(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドを合成する方法であって、前記方法は、水、アルコール、および水とアルコールの混合物からなる群から選択される溶媒中で、第１のアミノ酸または第１のペプチドと、α−アミン保護された第２のアミノ酸または第２のペプチドとを反応させる工程と、脱保護溶液を用いてα−アミン保護基を除去する工程と、前記第１のアミノ酸または第１のペプチドのＣ末端は不溶性支持体に固定され、前記方法は、得られたペプチドまたはタンパク質を、切断組成物を用いてポリマー支持体から切断する工程をさらに含み、前記α−アミン保護基は、保護剤と、アミノ酸またはペプチドにおける官能基との反応によって形成され、
前記保護剤は、
Ｉ．骨格構造と、
ＩＩ．少なくとも１つの水溶性増強官能基と、
ＩＩＩ．少なくとも１つの反応基と
を含み、
前記反応基は、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルオキシマエステル、オキシカルボニルＯ−スクシンイミド、オキシカルボニル無水物、ハロゲン化物、水酸化物およびチオール基からなる群から選択され、
前記骨格構造は、９−メチルフルオレン、ｔ−ブタンおよび／またはモノ−、ジもしくはトリフェニルメタンからなる群から選択される部分を含み、
前記水溶性増強官能基は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＣＮ、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記水溶性増強官能基および前記反応基は少なくとも１つの共有結合を介して骨格構造に結合している、
方法。
【請求項２】
前記第１のアミノ酸または第１のペプチドおよび前記第２のアミノ酸または第２のペプチドの任意の反応性側鎖官能基は、少なくとも１つの水溶性増強官能基を含む側鎖保護基により保護され、前記方法は、前記側鎖保護基を除去する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記α−アミン保護基は蛍光構造を含み、前記方法は、前記第１のアミノ酸または第１のペプチドにカップリングした前記α−アミン保護基によって生成される蛍光を測定することによって、ペプチド結合の形成の程度をモニターする工程および／または前記α−アミン保護基の除去の程度をモニターする工程をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記保護剤は少なくとも２つの水溶性増強官能基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶性増強官能基はＳＯ３−である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
遊離アミンをキャッピングするためにキャッピング剤が反応混合物に加えられ、反応の完了後に前記反応混合物を親和性カラムに通過させることを特徴とし、
前記キャッピング剤は、
Ｉ．骨格構造と、
ＩＩ．少なくとも１つの水溶性増強官能基と、
ＩＩＩ．少なくとも１つの反応基と
を含むキャッピング剤であって、
前記反応基は、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸Ｏ−スクシンイミド、カルボン酸オキシマエステル、カルボン酸無水物、ハロゲン化物およびチオール基からなる群から選択され、
前記骨格構造は、短鎖アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ８アルキル、環状アルキル鎖または芳香族化合物、より好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキルまたはベンジルから選択される基から選択される部分を含み、
前記水溶性増強官能基は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＣＮ、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記水溶性増強官能基および前記反応基は少なくとも１つの共有結合を介して前記骨格構造に結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
水性ペプチド合成の間にペプチドおよび／またはアミノ酸における官能基上に保護基を形成するのに適した保護剤であって、
前記保護剤は、
Ｉ．骨格構造と、
ＩＩ．少なくとも１つの水溶性増強官能基と、
ＩＩＩ．少なくとも１つの反応基と
を含み、
前記反応基は、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルオキシマエステル、オキシカルボニルＯ−スクシンイミド、オキシカルボニル無水物、ハロゲン化物、水酸化物およびチオール基からなる群から選択され、
前記骨格構造は、９−メチルフルオレン、ｔ−ブタンおよび／またはモノ−、ジもしくはトリフェニルメタンからなる群から選択される部分を含み、
前記水溶性増強官能基は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＣＮ、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記水溶性増強官能基および前記反応基は少なくとも１つの共有結合を介して前記骨格構造に結合している、
保護剤。
【請求項８】
前記水溶性増強官能基はＳＯ３−である、請求項７に記載の保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水、アルコールおよび水とアルコールの混合物からなる群から選択される溶媒中でペプチドを合成する方法、この方法で使用される化合物、ならびにペプチドを固相合成する方法を実施するための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドはアミノ酸の結合鎖であり、タンパク質の前駆体を表す。ペプチドおよびタンパク質は、全ての生物系の基本的な構成要素であり、様々な生命のプロセスに関与する。それらは医薬および生物科学において多くの用途を有する。結果として、ペプチドおよびタンパク質を合成する能力はヒトの生命に対して重要性が高い。
【０００３】
それ故、ペプチドの合成産物はかなりの関心が持たれている。ペプチドは、１つのアミノ酸のカルボキシル基（Ｃ末端）を別のアミノ酸のアミノ基またはＮ末端にカップリングすることによって合成される。固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は、溶液中でのペプチド構築に関連する中間体の精製問題を克服する目的で１９６３年にＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄらによって導入された（非特許文献１、非特許文献２を参照のこと）。固相合成時に、アミノ酸は連続的にカップリングされ、Ｃ末端を不溶性ポリマー支持体（固相）に固定しながら、所望の配列を保有するペプチドが得られる。所望の配列が構築されると、ペプチドは固相支持体から切断される。
【０００４】
この合成の概要は、自己重合を回避するために入ってくるアミノ酸のα−アミノ基の保護を必要とする。α−アミノ官能基についての標準的な保護基は、アリル系についての捕捉剤としてのＰｈＳｉＨ３の存在下でＰｄ触媒の中性条件下で除去される、酸に不安定なｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、塩基に不安定なフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）基である。
【０００５】
３つの上述のα−アミノ保護スキームのいずれかに従う固相ペプチド合成方法は、一般に、望ましくない化学変換からの構成要素であるアミノ酸の反応性側鎖のさらなる保護を必要とする。したがって、これらの保護基は、カップリングサイクルの間に使用される薬剤に対して耐性があることが必要である。さらに、増加しているペプチドの固相支持体への連結は、α−アミノ脱保護および鎖構築の条件に対して安定でなければならない。
【０００６】
Ｆｍｏｃベースのα−アミノ保護の場合、側鎖基はＦｍｏｃ部分を除去するために使用される塩基性試薬に対して耐性でなければならない。側鎖保護基は、一般に、ペプチド鎖を構築した後、弱酸性試薬によって除去される。これらの側鎖保護基は、一般に、所望のペプチド鎖を構築した後、無水ＨＦ、トリフルオロメタンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって切断される。
【０００７】
ペプチド構築手順は、典型的に、水に不溶性であり、ＳＰＰＳにおいて頻繁に使用されるα−アミノ保護基ＦｍｏｃおよびＢｏｃの強い疎水性のために、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびジクロロメタン（ＤＣＭ）、またはそれらの有機溶媒の混合物などの極性非プロトン性有機溶媒中で実施される。さらに、ＳＰＰＳにおいて一般に使用される側鎖保護基は、通常、疎水性であり、アミノ酸を水に不溶性にする。
【０００８】
ＦｍｏｃおよびＢｏｃ保護を適用するＳＰＰＳアプローチは広範に使用されているが、コストが高く、毒性がある、以前に述べられている有機溶媒を必要とすることに悩まされる。例えばＤＭＦはかなりの健康および環境リスクを伴い、それはヒトにおいて癌と関係があり、出生異常を引き起こす疑いがある。それ故、これらの毒性溶媒の使用は、例えばドラフト下で反応を実施し、高度な専門職員によって扱われることのような特別な技術的設備および予防措置を必要とする。さらに、使用された溶媒の処分は問題があり、高価な費用がかかる。結果として、有機溶媒を使用するＳＰＰＳは高価であり、有機化学合成のための特別な設備を有する専門研究所に制限される。
【０００９】
したがって、ペプチド合成および特にＳＰＰＳのための水性スキームが、以前に述べられている問題を回避するために非常に望まれている。
【００１０】
この問題を克服するための試みとして、Ｈｏｊｏらは水溶性保護基の使用を提案した（非特許文献３および非特許文献４）。彼らは、この目的のためにいくつかの保護基を開発し、それらには、２−（フェニル（メチル）スルホニル）エチルオキシカルボニルテトラチオボレート（Ｐｍｓ）、エタンスルホニルエトキシカルボニル（Ｅｓｃ）、および２−（４−スルホフェニルスルホニル）エトキシカルボニル（Ｓｐｓ）がある。特許文献１において、ＣＥＭ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、水または水溶液系中でのα，β−不飽和スルホンの脱保護および水性ＳＰＰＳにおけるそれらの使用を特許請求している。
【００１１】
しかしながら、上述の保護基はいくつかの主な欠点を有し、それらの欠点は、それらの制限された安定性（例えばＰｍｓに関して）、それらのわずかな溶解度（Ｅｓｃ）、ならびにそれらの高価な費用および例えば、それらの硫黄基の自己酸化が発生するのでシステインおよびメチオニンを除外する、複雑な合成および制限された有用性（Ｓｐｓ）である。二次的考察として、これらのα−アミン保護基は、カップリングしたアミノ酸の量を検出するために使用され得るか、または脱保護が進行している程度の指標を提供するための選択的吸収、ＵＶまたは蛍光シグナルを示さない。従来のＦｍｏｃ基と異なり、ＰｍｓおよびＥｓｃは従来のＵＶモニタリングで追跡できない。ＳｐｓはＵＶによってモニターされ得るが、Ｓｐｓの困難で、コストのかかる合成は、その使用を阻む傾向がある。結果として、これらの化合物の高い水溶性は、全体的な要点における水性ＳＰＰＳの問題に対する十分な解決策ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１３  １１５８１３  Ａ１号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，第２版，１９８４）
【非特許文献２】Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）
【非特許文献３】Ｈｏｊｏら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００４，５２，４２２−４２７
【非特許文献４】Ｈｏｊｏら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２００４，４５，９２９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目的は、一般的なペプチド合成および特に固相ペプチド合成のための水と相溶性の反応系についての改善された方法および装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
一実施形態において、本発明は、水性ペプチド合成の間にペプチドおよび／またはアミノ酸における官能基上に保護基を形成するのに適した保護剤であって、保護される官能基は、好ましくは、アミン、アルコール、チオールおよびカルボキシル基から選択され、保護剤は、
ｉ．骨格構造と、
ｉｉ．少なくとも１つの水溶性増強官能基と、
ｉｉｉ．少なくとも１つの反応基と
を含み、
骨格構造は、９−メチルフルオレン、ｔ−ブタンおよび／またはモノ−、ジもしくはトリフェニルメタンからなる群から選択される部分を含み、好ましくは骨格構造はこのような部分からなり、
水溶性増強官能基は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＣＮ、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、
水溶性増強官能基および反応基は少なくとも１つの共有結合を介して骨格構造に結合している、
保護剤を提供する。
【００１６】
本発明はまた、化学反応において官能基を保護するための前記化合物の使用に関する。好ましい実施形態において、保護剤は、水性ペプチド合成の間にペプチドおよび／またはアミノ酸における官能基上に保護基を形成するために使用される。好ましくは、保護される官能基は、好ましくは、アミン、アルコール、チオールおよびカルボキシル基から選択される。
【００１７】
好ましい実施形態において、水溶性増強官能基は、荷電官能基ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびＮ（ＣＨ３）３＋から選択される。水溶性増強官能基として荷電官能基を使用することは、非荷電官能基より効果的に水溶性を増加させるのに有用であると証明されている。保護剤は１つ以上の水溶性増強官能基を含んでもよく、好ましい実施形態において、保護剤は１つより多い水溶性増強官能基を含む。さらに好ましい実施形態において、保護剤は少なくとも２つの水溶性増強官能基を含む。他の好ましい実施形態において、保護剤は１〜８個、２〜７個、または３〜４個の水溶性増強官能基を含む。本発明者らは、水溶性をより大きな程度まで増加させるので、保護剤分子において１つより多い水溶性増強官能基を有することが有用であり得ることを見出した。骨格構造がｔ−ブタンまたはフェニルメタンである実施形態において、１つの水溶性増強官能基が十分であり得る。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、保護剤は、全て同じ種類、特に全てＳＯ３−種類である水溶性増強官能基を含む。代替の実施形態において、保護剤は異なる種類の水溶性増強官能基を含む。水溶性増強官能基がＳＯ３−である限り、保護剤はそれらの官能基の少なくとも２つを含むことが好ましい。水溶性増強官能基が全て同じ種類である場合、保護剤の合成はより効果的で、容易であり得る。
【００１９】
骨格構造は、９−メチルフルオレン、ｔ−ブタンおよび／またはモノ−、ジ−もしくはトリフェニルメタンからなる群から選択される部分を含む。好ましい実施形態において、骨格構造は９−メチルフルオレンおよびｔ−ブタンから選択される。
【００２０】
反応基は、保護される官能基との化学反応を受けることが好適であり、すなわち必要とされる化学反応性を有する。それは好ましくは、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルＯ−スクシンイミド、オキシカルボニルオキシマエステル（ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  Ｏｘｙｍａ  ｅｓｔｅｒ）、オキシカルボニル無水物、ハロゲン化物、オキシメチルハロゲン化物、水酸化物およびチオール基からなる群から選択される。骨格構造が９−メチルフルオレンである場合、反応基は好ましくは、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルオキシマエステルおよびオキシカルボニルＯ−スクシンイミドから選択される。骨格構造がｔ−ブタンである場合、反応基は好ましくは、水酸化物、ハロゲン化物、チオール、オキシカルボニルＯ−スクシンイミドおよびオキシカルボニル無水物から選択される。骨格構造がモノ−、ジ−およびトリフェニルメタンから選択される場合、反応基は好ましくは、ハロゲン化物、オキシメチルハロゲン化物およびオキシカルボニルハロゲン化物から選択される。
【００２１】
本発明の９−メチルフルオレン骨格構造を有する好ましい保護剤は以下の一般式１によって示され得る：
【化１】
0006736546.tif 000002
（式中、Ｒ１〜Ｒ８は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ８の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびＣＮから選択される。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルまたはＣＮではないＲ１〜Ｒ８の全ては水素である。
【００２２】
Ｒ９９は好ましくは、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルＯ−スクシンイミド、オキシカルボニルオキシマエステル、オキシカルボニル無水物、ハロゲン化物、オキシメチルハロゲン化物、水酸化物およびチオール基からなる群から選択され、Ｒ９９は好ましくは、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルオキシマエステルおよびオキシカルボニルＯ−スクシンイミドから選択される。
【００２３】
好ましい実施形態において、Ｒ２およびＲ７は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびＣＮから選択され、特にＲ２およびＲ７はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ３〜Ｒ６およびＲ８は水素である。
【００２４】
好ましい実施形態において、Ｒ３およびＲ６は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびＣＮから選択され、特にＲ３およびＲ６はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は水素である。
【００２５】
好ましい実施形態において、Ｒ２およびＲ６は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびＣＮから選択され、特にＲ２およびＲ６はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は水素である。
【００２６】
本発明の９−メチルフルオレン骨格構造を有する好ましい保護剤は以下の表１に示される。表に記載される化合物は決して本発明の範囲を限定するものではない。それらは本発明による例示的および好ましい保護剤を構成する。
【００２７】
【表１−１】
0006736546.tif 000003
【００２８】
【表１−２】
0006736546.tif 000004
【００２９】
本発明のｔ−ブタン骨格構造を有する好ましい保護剤は以下の一般式２によって示され得る：
【化２】
0006736546.tif 000005
（式中、Ｒ１は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、Ｒ１はＳＯ３−である。Ｒ９９は好ましくは、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルＯ−スクシンイミド、オキシカルボニル無水物、ハロゲン化物、オキシメチルハロゲン化物、水酸化物およびチオール基からなる群から選択され、Ｒ９９はより好ましくは、水酸化物、ハロゲン化物、チオール、オキシカルボニルＯ−スクシンイミドおよびオキシカルボニル無水物から選択される。
【００３０】
本発明のｔ−ブタン骨格構造を有する好ましい保護剤は以下の表２に示される。表に示される化合物は決して本発明の範囲を限定するものではない。それらは本発明による例示的および好ましい保護剤を構成する。
【００３１】
【表２】
0006736546.tif 000006
【００３２】
本発明のモノ−、ジまたはトリフェニルメタン骨格構造を有する好ましい保護剤はそれぞれ以下の一般式３、４または５によって例示され得る：
【化３】
0006736546.tif 000007
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルまたはＣＮではないＲ１〜Ｒ５の全ては水素である。
【００３３】
Ｒ９９は好ましくは、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルオキシマエステル、オキシカルボニルＯ−スクシンイミド、オキシカルボニル無水物、ハロゲン化物、オキシメチルハロゲン化物、ハロゲン化物およびチオール基からなる群から選択され、Ｒ９９はより好ましくは、ハロゲン化物、オキシメチルハロゲン化物およびオキシカルボニルハロゲン化物から選択される。
【００３４】
好ましい実施形態において、Ｒ３は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステルおよびＣＮから選択され、特にＲ３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は水素である。
【００３５】
【化４】
0006736546.tif 000008
（式中、Ｒ１〜Ｒ１０は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ１０の全ては水素である。
【００３６】
Ｒ９９は好ましくは、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルオキシマエステル、オキシカルボニルＯ−スクシンイミド、オキシカルボニル無水物、ハロゲン化物、オキシメチルハロゲン化物、水酸化物およびチオール基からなる群から選択され、Ｒ９９はより好ましくは、ハロゲン化物、オキシメチルハロゲン化物およびオキシカルボニルハロゲン化物から選択される。
【００３７】
好ましい実施形態において、Ｒ３およびＲ８は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３およびＲ８はＳＯ３−から選択される。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ９およびＲ１０は水素である。
【００３８】
【化５】
0006736546.tif 000009
（式中、Ｒ１〜Ｒ１５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ１５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ１５の全ては水素である。
【００３９】
Ｒ９９は好ましくは、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルオキシマエステル、オキシカルボニルＯ−スクシンイミド、オキシカルボニル無水物、ハロゲン化物、オキシメチルハロゲン化物、水酸化物およびチオール基からなる群から選択され、Ｒ９９はより好ましくは、ハロゲン化物、オキシメチルハロゲン化物およびオキシカルボニルハロゲン化物から選択される。特に好ましい実施形態において、Ｒ３、Ｒ８およびＲ１３がＳＯ３−である場合、Ｒ９９はハロゲン化物ではない。別の特に好ましい実施形態において、Ｒ３、Ｒ８およびＲ１３がＳＯ３−である場合、Ｒ９９は塩化物ではない。好ましい実施形態において、Ｒ９９は好ましくは、オキシカルボニルハロゲン化物、オキシカルボニルオキシマエステル、オキシカルボニルＯ−スクシンイミド、オキシカルボニル無水物、オキシメチルハロゲン化物、水酸化物およびチオール基からなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、Ｒ９９はハロゲン化物ではなく、特に塩化物ではない。
【００４０】
好ましい実施形態において、Ｒ３、Ｒ８およびＲ１３は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３、Ｒ８およびＲ１３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ９〜Ｒ１２、Ｒ１４およびＲ１５は水素である。
【００４１】
本発明のモノ−、ジまたはトリフェニルメタン骨格構造を有する好ましい保護剤は以下の表３に示される。表に示される化合物は決して本発明の範囲を限定するものではない。それらは本発明による例示的および好ましい保護剤を構成する。
【００４２】
【表３】
0006736546.tif 000010
【００４３】
本発明はまた、化学反応において官能基を保護するための保護剤の使用に関する。好ましくは、官能基はアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質に存在し、化学反応は、水、アルコールまたは水とアルコールの混合物から選択される溶媒中でのペプチドまたはタンパク質合成である。
【００４４】
方法
本発明は、ペプチドを合成する方法であって、水、アルコールおよび水とアルコールの混合物からなる群から選択される溶媒中で、第１のアミノ酸または第１のペプチドと、α−アミン保護された第２のアミノ酸または第２のペプチドとを反応させる工程と、脱保護溶液を用いてα−アミン保護基を除去する工程とを含み、α−アミノ保護基は本明細書に記載される保護剤のうちの１つと、第２のアミノ酸または第２のペプチドのα−アミン官能基との反応生成物であることを特徴とする、方法に関する。好ましい実施形態において、α−アミン保護基は以下の式６〜１０の少なくとも１つである。各場合、以下の一般式に示される窒素は保護されたアミノ基に属する：
【化６】
0006736546.tif 000011
（式中、Ｒ１〜Ｒ１５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ１５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ１５の全ては水素である。
【００４５】
好ましい実施形態において、Ｒ３、Ｒ８およびＲ１３はＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３、Ｒ８およびＲ１３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ９〜Ｒ１２、Ｒ１４およびＲ１５は水素である。
【００４６】
【化７】
0006736546.tif 000012
（式中、Ｒ１〜Ｒ８は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ８の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ８の全ては水素である。
【００４７】
好ましい実施形態において、Ｒ２およびＲ７は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ２およびＲ７はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ３〜Ｒ６およびＲ８は水素である。
【００４８】
好ましい実施形態において、Ｒ３およびＲ６は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３およびＲ６はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は水素である。
【００４９】
好ましい実施形態において、Ｒ２およびＲ６は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ２およびＲ６はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は水素である。
【００５０】
【化８】
0006736546.tif 000013
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ５の全ては水素である。
【００５１】
好ましい実施形態において、Ｒ３は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は水素である。
【００５２】
【化９】
0006736546.tif 000014
（式中、Ｒ１〜Ｒ１０は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮではないＲ１〜Ｒ１０の全ては水素である。
【００５３】
好ましい実施形態において、Ｒ３およびＲ８は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３およびＲ８はＳＯ３−から選択される。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ９およびＲ１０は水素である。
【００５４】
【化１０】
0006736546.tif 000015
（式中、Ｒ１は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、Ｒ１はＳＯ３−である。
【００５５】
特に好ましい実施形態において、α−アミノ保護基は、９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基、９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基またはｔｅｒｔ−ブチル−（２−スルホネート）オキシカルボニル基（Ｓｂｏｃ）である。本明細書に使用される場合、「Ｓｍｏｃ」という用語は、９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基または９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基を示す。
【００５６】
本発明に係る保護されたアミノ酸およびペプチドの構造、特にＳｍｏｃおよびＳｂｏｃ保護されたアミノ酸は、従来技術の保護されたアミノ酸またはペプチド、特にＦｍｏｃおよびＢｏｃ保護されたアミノ酸と比較してより良く水に溶解する。その理由は、本発明において水溶性増強官能基、特にスルホ（ＳＯ３−）基が保護剤に加えられたからである。したがって、本発明の利点の１つは、その保護された形態で水に溶解するアミノ酸および／またはペプチドの利用、ならびにペプチド合成のために水のみ、アルコールのみ、または水−アルコール混合物のみを使用し、すなわち他の溶解増強添加剤を使用せず、毒性溶媒を使用することを必要としない能力である。非毒性の水および／またはアルコール含有溶媒中でペプチド合成を実施することは、医薬および生物学的用途における使用のために様々な利点を与える。
【００５７】
好ましい溶媒は水および水−アルコール混合物であり、水が最も好ましい溶媒である。好ましいアルコールは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、２−プロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールまたはそれらの混合物である。
【００５８】
本明細書に使用される場合、「その保護された形態で水に溶解する」という用語は、組成物が水性溶媒系で進行する所望の反応に必要とされる溶解度を有することを意味する。任意の組成物の場合と同様に、「溶解」という用語は任意または全ての量で無制限の溶解を示すわけではない。
【００５９】
本発明における使用に適した脱保護溶液は好ましくは酸または塩基、好ましくは水性酸または塩基、すなわち好ましくは水溶性である酸および／または塩基を含む。好ましい酸はリン酸、塩酸またはトリフルオロ酢酸である。好ましい塩基はアミンおよびアンモニアである。好ましい脱保護溶液はアミンおよび／またはアンモニア溶液である。塩基は官能基を脱保護するのに必要な量および程度で使用される。特定の有機塩基の溶解度は、水、アルコールまたは水とアルコールの混合物に溶解し得る量を制限し得る。適切な塩基は、選択された溶媒中で脱保護を実施するのに十分な量の溶解を可能にする溶解度を有するものである。
【００６０】
Ｓｂｏｃ基を脱保護するための脱保護溶液は好ましくは、リン酸、塩酸またはトリフルオロ酢酸などの水性酸を含む。
【００６１】
Ｓｍｏｃ基を脱保護するための脱保護溶液は好ましくは、アミンまたはアンモニアなどの水溶性基を含む。水溶性基はペプチドを脱保護するのに必要な量および程度で使用される。特定の有機塩基の溶解度は、水、アルコールまたは水とアルコールの混合物中に溶解し得る量を制限し得る。適切な塩基は、選択された溶媒中で脱保護を実施するのに十分な量の溶解を可能にする溶解度を有するものである。
【００６２】
脱保護後、反応および脱保護工程はさらなるアミノ酸またはさらなるペプチドを使用して反復されてもよく、前記さらなるアミノ酸および／またはさらなるペプチドのα−アミノ基は好ましくは、所望の標的ペプチドが得られるまで本発明による保護基、特にＳｍｏｃ基またはＳｂｏｃ基で保護されることは理解される。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態において、前記第１のアミノ酸もしくは第１のペプチドおよび／または前記第２のアミノ酸もしくは第２のペプチドの任意の反応性側鎖官能基は、好ましくは少なくとも１つの水溶性増強官能基を含む側鎖保護基で保護される。側鎖保護基はスルホン酸基またはスルホン酸エステルを含んでもよい。方法は好ましくは側鎖保護基を除去する工程を含む。側鎖保護基の水溶性増強官能基は側鎖保護アミノ酸またはペプチドに水溶性を与える。適切な側鎖保護基は、上述の保護剤の１つと、アミノ酸またはペプチドの反応性側鎖官能基との反応生成物である。
【００６４】
側鎖保護基に関して、好ましいアミン保護基は以下の式１１〜１５に示されるものであり、窒素は保護されたアミノ基に属する。
【００６５】
【化１１】
0006736546.tif 000016
（式中、Ｒ１〜Ｒ１５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ１５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ１５の全ては水素である。
【００６６】
好ましい実施形態において、Ｒ３、Ｒ８およびＲ１３は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３、Ｒ８およびＲ１３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ９〜Ｒ１２、Ｒ１４およびＲ１５は水素である。
【００６７】
【化１２】
0006736546.tif 000017
（式中、Ｒ１〜Ｒ８は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ８の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ８の全ては水素である。
【００６８】
好ましい実施形態において、Ｒ２およびＲ７は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ２およびＲ７はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ３〜Ｒ６およびＲ８は水素である。
【００６９】
好ましい実施形態において、Ｒ３およびＲ６は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３およびＲ６はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は水素である。
【００７０】
好ましい実施形態において、Ｒ２およびＲ６は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ２およびＲ６はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７およびＲ８は水素である。
【００７１】
【化１３】
0006736546.tif 000018
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ５の全ては水素である。
【００７２】
好ましい実施形態において、Ｒ３は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は水素である。
【００７３】
【化１４】
0006736546.tif 000019
（式中、Ｒ１〜Ｒ１０は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ１０の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ１０の全ては水素である。
【００７４】
好ましい実施形態において、Ｒ３およびＲ８は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３およびＲ８はＳＯ３−から選択される。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ９およびＲ１０は水素である。
【００７５】
【化１５】
0006736546.tif 000020
（式中、Ｒ１は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、Ｒ１はＳＯ３−である。
【００７６】
特に好ましい実施形態において、側鎖アミン保護基は、９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基、９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基、トリ（４−スルホフェニル）メチル基（スルホＴｒｔ）、ｔｅｒｔ−ブチル−（２−スルホネート）オキシカルボニル基（Ｓｂｏｃ）および４−スルホ−カルボベンジルオキシ基（スルホＣＢｚ）から選択される。
【００７７】
好ましいアルコール保護基は以下の式１６〜１９に示される：
【化１６】
0006736546.tif 000021
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ５の全ては水素である。
【００７８】
好ましい実施形態において、Ｒ３は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は水素である。
【００７９】
【化１７】
0006736546.tif 000022
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ５の全ては水素である。
【００８０】
好ましい実施形態において、Ｒ３は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は水素である。
【００８１】
【化１８】
0006736546.tif 000023
（式中、Ｒ１は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、Ｒ１はＳＯ３−である。
【００８２】
【化１９】
0006736546.tif 000024
（式中、Ｒ１〜Ｒ１５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ１５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ１５の全ては水素である。
【００８３】
好ましい実施形態において、Ｒ３、Ｒ８およびＲ１３は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３、Ｒ８およびＲ１３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ９〜Ｒ１２、Ｒ１４およびＲ１５は水素である。
【００８４】
特に好ましい実施形態において、アルコール保護基は、４−スルホベンジル基（ＢｚＳ）、４−スルホ−ベンジルオキシメチル基（ＢＯＭＳ）、トリ（４−スルホフェニル）メチル基（スルホＴｒｔ）およびｔｅｒｔ−ブチル−１−スルホネート基（ｔＢｕｓ）から選択される。
【００８５】
好ましいチオール保護基は以下の式２０および２１に示される：
【化２０】
0006736546.tif 000025
（式中、Ｒ１〜Ｒ１５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ１５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ１５の全ては水素である。
【００８６】
好ましい実施形態において、Ｒ３、Ｒ８およびＲ１３は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３、Ｒ８およびＲ１３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ９〜Ｒ１２、Ｒ１４およびＲ１５は水素である。
【００８７】
【化２１】
0006736546.tif 000026
（式中、Ｒ１は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、Ｒ１はＳＯ３−である。
【００８８】
特に好ましい実施形態において、チオール保護基は、トリ（４−スルホフェニル）メチル基（スルホＴｒｔ）および１−スルホ−２−メチル−２−プロパンチオール基（ＳｔＢｕＳ）から選択される。
【００８９】
好ましいカルボキシル保護基は以下の式２２〜２５に示されるものである：
【化２２】
0006736546.tif 000027
（式中、Ｒ１〜Ｒ１５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ１５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、最も好ましくは少なくとも３つは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ１５の全ては水素である。
【００９０】
好ましい実施形態において、Ｒ３、Ｒ８およびＲ１３は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３、Ｒ８およびＲ１３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４〜Ｒ７、Ｒ９〜Ｒ１２、Ｒ１４およびＲ１５は水素である。
【００９１】
【化２３】
0006736546.tif 000028
（式中、Ｒ１は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、Ｒ１はＳＯ３−である。
【００９２】
【化２４】
0006736546.tif 000029
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ５の全ては水素である。
【００９３】
好ましい実施形態において、Ｒ３は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は水素である。
【化２５】
0006736546.tif 000030
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ５の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ５の全ては水素である。
【００９４】
好ましい実施形態において、Ｒ３は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は水素である。
【００９５】
特に好ましい実施形態において、カルボキシル保護基は、４−スルホベンジル基（ＢｚＳ）、４−スルホ−ベンジルオキシメチル基（ＢＯＭＳ）、トリ（４−スルホフェニル）メチル（スルホＴｒｔ）基およびｔｅｒｔ−ブチル−１−スルホネート基（ｔＢｕＳ）から選択される。
【００９６】
以下は最も好ましい保護基に対する概説である。
【化２６】
0006736546.tif 000031
【００９７】
本発明のさらに好ましい実施形態において、方法は固相ペプチド合成の改良であり、前記第１のアミノ酸または第１のペプチドのＣ末端は、好ましくはポリマーである不溶性支持体に固定される。不溶性支持体を使用することによって、成長ペプチドの中間体精製の労力が最小化される。精製は、好ましくは水、アルコールおよび水とアルコールの混合物からなる群から選択される溶媒中での各々の反応工程後に固定ペプチドを洗浄することによって容易に実施され得る。
【００９８】
一実施形態において、方法は、ペプチドが完成した場合、得られたペプチドを、切断組成物を用いてポリマー支持体から切断する工程をさらに含む。
【００９９】
適切な切断組成物および方法は当業者に周知である。典型的に、トリフルオロ酢酸および塩酸（ＨＦ）などの酸は切断する工程を実施するために使用される。好ましくは、ポリマー支持体から所望のペプチドを切断するのに適した酸は同時に、標的ペプチドにおいてアミノ酸に結合している側鎖保護基を除去する。
【０１００】
好ましくは、切断は、切断する工程の間および後に、望ましくない副反応からペプチドを保護する捕捉剤組成物（例えば、水、フェノール、ＤＴＴ、トリエチルシランおよびアニソール）の存在下で実施される。当業者は存在する保護基に関して適切な捕捉剤を選択できる。
【０１０１】
切断したペプチドは濾過によって切断支持体（例えば樹脂）から分離され得、次いでペプチドは、蒸発または溶媒により誘導される沈殿などの従来の工程によって濾液から回収され得る。
【０１０２】
本発明の特に好ましい実施形態において、α−アミン保護基は、蛍光構造、特に９−メチルフルオレン骨格構造を含み、方法は、第１のアミノ酸または第１のペプチドにカップリングしたα−アミン保護基によって生成される蛍光を測定することによって、ペプチド結合の形成の程度をモニターする工程および／またはα−アミン保護基の除去の程度をモニターする工程をさらに含む。好ましい実施形態において、９−メチルフルオレン骨格構造を含む保護基は、９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基または９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基である。
【０１０３】
固相ペプチド合成において、ペプチド結合の形成の程度をモニターする工程および／または蛍光保護基（例えばＳｍｏｃ）の除去の程度をモニターする工程は、支持体にＵＶ光を照射した後に蛍光強度の変化をモニターすること、および第１のアミノ酸または第１のペプチドを介して不溶性支持材料にカップリングした蛍光保護基によって生成される蛍光を測定することによって達成される。
【０１０４】
驚くべきことに、９−メチルフルオレンを含有する保護基、例えば９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基および９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基が内在蛍光特性を有することが観察された。これらの保護基の蛍光特性は、脱保護およびカップリング反応のいずれかまたは両方の完了後にモニターする機会を与える。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、保護剤およびそれぞれの保護基は、芳香族フルオレニル環系、例えば９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基および９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基に結合した２つ以上のスルホ基を含有する。これらの化合物における芳香族フルオレニル環系に結合した２つ以上のスルホ（ＳＯ３−）基は、ＳＰＰＳの間のペプチドの段階的な構築の間に使用される一般的な試薬と比較して固有である。Ｓｍｏｃなどのこれらの化合物は、各反応工程の終わりに存在する化合物の定量的な量を決定するためにそれらの内在蛍光によってモニターされ得る。
【０１０５】
支持体における蛍光（例えばＳｍｏｃ）基の証拠は、カップリングする工程が、ペプチド結合の形成を実質的に完了するために反復されなければならないか否かを決定するために蛍光で保護されたアミノ酸の首尾良いカップリングを決定するために使用され得る。同様に、支持体における蛍光基の証拠は、脱保護工程が蛍光保護基の除去を実質的に完了するために反復されなければならないか否かを決定するために脱保護工程の終わりに蛍光基の不完全な除去を決定するために使用され得る。
【０１０６】
典型的に、第１のアミノ酸または第１のペプチドがα−アミン保護された第２のアミノ酸または第２のペプチドと反応する、カップリング工程は、カップリング剤を加えることを含む。
【０１０７】
本発明はまた、本発明の方法における使用に適したカップリング剤に関する。典型的なカップリング剤はカルボジイミドおよびトリアゾールからなる群から選択される。好ましいカルボジイミドは、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、２−（（（エチルイミノ）メチレン）アミノ）−２−メチルプロパン−１−スルホネート（ＥＳＣ）および２，２’−（メタンジイリデンビス（アザニリリデン））ビス（２−メチルプロパン−１−スルホネート）（ＤＳＣ）である。好ましいトリアゾールは、Ｏ−ベンゾトリアゾリル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−］−ｙ１）−１．１，３，３−ｔｅｔｒａｎｔｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂＢｏｒａｔｅ）（ＴＢＴＵ）、Ｂｏｃ−ヒスチジン（トシル）；Ｂ０１’およびＢ０１’−Ｃｌ、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＢ）、および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）である。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態において、カップリング剤はスルホン酸基を含む。スルホン酸基は水含有溶媒中のカップリング剤の溶解度を増加させ、アニオン交換によってカップリング試薬のその後の分離を可能にする。
【０１０９】
好ましいカップリング剤は以下の式２６〜３０に示されるものである：
【化２７】
0006736546.tif 000032
（式中、Ｒ１は、好ましくは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ１はＳＯ３−である）。Ｒ２は、好ましくは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ２はＳＯ３−である。Ｒ１およびＲ２は同じであっても、異なっていてもよい。
【０１１０】
【化２８】
0006736546.tif 000033
（式中、Ｒ１は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ１はＳＯ３−である。Ｒ６６は、好ましくは、短鎖アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ８アルキル、より好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される。
【０１１１】
【化２９】
0006736546.tif 000034
（式中、Ｒ１は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ１はＳＯ３−である）。
【０１１２】
【化３０】
0006736546.tif 000035
（式中、Ｒ１は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ１はＳＯ３−である）。
【０１１３】
【化３１】
0006736546.tif 000036
（式中、Ｒ１〜Ｒ４は、独立して、水素、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、但し、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択される）。好ましい実施形態において、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋またはＣＮではないＲ１〜Ｒ４の全ては水素である。
【０１１４】
好ましい実施形態において、Ｒ３は、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋およびＣＮから選択され、特にＲ３はＳＯ３−である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は水素である。
【０１１５】
好ましい実施形態において、Ｒ５０は、ヒドロキシルの１つもしくは複数または以下の式３０．１〜３０．４（式中、Ｂは一般式３０の構造を示す）に与えられる置換基の１つから選択される：
【化３２】
0006736546.tif 000037
【０１１６】
特に好ましいカップリング剤は、２−（（（エチルイミノ）メチレン）アミノ）−２−メチルプロパン−１−スルホネート（ＥＳＣ）、２，２’−（メタンジイリデンビス（アザニリリデン））ビス（２−メチルプロパン−１−スルホネート）（ＤＳＣ）、２−（（（（３−（ジメチルアミノ）プロピル）イミノ）メチレン）アミノ）−２−メチルプロパン−１−スルホネート（ＭＰＳＣ）、およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）および２−（２−シアノ−２−（ヒドロキシイミノ）アセトキシ）−２−メチルプロパン−１−スルホネート（Ｃｙｍｓ）からなる群から選択される。
【０１１７】
【化３３】
0006736546.tif 000038
（式中、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキルから選択される）。
式３１（ＥＳＣ）
【０１１８】
【化３４】
0006736546.tif 000039
【０１１９】
カップリングする工程は、キャッピング試薬を加えることをさらに含んでもよい。記載されたキャッピング剤およびペプチド合成の方法における遊離アミンをキャッピングするためのそれらの使用は本発明の独立した部分を形成する。キャッピング剤は本発明の方法において使用され得るが、それらはペプチド合成の他の方法においても使用され得る。キャッピング剤は、得られる製品組成物の簡単で安全でコスト効率の良い精製を容易にする利点を有する。キャッピング試薬は、副産物の形成を防ぐために、カップリングする工程の後に遊離アミンのキャッピングを可能にし、キャッピング剤は、
Ｉ．骨格構造と、
ＩＩ．少なくとも１つの水溶性増強官能基と、
ＩＩＩ．少なくとも１つの反応基と
を含み、
骨格構造は、短鎖アルキル、好ましくはＣ１〜Ｃ８アルキル、環状アルキル鎖または芳香族化合物、より好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキルまたはベンジルから選択される群から選択される部分を含み、
水溶性増強官能基は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ（ＣＨ３）３＋、ＣＮおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、
水溶性増強官能基および反応基は少なくとも１つの共有結合を介して骨格構造に結合する。
【０１２０】
反応基は、好ましくは、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸Ｏ−スクシンイミド、カルボン酸オキシマエステル、カルボン酸無水物、ハロゲン化物およびチオール基からなる群から選択される。
【０１２１】
本発明の一実施形態において、キャッピング剤は本発明に係るペプチド合成の方法において加えられる。代替の実施形態において、キャッピング剤はペプチド合成の代替の方法において加えられ、その代替の方法は、溶媒中で第１のアミノ酸または第１のペプチドを、α−アミン保護された第２のアミノ酸または第２のペプチドと反応させる工程と、脱保護溶液でα−アミン保護基を除去する工程とを含み、キャッピング剤は遊離アミンをキャッピングするために反応混合物に加えられることを特徴とする。キャッピング剤は上述のものから選択される。反応の完了後、反応混合物を精製するために反応混合物を親和性カラムに通す。親和性カラムは好ましくはアニオンまたはカチオン交換カラムから選択される。
【０１２２】
水溶性増強官能基はカップリング後に容易な精製を可能にする。本発明の好ましい実施形態において、キャッピング剤はスルホン酸基を含む。
【０１２３】
好ましいキャッピング試薬は２−スルホ酢酸または４−スルホ安息香酸である。
【化３５】
0006736546.tif 000040
【０１２４】
本発明の別の好ましい実施形態において、方法は、水、アルコール、および水とアルコールの混合物からなる群から選択される溶媒を使用した少なくとも１回の洗浄工程と、洗浄工程において得られた廃水溶液を回収する工程と、廃水溶液を親和性クロマトグラフィーカラム、好ましくは固体アニオンおよび／またはカチオン交換支持体と接触させ、それによって水溶性増強官能基、特にＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−およびＮ（ＣＨ３）３＋のような荷電官能基である廃化合物を保持する工程とをさらに含む。少なくとも１つのスルホン酸基を含有する化合物を除去するためにアニオン交換支持体を使用することは特に効果的である。続いて、廃化合物は親和性クロマトグラフィーカラム、好ましくは固体アニオンおよび／またはカチオン交換支持体の再生によって回収され、処分され得る。あるいは、親和性クロマトグラフィーカラム、廃化合物を含有する、好ましくはアニオンおよび／またはカチオン交換支持材料が処分され得る。
【０１２５】
洗浄工程は典型的に、カップリングする工程の後、かつ脱保護工程の後に実施される。アニオンおよび／またはカチオン交換工程は、未反応または切断した保護基および試薬、例えば本明細書に記載されるカップリング剤およびキャッピング試薬などの全てのスルホ含有化合物の洗浄溶液からの除去を可能する。廃化合物はアニオンまたはカチオン交換カラムに保持され、精製した溶媒が得られる。保持された化合物は、アニオンもしくはカチオン交換材料と一緒にまたは溶出後に処分されてもよく、最小量の化学廃棄物のみが処分されなければならない。
【０１２６】
本発明のさらに好ましい実施形態において、方法は、切断する工程の後に精製工程であって、脱保護および切断された標的タンパク質またはペプチドを含有する溶液が、親和性クロマトグラフィーカラム、好ましくは固体アニオンおよび／またはカチオン交換支持体と接触する、精製工程、それによってスルホン酸基を含むものなどの廃化合物を保持する工程、ならびに精製した標的タンパク質を回収する工程をさらに含む。好ましい実施形態において、廃化合物は保護基の部分として少なくとも１つのスルホン酸基および他の試薬を含む。スルホ含有保護基およびスルホ含有試薬に起因して、親和性クロマトグラフィーカラム、好ましくはイオン交換法によって水、アルコール、および水とアルコールの混合物からなる群から選択される溶媒中でのカップリング、脱保護および切断反応の間に生成した過剰な化学物質および副産物の実質的に全てを除去することが可能である。もちろん、これはまた、他の荷電官能基と共に作用する。標的ペプチドのみがイオン交換カラムを通って流れることができるのに対して、ペプチド副産物、保護基残基および過剰な試薬はカラム上に保持される。カラムの再生後、最小量の化学廃棄物のみが処分されなければならない。これは、ＳＯ３−、ＯＳＯ３−エステル、ＯＰＯ３２−エステル、ＰＯ３２−、およびＮ（ＣＨ３）３＋などの荷電官能基を使用する有益な効果である。しかし非荷電官能基の１つ以上が使用されたとしても、プロセスは依然として水中で実施されてもよく、それによって従来技術のプロセスと比べて廃化学物質の量を減少させる。
【０１２７】
本発明の好ましい態様は、９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニルハロゲン化物（Ｓｍｏｃハロゲン化物）、９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニルＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｍｏｃ−ＮＨＳ）、９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニルＯ−スクシンイミド（Ｓｍｏｃ  ＯＳｕ）、９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニルハロゲン化物（Ｓｍｏｃハロゲン化物）、９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニルＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｍｏｃ−ＮＨＳ）、９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニルＯ−スクシンイミド（Ｓｍｏｃ  ＯＳｕ）、トリ（４−スルホフェニル）メチルハロゲン化物（スルホＴｒｔハロゲン化物）、ｔｅｒｔ−ブチル−（２−スルホネート）オキシカルボニル無水物（Ｓｂｏｃ２Ｏ）、ｔｅｒｔ−ブチル−（２−スルホネート）オキシカルボニルＯ−スクシンイミド（Ｓｂｏｃ−ＯＳｕ）、４−スルホ−カルボベンジルオキシハロゲン化物（スルホＣＢｚハロゲン化物）、２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−１−スルホネート（ｔＢｕＳ）、２−ブロモ−２−メチルプロパン−１−スルホネート（ｔＢｕＳ）、２−メルカプト−２−メチルプロパン−１−スルホネート（ＳｔＢｕＳ）、４−スルホベンジルハロゲン化物（ＢｚＳハロゲン化物）、および４−スルホ−ベンジルオキシメチルハロゲン化物（ＢＯＭＳハロゲン化物）からなる群から選択される保護試薬に関する。
【０１２８】
本発明に係る好ましいハロゲン化物は塩化物および臭化物である。上記の化合物は、有機化学における化学反応において官能基、例えばアミン基、アルコール基、チオール基、またはカルボキシル基を保護するための有用な試薬である。
【０１２９】
本発明の別の態様は、式６〜２５として上記に示されるものからなる群から選択され、より好ましくは式６〜１０として上記に示されるものから選択される保護基を含む修飾アミノ酸、ペプチドおよびそれらの塩に関する。特に好ましい実施形態において、これらの保護基には、９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基、９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシ−カルボニル基、トリ（４−スルホフェニル）メチル基（スルホＴｒｔ）、ｔｅｒｔ−ブチル−（２−スルホネート）オキシカルボニル基（Ｓｂｏｃ）、４−スルホ−カルボベンジルオキシ基（スルホＣＢｚ）、ｔｅｒｔ−ブチル−１−スルホネート基（ｔＢｕＳ）、１−スルホ−２−メチル−２−プロパンチオール基（ＳｔＢｕＳ）、４−スルホベンジル基（ＢｚＳ）、および４−スルホ−ベンジルオキシメチル基（ＢＯＭＳ）が含まれる。
【０１３０】
本発明のさらなる態様はペプチドを固相合成するための方法を実施するための装置に関する。前記装置は、不溶性（例えばポリマー）支持材料を受容するための反応容器と、不溶性支持材料にカップリングされた保護基によって生成される蛍光強度の変化をモニターするために配置される蛍光光度計とを含む。本発明の保護剤（例えばＳｍｏｃ）の内在蛍光に起因して、不溶性支持材料の蛍光強度の定量分析は、上述のＳＰＰＳ法におけるカップリング反応または脱保護反応の進展についての情報を与える。ペプチド合成装置内への蛍光光度計の組み込みは、加速される自動合成を可能にする。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態において、装置は、廃化合物を分離するために配置される少なくとも１つの固体アニオンおよび／またはカチオン交換支持体をさらに含む。固体アニオンおよび／またはカチオン交換支持体は、スルホ含有ペプチド副産物、保護基残基および過剰な試薬などの廃化合物から標的タンパク質を分離するために生成物ストリーム内に配置されてもよい。あるいはまたはさらに、固体アニオン交換支持体は、カップリングおよび脱保護工程の後に得られた洗浄溶液から過剰な試薬および副産物などの廃化合物を分離するために廃棄物ストリーム内に配置されてもよい。
【０１３２】
本発明は、添付の図面を参照した例示によって、さらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】図１は本発明に係る装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【０１３４】
図１は、上記の好ましい方法を実施するのに使用するための自動固相ペプチド合成装置の全体のレイアウトを概略的に示す。装置は、不溶性ポリマー支持体に固定された第１のアミノ酸または第１のペプチドを含有する反応容器１と、カップリング試薬、キャッピング試薬、切断試薬などを提供するための複数のリザーバを含む試薬容器２と、溶媒容器３と、保護されたアミノ酸および／またはペプチドを提供するための複数のリザーバを含むアミノ酸および／またはペプチド容器４とを含む。
【０１３５】
反応容器１および容器２、３、４は、特定の量の特定の試薬、アミノ酸および／またはペプチドが、従来の様式において制御手段（図示せず）の制御下で特定の順序で反応容器１に送達され得るように配置される管およびバルブを介して接続される。
【０１３６】
装置は、反応容器１の含有物の蛍光強度の変化を測定し、モニターするために配置される蛍光光度計５を含む。あるいは、反応容器１は一体化された蛍光光度計５を含んでもよいことが理解される。
【０１３７】
反応容器は、各々の洗浄工程後に廃棄物ストリームを除去するための廃棄物出口６と、切断工程後に生成物ストリームを除去するための生成物出口７とを備える。廃棄物出口６は廃棄物管８を介して、ストリームのｐＨが後の分離のために調整されるチャンバ９および第１のイオン交換カラム１０に接続される。生成物出口７は生成物管１１を介して第２のイオン交換カラム１２に接続される。
【０１３８】
イオン交換カラム１０、１１は、後で処分されなければならない副産物、過剰な試薬および保護基残基などの、スルホン酸化した廃化合物を保持するために配置される。第１のイオン交換カラム１０からの精製した溶媒ストリームは下水道に誘導され得るか、または再利用され得る。第２のイオン交換カラム１２からの精製した生成物ストリームは標的タンパク質を得るために使用される。
【０１３９】
本発明を例示するが、以下の実施例によって限定されない。
【実施例】
【０１４０】
実施例１：９−（３，６−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド（Ｓｍｏｃ−Ｃｌ）の合成
２ｇ（７．７３ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−クロリドを２０ｍＬの濃硫酸で処理した。反応混合物のワークアップ後、２．９６ｇ（７．０７ｍｍｏｌ、９１．４％）の粗Ｓｍｏｃ−クロリドを淡黄色の固体の形態で得た。
【化３６】
0006736546.tif 000041
Ｓｍｏｃ−クロリドの分析データ：
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝７．８０（ｓ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．４５（ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝１４５．５７，１４２．５４，１４１．６５，１２５．１６，１２１．６１，１２０．９０，６２．５４，４９．６５。
【０１４１】
実施例２：９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリド（Ｓｍｏｃ−Ｃｌ）の合成
２ｇ（７．７３ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−クロリドを２０ｍＬの濃硫酸で処理し、１００℃に加熱した。硫酸をＮａＯＨ（ｐＨ９．５）で中和し、溶媒を減圧下で除去し、ＮＭＲ分析により、標的中間体の形成を確認した。中間体を水中の２０％の硫酸中に再び溶解し、６時間撹拌して９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメタノールを形成した。硫酸をＮａＯＨ（ｐＨ６．７）で中和し、溶媒を減圧下で除去した。２５ｍｌのＤＣＭ中の１．２当量のホスゲンの溶液を０℃に冷却し、９−（２，７−ジスルホ）フルオレニルメタノールを撹拌しながらゆっくり加えた（Ｃａｒｐｉｎｏ  ａｎｄ  Ｈａｎ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９７２、３７、（２２）、３４０４−３４０９）。溶液を氷浴中で１時間撹拌し、次いで氷浴温度にて４時間静置した。溶媒および過剰なホスゲンを減圧下で除去して対応する生成物を得た。
【化３７】
0006736546.tif 000042
ＮＭＲ中間体：
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：６．０９（ｓ，２Ｈ），７．２３−７．４０（ｍ，２Ｈ），７．７２（ｓ，２Ｈ），７．９５（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：１４２．６１，１３２．９９，１３１．７４，１３０．２３，１２９．２８，１２７．２２，１２５．５７，１２４．６９。
９−（２，７−ジスルホ）−フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリドについてのＬＣ−ＡＰＣＩ−ＭＳ：
ＬＣ−ＡＰＣＩ−ＭＳ  Ｃ１５Ｈ９ＣｌＯ２２・についての計算値ｍ／ｚ：２５６．０３。測定値ｍ／ｚ：２５６．９４［Ｍ−Ｈ−２ｘＳＯ３］−。
【０１４２】
実施例３：Ｓｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（Ｓｍｏｃ−グリシン）の合成
２．５ｇ（８．４１ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−グリシンを３０ｍＬの濃硫酸で処理した。反応混合物のワークアップ後、３．７ｇ（８．０９ｍｍｏｌ、９６．２％）の粗Ｓｍｏｃ−グリシンを淡黄色の粉末の形態で得た。
【化３８】
0006736546.tif 000043
Ｓｍｏｃ−グリシンの分析データ：
ＬＣ−ＡＰＣＩ−ＭＳ  Ｃ１７Ｈ１４ＮＯ１０Ｓ２−についての計算値ｍ／ｚ：４５６．０１。測定値ｍ／ｚ：４５５．８５［Ｍ−Ｈ］−。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝８．０１（ｓ，２Ｈ），７．８７（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．７９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），５．９５（ｓ，ＮＨ），４．４１（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０１（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．６７（ｓ，２Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝１５８．２１，１４４．９４，１４２．４１，１４１．８８，１２５．５１，１２２．０９，１２１．０９，６５．７５，４６．９５，４４．３９。
【０１４３】
実施例４：Ｓｍｏｃ−Ｌ−Ａｌａ−ＯＨ（Ｓｍｏｃ−アラニン）の合成
２．５ｇ（８．０３ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｌ−アラニンを３０ｍＬの濃硫酸で処理した。反応混合物のワークアップ後、３．８ｇ（７．６４ｍｍｏｌ、９５．１％）の粗Ｓｍｏｃ−Ｌ−アラニンを白色粉末の形態で得た。
【化３９】
0006736546.tif 000044
Ｓｍｏｃ−アラニンの分析データ：
ＬＣ−ＡＰＣＩ−ＭＳ  Ｃ１８Ｈ１６ＮＯ７Ｓ・についての計算値ｍ／ｚ：３９０．０６。測定値ｍ／ｚ：３８９．９６［Ｍ−ＨＳＯ３］−。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ＝７．７８（ｄ，Ｊ＝１９．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．５５（ｄｄ，２Ｈ），５．９４（ｓ，ＮＨ），３．９５（ｍ，ＯＨ＋２Ｈ），３．８５（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝１．６４Ｈｚ，１Ｈ），１．０１（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，３Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ＝１７５．１１，１５８．１０，１４６．２１，１４５．８９，１４５．４４，１４３．５４，１２７．０９，１２４．０４，１２３．９０，１２１．４０，６７．２３，５１．０５，４８．５１，１７．５８。
【０１４４】
実施例５：Ｓｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ−ＯＨ（Ｓｍｏｃ−イソロイシン）の合成
２．５ｇ（７．０７ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｌ−イソロイシンを３０ｍＬの濃硫酸で処理した。反応混合物のワークアップ後、３．８ｇ（６．８２ｍｍｏｌ、９６．４％）の粗Ｓｍｏｃ−Ｌ−イソロイシンを白色粉末の形態で得た。
【化４０】
0006736546.tif 000045
Ｓｍｏｃ−イソロイシンの分析データ：
ＬＣ−ＡＰＣＩ−ＭＳ  Ｃ２１Ｈ２２ＮＯ７Ｓ・についての計算値ｍ／ｚ：４３２．１１。測定値ｍ／ｚ：４３２．０６［Ｍ−ＨＳＯ３］−。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ＝７．７９（ｄ，Ｊ＝１６．５Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５５（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．５Ｈｚ，２Ｈ），４．１５−３．８９（ｍ，ＯＨ＋２Ｈ），３．７７（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），１．５０（ｄｔｄ，Ｊ＝１３．２，１０．１，６．７Ｈｚ，１Ｈ），１．２０−１．０５（ｍ，１Ｈ），０．９７−０．８１（ｍ，１Ｈ），０．５５（ｄ，Ｊ＝６．８６Ｈｚ，３Ｈ），０．５４（ｔ，Ｊ＝７．４３Ｈｚ，３Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ＝１７３．９８，１５８．４９，１４６．１５，１４５．４５，１４３．４８，１２７．０９，１２４．０２，１２３．９５，１２１．３８，６７．３３，６０．３０，４８．５５，３８．３１，２６．３０，１５．９８，１１．６６。
【０１４５】
実施例６：Ｓｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ（Ｓｍｏｃ−ロイシン）の合成
２．５ｇ（７．０７ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｌ−ロイシンを３０ｍＬの濃硫酸で処理した。反応混合物のワークアップ後、３．６ｇ（７．０１ｍｍｏｌ、９９．１％）の粗Ｓｍｏｃ−Ｌ−ロイシンを白色粉末の形態で得た。
【化４１】
0006736546.tif 000046
Ｓｍｏｃ−ロイシンの分析データ：
ＬＣ−ＡＰＣＩ−ＭＳ  Ｃ２１Ｈ２２ＮＯ７Ｓ・についての計算値ｍｚ：４３２．１１。測定値ｍ／ｚ：４３２．０６［Ｍ−ＨＳＯ３］−。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，，ＭｅＯＤ）δ＝７．８０（ｄ，Ｊ＝１８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄｄ，Ｊ＝８．３，４．１Ｈｚ２Ｈ），４．１１−３．９３（ｍ，ＯＨ＋２Ｈ），３．８６（ｄｄ，Ｊ＝９．９，５．３Ｈｚ，１Ｈ），２．９４（ｔ，１Ｈ），１．４１−１．３１（ｍ，１Ｈ），１．３０−１．１７（ｍ，２Ｈ），０．５７（ｄｄ，Ｊ＝１４．７，６．５Ｈｚ，６Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ＝１７５．０８，１５８．４１，１４６．１８，１４５．９５，１４５．３８，１４３．５２，１２７．１０，１２４．０７，１２３．９７，１２１．４０，６７．２７，５３．９９，４８．５４，４１．４７，２５．８６，２３．２７，２１．７８。
【０１４６】
実施例７：スルホ−Ｔｒｔの合成
窒素雰囲気下で加熱した丸底フラスコにおいて、２３７ｍｇ（９．７５ｍｍｏｌ、３．０当量）のマグネシウムを１０ｍＬのＴＨＦに懸濁した。この混合物に、１５ｍＬのＴＨＦ中の１．８７８ｇ（９．７５ｍｍｏｌ、３当量）の４−クロロベンゼンスルホン酸の溶液の１／１０を激しく撹拌しながら加えた。グリニャール反応を開始するために、混合物を加熱還流し、一滴の臭化物を加えた。その後、４−クロロベンゼンスルホン酸溶液の残存部を滴下して加え、混合物をさらに３０分間還流し、その後、室温に冷却した。
【０１４７】
２番目の工程において、Ｋｏｃｈｉのカップリング法を利用した。この目的のために、３つ口フラスコを窒素雰囲気下に置き、メタノール中のドライアイスの懸濁液を使用することによって−７８℃に冷却した。その後、５０ｍＬのＴＨＦを加え、続いて０．３６１ｍＬ（３．２５ｍｍｏｌ、１当量）の四塩化炭素および０．３２５ｍｌ（０．０３ｍｍｏｌ、０．０１当量、ＴＨＦ中の０．１ｍｏｌ／Ｌ溶液）のテトラクロロ銅（ＩＩ）ジリチウムを加えた。この溶液に、以前に調製したグリニャール試薬を滴下して加えた。−７８℃にて１時間および０℃にて６時間撹拌した後、混合物を室温に加温し、さらに１８時間撹拌した。２０ｍＬの水を加えることによって溶液をクエンチした。揮発性成分を減圧下で除去し、茶色の固体の形態で１．６９ｇの粗製４，４’，４’’−（ヒドロキシメタントリイル）トリベンゼンスルホネート（スルホ−Ｔｒｔ）を得た。生成物を半分取ＲＰ−ＨＰＬＣによって単離した。４，４’，４’’−（ヒドロキシメタントリイル）トリベンゼンスルホネートの塩化チオニル（ＳＯＣｌ２）での処理により、トリ（４−スルホフェニル）メチルクロリド（スルホ−Ｔｒｔクロリド）が形成した。溶媒を減圧下で除去した。
【０１４８】
【化４２】
0006736546.tif 000047
スルホ−Ｔｒｔの分析データ：
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝７．６８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，６Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，６Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ＝１４０．９９，１３６．８８，１２８．９６，１２７．０２，７５．４５。
【０１４９】
実施例８：２−ヒドロキシ−２−メチルプロパン−１−スルホネート（ｔＢｕＳ−ＯＨ）の合成
６，００ｇの２−メチル−２−プロペン−１−スルホン酸ナトリウム塩を５０ｍｌの水に希釈した。１０ｍｌの硫酸を加え、反応物を室温にて一晩撹拌した。硫酸をＣａＣＯ３沈殿により除去した。溶媒を減圧により除去した。生成物を白色粉末として得た。ＬＣ−ＭＳおよびＮＭＲ分析により、標的化合物を確認した。
【化４３】
0006736546.tif 000048
ｔＢｕＳ−ＯＨの分析データ：
ＥＳＩ−ＭＳ  Ｃ４Ｈ９Ｏ４Ｓ−について計算値ｍ／ｚ：１５３．１８、測定値ｍ／ｚ：１５２．９［Ｍ−Ｈ］−。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１．１８（ｓ，６Ｈ），２．６７（ｓ，２Ｈ），５．２０（ｓ，１Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ：６７．８４，６１．８１，３９．５２，２９．６５。
【０１５０】
実施例９：２−ブロモ−２−メチルプロパン−１−スルホネート（ｔＢｕＳ−Ｂｒ）の合成
６，００ｇの２−メチル−２−プロペン−１−スルホン酸ナトリウム塩を２０ｍｌのＨＢｒ（４８％ｗ／ｗ）に希釈した。溶媒を減圧下で除去した。生成物を白茶色（ｗｈｉｔｅｂｒｏｗｎ）の粉末として得た。ＬＣ−ＭＳおよびＮＭＲ分析により、標的化合物を確認した。
【化４４】
0006736546.tif 000049
ｔＢｕＳ−Ｂｒの分析データ：
ＥＳＩ−ＭＳ  Ｃ４Ｈ８ＢｒＯ３Ｓ−についての計算値ｍ／ｚ：２１６，０７、測定値ｍ／ｚ：２１６，８［Ｍ−Ｈ］−。
【０１５１】
実施例１０：２−メルカプト−２−メチルプロパン−１−スルホネート（ＳｔＢｕＳ）の合成
３，００ｇの２−メチル−２−プロペン−１−スルホン酸ナトリウム塩を２５ｍｌの濃ＨＣｌに希釈し、反応溶液を一晩撹拌した。その後、酸をＮａＯＨ（ｐＨ＝６．８）で中和し、溶媒を減圧により除去した。窒素雰囲気下で加熱した丸底フラスコにおいて、２３３，６７ｍｇのマグネシウムを２０ｍＬのＴＨＦに懸濁した。１５ｍＬのＴＨＦ中の１，５ｇのｔＢｕＳ−Ｃｌの懸濁液を激しく撹拌しながら加えた。グリニャール反応を開始するために、混合物を加熱還流し（７０℃）、一滴の臭素を加え、混合物をさらに９０分還流し、その後、室温に冷却した。４当量の硫黄をグリニャール試薬に加え、８時間撹拌した。その後、２００ｍｌの水を加えた。混合物を室温にて２時間撹拌した。その後、溶媒を減圧下で除去し、得られた白色粉末をＮＭＲによって分析した。
【化４５】
0006736546.tif 000050
ＳｔＢｕＳの分析データ：
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＤｅｕｔｅｒｉｕｍＯｘｉｄｅ）δ：１．５６（ｓ，６Ｈ），２．１８（ｓ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），３．６７（ｓ，２Ｈ）。
１３Ｃ  ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ：６１．６６，３２．１３，２８．４８。
【０１５２】
実施例１１：（９−ＢＢＮ）−Ｌｙｓ（ＳＢｏｃ）の合成
１，６８ｇのリシンを乾燥ＴＨＦに懸濁し、ＴＨＦ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）中の２４．２８ｍｌの９−ボラビシクロ（３．３．１）ノナン（９−ＢＢＮ）を不活性ガス下で加えた。得られた懸濁液を１００℃にて１８時間還流した。溶媒を減圧下で除去した。（９−ＢＢＮ）−Ｌｙｓを２０ｍｌのＴＨＦに希釈し、１．９７ｇの１，１’−カルボニルジイミダゾールおよび２．５４ｇのｔＢｕＳ−ＯＨを不活性ガス下で加えた。得られた溶液を５時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた粗生成物をＤＣＭで３回洗浄してイミダゾール残渣を除去した。
【化４６】
0006736546.tif 000051
（９−ＢＢＮ）−Ｌｙｓ（ＳＢｏｃ）の分析データ：
ＥＳＩ−ＭＳ  Ｃ１９Ｈ３３ＢＮ２Ｏ７Ｓ２−についての計算値ｍ／ｚ：４４４．３５、測定値ｍ／ｚ：４４３．２［Ｍ−Ｈ］−。
【０１５３】
実施例１２：（９−ＢＢＮ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕｓ）の合成
２．００ｇのチロシンを乾燥ＴＨＦに懸濁し、ＴＨＦ（０．５ｍｏｌ／Ｌ）中の２５ｍｌの９−ＢＢＮを不活性ガス下で加えた。得られた懸濁液を１００℃にて１８時間還流した。溶媒を減圧下で除去した。（９−ＢＢＮ）Ｔｙｒを２０ｍｌのＴＨＦに懸濁し、２．３９ｇのｔＢｕＳ−Ｂｒを不活性ガス下で加えた。得られた溶液を２日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、得られた粗生成物をＴＨＦで３回洗浄して臭化物残渣を除去した。
【化４７】
0006736546.tif 000052
（９−ＢＢＮ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕＳ）の分析データ：
ＥＳＩ−ＭＳ  Ｃ２１Ｈ３１ＢＮＯ６Ｓ−についての計算値ｍ／ｚ：４３６．３５、測定値ｍ／ｚ：４３６．２［Ｍ＋Ｈ］＋、４５３．２［Ｍ＋Ｈ２Ｏ］＋。
【０１５４】
実施例１３：Ｓｍｏｃ保護されたアミノ酸の安定性試験
水性環境中でのＳｍｏｃ保護されたアミノ酸の安定性を決定するために、Ｓｍｏｃ−グリシンおよびＳｍｏｃ−Ｌ−ロイシンを水に溶解し、周囲温度にて８日間インキュベートした。分析的ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して３、６および８日後にアミノ酸の状態を調べた。化合物はかなりの時間、水性環境中で安定でなければならなかった。この安定性を証明するために、Ｓｍｏｃ−グリシンおよびＳｍｏｃ−ロイシンを最小量の水に溶解し、周囲温度に維持した。実験の結果を、３、６および８日後に実施したＲＰ−ＨＰＬＣによりモニターした。結果として、アミノ酸の組成の有意な変化は観察されなかった。
【０１５５】
実施例１４：Ｓｍｏｃ保護されたアミノ酸のＮ末端脱保護
ＳＰＰＳにおける利用に関して、保護基は安全な条件下で容易かつ効果的に脱保護可能でなければならない。Ｓｍｏｃ保護されたアミノ酸の脱保護条件を決定するために、一連の実験を、１ｍｇのＳｍｏｃ−グリシンを１ｍＬの水またはエタノールに溶解することによって実施した。この溶液に、以下の塩基
アンモニア（１０％水溶液）、
エタノールアミン（５０％水溶液）、
エチレンジアミン（５０％水溶液）または
ピペリジン（５０％水溶液）
のうちの１つを加え、混合物を室温にて５分間振盪しながらインキュベートした。分析的ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳによって結果を分析した。
【０１５６】
この結果により、アンモニアまたはアミンの水溶液が室温でのＳｍｏｃ脱保護に十分であることが示された。
【０１５７】
Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳ脱保護に使用されている標準的な塩基であるピペリジンに加えて、アンモニア、エタノールアミンおよびエチレンジアミンなどの水溶性塩基を使用することが可能であるように見える。これにより、ピペリジンベースの脱保護と比較して顕著に安く、容易な手順を利用することが可能となる。
【０１５８】
実施例１５：親和性クロマトグラフィーによる精製
Ｓｍｏｃ−アラニンを人工不純物としての非保護アラニンと混合し、１Ｍのギ酸に溶解し、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ａ−２５イオン交換カラムに充填した。カラムをさらなるギ酸で洗浄した後、Ｓｍｏｃ−アラニンを４Ｍのギ酸アンモニウム溶液で溶出した。充填前の溶液、充填後の溶液および溶出した画分をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０１５９】
この結果により、非保護のアラニンが妨害されずにイオン交換カラムを通過し、Ｓｍｏｃ保護されたアラニンがカラムに結合したことが示された。移動相を４Ｍのギ酸アンモニウム溶液に変化させると、Ｓｍｏｃ−アラニンは不純物を残さずにカラムから溶出した。それにより、Ｓｍｏｃ基は精製目的のために親和性クロマトグラフィーにおいて首尾良く使用され得ることが示された。
【０１６０】
実施例１６：Ｓｍｏｃアプローチ後の試験ペプチドＨ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−ＯＨの合成
Ｓｍｏｃ保護されたアミノ酸のカップリングを以下のように実施した。このように、３当量のそれぞれのＳｍｏｃ保護されたアミノ酸、２．８当量の活性化因子１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、３．０当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および一般塩基として６当量の炭酸水素ナトリウムを最小量の水に溶解し、３分間予備活性化した。典型的なカップリングを周囲温度にて６０分行った。ペプチド樹脂のＮ末端脱保護を１０％アンモニア水溶液を用いて二重脱保護工程として実施した。支持体から切断した後、試験ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣおよびＥＳＩ−ＭＳによって分析した。
ペプチドＨ−Ｖ−Ｇ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−ＯＨの分析データ：
ＲＰ−ＨＰＬＣ、１０→６０％ＭｅＣＮ、ｔＲ＝１９．１分。
ＥＳＩ−ＭＳ  Ｃ１６Ｈ２９Ｎ５Ｏ６についての計算値ｍ／ｚ：３８７．２１  測定値３８７．０［Ｍ＋Ｈ］＋
【０１６１】
【表４】
0006736546.tif 000053
【０１６２】
水、固体支持体（ＰＥＧＡ樹脂）およびＰＥＧＡ樹脂ペプチドの蛍光を、各々のカップリング工程後および脱保護工程後に決定した。結果を表１に示す。このように、各々のカップリング工程後、蛍光値はカップリングしたＳｍｏｃ基に起因して上昇し、各々の脱保護工程後、蛍光値は再び減少し、反応進行のリアルタイムモニタリングが可能であることを表す。
【図１】
0006736546.tif 000054