(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト網膜色素変性症GTPアーゼレギュレーター（RPGR）タンパク質をコードする配列番号１の核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載のポリヌクレオチド、及び上記核酸配列に機能的に連結され、かつそれとは異種の発現調節配列を含む発現カセット。
【請求項３】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４】
組換えアデノ随伴（rAAV）発現ベクターである、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含む、組換え単純ヘルペスウイルス（rHSV）。
【請求項６】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項７】
哺乳動物細胞である、請求項６記載の宿主細胞。
【請求項８】
HeLa細胞、BHK21細胞又はVero細胞である、請求項６記載の宿主細胞。
【請求項９】
V27細胞である、請求項６記載の宿主細胞。
【請求項１０】
発現調節配列がヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質（IRBP）プロモーターである、請求項２記載の発現カセット。
【請求項１１】
ヒトIRBPプロモーターが、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸配列を含み、桿体視細胞及び錐体視細胞での選択的発現を指令する、請求項１０記載の発現カセット。
【請求項１２】
ヒトIRBPプロモーターが配列番号８の核酸配列を含む、請求項１０記載の発現カセット。
【請求項１３】
配列番号７の核酸配列を含む、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
以下のステップ：
(a)配列番号１の核酸配列を含む組換え単純ヘルペスウイルス（rHSV）を単離された宿主細胞に感染させ、
(b)宿主細胞をインキュベートし、そして
(c)インキュベーション後にステップ(b)の宿主細胞からrAAVを回収する
を含む、請求項４記載のrAAV発現ベクターの製造方法。
【請求項１５】
単離された宿主細胞がHeLa細胞、BHK21細胞又はVero細胞である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
rHSVが、配列番号１の核酸配列に機能的に連結したヒトIRBPプロモーターを更に含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
ヒトIRBPプロモーターが、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸配列を含み、桿体視細胞及び錐体視細胞での選択的発現を指令する、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ヒトIRBPプロモーターが配列番号８の核酸配列を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
rHSVが配列番号７の核酸配列を含む、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2014年4月15日に出願された米国仮出願第61/979,633号に基づく優先権の利益を主張し、参照によりその全内容が本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概してヒト網膜色素変性症GTPアーゼレギュレーター（RPGR）をコードするコドン最適化核酸配列に関する。
【背景技術】
【０００３】
網膜色素変性症（RP）は、およそ3,500人に一人の割合で罹患する網膜の遺伝性変性疾患であり、全世界で150万人の患者がいると推定されている。Churchill et al., 2013, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54(2): 1411-1416を参照されたい。RPは桿体視細胞及び錐体視細胞の光受容体の進行性消失によって生じ、夜盲症に続いて視野の喪失に到る。この疾患は、法的盲又は全盲までもたらし得る。網膜色素変性症GTPアーゼレギュレーター（RPGR）遺伝子の変異は、RPの最も重篤なサブタイプであるヒトX連鎖型網膜色素変性症（XLRP）症例の70％以上を占めている。Beltran et al., 2012, PNAS 109(6): 2132-2137及びBader et al., 2003, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (44)4: 1458-1463を参照されたい。
【０００４】
RPGR遺伝子の選択的スプライシングによって、RPGRタンパク質の複数のアイソフォームが発現する。アイソフォームＡのmRNAは遺伝子の19個のエクソンを全て含み、アイソフォームＣのmRNAはエクソン1から15と、イントロン15の大きな部分を含む。イントロン15は、グルタミン酸及びグリシン反復（ヒトではEEEGEGEGE、マウスではEEGEGE）をコードする反復性の高い配列を含むプリンに富む領域である。Vervoort et al., Mutational hot spot within a new RPGR exon in X-linked retinitis pigmentosa. Nat Genet 2000; 25: 462-6を参照されたい。アイソフォームＡは全ての組織で構成的に発現しており、一方アイソフォームＣは「ORF15」とも呼ばれ、光受容体の結合繊毛で優勢的に発現する形態である。Hong et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2002; 43: 3373-82及びHong et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 2003; 44: 2413-21を参照されたい。
【０００５】
RPGR関連XLRPの合計55％はORF15の変異によって生じており、その全てが末端切断タンパク質をもたらす欠失から生じている。他の症例のほとんどはエクソン1-13の変異によって生じており、これはミスセンス変異又はナンセンス変異のいずれであっても良く、少数の例はイントロンの変異又は大きな欠失によって生じている。エクソン16-19の変異によると同定された症例はなかった。
【０００６】
最近の研究で、RPGR遺伝子の変異によって引き起こされるXLRPを治療するための遺伝子治療アプローチの可能性が実証された。例えば、Beltran等は、ヒトRPGRを発現するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの網膜下注入によって、XLRPのイヌモデルでの桿体視細胞及び錐体視細胞の光受容体機能が上昇することを示した。
【０００７】
しかしながら、臨床的使用のためのAAVベクターの大規模生産における課題の一つは、RPGR等の目的のタンパク質をコードする核酸配列が不安定であり、その結果、数種の変異及び欠失の蓄積が生じ得ることである。例えば、RPGR遺伝子は、反復性が高く、GAに富むcDNAの3'末端近くのORF15と呼ばれる1.2kbの領域を含む。この領域は、集団中の変異の「ホットスポット」である。この反復性の領域は、クローニング及びベクター調製の間、非常に不安定であり、取得されるクローンは一般的に変異及び欠失を含む。これらの変異はRPGRタンパク質の機能を変えたりなくしたりする可能性があり、遺伝子治療適用におけるこのタンパク質の使用を制限する。従って、AAVベクターの大規模生産の間、RPGR cDNAを安定化させる方法を特定する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
驚くべきことに、ヒトRPGRタンパク質をコードする配列番号１の核酸配列が、AAVプラスミドpTR-IRBP-RPGRsynの大規模生産において安定であることが見出された。この核酸配列は、野生型RPGR cDNAのコドン最適化を通して得られた。一態様において、本発明は、ヒトRPGRタンパク質をコードする配列番号１の核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
【０００９】
一態様において、本発明は、ヒト網膜色素変性症GTPアーゼレギュレーター（RPGR）タンパク質をコードする配列番号１の核酸配列を含むポリヌクレオチドを特徴とする。
【００１０】
一実施形態において、本発明は、上記態様のポリヌクレオチドと、上記核酸配列に機能的に連結し、かつそれとは異種である発現調節配列とを含む発現カセットを特徴とする。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、請求項１のポリヌクレオチドを含むベクターを特徴とする。更なる実施形態において、ベクターは、組換えアデノ随伴（rAAV）発現ベクターである。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、上記態様のいずれかのポリヌクレオチドを含む組換え単純ヘルペスウイルス（rHSV）を特徴とする。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、上記態様のいずれかのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を特徴とする。関連実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。更なる関連実施形態において、宿主細胞はHeLa細胞、BHK21細胞又はVero細胞である。別の更なる実施形態において、宿主細胞はV27細胞である。
【００１４】
別の実施形態において、発現調節配列はヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質（IRBP）プロモーターである。更なる関連実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは配列番号８の核酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸配列を含み、桿体視細胞及び錐体視細胞での選択的発現を指令する。別の更なる実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは配列番号８の核酸配列を含む。
【００１５】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７の核酸配列を含む。
【００１６】
本発明はまた、別の実施形態において、以下のステップ：(a)配列番号１の核酸配列を含む組換え単純ヘルペスウイルス（rHSV）を宿主細胞に感染させ、(b)宿主細胞をインキュベートし、そして(c)インキュベーション後に、ステップ(b)の宿主細胞からrAAVを回収する、ことを含む、上記態様のrAAV発現ベクターの製造方法を特徴とする。
【００１７】
一実施形態において、宿主細胞はHeLa細胞、BHK21細胞又はVero細胞である。
【００１８】
別の実施形態において、rHSVは更に、配列番号１の核酸配列に機能的に連結したヒトIRBPプロモーターを含む。更なる実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性を有する核酸配列を含み、桿体視細胞及び錐体視細胞での選択的発現を指令する。更なる関連実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは配列番号８の核酸配列を含む。
【００１９】
別の実施形態において、rHSVは、配列番号７の核酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ−１】コドン最適化RPGR cDNA（RPGRsyn; 配列番号１）及び野生型RPGR cDNA（Genbank Accession No. NM_001034853; 配列番号５）の配列アライメントを示す。
【図１Ａ−２】図１Ａ−１の続き。
【図１Ｂ−１】コドン最適化RPGR cDNA（RPGRsyn; 配列番号１）及び野生型RPGR cDNA（Genbank Accession No. NM_001034853; 配列番号５）の配列アライメントを示す。
【図１Ｂ−２】図１Ｂ−１の続き。
【図２】プラスミドpUC57-RPGRsynのマップを示す。
【図３】mini-prep及びより大規模のmidi-prep（Midi）で調製し、制限酵素NotI及びPciIで消化したpUC57-RPGRsynプラスミドDNAクローンN5及びN6を示す。mini-prepからのプラスミドDNAを、midi-prepによるより大規模な製造前にSURE2細胞中に再度トランスフォームした。
【図４】制限酵素NotI及びPciIで消化したmini-prep由来のpUC57-RPGRsynプラスミドDNA（mini_2及びmini_3）を示す。より大規模のmidi prepではプラスミドDNAは検出できなかった（midi_2及びmidi_3）。シーディング培養物を4℃で一晩保存し、より大規模のプラスミド生産のための接種物として使用した。
【図５】AAVプロウイルスプラスミドpTR-IRBP-RPGRsynのマップを示す。
【図６】4ラウンドの連続オーバーナイト増殖後の形質転換細菌から単離したpTR-IRBP-RPGRsynプラスミドDNAの制限地図を対照プラスミドpTR-IRBP-CNGB3coと共に示す。pTR-IRBP-RPGRsyn又はpTR-IRBP/GNAT2-hCNGB3coプラスミドで形質転換した細菌を、37℃で一晩培地中で増殖させた。翌朝、一晩培養した1.5mLからプラスミドDNAを精製し、残りの培養物を午後遅くまで室温に置き、続いてこれを使用して第2ラウンドの増殖のために2mLの培養培地に接種した（1:1000希釈）。同じ手順で第3及び第4ラウンドの増殖を行った。各ラウンドから精製されたプラスミドDNAを、次いでSma Iを用いた制限的消化によって分析して、プラスミドのITR配列の統合性を確認した。細菌中での3ラウンドの増殖を通して、制限地図はpTR-IRBP-RPGRsyn及び対照プラスミドpTR-IRBP-CNGB3coの双方で同じであった。しかしながら、細菌中での第3ラウンドの増殖後に収率は顕著に低下し、第4ラウンドの増殖後にはプラスミド制限断片はほとんど検出されなかった。
【図７−１】pTR-IRBP-RPGRsynプラスミドDNAから得られたコンティグのコンセンサス配列の参照pTR-IRBP-RPGRsyn配列との配列アライメントを示す。
【図７−２】図７−１の続き。
【図７−３】図７−２の続き。
【図７−４】図７−３の続き。
【図７−５】図７−４の続き。
【図７−６】図７−５の続き。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、ヒト網膜色素変性症GTPアーゼレギュレーター（RPGR）タンパク質をコードする配列番号１の核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。この核酸配列は、ベクターの複製の間の安定性の増大のためにコドン最適化されており、例えば遺伝子治療適用のためのアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターの作製のために使用することができる。
【００２２】
核酸配列は、コードされるアミノ酸配列を変えることなく宿主細胞中での安定性又は異種発現を向上させるためにコドン最適化することができる。例えば、コドンの最適化は、遺伝子発現、転写産物の安定性、タンパク質発現若しくはタンパク質の安定性にマイナスに影響する配列、例えば転写スプライス部位、DNA不安定性モチーフ、ポリアデニル化部位、二次構造、AUに富むRNAエレメント、二次ORF、コドンタンデムリピート、又は長い範囲の反復配列を除くために使用することができる。コドンの最適化はまた、対象の配列のG/C含量を調整するために使用することもできる。
【００２３】
コドンは、3個のヌクレオチドのセットからなり、特定のアミノ酸をコードするか、又は翻訳の終結をもたらす（すなわち終止コドン）。遺伝子コードは、複数のコドンが同じアミノ酸を特定するように重複しており、すなわち、20種のアミノ酸をコードするコドンが合計して61種存在する。コドンの最適化によって、DNA配列中に存在するコドンが同じアミノ酸をコードする好ましいコドン、例えば哺乳動物での発現に好ましいコドンに置き換えられる。従って、このプロセスにおいてアミノ酸配列は変化しない。コドン最適化は、遺伝子最適化ソフトウェアを使用して実施することができる。コドンを最適化したヌクレオチド配列は、アミノ酸配列に変更が生じていないことを確認するために、翻訳され、元のタンパク質配列とアライメントされる。例えば、ヒトRPGRをコードする配列番号１のヌクレオチド配列は、野生型のヒトRPGRヌクレオチド配列（Genbank Accession No. NM_001034853、配列番号５）のコドン最適化バージョンである。配列番号１及び配列番号５の双方が、同じRPGRタンパク質（配列番号６）をコードする。
【００２４】
コドン最適化の方法は当分野で公知であり、例えば米国特許出願公開第2008/0194511号、及び米国特許第6,114,148号に記載されている。
【００２５】
本発明の核酸配列は、合成配列として作製することができる。合成核酸配列を構築するための技術は当分野で公知であり、また合成遺伝子配列は、DNA 2.0（Menlo Park, Calif.）及びGenScript USA Inc.（Piscataway, N.J.）等のいくつかの会社から購入しても良い。あるいはまた、コドン変化は、標準的な分子生物学の技術、例えば部位特異的in vitro突然変異誘発、PCR、又は核酸配列を特異的に変更するのに適した当分野で公知の任意の他の遺伝子操作方法によって導入することができる。in vitro突然変異誘発のプロトコルは、例えばIn Vitro Mutagenesis Protocols, Braman, ed., 2002, Humana Press、及びSankaranarayanan, Protocols in Mutagenesis, 2001, Elsvier Science Ltd.に記載されている。
【００２６】
ヒトRPGR遺伝子は、染色体領域Xp21.1に位置し、172kbにわたる。Shu et al., 2012, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53(7): 3951-3958。選択的スプライシングを受けた複数の転写産物が存在し、その全てがアミノ(N)-末端RCC1様(RCCL)ドメインをコードしている。RCCLドメインは、小さなグアノシン三リン酸結合タンパク質Ranのグアニンヌクレオチド交換因子であるRCC1タンパク質に構造的に類似している。RPGR遺伝子は、90kDaと予想されるタンパク質をコードする19個のエクソン（RPGRex1-19）を含む。エクソン2から11はRCCLドメインをコードし、エクソン12から19は酸性残基に富み、イソプレニル化アンカーシグナル（isoprenylation anchorage signal）で終わるカルボキシル(C)-末端ドメインをコードする。RPGRex1-19中に見出される変異はXLRP患者の15％〜20％を占めており、その後の研究から、ORF15と呼ばれる選択的にスプライシングされたC-末端エクソン（RPGRORF15）を含む1以上の転写産物内に多くのより疾患原因となる変異が明らかとなっている。高頻度の微小欠損、フレームシフト、及び早期の停止変異がORF15内に見出されている。
【００２７】
一実施形態において、コドン最適化のために使用されるRPGR cDNAは、全長ヒトRPGRORF15クローン、C変異型、Genbank Accession No. NM_001034853（配列番号５）である。Vervoort et al., 2000, Nat Genet 25: 462-466を参照されたい。このクローンはエクソン1-ORF15を含み、三元（three-way）ライゲーションを使用して、エクソン1から15bの一部（ヌクレオチド169-1990）をヒトリンパ球から、1991-3627をヒトゲノムDNAから段階的に増幅することによって作製された。Beltran et al., 2012, PNAS 109(6): 2132-2137を参照されたい。
【００２８】
RPGRは、広範囲に発現しており、複雑な発現パターンを示す。上記Shu et al.を参照されたい。RPGR転写産物は、脳、眼、腎臓、肺、及び精巣を含む様々な組織で、いくつかの異なる分子種で検出される。RPGRタンパク質は、網膜、気管、脳、及び精巣で検出される。ヒト、マウス、及びウシの網膜では、RPGRは主に光受容体の結合繊毛に局在しているが、一部の分子種では外側部での発現も報告されている。RPGRは運動性繊毛の移行帯中、ヒト及びサルの蝸牛内で発現している。
【００２９】
本発明はまた、配列番号１の核酸配列及び該核酸配列に機能的に連結し、それとは異種である発現調節配列を含む、発現カセットを提供する。「発現調節配列」との用語は、核酸配列の複製又は発現（転写又は翻訳）に対して制御効果を発揮し得る任意の遺伝子エレメント（例えばポリヌクレオチド配列）をいう。一般的な発現調節配列には、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流制御ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（IRES）、及びエンハンサーが含まれる。
【００３０】
発現調節配列は、発現調節配列が第2の核酸配列と機能的関係におかれた場合に、核酸配列と機能的に連結している。例えば、プロモーターは、コーディング配列の発現にプロモーターが影響する場合にコーディング配列と機能的に連結している。「機能的に連結する」との用語は、例えば、発現調節配列と、発現させる核酸配列、及び場合によってターミネーター又はエンハンサー等の更なる発現調節配列との配置であって、発現調節配列のそれぞれが該核酸配列の発現を可能とし、改変し、促進し、又は他の方法で影響を与え得るような配置を包含する。
【００３１】
「異種（heterologous）」との用語は、異なる起源生物、又は同じ起源生物内の異なる遺伝子若しくはタンパク質から得られる、あるいはそれら由来である、核酸又はアミノ酸配列をいう。例えば、ヒトRPGR遺伝子の天然の発現調節配列ではない発現調節配列は、ヒトRPGR遺伝子に対して異種であるとみなされる。特定の実施形態において、発現調節配列は、RPGR遺伝子に対して異種であるプロモーターである。
【００３２】
好ましい実施形態において、発現調節配列は、ヒト光受容体間レチノイド結合タンパク質（IRBP）プロモーターである。IRBPは、網膜の光受容体細胞、及びずっと少ない程度で脳の松果腺内の松果体細胞にのみ発現している大きな糖タンパク質である。Al-Ubaidi et al., 1992, J Cell Biology, 119(6) 1681-1687を参照されたい。IRBPプロモーター領域は非常に良く性状解析されている。例えば、Albini等（1990, Nucleic Acids Research 18(17): 5181-5187）は、5'の非転写領域の2818bp（配列番号２）を含むヒトIRBPプロモーター領域のヌクレオチド配列（Genbank Accession No. X53044）を記載している。Beltran等（上記で引用）は、ヒトIRBPプロモーターの235bp断片が正常なイヌの網膜の桿体視細胞及び錐体視細胞の双方でのGFP発現を用量依存的及び時間依存的に指令することを実証した。ヒトIRBP遺伝子の5'の非翻訳領域の1.3kb断片（配列番号３）は、トランスジェニックマウスにおける光受容体細胞に特異的に細菌性レポーター遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、CAT）の発現を指令した。Al Ubaidi et al. 1992, J Cell Biology 119: 1681-1687を参照されたい。マウスIRBPの5'隣接領域の1783bp断片の多重（nested）欠失分析から、転写開始部位までの5'の70bp（配列番号４）からなる断片で高いプロモーター活性が維持されていたが、完全な組織特異的制御のためにはこの70bp断片の上流のエレメントが必要であることが示された。Boatright, et al., 1997, Molecular Vision 3: 15を参照されたい。
【００３３】
好ましい実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号８に対して少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する核酸配列を含む。更なる好ましい実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは配列番号８を含む。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「ベクター」との用語は、それが連結した別の核酸を運ぶことができる核酸分子、例えばプラスミドをいう。好ましいベクターは、それらが連結している核酸の自己複製及び／又は発現を可能にするものである。「rAAVベクター」は、アデノ随伴ウイルス（AAV）由来の核酸配列を含む組換えベクターである。組換えAAVは、プロデューサー細胞として知られる細胞内に遺伝子構築物を導入することによってin vitroで作製される。組換えAAVは、遺伝子欠損に基づくヒトの疾患の治療としての遺伝子治療のため、及びその適用可能性のためのベヒクルとして広く研究されてきた。臨床レベルでは、rAAVベクターは、嚢胞性線維症患者にcftr遺伝子を送達するために、また血友病患者に第IX因子遺伝子を送達するために、ヒト臨床試験で使用されている（Flotte, et al., 1998, Methods Enzymol 292: 717-732；及びWagner et al., 1998, Lancet 351: 1702-1703）。rAAVの作製のためのシステムは、3つのエレメントを使用する：1)対象遺伝子を含む遺伝子カセット、2)AAVrep及びcap遺伝子を含む遺伝子カセット、及び3)「ヘルパー」ウイルスタンパク質の供給源。rAAVの作製方法は当分野で公知であり、例えば米国特許第7,091,029号に記載されている。
【００３５】
遺伝子治療のためのrAAVベクターの作製は、適切なプロデューサー細胞株を使用して、in vitroで実施される。好ましい細胞株は293であるが、rAAVの作製は、限定するものではないが、ヒト又はサルの細胞株、例えばVero、WI38及びHeLa、及びげっ歯類の細胞、例えばBHK21等のBHK細胞を含む、他の細胞株を使用して達成することができる。
【００３６】
特定の実施形態において、rAAVは、ヒトRPGRタンパク質をコードする配列番号１の核酸配列を含む。rAAVは更に、配列番号１の核酸配列に機能的に連結した1以上の発現調節配列を含み得る。好ましい実施形態において、発現調節配列は、ヒトIRBPプロモーターである。更なる好ましい実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号８の核酸配列に対して少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有する核酸配列を含み、桿体視細胞及び錐体視細胞における選択的発現を指令する。特に好ましい実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは配列番号８を含む。
【００３７】
特定の実施形態において、rAAVは更に、SV40ポリAテイル、SV40スプライスドナー／スプライスアクセプター（SD/SA）配列、及びKozak配列を含み、それぞれが配列番号１の核酸配列に機能的に連結されている。好ましい実施形態において、rAAVは配列番号７の核酸配列を含む。
【００３８】
rAAV作製のために必要なエレメントの全てをプロデューサー細胞株に送達するための一つの戦略は、必要な遺伝子産物をコードする遺伝子カセットを含むプラスミドで細胞をトランスフェクトすること、並びにヘルパーウイルスAdを細胞に感染させてヘルパー機能を与えることを含む。このシステムは2つの異なる遺伝子カセットを有するプラスミドを用いる。第1は、rAAVとしてパッケージングされる組換えDNAをコードするプロウイルスプラスミドである。第2は、rep及びcap遺伝子をコードするプラスミドである。rAAV作製のために必要なヘルパーウイルス遺伝子産物をもたらすために、1型単純ヘルペスウイルス（HSV-1）等の他のDNAウイルスをAdの代わりに用いることができる（Conway et al., 1999, Gene Ther. 6: 973-985）。
【００３９】
rAAV作製のための別の戦略は、プロデューサー細胞にrAAV作製のために必要な全ての要素を同時に重感染させるために2種以上の組換えrHSV-1ウイルスを使用することに基づく。この戦略は、それぞれが異なる遺伝子カセットを含む、少なくとも2種の異なる形態のrHSVを使用する。必要なヘルパー機能の供給に加えて、これらのrHSVウイルスのそれぞれを操作して、感染によりプロデューサー細胞に異なるAAV（及び他の）遺伝子を送達する。この2種のrHSVの形態を、「rHSV/rcウイルス」及び「rHSV発現ウイルス」と呼ぶ。rHSV/rcウイルスは、AAV由来のrep及びcap遺伝子がHSVゲノム中に挿入された遺伝子カセットを含む。rep遺伝子は、AAVを感染させた宿主細胞中のrAAVゲノムの複製及びパッケージングに関与する。cap遺伝子は、感染した細胞によって産生されたrAAVのカプシドを含むタンパク質をコードする。
【００４０】
第2の組換えHSVは「rHSV発現ウイルス」である。rAAV作製系の通常のエレメントは、対象の遺伝子、例えばRPGR遺伝子をコードする導入遺伝子のDNA配列を、遺伝子の発現のために必要なプロモーターエレメントと共に含む発現カセットである。特定の実施形態において、rHSVはヒトRPGRタンパク質をコードする配列番号１の核酸配列を含む。rAAV作製のために操作される発現ベクターは、一般的に対象の遺伝子が2つのAAV-2逆方向末端反復（ITR）の間に挿入されて構築される。ITRは感染後に宿主細胞のゲノム中にそのDNAを挿入する、あるいは感染した細胞中に存続するための天然AAVの能力に関わっている。発現カセットは、上記のrHSV発現ウイルス中に組み込まれる。この第2のrHSVウイルスは、rHSV-1/rcウイルスと共に細胞に同時に重感染させるために使用される。
【００４１】
「組換えHSV」、「rHSV」、「rHSVベクター」及び「rHSV発現ベクター」との用語は、ウイルスゲノム中に組み込まれた異種遺伝子を含む単純ヘルペスウイルス（HSV）の単離され、遺伝子改変された形態をいう。rHSVの作製方法は当分野で公知であり、例えばConway等（1999, Gene Ther. 6: 973-985）；Conway等（1997, J Virol 71: 8780-8789）及び米国特許第7,037,723号に記載されている。
【００４２】
特定の実施形態において、rHSVはヒトRPGRタンパク質をコードする配列番号１の核酸配列を含む。rHSVは更に、配列番号１の核酸配列の発現を制御するための1以上の発現調節配列を含んでいても良く、この発現調節配列は配列番号１の核酸配列に機能的に連結する。好ましい実施形態において、発現調節配列は、配列番号１の核酸配列に機能的に連結したヒトIRBPプロモーターである。更なる好ましい実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号８の核酸配列に対して少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％の配列同一性を有する核酸配列を含み、桿体視細胞及び椎体視細胞における選択的発現を指令する。特に好ましい実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは配列番号８を含む。
【００４３】
上記の方法の特定の実施形態において、rHSVは更に、SV40ポリAテイル、SV40スプライスドナー／スプライスアクセプター（SD/SA）配列、及びKozak配列を含み、それぞれが配列番号１の核酸配列に機能的に連結されている。好ましい実施形態において、rHSVは配列番号７の核酸配列を含む。
【００４４】
本発明はまた、ヒトRPGRタンパク質をコードする配列番号１の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含むrAAV発現ベクターの作製方法を提供する。一実施形態において、本方法は、(a)配列番号１の核酸配列を含む組換え単純ヘルペスウイルス（rHSV）を宿主細胞に感染させ；（ｂ）宿主細胞をインキュベートし；そして（ｃ）インキュベーション後にステップ（ｂ）の宿主細胞からrAAVを回収する、ことを含む。
【００４５】
宿主細胞をrHSVに感染させることによってrAAV発現ベクターを作製する方法は当分野で公知であり、例えば米国特許第7,091,029号に記載されている。例えば、一実施形態において、DMEM等の増殖培地中でウイルスを希釈し、宿主細胞を含有するフラスコにウイルスを添加することによって宿主細胞をrHSVに感染させる。宿主細胞は、様々な時間、例えば22、26、30、34、又は46時間の間、ウイルスと共にインキュベートすることができる。インキュベーション時間の後、ウイルス感染細胞をペレット化し、続いてDMEM中に再懸濁することによって回収することができる。細胞に結合したrAAVは、3ラウンドの凍結及び融解を含む標準的な技術を使用して細胞を溶解させて、宿主細胞から回収することができる（上記で引用したConway等、1999を参照されたい）。
【００４６】
特定の実施形態において、上記の方法においてrAAV発現ベクターを作製するために使用する宿主細胞は、HeLa細胞、BHK21細胞又はVero細胞である。
【００４７】
上記の方法において使用するrHSVは、配列番号１の核酸配列に機能的に連結した、配列番号１の核酸配列の発現を制御するための1以上の発現調節配列を更に含み得る。好ましい実施形態において、発現調節配列は、配列番号１の核酸配列に機能的に連結したヒトIRBPプロモーターである。更なる好ましい実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号８の核酸配列に対して少なくとも95％、96％、97％、98％、又は99％の配列同一性を有する核酸配列を含み、桿体視細胞及び椎体視細胞における選択的発現を指令する。特に好ましい実施形態において、ヒトIRBPプロモーターは配列番号８を含む。
【００４８】
上記の方法の特定の実施形態において、rHSVは更に、SV40ポリAテイル、SV40スプライスドナー／スプライスアクセプター（SD/SA）配列、及びKozak配列を含み、それぞれが配列番号１の核酸配列に機能的に連結されている。好ましい実施形態において、rHSVは配列番号７の核酸配列を含む。
【表１】
0006635942.tif 000002
【００４９】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態及び態様を説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００５０】
［実施例１  RPGR遺伝子のコドン最適化及びプラスミド安定性の評価］
AAVの製造のために使用するAAVプラスミド中の野生型RPGR cDNAは、nt2461からnt3057の領域にいくつかの変異及び欠失を含んでいることが見出された。この領域には合わせて42bpの蓄積された欠失又は置換があった。プラスミドクローンは細菌中でのプラスミドの増殖中安定であることが見出され、AAVベクターに配列変化は見られなかった。
【００５１】
RPGR遺伝子、C変異型の3459bpのコーディング配列（配列番号５）を、Genscript, Inc.で哺乳動物での発現のためにコドン最適化した。コドン最適化は、哺乳動物で高頻度のコドンを選択すると共にGC含量を変えて安定性を高めるため、及び遺伝子の反復的性質を低減するために使用した。RPGRコーディング配列のコドン最適化バージョン（RPGRsyn；配列番号１）は、元の遺伝子（配列番号５）と72.1％の配列同一性を有する。図１を参照されたい。コドン最適化した遺伝子は、元の遺伝子と同じポリペプチド、すなわち配列番号６のポリペプチドをコードする。RPGRsyn遺伝子は、SV40ポリAテイル、SV40 SD/SA配列、Kozak配列、及びクローニング目的のための制限部位と共にGenScriptで合成された。合成された全部で3871bpの配列を配列番号７として表す。
【００５２】
RPGRsynを含むプラスミド（pUC57-RPGRsyn）のマップを図２に示す。このプラスミドは、小規模プラスミド製造において細菌中で安定に増殖することができた。このプラスミドはまた、AAVプラスミドのクローニングのために使用される細菌株であるSURE2細胞に再度トランスフォームされた後のより大規模な製造においてもその安定性を維持した。図３を参照されたい。大規模製造で作製されたpUC57-RPGRsynプラスミドDNAのクローンN5は、DNA配列解析によって元のプラスミドと同一であることが確認された。シーディング培養物を4℃で一晩保存して大規模プラスミド製造のための接種物として使用した場合、プラスミドの収率の範囲は、非常に低い収率から全く得られない状態までであった。図４を参照されたい。RPGRsyn cDNAを、次いでpUC57-RPGRsynプラスミドから放出させ、pTRを含むプラスミド中に挿入して、AAVプロウイルスプラスミドpTR-IRBP-RPGRsynを作製した（図５）。pTR-IRBP-RPGRsynはAAV2の逆方向末端反復（ITR）及びIRBPプロモーターを含む。プラスミドの大規模製造は、DNA配列決定から100％正確であることが確認された（図６）。pTR-IRBP-RPGRsynの安定性を更に確認するために、pTR-IRBP-RPGRsyn又はpTR-IRBP/GNAT2-hCNGB3coプラスミドで形質転換した細菌を37℃で一晩培地中で増殖させた。翌朝、一晩培養した1.5mLからプラスミドDNAを精製し、残りの培養物を午後遅くまで室温に置き、続いてこれを使用して第2ラウンドの増殖のために2mLの培養培地に接種した（1:1000希釈）。同じ手順で第3及び第4ラウンドの増殖を行った。各ラウンドから精製されたプラスミドDNAを、次いでSma Iを用いた制限的消化によって分析して、プラスミドのITR配列の統合性を確認した。図６に示すように、pTR-IRBP-RPGRsynの収率は、連続継代の間に低下した；しかしながら、安定なhCNGB3 cDNAを含むプラスミドであるpTR-IRBP-CNGB3coで同じパターンが観察される。従って、プラスミド収率の低下は、細菌自体、又はTR等の他の性質に関連しているが、RPGRsynには関係していない。図７にも示すように、RPGRsynを含む4.2kbのバンドは、継代にわたり安定であった（不安定であれば緩むか不鮮明になるであろう）。
【００５３】
［実施例２  AAVプラスミドの構築及び細菌中での評価］
IRBPプロモーター（234bp）、RPGRsyn cDNA（配列番号１）、及びSV40 ポリAシグナル配列を含むRPGRsyn発現カセットを含むAAVプラスミド（pTR-IRBP-RPGRsyn）を構築する。このIRBP断片は、イヌモデルでBeltran等が使用した235bpの断片内に含まれている（Beltran et al., 2012, PNAS 109(6): 2132-2137を参照されたい）。pTR-IRBP-RPGRsynの構築後、実施例１に記載した方法を使用して細菌内での安定性についてプラスミドを試験する。
pTR-IRBP-RPGRsynの安定性が確認されれば、IRBP-RPGRsyn発現カセットを含むHSV組換えプラスミド（pHSV106-IRBP-RPGRsyn）を構築する。pHSV106-IRBP-RPGRsynを、AAVベクターAAV-IRBP-RPGRsynの大規模生産のためのHSV-IRBP-RPGRsynヘルパーベクターの構築のために使用する。rHSVヘルパーウイルスは、哺乳動物細胞（V27、ICP27-相補Vero細胞株）中で増殖させる。RPGRsyn cDNAは、細菌内よりも哺乳動物細胞内でより安定である。この安定性の増大によって、プラスミドトランスフェクション法によるrAAV作製のために必要な試薬であるRPGRsyn cDNAを含むAAVプロウイルスプラスミドの大規模生産の必要性がなくなるであろう。
0006635942.tif 000003
0006635942.tif 000004
0006635942.tif 000005
0006635942.tif 000006
0006635942.tif 000007
【図１Ａ−１】
0006635942.tif 000008
【図１Ａ−２】
0006635942.tif 000009
【図１Ｂ−１】
0006635942.tif 000010
【図１Ｂ−２】
0006635942.tif 000011
【図２】
0006635942.tif 000012
【図３】
0006635942.tif 000013
【図４】
0006635942.tif 000014
【図５】
0006635942.tif 000015
【図６】
0006635942.tif 000016
【図７−１】
0006635942.tif 000017
【図７−２】
0006635942.tif 000018
【図７−３】
0006635942.tif 000019
【図７−４】
0006635942.tif 000020
【図７−５】
0006635942.tif 000021
【図７−６】
0006635942.tif 000022
【配列表】
0006635942000001.app