(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴルジ移行シグナルに作動可能に連結されているエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする外因性核酸配列を含み、かつ内因性ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性が欠損した真核細胞。
【請求項２】
糖タンパク質をコードする第２の外因性核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の真核細胞。
【請求項３】
内因性エンドグルコサミニダーゼ酵素を発現しない、請求項１または２に記載の真核細胞。
【請求項４】
哺乳動物細胞、特にＨｅｋ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項５】
前記エンドグルコサミニダーゼは、マンノシル−糖タンパク質エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９６）、特にＥｎｄｏ  Ｔである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項６】
前記糖タンパク質は、前記細胞によって分泌される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の真核細胞。
【請求項７】
真核細胞においてＯ−グリコシル化をさらに欠く単一ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を産生するための方法であって、
−  ゴルジ移行シグナルに作動可能に連結されているエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列を含み、内因性ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性が欠損し、かつ糖タンパク質をコードする第２の外因性核酸配列を含む真核細胞を、前記エンドグルコサミニダーゼ酵素および前記糖タンパク質を発現するのに適した条件で提供するステップと、
−  前記糖タンパク質が前記エンドグルコサミニダーゼと細胞内で接触された後、前記糖タンパク質を回収するステップと
を含む方法。
【請求項８】
前記糖タンパク質が前記エンドグルコサミニダーゼによって細胞内で処理された後、前記糖タンパク質をグリコシルトランスフェラーゼによって処理させるステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、糖鎖工学の分野、より詳細には、エンドグルコサミニダーゼが存在すると共に、ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）が欠損されている、真核細胞に関する。典型的に、糖タンパク質は細胞中にも存在する。これらの細胞は、（外因性）糖タンパク質を脱グリコシル化するかまたは部分的に脱グリコシル化するために使用され得、特に、特別な酵素を追加する必要がない。タンパク質産生におけるこれらの細胞の適用のための方法も提供される。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質は、細胞接着、腫瘍転移、病原体感染、および免疫応答などの多くの生物学的イベントにおいて不可欠な役割を果たす重要な種類の生体分子である。ほとんどの哺乳動物細胞表面タンパク質およびヒト血清タンパク質は、糖タンパク質であり、そのため、治療用糖タンパク質が重要な種類のバイオテクノロジー産物であることは驚くべきことではない。これらは、とりわけ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン−２、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、および抗体を含む。天然および組換え糖タンパク質の両方は、張り出しているオリゴ糖の構造のみが異なるグリコフォームの混合物として典型的に産生される。グリコシル化におけるこの不均一性は、糖タンパク質についての構造的および機能的研究（たとえば、結晶化研究）ならびに糖タンパク質薬剤の開発において大きい問題となる。付着している糖鎖は、たとえば、糖タンパク質のタンパク質フォールディング、安定性、作用、薬物動態、および血清半減期に対して重大な影響を有し得、糖鎖の中には、非常に免疫原性のものもある。グリコシル化は、真核生物における最も一般的なタンパク質の翻訳後修飾の１つである。Ｎ−グリコシル化は、高度に保存された代謝プロセスであり、これは、真核生物において生存能力に不可欠である。タンパク質Ｎ−グリコシル化は、小胞体（ＥＲ）において起こり、ここで、ドリコール（脂質キャリヤ中間体）上に構築されたＮ結合型オリゴ糖（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）が新生タンパク質の適切なアスパラギン残基（Ａｓｎ）に移される。これは、すべての真核生物に広く共通する同時翻訳イベントである。３つのグルコース残基および１つの特異的なα−１，２結合マンノース残基は、ＥＲにおいて特異的なグルコシダーゼおよびα−１，２−マンノシダーゼによって除去され、コアオリゴ糖構造、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２がもたらされる。このコア糖構造を有するタンパク質は、ゴルジ装置に輸送され、ここで、糖成分が様々な修飾を受ける。グリコシルトランスフェラーゼおよびマンノシダーゼは、ＥＲおよびゴルジ装置の内部（内腔）表面に沿って並び、それにより、糖タンパク質がＥＲおよびゴルジネットワークを進むときに糖タンパク質が連続して処理されるのを可能にする触媒表面を提供する。シス、中間、およびトランスゴルジならびにトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）の複数の区画は、グリコシル化反応を規則正しい順序で行うことができる異なる場所を提供する。糖タンパク質がＥＲにおける合成から後期ゴルジまたはＴＧＮにおける完全な成熟に進むにつれて、糖タンパク質は、特異的なＮ−グリカン構造が合成されるように、様々なグリコシダーゼ、マンノシダーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼに連続して曝露される。下等および高等真核生物間にはゴルジ装置における糖鎖の修飾に著しい差異がある。高等真核生物では、Ｎ結合型オリゴ糖は、典型的に、酵母において産生されたものと著しく異なる高マンノース、複合、および混合（ハイブリッド）型の構造である（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１−６６４（１９８５））。哺乳動物細胞では、糖鎖の修飾は���糖鎖が追加されるタンパク質成分に依存して３つの異なる経路をたどり得る。すなわち、（１）コア糖鎖が変化しない；（２）コア糖鎖が、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）中のＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸成分（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）をコア糖鎖中の６位のマンノースに追加し、その後、ＧｌｃＮＡｃ成分を除去して、糖タンパク質中に酸性糖鎖を形成することによって変化する；および（３）コア糖鎖が、ゴルジα−マンノシダーゼＩにより３つのマンノース残基を除去することによってＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に最初に変換され、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、次いで、ＧｌｃＮＡｃを追加し、さらに２つのマンノース残基を除去し、その後、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース（Ｇａｌ）、ＧａｌＮＡｃ、フコース、およびＮ−アセチルノイラミン酸（シアル酸（ＮｅｕＮＡｃ）とも呼ばれる）を連続して追加して、様々なハイブリッドまたは複合糖鎖を形成することによってさらに修飾される（Ｒ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋｏｒｎｆｅｌｄ，１９８５；Ｃｈｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。様々な生物が、様々なグリコシル化酵素（グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）ならびに様々なグリコシル基質を提供し、その結果として、糖側鎖の最終的な組成が高等真核生物宿主に依存して著しく異なり得る。典型的に、動物糖タンパク質のタンパク質Ｎ−グリカンは、２、３、または４分岐構造を有する。これらの分岐構造は、オリゴ糖残基の領域へのＧｌｃＮＡｃのＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ触媒による追加によって合成される。それらの形成に続いて、分岐構造は、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ、フコース（Ｆｕｃ）、およびシアル酸残基を含む様々な糖により終結する。
【０００３】
酵母および糸状菌（下等真核生物）では、Ｍａｎ８（９）ＧｌｃＮＡｃ２構造の一部分のみが（部分的に）切り取られてＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２になる。これらのオリゴ糖は、次いで、ジエステル結合でのマンノース残基および／またはマンノースリン酸残基の追加を通して菌類特異的グリカンにさらに修飾され得る。結果として生じるグリカンは、「高マンノース」型グリカンまたはマンナンとして知られている。たとえば、酵母糖ペプチドは、９〜１３のマンノース残基の高マンノースコアからなるオリゴ糖構造または２００残基以下からなる長い分岐マンナン外鎖を含む（Ｂａｌｌｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６６：３６３−３７９（１９９２）；Ｔｒｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２：５７−７５（１９９２））。
【０００４】
治療上の適用のための糖ペプチドおよび糖タンパク質の調製のための新たな戦略の検証および最適化にかなりの努力が向けられてきた。多くの有望な方法の中でおそらく最も立証されているアプローチは、所望のグリコシル化パターンを有する糖ペプチドを産生する細胞宿主の遺伝子操作である。特に酵母においてこれを実現することができる方法に関する最近の報告については、Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００５，１１９−２８およびＨａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７；１８（５）：３８７−９２を参照されたい。他の例示的な方法は、化学合成、酵素による合成、形成された糖ペプチドの酵素によるリモデリング、および当然のことながら１つ以上のこれらの技術のハイブリッドまたは組み合わせである方法を含む。
【０００５】
細胞宿主系に関して、原則として、哺乳動物、昆虫、酵母、菌類、植物、または原核細胞培養系は、商業上実現可能な数量のほとんどの治療用および他の糖ペプチドの産生に使用することができる。しかしながら、実際には、組換えで産生されたタンパク質に対する所望のグリコシル化パターンは、実現するのが困難である。たとえば、細菌は、ドリコール経路を介してＮ−グリコシル化せず、酵母は、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンを産生するのみであり、オリゴマンノース型Ｎ−グリカンは、一般に、ヒトにおいて多量に見出されず、肝臓に存在するマクロファージによって積極的に取り除かれる。同様に、植物細胞は、ヒト糖ペプチドの一般的な構成要素であるシアリル化オリゴ糖を産生しない。加えて、植物は、キシロースおよび／またはα−１，３結合フコースをタンパク質Ｎ−グリカンに追加し、動物と構造が異なり、哺乳動物において免疫原性となる糖タンパク質をもたらす（Ｌｅｒｏｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８；３８（１−２）：３１−４８；Ｂｅｔｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２００４；１４（５）：６０１−６；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１４２（２）：９９−１１５）。最近報告されたように、組換え哺乳動物糖ペプチドの産生に現在利用可能な昆虫細胞系のいずれも、哺乳動物において産生される場合に通常見出される同じグリカンを有する糖ペプチドを産生しないであろう（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊａｒｖｉｓ，２００６，１５９）。さらに、組換え糖ペプチドのグリコシル化パターンはまた、様々な細胞培養条件下で産生された場合（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１０：３９−４４（１９９４）およびＧａｗｌｉｔｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．４２：１１７−１３１（１９９５））、または２つの異なるバイオリアクターにおける名目上同一の細胞培養条件下で産生された糖ペプチド間でさえも異なり得る（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０００：４６２−４７０（２０００））。
【０００６】
したがって、この分野における著しい進歩にもかかわらず、グリコシル化の不均一性は問題のままである。組換えで産生された糖ペプチドのグリコシル化における不均一性は、細胞の機構（たとえば、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）が種間、細胞間、または個体間でさえも異なり得るために生じる。様々な酵素によって認識される基質は、グリコシル化が行われない部位があるかまたはもとのタンパク質のグリコシル化から大幅に修飾されるほど、十分に異なり得る。異種の真核生物宿主において産生される組換えタンパク質のグリコシル化は、もとのタンパク質と異なることが多いであろう。治療用糖タンパク質は、典型的に、同じペプチド骨格を有するが、グリコシル化の性質および部位の両方において異なるグリコフォームの混合物として細胞培養系で産生される。グリコシル化における不均一性は、糖タンパク質の精製、効能、および治療上の安全性に深刻な障害を引き起こす。細胞および／または糖鎖工学ならびにいくつかの生化学的修飾は、主要なグリコフォームを有する組換え糖タンパク質を産生する細胞または（たとえば、酵母）株を産出している可能性があるが、ほとんどの場合、自然に発現される糖タンパク質でのように、得られる構造は不均一のままである。特に、異なるグリコシル化形態は、所与のタンパク質の特性に対して著しく異なる影響を及ぼし得、グリコフォームの中には、アレルギーの問題および望まれない免疫応答さえ引き起こし得るものもある。これは、たとえば、酵母において通常産生される高マンノース型糖タンパク質について特に当てはまる。グリコシル化形態のそのような混合物からの、特定のグリコシル化状態を有する糖タンパク質の単離は非常に困難である。しかしながら、少量の不純物が、関心のある糖タンパク質の所望の活性に劇的に干渉し得るため、そのような阻止も非常に望ましい。
【０００７】
この解決法は、国際公開第２０１０／０１５７２２号パンフレットおよびＭｅｕｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  ３２（５）：４８５−９）において最近提唱された。報告された糖鎖工学戦略は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅと称され、哺乳動物細胞においてゴルジＮ−グリコシル化経路を短縮する。この短縮は、小さいシアリル化三糖Ｎ−グリカンを有するタンパク質の発現をもたらし、もとの哺乳動物細胞糖タンパク質と比較して複雑さが低下した。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ技術は、タンパク質フォールディングにおけるＮ−グリカンの機能に干渉せず、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅによって修飾される細胞の生理機能は、野生型細胞の生理機能に類似する。
【０００８】
しかしながら、グリコシル化における不均一性は、Ｎ結合型糖から起こるだけでなく、糖タンパク質に付着したＯ−グリカンからも起こる。これらの炭水化物鎖は、非常に多様であるが、ムチン型Ｏ−グリコシル化が最も一般的である。エンドグルコサミニダーゼとは対照的に、Ｏ−グリカンを除去する酵素は存在しない。
【０００９】
すべてがトリマンノシルコアを共有するＮ−グリカンと異なり、ムチン型Ｏ−グリカンは、構造的に共通して有しているものがほとんどない。セリンまたはトレオニンへのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の結合は、哺乳動物細胞においてムチン型Ｏ−グリコシル化を開始する。ＧａｌＮＡｃは、様々なムチン型Ｏ−グリカンの唯一の共通の残基である。ドナーとしてＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを使用し、ゴルジ装置においてＧａｌＮＡｃトランスフェラーゼのファミリーによって触媒される様々な単糖によるこれらの開始残基のさらなる伸長は、オリゴ糖の非常に多様な収集物をもたらす。
【００１０】
したがって、糖タンパク質の集団に対して均質（均一）なグリコシル化を提供する細胞系または合成方法を得る必要がある。好ましくは、方法は、Ｎ−およびＯ−グリコシル化が欠けている糖タンパク質をもたらす。このように得られた糖タンパク質は、直接または続くグリコシル基転移のための出発点として使用することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本出願の重要な目的は、費用および時間の両方において経済的である、糖タンパク質の所望のグリコシル化プロファイルを得るための系および方法を提供することである。方法は、望まれないグリコシル化産物を除去するために、産生された糖タンパク質に酵素を追加する必要がないため、既存の方法よりも安価でかつ速いものとすることができる。細胞および方法は、Ｎ−およびＯ−グリコシル化の両方を扱う。これは、内因性ＧａｌＥの発現および／または活性が欠損している細胞においてエンドグルコサミニダーゼ酵素を発現させることによって実現することができる。糖タンパク質の正確なグリコシル化（または糖タンパク質の中間のグリコフォームの本質的に均質のグリコシル化集団）は、同じ細胞系において糖タンパク質を産生することによって実現される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、第１の態様によれば、以下のものが提供される：エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする外因性核酸配列を含み、かつ内因性ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性が欠損した真核細胞。この真核細胞は、糖タンパク質をコードする第２の外因性核酸配列をさらに含み得る。特に、真核細胞は、内因性エンドグルコサミニダーゼ酵素を発現しない。
【００１３】
特定の実施形態によれば、真核細胞は、哺乳動物細胞、特にＨｅｋ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である。
【００１４】
特定の実施形態によれば、エンドグルコサミニダーゼは、特にマンノシル−糖タンパク質エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９６）、特にＥｎｄｏ  Ｔである。エンドグルコサミニダーゼは、ＥＲまたはゴルジ移行シグナルに作動可能に連結され得る。
【００１５】
糖タンパク質は、細胞によって分泌され得る。
【００１６】
外因性エンドグルコサミニダーゼによる細胞膜構成成分の脱グリコシルが強過ぎると、細胞膜の脆弱化に至り、最終的に細胞溶解に至ることが予想されるため、そのような戦略の研究は、特に驚くべきことである。これは、酵母細胞壁のマンノプロテインの脱グリコシルについて特に当てはまる。さらに、細胞がＯ−グリコシル化をさらに欠くという事実は、細胞における糖タンパク質がすべて単一ＧｌｃＮＡｃ修飾のみを有することを意味する。細胞がなお生存可能であり、かつそれらがあらゆるガラクトース含有糖脂質を欠きながらも、明らかな増殖異常も、外因的に産生された糖タンパク質の収率における不利益も示さないことは特に驚くべきことである。
【００１７】
本明細書において記載される細胞を使用する方法も本出願において提供される。特に、真核細胞においてＯ−グリコシル化をさらに欠く単一ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を産生するための方法であって、
−  エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列を含み、内因性ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性が欠損し、かつ糖タンパク質をコードする第２の外因性核酸配列を含む真核細胞を、エンドグルコサミニダーゼ酵素および糖タンパク質を発現するのに適した条件で提供するステップと、
−  糖タンパク質がエンドグルコサミニダーゼと細胞内でまたは細胞外で接触された後、糖タンパク質を回収するステップと
を含む方法が提供される。
【００１８】
エンドグルコサミニダーゼとの細胞内接触は、特にゴルジまたはＥＲで行われ得る。
【００１９】
方法は、糖タンパク質がエンドグルコサミニダーゼによって細胞内でまたは細胞外で処理された後、糖タンパク質をグリコシルトランスフェラーゼによって処理させるステップをさらに含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】（Ａ）２９３ｓ  ＧａｌＥ  ＫＯ産生タンパク質および（Ｂ）２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ産生タンパク質上に見出される典型的なＮ−グリカンである。
【図２】ＧａｌＥ遺伝子の最初の４つのエクソンおよび３つのガイドの位置を記号で示す（一定の縮尺ではない）。
【図３】３つの異なるガイドを有するＧａｌＥ遺伝子の断片のインビトロにおける消化である。３つのガイドは、すべて予想される分子量のバンドを示す。低分子量での強度のシグナルは、インビトロにおいて産生されたガイドＲＮＡである。
【図４】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイド１（Ｇ１）、ガイド２（Ｇ２）、およびガイド３（Ｇ３）により処置した細胞に由来するＤＮＡに対するＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイである。ＮＣはＷＴ細胞由来のコントロールである。
【図５】一番上のもとの配列に対する、様々なサンガーシークエンシングリード（「様々なクローン」と指定）のアライメントである。ガイド３の位置は、図の一番上に線で示す。突然変異配列中のインデルにボックスでマークする。ほとんどのリードは、様々な対立遺伝子における様々な編集により、複数のトラックから構成される。
【図６】ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞（ＧＤ）、ＨＥＫ２９３ｓ細胞、および様々なＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−クローンにおいて発現されるｈＧＭ−ＣＳＦである。ＨＥＫ２９３ｓは、ｈＧＭ−ＣＳＦがフルサイズのＮ−グリカンおよびＯ−グリカンをなお有するコントロールである。ＨＥＫ２９３ｓＧＤ細胞（ＧＤレーン）では、Ｎ−グリカンは小さく同質であり、残りのスミアは、Ｏ−グリカンによるものである。ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−発現において観察された３つの別々のバンドは、高分子量〜低分子量で、２つの占有Ｎ−グリコシル化部位で装飾された、１つの占有Ｎ−グリコシル化部位で装飾された、および占有Ｎ−グリコシル化部位で修飾されていないｈＧＭＣＳＦと対応する。ＵＤＰ−ＧａｌおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの欠如により、Ｎ−グリカン不均一性もＨＥＫ２９３ｓ産生ｈＧＭ−ＣＳＦと比較しておそらく低下している。
【図７】２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞（ＧＤ）、ＨＥＫ２９３ｓ細胞、およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅである可能性があるクローン由来のサンプル（Ａ、Ｂ、およびＮで標識）において発現されたｈＧＭ−ＣＳＦである。Ｎで標識したレーンは、機能的ＧａｌＥをなお発現するクローン由来のｈＧＭ−ＣＳＦである。Ｂで標識したレーンは、ＧａｌＥ  ＫＯに成功したが、ｅｎｄｏＴ処理がより低レベルであるクローン由来のｈＧＭ−ＣＳＦである。Ａで標識したレーンは、ＧａｌＥ  ＫＯに成功しているうえに、ｅｎｄｏＴ  Ｎ−グリカン処理レベルが比較的高いクローン由来のｈＧＭ−ＣＳＦである。星印を付けたクローンは、さらなる特徴付けのために選択した。
【図８】トリプシン処理ｈＧＭ−ＣＳＦのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析である。トリプシンペプチドＳＰＳＰＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲ（２１３４Ｄａ）は、４つの可能性のあるＯ−グリコシル化部位を含有する。ＨＥＫ２９３ｓ細胞（一番上のスペクトル）およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞（第２のスペクトル）において、本発明者らは、このペプチドに付着した様々な型のＯ−グリカンを検出した。ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−（第３のスペクトル）細胞株およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ（一番下のスペクトル）細胞株由来のｈＧＭ−ＣＳＦの両方において、これらのピークはなく、裸のペプチドのみが検出される。
【図９】ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において発現されるｈＧＭ−ＣＳＦ由来のシアリダーゼ処置ＬＬＮＬＳＲペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである。非グリコシル化ペプチドは、７１５Ｄａの分子量を有し、Ａｓｎ−ＧｌｃＮＡｃ装飾ペプチドは９１８Ｄａ、Ａｓｎ−ＧｌｃＮＡｃ−Ｇａｌ糖ペプチドは１０８０Ｄａである。
【図１０】そのままのｈＧＭ−ＣＳＦの異なるグリコフォームのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである。ＨＥＫ２９３ｓ産生ｈＧＭ−ＣＳＦは、不均一のＮ−およびＯ−グリコシル化によりスペクトルの端から端までスミアした（一番上のスペクトル）。ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−ｈＧＭ−ＣＳＦ（第２のスペクトル）は、Ｏ−グリコシル化を欠き、Ｎ−グリカンによる不均一性のみを示し、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ｈＧＭ−ＣＳＦ（第３のスペクトル）は、Ｎ−グリカン不均一性の低下を示すが、不均一のＯ−グリカンによりなおスミアする。最後のスペクトルにおいて、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ  ｈＧＭ−ＣＳＦのシグナルは、２つの推定上のＮ−グリコシル化部位上にＧｌｃＮＡｃを有さない、１つおよび２つのＧｌｃＮＡｃを有するｈＧＭ−ＣＳＦに対応する３つのピークに集中する。１６８４４Ｄａのｍ／ｚに、オリゴマンノースＮ−グリカンで装飾されたｈＧＭ−ＣＳＦの分子量に対応する小さいピークが観察される。
【図１１】ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−細胞（上のスペクトル）において産生される、そのままのｈＧＭ−ＣＳＦのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである。サンプルのＰＮＧａｓｅＦ処置は、Ｎ−グリカンの不完全な除去をもたらした（下のスペクトル）。
【図１２】ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において産生された、そのままのｈＧＭ−ＣＳＦのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルである（上部のスペクトル）。ＰＮＧａｓｅＦによる処置により、１６８４４のｍ／ｚを有するピークは完全に消化された。
【図１３】本発明者らがＨＥＫ２９３ｓから誘導した様々な細胞株、それらの可能性のあるＮおよびＯ結合型グリカン、ならびに様々な細胞株において発現されたｈＧＭ−ＣＳＦの不均一性に対するこの技術の結果についての概要である。
【図１４】ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ、およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅにおいて産生された、そのままのｈＧＭ−ＣＳＦのＱＴＯＦ  ＭＳ分析である。スペクトルは、図１０において観察されたデータと一致する。
【図１５】ＨＥＫ２９３ｓ（レーン１）、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−（レーン２）、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ（レーン３）、およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ（レーン４）細胞において安定して発現されたｈＥＰＯ−Ｈｉｓ６のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＨｉｓタグ特異的ウエスタンブロット分析である。分子量の明らかなシフトを観察することができる。これは、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞におけるＮ−グリカンの低下ならびにＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞においてＯ−グリカンがないことに対応する。
【図１６】ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ質量分析法によって分析されたトリプシン処理ｈＥＰＯ−Ｈｉｓ６のＭＳ１スペクトルである。トリプシンペプチドＥＡＩＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＲは、２つの可能性のあるＯ−グリコシル化部位を含有する。ＨＥＫ２９３ｓおよびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅの細胞が産生したｈＥＰＯに由来するトリプシンペプチド上において、両方の部位は、Ｏ−グリカンによって実際に占有された。ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−細胞およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において産生されるｈＥＰＯ−Ｈｉｓ６において裸のペプチドのみが検出される。
【図１７】ＨＥＫ２９３ｓ（レーン１）、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−（レーン２）、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ（レーン３）、およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ（レーン４）細胞において安定して発現されるエタネルセプトのウエスタンブロット分析である。分子量の明らかなシフトを観察することができる。これは、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞におけるＮ−グリカンの低下ならびにＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞においてＯ−グリカンがないことに対応する。
【図１８】ＨＥＫ２９３ｓ、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ、およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において発現されるＲＳＶ−ＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＳＶ−Ｇ特異的（ウサギ抗ＲＳＶ−Ｇ）ウエスタンブロット分析である。Ｎｏｎ＝非トランフェクト細胞；ＷＴ＝野生型ＲＳＶ−Ｇタンパク質をコードするベクターによりトランスフェクトした細胞。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本発明は、特定の実施形態に関しておよびある図面に関連して説明されるが、本発明は、それに限定されず、請求項によってのみ限定される。請求項におけるいかなる参照記号も、範囲を限定するとして解釈されないものとする。記載される図面は概要に過ぎず、非限定的である。図面において、要素のいくつかのサイズは誇張され得、説明の目的のために一定の縮尺で描かれていないことがあり得る。用語「含む」が本発明の説明および請求項において使用される場合、それは他の要素またはステップを除外しない。単数名詞を指すとき、不定冠詞または定冠詞、たとえば「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」、「その」が使用される場合、これは、特に何らかが他に明記されない限り、その名詞の複数形を含む。
【００２２】
さらに、説明および請求項における第１、第２、第３などの用語は、類似する要素を区別するために使用され、必ずしも連続したまたは時間的な順序を説明するために使用されるものではない。そのように使用される用語が適切な状況下で交換可能であり、本明細書において記載される本発明の実施形態は、本明細書において記載または例証される順序以外の順序での実施が可能であることが理解されるべきである。
【００２３】
以下の用語または定義は、専ら本発明の理解を促進するために提供される。本明細書において明確に定義されない限り、本明細書において使用される用語は、すべて当業者にとっての意味と同じ意味を有する。当業者は、当技術分野の定義および用語について、特にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１２）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １１４），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１６）に導かれる。本明細書において提供される定義は、当業者によって理解される範囲よりも狭いと解釈されるべきでない。
【００２４】
本出願において使用される「糖鎖工学酵母細胞」は、野生型酵母において発現されない、複合グリコシル化に必要とされる酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸配列を発現し、および／または野生型酵母において通常発現される、高マンノース型構造の産生に関与する少なくとも１つの酵素を発現しない酵母細胞である。
【００２５】
本明細書において使用される「エンドグルコサミニダーゼ」は、糖タンパク質または糖脂質のオリゴ糖における非末端ベータ結合Ｎ−アセチルグルコサミン残基のアノマー炭素およびそのアグリコン間の結合を加水分解し、それにより糖タンパク質または糖脂質または糖ポリマーから単糖またはオリゴ糖を放出する酵素を指す。エンドグルコサミニダーゼは、グリコシダーゼのサブセットであり、他の酵素活性（たとえば、グリコシルトランスフェラーゼ活性など）を有していてもまたは有していなくてもよい。特定の種類のエンドグルコサミニダーゼは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＵＢＭＢ）の命名法においてＥＣ３．２．１．９６として示されるエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはマンノシル−糖タンパク質エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって構成される。この特定の種類の酵素は、−［Ｍａｎ（ＧｌｃＮＡｃ）２］Ａｓｎ−構造を含有する高マンノース糖ペプチドおよび糖タンパク質におけるＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオシル単位のエンド加水分解を触媒することができる。１つのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基は、タンパク質に付着したままであり、残りのオリゴ糖はそのままで放出される。結果は、したがって単一ＧｌｃＮＡｃ修飾糖タンパク質となる。注意すべきことに、残りのＧｌｃＮＡｃ残基は、未修飾であり得、または加水分解された結合以外の位置で他の糖残基によりさらに修飾され得、たとえば、ＧｌｃＮＡｃ残基は３または６位にフコースを有し得る。しかしながら、修飾ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質は、ＧｌｃＮＡｃ残基の４位に第２の糖残基がない（すなわち典型的な糖鎖がない）ため、なお、単一ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質と呼ばれるであろう。エキソグリコシダーゼと比較したエンドグルコサミニダーゼの特定の長所は、それらが、Ｎ結合型およびＯ結合型グリカンの区別ならびにグリカンの種類の区別を可能にすることである。エンドグルコサミニダーゼの非限定的なリストが、本出願において提供される。
【００２６】
特に糖鎖工学酵母細胞に関して、本明細書において使用される「複合グリコシル化に必要とされる酵素」は、宿主酵母細胞において天然に存在せず、高等真核生物において見出される、特に哺乳動物において見出される、より詳細にはヒトにおいて見出される複合グリカンの合成に関与し得る任意の酵素を指す。最も詳細には、そのような酵素は、糖鎖からマンノース残基を除去する酵素（すなわちマンノシダーゼ）もしくはグリコシルトランスフェラーゼ、特にマンノシルトランスフェラーゼ以外のグリコシルトランスフェラーゼ（すなわち、高マンノースグリカンにおいて見出されない単糖を移すグリコシルトランスフェラーゼ）、および／またはホスホマンノシルトランスフェラーゼである。
【００２７】
本出願において使用される「グリコシルトランスフェラーゼ」は、生化学的反応においてグリコシル基の転移、特にＮ結合型糖タンパク質をもたらすための、アスパラギン結合糖残基へのグリコシル転移を触媒する酵素のグループのいずれかである。グリコシルトランスフェラーゼは、ＩＵＢＭＢ命名法においてＥＣ２．４に属し、特定の種類のグリコシルトランスフェラーゼは、ヘキソシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１）である。ペプチドを処理して糖タンパク質にする、幅広い種類のこれらの翻訳後酵素の中には、これらに限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびマンノシルトランスフェラーゼなどの酵素がある。本出願において記載される糖鎖工学酵母細胞の特定の実施形態について、外因性マンノシルトランスフェラーゼが除外されることに注意されたい。本出願において使用される「マンノシルトランスフェラーゼ」は、ゴルジ装置において、アクセプター分子、典型的に別の炭水化物へのマンノシル基の転移を触媒する酵素を指す。マンノシルトランスフェラーゼは、典型的に、酵母において内因性酵素であり、高マンノース型グリカンの合成に関与する。
【００２８】
注意すべきことに、酵素は、エンドグルコサミニダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼ活性の両方を有し得る。１つの酵素を使用して、これらの２つの活性を発揮することが可能であり得るが、典型的に、使用される酵素は、１つの機能のみを果たすであろう。したがって、それらが１つの機能のみを実行することを確かめるために修飾もしくは突然変異されているか、またはそれらが特定の機能をより効率的に実行することを確実にするために修飾もしくは突然変異されている酵素を使用することが想定される。そのような修飾酵素は、当技術分野において知られている。
【００２９】
本出願において使用される「糖タンパク質」は、それらの通常の生理学的状況および／またはそれらの機能的な形態において、それらのポリペプチド側鎖に共有結合されたオリゴ糖鎖（グリカン）を含有するタンパク質を指す。炭水化物が、同時翻訳または翻訳後修飾においてタンパク質に付着され得る。特に、本明細書において使用される糖タンパク質は、それらの生理学的活性形態においてＮ−グリコシル化を示すタンパク質である。したがって、糖タンパク質は、典型的に、少なくとも１つのアスパラギン残基に糖鎖を含有する。糖タンパク質の非限定的なリストが本明細書において提供される。用語「糖タンパク質」は、アミノ酸鎖の長さを指すことを意図されず、「糖ペプチド」は「糖タンパク質」の定義内に含まれる。
【００３０】
本出願において使用される用語「（グリコ）タンパク質」および「酵素」（たとえば、エンドグルコサミニダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ）は、天然に存在するタンパク質の機能的活性断片および変異体を包含することも意図される。実際に、多くの（たとえば、治療用）タンパク質について、（たとえば、治療上の、酵素の）効果を実現するのにタンパク質の一部分で十分であり得る。同じことが、変異体（すなわち、１つ以上アミノ酸が他のアミノ酸と置換されているが、機能性を保持するかまたは改善された機能性をさらに示すタンパク質）、特に酵素活性について最適化された酵素の変異体に当てはまる。
【００３１】
本出願に関連して、糖タンパク質は、タンパク質自体を指し、糖タンパク質は、そのグリコシル化または非グリコシル化形態であり得る。「グリコシル化」タンパク質は、少なくとも１つのオリゴ糖鎖を有する（グリコ）タンパク質である。
【００３２】
本明細書において使用される「糖鎖」、「オリゴ糖鎖」、または「炭水化物鎖」は、２つ以上の単糖の鎖である。結果として、単一の単糖（たとえば、単一ＧｌｃＮＡｃ残基）のみを有するタンパク質は、通常、他に指定のない限り、グリコシル化タンパク質とは呼ばれず、単糖を有するタンパク質または単糖（たとえば、ＧｌｃＮＡｃ）修飾タンパク質と呼ばれるであろう。糖タンパク質のオリゴ糖鎖中に含まれ得る典型的な単糖は、グルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）または別のシアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、キシロース（Ｘｙｌ）、およびその誘導体（たとえば、ホスホ誘導体）を含むが、これらに限定されない。糖鎖は、分岐していてもしていなくてもよく、１つ以上の型のオリゴ糖を含み得る。一般に、Ｎ結合型グリコシル化の糖鎖は、３つの型に類別され得る：高マンノース、複合、およびハイブリッド型グリコシル化。これらの用語は、当業者によく知られており、文献において定義されている。手短かに言えば、高マンノース型グリコシル化は、典型的に、（場合により多くの）マンノースおよび／またはマンノシルリン酸残基と共に２つのＮ−アセチルグルコサミンを含む（しかし、典型的に他の単糖はない）オリゴ糖鎖を指す。
【００３３】
複合グリコシル化は、典型的に、内側のコア構造Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に連結されることが多い、シアリルラクトサミン配列を有する、典型的に１つ、２つ、またはそれを超える（たとえば、６つまでの）分岐を外側に有する構造を指す。たとえば、複合Ｎ−グリカンは、様々なオリゴ糖で終結し得るが、典型的にマンノース残基では終結しない、交互のＧｌｃＮＡｃおよびガラクトース（Ｇａｌ）残基の少なくとも１つの分岐または少なくとも２つを有し得る。
【００３４】
ハイブリッド型グリコシル化は、中間形態、すなわち、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基に加えて末端のマンノースおよび末端の非マンノース残基の両方を有するグリコシル化タンパク質を包含する。複合グリコシル化とは対照的に、ハイブリッド型グリコシル化構造の少なくとも１つの分岐は、マンノース残基で終わる。
【００３５】
この分類は、タンパク質上の天然に存在するグリカンを説明するために使用されることが多いが、合成のおよび／または天然に存在しない糖も、たとえそれらの構造が古典的な例から異なっていたとしても、このように分類し得ることは明らかである。たとえば、単一ＧｌｃＮＡｃに連結されたガラクトースおよびシアル酸残基の単一の分岐からなる糖鎖は、たとえそれが内側のコアＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を欠いていたとしても複合糖になるであろう。
【００３６】
「ＥＲ移行シグナル」または「ゴルジ移行シグナル」は、それぞれ、それがコンジュゲートされたポリペプチドまたはタンパク質のＥＲまたはゴルジ装置への局在化を指示する分子、典型的にペプチドである。したがって、局在化は、それぞれＥＲまたはゴルジ装置における保持も意味する。典型的に、これらの局在化（または保持）配列は、成熟タンパク質として機能的に活性な場合にＥＲまたはゴルジ中に位置する（前）タンパク質に由来するペプチド配列である。
【００３７】
本明細書において使用される「ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ」、「ＧａｌＥ」、または「ＵＤＰ−グルコース４−エピメラーゼ」は、酵素クラスＥＣ５．１．３．２の酵素を指す。ヒト（および選択される他の）ＧａｌＥアイソフォームは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃに結合し、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃへのその変換を可逆的に触媒し、さらにＵＤＰ−ＧｌｕをＵＤＰ−Ｇａｌに変換する。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ（ｐｐＧａＮＴａｓｅｓ）として知られるグリコシルトランスフェラーゼのファミリーは、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃから糖タンパク質セリンおよびトレオニン残基にＧａｌＮＡｃを移す。ｐｐＧａＮＴａｓｅ媒介性のグリコシル化は、ムチン生合成の第１の関与ステップに相当する。
【００３８】
内因性ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼの発現および／または活性が欠損した細胞を作製するために、いくつかの戦略を使用することができ、戦略の本質は、Ｏ−グリコシル化が細胞中に存在しなくなる程度までその戦略がＧａｌＥ活性の減退をもたらす限り、本発明にとって重要ではない。細胞は、たとえば、ＧａｌＥをコードする（内因性）遺伝子を欠失させるか、突然変異させるか、交換するか、または他に破壊することにより（たとえば、実施例において記載されるようにＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ技術を使用して）、遺伝的レベルでＧａｌＥを欠損させることができる。代わりに、ＧａｌＥ遺伝子からの転写に干渉することができるか、または転写（核酸、ｍＲＮＡ）遺伝子産物もしくは翻訳（アミノ酸、タンパク質）遺伝子産物を除去もしくは阻害することができる。これは、たとえば、ＧａｌＥ  ｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ阻害を通して実現され得る。さらに、モルホリノ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＬＮＡ、小分子阻害、または類似する技術が、当業者が知っているように使用され得る。ＧａｌＥタンパク質は、たとえば、阻害性抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ、Ｆｃ、もしくはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、小分子、またはペプチドを使用して阻害される。
【００３９】
当業者に明らかなように、ＧａｌＥ発現および／または活性の欠損は、恒常的であっても（たとえば、遺伝的欠失）、誘発性であってもよい（たとえば、小分子阻害）。本明細書において使用される「欠損」は、典型的に、ＧａｌＥの活性が適切なコントロール（たとえば、完全なＧａｌＥ遺伝子を有する同じ細胞）の７５％未満、特に９０％未満であることを意味する。しかしながら、活性％よりも重要なものは、機能的な欠損である。すなわち、ＧａｌＥ阻害により、ＧａｌＮＡｃをセリンもしくはトレオニン残基にまたは新生グリカン鎖に（特にアミノ酸上に存在するＧｌｃＮＡｃ残基に）追加することができないという事実がもたらされるのであれば、細胞はＧａｌＥが機能的に欠損している。したがって、測定される酵素活性にかかわらず、ＧａｌＥ核酸またはタンパク質の阻害を通して、もはや糖タンパク質のアミノ酸（露出したセリンおよびトレオニン残基またはＧｌｃＮＡｃ修飾アミノ酸）にＧａｌＮＡｃ残基を追加することができない細胞は、ＧａｌＥ発現および／または活性が欠損していると言われる。
【００４０】
「ムチン型Ｏ−グリカンを欠く」という表現は、組成物の糖タンパク質にムチン型Ｏ−グリカンが本質的にないこと、したがって、糖タンパク質上にもともと存在していたＯ−グリカンがすべて除去されることを意味する。本発明の範囲内において、それらのもとのムチン型Ｏ−グリカンの５、１０、１５、または２０％をなお含む糖タンパク質は、ムチン型Ｏ−グリカンが本質的にないと見なされる。
【００４１】
本発明は、糖タンパク質をさらなる使用、たとえば治療上の使用または結晶化研究における使用により適したものにする改変されたグリコシル化パターン、特により均質のグリコシル化パターンを有する糖タンパク質を産生する細胞を提供することを目的とする。本発明者らは、Ｇｌｙｃｏｄｅｌｅｔｅ細胞株におけるＮ−グリコシル化について、これを行い得ることを以前に示した（国際公開第２０１０／０１５７２２号パンフレットおよびＭｅｕｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  ３２（５）：４８５−９））。
【００４２】
Ｎ−グリコシル化のように、Ｏ−グリコシル化は、組換えタンパク質産生における不均一性の主な原因となる。不均一のタンパク質を結晶にすることが非常に難しいため、これを除去することは、Ｏ−グリコシル化により重大な問題が発生することが多い結晶学において好都合になり得る。さらに、サブユニットワクチン分野において可能性があり得、Ｏ−グリカンは、Ｎ−グリカンのように安定したエピトープを包含し得る。たとえば、ＨＩＶのｇｐ１２０、ＲＳＶのＧタンパク質、およびエボラのＧＰタンパク質上のムチンドメインは、すべて非常にＯ−グリコシル化されている。
【００４３】
興味深いことに、Ｏ−グリコシル化の除去のためのアプローチを組み合わせることは、Ｎ−グリコシル化のばらつきをより一層低下させ、その結果として、単一ＧｌｃＮＡｃ残基のみがすべての糖上に残る。実施例の部および図１３を参照されたい。
【００４４】
したがって、第１の態様によれば、エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする外因性核酸配列を含み、かつ内因性ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性が欠損した真核細胞が提供される。この真核細胞は、典型的に、糖タンパク質をコードする第２の外因性核酸配列も含む。
【００４５】
糖タンパク質の性質は、本発明にとって重大ではないが、糖タンパク質は、典型的に、正確なＮ−グリコシル化がそれらの機能にとって重要である、医薬および／または産業に関連するタンパク質であろう。非限定的な例は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒト上皮増殖因子受容体−２（ＨＥＲ−２）、線維芽細胞増殖因子−アルファ（ＦＧＦ−α）、線維芽細胞増殖因子−ベータ（ＦＧＦ−β）、形質転換増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、インスリン様増殖因子−２（ＩＧＦ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経成長因子−ベータ（ＮＧＦ−β）などの多くのホルモン、増殖因子、サイトカイン、およびそれらの対応する受容体；前述のものの受容体、成長ホルモン（たとえば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン）；インスリン（たとえば、インスリンＡ鎖およびインスリンＢ鎖）、プロインスリン；エリトロポイエチン（ＥＰＯ）；コロニー刺激因子（たとえば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ））；インターロイキン（たとえば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１２）；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびその受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）；インターフェロン（たとえば、ＩＦＮ−α、β、またはγ）；腫瘍壊死因子（たとえば、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）ならびにそれらの受容体、ＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ−２；トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；トロンビン；脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）；凝固因子（たとえば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォンウィルブランド因子など）；抗凝固因子；組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、たとえばウロキナーゼまたはヒト尿または組織型ＴＰＡ；カルシトニン；ＣＤタンパク質（たとえば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１９など）；ＣＴＬＡタンパク質（たとえば、ＣＴＬＡ４）；Ｔ細胞およびＢ細胞受容体タンパク質；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ、たとえばＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３など）；神経栄養因子、たとえば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン、たとえば３〜６；レニン；リウマチ因子；ＲＡＮＴＥＳ；アルブミン；リラキシン；マクロファージ阻害性タンパク質（たとえば、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２）；ウイルスタンパク質または抗原；表面膜タンパク質；イオンチャネルタンパク質；酵素；アルカリホスファターゼ；レクチン；調節タンパク質；抗体；免疫調節性タンパク質（たとえば、ＨＬＡ、ＭＨＣ、Ｂ７ファミリー）、；ホーミング受容体；輸送タンパク質；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；Ｇプロテイン共役受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）；神経調節性タンパク質；アルツハイマー病関連タンパク質およびペプチド（たとえば、Ａ−ベータ）、ならびに上記のものの融合またはキメラタンパク質を含む、当技術分野において知られている他のものを含む。前述のタンパク質およびポリペプチドのいずれかの断片もしくは一部または突然変異体、変異体���もしくは類似体も、本明細書において提供される細胞および方法によって産生することができる適したタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドの中に含まれる。
【００４６】
糖タンパク質は、細胞によって分泌され得る。
【００４７】
エンドグルコサミニダーゼの性質は、糖タンパク質の所望のグリコ集団（ｇｌｙｃｏｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に依存するであろう。たとえば、エンドグルコサミニダーゼは、それらの基質特異性に関して選択され得る。いくつかのエンドグルコサミニダーゼ、たとえばＥｎｄｏ  ＨおよびＥｎｄｏ  Ｔは、高マンノース型糖鎖およびハイブリッド型糖を加水分解するが、複合炭水化物構造はそのままである。そのような酵素は、たとえば、複合グリコシル化ができない細胞から単一ＧｌｃＮＡｃ修飾糖タンパク質を得るために、または複合グリコシル化タンパク質および他のグリコフォームを産生する細胞（ほとんどの糖鎖工学酵母株など）において混入高マンノースおよび／もしくはハイブリッド型糖を除去するために理想的である。特定の実施形態によれば、エンドグルコサミニダーゼは、複合型グリカンではなく、高マンノース型糖鎖およびハイブリッド型グリカンを加水分解する。
【００４８】
エンドグルコサミニダーゼはまた、糖タンパク質（糖鎖のみではなく）に関して基質特異性を有し得、いくつかのエンドグルコサミニダーゼは、たとえば、他のエンドグルコサミニダーゼ（たとえば、Ｅｎｄｏ  Ｔ）よりも、（特にコンパクトにフォールドした）タンパク質からの糖鎖の加水分解において成功し、他のものは（また）、糖ペプチドまたはコンパクトにフォールドしていないタンパク質からの糖鎖の加水分解において特に成功し得る（たとえば、Ｅｎｄｏ  Ｈ、Ｅｎｄｏ  Ｔ）。重要なことに、これは、典型的に、エンドグルコサミニダーゼの特異性よりむしろ基質への接近およびその利用率と関係するため、これは特定のタンパク質に対するある酵素の使用を除外しないが、エンドグルコサミニダーゼの中には、すべてのＮ結合型糖構造の加水分解を完了するのにより多くの時間を必要とし得るものもある。
【００４９】
エンドグルコサミニダーゼの選択はまた、結果として生じる産物に依存し得る。たとえば、異なるグリコ集団（たとえば、加水分解されない複合型グリコシル化タンパク質および加水分解される他の型）が分泌される場合、結果として生じるタンパク質を容易に分離し得ることは重要となり得る。別の例として、さらなるグリコシル基転移が想定される場合、グリコシルトランスフェラーゼが糖修飾を付着させるのに適した基質をタンパク質上の単一ＧｌｃＮＡｃ残基が提示するように、単一ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質を残すエンドグルコサミニダーゼ（たとえば、Ｅｎｄｏ  Ｈ、Ｅｎｄｏ  Ｔ）が特に想定される。細菌が単一ＧｌｃＮＡｃ修飾糖タンパク質を産生することができず、これが、グリコシル基転移のための出発点として細菌において産生されるタンパク質を使用することをはるかに困難にするため、これは、細菌発現系と比較して本明細書において記載される真核細胞の重要な長所である。代わりに、単一ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質は、結晶化研究において使用することができるが、これは非グリコシル化タンパク質にも当てはまる。したがって、タンパク質上に単糖を残すことなく、糖鎖全体を除去するエンドグルコサミニダーゼ（ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦなど）は、産生された糖タンパク質を結晶化のために使用する場合に想定され得る。グリコシルトランスフェラーゼ活性などの他の酵素活性の存在または非存在についてさらに考慮され得る。Ｅｎｄｏ  Ａ、Ｅｎｄｏ  ＢＨ、およびＥｎｄｏ  Ｍは、たとえば、そのようなグリコシルトランスフェラーゼ活性を有することが知られており、それは、もはやこの活性を有さない突然変異体を扱うのにいくつかの実施形態について望ましいことがあり得る。
【００５０】
特定のクラスのエンドグルコサミニダーゼは、ＩＵＢＭＢ命名法においてＥＣ３．２．１．９６として示されるマンノシル−糖タンパク質エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって構成される。これらの酵素は、タンパク質上に１つのＧｌｃＮＡｃ残基を残しながら糖鎖を除去することができる。これらの例は、Ｅｎｄｏ  Ａ、Ｅｎｄｏ  ＢＨ、Ｅｎｄｏ  ＣＥ、Ｅｎｄｏ  Ｄ、Ｅｎｄｏ  Ｆ１、Ｅｎｄｏ  Ｆ２、Ｅｎｄｏ  Ｆ３、Ｅｎｄｏ  Ｈ、Ｅｎｄｏ  Ｍ、Ｅｎｄｏ  Ｔ（国際公開第２００６／０５０５８４号パンフレット）、ＡｃｍＡ、およびＥＮＧａｓｅを含むが、これらに限定されない。他の例は、当業者に知られており、たとえばｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇで、特にＧｌｙｃｏｓｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  Ｆａｍｉｌｙ  ８５および１８の下で見出すことができる。特に、国際公開第２００６／０５０５８４号パンフレットに記載されるヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）（以前はトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）として知られていた）由来のＥｎｄｏ  Ｔ酵素の使用が想定される（たとえば、その中の配列番号９〜１２を参照されたい）。
【００５１】
特定の実施形態によれば、真核細胞は、内因性エンドグルコサミニダーゼ酵素を発現せず、特にマンノシル−糖タンパク質エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを発現しない。代替の特定の実施形態によれば、真核細胞は、第１の外因性核酸配列によってコードされるエンドグルコサミニダーゼ酵素以外の、機能的なエンドグルコサミニダーゼ活性を有する酵素を発現しない。すなわち、それらは、たとえば、別のエンドグルコサミニダーゼを発現し得るが、もはやそのヒドロラーゼ活性を有しないように修飾されたエンドグルコサミニダーゼである（しかし、たとえば、そのグリコシルトランスフェラーゼ活性のみであり、その結果として、それは複合グリコシル化構造の合成において機能することができる）。
【００５２】
さらに、細胞は、内因性ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性が欠損されている。これがＯ−グリコシル化経路の第１のステップであるため、これは、Ｏ−グリコシル化が細胞において存在しないことを確実にする。さらに、これはまた、Ｎ−グリコシル化が外因性エンドグルコサミニダーゼの導入によって既に修飾されている場合に時折観察される残りの不均一性をより一層低下させることができる。
【００５３】
本明細書において記載される真核細胞は、いつでも使用できる（たとえば、結晶化研究のために）またはたとえばグリコシルトランスフェラーゼによるさらなるグリコ修飾（ｇｌｙｃｏｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応のための出発点として使用され得る単一ＧｌｃＮＡｃ修飾糖タンパク質を一様に産生する。
【００５４】
グリコシルトランスフェラーゼは、糖ペプチド上のオリゴ糖構造を修飾するために使用され、立体化学および位置化学が良好に制御された特定の産物を産生するのに非常に有効であることが示された。グリコシルトランスフェラーゼは、オリゴ糖を調製するために、かつ真核細胞において産生される糖ペプチド上の末端ＮおよびＯ結合型炭水化物構造を修飾するために使用され得る。たとえば、末端のオリゴ糖は、糖タンパク質（または糖ペプチド）の薬力学的効果（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）およびたとえば免疫原性などの様々な他の生物学的特性を改善する糖構造を作るために完全にシアリル化され得、および／またはフコシル化され得る。そのようなグリコシルトランスフェラーゼは、天然または合成経路において使用され得、たとえば、フコシルトランスフェラーゼは、グアノシン−５’−ジホスホフコースからサッカリドアクセプターの特定のヒドロキシルにフコース単位を移すために合成経路において使用されてきた（Ｉｃｈｉｋａｗａ  ｅｔａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２８３−９２９８（１９９２））。
【００５５】
適切な条件下において、エキソグリコシダーゼおよびエンドグリコシダーゼの両方は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有することが示された。エンドグリコシダーゼの使用に基づく方法は、単糖ではなくオリゴ糖が移されるという利点を有する。上記の酵素は、炭水化物（たとえば、糖タンパク質にコンジュゲートされることになる）およびグリコシル化糖タンパク質自体の生成に利用することができる。たとえば、単一ＧｌｃＮＡｃ修飾糖タンパク質のさらなる処理にグリコシルトランスフェラーゼが使用され得る方法の例については、たとえばＴａｋｅｇａｗａ  ＪＢＣ  ３０９４，Ｋｏｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，８３５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０００；国際公開第０３／０４６１５０号パンフレットおよび国際公開第０７／１３３８５５号パンフレットを参照されたい。
【００５６】
しかしながら、追加される必要のあるグリコシルトランスフェラーゼと共にさらなるグリコシル基転移ステップにおいて使用されることになる介在する糖タンパク質産物を送達する代わりに、本明細書において記載される細胞自体がグリコシルトランスフェラーゼを産生し得ることも想定される。実際に、細胞のグリコシルトランスフェラーゼが細胞内でまたは細胞外の環境において糖タンパク質に対するグリコシル化反応を実行し、それにより所望の（典型的に複合）グリコシル化プロファイルを有する糖タンパク質の均一な集団を産出することが想定される。
【００５７】
したがって、特定の実施形態によれば、細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする第３の外因性の核酸配列を有する。特定の代替の実施形態によれば、エンドグルコサミニダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼ活性は、同じ酵素によって実行される。これは、１つの酵素のみが存在するからであってもよく、両方の活性は、したがって同じ配列によってコードされる（ただし、酵素配列は同一であるが、局在化または分泌配列は異なる可能性もある）。代わりに、同じ酵素の２つのバージョンが細胞において発現され（たとえば、Ｅｎｄｏ  Ｔ、Ｅｎｄｏ  Ｍ）、一方はエンドグルコサミニダーゼ活性を有するが、（好ましくは）グリコシルトランスフェラーゼ活性を有しておらず、一方はグリコシルトランスフェラーゼ活性のみを有することが想定される。両方の活性をなお有する酵素が使用される場合、２つの酵素活性の干渉を回避するためにその基質への（時空的）接近を制御することが重要である。たとえば、酵素および糖タンパク質が分泌される場合、エンドグルコサミニダーゼ活性は、最初に活性化され得（たとえば、ｐＨを適合させることにより）、その後、グリコシル基転移のための基質を培地に追加することができる。たとえそうでも、糖タンパク質がグリコシルトランスフェラーゼ活性によって糖鎖により修飾された後、エンドグルコサミニダーゼが糖タンパク質を加水分解できないことを確実にするべきである。
【００５８】
特定の実施形態によれば、しかしながら、グリコシルトランスフェラーゼは、エンドグルコサミニダーゼと同じ配列によってコードされない。さらに特定の実施形態によれば、エンドグルコサミニダーゼと異なる１つ以上グリコシルトランスフェラーゼが使用される。例として、α−シアリルトランスフェラーゼなどのシアリルトランスフェラーゼ、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼなどのガラクトシルトランスフェラーゼ、およびフコシルトランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。
【００５９】
代替の必ずしも排他的ではない特定の実施形態によれば、細胞は、糖鎖工学酵母細胞、すなわち、複合グリコシル化に必要とされる少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの第３の外因性核酸配列も有し、および／または少なくとも１つの内因性グリコシルトランスフェラーゼの活性が欠損している酵母細胞である。特定の実施形態によれば、複合グリコシル化に必要とされる酵素は、マンノシダーゼまたはマンノシルトランスフェラーゼ以外のグリコシルトランスフェラーゼである。さらに特定の実施形態によれば、複合グリコシル化に必要とされる少なくとも１つの酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩ、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびシアリルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００６０】
特定の実施形態によれば、糖鎖工学酵母細胞は、高マンノース構造（高マンノース型グリカン）の産生に関与する少なくとも１つの酵素が発現されない（または細胞において機能的に活性ではない）。さらに特定の実施形態によれば、少なくとも１つのマンノシルトランスフェラーゼは、糖鎖工学酵母細胞において発現されない。典型的に、糖鎖工学酵母細胞において発現されないマンノシルトランスフェラーゼは、酵母細胞の野生型対応物において発現される。さらに特定の実施形態によれば、マンノシルトランスフェラーゼは、α−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ、α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ、またはβ−１，４−マンノシルトランスフェラーゼである。これらのタンパク質は、酵母において特定の名称を有することが多いが（たとえば、Ａｌｇ、Ｏｃｈ、Ｍｎｎ）、それらの活性は、当技術分野においてよく知られている。代わりにまたは加えて、少なくとも１つのマンノシルリン酸トランスフェラーゼは、糖鎖工学酵母細胞において機能的に活性ではない。
【００６１】
本明細書において記載される真核細胞において、グリコシルトランスフェラーゼは、エンドグルコサミニダーゼのように分泌され得るかまたは細胞中に保持され得、特にＥＲまたはゴルジにターゲティングされ得る。後者の場合、それは、典型的に、タンパク質が最初にエンドグルコサミニダーゼによって（部分的に）脱グリコシル化されることを確実にするために、グリコシル化タンパク質のためのＥＲ−＞ゴルジ構築経路の後期にターゲティングされるであろう、その後、それらは、グリコシルトランスフェラーゼによるグリコシル基転移を受ける。このように、エンドグルコサミニダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの組み合わせに依存して、天然に存在するグリカンおよび合成グリカンは、糖タンパク質に追加することができる。
【００６２】
真核細胞は、任意の真核生物とすることができるが、特定の実施形態において、酵母、植物、哺乳動物、および昆虫細胞が想定される。使用される細胞の性質は、典型的に、所望のグリコシル化特性ならびに／または糖タンパク質を産生する容易性および費用に依存するであろう。哺乳動物細胞は、たとえば複合グリコシル化を実現し、かつ免疫原性に関する問題を回避するために使用され得るが、哺乳動物細胞系においてタンパク質を産生することは対費用効果が高くないことがあり得る。植物および昆虫細胞ならびに酵母は、典型的に、高い産生レベルを実現し、より対費用効果が高いが、哺乳動物タンパク質の複合グリコシル化パターンを模倣するためにまたは免疫原性に関する問題を低下させるためにさらなる修飾が必要とされ得る。修飾グリコシル化経路を有する細胞株を含む、タンパク質産生のための真核細胞株は、当技術分野においてよく知られている。続く単離および／または精製のための、タンパク質を内部に有する、発現する、および産生するのに適した動物または哺乳動物宿主細胞の非限定的な例は、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）などのチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：５５５−５５６；およびＫｏｌｋｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０９０１−１０９０９）、ＣＨＯ−Ｋ１  Ｔｅｔ−Ｏｎ細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＥＣＡＣＣ  ８５０５０３０２と称されるＣＨＯ（ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、ＣＨＯクローン１３（ＧＥＩＭＧ、Ｇｅｎｏｖａ、ＩＴ）、ＣＨＯクローンＢ（ＧＥＩＭＧ、Ｇｅｎｏｖａ、ＩＴ）、ＥＣＡＣＣ  ９３０６１６０７と称されるＣＨＯ−Ｋ１／ＳＦ（ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、ＥＣＡＣＣ  ９２０５２１２９と称されるＲＲ−ＣＨＯＫ１（ＣＡＭＲ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、浮遊アダプトＣＨＯ−ＸＬ９９細胞（Ａｃｙｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｓｂａｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼネガティブＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）、およびｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（米国特許第５，７２１，１２１号明細書）；ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）；ヒト胎児由来腎臓細胞（たとえば、２９３細胞もしくは２９３Ｔ細胞または浮遊培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）；マウスセルトリ細胞；（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，１９８０，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏ���．，２３：２４３−２５１）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−３４）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）；ヒト肝癌細胞（ＨＥＰ−Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−５１）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４４２）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，１９８２，Ａｎｎａｌｓ  ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８）；ＭＣＲ５細胞；ＦＳ４細胞を含む。例示的な非哺乳動物細胞株は、Ｓｆ９細胞、バキュロウイルス昆虫細胞系（たとえば、Ｊａｒｖｉｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３１０，Ｉｓｓｕｅ  １，２５  Ｍａｙ  ２００３，Ｐａｇｅｓ  １−７を参照されたい）、タバコ細胞、トマト細胞、トウモロコシ細胞、藻類細胞などの植物細胞、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種、もしくはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種などの酵母を含むが、これらに限定されない。特定の実施形態によれば、真核細胞は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種（たとえば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種（たとえば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種（たとえば、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種（たとえば、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ））、またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）種（たとえば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））由来の酵母細胞である。特定の実施形態によれば、真核細胞は、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞であり、最も特定の実施形態ではピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である。ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は、哺乳動物細胞において見出されるものに類似する明瞭なゴルジ層板を有する分泌経路を有することが示された。
【００６３】
代替の特定の実施形態によれば、細胞は、Ｈｅｋ２９３細胞またはＣＨＯ細胞から選択される哺乳動物細胞である。
【００６４】
本明細書において記載される真核細胞は、単一ＧｌｃＮＡｃ修飾された、一様にグリコシル化させた糖タンパク質を産生し得る。
【００６５】
特定の実施形態によれば、第１の外因性核酸配列によってコードされるエンドグルコサミニダーゼ酵素は、マンノシル−糖タンパク質エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼであり、すなわち、それはＩＵＢＭＢ命名法におけるＥ．Ｃ．３．２．１．９６の活性を有し、それがタンパク質上に１つのＧｌｃＮＡｃ残基を残しながら糖鎖を除去し得ることを意味する。代替の実施形態によれば、第１の外因性核酸配列によってコードされるエンドグルコサミニダーゼは、異なる型のグリコシル化構造に対して異なる親和性を有する。後者の典型例は、ハイブリッド型糖および／または高マンノース糖を加水分解することができるが、複合型グリカンを切断することができないエンドグルコサミニダーゼである。さらに特定の実施形態によれば、エンドグルコサミニダーゼは、異なる型のグリコシル化構造に対して異なる親和性を有するマンノシル−糖タンパク質エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである。さらに特定の実施形態によれば、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、複合型グリカンではなくハイブリッド型糖および／または高マンノース糖を切断することができる。さらにより特定の実施形態によれば、エンドグルコサミニダーゼは、ＥｎｄｏＨまたはＥｎｄｏＴである。最も特定の実施形態によれば、エンドグルコサミニダーゼは、Ｅｎｄｏ  Ｔである。
【００６６】
本明細書において記載される細胞によって産生される糖タンパク質は、典型的に、容易に回収されるべきである。これは、糖タンパク質の分泌によって特に実現されるであろう。これは、エンドグルコサミニダーゼとの接触後（たとえば、エンドグルコサミニダーゼが細胞に残る場合）またはエンドグルコサミニダーゼとの接触前（たとえば、両方が分泌される場合）とすることができる。分泌シグナルは、一般に、糖タンパク質およびエンドグルコサミニダーゼ（または任意選択でグリコシルトランスフェラーゼも）の両方について、後者が分泌される場合、類似しているであろう。分泌シグナルの性質は、実際、典型的に、分泌されることになるタンパク質に依存しないであろうが、使用される真核細胞の型に依存するであろう。分泌シグナルが、使用される細胞型において機能的である（すなわち、分泌シグナルが、融合されるタンパク質またはペプチドの細胞外環境への分泌をもたらす）限り、この特徴は本発明にとって重大ではない。したがって、他の生物由来の分泌シグナルは、これらのシグナルが、使用される真核細胞において分泌に至る限り使用され得る。分泌シグナルは、当技術分野においてよく知られており、分泌されるタンパク質、典型的にそのＮ−末端に由来し得るかまたは合成して作製され得る（たとえば、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００２，ｖｏｌ．１５，ｎｏ４，ｐｐ．３３７−３４５）。代わりに、それらは、コンピューターによる方法を使用してゲノム配列から誘導することができる（Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００５，６：２５６）。さらに、細菌分泌シグナルを使用することができる。使用することができるシグナルペプチドのさらなる例は、国際公開第２００２／０４８１８７号パンフレット（真核細胞）、Ｓｃｈａａｆ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５；５：３０）（コケ細胞）、欧州特許第５４９０６２号明細書において記載される。酵母において使用される特定の分泌シグナルは、たとえばα−因子分泌ペプチド、ＰＨ０５分泌ペプチド、およびＢＡＲ１分泌シグナルを含む。
【００６７】
分泌が糖タンパク質の容易な回収のために特に想定されるが、代替の選択肢が存在する。産生された糖タンパク質は、たとえば、細胞中の封入体もしくは膜結合細胞小器官または類似する機能を有する構造中に堆積する。細胞が、産生に使用される生物の一部分である場合（たとえば、植物細胞培養物ではなく植物）、糖タンパク質は、それを回収することができる生物の特定の器官または組織（たとえば、腺または毛状突起）において産生され得るかまたはそこに輸送され得る。特にタンパク質が分泌されない場合、タンパク質が不活性な形態で堆積する可能性があることに注意するべきである。したがって、さらなるリフォールディングステップまたは再活性化ステップが、糖タンパク質の生理学的に適切な形態を得るために必要であり得る。
【００６８】
糖タンパク質に加えて、エンドグルコサミニダーゼはまた、細胞によって分泌され得るが（同一のまたは類似する分泌シグナルを使用して、すなわち、糖タンパク質のための分泌シグナルについての注意はエンドグルコサミニダーゼにも当てはまる）、エンドグルコサミニダーゼが細胞中に残ることは特に利点となり得る。これにより、両方のタンパク質が分泌される場合に生じる、エンドグルコサミニダーゼおよび糖タンパク質の分離の必要がなくなる。最も特に、エンドグルコサミニダーゼは、細胞中に残るだけでなく、完全に活性でもある。その活性は、所望の加水分解が起こることを確実にするために時空的に調節されるべきである。この目的のために、エンドグルコサミニダーゼは、ＥＲまたはゴルジ移行シグナルに作動可能に連結され得る。そのようなシグナルは、それぞれＥＲまたはゴルジにエンドグルコサミニダーゼをターゲティングし、そこでエンドグルコサミニダーゼは保持される。ＥＲおよびゴルジ装置は、タンパク質のグリコシル化が起こる細胞内の場所であるため、これらの細胞小器官へのターゲティングは、エンドグルコサミニダーゼが、糖タンパク質のグリコシル化を修飾するための細胞内の正確な位置にあることを確実にする。
【００６９】
複合グリコシル化に必要とされる少なくとも１つの酵素もＥＲ−＞ゴルジ分泌経路において機能するようにターゲティングされ、エンドグルコサミニダーゼを、これらの酵素が糖タンパク質に対して協力的に作用するようにターゲティングすることができるため、これは、特に本明細書において記載される糖鎖工学酵母細胞にも当てはまる。
【００７０】
実際に、酵母では、ヒトでのように、ＥＲおよびゴルジ装置の内腔表面は、糖タンパク質がＥＲからゴルジネットワーク、培地に進むときに糖タンパク質の連続した処理を可能にする触媒表面を提供する。糖タンパク質がＥＲから分泌経路まで進むとき、それは様々なマンノシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼに連続して曝露される。Ｎ−グリコシル化酵素の中には前の酵素によって作られる特定の基質に依存するものもあるため、いくつかの処理ステップは、前の反応に依存する。Ｎ−グリコシル化酵素、特にエンドグルコサミニダーゼなどの外因性酵素、および複合グリコシル化に必要とされる少なくとも１つの酵素は、そのため、特異的なＮ−グリカン構造の合成を可能にするために所定の順序に並べられなければならない。分泌経路の連続した処理環境の確立は、Ｎ−グリコシル化酵素の適切な局在化を必要とする。それぞれの区画が、内在する（たとえば、Ｎ−グリコシル化）酵素の特異的なセットを維持しながら、分泌経路を通して分泌タンパク質を輸送することができるメカニズム（ＥＲからシス、中間、およびトランスゴルジ区画へならびに培地へ）は、包括的な研究の対象であった。分泌経路の様々な区画にタンパク質を局在化させる十分に確立された２つのメカニズムは、呼び込み（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）および保持である（ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＢＭＢ  １  ２００３；Ｔｅａｓｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２７  １９９６）。
【００７１】
呼び込みは、タンパク質が他のタンパク質との相互作用を通してある細胞小器官に局在化されるプロセスである。いくつかのＥＲ内在タンパク質は、コンセンサス配列ＫＤＥＬ（配列番号１）（または酵母ではＨＤＥＬ（配列番号２））を有するカルボキシ末端テトラペプチドを含有し、これは、ＥＲへの効率的な局在化に必要とされることが示された。
【００７２】
いくつかのＥＲおよびゴルジ内在酵素は、ＩＩ型膜タンパク質である。これらのタンパク質は、アミノ末端に短い細胞質側末端、疎水性膜貫通ドメイン、内腔幹（ｌｕｍｉｎａｌ  ｓｔｅｍ）、およびＣ−末端触媒ドメインを含む共通のドメイン構造を有する。欠失研究および非ゴルジ内在タンパク質に対する融合物により、Ｎ−末端領域、特に膜貫通領域が多くのＩＩ型膜タンパク質のターゲティング情報を含有するとして同定された。Ｎ−末端ドメインがターゲティングに関与することは明らかであるが、それらのターゲティング能力を様々な種間でどの程度まで行き来させることができるかは依然として全く明らかでない。しかしながら、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＥＲおよびゴルジに本来局在化するタンパク質に関連するペプチドをコードする既知のＩＩ型膜タンパク質ドメインの遺伝子ライブラリーの設計（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，５０２２  ２００３；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２４４）など、かなりの進歩がなされ、たとえば、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｓｅｃ１２（ＥＲ局在化）、ＭＮＮ２（ゴルジ局在化）、およびＭＮＮ９（ゴルジ局在化）由来のリーダー配列の適性が確認された。国際公開第０２／０００８７９号パンフレットの表５中に列挙される配列は、ＨＤＥＬならびにＥＲ局在化のためのＭｎｓＩ由来のリーダー配列ならびにＯｃｈ１およびＭｎｔ１由来の（ゴルジ−シス局在化）、Ｍｎｎ２由来の（ゴルジ中間局在化）、Ｍｎｎ１由来の（ゴルジトランス局在化）、アルファ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ由来の（トランスゴルジネットワーク）、およびベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩ由来の（ゴルジ局在化）リーダー配列を含む。
【００７３】
移行シグナルは、したがって当技術分野においてよく知られており、それらの機能について、ＥＲまたはゴルジ中に通常局在化されるタンパク質から誘導され得る。さらに、ある生物由来の局在化配列は、他の生物において機能し得る。たとえば、ラットトランスゴルジ中に局在化することが知られている酵素であるラット由来のα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの細胞膜貫通領域は、酵母ゴルジ中にレポーター遺伝子（インベルターゼ）を局在化させることも示された（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋおよび共同研究者らは、２８アミノ酸の酵母マンノシルトランスフェラーゼ（Ｍｎｔｌ）、Ｎ−末端細胞質側末端を含有する領域、膜貫通領域、および８アミノ酸の軸領域のヒトＧａｌＴの触媒ドメインへの融合が活性ＧａｌＴのゴルジ局在化に十分であることも示した（Ｓｃｈｗｉｅｎｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１０）：５４８３−５４８９）。他の十分に立証されたモチーフは、ＥＲにおける保持のためのＫＤＥＬおよびＨＤＥＬモチーフである。特定の実施形態によれば、ＥＲまたはゴルジ移行シグナルは、機能的に活性な場合、それ自体ＥＲまたはゴルジ中に局在化するタンパク質由来のものである。そのようなタンパク質の例は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ジペプチジルアミノペプチダーゼＡ（Ｓｔｅ１３ｐ）、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ＧａｌＩ）、およびヒトガングリオシド−ＧＭ２−シンターゼを含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態によれば、局在化配列は、以下のタンパク質の１つから誘導される：Ｓｔｅ１３ｐ、ＧＬ２−シンターゼ、ガングリオシド−ＧＭ２−シンターゼ、およびα−２，６−グリコシルトランスフェラーゼ、特にα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ、特にβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ。
【００７４】
重要なことに、ゴルジ装置は、単に１つの均質の領域ではなく、５つの機能的領域を有する：シスゴルジネットワーク、シスゴルジ、中間ゴルジ、トランスゴルジ、およびトランスゴルジネットワーク。小胞体由来の小胞（小胞管状クラスターを介する）は、シスゴルジネットワークと融合し、続いて、ゴルジ装置を構成する積み重なる槽を通ってトランスゴルジネットワークまで進行し、そこでそれらはパッケージされ、必要とされる目的地に送られる。それぞれの領域は、たとえば、内容物がいずれの場所に内在するように定められているかに依存して、内容物を選択的に修飾する様々な酵素を含有する。したがって、細胞内でのエンドグルコサミニダーゼの厳密なターゲティングに依存して、グリコシル化経路は、様々な方法で修飾され得る。
【００７５】
たとえば、エンドグルコサミニダーゼは、糖構造が糖タンパク質に既に追加された後、ゴルジにおいて遅い段階でターゲティングされ得る。これは、たとえば、一種の「校正」または「インビボクリーンアップ」として、すなわち、所望の複合グリコシル化パターンを糖タンパク質上に産生させる状況ならびにハイブリッド型および／または高マンノース構造（ヒト型グリコシル化のために修飾される酵母において観察されることが多い状況）で特に想定され得る。その点で、ハイブリッド型および高マンノースグリコシル化構造に特異的なエンドグルコサミニダーゼ（たとえば、Ｅｎｄｏ  Ｔ、Ｅｎｄｏ  Ｈ）の遅い段階でのゴルジターゲティングは、異常にグリコシル化された糖タンパク質が脱グリコシル化され（特に単一ＧｌｃＮＡｃに）、その一方で複合グリコシル化を有する糖タンパク質がそのため分泌されることを確実にする。したがって、２つの容易に分離可能なグリコ集団が得られる。代替の選択肢は、細胞中で作製されたグリコシル化構造をすべて加水分解するエンドグルコサミニダーゼの遅い段階でのターゲティングである。（真核細胞の中には、限られた糖多様性（ｇｌｙｃｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）のみを有するものもあるため、または真核細胞が、たとえば複合グリコシル化に必要とされる酵素活性の欠損により、限られた糖多様性のみを有する糖タンパク質を産生するように修飾され得るため、広範な特異性を有するエンドグルコサミニダーゼである必要は特にない）。このように、均一なグリコシル化パターンは、糖タンパク質、たとえば非グリコシル化糖タンパク質のみまたは単一単糖修飾糖タンパク質のみの集団において得られてもよい。別の選択肢は、ＥＲ−＞ゴルジグリコシル化経路における初期にエンドグルコサミニダーゼをターゲティングすることであろう一方、グリコシルトランスフェラーゼ（たとえば、経路において遅い段階でターゲティングされるさらなる外因性グリコシルトランスフェラーゼ）は、さらに下流で活性となる。このように、均一なグリコ集団（たとえば、単一ＧｌｃＮＡｃ修飾糖タンパク質の）は、グリコシルトランスフェラーゼに基質として提供される。これは、グリコシル化糖タンパク質の均一な集団をもたらす。典型的なエンドグルコサミニダーゼが天然のグリコ構造（ｇｌｙｃｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の典型的な内部Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コア構造も除去するため、この均一なグリコ集団が、特に天然に存在しないグリコフォームの均一な集団であり得ることに注意されたい。しかしながら、そのような構造は、植物、酵母、または昆虫細胞において産生される特定のグリカンよりも哺乳動物においてそれほど免疫原性ではないことが多い。
【００７６】
本明細書でなされたエンドグルコサミニダーゼのターゲティングについての説明が、当然のことながら、細胞内の他の酵素、特にグリコシルトランスフェラーゼおよび／または特定の実施形態において使用される複合グリコシル化に必要とされる少なくとも１つの酵素のターゲティングにも適用されることは明らかであろう。実際に、これらの酵素がＥＲ−＞ゴルジ経路において活性であり、連続して作用するように、これらの酵素は慎重にターゲティングすべきである。特定の実施形態によれば、複合グリコシル化に必要とされる少なくとも１つの酵素は、２つ以上の酵素である。より詳細には、少なくとも１つの酵素は、複合グリコシル化のための経路を形成するために必要とされる多くの酵素である。特に、複合グリコシル化に必要とされる酵素のそれぞれは、それらが連続して正しい順序で作用するようにターゲティングされる（典型的に、ある酵素は糖鎖を修飾して、次の酵素のための基質にするであろう）。特定の実施形態によれば、複合グリコシル化に必要とされる少なくとも１つの酵素は、少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（たとえば、ＧｎＴ  Ｉ、ＧｎＴ  ＩＩ、ＧｎＴ  ＩＩＩ、ＧｎＴ  ＩＶ、ＧｎＴ  Ｖ、ＧｎＴ  ＶＩ）、少なくとも１つのマンノシダーゼ（特にマンノシダーゼＩＩ）、少なくとも１つのフコシルトランスフェラーゼ、少なくとも１つのガラクトシルトランスフェラーゼ、少なくとも１つのシアリルトランスフェラーゼ、またはこれらの酵素の任意の組み合わせである。
【００７７】
複合グリコシル化経路が遺伝子操作された糖鎖工学酵母の例は、当技術分野において広く記載される（たとえば、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，５０２２  ２００３；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ  １２４４；Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１１９  ２００５；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，３８７  ２００７；欧州特許第１２１１３１０号明細書；国際公開第０２／０００８７９号パンフレット；米国特許出願公開第２００６１４８０３９号明細書を参照されたい）。複合グリコシル化に必要とされる酵素がすべて分泌ＥＲ−＞ゴルジ経路の区画にターゲティングされ、したがって分泌されないことに注意されたい。
【００７８】
加えて、多くの他の遺伝子も、ＥＲおよびゴルジ特異的輸送体（たとえば、ＵＤＰ−ガラクトースおよび他の前駆物質についての共輸送および対向輸送輸送体）またはＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸などの活性化オリゴ糖前駆物質の合成に関与する酵素など、複合型グリコシル化糖タンパク質の最適な産生を確実にするために、本明細書において記載される糖鎖工学酵母細胞において形質転換され得る。実際に、複合グリコシル化に必要とされる少なくとも１つの酵素との接触は、効率的で正確なグリコシル化を確実にするために、特異的なグリコシルドナー（たとえば、糖ヌクレオチドドナー）の存在下において行われ得る。
【００７９】
産生される糖タンパク質のグリコシル化ステータスは、使用される細胞系（たとえば、いずれの酵素がその中に存在する）およびエンドグルコサミニダーゼの特異性の両方に依存するであろう。さらに、これらの酵素が作用する時間および場所も重要である（たとえば、いずれの酵素がＥＲ−＞ゴルジ経路において最初に作用する）。したがって、細胞が専ら非グリコシル化タンパク質または単一ＧｌｃＮＡｃ残基のみを有するタンパク質を発現することが可能である（たとえば、酵母細胞ならびに高マンノースおよびハイブリッド型グリカンを加水分解することができるエンドグルコサミニダーゼの場合）。これらのタンパク質は、たとえば結晶化研究のベースとして役立ち得る。別の可能性として、そのようなタンパク質は、たとえばグリコシルトランスフェラーゼによる処置によってさらに修飾され、所望のグリカン成分を有するタンパク質がもたらされる。
【００８０】
代わりに、所望の（典型的に複合）グリコシル化を実現することができる細胞を使用することができる（たとえば、エンドグルコサミニダーゼが複合グリコシル化に必要とされる酵素の後に作用する糖鎖工学酵母（細胞内、たとえばトランスゴルジもしくはトランスゴルジネットワークにおいて、または細胞外で））。このシナリオにおける前提条件は、エンドグルコサミニダーゼが所望の糖鎖を加水分解しないことである（たとえば、その特異性のために、エンドグルコサミニダーゼが空間的におよび／もしくは時間的にグリコシル化タンパク質から分離されるため、またはエンドグルコサミニダーゼが望まれないグリカンを除去した後にエンドグルコサミニダーゼが不活性にされるため）。典型的に、そのような細胞は、糖タンパク質の２つの集団を産生するであろう：適切にグリコシル化された形態および非グリコシル化または単一ＧｌｃＮＡｃ修飾形態（たとえば、ハイブリッド型またはマンノース型グリカン修飾を有する糖タンパク質の脱グリコシルから得られる）。そのような混合性集団は、一様にグリコシル化された集団が得られる前に分離ステップをなお必要とするが、複合グリコシル化を有するタンパク質および非グリコシル化タンパク質間の差異（たとえば、重量、流体力学的特性）が、異なってグリコシル化されたタンパク質間の差異よりもはるかに大きいため、この分離ステップは、従来の産生方法によるものよりもはるかに容易である。
【００８１】
代わりに、細胞が、適切にグリコシル化されたタンパク質のみを産生および／または分泌することを想定し得る。たとえば、糖鎖工学酵母について、これは、ＥＲ−＞ゴルジ経路において、複合グリコシル化のための少なくとも１つの酵素の直前にエンドグルコサミニダーゼ酵素をターゲティングすることにより、すべての糖タンパク質がエンドグルコサミニダーゼによって最初に（少なくとも部分的に）脱グリコシル化され、その後、それらが複合グリコシル化のための少なくとも１つの酵素によって修飾される方法で実現することができる。後者のアプローチを使用して、エンドグルコサミニダーゼが典型的にコアＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造またはその少なくとも一部分を除去するため、産生された糖タンパク質は、天然に存在しない炭水化物鎖を有し得、その結果として、複合グリコシル化のための酵素によって糖タンパク質上に追加された糖鎖が、単一ＧｌｃＮＡｃ残基などの短くなったベースとなる構造に追加されるであろう。天然に存在しないが、そのような複合糖鎖は非免疫原性であることも多く、たとえば安定性の増加、より長い半減期などの他の望ましい特性を有し得る。第１の酵素（たとえば、エンドグルコサミニダーゼ）による修飾後の糖タンパク質が、次の酵素（たとえば、複合グリコシル化に必要とされる酵素）に適した基質であることは常に重要であるが、そのような新たな合成経路の生成において特にそうである。
【００８２】
しかしながら、たとえば、専ら非グリコシル化タンパク質または単一単糖修飾タンパク質を保持するために、さらなる（複合）グリコシル化も阻害され得ることが理解される。したがって、特定の実施形態によれば、本明細書において記載される真核細胞は、ＥＲ−マンノシダーゼＩ、グルコシダーゼＩ、グルコシダーゼＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼＩＩ、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩ、およびＮ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩなど、複合グリコシル化に必要とされる少なくとも１つの酵素を含まない。そのような細胞は、糖タンパク質を複合グリコシル化することができない。しかしながら、たとえ（完全な）複合グリコシル化がそのような細胞において通常実現されなくても、特定の特異性を有するエンドグルコサミニダーゼを、糖タンパク質がエンドグルコサミニダーゼと接触した後に再び以下の酵素についての標的となることを確実にするＥＲ−＞ゴルジグリコシル化経路のある場所にターゲティングすることは可能であり得る。このように、新たな合成経路が生成され得る。たとえば、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼの直前にエンドグルコサミニダーゼをターゲティングすることは、Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩを欠く細胞において可能であり得る。このように、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼのみが、（部分的に）脱グリコシル化されたタンパク質（たとえば、単一ＧｌｃＮＡｃ修飾タンパク質）上に作用し、したがって、天然に存在しない複合グリコシル化を有するタンパク質を産出するであろう。
【００８３】
本明細書において記載される糖タンパク質の産生のための細胞は、典型的に細胞培養物の形態で提供されるが、これは必ずしもそうである必要はない。実際に、糖タンパク質を産生する細胞は、生物、たとえばトランスジェニック動物または植物の一部分であり得る。特定の実施形態によれば、本出願において記載される糖タンパク質およびエンドグルコサミニダーゼを含有する細胞を含む植物も想定される。典型的に、植物は、特にさらに様々な器官および／または組織において多数のこれらの細胞を有するであろう。
【００８４】
本明細書において記載される真核細胞は、糖タンパク質産生に特によく適している。特定の実施形態によれば、糖タンパク質は、特異的なグリコフォーム、特に単一ＧｌｃＮＡｃ修飾糖タンパク質が豊富である。したがって、真核細胞において単一ＧｌｃＮａｃ成分によって修飾された糖タンパク質を産生するための方法であって、
−  内因性ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性が欠損し、かつエンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする第１の外因性核酸配列および糖タンパク質をコードする第２の外因性核酸配列を含む真核細胞を、エンドグルコサミニダーゼ酵素および糖タンパク質を発現するのに適した条件で提供するステップと、
−  糖タンパク質がエンドグルコサミニダーゼと細胞内でまたは細胞外で接触された後、糖タンパク質を回収するステップと
を含む方法が提供される。
【００８５】
単一ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質は、細胞によって産生される糖タンパク質の唯一のグリコフォームであり得（すなわち、均一なグリコ集団が産生される）、すなわち糖タンパク質上に他のＮ−グリカンもＯ−グリカンも存在しない。
【００８６】
本明細書において記載される方法は、糖タンパク質およびエンドグルコサミニダーゼ間の接触が最適な状況下で行われることを確実にする（すなわち糖タンパク質上でのエンドグルコサミニダーゼの最適な活性を確実にする）ようにさらに適合させ得る。たとえば、接触が細胞内で行われる場合、エンドグルコサミニダーゼは、ゴルジまたはＥＲ（における所望の場所）にターゲティングされ得、そこでエンドグルコサミニダーゼは、糖タンパク質に対してその機能を及ぼす。たとえば、細胞におけるまたは細胞外での想定されるさらなるグリコシル基転移に依存して、所望の場所は、上記に記載されるように異なり得る。特定の実施形態によれば、細胞内接触はゴルジまたはＥＲで行われる。
【００８７】
エンドグルコサミニダーゼおよび糖タンパク質の両方は分泌されてもよく、または接触は細胞外で起こり得る。しかしながら、使用される細胞およびエンドグルコサミニダーゼに依存して、細胞についての最適な増殖条件および産生条件（たとえば、ｐＨ、温度）は、酵素活性についての最適な条件と異なり得る。したがって、糖タンパク質およびエンドグルコサミニダーゼ間の細胞外接触が起こる培地は、エンドグルコサミニダーゼの最適な酵素活性のために調節され得る。特定の実施形態によれば、細胞外接触が起こる培地の条件は、最適な酵素エンドグルコサミニダーゼ活性のために調節される。さらに特定の実施形態によれば、細胞外接触が起こる培地のｐＨは、最適な酵素エンドグルコサミニダーゼ活性のために調節される。典型的に、これは、細胞に糖タンパク質およびエンドグルコサミニダーゼの両方を産生させ、かつ分泌させた後の培地のｐＨシフトによって行われ得る。一般に、エンドグルコサミニダーゼは、通常、酸性環境において生理学的に活性であるため、そのようなｐＨシフトは、シフトダウンとなるであろう。別の特定の実施形態によれば、培地の温度は、最適な酵素活性のために調節される。増殖条件および産生条件の調節がエンドグルコサミニダーゼの活性の直前に行われ得ること、または条件を細胞増殖中に既に適合させ得ることに注意されたい。たとえば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞は、適正酸性培地において増殖し、タンパク質を産生することができ、この培地は、したがって、特定のエンドグルコサミニダーゼの最適な活性のために既に調節されている。しかしながら、真核細胞の中には、それらの完全性のためにＮ−グリコシル化に依存性であるものもあるため、増殖培地のｐＨを緩衝剤で処理してエンドグルコサミニダーゼが活性ではないｐＨにし、タンパク質産生が完了した後にのみｐＨをダウンシフトさせることは有益であり得る。
【００８８】
本発明の別の重要な態様として、単一ＧｌｃＮＡｃ  Ｎ−グリカンを含み、かつムチン型Ｏ−グリカンを欠く糖タンパク質が提供される。本発明によれば、前記糖タンパク質は、哺乳動物細胞株または生物において前記糖タンパク質を発現させることによって得られ、前記哺乳動物細胞または生物は、エンドグルコサミニダーゼ酵素をコードする外因性核酸配列を含む。前記哺乳動物細胞株または生物は、内因性ＵＤＰ−ガラクトース４−エピメラーゼ（ＧａｌＥ）の発現および／または活性が欠損している。
【００８９】
注意すべきことに、前に特定された本発明の特徴および実施形態は、すべて単一ＧｌｃＮＡｃ  Ｎ−グリカンを含み、かつムチン型Ｏ−グリカンを欠く前記糖タンパク質が得られるプロセスをさらに特定するのに役に立つ。
【００９０】
特定の実施形態、詳細な形状ならびに材料および／または分子が、本発明による細胞および方法について本明細書で議論されたが、形式および詳細において様々な変更形態または修飾形態がなされ得ることが理解される。以下の実施例は、特定の実施形態をよりよく例証するために提供され、それらは本出願を限定するように見なされるべきではない。本出願は、請求項によってのみ限定される。
【実施例】
【００９１】
実施例１：ＨＥＫ２９３Ｓ  Ｇｌｙｃｏｄｅｌｅｔｅ細胞株の生成
これは、国際公開第２０１０／０１５７２２号パンフレットおよびＭｅｕｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  ３２（５）：４８５−９）において記載されるように行った。手短かに言えば、インビトロにおける脱グリコシルを回避するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３Ｓ細胞株においてインビボ脱Ｎ−グリコシル化を実行する。糸状菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からクローニングされたためにｅｎｄｏＴと示されるｅｎｄｏＨ型エンドグリコシダーゼをコードする菌類遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＳ４２３０５０）の同定およびクローニング（ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｇｅｂｏｒｇ  Ｓｔａｌｓ，Ｇｈｅｎｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００４）により、それが可能になる。研究は、グルコサミントランスフェラーゼＩネガティブＨＥＫ細胞株において実行する（Ｒｅｅｖｅｓ，Ｃａｌｌｅｗａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ．９９（２００２）：１３４１９−１３４２４）。この細胞株は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンをほぼ排他的に産生し、これは、ｅｎｄｏＨ型エンドグリコシダーゼによってキトビオース結合で加水分解される。
【００９２】
ＥｎｄｏＴは、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（現在はヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）と称される）によって分泌され、これは、真核生物の分泌経路におけるフォールディングにそれが適合しているという事実を示す。タンパク質のフォールディングにおけるＮ−グリカンの機能に干渉しないように、ｅｎｄｏＴをトランスゴルジ／トランスゴルジネットワークにターゲティングする。
【００９３】
戦略
ＨＥＫ２９３Ｓ細胞株のトランスゴルジ／ＴＧＮへのｅｎｄｏＴ酵素のターゲティングは、ゴルジ保持グリコシルトランスフェラーゼのトランスゴルジターゲティングシグナルを融合することによって実現する。ゴルジに内在するほとんどのグリコシルトランスフェラーゼは、程度の差はあれ、細長い支えとなっている領域（ｓｔａｌｋ  ｒｅｇｉｏｎ）においてタンパク分解性のスプライシングを受ける（Ｊａｓｋｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４２）（１９９６），２６３９５−２６４０３）。ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ＧａｌＩ）またはヒトガングリオシド−ＧＭ２−シンターゼ（ＧａｌＮＡｃＴ）のＮ−末端を完全長ｅｎｄｏＴ酵素のＮ−末端に融合する。β−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６ＧａｌＩ）は、より特徴付けられており、そのＮ−末端は、トランスゴルジ中に保持されるが、それはいくつかの切断部位を含有し、場合によりタンパク分解性の処理を受ける（Ｋｉｔａｚｕｍｅ−Ｋａｗａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９（１２）（１９９９），１３９７−１４０６）。
【００９４】
ＧＭ２シンターゼのＮ−末端は、より短く、最初の２７アミノ酸のみがトランスゴルジ保持を決定すると思われ（Ｕｌｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｆｆｉｃ  ７（２００６），６０４−６１２）、アミノ酸２２および２３間に１つのカテプシン−Ｄスプライス部位を含有するのみである（ＧＬ−ＬＹＡＳＴ）（Ｊａｓｋｉｅｗｉｃｚ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（４２）（１９９６），２６３９５−２６４０３）。切断され過ぎたｅｎｄｏＴ融合タンパク質が分泌されると、これらの配列は非スプライス配列に変化する。
【００９５】
一方ではタンパク分解性の切断およびターゲティングを、ならびに他方ではインビボ脱Ｎ−グリコシル化の効率を評価するために、一過性の哺乳動物発現のための発現構築物を、哺乳動物発現ベクターｐＣＡＧＧＳを使用して作製する（Ｎｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０８（１９９１），１９３−２００）。２つの融合タンパク質についてのＭＹＣタグ付き構築物により、細胞内局在性実験および分泌の判断が可能になる。細胞内局在性実験は、抗ＭＹＣ抗体免疫蛍光顕微鏡検査法およびポジティブコントロールとしてトランスゴルジターゲティングｐＨｌｕｏｒｉｎ構築物を使用して実行する（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｉｓｔｏｌ．ａｃ．ｕｋ／ｓｙｎａｐｔｉｃ／ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ／ｐｈｌｕｏｒｉｎｓ．ｈｔｍ）。ＭＹＣタグ付きｅｎｄｏＴタンパク質の分泌は、抗ＭＹＣ抗体によるウエスタンブロットにより、およびネガティブコントロールとしてＮ−末端ゴルジターゲティング配列を有していないＭＹＣタグ付きｅｎｄｏＴを使用して評価する。糖タンパク質ヘマグルチニンＨ３の可溶性分泌形態をＨＥＫ２９３Ｓ細胞株に同時導入するために使用し、ｅｎｄｏＴ融合タンパク質の脱Ｎ−グリコシル化活性の評価を可能にする。そのようなヘマグルチニンコード配列もｐＣＡＧＧＳベクター中にクローニングする。ヘマグルチニンがｅｎｄｏＴによって細胞内で脱グリコシル化されると、分子量のシフトがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察される。
【００９６】
次いで、最良のゴルジターゲティングシグナルを、選択した融合タンパク質と共に、最終的な構築物を作製するために使用する。恒常的なおよびテトラサイクリン誘発性の発現を想定する。
【００９７】
テトラサイクリン誘発性の発現について、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターを使用する。安定した細胞株がしたがってゼオシンによる選択によって産生される。ＨＥＫ２９３Ｓ  ＧｎＴＩ−／−細胞株は、Ｔｅｔリプレッサータンパク質をコードするｐｃＤＮＡ６／ＴＲ構築物を既に含有している。これは、恒常的にかつ安定して発現され、テトラサイクリンが追加されるまでｐｃＤＮＡ４／ＴＯプラスミド（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの転写を阻止する。
【００９８】
恒常的な発現について、恒常的プロモーターおよび選択マーカー（ｐｃＤＮＡ６／ＴＲについて既に使用されているブラストサイジンではない）を含有する任意の哺乳動物発現ベクターを使用することができる。
【００９９】
実施例２．真核生物の分泌経路への菌類ｅｎｄｏＴ酵素のターゲティングによる糖タンパク質のインビボ脱Ｎ−グリコシル化
哺乳動物細胞におけるｅｎｄｏＴ構築物の一過性のトランスフェクション
ｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＴ−ｅｎｄｏＴ、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＴ−ｅｎｄｏＴ−ｍｙｃ、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＧａｌＮＡｃＴ−ｅｎｄｏＴ、およびｐＣＡＧＧＳ−ｈＧａｌＮＡｃＴ−ｅｎｄｏＴ−ｍｙｃを、国際公開第２０１０／０１５７２２号パンフレットおよびＭｅｕｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  ３２（５）：４８５−９）において記載されるように産生した。これらのプラスミドおよびさらに空のｐＣＡＧＧＳプラスミドは、Ｈｅｋ２９３Ｓ−Ｆｌｔ３細胞株を一過性にトランスフェクトするために使用した。ネガティブコントロールとして、細胞はまた、ＤＮＡなしでトランスフェクトした。細胞がトランスフェクションの日に少なくとも８５％〜９０％コンフルエントとなるように、細胞は、トランスフェクションの２日前に６つのウェルプレート中に１ウェル当たり２００．０００細胞で接種した。トランスフェクションの６時間前に培地の半分を無血清培地と交換し、トランスフェクションの３時間前にすべての培地（３ｍＬ）を２ｍＬの無血清培地と交換した。ＤＮＡリポプレックスは、５００μＬ無血清培地中で１０μＬのリポフェクタミン２０００と４μｇのプラスミドＤＮＡとを組み合わせ、室温で２０分間インキュベートすることによって調製した。インキュベーション後、リポプレックスを細胞に追加し、一晩インキュベートした。翌朝、３０％血清を含有する１ｍＬの培地をそれぞれのウェルに追加し、総血清濃度を１０％にした。
【０１００】
トランスフェクションと同時に、２μｇ／ｍＬ塩酸テトラサイクリンをそれぞれのウェルに追加し、Ｆｌｔ３細胞外ドメインの産生を誘発した（分泌）。０，５ｍｌの培地（細胞なし）をトランスフェクションの４８および７２時間後に収集し、後の分析のために−２０℃で保存した。
【０１０１】
Ｆｌｔ３検出のための培地サンプルのサンプル調製
ＢＳＡ（ウシ胎仔血清由来）を含有する培地サンプルは、ニッケルイオンを添加したキレートセファロース６Ｂビーズを使用してクリーンアップした。
【０１０２】
ビーズ調製：５００μＬのビーズに１ｍＬの１００ｍＭ硫酸ニッケルを添加し、ＲＴで５分間インキュベートした。それらを微量遠心機において５００ｇで１分間遠心沈殿させ、上清を廃棄した。この後、それらを１ｍＬのＰＢＳにより洗浄し、５００ｇで１分間遠心沈殿させ、上清を廃棄した。この洗浄ステップを５回繰り返し、最後の洗浄後に５００μＬのＰＢＳを追加した。
【０１０３】
ｈｉｓタグ付きＦｌｔ３の選択的な濃縮：２５０μＬのサンプルに等量の２×ＰＢＳを追加した。ビーズスラリー（上記に記載されるように調製）由来の２５μＬをこれに追加し、このミックスを１時間回転台上でインキュベートした。
【０１０４】
この後、ビーズを５００ｇで１分間遠心沈殿させ、上清を廃棄した。０，５ｍＬのＰＢＳをビーズに追加し、それらを５００ｇで１分間遠心沈殿させ、上清を廃棄した。この洗浄ステップを合計３回行った。
【０１０５】
ビーズを２５０μＬのＰＢＳ中に再懸濁した。結果として生じるサンプルのうち、２０μＬを取り、β−メルカプトエタノールを有する１０μＬの３×Ｌａｅｍｌｌｉバッファーをこれに追加し、サンプルを５分間加熱した。
【０１０６】
ウエスタンブロットによる分泌されたＦｌｔ３の検出
サンプル調製後、３０μＬの各サンプルを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に添加し、流した。ゲルは、ニトロセルロース膜に半乾燥ブロットし、１／１０００に希釈した一次ペンタｈｉｓ抗体および１／５０００に希釈した二次抗マウスＩｇＧ１によりｈｉｓタグ付きＦｌｔ３タンパク質の検出を実行した。
【０１０７】
ウエスタンブロットによる分泌されたｅｎｄｏＴ構築物の検出
同じ培地サンプルを、（タンパク分解性切断）ｅｎｄｏＴ融合タンパク質の分泌を判断するためにも使用した。β−メルカプトエタノールを有する１０μＬの３×Ｌａｅｍｌｌｉバッファーを２０μＬのもとのサンプルに追加し、これらを１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で流した。ニトロセルロース膜へのブロッティング後、検出は、１／３０００に希釈した抗ｍｙｃ一次抗体および１／５０００に希釈した抗マウス二次抗体を使用して実行した。
【０１０８】
結果
Ｈｅｋ２９３Ｓ−Ｆｌｔ３は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２  Ｎ−グリカンをほぼ排他的に産生する親の細胞株Ｈｅｋ２９３Ｓ−ＲｉｃＲからＳ．Ｓａｖｖｉｄｅｓ教授のグループによって生成された。それは、ヒトＦｌｔ３受容体のｈｉｓタグ付き細胞外ドメインについての安定したトランスフェクタント株であり、このタンパク質は、分泌経路を通過する。
【０１０９】
哺乳動物細胞へのｅｎｄｏＴ構築物の一過性のトランスフェクション
使用するトランスフェクションプロトコールにより、約３０〜４０％の効率で細胞をトランスフェクトすることが可能になる（ＦＡＣＳによって判断、結果は示さず）。毎日の顕微鏡観察は、ｅｎｄｏＴ融合タンパク質のいずれかまたは空のｐＣＡＧＧＳプラスミドをトランスフェクトした後の有意な細胞死も、ネガティブコントロールウェル（ＤＮＡなしでのトランスフェクション）よりも遅い増殖も示さなかった。
【０１１０】
Ｆｌｔ３検出のための培地サンプルのサンプル調製
サンプル中に大量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（約６６ｋＤａまで流れる）が存在し、分泌された非脱グリコシル化Ｆｌｔ３受容体が約７０ｋＤａまで流れるという事実のために、Ｆｌｔ３の免疫検出、とりわけ７０ｋＤａよりもわずかに小さい分子量のＢＳＡエリアに流れる、このタンパク質の脱グリコシル化形態の検出は、過剰なＢＳＡによる非特異的な（ａｓｐｅｃｉｆｉｃ）染色および実際のＦｌｔ３シグナルの遮断によって不明瞭になる。そのため、ニッケル添加キレートセファロースビーズによるクリーンアップステップを使用して、ある程度サンプルからＦｌｔ３を精製することは好都合である。Ｆｌｔ３分子がｈｉｓタグ付きであるため、このステップは、サンプル中のＦｌｔ３分子を選択的に濃縮し、検出が可能になる。
【０１１１】
Ｆｌｔ３ウエスタンブロット：ｅｎｄｏＴによる処理
分泌されたＦｌｔ３細胞外ドメインは、９つの推定上のＮ−グリコシル化部位を含有する（Ｒｏｓｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。今日に至るまで、これらの部位の７つは、Ｎ−グリカンにより修飾されることが確認された（個人的な情報交換、Ｋ．Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ）。ｅｎｄｏＴ融合タンパク質による少なくともいくつかのグリカンの除去により、ウエスタンブロット上でのバンドシフトが引き起こされることが予想され、これは実際にそうなる（示さず）。トランスフェクションおよび誘発の２日後、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＴ−ｅｎｄｏＴおよびｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＴ−ｅｎｄｏＴ−ｍｙｃトランスフェクト細胞によって産生されたＦｌｔ３の処理を観察することができる。３日後、もはや完全ではないグリコシル化Ｆｌｔ３をｅｎｄｏＴトランスフェクト細胞によって産生されたサンプルのいずれにおいても観察することができる。ｍｙｃタグ付きｅｎｄｏＴ融合タンパク質によりトランスフェクトされた細胞から生じるＦｌｔ３バンドが、非ｍｙｃタグ付きｅｎｄｏＴ融合タンパク質トランスフェクト細胞由来のものと同じ挙動を示すという事実は、両方の場合にｃ−ｍｙｃタグが融合タンパク質の機能に深刻に干渉しないという事実を示す。
【０１１２】
ウエスタンブロットによるｅｎｄｏＴ構築物の検出
両方のｅｎｄｏＴ融合タンパク質構築物は、ｃ−ｍｙｃタグによりＣ−末端にもタグを付けた。これにより、ｅｎｄｏＴ融合タンパク質のゴルジ内腔ドメインのタンパク分解性の処理および続く分泌の判断を可能にし、これは、次いでウエスタンブロットによって上清において検出されるはずである。これは、ヒトＧＭ２シンターゼのターゲティングドメインにＮ−末端で融合されたｅｎｄｏＴ（ｐＣＡＧＧＳ−ｈＧａｌＮＡｃＴ−ｅｎｄｏＴ−ｍｙｃ）について、実際にそうなる（示さず）。アミノ酸２２および２３間のカテプシンＤ様スプライス部位（ＧＬ−ＬＹＡＳＴ）での処理により、約３９，１ｋＤａ（非グリコシル化ｍｙｃタグ付き形態）の分泌断片がもたらされるであろう。分泌断片はほぼこの大きさである。クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ｐＣＡＧＧＳ−ｈＧａｌＮＡｃＴ−ｅｎｄｏＴおよびｐＣＡＧＧＳ−ｈＧａｌＮＡｃＴ−ｅｎｄｏＴ−ｍｙｃトランスフェクト細胞由来の上清サンプルを添加したレーンにおいて、小さいが明確に定められたバンドを示し、ＭＷにわずかな差異があるが、これはｍｙｃ−タグ（１，２ｋＤａ）の存在または非存在に起因するものである（示さず）。
【０１１３】
ｐＣＡＧＧＳ−ｈＳＴ−ｅｎｄｏＴ−ｍｙｃプラスミドによるトランスフェクションの３日後にウエスタンブロット上に断片を検出することができないため、ヒトβ−ガラクトシド−α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ｈＳＴ）のターゲティングドメインに融合されたｅｎｄｏＴは、大量に分泌されるとは思われない。融合タンパク質の最初の２７アミノ酸は、細胞質側ドメインおよび膜貫通ドメインを構成する。これは、理論上、アミノ酸２７および１００（これは使用されるｈＳＴの一部である）間のいずれでもタンパク分解性のスプライシングが生じ得、３８，６ｋＤａ〜４６，５ｋＤａの断片をもたらし得ることを意味する。たとえＮ−グリカンが存在したとしても（ｅｎｄｏＴ上に４つの部位、ｈＳＴターゲティングドメイン上に部位なし）、Ｎ−グリカンがＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２形態であることを考慮すれば、タンパク質は、６６ｋＤａ（約６０〜７０ｋＤａ）当たりのＢＳＡによって塞がれるエリアの外側となり、したがってウエスタンブロット上に検出されるであろう。さらに、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ネガティブコントロールレーン（空のｐＣＡＧＧＳによるトランスフェクション）において特別なバンドを示さない（示さず）。こういったことは、すべてｅｎｄｏＴタンパク質が実際に細胞の内部に残っており、したがって効率的にターゲティングされることを示す。
【０１１４】
実施例３．ＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞株の生成
戦略
本発明者らの目標は、ムチン型Ｏ−グリコシル化を完全に欠く細胞株を生成することである。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ技術とこの細胞株とを組み合わせることは、したがって、Ｏ−グリカンおよびＮ−グリカンの両方の不均一性が著しく低下した「ＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ」細胞株をもたらすであろう。これらの細胞株は、それらのＮ−グリカンが正確なフォールディングを媒介するのを必要とするが、完全に成熟したＮ−グリカンまたはＯ−グリカンが機能することを必要としない糖タンパク質を産生するのに有用であろう。たとえば、結晶学において、グリカンの不均一性は結晶形成を妨げ得る。加えて、グリカンは、生物製剤の効能、活性、および安定性に影響を及ぼすことが知られているが、グリカンの不均一性はバッチごとに異なり得、医薬タンパク質の特性が同様に異なり得ることを意味する。
【０１１５】
ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞において使用される戦略に類似する酵素戦略は、Ｏ−グリカンではできない。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞において、ｅｎｄｏＴ酵素は、合成されるＮ−グリカンをすべて認識する。Ｏ−グリカンについて、ムチン型Ｏ−グリカンの複雑で多様な混合物のすべてのメンバーを認識するそのような酵素は知られていない。そのため、本発明者らは、Ｏ−グリカン構築の最初のステップにおける遺伝子をノックアウトすることにより、Ｏ−グリコシル化生合成経路をターゲティングすることを求めた。すべてがトリマンノシルコアを共有するＮ−グリカンと異なり、ムチン型Ｏ−グリカンは構造的にほとんど共通していない。セリンまたはトレオニンへのＧａｌＮＡｃ結合によりＯ−グリコシル化が開始される。ＧａｌＮＡｃは、様々なムチン型Ｏ−グリカンの唯一の共通の残基である。しかしながら、Ｏ−グリコシル化開始酵素、ポリペプチド−ＧａｌＮＡｃ−トランスフェラーゼ（ｐｐＧａｌＮＡｃＴ）ファミリーのターゲティングは、ｐｐＧａｌＮＡｃＴファミリーが２１以上のメンバーを有するため、時間のかかる作業になるであろう。本発明者らがターゲティングすることができる１つの共有される特徴は、ｐｐＧａｌＮＡｃＴファミリーによって使用される基質：ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃである。ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃが提供される２つのルートがある：ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃを介した外部および内部代謝分子からのサルベージまたは中枢炭素代謝からのデノボ構築。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡＣからＵＤＰ−ＧＡｌＮＡｃへのエピマー化は、ＵＤＰ−ガラクトース−４’エピメラーゼ（ＧａｌＥ）によって触媒される。ＣＨＯ細胞における受容体媒介性のエンドサイトーシスを研究する実験中、ＧａｌＥは意図せずにノックアウトされ、これによりＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃおよびＵＤＰ−Ｇａｌの欠乏がもたらされた（Ｋｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０，１６７−１８４（１９８１））。これらの細胞において産生されたタンパク質は、いかなるムチン型Ｏ−グリカンも欠いた（Ｋｉｎｇｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ４４，７４９−７５９（１９８６））。そのため、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞においてＧａｌＥ遺伝子をターゲティングすることに決定した。
【０１１６】
著者らによれば、ＣＨＯ  ＧａｌＥ  ＫＯを単離するために使用した選択方法により、１つのＧａｌＥ欠損クローンが産出されたのみであった。加えて、実験を繰り返すことができなかった。そのため、本発明者らは、それらの手順を再現するのではなく、新たなアプローチを設計することを選択した。本発明者らの目標は、ゲノム編集ツールを利用することにより、ＨＥＫ２９３ｓ細胞においてＧａｌＥをノックアウトし、それによりそれらのタンパク質を図１Ａにおいて示されるＮ−グリカンで装飾し、Ｏ−グリカンでは装飾しないＯ−グリコシル化欠損ＨＥＫ２９３ｓ細胞を作ることであった。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞におけるこのアプローチの適用により、本発明者らは、これらのいわゆるＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞においてＮおよびＯ結合型の両方のグリカンから生じる不均一性に対処することを求めた（図１Ｂ）。
【０１１７】
ゲノム編集ツールが標的配列を実際に編集することを確実にするために、本発明者らは、インビトロアッセイにおいて新しく設計された標的ヌクレアーゼを最初に徹底的に特徴付けることによってボトムアップアプローチをたどった。加えて、本発明者らはまた、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（材料および方法の部に記載）を実行するための正確な条件を見出し、これによりインビボ試験が可能になった。成功の確率を増加させるために、本発明者らは、ニッカーゼＣａｓ９の切断頻度の方がはるかに低いため、ニッカーゼＣａｓ９の代わりにＷＴ  Ｃａｓ９を使用することによってＫＯを生成することに注目した。短時間で比較的容易なスクリーニングを可能にするスクリーニング方法が必要とされた。いくつかの表現型ベースのスクリーニング方法を使用したが、ポジティブコントロールがなかったため、スクリーニング方法が失敗しているか、またはスクリーニングした細胞にノックアウトがないに過ぎないか常に不明瞭であった。本発明者らは、１回のゲノムＤＮＡ調製当たり約１００万個の細胞を必要とし、これは細胞株を増やすことを必要とするため、ゲノムのレベルのスクリーニングも処理が難しかった。さらに、本発明者らは、ＰＣＲ増幅断片をシークエンシングのためのベクター中にクローニングしなければならず、これは労働集約型で時間のかかる戦略であった。スクリーニングで遭遇した問題にゲノムおよび表現型レベルの両方でアプローチした。ゲノムレベルでは、本発明者らは、適度な時間内で数十のクローンのスクリーニングを可能にする高速ゲノムＤＮＡ単離方法および特異的で頑健なポリメラーゼの組み合わせを最適化した。表現型レベルでは、本発明者らは、有望なＧａｌＥ  ＫＯクローンにおいてｈＧＭ−ＣＳＦを発現させた。Ｏ−グリカンシアル酸の除去をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で検出することができ、したがって、Ｏ−グリカンの完全な除去は、さらに大きい分子量シフトをもたらすはずであることを本発明者らは以前に示した（Ｍｅｕｒｉｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，４８５−４８９（２０１４））。
【０１１８】
ガイド構築および活性評価
ＧａｌＥ遺伝子のエクソン２、３、および４を標的にする３つのガイドを、ＭＩＴ（ＣＲＩＳＰＲ．ＭＩＴ．ＥＤＵ）から入手可能なオンラインツールにより設計した。それらの配列は表１からわかる。これらのガイドによって標的にされるＧａｌＥ遺伝子の遺伝子座を図２に示す。次いで、ガイドを、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．８，２２８１−２３０８（２０１３））の指示に従ってＦｅｎｇ  Ｚｈａｎｇの研究所のＰＸ４５８ベクター中にクローニングした。ガイドのためのクローニング部位とは別に、このベクターは、ＧＦＰ遺伝子の発現がＣａｓ９発現に共役しているＣａｓ９−ＧＦＰ発現カセットも有する。その発現が同じプロモーターから駆動されるため、ＧＦＰを発現する細胞は、Ｃａｓ９タンパク質も発現しなければならない。２つのコード配列は、結果として生じるｍＲＮＡにおいてＣＤＳのあるストレッチをリボソームにスキップさせ、同じｍＲＮＡから２つの別々のポリペプチド鎖を生成する、ウイルス起源のＤＮＡエレメントである２Ａ配列によって分離される。
【０１１９】
【表１】
0006790057.tif 000002
【０１２０】
生細胞におけるゲノム編集イベントの達成を試みる前に、本発明者らは、インビトロにおいて合成したガイドＲＮＡおよび組換えで産生したＣａｓ９により標的領域のＰＣＲ増幅ＤＮＡを消化することにより、選択したガイドの切断効率について判断した。図３において示されるように、３つのガイドは、すべてＧａｌＥ遺伝子の１８０５ｂｐ長のＰＣＲ増幅断片を予想される大きさの断片に処理する（表２）。
【０１２１】
【表２】
0006790057.tif 000003
【０１２２】
さらにガイドを特徴付けるために、本発明者らは、３つの異なるガイドによりＨＥＫ２９３ｓ細胞を有する１００万個の細胞をトランスフェクトした。７２時間後、ＧＦＰポジティブ細胞をプールにＦＡＣｓソートした。このプール由来の細胞を回収し、それらのゲノムＤＮＡを単離した。標的領域をＰＣＲ増幅した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを利用することにより（図４）、本発明者らは、ガイド１およびガイド３がインビボにおいて標的断片を切断することができたが、ガイド２が活性を示さなかったと結論付けることができた。表３は、予想される断片サイズを表す。
【０１２３】
【表３】
0006790057.tif 000004
【０１２４】
ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−ＫＯの生成および分析
遺伝子型スクリーニングの開発およびクローン選択への適用
ガイド１および３の両方がインビボゲノム編集の実現に成功したことを示したため、本発明者らは、ガイド１および３により再度ＨＥＫ２９３ｓ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１つの細胞にＦＡＣＳソートした。３４のクローンを増殖させ、安定した単一細胞株由来のコロニーにし、増やした。それぞれのクローンについて、本発明者らは、ゲノムＤＮＡ抽出のために２＊１０５細胞を回収し、１００μｌ  ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔバッファー中で溶解した。この方法はＤＮＡ精製ステップを必要としないため、この方法により、他の細胞溶解物と混合したゲノムＤＮＡの粗製抽出物がもたらされた。多量の混入物は、サンプル中のゲノムＤＮＡ濃度を測定するのを困難にする。異なるＰＣＲ反応に同様の量のゲノムＤＮＡを追加するために、本発明者らは、毎回、同量のバッファー中に同量の細胞を溶解し、１０μｌの総ＰＣＲ容量当たり１μｌのその粗ゲノムＤＮＡミックスを使用した。本発明者らは、本発明者らの標準的な高忠実度のポリメラーゼが粗ゲノムＤＮＡ抽出物中に存在する副産物から損害を受けることが多く、加えて、これにより標的領域の増幅が不良となるかまたは標的領域が増幅されないことも見出した。そのため、ポリメラーゼとしてＫａｐａ  ＨｉＦｉを使用することが不可欠であり、これは、非常に広範に変動するゲノムＤＮＡ品質を取り扱うことができると思われた。過去、このＰＣＲ産物は、ＰＣＲ産物を直接シークエンシングすると、ＤＮＡ純度が低いためにリードの品質が悪くなったため、ＴＯＰＯベクター中にクローニングされた。しかしながら、磁気ビートによるＰＣＲアンプリコンの精製により、高純度のＤＮＡサンプルがもたらされ、これは、ネステッドプライマーを使用することによる直接的なサンガーシークエンシングを可能にした。これは、中間のクローニングステップの必要を除き、結果的に分析時間を何日も減少させた。サンガーシークエンシングは、２１のクローンにおいて編集を明らかにし、１３個はなお野生型であった。
【０１２５】
ＨＥＫ２９３細胞における倍数性により、様々なＧａｌＥ対立遺伝子がどのように編集されるかを決定するのは困難となる。以前に、ＨＥＫ２９３細胞の全ゲノムシークエンシングは、ＨＥＫ２９３ｓ細胞においてＧａｌＥ遺伝子の位置で２，７２およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞において３，４８の倍数性レベルを明らかにした（Ｌｉｎ，Ｙ．−Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ２９３  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．５，（２０１４））。サンガーシークエンシングによりＰＣＲ増幅断片をシークエンシングすると、異なる対立遺伝子由来のリードは互いに重なり、図５におけるガイド３について例証されるように解釈が困難となる。
【０１２６】
重なったシークエンシングデータの問題に対処するために、本発明者らは、ＴＩＤＥと呼ばれるオンラインツールを使用した。このツールは、サンガーシークエンシングによるリードをデコンボリューションし、分析して、いずれのインデルがどの程度の頻度で生じるかを推定する（Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｅ．Ｋ．，Ｃｈｅｎ，Ｔ．，Ａｍｅｎｄｏｌａ，Ｍ．＆ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｓｅｌ，Ｂ．Ｅａｓｙ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｒａｃｅ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４２，ｅ１６８−ｅ１６８（２０１４））。ＴＩＤＥは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの代案として、細胞のプールからデータを分析するように設計される。しかしながら、本発明者らは、対立遺伝子変異を見出す方向にこのツールを転換させた。ＴＩＤＥ分析は、９つのクローンがすべての対立遺伝子において機能喪失型の突然変異を有すると思われることを明らかにした。それらの９つのクローンから、本発明者らは、ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプターを有するプライマーにより編集領域をＰＣＲ増幅した。これは、本発明者らがアンプリコンをディープシークエンスし、様々な対立遺伝子において様々なインデルの包括的な分析を生成するのを可能にした。それぞれのインデルの被覆度を算出することによって編集頻度を計算した。表４からわかるように、ＴＩＤＥおよびｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングからの結果は、ほとんどのクローンについて一致する。
【０１２７】
【表４】
0006790057.tif 000005
【０１２８】
ｈＧＭ−ＣＳＦ処理に基づくさらなるクローン選択
Ｏ−グリコシル化タンパク質に対するこのＫＯの効果をチェックするために、本発明者らは、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｈＧＭ−ＣＳＦ）発現プラスミドにより様々なクローンをトランスフェクトした。ｈＧＭ−ＣＳＦは、４つ以下の様々な構造のＯ−グリカンおよび２つ以下のＮ−グリカンを有し得ることが知られる小さいサイトカインである。その不均一のＯ−グリコシル化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でスミアを引き起こす。これは、図６、ＧＤレーンおよびＨＥＫ２９３ｓレーンにおいて示される。本発明者らのクローンにおいて産生されたｈＧＭ−ＣＳＦサンプルにおいてそのような広範囲なスミアが存在しないことは、ムチン型Ｏ−グリコシル化が欠けていることを示すと思われる。実際に、ウエスタンブロットによる分析は、３つのＮ−グリコフォームに相当する３本の別々のバンドのみを区別することができ、明らかなスミアがないことを示す。低分子量から高分子量にかけて、バンドは、Ｎ−グリカンで装飾されていないｈＧＭ−ＣＳＦ、１つのＮ−グリカンで装飾されたｈＧＭ−ＣＳＦ、および２つのＮ−グリカンで装飾されたｈＧＭ−ＣＳＦに相当する。Ｎ−グリカンは、ＵＤＰ−ＧａｌおよびＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃの欠如により、さらなる成熟も妨げられるため、３つの残りのグリコフォームは、図６において示されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で別々のバンドに分離する。結果的に、本発明者らは、選択したクローンのいずれも機能的なＧａｌＥ酵素をなお発現するものはないと結論付ける。
【０１２９】
本発明者らは、最終的に、タンパク質発現におけるその速い増殖および高い収率のために１つのクローン（３：１Ｈ６）を選択した。
【０１３０】
ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ
ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞株を生成するために、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞に、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−細胞の生成と同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構築物をトランスフェクトした。単一の細胞をトランスフェクションの７２時間後にソートした。１８のクローンから始めて増殖させ、２４ウェルプレートまで増やした。本発明者らはｈＧＭ−ＣＳＦ発現プラスミドによりそれらをトランスフェクトし、上記に記載される方法と同じ方法においてウエスタンブロットでグリコプロファイルについてチェックした。図からわかるように、それらのクローンのほとんどで発現されたｈＧＭ−ＣＳＦは、分子量が激しく低下したことを示し、機能喪失型のＧａｌＥ突然変異を示した。本発明者らは、ＧａｌＥ機能性およびｅｎｄｏＴ処理におけるクローンの差異に依存して３つの異なる型のｈＧＭ−ＣＳＦ処理を区別することができた。最初の型（図７においてＮで標識）において、Ｏ−グリコシル化によるスミアはなお明らかであり、結果的に、細胞はなお少なくとも１つの機能的なＧａｌＥ遺伝子コピーを有した。第２のｈＧＭ−ＣＳＦサンプル型（図７においてＢと標識）は、ＧａｌＥノックアウトに成功したが、ｅｎｄｏＴ活性が低下したまたはそれを欠く（ただし、ｅｎｄｏＴは親細胞において活性であった）細胞に起源を有する。結果的に、これらの細胞は、著しく低い分子量のｈＧＭ−ＣＳＦを産生するが、１つおよび２つのＮ−グリコシル化部位を有するＮ−グリコフォームはなお検出可能である。最後に、図７においてＡと標識される、残存しているグリカン不均一性がほぼ観察されない第３の型のｈＧＭ−ＣＳＦ処理が本発明者らにより観察される。本発明者らは、さらに、これらの細胞をＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅと呼ぶ。
【０１３１】
ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞をさらに特徴付けるために、本発明者らは、ＧａｌＥノックアウトの成功、ｈＧＭ−ＣＳＦのＮ−グリカンの適切なｅｎｄｏＴ処理、速い細胞増殖、および高い組換えタンパク質発現レベルに基づいて、図において星印で示されるクローンを選択した。
【０１３２】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるグリカンの特徴付け
両方の新たな細胞株をさらに特徴付けるために、選択したＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅクローン細胞株において産生されたｈＧＭ−ＣＳＦを精製した。これらのｈＧＭ−ＣＳＦサンプルのトリプシンペプチドは、ＧａｌＥ  ＫＯがＯ−グリコシル化の停止をもたらすことを確認するために、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で分析した。
【０１３３】
ｈＧＭ−ＣＳＦは、４つの可能性のあるＯ−グリコシル化部位を有し、すべて同じトリプシンペプチド上に位置する（ＳＰＳＰＳＴＱＰＷＥＨＶＮＡＩＱＥＡＲ、標的Ｔｈｒ残基およびＳｅｒ残基に下線を引く）（Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ，Ｋ．，Ｌｏｐｅｚ，Ｊ．Ａ．＆Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｂ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ．）３１，１８８１−１８８６（１９９２））。図８のスペクトルで表されるように、ＨＥＫ２９３ｓおよびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞の両方は、いくつかの型のＯ−グリカンでこのペプチドを装飾する。本発明者らは、Ｏ−グリコシル化部位がない糖ペプチド、１つのＯ−グリコシル化部位で占有された糖ペプチドまたは２つのＯ−グリコシル化部位で占有された糖ペプチドのみを検出することができた。しかしながら、３つ以上のＯ−グリカンを有するペプチドは不均一性が増加しており、場合により検出限界下でシグナルをスミアし得るため、これは、依然として他にある部位の修飾を除外するものではない。加えて、これらの糖ペプチドは、可能性としてこれ以上イオン化しない。ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において産生されたｈＧＭ−ＣＳＦのスペクトルでは、これらのＯ結合型グリコフォームのいずれも検出されず、ＧａｌＥ−／−細胞においてＯ−グリカンが存在しないことを確認した。本発明者らは、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−細胞株において残存しているＧａｌＥ活性のサインを観察することができず、本発明者らは、したがって完全なＧａｌＥノックアウトの生成に成功したと結論付ける。注目すべきことに、培養培地から集められたガラクトースもＧａｌＮＡｃもグリカンにならなかった。
【０１３４】
ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において産生されたｈＧＭ−ＣＳＦ上で、ガラクトシル化は、図９において示されるようにＮ結合型グリカン上に検出されなかった。この観察は、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞株におけるＮ−グリカンの均一性が親ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ株と比較してさらに強化されることを確認する。重要なことに、未処理Ａｓｎ−ＧｌｃＮＡｃ２−Ｍａｎ５グリカンを有する糖ペプチドは検出されなかった（データ示さず）。これは、最初のクローンのいくつかにおいて観察されたように、不完全なｅｎｄｏＴ処理を示すと思われる（図７においてＢで示すレーンを参照されたい）。結論として、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞株においてｈＧＭ−ＣＳＦタンパク質を発現させる場合、残存しているＧａｌＥ活性のサインを観察することができない。加えて、本発明者らは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計で完全なｈＧＭ−ＣＳＦを分析した。ＨＥＫ２９３ｓおよびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ｈＧＭ−ＣＳＦを、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において産生されたｈＧＭ−ＣＳＦと比較した（図１０）。第１のレーンは、ＨＥＫ２９３ｓ  ｈＧＭ−ＣＳＦのスペクトルを示す。不均一のＮおよびＯ結合型グリコフォームは、広範な不均一のシグナルをスミアする。図のレーン２は、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−細胞において産生されたｈＧＭ−ＣＳＦを示す。このスペクトルにおいて、本発明者らは、完全にアグリコシル化された（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）ピークおよびより高分子量で２つのより小さいスミアを検出することができた。ＰＮＧａｓｅＦ処置に際して、これらの小さい２つのスミアの主な画分は消化された（図１１）。この消化は、不完全であるが、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−細胞における残りの不均一性はＮ−グリコシル化から生じたことが確認される。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅを通してこのＮ−グリコシル化不均一性を扱う場合、３つの可能性のあるＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  Ｎ−グリカンスタンプを検出することができたが、それらのシグナルは、Ｏ−グリカン不均一性によりスペクトルを通してなおスミアした（図１０、レーン３）。ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞におけるＧａｌＥ  ＫＯの組み合わせに際して、ＯおよびＮ結合型グリカン不均一性の両方は、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ  ｈＧＭ−ＣＳＦを示す図の最後のレーンにおいて示されるように著しく低下した。ここで、ＧｌｃＮＡｃ残基で装飾されていないｈＧＭ−ＣＳＦ、１つのＧｌｃＮＡｃ残基で装飾されたｈＧＭ−ＣＳＦまたは２つのＧｌｃＮＡｃ残基で装飾されたｈＧＭ−ＣＳＦのみを検出することができた。結果的に、スペクトルにおいて検出された残りの不均一性は、特異なＮ−グリカン部位占有から生じた。１６８４４Ｄａのｍ／ｚで、オリゴマンノースＮ−グリカンで装飾されたｈＧＭ−ＣＳＦの分子量に対応する小さいピークが検出される。ＰＮＧａｓｅＦ消化は、このピークがＮ−グリカンであることを確認する（図１２）。
【０１３５】
完全なｈＧＭ−ＣＳＦは、解像度をより高くするためにｑｔｏｆ  ＭＳでも分析した（図１４）。これにより、前の結果をより詳細に確認した。本発明者らは、ＨＥＫ２９３ｓ産生ｈＧＭ−ＣＳＦについてのスペクトルを、これがあまりにも複雑であるためにデコンボリューションすることができなかったことから、得ることができなかった。
【０１３６】
本発明者らは、再度、Ｏ−グリカンが両方のＧａｌＥ  ＫＯ細胞株において検出されなかったと結論付ける。ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞は、非常に均質のグリコプロファイルを有し、単一ＧｌｃＮＡｃでのみ装飾される、２つのｈＧＭ−ＣＳＦ  Ｎ−グリコシル化部位の部位占有が異なることから生じる３つのピーク以外に不均一性はない。
【０１３７】
議論
ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞は、Ｎ−グリコシル化における不均一性に対処する。しかしながら、タンパク質グリコシル化は、主として２つの型になる：Ｏ結合型およびＮ結合型炭水化物。完全に均質の糖タンパク質を産生することを目的とする場合、Ｏ−グリコシル化は、ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ産生タンパク質において残る不均一性の最も重要な原因である。ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃをＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃにエピマー化するＧａｌＥ遺伝子をノックアウトすることにより、本発明者らは、ＨＥＫ２９３ｓ細胞からＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを取り除き、結果的にタンパク質上でのあらゆるムチン型Ｏ−グリコシル化を妨げた。ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃ装飾残基が検出されなかったため、代替のサルベージ経路は活性でないと思われ、または必要な前駆物質を集めることができなかった。ｈＧＭ−ＣＳＦ発現中に使用される培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３発現培地）中のガラクトースおよびＧａｌＮＡｃ濃度は明らかではなく、したがって、本発明者らは、サルベージされたクレオチド糖がないことを、培地中にそれらが存在していないか、または細胞においてサルベージ経路が不活性であるかもしくは破壊されていることによるものとすることはできない。ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞とＧａｌＥ  ＫＯ戦略とを組み合わせることにより、本発明者らは、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞を生成した。これらの細胞は、不可欠で複雑なＰＴＭを有するが、これらのＰＴＭによって引き起こされる固有の不均一性がないタンパク質を発現することができる。ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞の両方において予測されるグリコフォームは、質量分析法によって確認することができた。
【０１３８】
これらの新たな２つの細胞株により、本発明者らは、現在、野生型ＨＥＫ２９３ｓ細胞、Ｎ−グリコシル化が低下しているＨＥＫ２９３ｓ細胞、Ｏ−グリコシル化がないＨＥＫ２９３ｓ細胞、またはＯ−グリコシル化がなくかつＮ−グリコシル化が低下したＨＥＫ２９３ｓ細胞においてタンパク質を産生することに選択的に決めることができる。（ｈＧＭ−ＣＳＦ）グリカン不均一性に対する影響を有する異なる可能性のある細胞株の概要を図１３に提供する。
【０１３９】
ＧａｌＥ  ＫＯの生成を通して、本発明者らは、ゲノム編集のためのクローンのハイスループットスクリーニングを可能にするプロトコールを最適化した。表現型ｈＧＭ−ＣＳＦ発現スクリーニングは、非常に価値があったが、適用範囲がグリカン技術に限られている。一般に、ゲノム技術を通して新たな細胞株を生成するための表現型スクリーニングは、すべて同じ欠点を有する：そのような細胞株が生成されるのが初めてであるため、それらはポジティブコントロールを欠く。付録「いずれにも通じていない道路」において何回も示したように、表現型スクリーニングが機能していないか、または単に適切なクローンがないに過ぎないかを判断するのが困難になり得る。そのため、容易に適用可能な処理能力の高いゲノムスクリーニングが不可欠である。
【０１４０】
表現型スクリーニングとは対照的に、ゲノムスクリーニングに使用したプロトコールは、他の標的に容易に適応可能である。当初、本発明者らのゲノムスクリーニング方法は、非常に長い労働集約型のものであった。さらに、その間にも有望な適切なクローンが増殖され、細胞を維持または冷凍するためのさらなる作業をもたらした。この研究において最適化されたプロトコールにより、本発明者らは、現在、１日以内に数百のクローンをスクリーニングすることができる。可能性を示すために、本発明者らは、Ｃａｓ９ｎガイドによる相同組換えノックインイベントを目的とするより大規模なスクリーニングを実行した。サンプルのスマートなプールと遺伝子型スクリーニングとを組み合わせることにより、本発明者らは、構築物中にノックインを有する２つの細胞株を見出すために１２５のクローンをスクリーニングした（Ｔａｂａｋ，Ｌ．Ａ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｕｃｉｎ−ｔｙｐｅ  Ｏ−ｇｌｙｃａｎｓ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｅｍｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１，６１６−６２１（２０１０））。とりわけ、この部で作ったＩｌｌｕｍｉｎａサンプル調製物と組み合わせると、何百ものクローンのスクリーニングが数日以内で可能になる。これにより、細胞が十分な培養密度まで増殖する前にスクリーニングを終了することができるため、有望なクローンを維持するためのさらなる処理も省かれる。
【０１４１】
重要なことに、２９３ｓ  ＧａｌＥ  ＫＯ細胞は、１５を上回る継代にわたって培養され、主な増殖異常は検出されなかった。さらに、発現レベルは、極端に低下するとは思われなかった。ＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  ＧａｌＥ  ＫＯは、＞５の継代にわたって培養され、さらに主な増殖異常は検出されなかった。また、ここで、発現レベルはＷＴ  ＨＥＫ細胞と比較して極端に低下しなかった。
【０１４２】
実施例４．ｈＥＰＯ−Ｈｉｓ６の発現
前に述べた発見について明らかに示すために、Ｈｉｓ６タグ付きヒトＥＰＯを接着性ＨＥＫ２９３ｓ、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌｅ−／−、およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において安定して発現させた。
【０１４３】
ＨＥＫ２３９ｓ、ＨＥＫ２３９ｓＧａｌＥ−／−、ＨＥＫ２３９ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ、およびＨＥＫ２３９ＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋１０％  ＦＣＳ中で６ウェルプレートに接種した。接種の２４時間後に培地を吸引し、３ｍｌ無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３培地と交換し、細胞を偽トランスフェクトしたまたはｈＥＰＯをコードする発現ベクターによりトランスフェクトした（ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ；メーカーの指示に従った）。上清をトランスフェクションの５日後に収集した。
【０１４４】
上清サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を介して分析した（図１５）。ｈＥＰＯ−Ｈｉｓ６をＨＥＫ２９３ｓ（レーン１）、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−（レーン２）、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ（レーン３）、およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ（レーン４）細胞において安定して発現させた。分子量の明らかなシフトを観察することができる。これは、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞におけるＮ−グリカンの低下、ならびにＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞においてＯ−グリカンがないことに対応する。
【０１４５】
精製ＥＰＯ−Ｈｉｓ６のトリプシンペプチドをＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ質量分析計で分析した。
【０１４６】
質量スペクトルデータは、ムチン型Ｏ結合型グリコシル化のための標的部位としてトリプシンペプチドＥＡＩＳＰＰＤＡＡＳＡＡＰＬＲを同定する（標的Ｓｅｒ残基に下線を引く、図１６）。ＨＥＫ２９３ｓおよびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞は、Ｏ−グリカンによりこのペプチドを装飾することができる。占有Ｏ−グリコシル化部位がないペプチド、１つの占有Ｏ−グリコシル化部位を有するペプチドまたは２つの占有Ｏ−グリコシル化部位を有するペプチドが検出された。ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−細胞およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において産生されるｈＥＰＯ−Ｈｉｓ６のスペクトルにおいて、Ｏ結合型グリコフォームのいずれも検出されず、ＧａｌＥ−／−細胞においてムチン型Ｏ−グリカンが存在しないことを確認した。
【０１４７】
実施例５．エタネルセプトの発現
概念実証として、ＦｃテイルとヒトＴＮＦ受容体２との間の融合物からなり、複数のＯ−グリコシル化およびＮ−グリコシル化部位を含有するエタネルセプト（エンブレル）をＨＥＫ２９３ｓ、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌｅ−／−、およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において発現させた。すべての細胞株をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋１０％  ＦＣＳ中で６ウェルプレートに接種した。接種の２４時間後に培地を吸引し、３ｍｌ無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３培地と交換し、細胞を偽トランスフェクトしたまたはエタネルセプト（エンブレル）をコードする発現ベクターによりトランスフェクトした（ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ；メーカーの指示に従った）。上清をトランスフェクションの５日後に収集した。上清サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を介して分析し（図１７）、エタネルセプトがＨＥＫ２９３ｓ（レーン１）、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−（レーン２）、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ（レーン３）、およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ（レーン４）細胞において安定して発現したことが示された。分子量の明らかなシフトを観察することができ、これは、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞におけるＮ−グリカンの低下、ならびにＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞においてＯ−グリカンがないことに対応する。
【０１４８】
一方でＨＥＫ２９３ＳおよびＨＥＫ２９３ＳＧａｌＥ−／−間ならびに他方でＨＥＫ２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅおよびＨＥＫ２９３ＳＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ間で分子量が低下するのは、Ｇａｌｅ  ＫＯ細胞において産生されたエタネルセプトにＯ−グリカンが実際に欠けていることを示す。ＨＥＫ２９３ＳおよびＨＥＫ２９３ＳＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞間の分子量の差異は、野生型Ｎ−グリカンおよびＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ  Ｎ−グリカン間の予想される差異と一致する。
【０１４９】
実施例６．ＲＳＶ−Ｇ（呼吸器合胞体ウイルス−Ｇプロテイン）の発現
別の例として、ＲＳＶ−Ｇを様々な細胞株において発現させた。詳細には、ＨＥＫ２３９ｓ、ＨＥＫ２３９ｓＧａｌＥ−／−、ＨＥＫ２３９ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ、およびＨＥＫ２３９ＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋１０％  ＦＣＳ中で６ウェルプレートに接種した。接種の２４時間後に培地を吸引し、３ｍｌ無血清ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３培地と交換し、細胞を偽トランスフェクトしたまたはＲＳＶ−Ｇをコードする発現ベクターによりトランスフェクトした（ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ；メーカーの指示に従った）。上清をトランスフェクションの３日後に収集した。
【０１５０】
上清サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を介して分析し（図１８）、ＨＥＫ２９３ｓ、ＨＥＫ２９３ｓＧａｌＥ−／−、ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ、およびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞においてＲＳＶ−Ｇを発現できたことが示された。ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｏｕｂｌｅＤｅｌｅｔｅ細胞において、いかなるスミアもない１つの明らかなバンドが観察された。
【０１５１】
材料および方法
ガイド構築およびクローニング
ＧａｌＥ遺伝子をＵＣＳＣ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｒｏｗｓｅｒ（ｂｕｉｌｄ  ｎｒ．ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）からダウンロードし、ｈｔｔｐ：／／ＣＲＩＳＰＲ．ＭＩＴ．ＥＤＵで入手可能なツールを使用してガイドについてスクリーニングした。本発明者らは、ウェブサイトのアルゴリズムに従って最適なオフターゲットスコアを有する３つのガイドを選択した。ガイドをコードするオリゴおよびそのリバース相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）は、本発明者らのクローニング戦略、５’リン酸化と適合性の、ＩＤＴに発注したエンドを用いて伸長させた。最終的なガイド配列の配列を表５に表す。次に、３つのガイドを、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ１０において記載されるようにＰＸ４５８ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅを通して入手可能）中にクローニングした。手短かに言えば、オリゴは、それぞれのオリゴの１００μＭ希釈液の１μｌを８μｌデュプレキシング（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）バッファー（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）に追加することによってアニールした。このミックスを９８℃まで加熱し、５℃／分で２５℃まで少しずつ冷却した。アニールしたオリゴの１／２００希釈液の２μｌを１００ｎｇのＰＣ４５８ベクター、２μｌ  Ｔａｎｇｏバッファー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、１μｌのＤＴＴ（１０ｍＭ）、１μｌのＡＴＰ（１０ｍＭ）、１μｌ  ＢｂＳＩ  ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ制限酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、１μｌ  Ｔ７リガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、およびｍｉｌｌｉＱに追加し、２０μｌの総容積にした。このミックスを３７℃で５分〜２５℃で５分を６回繰り返すことにより、制限およびライゲ−ションをインキュベートした。次に、２μｌの産物を化学的にコンピテントなＭＣ１０６１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換した。細胞は、ＰＸ４８５ベクターを含有する細胞を選択するためにカルベニシリン抗生物質を含有するＬＢ培地において一晩３７℃で増殖させた。
【０１５２】
【表５】
0006790057.tif 000006
【０１５３】
本発明者らは、Ｕ６プロモーター（ＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣ）上にフォワードプライマーおよびリバースプライマーとしてガイドの下部のオリゴを使用して、コロニーＰＣＲにおいて、得られた大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）クローンを検証した。本発明者らは、メーカーの指示に従ってＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用し、アニーリング温度は５８℃とし、伸長時間は１分間とした。ＰＣＲサンプルは、ＭＣＥ−２０２  ＭｕｌｔｉＮＡ  Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（島津製作所、京都、日本）で分析した。
【０１５４】
ゲノムＤＮＡ調製
すべてのＨＥＫ細胞株からのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の単離のために、２＊１０５細胞を、メーカーの指示に従って１００μｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）中に溶解した。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔゲノムＤＮＡ抽出は、ＤＮＡ精製ステップを含まない。そのため、抽出物は、多量の残存している細胞溶解産物を含有し、サンプル中のゲノムＤＮＡ濃度を測定するのを困難にする。そのため、本発明者らは、常に、等量のＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ抽出溶液において、ゲノムＤＮＡを調製するための等量の細胞から始め、この部において記載されるｇＤＮＡに対するすべてのＰＣＲについて、本発明者らは、１０μｌの全ＰＣＲ容量当たり１μｌのこの溶解物を使用した。
【０１５５】
Ｃａｓ９によるインビトロにおける消化
標的（ＧａｌＥ遺伝子）の関心領域は、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）、表６に表すＧａｌＥフォワードおよびリバースプライマー、ならびにＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔにより単離したｇＤＮＡ鋳型を使用して、５５℃のアニーリング温度および２分間の伸長時間で増幅させた。アンプリコンは、メーカーの指示に従って磁気ビーズ（ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ、ＣｌｅａｎＮＡ、Ａｌｐｈｅｎ  ａａｎ  ｄｅｎ  Ｒｉｊｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して精製した。
【０１５６】
インビトロにおいてガイドＲＮＡを産生するために、本発明者らは、Ｔ７プロモーターを導入する必要があった。本発明者らは、したがって、ガイドの５’にＴ７プロモーターをコードするプライマーを使用した。フォワードプライマーの前方に置いたＴ７プロモーターを表６において太字で示す。リバースプライマーは、ガイドの構造の一部分に結合し（ガイドｒｅｖ）、このプライマー設計戦略は、以前に記載されている（Ｙａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＧａｌＮＡｃ−ｔｙｐｅ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｏｆ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＳｉｍｐｌｅＣｅｌｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｍｃｐ．Ｍ１１４．０４１５４１（２０１４））。これらのプライマーによる増幅のために、ＧｏＴａｑ  Ｇｒｅｅｎポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）をメーカーの指示に従って使用し、アニーリング温度は５８℃および伸長時間は３０秒間とした。マルチクローニング部位中にクローニングしたそれぞれのガイドを有する適切なＰＸ４５８プラスミドの１０ｎｇを鋳型として使用した。これらのＰＣＲ反応混合物からＲＮＡを転写するために、Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）をメーカーの指示に従って使用した。最初に、ＰＣＲアンプリコンを磁気ビーズ（ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  Ｕｐ、ＣｌｅａｎＮＡ、Ａｌｐｈｅｎ  ａａｎ  ｄｅｎ  Ｒｉｊｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により精製し、２ｐｍｏｌ  ＤＮＡを転写反応に供給した。
【０１５７】
【表６】
0006790057.tif 000007
【０１５８】
インビトロ転写ＲＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出を使用して精製した。最初に、等容積の酸性フェノール／クロロホルム（Ａｍｂｉｏｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を上部の水相から有機相を分離するために追加した。上部の相を新たなチューブに移し、１容量のイソプロパノールを追加することによってＲＮＡを沈殿させた。混合物を−２０℃で１５分間インキュベートし、１５，０００ｒｐｍで冷却したテーブルトップ遠心分離機においてＲＮＡをペレットにした。上清を除去し、ペレットをヌクレアーゼなしの水に再懸濁した。ＲＮＡ溶液をｎａｎｏｄｒｏｐによって定量化した。
【０１５９】
最終的に、２μｇのガイドＲＮＡを、２０μｌのヌクレアーゼなしの水および３μｌの１０×Ｃａｓ９ヌクレアーゼ反応バッファー中１μＭのＣａｓ９（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）に追加した。本発明者らは、３７℃で１０分間、Ｃａｓ９をガイドＲＮＡに結合させた。最終的に、５００ｎｇの鋳型ＤＮＡを追加し、１時間、３７℃でＲＮＡおよびＣａｓ９と共にインキュベートした。Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡの複合体による鋳型ＤＮＡの消化は、１，２％  ＴＡＥアガロースゲル上で反応混合物を分離することによって分析した。
【０１６０】
細胞株の培養、トランスフェクト、およびソート
ＨＥＫ２９３ｓおよびＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）において、３７℃および５％  ＣＯ２で加湿インキュベーター中において維持した。
【０１６１】
小規模産生またはゲノム編集実験のためにＨＥＫ２９３ｓまたはＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞をトランスフェクトするために、それらを、６ウェルにおいて１ウェル当たりおよそ２０００００細胞でまたはＴ２５において５０００００細胞でトランスフェクションの４８時間前に接種した。Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）は、メーカーの指示に従って、１ウェル当たり３，３μｇプラスミドＤＮＡをトランスフェクトするために使用した。
【０１６２】
蛍光タンパク質の発現を検出するために、細胞は、培地を上下にピペッティングすることにより、トランスフェクションの４８時間後に分離した。細胞を含有する培地は、４００ＲＰＭで４分間、ペレットにして沈殿させ、１＊１０＾６細胞／ｍｌでＰＢＳ中に再懸濁した。多細胞クラスターは、１００μｍ細胞ろ過器（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ、ＵＳＡ）上に懸濁液を加えることによってろ過した。次に、細胞は、ＧＦＰポジティブ単一細胞を選択することによってＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡ  ＩＩＩでソートした。ポジティブ細胞は、直接単一細胞でソートして９６ウェルプレート中に入れ、１ウェル当たり１細胞を接種するかまたはチューブ中にプールした。ウェルにおいて、新鮮なＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％  ＦＣＳおよび条件培地の１：１（ｖ／ｖ）ミックスを追加した。条件培地は、１０ｍｌ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％  ＦＣＳ中に１＊１０６  ＨＥＫ２９３ｓＧｌｙｃｏＤｅｌｅｔｅ細胞を接種することによって調製し、次いで３日間にわたって細胞を増殖させ、最終的に０，２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）でろ過することによって培地を回収した。
【０１６３】
ｈＧＭ−ＣＳＦ産生精製
ｈＧＭ−ＣＳＦは、以前に記載されるように１、質量スペクトル分析のために産生、精製および調製した。手短かに言えば、細胞をｈＧＭ−ＣＳＦ発現プラスミドによりトランスフェクトした。トランスフェクション後の１日目に培地をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）に交換し、上清をトランスフェクションの５日後に回収した。培地は、Ａｅｋｔａ  Ｐｕｒｅ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）のＮｉ２＋イオン（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を添加したＨｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰカラムに直接添加し、その後、ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）でポリッシングステップを続け、バッファーをＰＢＳに変えた。精製後のタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）によって決定した。
【０１６４】
ｈＧＭ−ＣＳＦペプチドｍａｌｄｉ−ｔｏｆ  ｍｓ分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析のために、２，５ｕｇのｈＧＭ−ＣＳＦサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、２０〜７０ｋＤａの領域をゲルから切り取り、ゲル内トリプシン消化を実行した。ペプチド抽出およびクリーンアップは、Ｃ１８  ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して実行し、５ｕｌの総容積でサンプルを溶出した。次に、２ｕｌのそれぞれのペプチドミックスをＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）マトリックスにおいてＭＡＬＤＩ標的プレート上にスポットした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析は、最適な分解のためにリフレクトロンを作動させ、陽イオンモードで実行した。
【０１６５】
ｈＧＭ−ＣＳＦ完全タンパク質ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ  ｍｓ
ＰＢＳ中の５μｇのｈＧＭ−ＣＳＦを別々のチューブに等分した。酵素なしでまたは５００ユニットＰＮＧａｓｅＦ（手製）を追加して、サンプルを３７℃で２４時間インキュベートした。消化後、０，１％  ＴＦＡを追加し、サンプルを、メーカーの指示に従ってＣ４  ＺｉｐＴｉｐｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して脱塩した。最終的な溶出は、３μｌの５０％アセトニトリル、４９，５％  ｍｉｌｌｉＱ、および０，５％  ＴＦＡ中で行い、これをＭＡＬＤＩプレート上に直接スポットした。１μｌの１０ｍｇ／ｍｌアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸マトリックスをそれぞれのスポットに追加した。サンプルは、リニアモードでＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４８００プロテオミクス分析機器で分析した。
【０１６６】
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ
６ウェルプレートにおいて、１＊１０６細胞は、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）トランスフェクション試薬を使用することにより、ガイドを含有する８，８μｇのＰＸ４５８ベクターによりトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、本発明者らは、トランスフェクト細胞からＧＦＰ発現クローンをＦＡＣｓソートした。本発明者らは、ソートした細胞をプールし、それらをおよそ１＊１０＾６細胞まで増やした。細胞は、培地を上下にピペッティングすることによって回収した。ゲノムＤＮＡは、メーカーの指示に従ってＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）により調製した。
【０１６７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡによって標的にされる領域は、鋳型として３０μｌの総ＰＣＲ容積に対して３μｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用してＰＣＲ増幅した。本発明者らは、Ｋａｐａ  ＨｉＦｉポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｐｅ  Ｔｏｗｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａ）および表７に表すプライマーを使用した。ＰＣＲは、メーカーの指示に従って実行し、アニーリング温度は７１℃および伸長時間は３０秒間とした。
【０１６８】
【表７】
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【０１６９】
アンプリコンは、磁気ビーズ（ＣｌｅａｎＮＡ、Ａｌｐｈｅｎ  ａａｎ  ｄｅｎ  Ｒｉｊｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して精製した。次に、４００ｎｇの精製ＤＮＡを、ｍｉｌｌｉＱを有する９μｌの総容積中に希釈し、これに１μｌの１０×Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を追加した。断片を、表８に表す温度勾配に従って変性させ、復元させた。
【０１７０】
【表８】
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【０１７１】
１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼのおよび１μｌのＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサー（ＩＤＴ、Ｌｅｕｖｅｎ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）をミックスに追加し、４２℃で１時間インキュベートした。最終的に、１μｌ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ停止溶液を追加し、サンプルを１，２％  ＴＡＥアガロースゲル上での分離によって分析した。
【０１７２】
サンガーシークエンシング
単一細胞由来のクローンを２４ウェルプレートにおいて増やし、これからゲノムＤＮＡを、前に詳述されるようにＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔを使用して調製した。関心領域をＫａｐａ  ＨｉＦｉポリメラーゼおよび表９に表すプライマーによってＰＣＲ増幅した。
【０１７３】
ＰＣＲは、メーカーの指示に従って実行し、アニーリング温度は７２℃および伸長時間は１分３０秒間とした。
【０１７４】
【表９】
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【０１７５】
アンプリコンは、磁気ビーズ（ＣｌｅａｎＮＡ、Ａｌｐｈｅｎ  ａａｎ  ｄｅｎ  Ｒｉｊｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して精製し、表７のフォワードプライマーを使用してシークエンシングした。
【０１７６】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング調製
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングは、特異的なアダプターを使用する。しかしながら、これらのアダプターは非常に長く、したがって、本発明者らは、最初により小さい中間アダプターを用いて関心領域を増幅し、次いで、本発明者らは、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプターを用いて第２の反応においてこれを伸長させた。したがって、最初に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドによって標的にされる領域をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔにより単離したｇＤＮＡから増幅し、同時に、最初のＰＣＲ反応において中間アダプター（表１０の最初の４つのプライマーの太字）を用いて伸長させた。この反応において、Ｋａｐａ  ＨｉＦｉポリメラーゼをメーカーの指示に従って使用し、アニーリング温度はそれぞれガイド３およびガイド１のプライマーについて７０℃および７２℃とし、伸長時間は３０秒間とした。アンプリコンは、磁気ビーズ（ＣｌｅａｎＮＡ、Ａｌｐｈｅｎ  ａａｎ  ｄｅｎ  Ｒｉｊｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して精製した。１００ｎｇの精製増幅産物（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｅ）を、一方にＰ５アダプターおよびＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングフォワードアダプターを、他方にＰ７アダプター、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングリバースアダプター、およびＴｒｕｓｅｑバーコード付着させるために再度増幅させた（表１０）。異なるＴｒｕｓｅｑバーコード（表１０、「Ｐ７  Ｔｒｕｓｅｑ１３〜２８」と命名したプライマー）をすべてのクローンに提供することにより、本発明者らは、シークエンシングの実行後、いずれの配列がいずれのクローンに属したかを追跡することができた。再度、Ｋａｐａ  ＨｉＦｉポリメラーゼをメーカーの指示に従って使用し、アニーリング温度は７０℃および伸長時間は３０秒間とした。しかしながら、増幅バイアスを回避するために１５サイクルのみを実行した。サンプルは、磁気ビーズ（ＣｌｅａｎＮＡ、Ａｌｐｈｅｎ  ａａｎ  ｄｅｎ  Ｒｉｊｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して精製し、濃度はｎａｎｏｄｒｏｐで測定した。本発明者らは、等モル量でサンプルをプールし、１０ｎＭまで混合物を希釈した。このサンプルは、１％の総ＤＮＡ濃度で他のサンプルと共にプールした。このミックスは、次いで、シングルエンドシークエンシングを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑで分析した。
【０１７７】
【表１０】
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【０１７８】
【表１１】
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【０１７９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット
タンパク質サンプルは、前に記載されるように、１２％  Ｔｒｉｃｉｎ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、調製した（ＤｅＡｎｇｅｌｉｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｇ．＆Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｔ．Ｌ．Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，４７４２−４７４３（１９９５））。サンプルは、メーカーの指示に従ってＴＥ７０Ｘ半乾燥転写ユニット（Ｈｏｅｆｅｒ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、  Ｍｕｎｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に転写した。次に、ブロットは、１時間、０，０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ２０および３％（ｗｔ／ｖｏｌ）粉乳を含有するＰＢＳによりブロックした。ｈＧＭ−ＣＳＦを視覚化するために、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００共役６×Ｈｉｓタグ抗体（カタログ番号２００−３４５−３８２、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、ＰＡ、ＵＳＡ）を１／１５０００希釈液中で追加し、１時間インキュベートした。ＰＢＳ＋０，０５％  ｔｗｅｅｎ２０による３回の洗浄ステップ後、ブロットは、ｏｄｙｓｓｅｙスキャナを使用して視覚化した（ＬＩ−ＣＯＲ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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