(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
土壌、菌糸、子実体、及び植物のうちの少なくとも１つを含む試料から核酸を抽出することなくリジドポラス マイクロポラスを検出する、リジドポラス マイクロポラスの検出方法であって、
（ＦＩＰ−１）配列番号１で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−１）配列番号３で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−１）配列番号５で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−１）配列番号７で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと
を用いることを特徴とする、リジドポラス マイクロポラスの検出方法。
【請求項２】
土壌、菌糸、子実体、及び植物のうちの少なくとも１つを含む試料から核酸を抽出することなくリジドポラス マイクロポラスを検出する、リジドポラス マイクロポラスの検出方法であって、
（ＦＩＰ−５）配列番号９で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−５）配列番号１１で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−５）配列番号１３で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−５）配列番号１５で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと
を用いることを特徴とする、リジドポラス マイクロポラスの検出方法。
【請求項３】
（ＬＦ−５）配列番号１７で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーを更に用いる、請求項２に記載のリジドポラス マイクロポラスの検出方法。
【請求項４】
土壌、菌糸、子実体、及び植物のうちの少なくとも１つを含む試料から核酸を抽出することなくリジドポラス マイクロポラスを検出する、リジドポラス マイクロポラスの検出方法であって、
（ＦＩＰ−９）配列番号１９で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−９）配列番号２１で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−９）配列番号２３で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−９）配列番号２５で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと
を用いることを特徴とする、リジドポラス マイクロポラスの検出方法。
【請求項５】
（ＬＢ−９）配列番号２７で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーを更に用いる、請求項４に記載のリジドポラス マイクロポラスの検出方法。
【請求項６】
土壌、菌糸、子実体、及び植物のうちの少なくとも１つを含む試料から核酸を抽出することなくリジドポラス マイクロポラスを検出する、リジドポラス マイクロポラスの検出方法であって、
（ＦＩＰ−１３）配列番号２９で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−１３）配列番号３１で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−１３）配列番号３３で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−１３）配列番号３５で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと
を用いることを特徴とする、リジドポラス マイクロポラスの検出方法。
【請求項７】
（ＬＢ−１３）配列番号３７で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーを更に用いる、請求項６に記載のリジドポラス マイクロポラスの検出方法。
【請求項８】
（ＦＩＰ−１）配列番号１で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−１）配列番号３で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−１）配列番号５で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−１）配列番号７で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと
を含む、リジドポラス マイクロポラスの検出用キット。
【請求項９】
（ＦＩＰ−５）配列番号９で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−５）配列番号１１で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−５）配列番号１３で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−５）配列番号１５で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと
を含む、リジドポラス マイクロポラスの検出用キット。
【請求項１０】
（ＬＦ−５）配列番号１７で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーを更に含む、請求項９に記載のリジドポラス マイクロポラスの検出用キット。
【請求項１１】
（ＦＩＰ−９）配列番号１９で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−９）配列番号２１で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−９）配列番号２３で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−９）配列番号２５で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと
を含む、リジドポラス マイクロポラスの検出用キット。
【請求項１２】
（ＬＢ−９）配列番号２７で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーを更に含む、請求項１１に記載のリジドポラス マイクロポラスの検出用キット。
【請求項１３】
（ＦＩＰ−１３）配列番号２９で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−１３）配列番号３１で表わされる塩基配列を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−１３）配列番号３３で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−１３）配列番号３５で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーと
を含む、リジドポラス マイクロポラスの検出用キット。
【請求項１４】
（ＬＢ−１３）配列番号３７で表わされる塩基配列を含むリバースプライマーを更に含む、請求項１３に記載のリジドポラス マイクロポラスの検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リジドポラス マイクロポラスの検出方法、及びリジドポラス マイクロポラスの検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
パラゴムノキ等に罹患する根白腐病は、原因菌であるリジドポラス マイクロポラス（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ）が植物の根に感染することにより引き起こされる土壌病害の一種である（例えば、非特許文献２参照。）。病症が進行すると、感染した植物は枯れてしまう。特に、ゴムノキ等のプランテーションにおいては、最も深刻な土壌病害の１つであり、根白腐病の早期発見と根白腐病の原因菌リジドポラス マイクロポラスの防除が重要な課題となっている。
【０００３】
土壌病害の病徴が現れる前の早期に原因菌を発見する目的で、分子生物学的手法を利用して、感染が疑われる土壌や植物中に原因菌が存在しているか否かを検出する方法が考えられている。例えば、ＰＣＲ法を用いた検出方法では、土壌や植物などを含む試料から核酸（例えば、ＤＮＡ又はｍＲＮＡなど）を抽出し、抽出した核酸を鋳型として、原因菌に特異的な塩基配列を有する核酸を、精密な温度制御と迅速な温度変化を要するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供して、必要に応じて転写、逆転写、増幅などを行った産物を検出することによって、試料における原因菌の有無を検出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３３１３３５８号公報
【特許文献２】特許第４４３７８５６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，（２０００）  ２８（１２）：ｅ６３
【非特許文献２】Ｓ．Ｋａｅｗｃｈａｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｆｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２００９）ｖｏｌ．３，ｐｐ．６４１−６４８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記ＰＣＲ法を用いた検出方法では、試料からの原因菌の核酸の抽出、ＰＣＲによる該核酸の転写、逆転写、増幅、増幅産物の検出などといった、専用機器及び熟練技能が要求される多段階の工程を伴う。そのため、ゴム農園のような圃場現場での実用化には多くの課題が残存している。
【０００７】
そこで、本発明は、根白腐病の原因菌リジドポラス マイクロポラスを簡易、迅速且つ高精度に検出することができ、ゴム農園のような圃場現場で好適に使用することができる、リジドポラス マイクロポラスの検出方法及びリジドポラス マイクロポラスの検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、試料から核酸を抽出することなくリジドポラス マイクロポラスを検出する、リジドポラス マイクロポラスの検出方法であって、該試料が、土壌、菌糸、子実体、及び植物のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする。土壌、菌糸、子実体、及び植物のうちの少なくとも１つを含む試料から核酸を抽出することなくリジドポラス マイクロポラスを検出することにより、処理操作の簡略化を図ることができる。
【０００９】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法では、
（ＦＩＰ−１）配列番号１で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−２）配列番号１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−３）配列番号１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−４）配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−１）配列番号３で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−１）配列番号５で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−２）配列番号５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−３）配列番号５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−４）配列番号６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−１）配列番号７で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−２）配列番号７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−３）配列番号７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−４）配列番号８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を用いることが好ましい。
【００１０】
あるいは、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法では、
（ＦＩＰ−５）配列番号９で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−６）配列番号９で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−７）配列番号９で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−８）配列番号１０で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−５）配列番号１１で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−６）配列番号１１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−７）配列番号１１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−８）配列番号１２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−５）配列番号１３で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−６）配列番号１３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−７）配列番号１３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−８）配列番号１４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−５）配列番号１５で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−６）配列番号１５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−７）配列番号１５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−８）配列番号１６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を用いることが好ましい。
【００１１】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法が、前記（ＦＩＰ−５）〜（ＦＩＰ−８）のいずれかを含むフォワードプライマーと、前記（Ｆ３−５）〜（Ｆ３−８）のいずれかを含むフォワードプライマーと、前記（ＢＩＰ−５）〜（ＢＩＰ−８）のいずれかを含むリバースプライマーと、前記（Ｂ３−５）〜（Ｂ３−８）のいずれかを含むリバースプライマーとを用いる場合、
（ＬＦ−５）配列番号１７で表わされる塩基配列、
（ＬＦ−６）配列番号１７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＬＦ−７）配列番号１７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＬＦ−８）配列番号１８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーを更に用いることがより好ましい。
【００１２】
あるいは、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法では、
（ＦＩＰ−９）配列番号１９で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−１０）配列番号１９で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−１１）配列番号１９で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−１２）配列番号２０で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−９）配列番号２１で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−１０）配列番号２１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−１１）配列番号２１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−１２）配列番号２２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−９）配列番号２３で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−１０）配列番号２３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−１１）配列番号２３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−１２）配列番号２４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−９）配列番号２５で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−１０）配列番号２５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−１１）配列番号２５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−１２）配列番号２６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を用いることが好ましい。
【００１３】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法が、前記（ＦＩＰ−９）〜（ＦＩＰ−１２）のいずれかを含むフォワードプライマーと、前記（Ｆ３−９）〜（Ｆ３−１２）のいずれかを含むフォワードプライマーと、前記（ＢＩＰ−９）〜（ＢＩＰ−１２）のいずれかを含むリバースプライマーと、前記（Ｂ３−９）〜（Ｂ３−１２）のいずれかを含むリバースプライマーとを用いる場合、
（ＬＢ−９）配列番号２７で表わされる塩基配列、
（ＬＢ−１０）配列番号２７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＬＢ−１１）配列番号２７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＬＢ−１２）配列番号２８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーを更に用いることがより好ましい。
【００１４】
あるいは、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法では、
（ＦＩＰ−１３）配列番号２９で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−１４）配列番号２９で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−１５）配列番号２９で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−１６）配列番号３０で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−１３）配列番号３１で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−１４）配列番号３１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−１５）配列番号３１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−１６）配列番号３２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−１３）配列番号３３で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−１４）配列番号３３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−１５）配列番号３３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−１６）配列番号３４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−１３）配列番号３５で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−１４）配列番号３５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−１５）配列番号３５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−１６）配列番号３６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を用いることが好ましい。
【００１５】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法が、前記（ＦＩＰ−１３）〜（ＦＩＰ−１６）のいずれかを含むフォワードプライマーと、前記（Ｆ３−１３）〜（Ｆ３−１６）のいずれかを含むフォワードプライマーと、前記（ＢＩＰ−１３）〜（ＢＩＰ−１６）のいずれかを含むリバースプライマーと、前記（Ｂ３−１３）〜（Ｂ３−１６）のいずれかを含むリバースプライマーとを用いる場合、
（ＬＢ−１３）配列番号３７で表わされる塩基配列、
（ＬＢ−１４）配列番号３７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＬＢ−１５）配列番号３７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＬＢ−１６）配列番号３８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーを更に用いることがより好ましい。
【００１６】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法において、上述する構成のプライマーの組み合わせ（以下、「プライマーセット」とも称する）を用いることにより、リジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡを効率的に増幅することができる。
【００１７】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、
（ＦＩＰ−１）配列番号１で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−２）配列番号１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−３）配列番号１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−４）配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−１）配列番号３で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−１）配列番号５で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−２）配列番号５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−３）配列番号５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−４）配列番号６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−１）配列番号７で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−２）配列番号７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−３）配列番号７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−４）配列番号８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を含むことを特徴とする。
【００１８】
あるいは、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、
（ＦＩＰ−５）配列番号９で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−６）配列番号９で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−７）配列番号９で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−８）配列番号１０で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−５）配列番号１１で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−６）配列番号１１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−７）配列番号１１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−８）配列番号１２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−５）配列番号１３で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−６）配列番号１３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−７）配列番号１３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−８）配列番号１４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−５）配列番号１５で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−６）配列番号１５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−７）配列番号１５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−８）配列番号１６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットが、前記（ＦＩＰ−５）〜（ＦＩＰ−８）のいずれかのフォワードプライマーと、前記（Ｆ３−５）〜（Ｆ３−８）のいずれかのフォワードプライマーと、前記（ＢＩＰ−５）〜（ＢＩＰ−８）のいずれかのリバースプライマーと、前記（Ｂ３−５）〜（Ｂ３−８）のいずれかのリバースプライマーとを含む場合、
（ＬＦ−５）配列番号１７で表わされる塩基配列、
（ＬＦ−６）配列番号１７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＬＦ−７）配列番号１７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＬＦ−８）配列番号１８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーを更に含むことが好ましい。
【００２０】
あるいは、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、
（ＦＩＰ−９）配列番号１９で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−１０）配列番号１９で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−１１）配列番号１９で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−１２）配列番号２０で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−９）配列番号２１で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−１０）配列番号２１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−１１）配列番号２１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−１２）配列番号２２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−９）配列番号２３で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−１０）配列番号２３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−１１）配列番号２３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−１２）配列番号２４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−９）配列番号２５で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−１０）配列番号２５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−１１）配列番号２５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−１２）配列番号２６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットが、前記（ＦＩＰ−９）〜（ＦＩＰ−１２）のいずれかのフォワードプライマーと、前記（Ｆ３−９）〜（Ｆ３−１２）のいずれかのフォワードプライマーと、前記（ＢＩＰ−９）〜（ＢＩＰ−１２）のいずれかのリバースプライマーと、前記（Ｂ３−９）〜（Ｂ３−１２）のいずれかのリバースプライマーとを含む場合、
（ＬＢ−９）配列番号２７で表わされる塩基配列、
（ＬＢ−１０）配列番号２７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＬＢ−１１）配列番号２７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＬＢ−１２）配列番号２８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーを更に含むことが好ましい。
【００２２】
あるいは、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、
（ＦＩＰ−１３）配列番号２９で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−１４）配列番号２９で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−１５）配列番号２９で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−１６）配列番号３０で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−１３）配列番号３１で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−１４）配列番号３１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−１５）配列番号３１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−１６）配列番号３２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−１３）配列番号３３で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−１４）配列番号３３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−１５）配列番号３３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−１６）配列番号３４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−１３）配列番号３５で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−１４）配列番号３５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−１５）配列番号３５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−１６）配列番号３６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を含むことを特徴とする。
【００２３】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットが、前記（ＦＩＰ−１３）〜（ＦＩＰ−１６）のいずれかのフォワードプライマーと、前記（Ｆ３−１３）〜（Ｆ３−１６）のいずれかのフォワードプライマーと、前記（ＢＩＰ−１３）〜（ＢＩＰ−１６）のいずれかのリバースプライマーと、前記（Ｂ３−１３）〜（Ｂ３−１６）のいずれかのリバースプライマーとを含む場合、
（ＬＢ−１３）配列番号３７で表わされる塩基配列、
（ＬＢ−１４）配列番号３７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＬＢ−１５）配列番号３７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＬＢ−１６）配列番号３８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーを更に含むことが好ましい。
【００２４】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、上述する構成のプライマーセットを含むことにより、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法に好適に使用することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、根白腐病の原因菌リジドポラス マイクロポラスを簡易、迅速且つ高精度に検出することができ、ゴム農園のような圃場現場で好適に使用することができる、リジドポラス マイクロポラスの検出方法及びリジドポラス マイクロポラスの検出用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の一実施形態に係る検出方法に従い、プライマーセットＩＤ１１を用いて、リジドポラス マイクロポラス特異的な塩基配列を有するＤＮＡの増幅を蛍光により検出した結果を示す。
【図２】図１で示す１１本のサンプルチューブについて、ＤＮＡ増幅反応の間の蛍光強度をリアルタイムＰＣＲ装置で測定した結果を示す。
【図３】本発明の一実施形態に係る検出方法に従い、プライマーセットＩＤ２８を用いて、リジドポラス マイクロポラス特異的な塩基配列を有するＤＮＡの増幅を蛍光により検出した結果を示す。
【図４】図３で示す１１本のサンプルチューブについて、ＤＮＡ増幅反応の間の蛍光強度をリアルタイムＰＣＲ装置で測定した結果を示す。
【図５】本発明の一実施形態に係る検出方法に従い、プライマーセットＩＤ４１を用いて、リジドポラス マイクロポラス特異的な塩基配列を有するＤＮＡの増幅を蛍光により検出した結果を示す写真である。
【図６】図５で示す１１本のサンプルチューブについて、ＤＮＡ増幅反応の間の蛍光強度をリアルタイムＰＣＲ装置で測定した結果を示す。
【図７】本発明の一実施形態に係る検出方法に従い、プライマーセットＩＤ２３を用いて、リジドポラス マイクロポラス特異的な塩基配列を有するＤＮＡの増幅を蛍光により検出した結果を示す写真である。
【図８】図７で示す１１本のサンプルチューブについて、ＤＮＡ増幅反応の間の蛍光強度をリアルタイムＰＣＲ装置で測定した結果を示す。
【図９】本発明の一実施形態に係る検出方法に従い、各プライマーセットについてＤＮＡ検出限界を調査した結果を示す。
【図１０】本発明の一実施形態に係る検出方法に従って、プライマーセットＩＤ１１を用いて、リジドポラス マイクロポラスの有無を蛍光により検出した結果を示す写真である。上段は、紫外線照射後、下段は紫外線照射前である。
【図１１】図１０で示す７本のサンプルチューブについて、ＤＮＡ増幅反応の間の蛍光強度をリアルタイムＰＣＲ装置で測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明をその実施形態に基づき詳細に例示説明する。
【００２８】
［リジドポラス マイクロポラスの検出方法］
＜被検試料＞
【００２９】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法は、土壌、菌糸、子実体、及び植物のうちの少なくとも１つを含む試料から核酸を抽出することなくリジドポラス マイクロポラスを検出することができる。検査対象となる試料は、土壌、菌糸、子実体、及び植物のうちの少なくとも１つを含むものであれば特に限定されず、根白腐病の原因菌リジドポラス マイクロポラスは感染する植物の種類が限定されることはないため、キャッサバやマンゴスチン等、根白腐病の発生が確認されているゴムノキ以外の植物や、ゴムノキ以外の植物が植えられている土壌に由来してもよい。根白腐病による土壌病害が大きな問題となっていることから、本発明においては、予防及び早期発見の観点から、ゴムノキ農園の土壌を含む試料、又は土壌表面若しくはゴムノキその他の植物組織表面に発生した菌糸を含む試料が好ましい。
【００３０】
本発明において、「試料から核酸を抽出することなく」とは、試料から微生物、植物細胞、動物細胞などの核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）が含まれる細胞を単離せずに細胞壁及び細胞膜を可溶化及び／又は破壊して、土壌並びに微生物細胞及び動植物細胞に由来する夾雑物から核酸を単離することなく増幅反応に供することを意味する。言い換えると、試料に対して、分子生物学の分野で公知の手法を用いて核酸の抽出操作を行わないことを意味する。核酸の抽出操作には、核酸の単離、精製、定量なども含まれる。核酸の抽出操作を行うことができる公知の手法としては、例えば、ＣＴＡＢ法、フィルターや吸着担体などを使用したカラムによる抽出、遠心分離、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿、アガロースゲル電気泳動などが挙げられる。
【００３１】
土壌病害の検査対象となる土壌、菌糸、子実体、又は植物を含む試料は、通常、核酸以外に土壌並びに微生物及び動植物細胞由来の夾雑物も含むことから、一般的なＰＣＲ法などを用いてリジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡの増幅反応を行う場合、上述するような公知の手法を用いて試料から核酸を抽出することが必要である。本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法は、試料からを抽出することなくリジドポラスイクロポラスを検出することができるため、土壌、菌糸、子実体、及び植物のうちの少なくとも１つを含む試料から核酸を抽出することなくＤＮＡ増幅反応に供することができるため、処理操作の大幅な簡略化を図ることができる。また、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法は、土壌のような多様な夾雑物を多く含む試料から核酸を抽出することなく根白腐病の原因菌を検出することができる点で、従来の土壌病害原因菌の検出方法と比較して産業上非常に有益である。
【００３２】
本発明の検出方法では、被検試料の予備処理は特に必要とせず、試料をごく少量採取して、予めプラスチックチューブなどに調製した増幅反応用バッファーに加えて、増幅反応液を調製することができる。試料の採取及び添加は、滅菌した爪楊枝や白金耳などを用いて行えばよい。増幅反応用バッファーは、後述するＤＮＡ増幅反応用試薬類、ＤＮＡ増幅検出用試薬などを含み得るが、必要に応じて、細胞壁及び細胞膜の可溶化試薬（例えば、界面活性剤）、タンパク質分解酵素などを含んでもよい。試料を加えた増幅反応液は、そのままＤＮＡ増幅反応に用いることができるが、微生物や動植物細胞の細胞壁及び細胞膜を破壊する目的で、必要に応じて超音波処理などを行ってもよい。
【００３３】
＜リジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列＞
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法では、リジドポラス マイクロポラスのゲノムＤＮＡ上のリジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有する領域を鋳型とするＤＮＡの増幅を検出することにより、リジドポラス マイクロポラスを検出することができる。リジドポラス マイクロポラスのゲノムＤＮＡ上で鋳型として増幅される領域としては、特に限定されないが、リジドポラス マイクロポラスのリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒｓ：「内部転写領域」又は「内部転写スペーサー領域」とも称される。以下、「ｒＤＮＡ−ＩＴＳ領域」と称する）の少なくとも一部を含むことが好ましい。ｒＤＮＡ−ＩＴＳ領域には、種保存性が高い塩基配列が存在するため、種の同定や、近縁種又は同胞種の識別、系統解析などで一般に用いることができる程度に高い種特異性を有する。そのため、リジドポラス マイクロポラスのｒＤＮＡ−ＩＴＳ領域の塩基配列の少なくとも一部を含むゲノムＤＮＡ領域を鋳型としてＤＮＡ増幅を行うことにより、リジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡを増幅することができるからである。
【００３４】
リジドポラス マイクロポラスのｒＤＮＡ−ＩＴＳ領域は、５'末端側から順にＩＴＳ−１領域、５．８Ｓ ｒＤＮＡ領域、及びＩＴＳ−２領域で構成され、約６００ｂｐの塩基長を有する。ｒＤＮＡ−ＩＴＳ領域には、上述するように、種保存性が高い塩基配列が存在するが、同時に進化速度が大きく、同種間で挿入、欠失、点変異などの変異が発生し易いという一面も有する。そのため、リジドポラス マイクロポラスのように亜種、変異種、変異株などの発生率が高い微生物では、同種間で多種多様な変異を有する可能性が高い。
【００３５】
そこで、本発明者らは、まず、リジドポラス マイクロポラスの４菌株及び近縁種の土中生息菌のｒＤＮＡ-ＩＴＳ領域の塩基配列で相同性検索を行い、リジドポラス マイクロポラスのｒＤＮＡ-ＩＴＳ領域におけるリジドポラス マイクロポラス特異的な塩基配列を特定した。具体的には、次のリジドポラス マイクロポラスの４菌株を相同性検索に用いた：Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  Ｐ２.１.ＡＢ.１株（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ６９７７２２）、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＦＲＩＭ６４２株（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ４００７０８）、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＦＲＩＭ６４６株（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ４００７０９）、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ５９０株（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ４００７０６）。これらのｒＤＮＡ-ＩＴＳ領域の塩基配列を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及びＤＮＡ Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）に対して、ＢＬＡＳＴで相同性検索を行い、既知の近縁種の土中生息菌のｒＤＮＡ-ＩＴＳ領域の塩基配列と比較した。
【００３６】
相同性検索で比較した既知の近縁種の土中生息菌は、次の通りであった。比較対象の担子菌には、「Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｕｌｍａｒｉｕｓ」(ＮＣＢＩ（米国立生物工学情報センター）のアクセッション番号：ＡＹ５９３８６８)、「Ｏｘｙｐｏｒｕｓ  ｃｏｒｔｉｃｏｌａ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＤＱ８７３６４１）、「Ｏｘｙｐｏｒｕｓ  ｃｕｎｅａｔｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＤＱ３８４５７５）、「Ｏｘｙｐｏｒｕｓ  ｐｏｐｕｌｉｎｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＦ０１１１２１）、「Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ  ｅｄｏｄｅｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＢ２８６０６７）、「Ｃａｌｖａｔｉａ  ｔｕｒｎｅｒｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＤＱ１１２５９６）、「Ｈａｎｄｋｅａ  ｆｕｍｏｓａ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＵ８３３６５５）、「Ｌｙｃｏｐｅｒｄｏｎ  ｒｉｍｕｌａｔｕｍ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＵ８３３６６４）、「Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｓｕｂｉｎｃａｒｎａｔａ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＪ２３７６２６）、「Ｃｏｌｌｙｂｉａ  ｒａｃｅｍｏｓａ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＦ２７４３７５）、「Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＥＵ５２０１９２）、「Ｇａｎｏｄｅｒｍａ  ａｐｐｌａｎａｔｕｍ」(ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＦＲ６８６５５６)、「Ｐｅｎｉｏｐｈｏｒａ  ｓｐ．」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＭ２０８１５４）、「Ｃｏｎｏｃｙｂｅ  ｂｕｌｂｉｆｅｒa」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＦ９０７８２４）、「Ｃｏｎｏｃｙｂｅ  ｓｕｂｐｕｂｅｓｃｅｎｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＦ９０７８３３）、「Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ１８８４３５）、「Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｌａｓｃｉｖｕｍ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＡＦ３７７２０５）、「Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＧＵ０８０２３０）、「Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＦＲ８７８０８７）を使用した。比較対象の接合菌には、「Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＮ９４２８７９)、「Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ０１４６８５)、「Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ  ｂｉｎａｒｉａｅ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ６５４０９０)を使用した。比較対象の子嚢菌には、「Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ６９４５００）、「Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＦ４９９６７６)、「Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＨＱ６９６９０６)、「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＮ５６１２６６）、「Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ」（ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＪＦ７９３５４０）を使用した。
【００３７】
上記の相同性検索の結果に基づき、リジドポラス マイクロポラスのｒＤＮＡ-ＩＴＳ領域において、種特異的な塩基配列が存在する領域、種内で変異が発生する箇所又は領域を推定した。この推定に基づき、リジドポラス マイクロポラスのｒＤＮＡ-ＩＴＳ領域において種内で変異が発生し易い箇所又は領域を特定したところ、リジドポラス マイクロポラスのｒＤＮＡ-ＩＴＳ領域の塩基配列には１０％程度の種内変異発生箇所が存在し得ることを見出した。リジドポラス マイクロポラスのｒＤＮＡ-ＩＴＳ領域の塩基配列のうち、本発明者らが特定した種内変異発生箇所又は領域を除くようにプライマーを設計することにより、リジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡを特異的且つ効率的に増幅することができるプライマーセットを開発することを企図した。
【００３８】
＜プライマーセット＞
以上のように鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法においてリジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡの増幅反応に用いることができるプライマーセットを４種類開発することができた。すなわち、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法に用いるプライマーセットは、下記に示す４種類のプライマーセットの少なくとも１つであることが好ましい。下記第１〜第４のプライマーセットは、いずれも、リジドポラス マイクロポラスのｒＤＮＡ−ＩＴＳ領域におけるリジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有する領域を鋳型とするＤＮＡの増幅に好適に用いることができる。
【００３９】
第１のプライマーセットは、
（ＦＩＰ−１）配列番号１で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−２）配列番号１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−３）配列番号１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−４）配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−１）配列番号３で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−２）配列番号３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−３）配列番号３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−４）配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−１）配列番号５で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−２）配列番号５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−３）配列番号５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−４）配列番号６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−１）配列番号７で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−２）配列番号７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−３）配列番号７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−４）配列番号８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を含むことを特徴とする。
配列番号１〜８の塩基配列は、下記に示す通りである。
【００４０】
【表１】
0006668057.tif 000002
【００４１】
第２のプライマーセットは、
（ＦＩＰ−５）配列番号９で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−６）配列番号９で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−７）配列番号９で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−８）配列番号１０で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−５）配列番号１１で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−６）配列番号１１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−７）配列番号１１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−８）配列番号１２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−５）配列番号１３で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−６）配列番号１３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−７）配列番号１３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−８）配列番号１４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−５）配列番号１５で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−６）配列番号１５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−７）配列番号１５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−８）配列番号１６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を含むことを特徴とする。
配列番号９〜１６の塩基配列は、下記に示す通りである。
【００４２】
【表２】
0006668057.tif 000003
【００４３】
前記第２のプライマーセットは、更に
（ＬＦ−５）配列番号１７で表わされる塩基配列、
（ＬＦ−６）配列番号１７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＬＦ−７）配列番号１７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＬＦ−８）配列番号１８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーを含むことが好ましい。
配列番号１７及び１８の塩基配列は、下記に示す通りである。
【００４４】
【表３】
0006668057.tif 000004
【００４５】
第３のプライマーセットは、
（ＦＩＰ−９）配列番号１９で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−１０）配列番号１９で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−１１）配列番号１９で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−１２）配列番号２０で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−９）配列番号２１で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−１０）配列番号２１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−１１）配列番号２１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−１２）配列番号２２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−９）配列番号２３で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−１０）配列番号２３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−１１）配列番号２３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−１２）配列番号２４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−９）配列番号２５で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−１０）配列番号２５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−１１）配列番号２５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−１２）配列番号２６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を含むことを特徴とする。
配列番号１９〜２６の塩基配列は、下記に示す通りである。
【００４６】
【表４】
0006668057.tif 000005
【００４７】
第３のプライマーセットは、更に、
（ＬＢ−９）配列番号２７で表わされる塩基配列、
（ＬＢ−１０）配列番号２７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＬＢ−１１）配列番号２７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＬＢ−１２）配列番号２８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーを含むことが好ましい。
配列番号２７及び２８の塩基配列は、下記に示す通りである。
【００４８】
【表５】
0006668057.tif 000006
【００４９】
第４のプライマーセットは、
（ＦＩＰ−１３）配列番号２９で表わされる塩基配列、
（ＦＩＰ−１４）配列番号２９で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＦＩＰ−１５）配列番号２９で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＦＩＰ−１６）配列番号３０で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（Ｆ３−１３）配列番号３１で表わされる塩基配列、
（Ｆ３−１４）配列番号３１で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｆ３−１５）配列番号３１で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｆ３−１６）配列番号３２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むフォワードプライマーと、
（ＢＩＰ−１３）配列番号３３で表わされる塩基配列、
（ＢＩＰ−１４）配列番号３３で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＢＩＰ−１５）配列番号３３で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＢＩＰ−１６）配列番号３４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと、
（Ｂ３−１３）配列番号３５で表わされる塩基配列、
（Ｂ３−１４）配列番号３５で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（Ｂ３−１５）配列番号３５で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（Ｂ３−１６）配列番号３６で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーと
を含むことを特徴とする。
配列番号２９〜３６の塩基配列は、下記に示す通りである。
【００５０】
【表６】
0006668057.tif 000007
【００５１】
前記第４のプライマーセットは、更に
（ＬＢ−１３）配列番号３７で表わされる塩基配列、
（ＬＢ−１４）配列番号３７で表わされる塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されている塩基配列、
（ＬＢ−１５）配列番号３７で表わされる塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列、又は
（ＬＢ−１６）配列番号３８で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、
を含むリバースプライマーを含むことが好ましい。
配列番号３７及び３８の塩基配列は、下記に示す通りである。
【００５２】
【表７】
0006668057.tif 000008
【００５３】
本発明において、プライマーが所定の「塩基配列を含む」とは、当該プライマーが、ＤＮＡ増幅反応の間に標的とする鋳型ＤＮＡとアニールして相補的なＤＮＡ鎖の合成及び伸長が可能な限りにおいて、当該所定の塩基配列の５'末端及び／又は３'末端に鋳型ＤＮＡと相補的又は非相補的な１〜数個の塩基を付加した塩基配列を有してもよいことを意味する。「数個」とは、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個を意味する。本発明においては、プライマーが所定の「塩基配列からなる」ことが好ましい。プライマーが所定の「塩基配列からなる」とは、プライマーの塩基配列が所定の塩基配列に対して１００％の同一性を有することを意味する。
【００５４】
本発明において、所定の塩基配列において「１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている」塩基配列とは、当該所定の塩基配列において鋳型ＤＮＡとのアニールに悪影響を及ぼさない部位で１〜数個の塩基が独立又は連続して、欠失、置換又は付加されている塩基配列を意味する。「数個」とは、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個を意味する。
【００５５】
本発明において、所定の塩基配列と「８０％以上の同一性を有する」塩基配列は、当該所定の塩基配列に対して８５％以上の同一性を有することが好ましく、９０％以上の同一性を有することがより好ましく、９５％以上の同一性を有することがより一層好ましい。所定の塩基配列に対して高い同一性を有するとＤＮＡ増幅の特異性及び効率を高めることができる。
【００５６】
本発明において、所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列」としては、当該所定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列であることが好ましい。所定の塩基配列に対して一層高い配列相補性を有するからである。
【００５７】
本発明において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載された条件が挙げられる。所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる」とは、具体的には、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％ホルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行って洗浄した後に、当該所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしていることを意味する。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００５８】
＜ＤＮＡ増幅方法＞
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法では、特に限定されないが、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いる既知の等温増幅法で、リジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡを増幅することが好ましい。温度昇降サイクルに供することなく、等温で目的配列を有するＤＮＡを増幅することができるからである。中でも、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ループ介在等温増幅）法を用いて、リジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡを増幅することが好ましい。ＬＡＭＰ法は、少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマーのセットと鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ増幅を行う等温核酸増幅法である。ＬＡＭＰ法の詳細については、例えば、特許第３３１３３５８号明細書、特許第４４３７８５６号明細書、栄研化学株式会社が提供するインターネット上のウェブページ（URL:  http://loopamp.eiken.co.jp/lamp/principle.html）等に記載されている。
【００５９】
ＬＡＭＰ法ではプライマーとして、鋳型ＤＮＡの塩基配列上の計６領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマーのセット（インナープライマーＦ（以下、ＦＩＰという。）、インナープライマーＢ（以下、ＢＩＰという。）、アウタープライマーＦ（以下、Ｆ３という。）及びアウタープライマーＢ（以下、Ｂ３という。））が使用されるが、増幅反応の進行に伴い、自己を鋳型としながら合成起点となる３'末端を有した、両端にそれぞれループ構造を有することを特徴とするダンベル型のＤＮＡが形成される。形成されたダンベル型のＤＮＡを鋳型として、上記プライマーによる増幅反応が更に連続的に進行して、特定の塩基配列が反復伸長したＤＮＡが合成される。
【００６０】
ＬＡＭＰ法では、上記４種類のプライマーのみからなるプライマーセットを用いてＤＮＡ増幅反応を行うことができるが、更に、上記ダンベル構造の５'末端側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマー（ループプライマーＦ（以下、ＬＦという。）及び／又はループプライマーＢ（以下、ＬＢという。））を用いると、ＤＮＡ合成の起点が増え、反応時間の短縮と増幅効率の向上を図ることができる。
【００６１】
ＬＡＭＰ法では、等温で鎖置換型のＤＮＡ増幅反応が進行するため、上に述べた合成反応は同時に並行して起こる。また、プライマーの３'末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするために、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。更に、常法のＰＣＲ法と比較して、単位時間あたりの増幅産物の量が非常に多い。従って、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法において、ＬＡＭＰ法を用いることにより、等温且つ短時間で、リジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡを特異的且つ効率的に増幅することができる。
【００６２】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法でＬＡＭＰ法を用いる場合は、調製した増幅反応液を６０〜６５℃で約３０分間〜１時間インキュベートするとＤＮＡ増幅反応が進行し、続いて８０〜９５℃で２〜５分間インキュベートすると進行中のＤＮＡ増幅反応を停止させることができる。
【００６３】
ＬＡＭＰ法を用いたリジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡの増幅に使用できるプライマーセットは、リジドポラス マイクロポラスのゲノムＤＮＡに特異的な塩基配列を含む周辺領域の塩基配列情報に基づき、ＬＡＭＰ法プライマー設計支援ソフトＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖ４等を使用して設計することができる。本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法においては、上述する第１〜第４のプライマーセットのいずれか1つ以上をＬＡＭＰ法と組み合わせて用いることが好ましい。これにより、リジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡの増幅の特異性及び効率を一層高めることができる。
【００６４】
＜検出手法＞
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法で用いる検出手法は、ＤＮＡ増幅を検出することができる限り特に限定しないが、ＤＮＡ増幅を蛍光で検出することができる蛍光検出試薬を用いることが好ましい。蛍光検出試薬としては、特に限定しないが、カルセイン−マンガン錯体を含む検出試薬が好ましい。カルセインは黄緑色の蛍光を発する色素化合物であり、マンガンイオン（Ｍｎ2+）と配位結合して錯体を形成すると、消光する性質を持つ。カルセインが予めマンガンイオン（Ｍｎ2+）と配位結合しているカルセイン−マンガン錯体を含む検出試薬を用いると、ＤＮＡ増幅反応に伴ってピロリン酸イオン（Ｐ2Ｏ74-）が大量に生成すると、カルセイン−マンガン錯体からマンガンイオン（Ｍｎ2+）が奪われて、カルセインが元の蛍光発光を回復する。一方、ピロリン酸イオンとマンガンイオンは、結合してピロリン酸マンガン（Ｍｎ2Ｐ2Ｏ7）の沈殿を生成するため、増幅反応液が白濁する。また、増幅反応液中にマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）が存在すると、カルセインの蛍光を増強することができる。このように、カルセインの蛍光は、紫外線を照射しなくても目視で検出可能であり得る。しかし、検出の際に約２４０〜２６０ｎｍ又は約３５０〜３７０ｎｍの波長の紫外線を照射すると、カルセインの励起による一層強い蛍光発光を検出することができ、目視検出の観点から好ましい。
【００６５】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法において、カルセイン−マンガン錯体を含む検出試薬を増幅反応液に予め添加しておくことが好ましい。カルセイン−マンガン錯体を含む検出試薬を増幅反応液に予め添加しておくことにより、ＤＮＡ増幅反応の停止後、特別な物理化学的処理を行わず又は紫外線照射だけで、ＤＮＡの増幅を黄緑色の蛍光及び／又は白濁として検出することができる。蛍光及び／又は白濁の検出は、リアルタイムＰＣＲ装置や吸光光度計などの専用機器を用いて行ってもよいが、目視で検出できることが好ましい。本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法において、カルセイン−マンガン錯体を含む検出試薬を上記第１〜第４のプライマーセットのいずれか１つ以上及び／又はＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅と組み合わせることがより好ましい。上記第１〜第４のプライマーセットのいずれか１つ以上及び／又はＬＡＭＰ法の高いＤＮＡ増幅効率によってピロリン酸イオンが大量に生成するため、より一層検出感度を高めることができ、目視で蛍光及び／又は白濁を検出することができる。
【００６６】
［リジドポラス マイクロポラスの検出用キット］
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、上述する第１〜第４のプライマーセットのうちの少なくとも１つのプライマーセットを含む。本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、上述する第１〜第４のプライマーセットのうちの少なくとも１つのプライマーセットを含むことにより、リジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡを増幅することができる。本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、特に限定されないが、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅と組み合わせることにより、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出に好適に使用することができる。
【００６７】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、上述する第１〜第４のプライマーセットのうちの少なくとも１つのプライマーセットに加えて、ＤＮＡ増幅に必要な反応容器及び試薬類、例えば、反応用チューブ、ＤＮＡポリメラーゼ、バッファー試薬類(無機塩類、界面活性剤などを適宜含み、希釈用プレミックスバッファーの形態でもよい)、各ｄＮＴＰ、ポジティブコントロールＤＮＡ、滅菌水（ｄＨ2Ｏ）などを含むことができる。前記試薬類は、使用するＤＮＡ増幅反応手法、ＤＮＡポリメラーゼ、及びその他の実施条件に応じて、公知のものから適宜選択することができるが、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅反応に使用可能であることが好ましい。
【００６８】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、更に、ＤＮＡ増幅の検出に必要な試薬類、例えば、蛍光検出試薬などを含むことができる。蛍光検出試薬は、特に限定されないが、ＤＮＡ増幅反応により生成するピロリン酸イオン（Ｐ2Ｏ74-）との反応によってカルセインが蛍光発光を回復する、カルセイン−マンガン錯体を含むことが好ましい。カルセイン−マンガン錯体を含む蛍光検出試薬を用いると、ＤＮＡ増幅反応の停止後、特別な物理的又は化学的処理を行わずに目視で蛍光を検出することができる。カルセイン−マンガン錯体を含む蛍光検出試薬を用いて検出する場合、更に、紫外線照射を行うことにより、カルセインが励起して一層強い蛍光発光を検出することができる。        
【００６９】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、上述する試薬類をマスターミックスやプレミックスの形態で含んでもよい。また、更に、使用説明書、紫外線照射装置などを含んでもよい。
【００７０】
上述する本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法及びリジドポラス マイクロポラスの検出用キットを用いることにより、数種類の専用試薬、爪楊枝、ウォーターバス、ヒートブロック等の温度調節可能な保温器など必要最低限の設備で、リジドポラス マイクロポラスを簡易、迅速且つ高精度に検出することができる。当該方法を用いることにより、実際に植えられているゴムノキ等の植物が立ち枯れ等の病徴を示す前に、当該植物又はそれが植えられている圃場の土壌が根白腐病の原因菌リジドポラス マイクロポラスに汚染されているか否かを、精密機器や熟練技術を要することなく簡易、迅速且つ高精度に調べることができる。従って、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法は、ゴム農園のような圃場現場で好適に使用することができる。
【実施例】
【００７１】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００７２】
［実施例１：抽出ＤＮＡを被検試料とした検出実験］
リジドポラス マイクロポラス（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ）を含む複数種の微生物から抽出したＤＮＡを被検試料として用いて、設計したプライマーセットでリジドポラス マイクロポラスを特異的に検出できるかを確認した。
【００７３】
被検試料として用いたＤＮＡは、次の菌株から抽出した：Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  Ｐ．２−５株（インドネシアのジャワ島の圃場から入手）、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＮＳ−１株（インドネシアのスマトラ島の圃場から入手）、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ  ＰＲ−５株（インドネシアのジャワ島の圃場から入手）、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ（インドネシアのスマトラ島の圃場から入手）、並びに、その他の５菌株（顕微鏡による形態観察の結果、リジドポラス マイクロポラスでもＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ属菌でもないことを確認している、種未同定菌株。インドネシアのジャワ島の圃場から入手）。抽出は、ＣＴＡＢ法を用い、その常法のプロトコルに従って行った。抽出したＤＮＡを吸光度測定によって定量した。このように各微生物株から抽出したＤＮＡをサンプルＤＮＡとして用いた。
【００７４】
＜プライマーセット＞
ＬＡＭＰ法を用いて核酸を増幅するため、下記４つのプライマーセット：ＩＤ１１、ＩＤ２８、ＩＤ４１、及びＩＤ２３を設計して、検出に用いた。これらプライマーは、ユーロフィンジェノミクス株式会社に合成を依頼して、ＨＰＬＣ精製グレードで入手した。
【００７５】
プライマーセットＩＤ１１：配列番号１で表わされる塩基配列からなるフォワードプライマー（ＦＩＰプライマー）と、配列番号３で表わされる塩基配列からなるフォワードプライマー（Ｆ３プライマー）と、配列番号５で表わされる塩基配列からなるリバースプライマー（ＢＩＰプライマー）と、配列番号７で表わされる塩基配列からなるリバースプライマー（Ｂ３プライマー）との組み合わせ
プライマーセットＩＤ２８：配列番号９で表わされる塩基配列からなるフォワードプライマー（ＦＩＰプライマー）と、配列番号１１で表わされる塩基配列からなるフォワードプライマー（Ｆ３プライマー）と、配列番号１３で表わされる塩基配列からなるリバースプライマー（ＢＩＰプライマー）と、配列番号１５で表わされる塩基配列からなるリバースプライマー（Ｂ３プライマー）と、配列番号１７で表わされる塩基配列からなるフォワードプライマー（ＬＦプライマー）との組み合わせ
プライマーセットＩＤ４１：配列番号１９で表わされる塩基配列からなるフォワードプライマー（ＦＩＰプライマー）と、配列番号２１で表わされる塩基配列からなるフォワードプライマー（Ｆ３プライマー）と、配列番号２３で表わされる塩基配列からなるリバースプライマー（ＢＩＰプライマー）と、配列番号２５で表わされる塩基配列からなるリバースプライマー（Ｂ３プライマー）と、配列番号２７で表わされる塩基配列からなるリバースプライマー（ＬＢプライマー）との組み合わせ
プライマーセットＩＤ２３：配列番号２９で表わされる塩基配列からなるフォワードプライマー（ＦＩＰプライマー）と、配列番号３１で表わされる塩基配列からなるフォワードプライマー（Ｆ３プライマー）と、配列番号３３で表わされる塩基配列からなるリバースプライマー（ＢＩＰプライマー）と、配列番号３５で表わされる塩基配列からなるリバースプライマー（Ｂ３プライマー）と、配列番号３７で表わされる塩基配列からなるリバースプライマー（ＬＢプライマー）との組み合わせ
【００７６】
＜ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅反応＞
ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅に必要なＤＮＡ増幅試薬類及びＤＮＡ増幅の検出に必要な検出用試薬を含む増幅反応液をチューブストリップ（アプライドバイオシステムズ社製「ＭｉｃｒｏＡｍｐＲ Ｆａｓｔ ８−Ｔｕｂｅ Ｓｔｒｉｐ」又は「 ＭｉｃｒｏＡｍｐＲ Ｏｐｔｉｃａｌ ８−ｃａｐ Ｓｔｒｉｐ」）に調製して、ＬＡＭＰ法によるＤＮＡ増幅反応に供した。 ＤＮＡ増幅用試薬としては、Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット（栄研化学株式会社製）を使用し、検出用試薬としては、カルセイン−マンガン錯体を含むＬｏｏｐａｍｐ蛍光・目視検出試薬（栄研化学株式会社製）を使用した。増幅反応液の組成、Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（２×）の組成、及びプライマーミックスの組成は、それぞれ下記の通りであった。増幅反応液は、下記の増幅反応液組成からサンプルＤＮＡを除いた組成の増幅検出用バッファーを予め調製してチューブストリップの各チューブに分注し、そこにサンプルＤＮＡを添加することによって調製した。
【００７７】
【表８】
0006668057.tif 000009
【００７８】
【表９】
0006668057.tif 000010
【００７９】
【表１０】
0006668057.tif 000011
【００８０】
増幅反応液が入ったチューブストリップを、リアルタイムＰＣＲ装置「Ｅｘｃｙｃｌｅｒ  ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ」（ＢＩＯＮＥＥＲ社製）にセットして、６３℃にて１時間インキュベートして増幅反応させ、続いて９５℃にて２分間インキュベートして増幅反応を停止させた。
【００８１】
＜目視検出＞
増幅反応終了後、チューブストリップの底面から波長２４０〜２６０ｎｍ、３５０〜３７０ｎｍの紫外線を照射して、蛍光発光の有無を観察した。サンプルＤＮＡ中にリジドポラス マイクロポラスに特異的な塩基配列を有するＤＮＡが含まれる場合には、増幅反応が起こってピロリン酸イオン（Ｐ2Ｏ74-）が生成され、生成したピロリン酸イオンがカルセイン−マンガン錯体からマンガンイオン（Ｍｎ2+）を奪うことにより、カルセインの黄緑色の蛍光が認められる。また、ピロリン酸イオンとマンガンイオンが反応してピロリン酸マンガン（Ｍｎ2Ｐ2Ｏ7）が生成すると、白濁が認められる。
【００８２】
＜結果＞
プライマーセットＩＤ１１、ＩＤ２８、ＩＤ４１及びＩＤ２３を用いて等温増幅反応を行い、蛍光を目視で観察した結果を、それぞれ図１、図３、図５及び図７として示す。被検対象であるサンプルＤＮＡがリジドポラス マイクロポラスの抽出ＤＮＡである２本のサンプルＲ１（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ Ｐ．２−５株）及びＲ２（Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ ＮＳ−１株）では、それぞれ、黄緑色の蛍光が観察された。一方、サンプルＤＮＡがＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属又はＧｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ属の菌株由来の抽出ＤＮＡであるサンプルＴ１（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ    ｈａｒｚｉａｎｕｍ  ＰＲ−５株）、Ｇ１（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ属菌株）、サンプルＤＮＡが他の６菌類由来の抽出ＤＮＡであるサンプルＯ１〜Ｏ６、サンプルＤＮＡに代えて滅菌水（ｄＨ2Ｏ）を用いたネガティブコントロールであるサンプルＮＣでは、黄緑色の蛍光が観察されなかった。
また、プライマーセットＩＤ１１、ＩＤ２８、ＩＤ４１及びＩＤ２３を用いた等温増幅反応の間に、１１本のサンプルチューブで観察される蛍光強度をリアルタイムで測定した結果を、それぞれ図２、図４、図６及び図８として示す。縦軸は蛍光強度、横軸は増幅反応開始からの経過時間（分）を示す。図２、図４、図６及び図８から、上記４つのプライマーセットは、いずれも６３℃でインキュベートしてから６０分間以内に増幅反応が開始されていることが分かる。
【００８３】
［実施例２：ＤＮＡ検出感度の調査］
Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＮＳ−１株（インドネシアのスマトラ島の圃場から入手）から抽出したＤＮＡをサンプルＤＮＡとして用い、プライマーセットＩＤ１１、ＩＤ２８、ＩＤ４１及びＩＤ２３の各々について、蛍光による検出でのＤＮＡ検出限界を調べた。サンプルＤＮＡの濃度を段階的に変化させたことを除いて、実施例１と同様に、ＤＮＡの抽出及び精製、反応液組成、増幅反応、蛍光検出を行った。結果を図９として示す。
図９では、反応液に添加したサンプルＤＮＡの濃度をそれぞれ１ｐｇ／μＬ、１０ｐｇ／μＬ、１００ｐｇ／μＬ、及び１０００ｐｇ／μＬとしたサンプルチューブを、それぞれ１、１０、１００、及び１０００と表し、サンプルＤＮＡに代えて滅菌水（ｄＨ2Ｏ）を用いたネガティブコントロールのサンプルチューブをＮＣと表した。また、増幅反応に使用したプライマーセットの番号を左側に示した。
【００８４】
図９から分かるように、プライマーセットＩＤ１１及びＩＤ４１を用いた場合は、１０、１００、及び１０００のサンプルチューブでカルセインに由来する黄緑色の蛍光が観察され、１のサンプルチューブではネガティブコントロールのサンプルチューブＮＣと同様に蛍光が観察できなかった。この結果は、プライマーセットＩＤ１１及びＩＤ４１は、１チューブ２５μＬの上記反応液あたり、少なくとも濃度１０ｐｇ／μＬのサンプルＤＮＡ１μＬ、すなわち、１０ｐｇのサンプルＤＮＡ量があれば検出可能であることを示す。同様に、プライマーセットＩＤ２８を用いた場合は、１チューブの反応液あたり、少なくとも１００ｐｇのサンプルＤＮＡ量（濃度１００ｐｇ／μＬまでのサンプルＤＮＡ１μＬ）があれば、検出可能であることが分かった。また、プライマーセットＩＤ２３を用いた場合は、１チューブの反応液あたり、少なくとも１ｐｇのサンプルＤＮＡ量（濃度１００ｐｇ／μＬまでのサンプルＤＮＡ１μＬ）があれば、検出可能であることが分かった。
以上の結果から、プライマーセットＩＤ１１、ＩＤ２８、ＩＤ４１及びＩＤ２３は、検出対象のＤＮＡ量が微量であっても検出可能であることが確認できた。
【００８５】
［実施例３：土壌又は菌糸を被検試料とした検出実験］
ゴム農園での実施を想定して、土壌や菌糸を被検試料として、微生物のＤＮＡを抽出することなく、リジドポラス マイクロポラスの有無を検出する実験を行った。被検試料として、次の７種類のサンプルを用いた。サンプル１：人工感染土（１２０℃で２０分間オートクレーブ滅菌した後に、Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＮＳ−１株を人工的に感染させたパラゴムノキ苗を植えた土）、サンプル２：オートクレーブ土（１２０℃で２０分間オートクレーブ滅菌した土）、サンプル３：Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＮＳ−１株の菌糸、サンプル４：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ  ＰＲ−５株の菌糸、サンプル５：サンプル２のオートクレーブ土から抽出したＤＮＡ、サンプルＰＣ：Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＮＳ−１株から抽出したＤＮＡ（ポジティブコントロール）、及びサンプルＮＣ：ネガティブコントロールとしての滅菌水（ｄＨ2Ｏ）。サンプル５のＤＮＡ及びサンプルＰＣのＤＮＡは、ＣＴＡＢ法を用いて抽出した。
【００８６】
実施例１で示す反応液を、サンプルＤＮＡを除いた組成で、チューブストリップの７本のチューブに調製した。プライマーセットとしては、プライマーセットＩＤ１１を用いた。被検試料が土又は菌糸であるサンプル１〜４では、１２０℃で２０分間オートクレーブ滅菌した爪楊枝の先を、被検試料（土又は菌糸）に接触させてから、チューブ内の反応液に浸した。被検試料が抽出ＤＮＡであるサンプル５及びＰＣでは、約１ｎｇ／μＬの濃度に調製したＤＮＡ溶液１μＬを反応液に加えた。サンプルＮＣでは、滅菌水１μＬを反応液に加えた。このようにして準備した７本のチューブからなるチューブストリップを、リアルタイムＰＣＲ装置「Ｅｘｃｙｃｌｅｒ  ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ」にセットして、６３℃で１時間インキュベートして増幅反応させ、その後９５℃で２分間インキュベートして増幅反応を停止させた。
【００８７】
反応停止後のチューブストリップをリアルタイムＰＣＲ装置から取り出して、波長２４０〜２６０ｎｍ、３５０〜３７０ｎｍの紫外線を照射して、蛍光を目視で観察した。結果を図１１として示す。図１０の上段が紫外線照射後の写真、図１０の下段が紫外線照射前の写真である。これらの写真から分かるように、紫外線照射前後に、サンプル１：人工感染土、サンプル３：Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＮＳ−１株の菌糸、及びサンプルＰＣ：Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＮＳ−１株の抽出ＤＮＡ（ポジティブコントロール）のサンプルチューブで鮮やかな黄緑色の蛍光が目視観察できた。一方、他のサンプル２、４、５及びＮＣのサンプルチューブでは、紫外線照射前後いずれも蛍光が目視観察できなかった。
【００８８】
リアルタイムＰＣＲ装置で等温増幅反応の間に蛍光強度を測定した結果を図１１として示す。図１１から分かるように、サンプル１：人工感染土、サンプル３：Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＮＳ−１株の菌糸、及びサンプルＰＣ：Ｒｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＮＳ−１株の抽出ＤＮＡ（ポジティブコントロール）のサンプルチューブで、蛍光強度の増加が認められ、ＤＮＡ増幅が検出された。
【００８９】
実施例１〜３の結果から明らかなように、本願発明の一実施形態である検出方法に従って、本願明細書で開示するプライマーセットを用いて、プライマーセットの設計開発に使用したリジドポラス マイクロポラス菌株とは別のリジドポラス マイクロポラス菌株であるＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ Ｐ．２−５株及びＲｉｇｉｄｏｐｏｒｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ  ＮＳ−１株をそれぞれ検出することができた。このように、本明細書で開示する検出方法及びプライマーセットによって、土壌や菌糸を含む試料から核酸を抽出することなく、簡易、迅速かつ高精度にリジドポラス マイクロポラスを検出できることが裏付けられた。つまり、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法、及び本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、根白腐病の原因菌リジドポラス マイクロポラスを簡易、迅速且つ高精度に検出することができ、ゴム農園のような圃場現場で好適に使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法及びリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、ゴム農園におけるパラゴムノキ等の根白腐病害の早期発見による病害蔓延の防止、天然ゴム生産量の維持、及び天然ゴム生産性の向上に利用することができる。また、本発明のリジドポラス マイクロポラスの検出方法及びリジドポラス マイクロポラスの検出用キットは、植樹時の土壌健全性診断への活用を通して、パラゴムノキ等の根白腐病発生の未然防止に役立てることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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