(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表現型に関連付けられた遺伝子を同定するコンピュータ実施方法であって、
ａ）特定の表現型を示す被験者のコホート内の突然変異を表すデータを取得することと、
ｂ）プロセッサにおいて、前記取得されたデータを使用して、各突然変異の進化作用（ＥＡ）スコアであって、摂動への表現型応答である前記ＥＡスコアを計算することと、
ｃ）前記コホート内の各遺伝子について、前記遺伝子で見つかった突然変異について、前記計算されたＥＡスコアの各分布を特定することと、
ｄ）ＥＡスコアの前記特定された分布を前記コホート内において、ランダム分布と定量的に比較することであって、それにより、比較データを確立することと、
ｅ）前記比較データに基づいて、非ランダムなＥＡスコアの分布を識別することと、
ｆ）前記識別されたＥＡスコアの非ランダム分布に基づいて、前記ＥＡスコアの分布のバイアスを評価することで前記表現型への前記コホート内の各遺伝子のリンクを評価することにより、前記表現型に関連付けられた遺伝子を同定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記データを取得するステップは、データストアから前記データを取得することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥＡスコアを計算するステップは、公式：
【数１】
0006707081.tif 000010
に従い、式中、∂ｆ／∂ｒiは進化勾配であり、Δｒiは残基位置ｉでの摂動であり、Δφは、前記摂動への前記表現型応答である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記計算されたＥＡスコアの分布を特定するステップは、計算されたＥＡスコアをＥＡスコア十分位数でビニングすることを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するステップは、二標本コルモゴロフ−スミルノフ検定、ウィルコクソン順位検定、及びアンダーソン−ダーリング検定の任意の組合せを使用することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するステップは、各分布に指数関数フィッティングされた減衰率λを計算し、前記減衰率を比較することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するステップは、遺伝子が前記表現型に関連しない場合、参照データセットから得られる予期分布と前記分布とを比較することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記参照データセットは、ｉ）標準遺伝コードに従ったランダムヌクレオチド変化の翻訳により取得される、同じ遺伝子でのランダム突然変異、ｉｉ）１０００ゲノムプロジェクト（ＴＧＰ）データからの同じ遺伝子での突然変異、及びｉｉｉ）がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データ内の任意の遺伝子で見られる全てのミスセンス変異のうちの少なくとも１つを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記表現型は疾患であり、前記被験者は、前記疾患が診断された患者であり、中ＥＡスコアまたは高ＥＡスコアに向かうバイアスを評価することによって、前記コホート内の各遺伝子の前記疾患への前記リンクが評価されて、疾患原因遺伝子を同定する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記同定された疾患原因遺伝子を患者での予後バイオマーカとして使用することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患はがんであり、前記方法は、ＥＡスコアの各分布の高ＥＡスコアに向かうバイアスの評価に基づいて、前記同定された疾患原因遺伝子の中でがん遺伝子から腫瘍抑制因子を区別することを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、高ＥＡスコアを有する突然変異に向かうバイアスを有する機能関連遺伝子群を同定するパスウェイに適用され、各パスウェイは遺伝子の集合であり、前記方法は、ＥＡスコアの分布に基づいて各パスウェイを最適化することであって、それにより、群として突然変異が高ＥＡスコアに有意にバイアスされる前記パスウェイ内の遺伝子のサブセットが存在するか否かを識別する、最適化することを更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
表現型に関連付けられた遺伝子を同定するコンピュータシステムであって、
ａ）特定の表現型を示す被験者のコホート内の突然変異を表すデータを保持するデータストアと、
ｂ）前記データストアに結合されて、前記データストアからのデータにアクセスするプロセッサと、
ｃ）前記プロセッサに動作可能に結合されるメモリであって、
ｉ）前記データストアからのデータを使用して、各突然変異の進化作用（ＥＡ）スコアであって、摂動への表現型応答である前記ＥＡスコアを計算することと、
ｉｉ）前記コホート内の各遺伝子について、前記遺伝子で見つかった突然変異の前記計算されたＥＡスコアの各分布を特定することと、
ｉｉｉ）前記コホート内のＥＡスコアの前記特定された分布とランダム分布とを定量的に比較することであって、それにより、比較データを確立する、比較することと、
ｉｖ）前記比較データに基づいて、非ランダムなＥＡスコアの分布を識別することと、
ｖ）前記識別されたＥＡスコアの非ランダム分布に基づいて、前記ＥＡスコアの分布のバイアスを評価することで前記表現型への前記コホート内の各遺伝子のリンクを評価することにより、前記表現型に関連付けられた遺伝子を同定することと
を行うように、前記プロセッサを構成するメモリと、
を備える、システム。
【請求項１４】
前記メモリは、公式
【数２】
0006707081.tif 000011
に従って前記ＥＡスコアを計算するように前記プロセッサを更に構成し、式中、∂ｆ／∂ｒiは進化勾配であり、Δｒiは残基位置ｉでの摂動であり、Δφは、前記摂動への前記表現型応答である、請求項１３に記載のコンピュータシステム。
【請求項１５】
前記メモリは、計算されたＥＡスコアをＥＡ十分位数でビニングすることにより、計算されたＥＡスコアの分布を特定するように前記プロセッサを更に構成する、請求項１３又は１４に記載のコンピュータシステム。
【請求項１６】
前記メモリは、二標本コルモゴロフ−スミルノフ検定、ウィルコクソン順位検定、及びアンダーソン−ダーリング検定の任意の組合せを使用して、ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するように前記プロセッサを更に構成する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のコンピュータシステム。
【請求項１７】
前記メモリは、各分布に指数関数フィッティングされた減衰率λを計算し、前記減衰率を比較することにより、前記ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するように前記プロセッサを更に構成する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のコンピュータシステム。
【請求項１８】
前記メモリは、遺伝子が前記表現型に関連しない場合、参照データセットから得られる予期分布と前記分布とを比較することにより、前記ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するように前記プロセッサを更に構成する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載のコンピュータシステム。
【請求項１９】
前記参照データセットは、ｉ）標準遺伝コードに従ったランダムヌクレオチド変化の翻訳により取得される、同じ遺伝子でのランダム突然変異、ｉｉ）１０００ゲノムプロジェクト（ＴＧＰ）データからの同じ遺伝子での突然変異、及びｉｉｉ）がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データ内の任意の遺伝子で見られる全てのミスセンス変異のうちの少なくとも１つを含む、請求項１８に記載のコンピュータシステム。
【請求項２０】
前記表現型は疾患であり、前記被験者は、前記疾患が診断された患者であり、中ＥＡスコアまたは高ＥＡスコアに向かうバイアスを評価することによって、前記コホート内の各遺伝子の前記疾患への前記リンクが評価されて、疾患原因遺伝子を同定する、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のコンピュータシステム。
【請求項２１】
前記メモリは、前記同定された疾患原因遺伝子を患者での予後バイオマーカとしてユーザに出力するように前記プロセッサを更に構成する、請求項２０に記載のコンピュータシステム。
【請求項２２】
前記疾患はがんであり、前記メモリは、ＥＡスコアの高ＥＡスコアに向かうバイアスの評価の各分布に基づいて、前記同定された疾患原因遺伝子の中でがん遺伝子から腫瘍抑制因子を区別するように前記プロセッサを更に構成する、請求項２０に記載のコンピュータシステム。
【請求項２３】
高ＥＡスコアを有する突然変異に向かうバイアスを有する機能関連遺伝子群を同定するパスウェイに適用され、各パスウェイは遺伝子の集合であり、前記メモリは、ＥＡスコアの分布に基づいて各パスウェイを最適化することであって、それにより、群として突然変異が高ＥＡスコアに有意にバイアスされる前記パスウェイ内の遺伝子のサブセットが存在するか否かを識別する、最適化することを行うように前記プロセッサを更に構成する、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載のコンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１４年１０月２２日に出願された米国仮出願第６２／０６７，２９４号明細書の利益を主張するものである。上記出願の教示全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
政府支援
本発明は、全米科学財団からの授与番号１０６２４５５並びに国立衛生研究所からの授与番号ＧＭ０７９６５６号及びＧＭ０６６０９９の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ウィルス、バクテリア、原虫生物、がん又は他の疾患プロセスでの単細胞並びに多細胞生物、植物、動物、及び他の生物及び進化体の選択圧への適応は、遺伝情報の内容及び処理に影響を及ぼす様々なプロセスを通して生じる。その結果、適応した生物は、わずかに異なる遺伝子及び遺伝子産物を有することにより並びにそれらの遺伝子及び遺伝子産物をわずかに異なるように表現し、配置し、分解し、他の遺伝子、遺伝子産物、及び外部環境と相互作用させることにより、祖先と異なる。そして、これらの違いの結果は、十分な利点を与え、それにより、適応した生物は、選択制約によりよく耐え、その仲間及び祖先と比較してより繁栄することになるか、又は少なくともあと１世代、生き続ける。
【０００４】
適応プロセスは多種多様であり、例として、ウィルスが、免疫学的監視を逃れ、その感染力を維持するようにいかに進化するか、バクテリアがいかに、抗生物質等の環境ストレス又は放射線等の遺伝子損傷物質に耐性を示すようになるか、及び同様に、がん細胞がいかに、常に突然変異して歯止めなく増殖し、免疫及び治療バリアを圧倒し、多くの場合、転移するかが挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生物医学研究の大部分は、これらの適応応答の土台をなす遺伝子の同定を目的としており、その理由は、疾患の状況では、これらの遺伝子が、発病の主原因であり、これらの遺伝子の締め出しが、新しい治療手法を提供するためである。そのため、適応プロセス中、正の選択下での遺伝子の発見と簡潔に言い換えることができる問題である、適応を仲介する遺伝子を同定することができる方法を見つけることが、広く関心を集めている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施形態は、表現型に関連付けられた遺伝子を同定するコンピュータ実施方法及びコンピュータシステムに関する。
【０００７】
表現型に関連付けられた遺伝子を同定するコンピュータ実施方法は、表現型を示す被験者のコホート内の突然変異を表すデータを取得することと、プロセッサにおいて、取得されたデータを使用して、各突然変異の進化作用（ＥＡ）スコアを計算することとを含む。コホート内の各遺伝子について、遺伝子で見つかった突然変異について、計算されたＥＡスコアの各分布が特定される。ＥＡスコアの特定された分布は、コホート内において、ランダム分布と定量的に比較されて、比較データを確立する。比較データに基づいて、非ランダムなＥＡスコアの分布が識別され、識別されたＥＡスコアの非ランダム分布に基づいて、表現型へのコホート内の各遺伝子のリンクを評価して、表現型に関連付けられた遺伝子を同定する。
【０００８】
突然変異を表すデータは、例えば、データストアから取得することができる。
【０００９】
ＥＡスコアは、公式：
【数１】
0006707081.tif 000002
に従って計算することができ、式中、∂ｆ／∂ｒiは進化勾配であり、Δｒiは残基位置ｉでの摂動（pertubation）であり、Δφは、摂動への表現型応答である。
【００１０】
計算されたＥＡスコアの分布を特定することは、例えばＥＡスコア十分位数で、計算されたＥＡスコアをビニングすることを含むことができる。他のビニング方法を使用してもよい。幾つかの実施形態では、計算されたＥＡスコアの分布は、ビニングなしで特定し得る。
【００１１】
ＥＡスコアの分布を定量的に比較することは、二標本コルモゴロフ−スミルノフ検定、ウィルコクソン順位検定、及びアンダーソン−ダーリング検定の任意の組合せを使用することを含むことができる。ＥＡスコアの分布の統計学的差を測定する他の方法を使用することもできる。
【００１２】
ＥＡスコアの分布を定量的に比較することは、各分布に指数関数フィッティングされた減衰率λを計算し、減衰率を比較することを含むことができる。
【００１３】
ＥＡスコアの分布を定量的に比較することは、遺伝子が表現型に関連しない場合、参照データセットから得られる予期分布と上記分布とを比較することを含むことができる。参照データセットは、ｉ）標準遺伝コードに従ったランダムヌクレオチド変化の翻訳により取得される、同じ遺伝子でのランダム突然変異、ｉｉ）１０００ゲノムプロジェクト（ＴＧＰ）データからの同じ遺伝子での突然変異、及びｉｉｉ）がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データ内の任意の遺伝子で見られる全てのミスセンス変異のうちの少なくとも１つを含むことができる。
【００１４】
幾つかの実施形態では、表現型は疾患であり、被験者は、疾患が診断された患者であり、コホート内の各遺伝子の疾患へのリンクが評価されて、疾患原因遺伝子を同定する。
【００１５】
本方法は、同定された疾患原因遺伝子を患者での予後バイオマーカとして使用することを更に含むことができる。
【００１６】
疾患はがんであってもよく、本方法は、ＥＡスコアの各分布に基づいて、同定された疾患原因遺伝子の中でがん遺伝子から腫瘍抑制因子を区別することを更に含むことができる。
【００１７】
表現型に関連付けられた遺伝子を同定するコンピュータシステムは、表現型を示す被験者のコホート内の突然変異を表すデータを保持するデータストアと、データストアに結合されて、データストアからのデータにアクセスするプロセッサと、プロセッサに動作可能に結合されるメモリをと含む。メモリは、ｉ）データストアからのデータを使用して、各突然変異の進化作用（ＥＡ）スコアを計算することと、ｉｉ）コホート内の各遺伝子について、遺伝子で見つかった突然変異について、計算されたＥＡスコアの各分布を特定することと、ｉｉｉ）ＥＡスコアの特定された分布をコホート内において、ランダム分布と定量的に比較することであって、それにより、比較データを確立することと、ｉｖ）比較データに基づいて、非ランダムなＥＡスコアの分布を識別することと、ｖ）識別されたＥＡスコアの非ランダム分布に基づいて、表現型へのコホート内の各遺伝子のリンクを評価することであって、それにより、表現型に関連付けられた遺伝子を同定する、評価することを行うように、プロセッサを構成している。
【００１８】
本コンピュータシステムのメモリは、上述した公式に従ってＥＡスコアを計算するようにプロセッサを更に構成することができる。
【００１９】
本コンピュータシステムのメモリは、計算されたＥＡスコアをＥＡ十分位数でビニングすることにより、計算されたＥＡスコアの分布を特定することと；二標本コルモゴロフ−スミルノフ検定、ウィルコクソン順位検定、及びアンダーソン−ダーリング検定の任意の組合せを使用して、ＥＡスコアの分布を定量的に比較することと；各分布に指数関数フィッティングされた減衰率λを計算し、減衰率を比較することにより、ＥＡスコアの分布を定量的に比較することと；および／または遺伝子が表現型に関連しない場合、参照データセットから得られる予期分布と分布とを比較することにより、ＥＡスコアの分布を定量的に比較することと；を行うように、プロセッサを更に構成することができる。参照データセットは、ｉ）標準遺伝コードに従ったランダムヌクレオチド変化の翻訳により取得される、同じ遺伝子でのランダム突然変異、ｉｉ）１０００ゲノムプロジェクト（ＴＧＰ）データからの同じ遺伝子での突然変異、及びｉｉｉ）がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データ内の任意の遺伝子で見られる全てのミスセンス変異のうちの少なくとも１つを含むことができる。
【００２０】
表現型は疾患であってもよく、被験者は、疾患が診断された患者であってもよく、コホート内の各遺伝子の疾患へのリンクが評価されて、疾患原因遺伝子を同定することができる。本コンピュータシステムのメモリは、同定された疾患原因遺伝子を患者での予後バイオマーカとしてユーザに出力するようにプロセッサを更に構成することができる。
【００２１】
実施形態では、疾患はがんであり、メモリは、ＥＡスコアの各分布に基づいて、同定された疾患原因遺伝子の中でがん遺伝子から腫瘍抑制因子を区別するようにプロセッサを更に構成する。
【００２２】
表現型に関連付けられた遺伝子を同定する方法及びコンピュータシステムは、高ＥＡスコアを有する突然変異に向かうバイアスを有する機能関連遺伝子群を同定するパスウェイに適用することができ、各パスウェイは遺伝子の集合であり、メモリは、ＥＡスコアの分布に基づいて各パスウェイを最適化することであって、それにより、群として突然変異が高ＥＡスコアに有意にバイアスされるパスウェイ内の遺伝子のサブセットが存在するか否かを識別する、最適化することを行うようにプロセッサを更に構成する。
【００２３】
以下は、同様の参照文字が、様々な図全体を通して同じ部分を指す添付図面に示されるような、本発明の実施形態例の以下のより具体的な説明から明らかになる。図面は、必ずしも一定の縮尺ではなく、代わりに、本発明の実施形態を説明することに重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】進化トレース（ＥＴ）及び進化トレース注釈（ＥＴＡ）を概略的に示し、ＥＴプロセスは、進化的分岐（１５）との多様性の相関からアラインメント配列（１０）の個々の位置をランク付け、ヒートマップ（２０）は、構造での最良ランク残基クラスタを示し（太線は最良であり、細線は最悪である）、機能部位をマークし、ＥＴＡプロセスは、６つの表面露出クラスタ及びトップランク残基の３Ｄ鋳型をとり（２５）、別の構造に一致する（３０）場合、機能類似性を示唆し、そのような一致は、機能を予測するために分析することができるタンパク質間にリンクネットワーク（３５）を作成する。
【図２Ａ】図２Ａは、２つの例で、進化作用（「作用」）が酵素活性の喪失に相関することを示すグラフである。（詳細な説明を参照のこと）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、作用が、他の方法よりも良好に突然変異の相対有害度を分類すること示すグラフである（詳細な説明を参照のこと）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、２つの例で、進化作用（「作用」）が酵素活性の喪失に相関することを示すグラフである（詳細な説明を参照のこと）。
【図２Ｄ】図２Ｄは、作用が、他の方法よりも良好に突然変異の相対有害度を分類すること示すグラフである（詳細な説明を参照のこと）。
【図３Ａ】ＣＡＧＩ（ゲノム解釈の精密評価）２０１１及びＣＡＧＩ  ２０１３の結果を示し、異なる群（異なる塗りつぶしパターンで区別される）からの現況技術による方法（文字Ａ〜Ｏ）の平均ランクを示して、シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）活性及びｐ１６突然変異を有する細胞の増殖率への突然変異の影響を予測し、ＣＢＳは１８の品質尺度を使用したが、ｐ１６は４つのみを使用し、図中、中実ブラック（「作用」）は、進化作用（ＥＡ）方程式を使用して得られた結果を示す。
【図３Ｂ】ＣＡＧＩ（ゲノム解釈の精密評価）２０１１及びＣＡＧＩ  ２０１３の結果を示し、異なる群（異なる塗りつぶしパターンで区別される）からの現況技術による方法（文字Ａ〜Ｏ）の平均ランクを示して、シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）活性及びｐ１６突然変異を有する細胞の増殖率への突然変異の影響を予測し、ＣＢＳは１８の品質尺度を使用したが、ｐ１６は４つのみを使用し、図中、中実ブラック（「作用」）は、進化作用（ＥＡ）方程式を使用して得られた結果を示す。
【図４Ａ】ゴールドスタンダードデータを示すグラフである：ＨｕｍＤｉｖ（図４Ａ）及びＨｕｍＶａｒ（図４Ｂ）データベース内の各変異体（黒色記号）の既知の機能状態を使用することを意味する、ゴールドスタンダードを使用して（「変異体を直接使用して」）推定された感度及び特性と比較した、コンピュータ内方法ＳＩＦＴ、突然変異アセッサー、及びポリフェン−２の感度及び特性の推定［ｐｏｓｔＭＵＴ（突然変異後）（シンプル）モデル（白色記号）、ゴールドスタンダードなしのｐｏｓｔＭＵＴモデル（グレー記号）］。
【図４Ｂ】ゴールドスタンダードデータを示すグラフである：ＨｕｍＤｉｖ（図４Ａ）及びＨｕｍＶａｒ（図４Ｂ）データベース内の各変異体（黒色記号）の既知の機能状態を使用することを意味する、ゴールドスタンダードを使用して（「変異体を直接使用して」）推定された感度及び特性と比較した、コンピュータ内方法ＳＩＦＴ、突然変異アセッサー、及びポリフェン−２の感度及び特性の推定［ｐｏｓｔＭＵＴ（突然変異後）（シンプル）モデル（白色記号）、ゴールドスタンダードなしのｐｏｓｔＭＵＴモデル（グレー記号）］。
【図５Ａ】１，０９２人の個人（ＴＧＰ）からの非同義コード突然変異のＥＡ分布を示すグラフであり、図５Ａは、表現型への影響により定義される全ての遺伝子及び様々な群を示す。
【図５Ｂ】１，０９２人の個人（ＴＧＰ）からの非同義コード突然変異のＥＡ分布を示すグラフであり、図５Ｂは、ＥＡ分布が、対立遺伝子頻度の対数に伴って線形に変化する率（Ｒ2値０．９２）で、指数関数的に減衰することを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、腫瘍で頻繁に見られた（ＩＡＲＣデータベースに集計された２６，５９７の事例で少なくとも１０倍）３４３個のｐ５３突然変異のＥＡ分布（６Ａ）を示し、黒色又は白色の棒は、酵母アッセイでの野生種トランス活性化活性の５０％未満又は５０％超の割合を示し、グレー（「アッセイデータなし」）は、データがないことを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、１，０２６個の散発性ｐ５３突然変異（６Ｂ）を示し、黒色又は白色の棒は、酵母アッセイでの野生種トランス活性化活性の５０％未満又は５０％超の割合を示し、グレー（「アッセイデータなし」）は、データがないことを示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＴＳＣ２（６Ｄ）、ＰＫＤ１（６Ｄ）、並びに８，５５３個の疾患関連突然変異及び７９４個の良性変異を有する２１８個の遺伝子（６Ｅ）での多型（白色）及び疾患関連（黒色）ヒト変異のＥＡ分布（６Ｃ）を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＴＳＣ２（６Ｄ）、ＰＫＤ１（６Ｄ）、並びに８，５５３個の疾患関連突然変異及び７９４個の良性変異を有する２１８個の遺伝子（６Ｅ）での多型（白色）及び疾患関連（黒色）ヒト変異のＥＡ分布（６Ｃ）を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＴＳＣ２（６Ｄ）、ＰＫＤ１（６Ｄ）、並びに８，５５３個の疾患関連突然変異及び７９４個の良性変異を有する２１８個の遺伝子（６Ｅ）での多型（白色）及び疾患関連（黒色）ヒト変異のＥＡ分布（６Ｃ）を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、本発明の実施形態を展開し得るコンピュータネットワーク環境の概略図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａのコンピュータネットワーク内のコンピュータノード又はデバイスのブロック図である。
【図８】本発明のコンピュータベースの一実施形態の流れ図である。
【図９Ａ】コード単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）の分布を示し、図９Ａは、ＴＧＰデータベース（２６１，８９９の特有のＳＮＶ）で見られるヒト変異を示す。
【図９Ｂ】コード単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）の分布を示し、図９Ｂは、ＴＣＧＡデータベース（２１のがんにわたる５，３９２人の患者からの８２９，６２５のＳＮＶ）に見られる体細胞がん突然変異を示す。
【図９Ｃ】コード単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）の分布を示し、図９Ｃは、全てのタンパク質の標準遺伝コードに従うランダムヌクレオチド変化を示す。
【図９Ｄ】コード単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）の分布を示し、図９Ｄは、腫瘍サプレッサーＴＰ５３、がん遺伝子ＰＩＫ３ＣＡ、及びがんに関連しないＤＮＡＨ５遺伝子の体細胞突然変異を示し、図９Ｄの棒ブラフの上部パネルは、ＴＧＰからのヒト多型を示し、下部パネルは、ＴＣＧＡからのがん突然変異を示し、各遺伝子の偽陽性率（ｑ値）は、がん突然変異の分布を、実験設計下で後述するテストを使用したランダム突然変異の分布及び実施例２の予期される結果セクションと比較することにより得られた。
【図１０】一個抜きＳＴＲＩＮＧ拡散を示すグラフであり、ＴＣＧＡ（黒色ドット）からの頭部及び頸部扁平上皮がん（ＨＮＳＣ）突然変異の分析から得られたがん遺伝子トップ候補を遺伝子のランダムセット（グレードット）と比較し、任意のカットオフ値が、各都度、異なる数の遺伝子を分け、ｚ値が各カットオフに与えられる。
【図１１Ａ】高作用に向けてバイアスされる機能関連遺伝子セットである「コアモジュール」の同定を示す。
【図１１Ｂ】高作用に向けてバイアスされる機能関連遺伝子セットである「コアモジュール」の同定を示す。
【図１１Ｃ】高作用に向けてバイアスされる機能関連遺伝子セットである「コアモジュール」の同定を示す。
【図１１Ｄ】高作用に向けてバイアスされる機能関連遺伝子セットである「コアモジュール」の同定を示す。
【図１２Ａ】「コアモジュール」のサポートを示すグラフであり、図１２Ａは、コアモジュール遺伝子の進化作用分布の積層ヒストグラムであり、図１２Ｂは、ＳＴＲＩＮＧ作用図、高信頼モードで１２の候補遺伝子を示す。
【図１２Ｂ】「コアモジュール」のサポートを示すグラフであり、図１２Ａは、コアモジュール遺伝子の進化作用分布の積層ヒストグラムであり、図１２Ｂは、ＳＴＲＩＮＧ作用図、高信頼モードで１２の候補遺伝子を示す。
【図１３】熱帯熱マラリア原虫のＫｅｌｃｈタンパク質での突然変異を示す（ＰＦ３Ｄ７＿１３４３７００）。
【図１４】突然変異の機能影響を概略的に示す。
【図１５Ａ】Ｋｅｌｃｈ突然変異の進化作用分布及び解釈を示す。
【図１５Ｂ】Ｋｅｌｃｈ突然変異の進化作用分布及び解釈を示す。
【図１５Ｃ】Ｋｅｌｃｈ突然変異の進化作用分布及び解釈を示す。
【図１５Ｄ】Ｋｅｌｃｈ突然変異の進化作用分布及び解釈を示す。
【図１６Ａ】寄生虫クリアランス半減期との進化作用スコアの相関を示す。
【図１６Ｂ】寄生虫クリアランス半減期との進化作用スコアの相関を示し、図１６Ｂの（*）は、寄生虫クリアランス半減期が、図１６Ａの白色ドット及び黒色ドットのプロットに基づいて、大まかな平均として計算されたことを示す。
【図１６Ｃ】寄生虫クリアランス半減期との進化作用スコアの相関を示し、図１６Ｃでの（*）は、寄生虫クリアランス半減期が、図１６Ａの白色ドット及び黒色ドットのプロットに基づいて、大まかな平均として計算されたことを示す。
【図１７Ａ】地理的地域による進化作用分布を示す。
【図１７Ｂ】地理的地域による進化作用分布を示す。
【図１７Ｃ】地理的地域による進化作用分布を示す。
【図１７Ｄ】地理的地域による進化作用分布を示す。
【図１８Ａ】進化作用方程式の計算を示す。
【図１８Ｂ】進化作用方程式の計算を示す。
【図１８Ｃ】進化作用方程式の計算を示す。
【図１８Ｄ】進化作用方程式の計算を示す。
【図１９Ａ】突然変異作用が実験的影響と相関することを示す。
【図１９Ｂ】突然変異作用が実験的影響と相関することを示す。
【図１９Ｃ】突然変異作用が実験的影響と相関することを示す。
【図１９Ｄ】突然変異作用が実験的影響と相関することを示す。
【図１９Ｅ】突然変異作用が実験的影響と相関することを示す。
【図２０】現況技術の方法と比較した、進化作用方法の性能を示す。
【図２１Ａ】突然変異作用が発病率と相関することを示す。
【図２１Ｂ】突然変異作用が発病率と相関することを示す。
【図２２Ａ】ヒトコード多型の略指数関数的作用分布を示し、図２２Ａに示されるように、対立遺伝子頻度（ｖ）閾値１％に基づいて、１０００ゲノムプロジェクト（１０９２人の個人を含む）からのコード多型を２２５，７５１の希少変異（左）及び３６，３５４の一般的な突然変異（右）に分け、両群とも、作用十位数にビニングされる場合、それぞれピアソン係数Ｒ2＝０．９５及び０．９８並びに減衰率２．１８×１０-2及び３．３８×１０-2で、指数関数的分布にフィッティングし、差し込み図は、均等な対数線形プロットを示す。
【図２２Ｂ】ヒトコード多型の略指数関数的作用分布を示し、図２２Ａに示されるように、対立遺伝子頻度（ｖ）閾値１％に基づいて、１０００ゲノムプロジェクト（１０９２人の個人を含む）からのコード多型を２２５，７５１の希少変異（左）及び３６，３５４の一般的な突然変異（右）に分け、両群とも、作用十位数にビニングされる場合、それぞれピアソン係数Ｒ2＝０．９５及び０．９８並びに減衰率２．１８×１０-2及び３．３８×１０-2で、指数関数的分布にフィッティングし、差し込み図は、均等な対数線形プロットを示し、これらの群は、図２２Ｂに示されるように、対立遺伝子のカウント又は頻度により更に分割され、対立遺伝子カウント又は頻度の同じ部分内の多型の作用分布も、０．８７〜０．９９のＲ2値で指数関数にフィッティングする。
【図２２Ｃ】ヒトコード多型の略指数関数的作用分布を示し、図２２Ａに示されるように、対立遺伝子頻度（ｖ）閾値１％に基づいて、１０００ゲノムプロジェクト（１０９２人の個人を含む）からのコード多型を２２５，７５１の希少変異（左）及び３６，３５４の一般的な突然変異（右）に分け、両群とも、作用十位数にビニングされる場合、それぞれピアソン係数Ｒ2＝０．９５及び０．９８並びに減衰率２．１８×１０-2及び３．３８×１０-2で、指数関数的分布にフィッティングし、差し込み図は、均等な対数線形プロットを示し、これらの群は、図２２Ｂに示されるように、対立遺伝子のカウント又は頻度により更に分割され、対立遺伝子カウント又は頻度の同じ部分内の多型の作用分布も、０．８７〜０．９９のＲ2値で指数関数にフィッティングし、図２２Ｃは、これらの指数関数の作用減衰率が、対立遺伝子頻度の対数に伴って線形に変化する（Ｒ2値０．９２）ことを示し、矢印は、１人の個人のエクソームからの全ての非同義突然変異で観測された減衰率を示す：１０００ゲノムプロジェクトの希少突然変異及び一般的突然変異の場合；ＴＣＧＡ（ｈｔｔｐ：／／ｔｃｇａｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から検索された体細胞がん突然変異の場合；及び標準遺伝コード（ランダムヌクレオチド）に従ったランダムヌクレオチド変化の翻訳により得られる非同義突然変異の場合。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明の実施形態例の説明は以下である。
【００２６】
疾患の原因となる遺伝子を同定する従来の手法は、様々な頻度尺度に頼っている。罹患患者で突然変異するこれらの遺伝子の頻度、罹患患者に遺伝マーカーが存在する又は存在しない頻度、罹患患者の遺伝子に非同義突然変異がある頻度（ｖｓ同義突然変異がある頻度）、罹患患者の遺伝子に切断を有する頻度等。これら全ての例で、これらの様々なマーカーの頻度が、所与の遺伝子で、偶然だけで予期されるよりも異常に大きいことを示すことを目的として、統計学的分析が行われ、異常に大きいことは、この遺伝子が異常な選択圧下にあることを示唆する。これらの手法は全て、観測的であり、これらのイベントのいずれの下流生物学的結果（downstream biological consequences）も解釈しない。より近代の手法は、これらの下流の結果を考慮に入れようとすることがはじまっており、例えば、疎水性のアミノ酸により置換される親水性のアミノ酸であり、小さなアミノ酸で置換される大きなアミノ酸であり、陰性荷電アミノ酸により置換される陽性荷電アミノ酸であり、進化的に不変の置換アミノ酸であり、通常、多型がないか、又はミスセンス若しくはナンセンス突然変異により頻繁に影響を受ける遺伝子であり、複製された遺伝子である等である。これら及び他の同様の考慮事項を更に結合して、突然変異イベントのある種の頻度及びそれが有害又は良性である結果を有する尤度に辿り着くことができる。
【００２７】
有利なことに、本手法の実施形態は、突然変異が良性（中立）、略中立、中程度に摂動、それとも遺伝子、実際には有機体全体に深刻に摂動している可能性が高いかの改善された尺度を提供する。この尺度は以下の特徴を有する：０から１に連続しており（完全に中立から遺伝子に対して最大に有害）、あらゆる遺伝子に適応し、中立遺伝子又は有害遺伝子の例を与える大きなデータセットにわたるトレーニングを通して導出されず、進化の基本メカニズム、すなわち、遺伝子型と表現型との関係に基づく。
【００２８】
一般に、本手法の方法及びコンピュータシステムを使用して、突然変異の頻度ではなく品質にフォーカスし、従来可能であったよりもはるかに高い精度で品質を測定することにより、正の選択下の遺伝子をはるかに高い分解能で同定することができる。これは、突然変異の可能性のある有害影響を予測的に測定することにより、コード突然変異（ミスセンス突然変異とも呼ばれ、タンパク質内のあるアミノ酸の別のアミノ酸への置換を生じさせる突然変異）で行われる。
【００２９】
タンパク質ミスセンス突然変異は臨床的に重要
遺伝的変異は、一般的であり、個人の疾患感受性に影響する。各誕生は約６６個の新規の突然変異をもたらし、これは、時間の経過に伴い、ランダムな個人間で４億を超えるＤＮＡ差異になる。これらの変異の約８０％は、血縁関係がない個人のプロテオーム内に約１０万のアミノ酸置換を含む単一ヌクレオチド置換である。タンパク質コード変異は多くの場合、適応度に影響を及ぼし、既知の疾患突然変異の８５％を占め、２，５００を超える病気に関連する。関連研究は、単一遺伝子疾患をこれらの突然変異の幾つかにリンクすることができるが、複数の遺伝的因子の影響を受けるより複雑な疾患では、多くの変異をソートして、最も有害な変異を同定する必要がある。現在、パーソナルエクソームに関する急激な到来（advent）によって、臨床医は、どのコード対立遺伝子変異が有害であるか否かを尋ねるように強いられている。これは、集団研究では疾患関連性が分からず、希少突然変異の影響が各突然変異の固有の同様に依存するため、複雑で、不可解であることが多い希少突然変異（〜１５−２０％）の割合により、より困難なタスクとなる。したがって、タンパク質突然変異の機能的影響を評価する手段に対する切迫した必要性が存在する。
【００３０】
タンパク質ミスセンス突然変異の有害な影響の計算予測
現在の手法は大方、ホモロジーに頼っている。ＳＩＦＴは、タンパク質ファミリアラインメント内のアミノ酸の頻度を計算し、突然変異体の頻度が偶然に予期される頻度よりも低い場合、突然変異を有害と分類する。ＭＡＰＰは、各アライン配列カラム内の物理化学的変異（体積、極性、ハイドロパシー）を定量化し、突然変異体がこのパターンに当てはまるか否かを計算する。同様にＡ−ＧＶＧＤは、突然変異体がアラインメント内の変動（グランサム差（Ｇｒａｎｔｈａｍ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ））外にあり、変動のサイズが置換のサイズ（グランサム変動(Ｇｒａｎｔｈａｍ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ））よりも小さい場合、突然変異体を有害と呼ぶ。精度を改善するために、機械学習（サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、ナイーブベイズ、及び決定木）は、配列保存、二次構造、溶媒露出度、機能部位の場所、結晶学的Ｂ因子、局所配列環境、及び天然変性等の特徴を組み合わせることができる。ポリフェンは、ＰＳＩＣ（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｏｕｎｔｓ）を使用して、アミノ酸が任意の位置で発生する確率を推定し、この確率は、注釈（annotation）及び構造的特徴を用いて調整した。現況技術によるポリフェン２は、２つの集合のヒトＳＮＰ（メンデル型疾患又は全ての疾患）でトレーニングされたナイーブベイズ分類器(単純ベイズ分類器)を使用して、一連の注釈及び構造的特徴でＰＳＩＣを重み付けする。他の方法としては、ＰＮＰｓ３Ｄ、ＰｈＤ−ＳＮＰ、Ｐａｒｅｐｒｏ、ＬＳ−ＳＮＰ、ＳＡＰＲＥＤ等が挙げられる。ＳＮＡＰ、ＭｕｔＰｒｅｄ等の幾つかの機械学習方法は、ウェブサーバの予測もプールする。
【００３１】
計算方法の評価
Ｈｉｃｋｓらは、２０１１年、ＢＲＣＡ１、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、及びＴＰ５３遺伝子での２６７のよく特徴づけられたミスセンス突然変異にわたり、４つの方法（ＳＩＦＴ、アラインＧＶＧＤ、ポリフェン２、及びＸｖａｒ（現在、突然変異アセッサー(mutationassessor)と呼ばれる）の正確性を比較した。全てのアルゴリズムは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積約８０％を有し、性能は同様であったが、それらのコールは一致しなかった。他の評価も存在し（例えば、ＤＲＥＡＭ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅ−ｄｒｅａｍ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｂｒｅｎｎｅｒ及びＪｏｈｎ  Ｍｏｕｌｔは、現況技術による方法を客観的に評価するために、ＣＡＧＩ（ゲノム解釈の精密評価）を編成した。競合するグループが、遺伝的変異を盲目的にスコア付けし、独立した評価者(independent assessors)が、評価者にのみ提供される実験結果を使用して、性能を評価する。最近、２０１１年及び２０１３年において、単純で全般的な分析式に基づく本発明の方法の性能は、最良であり（図３Ａ及び図３Ｂ、以下参照）、膨大なデータセットでトレーニングされた全ての統計学的及び機械学習ベースの方法を打ち負かした。多数の統計学的／機械学習手法の中で、本発明による分析方法は新規であり、前途有望である。
【００３２】
がん関連遺伝子の予測因子
突然変異の影響は通常、疾患原因遺伝子の予測に関連付けられない。代わりに、これらの遺伝子は、罹患患者の配列データでの突然変異頻度増大から発見される。幾つかの他の方法の中でも特に、ＭｕｔＳｉｇは、ゲノムにわたり突然変異率を背景率と突き合わせて比較することにより、腫瘍のエクソーム配列データからがんドライバー遺伝子を同定する（ＭｕｔＳｉｇ１．０）。ＭｕｔＳｉｇ１．５は、遺伝子毎の背景突然変異率の初期推定（ｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙ  ｅｓｔｉｍａｔｅ）を追加し、ＭｕｔＳｉｇ２．０は、複数の方法（ポリフェン、ＳＩＦＴ、ＣＨＡＳＭ、突然変異アセッサー等）で推定した正の選択のシグナル：ｉ）多発点での突然変異のクラスタ化及びｉｉ）突然変異の機能的影響を追加して、３つ全てのシグナル（頻度、クラスタ化、及び保存）に基づいて有意性を計算した。最新のものはＭｕｔＳｉｇＣＶであり、共変量空間内の「隣接」遺伝子からデータをプールする改良された背景突然変異率を有する。他の目立った方法としては、ＴＵＳＯＮエクスプローラが挙げられ、これは、複数の比率（機能の喪失、高い機能的影響、又はスプライシング突然変異ｖｓ大半は良性の突然変異）を使用して、シグネチャ突然変異パターンから腫瘍サプレッサー遺伝子及びがん遺伝子を同定する。別の方法も選択ベースを組み合わせる（頻度、機能的影響、領域的クラスタ化、及びリン酸化反応との関連性）。全体的に、これらの方法はなお初期段階にある。それとは対照的に、本発明は、十分にテストされた進化トレース手法を拡張して、進化の基本に結びついた新規の手法を提案する。この手法は、進化の略中立の説及び微積分の基本原理と両立し、疾患原因遺伝子を同定することができ、その理由は、疾患原因遺伝子が論理上、罹患患者で高影響突然変異を有するように正選択されるためである。
【００３３】
進化トレース及びタンパク質構造機能決定因子
本発明では、タンパク質機能決定因子を同定するために、進化ツリー（ＥＴ）を開発した。ＥＴは、メジャー（又はマイナー）な進化的分岐間で大半が変化する場合、配列残基を「重要度がより高い（又は低い）」ものとしてランク付ける（図１の１０及び１５において、残基変異は、枠の破断により示され、重要性は、線厚が太線から中線、中線から細線に低減するにつれて、低減する）。これらのパターンは、自然淘汰中、表現型の上で極めて重要である、一般的性質を有する位置を識別し、これらのパターンは、機能部位を予測し、それら自体で、機能を識別し（図１の２０、２５、３０、及び３５）、再設計又は模倣するように実験をガイドするのに十分である３Ｄクラスタをタンパク質構造内に形成する。したがって、比較的単純な進化パターンが、構造及び機能で重要な役割を果たす配列残基を系統的にトレースすることができる。さらに、トップランク位置間で構造的３Ｄクラスタ化を最大化することにより、機能部位、機能決定因子、及びタンパク質の全体機能の予測が改善する。これらのデータは、ミスセンス突然変異の解釈に有用であり、系統発生学的に重要な残基のＥＴ定義が、遺伝子型と表現型との関係のより深い側面を明らかにすることを示唆する。
【００３４】
図７Ａは、本発明の実施形態を実施し得るコンピュータネットワーク又は同様のデジタル処理環境を示す。クライアントコンピュータ／デバイス５０及びサーバコンピュータ６０は、アプリケーションプログラム等を実行する処理デバイス、記憶デバイス、及び入／出力デバイスを提供する。クライアントコンピュータ／デバイス５０は、通信ネットワーク７０を通して、他のクライアントデバイス／プロセッサ５０及びサーバコンピュータ６０を含め、他の計算デバイスにリンクすることもできる。通信ネットワーク７０は、現在、それぞれのプロトコル（ＴＣＰ／ＩＰ、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）等）を使用して、互いと通信するリモートアクセスネットワーク、グローバルネットワーク（例えば、インターネット）、コンピュータの世界規模の集まり、ローカルエリア又は広域ネットワーク、及びゲートウェイの一部であることができる。他の電子デバイス／コンピュータネットワークアーキテクチャも適する。
【００３５】
図７Ｂは、図７Ａのコンピュータネットワーク内のコンピュータ（例えば、クライアントプロセッサ／デバイス５０又はサーバコンピュータ６０）の内部構造の図である。各コンピュータ５０、６０はシステムバス７９を含み、バスは、コンピュータ又は処理システムの構成要素間でのデータ転送に使用される１組のハードウェア線である。バス７９は基本的に、要素間で情報の転送を可能にする、コンピュータシステムの様々な要素（例えば、プロセッサ、ディスクストレージ、メモリ、入／出力ポート、ネットワークポート等）を接続する共有導管である。システムバス７９には、様々な入力デバイス及び出力デバイス（例えば、キーボード、マウス、ディスプレイ、プリンタ、スピーカ等）をコンピュータ５０、６０に接続するＩ／Ｏデバイスインタフェース８２が取り付けられる。ネットワークインタフェース８６により、コンピュータは、ネットワーク（例えば、図７Ａのネットワーク７０）に取り付けられた様々な他のデバイスに接続することができる。メモリ９０は、本発明の実施形態（例えば、例及び図８において詳述される進化作用（ＥＡ）スコアの計算、計算されたＥＡスコアの各分布の特性、ＥＡスコアの特定された分布の定量的比較、非ランダムなＥＡスコアの分布の識別、表現型への遺伝子のリンク評価）の実施に使用されるコンピュータソフトウェア命令９２及びデータ９４に揮発性ストレージを提供する。ディスクストレージ９５は、本発明の実施形態の実施に使用されるコンピュータソフトウェア命令９２及びデータ９４に不揮発性ストレージを提供する。中央演算処理装置８４もシステムバス７９に取り付けられ、コンピュータ命令の実行を提供する。
【００３６】
一実施形態では、プロセッサルーチン９２及びデータ９４は、本発明のシステムのソフトウェア命令の少なくとも一部を提供するコンピュータ可読媒体（例えば、１つ又は複数のＤＶＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、テープ等のリムーバブル記憶媒体）を含め、コンピュータプログラム製品（全般的に９２で参照される）である。コンピュータプログラム製品９２は、当分野で周知のように、任意の適するソフトウェアインストール手順によりインストールすることができる。別の実施形態では、ソフトウェア命令の少なくとも一部は、ケーブル、通信接続、及び／又は無線接続を介してダウンロードすることもできる。他の実施形態では、本発明のプログラムは、伝搬媒体（例えば、無線波、赤外線波、レーザ波、音波、又はインターネット等のグローバルネットワーク若しくは他のネットワークを介して伝搬する電波）での伝搬信号で実施されるコンピュータプログラム伝搬信号製品１０７である。そのような伝送媒体又は信号は、本発明のルーチン／プログラム９２のソフトウェア命令の少なくとも一部を提供する。
【００３７】
代替の実施形態では、伝搬信号は、伝搬媒体で搬送されるアナログ搬送波又はデジタル信号である。例えば、伝搬信号は、グローバルネットワーク（例えば、インターネット）、電気通信ネットワーク、又は他のネットワークを介して伝搬されるデジタル信号であり得る。一実施形態では、伝搬信号は、数ミリ秒、数秒、数分、又はそれよりも長い期間にわたり、ネットワークを介してパケットで送信されるソフトウェアアプリケーションの命令等のある時間期間にわたり伝搬媒体を介して伝送される信号である。別の実施形態では、コンピュータプログラム製品９２のコンピュータ可読媒体は、コンピュータプログラム伝搬信号製品に関して上述したように、伝搬媒体を受け取り、伝搬媒体で具現される伝搬信号を識別することによる等、コンピュータシステム５０が受け取って読み取ることができる伝搬媒体である。
【００３８】
一般的に言えば、「搬送波媒体」又は一時的な搬送波という用語は、上記の一時的な信号、伝搬信号、伝搬媒体、他の媒体等を包含する。
【００３９】
これに関して、本明細書に記載される記載の実施形態の一実施態様が、プロセッサで実行されると、これらの実施形態の上述した機能の幾つか又は全てを実行するコンピュータプログラム（例えば、複数の命令）が符号化された少なくとも１つのコンピュータ可読媒体を備えることを理解されたい。本明細書で使用される場合、「コンピュータ可読媒体」という用語は、機械又は製品（すなわち、製造品）と見なすことができる非一時的コンピュータ可読媒体のみを包含する。コンピュータ可読媒体は、例えば、コンピュータ可読情報を符号化又は記憶し得る有形媒体、コンピュータ可読情報を符号化又は記憶し得る記憶媒体、及び／又はコンピュータ可読媒体を符号化又は記憶し得る非一時的媒体であり得る。非一時的コンピュータ可読媒体の他の非網羅的な例としては、コンピュータメモリ（例えば、ＲＯＭ、ＲＡＭ、フラッシュメモリ、又は他のタイプのコンピュータメモリ）、磁気ディスク又はテープ、光ディスク、及び／又は機械又は製品と見なすことができる他のタイプのコンピュータ可読媒体が挙げられる。
【００４０】
「プログラム」又は「ソフトウェア」という用語は、一般的な意味で本明細書で使用される場合、上述されるような本発明の様々な態様を実施するようにコンピュータ又は他のプロセッサをプログラムするのに利用することができる任意のタイプのコンピュータコード又はコンピュータ実行可能命令セットを指す。さらに、この実施形態の一態様によれば、実行されると、本発明の方法を実行する１つ又は複数のコンピュータプログラムが、単一のコンピュータ又はプロセッサに存在する必要がなく、本発明の様々な態様を実施するように幾つかの異なるコンピュータ又はプロセッサにモジュール式に分散してもよいことを理解されたい。
【００４１】
コンピュータ実行可能命令は、１つ又は複数のコンピュータ又は他のデバイスにより実行される、プログラムモジュール等の多くの形態であり得る。一般に、プログラムモジュールは、特定のタスクを実行するか、又は特定の抽象データ型を実施するルーチン、プログラム、オブジェクト、構成要素、データ構造等を含む。通常、プログラムモジュールの機能は、様々な実施形態において、所望に応じて結合又は分散し得る。
【００４２】
特に、本発明の実施形態は、図８に概説される以下の手順を実行するようにプログラムされるか、又は他の方法で構成されるコンピュータベースのシステム又は装置１００を提供する。
【００４３】
図８に示されるように、１０５において、データが受信され、データは、表現型を示す被験者のコホート内の突然変異を表す。１１０において、取得されたデータを使用して、プロセッサにより、各突然変異の進化作用（ＥＡ）スコアが計算される。特に、モジュール１１０は、以下に更に詳述する式（３）を計算する。１１５において、コホート内の各遺伝子について、遺伝子に見られる突然変異の計算されたＥＡスコアの各分布が特定される。次に、ＥＡスコアの特定された分布は、コホート内及びランダム分布と定量的に比較され（１２０）、比較データを確立する。比較データに基づいて、非ランダムなＥＡスコアの分布が識別される（１２５）。１３０において、識別されたＥＡスコアの非ランダム分布に基づいて、表現型へのコホート内の各遺伝子のリンクが評価されて、表現型に関連付けられた遺伝子を同定する。システム１００は、例えば、モジュール１３０において、表現型に関連付けられた、同定された遺伝子の出力を生成することができる。
【００４４】
上述したブロック（モジュール）が単なる例であり、本発明の実施形態が、上述されたブロックの数又はブロックの順序に決して限定されないことが当業者には容易に理解されるはずである。例えば、示されたブロックの幾つかは、記載される順序以外の順序で実行し得、又はより多数若しくはより少数のブロックを含み得る。さらに、本発明の実施形態のより広い範囲から逸脱せずに、様々な変形及び変更を１つ又は複数のブロックに行い得ることを理解されたい。示される流れ図の全てを実行する必要があるわけではなく、追加の流れ図を追加してもよく、又は追加の流れ図を他の流れ図で置換してもよいことも理解されたい。
【００４５】
定量的進化ツリー分析を使用して配列の機能部位を特定する方法が、２００２年１１月２７日に出願され、２００４年２月５日に米国特許第２００４／００２３２９６号明細書として公開された米国特許出願第１０／３０６，４９６号明細書に記載されている。
【００４６】
頭部及び頸部のがんを有する患者の予後を特定する方法及びコンピュータプログラム製品が、２０１３年３月１５日に出願され、２０１４年１月９日に国際公開第２０１４／００７８６５号パンフレットとして公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２３３６号明細書に記載されている。
【００４７】
タンパク質内の突然変異の表現型の影響を特定又は分類する方法、コンピュータプログラム製品、及びコンピュータシステムが、２０１３年３月１５日に出願され、２０１４年１月９日に国際公開第２０１４／００７８６３号パンフレットとして公開された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３２２１５号明細書に記載されている。
【実施例】
【００４８】
実施例１：コード突然変異の作用の測定
Ａ．論拠及び手法
１．進化作用（ＥＡ）方程式
コード突然変異は、折り畳み、動力学、標的、相互作用、及びタンパク質を機能可能にする多くの他の特徴を乱す。個々の各特徴が配列にいかに依存するかを計算する確実な方法は存在しないため、突然変異への各特徴の応答をスコア付けして、合算し、タンパク質機能への幾らかの突然変異の全体的な影響を推測することができない。
【００４９】
その代わり、本発明では、遺伝子型−表現型関係を引き合いに出すことにより、この問題への「システム」解決策が提案される。タンパク質配列（ｒ1，ｒ2，・・・，ｒn）が、γと呼ばれるタンパク質遺伝子型を定義するものとし、その機能特徴一式が、φと呼ばれるタンパク質適応表現型を定義するものとする。遺伝子型が適応をエンコードする際、進化関数ｆが存在すると仮定する。
ｆ（γ）＝φ                                                    （１）
（時間及び外部制約は暗示的である）。長い時間尺度にわたり、進化は「平滑」であるとも仮定し、したがって、ｆは微分可能であり、進化勾配
∇ｆ
が存在する。そうすると、遺伝子型摂動ｄγは、
∇ｆ・ｄγ＝ｄφ                                                （２）
により与えられる表現型応答ｄφを生じさせることになる。最後に、残基位置ｉでの単一ミスセンス突然変異の場合、摂動ベクトルｄγの唯一の非ゼロ成分は、ｉ番目の成分Δｒiであり、一次近似に向けて、式（２）は
【数２】
0006707081.tif 000003
に低減する。
【００５０】
この進化作用（ＥＡ）方程式又は単に作用は、点突然変異の適応影響を定義する。驚くべきことに、ｆは全体を通して未知のままであるが、この研究は、置換大きさのように、その導関数が有益に近似することができることをテストし、示す。そうすると、式（３）の左辺は、任意のタンパク質、配列位置、及び置換について近似されて、突然変異の有害性を提供し、正の選択を識別し、疾患遺伝子の発見をガイドすることができる。
【００５１】
他の考慮事項。式（１）は、遺伝子型−表現型結合モデルを単純に保つために、翻訳後修飾（又はエピジェネティック効果）を無視している。式（２）及び（３）は、点突然変異を進化尺度での「無限小」として見る。これが、ヒューマンスケールでのこれらのイベントの有害性を無視しないことを後に示す。
【００５２】
２．進化勾配∂ｆ／∂ｒiを測定するために
式（３）は、
∂φ／∂ｒi≒Δｆ／Δｒi                                            （４）
と書き換えることができ、したがって、偏導関数は、適応が残基ｉでの摂動に対していかに応答するかを記述する。しかし、これは、あらゆる配列位置の重要性のＥＴランクと同一であり、その理由は、突然変異が大きな系統発生変化に結合する位置ほど、ＥＴランクが良好であるためである。したがって、ＥＴを用いて勾配を近似し得、出現が新しいＥＴ法ほど正確であるため、それらの新しいＥＴ法がＥＡスコアを改善するか否かをテストすることができる（以下参照）。
【００５３】
他の考慮事項。（ｉ）機能部位及びアロステリックパスウェイを同定し、機能をブロック又は再プログラムする突然変異をガイドし、進化勾配の一般性を証明する基質特異性等のラージスケールでの機能を予測する構造的モチーフを定義した従来のＥＴ研究。（ｉｉ）ＥＴは、アラインメントの生成に十分な既知のホモログ（少なくとも１５〜２０の関連配列）を有する任意のタンパク質の任意の配列位置について計算することができる。（ｉｉｉ）ＥＴに精通した読み手は、ＥＴが０（最良）〜１（最悪）のパーセンタイルで残基の重要性をランク付けることを想起し得る。進化勾配は、
（∂ｆ／∂ｒi＝１−ＥＴランク（ｉ））
であるように逆にされる。
【００５４】
３．置換大きさの測定
式（３）中の第２項は、置換のサイズΔｒiである。Δｒiを計算するために、相対進化置換率を使用する。その論拠は、アラニン及びセリン等の生物物理的類似性及び化学的類似性が大きい、すなわち、「近い」アミノ酸ほど、いずれとも類似性が低いアスパラギン酸塩の場合よりも相互に置換する頻度が高い。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２等の転位行列は、対数オッズに関して置換の相対サイズを近似し得る。多くのタイプの置換行列があるため、どの置換行列がＥＡスコアを改善することができるかを評価する必要がある。
【００５５】
Ｂ．性能評価及びデータ例
１．実験コントロール
ＥＡを実験データセットと突き合わせて比較して、項∂ｆ／∂ｒi及びΔｒiの改善を評価する。
・Ｅ．ｃｏｌｉでの４，０４１個のｌａｃリプレッサー突然変異をβガラクトシダーゼ抑制について検査し、抑制活性が２０倍未満に落ちた場合、有害と判断し、残りを中立と判断した。図２Ａ中、ＥＡは、有害割合に相関した（Ｒ2＝０．９４）。
・３３６個のＨＩＶ−１プロテアーゼ突然変異をＧａｇ及びＧａｇ−Ｐｏｌ前駆タンパク質からの分解産物の濃度により検査し、産物がわずかであるか、又はない場合、有害と分類し、一方、残りは中立と見なされた。図２Ｃは、ＥＡが分解喪失と相関する（Ｒ2＝０．９６）ことを示す。
【００５６】
他の考慮事項。（ｉ）これらは大きな相関であるが、個々の値はビンの平均よりも散乱し得、プロットの幾つか（図２Ａ）は、線形性からのずれを示唆する。これらは、よりよいピアソン係数Ｒ2によりガイドされる進化勾配及び置換行列を更に改善する理由である。（ｉｉ）これらのテストを実行する他の大規模データセットも有し、生じ得るバイアスを低減する（バクテリオファージＴ４内の２，０１５個のリゾチーム突然変異をリゾチームの宿主細胞壁破壊に起因したプラーク形成について検査し、２，３１４個のｐ５３突然変異体をトランス活性化について検査した）。
【００５７】
２．方法論的コントロール
ＥＡをポリフェン２、ＳＩＦＴ、及びＭＡＰＰ等の他の方法と比較することもできる。一テストは、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を通して有害突然変異を分類することへの各手法の感度及び特異性を測定するというものである（図２Ｂ及び図２Ｄ）。ｌａｃリプレッサー及びＨＩＶ−１プロテアーゼに関して図２Ｂ及び図２Ｄに示されるように、ＥＡの性能は最高である。
【００５８】
他の考慮事項。上述したように、本発明者らは、ブラインドＣＡＧＩコンテストに参加した。２０１１年、８４個の突然変異体が、正常はＣＹＳ４オルソログがない場合の酵母成長の回復について、カリフォルニア大学バークレー校のＪａｓｐｅｒ  Ｒｉｎｅ博士により、２つの異なる成長条件下で検査された。２０１３年、ｐ１６突然変異体の体外活性が、異なる時点での細胞増殖をブロックする能力について、Ｍａｒｉａ  Ｃｈｉａｒａ  Ｓｃａｉｎｉらにより検査された。本発明者らによる１回の提出は、２０１１年では１番にランクされ、２０１３年では２番（トップ提出のグループは他に３つの提出を有し、そのうちの２つは最下位近くにランクされ、１つは中間であった、図３参照）にランクされた。重要なことに、全ての方法は大きなデータセットでトレーニングされた統計学的及び機械学習であり、それとは対照的に、本発明者らは本発明による分析手法を使用した。
【００５９】
Ｃ．進化勾配の近似を改善するために
１．本質的により平滑なＥＴアルゴリズム
本発明のデータ例は、∂ｆ／∂ｒiの近似に十分に確立されたバージョンのＥＴ１０８を使用した。新しい研究ほど、機能部位をよりよく同定する新規のＥＴバージョンを代わりに使用することが有利であり得ることを示唆し、その理由は、進化重要性のＥＴランクが、構造においてより平滑に分布する（すなわち、ＥＴランクのラプラシアンの二次形式が最小化される）ためである。この新しいＥＴは、タンパク質構造内の残基の接触対のランクを計算し、所与の残基についてランクの平均を出して、ＥＴランクを見つける。この対相互作用ＥＴ又はｐｉＥＴは、従来は見逃されてきた機能部位を同定し、５又は６個のトップランクの残基９１の鋳型に基づいて、構造的プロテオーム全体にわたりタンパク質機能予測を改善する。恐らく、この新しいアルゴリズムは、∂ｆ／∂ｒiをよりよく近似する一手法を提供する。
【００６０】
潜在的な危険。３Ｄ構造は利用可能ではないことがある。利用可能ではない場合、２つの対処的手法をテストすることができる。第１に、ホモロジーモデルは、例えば、ＭｏｄＢａｓｅ及びＳｗｉｓｓモデルで置換されるか、これらを用いて予め計算されるか、又はＩ−ＴＡＳＳＥＲ及びＭＵＦＯＬＤを用いて作成される。代替的には、ｐｉＥＴの予備的１Ｄ実施を使用することができる。この１Ｄ  ｐｉＥＴは、配列に沿った最近傍にわたるＥＴランクのラプラシアンの二次形式を最小化する。それ自体でなお、機能部位のＥＴ同定を大幅に上昇させることが可能であった（７４個のタンパク質のテストセットの構造を考慮した場合の２３％と比較して、これらの７４個のタンパク質のテストセットにおいてｚスコアを１５％改善）。
【００６１】
２．よりよい複数配列アラインメント（ＭＳＡ）
配列アラインメントは、ＥＴにとって重要であり、現在、各タンパク質に最適化されていない多くの選択（配列の類似性、挿入の程度、及び欠失に応じて、どのデータベース、検索及びアラインメントツール、及びどのホモログを含めるか？）を必要とする。一手法は、多種多様な配列データベース（ＮＣＢＩ非冗長データベース、Ｕｎｉｒｅｆ９０、Ｕｎｉｒｅｆ１００）への照会をＢＬＡＳＴすることであることができ、次に、配列データベースは、アラインメントのパラメータを変更させて、３つの方法：ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、及びＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａを用いてアラインすることができる。次に、各ＭＳＡの進化トレース分析の平均をとり、グローバルパーセンタイルランクを生成することができる。予備結果は、この平均が、単一の最良機能ＭＳＡと同程度良好であり、事例の７５％で任意の個々のＭＳＡよりも良好なＡＵＣをもたらすことを示す。より良好であるが、計算的需要がより高い手法は、あらゆる異なるＭＳＡから導出されるＥＴランクの平滑性を評価して、先に示されたように、構造又は配列内でどれが良好であるかを判断するというものである。
【００６２】
他の考慮事項。遺伝子複製（パラログ）は、機能的に多種多様であり得、不正確なＥＴに繋がる。この状況は通常、タンパク質ファミリ全体のトレースと、対象となるタンパク質の近傍に制限されたブランチのトレースとの相違を認識する相違ＥＴを用いて対処される。このプロセスは、固有のＥＴトレース結果を求めて系統発生学的ツリー検索をトラバースすることにより、自動化することができる。系統発生学的ツリーのノードｉの選択は、異なる配列集合に繋がり、これは、ＥＴランク（ｘj）の固有の集合に繋がる。タンパク質内の各位置のランク間の差を合算することにより、ノードｊのＥＴトレースとノードｋのＥＴトレースとを比較することができる。ｄjk＝Σi｜ｘj,i−ｘk,i｜。この関数は、ノード固有のＥＴトレース間の類似性を表す距離行列（ｄ）を提供する。次に、クラスタ化アルゴリズム（階層又は品質閾値等）を使用して、類似するＥＴシグネチャを有するノードの集合を識別することができる。これにより、クエリタンパク質により関連する、開始ツリーから明らかに異なる分析を提供するノードの識別に繋がる。
【００６３】
Ｄ．置換行列の近似を改善するために
１．より関連のある置換行列
予備置換対数オッズは、ＰＤＢデータベースの６７，０００のタンパク鎖に基づいた−サンプリングバイアスが生じた。行列が計算される配列は、対象となるタンパク質により特異的であるべきである。これは、（ａ）構造が利用可能であるか否かに関係なく、配列の参照セットを利用可能なもの全てに拡大し、（ｂ）ａ％よりも大きな配列同一性を有する配列を削除することにより、冗長性バイアスをなくし（例えば、ａ＝７５％）、（ｃ）参照配列を対象となる種のみ、多くの場合はモデル種（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハエ、カエル、ミミズ、Ｅ．ｃｏｌｉ等）に限定し、（ｄ）配列を同じＧＯ注釈の細胞位置を有するものに制限し、（ｅ）参照配列毎に、大半が機能的に関連する配列であるように、ｂ％を超える配列同一性を有する配列のみを含むＭＳＡを構築する（例えば、ｂ＝５０％）ことにより行うことができる。この手法は、対象となるタンパク質により細かく合わせられた置換行列を生成することができる。
【００６４】
２．ＥＴ依存置換行列
異なる進化勾配を有する配列位置の中で、相対置換率が同一であることは驚くべきことである。実際に、平均で、より大きなタンパク質の集合からの置換オッズは標準値に一致するが、進化勾配に応じて、この平均からの顕著なずれがある。例えば、アラニンからバリンへの置換オッズは、進化勾配が変化するにつれて、ベル型分布を形成し、アラニンからトレオニンへの置換オッズは、最初は平らであり、それから次第に小さくなり、一方、アラニンからアスパラギン酸塩への置換オッズは絶え間なく減衰する。これらのデータは、進化勾配が置換バイアスにおいて重要な因子であることを示し、本発明では、Δｒiを進化勾配−感度置換オッズにより近似することができる。予備データでは、ＥＴ依存置換行列は、ピアソンＲ2及びＡＵＣを５％〜１０％改善する。
【００６５】
他の考慮事項。（ｉ）既知又は予測される（ＡＰＳＳＰ２、ＰＳＩＰＲＥＤ、ＪＰＲＥＤ、及びＮＰＳ＠等の予測子を用いて）二次構造を説明し、三次構造に基づく溶媒露出度を説明するように、置換行列を更に改良することができる。予備データでは、これらは、有用であり、ＥＴ依存効果とは別個／相補的な変動を導入する。
【００６６】
Ｅ．ベンチマーク及び予期される結果
∂ｆ／∂ｒi及びΔｒiのこれらの近似を互いと突き合わせて及び他の方法と突き合わせて評価するために、Ｂ．１において考察したデータセットを別個のトレーニングセット及びテストセットに分割することができる。テストは以下を含む。
【００６７】
１．ピアソン線形相関の改善
ピアソンＲ2線形相関係数及びＥＡの傾きと機能喪失突然変異の割合との関係を測定することができる。信頼区間を定義するブートストラップ法により、任意の改善の統計学的有意性を評価することができる。より広くは、線形相関係数が、線形関係の尺度として最良に機能し、代わりに線形相関関数がｙ＝ｂｘaの形態である場合、乗法関係が予期され、対数変換を適用し、線形モデリング法を利用することが適切であることができることに留意する。
【００６８】
２．ＡＵＣの改善
ＲＯＣ曲線下面積は、感度（真の陽性率）と特異性（真の陰性率）との関係をプロットし、したがって、ＡＵＣは、正相関予測では０．５〜１である。ＲＯＣ及びＡＵＣに対処する統計学的方法は、ＲＯＣの分布を平均及び分散を有する正規分布として近似する（Ｐｅｐｅ２００３のセクション５．２．３の式５．２において与えられる）ことにより、十分に大きな標本サイズで、一定の偽陽性割合でのＲＯＣ曲線の信頼区間を見つけることができることを示す。経験的ＡＵＣは、ウイルコクソン順位和検定であり、したがって、この統計でも同様に信頼区間を特定することができる。さらに、より小さな標本サイズで良好に機能する、式（５．１０）により与えられる標本分散に基づいて、対数オッズＡＵＣの信頼区間を見つけることができる（Ｐｅｐｅ２００３、セクション５．２．５）。ＥＡのＡＵＣを別の方法と比較することも可能であり、信頼区間及び標本分散は、ＡＵＣでの差について、Ｐｅｐｅ２０２３、セクション５．２．６に与えられる。標本サイズが小さすぎるか、又は正規性仮定が満たされない場合、本発明では、ブートストラップ法を使用して、ＡＵＣの信頼区間を特定することができる。ＲＯＣ曲線及びＡＵＣは、ＲパッケージＲＯＣＲを使用して計算し、作成することができる。
【００６９】
３．現況技術の計算モデルとの比較
これらのテストは、ＥＡをＳＩＦＴ、ポリフェン２、ＭＡＰＰ、Ａ−ＧＶＧＤ、ＳＮＡＰ、ＭｕｔＰｒｅｄ、及び突然変異アセッサー（他の方法：ＰＡＮＴＨＥＲ、ＳＮＰｓ＆ＧＯ、ｎｓＳＮＰＡｎａｌｙｅｒ）等の他の方法と比較するのに適用することもできる。
【００７０】
他の考慮事項。（ｉ）本発明者らは、ＣＡＧＩ及びＤＲＥＡＭ等の国際ブラインドアセスメントコンテストに参加し続ける。（ｉｉ）タンパク質は多機能であり、突然変異についての特定の実験アッセイ間に相違が存在し得る。これらの問題を研究するために、後ろ向きｐ５３データセットが、ｐ５３活性の８つの異なるアッセイに対して突然変異的影響を与えることに留意する。ＥＡをそれぞれ１つ又はそれらの平均と比較することができる。これまで、最良の適応（Ｒ2＝０．９２）は平均を用いてのものである。（ｉｉｉ）異なる手法の相補性を評価することが重要である。次のセクションでは、それを行う方法について説明する。
【００７１】
Ｆ．ミスセンス突然変異の予測結合
本発明者らは、捕捉−再捕捉パラダイムに基づくｐｏｓｔＭと呼ばれる統計学的モデルを開発した。捕捉−再捕捉パラダイムとは、統計学的に厳密に有害影響の調和しない予測を結合し、その結果得られる、任意のミスセンス突然変異での機能性及び病原性の事後確率を推定する。この確率手法は、トレーニングセットも較正も必要としない。この確率手法は、異なるアルゴリズムが一致又は不一致であるデータのサブセットを分析することにより、ゴールドスタンダードがない状態で、個々の各コンピュータ内での方法の精度（感度及び特異性）と、有害である突然変異の割合を推定する。重要なことに、この枠組みにより、問い合わせられたアルゴリズムの読み取りを所与として、所与の部位での変異体が機能的に重要である事後確率を計算することができる。さらに、本発明者らは、追加の階層を導入することにより、より複雑であるが、より正確でもあるｐｏｓｔＭｕｔモデルを得た。実際には、本発明者らは、タンパク質機能に対して既知の機能的影響を及ぼすミスセンス突然変異への幾つかの適用を研究し、両アルゴリズムとも、シミュレーションデータで広くテストされ、図４Ａ及び図４Ｂに示される好都合な結果を有した。
【００７２】
他の考慮事項：ＰｏｓｔＭｕｔはバイナリ予測を結合し、一方、アルゴリズムの大半は連続スコアを提供する。本発明は、新しいアルゴリズムｐｏｓｔＭｕｔ−２においてこの欠点をなくすことができ、ｐｏｓｔＭｕｔ−２では、幾つかのアルゴリズムの連続スコアに基づいて、機能的な変異体の事後確率を推定することができる。
【００７３】
実施例２．疾患原因遺伝子の同定
Ａ．論拠：集団でのＥＡ分布
ＥＡは適応性の変化と相関するため、個人の集団は、より大きな作用を有するより少数のコード多型を有するはずである。図５Ａ（破線）は、作用（ＥＡ）の関数として、１０００ゲノムプロジェクト（ＴＧＰ）からの２６１，８９９個の固有のコード変異の頻度を示す。特に接合性、優性、遺伝的背景、又は形質関連性に関せずに、有害性の影響の他の尺度（図示せず）とは対照的に、作用分布は略指数関数的（Ｒ2＝０．９２）である。これは、集団が、適応性に伴って略指数関数的に多型を失うというＦｉｓｈｅｒの１９３０年の予測に一致するが、その実験的検証は、ゲノム変異体の適応効果のサイズに実用的な尺度がないことに起因して、今までなかった。ＥＡ分布の減衰率（λ）は、必須遺伝子（細線及び太線の実線）で大きく、切断遺伝子（点線）では低く、対立遺伝子頻度（ｖ）と対数線形である（図５Ｂ、Ｒ2＝０．９２）。これらのデータは、大きなＥＡスコアを有する変異ほど、より厳密に純化されることを示す。本発明者らの仮説は、このＥＡベースの純化パターンからのずれが、疾患に関連する異常な選択的制約を示すというものである。したがって、疾患原因突然変異、遺伝子、及びパスウェイが、それらを同定する異なるＥＡ分布を有し、ＥＡ測定が改善するにつれてより有意性を得ることをテストすることができる。
【００７４】
他の考慮事項：適応変化は、有益であってもよく、正の選択を受けることができる。しかし、ＥＡ分布の略指数関数的な減衰は、大半のコード変異が選択され、有利な突然変異はまれであり、せいぜい略中立の進化理論と一致しなければならないことを示す。
【００７５】
Ｂ．ＥＡスコアの分布に基づいて良性突然変異と疾患原因突然変異とを区別するために、まず、良性又は疾患関連のいずれかとして分類することができ、健康な患者又は罹患患者から様々にとられた突然変異及び遺伝子のＥＡスコアの分布を調べる。
【００７６】
１．データソース
ＵｎｉＰｒｏｔ（ＬＯＶＤ−Ｌｅｉｄｅｎ  Ｏｐｅｎ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ及びＨＧＭＤ−Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂｓｅ−として）は、手作業で精選(hand-curated)され、２０，３４３個のヒト遺伝子について、表現型の参照及び説明を有するとともに、多型が疾患関連であるか、それとも中立であるか、それともまだ分類されていないかを報告する。これらの遺伝子を研究して、良性突然変異及び疾患突然変異でのＥＡスコアの分布を比較することができる。例として、それぞれが複数の疾患関連変異、良性変異、及び少数の未分類変異を有する２１８個の遺伝子の集合を選択した。これらの遺伝子の中で、ＴＳＣ２（結節性硬化症２疾患）及びＰＫＤ１（多発性嚢胞腎１型）は、５２個及び９５の疾患連鎖突然変異並びに３０個及び５９個の良性変異をそれぞれ有する。
【００７７】
多くの他の遺伝子固有データベースも存在し、例えば、ＴＰ５３は、ヒトのがんで単一の最も突然変異するタンパク質であるｐ５３をエンコードし、ＩＡＲＣ（国際がん研究機関）は、ヒト腫瘍標本からの３０，０００を超えるＴＰ５３体細胞変異のデータベースを保持する。これらの突然変異は、有意性が不確かな散発性の突然変異から原因突然変異を区別するために、頻度により群化し得る。さらに、ｐ５３突然変異の略全てが、８つのｐ５３応答要素での体外トランス活性化について酵母研究で検査されている。
【００７８】
他の考慮事項：疾患関連遺伝子は、マウスの胚致死から（ｗｗｗ．ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｏｕｓｅ．ｏｒｇ）及びヒトの脳の過剰発現データから（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｘａ／）来ることもできる。良性変異のソースは、１０９２人の健康な個人で見つかったＳＮＶを含む１０００ゲノムプロジェクト（ＴＧＰ）である。これらの注釈は、全てが等しく信頼できるものではない。最良のデータは、独立したデータベースが一致する場合に現れる。
【００７９】
２．実験設計
これらのデータセットを使用して、良性突然変異と疾患関連突然変異との間でＥＡスコアの分布を比較することができる。個々の各突然変異で、ＥＡスコアを式（３）から計算し、ＥＡ十位数によりビニングすることができる。図６Ａ〜図６Ｅでの予備データは、これらの分布が大いに異なることを示す。ＴＰ５３では、頻繁に見られ（１０以上の事例）、原因である可能性が高い突然変異は、高作用にかなりスキューされ(skewed)、散発性ＴＰ５３突然変異の平らなＥＡ分布と統計学的に異なる（カイ二乗ｐ値＝９×１０-34）。ＥＡスコアの分布は、ＴＳＣ２及びＰＫＤ１の両方の疾患変異及び良性変異（ウイルコクソン順位和ｐ値＜０．０１）及びＵｎｉＰｒｏｔデータベースからの全ての２１８個の遺伝子の間（ウイルコクソン順位和ｐ値＜１０-16）でも異なる。定量的に、これらの差は２つの方法で測定することができる：各分布にフィッティングされた指数関数の減衰率λの差を用いる方法及びブートストラップ実施に続けて、信頼区間により突き止められる統計学的有意性を用いる方法。または各突然変異をＥＡスコアに基づいて良性又は有害として分類し、次に、感度−特異性ＲＯＣ（上記の実施例１参照）下のＡＵＣを測定することにより、測定することができる。このＡＵＣはそれぞれ、ｐ５３データでは０．８６であり、２１８全てのタンパク質では０．８５であり、ＳＩＦＴ、ＭＡＰＰ、ポリフェン、及びポリフェン２により達成されるよりも大きい（データは示されず）。
【００８０】
３．期待される結果
これらの研究は、ＥＡスコアが、コード突然変異の臨床的有害性の新規の尺度であることを示すはずである。疾患関連タンパク質では、低ＥＡスコアを有するコード変異体は通常、良性であり、一方、有害なものは通常、より大きなＥＡスコアを有する。これは、予備データでのＥＡスコアの逆の分布バイアス及び現在約０．８５であるＡＵＣにより反映されるように、個々の遺伝子及び遺伝子集合全体に対して該当する。これらの数字は、実施例１において上述した手順の結果として、ＥＡスコアが改善するにつれて改善することができる。
【００８１】
潜在的な危険。（ｉ）散発性突然変異が有害であることもあり、この分析の精度を下げる。これは、ＴＰ５３では、機能的影響を評価する酵母ベースの体外アッセイの網羅的なバッテリー(battery)を通して対処することができる。図６Ａ及び図６Ｂは、黒色で、ｐ５３突然変異体の有害割合（すなわち、トランス活性化の活性が平均で、８つの異なるアッセイにわたり５０％低減した）を示す。体外で機能を損なった散発性突然変異は大方、カイ二乗ｐ値２・１０-47で、大きなＥＡスコアにバイアスされた。したがって、高ＥＡスコアを有する散発性突然変異は、体外で機能的に有害であり、がんでのドライバー突然変異である可能性が高い。
【００８２】
Ｃ．疾患原因遺伝子を同定するために
これより、同一の疾患診断を有する患者のコホート内での突然変異のＥＡスコアの分布を調べる。そのようなコホートでは、繰り返し突然変異した遺伝子が原因であると考えられる。ＥＡスコアもこれらの遺伝子を検出するか否かをテストすることができる。データ例を図９Ａ〜図９Ｄに示す。
【００８３】
１．データソース
がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）は現在、２９の腫瘍型からの約１０，０００のゲノムを含んでいる。国際がんゲノムコンソーシアム（ＩＣＧＣ）は、１８の腫瘍型からの１１，６３３のがんゲノムを含んでいる（データリリース２０１４年５月１６日）。既知のがん遺伝子のリストががん遺伝子調査（ＣＧＣ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ）から取得可能であり、ＣＧＣは現在、５２２のがん遺伝子をリストしている。
【００８４】
２．実験設計及びデータ例
がんでの疾患原因遺伝子を同定するために、疾患コホート内の各遺伝子で見られる突然変異のＥＡ分布を、遺伝子が疾患に関連しない場合に予期される分布と比較することができる。参照セットは、ｉ）標準遺伝コードに従ったランダムヌクレオチド変化の翻訳により取得される、同じ遺伝子でのランダム突然変異、ｉｉ）ＴＧＰデータ（大半が健康な患者）からの同じ遺伝子での突然変異、及びｉｉｉ）ＴＣＧＡデータ内の任意の遺伝子で見られる全てのミスセンス変異を含む。
【００８５】
全てのＴＧＰコード変異体の背景ＥＡ分布（図９Ａ）は、図５Ａの破線曲線（「全ての遺伝子」）のベースである。ＴＣＧＡからの全ての体細胞がん突然変異の同じ分布は、はるかに小さな指数関数的減衰率（λ＝０．０１１）を有し、これは、ヌクレオチドがランダムに突然変異するシミュレーション分布から区別不可能である（図９Ｃ、図により、がん細胞での大半の遺伝子変化はランダムである）。腫瘍サプレッサーＴＰ５３及びがん遺伝子ＰＩＫ３ＣＡの分布は劇的に異なり（図９Ｄ）、高及び中ＥＡスコアにそれぞれ強くバイアスされる。これはまた、同等のＴＧＰ分布及びがんに関連しないＴＣＧＡ内の最も頻繁に突然変異する遺伝子であるＤＮＡＨ５とは明らかな対照をなす。これらの結果例は、がん遺伝子のＥＡ分布と非がん遺伝子のＥＡ分布とを比較して、がん関連遺伝子を同定する遺伝子変化の優先的選択を検出可能なことを示唆する。
【００８６】
３．統計
二標本コルモゴロフ−スミルノフ検定（ｑ値、図９）、ウィルコクソン順位検定、及びアンダーソン−ダーリング検定を用いて分布を比較することができる。コルモゴロフ−スミルノフは、古典的な検定であるが、漸近分布に基づいて計算される臨界値に頼り、したがって、小さな標本サイズを有する遺伝子は問題になるおそれがある。アンダーソン−ダーリング検定は、一般により強力であり、小さな標本サイズで有用であるが、コルモゴロフ−スミルノフ統計よりも遅い。ウィルコクソン順位検定も有用であり、その理由は、個々の観測の影響をあまり受けず、メジアンの差への感度が高い（コルモゴロフ−スミルノフは、分布のあらゆる差に対する感度が高い）ためである。
【００８７】
他の考慮事項。これらの結果例は、ＥＡががん遺伝子から腫瘍サプレッサーを区別し得ることも示唆する。ＴＰ５３のＥＡ分布は、高ＥＡ突然変異に向けて強くバイアスされ、その理由は恐らく、これらが遺伝子の腫瘍抑制機能を非活性化し、選択的成長利点をがん細胞に提供するためである。しかし、ＰＩＫ３ＣＡの場合、中ＥＡ値を有する突然変異が優先され、よりマイルドな影響で増強され、機能獲得突然変異であるが、機能を全てノックアウトするほどは強くない選択有利性ががん遺伝子で生じることを示唆する。
【００８８】
Ｄ．特定のがんへの適用
１．頭部及び頸部のがん
これらのＥＡ分布差を適用して、がん原因遺伝子を同定することができる。頭部及び頸部の扁平上皮がん（ＨＮＳＣ）でのＴＣＧＡからのデータ例は、３０６人の患者からの４２，２３６個のミスセンス突然変異を使用するプロセスを示す。
【００８９】
二標本コルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）検定をＨＮＳＣ突然変異の場合のＥＡスコアの各遺伝子の分布と、体細胞突然変異の場合の参照ＥＡ分布との間に適用する（ＴＣＧＡ  ＨＮＳＣデータ内の任意の遺伝子で見られた全てのミスセンス変異を使用した）。これは８８の遺伝子をもたらし（ｐ値＜０．０１）、そのうちの１５個は、文献内の頭部及び頸部のがんに関連付けられ（ＴＰ５３、ＰＩＫ３ＣＡ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＦＥ２Ｌ２、ＨＲＡＳ、ＦＢＸＷ７、ＥＰ３００、ＭＹＨ９、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＡＳＰ８、ＮＳＤ１、ＲＡＣ１、ＭＡＰＫ１、ＦＡＴ１、及びＰＴＰＲＴ）、さらに７個の遺伝子は、他のがんに関連付けられているが、今のところＨＮＳＣには関連付けられていない（ＥＰＨＡ３、ＳＭＡＲＣＡ４、ＤＦＮＡ５、ＰＰＦＩＡ１、ＣＵＬ３、ＤＯＣＫ２、及びＺＮＦ２１７）。
【００９０】
潜在的な危険。複数仮説検定が懸念される。ＨＮＳＣ遺伝子及び他のがん関連遺伝子のかなりの豊富さにも拘わらず、ベンジャミニ−ホッホバーグの方法（１９９５年）に基づいてｐ値を誤り発見率（ｑ値）に変換して、複数の検定を補正する場合、上位５つのみの十分に確立されたＨＮＳＣ原因遺伝子が有意なまま残る：ＴＰ５３（ｑ値＝７．２×１０-44）、ＰＩＫ３ＣＡ（ｑ値＝２．７×１０-4）、ＮＯＴＣＨ１（ｑ値＝２．８×１０-3）、ＮＦＥ２Ｌ２（ｑ値＝３．４×１０-3）、及びＨＲＡＳ（ｑ値＝５．６×１０-2）。１０個の既知のＨＮＳＣ遺伝子及びさらに７つの既知のＣＡ遺伝子の消失は、この複数検定手法が保守的すぎることを示唆する。この問題に対処するために、次に、８８個の遺伝子のリスト内の機能的結合の有意性に目を向ける。
【００９１】
２．遺伝子クラスタ化統計
２つの手法は、がんドライバー遺伝子候補リスト（Ｌ）が、ＳＴＲＩＮＧ（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら、２０１３年）等のタンパク質間相互作用ネットワークよりも豊富であるか否かをテストすることができる。第１に、所与の次数配列を有するランダムグラフ（ＲＧＧＤＳ：Ｒａｎｄｏｍ  Ｇｒａｐｈ  ｗｉｔｈ  Ｇｉｖｅｎ  Ｄｅｇｒｅｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら、２０１３年）と呼ばれ、参照（Ｍａｓｌｏｖ＆Ｓｎｅｐｐｅｎ、２００２；Ｐｒａｄｉｎｅｓら、２００５年）と同様の、所与のリスト内のタンパク質の次数分布を保存するランダム背景モデルを選ぶことができる。強力なエッジエンリッチメントは、リストＬ内のタンパク質に接続する、少なくとも観測数ｘのエッジを有するＲＧＧＤＳを標本化する低確率に対応する。ＸLをＬと同様のサイズを有するＲＧＧＤＳ内のタンパク質に接続するエッジの数を示す確率変数とする。そうすると、確率（ｐ値）は、ＳL（ｘ）＝Ｐ（ＸL≧ｘ）と書かれる。Ｌが大きい場合、ＸLは、累積確率関数Ｐ（ＸL≧ｘ）を明示的に書くことができるポアソン確率変数で近似することができる。
【００９２】
第２に、独立した評価として、リストＬ内のがんドライバー遺伝子候補が、クラスタ化する傾向を有するか否かを判断することができる。グラフ拡散モデルは、特定のクラスに属する遺伝子群、この場合「がん候補遺伝子」の注釈をＳＴＲＩＮＧ等のタンパク質間相互作用ネットワークを介して伝搬させて、関連遺伝子を暗示する。リストＬの高度にクラスタ化したメンバは、リストＬからのテストされた各候補遺伝子が、「抜か」れ、テストされて、その遺伝子が、リストＬからの残りの候補遺伝子を使用してネットワーク拡散により予測されたか否かを調べる一個抜き交差検証から見つけることができる。拡散スコアが、ネットワーク内の全ての遺伝子の拡散スコアの平均の１標準偏差上よりも大きい場合、クラスタの一部であると見なされる。最後に、一個抜き分析が、ＳＴＲＩＮＧネットワークからランダムに選択された等しい数の遺伝子に関して、遺伝子リストＬの統計学的に有意なエンリッチメントになるか否かをテストするために、各事例でクラスタ化する遺伝子の割合を比較することができる。ＳＴＲＩＮＧネットワーク内のランダムな遺伝子セットのクラスタ化を推定するために、このプロセスを少なくとも１０００回繰り返すことができる。
【００９３】
実際に、ＴＣＧＡからの頭部及び頸部の扁平上皮がん（ＨＮＳＣ）の分析から得られるがん遺伝子候補を１０〜１００個の遺伝子の範囲のランダム遺伝子セットと比較した（図１０）。ＨＮＳＣ遺伝子５０個未満の任意の数の場合、クラスタ化の割合は、同数のランダムに選択された遺伝子の場合のクラスタ化の割合から少なくとも３．２６標準偏差、離れていた。これは、一個抜き分析が、がんへの関連が予測された遺伝子を分けるｐ値のカットオフにある程度の信頼性を提供することを強く示唆する。（上位５つの遺伝子が除去される場合、クラスタ化は有意なままである（１．９５標準偏差））。
【００９４】
予期される結果及び追加の指示。これらの研究は、ＥＡスコアの分布が、機能関連性から生じる有意性の追加を伴って、突然変異頻度に大方基づく方法が同定できない潜在的ながん原因遺伝子を同定する新規の手法を提供することを示すことができる。そして、これらの遺伝子は、実験テストの候補である。追加の指示として、同方法は、がん以外の複雑な遺伝性疾患への遺伝子の関連性（又は非関連性）に適用することもできる：各多型の対立遺伝子頻度及び異なる人種群間の多様性を考慮に入れて、疾患コホート内で見られる生殖細胞系列突然変異の作用をＴＧＰ内で観測される突然変異の作用と比較することができる。
【００９５】
他の考慮事項。（ｉ）これは、ＭｕｔＳｉｇ及び他の技法のように、他のタイプの突然変異を考慮に入れていない。しかし、他のパラメータ（ナンセンス突然変異、ＫA／ＫS比検定等）を有するＥＡスコアを機械学習スキーマに組み込み、がん関連遺伝子を優先することができる。（ｉｉ）より気がかりなのは、多くの遺伝子が、多くの他の遺伝子での突然変異によりパスウェイが乱されるため、疾患に散発的に寄与し得ることである。次のセクションでは、希に突然変異する遺伝子及びそれらの基本のパスウェイを同定する更なる指示について概説する。
【００９６】
Ｅ．疾患原因パスウェイの同定
他の遺伝子と相乗的にがんに影響を及ぼす遺伝子を同定するために、パスウェイスケールで突然変異バイアスを分析することができる。機能関連遺伝子の群は、個々には低頻度であるが、集合的には十分に高頻度で突然変異し得、高作用に向けてバイアスされる。例えば、これは、細胞の特定の機能へのダメージが、がんに利点を与えるが、突然変異時、機能を妨害することが等しく可能な複数の遺伝子がある場合、生じ得る。略１５００のパスウェイ及び約７０００個の遺伝子で構成される、手作業で精選された、専門化により評価されたパスウェイデータベースであるリアクトームデータベースを使用して、本発明の実施形態は、図１１Ａ〜図１１Ｄに示されるような高作用突然変異に向かうバイアスを有する機能関連遺伝子群を同定することができる。このパイプラインは、患者コホート内の少なくとも１つの体細胞ミスセンス突然変異を含む２個以上の遺伝子からなる全てのリアクトームパスウェイを考慮する。高頻度ドライバーの再発見を回避するために、全てのパスウェイは、単一遺伝子分析で有意である遺伝子の寄与なしで考慮された。次に、各パスウェイは、がんでの全てのミスセンス突然変異を参照として用いるコルモゴロフ−スミルノフ二標本検定により特定されるように、突然変異が、群として高作用に有意にバイアスされるパスウェイ内の遺伝子のサブセット（「モジュール」）があるか否かを識別するように最適化される。次に、同サイズのランダムにシミュレートされたパスウェイの最適化から得られたモジュールの少なくとも９５％よりも有意なモジュールは、対象となる遺伝子モジュールであると見なされる。次に、この候補遺伝子群の正の選択は、非候補遺伝子群と比較した、候補遺伝子群での有意に増大したミスセンス：沈黙突然変異比を通して確認される。この方法により、現在の計算方法が見逃す低頻度ドライバー遺伝子を同定することができるのみならず、これらの突然変異により最も妨げられる生物学的プロセスを同定することもできる。この手法は、単一遺伝子及びパスウェイレベルの両方での新しい薬剤標的を提供するとともに、効率的な患者層別化の新しいマーカーを示す。
【００９７】
図１１Ａは、リアクトームデータベース内の７０６０個の遺伝子での全てのＴＣＧＡ  ＨＮＳＣＣ体細胞突然変異の進化作用分布を示す。図１１Ｂは、ＨＮＳＣＣでのリアクトームパスウェイ「セマフォリンシグナリングでのＳｅｍａ４Ｄ」（ＲＥＡＣＴ＿１９２５９．１）の進化作用分布を示す。パスウェイは、２７個の遺伝子及び１１１個のミスセンス体細胞突然変異を含む。この場合でのパスウェイの最適化は、高作用突然変異の大部分を占め、高作用に向けて有意にバイアスされた（ｐ＝１．０８ｅ−７）、１２個の遺伝子及び５８の突然変異（図１１Ｄ）の「コアモジュール」を同定し、一方、除外遺伝子（図１１Ｃ）は、低作用突然変異の大部分を占める。
【００９８】
図１２Ａ〜図１２Ｂは、「コアモジュール」へのサポートを示すグラフである。図１２Ａは、コアモジュール遺伝子の進化作用分布の積層ヒストグラムである。コアモジュール遺伝子のうちの２つ：ＳＥＭＡ４Ｄ（Ｂａｓｉｌｅら、２００６年；ＰＭＩＤ：１６７５４８８２）及びＭＹＨ９（Ｓｃｈｒａｍｅｋら、２０１４年；ＰＭＩＤ：２４４３６４２１）は、文献において、このがんのドライバー遺伝子として実験的に検証されたが、今まで計算的に決して予測されてこなかったと考えられる。このパスウェイ方法は、単一の突然変異のみを用いて、ＳＥＭＡ４Ｄを正確にがん遺伝子として同定する（作用＝５３．２４）とともに、ＭＹＨ９も正確に腫瘍サプレッサーとして同定する（メジアン作用＝８１．０７）。図１２Ｂでは、１２個の候補遺伝子が、ＳＴＲＩＮＧ作用図、高信頼モードで示される。１２個全ての遺伝子は、セット内の少なくとも１つの他の遺伝子と相互作用することが実験的に確認されている。
【００９９】
実施例３：ＫＥＬＣＨ突然変異
進化作用手法は、マラリアに関連するタンパク質の突然変異の研究に利用されてきた。
【０１００】
図１３は、熱帯熱マラリア原虫のＫｅｌｃｈタンパク質（ＰＦ３Ｄ７＿１３４３７００）での突然変異を示す。文献では、６３個のＫｅｌｃｈ突然変異が、４つの論文で報告された：ｉ）Ａｓｈｌｅｙら、２０１４年、ｉｉ）Ａｒｉｅｙら、２０１４年、ｉｉｉ）Ｓｔｒａｉｍｅｒら、２０１４年、ｉｖ）Ｔａｙｌｏｒら、２０１４年、及びｖ）Ｔａｋａｌａ−Ｈａｒｒｉｓｏｎ、２０１４年。突然変異は、以下のタイプの突然変異を含む：１）ナンセンス突然変異１、沈黙突然変異８、及びミスセンス突然変異５４。５４のミスセンス突然変異のうち、１７は耐性、１９は感受性、及び１８は未知である。ここで、「耐性」とは、アルテミシニンに関して寄生虫クリアランス半減期＞５を示すものとして定義され、「感受性」とは、アルテミシニンに関して寄生虫クリアランス半減期＜５を示すものとして定義され、「未知」は、アルテミシニンに関して寄生虫クリアランス半減期の乗法が利用可能ではないことを示す。
【０１０１】
図１４は、突然変異の機能的影響を示す。ここで、遺伝子型と表現型との正式な摂動式が、適応性へのタンパク質コード変異の進化作用を特定する。進化重要性は、あらゆる配列位置で別個に、本明細書に記載の進化トレース（ＥＴ）手順を用いて計算される（図１４、左上パネル、「部位の進化重要性」）。ＥＴ手順は、所与のアミノ酸配列位置での突然変異が、大きな進化ジャンプ（脊椎動物から無脊椎動物）にリンクされるか、それとも小さな進化ジャンプ（狼から犬）にリンクされるかを教える数字を生成する。大きなジャンプは、全体的な生物の「適応性」が、そのタンパク質でのその部位での突然変異の影響をかなり受けやすいことを示唆する。小さなジャンプは、逆、すなわち、適応性が、そのタンパク質のその部位での突然変異の影響を受けにくいことを示唆する。
【０１０２】
置換大きさは、コード突然変異により導入される摂動のサイズを測定する（図１４、左下パネル、「部位での置換大きさ」）。アランからバリンへは小さく、アラニンからリジンへは大きい。したがって、置換尺度を使用して、この値を計算する。微妙なことは、プロテオームの大部分にわたり計算されるこれらの置換尺度が、考慮下の部位の進化重要性に依存することである。
【０１０３】
図１４に概略的に示されるように、進化作用は、進化重要性と置換大きさとの積である。この積は、数量ｙの、別の数量ｘが変化し、これら２つがｙ＝ｆ（ｘ）であるような関数ｆにより関連する場合の変化を近似する一次摂動式を反映する。解は、ｄｙ＝ｆ’（ｘ）・ｄｘである。ｘが遺伝子型であり、ｙが適応性である場合、ｆはＥＴにより計算される進化重要性であり、ｄｘは置換大きさである。それらの積は、第一近似へは、ｄｙであり、これは、突然変異ｄｘの作用から生じる適応変化である。関数ｆ自体は、解かれないままであり、遺伝子型ｘを表現型／適応性ｙに結び付ける「進化関数」である。驚くべきことは、進化勾配ｆ’が容易に計算されることである。結果は、適応へのコード突然変異の進化作用の基本摂動式である（図１４、右パネル、「進化作用又は適応影響」）。
【０１０４】
図１５Ａ〜図１５Ｄは、Ｋｅｌｃｈ突然変異の進化作用分布及びそれらの解釈を示す。図中、ＫＳスコアは、ｉ）ランダムヌクレオチド変化（「ＫＳランタ゛ム」）及びｉｉ）１０００ゲノムプロジェクトで見つけられた多型（「ＫＳ1000G」）の作用分布と各作用分布を比較した場合のコルモゴロフ−スミルノフｐ値である。耐性突然変異は、有意な正の選択（非ランダム及び非多型）を示す。
【０１０５】
Ｋｅｌｃｈ機能に影響を及ぼす突然変異が中−高作用を有し、Ｋｅｌｃｈ機能に影響を及ぼさない突然変異が、低−中作用を有すると仮定した。図１５Ａ〜図１５Ｄに示される分布の解釈の結果は、以下を示唆する。
ｉ）５４のミスセンスＫｅｌｃｈ突然変異は、低又は高作用へのバイアスを有さない（図１５Ａ）。
ｉｉ）１７の耐性Ｋｅｌｃｈ突然変異は、中−高作用を有し、Ｋｅｌｃｈ機能の有意摂動に一致する（図１５Ｂ）。
ｉｉｉ）１９の感受性Ｋｅｌｃｈ突然変異は、低−中作用を有し、略中立に一致する（図１５Ｃ）。
ｉｖ）未知の表現型を有する１８のＫｅｌｃｈ突然変異は、低作用、中作用、及び高作用に分けることができる（図１５Ｄ）。
【０１０６】
図１５Ｄに示されるように、ＥＡ手順は、例えば、４つの未知の突然変異が高作用スコア（１００十分位数で）有することを明らかにした：Ｇ４４９Ｄ、Ｇ５５４Ｒ、Ｇ５４４５Ｅ、及びＧ６３８Ｒ。これは、ＥＡ手順の有用性の一実証である。４つの未知の突然変異は、例えば、Ｋｅｌｃｈ機能での各役割を解明するために、更なるテストの候補である。
【０１０７】
図１６Ａ〜図１６Ｃを参照すると、これらの図は、進化作用スコアと寄生虫クリアランス半減期との相関を示す。図１６Ａは、熱帯熱マラリア原虫のＫｅｌｃｈ突然変異の場合のＥＡスコア（バープロット）が重ねられた寄生虫クリアランス半減期測定値（ドット）を示す。図１６Ｂ及び図１６Ｃは、図１６Ａの寄生虫クリアランス半減期と作用スコアとの関係を示す。作用スコアが十位数でビニングされる場合（図１６Ｃ）、寄生虫クリアランス半減期と突然変異の作用スコアとの線形関係が現れる。
【０１０８】
図１７Ａ〜図１７Ｄは、熱帯熱マラリア原虫のＫｅｌｃｈ突然変異での地理的地域による進化作用分布を示す。図は、異なる地理的地域に見られる突然変異において、異なる作用分布が見られうることを示す。例えば、図１７Ｂは、カンボジア及びガンビアでの突然変異（Ａｒｉｅｙら、２０１４年）が、典型的な機能獲得分布を形成するように見えることを示す。さらに、図１７Ｃに示されるように、サハラ以南の突然変異（Ｔａｙｌｏｒら、２０１４年）は、ガンビアよりも影響性の高い突然変異及び影響性の低い突然変異の両方を含むように見える。図１７Ｄに示されるように、東南（ＳＥ）アジアの突然変異（Ａｓｈｌｅｙら、２０１４年）は、中−高作用突然変異と低作用突然変異との混合であるように見える。
【０１０９】
実施例４：適応性のタンパク質コード変異の進化作用
Katsonis,P.及びLichtarge,O.著、「A formal perturbation equation between genotype and phenotype determines the evolutionary action of protein coding variations on fitness」Genome Res.は、印刷されたジャーナルよりも先に、２０１４年９月１２にオンラインで公開された。
【０１１０】
序論
遺伝子型突然変異と表現型変異との関係は、短期では健康、長期では進化を決定し、適応への突然変異の作用によって決まる。しかし、この作用の特定での基本的な難しさは、複雑で、多くの場合には不可解な各突然変異の独自の状況に依存することである。その結果、分子機能及び適応全体への大半のゲノム変異の影響は、未知のままであり、適応効果を多型頻度にリンクする集団遺伝学理論から距離を置いている。ここで、本発明者らは、進化が連続であり、遺伝子型を表現型に結合する区別可能な物理プロセスであると仮定する。これは、適応へのコード突然変異の作用の公式へと繋がり、突然変異した部位の進化重要性と、アミノ酸類似性の差（difference in amino acid similarity）との積として解釈することができる。これらの項の近似は、系統発生配列分析から容易に計算可能であり、本発明者らは、この作用方程式が、多種多様なタンパク質での生体内及び生体外での点突然変異の影響を予測し、疾患原因遺伝子突然変異を発病率に相関付け、ヒトのコード多型の頻度を特定することの突然変異的、臨床的、及び集団遺伝学的エビデンスをそれぞれ示す。したがって、初歩的な微積分及び系統発生学を統合して、点突然変異を機能及び適応に定量的にリンクし、生物学の方程式に新しい分析の枠組みを開く、遺伝子型と表現型との進化関係の摂動分析にすることができる。実際に、この研究は、分子進化を、タンパク質再設計からヒトの遺伝変異の臨床評価までの用途を有する集団遺伝学に明示的に橋渡しする。
【０１１１】
各出生は、数世代にわたり、ランダムに選ばれた個人間で現在、４００万のＤＮＡ差に繋がった約７０の新しいヒト遺伝突然変異をもたらす。挿入、欠失、コピー数変異、及び染色体再編の他に、遺伝子変化は、ヒトのエクソーム当たり略１０，０００個のアミノ酸置換に翻訳される単一ヌクレオチド置換を含む。これらのタンパク質コード変異体は、適応に影響を及ぼし得、既知の疾患突然変異の８５％を占め、２５００を超える病気に関連する。それにも関わらず、関連研究は、疾患感受性のごく僅かな部分しか説明せず、個人的突然変異及び一般的突然変異の両方の役割は曖昧なままである。したがって、計算手法は、タンパク質機能の生物物理的、統計学的、及び機械学習的モデルの制限内で、どのコード変異が疾患の原因であるかを識別することを目的とする。これと並列して、大規模な理論が、突然変異の拡散及び固定、様々な集団サイズ及び適応効果でのそれらの分布、並びに選択又は浮動がそれらの運命を支配するか否かをモデリングする。しかし、適応への突然変異の作用の実用的な測定なしでは、理論を遺伝情報の大量流入に適用することはできない。
【０１１２】
ここで、進化が無限小突然変異ステップで進むという視点に従い、適応への突然変異の進化作用の方程式を提案する。この作用方程式は、現在のモデルよりも単純であり、略中立の進化理論と、物理系がいかに進化して、最小作用のパスを辿るのかを記述する物理学の基本変分原理と両立する遺伝子型−表現型関係のモデルから導出される。計算された進化作用は一貫して、後向き評価及び前向き評価の両方で突然変異の影響を予測する最も洗練されたホモロジーベース又は機械学習の方法で首位を占めた。後向き検証は、（１）分子機能の実験アッセイ、（２）ヒトの疾患関連性、及び（３）集団規模の多型の大きなデータセットを取り込んだ。前向き検証は、シスタチオニンβ−シンターゼの酵素活性への８４突然変異の影響を推定する予測子に挑戦するＣＡＧＩ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ）コミュニティコンテストを取り込んだ。進化作用サーバには、ｈｔｔｐ：／／ｍａｍｍｏｔｈ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／においてアクセス可能である。
【０１１３】
結果
遺伝子型−表現型摂動方程式
突然変異を評価するために、表現型を妨げ得る小さな遺伝子型摂動として各突然変異を扱う。タンパク質Ｐの場合、遺伝子型γはｎ子の残基（ｒ1，ｒ2，・・・，ｒn）Pの配列であり、グローバル適応表現型は、環境内の有機体の生き残り及び繁殖に影響を及ぼすＰの全ての構造的属性、動態属性、及び他の機能属性を統合するスカラー数量φである。種は時間の経過に伴って浮動又は適合するため、γ及びφは変化し、ｆ（γ）＝φであるような多変量進化適応関数ｆにより互いに結合され、ここで、時間及び自然淘汰制約は暗黙的である。本発明での中心仮説は、ｆが存在し、区別可能であるというものである。ｆが存在し、区別可能である場合、小さな遺伝子型摂動ｄγは、
ｄφ＝∇ｆ・ｄγ                                                    （５）
により与えられるグローバル適応表現型変異ｄφをトリガーし、式中、∇ｆはｆの勾配であり、・はスカラー積を示す［上記式（２）も参照のこと］。
【０１１４】
実際に、配列位置ｉでのアミノ酸Ｘから任意の他のアミノ酸Ｙへの単一ミスセンス突然変異の表現型変異を考慮する。そうすると、遺伝子型摂動は、Δｒi,X→Yと示されるその置換大きさに低減され、勾配は、∂ｆ／∂ｒiと示されるｉ番目の成分の進化適応関数の偏導関数に低減する。この最後の項は、位置ｉでの変異へのグローバル適応表現型の感度であり、暗黙的に、ｉでの状況依存性の一部、すなわち、その位置の構造的役割及び機能的役割を説明する。状況依存性の残りは、他の突然変異との上位相互作用を明示的に表すより高次の他の項に存在するはずである。簡易化するために、これらの項を無視し、それにより、種の参照遺伝子型への単一置換の進化作用（ＥＡ又は単に作用）は一次になる［上記式（３）も参照のこと］。
【数３】
0006707081.tif 000004
【０１１５】
この低減された形態において、進化作用方程式は、点突然変異が、適応を現在位置から突然変異の大きさ及びその部位での進化適応勾配に比例して変位させることを述べる（図１８Ａ）。この差示的発現は、項を進化データから評価することができるため、有用である。
【０１１６】
図１８Ａ〜図１８Ｄは、本発明の実施形態において利用される進化作用方程式の計算を示す。図１８Ａは、残基Ｒ１７５の進化重要性及びその位置でのアルギニン−ヒスチジン置換大きさからの、ＴＰ５３遺伝子でのＲ１７５Ｈ等の突然変異の進化作用の計算の図である。図１８Ｂでは、配列アラインメント及び関連する進化ツリーは、基本的遺伝子型変化に起因する表現型的変化として定義されるタンパク質残基の進化適応勾配が、その位置で異なる進化分岐間の系統発生距離に応じて、大きくなる（太線）か、又は小さくなる（細線）ことを示す。進化トレースは、残基変異を系統発生分岐に相関付けることにより、配列位置の機能重要性をランク付ける（Ｌｉｃｈｔａｒｇｅら、１９９６年；Ｍｉｈａｌｅｋら、２００４年）ため、ＥＴを用いて進化適応勾配を推定することができる。
【０１１７】
図１８Ｃでは、略６７，０００のタンパク質配列アラインメントから計算された行列が、突然変異部位での進化勾配十位数（最も可能性の高い置換は明るいグレーであり、最も可能性の低い置換は濃いグレーである）に依存し、標準ＢＬＯＳＵＭ６２（直線）と比較された、アラニンから他のアミノ酸（単一文字コードでの）への相対置換オッズを表示する。単一文字コードは、Ａ：アラニン、Ｗ：トリプトファン、Ｆ：フェニルアラニン、Ｙ：チロシン、Ｌ：ロイシン、Ｉ：イソロイシン、Ｖ：バリン、Ｍ：メチオニン、Ｃ：システイン、Ｈ：ヒスチジン、Ｔ：トレオニン、Ｇ；グリシン、Ｐ：プロリン、Ｑ：グルタミン、Ｎ：アスパラギン、Ｓ：セリン、Ｄ：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｋ：リジン、Ｒ：アルギニン。図１８Ｄでは、勾配固有（棒）、非固有（破線）、及びＢＬＯＳＵＭ６２（直線）の置換オッズが、バリン（Ｖ）、トレオニン（Ｔ）、及びアスパラギン酸塩（Ｄ）へのアラニン置換の場合について示される。
【０１１８】
進化適応勾配∂ｆ／∂ｒiを測定するために、進化ツリー（ＥＴ）法を用いて、あらゆる配列位置の重要性をランク付ける（Ｌｉｃｈｔａｒｇｅら、１９９６年；Ｍｉｈａｌｅｋら、２００４年；Ｗｉｌｋｉｎｓら、２０１３年）。定義により、勾配は、座標に関する機能の感度の比率である。ここで、∂ｆ／∂ｒiは、突然変異ステップに関するグローバル適応表現型の感度であり、又は単に変異で観測された適応差である。この定義はＥＴを指し、ＥＴは、タンパク質ファミリの配列アラインメント内のあらゆる位置を、大半が優性（又は劣性）進化分岐間で変化する場合に重要性が高い（又は低い）とランク付ける。そのような進化分岐距離は適応性を反映するため、実際には、ＥＴ及び進化勾配は等しい概念であり、∂ｆ／∂ｒiの近似にＥＴランクを選び得る（図１８Ｂ）。進化重要性の頻繁でより単純な尺度は、残基保存性であるが、保存性は、導関数というよりはむしろ平均であり、実際にＥＴよりも精度が低い。その点から見れば、従来のＥＴ研究は既に、進化勾配の幅広い用途を示してきた：ＥＴは、機能部位及びアロステリックパスウェイ残基を同定し、機能を阻害又は再プログラムする突然変異を誘導し、基質特異性等のラージスケールで機能を予測する構造的モチーフを定義する。
【０１１９】
置換大きさΔｒi,X→Yを測定するために、これらの置換の相対進化オッズを使用する。例えば、アミノ酸アラニンは、セリンへの生物物理学的及び化学的類似性がより大きいことを踏まえて、アスパラギン酸塩よりもセリンにより頻繁に置換される。概念上は独立しているが、本発明者らは、位置の勾配が置換オッズを強くバイアスすることを見出す。例えば、標準の均一な置換値と比較して、大きな勾配を有するアラニン位置は大方、小さな中立アミノ酸への置換に耐えるが、小さな勾配を有するアラニン位置は、大きな極性又は荷電したアミノ酸への置換を強く優先する（図１８Ｃ）。これらの傾向は、あらゆるアミノ酸対に固有である：アラニンからバリンへの置換オッズは、突然変異した位置での進化勾配が最小から最大に変化するにつれて、ベル形分布を形成し、アラニンからトレオニンへの置換オッズは、はじめは平らであり、それから次第に小さくなり、一方、アラニンからアスパラギン酸塩への置換オッズは、常に減衰する（図１８Ｄ）。これらの発見は、構造特徴への置換の依存性とは異なり、構造特徴への置換の依存に対して相補的でもある。各配列位置での進化勾配が置換バイアスにおいて重要な因子であることを示す。したがって、本発明では、Δｒi,X→Yを進化勾配感度−置換オッズで近似する。
【０１２０】
タンパク質機能の実験的喪失との進化作用の相関
図１９Ａ〜図１９Ｅは、実験的影響との突然変異作用の相関を示す。各図は、ＥＡ方程式である式（６）から予測された作用をｘ軸に沿って示し、（１９Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡタンパク質の１３個の点突然変異での組換え活性の平均喪失、（１９Ｂ）β−ガラクトシダーゼ抑制アッセイでのＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃリプレッサーでの４，０４１個の点突然変異の非機能割合（Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚら、１９９４年）、（１９Ｃ）プラーク形成アッセイでのバクテリオファージＴ４リゾチームでの２．０１５個の点突然変異の非機能割合（Ｒｅｎｎｅｌｌら、１９９１年）、（１９Ｄ）基質分解での３３６個のＨＩＶ−１プロテアーゼ点突然変異の非機能割合（Ｌｏｅｂら、１９８９年）、及び（１９Ｅ）８個の応答要素にわたる酵母で調査された２，３１４個のヒトＴＰ５３点突然変異の平均トランス活性化活性（Ｐｅｔｉｔｊｅａｎら、２００７年）として実験的に測定された活性又は適応の割合をｙ軸に沿って示す。データは活性十位数にビニングされ、Ｒ2値は、線形フィッティング後のピアソン積−モーメント相関係数を示し、平均の標準誤差は、誤差バーを用いて示される。
【０１２１】
十分に大きな進化ツリー、通常、様々な種からの２０を超える配列を有するタンパク質での任意の突然変異では、ここで、∂ｆ／∂ｒi及びΔｒi,X→Yの近似を適用して、中立値０から最大影響値１００まで正規化された進化作用を評価し、次に、この作用を実験的に観測された機能及び機能の相対変化と比較することができる。まず、進化作用は、ピアソンＲ2相関係数０．８７で、野生種に相対して３１個のＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ点突然変異でのＰ１ファージ媒体形質導入により、生体内で測定されたＤＮＡ組換えの平均喪失と線形相関する（図１９Ａ）。さらに広く見れば、より大きな独立したデータセットでは、進化作用と、生体内での機能不全突然変異体又は生体外での活性の平均喪失との相関は、β−ガラクトシダーゼ抑制への影響について調査されたＥ．ｃｏｌｉでの４０４１個のｌａｃリプレッサー突然変異、リゾチームによる宿主細胞壁の分解に起因したプラーク形成について調査されたバクテリオファージＴ４での２０１５個のリゾチーム突然変異、分解産物により調査された３３６個のＨＩＶ−１プロテアーゼ突然変異、及びトランス活性について調査された２３１４個のＴＰ５３突然変異（方法のセクション参照）では、０．７３〜０．９６（図１９Ｂ〜図１９Ｅ）の範囲である。スピアマンの順位相関係数は、少なくとも０．９８である。リゾチームでは、２つのレジームが明らかであった：低作用突然変異の表現型（又はアッセイ）への影響は最小であり、そして、ある作用閾値を超えてから急な線形応答がある（図１９Ｃ）。この遅れは、ｌａｃリプレッサー、ＨＩＶプロテアーゼ、及びＴＰ５３アッセイでの６２％、５３％、及び３０％とそれぞれ比較して、有害として突然変異全体の１６％しか分類されない、リゾチームアッセイの相対的な感受性のなさに起因し得る。ＴＰ５３にも遅れがあるが、遅れは小さく、トランス活性化の小さな差の平均を取る際の実験誤差を反映したものであり得る。
【０１２２】
参照として、突然変異影響の一般的な代替の尺度の感度及び特異性は、同じデータセットでより低い（図２０参照：後述）。さらに、独立した判断により評価されたブラインド予測も、作用方程式が、現況技術の突然変異影響の予測よりも良好に有害突然変異を同定することを示した（図３Ａ参照、「ＣＡＧＩ２０１１」）。これらと一緒に、データは、真核性、原核性、ウィルスタンパク質での８５００個の突然変異にわたり、進化作用方程式が、機能及び適応のアッセイへの突然変異の影響を定量化する。
【０１２３】
図２０は、現況技術の方法と比較した進化作用方法の性能を示す。進化作用、ポリフェン２、ＳＩＦＴ、及びＭＡＰＰでの無害突然変異から有害突然変異を分けるための相対感度及び特性の受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）が、各データセットで計算された：宿主細胞壁を破るための２，０１５個のバクテリオファージＴ４リゾチーム突然変異体、２０倍を超えるβ−ガラクトシダーゼを抑制するための４，０４１個のＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃリプレッサー突然変異体、Ｇａｇ及びＧａｇ−Ｐｏｌ前駆タンパク質を分解するための３３６個のＨＩＶ−１プロテアーゼ突然変異体（ポリフェン２は、ＨＩＶ−１プロテアーゼ突然変異の予測をリターンなかった）、及び酵母で８個のＴＰ５３応答要素をトランス活性化するための２，３１４個のヒトＴＰ５３突然変異体。
【０１２４】
上述したように、図３Ａは、進化作用方法の追加の性能データを示す。シスタチオニンβ−シンターゼ（ＣＢＳ）突然変異体の活性を予測する、異なる群（文字）からの本方法（バー）の平均ランクが、２０１１年のＣＡＧＩ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ）により評価された。ＣＢＳ活性は、２つの異なる成長条件（高濃度及び低濃度のピリドキシン補助因子）下で、正常なＣＹＳ４オルソログを欠く酵母細胞での成長を回復する各突然変異の能力について調査した（Ｍａｙｆｉｅｌｄら、２０１２年）。９つのグループからの２０の方法が、各補助因子濃度で９つの基準（正確性、再現率、精度、調和平均ｆ１、スピアマンの順位相関係数、スチューデントのｔ検定ｐ値、平方平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）、ｚスコアにわたるＲＭＳＤ、及び受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ））にわたり評価され、次に、それらのランクの平均をとった。進化作用は黒色で示され、高いバーほど、良好なランクである。生データ及び評価詳細は、ＣＡＧＩウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ．ｏｒｇ／）及びＣＡＧＩ主催者であるＳｕｓａｎｎａ  Ｒｅｐｏ，Ｊｏｈｎ  Ｍｏｕｌｔ，及びＳｔｅｖｅｎ  Ｅ．Ｂｒｅｎｎｅｒから入手可能である。進化作用分析ファイルは、ｈｔｔｐ：／／ｍａｍｍｏｔｈ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ＫａｔｓｏｎｉｓＬｉｃｈｔａｒｇｅＧＲにおいて入手可能である。
【０１２５】
遺伝性疾患での重症度との進化作用の相関
未知の有意性のタンパク質変異（ＶＵＳ）は、エクソーム解釈での反復問題であるため、次に、進化作用が、人間の疾患へのタンパク質突然変異の影響についてのバイオマーカであることができるか否かを問うた。まず、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースから、良性及び有害コード多型の両方がそれぞれ注釈付けられた（方法のセクション参照）２１８個の遺伝子のセットを集めた。進化作用分布は、良性であった突然変異と、有害であった突然変異とで劇的に異なり、良性の突然変異は低作用に強くバイアスされ、有害な突然変異は大きな作用に強くバイアスされた（ウィルコクソン順位和ｐ値＜１０-16、図６Ｅ参照）。その結果、作用は、他の方法よりも良好な特異性及び感度で２つのタイプの突然変異を分け、受信者動作特性曲線下面積は、全体で８５％であり、最大作用又は最小作用を有する突然変異のみが考慮された場合、ＡＵＣは９０％超に上昇した。第２のテストは、単一のタンパク質ファミリ内の有害突然変異を区別することを目的とした。２６，５９７個のヒト腫瘍の集まり（Ｐｅｔｉｔｊｅａｎら、２００７年）からはじまり、１０以上の異なる事例で見られ、したがって、発病で役割を果たす可能性がより高いＴＰ５３突然変異を、より少数の事例で見られたＴＰ５３突然変異と比較した。頻繁な突然変異の進化作用は、有意に大きく（カイ二乗ｐ値＝９×１０-34）、これらの突然変異は通常、体外で非機能的でもあった（図６Ａ参照）。これとは対照的に、頻度のより低い突然変異は、作用バイアスを有さなかった（図６Ｂ参照）。しかし、体外で機能を損なった、頻度のより低い突然変異のサブグループは、大きな作用にバイアスされた（カイ二乗ｐ値＝２×１０-47）。これらのデータは、臨床的に有害な多型の作用値及び臨床的に良性の多型の作用値がランダムではないことを示す。多くの疾患関連タンパク質において、低作用多型は通常、良性であり、高作用を有する多型は通常、有害である。
【０１２６】
これらの分布バイアスは、作用が、直接、遺伝子結果に依存する疾患での発病率の予測であり得ることを示唆する。したがって、２つの常染色体劣性単一遺伝子病に目を向けた。第１に、ＣＦＴＲ遺伝子の１０３個の突然変異のキュレートされ、十分に特徴づけられた研究が、それらを嚢胞性線維症（４４事例）、ＣＦＴＲ関連疾患（５３事例）、又は良性プレゼンテーション（６事例）にリンクした（Ｄｏｒｆｍａｎら、２０１０年）。これらの群のメジアン作用は、高作用値、中作用値、及び低作用値が群を分けるように、有意に異なった（ウィルコクソン順位和ｐ値＝１．６×１０-3、図２１Ａ）。第２に、ポンペ病は、ＧＡＡ遺伝子によりエンコードされる酵素である酸性α−グルコシダーゼの欠陥により生じる、臨床的に異種疾患である。ＧＡＡの既知のミスセンス突然変異は、重症度が下がる順序により、タイプＢ、タイプＣ、タイプＤ、タイプＥ、そして最後に非病原Ｆタイプに分類された（Ｋｒｏｏｓら、２００８年）。ＧＡＡ突然変異のメジアン作用は、臨床的重症度に伴って有意に上昇し（ウィルコクソン順位和ｐ値＝５×１０-6）、病原タイプＢ〜Ｅでは上位半分にあるが、非病原タイプＦでは下位半分にある（図２１Ｂ）。これらのデータは、２つの異なる疾患において、原因遺伝子の突然変異の進化作用が発病率に関連することを示す。
【０１２７】
図２１Ａ及び図２１Ｂは、図６Ａ、図６Ｂ、及び図６Ｅと同様に、突然変異作用が発病率に相関することを示す。図６Ｅが、良性である７９４事例（グレー）と比較した、疾患関連の８，５５３事例（黒色）での２１８個の遺伝子からのコード多型の作用分布を示すことを想起する。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースから得られたこれらの各遺伝子は、少なくとも１つの疾患にリンクされる。さらに、図６Ａは、残りの１．０２６個の散発性ＴＰ５３突然変異を示す図６Ｂと比較して、腫瘍標本で頻繁に（ＩＡＲＣデータベースに集計された２６，５９７事例での少なくとも１０倍）見られる３４３個のＴＰ５３突然変異の作用分布を示す。酵母アッセイでの野生種トランス活性化活性の５０％未満（超）の割合は、黒色（白色）であり、これらのデータが未知の割合はグレーである。
【０１２８】
図２１Ａ及び図２１Ｂに戻ると、図２１Ａは、臨床的プレゼンテーションの重症度によりビニングされたＣＦＴＲ遺伝子での１０３個の突然変異の作用分布を示す：本格的な嚢胞性線維症（上）、ＣＦＴＲ関連疾患（中）、及び症状なし（下）（Ｄｏｒｆｍａｎら、２０１０年）。図中、垂直バーはメジアン作用を示し、数字は各群内の合計突然変異を指し、ボックスサイズは分布の四分位数に一致し、誤差バーは変異の拡散を示す。図２１Ｂは、最も重症なクラスＢから、無症状患者を含むクラスＦまで重症度が下がるクラスにビニングされたＧＡＡ遺伝子内の１３５個のポンペ病突然変異の作用分布を示す。
【０１２９】
作用は、集団毎の多型の適応効果を反映
作用が発病率又は適応効果の一般的なバイオマーカである場合、集団が、より大きな作用を有するより少数のコード多型を有することが予期される。実際に、長期にわたる集団遺伝モデルは、多型が集団内に残る確率が、それらの適応効果に伴って略指数関数的に低減することを示唆するが、表現型効果のサイズの実用的な尺度ない状態で、ゲノムデータでの検証はなされていなかった。したがって、作用方程式の一般性をテストするために、作用の関数として、１０００ゲノムプロジェクト（１０００ゲノムプロジェクトコンソーシアム２０１２）からコード多型の頻度を集計した。２６１，８９９の特有のコード変異を一般的突然変異（１％を超える対立遺伝子頻度を有する３６，３７９のＳＮＰ）及び希少突然変異（１％未満の対立遺伝子を有する２２５，５２０のＳＮＶ）に分割した。特に接合性、優性、遺伝的背景、又は形質関連性に関せずに、有害性の影響の他の尺度とは対照的に、本発明者らは、作用分布が、両群で略指数関数的（それぞれＲ2＝０．９８及び０．９５）（図２２Ａ）であるが、λで示される減衰率又は喪失率が、希少突然変異の場合よりも一般的突然変異の場合で大きいことを発見した。これらの異なる喪失率を調べるために、変異は、ｖで示される変異の対立遺伝子頻度によってより細かく群化された（図２２Ｂ参照）。これは、ｖ単位で対数線形である喪失率を有する指数関数的文法のファミリを明らかにし、
λ＝α＋β・１ｎ（ｖ）                                              （７）
式中、α＝４．５×１０-2及びβ＝３．２×１０-3は、相関係数Ｒ2＝０．９２でこれらの分布をフィッティングする（図２２Ｃ参照）。これらのデータは、適応効果の一般的尺度としての進化作用をサポートし、１０００ゲノムプロジェクトからのヒトコード変異が、対立遺伝子頻度の冪乗関数により変調される作用の略指数関数的な関数として分布することを示し、
Ｎ＝Ｎ0・ｅ-λ・作用＝Ｎ0・ｅ-α・作用・ｖ-β・作用                  （８）
式中、Ｎは、所与の対立遺伝子頻度の突然変異の割合であり、Ｎ0＝０．２であり、喪失率λは、異なる作用を有する突然変異での選択制約のスケーリング係数である。
【０１３０】
単細胞、個人、及び集団で見つかるコード変異は、広範囲の異なる対立遺伝子頻度にわたる変異体のアンサンブルである。しかし、これらの異なるアンサンブルの全体的な作用分布も、互いに特有の喪失率λに伴って略指数関数的である。例えば、λは、個人のエクソームで最大であるが、１０００ゲノムプロジェクト内に配列される１０９２の個人からの変異の全セット等の個人群にわたり４０％低減し、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）に記載される全ての体細胞がん突然変異のセットにわたり７３％低減する（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ他．２０１３年）。これらのデータは、アンサンブル固有の喪失率が、個人のエクソームでは一般的な多型により、１０００ゲノムプロジェクトエクソームの群等の集団にわたっては希少変異体により、ＴＣＧＡからの体細胞がん組織ではランダムヌクレオチド変化により、支配されることを示す（図２２Ｃ参照）。
【０１３１】
考察
進化の基本的な問題は、遺伝子型変異が表現型変異をいかに駆動するかを定量化することである。したがって、この研究は、微分分析からの初歩的数学概念に適用されて、進化の方程式を公式化した。結果は、適応への遺伝子型摂動の効果についての計算可能な一次進化作用方程式である。分子レベルにおいて、作用は、ウィルス、バクテリア、及び真核生物からのタンパク質内の摂動の有害影響を推定する。個人では、進化作用により測定されるこの有害影響は、疾患原因遺伝子での突然変異の病原的及び臨床的過程に相関し、異なる作用分布により、有害突然変異を有する遺伝子と、中立突然変異を有する遺伝子を分ける。臨床的結果の作用閾値は、不可欠性、対立遺伝子優性、及び各タンパク質に固有の外部因子に応じて異なり得る。最後に、特に、１９３０年にＦｉｓｈｅｒにより予測した適応効果の分布を回復して、集合遺伝モデルに一致して（Ｆｉｓｈｅｒ、１９３０年；Ｏｒｒ、２００５年）、集団にわたり、より大きな進化作用に関連するより大きな臨床的有害性は、コード多型の純化淘汰を支配する。したがって、進化作用方程式は、分子遺伝学的データ、臨床遺伝学的データ、及び集団遺伝学的データにわたり、突然変異の表現型適応効果を定量的に橋渡しする。
【０１３２】
この進化作用方程式は、任意の微分可能関数ｆ（ｘ）＝γに対して、∇ｆ（ｘ）・ｄｘ＝ｄγであることに基づくとともに、遺伝子型γ及び適応表現型φがｘ及びγをそれぞれ表すことができ、微分可能な進化関数ｆにより関連することができるという前提に基づく。ミスセンス突然変異の場合、遺伝子型変異ｄγは、置換オッズにより推定されるアミノ酸類似性の差であり、勾配∇ｆの偏導関数成分は、各配列残基の進化重要性により推定される、突然変異への適応の感度である。進化重要性は多くの場合、保存性と融合されるが、微分分析の状況では、保存性等の平均は、導関数が定義により、変動の比率であるため、導関数がそうであるように、系統発生分析を直接使用して、配列内の変異を適応での変異に結合するＥＴよりも精度が低い。ＥＴが基本的な進化数量∇ｆを測定することは、特異性のアミノ酸決定因子をピンポイントすることにより、タンパク質関数を予測、選択的にブロック、再設計、又は模倣する精度及び多様性と調和する。置換オッズを改善するためにも同様に、置換部位の進化勾配を考慮することにより、系統発生分析を使用した。∇ｆ及びｄγは両項とも、それぞれ１つが、他方が略一定に保持される場合、中立突然変異から有害突然変異を分けるため、突然変異の影響に寄与する。
【０１３３】
遺伝子型と表現型との間の進化適応関数ｆが決して解かれないことは、注目に値する。摂動手法は、種の現在の適応状態からの無限小変異として突然変異を扱うため、∇ｆを評価することで十分である。これにより、適応風景（fitness landscape）においてグローバル進化パスを見つけること(これはｆを解き、タンパク質構造及び機能を配列から予測することに等しい)から、適応風景での配列突然変異及び「ジャンプ」としてパス多様性ｄφを評価することへと、焦点をシフトさせる。これらのジャンプを計算するには、式（６）を解く必要があり、式（６）は、系統発生的多様性ツリーが、これらの特徴の詳細が未知のままである場合であっても、過去の関連分子相互作用、細胞相互作用、系統的相互作用、及び環境的相互作用の全てにわたる突然変異の影響の統合サマリを提供するため、より単純である。将来、上位影響を説明する追加のより高次の摂動項を用いて、精度の改善が可能であり得る。改善の別のソースは、∇ｆ及びｄγが過去の進化レコードにわたり計算されるが、それらの積が、今日を含め、任意の時点での突然変異の進化作用ｄφについての情報を与えることである。換言すれば、突然変異の適応尺度及び作用は、時間不変であると仮定される。これは近似であり、その理由は、多様なタンパク質が、分岐固有の進化勾配変異に繋がり、例えば、リガンド固有部位を同定するために、微分ＥＴにより説明される（Ｌｉｃｈｔａｒｇｅら、１９９７年）現象である、新しい機能部位を発達させることができるためである。
【０１３４】
簡易性及びこれらの制限にも拘わらず、進化作用方程式は、大半の洗練された現在の機械学習及び統計学的方法と同様に、又はそれらよりも良好に、実験データに一致し、１０００ゲノムプロジェクトデータに適用される場合、多型の分布についての細かい詳細及び新しいパラメータを明るみに出す。第１に、大きな適応効果を有する突然変異への選択制約の強度は、進化作用分布の指数関数的喪失率定数であるλにより指定される。この喪失率は、少数の有害突然変異を有する選択圧と一貫して、個人で最大である。より良好な全体適合潜在性のために、希少変異が血縁関係のない個人に蓄積し得る集団では、より小さい。そして、λは最小であり、多様ながん細胞内でコドンバイアスそれ自体により設定される下限に達し、下限では、ランダムパッセンジャー突然変異の大きな背景が、希少がんドライブ突然変異を曖昧にする。第２に、多型は集団内で拡散するため、喪失率λは、ｖ＝１の場合、λ最大＝αである固定でのピークまで、βのレートで線形に成長する。したがって、α及びβは、進化浮動及び適合の基本パラメータである。αが同じ値の場合、大きなβを有する種ほど、中立対立遺伝子からの新しくより大きなずれに対して受ける淘汰力は小さく、これは、遺伝浮動及び起こり得る適合の土台をなす変異のプールを増大させ得る。それと相互に、βが同じ値の場合、大きなαを有する種ほど、中立対立遺伝子からのより大きなずれに対して受ける淘汰力を比較的大きく、浮動及び適合の可能性を下げる。突然変異率は分子因子及び選択因子の影響を受けるため、類似性因子がα及びβを変調し、進化の静止とバーストとの間のシフトの根底にあり得る。
【０１３５】
より確実なのは、分子進化の略中立の理論と調和して、大きい作用を有する突然変異ほど、選択においてますます不利であり、固定が大半、最小作用を有する多型を優先するはずである（図２２Ａ及び図２２Ｂ）ということである。これは、更に離れて分岐する際、ホモログタンパク質対間の進化作用差を比較する場合にも該当する。実際に、配列同一性に基づいて進化的により近いホモログは一貫して、全体的及び平均して、より低い作用差を示す。したがって、遺伝子型−表現型軌道は、略最小進化作用のパスを辿るはずであり、最小作用からより大きくずれる頻度は、喪失率λにより示されるように、指数関数的に減衰する。基本進化制約としての最小作用の出現は、興味深く、生物系での進化と物理学でのよく知られた変分原理との間の収束を示唆する。
【０１３６】
今のところ、初歩的な微積分及びφ＝ｆ（γ）である生物学の縮小ビューから開始して、生物学的スケール及びクレードにわたるデータにロバストに一致する、機能適応表現型への遺伝子型変異の進化作用の第１原理摂動方程式を示す。これは、進化の形式的分析への新しい方向を開き、実際に、コード変異の分析に光を投じ、生物工学、ゲノム解釈、並びに個人及び比較突然変異作用プロファイルに基づいた疾患の監視及び個人化への用途を有する。
【０１３７】
方法
作用の計算
作用Δφは、進化勾配∂ｆ／∂ｒiと置換の摂動大きさΔｒi,X→Yとの積により計算された。これらの２つの項∂ｆ／∂ｒi及びΔｒi,X→Yは、後述するように、進化トレース方法の重要性ランク及びアミノ酸置換オッズによりそれぞれ測定された。両項及び積を正規化して、各タンパク質のパーセンタイルスコアにする。したがって、高作用又は低作用は、有害又は中立評価をそれぞれを示し、それにより、例えば、６８という作用は、影響が、タンパク質内の全ての可能なアミノ酸置換の６８％よりも高いことを暗示する。
【０１３８】
タンパク質Ｐの位置ｉでの進化勾配を計算するために、ｂｌａｓｔａｌｌ２．２．１５を用いて、３つのデータベース（ＮＣＢＩ  ｎｒ、Ｕｎｉｒｅｆｌ００、及びＵｎｉＲｅｆ９０）内のホモログを検索した。各都度、ｅ値カットオフを１０-5に設定し、最小配列同定を３０％に設定し、全ての他のパラメータをデフォルト値に設定して、５０００までのホモログ配列を選択した。配列はＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ、２００４年）とアラインされ（ｈｔｔｐ：／／ｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／）、クエリ配列にギャップを有するカラムを削除した。次に、ｒｖＥＴ法を実行し、この方法は、トップランクの残基の中での空間クラスタ化及びランク情報を最大化することにより、配列選択を最適化させ、これらの３つのアルゴリズムのそれぞれで生成されるＥＴスコアの平均をとる。オッズが置換位置の進化勾配に応じて別個に計算されたという違いの下、ＢＬＯＳＵＭ方法論に従って置換対数オッズを計算した。このために、上記のように、ＰＤＢデータベース内で利用可能なタンパク質の６７，０００を超える複数の配列アラインメントを集め（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）、各アラインメントの各位置の進化勾配を計算した。後述するように、これらの位置は１０の群（勾配十位数）に分割され、各群の置換オッズを計算した。置換行列の追加の構造依存セットが、各勾配十位数を９つの群に更に分割し：低（＜１０Å2）、中（１０−５０Å2）、及び高溶媒露出度（＞５０Å2）、並びに螺旋状二次構造要素、鎖状二次構造要素、及びコイル状二次構造要素。置換オッズのビンが細かいほど、膜貫通パッチの場合等のタンパク質進化での一般性が低い選択制約をよりよく区別し得る。
【０１３９】
置換対数オッズの計算
ｆijcを、ｉがクラスｃ（１≦ｃ≦１０又は１≦ｃ≦９０）のカラム内の最も頻繁なアミノ酸である場合、任意のアミノ酸ｊ（１≦ｊ≦２０）へのアミノ酸ｉ（１≦ｉ≦２０）間の一致総数であるものとする。そうすると、クラスｃ内のｊによりアミノ酸ｉを置換する観測頻度ｑijcは、
【数４】
0006707081.tif 000005
である。
【０１４０】
データセット内のアミノ酸ｊの発生確率は、
【数５】
0006707081.tif 000006
である。
【０１４１】
次に、ｉの置換の対数オッズは、エントリ
【数６】
0006707081.tif 000007
を用いて計算される。
【０１４２】
ＢＬＯＳＵＭ方法論とは異なり、対数オッズは、最近傍整数に丸められない。
【０１４３】
突然変異影響の現在の予測子
ＳＩＦＴ予測は、「ＳＩＦＴ  ＢＬｉｎｋ」（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｆｔ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／）を使用して得られた。ＭＡＰＰ予測は、ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｎｄｅｌ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ＳｉｄｏｗＬａｂ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ＭＡＰＰ／）をインストールした後、入力としてＵｎｉＲｅｆ９０データベースからの配列アラインメントを使用して得られた。「ＭＡＰＰスコアのｐ値解釈」を影響として使用した。ポリフェン２予測は、ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｂｗｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｐｈ２／において、バッチクエリタブのデフォルトパラメータを使用して得られた。
【０１４４】
統計
カイ二乗検定を使用して、作用と臨床的関連又はＴＰ５３突然変異の酵母アッセイ活性との重複のｐ値を計算した。ウィルコクソン順位和検定を使用して、ＵｎｉＰｒｏｔ突然変異のデータセットでの疾患多型及び良性多型の分布と、ＴＰ５３、ＣＦＴＲ、及びＧＡＡ遺伝子の疾患型及び良性多型の分布とを比較した。
【０１４５】
実験データセット
組換え活性について、３１個のＥ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ突然変異のセットを野生種活性の割合としてＡｄｉｋｅｓａｖａｎらにおいて調査した（２０１１年）。突然変異は１０の作用群にビニングされ、平均組換えを計算した。宿主細胞壁のリゾチーム破壊に起因して形成されたプラーク量により、２０１５のバクテリオファージＴ４リゾチーム突然変異のセットをＲｅｎｎｅｌｌらにおいて調査した（１９９１年）。プラーク形成がない（−）突然変異及びプラーク形成の識別が難しい突然変異（−／＋）は、有害と見なされ、一方、プラーク形成が正常な突然変異（＋）及びプラーク形成が小さい突然変異（＋／−）は、中立と見なされた。タンパク質抑制活性により、４０４１のＥ．ｃｏｌｉ  ｌａｃリプレッサー突然変異のセットをＭａｒｋｉｅｗｉｃｚらにおいて調査した（１９９４年）。２０倍未満の抑制活性を有する突然変異（−及び−／＋）は、有害と見なされ、一方、２０倍を超える抑制活性を有する突然変異（＋及び＋／−）は、中立と見なされた。Ｇａｇ及びＧａｇ−Ｐｏｌ前駆タンパク質の分解産物量により、３３６のＨＩＶ−１プロテアーゼ突然変異のセットをＬｏｅｂらにおいて調査した（１９８９年）。産物がない突然変異（−）及びいくらかの産物を有する突然変異（−／＋）は、有害と見なされ、一方、正常機能を有する突然変異（＋）は、中立と見なされた。２３１４のＴＰ５３突然変異のセットを８つのＴＰ５３応答要素でのトランス活性化について酵母で調査した（Ｋａｔｏら、２００３年）。任意のアッセイでの１００％を超える値は、１００％に等しいものとして扱った。次に、平均トランス活性化を計算し、野生種活性の５０％未満の突然変異を有害として群化し、残りを中立として群化した。
【０１４６】
２６，５９７のＴＰ５３腫瘍突然変異をＩＡＲＣ  ＴＰ５３データベース（バージョンＲ１４）から取得し、３４２の反復突然変異（少なくとも１０回）及び１０２３の非反復突然変異（９回以下）に分割した。疾患関連遺伝子での９３４７のヒト突然変異をＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）から取得し、その後、それぞれを大まかに、キーワード「ｄｂＳＮＰ」、「多型」、及び「ＶＡＲ＿」により注釈されていた場合、中立と分類し、その他の場合は疾患関連として分類した。２０，３４３のヒト遺伝子から、７０％（１１，９９５）は少なくとも１つのＳＮＰエントリを有し、１５％（３０２３）のみが、少なくとも１つの疾患関連エントリを有した。「病原性不確定」とマークされた多くとも１０の突然変異を有した、同じ疾患に関連する少なくとも１０の突然変異を有する遺伝子を選択した。その結果としての２１８の遺伝子について、大まかな分類を調べて補正し、病原性不確定及び散発性がんに関連付けられた突然変異を除去した。ＧＡＡミスセンス突然変異及びそれらのポンペ病重症度分類をｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔｅｒ１５．ｅｒａｓｍｕｓｍｃ．ｎｌ／ｋｌｇｎ／ｐｏｍｐｅ／ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌから取得した。２７８，１７９のヒト多型をｈｔｔｐ：／／ｆｔｐ．１０００ｇｅｎｏｍｅｓ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｖｏｌ１／ｆｔｐ／ｐｈａｓｅ１／ａｎａｌｙｓｉｓ＿ｒｅｓｕｌｔｓ／ｉｎｐｕｔ＿ｃａｌｌ＿ｓｅｔｓ／において１０００ゲノムプロジェクトのフェーズ１分析から取得した。体細胞がん突然変異をｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／においてがんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）から取得した。
【０１４７】
上記タンパク質の進化作用分析の出力ファイルは、ｈｔｔｐ：／／ｍａｍｍｏｔｈ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ＫａｔｓｏｎｉｓＬｉｃｈｔａｒｇｅＧＲにおいて見出し得る。
【０１４８】
引用文献
The 1000 Genomes Project Consortium. 2012. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature 491: 56-65.
Adikesavan, A.K., P. Katsonis, D.C. Marciano, R. Lua, C. Herman, and O. Lichtarge. 2011.  Separation of Recombination and SOS Response in Escherichia coli RecA Suggests LexA Interaction Sites. PLoS Genet 7: e1002244.
Ariey F, et al., A molecular marker of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum malaria, Nature 505, 50-55 (02 January 2014) doi:10.1038/nature12876.
Ashley, EA et al., Spread of artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria, N Engl J Med. 2014 Jul 31;371(5):411-23. doi: 10.1056/NEJMoa1314981.
Benjamini, Y. & Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological), 289-300 (1995).
Conrad MD, et al., Polymorphisms in K13 and Falcipain-2 Associated with Artemisinin Resistance Are Not Prevalent in Plasmodium falciparum Isolated from Ugandan Children, PLOS, Published: August 21, 2014,DOI: 10.1371/journal.pone.0105690.
Dorfman, R., T. Nalpathamkalam, C. Taylor, T. Gonska, K. Keenan, X. Yuan, M. Corey, L. Tsui, J. Zielenski, and P. Durie. 2010. Do common in silico tools predict the clinical consequences of amino-acid substitutions in the CFTR gene? Clin Genet 77: 464-473.
Edgar, R.C. 2004. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res 32: 1792-1797.
Fisher, R.A. 1930. The genetical theory of natural selection. Oxford University Press, Oxford.
Franceschini, A. et al. STRING v9. 1: protein-protein interaction networks, with increased coverage and integration. Nucleic acids research 41, D808-D815 (2013).
Kato, S., S. Han, W. Liu, K. Otsuka, H. Shibata, R. Kanamaru, and C. Ishioka. 2003. Understanding the function-structure and function-mutation relationships of p53 tumor suppressor protein by high-resolution missense mutation analysis. Proc Natl Acad Sci USA  100: 8424.
Kroos, M., R.J. Pomponio, L. van Vliet, R.E. Palmer, M. Phipps, R. Van der Helm, D. Halley, and A. Reuser. 2008. Update of the Pompe disease mutation database with 107 sequence variants and a format for severity rating. Hum Mutat 29: E13-E26.
Lichtarge, O., H. Bourne, and F. Cohen. 1996. An evolutionary trace method defines binding surfaces common to protein families. J Mol Biol 257: 342 - 358.
Lichtarge, O., K.R. Yamamoto, and F.E. Cohen. 1997. Identification of functional surfaces of the zinc binding domains of intracellular receptors. J Mol Biol 274: 325-337.
Loeb, D., R. Swanstrom, L. Everitt, M. Manchester, S. Stamper, and C. Hutchison. 1989.  Complete mutagenesis of the HIV-1 protease. Nature 340: 397-400.
Markiewicz, P., L. Kleina, C. Cruz, S. Ehret, and J. Miller. 1994. Genetic studies of the lacrepressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as "spacers" which do not require a specific sequence. J Mol Biol 240: 421.
Maslov, S. & Sneppen, K. Specificity and stability in topology of protein networks. Science 296, 910-913 (2002).
Mayfield, J.A., M.W. Davies, D. Dimster-Denk, N. Pleskac, S. McCarthy, E.A. Boydston, L. Fink, X.X. Lin, A.S. Narain, M. Meighan, and J. Rine. 2012. Surrogate genetics and metabolic profiling for characterization of human disease alleles. Genetics: 1309-1323.
Mihalek, I., I. Res, and O. Lichtarge. 2004. A family of evolution-entropy hybrid methods for ranking protein residues by importance. J Mol Biol 336: 1265 - 1282.
Orr, H.A. 2005. The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat Rev Genet 6: 119-127.
Pepe, M.S. The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction. (Oxford University Press, 2003).
Petitjean, A., E. Mathe, S. Kato, C. Ishioka, S. Tavtigian, P. Hainaut, and M. Olivier. 2007.  Impact of mutant p53 functional properties on TP53 mutation patterns and tumor phenotype: lessons from recent developments in the IARC TP53 database. Hum Mutat 28: 622-629.
Pradines, J.R., Farutin, V., Rowley, S. & Dancik, V. Analyzing protein lists with large networks: edge-count probabilities in random graphs with given expected degrees. Journal of Computational Biology 12, 113-128 (2005).
Rennell, D., S. Bouvier, L. Hardy, and A. Poteete. 1991. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol 222: 67-86. 
Takala-Harrison S, et al., Independent emergence of artemisinin resistance mutations among Plasmodium falciparum in Southeast Asia. J Infect Dis. 2015 Mar 1;211(5):670-9. doi: 10.1093/infdis/jiu491. Epub 2014 Sep 1.
Taylor SM, et al., Absence of putative artemisinin resistance mutations among Plasmodium falciparum in Sub-Saharan Africa: a molecular epidemiologic study. J Infect Dis. 2015 Mar 1;211(5):680-8. doi: 10.1093/infdis/jiu467. Epub 2014 Sep 1.
Straimer J, et al., K13-propeller mutations confer artemisinin resistance in Plasmodium falciparum clinical isolates, Published Online December 11 2014, Science 23 January 2015:Vol. 347  no. 6220  pp. 428-431, DOI: 10.1126/science.1260867.
The Camcer Genome Atlas Research Network,Weinstein J.N.,et al.,2013.The cancer genome atlas pan-cancer analysis project.Nature genetics 45:1113-1120.
Wilkins,A.D.,E.Venner,D.C.Marciano,S.Erdin,B.Atri,R.C.Lua,and O.Lichtarge.2013.Accounting for epistaticinteractions improves the funcutional analysis of protein structures.Bioinformatics 29:2714-2721.
【０１４９】
本明細書において引用した全ての特許、公開出願、及び参照の教示は、全体的に参照により援用される。
【０１５０】
本発明は、本発明の実施形態例を参照して特に示され説明されたが、添付の特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から逸脱せずに、形態及び詳細に様々な変更を行い得ることが当業者には理解される。
なお、本発明は、態様として以下の内容を含む。
〔態様１〕
表現型に関連付けられた遺伝子を同定するコンピュータ実施方法であって、
ａ）表現型を示す被験者のコホート内の突然変異を表すデータを取得することと、
ｂ）プロセッサにおいて、前記取得されたデータを使用して、各突然変異の進化作用（ＥＡ）スコアを計算することと、
ｃ）前記コホート内の各遺伝子について、前記遺伝子で見つかった突然変異について、前記計算されたＥＡスコアの各分布を特定することと、
ｄ）ＥＡスコアの前記特定された分布を前記コホート内において、ランダム分布と定量的に比較することであって、それにより、比較データを確立することと、
ｅ）前記比較データに基づいて、非ランダムなＥＡスコアの分布を識別することと、
ｆ）前記識別されたＥＡスコアの非ランダム分布に基づいて、前記表現型への前記コホート内の各遺伝子のリンクを評価することであって、それにより、前記表現型に関連付けられた遺伝子を同定する、評価することと
を含む、方法。
〔態様２〕
前記データを取得するステップは、データストアから前記データを取得することを含む、態様１に記載の方法。
〔態様３〕
前記ＥＡスコアを計算するステップは、公式：
【数７】
0006707081.tif 000008
に従い、式中、∂ｆ／∂ｒiは進化勾配であり、Δｒiは残基位置ｉでの摂動であり、Δφは、前記摂動への表現型応答である、態様１又は２に記載の方法。
〔態様４〕
前記計算されたＥＡスコアの分布を特定するステップは、計算されたＥＡスコアをＥＡスコア十分位数でビニングすることを含む、態様１〜３のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様５〕
前記ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するステップは、二標本コルモゴロフ−スミルノフ検定、ウィルコクソン順位検定、及びアンダーソン−ダーリング検定の任意の組合せを使用することを含む、態様１〜４のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様６〕
前記ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するステップは、各分布に指数関数フィッティングされた減衰率λを計算し、前記減衰率を比較することを含む、態様１〜５のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様７〕
前記ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するステップは、遺伝子が前記表現型に関連しない場合、参照データセットから得られる予期分布と前記分布とを比較することを含む、態様１〜６のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様８〕
前記参照データセットは、ｉ）標準遺伝コードに従ったランダムヌクレオチド変化の翻訳により取得される、同じ遺伝子でのランダム突然変異、ｉｉ）１０００ゲノムプロジェクト（ＴＧＰ）データからの同じ遺伝子での突然変異、及びｉｉｉ）がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データ内の任意の遺伝子で見られる全てのミスセンス変異のうちの少なくとも１つを含む、態様７に記載の方法。
〔態様９〕
前記表現型は疾患であり、前記被験者は、前記疾患が診断された患者であり、前記コホート内の各遺伝子の前記疾患への前記リンクが評価されて、疾患原因遺伝子を同定する、態様１〜８のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様１０〕
前記同定された疾患原因遺伝子を患者での予後バイオマーカとして使用することを更に含む、態様９に記載の方法。
〔態様１１〕
前記疾患はがんであり、前記方法は、ＥＡスコアの各分布に基づいて、前記同定された疾患原因遺伝子の中でがん遺伝子から腫瘍抑制因子を区別することを更に含む、態様９に記載の方法。
〔態様１２〕
前記方法は、高ＥＡスコアを有する突然変異に向かうバイアスを有する機能関連遺伝子群を同定するパスウェイに適用され、各パスウェイは遺伝子の集合であり、前記方法は、ＥＡスコアの分布に基づいて各パスウェイを最適化することであって、それにより、群として突然変異が高ＥＡスコアに有意にバイアスされる前記パスウェイ内の遺伝子のサブセットが存在するか否かを識別する、最適化することを更に含む、態様１〜８のいずれか一態様に記載の方法。
〔態様１３〕
表現型に関連付けられた遺伝子を同定するコンピュータシステムであって、
ａ）表現型を示す被験者のコホート内の突然変異を表すデータを保持するデータストアと、
ｂ）前記データストアに結合されて、前記データストアからのデータにアクセスするプロセッサと、
ｃ）前記プロセッサに動作可能に結合されるメモリであって、
ｉ）前記データストアからのデータを使用して、各突然変異の進化作用（ＥＡ）スコアを計算することと、
ｉｉ）前記コホート内の各遺伝子について、前記遺伝子で見つかった突然変異の前記計算されたＥＡスコアの各分布を特定することと、
ｉｉｉ）前記コホート内のＥＡスコアの前記特定された分布とランダム分布とを定量的に比較することであって、それにより、比較データを確立する、比較することと、
ｉｖ）前記比較データに基づいて、非ランダムなＥＡスコアの分布を識別することと、
ｖ）前記識別されたＥＡスコアの非ランダム分布に基づいて、前記表現型への前記コホート内の各遺伝子のリンクを評価することであって、それにより、前記表現型に関連付けられた遺伝子を同定する、評価することと
を行うように、前記プロセッサを構成するメモリと、
を備える、システム。
〔態様１４〕
前記メモリは、公式
【数８】
0006707081.tif 000009
に従って前記ＥＡスコアを計算するように前記プロセッサを更に構成し、式中、∂ｆ／∂ｒiは進化勾配であり、Δｒiは残基位置ｉでの摂動であり、Δφは、前記摂動への表現型応答である、態様１３に記載のコンピュータシステム。
〔態様１５〕
前記メモリは、計算されたＥＡスコアをＥＡ十分位数でビニングすることにより、計算されたＥＡスコアの分布を特定するように前記プロセッサを更に構成する、態様１３又は１４に記載のコンピュータシステム。
〔態様１６〕
前記メモリは、二標本コルモゴロフ−スミルノフ検定、ウィルコクソン順位検定、及びアンダーソン−ダーリング検定の任意の組合せを使用して、ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するように前記プロセッサを更に構成する、態様１３〜１５のいずれか一態様に記載のコンピュータシステム。
〔態様１７〕
前記メモリは、各分布に指数関数フィッティングされた減衰率λを計算し、前記減衰率を比較することにより、前記ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するように前記プロセッサを更に構成する、態様１３〜１６のいずれか一態様に記載のコンピュータシステム。
〔態様１８〕
前記メモリは、遺伝子が前記表現型に関連しない場合、参照データセットから得られる予期分布と前記分布とを比較することにより、前記ＥＡスコアの前記分布を定量的に比較するように前記プロセッサを更に構成する、態様１３〜１７のいずれか一態様に記載のコンピュータシステム。
〔態様１９〕
前記参照データセットは、ｉ）標準遺伝コードに従ったランダムヌクレオチド変化の翻訳により取得される、同じ遺伝子でのランダム突然変異、ｉｉ）１０００ゲノムプロジェクト（ＴＧＰ）データからの同じ遺伝子での突然変異、及びｉｉｉ）がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）データ内の任意の遺伝子で見られる全てのミスセンス変異のうちの少なくとも１つを含む、態様１８に記載のコンピュータシステム。
〔態様２０〕
前記表現型は疾患であり、前記被験者は、前記疾患が診断された患者であり、前記コホート内の各遺伝子の前記疾患への前記リンクが評価されて、疾患原因遺伝子を同定する、態様１３〜１９のいずれか一態様に記載のコンピュータシステム。
〔態様２１〕
前記メモリは、前記同定された疾患原因遺伝子を患者での予後バイオマーカとしてユーザに出力するように前記プロセッサを更に構成する、態様２０に記載のコンピュータシステム。
〔態様２２〕
前記疾患はがんであり、前記メモリは、ＥＡスコアの各分布に基づいて、前記同定された疾患原因遺伝子の中でがん遺伝子から腫瘍抑制因子を区別するように前記プロセッサを更に構成する、態様２０に記載のコンピュータシステム。
〔態様２３〕
高ＥＡスコアを有する突然変異に向かうバイアスを有する機能関連遺伝子群を同定するパスウェイに適用され、各パスウェイは遺伝子の集合であり、前記メモリは、ＥＡスコアの分布に基づいて各パスウェイを最適化することであって、それにより、群として突然変異が高ＥＡスコアに有意にバイアスされる前記パスウェイ内の遺伝子のサブセットが存在するか否かを識別する、最適化することを行うように前記プロセッサを更に構成する、態様１３〜１９のいずれか一態様に記載のコンピュータシステム。
【図１】
0006707081.tif 000012
【図２Ａ】
0006707081.tif 000013
【図２Ｂ】
0006707081.tif 000014
【図２Ｃ】
0006707081.tif 000015
【図２Ｄ】
0006707081.tif 000016
【図３Ａ】
0006707081.tif 000017
【図３Ｂ】
0006707081.tif 000018
【図４Ａ】
0006707081.tif 000019
【図４Ｂ】
0006707081.tif 000020
【図５Ａ】
0006707081.tif 000021
【図５Ｂ】
0006707081.tif 000022
【図６Ａ】
0006707081.tif 000023
【図６Ｂ】
0006707081.tif 000024
【図６Ｃ】
0006707081.tif 000025
【図６Ｄ】
0006707081.tif 000026
【図６Ｅ】
0006707081.tif 000027
【図７Ａ】
0006707081.tif 000028
【図７Ｂ】
0006707081.tif 000029
【図８】
0006707081.tif 000030
【図９Ａ】
0006707081.tif 000031
【図９Ｂ】
0006707081.tif 000032
【図９Ｃ】
0006707081.tif 000033
【図９Ｄ】
0006707081.tif 000034
【図１０】
0006707081.tif 000035
【図１１Ａ】
0006707081.tif 000036
【図１１Ｂ】
0006707081.tif 000037
【図１１Ｃ】
0006707081.tif 000038
【図１１Ｄ】
0006707081.tif 000039
【図１２Ａ】
0006707081.tif 000040
【図１２Ｂ】
0006707081.tif 000041
【図１３】
0006707081.tif 000042
【図１４】
0006707081.tif 000043
【図１５Ａ】
0006707081.tif 000044
【図１５Ｂ】
0006707081.tif 000045
【図１５Ｃ】
0006707081.tif 000046
【図１５Ｄ】
0006707081.tif 000047
【図１６Ａ】
0006707081.tif 000048
【図１６Ｂ】
0006707081.tif 000049
【図１６Ｃ】
0006707081.tif 000050
【図１７Ａ】
0006707081.tif 000051
【図１７Ｂ】
0006707081.tif 000052
【図１７Ｃ】
0006707081.tif 000053
【図１７Ｄ】
0006707081.tif 000054
【図１８Ａ】
0006707081.tif 000055
【図１８Ｂ】
0006707081.tif 000056
【図１８Ｃ】
0006707081.tif 000057
【図１８Ｄ】
0006707081.tif 000058
【図１９Ａ】
0006707081.tif 000059
【図１９Ｂ】
0006707081.tif 000060
【図１９Ｃ】
0006707081.tif 000061
【図１９Ｄ】
0006707081.tif 000062
【図１９Ｅ】
0006707081.tif 000063
【図２０】
0006707081.tif 000064
【図２１Ａ】
0006707081.tif 000065
【図２１Ｂ】
0006707081.tif 000066
【図２２Ａ】
0006707081.tif 000067
【図２２Ｂ】
0006707081.tif 000068
【図２２Ｃ】
0006707081.tif 000069