(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）をコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）をコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクター、およびフォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターで多能性幹細胞をトランスフェクションし、かつ、得られた該トランスフェクションされた細胞をウイリアムズＥ培地またはリプロＦＦ培地中で培養することを含む、肝細胞系譜細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ）の製造方法。
【請求項２】
該トランスフェクションされた細胞が、肝細胞分化、肝細胞増殖、または両方のために処方された培地中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該トランスフェクションされた細胞が、約４日間から約１２日間培養される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
該トランスフェクションされた細胞が、少なくとも７日間培養される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
該多能性幹細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該多能性幹細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
該多能性幹細胞がヒト細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該トランスフェクションがインビトロで行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
該培養することがインビトロで行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
該細胞が、該複数の発現ベクターで同時にトランスフェクションされる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該細胞が、該複数の発現ベクターで順次トランスフェクションされる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程；
（ａ）４つの発現ベクターを人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞にインビトロで導入する工程、ここで該複数の発現ベクターはＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、およびフォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）をコードする遺伝子を含む発現ベクターであり、並びに
（ｂ）工程（ａ）で取得された該細胞をウイリアムズＥ培地中で少なくとも７日間培養する工程、
を含む、肝細胞系譜細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ）の製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法によって取得された肝細胞系譜細胞であって、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１４】
前記肝細胞系譜細胞がα−フェトプロテイン、アルブミン、またはその両方を発現する細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
ＣＥＢＰＡをコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクター、ＣＥＢＰＢをコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクター、ＦＯＸＡ１をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクター、およびＦＯＸＡ３をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターを含む試薬を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法に使用される肝細胞系譜細胞の製造用試薬。
【請求項１６】
ＣＥＢＰＡをコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクターを含む試薬、ＣＥＢＰＢをコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクターを含む試薬、ＦＯＸＡ１をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクターを含む試薬、およびＦＯＸＡ３をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターを含む試薬が、それぞれ別個の容器に格納された態様で含まれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法に使用される肝細胞系譜細胞の製造用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞系譜細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ）、中間細胞（Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｃｅｌｌｓ）、および肝細胞を取得する方法、結果として生じる細胞、並びにこれらを製造するための物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、４つのリプログラミング因子を使用して作成される（非特許文献１）。ｉＰＳ細胞は様々な種類の細胞に分化する能力を有し、再生医療に利用することが期待されている（非特許文献２）。一方、肝機能不全は命に関わる病気である。肝細胞をｉＰＳ細胞から製造することができれば、それらは肝機能不全患者における移植に使用できるかもしれない（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００３】
ｉＰＳ細胞を肝細胞に分化させる方法について、いくつかの報告がある（非特許文献５−１０）。これらの多くは、増殖因子を順次導入して、胎児肝で肝細胞分化を刺激している（非特許文献５および７−９）。別の方法は、ｉＰＳ細胞、ヒト臍帯血管内皮細胞、およびヒト間葉細胞の組み合わせを使用して、三次元肝臓を構築するものである（非特許文献１１）。
【０００４】
一方、肝臓発生に転写因子が関与する（非特許文献１１）が、転写因子を使用してｉＰＳ細胞を肝細胞に分化させる方法についての報告はごくわずかである（非特許文献６、９、および１２）。
【０００５】
フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）は、転写を開始するために圧縮されたクロマチンを広げることができ、「パイオニアリングファクター」と称される（非特許文献１３）。ＦＯＸＡ１は、肝臓発生に関与する（非特許文献１４）。フォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）は、肝細胞特異的遺伝子、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）およびアルブミン、のプロモータに結合し、それらの発現を上方制御する（非特許文献１５）。肝細胞核因子１ＡとＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ３、または肝細胞核因子４Ａとの組み合わせは、ヒト線維芽細胞の肝細胞様細胞への分化転換を促進する（非特許文献１６）。ＦＯＸＡ３、肝細胞核因子１Ａおよび肝細胞核因子４Ａからなる別の組み合わせを用いることにより、ヒト線維芽細胞は機能的肝細胞に分化転換した（非特許文献１７）。
【０００６】
ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）は、アントンソンらによりクローン化された（非特許文献１８）。ＣＥＢＰＡ欠損肝細胞は、肝細胞と胆管上皮細胞の両方の特徴を有する（非特許文献１９）。興味深いことに、胆管上皮細胞の特徴は、ＣＥＢＰＡの発現が低い肝芽細胞で増強されている（非特許文献２０）。これら報告から、ＣＥＢＰＡが成熟肝細胞への肝芽細胞の分化を促進することが示唆される。ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）は、アキラらによりクローン化された（非特許文献２１）。ＣＥＢＰＢは肝細胞の分化に関与する（非特許文献２２）。
【０００７】
最近、ｉＰＳ細胞において肝細胞への分化を開始するために必要な培地や培地に加える補助成分についての報告がある（非特許文献２３）。
【０００８】
ｉＰＳ細胞から分化した肝細胞を含む細胞群から、肝細胞からなる細胞培養物を得る方法および培地（特許文献１）や、多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導する培養培地および方法（特許文献２）について報告されている。
【０００９】
肝細胞の培養に適している培地として、ウイリアムズＥ培地（ＷＥ）が知られている。ＷＥは当初、ラット肝細胞初代培養を目的として線維芽細胞混合物から肝細胞を単離するために確立された（非特許文献２４）。ＷＥ中で培養されたラット初代肝細胞において薬物代謝は維持されている（非特許文献２５および２６）。肝細胞特異的機能である糖新生および尿素サイクルもＷＥ中で維持される（非特許文献２７および２８）。これらの知見は、肝細胞特異的機能を喪失せずに肝細胞を培養するためにＷＥが好適であることを示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開2014-128210号公報
【特許文献２】特開2016-26490号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. 2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131:861-72.
【非特許文献２】Hirschi KK, Li S, Roy K. 2014. Induced pluripotent stem cells for regenerative medicine. Annu Rev Biomed Eng 16:277-94.
【非特許文献３】Chang HM, Liao YW, Chiang CH, Chen YJ, Lai YH, Chang YL, Chen HL, Jeng SY, Hsieh JH, Peng CH, Li HY, Chien Y, Chen SY, Chen LK, Huo TI. 2012. Improvement of Carbon Tetrachloride-Induced Acute Hepatic Failure by Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cells without Reprogramming Factor c-Myc. Int J Mol Sci 13:3598-617.
【非特許文献４】van Wenum M, Chamuleau RA, van Gulik TM, Siliakus A, Seppen J, Hoekstra R. 2014. Bioartificial livers in vitro and in vivo: tailoring biocomponents to the expanding variety of applications. Expert Opin Biol Ther 14:1745-60.
【非特許文献５】DeLaForest A, Nagaoka M, Si-Tayeb K, Noto FK, Konopka G, Battle MA, Duncan SA. 2011. HNF4A is essential for specification of hepatic progenitors from human pluripotent stem cells. Development 138:4143-53.
【非特許文献６】Inamura M, Kawabata K, Takayama K, Tashiro K, Sakurai F, Katayama K, Toyoda M, Akutsu H, Miyagawa Y, Okita H, Kiyokawa N, Umezawa A, Hayakawa T, Furue MK, Mizuguchi H. 2011. Efficient Generation of Hepatoblasts From Human ES Cells and iPS Cells by Transient Overexpression of Homeobox Gene HEX. Mol Ther 19(2):400-7
【非特許文献７】Si-Tayeb K, Noto FK, Nagaoka M, Li J, Battle MA, Duris C, North PE, Dalton S, Duncan SA. 2010. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology 51:297-305.
【非特許文献８】Song Z, Cai J, Liu Y, Zhao D, Yong J, Duo S, Song X, Guo Y, Zhao Y, Qin H, Yin X, Wu C, Che J, Lu S, Ding M, Deng H. 2009. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Res 19:1233-42.
【非特許文献９】Takayama K, Inamura M, Kawabata K, Katayama K, Higuchi M, Tashiro K, Nonaka A, Sakurai F, Hayakawa T, Kusuda Furue M, Mizuguchi H. 2012. Efficient Generation of Functional Hepatocytes From Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells by HNF4alpha Transduction. Mol Ther 20:127-37
【非特許文献１０】Zaret KS, Watts J, Xu J, Wandzioch E, Smale ST, Sekiya T. 2008. Pioneer factors, genetic competence, and inductive signaling: programming liver and pancreas progenitors from the endoderm. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 73:119-26.
【非特許文献１１】Takebe T, Sekine K, Enomura M, Koike H, Kimura M, Ogaeri T, Zhang RR, Ueno Y, Zheng YW, Koike N, Aoyama S, Adachi Y, Taniguchi H. 2013. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499:481-4.
【非特許文献１２】Tomizawa M, Shinozaki F, Sugiyama T, Yamamoto S, Sueishi M, Yoshida T. 2013. Single-step protocol for the differentiation of human-induced pluripotent stem cells into hepatic progenitor-like cells. Biomed Rep 1:18-22.
【非特許文献１３】Xu CR, Zaret KS. 2012. Chromatin "pre-pattern" and epigenetic modulation in the cell fate choice of liver over pancreas in the endoderm. Nucleus 3:150-4.
【非特許文献１４】Zaret KS, Carroll JS. 2011. Pioneer transcription factors: establishing competence for gene expression. Genes Dev 25:2227-41.
【非特許文献１５】Costa RH, Kalinichenko VV, Holterman AX, Wang X. 2003. Transcription factors in liver development, differentiation, and regeneration. Hepatology 38:1331-47.
【非特許文献１６】Simeonov KP, Uppal H. 2014. Direct reprogramming of human fibroblasts to hepatocyte-like cells by synthetic modified mRNAs. PLoS One 9:e100134.
【非特許文献１７】Hang H, Yu Y, Wu N, Huang Q, Xia Q, Bian J. 2014. Induction of highly functional hepatocytes from human umbilical cord mesenchymal stem cells by HNF4alpha transduction. PLoS One 9:e104133.
【非特許文献１８】Antonson P, Xanthopoulos KG. 1995. Molecular cloning, sequence, and expression patterns of the human gene encoding CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP alpha). Biochem Biophys Res Commun 215:106-13.
【非特許文献１９】Tomizawa M, Garfield S, Factor V, Xanthopoulos KG. 1998. Hepatocytes deficient in CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBP alpha) exhibit both hepatocyte and biliary epithelial cell character. Biochem Biophys Res Commun 249:1-5.
【非特許文献２０】Yamasaki H, Sada A, Iwata T, Niwa T, Tomizawa M, Xanthopoulos KG, Koike T, Shiojiri N. 2006. Suppression of C/EBPalpha expression in periportal hepatoblasts may stimulate biliary cell differentiation through increased Hnf6 and Hnf1b expression. Development 133:4233-43.
【非特許文献２１】Akira S, Isshiki H, Sugita T, Tanabe O, Kinoshita S, Nishio Y, Nakajima T, Hirano T, Kishimoto T. 1990. A nuclear factor for IL-6 expression (NF-IL6) is a member of a C/EBP family. Embo J 9:1897-906
【非特許文献２２】Kheolamai P, Dickson AJ. 2009. Liver-enriched transcription factors are critical for the expression of hepatocyte marker genes in mES-derived hepatocyte-lineage cells. BMC Mol Biol 10:35.
【非特許文献２３】Tomizawa M, Shinozaki F, Motoyoshi Y, Sugiyama T, Yamamoto S, Ishige N. 2015. An Optimal Medium Supplementation Regimen for Initiation of Hepatocyte Differentiation in Human Induced Pluripotent Stem Cells. J Cell Biochem 116:1479-89.
【非特許文献２４】Pretlow TG, 2nd, Williams EE. 1973. Separation of hepatocytes from suspensions of mouse liver cells using programmed gradient sedimentation in gradients of ficoll in tissue culture medium. Anal Biochem 55:114-22.
【非特許文献２５】Takeba Y, Matsumoto N, Takenoshita-Nakaya S, Harimoto Y, Kumai T, Kinoshita Y, Nakano H, Ohtsubo T, Kobayashi S. 2011. Comparative study of culture conditions for maintaining CYP3A4 and ATP-binding cassette transporters activity in primary cultured human hepatocytes. J Pharmacol Sci 115:516-24.
【非特許文献２６】Wu D, Ramin SA, Cederbaum AI. 1997. Effect of pyridine on the expression of cytochrome P450 isozymes in primary rat hepatocyte culture. Mol Cell Biochem 173:103-11
【非特許文献２７】Dabos KJ, Nelson LJ, Hewage CH, Parkinson JA, Howie AF, Sadler IH, Hayes PC, Plevris JN. 2004. Comparison of bioenergetic activity of primary porcine hepatocytes cultured in four different media. Cell Transplant 13:213-29.
【非特許文献２８】Farghali H, Lincova D, Gaier N, Kmoniekova E, Kamenikova L, Canova N, Vitek L. 2002. Urea synthesis and cyclosporin a biotransformation in a laboratory scale hepatocyte bioreactor model. Pharmacol Res 46:511-7.
【非特許文献２９】Tomizawa M, Shinozaki F, Motoyoshi Y, Sugiyama T, Yamamoto S, Sueishi M. 2014. Dual gene expression in embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells using episomal vectors. Tissue Eng Part A 20:3154-62.
【非特許文献３０】Yates JL, Warren N, Sugden B. 1985. Stable replication of plasmids derived from Epstein-Barr virus in various mammalian cells. Nature 313:812-5
【非特許文献３１】Shibata MA, Miwa Y, Morimoto J, Otsuki Y. 2007. Easy stable transfection of a human cancer cell line by electrogene transfer with an Epstein-Barr virus-based plasmid vector. Med Mol Morphol 40:103-7.
【非特許文献３２】Tanaka J, Miwa Y, Miyoshi K, Ueno A, Inoue H. 1999. Construction of Epstein-Barr virus-based expression vector containing mini-oriP. Biochem Biophys Res Commun 264:938-43.
【非特許文献３３】Mitaka T, Sattler CA, Sattler GL, Sargent LM, Pitot HC. 1991. Multiple cell cycles occur in rat hepatocytes cultured in the presence of nicotinamide and epidermal growth factor. Hepatology 13:21-30.
【非特許文献３４】Nakamura T, Teramoto H, Tomita Y, Ichihara A. 1984. L-proline is an essential amino acid for hepatocyte growth in culture. Biochem Biophys Res Commun 122:884-91.
【非特許文献３５】Duan Y, Ma X, Zou W, Wang C, Bahbahan IS, Ahuja TP, Tolstikov V, Zern MA. 2010. Differentiation and characterization of metabolically functioning hepatocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells 28:674-8Fal
【非特許文献３６】Miyanari Y, Torres-Padilla ME. 2012. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature 483:470-3.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞から肝細胞系譜細胞を分化誘導して提供することができれば再生医療などの医薬分野で有用性が高く、そのような効率的な方法の開発が期待されている。肝臓発生に転写因子が関与することが知られているが、転写因子の組み合わせが多能性幹細胞の肝細胞への分化を開始するか知られていない。
【００１３】
本発明は、肝細胞系譜の細胞を製造する新規方法および該方法に使用される物質を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は上記課題を解決すべく、ｉＰＳ細胞の肝細胞への分化を開始することができる転写因子を鋭意検討した。その結果、４種類の転写因子、具体的にはＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３でｉＰＳ細胞をトランスフェクションすることにより、ｉＰＳ細胞から肝細胞系譜の細胞が分化誘導されることを見出した。また、これら転写因子でトランスフェクションしたｉＰＳ細胞を、ＷＥで培養することにより、短期間で肝細胞系譜の細胞への分化誘導がなされることを見出した。本発明はかかる知見を基に完成されたものである。
【００１５】
すなわち、本発明は、次に示す態様（ａｓｐｅｃｔｓ）／実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）／特徴（ｆｅａｔｕｒｅ）を、任意の順および／または任意の組み合わせにおいて包含し、それらを提供する。
【００１６】
１．ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）をコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）をコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクター、およびフォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターで細胞をトランスフェクションし、かつ、得られた該トランスフェクション細胞を増殖環境内で培養することを含む、肝細胞系譜細胞の製造方法。
２．該トランスフェクションされた細胞を肝細胞系譜細胞に分化させることをさらに含む、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３．該培養することが、該トランスフェクションされた細胞の肝細胞系譜細胞への分化を来たす、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
４．該４つの遺伝子が、該細胞を肝細胞系譜細胞へ分化させることに相乗的に作用する、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
５．該トランスフェクションされた細胞から肝細胞系譜細胞を取得することを更に含む、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
６．該肝細胞系譜細胞が不死の肝細胞系譜細胞である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
７．該肝細胞系譜細胞が、肝細胞に特徴的な細胞表面マーカーの少なくとも１つを発現している、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
８．該肝細胞系譜細胞が、α−フェトプロテイン、アルブミン、または両方を発現している、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
９．該トランスフェクションされた細胞が、肝細胞分化、肝細胞増殖、または両方のために処方された培地中で培養される、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
１０．該トランスフェクションされた細胞が、ウイリアムズＥ培地、リプロＦＦ（多能性を維持するフィーダー不含培地）培地中で培養される、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
１１．ウイリアムズＥ培地が、炭酸水素ナトリウム、Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、および４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液の１または２以上を含有する、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
１２．ウイリアムズＥ培地が、炭酸水素ナトリウム、Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、および４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液の１または２以上を含まない該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
１３．ウイリアムズＥ培地が、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を追加される、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
１４．該トランスフェクションされた細胞が、増殖環境内でウイリアムズＥ培地中で培養される、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
１５．該トランスフェクションされた細胞が、増殖環境内で培養した後にウイリアムズＥ培地中で培養される、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
１６．該トランスフェクションされた細胞が、約４日間から約１２日間培養される、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
１７．該トランスフェクションされた細胞が、少なくとも７日間培養される、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
１８．該細胞が哺乳動物細胞である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
１９．該細胞がヒト細胞である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
２０．該細胞が幹細胞である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
２１．該細胞が多能性幹細胞である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
２２．該細胞が人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
２３．該細胞が、２０１Ｂ７  ｉＰＳ細胞である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
２４．該細胞が胚性幹細胞である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
２５．該細胞が体細胞である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
２６．該細胞が線維芽細胞である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
２７．該トランスフェクションがインビトロで行われる、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
２８．該培養することがインビトロで行われる、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
２９．該増殖環境がインビトロの増殖環境である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３０．該増殖環境が、液体培地、固体支持体、または両方を含む、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３１．該細胞が、該複数の発現ベクターで同時にトランスフェクションされる、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３２．該細胞が、該複数の発現ベクターで順次トランスフェクションされる、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３３．該細胞が、該複数の発現ベクターの少なくとも２つで同時にトランスフェクションされる、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３４．複数の発現ベクターの２つまたはそれ以上の導入の間に少なくとも３０分間の間隔がある、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３５．該複数の遺伝子の少なくとも１つが構成的に活性化されている、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３６．該複数の遺伝子の少なくとも１つが誘発可能である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３７．少なくとも１つの誘導可能な遺伝子が、好適な培地中での増殖により誘導可能である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３８．培地がウイリアムズＥ培地である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
３９．トランスフェクションが、少なくとも１つの転写因子または遺伝子について一過性である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
４０．トランスフェクションが、少なくとも１つの転写因子または遺伝子について安定的である、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
４１．該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法によって取得された肝細胞系譜細胞。
４２．複数の工程；
（ａ）４つの発現ベクターを人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に導入する工程、ここで該複数の発現ベクターはＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、およびフォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）をコードする遺伝子を含む発現ベクターであり、並びに
（ｂ）工程（ａ）で取得された該細胞を増殖環境内で培養する工程、
を含む、肝細胞系譜細胞の製造方法。
４３．工程（ａ）で取得された該細胞が、ウイリアムズＥ培地中で培養される、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
４４．工程（ａ）および（ｂ）で取得された該細胞が、ウイリアムズＥ培地中で培養される、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
４５．工程（ａ）で取得された該細胞が、少なくとも７日間培養される、該任意の先行するまたは後述する実施形態／特徴／態様の方法。
【００１７】
本発明は、例えば、次に示す態様を包含し、それらを提供する。
【００１８】
４６．ＣＥＢＰＡをコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクター、ＣＥＢＰＢをコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクター、ＦＯＸＡ１をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクター、およびＦＯＸＡ３をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターで多能性幹細胞をトランスフェクションし、かつ、得られた該トランスフェクションされた細胞を増殖環境内で培養することを含む、肝細胞系譜細胞の製造方法。
４７．該トランスフェクションされた細胞が、肝細胞分化、肝細胞増殖、または両方のために処方された培地中で培養される、上記４６．載の方法。
４８．該トランスフェクションされた細胞が、ウイリアムズＥ培地またはリプロＦＦ培地中で培養される、上記４６．の方法。
４９．該トランスフェクションされた細胞が、増殖環境内でウイリアムズＥ培地中で培養される、上記４６．の方法。
５０．該トランスフェクションされた細胞が、増殖環境内で培養した後にリプロＦＦ培地中で培養される、上記４６．の方法。
５１．該トランスフェクションされた細胞が、約４日間から約１２日間培養される、上記４６．〜５０．のいずれかの方法。
５２．該トランスフェクションされた細胞が、少なくとも７日間培養される、上記４６．〜５０．のいずれかの方法。
５３．該多能性幹細胞がｉＰＳ細胞である、上記４６．〜５２．のいずれかの方法。
５４．該多能性幹細胞が哺乳動物細胞である、上記４６．〜５３．のいずれかの方法。
５５．該多能性幹細胞がヒト細胞である、上記４６．〜５３．のいずれかの方法。
５６．該トランスフェクションがインビトロで行われる、上記４６．〜５５．のいずれかの方法。
５７．該培養することがインビトロで行われる、上記４６．〜５６．のいずれかの方法。
５８．該増殖環境がインビトロの増殖環境である、上記４６．〜５７．のいずれかの方法。
５９．該増殖環境が、液体培地、固体支持体、または両方を含む、上記４６．〜５８．のいずれかの方法。
６０．該細胞が、該複数の発現ベクターで同時にトランスフェクションされる、上記４６．〜５９．のいずれかの方法。
６１．該細胞が、該複数の発現ベクターで順次トランスフェクションされる、上記４６．〜５９．のいずれかの方法。
６２．以下の工程；
（ａ）４つの発現ベクターを人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞にインビトロで導入する工程、ここで該複数の発現ベクターはＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、およびフォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）をコードする遺伝子を含む発現ベクターであり、並びに
（ｂ）工程（ａ）で取得された該細胞をウイリアムズＥ培地中で少なくとも７日間培養する工程、
を含む、肝細胞系譜細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ）の製造方法。
６３．上記４６．〜５９．のいずれかの方法によって取得された肝細胞系譜細胞。
６４．前記肝細胞系譜細胞がα−フェトプロテイン、アルブミン、またはその両方を発現する細胞である、上記６３．の細胞。
６５．ＣＥＢＰＡをコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクター、ＣＥＢＰＢをコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクター、ＦＯＸＡ１をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクター、およびＦＯＸＡ３をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターを含む試薬を含む、細胞系譜細胞の製造用試薬。
６６．ＣＥＢＰＡをコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクターを含む試薬、ＣＥＢＰＢをコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクターを含む試薬、ＦＯＸＡ１をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクターを含む試薬、およびＦＯＸＡ３をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターを含む試薬が、それぞれ別個の容器に格納された態様で含まれる、肝細胞系譜細胞の製造用試薬キット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞から肝細胞系譜細胞を製造する方法を提供することができる。また、多能性幹細胞の肝細胞系譜細胞への分化を開始することのできる４種類の転写因子の少なくとも１を含み、本発明に係る方法に使用される試薬および試薬キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、転写因子でトランスフェクションした２０１Ｂ７細胞におけるα−フェトプロテイン（Ａ）およびアルブミン（Ｂ）の相対的発現レベルを示す図である。横軸は、トランスフェクションに用いた各種転写因子を示す。図中（−）はトランスフェクションしなかった細胞を示す。（実施例１）
【図２】図２は、転写因子でトランスフェクションし、４種類の培地の１つで培養した２０１Ｂ７細胞のα−フェトプロテイン（Ａ）およびアルブミン（Ｂ）の相対的発現レベルを示す図である。横軸の上段はトランスフェクションに用いた転写因子を示し、また、「ａ」はＣＥＢＰＡ、「ａｂ」はＣＥＢＰＡとＣＥＢＰＢの組み合わせ、「ａｌｌ」はＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３の組み合わせを表す。横軸の下段は、各種培地を示し、「ＦＦ」はリプロＦＦ、「Ｌ１５」はレイボヴィッツ−１５、「ＷＥ」はウイリアムズＥ、「ＤＦ１２」はダルベッコ改変イーグル培地／ニュートリエントＦ−１２ハムを表す。（実施例１）
【図３】図３は、４種類の転写因子、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３でトランスフェクションし、その後４種類の培地の１つで培養した２０１Ｂ７細胞の拡大写真である。「Ａ」はリプロＦＦ、「Ｂ」はレイボヴィッツ−１５、「Ｃ」はウイリアムズＥ、「Ｄ」はダルベッコ改変イーグル培地／ニュートリエントＦ−１２ハムで培養した細胞を示す。元の倍率：×２００、スケールバー：２００μｍ。
【図４】図４は、ｐＥＢＮＫ−Ｈｙｇ／Ｃｈｅｒｒｙ（チェリーピッカー１；ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ１）でトランスフェクションし、様々な培地で培養した２０１Ｂ７細胞の拡大写真である。リプロＦＦレイボヴィッツ−１５、ウイリアムズＥ、およびダルベッコ改変イーグル培地／ニュートリエントＦ−１２ハムで培養した細胞をそれぞれ、「Ａ」と「Ｂ」、「Ｃ」と「Ｄ」、「Ｅ」と「Ｆ」、および「Ｇ」と「Ｈ」に示す。また、顕微鏡で白色光下に観察した結果を「Ａ」、「Ｃ」、「Ｅ」、および「Ｇ」に、蛍光鏡で観察した結果を「Ｂ」、「Ｄ」、「Ｆ」、および「Ｈ」に示す。元の倍率：×２００、スケールバー：２００μｍ。
【図５】図５は、４種類の転写因子、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３から選ばれた組み合わせで、またはプラスミドなしで、トランスフェクションし、ＷＥ培地で培養した２０１Ｂ７細胞を、抗α−フェトプロテイン抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）または抗アルブミン抗体（Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）で免疫染色した結果を示す拡大写真である。プラスミドなしでトランスフェクションした細胞を「Ａ」および「Ｅ」に示す。ＣＥＢＰＡでトランスフェクションした細胞を「Ｂ」および「Ｆ」に示す。ＣＥＢＰＡおよびＣＥＢＰＢでトランスフェクションした細胞を「Ｃ」および「Ｇ」に示す。ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３でトランスフェクションした細胞を「Ｄ」および「Ｈ」に示す。元の倍率：×４００、スケールバー：４００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明により、肝細胞系譜の細胞を製造する方法を提供できる。
【００２２】
また、本発明により、様々な種類の細胞を、肝細胞系譜の細胞を製造するための起点として使用する方法を提供できる。
【００２３】
さらに、本発明により、肝細胞系譜の細胞への細胞分化を補助するために利用される１以上の遺伝子を含む発現ベクターを提供できる。また、該発現ベクターを含む試薬および試薬キットを提供できる。
【００２４】
さらに、本発明により、肝細胞系譜の細胞への細胞分化を補助するために利用される１以上の増殖培地を提供できる。
【００２５】
さらにまた、本発明により、本発明に係る方法で製造された肝細胞系譜細胞を提供することができる。
【００２６】
本発明のさらなる特徴および利点は、後述する説明中にその一部が記載されており、そして、その一部分は該説明から明らかであり、あるいは、本発明の実施により知ることができる。本発明の課題および利点は、該説明および添付の特許請求の範囲中に具体的に示された要素および組み合わせによって実施および達成される。
【００２７】
これらおよび別の利点を達成するため、そして、本願発明の目的に従って、ここに具体的かつ概括的に説明されたように、本発明は肝細胞系譜の細胞を製造する方法に関する。該方法は、細胞を１以上の発現ベクターでトランスフェクションすることを含み得る。例えば、細胞を、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）をコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）をコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクター、およびフォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターでトランスフェクションすることができる。該方法は、得られたトランスフェクション細胞を増殖環境内で培養することを含み得る。
【００２８】
本発明はまた、本発明に係る方法で取得されるトランスフェクションされた、および／または、肝細胞系譜細胞に関する。
【００２９】
本発明はさらに、１以上の工程を含む、肝細胞系譜の細胞を製造する方法に関する。工程（ａ）は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に４種類の発現ベクターを導入することを含むことができ、ここで該発現ベクターは、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、およびフォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）をコードする遺伝子を含む発現ベクターである。工程（ｂ）は、工程（ａ）で得られた細胞を増殖環境内で培養することを含むことができる。
【００３０】
発明を実施するための形態を以下により具体的に説明する。以下の説明において、量、濃度、または別の値やパラメータが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値のいずれかとして与えられるとき、任意の上限または好ましい値と任意の下限または好ましい値との任意の一対から形成される全ての範囲を具体的に開示しており、複数の範囲が別々に開示されているかどうかは問わないと理解されるべきである。数値の範囲がここに列挙される場合、特に指定のない限り、該範囲はその終止点、並びに該範囲内の全ての整数（ｉｎｔｅｇｅｒ）および端数（ｆｒａｃｔｉｏｎ）を包含することが意図されている。本発明の範囲を、範囲を定義するときに列挙した具体的数値に制限することは意図されていない。
【００３１】
本発明は、肝細胞系譜の細胞を製造する方法に関する。該方法は、細胞を１以上の発現ベクターでトランスフェクションすることを含み得る。例えば、細胞を、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）をコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）をコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクター、およびフォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターでトランスフェクションすることができる。該方法は、得られたトランスフェクション細胞を増殖環境内で培養することを含み得る。トランスフェクションは、遺伝子などの核酸を任意の方法で細胞に導入することを意味する。トランスフェクション細胞は、遺伝子などの核酸を任意の方法で導入された細胞を意味する。
【００３２】
本発明に係る方法はさらに、上記トランスフェクション細胞を肝細胞系譜細胞に分化させることを含み得る。上記培養は、該トランスフェクション細胞の肝細胞系譜細胞への分化をもたらし得る。上記４種類の遺伝子の２種類以上が相乗的に作用して細胞を肝細胞系譜細胞に分化させ得る。該相乗作用は、細胞分化の時間、効率、および／または生産性に関連し得る。相乗作用は、超相加的か、または単一の遺伝子またはより小さい部分集合の遺伝子により引き起こされる分化以上であり得る。該方法はさらに、該トランスフェクション細胞から肝細胞系譜細胞を取得することを含み得る。
【００３３】
肝細胞系譜細胞とは、多能性幹細胞から肝細胞への分化が決定づけられた細胞から未熟肝細胞を経て成熟肝細胞に分化する過程の全ての段階の細胞を意味する。分化は部分的または完全なものであり得る。分化はさらに、最初の４種類の遺伝子以外に１つ以上の、例えば第５の遺伝子、第６の遺伝子といった追加の遺伝子を加えることにより補助され得る。肝細胞系譜細胞は、好ましくは肝細胞に特有の細胞表面マーカーの少なくとも１つを発現するものであり得る。肝細胞系譜細胞は、より好ましくはα−フェトプロテイン、アルブミン、またはその両方を発現するものであり得る。また、不死の細胞であり得る。また、中間細胞とは、多能性幹細胞から成熟肝細胞への分化途上にある細胞を意味する。
【００３４】
本発明に係る方法において、トランスフェクション細胞は、肝細胞分化、肝細胞増殖、またはその両方のために作成された培地中で培養され得る。該トランスフェクション細胞は、増殖環境内で培養された後、ウイリアムズＥ培地中で培養され得る。例えば、該トランスフェクション細胞は、ウイリアムズＥ培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ  Ｍｅｄｉｕｍ、またはＷｉｌｌｉａｍｓ’  Ｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）中で培養され得る。その他の適当な培地には、リプロＦＦ（Ｒｅｐｒｏ  ＦＦ：多能性を維持するフィーダーフリー培地）、レイボヴィッツ−１５（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｓ−１５：Ｌ１５）、およびダルベッコ改変イーグル培地／ニュートリエントＦ−１２ハム（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ／ＮｕｔｒｉｅｎｔＦ−１２  Ｈａｍ：ＤＦ１２）が包含され得る。培地は単独で、または組み合わせて使用することができる。組み合わせて使用するときは、例えば、培地を混合物としてまたは連続して、同期間の間、使用し得る。任意の適切なウイリアムズＥ培地は、炭酸水素ナトリウム、Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、および４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液の１以上を成分として含み得る。ウイリアムズＥ培地は、炭酸水素ナトリウム、Ｌ−グルタミン、フェノールレッド、および４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液の１以上を含まないものであり得る。ウイリアムズＥ培地は、乾燥粉末として、または、液体培地として供給され得る。ウイリアムズＥ培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したものであり得る。ウイリアムズＥ培地は、任意の好適な供給者、例えば、サーモフィッシャー  サイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）、またはロンザ（Ｌｏｎｚａ）から得ることができる。サーモフィッシャー  サイエンティフィックから入手できるウイリアムズＥ培地の例には、１２５５１−ウイリアムズＥ培地（１２５５１−Ｗｉｌｌｉａｍｓ’  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ；カタログ番号１２５５１０３２）、Ａ１２１７６−ウイリアムズＥ培地、フェノールレッド不含（Ａ１２１７６−Ｗｉｌｌｉａｍｓ’  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ，ｎｏ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ；カタログ番号Ａ１２１７６０１）、３２５５１−ウイリアムズＥ培地、ＧｌｕｔａＭＡＸ商標（３２５５１−Ｗｉｌｌｉａｍｓ’  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ，ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ；カタログ番号  ３２５５１０２０、３２５５１０８７）、および２２５５１−ウイリアムズＥ培地（２２５５１−Ｗｉｌｌｉａｍｓ’  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ；カタログ番号  ２２５５１０２２、２２５５１０８９）が含まれる。表１に１２５５１−ウイリアムズＥ培地の組成および成分として追加される例の濃度範囲を記載する。ここに列記された具体的な成分のいずれについても、これらの量は、記載された値から約１．０％から約２０％、または約０．１％から約１０％、約１．０％から約５％。約０．５％から約２．０％、または約０．１％から約０．５％の範囲で変化させ得ることが理解されるべきである。列記された成分の１つ以上は、任意に除外または等価の成分との置換ができる。例えば、２つの成分、３つの成分、４つの成分、５つの成分、１０の成分、１５の成分、２５の成分、またはそれ以上の成分、またはそれらの間の任意の数の成分の除外または置換ができる。
【００３５】
【表１】
0006792857.tif 000002
【００３６】
本発明に係る方法において、トランスフェクション細胞の培養は、任意の適当な時間行うことができる。例えば、該トランスフェクション細胞の培養は、少なくとも５分間、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも４５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも１２時間、少なくとも１日間、少なくとも３日間、少なくとも７日間（１週間）、少なくとも８日間、少なくとも１０日間、少なくとも１２日間、少なくとも１５日間、少なくとも２０日間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも６週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１年間、５分間以下、１年以上、または任意の合間の期間、行うことができる。該トランスフェクション細胞の培養は、例えば、およそ４日間から１２日間まで行うことができる。該トランスフェクション細胞の培養は、例えば、少なくとも７日間または７日間以上行うことができる。培養期間とは、該トランスフェクション細胞を培養する期間の合計あるいは、その一部分または一時期を意味し得る。例えば、該期間は、増殖環境内、または、特定の増殖培地若しくは細胞培養培地、または、一連の連続的な増殖培地若しくは細胞培養培地で、分化が完了する前の期間、または分化後の期間、細胞を培養することを意味し得る。該トランスフェクション細胞は、肝細胞系譜細胞に特有のマーカーの少なくとも１つの発現が、認識される閾値を超えるまで培養できる。該マーカーは、未熟肝細胞、成熟肝細胞、および両方に関連するものであり得る。該トランスフェクション細胞は、元の細胞のマーカーの発現が、認識される閾値を下回るまで培養できる。該トランスフェクション細胞は、肝細胞系譜細胞および／または肝細胞の形態を有するまで培養できる。
【００３７】
本発明に係る方法では、任意の好適な細胞をトランスフェクションできる。細胞は、脊椎動物細胞であり得る。細胞は、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、マウス細胞、霊長類細胞、またはヒト細胞であり得る。細胞は、幹細胞であり得る。例えば、細胞は、多能性幹細胞、ｉＰＳ細胞、ｉＰＳ細胞である２０１Ｂ７細胞、または胚性幹細胞であり得る。細胞は、体細胞または成熟細胞であり得る。例えば、細胞は線維芽細胞であり得る。
【００３８】
細胞のトランスフェクションは、細胞への発現ベクターの導入に好適な任意の適当な技術を使用して実施できる。発現ベクターは任意の好適な数を使用できる。例えば、少なくとも４つの発現ベクターを使用できる。例えば、少なくとも４つの異なる発現ベクターを使用できる。発現ベクターは任意の好適な発現ベクター又は任意の好適な発現ベクターの組み合わせを使用できる。発現ベクターとして、哺乳動物ベクターまたは哺乳動物プラスミドを使用できる。また、発現ベクターとして、人工ベクターを使用できる。発現ベクターとして、プラスミドを使用できる。エピソーマルプラスミドまたはエピソーマルベクターを使用できる。アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒａｌ；ＡＡＶ）ベクター、またはそれらの任意の組み合わせを使用することができる。第１の遺伝子、第２の遺伝子、第３の遺伝子、および第４の遺伝子は、１つ、２つ、３つ、または４つの発現ベクターの中に配置することができる。例えば、４つの遺伝子全てを同じ発現ベクター上に存在させ得るし、あるいは、各遺伝子をそれ独自の発現ベクター中に含有させることができる。特定の発現ベクターおよび／または遺伝子の単一コピーまたは複数コピーを、細胞にトランスフェクションすることができる。特定の遺伝子の１つ以上のコピーを、任意の所望の発現ベクター中に存在させることができる。
【００３９】
細胞のトランスフェクションは、２つ以上の発現ベクターを使用して実施できる。例えば、４つの発現ベクターすべてを同時に使用できる。細胞のトランスフェクションは、１つ以上の発現ベクターを順次使用して実施できる。任意の２つの発現ベクターをそれぞれトランスフェクションするタイミングに遅れがあってもよい。例えば、２以上の発現ベクターをトランスフェクションするタイミングの遅れは、１分未満、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも３時間、少なくとも６時間、、少なくとも１２時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも１週間、または間の時間が任意の長さであり得る。１つ以上の発現ベクターの細胞への導入の成功を確かめるために、１回以上の試験を実施することができる。１つ以上の発現ベクターのトランスフェクションは、少なくとも１つの転写因子または遺伝子について一過性のものであり得る。１つ以上の発現ベクターのトランスフェクションは、少なくとも１つの発現ベクターまたは遺伝子について安定的なものであり得る。該遺伝子の１つ以上は、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。
【００４０】
本発明において、任意の工程、複合工程、または全方法は、インビボ、インビロト、またはそれら両方で実施され得る。例えば、トランスフェクションは、インビトロで実施され得る。培養はインビボ、インビトロ、または両方で実施され得るが、好ましくはインビトロで実施される。増殖環境は、インビトロ増殖環境、インビボ増殖環境、またはそれら両方であり得るが、好ましくはインビトロ増殖環境である。増殖環境は、液体培地、固形支持体、またはそれら両方を含み得る。例えば、増殖環境が、肝組織、肝臓の一部分、または完全な肝臓の形成に貢献し得る。分化した細胞は、哺乳動物レシピエント、例えばマウスなどのげっ歯動物やヒトなどの霊長目動物に移植され得る。
【００４１】
１またはそれ以上の遺伝子の発現は制御し得る。１またはそれ以上の遺伝子の発現は、定型的（ｆｉｘｅｄ）または自動的（ａｕｔｏｍａｔｉｃ）であり得る。少なくとも１の、または、全ての遺伝子を、恒常的に活性化し得る。少なくとも１の、または、全ての遺伝子を、誘導することができる。例えば、少なくとも１の誘導可能な遺伝子を、好適な培地、例えばウイリアムズＥ培地中で増殖させることにより誘導することができる。遺伝子は、例えば、その他の遺伝子の１つの遺伝子産物またはその他の遺伝子の１つにより誘導された遺伝子産物により、直接的または間接的に誘導することができる。遺伝子の制御は、例えば遺伝子を含む発現ベクター上の１またはそれ以上の要素を通して調節することができる。このような要素は、例えばプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｏｒ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）、リボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）、誘導物質（ｉｎｄｕｃｅｒ）、抑制物質（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）、選択マーカーなどを包含し得る。
【００４２】
本発明はまた、本発明に係る方法により取得されたトランスフェクション細胞および／または肝細胞系譜細胞に関する。細胞は、不死の細胞であり得るし、または、限られた数の複製サイクルを有するものであり得る。細胞は、液体、固体、または液体／個体の支持体内での細胞培養における細胞という形態のものであり得る。細胞は、生物への移植に好適な組織または器官、例えば肝臓、という形態のものであり得る。肝細胞系譜細胞は、多能性幹細胞から肝細胞への分化が決定づけられた細胞から未熟肝細胞を経て成熟肝細胞に分化する過程の全ての段階の細胞を意味し、分化が部分的な肝細胞系譜細胞および分化が完全な肝細胞系譜細胞を含み得る。肝細胞系譜細胞は、好ましくは肝細胞に特有の細胞表面マーカーの少なくとも１つを発現するものであり得る。肝細胞系譜細胞は、より好ましくはα−フェトプロテイン、アルブミン、またはその両方を発現するものであり得る。
【００４３】
本発明はさらに、１またはそれ以上の工程を含む、肝細胞系譜細胞を製造する方法に関する。工程（ａ）は４つの発現ベクターを人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に導入することを包含し得る。ここで、該発現ベクターは、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（ＣＥＢＰＡ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β（ＣＥＢＰＢ）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）をコードする遺伝子を含む発現ベクター、およびフォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）をコードする遺伝子を含む発現ベクターをコードする遺伝子を含む発現ベクターである。工程（ｂ）は工程（ａ）で取得された細胞を増殖環境内で培養することを包含し得る。工程（ａ）で取得された細胞は、任意の好適な培地、例えばウイリアムズＥ培地内で培養され得る。工程（ａ）および（ｂ）で取得された細胞は、任意の好適な培地、例えばウイリアムズＥ培地内で培養され得る。工程（ａ）で取得された細胞は、任意の好適な期間、例えば少なくとも７日間培養され得る。
【００４４】
本発明はさらにまた、多能性幹細胞からの肝細胞系譜細胞の製造用試薬および試薬キットに関する。例えば、本発明は、ＣＥＢＰＡをコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクター、ＣＥＢＰＢをコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクター、ＦＯＸＡ１をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクター、およびＦＯＸＡ３をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターのうちのいずれか１の発現ベクターを含む、多能性幹細胞からの肝細胞系譜細胞の製造用試薬であり得る。好ましくは、当該第１の発現ベクター、当該第２の発現ベクター、当該第３の発現ベクター、および当該第４の発現ベクターを含む、多能性幹細胞からの肝細胞系譜細胞の製造用試薬であり得る。また、本発明は、ＣＥＢＰＡをコードする第１の遺伝子を含む第１の発現ベクターを含む試薬、ＣＥＢＰＢをコードする第２の遺伝子を含む第２の発現ベクターを含む試薬、ＦＯＸＡ１をコードする第３の遺伝子を含む第３の発現ベクターを含む試薬、およびＦＯＸＡ３をコードする第４の遺伝子を含む第４の発現ベクターを含む試薬のうちの１つまたはそれ以上が、それぞれ別個の容器に格納された態様で含まれる、多能性幹細胞からの肝細胞系譜細胞の製造用試薬であり得る。好ましくは、当該第１の発現ベクター、当該第２の発現ベクター、当該第３の発現ベクター、および当該第４の発現ベクターがそれぞれ別個の容器に格納された態様で含まれる、多能性幹細胞からの肝細胞系譜細胞の製造用試薬であり得る。
【００４５】
本発明の別の実施形態は、本明細書の検討およびここに開示された本発明の実施により、当業者に明白である。本明細書および実施例は例示に過ぎないことが意図されており、本発明の真の範囲および趣旨は次に述べる請求項およびその均等物により示されている。
【００４６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。下記実施例は本発明の例示を意図するものであり、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。なお、本研究は、日本学術振興会（Ｊａｐａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；ＪＳＰＳ）から、科学研究費補助金  基盤研究（Ｃ）の助成を受けたものである（１５Ｋ０９０３２）。
【００４７】
まず、ｉＰＳ細胞の分化を最も効率的に開始するための条件を決定するために、転写因子および培養培地の検討を行った。これらの検討は、任意の好適な細胞、例えば、肝細胞または体細胞から肝細胞系譜細胞を取得することに関連する。
【００４８】
ヒト成人肝臓での遺伝子発現とｉＰＳ細胞である２０１Ｂ７細胞での遺伝子発現とを、ＤＮＡマイクロアレイ解析を使用して比較した。転写因子を発現するエピソームプラスミドを構築した。２０１Ｂ７細胞を該エピソームプラスミドでトランスフェクションし、そしてリプロＦＦ、レイボヴィッツ−１５、ウイリアムズＥ、またはダルベッコ改変イーグル培地／ニュートリエントＦ−１２ハムで、７日間培養した。１２５５１−ウイリアムズ培地Ｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、ＷＥとして実施例で使用した（表１参照）。ＲＮＡを単離してリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムｑＰＣＲ）にかけ、ＡＦＰおよびアルブミンの発現を解析した。ｃＤＮＡマイクロアレイ解析により、１６の転写因子が２０１Ｂ７細胞よりヒト成人肝細胞で発現亢進していることが判明した。これら１６遺伝子を発現しているエピソームプラスミドを２０１Ｂ７細胞にトランスフェクションした。
【００４９】
ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３はＡＦＰを上方制御し、そしてＮａｎｏｇを下方制御した。これら４遺伝子をさらに解析した。ＡＦＰおよびアルブミンの発現は、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３を組み合わせてトランスフェクションし、そしてＷＥ中で培養した２０１Ｂ７細胞で最も高かった。ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３の組み合わせは、２０１Ｂ７細胞が肝細胞系譜への分化を開始するために適しており、そしてＷＥはトランスフェクション後の培養に最も適した培地であった。
【００５０】
ＦＯＸＡ１およびＦＯＸＡ３は、２０１Ｂ７細胞におけるＡＦＰおよびアルブミンの発現を増強した。これら結果から、ＦＯＸＡ１およびＦＯＸＡ３は、ＣＥＢＰＡおよびＣＥＢＰＢと相乗的に、肝細胞分化を開始することが示唆される。これら知見は、ＦＯＸＡ１およびＦＯＸＡ３が肝細胞分化に関与することを明らかに示す。本結果は、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３の組み合わせが肝細胞系譜へのｉＰＳ細胞の分化を促進することを示唆する。ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３の組み合わせを用いてトランスフェクションしてＷＥ中で培養した２０１Ｂ７細胞で、最高レベルのＡＦＰおよびアルブミンが得られた。これら結果は、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３の組み合わせを用いてトランスフェクションした後にｉＰＳ細胞が肝細胞系譜への分化を開始するために、ＷＥが好適であることをさらに示唆する。
【００５１】
このように、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３の組み合わせは、２０１Ｂ７細胞の肝細胞系譜への分化を開始するために好適であった。ＷＥはトランスフェクション後の培養に最も好適な培地であった。これら実験の詳細を、番号を付した下記実施例により説明する。
【実施例１】
【００５２】
ヒト成人肝臓での遺伝子発現とｉＰＳ細胞である２０１Ｂ７細胞での遺伝子発現とを、ＤＮＡマイクロアレイ解析を使用して比較した。その結果、２０１Ｂ７細胞と比較してヒト成人肝臓で上方制御されている転写因子が明らかになった。これら遺伝子をさらに調査して、肝細胞分化または肝細胞特異的機能に関与する転写因子の同定を行った。最終的に１６遺伝子を選択してさらなる解析を行った（表２）。１６遺伝子のｃＤＮＡを担持するオリジナルプラスミドは、寄贈または購入により取得し、エピソーマルベクターへのサブクローニングに使用した。具体的には、ＩＲＣＢ００３Ｏ２２、ＩＲＡＫ０４７０１９、ＩＲＡＫ０１５Ｃ１６、Ａｒｅ０７１Ｇ０１、ＩＲＡＬ０３１Ｏ０５、ＩＲＡＫ０４８Ｊ１５、ＩＲＡＫ０１２７Ｉ００２、ＩＲＡＬ０５８Ｎ２２、およびＷ０１Ａ０７３Ｎ１０は、日本文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト（日本）を介して、理研ＢＲＣにより提供された。その他は購入により取得した。最終的に、１６遺伝子を担持するエピソーマルベクターを構築した。
【００５３】
【表２】
0006792857.tif 000003
【００５４】
表２中の略称／頭字語を次に示す。ＣＥＢＰＡ：ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α、ＣＥＢＰＢ：ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β、ＣＥＢＰＤ：ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質δ、ＦＯＸＡ１：フォークヘッドボックスＡ１、ＦＯＸＡ２：フォークヘッドボックスＡ２、ＦＯＸＡ３：フォークヘッドボックスＡ３、ＧＡＴＡ４：ＧＡＴＡ結合タンパク質４、ＧＡＴＡ６：ＧＡＴＡ結合タンパク質６、ＨＥＸ：造血組織発現ホメオボックス（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、ＨＬＦ：肝白血病因子（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、ＨＮＦ１Ａ：肝細胞核因子１α（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ）、ＨＮＦ１Ｂ：肝細胞核因子４β、ＨＮＦ４Ｇ：肝細胞核因子４γ、ＳＯＸ７：性決定領域Ｙボックス７（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ  ｂｏｘ  ７）、ＳＯＸ１７：性決定領域Ｙボックス１７（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ  ｂｏｘ  １７）、ＰＣＲ：ＰＣＲで増幅され、クローニングベクターにクローン化され、そして配列決定された断片、（−）：元のプラスミドからエピソーマルプラスミドに直接的にサブクローン化されたもの。
【００５５】
２０１Ｂ７細胞は、理研細胞バンク（筑波、日本）より購入し、リプロＦＦ（リプロセル、横浜、日本）にて、マトリゲル商標（ベクトンディッキンソン、フランクリンレークス、ＮＪ、米国）でコートした６ウエルプレート（アサヒテクノグラス、船橋、日本）中でフィーダーフリー条件下に培養した。該細胞は、５％  ＣＯ２、３７℃にて加湿インキュベータ内でインキュベーションした。細胞は、次いでアキュターゼ商標（イノベーティブ  セル  テクノロジーズ社、サンディエゴ、ＣＡ、米国）を用いて回収し、新しい６ウエルプレート上に播種し、顕微鏡（ＣＫＸ４１Ｎ−３１ＰＨＰ、オリンパス、東京、日本）下で観察した。
【００５６】
ｃＤＮＡマイクロアレイ解析は、バイオマトリックスリサーチ社（流山、日本）により実施した。ヒト成人肝臓での遺伝子発現を、２０１Ｂ７細胞での遺伝子発現と比較した。ヒト成人肝臓からのトータルＲＮＡはクロンテック（マウンテンビュー、ＣＡ、米国）から購入した。リプロＦＦ中  で培養した２０７Ｂ７細胞からトータルＲＮＡを単離し、ＲＮイージー  ミニ  カラム（キアゲン、ベルノ、オランダ）で精製した。ＲＮＡ（１０μｇ）は、スーパースクリプト  インダイレクト  ｃＤＮＡ  ラべリング  キット（インビトロージェン）およびＣｙ商標３  モノリアクティブ  ダイまたはＣｙ商標５  モノリアクティブ  ダイ（ＧＥヘルスケア、リトルチャルフォント、英国）を使用して標識した。ダイ結合ｃＤＮＡは、ミニエリュート  ＰＣＲ  ピューリフィケーション  キット（キアゲン）を使用して精製し、そして、アジレント４４Ｋヒト６０−ｍｅｒオリゴマイクロアレイ（アジレント  テクノロジーズ、サンタクララ、ＣＡ）に、製造者使用説明書に従い、ハイブリダイズさせた。アジレント  マイクロアレイ  スキャナー（アジレント  テクノロジーズ）を使用してスライドの洗浄、乾燥、およびスキャンを行った。ジーンスプリングＧＸソフトウエア  パッケージ（アジレント  テクノロジーズ）を使用してデータの処理および解析を行った。
【００５７】
プラスミド構築の概略を表２示した。オリジナルプラスミドはマツモト博士（Ｄｒ．  Ｍ．  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、大阪大学、吹田、日本）およびクサントプロス博士（Ｄｒ．  ＫＧ．  Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ、カロリンスカ研究所、ストックホルム、スウェーデン）から提供されたか、あるいはリケンＤＮＡバンク（筑波、日本）、オリジーン（ＯｒｉＧｅｎｅ、ロックビル、ＭＤ、米国）、またはＤＮＡＦＯＲＭ（横浜、日本）から購入した。ｃＤＮＡを含む断片は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）（アジレント  テクノロジーズ社）に、それらのオリジナルプラスミドから制限消化によりサブクローン化するか、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。ＰＣＲで増幅した断片について、その配列の確認をバイオマトリックスリサーチ社で行った。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）中の断片を、ｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｎｅｏ（和光純薬、大阪、日本）、ｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｈｙｇ（和光純薬、大阪、日本）、ｐＥＢＮＫ−Ｎｅｏ（非特許文献２９）、またはｐＥＢＮＫ−Ｈｙｇ（非特許文献２９）にサブクローン化した。ｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｎｅｏ、ｐＥＢＭｕｌｔｉ−Ｈｙｇ、ｐＥＢＮＫ−Ｎｅｏ、およびｐＥＢＮＫ−Ｈｙｇはエピソーマルプラスミドである。
【００５８】
エピソーマルプラスミドは複製開始点およびエプスタイン‐バー  ウイルスの核抗原を含む。これら２つのファクターは、エピソーマルプラスミドの複製および細胞分裂後の娘細胞への分配を可能にする（非特許文献３０）。プラスミド中の遺伝子は少なくとも７日間発現する（非特許文献３１および３２）。トランスフェクションされた遺伝子のエピソーマルプラスミドからの発現は、従来の発現プラスミドからの発現より長いと予想された。ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＧＡＴＡ結合タンパク質６、および造血組織発現ホメオボックスは、それらのオリジナル  プラスミドからエピソーマルベクターに直接的にサブクローン化した。
【００５９】
クローニングのためのＰＣＲは次のように行った。肝白血病因子、肝細胞核因子１Ｂ、および性決定領域Ｙボックス１７のｃＤＮＡを、ＬＡ  ＰＣＲ商標キット  バージョン２．１（タカラ、大津、日本）を用いて製造者使用説明書に従い増幅した。次に、ＰＣＲを、ジーンアンプＰＣＲシステム９７００（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００、ライフテクノロジーズ）内で、９８℃で２０秒間の変性および６８℃で３分間のアニーリング／伸長で４０サイクル行った。鋳型は表２に示し、それらのプライマー配列は表３に列記した。
【００６０】
【表３】
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【００６１】
表３中の略称／頭字語を次に示す。ＨＬＦ：肝白血病因子、ＨＮＦ１Ｂ：肝細胞核因子１β、ＳＯＸ１７：性決定領域Ｙボックス１７。
【００６２】
トータルＲＮＡをアイソジェン（Ｉｓｏｇｅｎ、ニッポンジーン、東京、日本）を使用して単離し、５μｇをスーパースクリプトＩＩＩリバーストランスクリプターゼ（ライフテクノロジーズ）およびオリゴｄＴを使用して製造者使用説明書に従い、ファーストストランドｃＤＮＡ合成に掛けた。リアルタイムｑＰＣＲには、ファストＣＹＢＲグリーンマスターミックス（ｆａｓｔ  ＣＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ライフテクノロジーズ）を使用した。ｑＰＣＲは、ミニオプチコンシステム（Ｍｉｎｉ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，バイオラッド、ハーキュリーズ、ＣＡ、米国）中で行った。結果は、ミニオプチコンシステムで自動解析・表示させた。プライマー配列は表４−１、表４−２、および表４−３に列記した。
【００６３】
【表４−１】
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【００６４】
【表４−２】
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【００６５】
【表４−３】
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【００６６】
表４−１、表４−２、および表４−３中の略称／頭字語を次に示す。ＣＥＢＰＡ：ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α、ＣＥＢＰＢ：ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質β、ＣＥＢＰＤ：ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質δ、ＦＯＸＡ１：フォークヘッドボックスＡ１、ＦＯＸＡ２：フォークヘッドボックスＡ２、ＦＯＸＡ３：フォークヘッドボックスＡ３、ＧＡＴＡ４：ＧＡＴＡ結合タンパク質４、ＧＡＴＡ６：ＧＡＴＡ結合タンパク質６、ＨＥＸ：造血組織発現ホメオボックス（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ）、ＨＬＦ：肝白血病因子（ｈｅｐａｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｆａｃｔｏｒ）、ＨＮＦ１Ａ：肝細胞核因子１α（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ）、ＨＮＦ１Ｂ：肝細胞核因子１β、ＨＮＦ４Ｇ：肝細胞核因子４γ、ＳＯＸ７：性決定領域Ｙボックス７（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ  ｂｏｘ  ７）、ＳＯＸ１７：性決定領域Ｙボックス１７（ｓｅｘ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  Ｙ  ｂｏｘ  １７）、ＲＰＬ１９：リボソーマルプロテインＬ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ；ＲＰＬ）１９、ＡＦＰ：α−フェトプロテイン。
【００６７】
ｉＰＳ細胞からの肝細胞分化を促進する候補を同定するために、２０１Ｂ７細胞を各エピソーマルベクターを用いてトランスフェクションし、リプロＦＦ中で７日間培養した。２０１Ｂ７細胞を、マトリゲル商標でコートした６ウエルプレートまたは８ウエルチャンバースライド（マツナミ、岸和田、日本）に播種した。構築したエピソーマルベクターを、フュージーンＨＤ（ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ、クロンテック、マウンテンビュー、ＣＡ、米国）を用いて製造者使用説明書に従いトランスフェクションした。その後に、０．５μｇまたは０．１６μｇの各エピソーマルプラスミドをそれぞれ、６ウエルまたは８ウエルのチャンバースライドの各ウエルにトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞をリプロＦＦ（多能性を維持するフィーダーフリー培地）、レイボヴィッツ−１５（Ｌ−１５）、ウイリアムズＥ（ＷＥ）、またはダルベッコ改変イーグル培地／ニュートリエントＦ−１２ハム（ＤＦ１２）中で培養した。Ｌ−１５、ＷＥ、およびＤＦ１２には、ニコチンアミド（１．２  ｍｇ／ｍｌ、和光純薬）、プロリン（３０  ｎｇ／ｍｌ、和光純薬）、および１０％ノックアウト血清リプレースメント（ライフテクノロジーズ）を追加した。ニコチンアミドおよびプロリンは、肝細胞の増殖に必要であるため、添加した（非特許文献３３および３４）。いくつかの実験ではまた、細胞をｐＥＢＮＫ−Ｈｙｇ／Ｃｈｅｒｒｙを用いてトランスフェクションした。
【００６８】
培養後、ＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲにかけてＡＦＰ（図１Ａ）およびＮａｎｏｇ（図１Ｂ）のレベルを測定した。図１ＡおよびＢは、転写因子でトランスフェクションした２０１Ｂ７細胞におけるα−フェトプロテインおよびアルブミンの発現レベルを示す図である。２０１Ｂ７細胞は転写因子でトランスフェクションし、リプロＦＦ（リプロセル）中で培養した。２０１Ｂ７細胞は、転写因子でトランスフェクションし、そしてリプロＦＦ（リプロセル）中で培養した。培養７日後に、ＲＮＡを単離し、リアルタイムｑＰＣＲにかけ、α−フェトプロテイン（図１のＡ）およびアルブミン（図１のＢ）のレベルを解析した。ＡＦＰ発現は、１６遺伝子のうち１１遺伝子でトランスフェクションした２０１Ｂ細胞において、トランスフェクションしなかった細胞より、より高かった。Ｎａｎｏｇ発現は、７遺伝子でトランスフェクションした２０１Ｂ細胞において、トランスフェクションしなかった細胞より、より低かった。ＡＦＰは未成熟肝細胞のマーカーである（非特許文献３５）。Ｎａｎｏｇは多能性に関連する（非特許文献３６）。したがって、高いＡＦＰ発現を誘導すると同時にＮａｎｏｇ発現を抑制する転写因子が、ｉＰＳ細胞からの肝細胞分化を開始するために適していると考えられる。ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、フォークヘッドボックス１Ａ（ＦＯＸＡ１）、およびフォークヘッドボックスＡ３（ＦＯＸＡ３）がこれら基準に合致した。これら４つの転写因子を肝細胞分化のための候補遺伝子と考えた。
【実施例２】
【００６９】
本実施例では、肝細胞系譜へのｉＰＳ細胞の分化に、転写因子のどのような組み合わせ、および、どのような培地が適しているかを検討した。２０１Ｂ７細胞を、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、並びにＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３の組み合わせでトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞は、リプロＦＦ、Ｌ１５、ＷＥ、またはＤＦ１２中で７日間培養した。ＲＮＡを単離し、ｑＰＣＲにかけてＡＦＰ（図２のＡ）およびアルブミン（図２のＢ）のレベルを測定した。図２のＡおよびＢは、転写因子を用いたトランスフェクションおよび４つの培地中での培養の結果を説明する。２０１Ｂ７細胞は、ＣＥＢＰＡ（図中、ａと表示）、ＣＥＢＰＡとＣＥＢＰＢの組み合わせ（図中、ａｂと表示）、あるいはＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、フォークヘッドボックスＡ１、およびフォークヘッドボックスＡ３の組み合わせ（図中、ａｌｌと表示）を用いてトランスフェクションした。該細胞をリプロＦＦ（リプロセル）、レイボヴィッツ−１５（ライフテクノロジーズ）、ウイリアムズＥ（ライフテクノロジーズ）、またはダルベッコ改変イーグル培地／ニュートリエントＦ−１２ハム（シグマ−アルドリッチ）中で、７日間培養した。ＲＮＡを単離し、リアルタイム定量ＰＣＲにかけ、ＡＦＰ（図２のＡ）およびアルブミン（図２のＢ）の発現を解析した。
【００７０】
これら４つの転写因子全てを組み合わせて細胞をトランスフェクションし、そして該細胞をＷＥ中で培養することで、ＡＦＰおよびアルブミンの最も高い発現がもたらされた。これら結果から、この条件がｉＰＳ細胞の肝細胞分化に適していることが示唆された。
【実施例３】
【００７１】
本実施例では、トランスフェクション後に十分な細胞を取得するために、様々な培地の適合性を検討した。２０１Ｂ７細胞は、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３の組み合わせを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、リプロＦＦ（図３のＡ）、Ｌ１５（図３のＢ）、ＷＥ（図３のＣ）、またはＤＦ１２（図３のＤ）で７日間培養した。細胞の生存は、リプロＦＦ、ＷＥ、およびＤＦ１２よりもＬ１５で少なかった。２０１Ｂ７細胞は、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞をリプロＦＦ（リプロセル）（図３のＡ）、レイボヴィッツ−１５（ライフテクノロジーズ）（図３のＢ）、ウイリアムズＥ（ライフテクノロジーズ）（図３のＣ）、またはダルベッコ改変イーグル培地／ニュートリエントＦ−１２ハム（ＤＦ１２、シグマ−アルドリッチ）（図３のＤ）中で、７日間培養した。次いで、細胞を顕微鏡下で観察した。元の倍率：×２００、スケールバー：２００μｍ。
【００７２】
これら結果から、試験した他の培地と比較して、Ｌ１５はトランスフェクション後に十分な細胞を得るために不適当であることが示唆された。
【実施例４】
【００７３】
本実施例では、トランスフェクションした遺伝子が２０１Ｂ細胞で発現されたか否かを検討した。２０１Ｂ７細胞を、ｐＥＢＮＫ−Ｈｙｇ／Ｃｈｅｒｒｙでトランスフェクションし、リプロＦＦ（リプロセル）（図４のＡ、Ｂ）、レイボヴィッツ−１５（ライフテクノロジーズ）（図４のＣ、Ｄ）、ウイリアムズＥ（ライフテクノロジーズ）（図４のＥ、Ｆ）、またはダルベッコ改変イーグル培地／ニュートリエントＦ−１２ハム（ＤＦ１２、シグマ−アルドリッチ）（図４のＧ、Ｈ）中で、７日間培養した。次いで細胞を、顕微鏡（図４のＡ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）で白色光下にて、または蛍光鏡（図４のＢ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）で観察した。元の倍率：×２００、スケールバー：２００μｍ。他の３つの培地と比較して、Ｌ１５で培養した細胞では、生存細胞がごくわずかであった。この結果は図３のＡ−Ｄに示すの結果と一致した。ＣｈｅｒｒｙＰｉｃｋｅｒ１の蛍光強度は、リプロＦＦまたはＷＥ中で培養した２１０Ｂ７細胞で、より強かった（非特許文献２９）。これら結果から、２０１Ｂ７細胞はリプロＦＦまたはＷＥ中でトランスフェクションした遺伝子を発現していることが示唆された。
【実施例５】
【００７４】
上記結果から、ＷＥが転写因子でトランスフェクションした後の２０１Ｂ７細胞の培養に最適な培地であることが示された。そこで、２０１Ｂ７細胞をＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、またはＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３の組み合わせでトランスフェクションし、ＡＦＰおよびアルブミンのタンパク質レベルでの発現を免疫染色により確認した。
【００７５】
免疫染色は次のように行った。２０１Ｂ７細胞を、０．１６μｇ／ウエルのエピソーマルプラスドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞は、ＷＥ中で７日間培養した。インキュベーション後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（シグマ−アルドリッチ）を用いて４℃で１０分間固定化した。固定化した細胞を、１００％メタノール（和光純薬）中０．１％過酸化水素（和光純薬）を用いて４℃で３０分間インキュベーションし、内因性過酸化物を不活化した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でリンスした後に、標本を洗浄バッファー（ＰＢＳ中２％胎仔牛血清）を用いて４℃で３０分間インキュベーションした。マウスで産生させたモノクローナル抗ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）抗体（タカラ）またはウサギで産生させたポリクローナル抗ヒトアルブミン抗体（シグマアルドリッチ）を１／１０００希釈して用い、洗浄バッファー中の標本に加えた。検体は４℃で一晩インキュベーションした。一晩インキュベーション後、検体をＰＢＳで洗浄した。洗浄後、検体は、ヤギで産生させた抗マウス抗体にアルカリホスファターゼを結合させたもの（プロメガ、マジソン、ＷＩ、米国）またはヤギで産生させた抗ウサギ抗体にアルカリホスファターゼを結合させたもの（プロメガ）を１／１０００希釈して用い、洗浄バッファー中にて４℃で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、結合物を、ベクターレッドサブストレート（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、ベクターラボラトリーズ、バーリンゲーム、ＣＡ、米国）を使用して製造者使用説明書に従い可視化した。検体は、顕微鏡ＡＸ８０（オリンパス、東京、日本）下で観察した。
【００７６】
図５のＡ−Ｈは、免疫染色の結果を示す。２０１Ｂ７細胞は、プラスミドなし（図５のＡ、Ｅ）、ＣＥＢＰＡ（図５のＢ、Ｆ）、ＣＥＢＰＢ（図５のＣ、Ｇ）、並びにＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、フォークヘッドボックスＡ１、およびフォークヘッドボックスＡ３の組み合わせ（図５のＤ、Ｈ）を用いてトランスフェクションした。リプロＦＦ（リプロセル）、レイボヴィッツ−１５（ライフテクノロジーズ）、ウイリアムズＥ（ライフテクノロジーズ）、またはダルベッコ改変イーグル培地／ニュートリエントＦ−１２ハム（ＤＦ１２、シグマ−アルドリッチ）（図５のＤ、Ｈ）中で７日間培養後、細胞をα−フェトプロテイン（図５のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）に対する抗体またはアルブミン（図５のＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）に対する抗体で免疫染色した。元の倍率：×４００、スケールバー：４００μｍ。これら結果は、図２のＡおよびＢの結果と一致した。
【００７７】
ＡＦＰおよびアルブミンのシグナルは、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、またはＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＦＯＸＡ１、およびＦＯＸＡ３の組み合わせでトランスフェクションした２０１Ｂ７細胞において、トランスフェクションしなかった細胞（図５のＡ、Ｅ）よりも強かった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明により、多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞から肝細胞系譜細胞の効率的な分化誘導および製造が可能になる。本発明の方法は、再生医療などの医療分野で利用される肝細胞系譜細胞の供給を可能にするものであり極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７９】
配列番号１〜４６：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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