(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列がアミノ酸２８１にシステイン（Ｃ）を含む単離核酸分子。
【請求項２】
前記変異型ＳＭＯタンパク質が配列番号２のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸２８１にシステイン（Ｃ）を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号５の親核酸配列を含み、該配列が該アミノ酸２８１コード配列をシステイン（Ｃ）をコードするように変化させる変異を有する、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号２に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質であって、該アミノ酸配列がアミノ酸２８１にシステイン（Ｃ）を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列がアミノ酸２８１にシステイン（Ｃ）を含む、請求項４に記載の変異型ＳＭＯタンパク質。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の変異型ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する単離抗体であって、該抗体がアミノ酸２８１にトリプトファンを有する野生型ＳＭＯには結合しない単離抗体。
【請求項７】
前記抗体がモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が細胞毒性剤に結合されている、請求項６又は７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が検出可能な標識に結合されている、請求項６又は７に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体がＳＭＯ活性を阻害する、請求項６〜９のいずれかに記載の抗体。
【請求項１１】
サンプルにおける少なくとも１つのＳＭＯ変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸２８１コード配列をシステインに変化させる変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブとを接触させ、及び該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法。
【請求項１２】
前記プローブが検出可能に標識されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブがアンチセンスオリゴマーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸サンプル中におけるＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そして該プローブと接触させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＧＤＣ−０４４９による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプルにおいて変異ＳＭＯ遺伝子又は変異ＳＭＯタンパク質の存在を決定し、該変異ＳＭＯ遺伝子がアミノ酸２８１に変異を含むＳＭＯタンパク質をコードし、該ＳＭＯタンパク質がアミノ酸２８１にシステインを含み、それによって、該変異ＳＭＯ遺伝子又は変異ＳＭＯタンパク質の存在は、該腫瘍がＧＤＣ−０４４９による治療に耐性であることを示すことを含む方法。
【請求項１６】
前記変異の存在又は非存在を、核酸サンプルを検査することによって決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記変異の存在又は非存在を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
アミノ酸２８１にシステインを組み込む変異型ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型ＳＭＯと試験化合物とを接触させ、及び該化合物の該変異型ＳＭＯへの結合を検出し、それによって、該変異型ＳＭＯへの該試験化合物の結合は、該試験化合物が変異型ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法。
【請求項１９】
アミノ酸２８１にシステインを組み込む変異型ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異型ＳＭＯを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、及び該細胞におけるＧｌｉの活性を検出し、それによって、該Ｇｌｉ活性の存在は、該試験化合物が変異型ＳＭＯの阻害剤ではないことを示すことを含む方法。
【請求項２０】
ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、該方法は、細胞と試験薬剤の所定量とを接触させ、ここで、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答し又はヘッジホッグシグナル伝達経路の増大したヘッジホッグシグナル伝達及び／又は活性を有し、該細胞は請求項４又は５に記載の変異型ＳＭＯタンパク質を発現し；及び対照と比較して、該試験薬剤が該細胞内においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害するかどうかを決定し、該試験薬剤が該対照に対して該細胞内におけるヘッジホッグシグナル伝達を阻害する場合には、該試験薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定することを含む方法。
【請求項２１】
前記試験薬剤が前記細胞内においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する能力を、Ｇｌｉ１発現アッセイを使用して決定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、該方法は、細胞と試験薬剤の所定量とを接触させ、ここで、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答し又はヘッジホッグシグナル伝達経路の増大したヘッジホッグシグナル伝達及び／又は活性を有し、該細胞は請求項４又は５に記載の変異型ＳＭＯタンパク質を発現し；及び対照と比較して、該試験薬剤が該細胞の成長及び／又は増殖を阻害するかどうかを決定し、該試験薬剤が該対照に対して該細胞の成長及び／又は増殖を阻害する場合には、該試験薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定することを含む方法。
【請求項２３】
対照が野生型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞である、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記対照が前記試験薬剤と接触させた細胞と同じ変異型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞であり、該対照を該変異型ＳＭＯタンパク質が部分的又は完全に耐性である対照薬剤で処理する、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
対照薬剤がビスモデギブ、ＬＹ２９４０６８０、ＬＤＥ２２５及び／又は化合物５である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記試験薬剤が変異型ＳＭＯタンパク質に結合するが、野生型ＳＭＯタンパク質には結合しない、請求項２０〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記試験薬剤が変異体ＳＭＯタンパク質と野生型ＳＭＯタンパク質の両方に結合する、請求項２０〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記試験薬剤が野生型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞よりも変異型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞においてヘッジホッグシグナル伝達経路を阻害するのに有効である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記試験薬剤が野生型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞よりも変異型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞の成長及び／又は増殖を阻害するのに有効である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜３のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
【請求項３１】
請求項３０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３２】
請求項３０に記載のベクターを含む宿主細胞であって、該ベクターを発現することができる宿主細胞。
【請求項３３】
ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、該方法は、細胞と試験薬剤の所定量とを接触させ、ここで、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答し又はヘッジホッグシグナル伝達経路の増大したヘッジホッグシグナル伝達及び／又は活性を有し、該細胞は請求項３０に記載のベクターを発現し；及び対照と比較して、該試験薬剤が該細胞内においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害するかどうかを決定し、該試験薬剤が該対照に対して該細胞内におけるヘッジホッグシグナル伝達を阻害する場合には、該試験薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定することを含む方法。
【請求項３４】
前記試験薬剤が前記細胞内においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する能力を、Ｇｌｉ１発現アッセイを使用して決定する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法であって、該方法は、細胞と試験薬剤の所定量とを接触させ、ここで、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答し又はヘッジホッグシグナル伝達経路の増大したヘッジホッグシグナル伝達及び／又は活性を有し、該細胞は請求項３０に記載のベクターを発現し；及び対照と比較して、該試験薬剤が該細胞の成長及び／増殖を阻害するかどうかを決定し、該試験薬剤が該対照に対して該細胞の成長及び／増殖を阻害する場合には、該試験薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１４年２月４日に出願された米国仮出願第６１／９３５７７５号の優先権の利益を主張する。本明細書においてその全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
分子標的癌治療薬が臨床において印象的な活性を示している。最も注目された例のいくつかとしては、フィラデルフィア染色体陽性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）又はＫＩＴ／ＰＤＧＦＲ変異消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）におけるチロシンキナーゼ阻害剤のイマチニブ及びＥＧＦＲ変異非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）におけるエルロチニブが挙げられる（Ｋｒａｕｓｅ，Ｄ．Ｓ．及びＲ．Ａ．Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ（２００５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３（２）：１７２−１８７）。これらの薬剤を用いた治療は、これらの分子異常を有する患者集団における劇的な抗腫瘍応答をもたらした。しかし、この印象的な初期臨床応答にもかかわらず、ほとんどの患者が薬剤耐性の獲得のため最終的に進行する（Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．及びＪ．Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１８（１）：７３−７９）。耐性のメカニズムの同定は、結果として、より合理的な薬物の組み合わせ及び耐性の出現を潜在的に克服する又は避けることができる「第二世代」阻害剤の開発の扉を開いた。
【０００３】
髄芽腫は、小児における最も一般的な脳の悪性腫瘍を示す小脳の原始神経外胚葉腫瘍である（Ｐｏｌｋｉｎｇｈｏｒｎ，Ｗ．Ｒ．及びＮ．Ｊ．Ｔａｒｂｅｌｌ（２００７）Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｏｎｃｏｌ．４（５）：２９５−３０４）。髄芽腫の治療の一形態は、アジュバント放射線療法である。生存率の改善にもかかわらず、アジュバント放射線は衰弱性副作用に関連するため、新たな分子標的療法の必要性が支持される。
【０００４】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路は、髄芽腫の病因に直接関与する。抑制性受容体ＰＴＣＨ１における機能変異の根本的な欠失による場合が最も多い構成的Ｈｈシグナルが孤発例の約３０％で実証されている（Ｚｕｒａｗｅｌ，Ｒ．Ｈ．外，（２０００）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２７（１）：４４−５１；Ｋｏｏｌ，Ｍ．外，（２００８）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（８）：ｅ３０８８；Ｄｅｌｌｏｖａｄｅ，Ｔ．外（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２９：５３９；Ｒｕｂｉｎ，Ｌ．Ｌ．及びＦ．Ｊ．ｄｅ  Ｓａｕｖａｇｅ（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．５：１０２６）。ＰＴＣＨ１に対するヘテロ接合マウス（ＰＴＣＨ１＋／−）は髄芽腫を自発的に発症する場合があり、Ｈｈ経路阻害剤による治療により、腫瘍の除去及び生存期間の延長が生じた（Ｇｏｏｄｒｉｃｈ，Ｌ．Ｖ．外（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７（５３２９）：１１０９−１１１３；Ｒｏｍｅｒ，Ｊ．Ｔ．外（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ６（３）：２２９−２４０）。しかし、近年、新規Ｈｈ経路阻害剤ＧＤＣ−０４４９により治療された患者は、最初に、治療に対して劇的な応答を示した（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｍ．Ｒｕｄｉｎ外（２００９）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（前出））が、治療に対する永久的な応答を獲得するのにはやはり失敗し、腫瘍の再発を示したことが観察されている。
【０００５】
ＢＣＣは、最も一般的なヒトの癌であり、主にＨｈ経路の過剰活性化によって活動化する（Ｏｒｏ外，１９９７；Ｘｉｅ外，１９９８）。Ｈｈシグナル伝達と癌との関連は、最初に、髄芽腫（ＭＢ）及びＢＣＣに影響を非常に受けやすいゴーリン又は基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）の患者で発見された。これらの患者は、一般に、Ｈｈリガンドに対する受容体をコードするＰａｔｃｈｅｄ１（ＰＴＣＨ１）内にヘテロ生殖細胞変異を有する（Ｈａｈｎ外，１９９６；Ｊｏｈｎｓｏｎ外，１９９６）。Ｈｈリガンド結合は、蛇行膜貫通（ＴＭ）シグナル伝達物質平滑化（ＳＭＯ）のＰＴＣＨ１抑制を緩和する。散発的性ＢＣＣの大半は、ＰＴＣＨ１の変異及びヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を不活性化させることにより活動化し、残りの大部分は、ＳＭＯの変異の活性化を維持する（Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ外，２００５）。ＳＭＯは、融合サプレッサー（ＳＵＦＵ）及びプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）の阻害によりＧＬＩ転写因子の活性化及び核局在化を促進する。ＳＵＦＵは、細胞質においてＧＬＩ転写因子を結合させ隔離することによってＨｈ経路を負に調節する（Ｓｔｏｎｅ外，１９９９）。また、ＳＵＦＵの機能喪失変異はゴーリン症候群とも関連する（Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ外，２００９；Ｓｍｉｔｈ外，２０１４；Ｔａｙｌｏｒ外，２００２）。また、散発性ＢＣＣの約５０％はＴＰ５３変異も有する（Ｊａｙａｒａｍａｎ外，２０１４）。
【０００６】
数種のＨｈ経路阻害剤（ＨＰＩ）が近年ＢＣＣ及びＭＢの両方について臨床試験中である（Ａｍａｋｙｅ外，２０１３）。以前からＧＤＣ−０４４９として知られているビスモデギブは、転移性で局所的に進行したＢＣＣの治療について承認を受けたＳＭＯ阻害剤である（Ｓｅｋｕｌｉｃ外、２０１２）。ビスモデギブによる治療を受けたＢＣＣ患者の大半は、完全応答及び部分応答の両方を含めて臨床的利益を経験する（Ｓｅｋｕｌｉｃ外，２０１２）。
【０００７】
しかし、予備的な推定から、進行ＢＣＣ患者の２０％までが治療の１年以内にビスモデギブに対する耐性を生じることが示唆される（Ｃｈａｎｇ及びＯｒｏ，２０１２）。これまで、臨床でのビスモデギブに対する耐性獲得の唯一の機能的に特徴づけられた機構は、転移性ＭＢ患者からのものである。ＳＭＯ−Ｄ４７３Ｈ変異が再発転移性腫瘍からの生検で検出され、試験管内で薬物結合を阻害することが示された（Ｙａｕｃｈ外，００９）。近年、他の４つの臨床ＳＭＯ変異がビスモデギブ耐性ＢＣＣで報告されたが、機能的には検討されなかった（Ｂｒｉｎｋｈｕｉｚｅｎ外，２０１４；Ｐｒｉｃｌ外，２０１４）。ＳＭＯ阻害剤に対するいくつかの耐性機構が、追加のＳＭＯ変異、ＧＬＩ２などの下流Ｈｈ経路成分の増幅及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）キナーゼ及び非定型プロテインキナーゼＣι／λ（ａＰＫＣ−ι／λ）などのバイパスシグナル伝達経路の活性化を含めた前臨床モデルから示されている（Ａｔｗｏｏｄ外，２０１３；Ｂｕｏｎａｍｉｃｉ外，２０１０；Ｄｉｊｋｇｒａａｆ外，２０１１）。しかし、どの機構が患者において耐性にするのか不明なままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
追加のＧＤＣ−０４４９耐性変異型ＳＭＯタンパク質を同定し、そしてこのような変異型ＳＭＯタンパク質においてＳＭＯ活性を調節してＧＤＣ−０４４９による治療時における薬剤耐性を克服する化合物を見出すことが当該技術分野において急務となっている。さらに、そのＳＭＯ遺伝子型の自然変異による又は獲得した変異及び耐性による治療に対して耐性の場合がある患者を診断する方法に対する要望がさらに存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
開示の概要
本発明は、特定の実施形態では、単離された変異型ＳＭＯ核酸及びタンパク質、例えば腫瘍の化学療法耐性に関連するものに関し、また、ＳＭＯ変異に結合し又はＳＭＯ活性を調節する化合物についての及びスクリーニング方法、並びに癌診断及び治療、特に薬剤耐性腫瘍の診断及び／又は予後及び治療である変異の検出に関するものでもある。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列が野生型ＳＭＯアミノ酸配列の２８１位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含むものを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列がアミノ酸２８１にトリプトファン以外のアミノ酸を含むものを提供する。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、アミノ酸２８１にシステイン（Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の親核酸配列を含み、該配列は、異なるアミノ酸をコードするように、アミノ酸２８１をコードする配列を変化させる変異を含有する。いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸２８１をコードする配列に変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸にハイブリダイズ可能な核酸プローブも提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、変異型ＳＭＯ又はそのフラグメントをコードする該核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、約１０〜約５０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能な標識をさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の４５９位に対応するアミノ酸位置にアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸４５９におけるアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列はアミノ酸４５９にバリン（Ｖ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号５の親核酸配列を含み、該配列は、異なるアミノ酸をコードするようにアミノ酸４５９コード配列を変化させる変異を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸４５９コード配列に突然変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブを提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、変異型ＳＭＯ又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、約１０〜５０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能な標識をさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の５３５位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸５３５にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列はアミノ酸５３５にロイシン（Ｌ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号５の親核酸配列を含み、該配列は、異なるアミノ酸をコードするようにアミノ酸５３５コード配列を変化させる変異を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸５３５コード配列に突然変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブを提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、変異型ＳＭＯ又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、約１０〜５０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能な標識をさらに含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の４０８位に対応するアミノ酸位置にイソロイシン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸４０８にイソロイシン（Ｉ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列はアミノ酸４０８にバリン（Ｖ）を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号５の親核酸配列を含み、該配列は、異なるアミノ酸をコードするようにアミノ酸４０８コード配列を変化させる変異を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸４０８コード配列に突然変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズ可能な核酸プローブを提供する。いくつかの実施形態では、プローブは、変異型ＳＭＯ又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。いくつかの実施形態では、プローブは、約１０〜５０ヌクレオチド長を有する。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能な標識をさらに含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の２８１位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸２８１にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列はアミノ酸２８１にシステイン（Ｃ）を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の４５９位に対応するアミノ酸位置にアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸４５９にアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列はアミノ酸４５９にバリン（Ｖ）を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の５３５位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸５３５にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列はアミノ酸５３５にロイシン（Ｌ）を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の４０８位に対応するアミノ酸位置にイソロイシン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号７に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、アミノ酸４０８にイソロイシン（Ｉ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列は、アミノ酸４０８にイソロイシン（Ｉ）以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、該アミノ酸配列はアミノ酸４０８にバリン（Ｖ）を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ここに開示された変異型ＳＭＯタンパク質のいずれかに特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は、野生型ＳＭＯタンパク質には結合しない。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸２８１にトリプトファン以外のアミノ酸を含む変異型ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は、アミノ酸２８１にトリプトファンを有する野生型ＳＭＯには結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は、細胞傷害剤に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＳＭＯ活性を阻害する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸４５９にアラニン以外のアミノ酸を含む変異型ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は、アミノ酸４５９にトリプトファンを有する野生型ＳＭＯには結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は細胞傷害剤に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は検出可能な標識に結合する。いくつかの実施形態では、抗体はＳＭＯ活性を阻害する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸５３５にトリプトファン以外のアミノ酸を含む変異型ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は、アミノ酸５３５にトリプトファンを有する野生型ＳＭＯには結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は細胞傷害剤に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は検出可能な標識に結合する。いくつかの実施形態では、抗体はＳＭＯ活性を阻害する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸４０８にイソロイシン以外のアミノ酸を含む変異型ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する単離抗体を提供し、該抗体は、アミノ酸４０８にイソロイシンを有する野生型ＳＭＯには結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はそれらの抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態では、抗体は細胞傷害剤に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は検出可能な標識に結合する。いくつかの実施形態では、抗体はＳＭＯ活性を阻害する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるＳＭＯ又はそのフラグメントの第１細胞外ループのカルボキシ末端に相当するサンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるＳＭＯ又はそのフラグメントの第１膜貫通ドメインのアミノ末端に相当する該サンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるＳＭＯ又はそのフラグメントの第２膜貫通ドメインのカルボキシ末端に相当する該サンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるＳＭＯ又はそのフラグメントの第５細胞外ループのアミノ末端に相当する該サンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるＳＭＯ又はそのフラグメントの膜貫通ドメイン６のカルボキシ末端に相当する該サンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中の変異型ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、変異を含む疑いのあるＳＭＯ又はそのフラグメントの膜貫通ドメイン７のカルボキシ末端に相当する該サンプル核酸を増幅し、そして該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、電気泳動移動度をポリアクリルアミドゲル上で決定する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中における少なくとも１つのＳＭＯ変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸２８１をコードする配列をトリプトファン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質をコードする核酸又はそのフラグメントに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブとを接触させ、そして該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、該プローブはアンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、該核酸サンプル中における該ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そしてプローブと接触させる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中における少なくとも１つのＳＭＯ変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸４５９をコードする配列をアラニン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質をコードする核酸又はそのフラグメントに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブとを接触させ、そして該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、該プローブはアンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、該核酸サンプル中における該ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そしてプローブと接触させる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中における少なくとも１つのＳＭＯ変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸５３５をコードする配列をトリプトファン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質をコードする核酸又はそのフラグメントに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブとを接触させ、そして該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、該プローブはアンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、該核酸サンプル中における該ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そしてプローブと接触させる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、サンプル中における少なくとも１つのＳＭＯ変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、アミノ酸４０８をコードする配列をイソロイシン以外のアミノ酸に変化させる変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質をコードする核酸又はそのフラグメントに特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブとを接触させ、そして該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識されている。いくつかの実施形態では、該プローブはアンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、該核酸サンプル中における該ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントを増幅させ、そしてプローブと接触させる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＧＤＣ−０４４９による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプル中における変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在を決定し、ここで、該変異型ＳＭＯ遺伝子は、アミノ酸２８１に突然変異を含むＳＭＯタンパク質をコードし、該ＳＭＯタンパク質はアミノ酸２８１に突然変異を含み、それによって、該変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在は、該腫瘍がＧＤＣ−０４４９による治療に耐性であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＧＤＣ−０４４９による治療に影響を受けない又はもはや影響を受けやすくない腫瘍を有する被験体を該変異型ＳＭＯに結合する化合物で治療することを含む。いくつかの実施形態では、変異の有無を、核酸サンプルを調査することによって決定する。いくつかの実施形態では、該変異の有無を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＧＤＣ−０４４９による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプル中における変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在を決定し、ここで、該変異型ＳＭＯ遺伝子は、アミノ酸４５９に突然変異を含むＳＭＯタンパク質をコードし、該ＳＭＯタンパク質はアミノ酸４５９に突然変異を含み、それによって、該変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在は、該腫瘍がＧＤＣ−０４４９による治療に耐性であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＧＤＣ−０４４９による治療に影響を受けない又はもはや影響を受けやすくない腫瘍を有する被験体を該変異型ＳＭＯに結合する化合物で治療することを含む。いくつかの実施形態では、変異の有無を、核酸サンプルを調査することによって決定する。いくつかの実施形態では、該変異の有無を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＧＤＣ−０４４９による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプル中における変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在を決定し、ここで、該変異型ＳＭＯ遺伝子は、アミノ酸５３５に突然変異を含むＳＭＯタンパク質をコードし、該ＳＭＯタンパク質はアミノ酸５３５に突然変異を含み、それによって、該変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在は、該腫瘍がＧＤＣ−０４４９による治療に耐性であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、該変異型ＳＭＯを結合する化合物によるＧＤＣ−０４４９を用いた治療に感受性でなはい又はもはや感受性ではない腫瘍を有する対象を治療することを含む。いくつかの実施形態では、変異の有無を、核酸サンプルを調査することによって決定する。いくつかの実施形態では、該変異の有無を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＧＤＣ−０４４９による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプル中における変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在を決定し、ここで、該変異型ＳＭＯ遺伝子は、アミノ酸４０８に突然変異を含むＳＭＯタンパク質をコードし、該ＳＭＯタンパク質はアミノ酸４０８に突然変異を含み、それによって、該変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在は、該腫瘍がＧＤＣ−０４４９による治療に耐性であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＧＤＣ−０４４９による治療に影響を受けない又はもはや影響を受けやすくない腫瘍を有する被験体を該変異型ＳＭＯに結合する化合物で治療することを含む。いくつかの実施形態では、変異の有無を、核酸サンプルを調査することによって決定する。いくつかの実施形態では、該変異の有無を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＧＤＣ−０４４９による治療に耐性である又は耐性になるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、該腫瘍のサンプル中における変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在を決定し、ここで、該変異型ＳＭＯ遺伝子は、アミノ酸５３３に突然変異を含むＳＭＯタンパク質をコードし、該ＳＭＯタンパク質はアミノ酸５３３に突然変異を含み、それによって、該変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在は、該腫瘍がＧＤＣ−０４４９による治療に耐性であることを示すことを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＧＤＣ−０４４９による治療に影響を受けない又はもはや影響を受けやすくない腫瘍を有する被験体を該変異型ＳＭＯに結合する化合物で治療することを含む。いくつかの実施形態では、変異の有無を、核酸サンプルを調査することによって決定する。いくつかの実施形態では、該変異の有無を、タンパク質サンプルを検査することによって決定する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸２８１に変異を組み込む変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体ＳＭＯと試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異体ＳＭＯへの結合を検出し、それによって、該試験化合物の該変異型ＳＭＯへの結合は、該試験化合物が変異体ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸２８１に変異を組み込む変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体ＳＭＯを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞におけるＧｌｉの活性を検出し、それによって、Ｇｌｉ活性の存在は、該試験化合物が変異体ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸４５９に変異を組み込む変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体ＳＭＯと試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異体ＳＭＯへの結合を検出し、それによって、該試験化合物の該変異型ＳＭＯへの結合は、該試験化合物が変異体ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸４５９に変異を組み込む変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体ＳＭＯを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞におけるＧｌｉの活性を検出し、それによって、Ｇｌｉ活性の存在は、該試験化合物が変異体ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸５３５に変異を組み込む変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体ＳＭＯと試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異体ＳＭＯへの結合を検出し、それによって、該試験化合物の該変異型ＳＭＯへの結合は、該試験化合物が変異体ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸５３５に変異を組み込む変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体ＳＭＯを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞におけるＧｌｉの活性を検出し、それによって、Ｇｌｉ活性の存在は、該試験化合物が変異体ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸４０８に変異を組み込む変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体ＳＭＯと試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異体ＳＭＯへの結合を検出し、それによって、該試験化合物の該変異型ＳＭＯへの結合は、該試験化合物が変異体ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸４０８に変異を組み込む変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体ＳＭＯを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞におけるＧｌｉの活性を検出し、それによって、Ｇｌｉ活性の存在は、該試験化合物が変異体ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸５３３に変異を組み込む変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体ＳＭＯと試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異体ＳＭＯへの結合を検出し、それによって、該試験化合物の該変異型ＳＭＯへの結合は、該試験化合物が変異体ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸５３３に変異を組み込む変異体ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、該変異体ＳＭＯを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞におけるＧｌｉの活性を検出し、それによって、Ｇｌｉ活性の存在は、該試験化合物が変異体ＳＭＯの阻害剤であることを示すことを含む方法を提供する。
【００４８】
本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子を提供する。一態様では、該核酸分子は、配列番号２に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードし、該アミノ酸配列は、配列番号２の位置２８１に、トリプトファン（Ｗ）以外の任意のアミノ酸であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、配列番号２の位置２８１のアミノ酸はシステイン（Ｃ）である。本発明の一態様では、単離核酸配列は、配列番号５（野生型ＳＭＯ）の親核酸配列を含むが、ただし、位置８４１、８４２及び／又は８４３に、コードアミノ酸をトリプトファン（Ｗ）から異なるアミノ酸に変化させる１以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、トリプトファン（Ｗ）からシステイン（Ｃ）に変化させる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、該核酸分子は、配列番号３に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードし、該アミノ酸配列は、配列番号３の位置４５９に、アラニン（Ａ）以外の任意のアミノ酸であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３の位置４５９のアミノ酸はバリン（Ｖ）である。本発明の一態様では、単離核酸配列は、配列番号５（野生型ＳＭＯ）の親核酸配列を含むが、ただし、位置１３７５、１３７６及び／又は１３７７に、コードアミノ酸をアラニン（Ａ）から異なるアミノ酸に変化させる１以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、アラニン（Ａ）からバリン（Ｖ）に変化させる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、該核酸分子は、配列番号４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列をコードし、該アミノ酸配列は、配列番号４の位置５３５に、トリプトファン（Ｗ）以外の任意のアミノ酸であるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、配列番号４の位置５３５のアミノ酸はロイシン（Ｌ）である。本発明の一態様では、単離核酸配列は、配列番号５（野生型ＳＭＯ）の親核酸配列を含むが、ただし、位置１６０３、１６０４及び／又は１６０５に、コードアミノ酸をトリプトファン（Ｗ）から異なるアミノ酸に変化させる１以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、変異は、トリプトファン（Ｗ）からロイシン（Ｌ）に変化させる。
【００５１】
別の態様では、本発明は、ＳＭＯのアミノ酸２８１に変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブを提供する。一実施形態では、該プローブは、変異型ＳＭＯ又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。該プローブは約１０〜約５０ヌクレオチド長を有することができる。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識できる。該プローブは、変異型Ｓｍｏを野生型Ｓｍｏ（２８１位にトリプトファンを有する）に対して差次的に結合させる。
【００５２】
別の態様では、本発明は、ＳＭＯのアミノ酸４５９に変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブを提供する。一実施形態では、該プローブは、変異型ＳＭＯ又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。該プローブは約１０〜約５０ヌクレオチド長を有することができる。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識できる。該プローブは、変異型Ｓｍｏを野生型Ｓｍｏ（４５９位にトリプトファンを有する）に対して差次的に結合させる。
【００５３】
別の態様では、本発明は、ＳＭＯのアミノ酸５３５に変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズすることのできる核酸プローブを提供する。一実施形態では、該プローブは、変異型ＳＭＯ又はそのフラグメントをコードする核酸に相補的である。該プローブは約１０〜約５０ヌクレオチド長を有することができる。いくつかの実施形態では、該プローブは検出可能に標識できる。該プローブは、変異型Ｓｍｏを野生型Ｓｍｏ（５３５位にトリプトファンを有する）に対して差次的に結合させる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯ核酸又はそのフラグメントを提供する。本発明の核酸は、単離変異型ＳＭＯコード配列を含む。いくつかの実施形態では、該核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を含み、かつ、該核酸が配列番号１のヌクレオチド位置２８１に相当するヌクレオチド位置にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１の２８１位に相当するアミノ酸位置にシステイン（Ｃ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置８４１、８４２及び／又は８４３に相当するヌクレオチド位置に親野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の８４１、８４２及び／又は８４３位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含み、かつ、核酸が配列番号１の４０８位に相当するアミノ酸位置にイソロイシン（Ｉ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１個の突然変異を含有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１の４０８位に相当するアミノ酸位置にバリン（Ｖ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置１２２２、１２２３及び／又は１２２４に相当するヌクレオチド位置に親野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の１２２２、１２２３及び／又は１２２４位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含み、かつ、核酸が配列番号１の４５９位に相当するアミノ酸位置にアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１個の突然変異を含有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１の４５９位に相当するアミノ酸位置にバリン（Ｖ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置１３７５、１３７６及び／又は１３７７に相当するヌクレオチド位置に親野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の１３７５、１３７６及び／又は１３７７位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含み、かつ、核酸が配列番号１の５３３位に相当するアミノ酸位置にセリン（Ｓ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１個の突然変異を含有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１の５３３位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン（Ｎ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置１５９７、１５９８及び／又は１５９９に相当するヌクレオチド位置に親野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の１５９７、１５９８及び／又は１５９９位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一の配列を含み、かつ、核酸が配列番号１の５３５位に相当するアミノ酸位置にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１個の突然変異を含有する配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１の５３５位に相当するヌクレオチド位置にロイシン（Ｌ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の位置１６０３、１６０４及び／又は１６０５に相当するヌクレオチド位置に親野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の１６０３、１６０４及び／又は１６０５ヌクレオチド位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。
【００５５】
また、本発明は、少なくとも２０ヌクレオチド長であるフラグメントに上記変異の領域に及ぶような核酸のフラグメントを包含する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドフラグメントは、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ヌクレオチド長である。これらのフラグメントは、全長変異型ＳＭＯコード核酸分子にまで上記変異の領域に及ぶ任意の長さとすることができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質又はそれらのフラグメントを提供する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置２８１に置換が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の２８１位に相当するアミノ酸位置にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の２８１位に相当するアミノ酸位置にシステイン（Ｃ）を含むものとする。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置４０８に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の４０８位に相当するアミノ酸位置にイソロイシン（Ｉ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の４０８位に相当するアミノ酸位置にバリン（Ｖ）を含むものとする。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置４５９に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の４５９位に相当するアミノ酸位置にアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の４５９位に相当するアミノ酸位置にバリン（Ｖ）を含むものとする。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置５３３に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の５３３位に相当するアミノ酸位置にセリン（Ｓ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の５３３位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン（Ｎ）を含むものとする。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置５３５に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の５３５位に相当するアミノ酸位置にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の５３５位に相当するアミノ酸位置にロイシン（Ｌ）を含むものとする。
【００６２】
いくつかの実施形態では、変異型ヒトＳＭＯは、アミノ酸２８１が「Ｘａａ」（本願に関して、トリプトファン（Ｗ）以外の任意のアミノ酸を表す）として示される配列番号２に示される。いくつかの実施形態では、Ｘａａはシステイン（Ｃ）である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、変異型ヒトＳＭＯは、アミノ酸４０８が「Ｘａａ」（本願に関して、イソロイシン（Ｉ）以外の任意のアミノ酸を表す）として示される配列番号６に示される。いくつかの実施形態では、Ｘａａはバリン（Ｖ）である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、変異型ヒトＳＭＯは、アミノ酸４５９が「Ｘａａ」（本願に関して、アラニン（Ａ）以外の任意のアミノ酸を表す）として示される配列番号３に示される。いくつかの実施形態では、Ｘａａはバリン（Ｖ）である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、変異型ヒトＳＭＯは、アミノ酸５３３が「Ｘａａ」（本願に関して、セリン（Ｓ）以外の任意のアミノ酸を表す）として示される配列番号７に示される。いくつかの実施形態では、Ｘａａはアスパラギン（Ｎ）である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｘａａはバリン（Ｖ）である。いくつかの実施形態では、変異型ヒトＳＭＯは、アミノ酸５３５が「Ｘａａ」（本願に関して、トリプトファン（Ｗ）以外の任意のアミノ酸を表す）として示される配列番号４に示される。いくつかの実施形態では、Ｘａａはロイシン（Ｌ）である。
【００６７】
また、本発明は、配列番号２に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質であって、該アミノ酸配列が位置２８１にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むものも提供する。いくつかの実施形態では、位置２８１でのアミノ酸はシステイン（Ｃ）である。
【００６８】
また、本発明は、配列番号３に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質であって、該アミノ酸配列が位置４５９にアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含むものも提供する。いくつかの実施形態では、位置４５９でのアミノ酸はバリン（Ｖ）である。
【００６９】
また、本発明は、配列番号４に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質であって、該アミノ酸配列が位置５３５にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むものも提供する。いくつかの実施形態では、位置５３５でのアミノ酸はロイシン（Ｌ）である。
【００７０】
本発明は、本発明の変異型ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープが２８１位にトリプトファン以外のアミノ酸を有する変異型ＳＭＯ上に存在するが、野生型ＳＭＯには結合しないものをさらに提供する。いくつかの態様では、該抗体は、変異型ＳＭＯに対して高い親和性で結合するが、野生型ＳＭＯには高い親和性では結合しない。いくつかの態様では、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2又はＦｖフラグメント）である。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合されている。他の実施形態では、抗体は細胞障害剤、例えば限定されないが、化学療法剤、毒素又は放射性同位体に結合している。いくつかの態様では、抗体はＳＭＯ活性を阻害する。他の実施形態では、抗体は変異型ＳＭＯ活性のみを阻害する。
【００７１】
本発明は、本発明の変異型ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープが４０８位にトリプトファン以外のアミノ酸を有する変異型ＳＭＯ上に存在するが、野生型ＳＭＯには結合しないものをさらに提供する。いくつかの態様では、該抗体は、変異型ＳＭＯに対して高い親和性で結合するが、野生型ＳＭＯには高い親和性では結合しない。いくつかの態様では、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2又はＦｖフラグメント）である。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合されている。他の実施形態では、抗体は細胞障害剤、例えば限定されないが、化学療法剤、毒素又は放射性同位体に結合している。いくつかの態様では、抗体はＳＭＯ活性を阻害する。他の実施形態では、抗体は変異型ＳＭＯ活性のみを阻害する。
【００７２】
本発明は、本発明の変異型ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープが４５９位にアラニン以外のアミノ酸を有する変異型ＳＭＯ上に存在するが、野生型ＳＭＯには結合しないものをさらに提供する。いくつかの態様では、該抗体は、変異型ＳＭＯに対して高い親和性で結合するが、野生型ＳＭＯには高い親和性では結合しない。いくつかの態様では、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2又はＦｖフラグメント）である。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合されている。他の実施形態では、抗体は細胞障害剤、例えば限定されないが、化学療法剤、毒素又は放射性同位体に結合している。いくつかの態様では、抗体はＳＭＯ活性を阻害する。他の実施形態では、抗体は変異型ＳＭＯ活性のみを阻害する。
【００７３】
本発明は、本発明の変異型ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープが５３３位にトリプトファン以外のアミノ酸を有する変異型ＳＭＯ上に存在するが、野生型ＳＭＯには結合しないものをさらに提供する。いくつかの態様では、該抗体は、変異型ＳＭＯに対して高い親和性で結合するが、野生型ＳＭＯには高い親和性では結合しない。いくつかの態様では、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2又はＦｖフラグメント）である。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合されている。他の実施形態では、抗体は細胞障害剤、例えば限定されないが、化学療法剤、毒素又は放射性同位体に結合している。いくつかの態様では、抗体はＳＭＯ活性を阻害する。他の実施形態では、抗体は変異型ＳＭＯ活性のみを阻害する。
【００７４】
本発明は、本発明の変異型ＳＭＯタンパク質に特異的に結合する抗体であって、該抗体のエピトープが５３５位にトリプトファン以外のアミノ酸を有する変異型ＳＭＯ上に存在するが、野生型ＳＭＯには結合しないものをさらに提供する。いくつかの態様では、該抗体は、変異型ＳＭＯに対して高い親和性で結合するが、野生型ＳＭＯには高い親和性では結合しない。いくつかの態様では、該抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体又はその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2又はＦｖフラグメント）である。いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識に結合されている。他の実施形態では、抗体は細胞障害剤、例えば限定されないが、化学療法剤、毒素又は放射性同位体に結合している。いくつかの態様では、抗体はＳＭＯ活性を阻害する。他の実施形態では、抗体は変異型ＳＭＯ活性のみを阻害する。
【００７５】
また、本発明は、サンプル中における変異型ＳＭＯ遺伝子を検出する方法であって、サンプルから変異を含む疑いのあるＳＭＯの第１、第２、第５、第６又は第７膜貫通ドメイン、ＳＭＯのカルボキシ末端膜貫通ドメイン６、ＳＭＯのカルボキシ末端膜貫通ドメイン７又はそれらのフラグメントをコードする核酸を増幅し、及び該増幅核酸の電気泳動移動度と対応する野生型ＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントの電気泳動移動度とを比較することを含む方法も提供する。いくつかの実施形態では、該電気泳動移動度は、ポリアクリルアミドゲル上で決定される。このような実施形態では、変異型ＳＭＯの電気泳動移動度は、野生型Ｓｍｏと区別できる。
【００７６】
さらに、本発明は、サンプル中における少なくとも１つのＳＭＯ変異を同定する方法であって、該サンプルからの核酸と、変異を取り入れる変異型ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸に特異的にハイブリダイズできる核酸プローブとを接触させ、及び該ハイブリダイゼーションを検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、ＳＭＯの第１、第２、第５、第６又は第７膜貫通ドメインにおいて変異を検出する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯ変異は、Ｓｍｏにおいて８４１、８４２及び／又は８４３位で生じ（２８１位にアミノ酸をコードする）、ここで、該変異は、トリプトファン以外のアミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの実施形態では、該方法は、ＳＭＯの膜貫通ドメイン６のカルボキシ末端部分における変異を検出する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯ変異は、Ｓｍｏにおいて１３７５、１３７６及び／又は１３７７位（４５９位にアミノ酸をコードする）に生じ、ここで、該変異は、アラニン以外のアミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの実施形態では、該方法は、ＳＭＯの膜貫通ドメイン７のカルボキシ末端部分における変異を検出する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯ変異は、Ｓｍｏにおいて１６０３、１６０４及び／又は１６０５位（５３５位にアミノ酸をコードする）に生じ、ここで、該変異はトリプトファン以外のアミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能に標識される。いくつかの実施形態では、プローブはアンチセンスオリゴマーである。いくつかの実施形態では、サンプル中におけるＳＭＯ遺伝子又はそのフラグメントの核酸を増幅させ、そしてプローブと接触させる。
【００７７】
また、本発明は、ＧＤＣ−０４４９などの化学療法剤による治療に耐性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、腫瘍サンプル中における変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在を決定することを含み、ここで、該変異は、膜表面でＳＭＯの一部をコードするＳＭＯ遺伝子内に位置し（例えば、ＳＭＯの膜貫通ドメイン６のカルボキシ末端部分又はＳＭＯの膜貫通ドメイン７のカルボキシ末端部分）、それによって、該変異型ＳＭＯ遺伝子又は変異型ＳＭＯタンパク質の存在は、腫瘍が化学療法剤（例えばＧＤＣ−０４４９、これに限定されない）での治療に耐性であることを示す方法も提供する。いくつかの実施形態では、化学療法剤はＧＤＣ−０４４９である。他の実施形態では、化学療法剤はシクロパミンである。いくつかの実施形態では、変異はＳＭＯのアミノ酸２８１をコードするＳＭＯ遺伝子の部分にある。いくつかの実施形態では、変異はトリプトファンから別のアミノ酸にＳＭＯのアミノ酸２８１に変化を引き起こす。いくつかの実施形態では、他のアミノ酸はシステイン（Ｃ）である。いくつかの実施形態では、変異はＳＭＯのアミノ酸４５９をコードするＳＭＯ遺伝子の部分にある。いくつかの実施形態では、変異は、アラニンから別のアミノ酸にＳＭＯのアミノ酸４５９に変化を引き起こす。いくつかの実施形態では、他のアミノ酸はバリン（Ｖ）である。いくつかの実施形態では、変異は、ＳＭＯのアミノ酸５３５をコードするＳＭＯ遺伝子の部分にある。いくつかの実施形態では、変異は、トリプトファンから別のアミノ酸にＳＭＯのアミノ酸５３５に変化を引き起こす。いくつかの実施形態では、他のアミノ酸はロイシン（Ｌ）である。
【００７８】
また、本発明は、ＳＭＯ阻害剤による治療に感受性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、（ｉ）腫瘍サンプル中における野生型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、それによって、野生型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がＳＭＯ阻害剤による治療に感受性であることを示し、又は（ｉｉ）腫瘍の試料で変異型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在を決定することを含み、ここで、該変異はＳＭＯの２８１位でアミノ酸の変化をもたらし、それによって変異型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がＧＤＣ−０４４９などのＳＭＯ阻害剤による治療に感受性ではないことを示す方法も提供する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯ変異は、トリプトファン（Ｗ）２８１から他のアミノ酸への変化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はシステイン（Ｃ）である。
【００７９】
また、本発明は、ＳＭＯ阻害剤による治療に感受性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、（ｉ）腫瘍サンプル中における野生型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、それによって、野生型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がＳＭＯ阻害剤による治療に感受性であることを示し、又は（ｉｉ）腫瘍の試料で変異型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在を決定することを含み、ここで、該変異はＳＭＯの４５９位でアミノ酸の変化をもたらし、それによって変異型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がＧＤＣ−０４４９などのＳＭＯ阻害剤による治療に感受性ではないことを示す方法も提供する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯ変異は、アラニン（Ａ）４５９から他のアミノ酸への変化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はバリン（Ｖ）である。
【００８０】
また、本発明は、ＳＭＯ阻害剤による治療に感受性であるヒト被験体において腫瘍を同定するための方法であって、（ｉ）腫瘍サンプル中における野生型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在を決定し、それによって、野生型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がＳＭＯ阻害剤による治療に感受性であることを示し、又は（ｉｉ）腫瘍の試料で変異型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在を決定することを含み、ここで、該変異はＳＭＯの５３５位でアミノ酸の変化をもたらし、それによって変異型ＳＭＯタンパク質又は遺伝子の存在は、腫瘍がＧＤＣ−０４４９などのＳＭＯ阻害剤による治療に感受性ではないことを示す方法も提供する。いくつかの実施形態では、ＳＭＯ変異は、トリプトファン（Ｗ）５３５から他のアミノ酸への変化である。いくつかの実施形態では、アミノ酸はロイシン（Ｌ）である。
【００８１】
また、本発明は、ヘッジホッグ依存性腫瘍の治療を受けている患者の予後を決定する方法であって、腫瘍のサンプル中において、アミノ酸２８１、アミノ酸４５９又はアミノ酸５３５での変異の有無を決定し、それによって、該変異の存在は、所定のＳｍｏ阻害剤を使用して該変異が存在しない場合と比較して予後不良を示す方法も提供する。
【００８２】
さらに、本発明は、アミノ酸２８１、アミノ酸４５９又はアミノ酸５３５に変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、該変異型とＳＭＯ試験化合物とを接触させ、そして該化合物の該変異型ＳＭＯへの結合を検出することを含み、それによって、該試験化合物の該変異型ＳＭＯへの結合は、該試験化合物が該変異型ＳＭＯの阻害剤であることを示す方法を提供する。
【００８３】
また、本発明は、アミノ酸４５９、アミノ酸２８１又はアミノ酸５３５に変異を組み込む変異型ＳＭＯタンパク質のシグナル伝達を阻害する化合物をスクリーニングする方法であって、変異型ＳＭＯを発現する細胞と試験化合物とを接触させ、そして該細胞内でのＧｌｉの活性を検出することを含み、それによって、該Ｇｌｉ活性の存在は、該試験化合物が該変異型ＳＭＯの阻害剤ではないことを示す方法も提供する。いくつかの実施形態では、Ｇｌｉ活性は、検出可能な標識に結合されたＧＬＩタンパク質を使用して測定される。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は蛍光標識（例えば、ルシフェラーゼ）である。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｇは、野生型ヒトＳＭＯ（１Ａ）及びいくつかのヒト変異型ＳＭＯ（１Ｂ−１Ｉ）についてのアミノ酸配列を示す。図１Ａは、配列番号１を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｇは、野生型ヒトＳＭＯ（１Ａ）及びいくつかのヒト変異型ＳＭＯ（１Ｂ−１Ｉ）についてのアミノ酸配列を示す。図１Ｂは、配列番号２を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｇは、野生型ヒトＳＭＯ（１Ａ）及びいくつかのヒト変異型ＳＭＯ（１Ｂ−１Ｉ）についてのアミノ酸配列を示す。図１Ｃは、配列番号３を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｇは、野生型ヒトＳＭＯ（１Ａ）及びいくつかのヒト変異型ＳＭＯ（１Ｂ−１Ｉ）についてのアミノ酸配列を示す。図１Ｄは、配列番号４を示す。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｇは、野生型ヒトＳＭＯ（１Ａ）及びいくつかのヒト変異型ＳＭＯ（１Ｂ−１Ｉ）についてのアミノ酸配列を示す。図１Ｅは、配列番号５を示す。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｇは、野生型ヒトＳＭＯ（１Ａ）及びいくつかのヒト変異型ＳＭＯ（１Ｂ−１Ｉ）についてのアミノ酸配列を示す。図１Ｆは、配列番号６を示す。
【図１Ｇ】図１Ａ〜１Ｇは、野生型ヒトＳＭＯ（１Ａ）及びいくつかのヒト変異型ＳＭＯ（１Ｂ−１Ｉ）についてのアミノ酸配列を示す。図１Ｇは、配列番号７を示す。
【図２】図２は、ビスモデギブ耐性ＢＣＣにおけるヘッジホッグ経路のシグナル伝達のレベルを決定するために実施した実験の結果を示す。
【図３】図３は、処置前及び処置後生検におけるＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ変異の頻度を決定するために実施した実験の結果を示す。
【図４】図４は、Ｗ２８１変異を有するＳＭＯ変異体のビスモデギブ結合ポケットを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ変異体がＰＴＣＨに感受性かどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ変異体がビスモデギブに対して感受性であるかどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ、及びＳＭＯ−Ｗ５３５Ｌ変異体が変異を活性化しているかどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ変異体がＰＴＣＨ感受性であるかどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
【図５Ｅ】図５Ｅは、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ変異体がビスモデギブに対して感受性であるかどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
【図５Ｆ】図５Ｆは、ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ及びＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃがビスモデギブへの結合を損なったかどうかを決定するために実施した実験の結果を示す。
【図６Ａ−Ｃ】図６ＡはＨｈ経路の概略図を示す。図６Ｂは、肺に転移した患者１２（ＰＴ１２）からの散発性ＢＣＣの初期応答及び疾患の進行を示すスキャン写真を示す。赤の矢印は、治療前（ＰｒｅＲｘ）並びにビスモデギブ治療の４ヶ月後（病変サイズの減少を示す）及び３７ヶ月後（病気の進行を示す）における胸のコンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）における標的病変を示す。図６Ｃは、最初にビスモデギブに応答したが、その後再発した（黒矢印）、治療の指示期間後におけるゴーリン症候群の患者（ＰＴ１０）からの２つの局所的に進行したＢＣＣの写真を示す。
【図６Ｄ−Ｆ】図６Ｄは、ビスモデギブ治療の前及び１１ヶ月後における患者９．１（ＰＴ０９．１）からの局所的に進行した散発性ＢＣＣのヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片を示す。再発病変は、未治療の腫瘍の組織学的性質を維持していることに注意されたい。スケールバーは５０μｍを表す。図６Ｅは、ビスモデギブ耐性及び正常皮膚生検におけるＧＬＩ１及びＭＫＩ６７発現レベルを示すグラフである。ピアソンの相関係数（Ｒ）＝０．９６。正規化された読取り回数が示されている。図６Ｆは、１２名の再発ＢＣＣ患者で同定されたＨｈ経路遺伝子及びＴＰ５３における遺伝的変化の表形式の概要である。生殖細胞系列ＰＴＣＨ１変異体がゴーリンＢＣＣについて報告されている一方で、体細胞変異が散発性ＢＣＣについて示されている。２つの領域的に異なる生検をＰＴ０６、ＰＴ０８及びＰＴ０９について同じ初期腫瘍の再増殖時に得た。２つの別々のＢＣＣは患者ＰＴ１０において耐性を生じた。ＬＯＨを、ＳＮＰアレイからのマイナー対立遺伝子頻度によって決定した。緑のボックスは、ＬＯＨ事象、その後の変異対立遺伝子のコピー数増加を強調するものである。対立遺伝子特異的発現をＲＮＡｓｅｑにより決定した。
【図７】図７は、治療未経験散発性ＢＣＣで特定されＳＭＯ変異体を示す表である。ＳＭＯ−Ａ２３９Ｖは、以前には報告されていない（ＣＯＳＭＩＣ／ｄｂＳＮＰ）のに対し、他の全てのものは、以前に発癌性変異について報告されている。注：標的バリアントコーリングはＳＭＯ−Ａ２３９Ｖを同定したが、異なる読取カットオフ及び感度の低下のため、体細胞バリアントコールＶａｒｉａｎｔＴｏｏｌｓは同定しなかった。
【図８Ａ】図８Ａは、この研究で同定されたＳＭＯ突然変異の表形式の概要を示す。全ての変異は本質的に体細胞であった。これらは、同じ患者からの血液又は他の組織のいずれかで検出されなかったからである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＳＭＯ  ＴＭ領域（灰色のヘリックス；Ｗａｎｇ外，２０１３）の結晶構造にドッキングされたビスモデギブ（黄色）の計算モデルを示す。これまでに特徴づけられていない変異体残留物を緑色で強調している。
【図８Ｃ−Ｄ】図８Ｃは、治療前及び治療後の生検におけるＳＭＯ変異の有病率を示す棒グラフである。棒グラフは、ピロシーケンスによって決定される、ＰＴ０３、ＰＴ０４及びＰＴ１２（８Ｃ）についてのＳＭＯ−Ａ４５９Ｖに相当する位置での野生型（青）又は変異型（赤）ヌクレオチドの取り込み頻度を示す。ＳＭＯ変異はヘテロ接合性であることが予期され、ＳＭＯのコピー数は、最大Ｙ軸値を決めることに留意されたい。このコピー数は、ＰＴ０３、ＰＴ０４、ＰＴ１２、ＰＴ１０及びＰＴ１１については５０％であり（ＳＭＯコピー数は２である）、ＰＴ０９については２５％である（ＳＭＯコピー数は４である）。変異型ヌクレオチドの取り込みは、全ての治療前サンプルにおけるピロシーケンスアッセイのバックグラウンドレベル（＜５％）の範囲内にあるとみなされた。四重アッセイからのデータを血液コントロールに対してプロットする。エラーバーは、データの範囲を表す。図８Ｄは、治療前及び治療後の生検におけるＳＭＯ変異の有病率を示す棒グラフである。棒グラフは、ピロシーケンスによって決定される、ＰＴ０９（８Ｄ）についてのＳＭＯ−Ｖ３２１Ｍに相当する位置での野生型（青）又は変異型（赤）ヌクレオチドの取り込み頻度を示す。ＳＭＯ変異はヘテロ接合性であることが予期され、ＳＭＯのコピー数は、最大Ｙ軸値を決めることに留意されたい。このコピー数は、ＰＴ０３、ＰＴ０４、ＰＴ１２、ＰＴ１０及びＰＴ１１のために５０％であり（ＳＭＯコピー数は２である）、ＰＴ０９については２５％である（ＳＭＯコピー数は４である）。変異型ヌクレオチドの取り込みは、全ての治療前サンプルにおけるピロシーケンスアッセイのバックグラウンドレベル（＜５％）の範囲内にあるとみなされた。四重アッセイからのデータを血液コントロールに対してプロットする。エラーバーは、データの範囲を表す。
【図８Ｅ−Ｆ】図８Ｅは、治療前及び治療後の生検におけるＳＭＯ変異の有病率を示す棒グラフである。棒グラフは、ピロシーケンスによって決定される、ＰＴ１１（８Ｅ）についてのＳＭＯ−Ｌ４１２Ｆに相当する位置での野生型（青）又は変異型（赤）ヌクレオチドの取り込み頻度を示す。ＳＭＯ変異はヘテロ接合性であることが予期され、ＳＭＯのコピー数は、最大Ｙ軸値を決めることに留意されたい。このコピー数は、ＰＴ０３、ＰＴ０４、ＰＴ１２、ＰＴ１０及びＰＴ１１のために５０％であり（ＳＭＯコピー数は２である）、ＰＴ０９については２５％である（ＳＭＯコピー数は４である）。変異型ヌクレオチドの取り込みは、全ての治療前サンプルにおけるピロシーケンスアッセイのバックグラウンドレベル（＜５％）の範囲内にあるとみなされた。四重アッセイからのデータを血液コントロールに対してプロットする。エラーバーは、データの範囲を表す。図８Ｆは、初期にビスモデギブに対して応答したが、その後示された期間後に再発したＰＴ１１からの局所的に進行したＢＣＣ（白矢印）の写真を示す。
【図９】図９は、ＳＭＯのタンパク質ドメイン内における治療未経験ＢＣＣ（薄い灰色‐Ｓ２７８Ｉ）、耐性ＢＣＣ（黒）又は両方（薄い灰色−Ｌ４１２Ｆ、Ｗ５３５Ｌ）で同定された変異の位置を示す概略図である。アスタリスクは、以前に報告された発癌性変異を強調するものである。ＴＭヘリックスは、円筒によって表される。
【図１０Ａ−Ｃ】図１０Ａは、ＳＭＯ（灰色）に結合する結合ビスモデギブ（黄色）のトップダウン図を示し、かつ、薬剤結合ポケットにＷ２８１、Ｖ３２１及びＩ４０８（全て緑色）が近いこと明らかにする計算ドッキングモデルを示す。図１０Ｂの左は、ビスモデギブ（黄色）を基準にしたＶ３２１及びＷ２８１（両方とも緑色）の位置を示す。図１０Ｂの中央は、ＰＴ０２からのＣ２８１変異体がおそらくビスモデギブとの相互作用を破壊することを示す。図１０Ｂの右は、ＰＴ０９からのＭ３２１変異体がＷ２８１の立体構造に影響を与えることが予期されることを示す。図１０Ｃは、Ｉ４０８（左）からバリン（右）への変異がＨ４７０及びＶ４０４（これらは両方はビスモデギブと相互作用する）のパッキングに影響を与えることが予測されることを示す。この変異は、全体のタンパク質骨格構造のさらに大きな変化を引き起こし、ひいては第２シェル効果により薬剤結合中に影響を及ぼす場合がある。全てのパネルにおいて、変異残留物を赤字で強調している。
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａは、示されたＳＭＯ構築物をトランスフェクトしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるＧｌｉルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。値はＳＭＯ−ＷＴの活性に対して正規化されたものであり、プロットしたデータは、３回の平均値±ＳＤである。図１１Ｂは、示されたＰＴＣＨ１対ＳＭＯ発現構築物比でトランスフェクトされたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるＧｌｉルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。値はＰＴＣＨ１共トランスフェクションなしの活性に対して正規化されたものであり、プロットしたデータは、３回の平均値±ＳＤである。
【図１１Ｃ−Ｄ】図１１Ｃは、ＨＥＫ−２９３細胞内におけるＳＭＯ薬剤結合ポケット変異体の細胞表面発現を示す表である。示された値は、１００００個の細胞の事象について及び空ベクタートランスフェクト細胞及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でゲートしてＦＡＣＳによって決定されるときのＳＭＯの細胞表面発現を有する生存細胞のパーセンテージである。図１１Ｄは、ＳＨＨと共に又はＳＨＨなしで培養された非形質導入（ウイルスなし）、コントロールウイルス（ｔＲＦＰのみ）又はＣｒｅウイルス（ｔＲＦＰ−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰｃｒｅ）感染患者の小脳顆粒ニューロン前駆細胞のメチル−［３Ｈ］−チミジン取り込みからの結果を示すグラフである。メチル−［３Ｈ］−チミジン取り込みを、１分当たりのカウントで表し（ＣＰＭ）、そしてプロットされたデータは３回の平均値±のＳＤである。
【図１１Ｅ−Ｆ】図１１Ｅは、１００００万個の細胞事象について及び非形質細胞でゲートしてＦＡＣＳにより決定される、示されたウイルス構築物による感染後にｔｄＴｏｍａｔｏの発現について陽性であるＰｔｃｈ１ｌｏｘｐ／ｌｏｘＰ  Ｔｐ５３ｌｏｘｐ／ｌｏｘＰ  Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＰＰＴ）小脳顆粒ニューロン前駆細胞（ＣＧＮＰ）のパーセンテージを示す棒グラフである。図１１Ｆは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってパネルＥからのＰＰＴ  ＣＧＮＰにおけるヒトＳＭＯ  ｍＲＮＡレベルの定量化を示す棒グラフである。データは、マウスハウスキーピング遺伝子ＲＰＬ１９に対する２ΔＣｔ値であり、３回の平均±ＳＤとしてプロットされる。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａは、ビスモデギブによる用量応答後における、ＳＭＯ構築物がトランスフェクトされたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞における正規化Ｇｌｉルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。値は、未処理の活性に対して正規化され、プロットしたデータは、３回の平均値±標準偏差（ＳＤ）である。ＩＣ５０値は、非線形回帰フィッティング後に算出された。図１２Ｂは、示されたＭＯ構築物がトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞へのビスモデギブ−［3Ｈ］の結合を示す棒グラフである。ＥＶは、空のベクターを意味し、薬剤結合を１分当たりカウント測定した（ｃｐｍ）。特異的結合を、全結合から非特異的結合を減算することにより、過剰量での非標識ビスモデギブとの拮抗後に算出した。示したデータは、平均値±ＳＤである。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、一次ＣＧＮＰのウイルス形質導入スキームを示す図である。ＳＨＨの不在下では形質導入ＣＧＮＰのみが増殖し、これにより、ＳＭＯ変異体がビスモデギブの存在下での増殖を促進する能力を具体的に試験することが可能となる。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、ＳＨＨリガンド除去後のビスモデギブによる用量応答の後における、示されたウイルスがトランスフェクトされたＰＰＴ  ＣＧＮＰの正規化メチル−［３Ｈ］−チミジンの取り込みを示す一連のグラフである。各グラフは、同じコントロールデータを示す。プロットされたデータは、３回の平均値±ＳＤである。
【図１３Ａ−Ｃ】図１３Ａは、２１残基（濃い灰色の球形）の合計がＳＭＯ  ＴＭ構造（灰色ヘリックス）に結合したビスモデギブ（薄い灰色の球形）の４．５Å内に原子を有することが予測されることを示すモデルである。図１３Ｂは、Ｎ２１９、Ｄ３８４及びＳ３８７が水素結合ネットワーク（破線）を形成することを示すモデルである。これらの残基のいずれかの変異は、ビスモデギブ結合ポケットの形状を変化させる可能性がある。図１３Ｃは、示されたＳＭＯ構築物がトランスフェクトされかつ１μＭのビスモデギブで処理されたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるＧｌｉ−ルシフェラーゼレポーター活性を示す。値は、各構築物について未処理の活動レベルに正規化されたものであり、プロットされたデータは３回の平均±ＳＤである。
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａは、ＳＭＯ  ＴＭ領域（灰色のらせん、Ｗａｎｇ外，２０１３）の結晶構造にドッキングされたビスモデギブ（薄い灰色の球形）の計算モデルを示す。薬剤結合ポケットに対して遠位の変異体残基は濃い灰色で強調されている。図１４Ｂは、示されたＳＭＯ構築物がトランスフェクトされたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞におけるＧｌｉルシフェラーゼレポーター活性の結果を示す棒グラフである。値はＳＭＯ−ＷＴの活性レベルに対して正規化されたものであり、プロットされたデータは３回の平均値±ＳＤである。
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａは、ビスモデギブによる用量応答後における、示されたＳＭＯ構築物をトランスフェクトしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞における正規化Ｇｌｉルシフェラーゼレポーター活性を示すグラフである。プロットされたデータは、３回の平均値±ＳＤである。図１５Ｂは、示されたＳＭＯ構築物をトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３細胞への［3Ｈ］−ビスモデギブの結合を示す棒グラフである。非トランスフェクト細胞（ＵＮ）及び空ベクター（ＥＶ）がトランスフェクトされた細胞をコントロールとして含めた。薬剤結合を１分当たりのカウント（ｃｐｍ）で測定し、そして特異的結合を、総結合から非特異的結合を引くことにより、過剰の非標識ビスモデギブの競合後に算出した。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＨＥＫ−２９３細胞における活性化ＳＭＯ変異体の細胞表面発現を示す表である。示される値は、１００００個の細胞事象についてのＦＡＣＳ及び空ベクタートランスフェクト細胞及びＰＩでのゲート化によって決定されるときのＳＭＯの細胞表面発現を有する生存細胞のパーセンテージである。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ＳＨＨリガンドを除去した後のビスモデギブによる用量応答後における、示されたウイルスがトランスフェクトされたＰＰＴ  ＣＧＮＰの正規化メチル−［3Ｈ］−チミジン取り込みを示すグラフである。プロットされたデータは、３回の平均値±ＳＤである。２回の独立した実験を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、様々なＳＭＯ変異体がトランスフェクトされかつ示された化合物５００ｎＭで処理されたＰＰＴ  ＣＧＮＰの正規化メチル−［3Ｈ］−チミジン取り込みを示す。評価した各野生型（ＷＴ）又はＳＭＯ変異体のデータのセットについて、次の処理条件のそれぞれのデータを左から右に次の順序でバーとして示す：ビスモデギブ、ＬＹ２９４０６８０、ＬＤＥ２２５及び化合物５。値を、薬剤なしの増殖レベルに正規化し、プロットされたデータは、３回の平均値±ＳＤである。薬剤の存在下でのＳＭＯ−ＷＴの残留増殖は、これらの一次ＣＧＮＰ培養の線維芽細胞及びグリア汚染によるものであることに留意されたい。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、図１６Ａと同じデータを示すが、ただし、導入ＣＧＮＰをビスモデギブ又はＪＱ１のいずれかの１μＭで処理した。ＪＱ１を有するＳＭＯ−ＷＴでは、残留増殖が少ないが、これは、この化合物もＨｈ非依存性細胞増殖を阻害することを示唆することに留意されたい。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
詳細な説明
ヘッジホッグ依存性腫瘍のための化学療法に対する耐性に関連する変異事象が、シクロパミン及びＧＤＣ−０４４９などのヘッジホッグシグナル伝達を阻害する化合物による治療に対する腫瘍の耐性を与える平滑化（ＳＭＯ）で生じることが本発明の発見である。本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達に依存する癌についての予後、診断及び治療薬として有用な組成物及び方法を提供する。
【００８６】
ここで説明する又は参照する技術及び手順は、一般的によく理解されており、かつ、当業者により従来の方法、例えば次に記載された広く利用されている方法を用いて一般的に使用される：Ｓａｍｂｒｏｏｋ外，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，外著，（２００３））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ著（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ著，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著，（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ著，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ著，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）著，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ及びＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ及びＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ著，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ及びＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ著．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ及びＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ著，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ外著，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ外著，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ及びＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．著，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ及びＣ．Ｄｅａｎ著，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  Ａ���ｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ及びＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ著，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；並びにＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ外著，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）。引用した参考文献は、その全体が参考として援用される。
【００８７】
本明細書を解釈する目的のために、次の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆も同様である。以下に示す任意の定義が参照により援用される任意の刊行物と矛盾する場合には、以下に示す定義が優先するものとする。
【００８８】
本発明をさらに詳細な説明を継続する前に、本発明は、特定の組成物又はプロセス工程に限定されず、それ自体変更可能であると解すべきである。本明細書及び特許請求の範囲で使用するときに、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に指示しない限り、複数の対象を含むことに留意しなければならない。
【００８９】
特に定義しない限り、ここで使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業が一般的に理解するのと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ;Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ;ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは本発明で使用される用語の多くの一般的な辞書となる。
【００９０】
アミノ酸は、ここでは、それらの一般に知られている３文字記号によって又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される１文字記号によって言及する場合がある。同様に、ヌクレオチドは、一般的に受け入れられている１文字コードにより言及する場合がある。
【００９１】
ここで、ここで使用されるときに、「及び／又は」は、他のものと共に又は他のものなしに２つの特定の特徴又は成分のそれぞれの特定の開示として解釈すべきことを指摘することが好都合である。「Ａ及び／又はＢ」は、例えば、それぞれが個別に本明細書に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの特定の開示であると解釈すべきである。
【００９２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体をいうために本明細書において区別なく使用される。これらの用語は、１種以上のアミノ酸残基が対応する天然型アミノ酸の人工化学的模倣体並びに天然アミノ酸重合体及び非天然アミノ酸重合体であるアミノ酸重合体に適用される。本明細書で使用するときに、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」には、少なくとも、ここに記載される変異型ＳＭＯタンパク質、その変異体又はそのフラグメントのいずれかが包含される。
【００９３】
ここで、用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、かつ、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２種のインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）及び抗体フラグメントをカバーするが、ただし、これらのものが所望の生物学的活性を示す場合に限る。
【００９４】
「単離」抗体とは、その自然環境の成分から同定されかつ分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体についての研究、診断又は治療用途を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を挙げることができる。いくつかの態様では、抗体は、例えば、ローリー法で決定されるときに、（１）抗体の９５重量％超まで、いくつかの実施形態では、９９重量％超まで精製され；（２）例えば、スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度にまで精製され、或いは（３）例えば、クマシーブルー又は銀染色を使用して還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製される。単離抗体は、組換え細胞内におけるｉｎ  ｓｉｔｕ抗体を含む。というのは、抗体の自然環境の少なくとも１種成分は存在しないからである。しかしながら、通常は、単離抗体は少なくとも１回の精製工程により調製される。
【００９５】
「天然抗体」は、通常、２個の同一の軽（Ｌ）鎖及び２個の同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、１個の共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。また、各重鎖及び軽鎖は、規則的に間隔の開いた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶH）を有し、それに多数の定常ドメインが続く。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶL）及び他方の末端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖と重鎖可変ドメインと間の境界を形成すると考えられている。
【００９６】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインをいう。重鎖の可変ドメインを「ＶＨ」ということができる。軽鎖の可変ドメインを「ＶＬ」ということができる。これらのドメインは、一般に抗体の最も可変的な部分であり、かつ、抗原結合部位を含む。
【００９７】
用語「可変」とは、可変ドメインの所定の部分が抗体間において配列の点で広範囲に異なり、かつ、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性の点で使用されることを意味する。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布しているわけではない。このものは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方において高頻度可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのさらに高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖可変ドメインは、それぞれ、βシート構造の一部を連結する、場合によってはループを形成する３つのＨＶＲにより結合した、大きくβシート構造を採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖内におけるＨＶＲは、ＦＲ領域によって近接して共に保持され、かつ、他の鎖からのＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ外，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与といった様々なエフェクター機能を発揮する。
【００９８】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプの一方に分類できる。
【００９９】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）は異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1及びＩｇＡ2に分割できる。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。免疫グロブリンのサブユニット構造及び異なるクラスの三次元構造は周知であり、一般に、例えば、Ａｂｂａｓ外．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ.Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第４版．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．，２０００）に記載されている。抗体は、抗体と１種以上の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合又は非共有結合によって形成される大きな融合分子の一部であることができる。
【０１００】
ここでは、用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、その実質的に無傷の形態の抗体をいうために区別なく使用され、以下に定義される抗体フラグメントをいうものではない。これらの用語は、特にＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【０１０１】
本明細書の目的上、「裸の抗体」とは、細胞傷害性部分又は放射性標識には結合していない抗体のことである。
【０１０２】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部を含み、いくつかの実施形態では、その抗原結合領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【０１０３】
抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合フラグメントを、それぞれ単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメント及び残りの「Ｆｃ」フラグメントが生じ、それらの名称は、容易に結晶化するその能力を反映している。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、かつ、依然として抗原を架橋することが可能なＦ（ａｂ’）2フラグメントが生じる。
【０１０４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。一実施形態では、二本鎖Ｆｖ種は、堅固な非共有結合での１個の重鎖と１個の軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１本の重鎖及び１本の軽鎖可変ドメインは、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合でき、それによって軽鎖及び重鎖は、２本鎖Ｆｖ種と類似の「二量体」構造に会合できる。それは、この配置では、各可変ドメインの３つのＨＶＲは、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を決定するように相互作用する。集合的に、６個のＨＶＲが抗体に対する抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３個のみのＨＶＲを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識しかつ結合させる能力を有するが、ただし結合部位全体よりも低い親和性である。
【０１０５】
Ｆａｂフラグメントは、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、また軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１個以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によりＦａｂフラグメントとは相違する。ここで、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する命名である。Ｆ（ａｂ’）2抗体フラグメントは、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学結合も知られている。
【０１０６】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインと間に、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にするポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈuｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ,ｖｏｌ.１１３,Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
【０１０７】
用語「ダイアボディ」は、２個の抗原結合部位を有する抗体フラグメントであって、そのフラグメントが同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内における軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むものをいう。同じ鎖上にある２つのドメイン間での対形成を可能にする非常に短いリンカーを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成し、かつ、２つの抗原結合部位を創り出す。ダイアボディは、二価又は二重特異性であることができる。ダイアボディは、より完全には、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Ｈｕｄｓｏｎ外，Ｎａｔ.Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）。また、トリアボディ及びテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ外，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【０１０８】
本明細書で使用するときに、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいう、すなわち、集団を構成する個々の抗体が可能な変異、例えば少量で存在する場合のある天然型変異を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の特徴を別個の抗体の混合物ではないものと示す。所定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的を結合させるポリペプチド配列を含む抗体を含み、その際、該標的に結合するポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合の選択を含む方法によって得られた。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールといった、複数のクローンからの独特のクローンの選択であることができる。選択された標的結合配列をさらに変更して、例えば、標的に対する親和性を改善させ、標的結合配列をヒト化し、細胞培養におけるその産生を改善し、生体内でのその免疫原性を低減させ、多重特異性抗体を生成すること、そして改変された標的結合配列を含む抗体もこの開示のモノクローナル抗体であることを理解すべきである。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらのものが典型的には他の免疫グロブリンによって汚染されないという点で有利である。
【０１０９】
修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法（例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏ外，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５），Ｈａｒｌｏｗ外，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ外，：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）），ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｏｄｓ（例えば米国特許第４，８１６，５６７号），ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えばＣｌａｃｋｓｏｎ外，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）；及びＬｅｅ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）並びにヒト免疫グロブリン遺伝子座又はヒト免疫グロブリン配列をコード遺伝子の一部又は全てを有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生するための技術を含めた様々な技術（例えばＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ外，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ外，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；ａｎｄ  ５，６６１，０１６；Ｍａｒｋｓ外，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ外，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ外，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；及びＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）によって作製できる。
【０１１０】
ここで、モノクローナル抗体には、特に「キメラ」抗体が含まれる。重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一又は相同である一方で、鎖の残りは別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応配列並びにこのような抗体のフラグメントと同一又は相同であるが、ただし、それらのものが所望の生物活性を示す場合に限る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。キメラ抗体としては、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が挙げられる。抗体の抗原結合領域が、例えば目的の抗原でマカクザルを免疫化することによって産生される抗体に由来する。
【０１１１】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。一実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、該レシピエントのＨＶＲ由来の残基は、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲ由来の残基によって置換されている。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体性能をさらにさらに改良するために行うことができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、その際、超可変ループの全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、そしてＦＲの全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。また、ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部も含む。詳細については、Ｊｏｎｅｓ外，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ外，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）参照。また、例えばＶａｓｗａｎｉ  ａｎｄ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１０５−１１５（１９９８）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ２３：１０３５−１０３８（１９９５）；Ｈｕｒｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８−４３３（１９９４）；並びに米国特許第６，９８２，３２１号及び同７，０８７，４０９号参照。
【０１１２】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に相当する及び／又はここに開示されるヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製されたアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含めた当該技術分野において公知の様々な技術を使用して生成できる。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．,２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ外,Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．,２２２：５８１（１９９１）。また、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用できるのは、Ｃｏｌｅ外，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７（１）：８６−９５（１９９１）に記載された方法である。また、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５：３６８−７４（２００１）も参照されたい。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してこのような抗体を産生するように改変されているが、ただしその内因性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫ゼノマウスに抗原を投与することにより調製できる（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては米国特許第６０７５１８１号及び同６１５０５８４号を参照）。例えば、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されたヒト抗体についてはＬｉ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）も参照されたい。
【０１１３】
本明細書で使用されるときに、用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」は、配列において高頻度可変であり及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域をいう。一般に、抗体は、６個のＨＶＲを含み；ＶＨにおいて３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）において３つ。ネイティブ抗体では、Ｈ３及びＬ３は、６つのＨＶＲの最多様性を示し、特にＨ３は、抗体に良好な特異性を与える際に独自の役割を果たしていると考えられる。例えば、Ｘｕ外，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ著，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）参照。実際、重鎖からなる天然型ラクダ抗体のみが軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ外，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）；Ｓｈｅｒｉｆｆ外，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）参照。多数のＨＶＲの描写の数が使用されており、かつ、ここに含まれる。カバット相補性決定領域（ＣＤＲ）は配列可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔ外，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。コチアは構造的ループの場所に代わりに言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂｍのＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループとの間の妥協を表し、かつ、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
【０１１４】
ループ    Ｃ      接触  
−−−−  −−−−−−−−
Ｌ１      ＬＬＬ    Ｌ３０−Ｌ３６
Ｌ２      ＬＬＬ    Ｌ４６−Ｌ５５
Ｌ３      ＬＬＬ    Ｌ８９−Ｌ９６
Ｈ１      Ｈ３１−Ｈ３５Ｂ      Ｈ２６−Ｈ３５Ｂ      Ｈ    Ｈ３０（Ｋａｂａｔ番号付け）
Ｈ１      ＨＨＨ    Ｈ３０（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け）
Ｈ２      ＨＨＨ    Ｈ４７−Ｈ５８
Ｈ３      Ｈ９５−Ｈ１０２      Ｈ９５−Ｈ１０２      Ｈ９  Ｈ９３−Ｈ１０１
【０１１５】
ＨＶＲは、次のように「拡張ＨＶＲ」を含むことができる。ＶＬにおける２４−３６又は２４−３４（Ｌ１）、４６−５６又は５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７又は８９−９６（Ｌ３）及びＶＨにおける２６−３５（Ｈ１）、５０−６５又は４９−６５（Ｈ２）及び９３−１０２、９４−１０２又は９５−１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについてＫａｂａｔ外（前出）に従って番号が付けられている。
【０１１６】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、ここに定義されるようなＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【０１１７】
用語「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」又は「Ｋａｂａｔのようなアミノ酸位置番号付け」及びそれらの変形は、Ｋａｂａｔ外（前出）における抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインのために使用される番号付けシステムをいう。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＨＶＲの短縮又はそれへの挿入に相当する、より少ない又は追加のアミノ酸を含有することができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従って残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えばＫａｂａｔに従って残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含むことができる。残基のＫａｂａｔ番号付けは、配列の相同領域で、抗体と「基準」カバット番号付け配列とをアライメントすることによって所定の抗体について決定できる。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、可変ドメイン内の残基に言及するときに一般に使用される（おおよそ軽鎖の残基１−１０７及び重鎖の残基１−１１３）（例えば、Ｋａｂａｔ外，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．第５版．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及するときに一般に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ外前出で報告されたＥＵインデックス）。
【０１１８】
「親和性成熟」抗体とは、その１個以上のＨＶＲに１以上の変化を有するものであり、これは、該変化を有しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。一実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又はさらにはピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該技術分野で知られている所定の手順を使用して生成できる。例えば、Ｍａｒｋｓ外，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）には、ＶＨ及びＶＬドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、に記載されている。Ｂａｒｂａｓ外.Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３（１９９４）；Ｓｃｈｉｅｒ外.Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５（１９９５）；Ｙｅｌｔｏｎ外.Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１５５：１９９４−２００４（１９９５）；Ｊａｃｋｓｏｎ外．，Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１５４（７）：３３１０−９（１９９５）；及びＨａｗｋｉｎｓ外，Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.２２６：８８９−８９６（１９９２）に記載されている。
【０１１９】
「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体とは、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害又は減少させるものである。所定のブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。
【０１２０】
本明細書で使用するときに、「アゴニスト抗体」は、目的のポリペプチドの機能的活性の少なくとも１つを部分的に又は完全に模倣する抗体である。
【０１２１】
「成長阻害」抗体とは、抗体が結合する抗原を発現する細胞の増殖を阻害又は減少させるものである。例えば、抗体は、Ｓｍｏ又は変異体を試験管内又は生体内で発現させる癌細胞の増殖を阻害又は減少させることができる。
【０１２２】
「アポトーシスを誘導する」抗体とは、アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞フラグメント化及び／又は膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成といった標準的なアポトーシスアッセイにより決定されるようなプログラム細胞死を誘導するものである。
【０１２３】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域又はアミノ酸配列変異Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性をいい、抗体アイソタイプにより変わる。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞仲介細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；及びＢ細胞の活性化が挙げられる。
【０１２４】
本明細書において、用語「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含めて、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は異なる場合があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から又はＰｒｏ２３０からカルボキシル末端にまで伸長するように定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムに係る残基４４７）は、例えば、抗体の産生又は精製中に又は組換え抗体の重鎖をコードする核酸を操作することによって除去できる。したがって、インタクトな抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団及びＫ４４７残基を有する抗体と該残基を有しない抗体との混合物を有する抗体集団を含むことができる。
【０１２５】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。代表的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーションなどが挙げられる。このようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合するＦｃ領域を必要とし、例えば本明細書における定義で開示されているような様々なアッセイを使用して評価できる。
【０１２６】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域としては、天然配列ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２のＦｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３のＦｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４のＦｃ領域並びにそれらの天然型変異体が挙げられる。
【０１２７】
「変異型Ｆｃ領域」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾、いくつかの実施形態では１つ以上のアミノ酸置換によって天然配列Ｆｃ領域とは相違するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において約１〜約１０のアミノ酸置換、いくつかの実施形態では約１〜約５のアミノ酸置換を有する。変異型Ｆｃ領域は、本明細書のいくつかの実施形態では、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、いくつかの実施形態ではそれと少なくとも約９０％の相同性、いくつかの実施形態ではそれと少なくとも約９５％の相同性を有する。
【０１２８】
「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは天然ヒトＦｃＲである。いくつかの実施形態では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合し、かつ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含むものであり、対立遺伝子変異体及びそれらの受容体の選択的スプライシング型が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体としては、主として細胞質ドメインの点で異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害重合体」）が挙げられる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（例えば、Ｄａeｒｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：２０３−２３４（１９９７））。ＦｃＲは、例えばＲａｖｅｔｃｈ及びＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ外，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ外，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）で検討されている。将来的に同定されるべきものを含めて、他のＦｃＲは、本明細書にける用語「ＦｃＲ」に包含される。
【０１２９】
また、用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、新生児受容体ＦｃＲｎを含み、これは、母性ＩｇＧから胎児への移行（Ｇｕｙｅｒ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））及び免疫グロブリンの恒常性の調節を担当する。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法が知られている（例えば、Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １８（１２）：５９２−５９８（１９９７）；Ｇｈｅｔｉｅ外，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５（７）：６３７−６４０（１９９７）；Ｈｉｎｔｏｎ外，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（８）：６２１３−６２１６（２００４）；ＷＯ２００４／９２２１９（Ｈｉｎｔｏｎ外参照）。
【０１３０】
生体内でのヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトヒト細胞株又は変異型Ｆｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類においてアッセイできる。ＷＯ２０００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）には、ＦｃＲへの結合が改善又は減少した抗体変異体が記載されている。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ外．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照。
【０１３１】
「ヒトエフェクター細胞」とは、１種以上のＦｃＲを発現し、かつ、エフェクター機能を実行する白血球のことである。所定の実施形態では、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球が挙げられる。エフェクター細胞は、天然源、例えば血液から単離できる。
【０１３２】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」とは、細胞毒性の形態をいう。所定の細胞傷害性細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（のＦｃＲ）上に結合した分泌Ｉｇがこれらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原保持標的細胞に特異的に結合させ、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させるのを可能にする。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を仲介する主要な細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の第４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、例えば、米国特許第５，５００，３６２号若しくは同５，８２１，３３７号又は米国特許第６，７３７，０５６（Ｐｒｅｓｔａ）に記載されているような生体内ＡＤＣＣアッセイを実行してもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、ＰＢＭＣ細胞及びＮＫ細胞が挙げられる。その代わりに又はそれに加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ外ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて生体内で評価してもよい。
【０１３３】
「補体依存性細胞障害」又は「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解をいう。従来の補体経路の活性化は、同族抗原に結合している抗体（適切なサブクラスの）に補体系（Ｃ１ｑ）の第一成分を結合させることによって開始される。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されているようなＣＤＣアッセイを実施することができる。改変Ｆｃ領域のアミノ酸配列及び増加若しくは減少したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチド変異体（変異体Ｆｃ領域を有するポリペプチド）は、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号及びＷＯ１９９９／５１６４２号に記載されている。また、例えばＩｄｕｓｏｇｉｅ外．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照されたい。
【０１３４】
用語「Ｆｃ領域含有抗体」とは、Ｆｃ領域を含む抗体をいう。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７）は、例えば、抗体の精製中又は抗体をコードする核酸の組換え技術によって除去できる。したがって、本発明に係るＦｃ領域を有する抗体を含む組成物は、Ｋ４４７を有する抗体、Ｋ４４７が全て除去された抗体又はＫ４４７残基を有する抗体と該残基を有しない抗体との混合物を含むことができる。
【０１３５】
「結合親和性」とは、一般に、分子（例えば抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強さをいう。特に断りのない限り、本明細書で使用するときに、「結合親和性」とは、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性をいう。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、本明細書に記載されたものを含めて、当該技術分野において知られている一般的な方法によって測定できる。低親和性抗体は、一般に抗原にゆっくりと結合し、かつ、容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は、一般にそれよりも速く抗原に結合し、かつ、長く結合した状態が維持される傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で知られており、それらのいずれも本発明の目的のために使用できる。結合親和性を測定するための特定の例示的及び代表的な実施形態を以下に説明する。
【０１３６】
一実施形態では、本発明に係る「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、次のアッセイで説明されるように、目的の抗体のＦａｂバージョンとその抗原を用いて実施される放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、非標識抗原の滴定系列の存在下で、最小濃度の（125Ｉ）標識抗原でＦａｂを平衡化し、その後結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体コートプレートで捕捉することによって測定される（例えばＣｈｅｎ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）参照）。アッセイの条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（サーモサイエンティフィック社）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中捕獲用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）の５μｇ／ｍｌで一晩被覆し、その後ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンにより室温で２〜５時間（約２３℃）にわたりブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）において、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［125Ｉ］−抗原を目的のＦａｂ連続希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体Ｆａｂ−１２の評価と一致）。所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、このインキュベーションは、平衡に到達するのを確保するためにさらに長期間（例えば、約６５時間）継続できる。その後、混合物を室温でインキュベート捕捉プレートに移す（例えば１時間）。次いで、溶液を除去し、そしてプレートをＰＢＳ中０．１％ＴＷＥＥＮ−２０（商標）で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μＬ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ社）を添加し、そしてプレートを１０分間ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ社）でカウントする。２０％以下の最大結合を与えるそれぞれのＦａｂの濃度を、拮抗結合アッセイで使用するために選択する。
【０１３７】
別の実施形態によれば、Ｋｄ又はＫｄ値は、固定された抗原ＣＭ５チップと共に２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ビアコア社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して表面プラズモン共鳴アッセイを用いて〜１０応答単位（ＲＵ）で測定される。簡単にいうと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ社）を供給者の指示に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を５μＬ／分の流速で注入する前に１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）まで希釈して結合タンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成する。抗原の注入後に、１Ｍエタノールアミンを注入して未反応群をブロックする。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を約２５μｌ／分の流速で２５℃で０．０５％ＴＷＥＥＮ−２０（商標）界面活性剤（ＰＢＳＴ）と共にＰＢＳに注入する。会合速度（ｋon）及び解離速度（ｋoff）を、会合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、単純な１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）を、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Ｃｈｅｎ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）参照。ｏｎ速度が上記表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ-1ｓ-1を超える場合には、ｏｎ速度は、分光光度計、例えばストップフロー装備分光光度計（テルアビブインスツルメンツ社）又は撹拌キュベットを有する８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ社）で測定されるときの増加濃度の抗原の存在下でＰＢＳ中ｐＨ７．２において２５℃で２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の蛍光発光強度の増加又は減少を測定する（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）蛍光消光技術を使用することによって決定できる。
【０１３８】
また、本発明に係る「ｏｎ速度」、「会合の速度」、「会合速度」又は「ｋon」は、上記のようにＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００システム（ビアコア社、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して決定できる。
【０１３９】
本明細書で使用するときに、用語「実質的に同様」又は「実質的に同一」とは、２つの数値（例えば、本発明の抗体に関連する一方及び基準／比較抗体に関連する他方）間の類似性の程度が十分に高く、そのため、当業者が、該２つの値の間の差が該値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特性の文脈内でほとんど又は全く生物学的及び／又は統計的に有意でないと見なすであろうことをいう。該２つの値間の差は、例えば、基準／比較値に応じて約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満及び／又は約１０％未満である。
【０１４０】
本明細書で使用するときに、用語「実質的に減少」又は「実質的に異なる」とは、２つの数値（一般に分子に関連する一方及び基準／比較分子に関連する他方）間の類似性の程度が十分に高く、そのため、当業者が、該２つの値の間の差が該値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特性の文脈内で統計的に有意なものと見なすであろうことをいう。該２つの値間の差は、例えば、基準／分子に応じて約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超及び／又は約５０％超である。
【０１４１】
「精製（された）」とは、分子がサンプル中においてそれが含まれるサンプルの少なくとも９５重量％又は少なくとも９８重量％の濃度で存在することを意味する。
【０１４２】
「単離（された）」核酸分子とは、例えばその天然の環境中において通常関連のある少なくとも１種の他の核酸分子から分離された核酸分子である。単離核酸分子は、通常核酸分子を発現する細胞に含まれる核酸分子をさらに含むが、該核酸分子は、染色体外に存在する又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【０１４３】
「単離（された）」タンパク質は、例えばその天然の環境中において通常関連する少なくとも１種の他の細胞成分から分離されたタンパク質である。いくつかの実施形態では、「単離」タンパク質は、そのタンパク質が通常は発現されない細胞内で発現したタンパク質である。いくつかの実施形態では、単離タンパク質は組換えタンパク質である。
【０１４４】
本明細書で使用するときに、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送できる核酸分子をいうものとする。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡをいう。別のタイプのベクターはファージベクターである。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができるウイルスベクターである。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製可能である（例えば、複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製する。さらに、所定のベクターは、それらが機能的に連結される遺伝子の発現を指示することができる。本明細書においては、このようなベクターを「組換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」という。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミド形態の場合が多い。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は区別なく使用する場合がある。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態だからである。
【０１４５】
本明細書において区別なく使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、任意の長さのヌクレオチドの重合体をいい、ＤＮＡ及びＲＮＡを包含する。いくつかの実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡ分子又はそのフラグメントである。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは塩基、及び／又はそれらのアナログ、或いはＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼにより又は合成反応により重合体中に組み込むことができる任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログなどを含むことができる。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾は、重合体の形成前又は後に付与できる。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識への結合などの合成後になされる修飾を含むことができる。他のタイプの修飾としては、例えば、アナログによる天然型ヌクレオチドの１種以上の「キャップ」置換、ヌクレオチド内修飾、例えば、非荷電結合を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、カルバメートなど）及び荷電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）、ペンダント部分を含有するもの、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、インターカレーターを有するもの（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤を有するもの（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）、アルキル化剤を含有するもの、修飾結合を有するもの（例えば、αアノマー核酸など）並びにポリヌクレオチドの未修飾形態が挙げられる。さらに、糖類中に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換されていてよく、標準的な保護基によって保護されていてよく又は追加のヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されていてよく、又は固体若しくは半固体支持体に結合されていてよい。５’及び３’末端ＯＨは、リン酸化でき又はアミン若しくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換できる。また、他のヒドロキシルを標準的な保護基に誘導体化することもできる。また、ポリヌクレオチドは、当該技術分野において一般に知らされているリボース又はデオキシリボース糖のアナログ形態、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル−、２’−フルオロ−又は２’−アジドリボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース又はリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ及び塩基性ヌクレオシド、例えばアナログメチルリボシドなどを含むこともできる。１以上のホスホジエステル結合は別の連結基によって置換されていてもよい。これらの別の連結基としては、実施形態が挙げられるが、これに限定されない。ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ2（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ2（「ホルムアセタール」）（ここで、それぞれのＲ又はＲ’は、独立して、Ｈ又はエーテル（−Ｏ−）結合を含有していてよい置換若しくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。上記説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含めて、本明細書で引用される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
【０１４６】
本明細書で使用されるときに、「オリゴヌクレオチド」とは、一般的に、一般には全長約２００未満のヌクレオチドである（必須ではない）、短い概して一本鎖の一般に合成ポリヌクレオチドをいう。用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドのための上記説明は、オリゴヌクレオチドにも等しく十分に適用可能である。
【０１４７】
本明細書において区別なくに使用される用語「Ｓｍｏ」又は「ＳＭＯ」又は「平滑化」とは、特に示さない限り、霊長類（例えばヒト）及び齧歯動物（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含めて任意の脊椎動物源からの任意の天然平滑化タンパク質又は核酸をいう。この用語は、「全長」未プロセシングＳＭＯ並びに細胞内でのプロセシングにより得られるＳＭＯの任意の形態を包含する。また、この用語は、ＳＭＯの天然型変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。いくつかの実施形態では、本明細書で使用するときに、「変異型ＳＭＯ」又は「変異型ＳＭＯポリペプチド」又は「変異型ＳＭＯタンパク質」とは、ヒトＳＭＯの位置２８１でのＳＭＯの第２膜貫通に変異を有するＳＭＯ、ヒトＳＭＯの位置４０８でのＳＭＯの第５膜貫通ドメインに変異を有するＳＭＯ、ヒトＳＭＯの位置４５９でのＳＭＯの膜貫通ドメイン６に変異を有するＳＭＯ及び／又はヒトＳＭＯの位置５３３若しくは５３５でのＳＭＯの膜貫通ドメイン７に変異を有するＳＭＯをいう。いくつかの実施形態では、本明細書中で使用されるときに、「変異型ＳＭＯ」又は「変異型ＳＭＯポリペプチド」又は「変異型ＳＭＯタンパク質」とは、配列番号１の位置２８１、４０８、４１２、４５９、５３３及び／又は５３５に相当する１個以上のアミノ酸に変異を含む平滑化ポリペプチドをいう。いくつかの実施形態では、配列番号１の位置２８１、４０８、４１２、４５９、５３３及び／又は５３５に相当する１個以上のアミノ酸での変異は、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｓ５３３Ｎ及び／又はＷ５３５Ｌを含む。同様に、変異型ＳＭＯタンパク質は、野生型ヒトＳＭＯの上記位置の任意の１以上に変異を有すると記載される。本発明は、本明細書に記載の変異型ポリペプチド又は核酸のいずれかが配列識別子を基準にして説明できる又は野生型ヒトＳＭＯに関連して説明できることを意図する。さらに、変異体は、配列番号１に関連して説明でき又は他の配列識別子のいずれかに関連して説明できる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるときに、「治療」（及び「治療する」」等のバリエーション）とは、治療される個体又は細胞の自然過程を改変するための臨床的介入をいい、これは、予防のため又は臨床病理経過中に実施できる。治療の望ましい効果としては、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患若しくは障害の発症を遅らせる又は疾患若しくは障害の進行を遅らせるために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるときに、「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療される状態の１つ以上の症状の重症度を改善し、緩和し、及び／又は減少させることをいう。一例として、癌を治療するとは、進行又は発症を改善し（患者の状態を改善する）、遅延し又は遅らせる、癌の１以上の症状の重症度を低下させることをいう。例えば、癌の治療としては、次の任意の１つ以上が挙げられる：腫瘍の大きさを減少させる、腫瘍サイズ増加の速度を減少させる、サイズの増加を停止させる、転移の数を減少させる、痛みを低減させる、生存率を増加させる及び無増悪生存期間を増大させる。
【０１４９】
「治療する」又は「治療」又は「緩和」とは、治療される状態の１つ以上の症状の重症度を改善し、緩和し、及び／又は減少させることをいう。一例として、癌を治療するとは、進行又は発症を改善し（患者の状態を改善する）、遅延し又は遅らせる、癌の１以上の症状の重症度を低下させることをいう。例えば、癌の治療としては、次の任意の１つ以上が挙げられる：腫瘍の大きさを減少させる、腫瘍サイズ増加の速度を減少させる、サイズの増加を停止させる、転移の数を減少させる、痛みを低減させる、生存率を増加させる及び無増悪生存期間を増大させる。「診断」とは、疾患又は腫瘍の識別特性を同定又は決定するプロセスをいう。癌の場合には、診断の方法を、重症度又は疾患進行に基づいてステージング又は腫瘍分類として表現される場合もある。
【０１５０】
「診断」とは、疾患又は腫瘍の識別特性を同定又は決定するプロセスをいう。癌の場合には、診断の方法を、重症度又は疾患進行に基づいてステージング又は腫瘍分類として表現される場合もある。
【０１５１】
「個体」、「被験体」又は「患者」は、ヒトなどの脊椎動物である。所定の実施形態では、脊椎動物は哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜（ウシなど）、競技用動物、ペット（ネコ、イヌ、及びウマなど）、霊長類、マウス及びラットが挙げられるが、これらに限定されない。所定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１５２】
用語「医薬製剤」とは、活性成分の生物学的活性を有効とするような形態で、かつ、製剤が投与されるであろう被験体に対して許容できないほど毒性である追加の成分を全く含有しない製剤をいう。このような製剤は滅菌することができる。所定の実施形態では、医薬製剤は発熱物質を有しない。
【０１５３】
「無菌」製剤は、無菌的又は全て生微生物及びそれらの胞子を含まない。「有効量」とは、用量及び必要な期間にわたって所望の治療的又は予防的結果を達成するのに有効な量をいう。
【０１５４】
本発明の物質／分子の「治療有効量」は、所望の応答を誘発するために、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重並びに物質／分子の能力などの要因に応じて変化する場合がある。治療有効量は、治療的に有益な効果が物質／分子の任意の毒性又は有害な影響を上回る量を含む。「予防有効量」とは、必要な用量及び期間にわたって所望の予防結果を達成するのに有効な量をいう。点滴的には、必ずしも必要ではないが、予防的用量は、疾患の初期段階の前又はその時に患者に使用されているため、予防有効量は治療有効量よりも少ないであろう。
【０１５５】
本明細書で使用するときに、用語「細胞毒性剤」とは、細胞の機能を阻害若しくは阻止し及び／又は細胞死若しくは破壊を生じさせる物質をいう。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他のインターカレート剤、酵素及びそのフラグメント、例えば核酸分解酵素、抗生物質、及び毒素、例えば小分子毒素又は細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素（そのフラグメント及び／又は変異体を含む）、及び以下に開示する様々な抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含することを意図する。他の細胞毒性剤を以下に記載する。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【０１５６】
「毒素」は、細胞の成長及び増殖に有害な作用を及ぼすことのできる任意の物質である。
【０１５７】
「化学療法剤」は癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホン酸塩；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ及びウレドパなどのアジリジン；エチレンイミン及びメチロールメラミン、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロールメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（登録商標））；β−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成アナログトポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログのＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムヌスチンなどのニトロソ尿素；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばＮｉｃｏｌａｏｕ外，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照）；ＣＤＰ３２３、経口α−４インテグリン阻害剤；ダイネミシンを含めてダイネミシン；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団及び関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、ミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸リポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標））、ペグリル化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなどの葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジンアナログ；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充液；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルチン；ジアジキノン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳナチュラルプロダクツ社、米国オレゴン州ユージーン）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジキノン；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン  改変ナノ粒子製剤（ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標））及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））、及びカルボプラチンなどの白金剤；チューブリン重合が微小管形成を阻害するビンカ、例えばビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標））、及びビノレルビン（ナベルビン）；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノバントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネー���；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）。レチノイン酸などのレチノイド、例えばベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））；クロドロネートなどのビスホスホネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（登録商標）又はＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロン酸（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））又はリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））。トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、及び上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、及びＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えば、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；バイエル社）；ＳＵ−１１２４８（スニチニブ、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）、ファイザー社）；ペリホシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ又はエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えばＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ベルケイド（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；オブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））などのＢｃｌ−２阻害剤；ピクサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照）；チロシンキナーゼ阻害剤（以下の定義を参照）；ラパマイシン（シロリムス、Ｒａｐａｍｕｎｅ（登録商標））などのセリン−トレオニンキナーゼ阻害剤；ロナファルニブ（ＳＣＨ  ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））などのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤；及び上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体；並びにＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾロンの併用療法の略語）などの上記の２種以上の組合せ、並びにＦＯＬＦＯＸ（５−ＦＵ及びロイコボリンと併用したオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））による治療レジメンの略語）が挙げられる。
【０１５８】
ここで定義される化学療法剤は、癌の増殖を促進する場合のあるホルモンの影響を調節し、減少させ、ブロックし又は阻害するように作用する「抗ホルモン剤」又は「内分泌治療薬」を包含する。これらのものは、ホルモン自体であってよく、混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを有する抗エストロゲン、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（エビスタ）、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＳＥＲＭ３などの選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）；フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））及びＥＭ８００などのアゴニスト特性ない純粋な抗エストロゲン（このような薬剤は、ＤＮＡ結合を阻害し、エストロゲン受容体（ＥＲ）の二量体化を遮断し、ＥＲ代謝回転を増大させ及び／又はＥＲレベルを抑制することができる）；アロマターゼ阻害剤、例えばフォルメスタン及びエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））ステロイド性アロマターゼ阻害剤並びにアナストロゾール（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））及びアミノグルテチミドなどの非ステロイド性アロマターゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されず、また、他のアロマターゼ阻害剤としては、ボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、及び４（５）−イミダゾール；黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）及びＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン及びトリプテレリン；性ステロイド、例えば酢酸メゲストロール及び酢酸メドロキシプロゲステロンなどのプロゲスチン、ジエチルスチルベストロール及びプレマリンなどのエストロゲン、並びにフルオキシメステロン、オールトランス型レチノイン酸及びフェンレチニドなどのアンドロゲン／レチノイド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤＳ）；フルタミド、ニルタミド及びビカルタミドなどの抗アンドロゲン；及び上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体；並びに上記の２種以上の組み合わせが挙げられる。
【０１５９】
本明細書で使用するときに、「増殖阻害剤」とは、試験管内又は生体内のいずれかにおいて細胞（ＳＭＯを発現する細胞など）の増殖を阻害する化合物又は組成物をいう。したがって、成長阻害剤は、Ｓ期において細胞（ＳＭＯを発現する細胞など）の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例としては、細胞周期の進行をブロックする（Ｓ期以外のところで）薬剤、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が挙げられる。従来のＭ期ブロッカーとしては、ビンカ（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンなどが挙げられる。また、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル及びａｒａ−ＣなどのＧ１を停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及する。さらなる情報は、村上外著，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ編、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，第１章，「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９５）、例えば、第１３頁にある。タキサン（パクリタキセル及びドセタキセル）は、両方ともイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ローヌ・プーランローラ社）は、パクリタキセルの半合成アナログ（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、ブリストル・マイヤーズスクイブ社）である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の集合を促進し、脱重合を阻害ことによって微小管を安定化するところ、これは、細胞の有糸分裂の阻害をもたらす。
【０１６０】
「変異型Ｓｍｏアンタゴニスト」とは、ヒトＳＭＯの２８１、４０８、４５９、５３３又は５３５位にアミノ酸置換を有するＳＭＯの生物学的活性を阻害する化合物であって、この位置での野生型アミノ酸を任意の他のアミノ酸に変化させるものをいう。いくつかの実施形態では、ＳＭＯの生物学的活性は、ヘッジホッグによる刺激に関するシグナルをＧｌｉ転写因子の活性化に伝達する能力である。
【０１６１】
本明細書で使用するときに、用語「ヘッジホッグ経路阻害剤」とは、細胞内のヘッジホッグシグナル伝達を阻害することができる薬剤をいうものとする。特定の実施形態では、ヘッジホッグアンタゴニストは、本明細書に記載される変異型ＳＭＯタンパク質のいずれかを発現する細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、配列番号１の２８１、４０８、４５９、５３３又は５３５に相当する１個以上のアミノ酸に変異を含む平滑化ポリペプチドを発現する細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害することができる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、次の変異：Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｓ５３３Ｎ及び／又はＷ５３５Ｌのいずれかを含む平滑化ポリペプチドを発現する細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害することができる。
【０１６３】
Ｉ．核酸
本発明の核酸は、単離変異型ＳＭＯコード配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ビスモデギブに対して部分的に又は完全に耐性である変異型ＳＭＯタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、ヘッジホッグシグナル伝達経路におけるタンパク質をコードする遺伝子内に追加の突然変異を有する細胞においてビスモデギブに対して部分的に又は完全に耐性である変異型ＳＭＯタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、追加の変異は、本明細書に記載されたパッチ及び／又はＳＵＦＵ突然変異のいずれかである。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列が野生型ＳＭＯアミノ酸配列の２３９位に対応するアミノ酸位置にアラニン以外のアミノ酸を含むものを提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり、かつ、該核酸が配列番号１のヌクレオチド位置２３９に相当するアミノ酸位置にアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１つの変異を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、該核酸は、配列番号１の２３９位に相当するアミノ酸位置にバリン（Ｖ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の７１５、７１６及び／又は７１７位に対応するヌクレオチド位置で親の野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の７１５、７１６及び／又は７１７位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列が野生型ＳＭＯアミノ酸配列の２８１位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含むものを提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり、かつ、該核酸が配列番号１のヌクレオチド位置２８１に相当するヌクレオチド位置にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１つの変異を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、該核酸は、配列番号１の２８１位に相当するアミノ酸位置にシステイン（Ｃ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の８４１、８４２及び／又は８４３位に対応するヌクレオチド位置で親の野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の８４１、８４２及び／又は８４３位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列が野生型ＳＭＯアミノ酸配列の４０８位に対応するアミノ酸位置にイソロイシン以外のアミノ酸を含むものを提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり、かつ、該核酸が配列番号１のヌクレオチド位置４０８に相当するアミノ酸位置にイソロイシン（Ｉ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１つの変異を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、該核酸は、配列番号１の４０８位に相当するアミノ酸位置にバリン（Ｖ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の１２２２、１２２３及び／又は１２２４位に対応するヌクレオチド位置で親の野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の１２２２、１２２３及び／又は１２２４位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列が野生型ＳＭＯアミノ酸配列の４５９位に対応するアミノ酸位置にアラニン以外のアミノ酸を含むものを提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり、かつ、該核酸が配列番号１のヌクレオチド位置４５９に相当するアミノ酸位置にアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１つの変異を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、該核酸は、配列番号１の４５９位に相当するアミノ酸位置にバリン（Ｖ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の１３５７、１３５８及び／又は１３５９位に対応するヌクレオチド位置で親の野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の１３７５、１３７６及び／又は１３７７位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列が野生型ＳＭＯアミノ酸配列の５３３位に対応するアミノ酸位置にセリン以外のアミノ酸を含むものを提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり、かつ、該核酸が配列番号１のヌクレオチド位置５３３に相当するアミノ酸位置にセリン（Ｓ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１つの変異を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、該核酸は、配列番号１の５３３位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン（Ｎ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の１５９７、１５９８及び／又は１５９９位に対応するヌクレオチド位置で親の野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の１５９７、１５９８及び／又は１５９９位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、本発明は、変異型ＳＭＯタンパク質をコードする単離核酸分子であって、該アミノ酸配列が野生型ＳＭＯアミノ酸配列の５３５位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含むものを提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり、かつ、該核酸が配列番号１のヌクレオチド位置５３５に相当するアミノ酸位置にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１つの変異を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、該核酸は、配列番号１の５３５位に相当するアミノ酸位置にロイシン（Ｌ）をコードする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の１６０３、１６０４及び／又は１６０５位に対応するヌクレオチド位置で親の野生型ＳＭＯからの少なくとも１個の変異を有する。いくつかの実施形態では、パーセント同一性は、配列番号５と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％であるが、ただし、配列番号５の１６０３、１６０４及び／又は１６０５位に相当するヌクレオチド位置には少なくとも１個の変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であり、かつ、該核酸が表４に示されたアミノ酸変化のいずれか１つ以上を含むＳＭＯポリペプチドをコードするように少なくとも１つの変異を含む配列を含む（例６参照）。
【０１６５】
また、本発明は、少なくとも２０ヌクレオチド長であるフラグメントに上記変異の領域に及ぶような核酸のフラグメントも包含する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドフラグメントは、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ヌクレオチド長である。これらのフラグメントは、全長変異型ＳＭＯコード核酸分子にまで上記変異の領域に及ぶ任意の長さとすることができる。単離された変異型ＳＭＯ及びそれらのフラグメントを、例えばハイブリダイゼーションのために使用して、本発明の予後及び診断アッセイ用並びに組換え系における発現用のプライマー及びプローブを生成することができる（例えば、その免疫原として使用するための又は本明細書に記載された本発明のアッセイで使用するための変異型ＳＭＯタンパク質又はその部分を生成することができる）。
【０１６６】
本発明は、本発明の方法で変異型ＳＭＯ核酸分子を同定するために使用できる核酸プローブを提供する。変異型ＳＭＯを有することが疑われる組織又はＳＭＯの状態が知られていない組織由来の核酸サンプルは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ外，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）に記載されるような標準的な手順を使用して変異型ＳＭＯに特異的なプローブを用いてスクリーニングできる。あるいは、ＳＭＯをコードする核酸を組織から増幅し、そして本発明の特異的プローブでプローブして変異型ＳＭＯの有無を決定することができる。ＰＣＲ法は当該分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ外，前出；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ外，ＰＣＲ  ＰＲＩＭＥＲ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）。
【０１６７】
変異型ＳＭＯをコードするヌクレオチド配列（又はそれらの相補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を含めて分子生物学の分野において及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡプローブの生成において様々な用途を有する。また、変異型ＳＭＯをコードする核酸は、本明細書に記載された組換え技術による変異型ＳＭＯポリペプチドの調製のためにも有用であり、その際、変異型ＳＭＯポリペプチドは、例えば、本明細書に記載される抗変異型ＳＭＯ抗体の調製に使用できる。
【０１６８】
完全長の変異型ＳＭＯ核酸又はその一部は、変異型ＳＭＯを同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。
【０１６９】
場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基になる。ハイブリダイゼーションプローブは、全長変異型ＳＭＯヌクレオチド配列の少なくとも変異型の領域から誘導できる。
【０１７０】
例えば、スクリーニング法は、約４０塩基の選択されたプローブを合成するために公知のＤＮＡ配列を用いて変異型ＳＭＯのコード領域を単離することを含む。ハイブリダイゼーションプローブは、様々な標識、例えば32Ｐ又は35Ｓなどの放射性ヌクレオチド又はアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼなどの酵素標識によって標識できる。本発明の変異型ＳＭＯ遺伝子と相補的な配列を有する標識プローブを使用して、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、このようなライブラリーのどれにプローブがハイブリダイズするのかを決定することができる。ハイブリダイゼーション産物は、ポリアクリルアミドゲル上で分離できる。さらに、ＳＭＯの変異は、実施例に記載された方法を使用して決定できる。中程度のストリンジェンシー及び高ストリンジェンシーを含めたハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ外（前出）に記載されている。
【０１７１】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列を比較し、そしてＳＭＯ及び変異型ＳＭＯについての既知の配列と整列させることができる。膜貫通ドメイン６のカルボキシ末端領域における第１、第２、第５、第６若しくは第７膜貫通ドメインのいずれか、又は膜貫通ドメイン７のカルボキシ末端領域での配列同一性は、当該技術分野において公知の方法を用いて決定できる。
【０１７２】
ＳＭＯコード核酸の他の有用なフラグメントとしては、変異型ＳＭＯのｍＲＮＡ（センス）又は変異型ＳＭＯのＤＮＡ（アンチセンス）配列を標的にして結合することができる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。本発明に係るアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、変異領域を含む変異型ＳＭＯのＤＮＡのコード領域のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、一般に約１４〜３０ヌクレオチド、いくつかの実施形態では少なくとも約１４ヌクレオチドを含む。所定のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づくアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力については、例えば、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ外（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８に記載されている。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の変異型ＳＭＯ核酸のいずれかの発現を阻害することができる核酸を提供する。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合は、二本鎖の強化された分解、転写若しくは翻訳の早期の終結を含めたいくつかの手段の一つによって又は他の手段によって標的核酸配列の転写又は翻訳を阻止する二重鎖の形成をもたらす。このような方法は、本発明に包含される。このように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して変異型ＳＭＯタンパク質の発現を阻止することができ、その際、該変異型ＳＭＯタンパク質は、ＧＤＣ−０４４９などの化学療法に対する哺乳動物における癌の耐性に所定の役割を果たすことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド又はセンスオリゴヌクレオチドは、さらに、修飾糖ホスホジエステル骨格（又はＷＯ９１／０６６２９号に記載されているような他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、このような糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。このような耐性糖結合を有するオリゴヌクレオチドは、生体内で安定である（すなわち、酵素分解に耐性であることができる）が、標的ヌクレオチド配列に結合できるように配列特異性を保持する。
【０１７４】
変異型ＳＭＯタンパク質の発現を阻害するのに有用なアンチセンス化合物の具体例としては、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドとしては、骨格中にリン原子を保持するもの及び骨格中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的のために、そして場合によっては当該技術分野で参照されるときに、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホラミデート、例えば、３’−アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホソホチリエステル、セレノホスフェート及び通常の３’−５’結合を有する、これらの２’−５’結合アナログ並びに１以上のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’又は２’−２’結合である反転した極性を有するものが挙げられる。いくつかの実施形態では、反転極性を有するオリゴヌクレオチドは、ほぼ３’ヌクレオチド間結合に単一の３’−３’結合、すなわち、無塩基（核酸塩基が存在しない又はその代わりにヒドロキシル基を有する）であってもよい単一の反転ヌクレオシド残基を含む。また、様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許としては次のものが挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第：３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；５，１９４，５９９；５，５６５，５５５；５，５２７，８９９；５，７２１，２１８；５，６７２，６９７及び５，６２５，０５０。これらのそれぞれは参照により本明細書において援用する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、核酸は、修飾ヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド骨格を含む。いくつかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、或いは１個以上の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間結合によって形成される、その中にリン原子を含まない骨格を有する。これらのものとしては、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；及びメチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホネート及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ2成分部分を有する他のものが挙げられる。このようなオリゴヌクレオチドの調製を教示する代表的な米国特許としては次のものが挙げられるが、これらに限定されない：米国特許第：５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；５，７９２，６０８；５，６４６，２６９及び５，６７７，４３９。これらのそれぞれは参照により本明細書において援用する。
【０１７６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合、すなわち骨格の両方を新規な基で置換する。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の一つ、すなわち、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体をペプチド核酸（ＰＮＡ）という。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格を、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換する。核酸塩基は、保持され、かつ、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号；同５，７１４，３３１号；及び同５，７１９，２６２号が挙げられるが、これらに限定されない。これらのそれぞれは参照により本明細書で援用される。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ外（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００にある。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格及び／又はヘテロ原子骨格、特に上で参照した米国特許第５４８９６７７に記載された−ＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2−（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られている）、−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−ＣＨ2−前記天然のホスホジエステル骨格は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2−として表される）及び上で参照した米国特許第５６０２２４０号のアミド骨格を組み込んでいる。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
【０１７８】
また、修飾オリゴヌクレオチドは、１個以上の置換糖部分を含むこともできる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’位に次のうちの１つを含む：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル又はＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル又はＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル又はＮ−アルキニル；又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、該アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換Ｃ1〜Ｃ10アルキル又はＣ2〜Ｃ10アルケニル及びアルキニルであってよい。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｏ［（ＣＨ2）nＯ］mＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2、Ｏ（ＣＨ２）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＮＨ2及びＯ（ＣＨ2）nＯＮ［（ＣＨ2）nＣＨ3）］2（ここで、ｎ及びｍは１〜約１０である）。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、２’位に次のうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＳＯＣＨ3、ＳＯ2ＣＨ3、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するための基又はオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善するための基及び同様の特性を有他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）又は２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ外（１９９５）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７８：４８６−５０４）、すなわちアルコキシアルコキシ基である。いくつかの実施形態では、修飾としては、２−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち以下の実施例に記載されるような２’−ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ（ＣＨ2）2ＯＮ（ＣＨ3）2基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野においては２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ2）が挙げられる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、修飾としては、２’−ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に結合し、それによって二環糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。この結合は、いくつかの実施形態では、２’酸素原子及び４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ2−）n基（ここで、ｎは１又は２である）である。ＬＮＡ及びその調製は、ＷＯ９８／３９３５２号及びＷＯ９９／１４２２６号に記載されている。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ3）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）、２’−アリル（２’−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。２’−修飾は、アラビノ（上）位置又はリボ（下）位置にあってもよい。いくつかの実施形態では、２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。また、同様の修飾もオリゴヌクレオチド上、特に３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位又は２’−５’結合オリゴヌクレオチド及び５’末端ヌクレオチドの５’位にあることができる。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有することもできる。このような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許第としては次のものが挙げられるがこれらに限定されない：米国特許第：４，９８１，９５７；５，１１８，８００；５，３１９，０８０；５，３５９，０４４；５，３９３，８７８；５，４４６，１３７；５，４６６，７８６；５，５１４，７８５；５，５１９，１３４；５，５６７，８１１；５，５７６，４２７；５，５９１，７２２；５，５９７，９０９；５，６１０，３００；５，６２７，０５３；５，６３９，８７３；５，６４６，２６５；５，６５８，８７３；５，６７０，６３３；５，７９２，７４７；及び５，７００，９２０。これらのそれぞれは参照によって本明細書で援用する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（当該分野では単に「塩基」と呼ばれる場合が多い）修飾又は置換も含むことができる。本明細書で使用されるときに、「非修飾」又は「天然」核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基としては、他の合成及び天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、２−プロピル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ3又は−ＣＨ2−Ｃ＝ＣＨ）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが挙げられる。さらに、修飾核酸塩基としては、三環系ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］  ［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−Ｂ］  ［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，１３−ｄ］ピリミジン−２−オン）が挙げられる。また、修飾核酸塩基としては、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンで置換されたものが挙げられる。さらに、核酸塩基としては、米国特許第３６８７８０８号に開示されたもの、ＴＨＥ  ＣＯＮＣＩＳＥ  ＥＮＣＹＣＬＯＰＥＤＩＡ  ＯＦ  ＰＯＬＹＭＥＲ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．著，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐｐ．８５８−８５９に開示されているもの及びＥｎｇｌｉｓｃｈ外，ＡＮＧＥＷＡＮＤＴＥ  ＣＨＥＭＩＥ，ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＥＤＩＴＩＯＮ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９１，３０：６１３に開示されているものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるために特に有用である。これらのものとしては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ外．ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合であっても可能な塩基置換である。修飾核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第３，６８７，８０８号並びに次の米国特許が挙げられるが、これらに限定されない：４，８４５，２０５；５，１３０，３０２；５，１３４，０６６；５，１７５，２７３；５，３６７，０６６；５，４３２，２７２；５，４５７，１８７；５，４５９，２５５；５，４８４，９０８；５，５０２，１７７；５，５２５，７１１；５，５５２，５４０；５，５８７，４６９；５，５９４，１２１，５，５９６，０９１；５，６１４，６１７；５，６４５，９８５；５，８３０，６５３；５，７６３，５８８；６，００５，０９６；５，６８１，９４１及び５，７５０，６９２。これらのそれぞれを参照により本明細書において援用する。
【０１８２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドに、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを強化する１個以上の部分又は結合体を化学的に連結することを含む。本発明の化合物は、第一級又は第二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。本発明のコンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基が挙げられる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、陽イオン性脂質、リン脂質、陽イオン性リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び染料が挙げられる。本発明において、薬力学的特性を強化する基としては、オリゴマーの取り込みを改善し、分解に対するオリゴマーの耐性を向上させ、及び／又はＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。本発明において、薬物動態学的特性を強化する基としては、オリゴマーの取り込み、分布、代謝又は排出を改善する基が挙げられる。結合体部分としては、限定されないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ外．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ外．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ外．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ外．（１９９３）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ外．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：５３３−５３８）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ外．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ外．（１９９１）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ外．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２５９：３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ外．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７５：４９−５４）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ外．（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６：３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ外．（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ外．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １４：９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ外．（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（（Ｍｉｓｈｒａ外．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２６４：２２９−２３７）或いはオクタデシルアミン又はヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分。本発明のオリゴヌクレオチドは、活性な薬剤物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤又は抗生物質に結合できる。オリゴヌクレオチド−薬剤結合体及びその調製は、次の米国特許に記載されている：４，８２８，９７９；４，９４８，８８２；５，２１８，１０５；５，５２５，４６５；５，５４１，３１３；５，５４５，７３０；５，５５２，５３８；５，５７８，７１７，５，５８０，７３１；５，５８０，７３１；５，５９１，５８４；５，１０９，１２４；５，１１８，８０２；５，１３８，０４５；５，４１４，０７７；５，４８６，６０３；５，５１２，４３９；５，５７８，７１８；５，６０８，０４６；４，５８７，０４４；４，６０５，７３５；４，６６７，０２５；４，７６２，７７９；４，７８９，７３７；４，８２４，９４１；４，８３５，２６３；４，８７６，３３５；４，９０４，５８２；４，９５８，０１３；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，２４５，０２２；５，２５４，４６９；５，２５８，５０６；５，２６２，５３６；５，２７２，２５０；５，２９２，８７３；５，３１７，０９８；５，３７１，２４１，５，３９１，７２３；５，４１６，２０３，５，４５１，４６３；５，５１０，４７５；５，５１２，６６７；５，５１４，７８５；５，５６５，５５２；５，５６７，８１０；５，５７４，１４２；５，５８５，４８１；５，５８７，３７１；５，５９５，７２６；５，５９７，６９６；５，５９９，９２３；５，５９９，９２８；５，６８８，９４１及び６，６５６，７３０。そのそれぞれを参照により本明細書において援用する。
【０１８３】
所定の化合物の全ての位置を均一に修飾する必要はなく、実際には、上記修飾の複数を単一の化合物又はさらにはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込むこともできる。また、本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。本発明において、「キメラ」アンチセンス化合物又は「キメラ」は、２つ以上の化学的に異なる領域を含み、各々が少なくとも１個の単量体単位から構成されるアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、すなわち、オリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも１つの領域を含み、その際、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドについて、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加及び／又は標的核酸に対する結合親和性の増加を付与するように修飾されている。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質として機能することができる。一例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を大きく向上させる。その結果、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、同等の結果が、キメラオリゴヌクレオチドを使用する場合に、より短いオリゴヌクレオチドで得られる場合が多い。上記のように、本発明のキメラアンチセンス化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチドの複合構造、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣体として形成できる。いくつかの実施形態では、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾糖（例えば、２’−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−ＣＨ3）を３’末端で取り込んでヌクレアーゼ耐性を付与し、及び少なくとも４個の連続２’−Ｈ糖を有する領域を取り込んでＲＮａｓｅＨ活性を付与する。また、このような化合物は、当該技術分野においてハイブリッド又はギャップマーとも呼ばれている。いくつかの実施形態では、ギャップマーは、少なくとも４つの連続した２’−Ｈ糖を有する少なくとも１つの領域によって分離された３’末端及び５’末端に２’修飾糖（例えば２’−Ｏ−（ＣＨ2）2−Ｏ−ＣＨ3）の領域を有し、いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート骨格結合を取り入れている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、次の米国特許が挙げられるが、これらに限定されない：５，０１３，８３０；５，１４９，７９７；５，２２０，００７；５，２５６，７７５；５，３６６，８７８；５，４０３，７１１；５，４９１，１３３；５，５６５，３５０；５，６２３，０６５；５，６５２，３５５；５，６５２，３５６；及び５，７００，９２２。そのそれぞれを参照により本明細書において援用する。
【０１８４】
本発明に従って使用されるアンチセンス化合物は、固相合成の周知の技術によって従来どおり日常的に行うことができる。このような合成のための装置は、例えば、アプライド・バイオシステムズ（カリフォルニア州フォスターシティー）を含めていくつかのベンダーによって販売されている。当該技術分野で知られているかかる合成のための任意の他の手段を追加的又は代替的に使用することができる。ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することが知られている。また、本発明の化合物を、取り込み、分布及び／又は吸収を補助するために、他の分子、分子構造若しくは化合物の混合物、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所又は他の製剤と混合し、カプセル化し、結合させ又は会合させることができる。このような取り込み、分布及び／又は吸収補助性剤の調製を教示する代表的な米国特許としては、次の米国特許が挙げられるが、これらに限定されない：５，１０８，９２１；５，３５４，８４４；５，４１６，０１６；５，４５９，１２７；５，５２１，２９１；５，５４３，１５８；５，５４７，９３２；５，５８３，０２０；５，５９１，７２１；４，４２６，３３０；４，５３４，８９９；５，０１３，５５６；５，１０８，９２１；５，２１３，８０４；５，２２７，１７０；５，２６４，２２１；５，３５６，６３３；５，３９５，６１９；５，４１６，０１６；５，４１７，９７８；５，４６２，８５４；５，４６９，８５４；５，５１２，２９５；５，５２７，５２８；５，５３４，２５９；５，５４３，１５２；５，５５６，９４８；５，５８０，５７５；及び５，５９５，７５６。そのそれぞれを参照により本明細書において援用する。
【０１８５】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、有機部分に共有結合したオリゴヌクレオチド、例えばＷＯ９０／１００４８号に記載されたもの、及びポリ（Ｌ−リシン）などの標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増加させる他の部分に結合したオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、エリプチシンなどの挿入剤及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させて、標的ヌクレオチド配列に対するアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を改変することができる。
【０１８６】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えばＣａＰＯ4媒介ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーションを含めた任意の遺伝子導入法によって或いはエプスタイン・バーウイルスなどの遺伝子導入ベクターを使用することによって標的核酸配列を含む細胞に導入できる。一実施形態では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、好適なレトロウイルスベクターに挿入される標的核酸配列を含む細胞を、生体内又は生体外のいずれかにおいて組換えレトロウイルスベクターと接触させる。好適なレトロウイルスベクターとしては、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶに由来するレトロウイルス）又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクターから誘導されるものが挙げられるが、これらに限定されない（ＷＯ９０／１３６４１参照）。
【０１８７】
ＷＯ９１／０４７５３に記載されるように、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、リガンド結合分子との複合体の形成により標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入できる。好適なリガンド結合分子としては、細胞表面受容体、成長因子、他のサイトカイン又は細胞表面受容体に結合する他のリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、リガンド結合分子の結合は、その対応する分子若しくは受容体に結合するリガンド結合分子の能力を妨害せず、或いはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその共役バージョンが細胞に入るのを妨害しない。
【０１８８】
あるいは、ＷＯ９０／１０４４８に記載されるように、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、いくつかの実施形態では、内因性リパーゼにより細胞内で分解する。
【０１８９】
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般に、少なくとも約５ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０又は１０００ヌクレオチド長であり、この文脈において、用語「約」は、その参照した長さのプラスマイナス１０％の参照ヌクレオチド配列長さを意味する。
【０１９０】
また、変異型ＳＭＯをコードするヌクレオチド配列を使用して、該ＳＭＯをコードする遺伝子をマッピングするための及び遺伝子疾患を有する個体の遺伝子分析のためのハイブリダイゼーションプローブを構築することもできる。本明細書で提供されるヌクレオチド配列は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連鎖解析及びライブラリーによるハイブリダイゼーションスクリーニングなどの公知の技術を用いて染色体及び染色体の特定の領域にマッピングできる。
【０１９１】
潜在的な変異型ＳＭＯアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ構築物であり、ここで、例えばアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにはハイブリダイズし、そしてタンパク質翻訳を阻害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術を使用して、三重らせん形成又はアンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡを介して遺伝子発現を制御することができ、どちらの方法もＤＮＡ又はＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本明細書における変異型ＳＭＯをコードする核酸を使用して、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせん−Ｌｅｅ外（１９７９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３０７３；Ｃｏｏｎｅｙ外（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎ外（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３６０を参照）、これにより、転写及び変異型ＳＭＯの産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、生体内でｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子から変異型ＳＭＯへの翻訳を阻害する（Ｏｋａｎｏ（１９９１）Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５６：５６０）；ＯＬＩＧＯＤＥＯＸＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＳ  ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＩＮＨＩＢＩＴＯＲＳ  ＯＦ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８８）。また、上記のオリゴヌクレオチドを細胞に送達することもでき、それによって、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、変異型ＳＭＯの産生を阻害するように生体内で発現できる。いくつかの実施形態では、アンチセンスＤＮＡを使用する場合には、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０及び＋１０位置間の翻訳開始部位から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドを使用できる。
【０１９２】
核酸のいずれかは、変異ＳＭＯタンパク質を発現し、そして天然の標的又は発現した変異型平滑化タンパク質（例えば、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｓ５３３Ｎ及び／又はＷ５３５Ｌ変異を有する平滑化タンパク質）の結合相手を同定する際に使用するのに好適である。また、核酸を使用して、変異体平滑化生物活性を研究し、変異体平滑化及びその結合相手を様々な細胞及び組織から精製し、そしてヘッジホッグシグナル伝達経路のさらなる構成要素を同定することができる。
【０１９３】
ＩＩ．小分子
変異型ＳＭＯの潜在的なアンタゴニストは、ＧＤＣ−０４４９によって野生型ＳＭＯに占拠される部位に結合する小分子を含み、それによって変異型ＳＭＯの生物学的活性を遮断する。小分子の例としては、小ペプチド又はペプチド様分子、例えば、可溶性ペプチド、及び合成非ペプチジル有機又は無機化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡに対する配列特異的ハイブリダイゼーションによって作用し、その後エンドヌクレアーゼにより切断される。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術によって同定できる。さらなる詳細については、例えば、Ｒｏｓｓｉ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９−４７１及びＰＣＴ公開ＷＯ９７／３３５５１号（１９９７年９月１８日公開）を参照されたい。
【０１９５】
転写を阻害するために使用される三重らせん形成における核酸分子は一本鎖でありかつデオキシヌクレオチドから構成される。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのかなり大きな伸張を必要とするフーグスティーン塩基対形成規則により三重ヘリックス形成を促進するように設計されている。さらなる詳細については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３３５５１（前出）を参照されたい。
【０１９６】
これらの小分子は、上で議論したスクリーニングアッセイの任意の１つ以上及び／又は当業者に周知の他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０１９７】
ＩＩＩ．タンパク質
本発明は、単離された変異型ＳＭＯタンパク質を提供する。野生型ヒトＳＭＯは、配列番号１に示されている。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質は、部分的に又は完全にビスモデギブに耐性である。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質は、ヘッジホッグシグナル伝達経路におけるタンパク質をコードする遺伝子に追加の変異を有する細胞内において部分的に又は完全にビスモデギブに耐性である。いくつかの実施形態では、追加の変異は、本明細書に記載のパッチ及び／又はＳＵＦＵ変異のいずれかである。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の２３９位に対応するアミノ酸位置にアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置２３９に置換が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の２３９位に相当するアミノ酸位置にアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の２３９位に相当するアミノ酸位置にバリン（Ｖ）を含むものとする。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の２８１位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置２８１に置換が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の２８１位に相当するアミノ酸位置にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の２８１位に相当するアミノ酸位置にシステイン（Ｃ）を含むものとする。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の４０８位に対応するアミノ酸位置にイソロイシン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置４０８に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の４０８位に相当するアミノ酸位置にイソロイシン（Ｉ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の４０８位に相当するアミノ酸位置にバリン（Ｖ）を含むものとする。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の４５９位に対応するアミノ酸位置にアラニン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置４５９に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の４５９位に相当するアミノ酸位置にアラニン（Ａ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の４５９位に相当するアミノ酸位置にバリン（Ｖ）を含むものとする。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の５３３位に対応するアミノ酸位置にセリン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置５３３に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の５３３位に相当するアミノ酸位置にセリン（Ｓ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の５３３位に相当するアミノ酸位置にアスパラギン（Ｎ）を含むものとする。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列を含む単離変異型ＳＭＯタンパク質を提供し、該アミノ酸配列は、野生型ＳＭＯアミノ酸配列の５３５位に対応するアミノ酸位置にトリプトファン以外のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、アミノ酸位置５３５に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該アミノ酸配列は、配列番号１の５３５位に相当するアミノ酸位置にトリプトファン（Ｗ）以外のアミノ酸を含むものとする。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の５３５位に相当するアミノ酸位置にロイシン（Ｌ）を含むものとする。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一のアミノ酸配列を含むが、ただし、該ＳＭＯタンパク質は、表４に示されたアミノ酸変化の少なくとも１つを含むものとする（例えば例６参照）。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、変異型ヒトＳＭＯは、アミノ酸２８１が「Ｘａａ」（本願に関して、トリプトファン（Ｗ）以外の任意のアミノ酸を表す）として示される配列番号２に示される。いくつかの実施形態では、Ｘａａはシステイン（Ｃ）である。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、変異型ヒトＳＭＯは、アミノ酸４０８が「Ｘａａ」（本願に関して、イソロイシン（Ｉ）以外の任意のアミノ酸を表す）として示される配列番号６に示される。いくつかの実施形態では、Ｘａａはバリン（Ｖ）である。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、変異型ヒトＳＭＯは、アミノ酸４５９が「Ｘａａ」（本願に関して、アラニン（Ａ）以外の任意のアミノ酸を表す）として示される配列番号３に示される。いくつかの実施形態では、Ｘａａはバリン（Ｖ）である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、変異型ヒトＳＭＯは、アミノ酸５３３が「Ｘａａ」（本願に関して、セリン（Ｓ）以外の任意のアミノ酸を表す）として示される配列番号７に示される。いくつかの実施形態では、Ｘａａはアスパラギン（Ｎ）である。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、Ｘａａはバリン（Ｖ）である。いくつかの実施形態では、変異型ヒトＳＭＯは、アミノ酸５３５が「Ｘａａ」（本願に関して、トリプトファン（Ｗ）以外の任意のアミノ酸を表す）として示される配列番号４に示される。いくつかの実施形態では、Ｘａａはロイシン（Ｌ）である。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質のいずれかは、配列番号１〜９のいずれかの１位に相当するＮ末端メチオニンを欠失する。
【０２１１】
変異型ＳＭＯ及びそのフラグメントは、本明細書に記載の変異型ＳＭＯ核酸を使用して、当該技術分野で周知であるように組換え系で産生できる。このような核酸は、当該分野で周知のように、発現ベクターに組み込みこまれ、そしてタンパク質の提案された用途に応じて原核細胞又は真核細胞であることができる宿主細胞にトランスフェクトできる。例えば、変異型ＳＭＯの全長又はフラグメント（ここで、該フラグメントは、少なくとも、ＳＭＯの第二の膜貫通ドメイン及びヒトＳＭＯの位置２８１、ＳＭＯの第５膜貫通ドメイン及びヒトＳＭＯの位置４０８、ＳＭＯの第６膜貫通ドメイン及びヒトＳＭＯの位置４５９、及び／又はＳＭＯの第７膜貫通及び位置５３３又はヒトＳＭＯの５３５を含む）を免疫原として使用して、本発明の抗体を産生し又は本発明の抗体を精製することができる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントは、野生型ＳＭＯポリペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質）の同一の生物学的活性の少なくとも１つを有する。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸４５９に相当するアミノ酸位置に変異を有するＳＭＯタンパク質）は、野生型ＳＭＯタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質）と比較して基礎的な生物学的活性が増加している。用語「生物学的活性」、「生物活性」又は「機能性」とは、ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメントが野生型ＳＭＯタンパク質に関連する機能の少なくとも１つを実施することができること、例えばヘッジホッグシグナル伝達経路を形質導入することができること及び／又はＧｌｉ１の発現を誘導することができることを意味する。特定の実施形態では、ＳＭＯタンパク質は、キネシンモータータンパク質Ｃｏｓｔａｌ−２を結合させる。用語「生物学的活性」、「生物活性」、及び「機能性」は、本明細書中において区別なく使用される。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質のいずれか（例えば、本明細書に記載の変異型ＳＭＯタンパク質のいずれか）は、ヘッジホッグシグナルを伝達することが可能である。用語「能力を有する」又「することが可能である」とは、記載したタンパク質が適切な条件（例えば、生理学的条件又は標準的な実験室条件）下で上記生物活性を達成することを意味する。所定の実施形態では、用語「できる」とは、この能力を説明するために使用できる（例えば、「結合することができる」又は所定の配列に「結合する」）。例えば、ＳＭＯタンパク質（例えば、本明細書に記載の変異型ＳＭＯタンパク質のいずれか）がヘッジホッグシグナル伝達を促進する能力を有する又はヘッジホッグシグナル伝達を促進することが可能である場合には、ＳＭＯタンパク質は、通常の生理学的条件下で細胞内におけるヘッジホッグシグナル伝達を促進することが可能である。当業者であれば、ポリペプチドが能力を有するかどうか又は記載された生物活性を達成することが可能かどうかを試験するためにどのような条件が必要となるのかを理解するであろう。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、ＳＭＯ及び本明細書に記載の変異型ＳＭＯタンパク質は、平滑化機能獲得型変異を含む。いくつかの実施形態では、機能獲得型平滑化変異は、構成的に活性な平滑化タンパク質をもたらす。所定の実施形態では、平滑化における変異は、特定の位置、例えばスクリーニングアッセイに関連して上記したような配列番号１における特定の位置に相当する位置のいずれかに変異を含む。例えば、ＷＯ２０１１／０２８９５０及びＷＯ２０１２／０４７９６８を参照されたい。これらのそれぞれは参照により援用される。いくつかの実施形態では、平滑化変異は、配列番号１の５３５位に相当する位置での変異である。所定の実施形態では、変異は、配列番号１の５６２位に相当する位置での変異である。所定の実施形態では、変異は、配列番号１における５３５位又はその対応する位置でのＷ５３５Ｌである。いくつかの実施形態では、平滑化変異は、配列番号１のＲ５６２Ｑ位に相当する変異である（配列番号１の５６２位又は５６２位に相当する位置でのＲ５６２Ｑ変異）。いくつかの実施形態では、平滑化突然変異は、配列番号１の４１２位に相当する位置での変異、例えば配列番号１のこのような位置でのＬ４１２Ｆである。いくつかの実施形態では、平滑化変異は、所定の平滑化阻害剤に対して耐性にする変異を有する。いくつかの実施形態では、平滑化タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置又は配列番号１の５１８位に相当する位置に別のアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化は、配列番号１のアミノ酸位置５１８に相当するアミノ酸位置でのＥ５１８Ｋ又はＥ５１８Ａ置換である。いくつかの実施形態では、平滑化タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置４７３又は配列番号１の４７３位に相当する位置にアミノ酸変化を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＭＯタンパク質のいずれか（例えば、本明細書に記載の変異型ＳＭＯタンパク質のいずれか）は、別の薬剤に融合されている。いくつかの実施形態では、ＳＭＯタンパク質は別のポリペプチドに融合されている。
【０２１６】
本明細書に記載の変異型ＳＭＯタンパク質のいずれかは、天然の標的又は変異型平滑化タンパク質（例えば、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｓ５３３Ｎ及び／又はＷ５３５Ｌ変異を有する平滑化タンパク質）に対する結合相手を同定する際に使用するのに好適である。変異型ＳＭＯタンパク質を使用して、変異型平滑化生物活性を試験し、変異体型平滑化及びその結合相手を様々な細胞及び組織から精製し、ヘッジホッグシグナル伝達経路のさらなる構成要素を同定することもできる。
【０２１７】
ＩＶ．抗体
Ａ．抗変異型ＳＭＯ抗体
一態様では、本発明は、ＳＭＯ、特に変異型ＳＭＯに結合する抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体のいずれかは、本明細書に記載の変異型ＳＭＯポリペプチドのいずれかと結合する。例えば、変異型ＳＭＯのポリペプチドは、本発明の抗体が特異的に結合するエピトープを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＳＭＯタンパク質に結合するが、ただし、配列番号１の２８１、４０８、４５９、５３３及び／又は５３５位に相当するアミノ酸位置に変異が存在するものとする。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質には特異的に結合しない又は配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質と比較して変異ＳＭＯタンパク質を優先的に結合させる（例えば、結合は、変異型ＳＭＯタンパク質に選択的である）。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１の２８１、４０８、４５９、５３３及び／又は５３５位に相当するアミノ酸位置のいずれかに変異を欠失するＳＭＯタンパク質には結合しない。
【０２１８】
一実施形態では、抗ＳＭＯ抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗ＳＭＯ抗体は抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又は（Ｆａｂ’）2フラグメントである。一実施形態では、抗変異ＳＭＯ抗体は、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体である。一実施形態では、抗ＳＭＯ抗体は精製される。所定の実施形態では、組成物は、癌の治療のための医薬製剤である。
【０２１９】
１．抗体フラグメント
本発明は抗体のフラグメントも包含する。抗体フラグメントは、酵素消化などの従来の手段又は組換え技術によって生成できる。所定の状況では、全抗体ではなく抗体フラグメントを使用する利点がある。フラグメントのサイズが小さければ、迅速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍へのアクセス改善につながる可能性がある。所定の抗体フラグメントの検討については、Ｈｕｄｓｏｎ外．（２００３）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４を参照されたい。
【０２２０】
様々な技術が、抗体フラグメントの生成のために開発されてきた。伝統的に、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化により誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ外，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）；及びＢｒｅｎｎａｎ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５））。しかし、これらのフラグメントは、現在は組換え宿主細胞により直接生成できる。Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体フラグメントは、全て大腸菌で発現させかつ分泌できるため、これらのフラグメントの大量の容易な生成が可能である。抗体フラグメントは、上記抗体ファージライブラリーから単離できる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収し、そして化学的に結合させてＦ（ａｂ’）2フラグメントを形成させることができる（Ｃａｒｔｅｒ外，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、組換え宿主細胞培養液から直接単離できる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む生体内半減期の増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメントが米国特許第５８６９０４６号に記載されている。抗体フラグメントの生成のための他の技術は当業者には明らかであろう。所定の実施形態では、抗体は単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。ＷＯを９３／１６１８５、米国特許第５５７１８９４号；及び同５５８７４５８号を参照されたい。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠くそのままの結合部位を有する唯一の種である；したがって、これらのものは、生体内での使用中における低減した非特異的結合のために好適な場合がある。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合を生じるように構築できる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，著．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（前出）を参照されたい。また、抗体フラグメントは、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように「線状抗体」であってもよい。このような線状抗体は、単一特異性又は二重特異性であることができる。
【０２２１】
２．ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が当該技術分野で知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１個以上のアミノ酸残基を有することができる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「導入」残基と呼ばれる場合が多く、これは典型的には「導入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法に従って（Ｊｏｎｅｓ外．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ外．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ外．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）、ヒト抗体の対応する配列の超可変領域配列を置換することによって実施できる。したがって、このような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの超可変領域残基及び場合によってはいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体の相同部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０２２２】
ヒト化抗体の作製に使用されるヒト可変ドメイン、すなわち軽鎖及び重鎖の両方の選択は、抗原性を低減するために重要である場合がある。いわゆる「ベストフィット法」によれば、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。その後、齧歯動物のものに最も近いヒト配列をヒト化抗体用のヒトフレームワークとして受け入れる。例えば、Ｓｉｍｓ外．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａ外．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１参照。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体のために使用することができる。例えば、Ｃａｒｔｅｒ外．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａ外．（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３を参照されたい。
【０２２３】
抗体を抗原及び他の好ましい生物学的特性に対する高い親和性を保持しつつヒト化することが一般に望ましい。この目標を達成するために、一つの方法によれば、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルが一般に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を例示し表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。このようにして、ＦＲ残基をレシピエント及びインポート配列から選択し組み合わせることができ、それによって、標的抗原に対する増大した親和性などの所望の抗体特性が達成される。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与する。
【０２２４】
３．ヒト抗体
本発明のヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列と上記のような既知のヒト定常ドメイン配列とを組み合わせることによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製できる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス・ヒト異種細胞株が、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ外，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）に記載されている。
【０２２５】
ここで、免疫時に、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を生成することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列変異型マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ外，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ外，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）参照。
【０２２６】
また、遺伝子シャフリングを使用して、非ヒト、例えば齧歯類抗体からヒト抗体を誘導することもでき、その際、ヒト抗体は、出発非ヒト抗体に類似する親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によれば、本明細書に記載されるファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体フラグメントの重鎖又は軽鎖可変領域のいずれかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラの集団を生成する。抗原との選択により、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖ又はＦａｂが単離され、その際、ヒト鎖は、一次ファージディスプレイクローンにおける対応する非ヒト鎖を除去する際に破壊された抗原結合部位を復元する、すなわちエピトープは、ヒト鎖のパートナーの選択を支配（インプリント）する。このプロセスが残りの非ヒト鎖を置換するために繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴＷＯ９３／０６２１３を参照）。ＣＤＲ移植による非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を全く持たない完全にヒトの抗体を与える。
【０２２７】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２種の異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。所定の実施形態では、二重特異性抗体は、ヒト又はヒト化抗体である。所定の実施形態では、結合特異性の一方はＳＭＯに対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。所定の実施形態では、二重特異性抗体は、ＳＭＯの２種の異なるエピトープに結合することができる。また、二重特異性抗体は、ＳＭＯを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するために使用することもできる。これらの抗体は、ＳＭＯ結合アームと、細胞障害剤、例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、鎖、メトトレキサート又は放射性同位体ハプテンリシンＡなどを結合するアームとを有する。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメントとして調製できる（例えば、Ｆ（ａｂ’）2二重特異性抗体）。
【０２２８】
二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野で知られている。伝統的には、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖・軽鎖対の同時発現に基づくものであり、その際、２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダムな組み合わせのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。通常アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製はかなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の手順が１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９号及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ外，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５（１９９１）に記載されている。
【０２２９】
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性（抗体・抗原組合せ部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合させる。融合は、例えば、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行われる。所定の実施形態では、軽鎖結合に必要な部位を含む第１鎖定常領域（ＣＨ１）が融合部の少なくとも１つに存在する。免疫グロブリン重鎖融合体及び適宜免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別々の発現ベクターに挿入し、そして適切な宿主生物に同時形質移入する。これは、構築に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調節する際に大きな融通性を与える。同じ比率の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合又は比率が特に重要ではない場合には、１個の発現ベクターにおける２つのコード配列又は３つ全てのポリペプチド鎖を挿入することが可能である。
【０２３０】
このアプローチの一実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームにおける第１結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖・軽鎖対（第２結合特異性を与える）とから構成される。この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから所望の二重特異性化合物を分離するのを容易にすることが分かった。というのは、二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在すると分離の容易な方法が得られるからである。このアプローチは、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体のさらなる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ外，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
【０２３１】
別のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面は、組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーの割合を最大にするように操作できる。この界面は、抗体定常ドメインのＣH３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの１個以上の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置換する。この大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」が、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置換することによって第２抗体分子の界面に創り出される。これは、ホモダイマーなどの不要な他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるための機構を提供する。
【０２３２】
二重特異性抗体としては、架橋又は「ヘテロ結合体」抗体が挙げられる。例えば、ヘテロ結合体における抗体の一方はビオチンに結合し、他方はアビジンに結合することができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ９２／００３７３、ＷＯ９１／００３６０及びＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロ結合体抗体は、任意の好都合な架橋法を用いて作製できる。好適な架橋剤は、当該技術分野において周知であり、多数の架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０２３３】
また、抗体フラグメントから二重特異性抗体を産生する技術も文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製できる。Ｂｒｅｎｎａｎ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）には、インタクトな抗体をタンパク分解により切断してＦ（ａｂ’）2フラグメントを生成させる手順が記載されている。これらのフラグメントをジチオール錯化剤の亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元させて近接するジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’フラグメントはチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一方をメルカプトエチルアミンで還元することによりＦａｂ’−チオールに再変換し、そして他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合させて二重特異性抗体を形成させる。生成された二重特異性抗体は、酵素の選択的固定化用の薬剤として使用できる。
【０２３４】
近年の進歩により、大腸菌からＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接回収が容易になり、これを化学的に結合させて二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙ外，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５（１９９２）には、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）2分子の産生が記載されている。各Ｆａｂ’フラグメントを大腸菌から別々に分泌させ、そして試験管内で定方向化学カップリングを行って二重特異性抗体を形成させた。このように形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２受容体を過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合できたのみならず、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発した。
【０２３５】
また、組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作製し分離する様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して生成された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により２種の異なる抗体のＦａｂ’部分に結合させた。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成させた後、再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成させた。また、この方法は、抗体ホモダイマーの生成にも利用できる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）に記載された「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製する別のメカニズムを提供した。これらのフラグメントは、同一鎖上の２個のドメイン間での対形成を可能にするには短すぎるリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。したがって、一方のフラグメントのＶＨ及びＶＬドメインは、他方のフラグメントの相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、これにより、２個の抗原結合部位が形成する。また、単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用により二重特異性抗体フラグメントを作製する他の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：５３６８（１９９４）参照。
【０２３６】
二価を超える価数を有する抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔ外．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０２３７】
５．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション（及び／又は異化）できる。本発明の抗体は、３以上の抗原結合部位を有する多価抗体（ＩｇＭクラス以外である）であることができ（例えば四価抗体）、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に産生できる。多価抗体は、二量体化ドメイン及び３以上の抗原結合部位を含むことができる。所定の実施形態では、二量体化ドメインは、Ｆｃ領域又はヒンジ領域を含む（又はからなる）。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域及びＦｃ領域に対してアミノ末端にある３以上の抗原結合部位を含むであろう。所定の実施形態では、多価抗体は、３〜約８個の抗原結合部位を含む（又はからなる）。このような一実施形態では、多価抗体は、４個の抗原結合部位を含む（又はからなる）。多価抗体は、少なくとも１個のポリペプチド鎖（例えば、２個のポリペプチド鎖）を含み、該ポリペプチド鎖は、２個以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含むことができ、ここで、ＶＤ１は第１可変ドメインであり、ＶＤ２は第２可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖であり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖は、ＶＨ−ＣＨ１−柔軟リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含むことができる。ここで、多価抗体は、少なくとも２個（例えば４個）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含むことができる。ここで、多価抗体は、例えば、約２〜約８個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含むことができる。ここで意図される軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意にＣＬドメインをさらに含む。
【０２３８】
６．単一ドメイン抗体
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部又は軽鎖可変領域の全て若しくは一部を含む単一ポリペプチド鎖である。所定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ社、マサチューセッツ州ウォルサム；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照）。一実施形態では、単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部からなる。
【０２３９】
７．抗体変異体
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾が意図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することによって又はペプチド合成によって調製できる。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換が挙げられる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを行って最終構築物に到達させることができるが、ただし、該最終構築物は所望の特性を有するものとする。アミノ酸の変更は、その配列が作製された時に対象の抗体アミノ酸配列に導入できる。
【０２４０】
変異誘発のための可能な位置である抗体の所定の残基又は領域を同定するために有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されているように「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれている。ここで、標的残基の残基又は基を同定し（ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）、そして中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）で置換してアミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。その後、置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置は、置換部位に又は置換部位について追加又は他の変異を導入することにより精製される。アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、突然変異の性質自体は予め決定する必要はない。例えば、所定の部位での突然変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、そして発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０２４１】
アミノ酸配列挿入としては、長さが１個の残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入変異体としては、酵素（例えばＡＤＥＰＴのための）又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドに対する抗体のＮ末端又はＣ末端への融合物が挙げられる。
【０２４２】
所定の実施形態では、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように改変される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはＮ結合又はＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を創り出す。Ｏ結合グリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの結合をいうが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用できる。
【０２４３】
抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、好都合には、上記トリペプチド配列の一つ以上（Ｎ結合グリコシル化部位について）を創出又は除去するようにアミノ酸配列を改変することによって達成される。また、改変は、元の抗体の配列への１以上のセリン又はスレオニン残基の付加、欠失又は置換によって行うこともできる（Ｏ結合グリコシル化部位について）。
【０２４４】
抗体がＦｃ領域を含む場合には、それに結合する炭水化物を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、一般にＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ−結合によって結合する分岐の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ外．（１９９７）ＴＩＢＴＥＣＨ１５：２６−３２を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾は、所定の改善された特性を有する抗体変異体を作製するために行うことができる。
【０２４５】
例えば、Ｆｃ領域に結合した（直接的又は間接的に）フコースを欠失する炭水化物構造を有する抗体変異体が提供される。このような変異体は、改善したＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許出願公開ＵＳ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；ＵＳ２００４／００９３６２１（協和発酵工業株式会社）を参照されたい。「フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する刊行物の例としては、次のものが挙げられる：ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ外．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ外．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）。フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ外．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）；米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１，Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ；及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１，Ａｄａｍｓ外．，特に実施例１１）及びα−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞などのノックアウト細胞株（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ外．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．外．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）；及びＷＯ２００３／０８５１０７参照）が挙げられる。
【０２４６】
抗体変異体は、さらに二分オリゴ糖を有し、例えば、その際、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖は、ＧｌｃＮＡｃをによって二分されている。このような抗体変異体は、減少したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。このような抗体変異体の例は、例えばＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ外）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ外）；及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ外）に記載されている。また、Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖中に少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。このような抗体変異体は、改善したＣＤＣ機能を有することができる。このような抗体変異体は、例えばＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ外）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０２４７】
所定の実施形態では、抗体変異体は、ＡＤＣＣをさらに改善する１個以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３及び／又は３３４位における置換（残基のＥｕ番号付け）を有するＦｃ領域を含む。このような置換は、上記変形例のいずれかとの組み合わせで行うことができる。
【０２４８】
特定の実施形態では、本発明は、いくつか、ただし全てではないエフェクター機能を有する抗体変異体を意図し、これは、生体内での抗体の半減期が重要であり、さらには特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害であるである多くの用途のために望ましい候補となる。所定の実施形態では、抗体のＦｃ活性は、所望の特性のみが維持されていることを確認するために測定される。試験管内及び／又は生体内細胞毒性アッセイを実施してＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠失している（そのためおそらくＡＤＣＣ活性を欠失している）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認することができる。ＡＤＣＣを仲介する主要な細胞のＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−９２（１９９１）の第４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するインビトロアッセイの非限定的な例が米国特許第５，５００，３６２号（例えばＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６））及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ外．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；同５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用することができる（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、カリフォルニア州マウンテンビュー；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標））非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは又はさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、生体内で、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ外．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて評価できる。
【０２４９】
また、Ｃ１ｑの結合アッセイを実施して、抗体がＣ１ｑとを結合することができず、そのためＣＤＣ活性を欠いていることを確認することができる。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．外，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．及びＭ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）参照）。ＦｃＲｎ結合及び生体内クリアランス／半減期の決定は、当該技術分野に知られている方法を使用して実施できる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．外，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照）。
【０２５０】
１個以上のアミノ酸置換を有する他の抗体改変体が提供される。置換突然変異について関心ある部位としては高度可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表１に示した。「例示的置換」で示される実質的な変化を表１に与えており、又はアミノ酸クラスを参照して以下でさらに説明するとおりである。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、生成物を、例えば、抗原結合の改善、免疫原性の低下、ＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善などといった所望の活性に対してスクリーニングすることができる。
【０２５１】
【表１】
0006736467.tif 000002
【０２５２】
抗体の生物学的特性の改変は、（ａ）例えばシート又はらせん立体構造としての置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさに影響を及ぼす置換を選択することによって達成できる。アミノ酸は、それらの側鎖の性質の類似性に応じて分類できる（Ａ．Ｌ．レーニンジャー、生化学、第２編、第７３−７５頁、ワース出版社、ニューヨーク（１９７５））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０２５３】
あるいは、天然型残基を共通の側鎖特性に基づいてグループに分類できる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２５４】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを必要とする。また、このような置換残基を保存的置換部位又は残りの（非保存的）部位に導入することもできる。
【０２５５】
置換変異体の一種は、親抗体（例えばヒト化又はヒト抗体）の１個以上の高頻度可変領域残基の置換を伴う。一般的に、さらなる発展のために得られた変異体は、それらが生成される親抗体に対して生物学的特性を変更（例えば、改善）しているであろう。典型的な置換変異体は、好都合にはファージディスプレイベースの親和性成熟技術を用いて生成できる親和性成熟抗体である。簡単に言えば、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）を変異させて、各部位に全ての可能なアミノ酸置換を生成する。このようにして生成された抗体は、各粒子内にパッケージングされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物）の少なくとも一部への融合物として繊維状ファージ粒子から表示される。その後、これらのファージディスプレイ変異体を、それらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、スキャニング変異誘発（例えば、アラニンスキャニング）を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは又はさらに、抗原・抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体と抗原との間の接触点を同定することが有益な場合がある。このような接触残基及び隣接残基は、本明細書に詳述されるものを含めて当技術分野において知られている技術に従う置換のための候補である。このような変異体が生成されたら、変異体のパネルを本明細書に記載されたもの含めて当該分野で公知の技術を用いてスクリーニングし、１以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する変異体をさらなる開発のために選択できる。
【０２５６】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当該技術分野において知られている様々な方法によって調製される。これらの方法としては、天然源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）、又はオリゴヌクレオチド仲介（若しくは部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及び抗体の以前に調製された変異体又は非変異体バージョンのカセット突然変異誘発による調製が挙げられる。
【０２５７】
本発明の抗体のＦｃ領域に１個以上のアミノ酸修飾を導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することが望ましい場合がある。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステインのアミノ酸位置を含めて１以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を有するヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含むことができる。
【０２５８】
この説明及び当該分野の教示によれば、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、例えばＦｃ領域において、野生型対応抗体と比較して１以上の改変を含むことができることが企図される。それにもかかわらず、これらの抗体は、それらの野生型対応物と比較して、治療上の有用性に必要な実質的に同じ特徴を維持する。例えば、所定の改変を、例えばＷＯ９９／５１６４２に記載されるように改変した（すなわち改善又は減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらすであろうＦｃ領域において行うことができると考えられる。Ｆｃ領域変異体の他の例に関しては、例えばＤｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）及びＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）には、ＦｃＲへの改善した又は減少した結合を有する抗体変異体が記載されている。これらの特許文献の内容を参照により本明細書で特に援用する。Ｓｈｉｅｌｄｓ外．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。半減期が増大し、かつ、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善した抗体（これは胎児への母性ＩｇＧの移動を担当する（Ｇｕｙｅｒ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４）））がＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１に記載されている（Ｈｉｎｔｏｎ外）。これらの抗体は、中に１個以上の置換を有するＦｃ領域を含み、これはＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する。改変されたＦｃ領域アミノ酸配列及び増加又は減少したＣ１ｑ結合能を有するポリペプチド変異体が米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号及びＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許文献の内容は、参照により本明細書で援用される。また、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ外．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）も参照されたい。
【０２５９】
別の態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの界面に修飾を含む抗体を提供し、該修飾は、ヘテロダイマー化を容易にする及び／又は促進する。これらの修飾は、第１Ｆｃポリペプチドに隆起を導入し、第２Ｆｃポリペプチドにキャビティを導入することを含み、該隆起は、第１及び第２Ｆｃポリペプチドの複合体形成を促進するようにキャビティ内に配置可能である。これらの修飾を有する抗体を生成する方法は、例えば米国特許第５７３１１６８号に記載されるように当該技術分野において知られている。
【０２６０】
さらに別の態様では、抗体の１個以上の残基がシステイン残基で置換されたシステイン操作抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を生成することが望ましいことがある。所定の実施形態では、置換された残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。システイン残基に置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体の接近可能な部位に配置され、そしてこれを使用して、本明細書でさらに説明するように薬物部分又はリンカー・薬物部分などの他の部分に抗体を結合する。所定の実施形態では、次の残基のいずれか１つ以上がシステインで置換されていてもよい：軽鎖のＶ２０５（カバット番号付け）；Ａ１１８の重鎖（ＥＵ番号付け）；及び重鎖のＦｃｒのＳ４００（ＥＵ番号付け）。
【０２６１】
８．抗体誘導体
本発明の抗体は、当該分野において知られておりかつ直ぐに利用できる追加の非タンパク質性部分を含むように修飾できる。いくつかの実施形態では、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性重合体である。水溶性重合体の非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体又はランダム共重合体のいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコール単独重合体、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため、製造の際に利点を有することができる。重合体は、任意の分子量のものであってよく、また、分岐又は非分岐であってよい。抗体に結合する重合体の数は様々なものであってよく、２種以上の重合体が結合される場合には、それらは同一又は異なる分子とすることができる。一般に、誘導体化に使用される重合体の数及び／又はタイプは、抗体誘導体が所定の条件下で治療に使用されるかどうかを問わず、改善されるべき抗体の特定の性質又は機能（これらに限定されない）を含めた考慮に基づいて決定できる。
【０２６２】
別の実施形態では、抗体と、放射線に選択的に曝露することによって加熱できる及び非タンパク質部分との結合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Ｋａｍ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は任意の波長のものであることができ、通常の細胞に害を与えないが、抗体・非タンパク質部分に近い細胞が死滅する温度にまで非タンパク質部分を加熱する波長が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６３】
Ｂ．抗体を作製する所定の方法
１．所定のハイブリドーマベース法
本発明のモノクローナル抗体は、まずＫｏｈｌｅｒ外，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載され、さらにヒト・ヒトハイブリドーマに関するＨｏｎｇｏ外，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５）、Ｈａｒｌｏｗ外，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ外，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製できる。
【０２６４】
さらなる方法としては、例えば、ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒト天然ＩｇＭ抗体の産生に関する米国特許第７１８９８２６号に記載されたものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）がＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載されている。
【０２６５】
他の様々なハイブリドーマ技術については、例えば、ＵＳ２００６／２５８８４１；ＵＳ００６／１８３８８７（完全ヒト抗体）、ＵＳ２００６／０５９５７５；ＵＳ２００５／２８７１４９；ＵＳ２００５／１００５４６；ＵＳ２００５／０２６２２９；並びに米国特許第７０７８４９２号及び同７１５３５０７号を参照されたい。ハイブリドーマ法を使用してモノクローナル抗体を産生するための例示的なプロトコルを以下に説明する。一実施形態では、ハムスターなどのマウス又は他の適切な宿主動物を免疫化して、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合することになる抗体を産生する又は産生することのできるリンパ球を誘発する。抗体は、変異型ＳＭＯ又はそのフラグメントを含むポリペプチド及びアジュバント、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）／トレハロースジコロリノミコレート（ＴＤＭ）の複数回の皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射により動物内で産生される（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）。変異型ＳＭＯ又はそのフラグメントを含むポリペプチドは、組換え方法などの当該技術分野で周知の方法を使用して調製でき、それらの方法のいくつかは、本明細書でさらに説明する。免疫化された動物からの血清を抗変異型ＳＭＯ抗体についてアッセイし、そして任意に追加免疫を投与する。抗変異型ＳＭＯ抗体を産生する動物からリンパ球を単離する。あるいは、リンパ球を試験管内で免疫化することができる。
【０２６６】
次いで、リンパ球をポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成させる。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）を参照されたい。効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、しかもＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である骨髄腫細胞を使用することができる。例示的な骨髄腫細胞としては、マウス骨髄腫株、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来のもの、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（米国メリーランド州ロックビル）から入手可能なＳＰ−２又はＸ６３−ＡＧ８−６５３細胞が挙げられるが、これらに限定されない。また、ヒト骨髄腫及びマウス・ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ外，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０２６７】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、好適な培地、例えば未融合の親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１種以上の物質を含有する培地中に播種し増殖させる。親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合には、ハイブリドーマ用の培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、それらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を阻害する。いくつかの実施形態では、例えばＥｖｅｎ外，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４（３），１０５−１０８（２００６）に記載されるように、無血清ハイブリドーマ細胞培養方法を使用して、ウシ胎児血清などの動物由来の血清の使用を低減させる。
【０２６８】
ハイブリドーマ細胞培養の生産性を向上させるためのツールとしてのオリゴペプチドは、Ｆｒａｎｅｋ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１１−１２２（２００５）に記載されている。具体的には、標準的な培養培地を、所定のアミノ酸（アラニン、セリン、アスパラギン、プロリン）又はタンパク質加水分解物画分で富化し、そしてアポトーシスを、３〜６個のアミノ酸残基から構成される合成オリゴペプチドによって有意に抑制することができる。ペプチドはミリモル以上の濃度で存在する。
【０２６９】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地は、変異型ＳＭＯに結合するモノクローナル抗体の産生についてアッセイすることができる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの試験管内結合アッセイによって決定できる。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばスキャッチャード分析法によって決定できる。例えば、Ｍｕｎｓｏｎ外，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）を参照されたい。
【０２７０】
所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定した後に、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、そして標準的な方法により増殖させることができる。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ（前出）を参照されたい。この目的に適した培養培地としては、例えばＤ−ＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍として生体内で増殖できる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、好適には、培養培地、腹水若しくは血清から又は例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって分離される。ハイブリドーマ細胞からのタンパク質の単離のための手順の一つがＵＳ２００５／１７６１２２及び米国特許第６９１９４３６号に記載されている。この方法は、結合プロセルにおいて、リオトロピック塩などの最小限の塩を使用すること、いくつかの実施形態では、また溶出プロセスにおい少量の有機溶媒を使用することを含む。
【０２７１】
２．所定のライブラリースクリーニング方法
本発明の抗体を、コンビナトリアルライブラリーを使用することによって作製して、１以上の所望の活性を有する抗体をスクリーニングすることができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーを作製し、このようなライブラリーを所望の結合特性を有する抗体についてスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野において知られている。このような方法は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ外．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ外著．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に一般的に記載されている。例えば、Ｌｅｅ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００４），３４０（５）：１０７３−９３に記載されているように目的の抗体を生成する方法の一つは、ファージ抗体ライブラリーを使用することである。
【０２７２】
原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質に融合した抗体可変領域（Ｆｖ）の様々なフラグメントを表示するファージを含むファージライブラリーをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリーは、所望の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選別される。所望の抗原に結合することができるＦｖフラグメントを発現するクローンを抗原に吸着させ、それによってライブラリー中における非結合クローンから分離する。その後、結合クローンを抗原から溶出させ、そして抗原吸着／溶出の追加サイクルによりさらに濃縮することができる。本発明の抗体のいずれかは、Ｋａｂａｔ外，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．１−３に記載されるように、好適な抗原スクリーニング手法を設計して目的のファージクローンを選択し、その後目的のファージクローン及び好適な定常領域（Ｆｃ）配列からのＦｖ配列を使用して全長抗体クローンを構築することにより得ることができる。
【０２７３】
所定の実施形態では、抗体の抗原結合ドメインは、約１１０アミノ酸の２個の可変（Ｖ）領域、それぞれ軽（ＶＬ）鎖及び重（ＶＨ）鎖から形成され、両方とも３個の超可変ループ（ＨＶＲ）又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を与える。可変ドメインは、Ｗｉｎｔｅｒ外，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、ＶＨ及びＶＬが短い柔軟なペプチドを介して共有結合した単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント又はそれぞれ定常ドメインに融合しかつ非共有結合的に相互作用するＦａｂフラグメントとしてファージ上に機能的に表示できる。本明細書で使用するときに、ｓｃＦｖコード化ファージクローン及びＦａｂコードファージクローンを、まとめて「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」という。
【０２７４】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングし、そしてファージライブラリーにおいてランダムに組み換えることができ、次いで、これをＷｉｎｔｅｒ外，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように抗原結合クローンについて探索することができる。免疫化源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに免疫原に高親和性抗体を与える。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ外，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるように、ナイーブなレパートリーをクローニングして、任意の免疫源なしに広範囲の非自己抗原のみならず自己抗原にヒト抗体の単一源を与える。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、ナイーブライブラリーを、幹細胞からの非再編成Ｖ遺伝子セグメントをクローニングし、そしてランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して合成的に作製して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、そして試験管内で再配置を達成することができる。
【０２７５】
所定の実施形態では、繊維状ファージを使用して、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって抗体フラグメントを表示する。抗体フラグメントは、例えばＭａｒｋｓ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されているようにＶＨ及びＶＬドメインが柔軟なポリペプチドスペーサーにより同じポリペプチド鎖に結合した一本鎖Ｆｖフラグメント又はＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ外，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９：４１３３−４１３７（１９９１）に記載されるように一方の鎖がｐＩＩＩに融合され、他方が細菌宿主細胞のペリプラズムに分泌される（その際、Ｆａｂコートタンパク質構造の組立が野生型コートタンパク質の一部を置換することによってファージ表面上に表示されるようになる）Ｆａｂフラグメントとして表示できる。
【０２７６】
一般に、抗体遺伝子フラグメントをコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。抗変異型ＳＭＯクローンに有利なライブラリーが望ましい場合には、被験体を変異型ＳＭＯで免疫化して抗体応答を生じさせ、そして脾臓細胞及び／又は循環性Ｂ細胞その他の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をライブラリー構築のために回収する。一実施形態では、抗変異型ＳＭＯクローンに有利なヒト抗体遺伝子フラグメントライブラリーは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを保有する（かつ機能的内因性抗体産生系を欠く）トランスジェニックマウスにおける抗変異型ＳＭＯ抗体応答を生じさせることによって得られ、それによって変異型ＳＭＯの免疫化が変異型ＳＭＯに対するヒト抗体を産生するＢ細胞をもたらす。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製について以下に説明する。
【０２７７】
抗変異型ＳＭＯ反応性細胞集団のさらなる濃縮は、適切なスクリーニング手法を使用して変異型ＳＭＯ特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離することによって、例えば変異型ＳＭＯアフィニティークロマトグラフィー用いた細胞分離又は蛍光色素標識変異型ＳＭＯに対する細胞の吸着、その後のフロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって得ることができる。
【０２７８】
あるいは、非免疫化ドナーからの脾臓細胞及び／又はＢ細胞或いは他のＰＢＬの使用により、可能な抗体レパートリーの良好な提示が得られ、また、任意の動物（ヒト又は非ヒト）種を使用して抗体ライブラリーの構築が可能になり、その際、変異型ＳＭＯは抗原性ではない。試験管内抗体遺伝子構築物に組み込まれるライブラリーについて、幹細胞を被験体から採取して、再編成されていない抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を与える。目的の免疫細胞は、様々な動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、オオカミ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種などから得ることができる。
【０２７９】
抗体可変遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコードする核酸を目的の細胞から回収し、そして増幅させる。再構成ＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリーの場合には、所望のＤＮＡは、Ｏｒｌａｎｄｉ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：３８３３−３８３７（１９８９）に記載されるように、リンパ球からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、その後再構成ＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端に合致するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、それによって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。Ｖ遺伝子は、Ｏｒｌａｎｄｉ外．（１９８９）及びＷａｒｄ外，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４−５４６（１９８９）に記載されるように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５’末端でのバックプライマー及びＪセグメント内に基づくフォワードプライマーを用いて、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅できる。しかしながら、ｃＤＮＡから増幅するために、バックプライマーは、Ｊｏｎｅｓ外，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９：８８−８９（１９９１）に記載されるようにリーダーエクソンに基づくこともでき、フォワードプライマーは、Ｓａｓｔｒｙ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：５７２８−５７３２（１９８９）に記載されるように定常領域内に基づくこともできる。相補性を最大化するために、Ｏｒｌａｎｄｉ外（１９８９）又はＳａｓｔｒｙ外（１９８９）に記載されるように縮重をプライマーに組み込むことができる。所定の実施形態では、ライブラリーの多様性は、例えばＭａｒｋｓ外．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）の方法に記載されるように又はＯｒｕｍ外，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：４４９１−４４９８（１９９３）の方法に記載されるにように、免疫細胞核酸サンプル中に存在する利用可能な全てのＶＨ及びＶＬ配置を増幅するために各Ｖ遺伝子ファミリーに標的化されたＰＣＲプライマーを使用することによって最大化される。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングについては、まれな制限部位を、Ｏｒｌａｎｄｉ外（１９８９）に記載されるようにＰＣＲプライマー内に一方の末端のタグとして又はＣｌａｃｋｓｏｎ外，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されるようにタグプライマーによるさらなるＰＣＲ増幅によって導入することができる。
【０２８０】
合成的に再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントから試験管内で誘導できる。ヒトＶＨ遺伝子セグメントの大部分はクローニングされ、配列決定され（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７７６−７９８（１９９２）に報告）、マッピングされている（Ｍａｔｓｕｄａ外，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，３：８８−９４（１９９３）に報告）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、これらのクローニングされたセグメント（Ｈ１及びＨ２ループの全ての主要なコンホメーションを含む）を使用して、多様な配列及び長さのＨ３ループコードするＰＣＲプライマーで多様なＶＨ遺伝子レパートリーを生成することができる。また、ＶＨレパートリーは、Ｂａｒｂａｓ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７−４４６１（１９９２）に記載されるように、単一の長の長いＨ３ループに焦点を当てた全ての配列多様性を使用して作製することもできる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニングされ、配列決定されており（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３：１４５６−１４６１（１９９３）に報告）、そしてこれを使用して合成軽鎖レパートリーを作製することができる。ＶＨ及びＶＬの折りたたみの範囲並びにＬ３及びＨ３の長さに基づく合成Ｖ遺伝子レパートリーは、かなりの構造的多様性の抗体をコードすることになる。Ｖ遺伝子コードＤＮＡの増幅後に、生殖系列Ｖ遺伝子セグメントは、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）の方法に従って新件環内で再配列できる。
【０２８１】
抗体フラグメントのレパートリーは、いくつかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを組み合わせることによって構築できる。それぞれのレパートリーは異なるベクターで作製でき、例えばＨｏｇｒｅｆｅ外，Ｇｅｎｅ，１２８：１１９−１２６（１９９３）に記載されるようにこれらのベクターを試験管内で再結合させることができ、又はコンビナトリアル感染、例えばＷａｔｅｒｈｏｕｓｅ外，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３）に記載されたｌｏｘＰシステムによって生体内で再結合させることができる。生体内組換えのアプローチは、大腸菌形質転換効率によって課されるライブラリーサイズの制限を克服するために、Ｆａｂフラグメントの２本鎖の性質を利用する。ナイーブＶＨ及びＶＬレパートリーは、別々にクローニングされ、一方がファージミドにクローニングされ、他方はファージベクターにクローニングされる。その後、これら２つのライブラリーをファージミド含有細菌のファージ感染によって合成し、その結果、それぞれの細胞は異なる組合せを含み、ライブラリーサイズは、存在する細胞の数（約１０12クローン）によって制限されることになる。両方のベクターは、生体内組換えシグナルを含み、その結果、ＶＨ及びＶＬ遺伝子は単一のレプリコンに組み換えられ、ファージビリオンに同時パッキングされることになる。これら巨大なライブラリーは、良好な親和性（約１０-8ＭのＫd-1）の多数の抗体を与える。
【０２８２】
また、これらのレパートリーを、例えばＢａｒｂａｓ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されるように同じベクターに連続的にクローニングし、又は例えばＣｌａｃｋｓｏｎ外，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）に記載されるようにＰＣＲによって一緒にアセンブルし、その後クローニングすることができる。また、ＰＣＲアセンブリを使用して、ＶＨ及びＶＬ  ＤＮＡと、柔軟なペプチドスペーサーをコードするＤＮＡとを結合させて単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）レパートリーを形成させることもできる。さらに別の技術では、Ｅｍｂｌｅｔｏｎ外，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：３８３１−３８３７（１９９２）に記載されるように、「細胞内ＰＣＲアセンブリ」を使用して、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせる、その後連結した遺伝子のレパートリーをクローニングする。
【０２８３】
ナイーブライブラリーによって産生された抗体（天然又は合成のいずれか）は、中程度の解離定数（約１０6〜１０7Ｍ-1のＫｄ-1）のものであることができるが、親和性成熟は、Ｗｉｎｔｅｒ外（１９９４）（前出）に記載されるように二次ライブラリーから構築しかつ再選択することにより試験管内でも模倣できる。例えば、突然変異は、Ｈａｗｋｉｎｓ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９−８９６（１９９２）の方法又はＧｒａｍ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０（１９９２）の方法で、エラープローンポリメラーゼを使用することによって試験管内でランダムに導入できる（Ｌｅｕｎｇ外，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５（１９８９）に報告）。さらに、親和性成熟を、１以上のＣＤＲをランダムに突然変異させ、例えば選択された個々のＦｖクローンにおいて目的のＣＤＲに及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを使用して、より高い親和性クローンについてスクリーニングすることによって行うことができる。ＷＯ９６／０７７５４（１９９６年３月１４日公開）には、軽鎖遺伝子のライブラリーを作製するために、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域に変異誘発を誘導するための方法が記載されている。別の効果的なアプローチは、Ｍａｒｋｓ外，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されるように、ファージディスプレイにより選択されたＶＨ又はＶＬドメインと非免疫化ドナーから得られた天然型Ｖドメイン変異体のレパートリーとを再結合させ、数ラウンドの鎖再配置でさらに高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、約１０-9Ｍ以下の親和性を有する抗体及び抗体フラグメントの生成を可能にする。
【０２８４】
ライブラリーのスクリーニングは、当該技術分野において知られている様々な技術によって達成できる。例えば、変異型ＳＭＯを使用して吸着プレートのウェルを被覆し、吸着プレート上に固定された宿主細胞上で発現させ又は細胞選別に使用し、又はストレプトアビジン被覆ビーズによる捕獲のためにビオチンに結合させ、又はファージディスプレイライブラリーをパニングするための任意の他の方法で使用する。
【０２８５】
ファージライブラリサンプルと固定化変異型ＳＭＯとを、ファージ粒子の少なくとも一部分と吸着材とを結合させるのに適した条件下で接触させる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度等を含めた条件は、生理学的条件を模倣するように選択される。固相に結合したファージを洗浄した後に、例えばＢａｒｂａｓ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：７９７８−７９８２（１９９１）に記載されるように酸によって溶出させ、又は例えばＭａｒｋｓ外，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されるようにアルカリにより溶出させ、又は変異型ＳＭＯの抗原競合により、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ外，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）の抗原競合法に類似する手順で溶出させる。ファージは、１回目の選択で２０〜１，０００倍に濃縮できる。さらに、濃縮されたファージを細菌培養で増殖させ、そしてさらなる選択ラウンドに供すことができる。
【０２８６】
選択効率は、洗浄中の解離動態及び単一のファージ上の複数の抗体フラグメントが同時に抗原と結合できるかどうかを含めて多くの要因に依存する。速い解離動態（及び弱い結合親和性）を有する抗体は、短時間の洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相における抗原の高い被覆密度を使用することによって保持できる。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化させるのみのならず、解離したファージの再結合にも有利である。遅い解離速度（及び良好な結合親和性）を有する抗体の選択は、Ｂａｓｓ外．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，８：３０９−３１４（１９９０）及びＷＯ９２／０９６９０に記載されるような長時間の洗浄及び一価ファージディスプレイ及びＭａｒｋｓ外，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されるような抗原の低い被覆密度を使用することによって促進できる。
【０２８７】
僅かに異なる親和性を有する異なる親和性のファージ抗体間で変異型ＳＭＯについて選択することが可能である。しかしながら、選択された抗体のランダム変異（例えば、いくつかの親和性成熟技術で実施されるような）は、ほとんどが抗原に結合し、いくつかが高い親和性を有するなどの多数の変異体を生じさせる可能性がある。変異型ＳＭＯを制限すると、高い親和性のファージはまれにしか競合し得ない。より高い親和性の変異体を全て維持するために、ファージを過剰なビオチン化変異型ＳＭＯと共にインキュベートとすることができるが、ただしビオチン化変異型ＳＭＯは変異型ＳＭＯについて一定の標的モル親和性定数よりも低いモル濃度である。その後、高親和性結合ファージをストレプトアビジン被覆常磁性ビーズによって捕獲できる。このような「平衡捕捉」は、抗体を、低い親和性を有するファージの大過剰から２倍程度に高い親和性を有する変異型クローンの単離を可能にする感受性でそれらの結合親和性に応じて選択することを可能にする。また、固相に結合したファージを洗浄するのに使用される条件を操作して解離定数に基づいて区別することができる。
【０２８８】
抗変異型ＳＭＯクローンは活性に基づいて選択できる。所定の実施形態では、本発明は、例えばＧＤＣ−０４４９耐性腫瘍細胞などの変異型ＳＭＯを自然に発現する生細胞に結合する抗変異型ＳＭＯ抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、野生型ＳＭＯにおいてＧＤＣ−０４４９によって結合されたものと同じ領域に結合する抗変異型ＳＭＯ抗体を提供する。このような抗変異型ＳＭＯ抗体に相当するＦｖクローンは、（１）上記のようなファージライブラリーから抗変異型ＳＭＯクローンを単離し、そして任意に好適な細菌宿主内において集団を成長させることによりファージクローンの単離集団を増幅させ、（２）それぞれブロック性及び非ブロック性活性が望まれる変異型ＳＭＯ及び第２タンパク質を選択し、（３）抗変異型ＳＭＯファージクローンを固定化変異型ＳＭＯに吸着させ、（４）過剰の第２タンパク質を使用して、第２タンパク質の結合決定基と重複又は共有する変異型ＳＭＯ結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出させ、及び（５）工程（４）後に吸着されたままのクローンを溶出させることによって選択できる。任意に、所望のブロック／非ブロック特性を有するクローンを、本明細書に記載の選択手順を一回以上繰り返すことによってさらに濃縮することができる。
【０２８９】
本発明のハイブリドーマ由来モノクローナル抗体又はファージディスプレイＦｖクローンを、ＤＮＡをコードする従来の手順を使用して容易に単離し、そして配列決定する（例えば、ハイブリドーマ又はファージＤＮＡ鋳型から目的の重鎖及び軽鎖コード領域を特異的に増幅するために設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって）。いったん単離されたら、ＤＮＡは、発現ベクター内に配置でき、次いでこれを大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞内で所望のモノクローナル抗体の合成を得る。抗体コードＤＮＡの細菌における組換え発現に関する概説論文としては、Ｓｋｅｒｒａ外，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６（１９９３）及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ，１３０：１５１（１９９２）が挙げられる。
【０２９０】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡを、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする既知のＤＮＡ配列と組み合わせて（例えば、適切なＤＮＡ配列はＫａｂａｔ外（前出）から得ることができる）、全長又は部分長の重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成することができる。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含めて任意のアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用できること、このような定常領域を任意のヒト又は動物種から得ることができることが分かるであろう。一方の動物種（ヒトなど）の可変ドメインＤＮＡから誘導され、その後他方の動物種の定常領域ＤＮＡに融合させて「ハイブリッド」の完全長重鎖及び／又は軽鎖のためのコード配列を形成させたＦｖクローンは、ここで使用される「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に包含される。所定の実施形態では、ヒト可変ＤＮＡ由来のＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合させて全長又は部分長ヒト重鎖及び／又は軽鎖のためのコード配列を形成させる。
【０２９１】
また、本発明のハイブリドーマに由来する抗変異型ＳＭＯ抗体をコードするＤＮＡを、例えばハイブリドーマクローン由来の相同マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって修飾できる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）の方法のように）。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来抗体又はそのフラグメントをコードするＤＮＡを、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによってさらに修飾できる。このように、本発明のＦｖクローン又はハイブリドーマクローン由来抗体の結合特異性を有する「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０２９２】
３．ベクター、宿主細胞及び組換え方法
また、抗体は、組換え法を使用して製造することもできる。抗変異型ＳＭＯ抗体の組換え生成のために、抗体をコードする核酸を単離し、そしてさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは容易に単離でき、従来の手順を用いて配列決定できる（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分としては、一般的に、次の１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１個以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列。
【０２９３】
（ａ）シグナル配列成分
本発明の抗体は、組換えにより直接生成できるのみのならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生成でき、これは、いくつかの実施形態では、シグナル配列又は成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである。選択される異種シグナル配列は、いくつかの実施形態では、宿主細胞によって認識及びプロセシング（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断）されるものである。天然抗体シグナル配列を認識及びプロセシングしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ又は熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーから選択される原核生物シグナル配列によって置換する。酵母分泌のために、天然シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス及びクルイベロミセスα−因子リーダーを含む）又は酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンスグルコアミラーゼリーダー又はＷＯ９０／１３６４６号トに記載の信号に記載されたシグナルで置換できる。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０２９４】
（ｂ）複製起点
発現ベクター及びクローニングベクターの両方は、１種以上の選択された宿主細胞内においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターでは、この配列は、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製するのを可能にし、かつ、複製起点又は自律複製配列を含むものである。このような配列は、様々な細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ではない（ＳＶ４０起点が典型的にはそれのみで使用できる。これは初期プロモーターを含むからである）。
【０２９５】
（ｃ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性欠損を補完し、又は（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養素、例えば、ＢａｃｉｌｌｉのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
【０２９６】
選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止させる薬剤を使用する。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生成するため、選択レジメンを生き残る。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０２９７】
哺乳動物細胞に好適な選択可能マーカーの他の例は、抗体コード核酸を取り込むことのできる細胞の同定を可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、例えば、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。
【０２９８】
例えば、ＤＨＦＲ遺伝子で形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地中で形質転換体を培養することによって同定される。これらの条件下では、ＤＨＦＲ遺伝子は、任意の他の共形質転換核酸とともに増幅される。内因性ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０９６）を使用することができる。
【０２９９】
あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、ＧＳの阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシミンを含む培地中で形質転換体（Ｍｓｘ）を培養することによって同定される。これらの条件下では、ＧＳ遺伝子は、任意の他の共形質転換された核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅系は、上記のＤＨＦＲ選択／増幅系と組み合わせて使用できる。
【０３００】
別の方法として、形質転換された又は目的の抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲ遺伝子及びアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）など他の選択可能マーカーで同時形質転換された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）を、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン又はＧ４１８などの選択可能マーカーに対する選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択できる。米国特許第４９６５１９９を参照されたい。
【０３０１】
酵母での使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ外，Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９））。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカー、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１を与える。Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）。そのときに、酵母宿主細胞ゲノムにおけるｔｒｐ１欠損の存在は、トリプトファンの不在下での増殖による形質転換を検出するのに効果的な環境を与える。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
【０３０２】
また、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ酵母の形質転換に使用できる。あるいは、組換えウシキモシンの大規模生産用の発現系がＫ．ｌａｃｔｉｓについて報告されている。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０）。クルイベロミセスの産業的菌株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌用の安定なマルチコピー発現ベクターも開示されている。Ｆｌｅｅｒ外，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１）。
【０３０３】
（ｄ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは、一般に、宿主生物によって認識され、かつ、抗体をコードする核酸に機能的に結合しているプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に適したプロモーターとしては、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターなどが挙げられる。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが好適である。また、細菌系で使用するためのプロモーターは、抗体をコードするＤＮＡに機能的に連結されたシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列を有する。
【０３０４】
真核生物についてはプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始位置から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであることができる）領域である。大部分の真核生物遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加するためのシグナルであることができるＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列の全ては、真核生物発現ベクターに好適に挿入される。
【０３０５】
酵母宿主で使用するのに好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのためのプロモーターが挙げられる。
【０３０６】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のプロモーター領域である。酵母発現での使用に適したベクター及びプロモーターは、さらにＥＰ７３，６５７に記載されている。また、酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に有利に使用される。
【０３０７】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体転写は、例えば、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムから得られるプロモーター又は異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターによって制御できるが、ただし、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合性であることを条件とする。
【０３０８】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、好都合には、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をも含むＳＶ４０制限フラグメントとして得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとして簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを使用する哺乳動物宿主内でＤＮＡを発現する系が米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾が米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現についてのＲｅｙｅｓ外，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端リピートをプロモーターとして使用することができる。
【０３０９】
（ｅ）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増大される場合が多い。現在、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）からの多くのエンハンサー配列が知られている。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用するであろう。例としては、複製起点の後期側にあるＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側にあるポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、真核生物プロモーターの活性化のための増強要素についてのＹａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７−１８（１９８２）も参照されたい。エンハンサーは、抗体コード配列に対して５’又は３’位でベクターにスプライシングできるが、ただし、いくつかの実施形態では、プロモーターから５’位に位置する。
【０３１０】
（ｆ）転写終結成分
また、真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含有するであろう。このような配列は、真核生物又はウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’及び場合によっては３’非翻訳領域から一般に入手できる。これらの領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。有用な転写終結成分の一つは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びそこに開示された発現ベクターを参照されたい。
【０３１１】
（ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここで、ベクターにおいてＤＮＡをクローニングする又は発現させるのに好適な宿主細胞は、上記原核生物、酵母菌又は高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物としては、グラム陰性又はグラム陽性生物などの真性細菌、例えば腸内細菌科、例えば大腸菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、セラチア、例えばＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）、シュードモナス属、例えばＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びストレプトマイセス属が挙げられる。可能なＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主の一つは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、そのようなＥ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の株も好適である。これらの例は限定ではなく例示である。
【０３１２】
全長抗体は、抗体融合タンパク質及び抗体フラグメントは、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、例えば治療用抗体がそれ自体腫瘍細胞破壊に有効性を示す細胞傷害性剤（例えば毒素）に結合する場合には細菌内で産生できる。全長抗体は、血液循環においてより長い半減期を有する。Ｅ．ｃｏｌｉでの酸性はより速く、よりコスト効率的である。細菌内における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば米国特許第５６４８２３７号（Ｃａｒｔｅｒ外）、米国特許第５７８９１９９号（Ｊｏｌｙ外）、米国特許第５８４０５２３号（Ｓｉｍｍｏｎｓ外）を参照されたい。これらには、発現及び分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）及びシグナル配列が記載されている。また、Ｅ．ｃｏｌｉ内における抗体フラグメントの発現を記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ著，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい。発現後、抗体を可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離することができ、そして例えばアイソタイプに応じてプロテインＡ又はＧカラムに通して精製することができる。最終の精製は、例えばＣＨＯ細胞内で発現した抗体を精製するための方法と同様に実施できる。
【０３１３】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物は、抗体コードベクターのための好適なクローニング又は発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又は一般的なパン酵母が下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用されている。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株が本明細書で一般的に入手可能でありかつ有用であり、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；クルイベロミセス宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；及び糸状菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム及びアスペルギルス宿主、例えばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなどがある。治療用タンパク質の産生のための酵母及び糸状菌の使用を議論する総説については、例えば、Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）を参照されたい。
【０３１４】
経路が「ヒト化」されており、部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす所定の真菌及び酵母株を選択することができる。例えばＬｉ外．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）（ピキア・パストリスにおけるグリコシル化経路のヒト化を記載する）及びＧｅｒｎｇｒｏｓｓ（前出）を参照されたい。
【０３１５】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株及び変異体並びに宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（毛虫）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどが同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異体及びＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明に係るウイルスとして使用できる。
【０３１６】
また、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、ウキクサ（ウキクサ）、アルファルファ（Ｍ．ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同６０４０４９８号、同６４２０５４８号、同７１２５９７８号及び同６４１７４２９号（トランスジェニック植物内で抗体を産生するためＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載する）を参照されたい。
【０３１７】
脊椎動物細胞を宿主として使用することができ、また培養中の脊椎動物細胞の増殖（組織培養）が日常的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３又は２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ外，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ外，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））及び骨髄腫細胞株、例えばＮＳ０及びＳＰ２／０などが挙げられる。抗体産生に適した所定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ著，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２５５−２６８を参照されたい。
【０３１８】
宿主細胞は、抗体の産生のために上記発現又はクローニングベクターで形質転換され、そしてプロモーターを誘導し、形質転換体を選択し又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に改変された従来の栄養培地中で培養される。
【０３１９】
（ｈ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地で培養できる。例えばハムのＦ１０（シグマ社）、最小必須培地（（ＭＥＭ）（シグマ社）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ社）及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、シグマ社）などの市販の培地が宿主細胞の培養に好適である。
【０３２０】
さらに、Ｈａｍ外，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ外，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；又は再発行米国特許第３０９８５号に記載された培地のいずれかを宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれは、ホルモン及び／又は他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン若しくは上皮増殖因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）など）、微量元素（マイクロモル範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物であると定義される）、グルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充できる。また、他の任意の必要な補充物質が当業者に知られている適当な濃度で含まれていてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で使用されるものであり、当業者には明らかであろう。
【０３２１】
（ｉ）抗体の精製
組換え技術を使用する場合には、抗体を細胞内、細胞膜周辺腔内で産生することができ又は培地に直接分泌させることができる。抗体が細胞内で産生される場合には、第一工程として、粒状の破片、宿主細胞又は溶解フラグメントのいずれかを、例えば、遠心分離や限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒ外，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）には、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。簡単に述べると、細胞ペーストを約３０分にわたって酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で柔らかくする。細胞破片を遠心分離により除去することができる。抗体を培地中に分泌させる場合には、このような発現系からの上清を、一般に、まず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎやＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を、タンパク質分解を阻害する上記の任意の工程に含めることができ、また、抗生物質を外来性の汚染物の成長を防止するために含めることができる。
【０３２２】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製できる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づいて抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋ外，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧが全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ外．（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７−１５７５）。アフィニティーリガンドが結合するマトリックスはアガロースである場合が多いが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣH３ドメインを含む場合には、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製に有用である。また、タンパク質精製のための他の技術、例えばイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィーでのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿も回収されるべき抗体に応じて利用可能である。
【０３２３】
任意の予備的精製工程後に、目的の抗体と汚染物とを含む混合物を、約２．５〜４．５のｐＨの溶離緩衝液を使用して低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供し、いくつかの実施形態では低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施できる。
【０３２４】
一般に、研究、試験及び臨床に使用するための抗体を調製する様々な方法が当該分野で十分に確立されており、これは上記方法と整合し及び／又は目的の特定の抗体について当業者により適切とみなされている。
【０３２５】
Ｃ．免疫複合体
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント）又は放射性同位体（すなわち、放射性結合体）といった１種以上の細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む（区別なく「抗体・薬剤結合体」又は「ＡＤＣ」という。）免疫複合体を提供する。
【０３２６】
免疫複合体は、癌の治療において細胞傷害性薬剤、すなわち、細胞を死滅させる又は細胞の成長若しくは増殖を阻害する薬剤の局所送達のために使用されている（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：５４３−５４９；Ｗｕ外（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１３７−１１４６；Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）ｉ３：２０７−２１２；Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４；Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２；米国特許第４９７５２７８号）。免疫複合体は、腫瘍への薬剤成分の標的送達及び細胞内蓄積を可能にし、ここで、非結合型薬物の全身投与は、正常細胞のみならず排除しようとする腫瘍細胞に対する許容できないレベルの毒性もたらすことがある（Ｂａｌｄｗｉｎ外，Ｌａｎｃｅｔ（Ｍａｒ．１５，１９８６）ｐｐ．６０３−０５；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａ外著）ｐｐ．４７５−５０６。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方がこれらの戦略において有用であると報告されている（Ｒｏｗｌａｎｄ外，（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２１：１８３−８７）。これらの方法において使用される薬物としては、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート及びビンデシンが挙げられる（Ｒｏｗｌａｎｄ外（１９８６）前出）。抗体・毒素複合体で使用される毒素は、細菌毒素、例えばジフテリア毒素、植物毒素、例えばリシン、小分子毒素、例えばゲルダナマイシン（Ｍａｎｄｌｅｒ外（２０００）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１；Ｍａｎｄｌｅｒ外（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８；Ｍａｎｄｌｅｒ外（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１）、メイタンシノイド（ＥＰ１３９１２１３；Ｌｉｕ外，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３）、及びカリケアマイシン（Ｌｏｄｅ外（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８；Ｈｉｎｍａｎ外（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）が挙げられる。毒素は、ＤＮＡ結合、又はトポイソメラーゼ阻害、チューブリン結合を含めたメカニズムによってそれらの細胞毒性効果を発揮することができる。いくつかの細胞傷害性薬剤は、大きな抗体又はタンパク質受容体リガンドに結合した場合には非活性又は低活性になる傾向がある。
【０３２７】
ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン、バイオジェン／Ｉｄｅｃ社）は、正常及び悪性Ｂリンパ球の表面に見出されるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１カッパモノクローナル抗体とチオ尿素リンカー・キレート剤によって結合した１１１Ｉｎ又は９０Ｙ放射性同位体とから構成される抗体・放射性同位元素複合体である（Ｗｉｓｅｍａｎ外（２０００）Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２７（７）：７６６−７７；Ｗｉｓｅｍａｎ外（２００２）Ｂｌｏｏｄ  ９９（１２）：４３３６−４２；Ｗｉｔｚｉｇ外（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１０）：２４５３−６３；Ｗｉｔｚｉｇ外（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０（１５）：３２６２−６９）。ＺＥＶＡＬＩＮはＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与はほとんどの患者では重症及び長期の血球減少をもたらす。ＭＹＬＯＴＡＲＧ（商標）（ゲムツズマブ・オゾガミシン、Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、すなわちカリケアマイシンに結合したｈｕＣＤ３３抗体から構成される抗体・薬剤複合体が注射による急性骨髄性白血病の治療のために２０００年に承認された（Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ（２０００）２５（７）：６８６；米国特許第４９７０１９８号；同５０７９２３３号；同５５８５０８９号；同５６０６０４０号；同５６９３７６２号；同５７３９１１６号；同５７６７２８５号；同５７７３００１号）。カンツズマブ・メルタンシン（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ社）、すなわちメイタンシノイド薬剤部分ＤＭ１にジスルフィドリンカーＳＰＰを介して結合したｈｕＣ２４２抗体からなる抗体・薬剤複合体は、結腸、膵臓、胃、及び他の癌などのＣａｎＡｇを発現する癌の治療のためにフェーズＩＩ試験に進んでいる。ＭＬＮ−２７０４（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．、ＺＬ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ社）、すなわちメイタンシノイド薬剤部分ＤＭ１に結合した抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体からなる抗体・薬剤複合体が前立腺腫瘍の潜在的な治療のために開発中である。アウリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）及びモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）、すなわちドラスタチンの合成アナログは、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌細胞上のルイスＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的）にコンジュゲートされ（Ｄｏｒｏｎｉｎａ外（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（７）：７７８−７８４）、そして治療開発中である。
【０３２８】
所定の実施形態では、免疫複合体は、抗体及び化学療法剤又は他の毒素を含む。免疫複合体の生成に有用な化学療法剤は本明細書に記載されている（例えば上記）。使用することができる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。例えば１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。様々な放射性核種が放射結合抗体の産生のために利用可能である。例としては、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ及び186Ｒｅが挙げられる。抗体と細胞障害剤との結合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス  ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素をＶｉｔｅｔｔａ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が放射性ヌクレオチドの抗体への結合のためのキレート剤の例である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。
【０３２９】
また、抗体とカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン及びＣＣ１０６５並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体といった１種以上の小分子毒素との結合体もここでは意図される。
【０３３０】
１．メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、１種以上のメイタンシノイド分子に結合した抗体（全長又はフラグメント）を含む。
【０３３１】
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初に、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。その後、ある種の微生物もメイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルなどのメイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成メイタンシノール並びにその誘導体及びアナログは、例えば次の米国特許に開示されている：４，１３７，２３０；４，２４８，８７０；４，２５６，７４６；４，２６０，６０８；４，２６５，８１４；４，２９４，７５７；４，３０７，０１６；４，３０８，２６８；４，３０８，２６９；４，３０９，４２８；４，３１３，９４６；４，３１５，９２９；４，３１７，８２１；４，３２２，３４８；４，３３１，５９８；４，３６１，６５０；４，３６４，８６６；４，４２４，２１９；４，４５０，２５４；４，３６２，６６３；及び４，３７１，５３３。
【０３３２】
メイタンシノイド薬剤部分は、抗体薬剤複合体における魅力的な薬剤部分である。というのは、これらのものは、（ｉ）発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって比較的準備しやすく、（ｉｉ）抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる結合に適した官能基を有する誘導体化に適しており、（ｉｉｉ）血漿中で安定であり、及び（ｉｖ）様々な腫瘍細胞株に対して有効だからである。
【０３３３】
メイタンシノイドを含む免疫複合体、その製造方法及びそれらの治療用途は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号並びに欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１に開示されている。これらの開示をここに明示的に援用する。Ｌｉｕ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３（１９９６）には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合したＤＭ１と示されるメイタンシノイドを含む免疫複合体が記載されている。この複合体は、培養された結腸癌細胞に対して極めて細胞毒性であることが分かり、また生体内腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Ｃｈａｒｉ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）には、メイタンシノイドがヒト結腸癌細胞株上の抗原に結合するマウス抗体Ａ７又はＨＥＲ−２／ｎｅｕ発癌遺伝子に結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１にジスルフィドリンカーを介して結合した免疫複合体が記載されている。ＴＡ．１メイタンシノイド複合体の細胞毒性は、細胞当たり３×１０5のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞株ＳＫ−ＢＲ−３について試験管内で試験された。この薬剤複合体は、遊離メイタンシノイド剤に類似する細胞障害度を達成したところ、これは、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増やすことによって増大できた。Ａ７メイタンシノイド複合体は、マウスにおいて低い全身性細胞障害性を示した。
【０３３４】
抗体・メイタンシノイド複合体は、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性を有意に減少させることなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第５，２０８，０２０号参照（その開示は本明細書において参照により援用される）。抗体分子当たり結合した平均３〜４個のメイタンシノイド分子は、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞の細胞毒性を増強するのに有効性を示したが、毒素／抗体の１分子であっても裸抗体の使用について細胞傷害性を増強することが期待される。メイタンシノイドは、当該分野で周知であり、かつ、既知の技術によって合成又は天然源から単離できる。好適なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５，２０８，０２０号並びに他の特許及び上で言及した非特許刊行物に開示されている。いくつかの実施形態では、メイタンシノイドは、芳香族環又はメイタンシノール分子の他の位置で修飾されたメイタンシノール及びメイタンシノールアナログ、例えば様々なメイタンシノールエステルである。
【０３３５】
当該技術分野においては、抗体・メイタンシノイド複合体を作製するために知られている多くの結合基、例えば米国特許第５，２０８，０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、Ｃｈａｒｉ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）及び２００４年１０月８日に出願された米国特許出願公開第１０／９６０６０２号に記載されたものが存在する。これらの開示はここに明示的に援用される。リンカー成分ＳＭＣＣを含む抗体・メイタンシノイド複合体は、２００４年１０月８日に出願された米国特許出願公開第１０／９６０６０２号に開示されるように調製できる。連結基としては、上記特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基、又はエステラーゼ不安定性基、ジスルフィド及びチオエーテル基をいくつかの実施形態で使用することができる。追加の連結基は、本明細書に記載及び例示されている。
【０３３６】
抗体及びメイタンシノイドとの複合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス  ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウム）エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製できる。いくつかの実施形態では、カップリング剤としては、ジスルフィド結合を与えるためのＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ外，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７（１９７８））及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が挙げられる。
【０３３７】
リンカーは、結合の種類に応じて、様々な位置でメイタンシノイド分子に結合できる。例えば、エステル結合は、従来のカップリング技術を使用してヒドロキシル基との反応により形成できる。この反応は、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位で生じることができる。一実施形態では、結合は、メイタンシノール又はメイタンシノールアナログのＣ−３位で形成される。
【０３３８】
２．アウリスタチン及びドラスタチン
いくつかの実施形態では、免疫複合体は、ドラスタチン又はドラスタチンペプチドアナログ及び誘導体、アウリスタチンに結合した抗体を含む（米国特許第５６３５４８３号；同５７８０５８８号）。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管ダイナミクス、ＧＴＰ加水分解並びに核及び細胞分裂に干渉することが示されており（Ｗｏｙｋｅ外（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、また抗癌（米国特許第５６６３１４９号）及び抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔ外１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有する。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤部分は、ペプチド薬剤部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に結合できる（ＷＯ０２／０８８１７２）。
【０３３９】
代表的なアウリスタチンの実施形態としては、「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、２００４年１１月５日出願された米国特許出願公開第１０／９８３３４０号に開示されたＮ末端結合モノメチルアウリスタチン薬剤部分ＤＥ及びＤＦを含む。これらの開示は、その全体が参照により援用される。
【０３４０】
典型的には、ペプチド系薬剤部分は、２個以上のアミノ酸及び／又はペプチドフラグメント間でペプチド結合を形成することによって調製できる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野でよく知られている液相合成法に従って調製できる（Ｅ．Ｓｃｈｒoｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｌuｂｋｅ，「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照）。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤部分は、次の方法に従って調製できる：米国特許第５６３５４８３号；米国特許第５７８０５８８号；Ｐｅｔｔｉｔ外（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：５４６３−５４６５；Ｐｅｔｔｉｔ外（１９９８）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  １３：２４３−２７７；Ｐｅｔｔｉｔ，Ｇ．Ｒ．外，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，９９６，７１９−７２５；及びＰｅｔｔｉｔ外（１９９６）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  ５：８５９−８６３。また、Ｄｏｒｏｎｉｎａ（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１（７）：７７８−７８４；「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、２００４年１１月５日出願された米国特許出願公開第１０／９８３３４０号も参照されたい。これらの文献は、その全体が参照により援用される（例えば、リンカーに結合したＭＭＡＥ及びＭＭＡＦなどのモノメチルバリン化合物を調製するリンカー及び方法が開示される）。
【０３４１】
３．カリケアマイシン
他の実施形態では、免疫複合体は、１個以上のカリケアマイシン分子に結合した抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル以下の濃度で二本鎖ＤＮＡ破壊を生じさせることができる。カリケアマイシンファミリーの結合体の調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号（全てアメリカンシアナミド社）を参照されたい。使用可能なカリケアマイシンの構造的アナログとしては、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１が挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｉｎｍａｎ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３）、Ｌｏｄｅ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）及び上記Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ社の米国特許）。抗体が結合できる他の抗腫瘍剤は、抗葉酸剤であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡの両方は細胞内に作用部位を有し、かつ、形質膜を容易に通過しない。したがって、抗体仲介インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞取り込みは、細胞障害効果を大きく向上させる。
【０３４２】
４．他の細胞毒性剤
抗体に結合できる他の抗腫瘍剤としては、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５−フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されているＬＬ−Ｅ３３２８８複合体としてまとめて知られている薬剤ファミリー並びにエスペラマイシン（米国特許第５８７７２９６号）が挙げられる。
【０３４３】
使用できる酵素的に活性な毒素及びそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、エノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
【０３４４】
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ又はデオキシなどのＤＮＡエンドヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ）との間に形成された免疫複合体を意図する。
【０３４５】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高放射性原子を含むことができる。様々な放射性同位体が放射性結合抗体の産生のために利用可能である。例としては、Ａｔ211、Ｉ131、Ｉ125、Ｙ90、Ｒｅ186、Ｒｅ188、Ｓｍ153、Ｂｉ212、Ｐ32、Ｐｂ212及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。結合体を検出に使用する場合には、このものは、シンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても知られている）用のスピン標識、例えばヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含むことができる。
【０３４６】
放射性又は他の標識を公知の方法で結合体に導入することができる。例えば、ペプチドを生合成することができ、或いは例えば、水素の代わりにフッ素１９を伴う好適なアミノ酸前駆体を使用する化学アミノ酸合成によって合成することができる。ｔｃ99ｍ又はＩ123、Ｒｅ186、Ｒｅ188及びＩｎ111などの標識を、ペプチドのシステイン残基を介して結合させることができる。イットリウム−９０を、リジン残基を介して結合させることができる。ヨードゲン法（Ｆｒａｋｅｒ外（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：４９−５７）を使用してヨウ素−１２３を組み込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）には他の方法が詳細に説明されている。
【０３４７】
抗体と細胞障害剤との複合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（ビス（ｐ−ジアゾニウム）エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製できる。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）が放射性ヌクレオチドの抗体への結合のための代表的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６  を参照されたい。このリンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であることができる。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ外，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【０３４８】
これらの化合物としては、次の架橋試薬で調製されるＡＤＣ：市販されているＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホＥＭＣＳ、スルホＧＭＢＳ、スルホＫＭＵＳ、スルホＭＢＳ、スルホＳＩＡＢ、スルホＳＭＣＣ及びスルホＳＭＰＢ並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル（４−ビニルスルホン）ベンゾエート）が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、米国イリノイ州ロックフォードのピアス・バイオテクノロジー社から）。第４６７〜４９８頁、２００３年〜２００４年のアプリケーションハンドブック及びカタログを参照されたい。
【０３４９】
５．抗体薬剤複合体の調製
抗体薬剤複合体（ＡＤＣ）において、抗体（Ａｂ）は、リンカー（Ｌ）を介して１種以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体当たり約１〜約２０個の薬剤部分（Ｐ＝１〜約２０  ）に結合される。以下に示す式のＡＤＣは、いくつかの経路によって、（１）抗体の求核基と二価のリンカー試薬とを反応させて共有結合を介してＡｂ−Ｌを形成させ、その後薬剤部分Ｄと反応させること；及び（２）薬剤部分の求核基と二価のリンカー試薬とを反応させて共有結合を介してＤ−Ｌを形成させ、その後抗体の求核基と反応させることを含めて当業者に知られている有機化学反応、条件及び試薬を使用して調製できる。ＡＤＣを調製するためのさらなる方法は、本明細書に記載されている。
Ａｂ（ＬＤ）p
【０３５０】
リンカーは、１種以上のリンカー成分から構成できる。例示的なリンカー成分としては、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）が挙げられる。さらなるリンカー成分は、当該分野で公知であり、いくつかが本明細書に記載される。また、「Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌｖａｌｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｉｇａｎｄｓ」、２００４年１１月５日出願された米国特許出願公開第１０／９８３３４０号も参照されたい。その内容は、その全体が参照により本明細書で援用される。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、リンカーはアミノ酸残基を含むことができる。例示的なアミノ酸リンカー成分としては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては、バリン−シトルリン（ｖｃ又はｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆ又はａｌａ−ｐｈｅ）が挙げられる。例示的なトリペプチドとしては、グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）及びグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）が挙げられる。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基としては、天然型並びにマイナーアミノ酸及び非天然型アミノ酸アナログ、例えばシトルリンが挙げられる。アミノ酸リンカー成分は、特定の酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ、又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性の点で設計及び最適化できる。
【０３５２】
抗体上の求核基としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、及び（ｉｖ）糖ヒドロキシル基又は抗体がグリコシル化されるアミノ基。アミン、チオール及びヒドロキシル基は求核性であり、（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）ハロアセトアミドなどのアルキル及びベンジルハロゲン化物；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含めたリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成するように反応することができる。所定の抗体は、還元可能な鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）などの還元剤で処理することによる、リンカー試薬との結合のための反応を行ってもよい。このようにして、それぞれのシステイン架橋は、理論的には、２種の反応性のチオール求核基を形成することになる。追加の求核基をリシンと２−イミノチオラン（トラウト試薬）との反応により抗体に導入し、アミンをチオールに転化させることができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４個以上のシステイン残基を導入することによって抗体（又はそのフラグメント）に導入することができる（例えば、１個以上の非天然システインアミノ酸残基を含む変異型抗体を調製する）。
【０３５３】
また、抗体薬剤複合体を、リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応することができる求電子性部分を導入するための抗体の修飾によって生成することもできる。グリコシル化抗体の糖を、例えばヨウ素酸酸化試薬で酸化させて、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応することができるアルデヒド又はケトン基を形成させることができる。得られたイミンシッフ塩基基は安定な結合を形成することができ、又はこれを例えば水素化ホウ素試薬によって還元して安定なアミン結合を形成させることができる。一実施形態では、グリコシル化抗体の炭水化物部分とガラクトースオキシダーゼ又はメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応が、薬剤上の適当な基と反応することができるタンパク質中におけるカルボニル（アルデヒド及びケトン）基を生じさせることができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）。別の実施形態では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含むタンパク質はメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応し、第１アミノ酸の代わりにアルデヒドを生成することができる（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６；米国特許第５３６２８５２号）。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核試薬と反応することができる。
【０３５４】
同様に、薬剤部分上の求核基としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及び（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、及び酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物などのハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基を含めてリンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成するように反応することができるアリールヒドラジド基。
【０３５５】
あるいは、抗体及び細胞毒性剤を含む融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成によって作製できる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接する又は複合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域によって分離する複合体の２つの部分をコードするそれぞれの領域を含むことができる。
【０３５６】
さらに別の実施形態では、抗体は腫瘍プレターゲッティングにおける利用のための「受容体」（例えばストレプトアビジン）に結合でき、その際、抗体・受容体複合体を患者に投与し、その後クリアリング剤を使用して循環系から未結合複合体を除去し、その後細胞傷害性薬剤（例えば放射性ヌクレオチド）に結合する「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。様々な放射性核種が放射結合抗体の生成のために利用可能である。例としては、212Ｂｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、90Ｙ、及び186Ｒｅが挙げられる。
【０３５７】
Ｖ．方法
Ａ．抗体を有する変異体ＳＭＯの診断方法及び検出方法
一態様では、本発明の抗体は、生物学的サンプル中における変異型ＳＭＯの存在を検出するために有用である。本明細書で使用するときに、用語「検出する」は、定量的又は定性的検出を包含する。所定の実施形態では、生物学的サンプルは、細胞又は腫瘍組織などの組織を含む。
【０３５８】
一態様では、本発明は、生物学的サンプル中の変異型ＳＭＯの存在を検出する方法を提供する。所定の実施形態では、この方法は、変異型ＳＭＯに対する抗変異型ＳＭＯ抗体の結合を許容する条件下で該生物学的サンプルと該抗変異型ＳＭＯ抗体とを接触させ、そして該複合体が抗変異型ＳＭＯ抗体と変異型ＳＭＯとの間で形成されるかどうかを検出することを含む。
【０３５９】
一態様では、本発明は、変異型ＳＭＯの発現に関連する薬剤耐性などの変異型ＳＭＯの発現に関連する疾患又は状態を診断する方法を提供する。所定の実施形態では、この方法は、試験細胞と抗変異型ＳＭＯ抗体とを接触させ；変異型ＳＭＯに対する抗変異ＳＭＯ抗体の結合を検出することによって該試験細胞による変異型ＳＭＯの発現レベルを決定し（定量的又は定性的に）；及び試験細胞による変異型ＳＭＯの発現レベルと対照細胞（例えば、試験細胞と同じ組織起源の正常細胞又は野生型ＳＭＯを正常細胞に匹敵するレベルで発現する細胞）による変異型ＳＭＯの発現レベルとを比較することを含み、該対照細胞と比較したときにさらに高い試験細胞による変異型ＳＭＯ発現レベルが変異型ＳＭＯの発現増加と関連する疾患の存在を示す。所定の実施形態では、試験細胞は、変異型ＳＭＯの発現の増加に関連する疾患を有することが疑われる個体から得られる。所定の実施形態では、疾患は、癌又は腫瘍などの細胞増殖性障害である。例えば、腫瘍サンプルでは、ＳＭＯ発現の不均一性が存在する場合があると認められる。したがって、例えば、サンプル中において、サンプル中の細胞のサブセットみが変異型ＳＭＯを発現することができ、そのような発現は、例えば、薬物耐性と関連するのに十分であると認めら得る。したがって、発現を評価することは、サンプル中における発現を評価し、そしてサンプル中における細胞のサブセットにおいて変異型ＳＭＯタンパク質を検出することを含む。
【０３６０】
診断できる又は薬剤耐性が本発明の抗体を使用して評価できる例示的な疾患としては、髄芽腫、膵臓癌、基底細胞癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６１】
所定の他の方法を使用して、変異型ＳＭＯに対する抗体の結合を検出することができる。このような方法としては、当該技術分野で周知の抗原−結合アッセイ、例えばウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイとして、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ及び免疫組織化学（ＩＨＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６２】
所定の実施形態では、抗体は標識される。標識としては、直接検出される標識又は部分（例えば、蛍光、発色、高電子密度、化学発光、及び放射性標識など）並びに酵素又はリガンドなどの、例えば酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される部分が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な標識としては、放射性同位元素の32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、及び131Ｉ、蛍光団、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰなどの色素前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する酵素と結合された複素環式オキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はミクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６３】
所定の実施形態では、抗体は不溶性マトリックスに固定化される。固定化は、溶液中で遊離したままの任意の変異型ＳＭＯから抗変異ＳＭＯ抗体を分離することを伴うことができる。これは、従来、アッセイ手順の前に抗変異型ＳＭＯ抗体を不溶化させることによって、水不溶性マトリックス又は表面への吸着によって（Ｂｅｎｎｉｃｈ外、米国特許第３７２０７６０号）、又は共有結合によって（例えば、グルタルアルデヒド架橋を使用して）、又は抗変異型ＳＭＯ抗体と変異型ＳＭＯとの間の複合体の形成後に、例えば免疫沈降によって抗変異型ＳＭＯ抗体を不溶化することによって達成されている。
【０３６４】
診断又は検出の上記実施形態のいずれかは、抗変異ＳＭＯ抗体の代わりに又はそれに加えて本発明の免疫複合体を使用して実施できると解される。
【０３６５】
Ｂ．核酸プローブによる変異型ＳＭＯの検出方法
一態様では、本明細書に記載される核酸プローブは、生物学的サンプル中の変異型ＳＭＯ核酸の存在を検出するために有用である。本明細書で使用するときに、用語「検出する」は、定量的又は定性的な検出を包含する。所定の実施形態では、生物学的サンプルは、腫瘍組織などの細胞又は組織を含む。
【０３６６】
一態様では、本発明は、生物学的サンプル中における変異型ＳＭＯをコードする核酸の存在を検出する方法を提供する。所定の実施形態では、この方法は、生物学的サンプルからの核酸とここに記載されるプローブとを接触させ、ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを許容する条件下に該プローブを該核酸にハイブリダイズさせ、そして、該複合体が該プローブと該核酸サンプルとの間に形成されているかどうかを検出することを含む。
【０３６７】
変異型ＳＭＯをコードする核酸は、当該分野で知られている任意の方法を用いて検出できる。この方法としては、本明細書に記載されるプローブの使用、又はＰＣＲ増幅、ｒｔＰＣＲ配列決定、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、ＤＮＡの示差制限消化、ハイブリダイゼーション又は当該技術分野において周知任意の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６８】
これらの方法では、細胞内での当該変異型ＳＭＯの検出は、変異型ＳＭＯの発現増加に関連する疾患の存在を示す（すなわち、ＧＤＣ−０４４９などのＳｍｏ阻害剤による治療に対する耐性）。所定の実施形態では、試験細胞は、変異型ＳＭＯの発現に関連した耐性腫瘍を有すると疑われる個体から得られる。上で詳述したように、突然変異は、腫瘍サンプルからの細胞のサブセットなどのサンプルからの細胞のサブセットに存在することができると認められる。
【０３６９】
本発明の抗体を用いて診断することができる例示的な疾患としては、髄芽腫、膵臓癌、基底細胞癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７０】
Ｃ．細胞ベースアッセイでの変異型ＳＭＯの検出方法
変異型ＳＭＯは、当該技術分野で知られている細胞ベースアッセイで検出することができる。この方法としては、変異型ＳＭＯを含む疑いのある腫瘍サンプル又は組織の組織学的製剤の試験管内免疫組織化学染色における腫瘍サンプルなどの細胞サンプルの表面への変異型ＳＭＯ検出抗体の結合が挙げられるが、これらに限定されない。組織サンプルをＧＤＣ−０４４９及びヘッジホッグと接触させる機能アッセイは、Ｈｈシグナル伝達が起こるかどうかを決定する（例えば、経路成分の活性化、Ｇｌｉの発現等を測定することによって）。ＧＤＣ−０４４９を使用して破壊することができるＨｈシグナル伝達経路を使用した任意の機能的アッセイを本発明の方法で使用して変異型ＳＭＯの存在及び活性を決定することができる。
【０３７１】
Ｄ．変異型ＳＭＯに結合する化合物のスクリーニング方法
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示された変異型ＳＭＯタンパク質のいずれかを発現する細胞内においてヘッジホッグシグナリングを阻害することができるヘッジホッグ経路阻害剤のスクリーニング方法を提供する。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、単剤又は離散数の薬剤のものである。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、薬剤のプールのものである。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、ハイスループットスクリーニングである。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、化合物の１以上のライブラリーのものである（例えば、小分子のライブラリー、アンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリー、又は抗体若しくはペプチドのライブラリー）。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、一次アッセイ単独又は一次アッセイと１回以上の二次アッセイを含むことができる。いくつかの実施形態では、薬剤をアッセイ（例えばヘッジホッグシグナル伝達アッセイ）（例えば、本明細書に記載の又は当該技術分野において既知のＧｌｉ１の発現アッセイのいずれかを使用して薬剤に応答したＧｌｉ１の核酸又はタンパク質の発現を試験することによって）、変異型ＳＭＯタンパク質結合アッセイ（例えば、本明細書に記載の変異型ＳＭＯ結合アッセイのいずれかを使用することによって）、細胞増殖アッセイ（例えば、本明細書に記載の又は当該技術分野において既知の細胞増殖アッセイのいずれかを使用することによって）評価できる。スクリーニングアッセイでの使用は、変異型ＳＭＯタンパク質及び本発明の核酸のための代表的な使用である（例えば、変異型ＳＭＯタンパク質を、細胞を含まない又は細胞ベースアッセイで使用することができる）；変異型ＳＭＯ核酸をベクターに与え、そして使用してスクリーニングアッセイに好適な宿主細胞又は宿主生物内で変異型ＳＭＯタンパク質を発現させることができる。
【０３７２】
本発明は、変異型ＳＭＯに結合する化合物をスクリーニングするための方法を提供する。いかなる特定の動作モードに限定されるものではないが、ＧＤＣ−０４４９が野生型ＳＭＯを結合させ、変異型ＳＭＯを結合しない方法では、変異型ＳＭＯの阻害剤として作用する化合物が変異型ＳＭＯを結合することが期待される。したがって、変異型ＳＭＯタンパク質又はそのフラグメント、例えば膜貫通領域６（ＴＭ６）の全て又は一部を含むフラグメントを発現させ、そして当該分野で知られている任意の手段により化合物のライブラリーを使用して結合アッセイを実施することができる。また、ＧＤＣ−０４４９の潜在的な接触点に基づくモデリング手法を使用してＧＤＣ−０４４９のバリエーションによって表される化合物の小さなライブラリーを使用し、その後変異型ＳＭＯ及びＧＤＣ−０４４９のバリエーションについて同様の接触点をモデリングすることができる。このようなモデリングプログラム及びアルゴリズムは、当該技術分野で知られている任意のものであることができる。野生型及び変異型ＳＭＯの両方の阻害剤である、変異型ＳＭＯ及び野生型ＳＭＯを結合する化合物を同定することができる。あるいは、変異型ＳＭＯに結合するが、野生型ＳＭＯには結合しないため、変異型ＳＭＯ用の阻害剤である化合物を発見することができる。所定の実施形態では、結合及び／又はいくつかの他の読出し（例えば、ヘッジホッグシグナル伝達）を評価し、そして野生型ＳＭＯ又は好適な対照（例えば、空のベクター）の場合と比較する。
【０３７３】
一実施形態では、スクリーニングされる化合物は、ＧＤＣ−０４４９の変異体などの小分子化合物である。他の実施形態では、変異型ＳＭＯを結合する化合物は、野生型ＳＭＯに対するＧＤＣ−０４４９の結合部位と同じ領域にあるエピトープを特異的に認識する抗体である。一実施形態では、抗体は、変異型ＳＭＯのＴＭ６のカルボキシ末端部分の領域に結合し、変異型ＳＭＯ活性を阻害する。
【０３７４】
その代わりに又はそれに加えて、化合物は、変異型ＳＭＯ活性を阻害する能力についてスクリーニングできる。これらの実施形態では、これらの化合物が変異型ＳＭＯを発現する細胞におけるヘッジホッグシグナル伝達を阻害することができることを評価することができる。これらのアッセイは、無傷のヘッジホッグシグナリング経路を有するが野生型ＳＭＯの代わりに又はそれに加えて変異を有する組換えＳＭＯを発現する細胞で実施できる。これらのアッセイでは、候補阻害剤の存在下又は非存在下でヘッジホッグとインキュベートしたときに活性なヘッジホッグシグナル伝達を有する細胞の能力を決定する。ヘッジホッグシグナリングが候補化合物の存在下で阻害される場合には、このような化合物はヘッジホッグ阻害剤である。いくつかの実施形態では、細胞は野生型及び変異型ＳＭＯの両方を発現し、ＧＤＣ−０４４９及び候補阻害剤と共にインキュベートできる。他の実施形態では、細胞は変異型ＳＭＯのみを発現し、Ｈｈ及び候補阻害剤単独（すなわち、ＧＤＣ−０４４９の非存在下で）でインキュベートできる。Ｈｈシグナル伝達がそのような細胞において減少する又は阻害される場合には、その化合物は変異型ＳＭＯの阻害剤である。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法を提供し、該方法は次の工程を含む：細胞と所定量の試験薬剤とを接触させ、該細胞は、ヘッジホッグタンパク質に応答し又はヘッジホッグシグナル伝達経路の増加したヘッジホッグシグナル伝達及び／又は活性を有し、該細胞は、本明細書に記載の変異型ＳＭＯタンパク質のいずれかを発現し、及び（ｂ）対照と比較して、該試験薬剤が細胞内におけるヘッジホッグシグナル伝達を阻害するかどうかを決定し、ここで、該試験薬剤が対照に対して該細胞内におけるヘッジホッグシグナル伝達を阻害する場合には、該試験剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定する。いくつかの実施形態では、対照（又は比較のための基準）は、野生型ＳＭＯタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質）を発現する細胞である。いくつかの実施形態では、対照は、試験剤と接触させた細胞と同じ変異型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞であり、ここで、該対照は、変異型ＳＭＯタンパク質が部分的に又は完全に耐性である対照薬剤で処理されていない又は処理されている。いくつかの実施形態では、対照薬剤は、ビスモデギブ、ＬＹ２９４０６８０、ＬＤＥ２２５及び／又は化合物５である。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、変異型ＳＭＯタンパク質に結合するが、野生型ＳＭＯタンパク質には結合しない。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、変異型ＳＭＯタンパク質と野生型ＳＭＯタンパク質の両方に結合する。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、野生型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞よりも変異型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害するのに有効である。
【０３７６】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヘッジホッグ経路阻害剤を同定する方法を提供し、該方法は次の工程を含む：細胞と所定量の薬剤とを接触させ、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答し或いはヘッジホッグシグナル伝達経路の増大したヘッジホッグシグナル伝達及び／又は活性を有し、該細胞は本明細書に記載の変異型ＳＭＯタンパク質のいずれかを発現し、及び（ｂ）対照と比較して、該薬剤が細胞の成長及び／又は増殖を阻害するかどうかを決定し、その際、該薬剤が対照に対して細胞の成長及び／又は増殖を阻害する場合には、その薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定する。いくつかの実施形態では、対照は、野生型ＳＭＯタンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳＭＯタンパク質）を発現する細胞である。いくつかの実施形態では、対照は、試験剤と接触させた細胞と同じ変異型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞であり、該対照は、変異型ＳＭＯタンパク質が部分的に又は完全に耐性である対照薬剤で処理されない又は処理される。いくつかの実施形態では、対照薬剤は、ビスモデギブ、ＬＹ２９４０６８０、ＬＤＥ２２５及び／又は化合物５である。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、変異型ＳＭＯタンパク質に結合するが、野生型ＳＭＯタンパク質には結合しない。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、変異型ＳＭＯタンパク質及び野生型ＳＭＯタンパク質の両方に結合する。いくつかの実施形態では、試験薬剤は、野生型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞よりも変異型ＳＭＯタンパク質を発現する細胞の成長及び／又は増殖を阻害するのに有効である。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法で使用される細胞は、培養物中である。いくつかの実施形態では、培養中に細胞と接触した薬剤は、細胞培養物中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％でヘッジホッグシグナル伝達を部分的に又は完全に阻害するのに十分である。いくつかの実施形態では、培養中の細胞と接触した薬剤は、細胞培養物中の細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％の細胞増殖速度及び／又は生存率を減少させるのに十分であり、該細胞は、ヘッジホッグを発現若しくは過剰発現している又は活性なヘッジホッグシグナル伝達を有する。
【０３７８】
他の実施形態では、細胞は動物の細胞である。いくつかの実施形態では、動物は、哺乳動物又は他の脊椎動物である。いくつかの実施形態では、動物は出生後である。いくつかの実施形態では、動物は小児である。いくつかの実施形態では、動物は成体である。細胞を試験管内で参照する場合には、細胞は、哺乳動物などの任意の脊椎動物種、例えば齧歯類、ハムスター又はヒトであることができる。試験管内又は生体内において、細胞は癌細胞、例えば原発性癌細胞、転移癌細胞又は癌細胞株である。いくつかの実施形態では、細胞は髄芽腫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は基底細胞癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は母斑性基底細胞癌細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はゴーリン症候群細胞である。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路遺伝子内に１以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、１以上の変異はパッチされた状態である。いくつかの実施形態では、パッチ突然変異は機能喪失変異である。いくつかの実施形態では、１以上の変異は平滑化されている。いくつかの実施形態では、平滑化変異は、平滑化機能獲得型突然変異である。いくつかの実施形態では、機能獲得型平滑化突然変異は構成的に活性な平滑化タンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、１以上の変異は、サプレッサー融合状態であり、細胞はサプレッサー融合（ＳｕＦｕ）機能喪失を有する。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ変異はＳｕＦｕ活性の部分的な機能喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ変異は完全な機能喪失ＳｕＦｕ活性をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ突然変異はビスモデギブに対する耐性を付与する。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかで試験される薬剤は小分子である。他の実施形態では、薬剤はポリペプチドである。他の実施形態では、薬剤はｓｉＲＮＡアンタゴニストである。
【０３８１】
本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかのいくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯ  ＤＮＡは細胞内で外因的に発現する。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯ  ＤＮＡは細胞内で安定に発現する。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯ  ＤＮＡは細胞内で一時的に発現する。
【０３８２】
本発明で使用できる様々なヘッジホッグ経路阻害剤の増殖阻害効果は、当該分野において知られている方法によって、例えば変異型ＳＭＯポリペプチドを内因的に発現又はそれぞれの変異型ＳＭＯ遺伝子によるトランスフェクション後に発現する細胞を使用して評価できる。例えば、変異型ＳＭＯをコードするＤＮＡをトランスフェクトした適切な腫瘍細胞株及び細胞を、本発明のヘッジホッグ経路阻害剤により数日間（例えば、２〜７日）にわたって様々な濃度で処理し、そしてクリスタルバイオレット、ＭＴＴで染色し又はいくつかの他の比色若しくはルシフェラーゼベース（例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ）アッセイで分析することができる。増殖を測定する別の方法は、このようなヘッジホッグ経路阻害剤の存在下又は非存在下で、処理された細胞による3Ｈ−チミジン取り込みを比較することによる。処理後に、細胞を集め、そしてＤＮＡに取り込まれた放射能の量をシンチレーションカウンターで定量する。適切なポジティブコントロールは、選択された細胞株を、成長阻害抗体又はその細胞株の増殖を阻害することが知られている小分子により処理することを含む。生体内での腫瘍細胞の成長阻害は、当該分野において知られている様々な方法で決定できる。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路遺伝子内の１以上の変異を有するものである。いくつかの実施形態では、このようなヘッジホッグ経路阻害剤は、試験管内又は生体内でのヘッジホッグ発現腫瘍細胞の細胞増殖を、未処理の腫瘍細胞と比較して約１０〜２５％、約２５〜１００％、３０〜１００％、約５０〜１００％又は約又は７０〜１００％阻害する。成長阻害は、細胞培養において約０．５〜３０μｇ／ｍｌ、約０．５ｎＭ〜２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜１μＭ、約１〜５μＭ又は約５〜１０μＭのヘッジホッグ経路阻害剤濃度で測定でき、その際、成長阻害は、腫瘍細胞のアンタゴニストへの曝露後１〜１０日で決定される。アンタゴニストは、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重のアンタゴニスト及び／又はアゴニストの投与が抗体又は小分子アンタゴニストの最初の投与から約５日〜３ヶ月以内、いくつかの実施形態では約５〜３０日以内に腫瘍サイズの減少又は腫瘍細胞増殖をもたらす場合には生体内での増殖阻害である。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、細胞死を誘導するヘッジホッグ経路阻害剤を選択するために、例えばヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルー又は７ＡＡＤ取り込みで示されるときの膜の完全性の喪失を対照と比較して評価することができる。ＰＩ取込みアッセイは、補体及び免疫エフェクター細胞の非存在下で実施できる。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質を発現する発現腫瘍細胞を、培地のみ又は適切なヘッジホッグ経路阻害剤を含有する培地と共にインキュベートする。細胞を３日間インキュベートする。各処理後に細胞を洗浄し、そして細胞塊を除去するために３５ｍｍのストレーナキャップ付き１２×７５管（管当たり１ｍｌ、処理群当り３個の管）に等分する。次いで、管にＰＩ（１０μｇ／ｍｌ）を入れる。サンプルを、ＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）フローサイトメーター及びＦＡＣＳＣＯＮＶＥＲＴ（登録商標）ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）又は分析のために当業者が使用する任意の他の装置を使用して分析できる。その後、ＰＩ取り込みによって決定されるときに統計学的に有意なレベルの細胞死を誘導するヘッジホッグ経路阻害剤を選択することができる。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯポリペプチド上のエピトープに結合するヘッジホッグ経路阻害剤をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ著（１９８８）に記載されているような日常的なクロスブロッキングアッセイを実施できる。このアッセイを使用して、試験抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド又は他の有機分子が既知のヘッジホッグ経路阻害剤と同じ部位又はエピトープに結合するかどうかを決定することができる。その代わりに又はそれに加えて、エピトープマッピングを当該分野で公知の方法によって実施できる。例えば、変異型ＳＭＯタンパク質配列を、例えばアラニンスキャニング又は免疫学的に異なるＧＰＣＲタンパク質とキメラを作製することによって突然変異誘発して接触残基を同定することができる。変異型抗原を最初にポリクローナル抗体との結合について試験して適切な折り畳みを確保する。別の方法では、変異型ＳＭＯタンパク質の異なる領域に相当するペプチドを、試験抗体又は試験抗体及び特徴付けられた又は既知のエピトープを有する抗体との競合アッセイで使用できる。
【０３８５】
いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質又は候補のヘッジホッグ経路阻害剤を、固相上、例えばマイクロタイタープレート上に共有又は非共有結合によって固定化する。非共有結合は、一般的に、固体表面を変異型ＳＭＯタンパク質又は候補のヘッジホッグシグナル伝達因子の溶液で被覆し、そして乾燥させることによって達成される。あるいは、固定化される変異型ＳＭＯの標的部分に特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を使用して固体表面に固定することができる。このアッセイは、検出可能な標識によって標識できる非固定化成分を固定化成分、固着成分を含む被覆表面に添加することにより実施できる。反応が完了したら、未反応成分を例えば洗浄により除去することができ、そして固体表面に固着した複合体を検出する。元の非固定化成分が検出可能な標識を有する場合には、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が生じたことを示す。元の非固定化成分が標識を有しない場合には、複合体形成を、例えば固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体を使用することにより検出することができる。
【０３８６】
候補のヘッジホッグ経路阻害剤が相互作用するがここで同定したヘッジホッグシグナル伝達ポリペプチドには直接結合しない場合には、そのポリペプチドとの相互作用を、タンパク質・タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によってアッセイすることができる。このようなアッセイとしては、伝統的なアプローチ、例えば架橋、共免疫沈降及び勾配又はクロマトグラフィーカラムによる同時精製が挙げられる。さらに、タンパク質・タンパク質相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：５７８９−５７９３（１９９１）に開示されるようにＦｉｅｌｄｓ及び共同研究者が記載した酵母ベース遺伝子系を使用することによって監視できる（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）．３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２（１９９１））。酵母ＧＡＬ４などの多くの転写活性化因子は、２個の物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写・活性化ドメインとして機能する。上記刊行物に記載の酵母発現系（一般に「２ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性を利用し、２種のハイブリッドタンパク質を使用する。すなわち、標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合した一方、候補活性化タンパク質が活性化ドメインに融合した他方。ＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下でのＧＡＬ１−ＬａｃＺレポーター遺伝子の発現は、タンパク質・タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用性ポリペプチドを含むコロニーを、βガラクトシダーゼに対する発色基質を使用して検出する。２ハイブリッド技術を用いた２種の特異的タンパク質間のタンパク質・タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商標））がＣｌｏｎｔｅｃｈ社から市販されている。また、この系は、特定のタンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインをマッピングするのみならず、これら相互作用にとって重要なアミノ酸残基を特定するように拡張することもできる。
【０３８７】
アッセイは、当該技術分野でよく特徴付けられているタンパク質・タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースアッセイを含めて多様な形式できる。
【０３８８】
ヘッジホッグシグナル伝達ポリペプチド及び他の細胞内又は細胞外成分（例えば、Ｃｏｓｔａｌ−２）との相互作用を妨害する薬剤を、当業者に周知の手段によって試験することができる。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯポリペプチド及び細胞内又は細胞外成分を含む反応混合物を、２種の物質の相互作用及び結合条件下及び時間にわたって調製する。いくつかの実施形態では、候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応を試験化合物の不存在下及び存在下で実施する。また、プラセボを、ポジティブコントロールを提供するために第３反応混合物に添加することができる。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）を上記のように監視する。試験薬剤を含有する反応混合物中ではなく対照反応における複合体の形成は、その試験薬剤が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用を妨害することを示す。
【０３８９】
本発明は、上記アッセイ工程のいずれか１つ又は組み合わせを使用してヘッジホッグ経路阻害剤を同定するための方法を意図する。換言すれば、様々なスクリーニングアッセイを組み合わせて、例えば特定の活性を有するアンタゴニスト同定し又は一方のアッセイで変異型ＳＭＯに拮抗する薬剤が無関係のアッセイにおいてヘッジホッグシグナル伝達を阻害することを確認することができる。同定の任意のアッセイ又は方法について、結果を、ポジティブ及び／又はネガティブコントロールを含めた１以上の適切な対照と比較することができる。
【０３９０】
ヘッジホッグ経路阻害剤をスクリーニング及び／又は同定するための上記のアッセイ方法のいずれかについて、薬剤を単独で又はプールでスクリーニングすることができる。薬剤を、薬剤のライブラリー又は候補薬剤のセットからスクリーニングすることができる。スクリーニングできる好適な薬剤としては、抗体、抗体フラグメント、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ及び小分子（例えばブロモドメイン阻害剤）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるスクリーニング方法のいずれかにおいて使用される細胞は、活性化をもたらす又はヘッジホッグシグナル伝達を増加させる遺伝子内において１以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、１以上の変異は、機能のパッチ喪失をもたらすパッチ遺伝子である。いくつかの実施形態では、パッチ遺伝子における１以上の変異は、次の突然変異のうちの１つ以上を有するパッチタンパク質をコードする変異遺伝子をもたらす：Ｓ６１６Ｇ、ｆｓ２５１、Ｅ３８０*、Ｑ８５３*、Ｗ９２６*、Ｐ１３８７Ｓ、ｓｐ２６６７、Ｑ５０１Ｈ、ｆｓ１０１７、ＦＳ１０８又はＡ１３８０Ｖ。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達の活性化をもたらす又は増加させる遺伝子内に１以上の変異は平滑化された状態であり、細胞は平滑化変異を有する。いくつかの実施形態では、平滑化変異は、平滑化機能獲得型突然変異である。いくつかの実施形態では、機能獲得型平滑化変異は構成的に活性な平滑化タンパク質をもたらす。ＷＯ２０１１／０２８９５０及びＷＯ２０１２０４７９６８を参照されたい。これらの各々は参照により援用される。いくつかの実施形態では、平滑化突然変異は、配列番号１の５３５位に相当する位置での変異である。特定の実施形態では、変異は、配列番号１の５６２位に相当する位置での変異である。特定の実施形態では、変異は、５３５位又は配列番号１におけるその対応する位置でのＷ５３５Ｌである。いくつかの実施形態では、平滑化変異は、配列番号１のＲ５６２Ｑ位に相当する突然変異である（５６２位又は配列番号１の５６２位に相当する位置でのＲ５６２Ｑ変異）。いくつかの実施形態では、平滑化突然変異は、配列番号１の４１２位に相当する位置での突然変異、例えば配列番号１のそのような位置でのＬ４１２Ｆである。いくつかの実施形態では、平滑化変異は、所定の平滑化阻害剤に対して耐性にする別の変異を有する。いくつかの実施形態では、平滑化タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置５１８又は配列番号１の５１８位に相当する位置にアミノ酸変化を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化は、配列番号１のアミノ酸位置５１８に相当するアミノ酸位置でのＥ５１８Ｋ又はＥ５１８Ａ置換である。いくつかの実施形態では、平滑化タンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置４７３又は配列番号１の４７３位に相当する位置にアミノ酸変化を含む。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、１以上の変異は、ヘッジホッグ遺伝子であり、かつ、ヘッジホッグタンパク質の過剰発現をもたらす。いくつかの実施形態では、過剰発現したヘッジホッグタンパク質はソニックヘッジホッグタンパク質である。いくつかの実施形態では、過剰発現したヘッジホッグ蛋白質はインディアンヘッジホッグタンパク質である。いくつかの実施形態では、過剰発現したヘッジホッグ蛋白質にはデザートヘッジホッグタンパク質である。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、１以上の変異はサプレッサー融合状態であり、細胞はサプレッサー融合（ＳｕＦｕ又はＳＵＦＵ）機能喪失を有する。いくつかの実施形態では、これはＳｕＦｕ活性における機能喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ変異は、髄芽腫、髄膜腫、腺様嚢胞癌、基底細胞癌及び横紋筋肉腫癌細胞内にある。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ変異は、Ｂｒｕｇｉｅｒｅｓ外，２０１２，ＪＣＯ，３０（１７）：２０８７−２０９３に記載の突然変異のいずれかである。この文献はその全体が本明細書で援用される。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ変異は、表２Ａ若しくは表２Ｂに記載の変異のいずれか又はＢｒｕｇｉｅｒｅｓ外，２０１２，ＪＣＯ，３０（１７）：２０８７−２０９３に記載の突然変異のいずれかである。この文献はその全体が本明細書で援用される。
【０３９５】
【表２Ａ】
0006736467.tif 000003
【０３９６】
【表２Ｂ】
0006736467.tif 000004
【０３９７】
いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ変異は、配列番号８において次のアミノ酸位置のいずれかに相当する位置に変異を含む：位置１５、１８４、１２３、２９５、１８７。所定の実施形態では、ＳｕＦｕ変異は、Ｐ１５Ｌ、Ｑ１８４Ｘ、Ｒ１２３Ｃ、Ｌ２９５ｆｓ、又はＰ１８７Ｌのいずれか１以上を含み、ここで、該変異はその位置又は配列番号８における上記位置に相当する位置にある。いくつかの実施形態では、ＳｕＦＵ変異は、配列番号９におけるｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ（ＩＶＳ８−１Ｇ＞Ｔ）、ｃ．７２ｄｅｌＣ、ｃ．７２ｉｎｓＣ、１４３ｉｎｓＡ、ｃ．８４６ｉｎｓＣ、又はＩＶＳ１−１Ａ−＞Ｔに相当する変異のいずれかである。いくつかの実施形態では、ＳｕＦｕ変異は、Ｔａｙｌｏｒ外（２００２）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３１：３０６−３１０（例えば、ＩＶＳ８−１Ｇ＞Ｔ（＝ｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ）、１１２９ｄｅｌ、Ｐ１５Ｌ及びＮｇの２つ（全て＋ＬＯＨ））；Ｓｌａｄｅ外（２０１１）Ｆａｍ  Ｃａｎｃｅｒ  １０：３３７−３４２，２０１１（例えば、ｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ；ｃ．８４８ｉｎｓＣ）；Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ外（２００９）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ  １４９Ａ：１５３９−１５４３（例えば、ｃ．１０２２＋１Ｇ＞Ａ）；Ｎｇ外（２００５）Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  Ａ  １３４：３９９−４０３（例えば、１４３ｉｎｓＡ；ＩＶＳ１−１Ａ＞Ｔ）；Ｋｉｊｉｍａ外（２０１２）Ｆａｍ  Ｃａｎｃｅｒ１１：５６５−７０（例えば、ｃ．５５０Ｃ＞Ｔ（Ｑ１８４Ｘ））；Ａａｖｉｋｋｏ外（２０１２）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ９１：５２０−５２６（例えば、ｃ．３６７Ｃ＞Ｔ（Ｒ１２３Ｃ））；Ｓｔｅｐｈｅｎｓ外（２０１３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ１２３：２９６５−２９６８（例えば、ｘ８８１＿８８２ｉｎｓＧ（Ｌ２９５ｆｓ））；又はＲｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ外（２００５）Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ１５２：４３−５１（例えば、ｃ５６０Ｃ＞Ｔ（Ｐ１８７Ｌ））に記載された変異のいずれかである。
【０３９８】
いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞であり、第１０染色体重複及び／又は１０ｑの一部の欠失を有し、ここで、該部分はＳＵＦＵ及びＰＴＥＮを含む。いくつかの実施形態では、細胞はＦｓ１０１７  ＳＵＦＵ変異を含む。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかにおいて使用される細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路が活性な細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路が構成的に活性な細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘッジホッグ蛋白質又はヘッジホッグアゴニストで刺激された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞におけるヘッジホッグ経路の活性は、ＧｌｉルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるＧｌｉ１のレベル又は活性を監視することによって決定される。
【０４００】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかにおいて使用される細胞は、培養中の細胞である。いくつかの実施形態では、本発明は、複数の細胞を含む培養物を接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は脊椎動物におけるものである。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物におけるものであり、細胞を接触させることが哺乳動物にヘッジホッグシグナル伝達阻害剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒト被験体である。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞であり及び／又は哺乳動物は癌と診断された哺乳動物である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、次よりなる群から選択される癌細胞である：結腸、肺、前立腺、皮膚、血液、肝臓、腎臓、乳房、膀胱、骨、脳、髄芽細胞腫、肉腫、基底細胞癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、膵臓癌、又は精巣癌細胞。いくつかの実施形態では、癌細胞は、髄芽腫細胞、基底細胞癌細胞、又は母斑性基底細胞癌細胞（ゴーリン症候群細胞）である。
【０４０１】
特定の実施形態では、薬剤をヘッジホッグ経路阻害剤として同定したら、その薬剤を製剤化し、さらに細胞又は動物ベースアッセイで評価することができる。例えば、薬剤は、細胞又は動物ベース癌モデルで試験して抗癌剤としての有効性を評価することができる。
【０４０２】
ＶＩ．治療方法
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の平滑化変異のいずれかを有する平滑化タンパク質を発現する細胞の分化状態、生存及び／又は増殖を調節する方法に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、被験体（例えば、ヒト患者）におけるものである。いくつかの実施形態では、細胞は培養中のものであり、この方法は、試験管内方法を含む。所定の実施形態では、細胞は癌細胞である。所定の実施形態では、細胞は、望ましくない又は異常な細胞増殖によって特徴づけられる。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の平滑化突然変異のいずれかを含む平滑化タンパク質を含む又はそれを発現させるために予め決定されている。所定の実施形態では、細胞は、ヒトＳＭＯ野生型に対して配列番号１の２８１、４０８、４５９、５３３及び／又は５３５のいずれか一つ以上に相当するアミノ酸に変異を含む平滑化ポリペプチドを発現するように予め決定されている。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号１のＷ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｓ５３３Ｎ及び／又はＷ５３５Ｌに相当するアミノ酸に次の置換のいずれかを含む平滑化ポリペプチドを発現する。
【０４０３】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内においてヘッジホッグシグナル伝達を減少させる方法を提供し、該細胞は、本明細書に記載の平滑化突然変異のいずれかを有する平滑化タンパク質を発現し、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答する又はヘッジホッグシグナル伝達経路の遺伝子内に１以上の変異を含み（例えば、ヘッジホッグシグナル伝達経路の構成要素）、該１以上の変異は、リガンドの非存在下でヘッジホッグシグナル伝達経路のヘッジホッグシグナル伝達及び／又は活性化を増大させ、該方法は、該細胞と薬剤の有効量とを接触させる工程を含み、該薬剤はヘッジホッグ経路阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は、変異型平滑化タンパク質を選択的に結合させかつ阻害する化合物である。いくつかの実施形態では、薬剤は細胞内において変異型平滑化タンパク質の下流で作用するヘッジホッグシグナル伝達経路の成分を阻害する。他の実施形態では、薬剤はブロモドメイン阻害剤である。
【０４０４】
いくつかの実施形態では、本発明は、癌を有する被験体を抗癌治療剤で治療する方法を提供し、該被験体は、変異型ＳＭＯタンパク質を含む及び／又はそれを発現することが決定されており、該変異型ＳＭＯタンパク質は、配列番号１の２３９位に相当する位置にアラニン以外のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞内においてヘッジホッグシグナル伝達を阻害する方法を提供し、該細胞は、配列番号１の２３９位に相当する位置にアラニン以外のアミノ酸を有する変異型ＳＭＯタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、本発明は、次の工程を含む、癌を有する被験体を診断する方法を提供する：（ａ）該被験体からサンプルを得、（ｂ）該サンプルを配列番号１の２３９位に対応する位置にアラニン以外のアミノ酸を有する変異型ＳＭＯタンパク質をコードする核酸の存在について試験し、該サンプルが変異型ＳＭＯタンパク質を含む場合には、該被験体は癌を有する。いくつかの実施形態では、癌は基底細胞癌である。いくつかの実施形態では、変異型ＳＭＯタンパク質は、配列番号１のアミノ酸位置２３９に対応するアミノ酸位置にバリンを有する。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞の望ましくない成長、増殖又は生存を阻害する方法を提供し、該細胞は、本明細書に記載の平滑化突然変異のいずれかを有する平滑化タンパク質を発現し、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答する又はヘッジホッグシグナル伝達経路の遺伝子内に１以上の変異を含み、該１以上の変異は、リガンドの非存在下でヘッジホッグシグナル伝達経路のヘッジホッグシグナル伝達及び／又は活性化を増大させ、該方法は、細胞と薬剤の有効量とを接触させる工程を含み、該薬剤はヘッジホッグ経路阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は変異型平滑化タンパク質を選択的に結合させかつ阻害する薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は細胞内の変異型平滑化タンパク質の下流で作用するヘッジホッグシグナル伝達経路の成分を阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤はブロモドメイン阻害剤である。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、本発明は、腫瘍細胞の成長、増殖又は生存を阻害する方法を提供し、該腫瘍細胞は、本明細書に記載の平滑化突然変異のいずれかを有する平滑化タンパク質を発現し、該細胞はヘッジホッグタンパク質に応答する又はヘッジホッグシグナル伝達経路の遺伝子内に１以上の変異を含み、該１以上の変異は、リガンドの非存在下でヘッジホッグシグナル伝達経路のヘッジホッグシグナル伝達及び／又は活性化を増大させ、該方法は、細胞と薬剤の有効量とを接触させる工程を含み、該薬剤はヘッジホッグ経路阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は変異型平滑化タンパク質を選択的に結合させかつ阻害する薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤は細胞内の変異型平滑化タンパク質の下流で作用するヘッジホッグシグナル伝達経路の成分を阻害する。他の実施形態では、薬剤はブロモドメイン阻害剤である。いくつかの実施形態では、この方法は、それを必要とする患者に薬剤を投与することを含む。
【０４０７】
いくつかの実施形態では、ここに開示された方法のいずれかで処理された細胞は、活性化をもたらす又はヘッジホッグシグナル伝達を増加させる遺伝子内に１以上の変異を含み、ここで、該変異は上記のとおりである。
【０４１５】
いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞であり、第１０染色体重複及び／又は１０ｑの一部の欠失を有し、ここで、該部分はＳＵＦＵ及びＰＴＥＮを含む。いくつかの実施形態では、細胞はＦｓ１０１７  ＳＵＦＵ変異を含む。
【０４１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかで処理された細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路が活性な細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路が構成的に活性な細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘッジホッグ蛋白質又はヘッジホッグアゴニストで刺激された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞におけるヘッジホッグ経路の活性は、ＧｌｉルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるＧｌｉ１のレベル又は活性を監視することによって決定される。
【０４１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかで処理された細胞は、培養中の細胞である。いくつかの実施形態では、本発明は、複数の細胞を含む培養物を接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は脊椎動物におけるものである。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物におけるものであり、細胞を接触させることが哺乳動物にヘッジホッグシグナル伝達阻害剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒト被験体である。いくつかの実施形態では、細胞は癌細胞であり及び／又は哺乳動物は癌と診断された哺乳動物である。いくつかの実施形態では、癌細胞は、次よりなる群から選択される癌細胞である：結腸、肺、前立腺、皮膚、血液、肝臓、腎臓、乳房、膀胱、骨、脳、髄芽細胞腫、肉腫、基底細胞癌、胃癌、卵巣癌、食道癌、膵臓癌、又は精巣癌細胞。いくつかの実施形態では、癌細胞は、髄芽腫細胞、基底細胞癌細胞、又は母斑性基底細胞癌細胞（ゴーリン症候群細胞）である。
【０４１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示された方法のいずれかにおいて使用されるヘッジホッグ経路阻害剤は、本明細書に記載の変異型平滑化タンパク質のいずれかの発現を阻害するポリヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、本明細書に開示された変異型平滑タンパク質のいずれかをコードする核酸に特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は、野生型平滑化タンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するタンパク質をコードする核酸）をコードする核酸にはハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、本明細書に開示される変異型平滑化ポリペプチドのいずれかをコードするｍＲＮＡ転写物を標的とするＲＮＡｉアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉアンタゴニストはｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１９〜２３ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは二本鎖であり、かつ、一方又は両方の末端に短いオーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、本明細書に開示された変異型平滑化ポリペプチドのいずれかをコードするｍＲＮＡ転写物を標的とする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡは、野生型平滑化タンパク質（例えば、配列番号１の配列を有するタンパク質をコードする核酸）をコードするｍＲＮＡ転写物を標的としない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉはｓｈＲＮＡを含む。
【０４１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示された方法のいずれかにおいて使用されるヘッジホッグ経路阻害剤は、本明細書に記載の変異型平滑化ポリペプチドのいずれかに特異的に結合する小分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、ヘッジホッグシグナル伝達経路における平滑化の下流で作用するポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、小分子は、ヘッジホッグシグナル伝達経路とは異なる経路におけるポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、小分子はブロモドメイン阻害剤である。いくつかの実施形態では、ブロモドメイン阻害剤はＢＲＤ４阻害剤である。いくつかの実施形態では、ブロモドメイン阻害剤は、Ｃｉｃｅｒｉ外，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１０：３０５−３１２；Ｍｕｌｌｅｒ外，２０１４，Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ，５：２８８−２９６；Ｇａｒｎｉｅｒ外，２０１４，２４（２）：１８５−１９９に記載されたブロモドメイン阻害剤のいずれかである。これらの文献のそれぞれは、その全体が本明細書で援用される。いくつかの実施形態では、ブロモドメイン阻害剤は、ＢＩ−２５３６及びＴＧ−１０１３４８によるＩ−ＢＥＴ７６２、ＪＱ１、ＪＱ２、ＢＲＤ４である。
【０４２０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示された方法のいずれかにおいて使用されるヘッジホッグ経路阻害剤は、本明細書に記載変異型平滑化ポリペプチドのいずれかに特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヘッジホッグシグナル伝達経路における平滑化の下流で作用するポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【０４２１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかに従って薬剤と接触した細胞は、ヘッジホッグシグナル伝達経路の追加の阻害剤（例えば、ＨＰＩ）とも接触する。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路の追加の阻害剤は、ベラトラム型のステロイド系アルカロイドである。いくつかの実施形態では、ベラトラム型ステロイド系アルカロイドはシクロパミン若しくはＫＡＡＤ−シクロパミン又はその任意の機能的誘導体である（例えばＩＰＩ−２６９６０９又はＩＰＩ−９２６）。いくつかの実施形態では、ベラトラム型ステロイド系アルカロイドはジェルビン又はその任意の機能的誘導体である。いくつかの実施形態では、追加の阻害剤は、ビスモデギブ、ソニデジブ、ＢＭＳ−８３３９２３、ＰＦ−０４４４９９１３、ＬＹ２９４０６８０、又はその任意の機能的誘導体である。いくつかの実施形態では、追加の阻害剤は、シュロソウ属アルカロイド又はビスモデギブとは化学的に無関係の平滑化阻害剤であり、ソニデジブ、ＢＭＳ−８３３９２３、ＰＦ−０４４４９９１３、ＬＹ２９４０６８０、Ｅｒｉｖｅｄｇｅ、ＢＭＳ−８３３９２３（ＸＬ３１９）、ＬＤＥ２２５（エリスモデジブ）、ＰＦ−０４４４９９１３、ＮＶＰ−ＬＤＥ２２５、ＮＶＰ−ＬＥＱ５０６、ＴＡＫ−４４１、ＸＬ−３１９、ＬＹ−２９４０６８０、ＳＥＮ４５０、イトラコナゾール、ＭＲＴ−１０、ＭＲＴ−８３、又はＰＦ−０４４４９９１３が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、追加の阻害剤は、Ａｍａｋｙｅ外，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９（１１）：１４１０−１４２２に開示されている化合物のいずれかである（その全体が本明細書で援用される）。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路の追加の阻害剤は抗体である。いくつかの態様では、抗体は、ヘッジホッグタンパク質に結合する、例えば特異的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、ヘッジホッグシグナル伝達経路の追加の阻害剤はＲＮＡｉアンタゴニストである。
【０４２２】
治療又は診断を必要とする被験体としては、異常なヘッジホッグシグナル伝達をすでに有するもの並びに異常なヘッジホッグシグナル伝達を阻害すべきも又はそれ有しやすいものが挙げられる。例えば、被験体又は哺乳動物は、本発明の方法に従って、ヘッジホッグ経路阻害剤を受けた後に、患者が次の一つ以上の観察可能な及び／又は測定可能な減少又は非存在を示した場合には異常なヘッジホッグシグナル伝達に対する治療に成功している：腫瘍細胞の数の減少又は該細胞の非存在；腫瘍サイズの減少；軟組織及び骨への癌の広がりを含めた末梢器官への腫瘍細胞浸潤阻害（すなわちある程度緩やか、いくつかの実施形態では停止）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度緩やか、いくつかの実施形態では停止）；腫瘍増殖のある程度までの阻害；及び／又は特定の癌に関連する症状の一以上のある程度までの軽減；罹患率及び死亡率の減少並びに生命問題の質の改善。このようなヘッジホッグ経路阻害剤が増殖を阻害する及び／又は既存の癌細胞を死滅させることができる程度にまで、このものは細胞増殖抑制性及び／又は細胞傷害性であることができる。また、これらの兆候又は症状の低減は、患者が感じることができる。さらに、ヘッジホッグ経路阻害剤に対する暴露の成功（特に腫瘍応答が全く測定されない場合）は、皮膚パンチ生検又は毛包におけるＧｌｉ１の発現によって監視できる（ビスモデギブに対して行ったとおり）。
【０４２３】
特定の実施形態では、本明細書に開示されるヘッジホッグ経路阻害剤のいずれかによる治療を受けた被験体は、ビスモデギブに耐性である変異型平滑化タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、被験体は、本明細書に記載の平滑化突然変異のいずれかを含む平滑化タンパク質を発現する。所定の実施形態において、被験体は、配列番号１の２８１、４０８、４５９、５３３及び／又は５３５のいずれか１つ以上に対応するアミノ酸に変異を含む平滑化ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、被験体は、配列番号１のＷ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｓ５３３Ｎ及び／又はＷ５３５Ｌに対応するアミノ酸で変異を含む平滑化ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療方法のいずれかで治療される前に、被験体は、本明細書に記載の平滑化突然変異のいずれかを含む平滑化タンパク質を発現することが決定されている。所定の実施形態では、本明細書に記載の治療方法のいずれかで治療される前に、被験体は、配列番号１の２８１、４０８、４５９、５３３／又は５３５のいずれか一つ以上に対応するアミノ酸に変異を含む平滑化ポリペプチドを発現するように決定されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療方法のいずれかで治療される前に、被験体は、配列番号１のＷ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｓ５３３Ｎ及び／又はＷ５３５Ｌに対応するアミノ酸に変異を含む平滑化ポリペプチドを発現するように決定されている。
【０４２４】
疾患における治療及び改善の成功を評価するための上記パラメーターは、医師によく知られている日常的手法によって容易に測定可能である。癌治療について、有効性は、例えば、疾患の進行までの時間（ＴＴＰ）を評価し及び／又は応答速度（ＲＲ）を決定することによって測定できる。転移は、ステージング試験及び転移の程度を決定するためのカルシウムレベル及び他の酵素に関する試験によって決定できる。また、ＣＴスキャンを行って、腫瘍又は癌の外側の領域に広がりを見ることもできる。予後予測、診断及び／又は治療のプロセスに関連する本発明は、例えばＧｌｉ１の発現の決定及び評価を伴う。
【０４２５】
疾患（例えば癌）の治療、その症状の緩和又は診断の治療の目的のための「哺乳動物」とは、ヒト、家畜及び農場動物、動物園、スポーツ又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、フェレットなどを含めて哺乳動物として分類される任意の動物をいう。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は出生後である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は小児である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は成体である。
【０４２６】
１種以上の追加の治療剤との「併用」投与としては、任意の順序での同時（同時期）及び連続投与を含む。
【０４２７】
特定の実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、本明細書に記載の癌のいずれかから選択される癌又は腫瘍の１個以上の細胞がヘッジホッグ経路の成分に変異を含む癌、例えば、本明細書に記載の突然変異のいずれかの治療に使用される。腫瘍が所定のレベルの不均一性を有する場合の細胞を含むことが一般に分かりかつここで特に注目すべきである。したがって、腫瘍における細胞の全てが必ずしも特定の有害な変異を含むわけではない。したがって、本発明は、変異が腫瘍の全ての細胞に存在しない場合であっても治療を受ける癌又は腫瘍細胞がヘッジホッグ経路の成分に変異、例えば本明細書に記載の変異のいずれかを有する細胞を含む方法を意図する。
【０４２８】
さらに、ヘッジホッグ経路阻害剤の使用は、影響を受けた組織及び／又は細胞が高いヘッジホッグ経路活性化を示す疾患を特に標的とすることができると考えられる。Ｇｌｉ１の及びＧＬＩ２を含めてヘッジホッグシグナル伝達経路によって活性化されるＧｌｉ遺伝子の発現は、広範囲の組織及び疾患にわたってヘッジホッグシグナル伝達と最も一貫して相関するのに対し、Ｇｌｉ３はいくぶん相関が少ない。Ｇｌｉ遺伝子は、ヘッジホッグシグナル伝達の完全な効果を発揮するために必要な多くの遺伝子の発現を活性化する転写因子をコードする。しかし、Ｇｌｉ３の転写因子は、ヘッジホッグエフェクター遺伝子のレプレッサーとして作用する場合があるため、Ｇｌｉ３の発現はヘッジホッグシグナル伝達経路の効果の減少を引き起こすことがある。Ｇｌｉ３が転写活性化因子又はリプレッサーとして作用するかどうかは、翻訳後の事象に依存するため、Ｇｌｉ３タンパク質の活性化形態を検出する（リプレッシング形態に対して）ための方法（ウェスタンブロットなど）もヘッジホッグ経路活性化の信頼できる指標であることが予想される。Ｇｌｉ１遺伝子は、広範囲の癌、過形成及び未熟肺で強く発現するため、ヘッジホッグ経路の相対的な活性化のためのマーカーとして機能する。また、高いＧｌｉ遺伝子発現を有する未熟肺などの組織もヘッジホッグ阻害剤の影響を強く受ける。したがって、Ｇｌｉ遺伝子発現の検出を強力な予測ツールとして使用して、ヘッジホッグアンタゴニストを用いた治療の恩恵を特に受ける組織及び疾患を同定することができる。いくつかの実施形態では、Ｇｌｉ１の発現レベルは、転写物の直接検出によって又はタンパク質のレベル若しくは活性の検出によって検出される。転写物は、Ｇｌｉ１の転写産物又はそこから合成されたｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーション又はプローブに主に依存する広範囲の技術のいずれかを用いて検出できる。よく知られている技術としては、ノーザンブロッティング、逆転写ＰＣＲ及び転写物レベルのマイクロアレイ分析が挙げられる。Ｇｌｉタンパク質のレベルを検出するための方法としては、ウェスタンブロット法、免疫沈降法、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：いくつかの実施形態では、Ｇｌｉタンパク質の位置が決定されている基準物と比較する）、及び質量分析が挙げられる。質量分析を一連の精製工程と組み合わせて、特定のサンプル中における多数の異なるタンパク質レベルのハイスループット同定を可能にすることができる。また、質量分析及び二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、タンパク質分解事象、ユビキチン化、リン酸化、脂質修飾を含めてタンパク質に対する転写後修飾を同定することができる。また、ＧＬＩ活性を、基質ＤＮＡへの結合解析又は標的プロモーターの試験管内転写活性化により評価することもできる。ゲルシフトアッセイ、ＤＮＡフットプリンティングアッセイ及びＤＮＡ−タンパク質架橋アッセイは、ＤＮＡ上のＧＵ結合部位に結合することができるタンパク質の存在を評価するために使用できる全ての方法である。Ｊ  ＭｏＩ．Ｍｅｄ  ７７（６）：４５９−６８（１９９９）；Ｃｅｌｌ  １００（４）：４２３−３４（２０００）；Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２７���１９）：４９２３−４３０１（２０００）。
【０４２９】
Ｇｌｉ１はヘッジホッグ活性化の間に非常に普遍的に発現されるので、Ｇｌｉ１過剰発現の程度は、ヘッジホッグ経路阻害剤が有効な治療となることを決定するのに有用なはずである。いくつかの実施形態では、Ｇｌｉ１は、正常対照細胞／組織／被験体において少なくとも２倍程度に高いレベルで発現するはずである。いくつかの実施形態では、Ｇｌｉ１の発現は、正常細胞／組織／被験体において４、６、８又は１０倍程度高い。
【０４３０】
所定の実施形態では、Ｇｌｉ１の転写レベルが測定され、異常に高いＧｌｉ１のレベルを示す病変又は疾患組織がヘッジホッグ経路阻害剤で治療される。他の実施形態では、治療をうける状態は、たとえＧｌｉ１の発現レベルの測定を治療される組織で行っていない場合であっても、ヘッジホッグ経路の異常活性化と有意な相関を有することが知られている。未成熟肺組織、肺癌（例えば、アデノ癌腫、ブロンコ肺胞腺癌、小細胞癌）、乳癌（例えば、下乳管癌腫、下部小葉癌腫、管状癌腫）、前立腺癌（例えば腺癌）、及び良性前立腺過形成は、全て、所定の場合にＧｌｉ１の発現レベルの強い上昇を示す。したがって、Ｇｌｉ１の発現レベルは、組織のどれをヘッジホッグ経路阻害剤で治療する必要があるのかを決定するための強力な診断デバイスである。さらに、尿路上皮細胞の癌（例えば、膀胱癌、他の尿生殖器の癌）が所定の場合にＧＬＩ−Ｌレベルの上昇を有するという実質的に相関的な証拠が存在する。例えば、染色体９ｑ２２上のヘテロ接合性の欠失は、膀胱癌において一般的であることが知られている。Ｐｔｃｈ１遺伝子はこの位置に位置し、Ｐｔｃｈｌ機能欠失は、おそらく多くの他のタイプの癌と同様に過剰増殖の部分的な原因である。したがって、このような癌は、高Ｇｌｉ１の高発現を示し、かつ、ヘッジホッグアンタゴニストでの治療に特に適していると考えられる。
【０４３１】
所定の実施形態では、本明細書に記載のヘッジホッグ経路阻害剤のいずれかは、ｐｔｃｈ−１及び／又はｐｔｃｊ−２変異、例えば、ｐａｔｃｈ−１又はｐａｔｃｈ−２機能喪失変異を有する腫瘍を有する被験体を治療するために使用される。また、ｐｔｃｈ−１及びｐｔｃｈ−２の発現は、ヘッジホッグシグナル伝達経路によって活性化されるが、典型的にはｇｌｉ遺伝子と同程度ではなく、その結果として、ヘッジホッグ経路活性化のマーカーとしてのｇｌｉ遺伝子に劣る。ヘッジホッグ経路は高度に活性であるが、所定の組織では、ｐｔｃｈ−１又はｐｔｃｈ−２の一つのみが発現する。例えば、精巣の発達において、デザートヘッジホッグが重要な役割を果たし、ヘッジホッグ経路が活性化されるが、ｐｔｃ−２のみが発現する。したがって、これらの遺伝子は、ヘッジホッグ経路の活性化のためのマーカーとして個別には信頼できないが、両方の遺伝子の同時測定がヘッジホッグアンタゴニストで治療される組織のためのさらに有用な指標として意図される。
【０４３２】
脊椎動物における分化組織の秩序空間配置の形成の際のヘッジホッグシグナル伝達の幅広い関与を考慮すると、本発明のヘッジホッグ経路阻害剤は、異なる脊椎動物組織のアレイを生成及び／又は維持するための方法で、試験管内及び生体内の両方で使用できるであろう。ヘッジホッグ経路阻害剤は、適宜、上記性剤のいずれかであることができる。
【０４３３】
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、悪性髄芽腫及び他の原発性ＣＮＳ悪性神経外胚葉性腫瘍のための治療計画の一部として使用することができる。髄芽細胞腫、原発性脳腫瘍は、小児における最も一般的な脳腫瘍である。髄芽腫は、後頭蓋窩に発生する原始神経外胚葉（ＰＮＥＴ）腫瘍である。これらのものは、全ての小児脳腫瘍の約２５％を占める。組織学的には、これらのものは、真のロゼットで一般的に配置された小円形細胞腫瘍であるが、アストロサイト、上衣細胞又はニューロンへの分化を示すことができる。ＰＮＥＴは、松果体（松果体芽腫）及び大脳を含む脳の他の領域で発生する可能性がある。テント上領域に生じるものは、一般的に悪化した予後を有する。
【０４３４】
髄芽腫／ＰＮＥＴは、切除後のＣＮＳにおける任意の場所で再発することが知られており、さらには骨に転移することがある。したがって、治療前評価は、「転移の見落とし」の可能性を排除するために脊髄の検査を含むべきである。主としてこの目的のために脊髄造影の代わりにガドリニウム増強ＭＲＩが行われており、ＣＳＦの細胞診が日常的な手順として術後に得られる。
【０４３５】
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、上衣細胞腫の治療プログラムの一部として使用される。上衣腫は、小児における小児脳腫瘍の約１０％を占める。肉眼的に、これらのものは、脳室の上衣内側から発生する腫瘍であり、顕微鏡的にロゼット、カナル、及び血管周囲ロゼットを形成する。上衣腫が報告された５１人の子供のＣＨＯＰシリーズでは、３／４が組織学的に良性であり、約２／３が第四脳室領域から生じ、３／１がテント上領域に示された。プレゼンテーション時の年齢は、誕生時と４年との間にピークがある。年齢の中央値は約５年である。この疾患を有する多くの子供は乳児であるため、彼らはマルチモーダル治療を必要とする場合が多い。
【０４３６】
いくつかの実施形態では、様々な腫瘍におけるヘッジホッグシグナル伝達の関与に基づく本発明のヘッジホッグ経路阻害剤又は開発中のこのような組織におけるヘッジホッグ若しくはその受容体の発現を使用して、調節不全ヘッジホッグ活性を有する腫瘍の増殖を阻害することができる。このような腫瘍としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：ゴーリン症候群に関連する腫瘍（例えば、髄芽腫、髄膜腫など）、ｐｔｃｈ変異に関連する腫瘍（例えば、血管腫、横紋筋肉腫など）、Ｇｌｉ１の増幅に起因する腫瘍（例えば、グリア芽細胞腫、肉腫等）、Ｓｍｏ機能不全に起因する腫瘍（例えば、基底細胞癌等）、ＴＲＣ８、ＰＴＣホモログに結合する腫瘍（例えば、腎癌、甲状腺癌等）、Ｅｘｔ−１関連腫瘍（例えば、骨癌など）、Ｓｆｔ／ｘ誘導腫瘍（例えば、肺癌、軟骨肉腫等）、ヘッジホッグ蛋白質を過剰発現する腫瘍及び他の腫瘍（例えば、乳癌、尿生殖器癌（例えば、腎臓、膀胱、尿管、前立腺など）、副腎癌、消化管癌（例えば胃、腸等）。
【０４３７】
いくつかの実施形態では、本発明のヘッジホッグ経路阻害剤は、癌のいくつかの形態を治療するために使用することもできる。これらの癌としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：前立腺癌、膀胱癌、肺癌（小細胞及び非小細胞を含む）、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜又は他の子宮癌、卵巣癌、精巣癌、陰茎癌、膣癌、尿道癌、胆嚢癌、食道癌又は膵臓癌。追加の癌のタイプとしては、骨格筋又は平滑筋の癌、胃癌、小腸癌、唾液腺癌、肛門癌、直腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、下垂体癌、及び鼻咽頭癌が挙げられる。さらに、本発明のヘッジホッグアンタゴニストで治療することができる癌の典型的な形態は、ヘッジホッグ発現細胞を含む癌が挙げられる。本発明のヘッジホッグアンタゴニストで治療できる癌のさらなる例示的な形態は、Ｇｌｉ発現する細胞を含む癌が挙げられる。一実施形態では、癌は、ｐａｔｃｈ−１の変異によっては特徴付けられない。いくつかの実施形態では、癌は、平滑化及び／又はＳｕＦｕ変異によって特徴付けられる。
【０４３８】
所定の実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤を使用して基底細胞癌を有する被験体を治療することができる。所定の実施形態では、基底細胞癌は母斑性基底細胞癌である。所定の実施形態では、被験体はゴーリン症候群を有する。
【０４３９】
上記は、本発明のヘッジホッグ経路阻害剤のための試験管内及び生体内での使用の単なる例示である。ヘッジホッグ経路阻害剤は、変異型平滑化タンパク質（例えば、Ｗ２８１Ｃ、Ｉ４０８Ｖ、Ａ４５９Ｖ、Ｓ５３３Ｎ及び／又はＷ５３５Ｌ変異を有する平滑化タンパク質）についての天然標的又は結合相手を同定する際に使用して、変異型平滑化生物活性を研究し、変異型平滑化及びその結合相手を様々な細胞や組織から精製し、及びヘッジホッグシグナル伝達経路のさらなる構成要素を同定するのにも好適である。
【０４４０】
特定の実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、開示された抗体のいずれかである。本発明の抗体は、例えば試験管内、生体内及び生体外での治療法で使用できる。一態様では、本発明は、癌を治療し、望ましくない細胞増殖を阻害し、癌の転移を阻害し、及び腫瘍細胞のアポトーシスを生体内又は試験管内のいずれかで誘導するための方法を提供し、この方法は、変異型ＳＭＯに対する抗体の結合を許容する条件下で、本発明の抗体に細胞を暴露することを含む。特定の実施形態では、細胞は、骨髄性白血病細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、腎細胞、癌細胞及び神経膠芽腫細胞である。一実施形態では、本発明の抗体は、変異型ＳＭＯの活性を阻害するために使用することができ、この方法は、変異型ＳＭＯの活性が阻害されるように本発明の抗体に変異型ＳＭＯをさらすことを含む。
【０４４１】
一態様において、本発明は、個体に本発明の抗体の有効量を投与することを含む癌の治療方法を提供する。所定の実施形態では、癌を治療するための方法は、個体に本発明の抗体を含む薬学的製剤の有効量及び任意に以下に与えるものなどの少なくとも１種の追加の治療剤を投与することを含む。
【０４４２】
本発明の抗体は、治療において単独で又は他の組成物と組み合わせて使用できる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１種の追加の治療剤及び／又はアジュバントと同時投与できる。所定の実施形態では、追加の治療剤は抗ＶＥＧＦ抗体である。
【０４４３】
上記したこのような併用投与は、併用療法（複数の治療薬が同じ又は別個の製剤中に含まれる場合）及び別々の投与（この場合には、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、同時及び／又は後に行うことができる）を包含する。本発明の抗体は、放射線療法と併用できる。
【０４４４】
一実施形態では、本発明の抗体は、変異型ＳＭＯの発現及び／又は活性の増大に関連する疾患に罹患している個体に変異型ＳＭＯを結合させるための方法に使用され、この方法は該個体に抗体を投与することを含み、それによって、該個体において変異型ＳＭＯを結合させる。一実施形態では、変異型ＳＭＯは、ヒト変異型ＳＭＯであり、個体はヒトである。
【０４４５】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤又はアジュバント）は、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内及び局所治療のために必要であれば病巣内投与を含めて任意の適切な手段によって投与できる。非経口注射としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が挙げられる。さらに、抗体は、特に抗体の漸減用量で、パルス注入によって好適に投与される。投与は、投与が短期であるか長期であるかに部分的に依存して、任意の適切な経路、例えば静脈内又は皮下注射などの注射によることができる。
【０４４６】
本発明の抗体の結合標的の位置を、抗体の調製及び投与の際に考慮することができる。結合標的が細胞内分子である場合には、本発明の所定の実施形態は、結合標的が位置する細胞に導入される抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。一実施形態では、本発明の抗体は、細胞内抗体として細胞内で発現できる。本明細書で使用するときに、用語「細胞内抗体」とは、Ｍａｒａｓｃｏ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１１−１５（１９９７）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４：１６３−１７０（２００４）；米国特許第６００４９４０号及び同６３２９１７３号；米国特許出願公開第２００３／０１０４４０２号及びＰＣＴ公開ＷＯ２００３／０７７９４５号に記載されているように、細胞内で発現しかつ標的分子に選択的に結合することができる抗体又はその抗原結合部分をいう。例えば、遺伝子治療を使用して細胞内抗体を生成することに関する、１９９６年３月１４日公開されたＷＯ９６／０７３２１も参照されたい。
【０４４７】
細胞内抗体の細胞内発現は、所望の抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸（抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする遺伝子に通常関連する野生型リーダー配列及び分泌シグナルを欠失する）を標的細胞に導入することによって達成できる。本発明の抗体の全て又は一部をコードする１個以上の核酸を標的細胞に送達することができ、それによって、細胞内標的ポリペプチドに結合しかつ標的ポリペプチドの活性を調節することができる１個以上の細胞内抗体が発現するようにする。細胞に核酸を導入する任意の標準的な方法を使用することができ、この方法としては、マイクロインジェクション、弾道的注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、並びに目的の核酸を有するレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びワクシニアベクターによるトランスフェクションが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４４８】
所定の実施形態では、核酸（任意にベクター内に含まれる）は、生体内及び生体外方法で患者の細胞に導入できる。生体内送達の一例では、核酸を、例えば治療的介入が必要とされる部位に直接患者に注射する。生体内送達の別の例では、核酸を、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ随伴ウイルスなど）及び脂質ベースの系（遺伝子の脂質仲介移入に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ−Ｃｈｏｌである）によるトランスフェクションを使用して細胞に導入する。所定の遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ外，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３（１９９２）及びＷＯ９３／２５６７３並びにそこに引用される参考文献を参照されたい。生体外治療の例では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、そして改変された細胞を患者に直接投与するか、患者に移植される多孔性膜内にカプセル化する（例えば、米国特許第４８９２５３８号及び同５２８３１８７号を参照されたい）。核酸の生体外送達のために一般的に使用されるベクターは、レトロウイルスベクターである。
【０４４９】
別の実施形態では、内部移行抗体が提供される。抗体は、細胞への抗体の送達を増強するという所定の特徴を有することができ、又はそのような特性を有するように修飾できる。これを達成するための技術は当該技術分野で知られている。例えば、抗体の陽イオン化は、細胞への取り込みを促進することが知られている（例えば、米国特許第６７０３０１９号参照）。また、リポフェクション又はリポソームを使用して細胞内に抗体を送達することもできる。抗体フラグメントを使用する場合には、標的タンパク質に特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが有利なことがある。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子を、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するように設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成でき及び／又は組換えＤＮＡ技術によって作製できる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照されたい。
【０４５０】
標的細胞に抗体が入ることを、当該分野で公知の他の方法によって高めることができる。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔ又はアンテナペディアホメオドメインタンパク質から誘導されるものなどの所定の配列を、細胞膜を横切る異種タンパク質の効率的な取り込みを導くことができる。例えば、Ｃｈｅｎ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９９），９６：４３２５−４３２９を参照されたい。
【０４５１】
抗体の結合標的が脳内に位置する場合には、本発明の所定の実施形態は、血液脳関門を横断するための抗体を提供する。血液脳関門を横切って分子を輸送するためのいくつかの公知のアプローチが存在し、物理的方法、脂質ベースの方法、細胞ベースの方法、並びに受容体及びチャネルベース方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５２】
血液脳関門を横切って抗体を輸送する物理的方法としては、血液脳関門を完全に回避すること、又は血液脳関門に開口部を作製することが挙げられるが、これらに限定されない。回避方法としては、脳への直接注射（例えば、Ｐａｐａｎａｓｔａｓｓｉｏｕ外，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：３９８−４０６（２００２）参照）、間質注入／対流増強送達（例えば、Ｂｏｂｏ外，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２０７６−２０８０（１９９４））、及び送達デバイスを脳に移植すること（例えば、Ｇｉｌｌ外，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：５８９−５９５（２００３）；及びＧｌｉａｄｅｌ  Ｗａｆｅｒｓ（商標），Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌを参照）が挙げられる。関門に開口を作製する方法としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない：超音波（例えば、米国特許出願公開第２００２／００３８０８６号参照）、浸透圧（例えば高張マンニトールの投与による（Ｎｅｕｗｅｌｔ，Ｅ．Ａ．，Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｌｏｏｄ−Ｂｒａｉｎ  Ｂａｒｒｉｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ  １  ＆  ２，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））、例えばブラジキニン又は透過剤Ａ−７による透過処理（例えば米国特許第５１１２５９６号、同５２６８１６４号、同５５０６２０６号及び同５６８６４１６号参照）、及び抗体をコードする遺伝子を含むベクターによる血液脳関門にまたがるニューロンの形質移入（例えば米国特許出願公開第２００３／００８３２９９号参照）。
【０４５３】
血液脳関門を横切って抗体を輸送する脂質ベースの方法としては、血液脳関門の血管内皮上の受容体に結合する抗体結合フラグメントに結合するリポソーム内に抗体を封入すること（例えば、米国特許出願公開第２００２００２５３１３号参照）及び低密度リポタンパク質粒子（例えば米国特許出願公開第２００４０２０４３５４号参照）又はアポリポタンパク質Ｅ（例えば米国特許出願公開第２００４０１３１６９２号参照）に抗体を被覆することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５４】
血液脳関門を横切って抗体を輸送する幹細胞ベースの方法は、目的の抗体を発現する神経前駆細胞（ＮＰＣ）を遺伝子操作し、その後治療されるべき個体の脳に幹細胞を移植することを伴う。Ｂｅｈｒｓｔｏｃｋ外（２００５）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１５，２００５年１２月１５日先行オンライン出版を参照されたい（神経栄養因子ＧＤＮＦを発現するように遺伝子操作されたＮＰＣは、齧歯類及び霊長類モデルの脳に移植されたときにパーキンソン病の症状を低減させたことを報告する）。
【０４５５】
受容体及びバリアとして血液脳にわたって抗体を輸送するチャネルベースの方法としては、グルココルチコイド遮断薬を使用して血液脳関門の透過性を増大させること（例えば、米国特許出願公開第２００２／００６５２５９号、同２００３／０１６２６９５号、及び同２００５／０１２４５３３号を参照）；カリウムチャネルを活性化すること（例えば米国特許出願公開第２００５／００８９４７３号を参照）、ＡＢＣ薬剤トランスポーターを阻害すること（例えば米国特許出願公開第２００３／００７３７１３号を参照）；抗体にトランスフェリンをコーティングし、１個以上のトランスフェリンレセプターの活性を調節すること（例えば米国特許出願公開第２００３／０１２９１８６号を参照）及び抗体を陽イオン化すること（例えば米国特許第５００４６９７号を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４５６】
本発明の抗体は、医学的実用性に合わせた様式で処方、投薬及び投与されるであろう。ここで考慮する要因としては、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に知られている他の要因が挙げられる。抗体は、問題の疾患を予防又は治療するために現在使用されている１種以上の薬剤と共に処方される必要はないが、適宜そのように処方される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、疾患又は治療の種類及び上記他の要因に依存する。これらは、一般に本明細書に記載するのと同じ用量及び投与経路、又は上記投与量の１〜９９％、又は任意の用量かつ適切であると経験的／臨床的に判断された任意の経路によって使用される。
【０４５７】
疾患の予防又は治療について、本発明の抗体の適切な用量（単独で又は１種以上の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体を予防又は治療目的で投与するかどうか、以前の治療、患者の病歴及び抗体に対する応答、及び主治医の裁量に依存する。抗体は、一度に又は一連の治療にわたって患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば１回以上の別々の投与によるか、連続注入によるかを問わず抗体の約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）を患者への投与のための初期候補用量とすることができる。典型的な１日投与量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲内であろう。状態によっては数日以上にわたる反復投与については、治療は、一般に疾患の症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。抗体の例示的な投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組み合わせ）の１以上の用量を患者に投与することができる。このような用量は、間欠的に、例えば毎週又は３週間毎に投与できる（例えば、患者が抗体の約２〜約１２、例えば、約６用量を受けるように）。初期のより高い負荷用量、その後１回以上のより低い用量を投与することができる。典型的な投薬レジメンは、抗体の約４ｍｇ／  ｋｇの初期負荷用量、その後約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量を投与することを含む。しかしながら、他の投薬レジメンも有用なことがある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
【０４５８】
上記の治療方法のいずれかを、抗変異型ＳＭＯ抗体の代わりに又はそれに加えて本発明の免疫複合体を使用して実施できることと解される。
【０４５９】
ＶＩＩ．医薬製剤
いくつかの実施形態では、本明細書に記載したヘッジホッグ経路阻害剤又は本発明に係るヘッジホッグ経路阻害剤のいずれかを、医薬組成物に製剤化することができる。
【０４６０】
本発明に従って使用されるヘッジホッグ経路阻害剤の医薬組成物は、所望の純度を有する薬剤と任意の薬学的に許容されるキャリア、賦形剤又は安定剤とを混合させることによって保存のために凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製できる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ．第２０版，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．外著，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００））。許容されるキャリア、賦形剤、又は安定剤は、使用される投薬量及び濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、緩衝液、例えばアセテート、トリス、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなど）；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース若しくはデキストリンを含めた単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロース及び塩化ナトリウムなどの等張剤；スクロース、マンニトール、トレハロース若しくはソルビトールなどの糖；ポリソルベートなどの界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば亜鉛タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０４６１】
いくつかの実施形態では、本開示に係る及び／又は本明細書に記載されるヘッジホッグ経路阻害剤の製剤のいずれかは、治療される特定の適応症のために適宜２種以上の活性化合物、いくつかの実施形態では、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有することができる。所定の実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤及び第２活性物質は、一緒に製剤化されることを認識すべきである（例えば、製剤又は組成物は両方の薬剤を含有する）。他の実施形態では、２種（又はそれ以上）の活性剤は別々に製剤化され、それによって、別々の製剤を一緒に又は別々に市場に出し、販売し、保存し、又は使用することができる。別々に製剤化される場合には、本発明は、これらのものを同じ又は異なる時点で投与することができ、所定の実施形態では組み合わせ、そして同時に投与することができることを意図する。
【０４６２】
例えば、上記治療剤に加えて、製剤に、追加の抗体、例えば、第２治療剤又は他の標的に対する抗体（例えば腫瘍の増殖に影響する増殖因子）を含めることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、製剤中にヘッジホッグ阻害剤（例えばロボトニキニン）を含めることが望ましい。あるいは又はさらに、組成物は、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、及び／又は心臓保護剤をさらに含むことができる。このような分子は、意図する目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在する。いくつかの実施形態では、追加の活性化合物はステロイド系アルカロイドである。いくつかの実施形態では、ステロイドアルカロイドは、シクロパミン若しくはＫＡＡＤ−シクロパミン若しくはジェルビン又はその任意の機能的誘導体である（例えばＩＰＩ−２６９６０９又はＩＰＩ−９２６）。いくつかの実施形態では、追加の活性化合物はビスモデギブ、ソニデジブ、ＢＭＳ−８３３９２３、ＰＦ−０４４４９９１３、ＬＹ２９４０６８０又はその任意の誘導体である。いくつかの実施形態では、追加の活性化合物は、Ａｍａｋｙｅ外，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９（１１）：１４１０−１４２２に開示された化合物のいずれかである（その全体が本明細書で援用される）。いくつかの実施形態では、追加の活性化合物は、ｖｅｒａｔｒｕｍアルカロイド又はビスモデギブとは化学的に無関係の別の平滑化阻害剤であり、これらのものとしては、次のものが挙げられるがこれらに限定されない：Ｅｒｉｖｅｄｇｅ、ＢＭＳ−８３３９２３（ＸＬ３１９）、ＬＤＥ２２５（エリスモデジブ）、ＰＦ−０４４４９９１３、ＮＶＰ−ＬＤＥ２２５、ＮＶＰ−ＬＥＱ５０６、ＴＡＫ−４４１、ＸＬ−３１９、ＬＹ−２９４０６８０、ＳＥＮ４５０、イトラコナゾール、ＭＲＴ−１０、ＭＲＴ−８３、又はＰＦ−０４４４９９１３。上記のように、本発明は、第２活性物質をヘッジホッグ経路阻害剤と一緒に処方した製剤（例えば、２種の活性剤を含む単一の製剤として）並びに２種の活性剤が２種の別個の製剤又は組成物中に存在する実施形態を意図する。
【０４６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたような本発明のヘッジホッグ経路阻害剤のいずれかを、例えばコロイド状薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおけるコアセルベーション技術又は界面重合、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン・マイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製されたマイクロカプセル中に封入することができる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（前出）に開示されている。
【０４６４】
いくつかの実施形態では、本発明のヘッジホッグ経路阻害剤のいずれかは、持続放出製剤に製剤化される。持続放出製剤の好適な例としては、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性マトリクスが挙げられ、該マトリックスは成形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン・酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（登録商標）などの分解性乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸・グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリＤ（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０４６５】
本発明の方法に使用するための本開示の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定でき、かつ、特定の適応症又は用途に応じて変更できる。有効用量は、試験管内又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から推定できる。
【０４６６】
所定の実施形態では、本発明の組成物は、医薬製剤を含めて非発熱性である。換言すれば、所定の実施形態において、組成物は発熱物質を実質的に含まない。一実施形態では、本発明の製剤は、内毒素及び／又は関連する発熱物質を実質的に含まない発熱物質非含有製剤である。内毒素としては、微生物内部に閉じ込められ、かつ、微生物が破壊又は死滅した場合にのみ放出される毒素が挙げられる。発熱物質としては、細菌及び他の微生物の外膜からの発熱誘発性の熱安定性物質（糖タンパク質）が挙げられる。これらの物質はいずれも、ヒトに投与された場合に発熱、低血圧及びショックを引き起こす可能性がある。潜在的に有害な影響のため、内毒素の量が低くても、静脈内投与された薬学的薬剤溶液から除去しなければならない。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬物用途のために１時間以内で体重キログラム当たり用量につき５内毒素単位（ＥＵ）という上限を設定している（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。治療用タンパク質を比較的大用量及び／又は長期間にわたって（例えば患者の一生にわたって）投与する場合には、有害で危険な内毒素が少量であっても危険な場合がある。特定の実施形態では、組成物中における内毒素及び発熱物質レベルは、１０ＥＵ／ｍｇ未満、５ＥＵ／ｍｇ未満、１ＥＵ／ｍｇ未満、０．１ＥＵ／ｍｇ未満、０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、又は０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０４６７】
いくつかの実施形態では、ヘッジホッグ経路阻害剤は、無菌製剤に製剤化される。
これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０４６８】
ＩＸ．製品及びキット
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヘッジホッグ経路阻害剤などの本発明のヘッジホッグ経路阻害剤は製品に製造される。同様に、本発明のポリペプチド及び核酸、例えば変異型ＳＭＯポリペプチドも製品として製造できる。いくつかの実施形態では、製品は、容器と、ヘッジホッグシグナル伝達の全体又は一部の阻害のための又はヘッジホッグシグナル伝達経路の活性化に起因する疾患又は状態の治療のための使用を指示する該容器に関する又はそれに関連するラベル又はパッケージ挿入物を備える。他の実施形態では、製品は、容器と、スクリーニングアッセイにおける使用を示す該容器に関する又はそれに関連するラベル又は添付文書を備える。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器などが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成できる。いくつかの実施形態では、容器は、癌の症状を治療するのに有効な組成物を保持し、かつ、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであることができる）。組成物中における少なくとも１種の活性剤はヘッジホッグ経路阻害剤である。ラベル又はパッケージ挿入物は、ヘッジホッグ経路阻害剤を投与するための又はＳＭＯポリペプチド若しくは核酸若しくはベクター若しくは宿主細胞を使用するための説明書をさらに備える。さらに、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２容器を備えることができる。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含めて、商業的見地及び使用者の見地から望ましい他の材料をさらに備えることができる。
【０４６９】
いくつかの実施形態では、様々な他の目的のために、例えば変異型ＳＭＯタンパク質発現細胞死滅アッセイ、細胞からのヘッジホッグシグナル伝達ポリペプチドの精製又は免疫沈降のために有用なキットを提供する。変異型ＳＭＯタンパク質の単離及び精製のために、キットは、ビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合したそれぞれの変異型ＳＭＯタンパク質結合試薬を含むことができる。試験管内、例えばＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットでの変異型ＳＭＯタンパク質の検出及び定量のために当該分子を含むキットを提供することができる。いくつかの実施形態では、製品と同様に、キットは、容器と、該容器に関する又はそれに関連したラベル又は添付文書を備える。
【０４７０】
いくつかの実施形態では、容器は、本発明で使用可能な少なくとも１種のヘッジホッグ経路阻害剤を含む組成物を保持する。いくつかの実施形態では、例えば希釈剤及び緩衝液、対照抗体を含有する追加の容器を含めることができる。いくつかの実施形態では、ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物の説明並びに目的の試験管内又は診断使用のための指示を提供することができる。
【実施例】
【０４７１】
実施例
本発明を一般的に説明してきたが、これは以下の実施例を参照することによって理解されるであろう。実施例は、単に本発明の特定の態様及び実施形態を例示する目的のために含まれるに過ぎず、本発明を限定するものではない。
【０４７２】
例１
ビスモデギブ耐性基底細胞癌の遺伝子分析。
標的治療（例えば癌治療）に対する臨床応答は、薬剤耐性を付与する遺伝子変異の獲得のため短命な場合がある。耐性機構の同定は、新たな治療戦略を導くと考えられる。不適切なＨｈシグナル伝達は、基底細胞癌（ＢＣＣ）を含めたいくつかの癌に関連する。ＰＴＣＨにおける機能喪失変異（〜９０％）及びＳＭＯにおける活性化変異（〜１０％）は、ＢＣＣにおける主要なドライバーである。ビスモデギブ（ＧＤＣ−０４４９）に対する耐性の臨床的メカニズムを、再発基底細胞癌のエキソーム、ＲＮＡ及びコピー数を使用して同定した。
【０４７３】
図２に示すように、ビスモデギブ耐性は、ビスモデギブ耐性ＢＣＣ患者におけるヘッジホッグ経路シグナル伝達の上昇と関連していた。ビスモデギブ耐性ＢＣＣのエキソーム配列決定及びコピー数分析*の結果を以下の表３に示す。
【０４７４】
【表３】
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【０４７５】
遺伝子型の決定から、追加ビスモデギブ耐性腫瘍におけるＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ変異の第３例が明らかになった。ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖは、分析を受けた９名の耐性患者のうちの３名における治療後生検で見出された反復突然変異である。ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ変異は、治療後のみに存在し、４２個の独立した治療未経験ＢＣＣサンプルには存在しなかった（図３を参照されたい）。ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ変異はＳＭＯを活性化することができた。
【０４７６】
また、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ変異は再発ＢＣＣでも検出された。図４に示すように、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃはビスモデギブ結合ポケットである。
【０４７７】
ＷＴ−ＳＭＯ、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ、ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ、ＰＴＣＨ又は空ベクター（ＥＶ）を、ＧＬＩ１ルシフェラーゼレポーターを有するＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞に同時トランスフェクトした。ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖは、ＰＴＣＨ１及びビスモデギブに対する感受性が低下した活性化突然変異であることが示された（図５Ａ〜５Ｃ。エラーバーは標準偏差を表す）。ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃは、ＳＭＯ−ＷＴと同程度にＰＴＣＨ阻害に感受性である（図５Ｄ〜５Ｅ。エラーバーは標準偏差を表す）。示された構築物がトランスフェクトされた２９３細胞を、５ｎＭの［3Ｈ］−ビスモデギブ又は５０μＭの冷却ビスモデギブと共に又はそれなしでインキュベートした。特異的結合＝合計−非特異的結合（図５Ｅ。エラーバーは標準偏差を表す）。
【０４７８】
臨床ＳＭＯ変異の２つのサブグループがあるように思われる。（１）薬剤感受性が減少した活性化（Ａ４５９Ｖ及びＷ５３５Ｌ含む）及び（２）Ｐｔｃｈ感受性を維持し、依然としてビスモデギブ結合ポケットの立体構造を崩壊させる変異（Ｄ４７３Ｈ及びＷ２８１Ｃを含む）。
【０４７９】
例２：ビスモデギブ耐性及び未処理ＢＣＣのゲノム解析
ビスモデギブ耐性に関連する変異を同定するために、ゴーリン症候群（ｎ＝５）及び散発性（ｎ＝６）患者からのＢＣＣ及び追加のゴーリン患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルの標的ＳＭＯシーケンシングの全エキソームシーケンシング（ＷＥＳ）を実施した。全ての患者は、最初にはビスモデギブについて臨床上の利益を経験したが、その後治療を受ける間に進行した。
【０４８０】
患者の４名からの２つの別個の生検を採取し、それによって、ビスモデギブ耐性ＢＣＣから合計１６の生検を分析した。患者は、最初に転移（図６Ｂ）又は局所的に進行したＢＣＣ（図６Ｃ）について診断し、そして薬剤耐性病変がＢＣＣ（図６Ｄ）であったことを組織学的に確認した。比較のために、未処置ゴーリン症候群（ｎ＝１６）及び散発性（ｎ＝２７）ＢＣＣ患者からの腫瘍をＷＥＳに供した。２つの別個の生検を、合計４８の未処置ＢＣＣ生検を与えるゴーリン患者のうち５名から得た。ゴーリン患者からの未処理ＢＣＣのサンプルの平均体細胞突然変異率は３３．５／メガベース（Ｍｂ）であり、６．２〜６８．９／Ｍｂに変化し、そして散発性患者については２．４〜１６２．２／Ｍｂの範囲で５０．５／Ｍｂであった。これらの割合は、黒色腫（Ｌａｗｒｅｎｃｅ外，２０１３）を含めた他の癌と比較して高い。体細胞突然変異スペクトルのグローバル分析から、両方のコホートにおいてシトシンからチミン（Ｃ＞Ｔ）への塩基転位型突然変異に対する優位性が明らかになったが、これは紫外線光誘導突然変異誘発を示す（Ｍｉｌｌｅｒ，１９８５）。
【０４８１】
ＲＮＡ配列を使用する再発ＢＣＣ生検（ｎ＝１１）の転写分析から、Ｈｈ標的遺伝子ＧＬＩ１が正常皮膚サンプルの回収よりも１０倍高く発現した（ＤＥＳｅｑ２、ｐ＜０．００３）ことが明らかになった（図６Ｅ）。さらに、ＧＬＩ１発現レベルは、増殖マーカーＭＫＩ６７の発現レベルと高度に相関していた（Ｒ＝０．９６）が、これは、ＢＣＣの再成長を促すＨｈシグナル伝達の再活性化と一致する。したがって、分析は、ビスモデギブによってＳＭＯ阻害を回避するようにＨｈシグナル伝達を再活性化する遺伝的メカニズムを同定することに重点を置いた。この目的のために、選択された癌遺伝子の突然変異（Ｋａｎｄｏｔｈ外，２０１３）及び標準的なＨｈ経路成分を同定した。次に、ビスモデギブ耐性ＢＣＣにおけるゲノムワイドコピー数変化及びＬＯＨを、一塩基多型（ＳＮＰ；ｎ  ＝１１）及び比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ；ｎ＝４）アレイを使用して決定した。
【０４８２】
例３：ＢＣＣ開始におけるＰＴＣＨ１及びＳＭＯ変異
ＢＣＣ遺伝学に関する以前の報告と一致して（ａｙａｒａｍａｎ外，２０１４；Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ外，２００５）、再発ゴーリンの全て（１００％）及び散発性ＢＣＣの過半数（７５％）は、腫瘍サプレッサーＰＴＣＨ１に変異を示したが、これは遺伝子の全長にわたって発生しかつおそらく有害である：７つは切断であり、４つはエクソンのスプライシングに影響を与える可能性があり、２つはＣｏｎｄｅｌアルゴリズムによって有害であることが予測される（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｉｇａｓ，２０１１）。また、ゴーリン患者ＢＣＣ（ＰＴ１２）もＰＴＣＨ１の変化によって開始された可能性があった。ＰＴＣＨ１の変化なしの再発散発性腫瘍（ｎ＝２）は、既知の発癌性突然変異ＳＭＯ−Ｗ５３５Ｌを保持した（Ｘｉｅ外，１９９８）。これらＰＴＣＨ１及びＳＭＯ変異体は、最初に応答し、その後ビスモデギブ耐性を示したＢＣＣにおける開始事象である可能性が高い。
【０４８３】
ＰＴＣＨ１変異体の頻度に関する同様の傾向が未処置ゴーリン（９０％）及び散発性（７８％）のＢＣＣで観察され、３つの散発例において既知の発癌ＳＭＯ変異を同定した（図７）。再発ＢＣＣは、ゴーリン（５０％）と散発性（５７％）例との間で同様のＴＰ５３変異体頻度を示した一方で、未処置コホートＴＰ５３変異体では、ゴーリンＢＣＣ（２４％）よりも散発性ＢＣＣ（５９％）でより頻繁に観察されたが、これは、未処置の散発性ＢＣＣで観察された高い変異率を反映している可能性がある。
【０４８４】
例４：ＳＭＯ変異体のビスモデギブ依存選択
驚くべきことに、再発腫瘍生検の大半は、薬剤標的ＳＭＯに変異を保有し（１１／１６；６９％）、ほとんどがＰＴＣＨ１変異体と同時に生じた。比較すると、ＳＭＯ変異体は、未処置ゴーリンＢＣＣには完全に存在しておらず、４／２７（１５％）の未処置散発性ＢＣＣに存在していた。再発ＢＣＣで同定されたＳＭＯ変異を図８Ａに概説している。ＳＭＯ−Ｌ４１２Ｆ、ＳＭＯ−Ｗ５３５Ｌ及びＳＭＯ−Ｓ５３３Ｎ変異は、発癌ドライバーとして以前に報告されている（Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ外，１９９８；Ｓｗｅｅｎｅｙ外，２０１４；Ｘｉｅ外，１９９８）のに対し、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ及びＳＭＯ−Ｖ３２１Ｍは、近年、ビスモデギブ耐性ＢＣＣで同定された（Ｂｒｉｎｋｈｕｉｚｅｎ外，２０１４）。未処置ＢＣＣコホート又はＨｈ誘導癌の依然のゲノム解析では観察されなかったＳＭＯ−Ｉ４０８Ｖ及びＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ（Ｂｒａｓｔｉａｎｏｓ外，２０１３；Ｃｌａｒｋ外，２０１３；Ｊａｙａｒａｍａｎ外，２０１４；Ｋｏｏｌ外，２０１４；Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ外，１９９８）を含めて、４種のＳＭＯ変異が発見されたが、これは、これらのものがビスモデギブ耐性に関与することを強く示唆するものである。この研究からの全てのＳＭＯの変異は、ＴＭ領域内に位置し（図８Ｂ及び図９Ａ）、かつ、いくつかの種からＳＭＯタンパク質間で高度に保存された残基にアミノ酸置換を付与するが、これはＳＭＯ機能におけるそれらの重要性を反映している可能性がある。
【０４８５】
耐性機構は、デノボで又はさらに可能なのは治療前の腫瘍中に存在するマイナーサブクローンの選択により取得できる。両方のシナリオでは、治療による薬剤耐性の原因となる変化の濃縮が観察されるであろうことが予想された。ＳＭＯ変異体の薬物依存選択を評価するために、処置前の腫瘍における変異の検出及び治療後にＳＭＯ変異を保有する腫瘍細胞の割合について検討した。この目的のために、６名の患者から入手可能であった処置前ＦＦＰＥ腫瘍サンプルを配列決定し、そして治療後腫瘍クローンを分析した。ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖは、３名の患者からの治療後生検における検出されたが、対応する治療前生検ではバックグラウンドレベルを超えて検出可能ではなかった（図８Ｃ）。同様に、ＳＭＯ−Ｖ３２１Ｍに相当するヌクレオチド変化のみが治療後サンプルにおいてバックグラウンドレベルを超えて検出可能であったが、これは。デノボで生じた又はアッセイの検出限界を下回るレベルで最初に存在したＳＭＯの変異細胞の薬剤誘導選択と一致する（図８Ｄ及び８Ｅ）。興味深いことに、以前に報告されたＳＭＯ−Ｌ４１２Ｆ変異は、患者ＰＴ１１からの処置前及び処置後サンプルの両方で検出されたが、これは。この変異体がこの腫瘍のための発癌性ドライバーである可能性が高いことを示唆するものである（図８Ｆ）。変異型ヌクレオチドの頻度は、治療の際に減少するように見えることに注意されたい；これは、治療後サンプルにおける正常組織の高レベルの汚染によるものである。コピー数お酔いｂＳＮＰアレイ分析から、この腫瘍は、ＰＴＣＨ１については最初に２倍体であり、治療後にＰＴＣＨ１のコピー数喪失を取得したことが明らかになった。理論に拘束されることを望まないが、この患者が最初にビスモデギブに応答するという事実（図８Ｈ）は、この発癌性突然変異においてＰＴＣＨ１レベルの減少（コピー喪失による）が薬剤にさらされても腫瘍の再成長を促進する場合あるという可能性を提起する。
【０４８６】
ＳＭＯ変異が再発ＢＣＣにおいて支配的なクローンに存在したかどうかに対処するために、ＰＴＣＨ１及びＳＭＯ変異体の腫瘍細胞割合を、ＷＥＳからの対立遺伝子頻度並びにコピー数及びＳＮＰアレイからの腫瘍内容物情報を使用して計算した（Ｇｒｅｅｎｍａｎ外，２０１０；Ｎｉｋ−Ｚａｉｎａｌ外，２０１２；Ｓｔｊｅｒｎｑｖｉｓｔ外，２０１１）。ヘテロ接合性生殖細胞系列ＰＴＣＨ１変異は、ゴーリン患者由来の生検における正常皮膚及び観察される場合には腫瘍細胞における後のＬＯＨの汚染の原因となった。ＰＴ０９を除いて、ＳＭＯは、再発ＢＣＣでは二倍体であったため、完全クローンヘテロ接合性ＳＭＯ変異体の予想される対立遺伝子頻度は、腫瘍内容物の５０％であり、その後これを観察された対立遺伝子頻度と比較した。ＰＴＣＨ１変異は腫瘍細胞の＞８０％に存在したが、これは、これらの腫瘍における発癌ドライバーであるＰＴＣＨ１における有害事象と一致する。通常の汚染及び観察される対立遺伝子頻度に基づいて、全てのＳＭＯ変異は、これらのビスモデギブ耐性ＢＣＣにおける腫瘍細胞の＞６０％に存在すると推定されたが、これは、薬剤治療の際におけるそれらの選択性と一致する。
【０４８７】
例５：ＳＭＯの薬剤結合ポケットの変異はビスモデギブに対する耐性を付与する
この研究で発見されたＳＭＯ変異の性質への洞察を得るために、近年解明されたＳＭＯ  ＴＭ領域の結晶構造を利用した（Ｗａｎｇ外，２０１３）。ＳＭＯ構造上へのビスモデギブの計算ドッキングから、ＳＭＯ−Ｗ２８１、ＳＭＯ−Ｖ３２１及びＳＭＯ−Ｉ４０８が薬剤結合ポケットの近くに位置していることが明らかになった（ＤＢＰ；図１０Ａ）。ＳＭＯ−Ｗ２８１の芳香族インドールは、ビスモデギブのピリジン環とのエッジ・ツー・フェイスπスタッキング相互作用を形成し、かつ、狭い疎水性ポケットを形成するのに役立ち、これは、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ変異体の嵩高性の低い硫黄に対する置換により破壊される（図１０Ｂ、中央のパネル）。さらに、バリン３２１からメチオニンへの変異は、Ｗ２８１の配置を妨害しやすく、薬剤結合に二次的な効果を発揮する（図１０Ｂ、右のパネル）。Ｗ２８１とは異なり、残基Ｉ４０８は、試験した計算モデルでは薬剤とは直接接触しない；その代わりに、このものは、結合ポケット残基Ｈ４７０及びＶ４０４に対してそのデルタメチル基でパックされるが、これは、これを失ったときに、これらの残基の立体構造を変化させることにより結合に影響を及ぼすと予想される（図１０Ｃ）。
【０４８８】
ＤＢＰにおける変異の機能的影響を試験するために、ＧｌｉルシフェラーゼベースＨｈレポーターアッセイを使用した。ＤＢＰ変異は、ビスモデギブのＩＣ５０を、８０ｎＭのＩＣ５０を有するＳＭＯ−ＷＴのそれに対して１２〜４９倍増加させた（図１２Ａ）。これらのＩＣ５０値は、このアッセイにおけるＳＭＯの過剰発現のため過剰推定値であることに留意すべきである（Ｄｉｊｋｇｒａａｆ外，２０１１）。それぞれのＤＢＰ変異体は、ＳＭＯ−ＷＴと比較して、基礎活性の小さな増加（＜１．５倍）を示したが（図１１Ａ）、ほとんどのＳＭＯ−Ｉ４０８ＶはＰＴＣＨ１の過剰発現によって容易に阻害された（図１１Ｂ）。次に、ＳＭＯ−Ｉ４０８Ｖ及びＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃに対する［３Ｈ］標識ビスモデギブの結合を試験したところ、これらは、それぞれＩＣ５０の最小及び最大の増加を示した（図１２Ａ）。両方の変異体は、ＳＭＯ−ＷＴと同様の細胞表面レベルで発現したが、ビスモデギブ結合障害を示した（図１２Ｂ及び１１Ｃ）。
【０４８９】
前臨床腫瘍モデルにおいて、Ｈｈ経路は、腫瘍退縮を誘導するために転写レベルで、＞９０％阻害されなければならないことが実証されている（Ｗｏｎｇ外，２０１１）。ビスモデギブの存在下での細胞増殖に対するこれらのＳＭＯ変異の影響をよく理解するために、小脳顆粒ニューロン前駆体（ＣＧＮＰ）細胞のウイルス形質導入のためのアッセイを開発した。以前から、Ｈｈ誘導腫瘍細胞は培養中にそれらのＨｈ経路依存性を急速に失うことが注目されている（Ｓａｓａｉ外，２００６）。しかし、ＣＧＮＰは、Ｈｈ依存的に生体内で増殖し、かつ、有限期間にわたる培養中にＨｈ経路依存性を維持する（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ−Ｒｅｙａ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９９９）。Ｐｔｃｈ１ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ  Ｔｐ５３ｌｏｘｐ／ｌｏｘｐ  Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ−ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＰＰＴ）ｐｕｐから同定されたＣＧＮＰに、ＳＭＯ変異体を強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）・Ｃｒｅ融合タンパク質と共に発現するレンチウイルス構築物を感染させた（図１２Ｃ）。Ｃｒｅリコンビナーゼは、Ｐｔｃｈ１の欠失を誘導するため、形質導入ＣＧＮＰのみを外因性ソニックヘッジホッグリガンドの非存在下で増殖させることを確実にする（ＳＨＨ；図１１Ｄ）。これにより、様々なＳＭＯ変異体がＳＨＨリガンドを除去後にビスモデギブ及び他の阻害剤の存在下での増殖を促進させる能力を試験することが可能になった。  メチル−［３Ｈ］−チミジン取り込みによる増殖を監視すると同時に、Ｃｒｅ依存タンデム二量体（ｔｄ）Ｔｏｍａｔｏ発現により、感染細胞の可視化及び定量化が可能になった。また、この系は、良好なモデル患者遺伝学を可能にした。というのは、ＳＭＯ変異のほとんどがＴＰ５３変異を保有しかつＰＴＣＨ１の喪失によって誘導される腫瘍で同定されたからである。ＳＭＯ−ＷＴ及びＣｒｅを感染させたＰＰＴ  ＣＧＮＰは、〜２２ｎＭのＩＣ５０を有しており、増殖は最大１００ｎＭのビスモデギブで阻害された。これに対し、全てのＤＢＰ変異は、ビスモデギブ感受性に劇的な影響を及ぼし、感染細胞は、高レベルのビスモデギブで増殖し続けた（＞１μＭ；図１２Ｄ）。驚くべきことに、ＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃを感染させた細胞は、５μＭのビスモデギブの存在下であってもほぼ未処置のレベルで増殖し続けたが、これは、おそらく薬剤結合におけるこれらの残基の直接的な役割を反映するものである。ＣＧＮＰは、Ｃｒｅ依存性ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター発現のための蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって同様の頻度で感染し、しかも、ＳＭＯ変異体は、定量的逆転写（定量ＲＴ）ＰＣＲによって同等のレベルで発現したことが確認された。
【０４９０】
例６：ＳＭＯ薬剤結合ポケットの突然変異によるビスモデギブに対する耐性の予測
他のＤＢＰ変異が薬物耐性を促進することができるかどうかを調査するために、計算モデルを使用してビスモデギブの４．５Å内に位置する原子により２１ＳＭＯ残基を同定した（図１３Ａ）。アルゴリズムを使用して、この研究からのＳＭＯ−Ｗ２８１Ｃ及びＳＭＯ−Ｉ４０８Ｖを含めて、これらのＤＢＰ残基への非同義変化をもたらした１６０種の異なる一塩基変異体を同定した（表４）。
【０４９１】
表４：ビスモデギブ及びＬＹ２９４０６８０の両方の４．５オングストローム内の原子によるＳＭＯ残基の同定
【表４−１】
0006736467.tif 000006
【表４−２】
0006736467.tif 000007
【０４９２】
配列番号１の位置２１９、２２１、２８１、３８４、４０８及び５１８に対応するアミノ酸はビスモデギブ結合ポケット内にある。配列番号１の位置３２１、３８７、４５９及び４７３に対応するアミノ酸は、臨床変異に関連するが、変異したときにビスモデギブの４．５オングストローム内には見出されない。ＳＭＯ−Ｄ４７３はこの方法では同定されなかったが、ＳＭＯの結晶構造から、Ｄ４７３は、Ｒ４００、Ｈ４７０、Ｅ５１８及びＮ５２１を含めて、ビスモデギブに直接接触する数個の残基と共に水素結合ネットワークを形成することが明らかになった（Ｗａｎｇ外，２０１３；Ｙａｕｃｈ外，２００９）。ＳＭＯＥ５１８は、変異したときにビスモデギブ感受性に影響を与える残基としてアラニンスキャン突然変異誘発によって依然に同定された（Ｄｉｊｋｇｒａａｆ外，２０１１）。また、このアプローチは、Ｎ２１９及びＤ３８４を含めて、以前にＳＭＯ阻害剤ソニデジブ（ＬＤＥ２２５）に対する耐性の前臨床モデルに関与した残基も同定した（表４；Ｂｕｏｎａｍｉｃｉ外，２０１０）が、これは、水素結合ネットワークを介してＳＭＯコンホメーションを安定化させることが予想される（図１３Ｂ）。驚くべきことに、ＳＭＯ−Ｎ２１９Ｄ、ＳＭＯ−Ｄ３８４Ｎ及びＳＭＯ−Ｓ３８７Ｎは、全て、ＧｌｉルシフェラーゼベースのＨｈレポーターアッセイにおいてＳＭＯ−ＷＴと比較してビスモデギブに対する感受性の減少を示した（図１３Ｃ）。さらに、ＳＭＯ阻害剤ＬＹ２９４０６８０及びビスモデギブは、１４個の接触残基を共有することが分かった（表４）。理論に束縛されるものではないが、これは、化学的に異なる阻害剤が重複ＳＭＯ残基と相互作用し、しかも阻害剤間での交差耐性が臨床上生じる可能性があることを示唆するものである。
【０４９３】
例７：薬剤結合ポケットの範囲外のＳＭＯ変異はビスモデギブ耐性を付与する
また、ビスモデギブ結合ポケットに対して遠位に位置するＳＭＯ変異もビスモデギブ耐性と関連していた（図１４Ａ）。興味深いことに、ＳＭＯ−Ａ４５９Ｖは、ＳＭＯ−ＷＴに対して基礎活性の増加を示したが、確立された発癌性変異よりも少ない程度であった（図１４Ｂ）。この活性上昇は、ビスモデギブ（図１５Ａ）及びＰＴＣＨ１過剰発現の両方による阻害に対する感受性の減少と相関しており、ＳＭＯ−Ａ４５９ＶはそれぞれビスモデギブのＩＣ５０を約９倍にシフトさせた。さらに、試験した全ての活性化変異体は、ＳＭＯ−ＷＴに匹敵するレベルの細胞表面発現にもかかわらず、ビスモデギブ結合障害を示した（図１５Ｂ及び１５Ｃ）。
【０４９４】
ＰＰＴ  ＣＧＮＰアッセイを使用して、ビスモデギブの存在下での増殖に及ぼす非ＤＢＰ  ＳＭＯ変異の影響を調査した。ＣＧＮＰを発現するＳＭＯ−Ａ４５９Ｖ及びＳＭＯＷ５３５Ｌは、高濃度のビスモデギブで増殖し続けた（図１４Ｃ及び１５Ｄ）。これらのデータは、ＧＰＣＲについて観察されたように、活性化を促進し、アンタゴニストに対する親和性を減少させるようにＳＭＯ構造を不安定化させるＤＢＰの外部の変異と一致する（ＧＥＴＨＥＲ外，１９９７）。しかし、これらの変異によって、ＤＢＰに及ぼす潜在的なアロステリック効果を除外することはできない。ＰＴＣＨ１野生型でありかつ発癌性ＳＭＯ変異を保有するいくつかのＢＣＣ（ＰＴ０１、ＰＴ０７及びＰＴ１１からの）は、これらのＳＭＯ変異がビスモデギブ阻害に対する感受性を減少させるという事実にもかかわらず、初期に治療に応答した（図１５Ａ）。これは、ビスモデギブに対するＳＭＯ変異体の感受性におけるＰＴＣＨ１の機能喪失についての役割を示唆する可能性がある。
【０４９５】
例８：ビスモデギブ耐性を克服する治療オプション
複数のＳＭＯ変異がビスモデギブに対する耐性を付与することができることを確立されたので、次に、化学的に異なるＳＭＯ阻害剤がビスモデギブ耐性克服することができるかどうかに対処した。ＬＹ２９４０６８０及びＬＤＥ２２５は、近年、様々な癌のための臨床試験中でありＣｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）、化合物５は、ＳＭＯ−Ｄ４７３Ｈに対する前臨床有効性を示したＳＭＯ阻害剤である（Ｄｉｊｋｇｒａａｆ外，２０１１）。全ての化合物が同様にＰＰＴ  ＣＧＮＰを発現するＳＭＯ−ＷＴの増殖を抑制したが、ＳＭＯ−変異体発現細胞は、異なる程度にもかかわらず増殖し続けた（図１６Ａ）。この観察された様々なＳＭＯ阻害剤間の交差耐性は構造予測と一致し、これは、ＳＭＯアンタゴニストを組み合わせることが、獲得した耐性を克服するのに好適な治療オプションではないことを示唆する。さらに、再発腫瘍における再発ＳＵＦＵ及びＧＬＩ２変異体の同定から、ＳＭＯの下流Ｈｈ経路の構成要素を標的とすることについて論じることが可能である。これまでに開発されたＧＬＩ阻害剤は、有効性及び生物学的利用能に欠けるが、最近の研究から、ブロモドメイン含有タンパク質ＢＲＤ４がＧＬＩプロモーターを占有し、Ｈｈ経路の転写出力のために必要であることが分かった（Ｌｏｎｇ外，２０１４；Ｔａｎｇ外，２０１４）。ビスモデギブ耐性ＳＭＯ変異体を発現するＰＰＴ  ＣＧＮＰは、ブロモドメイン阻害剤ＪＱ１の存在下で増殖の減少を示した（図１６Ｂ）。
【０４９６】
例２〜９のための材料及び方法
患者及び組織試料
ビスモデギブ治療患者からの試料を、連邦政府のガイドラインに従って書面によるインフォームドコンセントを受けた後及び臨床研究ＳＨＨ３９２５ｇ、ＳＨＨ４４７６ｇ及びＳＴＥＶＩＥに参加する貢献センターの治験審査委員会（ＩＲＢ）により承認されたとおりに収集した。ビスモデギブ耐性メカニズムの解析のために、生検を、従来技術に記載されたとおり、予め治療上の研究者評価臨床的利益を経験した、局所進行性又は転移性ＢＣＣを有する１２人の患者から疾患進行時に得た（ＬｏＲｕｓｓｏ外，２０１１；Ｓｅｋｕｌｉｃ外，２０１２）。４３人の未治療患者から生検を採取し、ミシガン大学及びスタンフォード大学のＩＲＢによって承認されたプロトコルに従って比較のために配列決定した。
【０４９７】
ゲノム解析
１５個のビスモデギブ耐性ＢＣＣサンプル、４８個の未処置ＢＣＣ及び５２個の一致血液サンプルからのＤＮＡをＷＥＳに供した。腫瘍生検のＷＥＳは、６７倍を超える最小平均被覆率で達成された。コピー数の変化を、ＳＮＰ又はＣＧＨアレイによってビスモデギブ耐性ＢＣＣについて評価した。１１個の抵抗性ＢＣＣサンプルからのＲＮＡを、ＲＮＡ−ｓｅｑに供した。７個のＦＦＰＥサンプルからのＤＮＡを、パイロシーケンシングによって分析した。５個の正常皮膚サンプルからのＲＮＡ配列データ（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｅｘ社から入手）を、ＢＣＣ患者サンプルとの比較のためにベースライン遺伝子発現として使用した。
【０４９８】
動物
全てのマウスは、ジェネンテック社の動物使用ガイドライン及びカリフォルニア州立法的・倫理的実践に適合した、ジェネンテック社の動物ケア及び使用委員協会によって承認されたプロトコルに従って飼育し、維持した。
【０４９９】
機能分析
ＳＭＯ変異体は、記載されるとおりにｐＲＫ５−ＳＭＯベクターで生成し（Ｄｉｊｋｇｒａａｆ外，２０１１；Ｙａｕｃｈ外，２００９）、そして記載されるとおりにＧｌｉルシフェラーゼレポーターアッセイで利用し（Ｄｉｊｋｇｒａａｆ外，２０１１）又は一次ＣＧＮＰ培養の形質導入用のレンチウイルスベクターにクローン化した。増殖は、メチル−［３Ｈ］−チミジン取り込みを使用してアッセイした（Ｋｏｏｌ外，２０１４）。ＳＭＯ変異体に対する［３Ｈ］−ビスモデギブの結合を、記載されるとおりにＨＥＫ−２９３細胞で実施した（Ｄｉｊｋｇｒａａｆ外，２０１１）。
【０５００】
患者サンプル
再発腫瘍サンプルを、寄付センターでの連邦及び治験審査委員会（ＩＲＢ）のガイドラインに従って書面によるインフォームドコンセントを受けた後に採取した。未処置の散発性ＢＣＣサンプルをミシガン大学ＩＲＢ承認プロトコルのＨＵＭ０００６９０５２及びＨＵＭ０００５００８５に従って得た。未処置ゴーリン患者サンプルを、スタンフォード大学ＩＲＢ承認プロトコル２０１２−０２９に従って得た。
【０５０１】
組織学
ＦＦＰＥ及びＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）包埋サンプルを切断し、そして標準的な手順に従ってＨ＆Ｅ染色した。画像を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社）を使用して得た。
【０５０２】
ＤＮＡ及びＲＮＡ単離
冷凍ＢＣＣ腫瘍をＢｕｌｌｅｔ  ブレンダー（Ｎｅｘｔ  Ａｄｖａｎｃｅ）又はＴｉｓｓｕｅ  Ｌｙｚｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）のいずれかを使用して、ＲＬＴプラス溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中でホモジナイズした。核酸を、製造業者のプロトコールに従ってＡｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）で単離した。ＦＦＰＥ腫瘍切片を、マクロ解剖し、脱パラフィンし、そしてＡｌｌｐｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  ＦＦＰＥキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。
【０５０３】
エキソーム捕捉及び配列決定
エキソーム捕捉を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（カリフォルニア州サンタクララ、）ヒト全エキソームキット（５０Ｍｂ）を使用して実施した。エキソーム捕捉ライブラリーを、ＨｉＳｅｑ２０００（イルミナ、ＣＡ）で配列決定して２×７５ｂｐペアエンドデータを生成した。
【０５０４】
バリアントコーリング
エキソーム配列をＵＣＳＣヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）にｇｓｎａｐ（Ｗｕ及びＮａｃｕ，２０１０）バージョン２０１３−１０−１０を使用してパラメータ「-M 2−n 10−B 2−i 1−-pairmax-dna=1000−-terminal-threshold=1000−-gmap-mode=none−-clip-overlap」でアラインさせた。局所的再アラインメントを、ＧＡＴＫ  Ｉｎｄｅｌ  Ｒｅａｌｉｇｎｅｒを使用して実施した（ＤｅＰｒｉｓｔｏ外，２０１１）。重複読み取り値を、ピカードを使用して除去した。腫瘍及び対応する正常サンプルファイルについての体細胞バリアントコーリングを、デフォルトパラメータのＶａｒｉａｎｔＴｏｏｌｓ２を使用して実行した
（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/VariantTools.html）。
ｄｂＳＮＰ構築物１３１で表される（Ｓｈｅｒｒｙ外，２００１）がＣＯＳＭＩＣ  ｖ６２には存在しない（Ｆｏｒｂｅｓ外，２０１０）既知の生殖系列変異体を、全てのサンプルについてフィルタリングした。遺伝子機能に及ぼす全ての非同義体細胞変異の効果を、Ｃｏｎｄｅｌを使用して予測した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ  ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｉｇａｓ，２０１１）。全ての変異体に、Ｅｎｓｅｍｂｌリリース６３を使用して注釈をつけた。
【０５０５】
ＲＮＡ配列決定及びデータ解析
ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＣＡ）を使用して調製た。ライブラリーは、レーン当たり３回多重化し、そしてＨｉＳｅｑ２０００で配列決定してサンプル当たり少なくとも〜３０００万ペアエンド（２×７５ｂｐ）の測定値を得た。ＲＮＡ−ｓｅｑ測定値を、ｇｓｎａｐ（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｎａｃｕ，２０１０）バージョン２０１３−１０−１０を使用してパラメータ「-M 2−n 10−B 2−i 1−N 1−w 200000−E 1−−pairmax-rna=200000−-clip-overlap」でＵＣＳＣヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）にアラインメントした。遺伝子当たりの発現数を、ペア内で調和的にかつＮＣＢＩ及びＥｎｓｅｍｂｌ遺伝子アノテーションによって定義されるような各遺伝子座及びＲｅｆＳｅｑ  ｍＲＮＡ配列にユニークにアラインメントする測定値の数をカウントすることによって得た。差次的遺伝子発現解析を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ＤＥＳｅｑ２パッケージ（Ａｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｈｕｂｅｒ，２０１０）を使用して実行した。
【０５０６】
配列データ処理
全ての配列決定読み取り値を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ＳｈｏｒｔＲｅａｄパッケージを使用して品質について評価した（Ｍｏｒｇａｎ外，２００９）。全てのサンプルが正しく識別されたことを確認するために、全てのエキソーム及びＲＮＡ−ｓｅｑデータ変異体を相互比較し、そしてＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ＶａｒｉａｎｔＴｏｏｌｓ２パッケージを使用して遺伝的整合性を確認した。全ての患者対サンプルは正しく一致し、９０％カットオフを使用した他の患者とは一致しなかった。
【０５０７】
比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）
腫瘍サンプルを、ＡｇｉｌｅｎｔヒトゲノムＣＧＨ１Ｍマイクロアレイでアッセイした。ヒト男性ゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｐ／Ｎ  Ｇ１４７１）を基準として使用した。バックグラウンド減算信号強度の個々のｌｏｇ２比を、Ａｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェアバージョン１０．７から得た。ＬＯＧ２比を、ゲノムＧＣ含量についての１ＭＢウィンドウを使用してＧＣ含量波効果について補正した（Ｄｉｓｋｉｎ外，２００８）。各プローブについて得られたｌｏｇ２比の値を、ｃｇｈＦＬａｓｓｏアルゴリズムを使用して１つのサンプル及びその時の染色体にセグメント化した（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，２００８）。セグメンテーションを、パラメータｌａｍｂｄａ１＝０及びｌａｍｂｄａ２＝１０００＊現在の染色体上のプローブの割合を使用して行った。所定のセグメントのゲノム範囲内の全てのプローブは、そのセグメント内のプローブの平均コピー数の値が与えられた。
【０５０８】
ＳＮＰアレイ
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｕｍａｎＯｍｎｉ２．５−８アレイを、（Ｒｕｄｉｎ外，２０１２）によって開発された方法の以前に使用された修正バージョンを使用して処理した。上記のように、正常サンプルの大きなパネルを使用して、各ＳＮＰについて２個のプローブの挙動を学習させた。現在の分析について、４５０個のＨａｐＭａｐ正常サンプルを使用した。上記のように、各サンプル中における各プローブについての生信号を、所定の対立遺伝子の０、１又は２の真の基礎的コピーがＰＩＣＮＩＣの隠れマルコフモデルで必要とされるように１、２又は３にマッピングされたスケールに変換した。各対立遺伝子のためのプローブＡ及びＢについてのこれらの値を使用して、コピー数比（ＣＮＲ、式１）及びシータ（式２）を算出した。ＣＮＲを、全サンプル倍数、すなわち、ゲノム全体の平均コピー数に対する所定の遺伝子座での総コピー数の比として解釈できる。ＣＮＲ値を、ゲノムＧＣ含量についての１Ｍｂウィンドウを使用してＧＣ含量波効果に対して補正した（Ｄｉｓｋｉｎ外，２００８）。
式１：ＣＮＲ＝（Ａ＋Ｂ）／４
式２：シータ＝２／π＊アークタンジェント（Ｂ／Ａ）
【０５０９】
続いて、ＣＮＲ及びシータを、ゼロコピーが存在するときのＣＮＲについてのバックグラウンド値αを推定するＰＩＣＮＩＣの前処理ステップに入力した；π、正常細胞汚染からのシグナルのフラクション及び；φ、グローバル倍数性又は全ての調査ＳＮＰ位置にわたる平均コピー数。この推定は、ゲノムに沿ったＣＮＲの初期セグメンテーションを必要とする。本研究では、ｃｇｈＦＬａｓｓｏ（ｌａｍｂｄａ１＝０及びｌａｍｂｄａ２＝１０００のＬ２Ｌ１ＶｉｔＰａｔｈ（Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，２００８））を使用し、これは、ＣＢＳ（Ｖｅｎｋａｔｒａｍａｎ  ａｎｄ  Ｏｌｓｈｅｎ，２００７）又はＰＩＣＮＩＣの内部アルゴリズムのいずれかよりもより正確なセグメンテーションを与えることが分かった。さらに、π、α及びφ推定するためのＰＩＣＮＩＣの手順を修正してＸ及びＹ染色体についての性特異的予想コピー数（ｐｉ）を使用した。最後に、これら３つのパラメータについてのＰＩＣＮＩＣの元の事前分布は、この配列のプラットフォームには不適切であることが分かった。その代わりに、αを、０．７の平均値及び０．０５の標準偏差を有するガウシアンとしてモデル化し；πを、０．０５のアルファパラメータ及び１００のベータパラメータを揺するベータ分布としてモデル化し；及びφを、６．７１４３の形状パラメータ及び０．３５のスケールパラメータを有するガンマ分布としてモデル化した。
【０５１０】
α、π及びφを各サンプルについて推定した後に、ＰＩＣＮＩＣのＨＭＭを適用してデータをセグメント化し、そして整数対立遺伝子特異的コピー数を生成した。対立遺伝子特異的コピー数の少ない方がゼロに等しかったゲノムセグメントは、ＬＯＨの領域である。
【０５１１】
ＨＭＭフィットは、一般に、ほとんどのサンプルにおいてほとんどの染色体について非常に正確であったが、ＣＮＲが隣接する２つの整数の期待値の間にある場合がることが観察された。これは、生物学的な事実の反映ではないと考えられる２つの隣接するＨＭＭ状態間でジッタを生成した。これに対処するために、ＰＩＣＮＩＣのＨＭＭによって生成される総コピー数の整数推定値をｃｇｈＦＬａｓｓｏ（ＣＮＲ）によって生成される制約のない値で置換した。報告総コピー数を生成し、そして正常汚染について調節するために、α、π及びθの推定値をＰＩＣＮＩＣに従ってｃｇｈＦＬａｓｓｏ結果に適用した：
式３．δ＝（１−α）／（（２π）＋φ（１−π）
式４．
【数１】
0006736467.tif 000008
【０５１２】
腫瘍細胞割合
腫瘍細胞割合を記載されるとおりに算出した（Ｎｉｋ−Ｚａｉｎａｌ外，２０１２）。簡単に言えば、所定の変異を有する腫瘍細胞を、以下の式を使用して決定した：
【数２】
0006736467.tif 000009
ここで、ｒは、ＳＮＰアレイによって決定されるときの、腫瘍細胞である生検中における細胞の割合であり；ｒは、目的の基準にわたるＲ全読み値から外れる変異型対立遺伝子を報告する読み値の数であり；ＨＴ及びＨＮは、それぞれ腫瘍及び正常ゲノムにおけるその基準でのゲノムのコピー数である。全ての頻度をパーセンテージに変換した。いくつかの腫瘍細胞頻度は１００％を超えた。というのは、このモデルは、生殖細胞変異を占めず又は中立のＬＯＨをコピーしないからである。検証された生殖細胞変異について、次式を、汚染組織内の異なる比率での変異読み値を考慮して調節した：
【数３】
0006736467.tif 000010
【０５１３】
ビスモデギブ結合モデル
ＬＹ２９４０６８０（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＪＫＶ）が結合したＳＭＯの結晶構造は、ドッキングのための出発点として機能した。Ｍａｅｓｔｒｏバージョン９．５（シュレーディンガー社）で利用可能なシュレーディンガープログラムパッケージソフトを使用して、ＰｒｅｐＷｉｚを有するタンパク質調、Ｌｉｇｐｒｅｐを有するビスモデギブのリガンド調製及びグライドスタンダードプレシジョンとのドッキングを実施し、グライドドッキングステップで次の変更を除いて全てのステップについてデフォルトパラメータを保持した。フィフティポーズを、歪み補正項をオンにしてポストドッキング最小化を行うために含めた。トップ１０のポーズを分析のために書きこみ、これらの全ては同様の結合モードを示した。ピリジン隣接オルト−クロロフェニル環は、ほぼ同じ位置にとどまり、アミドのねじれ角の変化により、メチルスルホン及びその結合環の位置のわずかな変化が生じた。トップポーズを本研究の数値のために選択したが、上記変化は、突然変異の効果に関するいかなる解釈も変更していないであろう。図２Ｂ、図３Ａ〜Ｃ、図５Ａ〜Ｂ及び図６Ａは、ＭＯＥ２０１３．０８０１（ケミカル・コンピューティング・グループ社）を使用して作製された。結合ポケット及びＩｌｅ−４０８相互作用について示された表面領域は溶媒アクセス可能である。
【０５１４】
パイロシーケンシング
変異特異的ＰＣＲ（ＢＳＰ）プライマーを、ＰｙｒｏＭａｒｋアッセイデザインソフトウェアＶ２．０（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して設計した。ＰＣＲプライマーを、フォワード又はリバースプライマーのいずれかでの５’ビオチン標識で合成して、ストレプトアビジンセファロースビーズへのＰＣＲ産物の結合を容易にした。配列決定プライマーを、ＰｙｒｏＭａｒｋアッセイデザインソフトウェアＶ２．０（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して５’−ビオチン標識ＰＣＲプライマーの逆方向で設計した。ゲノムＤＮＡ（２０ｎｇ）を、プラチナムＰＣＲスーパーミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して２５μｌ反応で増幅させ、そしてＰＣＲ産物の２０μｌをＰｙｒｏｍａｒｋ  Ｑ２４（Ｑｉａｇｅｎ社）でのシークエンシングのために使用した。ＰＣＲ産物を、１０分間にわたってストレプトアビジンセファロースビーズと共にインキュベートし、その後７０％エタノール、Ｐｙｒｏｍａｒｋ変性溶液、そしてＰｙｒｏｍａｒｋ洗浄緩衝液で洗浄した。次いで、変性したＰＣＲ産物を、０．３μＭの配列決定プライマーを使用して配列決定した。パイログラムを可視化し、そして配列の品質を評価し、そしてＳＭＯ位置Ｌ４１２及びＡ５４９での変異体％を、ＰｙｒｏＭａｒｋソフトウェアバージョン２．０．４（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して決定した。
【０５１５】
コピー数アッセイ
ゲノムＤＮＡを、血液、治療前後の腫瘍サンプルから単離し、そして反応あたり１０ｎｇを四重ＴａｑＭａｎアッセイ（アプライドバイオシステムズ／ライフテクノロジーズ）における鋳型として使用して、ＣｏｐｙＣａｌｌｅｒソフトウェア（アプライドバイオシステムズ／ライフテクノロジーズ）でＰＴＣＨ１及びＲＮａｓｅ  Ｐ（基準）コピー数を決定した。
【０５１６】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡの１〜４μｇを、大容量ｃＤＮＡキット（アプライドバイオシステムズ／ライフテクノロジーズ社）を使用して逆転写させた。定量的ＰＣＲ反応を、ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（アプライドバイオシステムズ／ライフテクノロジーズ社）を使用して実施した。遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブ配列は請求により入手可能である。
【０５１７】
プラスミド
ＳＭＯの点変異体を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社）を用いてｐＲＫ５−ＳＭＯで生成した。ＳＭＯの点変異体を、ｐＲＫ５−ＳＭＯ−Ｆｌａｇ及びｐＲＫ７−ｇＤ−ＳＭＯ−ｍｙｃにクローニングした。ｐＲＫ５−ＰＴＣＨ１及びｐＲＫ５−ｅＧＦＰは先に記載した（Ｙａｕｃｈ外，２００９）。ＨｈルシフェラーゼレポーターＧｌｉ−ＢＳ構築物は先に記載され（Ｍｕｒｏｎｅ外，１９９９）、Ｒｅｎｉｌｌａトランスフェクション対照プラスミドＰＲＬ−ＴＫはプロメガ社製である。ｐＧＥＩＧＣは、ｐＧＩＰＺ（オープンバイオシステムズ社）のＺｅｏR−ＣＭＶie−ｔＧＦＰ−ＩＲＥＳ−ＰｕｒｏR−ｓｈＲＮＡ−ＷＲＥの内容物をＥＦ１αプロモーター、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及び強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ−Ｃｒｅ；Ｈａｒｆｅ外，２００４）のＣ末端に融合したＣｒｅリコンビナーゼを含むフラグメントで置換することによって作製されたＨＩＶベースの自己不活性化レンチウイルスベクターである。全ての構築物を配列決定により確認した；クローニングの詳細、ベクターマップ及び配列ファイルは請求により入手可能である。
【０５１８】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（ＡＴＣＣ）を、６ウェルプレートに、４ｍＭのグルタミン、１０ｍＭのヘペスｐＨ７．２及び１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース中において１．７５×１０5細胞／ウェルで播種した。１６時間後に、細胞に、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を使用してウェル当たり４００ｎｇの発現構築物、４００  ｎｇの９×−Ｇｌｉ−ＢＳ及び２００ｎｇのｐＲＬ−ＴＫをトランスフェクトした。ＰＴＣＨ１阻害実験のために、細胞に、２００ｎｇのＳＭＯ発現構築物及び空ベクターに対する様々なＰＴＣＨ１比を含む２００ｎｇの追加ＤＮＡをトランスフェクトした。６時間後に、１個のウェルからの細胞をトリプシン処理し、そして１２ウェルプレートの４個のウェルにわたって再分配した。１６時間後に、培地のＦＢＳ含有量を０．５％に減少させて一次繊毛の形成を誘導し、そして小分子Ｈｈ阻害剤を示された濃度で添加した。ホタルルシフェラーゼ活性を２４時間後にデュアルＧｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して決定し、Ｗａｌｌａｃ  ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を使用して読み取った。値をｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性で割ってトランスフェクション効率を正規化した。個々の実験を  二重又は三重で行い、そして少なくとも１回繰り返した。用量反応データをグラフパッドプリズムにおける４パラメータ式にフィットさせた：
【数４】
0006736467.tif 000011
ここで、「Ｙ」は、阻害剤を含まない対照の割合として算出された正規化Ｇｌｉ−ルシフェラーゼシグナル又は正規化チミジン取り込みであり、「Ｘ」は阻害剤濃度である。上及び下の（Ｂ）の値は、各サンプルについて等しくなるように制約される。「Ｈ」はヒルスロープである。
【０５１９】
［3Ｈ］−ビスモデギブ結合アッセイ
２×１０6個のＨＥＫ−２９３細胞を１０ｃｍプレートに播種し、１６時間後にＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用して空ベクター又はＳＭＯの発現構築物のいずれかの３μｇを細胞にトランスフェクションした。細胞を４０時間後に１ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ中で回収し、そして室温で１０分間にわたり４％ＰＦＡを含むＰＢＳで固定し、その後、これらのものを１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、ウェル当たり１００，０００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、室温で１時間にわたり５ｎＭの［3Ｈ］−ビスモデギブ（Ｓｅｌｃｉａ）と共に５０μＭの非標識ビスモデギブの存在下又は非存在下でインキュベートし、続いてＦｉｌｔｅｒｍａｔｅ細胞ハーベスター（パーキンエルマー社）を使用してフィルタープレート（パーキンエルマー社）に移した。ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ流体（パーキンエルマー社）の４０μｍをウェル毎に添加し、１分当たりのカウントを、パーキンエルマートップカウントＮＸＴを使用して評価した。全てのサンプルを３回分析した。特異的結合を、全結合から非特異的結合を減算することにより過剰量の非標識ビスモデギブとの競合後に算出した。
【０５２０】
ｇＤ−ＳＭＯ細胞表面発現のＦＡＣＳ分析
１×１０6個のＨＥＫ−２９３細胞を１０ｃｍプレートに播種し、６時間後にＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用してｇＤ−ＳＭＯ発現構築物３μｇを細胞にトランスフェクトした。細胞を４８時間後に１ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ中で除去し、その後、抗ｇＤ抗体（５Ｂ６、１μｇ／ｍｌ）と共に３０分間インキュベートし、その後１：１００ビオチン−ＳＰ共役Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ及び１：５０Ｒ−フィコエリトリン結合ストレプトアビジン（両方ともジャクソンイムノリサーチ研究所）と共に２０分間インキュベートした。細胞をヨウ化プロピジウム（５００ｎｇ／ｍｌ）に再懸濁し、ＨＴＳ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析した。
【０５２１】
ウイルス産生及び力価測定
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、１５ｃｍの皿にトランスフェクションの２４時間前に１０％熱不活性化ＦＢＳを含むＤＭＥＭ高グルコース中１．５ｘ１０6個の細胞／プレートで播種した。レンチウイルス上清を、６μｇのｐＧＥＩＧＣ−ＳＭＯ、１２μｇのパッケージングベクターΔ８．９（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ外，１９９７）、３μｇのエンベロープベクターＰＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びトランスフェクション試薬ＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用して同時トランスフェクションにより調製した。培地をトランスフェクション後１２時間で交換し、そしてウイルス上清を２４時間後に採取し、０．４５μｍのＰＥＳフィルター（ナルゲン社）に通して濾過し、そしてさらなる処理まで４℃で保存した。ウイルス上清を１時間３０分にわたって１００，０００×ｇでの超遠心分離によって２００倍に濃縮した（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ａｎｄ  Ｔｒｏｎｏ，２０００）。ウイルスペレットをＣＧＮＰ培地に再懸濁し、−８０℃で保存した。ウイルス力価を、６ウェルプレートに２×１０5細胞／ウェルで播種したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞について測定した。細胞を１２時間にわたって付着させ、その後培地を１：４００又は１：４０００希釈ウイルス濃縮物２ｍｌで置換した。ウェル当たりの細胞数をウイルスの添加の時点で計数し、６ウェルの平均を使用してウイルス力価を算出した。ウイルス上清を６０時間にわたって細胞上に残し、その後、細胞を採取し、ＦＡＣＳによる蛍光タンパク質発現について分析した。ウイルス力価を、ウイルス濃縮物の１μｌ当たり、方程式［細胞数／１００×％蛍光細胞］×１０００に従って形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌで算出した（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ａｎｄ  Ｔｒｏｎｏ，２０００）。１５％未満の蛍光細胞をもたらした形質導入のみを力価の計算に使用した。
【０５２２】
マウス
Ｐｔｃｈ１ｌｏｘｐ株はＲ．Ｔoｆｔｇａｒｄ及びＳ．Ｔｅｇｌｕｎｄ氏から提供された（スウェーデン国ストックホルムカロリンスカ研究所；Ｋａｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。Ｔｐ５３ｌｏｘｐ株はＡ．  Ｂｅｒｎｓ氏から提供された（オランダ国アムステルダムのオランダ癌研究所；Ｊｏｎｋｅｒｓ外，２００１年）。Ｒｏｓａ２６ＬＳＬ．ｔｄＴｏｍａｔｏ株は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ社から購入した（在庫番号：００７９０９；  Ｍａｄｉｓｅｎ外，２０１０）。全てのマウスを、カリフォルニア州法的及び倫理的プラクティスに従ってジェネンテック社の動物使用ガイドラインに従って飼育し、維持した。
【０５２３】
ＣＧＮＰの単離及び形質導入
出生後５〜７日のＰｔｃｈ１loxp/loxpＲｏｓａ２６LSL.tdTomatoＴｐ５３loxp/loxpマウスからの小脳を３７℃で１０分間にわたって０．０５％トリプシンで解離させた。細胞を、４℃で１０分間にわたって５１４×ｇでの遠心分離によって回収し、１×Ｂ２７（ビタミンＡなし；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、０．４５％グルコース（シグマアルドリッチ社）、２５ｍＭの塩化カリウム、０．４％ウシ血清アルブミン（シグマアルドリッチ社）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、２００ｎｇ／ｍｌのオクチル化組換えＳＨＨを含むＣＧＮＰ培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地中に再懸濁させ、そして０．４５μｍフィルター（ファルコン社）に通して濾過した。細胞をポリ−Ｄ−リジン被覆６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に５ｘ１０５個の細胞／ウェルで播種し、１の感染多重度（ＭＯＩ）でレンチウイルスに感染させた。２４時間後に、細胞をトリプシン処理により回収し、ＣＧＮＰ培地中で収集し、そして下流の用途のために再播種した。
【０５２４】
メチル−［3Ｈ］−チミジン取り込み
増殖に及ぼすＨＰＩｓの影響を調査するために、ウイルス形質導入ＣＧＮＰを、ポリ−Ｄ−リジン被覆９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）にＳＨＨなしＣＧＮＰ培地中において２５，０００細胞／ウェルで播種した。阻害剤の濃度を三重ウェルで試験し、この濃度は、ビスモデギブについては２５、５０、１００、２５０、５００、１０００及び５０００ｎＭ、ＬＤＥ２２５については５００ｎＭ、  ＬＹ２９４０６８０については５００ｎＭ、化合物５については５００ｎＭ、ＪＱ１については１μＭ及びＤＭＳＯについては０．１％（最高濃度ビヒクル対照）であった。２４時間後に、細胞を１μＣｉ／ｍＬのメチル−［3Ｈ］−チミジン（アマシャム／  ＧＥヘルスケア社）でパルスし、そしてさらに１６〜２４時間培養した。細胞を、９６ウェルフィルタープレート（パーキンエルマー）上にＦｉｌｔｅｒｍａｔｅセルハーベスター（パーキンエルマー社）を使用して回収し、そして取り込まれた放射線を、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（パーキンエルマー社）での液体シンチレーション分光光度法により定量した。
【０５２５】
化合物
ＧＤＣ−０４４９、化合物５及びＪＱ−１を、ＷＯ２００６０２８９５６、Ｗ０２００７０５９１５７及びＦｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ外，２０１０に記載されているように調製した。ＬＤＥ２２５（ＨＹ−１６５８２）及びＬＹ２９４０６８０（ＨＹ−１３２４２）はＭｅｄｃｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ社製のものであった。
【０５２６】
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【０５２７】
参照による援用
本明細書に記載の全ての刊行物及び特許文献は、それぞれの刊行物又は特許文献が具体的かつ個別に参照により援用されることが示されたかのように本明細書においてその全体が参照によって援用される。
【０５２８】
本発明の特定の実施形態を議論してきたが、上記明細書は例示であって限定的なものではない。当業者であれば、本明細書の及び特許請求の範囲の検討により本発明の多くのバリエーションが明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲をそれらの均等の全範囲と共に、及び明細書をこのようなバリエーションと共に参照することによって決定すべきである。上記実施例は、例示のみを目的とし、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【０５２９】
配列表
配列番号１：ヒト野生型平滑化アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５６２２．１）
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ
【０５３０】
配列番号２：ＳＭＯのアミノ酸位置２８１に変異を有するヒト平滑化アミノ酸配列
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｘａａ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ
【０５３１】
配列番号３：ＳＭＯのアミノ酸位置４５９に変異を有するヒト平滑化アミノ酸配列
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｘａａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ
【０５３２】
配列番号４：ＳＭＯのアミノ酸位置５３５に変異を有するヒト平滑化アミノ酸配列
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｘａａ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ
【０５３３】
配列番号５（野生型ＳＭＯ）atggccgctg cccgcccagc gcgggggccg gagctcccgc tcctggggct gctgctgctg ctgctgctgg gggacccggg ccggggggcg gcctcgagcg ggaacgcgac cgggcctggg cctcggagcg cgggcgggag cgcgaggagg agcgcggcgg tgactggccc tccgccgccg ctgagccact gcggccgggc tgccccctgc gagccgctgc gctacaacgt gtgcctgggc tcggtgctgc cctacggggc cacctccaca ctgctggccg gagactcgga ctcccaggag gaagcgcacg gcaagctcgt gctctggtcg ggcctccgga atgccccccg ctgctgggca gtgatccagc ccctgctgtg tgccgtatac atgcccaagt  gtgagaatga ccgggtggag ctgcccagcc gtaccctctg ccaggccacc cgaggcccct gtgccatcgt ggagagggag cggggctggc ctgacttcct gcgctgcact cctgaccgct tccctgaagg ctgcacgaat gaggtgcaga acatcaagtt caacagttca ggccagtgcg aagtgccctt ggttcggaca gacaacccca agagctggta cgaggacgtg gagggctgcg gcatccagtg ccagaacccg ctcttcacag aggctgagca ccaggacatg cacagctaca tcgcggcctt cggggccgtc acgggcctct gcacgctctt caccctggcc acattcgtgg ctgactggcg gaactcgaat cgctaccctg ctgttattct cttctacgtc aatgcgtgct tctttgtggg cagcattggc tggctggccc agttcatgga tggtgcccgc cgagagatcg tctgccgtgc agatggcacc  atgaggcttg gggagcccac ctccaatgag actctgtcct gcgtcatcat ctttgtcatc gtgtactacg ccctgatggc tggtgtggtt tggtttgtgg tcctcaccta tgcctggcac acttccttca aagccctggg caccacctac  cagcctctct cgggcaagac ctcctacttc cacctgctca cctggtcact cccctttgtc ctcactgtgg caatccttgc tgtggcgcag gtggatgggg actctgtgag tggcatttgt tttgtgggct acaagaacta ccgataccgt gcgggcttcg tgctggcccc aatcggcctg gtgctcatcg tgggaggcta cttcctcatc cgaggagtca tgactctgtt ctccatcaag agcaaccacc ccgggctgct gagtgagaag gctgccagca agatcaacga gaccatgctg cgcctgggca tttttggctt cctggccttt ggctttgtgc tcattacctt cagctgccac ttctacgact tcttcaacca ggctgagtgg gagcgcagct tccgggacta tgtgctatgt caggccaatg tgaccatcgg gctgcccacc aagcagccca tccctgactg tgagatcaag aatcgcccga gccttctggt ggagaagatc aacctgtttg ccatgtttgg aactggcatc gccatgagca cctgggtctg gaccaaggcc acgctgctca tctggaggcg tacctggtgc aggttgactg ggcagagtga cgatgagcca aagcggatca agaagagcaa gatgattgcc aaggccttct ctaagcggca cgagctcctg cagaacccag gccaggagct gtccttcagc atgcacactg tgtcccacga cgggcccgtg gcgggcttgg cctttgacct caatgagccc tcagctgatg tctcctctgc ctgggcccag catgtcacca agatggtggc tcggagagga gccatactgc cccaggatat ttctgtcacc cctgtggcaa ctccagtgcc cccagaggaa caagccaacc tgtggctggt tgaggcagag atctccccag agctgcagaa gcgcctgggc cggaagaaga agaggaggaa gaggaagaag gaggtgtgcc cgctggcgcc gccccctgag cttcaccccc ctgcccctgc ccccagtacc attcctcgac tgcctcagct gccccggcag aaatgcctgg tggctgcagg tgcctgggga gctggggact cttgccgaca gggagcgtgg accctggtct ccaacccatt ctgcccagag cccagtcccc ctcaggatcc atttctgccc agtgcaccgg cccccgtggc atgggctcat ggccgccgac agggcctggg gcctattcac tcccgcacca acctgatgga cacagaactc atggatgcag actcggactt ctga
【０５３４】
配列番号６：ＳＭＯのアミノ酸位置４０８に変異を有するヒト平滑化アミノ酸配列
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｘａａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ
【０５３５】
配列番号７：ＳＭＯのアミノ酸位置５３３に変異を有するヒト平滑アミノ酸配列
Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｃｙｓ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｇｌｎ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｃｙｓ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｔｈｒ  Ｍｅｔ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｐｈｅ  Ｔｙｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｐｈｅ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｘａａ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｍｅｔ  Ｈｉｓ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｌｅｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｌｙｓ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ａｒｇ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｈｉｓ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｃｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｃｙｓ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ  Ｐｒｏ  Ｇｌｎ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｐｈｅ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ａｌａ  Ｈｉｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｈｉｓ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｓｐ  Ｐｈｅ
【０５３６】
配列番号８：融合（ＳｕＦｕ）アミノ酸配列のヒトサプレッサー（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６１６９．２）
ＭＡＥＬＲＰＳＧＡＰＧＰＴＡＰＰＡＰＧＰＴＡＰＰＡＦＡＳＬＦＰＰＧＬＨＡＩＹＧＥＣＲＲＬＹＰＤＱＰＮＰＬＱＶＴＡＩＶＫＹＷＬＧＧＰＤＰＬＤＹＶＳＭＹＲＮＶＧＳＰＳＡＮＩＰＥＨＷＨＹＩＳＦＧＬＳＤＬＹＧＤＮＲＶＨＥＦＴＧＴＤＧＰＳＧＦＧＦＥＬＴＦＲＬＫＲＥＴＧＥＳＡＰＰＴＷＰＡＥＬＭＱＧＬＡＲＹＶＦＱＳＥＮＴＦＣＳＧＤＨＶＳＷＨＳＰＬＤＮＳＥＳＲＩＱＨＭＬＬＴＥＤＰＱＭＱＰＶＱＴＰＦＧＶＶＴＦＬＱＩＶＧＶＣＴＥＥＬＨＳＡＱＱＷＮＧＱＧＩＬＥＬＬＲＴＶＰＩＡＧＧＰＷＬＩＴＤＭＲＲＧＥＴＩＦＥＩＤＰＨＬＱＥＲＶＤＫＧＩＥＴＤＧＳＮＬＳＧＶＳＡＫＣＡＷＤＤＬＳＲＰＰＥＤＤＥＤＳＲＳＩＣＩＧＴＱＰＲＲＬＳＧＫＤＴＥＱＩＲＥＴＬＲＲＧＬＥＩＮＳＫＰＶＬＰＰＩＮＰＱＲＱＮＧＬＡＨＤＲＡＰＳＲＫＤＳＬＥＳＤＳＳＴＡＩＩＰＨＥＬＩＲＴＲＱＬＥＳＶＨＬＫＦＮＱＥＳＧＡＬＩＰＬＣＬＲＧＲＬＬＨＧＲＨＦＴＹＫＳＩＴＧＤＭＡＩＴＦＶＳＴＧＶＥＧＡＦＡＴＥＥＨＰＹＡＡＨＧＰＷＬＱＩＬＬＴＥＥＦＶＥＫＭＬＥＤＬＥＤＬＴＳＰＥＥＦＫＬＰＫＥＹＳＷＰＥＫＫＬＫＶＳＩＬＰＤＶＶＦＤＳＰＬＨ
【０５３７】
配列番号９：溶融（ＳｕＦｕ）ｃＤＮＡ配列のヒトサプレッサー（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１６１６９．２）
ＣＧＣＣＧＴＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＧＧＡＧＣＴＡＧＡＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＣＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＣＣＧＡＧＴＣＣＧＣＣＣＧＣＴＧＧＣＣＣＧＴＣＡＧＴＧＣＴＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＴＴＧＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＴＴＣＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＴＡＣＧＣＡＣＣＣＣＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＴＡＧＣＧＧＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＧＡＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＴＴＣＧＣＴＴＣＧＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＣＴＧＣＡＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＣＧＡＡＣＣＣＧＣＴＣＣＡＧＧＴＴＡＣＣＧＣＴＡＴＣＧＴＣＡＡＧＴＡＣＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＡＣＣＣＣＴＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＴＡＧＣＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＣＣＣＣＧＡＧＣＡＣＴＧＧＣＡＣＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＣＴＧＡＧＴＧＡＴＣＴＣＴＡＴＧＧＴＧＡＣＡＡＣＡＧＡＧＴＣＣＡＴＧＡＧＴＴＴＡＣＡＧＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＡＣＣＴＡＧＴＧＧＴＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＧＴＴＧＡＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＧＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＧＡＧＴＣＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＣＣＧＣＡＧＡＧＴＴＡＡＴＧＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＣＡＣＧＡＴＡＣＧＴＧＴＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＧＴＧＡＧＴＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＡＣＣＣＴＴＴＧＧＧＧＴＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＴＣＧＴＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＡＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＧＧＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＣＡＧＴＧＣＣＴＡＴＴＧＣＴＧＧＣＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＡＡＣＴＧＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＧＡＣＣＡＴＡＴＴＴＧＡＧＡＴＣＧＡＴＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＴＣＧＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＴＧＧＴＧＴＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＣＣＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＡＧＣＡＴＣＴＧＣＡＴＣＧＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＧＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＣＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＡＡＣＣＣＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＴＣＧＣＣＣＡＣＧＡＣＣＧＧＧＣＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＣＧＧＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＧＣＴＧＡＴＴＣＧＣＡＣＧＣＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧＡＧＣＧＴＡＣＡＴＣＴＧＡＡＡＴＴＣＡＡＣＣＡＧＧＡＧＴＣＣＧＧＡＧＣＣＣＴＣＡＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＣＣＴＡＡＧＧＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＴＧＧＡＣＧＧＣＡＣＴＴＴＡＣＡＴＡＴＡＡＡＡＧＴＡＴＣＡＣＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＣＧＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＣＧＣＣＴＴＴＧＣＣＡＣＴＧＡＧＧＡＧＣＡＴＣＣＴＴＡＣＧＣＧＧＣＴＣＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＡＣＣＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＡＧＧＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＧＣＣＴＧＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＡＣＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＣＣＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＴＧＴＡＡＣＡＧＴＴＧＴＧＴＣＡＡＣＧＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＡＧＧＡＣＡＡＧＴＧＴＧＡＧＧＡＡＧＡＣＴＧＣＧＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＣＡＧＣＣＣＡＧＴＧＧＧＧＴＧＣＣＡＴＧＣＡＣＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＡＧＧＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＣＴＧＧＣＴＡＡＧＣＣＴＴＧＴＧＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＣＣＡＧＴＧＡＧＴＧＧＧＣＡＡＡＴＧＣＧＧＡＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＧＡＴＴＣＴＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＴＣＴＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＣＴＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＣＴＧＣＣＧＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＣＧＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＴＧＣＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＣＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＡＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＧＣＣＡＴＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＣＡＧＡＡＣＴＴＣＡＴＴＣＣＣＣＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＣＧＣＡＴＴＣＴＣＴＧＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＣＴＴＧＧＴＧＴＴＣＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＧＡＧＧＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＡＧＴＡＧＡＧＡＣＡＣＴＣＣＣＴＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＴＧＡＧＣＣＴＡＧＴＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＧＧＧＧＴＧＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＣＡＡＧＴＧＡＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＡＧＡＣＴＴＧＧＴＧＡＣＣＣＣＡＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＡＧＧＣＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＣＡＡＣＣＡＧＧＣＣＴＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＡＧＧＴＴＣＡＧＣＡＣＡＴＣＡＣＡＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＣＴＧＴＣＡＴＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＴＣＴＧＴＡＡＣＣＡＧＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＴＴＴＣＣＴＣＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＡＧＧＣＴＧＴＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＴＡＣＴＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＴ
ＣＣＡＣＣＴＣＴＴＡＡＣＡＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴＡＡＣＡＣＴＧＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＴＣＡＴＧＣＣＣＴＡＴＣＴＴＴＣＡＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣＣＴＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＧＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＣＧＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴＣＡＣＡＧＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣＣＴＡＴＣＴＣＴＡＧＣＣＣＡＴＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＣＴＣＧＧＧＴＴＡＴＣＴＣＣＣＡＣＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＣＴＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＣＴＴＡＣＣＣＣＣＡＡＣＴＣＴＡＧＧＧＡＴＧＧＧＡＣＴＧＴＴＡＣＡＡＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＴＣＡＣＴＣＴＴＴＡＣＡＣＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＡＡＡＧＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＧＧＧＴＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＴＧＡＴＧＡＧＡＧＡＴＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧＧＧＧＴＡＴＧＡＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＣＴＣＣＡＴＧＧＡＧＣＣＡＣＴＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＴＡＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＧＧＣＴＡＴＣＴＧＧＴＴＡＡＴＴＣＣＡＴＣＡＡＧＣＴＣＡＧＡＧＴＴＡＡＡＡＧＧＣＡＴＡＴＣＡＧＣＣＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＧＧＡＧＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＣＡＡＧＡＴＧＣＡＡＧＣＣＡＣＴＣＧＧＧＡＣＣＴＧＡＴＧＴＣＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＣＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＴＡＣＣＡＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＧＣＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＣＣＡＴＴＣＣＴＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＡＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＧＣＣＧＴＡＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＴＣＧＴＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＣＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＣＴＡＡＧＣＴＴＴＧＴＣＡＴＴＡＧＴＴＴＧＴＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＴＴＧＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＴＡＡＧＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＧＡＧＣＴＣＣＧＡＧＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＣＴＧＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＴＡＴＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＴＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＧＴＡＴＣＡＣＡＣＡＴＴＴＣＴＣＡＣＣＡＧＧＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＴＧＧＧＣＡＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＴＣＴＴＧＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＣＣＴＴＡＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧＡＴＧＣＴＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＡＣＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＴＧＡＧＧＧＡＧＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＧＴＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＡＡＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＴＡＡＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＧＣＡＡＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＴＧＣＣＴＡＧＴＴＧＴＡＣＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＡＧＡＧＣＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＴＡＴＡＴＡＡＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＴＧＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＣＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＴＴＣＴＧＡＧＧＧＧＧＧＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＴＧＣＧＡＧＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＡＧＧＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＡＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＣＴＡＡＡＡＧＧＧＣＴＡＧＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＧＡＣＡＣＡＧＧＧＴＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧＧＧＧＴＴＴＣＧＧＡＴＴＧＡＧＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＴＧＣＣＣＣＴＡＴＧＧＧＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＣＣＴＴＴＡＣＴＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＧＴＣＴＧＧＴＣＴＴＣＣＣＴＴＴＣＴＧＧＣＴＴＣＴＡＧＧＡＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＡＣＡＡＧＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＡＴＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＡＧＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＣＡＧＴＧＧＣＧＡＣＴＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＣＴＴＴＴＧＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＧＧＧＴＧＡＣＴＣＡＣＴＴＡＧＡＴＧＴＣＧＴＴＴＣＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＣＴＧＴＡＡＴＣＴＡＡＧＴＧＣＡＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴＴＴＧＣＡＧ
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２】
0006736467.tif 000019
【図３】
0006736467.tif 000020
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ−Ｃ】
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【図６Ｄ−Ｆ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ−Ｄ】
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【図８Ｅ−Ｆ】
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【図９】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１１Ｅ−Ｆ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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