(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
搾汁されたアボカド油のイソプロパノール画分を有効成分として含む、難聴の予防または処置のための医薬組成物であって、
アボカド油のイソプロパノール画分が、皮および果肉を含むアボカドを搾汁して得られたアボカド油を吸着クロマトグラフィーに吸着させて、水、エタノールおよびイソプロパノールを順次に溶出溶媒として使用して得られるものである、前記難聴の予防または処置のための医薬組成物。
【請求項２】
吸着クロマトグラフィーが、シリカゲルまたは合成吸着剤をレジンに充填したカラムを使用して行われる、
請求項１に記載の難聴の予防または処置のための医薬組成物。
【請求項３】
難聴が、伝音難聴または感覚神経性難聴である、
請求項１に記載の難聴の予防または処置のための医薬組成物。
【請求項４】
搾汁されたアボカド油のイソプロパノール画分を有効成分として含む、難聴の改善のための健康機能食品であって、
アボカド油のイソプロパノール画分が、皮および果肉を含むアボカドを搾汁して得られたアボカド油を吸着クロマトグラフィーに吸着させて、水、エタノールおよびイソプロパノールを順次に溶出溶媒として使用して得られるものである、前記難聴の改善のための健康機能食品。
【請求項５】
吸着クロマトグラフィーが、シリカゲルまたは合成吸着剤をレジンに充填したカラムを使用して行われる、
請求項４に記載の難聴の改善のための健康機能食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
１．本発明の分野
本発明は、難聴の予防または処置のための活性成分としてアボカド油画分を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の記載
耳は、３つの部分、外耳（耳介および外耳道）、中耳（鼓膜および耳小骨）および内耳（蝸牛および聴神経）に分かれている。
【０００３】
音は、耳介および外耳道を通じて伝達されて鼓膜を振動させる音響エネルギーであり、および、鼓膜の振動は力学的エネルギーを生成し、およびこれが耳小骨へ伝達される。耳小骨の最後の骨であるアブミ骨は、蝸牛へ接続されており、これは蝸牛中のリンパへ送達されたエネルギーを転移させる。リンパへ送達されたエネルギーは、リンパ中で波を起こし、これは、蝸牛中の有毛細胞を刺激する。有毛細胞の運動がイオン変化を起こすにつれて、有毛細胞に付いている聴神経へ神経伝達物質が伝達され、および、音エネルギーが聴神経から脳へ電気エネルギーの形で送達される。
【０００４】
外耳および中耳は、音を伝達する器官である。これらの器官が炎症などの病気に感染すると、それらの多くは処置または手術によって回復することができ、および、結果として生じる難聴もまた、処置によって改善することができる。この難聴は、伝音難聴と呼ばれる。他方、音を感知する器官である蝸牛、電気エネルギーを通じて音を送達する聴神経、ならびに音の区別および理解などの包括的な役割を担う脳、における問題によって起こる難聴は、感音難聴と呼ばれる。
【０００５】
体の感覚器官の中で、聴覚器官はコミュニケーションのための最も基本的な感覚器官であり、およびそれは、言語または知識の習得、社会生活、および人の人生のための、最も重要な感覚器官の一つである。多くの難聴は、今に至るまで予防以外の処置を有しない、感覚神経性の難聴である。ひとたび難聴が起こると、処置は、補聴器などの補助を使用することによって、または機械デバイスを体内に移植することによって行うことができる。感音難聴は、発症の原因および時間によって分類することができる。時間に依存して、それは先天性難聴と後天性難聴とに分類される。先天性難聴は、出生前の傷害によって起こる難聴であり、これは遺伝、子宮または出生過程における問題によって起こる。
【０００６】
先天性難聴は、大抵、極めて重度であり、言語習得は追加の訓練または教育なしには不可能である。先天性難聴を処置するためには、高出力の補聴器または人工内耳が、音を聞くために移植される。しかしながら、かかる補助デバイスは、難聴の程度が増加するほど効果が少なく、およびかかるデバイスの聞き取り能力は正常な聞き取り能力とは異なり、これは日常生活を依然として不便にする。他方、後天性難聴は、疾患、騒音、薬物または出生後の事故によって起こり、および原因要素は、騒音、薬物、加齢、外傷、およびウイルスを包含する。最近は、騒音および加齢に起因する難聴が、急速に増加してきている。
【０００７】
科学および技術の発達により人間の寿命が長くなるにつれて、高齢者人口は世界中にわたって急速に増加している。多くの加齢に伴う難聴もまた感音難聴であり、予防および管理以外には処置または改善のための薬物または処置法はない。
【０００８】
加えて、社会の産業化に起因して、騒音誘発性難聴もまた急速に増加している。騒がしい環境で働いている労働者または兵士に発症する職業性の騒音誘発性難聴に加えて、文化的なおよび余暇の生活に起因する騒音誘発性難聴もまた増加している。この点に関して、合衆国におけるＯＳＨＡ（労働安全衛生局（Occupational Safety and Health Administration））は、８５ｄＢＡを上回る騒がしい環境のための騒音管理を実施している。研究では、ヒトの聴覚器官は７５ｄＢＡを上回る騒音によって影響されることが報告されている。７５ｄＢＡの騒音は道路沿いの騒音であることから、現代社会においては、聴覚器官に有害である騒音の中で誰もが生活していると言える。加えて、ＭＰ３の使用などの余暇生活ではしばしば大きな音にさらされ、騒音誘発性難聴は様々な年齢群で起こる。
【０００９】
より若い年で起こった騒音誘発性難聴は、彼らの４０代のうちから補聴器を使用しなければならない程度まで聴力を損傷し、および、物理的老化が組み合わせられたときに難聴のレベルは増加する。難聴の程度が増加するにつれて補聴器の効果もまた減少することから、高レベルの難聴は最終的にコミュニケーションにおける重大な問題に至る。
【００１０】
この点に関して、韓国特許出願第10-2008-0044810号は、オウゴン（Scutellaria radix）抽出物が、騒音誘発性難聴動物モデルにおける難聴を予防することに対して有意な効果を有するということを、開示している。加えて、難聴を予防または処置するための有効な物質として、抗酸化物質、ＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸）アンタゴニスト、アポトーシスインヒビター、成長因子等が研究されてきている。しかしながら、これらの物質は、臨床試験において限られた進歩しか示していない。
【００１１】
よって、難聴を処置することに使用することができる物質を開発しながら、本発明者らは、アボカド油を使用した吸着クロマトグラフィーによって溶出させたイソプロパノール画分が、ゼブラフィッシュモデルにおいてネオマイシンによって低減させられた有毛細胞の数を有意に増加させたことを確認することによって、本発明を完成させた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、アボカド油画分を含む難聴の処置のための組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の目的を達成するために、本発明は、難聴の予防または処置のための活性成分としてアボカド油のイソプロパノール画分を含有する医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、難聴の改善のための活性成分としてアボカド油のイソプロパノール画分を含有する健康機能食品もまた提供する。
【００１５】
本発明は、対象へアボカド油のイソプロパノール画分を投与するステップを含む、難聴を予防、改善または処置するための方法もまた提供する。
【００１６】
加えて、本発明は、難聴の予防、改善または処置のための医薬の調製のためのアボカド油の使用を提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によるアボカド油画分、とりわけ、アボカド油のイソプロパノール画分は、ゼブラフィッシュモデルにおいてネオマイシンによって低減させられた有毛細胞の数を有意に増加させるので、アボカド油のイソプロパノール画分を、難聴の処置において好都合に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、アボカド油を使用して吸着クロマトグラフィーを行うことによって水、エタノールまたはイソプロパノールの画分を調製するプロセスを例証する模式図である。
【図２】図２は、アボカド油のイソプロパノール画分（HP-20）が、ネオマイシンによって低減させられたゼブラフィッシュの有毛細胞の数を増加させたということを例証するグラフである。
【図３】図３は、アボカド油のイソプロパノール画分（HP-20）が、ネオマイシンによって低減させられたゼブラフィッシュの有毛細胞の数を増加させたということを例証する顕微鏡写真一式である。
【００１９】
【図４】図４は、アボカド油の水、エタノールおよびイソプロパノールの画分（HP-20）でそれぞれ処置したときに、アボカド油のイソプロパノール画分が、ネオマイシンによって低減させられたゼブラフィッシュの有毛細胞の数を増加させたということを例証するグラフである。
【図５】図５は、アボカド油の水、エタノールおよびイソプロパノールの画分（HP-20）でそれぞれ処置したときに、アボカド油のイソプロパノール画分が、ネオマイシンによって低減させられたゼブラフィッシュの有毛細胞の数を増加させたということを例証する顕微鏡写真一式である。
【図６Ａ】図６Ａは、アボカド油（ＡＧＯ）の構成成分を分析した結果である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、アボカド油のイソプロパノール画分（ＡＧＬ）の構成成分を分析した結果である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、アボカド油のイソプロパノール画分中およびアボカド油中の主要な構成成分の含有量を比較した結果である。
【００２０】
【図７】図７は、アボカド油のイソプロパノール画分中のリノール酸、アルファ−リノール酸およびステアリン酸が、ネオマイシンによって低減させられたゼブラフィッシュの有毛細胞の数を増加させたということを例証するグラフである。
【図８】図８は、アボカド油のイソプロパノール画分中のリノール酸、アルファ−リノール酸およびステアリン酸が、ネオマイシンによって低減させられたゼブラフィッシュの有毛細胞の数を増加させたということを例証する顕微鏡写真一式である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
好ましい態様の記載
以下、本発明を詳細に記載する。
【００２２】
本発明は、難聴の予防または処置のための活性成分としてアボカド油のイソプロパノール画分を含有する医薬組成物を提供する。
【００２３】
この明細書の中で使用する用語「アボカド油」は、圧縮、浸出、蒸留等によってアボカドから抽出された芳香成分を指す。前述のアボカド油は、アボカドエッセンス、香油、精油および精製油として使用することができる。
【００２４】
アボカド油は、アボカドの皮、果肉および種子からなる群から選択されるいずれか１以上から抽出された油であってもよく、およびアボカドの皮および果肉を圧搾することにより抽出された油であってもよい。それは、圧縮、溶媒抽出、超臨界二酸化炭素抽出または水蒸気蒸留によって抽出することができる。
【００２５】
この明細書の中で使用する用語「画分」は、特定の樹脂で満たされたクロマトグラフィー上に試料を吸着させ、および次いで溶出溶媒を加えることによって得られた液体を指す。それはつまり、本発明によるアボカド油のイソプロパノール画分は、吸着クロマトグラフィーのための樹脂で満たされたクロマトグラフィー上にアボカド油を吸着させ、および次いで溶出溶媒として水、エタノールおよびイソプロパノールを連続して加えることによって得ることができるということである。溶出溶媒は、４５〜８５℃、具体的には、５０〜８０℃、およびより具体的には、５５〜７５℃で使用することができる。
【００２６】
吸着クロマトグラフィーのための樹脂は、シリカゲルまたは合成吸着材であってもよい。合成吸着材は、コポリマーから構成されていてもよく、および、コポリマーは、スチレンとジビニルベンゼン（ＤＶＢ）とのコポリマーであってもよい。
【００２７】
難聴は、伝音難聴または感音難聴であってもよい。感音難聴は、騒音、薬物、加齢、外傷、およびウイルスによって起こる難聴であってもよく、および具体的には、耳毒性難聴であってもよい。耳毒性難聴は、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、ジベカシン、シソマイシン、リボドマイシン、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンからなる群から選択されるいずれか１以上の耳毒性の薬剤の投与によって起こる難聴であってもよい。
【００２８】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、アボカド油を使用して吸着クロマトグラフィーを行った。具体的には、吸着クロマトグラフィー上にアボカド油を吸着させ、および次いで溶出溶媒として水、エタノールおよびイソプロパノールを連続して加えることによって、アボカド油の水、エタノールおよびイソプロパノール画分を調製した（図１を参照）。
【００２９】
上記で調製されたアボカド油のイソプロパノール画分は、アボカド油よりも、ゼブラフィッシュ動物モデルにおいてネオマイシンによって低減させられた有毛細胞の数を有意に増加させた（図２および３を参照）。
【００３０】
上記で調製されたアボカド油のイソプロパノール画分は、水およびエタノール画分よりも、ゼブラフィッシュ動物モデルにおいてネオマイシンによって低減させられた有毛細胞の数を有意に増加させた（図４および５を参照）。
【００３１】
アボカド油のイソプロパノール画分は、アボカド油とは異なる組成を示し、および具体的には、リノール酸、アルファ−リノール酸およびステアリン酸の含有量が高かった（図６Ａ〜６Ｃを参照）。
【００３２】
加えて、アボカド油のイソプロパノール画分中のリノール酸、アルファ−リノール酸およびステアリン酸は、それぞれ、ゼブラフィッシュ動物モデルにおいてネオマイシンによって低減させられた有毛細胞の数を有意に増加させた（図７および８を参照）。
【００３３】
したがって、本発明のアボカド油のイソプロパノール画分は、難聴の処置のために効果的に使用することができる。
【００３４】
本発明による医薬組成物は、活性成分としてアボカド油のイソプロパノール画分を組成物の総重量の１０〜９５重量％で包含することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、活性成分に加えて、活性成分と同じかまたは同様の機能を有する１以上の有効成分を包含することができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、あらゆる一般的に使用される担体、希釈剤、賦形剤、またはそれらの混合物を包含することができる。薬学的に許容し得る担体は、制限なしに、生体中で本発明の組成物を送達することを可能とするあらゆる担体であってもよく、これは、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールまたはそれらの混合物などの、Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.において記載された化合物によって例示される。必要であれば、抗酸化剤、緩衝剤および静菌剤などの一般的な添加物を追加で加えることができる。
【００３６】
組成物が製剤化されるとき、一般的に使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤などを加えることができる。
【００３７】
本発明の組成物は、経口または非経口調製物として製剤化することができる。経口調製物は、固形および液体製剤を包含することができる。固形製剤は、錠剤、丸薬、粉末、顆粒、カプセルまたはトローチであってもよく、および、かかる固形製剤は、組成物へ１以上の賦形剤を加えることによって調製することができる。賦形剤は、デンプン、炭酸カルシウム、ショ糖、乳糖、ゼラチンまたはそれらの混合物であってもよい。単純な賦形剤のほか、滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、等々を使用してもよい。液体製剤は、懸濁物、溶液、エマルションまたはシロップであってもよく、および、上述した製剤は、湿潤剤、甘味料、芳香物質（aromatics）および保存料などの様々な賦形剤を含有することができる。
【００３８】
非経口投与のための製剤は、注射剤、坐剤、呼吸吸入粉末、スプレーエアロゾル、粉末およびクリーム等を包含することができる。注射剤は、滅菌水溶液、非水溶媒、懸濁物、エマルション等を包含することができる。非水溶媒および懸濁物は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステル等々を含有することができる。
【００３９】
本発明の組成物は、所望の方法に従って、経口的にまたは非経口的に投与することができる。非経口投与は、腹腔内注射、直腸注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射または胸腔内注射を包含することができる。
【００４０】
組成物は、薬学的に有効な量で投与されることができる。有効量は、疾患のタイプ、重症度、薬物の活性、患者の薬物に対する感受性、投与の時間、投与の経路、処置の期間、同時に使用される薬物等に従って決定することができる。しかしながら、所望の効果のために、本発明による医薬組成物に包含される活性成分の量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、具体的に言うと、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇとすることができる。投与の頻度は、１日１回または１日数回である。
【００４１】
本発明の組成物は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与されることができる。組合せ投与において、投与は、連続的または同時であることができる。
【００４２】
本発明は、難聴の改善のための活性成分としてアボカド油のイソプロパノール画分を含有する健康機能食品もまた提供する。
【００４３】
本発明によるアボカド油のイソプロパノール画分は、上に記載のとおりの特徴を有することができる。例えば、アボカド油は、アボカドの皮、果肉および種子からなる群から選択されるいずれか１以上から抽出された油であってもよい。画分は、吸着クロマトグラフィーのための樹脂で満たされたクロマトグラフィー上にアボカド油を吸着させ、および次いで溶出溶媒として水、エタノールおよびイソプロパノールを連続して加えることによって得ることができる。
【００４４】
難聴は、上に記載のとおりである。例えば、難聴は、伝音難聴または感音難聴であってもよく、および具体的には、感音難聴であってもよい。感音難聴は、耳毒性難聴であってもよい。
【００４５】
本発明の好ましい態様において、本発明者らは、アボカド油を使用して吸着クロマトグラフィーを行った。具体的には、吸着クロマトグラフィー上にアボカド油を吸着させ、および次いで溶出溶媒として水、エタノールおよびイソプロパノールを連続して加えることによって、アボカド油の水、エタノールおよびイソプロパノール画分を調製した（図１を参照）。
【００４６】
上記で調製されたアボカド油のイソプロパノール画分は、アボカド油よりも、ゼブラフィッシュ動物モデルにおいてネオマイシンによって低減させられた有毛細胞の数を有意に増加させた（図２および３を参照）。
【００４７】
上記で調製されたアボカド油のイソプロパノール画分は、水およびエタノール画分よりも、ゼブラフィッシュ動物モデルにおいてネオマイシンによって低減させられた有毛細胞の数を有意に増加させた（図４および５を参照）。
【００４８】
上記で調製されたアボカド油のイソプロパノール画分は、アボカド油とは異なる組成を示し、および具体的には、リノール酸、アルファ−リノール酸およびステアリン酸の含有量が高かった（図６Ａ〜６Ｃを参照）。
【００４９】
加えて、アボカド油のイソプロパノール画分中のリノール酸、アルファ−リノール酸およびステアリン酸は、それぞれ、ゼブラフィッシュ動物モデルにおいてネオマイシンによって低減させられた有毛細胞の数を有意に増加させた（図７および８を参照）。したがって、アボカド油のイソプロパノール画分は、難聴の改善のために効果的に使用することができる。
【００５０】
本発明の組成物は、そのまま、または他の食品もしくは成分と混合した後で、食品に加えてもよい。このとき、加える活性成分の含有量は目的に従って決定することができ、および一般的には、食品の総重量の０．０１〜９０重量部であってもよい。
【００５１】
健康機能食品の形態およびタイプは、特に限られるものではない。具体的に言うと、健康機能食品は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液体および丸剤の形態であってもよい。健康機能食品は、追加の成分として、様々なフレーバー、甘味料または天然の炭水化物を包含してもよい。甘味料は、天然または合成甘味料であってもよく、および、天然甘味料は、タウマチン、ステビア抽出物等々によって例示される。合成甘味料は、サッカリンおよびアスパルテーム等々によって例示される。加えて、天然の炭水化物は、単糖類、二糖類、多糖類、オリゴ糖および糖アルコール等々であってもよい。
【００５２】
上記で挙げた成分に加えて、本発明の健康機能食品は、様々な栄養素、ビタミン、ミネラル、フレーバー、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護コロイド状増粘剤、ｐＨ調節剤、安定剤、防腐剤、グリセリン、アルコール等々を包含することができる。全ての言及した成分は、単独でまたは一緒に加えることができる。それらの成分の混合比は実のところ問題ではないが、しかし一般的には、その各々は、本発明の組成物の１００重量部あたり０．０１〜０．１重量部で加えることができる。
【００５３】
本発明は、対象へアボカド油のイソプロパノール画分を投与するステップを含む、難聴を予防、改善または処置するための方法もまた提供する。
【００５４】
本発明によるアボカド油のイソプロパノール画分は、上に記載のとおりの特徴を有することができる。例えば、アボカド油は、アボカドの皮、果肉および種子からなる群から選択されるいずれか１以上から抽出された油であってもよい。画分は、吸着クロマトグラフィーのための樹脂で満たされたクロマトグラフィー上にアボカド油を吸着させ、および次いで溶出溶媒として水、エタノールおよびイソプロパノールを連続して加えることによって得ることができる。
【００５５】
前述の対象は哺乳動物であってもよく、具体的に言うと、ヒトであってもよい。
【００５６】
本発明のアボカド油のイソプロパノール画分は、所望の方法に従って、経口的にまたは非経口的に投与することができる。非経口投与は、腹腔内注射、直腸注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射または胸腔内注射を包含することができる。
【００５７】
アボカド油のイソプロパノール画分は、薬学的に有効な量で投与されることができる。有効量は、疾患のタイプ、重症度、薬物の活性、患者の薬物に対する感受性、投与の時間、投与の経路、処置の期間、同時に使用される薬物等に従って決定することができる。しかしながら、所望の効果のために、本発明によるアボカド油のイソプロパノール画分に包含される活性成分の量は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、具体的に言うと、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇとすることができる。投与の頻度は、１日１回または１日数回である。
【００５８】
本発明のアボカド油のイソプロパノール画分は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与されることができる。組合せ投与において、投与は、連続的または同時であることができる。
【００５９】
加えて、本発明は、難聴の予防、改善または処置のための医薬の調製のためのアボカド油のイソプロパノール画分の使用を提供する。
【００６０】
本発明によるアボカド油のイソプロパノール画分は、上に記載のとおりの特徴を有することができる。
【００６１】
発明を実施するための形態
本発明の実際的かつ現在好ましい態様は、以下の例に示すとおり例証的である。
しかしながら、当該技術分野における当業者が本開示を検討して本発明の精神と範囲の内で改変および改良を行い得ることは、当然理解される。
【００６２】
例１．アボカド油画分の調製
アボカド油を使用して吸着クロマトグラフィーを行うことによって、アボカド油の水、エタノールまたはイソプロパノール画分を調製した。
【００６３】
具体的には、１００ｇのダイヤイオンHP-20樹脂を１５０ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）エタノールに加えて、これをカラム中に満たした。その一方で、Avoplus（Diricom）、メキシコから購入した１０ｇのアボカド油を、５０％（ｖ／ｖ）エタノール中５０％（ｗ／ｖ）まで希釈し、調製したカラムにこれをロードした。メキシコから購入したアボカド油は、アボカドの皮および果肉を油搾り（oil-pressing）することによって調製された。アボカド油をロードしたカラムへ１００ｍｌの水を加えることによって、水画分が得られた。次いで、これに８００ｍｌの９９％（ｖ／ｖ）エタノールを加えることによってエタノール画分が得られ、および８００ｍｌのイソプロパノールを加えることによってイソプロパノール画分（HP-20）が得られた。水、エタノールまたはイソプロパノール画分を得たとき、各溶出溶媒を６０〜７０℃の温度まで加熱することによって使用した。
【００６４】
この時、アボカド油の水画分の収率は０．０７％、エタノール画分の収率は５．４％、およびイソプロパノール画分の収率は７５．５％であった。
【００６５】
実験例１．耳毒性に対するアボカド油画分の影響の確認−（１）
例１において調製されたアボカド油のイソプロパノール画分の、ネオマイシンによって低減させられた有毛細胞に対する効果を、以下の方法によって確認した。
【００６６】
具体的には、受精の６日後に、ゼブラフィッシュ幼生を２４ウェルプレート中に置き、およびネオマイシンをこれに１μＭの濃度で加えた。１時間後、ネオマイシンを除去し、および、例１において調製されたアボカド油のイソプロパノール画分を１μｇ／ｍｌの濃度で加えた。このとき、アボカド油を対照として使用し、および、０．０３％（ｗ／ｖ）の海水溶液を未処置対照として使用した。１２時間後、０．１％ＹＯ−ＰＲＯ（Life Technologies、米国）を加えることで、３０分間、幼生の有毛細胞を染色した。染色された有毛細胞を、蛍光顕微鏡（Olympus 1x70、Olympus、日本）を使用して観察し、および、その数を図２に示した。加えて、有毛細胞の顕微鏡写真を図３に示した。
【００６７】
図２および図３に示すとおり、アボカド油のイソプロパノール画分を加えた幼生においては、アボカド油に比べて、有毛細胞の数が有意に増加した（図２および３）。
【００６８】
実験例２．耳毒性に対するアボカド油画分の影響の確認−（２）
例１において調製されたアボカド油の水、エタノールおよびイソプロパノール画分の、ネオマイシンによって低減させられた有毛細胞に対する効果を、以下の方法によって確認した。
【００６９】
アボカド油のイソプロパノール画分を加える代わりに、アボカド油の水、エタノールおよびイソプロパノール画分をゼブラフィッシュ幼生にそれぞれ加え、および実験例１に記載されたのと同じやり方で染色した有毛細胞の数を計数して図４に示した。加えて、蛍光顕微鏡で撮った有毛細胞の顕微鏡写真を、図５に示した。
【００７０】
図４および図５に示すとおり、アボカド油のイソプロパノール画分を加えた幼生においては、アボカド油の水およびエタノール画分に比べて、有毛細胞の数が有意に増加した（図４および５）。
【００７１】
実験例３．アボカド油画分の構成成分の比較
アボカド油および例１において調製されたアボカド油のイソプロパノール画分の構成成分を、ＧＣ−ＭＳによって分析した。
【００７２】
その結果として、特定の構成成分は、アボカド油よりもアボカド油のイソプロパノール画分中で、有意により高いことが確認された（図６Ａ〜６Ｃ）。アボカド油におけるよりもアボカド油のイソプロパノール画分において有意により高い含有量である、５つの構成成分が導き出された。および、上位３つの構成成分を、耳毒性に対する有効性のために試験した。
【００７３】
実験例４．耳毒性に対するアボカドイソプロパノール画分中の単一物質の効果の確認
実験例３においてアボカド油のイソプロパノール画分中で高いと同定された構成成分であるリノール酸、アルファ−リノレン酸およびステアリン酸の、ネオマイシンによって低減させられた有毛細胞に対する影響を、以下の方法によって確認した。
【００７４】
アボカド油のイソプロパノール画分を加える代わりに、１μｇ／ｍｌのリノール酸、アルファ−リノレン酸およびステアリン酸をゼブラフィッシュ幼生にそれぞれ加え、および実験例１に記載されたのと同じやり方で染色した有毛細胞の数を計数して図７に示した。加えて、蛍光顕微鏡で撮った有毛細胞の顕微鏡写真を、図８に示した。
【００７５】
図７および図８に示すとおり、リノール酸、アルファ−リノレン酸およびステアリン酸を加えた幼生において、有毛細胞の数は有意に増加した（図７および８）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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