(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含む複合体であって、前記第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体のそれぞれが、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端に、ヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ  Ｆｃ配列、及びヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列における対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含む少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列、を含む第１のポリペプチドであって、前記置換がＥＵナンバリングによるＱ３４７Ｗ／Ｙ、Ｔ３６６Ｗ／Ｙ、及びＴ３９４Ｗ／Ｙからなる群から選択される、第一のポリペプチド、ならびに
（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端に、ヒンジ領域を含むヒトＩｇＧ  Ｆｃ配列、及びヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列における対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含む少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列、を含む第２のポリペプチドであって、前記置換がＥＵナンバリングによるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｔ／Ｖ／Ａ，及びＹ４０７Ｔ／Ｖ／Ａからなる群から選択される、第２のポリペプチド、
を含み、
前記第１のポリペプチドの突起が前記第２のポリペプチドの空隙内に位置することによって、前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドと二量化しており、
前記第１のポリペプチドのＣ末端または前記第２のポリペプチドのＣ末端のいずれかが、リンカーを介してＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされており、前記ＧＤＦ１５変異タンパク質が、少なくとも９８アミノ酸長で、配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一な連続アミノ酸配列を含み、前記ＧＤＦ１５変異タンパク質の前記Ｃ末端アミノ酸が、配列番号：１において１１２位にあるイソロイシンに対応し、かつ前記連続アミノ酸配列が配列番号：１のＮ末端に存在する最初の２個のアミノ酸を含まず、かつ前記ＧＤＦ１５変異タンパク質が配列番号：１のアミノ酸配列に対するＤ５Ｔ置換を含み、かつ
前記第１のヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質が前記第２のヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質と二量化し、それによって、前記第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含む複合体を形成している、前記複合体。
【請求項２】
前記第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に、
ヒンジ領域を含む前記ヒトＩｇＧ  Ｆｃ配列及び少なくとも１つの組み込まれた突起を含む前記ＣＨ３配列
前記リンカー、及び
前記ＧＤＦ１５変異タンパク質
を含み、かつ
前記第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に、
ヒンジ領域を含む前記ヒトＩｇＧ  Ｆｃ配列及び少なくとも１つの組み込まれた空隙を含む前記ＣＨ３配列
を含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記第１のポリペプチドのＩｇＧ  ＦｃがＩｇＧ１  Ｆｃである、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
前記第２のポリペプチドのＩｇＧ  ＦｃがＩｇＧ１  Ｆｃである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項５】
前記第１のポリペプチドが置換Ｔ３６６Ｗを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項６】
前記第２のポリペプチドが置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項７】
前記第１のポリペプチドがＣＨ２配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項８】
前記第２のポリペプチドがＣＨ２配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項９】
前記ＧＤＦ１５変異タンパク質が配列番号：１２９のアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１０】
前記ＧＤＦ１５変異タンパク質が配列番号：１２９のアミノ酸配列からなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１１】
前記リンカーが、グリシン−グリシン−グリシン−グリシン−セリン（Ｇ４Ｓ）ｎの配列を含み、ここでｎ＝２〜５である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１２】
前記リンカーが、（Ｇ４Ｓ）３または（Ｇ４Ｓ）５の配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１３】
前記第１のポリペプチドが配列番号：３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項１４】
前記第２のポリペプチドが配列番号：４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３記載の複合体。
【請求項１５】
前記第１のポリペプチドが配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の複合体。
【請求項１６】
前記ＧＤＦ１５変異タンパク質がＮ−グリコシル化されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１７】
第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含む複合体であって、前記第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体のそれぞれが、配列番号：５に記載のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、および配列番号：６に記載のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドを含み、前記第１のポリペプチドがＮ−グリコシル化されており、かつ前記第１のポリペプチドが前記第２のポリペプチドと二量化している、複合体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の第１及び第２のポリペプチドをコードする核酸であって、前記核酸からの第１及び第２のポリペプチドの発現をもたらす発現制御要素に任意で作動可能に連結されている、前記核酸。
【請求項１９】
第１の核酸及び第２の核酸であって、第１の核酸が請求項１〜１７のいずれか１項に記載の第１のポリペプチドをコードし、かつ第２の核酸が請求項１〜１７のいずれか１項に記載の第２のポリペプチドをコードし、それぞれ第１及び第２の核酸からの第１及び第２のポリペプチドの発現をもたらす発現制御要素にそれぞれ任意で作動可能に連結されている、前記第１及び第２の核酸。
【請求項２０】
請求項１８に記載の核酸または請求項１９に記載の第１及び第２の核酸を含むベクターであって、任意でウイルスベクターである、前記ベクター。
【請求項２１】
第１及び第２のベクターであって、前記第１のベクターが請求項１９に記載の第１の核酸を含み、かつ前記第２のベクターが請求項１９に記載の第２の核酸を含み、それぞれ任意でウイルスベクターである、前記第１及び第２のベクター。
【請求項２２】
（ａ）請求項１８に記載の核酸；
（ｂ）請求項１９に記載の第１及び第２の核酸；
（ｃ）請求項２０に記載のベクター；または
（ｄ）請求項２１に記載の第１及び第２のベクター
を含む、宿主細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の宿主細胞を培養し、複合体を単離することを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複合体を作製する方法。
【請求項２４】
前記第１のポリペプチドが配列番号：８０に記載のアミノ酸配列を含み、かつ前記第２のポリペプチドが配列番号：８１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の複合体と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または添加剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２６】
対象において体重障害またはグルコース代謝障害を処置する方法における使用のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の複合体を含む組成物。
【請求項２７】
対象において体重障害またはグルコース代謝障害を予防する方法における使用のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複合体を含む組成物。
【請求項２８】
前記グルコース代謝障害が代謝症候群である、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項２９】
対象における高血糖症を処置する方法における使用のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複合体を含む組成物。
【請求項３０】
対象における肥満を処置する方法における使用のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複合体を含む組成物。
【請求項３１】
前記処置する方法が、対象における血糖または体重の減少をもたらす、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記処置する方法が、対象における食物摂取の減少をもたらす、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
対象における高血糖症を予防する方法における使用のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複合体を含む組成物。
【請求項３４】
対象における肥満を予防する方法における使用のための、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の複合体を含む組成物。
【請求項３５】
対象が肥満であるか、または対象が真性糖尿病を有する、請求項２６〜２９及び３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
対象がヒトである、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列一覧の参照による組み込み
配列一覧を、２０１５年１０月２８日に作成され、１８８ＫＢのサイズを有するテキストファイル「ＮＧＭＢ−１４２＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」として本明細書と共に提供する。そのテキストファイルの内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月３１日出願の米国特許仮出願第６２／０７３，７３７号、及び２０１５年１０月２１日出願の米国特許仮出願第６２／２４４，６０４号の優先権を主張し、それらの出願は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
技術分野
本発明は特に、代謝関連状態の処置において有用であるポリペプチド複合体及びその組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
序論
肥満は最も一般的には、限られたエネルギー消費及び／または身体運動の欠如と結びついた過剰な食物摂取に起因する。肥満は、真性糖尿病、高血圧、アテローム硬化症、冠動脈疾患、睡眠無呼吸、通風、リウマチ、及び関節炎などの様々な疾患の発症の可能性を増大させる。さらに、例えば、４０を超える肥満指数が１０年超の平均余命の減少をもたらすように、死亡率リスクは肥満と直接相関する。
【０００５】
現行の薬理学的処置モダリティには、受容体群（例えば、ＣＢ１、５−ＨＴ２Ｃ、及びＮＰＹ）をターゲットとする食欲抑制物質；視床下部及びグレリンの分子作用における食欲回路の調節物質；ならびにリパーゼをターゲットとする栄養吸収阻害薬が含まれる。残念なことに、現行のモダリティはいずれも、その一部は非常に重篤であり得る有害作用を引き起こすことなく、肥満を効果的に処置することは示されていない。
【０００６】
高い血糖値は、膵臓β細胞によるインスリンの分泌を刺激する。次に、インスリンは、筋肉及び脂肪細胞へのグルコースの侵入を刺激して、グリコーゲン及びトリグリセリドの貯蔵、ならびにタンパク質の合成をもたらす。様々な細胞種におけるインスリン受容体の活性化は、グルコースの取り込み及び利用の増大によって、かつ肝グルコース排出の低減によって、循環グルコースレベルを低下させる。この調節ネットワーク内での崩壊は、糖尿病及び関連する病的症候群をもたらし得、それらに罹患している人口のパーセンテージは高く、さらに上昇している。
【０００７】
グルコース代謝障害を有する患者は、高血糖症、インスリン過剰血症、及び／またはグルコース不耐性に罹患し得る。異常なレベルのグルコース及び／またはインスリンに多くの場合に関連する障害の例は、肝臓、脂肪、及び筋細胞が正常な血中インスリンレベルに応答するそれらの能力を喪失するインスリン抵抗性である。
【０００８】
肥満、糖尿病、ならびに関連する代謝及び非代謝障害の有病率及び重症度を考慮すると、例えば、食欲、グルコース、及び／またはインスリンレベルを調節し、かつ患者におけるグルコースレベルの変動に対する生物学的応答を増強する処置モダリティは、依然として課題である。
【０００９】
ＭＩＣ−１（マクロファージ阻害性サイトカイン−１）としても公知の野生型ＧＤＦ１５は、体重調節に関連している（Ｔｓａｉ  ＶＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３；  ８  （２）：  ｅ５５１７４；  ＵＳ８，１９２，７３５（非特許文献１））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｔｓａｉ  ＶＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３；  ８  （２）：  ｅ５５１７４；  ＵＳ８，１９２，７３５
【発明の概要】
【００１１】
概要
代謝障害を処置するための修飾ＧＤＦ１５ポリペプチドを提供する。当該修飾ＧＤＦ１５ポリペプチドは、複合体で存在し得る。本開示の複合体は、２個のＧＤＦ１５ポリペプチドを含み得る。
【００１２】
ある種のケースでは、本発明の複合体は、
少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含む、第１のポリペプチドと；
少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含む、第２のポリペプチドと
を含み、その際、第１のポリペプチドの突起が第２のポリペプチドの空隙内に位置することによって、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと二量化しており、かつ第１のポリペプチドのＣ末端または第２のポリペプチドのＣ末端のいずれかが、少なくとも１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている。
【００１３】
ある種のケースでは、本発明の複合体は、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含み、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体のそれぞれが第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドが、少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み；第２のポリペプチドが、少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み；その際、第１のポリペプチドの突起が第２のポリペプチドの空隙内に位置することによって、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと二量化しており、第１のポリペプチドのＣ末端または第２のポリペプチドのＣ末端のいずれかが、少なくとも１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされており、かつ第１のヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質が第２のヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質と二量化し、それによって、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含む複合体を形成している。
【００１４】
例示的な実施形態では、第１のポリペプチドのＣ末端が、ＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされていてよい。他のケースでは、第２のポリペプチドのＣ末端が、ＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされていてよい。
【００１５】
少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含む、第１のポリペプチドであって、少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含む第２のポリペプチドと二量化している、前記第１のポリペプチド；及び
少なくとも１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ１５変異タンパク質であって、第１のポリペプチドのＣ末端がＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている、前記ＧＤＦ１５変異タンパク質
も、本明細書において企図する。第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドも含んでよい複合体で存在してよい。
【００１６】
少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含む、第１のポリペプチドであって、少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含む第２のポリペプチドと二量化している、前記第１のポリペプチド；及び
少なくとも１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ１５変異タンパク質であって、第１のポリペプチドのＣ末端がＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている、前記ＧＤＦ１５変異タンパク質
も、本明細書において開示する。第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドも含んでよい複合体で存在してよい。
【００１７】
ある種のケースでは、当該複合体中のＧＤＦ１５変異タンパク質は、野生型ＧＤＦ１５（配列番号：１）のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である連続アミノ酸配列を含んでよい。例えば、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位を作製する配列番号：１における対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含んでよく、例えば、その置換は、Ｄ５ＴまたはＤ５Ｓであってよい。他のケースでは、当該置換は、Ｒ２１Ｎであってよい。
【００１８】
例示的なケースでは、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位を作製する配列番号：１における対応するアミノ酸の次の置換対の少なくとも１つを含んでよい：Ｒ１６Ｎ及びＨ１８Ｔ／Ｓ；Ｓ２３Ｎ及びＥ２５Ｔ／Ｓ；Ｌ２４Ｎ及びＤ２６Ｔ／Ｓ；Ｓ５０Ｎ及びＦ５２Ｔ／Ｓ；Ｆ５２Ｎ及びＡ５４Ｔ／Ｓ；Ｑ５１Ｎ及びＲ５３Ｔ／Ｓ；Ｒ５３Ｎ及びＡ５５Ｔ／Ｓ；Ｓ６４Ｎ及びＨ６６Ｔ／Ｓ；Ｌ６５Ｎ及びＲ６７Ｔ／Ｓ；Ｓ８２Ｎ及びＮ８４Ｔ／Ｓ；Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｔ／Ｓ；Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｔ／Ｓ；Ｔ９４Ｎ及びＶ９６Ｔ／Ｓ；Ｖ９６Ｎ及びＬ９８Ｔ／Ｓ；Ｓ９７Ｎ及びＱ９９Ｔ／Ｓ；ならびにＡ１０６Ｎ及びＤ１０８Ｔ／Ｓ。
【００１９】
例示的なケースでは、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位を作製する配列番号：１における対応するアミノ酸の次の置換対の少なくとも１つを含んでよい：Ｒ１６Ｎ及びＨ１８Ｔ；Ｓ２３Ｎ及びＥ２５Ｔ；Ｌ２４Ｎ及びＤ２６Ｔ；Ｓ５０Ｎ及びＦ５２Ｔ；Ｆ５２Ｎ及びＡ５４Ｔ；Ｑ５１Ｎ及びＲ５３Ｔ；Ｒ５３Ｎ及びＡ５５Ｔ；Ｓ６４Ｎ及びＨ６６Ｔ；Ｌ６５Ｎ及びＲ６７Ｔ；Ｓ８２Ｎ及びＮ８４Ｔ；Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｔ；Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｔ；Ｔ９４Ｎ及びＶ９６Ｔ；Ｖ９６Ｎ及びＬ９８Ｔ；Ｓ９７Ｎ及びＱ９９Ｔ；ならびにＡ１０６Ｎ及びＤ１０８Ｔ。
【００２０】
一部のケースでは、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位を作製する配列番号：１における対応するアミノ酸の次の置換対の少なくとも１つを含んでよい：Ｒ１６Ｎ及びＨ１８Ｓ；Ｓ２３Ｎ及びＥ２５Ｓ；Ｌ２４Ｎ及びＤ２６Ｓ；Ｓ５０Ｎ及びＦ５２Ｓ；Ｆ５２Ｎ及びＡ５４Ｓ；Ｑ５１Ｎ及びＲ５３Ｓ；Ｒ５３Ｎ及びＡ５５Ｓ；Ｓ６４Ｎ及びＨ６６Ｓ；Ｌ６５Ｎ及びＲ６７Ｓ；Ｓ８２Ｎ及びＮ８４Ｓ；Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｓ；Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｓ；Ｔ９４Ｎ及びＶ９６Ｓ；Ｖ９６Ｎ及びＬ９８Ｓ；Ｓ９７Ｎ及びＱ９９Ｓ；ならびにＡ１０６Ｎ及びＤ１０８Ｓ。
【００２１】
ある種の実施形態では、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、配列番号：１における対応するアミノ酸の次の置換対の少なくとも１つを含んでよい：Ｓ２３Ｎ及びＥ２５Ｔ／Ｓ；Ｒ５３Ｎ及びＡ５５Ｔ／Ｓ；Ｓ６４Ｎ及びＨ６６Ｔ／Ｓ；Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｔ／Ｓ；Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｔ／Ｓ；Ｓ９７Ｎ及びＱ９９Ｔ／Ｓ；ならびにＡ１０６Ｎ及びＤ１０８Ｔ／Ｓ。
【００２２】
ある種の実施形態では、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、配列番号：１における対応するアミノ酸の次の置換対の少なくとも１つを含んでよい：Ｓ２３Ｎ及びＥ２５Ｔ；Ｒ５３Ｎ及びＡ５５Ｔ；Ｓ６４Ｎ及びＨ６６Ｔ；Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｔ；Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｔ；Ｓ９７Ｎ及びＱ９９Ｔ；ならびにＡ１０６Ｎ及びＤ１０８Ｓ。
【００２３】
ある種の実施形態では、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、配列番号：１における対応するアミノ酸の次の置換対の少なくとも１つを含んでよい：Ｓ２３Ｎ及びＥ２５Ｓ；Ｒ５３Ｎ及びＡ５５Ｓ；Ｓ６４Ｎ及びＨ６６Ｓ；Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｓ；Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｓ；Ｓ９７Ｎ及びＱ９９Ｓ；ならびにＡ１０６Ｎ及びＤ１０８Ｓ。
【００２４】
ある種の実施形態では、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、配列番号：１における対応するアミノ酸の次の置換対の少なくとも１つを含んでよい：Ｓ６４Ｎ及びＨ６６Ｔ／Ｓ；Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｔ／Ｓ；Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｔ／Ｓ；ならびにＳ９７Ｎ及びＱ９９Ｔ／Ｓ。例えば、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、配列番号：１における対応するアミノ酸の次の置換対の少なくとも１つを含んでよい：Ｓ６４Ｎ及びＨ６６Ｔ；Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｔ；Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｔ；及びＳ９７Ｎ及びＱ９９Ｔ；またはＳ６４Ｎ及びＨ６６Ｓ；Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｓ；Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｓ；ならびにＳ９７Ｎ及びＱ９９Ｓ。
【００２５】
他の実施形態では、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、配列番号：１における対応するアミノ酸の次の置換対の少なくとも１つを含んでよい：Ｋ９１Ｎ及びＤ９３ＴまたはＤ９３Ｓ；ならびにＤ９３Ｎ及びＧ９５ＴまたはＧ９５Ｓ。
【００２６】
他の実施形態では、当該複合体中のＧＤＦ１５変異タンパク質は、少なくとも９８アミノ酸長であってよい連続アミノ酸配列を含んでよく、かつ配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であってよく、その際、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質のＣ末端アミノ酸は、配列番号：１において１１２位にあるイソロイシンに対応する。
【００２７】
他の実施形態では、当該連続アミノ酸配列は、少なくとも９８アミノ酸長であってよく、かつ配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であってよく、その際、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質のＣ末端アミノ酸は、配列番号：１において１１２位にあるイソロイシンに対応する。
【００２８】
本明細書において開示する複合体中に存在する例示的なＧＤＦ１５変異タンパク質は、少なくとも９８アミノ酸長で、かつ配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である連続アミノ酸配列を含み、配列番号：１に対してアミノ酸の欠失を有する。例えば、前記ポリペプチドは、配列番号：１に対してＮ末端短縮化を有してよい。当該Ｎ末端短縮化は、配列番号：１に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４またはそれ以上のアミノ酸、例えば、１〜１４アミノ酸、２〜１４アミノ酸、３〜１４アミノ酸、２〜３アミノ酸、３〜５アミノ酸、または４〜６アミノ酸からなってよい。
【００２９】
本明細書において開示する例示的な複合体は、少なくとも９８アミノ酸長で、配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一な連続アミノ酸配列を含むＧＤＦ１５変異タンパク質を含み、その際、当該ポリペプチドのＣ末端アミノ酸は、配列番号：１において１１２位にあるイソロイシンに対応する。
【００３０】
ある種のケースでは、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質中の連続アミノ酸配列は、少なくとも９８アミノ酸長であり、かつ配列番号：１のＮ末端に存在する第１のアミノ酸に対応する最初のアミノ酸を含まず、その際、Ｃ末端アミノ酸は、配列番号：１において１１２位にあるイソロイシンに対応する。
【００３１】
ある種のケースでは、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質中の連続アミノ酸配列は、少なくとも９８アミノ酸長であり、かつ配列番号：１のＮ末端に存在する最初の２個のアミノ酸に対応する最初の２個のアミノ酸を含まず、その際、Ｃ末端アミノ酸は、配列番号：１において１１２位にあるイソロイシンに対応する。
【００３２】
ある種のケースでは、当該連続アミノ酸配列は、少なくとも９８アミノ酸長であり、かつ配列番号：１のＮ末端に存在する最初の３個のアミノ酸に対応する最初の３個のアミノ酸を含まず、その際、Ｃ末端アミノ酸は、配列番号：１において１１２位にあるイソロイシンに対応する。
【００３３】
ある種のケースでは、当該連続アミノ酸配列は、少なくとも９８アミノ酸長であり、かつ配列番号：１のＮ末端に存在する最初の６個のアミノ酸に対応する最初の６個のアミノ酸を含まず、その際、Ｃ末端アミノ酸は、配列番号：１において１１２位にあるイソロイシンに対応する。
【００３４】
ある種のケースでは、当該連続アミノ酸配列は、少なくとも９８アミノ酸長であり、かつ配列番号：１のＮ末端に存在する最初の１４のアミノ酸に対応する最初の１４個のアミノ酸を含まない。
【００３５】
ある種のケースでは、第１のポリペプチド（例えば、Ｆｃ−ノブ）または第２のポリペプチド（例えば、Ｆｃ−ホール）のいずれかのＣ末端は、リンカーを介して当該ＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている。例示的なリンカーには、配列（Ｇ４Ｓ）ｎが含まれ、ここで、ｎ＝１〜１０、例えば、１〜５または２〜５、例えば、２、３、４、または５である。
【００３６】
ある種のケースでは、当該ＩｇＧ  Ｆｃは、配列番号：２におけるアミノ酸配列（ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列）と少なくとも９０％同一な連続アミノ酸配列を含む。組み込まれた突起は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列における対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含んでよく、その置換は、ＥＵナンバリングによる、アミノ酸残基３４７、３６６、及び３９４からなる群から選択される位置にある。例えば、当該少なくとも１つの置換は、ＥＵナンバリングによるＱ３４７Ｗ／Ｙ、Ｔ３６６Ｗ／Ｙ、及びＴ３９４Ｗ／Ｙからなる群から選択される。
【００３７】
ある種のケースでは、当該組み込まれた空隙は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列における対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含み、その置換は、ＥＵナンバリングによるアミノ酸残基３６６、３６８、３９４、４０５、及び４０７からなる群から選択される位置にある。例えば、当該少なくとも１つの置換は、ＥＵナンバリングによるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｔ／Ｖ／Ａ，及びＹ４０７Ｔ／Ｖ／Ａからなる群から選択される。
【００３８】
ある種のケースでは、当該突起は、ＥＵナンバリングによる置換Ｔ３６６Ｗ／Ｙを含んでよく、当該空隙は、置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｔ／Ｖ／Ａを含んでよい。
【００３９】
例えば、当該突起は、ＥＵナンバリングによる置換Ｔ３６６Ｗ／Ｙを含んでよく、当該空隙は、置換Ｙ４０７Ｔ／Ｖ／Ａを含んでよい。他のケースでは、当該突起は、ＥＵナンバリングによる置換Ｔ３６６Ｙを含んでよく、当該空隙は、置換Ｙ４０７Ｔを含んでよい。他の例では、当該突起は、ＥＵナンバリングによる置換Ｔ３６６Ｗを含んでよく、当該空隙は、置換Ｙ４０７Ａを含んでよい。さらなる例では、当該突起は、ＥＵナンバリングによる置換Ｔ３９４Ｙを含んでよく、当該空隙は、置換Ｙ４０７Ｔを含んでよい。
【００４０】
ある種の実施形態では、第１及び第２のポリペプチドのＩｇＧ  Ｆｃ配列はそれぞれ、その第１と第２のポリペプチドとの間に少なくとも１つのジスルフィド結合を形成するヒンジ領域を含んでよい。ある種の実施形態では、第１及び第２のポリペプチドのＩｇＧ  Ｆｃ配列はそれぞれ、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、及びＣＨ３領域を含んでよく、その際、そのヒンジ領域は、その第１と第２のポリペプチドとの間に少なくとも１つのジスルフィド結合を形成する。
【００４１】
上記第１及び第２のポリペプチドをコードする核酸分子も、本明細書において提供する。当該核酸分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで当該ポリペプチドをコードする核酸分子の発現をもたらす発現制御要素に作動可能に連結されていてよい。当該核酸分子を含むベクターも企図する。当該ベクターは、ウイルスベクターであってよい。ある種のケースでは、第１のポリペプチドをコードする第１の核酸及び第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を提供する。当該核酸のそれぞれは、それぞれ第１及び第２の核酸からの第１及び第２のポリペプチドの発現をもたらす発現制御要素に作動可能に連結されている。第１の核酸を含む第１のベクター及び第２の核酸を含む第２のベクターも開示する。本明細書において言及するとおり、当該ベクターは、ウイルスベクターであってよい。
【００４２】
一部の実施形態は、上述のポリペプチドの１つまたは複数を発現する形質転換宿主細胞を含む。例えば、第１及び第２の核酸を含む宿主細胞を提供する。当該宿主細胞は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを発現する。
【００４３】
本開示の特定の実施形態では、上述の複合体の１つまたは複数を製剤化して、１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、担体または添加剤も含む医薬組成物を得る。ある種の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの追加の予防薬または治療薬も含む。
【００４４】
対象において体重障害を処置または予防するための；対象においてグルコース代謝障害を処置または予防するための上述の複合体の１つまたは複数の組成物（例えば、医薬組成物）も提供する。当該組成物は、対象において体重障害を処置または予防するために有効な複合体の量を含んでよい。当該組成物は、対象においてグルコース代謝障害を処置または予防するために有効な複合体の量を含んでよい。
【００４５】
本開示のいっそうさらなる実施形態は、上述の第１または第２のポリペプチドの一方に特異的に結合する抗体を含む。
【００４６】
さらに、本開示は、少なくとも１つの薬学的に許容される添加剤、担体、または希釈剤と共に製剤化された上記のとおりの抗体を含む医薬組成物を企図する。そのような医薬組成物は、少なくとも１つの追加の予防薬または治療薬を含有してもよい。
【００４７】
本開示のある種の実施形態は、上述の医薬組成物の１つ及び場合により、１つまたは複数の追加の成分を含む滅菌容器を企図する。例として、限定ではないが、当該滅菌容器は、シリンジであってよい。いっそうさらなる実施形態では、当該滅菌容器は、キットの１成分であり；そのキットは、例えば、少なくとも１つの予防薬または治療薬を含む第２の滅菌容器を含んでよい。
【００４８】
上述のポリペプチド及び複合体を作製する方法も、本明細書において開示する。当該方法は、当該ポリペプチドを発現する宿主細胞を培養すること；発現されたポリペプチドを含む複合体を単離することを含んでよい。
【００４９】
本開示は、対象に、上述の複合体の治療有効量を投与することによって、対象（例えば、ヒト）においてグルコース代謝障害を処置または予防する方法も企図する。一部の方法では、当該処置または予防は、対象における血漿中グルコースの減少、対象における血漿中インスリンの減少、体重及び／または食物摂取の減少、または対象における耐糖能の増大をもたらす。特定の実施形態では、当該グルコース代謝障害は、真性糖尿病である。
【００５０】
対象において体重障害を処置または予防する方法も開示する。当該方法は、対象に、本開示の複合体を投与することを含んでよく、その際、その複合体を、対象における体重障害の処置または予防において有効な量で投与する。一部の方法では、当該処置または予防は、対象における体重及び／または食物摂取の減少をもたらす。
【００５１】
一部の実施形態では、当該対象は、肥満しており、及び／または体重障害を有する。
【００５２】
いずれか特定の投与経路または投薬レジメンに限られないが、一部の実施形態では、投与は、非経口（例えば、皮下）注射による。
[本発明1001]
複合体であって、
少なくとも1つの組み込まれた突起を含むＣＨ3配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含む、第1のポリペプチドと；
少なくとも1つの組み込まれた空隙を含むＣＨ3配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含む、第2のポリペプチドと
を含み、
前記第1のポリペプチドの突起が前記第2のポリペプチドの空隙内に位置することによって、前記第1のポリペプチドが前記第2のポリペプチドと二量化しており、かつ
前記第1のポリペプチドのＣ末端または前記第2のポリペプチドのＣ末端のいずれかが、少なくとも1つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ15変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている、前記複合体。
[本発明1002]
第1のヘテロ二量体及び第2のヘテロ二量体を含む複合体であって、前記第1のヘテロ二量体及び第2のヘテロ二量体のそれぞれが、第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを含み、
前記第1のポリペプチドがＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み、前記ＩｇＧ  Ｆｃ配列が少なくとも1つの組み込まれた突起を含むＣＨ3配列を含み；かつ
前記第2のポリペプチドがＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み、前記ＩｇＧ  Ｆｃ配列が少なくとも1つの組み込まれた空隙を含むＣＨ3配列を含み；
前記第1のポリペプチドの突起が前記第2のポリペプチドの空隙内に位置することによって、前記第1のポリペプチドが前記第2のポリペプチドと二量化しており、
前記第1のポリペプチドのＣ末端または前記第2のポリペプチドのＣ末端のいずれかが、少なくとも1つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ15変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされており、かつ
前記第1のヘテロ二量体におけるＧＤＦ15変異タンパク質が前記第2のヘテロ二量体におけるＧＤＦ15変異タンパク質と二量化し、それによって、前記第1のヘテロ二量体及び第2のヘテロ二量体を含む複合体を形成している、前記複合体。
[本発明1003]
前記第1のポリペプチドのＣ末端が前記ＧＤＦ15変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている、本発明1001から1002のいずれかの複合体。
[本発明1004]
前記第2のポリペプチドのＣ末端が前記ＧＤＦ15変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている、本発明1001から1002のいずれかの複合体。
[本発明1005]
第1のポリペプチドを含む複合体であって、前記第1のポリペプチドが、
少なくとも1つの組み込まれた突起を含むＣＨ3配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列であって、前記第1のポリペプチドが、少なくとも1つの組み込まれた空隙を含むＣＨ3配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含む第2のポリペプチドと二量化している、前記ＩｇＧ  Ｆｃ配列と、
少なくとも1つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ15変異タンパク質であって、前記第1のポリペプチドのＣ末端が前記ＧＤＦ15変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている、前記ＧＤＦ15変異タンパク質と
を含む、前記複合体。
[本発明1006]
第1のポリペプチドを含む複合体であって、前記第1のポリペプチドが、
少なくとも1つの組み込まれた空隙を含むＣＨ3配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列であって、前記第1のポリペプチドが、少なくとも1つの組み込まれた突起を含むＣＨ3配列を含むＩｇＧ  Ｆｃ配列を含む第2のポリペプチドと二量化している、前記ＩｇＧ  Ｆｃ配列と、
少なくとも1つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ15変異タンパク質であって、前記第1のポリペプチドのＣ末端が前記ＧＤＦ15変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている、前記ＧＤＦ15変異タンパク質と
を含む、前記複合体。
[本発明1007]
前記ＧＤＦ15変異タンパク質が、野生型ＧＤＦ15（配列番号：1）のアミノ酸配列と少なくとも90％同一である連続アミノ酸配列を含む、本発明1001から1006のいずれかの複合体。
[本発明1008]
前記ＧＤＦ15変異タンパク質が、
前記Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位を作製する、配列番号：1における対応するアミノ酸の少なくとも1つの置換
を含む、本発明1001から1007のいずれかの複合体。
[本発明1009]
前記置換がＤ5ＴまたはＤ5Ｓを含む、本発明1008の複合体。
[本発明1010]
前記置換がＲ21Ｎを含む、本発明1008の複合体。
[本発明1011]
前記ＧＤＦ15変異タンパク質が、
前記Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位を作製する、配列番号：1における対応するアミノ酸の以下の置換対の少なくとも1つ
を含む、本発明1008の複合体：
ｉ）  Ｒ16Ｎ及びＨ18Ｔ、またはＲ16Ｎ及びＨ18Ｓ；
ｉｉ）  Ｓ23Ｎ及びＥ25Ｔ、またはＳ23Ｎ及びＥ25Ｓ；
ｉｉｉ）  Ｓ50Ｎ及びＦ52Ｔ、またはＳ50Ｎ及びＦ52Ｓ；
ｉｖ）  Ｆ52Ｎ及びＡ54Ｔ、またはＦ52Ｎ及びＡ54Ｓ；
ｖ）  Ｒ53Ｎ及びＡ55Ｔ、またはＲ53Ｎ及びＡ55Ｓ；
ｖｉ）  Ｓ64Ｎ及びＨ66Ｔ、またはＳ64Ｎ及びＨ66Ｓ；
ｖｉｉ）  Ｋ91Ｎ及びＤ93Ｔ、またはＫ91Ｎ及びＤ93Ｓ；
ｖｉｉｉ）  Ｄ93Ｎ及びＧ95Ｔ、またはＤ93Ｎ及びＧ95Ｓ；
ｉｘ）  Ｔ94Ｎ及びＶ96Ｔ、またはＴ94Ｎ及びＶ96Ｓ；
ｘ）  Ｖ96Ｎ及びＬ98Ｔ、またはＶ96Ｎ及びＬ98Ｓ；
ｘｉ）  Ｓ97Ｎ及びＱ99Ｔ、またはＳ97Ｎ及びＱ99Ｓ；ならびに
ｘｉｉ）  Ａ106Ｎ及びＤ108Ｔ、またはＡ106Ｎ及びＤ108Ｓ。
[本発明1012]
配列番号：1における対応するアミノ酸の以下の置換対の少なくとも1つを含む、本発明1011の複合体：
Ｓ23Ｎ及びＥ25Ｔ、またはＳ23Ｎ及びＥ25Ｓ；
Ｒ53Ｎ及びＡ55Ｔ、またはＲ53Ｎ及びＡ55Ｓ；
Ｓ64Ｎ及びＨ66Ｔ、またはＳ64Ｎ及びＨ66Ｓ；
Ｋ91Ｎ及びＤ93Ｔ、またはＫ91Ｎ及びＤ93Ｓ；
Ｄ93Ｎ及びＧ95Ｔ、またはＤ93Ｎ及びＧ95Ｓ；
Ｓ97Ｎ及びＱ99Ｔ、またはＳ97Ｎ及びＱ99Ｓ；ならびに
Ａ106Ｎ及びＤ108Ｔ、またはＡ106Ｎ及びＤ108Ｓ。
[本発明1013]
配列番号：1における対応するアミノ酸の以下の置換対の少なくとも1つを含む、本発明1011の複合体：
Ｓ64Ｎ及びＨ66Ｔ、またはＳ64Ｎ及びＨ66Ｓ；
Ｋ91Ｎ及びＤ93Ｔ、またはＫ91Ｎ及びＤ93Ｓ；
Ｄ93Ｎ及びＧ95Ｔ、またはＤ93Ｎ及びＧ95Ｓ；ならびに
Ｓ97Ｎ及びＱ99Ｔ、またはＳ97Ｎ及びＱ99Ｓ。
[本発明1014]
配列番号：1における対応するアミノ酸の以下の置換対の少なくとも1つを含む、本発明1011の複合体：
Ｋ91Ｎ及びＤ93Ｔ、またはＫ91Ｎ及びＤ93Ｓ；ならびに
Ｄ93Ｎ及びＧ95Ｔ、またはＤ93Ｎ及びＧ95Ｓ。
[本発明1015]
前記ＧＤＦ15変異タンパク質が、少なくとも98アミノ酸長で、配列番号：1のアミノ酸配列と少なくとも95％同一な連続アミノ酸配列を含み、前記ポリペプチドのＣ末端アミノ酸が、配列番号：1において112位にあるイソロイシンに対応する、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1016]
前記連続アミノ酸配列が少なくとも98アミノ酸長であり、配列番号：1のＮ末端に存在する最初のアミノ酸に対応する最初のアミノ酸を含まず、前記Ｃ末端アミノ酸が、配列番号：1において112位にあるイソロイシンに対応する、本発明1015の複合体。
[本発明1017]
前記連続アミノ酸配列が少なくとも98アミノ酸長であり、配列番号：1のＮ末端に存在する最初の2個のアミノ酸に対応する最初の2個のアミノ酸を含まず、前記Ｃ末端アミノ酸が、配列番号：1において112位にあるイソロイシンに対応する、本発明1015の複合体。
[本発明1018]
前記連続アミノ酸配列が少なくとも98アミノ酸長であり、配列番号：1のＮ末端に存在する最初の3個のアミノ酸に対応する最初の3個のアミノ酸を含まず、前記Ｃ末端アミノ酸が、配列番号：1において112位にあるイソロイシンに対応する、本発明1015のいずれかの複合体。
[本発明1019]
前記連続アミノ酸配列が少なくとも98アミノ酸長であり、配列番号：1のＮ末端に存在する最初の6個のアミノ酸に対応する最初の6個のアミノ酸を含まず、前記Ｃ末端アミノ酸が、配列番号：1において112位にあるイソロイシンに対応する、本発明1015の複合体。
[本発明1020]
前記連続アミノ酸配列が少なくとも98アミノ酸長であり、配列番号：1のＮ末端に存在する最初の14個のアミノ酸に対応する最初の14個のアミノ酸を含まない、本発明1015の複合体。
[本発明1021]
前記第1のポリペプチドまたは前記第2のポリペプチドのいずれかのＣ末端が、リンカーを介して、前記ＧＤＦ15変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1022]
前記ＩｇＧ  Ｆｃが、配列番号：2におけるアミノ酸配列と少なくとも90％同一な連続アミノ酸配列を含む、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1023]
前記組み込まれた突起が、ヒトＩｇＧ1  Ｆｃ配列における対応するアミノ酸の少なくとも1つの置換を含み、前記置換が、ＥＵナンバリングによるアミノ酸残基347、366、及び394からなる群から選択される位置にある、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1024]
前記少なくとも1つの置換が、ＥＵナンバリングによるＱ347Ｗ／Ｙ、Ｔ366Ｗ／Ｙ、及びＴ394Ｗ／Ｙからなる群から選択される、本発明1023の複合体。
[本発明1025]
前記組み込まれた空隙が、ヒトＩｇＧ1  Ｆｃ配列における対応するアミノ酸の少なくとも1つの置換を含み、前記置換が、ＥＵナンバリングによるアミノ酸残基366、368、394、405、及び407からなる群から選択される位置にある、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1026]
前記少なくとも1つの置換が、ＥＵナンバリングによるＴ366Ｓ、Ｌ368Ａ、Ｔ394Ｓ、Ｆ405Ｔ／Ｖ／Ａ、及びＹ407Ｔ／Ｖ／Ａからなる群から選択される、本発明1025の複合体。
[本発明1027]
前記突起が、ＥＵナンバリングによる前記置換Ｔ366Ｗ／Ｙを含み、前記空隙が前記置換Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、及びＹ407Ｔ／Ｖ／Ａを含む、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1028]
前記突起が、ＥＵナンバリングによる前記置換Ｔ366Ｗ／Ｙを含み、前記空隙が前記置換Ｙ407Ｔ／Ｖ／Ａを含む、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1029]
前記突起が、ＥＵナンバリングによる前記置換Ｔ366Ｙを含み、前記空隙が前記置換Ｙ407Ｔを含む、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1030]
前記突起が、ＥＵナンバリングによる前記置換Ｔ366Ｗを含み、前記空隙が前記置換Ｙ407Ａを含む、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1031]
前記突起が、ＥＵナンバリングによる前記置換Ｔ394Ｙを含み、前記空隙が前記置換Ｙ407Ｔを含む、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1032]
前記第1及び第2のポリペプチドにおけるＩｇ  Ｆｃ配列中に存在するヒンジ領域間で形成される1つまたは2つのジスルフィド結合を介して、前記第1のポリペプチドが前記第2のポリペプチドと二量化している、前記本発明のいずれかの複合体。
[本発明1033]
前記本発明のいずれかの第1及び第2のポリペプチドをコードする、核酸。
[本発明1034]
前記核酸からの第1及び第2のポリペプチドの発現をもたらす発現制御要素に作動可能に連結されている、本発明1033の核酸。
[本発明1035]
本発明1033から1034のいずれかの核酸分子を含む、ベクター。
[本発明1036]
ウイルスベクターを含む、本発明1035のベクター。
[本発明1037]
本発明1001から1032のいずれかの第1及び第2のポリペプチドを発現する、宿主細胞。
[本発明1038]
本発明1033から1034のいずれかの核酸分子または本発明1035から1036のいずれかのベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1039]
前記本発明のいずれかの第1のポリペプチドをコードする第1の核酸、及び前記本発明のいずれかの第2のポリペプチドをコードする第2の核酸。
[本発明1040]
前記核酸のそれぞれが、それぞれ第1及び第2の核酸からの第1及び第2のポリペプチドの発現をもたらす発現制御要素に作動可能に連結されている、本発明1039の第1及び第2の核酸。
[本発明1041]
本発明1039から1040のいずれかの、第1の核酸を含む第1のベクター及び第2の核酸を含む第2のベクター。
[本発明1042]
前記ベクターのそれぞれがウイルスベクターを含む、本発明1041の第1及び第2のベクター。
[本発明1043]
本発明1001から1032のいずれかの第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドを発現する、宿主細胞。
[本発明1044]
本発明1039から1040のいずれかの第1の核酸を含む宿主細胞及び第2の宿主細胞；または本発明1041から1042のいずれかの第1のベクター及び第2のベクターを含む宿主細胞。
[本発明1045]
本発明1001から1032のいずれかの第1のポリペプチドを発現する第1の宿主細胞、及び本発明1001から1032のいずれかの第2のポリペプチドを発現する第2の宿主細胞。
[本発明1046]
本発明1039から1040のいずれかの第1の核酸を含む第1の宿主細胞、及び本発明1039から1040のいずれかの第2の核酸を含む第2の宿主細胞；または本発明1041から1042のいずれかの第1のベクターを含む第1の宿主細胞、及び本発明1040から1041のいずれかの第2のベクターを含む第2の宿主細胞。
[本発明1047]
本発明1001から1032のいずれかの複合体と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または添加剤とを含む、医薬組成物。
[本発明1048]
少なくとも1つの追加の予防薬または治療薬をさらに含む、本発明1047の医薬組成物。
[本発明1049]
本発明1001から1032のいずれかのＧＤＦ15変異タンパク質に特異的に結合する、抗体。
[本発明1050]
本発明1049の抗体と、薬学的に許容される希釈剤、担体、または添加剤とを含む、医薬組成物。
[本発明1051]
少なくとも1つの追加の予防薬または治療薬をさらに含む、本発明1050の医薬組成物。
[本発明1052]
本発明1047から1048及び1050から1051のいずれかの医薬組成物を含む、滅菌容器。
[本発明1053]
シリンジである、本発明1052の滅菌容器。
[本発明1054]
本発明1052から1053のいずれかの滅菌容器を含む、キット。
[本発明1055]
本発明1001から1032のいずれかの複合体を作製する方法であって、
前記第1及び第2のポリペプチドを発現する宿主細胞を培養する工程、および
前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドを含む複合体を単離する工程
を含む、前記方法。
[本発明1056]
対象において体重障害を処置または予防する方法であって、対象に、本発明1001から1032のいずれかの複合体を投与する工程を含み、前記複合体が、対象における前記体重障害の処置または予防において有効な量で投与される、前記方法。
[本発明1057]
対象においてグルコース代謝障害を処置または予防する方法であって、対象に、本発明1001から1032のいずれかの複合体を投与する工程を含み、前記複合体が、対象における前記グルコース代謝障害の処置または予防において有効な量で投与される、前記方法。
[本発明1058]
前記投与が、前記対象による食物摂取の減少をもたらす、本発明1056から1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記投与が、前記対象の体重減少をもたらす、本発明1056から1057のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記投与が、前記対象において血糖低下をもたらす、本発明1056から1057のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記グルコース代謝障害が真性糖尿病である、本発明1057の方法。
[本発明1062]
前記対象がヒトである、本発明1056から1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記対象が肥満である、本発明1056から1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記投与が非経口注射による、本発明1056から1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記非経口注射が皮下である、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記投与が、前記複合体を毎日投与することを含む、本発明1056から1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
前記投与が、前記複合体を週に2回投与することを含む、本発明1056から1065のいずれかの方法。
[本発明1068]
前記投与が、前記複合体を週に1回投与することを含む、本発明1056から1065のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記投与が、前記複合体を隔週投与することを含む、本発明1056から1065のいずれかの方法。
[本発明1070]
前記投与が、前記複合体を月に1回投与することを含む、本発明1056から1065のいずれかの方法。
[本発明1071]
対象において体重障害を処置または予防するための、本発明1001から1032のいずれかの複合体を含む組成物。
[本発明1072]
対象における前記体重障害の処置において有効な量で対象に投与される、対象において前記体重障害を処置するための本発明1071の組成物。
[本発明1073]
対象における前記体重障害の予防において有効な量で対象に投与される、対象において前記体重障害を予防するための本発明1071の組成物。
[本発明1074]
対象においてグルコース代謝障害を処置または予防するための、本発明1001から1032のいずれかの複合体を含む組成物。
[本発明1075]
対象における前記グルコース代謝障害の処置において有効な量で投与される、対象においてグルコース代謝障害を処置するための本発明1074の組成物。
[本発明1076]
対象における前記グルコース代謝障害の予防において有効な量で投与される、対象においてグルコース代謝障害を予防するための本発明1074の組成物。
[本発明1077]
前記組成物の投与が、対象による食物摂取の減少をもたらす、本発明1071から1076のいずれかの組成物。
[本発明1078]
前記組成物の投与が、対象の体重減少をもたらす、本発明1071から1076のいずれかの組成物。
[本発明1079]
前記組成物の投与が、対象における血糖の低下をもたらす、本発明1071から1076のいずれかの組成物。
[本発明1080]
対象が真性糖尿病を有するか、または真性糖尿病を発症するリスクを有する、本発明1071から1076のいずれかの組成物。
[本発明1081]
非経口注射のために製剤化されている、本発明1071から1080のいずれかの組成物。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ｆｃ／Ｆｃポリペプチドがノブ−イン−ホールＦｃ対である（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５分子のヘテロ二量体のホモ二量体複合体（Ａ〜Ｆ）、ならびにそのヘテロ二量体のホモ二量体複合体の発現及びアセンブリを増強するためのＧＤＦ１５分子上へのＮ連結グリカンの組込み（Ｅ、Ｆ）のイラスト図を示す。
【図２Ａ】操作された（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５複合体のＥｘｐｉ  ２９３Ｆ一過性発現からの回収量を示す。回収量は次のとおりである：（０＝凝集物／発現なし、＜２５ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ〜４９．９ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ〜７４．９ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ〜９９．０ｍｇ／Ｌ、＞１００ｍｇ／Ｌ）。（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５におけるＧＤＦ１５配列上へのＮ連結グリカンの付加は、精製後の全回収量の著しい増大をもたらす。
【図２Ｂ】Ｆｃにコンジュゲートされなかった野生型ＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５−グリコシル化変異体（糖変異タンパク質（ｇｌｙｃｏｍｕｔｅｉｎ））のＥｘｐｉ  ２９３Ｆ一過性発現からの回収量を示す。
【図３】週１回で４週間にわたる（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５複合体０．４ｎｍｏｌ／ｋｇの皮下送達、続く、１４日間の回復期での、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスモデルにおける体重減少を示す。Ｂ１３ａ／Ｂ１３ｂ変異体は、Ｂ９ａ／Ｂ９ｂ及びＢ１１ａ／Ｂ１１ｂ変異体と比較して、有意に改善した有効性を有する。
【図４】週１回で４週間にわたる（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５複合体０．４ｎｍｏｌ／ｋｇの皮下送達、続く、１４日間の回復期での、ＤＩＯマウスモデルにおける体重減少パーセントを示す。Ｂ１３ａ／Ｂ１３ｂ変異体は、投薬後の１４日間の回復の後に、２０％超の体重のビヒクル減算％変化（ａ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ  ％  ｃｈａｎｇｅ）を有する。
【図５】週１回で４週間にわたる（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５複合体４．０ｎｍｏｌ／ｋｇの皮下送達、続く、１４日間の回復期での、ＤＩＯマウスモデルにおける体重減少を示す。
【図６】週１回で４週間にわたる（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５複合体４．０ｎｍｏｌ／ｋｇの皮下送達、続く、１４日間の回復期での、ＤＩＯマウスモデルにおける体重減少パーセントを示す。
【図７】図３及び５において示された０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び４．０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群でのＤＩＯマウスの各群（ｎ＝６）について、観察された体重減少（ＳＥＭ及びｐ−値を含む）をまとめている。すべての群について、独立ｔ検定によって（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１及び＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図８】図３及び５において示された０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び４．０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群でのＤＩＯマウスの各群（ｎ＝６）について、観察された体重減少（ＳＥＭ及びｐ−値を含む）をまとめている。すべての群について、独立ｔ検定によって（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１及び＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【図９】図４及び６において示された０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び４．０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量群でのＤＩＯマウスの各群（ｎ＝６）について、体重減少パーセント（ＳＥＭ及びｐ−値を含む）をまとめている。すべての群について、独立ｔ検定によって（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１及び＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
詳細な説明
本開示の方法及び組成物をさらに記載する前に、本開示は、本明細書において記述する特定の実施形態に限定されないことを理解し、また本明細書において使用する専門用語は、特定の実施形態を記載することだけを目的としており、限定を意図したものではないことも理解されたい。
【００５５】
値の範囲が示されている場合、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値（文脈が別段に明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで）、及びその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が本発明に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は独立して、より小さい範囲内に含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って本発明にも包含される。表示範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される上限値及び下限値のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に包含される。別段に定義しない限り、本明細書において使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解する意味と同一の意味を有する。
【００５６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段に明確に指示しない限り、複数指示物を含むことに留意すべきである。したがって、例えば、「当該複合体（ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」という言及は、１つまたは複数の複合体への言及を含む、などである。特許請求の範囲が任意の場合による要素を除外するように作成されてもよいことがさらに留意される。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連した「単に」、「のみ」などの排他的専門用語の使用、または「否定的」限定の使用のための先行する根拠として役立つように意図されている。
【００５７】
本明細書において論述する刊行物は、本出願の出願日前にそれらが開示されたということだけで提供されている。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が、先行発明という理由でそのような出版物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供している刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。
【００５８】
定義
本明細書において互換的に使用される「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、遺伝的にコードされた、及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的に、または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾ポリペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。この用語には、これらだけに限定されないが、同種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を含むか、または含まない異種及び同種リーダー配列を有する融合タンパク質を含む融合タンパク質；免疫的にタグ付けされたタンパク質などが含まれる。具体的な実施形態では、この用語は、遺伝的にコードされたアミノ酸を含む任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。特定の実施形態では、この用語は、異種アミノ酸配列に融合した遺伝的にコードされたアミノ酸を含む任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。特定の実施形態では、この用語は、場合により、異種配列に融合している９８〜１１２アミノ酸長のアミノ酸を指す。具体的な実施形態では、適切な場合には、本明細書に開示及び記載のタンパク質及び分子に言及する場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において定義するとおりのポリペプチドを指す。
【００５９】
「複合体」という用語は、本明細書において使用する場合、少なくとも２個のポリペプチドを含み、そのポリペプチドのそれぞれがＮ末端及びＣ末端を含むタンパク質複合体を指す。当該少なくとも２個のポリペプチドは、共有結合性及び非共有結合性相互作用（例えば、静電、π作用、ファンデルワールス力、及び疎水作用）の一方または両方を介して相互に会合していてよい。当該少なくとも２個のポリペプチドは、同じであってよい、すなわち、同一のアミノ酸配列を有してもよいし、または異なってもよい、すなわち、同一のアミノ酸配列を有さなくてもよい。両方のポリペプチドが同一である２個のポリペプチドを有する複合体は、ホモ二量体と称される。２個のポリペプチドを有し、それらのポリペプチドが異なる複合体は、ヘテロ二量体と称される。３個のポリペプチドを有し、それらの３個のポリペプチドが同一である複合体は、ホモ三量体と称される。３個のポリペプチドを有し、それらの３個のポリペプチドのうちの少なくとも１つが他のポリペプチド（複数可）とは異なる複合体は、ヘテロ三量体と称される。４個のポリペプチドを有し、それらの４個のポリペプチドが同一である複合体は、ホモ四量体と称される。４個のポリペプチドを有し、それらの４個のポリペプチドのうちの少なくとも１つが他のポリペプチド（複数可）とは異なる複合体は、ヘテロ四量体と称される。第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと二量化してヘテロ二量体を形成しており、２個のそのようなヘテロ二量体が二量化してその複合体を形成している、４個のポリペプチド（第１のポリペプチドが２分子、第２のポリペプチドが２分子）の例示的な複合体は、２個のヘテロ二量体のホモ二量体複合体と称され得る。
【００６０】
本開示は、これらだけに限定されないが、第２のポリペプチドに会合している第１のポリペプチドを有し、その際、第１のポリペプチドが「ノブ」Ｆｃであり、第２のポリペプチドが「ホール」Ｆｃであり、かつ第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかが、ＧＤＦ１５（またはＧＤＦ１５変異タンパク質、例えば、本明細書に記載のＧＤＦ１５変異タンパク質）アミノ酸配列に融合しているヘテロ二量体を含む、上記で定義したとおりの複合体を企図する。当該第１及び第２のポリペプチドは、非共有結合性相互作用（例えば、当該Ｆｃのノブとホール領域との間の疎水性相互作用などの疎水作用）、共有結合（例えば、当該第１及び第２のポリペプチドにおけるＦｃのヒンジ領域間での１つまたは２つまたはそれ以上のジスルフィド結合などのジスルフィド結合）、またはそれら両方を介して相互に物理的に会合していてよい。
【００６１】
本開示はまた、相互に結合している２個のヘテロ二量体を含み、各ヘテロ二量体が第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、その際、第１のポリペプチドが「ノブ」Ｆｃであり、第２のポリペプチドが「ホール」Ｆｃであり、かつ第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかがＧＤＦ１５（またはＧＤＦ１５変異タンパク質）アミノ酸配列に融合している複合体を企図する。当該複合体内で、２個のヘテロ二量体は、非共有結合性相互作用（例えば、疎水性作用）、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）、またはそれら両方によって物理的に会合していてよい。当該複合体中のヘテロ二量体のそれぞれにおける第１及び第２のポリペプチドは、非共有結合性相互作用（例えば、疎水性作用）、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）、またはそれら両方によって相互に物理的に会合していてよい。
【００６２】
本開示はまた、相互に会合している２個のヘテロ二量体を含み、各ヘテロ二量体が第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、その際、第１のポリペプチドが「ノブ」Ｆｃであり、第２のポリペプチドが「ホール」Ｆｃであり、かつ第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかがＧＤＦ１５（またはＧＤＦ１５変異タンパク質）アミノ酸配列に融合している複合体を企図する。当該複合体内で、２個のヘテロ二量体は、非共有結合性相互作用（例えば、疎水性作用）または共有結合性相互作用（例えば、ジスルフィド結合（複数可））によって、ＧＤＦ１５ポリペプチドの間で物理的に会合していてよく、ヘテロ二量体のそれぞれにおける第１及び第２のポリペプチドは、非共有結合性相互作用（例えば、ノブ−イントゥ−ホール）、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）、またはそれら両方によって、相互に物理的に会合していてよい。
【００６３】
「患者」または「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、哺乳類）を指すために互換的に使用される。
【００６４】
「処置する」「処置すること」、「処置」などの用語は、対象が罹患している疾患、障害、もしくは状態、または対象が罹患している疾患、障害、状態に関連する少なくとも１つの症状の根本的な原因の少なくとも１つを一時的、または永続的に除去、低減、抑制、緩和、または寛解するように、疾患、障害もしくは状態、またはその症状が診断、観察などされた後に開始される一連の行為（薬剤、例えば、ポリペプチド、複合体、またはポリペプチド、複合体を含む医薬組成物の投与など）を指す。したがって、処置には、活動性の疾患を（例えば、血流中のインスリン及び／またはグルコースのレベルを低下させるように、耐糖能を増大するように、グルコースレベルの変動を最小化するように、及び／またはグルコースホメオスターシスの破壊に起因する疾患に対して保護し、体重を減少させ、体重の増加を阻止するように）阻害すること（すなわち、疾患、障害、もしくは状態、またはそれらと関連する臨床症状の発症、あるいはさらなる進展を阻止すること）が含まれる。
【００６５】
「処置を必要とする」という用語は、本明細書において使用する場合、対象が処置を必要としているか、処置によって利益を受けるという、医師または他の介護者によって成される判断を指す。この判断は、医師または介護者の専門知識の領域にある様々な因子に基づき成される。
【００６６】
「予防する」、「予防すること」、「予防」などの用語は、疾患、障害、状態などを発症する対象のリスク（例えば、臨床症状の非存在によって決定される）を一時的か、または永続的に予防、抑制、阻害、または低減するか、または一般的に特定の疾患、障害、または状態を有する素因のある対象の状況において、その発症を遅延させるような手法で（例えば、疾患、障害、状態、またはその症状の発症前に）開始される、一連の行為（薬剤、例えば、ポリペプチド、複合体、またはポリペプチド、複合体を含む医薬組成物の投与など）を指す。ある種の例では、この用語はまた、疾患、障害、もしくは状態の進行を減速させること、または有害か、もしくは別段に望ましくない状況へのその進行を阻害することを指す。
【００６７】
「予防を必要とする」という用語は、本明細書において使用する場合、対象が予防ケアを必要としているか、または予防ケアから利益を受けるであろうという、医師または他の介護者によって成される判断を指す。この判断は、医師または介護者の専門知識の領域にある様々な因子に基づき成される
【００６８】
「治療有効量」という語句は、単独か、または医薬組成物の一部として、単回用量で、または一連の用量の一部として、患者に投与された場合に、疾患、障害または状態のいずれかの症状、態様、または特徴に対していずれかの検出可能なプラスの作用を有し得る量での対象への薬剤の投与を指す。関連生理学的作用を測定することによって、治療有効量を確認することができる。例えば、高血糖状態の場合には、その薬剤量が高血糖状態を処置するために有効であるかを決定するために、血糖の低下もしくは減少、または糖負荷試験における改善を使用することができる。例えば、治療有効量は、空腹時血漿中グルコース（ＦＰＧ）の任意のレベル（例えば、基線レベル）を減少または低下させるために十分な量であり、例えば、その量は、２００ｍｇ／ｄｌ超のＦＰＧレベルを２００ｍｇ／ｄｌ未満に減少させるために十分であり、その量は、１７５ｍｇ／ｄｌ〜２００ｍｇ／ｄｌのＦＰＧレベルを出発レベル未満に減少させるために十分であり、その量は、１５０ｍｇ／ｄｌ〜１７５ｍｇ／ｄｌのＦＰＧレベルを出発レベル未満に減少させために十分であり、その量は、１２５ｍｇ／ｄｌ〜１５０ｍｇ／ｄｌのＦＰＧレベルを出発レベル未満に減少させるために十分である、などである（例えば、１２５ｍｇ／ｄｌ未満に、１２０ｍｇ／ｄｌ未満に、１１５ｍｇ／ｄｌ未満に、１１０ｍｇ／ｄｌ未満などにＦＰＧレベルを減少させる）。ＨｂＡ１ｃレベルの場合には、有効量は、レベルを約１０％〜９％超、約９％〜８％超、約８％〜７％超、約７％〜６％、約６％〜５％超など減少または低下させるために十分な量である。より詳細には、約０．１％、０．２５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、３３％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれ以上のＨｂＡ１ｃレベルの減少または低下を、本開示は企図する。投薬レジメン及び対象の状態などの診断分析と関連して、治療有効量を調整することができる。
【００６９】
「変化をもたらすために十分な量で」という語句は、特定の治療薬の投与前（例えば、基線レベル）とその後に測定された指標のレベルの間に検出可能な差違があることを意味する。指標には、任意の客観的パラメータ（例えば、グルコースまたはインスリンまたは食物摂取または体重のレベル）または主観的パラメータ（例えば、健康または食欲についての対象の感覚）が含まれる。
【００７０】
「耐糖能」という語句は、本明細書において使用する場合、グルコース摂取が変動したときに、血漿中グルコース及び／または血漿中インスリンのレベルを制御する対象の能力を指す。例えば、耐糖能は、約１２０分以内に、血漿中グルコースのレベルを減少させて、グルコースの摂取前に決定されたレベルに戻す対象の能力を包含する。
【００７１】
「糖尿病」及び「糖尿病性」という用語は、インスリンの不適切な産生または利用を伴い、高血糖症及び糖尿によって往々にして特徴づけられる炭水化物代謝の進行性疾患を指す。「糖尿病前症」及び「前糖尿病性」という用語は、対象が、糖尿病において典型的に観察される特徴、症状などは有しないが、処置せず放置すれば、糖尿病に進行し得る特徴、症状などは有する状態を指す。これらの状態の存在は、例えば、空腹時血漿中グルコース（ＦＰＧ）検査または経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）のいずれかを使用して決定することができる。両方とも通常は、検査開始前に少なくとも８時間にわたって、対象が絶食することを必要とする。ＦＰＧ検査では、絶食の完了後に、対象の血糖を測定し；一般的に、対象は終夜絶食し、対象が朝、食事を取る前に、血糖を測定する。健康な対象は一般的に、約９０〜約１００ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し、「糖尿病前症」を有する対象は一般的に、約１００〜約１２５ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し、かつ「糖尿病」を有する対象は一般的に、約１２６ｍｇ／ｄｌ超のＦＰＧレベルを有するであろう。ＯＧＴＴでは、対象の血糖を、絶食後、及び再度、グルコースリッチな飲料を飲んでから２時間後に測定する。グルコースリッチな飲料の消費から２時間後に、健康な対象は一般的に、約１４０ｍｇ／ｄｌ未満の血糖濃度を有し、前糖尿病性対象は一般的に、約１４０〜約１９９ｍｇ／ｄｌの血糖濃度を有し、糖尿病性対象は一般的に、約２００ｍｇ／ｄｌまたはそれを超える血糖濃度を有する。上述の血糖値は、ヒト対象に関するが、正常血糖、中程度高血糖症及び顕性高血糖症は、マウス対象では尺度が異なる。４時間の絶食後に健康なマウス対象は一般的に、約１００〜約１５０ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し、「糖尿病前症」を有するマウス対象は一般的に、約１７５〜約２５０ｍｇ／ｄｌのＦＰＧ濃度を有し、「糖尿病」を有するマウス対象は一般的に、約２５０ｍｇ／ｄｌ超のＦＰＧ濃度を有するであろう。
【００７２】
「インスリン抵抗性」という用語は、本明細書において使用する場合、正常量のインスリンが正常な生理学的または分子応答を生成することができない状態を指す。一部のケースでは、内因的に産生されるか、または外因的に投与される過生理学的量のインスリンで、完全に、または部分的にインスリン抵抗性を克服し、生物学的応答を生成することができる。
【００７３】
「代謝症候群」という用語は、これらだけに限定されないが、インスリン過剰血症、異常な耐糖能、肥満、腹部または上半身部分への脂肪の再分布、高血圧、異常フィブリノゲン血症（ｄｙｓｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ）、ならびに高トリグリセリド、低値の高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）−コレステロール、及び高値の小型高密度低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）粒子を特徴とする脂質異常症を含む関連する一群の形質を指す。代謝症候群を有する対象は、２型糖尿病及び／または他の障害（例えば、粥状動脈硬化）を発症するリスクがある。
【００７４】
「グルコース代謝障害」という語句は、健康な個体と比べて対象における上昇したグルコースレベル及び／もしくは上昇したインスリンレベルに関連する臨床症状または臨床症状の組み合わせによって特徴づけられる任意の障害を包含する。上昇したグルコース及び／またはインスリンレベルは、次の疾患、障害、及び状態において特に症状発現され得る：高血糖症、２型糖尿病、妊娠糖尿病、１型糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能障害、インスリン過剰血症、グルコース代謝不良、糖尿病前症、他の代謝障害（Ｘ症候群とも称される代謝症候群など）、ならびに肥満など。本開示の複合体及びその組成物は、例えば、グルコースホメオスターシスを達成する、及び／または維持するために、例えば、健康な対象において見出される範囲に血流中のグルコースのレベルを減少させる、及び／またはインスリンのレベルを減少させるために使用することができる。
【００７５】
「高血糖症」という用語は、本明細書において使用する場合、健康な個体と比べて上昇したグルコース量が対象の血漿中に循環している状態を指す。高血糖症は、本明細書に記載のとおりの空腹時血糖値の測定を含む、当技術分野で公知の方法を使用して診断することができる。
【００７６】
「インスリン過剰血症」という用語は、本明細書において使用する場合、血糖値が上昇しているか、または正常であるかのいずれかであるときに、同時に、循環インスリンのレベルが上昇している状態を指す。インスリン過剰血症は、高トリグリセリド、高コレステロール、高値の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、及び低値の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）などの脂質異常症；高尿酸レベル；多嚢胞性卵巣症候群；２型糖尿病、ならびに肥満に関連するインスリン抵抗性に起因し得る。インスリン過剰血症は、約２μＵ／ｍＬ超の血漿中インスリンレベルを有すると診断され得る。
【００７７】
本明細書において使用する場合、「体重障害」という語句は、過剰な体重及び／または食欲増進に関連する状態を指す。対象が参照の健康な個体と比較して過体重であるかを決定するために、様々なパラメータが使用され、それには、対象の年齢、身長、性別、及び健康状態が含まれる。例えば、対象は、対象のキログラムでの体重を対象のメートルでの身長の２乗で割ることによって計算される対象の肥満指数（ＢＭＩ）の評価によって、過体重または肥満と判断され得る。約１８．５〜約２４．９ｋｇ／ｍ２の範囲のＢＭＩを有する成人は正常な体重を有すると判断され；約２５〜約２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する成人は過体重（前肥満）と判断され得；約３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人は肥満と判断され得る。食欲増進は往々にして、過剰体重に寄与する。例えば、多くの場合に不眠症に関連する朝の食欲不振及び夜の過食によって特徴付けられるが、視床下部の損傷に関連し得る夜食症候群を含む、食欲増進に関連する状態がいくつかある。
【００７８】
「活性化物質」という用語は、例えば、代謝障害を処置または予防するために使用される１つまたは複数の薬剤、例えば、ポリペプチドまたは複合体の機能または活性を刺激する、増大させる、活性化させる、促進する、活性化を増強する、感受性を増加させる、または上方調節する薬剤を指す。加えて、活性化物質には、本発明のポリペプチドと同じ作用機序を通じて動作する薬剤（すなわち、当該ポリペプチドの手法と類似の手法で、当該ポリペプチドと同じシグナル伝達経路を調節する薬剤）が含まれ、それらは、当該ポリペプチドの生物学的応答に匹敵する（またはそれより大きい）生物学的応答を誘発することができる。活性化物質の例には、小分子化合物などのアゴニストが含まれる。
【００７９】
「調節物質」という用語はまとめて、本発明のポリペプチド及び活性化物質を指す。
【００８０】
「調節する」、「調節」などという用語は、直接的もしくは間接的のいずれかで１つもしくは複数のポリペプチド（もしくはそれらをコードする核酸分子）の機能もしくは活性を増大させる薬剤（例えば、活性化物質）の能力；または１つもしくは複数のポリペプチドの効果に匹敵する効果を生成する薬剤の能力を指す。
【００８１】
本開示を通じて、１文字または３文字コードによってアミノ酸が言及されていることが分かるであろう。読者の便宜のために、１文字及び３文字のアミノ酸コードを以下に提示する。
0006722175.tif 000002
【００８２】
本明細書において使用する場合、「変異体」という用語は、天然に存在する変異体（例えば、同族体及び対立遺伝子変異体）及び天然に存在しない変異体（例えば、組換え修飾されたもの）を包含する。天然に存在する変異体は、同族体、すなわち、種によって、それぞれ、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列が異なる核酸及びポリペプチドを含む。天然に存在する変異体は、対立遺伝子変異体、すなわち、種内で個体によってそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸配列が異なる核酸及びポリペプチドを含む。天然に存在しない変異体は、配列の変化が人工的に導入される、例えば、その変化がヒトの介入（「ヒトの手」）によって研究室または他の施設において生成される、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の変化をそれぞれ含む核酸及びポリペプチドを含む。
【００８３】
ＧＤＦ１５に関して、「天然」または「野生型」という用語は、生物学的に活性な天然に存在するＧＤＦ１５変異体を含む、生物学的に活性な天然に存在するＧＤＦ１５を指す。この用語は、１１２アミノ酸ヒトＧＤＦ１５成熟配列（配列番号：１）を含む。
【００８４】
「変異タンパク質」という用語は、本明細書において使用する場合、組換えタンパク質、すなわち、アミノ酸配列に人工的に導入された変化、例えば、ヒトの介入（ヒトの手」）によって研究室または他の施設において生成されたアミノ酸配列の変化を含むポリペプチドを広く指す。これらのポリペプチドは通常、単一または複数のアミノ酸置換または欠失を保有し、部位特異的もしくはランダム変異誘発を受けているクローン化遺伝子、または完全に合成された遺伝子に往々にして由来する。したがって本開示の「ＧＤＦ１５変異タンパク質」は、参照ポリペプチドに対して、例えば、天然／野生型成熟ヒトＧＤＦ１５（配列番号：１）に対して、例えば、アミノ酸置換及び／またはアミノ酸欠失（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４またはそれ以上のアミノ酸のＮ末端短縮化）を包含する。
【００８５】
天然ヒトＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５変異タンパク質に関して本明細書において使用する場合、「修飾された」、「修飾」などという用語は、ヒトＧＤＦ１５、天然に存在するＧＤＦ１５変異体、またはＧＤＦ１５変異タンパク質の特性を修飾する１つまたは複数の変化を指し、その変化は、ＧＤＦ１５ポリペプチド（天然また変異タンパク質）自体の一次アミノ酸配列を変更しない。そのような特性には、例えば、溶解性、循環半減期、安定性、クリアランス、免疫原性またはアレルゲン性、及び製造可能性（例えば、費用及び効率）が含まれる。「修飾」には、ＧＤＦ１５ポリペプチド（天然または変異タンパク質）自体の一次アミノ酸配列を変更しない共有結合性化学修飾が含まれる。実行することができるヒトＧＤＦ１５、天然に存在するＧＤＦ１５変異体、またはＧＤＦ１５変異タンパク質に対する変化には、これらだけに限定されないが、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１個または複数の分子またはその誘導体の共有結合）；グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）、ポリシアル酸化、及びヘシル化（ｈｅｓｙｌａｔｉｏｎ）；マルトース結合タンパク質融合；アルブミン融合（例えば、ＨＳＡ融合）；例えば、コンジュゲートした脂肪酸鎖を介したアルブミン結合（アシル化）；Ｆｃ融合；ならびにＰＥＧ模倣体との融合の１つまたは複数が含まれる。一部の特定の実施形態は、Ｆｃへの融合を含む修飾を伴い、さらに他の特定の修飾は、グリコシル化、またはそれらの組合せを含む修飾を伴う。
【００８６】
「ＤＮＡ」、「核酸」、「核酸分子」、「ポリヌクレオチド」などという用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、またはそれらの類似体を指すように、本明細書において互換的に使用される。ポリヌクレオチドの非限定的な例には、直線状及び環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、プライマーなどが含まれる。
【００８７】
「プローブ」という用語は、問題の遺伝子または配列に対応するＤＮＡまたはＲＮＡの断片を指し、その断片は、放射性標識（例えば、３２Ｐもしくは３５Ｓの組み込みによって）されているか、またはいくつかの他の検出可能な分子、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、もしくはフルオレセインを用いて標識されている。ＤＮＡまたはＲＮＡのストレッチは相補的配列とハイブリダイズするので、例えば、ウイルスプラーク、細菌コロニー、または問題の遺伝子を含有するゲル上のバンドを標識するために、プローブを使用することができる。プローブはクローン化されたＤＮＡであるか、または合成ＤＮＡ鎖であり得；後者は、例えば、タンパク質の一部をミクロシークエンシングする、タンパク質をコードする核酸配列を推定する、その配列を保有するオリゴヌクレオチドを合成する、配列を放射標識する、及びそれをプローブとして使用してｃＤＮＡライブラリまたはゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、単離したタンパク質からｃＤＮＡまたはゲノムクローンを得るために使用することができる。
【００８８】
「異種」という用語は、異なる供給源に由来する構造によって定義される２つの成分を指す。例えば、ポリペプチドの文脈では、「異種」ポリペプチドは、異なるポリペプチド（例えば、組換えポリペプチドを含む第１の成分及び天然のＧＤＦ１５ポリペプチドに由来する第２の成分）に由来する作動可能に連結されたアミノ酸配列を含んでよい。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの文脈では、「異種」ポリヌクレオチドは、異なる遺伝子（例えば、本明細書に開示する一実施形態によるポリペプチドをコードする核酸からの第１の成分及び担体ポリペプチドをコードする核酸からの第２の成分）に由来し得る作動可能に連結された核酸配列を含んでよい。他の例示的な「異種」核酸は、コード配列を含む核酸が、コード配列の起源とは異なる遺伝的起源に由来する調節要素（例えば、プロモーター）に作動可能に連結されている発現コンストラクトを含む（例えば、プロモーター、コード配列、またはその両方とは異なる遺伝的起源であってよい問題の宿主細胞において発現を提供するため）。例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドまたはそのドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＴ７プロモーターは、異種核酸と言われる。組換え細胞の文脈では、「異種」は、核酸が存在する宿主細胞とは異なる遺伝的起源のものである核酸（またはポリペプチドなどの遺伝子産物）の存在を指し得る。
【００８９】
「作動可能に連結された」という用語は、所望の機能を提供するための分子間の連結を指す。例えば、核酸の文脈での「作動可能に連結された」とは、核酸配列間の機能的連結を指す。例として、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、または一連の転写因子結合部位など）は、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結され得、その発現制御配列は、第２のポリヌクレオチドの転写及び／または翻訳に影響を及ぼす。ポリペプチドの文脈では、「作動可能に連結された」とは、ポリペプチドの記載の活性を提供するためのアミノ酸配列（例えば、異なるドメイン）の間の機能的連結を指す。
【００９０】
ポリペプチドの構造の文脈で本明細書において使用する場合、「Ｎ末端」（または「アミノ末端」）及び「Ｃ末端」（または「カルボキシル末端」）は、それぞれ、ポリペプチドのアミノ最端及びカルボキシル最端を指す一方で、「Ｎ末端（の）」及び「Ｃ末端（の）」という用語は、それぞれ、Ｎ末端及びＣ末端に向かうポリペプチドのアミノ酸配列の相対的位置を指し、それぞれ、Ｎ末端及びＣ末端の残基を含み得る。「すぐＮ末端（の）」または「すぐＣ末端（の）」は、第１及び第２のアミノ酸残基が、連続アミノ酸配列を提供するように共有結合で結合されている、第２のアミノ酸残基に対する第１のアミノ酸残基の位置を指す。
【００９１】
アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列（例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドに「由来する」アミノ酸配列）の文脈では、「〜に由来する」は、そのポリペプチドまたは核酸が参照ポリペプチドまたは核酸（例えば、天然に存在するＧＤＦ１５ポリペプチドまたはＧＤＦ１５をコードする核酸）の配列に基づく配列を有することを示すことを意味し、そのタンパク質または核酸が作製される供給源または方法について限定することを意味しない。例として、「〜に由来する」という用語は、参照アミノ酸またはＤＮＡ配列の同族体または変異体を含む。
【００９２】
ポリペプチドの文脈において、「単離された」という用語は、天然に存在する場合、天然に生じ得る環境とは異なる環境にある問題のポリペプチドを指す。「単離された」は、問題のポリペプチドが実質的に濃縮されている、及び／または問題のポリペプチドが部分的にまたは実質的に精製されているサンプル内に存在するポリペプチドを含むことを意味する。当該ポリペプチドが天然に存在しない場合、「単離された」は、そのポリペプチドが、合成または組換え手段のいずれかによって作製された環境から分離されていることを示す。
【００９３】
「濃縮された」は、問題のポリペプチドがａ）生物学的サンプルなどの出発サンプル（例えば、ポリペプチドが天然に存在しているサンプル、またはポリペプチドが投与後に存在しているサンプル）中のポリペプチドの濃度よりも高い濃度（例えば、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも６４倍高い、またはそれ以上高い）で、またはｂ）ポリペプチドが作製された環境（例えば、細菌細胞においてなど）よりも高い濃度で存在するように、サンプルが非天然に操作される（例えば、実験室において、例えば、科学者または臨床医によって）ことを意味する。
【００９４】
「実質的に純粋」は、成分（例えば、ポリペプチド、二量体、四量体、複合体）が組成物の全内容物の約５０％超、典型的には、総ポリペプチド含量の約６０％超を構成することを示す。より典型的には、「実質的に純粋」は、全組成物の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれ以上が問題の成分である組成物を指す。一部のケースでは、当該成分は、組成物の全内容物の約９０％超、または約９５％超を構成する。
【００９５】
「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、同一の構造的特徴を有する糖タンパク質を指す。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗原特異性を欠く抗体及び他の抗体様分子の両方を含む。抗体を、本明細書において以下で詳細に記載する。
【００９６】
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質の抗体集団から得た抗体を指す、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。異なる決定基（エピトープ）を指向する異なる抗体を含み得るポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。
【００９７】
抗体の文脈において、「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」という用語は、その天然環境の混入成分から分離及び／または回収された抗体を指し；そのような混入成分には、抗体の診断または治療用途に干渉する可能性がある物質が含まれ、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。
【００９８】
「保存的アミノ酸置換」という語句は、次の群の範囲内でのアミノ酸残基の置換を指す：１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ；２）Ｒ、Ｋ；３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ；４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ；５）Ｑ、Ｎ；及び６）Ｄ、Ｅ。保存的アミノ酸置換は、そのタンパク質中のアミノ酸（複数可）を、同様の酸性度、塩基性度、電荷、極性、または側鎖サイズの側鎖を有するアミノ酸と置き換えることによって、そのタンパク質の活性を保存し得る。置換、挿入、または欠失のための誘導は、異なる変異タンパク質または異なる種からのタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントに基づき得る。
【００９９】
増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）
ＭＩＣ−１（マクロファージ阻害性サイトカイン−１）としても知られるＧＤＦ１５、ＰＤＦ（前立腺分化因子）、ＰＬＡＢ（胎盤骨形成タンパク質）、ＮＡＧ−１（非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）活性化遺伝子）、ＴＧＦ−ＰＬ、及びＰＴＧＦＢは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである。６２ｋＤａ細胞内前駆体タンパク質として合成され、フューリン様プロテアーゼによって後に切断されるＧＤＦ１５は、２５ｋＤａジスルフィド連結タンパク質として分泌される。（例えば、Ｆａｉｒｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ  ６５：２−５  （１９９９）を参照されたい）。ＧＤＦ１５  ｍＲＮＡは、肝臓、腎臓、膵臓、結腸、及び胎盤を含むいくつかの組織において見られ、肝臓におけるＧＤＦ１５発現は、肝臓、腎臓、心臓、及び肺などの臓器の損傷中に顕著に上方制御され得る。
【０１００】
ＧＤＦ１５前駆体は、２９アミノ酸シグナルペプチド、１６７アミノ酸プロドメイン、及びフューリン様プロテアーゼによってプロドメインから切断される１１２アミノ酸の成熟ドメインを含有する３０８アミノ酸ポリペプチド（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．ＮＰ＿００４８５５．２）である。３０８アミノ酸ＧＤＦ１５ポリペプチドは「完全長」ＧＤＦ１５ポリペプチドと称され、１１２アミノ酸ＧＤＦ１５ポリペプチド（「全長」ＧＤＦ１５のアミノ酸１９７〜３０８）は、「成熟」ＧＤＦ１５ポリペプチドである（配列番号：１）。別段に示さない限り、用語「ＧＤＦ１５」は、１１２アミノ酸成熟ヒト配列を指す。加えて、特定のＧＤＦ１５残基に対する数的言及は、１１２アミノ酸成熟配列を指す（すなわち、残基１はＡｌａ（Ａ）であり、残基１１２はＩｌｅ（Ｉ）である；配列番号：１を参照されたい）。留意すべきは、ＧＤＦ１５前駆体アミノ酸配列は３つの切断部位を予測し、３種の推定上の「成熟」ヒトＧＤＦ１５形態（すなわち、１１０、１１２、及び１１５アミノ酸）をもたらす一方で、１１２アミノ酸成熟配列が正しいと認められる。
【０１０１】
本開示の範囲は、マウス（ＮＰ＿０３５９４９）、チンパンジー（ＸＰ＿５２４１５７）、オランウータン（ＸＰ＿００２８２８９７２）、アカゲザル（ＥＨＨ２９８１５）、ジャイアントパンダ（ＸＰ＿００２９１２７７４）、テナガザル（ＸＰ＿００３２７５８７４）、モルモット（ＸＰ＿００３４６５２３８）、フェレット（ＡＥＲ９８９９７）、ウシ（ＮＰ＿００１１９３２２７）、ブタ（ＮＰ＿００１１６７５２７）、イヌ（ＸＰ＿５４１９３８）、及びカモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ；ＡＦＶ６１２７９）を含む、他の哺乳類種からのＧＤＦ１５オルソログ、及びその修飾形態ならびにそれらの使用を含む。ヒトＧＤＦ１５の成熟形態は、マウスオルソログに対して約６７％のアミノ酸同一性を有する。
【０１０２】
簡便にするために、下記の修飾ヒトＧＤＦ１５分子、ＧＤＦ１５変異体（例えば、変異タンパク質）、及び修飾ＧＤＦ１５変異タンパク質をまとめて、本明細書において以下では「ポリペプチド（複数可）」と称する。本開示のポリペプチド及び核酸分子に関連する「ヒト」についてのいずれの言及も、そのポリペプチドまたは核酸を得る手法または供給源について限定することを意味したものではなく、むしろ、天然に存在するヒトポリペプチドまたは核酸分子の配列に対応し得るように、配列を参照しているに過ぎないことに留意すべきである。特定の実施形態では、修飾ヒトＧＤＦ１５分子は、Ｎ−グリコシル化二量体である。ヒトポリペプチド及びそれらをコードする核酸分子に加えて、本開示は、ＧＤＦ１５関連ポリペプチド及び他の種からの対応する核酸分子を企図する。
【０１０３】
Ａ．所望の物理的特性を有するポリペプチド
本開示は、一部では、配列番号：１（成熟１１２アミノ酸長ヒトＧＤＦ１５）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である連続アミノ酸配列を含むポリペプチドを企図する。当該ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列に対して１つまたは複数のアミノ酸置換及び／または欠失を含んでよい。ある種の実施形態では、アミノ酸置換に加えて、本開示のポリペプチドはまた、配列番号：１のアミノ酸配列に対してアミノ酸欠失を含んでよい。一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列に対してアミノ酸欠失を含んでよい。
【０１０４】
簡便さと明確さのために、配列番号：１のアミノ酸配列を、本明細書において提供するポリペプチドのための参照配列として使用する。したがって、アミノ酸残基位置は、本明細書では、配列番号：１を参照してナンバリングされている。配列番号：１の配列を下記に示す。
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【０１０５】
一部の実施形態では、本開示のポリペプチドは、１つまたは複数のＮ連結グリコシル化コンセンサス部位（複数可）を、そのような部位が配列番号：１においては存在しない位置に導入する１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失を含んでよい。当該Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位は、配列ＮＸＳ／Ｔを含み、ここで、ＮはＡｓｎであり；Ｘはプロリン以外のアミノ酸であり；Ｓｅｒ（Ｓ）またはＴｈｒ（Ｔ）のいずれかが続く。
【０１０６】
本開示のポリペプチドの例には、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のグリコシル化コンセンサス部位（例えば、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位）を、そのような部位が配列番号：１のアミノ酸配列においては存在しないアミノ酸位置に有するポリペプチドが含まれる。
【０１０７】
ある種の実施形態では、当該ポリペプチドは、１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位をその置換位置に提供する、配列番号：１に対する１つのアミノ酸置換を含んでよい（例えば、配列番号：１中のＮＧＤ配列を、１つの置換によってＮＧＴ／Ｓに変えてよい；置換位置に下線を引いた。他のケースでは、当該ポリペプチドは、１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位をその置換位置に提供する、配列番号：１に対する２つのアミノ酸置換を含んでよい（例えば、配列番号：１中のＫＴＤ配列を、２つの置換によってＮＴＴ／Ｓに変えてよい；置換位置に下線を引いた）。一部の実施形態では、当該ポリペプチドは、１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位をその置換位置に提供する、配列番号：１に対する３つのアミノ酸置換を含んでよい（例えば、配列番号：１中のＧＰＧ配列を、３つの置換によってＮＴＴ／Ｓに変えてよい；置換位置に下線を引いた）。
【０１０８】
ある種の実施形態では、当該ポリペプチドは、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位をその欠失の位置に提供する、配列番号：１に対する１つまたは複数のアミノ酸欠失を含んでよい。例えば、配列番号：１中のＮＧＤＨＣＰＬＧＰＧＲＣＣＲＬＨＴ（配列番号：１１９）配列を、アミノ酸ＤからＨ（下線付き）の欠失によって変えてよく）、それによって、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位：ＮＧＴを得る。
【０１０９】
ある種の実施形態では、当該ポリペプチドは、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位をその付加部位（複数可）に提供する、配列番号：１に対する１つまたは複数のアミノ酸付加を含んでよい。１つのアミノ酸付加によるＮ連結グリコシル化コンセンサス部位の導入例には、配列番号：１中の配列ＬＨＴにＮを付加して、配列ＬＮＨＴを生じさせることが含まれ、ここで、ＮＨＴは、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス部位である。
【０１１０】
上述のとおり、当該ポリペプチドは、配列番号：１に対する１つまたは複数の置換を含んでよく、その置換は、配列番号：１における対応するアミノ酸の位置としてナンバリングしてよい。
【０１１１】
ある種の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である連続アミノ酸配列を含んでよく、ここで、その連続アミノ酸配列は、置換Ｄ５Ｔ／ＳまたはＲ２１Ｎを有する。
【０１１２】
ある種の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である連続アミノ酸配列を含んでよく、ここで、その連続アミノ酸配列は、配列番号：１における対応するアミノ酸に対する次の置換対の少なくとも１つを有する：
ｉ．  Ｒ１６Ｎ及びＨ１８Ｔ、またはＲ１６Ｎ及びＨ１８Ｓ；
ｉｉ．  Ｓ２３Ｎ及びＥ２５Ｔ、またはＳ２３Ｎ及びＥ２５Ｓ；
ｉｉｉ．  Ｌ２４Ｎ及びＤ２６Ｔ、またはＬ２４Ｎ及びＤ２６Ｓ；
ｉｖ．  Ｓ５０Ｎ及びＦ５２Ｔ、またはＳ５０Ｎ及びＦ５２Ｓ；
ｖ．  Ｆ５２Ｎ及びＡ５４Ｔ、またはＦ５２Ｎ及びＡ５４Ｓ；
ｖｉ．  Ｑ５１Ｎ及びＲ５３Ｔ、またはＱ５１Ｎ及びＲ５３Ｓ；
ｖｉｉ．  Ｒ５３Ｎ及びＡ５５Ｔ、またはＲ５３Ｎ及びＡ５５Ｓ；
ｖｉｉｉ．  Ｓ６４Ｎ及びＨ６６Ｔ、またはＳ６４Ｎ及びＨ６６Ｓ；
ｉｘ．  Ｌ６５Ｎ及びＲ６７Ｔ、またはＬ６５Ｎ及びＲ６７Ｓ；
ｘ．  Ｓ８２Ｎ及びＮ８４Ｔ、またはＳ８２Ｎ及びＮ８４Ｓ；
ｘｉ．  Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｔ、またはＫ９１Ｎ及びＤ９３Ｓ；
ｘｉｉ．  Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｔ、またはＤ９３Ｎ及びＧ９５Ｓ；
ｘｉｉｉ．  Ｔ９４Ｎ及びＶ９６Ｔ、またはＴ９４Ｎ及びＶ９６Ｓ；
ｘｉｖ．  Ｖ９６Ｎ及びＬ９８Ｔ、またはＶ９６Ｎ及びＬ９８Ｓ；
ｘｖ．  Ｓ９７Ｎ及びＱ９９Ｔ、またはＳ９７Ｎ及びＱ９９Ｓ；ならびに
ｘｖｉ．  Ａ１０６Ｎ及びＤ１０８Ｔ、またはＡ１０６Ｎ及びＤ１０８Ｓ。
【０１１３】
例えば、上記ｉ）中の置換は、当該ポリペプチドが、配列番号：１ではアミノ酸位１８に対応するアミノ酸位にトレオニン（Ｔ）またはセリン（Ｓ）を有することを示しており、その際、配列番号：１では、ヒスチジン（Ｈ）がアミノ酸位１８に存在する。同様に、５位のＤの、ＴまたはＳでの置換は、Ｄ５Ｔ／Ｓによって示され得る。配列番号：１に対するポリペプチドにおける対応するアミノ酸の位置は、それらのアミノ酸配列をアラインさせることによって決定し得る。
【０１１４】
ある種の実施形態では、当該ポリペプチドは、単一のＮ−グリコシル化コンセンサス配列を提供する２つのアミノ酸置換（置換対）を、配列番号：１ではＮ−グリコシル化コンセンサス配列が存在しない位置に含んでよい。そのような置換の例には、上記で列挙したＲ１６Ｎ及びＨ１８Ｔ／Ｓ；Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｔ／Ｓ；Ｔ９４Ｎ及びＶ９６Ｔ／Ｓなどが含まれる。Ｒ１６Ｎ及びＨ１８Ｔ／Ｓは、当該ポリペプチドが、Ｎを、配列番号：１においてはＲが存在する配列番号：１の１６位に対応する位置に有することを示し、そのポリペプチドは、ＴまたはＳのいずれかを、配列番号：１では１８位に対応し、Ｈが存在する位置に有する。配列番号：１における配列ＲＸＨ（１６〜１８位に）は、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス配列のためのいずれの残基も含まないので、その置換対は、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス配列の導入をもたらす。
【０１１５】
代替の実施形態では、Ｎ連結グリコシル化コンセンサス配列を提供するために、単一アミノ酸置換で十分であり得、例えば、配列番号：１には、配列ＮＧＤ（３〜５位に）が存在するので、ＴまたはＳでのＤの単一置換は、それぞれ、両方ともＮ−グリコシル化コンセンサス配列である、配列ＮＧＴまたはＮＧＳを生成する。
【０１１６】
ある種のケースでは、１つよりも多いＮ−グリコシル化コンセンサス配列を、野生型ＧＤＦ１５に導入してもよい。例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のＮ−グリコシル化コンセンサス配列を得るために、野生型ＧＤＦ１５アミノ酸配列を置換及び／または欠失によって修飾してもよい。ある種の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号：１の１１２アミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１１２連続アミノ酸を含んでよく、その際、その１１２連続アミノ酸は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のＮ−グリコシル化コンセンサス配列、例えば、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、または１〜２のＮ−グリコシル化コンセンサス配列を含む。
【０１１７】
ある種の実施形態では、当該ポリペプチドは、配列番号：１の１１２アミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１１２連続アミノ酸を含んでよく、その際、その１１２連続アミノ酸は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の、本明細書において記述した置換対を含む。
【０１１８】
本開示はまた、上記のポリペプチドの活性断片であるポリペプチド（例えば、サブ配列）を企図する。活性断片またはサブ配列の長さは、４０アミノ酸から１１１アミノ酸、例えば、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、１０６、１０９、または最高１１１アミノ酸であってよい。
【０１１９】
当該ポリペプチドは、連続アミノ酸の定義された長さ（例えば、「比較ウィンドウ」）にわたって参照配列と比較して、定義された配列同一性を有する。比較するための配列のアライメント方法は当技術分野において周知である。比較するための最適な配列のアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  （１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３  （１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）の類似法の検索、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行、または手動アライメント及び視覚検査（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  １９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）によって行うことができる。
【０１２０】
例として、適切なポリペプチドは、配列番号：１における４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または最高１１２アミノ酸の連続ストレッチに対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【０１２１】
本明細書において開示するポリペプチドの例示的な断片には、配列番号：１に対するアミノ酸欠失を有するポリペプチドが含まれる。例えば、当該ポリペプチドは、配列番号：１に対するＮ末端短縮化及び／またはＣ末端短縮化を有してよい。当該短縮化は、参照ポリペプチド、例えば、配列番号：１に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、またはそれ以上のアミノ酸からなってよい。ある種の実施形態では、問題のポリペプチドは、配列番号：１に対して、本明細書において開示するものなどのＮ連結グリコシル化コンセンサス配列を導入する１つまたは複数の置換、ならびにＮ末端短縮化及び／またはＣ末端短縮化を含んでよい。
【０１２２】
ある種の実施形態では、当該ポリペプチドは、少なくとも９８アミノ酸長であり、かつ配列番号：１における９８アミノ酸の対応するストレッチに対して少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有してよい。このポリペプチドは、配列番号：１のＣ末端に存在するアミノ酸を保持しながら、配列番号：１のＮ末端に存在する最初の２つから最初の１４までのアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４アミノ酸）を欠失していてよい。言い換えると、欠失アミノ酸（複数可）は、配列番号：１のＮ末端アミノ酸に対応する。
【０１２３】
ある種の実施形態では、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、少なくとも１０６アミノ酸長であり、かつ配列番号：１における１０６アミノ酸の対応するストレッチに対して少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有してよい。当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、配列番号：１のＮ末端に存在する最初の６個のアミノ酸を欠失していてよい。
【０１２４】
ある種の実施形態では、当該ポリペプチドは、少なくとも１０９アミノ酸長であり、かつ配列番号：１における１０９アミノ酸の対応するストレッチに対して少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有してよい。当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、配列番号：１のＮ末端に存在する最初の３個のアミノ酸を欠失していてよい。
【０１２５】
例示的な本開示のポリペプチドは、ＷＴ  ｈＧＤＦ１５に対して２個のＮ末端アミノ酸の欠失（ΔＮ２）を含んでよく、そのＮ末端でＦｃ配列に融合していてよい。しかしながら、アミノ酸置換の位置に言及する場合、示されている残基番号は、ＷＴ成熟ｈＧＤＦ１５（ＷＴ；配列番号：１）における位置に対応する残基番号である。したがって、Ｎ末端で最初の２個のアミノ酸を欠失しているポリペプチドのＮ末端にあるアミノ酸Ｎは、ＧＤＦ１５変異タンパク質ポリペプチドアミノ酸配列における最初のアミノ酸であり、異種アミノ酸配列（例えば、Ｆｃ）が先行するが、残基３と称され得る。
【０１２６】
上述のとおり、これらのポリペプチド断片は、配列番号：１の配列に対してＮ−グリコシル化コンセンサス配列を導入する１つまたは複数のアミノ酸置換、例えば、本明細書において開示する１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸置換を含んでよい。
【０１２７】
上記で示したとおり、また下記でより詳細に記載するとおり、本開示のポリペプチドを、例えば、ペグ化（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つまたは複数の分子またはその誘導体の共有結合）；グリコシル化（例えば、Ｎ−グリコシル化）；ポリシアル酸化；血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、イヌ血清アルブミン、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含むアルブミン融合分子；例えば、コンジュゲートした脂肪酸鎖（アシル化）を介してのアルブミン結合；Ｆｃ融合；ならびにＰＥＧ模倣体との融合を介して修飾してもよい。ある種の実施形態では、当該修飾を、部位特異的手法で導入する。他の実施形態では、当該修飾はリンカーを含む。当該リンカーは、修飾部分をポリペプチドにコンジュゲートし得る。
【０１２８】
特定の実施形態では、本開示は、アルブミンとのコンジュゲーションによる、成熟ヒトＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５変異タンパク質（上記のポリペプチドなど）の修飾を企図する。他の実施形態では、本開示は、Ｎ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化を介しての、当該ポリペプチドの修飾を企図する。アルブミン及びそのポリペプチドコンジュゲート（例えば、融合タンパク質）、及びグリコシル化ポリペプチドの特徴を本明細書において下記でさらに記載する。
【０１２９】
Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチド及びその複合体
例示的な実施形態では、本明細書において開示するＧＤＦ１５ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、ヒトＧＤＦ１５分子、修飾ヒトＧＤＦ１５分子、ＧＤＦ１５変異タンパク質、及び修飾ＧＤＦ１５変異タンパク質）の１つまたは複数のアミノ酸配列に融合したＦｃポリペプチドまたはその断片を含む融合ポリペプチドとして存在し得る。本明細書において提供するとおり、当該ＧＤＦ１５ポリペプチドは、野生型ポリペプチドまたは変異タンパク質、例えば、グリコシル化変異タンパク質であってよい。本明細書において使用する場合、ポリペプチド、例えば、ＧＤＦ１５ポリペプチドの文脈における「グリコシル化変異タンパク質」または「糖変異タンパク質」または「グリコシル化変異体」または「糖変異体」は、１つまたは複数のグリコシル化コンセンサス部位を、参照（野生型）ポリペプチドがその位置にグリコシル化コンセンサス部位を含まないアミノ酸配列における位置に含むポリペプチドを指す。ある種のケースでは、当該融合ポリペプチドは、本明細書において開示するＧＤＦ１５糖変異タンパク質のＮ末端に融合しているＦｃ−配列を含んでよい。
【０１３０】
本明細書において記載しているか、または当技術分野で公知の任意のＦｃポリペプチド配列は、本開示の融合タンパク質の成分であり得る。当該融合タンパク質の成分を場合により、本明細書に記載のリンカーなどのリンカーを介して共有結合で結合することができる。本開示の実施形態の一部では、当該融合タンパク質は、Ｆｃポリペプチド配列をＮ末端部分として、かつ本明細書に記載のポリペプチドをＣ末端部分として含む。
【０１３１】
ある種のケースでは、本明細書において開示するＦｃ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチドのＦｃパートナーは、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）またはその変異体の配列を有するＦｃであってよい。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃのアミノ酸配列を配列番号：２として示す。
0006722175.tif 000004
【０１３２】
ヒンジ領域は、斜字体であり、ＣＨ２ドメインは、下線が引かれ、ＣＨ３ドメインは、二重下線が引かれている。当該Ｆｃ配列におけるアミノ酸位置のナンバリングは、ＥＵナンバリング（Ｅｄｅｌｍａｎ，  Ｇ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＵＳＡ，  ６３，  ７８−８５  （１９６９））による。したがって、配列番号：２において１位にあるグルタミン酸残基「Ｅ」は、ＥＵナンバリングによると、２１６とナンバリングされ；ＣＨ２ドメインは、２３１とナンバリングされるアラニン（Ａ）で始まり；ＣＨ３ドメインは、３４１とナンバリングされるグリシン（Ｇ）で始まる。
【０１３３】
本明細書において開示するＦｃ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチドのＦｃパートナーは、配列番号：２と少なくとも９０％同一、例えば、配列番号：２と少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、またはそれ以上同一である連続アミノ酸配列を有するＦｃであってよい。ある種の実施形態では、当該Ｆｃパートナーは、配列番号：２におけるＣＨ３ドメインと少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＨ３ドメインまたは連続アミノ酸配列を含むＦｃの断片であってよい。ある種の実施形態では、当該Ｆｃパートナーは、配列番号：２におけるＣＨ２及びＣＨ３ドメインと少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインまたは連続アミノ酸配列を含むＦｃの断片であってよい。ある種の実施形態では、当該Ｆｃパートナーは、配列番号：２におけるヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインと少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である部分ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン、または連続アミノ酸配列を含むＦｃの断片であってよい。ある種の実施形態では、当該Ｆｃパートナーは、配列番号：２において記述されたアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有してよい。
【０１３４】
ある種のケースでは、当該Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチドのＦｃパートナーは、組み込まれた突起を含んでよく、その突起は、組み込まれた空隙を含む別のＦｃポリペプチドと会合し得る。他のケースでは、当該Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチドのＦｃパートナーは、組み込まれた空隙を含んでよく、その空隙は、組み込まれた突起を含む別のＦｃポリペプチドと会合し得る。組み込まれた突起及び／または空隙を有する例示的なＦｃ配列は、米国特許第８，２１６，８０５号において記載されている。ある種のケースでは、当該突起及び空隙を、ＦｃポリペプチドのＣＨ３ドメインに組み込んでよい。ある種のケースでは、本開示のＦｃ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチドと会合するＦｃパートナーは、ＧＤＦ１５ポリペプチドにコンジュゲートされていない。したがって、当該Ｆｃパートナーは、当該Ｆｃ−ＧＤＦ１５融合ポリペプチドと二量化して、ヘテロ二量体１個当たり１個のＧＤＦ１５分子を有するヘテロ二量体を形成する。
【０１３５】
「突起」または「ノブ」を、第１のポリペプチドのＣＨ３ドメインにおける小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）に置き換えることによって組み込んでよい。当該突起に対して同一または同様のサイズの補償的「空隙」または「ホール」を場合により、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）に置き換えることによって、第２のポリペプチドのＣＨ３ドメインに作製する。
【０１３６】
「第１のポリペプチド」は、第２のポリペプチドと会合することとなる任意のポリペプチドであってよい。第１及び第２のポリペプチドは、「インターフェース」（下記で定義）で接する。当該インターフェースに加えて、第１のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインまたはヒンジ領域などの１つまたは複数の追加のドメインを含んでよい。ある種のケースでは、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドのインターフェースを形成し得るＣＨ３ドメインを含む。
【０１３７】
「第２のポリペプチド」は、「インターフェース」を介して第１のポリペプチドと会合することとなる任意のポリペプチドであってよい。当該インターフェースに加えて、第２のポリペプチドは、ＣＨ２ドメインまたはヒンジ領域などの１つまたは複数の追加のドメインを含んでよい。ある種のケースでは、第２のポリペプチドは、第２のポリペプチドのインターフェースを形成し得るＣＨ３ドメインを含む。
【０１３８】
当該「インターフェース」は、第２のポリペプチドのインターフェースにおける１個または複数の「コンタクト」アミノ酸残基（または他の非アミノ酸基）と相互作用する、第１のポリペプチドにおける「コンタクト」アミノ酸残基（または炭水化物基、ＮＡＤＨ、ビオチン、ＦＡＤ、またはｈａｅｍ基などの他の非アミノ酸基）を含む。ある種のケースでは、当該インターフェースは、定常ドメイン（またはその断片）などの免疫グロブリンのドメインであってよい。ある種のケースでは、当該インターフェースは、ＩｇＧ抗体、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体に由来する免疫グロブリンのＣＨ３ドメインを含む。
【０１３９】
「突起」は、第１のポリペプチドのインターフェースから突出しており、したがって、隣接するインターフェース（すなわち、第２のポリペプチドのインターフェース）における補償的空隙に位置し得て、ヘテロ二量体を安定化し、それによって、例えば、ホモ二量体形成よりもヘテロ二量体形成を支持するような少なくとも１個のアミノ酸側鎖を指す。当該空隙は、元のインターフェース中に存在してもよいし、または合成で（例えば、そのインターフェースをコードする核酸を変更することによって）導入してもよい。当該突起を、合成で（例えば、そのインターフェースをコードする核酸を変更することによって）、例えば、組換えの手段によって導入してもよい。
【０１４０】
「空隙」は、第２のポリペプチドのインターフェースからくぼんでいて、したがって、第１のポリペプチドの隣接するインターフェース上の対応する突起を収容する少なくとも１個のアミノ酸側鎖を指す。当該空隙は、元のインターフェース中に存在してもよいし、または合成で（例えば、そのインターフェースをコードする核酸を変更することによって）導入してもよい。例えば、第２のポリペプチドのインターフェースをコードする核酸を、空隙をコードするように変更する。
【０１４１】
突起は、「ノブ」とも称され、空隙は、「ホール」とも称される。例示的な突起及び空隙は、米国特許第８，２１６，８０５号において開示されており、次のアミノ酸位での置換を含む：３４７、３６６、３６８、３９４、４０５、及び４０７。アミノ酸の位置のナンバリングは、ＥＵナンバリングによる。組み込まれた突起は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列における対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含んでよく、その置換は、アミノ酸残基３４７、３６６、及び３９４からなる群から選択される位置にある。例えば、少なくとも１つの置換は、Ｑ３４７Ｗ／Ｙ、Ｔ３６６Ｗ／Ｙ、及びＴ３９４Ｗ／Ｙからなる群から選択される。ある種のケースでは、組み込まれた空隙は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列における対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含み、その置換は、アミノ酸残基３６６、３６８、３９４、４０５、及び４０７からなる群から選択される位置にある。例えば、少なくとも１つの置換は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｔ／Ｖ／Ａ、及びＹ４０７Ｔ／Ｖ／Ａからなる群から選択される。
【０１４２】
ある種のケースでは、当該突起は、置換Ｔ３６６Ｗ／Ｙを含んでよく、当該空隙は、置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｔ／Ｖ／Ａを含んでよい。
【０１４３】
例えば、当該突起は、置換Ｔ３６６Ｗ／Ｙを含んでよく、当該空隙は、置換Ｙ４０７Ｔ／Ｖ／Ａを含んでよい。他のケースでは、当該突起は、置換Ｔ３６６Ｙを含んでよく、当該空隙は、置換Ｙ４０７Ｔを含んでよい。他の実施例では、当該突起は、置換Ｔ３６６Ｗを含んでよく、当該空隙は、置換Ｙ４０７Ａを含んでよい。さらなる例では、当該突起は、置換Ｔ３９４Ｙを含んでよく、当該空隙は、置換Ｙ４０７Ｔを含んでよい。
【０１４４】
ある種の実施形態では、当該融合ポリペプチド中のＧＤＦ１５ポリペプチドのＦｃパートナーは、融合ポリペプチドの特性を改善する追加の変異を含んでよい。したがって、本明細書に記載の第１及び第２のポリペプチド中のＦｃ配列は、追加の変異を含んでよい。例えば、当該Ｆｃパートナー配列は、さもなければＦｃパートナーに特徴的であり得るＩｇＧエフェクター機能を排除（例えば、低下または除去）する変異（複数可）を含んでよい。ある種のケースでは、当該Ｆｃパートナー配列は、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）などのエフェクター機能を排除する変異（複数可）を含んでよい。
【０１４５】
４種のヒトＩｇＧアイソタイプは、活性化Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩａ）、阻害性ＦｃγＲＩＩｂ受容体、及び補体第一成分（Ｃ１ｑ）に、異なる親和性で結合して、非常に異なるエフェクター機能をもたらす。したがって、結合領域内の変異は、エフェクター機能に対して重大な影響を有し得る。
【０１４６】
ＩｇＧとＦｃγＲｓまたはＣ１ｑとの結合は、ヒンジ領域及びＣＨ２ドメインに位置する残基に左右される。ＣＨ２ドメインの２つの領域が、ＦｃγＲｓ及びＣ１ｑ結合には重要であり、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４において独特の配列を有する。ヒトＩｇＧ１における、２３３〜２３６位にあるＩｇＧ２残基、ならびに３２７、３３０、及び３３１位にあるＩｇＧ４残基の置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を多大に減少させることが示された（Ａｒｍｏｕｒ  ＫＬ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２９（８）：２６１３−２４；  Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７６（９）：６５９１−６０４）。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  らは、Ｋ３２２を含む異なる位置でのアラニン置換が、相補的活性化を有意に減少させることを実証した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ＥＥ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６４（８）：４１７８−８４）。同様に、マウスＩｇＧ２ＡのＣＨ２ドメイン中の変異は、ＦｃγＲＩ及びＣ１ｑへの結合を減少させることが示された（Ｓｔｅｕｒｅｒ  Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５（３）：１１６５−７４）。ある種の実施形態では、当該Ｆｃポリペプチドは、ＩｇＧエフェクター機能（複数可）を排除するＣＨ２ドメインにおける変異を含んでよい。ＣＨ２領域における例示的な変異には、
0006722175.tif 000005
が含まれる。
【０１４７】
一部の実施形態では、当該ＧＤＦ１５糖変異タンパク質にコンジュゲートされたＦｃポリペプチドは、野生型ヒンジ配列（一般的に、そのＮ末端にある）の一部またはすべてを含む。一部の実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、機能性または野生型ヒンジ配列を含まない。ある種のケースでは、当該Ｆｃ配列は、次のヒンジ配列：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号：１００）；ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号：１０１）；ＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号：１０２）；ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号：１０３）；ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号：１０４）；ＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号：１０５）；ＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号：１０６）；もしくはＣＰＰＣＰ（配列番号：１０７）；または１つもしくは複数の置換（例えば、１〜６つの置換、例えば、１〜５、１〜４、１、２、３、４、５、または６つの置換）を有するそれらの変異体の１つを含んでよい。ある種のケースでは、当該Ｆｃ配列は、別のＦｃのヒンジ領域と共有結合（例えば、１つまたは複数のジスルフィド結合）を形成するヒンジ領域を含んでよい。したがって、ある種の実施形態では、本明細書において開示する複合体における第１及び第２のポリペプチドは、第１及び第２のポリペプチドのヒンジ領域間の共有結合性相互作用を介して会合していてよい。共有結合性相互作用は、１つまたは２つの分子間ジスルフィド結合を含んでよい。
【０１４８】
本明細書において詳細に記載するとおり、ＧＤＦ１５糖変異タンパク質にコンジュゲートされているＦｃノブ配列またはホール配列を含む第１のポリペプチドを企図する。そのようなポリペプチドは、第２のＦｃポリペプチドとの複合体であってよく、その第２のポリペプチドと第１のポリペプチドとは、Ｆｃ配列のノブがホール内に位置することによって物理的に会合し得る。
【０１４９】
ある種のケースでは、第１のＦｃポリペプチド及び第２のＦｃポリペプチドの複合体を開示する。第１または第２のポリペプチドの一方は、Ｆｃ及びＧＤＦ１５の融合ポリペプチドであってよい。本明細書において記述するとおり、当該ＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＧＤＦ１５ポリペプチドのグリコシル化をもたらすグリコシル化変異（複数可）を含んでよい。グリコシル化ＧＤＦ１５ポリペプチドは、ＧＤＦ１５−グリカンまたはＧＤＦ１５−糖変異タンパク質とも称され得る。当該ＧＤＦ１５−グリカンまたはＧＤＦ１５−糖変異タンパク質は、本明細書において開示するとおりであってよい。ある種のケースでは、本明細書において提供するＦｃ−ノブポリペプチドまたはＦｃ−ホールポリペプチドに融合しているＧＤＦ１５−グリカンまたはＧＤＦ１５−糖変異タンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である連続アミノ酸配列を含むポリペプチドであってよく、その際、その連続アミノ酸配列は、配列番号：１のアミノ酸配列に対して置換Ｄ５Ｔ；Ｄ５Ｓ；またはＲ２１Ｎを有する。ある種の実施形態では、当該Ｆｃ−ノブポリペプチドまたはＦｃ−ホールポリペプチドに融合しているＧＤＦ１５−グリカンまたはＧＤＦ１５−糖変異タンパク質は、配列番号：１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであってよく、その際、そのアミノ酸配列は、配列番号：１のアミノ酸配列に対して次の置換対の１つまたは複数を含む：
ｘｖｉｉ．  Ｒ１６Ｎ及びＨ１８Ｔ、またはＲ１６Ｎ及びＨ１８Ｓ；
ｘｖｉｉｉ．  Ｓ２３Ｎ及びＥ２５Ｔ、またはＳ２３Ｎ及びＥ２５Ｓ；
ｘｉｘ．  Ｓ５０Ｎ及びＦ５２Ｔ、またはＳ５０Ｎ及びＦ５２Ｓ；
ｘｘ．  Ｆ５２Ｎ及びＡ５４Ｔ、またはＦ５２Ｎ及びＡ５４Ｓ；
ｘｘｉ．  Ｒ５３Ｎ及びＡ５５Ｔ、またはＲ５３Ｎ及びＡ５５Ｓ；
ｘｘｉｉ．  Ｓ６４Ｎ及びＨ６６Ｔ、またはＳ６４Ｎ及びＨ６６Ｓ；
ｘｘｉｉｉ．  Ｋ９１Ｎ及びＤ９３Ｔ、またはＫ９１Ｎ及びＤ９３Ｓ；
ｘｘｉｖ．  Ｄ９３Ｎ及びＧ９５Ｔ、またはＤ９３Ｎ及びＧ９５Ｓ；
ｘｘｖ．  Ｔ９４Ｎ及びＶ９６Ｔ、またはＴ９４Ｎ及びＶ９６Ｓ；
ｘｘｖｉ．  Ｖ９６Ｎ及びＬ９８Ｔ、またはＶ９６Ｎ及びＬ９８Ｓ；
ｘｘｖｉｉ．  Ｓ９７Ｎ及びＱ９９Ｔ、またはＳ９７Ｎ及びＱ９９Ｓ；ならびに
ｘｘｖｉｉｉ．  Ａ１０６Ｎ及びＤ１０８Ｔ、またはＡ１０６Ｎ及びＤ１０８Ｓ。
【０１５０】
ある種のケースでは、当該複合体は、第１及び第２のポリペプチドを含んでよい。当該第１のポリペプチドは、ＩｇＧ  Ｆｃ配列を含んでよく、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列は、少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列を含んでよく；第２のポリペプチドは、ＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列は、少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列を含み、その際、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドの突起が第２のポリペプチドの空隙内に位置することを介して、第２のポリペプチドと二量化しており、かつ第１のポリペプチドのＣ末端または第２のポリペプチドのＣ末端のいずれかが、少なくとも１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている。したがって、当該複合体は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドのヘテロ二量体を含む。第１または第２のポリペプチドのいずれかが、本明細書において開示するＧＤＦ１５変異タンパク質に融合しているので、ヘテロ二量体１個当たり１個のＧＤＦ１５分子が存在する。ある種のケースでは、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質は、本明細書に記載のＧＤＦ１５変異タンパク質であってよい。
【０１５１】
本明細書において論述するとおり、第１及び第２のポリペプチドは相互作用して、疎水性相互作用、ジスルフィド結合、またはその両方などの共有結合性及び／または非共有結合性相互作用を介してヘテロ二量体を形成してよい。
【０１５２】
ある種の実施形態では、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含む複合体を開示する。第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体のそれぞれは、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含んでよく、その第１のポリペプチドは、ＩｇＧ  Ｆｃ配列を含んでよく、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列は、少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列を含んでよく；第２のポリペプチドは、ＩｇＧ  Ｆｃ配列を含んでよく、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列は、少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列を含んでよく；その際、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドの突起が第２のポリペプチドの空隙内に位置することを介して、第２のポリペプチドと二量化しており、第１のポリペプチドのＣ末端または第２のポリペプチドのＣ末端のいずれかが、少なくとも１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされており、第１のヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質が第２のヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質と二量化し、それによって、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含む複合体を形成している。第２のヘテロ二量体と物理的に会合している第１のヘテロ二量体を含む本開示の複合体では、ヘテロ二量体−ヘテロ二量体複合体１個当たり２個のＧＤＦ１５分子が存在する。
【０１５３】
本明細書において言及するとおり、第１及び第２のポリペプチドは相互作用して、疎水性相互作用、ジスルフィド結合、またはその両方などの共有結合性及び／または非共有結合性相互作用を介してヘテロ二量体を形成してよく、かつ第１及び第２のヘテロ二量体二量体は相互作用して、疎水性相互作用、ジスルフィド結合、またはその両方などの共有結合性及び／または非共有結合性相互作用によって二量体−二量体複合体を形成してよい。
【０１５４】
ある種のケースでは、本明細書に記載のヘテロ二量体のそれぞれに、例えば、２個のヘテロ二量体の複合体に存在するＧＤＦ１５変異タンパク質は、配列において同一でも、または異なってもよい。ある種のケースでは、２個のヘテロ二量体の複合体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質は、配列において同一であってよい。
【０１５５】
ＧＤＦ１５変異タンパク質に融合するための、かつＦｃ−ＧＤＦ１５融合タンパク質への結合パートナーとしての例示的なＦｃ配列を本明細書において開示する。ある種の実施形態では、本開示の複合体中に存在するＦｃ配列は、組み込まれた「ノブ」及び「ホール」配列以外は、配列において同様または同一であってよい。
【０１５６】
ある種のケースでは、相互作用して、本明細書において開示する複合体を形成し得る第１及び第２のポリペプチドは、対Ｉ〜ＶＩＩＩとして下記で記述するとおりであってよい。下記に提示する配列では、ヒト免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ）Ｇ１（ｈＩｇＧ１）Ｆｃ配列の後に、リンカー配列（下線付き）、続いて、ＧＤＦ１５変異タンパク質配列（太字）が続く。
【０１５７】
対Ｉ：
第１のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｗ）−（Ｇ４Ｓ）２−ΔＮ２−ＧＤＦ１５（Ｎ３−Ｉ１１２）（Ｄ５Ｔ）
0006722175.tif 000006
（配列番号：３）
【０１５８】
第２のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｓ）（Ｌ３６８Ａ）（Ｙ４０７Ｖ）
0006722175.tif 000007
（配列番号：４）
【０１５９】
対ＩＩ：
第１のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｗ）−（Ｇ４Ｓ）５−ΔＮ２−ＧＤＦ１５（Ｎ３−Ｉ１１２）（Ｄ５Ｔ）
0006722175.tif 000008
（配列番号：５）
【０１６０】
第２のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｓ）（Ｌ３６８Ａ）（Ｙ４０７Ｖ）
0006722175.tif 000009
（配列番号：６）
【０１６１】
対ＩＩＩ：
第１のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｗ）−（Ｇ４Ｓ）５−ΔＮ３−ＧＤＦ１５（Ｇ４−Ｉ１１２）（Ｒ２１Ｎ）
0006722175.tif 000010
（配列番号：７）
【０１６２】
第２のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｓ）（Ｌ３６８Ａ）（Ｙ４０７Ｖ）
0006722175.tif 000011
（配列番号：８）
【０１６３】
対ＩＶ：
第１のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｗ）−（Ｇ４Ｓ）５−ΔＮ３−ＧＤＦ１５（Ｇ４−Ｉ１１２）（Ｓ２３Ｎ／Ｅ２５Ｔ）
0006722175.tif 000012
（配列番号：９）
【０１６４】
第２のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｓ）（Ｌ３６８Ａ）（Ｙ４０７Ｖ）
0006722175.tif 000013
（配列番号：１０）
【０１６５】
対Ｖ：
第１のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｗ）−（Ｇ４Ｓ）５−ΔＮ３−ＧＤＦ１５（Ｇ４−Ｉ１１２）（Ｆ５２Ｎ／Ａ５４Ｔ）
0006722175.tif 000014
（配列番号：１１）
【０１６６】
第２のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｓ）（Ｌ３６８Ａ）（Ｙ４０７Ｖ）
0006722175.tif 000015
（配列番号：１２）
【０１６７】
対ＶＩ：
第１のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｗ）−（Ｇ４Ｓ）５−ΔＮ３−ＧＤＦ１５（Ｇ４−Ｉ１１２）（Ｒ５３Ｎ／Ａ５５Ｔ）
0006722175.tif 000016
（配列番号：１３）
【０１６８】
第２のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｓ）（Ｌ３６８Ａ）（Ｙ４０７Ｖ）
0006722175.tif 000017
（配列番号：１４）
【０１６９】
対ＶＩＩ：
第１のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｗ）−（Ｇ４Ｓ）５−ΔＮ３−ＧＤＦ１５（Ｇ４−Ｉ１１２）（Ｋ９１Ｎ／Ｄ９３Ｔ）
0006722175.tif 000018
（配列番号：１５）
【０１７０】
第２のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｓ）（Ｌ３６８Ａ）（Ｙ４０７Ｖ）
0006722175.tif 000019
（配列番号：１６）
【０１７１】
対ＶＩＩＩ：
第１のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｗ）−（Ｇ４Ｓ）５−ΔＮ３−ＧＤＦ１５（Ｇ４−Ｉ１１２）（Ｄ９３Ｎ／Ｇ９５Ｔ）
0006722175.tif 000020
（配列番号：１７）
【０１７２】
第２のポリペプチド：ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（ＡＡ）（Ｔ３６６Ｓ）（Ｌ３６８Ａ）（Ｙ４０７Ｖ）
0006722175.tif 000021
（配列番号：１８）
【０１７３】
ある種のケースでは、相互作用して本明細書において開示する複合体を形成し得る第１及び第２のポリペプチドは、対ＩからＶＩＩＩにおいて上記で開示したとおりのそれぞれ第１及び第２のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有し得る。例えば、配列同一性は、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、またはそれ以上であってよい。
【０１７４】
ある種の実施形態では、当該複合体は、配列番号：３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと；配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含んでよく、その際、第１及び第２のポリペプチドは、少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合を介して共有結合性に連結している。第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含み、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体のそれぞれが、配列番号：３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと；配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含む複合体も本明細書において提供する。
【０１７５】
ある種の実施形態では、当該複合体は、配列番号：５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと；配列番号：６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含んでよく、その際、第１及び第２のポリペプチドは、少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合を介して共有結合性に連結している。第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含み、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体のそれぞれが、配列番号：５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと；配列番号：６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含む複合体も本明細書において提供する。
【０１７６】
ある種の実施形態では、当該複合体は、配列番号：７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと；配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含んでよく、その際、第１及び第２のポリペプチドは、少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合を介して共有結合性に連結している。第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含み、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体のそれぞれが、配列番号：７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドと；配列番号：８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一なアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドとを含む複合体も本明細書において提供する。
【０１７７】
特定の実施形態では、本明細書において開示する複合体は、２個のヘテロ二量体を含んでよく、その際、各ヘテロ二量体は：
（ａ）ノブ（Ｆｃ−ノブ）を含み、かつ下記の配列を有するｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチド：
0006722175.tif 000022
（配列番号：１２７）；及び
（ｂ）ホール（Ｆｃ−ホール）を含み、かつ下記の配列を有するｈＩｇＧ１−Ｆｃポリペプチド：
0006722175.tif 000023
（配列番号：４）
を含み、
Ｆｃ−ノブ（ａ）またはＦｃ−ホール（ｂ）のいずれかは、Ｃ末端で、ＧＤＦ１５糖変異タンパク質のＮ末端に融合している。当該ＧＤＦ１５糖変異タンパク質の配列は、下記のとおりであってよい。
0006722175.tif 000024
ある種の例では、当該Ｆｃ−ノブのアミノ酸配列は、配列番号：１２７のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であってよい。ある種の例では、当該Ｆｃ−ホールのアミノ酸配列は、配列番号：４のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であってよい。ある種の例では、当該ＧＤＦ１５変異タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：１２８〜１３６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であってよい。
【０１７８】
当該Ｆｃ−ノブまたは当該Ｆｃ−ホールは、リンカー配列（Ｇ４Ｓ）ｎ（ここで、ｎ＝１〜１０、例えば、２、３、４、または５）を介して、当該ＧＤＦ１５糖変異タンパク質と一緒になっていてよい。
【０１７９】
ある種の例では、本開示の複合体は、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、例えば、少なくとも５５ｍｇ／Ｌ、６０ｍｇ／Ｌ、６５ｍｇ／Ｌ、７０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、８０ｍｇ／Ｌ、８５ｍｇ／Ｌ、９０ｍｇ／Ｌ、９５ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ、１１０ｍｇ／Ｌ、１２０ｍｇ／Ｌ、１３０ｍｇ／Ｌ、１４０ｍｇ／Ｌ、１５０ｍｇ／Ｌ、１６０ｍｇ／Ｌ、１７０ｍｇ／Ｌ、１８０ｍｇ／Ｌ、１９０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ超、またはそれ以上の回収量を有してよい。ある種のケースでは、本開示の複合体は、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌ、例えば、６０ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ〜２５０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ〜１７５ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ〜２５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ〜１２５ｍｇ／Ｌ、１１０ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌ、または１５０ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌの回収量を有してよい。当該複合体の回収量は、それぞれの完全にアセンブルされた複合体において存在する２個の二量体を形成する第１及び第２のポリペプチドを発現する宿主細胞が培養されている培養培地から得られた、完全にアセンブルされた二量体−二量体複合体の量を指す。
【０１８０】
本開示はまた、Ｆｃポリペプチド融合パートナー、及びそのＦｃポリペプチド融合パートナーが修飾されて、荷電Ｆｃ対の一方のパートナーとなっているようなものを含む融合タンパク質を企図する。「荷電Ｆｃ対のパートナー」は、（ｉ）（場合により、ヒンジ領域を欠失し）、かつ荷電対変異を含む「負に荷電した」Ｆｃ配列、または（ｉｉ）（場合により、ヒンジ領域を欠失し）、かつ荷電対変異を含む「正に荷電した」Ｆｃ配列を指す。Ｆｃ配列における電荷対変異の性質を記載し、全体配列またはコンストラクトが陽電荷または負電荷を必ずしも有さないことを示すことに平易に言及するために、本明細書では「正に荷電した」及び「負に荷電した」を使用する。本開示のポリペプチドコンストラクト（例えば、ＧＤＦ１５糖変異タンパク質、修飾ＧＤＦ１５糖変異タンパク質）において使用するために適した荷電Ｆｃアミノ酸配列は、例えば、ＷＯ２０１３／１１３００８において記載されている。
【０１８１】
正に荷電したＦｃ（「Ｆｃ（＋）」）の例には、ヒンジ領域を欠失したＦｃ配列のアスパラギン酸からリシンへの変異（Ｅ３５６Ｋ）及びグルタミン酸からリシンへの変異（Ｄ３９９Ｋ）を含むＦｃが含まれる。負に荷電したＦｃ（「Ｆｃ（−）」）の例には、ヒンジ領域を欠失したＦｃ配列における２つの、リシンからアスパラギン酸への変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）を含むＦｃが含まれる。Ｃ末端リシン（Ｋ４７７）もまた、場合により欠失していてよい。Ｆｃ（＋）ポリペプチド融合タンパク質（例えば、Ｆｃ（＋）ＧＤＦ１５変異タンパク質融合タンパク質）及びＦｃ（−）ポリペプチド融合タンパク質（例えば、Ｆｃ（−）ＧＤＦ１５変異タンパク質融合タンパク質）を一緒にインキュベートすると、アスパラギン酸残基が静電力によってリシン残基と会合して、ＧＤＦ１５ポリペプチド融合タンパク質のＦｃ（＋）とＦｃ（−）配列との間でのＦｃヘテロ二量体の形成を促進する。
【０１８２】
本開示はまた、「ヘミ」または「ヘミＦｃ」コンストラクトと指定されるコンストラクトを企図し、これは、第１のＦｃ配列のＮ末端を第２のＦｃ配列のＣ末端に接続するリンカーによって、縦に並んで接合された２つのＦｃ配列を含む。一部の実施形態では、単量体は、ＧＤＦ１５配列のＮ末端を第１のＦｃ配列のＣ末端に接続する第１のリンカーによって、第１のＦｃ配列に連結されたポリペプチド（例えば、修飾された成熟ＧＤＦ１５またはＧＤＦ１５糖変異タンパク質）配列を含み、その際、第１のＦｃ配列は、第１のＦｃ配列のＮ末端を第２のＦｃ配列のＣ末端に接続する第２のリンカーによって、第２のＦｃ配列に連結されている。第１及び第２のＦｃ配列はまた、Ｆｃヒンジ領域によって会合されている。２個のそのような単量体は会合して、二量体を形成し、その中で、単量体は、２つのポリペプチド配列間の鎖間ジスルフィド結合を介して連結されている。本開示のＧＤＦ１５変異タンパク質との使用に適したヘミＦｃポリペプチドの例については、ＷＯ２０１３／１１３００８を参照されたい。
【０１８３】
本開示はまた、荷電Ｆｃ対（例えば、Ｆｃの多量体）のパートナーを含む、Ｆｃポリペプチドまたはその断片の多量体を有する融合タンパク質を企図する。
【０１８４】
本開示の複合体は、溶解性の上昇、凝集の低下、及び／または血清半減期の延長などの改善された特性を有する。ある種のケースでは、当該複合体の溶解性は一般的に、非コンジュゲートの組換えヒトＧＤＦ１５及びＦｃ（ノブまたはホール）コンジュゲートされた野生型ＧＤＦ１５に対して改善されている。ある種の実施形態では、当該複合体は、ｐＨ７．０でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に少なくとも１ｍｇ／ｍＬの溶解性を有する。他の実施形態では、当該複合体は、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも５ｍｇ／ｍＬの溶解性を有する。他の実施形態では、当該複合体は、ｐＨ７．０でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に少なくとも６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１０ｍｇ／ｍＬの溶解性を有する。特定の実施形態では、当該複合体は、１０ｍｇ／ｍＬ超の溶解性を有する。
【０１８５】
グリコシル化：本開示の目的では、「グリコシル化」は、グリカンをタンパク質、脂質、または他の有機分子に結合する酵素プロセスを広く指すことを意味する。本開示と関連した「グリコシル化」という用語の使用は一般的に、１つまたは複数の炭水化物部分を付加または欠失させる（潜在するグリコシル化部位を除去することによってか、または化学及び／もしくは酵素手段によってグリコシル化を欠失させることによってかのいずれか）、ならびに／または天然配列に存在しても存在しなくてもよい１つまたは複数のグリコシル化部位を付加することを意味することが意図される。加えて、この語句は、存在する様々な炭水化物部分の性質及び比率の変化を伴う天然タンパク質のグリコシル化の質的変化を含む。
【０１８６】
グリコシル化は、タンパク質の物理的特性に劇的に影響を与え得、タンパク質の安定性、分泌、及び細胞内局在にも重要であり得る。実際に、本明細書に記載のＧＤＦ１５変異タンパク質ポリペプチドのグリコシル化は、それらの物理的特性に有益な改善を与える。例として、限定ではないが、ＧＤＦ１５変異タンパク質の溶解性を、グリコシル化によって改善することができ、そのような改善は多大であり得る（実施例を参照されたい）。そのような修飾ＧＤＦ１５変異タンパク質によって呈される溶解性の改善は、例えば、薬剤投与について、非グリコシル化ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質よりも適切な製剤の生成を可能にすることができる。グリコシル化ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５変異タンパク質ポリペプチドはまた、増強された安定性を呈し得る。さらに、当該ポリペプチドは、半減期などの１つまたは複数の薬物動態特性を改善し得る。
【０１８７】
グリコシル化部位の付加は、上記のとおりアミノ酸配列を変更することによって達成することができる。当該ポリペプチドの変更は、例えば、１個もしくは複数のセリンもしくはトレオニン残基（Ｏ連結グリコシル化部位で）、またはアスパラギン残基（Ｎ連結グリコシル化部位で）の付加、またはそれによる置換によって成してもよい。各種類において存在するＮ連結及びＯ連結オリゴ糖及び糖残基の構造は、異なってもよい。両方に共通して存在する糖の種類の１つは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（本明細書において下記では、シアル酸と称する）である。シアル酸は通常、Ｎ連結及びＯ連結オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷によって、糖タンパク質に酸性の特性を付与し得る。本開示の特定の実施形態は、上記のとおりのＮ−グリコシル化変異体の生成及び使用を含む。
【０１８８】
当該ポリペプチド上の炭水化物部分の数を増大させる別の手段は、グリコシドをそのポリペプチドに化学的または酵素的にカップリングさせることによる手段である。
【０１８９】
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）欠損チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、組換え糖タンパク質の生成のために一般的に使用される宿主細胞である。これらの細胞は、酵素ベータ−ガラクトシドアルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼを発現せず、したがってアルファ−２，６連結におけるシアル酸を、これらの細胞で産生された糖タンパク質のＮ連結オリゴ糖に付加しない。
【０１９０】
特定の実施形態では、少なくとも１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ１５変異タンパク質をグリコシル化する。したがって、特定の実施形態では、本明細書において開示する複合体中のＧＤＦ１５変異タンパク質は、そのＧＤＦ１５変異タンパク質に導入されたＮ連結グリコシル化コンセンサス部位でグリコシル化されていてよい。ある種のケースでは、本明細書において開示する複合体は細胞系からの発現中に生成されたグリコシル化ＧＤＦ１５などのグリコシル化ＧＤＦ１５を含んでよいが、その複合体を、生成後に処理して炭水化物部分を除去してよい。炭水化物部分の生成後除去は、真核宿主細胞における発現中に、ＧＤＦ１５変異タンパク質（及びＦｃ配列）に結合した実質的にすべての炭水化物基の除去をもたらし得る。
【０１９１】
したがって、本開示は、別のタンパク質（例えば、対象タンパク質とは異種のアミノ酸配列を有するタンパク質）などのポリペプチド配列のＮ末端及び／もしくはＣ末端での１つもしくは複数の追加の成分もしくは分子、または担体分子のコンジュゲーションを企図する。したがって、例示的なポリペプチド配列を、別の成分または分子とのコンジュゲートとして提供することができる。
【０１９２】
ポリペプチドを、タンパク質；セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどの多糖；ポリグルタミン酸、ポリリシンなどのポリマー性アミノ酸；アミノ酸コポリマー；不活性化ウイルス粒子；ジフテリア、破傷風、コレラ、ロイコトキシン分子からの類毒素などの不活性化細菌性毒素；不活性化細菌；及び樹状細胞などの、大きく、ゆっくり代謝される高分子にコンジュゲートさせてもよい。所望の場合には、そのようなコンジュゲートされた形態を使用して、本開示のポリペプチドに対する抗体を生成することができる。ある種のケースでは、本明細書に記載の複合体におけるＧＤＦ１５は、大きく、ゆっくり代謝される高分子にコンジュゲートされたポリペプチドであってよい。
【０１９３】
コンジュゲーションのための追加の候補成分及び分子には、単離または精製に適したものが含まれる。特定の非限定的な例には、ビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対）、抗体、受容体、リガンド、レクチン、または固体支持体（例えば、プラスチックもしくはポリスチレンビーズ、プレートもしくはビーズ、磁気ビーズ、試験片、及び膜を含む）を含む分子などの結合分子が含まれる。
【０１９４】
カチオン交換クロマトグラフィーなどの精製方法を使用して、コンジュゲートをそれらの様々な分子量に効率的に分離する電荷の差によってコンジュゲートを分離してもよい。例えば、カチオン交換カラムに装填し、次いで、約２０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ約４で洗浄し、次いで、約３〜５．５のｐＨ、例えば、ｐＨ約４．５で緩衝された（０Ｍ〜０．５Ｍ）ＮａＣｌの直線勾配で溶離することができる。カチオン交換クロマトグラフィーによって得られた画分の内容物を従来の方法、例えば、質量分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または分子量によって分子実体を分離するための他の公知の方法を使用して、分子量によって特定してよい。
【０１９５】
リンカー：本開示のポリペプチド配列を修飾するために使用される上述の成分及び分子のいずれも場合により、リンカーを介して任意にコンジュゲートさせてよい。適切なリンカーには、一般的に、修飾ポリペプチド配列と連結された成分及び分子との間での多少の移動を可能にするために十分な長さのものである「柔軟なリンカー」が含まれる。当該リンカー分子は、約６〜５０個の原子長であり得る。当該リンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、２〜１０の単量体単位を含有するエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、またはそれらの組み合わせであってもよい。適切なリンカーを容易に選択することができ、それは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０のアミノ酸などの任意の適切な長さのものであり得る。
【０１９６】
例示的な柔軟なリンカーには、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧｍＳｏ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号：１２０）、（ＧｍＳｏＧｍ）ｎ、（ＧｍＳｏＧｍＳｏＧｍ）ｎ（配列番号：１２１）、（ＧＳＧＧＳｍ）ｎ（配列番号：１２２）、（ＧＳＧＳｍＧ）ｎ（配列番号：１２３）、及び（ＧＧＧＳｍ）ｎ（配列番号：１２４）、ならびにそれらの組合せ（ここで、ｍ、ｎ、及びｏはそれぞれ独立に、少なくとも１〜２０、例えば、１〜１８、２〜１６、３〜１４、４〜１２、５〜１０、１、２、３、４、５、６、７、８，９、または１０の整数から選択される）、ならびに他の柔軟なリンカーが含まれる。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは比較的構造不定であり、したがって、成分間の中性テザーとして機能し得る。例示的な柔軟なリンカーには、これらだけに限定されないが、ＧＧＳＧ（配列番号：２１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号：２２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号：２３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号：２４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号：２５）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号：２６）が含まれる。
【０１９７】
追加の柔軟なリンカーには、グリシンポリマー（Ｇ）ｎまたはグリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号：１２０）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：１２５）、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：１２６）（ここで、ｎ＝１〜５０、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜５０）が含まれる。例示的な柔軟なリンカーには、これらだけに限定されないが、ＧＧＧＳ（配列番号：１９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号：２０）、ＧＧＳＧ（配列番号：２１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号：２２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号：２３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号：２４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号：２５）、及びＧＳＳＳＧ（配列番号：２６）が含まれる。これらのリンカー配列の多量体（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１０〜２０、２０〜３０、または３０〜５０）を一緒に連結して、異種アミノ酸配列を本明細書において開示するポリペプチドにコンジュゲートするために使用され得る柔軟なリンカーを得てもよい。本明細書に記載のとおり、当該異種アミノ酸配列は、シグナル配列及び／または融合パートナー、例えば、アルブミン、Ｆｃ配列などであってよい。
【０１９８】
リンカーの例には、例えば、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号：１２６）（ここで、ｎは、１〜約１０（例えば、ｎ＝１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）の整数である）；ＧＧＧＳＧＧＧＳＩＥＧＲ（配列番号：４８）；ＧＧＧＧＧ（配列番号：２７）；ＥＧＧＧＳ（配列番号：２８）が含まれる。
【０１９９】
一部のケースでは、当該リンカーは、切断可能なリンカー、例えば、酵素的に切断可能なリンカーであってよい。他のケースでは、当該リンカーは、非切断性リンカー、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで通常の生理学的条件下で酵素的に切断されないリンカーである。
【０２００】
例えば、タンパク質分解的に切断可能なリンカーには、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）切断部位、例えば、コラゲナーゼ−１、−２、及び−３（ＭＭＰ−１、−８、及び−１３）、ゼラチナーゼＡ及びＢ（ＭＭＰ−２及び−９）、ストロメライシン１、２、及び３（ＭＭＰ−３、−１０、及び−１１）、マトリライシン（ＭＭＰ−７）、ならびに膜メタロプロテイナーゼ（ＭＴ１−ＭＭＰ及びＭＴ２−ＭＭＰ）から選択されるＭＭＰの切断部位が含まれ得る。ＭＭＰ−９の切断配列は、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ（ここで、Ｘは、任意の残基；Ｈｙは、疎水性残基を表す）（配列番号：２９）、例えば、Ｐｒｏ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）（配列番号：３０）、例えば、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号：３１）、またはＰｒｏ−Ｌｅｕ／Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ（配列番号：３２）である。プロテアーゼ切断部位の別の例は、プラスミノゲンアクチベーター切断部位、例えば、ｕＰＡまたは組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）切断部位である。ｕＰＡ及びｔＰＡの切断配列の具体的な例には、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇを含む配列が含まれる。別の例は、トロンビン切断部位、例えば、ＣＧＬＶＰＡＧＳＧＰ（配列番号：３３）である。プロテアーゼ切断部位を含む追加の適切なリンカーには、以下のアミノ酸配列の１つまたは複数を含むリンカーが含まれる：１）カテプシンＢによって切断されるＳＬＬＫＳＲＭＶＰＮＦＮ（配列番号：３４）またはＳＬＬＩＡＲＲＭＰＮＦＮ（配列番号：３５）；エプスタイン−バーウイルスプロテアーゼによって切断されるＳＫＬＶＱＡＳＡＳＧＶＮ（配列番号：３６）またはＳＳＹＬＫＡＳＤＡＰＤＮ（配列番号：３７）；ＭＭＰ−３（ストロメライシン）によって切断されるＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭＮ（配列番号：３８）；ＭＭＰ−７（マトリライシン）によって切断されるＳＬＲＰＬＡＬＷＲＳＦＮ（配列番号：３９）；ＭＭＰ−９によって切断されるＳＰＱＧＩＡＧＱＲＮＦＮ（配列番号：４０）；サーモリシン様ＭＭＰによって切断されるＤＶＤＥＲＤＶＲＧＦＡＳＦＬ（配列番号：４１）；マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ−２）によって切断されるＳＬＰＬＧＬＷＡＰＮＦＮ（配列番号：４２）；カテプシンＬによって切断されるＳＬＬＩＦＲＳＷＡＮＦＮ（配列番号：４３）；カテプシンＤによって切断されるＳＧＶＶＩＡＴＶＩＶＩＴ（配列番号：４４）；マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ−１）によって切断されるＳＬＧＰＱＧＩＷＧＱＦＮ（配列番号：４５）；ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベーターによって切断されるＫＫＳＰＧＲＶＶＧＧＳＶ（配列番号：４６）；膜型１マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）によって切断されるＰＱＧＬＬＧＡＰＧＩＬＧ（配列番号：４７）；ストロメライシン３（またはＭＭＰ−１１）、サーモリシン、線維芽細胞コラゲナーゼ、及びストロメライシン−１によって切断されるＨＧＰＥＧＬＲＶＧＦＹＥＳＤＶＭＧＲＧＨＡＲＬＶＨＶＥＥＰＨＴ（配列番号：９４）；マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（コラゲナーゼ−３）によって切断されるＧＰＱＧＬＡＧＱＲＧＩＶ（配列番号：４９）；組織型プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）によって切断されるＧＧＳＧＱＲＧＲＫＡＬＥ（配列番号：５０）；ヒト前立腺特異的抗原によって切断されるＳＬＳＡＬＬＳＳＤＩＦＮ（配列番号：５１）；カリクレイン（ｈＫ３）によって切断されるＳＬＰＲＦＫＩＩＧＧＦＮ（配列番号：５２）；好中球エラスターゼによって切断されるＳＬＬＧＩＡＶＰＧＮＦＮ（配列番号：５３）；ならびにカルパイン（カルシウム活性化中性プロテアーゼ）によって切断されるＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰ（配列番号：５４）。
【０２０１】
本明細書において提供する具体的なアミノ酸配列及び核酸配列に加えて、本開示はまた、配列において、それらのアミノ酸及び核酸と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一である配列を有するポリペプチド及び核酸を企図する。２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列、または２つもしくはそれ以上のアミノ酸配列に関しての「同一である（同一な）」または「同一性」パーセントという用語は、指定領域にわたって最大対応で比較及びアラインさせた場合に、同じであるか、または規定のパーセンテージの同じ（例えば、指定の領域にわたって少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一な）アミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。本開示は具体的には、その第１のポリペプチド及びその第２のポリペプチドが配列において、本明細書において提供する第１及び第２のポリペプチド対のそれぞれの第１及び第２のポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する、複合体中に存在する第１及び第２のポリペプチドを企図する。
【０２０２】
ポリペプチドの生成方法
本開示のポリペプチドを、組換え方法及び非組換え方法（例えば、化学合成）を含む任意の適切な方法によって生成することができる。
【０２０３】
Ａ．化学合成
ポリペプチドを化学的に合成する場合、液相または固相を介して合成を進めることができる。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、非天然アミノ酸及び／またはペプチド／タンパク質骨格の修飾の組み込みを可能にする。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃなどのＳＰＰＳの様々な形態を、本開示のポリペプチドを合成するために利用可能である。化学合成の詳細は当技術分野において公知である（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ  Ａ．  ２００６  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ６：３−１０；及びＣａｍａｒｅｒｏ  Ｊ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．  １２：７２３−８）。
【０２０４】
Ｂ．組換え生成
ポリペプチドを、組換え技術を使用して生成する場合、そのポリペプチドを、任意の適切なコンストラクト、及び細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母宿主細胞などの、それぞれ、原核細胞または真核細胞であり得る任意の適切な宿主細胞を使用して、細胞内タンパク質として、または分泌タンパク質として生成してよい。宿主細胞として使用してよい真核細胞の他の例には、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び／または植物細胞が含まれる。哺乳類宿主細胞を使用する場合、それらには、ヒト細胞（例えば、ＨｅＬａ、２９３、Ｈ９、及びＪｕｒｋａｔ細胞）；マウス細胞（例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ細胞、及びＣ１２７細胞）；霊長類細胞（例えば、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７、及びＣＶ１）、及びハムスター細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）が含まれ得る。具体的な実施形態では、当該ポリペプチド及びそのポリペプチドを含む複合体をＣＨＯ細胞中で生成する。他の実施形態では、当該ポリペプチド及びそのポリペプチドを含む複合体を酵母細胞中で生成し、特定の実施形態では、酵母細胞は、哺乳類様Ｎ−グリカンを含む糖タンパク質を生成するように遺伝子操作された酵母細胞であってよい。
【０２０５】
ポリペプチドの発現に適切な様々な宿主−ベクター系を、当技術分野で公知の標準的な手順に従って使用してよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｄｓ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓを参照されたい。遺伝物質を宿主細胞に導入するための方法には、例えば、形質転換、電気穿孔、コンジュゲーション、リン酸カルシウム法などが含まれる。トランスファーのための方法を、導入されたポリペプチドコード核酸の安定した発現を提供するように選択することができる。当該ポリペプチドコード核酸を、遺伝性エピソーム要素（例えば、プラスミド）として提供することができるか、またはゲノム的に統合することができる。問題のポリペプチドの生成において使用するための様々な適切なベクターが市販されている。
【０２０６】
ベクターは、宿主細胞における染色体外維持を提供することができるか、または宿主細胞ゲノムへの統合を提供することができる。当該発現ベクターは転写及び翻訳の制御配列を提供し、そのコード領域が転写開始領域ならびに転写及び翻訳の停止領域の転写制御下で作動可能に連結されている場合、誘導性または構成的発現を提供し得る。一般的に、転写及び翻訳の制御配列には、これらだけに限定されないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列が含まれ得る。プロモーターは、構成的または誘導性のいずれかであり得、強い構成的プロモーター（例えば、Ｔ７）であり得る。
【０２０７】
発現コンストラクトは一般的に、問題のタンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列付近に位置する簡便な制限部位を有する。発現宿主において作動的な選択可能なマーカーが、ベクターを含有する細胞の選択を容易にするために存在してよい。さらに、当該発現コンストラクトは追加の要素を含んでよい。例えば、当該発現ベクターは、１つまたは２つの複製系を有してよく、したがって、発現のために生体、例えば、哺乳類または昆虫の細胞において、ならびにクローン化及び増幅のために原核宿主においてそれを維持することが可能である。加えて、当該発現コンストラクトは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含有してよい。選択可能な遺伝子は当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞と共に変動するはずである。
【０２０８】
タンパク質の単離及び精製は、当技術分野で公知の方法に従って達成することができる。例えば、タンパク質を構成的に及び／または誘導時に発現するように遺伝的に修飾された細胞の溶解産物から；宿主細胞を増殖させた培養培地から；またはサンプル（細胞溶解産物、培養培地、または反応混合物）を、そのタンパク質と特異的に結合するタグと接触させ、非特異的に結合した材料を除去するために洗浄し、特異的に結合したタンパク質を溶離することを伴い得るアフィニティー精製によって合成反応混合物から、タンパク質を単離することができる。単離されたタンパク質を、透析及びタンパク質精製方法において通常使用される他の方法によってさらに精製することができる。一実施形態では、当該タンパク質を、金属キレートクロマトグラフィー方法を使用して単離してもよい。タンパク質は、単離を容易にするために修飾を含んでよい。ある種の実施形態では、本開示の複合体を、サイズに基づき分離してよい。
【０２０９】
ある種の実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む複合体であって、第１のポリペプチドがＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列が少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列を含み；第２のポリペプチドがＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列が少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列を含み；その際、第１のポリペプチドの突起が第２のポリペプチドの空隙内に位置することによって、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと二量化しており、第１のポリペプチドのＣ末端または第２のポリペプチドのＣ末端のいずれかが、少なくとも１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされている複合体を、第１及び第２のポリペプチドを発現する宿主細胞が培養された培地から単離してよい。
【０２１０】
ある種の実施形態では、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含む複合体であって、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体のそれぞれが、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドがＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列が少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列を含み；第２のポリペプチドがＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列が少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列を含み；その際、第１のポリペプチドの突起が第２のポリペプチドの空隙内に位置することによって、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと二量化しており、第１のポリペプチドのＣ末端または第２のポリペプチドのＣ末端のいずれかが、少なくとも１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされていて、第１のヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質が第２のヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質と二量化し、それによって、第１のヘテロ二量体及び第２のヘテロ二量体を含む複合体を形成している複合体を、第１及び第２のポリペプチドを発現する宿主細胞が培養された培地から単離してよい。
【０２１１】
本明細書において言及するとおり、第１及び第２の核酸は、単一の宿主細胞または２つの異なる宿主細胞において単一のベクターまたは別々のベクター中に存在してよい。ある種のケースでは、本開示の第１及び第２のポリペプチドは、それぞれ、同じ細胞中に発現されて存在し得る第１及び第２の核酸によってコードされてよい。第１及び第２の核酸が異なる細胞中に存在する実施形態では、それらの細胞を、生成プロセス中のある時点で融合してもよい。
【０２１２】
当該複合体を、実質的に純粋か、または単離された形態（例えば、他のポリペプチドを非含有）で調製し得る。当該複合体は、存在し得る他の成分（例えば、他のポリペプチドもしくは他の複合体（例えば、ホモ二量体、ホモ四量体）または他の宿主細胞成分）に対して、複合体が濃縮された組成物で存在し得る。例えば、当該複合体が、他の発現タンパク質が実質的に非含有である、例えば、その組成物の９０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満が、他の発現タンパク質からなる組成物で存在するように、精製された複合体（例えば、ヘテロ二量体−ヘテロ二量体複合体）を提供し得る。
【０２１３】
抗体
本開示は、本開示のポリペプチドまたは融合タンパク質に特異的に結合する単離抗体を含む抗体を提供する。「抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ならびにＦａｂ及びＦ（ａｂ）'２を含む抗体結合断片を包含するが、ただし、それらが所望の生物学活性を呈することを条件とする。基本的な全抗体構造単位は四量体を含み、各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対から構成され、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）とを有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。対照的に、各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を画定する。ヒトの軽鎖はカッパ及びラムダとして分類される一方で、ヒト重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな抗体の酵素もしくは化学切断によって生成される。結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、及び単鎖抗体を含む。
【０２１４】
各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、いくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、そのもう他方の末端に定常ドメインを有し；その軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインとアラインされ、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインとアラインされる。軽鎖及び重鎖内で、可変領域及び定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。抗体の鎖はすべて、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって結合された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を呈する。各対の２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域によってアラインされ、特定のエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、軽鎖及び重鎖は両方とも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。
【０２１５】
インタクトな抗体は２つの結合部位を有し、二機能性または二重特異性抗体を除き、その２つの結合部位は同一である。二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対、及び２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合、またはＦａｂ'断片の連結を含む様々な方法によって生成され得る。
【０２１６】
上述のとおり、結合断片は、インタクトな抗体の酵素または化学切断によって生成され得る。酵素パパインでの抗体の消化は、「Ｆａｂ」断片としても公知の２つの同一な抗原結合断片、及び抗原結合活性を有しない「Ｆｃ」断片をもたらす。酵素ペプシンでの抗体の消化は、抗体分子の２つのアームが連結されたままであり、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ'）２断片をもたらす。Ｆ（ａｂ'）２断片は抗原を架橋する能力を有する。
【０２１７】
本明細書において使用する場合、「Ｆａｂ」という用語は、ＶＨ及びＶＬ領域、さらには、軽鎖の定常ドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとを含む抗体の断片を指す。
【０２１８】
本明細書において使用する場合、「Ｆｖ」という用語は、抗原認識及び抗原結合部位の両方を維持する抗体の最小断片を指す。２本鎖Ｆｖ種において、この領域は非共有結合性会合において１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体を含む。単鎖Ｆｖ種において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が２本鎖Ｆｖ種における構造に類似する「二量体」構造において会合することができるように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合性に連結され得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定するように相互作用するのは、この構成においてである。６つのＣＤＲがまとまって、抗体に抗原結合特異性を付与するが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的である３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【０２１９】
本明細書において使用する場合、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、特定のリガンドに接触し、その特異性を決定する免疫受容体の一部を指す。
【０２２０】
「超可変領域」という用語は、抗原結合性を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般的に、ＣＤＲからのアミノ酸残基、及び／または「超可変ループ」からのそれらの残基を含む。
【０２２１】
本明細書において使用する場合、「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の抗体の結合部位を指す。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面分類、さらには、特定の３次元構造特性及び電荷特性を含む。抗体は、解離定数が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、または≦１０ｎＭであるときに、抗体に結合すると言われている。平衡定数（「ＫＤ」）の上昇は、エピトープと抗体との間の親和性が低いことを意味する一方で、平衡定数の低下は、エピトープと抗体との間の親和性が高いことを意味する。ある量を「超えない」ＫＤを有する抗体は、抗体が所与のＫＤ以上で強くエピトープに結合することを意味する。ＫＤはエピトープ及び抗体の結合特性を説明するが、「効力」は抗体の機能についての抗体自体の有効性を説明する。平衡定数と効力との間に相関は必ずしもなく；したがって、例えば、比較的低いＫＤが、高い効力を自動的に意味することはない。
【０２２２】
抗体に関して、「選択的に結合する」という用語は、その抗体が単一の物質だけに結合することを意味せず、むしろ第１の物質に対する抗体のＫＤが第２の物質に対する抗体のＫＤより低いことを意味する。１つのエピトープにのみ排他的に結合する抗体は、その単一エピトープに結合する。
【０２２３】
ヒトに投与する場合、げっ歯類（すなわち、マウスまたはラット）可変及び／または定常領域を含有する抗体は時折、例えば、身体からの迅速なクリアランス、または抗体に対する身体による免疫応答の発生に関連する。げっ歯類由来の抗体の利用を回避するために、完全ヒト抗体を、げっ歯類が完全ヒト抗体を生成するように、げっ歯類へのヒト抗体機能の導入を介して生成することができる。本明細書において特に特定されない限り、「ヒト」及び「完全ヒト」抗体を互換的に使用することができる。「完全ヒト」という用語は、部分的にのみヒトである抗体を、全く、または完全にヒトである抗体と識別するときに有用であり得る。当業者は、完全ヒト抗体を生成する様々な方法を分かっている。
【０２２４】
起こり得るヒト抗マウス抗体応答に対処するために、キメラまたはさもなければヒト化抗体を利用することができる。キメラ抗体は、ヒト定常領域及びマウス可変領域を有し、したがって、ヒト抗キメラ抗体応答が一部の患者において観察され得る。したがって、起こり得るヒト抗マウス抗体応答またはヒト抗キメラ抗体応答を避けるために、多量体酵素に対する完全ヒト抗体を提供することが有利である。
【０２２５】
完全ヒトモノクローナル抗体は、例えば、当業者に公知の技術によってハイブリドーマ細胞系を生成することによって調製され得る。他の調製方法は、ＣＨＯ細胞などの適切な哺乳類宿主細胞の形質転換のための、特定の抗体をコードする配列の使用を伴う。形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス（またはウイルスベクターの中）にパッケージングし、そのウイルス（またはベクター）を宿主細胞に形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞の中に導入するための任意の公知の方法によって、または当技術分野において公知の遺伝子導入手順によって行うことができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳類細胞の中に導入するための方法は、当技術分野において周知であり、それには、デキストラン媒介遺伝子導入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介遺伝子導入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム内へのポリヌクレオチド（複数可）の封入、及び核内へのＤＮＡの直接微量注入が含まれる。発現の宿主として利用可能な哺乳類細胞系は、当技術分野において周知であり、それには、これらだけに限定されないが、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、及びヒト肝細胞癌細胞が含まれる。
【０２２６】
当該抗体を、本開示のポリペプチドを検出するために使用することができる。例えば、対象において本開示の１つまたは複数のポリペプチドのレベルを検出し、かつ検出されたレベルを、標準的な対照レベルまたは以前に決定された対象における基線レベル（例えば、任意の病気前）のいずれかと比較することによって、当該抗体を診断剤として使用することができる。
【０２２７】
治療的及び予防的使用
本開示は、本明細書に記載のとおりの本開示の複合体またはその組成物を投与することによって、肥満及び他の体重障害、高血糖、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、グルコース代謝障害などの代謝及び代謝関連の疾患を処置または予防するための方法を提供する。そのような方法は、例えば、症状の重症度または頻度を減少させることによって、疾患、障害、または状態に関連する１つまたは複数の症状に対して有利な作用も有し得る。
【０２２８】
対象が、本明細書において提供する方法によって体重障害（例えば、肥満）を処置または予防するための候補であり得るかを決定するために、これらだけに限定されないが、病因及び対象の状態の程度（例えば、参照の健康な個体と比較して、対象がどの程度過体重であるか）などのパラメータを評価すべきである。例えば、約２５〜約２９．９ｋｇ／ｍ２のＢＭＩを有する成人は、過体重（肥満前）と判断され得る一方で、約３０ｋｇ／ｍ２以上のＢＭＩを有する成人は、肥満と判断され得る。本明細書において論述するとおり、本発明の複合体は、食欲抑制、例えば、食欲低下をもたらし、体重減少につながり得る。
【０２２９】
対象が、本明細書において提供する方法によって高血糖、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、及び／もしくはグルコース障害を処置または予防するための候補であるかを決定するために、当技術分野において公知の様々な診断方法を利用してよい。そのような方法には、本明細書の別の箇所において記載するもの（例えば、空腹時血漿中グルコース（ＦＰＧ）の評価及び経口ブドウ糖負荷試験（ｏＧＴＴ））が含まれる。
【０２３０】
本明細書において提供する複合体は、肥満及び他の体重障害、高血糖症、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、グルコース代謝障害などの代謝及び代謝関連疾患を処置または予防するために対象に投与すると、血糖値の低下、体重の減少、及び／または食物摂取の減少をもたらし得る。
【０２３１】
ある種の実施形態では、本明細書において企図する複合体は、血糖値、体重、及び／または食物摂取を、その複合体の投与が非存在である場合と比較して少なくとも５％減少させ得る。例えば、本明細書において企図する複合体は、処置または予防の開始前のものと比較した場合に、血糖値、体重、及び／または食物摂取を少なくとも１０％、２０％、３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少させ得る。
【０２３２】
ある種の実施形態では、代謝障害を処置するために使用される本開示の複合体は、複合体１つ当たり２個のヘテロ二量体分子を含み、その際、各ヘテロ二量体が同じで、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドがＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列が少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列を含んでよく；第２のポリペプチドがＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列が少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列を含み；その際、第１のポリペプチドの突起が第２のポリペプチドの空隙内に位置することを介して、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと二量化して、ヘテロ二量体を形成しおり、各ヘテロ二量体における第１のポリペプチドのＣ末端または第２のポリペプチドのＣ末端のいずれかが、少なくとも１つのＮ連結グリコシル化コンセンサス部位を含むＧＤＦ１５変異タンパク質のＮ末端にコンジュゲートされており、ヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質が、他方のヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質と二量化し、それによって、２個のヘテロ二量体を含む複合体を形成している複合体であってよい。
【０２３３】
また他の実施形態では、代謝障害を処置するために使用される本開示の複合体は、複合体１個当たり２個のヘテロ二量体分子を含み（ヘテロ二量体と会合したヘテロ二量体）、その際、各ヘテロ二量体が同じであり、各ヘテロ二量体が、ＩｇＧ  Ｆｃ配列を有し、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列が少なくとも１つの組み込まれた突起を含むＣＨ３配列を含み得、その際、第１のポリペプチドのＣ末端が、ＧＤＦ１５糖変異タンパク質のＮ末端に融合している第１のポリペプチドと、ＩｇＧ  Ｆｃ配列を含み、そのＩｇＧ  Ｆｃ配列が少なくとも１つの組み込まれた空隙を含むＣＨ３配列を含む第２のポリペプチドとを含み；その際、第１のポリペプチドの突起が第２のポリペプチドの空隙内に位置することを介して、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと二量化して、ヘテロ二量体を形成しており、ヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質が、他方のヘテロ二量体におけるＧＤＦ１５変異タンパク質と二量化し、それによって、２個のヘテロ二量体を含む複合体を形成している複合体であってよい
【０２３４】
医薬組成物
本開示の複合体は、対象に投与するために適した組成物の形態であり得る。一般的に、そのような組成物は、１つもしくは複数の複合体、及び１つもしくは複数の薬学的に許容される、もしくは生理学的に許容される希釈剤、担体、または添加剤を含む「医薬組成物」である。ある種の実施形態では、当該複合体は、医薬組成物中に治療有効量で存在する。当該医薬組成物を、本開示の方法において使用してよく；したがって、例えば、当該医薬組成物は、本明細書に記載の治療法及び予防法ならびに使用を実践するために、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与することができる。本明細書において言及するとおり、当該複合体は、グリコシル化されていても、またはされていなくてもよい。例えば、当該複合体は、真核宿主細胞において生成されるときにグリコシル化されてもよいし、医薬組成物へと製剤化する前に炭水化物部分を除去するためのプロセスを受けてもよい。炭水化物部分の除去は、当該複合体におけるポリペプチドのグリコシル化の顕著な低減または当該複合体におけるポリペプチドのグリコシル化の完全な非存在をもたらし得る。
【０２３５】
具体的な実施形態では、本開示は、複合体、Ｎ−グリコシル化複合体、またはその組成物を投与することによって、グルコース代謝障害または体重障害を処置するための方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、当該複合体、Ｎ−グリコシル化複合体、またはその組成物を投与することによる、食物摂取を減少させるか、または体重を減少させるための方法。本開示はさらに、肥満及び他の体重障害、高血糖症、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、及びグルコース代謝障害などの代謝及び代謝関連疾患から選択される状態の処置において使用するための医薬品の製造における、上述の配列、複合体、Ｎ−グリコシル化複合体、またはその組成物の使用を提供する。本開示はさらに、グルコース代謝障害または体重障害の処置において使用するための医薬品の製造における、上述の配列、複合体、Ｎ−グリコシル化複合体、またはその組成物の使用を提供する。本開示はさらに、食物摂取または体重の減少において使用するための医薬品の製造における、上述の配列、複合体、Ｎ−グリコシル化複合体、またはその組成物の使用を提供する。
【０２３６】
肥満及び他の体重障害、高血糖症、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、及びグルコース代謝障害などの代謝及び代謝関連疾患から選択される状態を処置または予防するための本明細書において開示する組成物、例えば、配列、複合体、及びＮ−グリコシル化複合体の医薬組成物も、本明細書において提供する。本開示はさらに、グルコース代謝障害または体重障害を処置するための上述の配列、複合体、またはＮ−グリコシル化複合体の組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本開示はさらに、食物摂取または体重を減少させるための上述の配列、複合体、またはＮ−グリコシル化複合体の組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【０２３７】
本開示の医薬組成物は、意図する方法または投与経路に適合するように製剤化することができ；例示的な投与経路を本明細書において記述する。さらに、本開示によって企図される疾患、障害、及び状態を処置または予防するために、当該医薬組成物を、本明細書に記載のとおりの他の治療活性な薬剤または化合物（例えば、グルコース低下剤）と併用してよい。
【０２３８】
当該医薬組成物は典型的には、本開示によって企図される複合体の少なくとも１つの治療有効量と、１つまたは複数の薬学的及び生理学的に許容される製剤用薬剤とを含む。適切な薬学的に許容される、もしくは生理学的に許容される希釈剤、担体、または添加剤には、これらだけに限定されないが、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸及び重硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチルもしくはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾアート）、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、界面活性剤、緩衝剤、ビヒクル、希釈剤、及び／またはアジュバントが含まれる。例えば、適切なビヒクルは、生理食塩水またはクエン酸緩衝生理食塩水であってよく、非経口投与用の医薬組成物に一般的な他の材料が補充されることもある。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水が、さらなる例示的なビヒクルである。当業者であれば、医薬組成物及び剤形において使用することができる様々な緩衝剤を容易に認識するであろう。典型的な緩衝剤には、これらだけに限定されないが、薬学的に許容される弱酸、弱塩基、またはそれらの混合物が含まれる。例として、緩衝剤の成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びそれらの塩などの水溶性材料であってよい。許容される緩衝剤には、例えば、トリス緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ'−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、及びＮ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）が含まれる。
【０２３９】
医薬組成物を製剤化した後、それを、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または無水もしくは凍結乾燥された粉末として減菌バイアルに保管し得る。そのような製剤は、直ちに使用可能な形態、使用前に再構成を必要とする凍結乾燥形態、使用前に希釈を必要とする液体形態、または他の許容される形態のいずれかで保管し得る。一部の実施形態では、当該医薬組成物を、単回使用容器（例えば、単回使用バイアル、アンプル、シリンジ、または自動注入装置（例えば、ＥｐｉＰｅｎ（登録商標）に類似する））で提供する一方で、多回使用容器（例えば、多回使用バイアル）を他の実施形態では提供する。任意の薬物送達装置を、当該複合体を送達するために使用してよく、それには、移植片（例えば、移植可能なポンプ）及びカテーテル系が含まれ、その両方は当業者に周知である。一般的に皮下または筋肉内投与されるデポー注射剤も、定義された期間にわたって、本明細書に開示する複合体を放出するために利用してよい。デポー注射剤は通常、固系または油系のいずれかであり、本明細書に記述する製剤成分の少なくとも１つを一般的に含む。当業者であれば、デポー注射剤の考えられ得る製剤及び使用を熟知している。
【０２４０】
当該医薬組成物は、減菌注射用水性または油性懸濁液の形態であってよい。この懸濁液を、本明細書において上述したそれらの適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を使用する公知の技術に従って製剤化してよい。当該減菌注射用製剤はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液などの非毒性で非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の減菌注射用液剤または懸濁剤であってよい。使用してもよい許容される希釈剤、溶媒、及び分散剤には、水、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム溶液、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの適切な混合物が含まれる。加えて、減菌不揮発性油を、溶媒または懸濁媒として従来どおり使用する。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む、任意の無刺激性不揮発性油を使用してよい。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を、注射剤の調製において使用する。特定の注射用製剤の吸収の延長を、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチン）を含むことによって達成することができる。
【０２４１】
活性成分（例えば、本開示の複合体）を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬カプセル剤もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤、液剤、ミクロビーズ剤、またはエリキシル剤として、経口使用に適切な形態であってよい。経口使用を意図されている医薬組成物は、医薬組成物を製造する分野において公知の任意の方法に従って調製され得、そのような組成物は、薬学的に優れていて、味の良い調製物を提供するために、例えば、甘味剤、香味剤、着色剤、及び防腐剤などの１つまたは複数の薬剤を含有してよい。錠剤、カプセル剤などは、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される添加剤との混合物中に活性成分を含有する。これらの添加剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの希釈剤；造粒剤及び崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプンまたはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム、ならびに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであってよい。
【０２４２】
経口投与に適した錠剤、カプセル剤などを、胃腸管における崩壊及び吸収を遅延させ、それによって持続作用を提供するための公知の技術によってコーティングしてもよいし、またはコーティングしなくてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用してもよい。それらを、当技術分野において公知の技術によってコーティングして、制御放出用の浸透性治療錠剤を形成してもよい。追加の薬剤には、投与された組成物の送達を制御するために、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、もしくはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなどの生分解性もしくは生体適合性粒子またはポリマー物質が含まれる。例えば、経口剤を、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルもしくはポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルの使用によって、それぞれ、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、あるいはコロイド薬物送達系に封入することができる。コロイド状分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ミクロビーズ、及び脂質に基づく系（水中油型乳剤、ミセル、混合されたミセル、及びリポソームを含む）が含まれる。リポソームを調製する方法は、例えば、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、及び同第４，８３７，０２８号において記載されている。上述の製剤を調製するための方法は当業者に明らかである。
【０２４３】
経口使用のための製剤をまた、活性成分が、不活性固形希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリン、または微結晶セルロースと混合される硬ゼラチンカプセル剤として、あるいは活性成分が、水、または油性媒質、例えば、ラッカセイ油、流動パラフィン、もしくはオリブ油と混合される軟ゼラチンカプセル剤として提示してもよい。
【０２４４】
水性懸濁剤は、その製造に適した添加剤との混合物中に活性物質を含有する。そのような添加剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガントガム、及びアラビアゴムであり得；分散剤もしくは湿潤剤は、例えば、天然に存在するリン脂質（例えば、レシチン）、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート）、またはエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレアート）であり得る。水性懸濁剤は、１つまたは複数の防腐剤も含んでよい。
【０２４５】
油性懸濁剤は、活性成分を植物油、例えば、ラッカセイ油、オリブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油中に、または流動パラフィンなどの鉱油中に懸濁させることによって製剤化し得る。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン、またはセチルアルコールを含有してよい。上述のものなどの甘味剤及び香味剤を、味の良い経口剤を提供するために添加してよい。
【０２４６】
水の添加によって水性懸濁剤を調製するために適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、及び１つまたは複数の防腐剤との混合物中に活性成分を提供する。適切な分散剤もしくは湿潤剤、及び懸濁化剤は、本明細書において例示する。
【０２４７】
本開示の医薬組成物はまた、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、植物油、例えば、オリブ油もしくはラッカセイ油、または鉱油、例えば、流動パラフィン、またはこれらの混合物であってよい。適切な乳化剤は、天然に存在するガム、例えば、アラビアゴムもしくはトラガントガム；天然に存在するリン脂質、例えば、ダイズ、レシチン、及び脂肪酸由来のエステルまたは部分エステル；ヘキシトール無水物、例えば、ソルビタンモノオレアート；ならびに部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってよい。
【０２４８】
製剤は、移植片、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグ、及びミクロ封入された送達系を含む制御放出製剤などの、迅速な分解または身体からの排除に対して組成物を保護するための担体も含むことができる。例えば、モノステアリン酸グリセリル、もしくはステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を単独で、または蝋との組合せで使用してもよい。
【０２４９】
本開示は、薬物を直腸投与するための坐剤の形態での当該複合体の投与を企図する。当該坐剤は、通常の温度では固体であるが、直腸温度では液体であり、したがって、直腸で溶融して薬物を放出するために適切な非刺激性添加剤と薬物を混合することによって調製することができる。そのような材料には、これらだけに限定されないが、カカオバター及びポリエチレングリコールが含まれる。
【０２５０】
本開示によって企図される複合体は、現在既知の、また将来開発される任意の他の適切な医薬組成物の形態（例えば、鼻または吸入用途のためのスプレー）であってよい。
【０２５１】
製剤中のポリペプチドの複合体の濃度は、幅広く変動し得（例えば、約０．１質量％未満から、通常約２質量％または少なくとも約２質量％、多くて２０質量％〜５０質量％またはそれ以上）、主に、例えば、選択される特定の投与様式に従って、流体量、粘度、及び対象に基づく要因に基づき、通常選択される。
【０２５２】
Ｎａｎｏ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌデポー送達技術（Ｎａｎｏ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ；Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）の使用を、本明細書において企図する。当該技術は、タンパク質及びペプチド治療薬などの高分子のゼロ次放出速度を生成するチタニアナノチューブ膜を利用する。その生体適合膜は、治療薬高分子の長期（例えば、最高１年）にわたる一定速度の送達をもたらす小さな皮下インプラントに収容される。当該技術は、ＩＩ型糖尿病を処置するためのＧＬＰ−１アゴニストを送達するために現在評価中である。ある種の実施形態では、本明細書において開示する複合体(複数可）は、膜を含む製剤であってよい。例えば、当該複合体を、膜に含浸し、その膜で囲んでよい。当該膜は、ディスク、チューブ、または球体の形状であってよい。ある種の実施形態では、当該チューブはナノチューブであってよいか、または当該球体はナノ球体であってよい。
【０２５３】
投与経路
本開示は、任意の適切な手法での、本開示の複合体及びその組成物の投与を企図する。適切な投与経路には、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、皮下（例えば、注射または移植片）、腹腔内、槽内、関節内、腹腔内、脳内（実質内）、及び脳室内）、経口、経鼻、経膣、舌下、眼内、直腸内、局所（例えば、経皮）、舌下、及び吸入が含まれる。
【０２５４】
一般的に皮下または筋肉内投与されるデポー注射剤も、定義された期間にわたって、本明細書において開示している複合体を放出するために利用してよい。デポー注射剤は通常、固系または油系のいずれかであり、本明細書に記述の製剤成分の少なくとも１つを一般的に含む。当業者は、デポー注射剤の考えられ得る製剤及び使用を熟知している。
【０２５５】
抗体に関して、例示的な一実施形態では、本開示の抗体または抗体断片を、注射用の減菌等張性水性生理食塩溶液に１０ｍｇ／ｍｌで、４℃で保管し、対象に投与する前に、注射のために１００ｍｌまたは２００ｍｌのいずれかの０．９％塩化ナトリウム中で希釈する。当該抗体を、０．２〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で、１時間にわたって静脈内注入によって投与する。他の実施形態では、当該抗体を、１５分〜２時間の期間にわたって静脈内注入によって投与する。なお他の実施形態では、投与手順は、皮下大量注射による。
【０２５６】
本開示は、本開示の複合体を少なくとも１日２回、少なくとも１日１回、少なくとも４８時間毎に１回、少なくとも７２時間毎に１回、少なくとも週に１回、少なくとも２週毎に１回、または月に１回、対象に投与する方法を企図する。
【０２５７】
併用療法
本開示は、１つまたは複数の活性治療薬または他の予防もしくは治療モダリティと併用しての、本明細書において提供する複合体の使用を企図する。そのような併用療法では、様々な活性薬剤は往々にして、異なる作用機序を有する。そのような併用療法は、薬剤の１つまたは複数の用量低減を可能にし、それによって、薬剤の１つまたは複数に関連する有害な作用を減少または排除することによって特に有利であり得；さらに、そのような併用療法は、基礎疾患、障害、または状態に対して相乗的な治療または予防作用を有し得る。
【０２５８】
本明細書において使用する場合、「併用」は、別個に投与され得る、例えば、別個に投与するために別個に製剤化される（例えば、キットにおいて提供され得るような）治療薬、及び単一の製剤で一緒に投与することができる（すなわち、共製剤化（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ））治療薬を含むことを意味する。
【０２５９】
ある種の実施形態では、複合体を、順次投与または適用し、例えば、１つの薬剤を１つまたは複数の他の薬剤の前に投与する。他の実施形態では、当該複合体を同時に投与し、例えば、２つ以上の薬剤を同時にまたはほぼ同時に投与し；それらの２つ以上の薬剤は、２つ以上の別個の製剤に存在するか、または単一製剤に組み合わされてよい（すなわち、共製剤化）。２種以上の薬剤を順次に、または同時に投与するかどうかに関わらず、それらは本開示の目的のために併用して投与されると考える。
【０２６０】
本開示の複合体を、肥満、摂食障害、高血糖症、インスリン過剰血症、グルコース不耐性、及び他のグルコース代謝障害に罹患している対象に通常投与されるものを含む、本明細書において記述する疾患、障害、または状態の処置、予防、抑制、または寛解において有用な他の薬剤と併用することができる。
【０２６１】
本開示は、多数の薬剤（及びそのクラス）との併用療法を企図しており、それらの薬剤には、１）インスリン、インスリン模倣物質、及びスルホニル尿素を含む、インスリン分泌の刺激を伴う薬剤（例えば、クロロプロパミド、トラザミド、アセトへキサミド、トルブタミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド）及びメグリチニド（例えば、レパグリニド（ＰＲＡＮＤＩＮ）及びナテグリニド（ＳＴＡＲＬＩＸ））；２）ビグアニド（例えば、メトホルミン（ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥ））及びその薬学的に許容される塩、特に、Ｇｌｕｍｅｔｚａ（商標）、Ｆｏｒｔａｍｅｔ（商標）及びＧｌｕｃｏｐｈａｇｅＸＲ（商標）などのメトホルミン塩酸塩及びその延長放出製剤）ならびにグルコース利用を促進すること、肝グルコース産生を減少させること、及び／もしくは腸管グルコース排出を減少させることによって作用する他の薬剤；３）アルファ−グルコシダーゼ阻害薬（例えば、アカルボーズ、ボグリボース、及びミグリトール）ならびに炭水化物消化、及びその結果として腸からの吸収を減速させ、食後の高血糖を減少させる他の薬剤；４）インスリン、及びインスリン模倣物質（例えば、インスリンデグルデク、インスリングラルギン、インスリンリスプロ、インスリンデテミル、インスリングルリジン、及びそれぞれの吸入可能な製剤）を含むインスリン作用を増強して（例えば、インスリン増感によって）、末梢組織におけるグルコース利用を促進するチアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン（ＡＶＡＮＤＩＡ）、トログリタゾン（ＲＥＺＵＬＩＮ）、ピオグリタゾン（ＡＣＴＯＳ）、グリピジド、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン、ＡＭＧ１３１、ＭＢＸ２０４４、ミトグリタゾン、ロベグリタゾン、ＩＤＲ−１０５、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン、ダルグリタゾン；５）ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬（例えば、アログリプチン、オマリグリプチン、リナグリプチン、ビルダグリプチン（ＧＡＬＶＵＳ）、及びシタグリプチン（ＪＡＮＵＶＩＡ））を含むグルカゴン様ペプチド、ならびにグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ならびにＧＬＰ−１アゴニスト及び類似体（例えば、エクセナチド（ＢＹＥＴＴＡ及びＩＴＣＡ６５０（１２ヶ月の期間にわたってエクセナチド類似体を送達する皮下に挿入される浸透圧ポンプ；Ｉｎｔａｒｃｉａ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））ならびにＧＬＰ−１受容体アゴニスト（例えば、鼻腔内、経皮、及びその週１回製剤を含むデュラグルチド、セマグルチド、アルビグルチド、エクセナチド、リラグルチド、リキシセナチド、タスポグルチド、ＣＪＣ−１１３１、及びＢＩＭ−５１０７７）；６）ならびにＤＰＰ−ＩＶ耐性類似体（インクレチン模倣物質）、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、フェノフィブル酸誘導体などのＰＰＡＲアルファアゴニスト（例えば、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、シプロフィブラート、フェノフィブラート、ベザフィブラート）、二重作用性ＰＰＡＲアゴニスト（例えば、ＺＹＨ２、ＺＹＨ１、ＧＦＴ５０５、チグリタザル（ｃｈｉｇｌｉｔａｚａｒ）、ムラグリタザル、アレグリタザル、ソデルグリタザル、及びナベグリタザル）、汎作用性ＰＰＡＲアゴニスト、ＰＴＰ１Ｂ阻害薬（例えば、ＩＳＩＳ−１１３７１５及びＴＴＰ８１４）、ＳＧＬＴ阻害薬（例えば、ＡＳＰ１９４１、ＳＧＬＴ−３、エンパグリフロジン、ダパグリフロジン、カナグリフロジン、ＢＩ−１０７７３、ＰＦ−０４９７１７２９、レモグロフロジン、ＴＳ−０７１、トホグリフロジン、イプラグリフロジン、及びＬＸ−４２１１）、インスリン分泌促進物質、アンジオテンシン変換酵素阻害薬（例えば、アラセプリル、ベナゼプリル、カプトプリル、セロナプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、イミダプリル、リシノプリル、モベルチプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、テモカプリル、またはトランドラプリル）、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（例えば、ロサルタン、すなわち、ＣＯＺＡＡＲ（登録商標）、バルサルタン、カンデサルタン、オルメサルタン、テルメサルタン、及びＨＹＺＡＡＲ（登録商標）などのヒドロクロロチアジドと併用されるこれらの薬物のいずれか）、またはＬＣＺ６９６などの他の抗高血圧薬、ＲＸＲアゴニスト、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害薬、免疫調節物質、交感神経遮断薬（ｓｙｍｐａｔｈｏｌｉｔｉｃｓ）、ベータ−アドレナリン遮断薬（例えば、プロプラノロール、アテノロール、ビソプロロール、カルベジロール、メトプロロール、またはメトプロロール酒石酸塩）、アルファアドレナリン遮断薬（例えば、ドキサゾシン、プラゾシン、またはアルファメチルドーパ）中枢性アルファアドレナリンアゴニスト、末梢血管拡張薬（例えば、ヒドララジン）；ベータ−３アドレナリン受容体アゴニスト、１１ベータ−ＨＳＤ１阻害薬、中性エンドペプチダーゼ阻害薬（例えば、チオルファン及びホスホラミドン）、アルドステロンアンタゴニスト、アルドステロンシンターゼ阻害薬、レニン阻害薬（例えば、ジ−及びトリ−ペプチドの尿素誘導体（米国特許第５，１１６，８３５号を参照されたい）、アミノ酸及び誘導体（米国特許第５，０９５，１１９号及び同第５，１０４，８６９号）、非ペプチド結合によって連結したアミノ酸鎖（米国特許第５，１１４，９３７号）、ジ−及びトリ−ペプチド誘導体（米国特許第５，１０６，８３５号）、ペプチジルアミノジオール（米国特許第５，０６３，２０８号及び同第４，８４５，０７９号）及びペプチジルベータ−アミノアシルアミノジオールカルバマート（米国特許第５，０８９，４７１号）；同じく、次の米国特許第５，０７１，８３７号；同第５，０６４，９６５号；同第５，０６３，２０７号；同第５，０３６，０５４号；同第５，０３６，０５３号；同第５，０３４，５１２号、及び同第４，８９４，４３７において開示されているとおりの様々な他のペプチド類似体、ならびに小分子レニン阻害薬（ジオールスルホンアミド及びスルフィニル（米国特許第５，０９８，９２４号）、Ｎ−モルホリノ誘導体（米国特許第５，０５５，４６６号）、Ｎ−複素環式アルコール（米国特許第４，８８５，２９２号）、及びピロルイミダゾロン（米国特許第５，０７５，４５１）；同じく、ペプスタチン誘導体（米国特許第４，９８０，２８３号）ならびにスタトン含有ペプチドのフルオロ−及びクロロ誘導体（米国特許第５，０６６，６４３）、エナルクレイン、ＲＯ４２−５８９２、Ａ６５３１７、ＣＰ８０７９４、ＥＳ１００５、ＥＳ８８９１、ＳＱ３４０１７、アリスキレン（２（Ｓ），４（Ｓ），５（Ｓ），７（Ｓ）−Ｎ−（２−カルバモイル−２−メチルプロピル）−５−アミノ−４−ヒドロキシ−２，７−ジイソプロピル−８−［４−メトキシ−３−（３−メトキシプロポキシ）−フェニル］−オクタンアミドヘミフマラート）ＳＰＰ６００、ＳＰＰ６３０、及びＳＰＰ６３５を含む）、エンドセリン受容体アンタゴニスト、ホスホジエステラーゼ−５阻害薬（例えば、シルデナフィル、タダルフィル（ｔａｄａｌｆｉｌ）、及びバルデナフィル）、血管拡張薬、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン、ニフェジピン、ベラパルミル、ジルチアゼム、ガロパミル、ニルジピン、ニモジピン、ニカルジピン）、カリウムチャネル活性化物質（例えば、ニコランジル、ピナシジル、クロマカリム、ミノキシジル、アプリルカリム（ａｐｒｉｌｋａｌｉｍ）、ロプラゾラム（ｌｏｐｒａｚｏｌａｍ））、脂質低下薬、例えば、ラクトンプロドラッグ形態でＺＯＣＯＲ（登録商標）及びＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）として販売され、投与後に阻害薬として機能するシンバスタチン及びロバスタチンなどのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬、ならびにアトルバスタチン（特に、ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）で販売されているカルシウム塩）、ロスバスタチン（特に、ＣＲＥＳＴＯＲ（登録商標）で販売されているカルシウム塩）、プラバスタチン（特に、ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標）で販売されているナトリウム塩）、セリバスタチン、及びフルバスタチン（特に、ＬＥＳＣＯＬ（登録商標）で販売されているナトリウム塩）などのジヒドロキシ開環酸ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬の薬学的に許容される塩；上述のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬などの任意の他の脂質低下薬と、特に、シンバスタチン（ＶＹＴＯＲＩＮ（登録商標））と、またはアトルバスタチンカルシウムと併用されるエゼチミベ（ＺＥＴＩＡ（登録商標））及びエゼチミベなどのコレステロール吸収阻害薬；ＨＤＬ上昇薬（ＨＤＬ−ｒａｉｓｉｎｇ  ｄｒｕｇ）、（例えば、ナイアシン及びニコチン酸受容体アゴニスト、ならびにその長期−もしくは制御放出バージョン、及び／またはＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害薬を含むバージョン；アシピモックス及びアシフランなどのナイアシン受容体アゴニスト、さらには、ナイアシン受容体部分アゴニスト；グルカゴン受容体アンタゴニスト（例えば、ＭＫ−３５７７、ＭＫ−０８９３、ＬＹ−２４０９０２１、及びＫＴ６−９７１）；胆汁酸金属イオン封鎖剤（例えば、コレスチラン、コレスチミド、コレセベラム（ｃｏｌｅｓｅｖａｌａｍ）塩酸塩、コレスチポール、コレスチラミン、及び架橋デキストランのジアルキルアミノアルキル誘導体）、アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ阻害薬（例えば、アバシミベ）；アスピリン、非ステロイド系抗炎症薬またはＮＳＡＩＤ、グルココルチコイド、及び選択的シクロオキシゲナーゼ−２またはＣＯＸ−２阻害薬などの、炎症性状態における使用が意図される薬剤；グルコキナーゼ活性化物質（ＧＫＡ）（例えば、ＡＺＤ６３７０）；���１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ１型の阻害薬（例えば、米国特許第６，７３０，６９０号において開示されているもの及びＬＹ−２５２３１９９など）；ＣＥＴＰ阻害薬（例えば、アナセトラピブ、エバセトラピブ、及びトルセトラピブ）；フルクトース１，６−ビスホスファターゼの阻害薬（例えば、米国特許第６，０５４，５８７号；同第６，１１０，９０３号；同第６，２８４，７４８号；同第６，３９９，７８２号；及び同第６，４８９，４７６号において開示されているものなど）；アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ−１または２（ＡＣＣ１またはＡＣＣ２）の阻害薬；ＰＣＳＫ９阻害薬；ＧＰＲ−４０部分アゴニスト；ＳＣＤ調節物質；脂肪酸シンターゼの阻害薬；アミリン及びアミリン類似体（例えば、プラムリンチド）が、化学的に考えられ得る上記活性薬剤の薬学的に許容される塩形態を含めて含まれる。
【０２６２】
さらに、本開示は、代謝を刺激する、または食欲を減少させる薬剤などの、体重減少を促進するための薬剤及び方法、ならびに体重減少を促進するための食事の変更及び／または運動レジメンとの併用療法を企図する。
【０２６３】
本開示の複合体は、その状況下に適した任意の手法で、１つまたは複数の他の薬剤と併用してよい。一実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤及び少なくとも１つの本開示の複合体での処置を、一定時間にわたって維持する。別の実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤での処置を削減または中断する（例えば、対象が安定している場合）一方で、本開示の複合体での処置を一定の投薬レジメンで維持する。さらなる一実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤での処置を削減または中断する（例えば、対象が安定している場合）一方で、本開示の複合体（複数可）での処置を削減する（例えば、低用量、投薬頻度の減少、または処置レジメンの短縮）。また別の実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤での処置を削減または中断し（例えば、対象が安定している場合）、本開示の複合体での処置を増大させる（例えば、高用量、投薬頻度の増大、または処置レジメンの延長）。また別の実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤での処置を維持し、本開示の複合体での処置を削減または中断する（例えば、低用量、投薬頻度の減少、または処置レジメンの短縮）。また別の実施形態では、少なくとも１つの活性薬剤での処置及び本開示の複合体（複数可）での処置を削減または中断する（例えば、低用量、投薬頻度の減少、または処置レジメンの短縮）。
【０２６４】
投薬
本開示の複合体を、例えば、投与の目標（例えば、所望される解消程度）；処置される対象の年齢、体重、性別、ならびに健康及び身体状態；当該ポリペプチドの性質、及び／または投与される製剤；投与経路；ならびに疾患、障害、状態、またはその症状の性質（例えば、グルコース／インスリンの調節不全の重症度、及び障害の段階）に依存する量で、対象に投与してよい。当該投薬レジメンは、投与される薬剤に関連する任意の有害作用の存在、性質、及び程度も考慮に入れてよい。有効な投薬量及び投薬レジメンは、例えば、安全性及び用量漸増試験、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究（例えば、動物モデル）、及び当業者に公知の他の方法から容易に決定することができる。
【０２６５】
一般的に、投薬パラメータは、その投薬量が、対象に対して不可逆的に有害であり得る量未満（すなわち最大許容量、「ＭＴＤ」）であり、対象に対して測定可能な作用を生成するために必要とされる量以上であることを必要とする。そのような量は、投与経路及び他の要因を考慮に入れて、例えば、吸収、分布、代謝、及び排出に関連する（「ＡＤＭＥ」）薬物動態及び薬力学的パラメータによって決定される。
【０２６６】
有効量（ＥＤ）は、それを服用する対象の一部の割合において、治療反応または所望の作用を生成する薬剤の用量または量である。薬剤の「半有効量」またはＥＤ５０は、それを投与される個体群の５０％において、治療反応または所望の作用を生成する薬剤の用量または量である。ＥＤ５０は通常、薬剤の作用の妥当な予測の尺度として使用されるが、これは、すべての関連要因を考慮に入れると、必ずしも、臨床医が適切であると判断し得る用量ではない。したがって、一部の状況では、有効量は計算されたＥＤ５０超であり、他の状況では、有効量は計算されたＥＤ５０未満であり、またさらに他の状況では、有効量は計算されたＥＤ５０と同じである。
【０２６７】
加えて、本開示の複合体（複数可）の有効量は、対象に１つまたは複数の用量で投与した場合に、健康な対象に対して所望の結果を生成する量であり得る。例えば、有効用量は、高血漿中グルコース及び／または血漿中インスリンを有する対象に投与されたときに、健康な対象のそれらに対して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または８０％超の所望の減少を達成する量であり得る。
【０２６８】
適切な投薬レベルは一般的に、１日当り約０．００１〜１００ｍｇ／患者体重１ｋｇであり、これを単回または複数回の用量で投与することができる。一部の実施形態では、投薬レベルは、１日当り約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇであり、他の実施形態では、１日当り約０．０５〜約１０ｍｇ／ｋｇである。適切な投薬レベルは、１日当り約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ、１日当り約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ、または１日当り約０．１〜５ｍｇ／ｋｇであり得る。この範囲内で、投薬量は、１日当り０．００５〜０．０５、０．０５〜０．５、または０．５〜５．０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０２６９】
経口剤の投与では、当該組成物を、活性成分１．０〜１０００ミリグラム、特に、活性成分１．０、３．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０、及び１０００．０ミリグラムを含有する錠剤、カプセル剤などの形態で提供することができる。当該複合体を、例えば、１日１〜４回、多くの場合には、１日１回または２回のレジメンで投与してよい。
【０２７０】
本開示の複合体（複数可）の投薬を、当該複合体の薬物動態（例えば、半減期）及び薬力学的応答（例えば、当該複合体の治療効果の持続時間）に応じて、１日１回〜毎月１回の範囲であってよい、適切な頻度で繰り返してよい。一部の実施形態では、投薬を１週間に１回、２週毎に１回、毎月１回の間で頻繁に繰り返す。他の実施形態では、複合体を、ほぼ１ヶ月に１回投与してよい。
【０２７１】
ある種の実施形態では、開示している複合体の投薬量は、「単位剤形」に含有される。「単位剤形」という語句は、物理的に分離した単位を指し、各単位は、単独か、または１つもしくは複数の追加の薬剤との併用のいずれかで、所望の作用を生成するために十分な所定量の本開示の複合体を含有する。単位剤形のパラメータは、特定の薬剤及び達成される作用に左右されることは分かるであろう。
【０２７２】
キット
本開示は、本開示の複合体（複数可）、及びその医薬組成物を含むキットも企図する。当該キットは一般的に、以下に記載するとおりの様々な成分を収容する物理的構造の形態であり、例えば、上述の方法の実行（例えば、体重減少を必要とする対象への複合体の投与）において利用され得る。
【０２７３】
キットは、対象への投与に適した医薬組成物の形態であってよい、本明細書において開示する複合体（複数可）の１つまたは複数を含むことができる（例えば、減菌容器内で提供される）。当該複合体（複数可）は、すぐに使用できる形態で、または例えば、投与前に再構成または希釈を必要とする形態で提供され得る。複合体（複数可）がユーザによって再構成される必要がある形態である場合、当該キットは、当該複合体（複数可）と共に、または別個にパッケージングされた緩衝液、薬学的に許容される添加剤なども含んでもよい。併用療法を企図する場合、当該キットは別個にいくつかの薬剤を含有してよいか、またはそれらは当該キットに既に組み合わされていてよい。当該キットの各成分を個々の容器内に封入することができ、様々な容器のすべては、単一のパッケージ内にあり得る。本開示のキットを、その中に収容された成分を適切に保持するために必要な状態（例えば、冷却または凍結）のために設計することができる。
【０２７４】
キットは、その中の成分についての情報及びそれらの使用説明書（例えば、作用機序、薬物動態及び薬力学、有害作用、禁忌などを含む、活性成分（複数可）の投薬パラメータ、臨床薬理）を特定することを含むラベルまたは添付文書を含んでよい。ラベルまたは文書は、ロット番号及び有効期限などの製造情報を含むことができる。当該ラベルまたは添付文書は、例えば、成分を収容する物理的構造に統合されるか、物理的構造内に別個に収容されるか、またはキットの成分（例えば、アンプル、チューブ、またはバイアル）に添付されてよい。例示的な説明書には、開示の調節物質、及びその医薬組成物での血糖の減少または低下、高血糖の処置、糖尿病の処置などのための説明書が含まれる。
【０２７５】
加えて、ラベルまたは文書には、ディスク（例えば、ハードディスク、カード、メモリディスク）、光学ディスク（ＣＤ−もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ／ＲＡＭなど）、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、または電気記憶媒体（ＲＡＭ及びＲＯＭなど）、またはこれらのハイブリッド（磁気／光学記憶媒体、ＦＬＡＳＨメディア、もしくはメモリ型カードなど）などのコンピュータ可読媒体が含まれるか、それに組み込むことができる。一部の実施形態では、実際の説明書は、当該キットに存在しないが、例えば、インターネットを介して遠隔源から説明書を得るための手段が提供される。
【実施例】
【０２７６】
実験
次の実施例は、当業者に、本発明をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するように提示され、本発明者らが自身の発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、以下の実験が全てまたは唯一の実行される実験であると示すようにも意図されていない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して確度を確保する努力が成されているが、多少の実験誤差及び偏差が計上されるはずである。
【０２７７】
別段に示さない限り、部は、質量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度（℃）であり、圧力は、大気圧であるか、またはそれに近い。次を含む標準的な略語を使用する：ｂｐ＝塩基対（複数可）；ｋｂ＝キロベース（複数可）；ｐｌ＝ピコリットル（複数可）；ｓまたはｓｅｃ＝秒（複数可）；ｍｉｎ＝分（複数可）；ｈまたはｈｒ＝時間（複数可）；ａａ＝アミノ酸（複数可）；ｋｂ＝キロベース（複数可）；ｎｔ＝ヌクレオチド（複数可）；ｎｇ＝ナノグラム；μｇ＝マイクログラム；ｍｇ＝ミリグラム；ｇ＝グラム；ｋｇ＝キログラム；ｄｌまたはｄＬ＝デシリットル；μｌまたはμＬ＝マイクロリットル；ｍｌまたはｍＬ＝ミリリットル；ｌまたはＬ＝リットル；μＭ＝マイクロモル；ｍＭ＝ミリモル；Ｍ＝モル；ｋＤａ＝キロダルトン；ｉ．ｍ．＝筋肉内（に）；ｉ．ｐ．＝腹腔内（に）；ｓ．ｃ．＝皮下（に）；ｂｉｄ＝１日２回；ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー；ＢＷ＝体重；Ｕ＝単位；ｎｓ＝統計的に有意ではない；ＰＧ＝空腹時血漿中グルコース；ＦＰＩ＝空腹時血漿中インスリン；ＩＴＴ＝インスリン耐性試験；ＰＴＴ＝ピルビン酸耐性試験；ｏＧＴＴ＝経口ブドウ糖負荷試験；ＧＳＩＳ＝グルコース刺激されたインスリン分泌；ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水；ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応；ＮＨＳ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；ＤＭＥＭ＝ダルベッコ変法イーグル培地；ＧＣ＝ゲノムコピー；ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸。
【０２７８】
材料及び方法
次の方法及び材料を以下の実施例において使用した。
【０２７９】
動物。食餌誘発性肥満の（ＤＩＯ）雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、脂肪６０ｋｃａｌ％、タンパク質２０ｋｃａｌ％、及び炭水化物２０ｋｃａｌ％を含有する高脂肪食（Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）で１２〜２０週間にわたって飼育した。すべての動物研究は、ＮＧＭ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。ＤＩＯ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、その肥満がカロリーの過剰摂取に基づく、肥満のヒト様モデルを示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは肥満しやすく、顕著な体重増加、さらには、インスリン過剰血症及び時折、高血糖症が観察される。その系統は、食事性肥満をモデリングするために最も一般的に使用されるマウス系である。（Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ  （２０１２）  ３３：  １７３−１８１）。
【０２８０】
核酸及びアミノ酸配列。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０００５２９．２は、ヒトＧＤＦ１５変異体をコードするＯＲＦのｃＤＮＡを示し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４８５５．２は、ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を示す。Ｆｃ−融合パートナーのｃＤＮＡをＩｎｖｉｖｏＧｅｎで購入し（ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ６２３４２７．１、タンパク質ＩＤ＝ＡＡＴ４９０５０）、示されているとおりに修飾した。ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクターによってコードされるＦｃ−融合パートナーのアミノ酸配列は：
0006722175.tif 000025
（配列番号：５５）
である。
【０２８１】
発現コンストラクトの構築。哺乳類発現ベクターｐＴＴ５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａ）を、ＰｍｅＩとＥｃｏＲＩ部位との間にＫｏｚａｋ要素及びヒトＩｇＫ−シグナルペプチド配列：
0006722175.tif 000026
（配列番号：５６）を挿入することによって修飾した。両方の制限部位を除去する一方で、分泌される因子のさらなるインフレームクローニングのために、ＡｇｅＩ部位を作製した。単一断片挿入（例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分）のために、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用した。２つ以上のＰＣＲ生成断片（すなわち、ｈＩｇＧ１−Ｆｃ＋ＧＤＦ１５）を挿入するために、本発明者らは、製造プロトコルに従ってＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用した。すべてのＰＣＲ断片を、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＰＣＲミックスによって増幅し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用してゲル精製した。ＴＯＰ１０  Ｅｌｅｃｔｒｏコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をクローニング反応で形質転換し、カルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレート上に播種し、終夜３７℃でインキュベートした。単一コロニーを取り出し、配列決定によって分析した。陽性コロニーからのＤＮＡを増幅し（ＤＮＡ−Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ、Ｑｉａｇｅｎ）、全配列を確認し、組換えタンパク質発現のために哺乳類細胞に遺伝子導入するために使用した。
【０２８２】
特異的変異タンパク質を作製するために、製造プロトコルに従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＬｉｇｈｔｎｉｎｇまたはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ）のいずれか、及び適切なプライマーを用いて、部位特異的変異誘発を行った。
【０２８３】
（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５融合分子、野生型ＧＤＦ１５、及びＧＤＦ１５−糖変異タンパク質の発現。すべての分子を、一過性遺伝子導入されたｉｎ  Ｅｘｐｉ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から回収した。細胞を、Ｅｘｐｉ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で定期的に継代し、様々なサイズの振盪フラスコ内で懸濁培養として維持した。典型的には、細胞を５ｅ５生細胞／ｍｌの細胞密度で継代し、３日間にわたって増殖させた後に継代した。そのフラスコを、１１０ＲＰＭの撹拌速度でＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋシェーカープラットフォーム（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）上で、加湿ＣＯ２インキュベーター（３７℃及び５％ＣＯ２）内に維持した。
【０２８４】
培養物の細胞密度が９５％超の生存率で２．５ｅ６生細胞／ｍＬに達したときに、遺伝子導入を行った。典型的には、遺伝子導入５０ｍＬで、２．５ｅ６細胞／ｍＬ×５０ｍＬの細胞を、培養物体積４２．５ｍＬで２５０ｍＬ振とうフラスコに接種した。問題の遺伝子を含有する発現ベクターから成るプラスミドＤＮＡ５０マイクログラム（５０μｇ）を最初に、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．５ｍＬ中で希釈した。同時に、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．６７倍体積（プラスミドＤＮＡの量に対して）も、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ低血清培地２．５ｍＬ中で希釈した。室温での５分間にわたるインキュベーションの後に、希釈した遺伝子導入試薬を、希釈したプラスミドＤＮＡにゆっくりと添加して、遺伝子導入コンピテント複合体を形成した。さらに２０分間にわたる室温でのインキュベーション期間の後に、遺伝子導入複合体５ｍＬを、細胞培養物４２．５ｍＬに添加した。次いで、遺伝子導入された細胞を、１１０ＲＰＭで維持されるオービタルシェーカー上の加湿ＣＯ２インキュベーターに配置した。遺伝子導入から２４時間後に、遺伝子導入された培養物に、エンハンサー１溶液２５０μＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びエンハンサー２溶液２．５ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を供給した。次いで、培養物を、オービタルシェーカー上の加湿ＣＯ２インキュベーターに再配置した。遺伝子導入から６〜７日後に、３０００ＲＰＭで３０分間にわたって遠心分離し、その後、０．２μｍフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過することによって、培養物を採取した。次いで、サンプルを、発現に関してクマシー（ｃｏｍｍａｓｓｉｅ）染色ゲル上で分析した。
【０２８５】
組換えタンパク質の精製。馴化培地（ＣＭ）中で発現された（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５分子を、精製後に回収量及び活性について評価した。ＣＭを、２０ｍｇ／樹脂ｍＬ以下の装填容量でｍＡｂ  ＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅカラム（ＧＥ）に通した。回収量の評価では、ＣＭ体積は、５０ｍＬ〜１０００ｍＬの範囲であった。ＣＭのｍＡｂ  ＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ装填の後に、カラムを１倍ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ）５〜１０カラム体積で洗浄し、低ｐＨグリシン緩衝液（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ）でのステップ溶離を続けた。溶離の後に、（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５貯留物を、１ＭトリスｐＨ８．０（Ｔｅｋｎｏｖａ）でｐＨ中和し、次いで、１倍ＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で予め平衡化させておいたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）カラム上に注入した。（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５インタクトな完全にアセンブルされた分子の画分を貯留し、純度について評価し、適切な吸光係数及び分子量を使用してＡ２８０方法によって定量して、出発ＣＭ体積に基づき回収量を決定した。完全にアセンブルされた分子は、２個のヘテロ二量体の二量体−二量体複合体であった。各ヘテロ二量体は、ノブ−イン−ホール相互作用を介してＦｃ−ＧＤＦ１５糖変異タンパク質と会合したＦｃを有し、２個のヘテロ二量体は、ＧＤＦ１５−ＧＤＦ１５相互作用を介して会合した。
【０２８６】
ＷＴ  ＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５糖変異タンパク質の精製。イオン交換捕捉を使用して、Ｆｃにコンジュゲートされていない野生型ＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５糖変異タンパク質を培養培地から精製した。宿主細胞タンパク質不純物からの最適な溶離及び分離に適した塩／ｐＨ導電性（ｃｏｎｄｕｃｉｖｅ）の勾配を使用して、ＷＴ  ＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５糖変異タンパク質を溶離した。次いで、ＧＥ  ＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰを使用し、ｐＨ８．０で硫酸アンモニウムの漸減直線勾配を使用して、すべてのＧＤＦ１５分子をさらに精製した。画分を評価し、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのゲルシフトによって、純度及びグリコシル化特性に基づき貯留した。（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５分子と同様に、ＩｇＫシグナルペプチドを使用して、野生型ＧＤＦ１５及びＧＤＦ１５糖変異タンパク質を発現させた。
【０２８７】
実施例１：ヘテロ二量体ノブ−イン−ホール（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５融合分子の設計
Ｆｃ−ＧＤＦ１５設計は、図１において記載されており、一次配列は、下記に示されている（コンストラクトＢ１ａ／ｂ〜Ｂ１９ａ／ｂ）。Ｆｃ−ＧＤＦ１５分子の生成アセンブリを達成するために、効率的なシステムを設計して、ＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５二量化を可能にしつつ、Ｆｃ／Ｆｃ二量化を可能にした。単鎖Ｆｃ−ＧＤＦ１５のミスフォールディング及び凝集の可能性を回避するために、ヘテロ二量体融合パートナーをＦｃ／Ｆｃ相互作用のために設計して、高忠実度のＧＤＦ１５／ＧＤＦ１５ホモ二量化を可能にした。ノブ−イン−ホールＦｃ／Ｆｃヘテロ二量体を、ＧＤＦ１５アセンブリ及びＥｘｐｉ２９３Ｆ一過性系からの分泌に対処するように設計した。（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（ｎ＝２、３、４、または５）及びＧＤＦ１５とカップリングさせた［Ｔ３６６Ｙ（ノブ）／／Ｙ４０７Ｔ（ホール）］または［Ｔ３６６Ｗ（ノブ）／／Ｔ３６６Ｓ−Ｌ３６８Ａ−Ｙ４０７Ｖ（ホール）］システムを使用して、Ｆｃ／Ｆｃヘテロ二量体ノブ−イン−ホールシステムを評価した。ＦｃのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸位のナンバリングは、ＥＵナンバリングシステムに基づくことに留意する（Ｅｄｅｌｍａｎ，  Ｇ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  ＵＳＡ，  ６３，  ７８−８５  （１９６９））。すべてのケースにおいて、Ｆｃ−融合（ノブ／ホール）パートナーを、アミノ酸残基Ａ１〜Ｉ１１２、Ｒ２〜Ｉ１１２、Ｎ３〜Ｉ１１２、Ｇ４〜Ｉ１１２、Ｄ５〜Ｉ１１２、Ｈ６〜Ｉ１１２、またはＣ７〜Ｉ１１２を含む成熟ＧＤＦ１５のＮ末端にカップリングさせた。Ｎ末端での配列（ＡＲＮＧＤＨ、配列番号：９５）が、タンパク質分解感受性の部位として予め実証されていて、Ｎ末端短縮化が、これらのＮ末端短縮化を含まないＧＤＦ１５よりも優れた安定性をもたらすので、ＧＤＦ１５のＮ末端短縮化（Δ１＝Ｒ２〜Ｉ１１２、Δ２＝Ｎ３〜Ｉ１１２、Δ３＝Ｇ４〜Ｉ１１２、Δ４＝Ｄ５〜Ｉ１１２、Δ５＝Ｈ６〜Ｉ１１２、またはΔ６＝Ｃ７〜Ｉ１１２）を安定性の増強のために導入した。
【０２８８】
図１Ａ〜１Ｄは、２つの分子間ジスルフィド結合を含有する野生型ＩｇＧヒンジとカップリングしているか、ヒンジドメインを伴わない（Δヒンジ）かのいずれかで、Ｆｃ−ＧＤＦ１５上のノブ対ホール（鎖Ａ）が、ヘテロ二量体Ｆｃパートナー上の対応するホール対ノブ（鎖Ｂ）とカップリングした配置を示している。当該Ｆｃヘテロ二量体ノブまたはホールＡ／Ｂ鎖では、ＡＡ変異
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をＩｇＧ１エフェクター機能性の除去のために導入した。（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５ヘテロ二量体ノブ−イン−ホール設計をアセンブリについて発現プロファイルし、図２Ａにおいて報告する。すべてのケースで、ノブ−イン−ホール（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５の一過性発現は、精製の後に、正確にアセンブリされた生成物０ｍｇ／Ｌ〜７４．９ｍｇ／Ｌの回収量をもたらした（０＝凝集物／発現なし、＜２５ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ〜４９．９ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ〜７４．９ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ〜９９．０ｍｇ／Ｌ、＞１００ｍｇ／Ｌ）。すべての場合に、ノブ−イン−ホールヘテロ二量体Ｆｃ／Ｆｃ−ＧＤＦ１５分子のアセンブリ及び分泌は、Ｆｃ（ホール）：Ｆｃ（ホール）、Ｆｃ（ノブ）：Ｆｃ（ノブ）、Ｆｃ（ノブ）−ＧＤＦ１５：Ｆｃ（ノブ）−ＧＤＦ１５及びＦｃ（ホール）−ＧＤＦ１５：Ｆｃ（ホール）−ＧＤＦ１５などのミスフォールディングされたホモ二量体種の様々な混入レベルを伴った。発現プロファイリングに基づき、ヘテロ二量体Ｆｃパートナー鎖上のＴ３６６Ｓ−Ｌ３６８Ａ−Ｙ４０７Ｖ（ホール）とカップリングされた、Ｆｃ−ＧＤＦ１５鎖上に配置されたＴ３６６Ｗ（ノブ）（図１Ｄ）は、Ｆｃ／Ｆｃ−ホモ二量体生成物の最大安定性及び最小化ミスペアリングで、生成物を生成することが見出された（図２Ａ、変異体Ｂ５ａ／Ｂ５ｂ）。この設計が、さらなる発現操作及び最適化の焦点となった。
【０２８９】
一過性に発現されたＥｘｐｉ  ２９３Ｆ源からの変異体Ｂ５ａ／Ｂ５ｂの回収量は、０．０ｍｇ／Ｌ〜２４．９ｍｇ／Ｌの範囲の回収量を示した。発現、アセンブリ、及び回収量を増強するために、Ｎ−グリコシル化部位をＧＤＦ１５の成熟配列内に導入した（図１Ｆ）。設計されたコンストラクトにおいて、ＧＤＦ１５上の単一Ｎ連結グリカンコンセンサス部位の存在は、完全成熟（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５ノブ−イン−ホールヘテロ二量体Ｂ５ａ／Ｂ５ｂの発現、アセンブリ、及び回収量を著しく改善した（図２Ａ、変異体Ｂ９ａ／Ｂ９ｂ〜Ｂ１９ａ／Ｂ１９ｂ）。リンカー長は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを介して受容体結合及び活性について、（Ｇ４Ｓ）ｎでｎ＝５の場合に最適であることが見出された。Ｄ５Ｔ位上のグリカンの存在は、成熟ＧＤＦ１５のＮ３位上の一次脱アミド部位を完全に除去し、実施例２において証明されるとおり、分子の安定性をさらに増強すると考えられる。
【０２９０】
ＧＤＦ１５の配列内のＮ連結グリカンの存在は、発現を助け、分泌プロセス中の小胞体及びゴルジ体内での滞留時間の増大による蓄積から、ミスフォールディングされた生成物を最小化すると示される。この追加の滞留時間は、フォールディング反応速度に対して有益効果を有すると提案され、著しく改善されたヘテロ−二量体（Ｆｃ／Ｆｃ）ノブ−イン−ホールペアリング及び哺乳類組織培養からの回収量を可能にする。
【０２９１】
変異体（Ｂ１ａ／ｂ−Ｂ１９ａ／ｂ）の配列を下記に示す。下記に示す配列において、ヒトＩｇＫシグナルペプチドに、下記のケースでは、Ｆｃ配列が続く。リンカー及びＧＤＦ１５配列も含む配列では、Ｆｃ配列に、リンカー配列（下線）が続き、それに、ＧＤＦ１５配列（太字）が続く。当該Ｆｃ配列におけるアミノ酸置換の位置のナンバリングは、ＥＵナンバリングに基づき、その置換は、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号：２）において対応する位置に存在するアミノ酸を参照している。ＧＤＦ１５配列におけるＮ末端欠失及びアミノ酸置換（複数可）のナンバリングは、野生型ヒト成熟ＧＤＦ１５（配列番号：１）を参照している。
【０２９２】
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【０２９３】
図２Ｂに列挙した野生型ヒト成熟ＧＤＦ１５（配列番号：１）及びＧＤＦ１５糖変異タンパク質の配列は次のとおりである：
【０２９４】
ＩｇＫ−野生型ヒト成熟ＧＤＦ１５
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【０２９５】
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【０２９６】
２９３細胞によって発現されるシグナルペプチダーゼによって、分泌されたポリペプチドから切断されるＩｇＫシグナルペプチドを使用して、ＧＤＦ１５分子を発現させた。野生型ヒト成熟ＧＤＦ１５（配列番号：１）及びＧＤＦ１５糖変異タンパク質の回収量を図２Ｂにおいて列挙する。
【０２９７】
Ｆｃ−Ｆｃ（ノブ／ホール）ＧＤＦ１５糖変異タンパク質として発現され得る例示的なＧＤＦ１５糖変異タンパク質は、２０１５年７月２８日出願の米国特許出願第１４／８１１，５７８号において記載されている。
【０２９８】
実施例２：ＤＩＯマウスモデルにおける体重及び食物摂取に対する、（Ｆｃ／Ｆｃ）−ＧＤＦ１５融合分子の効果
体重に対する、組換えヒトＧＤＦ１５に融合した組換えＦｃ−ヘテロ二量体（すなわち、各ヘテロ二量体がＦｃ−ＧＤＦ１５糖変異タンパク質ポリペプチドと二量化したＦｃポリペプチドを有する２個のヘテロ二量体の複合体）を有する皮下投与された融合分子の効果を３５日間にわたって評価した。簡単には、当該融合分子Ｂ９ａ／Ｂ９ｂ、Ｂ１１ａ／Ｂ１１ｂ、及びＢ１３ａ／Ｂ１３ｂを、０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び４ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で、単一皮下大量注射（１０ｍＬ／ｋｇ）として、体重約３５〜４０ｇのＤＩＯマウスに毎週１回、２１日間にわたって投与した。ビヒクル対照または融合分子の投与後に、２１日間のタンパク質投薬、続く、１４日間のウォッシュアウト（投与後）からなる３５日間にわたる様々な時点で体重減少をモニターして、有効性をモニターした。
【０２９９】
図３〜６において図示されているとおり、０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ及び４ｎｍｏｌ／ｋｇの用量での当該Ｆｃ融合分子（ヘテロ二量体−ヘテロ二量体複合体）の投与は、有意な体重減少をもたらした。マウスの各群において、各規定の時点で、ビヒクル対照群と比較する独立ステューデントｔ検定によって、ｎ＝６及びｐ値（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１、ｎｓ＝非有意）を決定した。図７において図示されているとおり、合計体重がＳＥＭ分析と共に、全群について各サンプリング時点で示されている。図８において示されているとおり、体重（ｇ）の変化がＳＥＭ分析及びｐ値と共に、全群について各サンプリング時点で示されている。図９において示されているとおり、体重（％）のパーセント変化がＳＥＭ分析及びｐ値と共に、全群について各サンプリング時点で示されている。
【０３００】
図３及び５において図示されているとおり、０．４ｎｍｏｌ／ｋｇ用量試験において、Ｂ９ａ／Ｂ９ｂ及びＢ１１ａ／Ｂ１１ｂと比較した場合に、Ｂ１３ａ／Ｂ１３ｂで体重減少における有効性の増大が観察される。Ｂ１３ａ／Ｂ１３ｂでｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の増大は、ＧＤＦ１５の２個のＮ末端残基の短縮化（ΔＡＲ）による安定性の増強に帰せられる。
【０３０１】
本発明を実施するために発明者らに公知の最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態が本明細書において記載されている。前述の記載を読むことで、開示している実施形態の変形形態は当業者に明らかとなり得、当業者であれば、そのような変形形態を適切に使用することができることが期待される。したがって、本発明が本明細書に特別に記載したものとは別段に実践され、かつ本発明が、適用法令に認められる限り、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載の対象の全ての変更形態及び等価物を含むことが意図されている。さらに、それらの全ての考えられ得る変形形態での上記の要素のいずれの組み合わせも、本明細書において別段に示さない限り、または文脈によって別段に明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【０３０２】
本明細書において引用した全ての刊行物、特許出願、アクセッション番号、及び他の参照文献は、各個別の刊行物または特許出願が、具体的かつ個別に参照によって組み込まれることが示されている場合と同様に、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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