−ＣＨＦ２ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ２Ｆであり、
−Ｒ２が、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＮ、または−ＯＣＨ３から選択される。）
の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
下記式、
【化２】
0006794560.tif 000097
である、請求項１の式に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
下記式
【化３】
0006794560.tif 000098
である、請求項１もしくは請求項２の式に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
下記式
【化４】
0006794560.tif 000099
である、請求項１〜３のいずれか１項の式に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
下記式
【化５】
0006794560.tif 000100
である、請求項１〜４のいずれか１項の式に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
式中、ｎが０であり、Ｒ１が−Ｃ１〜４アルキルであり、Ｒ２が−ＣＨ３である、請求項１〜５のいずれか１項の式に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
式中、Ｒ１がイソプロピルである、請求項６の式に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
下記式
【化６−１】
0006794560.tif 000101
【化６−２】
0006794560.tif 000102
【化６−３】
0006794560.tif 000103
である、請求項１の式に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項９】
下記式
【化７】
0006794560.tif 000104
である、請求項１〜８のいずれか１項の式に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンである、請求項１〜９のいずれか１項の式に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
下記式
【化８】
0006794560.tif 000105
である、請求項１〜８のいずれか１項の式に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンである、請求項１〜８または１１のいずれか１項に記載の式の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の式の化合物、またはその薬学的に許容される塩と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１４】
有効量の請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む、癌治療用医薬組成物であって、
前記癌が、膀胱癌、乳癌、胆管癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌、胆嚢癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝癌、肺癌、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、または腎癌である、医薬組成物。
【請求項１５】
前記癌が、血清ＣＤ７３活性が測定された患者に存在する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記癌が、組織ＣＤ７３の発現が測定された患者に存在する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
療法における使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の式による化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の式による化合物、またはその薬学的に許容される塩を含む、癌治療剤。
【請求項１９】
前記癌が、膀胱癌、乳癌、胆管癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌、胆嚢癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝癌、肺癌、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、または腎癌である、請求項１８に記載の剤。
【請求項２０】
癌治療剤の製造のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の式による化合物またはその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項２１】
前記癌が、膀胱癌、乳癌、胆管癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌、胆嚢癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝癌、肺癌、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、または腎癌である、請求項２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ７３の活性を阻害し、かつ癌を治療するのに有用である、５−［５］−［２−シクロアルキル］−６−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン化合物、またはその薬学的に許容される塩、および当該化合物を含む医薬組成物に関する。
【０００２】
５’−ヌクレオチダーゼまたはエクト−５’ヌクレオチダーゼ（ＥＣ３．１．３．５）としても公知のＣＤ７３は、５’モノヌクレオチドをヌクレオシドに転換する酵素である。ＣＤ７３は多くの組織において発現し、癌組織において上方調節され、ＣＤ７３経路はアデノシン受容体シグナル伝達を介して抗腫瘍Ｔ細胞免疫を制限することにより腫瘍成長を促進する（Ｚｈａｎｇ  Ｂ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１０；７０：６４０７−６４１１、Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０１７；２２：１６８６−１６９６）。
【０００３】
ＣＤ７３欠損マウスは、抗腫瘍免疫が増大しており、実験的転移に耐性がある（Ｓｔａｇｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１１；７１：２８９２−２９００）。腫瘍ＣＤ７３によって産生された細胞外アデノシンは、腫瘍微小環境において蓄積し、抗腫瘍Ｔ細胞免疫を損ない（Ｚｈａｎｇ  Ｂ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１０；７０：６４０７−６４１１、Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２０１７；２２：１６８６−１６９６）、腫瘍による免疫逃避、腫瘍細胞の増殖、移動、血管新生、転移および化学療法抵抗性と関連している（Ｉｎｏｕｅ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１７；８：８７３８−８７５１）。
【０００４】
ＣＤ７３発現の上昇は、免疫抑制の増大と関係していることも報告されている（Ｊｉｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７０：２２４５−２２５５（２０１０）、Ｂｅａｖｉｓ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３３：２３１−７（２０１２  ）、Ｂｅａｖｉｓ，ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．３：５０６−１７（２０１５）、Ｌｏｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１０：１１０９１−１１０９６（２０１３））。
【０００５】
したがって、ＣＤ７３経路は免疫抑制効果を発揮し、ＣＤ７３経路を遮断することが癌を治療する上で有用であり得ることが示唆されてきた（Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；５：ｅ１２１６２９２，ｄｏｉ：１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０１６．１２１６２９２、Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１６；２：９５−１０９、Ａｌｌａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１６；８：１４５−１６３）。ＣＤ７３阻害剤は、癌の治療について臨床試験中である（Ｈａｙ  ＣＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；５（８）：ｅ１２０８８７５、Ａｌｌａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１６；８：１４５−１６３）。
【０００６】
より詳しくは、癌の治療のために、代替のＣＤ７３阻害剤を提供する必要性が残っている。特に、経口的に利用可能な小分子ＣＤ７３阻害剤についての必要性が残っており、当該小分子ＣＤ７３阻害剤は腫瘍微小環境においてより完全な標的阻害を呈する。
【０００７】
したがって、本発明は、癌を治療するために有用であり得るＣＤ７３阻害化合物を提供する。本発明は、式Ｉの化合物であって、
【化１】
0006794560.tif 000002
式中、ｎが、０〜３であり、
Ｒ１は−Ｈ、−Ｆ、−ｇｅｍ−ジフルオロ、−ｇｅｍ−ジメチル、−Ｃ１〜４アルキル、−ＣＨＦ２、−ＣＨＦ２ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ２Ｆであり、
Ｒ２が、−Ｈ、−ＣＨ３、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＮ、または−ＯＣＨ３から選択される、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、式Ｉの化合物であって、式中、ｎが０であり、Ｒ１が−Ｃ１〜４アルキルであり、Ｒ２が−ＣＨ３である、化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０００９】
別の実施形態において、本化合物は、
【化２−１】
0006794560.tif 000003
【化２−２】
0006794560.tif 000004
【化２−３】
0006794560.tif 000005
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１０】
別の実施形態において、本化合物は、
【化３】
0006794560.tif 000006
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１１】
別の実施形態において、本化合物は、
【化４】
0006794560.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１２】
別の実施形態において、本化合物は、
【化５】
0006794560.tif 000008
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１３】
別の実施形態において、本化合物は、
【化６】
0006794560.tif 000009
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１４】
別の実施形態において、本化合物は、
【化７】
0006794560.tif 000010
またはその薬学的に許容される塩である。
【００１５】
一実施形態において、式Ｉの化合物は、下記式の化合物であって、
【化８】
0006794560.tif 000011
式中、Ｒ１が−ＣＨ２ＣＨ３もしくは−ＣＨ（ＣＨ３）２である、化合物、またはその薬学的に許容される塩である。別の実施形態において、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ３、またはその薬学的に許容される塩である。別の実施形態において、Ｒ１は−ＣＨ（ＣＨ３）２、またはその薬学的に許容される塩である。
【００１６】
別の実施形態において、式Ｉの化合物は式：
【化９】
0006794560.tif 000012
もしくは
【化１０】
0006794560.tif 000013
であり、式中、Ｒ１は、ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ（ＣＨ３）２、またはその薬学的に許容される塩である。
【００１７】
別の実施形態において、式Ｉの化合物は、下記式の化合物であって、
【化１１】
0006794560.tif 000014
式中、Ｒ１は−ＣＨ２ＣＨ３または−ＣＨ（ＣＨ３）２である、化合物、またはその薬学的に許容される塩である。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、化合物：
【化１２】
0006794560.tif 000015
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、化合物：
【化１３】
0006794560.tif 000016
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、化合物：
【化１４】
0006794560.tif 000017
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、化合物：
【化１５】
0006794560.tif 000018
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンである化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンである化合物、またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００２４】
一実施形態において、本発明は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンまたはその薬学的に許容される塩と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンと、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
一実施形態において、本発明は、癌を治療するための方法であって、癌を治療することを必要とする患者へ、有効量の５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、癌を治療するための方法であって、癌を治療することを必要とする患者へ、有効量の５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法を提供する。
【００２８】
一実施形態において、本発明は、療法における使用のための、５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンまたはその薬学的に許容される塩を提供する。
【００２９】
別の実施形態において、本発明は、療法における使用のための、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、または薬学的に許容される塩を提供する。
【００３０】
一実施形態において、本発明は、療法における使用のための、５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、または薬学的に許容される塩を提供する。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、療法における使用のための、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、または薬学的に許容される塩を提供する。
【００３２】
一実施形態において、本発明は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、またはその薬学的に許容される塩を含む、癌を治療する上での使用のための医薬組成物を提供する。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン、またはその薬学的に許容される塩を含む、癌を治療する上での使用のための医薬組成物を提供する。
【００３４】
一実施形態において、本発明は、癌の治療のための薬剤の製造における、５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンまたはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、癌の治療のための薬剤の製造における、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンまたはその薬学的に許容される塩の使用を提供する。
【００３６】
一実施形態において、本発明は、４−クロロ−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジンの調製および使用を提供し、これは以下のように構造的に表すことができ、
【化１６】
0006794560.tif 000019
癌の治療のための化合物または薬剤の製造において有用である。別の実施形態において、本発明は、化合物または薬剤の製造における使用のための４−クロロ−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジンを提供する。
【００３７】
一実施形態において、本発明は、４，４，５，５−テトラメチル−２−（２−置換−シクロプロピル）−１，３，２−ジオキサボロランの調製および使用を提供し、これは以下のように構造的に表すことができ、
【化１７】
0006794560.tif 000020
式中、Ｒ１＝ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ（ＣＨ３）２であり、これは、癌の治療のための薬剤の製造において有用である。一実施形態において、Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ３である。別の実施形態において、Ｒ＝ＣＨ（ＣＨ３）２である。別の実施形態において、本発明は、化合物または薬剤の製造における使用のための、４，４，５，５−テトラメチル−２−（２−置換−シクロプロピル）−１，３，２−ジオキサボロランを提供する。
【００３８】
一実施形態において、本発明は、２−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチル−シクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロランの調製および使用を提供し、これは以下のように構造的に表すことができる。
【化１８】
0006794560.tif 000021
癌の治療のための化合物または薬剤の製造に有用である。別の実施形態では、本発明は、化合物または薬剤の製造に使用するための２−［（１Ｓ、２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロランを提供する。
【００３９】
一実施形態では、本発明は、２−［（１Ｓ、２Ｓ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロランの調製および使用を提供し、これは以下のように構造的に表すことができ、
【化１９】
0006794560.tif 000022
これは、癌の治療のための化合物または薬剤の製造において有用である。別の実施形態において、本発明は、化合物または薬剤の製造における使用のための２−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロランを提供する。
【００４０】
一実施形態において、本発明は、（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロパンカルボキシラートを用いた、２−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロランのキラル合成に準備し、これは以下のように構造的に表すことができ、
【化２０】
0006794560.tif 000023
式中、Ｒ１＝ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ（ＣＨ３）２であり、これは癌の治療のための化合物または薬剤の製造において有用である。別の実施形態において、本発明は、化合物または薬剤の製造における使用のための（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロパンカルボキシラートを提供する。
【００４１】
一実施形態において、本発明は、（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロパンカルボキシラートを用いた２−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロランのキラル合成に準備し、これは以下のように構造的に表すことができ、
【化２１】
0006794560.tif 000024
癌の治療のための化合物または薬剤の製造において有用である。別の実施形態において、本発明は、化合物または薬剤の製造における使用のための（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロパンカルボキシラートを提供する。
【００４２】
ＣＤ７３タンパク質は、脳、甲状腺、副腎、骨髄、リンパ節、扁桃、脾臓、心筋、平滑筋、肺、咽頭鼻部、肝臓、胆嚢、膵臓、唾液腺、口腔粘膜、食道、胃、十二指腸、小腸、結腸、直腸、腎臓、膀胱、精巣、前立腺、卵管、膣、乳房、子宮頸部、子宮、子宮内膜、卵巣、軟部組織および皮膚を含む多くの組織において発現する（ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００１３５３１８−ＮＴ５Ｅ／ｔｉｓｓｕｅ）。ＣＤ７３は、複数の種類の腫瘍において過剰発現する（Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １３，８４２−８５７（２０１３）、Ａｎｔｏｎｉｏｌｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２：９５−１０９（２０１６）。ＣＤ７３は、肝細胞、膵管腺癌、肝外胆管細胞癌を含む、正常なおよび病理学的なヒト肝胆道膵臓組織においても発現する（Ｓｃｉａｒｒａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１９；ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２６２−０１８−２２９０−１）。
【００４３】
ＣＤ７３の発現および活性の上昇は、腫瘍の浸潤性および転移と、ならびに患者のより短い生存期間と関係している（Ｊｉｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１０；７０：２２４５−２２５５）。ＣＤ７３発現の上昇は予後不良と関係づけられてきた（Ｉｎｏｕｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ８：８７３８−８７５１（２０１７）、Ｔｕｒｃｏｔｔｅ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：４４９４−４５０３（２０１５）、Ｌｕ  ＹＴ，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１９：１９１２−１９１８（２０１３）、Ｗｕ  ＸＲ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１０６：１３０−１３７（２０１２）、Ｂｕｉｓｓｅｒｅｔ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９：１０５６−１０６２（２０１７）、Ｌｅｃｌｅｒｃ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２：１５８−６６（２０１６））。
【００４４】
トリプルネガティブ乳癌におけるＣＤ７３発現は、臨床成績不良、およびアントラサイクリン化学療法に対する耐性の上昇と関係している（Ａｌｌａｒｄ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１４；１８：８６３−８８１）。ＣＤ７３は、頭頸部扁平上皮癌の予後不良と関係している（Ｒｅｎ  Ｚ−Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔｓ  ２０１６；７：６１６９０−６１７０２）。ＣＤ７３の発現は、腎細胞癌の進行とも関係している（Ｙｕ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．２０１５；９：２４８５−２４９４）。
【００４５】
ＣＤ７３は、子宮内膜腫瘍（Ａｌｉａｇａｓ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ２０１４；ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１４／５０９０２７）、前立腺腫瘍組織（Ｌｅｃｌｅｒｃ  ＢＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６；２２：１５８−１６６）、非小細胞肺癌組織（Ｉｎｏｕｅ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１７；８：８７３８−８７５１）において過剰発現する。ＣＤ７３は、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、胃癌、および胆嚢癌を含む腫瘍において過剰発現することが報告されてきた（Ｇａｏ  Ｚ−Ｗ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ  Ｈ−Ｚ，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１４；ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１４／４６０６５４）。ＣＤ７３は、膠芽腫、黒色腫、乳癌、卵巣癌、髄芽腫、および膀胱癌の細胞株を含む癌細胞株において過剰発現することが報告されてきた（Ｇａｏ  Ｚ−Ｗ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ  Ｈ−Ｚ，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ．Ｉｎｔ．２０１４；ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１４／４６０６５４）  。
【００４６】
ＣＤ７３−アデノシンは、卵巣癌患者における免疫応答および生存を低減させることが報告されてきた（Ｇａｕｄｒｅａｕ  Ｐ−Ｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１６；５（５）：ｅ１１２７４９６）。
【００４７】
選択的ＣＤ７３阻害剤α，β−メチレンアデノシン５’−二リン酸を用いたインビボでのＣＤ７３遮断は、ＥＧ７（リンパ腫）、ＭＣ３８（結腸）、ＡＴ−３（乳房）およびＢ１６Ｆ１０（黒色腫）の腫瘍細胞を皮下注射した同系マウスにおける腫瘍成長を低減させることが報告されてきた（Ｓｔａｇｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１１；７１：２８９２−２９００、Ｆｏｒｔｅ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８９：２２２６−２２３３）。抗ＣＤ７３抗体療法は、乳房腫瘍の成長および転移を阻害することが報告されてきた（Ｓｔａｇｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０１０；１０７：１５４７−１５５２、Ｔｅｒｐ  ＭＧ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１９１：４１６５−４１７３）。
【００４８】
さらに、アデノシンおよびＣＤ７３酵素活性は癌患者において上昇することが報告されており（Ｈｕａｎｇ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７５：１５３８（２０１５）、免疫チェックポイント阻害剤に応答しない患者は、応答する患者よりも高いアデノシンレベルを有することが報告されてきた（Ｇｉａｎｎａｋｉｓ  ＨＸ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３５：１５  Ｓｕｐｐｌ．３０３６−３０３６（２０１７））。
【００４９】
発癌活性化およびエストロゲン受容体欠損は、ＣＤ７３発現の上昇と関係することが報告されてきた（Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７７：４６９７−４７０９（２０１７）、Ｓｐｙｃｈａｌａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：７０８−１７（２００４）、Ａｓｃｉｅｒｔｏ  ａｎｄ  ＭｃＡｒｔｈｕｒ  Ｊ．，Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１５：１７３（２０１７）、Ｙｏｕｎｇ  Ａ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７７：４６８４−４６９６（２０１７））。
【００５０】
ＣＤ７３阻害剤治療から利益を得ることができる対象には、非小細胞肺癌、膀胱癌、および黒色腫のような、抗ＰＤ１／ＰＤＬ−１阻害剤に耐性があるまた不応性の腫瘍に罹患している対象、非小細胞肺癌、膀胱癌、黒色腫、結腸および膵臓のようなＥＧＦＲ／ＢＲＡＦ／Ｋｒａｓ変異癌に罹患している患者、トリプルネガティブ乳癌のようなエストロゲン受容体（−）癌に罹患している患者、膵癌および結腸直腸癌のような、ＣＤ７３の発現レベルが高い対象が含まれる。所望の場合、このような対象は、ＩＨＣアッセイによって測定されるように、腫瘍内の高いＣＤ７３発現レベルの存在に基づいて、または、ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって検出されるような腫瘍内のＥＧＦＲおよびＢＲＡＦの変異の存在に基づいて、または、ＩＨＣアッセイもしくはＲＴ−ＰＣＲアッセイによって検出されるような腫瘍内のエストロゲン受容体の欠損に基づいて、または、ＬＣ−ＭＳアッセイによって検出されるような腫瘍内もしくは血漿中の高レベルのアデノシンおよびＡＭＰの存在に基づいて、本明細書に開示する化合物またはその薬学的に許容される塩を用いた療法のために選択することができる。薬力学的評価のために、本明細書に説明するＬＣ−ＭＳ系エクスビボアッセイを使用して、血中でのＡＭＰからアデノシンへの転換に対するＣＤ７３阻害剤の効果を測定することができる。
【００５１】
本発明は、患者における癌を治療する方法であって、癌を治療することを必要とする患者へ、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法も提供する。
【００５２】
本発明は、癌を治療する方法であって、癌を治療することを必要とする対象へ、有効量の本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法も提供し、癌は、膀胱癌、乳癌、胆管癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌、胆嚢癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝癌、肺癌、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、または腎癌である。一実施形態において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌である。別の実施形態において、肺癌は非小細胞肺癌である。１つの好ましい実施形態において、化合物は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンである。
【００５３】
一実施形態において、患者は、血清ＣＤ７３活性が判定された患者である。１つの好ましい実施形態において、「ＣＤ７３活性を判定すること」は、ＣＤ７３活性が存在するかどうかを判定することを意味する。ＣＤ７３発現またはＣＤ７３活性のレベルを判定する方法は、当業者に公知であり、例えば、Ｓ  Ｍｏｒｅｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．２０１７；１５：２４４を参照されたい。別の好ましい実施形態において、「ＣＤ７３活性を判定すること」は、ＣＤ７３によるＡＭＰからアデノシンへの転換のレベルを定量化することを意味し、ＣＤ７３活性のレベルを定量化することを容易にするＬＣ−ＭＳ系アッセイが本明細書で提供される。
【００５４】
別の実施形態において、患者は、組織内のＣＤ７３発現が判定された患者である。別の実施形態において、組織は腫瘍組織である。組織におけるＣＤ７３発現のレベルを判定するための方法は、当業者に公知であり、例えば、ウェスタンブロット法または免疫組織化学的手法を使用する（Ｘ−Ｒ  Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．２０１２；１０６：１３０−１３７）。
【００５５】
本発明は、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩が投与された患者からの組織内でＣＤ７３発現を判定することを含む方法も提供する。好ましい実施形態において、組織は腫瘍組織である。
【００５６】
本発明は、本明細書の式Ｉの化合物による化合物またはその薬学的に許容される塩が投与された患者からの血清中のＣＤ７３活性を判定することを含む方法も提供する。この方法は感度が高く、腫瘍生検を包含せず、抗体または免疫組織化学的手法を包含せず、ＣＤ７３活性の定量化を容易にする（例えば、ＥＣ５０の計算を容易にすることによる）。１つの好ましい実施形態において、化合物は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンである。別の好ましい実施形態において、本方法は、放射標識アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を使用してＣＤ７３活性をアッセイすることと、質量分析を使用して放射標識ＡＭＰの濃度を測定することと、をさらに含む。別の好ましい実施形態において、放射標識ＡＭＰは１３Ｃ５＿１５Ｎ５−ＡＭＰである。
【００５７】
別の好ましい実施形態において、本方法は、（ａ）患者へ投与された種々の濃度の化合物を含有するように構成された複数の容器（例えば、マイクロタイタープレート）の各々において患者からの血清を提供することと、（ｂ）複数の容器内の各容器において１３Ｃ１０＿１５Ｎ５＿ＡＭＰを提供することと、（ｃ）混合（例えば、振盪）を容易にする条件下で複数の容器をインキュベートすることと、（ｄ）複数の容器を遠心分離することと、（ｅ）各容器からの上清を新たな個々の容器へ移すことと、（ｆ）新たな個々の容器の各々において、内部標準を含有する抽出溶液を提供することと、（ｇ）新たな個々の容器を遠心分離することと、（ｈ）上清を新たな各個々の容器から個々の分析容器へと移すことと、（ｉ）本明細書において説明するように（「アデノシンおよびアデノシン精製物のための質量分析」）、ＬＣ／ＭＳによる１３Ｃ１０＿１５Ｎ５＿アデノシン、１３Ｃ１０＿１５Ｎ４＿イノシンおよび１５Ｎ４ヒポキサンチンについての各個々の分析容器中の上清をアッセイすることと、（ｊ）ＥＣ５０を計算することと、を含む。１つの好ましい実施形態において、化合物は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンである。好ましい実施形態において、内部標準は、１３Ｃ５−ＡＭＰ、１３Ｃ５−アデノシン、１５Ｎ４−イノシン、および１３Ｃ５−ヒポキサンチンである。
【００５８】
本発明は、療法における本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用も提供する。一実施形態において、療法は癌の治療である。別の実施形態において、癌は、膀胱癌、乳癌、胆管癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌、胆嚢癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝癌、肺癌、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌または腎癌である。一実施形態において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌である。別の実施形態において、肺癌は非小細胞肺癌である。１つの好ましい実施形態において、化合物は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンである。
【００５９】
本発明は、癌の治療のための薬剤の製造のための、本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用も提供する。一実施形態において、癌は、膀胱癌、乳癌、胆管癌、結腸直腸癌、結腸癌、胃癌、胆嚢癌、膠芽腫、頭頸部癌、肝癌、肺癌、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌または腎癌である。一実施形態において、乳癌はトリプルネガティブ乳癌である。別の実施形態において、肺癌は非小細胞肺癌である。１つの好ましい実施形態において、化合物は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンである。
【００６０】
一実施形態において、本発明は、有効量の本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の抗腫瘍薬と同時の、別々の、または連続した組み合わせで投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。抗腫瘍薬の非限定的な例としては、ラムシルマブ、ネシツムマブ、オララツマブ、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ガルニセルチブ、アベマシクリブ、ゲフィチニブ、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソームドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミドおよびドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イクサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、およびイリノテカン）、セツキシマブ、ＥＧＦＲ阻害薬、Ｒａｆ阻害薬、Ｂ−Ｒａｆ阻害薬、ＥＲＫ阻害薬、ＣＤＫ４／６阻害薬、イドレラミン２，３−ジオキシゲナーゼ阻害薬、ＴＧＦβ阻害薬、ならびにＴＧＦβ受容体阻害薬が挙げられる。
【００６１】
別の実施形態において、本発明は、有効量の本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の免疫腫瘍薬と同時の、別々の、または連続した組み合わせにおいて投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、免疫腫瘍薬は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体である。免疫腫瘍薬の非限定的な例としては、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、リリルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＬＹ３３０００５４（その重鎖および軽鎖の配列はそれぞれ、ＷＯ２０１７／０３４９１６およびＵＳ２０１７／００５８０３３において配列番号１０および配列番号１１において明らかにされる）。１つの好ましい実施形態において、免疫腫瘍薬は抗ＰＤ−１抗体である。別の好ましい実施形態において、免疫腫瘍薬は抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。別の好ましい実施形態において、化合物は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンであり、免疫腫瘍薬はＬＹ３３０００５４である。
【００６２】
一実施形態において、本発明は、有効量の本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、別の薬剤と同時の、別々の、または連続した組み合わせにおいて投与することを含む、非小細胞肺癌を治療する方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、他の薬剤はオシメルチニブ、セツキシマブまたはアベマシクリブである。別の好ましい実施形態において、他の薬剤はオシメルチニブである。別の好ましい実施形態では、他の薬剤はセツキシマブである。別の好ましい実施形態では、他の薬剤はアベマシクリブである。
【００６３】
別の実施形態において、本発明は、有効量の本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、別の薬剤と同時の、別々の、または連続した組み合わせにおいて投与することを含む、黒色腫を治療する方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、他の薬剤は、ＢＲＡＦ阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。別の好ましい実施形態において、他の薬剤は、ＢＲＡＦ阻害剤である。別の好ましい実施形態において、他の薬剤は、抗ＰＤ−１抗体である。別の好ましい実施形態において、他の薬剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。別の好ましい実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＬＹ３３０００５４である。別の好ましい実施形態において、化合物は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンであり、他の薬剤は抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＬＹ３３０００５４である。
【００６４】
別の実施形態において、本発明は、有効量の本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、別の薬剤と同時の、別々の、または連続した組み合わせにおいて投与することを含む、結腸直腸癌を治療する方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、他の薬剤はアベマシクリブである。別の好ましい実施形態において、化合物は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンであり、他の薬剤はアベマシクリブである。
【００６５】
別の実施形態において、本発明は、有効量の本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、別の薬剤と同時の、別々の、または連続した組み合わせにおいて投与することを含む、膵癌を治療する方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、他の薬剤はアベマシクリブである。別の好ましい実施形態において、化合物は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンであり、他の薬剤はアベマシクリブである。
【００６６】
別の実施形態において、本発明は、有効量の本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、別の薬剤と同時の、別々の、または連続した組み合わせにおいて投与することを含む、トリプルネガティブ乳癌の治療方法を提供する。１つの好ましい実施形態において、化合物は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンである。
【００６７】
本発明は、ＣＤ７３酵素活性を阻害することを必要とする患者へ、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、患者におけるＣＤ７３酵素活性を阻害する方法も提供する。本発明は、ＡＭＰからアデノシンへの転換を阻害することを必要とする患者へ、有効量の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、患者におけるＡＭＰからアデノシンへの転換を阻害する方法も提供する。
【００６８】
別の実施形態において、本発明は、有効量の本明細書の式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、アデノシンを調節する１つ以上の薬剤と同時の、別々の、または連続した組み合わせにおいて投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。アデノシンを調節する薬剤の非限定的な例としては、抗ＣＤ７３抗体およびアデノシン受容体アンタゴニストが挙げられる。
【００６９】
本発明は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。本発明はさらに、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することを含む、医薬組成物を調製するための方法を提供する。本発明は、式Ｉの化合物の合成のための新規の中間体および方法も包含する。
【００７０】
先に使用したように、および本発明の明細書のいたるところで、次の用語は、特に明記しない限り、次の意味を有すると理解されるものとする。
【００７１】
「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」とは、哺乳動物、例えばヒトへの生物学的に活性のある薬剤の送達のために当技術分野で概して受け入れられている媒体である。
【００７２】
「治療」、「治療する」、「治療すること」などの用語は、障害の進行を遅らせるまたは逆転させることを含むことを意味する。これらの用語には、障害または容態が実際に除去されていない場合でも、障害または容態の進行自体が遅くなったり逆転させたりしていない場合でも、障害または容態の１つ以上の症状を緩和、寛解、減衰、除去、または軽減することも含まれる。
【００７３】
「有効量」は、治療している臨床医によって患者の生物学的もしくは医学的応答または患者に対する所望の治療効果を誘起させるであろう、本発明の化合物もしくはその薬学的に許容される塩、または本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を含有する医薬組成物の量を意味する。一実施形態において、本化合物またはその薬学的に許容される塩は、インビトロまたはエクスビボＣＤ７３酵素アッセイにおいてＡＭＰからアデノシンへの転換を阻害する。別の実施形態において、化合物またはその薬学的に許容される塩は、異なる用量の化合物を用いて治療された動物からのマウス全血中でのＡＭＰからアデノシンへの転換を阻害する。
【００７４】
「ｇｅｍ−ジフルオロ」は、同じ炭素へ結合した２つのフッ素原子を指す。
【００７５】
「ｇｅｍ−ジメチル」は、同じ炭素へ結合した２つのメチル基を指す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語はヒトを指す。
【００７７】
有効量は、当業者のような担当診断医により、公知の技法の使用によって、および同様の状況下で得られた結果を観察することによって、容易に決定され得る。患者のための有効量を決定する際には、患者の種、患者のサイズ、年齢、および全体的な健康状態；関与する特定の疾患または障害；疾患または障害の程度または関与または重症度；個々の患者の応答；投与される特定の化合物；投与の様式；投与される製剤の生物学的利用率特性；選択された投薬計画；付随する薬物の使用；ならびに他の関連する状況を含むが、これらに限定されない、多数の要因が担当診断医によって考慮される。
【００７８】
本発明の化合物は、広い薬用量範囲にわたって使用することができる。例えば、１日あたりの薬用量は通常、体重１ｋｇあたり約０．０１〜約５０ｍｇの範囲内に収まる。
【００７９】
本発明の化合物は、好ましくは、経口経路、静脈内経路、および経皮経路を含む、化合物を生物学的に利用可能にするいずれかの経路によって投与される医薬組成物として製剤される。より好ましくは、そのような組成物は経口投与用である。そのような医薬組成物およびそれらを調製するための方法は、当該技術分野において周知である。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｄ．Ｂ．Ｔｒｏｙ，Ｅｄｉｔｏｒ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００６を参照されたい）。
【００８０】
本発明の化合物が塩を形成することができることは当業者によって理解するであろう。本発明の化合物は、塩基性複素環を含有し、したがって、多数の無機酸および有機酸のいずれかと反応して、薬学的に許容される酸付加塩を形成する。このような薬学的に許容される酸付加塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は、当技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８）を参照されたい。
【００８１】
「薬学的に許容される塩（ｓａｌｔｓ）」または「薬学的に許容される塩（ｓａｌｔ）」は、本発明の化合物の比較的非毒性の無機塩（ｓａｌｔ）および有機塩（ｓａｌｔ）または無機塩（ｓａｌｔｓ）および有機塩（ｓａｌｔｓ）を指す（Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ  ６６，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  １９７７）。
【００８２】
化合物名における「異性体１」の指定は、以下の「調製物および実施例」において説明する条件下で一対の鏡像異性体の混合物がキラルクロマトグラフィーによって分離されるとき、本発明の対応する中間体または化合物が２つの溶離する鏡像異性体の１番目であることを意味する。化合物名における「異性体２」の指定は、以下の「調製物および実施例」において説明する条件下で一対の鏡像異性体の混合物がキラルクロマトグラフィーによって分離されるとき、本発明の対応する中間体または化合物が２つの溶離する鏡像異性体の２番目であることを意味する。
【００８３】
本発明の化合物は、当技術分野で周知かつ認識されている合成方法によって調製することができる。これらの反応のステップに適した反応条件は、当技術分野で周知であり、溶媒および共試薬の適切な置換は、当技術分野の技術内である。同様に、合成中間体は、必要または所望に応じて種々の周知の技術によって単離および／または精製されることができることは当業者によって認識されるであろうし、頻繁に、後続の合成ステップにおいて種々の中間体を、ほとんどまたはまったく精製せずに直接使用することができることになる。さらに、当業者は、いくつかの状況において、複数の部分が導入される順序が重要ではないことを認識するであろう。本発明の化合物を製造するために必要とされるステップの特定の順序は、当業者によって十分に認識されているように、合成される特定の化合物、出発化合物、および置換された部分の相対的傾向に依存する。特に明記しない限り、すべての置換基はすでに定義したとおりであり、すべての試薬は当技術分野において周知であり認識されている。
【００８４】
本明細書で使用される場合、次の用語は示される意味を有する：「ＡＣＮ」はアセトニトリルを指し、「ＤＡＳＴ」は三フッ化ジエチルアミノ硫黄を指し、「ＤＣＭ」はジクロロメタンを指し、「ＤＭＡＰ」は、４−ジメチルアミノピリジンを指し、「ｄｍｓｏ」または「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し、「ｅｅ」は鏡像体過剰率を指し、「ＥＳ／ＭＳ」は、エレクトロスプレー質量分析法を指し、「ＥｔＯＡｃ」は酢酸エチルを指し、「Ｅｔ２Ｏ」はジエチルエーテルを指し、「ＦＢＳ」は、ウシ胎児血清を指し、「ＧＣ−ＭＳ」はガスクロマトグラフィー−質量分析法を指し、「ＨＢＳＳ」はハンクの平衡塩溶液を指し、「ＩＣ５０」は最大半値の阻害濃度を指し、「ＬＡＨ」は水素化アルミニウムリチウムを指し、「ＬＣ−ＥＳ／ＭＳ」は液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析法を指し、「ＭＳ」は質量分析法を指し、「ＭｅＯＨ」はメタノールを指し、「ＭＴＢＥ」はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを指し、「ｎＢｕＬｉ」は、ｎ−ブチルリチウムを指し、「ｎｍ」はナノメートル（複数可）を指し、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴を指し、「ＯＡｃ」はアセタートを指し、「ｐｓｉ」はポンド／平方インチを指し、「ＲＴ」は室温または外界温度を指し、「ＳＣＸ」は、強カチオン交換を指し、「ＳＦＣ」とは、超臨界流体クロマトグラフィーを指し、「ＳＮＡｒ」は求核芳香族置換を指し、「ＴＥＡ」はトリエチルアミンを指し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを指し、「ｔＲ」は保持時間を指し、「ｗ／ｗ」は、溶液中の重量／重量比を指す。
【００８５】
本発明の化合物は、次のスキームにおいて示されるように合成することができる。
【化２２】
0006794560.tif 000025
【００８６】
スキーム１は、式Ｉａの化合物の調製を図示している。周知の鈴木型条件を使用して、市販の（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）ボロン酸１を４，６−ジクロロ−３−メチル−ピリダジンへカップリングすることができる。３のクロロ部分と適切に置換されたトランス−シクロプロピルボロナートとのその後の鈴木カップリングを達成して、４を得ることができる。当業者は、化合物４の鏡像異性体が、当技術分野で周知のキラル分離技術を使用して分離することができることを認識するであろう。式Ｉａの化合物は、当技術分野で十分に説明されている一連の脱メチル化条件下で、４におけるメトキシ基の脱保護により調製することができる。
【化２３】
0006794560.tif 000026
【００８７】
スキーム２は、式ＩＩの化合物を調製するために必要とされる必須のシクロプロピルボロン酸エステルを図示する。当業者は、適切に置換されたアルキン５のヒドロホウ素化が一連の条件下で、特にＣｕまたはＺｒのような遷移金属触媒の存在下でもたらされ、アルケニルボロナート６を得ることができることを認識するであろう。アルケニルボロナートは、Ｓｉｍｍｏｎｓ−Ｓｍｉｔｈシクロプロパン化、Ｃｏｒｅｙ−Ｃｈａｙｋｏｖｓｋｙ反応、および遷移金属触媒を用いた（例えば、Ｃｕ、Ｐｄ、またはＮｉ）および用いない（例えば、熱的にまたは光化学的に）場合の両方のジアゾメタン（またはジアゾ化合物）によるシクロプロパン化の方法のような、当技術分野で周知の安定化カルベノイド型条件下でシクロプロパン化して、適切に置換されたトランス−シクロプロピルボロナート７を得ることができる。当業者は、熱力学的に好ましいシクロプロパン化生成物が７におけるトランス鏡像異性体の混合物であることを認識するであろう。
【化２４】
0006794560.tif 000027
【００８８】
スキーム３は、式Ｉｂの化合物のキラル合成を図示する。修飾されたＳａｎｄｍｅｙｅｒ条件（ラジカルＳＮＡｒ）下での適切に置換されたアミノ酸８のジアゾ化による９の生成は、当技術分野で周知である。アルコール１０へのその後の還元は、水素化アルミニウムおよびジボランを還元剤として含む、当技術分野で周知の一連の還元剤を利用して達成することができる。塩基性条件下でのキラルエポキシド１１への環化は、当技術分野で十分に説明されている。立体選択的なＨｏｒｎｅｒ−Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ−Ｅｍｍｏｎｓ反応は、キラルエポキシド１１を適切なホスホン酸エステル（例えば、エチル２−ジエトキシホスホリルアセタートまたはトリエチルホスホノアセタート）および適切な塩基（例、アルキルリチウム、金属アルコキシド、または金属水素化物）を用いて処理することによって使用して、トランス−シクロプロパン誘導体１２を得ることができる（例えば、Ｌ．Ｄｅｌｈａｙｅ；Ａ．Ｍｅｒｓｃｈａｅｒｔ；Ｐ．Ｄｅｌｂｅｋｅ；Ｗ．Ｂｒｉｏｎｅ．Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．＆Ｄｅｖ．２００７，１１，６８９−６９２を参照されたい。）化合物１２の対応する酸１３への加水分解は、当技術分野で十分に説明されている広範な塩基性条件下で達成することができる。酸１３と適切に置換されたＮ−ヒドロキシフタルイミドとのその後のカップリングは、当技術分野で十分に説明されており、適切な酸活性化剤、例えば、穏やかな非求核性塩基の存在下でカルボニルジイミダゾールを利用して、化合物１４を調製する。Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステル１４の脱カルボキシル化ボリル化は、遷移金属触媒の存在下で（例えば、鈴木−宮浦反応）、光分解条件下で、または、例えば、ピリジン−ボロンラジカルによって容易にされる、トランス−シクロプロパンボロナート１５を得るためのラジカルカップリングにおけるＮ−ヒドロキシフタルイミドエステルとジホウ素との錯体形成を含む単一電子移動反応によることを含む、当技術分野で公知の多くの条件下で達成することができる。（例えば、Ｗ．−Ｍ．Ｃｈｅｎｇ；Ｓ．Ｒｕｉ；Ｂ．Ｚｈａｏ；Ｗ．−Ｌ．Ｘｉｎｇ；Ｙ．Ｆｕ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１７，１９，４２９１−４２９４を参照されたい。）ボロナート１５と塩化アリール４とのカップリングおよびその後の脱メチル化は、スキーム１において説明されるものと同様に実施され、式Ｉｂのキラル化合物型を得ることができる。
【化２５】
0006794560.tif 000028
【００８９】
スキーム４は、式Ｉｃの化合物の合成を図示する。ジクロルピリダジン１７の求核置換は、当技術分野において周知のラジカル条件（例えば、Ｍｉｎｉｓｃｉ反応）下で実施して、置換ピリダジン１９を得ることができる。ボロナート２０と塩化アリール１９とのカップリングおよびその後の脱メチル化は、スキーム１に説明するものと同様に実施して、式Ｉｃの化合物型を得ることができる。
【化２６】
0006794560.tif 000029
【００９０】
スキーム５は、式Ｉｄの化合物の合成を図示する。２−クロロピリダジン２１の置換は、当技術分野において一般的に公知の求核条件下で実施して、メトキシピリダジン２２を提供することができる。２２のその後の脱メチル化をスキーム１に説明されているものと同様に実施して、式Ｉｄの化合物型を得ることができる。
【化２７】
0006794560.tif 000030
【００９１】
スキーム６は、式Ｉｅの化合物の合成を図示する。式Ｉｃのシアン化は、遷移金属（例えば、Ｐｄ、Ｃｕ、Ｒｈ）触媒反応を含む、当技術分野において公知の種々の条件下で達成して、式Ｉｅの化合物を提供することができる。
【化２８】
0006794560.tif 000031
【００９２】
スキーム７は、式Ｉｆの化合物の合成を図示する。アルケニルボロナートは、スキーム２に説明されているものと同様にシクロプロパン化されることができる。ボロナート２５と塩化アリール３とのカップリングは、スキーム１に説明されているものと同様に実施して、キラル化合物２６を得ることができる。ジエチルアセタール２６からアルデヒド２７へのマスキング解除は、適切な酸を用いた処理によって達成することができる。種々のフッ素化試薬（例えば、ＤＡＳＴ、ＸｔａｌＦｌｕｏｒ（登録商標）、Ｆｌｕｏｌｅａｄ（商標）またはＤｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標））を用いたアルデヒド２７の処理は、ジフルオロメチル２８を提供することができる。２８のその後の脱メチル化は、スキーム１に説明されたものと同様に実施して、式Ｉｆの化合物型を得ることができる。
【化２９】
0006794560.tif 000032
【００９３】
スキーム８は、式Ｉｇの化合物の合成を図示する。メタンスルホナート２９は、フッ化カリウムまたはフッ化ｔｅｒｔブチルアンモニウムのような試薬を用いる当業者に公知の置換技術を用いてフッ化物３０へ転換することができる。スキーム１に説明されているものと同様に、その後の脱メチル化を実施して、式Ｉｇのキラル化合物を得ることができる。
【００９４】
調製物および実施例
次の調製例および実施例は、本発明をさらに示し、本発明の化合物の典型的な合成を表すが、いかなる方法においても本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。試薬および出発材料は容易に入手可能であるか、または当業者によって容易に合成されることができる。調製物および実施例が、説明としてであって制限としてではなく明らかにされていること、および種々の変更は当業者によってなされることができることは理解されるべきである。
【００９５】
ＬＣ−ＥＳ／ＭＳは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００液体クロマトグラフィーシステムで実施される。エレクトロスプレー質量分析測定（ポジティブモードおよび／またはネガティブモードで取得）は、ＨＰ１１００ＨＰＬＣに接続されたＭａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ四重極質量分析計で実施される。ＬＣ−ＭＳ条件（低ｐＨ）：カラム：ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）ＧＥＭＩＮＩ（登録商標）ＮＸ  Ｃ−１８  ２．１×５０ｍｍ  ３．０μｍ、勾配：５〜１００％Ｂで３分間、次に１００％Ｂで０．７５分間カラム温度：５０℃±１０℃、流量：１．２ｍＬ／分、溶媒Ａ：０．１％ＨＣＯＯＨ含有脱イオン水、溶媒Ｂ：０．１％ギ酸含有ＡＣＮ、波長２１４ｎｍ。代替ＬＣ−ＭＳ条件（高ｐＨ）：カラム：ＷＡＴＥＲＳ（商標）ＸＴＥＲＲＡ（登録商標）ＭＳ  Ｃ−１８カラム２．１×５０ｍｍ、３．５μｍ；勾配：５％の溶媒Ａで０．２５分、３分間で５％〜１００％の勾配の溶媒Ｂ、および１００％の溶媒Ｂで０．５分間、または３分間で１０％〜１００％の溶媒Ｂ、および１００％の溶媒Ｂで０．７５分間；カラム温度：５０℃±１０℃；流量：１．２ｍＬ／分；溶媒Ａ：１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ９；溶媒Ｂ：ＡＣＮ；波長：２１４ｎｍ。
【００９６】
分取逆相クロマトグラフィーは、Ｍａｓｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ質量分析計およびＬｅａｐ自動試料採取装置／分画収集装置を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００ＬＣ−ＥＳ／ＭＳで実施される。高ｐＨ方法は、７５×３０ｍｍのＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）ＧＥＭＩＮＩ（登録商標）−ＮＸ、１０×２０ｍｍのガードを備えた５μｍ粒径カラムで実行される。８５ｍＬ／分の流量。溶離液は、ＡＣＮ中の１０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ１０）である。
【００９７】
ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＩＩＩ  ＨＤ４００ＭＨｚ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで実施し、ｐｐｍで報告されるＣＤＣｌ３または（ＣＤ３）２ＳＯ溶液として得、残留溶媒［ＣＤＣｌ３、７．２６ｐｐｍ、（ＣＤ３）２ＳＯ、２．５０ｐｐｍ］を参照標準物質として使用する。ピーク多重度を報告するとき、次の略語を使用することができる：ｓ（一重線）、ｄ（二重線）、ｔ（三重線）、ｑ（四重線）、ｍ（多重線）、ｂｒ−ｓ（ブロード一重線）、ｄｄ（二重線の二重線）、ｄｔ（三重線の二重線）。カップリング定数（Ｊ）は、報告するとき、ヘルツ（Ｈｚ）で報告する。
【００９８】
調製物１
ｒａｃ−トランス−２−（２−エチルシクロプロピル）−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン
【化３０】
0006794560.tif 000033
Ｅｔ２Ｏ（４５．３０ｍＬ）中の２−［（Ｅ）−ブタ−１−エニル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（１．６５ｇ、９．０６ｍｍｏｌ）の溶液へＰｄ（ＯＡｃ）２（０．２０ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を添加する。５分間超音波処理し、−５℃に冷却する。
【００９９】
２５０ｍＬ三角フラスコに、ＫＯＨ（１６２ｍＬ）、次いでＥｔ２Ｏ（２４５ｍＬ）の４０％水溶液を入れる。この二相混合物を氷浴／飽和ＮａＣｌ水溶液浴中で−５℃に冷却する。Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（３６．１ｇ、３５０ｍｍｏｌ）を１０分かけて少しずつ添加する。１５分間攪拌し、ドライアイス浴／アセトン浴の中に入れる。エーテル層をメスシリンダー中にデカントし、Ｅｔ２Ｏ混合物（７１ｍＬ、約１０当量のＣＨ２Ｎ２）を上述の溶液に−５℃で添加する。２時間後、反応内容物を珪藻土で濾過し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮して、表題化合物（１．０８ｇ、５８％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ：−０．５１（ｄｔ，Ｊ＝９．３，５．７Ｈｚ，１Ｈ），０．３３−０．３７（ｍ，１Ｈ），０．５０−０．５４（ｍ，１Ｈ），０．７６−０．８４（ｍ，１Ｈ），０．９１（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），１．１４（ｓ，１２Ｈ），１．２１−１．３０（ｍ，２Ｈ）。
【０１００】
調製物１の代替手順
０℃で冷却した窒素下で、ＴＨＦ（４１．３ｍＬ、４１．３ｍｍｏｌ）中のリチウムトリエチルボロヒドリドの１Ｍ溶液を、ＴＨＦ（３．４Ｌ）中のビス（ペンタメチルシクロペンタジエニル）ジルコニウムジクロリド（１１．１ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。ＲＴに加温し、アルミホイルでフラスコを遮光しながら１時間撹拌する。
【０１０１】
−７８℃の窒素下で冷却した別のフラスコ中で、１−ブタ−１−イン（５０．６ｇ、９３６ｍｍｏｌ）を凝縮させ、ピナコールボラン（５５．０ｇ、４２５ｍｍｏｌ）を添加する。得られた混合物を−７８℃で３０分間撹拌し、カニューレを介して第１のフラスコの内容物を添加する。ＴＥＡ（５．９３ｍＬ、４２．６ｍｍｏｌ）を添加し、２０時間ＲＴへ加温しながら反応混合物を撹拌する。カニューレを介して氷／水（１．５Ｌ）の混合物の添加によって反応をクエンチし、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）を添加し、ＲＴで３０分間撹拌する。得られた層を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（２ｘ２００ｍＬ）で再抽出する。有機抽出物を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮して、２−［（Ｅ）−ブタ−１−エニル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（５３ｇ、６５％）を黄色の油として得る。ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８２（Ｍ＋）。
【０１０２】
トルエン中のジエチル亜鉛の溶液（１５重量％、５５０ｍＬ、６１１ｍｍｏｌ）をクロロヨードメタン（５５ｍＬ、７５５ｍｍｏｌ）に−２０℃で１０分間かけて添加し、３５分間撹拌する。トルエン（１００ｍＬ）中の２−［（Ｅ）−ブタ−１−エニル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（５３ｇ、２７７ｍｍｏｌ）の溶液を、反応物の内部温度を−２０℃に維持しながら２０分間かけて滴下して添加する。０℃に加温しながら、混合物を２時間撹拌する。飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（７５０ｍＬ）の緩徐な添加によって反応をクエンチする。有機層を分離し、ＥｔＯＡｃ（２ｘ２５０ｍＬ）で水相を再抽出する。有機抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、さらに精製することなく使用するのに適した油として表題化合物（４８ｇ、８４％）を得る。ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８０（Ｍ−１６）。
【０１０３】
調製物２
４，４，５，５−テトラメチル−２−［（Ｅ）−３−メチルブタ−１−エニル］−１，３，２−ジオキサボロラン
【化３１】
0006794560.tif 000034
ピナコールボラン（９．５ｍｌ、６４ｍｍｏｌ）を氷冷３−メチルブタ−１−イン（４．９１ｇ、７２．０ｍｍｏｌ）へ５分間かけて滴下して添加する。圧力容器を密封し、ＲＴまで加温し、１８時間撹拌する。ビス（シクロペンタジエニル）ジルコニウム（ＩＶ）クロリドヒドリド（２．０ｇ、７．４ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（１．１ｍＬ、７．９ｍｍｏｌ）を添加する。圧力容器を密封し、６０℃の油浴の中に入れて、１０分間撹拌する。得られた赤色の溶液をＲＴへ２．５時間冷却する。この反応混合物をＤＣＭ（２００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、シリカゲルのパッドで濾過し（１５０ｍＬ）、シリカゲルをＤＣＭ（７００ｍＬ）ですすぎ、真空濃縮して、表題化合物（１１．５ｇ、８２％）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１９６（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１．０３（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，６Ｈ），１．２９（ｓ，１２Ｈ），２．３７（ｍ，１Ｈ），５．４０（ｄｄ，１Ｈ），６．６４（ｄｄ，１Ｈ）。
【０１０４】
調製物３
ｒａｃ−トランス−２−［２−イソプロピルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン
【化３２】
0006794560.tif 000035
少しずつ、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素を、Ｅｔ２Ｏ（７０ｍＬ）およびＫＯＨ水溶液（３０．５ｇ、４３５ｍｍｏｌ、７０ｍＬのＨ２Ｏ）の氷冷二相混合物へを添加する。固体が溶解するまで撹拌する（５分未満）。得られたジアゾメタン溶液を、Ｅｔ２Ｏ（７０ｍＬ）中のＰｄ（ＯＡｃ）２（２３７ｍｇ、１．０５ｍｍｏｌ）および４，４，５，５−テトラメチル−２−［（Ｅ）−３−メチルブタ−１−エニル］−１，３，２−ジオキサボロラン（４．００ｇ、２０．４ｍｍｏｌ）の急速に撹拌されている氷冷懸濁液中へピペットで移す。添加が完了した後、反応混合物をＲＴへ加温し、珪藻土で濾過し、濾液を真空で濃縮する。得られた残渣をＤＣＭ中に溶解し、シリカゲルのプラグ（２５ｇ）で濾過し、真空濃縮して、表題化合物（４．３２ｇ、９９％超）を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２１０（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：−０．３５（ｍ，１Ｈ），０．４５（ｍ，１Ｈ），０．６５（ｍ，１Ｈ），０．７８（ｍ，１Ｈ），０．９８（ｍ，７Ｈ），１．２３（ｓ，１２Ｈ）。
【０１０５】
調製物４
４−クロロ−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン
【化３３】
0006794560.tif 000036
圧力バイアルに、２，４−ジメトキシ−５−ピリミジニルボロン酸（６．７５ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）、４，６−ジクロロ−３−メチル−ピリダジン（５．９８ｇ、３６．７ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（０．５５ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）、Ｃｓ２ＣＯ３（２９．９ｇ、９１．８ｍｍｏｌ）を、１，４−ジオキサン／Ｈ２Ｏ（１５１ｍＬ）の４：１混合物中で合わせる。脱気し、Ｎ２を充填し戻す。容器を密封し、７０℃で３時間加熱する。残渣を珪藻土で濾過し、ＥｔＯＡｃですすぐ。有機混合物を水、続いて飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、蒸発乾固させる。得られた黒色の残渣を、０〜３０％のＤＣＭ／（ＤＣＭ中の３３％のＭｅＯＨ）の勾配を２００ｍＬ／分の流量で１５分間かけて用いる３３０ｇのＲＥＤＩＳＥＰ（登録商標）カラムを用いるシリカゲル上でのクロマトグラフィーによって精製し、クロマトグラフィー画分の蒸発後に表題化合物（６．２ｇ、６３％）を得た。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６７／２６９［Ｍ＋１］＋Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ：２．７４（ｓ，３Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），４．０３（ｓ，３Ｈ），８．２０（ｓ，１Ｈ），８．８７（ｓ，１Ｈ）。
【０１０６】
調製物４の代替手順
１，４−ジオキサン（１１７５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（３４０ｍＬ）中の（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）ボロン酸（８５ｇ、４３９ｍｍｏｌ）、４，６−ジクロロ−３−メチル−ピリダジン（７５ｇ、４３７ｍｍｏｌ）およびＣｓ２ＣＯ３（３５８ｇ、１０９９ｍｍｏｌ）の混合物に窒素流を５分間通過させる。［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（６．６ｇ、８．７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を７５℃で１６時間撹拌する。反応物をＲＴへ冷却し、この混合物を珪藻土で濾過し、このフィルターケークをＥｔＯＡｃですすぐ。得られた層を分離し、有機相を飽和ＮａＣｌ水溶液で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空濃縮する。得られた残渣に水（５００ｍＬ）を添加し、ＲＴで１６時間撹拌し、得られた固体を濾過する。収集した固体をＨ２Ｏで洗浄し、真空下で１６時間乾燥させて、所望の化合物（７０ｇ、５４％）を褐色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６７／２６９［Ｍ＋１］＋
【０１０７】
次の例は、本質的に調製物４において説明したとおり調製することができる。
【表１】
0006794560.tif 000037
【０１０８】
調製物６
トランス−５−［２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−２，４−ジメトキシ−ピリミジン
【化３４】
0006794560.tif 000038
２０ｍＬの圧力バイアルに、４−クロロ−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン（０．６ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、ビス（ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４−ジメチルアミノフェニル）ホスフィン）ジクロロパラジウム（ＩＩ）（１１４ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、Ｋ２ＣＯ３（０．６９ｇ、４．９ｍｍｏｌ）、Ｈ２Ｏ（２．２５ｍＬ）およびラセミ体のトランス−２−［２−エチルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（０．６６ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）を入れる。フラスコを脱気し、Ｎ２で充填し戻す。容器を密封し、９０℃で一晩加熱する。反応混合物を珪藻土上で濾過し、有機層を水、続いて飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮する。得られた残渣を、２７５グラムのＲＥＤＩＳＥＰ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ｃ１８カラムを用いて、３０〜５０％の１０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３／ＡＣＮの勾配で２０分間かけて１５０ｍＬ／分の流量で溶離する逆相クロマトグラフィーによって精製して、クロマトグラフィー画分の蒸発後、異性体の本質的にラセミ混合物である表題化合物（４７５ｍｇ、７０％）を白色の固体として得た。
【０１０９】
得られた異性体をＳＦＣ（カラム：ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）ＬＵＸ（登録商標）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−４、４．６ｘ１５０ｍｍ、４０％ＭｅＯＨ／ＣＯ２アイソクラティック、流量：５ｍＬ／分、ＵＶ２５０ｎｍ）による精製に供して、いずれも９８％超の鏡像体過剰率である０．１９７ｇの異性体１：ｔＲ＝２．７１分（ＵＶ）、および０．１９５ｇの異性体２：ｔＲ３．５５分（ＵＶ）を得た。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０１（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１０】
調製物７
トランス−５−［２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−２，４−ジメトキシ−ピリミジン
【化３５】
0006794560.tif 000039
４−クロロ−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン（１．９７ｇ、７．３９ｍｍｏｌ）、ｒａｃ−トランス−２−［２−イソプロピルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（３．３２ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）、ビス（ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４−ジメチルアミノフェニル）ホスフィン）ジクロロパラジウム（ＩＩ）（１．３５ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（３７ｍＬ）、および１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３水溶液（１８ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）を合わせる。反応容器をＮ２でパージし、９０℃へ１８時間加熱する。ＲＴへ冷却し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈し、層を分離する。有機層を１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で連続して洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濾液を真空濃縮する。得られた残渣を、６０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭの勾配で溶離するシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製し、クロマトグラフィー画分の蒸発後、表題化合物を異性体の本質的にラセミ混合物（１．４８ｇ、６４％）として得る。
【０１１１】
異性体をＳＦＣ（カラム：ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）ＬＵＸ（登録商標）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−４、４．６ｘ１５０ｍｍ、４０％ＭｅＯＨ／ＣＯ２アイソクラティック、流量：５ｍＬ／分、ＵＶ２５０ｎｍ）による精製に供して、６４７ｍｇの異性体１：ｔＲ＝２．５６分および６４７ｍｇの異性体２：ｔＲ＝３．７５分を得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１５（Ｍ＋Ｈ）。
【０１１２】
調製物８
（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロパンカルボン酸エチル
【化３６】
0006794560.tif 000040
氷浴／水浴（内部温度：８℃）中で冷却した１，４−ジオキサン（４００ｍＬ）中の２−ジエトキシホスホリル酢酸エチル（６２．２ｇ、２７７ｍｍｏｌ）の溶液に、ヘキサン中のｎＢｕＬｉの２．５Ｍ溶液（１１０ｍＬ、２８０ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下して添加する。冷却浴を取り外し、ＲＴで３０分間撹拌する。カニューレを介して溶液を１Ｌの圧力容器へ移し、（２Ｒ）−２−エチルオキシラン（２０ｇ、２８０ｍｍｏｌ）を添加する。得られた混合物を１５０℃（５０ｐｓｉの圧力）で１７時間撹拌する。反応物をＲＴへ冷却し、水（２５０ｍＬ）を添加する。有機相を分離し、水相をＭＴＢＥ（２ｘ２００ｍＬ）で再抽出する。有機抽出物を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液（２ｘ１５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮して、粗表題化合物（４９．１ｇ、定量的）を黄色の油として得、これはさらなる精製なしでの使用に適している。ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１４２（Ｍ＋），９７（Ｍ−４５）。
【０１１３】
調製物９
（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロパンカルボン酸
【化３７】
0006794560.tif 000041
（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロパンカルボン酸エチル（３９．４４ｇ、２７７．４ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（３１５ｍＬ）および水酸化ナトリウムの２５％水溶液（３１５ｍＬ）の混合物を１００℃で１６時間撹拌する。混合物をＲＴへ冷却し、ＭＴＢＥ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、有機相を廃棄する。水相をＨＣｌの３７％水溶液でｐＨが約１〜２になるまで酸性化し、ＭＴＢＥ（３ｘ３００ｍｌ）で抽出し、層を分離し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮して、表題化合物（２５．１ｇ、７５％）を琥珀色の油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．７９−０．８５（ｍ，１Ｈ），１．００（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，３Ｈ），１．２２−１．２６（ｍ，１Ｈ），１．３２−１．４２（ｍ，３Ｈ  ），１．４３−１．４８（ｍ，１Ｈ），９．０−１２．０（ｂｒ−ｓ，１Ｈ）。
【０１１４】
調製物１０
（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロパンカルボキシラート
【化３８】
0006794560.tif 000042
ＤＣＭ（３６０ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロパンカルボン酸（２５．１ｇ、２０９ｍｍｏｌ）、２−ヒドロキシイソインドリン−１，３−ジオン（３４．８ｇ、２０９ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２．５８ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃で撹拌して、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（２９．３ｇ、２３０ｍｍｏｌ）を滴下して添加する。冷却浴を取り外し、反応液をＲＴで２時間撹拌する。懸濁液をシリカゲルプラグで濾過し、ＤＣＭで溶離する。溶媒を蒸発させ、得られた残渣を、１５％ヘキサン／アセトンで溶離するシリカゲル上でのクロマトグラフィーによって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（５１．５６ｇ、８４％）を淡黄色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２６０（Ｍ＋１）。
【０１１５】
調製物１１
２−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン
【化３９】
0006794560.tif 000043
Ｎ２流を、ＥｔＯＡｃ（１Ｌ）中の（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロパンカルボキシラート（５１ｇ、１７３．１ｍｍｏｌ）およびビス（ピナコラート）ジボロン（８７．９ｇ、３４６ｍｍｏｌ）の溶液に５分間通過させる。イソニコチン酸エチル（５．３４ｇ、３５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を８５℃で２４時間撹拌する。得られた懸濁液を冷却し、濾過して固体を廃棄し、褐色の濾液を減圧下で濃縮する。得られた粗残渣をシリカゲルプラグ上で濾過し、２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する。溶媒を濾液から除去し、得られた残渣を、３％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離するシリカゲル上でのクロマトグラフィーを使用して再精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後に、表題化合物（１７．１ｇ、４９％）を無色の油として得る。ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１８０（Ｍ−１６）。
【０１１６】
調製物１２
（２Ｓ）−２−クロロ−３−メチル−ブタン酸
【化４０】
0006794560.tif 000044
Ｌ−バリン（２８６ｇ、２．４４ｍｏｌ）およびＨＣｌの５Ｍ水溶液（３．２５Ｌ、１６．３ｍｏｌ）の溶液を０℃で冷却する。内部温度を５℃未満に維持しながら、ＮａＮＯ２の４Ｍ水溶液（１Ｌ、４ｍｏｌ）を２時間かけて滴下して添加する。この反応物をＲＴへ加温しながら２時間撹拌し、ＲＴでさらに１６時間撹拌する。少しずつ３０分間かけて、Ｎａ２ＣＯ３（２４２ｇ、２．２８ｍｏｌ）を添加する。得られた溶液をＭＴＢＥ（３ｘ１０００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を飽和ＮａＣｌ水溶液（５００ｍＬ）で洗浄し、有機抽出物をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮する。得られた残渣を真空蒸留（１５ｍｂａｒ／１４０℃）によって精製して、表題化合物（２４８ｇ、６８％）を油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１．１（ｄｔ，Ｊ＝６．６，２．６Ｈｚ，６Ｈ）、２．３４−２．４２（ｍ，１Ｈ），４．１９−４．２３（ｍ，１Ｈ），１０．０−１２．０（ｂｒ−ｓ，１Ｈ）。
【０１１７】
調製物１３
（２Ｓ）−２−クロロ−３−メチル−ブタン−１−オール
【化４１】
0006794560.tif 000045
２−メチルテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中の（２Ｓ）−２−クロロ−３−メチル−ブタン酸（１３７ｇ、１ｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却する。内部温度を１０℃未満に維持しながら、メチルテトラヒドロフラン（４８０ｍＬ、１．１ｍｏｌ）中のＬＡＨの２．３Ｍ溶液を２．５時間かけて滴下して添加する。ＲＴに加温し、混合物をＲＴで１時間、５０℃で１時間撹拌する。この反応物を０℃に冷却し、Ｈ２Ｏ（１．４８ｍＬ）、ＮａＯＨの１５％水溶液（１．４８ｍＬ）およびＨ２Ｏ（４．４６ｍＬ）を順番に緩徐に添加する。混合物をＲＴに加温させ、珪藻土の床で濾過し、溶媒を真空蒸発させて、表題化合物（１１０ｇ、８１％）を無色の油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．９７−１．１（ｍ，６Ｈ），１．９４−２．１８（ｍ，１Ｈ），２．６０−３．０９（ｂｒ−ｓ，１Ｈ），３．７１−３．７８（ｍ，１Ｈ），３．８０−３．８５（ｍ，１Ｈ），３．９０−３．９６（ｍ，１Ｈ）。
【０１１８】
調製物１４
（２Ｒ）−２−イソプロピルオキシラン
【化４２】
0006794560.tif 000046
Ｈ２Ｏ（１９５ｍＬ）中のＫＯＨ（１９５ｇ、３．４８ｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、内部温度を５℃未満に維持しながら、無水（２Ｓ）−２−クロロ−３−メチル−ブタン−１−オール（１１０ｇ、８０１ｍｍｏｌ）を２０分間かけて添加する。この反応混合物をＲＴまで加温させる。１００ｍｂａｒでの真空蒸留によって反応混合物を精製し、２３℃から５０℃まで加温して、表題化合物（４７ｇ、６４％）を無色の油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．９８（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．０５（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ），１．５１（ｏ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），２．５２−２．５４（ｍ，１Ｈ），２．７０−２．７５（ｍ，２Ｈ）。
【０１１９】
調製物１５
（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロパンカルボン酸エチル
【化４３】
0006794560.tif 000047
氷浴／水浴（内部温度：８℃）中で冷却した１，４−ジオキサン（８７０ｍＬ）中の２−ジエトキシホスホリル酢酸エチル（１５３ｍＬ、７７２ｍｍｏｌ）の溶液に、ヘキサン中のｎＢｕＬｉの２．５Ｍ溶液（３１０ｍＬ、７８０ｍｍｏｌ）を２５分間かけて滴下して添加する。ＲＴに加温し、４０分間撹拌するこの溶液を、カニューレを介して３Ｌ圧力容器へ移し、１，４−ジオキサン（１８０ｍＬ）中の（２Ｒ）−２−イソプロピルオキシラン（７０ｇ、７７２ｍｍｏｌ）を添加する。この反応混合物を５０ｐｓｉの圧力で１５０℃、１４時間撹拌する。この反応混合物をＲＴに冷却し、Ｈ２Ｏ（７００ｍＬ）を添加する。層を分離し、水相をＭＴＢＥ（２ｘ５００ｍＬ）で再抽出する。有機相を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液（２ｘ３５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮して、粗表題化合物（１０７．７ｇ、９９％超）を、さらなる精製なしでのその後の使用に適している黄色の油として得る。ＧＣ−ＭＳ（ｍ／ｚ）：１５６（Ｍ＋）。
【０１２０】
調製例１６（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロパンカルボン酸
【化４４】
0006794560.tif 000048
ＮａＯＨの２５％水溶液（８００ｍＬ）を含有する１，４−ジオキサン（８００ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロパンカルボン酸エチル（１０７．７ｇ、４８２．６ｍｍｏｌ）の混合物を１００℃で７時間撹拌する。この混合物をＲＴに冷却し、水（３００ｍＬ）を添加し、ＭＴＢＥ（２ｘ５００ｍＬ）で抽出し、有機相を廃棄する。ｐＨが約１〜２になるまで、水相を３７％ＨＣｌ水溶液（およそ５００ｍＬ）で酸性化する。
【０１２１】
酸性化された水性混合物をＭＴＢＥ（２ｘ６００ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮して、表題化合物（５４．２ｇ、７５％）を琥珀色の油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：０．８１−０．８６（ｍ，１Ｈ），１．０１（ｄｄ，Ｊ＝５．９，３．７Ｈｚ，６Ｈ），１．０４−１．１３（ｍ，１Ｈ），１．２０−１．２４（ｍ，１Ｈ），１．２８−１．３７（ｍ，１Ｈ），１．３９−１．４４（ｍ，１Ｈ）。
【０１２２】
調製物１７
（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロパンカルボキシラート
【化４５】
0006794560.tif 000049
ＤＣＭ（６９０ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロパンカルボン酸（５４．２ｇ、３５９ｍｍｏｌ）、２−ヒドロキシイソインドリン−１，３−ジオン（５９．８ｇ、３５９ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４．４４ｇ、３５．９ｍｍｏｌ）の懸濁液を０℃で撹拌する。Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（５０．４ｇ、３９５ｍｍｏｌ）を滴下して添加し、ＲＴに加温し、得られた反応混合物をＲＴで２時間撹拌する。Ｈ２Ｏ（６００ｍＬ）を添加し、相を分離する。水相をＤＣＭ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、蒸発させる。得られた固体残渣を、１００％ＤＣＭで溶離するシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製して、クロマトグラフィー画分の蒸発後、表題化合物（９６ｇ、８８％）を淡黄色の固体として得た。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７４（Ｍ＋１）。
【０１２３】
調製物１８
２−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン
【化４６】
0006794560.tif 000050
ＥｔＯＡｃ（４８０ｍＬ）中の（１，３−ジオキソイソインドリン−２−イル）（１Ｓ，２Ｓ）−２−イソプロピルシクロプロパンカルボキシラート（９６ｇ、３１６ｍｍｏｌ）およびビス（ピナコラート）ジボロン（１６０ｇ、６３０ｍｍｏｌ）の溶液に窒素流を１５分間通す。この混合物を８５℃で撹拌し、イソニコチン酸エチル（２４．３８ｇ、１５７ｍｍｏｌ）を１０分間かけて滴下して添加する。得られた混合物を８５℃で１６時間撹拌する。得られた懸濁液を冷却し、固体を濾過して廃棄し、褐色の濾液を減圧下で蒸発させる。粗残渣をシリカゲルプラグ上で濾過し、２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離する。溶媒を濾液から除去し、得られた残渣を３％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶離するシリカゲル上でのクロマトグラフィーを使用して再精製し、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（２５．３ｇ、３８％）を無色の油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：−０．３３−−０．３８（ｍ，１Ｈ），０．４２−０．４７（ｍ，１Ｈ），０．６３−０．６７（ｍ，１Ｈ），０．７５−０．８２（ｍ，１Ｈ），０．８９−１．０２（ｍ，１Ｈ），０．９８（ｍ，６Ｈ），１．２４（ｓ，１２Ｈ）。
【０１２４】
調製物１９
４，４，５，５−テトラメチル−２−［（Ｅ）−４−メチルペンタ−１−エニル］−１，３，２−ジオキサボロラン
【化４７】
0006794560.tif 000051
無水ＤＣＭ（９．７ｍＬ）中に［（Ｅ）−４−メチルペンタ−１−エニル］ボロン酸（０．９７５ｇ、７．６２ｍｍｏｌ）およびピナコール（１．１１ｇ、９．１４ｍｍｏｌ）を溶解する。ＭｇＳＯ４（０．７３１３ｇ、６．０５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３日間撹拌する。不溶性固体を濾過し、溶媒を減圧下で除去して、表題化合物を透明な油として得る（１．６ｇ、１００％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：０．８６（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，６Ｈ），１．０８（ｓ，６Ｈ），１．１９（ｓ，１２Ｈ），１．６２−１．７２（ｍ，１Ｈ），２．０１（ｔｄ，Ｊ＝６．９，１．４Ｈｚ，２Ｈ），３．９２（ｓ，１Ｈ），５．３１（ｄｔ，Ｊ＝１７．９，１．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４７（ｄｔ，Ｊ＝１７．９，６．９Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１２５】
調製物２０
ｔｅｒｔ−ブチル−［（２Ｓ）−オキシラン−２−イル］メトキシ］−ジフェニル−シラン
【化４８】
0006794560.tif 000052
ＤＭＦ（１３５ｍＬ）中の［（２Ｒ）−オキシラン−２−イル］メタノール（１５．０ｇ、２０２．６ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、イミダゾール（３３．３４ｇ、４８９．８ｍｍｏｌ）を添加し、１５分間撹拌する。ｔｅｒｔ−ブチル−クロロ−ジフェニル−シラン（７７ｍＬ、３０２．５ｍｍｏｌ）を３０分間かけて滴下して添加し、室温まで一晩撹拌する。ヘキサン（１Ｌ）、エーテル（５００ｍｌ）および水（１Ｌ）で希釈する。層を分離し、水層をエーテル（２ｘ１Ｌ）で抽出する。有機物を合わせ、水（３ｘ７５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させる。溶媒を減圧下で蒸発させる。シリカゲルクロマトグラフィー：溶離剤ヘキサン中の０〜１０％ＥｔＯＡｃによって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（１１．７７ｇ、１８％）を油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．０８（ｓ，９Ｈ），２．６４（ｄｄ，Ｊ＝２．６，５．１Ｈｚ，１Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），３．１５（四重線，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｄｄ，Ｊ＝４．７，１１．８Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｄｄ，Ｊ＝３．２，１１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４０−７．４８（ｍ，６Ｈ），７．７１（ｍ，４Ｈ）。
【０１２６】
調製物２１
（１Ｓ，２Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）シクロプロパンカルボン酸エチル
【化４９】
0006794560.tif 000053
１，４−ジオキサン（４０ｍＬ）中のナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（３．６７ｇ、３７．８２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ホスホノ酢酸トリエチル（７．５ｍＬ、３８ｍｍｏｌ）を室温で緩徐に添加する。１時間後、ｔｅｒｔ−ブチル−［［（２Ｓ）−オキシラン−２−イル］メトキシ］−ジフェニル−シラン（１１．７７ｇ、３３．７６ｍｍｏｌ）を添加し、密封した圧力容器中で１４０℃で一晩加熱する。ホスホノ酢酸トリエチル（２ｍＬ）をさらに添加し、１６０℃で１時間加熱する。この混合物を冷却させて、ＤＣＭ（３００ｍｌ）および水（１５０ｍＬ）で希釈する。層を分離し、水層をＤＣＭ（３ｘ１５０ｍＬ）で抽出する。有機物を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させる。珪藻土で濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させて、（１Ｓ，２Ｓ）−２−［［ｔｅｒｔ−ブチル（ジフェニル）シリル］オキシメチル］シクロプロパンカルボン酸エチル（１８．４５ｇ）を油として得る。ＴＨＦ（７５ｍＬ）中に溶解し、室温でフッ化テトラブチルアンモニウム（１Ｍ  ＴＨＦ、６７ｍＬ、６７ｍｍｏｌ、１．０Ｍ）を添加する。４８時間撹拌し、１３０ｍｂａｒおよび３０℃で溶媒を除去する。シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：ヘキサン中の０〜５０％ＥｔＯＡｃによって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（３．３５ｇ、６２％）を油として単離する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：１４２（Ｍ＋１）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：０．９０−０．８６（ｍ，１Ｈ），１．２３（ｄｄ，Ｊ＝４．５，８．９Ｈｚ，１Ｈ），１．２８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，４Ｈ），１．５６−１．６０（ｍ，１Ｈ），１．６９−１．７７（ｍ，２Ｈ），２．０６（ｓ，２Ｈ），３．５０（ｄｄ，Ｊ＝６．９，１１．５Ｈｚ，１Ｈ），３．６４（ｄｄ，Ｊ＝６．０，１１．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１４（ｑｄ，Ｊ＝７．１，２．９Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１２７】
調製物２２
（１Ｓ，２Ｓ）−２−ホルミルシクロプロパンカルボン酸エチル
【化５０】
0006794560.tif 000054
ＤＣＭ（４２５ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｓ）−２−（ヒドロキシメチル）シクロプロパンカルボン酸エチル（１２．２５ｇ、８４．９ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、クロロクロム酸ピリジニウム（２６．０９ｇ、１１８．６ｍｍｏｌ）を一度に添加する。３０分後、氷浴を取り外し、室温で４時間撹拌する。水（２００ｍＬ）を添加し、珪藻土で濾過する。さらなる水（１００ｍＬ）およびＤＣＭ（８００ｍＬ）ですすぐ。珪藻土ケークをＤＣＭ中に懸濁し、濾過する。この操作を２回繰り返す。有機物を合わせ、水層を分離し、有機物をシリカのパッドで濾過する。さらなるＤＣＭですすぎ、溶媒を減圧下で蒸発させて、表題化合物（１１．０ｇ、９１％）を油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．３０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），１．５７−１．５０（ｍ，１Ｈ），１．６０−１．６５（ｍ，２Ｈ），２．２６−２．３０（ｍ，１Ｈ），２．４５（ｔｄ，Ｊ＝９．０，４．２Ｈｚ，１Ｈ），４．１３−４．２２（ｍ，３Ｈ），９．３２（ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１２８】
調製物２３
（１Ｓ，２Ｓ）−２−（ジフルオロメチル）シクロプロパンカルボン酸エチル
【化５１】
0006794560.tif 000055
ＤＣＭ（２２０ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｓ）−２−ホルミルシクロプロパンカルボン酸エチル（１１．００ｇ、７７．３８ｍｍｏｌ）の氷冷溶液に、三フッ化ジエチルアミノ硫黄（２４ｍＬ、１７２．３ｍｍｏｌ）を３分間かけて添加する。１時間後、氷浴から取り外し、室温で２時間撹拌する。三フッ化ジエチルアミノ硫黄（３．５ｍＬ）を添加し、さらに１時間撹拌する。この混合物を氷浴中で冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液中へと注意深く注ぐ。層を分離し、水層をＤＣＭ（２ｘ５０ｍＬ）で抽出する。
【０１２９】
有機物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させる。この試料をシリカの小さなパッドで濾過し、溶媒を減圧下（２５０ｍｂａｒおよび３０℃）で蒸発させて、表題化合物（１１．１０ｇ、８７％）を油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．１４−１．１９（ｍ，１Ｈ），１．２９（ｍ，１Ｈ），１．３０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），１．９７−１．８９（ｍ，２Ｈ），４．２２（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），５．７９（ｔｄ，ＪＨ−Ｆ＝５６．８Ｈｚ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１３０】
調製物２４
（１Ｓ，２Ｓ）−２−（ジフルオロメチル）シクロプロパンカルボン酸
【化５２】
0006794560.tif 000056
ＭｅＯＨ（７５ｍＬ）中の（１Ｓ、２Ｓ）−２−（ジフルオロメチル）シクロプロパンカルボン酸エチル（１１．１０ｇ、６７．６２ｍｍｏｌ）の溶液に１Ｎ  ＮａＯＨ（７５ｍＬ）を添加し、ＲＴで一晩撹拌する。ＤＣＭ（７０ｍＬ）を添加し、層を分離する。水層をＤＣＭ（７０ｍＬ）で抽出する。水層を氷浴中で冷却し、３５％ＨＣｌの添加によってｐＨを１に調整する。ＤＣＭ（５０ｍＬ）を添加し、２つの層を分離する。水層をＤＣＭで抽出する。有機物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を減圧下（２００ｍｂａｒ、３０℃）で蒸発させて、表題化合物（６．２５ｇ、６８％）を油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：１．２６（ｄｔ，Ｊ＝８．４，５．９Ｈｚ，１Ｈ），１．３４−１．３９（ｍ，１Ｈ），１．９２−１．９６（ｍ，１Ｈ），２．０１−２．０７（ｍ，１Ｈ），５．８２（ｔｄ，ＪＨ−Ｆ＝５９Ｈｚ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１３１】
調製物２５
トランス−ベンジル−２−アセチルシクロプロパンカルボキシラート
【化５３】
0006794560.tif 000057
Ｋ２ＣＯ３（３６．２ｇ、２６１．９３ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４００ｍＬ）中のベンジルブロモアセタート（４０ｇ、１７４．６１８ｍｍｏｌ）、メチルビニルケトン（４３ｍＬ、５２３．８５ｍｍｏｌ）、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（２．３ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）の混合物へ添加する。Ｎ２下、８０℃で一晩撹拌する。冷却させ、濾過し、溶媒を減圧下で蒸発させる。シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤０〜５０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（１３．４ｇ、３５％）を得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．３３−１．３９（ｍ，２Ｈ），２．０８−２．１３（ｍ，１Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．５４−２．５９（ｍ，２Ｈ），５．１３（ｓ，２Ｈ），７．３９−７．３７（ｍ，６Ｈ）。
【０１３２】
調製物２６
トランス−ベンジル−２−（１，１−ジフルオロエチル）シクロプロパンカルボキシラート
【化５４】
0006794560.tif 000058
ＥｔＯＨ（０．０５当量）をトランス−ベンジル−２−アセチルシクロプロパンカルボキシラート（２．７６ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）および三フッ化ビス（２−メトキシエチル）アミノ硫黄（２３．２ｍＬ、１２６ｍｍｏｌ）の混合物へ０℃で添加する。室温に加温させて、５０℃で４０時間加熱する。ＤＣＭで希釈し、混合物を氷浴中で冷却して、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を緩徐に添加する。層を分離し、水層をＤＣＭ（２ｘ１００ｍＬ）で抽出する。有機物を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させる。減圧下で溶媒を蒸発させます。シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：１０％ＭＴＢＥ／ヘキサン）によって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（２．３０ｇ、７６％）を無色の油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．１９（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６７（ｔ，Ｊ  Ｈ−Ｆ＝１６Ｈｚ，３Ｈ），１．９３−１．９８（ｍ，１Ｈ），２．００−２．０８（ｍ，１Ｈ），５．１３（ｓ，２Ｈ），７．３８−７．４０（ｍ，５Ｈ）。
【０１３３】
調製物２７
トランス−２−（１，１−ジフルオロエチル）シクロプロパンカルボン酸
【化５５】
0006794560.tif 000059
１０％Ｐｄ／Ｃ（１．５３ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ中のトランス−ベンジル−２−（１，１−ジフルオロエチル）シクロプロパンカルボキシラート（６．５６ｇ、２７．３ｍｍｏｌ）の溶液（１３６ｍＬ、０．２Ｍ）に加える。バルーンを使用して、Ｈ２下でＲＴで３時間撹拌する。珪藻土で濾過し、ＥｔＯＡｃですすぐ。溶媒を減圧下で蒸発させて、表題化合物（４．０３ｇ、９８％）を無色の油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ｄ６−ＤＭＳＯ）：１．１０（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），１．６６（ｔ，Ｊ  Ｈ−Ｆ＝１８．４Ｈｚ，３Ｈ），１．７２−１．７７（ｍ，１Ｈ），１．９６−１．９９（ｍ，１Ｈ），１２．４９（ｓ，１Ｈ）。
【０１３４】
調製物２８
５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−２，４−ジメトキシ−ピリミジン
【化５６】
0006794560.tif 000060
４−クロロ−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン（１６ｇ、５４．０ｍｍｏｌ）、２−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（１７ｇ、８３．２２ｍｍｏｌ）、Ｎａ２ＣＯ３の２Ｍ水溶液（７０ｍＬ、１４０ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（２９０ｍＬ）の混合物にＮ２を１０分間発泡させることによって、この混合物を脱気する。ビス（ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４−ジメチルアミノフェニル）ホスフィン）ジクロロパラジウム（ＩＩ）（２．０ｇ、２．７４ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を９０℃で１６時間撹拌する。この反応混合物をＲＴに冷却し、Ｈ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで抽出する。得られた相を分離し、有機相を無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、真空濃縮する。得られた残渣を、６０〜１００％ヘキサン／ＥｔＯＡｃの勾配で溶離するシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（１２．９５ｇ、７７％）を琥珀色の油として得る。油はＲＴで静置して凝固させると、オフホワイト色の固体になる。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０１（Ｍ＋１）。
【０１３５】
調製物２９
５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−２，４−ジメトキシ−ピリミジン
【化５７】
0006794560.tif 000061
４−クロロ−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン（１９．１ｇ、７０．６ｍｍｏｌ）、Ｋ３ＰＯ４（４５．９ｇ、２１２ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（３００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（７５ｍＬ）を混合し、この混合物をＮ２で１０分間脱気する。［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（７．９８ｇ  １０．６ｍｍｏｌ）を添加する。窒素でさらに２分間発泡させて、２−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン（２２．２ｇ、１０６ｍｍｏｌ）を一度に添加する。得られた混合物を８０℃で１６時間撹拌する。この反応物をＲＴに冷却し、Ｈ２Ｏを添加し、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機層を分離し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。得られた残渣を、８５％ヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶離するシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（２１．５ｇ、９２％）を琥珀色の油として単離する。この油はＲＴで静置すると凝固して、オフホワイト色の固体になる。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１５（Ｍ＋１）。
【０１３６】
調製物３０
４−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−（ジフルオロメチル）シクロプロピル］−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン
【化５８】
0006794560.tif 000062
ジメチル亜鉛（トルエン中の２Ｍ、１．５ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（６ｍＬ）中の３−クロロ−４−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−（ジフルオロメチル）シクロプロピル］−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）ピリダジン（５０２ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）および１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン−パラジウム（ＩＩ）ジクロリド（５３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の脱気した懸濁液に添加する。。密封したバイアル中で６０℃で２時間加熱する。室温まで冷却させる。飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液を添加し、ＤＣＭ（３ｘ）で抽出する。有機物を合わせ、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去する。シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物を黄色の残渣（４３３ｍｇ、９１．８％）として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３２３（Ｍ＋１）。
【０１３７】
調製物３１
３，６−ジクロロ−４−シクロプロピル−ピリダジン
【化５９】
0006794560.tif 000063
水（３００ｍＬ）中の３，６−ジクロロピリダジン（１０．００ｇ、６７．１２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、１０ｍＬの濃Ｈ２ＳＯ４およびシクロプロパンカルボン酸（５．８５ｍＬ、７３．７ｍｍｏｌ）を添加し、７０℃で加熱し、Ｎ２で脱気する。１０ｍＬのＨ２Ｏ中のＡｇＮＯ３（２．２８ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）の溶液を３０秒間かけて添加し、続いて１５０ｍＬのＨ２Ｏ中の（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ８（４６ｇ、２０１．５７７ｍｍｏｌ）の溶液を３０分間かけて滴下して添加する。１時間後、この混合物をＲＴに冷却し、氷へと注ぎ、濃ＮＨ４ＯＨの添加によってｐＨを９に調整する。ＥｔＯＡｃで希釈し、有機層を分離する。さらなるＥｔＯＡｃで水層を抽出する。有機物を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で溶媒を蒸発させる。逆相クロマトグラフィー（Ｃ１８  Ｇｏｌｄ  ４１５ｇ、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の２５〜１００％の勾配のＡＣＮ、１５０ｍＬ／分、３０分間）によって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（６．８３ｇ、５４％）を白色の固体として単離する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）１８９／１９１。
【０１３８】
次の例は、本質的に調製物２２において説明されているとおり調製することができる。
【表２−１】
0006794560.tif 000064
【表２−２】
0006794560.tif 000065
【０１３９】
調製物４３
３−クロロ−４−シクロプロピル−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）ピリダジン
【化６０】
0006794560.tif 000066
（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）ボロン酸（４．６０ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）、３，６−ジクロロ−４−シクロプロピル−ピリダジン（５．２ｇ、２８ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（４．４ｇ、３２ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（１２５ｍＬ）およびＨ２Ｏ（４２ｍＬ）を混合し、この混合物をＮ２で１０分間脱気する。［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）ジクロロメタン錯体（１．５ｇ、１．８ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２でさらに脱気する。得られた混合物を６０℃で１時間撹拌する。この反応物をＲＴに冷却し、Ｈ２Ｏを添加し、ＥｔＯＡｃで抽出する。有機層を分離する。水層をさらなるＥｔＯＡｃで抽出する。有機物を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させる。得られた残留物を、７０％ヘキサン／（３：２のアセトン：ＤＣＭ）で溶離するシリカ上でのクロマトグラフィーによって精製し、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（２．４ｇ、３３％）を淡黄色の固体として単離する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２９３／２９５［Ｍ＋１］＋
【０１４０】
次の例は、本質的に調製物６において説明したとおり調製することができる。
【表３−１】
0006794560.tif 000067
【表３−２】
0006794560.tif 000068
【０１４１】
調製物５２
４−シクロブチル−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メトキシ−ピリダジン
【化６１】
0006794560.tif 000069
シクロブチルカルボン酸からの調製物２１および３３の後に、３−クロロ−４−シクロブチル−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）ピリダジンを得た。
【０１４２】
３−クロロ−４−シクロブチル−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）ピリダジン（０．４２ｇ、１．４ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（１２ｍＬ）中にＮａ（０．１６ｇ、６．８ｍｍｏｌ）を溶解することによって調製されたＮａＯＭｅの溶液に添加する。蓋をしたバイアル中でこの混合物を６０℃で一晩加熱する。この混合物をＲＴに冷却させ、５０％飽和ＮａＣｌ水溶液を添加し、ＤＣＭ（３ｘ）で抽出する。有機物を合わせ、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させる。減圧下で溶媒を除去し、表題化合物（０．３８ｇ、９３％）を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３０３（Ｍ＋１）。
【０１４３】
次の例は、本質的に調製物５２において説明されているとおり調製することができる。
【表４】
0006794560.tif 000070
【０１４４】
調製物５９
トランス−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−［２−［２−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）シクロプロピル］エトキシ］シラン
【化６２】
0006794560.tif 000071
市販のｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−［（Ｅ）−４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）ブタ−３−エノキシ］シランから、本質的に調製物３において説明したとおり調製することができる。１Ｈ  ＮＭＲ（４００．１３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：３．７０−３．６６（ｍ，２Ｈ），１．５１−１．３８（ｍ，２Ｈ），１．２３（ｓ，１２Ｈ），１．０４−０．９６（ｍ，１Ｈ），０．９１（ｓ，９Ｈ），０．７１−０．６７（ｍ，１Ｈ），０．４６−０．４１（ｍ，１Ｈ），０．０７（ｓ，６Ｈ），−０．３８（ｄｔ，Ｊ＝９．３，５．８Ｈｚ，１Ｈ）。
【０１４５】
調製物６０
トランス−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−［２−［２−［６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン−４−イル］シクロプロピル］エトキシ］シラン
【化６３】
0006794560.tif 000072
本質的に調製物４において説明したとおり調製することができる。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：４１７（Ｍ＋１）。
【０１４６】
調製物６１
トランス−２−［２−［６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン−４−イル］シクロプロピル］エタノール
【化６４】
0006794560.tif 000073
ＤＣＭ（３ｍＬ）中のフッ化テトラブチルアンモニウム（５ｍＬ、５ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１Ｍ）およびトランス−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−［２−［２−［６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン−４−イル］シクロプロピル］エトキシ］シラン（１．１５ｇ、８．９ｍｍｏｌ）を入れ、６０℃で１時間撹拌する。室温に冷却する。ＤＣＭ（８０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ（３ｘ３０ｍＬ）で洗浄する。有機物を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去する。シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤０〜３０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物（０．５３ｇ、５３％）を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１７（Ｍ＋１）。１Ｈ  ＮＭＲ（３９９．８０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．９２（ｓ，１Ｈ），７．２９（ｍ，１Ｈ）、４．０３（ｓ，３Ｈ），４．０２（ｓ，３Ｈ），３．８１（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７６（ｓ，３Ｈ），１．７３−（ｍ，３Ｈ），１．２６（ｍ，２Ｈ），１．０３（ｍ，２Ｈ）。
【０１４７】
調製物６２
トランス−２−［２−［６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン−４−イル］シクロプロピル］エチルメタンスルホナート
【化６５】
0006794560.tif 000074
ＤＣＭ（８ｍＬ）中のトランス−２−［２−［６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン−４−イル］シクロプロピル］エタノール（０．３９０ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．４ｍＬ、２ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メタンスルホニル（０．２ｍＬ、３ｍｍｏｌ）を０℃でＮ２下で添加する。０℃で４０分間撹拌する。５０ｍＬのＤＣＭで希釈し、５％ＮａＨＣＯ３（２ｘ３０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）で洗浄する。有機物を合わせ、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で蒸発させる。シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：０〜２０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物を褐色の固体（０．２８０ｇ、５８％）として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３９５（Ｍ＋１）。１Ｈ  １Ｈ  ＮＭＲ（３９９．８０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：８．９８（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），４．３７（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０７（ｓ，３Ｈ），４．０５（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），２．８１（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｍ，１Ｈ），１．９０−１．７８（ｍ，２Ｈ），１．２７（ｍ，１Ｈ），１．０６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１４８】
調製物６３
トランス−２，４−ジメトキシ−５−［６−メチル−５−［２−（２−フルオロエチル）シクロプロピル］ピリダジン−３−イル］ピリミジン
【化６６】
0006794560.tif 000075
ＴＨＦ（３ｍＬ）中のトランス−２−［２−［６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メチル−ピリダジン−４−イル］シクロプロピル］エチルメタンスルホナート（０．２８０ｇ、０．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、フッ化テトラブチルアンモニウム水和物（３ｍＬ、３ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中１Ｍ）を添加する７０℃で２時間加熱する。ＲＴに冷却する。ＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去する。シリカゲルクロマトグラフィー（溶離剤：０〜２０％ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ）によって精製して、クロマトグラフィー画分からの溶媒除去後、表題化合物を淡黄色の油（０．１７０ｇ、７１％）として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：３１９（Ｍ＋１）。１Ｈ  ＮＭＲ（３９９．８０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：９．０１（ｍ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），４．６７−４．５２（ｄｔ，Ｊ  Ｈ−Ｆ  ４８Ｈｚ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），４．０８（ｓ，３Ｈ），４．０７（ｓ，３Ｈ），２．８３（ｓ，３Ｈ），２．００−１．９４（ｍ，３Ｈ），１．２７（ｍ，１Ｈ），１．０６（ｍ，２Ｈ）。
【０１４９】
キラル分離：Ｌｕｘ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−４カラム、２５０ｘ２１ｍｍ、流量７０ｇ／分、溶離剤：４０％ＭｅＯＨ／ＣＯ２
【０１５０】
鏡像異性体１  ９９％超の鏡像体過剰率、ｒｔ２．５９分（Ｌｕｘ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−４、４．６×１５０ｍｍ、４０％のＭｅＯＨ／ＣＯ２、５ｍＬ／分、２２５ｎｍ）。鏡像異性体２  ９９％超の鏡像体過剰率。ｒｔ３．３４分（Ｌｕｘ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−４、４．６×１５０ｍｍ、４０％ＭｅＯＨ／ＣＯ２、５ｍＬ／分、２２５ｎｍ）。
【０１５１】
実施例１
５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン
【化６７】
0006794560.tif 000076
ＨＣｌの１Ｍ水溶液（４ｍＬ）中に５−［５−［（−２−エチルシクロプロピル）−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−２，４−ジメトキシ−ピリミジン異性体１（１９７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）を溶解し、得られた混合物を７０℃へ一晩加熱する。この反応混合物をＲＴに冷却し、−７８℃のアセトン／ドライアイス浴中で凍結させ、凍結乾燥により溶媒を除去して、表題化合物（０．１７６ｇ、９７％）を淡黄色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７３（Ｍ＋Ｈ）。
１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ：１．００（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ），１．１１−１．１６（ｍ，１Ｈ），１．２７−１．３３（ｍ，２Ｈ），１．４７−１．５２（ｍ，２Ｈ），１．９２−１．９６（ｍ，１Ｈ），２．８０（ｓ，３Ｈ），８．００（ｓ，１Ｈ），８．４１（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），１１．７３（ｓ，１Ｈ），１１．９９−１１．９１（ｍ，１Ｈ）。
【０１５２】
実施例１〜５の代替手順
５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−２，４−ジメトキシ−ピリミジン（１６．２ｇ、５１．５ｍｍｏｌ）およびＨＣｌの１Ｍ水溶液（１３５ｍＬ、１３５ｍｍｏｌ）の懸濁液を４５℃で１６時間撹拌する。ＲＴに冷却し、Ｋ２ＨＰＯ４の２Ｍ水溶液を添加してｐＨを約６にし（約１５０ｍＬ）、ＲＴで１６時間撹拌する。得られた固体を濾過して収集し、水で洗浄し、真空オーブン中で４５℃で１６時間乾燥させて、表題化合物（１３．８ｇ、９３％）を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７３（Ｍ＋１）。
【０１５３】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンの結晶化５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−をメタノール中に溶解し、５０℃で１時間撹拌し、外界温度に冷却させて、溶液から結晶化する。固体を真空濾過により単離し、７０℃で真空下で短時間乾燥させる。
【０１５４】
実施例２
５−  ［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン
【化６８】
0006794560.tif 000077
トランス−５−［５−［２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−２，４−ジメトキシ−ピリミジン異性体１（６２８ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３ｍＬ）中に溶解する。ＨＣｌの１Ｍ水溶液（５ｍＬ）を添加し、７０℃に３時間で加熱する。ＲＴに冷却し、反応混合物をＭｅＯＨ洗浄ＳＣＸカラム（２０ｇ、Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ  ＳＩＬＩＡＢＯＮＤ  Ｔｏｓｉｃ  Ａｃｉｄ）にロードし、ＳＣＸカラムをＭｅＯＨ（１４０ｍＬ）で洗浄し、所望の生成物を２Ｍ  ＮＨ３／ＭｅＯＨ（１４０ｍｌ）で溶離する。ＮＨ３／ＭｅＯＨ画分を濃縮して、表題化合物をクリーム色の固体として得る（５４６ｍｇ、９５％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８７（Ｍ＋Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ：０．９９（ｍ，９Ｈ），１．２４（ｍ，１Ｈ），１．８１（ｍ，１Ｈ），２．７２（ｓ，３Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ），１１．４３（ｂｓ，２Ｈ）。
【０１５５】
実施例１〜５の代替手順
５−  ［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−２，４−ジメトキシ−ピリミジン（２１．５ｇ、６５．６ｍｍｏｌ）および１ＭのＨＣｌ水溶液（１６５ｍＬ、１３５ｍｍｏｌ）の懸濁液を４５℃で１６時間撹拌する。ＲＴに冷却し、ＭＴＢＥで抽出する。有機相を廃棄し、ｐＨ約６（約１５０ｍＬ）になるまでＫ２ＨＰＯ４の２Ｍ水溶液を水相に添加する（およそ１５０ｍＬ）。得られた混合物をＲＴで１６時間撹拌する。得られた固体を濾過して収集し、水で洗浄し、真空オーブン中で４５℃で１６時間乾燥させて、表題化合物（１４．３ｇ、７６％）を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２８７（Ｍ＋１）。
【０１５６】
実施例３
５−［５−［２−（ジフルオロメチル）シクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン
【化６９】
0006794560.tif 000078
５−［５−［２−（ジフルオロメチル）シクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンは、本質的に実施例１において説明したとおり調製することができる。
【０１５７】
次の実施例は、本質的に実施例１において説明したとおり調製することができる。
【表５】
0006794560.tif 000079
【０１５８】
実施例７
５−（６−クロロ−５−シクロプロピル−ピリダジン−３−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン
【化７０】
0006794560.tif 000080
ＭｅＯＨ（１７ｍＬ）中の３−クロロ−４−シクロプロピル−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）ピリダジン（１．０ｇ、３．４ｍｍｏｌ）の溶液に１Ｍ  ＨＣｌ（１４ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）を添加し、５０℃で一晩撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、表題化合物（０．９ｇ、１００％）を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：（３５Ｃｌ／３７Ｃｌ）２６５／２６７
次の実施例は、本質的に実施例７において説明したとおり調製することができる。
【表６−１】
0006794560.tif 000081
【表６−２】
0006794560.tif 000082
【０１５９】
実施例１６
４−シクロプロピル−６−（２，４−ジオキソ−１Ｈ−ピリミジン−５−イル）ピリダジン−３−カルボニトリル
【化７１】
0006794560.tif 000083
ＤＭＦ（１ｍＬ、１２．９ｍｍｏｌ）中の５−（６−クロロ−５−シクロプロピル−ピリダジン−３−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン（Ａ、５７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１００質量％）の溶液をＮ２で脱気する。Ｚｎ（ＣＮ）２（２０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（５ｍｇ、０．００５４ｍｍｏｌ）および１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン（６ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２でさらに脱気する。キャップをしっかりと閉め、１２０℃で一晩加熱する。ＲＴに冷却し、珪藻土で濾過する。逆相クロマトグラフィー（Ｃ１８  Ｇｏｌｄ  １５．５ｇ、１０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の５〜２０％ＡＣＮの勾配、２０ＣＶ）によって精製して、表題化合物（０．０３２ｇ、５８％）を淡黄色の固体として単離する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２５６（Ｍ＋１）。
【０１６０】
次の実施例は、本質的に実施例１６において説明したとおり調製することができる。
【表７】
0006794560.tif 000084
【０１６１】
実施例２３
５−（５−シクロブチル−６−メトキシ−ピリダジン−３−イル）−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン
【化７２】
0006794560.tif 000085
１Ｍ  ＨＣｌ（５．２ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を４−イクロブチル−６−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−３−メトキシ−ピリダジン（０．３９ｇ、１．３ｍｍｏｌ）に添加し、５０℃で６時間、次いでＲＴで一晩撹拌する。溶媒を減圧下で除去する。ＳＣＸカートリッジ（１０ｇ、溶離剤６０ｍＬ  ＤＣＭ、６０ｍＬ  ＤＣＭ中の５０％ＭｅＯＨ、および１２０ｍＬのＤＣＭ中のＭｅＯＨ中の５０％７Ｍ  ＮＨ３）を通過させて精製し、表題化合物（０．３３７ｇ、９６％）を白色の固体として得る。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２７５（Ｍ＋１）。
【０１６２】
次の実施例は、本質的に実施例２３において説明したとおり調製することができる。
【表８】
0006794560.tif 000086
【０１６３】
実施例３０
５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−（２−フルオロエチル）シクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン
【化７３】
0006794560.tif 000087
ＨＣｌ（Ｈ２Ｏ中の１Ｍ、２ｍＬ、２ｍｍｏｌ）をトランス２，４−ジメトキシ−５−［６−メチル−５−［２−（２−フルオロエチル）シクロプロピル］ピリダジン−３−イル］ピリミジン（０．０４３ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の鏡像異性体１に添加し、５０℃で一晩加熱する。溶媒を減圧下で除去する。ＳＣＸカートリッジを通過させて精製して（１２ｇ、溶離剤７０ｍＬのＭｅＯＨ、７０ｍＬのＭｅＯＨ中の２Ｍ  ＮＨ３）で精製して、表題化合物（０．０３７ｇ、８９％）を白色の固体ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｚ）：２９１（Ｍ＋１）として得る。
【０１６４】
生物学的アッセイ
次のアッセイは、本発明の例示化合物がＣＤ７３活性の阻害剤であり、癌を治療する上で有用であることを実証している。
【０１６５】
ＣＤ７３タンパク質の発現および精製
Ｃ末端６−ＨＩＳタグ付きヒトＣＤ７３（アミノ酸１〜５４７）を、細胞にＣＤ７３遺伝子を一過性にトランスフェクトすることによって、ＨＥＫ２９３Ｆ哺乳動物細胞において発現させ、Ｎｉ２＋アフィニティーおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製する。Ｃ末端６−ＨＩＳタグ付きマウスＣＤ７３（アミノ酸１〜５４９）を、先に説明したとおり発現させ精製する。Ｃ末端６−ＨＩＳタグ付きラットＣＤ７３（アミノ酸１〜５４９）を、先に説明したとおり発現させ精製する。
【０１６６】
アデノシンについての質量分析およびアデノシン精製
Ａｇｉｌｅｎｔ  ３００  ＲａｐｉｄＦｉｒｅ自動抽出システム（Ａｇｉｌｅｎｔ、カリフォルニア州サンタクララ市）を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）インターフェイスソースを備えたＳｃｉｅｘ  ６５００トリプル四重極質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ、マサチューセッツ州フレイミングハム町）に連結された３つのＨＰＬＣ四元ポンプで使用する。ＲａｐｉｄＦｉｒｅ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃシステムに、再利用可能なＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＨＩＬＩＣ（Ｈ１）固相抽出（ＳＰＥ）カートリッジ（Ｇ９２０３−８０１０９）をロードする。
【０１６７】
試料のローディングおよび洗浄に使用される溶媒Ａは、５％（ｖ／ｖ）ＡＣＮを含有する５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ４．０）である。試料の溶離に使用される溶媒Ｂは、７０％ＡＣＮ／３０％ＭｅＯＨ中の０．３％ギ酸＋２％水酸化アンモニウムである。試料は、マルチウェルプレートから直接、真空下で収集ループ上へと１０μＬを吸引することによって連続的に分析される。１０μＬの試料をＨＩＬＩＣカートリッジ上にロードし、四元ポンプ１によって、溶媒Ａを１．２５ｍＬ／分の流量で３０００ミリ秒間使用して洗浄する。保持された分析物は、四元ポンプ３によって、溶媒Ｂを１．２５ｍＬ／分の流量で３０００ミリ秒間使用して、質量分析計へ溶離する。このシステムを四元ポンプ１によって、溶媒Ａを１．２５ｍＬ／分の流量で３０００ミリ秒間使用して再平衡化する。
【０１６８】
トリプル四重極質量分析計にエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ソースを装備し、ポジティブモード（Ｍ＋Ｈ）＋において選択した反応モニタリング（ＳＲＭ）を使用して分析物を監視する。アデノシンをｍ／ｚ２６８．０５／１３６．０で、アデノシン一リン酸をｍ／ｚ３４８．１／１３６．０で監視する。内部標準としてそれぞれ１３Ｃ５アデノシンおよび１５Ｎ５  ＡＭＰを使用して、アデノシンおよびアデノシン一リン酸についての面積比の値を計算する。
【０１６９】
ヒトＣＤ７３生化学アッセイ
このアッセイの目的は、ＣＤ７３酵素活性の阻害剤を特定し、特徴付けることとする。２μＭアデノシン一リン酸（Ｓｉｇｍａ＃０１９３０）、１０ｍＭトリスｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％ＢＳＡ、０．２ｍＭ  オクチルグルコシド、および５０ｐＭ  ＣＤ７３タンパク質を含有する反応混合物（２０μＬ）を３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ＃２６４５７３）に入れる。ＲＴで３０分間のインキュベーション後、２％ギ酸および１０μＭ  １３Ｃ５−アデノシン（１３Ｃ５で標識したリボース）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−＃ＣＬＭ−３６７８−０）を含有する２０μＬの停止溶液を添加すること、続いて４０μＬのｄＨ２Ｏの添加によって反応を終止させる。アデノシン−１３Ｃ５およびアデノシンリボース−１３Ｃ５（内部標準）のレベルは、先に説明したとおり質量分析を利用して決定する。シグナル比（アデノシンピーク積分／アデノシン内部標準ピーク積分）を使用して、各反応を定量化する。式｛％阻害＝１００ｘ［１−（Ｘ−ＭＩＮ）／（ＭＡＸ−ＭＩＮ）］｝を使用することによって阻害百分率を計算し、式中、Ｘはウェルシグナル比に等しく、ＭＡＸはＤＭＳＯ対照のシグナル比中央値に等しく、ＭＩＮは公知の競合的阻害剤の１０ＸＩＣ５０超の存在下での酵素活性のシグナル比に等しい。スクリーニング目的のために、各化合物を１％ＤＭＳＯ中の５０μＭで検査する。０．００２５〜５０μＭの１０種類の濃度で各化合物を検査することによって、各化合物のＩＣ５０を決定する（１：３希釈スキームを使用）。
【０１７０】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンについてのＩＣ５０は、０．０２８μＭである。
【０１７１】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンについてのＩＣ５０は、０．０４３μＭである。
【０１７２】
本明細書に開示する実施例の化合物はすべて、０．０６２μＭ未満のＩＣ５０を呈する。
【０１７３】
ヒトＣＤ７３機序アッセイ
このアッセイの目的は、関心対象の化合物の作用の機序を決定することとする。このアッセイは、ヒトＣＤ７３生化学アッセイについて先に示したとおり行う。各化合物を、１：３希釈スキームを使用して０．０２３〜５０μＭの８種類の異なる濃度で検査するが、３倍希釈スキームを使用して０．０２３〜５０μＭの８種類の異なる濃度のＡＭＰで検査する。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７．００を使用して、さまざまな阻害剤および基質濃度の面積比をプロットし、専用の混合モデル阻害を使用して当てはめて、阻害についてのＶｍａｘ、Ｋｍ、Ｋｉ、およびアルファ値を決定する｛（Ｖｍａｘ見かけ＝Ｖｍａｘ／（１＋［Ｉ］／（Ａｌｐｈａ×Ｋｉ））、Ｋｍ見かけ＝Ｋｍ×（１＋［Ｉ］／Ｋｉ）／（１＋［Ｉ］／（Ａｌｐｈａ×Ｋｉ））、Ｙ＝Ｖｍａｘ見かけ×Ｘ／（Ｋｍ見かけ＋Ｘ）、式中、Ａｌｐｈａ、Ｖｍａｘ、Ｋｍ、Ｋｉは各化合物で共有される｝。
【０１７４】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンおよび５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）  −２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンは各々、酵素−リン酸複合体へ結合するがアポ酵素自体へは結合しない非競合的阻害剤である。
【０１７５】
表１に示すように、ＡＭＰの基質濃度を上げると、ＩＣ５０値が低減するので、非競合的阻害剤、例えば、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオネムの効力が高まる。
【表９】
0006794560.tif 000088
【０１７６】
マウスＣＤ７３機序アッセイ
このアッセイの目的は、マウスＣＤ７３酵素活性の阻害に関して阻害剤を評価することとする。このアッセイは、３μＭのＡＭＰおよび５０ｐＭのマウスＣＤ７３酵素を使用することを除き、ヒトＣＤ７３生化学アッセイについて先に説明したとおり行う。
【０１７７】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンについてのＩＣ５０は、０．１７５μＭである。
【０１７８】
Ｃａｌｕ６ヒト細胞アッセイ
このアッセイの目的は、細胞に基づくアッセイにおいてＣＤ７３に対して化合物を検査することとする。Ｃａｌｕ６細胞（１５００個／ウェル）を、１００μＬの培地（ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃１１０９５−０７２）＋１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ＃１１３６０−０７０）＋１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ＃１１１４０−０５０）＋１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ＃ＳＨ３００７１）を含有する９６ウェルポリ−Ｄ−リジンコーティング済みプレート（ＢＤ＃３５６６４０）中で成長させる。プレートをＲＴで３０分間インキュベートし、続いて３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートする。細胞をアッセイ緩衝液（１０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．２、１０ｍＭ  Ｄ−グルコース、１ｍＭ  ＫＣｌ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）（９０μＬ／ウェル）で２回洗浄する。次に、９０μＬのアッセイ緩衝液を各ウェルに添加し、続いて１ウェルあたり１０μＬのＡＭＰおよび化合物プレミックス（５０μＭ  ＡＭＰ、１％ＤＭＳＯ中のさまざまな濃度の化合物）を添加する。プレートを室温で６０分間インキュベートする。次に、ウェルあたり１０μＬの上清を取り出して新たなプレートに入れ、続いて２０μＬの停止液（２％ギ酸、１．２μＭアデノシンリボース−１３Ｃ５（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ−＃ＣＬＭ−３６７８−０）および質量分析用の９０μＬのｄｄＨ２Ｏを添加する。アデノシン−１３Ｃ５およびアデノシンリボース−１３Ｃ５（内部標準）のレベルは、ヒトＣＤ７３生化学アッセイについて先に説明したとおり、質量分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲａｐｉｄＦｉｒｅ）を利用することによって決定する。阻害百分率も先に説明したとおり計算する。
【０１７９】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンについてのＩＣ５０は、０．００７３ｕＭである（実施例２の化合物）。
【０１８０】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンについてのＩＣ５０は、０．０２８ｕＭである。
【０１８１】
エクスビボ標的阻害アッセイ
このアッセイの目的は、エクスビボに基づくアッセイにおいてマウスの血中マウスＣＤ７３に対する化合物を検査することとする。腫瘍がおよそ４００ｍｍ３に達した後、動物（６匹／群）に２０％ＨＰＢＣＤ（２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）（ｐＨ２）中に配合した各化合物を経口投与する。経口投与を介した化合物処置へ供した動物から収集した全血を用いたエクスビボアッセイについて説明したとおり、処置後、血液をヘパリン管中に収集し、１３Ｃ１０−１５Ｎ５−ＡＭＰから標識したアデノシン、イノシン、およびヒポキサンチンへの転換のエクスビボ分析に使用する。
【０１８２】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンは、表２に示すように、本化合物の異なる用量で処置した動物からのマウス全血中のＡＭＰからアデノシン、イノシン、およびヒポキサンチンへの転換を阻害する。
【表１０】
0006794560.tif 000089
【０１８３】
５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンについてのＩＣ５０は、０．００７３ｕＭである。
【０１８４】
ヒトＣＤ７３アッセイのＣａｌｕ６腫瘍に基づくインビボ標的阻害
このアッセイの目的は、インビボ標的阻害アッセイにおいて、ヒト癌Ｃａｌｕ６細胞に由来する異種移植腫瘍におけるヒトＣＤ７３に対する化合物を検査することとする。Ｃａｌｕ６細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎児血清を補充したＨＢＳＳ培地中で成長させる。コンフルエントに至っていない細胞をトリプシンで収穫し、血清を含んでいない成長培地で２回すすぐ。ＨＢＳＳとＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニュージャージー州フランクリンレイクス地区）の１：１の混合物中の５ｘ１０６個をヌードマウス（Ｔｈｅ  Ｈａｒｌｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の後部脇腹に注射することによって、皮下腫瘍の成長を開始させる。平均腫瘍量がおよそ４００〜５００ｍｍ３に達したとき、腫瘍の大きさおよび体重によって動物を無作為化し、示すとおり、個々の処置群へと入れる。処置後、腫瘍試料（各５０〜８０ｍｇ）を収集し、後で説明するような内部標準を含有する１ｍＬの氷冷抽出緩衝液中で加工する。
【０１８５】
ホイル片および液体Ｎ２を乳鉢へ入れて予冷する。腫瘍組織をホイル片上に落とし、液体Ｎ２を添加する。別のホイル片を腫瘍組織の上に置き、腫瘍が完全に接地するまで乳棒でたたく。５０〜１００ｍｇの腫瘍組織をチューブ（Ｆｉｓｈｅｒｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号０２−６８１−３０２）の中に入れ、ドライアイスの上に置く。１個の金属ビーズ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号６９９８９）ならびに１３Ｃ５−アデノシン、１３Ｃ５−ＡＭＰ、１５Ｎ５−ＧＴＰ、１５Ｎ４−イノシン５’−一リン酸、および１３Ｃ−１５Ｎ−ヒポキサンチン（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  ＬａｂおよびＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の内部標準を含有する８０％のメタノール１ｍｌをチューブに添加し、ＬＣ／ＭＳ分析に使用するまで試料を‐８０℃で保存する。
【０１８６】
経口投与を介した化合物処置へ供した動物から収集した全血を用いるエクスビボアッセイについて説明したとおり、血液をヘパリン管中に収集し、１３Ｃ５−１５Ｎ５−ＡＭＰから標識アデノシン、イノシン、およびヒポキサンチンへの転換のエクスビボ分析のために使用する。
【０１８７】
表３に示すように、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンは、異なる用量の化合物を用いて処置したＣａｌｕ６腫瘍におけるＡＭＰからアデノシンへの転換を阻害する。
【表１１】
0006794560.tif 000090
【０１８８】
Ｔ細胞抑制アッセイ
カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を標識剤として使用しヒトＰＢＭＣまたは単離されたＣＤ４細胞（０．５×１０６〜１×１０８個）を、５％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１００８２）を含有する標識緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０ｗ／Ｌ−グルタミン、ＧＩＢＣＯカタログ番号１１８７５）で洗浄し、１ｍｌの標識緩衝液中に懸濁する。細胞を、５０μＭ  ＣＦＳＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号４２３８０１）を含有する１１０μｌのＰＢＳと混合し、室温で５分間インキュベートする。標識細胞を、５％ＨＩ  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１００８２）を含有するＰＢＳで１回、１ｘペニシリン／ストレプトマイシンを含有する）Ｔ細胞清浄成長培地（Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４−７４４Ｑ）で１回洗浄し、ＰＭＢＣおよびＣＤ４細胞に使用する培地中で懸濁する。
【０１８９】
Ｔ細胞の活性化および処理
ＣＦＳＥ標識ヒトＰＢＭＣ（６００，０００個／ｍＬ）またはＣＤ４細胞（５００，０００個／ｍＬ）をＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１１３１Ｄ）と、１：１の細胞／ビーズとヒトＩＬ−２（６０ＩＵ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１０１１４５６００１）との比で混合する。細胞を、３７℃の水浴中に１０分に入れ、Ｔ細胞を予め活性化する。ＰＢＭＣ（１２５μｌ／ウェル）またはＣＤ４細胞（１００μｌ／ウェル）を９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３７９９，Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に移す。ＰＢＭＣを使用して化合物を検査するために、種々の濃度の検査化合物を、４００〜６００μＭのＡＭＰを含有する細胞正常成長培地（１２５μＬ）中で調製する。ＣＤ４細胞を使用して化合物を検査するために、種々の濃度の検査化合物を、２００〜２５０μＭのＡＭＰを含有する細胞正常成長培地（１００μＬ）中で調製する。処理された細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で６８〜７０時間培養する。
【０１９０】
処理したＰＢＭＣを含有する培地（１６０μｌ）をプレートに移し、サイトカインアッセイに使用する残りの培地を、代謝産物のＬＣ−ＭＳ分析のための試料の調製のために、ＡｃｒｏＰｒｅｐ９６プレート（ＡｃｒｏＰｒｅｐ９６フィルタープレート、Ｏｍｅｇａ  ３Ｋ  ＮＴＲＬ  ３５０ｕｌウェル、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号８０３３）に移す。
【０１９１】
ＣＤ４細胞を含有する培地（１００μｌ）をＡｃｒｏＰｒｅｐプレートに移してこれで別のプレートへと、１５００ｇで２時間の遠心分離を介して濾過する。濾過した培地（５０μＬ／ウェル）を代謝産物のＬＣ−ＭＳ分析のために、等容積の８０％メタノール、１％ＮＨ４ＯＨ、および内部標準（２５０ｎｇ／ｍＬの１３Ｃ５−ＡＭＰおよび２５０ｎｇ／ｍＬの１３Ｃ５−アデノシン）と混合する。
【０１９２】
処理したＰＢＭＣまたはＣＤ４細胞を収集してフローサイトメトリーのために染色して、Ｔ細胞増殖を定量化する。
【０１９３】
フローサイトメトリー
ＰＢＭＣまたはＣＤ４細胞を、ＤＰＢＳで１：２００に希釈したＺｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２３１０２、ロット番号Ｂ１９５８７５）で１５分間染色し、続いてフロー染色緩衝液（ＤＰＢＳ−２％ＨＩＦＢＳ−０．５％ＢＳＡ）中で１：５に希釈したヒトＦｃ受容体結合阻害剤（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号Ｎｏ．１４−９１６１−７３）で氷上で１５分間ブロッキングする。ＰＢＭＣを、ＡＰＣ／Ｃｙ７抗ヒトＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３００４２６、１：２０希釈）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４１６、１：２０希釈）、およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ抗ヒトＣＤ８ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３００９２７、１：２０希釈）のカクテルで染色し、ＣＤ４細胞を氷上で３０分間、フロー染色緩衝液中のＡＰＣ抗ヒトＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４１６、１：２０希釈）で染色する。
【０１９４】
フローデータはＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅによって獲得する。各蛍光チャネルを適切に補正する。データはＦｌｏＪｏ第７．６．５で加工し、次のゲート処理戦略を用いる：ＦＳＣ対ＳＳＣドットプロットでゲート処理されたリンパ球、ＳＳＣ対Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａドットプロットでゲート処理されたリンパ球の生細胞、ＡＰＣ−Ｃｙ７対Ｚｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａドットプロットでゲート処理されたリンパ球の生細胞のＣＤ３細胞、ＡＰＣ対Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅドットプロットでゲート処理されたＣＤ３細胞のＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞、ＡＰＣ対ＣＦＳＥ（ＦＩＴＣ）およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ対ＣＦＳＥ（ＦＩＴＣ）ドットプロットでさらにゲート処理されたＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞である。ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の増殖を、増殖ツールによって分析する。増殖指数（ＰＩ）を、総細胞数／出発細胞数として定義し、化合物救出％を（ＰＩＡＭＰなし化合物なし−ＰＩ試料）／（ＰＩＡＭＰなし化合物なし−ＰＩＡＭＰあり化合物なし）×１００として計算する。
【０１９５】
表４に示すように、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンによるＣＤ７３の阻害は、Ｔ細胞増殖のアデノシン媒介阻害を救出し、このことは、成長培地中のアデノシンレベルの用量依存的低減がと相関している。
【表１２】
0006794560.tif 000091
【０１９６】
サイトカイン分析
処理したＰＢＭＣ由来の培養液を、サイトカインＥＬＩＳＡキットの１ｘＥＬＩＳＡ／ＥＬＩＳＰＯＴ希釈液で１：７．５、１：２．５、１：５０に希釈し、Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ  ａｌｐｈａ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−ＧＯ！キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  カタログ番号８８−７３４６−２２）を使用してＴＮＦαを、Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−１β  ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−ＧＯ！キット（第２世代）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号８８−７２６１−２２）を使用してＩＬ−１βを、Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ  ｇａｍｍａ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−ＧＯ！キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号８８−７３１６−２２）ベースの製造元のマニュアルを用いてＩＦＮγを分析する。
【０１９７】
表５に示すように、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンによるＣＤ７３の阻害は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＮＦ−αレベルを上昇させる。
【表１３】
0006794560.tif 000092
【０１９８】
表６に示すように、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオンによるＣＤ７３の阻害は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＮＦ−αレベルを上昇させる。
【表１４】
0006794560.tif 000093
【０１９９】
インビボモデル
所望の場合、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩のＣＤ７３阻害効果の前臨床モデリングを、例えば、当技術分野において、例えば、Ｒｏｎｇｖａｕｘ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１３；３１：６３５−７４において、およびそこに引用されている文献において、Ｓａｎｍａｍｅｄ  ＭＦ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１６；２７：１１９０−１１９８、およびそこに引用されている文献において明らかにされている方法によって実施することができる。
【０２００】
ヒト血清中のＣＤ７３活性を測定するためのＬＣ／ＭＳに基づくアッセイ
新鮮な正常ヒト血液を室温で１，５００ｇで１５分間遠心分離し、血清を含有する上部画分を収集する。収集した血清（２５ｕｌ／ウェル）を、種々の濃度の実施例２の化合物および一定濃度のレバミソール（１，５００ｕＭ）を含有する９６ディープウェルプレート（ＤＷＰ）（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓａｌｅｓ  ＆  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．カタログ番号９６８８２０）へ移す。氷上で６０分間のインキュベーション後、１３Ｃ５−１５Ｎ５−ＡＭＰ（５０ｕＭ）をプレートの各ウェルに入れ、プレートを室温で１５分間インキュベートする。次に、このプレートを２００ｕＬ／ウェルの１７．３ＴＣＡを添加してドライアイス上に置き、続いてプレート振盪機（Ｑｉａｇｅｎ）で２６ｆｐｓで３分間振盪する。次に、プレートを４℃で２９４０ｇで２０分間遠心する。遠心分離後、各ウェルからの１００μｌ／ウェルの上清を新たな９６ディープウェルプレートに移し、氷上で１８．４ｕｌ／ウェルの２．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３と混合し、続いて内部標準（ＩＳ）（１３Ｃ５―ＡＭＰ、１３Ｃ５−アデノシン、１３Ｃ５−ヒポキサンチン、および１５Ｎ４−イノシン）を含有する２００μｌの抽出溶液を添加する。４℃、２９４０ｇで２０分間のさらなる遠心分離後、２００ｕｌ／ウェルの上清を、先に説明したとおりＬＣ／ＭＳによる１３Ｃ１０−１５Ｎ５−アデノシン、１３Ｃ１０−１５Ｎ５−イノシンおよび１５Ｎ５−ヒポキサンチンの分析のために使用する。ＥＣ５０計算のために、血清中のＣＤ７３阻害剤の濃度を、インシリコモデルにまたは実験的に由来する非結合画分（％）で補正する。
【０２０１】
表７は、５−［５−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−イソプロピルシクロプロピル］−６−メチル−ピリダジン−３−イル］−１Ｈ−ピリミジン−２，４−ジオン（実施例２の化合物）によるヒト血清中のＣＤ７３活性の阻害についてのデータを含む。
【表１５】
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【０２０２】
表８は、本明細書に開示するある特定の化合物によるヒト血清中のＣＤ７３活性の阻害についてのデータを含む。
【表１６】
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