(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
立体試料（１６）の顕微鏡結像のための方法であって、
顕微鏡対物レンズ（１２）の焦点を、補正手段（１８）を用いて、少なくとも二つの基準面に順次合わせ、前記基準面は、前記立体試料（１６）内で前記顕微鏡対物レンズ（１２）の光軸（Ｏ）に沿って異なる立体試料深度に存在しており、
各基準面に対して、前記補正手段（１８）の基準設定位置を求め、前記基準設定位置のもとでは前記立体試料深度に依存する収差が、前記補正手段（１８）によって前記光軸（Ｏ）に沿って補正され、
前記求められた基準設定位置に基づいて、前記立体試料（１６）内の少なくとも一つの目標面に対して、前記補正手段（１８）のための目標設定位置を決定し、前記目標設定位置においては前記目標面の立体試料深度内で出現する収差が前記補正手段（１８）によって前記光軸（Ｏ）に沿って補正され、
前記立体試料（１６）の結像のために、前記顕微鏡対物レンズ（１２）の焦点を、前記目標面に合わせ、前記補正手段（１８）を、前記目標設定位置にもたらすようにし、
前記各基準面に対して、前記補正手段（１８）によって前記各基準設定位置において引き起こされた、前記顕微鏡対物レンズ（１２）の目標焦点距離に対する物体焦点距離の偏差を、基準焦点距離偏差として求め、
前記基準焦点距離偏差に基づき、前記目標面に対して、目標焦点距離偏差を決定し、前記目標焦点距離偏差は、前記補正手段（１８）により前記目標設定位置において引き起こされた、前記目標焦点距離に対する前記物体焦点距離の偏差を提示するものであり、
前記顕微鏡対物レンズ（１２）の焦点を、前記目標焦点距離偏差に基づいて前記目標面へ合わせる、
方法。
【請求項２】
前記基準焦点距離偏差に基づいて、焦点距離規定を求め、前記焦点距離規定は、前記物体焦点距離の偏差を前記補正手段（１８）の設定位置に依存して提示するものであり、前記目標焦点距離偏差を、前記焦点距離規定を用いて、または、補間により決定する、
請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記補正手段（１８）の複数の前記基準設定位置に基づいて、補正規定を求め、前記補正規定は、前記収差の補正のために設けられた前記補正手段（１８）の設定位置を、前記立体試料深度に依存して提示するものであり、前記補正手段（１８）の前記目標設定位置を、前記補正規定を用いて、または、補間により決定する、
請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記各基準面に対して、前記補正手段（１８）によって前記各基準設定位置において引き起こされた、前記顕微鏡対物レンズ（１２）の目標倍率に対する倍率の偏差を、基準倍率偏差として求め、
前記基準倍率偏差に基づき、前記目標面に対して、目標倍率偏差を決定し、前記目標倍率偏差は、前記補正手段（１８）により前記目標設定位置において引き起こされた、前記目標倍率に対する前記倍率の偏差を提示するものであり、
可変の倍率要素が、前記目標倍率偏差に基づいて調整される、
請求項１から３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記各基準面に対して、少なくとも一つの基準制御パラメータまたは照明光出力が確定され、前記基準制御パラメータまたは前記照明光出力に基づいて、前記目標面に対して、目標制御パラメータが決定および設定される、
請求項１から４いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
少なくとも二つの基準面が、前記光軸（Ｏ）に沿って等距離の複数の平面を含んでいる、
請求項１から５いずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記顕微鏡対物レンズ（１２）は、焦点合わせのために、前記立体試料（１６）に対して相対的に前記光軸（Ｏ）に沿って移動する、
請求項１から６いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記光軸（Ｏ）に沿って結像すべき立体試料領域が、最小の立体試料深度に存在する基準面と、最大の立体試料深度に存在する基準面と、によって制限される、
請求項１から７いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、立体試料の顕微鏡結像のための方法並びに顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡において、三次元方向に拡がるボリュームのある試料（以下立体試料とも称する）の高品質な三次元結像は主要な課題である。その際に取り組むべき問題の１つは収差の形成にあり、これは試料中の光の経路によって引き起こされる。ここでは特にいわゆる球面収差に気をつける必要があり、これは立体試料の屈折率と、試料を取り巻く媒体の屈折率とが異なることによって生じる。そのような屈折率の不整合によって引き起こされる球面収差は、試料内の光の経路が長ければ長いほど大きくなる。そのため、立体試料内の深いところにある物体面を正確に結像することは特に困難である。顕微鏡の対物レンズの光軸に沿って、すなわち試料の深度方向において、試料の屈折率が変化するならば、試料の高品質な３次元結像を達成することはさらに困難となる。
【０００３】
前述の収差を回避するために、大抵は、球面収差を補正する調整が可能な補正手段を備えた液浸対物レンズが用いられる。そのような、従来技術からも公知の補正手段は、例えば電動調整可能なレンズマウントを有しており、このレンズマウントは、顕微鏡対物レンズに含まれるレンズユニットを、収差の補正のために光軸に沿って変位させる。この種の補正調整に対する一例は、独国特許出願公開第１０２０１１０５１６７７号公報に開示されている。
【０００４】
屈折率不整合によって引き起こされる球面収差を、軸方向の広い範囲において補正すべき場合には、所期の屈折力を備えた補正手段を設けることが必要である。それにより、補正調整の際に、物体焦点距離の不所望な変化が、すなわち光軸に沿って結像される物体面の変位が起きる可能性がある。そのような物体焦点距離の変化は、ひいては撮像された立体画像の許容できない歪みにつながる。
【０００５】
従来技術に対してはさらに、顕微鏡パラメータの、例えば多光子顕微鏡におけるレーザ出力の深度に依存した設定を行う構想が参照される。しかしながらこれらのパラメータは、顕微鏡対物レンズのその結像性能やその焦点距離設定に関する補正には影響を与えない。従って現在の従来技術では、特に、試料深度を超えて不均一な屈折率を有している試料の軸方向に広大に拡がる、高品質な顕微鏡立体撮像を許容するものは存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、立体試料を光軸に沿って広い範囲でエラーなく結像させることを可能にする方法および顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、独立請求項に記載された態様によって前記課題を解決する。好ましい改善形態は各従属項に記載されている。
【０００８】
本発明に係る方法では、顕微鏡対物レンズの焦点が、補正手段を用いて、基準面として用いられる少なくとも二つの物体面に順次合わせられ、それらは、立体試料内で顕微鏡対物レンズの光軸に沿って異なるサンプル深度に存在している。各基準面に対しては、補正手段の基準設定位置が求められ、該基準設定位置のもとで試料深度に依存する収差が、補正手段によって補正される。その後で、求められた基準設定位置に基づいて、試料内の少なくとも１つの目標面に対する、補正手段のための目標設定位置が決定され、この目標設定位置においては目標面の試料深度内で出現する収差が補正手段によって補正される。最後に立体試料の結像のために、顕微鏡対物レンズの焦点が目標面に合わせられ、補正手段が目標設定位置にもたらされる。
【０００９】
顕微鏡対物レンズの焦点を、集束装置を用いて少なくとも２つの基準面に合わせることによって、いわゆる結像すべき試料領域が光軸に沿って、すなわち顕微鏡で見るべきボリュームが確定する。顕微鏡で見るべきボリュームの、好ましくは本来の画像撮影に先行する装置プロセスにおいて実施される当該確定の枠内では、試料内で異なる試料深度で存在する少なくとも２つの基準面に対して、補正手段のための基準設定位置が次のように決定される。すなわちこの基準設定位置において、試料深度に依存する収差が、それぞれ補正手段によって所望の方法で補正されるように決定される。その際補正手段の基準設定位置は、ユーザーによって手動で求められるか、それともこの目的に適した制御ユニットを用いて自動化されて求められてもよい。
【００１０】
基準面に対して求められる補正手段の基準設定位置は、引き続き少なくとも一つの、但し通常は複数の目標面に対して、補正手段のためのそれぞれ一つの目標設定位置を決定するために用いられ、それらは後で各目標面の結像の際に、当該目標面内で出現する深度に依存した収差を最良に補正するために考慮される。この場合これらの目標面は、基準面によって光軸に沿って定められる結像領域内に存在する。
【００１１】
このように個々の基準面に対して決定される基準設定位置は、顕微鏡で見るべき立体試料内の任意の各目標面において、深度に依存する収差の所望の補正を達成するために、その後の立体試料の三次元結像の際に使用することができるいわゆる基準点を形成する。この場合立体試料の三次元結像においてそれぞれ狙った目標面は、通常は、事前に顕微鏡の設定位置の枠内で定められた基準面とは一致しない。しかしながら、目標面と基準面との間のそのような一致も、本発明によれば排除されないこと、すなわちそれぞれ観察される目標面は、事前に定められた基準面の一つとの一致が許容されることにも言及しておく。
【００１２】
この方法の非常に好ましい実施形態によれば、各基準面に対して、補正手段によって各基準設定位置において引き起こされた、顕微鏡対物レンズの目標焦点距離に対する物体焦点距離の偏差が基準焦点距離偏差として求められる。その後で、個々の基準面に対して求められた基準焦点距離偏差に基づいて、目標面に対して、目標焦点距離偏差を決定し、これは、補正手段により目標設定位置において引き起こされた、目標焦点距離に対する物体焦点距離の偏差を表している。最後に顕微鏡対物レンズの焦点が、目標焦点距離偏差を考慮して目標面へ合わせられる。
【００１３】
この実施形態は、特に好ましい方法で、顕微鏡対物レンズの物体焦点距離への、すなわち顕微鏡対物レンズの焦点がまさにそこへ合わせられる物体面の軸方向位置への補正調整の作用を考慮し補正することを可能にしている。それにより、詳細には、補正手段によって引き起こされる物体面の不所望な軸方向の変位が、結像すべき目標面への顕微鏡対物レンズの焦点合わせの際に、前記求められた目標焦点距離偏差を考慮することによって補償される。この目的のためにまず、顕微鏡対物レンズの物体焦点距離への補正手段の各調整がどのように作用するのかを求めなければならない。この補正調整の作用の正確な情報は、例えば適切な検査試料を介して得られるか、それとも顕微鏡の設定の際に、補正手段の反復的な調整とそれに続く顕微鏡対物レンズの追従焦点合わせによって得られる。しかしながら好ましい実施形態によれば、物体焦点距離への補正調整の作用の情報を、顕微鏡対物レンズの光学的設計の情報から単独で得て、この情報に基づき目標焦点距離偏差を数値的に求めることも可能である。
【００１４】
補正手段によって引き起こされる物体焦点距離の変化の考慮は、使用すべき補正手段の十分に自由な選択を可能にする。それにより、使用される補正手段が、物体焦点距離の始めからのあらゆる変化を回避するために、可及的に僅かな屈折力しか有さないことは特に不要となる。比較的大きな屈折力によれば、特に軸方向に拡がる立体試料において発生するような比較的大きな屈折率不整合も補償することができるので、それによって、本発明に係る方法は、大きな立体試料の正確な３次元結像も可能である。
【００１５】
好ましくは、基準焦点距離偏差に基づいて、焦点距離規定が求められ、該焦点距離規定は、物体焦点距離の偏差を、補正手段の設定位置に依存して提示している。従ってボリューム画像撮影に使用される目標焦点距離偏差は、この焦点距離規定に基づいて決定される。前述の焦点距離規定は、例えば適切なパラメトリック関数若しくは数値テーブルの形態で記憶されていてもよく、それに基づき数学的な補間の経過において、目標焦点距離偏差が算出されてもよい。この補完は、例えば線形またはキュービック法若しくはスプライン法により実施することができる。
【００１６】
相応の方法で、本発明に係る方法の好ましい改善形態によれば、補正手段の複数の基準設定位置に基づいて補正規定が求められ、この補正規定は、収差の補正のために設けられた補正手段の設定位置を、立体試料深度に依存して提示する。その後で補正手段の目標設定位置が、当該補正規定に基づいて、特に補間によって決定可能である。
【００１７】
補正手段の設定位置に依存して物体焦点距離のみが変化するのではなく、顕微鏡対物レンズの焦点距離とその倍率もそれに伴って変化する場合には、好ましくは、各基準面に対して、補正手段によって各基準設定位置において引き起こされた、顕微鏡対物レンズの目標倍率に対する倍率の偏差が、基準倍率偏差として求められる。その後で、各基準面に対して求められた前記基準倍率偏差に基づいて、目標面に対して、目標倍率偏差が決定され、この目標倍率偏差は、補正手段によって目標設定位置において引き起こされた、目標倍率に対する倍率の偏差を提示するものである。最後に、補正手段によって引き起こされた倍率変化を補償するために、可変の倍率要素が、前記目標倍率偏差を考慮して調整される。この、補正手段によって変化した倍率若しくは物体焦点距離の補償は、好ましくは、収差の補正と、焦点距離変化の補正とに並行してリアルタイムで行われる。可変の倍率要素は、例えばバリオカメラアダプタとして、または共焦点若しくは多光子顕微鏡の走査システムの一部として実現可能である。
【００１８】
さらなる好ましい実施形態によれば、各基準面に対して少なくとも一つの基準制御パラメータが確定される。その後で、そのようにして確定された基準制御パラメータに基づいて、目標面に対して、目標制御パラメータが決定および設定される。そのような基準制御パラメータに対する一例は、例えば立体試料の結像の際に各目標面を照明する光出力である。それにより、顕微鏡で見るボリューム全体に亘って均一な画像明度が達成され得る。さらなる例は、多光子鏡検法における、試料の分散を補償するためのいわゆるプリチャープである。
【００１９】
好ましくは、少なくとも二つの基準面は、光軸に沿って等距離の複数の平面を含む。このケースでは、顕微鏡の設定の際に定められる基準面が、光軸に沿って互いに等しい距離を有しているので、基準面に対して求められる補正手段の基準設定位置が、顕微鏡で見るべきボリューム内の全ての可能な目標面において、補正手段のためのそれぞれ一つの正確な目標設定位置と、それに伴う各試料深度内で出現する収差の良好な補正とが検出され得るような信頼性の高い基礎を形成する。
【００２０】
顕微鏡対物レンズの焦点を、所望の各物体面に合わせるために、顕微鏡対物レンズは、立体試料に対して相対的に光軸に沿って移動可能である。このことは、顕微鏡対物レンズに若しくは立体試料を載せた載置台に係合する集束装置を用いて行うことができる。すなわち第一の実施形態によれば、前記集束装置は、顕微鏡対物レンズを空間内で移動させ、一方載置台は位置固定されたままである。それに対して第二の実施形態によれば、載置台は、固定的に保持された顕微鏡対物レンズのもとで空間内を移動する。またこれら２つの集束の組み合わせも考えられる。
【００２１】
本発明のさらなる態様によれば、立体試料を結像するための顕微鏡が提案され、この顕微鏡は、顕微鏡対物レンズと、補正手段と、集束装置と、制御ユニットとを含んでいる。この場合、前記制御ユニットは、顕微鏡対物レンズ、補正手段および集束装置を、上記で説明したような方法で駆動制御するように構成されている。
【００２２】
好ましくは、本発明に係る顕微鏡では、補正手段が、顕微鏡対物レンズ内に含まれるレンズユニットと、該レンズユニットを光軸に沿って移動させるための駆動ユニットとを含んでいる。
【００２３】
前記顕微鏡において、補正手段によって引き起こされる物体焦点距離の偏差が上述したような方法で考慮されるならば、レンズユニットに、立体試料内での屈折率の大きな変動も補正できるような大きな屈折力を備えさせることが可能である。
【００２４】
特に好ましい実施形態によれば、駆動ユニットは、顕微鏡対物レンズのハウジングに配置された、光軸周りで回転可能な補正リングを含み、その回転運動は、レンズユニットの光軸に沿った調整移動に置換可能である。この補正手段の構成は、例えば冒頭に述べたような独国特許出願公開第１０２０１１０５１６７７号公報に開示されている補正手段のように実現されてもよく、その開示内容は、ここにおける関連づけにより本願に組み込まれる。
【００２５】
本発明のさらなる好ましい改善形態は、図面を参照して以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】補正手段の適正な設定調整のもとで第１の基準面上へ焦点が合わせられている顕微鏡対物レンズを示した概略図
【図２】収差が補正手段によって補正されることなしで、顕微鏡対物レンズの焦点が第２の基準面上へ合わせられている、図１に対応する概略図
【図３】第２の基準面上へ設定調整された補正手段によって引き起こされる焦点距離偏差を示した図２に対応する概略図
【図４】第２の基準面に対する焦点距離補正を示す図３に対応する概略図
【図５】顕微鏡を調整するための方法ステップを示したフローチャート
【図６】図５に従って調整された顕微鏡を用いて立体試料を結像するための方法ステップを示したフローチャート
【図７】正立型顕微鏡スタンドと集束装置として調節可能な載置台とを有する本発明に係る顕微鏡の一実施形態
【図８】正立型顕微鏡スタンドと集束装置として調節可能な載置台とを有する本発明に係る顕微鏡のさらなる実施形態
【図９】倒立型顕微鏡スタンドと集束装置として調節可能な載置台とを有する、本発明に係る顕微鏡のさらなる実施形態
【図１０】倒立型顕微鏡スタンドと集束装置として調節可能な載置台とを有する、本発明に係る顕微鏡のさらなる実施形態
【発明を実施するための形態】
【００２７】
まず、図１および図４に関連して、屈折率不整合によって引き起こされる球面収差、並びに球面収差の補正によって引き起こされる対物レンズ焦点距離の変化が本発明によってどのように補正されるかを完全に基本的に説明する。この目的のために、図１乃至図４においては、本発明に係る方法の説明を容易にするために、顕微鏡構成要素および、球面収差の補正および対物レンズ焦点距離の再調整に関連している特性量が純粋に概略的に示されている。
【００２８】
図１乃至図４に示すように、全般的に符号１０の付された顕微鏡は、顕微鏡対物レンズ１２、載置台１４（この上に立体試料１６が載置される）、補正手段１８（これは本発明の実施形態では顕微鏡対物レンズ１２の一部である）、並びに制御ユニット２０を含んでいる。さらにこの顕微鏡１０は、集束装置を有しており、該集束装置を用いて立体試料１６が載置されている載置台１４は、光軸Ｏに沿って顕微鏡対物レンズ１２に対して相対的に調節可能である。集束装置は、図１乃至図４において単に二重矢印２２によって概略的に描写されている。補正手段１８と同様に、集束装置２２も、制御ユニット２０を介して制御されている。この目的のために、補正手段１８と集束装置２２は、接続線路２４若しくは２６を介して制御ユニット２０に接続されている。
【００２９】
補正手段１８は、顕微鏡対物レンズ１２内に含まれた、図１乃至図４には示されていない結像光学系の一部であるレンズユニットを有している。屈折率不整合によって引き起こされる球面収差を、以下に説明する方法で補正するために、補正手段１８は、制御ユニット２０を介して光軸Ｏに沿って移動可能である。
【００３０】
図１には、顕微鏡対物レンズ１２の焦点が、物体面２８に合わせられている状態が示されている。この図１に示されている状態においては、補正手段１８が、光軸Ｏに沿って次のように設定されるべきである。すなわち球面収差が補正手段１８によって最良に補正されるように設定されるべきである。この最良な補正設定位置は、図１中において符号ｃ１で示されている。
【００３１】
物体面２８は、第１の基準面２８を形成しており、それに対して補正手段１８の所望の設定位置ｃ１（以下では第１の基準設定位置とも称する）が求められる。
【００３２】
図１に示されている状態においては、第１の基準面２８が、試料１６内で、光軸Ｏに沿って、顕微鏡対物レンズ１２の物体焦点距離に相応する位置に存在している。基準設定位置ｃ１に依存しているこの物体焦点距離は、図１中では符号ｄ０（ｃ１）で表す。物体焦点距離ｄ０（ｃ１）は、第１の基準面２８によって形成される物体面（より正確には最も物体側に位置する光学面）から顕微鏡対物レンズ１２までの距離を示している。
【００３３】
図１においてパラメータｚ１は、立体試料１６を載せた載置台１４から顕微鏡対物レンズ１２における固定の基準点までの距離を表している。この顕微鏡対物レンズ１２における固定の基準点は、例えば図１中には示されていない対物レンズ回転台への顕微鏡対物レンズ１２の当接面によって与えられる。つまりこのパラメータｚ１は、立体試料１６と顕微鏡対物レンズ１２との間の距離を示し、それによって以下では集束距離とも称する集束装置２２の制御量を表す。従ってこの集束距離ｚ１は、物体面２８が立体試料１６内で存在している深度に対する尺度でもある。このことは、集束距離ｚ１が変化する場合には、試料深度（これに対して顕微鏡対物レンズ１２の焦点が立体試料１６内で合わせられている）も同様に変化することを意味する。
【００３４】
図２には、顕微鏡対物レンズ１２の焦点が、立体試料１６内の（この例ではより短い）集束距離ｚ２に相応する深度に合わせられている状態が示されている。従って物体面２８は、図２による状態では、上方から見て立体試料１６内のより深い深度に存在している。このより深い深度にある物体面は、第２の基準面を定めている。
【００３５】
図２に示した状態では、物体面２８から到来する立体試料１６内の光の経路長は、図１による状態のものよりも長くなるので、屈折率不整合の結果として球面収差が現れる。この球面収差は、図２中では、立体試料１６から顕微鏡対物レンズ１２の方向へ出射する光ビームにおける折り曲げによって象徴的に表されている。図２中の補正手段１８は、いまなお図１による状態に対して最適化された基準設定位置ｃ１のままであるので、図２中の球面収差はまだ未補正である。
【００３６】
図３には、補正手段１８の調整によって、図２に示した球面収差がどのように補正されるかが示されている。そのため図３では、補正手段１８に対して、設定位置ｃ１とは異なる第２の基準設定位置ｃ２が選択されており、これによって第２の基準面２８に対する球面収差が最良に補正される。しかしながら補正手段１８の、基準設定値ｃ２への移動によって、顕微鏡対物レンズ１２の物体焦点距離は、所望の目標焦点距離に対して変化している。この変化した物体焦点距離は、図３中では符号ｄ０（ｃ２）で表されている。これにより、図２中の物体面２８は、光軸Ｏに沿って次式、
Δｄ０（ｃ１，ｃ２）＝ｄ０（ｃ２）−ｄ０（ｃ１）
によって与えられる量だけ上方に変位する。
【００３７】
図４には最終的に、物体焦点距離の変化の結果としての物体面２８の望ましくない変位がどのように補償されるかが示されている。それにより集束装置２２を用いて、図３で示された集束距離ｚ２が、図４において、補正手段１８によって引き起こされた物体焦点距離の変化分、すなわちΔｄ０（ｃ１，ｃ２）だけ低減される。このことは、図４による実施例において、載置台１４が前記量Δｄ０（ｃ１，ｃ２）だけ光軸Ｏに沿って上方へシフトされることを意味する。それにより、再び元の狙い通りの物体面２８に立体試料１６内で接近し得る。
【００３８】
図５には、本来の撮像前に行われる顕微鏡１０の設定、特に基準面を確定し、この基準面に対して補正手段のための基準設定位置と、目標焦点距離に対する基準焦点距離偏差と、を求めるために用いる設定を単に例示的に表したフローチャートが示されている。補正手段１８の調整によって物体焦点距離の偏差と共に目標倍率に対する倍率の偏差も引き起こされる限り、基準倍率偏差も任意に考慮される。
【００３９】
ステップＳ１では、顕微鏡対物レンズ１２の焦点を、集束装置２２を用いて当該基準面Ｘｎに合わせることによって基準面Ｘｎに接近する。ステップＳ２では、補正手段１８が、基準設定位置ｃｎにもたらされる。この基準設定位置ｃｎでは、屈折率不整合によって引き起こされる基準面Ｘｎに対する球面収差が最良に補正される。補正手段１８の調整により、物体焦点距離に変化量Δｄ０（ｃｎ）が生じたならば、物体面は図４に相応して再調整される。従ってこの変化量Δｄ０（ｃｎ）は、基準焦点距離偏差に相応する。補正手段１８の調整によってさらに物体焦点距離の変化と共に倍率の変化が引き起こされるならば、付加的に基準倍率偏差β（ｃｎ）も決定される。
【００４０】
ステップＳ２およびＳ３は、前述の図１乃至図４に基づいて説明したように実施される。この場合、ステップＳ３の実施は、特にリアルタイムで行うと有利である。
【００４１】
ステップＳ４では、ステップＳ２およびＳ３において求められた特性量ｃｎ，Ｚｎおよび場合によってはβ（ｃｎ）が、基準点ｎとして記憶されるべきか否かが決定される。この場合、ｎは整数の制御変数を表している。前述の特性量が記憶されるべきならば、これらの記憶がステップＳ５で行われ、さらにこの経過はステップＳ６に進む。基準点ｎとして記憶されるべきでない場合には、この経過は直接ステップＳ６に進む。
【００４２】
ステップＳ６では、さらなる基準点が求められるべきか否かが決定される。これが当てはまる場合には、制御変数ｎが１だけ高められ（ｎ＝ｎ＋１）、制御経過はステップＳ１にフィードバックされる。さらなる基準点が何も求められるべきでない場合には、ステップＳ７において、顕微鏡対物レンズ１２の焦点を後続の立体試料１６の結像の際に合わせるべき目標面ｚｋが確定され、ステップＳ８において記憶される。
【００４３】
図６には、図５に従って行われた顕微鏡１０の設定に基づいてどのように立体撮像が実施されるかを例示的に示したフローチャートが示されている。
【００４４】
ステップＳ１０では、目標面ｚｋに対する撮像プロセスが開始され、この場合ｋは整数の制御変数を表している。ステップＳ１１は、目標面ｚｋを識別する情報が読み出される。この情報は、事前に顕微鏡１０の設定の際に記憶されている（図５のＳ８参照）。ステップＳ１２では、個々の基準面に対応付けられた基準点、すなわち基準設定位置ｃｎおよび基準焦点距離偏差ｚｎ（図５のＳ５参照）が準備される。ステップＳ１１およびＳ１２において準備された情報は、さらに、選択された目標面ｚｋに対して相応の目標量を求めるために使用され、詳細には補正手段１８のための目標設定位置ｃｋ、集束装置２２を駆動制御するのに用いる目標焦点距離偏差ｘｋ、および（任意で）可変倍率要素を駆動制御するのに用いる目標倍率偏差βｋを求めるために使用される。
【００４５】
詳細には、ステップＳ１３において、目標面ｚｋに対して補正手段１８のための目標設定位置ｃｋが算出される。ステップＳ１４では、目標面ｚｋ内の球面収差を最良に補正するために、補正手段１８が目標設定位置ｃｋへ移動される。
【００４６】
ステップＳ１５では、目標面ｚｋに対する基準焦点距離偏差ｘｋが算出される。ステップＳ１６では、集束装置２２が、基準焦点距離偏差ｘｋに相応して調整される。
【００４７】
ステップＳ１７では、目標面ｚｋに対する目標倍率偏差βｋが算出される。その後、ステップＳ１８では、可変倍率要素が、この目標倍率偏差βｋに相応して調整される。
【００４８】
この場合、ステップＳ１３およびＳ１４によって形成される補正手段１８の調整のための処理分岐、ステップＳ１５およびＳ１６によって形成される集束装置２２の調整のための処理分岐、並びに（任意で）ステップＳ１７およびＳ１８によって形成される可変倍率要素の調整のための処理分岐は、並行して実施される。これらの処理分岐は、一緒にステップＳ１９に進み、そこにおいて目標面ｚｋに関連する目標量ｃｋ，ｚｋおよびβｋの設定が滞りなく行われた後に目標面ｚｋの画像が撮像される。そのように生成された立体画像データは、ステップＳ２０において記憶される。ステップＳ２１では、さらなる基準面が撮像されるべきか否かの問合せが行われる。これが該当する場合には、制御変数ｋが、１だけ高められ（ｋ＝ｋ＋１）、前記の説明による撮像プロセスが新たに実施される。さらなる目標面が何も撮像されるべきでない場合には、当該プロセスは終了する。
【００４９】
ここでは、図５および図６に関連して説明した前記経過が単なる例示として理解されるべきであることを言及しておく。ここでは様々な変更が考えられ、例えば、補正手段１８の設定だけは考慮するが、しかしながら物体焦点距離の変更および顕微鏡倍率の変更は補正手段１８の調整のために考慮しない、立体画像の撮影も考えられる。このケースでは、ステップＳ１５，Ｓ１６若しくはステップＳ１７，Ｓ１８によって形成される２つの処理分岐は省くことが可能である。しかしながらまた付加的若しくは並行して実施される処理分岐、例えば目標面に関連する目標制御パラメータ、例えば照明光出力の設定が、事前に定められる基準面に関連する基準制御パラメータに基づくような処理分岐を設けることも可能である。
【００５０】
図７乃至図１０には、本発明に係る顕微鏡１０の様々な実施形態が示されている。
【００５１】
図７に係る顕微鏡１０は、既に図１および図４に基づいて説明した顕微鏡構成要素の他に、正立型顕微鏡スタンド３０、並びに接続線路３４を介して制御ユニット２０に接続されているドキュメントユニット３２を含んでいる。図７に係る実施形態では、集束装置２２は（図１乃至図４に係る実施形態のように）光軸に沿って電動で調整可能な載置台１４によって実施されている。図７ではさらに液浸媒体３６が示されており、その中に立体試料１６が埋め込まれている。この液浸媒体３６の屈折率は、立体試料１６の屈折率に可及的に良好に適合するように選択されている。
【００５２】
図８に係る実施形態は、図７に示された実施形態に対して次の点が変更されている。すなわち集束装置２２が、調整可能な載置台によってではなく、光軸に沿って移動可能な対物レンズ回転台によって形成されている点である。この対物レンズ回転台には顕微鏡対物レンズ１２が保持されている。
【００５３】
それに対して図９に係る実施形態は、倒立型顕微鏡スタンド３８を有している。集束装置２２は、この実施形態でも光軸に沿って調整可能な対物レンズ回転台４０によって形成されている。
【００５４】
最後に図１０に係る実施形態は、図９に示された実施形態に対して次の点が変更されている。すなわち集束装置２２が、光軸に沿って調整可能な載置台１４によって実現されている点である。
【００５５】
図７乃至図１０に係る実施形態も、単なる例示例として理解されるべきである。特に本発明は、特定の顕微鏡タイプに限定されるものではない。むしろ、本発明は、様々な顕微鏡法に適用可能であり、例えば広視野顕微鏡、共焦点顕微鏡、多光子顕微鏡または光シート顕微鏡などに適用可能である。
【符号の説明】
【００５６】
１０      顕微鏡
１２      顕微鏡対物レンズ
１４      載置台
１６      立体試料
１８      補正手段
２０      制御ユニット
２２      集束装置
２４      接続線路
２６      接続線路
２８      物体面
３０      正立型顕微鏡スタンド
３２      記録ユニット
３４      接続線路
３６      液浸媒体
３８      倒立型顕微鏡スタンド
４０      対物レンズ回転台
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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