(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；  
配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６９のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
配列番号５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
を含有することを特徴とするメソテリン特異的抗体。
【請求項２】
配列番号１、３、４６、４８、５１、または１１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載のメソテリン特異的抗体。
【請求項３】
配列番号２、４、４７、４９、５２、１０９、または１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含有することを特徴とする請求項１に記載のメソテリン特異的抗体。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号４６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号５１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号４８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
配列番号１１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号１１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
を含有することを特徴とする請求項１に記載のメソテリン特異的抗体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の抗体をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞を培養して抗体を発現させるステップを含む請求項１〜４のいずれかに記載の抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＳＬＮ）に特異的に結合する抗体、前記抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、前記抗体の製造方法、および前記抗体を有効成分として含む癌または腫瘍治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、固形腫瘍を含む様々な癌または腫瘍の治療において非常に効果的である。例えば、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は乳癌の治療に、アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）は大腸癌の治療に成功的に用いられている。抗体を用いた癌または腫瘍治療法の開発の核心は、腫瘍細胞で優勢に発現（過発現）する膜表面タンパク質に対する抗体を開発することにある。
【０００３】
メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＳＬＮ）は、６９〜７１ｋＤａの前駆体ポリペプチドであって糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であり、細胞の表面上においてグリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）‐結合タンパク質の前駆体の形態で発現される。前記前駆体は、前駆体中のフューリン（ｆｕｒｉｎ）部位（ＲＰＲＦＲＲ）で分割されると、４０ｋＤａのＣ‐末端ポリペプチドであるＧＰＩ‐結合メソテリン膜タンパク質と、細胞から遊離されるＮ‐末端ポリペプチドである３２ｋＤａの巨核球増強因子（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ、ＭＦＰ）を形成することとなる（Hassan R. et al., Clin. Cancer Res., 10(12 Pt 1):3937-3942, 2004; Chang, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93(1):136-40, 1996）。
【０００４】
メソテリンは、ヒトの膵臓細胞株であるＨＰＣ‐Ｙ５から精製され、巨核球増強活性（ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ‐ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有するということが観察されており、巨核球増強因子（ＭＦＰ、ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）と命名された（Yamaguchi N. et al., J. Biol. Chem. 269:805-808, 1994）。
【０００５】
メソテリンの機能は未だに明らかではなく、メソテリン遺伝子の発現を欠乏したマウス（ｍｏｕｓｅ）を作製した際に、致命的な生殖学的、血液学的、または解剖学的異常は観察されなかった（Bera, T.K. et al., Mol. Cell. Biol. 20(8):2902-2906, 2000）。
【０００６】
メソテリンは、腹膜、胸膜、および心膜の体腔の中皮層（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｌｉｎｉｎｇ）の細胞表面に存在する糖タンパク質である。メソテリンは、癌／腫瘍細胞である中皮腫（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ）、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、肺癌、および子宮内膜癌で優勢に発現（過発現）されるのに対し、正常細胞、例えば、中皮細胞ではその発現が限定されるため、腫瘍治療法の理想的な標的となることができる（Argani, P. et al., Clin. Cancer Res., 7(12):3862-8, 2001; Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 10(12 Pt 1):3937, 2004）。
【０００７】
また、メソテリンは、卵巣癌の抗原として確認された、腫瘍細胞の表面に存在するムチン‐類似糖タンパク質であるＣＡ１２５（ＭＵＣ‐１６）に特異的に反応（相互作用）する。すなわち、膜‐結合メソテリン（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｕｎｄ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）に対するＣＡ１２５結合は、異型（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｅ）細胞の付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）および転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉ）を媒介することができ、ＣＡ１２５およびメソテリンは、進行された卵巣腺癌で共‐発現されることが明らかになった（Rump, A. et al., J. Biol. Chem., 279(10):9190-8, 2004）。腹腔内皮におけるメソテリンの発現は、卵巣癌の転移形成において選好される部位と相互関連があり、メソテリン‐ＣＡ１２５結合は、卵巣腫瘍の腹腔転移を容易にする（Gubbels, J.A. et al., Mol. Cancer, 5(1):50, 2006）。
【０００８】
近年、メソテリンを発現する肺癌、卵巣癌、および膵臓癌を対象とする、抗体ベースの標的化治療法が開発されている。一例として、マウスを免疫化して生成されたｍＡｂ  Ｋ１が、膜‐結合メソテリンポリペプチドに対する１次抗体として開発されている（Chang, K., et al., Int. J. Cancer, 50(3):373, 1992）。しかしながら、ｍＡｂ  Ｋ１抗体の低親和度および不良な内在化率により、化学的に変形されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａの切断型に連結されたｍＡｂ  Ｋ１からなる免疫毒素（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）は、臨床開発に適しないことが明らかになった（Hassan, R., et al., J. Immunother., 23(4):473, 2000]; Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 10(12 Pt 1):3937, 2004）。その後、ＳＳ１‐（ｄｓＦｖ）‐ＰＥ３８を始めとして、より親和度の高い１本鎖抗体が開発されており、これは、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で腫瘍細胞を死滅させる能力を有するだけでなく（Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 8(11):3520, 2002）、ヒトメソテリン‐発現腫瘍の齧歯類モデルにおいても効能を示した（Fan, D., et al., Mol. Cancer Ther., 1(8):595, 2002）。上記の結果によると、メソテリンは、多発性癌の免疫治療に適した標的であることが分かる。しかし、前記ＳＳ１‐（ｄｓＦｖ）‐ＰＥ３８は、臨床試験で免疫原性が観察され、殆どの患者に対する二次投与が中断されたことがある。また、ＳＳ１‐（ｄｓＦｖ）‐ＰＥ３８は、急速に血中から除去される傾向を示すため、融合タンパク質の形態でＳＳ１‐（ｄｓＦｖ）‐ＰＥ３８をペグ化することで、生体内における抗体の持続性を増加させるための試みが行われている（Filpula, D., et al., Bioconjugate Chem., 18(3):773, 2007）。
【０００９】
異種移植齧歯類を癌モデルとする免疫毒素癌治療法の臨床試験は、治療抗体とその齧歯類相同体との間の交差反応性の欠乏によって制限されることがある。また、齧歯類由来の抗体またはキメラ抗体で治療された患者で形成された中和性の抗‐マウスＦｖ抗体は、用量制限毒性を引き起こしたり、治療効能を減少させたりする恐れがある。したがって、癌治療の効果を高めるためには、メソテリン抗原に対する増加された親和度、減少された解離率、齧歯類交差反応性がともに組み合わされた標的化抗体が要求される。
【００１０】
また、新規な抗‐メソテリン抗体の追加的な特性は、異なる癌または腫瘍細胞の細胞表面で発現されるメソテリンに対する親和度が維持されるべきであるということである。メソテリンは非常に可変的なタンパク質であって、多重部位で翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）後、タンパク質加水分解を経るだけでなく、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）される（Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res., 10(12 Pt 1):3937, 2004）。転写変異体１（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＮＭ＿００５８２３）が、現在まで試験された腫瘍細胞株で現われた主要種を代表するとされているが、３つの異なるスプライシング変異体（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｖａｒｉａｎｔ）が検出されたため、可変性は転写レベルまで拡大される（Muminova, Z.E., et al., BMC Cancer, 4:19, 2004; Hellstrom, I., et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 15(5):1014, 2006）。したがって、効果的な抗‐メソテリン抗体は、異なる形態のメソテリンを発現させるグリコシル化パターンにおける可変性を含むが、個々の可変性とは独立して、異なる患者に由来の癌または腫瘍細胞の表面で発現されるメソテリンエピトープに不変的に結合すべきである。
【００１１】
そこで、本発明者らは、ＭＳＬＮに特異的に結合する新規な抗体を製造するために鋭意努力した結果、癌細胞で過発現されるＭＳＬＮに対して高い親和力を有する前記新規な抗体を発明し、本発明による抗体の効率的な抗がん剤としての可能性を確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＳＬＮ）に特異的に結合する新規な抗体、前記抗体をコードする核酸、前記核酸を含むベクターおよび宿主細胞、前記抗体の製造方法、および前記抗体を有効成分として含む癌または腫瘍治療用薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明は、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＳＬＮ）に特異的に結合する新規な抗体を提供する。
【００１４】
本発明はまた、配列番号９、１５、２１、２７または５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号１０、１６、２２、２８、６０、６５、７１、７５、８０、８４、１２１、１２２、１２３または１２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号１１、１７、２３、２９、６１、６６、７２、７６、８１、８５、１２４または１２６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、を含む重鎖可変領域を含有することを特徴とするメソテリン特異的抗体を提供する。
【００１５】
本発明はまた、配列番号１２、１８、２４、３０、６２、６７、７０、７７、８６または１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号１３、１９、２５、６３、６８、７３、７８または８２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号１４、２０、２６、６４、６９、７４、７９、８３、８７、１１８、１１９または１２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と、を含む軽鎖可変領域を含有することを特徴とするメソテリン特異的抗体を提供する。
【００１６】
本発明はまた、配列番号１、３、５、７、４６、４８、５１、５３、５５、５７、１１２、１１３、１１４、１１５または１１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２、４、６、８、４７、５２、５４、５６、５８、１０９、１１０または１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領と、を含有することを特徴とするメソテリン特異的抗体を提供する。
【００１７】
本発明はまた、ＭＳＬＮに対する抗体をコードする核酸；前記核酸を含むベクター；および前記ベクターが導入されている細胞を提供する。
【００１８】
本発明はまた、抗‐ＭＳＬＮ抗体を有効性分として含む癌または腫瘍治療用薬学組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】抗‐メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＳＬＮ）抗体のうちクローンＭＳ５０２の軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）の予測構造を示した図である。
【図２】軽鎖可変領域突然変異の結合力を相対比較して示した図である。
【図３】重鎖可変領域突然変異の結合力を相対比較して示した図である。
【図４】ＭＳＬＮを細胞株で発現するためのベクターを示した図である。
【図５】ＭＳＬＮの前駆体形態と成熟形態をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上で示した図である。
【図６】ＭＳＬＮを発現する細胞株および腫瘍細胞株でのＭＳＬＮの発現量を分析して示した図である。
【図７】本発明の抗‐ＭＳＬＮ抗体を用いて、ＭＳＬＮを発現する細胞株に対する選択的結合を分析して示した図である。
【図８】本発明の抗‐ＭＳＬＮ抗体を用いて、中皮腫（Ｈ２２６、Ｈ２０５２）および膵臓癌（ＡｓＰＣ‐１）の細胞膜への抗体結合有無を、ＦＡＣＳを行った後ＭＦＩ値で示した図である。
【図９】本発明の抗‐ＭＳＬＮ抗体を用いて、ＭＳＬＮを発現する腫瘍細胞に選択的に結合するかを確認した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明で用いられているように、用語「メソテリン」または「ＭＳＬＮ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）」は、細胞によって天然的に発現される、ヒトＭＳＬＮの任意の変異体、イソ型、および種相同体を指称する。
【００２１】
用語「ヒトメソテリン」は、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）の受託番号ＮＰ＿００５８１４を有するヒトメソテリンの完全なアミノ酸配列のような、ヒト配列メソテリンを指称する。
【００２２】
本発明の一実施形態では、配列番号１２７で表されるメソテリンに特異的に結合するように構造的に特性化されて分離された単クローン性抗体、「クローンＭＩ３２３」、「クローンＭＩ３２９」、「クローンＭＩ４０３」および「クローンＭＩ４０７」と、「クローンＭＳ５０１」、「クローンＭＳ５０２」、「クローンＭＳ５０３」、「クローンＭＳ５０４」、「クローンＭＳ５０５」および「クローンＭＳ５０６」と、「クローンＣ２Ｇ１」、「クローンＣ２Ｇ４」、「クローンＣ３Ｃ８」、「クローン５４」、「クローン５６」、「クローン２‐３０」、「クローン２‐７３」および「クローン２‐７８」と、「クローン５６‐Ｃ２Ｇ４」、「クローン２‐３０‐Ｃ２Ｇ４」、「クローン２‐７３‐Ｃ２Ｇ４」および「クローン２‐７８‐Ｃ２Ｇ４」を製造した。
【００２３】
各抗体の重鎖ＣＤＲおよび軽鎖ＣＤＲに対するアミノ酸配列は、下記表２、表５、表１２、および表１６に記載のとおりである。下記の表１、表４、表１１、および表１５に記載された通り、抗‐ＭＳＬＮ抗体は、鎖可変領域および軽鎖可変領のアミノ酸配列またはこれと相同性を有する配列を含んでもよい。
【００２４】
本発明の他の実施形態では、精製された抗体である「クローンＭＩ３２３」、「クローンＭＩ３２９」、「クローンＭＩ４０３」、「クローンＭＳ５０２」、「クローンＣ２Ｇ１」、「クローンＣ２Ｇ４」、「クローンＣ３Ｃ８」、「クローン５６‐Ｃ２Ｇ４」、「クローン２‐３０‐Ｃ２Ｇ４」、「クローン２‐７３‐Ｃ２Ｇ４」、または「クローン２‐７８‐Ｃ２Ｇ４」の組換えヒトＭＳＬＮ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ＭＳＬＮ）に対する個別抗体クローンを選別するために酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）を用いており（データ図示せず）、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ‐２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）バイオセンサを用いて定量的な結合力を測定した（実施例２‐５，実施例３‐１１，実施例３‐１４）。その結果、表８、表１４、および表１８に示されたように、やや差はあるが、前記製造された全てのクローン抗体で多少差はあるがメソテリンに対する親和度を示した。
【００２５】
本発明のさらに他の実施形態では、免疫および合成ライブラリから導出された抗‐ＭＳＬＮ抗体が、ＭＳＬＮを発現する細胞に選択的に結合するかを評価するために、癌細胞株におけるＭＳＬＮの発現量を測定し、各細胞に対する抗体の結合をＦＡＣＳ試験により確認した。その結果、図５に示されたように、それぞれの癌細胞株から７０ｋＤａの前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）形態と４０〜５０ｋＤａの成熟（ｍａｔｕｒｅ）形態のＭＳＬＮの存在有無を測定し、Ｈ２８、ＭｉａＰａＣａ‐２、ＢｘＰＣ‐３、Ｃａｐａｎ‐１細胞株はＭＳＬＮ陰性であり、Ｈ２２６、Ｈ２４５２（Ｈ２０５２）、ＡｓＰＣ‐１はＭＳＬＮ陽性であることを確認した。
【００２６】
また、前記ＭＳＬＮ発現細胞株（Ｈ２２６、Ｈ２４５２（Ｈ２０５２）、ＡｓＰＣ‐１）に対する抗‐ＭＳＬＮ候補抗体の選択的結合の分析を行った結果、図８および表１９に示されたように、中皮腫と膵臓癌細胞株のＭＳＬＮに対するＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＳ５０２候補抗体の結合程度は、やや差はあるが、何れも有意な結合力を示し、特に、ＭＩ３２３候補抗体は優れた結合様相を示した。
【００２７】
尚、ＭＳＬＮに対して優れた結合様相を示すＭＩ３２３候補抗体とＢｉａｃｏｒｅ  ＫＤ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）値のパターンが異なるＭＳ５０２、ＭＳ５０２候補抗体から作製された重鎖可変領域突然変異２‐７８‐Ｃ２Ｇ４候補抗体が、ＭＳＬＮを発現する腫瘍細胞に選択的に結合するかを、ＭＳＬＮ過発現ＭｉａＰａＣａ‐ＭＳＬＮ＃２細胞とＭＳＬＮを発現しないＭｉａＰａＣａ‐２で評価した結果、図９に示されたように、ＭＩ３２３、ＭＳ５０２、２‐７８‐Ｃ２Ｇ４候補抗体は、ＭｉａＰａＣａ‐２に比べてＭＳＬＮ過発現ＭｉａＰａＣａ‐ＭＳＬＮ＃２細胞で優れた結合様相を示した。
【００２８】
したがって、一観点において、本発明は、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＳＬＮ）、好ましくは配列番号１２７で表されるメソテリンに特異的に結合する抗体に関する。
【００２９】
本発明によるメソテリンに特異的に結合する抗体は、配列番号９、１５、２１、２７または５９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１と、配列番号１０、１６、２２、２８、６０、６５、７１、７５、８０、８４、１２１、１２２、１２３または１２５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２と、配列番号１１、１７、２３、２９、６１、６６、７２、７６、８１、８５、１２４または１２６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３と、を含む重鎖可変領域を含有することを特徴としてもよい。
【００３０】
本発明によるメソテリンに特異的に結合する抗体は、配列番号１２、１８、２４、３０、６２、６７、７０、７７、８６または１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号１３、１９、２５、６３、６８、７３、７８または８２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号１４、２０、２６、６４、６９、７４、７９、８３、８７、１１８、１１９または１２０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３と、を含む軽鎖可変領域を含有することを特徴としてもよい。
【００３１】
本発明において、メソテリンに特異的に結合する抗体は、配列番号１、３、５、７、４６、４８、５１、５３、５５、５７、１１２、１１３、１１４、１１５または１１６のアミノ酸配列と８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは１００％以上の相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含有することを特徴としてもよく、前記体は、配列番号２、４、６、８、４７、５２、５４、５６、５８、１０９、１１０または１１１のアミノ酸配列と８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは１００％以上の相同性を有する配列を含む軽鎖可変領を含有することを特徴としてもよい。
【００３２】
本発明において、メソテリンに特異的に結合する抗体は、配列番号１、３、５、７、４６、４８、５１、５３、５５、５７、１１２、１１３、１１４、１１５または１１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２、４、６、８、４７、５２、５４、５６、５８、１０９、１１０または１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含有することを特徴としてもよく、前記体は、ヒト単クローン抗体であることを特徴としてもよいが、これに制限されるものではない。
【００３３】
前記抗体は、保存的置換によって抗体のアミノ酸配列が置換されることができる。ここで、用語「保存的置換」とは、１またはそれ以上のアミノ酸を該当ポリペプチドの生物学的または生化学的機能の損失を引き起こさない類似の生化学的特性を有するアミノ酸で置き換えることを含むポリペプチドの変形を指称する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基で代替させる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業者に規定されている。例えば、これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐した側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。本発明の抗体が保存的アミノ酸置換をもって活性を保持し続けることができると予想される。
【００３４】
核酸およびポリペプチドにおいて、用語「実質的相同性」とは、２種の核酸または２種のポリペプチドまたはこれらの指定された配列が最適に整列および比較される際に、適切なヌクレオチドまたはアミノ酸の挿入または欠失を有すると、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、通常はヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８５％、好ましくは約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％、さらに好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％または９９．５％が同一であることを意味する。代案的に、断片が選択的なハイブリダイズ条件の下でその鎖の相補体とハイブリダイズされる場合、核酸に対する実質的相同性が存在する。本発明は、本願で言及された特定核酸配列およびアミノ酸配列に対して実質的相同性を有する核酸配列およびポリペプチド配列を含む。
【００３５】
本発明による抗体は、例えば、表２、表５、表１２、および表１６に記載の重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、２、および３の配列と軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、２および３の配列は、構造的に類似の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）配列が混合されて、重鎖（ＶＨ）／軽鎖（ＶＬ）対のＣＤＲ１、２および３で配置されて形成されることができる。
【００３６】
本発明で用いられているように、用語「抗体」または「抗体組成物」は、単一分子組成の抗体分子の製剤を指称する。ここで、単クローン抗体組成物は、特定エピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。したがって、用語「ヒト単クローン性抗体」とは、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列（ｈｕｍａｎ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に由来の可変および不変領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を指称する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるランダムまたは部位特異的な突然変異の誘発、または生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）における体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでもよい。
【００３７】
本明細書で使われる用語「抗体」とは、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子として、抗原を特異的に認識する受容体の役割をするタンパク質分子を意味し、多クローン性抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）および単クローン性抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）と、全長抗体および抗体断片を全て含んでもよい。また、前記抗体はキメラ性抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）および二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）または二重特異性分子、（例えば、二重特異性抗体）、ジアボディ、トリアボデ及びテトラボディを含んでもよい。
【００３８】
全長抗体は、２つの全体の長さの軽鎖および２つの全体の長さの重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。前記全長抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。前記抗体断片は、抗原結合能力を有する断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖを含む。
【００３９】
前記Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の一番目の不変領域（ＣＨ１ドメイン）を有する構造で一つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有する点でＦａｂと差がある。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなして生成される。
【００４０】
前記Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）は、重鎖可変部位及び軽鎖可変部位だけを有している最小の抗体断片を意味する。二本鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されていて、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は一般にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されている。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができて（例えば、全抗体をパパインで制限切断してＦａｂを得ることができて、ペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ’）２断片を得ることができる）、遺伝子組み換え技術（例えば、抗体の重鎖またはこれの可変領域をコードするＤＮＡ及び軽鎖またはこれの可変領域をコードするＤＮＡを鋳型にして、プライマー対を利用してＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によって増幅させて、ペプチドリンカーをコードするＤＮＡと両末端がそれぞれ重鎖またはこれの可変領域及び軽鎖またはこれの可変領域と連結されるようにするプライマー対を組み合わせて増幅）を介して製作することができる。
【００４１】
免疫グロブリンは、重鎖および軽鎖を持ち、それぞれの重鎖および軽鎖は、不変領域と可変領域（前記部位は、ドメインとしても知られている）を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下「ＣＤＲ」と称する）と呼ばれる３つの多変可能な領域と４つの構造領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端から始まって順次ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれて、また、特定のＣＤＲが位置している鎖によって識別することができる。
【００４２】
本明細書で使用する「単クローン抗体（単一クローン抗体、ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、実質的に同じ抗体集団から収得した単一分子組成の抗体分子を意味し、特定エピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示すことができる。
【００４３】
本願で使用される用語「ヒト化抗体」とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域、及びフレームワーク領域を含んだ抗体を構成するすべてのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンから構成されていることを意味する。ヒト化抗体は、通常的にヒトの疾病治療に使用するための少なくとも３つ以上の潜在的な長所を有している。第一に、それはヒト免疫体系とより良好に相互作用し、例えば、補体?依存性細胞傷害性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＣＤＣ）または抗体−依存性細胞性細胞傷害性（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＡＤＣＣ）によって目的細胞をより効率的に標的を破壊することができる。第二に、ヒト免疫体系は、前記抗体を外来のものとして認識しない。第三に、ヒト循環系内の半減期が天然発生抗体と類似して、より少ない量をより少ない頻度で投与することができる。
【００４４】
本願で使用される用語「ＭＳＬＮに特異的に結合する抗体」、すなわち「クローンＭＩ３２３」、「クローンＭＩ３２９」、「クローンＭＩ４０３」および「クローンＭＩ４０７」と、「クローンＭＳ５０１」、「クローンＭＳ５０２」、「クローンＭＳ５０３」、「クローンＭＳ５０４」、「クローンＭＳ５０５」および「クローンＭＳ５０６」と、「クローンＣ２Ｇ１」、「クローンＣ２Ｇ４」、「クローンＣ３Ｃ８」、「クローン５４」、「クローン５６」、「クローン２‐３０」、「クローン２‐７３」および「クローン２‐７８」と、「クローン５６‐Ｃ２Ｇ４」、「クローン２‐３０‐Ｃ２Ｇ４」、「クローン２‐７３‐Ｃ２Ｇ４」および「クローン２‐７８‐Ｃ２Ｇ４」とは、ＭＳＬＮに結合してＭＳＬＮの生物学的活性の抑制を招く抗体を意味して、抗−ＭＳＬＮ抗体と混用して使用することができる。
【００４５】
ここで、「クローンＭＩ３２３」、「クローンＭＩ３２９」、「クローンＭＩ４０３」および「クローンＭＩ４０７」は、マウスに組換えヒトＭＳＬＮを免疫（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）した後収得した抗体であり、「クローンＭＳ５０１」、「クローンＭＳ５０２」、「クローンＭＳ５０３」、「クローンＭＳ５０４」、「クローンＭＳ５０５」および「クローンＭＳ５０６」は、ｓｃＦｖライブラリーからのファージディスプレイから収得した抗体であり、「クローンＣ２Ｇ１」、「クローンＣ２Ｇ４」、「クローンＣ３Ｃ８」、「クローン５４」、「クローン５６」、「クローン２‐３０」、「クローン２‐７３」および「クローン２‐７８」は、表９に示された通り、「クローンＭＳ５０２」に突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）を導入した抗体であり、「クローン５６‐Ｃ２Ｇ４」、「クローン２‐３０‐Ｃ２Ｇ４」、「クローン２‐７３‐Ｃ２Ｇ４」および「クローン２‐７８‐Ｃ２Ｇ４」は、導入された突然変異抗体間の組み合わせで製造した抗体である。
【００４６】
前記ＭＳＬＮに対する抗体のＫＤ（平衡解離定数、ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）は、例えば、
（１）クローンＭＩ３２３の場合、１．８ｘ１−８Ｍ以下、好ましくは１．８ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは１．８ｘ１０−１０Ｍ以下であってもよく、
（２）クローンＭＩ３２９の場合、３．５ｘ１−９Ｍ以下、好ましくは３．５ｘ１０−１０Ｍ以下、より好ましくは３．５ｘ１０−１１Ｍ以下であってもよく、
（３）クローンＭＩ４０３の場合、４．５ｘ１−８Ｍ以下、好ましくは４．５ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは４．５ｘ１０−１０Ｍ以下であってもよく、
（４）クローンＭＳ５０２の場合、２．３ｘ１−８Ｍ以下、好ましくは２．３ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは２．３ｘ１０−１０Ｍ以下であってもよく（表８参照）、
（５）クローンＣ２Ｇ１の場合、９．３９ｘ１−９Ｍ以下、好ましくは９．３９ｘ１０−１０Ｍ以下、より好ましくは９．３９ｘ１０−１１Ｍ以下であってもよく、
（６）クローンＣ２Ｇ４の場合、４．３２ｘ１−９Ｍ以下、好ましくは４．３２ｘ１０−１０Ｍ以下、より好ましくは４．３２ｘ１０−１１Ｍ以下であってもよく、
（７）クローンＣ３Ｃ８の場合、１．２２ｘ１−８Ｍ以下、好ましくは１．２２ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは１．２２ｘ１０−１０Ｍ以下であってもよく、
（８）クローン５６の場合、１．２５ｘ１−８Ｍ以下、好ましくは１．２５ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは１．２５ｘ１０−１０Ｍ以下であってもよく、
（９）クローン２‐３０の場合、１．６６ｘ１−８Ｍ以下、好ましくは１．６６ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは１．６６ｘ１０−１０Ｍ以下であってもよく、
（１０）クローン２‐７８の場合、１．６３ｘ１−９Ｍ以下、好ましくは１．６３ｘ１０−１０Ｍ以下、より好ましくは１．６３ｘ１０−１１Ｍ以下であってもよく、
（１１）クローン５６‐Ｃ２Ｇ４の場合、１．６３ｘ１−８Ｍ以下、好ましくは１．６３ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは１．６３ｘ１０−１０Ｍ以下であってもよく、
（１２）クローン２‐３０‐Ｃ２Ｇ４の場合、２．３４ｘ１−８Ｍ以下、好ましくは２．３４ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは２．３４ｘ１０−１０Ｍ以下であってもよく、
（１３）クローン２‐７３‐Ｃ２Ｇ４の場合、１．６５ｘ１−８Ｍ以下、好ましくは１．６５ｘ１０−９Ｍ以下、より好ましくは１．６５ｘ１０−１０Ｍ以下であってもよく、
（１４）クローン２‐７８‐Ｃ２Ｇ４の場合、３．７２ｘ１０−９Ｍ以下、好ましくは３．７２ｘ１０−１０Ｍ以下、より好ましくは３．７２ｘ１０−１１Ｍ以下であってもよい（表１８参照）。
【００４７】
本発明のさらに他の実施形態では、ヒトＭＳＬＮに結合する免疫ライブラリに由来のマウス（ｍｏｕｓｅ）の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）と軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子を把握した後、重鎖可変領域の遺伝子は、ヒト免疫グロブリンタイプ１の重鎖不変領域（ＩｇＧ１  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子と連結し、軽鎖可変領域の遺伝子は、ヒトカッパ軽鎖不変領域（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）と連結してから、これらをそれぞれ動物細胞用タンパク質発現ベクターに挿入してベクターを作製した後、これらをＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞株に形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、培養することで抗体を生産した後、これをプロテインＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）で精製することにより、抗体を製造した（実施例１‐３）。
【００４８】
本発明のさらに他の実施形態では、ヒトＭＳＬＮに結合する合成ｓｃＦｖライブラリに由来のマウス（ｍｏｕｓｅ）の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）と軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子を把握した後、重鎖可変領域の遺伝子は、ヒト免疫グロブリンタイプ１の重鎖不変領域（ＩｇＧ１  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）の遺伝子と連結し、軽鎖可変領域の遺伝子は、ヒトカッパ軽鎖不変領域（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）と連結してから、これらをそれぞれ動物細胞用タンパク質発現ベクターに挿入してベクターを作製した後、これらをＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞株に形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）し、培養することで抗体を生産した後、これをプロテインＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ）で精製することにより、抗体を製造した（実施例２‐４、実施例３‐１０、実施例３‐１２、実施例３‐１３）。
【００４９】
したがって、他の観点において、本発明は、前記抗体をコードする核酸に関する。本明細書で使用される「核酸」とは、細胞、細胞溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中に存在したり、または、部分的に精製された形態または、実質的に純粋な形態で存在する場合もある。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド化（ｂａｎｄｉｎｇ）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当業界に広く知られたその他のものを含む標準技術によって他の細胞成分またはその他汚染物質、例えば他の細胞の核酸またはタンパク質から精製されて出る場合「単離」されるか、「実質的に純粋になる」ものである。本発明の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでも含まなくでもよい。
【００５０】
また他の観点において、本発明は、前記核酸を含むベクターに関する。抗体またはその抗体断片の発現のために、部分的であるか全長である軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを標準分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅または目的抗体を発現するハイブリドーマを使用したｃＤＮＡクローニング）で収得することができて、ＤＮＡが転写及び翻訳制御配列に「作動するように結合」されて発現ベクター内に挿入されることができる。
【００５１】
本明細書で使用される「作動するように結合」とは、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図的機能をするように抗体遺伝子がベクター内にライゲーションされることを意味することができる。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現用宿主細胞と相溶性があるように選択される。抗体の軽鎖遺伝子及び抗体の重鎖遺伝子は、別個のベクター内に挿入されるか、二つの遺伝子共に同じ発現ベクター内に挿入される。抗体は標準方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補性制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が全く存在しない場合、平滑（ｂｌｕｎｔ）末端ライゲーション）で発現ベクター内に挿入される。場合により、前記組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にする信号ペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、信号ペプチドがフレームに合うように抗体鎖遺伝子のアミノ末端に結合されるようにベクター内にクローニングできる。信号ペプチドは、免疫グロブリンと信号ペプチドまたは、異種性信号ペプチド（すなわち、免疫グロブリンの他タンパク質由来の信号ペプチド）であり得る。また、前記組み換え発現ベクターは、宿主細胞で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」とは、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、インハンサー及びその他発現制御要素（例えば、ポリアデニル化信号）を含むことができる。当業者は、形質転換させる宿主細胞の選択、タンパク質の発現水準などのような因子に応じて調節配列を異なるように選択して、発現ベクターのデザインが変わる可能性があることを認識することができる。
【００５２】
本発明はまた、前記核酸または前記ベクターを含む宿主細胞を含むことができる。前記核酸または前記ベクターは、宿主細胞に形質移入またはトランスフェクションされる。「形質移入」または「トランスフェクション」させるために、原核または真核宿主細胞内に外因性ＤＮＡを導入するには通常使用される様々な技術、例えば電気泳動法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションまたはリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などを使用することができる。本発明に係る抗体は、哺乳類細胞への適用の可能性を考慮して、真核細胞、好ましくは哺乳類宿主細胞で発現することができる。前記抗体の発現に適した哺乳類宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ，ＣＨＯ）細胞（例えば、ＤＨＦＲ選抜可能なマーカーと共に使用されるｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞またはＳＰ２細胞などを例示することができる。
【００５３】
また他の観点において、本発明は、宿主細胞を培養して抗体を発現させる工程を含む抗体の製造方法に関する。前記抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが、哺乳類宿主細胞内に導入される場合、抗体は、宿主細胞で抗体が発現するようにするのに十分な期間の間、または、さらに好ましくは宿主細胞が培養される培養培地内に抗体が分泌されるようにするのに十分な期間の間宿主細胞を培養することによって製造されることができる。
【００５４】
場合により、発現した抗体は、宿主細胞から分離して均一に精製することができる。前記抗体の分離または精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法、例えばクロマトグラフィーによって実行されることができる。前記クロマトグラフィーは、例えば、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを含む親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは疏水性クロマトグラフィーを含むことができる。前記クロマトグラフィー以外に、追加でろ過、超ろ過、塩析、透析などを組み合わせることによって抗体を分離、精製することができる。
【００５５】
また他の観点において、本発明は、抗体を有効性分として含む癌または腫瘍治療用薬学組成物に関する。
【００５６】
用語「癌」または「腫瘍」は、典型的に調節されない細胞の成長／増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指称または説明する。癌の例は、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非−ホジキンリンパ腫）、膠芽細胞腫、肉腫、および白血病などを含むが、これに限定されない。このような癌のより詳細な例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌腫、肺扁平上皮癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、白血病、および他のリンパ球増殖性障害、および様々な類型の頭頸部癌が含まれる。本発明で、前記癌は、好ましくはメソテリン‐陽性癌であり、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、胃腸癌、子宮内膜癌、および中皮腫で構成された群から選択されることを特徴としてもよい。
【００５７】
本発明は、治療有効量の抗‐ＭＳＬＮ抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学組成物を提供する。「薬学的に許容される担体」とは、製剤を製剤化または安定化させることを助けるために活性成分に追加できる物質であって、患者に有意な有害毒性効果を引き起こさない。
【００５８】
前記担体は、患者を刺激せずに投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌および生体に適したものであって、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。他の担体は、例えば、文献［Remington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin)］に記載されている。このような組成物は、治療有効量の１種以上の抗‐ＭＳＬＮ抗体を含む。
【００５９】
薬学的に許容される担体は、滅菌注射可能な溶液剤または分散液剤を即時投与用（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）に製造するための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む。製薬活性物質のためのこのような媒質および作用剤の使用は、当業界に公知されている。組成物は、好ましくは、非経口注射用として製剤化される。組成物は、溶液剤、マイクロエマルション剤、リポソーム剤、または高い薬物濃度に適したその他の要求される構造物として製剤化されることができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、並びにこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒質であってもよい。一部の場合において、組成物中に、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含ませてもよい。滅菌注射可能な溶液剤は、必要量の活性化合物を、必要に応じて前記記載の成分の１種またはこれらの組み合わせ物とともに、好適な溶媒中に組み込んだ後、滅菌マイクロ濾過を行うことで製造されることができる。一般に、分散液剤は、活性化合物を、基本的な分散媒質および上記に記載のものからのその他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことで製造される。滅菌注射可能な溶液剤を製造するための滅菌粉末の場合、一部の製造方法は、活性成分、および任意の追加の所望の成分の粉末を、予め滅菌‐濾過したその溶液から生成する真空乾燥および冷凍‐乾燥（凍結乾燥）である。
【００６０】
薬学組成物は、苦しむ患者の重症度によって変わり得る投与量および頻度で、経口または非経口投与されることができる。組成物は、必要に応じて、ボーラス（ｂｏｌｕｓ）としてまたは連続注入によって患者に投与されることができる。例えば、Ｆａｂ断片として提示される本発明の抗体のボーラス投与の量は、０．００２５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５〜０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０〜０．１０ｍｇ／ｋｇ、または０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇであってもよい。連続注入の場合、Ｆａｂ断片として提示される本発明の抗体は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／分、０．０１２５〜１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０〜０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０〜１．０ｍｇ／ｋｇ／分、または０．１０〜０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で、１時間〜２４時間、１時間〜１２時間、２時間〜１２時間、６時間〜１２時間、２時間〜８時間、または１時間〜２時間投与されることができる。全長抗体（完全不変領域を有する）として提示される本発明の抗体を投与する場合、その投与量は、約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、２〜８ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇであってもよい。このような全長抗体は、典型的に、３０分〜３５分の時間に持続注入することで投与する。投与頻度は状態の重症度によって変わる。頻度は、１週当たり３回〜毎１週または２週毎に１回の範囲であってもよい。
【００６１】
さらに、組成物は、皮下注射を介して患者に投与することができる。例えば、１０〜１０．０ｍｇの投与量の抗‐ＭＳＬＮ抗体が毎週、隔週または毎月皮下注射を介して患者に投与されることができる。
【００６２】
本発明で用いられているように、「治療有効量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な受益／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、抗‐ＭＳＬＮ抗体の組み合わせ物の量を意味する。正確な量は、治療組成物の成分および物理的特徴、意図された患者集団、個々の患者の考慮事項などを含んで決定されるが、これに制限されずに多くの因子によって変わり得て、当業者が容易に決定することができる。これらの要因を完全に考慮すると、副作用なしに最大効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要で、この服用量は、当該分野の専門家によって容易に決定されることができる。
【００６３】
本発明の薬剤学的組成物の服用量は、特に限定されないが、患者の健康状態及び体重、疾患の重症度、薬剤の種類、投与経路及び投与時間を含んだ多様な要因により変わる。組成物は一日に１回量または、多数回容量でラット、ネズミ、家畜、ヒトなどを含む哺乳類内に典型的に許された経路、例えば、経口に、直腸に、静脈に（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）、皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、子宮内に（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅｌｙ）または脳血管内に（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒｌｙ）投与されてもよい。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。
【００６５】
実施例１：免疫ライブラリからの抗‐ＭＳＬＮ抗体の製造方法
癌細胞の表面で過発現するＭＳＬＮ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）に対する抗体を用いて、抗がん剤を作製しようとした。
【００６６】
１‐１：抗‐ＭＳＬＮ抗体の選別
マウス（ｍｏｕｓｅ）に組換えヒトＭＳＬＮを免疫化（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）した後、脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を摘出してＢリンパ球を抽出し、これから全ＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）を分離してから、ｃＤＮＡを合成した。前記合成したｃＤＮＡからのマウス（ｍｏｕｓｅ）の種々の抗体遺伝子をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によりクローニングし、これをｐＣｏｍｂ３Ｘ  ｐｈａｇｅｍｉｄに挿入して、様々な配列の抗体断片をディスプレイする抗体ライブラリを作製した。抗体ライブラリからヒトＭＳＬＮに特異的に結合する抗体を探すために、ＭＳＬＮが固定された磁気ビーズ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ）と抗体ライブラリを交ぜ、標的抗原に結合するクローンを分離して培養した。その後、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）により、標的抗原（ヒトＭＳＬＮ）に特異的に結合するクローン（ＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＩ４０７）を個別的に確認し、塩基配列分析により、抗体遺伝子配列およびそれによるアミノ酸配列を把握した。
【００６７】
その結果、表１に示されたように、ヒトＭＳＬＮに特異的に結合するクローンが選別され、これらのアミノ酸配列を確認した。
【００６８】
表２は、表１のクローン抗体のＣＤＲアミノ酸配列をＫａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを基準として表記したものである。
【００６９】
【表１】
0006738893.tif 000002
【００７０】
【表２】
0006738893.tif 000003
【００７１】
１‐２：ＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＩ４０７クローン抗体のＩｇＧ遺伝子クローニング
前記ＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＩ４０７クローン抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子が含有されたｐＣｏｍｂ３Ｘ  ｐｈａｇｅｍｉｄを抽出した後、これを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にして、Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ  Ｐｆｕ  ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて、ＮｏｔＩが含まれた順方向プライマー（表３：配列番号３１〜３４）とＡｐａＩが含まれた逆方向プライマー（表３：配列番号３５）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃で１０分間露出後、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。その後、分離した遺伝子をＮｏｔＩ、ＡｐａＩ制限酵素で３７℃で１２時間以上反応させた後、制限酵素で反応させた遺伝子をさらに１％のアガロースゲルから分離した。ヒト免疫グロブリンタイプ１の重鎖不変領域（ＩｇＧ１  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）遺伝子が入っているｐｃＩＷプラスミドベクターも同様の方法により切断し、アガロースゲルから分離した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ））を用いて、前記分離されたＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＩ４０７の重鎖可変領域遺伝子を、ヒト重鎖不変領域が入っている線形ｐｃＩＷベクターのＮｏｔＩ、ＡｐａＩサイトに挿入した。前記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹した後、３７℃で１２時間以上培養した。次に、単コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養した後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５、ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを分離し、それをＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【００７２】
前記ＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＩ４０７クローン抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子が含有されたｐＣｏｍｂ３Ｘ  ｐｈａｇｅｍｉｄを抽出した後、これを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にして、ＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＩ４０７クローン抗体の軽鎖可変領域をＡｃｃｕｐｏｗｅｒ  Ｐｆｕ  ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて、ＮｏｔＩが含まれた順方向プライマー（表３：配列番号３６、３８、４０、４２）と逆方向プライマー（表３：配列番号３７、３９、４１、４３）でＰＣＲを行った。また、ヒト抗体のカッパー軽鎖不変領域（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）に対して、順方向プライマー（表３：配列番号４４）とＨｉｎｄＩＩＩが含まれた逆方向プライマー（表３：配列番号４５）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃で１０分間露出後、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。その後、各軽鎖可変領域と軽鎖不変領域を交ぜ、重なりＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲ）を行い、軽鎖領域（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ）を発現する遺伝子をクローニングした。条件としては、９４℃で１０分間露出後、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。分離した遺伝子をＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で３７℃で１２時間以上反応させた後、制限酵素で反応させた遺伝子をさらに１％のアガロースゲルから分離した。ｐｃＩＷプラスミドベクターも同様の方法により切断し、アガロースゲルから分離した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ））を用いて、前記分離されたＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＩ４０７の軽鎖可変領域遺伝子を、線形ｐｃＩＷベクターのＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。前記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹した後、３７℃で１２時間以上培養した。次に、単コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養した後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５、ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを分離し、それをＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【００７３】
【表３】
0006738893.tif 000004
【００７４】
１‐３：ＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＩ４０７クローン抗体のＩｇＧ生産および精製
マウス免疫反応により得られた抗‐ＭＳＬＮ抗体であるＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＩ４０７クローンを生産および精製するために、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の一日前に、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞を２．０×１０６細胞／ｍＬの濃度で接種した。２４時間培養（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）後、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１０１、Ｇｉｂｃｏ）を添加して、細胞数２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度（生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）＝９５％）で３０ｍＬを準備した。３０μｇのＤＮＡ（ｐｃＩＷ‐ａｎｔｉ‐ＭＳＬＮ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ：１５μｇ、ｐｃＩＷ‐ａｎｔｉ‐ＭＳＬＮ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ：１５μｇ）を、全体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）に希釈し、常温で５分間反応させた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）８０μＬを、全体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍＬに混合した後、常温で５分間反応させた。５分間反応後、それぞれ希釈したＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬１．５ｍＬをよく混合して常温で２０〜３０分間反応させた。ＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬の混合液３ｍＬをＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞に処理した。１６〜１８時間懸濁培養した後（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）と１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）を添加し、５日間懸濁培養した。培養が終わると、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を０．２２μｍのフィルターに通過させて準備した。各３０ｍＬの培養液当たりにプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ）であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７‐５２６９‐０２、Ｇｉｂｃｏ）を１００μＬずつ準備し、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離して貯蔵溶液を除去した後、プロテインＡバインディング緩衝液（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００７、Ｐｉｅｒｃｅ）４００μＬずつ３回洗浄した。前記準備された培養液にプロテインＡレジン（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ）を入れて室温で３０分間回転反応させた。Ｐｉｅｒｃｅ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ‐ｓｎａｐ  ｃａｐ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６９７２５、Ｔｈｅｒｍｏ）に培養液とレジン（ｒｅｓｉｎ）の混合物を入れ、ＱＩＡｖａｃ  ２４  Ｐｌｕｓ  ｖａｃｕｕｍ  ｍａｎｉｆｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９４１３、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、カラムにレジン（ｒｅｓｉｎ）のみを残した。プロテインＡバインディング緩衝液５ｍＬを入れてレジン（ｒｅｓｉｎ）を洗浄した後、プロテインＡ溶出緩衝液（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００９、Ｐｉｅｒｃｅ）２００μＬを入れて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）し、室温��２分間反応させた後、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離して溶出した。各溶出液（ｅｌｕａｔｅ）には１．５ＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２．５μＬを入れて中和させた。溶出は４〜６回にわたって行い、各分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はＮａｎｏｄｒｏｐ  ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。タンパク質が検出された分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）は集めてＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ  ＭＷＣＯ、５ｍＬ（Ｃａｔ．Ｎｏ．００８９８９２、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）緩衝液に緩衝液を交換した後、還元および非還元の条件でタンパク質電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）を行って最終的に濃度を定量するとともに、抗体の状態を検証し、４℃に保管した。
【００７５】
実施例２：ファージディスプレイ合成ｓｃＦｖライブラリからの抗‐ＭＳＬＮ抗体の製造方法
２‐１：ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）を用いた抗‐ヒトＭＳＬＮ  ｓｃＦｖ抗体の選別
１次パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）では、１０１３以上のライブラリーストック（ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｔｏｃｋ）１ｍＬを、ＭＳＬＮがコーティングされたＳｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｔｕｂｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．４４４２０２，Ｎｕｎｃ）にて３７℃、２時間反応させた。これと同時に、ＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１０μＬをＳＢ１０ｍｌ／テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）１０μＬに接種（ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）させ、ＯＤ６００で０．８〜１．０となるように育てた。３７℃、２時間反応させたものを５ｍｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで４回洗浄し、２次パニングからは、パニングの回数が増加するにつれて０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳの洗浄回数を増加させた。その後、１％のＢＳＡ／０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．０）で常温で１０分間培養してファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）を精製した。精製したファージミドを５０ｍＬのチューブに移し、２ＭのＴｒｉｓ７０μＬで中和させた。ＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）９ｍＬを処理し、１ｍＬは洗浄されたチューブに処理した。常温で３０分間感染させた後、ＳＢ１０ｍＬ、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）２０μＬ、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）１０μＬを添加し、３７℃、２２０ｒｐｍで１時間懸濁培養させた。その後、ＶＣＳ  Ｍ１３ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）１ｍＬ（１０１１ｐｆｕ）を処理してから、１時間３７℃、２２０ｒｐｍで懸濁培養した後、ＳＢ８０ｍＬ、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）１００μＬ、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）１００μＬを処理し、３７℃、２２０ｒｐｍで１２時間以上培養した。１２時間以上培養したものを、３５００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心分離した後、上澄み液を新しいチューブに移し、２０ｍＬの２０％ＰＥＧ／１５％ＮａＣｌを添加してよく混合した後、氷で３０分間反応させた。その後、８０００ｒｐｍ、４℃、３０分で上澄み液を捨て、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を集めて２ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで再懸濁させてから、１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間遠心分離させた。この際、集まったペレットは捨て、上澄み液２ｍＬのうち１ｍＬは−２０℃に保管し、１ｍＬは次のパニングに用いた。
【００７６】
２‐２：ＥＬＩＳＡ方式の個別クローン確保
ファージディスプレイ合成ｓｃＦｖライブラリから最終増幅集団の単コロニーを採取した後、ＳＢ／カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）１．５ｍＬに、ＯＤ６００で０．８〜１．０程度まで３７℃、２２０ｒｐｍで培養した後、１ｍＭのＩＰＴＧ、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間以上培養させた。この反応物を５５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、それぞれの上澄み液のみを、ＭＳＬＮ抗原が敷かれているＥＬＩＳＡプレートに添加し、２時間常温で反応させた。その後、ＰＢＳＴ（１ＸＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した後、ＨＲＰ／Ａｎｔｉ‐ｈＦａｂ‐ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳで１／５０００に希釈したものを添加し、常温で１時間反応させた。その後、さらにＰＢＳＴ（１ＸＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した後、ＴＭＢ溶液を添加し、５〜１０分間反応させてから、ＴＭＢ  ｓｔｏｐ溶液を添加した。その後、ＴＥＣＡＮ  ｓｕｎｒｉｓｅを用いて４５０ｎｍの測定波長でその値を読み取り、高いＯ．Ｄ値を有するクローンを個別クローンとして確保した。
【００７７】
その結果、表４に示されたように、ヒトＭＳＬＮに特異的に結合するクローンが選別され、これらのアミノ酸配列を確認した。
【００７８】
表５は、表４のクローン抗体のＣＤＲアミノ酸配列をＫａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを基準として表記したものである。
【００７９】
【表４】
0006738893.tif 000005
【００８０】
【表５】
0006738893.tif 000006
【００８１】
２‐３：抗‐メソテリン抗体のＩｇＧ遺伝子クローニング
確保されたＭＳ５０１、ＭＳ５０２、ＭＳ５０３、ＭＳ５０４、ＭＳ５０５、ＭＳ５０クローン抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子が含有されたｐＣｏｍｂ３Ｘ  ｐｈａｇｅｍｉｄを抽出した後、これを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にして、ＭＳ５０１、ＭＳ５０２、ＭＳ５０３、ＭＳ５０４、ＭＳ５０５、ＭＳ５０６クローン抗体の軽鎖可変領域をＡｃｃｕｐｏｗｅｒ  Ｐｆｕ  ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて、ＮｏｔＩが含まれた順方向プライマー（表６：配列番号８６）と逆方向プライマー（表６：配列番号８７）でＰＣＲを行った。また、ヒト抗体のカッパー軽鎖不変領域（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）に対して、順方向プライマー（表６：配列番号８８）と逆方向プライマー（表６：配列番号８９）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃で１０分間露出後、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。その後、各軽鎖可変領域と軽鎖不変領域を交ぜ、重なりＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲ）を行い、軽鎖領域（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ）を発現する遺伝子をクローニングした。条件としては、９４℃で１０分間露出後、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。分離した遺伝子をＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で３７℃で１２時間以上反応させた後、制限酵素で反応させた遺伝子をさらに１％のアガロースゲルから分離した。ｐｃＩＷプラスミドベクターも同様の方法により切断し、アガロースゲルから分離した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ））を用いて、前記分離されたＭＳ５０１、ＭＳ５０２、ＭＳ５０３、ＭＳ５０４、ＭＳ５０５およびＭＳ５０６の軽鎖可変領域遺伝子を、線形ｐｃＩＷベクターのＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。前記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹した後、３７℃で１２時間以上培養した。次に、単コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養した後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５、ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを分離し、それをＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【００８２】
前記ＭＳ５０１、ＭＳ５０２、ＭＳ５０３、ＭＳ５０４、ＭＳ５０５、ＭＳ５０６クローン抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子が含有されたｐＣｏｍｂ３Ｘ  ｐｈａｇｅｍｉｄを抽出した後、これを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）にして、Ａｃｃｕｐｏｗｅｒ  Ｐｆｕ  ＰＣＲ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）を用いて、ＮｏｔＩが含まれた順方向プライマー（表６：配列番号９０）とＡｐａＩが含まれた逆方向プライマー（表６：配列番号９１）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃で１０分間露出後、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。その後、分離した遺伝子をＮｏｔＩ、ＡｐａＩ制限酵素で３７℃で１２時間以上反応させた後、制限酵素で反応させた遺伝子をさらに１％のアガロースゲルから分離した。ヒト免疫グロブリンタイプ１の重鎖不変領域（ＩｇＧ１  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）遺伝子が入っているｐｃＩＷプラスミドベクターも同様の方法により切断し、アガロースゲルから分離した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ））を用いて、前記分離されたＭＳ５０１、ＭＳ５０２、ＭＳ５０３、ＭＳ５０４、ＭＳ５０５、ＭＳ５０６の重鎖可変領域遺伝子を、ヒト重鎖不変領域が入っている線形ｐｃＩＷベクターのＮｏｔＩ、ＡｐａＩサイトに挿入した。前記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹した後、３７℃で１２時間以上培養した。次に、単コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養した後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５、ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを分離し、それをＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【００８３】
【表６】
0006738893.tif 000007
【００８４】
２‐４：ＭＳ５０１、ＭＳ５０２、ＭＳ５０３、ＭＳ５０４、ＭＳ５０５、ＭＳ５０６クローン抗体のＩｇＧの生産および精製
ファージディスプレイｓｃＦｖライブラリから得られたＭＳ５０１、ＭＳ５０２、ＭＳ５０３、ＭＳ５０４、ＭＳ５０５、ＭＳ５０６クローン抗体を生産および精製するために、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の一日前に、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞を２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で接種した。２４時間培養（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）後、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１０１、Ｇｉｂｃｏ）を添加して、細胞数２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度（生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）＝９５％）で３０ｍＬを準備した。３０μｇのＤＮＡ（ｐｃＩＷ‐ＭＳ５０２重鎖可変領域：１５μｇ、ｐｃＩＷ‐ａｎｔｉ‐ＭＳＬＮ軽鎖可変領域突然変異：１５μｇ）を、全体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）に希釈し、常温で５分間反応させた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）８０μＬを、全体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍＬに混合した後、常温で５分間反応させた。５分間反応後、それぞれ希釈したＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬１．５ｍＬをよく混合して常温で２０〜３０分間反応させた。ＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬の混合液３ｍＬをＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞に処理した。１６〜１８時間懸濁培養した後（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）と１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）を添加し、５日間懸濁培養した。培養が終わると、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を０．２２μｍのフィルターに通過させて準備した。各３０ｍＬの培養液当たりにプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ）であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７‐５２６９‐０２、Ｇｉｂｃｏ）を１００μＬずつ準備し、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離して貯蔵溶液を除去した後、プロテインＡバインディング緩衝液（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００７、Ｐｉｅｒｃｅ）４００μＬずつ３回洗浄した。前記準備された培養液にプロテインＡレジン（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ）を入れて室温で３０分間回転反応させた。Ｐｉｅｒｃｅ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ‐ｓｎａｐ  ｃａｐ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６９７２５、Ｔｈｅｒｍｏ）に培養液とレジン（ｒｅｓｉｎ）の混合物を入れ、ＱＩＡｖａｃ  ２４  Ｐｌｕｓ  ｖａｃｕｕｍ  ｍａｎｉｆｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９４１３、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、カラムにレジン（ｒｅｓｉｎ）のみを残した。プロテインＡバインディング緩衝液５ｍＬを入れてレジン（ｒｅｓｉｎ）を洗浄した後、プロテインＡ溶出緩衝液（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００９、Ｐｉｅｒｃｅ）２００μＬを入れて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）し���室温で２分間反応させた後、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離して溶出した。各溶出液（ｅｌｕａｔｅ）には１．５ＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２．５μＬを入れて中和させた。溶出は４〜６回にわたって行い、各分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はＮａｎｏｄｒｏｐ  ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。タンパク質が検出された分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）は集めてＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ  ＭＷＣＯ、５ｍＬ（Ｃａｔ．Ｎｏ．００８９８９２、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）緩衝液に緩衝液を交換した後、還元および非還元の条件でタンパク質電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）を行って最終的に濃度を定量するとともに、抗体の状態を検証し、４℃に保管した。
【００８５】
２‐５：抗‐ＭＳＬＮ抗体の抗原に対する定量的な結合力の測定
精製された抗‐ＭＳＬＮ抗体であるＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＳ５０２クローン抗体の組換えヒトＭＳＬＮ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）に対する定量的な結合力（親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ））を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ‐２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）バイオセンサを用いて測定した。ＨＥＫ２９３細胞から精製されたＭＳＬＮ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３２６５‐ＭＳ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を、アミン‐カルボキシル反応を用いてＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）に２００Ｒｍａｘとなるように固定させた後、ＨＢＳ‐ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）に順に希釈したクローンＣ２Ｇ１、クローンＣ２Ｇ４、またはクローンＣ３Ｃ８抗体を、０．０７８ｎＭ〜５ｎＭの濃度範囲で結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１２０秒、解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１８００秒間３０μＬ／分の流速で流した。１０ｍＭのグリシン‐ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒間３０μＬ／分の流速で流すことで、ＭＳＬＮに結合された抗体の解離を誘導した（表７）。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ‐２００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、親和度を運動速度定数（ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）と平衡解離定数（ＫＤ）として収得した（表８）。
【００８６】
【表７】
0006738893.tif 000008
【００８７】
【表８】
0006738893.tif 000009
【００８８】
実施例３：ＭＳ５０２クローン親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）抗体の製造方法
３‐１：ＭＳ５０２クローン親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）ライブラリの設計
抗‐メソテリンＭＳ５０２クローンのアミノ酸配列をＳｗｉｓｓ  ｍｏｄｅｌのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）に接続して入力した後、鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）配列を探した。相同性配列に基づいて５０個の配列を探した後、各配列を鋳型として指定してモデリング（ｍｏｄｅｌｉｎｇ）を行った。ＱＭＥＡＮ４値（Ｃβ、ａｌｌ  ａｔｏｍ、ｓｏｌｖａｔｉｏｎ、ｔｏｒｓｉｏｎ）を基準として５０個程度の配列を順位毎に並べ、ＱＭＥＡＮ４値以外にも、配列のｉｄｅｎｔｉｔｙとｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎを考慮して鋳型を選定した。重鎖可変領域は３ｇ６ａ．１．Ｂ、軽鎖可変領域は３ｑｈｚ．１．Ｂ（ＬＣＤＲ１、２）と４ｏ５ｌ．１．Ａ（ＬＣＤＲ３）が選定された。選定された鋳型をベースとして得られたＭＳ５０２構造をｐｙｍｏｌプログラムで分析し、ＣＤＲののうち突出したアミノ酸を基準としてパラトープ（ｐａｒａｔｏｐｅ）を選定した（図１参照）。このうち、ＶＬ  ＣＤＲ２  Ｙ４９、Ｙ５０、Ｋ５３の場合、ＴｙｒとＬｙｓが一般的に結合に肯定的な効果を示すアミノ酸であるため、パラトープと予想されるが、突然変異候補アミノ酸から除外させた。突然変異の導入は、既存の配列を５０％保存した後、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙの割合を高め、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）、正電荷（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅ）、負電荷（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈａｒｇｅ）の割合が均一に含まれるように（表９）、ｈａｎｄｍｉｘ  ｐｒｉｍｅｒ（ＩＤＴ、米国）を用いてヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列を調節して設計した。重鎖可変領域は、ＣＤＲ１、２、３の全てに突然変異が導入されるため、それぞれ３つの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）に分けて断片ＰＣＲ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＰＣＲ）を行った後、オーバーラッピングＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲ）を行うことで、ライブラリが構築されるように設計した。軽鎖可変領域は、ＣＤＲ１、３のみに突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）が導入されるため、それぞれ２つの断片に分けて断片ＰＣＲを行った後、オーバーラッピングＰＣＲを行うことで、ライブラリが構築されるように設計した。突然変異の導入によるライブラリの理論的な大きさは、重鎖可変領域は５．８３×１０１０、軽鎖可変領域は２．１６×１０４であった。
【００８９】
【表９】
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【００９０】
３‐２：軽鎖可変領域ライブラリの構築
ライブラリに突然変異を導入するために、先ず、軽鎖可変領域を２つに分けて断片ＰＣＲ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＰＣＲ）を行った。軽鎖可変領域の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）１番は、抗‐メソテリンＭＳ５０２クローンの軽鎖可変領域遺伝子配列を鋳型にして順方向プライマー（表１０：配列番号９３）、逆方向プライマー（表１０：配列番号９４）を添加し、軽鎖可変領域の断片２番は、抗‐メソテリンＭＳ５０２クローンの軽鎖可変領域遺伝子配列を鋳型にして順方向プライマー（表１０：配列番号９５）、逆方向プライマー（表１０：配列番号９６）を添加した後、それぞれの断片をＰｒｉｍｅｒｓｔａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９８℃で２分間露出後、９８℃で１０秒、６０℃で１５秒、７２℃で２０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、それをゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＣＡＴ．ＮＯ．２８７０６、ＱＩＡＧＥＮ）を用いてそれぞれ分離した。軽鎖不変領域は、軽鎖ラムダ領域を鋳型にして順方向プライマー（表１０：配列番号９７）、逆方向プライマー（表１０：配列番号９８）を添加した後、それぞれの断片をＰｒｉｍｅｓｔａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｒｅｍｉｘを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９８℃で２分間露出後、９８℃で１０秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、それをゲル抽出キットを用いて分離した。確保された軽鎖可変領域の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）１、２と、軽鎖不変領域を１：１：１のモル比となるようにして鋳型にし、順方向プライマー（表１０：配列番号９２）、逆方向プライマー（表１０：配列番号９８）を添加した後、それぞれの断片をＰｒｉｍｅｓｔａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｒｅｍｉｘを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９８℃で２分間露出後、９８℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、それをゲル抽出キットを用いて分離した後、軽鎖可変‐不変領域の親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）遺伝子を確保した。確保された遺伝子をＮｒｕＩとＸｂａＩ（ＮＥＢ）制限酵素で３７℃で４時間反応させた。制限酵素で反応させた遺伝子をさらに１％アガロースゲルから分離した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ、ＮＥＢ）を用いて、前記分離された遺伝子を、ＭＳ５０２重鎖可変‐不変領域が入っている線形ｐＣｏｍｂ３ｘベクターのＮｒｕＩ、ＸｂａＩサイトに挿入した。前記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた後、ＬＢ培地��００ｍＬで１時間、３７℃、２２０ｒｐｍで培養した後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）１５０μＬ、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）３００μＬを処理した後、３７℃、２２０ｒｐｍで１時間振盪培養した。これに、ＶＣＳ  Ｍ１３ヘルパーファージ４．５ｍＬ（１０１１ｐｆｕ）を処理した後、３７℃、２２０ｒｐｍで１時間振盪培養した。その後、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）３００μＬ、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）３００μＬを処理し、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した。翌日、培養した細胞を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄み液を新しい容器に移した。ファージ（ｐｈａｇｅ）を沈殿させるために、５ＸのＰＥＧ／ＮａＣｌを１Ｘとなるように上澄み液に添加した後、氷で３０分以上放置した。沈殿させたファージを８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上澄み液を捨て、沈殿されたファージを１０ｍＬのＰＢＳで再懸濁（ｒｅ‐ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。細胞破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去するために、１０ｍＬのＰＢＳで溶かしたファージを１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を分離した後、４℃に保管した。ライブラリの大きさは、形質転換１時間後に培養液１００μＬを採取し、段階的希釈方式によりカルベニシリン（Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹した後、３７℃で１２時間以上培養してから、コロニーカウンティング（ｃｏｌｏｎｙ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）によって確認した。
【００９１】
３‐３：重鎖可変領域ライブラリの構築
ライブラリに突然変異を導入するために、先ず、重鎖可変領域を３つに分けて断片ＰＣＲ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ＰＣＲ）を行った。重鎖可変領域の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）１番は、抗‐メソテリンＭＳ５０２クローンの重鎖可変領域遺伝子配列を鋳型にして順方向プライマー（表１０：配列番号９９）、逆方向プライマー（表１０：配列番号１００）を添加し、重鎖可変領域の断片２番は、抗‐メソテリンＭＳ５０２クローンの重鎖可変領域遺伝子配列を鋳型にして順方向プライマー（表１０：配列番号１０１）、逆方向プライマー（表１０：配列番号１０２）を添加し、重鎖可変領域の断片３番は、抗‐メソテリンＭＳ５０２クローンの重鎖可変領域遺伝子配列を鋳型にして順方向プライマー（表１０：配列番号１０３）、逆方向プライマー（表１０：配列番号１０４）を添加した後、それぞれの断片をＰｒｉｍｅｒｓｔａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｒｅｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９８℃で２分間露出後、９８℃で１０秒、６０℃で１５秒、７２℃で２０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、それをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。確保された重鎖可変領域の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）１、２、３を１：１：１のモル比となるようにして鋳型にし、順方向プライマー（表１０：配列番号９９）、逆方向プライマー（表１０：配列番号１０６）を添加した後、それぞれの断片をＰｒｉｍｅｓｔａｒ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｒｅｍｉｘを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９８℃で２分間露出後、９８℃で２０秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、それをゲル抽出キットを用いて分離した後、重鎖可変‐不変領域の親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）遺伝子を確保した。確保された遺伝子をＸｈｏＩとＡｐａＩ（ＮＥＢ）制限酵素で３７℃で４時間反応させた。制限酵素で反応させた遺伝子をさらに１％アガロースゲルから分離した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ、ＮＥＢ）を用いて、前記分離された遺伝子を、ＭＳ５０２軽鎖可変‐不変領域が入っている線形ｐＣｏｍｂ３ｘベクターのＸｈｏＩ、ＡｐａＩサイトに挿入した。前記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた後、ＬＢ培地３００ｍＬで１時間、３７℃、２２０ｒｐｍで培養した後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）１５０μＬ、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）３００μＬを処理した後、３７℃、２２０ｒｐｍで１時間懸濁培養した。これに、ＶＣＳ  Ｍ１３ヘルパーファージ４．５ｍＬ（１０１１ｐｆｕ）を処理した後、３７℃、２２０ｒｐｍで１時間振盪培養した。その後、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）３００μＬ、カルベニシリン（ｃ���ｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）３００μＬを処理し、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した。翌日、培養した細胞を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄み液を新しい容器に移した。ファージ（ｐｈａｇｅ）を沈殿させるために、５ＸのＰＥＧ／ＮａＣｌを１Ｘとなるように上澄み液に添加した後、氷で３０分以上放置した。沈殿させたファージを８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上澄み液を捨て、沈殿されたファージを１０ｍＬのＰＢＳで再懸濁（ｒｅ‐ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。細胞破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去するために、１０ｍＬのＰＢＳで溶かしたファージを１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液を分離した後、４℃に保管した。ライブラリの大きさは、形質転換１時間後に培養液１００μＬを採取し、段階的希釈方式によりカルベニシリン（Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹した後、３７℃で１２時間以上培養してから、コロニーカウンティング（ｃｏｌｏｎｙ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ）によって確認した。
【００９２】
【表１０】
0006738893.tif 000011
【００９３】
表１０において、Ｘコドン（ｃｏｄｏｎ）は、それぞれのＡＣＧＴを特定の割合で調節したｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｄｏｎであって、翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）されるアミノ酸の割合を調節可能とする。一例として、配列番号１０２のＮＸ１Ｘ２コドンの場合、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔがランダムな割合でコードされ、Ｘ１は、Ａ１０％、Ｃ１０％、Ｇ７０％、Ｔ１０％、Ｘ２は、Ａ１０％、Ｃ７０％、Ｇ１０％、Ｔ１０％の割合でコードされる。これは、逆方向プライマーで設計されたものであるため、純方向に変換するとＸ２Ｘ１Ｎコドンとなり、Ｘ２は、Ａ１０％、Ｃ７０％、Ｇ１０％、Ｔ１０％、Ｘ１は、Ａ１０％、Ｃ１０％、Ｇ７０％、Ｔ１０％の割合でコードされる。結果として、これは、重鎖可変領域ＣＤＲ１  Ｋａｂａｔ番号を基準として３１番を、Ｔｙｒ７％、Ｓｅｒ８％、Ｇｌｙ１％、Ｈｉｓ７％、Ａｓｐ７％、Ｐｈｅ１％、Ｔｈｒ７％、Ａｓｎ４９％、Ａｌａ１％、Ｖａｌ１％、Ｌｅｕ１％、Ｉｌｅ７％、Ｐｒｏ１％、Ｃｙｓ１％のアミノ酸に翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）されるようにする。
【００９４】
３‐４：軽鎖可変領域突然変異抗体の選別
Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ｔｕｂｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．４４４２０２，Ｎｕｎｃ）に、組換えヒトタンパク質ＭＳＬＮ１ｍＬを１μｇ／ｍＬの濃度で入れ、４℃で１２時間以上コーティングしたチューブを０．０５％のＰＢＳＴ５ｍＬで３回洗浄した。ＭＳＬＮがコーティングされたイムノチューブ（Ｉｍｍｕｎｏ  ｔｕｂｅ）に５ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳを入れ、常温で２時間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。イムノチューブのブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）緩衝液を除去した後、軽鎖可変領域ファージライブラリをチューブに処理して常温で２時間反応させた。その後、ＰＢＳＴ５ｍＬで４回洗浄した。イムノチューブに１ｍＬのグリシン（ｐＨ２．０）溶出緩衝液を処理し、常温で１０分間反応させて上澄み液を収得した後、溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）したファージに１．５ＭのＴｒｉｓ‐Ｃｌ（ｐＨ８．８）１００μＬを添加して中和させた。約２時間培養した（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）ＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１０ｍＬに、中和させたファージを処理した。常温で３０分間感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、感染されたＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１０ｍＬに、ＳＢ１０ｍＬ、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）（５０ｍｇ／ｍｌ）２０μＬ、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）（１００ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加し、３７℃で１時間振盪培養（２００ｒｐｍ）した。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（＞１０１１ｐｆｕ／ｍｌ）１ｍＬを処理した後、３７℃で１時間振盪培養（２００ｒｐｍ）した。１時間培養後、ＳＢ８０ｍＬ、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）１００μＬ、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）（１００ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを処理し、３７℃で一晩培養（２００ｒｐｍ）した。一晩培養したライブラリは４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液のみを分離し、５ＸのＰＥＧ／ＮａＣｌ緩衝液を１Ｘで入れて混合してから、氷で３０分間放置した。８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を２ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで再懸濁した後、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液のみを取って次のパニングに使用した。前記過程を４回繰り返して行った。
【００９５】
３‐５：重鎖可変領域突然変異抗体の選別
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  ｂｉｏｔｅｃ  １３０‐０４８‐１０１）５０μＬの上澄み液を除去した後、ＰＢＳ１ｍｌを入れて３回洗浄した。ビーズ（Ｂｅａｄ）に、１％のＢＳＡが含まれたＰＢＳ１ｍＬを入れ、常温で２時間回転（ｒｏｔａｔｉｏｎ）してブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）させた。５０ｎＭのＭＳＬＮを５００μＬのＰＢＳに入れた後、ＭＳ５０２  ＶＨ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｈａｇｅ５００μＬを混合し、常温で１時間回転して反応させた。ビーズのブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）緩衝液を除去した後、ＭＳＬＮとファージが混合された溶液をビーズに処理して常温で１５分間反応させた。その後、ＰＢＳＴ１ｍＬで６回洗浄した。ｂｅａｄに１ｍＬのグリシン（ｐＨ２．０）溶出緩衝液を処理し、常温で１０分間反応させて上澄み液を収得した後、溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）したファージに１．５ＭのＴｒｉｓ‐Ｃｌ（ｐＨ８．８）１００μＬを添加して中和させた。約２〜２．５時間培養した（ＯＤ６００＝０．８〜１．０）ＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１０ｍＬに、中和させたファージを処理した。常温で３０分間感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、感染されたＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）１０ｍＬに、ＳＢ１０ｍＬ、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）（５０ｍｇ／ｍｌ）２０μＬ、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）（１００ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加し、３７℃で１時間振盪培養（２００ｒｐｍ）した。ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（＞１０１１ｐｆｕ／ｍｌ）１ｍＬを処理した後、３７℃で１時間懸濁培養（２００ｒｐｍ）した。１時間培養後、ＳＢ８０ｍＬ、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）１００μＬ、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）（１００ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを処理し、３７℃で一晩培養（２００ｒｐｍ）した。一晩培養したライブラリは４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液のみを分離し、５ＸのＰＥＧ／ＮａＣｌ緩衝液を１Ｘで入れて混合してから、氷で３０分間放置した。８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上澄み液を除去し、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を２ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで再懸濁した後、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄み液のみを取って次のパニングに使用した。ＭＳＬＮに対して、ＭＳ５０２  ＶＨ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｈａｇｅを用いてビーズパニングを総３次まで行った。２、３次パニングの結果、ｏｕｔｐｕｔ  ｔｉｔｅｒが増加したことから、ＭＳＬＮに対する抗体が増幅されたことが確認された。
【００９６】
３‐６：ＥＬＩＳＡ方式の個別クローンの確保
軽鎖／重鎖可変領域のそれぞれのライブラリの最終増幅集団の単コロニーを採取した後、ＳＢ／カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）１．５ｍＬに、ＯＤ６００で０．８〜１．０程度まで３７℃、２２０ｒｐｍで培養した後、１ｍＭのＩＰＴＧ、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間以上培養させた。この反応物を５５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、それぞれの上澄み液のみを、ＭＳＬＮ抗原が敷かれているＥＬＩＳＡプレートに添加し、２時間常温で反応させてから、ＰＢＳＴ（１ＸＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した。その後、ＨＲＰ／Ａｎｔｉ‐ｈＦａｂ‐ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを１％ＢＳＡ／１ＸＰＢＳで１／５０００に希釈したものを添加した後、１時間常温で反応させた。その後、さらにＰＢＳＴ（１ＸＰＢＳ、０．０５％ｔｗｅｅｎ２０）で４回洗浄した後、ＴＭＢ溶液を添加し、５〜１０分間放置してからＴＭＢ  ｓｔｏｐ溶液を添加した。その後、ＴＥＣＡＮ  ｓｕｎｒｉｓｅを用いて、４５０ｎｍの測定波長でその値を読み取り、高いＯ．Ｄ値を有するクローンを個別クローンとして確保した。
【００９７】
その結果、表１１に示されたように、ヒトＭＳＬＮに特異的に結合するクローンが選別され、これらのアミノ酸配列を確認した。
【００９８】
表１２は、表１１のクローン抗体のＣＤＲアミノ酸配列をＫａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇを基準として表記したものである。
【００９９】
【表１１】
0006738893.tif 000012
0006738893.tif 000013
【０１００】
【表１２】
0006738893.tif 000014
【０１０１】
３‐７：ＳＰＲを用いた個別クローンの結合力の相対比較および選定
実施例３‐３で実施したＥＬＩＳＡ方式の個別クローンの確認で確保された個別クローンの培養液を用いて結合力を比較測定するために、先ず、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、ヒトＭＳＬＮをアセテート緩衝液（ｐＨ４．０）に１μｇ／ｍｌに溶かし、流速１０μＬ／分で流して、１０００Ｒｕとなるように固定した。実施例３‐６で発現したＦａｂ上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）をｐＨ７．４のＨＢＳ‐ＥＰ緩衝液に１／１０に希釈し、流速３０μＬ／分で結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１２０秒、解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１８０秒で流して、バインディング（ｂｉｎｄｉｎｇ）分析を行った。再生（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、１０ｍＭのグリシン‐ＨＣｌ（ｐＨ１．５）緩衝液で３０秒間行った。ＥＬＩＳＡとＳＰＲバインディングデータを比較分析し、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の最終クローンを選定した。
【０１０２】
その結果、図２および図３に示されたように、軽鎖可変領域突然変異および重鎖可変領域突然変異の結合力を相対比較し、最終クローンとして、軽鎖可変領域ではＣ２Ｇ１、Ｃ２Ｇ４、Ｃ３Ｃ８を選定し、重鎖可変領域では５６、２‐３０、２‐５８、２‐７３、２‐７８を選定した。
【０１０３】
３‐８：クローンＭＳ５０２軽鎖可変領域突然変異抗体のＩｇＧ遺伝子クローニング
確保された軽鎖可変領域Ｃ２Ｇ１、Ｃ２Ｇ４、Ｃ３Ｃ８遺伝子を鋳型にして、それぞれをＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ重合酵素（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１０Ｂ；Ｔａｋａｒａ）を用いて、ＮｏｔＩが含まれた順方向プライマー（表６：配列番号８６）と逆方向プライマー（表６：配列番号８７）でＰＣＲを行った。また、ヒト抗体のカッパー軽鎖不変領域（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）に対して、順方向プライマー（表６：配列番号８８）と逆方向プライマー（表６：配列番号８９）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９４℃で１０分間露出後、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。その後、各軽鎖可変領域と軽鎖不変領域を交ぜ、重なりＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ＰＣＲ）を行い、軽鎖領域（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｒｅｇｉｏｎ）を発現する遺伝子をクローニングした。条件としては、９４℃で１０分間露出後、９４℃で１５秒、５６℃で３０秒、７２℃で９０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。分離した遺伝子をＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で３７℃で１２時間以上反応させた後、制限酵素で反応させた遺伝子をさらに１％のアガロースゲルから分離した。ｐｃＩＷプラスミドベクターも同様の方法により切断し、アガロースゲルから分離した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ０２０３Ｓ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ））を用いて、前記分離されたＭＳ５０１、ＭＳ５０２、ＭＳ５０３、ＭＳ５０４、ＭＳ５０５およびＭＳ５０６の軽鎖可変領域遺伝子を、線形ｐｃＩＷベクターのＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した。前記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹した後、３７℃で１２時間以上培養した。次に、単コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養した後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５、ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを分離し、それをＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０１０４】
３‐９：クローンＭＳ５０２重鎖可変領域突然変異抗体のＩｇＧ遺伝子クローニング
重鎖可変領域５６、２‐３０、２‐５８、２‐７３、２‐７８遺伝子を鋳型にして、それぞれをＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ重合酵素（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｒ０１０Ｂ；Ｔａｋａｒａ）を用いて、ＮｏｔＩが含まれた順方向プライマー（表６：配列番号９０）とＡｐａＩが含まれた逆方向プライマー（表６：配列番号９１）でＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件としては、９８℃で２分間露出後、９８℃で１０秒、５８℃で１０秒、７２℃で３０秒間の露出を３０回繰り返した後、７２℃で５分間反応させた。前記増幅された遺伝子を、１％のアガロースゲルで予想した大きさのＤＮＡバンドを確認し、これをゲル抽出キットを用いてそれぞれ分離した。その後、分離した遺伝子をＫｐｎＩとＡｐａＩ制限酵素で３７℃で４時間以上反応させた後、制限酵素で反応させた遺伝子をさらに１％のアガロースゲルから分離した。ｐｃＩＷプラスミドベクターも同様の方法により切断し、アガロースゲルから分離した。Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを用いて、前記分離された遺伝子を、ヒト重鎖不変領域が入っている線形ｐｃＩＷベクターのＮｏｔＩ、ＡｐａＩサイトに挿入した。前記ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物をＸＬ１‐Ｂｌｕｅバクテリア（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ‐Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００２２８、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた後、カルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）が含まれたＬＢプレート（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＬＮ００４ＣＡ、ＮａｒａｅＢｉｏｔｅｃｈ）に塗抹した後、３７℃で１２時間以上培養した。次に、単コロニー（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｉｅｓ）を選んで培養した後、プラスミドミニキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７４０５、ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを分離し、それをＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０１０５】
３‐１０：クローンＭＳ５０２軽鎖可変領域突然変異抗体のＩｇＧの生産および精製
軽鎖可変領域突然変異抗体Ｃ２Ｇ１、Ｃ２Ｇ４、Ｃ３Ｃ８を生産および精製するために、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の一日前に、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞を２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で接種した。２４時間培養（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）後、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１０１、Ｇｉｂｃｏ）を添加して、細胞数２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度（生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）＝９５％）で３０ｍＬを準備した。３０μｇのＤＮＡ（ｐｃＩＷ‐ＭＳ５０２重鎖可変領域：１５μｇ、ｐｃＩＷ‐ａｎｔｉ‐ＭＳＬＮ軽鎖可変領域突然変異：１５μｇ）を、全体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）に希釈し、常温で５分間反応させた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）８０μＬを、全体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍＬに混合した後、常温で５分間反応させた。５分間反応後、それぞれ希釈したＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬１．５ｍＬをよく混合して常温で２０〜３０分間反応させた。ＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬の混合液３ｍＬをＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞に処理した。１６〜１８時間懸濁培養した後（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）と１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）を添加し、５日間懸濁培養した。培養が終わると、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を０．２２μｍのフィルターに通過させて準備した。各３０ｍＬの培養液当たりにプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ）であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７‐５２６９‐０２、Ｇｉｂｃｏ）を１００μＬずつ準備し、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離して貯蔵溶液を除去した後、プロテインＡバインディング緩衝液（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００７、Ｐｉｅｒｃｅ）４００μＬずつ３回洗浄した。前記準備された培養液にプロテインＡレジン（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ）を入れて室温で３０分間回転反応させた。Ｐｉｅｒｃｅ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ‐ｓｎａｐ  ｃａｐ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６９７２５、Ｔｈｅｒｍｏ）に培養液とレジン（ｒｅｓｉｎ）の混合物を入れ、ＱＩＡｖａｃ  ２４  Ｐｌｕｓ  ｖａｃｕｕｍ  ｍａｎｉｆｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９４１３、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、カラムにレジン（ｒｅｓｉｎ）のみを残した。プロテインＡバインディング緩衝液５ｍＬを入れてレジン（ｒｅｓｉｎ）を洗浄した後、プロテインＡ溶出緩衝液（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００９、Ｐｉｅｒｃｅ）２００μＬを入れて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）し、室温で２分間反応させた後、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離して溶出した。各溶出液���ｅｌｕａｔｅ）には１．５ＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２．５μＬを入れて中和させた。溶出は４〜６回にわたって行い、各分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はＮａｎｏｄｒｏｐ  ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。タンパク質が検出された分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）は集めてＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ  ＭＷＣＯ、５ｍＬ（Ｃａｔ．Ｎｏ．００８９８９２、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）緩衝液に緩衝液を交換した後、還元および非還元の条件でタンパク質電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）を行って最終的に濃度を定量するとともに、抗体の状態を検証し、４℃に保管した。
【０１０６】
３‐１１：ＭＳＬＮ抗原に対するＭＳ５０２軽鎖可変領域突然変異抗体の定量的な結合力の測定
精製された抗‐ＭＳＬＮ抗体であるＭＳ５０２クローン軽鎖可変領域突然変異抗体Ｃ２Ｇ１、Ｃ２Ｇ４、Ｃ３Ｃ８の組換えヒトＭＳＬＮ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）に対する定量的な結合力（親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ））を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ‐２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）バイオセンサを用いて測定した。ＨＥＫ２９３細胞から精製されたＭＳＬＮ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３２６５‐ＭＳ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を、アミン‐カルボキシル反応を用いてＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ‐１００５‐３０）に２００Ｒｍａｘとなるように固定させた後、ＨＢＳ‐ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）に順に希釈したクローンＣ２Ｇ１、クローンＣ２Ｇ４、またはクローンＣ３Ｃ８抗体を、０．０７８ｎＭ〜５ｎＭの濃度範囲で結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１２０秒、解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１８００秒間３０μＬ／分の流速で流した。１０ｍＭのグリシン‐ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒間３０μＬ／分の流速で流すことで、ＭＳＬＮに結合された抗体の解離を誘導した（表１３）。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ‐２００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、親和度を運動速度定数（ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）と平衡解離定数（ＫＤ）として収得した（表１４）。
【０１０７】
【表１３】
0006738893.tif 000015
【０１０８】
【表１４】
0006738893.tif 000016
【０１０９】
３‐１２：クローンＭＳ５０２重鎖可変領域突然変異抗体のＩｇＧの生産および精製
重鎖可変領域突然変異抗体クローン５６、２‐３０、２‐５８、２‐７３、２‐７８を生産および精製するために、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の一日前に、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞を２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で接種した。２４時間培養（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）後、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１０１、Ｇｉｂｃｏ）を添加して、細胞数２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度（生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）＝９５％）で３０ｍＬを準備した。３０μｇのＤＮＡ（ｐｃＩＷ‐ＭＳ５０２重鎖可変領域突然変異：１５μｇ、ｐｃＩＷ‐ＭＳ５０２軽鎖可変領域：１５μｇ）を、全体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）に希釈し、常温で５分間反応させた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）８０μＬを、全体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍＬに混合した後、常温で５分間反応させた。５分間反応後、それぞれ希釈したＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬１．５ｍＬをよく混合して常温で２０〜３０分間反応させた。ＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬の混合液３ｍＬをＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞に処理した。１６〜１８時間懸濁培養した後（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）と１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）を添加し、５日間懸濁培養した。培養が終わると、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を０．２２μｍのフィルターに通過させて準備した。各３０ｍＬの培養液当たりにプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ）であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７‐５２６９‐０２、Ｇｉｂｃｏ）を１００μＬずつ準備し、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離して貯蔵溶液を除去した後、プロテインＡバインディング緩衝液（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００７、Ｐｉｅｒｃｅ）４００μＬずつ３回洗浄した。前記準備された培養液にプロテインＡレジン（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ）を入れて室温で３０分間回転反応させた。Ｐｉｅｒｃｅ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ‐ｓｎａｐ  ｃａｐ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６９７２５、Ｔｈｅｒｍｏ）に培養液とレジン（ｒｅｓｉｎ）の混合物を入れ、ＱＩＡｖａｃ  ２４  Ｐｌｕｓ  ｖａｃｕｕｍ  ｍａｎｉｆｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９４１３、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、カラムにレジン（ｒｅｓｉｎ）のみを残した。プロテインＡバインディング緩衝液５ｍＬを入れてレジン（ｒｅｓｉｎ）を洗浄した後、プロテインＡ溶出緩衝液（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００９、Ｐｉｅｒｃｅ）２００μＬを入れて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）し、室温で２分間反応させた後、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離して溶���した。各溶出液（ｅｌｕａｔｅ）には１．５ＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２．５μＬを入れて中和させた。溶出は４〜６回にわたって行い、各分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はＮａｎｏｄｒｏｐ  ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。タンパク質が検出された分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）は集めてＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ  ＭＷＣＯ、５ｍＬ（Ｃａｔ．Ｎｏ．００８９８９２、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）緩衝液に緩衝液を交換した後、還元および非還元の条件でタンパク質電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）を行って最終的に濃度を定量するとともに、抗体の状態を検証し、４℃に保管した。
【０１１０】
３‐１３：クローンＭＳ５０２の最終軽鎖可変領域突然変異Ｃ２Ｇ４クローンと組み合わせた重鎖可変領域突然変異抗体のＩｇＧの生産および精製
【０１１１】
軽鎖可変領域突然変異のうち、親和度の測定で最も優れた値を有するＣ２Ｇ４クローンを軽鎖可変領域の最終クローンとして選定して固定し、これに、重鎖可変領域突然変異抗体クローン５６、２‐３０、２‐５８、２‐７３、２‐７８を組み合わせて生産および精製するために、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）の一日前に、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞を２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で接種した。２４時間培養（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）後、Ｅｘｐｉ２９３ＴＭＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４３５１０１、Ｇｉｂｃｏ）を添加して、細胞数２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度（生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）＝９５％）で３０ｍＬを準備した。３０μｇのＤＮＡ（ｐｃＩＷ‐ＭＳ５０２重鎖可変領域突然変異抗体：１５μｇ、ｐｃＩＷ‐軽鎖可変領域突然変異Ｃ２Ｇ４：１５μｇ）を、全体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）に希釈し、常温で５分間反応させた。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）８０μＬを、全体積が１．５ｍＬとなるようにＯｐｔｉＰｒｏＴＭＳＥＭ培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．１２３０９０１９、Ｇｉｂｃｏ）１．５ｍＬに混合した後、常温で５分間反応させた。５分間反応後、それぞれ希釈したＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬１．５ｍＬをよく混合して常温で２０〜３０分間反応させた。ＤＮＡとＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬の混合液３ｍＬをＥｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞に処理した。１６〜１８時間懸濁培養した後（３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍ）、１５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）と１．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１４５２４、Ｇｉｂｃｏ）を添加し、５日間懸濁培養した。培養が終わると、４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を除去した後、上澄み液を０．２２μｍのフィルターに通過させて準備した。各３０ｍＬの培養液当たりにプロテインＡレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ）であるＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１７‐５２６９‐０２、Ｇｉｂｃｏ）を１００μＬずつ準備し、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離して貯蔵溶液を除去した後、プロテインＡバインディング緩衝液（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００７、Ｐｉｅｒｃｅ）４００μＬずつ３回洗浄した。前記準備された培養液にプロテインＡレジン（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｒｅｓｉｎ）を入れて室温で３０分間回転反応させた。Ｐｉｅｒｃｅ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ‐ｓｎａｐ  ｃａｐ（Ｃａｔ．Ｎｏ．６９７２５、Ｔｈｅｒｍｏ）に培養液とレジン（ｒｅｓｉｎ）の混合物を入れ、ＱＩＡｖａｃ  ２４  Ｐｌｕｓ  ｖａｃｕｕｍ  ｍａｎｉｆｏｌｄ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１９４１３、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、カラムにレジン（ｒｅｓｉｎ）のみを残した。プロテインＡバインディング緩衝液５ｍＬを入れてレジン（ｒｅｓｉｎ）を洗浄した後、プロテインＡ溶出緩衝液（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｃａｔ．Ｎｏ．２１００９、Ｐｉｅｒｃｅ）２００μＬを入れて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）し、室温で２分間反応させた後、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離して溶出した。各溶出液（ｅｌｕａｔｅ）には１．５ＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ９．０）２．５μＬを入れて中和させた。溶出は４〜６回にわたって行い、各分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）はＮａｎｏｄｒｏｐ  ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。タンパク質が検出された分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）は集めてＺｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、７Ｋ  ＭＷＣＯ、５ｍＬ（Ｃａｔ．Ｎｏ．００８９８９２、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）緩衝液に緩衝液を交換した後、還元および非還元の条件でタンパク質電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）を行って最終的に濃度を定量するとともに、抗体の状態を検証し、４℃に保管した。
【０１１２】
【表１５】
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【０１１３】
【表１６】
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【０１１４】
３‐１４：ＭＳＬＮ抗原に対するＭＳ５０２重鎖可変領域突然変異抗体、およびＣ２Ｇ４と重鎖可変領域突然変異抗体の組み合わせの定量的な結合力の測定
精製された抗‐ＭＳＬＮ抗体であるＭＳ５０２クローン重鎖可変領域突然変異抗体クローン５６、２‐３０、２‐７３、２‐７８と、これをＣ２Ｇ４軽鎖可変領域と組み合わせた抗体５６‐Ｃ２Ｇ４、２‐３０‐Ｃ２Ｇ４、２‐７３‐Ｃ２Ｇ４、２‐７８‐Ｃ２Ｇ４のそれぞれの組換えヒトＭＳＬＮ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）に対する定量的な結合力（親和度（Ａｆｆｉｎｉｔｙ））を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ‐２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）バイオセンサを用いて測定した。ＨＥＫ２９３細胞から精製されたＭＳＬＮ（Ｃａｔ．Ｎｏ．３２６５‐ＭＳ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を、アミン‐カルボキシル反応を用いてＣＭ５チップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＲ‐１００５‐３０）に２００Ｒｍａｘとなるように固定させた後、ＨＢＳ‐ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）に順に希釈したクローン５６、クローン２‐３０、クローン２‐７３、クローン２‐７８、クローン５６‐Ｃ２Ｇ４、クローン２‐３０‐Ｃ２Ｇ４、クローン２‐７３‐Ｃ２Ｇ４、クローン２‐７８‐Ｃ２Ｇ４抗体を、０．０７８ｎＭ〜５ｎＭの濃度範囲で結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１２０秒、解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１８００秒間３０μＬ／分の流速で流した。１０ｍＭのグリシン‐ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒間３０μＬ／分の流速で流すことで、ＭＳＬＮに結合された抗体の解離を誘導した（表１７）。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ‐２００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、親和度を運動速度定数（ＫｏｎおよびＫｏｆｆ）と平衡解離定数（ＫＤ）として収得した（表１８）。
【０１１５】
【表１７】
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【０１１６】
【表１８】
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【０１１７】
実施例４：ＭＳＬＮ発現癌細胞に対する抗‐ＭＳＬＮ抗体の結合に対するＦＡＣＳ分析
免疫および合成ライブラリから導出された抗‐ＭＳＬＮ抗体が、ＭＳＬＮを発現する細胞に選択的に結合するかを評価するために、癌細胞株におけるＭＳＬＮの発現量を測定し、各細胞に対する抗体の結合をＦＡＣＳ試験により確認した。
【０１１８】
４‐１：ＭＳＬＮ発現細胞株の作製
ＭＳＬＮ陰性細胞株であると確認されたＭｉａＰａＣａ‐２膵臓癌細胞に、ＭＳＬＮ発現ユニットとハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）抵抗遺伝子を有するプラスミド（ｐＣＭＶ／ＭＳＬＮ）を、ｊｅｔＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ）  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、１０１‐４０）を用いて細胞内に伝達した（図４）。細胞培養液を、４８時間後にハイグロマイシンＢ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）（２００μｇ／ｍＬ）を含んでいる培養液に交換した。３日毎に培養液を交換しながら、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）に対して抵抗性を示すコロニーを１０個獲得し、それぞれのＭＳＬＮ発現量をウエスタンブロット法により確認した。膵臓癌細胞株４種（ＭｉａＰａＣａ‐２、ＢｘＰＣ‐３、Ｃａｐａｎ‐１、ＡｓＰＣ‐１）および中皮腫細胞株２種（Ｈ２８、Ｈ２４５２）に対しても、抗‐ＭＳＬＮ抗体（＃１３３４８９、Ａｂｃａｍ）を用いてウエスタンブロット法により細胞内のＭＳＬＮ発現量を確認した。培養されている細胞にＴｒｙｐｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液を加えて剥離させた後、１５ｍＬのチューブに入れて２０００ｒｐｍで３分間常温で遠心分離して培養液を除去し、１ｘＳＤＳ‐ＰＡＧＥ試料緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、２％のＳＤＳ、１００ｍＭのＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、０．１％のＢＰＢ（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）、１０％のグリセロール）１００μＬで懸濁し、５分間加熱した。遠心分離により上澄み液を回収し、４‐１２％のＳＤＳ‐ＰＡＧＥで２０ｍＡで約２時間電気泳動し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜に移すために、トランスファーユニットを用いて３００ｍＡにて、Ｔｒｉｓ‐グリシン緩衝液（３９ｍＭのグリシン、４８ｍＭのＴｒｉｓ、０．０３７％のＳＤＳ、２０％メタノール）で約９０分間電気泳動した。タンパク質が移されたＰＶＤＦ膜に、ＴＢＳブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて常温で一時間ブロッキングした。１次抗体として抗‐ＭＳＬＮ抗体（＃１３３４８９、Ａｂｃａｍ）を５％スキムミルク／１ｘＴＢＳＴ緩衝液に１：２，０００に希釈し、常温で１時間程度反応させた後、１ｘＴＢＳＴ緩衝液で５分ずつ６回洗浄した。２次抗体として抗マウスＨＲＰ（ＫＰＬ、ＭＡ、ＵＳＡ）を５％スキムミルク／１ｘＴＢＳＴ緩衝液に１：２０，０００に希釈し、３０分間反応させた後、１ｘＴＢＳＴ緩衝液で５分ずつ６回洗浄し、発色反応液（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）でＭＳＬＮタンパク質バンドを検証した。
【０１１９】
その結果、図５に示されたように、それぞれの癌細胞株から７０ｋＤａの前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）形態と４０〜５０ｋＤａの成熟（ｍａｔｕｒｅ）形態のＭＳＬＮの存在有無を測定したところ、Ｈ２８、ＭｉａＰａＣａ‐２、ＢｘＰＣ‐３、Ｃａｐａｎ‐１細胞株はＭＳＬＮ陰性であり、Ｈ２２６、Ｈ２４５２（Ｈ２０５２）、ＡｓＰＣ‐１はＭＳＬＮ陽性であることが確認された。
【０１２０】
４‐２：ＭＳＬＮ発現細胞株および腫瘍細胞株におけるＭＳＬＮ発現量の分析
ＭＳＬＮを人為的に発現させた細胞株であるＭｉａＰａＣａ‐ＭＳＬＮに対して、細胞の表面に存在するＭＳＬＮをＦＡＣＳ試験により測定した。培養容器で培養している分析すべき細胞をＴｒｙｐｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ溶液を加えて剥離させた後、５０ｍＬのチューブに入れて２０００ｒｐｍで３分間常温で遠心分離して培養液を捨て、ＰＢＳで１回洗浄した。ＦＡＣＳ緩衝液で懸濁した後、丸底チューブに移して２０００ｒｐｍで３分間常温で遠心分離した。上澄み液を捨て、ＦＡＣＳ緩衝液で細胞の密度が４ｘ１０５個／ｍＬとなるようによく溶いた。そして、４℃で候補抗体１μｇを添加した。１時間後にＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ヤギ由来の抗‐ヒトＩｇＧ抗体（ＦＩＴＣ接合）を試料当たり１μＬを入れ、４℃で３０分間結合させた。２０００ｒｐｍで３分間遠心分離して細胞を回収した後、固定緩衝液（Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）５００μＬを入れ、細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒで測定した（図６）。
【０１２１】
４‐３：抗‐ＭＳＬＮ抗体のＭＳＬＮ発現細胞株に対する選択的結合の分析
ＭＳＬＮを過発現させた細胞株（ＭｉａＰａＣａ‐ＭＳＬＮ  ＃２）に抗‐ＭＳＬＮ抗体が選択的に結合するかを、ＦＡＣＳ試験により測定した。前記実施例４‐２で記述した方法により抗‐ＭＳＬＮ候補抗体を標識させた後、ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒで測定した（図７）。
【０１２２】
結合力に優れたＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＳ５０２候補抗体が、中皮腫（Ｈ２２６、Ｈ２０５２）および膵臓癌（ＡｓＰＣ‐１）の細胞膜ＭＳＬＮにも良好に結合するかを、ＦＡＣＳ試験により測定してＭＦＩ値で比較した。
【０１２３】
【表１９】
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【０１２４】
その結果、図８および表１９に示されたように、中皮腫と膵臓癌細胞株のＭＳＬＮに対するＭＩ３２３、ＭＩ３２９、ＭＩ４０３、ＭＳ５０２候補抗体の結合程度は、やや差はあるが、何れも有意な結合力を示し、特に、ＭＩ３２３候補抗体は優れた結合様相を示した。
【０１２５】
尚、ＭＳＬＮに対して優れた結合様相を示すＭＩ３２３候補抗体とＢｉａｃｏｒｅ  ＫＤ（Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）値のパターンが異なるＭＳ５０２、ＭＳ５０２候補抗体から作製された重鎖可変領域突然変異２‐７８‐Ｃ２Ｇ４候補抗体が、ＭＳＬＮを発現する腫瘍細胞に選択的に結合するかをＭＳＬＮ過発現ＭｉａＰａＣａ‐ＭＳＬＮ  ＃２細胞とＭＳＬＮを発現しないＭｉａＰａＣａ‐２で評価した。
【０１２６】
その結果、図９に示されたように、ＭＩ３２３、ＭＳ５０２、２‐７８‐Ｃ２Ｇ４候補抗体は、ＭｉａＰａＣａ‐２に比べてＭＳＬＮ過発現ＭｉａＰａＣａ‐ＭＳＬＮ  ＃２細胞で優れた結合様相を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明によるメソテリンに特異的に結合する抗体は、抗原に対する高い親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）および特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）により、癌または腫瘍疾患の治療または診断に効果的に使用されることができる。
【０１２８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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