(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸分子を検出する方法であって、
整列可能な足場／受容体複合体であって、標的核酸分子の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含む受容体が付着されている足場部分を含み、前記足場部分または前記足場／受容体複合体が５：１を超えるアスペクト比を有する足場／受容体複合体を提供することと、
足場／受容体複合体を試料に暴露し、それによって、標的核酸分子が存在する場合、受容体を標的核酸分子に結合させることと、
足場／受容体／標的複合体の整列を誘導することと、
標的核酸分子が存在する場合、受容体に対する標的核酸分子の結合によって影響を受けた、足場／受容体複合体の整列における変化を検出するために、ＬＤを用いることとを含み、
少なくとも、整列可能な、第１足場／受容体複合体、および第２足場／受容体複合体が提供され、
前記第１足場／受容体複合体および第２足場／受容体複合体は、同一の標的核酸に結合し、前記第１複合体の前記受容体は、標的核酸の第１部分に相補的である核酸配列を含み、前記第２複合体の前記受容体は、標的核酸の第２部分に相補的である核酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
試料中の標的核酸分子を検出する方法であって、
少なくとも、整列可能な、第１足場／受容体複合体および第２足場／受容体複合体であって、標的核酸分子の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含む受容体が付着されている足場部分を含み、前記足場部分または前記足場／受容体複合体が５：１を超えるアスペクト比を有する、第１足場／受容体複合体および第２足場／受容体複合体を提供することと、
第１足場／受容体複合体および第２足場／受容体複合体を試料に暴露し、それによって、標的核酸分子が存在する場合、受容体を標的核酸分子に結合させることと、
第１足場／受容体／標的複合体および第２足場／受容体／標的複合体の整列を誘導することと、
標的核酸分子が存在する場合、受容体に対する標的核酸分子の結合によって影響を受けた、第１足場／受容体複合体および第２足場／受容体複合体の整列における変化を検出するために、ＬＤを用いることとを含み、
前記第１足場／受容体複合体は、前記第２複合体の前記受容体の核酸配列とは異なる核酸配列を含む、前記第１複合体の前記受容体によって、前記第２足場／受容体複合体が結合する標的核酸とは異なる標的核酸に結合し、
異なるＬＤシグナルが各標的について検出されるように、異なる発色団が、前記第１足場／受容体複合体および第２足場／受容体複合体に付着されることを特徴とする方法。
【請求項３】
試料中の標的核酸分子を検出する方法であって、
整列可能な足場／受容体複合体であって、標的核酸分子の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含む受容体が付着されている足場部分を含み、前記足場部分または前記足場／受容体複合体が５：１を超えるアスペクト比を有する足場／受容体複合体を提供することと、
足場／受容体複合体を試料に暴露し、それによって、標的核酸分子が存在する場合、受容体を標的核酸分子に結合させることと、
足場／受容体／標的複合体の整列を誘導することと、
標的核酸分子が存在する場合、受容体に対する標的核酸分子の結合によって影響を受けた、足場／受容体複合体の整列における変化を検出するために、ＬＤを用いることとを含み、
少なくとも、整列可能な、第１足場／受容体複合体、および第２足場／受容体複合体が提供され、
前記標的核酸は、二本鎖であり、前記第１複合体の前記受容体は、二本鎖標的核酸分子の１つの鎖の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含み、
前記第２複合体の前記受容体は、二本鎖標的核酸分子の他方の鎖の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
前記足場／受容体複合体の整列は、せん断流、磁気的整列、電気泳動効果によって、または圧搾ゲルを用いることによって達成されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
試料中に存在し得る標的核酸分子の増幅工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅工程は、前記足場／受容体複合体の存在下で実施されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記受容体は、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸分子、またはアプタマーを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記足場部分は、合成ポリマー、カーボンナノチューブ、生体分子繊維、結晶、無機粒子、合成生物学的コンストラクト、および異なる極性の液体の混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体分子繊維は、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｉｋｅ、およびＮ１などの糸状バクテリオファージであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記足場は、発色団の付着によって修飾されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも、整列可能な、第１足場／受容体複合体、および第２足場／受容体複合体を含み、
各足場／受容体複合体は、受容体が付着されている足場部分を含み、前記足場部分または前記足場／受容体複合体は、５：１を超えるアスペクト比を有し、
前記第１足場／受容体複合体の前記受容体は、標的核酸分子の第１部分に相補的である核酸配列を含み、前記第２足場／受容体複合体の前記受容体は、標的核酸分子の第２部分に相補的である核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１、４〜１０のいずれか１項に記載の方法における使用のための溶液。
【請求項１２】
少なくとも、整列可能な、第１足場／受容体複合体、および第２足場／受容体複合体を含み、
各足場／受容体複合体は、受容体が付着されている足場部分を含み、前記足場部分または前記足場／受容体複合体は、５：１を超えるアスペクト比を有し、
前記第１足場／受容体複合体は、前記第２複合体の前記受容体の核酸配列とは異なる核酸配列を含み、
異なるＬＤシグナルが各標的について検出されるように、異なる発色団が、前記第１足場／受容体複合体、および前記第２足場／受容体複合体に付着されることを特徴とする、請求項２、および４〜１０のいずれか１項に記載の方法における使用のための溶液。
【請求項１３】
少なくとも、整列可能な、第１足場／受容体複合体、および第２足場／受容体複合体を含み、
各足場／受容体複合体は、受容体が付着されている足場部分を含み、前記足場部分または前記足場／受容体複合体は、５：１を超えるアスペクト比を有し、
前記第１複合体の前記受容体は、二本鎖標的核酸分子の１つの鎖の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含み、
前記第２複合体の前記受容体は、二本鎖標的核酸分子の他方の鎖の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含むことを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の方法における使用のための溶液。
【請求項１４】
試料中の標的核酸分子を検出するための分子センサであって、
標的核酸分子を潜在的に含む溶液を流過させるように構成された流路と、
光源と、
前記光源からの光が前記流路を通過した後に当該光を受光し、２つの垂直配向分極における偏光度を測定することができるように配設された検出器と、
請求項１１〜１３のいずれか１項に係る溶液とを含むことを特徴とする分子センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、限定されるものではないが、ＰＣＲ／サーモサイクリング反応、および等温反応などの増幅反応の間、または後に、試料中の核酸分子の存在を検出するために二色性を利用する分子センサに関する。また、本発明は、センサにおける使用のためのセンサ素子に関する。
【背景技術】
【０００２】
もともと、生物は、多くの複合分子と、分子集合体とを含む。最も重要な分子および集合体のいくつかは、大きいものであり、高アスペクト比を有する（すなわち、１つの軸が、他のどの軸よりも有意に長い）。これらの高アスペクト比の分子を特異的に検出するために光学的な装置を使用することが知られている。そのような装置は、これらの長い分子が偏光（すなわち、一方向にのみ固定された電界を有する光）と相互作用する方法に依存している。
【０００３】
上述の装置において利用されている現象は、二色性として知られている。入射光は、直線偏光されて直線二色性（ＬＤ）を生じさせるか、または円偏光されて円二色性（ＣＤ）を生じさせるかのいずれかとなる。ＬＤは、いくつかの分子構造によって示される特性であり、これによって直線偏光は、２つの直交軸に沿って異なって吸収される。ＣＤは、左円偏光および右円偏光の吸収における差異に関連している。選択的光吸収を可能にする分子は、発色団として知られている。二色性分子、すなわち二色性特性を示す分子は、特定の種類の発色団である。二色性物質の例としては、いくつかの天然結晶、延伸ポリマー、および他の非等方性分子がある。生体分子は、広い範囲の発色団（芳香族側鎖、ヌクレオチド、およびペプチド骨格など）を含む。
【０００４】
二色性効果を観察することを可能にするために、発色団を、入射偏光光ビームに関して、整列させることが、または少なくとも部分的に整列させることが必要である。うまく整列された関心部分のいくつかの例は、ＤＮＡ、繊維性タンパク質、および膜（膜タンパク質）の形態である直線状生体分子を含む（Marrington R, Small E, Rodger A, Dafforn TR, Addinall SG, “FtsZ fiber bundling is triggered by a conformational change in bound GTP” J Biol Chem 2004;279(47):48821-48829; Dafforn TR, Rajendra J, Halsall DJ, Serpell LC, Rodger A, “Protein fiber linear dichroism for structure determination and kinetics in a low-volume, low-wavelength couvette flow cell” Biophys J 2004;86(1 Pt 1):404-410; Dafforn TR, Rodger A, “Linear dichroism of biomolecules: which way is up?” Curr Opin Struct Biol 2004;14(5):541-546; Halsall DJ, Rodger A, Dafforn TR, “Linear dichroism for the detection of single base pair mutations” Chem Commun (Camb) 2001(23):2410-2411）。
【０００５】
そのような分子を整列させるための特に便利な方法は、分子を含む溶液を作製し、続いてその溶液を流過させることである。分子の細長い性質のゆえに、流れによって生じたせん断力の結果として整列が生じ、よって、試料を直線二色性の効果を示すために適したものとする。
【０００６】
公知の装置において、関心分子が整列さていれば、直線偏光は、整列された分子の軸に実質的に垂直な方向から溶液を通過して方向付けられる。光の吸収が分子内に生じるが、それは、特定の波長において、放射電界は、分子中の電子を特定の方向に促す。いくつかの分子が同様に整列されるとき、各分子の電子の特徴は、同一の好ましい正味変位方向である。ＬＤは、２つの直行する偏光の間における入射光の吸光度の差異の尺度である。入射光の波長を変化させ、試料から現れる光を検出することで、波長に対する試料の吸光度を示すスペクトルを得ることができる。
【０００７】
分子のＬＤスペクトルは、存在する発色団についての、発色団の配向（したがって、分子配座）、および偏光軸に対する発色団の配向を含む情報を提供する。この情報は、分子構造を理解する上で重要である。ＬＤは、試料のバルク特性の尺度であることに留意されたい。吸光強度は、試料中に存在する標的分子の数を定量化するために使用することができる。また、ＬＤは、整列の変化に非常に敏感であるので、分子構造の異常を検出することができる。たとえば、ＬＤは、ＤＮＡの１３００ｂｐ（塩基対）フラグメントにおける１つのミスマッチ水素結合によって生じる歪みを検出することができる。
【０００８】
さらに、ＬＤは、複合体の形成に非常に敏感である。なぜなら、整列された分子の第２分子に対する結合は、以下の２つの測定可能な効果を有するからである。
１）整列部分の形状が変化すると、その結果、その整列も変化させ、そして観察されるＬＤスペクトルにおける変化をもたらす。
２）第２分子自体は、整列された分子に対する付着によって整列する。このことは、予め整列されていない第２分子の発色団についてのＬＤシグナルの発生をもたらす。したがって、複合体構造の情報を得ることができる。上述の効果は双方とも、複合体の形成を検出するために使用することができる検出可能な現象をもたらす。複合体の性質に関して、構造的情報が分かるだけではなく、相互作用の親和性も測定することができる。
【０００９】
特定の核酸配列の存在を検出することが望ましい多くの分野が存在する。たとえば、疾患、または特定遺伝子のためにバイオマーカの検出において、核酸配列は、病原体、または遺伝子の存在を検出するために使用することができる。また、存在する特定遺伝子の量を定量することができる。
【００１０】
少量のＤＮＡを検出するための方法の１つの例は、ＤＮＡが酵素、および好適な基質を用いる複製処理によって増幅されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。本来の二本鎖配列（標的）は、もし存在する場合、熱の使用によって２つの一本鎖に分離される。各一本鎖ＤＮＡは、短い（典型的には、１０〜３０塩基）オリゴヌクレオチド（プライマー）によって結合する。ＤＮＡは、配列を決定するために、標的を用いて（耐熱性）ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって複製され、プライマーは、新規ＤＮＡ分子（アンプライマー（amplimer））をもたらすための出発点である。この処理は、いくつかのサイクルにわたって繰り返され、アンプライマー濃度の指数関数的増加をもたらす。構成要素は、ヌクレオチドである。
【００１１】
アンプライマーの検出は、これまで様々な方法で実施されており、主な方法は、
ＰＣＲの最後のみにおける検出であり、
１）核酸標的配列の有無を検出するための、反応の最後における反応成分の電気泳動分離である。
【００１２】
反応（ｑ−ＰＣＲ）の間における生成物の増加量を検出し、これを標的の出発濃度を推測するために使用するために、
２）二本鎖核酸のみに結合し、一本鎖には結合しない色素の使用
３）二本鎖核酸に結合したとき、その蛍光が変化する色素の使用
４）遊離型で蛍光シグナルを消滅させるが、それらの相補配列に結合したとき、大きなシグナルをもたらす、オリゴヌクレオチドの対向末端に２種類の色素分子が存在するように、増幅において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの標識化。
【００１３】
上述のように、ＤＮＡをそのＬＤシグナルから直接に検出することができる。この手法において、アンプライマーは、プライマー、または核酸よりも溶液中のせん断流において整列するその能力によって、色素を使用することなく、直接に検出することができる。整列は、細い管（キャピラリ）を通る流れによって、またはクエット流れによってもたらされる。後者は、２つの同軸シリンダであって、それらの間に環状間隙を有する同軸シリンダ（１つは内部、他方は外部）の使用によってもたらされる。１つのシリンダは、他方に対して回転し、せん断勾配が、他方よりも非常に長い１つの軸を有するいくつかの分子を整列させるために形成される。多くのアンプライマーが存在する試料において、吸光度における相違は、大きいものであり、大きなＬＤシグナルをもたらす。様々なサイクル数でアンプライマーを検出することができることに加えて、近年、ＬＤ細胞を加熱および冷却する速度における技術的な進歩によって、ＬＤ整列細胞において増幅反応を実施し、ｑ−ＰＣＲを実施することができるようになった。
しかしながら、アンプライマーを直接検出するこの検出手法は、２つの大きな欠点を有している。
１）アンプライマーが長くなければならないこと（＞約４００塩基対）
２）多重化するための余地がないこと（以下を参照）
【００１４】
ＷＯ２００８／０５９２８０は、センサ素子が、高アスペクト比を有する足場部分であって、それに付着した受容体部分を有する足場部分を包含した分子センサを開示している。整列可能な足場部分を受容体部分の付着のための基質として使用することは、受容体部分自体も、標的分子も本来の整列特性を必要とすることを意味する。二色性スペクトルを得ることによって整列された分子を検出することができるとともに、センサは、整列された分子を定量し、ミスマッチなどの分子的異常の存在を検出するために使用することができる。受容体部分と標的分子との結合特性は、センサを用いて調べられてもよい。二色性分子の固有の性質は、センサが非常に高感度であることを意味する。
【００１５】
本発明は、ＷＯ２００８／０５９２８０に開示されたセンサのさらなる発展を示し、二色性分析の応用を改良することを目的とする。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の第１態様によれば、試料中の標的核酸分子を検出する方法を提供し、当該方法は、
整列可能な足場／受容体複合体であって、前記複合体の受容体が、標的核酸分子の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含む足場／受容体複合体を提供することと、
前記足場／受容体複合体を試料に暴露し、それによって、標的核酸分子が存在する場合、受容体を標的核酸分子に結合させることと、
足場／受容体／標的複合体の整列をもたらすことと、
標的核酸分子が存在する場合、受容体に対する標的核酸分子の結合によって影響を受けた、足場／受容体複合体の整列における変化を検出するために、ＬＤを用いることと、を含む。
【００１７】
標的核酸分子は、一本鎖、または二本鎖であってもよく、後者の場合、二本鎖核酸分子は、ｉ）受容体を相補鎖に結合させるために部分的に変性されるか、またはｉｉ）受容体が二本鎖標的に結合した三本鎖複合体を形成する。
【００１８】
標的核酸分子は、一本鎖、または二本鎖であってもよく、後者の場合、二本鎖核酸分子は、ｉ）受容体を相補鎖に結合させるために部分的に変性されるか、またはｉｉ）受容体が二本鎖標的に結合した三本鎖複合体を形成する。
【００１９】
標的分子の結合によって生じる足場／受容体複合体の整列における変化は、整列の低下であってもよく、整列の増加であってもよい。前者は、ｉ）標的による足場／受容体複合体の架橋、またはｉｉ）低い整列をもたらす足場／受容体／標的複合体における流体力学における変化を原因とする、整列の崩壊によって影響を受ける。後者は、たとえば、足場／受容体を有する非常に長い標的分子の集合によって、より高度の整列をもたらす足場／受容体／標的複合体における流体力学特性の変化によって影響を受ける。
【００２０】
足場／受容体複合体の整列は、当業者に公知の任意の方法によって達成されてもよい。たとえば、足場／受容体複合体は、せん断流、磁気整列、電気泳動効果によって整列されてもよく、または圧搾ゲルを用いることによって整列されてもよい。足場／受容体複合体のＬＤシグナルを検出するための方法は、当業者に公知である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも整列可能な、第１足場／受容体複合体および第２足場／受容体複合体を提供することを含む。一実施形態において、第１足場／受容体複合体、および第２足場／受容体複合体は、異なる標的核酸に結合する。この実施形態において、第１複合体の受容体は、第２複合体の受容体の核酸配列とは異なる核酸配列を含む。特定の実施形態において、多数の異なる種類の足場／受容体複合体が使用され、複合体の各種類における受容体は、異なる標的核酸に結合する異なる核酸配列を含む。この実施形態は、多重化、すなわち、１回のアッセイにおいて複数の異なる標的核酸の検出を可能にする。このことは、異なるＬＤシグナルが各標的について検出されるように、足場／受容体複合体に付着される異なる発色団を必要とする。
【００２２】
別の実施形態において、第１、および第２足場／受容体複合体が提供され、それぞれ同一の標的核酸に結合する。この実施形態において、第１複合体の受容体は、標的核酸の第１部分に相補的である核酸配列を含み、第２複合体の受容体は、標的核酸の第２部分に相補的である核酸配列を含む。
【００２３】
標的核酸が二本鎖であるさらなる実施形態において、第１複合体の受容体は、二本鎖標的核酸分子の１つの鎖の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含み、第２複合体の受容体は、二本鎖標的核酸分子の他方の鎖の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含む。二本鎖標的核酸分子は、第１複合体の受容体と第２複合体の受容体とに同時に結合してもよく、それによって第１複合体および第２複合体の間に架橋を生じ、ＬＤによって検出可能である複合体の整列の低下をもたらす。
【００２４】
本発明の方法は、試料中に存在し得る標的核酸分子を増幅する工程をさらに含んでもよい。このことは、試料中の標的核酸分子の濃度が低い場合に特に有用である。標的核酸分子は、サーモサイクリング法（たとえば、ＰＣＲ）、および等温法（たとえば、ＬＡＭＰ  −ループ介在等温増幅、またはＲＰＡ−  リコンビナーゼポリメラーゼ増幅）などの、当業者に公知である任意の公知の増幅方法を用いて増幅されてもよい。したがって、一実施形態において、標的核酸分子は、アンプライマーである。増幅用のプライマーは、足場／受容体複合体を妨害しないように設計される。標的核酸分子の増幅は、足場／受容体複合体を試料に暴露する前に実施されてもよい。また、増幅工程は、足場／受容体複合体の存在下において実施されてもよい。この実施形態において、増幅反応は、ＬＤ整列細胞において実施される。足場／受容体複合体に対するアンプライマーの結合によって生じる、足場／受容体複合体の整列における変化は、続いて増幅反応の間に測定することができる。
【００２５】
受容体は、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ分子などのオリゴヌクレオチドを含んでもよく、または受容体は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、もしくはアプタマーを含んでもよい。
【００２６】
一実施形態において、受容体は、標的核酸分子の少なくとも一部に相補的である核酸配列からなる。特定の実施形態において、受容体は、オリゴヌクレオチド、または標的に対して十分な特異性を示す他の分子からなる。
【００２７】
受容体核酸、または他の分子は、他の非標的分子から区別されるように、標的に対して十分な特異性を有する必要がある。このことは、たとえば核酸の配列が、標的に対して完全な相補性を有さなければならないことを意味するものではない。目的について十分な特異性を含む、標的に対する相補性の程度は、温度、イオン強度、および他の物理−化学的パラメータに依存する。
【００２８】
互いに対する核酸配列の結合強度は、配列に基づいて計算することができる周知のパラメータであることが理解されるであろう。標的配列中に天然変異が存在する場合、続いて（配列の１以上の部位において任意の塩基を有する）ランダム化された配列のいくつかを有する多数の受容体配列を製造することができる。
【００２９】
本明細書において使用されるように、高アスペクト比は、５：１を超える、１０：１を超える、２０：１を超える、５０：１を超える、７５：１を超える、いくつかの実施形態において１００：１を超えるアスペクト比に関する。
【００３０】
足場部分が、高アスペクト比を有してもよく、または足場／受容体複合体が、高アスペクト比を有してもよい。
【００３１】
好適な足場部分の例は、
・  合成ポリマー、
・  カーボンナノチューブ、
・  生体分子繊維、
・  結晶、
・  無機粒子、たとえば金属フラグメント、
・  合成生物学的構築物、
・  （相分離、続いて少ない相の領域の整列を生じるために）異なる極性の液体の混合物を含む。
【００３２】
本明細書において使用されるように、生体分子繊維は、必要な高アスペクト比を有する任意の生体分子であり、流れ条件下で整列可能である。生体分子繊維の例は、脂質小胞、糸状バクテリオファージ、ならびにアミノ酸ポリマー（すなわち、ポリペプチド、またはタンパク質）などのポリマー、および核酸ポリマー（すなわち、ＲＮＡ、またはＤＮＡ）を含む。
【００３３】
ある実施形態において、生体分子繊維は、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｉｋｅ、およびＮ１などの糸状バクテリオファージである。
【００３４】
いくつかの実施形態において、足場は、足場自体が本来的に二色性である必要がないように、発色団の追加によって修飾されてもよい。発色団は、他の足場部分に自由に交換されないような方法で足場部分に付加される。ある実施形態において、付加は、１以上の共有結合によるものである。
【００３５】
好適な発色団の例は、以下の表１におけるものを含む。
【表１】
0006722594.tif 000002
【００３６】
本発明の第２態様によれば、整列可能な足場／受容体複合体を含むセンサ素子であって、前記複合体の前記受容体が、標的核酸分子の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含むセンサ素子が提供される。
【００３７】
本発明の第３態様によれば、試料中の標的核酸分子を検出するための分子センサであって、
標的核酸分子を潜在的に含む溶液を流過させるように構成された流路と、
偏光の供給源と、
前記供給源からの光が前記流路を通過した後に当該光を受光し、２つの垂直配向分極における偏光度を測定することができるように配設された検出器と、
本発明の第２態様に係るセンサ素子とを含む分子センサを提供する。
【００３８】
光源自体が偏光を発してもよく、または好適なフィルタが光源と流路との間に適用されてもよいことが理解される。また、センサは、完全に検出器内で偏光を検出するとともに非偏光を使用してもよい。
【００３９】
流路は、クエットセル、またはたとえばプラスチックチップにおける単一の流路によって好都合に提供されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
本発明は、添付の図面を参照して、一例としてさらに詳細に説明される。
【図１】本発明の実施形態に係るセンサの概略図である。
【図２ａ】標的核酸を含む試料にさらされる前の、本発明の一実施形態に係る、第１足場／受容体複合体、および第２足場／受容体複合体の概略図である。
【図２ｂ】本発明の一実施形態に係る、標的核酸に結合した第１足場／受容体複合体、および第２足場／受容体複合体の概略図である。
【図３】適切なコントロールを用い、標的分子の非存在下、および存在下における、２２０ｎｍにおけるＬＤシグナルの一例である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図１について、本発明に係る分子センサ８を示す。センサ８は、主にプラスチック材料から作製され、不透明である細長いパイプ２の形態の流路を備える。パイプ１２の中央部分は、観察窓６として構成され、採用された光の波長に対して透光性である材料から作製された。この特定の例において、観察窓６は、可視光を透過する石英ガラスで作製される。したがって、この例において、観察窓６は、約４００ｎｍ〜７００ｎｍの波長範囲の光が通過できるように構成される。
【００４２】
観察窓６の隣接した１側面は、光源３である。光源３は、２つの直交する直線偏光光線を、観察窓６を通り、それによって流路５を通って放射するように構成される。光源３に対向して、観察窓６および流路５の他方側に配置されるのが、検出器１である。検出器１は、光源３によって放射され、観察窓６と流路５とを通過した光線を検出するように構成される。
【００４３】
使用時において、複数のセンサ素子を含む溶液であって、センサ素子のそれぞれが、（ｉ）高アスペクト比を有する整列可能な足場部分（および結合した発色団）と、（ｉｉ）標的核酸分子の少なくとも一部に相補的である核酸配列を含む１以上の受容体とを含む溶液が、分析される試料にさらされる。関心標的核酸を含み得る試料は、図１の矢印４によって示される方向にパイプ２を通って流れる。
【００４４】
図２ａについて、第１の整列可能な足場／受容体複合体２０は、複数の受容体２４に付着した足場部分２２を含み、各受容体は、標的核酸分子の一部に相補的である配列を含む（図示されていない）。
示された実施形態において、第２足場／受容体複合体３０は、付着した複数の受容体３４を有する足場部分３２を含む。受容体３４は、標的核酸分子の一部に相補的であるが、第１足場／受容体複合体２０における受容体２４の配列とは異なる配列を含む。
【００４５】
図２ｂに示されるように、受容体２４の配列は、二本鎖標的核酸分子４０の一本鎖２６の一部に相補的であるが、受容体３４の配列は、標的核酸分子４０の反対の鎖３６の一部に相補的である。足場／受容体複合体２０，３０が、標的核酸分子４０を含む試料にさらされたとき、受容体２４，３４は、相補配列によって標的核酸分子４０の鎖にハイブリダイズする。図２ｂに示されるように、単一の標的核酸分子４０は、第１足場／受容体複合体２０における受容体２４と、第２足場／受容体複合体３０における受容体３４とにハイブリダイズしてもよく、それによって複合体２０，３０を互いに架橋させる。複合体２０，３０のこの架橋は、溶液中の足場／受容体複合体２０，３０の整列を変化する。整列における変化は、ＬＤによって検出される。
【００４６】
このことは、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるアンピシリン耐性遺伝子などの遺伝子の存在を検出するために実施することができる。図３について、この場合のＬＤシグナルは、足場分子発色団からの本来的なＬＤシグナルに由来するものであるが、足場分子に結合した他の発色団を用いて実施することができる。試料１は、細菌性プラスミドのアンピシリン耐性遺伝子にフォワード、およびリバースプライマーを用いるが、足場分子を用いることなく実施されるＰＣＲであるので、最小のＬＤシグナルが予想される。試料２は、足場分子に結合して足場／受容体複合体を形成するフォワードプライマーと、足場分子に結合しないリバースプライマーとを用いて実施されるＰＣＲである。これは、標的アンピシリン耐性遺伝子の不在下で実施された。この試料は、アッセイにおける陰性試料を表す。試料３は、足場分子に結合して足場／受容体複合体を形成するフォワードプライマーと、足場分子に結合しないリバースプライマーとを用いて実施されるＰＣＲである。これは、標的アンピシリン耐性遺伝子の存在下において実施された。この試料は、アッセイにおける陽性試料を表す。試料１は、ＰＣＲ産物がアッセイを有意に阻害しないことを示す。試料２および３の間におけるシグナルの減少は、アンピシリン耐性遺伝子を含む標的ＤＮＡが、このアッセイを用いて検出することができることを示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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