(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を備えることを特徴とする、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含有する抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の製造方法。
ａ）抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の軽鎖と、重鎖とをコードする核酸を提供する工程；
ｂ）ａ）の核酸を用いて組換えプラスミドを構築し、真核哺乳動物ＣＨＯ細胞である宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする工程；
ｃ）前記高発現クローンを大規模培養することで、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を得、分離および精製する工程；
前記宿主細胞は無血清培地で培養され、細胞培養温度が３３℃〜３６℃、細胞培養培地のｐＨ値が６．５〜６．９、および細胞培養培地の浸透圧が２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【請求項２】
ハムスターに最適化したコドンに基づいて、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の軽鎖と重鎖のコード配列をデザインおよび合成することを特徴とする請求項１に記載された方法。
【請求項３】
細胞培養温度は３４℃であることを特徴とする請求項１に記載された方法。
【請求項４】
細胞培養培地のｐＨ値は６．６であることを特徴とする請求項１に記載された方法。
【請求項５】
細胞培養培地における浸透圧は３４０ｍＯｓｍ／ｋｇであることを特徴とする請求項１に記載された方法。
【請求項６】
細胞培養培地は無血清培地であることを特徴とする請求項１に記載された方法。
【請求項７】
得られる抗体が低い免疫原性を有し、動的光散乱（ＤＬＳ）分析で測定されたｚ−平均（ｚ−ａｖｇ）が１０〜２５ｎｍである、請求項１に記載された方法。
【請求項８】
得られる抗体がＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有せず、および／またはＧａｌ−α（２，３／６）−Ｇａｌグリカンを含有する請求項１に記載された方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法で作成された抗体と薬学的に許容される担体とを含み、前記抗体がＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体に、請求項１に記載の方法で作成された抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を加える工程を有し、前記抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体がＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない薬物の製造方法。
【請求項１１】
水と抗ＥＧＦＲ抗体を含む液体薬物組成物であって、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含有し、
前記抗体は、動的光散乱（ＤＬＳ）分析で測定されたｚ−平均（ｚ−ａｖｇ）が１０〜２５ｎｍであり、かつ
前記抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない、または、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（２，３／６）−Ｇａｌグリカンを含有することを特徴とする液体薬物組成物。
【請求項１２】
抗体のｚ−平均は、１５〜２０ｎｍであることを特徴とする請求項１１に記載の液体薬物組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法で作成した抗体であり、前記抗体がＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない抗体の、がんを有するヒト被験者を治療するための組成物を用意するための使用。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法で作成した抗体であり、前記抗体がＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない抗体の、ヒト被験者のがんの進行を抑制するための、組成物を用意するための使用。
【請求項１５】
がんは頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）または結腸直腸がんであることを特徴とする請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項１６】
結腸直腸がんは、Ｋ−Ｒａｓ野生型、ＥＧＦＲ−発現の結腸直腸がんであることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記組成物は、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン、５−フルオロウラシル、フォリン酸）と併用して投与されることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記組成物は、イリノテカンと併用して投与されることを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
被験者は、再発性または転移性頭頸部扁平上皮がんを有し、かつ、先行のプラチナベースの治療に失敗したことを特徴とする請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項２０】
被験者は、局所的または局部的に進行した頭頸部扁平上皮がんを有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項２１】
前記組成物は、放射性治療と併用し、がんの初期治療に用いられることを特徴とする請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
被験者は、再発性の局所疾患または転移性頭頸部扁平上皮がんを有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項２３】
前記組成物は、５−ＦＵを用いるプラチナベースの治療と併用されることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【請求項２４】
前記組成物は、追加の治療薬と併用され、追加の治療薬がイリノテカンであることを特徴とする請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項２５】
追加の治療薬は、化学療法剤であることを特徴とする請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
被験者は、オキサリプラチンおよびイリノテカンベースの化学療法に失敗したことを特徴とする請求項１３または１４に記載の使用。
【請求項２７】
被験者は、イリノテカンに対して不耐症であることを特徴とする請求項１３または１４に記載された使用。
【請求項２８】
請求項１に記載の方法で作成した抗体であり、前記抗体がＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない抗体の、結腸直腸がんを有する被験者の結腸直腸がんの進行を治療または抑制するための組成物を用意するための使用。
【請求項２９】
請求項１に記載の方法で作成した抗体であり、前記抗体がＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない抗体およびイリノテカンの、結腸直腸がんを有する被験者の結腸直腸がんの進行を治療または抑制するための組成物を用意するための使用。
【請求項３０】
前記結腸直腸がんは、進行した結腸直腸がんであることを特徴とする請求項２８または２９に記載の使用。
【請求項３１】
水と抗ＥＧＦＲ抗体とを含む液体薬物組成物であって、
前記抗ＥＧＦＲ抗体は、請求項１に記載の方法で作成した抗体であり、
前記抗体はＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない抗体であり、
前記組成物はポリソルベートおよび／またはサッカロースを含有しないことを特徴とする液体薬物組成物。
【請求項３２】
水、請求項１に記載の方法で作成した抗ＥＧＦＲ抗体、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物、および、リン酸二ナトリウム二水和物を含み、前記抗ＥＧＦＲ抗体がＮ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有せず、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない液体医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
当該出願は、２０１５年１月７日に提出された中国特許出願第２０１５１０００６２３３７号の優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明はバイオテクノロジー分野に関し、更に具体的に、本発明は新型抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の製造方法およびその応用に関する
【背景技術】
【０００３】
腫瘍、特に悪性腫瘍は、現在世界中の人間の健康に危害を与える疾患の一つであり、その致死性はすべての疾患のうちにおいて第２位である。近年では、その発病率は著しく上昇している。悪性がんの治療効果は良くないと共に、末期転移率は高く、予後も思わしくない。現在臨床的に用いる通常の治療法は放射線治療、化学療法と手術を含むが、たとえそれらの治療法が病痛を著しく緩和して、ライフタイムを延長しても、極めて限定的であり、治療効果はさらに高めるのは困難である。
【０００４】
成長因子受容体型チロシンキナーゼのように、それぞれのリガンドによってその増殖因子受容体を活性化させて、通常細胞の増殖を厳密に制御する。がん細胞も増殖因子受容体の活性化で増殖するものであるが、がん細胞は、その正常増殖の厳密な制御を失ったものである。このような制御できなくなることは、多くの要素、例えば成長因子の過剰発現、成長因子受容体の過剰発現、または成長因子に調節される生化学的経路の自発性活性化によって引き起こされる。発がんに関与する受容体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦＲ）、神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）および線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦ）などを含む。
【０００５】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）はｃ−ｅｒｂＢ１／ＨＥＲ１とも呼ばれ、そのファミリーメンバーは全て成長因子受容体チロシンキナーゼであり、それら細胞表面は特異な成長因子あるいは天然リガンドと相互作用して、例えばＥＧＦあるいはＴＧＦ  ｃｉと相互作用して、これによって受容体型チロシンキナーゼを活性化する。このファミリーとして最初に見つけられたのは、見掛け分子量が１６５ＫＤの糖タンパク質である。
【０００６】
ＥＧＦＲは腫瘍細胞の成長、修復と生存、血管新生、および、侵襲と転移の調節に重要な役割を果たし、かなりのヒト腫瘍に発現する。多くの悪性腫瘍において、ＥＧＦＲの発現は、予後不良と低い生存率にしばしば関与する。このことから、ＥＧＦＲの活性を遮断できる薬物があれば、そのリン酸化とシグナル伝達を抑制して、そして様々な面における抗腫瘍作用を果たしながら、化学治療と放射線治療の抗腫瘍性治療効果を増加することもできる。複数の研究では、ＥＧＦＲ阻害剤と複数の化学治療薬と放射性治療薬をある腫瘍株に併用すると、相加・相乗効果を示した。
【０００７】
ＥＧＦＲ阻害剤は、モノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、キナゾリンピロロ−／ピロロ−／ピリドピリミジン、リガンド−毒素と免疫毒の複合体、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＥＧＦＲ／リガンド仲介のワクチンなどを含む。
【０００８】
一部の生体内と生体外実験では、抗ＥＧＦＲ抗体が、ＥＧＦＲを発現した腫瘍細胞株の成長を抑制したことを示した。固形腫瘍の治療では、ある抗ＥＧＦＲのモノクローナル抗体の単独使用、あるいはそれと伝統治療法との併用の治療効果は、励みになる。
【０００９】
グリコシル化はタンパク質の重要な翻訳後修飾である。タンパク質分子表面の糖鎖は、タンパク質分子の構造と機能に深遠な影響を有して、重要な翻訳後加工過程として、グリコシル化は、タンパク質の適切な折り畳み、局在化、免疫原性および生物学的活性に大きい影響がある。ｍＡｂ抗体のグリコシル化とグリカン構造は、その抗体機能と強く相関して、ＩｇＧ分子と、ＦｃＲｓ、ＣｌｑおよびＦｃＲｎの結合に影響することによって、それぞれにＩｇＧ分子の抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）および半減期を調節する。グリコシル化は、さらにｍＡｂの安全性特徴に影響して、特に非ヒトグリカンに対して、潜在的免疫原性を有する。Ｆａｂ機能領域に存在するグリカンは、このような薬物の安全性と有効性特徴に同時に影響することができる。
【００１０】
グリコシル化修飾は細胞発現系およびサブクローンの選択に高度に依存し、細胞培養過程における多くの要素（例えば培地の成分、培養条件）はいずれもグリコシル化に影響し、ひいては治療用タンパク質の生物学的活性、治療効果、免疫原性および薬物動態に影響する。
【００１１】
現在市販されている治療用モノクローナル抗体のうち、ほとんどはＤＮＡ組換え技術によって実現されるものであり、ほとんどはインビトロ細胞培養技術によるものである。哺乳動物細胞の構造、機能および遺伝子発現調節の複雑性により、哺乳動物細胞中における外来遺伝子の発現は原核生物中における発現と大いに異なることから、哺乳動物細胞中における外来遺伝子の高効率発現の機構も、原核生物細胞中における機構と異なっている。哺乳動物細胞中における外来遺伝子の発現は、遺伝子の転写、ｍＲＮＡの翻訳および翻訳後修飾などの過程を含む。翻訳後修飾は、グリコシル化、リン酸化、オリゴマーの形成およびタンパク質分子内または分子間のジスルフィド結合の形成を含む。タンパク質の機能にとって、翻訳後修飾は、非常に重要なものであり、生物学的機能を有するタンパク質（例えば膜タンパク質、抗体、および特異的触媒機能を有する酵素）の発現は、哺乳動物細胞中で行わなければならない場合もある。ＣＨＯ細胞およびマウス骨髄腫細胞（ＮＳ０，ＳＰ２／０）発現系は、現在、治療用抗体およびＦｃ融合タンパク質に対する細胞エンジニアリングシステムとしての至適基準になっている。統計により、現在で認証された治療性モノクローナル抗体のうち、４８％はＣＨＯ細胞に発現して、４５％はマウス細胞（２１％はＮＳ０細胞、１４％はＳＰ２／０細胞、１０％はハイブリドーマ細胞）に発現する。異なる発現システムと培養の条件で、ポリペプチド鎖の完全性は変化しないようだが、グリコシル化タイプの変化は無視できない。
【００１２】
セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｃ２２５  ｍＡｂ）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を特異的に標的とする組換えキメラモノクローナル抗体であり、複数の国家において転移性結腸直腸がんと頭頸部扁平上皮がんの治療に使用されることが許可されている。しかし、多くの研究において、臨床応用には、当該薬は過敏反応の発生率が高いと報告された。過敏反応を有する多くの患者の血清中には、薬物特異性のＩｇＥ抗体が見られ、このＩｇＥ抗体はα−Ｇａｌと特異性に反応する。さらなる研究は、以下の事実を見出した：Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）は、哺乳動物細胞（マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０）で発現されて調製されたものであり、当該マウス細胞株は付加のα１，３−ガラクトシダーゼトランスフェラーゼを含み、主にガラクトース残基をαコンホメーションのＵＤＰ−Ｇａｌから末端のガラクトース残基へ転移することを仲介して、そしてα−Ｇａｌを生成する。α−Ｇａｌは好ましくない非ヒト二糖であり、あるｍＡｂｋ、特にマウス由来の細胞系内に発現したｍＡｂのグリカン上に存在することが発見された。ある患者体内には、高レベルの抗α−ＧａｌＩｇＥ抗体の存在が見出された。グリカン中にα−Ｇａｌユニットを含むｍＡｂを用いて治療する場合に、深刻な過敏症を誘発する可能性がある。また、マウス細胞のＩｇＧグリコシル化と、ヒトのＩｇＧグリコシル化との相異点は、マウス細胞は、α−Ｇａｌのエピトープを生成する生合成機構を有するだけでなく、Ｎ−アセチルフェノールノイラミニダーゼ（ＮＡＮＡ）を生成するというよりはむしろ、Ｎ−ヒドロキシエチルノイラミニダーゼ（ＮＧＮＡ）を生成することにある。ＮＧＮＡとＮＡＮＡとの区別は、ＮＧＮＡが一つの付加の酸素原子を有することにあり、そして、糖タンパク質がＮＧＮＡの残基を含めば、糖タンパク質は、人体における免疫原性と密接に関連すると認められる。ある市販の治療用糖タンパク質はＮＧＮＡの残基を含むため、患者の体内に深刻な有害反応を引き起こした。
【発明の概要】
【００１３】
ＳＰ２／０細胞を宿主細胞として使用し、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を調製する欠点を克服するため、適切な宿主細胞を利用し、かつ、培養条件を最適化することによって、培養細胞中に発現したタンパク質と天然のヒトタンパク質との差異を低減して、人体に対する薬物安全性を高める必要がある。
【００１４】
本発明の発明者は、ＣＨＯ細胞を宿主細胞とし、無血清培養で培養し、異なるグリカン構造を有する遺伝子工学抗ＥＧＦＲ抗体（ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂ）の調製を達成した。この抗体は、α−Ｇａｌグリカン構造を含有しないので、薬物特異的なＩｇＥ抗体が仲介した過敏症を誘発しない；操作された細胞の中に内在性レトロウイルス粒子がなく、このような操作細胞の培養で得られた抗体中には不純物が含まれない。この方法によって調製された抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）ｍＡｂより優れた臨床的安全性を有する。
【００１５】
下記工程を備えることを特徴とする、新規抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の製造方法。
ａ）新規抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体に、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含有させる；
ｂ）配列番号１と３で示される核酸断片を用いて組換えプラスミドを構築し、宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする；
ｃ）細胞培養条件を最適化し、大規模培養し、新規抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を得、分離精製する。
【００１６】
主にハムスターに最適化したコドンに基づいて、新規抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体の軽鎖と重鎖のコード配列をデザイン・合成する。
【００１７】
前記宿主細胞は、真核哺乳動物ＣＨＯ細胞である。
【００１８】
前記細胞培養の温度は３３℃〜３６℃、好ましくは３４℃である。
【００１９】
前記細胞培養の成長培地のｐＨ値は６．５〜６．９、好ましくはｐＨ６．６である。
【００２０】
前記細胞培養の成長培地の浸透圧は２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは３４０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００２１】
前記培地は無血清培地であって、無血清条件で前記宿主細胞を培養する。
【００２２】
ＣＭＡＢ００９抗体と薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【００２３】
ＣＭＡＢ００９新規抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を用いて、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する腫瘍を治療する薬物の製造方法。
【００２４】
薬物で上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する腫瘍を治療する方法であって、前記薬物は、ＣＭＡＢ００９と薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。
【００２５】
さらに、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現する腫瘍を治療する他の薬物と併用することを含む方法。
【００２６】
水と抗ＥＧＦＲ抗体を含む液体薬物組成物であって、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含有し、前記抗体は、動的光散乱（ＤＬＳ）分析で測定される、約１０〜２５ｎｍのｚ−平均（ｚ−ａｖｇ）を有し、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を含有しない、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない、および／またはＧａｌ−α（２，３／６）−Ｇａｌグリカンを含有することを特徴とする組成物。
【００２７】
水と１５〜２０ｎｍのｚ−平均を有する抗ＥＧＦＲ抗体を含む組成物。
【００２８】
がんを有するヒト被験者を治療する方法であって、前記方法は、前記組成物を被験者に投与（給与）することにより、当該がんを治療することを特徴とする方法である。
【００２９】
ヒト被験者のがんの進行を抑制する方法であって、前記方法は、前記組成物を被験者に投与することにより、当該進行を抑制することを特徴とする方法である。
【００３０】
がんは頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）または結腸直腸がんである。
【００３１】
結腸直腸がんは、Ｋ−Ｒａｓ野生型、ＥＧＦＲ−発現の結腸直腸がんである。
【００３２】
抗体は、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン、５−フルオロウラシル、フォリン酸）と併用して投与される。
【００３３】
抗体は、イリノテカンと併用して投与される。
【００３４】
被験者は、再発性または転移性頭頸部扁平上皮がんを有し、かつ、先行のプラチナベースの治療に失敗した被験者である。
【００３５】
被験者は、局所的または局部的に進行した頭頸部扁平上皮がんを有する。
【００３６】
抗体は、放射性治療と併用し、がんの初期治療に用いられる。
【００３７】
被験者は、再発性の局所疾患または転移性頭頸部扁平上皮がんを有する。
【００３８】
抗体は、５−ＦＵを用いるプラチナベースの治療と併用される。
【００３９】
抗体は、追加の治療薬と併用される。
【００４０】
追加の治療薬は、化学療法剤である。
【００４１】
被験者は、オキサリプラチンとフルオロピリミジンベースの治療に失敗した被験者である。
【００４２】
結腸直腸がんを有する被験者の結腸直腸がんの進行を治療または抑制する方法であって、前記方法は、抗ＥＧＦＲ抗体とイリノテカンを投与することにより、結腸直腸がんを治療することを含み、前記抗体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含有し、かつ、Ｇａｌ−α（２，３／６）−Ｇａｌグリカンを含有することを特徴とする方法である。
【００４３】
結腸直腸がんを有する被験者の結腸直腸がんの進行を治療または抑制する方法であって、前記方法は、抗ＥＧＦＲ抗体とイリノテカンを投与することにより、結腸直腸がんを治療することを含み、前記抗体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含有し、かつ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンおよびＧａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しないことを特徴とする方法である。
【００４４】
前記結腸直腸がんは、進行した結腸直腸がんである。
【００４５】
前記抗体は、４００ｍｇ／ｍ2の初期用量、続いて２５０ｍｇ／ｍ2の週用量で被験者に点滴によって投与される。
【００４６】
前記抗体は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞において製造される。
【００４７】
水と抗ＥＧＦＲ抗体を含む液体薬物組成物であって、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含有し、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞において製造され、前記組成物は、ポリソルベートおよび／またはサッカロースを含有しないことを特徴とする組成物。
【００４８】
基本的に、水、抗ＥＧＦＲ抗体、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物、および、リン酸二ナトリウム二水和物を含む液体医薬組成物であって、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含有し、前記抗ＥＧＦＲ抗体は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンを含有しない、Ｇａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない、および／または、Ｇａｌ−α（２，３／６）−Ｇａｌグリカンを含有することを特徴とする組成物。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】セツキシマブとＣＭＡＢ００９重鎖のＦｃセグメントオリゴ糖蛍光標識クロマトグラムのＬＣ／ＭＳ解析
【図２】セツキシマブとＣＭＡＢ００９重鎖のＦａｂ断片オリゴ糖蛍光標識クロマトグラムのＬＣ／ＭＳ解析
【図３】Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ免疫原性解析（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ  システム）
【図４】Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ免疫原性解析（Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  システム）
【図５】図５は、実施例９に記載されたＣＭＡＢ００９試験における無増悪生存期間（ＰＦＳ）をグラフで示す。ＰＦＳは、無作為化から客観的な腫瘍増殖の進行または死亡までの時間として定義される。
【図６】図６は、実施例９に記載されたＣＭＡＢ００９試験における患者の全生存期間（ＯＳ）をグラフで示す。
【図７】図７には、ＤＬＳ法を使用して、Ｅｒｂｉｔｕｘに対するＣＭＡＢ００９の特性をグラフで示して、サイズ分布を決定する。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、少なくとも部分的に、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞中で抗ＥＧＦＲ抗体を製造することによる治療上の利点に基づくものである。ＣＭＡＢ００９は、ＣＨＯ細胞において製造された抗ＥＧＦＲ抗体であって、セツキシマブのアミノ酸配列を有する。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）と比較すると、がんを有する患者にＣＭＡＢ００９の投与することで、免疫原性反応が低減し、疾患の進行が進んだ場合にも効能が改善した。
【００５１】
ここで、用語「セツキシマブ」は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含有する抗ＥＧＦＲ抗体を指す。セツキシマブの軽鎖と重鎖の配列を以下に示す：
Gatatccttctgacacagtctccagtgatactgtcagtttctccaggggagcgcgtctca 60
Tttagttgtcgggccagtcagagtatcggcacaaacatccattggtaccagcagcggaca 120
Aacggctccccccggttgctcattaagtacgcaagcgagtctatctctgggataccaagt 180
Cgcttctcgggtagtggtagcggaacagattttactctgagtatcaatagcgtcgaatcc 240
Gaagatattgccgattactactgtcagcagaataacaactggccaaccacattcggcgcc 300
Ggtaccaagctggaactcaagcgcacagttgccgcacctagtgtcttcatcttcccacca 360
Tctgacgagcaactaaagagtggcactgcaagtgtcgtatgtctgctgaacaacttttac 420
Ccacgggaggctaaagtgcagtggaaggtagacaacgcccttcagagcggaaattctcag 480
Gaaagcgtcaccgaacaagattccaaggatagcacatactccctgtcctctaccctgaca 540
Ctgtcaaaagctgactacgaaaagcataaagtgtatgcttgcgaggtgactcatcagggg 600
Ctcagctcgcccgtcaccaagtccttcaaccgtggagaatgt       (配列番号:1)
【００５２】
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPS 60
RFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPP 120
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT 180
LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC  (配列番号:2)
【００５３】
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPS 60
RFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR (配列番号:5;軽鎖の可変領域であり、CDRは黄色を付ける)
【００５４】
CDR1
【００５５】
RASQSIGTNIH (配列番号:6)
【００５６】
CDR2
【００５７】
YASESIS (配列番号:7)
【００５８】
CDR3
【００５９】
QQNNNWPTT (配列番号:8)
【００６０】
caggtgcagctgaagcagagcggaccaggcctggtccagccctcacagtccctgagcatt 60
Acttgtactgtgagtgggttctcgttgacgaactacggggtgcattgggtgcgccagagt 120
Cccggtaaagggctggagtggttaggcgtgatttggagcggcggtaacactgactataat 180
Acccctttcaccagtcgcttgagtatcaataaggataattcaaagtctcaagtgtttttt 240
Aagatgaactccctacagagcaacgatacggctatctactactgtgcccgcgcccttaca 300
Tactacgactatgagttcgcttattggggccaggggaccttggtcactgtgtctgcagct 360
Tctacaaaagggccatccgtgttcccactggcccccagttccaagagcactagtggtggc 420
Acagcagccctcgggtgcctcgtgaaggattacttcccggagccagtgaccgtcagttgg 480
Aactccggcgctctaacaagcggagtacatacttttccagccgtgctgcagtcttcaggg 540
Ctttacagtctttcctccgttgtgacagtgcccagcagcagcctgggcacccagacttat 600
Atttgtaatgtgaaccataagccttctaatactaaggtggacaagagagttgagccaaag 660
tcctgtgacaaaactcacacatgccccccttgcccagctcctgagttgttgggcggccct 720
tccgtcttcctgtttcccccgaaacctaaggataccctgatgatatctcggacaccagaa 780
gtgacatgcgtcgtggtcgatgtgtcacacgaagaccctgaggtgaaatttaactggtac 840
gtagacggtgtagaagttcacaacgctaagacaaagcctcgggaagagcagtacaactca 900
acctaccgagtagtgtccgtgcttactgttctgcaccaggactggctgaatggaaaggaa 960
tataagtgtaaagtgtccaataaggcactgcctgctccaatcgagaagacgatttctaaa 1020
gccaagggacaaccaagagaacctcaggtgtataccttgcccccatctagagaagagatg 1080
accaaaaaccaggtgtcacttacatgcctcgtgaaaggcttctatccttctgacattgcc 1140
gtcgaatgggagagtaacggacagcccgagaacaactacaagaccacacctccagtgctg 1200
gattcggatggctctttcttcctttatagtaagctcactgtggacaagtcccgatggcag 1260
caggggaacgtgttctcttgcagcgtgatgcacgaggcattgcataatcactacacccag 1320
aagtctctctcattatcccctggcaag   (配列番号:3)
【００６１】
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYN 60
TPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSAA 120
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG 180
LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP 240
SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS 300
TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEM 360
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ 420
QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号:4)
【００６２】
QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYN 60
TPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (配列番号:9;軽鎖の可変領域であり、CDRは黄色を付ける)
【００６３】
CDR1
【００６４】
NYGVH (配列番号:10)
【００６５】
CDR2
【００６６】
VIWSGGNTDYNTPFTS (配列番号:11)
【００６７】
CDR3
【００６８】
ALTYYDYEFAY (配列番号:12)
【００６９】
ここで、用語「ＣＭＡＢ００９」は、ＣＨＯ細胞において製造されたセツキシマブ抗体を指す。また、ＣＭＡＢ００９抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖とを含有する。さらに、ＣＭＡＢ００９抗体は、Ｎ−グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）グリカンとＧａｌ−α（１，３）−Ｇａｌグリカンを含有しない。ＣＭＡＢ００９抗体は、例えば、Ｇａｌ−α（２，３／６）−ＧａｌグリカンのようなＣＨＯ細胞の発現に関するグリカンを含有する。
【００７０】
ここで、用語「併用」は、治療の施しに関して使用される場合、二つまたはこれ以上の治療剤、例えば、ＣＭＡＢ００９とイリノテカンとを採用することで、病気、例えば、転移性結腸直腸がんを治療することを指す。用語「併用」の使用は、がんを有する被験者に治療が施される順序に対する制限にならない。例えば、二つ目の治療の前（例えば、１分、４５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間）、同時、若しくは後（例えば、１分、４５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間）に、がんを有した又は有する被験者に一つ目の治療を施してもよい。任意の追加の治療は、他の追加の治療とともに、任意の順序で行うことができる。
【００７１】
本発明は、ＣＨＯ細胞の使用より、改良した抗ＥＧＦＲ抗体を製造するものであり、その抗ＥＧＦＲ抗体は、例えば骨髄腫細胞において製造された抗ＥＧＦＲ抗体よりも有効かつ安全なものである。ＣＨＯ細胞におけるグリコシル化機構は、ヒトのＩｇＧグリコシル化機構と非常に似ており、以前の研究では、ＣＨＯ細胞は、α−Ｇａｌエピトープを有する糖タンパク質の生合成機構を有さないことを示唆しており、最近の研究では、ＣＨＯ細胞におけるα１，３−ハーフガラクトシダーゼトランスフェラーゼ遺伝子の存在を報告しているが、クローン選択のプロセス中において、該遺伝子が発現しない状態または低発現状態にあり、かつ当該グリコシドのα１，３−ガラクトシダーゼトランスフェラーゼ遺伝子はどのようにしてＣＨＯ細胞株において活性化されるかは不明であり、他のグリコシドトランスフェラーゼと同様に、それはトランスフェクションプロセスに関連していると考えられる。以上に基づき、ＣＨＯ発現システムをデザイン・選択して、異なるグリカン構造を有する遺伝子工学抗ＥＧＦＲ抗体（ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂ）を製造することに成功した。構造の解析により、Ｅｒｂｉｔｕｘグリカンは、大量のα−Ｇａｌを含有して、かつ末端シアル酸として、高い免疫原性を有するＮＧＮＡを主に含有することを確認した。ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂグリカンはα−Ｇａｌを含まず、末端シアル酸は主にＮＡＮＡの形態である。その後の臨床研究で、抗体が良好な耐性を有し、薬物関連過敏症は観察されず、ＩｇＥ特異的ＡＤＡは検出されないことを確認した。免疫原性を大幅に低下させると同時に、ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体の生体内クリアランスの特徴は、キメラ抗体の生体内の代謝と一致し、薬物動態パラメーターはＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）と一致する。ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体は、著しい臨床効果を初めて達成し、過敏症の潜在的な患者に最大の利益をもたらすと期待される。
【００７２】
Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）モノクローナル抗体と比較して、ＣＭＡＢＯＯ９モノクローナル抗体は同じアミノ酸一次構造を持ち、α−Ｇａｌを含まず、末端シアル酸は主にヒトのシアル酸形式のＮ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）である。これは、臨床研究において観察されたより良好な耐性と一致し、薬物関連過敏症は観察されなかった。免疫原性を大幅に低下させると同時に、ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体の生体内クリアランスの特徴は、キメラ抗体の生体内の代謝と一致し、薬物動態パラメーターはＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）と一致する。
【００７３】
この研究は、ｍＡｂグリコシル化構造を改変することによって、モノクローナル抗体の生物学的活性およびクリアランス特性に影響を与えずに、モノクローナル抗体の免疫原性を低下させて、過敏症の発生を予防することに有効であることを証明した。これは、臨床的有害反応の発生率を低減することができ、過敏症の潜在的な患者に最大の利益をもたらし、潜在的に安全で耐性があり効果的な標的薬物を提供することを期待される。
【実施例】
【００７４】
以下の実施形態、本発明の実施例をさらに詳細に説明する。これらの実施形態、実施例は説明のためのものであるが、本発明は、それらに限定されない。
【００７５】
実施例１：  真核発現ベクターの構築
チャイニーズハムスター卵巣細胞発現システムでより高効率の発現が得られるように、ハムスター好適コドンを選択して真核高効率発現ベクターを構築した。ハムスター好適コドンは表１に示す。
【００７６】
【表１】
0006643356.tif 000002
【００７７】
シグナルペプチドは、チャイニーズハムスターＢ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質β鎖由来のシグナルペプチドを選択した。
ＭＡＴＭＶＰＳＳＶＰＣＨＷＬＬＦＬＬＬＬＦＳＧＳＳ  （配列番号：  １３），  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＧＴＧ  ＣＣＣ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＴＴＣ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  （配列番号：  １４）。
【００７８】
ハムスター好適コドンに基づいてデザイン・合成することで、ＣＭＡＢ００９軽鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列と配列番号２のアミノ酸配列を有し、ＣＭＡＢ００９重鎖は、配列番号３のヌクレオチド配列と配列番号４のアミノ酸配列を有する。上記軽鎖と重鎖を真核細胞高効率発現ベクターに連結し、軽鎖と重鎖の真核発現ベクターを得た。
【００７９】
実施例２：    宿主細胞の選択と改造
生物製薬分野において、宿主細胞の選択には、以下のいくつかの重要な面に注目する必要がある：グリコシル化および他の翻訳後修飾のタイプは免疫原性をもたらすことを避けられること；宿主細胞はバイオリアクターでの大規模培養に適し、かつ、動物由来成分フリーの化学成分限定的（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｆｒｅｅ、ＡＣＤＦ）培地中で高密度まで増殖できること；ウイルス安全性；ＡＣＤＦ中で行われるクローニングおよびストレススクリーニングに適すること。
【００８０】
ＣＨＯ細胞は、バイオリアクター内で高密度で増殖することができ、遺伝子操作が容易であり、ヒトに似たＮ−グリコシル化を有し、ウイルス伝播のリスクを低下させるから、バイオ医薬分野で広く使用されている。工業的生産によく使われるクローンは、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１およびＣＨＯ−ＤＧ４４である。ＣＨＯ−Ｋ１は初代ＣＨＯ細胞と類似して、ＤＧ４４とＤＸＢ１１はランダム突然変異を経てＤＨＦＲ遺伝子が欠失しているため、それらは、代謝の欠陥により遺伝子増幅に使用することができる。ＣＨＯ−Ｋ１はＣＳ選択システムを使用するが、ＣＨＯ−Ｋ１における内因性ＣＳ発現のために、そのスクリーニング効率が低い。
【００８１】
本発明は、宿主細胞として、治療用抗体の工業的生産により広く使用されるＣＨＯ細胞を選択し、かつＣＨＯ−Ｋ１を適切に設計した。発明人は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術によりＣＨＯ−Ｋ１のＣＳ遺伝子をノックアウトし、得られた細胞株をＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-と名づけて、内因性ＣＳの発現をなくし、高発現細胞クローンのスクリーニングにとってより有利になった。
【００８２】
実施例３：  宿主細胞にトランスフェクトし、高発現クローンをスクリーニングする
リポソーム法でＣＨＯ−ＣＲ−ＧＳ-/-をコトランスフェクトし、ＣＳスクリーニングシステムでストレススクリーニングし、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を高効率で発現する安定な細胞クローンを得た。複数回のトランスフェクションおよびスクリーニングにより、発現量が２０ｐｇ／ｃｅｌｌ．ｄａｙを超える細胞クローンを得た。
【００８３】
実施例４：    培養条件の同定
ＣＨＯ−ＣＲ−Ｇ５-/-用の汎用基本培地を開発した。それは合成型培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｆｉｎｅｄ、ＣＤ）、即ち細胞成長の需要に応じてアミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコースおよび微量元素などを一定の比率で組み合わせてなる基本培地である。基本培地はスクリーニングで得られる操作細胞の成長の需要を基本的に満たすことができる。操作細胞から所望の抗体収率をより改善するために、ホルモン、遺伝子改変の組換え成長因子の添加、アミノ酸量の調節を含む基礎培地の最適化を行った。
【００８４】
培養ｐＨは６．５〜６．９で、好ましくはｐＨ６．６である；培養温度は３３℃〜３６℃で、好ましくは３４℃である；浸透圧は２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇで、好ましくは３４０ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００８５】
複数の比較および最適化をした結果、培養条件としてｐＨ６．６、温度３４℃、３４０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、培地（ＣＨＯＭ−Ｂ０９）と補足培地（ＣＨＯＭ−Ｓ０９）は、抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体を発現する操作細胞の大規模無血清培養に適したことを確認した。
【００８６】
流加（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養法を利用して、最適化された培地における操作細胞の発現収率は、３０ｐｇ／ｃｅｌｌ．ｄａｙより大きかった。２週間の培養周期で収穫する培養物上澄中で、目的抗体の収量は３ｇ／Ｌ以上になった。
【００８７】
実施例５：    ＣＭＡＢ００９抗体の分離精製
スクリーニングされた高発現クローンを無血清培地で増幅培養し、上澄を収集し、９０００ｒｐｍ＊２０ｍｉｎ、４℃で遠心し、沈殿した細胞と破片を捨てた；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の５０ＫＤ限外濾過カセットで限外濾過濃縮を行った後、さらに９０００ｒｐｍ＊３０ｍｉｎ、４℃で遠心し、細胞破片を除去した；０．４５μｍ濾過膜で濾過し、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（組換えタンパク質Ａ）アフィニティークロマトグラフィーで予備精製を行った；同所洗浄緩衝液は６Ｍ  ＧｕＣｌで、カラム用結合緩衝液は２０ｍＭ  ＰＢ＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０であった；カラム体積の３〜５倍量で平衡化した後、カラム体積の３〜５倍量の溶出緩衝液２０ｍＭ  Ｃｉｔｒｉｃ  Ａｃｉｄ（クエン酸緩衝液）  ｐＨ３．０で溶出した。平衡化および洗浄の後、カラムを２０％ＥｔＯＨ中に保存した。ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａから溶出された目的タンパク質に対して、Ｈｉｔｒａｐ  Ｇ２５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で脱塩、緩衝液交換を行い、カラム溶出緩衝液をＰＢＳ（２０ｍＭＰＢ＋１５０ｍＭＮａＣｌ  ｐＨ７．０）とし、同所洗浄液を０．５Ｍ  ＮａＯＨとした。以上の精製ステップは全て氷上で行われ、精製で得られた抗体を５０ＫＤ限外濾過遠心チューブ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮し、ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体を得た。
【００８８】
精製後、標準的な動的光散乱（ＤＬＳ）分析に従って、ＣＭＡＢ００９は特徴付けられた。ＣＭＡＢ００９は、Ｅｒｂｉｔｕｘと比較して、より均質なサイズ分布を有することを確認した。Ｅｒｂｉｔｕｘのｚ平均（ｚ−ａｖｇ）は３１．５６ｎｍであり、ＣＭＡＢ００９のｚ−ａｖｇは１６．７９ｎｍであることを確認した。さらに、Ｅｒｂｉｔｕｘの多分散指数（ＰＤＩ）は０．３１３で、ＣＭＡＢ００９の多分散指数は０．１２８であることを確認した。ＣＭＡＢ００９とＥｒｂｉｔｕｘの特性比較として、ＤＬＳ法で確認されたサイズ分布を図７に示す。
【００８９】
実施例６：  培養産物のグリコシル化の比較
ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体とセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、Ｃ２２５モノクローナル抗体）の糖鎖の比較分析には、ＬＣ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳ技術を使用した。
【００９０】
サンプルの用意：グルコシダーゼ消化後にＦａｂ由来のＦｃ断片およびオリゴ糖を調製した；Ｆａｂ上のオリゴ糖をオリゴ糖エキソヌクレアーゼで処理した；オリゴ糖を２−ＡＢ蛍光標識した；ＨＩＬＩＣ固相抽出で過剰の２−ＡＢを除去した後、蛍光標識糖鎖を有するオリゴ糖を得、次いでＬＣ／ＭＳおよびＭＳ／ＭＳクロマトグラフィーで分析した。
【００９１】
蛍光標識後、ＭＡｂのグリコシダーゼ処理由来の遊離グリカンを、それぞれ、ＬＣ／ＭＳ、ＭＳ／ＭＳおよびオリゴ糖エキソヌクレアーゼ処理によって分析した。その結果は、図１に示すように、ＣＭＡＢ００９抗体および元の抗体セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））はそれぞれ、２つのグリコシル化サイトを有し、それらのＦｃセグメント上に全く同じグリカン鎖構造を有する。しかし、それらのＦａｂセグメントは、異なるグリカン鎖構造を有しており、ＣＭＡＢ００９  Ｆａｂフラグメントは主にシアル酸ＮＡＮＡグリカン鎖構造を有するが、元のセツキシマブ  Ｆａｂフラグメントは主にシアル酸ＮＧＮＡグリカン鎖構造を有する；ＣＭＡＢ００９  Ｆａｂのグリカンはα−ガラクトースを含まないが、元のセツキシマブ  Ｆａｂのグリカンは多量のα−ガラクトースを含む。重鎖Ｆａｂ断片のグリカン構造のＬＣ／ＭＳ分析を図２に示す。
【００９２】
実施例７：  臨床耐性試験
ＣＭＡＢ００９  ｍＡｂ臨床的耐性の初期評価
最初の研究では、合計１８名の被験者を、単回静脈内投与の研究において、１００ｍｇ／ｍ2用量、２５０ｍｇ／ｍ2用量および４００ｍｇ／ｍ2用量の用量群それぞれに、３、６、６名の被験者を割り当てた。単回投与試験を行った被験者のうち、３名が疾患の進行により撤回した；研究デザインによれば、残りの１５名の被験者は複数回投与の組入れ基準により複数回投与群に参加し、３名の追加被験者は複数回投与された（表１）。
【００９３】
【表１−２】
0006643356.tif 000003
【００９４】
この研究を受けた被験者は、従来の有効な治療法で難治であり、従来の治療では治らない、または癌が再発した患者であり（結腸直腸癌１０例、肺癌７例、胃癌１例）、被験者の統計学的特徴と、被験者の事前治療を表２に示す。
【００９５】
【表２】
0006643356.tif 000004
【００９６】
被験者のベースライン、単回投与の三つの群と複数回投与の二つの群の被験者の身長、体重、体表面、ＥＣＯＧ点数に基づき、比較および分析を行った。結果を表３に示すが、統計的に有意差はない。
【００９７】
【表３】
0006643356.tif 000005
【００９８】
結果は、ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体が良好な耐性を示した。１８名の被験者の中で、表４に示されたグレードＩＩＩ−ＩＶの薬物関連毒性を示したものがなく、すべての薬物関連毒性はグレードＩ−ＩＩに発生して、毒性の発生率は用量または投与頻度とは関係がない。用量制限毒性は観察されず、薬物に関連する過敏症は観察されなかった。
【００９９】
【表４】
0006643356.tif 000006
【０１００】
本研究では、ＣＭＡＢ００９抗体に関連する過敏症は観察されなかったが、Ｐａｕｌａ  Ｍ．  Ｆｒａｃａｓｓｏらの発見によれば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）に伴う過敏反応の発生率は３１％に達し、クラスＩＩＩ−ＩＶ過敏症の発生率は１３％であった。Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｈ．  Ｃｈｕｎｇらは、元のＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）の投与で起こる過敏症に関する研究を行った（Ｃｈｕｎｇ  ＣＨ、Ｍｉｒａｋｈｕｒ  Ｂら、セツキシマブ誘発の過敏症およびガラクトース−α−１，３−ガラクトースに対する特異的なＩｇＥ；Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２００８；  ３５８（１１）：１１０９−１７）。Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）治療を受けた７６人の被験者のうち、２５人が過敏症を有し、過敏症の発生率は３３％に達し、これはＰａｕｌａ  Ｍ．  Ｆｒａｃａｓｓｏの結果と一致していた。Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｈ．  Ｃｈｕｎｇの研究は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）関連の過敏症はα−Ｇａｌ特異的なＩｇＥで誘導されたものであることを確認した。
【０１０１】
実施例８：  臨床結果の安全性、免疫原性試験
ＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体臨床安全性：ほとんどの有害事象は薬物関連発疹であり、臨床的に有意な新たな毒性は観察されず、７３名の被験者の間で重篤な過敏症は観察されなかった。
【０１０２】
免疫原性は、生物医薬品の安全性評価において重要な側面である。伝統的なＥＬＩＳＡは、免疫原性解析に使用することができるが、以下の問題が存在する：理論的には、抗体を捕捉するためのコーティングされたＦａｂセグメントは、抗原−抗体相互作用を促進するための最適なコンホメーションに向けられるべきが、捕捉に用いられるＦａｂセグメントは部分的または全体的にマイクロタイタープレートに結合して、抗体捕捉活性が低下することがある。
【０１０３】
本研究では、底部は生体分子相溶性層と結合したＳＡリガンドで覆われていた、バイオフィルム干渉技術で製造されたバイオセンサーおよび光ファイバーを使用する。捕捉されたビオチン化抗体がリガンドに結合されると、バイオフィルムの厚さが増加し、反射光の干渉スペクトル曲線が測定可能な距離に変動し、それによって分子間相互作用のリアルタイム測定が可能になる。この方法は、捕捉された抗体の自己組織化プロセスに相当し、バイオセンサーの表面に、抗体を捕捉するために、一定の密度で多数の最適なコンホメーションを形成し、それは分析感度を向上させるだけでなく、線形範囲も増加させ、非特異的結合由来の偽陽性反応を減少することに寄与する。
【０１０４】
Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ免疫原性解析：臨床血清サンプル中のＡＤＡの検査；結果は、図３、４に示す：カットポイント値分析で、７３人の被験者において、３名の潜在的に陽性の被験者がいる（ＨＰＣは強陽性、ＭＩＰＣは陽性、ＬＰＣは弱陽性、ＮＣは陰性である）。
【０１０５】
本研究におけるＣＭＡＢ００９モノクローナル抗体の免疫原性解析では、被験者の１．４％（１／７３）にＡＤＡが検出され、サブタイプ解析により、それらはＩｇＧ型であり、過敏症で誘導されるＩｇＥ型ＡＤＡではないことを確認した。臨床試験で被験者に重度の過敏反応は観察されなかったことから、この試験の結果は、臨床安全性評価の結果と一致する。
【０１０６】
実施例９：    ＣＭＡＢ００９治療の改善されたがん治療有効性と低下した免疫原性
第２／３相の研究では、転移性結腸直腸癌を有する患者にＣＭＡＢ００９を投与して、ＣＭＡＢ００９の有効性および免疫原性を確認した。以下に記載するように、研究の結果は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）を用いて実施された類似の研究と比較した。驚くべきことに、ＣＭＡＢ００９は、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）の既知の効力を超える有効性を有することが判明した。例えば、ＣＭＡＢ００９は、患者の全生存期間および疾患進行までの時間を延長させることができる。以下の研究は、Ａｌｂｅｒｔｏ  Ｆ．  Ｓｏｂｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００８、２６：２３１１−２３１９に記載されたＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）研究に相当する。
【０１０７】
ＣＭＡＢ００９試験は、患者をスクリーニングすることによって開始され、これらの患者は、以下のように決定した：１）組織学的に確認された転移性結腸直腸腺癌を有するもの；２）免疫組織化学によるＥＧＦＲ発現またはＥＧＦＲ非発現のＫＲＡＳ野生型腫瘍を有するもの；３）ＣＴまたはＭＲＩで少なくとも１ｃｍ直径、身体検査または他の図像検査で少なくとも２ｃｍ直径、という測定可能な病変を有するもの；４）ＥＣＯＧ全身状態が０〜１であるもの；５）フルオロピリミジンとオキサリプラチン治療は失敗した（疾患が進行／毒性による中止）、その後少なくとも１ヶ月停止する、イリノテカンを使用したことがないもの。５０１名の患者を確認し、無作為に２：１となるように、グループ１とグループ２に分けた。グループ１は、ＣＭＡＢ００９とイリノテカンの組み合わせを投与された３３７名の患者が含まれる。具体的には、グループ１の患者はＣＭＡＢ００９を、４００ｍｇ／ｍ2の初期用量で投与され、その後、毎週２５０ｍｇ／ｍ2を注入投与した。イリノテカンの投与量は、２週間ごとに１８０ｍｇ／ｍ2に維持した。グループ２は、本研究の前に、患者の治療と一致した用量でイリノテカン単剤療法を投与された１６４人の患者が含まれる。疾患が進行または毒性が患者の許容できないレベルに達するまで、両方のグループの患者を治療した。患者のベースライン特性を表５に示す。
【０１０８】
【表５】
0006643356.tif 000007
【０１０９】
グループ１とグループ２の患者の放射線学的応答について評価した。結果を表６に示す。なお、表６の全体的な応答率（ＯＲＲ）は、ＣＲとＰＲの比率の合計に従って決定し、疾患制御率（ＤＣＲ）は、ＣＲ、ＰＲとＳＤの割合の合計に従って決定した。
【０１１０】
類似の研究（Ａｌｂｅｒｔｏ  Ｆ．  Ｓｏｂｒｅｒｏ，  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００８、２６：２３１１−２３１９を参照）に報告されたＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）のデータと比較すると、ＣＭＡＢ００９を受けた患者の全生存期間が良好（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）＋イリノテカンを投与された患者の場合１０．７ヶ月  ｖｓ  ＣＭＡＢ００９  ＋イリノテカンを投与された患者の場合１７．６ヶ月）であることと、疾患進行までの期間の延長（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）＋イリノテカンを投与された患者の場合４．０ヶ月  ｖｓ  ＣＭＡＢ００９  ＋イリノテカンを投与された患者の場合５．６ヶ月）を示した。
【０１１１】
【表６】
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【０１１２】
Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）の報告されたデータと比較すると、驚くべきことに、ＣＭＡＢ００９を受けた患者の全生存期間の方が高い、すなわちＥｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）＋イリノテカンの場合１０．７ヶ月であるのに対し、ＣＭＡＢ００９＋イリノテカンの場合１７．５ヶ月である。ＣＭＡＢ００９試験からの疾患進行の増加を示すデータも図５に示す（発表されたＥｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）データと比較する；Ａｌｂｅｒｔｏ  Ｆ．Ｓｏｂｒｅｒｏ，  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００８、２６：２３１１−２３１９の図３を参照）。ＣＭＡＢ００９試験からの全生存期間の延長を示すデータも図６に示されている（発表されたＥｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）データと比較する；Ａｌｂｅｒｔｏ  Ｆ．Ｓｏｂｒｅｒｏ，  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００８、２６：２３１１−２３１９の図２を参照）。
【０１１３】
試験の安全性評価を以下の表７に示す。
【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
特に、ＣＭＡＢ００９試験の有害事象はＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）の報告された有害事象よりも低かった。グレード３〜４の有害事象を以下の表８に記載する（Ａｌｂｅｒｔｏ  Ｆ．  Ｓｏｂｒｅｒｏ，  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２００８、２６：２３１１−２３１９の表３と比較）。
【０１１６】
【表８】
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【０１１７】
つまり、同じ一次構造を有するが、ＣＭＡＢ００９は、驚くべきことに、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ）より効果的であり、例えば、疾患の進行までの時間がより長いだけでなく、過敏症反応に関連する有害事象（例えば、にきびのような発疹または下痢）の発生率が低下した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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