(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）環境内に、超音波切り替え可能な第１フルオロフォアを配置する工程と、
（ｂ）前記環境を超音波ビームに曝露させて、前記環境内に活性化領域を形成する工程と、
（ｃ）前記第１フルオロフォアを前記活性化領域内に配置して、前記第１フルオロフォアをオフ状態からオン状態に切り替える工程と、
（ｄ）前記環境を電磁放射ビームに曝露させ、それにより前記第１フルオロフォアを励起させる工程と、
（ｅ）前記第１フルオロフォアにより放出された第１超音波蛍光信号と第１バックグラウンド信号を含む第１フォトルミネセンス信号を前記環境内の第１場所において検出する工程と、
（ｆ）前記第１フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定して、前記第１場所に対する第１相関係数を生成する工程であって、前記第１基準信号は前記第１フルオロフォアの前記第１超音波蛍光信号に対応し、前記第１フォトルミネセンス信号と前記第１基準信号との相関関係を算定する工程が、前記第１フォトルミネセンス信号の時間強度減衰プロファイルと、前記第１基準信号の時間強度減衰プロファイルと、を比較する工程を含む、工程と、
（ｇ）前記第１フォトルミネセンス信号と前記第１場所に対する前記相関係数とを乗算して、前記第１場所に対する第１修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
を含む、イメージング方法。
【請求項２】
前記環境を前記電磁放射ビームに曝露させることは、前記環境内に存在する少なくとも１つのフォトルミネセンスバックグラウンド種も励起させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１バックグラウンド信号は、前記少なくとも１つのフォトルミネセンスバックグラウンド種により放出される第１バックグラウンドフォトルミネセンス信号を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１場所に対する前記相関係数は、式（１）にしたがって生成され、
【数１】
0006767377.tif 000018
ρＩ，Ｒは前記第１場所に対する前記相関係数であり、Ｉ（ｔ）は前記第１場所における前記第１フォトルミネセンス信号の前記時間強度減衰プロファイルであり、Ｒ（ｔ）は前記第１基準信号の前記時間強度減衰プロファイルであり、ＮはＩ（ｔ）およびＲ（ｔ）における時間点の個数である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１場所に対する前記相関係数はビン分割された相関係数である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｅｎ）前記第１フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号と第ｎ追加的バックグラウンド信号とのうちの少なくとも一方を含むｎ個の追加的フォトルミネセンス信号を前記環境内のｎ個の追加的場所において検出する工程と、
（ｆｎ）前記ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号と前記第１基準信号との相関関係を算定して、前記ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的相関係数を生成する工程と、
（ｇｎ）前記ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号と前記ｎ個の追加的相関係数とを乗算して、前記ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
をさらに含み、
ｎは１〜１０００の整数である、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｈ）前記第１場所に対する前記第１修正済みフォトルミネセンス信号と、第２場所に対する第２修正済みフォトルミネセンス信号と、前記ｎ個の追加的場所に対する前記ｎ個の追加的修正済みフォトルミネセンス信号と、を組み合わせて、前記環境内の前記第１フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成する工程、
をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ａ）環境内に、超音波切り替え可能な第１フルオロフォアおよび超音波切り替え可能な第２フルオロフォアを配置する工程と、
（ｂ）前記環境を超音波ビームに曝露させて、前記環境内に活性化領域を形成する工程と、
（ｃ）前記第１フルオロフォアを前記活性化領域内に配置して、前記第１フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替える工程、および／または、前記第２フルオロフォアを前記活性化領域内に配置して、前記第２フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替える工程と、
（ｄ）前記環境を電磁放射ビームに曝露させ、それにより前記第１フルオロフォアおよび／または前記第２フルオロフォアを励起させる工程と、
（ｅ）前記第１フルオロフォアにより放出された第１超音波蛍光信号と、前記第２フルオロフォアにより放出された第１蛍光信号と、第１バックグラウンド信号と、のうちの少なくとも１つを含む第１フォトルミネセンス信号を前記環境内の第１場所において検出する工程と、
（ｆ）前記第１フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定して、前記第１場所に対する第１相関係数を生成する工程と、
（ｇ）前記第１フォトルミネセンス信号と前記第１場所に対する前記第１相関係数とを乗算して、前記第１場所に対する第１修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
を含む、イメージング方法。
【請求項９】
（ｆ２）前記第１フォトルミネセンス信号と第２基準信号との相関関係を算定して、前記第１場所に対する第２相関係数を生成する工程と、
（ｇ２）前記前記第１フォトルミネセンス信号と前記第１場所に対する前記第２相関係数とを乗算して、前記第１場所に対する第２修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
をさらに含み、
前記第１基準信号は前記第１フルオロフォアの前記第１超音波蛍光信号に対応し、
前記第２基準信号は前記第２フルオロフォアの前記第１超音波蛍光信号に対応する、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｅｎ）前記第１フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号と、前記第２フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号と、第ｎ追加的バックグラウンド信号とのうちの少なくとも１つを含むｎ個の追加的フォトルミネセンス信号を前記環境内のｎ個の追加的場所において検出する工程と、
（ｆ１ｎ）前記ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号と前記第１基準信号との相関関係を算定して、前記ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第１相関係数を生成する工程と、
（ｇ１ｎ）前記ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号と前記ｎ個の追加的場所に対する前記ｎ個の追加的第１相関係数とを乗算して、前記ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第１修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
（ｆ２ｎ）前記ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号と前記第２基準信号との相関関係を算定して、前記ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第２相関係数を生成する工程と、
（ｇ２ｎ）前記ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号と前記ｎ個の追加的場所に対する前記ｎ個の追加的第２相関係数とを乗算して、前記ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第２修正済みフォトルミネセンス信号を生成する工程と、
をさらに含み、
ｎは１〜１０００の整数である、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｈ１）前記第１場所に対する前記第１修正済みフォトルミネセンス信号と、前記ｎ個の追加的場所に対する前記ｎ個の追加的第１修正済みフォトルミネセンス信号と、を組み合わせて、前記環境内の前記第１フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成する工程と、
（ｈ２）前記第１場所に対する前記第２修正済みフォトルミネセンス信号と、前記ｎ個の追加的場所に対する前記ｎ個の追加的第２修正済みフォトルミネセンス信号と、を組み合わせて、前記環境内の前記第２フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成する工程、
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）環境内に、超音波切り替え可能な第１フルオロフォアおよび超音波切り替え可能な第２フルオロフォアを配置する工程と、
（ｂ）前記環境を超音波ビームに曝露させて、前記環境内に活性化領域を形成する工程と、
（ｃ）前記第１フルオロフォアを前記活性化領域内に配置して、前記第１フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替える工程、および／または、前記第２フルオロフォアを前記活性化領域内に配置して、前記第２フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替える工程と、
（ｄ）前記環境を電磁放射ビームに曝露させ、それにより前記第１フルオロフォアおよび／または前記第２フルオロフォアを励起させる工程と、
（ｅ）前記第１フルオロフォアにより放出された第１超音波蛍光信号と前記第２フルオロフォアにより放出された第２超音波蛍光信号とのうちの少なくとも一方を含む第１フォトルミネセンス信号を前記環境内の第１場所において検出する工程と、
（ｆ）前記第１フォトルミネセンス信号を、前記第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応する第１基底ベクトルと、前記第２フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応する第２基底ベクトルと、に直交分解する工程と、
を含む、イメージング方法。
【請求項１３】
（ｇ１）前記第１場所における前記第１フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号に対する基底ベクトル係数ａを判定する工程と、
（ｇ２）前記第１場所における前記第２フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号に対する基底ベクトル係数ｂを判定する工程と、
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（ｈ１）前記第１フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号と前記係数ａとを乗算して、前記第１場所における前記第１フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
（ｈ２）前記第２フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号と前記係数ｂとを乗算して、前記第１場所における前記第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｅｎ）前記第１フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号と、前記第２フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号と、のうちの少なくとも一方を含むｎ個の追加的フォトルミネセンス信号を前記環境内のｎ個の追加的場所において検出する工程と、
（ｆｎ）前記ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号を、前記第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応するｎ個の追加的第１基底ベクトルと、前記第２フルオロフォアの正規化された超音波信号に対応するｎ個の追加的第２基底ベクトルと、に直交分解する工程と、
（ｇ１ｎ）前記ｎ個の追加的場所における前記第１フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号に対するｎ個の追加的基底ベクトル係数ａｎを判定する工程と、
（ｇ２ｎ）前記ｎ個の追加的場所における前記第２フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号に対するｎ個の追加的基底ベクトル係数ｂｎを判定する工程と、
（ｈ１ｎ）前記第１フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号と前記ｎ個の追加的係数ａｎとを乗算して、前記ｎ個の追加的場所における前記第１フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
（ｈ２ｎ）前記第２フルオロフォアの前記正規化された超音波蛍光信号と前記ｎ個の追加的係数ｂｎとを乗算して、前記ｎ個の追加的場所における前記第２フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
をさらに含み、
ｎは１〜１０００の整数である、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ１）前記第１場所における前記第１フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と、前記ｎ個の追加的場所における前記第１フルオロフォアの前記ｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と、を組み合わせて、前記環境内の前記第１フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成する工程と、
（ｉ２）前記第１場所における前記第２フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と、前記ｎ個の追加的場所における前記第２フルオロフォアの前記ｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と、を組み合わせて、前記環境内の前記第２フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成する工程と、
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ｊ１）前記第１フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と第１基準信号との相関関係を算定して、前記第１場所に対する前記第１基準信号に対する第１相関係数を生成する工程と、
（ｋ１）前記第１フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と前記第１基準信号に対する前記第１相関係数とを乗算して、前記第１場所に対する前記第１フルオロフォアの第１修正済み分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
（ｊ２）前記第２フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と第２基準信号との相関関係を算定して、前記第１場所に対する前記第２基準信号に対する第１相関係数を生成する工程と、
（ｋ２）前記第２フルオロフォアの前記分離された超音波蛍光信号と前記第２基準信号に対する前記第１相関係数とを乗算して、前記第１場所に対する前記第２フルオロフォアの第１修正済み分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
をさらに含み、
前記第１基準信号は前記第１フルオロフォアの前記第１超音波蛍光信号に対応し、
前記第２基準信号は前記第２フルオロフォアの前記第１超音波蛍光信号に対応する、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
（ｊ１ｎ）前記第１フルオロフォアの前記ｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と第１基準信号との相関関係を算定して、前記ｎ個の追加的場所に対する前記第１基準信号に対するｎ個の追加的相関係数を生成する工程と、
（ｋ１ｎ）前記第１フルオロフォアの前記ｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と前記第１基準信号に対する前記ｎ個の追加的相関係数とを乗算して、前記ｎ個の追加的場所に対する前記第１フルオロフォアのｎ個の追加的修正済み分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
（ｊ２ｎ）前記第２フルオロフォアの前記ｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と第２基準信号との相関関係を算定して、前記ｎ個の追加的場所に対する前記第２基準信号に対するｎ個の追加的相関係数を生成する工程と、
（ｋ２ｎ）前記第２フルオロフォアの前記ｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と前記第２基準信号に対する前記ｎ個の追加的相関係数とを乗算して、前記ｎ個の追加的場所に対する前記第２フルオロフォアのｎ個の追加的修正済み分離された超音波蛍光信号を生成する工程と、
をさらに含み、
前記第１基準信号は前記第１フルオロフォアの前記第１超音波蛍光信号に対応し、
前記第２基準信号は前記第２フルオロフォアの前記第１超音波蛍光信号に対応する、
請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年２月６日に出願された米国特許出願整理番号第１４／６１５，９９３号の優先権を合衆国法典第３５巻第１１９条にしたがって主張する。米国特許出願整理番号第１４／６１５，９９３号は２０１４年１月２３日に出願された米国特許出願整理番号第１４／１６２，３７５号の一部継続出願であり、米国特許出願整理番号第１４／１６２，３７５号は、２０１３年１月２４日に出願された米国仮特許出願整理番号第６１／７５６，０６５号の優先権を合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）にしたがって請求する。なお、これらの特許は、参照することにより、その全体が本願に援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立画像生物医学・生物工学研究所を通して国立衛生研究所により授与された契約７Ｒ１５ＥＢ０１２３１２−０２の下に、テキサスがん予防研究所により授与された契約ＲＰ１２００５２の下に、およびアメリカ国立科学財団により授与された契約ＣＢＥＴ−１２５３１９９の下に、政府支援を受けてなされたものである。合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、高解像度イメージングのためのシステムおよび方法に関し、さらに詳細には、超音波切り替え可能蛍光（ＵＳＦ）を使用するイメージングに関する。
【背景技術】
【０００４】
深い生体組織における蛍光イメージングは、組織の構造、機能、および機能不全に関する重要な情報を提供することができる。一方、従来の蛍光イメージング技術は、深部組織における強力な光散乱のために、進入深さおよび／または空間解像度において限界がある。いくつかの従来の蛍光イメージング技術は、信号対雑音比（ＳＮＲ）においても限界がある。その結果、係る方法は、多数の組織生物学および／または臨床用途に対して有効性が低下してしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、高解像度イメージングのための、さらに詳細には、深い生体組織に対するイメージングのための、改善されたシステムおよび方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、いくつかの場合において、他の方法と比較して１つまたは複数の利点を提供し得るイメージング方法が本明細書で説明される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、音波回折限界を超える解像度を有する深い生体組織のイメージングを提供し得、さらに、改善されたイメージング深さ対イメージング解像度比（ＤＲＲ：ｉｍａｇｉｎｇ  ｄｅｐｔｈ−ｔｏ−ｉｍａｇｉｎｇ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒａｔｉｏ）および／または改善された信号対雑音比（ＳＮＲ）を示し得る。加えて、本明細書で記載の方法のフルオロフォアは、いくつかの場合では、蛍光強度の大きいオン／オフ比または寿命を、および／または、オン状態およびオフ状態間の狭い遷移帯域幅を示し得る。さらに、本明細書で記載の方法のフルオロフォアは、オン状態およびオフ状態間の調整可能な閾値を示し得る。さらに、いくつかの事例では、本明細書で記載の方法は、１つまたは複数の生物医学的応用に対して望ましいものとなり得る、複数の分子標的を同時に撮像することを含む多重超音波蛍光イメージングを可能にし得る。
【０００７】
本明細書で記載の方法は、いくつかの実施形態では、オフ状態とオン状態との間の切り替え閾値を有する超音波切り替え可能フルオロフォアの集団を生物学的環境に配置することと、生物学的環境を超音波ビームに曝露させて、生物学的環境内に活性化領域を形成することと、を含む。この方法は、活性化領域内の全フルオロフォアのうちの少なくとも１つのフルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替えることと、少なくとも１つのフルオロフォアを電磁放射ビームで励起させることと、少なくとも１つのフルオロフォアにより放出された光を検出することと、を、さらに含む。いくつかの実施形態では、活性化領域は、最高負圧を、および／または最高温度を、有し、少なくとも１つのフルオロフォアの切り替え閾値は、活性化領域の最高負圧の少なくとも約５０％であるか、または、活性化領域の最高温度の少なくとも約５０％である。いくつかの場合では、例えば、フルオロフォアは、オフ状態とオン状態との間の切り替え温度閾値を有し、活性化領域は、フルオロフォアの切り替え温度閾値以上である最高温度を有する。
【０００８】
加えていくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、複数の異なる方向から生物学的環境を複数の超音波ビームに曝露させることを含む。なお超音波ビームの焦点ゾーンは少なくとも部分的に重なり合う。さらに、係る場合では、フルオロフォアの切り替え閾値は、全超音波ビームのうちの１つの超音波ビームの焦点ゾーンのみにより提供される最高温度または最高負圧よりも大きい。
【０００９】
さらに、いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、生物学的環境を超音波ビームに曝露させる以前に、生物学的環境を電磁放射のパルスビームに曝露させることをさらに含み、パルスビームはわずか１００ピコ秒（ｐｓ）のパルス幅を有する。なおパルス幅はパルスの最大光パワーの１／２における時間間隔の幅全体として定義される。
【００１０】
加えていくつかの事例では、本明細書で記載の方法は、（ａ）第１超音波切り替え可能フルオロフォアを環境（例えば生物学的環境など）に配置することと、（ｂ）環境を超音波ビームに曝露させて、環境内に活性化領域を形成することと、（ｃ）第１フルオロフォアを活性化領域内に配置して、第１フルオロフォアをオフ状態からオン状態に切り替えることと、（ｄ）環境を電磁放射ビームに曝露させて、第１フルオロフォアを励起させることと、を含む。いくつかの場合では、環境を電磁放射ビームに曝露させることは、環境に存在する少なくとも１つのフォトルミネセンスバックグラウンド種も励起させる。さらに本明細書で記載の方法は、（ｅ）第１フルオロフォアにより放出された第１超音波蛍光信号と第１バックグラウンド信号とのうちの少なくとも一方を含む第１フォトルミネセンス信号を環境内の第１場所において検出することも、含み得る。いくつかの事例では、第１バックグラウンド信号は、少なくとも１つのフォトルミネセンスバックグラウンド種により放出される第１バックグラウンドフォトルミネセンス信号を含む。加えて、いくつかの実施形態では、この方法は、（ｆ）第１フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定して、第１場所に対する第１相関係数を生成することと、（ｇ）第１フォトルミネセンス信号と第１場所に対する相関係数とを乗算して、第１場所に対する第１修正済みフォトルミネセンス信号を生成することと、をさらに含む。本明細書で記載の方法の第１基準信号は、いくつかの場合では、第１フルオロフォアの第１超音波蛍光信号に対応する。さらに、いくつかの場合では、第１フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定することは、第１フォトルミネセンス信号の時間強度減衰プロファイルと、第１基準信号の時間強度減衰プロファイルと、を比較することを含む。
【００１１】
加えて、環境内の第１場所におけるフォトルミネセンス信号を検出および処理する前述のステップ（ｅ）〜（ｇ）を任意の所望回数だけ反復すると、環境内の複数の場所に対する複数の修正済みフォトルミネセンス信号が生成され得る。例えば、いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、（ｅ２）第１フルオロフォアにより放出された第２超音波蛍光信号と第２バックグラウンド信号とのうちの少なくとも一方を含む第２フォトルミネセンス信号を環境内の第２場所において検出することと、（ｆ２）第２フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定して、第２場所に対する相関係数を生成することと、（ｇ２）第２フォトルミネセンス信号と第２場所に対する相関係数とを乗算して、第２場所に対する第２修正済みフォトルミネセンス信号を生成することと、をさらに含む。さらに一般的には、ｎ個の修正済みフォトルミネセンス信号が、環境内のｎ個の場所におけるｎ個のフォトルミネセンス信号から、およびｎ個の場所におけるｎ個の相関係数から、生成され得る。なおｎは、任意の所望の整数（例えば２〜１０００の範囲の整数など）であり得る。このようにして、環境内の第１フルオロフォアにより放出される超音波蛍光の空間的プロットまたはプロファイルが、以下でさらに説明されるように、取得され得る。
【００１２】
さらに、いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、２つ以上の超音波切り替え可能フルオロフォアの同時使用も含み得る。したがって本明細書で記載の方法は、いくつかの事例では、複数の異なる超音波切り替え可能フルオロフォアを使用する多重イメージングを含む多重超音波蛍光イメージングを許可または提供し得る。
【００１３】
加えていくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、（ａ）環境内に、第１超音波切り替え可能フルオロフォアおよび第２超音波切り替え可能フルオロフォアを配置することと、（ｂ）環境を超音波ビームに曝露させて、環境内に活性化領域を形成することと、（ｃ）第１フルオロフォアを活性化領域内に配置して、第１フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替えること、および／または、第２フルオロフォアを活性化領域内に配置して、第２フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替えることと、（ｄ）環境を電磁放射ビームに曝露させ、それにより第１フルオロフォアおよび／または第２フルオロフォアを励起させることと、（ｅ）第１フルオロフォアにより放出された第１超音波蛍光信号と第２フルオロフォアにより放出された第１超音波蛍光信号とのうちの少なくとも一方を含む第１フォトルミネセンス信号を環境内の第１場所において検出することと、（ｆ）第１フォトルミネセンス信号を、第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応する第１基底ベクトルと、第２フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応する第２基底ベクトルと、に直交分解することと、を含む。加えて、いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、（ｇ１）第１場所における第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対する基底ベクトル係数ａを判定することと、（ｇ２）第１場所における第２フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対する基底ベクトル係数ｂを判定することと、をさらに含む。本明細書で記載の方法は、（ｈ１）第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号と係数ａとを乗算して、第１場所における第１フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号を生成すること、および、（ｈ２）第２フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号と係数ｂとを乗算して、第１場所における第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号を生成することも、含み得る。さらに、以下でさらに説明されるように、ステップ（ｅ）〜（ｈ）の前述の処理を任意の所望回数だけ反復すると、環境内における任意の所望個数の追加的場所における第１フルオロフォアおよび／または第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号が生成され得る。
【００１４】
加えて、（ｉ１）第１場所における第１フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号と、ｎ個の追加的な場所における第１フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と、を組み合わせて、環境内における第１フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成すること、および、（ｉ２）第１場所における第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号と、ｎ個の追加的場所における第２フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と、を組み合わせて、環境内における第２フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成することにより、環境内の第１フルオロフォアおよび第２フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の別個の空間的プロットを生成することも可能である。さらに、第１フルオロフォアおよび第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号が環境内における１つまたは複数の場所に対して得られると、所望により、これらの信号のＳＲＮを、上記で記載したように、改善することが可能である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法で使用される超音波切り替え可能フルオロフォアは、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）供与体種およびＦＲＥＴ受容体種を含む。いくつかの係る事例では、フルオロフォアのＦＲＥＴ供与体種とＦＲＥＴ受容体種との間の距離は、超音波ビームの存在により変更される。例えばいくつかの実施形態では、フルオロフォアは、マイクロバブルの表面に取り付けられた１つまたは複数のＦＲＥＴ供与体種および１つまたは複数のＦＲＥＴ受容体種を含むマイクロバブルを含む。他の場合では、本明細書で記載の方法で使用される超音波切り替え可能フルオロフォアは熱応答性ポリマーを含む。加えて、いくつかの場合では、本明細書で記載のフルオロフォアの熱応答性ポリマーは、１つまたは複数の蛍光団を含むか、または、１つまたは複数の蛍光種（例えば１つまたは複数の蛍光染料分子など）に抱合される。他の事例では、本明細書で記載のフルオロフォアは、熱応答性ポリマーナノ粒子の表面に分散された、および／または、熱応答性ポリマーナノ粒子の表面に取り付けられた、蛍光物質を含む。さらに、いくつかの実施形態では本明細書で記載の超音波切り替え可能フルオロフォアは、近赤外線（ＮＩＲ）における蛍光放出プロファイルを、少なくとも約２の蛍光強度におけるオン・オフ比（ＩＯｎ／ＩＯｆｆ）を、少なくとも約１．５の蛍光寿命におけるオン・オフ比（τＯｎ／τＯｆｆ）を、および／または、わずか約１０℃のオン状態とオフ状態との間の遷移帯域幅（ＴＢＷ）を、を示す。
【００１６】
加えて、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法の生物学的環境は深部組織を含む。いくつかの場合では、生物学的環境は腫瘍脈管構造を含む。さらに、いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、少なくとも約１００の進入深さ／解像度比を示す。
【００１７】
これらの実施形態、および他の実施形態が、以下の詳細な説明において、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本明細書で記載の方法の一実施形態に係る超音波切り替え可能な蛍光処理を示す図である。
【図２】本明細書で記載の方法の一実施形態に係る超音波切り替え可能な蛍光処理を示す図である。
【図３】本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適である温度依存性フルオロフォアの蛍光強度および蛍光寿命のプロットを示す図である。
【図４】本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適であるフルオロフォアの構成要素の構造を示す図である。
【図５】本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適であるフルオロフォアの蛍光切り替え曲線を示す図である。
【図６】本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適であるフルオロフォアに関する蛍光データを示す図である。
【図７】本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適であるフルオロフォアの蛍光特性を測定するために使用されるシステムを示す図である。
【図８Ａ】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法の要素およびステップを示す図である。
【図８Ｂ】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法の要素およびステップを示す図である。
【図８Ｃ】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法のステップを示す図である。
【図９Ａ】本明細書で記載の一実施形態に係る方法により得られたＵＳＦ画像を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ａの画像に対応する比較画像を示す図である。
【図９Ｃ】本明細書で記載の一実施形態に係る方法により得られた蛍光プロファイルを示す図である。
【図９Ｄ】本明細書で記載の一実施形態に係る方法により得られた蛍光プロファイルを示す図である。
【図１０】本明細書で記載の方法の一実施形態に係る超音波切り替え可能な蛍光処理を示す図である。
【図１１】本明細書で記載の方法の一実施形態に係る超音波切り替え可能な蛍光処理を示す図である。
【図１２】本明細書で記載の方法の一実施形態に係る超音波切り替え可能な蛍光処理を示す図である。
【図１３】本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適であるフルオロフォアの構成要素の構造を示す図である。
【図１４】本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態に関するイメージング解像度と、フルオロフォア切り替え閾値と、のプロットを示す図である。
【図１５】本明細書で記載の方法の一実施形態に係る超音波切り替え可能な蛍光処理を示す図である。
【図１６】本明細書で記載の方法の一実施形態に係る超音波切り替え可能な蛍光処理を示す図である。
【図１７】本明細書で記載の方法の一実施形態に係る超音波切り替え可能な蛍光処理を示す図である。
【図１８Ａ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアにおける使用に対して好適な蛍光物質の構造を示す図である。
【図１８Ｂ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアにおける使用に対して好適な蛍光物質の構造を示す図である。
【図１９Ａ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの放出プロファイルを示す図である。
【図１９Ｂ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの放出プロファイルを示す図である。
【図１９Ｃ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの放出プロファイルを示す図である。
【図１９Ｄ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの放出プロファイルを示す図である。
【図１９Ｅ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの放出プロファイルを示す図である。
【図１９Ｆ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの放出プロファイルを示す図である。
【図２０Ａ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの放出プロファイルを示す図である。
【図２０Ｂ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの放出プロファイルを示す図である。
【図２１Ａ】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法の要素およびステップを示す図である。
【図２１Ｂ】図２１Ａの要素に対応するイメージング方法のステップを示す図である。
【図２１Ｃ】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法の要素およびステップを示す図である。
【図２１Ｄ】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法の要素およびステップを示す図である。
【図２１Ｅ】図２１Ｃおよび図２１Ｄの要素に対応するイメージング方法のステップを示す図である。
【図２１Ｆ】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法の要素およびステップを示す図である。
【図２１Ｇ】図２１Ｆの要素に対応するイメージング方法のステップを示す図である。
【図２２Ａ】本明細書で記載の一実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの放出プロファイルを示す図である。
【図２２Ｂ】図２２Ａのフルオロフォアに関連付けられたバックグラウンド信号の放出プロファイルを示す図である。
【図２２Ｃ】図２２Ａのフルオロフォアに対する超音波蛍光放出プロファイルを示す図である。
【図２２Ｄ】図２２Ａのフルオロフォアに対する超音波蛍光放出プロファイルを示す図である。
【図２２Ｅ】本明細書で記載の一実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの放出プロファイルを示す図である。
【図２２Ｆ】図２２Ｅのフルオロフォアに関連付けられたバックグラウンド信号の放出プロファイルを示す図である。
【図２２Ｇ】図２２Ｅのフルオロフォアに対する超音波蛍光放出プロファイルを示す図である。
【図２２Ｈ】図２２Ｅのフルオロフォアに対する超音波蛍光放出プロファイルを示す図である。
【図２３Ａ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの超音波蛍光放出プロファイルを示す図である。
【図２３Ｂ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの超音波蛍光放出プロファイルを示す図である。
【図２３Ｃ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの超音波蛍光放出プロファイルを示す図である。
【図２３Ｄ】本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの超音波蛍光放出プロファイルを示す図である。
【図２４Ａ】本明細書で記載の一実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの超音波蛍光放出プロファイルを示す図である。
【図２４Ｂ】本明細書で記載の一実施形態に係る超音波切り替え可能フルオロフォアの超音波蛍光放出プロファイルを示す図である。
【図２４Ｃ】本明細書で記載の一実施形態にしたがって検出されたフォトルミネセンス信号の全体を示す図である。
【図２５】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法の要素およびステップを示す図である。
【図２６】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法の要素およびステップを示す図である。
【図２７】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法の要素およびステップを示す図である。
【図２８】本明細書で記載の一実施形態に係るイメージング方法の要素およびステップを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書で記載の実施形態は、以下の詳細な説明、事例、および図面を参照することにより、より容易に理解され得る。一方、本明細書で記載の要素、装置、および方法は、詳細な説明、事例、および図面において提示される特定的な実施形態に限定されない。これらの実施形態が本発明の原理を単に例示するものであることを理解すべきである。多数の変更例および改変例が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者に容易に明らかとなることであろう。
【００２０】
加えて、本明細書で開示される全範囲が、当該の範囲に包含される任意のおよびすべての部分範囲を含むことを理解すべきである。例えば「１．０〜１０．０」の範囲が記載されている場合は、１．０以上の最小値で始まり１０．０以下の最大値で終わるあらゆる全部の部分範囲（例えば１．０〜５．３、４．７〜１０．０、または３．６〜７．９）が含まれるものと考えるべきである。
【００２１】
本明細書で開示される全範囲は、別に明記なき限り、当該範囲の端点を含むものと考えるべきである。例えば「５〜１０」の範囲は一般に、端点５および１０を含むものと考えるべきである。
【００２２】
さらに、「〜まで」という文言が分量または数量との関連で使用される場合、当該の分量が少なくとも検出可能な分量または数量であることを理解すべきである。例えば、特定の分量「まで」の分量において存在する物質は、検出可能な分量から、当該の特定された分量を含んで当該の分量まで、存在し得る。
【００２３】
一態様では、イメージング方法が本明細書で説明される。いくつかの実施形態では、イメージング方法は、オフ状態とオン状態との間の切り替え閾値を有する超音波切り替え可能フルオロフォアの集団を生物学的環境に配置することと、生物学的環境を超音波ビームに曝露させて、生物学的環境内に活性化領域を形成することと、を含み、活性領域は最高負圧および最高温度を有し、少なくとも１つのフルオロフォアの切り替え閾値は、活性化領域の最高負圧の約５０％であるか、または、最高温度の少なくとも約５０％である。この方法は、活性化領域内の全フルオロフォアのうちの少なくとも１つのフルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替えることと、少なくとも１つのフルオロフォアを電磁放射ビームで励起させることと、少なくとも１つのフルオロフォアにより放出された光を検出することと、をさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのフルオロフォアの切り替え閾値は、活性化領域の最高負圧または最高温度の、少なくとも６０％または少なくとも約７０％である。いくつかの場合では、少なくとも１つのフルオロフォアの切り替え閾値は、活性化領域の最高負圧または最高温度の、約６０％〜約１００％、約６０％〜約９０％、約７０％〜約１００％、約７０％〜約９５％、または、約７０％〜約９０％である。以下でさらに説明するように、係る切り替え閾値を選択するならば、いくつかの場合では、活性化領域の体積を、活性化領域を形成するために使用される超音波ビームの焦点ゾーンのサイズより小さいサイズへと効果的に縮小させることにより、イメージング解像度の改善が可能となる。
【００２４】
他の実施形態では、イメージングの方法は、オフ状態とオン状態との間の切り替え閾値を有する超音波切り替え可能フルオロフォアの集団を生物学的環境に配置することと、複数の異なる方向から生物学的環境を複数の超音波ビームに曝露させて、生物学的環境内に活性化領域を形成することと、を含み、超音波ビームの焦点ゾーンは少なくとも部分的に重なり合う。いくつかの場合では、例えば、２つの直交する超音波ビームが使用される。加えて、いくつかの事例では、フルオロフォアの切り替え閾値は、全超音波ビームのうちの１つの超音波ビームのみの焦点ゾーンにより提供される最高負圧または最高温度よりも大きい。この方法は、活性化領域内の全フルオロフォアのうちの少なくとも１つのフルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替えることと、少なくとも１つのフルオロフォアを電磁放射ビームで励起させることと、少なくとも１つのフルオロフォアにより放出された光を検出することと、をさらに含む。以下でさらに詳細に説明するように、本明細書で記載のように複数の超音波ビームを使用するならば、活性化領域のサイズが縮小されることにより、イメージング解像度の改善が可能となる。
【００２５】
さらに他の実施形態では、イメージングの方法は、オフ状態とオン状態との間の切り替え閾値を有する超音波切り替え可能フルオロフォアの集団を生物学的環境に配置することと、一定時間にわたるパルスビームの光パワーのＦＷＨＭに基づいて、生物学的環境を、わずか１００ｐｓのパルス幅を有する電磁放射のパルスビームに曝露させることと、を含む。この方法は、生物学的環境を超音波ビームに曝露させて、生物学的環境内に活性化領域を形成することと、活性化領域内の全フルオロフォアのうちの少なくとも１つのフルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替えることと、少なくとも１つのフルオロフォアを電磁放射の第２ビームで励起させることと、少なくとも１つのフルオロフォアにより放出された光を検出することと、をさらに含む。さらに、いくつかの場合では、パルスビームは、わずか約５０ｐｓの、またはわずか約１０ｐｓの、パルス幅を有する。いくつかの実施形態では、パルスビームは、約１ｐｓ〜約１００ｐｓの、約１ｐｓ〜約１０ｐｓの、約１ｐｓ〜約５０ｐｓの、約１０ｐｓ〜約１００ｐｓの、または、約１０ｐｓ〜約５０ｐｓの、パルス幅を有する。以下でさらに説明するように、生物学的環境を電磁放射のパルスビームへと本明細書で記載する様式で曝露させることは、いくつかの実施形態では、フルオロフォア放出の検出を時間的に分離することにより、生物学的環境内に存在する他の種からの放出と比較して、本方法の信号対雑音比（ＳＮＲ）の改善を可能にする。したがって、いくつかの場合では、少なくとも１つのフルオロフォアにより放出される光を検出するステップは、係る他の種の蛍光寿命に対応する遅延の後に実施される。加えて、いくつかの実施形態では、パルスビームの波長は、生物学的環境内に存在する１つまたは複数の種の吸収プロファイルと実質的に重なり合うよう、選択される。
【００２６】
さらに他の実施形態では、イメージングの方法は、（ａ）第１超音波切り替え可能フルオロフォアを、または超音波切り替え可能フルオロフォアの第１集団を、生物学的環境などの環境に配置することと、（ｂ）環境を超音波ビームに曝露させて、環境内に活性化領域を形成することと、（ｃ）第１フルオロフォアを活性化領域内に配置して、第１フルオロフォアをオフ状態からオン状態に切り替えることと、（ｄ）環境を電磁放射ビームに曝露させ、それにより第１フルオロフォアを励起させることと、を含む。いくつかの場合では、環境を電磁放射ビームに曝露させることは、環境に存在する少なくとも１つのフォトルミネセンスバックグラウンド種も励起させる。さらに、この方法は、（ｅ）第１フルオロフォアにより放出された第１超音波蛍光信号と第１バックグラウンド信号とのうちの少なくとも一方を含む第１フォトルミネセンス信号を環境内の第１場所において検出すること、をさらに含む。いくつかの事例では、第１バックグラウンド信号は、少なくとも１つのフォトルミネセンスバックグラウンド種により放出された第１バックグラウンドフォトルミネセンス信号を含む。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、（ｆ）第１フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定して、第１場所に対する第１相関係数を生成することも、含む。いくつかの場合では、第１基準信号は第１フルオロフォアの第１超音波蛍光信号に対応する。加えて、本明細書で記載の方法は、（ｇ）第１フォトルミネセンス信号と第１場所に対する相関係数とを乗算して、第１場所に対する第１修正済みフォトルミネセンス信号を生成することも含む。
【００２７】
さらに、環境内の第１場所におけるフォトルミネセンス信号の検出および処理を実施する前述のステップ（ｅ）〜（ｇ）を任意の所望回数だけ反復すると、環境内の複数の場所に対する複数の修正済みフォトルミネセンス信号が生成され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、（ｅ２）第１フルオロフォアにより放出された第２超音波蛍光信号と第２バックグラウンド信号とのうちの少なくとも一方を含む第２フォトルミネセンス信号を環境内の第２場所において検出することと、（ｆ２）第２フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定して、第２場所に対する相関係数を生成することと、（ｇ２）第２フォトルミネセンス信号と第２場所に対する相関係数とを乗算して、第２場所に対する第２修正済みフォトルミネセンス信号を生成することと、をさらに含む。
【００２８】
同様に、ステップ（ｅ）〜（ｇ）または（ｅ２）〜（ｇ２）の同一の処理を反復すると、環境内の第３場所における第３フォトルミネセンス信号からの第３修正済みフォトルミネセンス信号と、第３場所に対する相関係数と、が生成され得る。さらに一般的には、ｎ個の修正済みフォトルミネセンス信号が、環境内のｎ個の場所におけるｎ個のフォトルミネセンス信号から、およびｎ個の場所に対するｎ個の相関係数から、生成され得る。なおｎは、任意の所望の整数（例えば、２〜１０００の、２〜５００の、２〜１００の、２〜５０の、２〜３０の、または２〜２０の範囲の整数）であり得る。いくつかの場合では、ｎは１０００より大きい値であり得る。加えて、ｎ個の場所は、環境内の１つまたは複数の方向において連続的または不連続的である場所を含む、環境内の所望の場所の任意の集合であり得る。さらに、本明細書で記載の環境内の場所は、いくつかの実施形態では、環境内のボクセル、および／または、ｘ座標、ｙ座標、ならびにｚ座標のうちの１つまたは複数により特定される場所、であり得る。いくつかの場合では、例えば、１つの場所は、環境内の場所のラスタ走査に対して特定され得るｘｙ座標の値もしくは環境の順序対（ｘ，ｙ）またはｘｙｚ座標値（ｘ，ｙ，ｚ）を中心とするボクセルである。このようにして、環境内の第１フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットまたはプロファイルが取得され得る。加えて、以下でさらに説明するように、係るプロットは、上述の相関関係の算定および乗算のステップを実施することなく生成された別の同様のプロットと比較して、改善されたＳＮＲを有し得る。
【００２９】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で記載のイメージングの方法は、（ｅｎ）第１フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号と第ｎ追加的バックグラウンド信号とのうちの少なくとも一方を含む、環境内のｎ個の追加的場所におけるｎ個の追加的フォトルミネセンス信号を検出することと、（ｆｎ）ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定して、ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的相関係数を生成することと、（ｇｎ）ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号とｎ個の追加的相関係数とを乗算して、ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的修正済みフォトルミネセンス信号を生成することと、をさらに含み、ｎは１〜１０００の整数である。さらに、係る方法は、（ｈ）第１場所に対する第１修正済みフォトルミネセンス信号と、第２場所に対する第２修正済みフォトルミネセンス信号と、ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的修正済みフォトルミネセンス信号と、を組み合わせて、環境内の第１フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成することも含み得る。
【００３０】
以下でさらに説明するように、環境内の超音波切り替え可能フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを本明細書で記載のように生成することは、いくつかの実施形態では、存在し得るあらゆるバックグラウンドフォトルミネセンス（例えば蛍光性バックグラウンド種により放出されるバックグラウンド蛍光など）の強度を低下させることにより、本方法のＳＮＲの改善を可能にする。「バックグラウンド」種が、本明細書での参照目的のために、環境内に存在する超音波切り替え可能フルオロフォア以外の種であることを理解すべきである。さらに詳細には、バックグラウンド種は本方法のイメージング分析種ではない種であり得る。いくつかの事例では、バックグラウンド信号が組織自家蛍光を含むか、組織自家蛍光から構成されるか、または組織自家蛍光から実質的に構成されるよう、バックグラウンド種はイメージング対象の生物学的環境に存在する生体組織を含むか、係る生体組織から構成されるか、または係る生体組織から実質的に構成され得る。
【００３１】
加えて、いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、１つまたは複数の超音波切り替え可能フルオロフォアの同時使用を含み得る。したがって本明細書で記載の方法は、いくつかの事例では、複数の異なる超音波切り替え可能フルオロフォアを使用する多重化イメージングを含む多重超音波蛍光イメージングを許可または提供し得る。例えばいくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、（ａ）環境内に、第１超音波切り替え可能フルオロフォアおよび第２超音波切り替え可能フルオロフォアを配置することと、（ｂ）環境を超音波ビームに曝露させて、環境内に活性化領域を形成することと、（ｃ）第１フルオロフォアを活性化領域内に配置して、第１フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替えること、および／または、第２フルオロフォアを活性化領域内に配置して、第２フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替えることと、（ｄ）環境を電磁放射ビームに曝露させ、それにより第１フルオロフォアおよび／または第２フルオロフォアを励起させることと、（ｅ）第１フォトルミネセンス信号を環境内の第１場所において検出することと、を含む。第１フォトルミネセンス信号は、第１フルオロフォアにより放出された第１超音波蛍光信号と、第２フルオロフォアにより放出された第１蛍光信号と、第１バックグラウンド信号と、のうちの少なくとも１つを含み得る。さらに、この方法は、（ｆ）第１フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定して、第１場所に対する第１相関係数を生成することと、（ｇ）第１フォトルミネセンス信号と第１場所に対する第１相関係数とを乗算して、第１場所に対する第１修正済みフォトルミネセンス信号を生成することと、をさらに含み得る。
【００３２】
さらに、係る方法では、検出、相関関係算出、および他の信号処理ステップ（ｅ）〜（ｇ）は、ただ１つの超音波切り替え可能フルオロフォアまたは超音波切り替え可能フルオロフォアの集団を使用する実施形態に対して、同様のように実施され得、および／または、本明細書で記載のように反復され得る。例えば、いくつかの場合では、相関係数は、１つの超音波切り替え可能フルオロフォアに対して本明細書で記載の様式で判定される。加えて、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、（ｅｎ）環境内のｎ個の追加的場所におけるｎ個の追加的フォトルミネセンス信号を検出すること、をさらに含む。なお、ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号は、第１フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号と、第２フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号と、第ｎ追加的バックグラウンド信号と、のうちの少なくとも１つを含む。係る方法は、（ｆｎ）ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定して、ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第１相関係数を生成するステップ、および（ｇｎ）ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号とｎ個の追加的第１相関係数とを乗算して、ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的修正済みフォトルミネセンス信号を生成するステップも含み得、ｎは１〜１０００の整数である。
【００３３】
したがって、１つの超音波切り替え可能フルオロフォアを使用する実施形態に対して上述したように、本明細書で記載の方法は、環境内に存在する超音波切り替え可能フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロファイルまたはプロットを生成するために使用され得る。さらに、特定の空間的プロットに関連付けられたフルオロフォアが基準信号の選択により決定され得ることを理解すべきである。例えば、いくつかの場合では、第１基準信号は第１フルオロフォアの第１超音波蛍光信号に対応する。係る事例では、本明細書で記載の方法は、（ｈ）第１場所に対する第１修正済みフォトルミネセンス信号とｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的修正済みフォトルミネセンス信号とを組み合わせて、環境内の第１フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成することをさらに含み得る。加えて、環境内の第２フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成することも可能である。係るプロットを生成するために、基準信号は、第１フルオロフォアよりもむしろ第２フルオロフォアの第１超音波蛍光信号に対応するよう、選択され得る。
【００３４】
さらに、本明細書で記載のいくつかの実施形態では、複数の異なる基準信号が、本明細書で記載のフォトルミネセンス信号の相関関係を算定（連続的な算定を含む）するために使用され得る。例えば、いくつかの事例では、本明細書で記載の方法は、（ｆ２）第１フォトルミネセンス信号と第２基準信号との相関関係を算定して、第１場所に対する第２相関係数を生成することと、（ｇ２）第１フォトルミネセンス信号と第１場所に対する第２相関係数とを乗算して、第１場所に対する第２修正済みフォトルミネセンス信号を生成することと、をさらに含み得る。いくつかの場合では、第１基準信号は第１フルオロフォアの第１超音波蛍光信号に対応し、第２基準信号は第２フルオロフォアの第１超音波蛍光信号に対応する。
【００３５】
理論に拘束されることを意図するものではないが、係る異なる基準信号が、本明細書で記載の超音波切り替え可能フルオロフォアを含む、超音波切り替え可能フルオロフォアの一意的なフォトルミネセンス放出プロファイルにより、多重化イメージングを取得するために使用され得るものと考えられる。係る超音波切り替え可能フルオロフォアは、一意的な超音波蛍光信号を有し得る。さらに、超音波蛍光信号は、波長領域において、および／または、時間的または時間領域において、一意的であり得る。したがって、本明細書で記載のいくつかの実施形態では、第１超音波切り替え可能フルオロフォアおよび第２超音波切り替え可能フルオロフォアは、異なる超音波蛍光放出プロファイルを有し得る。例えば、いくつかの場合では、プロファイルのピーク放出波長が異なり、それにより、フルオロフォアは異なる色の電磁放射を放出する。いくつかの事例では、フルオロフォアは異なる時間強度減衰プロファイルを有する。さらに一般的には、本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態では、第１フルオロフォアおよび第２フルオロフォアの超音波蛍光放出プロファイルは数学的に直交であるか、相関関係を有さないか、または弱い相関関係を有する。係る事例では、１つのフルオロフォアの超音波蛍光放出から実質的に構成される信号が、他のフルオロフォアの超音波蛍光放出に基づく基準信号に対して相関関係の算定が実施されると、小さい相関係数が得られることとなる。例えば、いくつかの場合では、第２フルオロフォアの超音波蛍光信号に対応する基準信号を使用して第１フルオロフォアの第１超音波蛍光信号の相関関係を算定すると、小さい相関係数（例えば０．３より小さい）が生成され、その逆もまた成り立つ。
【００３６】
さらに、環境内の第１場所におけるフォトルミネセンス信号の検出および処理を実施する前述のステップ（ｅ）〜（ｇ）を任意回数だけ反復すると、環境内の複数の場所に対する複数の修正済みフォトルミネセンス信号が生成され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、複数の超音波切り替え可能フルオロフォアを使用する本明細書で記載の方法は、（ｅｎ）環境内のｎ個の追加的場所におけるｎ個の追加的フォトルミネセンス信号を検出すること、をさらに含む。なお、ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号は、第１フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号と、第２フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号と、第ｎ追加的バックグラウンド信号と、のうちの少なくとも１つを含む。この方法は、（ｆ１ｎ）ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号と第１基準信号との相関関係を算定して、ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第１相関係数を生成することと、（ｇ１ｎ）ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号とｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第１相関係数とを乗算して、ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第１修正済みフォトルミネセンス信号を生成することと、（ｆ２ｎ）ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号と第２基準信号との相関関係を算定して、ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第２相関係数を生成することと、（ｇ２ｎ）ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号とｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第２相関係数とを乗算して、ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第２修正済みフォトルミネセンス信号を生成することと、も含み得る。なお、ｎは上述の整数（例えば１〜１０００の整数）である。
【００３７】
加えて、単一の超音波切り替え可能フルオロフォアの使用に対して上述したように、本明細書で記載の方法は、１つまたは複数のフルオロフォアに対する超音波蛍光放出の空間的プロットを生成するために使用され得る。例えば、いくつかの事例では、本明細書で記載の方法は、（ｈ１）第１場所に対する第１修正済みフォトルミネセンス信号とｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第１修正済みフォトルミネセンス信号とを組み合わせて、環境内の第１フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成することをさらに含む。さらに、係る方法は、（ｈ２）第１場所に対する第２修正済みフォトルミネセンス信号と、ｎ個の追加的場所に対するｎ個の追加的第２修正済みフォトルミネセンス信号と、を組み合わせて、環境内の第２フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成することも含み得る。
【００３８】
さらに、２つの異なる超音波切り替え可能フルオロフォアに対して上述した同一の処理が、３つ以上の異なるフルオロフォアを使用する多重化イメージングのためにも使用され得ることを理解されたい。一般に、任意の所望個数の異なる超音波切り替え可能フルオロフォアが使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、３つ、４つ、または５つの異なる超音波切り替え可能フルオロフォアが使用され得る。さらに、係る場合では、本明細書で記載の方法は、それぞれ３つ、４つ、または５つのフルオロフォアに対応する３つ、４つ、または５つの基準信号を用いる３つ、４つ、または５つの相関関係算定および乗算のステップ（例えばステップ（ｆ１ｎ）、（ｇ１ｎ）、（ｆ２ｎ）、および（ｇ２ｎ）で説明されたステップなど）を実施することを含み得る。一般に、ｍ個までの異なる超音波切り替え可能フルオロフォアが使用され得る。なおｍは、５、１０、２０、５０、または１００であり得る。
【００３９】
上記で記載の多重化されたＵＳＦイメージングの方法は、イメージング対象の環境内のいずれの場所も、ｍ個の異なる超音波切り替え可能フルオロフォアのうちの２つ以上を含まない場合、特に有用であり得る。一方、いくつかの場合では、異なるフルオロフォアが環境内の共通のボクセルに存在するかまたは存在し得る場合でさえも、複数の異なる超音波切り替え可能フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の複数の空間的プロットを生成することも可能である。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、（ａ）第１超音波切り替え可能フルオロフォアおよび第２超音波切り替え可能フルオロフォアを環境内に配置することと、（ｂ）環境を超音波ビームに曝露させて、環境内に活性化領域を形成することと、（ｃ）第１フルオロフォアを活性化領域内に配置して、第１フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替えること、および／または、第２フルオロフォアを活性化領域内に配置して、第２フルオロフォアをオフ状態からオン状態へと切り替えることと、（ｄ）環境を電磁放射ビームに曝露させ、それにより第１フルオロフォアおよび／または第２フルオロフォアを励起させることと、を含む。この方法は、（ｅ）環境内の第１場所における第１フォトルミネセンス信号を検出することをさらに含み得る。なお第１フォトルミネセンス信号は、第１フルオロフォアにより放出された第１超音波蛍光信号と、第２フルオロフォアにより放出された第１超音波蛍光信号と、のうちの少なくとも一方を含む。加えて、いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、（ｆ）第１フォトルミネセンス信号を、第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応する第１基底ベクトルと、第２フルオロフォアの正規化された超音波信号に対応する第２基底ベクトルと、に直交分解することも含む。さらに、いくつかの実施形態では、この方法は、（ｇ１）第１場所における第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対する基底ベクトル係数ａを判定することと、（ｇ２）第１場所における第２フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対する基底ベクトル係数ｂを判定することと、をさらに含む。さらに、この方法は、（ｈ１）第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号と係数ａとを乗算して、第１場所における第１フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号を生成すること、および、（ｈ２）第２フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号と係数ｂとを乗算して、第１場所における第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号を生成することも、含み得る。「分離」された超音波蛍光信号とは、本明細書における参照目的のために、ＵＳＦイメージング実験により検出されたより複雑な信号（例えば、異なる超音波蛍光信号の組み合わせを含む、信号の組み合わせを含み得る本明細書で記載の検出されたフォトルミネセンス信号など）から取り出された、解離された、または明確化された、超音波蛍光信号を指し得る。したがって、本明細書で記載の様式で方法を実施することにより、イメージング対象の環境内の２つ以上のフルオロフォアから放出された信号が互いに区別されることが、たとえこれらのフルオロフォアが環境内の同一のおおよその位置（例えば同一のボクセル）に存在していたとしても、可能となり得る。
【００４０】
さらに、ステップ（ｅ）〜（ｈ）の前述の処理を任意の所望回数だけ反復すると、環境内における任意の所望個数の追加的場所における第１フルオロフォアおよび／または第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号が生成され得る。したがって、いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、（ｅｎ）環境内のｎ個の追加的場所におけるｎ個の追加的フォトルミネセンス信号を検出することをさらに含み得る。なお、ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号は、第１フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号および第２フルオロフォアにより放出された第ｎ追加的超音波蛍光信号のうちの少なくとも一方を含む。係る方法は、（ｆｎ）ｎ個の追加的フォトルミネセンス信号を、第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応するｎ個の追加的第１基底ベクトルと、第２フルオロフォアの正規化された超音波信号に対応するｎ個の追加的第２基底ベクトルと、に直交分解することも、含み得る。加えて、この方法は、（ｇ１ｎ）ｎ個の追加的場所における第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対するｎ個の追加的基底ベクトル係数ａｎを判定することと、（ｇ２ｎ）ｎ個の追加的場所における第２フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対するｎ個の追加的基底ベクトル係数ｂｎを判定することと、（ｈ１ｎ）第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号とｎ個の追加的係数ａｎとを乗算して、ｎ個の追加的場所における第１フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号を生成することと、（ｈ２ｎ）第２フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号とｎ個の追加的係数ｂｎとを乗算して、ｎ個の追加的場所における第２フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号を生成することと、をさらに含み得る。上述のように、ｎは任意の所望の整数（例えば１〜１０００の整数）であり得る。
【００４１】
加えて、上述のように、環境内の第１フルオロフォアおよび第２フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の別個の空間的プロットを生成することも可能である。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、（ｉ１）第１場所における第１フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号と、ｎ個の追加的場所における第１フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と、を組み合わせて、環境内の第１フルオロフォアにより放出された音波蛍光の空間的プロットを生成すること、および、（ｉ２）第１場所における第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号と、ｎ個の追加的場所における第２フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と、を組み合わせて、環境内の第２フルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成すること、をさらに含む。
【００４２】
さらに、第１フルオロフォアおよび第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号が環境内の１つまたは複数の場所に対して取得されると、所望により、これらの信号のＳＮＲの改善が上述の様式で可能となる。例えば、いくつかの事例では、本明細書で記載の方法は、（ｊ１）第１フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号と第１基準信号との相関関係を算定して、第１場所に対する第１基準信号に対する第１相関係数を生成することと、（ｋ１）第１フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号と第１基準信号に対する第１相関係数とを乗算して、第１場所に対する第１フルオロフォアの第１修正済み分離された超音波蛍光信号を生成することと、（ｊ２）第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号と第２基準信号との相関関係を算定して、第１場所に対する第２基準信号に対する第１相関係数を生成することと、（ｋ２）第２フルオロフォアの分離された超音波蛍光信号と第２基準信号に対する第１相関係数とを乗算して、第１場所に対する第２フルオロフォアの第１修正済み分離された超音波蛍光信号を生成することと、をさらに含む。さらに、係る実施形態では、第１基準信号は第１フルオロフォアの第１超音波蛍光信号に対応し得、第２基準信号は第２フルオロフォアの第１超音波蛍光信号に対応し得る。
【００４３】
分離された超音波蛍光信号の係る相関関係算定および修正をイメージング対象の環境内の任意の所望個数の場所に対して実施することが可能であることをさらに理解すべきである。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、（ｊ１ｎ）第１フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と第１基準信号との相関関係を算定して、ｎ個の追加的場所に対する第１基準信号に対するｎ個の追加的相関係数を生成することと、（ｋ１ｎ）第１フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と第１基準信号に対するｎ個の追加的相関係数とを乗算して、ｎ個の追加的場所に対する第１フルオロフォアのｎ個の追加的修正済み分離された超音波蛍光信号を生成することと、（ｊ２ｎ）第２フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と第２基準信号との相関関係を算定して、ｎ個の追加的場所に対する第２基準信号に対するｎ個の追加的相関係数を生成することと、（ｋ２ｎ）第２フルオロフォアのｎ個の追加的分離された超音波蛍光信号と第２基準信号に対するｎ個の追加的相関係数とを乗算して、ｎ個の追加的場所に対する第２フルオロフォアのｎ個の追加的修正済み分離された超音波蛍光信号を生成することと、を含み得る。なお、第１基準信号は第１フルオロフォアの第１超音波蛍光信号に対応し、第２基準信号は第２フルオロフォアの第１超音波蛍光信号に対応する。
【００４４】
さらに所望により、複数の場所に対する係る修正済み分離された超音波蛍光信号は、上述のステップ（ｉ１）または（ｉ２）で記載のように、環境内のフルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成するために使用され得る。加えて、「修正済み」超音波蛍光信号が、１つまたは複数の信号処理ステップ（例えば本明細書で記載の１つまたは複数の乗算ステップなど）を通して修正された超音波蛍光信号を指し得ることを理解すべきである。
【００４５】
さらに、２つの異なる超音波切り替え可能フルオロフォアに対して上述した同一の処理が、３つ以上の異なるフルオロフォアを使用する多重化イメージングのためにも使用され得ることを理解すべきである。一般に、任意の所望個数の異なる超音波切り替え可能フルオロフォアが使用され得る。例えば、いくつかの実施形態では、３つ、４つ、または５つの異なる超音波切り替え可能フルオロフォアが使用され得る。さらに、係る場合では、本明細書で記載の方法は、それぞれ３つ、４つ、または５つのフルオロフォアに対応する３つ、４つ、または５つの基準信号を用いる３つ、４つ、または５つの相関関係算定および乗算のステップ（例えばステップ（ｆ１ｎ）、（ｇ１ｎ）、（ｆ２ｎ）、および（ｇ２ｎ）で説明されたステップなど）を実施することを含み得る。一般に、ｍ個までの異なる超音波切り替え可能フルオロフォアが使用され得る。なおｍは、５、１０、２０、５０、または１００であり得る。一方、本明細書でさらに説明するように、単一のボクセル内の係る多重化イメージングに関しては、ｍ個の異なる超音波切り替え可能フルオロフォアのｍ個の超音波蛍光放出プロファイルが、数学的に直交であるか、相関関係を有さないか、または弱い相関関係を有することが好ましいことを理解すべきである。
【００４６】
ここで、本明細書で方法のステップに注目すると、本明細書で記載のイメージングの方法の特定のステップは、超音波切り替え可能フルオロフォアを、または超音波切り替え可能フルオロフォアの集団を、環境内に配置することを含む。本発明の目的と一致しないあらゆる環境も使用され得る。いくつかの実施形態では、環境は生物学的環境である。本明細書で記載の方法の環境は、非生物学的環境であってもよい。いくつかの場合では、例えば、生物学的環境は生体内環境（例えば、組織、器官、血管、または生体の他の部分など）である。いくつかの実施形態では、生物学的環境は腫瘍または腫瘍脈管構造を含む。他の場合では、生物学的環境は生体外環境（例えば組織培養など）を含む。本明細書で記載の方法の生物学的環境は、生物学的ファントム物質または組織模倣性ファントム物質（例えば寒天、シリコーン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）ゲル、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル、またはゼラチン中における油の分散など）を含むか、または係るファントム物質により置き換えられ得る。他のファントム物質も使用され得る。
【００４７】
さらに、いくつかの実施形態では、生物学的環境は深部組織を含む。「深部」組織」とは、本明細書での参照目的のために、器官、組織培養、または、生物学的環境に関連付けられた他のより大きい構造体の外側表面（例えばファントム物質の場合では、ファントム物質の外側表面）の少なくとも約１ｃｍ下方に位置する組織（またはファントム物質の場合には、ファントム物質の内部領域）を含む。いくつかの実施形態では、例えば、深部組織は外側表面の下方約１ｃｍ〜約１０ｃｍ、または約１ｃｍ〜約５ｃｍに位置する。いくつかの場合では、深部組織は外側表面の下方において１０ｃｍを超える位置にある。さらに、外側表面は、いくつかの実施形態では、器官の外皮表面を含む。
【００４８】
加えて、本発明の目的と一致しない、任意の超音波切り替え可能フルオロフォアが、または、異なる超音波切り替え可能フルオロフォアの組み合わせが、使用され得る。「超音波切り替え可能」なフルオロフォアとは、本明細書での参照目的のために、超音波ビームに曝露されるとそれに応答してオン状態とオフ状態との間で切り替わるよう動作するフルオロフォアを含む。超音波ビームは、フルオロフォアの切り替え応答に対して、直接的または間接的に応答し得る。例えば、いくつかの場合では、超音波ビームとフルオロフォアとの直接的な相互作用が生じると、フルオロフォアの蛍光状態間が切り替わる。他の場合では、超音波ビームとフルオロフォアの中間的環境または微環境との間に直接的な相互作用が生じると、フルオロフォアの微環境の少なくとも１つの特性が変化する。係る場合では、超音波ビームにより誘導される環境的変化に応答して、フルオロフォアはオン蛍光状態とオフ蛍光状態との間で切り替わり得る。かくしてフルオロフォアは、超音波ビームへの曝露に応答して、間接的に切り替え可能となり得る。
【００４９】
フルオロフォアの「オン」状態は、本明細書における参照目的のために、（１）フルオロフォアの蛍光強度が、蛍光強度が比較的低いフルオロフォアの「オフ」状態と比較して比較的高い状態、または、（２）フルオロフォアの蛍光寿命が、蛍光寿命が比較的短いフルオロフォアの「オフ」状態と比較して比較的長い状態、を含む。さらに、両方の場合において、オン状態およびオフ状態は、臨界的切り替えパラメータ（例えば温度または負圧など）の関数としてプロットされたとき、蛍光の強度または寿命のプロファイルにおいて階段関数を実質的に画成する。オン状態におけるよりもオフ状態においてより長い寿命を有するフルオロフォアは、フルオロフォアから放出された光子の時間ゲーティング検出または時間遅延検出（例えば、励起の後の比較的長い時間の後に受容された光子のみがＵＳＦ信号の一部として検出器によりカウントされる時間ゲーティング検出）を使用する本明細書で記載の方法における使用に対して特に好適である。いくつかの場合では、フルオロフォアのオン状態は、フルオロフォアの理論的最大蛍光強度の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％を示し、フルオロフォアのオフ状態は、フルオロフォアの理論的最大蛍光強度のわずか５０％、わずか約３０％、わずか約１０％またはわずか約５％を示す。
【００５０】
オン状態対オフ状態の存在に対する物理的原因は異なり得る。例えば、いくつかの場合では、フルオロフォアの蛍光強度または蛍光寿命は、環境状態における変化（例えば、いくつかの熱応答性ポリマー、ｐＨ感受性の化学種、または感圧性の物質により示される変化など）に応答するフルオロフォアの構造変化または化学変化に起因して変化する。いくつかの場合では、フルオロフォアの蛍光強度または蛍光寿命は内部蛍光クエンチに応答して変化する。なお、係るクエンチは超音波の存在により直接的または間接的に誘導され得る。
【００５１】
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で記載のフルオロフォアは、ＦＲＥＴ供与体種およびＦＲＥＴ受容体種を含み、ＦＲＥＴ供与体種とＦＲＥＴ受容体種との間の距離は超音波ビームの存在により変更される。ＦＲＥＴ供与体種は第１蛍光種または他の発色団であり得、ＦＲＥＴ受容体種は第２蛍光種または他の発色団であり得る。係る場合では、当業者により理解されるように、供与体種と受容体種との間のＦＲＥＴエネルギー伝達により、供与体種の蛍光クエンチが生じ得る。したがって、受容体種はフルオロフォアの蛍光クエンチ種であるとみなされ得る。本発明の目的と一致しないあらゆる供与体−受容体のペアが本明細書で記載のＦＲＥＴベースのフルオロフォアにおいて使用され得る。例えば、いくつかの場合では、供与体種はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６を含み、受容体種はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を含む。受容体種および供与体種の他の組み合わせも可能である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載のフルオロフォアは、１つまたは複数のＦＲＥＴ供与体種を含むマイクロバブルと、マイクロバブルの外部表面に取り付けられた１つまたは複数のＦＲＥＴ受容体種と、を含み、マイクロバブルは超音波ビームの存在に応答してサイズが変化するよう動作する。サイズにおける変化により、ＦＲＥＴ供与体種とＦＲＥＴ受容体種との間の距離に増減が生じ、それによりＦＲＥＴエネルギー伝達効率に増減が生じ得る。その結果、マイクロバブルの蛍光クエンチおよび全体的な蛍光強度が、マイクロバブルのサイズに基づいて変動し得る。
【００５３】
本明細書で記載のマイクロバブルは、任意のサイズを有し、本発明の目的と一致しない任意の化学種から形成され得る。いくつかの場合では、マイクロバブルは、約１μｍ〜約１０μｍの範囲または約１μｍ〜約５μｍの範囲の直径を有し得る。他のサイズのマイクロバブルも使用され得る。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で記載のマイクロバブルは、ポリマー物質（例えば有機ポリマー物質など）から形成された外殻により包囲されたガスコアを含む。他の場合では、外殻は脂肪性物質から形成される。いくつかの実施形態では、マイクロバブルは、アルブミン、ガラクトース、脂質、および六フッ化硫黄から形成された外殻を含む。加えて、本明細書で記載のマイクロバブルのガスコアは、空気、窒素、およびペルフルオロカーボン（例えばオクタフルオロプロパンなど）を含み得る。さらに、いくつかの場合では、本明細書で記載のマイクロバブルは、市販のマイクロバブル（例えばＳｏｎｏＶｕｅＴＭ、ＯｐｔｉｓｏｎＴＭ、ＩｍａｇｅｎｔＴＭ、ＤｅｆｉｎｉｔｙＴＭ、またはＴａｒｇｅｓｔａｒＴＭマイクロバブルなど）から形成される。本明細書で記載のＦＲＥＴ供与体種および／または受容体種は、本発明の目的と一致しない任意の様式で係るマイクロバブルの表面に取り付けられ得る。いくつかの場合では、例えば、供与体種および／または受容体種は、カルボジイミド、マレイミド、またはビオチン−ストレプトアビジン結合方式のうちの１つまたは複数を使用して市販のマイクロバブルの外部表面に取り付けられる。
【００５４】
加えて、いくつかの実施形態では、本明細書で記載のフルオロフォアは熱応答性ポリマーを含む。「熱応答性」ポリマーとは、本明細書における参照目的のために、温度依存性の様式で変化する物理的特性または化学的特性を有するポリマーを含む。なお係る変化は不連続的な変化または２値的な変化である。例えば、いくつかの場合では、熱応答性ポリマーの物理的構造または極性は温度依存性の形で変化し、熱応答性ポリマーは、閾値温度より下では第１の構造を示し、閾値温度より上では第２の実質的に異なる構造を示す。いくつかの実施形態では、例えば、熱応答性ポリマーは、閾値温度より下では拡張されたコイル状または鎖状の構造を示し、閾値温度より上では密集型または球状構造を示す。いくつかの係る場合では、閾値温度はポリマーの「下方臨界溶解温度」（ＬＣＳＴ：ｌｏｗｅｒ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）とも呼ばれ得る。
【００５５】
本発明の目的と一致しない任意の熱応答性ポリマーが使用され得る。いくつかの実施形態では、熱応答性ポリマーは、アクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、アクリル酸、およびアリルアミンのうちの１つまたは複数を有する、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）またはＮ−イソプロピルアクリルアミドのコポリマーを含む。他の場合では、熱応答性ポリマーは、ポリ（Ｎ−ビニルカプロラクタム）（ＰＶＣＬ）またはプルロニックポリマーなどのポロキサマーを含む。他の熱応答性ポリマーも使用され得る。
【００５６】
加えて、いくつかの場合では、本明細書で記載のフルオロフォアの熱応答性ポリマーは、１つまたは複数の蛍光団を含むか、または、１つまたは複数の蛍光種（例えば１つまたは複数の蛍光染料分子など）に抱合される。熱応答性ポリマーは、本発明の目的に一致しない任意の様式において蛍光種に抱合され得る。例えば、いくつかの場合では、熱応答性ポリマーは、１つまたは複数の共有結合（例えば、１つまたは複数のエステル結合、または１つまたは複数のアミド結合）を通して蛍光種に連結される。
【００５７】
図１では、本明細書で記載の一実施形態に係る熱応答性フルオロフォアを使用する超音波により切り替えられる蛍光処理が概略的に示されている。図１で示されているように、熱応答性ポリマーが蛍光種に抱合されるとフルオロフォアが提供される。フルオロフォアは上述のように鎖状構造および球状構造を有し、この構造は温度依存性である。さらに一方の構造から他方の構造への遷移が生じると、蛍光種の蛍光強度または蛍光寿命が変化する。本明細書でさらに説明されるように、蛍光強度または蛍光寿命における変化は、ポリマーが球状構造と比較して鎖状構造にあるときの蛍光種の微環境における差異に起因し得る。例えば、いくつかの場合では、フルオロフォアにより経験されるポリマー環境の極性および／または粘度は、ポリマーが鎖状構造にあるかまたは球状構造にあるかどうかに応じて変化する。
【００５８】
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で記載のフルオロフォアは、熱応答性ポリマーのナノ粒子の表面に分散および／または取り付けられた蛍光物質を含む。さらに、蛍光物質の蛍光特性は、ポリマーナノ粒子の構造、極性、または他の物理的特性もしくは化学的特性の変化に依存し得る。加えて、特性変化は温度依存性の変化であり得る。このようにして、熱応答性ポリマーナノ粒子に温度変化が生じると、蛍光物質の蛍光強度および／または蛍光寿命が変化し得る（蛍光物質のオン状態と蛍光物質のオフ状態との間の変化を含む）。
【００５９】
例えば、いくつかの実施形態では、熱応答性ポリマーナノ粒子は温度依存性の極性を示し得、ナノ粒子に分散された蛍光物質は極性依存性の蛍光強度および／または蛍光寿命を示し得る。したがってナノ粒子の温度が変化すると、フルオロフォアの蛍光強度および／または蛍光寿命が変化し得る。
【００６０】
他の典型的な実施形態では、熱応答性ポリマーナノ粒子は、閾値温度より下では親水性の内部を有し、閾値温度より上では疎水性の内部を有し得る。したがって係るナノ粒子は、極性溶媒または非極性溶媒に分散されたとき、温度依存性のサイズを示し得る。例えば、閾値温度よりも低い水または他の極性溶媒に分散された場合、ナノ粒子は、ナノ粒子の親水性の内部に水が存在するため、より大きいサイズを示し得る。同様に、閾値温度より上では、ナノ粒子は、現時点では疎水性となったナノ粒子の内部から水が排出されるため、より小さいサイズを示し得る。かくして、ナノ粒子に分散された蛍光物質が温度依存性の濃度を有することとなり、その結果、フルオロフォア全体の蛍光特性が温度依存性となり得る。このプロセスは図２で概略的に示されている。
【００６１】
さらに他の典型的な実施形態では、超音波切り替え可能フルオロフォアは、ポリマーナノ粒子またはミセルが蛍光物質に対するナノカプセルとして作用するよう、蛍光色素などの蛍光物質をポリマーナノ粒子またはミセルの内部に組み込むことにより、形成される。さらに、ポリマーナノ粒子は、熱応答性ポリマー（上述の熱応答性ポリマーなど）から形成され得る。本明細書で記載のナノカプセルを形成するために好適なポリマーの非限定的な例としては、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ９８、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）、およびアクリルアミド（ＡＡｍ）またはＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）を有するＰＮＩＰＡＭのコポリマーが挙げられる。さらに、いくつかの事例では、ナノ粒子またはナノカプセルは、上述の熱応答性ポリマーとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とを重合することにより、および／または、ペンダント基としてのＰＥＧを熱可塑性ポリマーに抱合させることにより、形成され得る。係るフルオロフォアは、いくつかの場合では、以下でさらに説明されるように、切り替え閾値を有し得る。なお切り替え閾値はＰＥＧの含有により少なくとも部分的に制御される。
【００６２】
本明細書で記載の熱応答性ポリマーまたはポリマーナノカプセルなどのポリマーナノ粒子は、本発明の目的と一致しないサイズまたは形状を有し得る。いくつかの実施形態では、例えば、熱応答性ポリマーナノ粒子は実質的に球形状であり、約１０ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲の、約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍの範囲の、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の、または約７０ｎｍ〜約１５０ｎｍの範囲の、直径を有する。いくつかの場合では、ポリマーナノカプセルは実質的に球形状であり、約１００ｎｍより小さい、または約５０ｎｍより小さい、直径を有する。いくつかの事例では、ポリマーナノカプセルは、約２０ｎｍ〜約９０ｎｍの範囲の、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍの範囲の、または約２０ｎｍ〜約７０ｎｍの範囲の、サイズを有する。他のサイズおよび形状も可能である。
【００６３】
さらに、本発明の目的と一致しない任意の蛍光物質を、熱応答性ポリマーナノ粒子または他のポリマーナノ粒子に分散させ、および／または取り付けた場合にも、本明細書で記載のフルオロフォアが形成され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で記載のように、蛍光物質は、極性の影響を受ける蛍光強度および／または蛍光寿命を示す。他の場合では、蛍光物質は、温度依存性、粘度依存性、ｐＨ依存性、および／またはイオン強度依存性の、蛍光強度および／または蛍光寿命を示す。
【００６４】
本明細書で記載のいくつかの実施形態での使用に対して好適な蛍光物質の非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−ベンゾフラザンスルホンアミド（ＤＢＤ）、４−（２−アミノエチルアミノ）−７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル）ベンゾフラザン（ＤＢＤ−ＥＤ）、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ｄｙｌｉｔｅ−７００−２ＢなどのＤｙｌｉｔｅ−７００、ＩＲ−８２０、３，３’−ジエチルチアトリカルボシアニンヨージド（ＤＴＴＣＩ）、ＬＳ−２７７、ＬＳ−２８８、シアニン色素、ローダミン６ＧもしくはローダミンＢなどのローダミン色素、またはクマリンなどの有機色素が挙げられる。いくつかの事例では、蛍光物質はアザジピロメテンを含む。加えて、いくつかの場合では、蛍光物質は、ＩＩ族〜ＶＩ族半導体ナノ結晶（例えばＺｎＳまたはＣｄＳＥなど）を、もしくはＩＩＩ族〜Ｖ族半導体ナノ結晶（例えばＩｎＰまたはＩｎＡｓなど）を含む半導体ナノ結晶または量子ドットなどの無機種を含む。他の事例では、蛍光物質はランタニド種を含む。本明細書で記載の超音波切り替え可能フルオロフォアにおける使用に対して好適である追加的な非限定的な例としては、Ａｍｉｎら、“Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｅｒｒｏｃｅｎｅ−Ａｚａｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈａｎｅ  Ｄｏｎｏｒ−Ａｃｃｅｐｔｏｒ  Ｄｙａｄｓ  ａｎｄ  Ｔｒｉａｄｓ，”  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ａ  ２０１１，  １１５，  ９８１０−９８１９、Ｂａｎｄｉら、“Ａ  Ｂｒｏａｄ−Ｂａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｍｉｔｔｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｒｉａｄ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ２０１３，  ４９，  ２８６７−２８６９、Ｊｏｋｉｃら、“Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐｈｏｔｏｓｔａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐＨ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＢＦ２−Ｃｈｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｔｒａａｒｙｌａｚａｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈａｎｅ  Ｄｙｅｓ，”  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１２，  ８４，  ６７２３−６７３０、Ｊｉａｎｇら、“Ａ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｔｕｒｎ−Ｏｎ  ＮＩＲ  Ｐｒｏｂｅ  ｆｏｒ  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ，”  Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２０１２，  １０，  １９６６−１９６８、および、Ｋｕｃｕｋｏｚら、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ａｚａ−ｂｏｒｏｎ−ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈａｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｘｙ  ａｎｄ  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  Ｔｗｏ−Ｐｈｏｔｏｎ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｃｒｏｓｓ−Ｓｅｃｔｉｏｎ，”  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ａ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４７  （２０１２），  ２４−２９、に記載の蛍光物質が挙げられる。上記の文献の全部は参照することにより本明細書に援用される。他の蛍光物質も使用され得る。
【００６５】
本明細書で記載の超音波切り替え可能フルオロフォアは、本発明の目的と一致しない任意の蛍光放出プロファイルを有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、可視光を含む放出プロファイルまたは電磁スペクトルの可視領域を中心とする放出プロファイル（例えば４５０ｎｍ〜７５０ｎｍの範囲）を示す。いくつかの場合では、フルオロフォアは、赤外線（ＩＲ）光を含む放出プロファイルまたは電磁スペクトルのＩＲ領域を中心とする放出プロファイルを示す。例えば、いくつかの事例では、本明細書で記載のフルオロフォアは、近赤外線（ＮＩＲ、７５０ｎｍ〜１．４μｍ）、短波長赤外線（ＳＷＩＲ、１．４〜３μｍ）、中波長赤外線（ＭＷＩＲ、３〜８μｍ）、または、長波長赤外線（ＬＷＩＲ、８〜１５μｍ）を中心とする放出プロファイルを示す。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で記載のフルオロフォアは、水および／または生体組織が吸収最小値を有する波長と重なり合う放出プロファイル（例えば、約７００ｎｍ〜約８００ｎｍの、または約１．２５μｍ〜約１．３５μｍの範囲の波長など）を有する。加えて、いくつかの場合では、本明細書で記載の超音波切り替え可能フルオロフォアの集団は、異なる放出プロファイルを有するフルオロフォアを含む。例えば、いくつかの場合では、係る集団のうちの第１フルオロフォアはＮＩＲにおいて放出し、係る集団のうちの第２フルオロフォアは電磁スペクトルの可視領域において放出し得る。さらに、いくつかの事例では、第１フルオロフォアおよび第２フルオロフォアは、以下でさらに説明するように、異なる時間強度減衰プロファイルを有し得る。いくつかの実施形態では、第１フルオロフォアおよび第２フルオロフォアの超音波蛍光放出プロファイルは数学的に直交するか、または相関関係を有さない。このようにして多重化イメージングが達成され得る。
【００６６】
さらに、いくつかの事例では、本明細書で記載のフルオロフォアは、少なくとも約１ｎｓの、少なくとも約３ｎｓの、または少なくとも約１０ｎｓの、蛍光寿命を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で記載のフルオロフォアは、約１ｎｓ〜約１５ｎｓの範囲の、約１ｎｓ〜約１０ｎｓの範囲の、約１ｎｓ〜約４ｎｓの範囲の、約３ｎｓ〜約７ｎｓの範囲の、約３ｎｓ〜約５ｎｓの範囲の、または約１０ｎｓ〜約１５ｎｓの範囲の、蛍光寿命を示す。
【００６７】
加えて、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の超音波切り替え可能フルオロフォアは、フルオロフォアのオン状態およびオフ状態に関する１つまたは複数の望ましい特徴を示す。例えば、いくつかの場合では、フルオロフォアは、蛍光強度における高いオン・オフ比（ＩＯｎ／ＩＯｆｆ）、蛍光寿命における高いオン・オフ比（τＯｎ／τＯｆｆ）、オン状態とオフ状態との間の鋭利な遷移帯域幅（ＴＢＷ）、および／または、例えば調整可能な切り替え閾値温度（Ｔｔｈ）または調整可能な切り替え閾値圧力（Ｐｔｈ）などの調整可能な切り替え閾値（Ｓｔｈ）、を示す。これらの測定規準は図３を参照してさらに説明され得る。
【００６８】
図３では、温度依存性のフルオロフォアの蛍光強度および蛍光寿命のプロットが温度の関数として示されている。一方、同一の原理および命名法が、圧力依存性の蛍光に対して、または本明細書で記載の他のいくつかの変数に依存するフルオロフォアに対して、類似の方法で適用可能であることを理解すべきである。係る事例では、図３の温度軸は、図３の外観を実質的に変更させることなく、圧力軸により、または、蛍光の切り替えに関連する他の変数に対応する軸により、置き換えられ得る。図３を参照すると、Ｔｔｈは切り替え閾値温度を指す。ＩＯｎ／ＩＯｆｆは、閾値温度より高い温度の範囲におけるフルオロフォアの平均蛍光強度と、閾値温度より低い温度の範囲におけるフルオロフォアの平均蛍光強度と、の比を指す。同様に、τＯｎ／τＯｆｆは、閾値温度より高い温度の範囲におけるフルオロフォアの平均蛍光寿命と、閾値温度より低い温度の範囲におけるフルオロフォアの平均蛍光寿命と、の比を指す。いくつかの実施形態では、これらの平均値は、切り替え閾値の大きさの約５％〜約１００％である大きさを有する温度の範囲であるが遷移帯域幅ＴＢＷの外側に存在する範囲において、取得される。ＴＢＷは、フルオロフォアが階段関数の形でオン状態からオフ状態に切り替わる温度値（または同様に、圧力または他の変数値）の範囲を指す。換言すると、ＴＢＷはオン状態とオフ状態との間のステップの幅を指す。ＴＢＷが小さいほど、フルオロフォアの蛍光強度プロファイルは、オン状態とオフ状態との間で不連続性を有する真の階段関数との類似性が大きくなる。図３では、ＩＯｎ値は、約３３℃〜約４８℃温度範囲（約１６℃、または２６℃のＴｔｈ値の約６２％の範囲）における平均強度として取得され、ＩＯｆｆ値は約２３℃〜約２５℃の範囲（約３℃、または２６℃のＴｔｈ値の約１２％の範囲）における平均強度として取得される。一般に、オン状態およびオフ状態における平均蛍光強度を判定するために使用される温度値の範囲は、特定のイメージング用途に対する対象となる温度値の範囲に基づき得る。本明細書で記載の超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下の表１で与えられるＩＯｎ／ＩＯｆｆ値、τＯｎ／τＯｆｆ値、ＴＢＷ値、およびＴｔｈ値のうちのいずれかを示し得る。
【表１】
0006767377.tif 000002
【００６９】
本明細書で記載のイメージングの方法は、いくつかの実施形態では、生物学的環境などの環境を電磁放射のパルスビームに曝露させる（生物的環境を超音波ビームに曝露させる前を含む）ことも含む。電磁放射のパルスビームは、ピコ秒のパルス幅（例えば、わずか１００ｐｓのパルス幅）を有し得る。なおバルス幅は一定時間にわたるパルスビームの光パワーのＦＷＨＭとして定義される。パルスビームは本発明の目的と一致しない任意の波長およびパワーを有し得る。いくつかの場合では、例えば、パルスビームの波長は、上記でさらに説明されているように、生物学的環境に存在する１つまたは複数の種の吸収プロファイルと実質的に重なり合うよう、選択される。いくつかの実施形態では、パルスビームは可視波長、またはＮＩＲ波長を有する。他のパルスビームも使用され得る。
【００７０】
本明細書で記載の方法は、生物学的環境などの環境を１つまたは複数の超音波ビームに曝露させて、環境内に活性化領域を形成することも含む。超音波ビームは、本発明の目的と一致しない任意の超音波周波数を有し得る。いくつかの実施形態では、超音波ビームは、約２０ｋＨｚより大きい周波数または約２ＭＨｚより大きい周波数を有する、振動する音圧波を含む。いくつかの場合では、本明細書で記載の超音波ビームは、約５ＧＨｚまでの周波数、または約３ＧＨｚまでの周波数を有する。いくつかの実施形態では、超音波ビームは、約２０ｋＨｚ〜約５ＧＨｚの、約５０ｋＨｚ〜約１ＧＨｚの、約５００ｋＨｚ〜約４ＧＨｚの、約１ＭＨｚ〜約５ＧＨｚの、約２ＭＨｚ〜約２０ＭＨｚの、約２ＭＨｚ〜約１０ＭＨｚの、約５ＭＨｚ〜約２００ＭＨｚの、約５ＭＨｚ〜約１５ＭＨｚの、約２００ＭＨｚ〜約１ＧＨｚの、約５００ＭＨｚ〜約５ＧＨｚの、または、約１ＧＨｚ〜約５ＧＨｚの、周波数を有する。
【００７１】
加えて、超音波ビームは、本発明の目的と一致しない任意のパワーを有し得る。いくつかの実施形態では、例えば、超音波ビームは、約０．１Ｗ／ｃｍ２〜約１０Ｗ／ｃｍ２の範囲の、約０．１Ｗ／ｃｍ２〜約５Ｗ／ｃｍ２の範囲の、約０．５Ｗ／ｃｍ２〜約５Ｗ／ｃｍ２の範囲の、約１Ｗ／ｃｍ２〜約１０Ｗ／ｃｍ２の範囲の、または、約１Ｗ／ｃｍ２〜約５Ｗ／ｃｍ２の範囲の、パワーを有する。他の場合では、超音波ビームは、約１００Ｗ／ｃｍ２〜約５０００Ｗ／ｃｍ２の範囲の、または、約１００Ｗ／ｃｍ２〜約３０００Ｗ／ｃｍ２の範囲の、パワーを有する。いくつかの場合では、高いパワー（例えば本明細書で記載の高いパワーなど）を有する超音波ビームを使用すると、活性化領域内で非線形性効果が生じることとなり得る。さらに、いくつかの実施形態では、活性化領域の効果的なサイズがこのようして小さくなると、イメージング解像度が改善されることとなる。
【００７２】
環境は、本発明の目的と一致しない任意の様式で、超音波ビームに曝露され得る。例えば、いくつかの実施形態では、生物学的環境が、制限された期間の間のみ、本明細書で記載の超音波ビームに曝露される。いくつかの場合では、例えば、超音波ビームは、１秒よりも短い期間にわたり、または約５００ｍｓよりも短い期間にわたり、環境に対して提供される。いくつかの実施形態では、超音波ビームは、約３００ｍｓより短い期間にわたり、約１００ｍｓより短い期間にわたり、約５０ｍｓより短い期間にわたり、または約１０ｍｓより短い期間にわたり、環境に提供される。いくつかの場合では、超音波ビームは、約１ｍｓ〜約１秒、約１ｍｓ〜約５００ｍｓ、約１ｍｓ〜約３００ｍｓ、約１ｍｓ〜約１００ｍｓ、約１ｍｓ〜約５０ｍｓ、約１ｍｓ〜約１０ｍｓ、約１０ｍｓ〜約３００ｍｓ、約１０ｍｓ〜約１００ｍｓ、約１０ｍｓ〜約５０ｍｓ、または、約５０ｍｓ〜約１００ｍｓにわたり、環境に提供される。生物学的環境を超音波ビームに曝露させる曝露時間が短い場合、いくつかの実施形態では、蛍光信号の時間ゲーティングが可能となり、それにより、１つまたは複数の望ましくないかまたは非検体の蛍光信号（例えば組織自家蛍光信号またはオン状態にランダムに切り替わるフルオロフォアからの信号）から、所望のＵＳＦ信号を時間的に分離することが可能となる。
【００７３】
さらに、超音波ビームは持続波ビームまたはパルスビームもしくは変調ビームであり得る。変調超音波ビームまたはパルス超音波ビームの使用は、いくつかの実施形態では、ＵＳＦ信号の周波数ゲーティング検出を可能にすることにより、本明細書で記載の方法のＳＮＲの改善をさらに可能にする。例えば、いくつかの場合では、パルス超音波ビームまたは変調超音波ビームは、特定の周波数または変調を有する超音波曝露を提供する。その結果、対応するＵＳＦ信号も同一の特定の周波数または変調を示し得る。したがって、いくつかの係る場合では、ロックイン増幅器が、特定の周波数または変調に対する検出器の感度を大きくさせ、それにより、本方法の全体的な感度およびＳＮＲを大きくさせるために、使用される。
【００７４】
本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態では、単一の超音波ビームが、単一の超音波トランスデューサ（例えば高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）トランスデューサなど）を使用して、環境に向かって誘導される。他の事例では、複数の超音波ビームが、複数の超音波トランスデューサを使用して、環境に向かって誘導される。さらに、いくつかの場合では、第１超音波ビームは第１方向から第１角度で環境に向かって誘導され、第２超音波ビームは、第１角度および／または第１方向とは異なる、第２角度で、および／または第２方向から、環境に向かって誘導される。いくつかの実施形態では、例えば、第１方向および第２方向は、直交するか、または実質的に直交する（例えば８０〜１００度で隔てられた角度）。他の場合では、これらの方向は、８０度よりも小さい角度で、または、１００度よりも大きい角度で、隔てられる。さらに、所望により、追加的超音波ビームも、追加的方向から、または追加的角度で、環境に向かって誘導され得る。係る場合では、ビームの焦点ゾーンが互いに重なり合うかまたは交わり合って、これらのビームの交差箇所において活性化領域が形成され得る。かくして活性化領域は、活性化領域を生成するために使用される単一の超音波ビームの焦点ゾーンよりも小さい体積または断面を有することとなり、それにより、イメージング解像度が改善され得る。いくつかの場合では、例えば、活性化領域は、約２ｍｍより小さい、１．５ｍｍよりも小さい、または約１ｍｍより小さい横方向寸法および／または軸方向寸法を有する。いくつかの実施形態では、活性化領域は、約７００μｍより小さい、または約５００μｍより小さい横方向寸法および／または軸方向寸法を有する。いくつかの実施形態では、活性化領域は、約３００μｍ〜約２ｍｍ、約４００μｍ〜約１．５ｍｍ、約４００μｍ〜約１ｍｍ、約４００μｍ〜約７００μｍ、または、約４００μｍ〜約５００μｍ横方向寸法および／または軸方向寸法を有する。いくつかの場合では、横方向寸法および軸方向寸法の両方が、約１ｍｍより小さい、または約７００μｍより小さいサイズを含む、本明細書で記載のサイズを有する。さらに、いくつかの実施形態では、活性化領域の横方向寸法および軸方向寸法が異なる場合、比較的非等方性の活性化領域が提供されることとなる。代替的に、他の事例では、横方向寸法および軸方向寸法は実質的に同一である場合、比較的「正方形」のまたは等方性の活性化領域が提供される。
【００７５】
「活性化領域」は、本明細書での参照目的のために、本明細書で記載の超音波切り替え可能フルオロフォアがオフ状態からオン状態へと切り替わり得る環境の領域を含む。例えば、いくつかの場合では、活性化領域は、環境の他の部分と比較して負圧の領域を含む。同様に、他の事例では、活性化領域は高温領域を含む。本明細書でさらに説明されるように、本明細書で記載の活性化領域の温度、圧力、または他の特性は、生物学的環境に分散されたフルオロフォアの切り替え閾値に基づいて選択され得る。例えば、いくつかの場合では、１つまたは複数の超音波ビームは、約３０℃より高い、約３５℃より高い、または約３０℃〜約５０℃の範囲の平均温度または最高温度を有する活性化領域を形成するよう構成される。他の実施形態では、活性化領域は、約１０ｋＰａ〜約１５０ｋＰａの範囲、または約８０ｋＰａ〜約１２０ｋＰａの範囲の平均負圧または最高負圧を有する。さらに、本明細書でさらに説明されるように、活性化領域のサイズ、形状、および／または他の特性は、活性化領域を形成するために使用された１つまたは複数の超音波ビームの個数および／またはパワーにより決定され得る。いくつかの場合では、例えば、活性化領域のサイズおよび形状は、単一の超音波ビームの焦点ゾーンにより画定される。他の場合では、活性化領域は、複数の超音波ビームの焦点ゾーンの重なり合うにより画定される。
【００７６】
本明細書で記載のフルオロフォアは、本発明の目的と一致しない任意の様式で活性化領域内に配置され得る。いくつかの場合では、フルオロフォアは、環境の近傍エリアから活性化領域へと分散されることにより、環境の活性化領域に進入するか、または環境の活性化領域内に配置される。他の事例では、活性化領域は、環境内の特定場所に形成され、係る特定場所では、フルオロフォアまたはフルオロフォアの集団が発見される可能性があり、または発見され得ないことが知られている。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の超音波ビームが、環境において、または環境内で、ラスタ走査されると、複数の活性化領域が環境内の異なる場所において連続的に生成される。
【００７７】
本明細書で記載のイメージング方法は、環境を電磁放射ビームに曝露させること、および／または、電磁放射ビームを用いて少なくとも１つのフルオロフォアをオン状態に励起させることも、含む。フルオロフォアは、本発明の目的と一致しない任意の様式で、電磁放射ビームを用いて励起され得る。いくつかの実施形態では、例えば、フルオロフォアはレーザ励起源（例えばダイオードレーザなど）を使用して励起される。他の事例では、フルオロフォアは、１つまたは複数の発光ダイオード（ＬＥＤ）または広帯域励起源を使用して励起される。さらに、本明細書で記載の励起源は、本発明の目的と一致しない任意波長の光を提供し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で記載のフルオロフォアは、可視光、ＮＩＲ光、またはＩＲ光を含む電磁放射ビームで励起される。他の場合では、電磁放射ビームは紫外線（ＵＶ）光を含む。
【００７８】
本明細書で記載の方法は、環境内または環境内の特定の場合内で放出されたフォトルミネセンス信号または他の光を検出することも含む。いくつかの実施形態では、例えば、方法は、少なくとも１つの超音波切り替え可能フルオロフォアにより放出された光を検出することを含む。フルオロフォアにより放出された光は、本発明の目的と一致しない任意の様式で検出され得る。いくつかの実施形態では、例えば、オン状態にある少なくとも１つのフルオロフォアにより放出された光を検出することは、時間ゲーティング様式または周波数ゲーティング様式（本明細書で記載の時間ゲーティング様式または周波数ゲーティング様式を含む）で光を検出することを含む。いくつかの場合では、オン状態にある少なくとも１つのフルオロフォアにより放出された光は、オフ状態にあるフルオロフォアの蛍光寿命よりも長い時間遅延の後に、または生物学的環境に存在する他の種の蛍光寿命よりも長い時間遅延の後に、検出される。例えば、いくつかの実施形態では、オン状態にある少なくとも１つのフルオロフォアにより放出された光は、生物学的環境に存在する非フルオロフォア種の自家蛍光寿命（例えば約４ｎｓまで、または約５ｎｓまでとなり得る組織の自家蛍光寿命など）よりも長い時間遅延の後に検出される。加えて、本発明の目的と一致しない任意の検出器も使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、１つまたは複数の光電子増倍管（ＰＭＴ）検出器が使用され得る。他の構成も可能である。
【００７９】
同様に、環境内の１つまたは複数の場所におけるフォトルミネセンス信号を検出することは、本発明の目的と一致しない任意の様式でも実施され得る。いくつかの場合では、例えば、環境内の複数の場所における複数のフォトルミネセンス信号は、環境をラスタ走査することにより、検出される。環境内の異なる場所において一連の活性化領域が超音波ビームにより連続的に生成されるよう、係るラスタ走査は、環境全域において、または環境内において、１つまたは複数の超音波ビームのラスタ走査することを含み得る。いくつかの事例では、本明細書で記載の検出器を、環境内の１つの場所から他の場所へと移動または走査させることも可能である。係る様式で検出器を移動または操作させることにより、本方法の検出エリアを大きくすることが可能である。他の場合では、電荷結合素子（ＣＣＤ）撮像センサまたはカメラなどの２次元検出器が、複数の場所におけるフォトルミネセンス信号を同時に検出するために使用され得る。
【００８０】
本明細書で記載のイメージング方法は、いくつかの実施形態では、１つまたは複数の検出されたフォトルミネセンス信号と１つまたは複数の基準信号との相関関係を算定して、イメージング対象の環境内の１つまたは複数の場所に対する１つまたは複数の相関係数を生成することも含む。係る方法は、１つまたは複数の検出されたフォトルミネセンス信号と、１つまたは複数の場所に対する１つまたは複数の相関係数と、を乗算して、１つまたは複数の修正済みフォトルミネセンス信号を生成することも含み得る。前述の相関関係算定および乗算のステップは、本発明の目的と一致しない任意の様式でも実施され得る。さらに本明細書で記載の方法の「基準」信号は、イメージング対象の環境に配置されたフルオロフォアと同一の発光または蛍光放出プロファイルを有する信号であり得る。したがって、「基準」信号は、本明細書でさらに説明するように、検出された信号がそれに対して比較される標準信号として使用され得る。加えて、係る基準信号は、１つまたは複数のフォトルミネセンス信号がイメージング対象の環境から検出されたときに使用されるのと同一または実質的に同様の実験条件下で、生成または測定され得ることが理解されるべきである。例えば、以下に挙げる実験条件、すなわち、環境を超音波ビームに曝露させる様式（例えば、使用される超音波ビームの個数、パワー、および方向）と、環境を電磁放射ビームに曝露させる様式（例えば、使用される放射源のパワー、波長、および種類（パルスビームまたは持続波））と、フォトルミネセンス信号を検出する様式（例えば、使用される検出器の種類および配置）と、環境の性質（例えば、イメージングの深度、および使用される組織の種類）と、が、基準信号の生成または測定のために、および、１つまたは複数のフォトルミネセンス信号の検出のために、一定に、または実質的に一定（実験誤差内で）に、保持され得る。
【００８１】
本明細書で記載のいくつかの実施形態では、フォトルミネセンス信号と基準信号との相関関係を算定することは、フォトルミネセンス信号の時間強度減衰プロファイルと、基準信号の時間強度減衰プロファイルと、を比較することを含む。係る比較は、いくつかの場合では、検出されたフォトルミネセンス信号が基準信号に対してどれほど密接に対応するかについての評価指標として作用する相関係数を生成し得る。理論に拘束されることを意図するものではないが、時間領域における超音波切り替え可能フルオロフォアの一意的なスペクトルシグネチャが、以下でさらに説明されるように、フォトルミネセンス信号および基準信号の時間強度減衰プロファイルが比較されるとき、特に有用な相関係数の生成を可能にすると考えられる。いくつかの実施形態では、環境なの場所に対する相関係数は、式（１）にしたがって生成される。
【数１】
0006767377.tif 000003
式中、ρＩ，Ｒは第１場所に対する相関係数であり、Ｉ（ｔ）は第１場所における第１フォトルミネセンス信号の時間強度減衰プロファイルであり、Ｒ（ｔ）は第１基準信号に対する時間強度減衰プロファイルであり、ＮはＩ（ｔ）およびＲ（ｔ）における時間点の個数である。
【００８２】
さらに、いくつかの場合では、本明細書で記載の様式で生成された相関係数は、ビン分割された相関係数である。「ビン分割」された相関係数は、本明細書での参照目的のために、すべての可能な相関係数値のビン分割に基づく値が割り当てられた相関係数である。例えば、いくつかの場合では、相関係数の値は、最初に上記の式（１）にしたがって決定され得る。式（１）を使用することにより、すべての相関係数は理論的に−１〜＋１の範囲の値を有し得る。一方、本明細書で記載の相関関係算定ステップに関しては、負の値は物理的には無意味となり得る。したがって、式（１）により相関係数の負の値が与えられる場合、負の相関係数を強制的にゼロの値とするビン分割処理が使用され得る。相関係数の他の値も、改善されたＳＮＲが提供されるよう、「変更」またはビン分割され得る。したがって、いくつかの場合では、ビン分割処理における次のステップとして、特定の相関係数の「実際」値が、係数値の複数の「ビン」のうちの１つに特定の相関係数を配置するために、使用され得る。加えて、本明細書で記載の乗算ステップ（例えば上述のステップ（ｇ）または（ｇｎ））を実施するために、同一のビン内のすべての相関係数が同一の値（例えば、相関係数をビン分割するために使用されるビン分割表により提供される値など）を有するものとして処理され得る。本明細書で記載のいくつかの実施形態における使用に対して好適なビン分割表の１つの非限定的な例が、以下の表２で提供される。一方、他のビン分割表も使用され得ることを理解すべきである。
【表２】
0006767377.tif 000004
【００８３】
加えて、本明細書で記載の相関関係算定および／または乗算ステップが、本発明の目的と一致しない、任意のコンピュータもしくはソフトウェアアルゴリズムを、または、他のハードウェアおよび／またはソフトウェアを、使用して実施され得ることがさらに理解される。いくつかの場合では、例えば、１つまたは複数のＭＡＴＬＡＢアルゴリズムが使用される。
【００８４】
本明細書で記載の方法は、いくつかの実施形態では、環境内の複数の場所に対する複数の修正済みフォトルミネセンス信号を組み合わせて、環境内のフルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成することも含む。修正済みフォトルミネセンス信号は、本発明の目的と一致しない任意の様式で組み合わされ得る。いくつかの場合では、例えば、修正済みフォトルミネセンス信号が組み合わされると、１つまたは複数の軸に沿った距離の関数として蛍光強度のプロットが提供される。１つの実施形態における距離の関数としての蛍光強度のプロットが例えば図２２で示されている。他の実施形態では、修正済みフォトルミネセンス信号が組み合わされると、環境内の２次元または３次元の関数として蛍光強度のプロットが提供される。修正済みフォトルミネセンス信号は、他の様式での組み合わせも可能である。
【００８５】
さらに、上述のように、本明細書で記載の方法にしたがって生成された空間的プロットは、本明細書で記載の相関関係算定および乗算ステップを実施することなく生成された同様のプロットと比較して、改善されたＳＮＲを有し得る。例えば、いくつかの場合では、本明細書で記載の環境内のフルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットは、相関関係算定ステップが本明細書で記載の様式で実施されなかった場合に環境（または同様の環境）内のフルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットのＳＮＲの、少なくとも約５０％大きい、少なくとも約７０％大きい、少なくとも約１００％大きい、少なくとも約１５０％大きい、少なくとも約２００％大きい、少なくとも約２５０％大きい、少なくとも約３００％大きい、少なくとも約４００％大きい、少なくとも約５００％大きい、少なくとも約６００％大きい、少なくとも約７００％大きい、少なくとも約８００％大きい、少なくとも約９００％大きい、少なくとも約１０００％大きい、ＳＮＲを有し得る。前述のパーセンテージが、２つの関連するＳＮＲ値における差異を、低い方のＳＮＲ値で除算し、その値に１００倍することにより、判定されたものであることを理解すべきである。いくつかの事例では、本明細書で記載の方法を使用して得られたＳＮＲは、本明細書で記載の相関関係算定ステップを含まない同様の方法により得られたＳＮＲよりも、約２０〜３００％大きい、約１５〜２５０％大きい、約１５〜２００％大きい、約１５〜１００％大きい、約５０〜３００％大きい、約５０〜２５０％大きい、約５０〜２００％大きい、約５０〜１５０％大きい、約５０〜１００％大きい、約７０〜３００％大きい、約７０〜２５０％大きい、約１００〜３００％大きい、約１００〜２５０％大きい、約１００〜２００％大きい、約１５０〜３００％大きい、約１５０〜２５０％大きい、約２００〜３００％大きい、または、約２００〜２５０％大きい。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書で記載の環境内のフルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットは、少なくとも約８０の、少なくとも約１００の、少なくとも約１５０の、少なくとも約２００の、少なくとも約２５０の、少なくとも約３００の、少なくとも約３５０の、または、少なくとも約４００のＳＮＲを有し得る。いくつかの事例では、本明細書で記載の様式で生成された空間的プロットのＳＮＲは、約８０〜約４００の範囲、約１００〜約３５０の範囲、約１５０〜約３５０の範囲、約２００〜約３５０の範囲、約２５０〜約３５０の範囲、約３００〜約４００の範囲、または、約３００〜約３５０の範囲である。本明細書で記載の様式で提供された空間的プロットの非限定的な例が、以下の実施例１０で、図示され、さらに説明される。
【００８６】
本明細書で記載の空間的プロットのＳＮＲの値が、本発明の目的と一致しない任意の様式で決定され得ることに注意すべきである。いくつかの場合では、空間的プロットのＳＮＲは以下のように決定される。第１に、正規化されたＵＳＦ画像の放出プロファイルを使用して、プロファイルのピーク強度およびＦＷＨＭが決定される。次に、ピーク波長はＦＷＨＭの値の３倍である帯域幅を有する信号範囲の中心として割り当てられる。次に、この信号範囲の外側のデータの全部がバックグラウンドとして取り扱われる。次に、バックグラウンドの標準偏差が計算され、放出プロファイルのノイズとして取り扱われる。次に、プロファイルのＳＮＲは、ピーク強度をノイズで除算することにより、計算される。さらに、所望により、複数の測定に対するＳＮＲが決定され、平均される。平均ＳＮＲが、ＵＳＦ画像のＳＮＲとして得られ得る。
【００８７】
加えて、本明細書で記載の方法は、いくつかの場合では、１つまたは複数のフォトルミネセンス信号を、第１フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応する第１基底ベクトルと、第２フルオロフォアの正規化された超音波信号に対応する第２基底ベクトルと、に直交分解することを含む。係る方法は、環境内の複数の場所における複数のフルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対する基底ベクトル係数を判定することも含み得る。フォトルミネセンス信号は、本発明の目的と一致しない任意の様式で分解され得る。例えば、いくつかの事例では、フォトルミネセンス信号は、コンピュータもしくはソフトウェア・アルゴリズム、または他のハードウェア（例えばＭＡＴＬＡＢ曲線当てはめアルゴリズムなど）を使用して、基底ベクトルに分解される。同様に、フォトルミネセンス信号が基底ベクトルに分解されると、以下でさらに説明されるように、基底ベクトルの係数は、任意の好適なコンピュータまたはソフトウェア・アルゴリズム（例えばＭＡＴＬＡＢアルゴリズムなど）を使用して、判定され得る。加えて、フルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号と適切な係数とを乗算して、環境内の特定の場所におけるフルオロフォアの分離された超音波蛍光信号を生成することは、本発明の目的と一致しない任意の様式で実施され得る。例えば、いくつかの事例では、ＭＡＴＬＡＢアルゴリズムなどのアルゴリズムが使用され得る。
【００８８】
本明細書で記載の方法は、いくつかの場合では、複数の場所における１つまたは複数のフルオロフォアの分離された超音波蛍光信号を組み合わせて、環境内の１つまたは複数のフルオロフォアにより放出された超音波蛍光の空間的プロットを生成することも含む。分離された超音波蛍光信号は、本発明の目的と一致しない任意の様式で組み合わされ得る。いくつかの場合では、例えば、分離された信号が組み合わされると、１つまたは複数の軸に沿った距離の関数として蛍光強度のプロットが提供される。他の実施形態では、分離された信号が組み合わされると、環境内の２次元または３次元の関数として蛍光強度のプロットが提供される。したがって、分離された超音波蛍光信号を本明細書で記載の様式で組み合わせることは、環境内の１次元、２次元、または３次元における複数のフルオロフォアの多重化イメージングを提供し得る。
【００８９】
上述のように、本明細書で記載のイメージング方法は、いくつかの実施形態では、改善された進入深さ／解像度比（ＤＲＲ）を示し得る。イメージング方法の「進入深さ」は、本明細書における参照目的のために、イメージング対象内部における超音波ビームの強度が、表面におけるその初期値の１／ｅ（約３７パーセント）まで低下するイメージング対象の表面下方の深さとして定義される。方法の「解像度」は、本明細書における参照目的のために、顕微鏡的解像度（すなわち、別個の物体の区別が可能なサイズ）であり、これは、所与の寸法における活性化領域のＦＷＨＭと等しい。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、少なくとも１００のＤＲＲを示す。他の場合では、本明細書で記載の方法は、少なくとも約２００、少なくとも約３００、または少なくとも約４００のＤＲＲを示す。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の方法は、約５００までのＤＲＲを示す。いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、約１００〜約５００の範囲の、約１００〜約４００の範囲の、約１００〜約３００の範囲の、または、約２００〜約５００の範囲の、ＤＲＲを示す。さらに、本明細書で記載の方法の進入深さは、いくつかの実施形態では、１００ｍｍまで、５０ｍｍまで、または、３０ｍｍまで、となり得る。いくつかの場合では、進入深さは、約１０ｍｍ〜約１００ｍｍの範囲、約１０ｍｍ〜約６０ｍｍの範囲、約１０ｍｍ〜約５０ｍｍの範囲、約２０ｍｍ〜約９０ｍｍの範囲、または、約２０ｍｍ〜約５０ｍｍの範囲、である。加えて、本明細書で記載の方法の解像度は、いくつかの実施形態では、約１００μｍより小さい、約７０μｍより小さい、約５０μｍより小さい、または、約３０μｍより小さい。いくつかの場合では、解像度は、約１０μｍ〜約１００μｍの範囲、約１０μｍ〜約７０μｍの範囲、約１０μｍ〜約５０μｍの範囲、約１０μｍ〜約３０μｍの範囲、約２０μｍ〜約１００μｍの範囲、約２０μｍ〜約８０μｍの範囲、約２０μｍ〜約５０μｍの範囲、または、約３０μｍ〜約７０μｍの範囲である。
【００９０】
本明細書で記載のイメージング方法が、本発明の目的と一致しない、本明細書で記載のステップの任意の組み合わせを含み得、機材および物質の任意の組み合わせを使用し得ることが理解される。例えば、いくつかの場合では、本明細書で記載の方法は、熱応答性ポリマーを含む１つまたは複数のフルオロフォアを深い生体組織に配置することと、２つの直交するＨＩＦＵトランスデューサを使用して活性化領域を形成することと、時間ゲーティング様式でフルオロフォアからの放出を検出し、それにより、約２００より大きいＤＲＲを提供することと、を含む。さらに、いくつかの事例では、係る方法は、環境内の複数の場所に対する複数の相関係数を生成した後に、および／または、１つまたは複数のフォトルミネセンス信号を直交分解し、その後に、複数のフルオロフォアに対する分離された超音波蛍光信号を生成した後に、フルオロフォアの超音波蛍光放出の空間的プロットを生成することをさらに含む。他の組み合わせおよび構成も可能である。
【００９１】
本明細書で記載のいくつかの実施形態について、以下の非限定的な事例においてさらに例示する。
【００９２】
実施例１
超音波切り替え可能フルオロフォア
一般事項
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係るイメージング方法における使用に対して好適な一連の超音波切り替え可能フルオロフォアまたは造影剤が、環境の影響を受けやすいＮＩＲ色素、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）を熱応答性ポリマーナノ粒子（ＮＰ）に封入することにより、準備された。ＮＰは、本明細書で記載の生物学的環境などの水性環境に配置され得る。環境の温度が閾値温度（ＮＰのＬＣＳＴと呼ばれ得る）より低い場合、ＮＰは親水性を示し、大量の水を吸収する。その結果、ＮＰの平均直径は比較的大きくなる。理論に拘束されることを意図するものではないが、水が極性および非粘性の微環境を提供し、それにより、励起されたＩＣＧ分子の非放射性減衰速度が大きくなるために、水分を多く含む微環境ではＩＣＧ分子が弱い蛍光を発するものと考えられる。温度が閾値温度を超えるとＮＰは疎水性を示し、ＮＰから水が排出され、それに応じて平均ＮＰ直径が小さくなる。再び、理論に拘束されることを意図するものではないが、ＮＰ内に分散されたＩＣＧ分子が、次に、水分を多く含む微環境と比較して、比較的低い極性および高い粘性を有する、ポリマーを多く含む微環境に曝露されると考えられる。極性が低く粘性が高い係る微環境は、励起されたＩＣＧ分子の非放射性減衰速度を抑制し、その結果、ＩＣＧの蛍光強度が大きくなると考えられる。オフ状態からオン状態へのこの蛍光切り替え挙動が、可逆性であり、反復可能であることが観察された。特に、高密度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）トランスデューサが、トランスデューサの焦点ゾーンの温度をＮＰのＬＣＳＴより高く、または低く、することにより、フルオロフォアをオン状態とオフ状態との間で可逆的および反復的に切り替えるために、使用され得た。
【００９３】
ＮＰは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＭ）の、またはアクリルアミド（ＡＡｍ）との、もしくはＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）との、そのコポリマーの、熱応答性ポリマーから形成された。図４では、係るポリマーおよびＩＣＧの構造が示されている。特に、（１）ＩＣＧが封入されたＰ（ＮＩＰＡＭ−ＴＢＡｍ１８５：１５）ＮＰと、（２）ＩＣＧが封入されたＰＮＩＰＡＭ・ＮＰと、（３）ＩＣＧが封入されたＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｍ９０：１０）ＮＰと、（４）ＩＣＧが封入されたＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｍ８６：１４）ＮＰと、を含む、四種類のポリマーＮＰが合成された。前記の式における比率は、ＮＰを形成するために使用された、ＮＩＰＡＭのモノマーと、ＴＢＡｍまたはＡＡｍのモノマーと、のモル比を指す。これらの熱応答性ポリマーＮＰのＬＣＳＴは、ＰＮＩＰＡＭと重合されるＡＡｍおよび／またはＴＢＡｍの量に基づいて変更され得る。例えば、親水性モノマー（例えばＡＡｍなど）を使用すると、ポリマーはより高いＬＣＳＴを有した。対照的に、疎水性モノマー（例えばＴＢＡｍなど）を使用した場合、ＬＣＳＴは低下した。加えて、ＴＢＡｍはＮＩＰＡＭよりも疎水性が高く、その一方で、ＡＡｍはＮＩＰＡＭよりも親水性が高いことに注意すべきである。
【００９４】
物質
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）と、アクリルアミド（ＡＡｍ）と、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）と、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）と、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）と、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）と、アスコルビン酸ナトリウムと、ＩＣＧと、を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。全部の薬品は、さらに精製を実施することなく、入荷状態のまま使用した。
【００９５】
合成
ＩＣＧを含むＰＮＩＰＡＭ・ＮＰは以下のように調製された。他のＮＰは、適量のＴＢＡｍおよび／またはＡＡｍモノマーを追加することを除き、同様の手続きを使用して調製された。加えて、ＴＢＡｍおよび／またはＡＡｍを、アクリル酸（ＡＡｃ）およびアリルアミン（ＡＨ）の一方または両方で部分的または完全に置換して、Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ）、Ｐ（ＴＢＡｍ−ＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ）、またはＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ）などの他のコポリマーを形成することも可能であった。
【００９６】
簡潔に、ＰＮＩＰＡＭ・ＮＰを調製するために、ＮＩＰＡＭ（モノマー、０．６８２２ｇ）、ＢＩＳ（架橋剤、０．０１３１ｇ）、およびＳＤＳ（界面活性剤、０．０２１９ｇ）が、２５０ｍＬシュレンク管内で５０ｍＬの脱イオン化水中に溶解され、その後、１０分間、窒素パージを実施した。次に、ＩＣＧ（フルオロフォア、０．００３４ｇ）と、ＡＰＳ（開始剤、０．０３９ｇ）、ＴＥＭＥＤ（促進剤、５１μＬ）がシュレンク管に加えられた。次に、シュリンクラインに真空を印加した後に窒素を充填するサイクルを３回実施した後、シュレンク管を不活性窒素雰囲気下に置いた。次に、シュレンク管の内容が４時間にわたり室温で攪拌された。反応は、シュレンク管の内容を空気に曝露させることにより停止された。１０−ｋＤａ分子量カットオフ膜を使用して生成物を３日間にわたり脱イオン化水に対して透析すると、余剰の界面活性剤および未反応物質が除去された。最終生成物の組成は、フーリエ変換赤外線（ＦＴＩＲ）スペクトロメータ（米国フロリダ州ウェストパームビーチのＴｈｅｒｍｏ  Ｎｉｃｏｌｅｔ  ６７００）を使用して４，０００〜６００ｃｍ−１で確認された。
【００９７】
ＮＰの直径は、動的光散乱（ＤＬＳ）および透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により測定された。ＴＥＭは、ＮＰの形態を判定するためにも使用された。ＤＬＳ測定のために、生成物の２００μＬを２．８ｍＬの脱イオン化水で希釈し、次に、Ｎａｎｏｔｒａｃ１５０（米国カリフォルニア州サンディエゴ、Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ、日機装）を用いて室温（２５℃）で分析した。ＴＥＭ測定のために、試料は、生成物ＮＰの水性分散液（約１ｍｇ／ｍｌの濃度）を、炭素コーティングが施された銅格子（ＦＦ２００−Ｃｕ−５０、米国ペンシルベニア州ハットフィールド、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に滴下し、次に、０．２％の酢酸ウラニルで着色することにより、準備された。ＴＥＭ実験は、ＪＥＯＬ１２００ＥＸ  ＴＥＭ（米国マサチューセッツ州ピーボディ、ＪＯＥＬ）を使用して実施された。ＮＰは、動的光散乱（ＤＬＳ）および透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によれば、７０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲のサイズを有した。特に、ＤＬＳによる測定時、（１）ＩＣＧを含むＰＮＩＰＡＭ  ＮＰは１５０±２５ｎｍの平均サイズを有し、（２）ＩＣＧを含むＰ（ＮＩＰＡ−ＴＢＡｍ１８５：１５）ＮＰは７６±４ｎｍの平均サイズを有し、（３）ＩＣＧを含むＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｍ８６：１４）ＮＰは７５±２５ｎｍの平均サイズを有し、（４）ＩＣＧを含むＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｍ９０：１０）ＮＰは７６±２ｎｍの平均サイズを有した。水溶液中のＮＰの周囲に界面活性剤（ＳＤＳ）および水和層が存在したため、ＤＬＳにより測定されたサイズはＴＥＭにより測定されたサイズよりもいくぶん大きいものであった。例えば、上述の試料（１）のＮＰの平均サイズは、ＴＥＭにより測定された場合、およそ１１０ｎｍであった。ＮＰは略球形状で会った。
【００９８】
ポリマーＮＰの蛍光切り替え曲線を図５に示す。蛍光強度は試料温度の関数としてプロットされている。シャープな切り替え特性が明らかに４つのすべてのＮＰに見られ得る。なお切り替え閾値温度（ＬＣＳＴまたはＴｔｈの）は２８℃、３１℃、３７℃、および４１℃であった。さらに、切り替えは単一の試料において複数回観察された。例えば図６では、低温（２５℃、ｘ軸上の測定点１、３、５、７、９、および１１）と高温（４４℃、測定点２、４、６、８、１０、および１２）との間でサイクルする１２個の異なる時間点における、ＩＣＧを含むＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｍ：９０：１０）ＮＰに対する蛍光データが示されている。加えて、ＩＯｎ／ＩＯｆｆ比は、試料（１）、（２）、（３）、および（４）に対して、それぞれ３．３、２．９、９．１、および９．１に達した。これらの値は、いくつかの他の造影剤のＩＯｎ／ＩＯｆｆ比の少なくとも１．６〜５．１倍である。
【００９９】
本明細書で記載のフルオロフォアの蛍光特性を測定するために使用したシステムを図７に概略的に示す。一般に、フルオロフォアの放出パルスを１００回平均して、その平均ピーク値が蛍光強度を表すために使用された。図７で示される「Ｆｅｘ」は励起フィルタを指し、「Ｆｅｍ」は放出フィルタを指し、「Ｌ」はレンズを指し、「ＰＭＴ」は光電子増倍管を指し、「ＢＭ」はビームスプリッタを指し、「ＰＤ」はフォトダイオードを指し、「ＰＤＧ」はパルス遅延発生器を指し、「ＮＤフィルタ」は減光フィルタを指す。
【０１００】
実施例２
熱応答性ポリマーナノ粒子を使用するイメージング方法
一般事項
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係るイメージング方法は以下のように実施された。最初に、小型シリコーンチューブに（０．６９ｍｍの平均直径を有する、米国ペンシルベニア州、ＩｎｓｔｅｃｈＬａｂ、ＢＳＩＬＴ０３１）、実施例１のＩＣＧを含むＰＮＩＰＡＭ  ＮＰ（ＬＣＳＴ＝３１℃）の水性溶液を充填した。次に、シリコーンチューブを一片のブタの筋肉組織に埋め込み、血管をＵＳＦイメージングのターゲットとして模擬した。図８Ａでは、イメージングのために使用される組織試料、チューブ、励起光源、蛍光収集ファイバ、およびＨＩＦＵトランスデューサの構成が概略的に図示されている。ブタ組織は、およそ８ｍｍの厚さ（図８Ａのｚ軸方向）と、およそ２０ｍｍの幅（ｘ軸方向）と、を有した。チューブはｙ軸方向に沿って組織内に挿入された。チューブの中心から組織の上部表面までの距離はおよそ４ｍｍであった。およそ３ｍｍの直径を有するファイババンドル（米国ニュージャージー州、Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ、ＮＴ３９−３６６）が、レーザから組織の底部まで励起光を送達して、ＨＩＦＵビームに曝露させることによりオン状態に切り替わるようフルオロフォアを励起するために使用された。第２ファイババンドル（Ｅｄｍｕｎｄ  Ｏｐｔｉｃｓ、ＮＴ４２−３４５）が、ＵＳＦ光子を収集するために組織の上部に留置された。２．５ＭＨｚＨＩＦＵトランスデューサ（米国ワシントン、ＳｏｎｉｃＣｏｎｃｅｐｔｓ、Ｈ−１０８、有効直径：６０ｍｍ、焦点距離：５０ｍｍ）が、組織の底部に配置され、チューブ領域に集光された。音響エネルギーを組織に効率的に伝達するために、ＨＩＦＵトランスデューサ、組織試料の底部表面、および励起光を送達するためのファイババンドルが、水中に沈められた。チューブを２次元的にイメージングするために、ＨＩＦＵトランスデューサは、ｘ−ｙ平面において走査および平行移動された。
【０１０１】
ＵＳＦイメージングシステム
ＵＳＦイメージングシステムの構成が図８Ｂに概略的に示されている。このシステムは、４つの主要サブシステム、すなわち、（１）光学サブシステム、（２）超音波サブシステム、（３）温度測定サブシステム、および（４）電子制御サブシステム、を含む。光学サブシステムは、励起光または電磁放射ビームの送達と、放射光の収集と、を実施するための構成要素を含んだ。励起光は、８０８ｎｍダイオードレーザ（ＭＤＬ−ＩＩＩ−８０８Ｒ）を使用して生成され、上述のファイババンドルを介して試料組織の底部へ送達された。バンドパスフィルタＦ１（ニューヨーク州、Ｓｅｍｒｏｃｋ、ＦＦ０１−７８５／６２−２５。中心波長：７８５ｎｍ、帯域幅：６２ｎｍ）が、放出フィルタの通過帯域に配置されたダイオードレーザの望ましくない側波帯成分を除去するための励起フィルタとして使用された。レーザは、持続波（ＣＷ）モードで動作されたが、試料照射回数および期間は、パルス遅延発生器（カリフォルニア州、ハイランド、ＰＤＧ、Ｐ４００）によりトリガされる高速メカニカルシャッタ（ニューヨーク州、ＵＮＩＢＩＴＺ  ＬＳ３Ｔ２）を使用して制御された。シャッタは０．５ｍｓの応答時間を有した。代替的に、ＣＷレーザよりもむしろパルスレーザを使用することも可能である。上述の第２ファイババンドルを介して収集された放出済み光子は、１組の放出フィルタへと送達された後に、光電子増倍管（ＰＭＴ）により受容された。４つの放出フィルタの組み合わせは、励起光子の最大拒否と、蛍光放出光子の通過と、を可能にした。特に、２つのロングパス干渉フィルタ（Ｆ２およびＦ５。米国ニューヨーク州Ｓｅｍｒｏｃｋ、ＢＬＰ０１−８３０Ｒ−２５。エッジ波長：８４６ｎｍ）と、２つのロングパス吸収ガラスフィルタ（Ｆ３およびＦ４。米国カリフォルニア州アーヴィン、ニューポート、ＦＳＲ−ＲＧ８３０。カットオン：８３０ｎｍ）が図８Ｂで示されるように配置された。２つのＮＩＲアクロマティック複レンズ（米国ニュージャージー州、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ＡＣ−２５４−０３５−Ｂ）が、励起光子が干渉フィルタにより最も良好に拒否されるよう蛍光光子をコリメートすることと、フィルタ済み光子を冷却された低ノイズＰＭＴ（日本国、浜松、高電圧電源Ｃ８１３７−０２により駆動されるＨ７４２２Ｐ−２０）に集光させることと、を実施するために、使用された。信号は、低ノイズ電流前置増幅器（米国カリフォルニア州、ＳｔａｎｆｏｒｄＲｅｓｅａｒｃｈＳｙｓｔｅｍｓ、ＳＲ５７０）により、さらに増幅され、マルチチャンネルオシロスコープ（米国オレゴン州、Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ、ＤＰＯ４１０２Ｂ−Ｌ）により取得された。
【０１０２】
超音波サブシステムは、上述のＨＩＦＵトランスデューサと、様々な駆動要素と、インピーダンス整合ネットワーク（ＮＷＭ）と、無線周波数（ＲＦ）出力増幅器と、ファンクションジェネレータ（ＦＧ）と、を含むものであった。特に、２．５ＭＨｚの中心周波数を有するゲーティング処理された正弦波信号が、ＦＧ（米国、カリフォルニア州、Ａｇｉｌｅｎｔ、３３２２０Ａ）により生成され、ＲＦ出力増幅器（米国、ニューヨーク州、Ｅ＆Ｉ、３２５ＬＡ）により、さらに増幅された。増幅された信号はＨＩＦＵトランスデューサを駆動するためにＮＷＭに入力された。ＨＩＦＵトランスデューサは、シリコーン試料チューブ上に集光された。ＨＩＦＵトランスデューサは、初期のＨＩＦＵ位置決めと、後続の走査と、の両方を行うために、２次元平行移動ステージ上に取り付けられた。初期位置決め時には、ＨＩＦＵトランスデューサは、熱電対からの温度信号がその最大値に達した位置（熱電対接続部がＨＩＦＵ焦点上に配置されたことを示す）に移動された。この位置は画像の中心にあると考えられた。長方形エリア（４．０ｍｍｘ１．０２ｍｍ）が、中心を包囲するＨＩＦＵトランスデューサによりラスタ走査された。超音波サブシステムの全体は、ＨＩＦＵパルスの放出と、励起光パルスの放出と、オシロスコープのデータ取得と、を含むＰＤＧにより制御された。これらの処理の時間系列は図８Ｃにプロットされる。この実施例では、超音波曝露時間は３００ｍｓであった。この曝露時間は、ＰＤＧからのゲーティング処理パルスの幅により判定された。
【０１０３】
レーザパルス、蛍光信号、およびデータ取得を適切に同期するために、以下のストラテジーが取られた。レーザパルスは、レーザビームを２０ｍの光ファイバ（米国ニュージャージー州、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社、ＦＴ２００ＥＭＴ）に接続することにより、およそ１００ｎｓ遅延された。励起光パルスがレーザにより放出されると、少量のレーザエネルギーがビームスプリッタにより分割され、高速フォトダイオード（ＰＤ）に送達され、電子パルスが生成された。このパルスはＰＤＧをトリガするために使用された。ＰＤＧの出力は、データ取得のためにオシロスコープをトリガするために使用された。トリガ時間はＰＤＧの出力遅延時間を制御することにより調節された。したがってオシロスコープのデータ取得は、蛍光信号に対して良好に同期および整合した。レーザパルスからの１００ｎｓの遅延は、トリガ信号の全体的電子遅延を生じさせるにあたり十分に大きいものであった。
【０１０４】
ＨＩＦＵ焦点における温度は、増幅器および第２オシロスコープを介して、ミクロンサイズの熱電対により測定された。特に、７５μｍの小さい接合サイズを有する熱電対（米国コネチカット州、ＯｍｅｇａＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＣＨＣＯ００３）が、ＨＩＦＵにより誘導された温度変化を測定するために、シリコーンチューブに配置された。接合部は走査エリアの中心に固定された。熱電対からの出力電圧信号は、高精度オペレーショナル増幅器ＯＰＡ２２７７を含む増幅器回路により増幅され、オシロスコープ（米国カリフォルニア州、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｉｎｆｉｎｉｉｕｍ  ５４８３０Ｄ  ＭＳＯ）により取得された。ＨＩＦＵトランスデューサをｘ軸方向に沿って走査させることにより、温度プロファイルが取得された。熱電対信号は温度と線形に比例した。この温度は、試験の前に組織試料の外部で事前に較正されたものであった。ＨＩＦＵ焦点において測定されたピーク温度は、およそ４５℃であった。
【０１０５】
超音波曝露期間の間、ＨＩＦＵ焦点における組織温度は連続的に増加した。曝露の後、温度は熱拡散の結果として減少した。励起光は、超音波曝露の終了直前の最終的な２ｍｓ間にわたり組織を照射した。照射はシャッタを開くことにより開始された。同時に、蛍光信号はオシロスコープにより取得された。オシロスコープはＰＤＧからのパルスによりトリガされた。ＨＩＦＵトランスデューサは２次元平行移動ステージを使用して走査および平行移動された。
【０１０６】
高解像度ＵＳＦ画像
上述のＨＩＦＵトランスデューサは、上述の組織試料における試料チューブを超音波的にイメージングするために使用された。パルサー／レシーバ（米国、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＮＤＴ、５０７３ＰＲ）が、トランスデューサの励起および反射された音響エコーの受容の両方を実施するために、使用された。ＮＷＭは、トランスデューサとパルサー／レシーバとの間のインピーダンス整合のためにも使用された。反射された音響信号はパルサー／レシーバにより増幅され、コンピュータに接続されたデジタイザ（ＮＩ  ＵＳＢ５１３３）により取得された。係る受信された信号は通常、超音波イメージング分野ではＡラインと呼ばれ、深さ（ｚ軸）方向に沿った組織音響インピーダンス分布を表す。１つのＡラインがｘｙ平面における各場所において取得された。ＨＩＦＵトランスデューサをｘｙ平面において走査させることにより、一連の３次元（ｘ、ｙ、およびｚ）データが取得された。各Ａラインのエンベロープは、異なる深さにおけるＣモード画像を形成するために、計算された。ＵＳＦ画像と比較するために、ｘｙ平面における１組の２次元データ（Ｃモード画像のうちの１つ）が、チューブ位置におけるｚの深さを固定することにより、抽出された。図９Ｂの画像はこのように形成された。
【０１０７】
図９Ａでは、ｘｙ平面上のチューブのＵＳＦ画像が示されている。２本の垂直破線はチューブの内側縁部の場所を示す。各ｙ場所におけるｘ軸方向に沿ったＵＳＦ画像プロファイルのＦＷＨＭおよびＦＷＥＭ（ｆｕｌｌ−ｗｉｄｔｈ−ａｔ−ｏｎｅ−ｅｉｇｈｔｈ−ｏｆ−ｔｈｅ−ｍａｘｉｍｕｍ）が計算された。異なるｙ場所における平均されたＦＷＨＭおよびＦＷＥＭは、それぞれ０．４８±０．１３ｍｍおよび０．６８±０．１９ｍｍであった。ＦＷＨＭ（０．４８ｍｍ）はチューブの内径よりも狭く、ＦＷＥＭ（０．６９ｍｍ）はチューブ内径（０．６９ｍｍ）に非常に近い。内径がチューブの全サイズを説明するパラメータであるとみなされ得るため、ＦＷＨＭよりもむしろＦＷＥＭがＵＳＦ画像の全サイズを説明するパラメータとみなされ得る。
【０１０８】
ＵＳＦ画像と純粋な超音波画像を比較するために、一般に使用されるパルスエコー法を介して同一のＨＩＦＵトランスデューサを使用して同一の試料がｘｙ平面上で走査された。各ｘｙ場所において、チューブの上部内側境界から反射された超音波エコーが記録され、超音波画像を生成するために使用された。その結果が図９Ｂに示されている。平均のＦＷＨＭおよびＦＷＥＭはそれぞれ０．７６±０．０１ｍｍおよび１．１２±０．０２ｍｍであった。これらの値の両方はＵＳＦ画像の値よりも大きい。筋肉中の超音波速度が１，５４２〜１，６２６ｍ／ｓの範囲であると仮定すると、採用されたＨＩＦＵトランスデューサ（周波数＝２．５ＭＨｚおよびｆ値＝０．８３）の理論的回折限界横方向焦点サイズ（ＦＷＨＭに相当する）は０．５１２〜０．５４ｍｍの範囲となる。この値も、チューブのＵＳＦプロファイルの平均ＦＷＨＭよりも大きい。したがって本明細書で記載のイメージング方法は音響回折限界を超える解像度を達成することが可能である。
【０１０９】
図９Ｃおよび図９Ｄでは、図９Ａでマークされた水平破線に沿った、ＵＳＦの生成による蛍光、拡散された蛍光、超音波、および温度の強度プロファイルが示されている。特に図９Ｃでは、ｙ＝０におけるｘ軸に沿ったＵＳＦ信号および拡散された蛍光信号のプロファイルが示されている。図９Ｄでは、ｙ＝０におけるｘ軸に沿ったＵＳＦ、超音波、および温度信号のプロファイルが示されている。ＵＳＦおよび超音波画像の両方は、正規化され、双三次補間法に基づいて内挿された。拡散された蛍光信号のＦＷＨＭは３．９ｍｍであった。この値は、対応するＵＳＦ画像のプロファイルのＦＷＨＭ（０．４８ｍｍ）およびチューブの内径（０．６９ｍｍ）よりも顕著に大きい。したがって、本明細書で記載の方法は、蛍光拡散光トモグラフィ（ＦＤＯＴ）などの拡散蛍光方法と比較して、改善された解像度を提供し得る。図９Ｄにおいて、ＵＳＦ信号プロファイルのＦＷＨＭが０．５４であることと比較して、温度プロファイルが０．６６ｍｍのＦＷＨＭを有し、超音波プロファイルが０．７６ｍｍのＦＷＨＭを有したことに注目すべきである。図９Ｃで示される拡散蛍光のプロファイルを得るために、試料は、他のすべての成分が固定状態に保たれる一方でｘ軸方向に沿って走査された。ＨＩＦＵがオフ状態に維持され、温度が室温（ＬＣＳＴより低い）に保たれたが、レーザがオン状態にあるときＵＳＦ造影剤は依然として何らかの蛍光を放出した。なぜなら、ＵＳＦ造影剤は、オフ状態にあるときでさえも、必ずしも１００パーセントのオフ状態ではないためである。励起光が放出フィルタから漏出することにより結果に歪みが生じることを回避するために、バックグラウンド走査が、チューブに水を充填することにより、実施された。このバックグラウンドデータは、フルオロフォアを含むチューブから取得された結果から差し引かれた。
【０１１０】
実施例３
超音波切り替え可能フルオロフォア
一般事項
本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適な一連の超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下のように準備された。フルオロフォアは、（１）線状の熱応答性ポリマー構造に連結されているか、（２）実施例１で上述のＮＰなどの熱応答性ポリマーＮＰ内に分散されているか、（３）熱応答性ポリマーＮＰの表面に連結されているか、または、（４）一部が熱応答性ポリマーＮＰ内に分散され且つ一部が熱応答性ポリマーＮＰの表面に連結されている、複数のＦＲＥＴ供与体種および複数のＦＲＥＴ受容体種を含んだ。構造（１）、（３）、および（４）がそれぞれ図１０〜図１２に示されている。加えて、様々なフルオロフォアのいくつかの特性が表２および表３に提供されている。表３では、線状の熱応答性ポリマーに基づくフルオロフォアの特性が説明されている。表４では、熱応答性ポリマーナノ粒子に基づくフルオロフォアの特性が説明されている。表３および表４で使用される命名法は、この実施例で以下でさらに説明される命名法に対応する。加えて、表３および表４で報告される測定値は、上記の実質例１および実施例２で説明された方法で得られたものである。
【０１１１】
構造（１）
一般に、熱応答性線状ポリマーが最初に合成され、次に、ヒドロキシル部分、カルボキシル部分、および／またはアミン部分などの、ポリマー上の適切な部分と蛍光種との間に共有化学結合を形成することにより、蛍光種がポリマー上にグラフト重合された。いくつかの場合では、例えば、カルボジイミド結合方式が使用された。抱合は他の方法でも実施され得る。一般に、供与体種は、可視領域における短い励起／放出波長を有し、その一方で、受容体種は赤色／ＮＩＲ放出（長い波長）を有した。蛍光状態へ励起される受容体種がまったく存在しないかまたはほとんど存在しないよう、短波長励起光（供与体種に対する）がシステムを励起するために使用された。熱応答性ポリマーが上述のように球状構造を取ると、供与体種および／または受容体種間の距離が減少し、その結果、供与体種から受容体種へのＦＲＥＴが生じる。したがって、受容体種の放出（長波長における）が観察され得た。
【０１１２】
全般的構造（１）を有する一連のフルオロフォアを形成するために、以下の物質が使用された。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）、アクリルアミド（ＡＡｍ）、アクリル酸（ＡＡｃ）、アリルアミン（ＡＨ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）、および、７−（２−アミノエチルアミノ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−ベンゾフラザンスルホンアミド（ＤＢＤ−ＥＤ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入された。ＳｅＴａｕ４２５モノＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、Ｓｑｕａｒｅ６６０モノ−ＮＨＳ、Ｓｅｔａ７００モノ−ＮＨＳ、Ｓｅｔａ６３３モノ−ＮＨＳ、および、Ｓｑｕａｒｅ６６０モノ−ＮＨ２は、ＳＥＴＡ  ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ（米国イリノイ州アーバナ）から購入され、それぞれＳＴ４２５、Ｓｑ６６０、Ｓｔ７００、Ｓｑ６３３、およびＳｑ６６０ａとして示された。全部の薬品は、さらに精製を実施することなく、入荷状態のまま使用した。
【０１１３】
全般的構造（１）を有するフルオロフォアの熱応答性ポリマー成分は、少なくとも３つの官能化部分、すなわち、（ａ）主要熱応答性ユニット（例えばＮＩＰＡＭなど）、（ｂ）ＬＣＳＴ制御ユニット（例えばＴＢＡｍまたはＡＡｍなど）、および、（ｃ）蛍光種に結合するための機能化ユニット（例えばＡＡｃまたはＡＨなど）、を含んだ。線状ポリマーはフリーラジカル重合を通して合成された。すべての反応は２５０ｍＬシュレンク管内で実施された。３つの主要なステップを以下に示す。最初にパージ手順が実施され、反応混合物が１０分間にわたり窒素を用いてパージされた。開始剤（例えばＡＰＳ）または促進剤（例えばＴＥＭＥＤ）が加えられたとき、真空印加（１分）および窒素充填（５秒）のサイクルを３回実施することにより酸素がパージされた。次に、室温で４時間にわたり窒素下で反応混合物を攪拌することにより、重合反応が実施された。最後に、ポリマー生成物は、３日間にわたり適切な分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）膜を用いて未反応モノマー、開始剤、または他の小さい分子を除去する透析により、精製された。
【０１１４】
一例としてＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ２００：１）を使用すると、全般的な手術は以下の通りである。２００：１のモル比の１．３６４４ｇのＮＩＰＡＭ（モノマー）および４μＬのＡＡｃ（モノマー）の試料が、シュレンク管内で５０ｍＬの脱イオン化（ＤＩ）水に溶解された。パージ手順の間、０．０６７ｇのＡＰＳ（開始剤）および５１μＬのＴＥＭＥＤ（促進剤）がシュレンク管に加えられた。反応後、試料は、３．５ＫのＭＷＣＯ膜で透析された。生成した溶液が収集され、後にアミンを含有する蛍光種と抱合させるために、凍結乾燥された。ＮＨＳを含有する蛍光種と抱合させるために、アミン官能化されたポリマーＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ）が、ＡＡｃに代わってＡＨを使用する点を除き上記と同一の手順を使用して、合成された。さらに一般的に、前述の手順を使用して、以下の熱応答性ポリマー、すなわち、Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＴＢＡｍ−ＡＡｃ８５：１５：１）、Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＴＢＡｍ−ＡＡｃ１８５：１５：１）、Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＴＢＡｍ−ＡＡｃ５８５：１５：１）、および、Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｍ−ＡＡｃ２００：３２：１）、が合成された。
【０１１５】
ポリマーの合成後、ポリマーと蛍光種との間の抱合が、カルボキシル基と主要アミン部分との間の化学反応を使用して、実施された。いくつかの場合では、蛍光種はＮＨＳを含んだ。ＮＨＳは熱応答性ポリマーの主要なアミン（例えばＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ）中に存在するアミンなど）と反応された。他の場合では、蛍光種は、ＥＤＣの存在下でポリマーのカルボキシル基と抱合した主要なアミンを含んだ（例えばＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ）。抱合反応は、光の影響を受けやすい色素または蛍光種を保護するために、７ｍＬの茶色ガラス管内で実施された。抱合のための全般的手順は以下の通りである。アミンを含有する色素（例えばＤＢＤ−ＥＤまたはＳｑ６６０ａなど）に対して、５ｍｇのポリマー、２５ｍｇのＥＤＣ、および、０．３ｍｇのＤＢＤ−ＥＤ、および／または５μＬのＳｑ６６０ａ（１ｍｇ／１００μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の原液）が、ガラス管内の５ｍＬ脱イオン化水に溶解された。次に、ガラス管は攪拌され、室温で終夜にわたり反応された。反応の完了後、抱合物は上述の適切なＭＷＣＯ透析膜を用いて精製された。ＮＨＳを含有する色素（例えば、ＳＴ４２５、Ｓｔ６３３、Ｓｑ６６０、およびＳｔ７００）に対して、５ｍｇのポリマーおよび１０μＬの色素（原液：１ｍｇ／１００μＬのＤＭＳＯ）が、５ｍＬのリン酸塩緩衝剤食塩水（ＰＢＳ、８ｍＭのリン酸ナトリウム、２ｍＭのリン酸カリウム、０．１４ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＫＣＬ、ｐＨ８．３〜８．６）に溶解された。次に、溶液は攪拌され、室温で終夜にわたり反応された。次に、１ｍＬの２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．８）が溶液に加えられ、色素の未反応ＮＨＳ部分が２時間にわたり反応停止された。最後に、試料は透析により精製された。
【０１１６】
いくつかの場合ではＤＢＤ−ＥＤ、Ｓｔ６３３、Ｓｑ６６０、およびＳｔ７００が極性の影響を受けやすいフルオロフォアとして使用されたことに注目すべきである。他の事例では、ＤＢＤ−ＥＤまたはＳＴ４２５が供与体種として使用され、Ｓｑ６６０（ａ）が受容体として使用された。
【０１１７】
構造（２）
構造（２）を有するフルオロフォアは実施例１で上述したように準備された。
【０１１８】
構造（３）
構造（３）を有するフルオロフォアは、最初に、蛍光種を含めることを除いて実施例１での説明のように熱応答性ＮＰを準備することにより、準備された。次に、蛍光種は、５ｍｇの線状ポリマーよりもむしろ５ｍＬのポリマーＮＰ溶液が使用されたことを除いて、線状熱応答性ポリマーに対して上述した様式に対応する様式で、ＮＰの表面に取り付けられた。構造（３）を有する１つの例示的なフルオロフォアとして、Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ２００：１）ＮＰ−ＤＢＤ−ＥＤ−Ｓｑ６６０ａが、２つのアミン含有色素（ＤＢＤ−ＥＤおよびＳｑ６６０ａ）をＡＡｃモノマーにより提供されるカルボキシル部分を通してポリマーＮＰ（Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｃ２００：１）ＮＰ）の表面に共有結合させることにより、準備された。
【０１１９】
構造（４）
構造（４）を有するフルオロフォアは、最初に、熱応答性ＮＰを実施例１で説明したように準備し、次に、構造（３）に対して上述したように蛍光種をＮＰの表面に抱合させることにより、準備された。構造（４）を有する１つの例示的なフルオロフォアとして、ＤＢＤ−ＥＤがＰ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ８６：１４）ＮＰの内部に封入され、Ｓｑ６６０は、ＮＨＳ部分（色素に由来）とアミン部分（ＡＨモノマーに由来）との抱合を介して、ＮＰの表面に取り付けられた。係るフルオロフォアは、一般的な命名法ＤＢＤ−ＥＤ＠Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ８６：１４）ＮＰ−Ｓｑ６６０を使用して示される。ここで、記号「＠」に先行する種は、指定されたポリマーに封入され、ハイフン「−」に後続する種はＮＰの表面に抱合される。
【０１２０】
【表３】
0006767377.tif 000005
0006767377.tif 000006
【表４】
0006767377.tif 000007
【０１２１】
実施例４
超音波切り替え可能フルオロフォア
一般事項
本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適な一連の超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下のように準備された。フルオロフォアは、熱応答性ポリマーと、電磁スペクトルの赤色／ＮＩＲ部分において放出ピークを有する蛍光物質と、を含んだ。特に、ＡＤＰＤＩシアノけい皮酸色素（ＡＤＰＤＩＣＡ）が使用された。ＡＤＰＤＩＣＡの構造が図１３で示されている。いくつかのフルオロフォアは、上述の実施例３からの全般的構造（１）を有し、他のフルオロフォアは実施例３からの全般的構造（２）を有し、さらに他のフルオロフォアは実施例３からの全般的構造（３）を有した。
【０１２２】
物質
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、アクリルアミド（ＡＡｍ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）、アクリル酸（ＡＡｃ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）、および、アスコルビン酸ナトリウム、が、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入された。全部の薬品は、さらに精製を実施することなく、入荷状態のまま使用した。
【０１２３】
合成
ＡＤＰＤＩＣＡは、Ｂａｎｄｉら、“Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ−Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  Ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｂｉｓｆｅｒｒｏｃｅｎｅ／ＢＦ２−Ｃｈｅｌａｔｅｄ−Ａｚａｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ／Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅ  Ｔｅｔｒａｄｓ，”  Ｃｈｅｍ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  ２０１３，  １９，  ７２２１−７２３０、および、Ｂａｎｄｉら、“Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｖｉａ  Ｍｅｔａｌ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ＡｚａＢＯＤＩＰＹ−Ｚｉｎｃ  Ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  ａｎｄ  ＡｚａＢＯＤＩＰＹ−Ｚｉｎｃ  Ｎａｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｉｎｄｕｃｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，”  Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃ  ２０１３，  １１７，  ５６３８−５６４９に記載のアザジピロメテン合成手順にしたがって、準備された。簡略には、３−（４−ヒドロキシフェニル）−１−フェニル−２−プロペン−１−オンは、対応する４−ヒドロキシベンズアルデヒド、アセトフェノン、および水酸化カリウムを反応させることにより、準備された。この種は、後に、乾燥エタノール中でニトロメタンおよびジエチルアミンと反応させて、３−（４−ヒドロキシフェニル）−４−ニトロ−１−フェニルブタン−１−オンが得られた。次に、４−｛２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピノ−ルイルイミノ］−５−フェニル−２Ｈ−ピロール−３−ｙｌ｝フェノールが、エタノール中で酢酸アンモニウムと反応させることにより、合成された。次に、ＢＦ２キレート４−｛２−［３−（４−ヒドロキシフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−２イルイミノ］−５−フェニル−２Ｈ−ピロール−３−イル｝フェノールが、この生成物を、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中でジイソプロピルエチルアミンおよび三フッ化ホウ素ジエチルエーテルで処理することにより、この生成物から形成された。次に、ＢＦ２キレート種は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）の存在下で適切な安息香酸と反応された後、クロマトグラフィ精製が実施された。
【０１２４】
全般的構造（１）を有するフルオロフォアは、ＡＤＰＤＩＣＡが蛍光種として使用される点を除き、上述の実施例３における構造（１）に対して記載された手順にしたがって準備された。加えて、精製が、３．５ＫＤａのＭＷＣＯ膜を使用する３日間にわたる透析により、実施された。熱応答性ポリマーは、Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ２００：１）、Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＴＢＡｍ−ＡＨ１８５：１５：１）、および、Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｍ−ＡＨ１７２：２８：１）を含んだ。したがって、全般的構造（１）を有する以下のフルオロフォア、すなわち、（ａ）Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ２００：１）−ＡＤＰＤＩＣＡ、（ｂ）Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＴＢＡｍ−ＡＨ１８５：１５：１）−ＡＤＰＤＩＣＡ、および、（ｃ）Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＡｍ−ＡＨ１７２：２８：１）−ＡＤＰＤＩＣＡ、が形成された。熱応答性ポリマーに対するＡＤＰＤＩＣＡの抱合は、ＡＤＰＤＩＣＡのカルボキシル基と、ポリマーのＡＨ繰り返し単位により提供されるアミン基と、の間にアミド結合を形成することにより、実施された。
【０１２５】
全般的構造（２）を有するフルオロフォアは、上述の実施例３における構造（２）に対して記載された手順にしたがって準備された。特に、ＤＢＤ−Ｓｑ６６０ＦＲＥＴシステムに対する手順に対応した。この様式で形成された１つの典型的なフルオロフォアは、ＡＤＰＤＩＣＡ＠Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ２００：１）ＮＰであった。ＡＤＰＤＩＣＡ＠Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ２００：１）ＮＰにおいて、ＡＤＰＤＩＣＡはＮＰ内部に封入された。
【０１２６】
全般的構造（３）を有するフルオロフォアは、上述の実施例３における構造（３）に関して記載した手順にしたがって準備された。特に、ＤＢＤ−Ｓｑ６６０ＦＲＥＴシステムに対する手順に対応した。この様式で形成された１つの典型的なフルオロフォアは、Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ２００：１）ＮＰ−ＡＤＰＤＩＣＡであった。Ｐ（ＮＩＰＡＭ−ＡＨ２００：１）ＮＰ−ＡＤＰＤＩＣＡにおいて、ＡＤＰＤＩＣＡはＮＰの表面に取り付けられた。構造（１）と同様に、熱応答性ポリマーに対するＡＤＰＤＩＣＡの抱合は、ＡＤＰＤＩＣＡのカルボキシル基と、ポリマーのＡＨ繰り返し単位により提供されるアミン基と、の間にアミド結合を形成することにより、実施された。
【０１２７】
蛍光イメージング
上述のフルオロフォアの温度依存性の蛍光特性は、７１１ｎｍ／２５ｎｍバンドパス放出フィルタを使用して２つの異なる励起波長（λｅｘ＝６０９ｎｍまたは６５５ｎｍ）において評価された。フルオロフォアの温度は、フルオロフォアを温度制御された水槽内に配置することにより、制御された。結果は表５および表６に示されている。表５では、λｅｘ＝６０９ｎｍに対するデータが示されている。表６では、λｅｘ＝６５５ｎｍに対するデータが示されている。表５および表６において「λｅｘ」として標識されたデータは使用された放出フィルタを指し、「ｌｐ」はロングパスフィルタを指す。
【表５】
0006767377.tif 000008
0006767377.tif 000009
【表６】
0006767377.tif 000010
【０１２８】
実施例５
マイクロバブルを使用するイメージング方法
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係るイメージング方法は以下のように実施された。最初に、マイクロバブルを含む一連のフルオロフォアが準備された。１つの場合では、フルオロフォアは、マイクロバブルの外側表面に取り付けられた複数のＦＲＥＴ受容体種（または「フルオロフォア」種。「Ｆ」と略称される）および複数のＦＲＥＴ供与体種（または「クエンチャ」種。「Ｑ」と略称される）を有するＴａｒｇｅｓｔａｒ−Ｂマイクロバブルを含んだ。特に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（ＡＦ）５４６（供与体またはＦ）およびＡＦ６４７（受容体またはＱ）がビオチン−ストレプトアビジン結合を介してマイクロバブル表面上に標識された。
【０１２９】
イメージングのために、励起光（５３２ｎｍ）の強度は１５ＨＭｚに変調された。個々のＦ−Ｑマイクロバブルは、超音波的および光学的に透明なマイクロバブルを通って低速で流動した。２．２５ＭＨｚの中心周波数における３サイクルの超音波バーストが、Ｆ−Ｑマイクロバブルを膨張させるために使用された。当初、ＡＦ５４６からの蛍光信号は、ＡＦ５４６からＡＦ６４７へのＦＲＥＴエネルギー伝達のために、弱い値であった。一方、ＡＦ５４６からの蛍光放出は、超音波バーストにより形成された負圧の間のマイクロバブル膨張のために、超音波的にオン状態に（約５のＩＯｎ／ＩＯｆｆ比、および約５のτＯｎ／τＯｆｆ比で）切り替えられ得た。受容体（ＡＦ６４７）からの放出は、補完的な挙動を示した。
【０１３０】
良好に制限された超音波負圧力場が、Ｆ−ＱマイクロバブルベースのＵＳＦイメージングのために、回折限界超音波ビームを使用して、形成され得た。超音波ビームは、２つの集光された５ＭＨｚトランスデューサにより提供された。各ビームの集光された負圧領域の横方向サイズのＦＷＨＭは約４５０μｍであった。このサイズは、主にトランスデューサの回折および開口数（ＮＡ）により、判定された。焦点の軸方向サイズは約３８０μｍであった。このサイズは、主に超音波のパルス長さならびに周波数およびトランスデューサにより判定された（軸方向解像度が、少なくとも１／２パルス幅×超音波速度であると仮定する）。２つの超音波パルスが垂直に伝播し共通の焦点ゾーンで交錯したとき、干渉された圧力場は、２つの個々の垂直な場を足し合わせることにより、得られた。このようにして、小さい負圧領域が形成された。この小さい領域は、当該領域を形成するために使用されたビームの焦点ゾーンよりも小さいサイズを有した。２つのビームにより形成された主要負圧領域（ＭＮＰＲ：ｍａｉｎ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のＦＷＨＭは、横方向において約１６５μｍであった。この値は、個々の超音波パルスの横方向解像度および軸方向解像度の、それぞれ約１／２．７および１／２．３であった。同様の結果が干渉場の軸方向においても見られた。
【０１３１】
ＭＮＰＲが空間的に制限されていたため、ＭＮＰＲは、超音波パルスの伝搬のために、時間的にも制限されていた。制限されたＭＮＰＲの寿命はおよそ０．０８〜２４μｓであった。この時間的期間は、ｐｓ光パルスを使用する隣接組織の照射がフルオロフォアをオン状態に励起させることを可能にするにあたり十分な長さであった。この時間的期間は、励起光パルスの幅よりもはるかに長いものであった。励起光パルスの幅は、光が組織内で散乱するために、深部組織において１〜３ｎｓに広げられ得る。したがって必要に応じて、複数の光パルスが単一の時間窓において提供され得る。この時間窓内のみにおいて組織を光学的に照射する（すなわち、励起を時間的に制限する）ことにより、ＭＮＰＲの前後に個々の超音波パルスにより予期せずオン状態へと切り替えられるフルオロフォアにより生成されるバックグラウンド蛍光ノイズを回避することが可能である。かくしてＵＳＦ蛍光信号は、光パルスおよび超音波パルスの両方が空間的および時間的に重なり合うときにのみ、検出され得る。
【０１３２】
加えて、本明細書で記載の空間解像度は、いくつかの実施形態では、本明細書で記載のマイクロバブルを振動させる圧力閾値を適切に選択することにより、さらなる改善が可能であることが見出された。例えば、負圧閾値が１００ｋＰａであり、それぞれの個々の超音波パルスにおける負ピーク圧力がこの閾値より小さいものと仮定すると、フルオロフォアは、２つの超音波パルスが重なり合いＭＮＰＲが形成されるまで、オン状態に切り替わらないであろう。上述の２つの超音波パルスがＭＮＰＲを形成するために使用されると、干渉場の最高負圧は、建設的干渉のために倍増（２００ｋＰａ）される。圧力が１００ｋＰａを超える領域内のＦ−Ｑマイクロバブルのみがオン状態に切り替えられ得る。この領域の全サイズは約１６５μｍであり、そのＦＷＨＭ（空間解像度）は約８３μｍである。一方、さらに小さい活性化領域サイズと、さらに高解像度パワーが、切り替え閾値（例えば、１００ｋＰａ）と個々の超音波ビームにより提供されるピーク負圧との間の関係をさらに調整することにより、得られ得る。負圧切り替え閾値が大きくなる（より負となる）と、Ｆ−Ｑマイクロバブルがオン状態に切り替えられ得る領域のサイズは小さくなり、したがって空間解像度は改善される。図１４では、Ｆ−Ｑマイクロバブルがオン状態に切り替えられる活性化領域のＦＷＨＭと、マイクロバブルの閾値との、間の関係が示されている。なお、切り替え閾値は個々の超音波ビームの最高負圧のパーセンテージとして表される。閾値が最高負圧の約７０パーセントを超えると、解像度は、５ＭＨｚおよび１０ＭＨｚの超音波周波数の両方に対して、ただちに改善される。例えば、閾値が最高負圧の９０パーセントである場合、空間解像度は、１０ＭＨｚおよび５ＭＨｚの超音波周波数に対して、それぞれ１４μｍおよび３５μｍに達する。空間解像度のこの値は、純粋な超音波の横方向および軸方向（４５０μｍおよび３８０μｍ）と比較して、顕著に改善されている。
【０１３３】
一般に、空間解像度の改善には信号対雑音比（ＳＮＲ）の劣化が伴い得る。この劣化は、活性化領域が小さくなることに起因するものである。所与の濃度のフルオロフォアにおいて、より少量のフルオロフォアが、より小さい体積の生物学的環境において見出され得る。結果として、より少量のフルオロフォアが、励起されるためにオン状態において利用可能であり得、より弱いＵＳＦ信号が期待され得る。単一のＦ−Ｑマイクロバブルが撮像ボクセル（例えば３０μｍ引ける３０μｍ×３０ボクセル）に配置されている場合、極端な非ゼロの場合が生じ得る。通常、２μｍ直径のマイクロバブルはマイクロバブルの体積に基づいて５×１０４分子／μｍ２で標識され得る。これは、濃度を計算するためにバブルの体積を使用して、２４９μＭの体積濃度に等しい。体積が３０μｍ×３０μｍ×３０μｍボクセルであると取られるならば、この標識量は、３６ｎＭの体積濃度に等しい。これらの濃度は、組織イメージングに対する大部分の光学技術の検出限界（ｆＭ−ｎＭ）よりはるかに上である。したがって、高感度光学検出システム（例えば時間ゲーティングおよび／または光子計数システムなど）は、活性化領域が小さいため、ＳＮＲにおけるあらゆる損失を実質的に補償し得、組織内の単一のＦ−Ｑマイクロバブルを検出することが可能である。
【０１３４】
実施例６
超音波切り替え可能フルオロフォア
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る方法における使用に対して好適な追加的な超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下を含む。
【０１３５】
Ｆ−Ｑ−ＨＪマイクロバブル
マイクロバブルの表面上のドナ−受容体対間でＦＲＥＴを実装するために、供与体および受容体は、ホリデイジャンクション（ＨＪ）を介してマイクロバプル上に標識され得る。図１５では、係るマイクロバブルが概略的に示されている。２つの交差する線はＨＪの２本のアームを表す。ＨＪは四差路の形の４本のＤＮＡ二重らせんからなる。２つの四角形は、（ストレプトアビジン−ビオチン結合を、または、ＨＪの核酸と供与体および受容体に取り付けられたＮＨＳエステルとの間の反応を、介して）２本のアームの２つの端部において標識された１対の供与体種および受容体種を示す。水平方向に向けられた線はマイクロバブルの外殻を示し、その外殻上に、ＨＪの他方の２つの端部が（ビオチン−ストレプトアビジン結合または他の結合方式を介して）取り付けられている。バブルが膨張（収縮）すると、距離Ｒｓは増加（減少）する。その結果、供与体と受容体との間の距離（ＲＤＡ）が増加（減少）し、（ｌ１／ｌ２）は大きくなり、それに付随して供与体がオン状態（オフ状態）に切り替わる。２本のアーム間の初期角度（θ）は制御可能である。マイクロバブルの表面積か比較的大きいため、多数のＦ−Ｑ−ＨＪが、顕著に干渉することなく、単一のマイクロバブル上に標識され得る。係る設計は、ＵＳＦ遷移帯を狭め、超音波切り替え効率およびＳＮＲを改善し得る。
【０１３６】
Ｆ−Ｑ−ヘアピン−ＮＰマイクロバブル
他の標識ストラテジーは、供与体−受容体対をＤＮＡヘアピン複合体上に取り付けることである（図１６および図１７参照）。ヘアピン複合体の一方の端部は、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介して、マイクロバブル表面に取り付けられ、他方の端部は、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン結合を介して、はるかに小さい金ナノ粒子（Ａｕ−ＮＰ、直径は数十ｎｍ）に取り付けられる。Ｆ−Ｑ（またはＤ−Ａ）標識されたＤＮＡヘアピン複合体は３つの主要な成分、すなわち、（１）ヘアピン分子（図１６における点線領域）、（２）供与体および受容体に取り付けられたオリゴヌクレオチド、および、（３）受容体およびビオチンに取り付けられたオリゴヌクレオチド、からなる。理論に拘束されることを意図するものではないが、供与体をオン状態に切り替えるための原理は、以下のように説明され得る。超音波圧力がマイクロバブル壁部を加速させ、それにより、ヘアピン分子を伸長させることによりＡｕナノ粒子を加速させる。加速されたＡｕ−ＮＰは、ヘアピン分子上に反対の力を印加する。この力が十分に大きい場合、ヘアピンループが開かれ、それにより供与体−受容体距離が増大し、供与体がオン状態に切り替わる。約１８ピコニュートン（ｐＮ）の力が、ヘアピンを開放し、供与体放出をオン状態にするために、使用され得る。力が６ＰＮより小さくなると、ヘアピンは閉じられ、供与体はオフ状態に切り替わる。２μｍの直径を有するマイクロバブルに印加された１５０ｋＰａの超音波圧力波を有し、且つ２０ｎｍの直径を有するＡｕ−ＮＰに取り付けられた超音波パルスが、ヘアピン分子を伸長させるために約２０ｐＮの力を生成し得ることが推定される。したがって超音波的に蛍光をオン状態に切り替えることが可能である。
【０１３７】
Ｆ−Ｑ−ヘアピンマイクロバブル
上記のＦ−Ｑ−ＨＪマイクロバブルのホリデイジャンクションを上述のＤＮＡヘアピン分子で置き換えることも可能である。２つの端部は２つの相補的なオリゴヌクレオチドにアニールされ得る。一方のオリゴヌクレオチドが、供与体（例えばＡＦ６１０など）およびビオチンで標識される。同様に、他方のオリゴヌクレオチドが、受容体（例えばＡＦ６４７など）およびビオチンに取り付けられる。これらのビオチン端部は、ストレプトアビジン標識マイクロバブルに取り付けられ得る。ＤＮＡ分子の長さが、その持続長（通常は約５０ｎｍ）よりも短い場合、ＤＮＡ分子は弾性棒のような挙動を示す。したがって２本のアームは自然に伸長され、マイクロバブル表面に取り付けられる。超音波ビームに対する曝露により負圧サイクルの間にマイクロバブルが伸長されたとき、力がヘアピンアームの両端に印加され、それによりヘアピンが開かれ、上述のように供与体がオン状態に切り替えられる。
【０１３８】
Ｆ−Ｑ−ＤＮＡ−ＮＰマイクロバブル
蛍光標識された二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ分子を介してマイクロバブルに比較的小さいナノ粒子（数十ｎｍ）を取り付けることも可能である。ｄｓ−ＤＮＡは、ビオチン−ストレプトアビジン結合を介してマイクロバブル表面に取り付けられる。ｄｓ−ＤＮＡの他方端は、チオール結合を介して、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）に取り付けられる。通常、ｄｓ−ＤＮＡは湾曲し、ｄｓ−ＤＮＡとＡｕＮＰとの間の静電気的引力、疎水性相互作用、およびイオン−双極子分散相互作用により、ＡｕＮＰの表面に平坦に吸収される。ＡｕＮＰとＤＮＡ分子との間の引力により、ＡｕＮＰは、ｄｓ−ＤＮＡの一方の端部上に標識された蛍光種に対して近接する。ＡｕＮＰの表面は、比較的長い距離（約３〜２０ｎｍ）内の蛍光種をクエンチし得る。超音波圧力波が印加されてマイクロバブルが圧縮されると、加速されたマイクロバブル壁部は、ｄｓ−ＤＮＡ分子を伸長させることにより、ＡｕＮＰを加速させるであろう。マイクロバブル壁部の加速（超音波圧力強度により制御される）が十分に大きいためＤＮＡとＡｕＮＰとの間の静電気的引力およびその他の相互作用により、力が生成された場合、ＡｕＮＰは、（ＡｕＮＰの質量のために）同一の加速を経験することができず、その結果、蛍光種がＡｕＮＰ表面から分離して、クエンチ効果が失われることとなる。
【０１３９】
ＱＤ−熱応答性ポリマー−受容体フルオロフォア
他のＦＲＥＴベースのフルオロフォアは、ＣｄＳｅ量子ドットなどの半導体量子ドットを供与体として、および、小分子色素を受容体として、使用する。量子ドットは、熱応答性ポリマーから形成された１つまたは複数のリンカーを使用して、１つまたは複数の受容体色素に取り付けられる。例えば、赤色放出量子ドット（Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が供与体として選択され、ＮＩＲ色素（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が受容体として選択される。複数の受容体（ＡＦ７５０）が、上述の連結方式を使用して熱応答性ポリマーを介して、単一の供与体（Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５）上に取り付けられる。ＱＤ供与体は非常に長く寿命（およそ３０ｎｓ）を有し、受容体ＡＦ７５０は非常に短い寿命（およそ０．７ｎｓ）を有する。Ｔ＜ＬＣＳＴである場合、熱応答性ポリマーは拡張されたコイル状または鎖状の構造を示し、この構造は比較的長い。したがって供与体と受容体との間の距離は、ＦＲＥＴクエンチ範囲（＞４０ｎｍ）よりも全般に短い。ＨＩＦＵトランスデューサが、上述のようにＬＣＳＴよりも高い温度に熱応答性ポリマーを加熱すると、ポリマーは球状構造に遷移し、それにより、供与体−受容体距離が小さく（＜２０ｎｍ）なる。結果として、ＦＲＥＴエネルギー移動が生じる。したがって供与体（Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５）の励起エネルギーの一部が受容体（ＡＦ７５０）に移動され、供与体（ＡＦ７５０）がＮＩＲ波長において光子を放出する。これらのＦＲＥＴ関連の光子は、供与体寿命および受容体寿命のうちのより長い寿命に近い寿命（この場合、およそ３０ｎｓ）を有し得る。したがって放出されたＮＩＲ光子は、本明細書で記載の時間ゲーティング検出技術を使用して、高いＳＮＲで容易に検出することが可能である。ロングパス光学フィルタは、ＱＤ放出の検出を排除するために使用され得る。
【０１４０】
実施例７
超音波切り替え可能フルオロフォア
一般事項
本明細書で記載の方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適な一連の超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下のように準備された。亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰＣ）誘導体が、本明細書で記載のいくつかの実施形態に係るイメージング方法に対する造影剤として、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−９８ミセルまたはＰ（ＮＩＰＡ−ＴＢＡｍ）ナノ粒子（ＮＰ）に封入された。
【０１４１】
物質
亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰＣ）、亜鉛２，９，１６，２３−テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン（ＺｎＰＣＴＴＢ）、亜鉛１，４，８，１１，１５，１８，２２，２５−オクタブトキシ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン（ＺｎＰＣＯＢ）、亜鉛１，２，３，４，８，９，１０，１１，１５，１６，１７，１８，２２，２３，２４，２５−ヘキサデカフルオロ−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン（ＺｎＰＣＨＦ）、亜鉛２，３，９，１０，１６，１７，２３，２４−オクタキス（オクチルオキシ）−２９Ｈ，３１Ｈ−フタロシアニン（ＺｎＰＣＯＯ）、および、亜鉛２，１１，２０，２９−テトラ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，３−ナフタロシアニン（ＺｎＴＴＢＮＰＣ）が、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入された。これらのＺｎＰＣ誘導体の化学構造が図１８Ａおよび図１８Ｂに図示されている。テトラブチルアンモニウムヨージド（ＴＢＡＩ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−９８（ＢＡＳＦ、米国ニュージャージー州フォーハムパーク）、ＮＩＰＡＭ、ＴＢＡｍ、ＢＩＳ、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（ＡＣＡ）、および、ＳＤＳも、使用された。
【０１４２】
ＺｎＰＣ封入されたＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−９８ミセルの合成
ＺｎＰＣが３０分間にわたり超音波処理下でテトラブチルアンモニウムヨージドを添加してクロロホルム中に溶解された。一方、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−９８が５０ｍｇ／ｍｌの濃度の脱イオン化（ＤＩ）水（ｐＨ８．５）に溶解された。ＺｎＰＣクロロホルム溶液が、激しく攪拌（５００ｒｐｍ）しながら、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−９８水溶液に一滴ずつ加えられた。結果的に生成したエマルジョンは、４０Ｗで４分間にわたり超音波プローブ（Ｑｓｏｎｉｃａ）を用いて（各１分間の実行の後に３０秒のパルス）さらに分散された。クロロホルムはドラフト内で一晩にわたり蒸発された。透明な溶液が得られ、その後、その溶液は０．４５μｍ膜を使用して濾過された。
【０１４３】
ＺｎＰＣ封入されたＰ（ＮＩＰＡＭ−ＴＢＡｍ）ＮＰの合成
１．３６４４ｇのＮＩＰＡＭ、０．１２４７ｇのＴＢＡｍ、０．０１３１ｇのＢＩＳ、０．０７０ｇのＡＣＡ、および、０．０２１９ｇのＳＤＳの混合物が、２５０ｍＬシュレンク管内で５０ｍＬのＤＩ水（ｐＨ１０．５）に溶解され、引き続き１０分間にわたり窒素パージが実施された。ＺｎＰＣ  ＤＭＳＯ溶液（２ｍＬ）がシュレンク管に加えられ、次にシュレンク管は真空下に置かれ、その後、窒素でパージされた。ポンプ／パージ手順は、シュレンク管内に窒素雰囲気を提供するために、３回反復された。この反応は７０℃で一晩にわたり実行された。次にこの反応は、バルブを弛めて環境を空気に曝露させることにより、停止された。試料は１０−ｋＤａ分子量のカットオフ膜を使用して３日間にわたりＤＩ水に対して透析され、それにより過剰な界面活性剤および未反応物質が除去された。
【０１４４】
ＺｎＰＣ封入されたＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−９８ミセルの蛍光応答
上記のフルオロフォアに関する温度依存性の蛍光特性が、λｅｘ＝６０９ｎｍの励起波長において、７１１ｎｍ／２５ｎｍのバンドパス放出フィルタを使用して（より長い放出ピーク波長を有するＺｎＴＴＢＰＣについては、例外として、７６５ｎｍ／６２ｎｍのバンドパスフィルタを使用した）、評価された。その結果を表７および図１９Ａ〜図１９Ｆに示す。
【表７】
0006767377.tif 000011
【０１４５】
ＺｎＰＣ封入されたＰ（ＮＩＰＡＭ−ＴＢＡｍ）ＮＰの蛍光応答
ＺｎＰＣ封入されたＰ（ＮＩＰＡＭ−ＴＢＡｍ）ＮＰの蛍光強度を図２０Ａおよび図２０Ｂに示す。ＩＯｎ／ＩＯｆｆ比は、ＺｎＰＣおよびＰ（ＮＩＰＡＭ−ＴＢＡｍ）含有ＮＰに対して、およそ１．８であった。オフ状態（Ｔ＜ＬＣＳＴ）にあるＮＰ内部に封入された色素（Ａ）の蛍光寿命は、およそ３ｎｓであった（図２０Ａ）。
【０１４６】
実施例８
超音波切り替え可能フルオロフォア
一般事項
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係る一連の超音波切り替え可能フルオロフォアは、以下のように準備された。特に、二種類のＮＩＲ色素、すなわちアザＢＯＤＩＰＹ誘導体および亜鉛フタロシアニン（ＺｎＰＣ）誘導体が、フルオロフォアを準備するために使用された。ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−９８、およびＰＥＧとのこれらのコポリマーの感熱性ポリマーが、異なる切り替え閾値を有する色素に対するナノカプセルを合成するために使用された。ナノカプセルの直径は、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により測定に基づいて、約２０ｎｍ〜約７０ｎｍの範囲であった。上記の２つの色素種類から、ＡＤＰＤＩＣＡおよびＺｎＰＣ（ＴＴＢ）がフルオロフォアを形成するために使用された。これらのフルオロフォアの切り替え特性を表８にまとめた。
【０１４７】
物質
ＡＤＰＤＩＣＡは、上述の実施例４と同様にＢａｎｄｉらに記載の技術にしたがって合成された。ＡＤＰＤＩＣＡの化学構造を図１３で示す。ＺｎＰＣ（ＴＴＢ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。ＺｎＰＣ（ＴＴＢ）の化学構造を図１８Ａで示す。ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７およびＦ−９８はＢＡＳＦ（米国、ニュージャージー州、フォーハムパーク）から購入した。メトキシルＰＥＧカルボン酸生成物（ＭＷ＝２０，０００、３０，０００、および４０，０００ｇ／ｍｏｌ）はＮａｎｏｃｓ社（米国ニューヨーク州ニューヨーク）から購入した。全部の薬品は、さらに精製を実施することなく、直接的に使用した。ＴＢＡＩも使用した。
【０１４８】
合成
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７またはＦ−９８（所望の準備に応じて）がＤＩ水（ｐＨ８）に溶解された。色素／ＴＢＡＩ（モル比＝１／６）が、クロロホルム中に溶解され、３０分間にわたり超音波処理状態に保たれた。色素／ＴＢＡＩクロロホルム溶液は、溶液を攪拌しつつ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ水溶液中に一滴ずつ加えられた。溶液は、２０Ｗで動作する超音波発生装置（米国コネチカット州ニュートン、Ｑｓｏｎｉｃａ有限責任会社）を使用して４分間にわたり、さらに分散された。結果的に生成された溶液は、クロロホルムが完全に蒸発するまで、ドラフト下で攪拌し続けた。結果的に生成した透明な溶液は、１．２μｍの膜（米国ペンシルベニア州ピッツバーグ、ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濾過器（１０，０００分子量カットオフ、米国マサチューセッツ州ビルリカ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過された。
【０１４９】
フルオロフォアの特徴評価
フルオロフォアの光学切り替え特性は、実施例１および実施例２で上述したシステムにしたがって測定された。測定結果を表８に示す。
【表８】
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【０１５０】
実施例９
ＵＳＦイメージングシステム
本明細書で記載のイメージング方法のいくつかの実施形態における使用に対して好適なＵＳＦイメージングシステムが提供される。特に、以下の３つのＵＳＦイメージングシステム、すなわち、（１）持続波（ＣＷ）モードシステム、（２）周波数領域（ＦＤ）モードシステム、および、（３）時間領域（ＴＤ）モードシステムが、テストされた。これらのシステムに関するシステム構成および時間系列を図２１Ａ〜図２１Ｇに示す。
【０１５１】
ＣＷモードシステムに関しては、イメージング対象の環境（例えば生体組織など）は、短い時間的期間（ミリ秒のオーダー）にわたり連続的にＨＩＦＵに曝露される。励起レーザが、ＨＩＦＵ曝露の前に、またはＨＩＦＵ曝露の間に、アクティブ化または電源投入されると、ＵＳＦ信号が生成される。次に、ＵＳＦ信号の蛍光強度が各場所において計算される（図２１Ａおよび図２１Ｂ参照）。
【０１５２】
ＦＤモードシステムに関しては、ＨＩＦＵ曝露は短期間にわたり事前決定された周波数で変調される。さらにＵＳＦ信号は、変調されたＨＩＦＵ周波数と同一の周波数を有する。ロックイン増幅器の使用により、変調されたＵＳＦ信号は、非常に高い感度で検出され得る（図２１Ｃ〜図２１Ｅ）。加えて、レーザ照射も、超音波信号がＣＷモードで動作する一方で、比較的高い周波数に（例えばｋＨｚからＭＨｚへと）変調され得る（図２１Ｃ〜図２１Ｅ）。このようにしてロックイン増幅器は、超音波に起因する蛍光信号変化を検出するために使用され得る。さらにロックイン増幅器を使用することにより、システムはＵＳＦ信号に対して高感度を有することが可能となる。
【０１５３】
ＴＤモードシステムに関しては、ＨＩＦＵ曝露は短い時間的期間（ミリ秒のオーダー）にわたり継続して行われ、レーザがピコ秒パルスを照射して、ＨＩＦＵ加熱が終了した後、ＵＳＦ造影剤が励起される。このようにして、放出されたＵＳＦ信号は、オン状態に切り替えられたフルオロフォアの蛍光寿命が長いため、数十ナノ秒のオーダーの幅を有するパルスとなる（図２１Ｆおよび図２１Ｇ）。それとは対照的に、バックグラウンドノイズは、蛍光バックグラウンド種の蛍光寿命が短いため、減衰がはるかに迅速となる。したがって、時間ゲーティング検出技術を使用することにより、ＵＳＦ信号は、信号の末尾部分のみを取得することによりバックグラウンドノイズから時間的に分離することが可能である。したがって感度および信号対雑音比の両方が、特定の他の方法／システムと比較して、顕著に改善される。
【０１５４】
加えて、加熱期間における顕著な熱拡散を回避するために、ＨＩＦＵ曝露時間は、熱拡散時定数よりもはるかに短い時間である数ミリ秒に制限され得る。
【０１５５】
実施例１０
改善されたＳＮＲを提供するイメージング方法
本明細書で記載のいくつかの実施形態に係るイメージング方法は以下のように実施された。最初に、一連の超音波切り替え可能フルオロフォアは、上述の実施例７にしたがって準備された。フルオロフォアは、（１）ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７ポリマーから形成されたナノカプセルまたはミセルに封入されたＡＤＰＤＩＣＡを含むフルオロフォア、および、（２）ＰＮＩＰＡＭナノ粒子に封入されたＩＣＧを含むフルオロフォアを含んだ。これらのフルオロフォアは、上述の実施例７および実施例８での記載と同様に準備された。２つの異なるフルオロフォアのピーク放出波長は、それぞれおよそ７１０ｎｍおよび８１０ｎｍであった。加えて、これらのフルオロフォアのＵＳＦ信号の動的な挙動は互いに異なり、図２２で示されるノイズからも異なるものであった。特に図２２Ａでは、ＡＤＰＤＩＣＡ含有フルオロフォアのＵＳＦ信号の時間的減衰プロファイルが示されている。図２２Ｂでは、ＡＤＰＤＩＣＡ含有フルオロフォアを使用するイメージング実験に対するバックグラウンド信号またはノイズ信号の時間的減衰プロファイルが示されている。同様に図２２Ｅでは、ＩＣＧ含有フルオロフォアのＵＳＦ信号の時間的減衰プロファイルが示されている。図２２Ｆでは、ＩＣＧ含有フルオロフォアを使用するイメージング実験に対するバックグラウンド信号またはノイズ信号の時間的減衰プロファイルが示されている。２つのフルオロフォアの時間的減衰プロファイルが異なるのは、理論に拘束されることを意図するものではないが、（１）蛍光色素の異なる環境的感度、（２）フルオロフォアの異なる構造（例えば、ミセル対ナノ粒子）、および、（３）フルオロフォアを形成するために使用された異なる感熱性ポリマー、のうちの１つまたは複数に起因するものと考えられる。異なる超音波切り替え可能フルオロフォアの異なる放出プロファイルは、多重ＵＳＦイメージングを可能にし得る。
【０１５６】
特に、図２２Ａおよび図２２Ｅで図示するフルオロフォアの放出プロファイルが、所与の実験条件（例えば上述の条件など）に対して一意的且つ一貫した形状を有することに注意すべきである。器具および実験条件が固定されると、所与のフルオロフォアに対するＵＳＦ動的曲線の形状は変化せず、信号強度に対して独立していることにも、さらに注意すべきである。各信号の強度は、固定された時間点におけるピーク値まで増加し、次に、減衰または低減する。それとは対照的に、バックグラウンド信号（図２２Ｂおよび図２２Ｆ）は不規則的に変動し、他のノイズ信号に対していかなる相関関係も示さない。さらに重要であるが、バックグラウンド信号は、超音波蛍光信号が示すのと同じ時間的減衰プロファイルを示さない。したがってバックグラウンド信号は、超音波蛍光信号に対する強い数学的な相関関係を示さない。理論に拘束されることを意図するものではないが、異なる時間的減衰プロファイルは、任意のＵＳＦ信号が、環境内の特定的な場所において検出されたフォトルミネセンス信号の合計の相関分析を実施するための基準信号として選択されることを可能にすると考えられる。相関関係が実施されると、相関係数（ＣｒＣ）の計算が可能となる。係る分析が実施されると、ＵＳＦに関連する信号が大きいＣｒＣを有する一方でバックグラウンド信号が小さいＣｒＣを有することが見出された。したがって上述のように、適切にＣｒＣ閾値を選択することにより、ＣｒＣはＵＳＦ信号とバックグラウンドノイズとを区別するために使用され得る。
【０１５７】
単色ＵＳＦイメージングにおいて、小さいシリコーンチューブ（内径：０．３１ｍｍ、外径：０．６４ｍｍ）が、上述のフルオロフォアの水溶液で充填され、１片のブタの筋肉組織に埋め込まれた。この構造は、ＵＳＦイメージング実験に対するターゲットとして血管をシミュレートすることを意図するものであった。組織の厚さはおよそ１２ｍｍであった。チューブ中心から組織の上部表面までの距離はおよそ６ｍｍであった。集光された超音波ビームが、さらに上述したように、チューブ内のフルオロフォアをオフ状態からオン状態へと外的および局所的に切り替えるために使用された。放出された蛍光光子は、冷却された低ノイズＰＭＴにより収集された。超音波ビームを用いて試料に対してラスタ走査を実施した後、ＵＳＦ画像が上述のようにして生成された。特に、試料内の複数の場所のそれぞれに対して、検出されたフォトルミネセンス信号の合計と基準信号とを比較する相関分析が実施された。この場合では、典型的なＵＳＦ信号が、基準信号として機能するために、ＵＳＦ画像から選択された。相関係数は、上記の式（１）にしたがって計算された。バックグラウンド信号が図２２に示される基準信号の一意的な動的パターンに従わないため、バックグラウンド信号に対する相関係数は、ゼロであるか、ゼロに近いか、または非常に小さい（例えば＜０．３）。このように、ノイズは、バックグラウンド信号を含む検出された信号に対して、環境内の関連する場所に対するバックグラウンド信号に関連付けられた相関係数を乗算することにより、顕著に抑えることができた。
【０１５８】
このようにして、ＵＳＦ画像のＳＮＲは劇的に増加した。相関処理前後のＵＳＦ画像が図２２および図２３に示されている。特に、図２２Ｃ／図２３Ｃおよび図２２Ｄ／図２３Ｄではそれぞれ、相関／乗算処理の前後のＡＤＰＤＩＣＡベースのフルオロフォアの空間的蛍光放出プロファイルが示されている。これら２つのプロファイルのＳＮＲは、それぞれ８８および３００と計算された。同様に、相関分析の前後のＩＣＧベースのフルオロフォアの空間的蛍光放出プロファイルがそれぞれ、図２２Ｇ／図２３Ａおよび図２２Ｈ／図２３Ｂに示されている。ＩＣＧベースのフルオロフォアに対して、ＳＮＲはそれぞれ、相関の前後で３１および３４５であった。
【０１５９】
実施例１１
多重化イメージング方法
本明細書で記載の一実施形態に係る多重化イメージング方法は、以下のように実施された。最初に、ＡＤＰＤＩＣＡ含有超音波切り替え可能フルオロフォアおよびＩＣＧ含有超音波切り替え可能フルオロフォアが、実施例１０で上述したように準備された。次に、前述のフルオロフォアが、実施例２で上述したのと同様のイメージングシステムを使用して、撮像された。励起光源は、６７１ｎｍの励起波長を有するダイオードレーザ（ＭＬＬ−ＦＮ−６７１）であった。１つの６７３／１１バンドパスフィルタ（中心波長：６７３ｎｍ、帯域幅：１１ｎｍ）が励起フィルタとして適用され、３つのロングパスフィルタ（エッジ波長：７１５ｎｍ）および２つのロングパス吸収フィルタ（エッジ波長：６９０ｎｍ）が放出フィルタとして使用された。
【０１６０】
２色ＵＳＦイメージングに対して、小さいチューブ（内径：０．３１ｍｍ、外径：０．６４ｍｍ）が散乱シリコーンファントム内に埋め込まれた。散乱物質はＴｉＯ２であった。ファントムの厚さはおよそ１２ｍｍであった。チューブは、ＡＤＰＤＩＣＡベースのフルオロフォアの水溶液３５０μＬと、ＩＣＧベースのフルオロフォアの水溶液２５０μＬと、の混合物で充填された。２つの水溶液は、水溶液体積あたり同一重量のフルオロフォアを含んだ。集光された超音波ビームが、チューブ内のフルオロフォアをオフ状態からオン状態へと外的および局所的に切り替えるために使用された。放出された光子は、冷却された低ノイズＰＭＴにより収集された。超音波ビームを用いてラスタ走査を実施した後、ＵＳＦ画像が上述のようにして得られた。
【０１６１】
特に、検出されたフォトルミネセンス信号は、ＡＤＰＤＩＣＡベースのフルオロフォアの正規化された超音波蛍光信号に対応する第１基底ベクトルと、ＩＣＧベースのフルオロフォアの正規化された超音波信号に対応する第２基底ベクトルと、に直交分解された。したがって、環境内の特定の場所に対して、検出されたフォトルミネセンス信号の合計は、次の式（２）にしたがって表現され得る。
【数２】
0006767377.tif 000013
式中、「Ｍｉｘｔｕｒｅ」はフォトルミネセンス信号（ベクトルとして表現される）の合計を表し、「ＡＤＰＤＩＣＡ」はＡＤＰＤＩＣＡベースのフルオロフォアに対応する基底ベクトルを表し、「ＩＣＧ」はＩＣＧベースのフルオロフォアに対応する基底ベクトルを表し、ａおよびｂは基底ベクトルに対する係数である。図２４では、１つの特定的場所に対する式（２）に対応する信号が示されている。特に、図２４Ａでは、ＡＤＰＤＩＣＡベースのフルオロフォアの成分信号が示され、図２４Ｂでは、ＩＣＧベースのフルオロフォアの成分信号が示され、図２４Ｃでは、検出されたフォトルミネセンス信号の合計が示されている。ＭＡＴＬＡＢにおける曲線当てはめアルゴリズムを使用して、試料内の１つの場所に対して９５％の信頼度内で、基底ベクトル係数ａは３．９と判定され、基底ベクトル係数ｂは２．６と判定された。ａとｂとの比（３．９／２．６＝１．５）は混合物の組成（３５０／２５０＝１．４）に近い値であった。
【０１６２】
実施例１２
複数の超音波トランスデューサを使用するイメージング方法
本明細書で記載の一実施形態に係る複数の超音波トランスデューサを使用するイメージング方法は以下のように実施された。複数の超音波トランスデューサを使用することに加えて、以下の方法は、ＵＳＦイメージングおよび超音波（ＵＳ：Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）イメージングの組み合わせを使用するデュアルモダリティイメージングを含んだ。
【０１６３】
この方法は、図２５で図示するＵＳＦイメージングシステムを使用して実施された。図２５で図示するブロック図では、ＭＴは、０．１Ｈｚ周波数を有するマスタートリガ（Ｔ−１）を送信するためのパルス遅延発生器である。ＦＧ−１は、デュアルＨＩＦＵトランスデューサモジュール（デュアル９ＭＨｚ−ＨＩＦＵ）に対するゲーティング（単一サイクル、０．５マイクロ秒遅延を有するパルス信号）と、超音波トランスデューサ（ＵＳＴ）モジュールに対する複合トリガリング（１ＫＨｚ、３００サイクル、パルス信号）と、を実施するためのファンクションジェネレータである。ＦＧ−２は、デュアルＨＩＦＵの各ＨＩＦＵ（ＨＩＦＵ−１およびＨＩＦＵ−２）を、それぞれ９ＭＨｚ正弦波信号を使用するパワー増幅器（ＲＦＡ−１およびＲＦＡ−２）により駆動するためのファンクションジェネレータである。パルスＴ／Ｒは、ＵＳＴを駆動するためのパルス送受信器である。ＦＧ−３は、励起レーザ光源（レーザ）を１ＫＨｚ周波数で変調するためのファンクションジェネレータである。Ｗは、デュアルＨＩＦＵ−ＵＳＴモジュールを浸漬し、試料（Ｓ）を部分的に浸漬するための水タンクである。ＳＴは内径（ＩＤ）が０．３１ｍｍおよび外径（ＯＤ）が０．６４ｍｍのシリコーンチューブである。３Ｄ−ＴＳは３次元（３Ｄ）平行移動台である。ＴＳ−ＭＣＵは３Ｄ平行移動台モータ駆動制御ユニットである。ＣＴ−１は、励起レーザ光源を光バンドル（ＯＢ−１）に集光させるためのコリメーションチューブである。ＣＴ−２は、試料（Ｓ）内からの光バンドル（ＯＢ−２）から収集された蛍光信号を案内するための最適化されたコリメーションチューブである。ＰＭＴは、光学的蛍光信号を検出するための光電子増倍管である。Ｐｒｅ−ａｍｐはＰＭＴから検出された光信号をフィルタ処理するための前置増幅器である。ＬＩＡは、検出された光信号から１ＫＨｚ周波数信号を検出するためのロックイン増幅器である。ＮＩ−ＤＡＱは、光信号を記録するためのＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔデータ取得モジュールである。デジタイザは、超音波信号を記録するためのＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔデータ取得モジュールである。ＣＢ−１は超音波信号データを伝達するための通信バスである。ＣＢ−２はＴＳ−ＭＣＵを制御するためのシリアル通信バスである。ＣＢ−３は光信号データを伝達するための通信バスである。Ｔ−２は１ＫＨｚ周波数を有するパルス信号であり、ＬＩＡに対する基準信号として機能する。Ｔ−３は３Ｄ−ＴＳの動きをトリガするための単一サイクルパルス信号である。
【０１６４】
より一般的には、図２５で図示するシステムは、４つのモジュールに区画化され得る。これらのモジュールは、（１）ソースモジュール、（２）試料モデルモジュール、（３）検出モジュール、（４）平行移動モジュール、を含む。これらのモジュールの各モジュールについては、以下でさらに詳細に説明する。
【０１６５】
ソースモジュール
ソースモジュールは、３つのサブモジュール、すなわち、（１）超音波モジュール、（２）デュアル高密度焦点式超音波モジュール、および（３）励起レーザモジュールにさらに区画化され得る。これらのサブモジュールの各サブモジュールについて、以下でさらに説明する。
【０１６６】
超音波モジュール
超音波モジュールは、走査の間における各場所におけるＡラインを取得するために使用される。なお走査は、任意の所望のライン、平面、または３Ｄ平面に沿って実施され得、平行移動モジュールを使用して規制される。超音波の高解像度イメージングを達成するために、１０ＭＨｚ（１０ＭＨｚ、Ｖ３１５、米国マサチューセッツ州ウォルサム、オリンパス）周波数の集光超音波トランスデューサ（ＵＳＴ）が使用された。ここでは、単一要素超音波トランスデューサが設計の簡略化のために選択された。一方、所望により、単一要素超音波トランスデューサは、超音波トランスデューサのアレイで置き換えることも可能である。ここでは電子的集光が、多段深度セクタイメージングを実施するため、および、より微細な解像度を達成するために、実施され得る。ＵＳＴの焦点距離はおよそ３４ｍｍ（約１．３４インチ）であり、直径は１９ｍｍ（約０．７５インチ）である。パルスエコー法が超音波イメージングのために用いられ、したがって、パルス生成器／受信器（米国マサチューセッツ州ウォルサム、ＯｌｙｍｐｕｓＮＤＴ、５０７７ＲＰ）により駆動される。なおこのパルス生成器／受信器は、２チャンネル型ファンクションジェネレータ（ＦＧ−１、米国テキサス州、Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ、ＡＦＧ３２５２）の第１チャンネルによりトリガされる。各走査場所におけるＦＧ−１のチャンネル１からの各バーストにおける複数のパルスサイクルにより達成される複合トリガは、平均処理（さらなる詳細については、この実施例のデータ処理セクションにおいて討論する）により、ノイズ低減ために用いられる。
【０１６７】
デュアル高密度焦点式超音波モジュール
デュアル高強度集光超音波モジュールに対して、２チャンネル型ファンクションジェネレータ（ＦＧ−１）の第２チャンネルは、第２ファンクションジェネレータ（ＦＧ−２）に対するゲーティングトリガとして使用される。なおＦＧ−２は、カスタム注文のデュアル高密度焦点式超音波（デュアルＨＩＦＵ）トランスデューサ（ＨＩＦＵ、ＳＵ−１０９、米国ワシントン州ボセル、ＳｏｎｉｃＣｏｎｃｅｐｔｓＬｔｄ）を駆動する。デュアルＨＩＦＵトランスデューサは、２つの９ＭＨｚ周波数ＨＩＦＵトランスデューサ（直径＝２３ｍｍ、焦点距離＝３５ｍｍ）がその基部に対しておよそ４５度で、互いに対して９０度の角度で、互いに対して対向し、およそ５ｃｍ離間された状態で取り付けられるよう、設計される。デュアルＨＩＦＵ間の分離エリアは、完全中空の円形間隙を有するよう設計される。この間隙は、３１．７５ｍｍの直径を有し、その直径が２ｃｍである超音波トランスデューサを配列するための十分な空間を有し、それにより、両側におよそ０．５ｃｍの自由な動きが可能となるよう、カスタマイズされる。デュアルＨＩＦＵの予備試験の間、ＨＩＦＵの性能仕様がわずかに変動することが観察された。したがってそれぞれのＨＩＦＵ焦点において略同一のピーク圧力を達成するために、２つのＨＩＦＵは異なる電圧で駆動される。デュアルＨＩＦＵは、２チャンネル型ファンクションジェネレータ（ＦＧ−２、米国イリノイ州シカゴ、Ａｇｌｉｌｅｎｔ３３５００Ｂ）からの、それぞれの振幅（ピーク間電圧、Ｖｐｐ）の正弦波信号を使用して駆動される。２つチャンネルの各チャンネルは、個々がデュアルＨＩＦＵ構成にあるそれぞれの９ＭＨｚのＨＩＦＵトランスデューサを駆動するための、それぞれの専用のパワー増幅器に接続される。かくして、増幅された駆動パワーは、それぞれの焦点において、より高いピーク圧力を生成する。このようにして、デュアルＨＩＦＵーＵＳＴユニットは、上向き（光学テーブルに対して垂直）になるようグループ化および配置される。ここで、ＵＳＴは、所望の試料または組織に対向するカスタム設計のデュアルＨＩＦＵの中央に配置される。グループ化されたユニットが、所望のライン、平面、または、カスタムプログラムされたＭＡＴＬＡＢ  ＧＵＩを使用する３次元的走査のための３次元平行移動台システム（３Ｄ−ＴＳ、米国ニューヨーク州、Ｖｅｌｍｅｘ、ＶＸＭモータ駆動Ｘスライド組立体）上に取り付けられる。ＦＧ−１の第２チャンネルからのゲーティング信号の期間はＨＩＦＵ曝露の期間を制御する。ＨＩＦＵ曝露の期間は、ＦＧ−２からの所望の駆動電圧と組み合わされて、研究対象の試料または組織内における超音波に誘導された温度変動を制御するための間接的方法を提供する。
【０１６８】
パルス遅延発生器は、０．１Ｈｚ周波数を有するマスタートリガとして使用される。このマスタートリガは、ファンクションジェネレータ（ＦＧ−１）およびデータ取得カード（ＮＩ−ＤＡＱカード、米国テキサス州ダラス、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＰＣＩＥ−６３６３）をトリガし、それにより、走査タイミングおよび取得タイミングとともに、デュアルＨＩＦＵおよびＵＳＴの両方の動作が制御される。ファンクションジェネレータＦＧ−１の第１チャンネルに対する直接的トリガと比較して０．５秒の遅延が、ＦＧ−１の第２チャンネルに対して設定される。その結果、超音波イメージングを完了させるための十分な時間が提供される。これにより、これらの周波数が互いに近いために９ＭＨｚのＨＩＦＵ信号が１０ＭＨｚのＵＳＴによりピックアップされることが確実に回避される。
【０１６９】
励起レーザモジュール
励起レーザモジュールは第３サブモジュールである。第３サブモジュールはフルオロフォア励起源として持続波レーザを含む。励起源は、光バンドル（ＯＢ−１およびＯＢ−２、米国ニュージャージー州バリントン、ＥｄｍｕｎｄＯｐｔｉｃｓ、モデル＃３９３６６）により、研究対象の所望の試料または組織を照射するために使用される。これは、研究のために使用される色素／対照液に応じて、８０８ｎｍ（中国ＪＬ、ＤｒａｇｏｎＬａｓｅｒｓ、ＭＧＬ−ＩＩ−８０８−２Ｗ）または６７１ｎｍ（米国ユタ州ミッドベール、Ｏｐｔｏｅｎｇｉｎｅ有限責任会社、ＭＬＬ−ＦＮ−６７１−５００ｍＷ）のいずれかを使用することにより、達成される。８０８ｎｍレーザ光源の場合、このレーザのビームプロファイルは長方形である。係るビームプロファイルに対して、平凸ＮＩＲレンズ（Ｌ１およびＬ２、米国ニュージャージー州ニュートン、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、モデル＃ＡＣ２５４−０３５−Ｂ）を有する簡単な構成が、長方形ビームを光バンドル（ＯＢ−１、モデル＃３９３６６）の一方の端部上に集光させるために用いられる。他のレーザ（６７１ｎｍのＣＷレーザ）に関しては、ビームプロファイルの断面が光バンドルの開放端部に対して同等であるため、レンズは不要である。両方の構成において、励起波長範囲を制限するために、フィルタがレーザヘッドの前方に配置される。なお、７８５／６２ｎｍ（米国ニューヨーク州ロチェスター、Ｓｅｍｒｏｃｋ、ＦＦ０１−７８５／６２−２５）および６７１／１１ｎｍ（米国ニューヨーク州ロチェスター、Ｓｅｍｒｏｃｋ、ＦＦ０１−６７３／１１−２５）が、それぞれ用いられる。光バンドルの他方の端部は、放出されるレーザが、図２５で図示するように超音波ユニットが集光される水中の組織の同一側面を照射するよう、配置される。発散レーザ照射を出力するともに、光バンドルを、試料から許容可能な距離に、光学テーブルに対して約４５度の角度で、配置することにより、研究対象の試料／組織の所望以上の領域に対する均質な照射が確実に行われることとなる。周波数依存の蛍光イメージングがこの研究に対して選択されたため、レーザはファンクションジェネレータ（ＦＧ−３、米国イリノイ州シカゴ、Ａｇｉｌｅｎｔ、３３２２０Ａ）を使用して１ＫＨｚ周波数で駆動される。ＦＧ−３ファンクションジェネレータのトリガ出力は、１ＫＨｚの光信号のみが観察および記録され、それにより、所望の光信号に対するシステムの感度が向上するよう、ロックイン増幅器に対する基準入力として使用される。
【０１７０】
試料モジュール
試料モジュールは、試料または組織のプレパラート、および色素／造影剤のプレパラートからなる。デュアルＨＩＦＵ−ＵＳモジュールに関する試料プレパラートが図２６で示されており、図２６は、超音波および試料のモジュール構成を強調する、実験ブロック図の最小化バージョンを示す。Ｉｎｐｕｔ−１：デュアルＨＩＦＵトランスデューサ（９ＭＨｚのＨＩＦＵ、デュアル：ＨＩＦＵ−１およびＨＩＦＵ−２）、Ｉｎｐｕｔ−２：超音波トランスデューサ（ＵＳＴ）に対する駆動信号、ＵＳＴ：１０ＭＨｚの超音波トランスデューサ、ＳＴ：試料（Ｓ）中に埋め込まれたシリコーンチューブ、なお１、２、および３は、チューブ１、チューブ２、およびチューブ３を表す、３Ｄ−ＴＳ：３次元平行移動台、Ｗ：デュアルＨＩＦＵ−ＵＳＴモジュールを浸漬するための水タンク。
【０１７１】
研究対象のブタ組織試料は、深さに沿って、組織試料の大きい側面の両側からおよそ５〜６ｍｍの距離で埋め込まれた３つのシリコーンチューブ（６０−０１１−０１、米国カリフォルニア州カーピンテリア、ＨｅｌｌｉｘＭｅｄｉｃａｌ）を含んだ。あらゆる２つのシリコーンチューブ間の横方向距離は、組織内でおよそ２ｍｍ離間している。デュアルＨＩＦＵは、チューブ２上に集光され、この位置に対して走査が実施される。走査の前に、ＵＳ焦点およびデュアルＨＩＦＵ焦点に対するチューブ２の場所が測定および記録される。ＵＳ焦点およびデュアルＨＩＦＵ焦点間のチューブ２位置の２Ｄ位置のこの不一致は、デュアルモダリティＭＡＴＬＡＢ処理の重ね合わせの際に考慮される必要がある。チューブ１は純粋なＡＤＰ色素溶液を含み、チューブ２はＩＣＧ：ＡＤｐ（３：２）比の溶液からなり、チューブ３はＩＣＧ色素溶液からなる。全溶液は、それぞれのシリンジを使用して、非常に低い注入速度で排出される。なお流速は約０．１インチ／時間である。
【０１７２】
ＵＳＦ造影剤物質および合成
物質：Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＴＢＡｍ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、テトラブチルアンモニウムヨージド（ＴＢＡＩ）、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、および、ＩＣＧは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入された。ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ９８はＢＡＳＦ（米国ニュージャージー州フォーハムパーク）から購入された。全部の薬品は、入荷状態のまま使用した。
【０１７３】
ＵＳＦ造影剤の合成
（１）ＩＣＧ・ＮＰ。ＩＣＧ封入ＰＮＩＰＡＭ・ＮＰは上述のように合成された。（２）ＡＤＰ（ＯＨ）２（底部）ナノカプセル。これらのナノカプセルは前述のように準備された。完結には、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ９８は５０ｍｇ／ｍＬの濃度で脱イオン化水中に溶解された。色素／ＴＢＡＩ（モル比＝１：６）が、クロロホルム中に溶解され、３０分間にわたり超音波処理状態に保たれた。次に、色素溶液は攪拌しながらＰｌｕｒｏｎｉｃ水溶液中に滴下され、次に４分間にわたり超音波発生装置を用いて分散された。クロロホルムが蒸発されて、色素が、Ｐｌｕｒｏｎｉｃナノカプセルの疎水性コアに封入された。自由色素は、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ遠心濾過器（１００００分子量カットオフ、米国マサチューセッツ州ビレリカ、ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ）を使用して除去された。
【０１７４】
検出モジュール
検出モジュールは３つのサブモジュール、すなわち（１）コリメーションチューブフィルタセットモジュール、（２）光センサモジュール、および、（３）ポスト光センサハードウェアモジュール、に分類される。
【０１７５】
（１）コリメーションチューブ（ＣＴ−２）のブロック図が図２７に示されている。図２７において、Ｌ１：ＯＢ−２（光バンドル）からの光学的蛍光信号を通過させる近赤外線（ＮＩＲ）平凸レンズである。ＬＰ１およびＬＰ２：ロングパス光学フィルタであり、７１５ＬＰおよび８３０ＬＰは、それぞれＡＤＰ溶液およびＩＣＧ溶液に対するフィルタである。ＲＧ１およびＲＧ２：吸収フィルタであり、ＲＧ６８０およびＲＧ８０８は、それぞれＡＤＰおよびＩＣＧに対するフィルタである。ＩＲ−１：コリメートされた光信号をＰＭＴへと通過させるかまたは拒否するかを制御するためのアイリス絞りである。ＩＲ−２：ＰＭＴの前方においてピンホールとして作用する固定開放アイリス絞りである。光学的漏出信号を最小化し、且つ、より長い光学的波長（励起波長よりも長い）の検出効率を最大化するよう構成されたカスタム構築のフィルタ−レンズ構成を使用することにより、予期に反して良好な結果が達成されたことが、驚くべきことに発見された。このフィルタ−レンズ構成は、簡便性のためにコリメーションチューブ（ＣＴ）構成と呼ばれる。光ファイババンドルが、空気に曝露されるブタ組織の表の側面上に垂直に、極めて接近して配置される。このことにより、蛍光信号の大部分が、大部分が漏出であるバックグラウンド光信号とともに、光バンドルの開放端部により収集されることが確実となる。なぜなら、その受光角が約６０度であるためである。この光バンドルの、光バンドル（ＯＢ−１）の他方の端部（コリメーションチューブの試料側と呼ばれる）は、光バンドルからの発散光信号が平行化されるよう、すなわちコリメートされるよう、ＮＩＲ平凸レンズ（Ｌ１）の焦点に固定される。他方の平凸レンズ（Ｌ２）は、平行な光ビームが冷却ＰＭＴ（米国ニュージャージー州ブリッジウォーター、Ｈ７４２２−２０）の開放センサ端部上に集光されるよう、反対方向に対向するコリメーションチューブの試料端部からおよそ４０ｃｍの位置に配置される。コリメーションチューブのこの端部はコリメーションチューブのＰＭＴ側と呼ばれる。ここで、コリメーションチューブは、３つのセクション（試料端部フィルタセット、中央フィルタセット、およびシャッタ）を有する。試料端部フィルタはロングパスフィルタ（ＬＰ１）である。ＡＤＰ色素に対しては７１５ｎｍロングパス（米国ニューヨーク州ロチェスター、Ｓｅｍｒｏｃｋ、ＦＦ０１−７１５／ＬＰ−２５）が使用され、ＩＣＧ色素に対しては８３０ｎｍロングパス（米国ニューヨーク州ロチェスター、Ｓｅｍｒｏｃｋ、ＢＬＰ０１−８３０Ｒ−２５）が使用される。ＬＰ１は、サンプル端部レンズ（Ｌ１）の直後に取り付けられる。中央フィルタセットは、コリメーションチューブの中心に配置され、３つのフィルタから構成される。なお、１つのロングパスフィルタ（ＬＰ１と同一のＬＰ２）が２つの吸収フィルタ（ＲＧ１およびＲＧ２）間に配置されている。ゼロ開口アイリス絞り（米国ニュージャージー州ニュートン、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ＳＭ１Ｄ１２ＳＺ）がシャッタとして使用され、Ｌ１レンズとＬ２レンズとの間の距離の約２／３の位置（試料端部から測定する）に配置される。アイリス絞りのアパーチャ直径を調整／変化により、光信号は、許容または完全遮断され得る。試料側レンズ（Ｌ１）およびＰＭＴ側レンズ（Ｌ２）とともに３つのセクションの全部は、外部からの無関係な光信号が完全に拒否されるよう、チューブレンズにより接続される。したがって、コリメーションチューブのＰＭＴ側から出て来る光信号は、励起レーザ光源からの最小化された漏出、および、望ましくない周辺光信号を有する、造影剤からのフィルタ済み蛍光信号である。上述のように、予想に反して良好な結果が、上述のカスタム構築されたフィルタ−レンズ構成を使用することにより達成可能であることが、驚くべきことに発見された。特に、本明細書で記載の構造を有するコリメーションチューブを使用してフォトルミネセンス信号を検出することが、改善されたＳＮＲを提供し得ることが発見された。特に、第１（近位）コリメーションレンズ（Ｌ１）、第２（遠位）コリメーションレンズ（Ｌ２）、および、第１コリメーションレンズと第２コリメーションレンズとの間に配置された１つまたは複数のフィルタを有するコリメーションチューブが使用され、第１コリメーションレンズが、フィルタから、および／または第２コリメーションレンズから、１０ｃｍより大きい距離または２０ｃｍより大きい距離（例えば２５〜５０ｃｍ、２５〜４０ｃｍ、または３０〜４０ｃｍの距離）だけ離間されることは、有利であり得る。
【０１７６】
（２）冷却光電子増倍管が、内部高電圧電源を有する光センサとして使用される。この光センサの望ましい特徴は、そのスペクトル応答が、３００ｎｍ〜８９０ｎｍの範囲であり、熱ノイズ変動が小さく、極めて低い光信号に対してさえ、高い信号対雑音（ＳＮＲ）比を有するという点である。アイリス絞りは、平凸レンズ（Ｌ２）の焦点距離における冷却ＰＭＴセンサヘッドの前方に配置され、本質的でない光信号を拒否するためのピンホール構成として動作する１ｍｍ（約２０％）直径開口部に固定される。
【０１７７】
（３）ポスト光センサハードウェアモジュールは、低ノイズ電流前置増幅器（ＰｒｅＡｍｐ、米国カリフォルニア州サニーべール、ＳｔａｎｆｏｒｄＲｅｓｅａｒｃｈ、ＳＲ５７０）およびロックイン増幅器（ＬＩＡ、米国カリフォルニア州サニーべール、ＳｔａｎｆｏｒｄＲｅｓｅａｒｃｈ、ＳＲ８３０）から構成される。電流前置増幅器は、ハードウェアフィルタリング（６または１２ｄＢのカットオフを有する）と、ユーザ定義による（所望の）感度と、を適用する一方で、冷却ＰＭＴから出力された電流を電圧出力に変換する。励起源が１ＫＨｚにおいて変調されているために、１ＫＨｚ周波数の光信号が妨げられることなく通過することが可能となるよう、感度は５０ｎＡ／Ｖに設定される。１０ＫＨｚのローパス（１２ｄＢを有する）、または３Ｈｚ〜１０ＫＨｚのバンドパス（６ｄＢを有する）が、本質的でない光信号がフィルタ除去されるよう、設定され得る。前置増幅器から出力されたフィルタ済み光信号は、（処理されるべき）入力としてロックイン増幅器に供給され、基準信号は、１ＫＨｚ周波数において励起レーザを変調するために使用されたファンクションジェネレータ（ＦＧ−３）からの同期出力から取得／供給される。ロックイン増幅器の出力は、時間に対して好適／所望の１ＫＨｚ周波数を有する（１ＫＨｚが基準信号としてＬＩＡに与えられるため）光信号のみの振幅および位相の両方のデータ／情報から構成される。ＬＩＡ出力は、その２つのパラメータ設定、時定数、および感度により、決定される。時定数は３００ミリ秒（ｆ＝１ＫＨｚに対して１／２πｆ〜０．１５９ミリ秒より大きい）に設定され、それにより、時間に対するＬＩＡの低速な累積応答が確保される。感度は、研究対象の組織／試料内における局所的温度変動に対する色素溶液の蛍光応答の微分である信号強度に応じて、２０ｍＶ〜５００ｍＶの範囲で変動する。
【０１７８】
平行移動モジュール
３つのＶｅｌｍｅｘ線形平行移動モータ駆動台が、設計システム（３Ｄ−ＴＳ）に対する３Ｄ走査能力を有するよう、構成される。３Ｄ−ＴＳはコンピュータに接続され、カスタム構築されたＧＵＩ・ＭＡＴＬＡＢインターフェースを使用して制御される。ＧＵＩは、３Ｄ−ＴＳモジュールの様々な側面（例えばステップサイズ、加速度、走査速度、走査面、走査面内の走査場所の個数、その他）を制御するようプログラムされている。走査プランは、前方向（Ｘ、Ｙ、およびＺ方向）に沿った１Ｄ、２Ｄ、および３Ｄ面走査能力を含む。デュアルＨＩＦＵ−ＵＳＴモジュールは、組織試料内のターゲットの走査を実施するために、この３Ｄ−ＴＳモジュール上に取り付けられる。試料台の他の全部の構成要素は、走査の実施時は比較的静止状態にある。
【０１７９】
実験
実験は、励起レーザ波長と、ターゲット（シリコーンチューブ）とともに使用される色素溶液に相互依存する漏出波長を最小化または拒否するための、そのフィルタセットと、に応じて、２セットの走査に分割される。これらのチューブには１〜３の番号が付されている。チューブ１はＡＤＰを含み、チューブ３はＩＣＧ色素溶液を含む。チューブ２はＩＣＧおよびＡＤＰの混合物（３：２の比）を含む。ＨＩＦＵ−ＵＳモジュールは、試料研究に対して垂直に配置されるべきである。ＵＳおよびＵＳＦ十字焦点の焦点は、デュアルＨＩＦＵモジュールに対するＵＳトランスデューサの物理的制限調節により、深さに沿っておよそ１．５ｍｍおよび横方向に沿っておよそ０．２ｍｍの領域である。デュアルＨＩＦＵ−ＵＳモジュールは、デュアルＨＩＦＵの交差焦点が、試料の中央であるチューブ２に集光されるよう、調整される。
【０１８０】
実験動作タイミング
パルス遅延発生器（米国カリフォルニア州サニーベール、ＳｔａｎｆｏｒｄＲｅｓｅａｒｃｈ、ＤＧ６４５）を使用するマスタートリガ（ＭＴ）が、ファンクションジェネレータ（ＦＧ−１）およびデータ取得カード（ＮＩ−ＤＡＱ）の両方をトリガするために使用される。マスタートリガは、それぞれのゲーティングパルス列を送信するよう、ファンクションジェネレータＦＧ−１の２つのチャンネルを起動する。ＦＧ−１のチャンネル１は、単位トリガあたり８〜１６パルスを有する１Ｋｈｚパルス列に設定される。１Ｋｈｚパルス列の各パルスは、超音波取得のためのパルスエコー法を実装するためのパルス生成器／受信器（パルサー、米国マサチューセッツ州ウォルサム、Ｏｌｙｍｐｕｓ、５０７７ＰＲ）に対する外部トリガとして作用する。超音波パルスエコーの取得速度およびデータ伝達が一緒に数十マイクロ秒の時間を要するため、１Ｋｈｚパルス周波数（パルス間に約１マイクロ秒）は、超音波Ａラインデータを取得および記録するにあたり十分である。パルサーにより受容された超音波信号（Ａライン）は、パルサーによりトリガされるデジタイザ（米国テキサス州ダラス、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＮＩ−ＵＳＢ  ５１３３）を使用して記録され、単位トリガあたり複数のパルスが、単一走査場所における複数のＡラインを記録する。これらのＡラインを平均し、それによりノイズを低減させることが実施され、各走査場所に対する結果が、コンピュータ内の所望の場所に行列ファイルとして格納される。一方、ＦＧ−１ファンクションジェネレータのチャンネル２は、デュアルＨＩＦＵを駆動するために使用されるファンクションジェネレータＦＧ−２のゲーティング処理のために使用される。チャンネル２は、ＵＳ取得が完了するために十分な時間が与えられるよう、５００マイクロ秒の遅延を有するよう設定される。ＦＧ−２ファンクションジェネレータを使用することにより、使用された定義済み駆動電圧と組み合わせてＦＧ−１を使用して、チャンネル２パルス幅の期間と、単位トリガあたりのパルス個数と、を制御することにより、デュアルＨＩＦＵは、所望の駆動パワーで「オン状態」および「オフ状態」に切り替えられることが可能である。かくして、組織または試料内の温度を管理することに関する間接的制御が達成される。
【０１８１】
マスタートリガは、その取得を開始するようＮＩ−ＤＡＱもトリガし、遅延は導入されない。それにより、マスタートリガの開始から光信号（ＵＳＦ信号）が取得される。この研究に関して、ＮＩ−ＤＡＱカードの２つのチャンネルは、マスタートリガからのトリガ時における、ＰＭＴ−前置増幅器出力信号（変調された蛍光信号出力）と、ＬＩＡ出力（１ＫＨｚ周波数の感度振幅信号出力）と、を記録するようプログラムされる。光信号取得の典型的な期間は、ＬＩＡが３００ミリ秒時定数を有するよう設定されている場合、約４〜６秒である。取得が記録され、ＭＡＴＬＡＢを使用して行列変数に格納されると、ソフトウェアパルストリガが生成される。このパルストリガは、次の場所荷移動するようＶｅｌｍｅｘ３Ｄ平行移動台をトリガするために、出力ＮＩ−ＤＡＱポートにより、送出される。ＤＡＱ取得期間（約４〜６秒）と、次の走査場所への平行移動の期間（２秒よりも短い）と、の合計が、マスタートリガ間の期間を超えることがないよう、注意すべきである。したがってこの研究に対して、マスタートリガは０．１Ｈｚ周波数（約１０秒）に設定される。（光学的ＵＳＦ信号に対する）ＮＩ−ＤＡＱの、および（超音波信号に対する）データデジタイザの、データ伝達は顕著に速いため、マスタートリガ間の期間が、任意の２つの走査場所間の期間を決定し、それにより、システムの走査および取得の期間全体を決定する。
【０１８２】
データ処理
ＵＳＦ画像処理
超音波切り替え可能蛍光イメージングは、周波数領域蛍光イメージング技術を使用して実施される。係るイメージング技術では、励起レーザ光源は所望の（１ＫＨｚ正弦波）波形で変調され、検出される蛍光も、励起源変調周波数で変調するであろう。このように、１ＫＨｚ蛍光信号のみが処理されるべき望ましい信号であり、他の全部の光信号は拒否され得る。検出される蛍光信号は、冷却ＰＭＴを使用して記録され、蛍光信号に対する感度および特異度を増加させるために、ＬＩＡに提供される。したがって、検出される蛍光は、ＰＭＴおよびＬＩＡから出力される２つの出力信号を有する。両方の信号は、ＮＩ−ＤＡＱ取得モジュールの２つのチャンネルにより記録される。
【０１８３】
組織試料内のターゲットは、０．３６ｍｍの内径（ＩＤ）および０．６１ｍｍの外径（ＯＤ）を有するシリコーンチューブである。色素溶液は停滞を回避するためにシリンジポンプを使用して毎時０．０１インチの低流速で循環される。
【０１８４】
ＬＩＡ出力−最大振幅対初期ベースライン振幅
ソースセクションで記載したように、ＬＩＡモジュールは、ＬＩＡの感度および特異度を決定する２つの主要なパラメータ設定を有する。なお、このパラメータ設定とは（１）時定数および（２）感度である。時定数は１ＫＨｚ変調光信号に対して３００ミリ秒に設定される。このことは、時間に対して１ＫＨｚ振幅信号を変化させることに対するより低速な累積応答を、ＬＩＡに与える。その結果として、信号対バックグラウンド比は、より高くなる。Ｎｉ−ＤＡＱデータ取得モジュールの開始と、ＵＳＦ信号を生成するデュアルＨＩＦＵモジュールの開始と、の間にも０．５秒の遅延が存在する。したがって初期データ取得のおよそ約０．５秒間は、ＵＳＦ信号を有さず、したがってベースラインまたはバックグラウンド信号として使用され得る。ＵＳＦデータは、デュアルＨＩＦＵ駆動（「オン状態」）の期間（約２５０マイクロ秒）に応じて、約４〜６秒間にわたり記録される。このデュアルＨＩＦＵ駆動期間は、研究対象の試料または組織内で温度が誘導される期間を間接的に制御する。デュアルＨＩＦＵが駆動される期間および振幅（デュアルＨＩＦＵに供給されるパワーに対応する）の組み合わせが組織内の温度上昇を決定することに注目すべきである。デュアルＨＩＦＵが活性化される期間、または「オン状態」である期間に対して徐々に温度が上昇し、デュアルＨＩＦＵが不活性化されると、または「オフ状態」に切り替えられると温度が徐々に低下する点も、考慮すべきである。ＨＩＦＵに誘導される蛍光信号の増加および減少の比率は異なり、後者の場合では、より低速である。温度上昇のこの比率および変化量も、それにより蛍光応答も、組織の本質的な物理的特性および熱的特性と、デュアルＨＩＦＵの機械的仕様および電気的仕様と、に依存する。
【０１８５】
ＬＩＡに対する基準信号は、１ＫＨｚパルス信号であるファンクションジェネレータ（ＦＧ−３）の同期信号から提供される。感度は、研究に対して使用される造影剤イメージング色素溶液（それぞれＩＣＧおよびＡＤＰ）に応じて、２０ｍｖまたは２００ｍｖに設定される。ＬＩＡ出力振幅信号の最大値と、最初の０．５秒のベースラインと、の間の差異が、誘導されたピーク温度変動に直接的に対応するＵＳＦ信号変動であると考えられる。したがって、走査場所におけるピーク温度に対応する絶対的な蛍光信号強度が記録され、この処理は他の走査場所に対して反復される。したがって２Ｄ画像が生成される。なお生成された２Ｄ画像のグレースケール強度値は、考慮対象の組織または試料内の物理的場所に対するＵＳＦ信号のピーク温度に対応する。
【０１８６】
その対応する入力および基準信号を有するＬＩＡの位相感受性の検出出力は、次のように与えられる。
【数３】
0006767377.tif 000014
【０１８７】
信号はＶｓｉｇｓｉｎ（ωｒｔ＋θｓｉｇ）である。式中、Ｖｓｉｇは信号振幅であり、ωｒは信号周波数であり、θｓｉｇは信号の位相であり、その一方で、基準信号は、ＶＬｓｉｎ（ωＬｔ＋θｒｅｆ）である。式中、ＶＬは基準振幅であり、ωｒは基準信号周波数であり、θｒｅｆは基準信号の位相である。
【０１８８】
特徴抽出
２Ｄ・ＵＳＦ画像が生成されると、信号対バックグラウンドノイズ比が比較的低い値であることがただちに観察された。ＵＳＦ画像のＳＮＲを高めるため、カスタマイズされた特徴抽出アルゴリズムが採用される。特徴抽出アルゴリズムは、２つの部分（相関行列の生成、および、べき関数を使用するグレースケールマッピング）に分類される。処理された相関行列を元の２ＤＵＳＦ画像に乗算すると、所望の特徴が改善され、それによりＵＳＦ画像（処理済みＵＳＦ画像と呼ばれる）のＳＮＲが向上する。
【０１８９】
相関行列の生成
組織試料に梅これまたチューブ内のＩＣＧ色素またはＡＤＰ色素の蛍光信号の典型的な動的応答は基準信号であると考えられる。一般的なＭＡＴＬＡＢ相関関数が、ＵＳＦ画像内の全走査点のうちの各走査点に対応する全信号のうちの各信号に適用されると、−１〜１の範囲の相関値が得られる。ここで、負の相関値は基準信号に対する逆の関係に対応し、０は相関性が存在しないことに対応し、正の相関値は基準信号に対する高い相関性に対応する。相関関数は、次の相互相関式により支配される。
【数４】
0006767377.tif 000015
式中Ｒ（Ｘ，Ｙ）はＸ（ｔ）およびＹ（ｔ）信号系列の相互相関係数であり、Ｘ（ｔ）は入力信号であり、Ｙ（ｔ）は基準信号であり、Ｎは信号サンプルサイズである。
【０１９０】
グレースケールマッピング
オリジナルのＵＳＦ・２Ｄ画像の相関行列または相関画像が形成されると、特徴抽出アルゴリズムが２Ｄ相関画像上に実装される。特徴抽出アルゴリズムは次のべき乗公式により支配される。
【数５】
0006767377.tif 000016
式中、Ｐｏｕｔ（ｉ，ｊ）は出力ピクセル値であり、Ｐｉｎ（ｉ，ｊ）は相関行列値であり、ａおよびｂは定数である。「ｂ」に対して、より高い値（通常は１０００〜１０００００。ａは１に等しい）を選択することにより、より高い強度値を有する画像の特徴はさらに高くなり、それにより、より低い強度値はさらに低く抑えられ得る。一般に画像のダイナミックグレースケールは、さらに大きくなる。この処理はグレースケールマッピングと呼ばれる。このことにより、相関性がないグレースケール値、相関性がゼロであるグレースケール値、またはある程度まで相関性が低いグレースケール値が完全に抑えられ、それにより高い相関性を有する強度／グレースケール値が強調されることが確実となる。
【０１９１】
処理済みＵＳＦ画像：処理済み相関行列のオリジナルＵＳＦ画像への適用
グレースケールマッピングが施された相関行列が生成されて、この相関行列がオリジナルのＵＳＦ・２Ｄ画像に乗算されると、ＵＳＦ・２Ｄ画像は処理済みＵＳＦ画像となり、その結果として生成されたこの処理済みＵＳＦ画像は、高濃度の蛍光領域が強調表示されるという特徴を有する。
【０１９２】
上述のアルゴリズムは、２Ｄ・ＵＳＦ画像を生成し、高い蛍光濃度の領域を強調表示するための、段階的アプローチである。オリジナルのＵＳＦ・２Ｄ画像強度が直接的に処理されるのではなく、それに代わって相関行列ＵＳＦ・２Ｄ画像が処理されることに注意すべきである。それにより、オリジナルのＵＳＦ・２Ｄ画像強度は、ピクセルごとに、処理済みＵＳＦ画像を処理済み相関行列を除算することにより、処理済みＵＳＦ・２Ｄ画像から回復または再計算され得る。
【０１９３】
ＵＳ画像処理
デジタイザは、その高いサンプリングレート（最高サンプリングレートは１００ＭＳ／秒である）に対する超音波Ａライン信号を記録するために使用される。デジタイザはＭＡＴＬＡＢを使用することにより制御される。ＭＡＴＬＡＢにより、デジタイザは、トリガに対する２０マイクロ秒の遅延後に６０マイクロ秒のデータを記録するよう設定される。このことにより、ＵＳＴの表面および水からの高エコー振幅信号を含むＵＳエコー信号の最初の２０マイクロ秒は、確実に拒否される。水中の平均超音波速度が１４８０毎秒メートルであるとすると、６０マイクロ秒の記録は、およそ４．４ｃｍの深さの情報が記録されることに対応する。
【０１９４】
ＡラインからＢモードへの画像生成
各走査点におけるＡラインが記録され、座標情報（例えば、絶対位置、および軸方向ならびに横方向の両方に沿った走査点間の距離など）とともに格納される記録されたＡラインは振幅エコー情報を有するため、ベースラインシフトを除去した後に上方エンベロープ情報に変換される。各深さに沿って、Ａラインのエンベロープ（エンベロープＵＳ信号と呼ばれる）は、行列において列方向に積み重ねられ、次に、これが２Ｄ画像として格納される。これは、Ｂモード画像または輝度モードＵＳ画像を意味する。Ｂモード画像または輝度モードＵＳ画像では、グレースケール強度値は、より高い音響インピーダンス不整合境界面に対応し、それにより、ＲＯＩの構造的情報が強調される。
【０１９５】
２Ｄ深度走査（ＸＺ走査）に対しては、各ラインの各走査点が１ＤエンベロープＵＳ信号を有するため、生成されるＢモード画像の個数は深度走査ラインの本数に等しいことに注意すべきである。観察される必要があるＢモードの選択については、以下のＵＳＦおよびＵＳ画像の重ね合わせのセクションで詳細に説明する。
【０１９６】
カスタマイズされたテンプレート照合アルゴリズムによるチューブ位置抽出
カスタマイズされたテンプレート照合アルゴリズムは、相関法に基づいて開発されたものである。超音波（ＵＳ）Ｂモード画像におけるチューブ構造は、その寸法がシリコーンチューブの断面直径（ＯＤ＝０．６４ｍｍ）と０．４ｍｍとの合計となり、それによりチューブ全体が確実に考慮されるテンプレートとして、選択される。次にオリジナルのＵＳ・Ｂモード画像およびテンプレートをＭＡＴＬＡＢのビルトイン関数「ｎｏｒｍｘｃｏｒｒ２」に与えると、相関行列が生成される。次に、０．７の相関値におけるカットオフを有する閾値化が適用されると、負、ゼロ、またはより低い相関値がゼロに抑えられる。したがって生成された処理済み相関行例は、考慮対象の組織試料内に埋め込まれた３本のチューブの位置に対応する３つの領域を含む。
【０１９７】
デュアルモダリティイメージング：ＵＳＦ画像のＵＳ画像上への重ね合わせ
処理済みＵＳＦ画像のオリジナルのＵＳ・Ｂモード画像上への直接的重ね合わせ
処理済みＵＳＦ・２Ｄ画像は、透明性を使用するが軽微な変更を有する、画像重ね合わせの直接的方法を使用して、グレースケール化されたＵＳ・Ｂモード画像上にカラー画像として重ね合わせるために使用される。重ね合わせコードは、処理済みＵＳＦ画像強度値と、透明性の度合いと、の制御閾値化を有するよう、変更される。制御閾値化は、ＵＳＦ画像における末尾部を最小化または除去し、より高濃度蛍光領域を示すために、２つの方法に分類される。
【０１９８】
方法１：処理済みＵＳＦ画像のこの方法で使用される定義された閾値化は、０〜１の範囲のカットオフにより決定される。この値は画像における最高強度のパーセンテージを決定する（１は、画像全体の最高強度の１００パーセントである）。したがって閾値カットオフより大きいパーセンテージの強度の全体が、バックグラウンドＵＳ・Ｂモードグレースケール画像上に重ね合わされる。
【０１９９】
方法２：処理済みＵＳＦ画像に対して、カスタム生成された形態学的アルゴリズムが、閾値方法を使用して実装される。閾値化の同様の処理が実装されるが、より小さいカットオフ値を有する。このようにして得られたＵＳＦ画像は、分離された２値画像形成濃度領域に変換される。領域の中で最大の２つのエリアが選択され、分離された領域の残りは除去または拒否される。このように生成された処理済み２値画像はマスクのように作用し、次に、処理済みＵＳＦ画像に対して乗算される。このようにしてＵＳＦ画像の末尾部が顕著に低減され、より高濃度の蛍光領域が強調される。
【０２００】
観察
２つ以上のターゲット（本研究では、ＩＣＧまたはＡＤＰのいずれかの色素溶液で充填されたシリコーンチューブ）を有する処理済みＵＳＦ画像に対する形態学的操作は、チューブの位置と一致しない領域をもたらすこともあった。理論に拘束されることを意図するものではないが、２つの隣接するチューブの末尾領域が互いに対して近接するかまたは重なり合い、その結果、高濃度領域のエリアよりも大きいエリアが形成される場合があると考えられる。したがって上記のアルゴリズムは、偶然に、これらの末尾重ね合わせ領域を、ＵＳＦ画像における最大の２つの領域のうちの１つであると選択する。この懸念事項は、蛍光濃度領域がチューブの位置に基づいて選択されるなら、克服され得る。
【０２０１】
ＵＳ案内ＵＳＦ画像重ね合わせ：ＵＳＦ画像の高濃度領域の強調表示
ＵＳ・Ｂモード画像に対してテンプレート照合アルゴリズムを実装することにより、チューブの位置または領域がもたらされた。このように得られた処理された相関済みＵＳ・Ｂモード画像は２値画像に変換される。ＵＳ・Ｂモード相関行列のこの２値画像は基準画像として使用され、ＵＳＦ画像の２値画像は、カスタム開発されたＭＡＴＬＡＢ関数に対する入力画像として使用される。この関数は、入力画像と基準画像との間で互いに交差する領域を選択し、交差しない他の領域は除外または拒否する。このようにして得られた２値画像は、処理済みＵＳＦ画像に対して乗算するために使用される。このように、チューブ位置に配置されるＵＳＦ蛍光濃度領域が、選択され、次に、重ね合わせ画像プログラムにおいて使用される。
【０２０２】
画像重ね合わせプログラムの追加的変更は、２つの処理済みＵＳＦ・２Ｄ画像を、グレースケール化されてはいるが異なる色を有するＵＳ・Ｂモード画像上に組み込むこと、を含む。このカラーコーディングは、イメージング時にチューブにおいて使用された異なる色素容器を区別することを支援する。赤色カラーコーディングはＩＣＧ試料を示し、緑色カラーはチューブ内に分散されたＡＤＰ試料に関するものである。黄色の第３カラーは、チューブが２つの色素溶液（ＩＣＧおよびＡＤＰ）の混合物で充填されていることを示す、共通の重なり合うエリアを有する２つの重ね合わされた画像の領域を強調するために使用される。
【０２０３】
結果および考察
単一ターゲットのためのＵＳＦイメージング
ブタ組織試料実験内で埋め込まれた単一ターゲット（単一チューブ）に対して、予備実験に対して使用されたブタ組織の厚さは約４〜５ｍｍであり、使用された色素溶液はＡＤＰであり、ターゲットシリコーンチューブの仕様は以下の通りである。ＩＤ：０．３１ｍｍおよびＯＤ：０．６４ｍｍ。
【０２０４】
生成された２Ｄ・ＵＳＦ画像は温度変動に関する情報を含み、かくしてＵＳＦ画像内の蛍光領域は、デュアルＨＩＦＵの焦点エリア内に誘導された温度の直接的な結果である。したがって、組織内の単一チューブのデュアルＨＩＦＵ超音波処理に対する蛍光応答は、ＵＳＦ画像内の十字形状の蛍光領域を有することが示される。この領域は２つの区分：（ａ）十字中心領域および（ｂ）末尾領域、を有することが示されている。十字中心領域は色素溶液を有するチューブの位置に形成され、末尾領域は、デュアルＨＩＦＵモジュールのそれぞれの個々のＨＩＦＵの焦点エリアの先端である。
【０２０５】
十字中心領域は、４つの末尾部と較べると、比較的高い蛍光強度を有することが示される。この観察は、デュアルＨＩＦＵの２つの焦点領域の結合部において個々のＨＩＦＵの圧力が比較的大きい（建設的干渉を有する）ため、十字中心領域がより高い温度変動を有し、中心領域から焦点領域の主要軸に沿って頂点へと移動するにしたがって、比較的より小さくなる、という仮説と一致する。
【０２０６】
単一ＨＩＦＵ−ＵＳＦ研究では、同様のターゲット領域の蛍光領域のＦＷＨＭは、ＨＩＦＵの圧力領域のＦＷＨＭと、色素溶液が分散されたターゲット領域（シリコーンチューブ）の断面と、の畳み込みであることが観察されている。このデュアルＨＩＦＵ−ＵＳＦ研究では、蛍光領域のＦＷＨＭは、以前の研究（ＦＷＨＭが深さに沿って約４〜６ｍｍであり、横方向に沿って１．２〜１．５ｍｍである）と比較して、深さ方向および横方向の両方に沿って約１〜１．２ｍｍに相当に低減されることが明らかに観察され得る。したがってデュアルＨＩＦＵまたはＵＳＦイメージングを使用することにより、ＵＳＦイメージングの軸方向解像度が大きくなることが見られ得る。１つの事例では、軸方向に沿った解像度がこのように７．６６ｍｍから１．５ｍｍに低減されたことが結論された。
【０２０７】
３つのターゲットを有するＵＳＦイメージング
より厚い（約１０〜１２ｍｍの厚さ）ブタ組織試料内の一連の同様のターゲット（シリコーンチューブ）のＵＳＦ画像はＵＳ画像とともに得られた。特に、ＢモードＵＳ画像は３つのターゲットの形状および位置に関する構造的情報を与え、ＵＳＦ画像は、シリコーンチューブ内に分散された色素溶液の濃度に比例する、根底をなす生理学的情報を与える。複数ターゲット実験に対して、３本のチューブが考慮され、試料準備セクションで論じられるように配列される。ここで表される結果は、その対応するＡＤＰフィルタセット（８３０ＬＰ、ロングパスフィルタ＋ＲＧ７８０、吸収フィルタ）とともに８０８ｎｍレーザ励起を使用した。ＡＤＰベースのＵＳＦ画像のＳＮＲが顕著に高いため、特徴抽出アルゴリズム（相関プラスグレースケールマッピング）は適用されず、したがってオリジナルの未処理データが重ね合わせに使用される。ＩＣＧの場合、特徴抽出アルゴリズムが、ＩＣＧベースのＵＳＦ画像の低濃度領域を強調表示するために適用される。
【０２０８】
そのＡＤＰ溶液が８０８ｎｍレーザ光源により励起されないため、チューブ１が蛍光をまったく示さなかったことが観察された。一方、チューブ２およびチューブ３は、デュアルＨＩＦＵ超音波処理に応答して蛍光を示し、それにより、ＵＳＦ現象の発生が示された。面積および蛍光強度レベルは、ＩＣＧ濃度がチューブ３における未混合ＩＣＧ溶液と比較してチューブ２（ＩＣＧ：ＡＤＰが約３：２）において異なるという事実により、チューブ２およびチューブ３から異なる。蛍光の濃度クラスタは、ＢモードＵＳ画像におけるチューブの位置において正確に重ね合わされ、それにより、それぞれのチューブ内で８０８ｎｍの感光性溶液、ＩＣＧ色素溶液の存在が、さらに確認される。重ね合わされたＵＳＦ画像は、蛍光の２つの異なる濃度エリア／領域を示した。チューブの位置から離間した蛍光領域は末尾領域と呼ばれ、チューブ位置の上方の高濃度領域は十字中心領域と呼ばれる。選択された閾値カットオフに応じて、末尾領域は、より小さい値に対して支配的となり、より大きい値に対して非支配的になる。しかしより大きいカットオフは、画像において最高濃度の蛍光のみが表示されるが、周囲の情報が失われてしまうことを示唆する。蛍光末尾領域情報を最小化する一方でＵＳＦ画像の最大情報を保存することが必要である。これを達成するために、チューブ位置に近接するかまたはチューブ位置上方にあるこれらの領域を選択するための形態学的操作が実行される。
【０２０９】
形態学的操作を使用して処理されたＵＳＦイメージング
形態学的操作は、ＵＳＦ画像を２値画像に変換し、次に、ＵＳ・Ｂモードチューブ位置と重なる２値画像のこれらの領域を選択することを含む。形態学的操作の利点は、低閾値カットオフが選択可能であることである。ＵＳＦ画像に対する係る操作が、さらに低い蛍光強度領域を有したとしても、これらの全領域は後に除去または拒否され、それにより、ＵＳＦ蛍光情報の大部分が維持されるであろう。
【０２１０】
処理済みＵＳＦ画像の２値画像がいくつかの領域からなることは明らかである。観察により、小さい領域の大部分が、低い蛍光強度値からなるＵＳＦ信号の末尾領域に属すると推論され得る。したがって、処理済みＵＳＦ画像において明らかでない低蛍光末尾領域が２値画像では明らかであり、大部分が十字中心区域であるＵＳＦ画像の高濃度領域を得るために、後に除去され得ることが、観察され得る。２つの簡略化された方法が、所望のＵＳＦ十字中心領域を選択するために、用いられる。第１の方法は、２値画像上における２つの最大領域を選択することであり、第２の方法は、所望の領域を選択するために、ＢモードＵＳ画像からチューブの位置を使用することである。
【０２１１】
方法１：簡略化された形態学的方法
この選択方法は、２値画像における全領域を別個にそれ自身の２値画像のそれぞれに分割することを含み、各領域内の面積も計算する。次に、これらの領域は、面積に応じて、ソートされる。最大の２つの領域と、それらのそれぞれの２値画像と、が選択され、互いに加算され、これらの残りはただ無視される。結果として生成された２値画像またはマスクは、ＩＣＧ溶液で充填された２つのチューブ位置において正確に配置された２つの領域のみを含む。これらの２値画像が区分的にＵＳＦ画像と乗算されると、ＵＳ・Ｂモード画像上に重ね合わされる。全般的形態学的方法の１つの欠点は、最大の２つの領域のうちの一方がチューブの位置と重なり合わない可能性が存在することである。このシナリオは、２つの隣接するチューブの末尾領域が重なり合って、チューブ２の蛍光十字中心領域よりも大きい領域を形成するとき、観察される。したがって、ＵＳＦ蛍光領域選択に対してチューブの位置を組み込む変更が必要である。
【０２１２】
方法２：ＵＳに支援された形態学的操作方法
ＵＳ画像のデータ処理セクションで説明したテンプレート照合アルゴリズムを使用することにより、ターゲットチューブの位置を正確に得ることが可能である。次にこの画像は、オリジナルＵＳＦ画像のサイズに修正され、次に、２値画像に変換される。結果的に生成された２値ＵＳ処理済み画像は、所望の対象領域を選択するための形態学的操作アルゴリズムに対する基準画像として使用される。領域の選択は、２値ＵＳ処理済み画像と２値ＵＳＦ処理済み画像との間の交差領域を単に見出すことにより、なされる。
【０２１３】
デュアルモダリティイメージングの実現：
処理のブタ組織試料に対して、２セットのデータが記録される。第１セットのデータは、ＡＤＰフィルタセット（７１５ＬＰ＋ＲＧ６９５）を用いる６７１ｎｍレーザ励起を有し、第２セットデータは、ＩＣＧフィルタセット（８３０ＬＰ＋ＲＧ７８０）を用いる８０８ｎｍレーザ励起を有する。実験モジュールの残りは変更されない。上述の画像処理はＡＤＰ・ＵＳＦデータセットにも適用され、それにより、同様の結果が得られた。以下のセクションでは、ＵＳ・Ｂモード画像上に重ね合わされたＩＣＧおよびＡＤＰ・ＵＳＦ処理済み画像に関する。２セットのＵＳＦイメージングに対してデュアルＨＩＦＵ・ＵＳＴモジュールおよびブタ組織試料の位置を変化させないよう細心の注意が払われた。両方のＵＳＦ画像が正規化され、０．５の閾値が両方のＵＳＦ画像に適用される。
【０２１４】
ＡＤＰ蛍光濃度領域がＩＣＧ領域と比較して限定されたものであることが観察された。このことは、温度変化に対するＡＤＰの蛍光応答（感度）がＩＣＧと比較して高いものであるため、理解可能である。このことと、正規化されたＵＳＦ画像の両方に同一の閾値が適用されるという事実と、が組み合わされると、蛍光領域は、ＩＣＧと比較してＡＤＰで充填されたチューブの場合、大きく制約される。チューブ２がＩＣＧおよびＡＤＰの混合物（３：２の比）を含むことに注目すべきである。全蛍光領域はそれぞれのチューブ位置と完全に重なり合う。チューブ２の場合、２つの処理済みＵＳＦ画像が正確に重なり合うにもかかわらず、両方のＵＳＦ画像からの蛍光強度を強調表示するという根底をなす概念が過小評価される。したがって、２つのＵＳＦ処理済み画像の共通エリアを選択し、チューブ２がＩＣＧおよびＡＤＰ溶液の配合物で充填されているという概念を強調表示するために異なる色を割り当てるための他の簡単な形態学的操作が、用いられる。
【０２１５】
変更画像重ね合わせアルゴリズムと組み合わされたＵＳＦおよびＵＳがデュアルモダリティイメージングは、両方のＵＳＦ処理済み２値画像の共通エリアを使用する概念を実現する。これはチューブ２の位置における十字中心蛍光領域の大部分（９０％を超える）を含む。組み合わされたＵＳＦ画像（Ｐｃｏｍｂｉｎｅｄ（ｉ，ｊ））の強度レベルは、次の式で示されるように、それぞれのピクセル位置におけるそれぞれの重み付けられた強度の積の和により計算される。
【数６】
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【０２１６】
組み合わされた重み付けられた蛍光強度が計算されると、その蛍光強度は２つのカラーＵＳＦ画像上に重ね合わされる。２つのＵＳＦ画像の共通エリアは、それぞれのＵＳＦ画像においてゼロにされるか、または除去され、その一方で、第３の組み合わされた重み付けられたＵＳＦ画像により重ね合わされることに、注意すべきである。
【０２１７】
加えて、以前の実験と同様の複数の奥行き面走査が実施され、この奥行き面走査を一緒に積み重ねると、３次元データが形成され、この３次元データは、後に任意の所望の面において閲覧され得る。所与の関心対象の領域の３Ｄプロファイルを、任意の所望の角度または面において、超音波およびＵＳＦイメージングのデュアルモダリティを使用して、このようにキャプチャおよび可視化することが可能である。
【０２１８】
本発明の様々な実施形態について、様々な目的を満足させることに関して説明してきた。これらの実施形態が本発明の原理を単に例示するものであることを理解すべきである。本発明の多数の変更例および改変例が、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、当業者に容易に明らかとなることであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２１Ｇ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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