(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ろ紙に全血を含ませた後に乾燥させた乾燥ろ紙血中の標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法であって、
下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む、前記検出方法。
（Ａ）ＰＣＲ反応用の９６穴チューブ若しくは８連チューブに前記乾燥ろ紙血を添加する工程であって、前記ろ紙は、直径１．２ｍｍ〜２．０ｍｍの円形かつ、全血を全反応溶液量に対して０．９５v/v％〜６．６v/v％を含むパンチ片である前記工程
（Ｂ）ＰＣＲ反応用のチューブに２０〜５０μＬのＰＣＲ試薬を添加する工程
（Ｃ）ＰＣＲ試薬と前記乾燥ろ紙血を添加したチューブをキャップにより密閉した状態で、ＰＣＲ反応を行う工程
（Ｄ）ＰＣＲ反応により増幅された標的核酸を、チューブ内に前記乾燥ろ紙血のパンチ片が存在した状態で経時的に光学的に検出する工程
【請求項２】
（Ａ）の工程の後、（Ｂ）の工程を行う請求項１に記載の標的核酸を検出する方法。
【請求項３】
ＰＣＲ試薬は少なくともプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、インターカレーター若しくは蛍光標識プローブを含む請求項１又は２に記載の標的核酸を検出する方法。
【請求項４】
前記インターカレーターへの励起光照射によって発生する蛍光の検出により、前記増幅された標的核酸を検出する、請求項３に記載の標的核酸を検出する方法。
【請求項５】
前記蛍光標識プローブが、蛍光物質とクエンチャーとを有し且つ核酸増幅反応の鋳型に相補的な部分配列を含み、前記蛍光物質への励起光照射によって発生する蛍光の検出により、前記増幅された標的核酸を検出する、請求項３に記載の標的核酸を検出する方法。
【請求項６】
標的核酸が、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ及びＳＭＮ１からなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子である、請求項１〜５のいずれかに記載の標的核酸を検出する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の標的核酸をリアルタイムＰＣＲで検出する方法により標的核酸を定量する方法において、以下の標準品を用いて標的核酸を定量する方法；
（１）標的核酸の配列を含む人工核酸を含み、乾燥ろ紙血に含まれたものではない標準品であって、当該標準品は直接反応溶液に溶解させて使用されるものである前記標準品。
【請求項８】
請求項７に記載の標的核酸をリアルタイムＰＣＲで検出する方法により標的核酸を定量する方法に用いられる定量キットであって、少なくとも以下を含む前記定量キット；
（１）標的核酸の配列を含む人工核酸を含み、乾燥ろ紙血に含まれたものではない標準品であって、当該標準品は直接反応溶液に溶解させて使用されるものである前記標準品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲによる核酸の検出方法に関する。詳しくは、ろ紙に血液を含ませた後に乾燥させたろ紙血中の標的核酸を光学的に検出する方法、当該検出方法による核酸定量方法及び核酸定量キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患のスクリーニング及び診断を行うための検体として、ろ紙に血液を含ませた後に乾燥させたろ紙血は、試料の安定性が高く、飛散の可能性がないため、保管および輸送の観点から有用である。また、通常の採血が困難である新生児からの検体採取方法として、新生児マススクリーニングで用いられている。また、疾患のスクリーニング及び診断を目的として、関連遺伝子の変異有無の判定や遺伝子の定量にＰＣＲ反応が広く用いられている。具体的には、スクリーニング検査として、重症複合免疫不全症の指標として環状ＤＮＡのＴＲＥＣ（T-cell receptor excision circles ）及びＸ連鎖無ガンマグロブリン血漿の指標として環状ＤＮＡのＫＲＥＣ（kappa-deleting recombination excision circles）定量が、米国を中心に普及している。さらに、脊髄性筋委縮症に対する治療薬が開発されてきたこともあり、その原因遺伝子であるＳＭＮ１(Survival Motor Neuron 1)のホモ欠失によるスクリーニングの要望が高まってきている。
【０００３】
その検査に用いられる乾燥ろ紙血には、ＰＣＲ反応を阻害する物質（ヘモグロビンなど）が多く含まれるため、一般にはろ紙血から核酸を抽出し精製して、反応試料とする方法が用いられている。一方、検体中の夾雑物によるＰＣＲ反応阻害物質の影響を低減している試薬も商業利用されている（株式会社島津製作所製; Ampdirect（登録商標））。この試薬を使用すると、ろ紙血切片から直接ＰＣＲ反応を行うことが可能であり、その増幅産物を電気泳動で検出することで確認されている（特許文献１）。しかしながら、このような試薬においても、光学的手段を用いて検出する場合には、血中に含まれるヘモグロビンやＰＣＲ反応時の熱変性により発生する血液成分の沈殿が光学的経路を阻害することにより、正確な結果を得ることができない。その為、ＰＣＲ反応の際に、反応液に対して全血試料の添加割合を規定する方法が開示されている（特許文献２）。しかしながら、全血成分由来の影響に加えて、ＰＣＲ反応液中に存在する乾燥ろ紙血由来のろ紙切片自体が光学検出の光路を妨害することもあり、影響を十分に軽減できない恐れもある。
【０００４】
このような問題を解決するために、ろ紙血切片を洗浄する、前処理液に浸す、又は前処理液に浸して加温する、などの簡易前処理工程を行うことで、上記反応阻害物質の除去、同物質の反応液内拡散の抑制を行い、前処理工程終了後に、ＰＣＲ反応試薬を添加し、ろ紙血切片が入ったままＰＣＲ反応を行うという方法が実施されている（非特許文献１）。しかしながら、多段階の操作が必要になることでコンタミネーションの可能性が増加するうえに、新生児スクリーニングなどで多検体解析を行う場合には、時間及び手間がかかることで解析のコストが増加し、最善の方法であるとは言えない。
また、定量する場合に、ろ紙血の影響を相殺させる為、ろ紙血ベースのキャリブレーター（標準品）を設定する方法も考えられるが、ろ紙血から抽出される成分の変動による影響度合いのバラツキ等により、正確性及び再現性の悪化を招く恐れがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２８３１６５号公報
【特許文献２】第５１４４５１８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Clinical Chemistry、61:2、412-419、2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ろ紙に血液を含ませた後、乾燥させたろ紙血の切片中に含まれる標的核酸をリアルタイムＰＣＲによる核酸増幅反応を利用して増幅した産物を光学的に検出する方法及び定量する方法、さらにはこれらの方法に用いられるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
乾燥ろ紙血は、ろ紙に血液を含ませた後に乾燥させ、穴あけパンチ工具によりパンチ穴形状の紙片（本明細書中、単にパンチ片ということがある）として取り出される。本発明者らは、このようなパンチ片の大きさ又はパンチ片に含まれる全血量、ＰＣＲ反応試薬の量、ＰＣＲ反応時にＰＣＲ反応チューブにキャップを装着すること等について種種の検討を行ったところ、従来のような煩雑な前処理をすることなく、乾燥ろ紙血から直接標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより光学的に検出及び定量できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
＜１＞ろ紙に血液を含ませた後に乾燥させたろ紙血の標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法であって、
下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む、前記検出方法。
（Ａ）ＰＣＲ反応用のチューブに乾燥ろ紙血を添加する工程であって、ろ紙は、直径１．２ｍｍ〜２．０ｍｍの円形のパンチ片又は全血を全反応溶液量に対して０．９５v/v％〜６．６v/v％を含むパンチ片である前記工程
（Ｂ）ＰＣＲ反応用のチューブに２０〜５０μＬのＰＣＲ試薬を添加する工程
（Ｃ）ＰＣＲ試薬とろ紙を添加したチューブをキャップにより密閉した状態で、ＰＣＲ反応を行う工程
（Ｄ）ＰＣＲ反応により増幅された標的核酸を経時的に光学的に検出する工程
＜２＞（Ａ）の工程の後、（Ｂ）の工程を行う＜１＞に記載の標的核酸を検出する方法。
＜３＞チューブは、ＰＣＲ反応用９６穴チューブ若しくは８連チューブである＜１＞又は＜２＞に記載の標的核酸を検出する方法。
＜４＞ＰＣＲ試薬は少なくともプライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、インターカレーター若しくは蛍光標識プローブを含む＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の標的核酸を検出する方法。
＜５＞前記インターカレーターへの励起光照射によって発生する蛍光の測定により、前記増幅された標的核酸を検出する、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の標的核酸を検出する方法。
＜６＞前記蛍光標識プローブが、蛍光物質とクエンチャーとを有し且つ核酸増幅反応の鋳型に相補的な部分配列を含み、前記蛍光物質への励起光照射によって発生する蛍光の測定により、前記増幅された標的核酸を検出する、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の標的核酸を検出する方法。
＜７＞標的核酸が、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ及びＳＭＮ１からなる群から選ばれる１つ以上の遺伝子である、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の標的核酸を検出する方法。
＜８＞＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の標的核酸をリアルタイムＰＣＲで検出する方法により標的核酸を定量する方法において、以下の標準品を用いて標的核酸を定量する方法；
＜１＞標的核酸の配列を含む人工核酸を含み、乾燥ろ紙血に含まれたものではない標準品。
＜９＞＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の標的核酸をリアルタイムＰＣＲで検出する方法により標的核酸を定量する方法に用いられる定量キットであって、少なくとも以下を含む前記定量キット；
（１）標的核酸の配列を含む人工核酸を含み、乾燥ろ紙血に含まれたものではない標準品。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、乾燥ろ紙血に含まれる僅かな標的核酸を直接リアルタイムＰＣＲにより特異的に、かつ迅速に検出及び定量することが可能になる。例えば、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣやＳＭＮ１、ＳＭＮ２のように、新生児に対するスクリーニング検査では、乾燥ろ紙血から一部をパンチ片として取り出して検体とするので、貴重な検体の節約につながる。さらに、前処理工程も不要となることから、スクリーニング検査としての解析効率の向上及びコストの削減が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（ＰＣＲ反応用チューブ）
本発明に用いられるチューブは、ＰＣＲ反応用のチューブであり、ろ紙血のパンチ片がスムーズに挿入でき、キャップにより密閉できる構造であればよい。また、チューブ上部の開口部が円形（例えば、内径２．５ｍｍ〜１０ｍｍ程度）で底部が上部の開口部よりも狭くなっている形状が良く、逆円錐形などが好ましい。
上記チューブの容量は、ＰＣＲ反応試薬を添加し、ＰＣＲ反応による温度変化によっても反応溶液を十分に収容できる容量であればよく、０．１ｍＬ〜０．３ｍＬ容量が好ましく、さらに好ましくは０．１５ｍＬ〜０．２５ｍＬ容量、最も好ましくは０．２ｍＬ容量である。
本発明に用いるＰＣＲ反応用チューブは、チューブが９６個連続しているＰＣＲ反応用９６穴チューブ又は８個連続している８連チューブが好ましく、市販品としては、９６ウェルＰＣＲプレート、ＰＣＲ８連チューブなどの名称で販売されているものを用いることができる。市販品としては、LightCycler480 Multiwell Plate 96（ロッシュ社）、96-Well PCR Plate, Flat Top, Low Profile, Natural, Polypropylene, UltraFlux（Scientific Specialties, Inc.社）、エッペンドルフ PCR プレート 96、スカートレス, 150 μL, カラーレス（エッペンドルフ社）、PCRプレート 96well シンプレート0.1ml ナチュラル（BM機器社）、LightCycler（登録商標）8-Tube Strips（ロッシュ社）などが挙げられる。
これらの反応用チューブの材質は、反応溶液のコンタミが少なく、また、ＰＣＲ反応の温度変化による内部圧力変動によっても形状が変化しない剛性を有することが望ましく、例えばポリプロピレン製が挙げられる。
【００１１】
（キャップ）
本発明に用いられるキャップは、ＰＣＲ反応チューブの開口部に勘合し、密閉できる構造であればよい。また、材質は、ＰＣＲ反応チューブと同様に、ＰＣＲ反応により生じる内部圧力変動によって変形しない材質であることが望ましく、また、光透過性の高い材質であることが望ましく、ポリプロピレン製が挙げられる。具体的には、LightCycler（登録商標）8-Tube Strips（ロッシュ社）、オプティカルフラット 8 キャップストリップ（バイオラッド社）、MicroAmpTM Optical 8-Cap Strips（Thermo Fisher Scientific社）、Strips of 8 Flat Optical Caps（日本ジェネティクス社）、キャップストリップ、8ストリップ、フラット（エッペンドルフ社）などが挙げられる。
本発明において、ＰＣＲ反応チューブをキャップにより密閉した状態でＰＣＲ反応を行うことにより、サーマルサイクルによる気泡の発生を抑制することができる。このため、反応溶液中のパンチ片の振動やパンチ片の浮き上がりが抑制されることになる。したがって、パンチ片中に含まれる妨害物質の必要以上の反応液への溶出を抑制することができると考えられる。また、気泡の発生によるパンチ片の浮き上がりが抑制できるため、リアルタイムＰＣＲによる光学的検出が、パンチ片によって光路を遮られることがなく、再現性よく行うことができる。
【００１２】
（血液試料／乾燥ろ紙血）
本発明に用いられる血液試料は、ろ紙（フィルターペーパー）に血液を含ませた後に乾燥させたろ紙中の血液であり、単に乾燥ろ紙血ということがある。乾燥ろ紙血から切り出された本発明のパンチ片の大きさは、含まれる血液の量を適切な範囲とする必要があることから、直径１．２〜２．０ｍｍが望ましく、１．５ｍｍ〜１．８ｍｍがよりいっそう望ましい。また、前記パンチ片に含まれる全血量としては、ＰＣＲ全反応溶液量に対して０．９５ｖ／ｖ％〜６．６ｖ／ｖ％が望ましく、１．４ｖ／ｖ％〜５．２ｖ／ｖ％がよりいっそう望ましい。
本発明に用いられる乾燥ろ紙血としては、例えば、新生児マス・スクリーニングなど新生児のかかとから採血したろ紙血、同時にオプショナルスクリーニングとして採血されたろ紙血などが用いられるがこれらに限定されない。
【００１３】
（ＰＣＲ試薬）
本発明に用いられるＰＣＲ試薬は、少なくとも、プライマーのセット、ポリメラーゼ、dNTP（デオキシヌクレオシド三リン酸）各種、インターカレーター若しくは蛍光標識プローブを含む。また、典型的には当該試薬にはバッファーも含まれている。バッファーとしては、生物の体液中に存在する正電荷物質（ある種のタンパク質など）や負電荷物質（ある種の糖、色素など）などのＤＮＡ増幅反応を阻害する物質の作用を抑制する働きを持つバッファーであれば特に限定されない。市販されているものとして、例えば、Ampdirect、Ampdirect plus（ともに（株）島津製作所製）等が挙げられる。
本発明に用いられるＰＣＲ試薬の反応用チューブへの添加量は、２０〜５０μＬである。
【００１４】
（リアルタイムＰＣＲ）
リアルタイムＰＣＲ法は、一般的に、ＰＣＲにおいて増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングする方法を意味する。本発明において、リアルタイムＰＣＲにより検出するとは、ＰＣＲ反応の後に増幅された標的核酸（以下、単に増幅産物ともいう）を光学的手段により検出することを意味する。なお、増幅産物の検出は、例えば、ＰＣＲ反応終了時または終了後に行ってもよいし、ＰＣＲ反応工程と並行して行ってもよい。並行して行う場合、増幅産物の検出は、例えば、経時的に行うことができる。経時的な検出（モニタリング）は、例えば、連続的であっても非連続的（断続的）であってもよい。
【００１５】
ＰＣＲ反応における各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。本発明は、ＰＣＲ反応においてチューブをキャップで密閉してからＰＣＲ反応を開始することで、上記温度変化による気泡の発生を抑え、パンチ片を浮き上がらせることなく、振動を抑えることができる。このため、パンチ片からの余分な妨害物質の抽出を抑え、パンチ片中に含まれる標的核酸を、煩雑な前処理をすることなく光学的に検出及び定量することが可能となった。また、リアルタイムＰＣＲという継続的なＰＣＲ反応のモニタリングにおいては、途中でパンチ片を遠心分離等により強制的に底部に納めることが出来ないため、パンチ片の浮き上がりは光学的検出にとって致命的である。本発明によりパンチ片の浮き上がりを防止することができるため、リアルタイムＰＣＲにおいてパンチ片に光路を遮られることなく、連続的な光学的検出が可能となった。
【００１６】
ＰＣＲ反応により生成した増幅産物は、例えば、前記増幅産物から発生する蛍光強度を検出することにより検出できる。蛍光検出としては、特に制限されないが、従来公知のインターカレーター法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法、ハイブリダイゼーション法、サイクリングプローブ法などがある。
【００１７】
蛍光強度の検出は、例えば、蛍光光度計で行うことができる。また、一般に、ＰＣＲ反応ユニット（例えば、サーマルサイクラー）と光学系ユニット（例えば、蛍光光度計）との両方を備える装置が使用される。具体例としては、市販のSmartCycler（商品名、タカラバイオ社製）、ライトサイクラー（商品名、ロシュ・ダイアグノスティック社製）、ABI PRISM7000（商品名、アプライド・バイオシステム社製）等があげられる。
【００１８】
（標的核酸の定量方法）
本発明の標的核酸の定量方法は、乾燥ろ紙血中の標的核酸に相補的な増幅産物を生成させ、前記増幅産物を光学的手段により検出して、前記増幅産物を定量する方法である。前記増幅産物が所定量となったＰＣＲサイクル数をカウントすることによって、前記乾燥ろ紙血中に含まれる標的核酸を定量する方法ことができる。また、後述する実施例のように、標準品から算出されたＣｑ値の検量線から乾燥ろ紙血中の全血１μＬのコピー数を換算して定量することもできる。
【００１９】
本発明は、ろ紙に血液を含ませた後に乾燥させたろ紙血の標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより検出する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む検出方法である。
（Ａ）ＰＣＲ反応用のチューブに乾燥ろ紙血を添加する工程であって、ろ紙は、直径１．２ｍｍ〜２．０ｍｍの円形のパンチ片又は全血を全反応溶液量に対して０．９５v/v％〜６．６v/v％を含むパンチ片である前記工程
（Ｂ）ＰＣＲ反応用のチューブに２０〜５０μＬのＰＣＲ試薬を添加する工程
（Ｃ）ＰＣＲ試薬とろ紙を添加したチューブをキャップにより密閉した状態で、ＰＣＲ反応を行う工程
（Ｄ）ＰＣＲ反応により増幅された標的核酸を経時的に光学的に検出する工程
ここで、（Ａ）工程と（Ｂ）工程は、いずれを先に行っても、また同時に行ってもよいが、（Ａ）の工程の後、（Ｂ）の工程を行うことが望ましい。（Ａ）を先に行うことで、ろ紙が仮にチューブ壁面などに付着した場合でも、試薬溶液によりチューブ底部に収容することがより確実になるからである。また、ＰＣＲ反応開始前にパンチ片を確実にチューブの底に収めるために、遠心分離などを行うことも望ましい。
このように、本発明は乾燥ろ紙血から分離・精製などの前処理を行わずに、ろ紙血を直接リアルタイムＰＣＲに供することを特徴としている。このような前処理を行わない試料には、通常、ＤＮＡ増幅反応を阻害する物質が含まれている。ＤＮＡ増幅反応を阻害する物質とは、血中に含まれるヘモグロビンやＰＣＲ反応時の熱変性により発生する血液成分の沈殿物などである。
以上より、前処理を行わずにＰＣＲ反応を行おうとすると妨害物質の影響を受けることが予想される。しかし、本発明によれば、上述のとおりパンチ片の大きさ、あるいはパンチ片に含まれる全血量、ＰＣＲ反応試薬量を所定の範囲内として、パンチ片をチューブの底に収め、さらにチューブをキャップで密閉してからＰＣＲ反応を行うことで、温度変化による気泡の発生を抑え、紙片を浮き上がらせることなく、振動を抑えることが可能になる。このため、パンチ片からの余分な妨害物質の抽出を抑えることが出来、パンチ片中に含まれる標的核酸を、煩雑な前処理をすることなく直接リアルタイムＰＣＲにより光学的に検出及び定量することが可能となった。
【００２０】
（標的核酸）
本発明のリアルタイムＰＣＲにより検出される標的となる核酸は、特に制限はなく、全血由来のＤＮＡ、ＲＮＡのほか、ウイルス等によって全血に導入された外来核酸等いずれも含まれる。
このうちでも、例えば新生児の全血由来の核酸が好ましく、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ、ＳＭＮ１、ＳＭＮ２などが挙げられる。
【００２１】
（標準品／キット）
本発明の標準品（キャリブレーターともいう）は、前記の標的核酸を検出する方法により標的核酸を定量する方法に用いられる標準物質をいう。本発明の標準品は、標的核酸の配列を含む人工核酸を含み、乾燥ろ紙血に含まれたものではないことを特徴としている。標準品の形態については、乾燥ろ紙血の影響を相殺させる為、乾燥ろ紙血に含ませて定量に用いる方法も考えられるが、乾燥ろ紙血から抽出される成分の変動による影響度合いや、乾燥ろ紙血からの標準品の溶出のバラツキ等により、正確性及び再現性の悪化を招く恐れがある。これに対して、本願発明の標準品は、あえて乾燥ろ紙血に含まれない形態とし、例えば、溶液状態あるいは凍結乾燥品などの形態で存在する標準品である。本発明の標準品はこのような形態を採ることにより、直接反応溶液に溶解させることが可能となり正確な定量が実現できる。
本発明は、このような標準品を含む標的核酸の定量キットを提供することもできる。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
本実施例は、乾燥ろ紙血からパンチ片を取り出し、直接ＰＣＲ反応を実施し、増幅産物をリアルタイムＰＣＲにより光学的に検出した例である。
【００２３】
〔実施例１〕ＴＲＥＣ／ＫＲＥＣ遺伝子定量系
（ａ）試験材料
（ａ−１）ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ、ＲＮａｓｅＰ増幅用プライマー
ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ、内部標準遺伝子（ＲＮａｓｅＰ）増幅用のプライマーとして、下記のプライマーをシグマ-アルドリッチ社に合成依頼したものを用いた。
ＴＲＥＣ用フォワードプライマー
５’−CCCTTTCAACCATGCTGACA−３’（配列番号１）
ＴＲＥＣ用リバースプライマー
５’−GTGCCAGCTGCAGGGTTTAG−３’(配列番号２）
ＫＲＥＣ用フォワードプライマー
５’−CAGCTCAGCGCCCATTACG−３’(配列番号３）
ＫＲＥＣ用リバースプライマー
５’−TGGGACTCCAGGAGCCAG−３’(配列番号４）
ＲＮａｓｅＰ用フォワードプライマー
５’−GCGGAGGGAAGCTCATCA−３’(配列番号５）
ＲＮａｓｅＰ用リバースプライマー
５’−GTCTGACCTCGCGCGGA−３’(配列番号６）
【００２４】
（ａ−２）ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ、ＲＮａｓｅＰ検出プローブ
ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ、ＲＮａｓｅＰのＰＣＲ増幅を確認するためのプローブとして、蛍光標識を施した下記の検出プローブを、プライムテック社に合成依頼して作成したものを用いた。
【００２５】
ＴＲＥＣ用検出プローブ
５’−(Quasar670)−CCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT−(BHQ3)−３’(塩基配列部分は配列番号７）
ＫＲＥＣ用検出プローブ
５’−(ROX)−TCTGCACGGGCAGCAGGTTGG−(BHQ2)−３’（塩基配列部分は配列番号８）
ＲＮａｓｅＰ用検出プローブ
５’−(FAM)−CCACGAGCTGAGTGCGTCCTG−(BHQ1)−３’（塩基配列部分は配列番号９）
【００２６】
（ａ−３）プラスミド
ＰＣＲ増幅産物を定量する為、下記に示すＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ、ＲＮａｓｅＰの遺伝子部分配列をベクターに組み込んだプラスミドを、ユーロフィン社に合成依頼したものを検量線用の標準品として用いた。
【００２７】
ＴＲＥＣ部分配列（配列番号１０）
GACTGAATTCGGCTCTGTCTAGTGTGATAACATTTTGTTATCTTATTCATTGTCTTCATCCCTGAAATACACTCTGCTCTCTCCTATCTCTGCTCTGAAAGGCAGAAAGAGGGCAGCCCTCTCCAAGGCAAAATGGGGCTCCTGTGGGGAACAGAGGGGTGCCTCTGTCAACAAAGGTGATGCCACATCCCTTTCAACCATGCTGACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACTCCTGTGCACGGTGATGCATAGGCACCTGCACCCCGTGCCTAAACCCTGCAGCTGGCACGGGCCCTGTCTGCTCTTCATTCACCGTTCTCACGAGTTGCAATAAGTTCAGCCCTCCATGTCACACTGTGTTTTCCATCCTGGGGAGTGTTTCACAGCTATCCCAAGCCCCACGCTGACGAATCACGGCCGAAAACACACTCTGATGCCAGCACAGACCACGGAGCAAATGTCAGACAAGATCAGCCTCGGAAAAGTGAGGAATTCAGTC
【００２８】
ＫＲＥＣ部分配列（配列番号１１）
GCTTTAAATTATTTACAATCCCCTAATGGAAATTTTCACTAATGAGATATCATAATGAATGTGAATTTTATTTCTGAAATCTCTAATAAATCAGTCTTCTCCCTGGTTTTCCCAGCTCAGCGCCCATTACGTTTCTGTTCTCTTTCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACTGTGCATCAGCACAGTGTGCGCTGCCAACCTGCTGCCCGTGCAGAAACTCTAGGGTAAGAGCTGGCTCCTGGAGTCCCACCCAGGCTGCGTGTCCCTCACAGTCTGCTCTGTGTCTATGTGTGTGTGTTGGGGGGATATTATTGGACAATTCAAGGGAGGCTCAGTGAGGAGGAAGGAAAATTTCATGTAATTCTTTCTGGTTTGTCTTTCTCAACCCCCTCCTCCTGCCTACTCCTTAACTGAGAGAGTG
【００２９】
ＲＮａｓｅＰ部分配列（配列番号１２）
ATAGGGCGGAGGGAAGCTCATCAGTGGGGCCACGAGCTGAGTGCGTCCTGTCACTCCACTCCCATGTCCCTTGGGAAGGTCTGAGACTAGGGCCAGAGGCGGCCCTAACAGGGCTCTCCCTGAGCTTCGGGGAGGTGAGTTCCCAGAGAACGGGGCTCCGCGCGAGGTCAGACTGGGCAGGAGATGCCGTGGACCCCGCCCTTCGGGGAGGGGCCCGGCGGATGCCTCCTTTGCCGGAGCTTGGAACAGACTCACGGCCAGCGAAGTGAGTTCAATGGCTGAGGTGAGGTACCCCGCAGGGGACCTCATAACCCAATTCAGACTACTCTCCTCCGCCCATT
【００３０】
（ｂ）ＰＣＲ試薬
ＰＣＲ試薬の組成を以下に示す。
ＰＣＲバッファー（Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ  Ｐｌｕｓ；島津製作所社）            
０．２５μM （終濃度）ＴＲＥＣ用フォワードプライマー  
０．２５μM （終濃度）ＴＲＥＣ用リバースプライマー    
０．１２５μM （終濃度）ＫＲＥＣ用フォワードプライマー
０．１２５μM （終濃度）ＫＲＥＣ用リバースプライマー
０．１２５μM （終濃度）ＲＮａｓｅＰ用フォワードプライマー
０．１２５μM （終濃度）ＲＮａｓｅＰ用リバースプライマー
０．１３５μM （終濃度）ＴＲＥＣ用検出プローブ
０．１３５μM （終濃度）ＫＲＥＣ用検出プローブ
０．１３５μM （終濃度）ＲＮａｓｅＰ用検出プローブ
０．０３Ｕ/μＬ  ＢＩＯＴＡＱ  ＨＳＤＮＡポリメラーゼ
【００３１】
（ｃ）検量線用標準品含有ＰＣＲ試薬
上記ＰＣＲ試薬に各プラスミドを添加して、以下の標準品（希釈系列；ＳＴＤ１〜４）含有ＰＣＲ試薬を調製した。かっこ内は、それぞれの遺伝子のＰＣＲ１反応あたりのコピー数を示す。本試薬は、乾燥ろ紙血に含ませることなく、溶液状態で用いられた。
ＳＴＤ１（ＴＲＥＣ １０，０００ｃｏｐｙ／反応、ＫＲＥＣ １０，０００ｃｏｐｙ／反応、ＲＮａｓｅＰ  １００，０００ｃｏｐｙ／反応）
ＳＴＤ２（ＴＲＥＣ １，０００ｃｏｐｙ／反応、ＫＲＥＣ １，０００ｃｏｐｙ／反応、ＲＮａｓｅＰ  １０，０００ｃｏｐｙ／反応）
ＳＴＤ３（ＴＲＥＣ １００ｃｏｐｙ／反応、ＫＲＥＣ １００ｃｏｐｙ／反応、ＲＮａｓｅＰ  １，０００ｃｏｐｙ／反応）
ＳＴＤ４（ＴＲＥＣ １０ｃｏｐｙ／反応、ＫＲＥＣ １０ｃｏｐｙ／反応、ＲＮａｓｅＰ  １００ｃｏｐｙ／反応）
【００３２】
（ｄ）コントロール乾燥ろ紙血
ブタ全血に、ＴＲＥＣプラスミド及びＫＲＥＣプラスミドを、それぞれ１２．５ｃｏｐｙ／μＬとなるように添加し、さらにＫ５６２細胞株（慢性骨髄性白血病細胞由来；国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所細胞バンクより分譲）より抽出したゲノムＤＮＡを１３．５ｎｇ/μＬとなるように添加した後、採血用ろ紙（アドバンテック社）に４０μＬ染み込ませ、そのまま乾燥させた。
【００３３】
（ｅ）ＰＣＲ反応の条件
（i）９５℃：１５分
（ii）９５℃：１５秒、６３℃：８０秒（４５サイクル）
（iii）３７℃：５分
【００３４】
（ｆ）リアルタイムＰＣＲ測定
（ｆ−１）測定方法
以下の手順で測定した。
（i）コントロール乾燥ろ紙血から、パンチャーを用いて直径１．２ｍｍ、１．５ｍｍ、１．８ｍｍ、２．０ｍｍ、３．０ｍｍの円形のパンチ片を採取した。
（ii）ＰＣＲ反応用のチューブ(ロッシュ社製：LightCycler(登録商標）8-Tube Strips、ポリプロピレン製）に上記パンチ片を投入した。
（iii）そのチューブに２０μＬ、３０μＬ、４０μＬ、５０μＬのＰＣＲ試薬をそれぞれ加えた後、キャップ（前記チューブとセットになっているもの）をして密閉した。
（iv）検量線用標準品含有ＰＣＲ試薬も添加量に合わせてチューブに分注したものを用意した。
（v）サーマルサイクラー装置（LightCycler96；ロッシュ社）を用いて、ＴＲＥＣ、ＫＲＥＣ及びＲＮａｓｅＰの３項目同時リアルタイムＰＣＲ測定を行った。
（vi）各組み合わせをそれぞれ４回測定し、標準品から算出されたＣｑ値の検量線から、パンチ片中の全血１μＬあたりのコピー数として換算し、４回のコピー数の平均値を算出した。また、平均値を設定値で序したものを回収率とした。
【００３５】
（ｆ−２）測定結果
結果を表１〜３に示す。パンチ片のサイズの違いでは、直径１．５ｍｍ〜２．０ｍｍの場合は、増幅の再現性及び回収率も良好となった。直径１．２ｍｍでは、増幅が起きない場合があったが、回収率は良好であった。一方、直径３．０ｍｍの場合では増幅曲線を描くことが出来なかったため、測定が出来ないものがあった（表中のグレーの網掛け部）。その要因としては、パンチ片のサイズが大きくチューブの底に届いておらず、このため、紙片が光路を遮ることで光が反応溶液に届かず、蛍光検出に影響しているものと考えられた。
【００３６】
【表１】
0006761093.tif 000002
【００３７】
【表２】
0006761093.tif 000003
【００３８】
【表３】
0006761093.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明によれば、乾燥ろ紙血に含まれる僅かな標的核酸を特異的に、かつ迅速にリアルタイムＰＣＲにより検出及び定量することが可能になる。
【要約】
【課題】本発明は、ろ紙に血液を含ませた後乾燥させたろ紙血の紙片中に含まれる標的核酸を、核酸増幅反応を利用して増幅した産物をリアルタイムＰＣＲにより光学的に検出する方法及び定量する方法、さらにはこれらの方法に用いられるキットを提供することを目的とする。
【解決手段】本発明によれば、乾燥ろ紙血パンチ片の大きさ又はパンチ片に含まれる全血量、ＰＣＲ反応試薬の量、ＰＣＲ反応チューブにキャップをした状態でＰＣＲ反応を行うこと等により、煩雑な前処理をすることなく乾燥ろ紙血より標的核酸をリアルタイムＰＣＲにより光学的に検出及び定量できる方法及びキットを提供する。
【選択図】なし【配列表】
0006761093000001.app