(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）またはその塩の生成プロセスにおいて、
（ａ）ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）の種、またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種の少なくとも１つを含む微生物培養物を調製するステップと、
（ｂ）糖蜜と、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインと、コメタンパク質と、栄養酵母と、糖と、１種以上のミネラル塩と、１種以上のヌクレオチドと、オリーブ油と、を含有する水性ブロスを前記微生物培養物で処理して微生物ブロスを生成するステップと、
（ｃ）少なくとも約４８時間にわたり約３５℃〜約４０℃の温度で前記微生物ブロスをインキュベートするステップと、
（ｄ）Ｒ−リポ酸、ウコン根茎、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、グルタチオン、Ｌ−アルギニン、およびＮＡＤＨを前記微生物ブロスに供給するステップと、
（ｅ）ｐＨを約８．０に調整するステップと、
（ｆ）少なくとも約１０日間にわたり前記微生物ブロスをインキュベートするステップと、
（ｇ）任意選択的に、少なくとも１２日後に糖蜜、コメタンパク質、栄養酵母、およびナタマイシンを前記微生物ブロスに供給するステップと、
（ｈ）任意選択的に、ｐＨを約８．０に調整するステップと、
（ｊ）少なくとも約２日間〜少なくとも約９日間にわたり前記微生物ブロスをインキュベートするステップと、
（ｋ）ｐＨを約２．０に調整するステップと、
（ｌ）全微生物ブロス体積の約６０〜１００％の体積のオリーブ油と、全微生物ブロス体積の約１００％の体積の水と、を添加して２層を形成するステップと、
（ｍ）前記オリーブ油層と前記水性層とを混合して前記オリーブ油層へのＤＨＬＡまたはその塩の抽出を行うステップと、
（ｎ）ＤＨＬＡまたはその塩を含有する前記オリーブ油層を分離するステップと、
を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項２】
請求項１に記載のプロセスにおいて、前記微生物培養物がＬ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）とＬ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）とを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項３】
請求項１に記載のプロセスにおいて、前記インキュベートするステップが約３５℃〜約４０℃の温度で行われることを特徴とするプロセス。
【請求項４】
請求項１に記載のプロセスにおいて、Ｒ−リポ酸が前記微生物ブロスの全重量を基準にして約２０ｇ／ｋｇ〜約４０ｇ／ｋｇの量で前記微生物ブロスに添加されることを特徴とするプロセス。
【請求項５】
請求項１に記載のプロセスにおいて、ＤＨＬＡまたはその塩を含有する前記オリーブ油層が約１０ｍｇ／ｍｌのＤＨＬＡ濃度を有することを特徴とするプロセス。
【請求項６】
ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）またはその塩の生成プロセスにおいて、
（ａ）ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）の種、またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種の少なくとも１種を含む微生物培養物を調製するステップと、
（ｂ）糖蜜と、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインと、コメタンパク質と、栄養酵母と、糖と、１種以上のミネラル塩と、１種以上のヌクレオチドと、第１の食用油と、を含有する水性ブロスを前記微生物培養物で処理して微生物ブロスを生成するステップと、
（ｃ）少なくとも約４８時間にわたり約３５℃〜約４０℃の温度で前記微生物ブロスをインキュベートするステップと、
（ｄ）Ｒ−リポ酸、ウコン根茎、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、グルタチオン、Ｌ−アルギニン、およびＮＡＤＨを前記微生物ブロスに供給するステップと、
（ｅ）ｐＨを約８．０に調整するステップと、
（ｆ）少なくとも約１０日間にわたり前記微生物ブロスをインキュベートするステップと、
（ｇ）任意選択的に、少なくとも１２日後に糖蜜、コメタンパク質、栄養酵母、およびナタマイシンを前記微生物ブロスに供給するステップと、
（ｈ）任意選択的に、ｐＨを約８．０に調整するステップと、
（ｊ）少なくとも約２日間〜約９日間にわたり前記微生物ブロスをインキュベートするステップと、
（ｋ）ｐＨを約２．０に調整するステップと、
（ｌ）全微生物ブロス体積の約６０〜１００％の体積の第２の食用油と、全微生物ブロス体積の約１００％の体積の水と、を添加して２層を形成するステップと、
（ｍ）前記食用油層と前記水性層とを混合して前記食用油層へのＤＨＬＡまたはその塩の抽出を行うステップと、
（ｎ）ＤＨＬＡまたはその塩を含有する前記食用油層を分離するステップと、
を含むことを特徴とするプロセス。
【請求項７】
請求項６に記載のプロセスにおいて、前記微生物培養物がＬ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）とＬ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）とを含むことを特徴とするプロセス。
【請求項８】
請求項６に記載のプロセスにおいて、前記インキュベートするステップが約３５℃〜約４０℃の温度で行われることを特徴とするプロセス。
【請求項９】
請求項６に記載のプロセスにおいて、Ｒ−リポ酸が前記微生物ブロスの全重量を基準にして約２０ｇ／ｋｇ〜約４０ｇ／ｋｇの量で前記微生物ブロスに添加されることを特徴とするプロセス。
【請求項１０】
請求項６に記載のプロセスにおいて、ＤＨＬＡまたはその塩を含有する前記食用油層が約１０ｍｇ／ｍｌのＤＨＬＡ濃度を有することを特徴とするプロセス。
【請求項１１】
請求項６に記載のプロセスにおいて、前記第１の食用油および前記第２の食用油が同一でありうるかまたは異なりうるとともに、前記第１の食用油および前記第２の食用油が、それぞれ独立して、オリーブ油、ブドウ種子油、ゴマ油、ボラージ油、魚油、シーバックソーン油、アマ油、ココヤシ油、ピーナッツ油、キャノーラ油、ホホバ油、トウモロコシ油、パーム油、マツヨイグサ油、アマランス油、サフラワー油、ダイズ油、ヒマワリ油、パーム油、メンジツ油、アーモンド油、カシュー油、ヘーゼルナッツ油、マカデミア油、ペカン油、ピスタシオ油、クルミ油、アサイー油、ブラックカラント油、アンズ油、アルガン油、アーティチョーク油、アボカド油、ババス油、ベン油、ボルネオタローナッツ油、バッファローヒョウタン油、イナゴマメ莢油、コリアンダー種子油、アマナズナ油、アサ油、カポック種子油、ラレマンティア油、メドウフォーム種子油、カラシ油、オクラ種子油、シソ種子油、ペキ油、パインナッツ油、ケシ種子油、プルーン核油、カボチャ種子油、キノア油、ラムティル油、コメヌカ油、チャ油、アザミ油、およびコムギ胚芽油からなる群から選択されることを特徴とするプロセス。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプロセスにおいて、前記第１の食用油および前記第２の食用油がそれぞれオリーブ油であることを特徴とするプロセス。
【請求項１３】
請求項１２に記載のプロセスにおいて、ＤＨＬＡまたはその塩を含有する前記食用油層が約１０ｍｇ／ｍｌのＤＨＬＡ濃度を有することを特徴とするプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｒ−リポ酸からジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）へのバイオ変換に関する。本プロセスは、次のいずれかの細菌の属：ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から選択される細菌を用いてリポ酸を発酵させる。より特定的には、本発明は、非伝統的溶媒系（すなわち食品油）を利用したＤＨＬＡの抽出方法に関する。一般的には、本方法で生成されるＤＨＬＡは、不活性化または死滅させた細胞から単離される。
【背景技術】
【０００２】
ジヒドロリポ酸は価値のある栄養物質である。その生成および単離は、そのジスルフィド形すなわちリポ酸への酸化が各種標準条件下で容易に起こるため困難である。
【０００３】
ＤＨＬＡは、典型的には、正常代謝活性時にリポ酸またはα−リポ酸（ＡＬＡ）のレドックス変換により生体内で生成される。しかしながら、生体は、一般に、代謝機能を支援するのに足る量のＤＨＬＡを生成するにすぎない。しかしながら、ＤＨＬＡは、糖尿病、緑内障、アテローム硬化症、他のニューロパチーなどのいくつかの分解性病理学的症候群の原因となりうる反応性窒素種（ＲＮＳ）および反応性酸素種（ＲＯＳ）たとえば一重項酸素などを捕捉するために利用可能な少なくとも部分的には有効な抗酸化剤およびキレート化剤であることが示されている。ＤＨＬＡはまた、細胞内で酸化的損傷の防止または修復および生体内である特定の重要な栄養素たとえばビタミンＣやＥなどの再生に少なくとも部分的には有効であることが見いだされている。しかしながら、市販のＤＨＬＡは存在しておらず、ＡＬＡが存在するにすぎないが、このＡＬＡは、ＤＮＡを有していない非生物源に由来するものであり、とくに長期使用では細胞ＤＮＡ分解を誘発するおそれがある。結果として、最小量のＤＨＬＡを生成するように細胞内で使用されるかかるＡＬＡは、長期使用には有益でないと考えられる。それとは逆に、かつて生きていた生物源に由来するＤＨＬＡは、細胞ＤＮＡを支持することが知られるＤＮＡを含む。Ｍａｒｓｈａｌｌに付与された米国特許第８，５３０，２０９号明細書では、医薬または栄養サプリメントに使用される安定化ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）は、かつて生きていた生物源に由来する。とくに、安定化ＤＨＬＡ化合物は、少なくとも１種の生存プロバイオティック生物と、Ｒ−リポ酸と、少なくとも１種の栄養医薬剤または栄養剤と、を含む微生物培養培地に由来しうる。
【０００４】
多量のＤＨＬＡの単離および／または安定化が困難であることは明らかである。天然源では、以上で考察したように比較的少量をｉｎ  ｖｉｖｏで単離可能である。しかしながら、ｉｎ  ｓｉｔｕでより多量のＤＨＬＡを調製・単離する方法が見いだせれば、これは栄養医薬および医療の技術分野に価値のある貢献を果たすであろう。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、細菌を利用したリポ酸からジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）へのバイオ変換に関する。
【０００６】
本発明の一般的な目的は、医薬または栄養サプリメントに使用されるＤＨＬＡまたはその塩を含む有益な化合物の生成方法を提供することである。
【０００７】
実施形態では、少なくとも１種の生存プロバイオティック生物、Ｒ−リポ酸、および／または少なくとも１種の栄養剤を含む微生物培養培地を蒸溜水に分散させてブロスを形成するステップと、選択された期間にわたり所定の温度でブロスをインキュベートしてプロバイオティック活性を誘発するステップと、任意選択的に、有機エタノールを添加してプロバイオティック活性を停止するステップと、オリーブ油抽出によりブロスから所望の化合物を分離するステップと、を含むＤＨＬＡの生成方法が本明細書に記載されている。
【０００８】
他の実施形態では、以下のステップ、すなわち、
（ａ）ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）の種、またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種の少なくとも１種を含む微生物培養物を調製するステップと、
（ｂ）糖蜜と、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインと、コメタンパク質と、栄養酵母と、糖と、１種以上のミネラル塩と、１種以上のヌクレオチドと、第１の食用油と、を含有する水性ブロスを微生物培養物で処理して微生物ブロスを生成するステップと、
（ｃ）少なくとも約４８時間にわたり約３５℃〜約４０℃の温度で微生物ブロスをインキュベートするステップと、
（ｄ）Ｒ−リポ酸、ウコン根茎、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、グルタチオン、Ｌ−アルギニン、およびＮＡＤＨを微生物ブロスに供給するステップと、
（ｅ）ｐＨを約８．０に調整するステップと、
（ｆ）少なくとも約１０日間にわたり微生物ブロスをインキュベートするステップと、
（ｇ）任意選択的に、少なくとも１２日後に糖蜜、コメタンパク質、栄養酵母、およびナタマイシンを微生物ブロスに供給するステップと、
（ｈ）任意選択的に、ｐＨを約８．０に調整するステップと、
（ｊ）少なくとも約２日間〜少なくとも約９日間にわたり微生物ブロスをインキュベートするステップと
（ｋ）ｐＨを約２．０に調整するステップと、
（ｌ）全微生物ブロス体積の約６０〜１００％の体積の第２の食用油と、全微生物ブロス体積の約１００％の体積の水と、を添加して２層を形成するステップと、
（ｍ）食用油層と水性層とを混合して食用油層へのＤＨＬＡまたはその塩の抽出を行うステップと、
（ｎ）ＤＨＬＡまたはその塩を含有する食用油層を分離するステップと、
を含む、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）またはその塩の生成プロセスが記載されている。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、油層に含まれるＤＨＬＡを生成するためにバッチモードで行われるバルク発酵プロセスの一実施形態の模式図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、一実施形態でバルク発酵プロセスの原理に基づいて使用されるスキッド上の代表的反応器を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、バルク発酵プロセスに使用される各種例示的ポートが示されている図２Ａの反応器スキッドの上面図を示す。ポートレイアウトおよび各ポートの説明が示されている。
【図３】図３は、オリーブ油の添加前にバルク発酵プロセスで生成されたｍｇ／ｍｌ単位のＤＨＬＡ変換量を時間に対して示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＤＨＬＡ分析標準のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、バルク発酵プロセスの一実施形態に従って１４日間の発酵を行った後の生成されたＤＨＬＡサンプルのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
過去数十年間にわたり、医学産業、医薬産業、および栄養産業は、さまざまな疾患の治療／予防のためにさらには良好な健康および生体機能の維持のために、伝統的なハーブ医薬および／またはホメオパシー医薬の使用に大きな関心を示してきた。生物学、化学、および医学の分野の進歩のおかげで、研究者は、人体ならびにその膨大な数の代謝プロセスおよび生理学的プロセスに及ぼす各種化合物の影響および効果をより詳細かつ正確に研究できるようになってきた。かかる進歩は、たとえば、栄養素、ビタミン、ミネラル、他の天然に存在するまたは合成の化合物など、多くの化合物の摂取に関して、さらにはこれらの化合物が日々の生体機能に果たす役割に関して、理解の向上につながっている。
【００１１】
一研究領域では、「反応性酸素種」（ＲＯＳ）の生理学的効果の理解に重点が置かれてきた。ＲＯＳは、生物の正常代謝プロセスの副産物である。ＲＯＳには、生体構造に酸化的損傷を引き起こす可能性のある酸素由来フリーラジカルや非ラジカル誘導体が含まれる。ＲＯＳはまた、老化プロセスやいくつかの病理学的症候群たとえば糖尿病などに関与することも示されている。しかしながら、ＲＯＳにより引き起こされる酸化的損傷は、たとえば、生体内でＲＯＳと直接反応しうる抗酸化剤を使用するなど、いくつかの機序により低減したり防止したりすることが可能である。
【００１２】
各種の栄養医薬剤または栄養剤を本発明の微生物培養培地で利用しうるが、好適な栄養医薬剤または栄養剤は、所望の有益な化合物の生成のほかに微生物培地の安定性にも寄与すべきである。微生物培養培地で利用される１種または複数種の特定の栄養医薬剤または栄養剤は、誘導される有益な化合物に依存するであろう。たとえば、微生物培養培地から誘導される有益な化合物が安定化ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）である場合、微生物培地に含まれる栄養剤はウコン根茎（クルクマ・ロンガ（ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ））でありうる。他の好ましい実施形態では、微生物培養培地で利用される栄養医薬剤または栄養剤は、誘導される有益な化合物の合成形もしくは前駆体でありうるか、またはたとえば、有益な化合物を単離するために処理しなければならない植物やハーブなど、有益な化合物の天然に存在する供給源でありうる。
【００１３】
ＤＨＬＡの可能な使用としては、フリーラジカルを中和して害を引き起こさないようにする栄養医薬成分または活性医薬成分（ＡＰＩ）としての使用が挙げられる。それは、損傷を引き起こすスーパーオキシドラジカル、ヒドロペルオキシラジカル、およびヒドロキシルラジカルを直接破壊する。ジヒドロリポエート（ＤＬ−６，８−ジチオールオクタン酸）は、ミクロソーム脂質過酸化に対して抗酸化活性を有することがｉｎ  ｖｉｔｒｏで示されている。ジヒドロリポエートは、低酸素・興奮毒性ニューロン損傷のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよび脳虚血のｉｎ  ｖｉｖｏ齧歯動物モデルを用いて、ニューロン保護活性に関して試験されている。ジヒドロリポエートは、ジメチルチオウレアと同様に、大脳組織内への反応性酸素種の蓄積を減少させることにより、虚血性損傷に対してニューロンを保護することが可能である。
【００１４】
本明細書に記載のプロセスは、比較的短い時間で多量のＤＨＬＡを生成する方法を提供する。さらに、抽出方法は、抽出プロセスで通常使用される従来の溶媒を用いずにＤＨＬＡおよびリポ酸を抽出して取り出す方法を提供する。このプロセスは、すべての溶媒抽出プロセスの最終生成物に通常存在する溶媒残留物を残さない。
【００１５】
一態様では、その主な実施形態のプロセスは、ｉｎ  ｓｉｔｕでＤＨＬＡを生成するために以下の成分を含有する。この処方では、変換率は他の例示的方法ほど高くなく、ピーク変換量を達成する期間は２１日を超える。
【００１６】
ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）
Ｒ−リポ酸
ウコン（根茎源）
Ｎ−アセチルＬシステイン
ＮＡＤＨ
糖蜜
ＲＯ水
水酸化ナトリウム
塩酸
オリーブ油
コメタンパク質
酵母フレーク
有機ショ糖
硫酸マンガン
硫酸マグネシウム
リン酸二カリウム
ナタマイシン
【００１７】
一般的には、Ｒ−リポ酸を溶解する溶媒系は、生成物ＤＨＬＡを抽出して取り出すために使用可能である。しかしながら、水溶性成分が抽出されて取り出されないようにまたはかかる成分の共抽出が少なくとも最小限に抑えられるように、水と非混和性の溶媒が好ましい。使用する細菌もまた、変更可能である。ほとんどの細菌はＤＨＬＡを生成する。本明細書に記載および列挙された細菌種は、たとえばＤＨＬＡ生成に使用して非常に高い収率が得られる非常に効率的なものの一部である。
【００１８】
他の実施形態では、ｉｎ  ｓｉｔｕで大規模にＤＨＬＡを生成するために以下の成分が使用される。
【００１９】
ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）
ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）
Ｒ−リポ酸
ウコン
グルタチオン
Ｎ−アセチルＬシステイン
Ｌ−アルギニン
ＮＡＤＨ
糖蜜
ＲＯ水
水酸化ナトリウム
塩酸
オリーブ油
コメタンパク質
酵母フレーク
有機ショ糖（スクロースとして）
硫酸マンガン
硫酸マグネシウム
リン酸二カリウム
ナタマイシン
【００２０】
Ｎｕｃｌｅｏｃｅｌｌヌクレオチドは、Ｆｕｔｕｒｅ  Ｆｏｏｄ，Ｓａｎｔａ  Ｒｏｓａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である。
【００２１】
Ａｕｓｓｉ／Ａｕｓｓｉｅミネラルは、Ｓｙｍｂｉｏ  Ａｌｌｉａｎｃｅ，Ｅｉｇｈｔ  Ｍｉｌｅ  Ｐｌａｉｎｓ，Ｑ４１１３，Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手可能である。
【００２２】
ナタマイシン５０％は、ＰｒｏＦｏｏｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｓｌｅ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能である。
【００２３】
抽出に有用なオリーブ油は、Ｃｉｂａｒｉａ  Ｍｏｒｏｃｃａｎ  Ｏｌｉｖｅ  Ｏｉｌ，Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａである。
【００２４】
代替的に、ＤＨＬＡ抽出を目的として他の天然油を本プロセスで使用しうる。好適な油としては、本プロセスの実施形態で使用しうる食品油や植物油をはじめとする食用油が挙げられ、さらには、限定されるものではないが、ブドウ種子油、ゴマ油、ボラージ油、魚油、シーバックソーン油、アマ油、ココヤシ油、ピーナッツ油、キャノーラ油、ホホバ油、トウモロコシ油、パーム油、マツヨイグサ油、アマランス油、サフラワー油、ダイズ油、ヒマワリ油、パーム油、メンジツ油、アーモンド油、カシュー油、ヘーゼルナッツ油、マカデミア油、ペカン油、ピスタシオ油、クルミ油、アサイー油、ブラックカラント油、アンズ油、アルガン油、アーティチョーク油、アボカド油、ババス油、ベン油、ボルネオタローナッツ油、バッファローヒョウタン油、イナゴマメ莢油、コリアンダー種子油、アマナズナ油、アサ油、カポック種子油、ラレマンティア油、メドウフォーム種子油、カラシ油、オクラ種子油、シソ種子油、ペキ油、パインナッツ油、ケシ種子油、プルーン核油、カボチャ種子油、キノア油、ラムティル油、コメヌカ油、チャ油、アザミ油、およびコムギ胚芽油が挙げられる。そのほかに、イソアミルアセテートを本プロセスで抽出剤として使用しうる。
【００２５】
リポ酸からＤＨＬＡへのバイオ変換のための生成プロセスでは、１種以上の食用油を使用可能である。第１の食用油および第２の食用油は、同一でありうるかまたは異なりうるとともに、食用油は、食品油、植物油、ボタニカル油、ブドウ種子油、ゴマ油、ボラージ油、魚油、シーバックソーン油、アマ油、ココヤシ油、ピーナッツ油、キャノーラ油、ホホバ油、トウモロコシ油、パーム油、マツヨイグサ油、アマランス油、サフラワー油、ダイズ油、ヒマワリ油、パーム油、メンジツ油、アーモンド油、カシュー油、ヘーゼルナッツ油、マカデミア油、ペカン油、ピスタシオ油、クルミ油、アサイー油、ブラックカラント油、アンズ油、アルガン油、アーティチョーク油、アボカド油、ババス油、ベン油、ボルネオタローナッツ油、バッファローヒョウタン油、イナゴマメ莢油、コリアンダー種子油、アマナズナ油、アサ油、カポック種子油、ラレマンティア油、メドウフォーム種子油、カラシ油、オクラ種子油、シソ種子油、ペキ油、パインナッツ油、ケシの実、プルーン核油、カボチャ種子油、キノア油、ラムティル油、コメヌカ油、チャ油、アザミ油およびコムギ胚芽油からなる群から選択される。
【００２６】
バイオ変換は、ＤＨＬＡを生成するために供給原料としてリポ酸を用いて発酵プロセスで行われる。微生物培養物は、記載の１つ以上の種の細菌細胞を含有するものと理解される。微生物培養物は、酵母を含有する微生物ブロスを調製するために使用される。
【００２７】
一般的原理として、以上の成分リストにより提供されるブロスは、いくつかの予想外の利点および有益な性質を含む。理論により拘束されるものではないが、発酵ブロスは、成分の１つ以上に基づいて次の性質を含む。コメタンパク質およびＬ−システイン（すなわち、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの形態で）はそれぞれ、窒素質および炭素質の化合物を提供しうる。酵母フレークは必須ビタミンＢを提供し、有機ショ糖（スクロース）は発酵性炭水化物およびエネルギー源である。オリーブ油（ブロス部分）は、乳酸桿菌の代謝に必要とされるオレイン酸および他の脂肪酸を供給する。硫酸マグネシウムおよび硫酸マンガンは、乳酸桿菌の増殖に必須のイオンを提供する。リン酸塩は、良好な緩衝作用を提供する。ナタマイシンは、糸状菌および酵母の成長を防止する。グルタチオン、Ｌ−アルギニン、Ｎ−アセチルＬ−システイン、およびＮＡＤＨは、成長促進剤および還元剤である。ウコンは、Ｒ−リポ酸（出発材料供給原料として）の重合を防止することが可能である。ヌクレオチドは、成長因子として利用される。Ａｕｓｓｉｅミネラルは、必須ミネラルを提供可能である。糖蜜は、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）生物の追加の成長因子を提供する。
【００２８】
以上に記載の方法は、以下の実施例と関連させるとさらに理解しうる。そのほかに、本発明を例示するために、限定されるものではないが以下の実施例を提供する。
【実施例】
【００２９】
実施例１
ＤＨＬＡバルク発酵プロセス（バッチモード）
（１）以下のように、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）およびＬ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）のストック培養物から４８時間接種培養物を調製する。
【００３０】
（１ａ）ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）接種物の調製：
混合開始日の４８時間前、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）接種物を調製した。Ｎｅｂｒａｓｋａ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．製の１０グラムの原料（００２２）フリーズドライ１００億ＣＦＵ／ｇラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）をＥｄｇｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号Ｂ−０９６５  Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮにより供給された５００ｍＬのＭＲＳブロスに添加した。９０％Ｎ２：５％ＣＯ２：５％Ｏ２の雰囲気を用いて３７℃で接種物をインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、遠心分離機を用いて５００ｍＬの接種物をリン酸緩衝液で２回洗浄した。次いで、洗浄されたペレットを合計１００ｍＬのリン酸緩衝液で再構成し、ＤＨＬＡ発酵バルクバッチに接種するために１つの容器にまとめた。
【００３１】
（１ｂ）ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）接種物の調製：
使用したラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）接種物は、ケフィアから単離した。ストック培養プログラム作業指示書ＦＭ９８０２−１１に従ってグリセロールストック培養物を作製した。この接種物は、混合開始日の４８時間前に調製した。Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）グリセロールストック（Ｌｏｔ＃２０１４−３０．０４）の一掻きをＥｄｇｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号Ｂ−０９６５  Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮにより供給された５００ｍＬのＭＲＳブロスに添加した。９０％Ｎ２：５％ＣＯ２：５％Ｏ２の雰囲気を用いて３７℃で接種物をインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、遠心分離機を用いて５００ｍＬの接種物をリン酸緩衝液で２回洗浄した。次いで、洗浄されたペレットを合計１００ｍＬのリン酸緩衝液で再構成し、ＤＨＬＡ発酵バルクバッチに接種するために１つの容器にまとめた。
【００３２】
（２）接種培養物を２回洗浄する。洗浄は、細胞の遠心分離と、上清のデカンテーションと、次いでＲＯ水中への細胞の浸漬と、を含む。
【００３３】
（３）ＰＲＬブロス（以下の表１の通り）中に糖蜜（１４ｋｇ）を混合してステップ（２）の細胞培養物（「接種物」）を接種することにより、培地を調製した。この培地は、以下に記載の反応器内でインターバル撹拌が可能な培養システム内にある。インターバル設定は、１５０ＲＰＭで３分間および休止１分間である。したがって、以上の成分は、９８°Ｆおよび５％ＣＯ２：５％Ｏ２：９０％Ｎ２の大気条件に設定された反応器に添加される。
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【００３４】
反応器および装置（図２Ａおよび２Ｂも参照されたい）。
【００３５】
ステンレス鋼ＤＣＩ  １５０ガロン反応器の変更はすべて、自社内のメンテナンス部門により達成した。所要の雰囲気を形成するためにおよびこのプロセスに関連するすべてのデータを取得するために、槽上で利用可能な１１個のポートのうち７個のポートを利用した。気密シール槽を備えうることは、雰囲気の調整に不可欠である。槽の模式図を図２Ａに示す。
【００３６】
ポートレイアウトおよび各ポートの説明は、図２Ｂに規定される。ｐＨ読取りはすべて、毎日校正したＡｃｃｕｍｅｔ  Ａｂ１５  ｐＨ計を用いて行った。調整手順時に槽内のリアルタイムｐＨを測定するために、Ｈａｎｎａｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製のフロースルーモニターｐＨ電極を二次的補助手段として使用した。温度読取りはすべて、温度読取りオンラインへのライブアクセスによりＤｉｃｋｓｏｎ製のデータプローブを用いて測定した。このプロジェクトの温度範囲は、８５〜１０５°Ｆであった。雰囲気条件はすべて、ｉＳｅｎｓｅ二酸化炭素酸素バイオガスメーターおよびサンプリングデータロガーを用いてモニターした。表２には、槽を変更するために使用したすべての部品についてそれぞれの販売業者および部品番号が記載されている。
【００３７】
したがって、反応器の拡張およびデータの取得に使用した装置は、表２に列挙されている。
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【００３８】
（４）３日目：Ｒ−リポ酸、ウコン、Ｎ−アセチル  Ｌ−システイン、グルタチオン、Ｌアルギニン、およびＮＡＤＨを表３のようにバッチに添加する。
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【００３９】
（５）１０分以内に５０％水酸化ナトリウムを用いてバッチを８．０のｐＨにｐＨ調整し、次いで、５％Ｏ２および５％ＣＯ２の雰囲気で３７℃に維持した。
【００４０】
（６）バッチを１４〜２１日間（ステップ７および８を含めて）発酵する。注：３〜１３日目のプロセス時、５０％水酸化ナトリウムを用いてｐＨを８．０（±０．５）に調整する。
【００４１】
（７）３日目から始めて、水酸化ナトリウムを用いて酸性ｐＨから８．０のｐＨにバッチを毎日ｐＨ調整する。８のｐＨが達成されて維持されたら調整を停止し、所要により再開する。
【００４２】
（８）１２日目：表４のように、水中の糖蜜、コメタンパク質、酵母フレーク、およびナタマイシン（５０％）をバッチに供給する。また、この供給後、再びｐＨを８．０に再調整する。
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【００４３】
（９）発酵が終了し、バッチが７０％以上の変換率に達したら（以下で実証される通り）、塩酸を用いてバッチを２．０．のｐＨにｐＨ調整する。一般的には、発酵は１４〜２１日目に終了する。好ましい一実施形態では、発酵は約１４日後に終了する。
【００４４】
（９ａ）ＤＨＬＡ分析用のＨＰＬＣプロトコル
３日目から始めて、サンプルを毎日捕集することによりＤｉｏｎｅｘ  Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ７  ネットワークＨＰＬＣシステムでＨＰＬＣ−ＵＶ  Ｖｉｓダイオードアレイ分析を用いてＤＨＬＡ変換量をモニターした。表５には、使用したすべての試薬および標準が規定されており、また、表６には、ＨＰＬＣ分析に使用したすべての一般設備および供給品が規定されている。
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【００４５】
試験方法ＴＭ９８０２−０９５に従って途中段階および最終生成物の両方のサンプルを分析した。ピペッティングにより２．０００ｍＬのサンプルを５０ｍＬのメスフラスコに入れてＤＨＬＡバルク発酵希釈剤（０．１％ｗ／ｖグルタチオンおよびＮ−アセチル−Ｌ−システイン、０．１％リン酸ｖ／ｖ、アセトニトリル／蒸留水中（４９９：４９９：２））を用いて所定の体積に希釈することにより、バルク発酵サンプルを毎日調製した。シリンジフィルターを用いてサンプルを濾過し、濾液の最初の１〜２ｍＬを廃棄したうえで、ＨＰＬＣバイアルに入れた。ピペッティングにより２．０００ｍＬのサンプルを５０ｍＬメスフラスコに入れてＩＰＡで所定の体積に希釈することにより、最終生成物サンプルを調製した。シリンジフィルターを用いてサンプルを濾過し、濾液の最初の１〜２ｍＬを廃棄したうえで、ＨＰＬＣバイアルに入れた。代表的なＨＰＬＣ条件は以下の表７に概説されている。
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【００４６】
ＤＨＬＡ発酵バルク変換量のＨＰＬＣ結果。
【００４７】
ＤＨＬＡ変換量の進行を追跡するために、毎日行ったすべてのサンプルをＨＰＬＣで試験した。表８は、処理終了までの毎日の結果を示す（図３の線グラフも参照されたい）。各ピークの面積を計算するために、ＤＨＬＡ標準を毎日調製してさまざまな体積で注入することにより、曲線を作成した。ＤＨＬＡ変換の連続進行は、７日後から毎日観測された（図３）。図４Ａは、ＤＨＬＡ標準のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、また、図４Ｂは、発酵１４日後に生成されたＤＨＬＡサンプルのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
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【００４８】
（１０）全ブロス体積の６０〜１００％のオリーブ油をバッチに添加し、ブロス体積の１００％の水をバッチに添加する。
【００４９】
（１１）次いで、水性ブロスからＤＨＬＡ油を抽出するためにバッチを４５分間以上混合する。
【００５０】
（１２）混合後、ブロスを沈降させる（または遠心分離する）。遠心分離によりほとんどの残留細胞物質は除去されるであろう。
【００５１】
（１３）沈降後、ＤＨＬＡを含有するオリーブ油層を吸い上げる。
【００５２】
一実施形態では、単離されたＤＨＬＡ含有油層は、ＤＨＬＡ含有率または抗酸化活性に関してアッセイ可能である。
【００５３】
一実施形態では、ＤＨＬＡを含有して得られるオリーブ油層は、約１０ｍｇ／ｍｌのＤＨＬＡ濃度を有しうる。他の実施形態では、ＤＨＬＡを含有して得られるオリーブ油層は、約５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのＤＨＬＡ濃度を有しうる。
【００５４】
プロセスの他の実施形態では、細菌細胞を溶解しうるかまたはエタノールにより不活性化しうる。すなわち、細胞を不活性化させるかまたは死滅させることが可能である。別の言い方をすると、死細胞は、「かつて生きていた」とみなしうるものであり、別の言い方をすると、溶解または不活性化された細胞は、ＣＦＵ数が０に近いかまたは本質的に０である「細胞状態」を有しうる。ＭＲＳ寒天を用いた標準プレートカウントは、細胞の生存能を評価するために利用される。
【００５５】
次に、図１に目を向けると、ＤＨＬＡ生成プロセス（１０）が示されている。微生物培養物から作製された微生物ブロスは、「０日目」に反応器（２０）に添加される。約４８時間の発酵後、実施例では、「３日目」に供給原料Ｒ−リポ酸を含めて成分が微生物ブロスに供給され、そして反応器（２０）内で発酵が１４〜２１日間継続される。「１２日目」に「１２日目」の成分、すなわち、水中の糖蜜、コメタンパク質、酵母フレーク、およびナタマイシンが発酵バッチに供給される。発酵が終了した後、バッチは、２．０のｐＨに調整され、ＤＨＬＡ生成物の抽出のためにオリーブ油（３０）が反応器（２０）内の発酵微生物ブロスに添加される。ＤＨＬＡはオリーブ油層（４０）に単離される。プロセス（１０）の生成物はＤＨＬＡ含有油層（４０）である。
【００５６】
有用なＤＨＬＡ塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどを含むカルボン酸の付加塩が挙げられうる。
【００５７】
最後に、現在では、非生物源から誘導される化合物は、細胞ＤＮＡの栄養供給および再生が可能なコヒーレント光を発することが知られるＤＮＡを欠如しているが分かっている。非生物源栄養素が細胞に入ると、ＤＮＡ分解および早期細胞死を引き起こすおそれがある。それとは逆に、かつて生きていた生物源から誘導される化合物は細胞ＤＮＡを支持する。したがって、かつて生きていた生物源から誘導される化合物は、生体内で天然に摂取または生成される化合物にかなり近く、とくに長期使用ではより安全であるので、摂取にはより好適であると考えられる。例示的なＤＮＡ源の１つは、本明細書で用いられるＮｕｃｌｅｏｃｅｌｌヌクレオチドである。
【００５８】
各種生存プロバイオティック生物が本発明の微生物培養培地に含まれうるが、ある特定の好ましい実施形態によれば、少なくとも１種のプロバイオティック生物は、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）の種、一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびそれらの組合せから選択可能である。
【００５９】
他の実施形態によれば、本明細書に記載のプロセスは、次のいずれかの細菌の属：ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から選択される細菌を用いてリポ酸を発酵させる。
【００６０】
好適なラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種の例としては、限定されるものではないが、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．パラカゼイ（Ｌ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、Ｌ．ジョンソニイ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブルガリカス（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．グラッセリ（Ｌ．ｇｒａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００６１】
好適なエンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種の例としては、限定されるものではないが、Ｅ．ファセウム（Ｅ．ｆａｃｅｕｍ）、Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｅ．デュランス（Ｅ．ｄｕｒａｎｓ）、Ｅ．ガリナルム（Ｅ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００６２】
各種の栄養医薬剤または栄養剤を本発明の微生物培養培地で利用しうるが、好適な栄養医薬剤または栄養剤は、所望の有益な化合物の生成のほかに微生物培地の安定性にも寄与すべきである。微生物培養培地で利用される１種または複数種の特定の栄養医薬剤または栄養剤は、誘導される有益な化合物に依存するであろう。たとえば、微生物培養培地から誘導される有益な化合物が安定化ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）である場合、微生物培地に含まれる栄養剤はウコン根茎（クルクマ・ロンガ（ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ））でありうる。他の好ましい実施形態では、微生物培養培地で利用される栄養医薬剤または栄養剤は、誘導される有益な化合物の合成形もしくは前駆体でありうるか、またはたとえば、有益な化合物を単離するために処理しなければならない植物やハーブなど、有益な化合物の天然に存在する供給源でありうる。
【００６３】
本発明のある特定の好ましい実施形態によれば、医薬または栄養サプリメントに使用される安定化ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）は、かつて生きていた生物源から誘導される。とくに、安定化ＤＨＬＡ化合物は、少なくとも１種の生存プロバイオティック生物と、Ｒ−リポ酸と、少なくとも１種の栄養医薬剤または栄養剤と、を含む微生物培養培地に由来しうる。
【００６４】
α−リポ酸（ＡＬＡ）の合成源は、一般に、等量でＲ−リポ酸とＳ−リポ酸とを含む。しかしながら、Ｓ−リポ酸を含有するＡＬＡは、望ましくない化合物の生成をもたらす炎症誘発性を有し、ＡＬＡの機能を損ねるおそれがあることを発見した。したがって、実際には、微生物培養培地および微生物発酵ブロスではＲ−リポ酸が利用される。
【００６５】
各種の栄養医薬剤または栄養剤を本発明の微生物培養培地で利用しうるが、好適な栄養医薬剤または栄養剤は、ＤＨＬＡの生成に寄与すべきであるほかに微生物培地の安定性にも寄与するべきである。ある特定の好ましい実施形態によれば、栄養医薬剤または栄養剤はウコン根茎（クルクマ・ロンガ（ｃｕｒｃｕｍａ  ｌｏｎｇａ））でありうる。
【００６６】
本発明の安定化ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）は、少なくとも１種の生存プロバイオティック生物と、Ｒ−リポ酸と、少なくとも１種の栄養剤と、を含む微生物培養培地を蒸溜水中に分散させて微生物ブロスを形成することにより、調製可能である。次いで、選択された期間、たとえば、約７２〜約３３６時間（すなわち約３〜約１４日間）などにわたり、所定のまたは好ましいｐＨ範囲（たとえば約８．０）および温度範囲（たとえば約３５℃〜約４０℃）でブロスをインキュベートして、プロバイオティック活性を誘発する。インキュベーション期間の終了時、有機エタノールをブロスに添加してプロバイオティック活性を停止し、合成化合物を保存しうる。その後、生成物ＤＨＬＡは、油抽出によりブロスから分離され、医薬または栄養サプリメントの調製に使用される。
【００６７】
以上の明細書では本発明をそのある特定の好ましい実施形態との関連で記載するとともに、多くの詳細事項を例示目的で述べてきたが、本発明は、そのほかの実施形態も可能であり、本明細書に記載の詳細事項のいくつかは、本発明の基本原理から逸脱することなく、かなりの変更を加えうることは、当業者には自明なことであろう。
【００６８】
本明細書で引用した参照文献はすべて、その全体が参照により組み込まれる。本発明は、その趣旨またはその本質的属性から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化しうるので、本発明の範囲を示すものとしては、上記の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲を参照すべきである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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