(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニット（acetolactate synthase large subunit; IlvBタンパク質）において、９６番目の位置のアミノ酸（トレオニン）がセリン（serine）、システイン（cysteine）またはアラニン（alanine）に置換されている、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列の５０３番目のアミノ酸（トリプトファン）が、グルタミン（glutamine）にさらに置換された、請求項１に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体。
【請求項３】
配列番号２８〜３０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列のアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットにおいて、Ｎ端から５０３番目のアミノ酸（トリプトファン）が、グルタミン（glutamine）、アスパラギン（asparagine）、またはロイシン（leucine）に置換されている、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体。
【請求項５】
配列番号３１〜３３のいずれか一つのアミノ酸配列からなる、請求項４に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターが導入された、形質転換体。
【請求項９】
請求項１に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体、又は前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む、Ｌ−分岐鎖アミノ酸を生産する、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp．）の微生物。
【請求項１０】
請求項４又は５に記載のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体；前記変異体をコードするポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む、Ｌ−分岐鎖アミノ酸を生産する、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp．）の微生物。
【請求項１１】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項９又は１０に記載のＬ−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物。
【請求項１２】
前記Ｌ−分岐鎖アミノ酸が、Ｌ−バリン、またはＬ−ロイシンである、請求項９又は１０に記載のＬ−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物。
【請求項１３】
（ａ）請求項９又は１０に記載のＬ−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物を培地で培養する段階；及び
（ｂ）前記（ａ）段階の微生物または培養した培地からＬ−分岐鎖アミノ酸を回収する段階を含む、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の生産方法。
【請求項１４】
前記Ｌ−分岐鎖アミノ酸が、Ｌ−バリン、またはＬ−ロイシンである、請求項１３に記載のＬ−分岐鎖アミノ酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、新規なアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体及びその用途に関するもので、具体的には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体、これを含む微生物、またはこれを用いるＬ−分岐鎖アミノ酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分岐鎖アミノ酸、すなわち、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンは、個体においてタンパク質を増加させる作用をして、運動時のエネルギー源として重要な役割をすることが知られており、医薬品、食品などに使用されている。分岐鎖アミノ酸は、類似した生合成過程で同一の酵素を用いるため、１種類の分岐鎖アミノ酸を工業的な規模で発酵を介して製造するには困難である。分岐鎖アミノ酸の製造において、分岐鎖アミノ酸生合成の最初の酵素であるアセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase）の役割が最も重要であるが、これに関する先行研究は主に小サブユニット（acetohydroxy acid synthase small subunit;IlvNタンパク質）の変異に起因するフィードバック解除に関連した研究がほとんどで（非特許文献１、特許文献１〜４）、関連研究が非常に不足している実情である。
【０００３】
アセトヒドロキシ酸シンターゼは、２分子のピルビン酸からアセト乳酸（acetolactic acid）を生成する役割と、ケト酪酸（ketobutyric acid）及びピルビン酸からアセトヒドロキシ酪酸（2-aceto-2-hydroxy-butyrate）を生成する役割を果たす酵素である。前記アセトヒドロキシ酸シンターゼはピルビン酸（pyruvate）のデカルボキシル化（decarboyxlation）と他のピルビン酸分子との縮合反応を触媒し、バリン及びロイシンの前駆体であるアセト乳酸を生産したり、ピルビン酸のデカルボキシル化と２−ケト酪酸（2-ketobutyrate）との縮合反応を触媒してイソロイシンの前駆体であるアセトヒドロキシ酪酸を生成しうる。したがって、アセトヒドロキシ酸シンターゼは、Ｌ−分岐鎖アミノ酸生合成の初期過程に関与する非常に重要な酵素である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国公開特許第２０１４−０３３５５７４号
【特許文献２】米国公開特許第２００９−４９６４７５号
【特許文献３】米国公開特許第２００６−３０３８８８号
【特許文献４】米国公開特許第２００８−２４５６１０号
【特許文献５】韓国登録特許第１０−１１１７０２２号
【特許文献６】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号
【特許文献７】韓国特許出願番号第１０−２０１５−０１１９７８５号
【特許文献８】韓国公開特許第１０−２０１７−００２４６５３号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Protein Expr Purif. 2015 May;109:106-12.
【非特許文献２】Pearson et al（1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献３】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276−277
【非特許文献４】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献５】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math（1981） 2:482
【非特許文献６】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National BiomedicalＲesearch Foundation, pp. 353−358（1979）
【非特許文献７】Gribskov et al（1986） Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献８】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7−１1.8
【非特許文献９】Appl. Microbiol. Biothcenol.（1999）52:541-545
【非特許文献１０】J. Biol. Chem. 1948. 176:367-388
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本出願者らは、Ｌ−分岐鎖アミノ酸を効果的に生産するために努力した結果、アセトヒドロキシ酸シンターゼの変異体、具体的には、アセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットの変異体を開発した。そこで、前記変異体を含む微生物から高収率でＬ−分岐鎖アミノ酸を生産しうることを確認し、本出願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本出願の一つの目的は、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase）変異体を提供することにある。
【０００８】
本出願の他の目的は、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター及び前記ベクターが導入された形質転換体を提供することにある。
【０００９】
本出願の別の目的は、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体を含むか、前記ベクターが導入された、Ｌ−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物を提供することにある。
【００１０】
本出願の別の目的は、前記Ｌ−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物を培地で培養する段階；及び前記微生物またはその培地からＬ−分岐鎖アミノ酸を回収する段階を含む、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の生産方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
本出願にかかるアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体は、微生物にその活性が導入される場合、前記微生物のＬ−分岐鎖アミノ酸生産能を著しく増加されるため、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の大量生産に広く活用されうる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
前記目的を達成するための本出願の一つの態様は、アセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニット（acetolactate synthase large subunit;IlvBタンパク質）のアミノ酸配列から９６番目の位置のトレオニンがトレオニン以外の他のアミノ酸に置換されるか、アミノ酸配列から５０３番目の位置のトリプトファンがトリプトファン以外の他のアミノ酸に置換されるか、またはアミノ酸配列から９６番目の位置のトレオニン及び５０３番目の位置のトリプトファンの両方が他のアミノ酸に置換された、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体である。
【００１３】
具体的には、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットは、配列番号１で記載されるアミノ酸配列を有してもよい。より具体的には、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体は、配列番号１で記載されたアミノ酸配列であり、そのＮ末端から９６番目のトレオニン（threonine）または５０３番目のトリプトファン（tryptophan）が他のアミノ酸に置換されたもの、または９６番目のトレオニンと５０３番目のトリプトファンの両方が他のアミノ酸に置換された、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体であってもよい。
【００１４】
本出願において、用語、「アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase）」は、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の生合成に関与する酵素であり、Ｌ−分岐鎖アミノ酸生合成の最初の段階に関与する。具体的には、アセトヒドロキシ酸シンターゼはピルビン酸（pyruvate）のデカルボキシル化（decarboyxlation）と他のピルビン酸分子との縮合反応を触媒し、バリンの前駆体であるアセト乳酸を生産したり、ピルビン酸のデカルボキシル化と２−ケト酪酸（2-ketobutyrate）との縮合反応を触媒して、イソロイシンの前駆体であるアセトヒドロキシ酪酸を生成する。具体的には、アセト乳酸から出発して、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（acetohydroxy acid isomeroreductase）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（dihydroxy acid dehydratase）、トランスアミナーゼＢ（transaminase B）によって触媒された反応を順次経ると、Ｌ−バリンが生合成される。また、アセト乳酸からアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（acetohydroxy acid isomeroreductase）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（dihydroxy acid dehydratase）、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（2-isopropylmalate synthase）、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ（isopropylmalate isomerase）、３−イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（3-isopropylmalate dehydrogenase）、トランスアミナーゼＢ（transaminase B）によって触媒された反応を順次経ると、Ｌ−ロイシンが生合成される。一方、アセトヒドロキシ酪酸から出発してアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（acetohydroxy acid isomeroreductase）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（dihydroxy acid dehydratase）、トランスアミナーゼＢ（transaminase B）によって触媒された反応を順次経ると、Ｌ−イソロイシンが生合成される。したがって、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の生合成経路において重要な酵素である。
【００１５】
アセトヒドロキシ酸シンターゼはｉｌｖＢ及びｉｌｖＮ、２つの遺伝子によってコードされ、ｉｌｖＢ遺伝子はアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニット（large subunit;IlvB）を、ｉｌｖＮ遺伝子はアセトヒドロキシ酸シンターゼの小サブユニット（small subunit;IlvN）をそれぞれコードする。
【００１６】
本出願でアセトヒドロキシ酸シンターゼはコリネバクテリウム属微生物由来であってもよく、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来であってもよい。より具体的には、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットは、配列番号１で記載されたアミノ酸配列だけでなく、前記の配列と７０％以上、具体的には、８０％以上、より具体的には、８５％以上、さらに具体的には、９０％以上、よりさらに具体的には、９５％以上の相同性または同一性を有し、ＩｌｖＢタンパク質活性を有するタンパク質であれば、制限なく含まれてもよい。また、ＩｌｖＢタンパク質活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コドンの軸退性（degeneracy）により前記タンパク質を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、コーディング領域から発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われることがあり、前記配列番号１のアミノ酸配列は、コードする塩基配列であれば制限なく含まれてもよいが、具体的には、配列番号２の塩基配列によってコードされたものであってもよい。
【００１７】
本出願において、「アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体」とは、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質のアミノ酸配列上、１つまたはそれ以上のアミノ酸が変異（例えば、追加、除去、または置換）されたタンパク質を意味する。具体的には、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体は、アセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質が、本出願の変異によってその活性が野生型または変形前と比較して効率的に増加されたタンパク質である。本出願において変異は、一般的に酵素を改良するための方法として当業界に知られている公知の方法を制限なく用いてもよく、ここには、合理的な設計（rational design）と誘導進化（directed evolution）などの戦略がある。例えば、合理的な設計戦略には、特定位置のアミノ酸を位置指定突然変異導入（site-directed mutagenesisまたはsite-specific mutagensis）する方法などがあり、誘導進化の戦略には、ランダム変異（random mutagenesis）を起こす方法などがある。また、自然な突然変異によって、外部からの操作なしに突然変異されたものであってもよい。具体的には、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体は、分離されたものであってもよく、または組換えタンパク質であってもよく、非自然に発生したものであってもよい。しかし、これに制限されるものではない。
【００１８】
本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体は、これに制限されるものではないが、具体的には、配列番号１で記載されたアミノ酸配列を有するＩｌｖＢタンパク質のＮ末端から９６番目のトレオニン（threonine）または５０３番目のトリプトファン（tryptophan）が突然変異されたＩｌｖＢタンパク質であってもよく、または、これに制限されるものではないが、９６番目のトレオニン及び５０３番目のトリプトファンが同時に他のアミノ酸に置換されたＩｌｖＢタンパク質であってもよい。その例として、前記９６番目のトレオニンが、セリン（serine）、システイン（cystein）またはアラニン（alanine）に置換されたものであってもよく、前記５０３番目のトリプトファンが、グルタミン（glutamine）、アスパラギン（asparagine）またはロイシン（leucine）に置換されたＩｌｖＢタンパク質であってもよい。また、前記９６番目または５０３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されると同時に、アミノ酸配列のうち、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体と同一または相応する活性を示すなら、本出願のカテゴリに含まれるのは自明である。
【００１９】
また、本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体のカテゴリには、前記記述された変異を有するアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットの変異体それ自体、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットの変異体を含むアセトヒドロキシ酸シンターゼ、またはアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットの変異体と小サブユニットの両方を有するアセトヒドロキシ酸シンターゼが含まれるが、特にこれに制限されるものではない。
【００２０】
本出願では、アセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質の９６番目及び５０３番目のアミノ酸を様々な他のアミノ酸に置換して、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の生産量が増加することを確認することにより、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の生産増加と関連したアセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質の変異において、前記９６番目及び５０３番目の位置が重要な位置であることを確認した。ただし、本出願の実施例で置換されたアミノ酸は、本出願の効果を示す代表的な一例示に過ぎないもので、本出願の範囲が実施例に限定されるものではなく、９６番目トレオニンをトレオニン以外の他のアミノ酸に、５０３番目のトリプトファンをトリプトファン以外の他のアミノ酸に、または９６番目のトレオニンと５０３番目のトリプトファンの両方を他のアミノ酸に置換する場合、実施例に記載された効果と対応する効果を期待できることは自明である。
【００２１】
また、本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体は、配列番号２８〜３３のいずれか１つで記載されるアミノ酸配列を有してもよいが、これに制限されない。また、本出願の変異を含み、実質的にアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体と同一または相応する活性を有する限り、前記配列と７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％以上の相同性または同一性を有するポリペプチドを制限なく含んでもよい。
【００２２】
相同性（homology）及び同一性（identity）は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連する程度を意味し、パーセンテージで表示されてもよい。
【００２３】
用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
【００２４】
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムによって決定され、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に利用されてもよい。実質的に、相同性（homologous）を有するか同一（identical）の配列は、一般的に、配列全体または全長と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の中間または高い厳しい条件（stringent conditions）でハイブリッドしてもよい。ハイブリッドするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
【００２５】
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献２と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献３）（バージョン５．０．０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献４）を用いて決定してもよい（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic AcidsＲesearch 12: 387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（ Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403（1990）； Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA／.]（1988） SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて、相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【００２６】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献５に公知されたように、例えば、非特許文献４のようなＧＡＰコンピュータープログラムを利用して配列情報を比較することによって決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献６に開示されたように、非特許文献７の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップでの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本願で用いられるものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
【００２７】
本発現のもう一つの様態は、本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチドである。
【００２８】
本出願において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を含む意味を有し、その基本構成単位であるヌクレオチドは、天然ヌクレオチドの他に、糖または塩基部位が変更された類似体（analogue）も含む。本出願において、前記ポリヌクレオチドは、細胞から分離されたポリヌクレオチドまたは人為的に合成されたポリヌクレオチドであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００２９】
本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチドは、本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体の活性を有するタンパク質をコードする塩基配列であれば、制限なく含まれてもよい。具体的には、前記ポリヌクレオチドはコドンの縮退性（degeneracy）により、または前記タンパク質を発現させようとする生物で好まれるコドンを考慮して、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコーディング領域に多様な変形が行われてもよい。前記配列番号２８〜３３のアミノ酸配列をコードする塩基配列であれば、制限なく含まれてもよいが、具体的には、例えば、配列番号３４〜３９のいずれか１つに記載される塩基配列を有するものであってもよい。また、本出願の変異を含み、実質的にアセトヒドロキシ酸シンターゼの活性を有する限り、コドンの縮退性により前記配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチドを制限なく含んでもよい。
【００３０】
また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化して、配列番号２８〜３３のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であれば、制限なく含まれてもよい。前記「厳しい条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al., 同上）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子同士、８０％以上、具体的には、８５％以上、より具体的には、９０％以上、さらに具体的には、９５％以上、よりさらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士でハイブリッド化する。そして、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を挙げられる。混成化は、たとえ混成化の厳密度によって塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。前記用語、「相補的」は、互いに混成化が可能であるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されてもよい。ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野でよく知られている（非特許文献８参照）。
【００３１】
本出願のもう一つの様態は、本出願の変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターである。
【００３２】
本出願において、用語「ベクター」は、宿主細胞に塩基のクローニング及び／または転移のための任意の媒介物をいう。ベクターは他のＤＮＡ断片が結合して、結合された断片の複製をもたらす複製単位（replicon）であってもよい。「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、 自分からの調節によって複製可能な、任意の遺伝的単位をいう。具体的には、天然状態であったり、組換えされた状態のプラスミド、ファージ、コスミド、染色体及びウイルスであってもよい。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＭＢＬ３、λＭＢＬ4、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。本出願で用いられてもよいベクターは特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを用いてもよい。また、前記ベクターにトランスポゾンまたは人工染色体を含んでもよい。
【００３３】
本出願において、ベクターは、本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む限り、特に制限されないが、哺乳類細胞（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞またはバクテリア細胞（例えば、大腸菌など）を含む真核または原核細胞で前記核酸分子を複製及び／または発現しうるベクターになってもよく、具体的には、宿主細胞で前記ポリヌクレオチドが発現できるように、適切なプロモーターに作動可能に連結され、少なくとも１つの選別マーカーを含むベクターになってもよい。
【００３４】
また、前記において、用語、「作動可能に連結された」ものとは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようなプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００３５】
本出願のもう一つの態様は、本出願のベクターが導入された形質転換体である。
【００３６】
本出願において、形質転換体は、特にこれに制限されないが、前記ベクターが導入され、本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体を発現できれば、すべての形質転換が可能な細胞が含まれてもよい。具体的には、形質転換されたエシェリキア属、コリネバクテリウム属、ストレプトマイセス属、ブレビバクテリウム属、セラチア属、プロビデンシア属、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞；酵母細胞；ピキア・パストリスなどの菌類細胞；ショウジョウバエ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；チャイニーズハムスター卵巣細胞（chinese hamster ovary cells；ＣＨＯ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（human lymphoblastoid）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボウメラノーマ細胞、ＨＴ−１０８０、ベビーハムスター腎臓細胞（baby hamster kidney cells；ＢＨＫ）、ヒト胎児腎臓細胞（human embryonic kidney cells；ＨＥＫ）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞；または植物細胞になってもよい。
【００３７】
本出願のもう一つの態様は、前記アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体を含むか、前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入された、Ｌ−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物である。
【００３８】
本出願において、用語、「Ｌ−分岐鎖アミノ酸」とは、側鎖に分岐アルキル基があるアミノ酸をいい、バリン、ロイシン、及びイソロイシンを含む。具体的には、本出願において、前記Ｌ−分岐鎖アミノ酸は、Ｌ−バリンまたはＬ−ロイシンであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００３９】
本出願において、前記「微生物」は、野生型微生物や、自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり弱化されるなどの原因によって、特定メカニズムが弱化または増強された微生物をすべて含む概念である。本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体を発現できるすべての微生物を指し、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよい。より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）などであってもよい。よりさらに具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムであるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本出願において、用語、「Ｌ−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物」とは、天然型または変異を介してＬ−分岐鎖アミノ酸の生産能を有している微生物を意味し、具体的には、非自然的に発生した（non-natural occuring）組換え微生物であってもよいが、これに制限されない。前記Ｌ−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物は、本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体を含むか、前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが導入されたもので、野生型微生物、天然型アセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質を含む微生物、アセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質を含む非変形微生物またはアセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質を含まない微生物に比べて、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の生産能が大幅に増加されうる。
【００４１】
本出願のもう一つの態様は、本出願のＬ−分岐鎖アミノ酸を生産する微生物を培養する段階；及び前記段階で収得される微生物または培地からＬ−分岐鎖アミノ酸を回収する段階を含む、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の生産方法である。
【００４２】
本出願において、用語、「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願で、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の生産能を有する微生物を用いたＬ−分岐鎖アミノ酸の生産方法は、当業界に広く知られている方法を用いて行ってもよい。具体的には、前記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは反復注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続式で培養してもよいが、これに制限されるものではない。
【００４３】
培養に用いられる培地は、適切な方法で特定菌株の要件を満たす必要がある。例えば、コリネバクテリウム属菌株に対する培養培地は公知となっている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology American Society for Bacteriology、Washington D.C.、USA、1981）。用いられてもよい糖源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、でん粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油のようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれてもよい。これらの物質は、個別的に、または混合物として用いられてもよく、これに制限されるものではない。用いられてもよい窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール、及び尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれてもよい。窒素源も個別的に、または混合物として用いられてもよく、これに制限されるものではない。用いられてもよいリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウムを含有する塩が含まれてもよい。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。さらに、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。前記された原料は、培養過程で培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加されてもよい。しかし、これに制限されるものではない。
【００４４】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で用いて培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために培養物内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。培養物の温度は、通常２０℃〜４５℃、具体的には、２５℃〜４０℃であってもよい。培養は、所望のＬ−分岐鎖アミノ酸の生成量が最大に得られるまで続けてもよい。このような目的で、培養時間は１０〜１６０時間であってもよい。Ｌ−分岐鎖アミノ酸は、培養培地中に排出されるか、細胞の中に含まれていてもよい。しかし、これに制限されるものではない。
【００４５】
微生物または培地からＬ−分岐鎖アミノ酸を回収する方法は当業界に知られている適合する方法を用いて行ってもよい。例えば、遠心分離、ろ過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外ろ過、透析法、分子体クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和度クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ及びこれらの方法を組合わせて用いてもよいが、これらの例に限定されるものではない。また、前記Ｌ−分岐鎖アミノ酸を回収する段階は、さらに精製段階を含んでもよく、当該分野に公知された適合する方法を用いて行ってもよい。 
以下、本出願の実施例により詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
＜実施例１＞人工突然変異法を用いた変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase）をコードするＤＮＡライブラリの製作
本実施例では、アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異体を取得するために、下記の方法で染色体内の１次交差挿入用のベクターライブラリを製作した。コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ（配列番号１）をコードするｉｌｖＢ遺伝子（配列番号２）を対象に、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ法を行い、塩基置換変異がランダムに導入されたｉｌｖＢ遺伝子変異体（２３９５ｂｐ）を獲得した。Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲはＧｅｎｅｍｏｒｐｈＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Stratagene）を用いて行い、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７のゲノムＤＮＡを鋳型とし、プライマー１（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を用いた。
【００４７】
プライマー１（配列番号３）：５’− ＡＡＣＣＧ ＧＴＡＴＣ ＧＡＣＡＡ ＴＣＣＡＡ Ｔ -３’
プライマー２（配列番号４）：５’− ＧＧＧＴＣ ＴＣＴＣＣ ＴＴＡＴＧ ＣＣＴＣ -３’
増幅された遺伝子断片内に変異が１ｋｂ当り０〜３．５個が導入されるようにし、ＰＣＲ条件は、変性９６℃、３０秒；アニーリング５３℃、３０秒；及び重合反応７２℃、２分を３０回繰り返した。
【００４８】
増幅された遺伝子断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（Invitrogen社）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（以下、「ｐＣＲ２．１」）に連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニー２０種を選別した後、プラスミドを獲得して塩基配列を分析した結果、２．１変異／ｋｂの頻度で互いに異なる位置に変異が導入されたことを確認した。約２０，０００個の形質転換された大腸菌コロニーをとり、プラスミドを抽出し、これをｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ｍｔ）ライブラリと命名した。
【００４９】
また、対照群として用いるための野生型のｉｌｖＢ遺伝子を有するプラスミドを製作した。プライマー１（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７のゲノムＤＮＡを鋳型とし、前記のような条件でＰＣＲした。ポリメラーゼはＰｆｕＵｌｔｒａ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いた。製作されたプラスミドをｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ＷＴ）と命名した。
【００５０】
＜実施例２＞ｉｌｖＢ欠損菌株の製作
ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（特許文献５）菌株を親菌株にしてｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ｍｔ）ライブラリを導入するためのｉｌｖＢ欠損菌株を製作した。
【００５１】
ｉｌｖＢ欠損ベクターを製作するために、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７の染色体を鋳型とし、プライマー３（配列番号５）及びプライマー４（配列番号６）、プライマー５（配列番号７）及びプライマー６（配列番号８）を用いてＰＣＲを行った。
【００５２】
プライマー３（配列番号５）：５’− ＧＣＧＴＣ ＴＡＧＡＧ ＡＣＴＴＧ ＣＡＣＧＡ ＧＧＡＡＡ ＣＧ−３’
プライマー４（配列番号６）：５’− ＣＡＧＣＣ ＡＡＧＴＣ ＣＣＴＣＡ ＧＡＡＴＴ ＧＡＴＧＴ ＡＧＣＡＡ ＴＴＡＴＣ Ｃ−３’
プライマー５（配列番号７）：５’− ＧＧＡＴＡ ＡＴＴＧＣ ＴＡＣＡＴ ＣＡＡＴＴ ＣＴＧＡＧ ＧＧＡＣＴ ＴＧＧＣＴ Ｇ−３’
プライマー６（配列番号８）：５’− ＧＣＧＴＣ ＴＡＧＡＡ ＣＣＡＣＡ ＧＡＧＴＣ ＴＧＧＡＧ ＣＣ−３’
ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
【００５３】
その結果、ｉｌｖＢ遺伝子プロモーターの前部分とｉｌｖＢ遺伝子の３’末端をそれぞれ含む７３１ｂｐの配列番号９のＤＮＡ断片と７１２ｂｐの配列番号１０のＤＮＡ断片を収得した。
【００５４】
増幅された配列番号９と配列番号１０を鋳型とし、プライマー３（配列番号５）及びプライマー６（配列番号８）でＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で６０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
【００５５】
その結果、ｉｌｖＢ遺伝子プロモーターの前部分を含むＤＮＡ断片と３’末端を含むＤＮＡ断片が連結された１４０７ｂｐの配列番号１１のＤＮＡ断片（以下、ｉｌｖＢ断片）が増幅された。
【００５６】
コリネバクテリウム・グルタミカム内で複製が不可能なｐＤＺベクター（特許文献６）と前記増幅されたｉｌｖＢ断片を制限酵素ＸｂａＩで処理した後、ＤＮＡ接合酵素を用いて連結した後、クローニングすることによりプラスミドを獲得し、これをｐＤＺ−ｉｌｖＢと命名した。
【００５７】
ｐＤＺ−ｉｌｖＢをコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに電気パルス法（非特許文献９）でそれぞれ形質転換した後、カナマイシン（kanamycin）２５ｍｇ／ｌ及びＬ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンをそれぞれ２ｍＭずつ含有した選別培地から形質転換菌株を獲得した。２次組換え過程（cross−over）でゲノム上に挿入されたｉｌｖＢ断片によってｉｌｖＢ遺伝子が不活性化された菌株を取得し、これをＫＣＣＭ１１２０１ＰｉｌｖＢと命名した。
【００５８】
＜実施例３＞アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異菌株のライブラリ製作及びＬ−アミノ酸の生産能の増加菌株の選別
前記製作したＫＣＣＭ１１２０１ＰｉｌｖＢ菌株を親菌株にして前記製作されたｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ｍｔ）ライブラリを相同染色体組換えによって形質転換した。これをカナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）が含まれた複合平板培地に塗抹して約１０，０００個のコロニーを確保し、各コロニーをＫＣＣＭ１１２０１ＰｉｌｖＢ／ｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ｍｔ）−1から ＫＣＣＭ１１２０１ＰｉｌｖＢ／ｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ｍｔ）−１００００までと命名した。
【００５９】
また、前記製作したｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ＷＴ）のベクターをＫＣＣＭ１１２０１ＰｉｌｖＢ菌株に形質転換して対照群菌株を製作し、ＫＣＣＭ１１２０１ＰｉｌｖＢ／ｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ＷＴ）と命名した。
【００６０】
＜複合平板培地（ｐＨ ７．０）＞
ブドウ糖１０ｇ、ペプトン１０ｇ、牛肉抽出物５ｇ、酵母抽出物５ｇ、脳心臓浸出液（Brain Heart Infusion）１８．５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素２ｇ、ソルビトール（sorbitol）９１ｇ、寒天２０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）
確保された約１０，０００個のコロニーをそれぞれ３００μｌの選別培地に接種して、９６ディープウェルプレートで３２℃、１０００ｒｐｍで約２４時間培養した。培養液の中に生産されたＬ−アミノ酸の生産量を分析するためにニンヒドリン方法を用いた（非特許文献１０）。培養が完了した後、培養上澄み液１０μｌとニンヒドリン反応溶液１９０μｌとを６５℃で３０分間反応させた後、波長５７０ｎｍで分光光度計（spectrophotometer）で吸光度を測定した。対照群ＫＣＣＭ１１２０１ＰｉｌｖＢ／ｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ＷＴ）菌株の吸光度と比較して１０％以上増加した吸光度を示す変異菌株のコロニー約２１３個を選別した。その他のコロニーは対照区に比べて類似または減少した吸光度を示した。
【００６１】
＜選別培地（ｐＨ ８．０）＞
ブドウ糖１０ｇ、硫酸アンモニウム５．５ｇ、硫酸マグネシウム７水塩１．２ｇ、第１リン酸カリウム ０．８ ｇ、第２リン酸カリウム １６．４ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド２０００μｇ（ 蒸留水１Ｌ基準 ）
選別された２１３個の菌株は、前記と同様の方法でニンヒドリン反応を繰り返して行い、ＫＣＣＭ１１２０１ＰｉｌｖＢ／ｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ＷＴ）菌株に比べてＬ−アミノ酸生産能が向上された菌株の上位６０種を選別した。
【００６２】
＜実施例４＞アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異菌株ライブラリ選別株のＬ−バリン生産能の確認
前記実施例３で選別した６０種の菌株のＬ−バリン生産能を比較するために、以下のような方法で培養し、培養液の成分を分析した。
【００６３】
生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を１白金耳を接種して、３０℃、７２時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。ＨＰＬＣを用いてＬ−バリンの濃度を分析した。
【００６４】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチンアミド３０００μｇ、炭酸カルシウム３０（蒸留水1リットルあたり）
６０種の菌株のうち、Ｌ−バリン濃度が向上された菌株２種を選別して、前記培養及び分析を繰り返して行い、分析されたＬ−バリンの濃度は下記表１の通りである。残り５８種の菌株は、Ｌ−バリン濃度がむしろ下がる結果を示した。
【００６５】
【表１】
0006794555.tif 000002
【００６６】
Ｌ−バリン濃度分析の結果、前記２種の選別株のＬ−バリンの収率が対照群ＫＣＣＭ１１２０１ＰｉｌｖＢ／ｐＣＲ２．１−ｉｌｖＢ（ＷＴ）菌株に比べて最大２０．７％増加したことを確認した。
【００６７】
＜実施例５＞アセトヒドロキシ酸シンターゼの変異菌株ライブラリ選別株のｉｌｖＢ遺伝子変異の確認
前記実施例４で選別した２種菌株のアセトヒドロキシ酸シンターゼに導入されたランダム変異を確認するために、ｉｌｖＢ遺伝子の塩基配列を分析した。塩基配列を決定するためにプライマー７（配列番号１２）及びプライマー８（配列番号１３）を用いてＰＣＲを行った。
プライマー７（配列番号１２）：５’− ＣＧＣＴＴ ＧＡＴＡＡ ＴＡＣＧＣ ＡＴＧ −３’
プライマー８（配列番号１３）：５’− ＧＡＡＣＡ ＴＡＣＣＴ ＧＡＴＡＣ ＧＣＧ −３’
【００６８】
確保されたそれぞれの変異型ｉｌｖＢ遺伝子断片の塩基配列分析を通じて、配列番号２の野生型ｉｌｖＢ遺伝子の塩基配列と比較して変異型ｉｌｖＢ遺伝子の塩基配列を確認した。これにより、変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質のアミノ酸配列を確認した。選別した菌株２種の変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質の情報は、下記の表２の通りである。
【００６９】
【表２】
0006794555.tif 000003
【００７０】
＜実施例６＞アセトヒドロキシ酸シンターゼ変異導入用ベクターの製作
前記実施例５で確認した変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質の効果を確認するために、これを染色体上に導入しうるベクターを製作した。
【００７１】
確認された塩基配列に基づいて、５’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を挿入したプライマー９（配列番号１４）とプライマー１０（配列番号１５）、及びプライマー１１（配列番号１６）とプライマー１２（配列番号１７）を合成した。このプライマー対を用いて、前記選別された２種の染色体をそれぞれ鋳型としてＰＣＲを行い、２種の変異型ｉｌｖＢ遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で２分の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
プライマー９（配列番号１４）：５’− ＣＧＣＴＣ ＴＡＧＡＣ ＡＡＧＣＡ ＧＧＴＴＧ ＡＧＧＴＴ ＣＣ −３’
プライマー１０（配列番号１５）：５’− ＣＧＣＴＣ ＴＡＧＡＣ ＡＣＧＡＧ ＧＴＴＧＡ ＡＴＧＣＧ ＣＧ −３’
プライマー１１（配列番号１６）：５’− ＣＧＣＴＣ ＴＡＧＡＣ ＣＣＴＣＧ ＡＣＡＡＣ ＡＣＴＣＡ ＣＣ −３’
プライマー１２（配列番号１７）：５’− ＣＧＣＴＣ ＴＡＧＡＴ ＧＣＣＡＴ ＣＡＡＧＧ ＴＧＧＴＧ ＡＣ −３’
【００７２】
ＰＣＲで増幅した２種の遺伝子断片を制限酵素ＸｂａＩで処理して、それぞれのＤＮＡ切片を獲得した後、これを制限酵素ＸｂａＩ末端を有する染色体導入用ｐＤＺベクターに連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
【００７３】
ＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドのｉｌｖＢ遺伝子に挿入された変異に応じて、それぞれｐＤＺ−ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）、ｐＤＺ−ｉｌｖＢ （Ｔ９６Ｓ）と命名した。
【００７４】
＜実施例７＞ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ由来のアセトヒドロキシ酸シンターゼ変異導入菌株の製作及びＬ−バリン生産能の比較
前記実施例６で製造した新規変異の導入ベクター２種をそれぞれ２段階相同染色体組換えによりＬ−バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐに形質転換させた。その後、染色体上のｉｌｖＢ変異が導入された菌株を塩基配列分析によって選別し、前記ｉｌｖＢ変異が導入された菌株をそれぞれＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）と命名した。そして、前記変異導入ベクターの中で、ｐＤＺ−ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）を前記製作した菌株ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）に形質転換させた。その後、染色体上のｉｌｖＢ変異２種の両方が導入された菌株をＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ／ Ｔ９６Ｓ）と命名した。
【００７５】
実施例４と同様の方法で培養して、そこからＬ−バリンの濃度を分析した（表３）。
【００７６】
【表３】
0006794555.tif 000004
【００７７】
２種の新規変異導入菌株（ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ））は、親菌株に比べてＬ−バリン生産能が最大１７．８％増加し、２種の変異両方が導入された菌株（ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ／Ｔ９６Ｓ））は、親菌株に比べてＬ−バリン生産能が２１．４％増加した。
【００７８】
そこで、本発明のアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットの変異体は、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の生合成経路の最初の酵素であるため、Ｌ−バリンだけでなく、Ｌ−イソロイシン及びＬ−ロイシン生産能の増加にも影響を与えることが予想される。
【００７９】
本発明者らは、前記Ｌ−バリンが向上された菌株であるＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）及びＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＪ−０７９３及びＫＣＪ−０７９６と命名し、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１６年１月２５日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１８０９Ｐ及びＫＣＣＭ１１８１０Ｐを与えられた。
【００８０】
＜実施例８＞変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするＤＮＡが含まれたＬ−バリン生合成過発現ベクターの製作
対照群として、Ｌ−バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１ＰからＬ−バリン生合成過発現ベクターを製作した。また、前記実施例７で製造したそれぞれのＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）から変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするＤＮＡが含まれたＬ−バリン生合成過発現ベクターを製作した。
【００８１】
前記ベクターの製作のために５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を挿入したプライマー１３（配列番号１８）と３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を挿入したプライマー１４（配列番号１９）を合成した。このプライマー対を用いて、Ｌ−バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ及び前記実施例７で製造したＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）の染色体をそれぞれ鋳型としてＰＣＲを行い、２種の変異型ｉｌｖＢＮ遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で４分の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
【００８２】
プライマー１３（配列番号１８）：５’− ＣＧＡＧＧ ＡＴＣＣＡ ＡＣＣＧＧ ＴＡＴＣＧ ＡＣＡＡＴ ＣＣＡＡＴ −３’
プライマー１４（配列番号１９）：５’− ＣＴＧＴＣ ＴＡＧＡＡ ＡＴＣＧＴ ＧＧＧＡＧ ＴＴＡＡＡ ＣＴＣＧＣ −３’
【００８３】
前記ＰＣＲで増幅された２種の遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理して、それぞれのＤＮＡ切片を獲得した後、これを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩ末端を有する過発現ベクターｐＥＣＣＧ１１７に連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
【００８４】
ＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドのｉｌｖＢ遺伝子に挿入された変異に応じて、それぞれｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢＮ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）Ｎ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）Ｎと命名した。
【００８５】
＜実施例９＞同じ変異位置で他のアミノ酸に置換されたアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードするＤＮＡが含まれたＬ−バリン生合成過発現ベクターの製作
実施例５で確認した変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼタンパク質において、変異位置の効果を確認するために、９６番目のアミノ酸がトレオニンまたはセリン以外のアミノ酸に、５０３番目のアミノ酸がトリプトファンまたはグルタミン以外のアミノ酸に置換された変異を含むベクターを製作した。
【００８６】
具体的には、Ｌ−バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐからアセトヒドロキシ酸シンターゼの５０３番目のアミノ酸がアスパラギンまたはロイシンに置換された形態の変異または９６番目のアミノ酸がアラニンまたはシステインに置換された形態の変異が含まれたＬ−バリン生合成過発現ベクターを製作した。前記置換されたアミノ酸は、置換できるアミノ酸の代表的な例であるだけで、これに制限されるものではない。
【００８７】
前記ベクターの製作のために、まず、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株の染色体を鋳型とし、プライマー１３（配列番号１８）及びプライマー１５（配列番号２０）、プライマー１６（配列番号２１）及びプライマー１４（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行い、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する約２０４１ｂｐのＤＮＡ断片と３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を有する１０５５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で２分重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
【００８８】
プライマー１５（配列番号２０）：５’− ＣＴＴＣＡ ＴＡＧＡＡ ＴＡＧＧＧ ＴＣＴＧＧ ＴＴＴＴＧ ＧＣＧＡＡ ＣＣＡＴＧ ＣＣＣＡＧ −３’
プライマー１６（配列番号２１）：５’− ＣＴＧＧＧ ＣＡＴＧＧ ＴＴＣＧＣ ＣＡＡＡＡ ＣＣＡＧＡ ＣＣＣＴＡ ＴＴＣＴＡ ＴＧＡＡＧ −３’
その後、増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型として、プライマー１３（配列番号１８）及びプライマー１４（配列番号１９）でＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性した後、９４℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で４分の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
【００８９】
その結果、アセトヒドロキシ酸シンターゼの５０３番目のアミノ酸がアスパラギンに置換された形態の変異が含まれたｉｌｖＢＮ遺伝子断片を収得した。
【００９０】
同様の方法で、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株の染色体を鋳型としてプライマー１３（配列番号１８）及びプライマー１７（配列番号２２）、プライマー１８（配列番号２３）及びプライマー１４（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行い、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する約２０４１ｂｐのＤＮＡ断片と３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を有する１０５５ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【００９１】
プライマー１７（配列番号２２）：５’− ＣＴＴＣＡ ＴＡＧＡＡ ＴＡＧＧＧ ＴＣＴＧＣ ＡＧＴＴＧ ＧＣＧＡＡ ＣＣＡＴＧ ＣＣＣＡＧ −３’
プライマー１８（配列番号２３）：５’− ＣＴＧＧＧ ＣＡＴＧＧ ＴＴＣＧＣ ＣＡＡＣＴ ＧＣＡＧＡ ＣＣＣＴＡ ＴＴＣＴＡ ＴＧＡＡＧ −３’
その後、増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、プライマー１３（配列番号１８）及びプライマー１４（配列番号１９）でＰＣＲを行った。
【００９２】
その結果、アセトヒドロキシ酸シンターゼの５０３番目のアミノ酸がロイシンに置換された形態の変異が含まれたｉｌｖＢＮ遺伝子断片を収得した。
【００９３】
同様の方法で、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株の染色体を鋳型としてプライマー１３（配列番号１８）及びプライマー１９（配列番号２４）、プライマー２０（配列番号２５）及びプライマー１４（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行い、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する約８１９ｂｐのＤＮＡ断片と３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を有する２２７６ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【００９４】
プライマー１９（配列番号２４）：５’− ＧＧＴＴＧ ＣＧＣＣＴ ＧＧＧＣＣ ＡＧＡＴＧ ＣＴＧＣＡ ＡＴＧＣＡ ＧＡＣＧＣ ＣＡＡＣ −３’
プライマー２０（配列番号２５）：５’− ＧＴＴＧＧ ＣＧＴＣＴ ＧＣＡＴＴ ＧＣＡＧＣ ＡＴＣＴＧ ＧＣＣＣＡ ＧＧＣＧＣ ＡＡＣＣ −３’
その後、増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、プライマー１３（配列番号１８）及びプライマー１４（配列番号１９）でＰＣＲを行った。
【００９５】
その結果、アセトヒドロキシ酸シンターゼの９６番目のアミノ酸がアラニンに置換された形態の変異が含まれたｉｌｖＢＮ遺伝子断片を収得した。
【００９６】
同様の方法で、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ菌株の染色体を鋳型としてプライマー１３（配列番号１８）及びプライマー２１（配列番号２６）、プライマー２２（配列番号２７）及びプライマー１４（配列番号１９）を用いてＰＣＲを行い、５’末端にＢａｍＨＩ制限酵素部位を有する約８１９ｂｐのＤＮＡ断片と３’末端にＸｂａＩ制限酵素部位を有する２２７６ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
【００９７】
プライマー２１（配列番号２６）：５’− ＧＧＴＴＧ ＣＧＣＣＴ ＧＧＧＣＣ ＡＧＡＧＣ ＡＴＧＣＡ ＡＴＧＣＡ ＧＡＣＧＣ ＣＡＡＣ −３’
プライマー２２（配列番号２７）：５’− ＧＴＴＧＧ ＣＧＴＣＴ ＧＣＡＴＴ ＧＣＡＴＧ ＣＴＣＴＧ ＧＣＣＣＡ ＧＧＣＧＣ ＡＡＣＣ −３’
その後、増幅された２つのＤＮＡ断片を鋳型とし、プライマー１３（配列番号１８）及びプライマー１４（配列番号１９）でＰＣＲを行った。
【００９８】
その結果、アセトヒドロキシ酸シンターゼの９６番目のアミノ酸がシステインに置換された形態の変異が含まれたｉｌｖＢＮ遺伝子断片を収得した。
実施例８と同様の方法で、ＰＣＲで増幅された前記４種の変異型遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理して、それぞれのＤＮＡ切片を獲得した後、これを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩ末端を有する過発現ベクターｐＥＣＣＧ１１７に連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。
【００９９】
ＰＣＲにより目的の遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常知られているプラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、このプラスミドのｉｌｖＢ遺伝子に挿入された変異に応じて、それぞれ順にｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｎ）Ｎ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｌ）Ｎ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ａ）Ｎ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｃ）Ｎと命名した。
【０１００】
＜実施例１０＞野生型由来の変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ導入菌株の製作及びＬ−バリン生産能の比較
前記実施例８及び実施例９で製造したＬ−バリン生合成過発現ベクターｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢＮ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）Ｎ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）Ｎ及びｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｎ）Ｎ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｌ）Ｎ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ａ）Ｎ、ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｃ）Ｎをコリネバクテリウム・グルタミカム野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２に電気穿孔法でそれぞれ挿入した。製作された菌株は、それぞれコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２：：ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢＮ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２：：ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）Ｎ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２：：ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ （Ｔ９６Ｓ）Ｎ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２：：ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｎ）Ｎ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２：：ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｌ）Ｎ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２：：ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ａ）Ｎ及びコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２：：ｐＥＣＣＧ１１７−ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｃ）Ｎと命名した。ベクターが形質転換された場合、カナマイシン耐性を有するようになるため、カナマイシンが２５ｍｇ／ｌの濃度で含まれた培地での生長有無を介して形質転換を確認した。
【０１０１】
製作した菌株を評価するために実施例４で用いた培地と同様の方法で、生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。ＨＰＬＣを用いてＬ−バリンの濃度を分析した（表４）。
【０１０２】
【表４】
0006794555.tif 000005
【０１０３】
その結果、アセトヒドロキシ酸シンターゼの９６番目または５０３番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された新規変異は、対照群に比べてＬ−バリン生産能が最大７００％増加したことを確認した。このことから、前記の９６番目と５０３番目の位置の重要性を確認し、さらに、Ｌ−バリンだけでなく、他の分岐鎖アミノ酸の生産能にも影響を与えると予想される。
【０１０４】
＜実施例１１＞変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ導入菌株の製作及びＬ−ロイシン生産能の比較
本出願のアセトヒドロキシ酸シンターゼの大サブユニットの変異体は、他のＬ−分岐鎖アミノ酸の生産能の増加にも影響を与えるかを確認するために、Ｌ−分岐鎖アミノ酸の別の例として、Ｌ−ロイシンの生産能を確認した。
【０１０５】
具体的には、前記実施例６で製造した新規変異の導入ベクター２種をそれぞれ２段階相同染色体組換えによりＬ−ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６１Ｐ（特許文献７及び８）に形質転換させた。その後、染色体上のｉｌｖＢ変異が導入された菌株を塩基配列分析によって選別し、前記ｉｌｖＢ変異が導入された菌株をそれぞれＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）及びＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）と命名した。
【０１０６】
前記コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６１Ｐは、ノルロイシン（Norleucine、NL）に対する耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７由来の突然変異株であって、次のような方法により収得した。
【０１０７】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７を活性化培地で１６時間培養して、活性化された菌株を１２１℃で５分間滅菌した種培地に接種し、１４時間培養した後、培養液５ｍｌを回収した。回収した培養液を１００ｍＭクエン酸緩衝溶液（citric buffer）で洗浄した後、ＮＴＧ（N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）を最終濃度２００ｍｇ／Ｌとなるよう添加した後、２０分間処理し、１００ｍＭリン酸緩衝溶液（phosphate buffer）で洗浄した。ＮＴＧで処理された菌株を最小培地に塗抹して死滅率を計算した結果、死滅率は８５％であった。Ｌ−ロイシンの誘導体に該当するノルロイシン（Norleucine、NL）に対する耐性変異株を取得するために、ＮＴＧが処理された菌株をＮＬの最終濃度がそれぞれ２０ｍＭ、３０mL、４０ｍＭ及び５０ｍＭになるように添加された最小培地に塗抹し、３０℃で５日間培養してＮＬ耐性変異株を取得した。
【０１０８】
＜活性化培地＞
肉汁１％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．５％、酵母エキス１％、寒天２％、ｐＨ７．２
【０１０９】
＜種培地＞
ぶどう糖５％、バクトペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母エキス１％、尿素０．４％、 ｐＨ７．２
【０１１０】
＜最小培地＞
ぶどう糖１．０％、硫酸アンモニウム０．４％、硫酸マグネシウム０．０４％、リン酸第１カリウム０．１％、尿素０．１％、チアミン０．００１％、ビオチン２００μｇ／Ｌ、寒天２％、ｐＨ７．０
前記の方法で得られた変異株は、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＪ−２４（Corynebacterium glutamicum KCJ−24）と命名し、２０１５年１月２２日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１６６１Ｐを与えられた。
【０１１１】
前記ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）及びＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）を実施例４と同様の方法で培養し、そこからＬ−ロイシンの濃度を分析した（表５）。
【０１１２】
【表５】
0006794555.tif 000006
【０１１３】
２種の新規変異の導入菌株（ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）、ＫＣＣＭ１１６６１Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ））は、親菌株に比べてＬ−ロイシン生産能が最大２６．９％増加した。
【０１１４】
＜実施例１２＞ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ由来の変異されたアセトヒドロキシ酸シンターゼ導入菌株の製作及びＬ−ロイシン生産能の比較
前記実施例６で製造した新規変異の導入ベクター２種をそれぞれ２段階相同染色体組換えにより他のＬ−ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６２Ｐ（特許文献７及び８）に形質転換させた。その後、染色体上のｉｌｖＢ変異が導入された菌株を塩基配列分析によって選別し、前記ｉｌｖＢ変異が導入された菌株をそれぞれＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）と命名した。
【０１１５】
前記コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１６６２Ｐは、ノルロイシン（Norleucine、NL）に対する耐性を有するコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来の突然変異株であって、次のような方法により収得した。
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を親菌株にして、実施例１１のＫＣＣＭ１１６６２Ｐを収得する方法と同様の方法で培養し、最終的にＮＬ耐性変異株を獲得した。
【０１１６】
前記方法で得られた変異株は、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＪ−２８（Corynebacterium glutamicum KCJ−28）と命名し、２０１５年１月２２日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託し、それぞれ受託番号ＫＣＣＭ１１６６２Ｐを与えられた。
【０１１７】
前記ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）及びＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ）を実施例４と同様の方法で培養して、そこからＬ−ロイシンの濃度を分析した（表６）。
【０１１８】
【表６】
0006794555.tif 000007
【０１１９】
前記２種の新規変異の導入菌株（ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｗ５０３Ｑ）、ＫＣＣＭ１１６６２Ｐ：：ｉｌｖＢ（Ｔ９６Ｓ））は、親菌株に比べてＬ−ロイシン生産能が最大１３．３％増加した。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【配列表】
0006794555000001.app