(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
三機能性抗原結合分子であって、前記抗原結合分子は、各ポリペプチドが相互に連結した４つの抗体可変領域を有する、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含む抗原結合ポリペプチド二量体であり、
（ａ）前記第１ポリペプチドは、約１２個以下のアミノ酸残基のリンカーによって相互に連結された第１および第２抗体可変重鎖領域（ＶＨ）、ならびに、抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）と連結された第３抗体可変重鎖領域（ＶＨ）を有する一本鎖Ｆｖ抗原結合ユニットを含み、前記第３抗体可変重鎖領域（ＶＨ）および抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）は、第１抗原結合部位に会合することができ、前記第１または第２抗体可変重鎖領域（ＶＨ）は、ペプチドリンカーによって前記一本鎖Ｆｖ抗原結合ユニットと連結されている、
（ｂ）前記第２ポリペプチドは、約１２個以下のアミノ酸残基のリンカーによって相互に連結された第１および第２抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）、ならびに、抗体可変重鎖領域（ＶＨ）と連結された第３抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）を有する一本鎖Ｆｖ抗原結合ユニットを含み、前記第３抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）および抗体可変重鎖領域（ＶＨ）は、第２抗原結合部位に会合することができ、第１または第２抗体可変軽鎖領域は前記一本鎖Ｆｖ抗原結合ユニットとペプチドリンカーによって連結されている、
（ｃ）前記第１ポリペプチドの前記第１抗体可変重鎖領域（ＶＨ）は、前記第２ポリペプチドの前記第２抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）と第３抗原結合部位に対して会合する、
（ｄ）前記第１ポリペプチドの前記第２抗体可変重鎖領域（ＶＨ）は、前記第２ポリペプチドの前記第１抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）と第４抗原結合部位に対して会合する、
（ｅ）前記４つの抗原結合部位のうちの２つは、同一抗原に対して特異的である、三機能性抗原結合分子。
【請求項２】
２つの前記一本鎖Ｆｖ抗原結合ユニットの前記第１および第２抗原結合部位は、同一抗原に対して特異的である請求項１に記載の三機能性抗原結合分子。
【請求項３】
前記第１および第２ポリペプチド間の会合によって形成された前記第３および第４抗原結合部位は、同一抗原に対して特異的である請求項１または２に記載の三機能性抗原結合分子。
【請求項４】
前記同一抗原に対して特異的である前記２つの抗原結合部位は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に提示される抗原に対して特異的である請求項１〜３のいずれか一項に記載の三機能性抗原結合分子。
【請求項５】
免疫エフェクター細胞に対する特異性は、ＣＤ３、ＣＤ１６およびＣＤ１６Ａからなる群から選択される請求項４に記載の三機能性抗原結合分子。
【請求項６】
他の２つの結合部位は、同一細胞上の２つの異なる抗原に対して特異的である請求項４または５に記載の三機能性抗原結合分子。
【請求項７】
前記細胞は、腫瘍細胞である請求項６に記載の三機能性抗原結合分子。
【請求項８】
前記２つの異なる抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ２００、ＣＤ２６７、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、トムゼン・フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ：ＴＦ）抗原、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＣＤ５、ＩＬ４−Ｒα、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩ、ＩｇＥ、ｇｐＡ３３、および、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体からなる群から選択される、請求項７に記載の三機能性抗原結合分子。
【請求項９】
第１抗原結合部位および第２抗原結合部位は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に提示される２つの異なる抗原エピトープに対して特異的である請求項１または２に記載の三機能性抗原結合分子。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の三機能性抗原結合分子のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
腫瘍療法において使用するための請求項７または８に記載の三機能性抗原結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多機能性（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）、例えば三機能性、の抗原結合分子、および、その治療適用、例えば免疫療法、に関する。前記分子は、Ｆｖ抗体誘導体である。特定の実施形態では、本発明は、多量体、例えば、二量体、の抗原結合分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性、すなわち二機能性の抗体は、２つの異なる治療標的と闘うため、または２つの別個の機能を実施するために使用できる。そのような抗体は、例えば、特定の標的細胞に向かう免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞を動員するために使用できる。様々な抗体フラグメントをベースとする分子は、公知であり、例えば癌療法のために開発中である。
【０００３】
二機能性および二量体の抗体は、抗体可変領域だけを使用して構築できる。例えば、ＶＨおよびＶＬ領域間のリンカー配列は、それらがフォールディングすることができない程度まで短縮することができ、分子内様式で相互に結合する。例えば二から十二個の残基のそのような短いリンカーは、ｓｃＦｖ分子の前記のフォールディングを防止し、様々なポリペプチド鎖の相補的可変領域間の分子間ＶＨ−ＶＬ対合に好都合であり、二量体「ダイアボディ」を形成する（非特許文献１（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８））。そのようなダイアボディは、各々が別の抗体のＶＬ領域に短いリンカーによって接続された１つの抗体由来のＶＨ領域からなる、２つの一本鎖ポリペプチド融合生成物の非共有結合によって得られる二機能性抗体のために使用できる。
【０００４】
特許文献１（国際公開第０３／０２５０１８号パンフレット）は、その構造が少なくとも４つの結合領域を備える同一の一本鎖ポリペプチドによって形成される、二重特異性および多量体の抗原結合分子を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第０３／０２５０１８号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
各ポリペプチド鎖の末端部分にあるＶＨおよびＶＬ領域は、短いリンカーによって連結され、他方のポリペプチド鎖の対応するＶＨおよびＶＬ領域と分子間会合するが、各ポリペプチド鎖の他方のＶＨおよびＶＬ領域は、同一鎖内で相互に分子内結合して抗原結合ｓｃＦｖユニットを生じる。そのような構築物はホモ二量体である、すなわちそのような構築物は相互に結合した同一の一本鎖ポリペプチドからなる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、少なくとも三機能性である、多機能性の抗原結合分子が提供される。一部の実施形態では、三機能性抗原結合分子は、少なくとも三重特異的である、すなわち少なくとも３つの異なる抗原エピトープに対する特異性を有する。
【０００９】
本発明による抗原結合分子は、可変（Ｆｖ）抗体領域だけを含むが、定常抗体領域が欠如する、Ｆｖ誘導体である。抗原結合分子の可変（Ｆｖ）抗体領域は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって相互に結合されている。本発明による抗原結合分子は、単一ポリペプチド鎖の単量体または多重鎖ポリペプチドの多量体である可能性がある。多量体抗原結合分子は、例えば、２本のポリペプチド鎖を有する二量体、３本のポリペプチド鎖を有する三量体または４本のポリペプチド鎖を有する四量体であってよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明による三機能性、すなわち三重特異性の抗原結合ポリペプチド二量体を形成するための第１および第２ポリペプチドを示す図である。第１ポリペプチドは、次々に連結された４つの抗体可変領域ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ、ＶＨを有する。第１および第２ＶＨ抗体可変領域（黒色）は、同一の第１特異性を有し、同一ポリペプチド内の分子内対合を防止するために短いリンカーＬ３および同一ポリペプチド内の可変領域対によって第２特異性の抗原結合部位を分子内で形成できる第２リンカーＬ１によって連結された他の第３可変抗体領域ＶＬおよび第４可変抗体領域ＶＨの抗体可変領域対（白色）を有する一本鎖Ｆｖユニットによって連結されている。異なる特異性の第２抗体可変領域ＶＨおよび第３抗体可変領域ＶＬは、第３リンカーＬ２によって連結されている。  第２ポリペプチドは、次々に連結された４つの抗体可変領域ＶＬ、ＶＬ、ＶＬ、ＶＨを有する。第１および第２ＶＬ抗体可変領域（黒色）は、同一の第１特異性を有し、同一ポリペプチド内の分子内対合を防止するために短いリンカーＬ４ならびに他の第３可変抗体領域ＶＬおよび第３特異性を有する第４可変抗体領域ＶＨの抗体可変領域対（灰色）を有する一本鎖Ｆｖユニットによって連結され、および同一ポリペプチド内の可変領域対によって抗原結合部位を分子内で形成できる第２リンカーＬ１によって連結されている。異なる特異性の第２抗体可変領域ＶＬおよび第３抗体可変領域ＶＬは、第３リンカーＬ２によって連結されている。
【図２】図１の２つのポリペプチド間の非共有会合によって形成された抗原結合ポリペプチド二量体を示す図であり、第１ポリペプチドの短いリンカーによって連結された２つの抗体可変ＶＨ領域は第２ポリペプチドの２つの対応する抗体可変ＶＬ領域と会合し、それにより同一特異性を有する２つの抗原結合部位（黒色）を形成するが、他方第２特異性は、第１ポリペプチド（白色）の一本鎖Ｆｖユニットによって提供され、第３特異性は第２ポリペプチド（灰色）の一本鎖Ｆｖユニットによって提供される。
【図３】腫瘍細胞の二重標的化のための三重特異性抗体である、本発明による三機能性抗原結合分子、特に三機能性抗原結合ポリペプチドを示す図である。抗体、すなわち抗原結合ポリペプチドは、腫瘍細胞上の２つの異なる標的／エピトープを標的とするように設計されており、第３機能性はエフェクター細胞に高親和性で結合する。抗原結合ポリペプチドは、４つの抗原結合部位からなるが、２つの中央抗原結合部位は腫瘍細胞上の２つの異なる抗原に結合し、２つの周辺抗原結合部位はエフェクター細胞に結合する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一部の実施形態では、三重特異性抗原結合分子は、少なくとも四価である。「四価」は、抗原結合分子が４つの抗原結合部位を含むことを意味するが、このとき抗原結合部位の各々は、相互に会合（ａｓｓｏｃｉａｔｅ）した同一の抗原エピトープ特異性の１つの可変重鎖（ＶＨ）領域および可変軽鎖（ＶＬ）領域を有するＶＨ／ＶＬ対を含む。そこで、そのような四価抗原結合分子は、少なくとも８つの可変抗体領域、つまり４つの可変重鎖（ＶＨ）領域および４つの可変軽鎖（ＶＬ）領域を含む。三重特異性および四価の抗原結合分子は、第１抗原エピトープに対する特異性を有する抗原結合部位、第２抗原エピトープに対する特異性を有する抗原結合部位および第３抗原エピトープに対する特異性を有する２つの抗原結合部位を含む。そこで、この三重特異性および四価の抗原結合分子は、３つの異なる抗原エピトープに対する異なる特異性を有する。例えば、そのような抗原結合分子は、第１抗原エピトープに対する特異性を有する第１抗原結合部位、第２抗原エピトープに対する特異性を有する第２抗原結合部位、第３抗原エピトープに対する特異性を有する第３および第４抗原結合部位を含む。三重特異性および四価の抗原結合分子が多量体である一部の実施形態では、抗原結合分子は、ヘテロ二量体である、すなわち少なくとも２本の異なるポリペプチド鎖を含み、これらの２本のポリペプチド鎖は少なくとも１つの可変領域が異なり、例えば、１本のポリペプチド鎖はＶＨ領域しか含まず、他方の１本のポリペプチド鎖は、同一抗原エピトープ特異性の各ＶＬ領域しか含まない。
【００１２】
四価抗原結合分子は８つの抗体可変領域を含むために、その分子量は１００ｋＤａ超であり、これは三価および三重特異性の一本鎖Ｆｖ分子と比較して、そのような分子の長い半減期を生じさせる。
【００１３】
さらに、各三重特異性および四価の抗原結合分子は、同一抗原エピトープに対する特異性を有する２つの抗原結合部位を含む。これにより、アビディティ、つまり抗原エピトープと抗原結合分子との間の相互作用の強度が増加する。アビディティがより高いという利点は、相互作用の安定性および標的上での保持（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）を増加させる。例えば、標的が例えばＴ細胞もしくはＮＫ細胞などの細胞傷害性免疫エフェクター細胞である場合は、アビディティが高いほど、抗原結合分子の細胞溶解能力の増加を生じさせることができる。また別の実施例では、標的が腫瘍細胞である場合は、アビディティが高いほど標的上での保持時間が改善され、標的からのオフレート（ｏｆｆ−ｒａｔｅｓ）を低下させる。本発明の特定の実施形態では、三重特異性および四価の抗原結合分子は、同一種類の腫瘍細胞の２つの異なる抗原エピトープに対して特異的な第１および第２抗原結合部位ならびに例えばＴ細胞もしくはＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞上の抗原エピトープに対して特異的である第３および第４抗原結合部位を含む。そのような抗原結合分子は、特定の種類の腫瘍細胞に対する特異性そしてアビディティの増加ならびに免疫エフェクター細胞上の受容体を活性化するためのアビディティの増加をもたらし、結果として有益にも抗原結合分子の特異的な細胞溶解能を増加させる。２つの別個の腫瘍抗原エピトープへの結合は、標的化特異性の増加および標的外への毒性を減少させることによる治療濃度域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗｉｎｄｏｗ）の拡張をもたらす。重要なことに、構造的複雑性にもかかわらず、本発明によるそのような三重特異性および四価の抗原結合分子は、安定性である。
【００１４】
このため、本発明による抗原結合分子は、腫瘍細胞または感染性因子を破壊するために、免疫エフェクター細胞の細胞傷害（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）能を向け直すための様々な方法において利用できる。一部の実施形態では、三重特異性抗原結合分子は、標的上の２つの異なる抗原エピトープに結合することができる。例えば、２つの異なるエピトープは、エスケープ変異体を防止するため、または有効性を増強するために同一抗原上にあってよい、または２つのエピトープは、標的の２つの異なる抗原上にあってもよい。他の実施形態では、三重特異性抗原結合分子は、免疫エフェクター細胞上の２つの異なる抗原エピトープに結合することができる。例えば、第１抗原結合部位は、活性化受容体、例えばＣＤ１６ＡまたはＣＤ３に対する特異性を有し、第２抗原結合部位は、共刺激受容体、例えば、ＣＤ１３７またはＣＤ２８に対する特異性を有する。また別の実施例では、第１抗原結合部位はＣＤ１６Ａに対する特異性を有し、第２抗原結合部位はＮＫ細胞上のまた別の活性化受容体、例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ、ＮＣＲに対する特異性を有する。
【００１５】
また別の実施形態では、三重特異性抗原結合分子は、腫瘍細胞上の抗原エピトープに対する特異性を有する第１抗原結合部位、免疫エフェクター細胞上の抗原エピトープに対する特異性を有する第２抗原結合部位ならびに成長因子、サイトカイン、ケモカイン、マイトジェンおよびアルブミンの群から選択される可溶性タンパク質上の抗原エピトープに対する特異性を有する第３抗原結合部位を有する。そのような可溶性タンパク質の例は、ＩＬ−６、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ−Ａ、ＨＢ−ＥＧＦ、アンジオポエチン−２およびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。
【００１６】
また別の実施形態では、抗原結合分子は、１つのタイプの細胞上に存在する抗原の抗原エピトープに対する特異性を有する１つの抗原結合部位および１つ以上の他のタイプの細胞上の抗原エピトープの特異性を有する３つの抗原結合部位を有する。
【００１７】
「エフェクター細胞」は、細胞傷害性、食作用、抗原提示、サイトカイン遊離を刺激または誘発できる免疫系の細胞である。そのようなエフェクター細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞および抗原提示細胞であるが、それらに限定されない。エフェクター細胞に対する好適な特異性の例には、ＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ３サブユニット、例えばＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２８およびＴ細胞に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の他の成分；ＮＫ細胞に対するＣＤ１６、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ２５、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ９４、ＣＤ３３５（ＮＫｐ４６）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４４）、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＮＫｐ８０、ＮＫＧ２ＣおよびＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ、ＮＣＲ、顆粒球に対するＣＤ１８、ＣＤ６４およびＣＤ８９、単球およびマクロファージに対するＣＤ１８、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８９およびマンノース受容体；樹状細胞に対するＣＤ６４およびマンノース受容体、ならびにＣＤ３５が含まれるがそれらに限定されない。本発明の特定の実施形態では、エフェクター細胞のそれらの特異性、すなわち細胞表面分子は、そのような細胞表面分子への三重特異性抗原結合分子の結合後に細胞殺滅を媒介し、それにより細胞溶解またはアポトーシスを誘導するために好適である。
【００１８】
ＣＤ３抗原は、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体に会合している。エフェクター細胞に対する特異性がＣＤ３である場合は、本発明による抗原結合分子のＣＤ３への結合は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を誘発する。抗原結合分子のＣＤ３および標的細胞、例えば腫瘍細胞への結合によって、標的細胞の細胞溶解が誘導することができる。
【００１９】
ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＩＩＩＡ）抗原は、ＮＫ細胞の表面上で発現した受容体である。ＮＫ細胞は、固有の細胞溶解活性を有し、本発明による抗原結合分子がＣＤ１６またはＣＤ１６Ａに結合することによって、標的に向かうＮＫ細胞の細胞傷害活性を誘発することができる。
【００２０】
「標的」は、その上に抗原エピトープが位置する、および抗原結合分子が結合すべき部位である。標的の例は、細胞、例えばウイルスもしくは細菌病原体などの感染性因子、例えばデング熱ウイルス、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、ＨＣＶ、または、例えばＩＬ−２／ＩＬ２Ｒなどの自己免疫標的を持っている細胞、自己免疫マーカーまたは自己免疫抗原もしくは腫瘍細胞である。抗原結合部位の少なくとも１つがエフェクター細胞に対する特異性を有する実施形態では、標的は、各生物学的応答、例えば免疫応答を誘導もしくは誘発するために、エフェクター細胞がそれに向け直されなければならない腫瘍細胞であってよい。
【００２１】
腫瘍細胞に対する好適な特異性は、各腫瘍細胞上の腫瘍抗原または細胞表面抗原、例えば特異的腫瘍マーカーであってよい。本明細書で使用する用語「腫瘍抗原」は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を含む。本明細書で使用する用語「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）は、腫瘍細胞上ならびに胎児期中（以前の胎児性抗原）および選択された器官での生後の正常細胞上に、しかし腫瘍細胞上よりはるかに低い濃度で存在するタンパク質を意味する。ＴＡＡは、腫瘍細胞の近くのストローマ内でも存在する可能性があるが、身体内の他の場所の巣とローマ内ではより少量で発現する。これとは対照的に、用語「腫瘍特異的抗原」（ＴＳＡ）は、腫瘍細胞によって発現したタンパク質を意味する。用語「細胞表面抗原」は、細胞の表面上の抗体が認識することができる分子、そのあらゆる抗原またはフラグメントを意味する。
【００２２】
腫瘍細胞に対する特異性の例には、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ２００、ＣＤ２６７、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲ３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦＲ、ＩＧＦ−１Ｒ、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、トムゼン・フリーデンライヒ（Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ：ＴＦ）抗原、ＴＮＦＲＳＦ１７、ｇｐＡ３３、ＭＵＣ−１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＣＤ５、ＩＬ４−Ｒα、ＩＬ１３−Ｒ、ＦｃεＲＩ、ＭＨＣＩ／ペプチド複合体およびＩｇＥが含まれるが、それらに限定されない。
【００２３】
腫瘍特異性がＣＤ１９抗原に向けられている本発明による抗原結合分子は、ＣＤ１９抗原がリンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）から非ホジキン（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ）リンパ腫（ＮＨＬ）への実質的に全部のＢ系統悪性腫瘍上で発現するために、Ｂ細胞悪性腫瘍の免疫療法のために使用することができる。
【００２４】
腫瘍特異性がＣＤ３０に向けられている本発明による抗原結合分子は、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）およびＴ細胞リンパ腫を治療する際に特に有用な可能性がある。
【００２５】
身体内で本発明による抗原結合分子の血清中半減期を増加させるためには、抗原結合分子は、所望であれば、アルブミン、例えばＨＳＡに融合させることができる、またはペグ化、シアリル化もしくはグリコシル化させることができる（例えば、Ｓｔｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８３：７８０４−７８１２を参照されたい）。
【００２６】
一部の実施形態では、三重特異性抗原結合分子は、少なくとも１つの抗原結合部位を含み、抗原結合部位のＶＨ／ＶＬ対のＶＨおよびＶＬ領域は相互に非共有的に結合している、すなわちこのＶＨ／ＶＬ対のＶＨおよびＶＬ領域は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって連結（ｌｉｎｋ）されていない。特定の実施形態では、これらの非共有結合ＶＨおよびＶＬ領域は、多量体抗原結合分子の異なる、すなわち第１および第２ポリペプチド鎖上に位置する。他の実施形態では、これらの非共有結合ＶＨおよびＶＬ領域は、単量体抗原結合分子の同一ポリペプチド鎖上に位置するが、少なくともまた別の可変領域は、これらの非共有結合ＶＨおよびＶＬ領域の間にある単量体上に配列されている。一部の実施形態では、この抗原結合部位のこれらの非共有結合ＶＨおよびＶＬ領域の各々は、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって１つの並列する抗原結合部位の第２ＶＨ／ＶＬ対のＶＨまたはＶＬ領域に結合されている。好ましくは、並列する抗原結合部位のＶＨ／ＶＬ対のＶＨまたはＶＬ領域へのそのようなペプチドリンカーは、並列する領域間の分子内フォールディングを防止し、２つの相互に非共有結合したＶＨおよびＶＬ領域の会合を推し進めるために短い。例えば、ペプチドリンカーは、１２個以下のアミノ酸残基、好ましくは３〜９個のアミノ酸残基を含む。２つの非共有結合ＶＨおよびＶＬ領域による少なくとも１つの抗原結合部位の生成は、それがより緊密な抗原結合分子をもたらすために、抗原結合分子の安定性にとって有益である。
【００２７】
例えば、図１および２は、中央ＶＨ／ＶＬ対のＶＨおよびＶＬ領域（黒色で図示した）が相互に非共有結合している、三重特異性抗原結合分子を示している。この例では、非共有結合ＶＨおよびＶＬ領域は、異なるポリペプチド鎖上に位置している。この抗原のこれらの非共有結合ＶＨおよびＶＬ領域の各々は、１つの並列する抗原結合部位の第２ＶＨ／ＶＬ対のＶＨまたはＶＬ領域にペプチドリンカーＬ３またはＬ４によって結合している。
【００２８】
また別の実施形態では、三重特異性抗原結合分子は、少なくとも１つの第１抗原結合部位を含み、この第１抗原結合部位のＶＨ／ＶＬ対のＶＨおよびＶＬ領域は、相互に非共有結合している、すなわちこのＶＨ／ＶＬ対のＶＨおよびＶＬ領域はペプチドリンカーまたはペプチド結合によって連結しておらず、この第１抗原結合部位の非共有結合ＶＨ領域はペプチドリンカーによって第１抗原結合部位に並列して位置する第２抗原結合部位のＶＨ／ＶＬ対のＶＨ領域に結合しており、第１抗原結合部位の非共有結合ＶＬ領域は第１抗原結合部位に並列して位置する第２抗原結合部位のＶＨ／ＶＬ対のＶＬ領域にペプチドリンカーによって結合している。抗原結合分子が一本鎖である、すなわち単量体のポリペプチドである実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域が同一ポリペプチド鎖上に配列されている。抗原結合分子が多量体、すなわち多重鎖のポリペプチドである実施形態では、第２抗原結合部位のＶＨ領域へペプチドリンカーまたはペプチド結合によって結合された第１抗原結合部位のＶＨ領域は第１ポリペプチド上に位置し、第２抗原結合部位のＶＬ領域へペプチドリンカーまたはペプチド結合によって結合された第１抗原結合部位のＶＬ領域は、第２ポリペプチド上に位置する。好ましくは、ペプチドリンカーは、各々並列するＶＨ−ＶＨおよび並列するＶＬ−ＶＬ領域間での分子内フォールディングを防止し、第１および第２抗原結合部位を形成するためにＶＨ−ＶＨ領域とＶＬ−ＶＬ領域との会合を推し進めるために、短く、例えば１２個未満の残基、好ましくは３〜９個のアミノ酸残基である。このＶＨ−ＶＨおよびＶＬ−ＶＬ領域配列は、三重特異性抗原結合分子の正確なフォールディングを促進する。
【００２９】
「抗原結合分子」は、好ましくは少なくとも４つの抗原結合部位を有する、多価抗原結合特性を備える免疫グロブリン誘導体の分子を意味する。抗原結合分子は、一本鎖、すなわち単量体のポリペプチドまたは多重鎖、すなわち多量体のポリペプチドであってよい。抗原結合分子の各ポリペプチドは、ペプチドリンカーまたはペプチド結合によって相互に連結された抗体可変（Ｆｖ）領域を含む。各抗原結合部位は、同一抗原エピトープに結合する抗体、すなわち免疫グロブリン可変重鎖領域（ＶＨ）および抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）によって形成される。抗原エピトープは、同一または異なる抗原上にあってよい。好ましくは、本発明による抗原結合分子は、免疫グロブリン定常領域またはそのフラグメントを含んでいない。
【００３０】
用語「ポリペプチド」は、アミド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを意味する。ポリペプチドは、好ましくは、分岐鎖状ではない一本鎖融合タンパク質である。ポリペプチド内では、抗体可変（Ｆｖ）領域は、次々に結合している。ポリペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端に加えて、隣接アミノ酸残基を有していてよい。例えば、ポリペプチドは、好ましくは、ポリペプチドの精製のために有用な可能性があるＣ末端で、Ｔａｇ配列を含有していてよい。Ｔａｇ配列の例は、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、例えば６つのＨｉｓ残基からなるＨｉｓ−Ｔａｇ、例えばＤＹＫＤＤＤＤＫオクタペプチド（配列番号５）であるＦＬＡＧ、または例えばＷＳＨＰＱＦＥＫオクタペプチド（配列番号６）であるＳＴＲＥＰ（登録商標）ＩＩである。多量体抗原結合分子のためには、好ましくは異なるＴａｇ配列が異なるポリペプチドのために使用される。
【００３１】
ペプチドリンカーのアミノ酸組成に関して、領域の会合を干渉しない、ならびに多量体分子の多量体化、例えば二量体化を妨害しないペプチドが選択される。例えば、グリシンおよびセリン残基を含むリンカーは、一般にプロテアーゼ耐性を提供する。リンカーのアミノ酸配列は、例えば、抗原結合分子の抗原結合および生産収率を改善するためにファージディスプレイ法によって最適化することができる。一の実施形態では、（Ｇ２Ｓ）ｘペプチドリンカーが使用される。
【００３２】
本発明の一部の実施形態では、少なくとも１つ、好ましくは全部の抗体可変領域は、完全にヒト、ヒト化またはキメラ領域である。ヒト化抗体は、明確に確立された方法、例えば、ＣＤＲグラフト化法によって生成できる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．Ｌｏ；Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．ＩＩ  Ｓｅｒｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）を参照されたい）。そこで、当業者であれば、非ヒト、例えばマウスまたは非霊長類起源から、ヒト免疫系における抗原結合分子の免疫原性を減少させて有効性を改善するために、当分野において公知の標準分子生物学技術を用いて、抗原結合分子および可変領域のヒト化または完全にヒトバージョンを容易に作製することができる。本発明の好ましい実施形態では、全抗体可変領域は、ヒト化または完全にヒトである、最も好ましくは、本発明による抗原結合分子は、ヒト化または完全にヒトである。本明細書で使用する用語「完全にヒト」は、ポリペプチド内の可変領域および可変領域を結合するペプチドのアミノ酸配列はヒトに由来する、またはヒトにおいて見出せることを意味する。本発明の特定の実施形態では、可変領域は、ヒトまたはヒト化の可能性があるが、抗体可変領域を結合するペプチドはヒトまたはヒト化ではない可能性がある。
【００３３】
一部の実施形態では、本発明は、多機能性抗原結合ポリペプチド多量体を提供する。
【００３４】
一部の実施形態では、本発明は、３つの異なる抗原またはエピトープを標的とするために設計された三機能性抗原結合ポリペプチド多量体の抗原結合分子を提供する。そのような多量体は、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含む。２つのポリペプチドの各々は、各ポリペプチドのＮ末端からＣ末端へ相互に結合された少なくとも４つの抗体可変領域を有する一本鎖融合ペプチドである。これらのポリペプチドの各々は、同一ポリペプチド内の分子内対合を防止するための短いリンカーによって連結された２つの抗体可変領域および同一ポリペプチド内の可変領域対によって抗原結合部位を分子内形成できる他の２つの可変領域の抗体可変領域対を有する一本鎖Ｆｖユニットを含む。多量体は、２つのポリペプチド間の非共有会合によって形成されるが、他方１つのポリペプチドの短いリンカーによって連結された２つの抗体可変領域は、他のポリペプチドの２つの対応する抗体可変領域と会合し、それにより２つの追加の抗原結合部位を形成する。そこで、この多量体は、少なくとも４つの抗原結合部位を含み、少なくとも四価である。本発明の特定の態様では、多量体は、二量体である、すなわち２本のポリペプチド鎖からなる。
【００３５】
そのような三重特異性および四価の抗原結合二量体を生成するためには、２つのポリペプチドは、３つの特異性のうちの少なくとも１つに関して、各抗体可変軽鎖領域および可変重鎖領域は、この特異性に対してポリペプチドの１つが可変重鎖領域しか含有せず、他のポリペプチドはこの特異性に対する可変軽鎖領域しか含有しないように異なるポリペプチド内に挿入されなければならないので、異なる抗体可変領域組成を備えていなければならない。そこで、本発明によるそのような二量体は、２つの異なるポリペプチドから構成されているために、ヘテロ二量体である。
【００３６】
３つの異なる特異性のための抗体可変領域を含む２つの異なるポリペプチドの正確な会合を可能にするため、および２つの同一ポリペプチド間の間違ったホモ二量体化を防止するために、特定の措置を講じることができる。例えば、本発明者らは、１つのポリペプチド内で短いリンカーによって連結された２つの抗体可変重鎖領域を挿入することおよび他のポリペプチド内に短いリンカーによって連結された２つの対応する抗体可変軽鎖領域を挿入することによって、２つの異なる三重特異性ポリペプチド間の正確なヘテロ二量体化を得た。驚くべきことに、三重特異性抗原結合ポリペプチド二量体のヘテロ二量体種だけが形成されている。
【００３７】
このため、一の実施形態では、本発明は、
三重特異性抗原結合分子であって、第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチドを含む三重特異性抗原結合ポリペプチド二量体であり、各ポリペプチドが相互に連結した少なくとも４つの抗体可変領域を有する三重特異性抗原結合分子を提供するが、このとき
（ａ）第１ポリペプチドは、例えば約１２個以下のアミノ酸残基の同一ポリペプチド内の分子内対合を防止する第１リンカーによって相互に結合された第１および第２抗体可変重鎖領域（ＶＨ）ならびに第２ペプチドリンカーによって抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）と結合された第３抗体可変重鎖領域（ＶＨ）を有する一本鎖Ｆｖ抗原結合ユニットを含み、前記第３抗体可変重鎖領域（ＶＨ）および抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）は、第１抗原結合部位に会合することができ、第２抗体可変重鎖領域（ＶＨ）は、第３ペプチドリンカーによって一本鎖Ｆｖ抗原結合ユニットと結合されている、および
（ｂ）第２ポリペプチドは、例えば約１２個以下のアミノ酸残基の同一ポリペプチド内の分子内対合を防止する第２リンカーによって相互に連結された第１および第２抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）ならびに第２ペプチドリンカーによって抗体可変重鎖領域（ＶＨ）と連結された第３抗体可変領域（ＶＬ）を有する一本鎖Ｆｖ抗原結合ユニットを含み、前記第３抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）および抗体可変重鎖領域（ＶＨ）は、第２抗原結合部位に会合することができ、第２抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）は、第３ペプチドリンカーによって一本鎖Ｆｖ抗原結合ユニットと結合されている、および
（ｃ）第１ポリペプチドの第１および第２抗体可変重鎖領域（ＶＨ）は、二つの追加の、すなわち第３および第４抗原結合部位へ第２ポリマーの第１および第２抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）と結合するが、他方１つの好ましい実施形態では、第１ポリペプチドの第１抗体可変重鎖領域（ＶＨ）は、第２ポリペプチドの第２抗体軽鎖領域（ＶＬ）と第３抗原結合部位へ会合し、第１ポリペプチドの第２抗体可変重鎖領域（ＶＨ）は、第２ポリペプチドの第１抗体可変軽鎖領域（ＶＬ）と第４抗原結合部位へ会合する。
【００３８】
三重特異性抗原結合ポリペプチド二量体は、前記４つの抗原結合部位の２つが同一抗原に対して特異的である場合に形成される。
【００３９】
そのような三重特異性二量体は、３つの異なる特異性を認識し、例えば、標的細胞上の２つの異なる抗原もしくはエピトープを標的とすることができ、および第三機能性、すなわち特異性を用いて、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫エフェクター細胞に結合する。
【００４０】
本発明による三重特異性二量体は、様々な方法で利用できる。
【００４１】
例えば、抗体可変領域は、他のポリペプチドの２つの対応する抗体可変領域と会合する２つの抗体可変領域を、例えば、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に配置できるように、ポリペプチド内に配列することができる。これらの２つの抗体可変領域は、同一の特異性または別個の特異性を有していてよい。例えば、両方が同一免疫エフェクター細胞にとって特異的である場合がある、または腫瘍細胞上の２つの抗原に対して別個の特異性を有している場合がある。
【００４２】
さらに、一本鎖Ｆｖユニットを形成する２つの抗体可変領域は、例えばポリペプチドのＮ末端からＣ末端に向かう方向にＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨの順序にある可能性がある。２つの二量体化ポリペプチドの一本鎖Ｆｖユニットは、同一または異なる特異性を有する可能性がある。例えば、他のポリペプチドの２つの対応する抗体可変領域と会合する２つの抗体可変領域が同一特異性を有する場合、２つのポリペプチドの一本鎖Ｆｖユニットは、三重特異性二量体を達成するために異なる特異性を有する。
【００４３】
そこで、少なくとも４つの抗体可変領域は、例えば、他のポリペプチドの２つの対応する抗体可変領域と会合する２つの抗体可変領域が免疫エフェクター細胞に対して特異的であり、２つのポリペプチドの一本鎖Ｆｖユニットが２つの別個の腫瘍抗原に対する特異性を有する、または他のポリペプチドの２つの対応する抗体可変領域と会合する２つの抗体可変領域が別個の腫瘍抗原に対して特異的であり、２つのポリペプチドの両方の一本鎖Ｆｖユニットが免疫エフェクター細胞に対して同一特異性を有するように配列することができる。
【００４４】
抗原結合ポリペプチドは「二量体」であり、この用語は、第１および第２ポリペプチド単量体の複合体を意味する。一の態様では、抗原結合ポリペプチド二量体は「ヘテロ二量体」であり、この用語は抗原結合ポリペプチドが２つの別個のポリヌクレオチドによってコードされる２つの異なるポリペプチド単量体から構成されることを意味する。
【００４５】
好ましくは、抗原結合二量体では、第１および第２ポリペプチドは、特に第１および第２ポリペプチド間に非共有結合があることを前提に、相互に非共有結合している。しかし、所望であれば、２つのポリペプチドは、少なくとも１つの共有結合によって、例えば異なるポリペプチドのシステイン残基間のジスルフィド架橋によって更に安定させることができる。
【００４６】
リンカーの長さは、抗原結合ポリペプチド二量体の柔軟性に影響を及ぼす。抗原結合ポリペプチド二量体の所望の柔軟性は、標的抗原密度および標的抗原、すなわちエピトープの接近可能性（ａｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）に左右される。リンカーが長いほど、よりしなやかな抗原結合部位を備える、より柔軟性の抗原結合ポリペプチド二量体を提供する。リンカーの長さが二量体抗原結合ポリペプチドの形成に及ぼす影響は、例えば、Ｔｏｄｏｒｏｖｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８：４７−６６；Ｐｅｒｉｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１２１７−１２２６；Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １７：３５７−３６６および国際公開第９４／１３８０４号パンフレットに記載されている。
【００４７】
本発明によると、第１ポリペプチドの第１および第２抗体可変重鎖領域ならびに第２ポリペプチドの第１および第２抗体可変軽鎖領域の第１ペプチドリンカーの長さは、第１ポリペプチドの領域が第２ポリペプチドの領域と分子間会合して、二量体抗原結合ポリペプチドを形成できるような長さであることが好ましい。そのようなリンカーは、「短い」、すなわち０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または約１２個のアミノ酸残基からなる。アミノ酸残基がゼロの場合には、リンカーは、ペプチド結合である。そのような短いリンカーは、異なるポリペプチドの抗体可変軽鎖領域と抗体可変重鎖領域との間を結合、及び抗原結合部位を形成することによる、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの正確な二量体化に好都合である。リンカーを約１２個以下のアミノ酸残基に短縮することは、一般に、同一ポリペプチド鎖の隣接領域が相互作用することを防止する。本発明の一の実施形態では、これらのリンカーは、約３から約１０、例えば７個の隣接アミノ酸残基からなる。それに加えて、原則的には、可変抗体領域間の１２個超のアミノ酸残基を備えるリンカーを有する２つのポリペプチドが相互に正確に二量体化することが可能である（例えば、Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １７：３５７−３６６を参照されたい）。
【００４８】
ポリペプチドの一本鎖Ｆｖユニットについては、第２ペプチドリンカーは、分子内で頭−尾でフォールディングするため、および、一本鎖抗原結合（ｓｃＦｖ）ユニットを形成するために、長く柔軟性である（一般に、約１２個以上のアミノ酸残基からなる）。追加のアミノ酸残基は、追加の柔軟性を提供する。例えば、ポリペプチド内の一本鎖ＦｖユニットのＶＨおよびＶＬ、または、ＶＬおよびＶＨ間のこのリンカーは、約１２〜約３５個、特に１５〜２５個の隣接アミノ酸残基からなっていてよい。
【００４９】
一本鎖Ｆｖユニットを他のポリペプチドの対応する可変領域と会合する他の２つの抗体可変領域と連結するためのポリペプチドの第３ペプチドリンカーは、例えば、５から３０、好ましくは少なくとも６、７、８、９、１０、１１または１２個の隣接アミノ酸残基であってよい。
【００５０】
本発明の一の実施形態では、三重特異性抗原結合ポリペプチド二量体は、腫瘍細胞上の２つの別個の抗原に対しては二重特異性であり、さらにエフェクター細胞に対して、特にＴ細胞またはＮＫ細胞に対して特異的である。腫瘍細胞に対する好適な特異性は、各腫瘍細胞上の腫瘍抗原または細胞表面抗原、例えば特異的腫瘍マーカーであってよい。そのような三重特異性抗原結合二量体は、腫瘍細胞および免疫エフェクター細胞に二機能性で結合し、これによりＴ細胞もしくはＮＫ細胞により誘導された細胞傷害応答を誘発する。
【００５１】
本明細書に記載した実施形態のいずれか１つによる抗原結合分子は、抗原結合分子を形成する個々のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを発現することによって生成することができる。このため、本発明のまた別の実施形態は、ポリヌクレオチド、例えば、上述した抗原結合分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００５２】
ポリヌクレオチドは、当業者には公知の方法によって、例えば、ペプチドリンカーによって分離された、またはポリペプチドのペプチド結合によって直接連結された抗体可変領域をコードする遺伝子を好適なプロモーター、および任意選択的に好適な転写ターミネーターに機能的に連結した遺伝子構築物に組み合わされ、およびそれを細菌内、または、例えばＣＨＯ細胞などの他の適切な発現系内で発現させることによって構築することができる。利用されるベクター系および宿主に依存して、構成的および誘導性プロモーターを含むあらゆる多数の好適な転写および翻訳エレメントが使用されてよい。プロモーターは、プロモーターが各宿主細胞内でのポリヌクレオチドの発現を駆動するように選択される。
【００５３】
ポリヌクレオチドは、ベクター内、好ましくは本発明のまた別の実施形態を表す発現ベクター内に挿入されてよい。これらの組換えベクターは、当業者であれば周知の方法によって構築することができる。
【００５４】
様々な発現ベクター／宿主系は、本発明のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含ませる、および、発現させるために利用できる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現させるための発現ベクターの例は、哺乳動物細胞内で発現させるためのｐＳＫＫ（ＬｅＧａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）２８５（１）：１１１−２７）またはｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）である。
【００５５】
そこで、本明細書に記載した抗原結合分子は、上述したポリペプチド鎖をコードするベクターを宿主細胞内に導入する工程、および、それによりポリペプチド鎖が発現する条件下で前記宿主細胞を培養する工程によって生成し、単離し、および任意選択的にさらに精製することができる。
【００５６】
本発明のまた別の実施形態では、上述の抗原結合分子、ポリヌクレオチド、および少なくとも１つの追加の成分を含む組成物が提供される。
【００５７】
本発明はさらに、上述した抗原結合分子を、癌（例えば、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病）を治療するために被験者、例えば患者に有効量で投与する方法を提供する。抗原結合分子は、医薬品として使用できる。
【００５８】
当業者であれば、当分野において公知の確立された技術および標準方法を利用することによって、過度の負担を伴わずに本明細書に記載した抗原結合分子を容易に構築および入手することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．（２００２）；またはＡｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．Ｌｏ、Ｂｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．ＩＩ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）を参照されたい。
【００５９】
（図面の簡単な説明）
（図１）本発明による三機能性、すなわち三重特異性の抗原結合ポリペプチド二量体を形成するための第１および第２ポリペプチドを示す図である。第１ポリペプチドは、次々に連結された４つの抗体可変領域ＶＨ、ＶＬ、ＶＨ、ＶＨを有する。第１および第２ＶＨ抗体可変領域（黒色）は、同一の第１特異性を有し、同一ポリペプチド内の分子内対合を防止するために短いリンカーＬ３および同一ポリペプチド内の可変領域対によって第２特異性の抗原結合部位を分子内で形成できる第２リンカーＬ１によって連結された他の第３可変抗体領域ＶＬおよび第４可変抗体領域ＶＨの抗体可変領域対（白色）を有する一本鎖Ｆｖユニットによって連結されている。異なる特異性の第２抗体可変領域ＶＨおよび第３抗体可変領域ＶＬは、第３リンカーＬ２によって連結されている。
第２ポリペプチドは、次々に連結された４つの抗体可変領域ＶＬ、ＶＬ、ＶＬ、ＶＨを有する。第１および第２ＶＬ抗体可変領域（黒色）は、同一の第１特異性を有し、同一ポリペプチド内の分子内対合を防止するために短いリンカーＬ４ならびに他の第３可変抗体領域ＶＬおよび第３特異性を有する第４可変抗体領域ＶＨの抗体可変領域対（灰色）を有する一本鎖Ｆｖユニットによって連結され、および同一ポリペプチド内の可変領域対によって抗原結合部位を分子内で形成できる第２リンカーＬ１によって連結されている。異なる特異性の第２抗体可変領域ＶＬおよび第３抗体可変領域ＶＬは、第３リンカーＬ２によって連結されている。
（図２）図１の２つのポリペプチド間の非共有会合によって形成された抗原結合ポリペプチド二量体を示す図であり、第１ポリペプチドの短いリンカーによって連結された２つの抗体可変ＶＨ領域は第２ポリペプチドの２つの対応する抗体可変ＶＬ領域と会合し、それにより同一特異性を有する２つの抗原結合部位（黒色）を形成するが、他方第２特異性は、第１ポリペプチド（白色）の一本鎖Ｆｖユニットによって提供され、第３特異性は第２ポリペプチド（灰色）の一本鎖Ｆｖユニットによって提供される。
（図３）腫瘍細胞の二重標的化のための三重特異性抗体である、本発明による三機能性抗原結合分子、特に三機能性抗原結合ポリペプチドを示す図である。抗体、すなわち抗原結合ポリペプチドは、腫瘍細胞上の２つの異なる標的／エピトープを標的とするように設計されており、第３機能性はエフェクター細胞に高親和性で結合する。抗原結合ポリペプチドは、４つの抗原結合部位からなるが、２つの中央抗原結合部位は腫瘍細胞上の２つの異なる抗原に結合し、２つの周辺抗原結合部位はエフェクター細胞に結合する。
【実施例】
【００６０】
以下の実施例では、本発明の範囲を限定することなく、本発明についてさらに例示する。
【００６１】
（実施例１）
ＤＮＡ構築物：
ポリペプチド鎖をコードするプラスミドＤＮＡは、ＤＮＡ操作または遺伝子合成およびシーケンシングによって生成される。哺乳動物細胞の一過性または安定性トランスフェクションのための発現構築物は、真核細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ５／ＦＲＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）をベースとしており、ウイルスもしくはユビキタスなプロモーターの制御下で対象の生成物遺伝子ならびに選択マーカーとしてのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）耐性カセットを含む。精製および分析のためには、生成物鎖は、Ｈｉｓ−タグ、ＦＬＡＧ−タグまたはＳｔｒｅｐＩＩ−タグを備えて発現する。
【００６２】
細胞系および細胞培養
ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズ・ハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ）卵巣細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−６１）の誘導体であるＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）（Ｋａｏ  ａｎｄ  Ｐｕｃｋ，１９６８）は、Ｌ−グルタミン、１０％のＦＣＳおよび１００μｇ／ｍＬのゼオシンが補充されたＨａｍのＦ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘ中で培養する。付着性細胞は、０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡで剥離し、標準細胞培養プロトコルにしたがって継代培養する。
【００６３】
懸濁液中での増殖に順応させるために、細胞を組織培養フラスコから剥離させ、３７℃、５％のＣＯ２および１２０ｒｐｍで振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）内でその後のインキュベーションのために無血清培地中に静置する。懸濁液順応Ｆｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞を培養するための標準培地は、Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、ＨＴサプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）および１００μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）が補充されたＨｙＣｌｏｎｅ  ＣＤＭ４  ＣＨＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）である。懸濁液順応細胞は、２Ｅ＋６から３Ｅ＋６細胞／ｍＬの播種密度で２〜３日毎に継代培養する。細胞の濃度および生存性は、トリパンブルー色素排除法を使用して全培養中で決定する。細胞は、１０％のＤＭＳＯを含む培地中で低温保存し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を使用してマイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）に対する陰性を試験する。
【００６４】
安定性にトランスフェクトした細胞プールの生成
三重特異性候補抗体を安定性に発現する組換えＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞系は、懸濁液順応細胞のトランスフェクションによって生成する。このため、細胞は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、対象のタンパク質（ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ）をコードする発現プラスミド（２．５μｇ）およびＦｌｐリコンビナーゼ（ｐＯＧ４４、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）でのコトランスフェクションの前日にゼオシンを含まない標準培地中に静置する。手短には、ベクターＤＮＡおよびトランスフェクション試薬を計１００μＬのＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）中で１：３のＤＮＡ：ＰＥＩ質量比で混合し、１０分間インキュベートし、その後に１ｍＬのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中に懸濁させた２Ｅ＋６のＦｌｐ−Ｉｎ  ＣＨＯ細胞に添加する。２４時間のインキュベーション後、安定性にトランスフェクトした細胞の選択は、培養をＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中での０．１Ｅ＋６生存細胞／ｍＬに希釈し、Ｔ７５の培養フラスコ中で播種した後に５００μｇ／ｍＬのハイグロマイシンＢの添加によって開始する。Ｆｌｐリコンビナーゼは、部位特異性ＤＮＡ組換え法（Ｏ’  Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９１）を通して統合ＦＲＴ部位でのゲノム内へのＦｌｐ−Ｉｎ発現構築物の挿入を媒介する。選択中、生存性細胞密度を週２回測定し、細胞を遠心し、０．１Ｅ＋６の生存性細胞／ｍＬの最高密度で新鮮選択培地中に再懸濁させる。組み換えタンパク質生成物を安定性で発現する細胞プールは、選択のおよそ三週間後に回収し、その時点に細胞は振とうフラスコ内で標準培養培地へ移す。組換え分泌タンパク質の発現は、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）テクノロジーを使用する細胞培養上清のタンパク質ゲル電気泳動法によって確証する。安定性細胞プールは、５０％のＰｒｏＦｒｅｅｚｅ（Ｌｏｎｚａ製）および７．５％のＤＭＳＯを含有する培地中に低温保存する。
【００６５】
流加回分（Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）ＣＨＯ細胞懸濁液培養中での組換え分泌タンパク質の生成
組換えタンパク質は、安定性にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞系の１０日間流加回分培養中で、細胞培養上清中への分泌によって生成する。このため、対象の生成物を安定性に発現する細胞プールは、ガス透過性キャップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）を備えるポリカーボネート製エルレンマイヤーフラスコ内の標準培養培地中で６Ｅ＋５細胞／ｍＬの出発密度で播種し、１４０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートする。流加回分培養中、培地には第０日（開始日）に４０ｍＬ／ＬのＡｃｔｉＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  Ａ（ＰＡＡ）および４ｍＬ／ＬのＡｃｔｉＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（ＰＡＡ）を、および第３、５および７日には２倍量を補充する。細胞培養上清は、典型的には＞７５％の培養生存性で１０日後に採取する。サンプルは、補充する前に２日毎に生成培養から収集し、細胞密度および生存性を評価する。採取日に、さらに使用する前にＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＰＬＵＳ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を使用して細胞培養上清を遠心分離および真空濾過（０．２２μｍ）によって澄ませる（ｃｌｅａｒ）。
【００６６】
発現力価の決定
細胞培養上清（ＣＣＳ）中のタンパク質発現力価および生成物完全性は、第７日および１０日（０．２２μｍ濾過の前および後）にＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。生成物力価は、公知の濃度の参照タンパク質との比較によって半定量的に決定する。
【００６７】
三重特異性抗原結合ポリペプチドの精製
Ｈｉｓタグ化生成物は、Ｎｉ−ＮＴＡ−および予備的サイズ排除クロマトグラフィーを含む二段階手順でＣＨＯ細胞培養上清から精製する。第一に、上清は真空濾過（０．２２μｍ）によって澄ませ、５ｍＭのイミダゾールへ調整し、その後に５ｍＬ／分の流量でＩＭＡＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ中で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦクロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）に装填する。その後、カラムは５ＣＶのＩＭＡＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ａおよび１０ＣＶのＩＭＡＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＡおよびＩＭＡＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（７％）の混合物で洗浄する。Ｈｉｓタグ生成物は、その後同一流量で１０ＣＶの３０％のＩＭＡＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂおよび５ＣＶの１００％のＩＭＡＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂを用いて連続的な洗浄により溶出させる。２．５ｍＬの溶出画分を収集し、タンパク質の含量および純度は、各画分を一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけその後にＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅテクノロジー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用するタンパク質の可視化を実施することによって評価する。生成物含有画分をプールし、限外濾過によって濃縮する。引き続いて、濃縮サンプルは、ＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）カラムを使用するゲルろ過によって精製し、２．５ｍＬ／分でＳＥＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  （２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中で溶出させる。分子重量マーカータンパク質（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）のカラム滞留を用いて溶出体積の比較によって決定した精製生成物を含有する画分を収集してプールする。ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製）を使用した最終バッファー交換（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）の後に、サンプルは、上述のように限外濾過によって１．０〜１．５ｍｇ／ｍＬに濃縮する。最終サンプルの純度および均質性（典型的には＞９０％）は、選択した事例において、上述したように還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後にタンパク質のＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅゲル可視化によって、その後に特異的抗体を用いた免疫ブロッティングおよび分析的ＳＥＣ各々によって評価する。精製タンパク質は、その後に使用するまで−８０℃でアリコートとして保存する。
【００６８】
（実施例２）
ＣＤ３×ＣＤ１９×ＣＤ３０三重特異性分子
抗体ＯＫＴ３、ＨＤ３７およびＨＲＳ３各々に由来するＣＤ３−、ＣＤ１９−およびＣＤ３０−抗体可変結合領域を含有する抗原結合ポリペプチド二量体は、実施例１によって生成する。
【００６９】
Ｔｒｉｓｐｅｃ  １：
ＶＨ（ＣＤ３）−（Ｇ２Ｓ）２−ＶＨ（ＣＤ３）−（Ｇ２Ｓ）３−ＶＨ（ＣＤ３０）−（Ｇ２Ｓ）５−ＶＬ（ＣＤ３０）−ＨｉＳ６（配列番号１）
ＶＬ（ＣＤ３）−（Ｇ２Ｓ）２−ＶＬ（ＣＤ３）−（Ｇ２Ｓ）３−ＶＨ（ＣＤ１９）−（Ｇ２Ｓ）５ＶＬ（ＣＤ１９）−ＦＬＡＧ（配列番号２）
【００７０】
Ｔｒｉｓｐｅｃ  ２：
ＶＨ（ＣＤ３０）−（Ｇ２Ｓ）２−ＶＨ（ＣＤ１９）−（Ｇ２Ｓ）２−ＶＨ（ＣＤ３）−（Ｇ２Ｓ）５−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｈｉｓ６（配列番号３）
ＶＬ（ＣＤ１９）−（Ｇ２Ｓ）２−ＶＬ（ＣＤ３０）−（Ｇ２Ｓ）２−ＶＨ（ＣＤ３）−（Ｇ２Ｓ）５−ＶＬ（ＣＤ３）−ＦＬＡＧ（配列番号４）
【００７１】
リンカー１＝（Ｇ２Ｓ）２、リンカー２＝（Ｇ２Ｓ）５、リンカー３＝（Ｇ２Ｓ）３
【００７２】
Ｔｒｉｓｐｅｃ  １およびＴｒｉｓｐｅｃ  ２の免疫沈降法は、抗原結合ポリペプチド二量体のヘテロ二量体種だけが検出されることを示している。Ｔｒｉｓｐｅｃ  １およびＴｒｉｓｐｅｃ  ２は、７日間後に４０℃および１時間後にｐＨ３．５で優れた安定性を示す。
【００７３】
（例）
三重特異性抗体によって媒介される細胞傷害活性の評価
試験手順
バッフィーコートからのＰＢＭＣの単離およびＴ細胞の濃縮
ＰＢＭＣは、バッフィーコートから密度勾配遠心分離によって単離する。Ｔ細胞は、ＰＢＭＣ集団から、製造業者の取扱説明書にしたがって、手つかずのヒトＴ細胞の免疫磁気単離用のＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＨＵＭＡＮ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ＫｉｔおよびＢｉｇ  Ｅａｓｙ  ＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｍａｇｎｅｔを使用して濃縮する。
【００７４】
ＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ
エフェクター細胞として使用されるＴ細胞は、記載されたようにフローサイトメトリーによって特徴付ける。
標的細胞（ＭＥＣ−１：ＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ４９７；ＮＡＬＭ−６：ＤＳＭＺ、カタログ番号：ＡＣＣ１２８）は、下記に記載するように標準条件下で培養する。細胞傷害性アッセイのために、標的細胞を採取し、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて二回洗浄し、２×１０７／ｍＬの密度へＰＫＨ６７Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｋｅｒ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ内に用意された希釈液Ｃ中に再懸濁させる。細胞懸濁液は次に、等量の二重濃縮ＰＫＨ６７標識溶液（例えば、２５０μＬの希釈液Ｃ中の１μＬのＰＫＨ６７）と混合し、製造業者の取扱説明書にしたがってインキュベートする。染色反応を停止させる。標識した標的細胞を完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した後、細胞を計数し、完全ＲＰＭＩ培地中で２×１０５／ｍＬの密度へ再懸濁させる。
【００７５】
２×１０４個の標的細胞は、次に個別ウエル中でＴ細胞および指示された抗体と一緒に播種する。抗体の非存在下での自発的な細胞死およびエフェクターによる標的の殺滅を決定する。
【００７６】
インキュベーション後、培養はＦＡＣＳバッファーを用いて一回洗浄し、次に２μｇ／ｍＬのＰｌが補充された１５０μＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させる。陽性緑色ＰＫＨ６７染色によって特徴付けられるがＰＩ染色については陰性である生存標的細胞の絶対量は、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＦＣ５００  ＭＰＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ製）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を使用して測定する。
【００７７】
測定された残留生存標的細胞に基づくと、特異的細胞溶解のパーセンテージは、以下の式：［１−（生存標的（サンプル）の数）／（生存標的（自発的）の数）］×１００％にしたがって計算する。シグモイド用量応答曲線およびＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン６．００、Ｗｉｎｄｏｗｓ用、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を使用して非線形回帰／４パラメーターロジスティックフィット（ｌｏｇｉｓｔｉｃ  ｆｉｔ）によって計算する。
【００７８】
統計的分析
所定の抗体濃度について得られた溶解値は、Ｐｒｉｓｍソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、バージョン６．００、Ｗｉｎｄｏｗｓ用、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を使用するシグモイド用量応答／４パラメーターロジスティックフィット分析によって決定および分析し、ＥＣ５０値および反復した溶解率の平均値およびＳＤを計算するために使用した。
【００７９】
結果
Ｔｒｉｓｐｅｃ  １およびＴｒｉｓｐｅｃ  ２は、各単一陽性細胞系と比較すると、二重陽性細胞系（ＣＤ１９＋およびＣＤ３０＋）上でより高い細胞傷害能を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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