(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および末梢循環癌幹細胞（ＣＳＣ）を捕獲する方法であって、フローベース装置に前記試料を導入する工程を含み、フローベース装置は、固定化細胞ローリング薬剤、固定化ＣＴＣ特異的捕獲薬剤および固定化ＣＳＣ特異的捕獲薬剤を含み、および前記試料は、ＣＴＣが細胞ローリング薬剤およびＣＴＣ特異的捕獲薬剤に結合することおよびＣＳＣが細胞ローリング薬剤およびＣＳＣ特異的捕獲薬剤に結合することを可能にする条件下でフローベース装置に導入される、方法。
【請求項２】
試料から末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および末梢循環癌幹細胞（ＣＳＣ）を捕獲するためのマイクロ流体装置であって：
（ａ）細胞捕獲表面およびフロー可動化表面を含む第１の流路であり、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤もしくはＣＳＣ特異的捕獲薬剤および細胞ローリング誘導薬剤は、細胞捕獲表面に固定される流路、
（ｂ）細胞捕獲表面およびフロー修正表面を含む第２の流路であり、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤もしくはＣＳＣ特異的捕獲薬剤および細胞ローリング誘導薬剤は、細胞捕獲表面に固定される流路、
を含み、
第１の流路がＣＴＣ特異的捕獲薬剤を含む場合、第２の流路はＣＳＣ特異的捕獲薬剤を含むか、または第１の流路がＣＳＣ特異的捕獲薬剤を含む場合、第２の流路はＣＴＣ特異的捕獲薬剤を含む、装置。
【請求項３】
請求項２の装置であって、第１および第２の流路は、接続し、それぞれの流路は、入口および出口を有する、装置。
【請求項４】
請求項１の方法であって、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、抗体、抗体断片、操作された抗体、葉酸、トランスフェリン、ペプチドおよびアプタマーである、方法。
【請求項５】
請求項１または４のいずれか１項の方法であって、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤は、ＣＴＣ表面上の部分を特異的に結合するか、またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、ＣＳＣ表面上の部分を特異的に結合する、方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ−２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ２４または葉酸結合受容体（ＦＡＲ）に結合するか、またはＣＴＣ特異的捕獲薬剤は、ＲＧＤペプチドである、方法。
【請求項７】
請求項５の方法であって、ＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ１、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ１０、ＣＤ１２７またはＣＤ１３３に結合する、方法。
【請求項８】
請求項１または４−６のいずれか１項の方法であって、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、リンカーへの付着を介して固定され、前記リンカーは、装置の表面に付着している、方法。
【請求項９】
請求項８の方法であって、リンカーは、（ｉ）ポリエチレングリコールに共有結合した修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマー、または（ｉｉ）ポリエチレングリコールに共有結合したポリエステル−ｎ−カルボキシラート−１−アルキンデンドロン（ｎは、８、１６、３２、６４または１２８である）を含む重合体ナノリンカーである、方法。
【請求項１０】
請求項９の方法であって、修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、世代３、世代４、世代５、世代６、世代７、世代８および世代９の修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群より選択される、方法。
【請求項１１】
請求項１または４−１０のいずれか１項の方法であって、細胞ローリング誘導薬剤は、セレクチンまたはセレクチンのＣＴＣ結合断片である、方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法であって、細胞ローリング誘導薬剤は、リンカーを介してマイクロ流体装置の表面に固定されるか、またはエポキシ基、カルボキシル基、チオール基、アルキン基、アジド基、マレイミド基、ヒドロキシル基、アミン基、アルデヒド基およびこれらの組み合わせからなる群より選択される化学的部分を介して表面に共有結合する、方法。
【請求項１３】
請求項２または３のいずれか１項の装置であって、細胞ローリング誘導薬剤およびＣＴＣ特異的捕獲薬剤またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、実質的に一定の様式で配置される、装置。
【請求項１４】
請求項１３の装置であって、細胞捕獲表面は、第１および第２の領域のパターンを含み、第１の領域は、細胞ローリング誘導薬剤を含み、および第２の領域は、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤を含む、装置。
【請求項１５】
請求項１４の装置であって、第１および第２の領域は、交互のパターンで配置される、装置。
【請求項１６】
請求項２または３の装置であって、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、抗体、抗体断片、操作された抗体、葉酸、トランスフェリン、ペプチドおよびアプタマーである、装置。
【請求項１７】
請求項２、３または１６のいずれか１項の装置であって、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤は、ＣＴＣ表面上の部分を特異的に結合するか、またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、ＣＳＣ表面上の部分を特異的に結合する、装置。
【請求項１８】
請求項１７の装置であって、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ−２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ２４または葉酸結合受容体（ＦＡＲ）に結合するか、またはＣＴＣ特異的捕獲薬剤は、ＲＧＤペプチドである、装置。
【請求項１９】
請求項１７の装置であって、ＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ１、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ１０、ＣＤ１２７またはＣＤ１３３に結合する、装置。
【請求項２０】
請求項２、３または１６−１９のいずれか１項の装置であって、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、リンカーへの付着を介して固定され、前記リンカーは、装置の表面に付着している、装置。
【請求項２１】
請求項２０の装置であって、リンカーは、（ｉ）ポリエチレングリコールに共有結合した修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマー、または（ｉｉ）ポリエチレングリコールに共有結合したポリエステル−ｎ−カルボキシラート−１−アルキンデンドロン（ｎは、８、１６、３２、６４または１２８である）を含む重合体ナノリンカーである、装置。
【請求項２２】
請求項２１の装置であって、修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、世代３、世代４、世代５、世代６、世代７、世代８および世代９の修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群より選択される、装置。
【請求項２３】
請求項２、３または１６−２２のいずれか１項の装置であって、細胞ローリング誘導薬剤は、セレクチンまたはセレクチンのＣＴＣ結合断片である、装置。
【請求項２４】
請求項２３の装置であって、細胞ローリング誘導薬剤は、リンカーを介してマイクロ流体装置の表面に固定されるか、またはエポキシ基、カルボキシル基、チオール基、アルキン基、アジド基、マレイミド基、ヒドロキシル基、アミン基、アルデヒド基およびこれらの組み合わせからなる群より選択される化学的部分を介して表面に共有結合する、装置。
【請求項２５】
請求項２、３または１６−２４のいずれか１項の装置であって、細胞ローリング誘導薬剤およびＣＴＣ特異的捕獲薬剤またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、実質的に一定の様式で配置される、装置。
【請求項２６】
請求項２５の装置であって、細胞捕獲表面は、第１および第２の領域のパターンを含み、第１の領域は、細胞ローリング誘導薬剤を含み、および第２の領域は、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤を含む、装置。
【請求項２７】
請求項２６の装置であって、第１および第２の領域は、交互のパターンで配置される、装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の記載
本発明は、全米科学財団（ＮＳＦ）によって授与されたＣＢＥＴ−０９３１４７２のもとに政府支援で行われた。政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
関連出願の相互参照
【０００２】
本出願は、２０１４年３月７日に出願された米国仮特許出願番号第６１／９４９，４７２号に対する優先権を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
技術分野
本発明は、試料から末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および末梢循環癌幹細胞（ＣＳＣ）を捕獲する方法および本方法を実行するための複数流路マイクロ流体装置に関する。
関連技術の簡単な説明
【０００４】
癌は、依然として世界で最も深刻な疾患の１つであり、毎年１０，０００，０００を超える新たな症例がある。原発腫瘍を治療するための診断および治療方法における近年の進歩が、過去２年間の癌の死亡率の減少をもたらしたが、いまだに癌の転移は、患者が多くの場合再発するような大きな課題を生じさせる。播種性および末梢循環腫瘍細胞（それぞれ、ＤＴＣおよびＣＴＣ）は、原発腫瘍から遠隔部位で二次腫瘍形成を誘導することが公知であり、転移として公知である。癌転移を描写する２つの主要な理論、種と土壌仮説および機械的捕捉理論は、有効であり、およびそれぞれについての血管外遊出過程は、類似し、３つの逐次的工程からなる。転移機構は、細胞ローリング−炎症の部位に白血球を動員するのに利用される自然に起こる過程−によって開始されることが公知である。第２の工程において、細胞は、内皮細胞に堅く付着する。第３の工程において、細胞は、内皮を介して遊出し（漏出性出血）、二次腫瘍形成をもたらす。
【０００５】
転移性癌の診断および予後における研究努力は、骨髄（ＢＭ）中のＤＴＣおよび血液中のＣＴＣの検出に集中してきた。ＤＴＣの検出は、ＢＭの吸引−侵襲的で、時間がかかり、および患者にとってたいてい痛みを伴う方法を必要とし、治療上の処置とともに予後研究のために必要である度々のサンプリングがいやがられる。結果的に、癌患者の末梢血液中のＣＴＣの有効な検出は、その最小の侵襲性および簡単なサンプリング（すなわち血液抜き取り）のために選択肢として期待できる。しかし、ＣＴＣの臨床使用は、日常的な臨床実践にまだ実行されてこなかった。実際のところ、患者の血液中のＣＴＣの臨床上の意義は、ＢＭ中のＤＴＣについてのものより明らかでない。フィコールに基づくアッセイまたはＯｎｃｏＱｕｉｃｋアプローチおよびその他の免疫磁気濃縮手順を使用して濃縮するのが相対的に容易であるＢＭ中のＤＴＣとは異なり、ＣＴＣは、極めてまれであり（１０６−１０９個の正常な血液細胞のバックグラウンドにおいて１つの腫瘍細胞の範囲であると推定される）、ＣＴＣの効率的な、臨床的に有意な検出のとてつもない課題を提示する。
【０００６】
腫瘍は、腫瘍発生細胞または末梢循環癌幹細胞を含むことが公知である。末梢循環癌幹細胞は、自己複製し、および分化した子孫を生み出して正常な幹細胞に類似の様式で階層的な細胞システムを構築することができる。これらの細胞は、免疫不全マウスを使用する異種移植片移植において明白な腫瘍形成性活性を示し、それは癌の発症における細胞の重要な役割を示す。加えて、ＣＳＣが治療および転移後の再発において重要な役割を果たし得る増加の証拠がある（Ｔｒｕｍｐｐ  ＆  Ｗｉｅｓｔｌｅｒ，  Ｎａｔ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｒａｃｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  ５：３３７−４７，  ２００８）。
したがって、癌の診断および予後を助ける増強された感度および特異性をもつ末梢循環腫瘍細胞および末梢循環幹細胞を効率的に単離する装置および方法に対する需要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｔｒｕｍｐｐ  ＆  Ｗｉｅｓｔｌｅｒ，  Ｎａｔ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐｒａｃｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  ５：３３７−４７，  ２００８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明の生体模倣プラットホームは、１つのプラットホーム上に複数の流路を収容することができ、それは、末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および癌幹細胞（ＣＳＣ）をターゲットとすることができる。第１の流路（図１における領域「ｉ」）は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ−２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ２４および葉酸結合受容体（ＦＡＲ）などのＣＴＣマーカーへの特異的結合に基づいて、癌患者血液からＣＴＣを捕獲することができる。捕獲されたＣＴＣは、トリプシンまたはその他のＥＤＴＡをベースとする剥離溶液を使用して領域「ｉ」から剥離することができる。捕獲されたＣＴＣ、より幹様のＣＴＣ、潜在的ＣＳＣの中で、次いで、ＣＳＣに特異的なその他の流路（図１における領域「ｉｉ」）を使用して区別することができる。細胞区別については、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ１、Ｎ−カドヘリンおよびＣＤ１３３などの幹細胞マーカーは、第２の流路において利用することができる。原位置でのＣＴＣおよびＣＳＣを捕獲する、および区別するこの概念は、複数流路システムに拡張することができる。複数流路システム、３つの流路装置についての例の１つを図１Ｂに示す。加えて、この３つの流路フローチャンバーは、その他の目的：たとえば、ＣＴＣおよびＣＳＣのハイスループットスクリーニングおよび捕獲のための異なる癌患者の３つの血液試料からの同時ＣＴＣ捕獲に使用することができる。２つおよび３つの流路フローチャンバーのための例示的な寸法を図２に示す。ＣＴＣ検出効率を最大にするために、表面機能化のためのパラメーター、すなわちＥセレクチンおよび抗体の幅、並びに抗体ストライプの角度は、図３に図示するように変更することができる。
【０００９】
本発明の装置は、ＣＴＣおよびＣＳＣの単離への感度および特異性を改善する。第１に、Ｅセレクチンなどの細胞ローリング誘導薬剤の固定化は、赤血球および血漿からのＣＴＣおよびＣＳＣの単離を改善する。重要なことに、天然に存在する細胞ローリング現象は、捕獲表面に速く流れる細胞を動員する最も効率的な方法の１つであり、目詰まりおよび非特異的捕獲の問題をしばしば生じるフロー変動の必要性を除去する。第２に、デンドリマーナノリンカーを介する抗体などの腫瘍細胞特異的および／または幹細胞特異的捕獲薬剤の固定化は、強力な多価結合を達成して捕獲効率を増強する。第３に、本発明の装置のモジュラー性質は、捕獲薬剤として任意のマーカーの使用を可能にし、それは、高度に不均一な表現型を持つＣＴＣおよびＣＳＣの有効な検出に理想的に適する。加えて、本発明の最適化された複数流路装置は、高スループットで、ＣＴＣ並びにＣＳＣの高効率の捕獲を達成する。たとえば、単一の流路デザインでの０．４ｄｙｎ／ｃｍ２または５０μＬ／分の同じ流量で、３−流路デザインは、２０分ではなく、７分で１ｍＬの血液の解析を達成するだろう。
【００１０】
本発明は、フローベース装置に前記試料を導入する工程を含む、試料からＣＴＣおよびＣＳＣを捕獲する方法であって、装置は、少なくとも２つのチャンバーを含み、第１のチャンバーは、固定化細胞ローリング誘導薬剤および固定化ＣＴＣ特異的捕獲薬剤を含み、および第２のチャンバーは、固定化細胞ローリング誘導薬剤および固定化ＣＳＣ特異的捕獲薬剤を含み、および前記試料は、ＣＴＣおよびＣＳＣが細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤に結合することを可能にする条件下で装置に導入される方法を提供する。
【００１１】
試料は、血液、リンパ液または脳脊髄液などのＣＴＣおよび／またはＣＳＣを含む任意の液体である。
【００１２】
本発明の方法において、捕獲薬剤は、ＣＴＣおよび／またはＣＳＣを捕獲するために、抗体、抗体断片、操作された抗体、葉酸、トランスフェリン、ペプチドおよびアプタマーなどのＣＴＣまたはＣＳＣに特異的に結合する任意の薬剤である。
【００１３】
本発明の方法のいずれかにおいて、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤は、抗体、抗体断片、操作された抗体、葉酸、トランスフェリン、ペプチドおよびアプタマーなどのＣＴＣ表面上の部分を特異的に結合する。たとえば、捕獲薬剤は、少し例を挙げれば、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ−２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ２４または葉酸結合受容体（ＦＡＲ）に結合する。加えて、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤は、ＲＧＤペプチドなどのペプチドである。
【００１４】
本発明の方法のいずれかにおいて、ＣＳＣ特異的な捕獲は、抗体、抗体断片、操作された抗体、葉酸、トランスフェリン、ペプチドまたはアプタマーなどのＣＳＣ表面上の部分を特異的に結合する。たとえば、少し例を挙げれば、ＣＳＣ特異的捕獲薬剤は、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ１、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ１０、ＣＤ１２７またはＣＤ１３３に結合する。
【００１５】
本発明の方法のいずれかにおいて、捕獲薬剤は、ＣＴＣおよび／またはＣＳＣを捕獲するために、装置の表面への付着を介して固定される、または薬剤は、リンカーへの付着を介して固定され、前記リンカーは、装置の表面に付着している。
【００１６】
本発明の方法において使用される装置の表面に捕獲薬剤を付着するリンカーは、ポリエチレングリコールに共有結合した修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーなどの重合体ナノリンカーである。一つの側面において、修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、世代３、世代４、世代５、世代６、世代７、世代８および世代９の修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群より選択される。もう一つの側面において、重合体ナノリンカーは、ポリエチレングリコールに共有結合するポリエステル−ｎ−カルボキシラート−１−アルキンデンドロンを含み、ｎは、８、１６、３２、６４または１２８である。
【００１７】
本発明は、装置に導入される試料に．０５〜１０ｄｙｎ／ｃｍ２の間のせん断応力をかける工程をさらに含む本発明の方法のいずれかを提供する。方法のもう一つの側面において、せん断応力は、０．１ｄｙｎ／ｃｍ２〜２ｄｙｎ／ｃｍ２の間である。方法のさらにもう一つの側面において、せん断応力は、約０．１６ｄｙｎ／ｃｍ２である。
【００１８】
本発明の方法のいずれかにおいて、細胞ローリング誘導薬剤は、セレクチンまたはセレクチンのＣＴＣもしくはＣＳＣ結合断片である。たとえば、セレクチンは、Ｅセレクチン、ＰセレクチンおよびＬセレクチンからなる群より選択される。
【００１９】
方法のもう一つの側面において、固定化細胞ローリング誘導薬剤および固定化捕獲薬剤は、実質的に一定の様式で配置される。
【００２０】
方法のさらにもう一つの側面において、固定化細胞ローリング誘導薬剤および固定化捕獲薬剤は、パターンで配置される。
【００２１】
本発明の方法のいずれかにおいて、細胞ローリング誘導薬剤は、装置の表面に共有結合する。たとえば、細胞ローリング誘導薬剤は、エポキシ基、カルボキシル基、チオール基、アルキン基、アジド基、マレイミド基、ヒドロキシル基、アミン基、アルデヒド基およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化学的部分を介して表面に共有結合する。
【００２２】
本発明の方法のいずれかのさらにもう一つの側面において、細胞ローリング誘導薬剤は、リンカーを介して装置の表面に固定される。たとえば、リンカーは、デンドリマー、デンドロン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２３】
また、試料から末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および末梢循環癌幹細胞（ＣＳＣ）を捕獲するためのフローベース複数流路装置であって：（ａ）第１の流路は、細胞捕獲表面およびフロー可動化表面を含み、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤および細胞ローリング誘導薬剤は、細胞捕獲表面に固定される流路および（ｂ）第２の流路は、細胞捕獲表面およびフロー修正表面を含み、ＣＳＣ捕獲薬剤および細胞ローリング誘導薬剤は、細胞捕獲表面に固定される流路を含む装置が、本明細書において提供される。用語「複数流路」は、２個以上の流路をいう。本発明の装置は、２個の流路、３個の流路、４個の流路、５個の流路、６個の流路、７個の流路、８個の流路、９個の流路または１０個以上の流路を有してもよい。
【００２４】
装置の一つの側面において、装置内の複数の流路は接続し、および試料は、流路の間を流れるだろう。もう一つの側面において、装置は、複数の流入および複数の流出を有し、たとえば、それぞれの流路は、それ自体の流入および流出を有し、および流路は、接続しない、またはそれぞれの流路は、それ自体の流入を有し、および流路は、単一または複数の流出と接続する。
【００２５】
本発明の装置のいずれかにおいて、細胞ローリング誘導薬剤は、セレクチンまたはセレクチンのＣＴＣもしくはＣＳＣ結合断片である。装置のもう一つの側面において、セレクチンは、Ｅセレクチン、ＰセレクチンまたはＬセレクチンである。
【００２６】
本発明の装置のいずれかにおいて、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤は、抗体、抗体断片、操作された抗体、葉酸、トランスフェリン、ペプチドまたはアプタマーなどのＣＴＣ表面上の部分を特異的に結合する。たとえば、捕獲薬剤は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ−２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ２４または葉酸結合受容体（ＦＡＲ）に結合する。加えて、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤は、ＲＧＤペプチドなどのペプチドである。
【００２７】
本発明の装置のいずれかにおいて、ＣＳＣ捕獲薬剤は、抗体、抗体断片、操作された抗体、葉酸、トランスフェリン、ペプチドおよびアプタマーなどのＣＳＣ表面上の部分を特異的に結合する。たとえば、捕獲薬剤は、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ１、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ１０、ＣＤ１２７またはＣＤ１３３に結合する。
【００２８】
本発明の装置のいずれかにおいて、捕獲薬剤は、ＣＴＣおよび／またはＣＳＣを捕獲するために、装置の表面への付着を介して固定される、または薬剤は、リンカーへの付着を介して固定され、前記リンカーは、装置の表面に付着している。
【００２９】
本発明の装置のいずれかの表面に捕獲薬剤を付着させるリンカーは、ポリエチレングリコールに共有結合する修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーなどの重合体ナノリンカーである。一つの側面において、修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、世代３、世代４、世代５、世代６、世代７、世代８または世代９の修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群より選択される。もう一つの側面において、重合体ナノリンカーは、ポリエチレングリコールに共有結合するポリエステル−ｎ−カルボキシラート−１−アルキンデンドロンを含み、ｎは、８、１６、３２、６４または１２８である。
【００３０】
本発明の装置のいずれかのもう一つの側面において、細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤は、実質的に一定の様式で配置される。
【００３１】
本発明の装置のいずれかのもう一つの側面において、細胞捕獲表面は、第１および第２の領域のパターンを含み、第１の領域は、細胞ローリング誘導薬剤を含み、および第２の領域は、捕獲薬剤を含む。一つの側面において、第１の領域は、捕獲薬剤をさらに含む。
【００３２】
本発明の装置のいずれかのもう一つの側面において、第１および第２の領域は、交互のパターンで配置される。
【００３３】
本発明の装置のいずれかにおいて、細胞ローリング誘導薬剤は、細胞捕獲表面に共有結合する。たとえば、共有結合形付着は、エポキシ基、カルボキシル基、チオール基、アルキン基、アジド基、マレイミド基、ヒドロキシル基、アミン基、アルデヒド基またはそれらの組み合わせなどの化学的部分を介する。
【００３４】
本発明の装置のいずれかにおいて、細胞ローリング誘導薬剤は、リンカーを介してマイクロ流体装置の表面に固定される。たとえば、リンカーは、デキストラン、デンドリマー、ポリエチレングリコール、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびそれらの組み合わせである。
【００３５】
本開示のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかし、本開示の精神および範囲内の種々の変更および修正が、この詳細な説明から当業者にとって明らかになるだろうゆえに、詳細な説明および具体的例が、本開示の好ましい態様を示すと共に、例として与えられることが理解されるべきである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
試料から末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および末梢循環癌幹細胞（ＣＳＣ）を捕獲する方法であって、フローベース装置に前記試料を導入する工程を含み、装置は、少なくとも２つのチャンバーを含み、第１のチャンバーは、固定化細胞ローリング薬剤および固定化ＣＴＣ特異的捕獲薬剤を含み、および第２のチャンバーは、固定化細胞ローリング薬剤および固定化ＣＳＣ特異的捕獲薬剤を含み、および前記試料は、ＣＴＣおよびＣＳＣが細胞ローリング薬剤および捕獲薬剤に結合することを可能にする条件下で装置に導入される、方法。
（項目２）
項目１の方法であって、捕獲薬剤は、抗体、抗体断片、操作された抗体、葉酸、トランスフェリン、ペプチドおよびアプタマーである、方法。
（項目３）
項目１または２の方法であって、ＣＴＣに特異的な捕獲薬剤は、ＣＴＣ表面上の部分を特異的に結合する、方法。
（項目４）
項目３の方法であって、捕獲薬剤は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ−２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ２４および葉酸結合受容体（ＦＡＲ）に結合する、方法。
（項目５）
項目３の方法であって、捕獲薬剤は、ＲＧＤペプチドである、方法。
（項目６）
項目１−５のいずれか１項の方法であって、ＣＳＣに特異的な捕獲薬剤は、ＣＳＣ表面上の部分を特異的に結合する、方法。
（項目７）
項目６の方法であって、捕獲薬剤は、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ１、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ１０、ＣＤ１２７およびＣＤ１３３に結合する、方法。
（項目８）
項目１−７のいずれか１項の方法であって、捕獲薬剤は、装置の表面への付着を介して固定される、方法。
（項目９）
項目１−７のいずれかの方法であって、捕獲薬剤は、リンカーへの付着を介して固定され、前記リンカーは、装置の表面に付着している、方法。
（項目１０）
項目９の方法であって、リンカーは、重合体ナノリンカーである、方法。
（項目１１）
項目１０の方法であって、重合体ナノリンカーは、ポリエチレングリコールに共有結合した修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーを含む、方法。
（項目１２）
項目１１の方法であって、修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、世代３、世代４、世代５、世代６、世代７、世代８および世代９の修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群より選択される、方法。
（項目１３）
項目１１の方法であって、重合体ナノリンカーは、ポリエチレングリコールに共有結合したポリエステル−ｎ−カルボキシラート−１−アルキンデンドロンを含み、ｎは、８、１６、３２、６４または１２８である、方法。
（項目１４）
装置に導入される試料に．０５〜１０ｄｙｎ／ｃｍ２の間のせん断応力をかけることをさらに含む項目１−１３のいずれか１項の方法。
（項目１５）
項目１−１４のいずれか１項の方法であって、細胞ローリング誘導薬剤は、セレクチンまたはセレクチンのＣＴＣ結合断片である、方法。
（項目１６）
項目１５の方法であって、セレクチンは、Ｅセレクチン、ＰセレクチンおよびＬセレクチンからなる群より選択される、方法。
（項目１７）
項目１−１６のいずれか１項の方法であって、細胞ローリング誘導薬剤は、マイクロ流体装置の表面に共有結合する、方法。
（項目１８）
項目１７の方法であって、細胞ローリング誘導薬剤は、エポキシ基、カルボキシル基、チオール基、アルキン基、アジド基、マレイミド基、ヒドロキシル基、アミン基、アルデヒド基およびそれらの組み合わせからなる群より選択される化学的部分を介して表面に共有結合する、方法。
（項目１９）
項目１−１６のいずれかの方法であって、細胞ローリング誘導薬剤は、リンカーを介してマイクロ流体装置の表面に固定される、方法。
（項目２０）
項目１９の方法であって、リンカーは、デンドリマー、デンドロン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、方法。
（項目２１）
試料から末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）および末梢循環癌幹細胞（ＣＳＣ）を捕獲するためのマイクロ流体装置であって：
（ａ）細胞捕獲表面およびフロー可動化表面を含む第１の流路であり、ＣＴＣ特異的捕獲薬剤および細胞ローリング誘導薬剤は、細胞捕獲表面に固定される流路、
（ｂ）細胞捕獲表面およびフロー修正表面を含む第２の流路であり、ＣＳＣ特異的捕獲薬剤および細胞ローリング誘導薬剤は、細胞捕獲表面に固定される流路、
を含む、装置。
（項目２２）
項目２１の装置であって、第１および第２の流路は、接続する、装置。
（項目２３）
項目２１の装置であって、それぞれの流路は、入口および出口を有する、装置。
（項目２４）
項目２１−２３のいずれか１項の装置であって、細胞ローリング誘導薬剤は、セレクチンまたはセレクチンのＣＴＣ結合断片である、装置。
（項目２５）
項目２１−２４のいずれか１項の装置であって、セレクチンは、Ｅセレクチン、ＰセレクチンおよびＬセレクチンからなる群より選択される、装置。
（項目２６）
項目２１−２５のいずれかの装置であって、捕獲薬剤は、抗体、抗体断片、操作された抗体、葉酸、トランスフェリン、ペプチドおよびアプタマーである、装置。
（項目２７）
項目２１−２６のいずれか１項の装置であって、ＣＴＣに特異的な捕獲薬剤は、ＣＴＣ表面上の部分を特異的に結合する、装置。
（項目２８）
項目２７の装置であって、捕獲薬剤は、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ−２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ２４および葉酸結合受容体（ＦＡＲ）に結合する、装置。
（項目２９）
項目２７の装置であって、捕獲薬剤は、ＲＧＤペプチドである、装置。
（項目３０）
項目２１−２９のいずれか１項の装置であって、ＣＳＣに特異的な捕獲薬剤は、ＣＳＣ表面上の部分を特異的に結合する、装置。
（項目３１）
項目３０の装置であって、捕獲薬剤は、ＣＤ４４、ＣＸＣＲ１、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ１０、ＣＤ１２７およびＣＤ１３３に結合する、装置。
（項目３２）
項目２１−３１のいずれか１項の装置であって、捕獲薬剤は、細胞捕獲表面への直接の付着を介して細胞捕獲表面に固定される、装置。
（項目３３）
項目２１−３２のいずれか１項の装置であって、捕獲薬剤は、表面に直接付着したリンカーへの付着を介して細胞捕獲表面上に固定される、装置。
（項目３４）
項目３３の装置であって、リンカーは、重合体ナノリンカーである、装置。
（項目３５）
項目３４の装置であって、重合体ナノリンカーは、ポリエチレングリコールに共有結合した修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーを含む、装置。
（項目３６）
項目３４の装置であって、修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、世代３、世代４、世代５、世代６、世代７、世代８および世代９の修飾ポリ（アミドアミン）デンドリマーからなる群より選択される、装置。
（項目３７）
項目３４の方法であって、重合体ナノリンカーは、ポリエチレングリコールに共有結合したポリエステル−ｎ−カルボキシラート−１−アルキンデンドロンを含み、ｎは、８、１６、３２、６４または１２８である、方法。
（項目３８）
項目２１−３７の１つのいずれかの装置であって、細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤は、実質的に一定の様式で配置される、装置。
（項目３９）
項目３８の装置であって、細胞捕獲表面は、第１および第２の領域のパターンを含み、第１の領域は、細胞ローリング誘導薬剤を含み、および第２の領域は、捕獲薬剤を含む、装置。
（項目４０）
項目３９の装置であって、第１の領域は、捕獲薬剤をさらに含む、装置。
（項目４１）
項目３９または４０の装置であって、第１および第２の領域は、交互のパターンで配置される、装置。
（項目４２）
項目２１−４１のいずれか１項の装置であって、細胞ローリング誘導薬剤は、細胞捕獲表面に共有結合する、装置。
（項目４３）
項目４２の装置であって、共有結合は、エポキシ基、カルボキシル基、チオール基、アルキン基、アジド基、マレイミド基、ヒドロキシル基、アミン基、アルデヒド基およびこれらの組み合わせからなる群より選択される化学的部分を介する、装置。
（項目４４）
項目２１−４３のいずれか１項の装置であって、細胞ローリング誘導薬剤は、リンカーを介してマイクロ流体装置の表面に固定される、装置。
（項目４５）
項目４４の装置であって、リンカーは、デキストラン、デンドリマー、ポリエチレングリコール、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、装置。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、ＣＴＣおよびＣＳＣ捕獲および区別のための生体模倣プラットホームモデルを提供する。パネルＡにおいて：癌患者血液から領域「ｉ」において捕獲されたＣＴＣの中で、幹様癌細胞は、領域「ｉｉ」を使用して連続的に区別し、および単離することができる。原位置でのＣＴＣおよびＣＳＣを捕獲する、および区別するこの概念は、パネルＢに示したように３つの流路装置としてさらに適用することができる。３つの流路装置は、パネルＣに示したように複数の血液試料のハイスループットスクリーニングに使用することができる。
【００３７】
【図２】図２は、本発明の複数流路のフローベース装置のためのフローチャンバーの原型を提供する。たとえば、２つまたは３つの流路フローチャンバーは、示した寸法のように作ることができる。
【００３８】
【図３】図３は、本発明の複数流路フローベース装置の模式図を提供する。最高のＣＴＣ検出感度および特異性を得るために、Ｅセレクチンパターンの幅（ａ）、抗体パターンの幅（ｂ）および抗体パターンの角度などの表面機能化のためのパラメーターを修正することができる。
【００３９】
【図４】図４は、同じ条件下でｂ）直鎖状重合体の固定化表面と比較してａ）デンドリマー被覆表面上の実質的に増強された腫瘍細胞捕獲を示す。
【００４０】
【図５】図５は、増強された細胞捕獲および多価結合および細胞ローリングの組み合わせによる効率を示す。パネルａ）は、Ｅセレクチンと一緒のデンドリマー被覆表面が、捕獲効率において〜７倍の増大を示すことを示す。パネルｂ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（１０−１，０００）が１０７個のＨＬ−６０細胞の中に添加されたときに、デンドリマー表面が＞７５％の腫瘍細胞捕獲を達成することを示す。誤差バー：標準的誤差（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５を示す。
【００４１】
【図６ＡＢ】図６は、ａＥＧＦＲをもつ単一流路フローベース装置を使用して健康な、およびトランスジェニックマウスからのＣＴＣ検出を示す。パネルａ）は、健康なＦＶＢ／ＮマウスおよびＣＥＯトランスジェニックマウスを使用する実験の図解を示す。パネルｂ）は、健康なマウスとトランスジェニックマウスとの間の血液１００μＬあたりの捕獲されたＣＴＣ数の比較を示す。パネルｃ）は、捕獲された細胞の免疫染色スキームを提供し、およびパネルｄ）は、ＤＡＰＩ、サイトケラチンおよびＣＤ４５染色後の捕獲されたＣＴＣの実際の蛍光イメージを示す。
【図６ＣＤ】図６は、ａＥＧＦＲをもつ単一流路フローベース装置を使用して健康な、およびトランスジェニックマウスからのＣＴＣ検出を示す。パネルａ）は、健康なＦＶＢ／ＮマウスおよびＣＥＯトランスジェニックマウスを使用する実験の図解を示す。パネルｂ）は、健康なマウスとトランスジェニックマウスとの間の血液１００μＬあたりの捕獲されたＣＴＣ数の比較を示す。パネルｃ）は、捕獲された細胞の免疫染色スキームを提供し、およびパネルｄ）は、ＤＡＰＩ、サイトケラチンおよびＣＤ４５染色後の捕獲されたＣＴＣの実際の蛍光イメージを示す。
【００４２】
【図７】図７は、単一流路フローベース装置を使用して得られた臨床データを提供する。パネルａ）は、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）＊およびフローベース装置上で捕獲された患者の血液の７．５ｍＬあたりのＣＴＣ数の比較を提供する。パネルｂ）は、Ｅセレクチンのない同じ表面と比較して、〜２５倍まで細胞ローリングについてＥセレクチンをもつフローベース装置を使用して捕獲された細胞間の劇的に増加したＣＴＣ純度を示す。＊値を文献から得た。
【００４３】
【図８】図８は、複数の抗体およびデンドリマーを使用して表面機能化の模式図を提供する。
【００４４】
【図９】図９は、種々のデンドリマー−抗体複合体を使用してポスト−ＥＭＴ細胞の有効な捕獲を示す。ａ）ＴＧＦ−β治療によるＥＭＴにおける３つのＢＣＡ細胞の受容体発現変化。ｂ）ＥＭＴ前および後にデンドリマー被覆表面を使用してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の表面捕獲の倍増強。誤差バー：標準誤差（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５を示す。
【００４５】
【図１０】図１０は、フローチャンバーの中に構築される多機能性表面の作製の概略図を示す：ａ）表面固定化のために複数流路ＰＤＭＳステンシルを適用し、および抗体を灌流する；ｂ）ステンシルを除去し、およびＥセレクチンを埋め戻す；およびｃ）フローチャンバーで構築する。
【００４６】
【図１１】図１１は、種々の流路でカスタマイズされたフローチャンバーを示す。パネルａ）は、２つの流路フローチャンバー装置を提供する。パネルｂ）は、蛍光顕微鏡上にマウントされた機能化された捕獲表面で構築された複数流路フローベース装置を示す。パネルｃ）は、３つの流路をもつフローベース装置のさらなるデザインを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
本明細書において、および添付の請求の範囲において使用されるように、別途はっきりと指示しない限り、単数形「１つ」、「および」および「その」は、複数の指示対象を含むことが留意されなければならない。
【００４８】
一つの側面において、試料からＣＴＣおよびＣＳＣを捕獲するための装置は、少なくとも２つの流路を含み、それぞれの流路は、細胞捕獲表面およびフロー修正表面を含む。たとえば、１つの流路において、細胞捕獲表面は、細胞ローリング誘導薬剤およびＣＴＣ特異的捕獲薬剤を含み、およびもう一つの流路において、細胞捕獲表面は、細胞ローリング誘導薬剤およびＣＳＣ特異的捕獲薬剤を含む。試料からＣＴＣおよびＣＳＣを捕獲する方法は、一つの側面において、ＣＴＣおよびＣＳＣが、細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤に結合することを可能にする条件下で試料を装置に導入することを含む。
【００４９】
任意で、フロー修正表面は、流路を介して流れている試料における回転フローを誘導するために配置される１つまたは複数の構造を含む。フロー修正表面は、試料における回転フローを誘導し、それは、細胞捕獲表面と細胞の増強された接触、およびしたがって、より効率的なＣＴＣおよびＣＳＣ捕獲を可能にし得る。
【００５０】
本発明の方法は、約２００〜５００μＬ／分の流量の生理学的範囲における生物学的試料の高スループット分離を提供する。いくつかの態様において、０．０５ｄｙｎ／ｃｍ２〜１０ｄｙｎ／ｃｍ２の間のせん断応力は、マイクロ流体装置１０に導入される試料にかけられる。いくつかの態様において、０．１ｄｙｎ／ｃｍ２〜２ｄｙｎ／ｃｍ２の間のせん断応力は、マイクロ流体装置１０に導入される試料にかけられる。いくつかの態様において、せん断応力は、約０．０５、約０．１０、約０．１５、約０．２０、約０．２５、約０．３０、約０．３５、約０．４０、約０．４５、約０．５０、約０．５５、約０．６０、約０．６５、約０．７０、約０．７５、約０．８０、約０．８５、約０．９０、約０．９５、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２．０、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９、約１０．０ｄｙｎ／ｃｍ２である。いくつかの態様において、せん断応力は、約０．１６ｄｙｎ／ｃｍ２である。
Ｉ．マイクロ流体装置
【００５１】
本発明の装置は、細胞捕獲表面およびフロー修正表面を有する少なくとも２つの流路を含む。細胞捕獲表面は、フロー修正表面の反対側に配置することができる。たとえば、細胞捕獲表面は、流路の底面表面上に配置することができ、フロー修正表面は、細胞捕獲表面の反対側に、流路の上部表面上に配置することができる。あるいは、フロー修正は、細胞捕獲表面に隣接して配置することができる。さらにもう一つの態様において、細胞捕獲表面およびフロー修正表面は、単一の表面に組み込むことができる。流路は、たとえば４つの壁を有する閉じた流路であることができる。細胞捕獲表面および／またはフロー修正表面は、流路の複数の壁に配置することができる。
【００５２】
装置内の複数の流路は、接続することができ、試料は、流路の間を流れるだろう。もう一つの側面において、装置は、複数の流入および複数の流出を有することができ、たとえばそれぞれの流路は、それ自体の流入および流出を有し、および流路は、接続しない、またはそれぞれの流路は、それ自体の流入を有し、および流路は、単一の、または複数の流出と接続する。複数の流路は、均一の形状および／またはサイズであることができる。あるいは、複数の流路は、単一の装置内で異なる形状およびサイズを有することができる。
【００５３】
流路は、任意の適切な断面形状を有することができる。たとえば、流路は、矩形、三角、環状または楕円であり得る。マイクロ流体装置の寸法は、以下の方程式を使用して液体抵抗を最小限にすると共に、最大液体回転に最適化されることができる：
【数１】
0006736480.tif 000002
式中μは、動粘性率であり、Ｌは、流路長であり、ｗは、流路幅であり、およびｈは、流路高である。
【００５４】
たとえば、流路は、約５０μｍ〜約６００μｍ、約１００μｍ〜約５００μｍ、約２００μｍ〜約４００μｍの高さを有することができる。その他の適切な高さは、たとえば、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０または６００μｍを含む。流路は、約２００μｍ〜約２０００μｍ、約４００μｍ〜約１５００μｍ〜、約５００μｍ〜約１０００μｍまたは約６００μｍ〜約８００μｍの幅を有することができる。その他の適切な幅は、たとえば、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００μｍを含む。流路は、約２００μｍ〜約５０００μｍ、約４００μｍ約４０００μｍ、約６００μｍ〜約２０００μｍまたは約８００μｍ〜約１０００μｍの長さを有することができる。その他の適切な長さは、たとえば、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００または５０００μｍを含む。
【００５５】
細胞捕獲表面は、基板に付着した細胞ローリング誘導薬剤およびＣＴＣおよび／またはＣＳＣ特異的捕獲薬剤を含む。基板は、たとえば、ガラス、プラスチック（または重合体被覆）、ヒドロゲル、マトリゲルまたは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）被覆基板であることができる。細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤は、たとえばリンカーを使用して、直接または間接的のいずれかで基板上で固定されることができる。細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤は、細胞捕獲表面全体に一様に配置することができる。たとえば、細胞捕獲表面は、細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤を有する交互領域を含むことができる。交互領域は、実質的に同じ幅を有することができる、または幅は、領域の中で変更することができる。細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤を含む領域は、たとえば、流路を通るフローの方向に平行のように、またはそれに対して角度をつけられて配置されることができる。たとえば、領域は、流路を通るフローの方向に接線方向に配置されることができる。
【００５６】
フロー修正表面は、当該技術分野において周知である。任意の公知のフロー修正表面を使用することができる。たとえば、フロー修正表面は、流路の中に表面から拡張して、１つまたは複数の隆起を任意に含むことができる。隆起は、流路を通って流れる試料における回転フローを誘導するように成形され、サイズ設定され、および配向される。細胞捕獲表面およびフロー修正表面は、たとえば、細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤でフロー修正表面を被覆することによって装置の単一の表面上に含めることができる。たとえば、隆起は、細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤で被覆することができる。隆起の全てまたは部分は、被覆することができる。たとえば、隆起の側面は、細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤で被覆することができる。試料における回転フローの誘導は、細胞捕獲効率を増強することができる。低拡散率を有する細胞は、これらが入る流路の領域に残留する傾向を有するだろう。たとえば、血液細胞は、これらの大きな直径のために本質的に低い拡散率を有する。これは、細胞が細胞捕獲表面から遠く離れている流路に入るときに、細胞捕獲過程に有害に影響を及ぼす。たとえば、血液細胞が上部の近くのマイクロ流体流路に入る場合、それは、流路の底面に位置する生体機能化された基板と細胞の相互作用を限定して、マイクロ流路に沿って数センチメートル移動するにつれて、おそらく上部近くに残るだろう。試料における回転フロー誘導は、細胞捕獲表面の方へ細胞を押しやるだろう、これにより細胞と細胞捕獲表面との接触を増強する。
【００５７】
隆起は、たとえば矩形、環状、楕円または三角などの任意の適切な横断面形を有することができる。隆起は、約１０μｍ〜約３００μｍ、約５０μｍ〜約３００μｍ、約１００μｍ〜約２５０μｍまたは約１５０μｍ〜約２００μｍの厚さを有することができる。その他の適切な厚みｔは、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００μｍを含む。隆起は、約５０μｍ〜約３００μｍ、約１００μｍ〜約２５０μｍまたは約１５０μｍ〜約２００μｍの幅を有することができる。その他の適切な幅は、約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５または３００μｍを含む。隣接する隆起間の距離は、約５０μｍ〜約５００μｍ、約１００μｍ〜約４００μｍまたは約２００μｍ〜約３００μｍであることができる。その他の適切な距離は、約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００μｍを含む。隣接する隆起間の距離は、フロー修正表面全体に実質的に均一であることができ、または変化することができる。
【００５８】
隆起は、たとえば、フローに対して垂直方向に伸びる実質的に直線的であることができる。隆起は、ヘリンボーン構造を有することができる。隆起は、フローの方向に対して角度をつけることができる。たとえば、隆起は、フローの方向に対して垂直または斜めに角度をつけることができる。一つの態様において、隆起は、フローの方向Ｆに対して４５°の角度である。その他の適切な角度は、約４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、８５°、９０°、１００°、１１０°、１２０°、１３０°、１４０°、１５０°、１６０°および１７０°を含む。１つまたは複数の隆起は、一様に角度をつけることができる。あるいは、隆起の角度を流路全体にわたって変更して、流路を通して流れている試料に異なる回転特性を誘導することができる。
【００５９】
１つまたは複数の隆起は、パターンで配置することができる。たとえば、フロー修正表面は、１つまたは複数の隆起を有する第１の領域および隆起が欠けている第２の領域を含むことができる。あるいは、第２の領域は、第１の領域の隆起と異なったように配向され、サイズ設定され、および／または成形された隆起を含むことができる。フロー修正表面は、隆起が完全に欠けている第３の領域をさらに含むことができる。異なったようにサイズ設定され、配向され、および／または成形された隆起を有する領域の任意の適切な数をフロー修正表面上に含めることができる。第１および第２の領域は、たとえばフロー修正表面全体に一様に交互になることができる。
【００６０】
マイクロ流体装置は、細胞ローリング誘導薬剤を有する領域および捕獲薬剤を有する領域をもつ細胞捕獲表面を作製することによって生み出されることができる。次いで、フロー修正表面を有するマイクロ流体流路は、細胞捕獲表面に付着することができる。
【００６１】
細胞捕獲表面は、基板、たとえばガラススライド上の細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤をパターン化することによって形成することができる。細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤の領域を形成する任意の公知の方法は、細胞捕獲表面を形成するのに使用することができる。細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤は、たとえば重合体ステンシル、たとえば、ＰＤＭＳステンシルを使用してパターン化することができる。ステンシルは、当技術分野において公知のとおり、たとえばフォトリソグラフィーを使用して形成することができる。フォトレジストは、ウエハ上で被覆され、およびフォトマスクを使用して選択的に露光することができる。次いで、フォトレジストは、現像され、除去されているフォトレジストの非露光部分を生じ、それによって、ステンシルのためのネガティブ鋳型を形成する。次いで、ＰＤＭＳなどの重合体をネガティブ鋳型上へ注ご、および硬化することができ、それによって、ステンシルを生じる。ステンシルは、第１の表面から突出する１つまたは複数の構造を含む。突出構造のサイズ、配向および形状は、細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤の所望の領域のサイズ、配向および形状と実質的に同じである。基板上に置かれたときに、突出構造は、基板の部分を覆う働きをする。細胞ローリング誘導薬剤または捕獲薬剤は、基板の露出した部分に付着することができる。次いで、ステンシルを除去することができ、および基板の露出した部分は、細胞ローリング誘導薬剤または捕獲薬剤で満たすことができ、それによって、細胞捕獲表面を形成する。
【００６２】
たとえば、細胞ローリング誘導薬剤および捕獲薬剤は、たとえば物理吸着またはプラズマアブレーションを使用して基板に付着することができる。たとえば、薬剤は、所望の薬剤が可溶性培地中に置かれたマイクロ流体吸着を使用して付着することができ、および基板上へ置かれたマイクロ流体流路を通して注射することができる。溶液は、数時間にわたって表面に吸着することができる。この技術は、所望の薬剤が熱に影響されやすい、またはダメージを受けるときに有益である。
【００６３】
共有結合に適切な基の異なる密度およびパターンで表面を作製する方法は、当該技術分野において周知である（たとえば、Ｒｕｓｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ８：  １７７５−８９  （Ｊｕｎｅ  ２００７）  ａｎｄ  Ｌｅｃｋｂａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３７：  ２２７−２３７  （１９９１）を参照されたい、その両方の全ての内容は、参照により本明細書に援用される）。いくつかの態様において、捕獲薬剤および／または細胞ローリング誘導薬剤の密度は、約１０ｎｇ／ｃｍ２〜約６００ｎｇ／ｃｍ２の範囲である。いくつかの態様において、捕獲薬剤および／または細胞ローリング誘導薬剤の密度は、約３０ｎｇ／ｃｍ２を上回る。たとえば、いくつかの態様において、捕獲薬剤および／または細胞ローリング誘導薬剤の密度は、約３０ｎｇ／ｃｍ２〜約３６０ｎｇ／ｃｍ２の範囲である。いくつかの態様において、捕獲薬剤および／または細胞ローリング誘導薬剤の密度は、約５０ｎｇ／ｃｍ２〜約３００ｎｇ／ｃｍ２の範囲である。いくつかの態様において、捕獲薬剤および／または細胞ローリング誘導薬剤の密度は、約１００ｎｇ／ｃｍ２〜約２００ｎｇ／ｃｍ２の範囲である。
【００６４】
流路およびフロー修正表面は、当技術分野において公知であるとおり形成されることができる。Ｓｔｒｏｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５：６４７−５１を参照されたい、それの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。フロー修正表面は、ソフトリソグラフィを使用して形成することができる。たとえば、フロー修正表面は、デュアルハイトＳＵ−８フォトレジスト鋳型などのフォトレジストを使用して形成することができる。鋳型は、第１に回転させ、およびマイクロ流体流路をパターン化することによって作製される。流路パターンを現像する前に、第２のフォトレジスト層は、鋳型上へ回転塗布されてフロー修正表面の隆起のためのパターンができる。整列マーカーを第２のフォトレジスト層の適当な配向を容易にするために添加してもよい。次いで、鋳型は、露光され、硬く焼かれおよび現像され、それによって、フロー修正表面の隆起を鋳造するだろう構造をもつ流路を含む鋳型ができる。次いで、できた鋳型は、重合体、たとえばＰＤＭＳで被覆された流路およびフロー修正表面を形成する。
ＩＩ細胞ローリング
【００６５】
本発明のマイクロ流体装置のチャンバーは、固定化細胞ローリング誘導薬剤を含む。一過性リガンド−受容体相互作用の形成は、血液および血管内皮に流れている細胞間で一般に生じる；この生理的過程は、細胞ローリングとして公知である。細胞ローリングは、炎症の部位に対する白血球の動員、静脈内注射後の造血前駆細胞のホーミングおよびＣＴＣ誘導された転移などの生物学的に重要な過程において重要な役割を演じることが公知である。この挙動は、血管内皮細胞表面上のセレクチン（たとえば、Ｅ、Ｐ、Ｌセレクチン）とＰセレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）を含む膜タンパク質との間の動的相互作用によって典型的に媒介される。当業者は、ＣＴＣまたはＣＳＣを誘導して細胞ローリングを起こすことができる任意の分子が、開示された方法を実施し、および開示された装置を作製するのに使用されることができることを認識するだろう。
【００６６】
本開示のいくつかの態様において、細胞ローリング誘導薬剤は、セレクチンである。もう一つの態様において、セレクチンは、内皮（Ｅ）セレクチンである。さらにもう一つの態様において、セレクチンは、Ｐセレクチンである。もう一つの態様において、セレクチンは、Ｌセレクチンである。その上、ＣＴＣを結合する能力を保持するセレクチンの断片は、本開示の範囲内であると明確に想像される。
【００６７】
Ｅセレクチン（ＣＤ６２Ｅ）は、活性化内皮上および骨−皮膚微小血管内膜上のその発現によって、および細胞ローリング、細胞シグナリングおよび走化性におけるその役割のために疾患において特に注目に値する。多くの研究は、前立腺、乳房および結腸癌細胞などの種々のタイプの癌細胞の接着およびホーミングに関わることにおいてＥセレクチンによって果たされる重要な役割を指摘する。Ｅセレクチンは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などの炎症性サイトカインに応答して内皮細胞によって新規に合成される。したがって、細胞ローリング挙動に基づいた細胞分離は、それが生理的過程を模倣するように利用され、およびその他の免疫標識検出法に必要である標識化および標識除去工程を無くす。しかし、白血球、血小板、好中球、間葉および造血幹細胞並びに転移性癌細胞を含む大きなクラスの細胞が、セレクチン上を転がることを示すならば、細胞混合物または全血からの特異的細胞型のためのローリングに基づいた検出は、十分な特異性を達成する限界を有し、それは臨床的に有意な装置への技術の変換を妨げた。本開示の方法および装置は、固定化捕獲薬剤と細胞ローリング誘導薬剤を合わせることによってこの限界を克服する。任意の特定の理論によって縛られることを意図せずに、細胞ローリング誘導薬剤が、末梢循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）にマイクロ流体装置の表面上で「ローリング」挙動（上で記述した）を示させると考えられる。次いで、ローリングＣＴＣは、固定化捕獲薬剤に接触し、およびこれにより、装置によって捕獲される（すなわち、固定される）。
【００６８】
任意の共有結合性の化学的性質は、マイクロ流体装置の表面に細胞ローリング誘導薬剤を固定するのに使用されてもよい。いくつかの態様において、細胞ローリング誘導薬剤は、１つまたは複数の化学的部分を介して表面に付着する。一般に、化学的部分と表面との間の結合は、共有結合である。限定されないが、いくつかの態様において、化学的部分は、エポキシ基、カルボキシル基、チオール基、アルキン基、アジド基、マレイミド基、ビニル基、ヒドロキシル基、アミン基、アルデヒド基およびこれらの組み合わせを含む。
【００６９】
いくつかの態様において、細胞ローリング誘導薬剤は、リンカーを介してマイクロ流体装置の表面に固定される。いくつかの態様において、リンカーは、デンドリマー、デンドロン、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリ（Ｌ−リジン）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００７０】
本発明の装置および方法において使用されるＣＴＣを捕獲するためのローリング効果は、国際公開番号ＷＯ２０１０／１２４２２７号および米国特許公開番号第２０１２００７７２４６号において詳細に記述され、それは、これらの全体が本明細書において参照により援用される。
ＩＩＩ．細胞捕獲
Ａ．捕獲薬剤
【００７１】
本発明のマイクロ流体装置の流路は、固定化捕獲薬剤を含む。当業者は、末梢循環腫瘍細胞に選択的に結合することができる任意の分子が、捕獲薬剤として有用だろうことを認識するだろう。末梢循環腫瘍細胞に選択的な結合を示すこのような分子の具体的例は、抗体（または抗体断片）、葉酸、トランスフェリン、一定のペプチドおよびアプタマーを含む。抗体の例は、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ベバシズマブ（アバスチン）、抗ＣＤ３３抗体（マイロターグ）、抗ＣＤ２０抗体（ゼバリンおよびベキサール）およびこれらの断片および操作された形態（たとえば、二重特異性抗体、アビマー、その他）を含むが、限定されない。ペプチドの例は、ＲＧＤおよびＮＧＲを含むが、限定されない。
【００７２】
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、肺、結腸直腸、乳房、前立腺、頭頸部および肝臓起源などだが、血液細胞は無い種々の癌腫によって頻繁に過剰発現される。したがって、非ＣＴＣ細胞の結合を回避すると共に、ＣＴＣの特異的結合（すなわち、「捕獲」）を可能にするために、いくつかの態様において、捕獲薬剤は、抗ＥｐＣＡＭ抗体である。抗ＥｐＣＡＭ抗体は、たとえば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ＡｂｃａｍおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅを含むいくつかの供給元から市販されている。あるいは、本開示の方法を実践する、または本開示の装置を生み出すために有用な抗ＥｐＣＡＭ抗体は、当該技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。
【００７３】
本明細書に使用される用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、（ｉ）無処置の抗体（たとえば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体）、（ｉｉ）たとえば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、（Ｆａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、単鎖抗体結合部位、ｓＦｖを含むそれらの抗原結合部分（ｉｉｉ）二重特異的抗体およびそれらの抗原結合部分および（ｉｖ）多重特異的抗体およびそれらの抗原結合部分を意味すると理解される。
【００７４】
本明細書に使用される用語「特異的に結合する」、「特異的に結合する」および「特異的結合」は、抗体が、少なくとも約１０６Ｍ−１、より好ましくは、少なくとも約１０７Ｍ−１、より好ましくは、少なくとも約１０８Ｍ−１および最も好ましくは少なくとも約１０１０Ｍ−１の特定の抗原に選択的な結合親和性を有することを意味すると理解される。適切な対照は、「特異的」と「非特異的」結合とを区別するのに使用することができる。
【００７５】
本明細書に使用される用語「ＣＴＣ特異的捕獲薬剤」は、ＣＴＣに特異的に結合する、たとえば薬剤がＣＴＣの表面上の部分に特異的に結合する薬剤を意味すると理解される。加えて、用語「ＣＳＣ特異的捕獲薬剤」は、ＣＳＣに特異的に結合する、たとえば薬剤がＣＳＣの表面上の部分に特異的に結合する薬剤を意味すると理解される。
【００７６】
いくつかの態様において、捕獲薬剤は、トランスフェリンである。トランスフェリンは、鉄結合輸送タンパク質であり、それは、陰イオン、たとえば、ビカルボナートの結合に結合して第二鉄の２つの原子を結合することができる。トランスフェリンは、吸収およびヘム分解の部位から貯蔵および利用の部位までの鉄の輸送の役割を担う。トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）は、癌の広い範囲において過剰発現されることが公知であり、トランスフェリンを捕獲薬剤として有用にする。
【００７７】
いくつかの態様において、捕獲薬剤は、ＲＧＤ配列、その構造的または機能的均等物またはこれらの組み合わせを含むＲＧＤペプチド、ｃＲＧＤペプチド、ＲＧＤ模倣、ペプチドまたはタンパク質である。本明細書において記述したＲＧＤまたはＲＧＤ模倣は、環状Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチドの修飾から生じる任意のペプチドまたはペプチド模倣を含む。修飾は、ペンダント基に、および／またはペプチドのバックボーンにあることができる。ペプチド合成は、ペプチド擬態の合成を含み、十分に実証されており、およびたとえばコンビナトリアルケミストリーを介して容易に達成することができる。
【００７８】
いくつかの態様において、捕獲薬剤は、葉酸である。葉酸は、葉酸受容体（ＦＲ）として公知の腫瘍関連抗原に結合することが公知であり、葉酸を捕獲薬剤として有用にする。
Ｂ．多価効果
【００７９】
多価相互作用−生物学的システムにおける複数の受容体に対する複数のリガンドの同時の結合イベント−は、特異的細胞型のターゲティングを促進するために広範囲に調査されてきた。また、これらの活性は、ウイルス性、寄生的、マイコプラズマおよび細菌性病原体の付着を含む多数の病理学的過程の中心となる。生物学的多価阻害剤の研究は、１〜９桁のオーダーでの増大で、結合活性の定量的測定を得る。
【００８０】
本開示のいくつかの側面において、多価効果は、リンカーへの付着を介して細胞捕獲表面の基板上に捕獲薬剤を固定することによって達成され、それは、細胞捕獲表面の基板に直接付着する。いくつかの態様において、リンカーは、重合体ナノリンカーである。いくつかの態様において、重合体ナノリンカーは、修飾ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである。
【００８１】
ナノリンカーは、樹状重合体でもよい。たとえば、デンドリマー、テクト−デンドリマー、規則的デンドロン、デンドリグラフトおよび超分枝重合体を含む公知の樹状構築物のいずれが使用されてもよい。また、核から放射する複数のアームを有する樹状星状分枝重合体が使用されてもよい。したがって、本明細書に使用される樹状重合体は、多くの末端反応性基を有する高密度に分枝した構造をもつ重合体である。樹状重合体は、いくつかの層または多数の反復単位を含み、通常分枝細胞といわれ、それは、１つまたは複数の分枝点をすべて含む。樹状重合体は、デンドリマーおよび超分枝重合体を含み、２つ以上の反応基を有する単量体ユニットの反応または単量体ユニットの少なくとも１つが少なくとも３つの反応基を有する単量体ユニットの組み合わせによって作製される。使用され得るデンドリマーは、単一の原子または原子団であることができる共通のコアから放射する複数のデンドロンからなるものを含む。それぞれのデンドロンは、末端表面基、２つ以上の分枝機能性を有する内部分枝接続および隣接した分枝接続を共有結合的に接続する二価コネクタから一般に成る。
【００８２】
デンドリマー、デンドロン、超分枝重合体、星状分枝重合体、密度の高い星状分枝重合体および超櫛分枝重合体を作製し、および特徴づける方法は、当該技術分野においてすべて周知であり、および文献に丁寧に記述されている。デンドロンは、規則的分枝重合体であり、およびこれらの構造は、分子レベルで正確に制御されることができ、およびこれらは、独特の特性を有する。これらは、楔形であり、および分枝が始まる限局的な位置を含む。異なるデンドロンは、それぞれの分枝から拡張する異なる数の分枝および異なる数の層を有してもよい。本開示のいくつかの態様において、重合体ナノリンカーは、ポリエチレングリコールに共有結合するポリエステル−ｎ−カルボキシラート−１−アルキンデンドロンを含み、ｎは、８、１６、３２、６４または１２８である。
【００８３】
使用され得る樹状重合体の具体的例は、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、デンドリグラフトおよび超分枝重合体；ポリ（ベンジルエーテル）デンドリマー、デンドリグラフトおよび超分枝重合体；ポリエステルデンドリマーおよび超分枝重合体；ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）デンドリマー、デンドリグラフトおよび超分枝重合体；有機ケイ素含有デンドリマー、デンドリグラフトおよび超分枝重合体、ポリスチレン樹枝状重合体を含む。
【００８４】
１つが類似の分子重量線状重合体にリガンドを結合する場合得られるものと比較して、デンドリマーの形状が、リガンドをスペースの小さな領域にプレ組織化するので、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、促進性の多価効果のための優れたメディエーターであることが報告されていた。したがって、１つは、リガンドを局在化させるために、エントロピーペナルティを「前払いした」。第２に、デンドリマー構造は、全てのリガンドが細胞表面を対象にすることを可能にする。これが、必ずしも、もつれ合った、または架橋された鎖が必要とされたリガンド配向を妨げ得る類似の分子重量超分枝重合体についての場合であるというわけではない。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、非常に曲げやすく、および表面との相互作用により等方媒体において採用される球状形状から円盤状構造まで容易に変形する。プレ組織化、重合体バックボーントポロジーおよび簡単な変形性のこの組み合わせは、ＰＡＭＡＭデンドリマーを細胞表面への多価結合を達成するための有効な材料にする。さらにまた、多価効果は、標的タンパク質または細胞の特異性および検出感度を有意に増加させることができる。抗ＥｐＣＡＭなどの癌細胞特異的マーカーと結合するＰＡＭＡＭデンドリマーを固定することによって、表面の特異性および感度は、多価効果によって実質的に増加する。
【００８５】
いくつかの態様において、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、ポリエチレングリコールに共有結合する。
【００８６】
いくつかの態様において、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、世代３のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代４のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代５のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代６のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代７のＰＡＭＡＭデンドリマー、世代８のＰＡＭＡＭデンドリマーおよび世代９のＰＡＭＡＭデンドリマーからなる群より選択される。
【００８７】
本発明の装置および方法において使用されるデンドリマーの多価効果は、国際公開番号ＷＯ２０１０／１２４２２７号および米国特許公開番号第２０１２００７７２４６号に詳細に記述され、それは、これらの全体が本明細書において参照により援用される。
【実施例】
【００８８】
実施例
以下の例は、例証のために提供され、および任意の方法において本発明の範囲を限定しない。
実施例１：生体模倣表面は、細胞捕獲を促進する
【００８９】
新規の生物機能の表面を固定化セレクチンおよびａＥｐＣＡＭで作製して、その全体が本明細書において参照により援用されるＭｙｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２６（１１）：  ８５８９−９６，  ２０１０に記載されたように、これらの表面上の腫瘍細胞ローリングおよび固定結合を誘導した。細胞ローリングの誘導は、捕獲効率を改善し、それは、Ｍｙｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２６（１１）：  ８５８９−９６，  ２０１０に記載されたように、このＣＴＣ装置のより高い感度に変換される。この装置のもう一つの独特の特徴は、細胞捕獲への微小工学の適用である。デンドリマー媒介多価効果を介して癌細胞ターゲティングにおける増強された結合活性は（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  １４（１）：１０７−１５，  ２００６）、まれなＣＴＣの検出を著しく向上させ得る。多価効果を利用する高感度表面を作製するために、世代７（Ｇ７）ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーおよびａＥｐＣＡＭを図４に図示したように使用した。Ｇ７  ＰＡＭＡＭデンドリマーをこれらの適切なサイズ（直径８−１０ｎｍ）および表面官能基の数（理論的に５１２）のため選択してデンドリマーあたり複数のａＥｐＣＡＭ（Ｆｃ領域の直径約５．５ｎｍ）を収容し、それによって、多価結合の結合を可能にした。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｘを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイは、〜５個のａＥｐＣＡＭ分子と結合するデンドリマーが、１００万倍を超えるまで遊離ａＥｐＣＡＭより劇的により低いＫＤ値（より強力な結合）を示すことを明らかにした。
【００９０】
次いで、デンドリマーを経た強力な多価結合の効果をＭｙｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇ  ５０（４９）：１１７６９−７２，  ２０１１に記載されたように、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞などの複数の癌細胞株を用いて、腫瘍細胞捕獲表面において試験した。図５ａに示したように、デンドリマー固定化表面は、〜７倍まで全ての３つの細胞株について直鎖状重合体（ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ））で被覆したものより実質的に多くの細胞を捕獲した。予備調査のように、また、我々は、インビボ状況をシミュレートするために、１０７個のＨＬ−６０細胞あたり１０−１，０００個の腫瘍細胞でＨＬ−６０細胞を含むＰＢＳ緩衝液中に添加された３つの癌細胞株を添加した。デンドリマー−ａＥｐＣＡＭ被覆表面の捕獲効率は、Ｅセレクチンと共に、試験した混合比の全体にわたって７５％を超えて維持された一方で、ＰＥＧ化された表面は、捕獲効率を２５％の下に落とした（図５ｂ）。なお、我々が以前に証明したように（Ｍｙｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．  ８６（１２）：６０８８−９４，  ２０１４）、捕獲された細胞以外のローリング細胞（ＨＬ−６０）をＥＧＴＡ−追加されたＰＢＳ緩衝液で３分間洗浄することによって、表面から容易に剥離し、および除去することができる。
実施例２：生体模倣表面は、ＣＴＣの感度および検出を改善する
【００９１】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のためのトランスジェニックマウスモデルからの血液試料を生体模倣表面の感度を調査するのに使用した。ＮＳＣＬＣのサイクリンＥ過剰発現（ＣＥＯ）マウストランスジェニックモデルをＭａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １０４（１０）：４０８９−９６，  ２０１３に記載されたように、細胞周期制御因子ＣＥＯの過剰発現のために工学的に作製した。このマウスモデルは、染色体不安定性、肺異形成および過形成、ヘッジホッグ−経路活性化、単一および複数の腺癌並びに重要なことに転移などのＮＳＣＬＣ患者において見いだされる重大な特徴を示す。ＣＴＣ数に関して、トランスジェニックマウス（１００μＬあたり７５．３±１４．９  ＣＴＣ、ｎ＝７）が、健康な対照（１００μＬあたり４．４±１．２  ＣＴＣ、ｎ＝６、ｐ＝０．００１１）から有意な差を示した図６ｂに示したように、健康な、およびトランスジェニックマウスからａＥＧＦＲで機能性をもたせられた表面上で捕獲されたＣＴＣの数。（平均±ＳＤ（＊＊ｐ＜０．００５））。なお、ＣＴＣをＮａｇｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：１２３５−９，  ２００７に記載されたように、標準的な免疫染色方法（図７ｃおよびｄ）を使用して同定した。捕獲された細胞の中で、サイトケラチン（ＣＫ）抗体（ＣＫ＋）に結合し、ＤＡＰＩ（ＤＡＰＩ＋）によって染色され、およびＣＤ４５（ＣＤ４５−）にこれまでにネガティブだった細胞をＣＴＣとして同定した。ＣＫ−／ＣＤ４５＋／ＤＡＰＩ＋によって定義された白血球および核無しの自家蛍光細胞を計数しなかった。
【００９２】
また、生体模倣表面を治療上の介入の結果としてのＣＴＣ数変化をモニターするその能力について試験した。ＣＥＯマウスを無し（対照）、非特異的ロック核酸（Ｍ４７）およびＮＳＣＬＣ細胞を死滅させるのに有効であると公知である抗ｍｉＲ−３１ロック核酸（Ｍ５３）で治療した。群Ｍ５３（１１．３±９．２  ＣＴＣ、ｎ＝７、ｐ＝０．０３９）は、Ｍ４７群（４０．５±２９．７  ＣＴＣ、ｎ＝６）および治療無しの対照ＣＥＯマウス（２５．４±２６．９  ＣＴＣ、ｎ＝６）と比較して有意により少ないＣＴＣ数を示した。また、７ｂに示したデータは、インビトロでの腫瘍細胞株（ＥＤ−１およびＥＤ１−ＳＣ）とインビボでのＣＴＣ（対照Ｍ４７およびＭ５３）との間にサイズにおいて有意な差があることを示し、サイズのみに基づいたＣＴＣ検出方法が、十分に有効でないことがあり得ることを示す。加えて、図７ｃに示したように、インビボでのＣＴＣにおける「生存して」捕獲されたものは、拡張した培養であり得る。
実施例３：生体模倣表面の臨床検証
【００９３】
臨床研究を２０人の癌患者から収集された血液試料を使用して実施した。ヘパリン処理チューブ（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標））に収集された抜かれた血液を室温にて保持した。ＣＴＣ捕獲を血液を抜いた後２４時間以内に単一チャンバーフローベース装置（図７に示した）を使用して実行した。血液中のＣＴＣを含む単核細胞を供給業者のプロトコルに従ってＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓを使用して最初に分離し、および回収した。回収された単核細胞を含む軟膜を完成されたＤＭＥＭ培地に再懸濁し、およびＭｙｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．  ８６（１２）：６０８８−９４，  ２０１４に記述された条件下でＣＴＣ捕獲のために表面上で固定されたａＥｐＣＡＭ、ａＥＧＦＲおよびａＨＥＲ２をもつ単一チャンバー装置に注入した。ＣＴＣを上で記述した同じ方法を使用して同定した。
【００９４】
図７に示したように、生体模倣表面は、全ての患者からの臨床ＣＴＣの方へ大きな感度を示した。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（商標）が、Ｈ＆Ｎ癌患者から０−４６個のみのＣＴＣを捕獲することが報告された一方で、単一チャンバー装置は、同じ血量（７．５ｍＬ）あたり平均２，０４８個のＣＴＣを捕獲した（図７ａ）。加えて、Ｅセレクチンをもつ捕獲表面は、Ｅセレクチンのない同じ表面を比較して、〜２５倍まで捕獲細胞間の有意に増強されたＣＴＣ純度を示し、捕獲純度および特異性を決定する我々の装置における細胞ローリングの重要性を示した（図７ｂ）。要約すれば、インビボおよび臨床研究は、生体模倣表面が、培養展開のための可能性をもつ「生存している」臨床ＣＴＣを効率的に捕獲する高感度、特異的および費用効果的なＣＴＣ検出システムとして発展される大きな可能性があることを示す。
実施例４：複数流路装置の作製および特性化
【００９５】
この研究において、複数チャンバー装置は、複数チャンバー装置の捕獲表面上にパターンで固定されたＣＴＣに特異的な複数の抗体および複数のｃＣＳＣ−特異的抗体を用いた。パターンは、多価捕獲のために、ａＣＤ４４、ａＣＤ１０、ａＣＤ２７１とともに、ローリングためのＥセレクチンおよび抗上皮細胞接着分子（ａＥｐＣＡＭ）および抗ヒト上皮成長因子受容体２（ａＨＥＲ２）をもつＧ７  ＰＡＭＡＭデンドリマーを含んだ。さらに、また、捕獲ＣＴＣからＣＳＣを効率的に単離するために、ＣＤ４４、ＣＤ１０およびＣＤ２７などのＣＳＣマーカー特異的固定化抗体を捕獲表面上に固定した。
【００９６】
多機能性表面は、層ごとのアプローチによって作製した。図８に示したように、エポキシ機能性をもたせられた表面をポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）で作製される複数流路ステンシルを使用してソフトリソグラフィによって、種々の抗体でマイクロパターン化した。次いで、複数パターン化表面をＥセレクチンで処理して、空間を埋め戻して、その後種々の細胞のローリングを誘導した。ａＥｐＣＡＭ、ａＨＥＲ２およびａＥＧＦＲの固定化をパターン化された様式でＧ７  ＰＡＭＡＭデンドリマー被覆表面上部の上で行い、Ｅセレクチンを添加し、およびフローチャンバーに構築し、Ｍｙｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．  ８６（１２）：６０８８−９４，  ２０１４に記載されたように類似の固定化プロトコルを使用して生体模倣表面を生み出した。タンパク質固定化をＥセレクチン抗体／ＦＩＴＣ複合体および蛍光タグ付け抗体などの蛍光抗体を使用して確認した。タンパク質が共有結合的に固定化されたことを確認するために、表面をＨｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２３（２４）１２２６１ｐ−８，  ２００７に記載されたように、高イオン強度をもつ緩衝液を使用して完全にリンスする工程の後に再撮像した。加えて、Ｘ線光電子分光法を使用して、表面の元素組成を解析した。
【００９７】
生体模倣表面が高度に不均一な表現型をもつ腫瘍細胞を効率的に捕獲したことを確認するため、５つの細胞株をＥＭＴを受けるために誘導し、および装置に潅流した。簡潔には、頭頚部癌細胞を７２時間１０および２０ｎｇ／ｍＬの濃度にてＴＧＦ−βで処理した。ＥＭＴをＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １１７（３１）：  ９２３３−４０，  ２０１３に記載されたように、ウエスタンブロット法によって、並びにピコ〜ナノスケールＡＦＭ力測定および細胞レベル創傷治癒アッセイ両方を使用して増強された細胞骨格活性を観察することによって確認した。捕獲効率およびポストＥＭＴ細胞の表面挙動をＭｙｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇ  ５０（４９）：１１７６９−７２，  ２０１１に記述された類似の方法を使用して、プレＥＭＴ対応物と比較した（図９を参照されたい）。
【００９８】
５つの細胞株を使用してインビトロでのフローチャンバー試験を実行してパターン寸法を最適化する。タンパク質パターンの長さおよび角度を最適化して安定してローリングを誘導し、および腫瘍細胞特異的捕獲を最大にする。Ｅセレクチンおよびデンドリマー抗体ドメインの長さを２つのドメインが０．５−４．０ｄｙｎ／ｃｍ２の種々のせん断応力にて細胞の安定なローリング（１−１０μｍ／ｓ）を誘導し、およびそれぞれ、表面領域あたりの捕獲された細胞の数を最大にする条件に最適化する。また、同じ最適化プロセスを健康なドナーから得られたヒト血液中に添加された後に細胞を使用して実行する。
【００９９】
解離定数（ＫＤ）の定量的測定をＭｙｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．  ８３（３）：１０７８−８３，  ２０１１に記載されたように、ＳＰＲを使用して細胞模倣ミクロスフェアと表面固定化デンドリマー抗体複合体の相互作用について得る。たとえば、ＥｐＣＡＭ断片をミクロビーズ−ストレプトアビジン複合体との結合に続いて、ビオチン化キットを使用してビオチン化する。動力学的パラメーターに基づいて、デンドリマーあたりの最適な数の表面固定化抗体を決定する。最適化された装置を一連のＣＴＣを捕獲することにおけるその効率を確認し、および調査する。
実施例６：高スループットおよび効率的な捕獲のための複数流路の装置の製作
【０１００】
上で記述した最適化されたパターン表面を複数流路装置に変換した。２−３個の流路をもつ一連の専用設計されたフローチャンバーをより長い流路長で製造し、それは、ＣＴＣおよびＣＳＣの捕獲効率、スループットおよび区別検出を上昇させる。複数流路フローチャンバー（いくつかの流路デザインおよび顕微鏡での設定を図１１に示す）は、現在研究室において使用されているシステムから主要な構成変更なしで、市販の単一流路フローチャンバー（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ）より多くの表面パターニングにおける柔軟性および増強された感度を提供する。
【０１０１】
原型デザインを健康なドナーからのヒト血液に添加された種々の腫瘍細胞を使用してこれらの捕獲効率において比較する。比較実験を濃度（１ｍＬのヒト血液に添加された２０−２，０００個の腫瘍細胞）および同じ捕獲時間（１０分）で実行する。
【図１】
0006736480.tif 000003
【図２】
0006736480.tif 000004
【図３】
0006736480.tif 000005
【図４】
0006736480.tif 000006
【図５】
0006736480.tif 000007
【図６ＡＢ】
0006736480.tif 000008
【図６ＣＤ】
0006736480.tif 000009
【図７】
0006736480.tif 000010
【図８】
0006736480.tif 000011
【図９】
0006736480.tif 000012
【図１０】
0006736480.tif 000013
【図１１】
0006736480.tif 000014