(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）であって、該ウイルスは不活性UL4遺伝子を有するＤＥＶ。
【請求項２】
前記UL4遺伝子が、突然変異、又は欠失、又は割り込みを受けている、請求項１記載のＤＥＶ。
【請求項３】
前記UL4遺伝子配列の少なくとも２０％が、欠失されている、請求項２記載のＤＥＶ。
【請求項４】
前記UL4遺伝子配列の少なくとも５０％が、欠失されている、請求項２記載のＤＥＶ。
【請求項５】
前記UL4遺伝子配列の少なくとも６０％が、欠失されている、請求項２記載のＤＥＶ。
【請求項６】
外来核酸をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項記載のＤＥＶ。
【請求項７】
外来核酸が、不活性UL4遺伝子内に局在する、請求項６記載のＤＥＶ。
【請求項８】
前記ウイルスが、UL4遺伝子配列の全て又は一部に代えて、UL4遺伝子に局在する外来核酸を含む、請求項６又は７記載のＤＥＶ。
【請求項９】
外来核酸が、UL44遺伝子、UL27−UL26遺伝子間領域、UL23遺伝子、UL45−UL46遺伝子間領域、UL50−UL51遺伝子間領域、US4遺伝子、US5遺伝子、US7遺伝子、US7−US8遺伝子間領域、又はUS10遺伝子から選択される挿入部位に局在する請求項６記載のＤＥＶ。
【請求項１０】
外来核酸が、抗原又は免疫促進性分子をコードする、請求項６〜９のいずれか一項記載のＤＥＶ。
【請求項１１】
外来核酸が、鳥病原体由来の抗原をコードする、請求項１０記載のＤＥＶ。
【請求項１２】
抗原が、鳥パラミクソウイルス１型抗原性タンパク質又はペプチド、ガンボロ病ウイルスの抗原性タンパク質又はペプチド、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）の抗原性タンパク質又はペプチド、マイコプラズマ・ガリセプチカムの抗原性タンパク質又はペプチド、又は鳥インフルエンザウイルスの抗原性タンパク質又はペプチドから選択される、請求項１１記載のＤＥＶ。
【請求項１３】
抗原が、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）又はそのフラグメント、伝染性嚢病ウイルスＶＰ２（ＩＢＤＶ）又はそのフラグメント、伝染性咽頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）のｇＢタンパク質又はそのフラングメント、Mycoplasma galisepticumの４０Ｋタンパク質又はそのフラグメント、及び鳥インフルエンザウイルスの表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）又はそのフラグメントから選択される、請求項１２記載のＤＥＶ。
【請求項１４】
抗原性ペプチドが、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質若しくはその免疫原性フラグメント、又はインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質若しくはそのフラグメントである、請求項１３記載のＤＥＶ。
【請求項１５】
前記ＤＥＶが、ニワトリにおいて弱毒化されている、請求項１〜１４のいずれか一項記載のＤＥＶ。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項記載のＤＥＶのゲノムを含む、核酸分子。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか一項記載のＤＥＶ又は請求項１６記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１８】
コンピテント細胞に、請求項１６記載の核酸分子又は請求項１記載のＤＥＶを感染させ、ＤＥＶを回収することを含む、請求項１〜１５のいずれか一項記載のＤＥＶを製造又は複製するための方法。
【請求項１９】
家禽へのワクチン接種又は免疫付与に使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項記載のＤＥＶ。
【請求項２０】
家禽において防御免疫を誘導するために使用するための、請求項１〜１５のいずれか一項記載のＤＥＶ。
【請求項２１】
家禽が、ニワトリである、請求項１９又は２０記載の使用のためのＤＥＶ。
【請求項２２】
ＤＥＶが、注射により投与される、請求項１９〜２１のいずれか一項記載の使用のためのＤＥＶ。
【請求項２３】
ＤＥＶが、インオボ又は孵化後第１日若しくは第２日に投与される、請求項１９〜２２のいずれか一項記載の使用のためのＤＥＶ。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか一項記載のＤＥＶ、請求項１６記載の核酸分子、又は請求項１７記載の宿主細胞、及び薬学的又は獣医学に許容し得る賦形剤又は担体を含む、組成物。
【請求項２５】
佐剤をさらに含む、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
鳥に免疫付与するためのワクチン接種キットであって、以下の成分、
ａ．有効量の請求項２４又は２５記載の組成物、及び
ｂ．該組成物を該鳥に投与するための手段
を含むワクチン接種キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ウイルス及びその使用に関する。さらに詳細には、本発明は、新規アヒル腸炎ウイルス（Duck Enteritis Virus）構築体、及び関心対象のポリペプチドを発現、又は動物、特に家禽に送達するための、それらの使用に関する。本発明は特に、家禽に、鳥病原体に対するワクチン接種をするのに好適である。
【背景技術】
【０００２】
家禽の肉及び卵は重要な食物源であり、それらの消費は人口増加及び人々の高い品質−価格比に起因して継続的に増加している。近年の鳥インフルエンザの流行により、世論の焦点が家禽の健康や食品の安全性及び安全保障に集まり、また家禽ワクチン技術が世界的に注目されている。
【０００３】
病原体タンパク質を発現しているリコンビナントウイルスが、標的病原体に対する家禽ワクチンとして一般的に用いられている。このようなウイルスを含むワクチンは、感染細胞内で外来病原体タンパク質又はそのフラグメントの発現を誘導し、その後特異的且つ保護的な体液性免疫や細胞媒介性免疫を誘導できる。
【０００４】
これに関し、病原体由来の外来遺伝子が統合されているウイルスがいくつか、ウイルスベクターワクチンとして使用するために開発されている。これらのウイルスベクター（又はリコンビナントウイルス）は典型的には、鶏痘（ＥＰ−Ａ−０，５１７，２９２）などの鳥ポックスウイルス、ヘルペス（疱疹）ウイルス、特にＨＶＴ（例えば、ＷＯ−Ａ−８７／０４４６３、５，９８０，９０６、５，８５３，７３３）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）又は鳥アデノウイルスに基づいている。これらのリコンビナント鳥ウイルスは、疾患及び／又は動物に応じて様々なレベルの保護を提示する。
【０００５】
例えば、ポックスウイルス、ＮＤＶ、及びアデノウイルスはニワトリにおいて存続しないので、それらはニワトリでの長期継続期間の免疫のための最良の候補とは考えられない。リコンビナントＨＶＴ発現抗原は利点を示しており、現在ニワトリのワクチン接種用に市販されている（例えば、Vectormune（登録商標）IBD、Vectormune（登録商標）ND、又はVectormune（登録商標）LT）。
【０００６】
しかしながら、病原体の数と多様性の増加、及び家禽消費の継続的成長を考慮して、家禽において有効な防御免疫を引き起こすために使用され得る、代替的なワクチン接種戦略及び／又はシステムが必要とされている。特に、非常に若年の動物（３日以内）又はインオボ（in ovo）で免疫を獲得するのに有効なシステムが必要とされている。
【０００７】
これに関し、動物での、特に家禽でのワクチン接種を改良して安定なタンパク質発現及び有効な防御効果を許容する、代替的な適合性ウイルスベクターを見出すことを目的として新しいウイルス血清型が探索されている。
【０００８】
ＷＯ ２０１４／００３６７３５で、ニワトリにおけるアヒル腸炎ウイルス（Duck Enteritis Virus）の使用の可能性が議論されている。ＤＥＶは自然にアヒル（カモ）又はガチョウに感染するものの、ニワトリに対する公知の向性はない。この明細書では、DEV構築体が１週齡のニワトリに筋肉内注射により投与されてもよいことを示唆する。この明細書ではしかしながら、晩期投与のみが報告される。
【０００９】
ＤＥＶを用いてさらに実験を行うことによって、本発明者らはしかしながら、このようなウイルスが若年のニワトリ（３日以下）又はインオボで投与されると致死的であることを見出した。驚くべきことに、孵化後一週でニワトリに野生型ＤＥＶ（又はＷＯ ２０１４／００３６７３５で提案されるような全てのネイティブな遺伝子を含むDEV構築体）を投与することは、良好な寛容性を示すようであるが、孵化後第１日又はインオボでこのような構築体を投与することは、動物の夥しい大量死（すなわち、８０〜１００％の範囲）を引き起こす。さらにいっそう驚くべきことに、本発明者らは、ＤＥＶの構造を改変して、ごく早期（３日以下）のものを含む家禽にて又はインオボで使用されてもよく、且つインビボにて実質的で早期的なタンパク質発現を引き起こすことのできるDEV構築体を生成することを可能としている。このようなウイルスはしたがって、家禽にワクチン接種するための新規な効力あるベクターを表す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ごく早期（すなわち、孵化後第３日又はそれ以前や、インオボ）を含む動物、特に家禽においてインビボで、遺伝子又はタンパク質を発現するのに好適な新規ウイルス構築体を提供する。特に、本発明はUL4遺伝子の不活化によって得られる新規ＤＥＶを提供し、このようなＤＥＶが（ｉ）インビボ、特にニワトリにおいて弱毒化されていること、及び（ｉｉ）安定であって防御免疫を誘発するのに好適な様態で外来遺伝子を発現することができることを立証する。このようなＤＥＶは、例えばニワトリに対する公知な天然の向性を有しないので、ニワトリをワクチン接種するためのこのようなDEV構築体の使用は、汎発又はワクチン接種を受けていない動物への混入のリスクを伴うものでない。さらに、ニワトリはＤＥＶに対する母系の抗体又は免疫を有さず、本発明のウイルスは、ワクチン接種を受けた動物においてごく早く免疫の開始を誘発するために使用することができる。驚くべきことに、以前に示されたとおり、野生型ＤＥＶは若年のニワトリ又はインオボにおいて致死的であるが、本発明のＤＥＶは安全であり、関心対象の遺伝子をインビボで事実上発現することができる。このような新規ＤＥＶはしたがって、非ヒト動物、特に家禽をワクチン接種するための、且つ早期防御免疫を与えるための非常に強力なベクターを表す。
【００１１】
本発明の目的は、さらに詳細にはアヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子を有する。本発明は実際に、UL4遺伝子を不活化することによって、生存能力があり安定且つ複製性のＤＥＶを得ることが可能なこと、及び外来遺伝子材料の挿入によって、リコンビナントDEVを生成するためにこのようなウイルスが使用され得ることを示す。結果はさらに、このようなウイルスから細胞感染に伴ってこのような外来遺伝子材料が高発現されること、及びこのような発現は長期に亘り安定なままであることを示す。さらに、そして顕著に、ネイティブなＤＥＶや本発明者らにより生成された多くの他の欠失されたDEV構築体は若年のニワトリ（孵化後第３日又はそれ以前）及びインオボにて病原性又は致死性であることが見出されたが、UL4の不活化は、インオボを含め若年の動物内にタンパク質及び抗原を発現させるのに安全に使用されることのできる弱毒化ウイルスを生成する。このような知見は総体的に驚くべきであり、本発明のウイルスの優れた利点及び有用性を提示する。
【００１２】
本発明のさらなる目的はしたがって、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子を有し、外来核酸を含む。
【００１３】
特定の実施形態によれば、UL4遺伝子は、突然変異、若しくは欠失、若しくは割り込みを受けており、且つ／又は外来核酸は、UL4遺伝子配列の全て又は一部に代えて、UL4遺伝子に局在し、且つ／又は外来核酸は、鳥病原体をコードする。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、不活性UL4遺伝子を有するＤＥＶのゲノムを含む核酸分子である。
【００１５】
本発明はさらに、先に定義したようなＤＥＶ又は核酸を含む宿主細胞に関する。
【００１６】
本発明はまた、コンピテント細胞に先に定義したようなＤＥＶ又は核酸分子を感染させ、ＤＥＶを回収することを含む、先に定義したようなＤＥＶを製造又は複製するための方法も提供する。
【００１７】
本発明はまた、ＤＥＶのUL4遺伝子配列に、好ましくは全て又は少なくとも２０％のUL4遺伝子配列に代えて、外来核酸を挿入することを含む、リコンビナントDEVを作成するための方法にも関する。
【００１８】
本発明はまた、先に定義したようなＤＥＶ、核酸、又は宿主細胞、薬学的又は獣医学的に許容し得る賦形剤又は担体、及び任意で佐剤を含む組成物も提供する。
【００１９】
本発明はまた、先に定義したようなＤＥＶ、核酸、又は宿主細胞、薬学的又は獣医学的に許容し得る賦形剤又は担体、及び任意で佐剤を含むワクチンも提供する。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、鳥類、特に家禽、より詳細にはニワトリ、より詳細には若年の家禽（孵化後第３日もしくはそれ以前又はインオボ）へのワクチン接種又は免疫付与をする使用のための先に定義したような組成物、ＤＥＶ、核酸又は宿主細胞に関する。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、鳥類、特に家禽、より詳細にはニワトリ、より詳細には若年の家禽（孵化後第３日もしくはそれ以前又はインオボ）において防御免疫を誘導する使用のための先に定義したような組成物、ＤＥＶ、核酸又は宿主細胞に関する。
【００２２】
本発明はまた、非ヒト動物、特に家禽、より詳細にはニワトリ、より詳細には若年の家禽（孵化後第３日もしくはそれ以前又はインオボ）にワクチン接種する方法であって、当該非ヒト動物に先に定義したような組成物、又はウイルスを投与することを含む方法にも関する。
【００２３】
本発明の特定の目的は、家禽にワクチン接種する方法であって、先に定義したような組成物、又はウイルスをインオボ投与することを含む方法である。
【００２４】
別の本発明の特定の目的は、家禽にワクチン接種する方法であって、先に定義したような組成物、又はウイルスを、孵化後第１日（すなわち、約２４時間以内）に投与することを含む。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、非ヒト動物において一以上の鳥病原体に対して免疫原性又は保護的応答を誘導するための方法であって、当該非ヒト動物、特に家禽、より詳細にはニワトリ、より詳細には若年の家禽（孵化後第３日もしくはそれ以前又はインオボ）に、先に定義したような組成物、ワクチン又はウイルスを投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
本発明のウイルス又は組成物は、任意の経路によって投与され得る。好ましくは、それらはインオボ、又は孵化後１又は２日に皮下（例えば、ｓ．ｃ．）注射により投与され、非常に早期に免疫を付与する。
【００２７】
本発明はさらに、鳥に免疫付与するためのワクチン接種キットであって、以下の成分：
ａ．有効量の前記組成物、及び
ｂ．前記組成物を当該鳥に投与するための手段
を含むワクチン接種キットを提供する。
【００２８】
本発明は、任意の動物においてポリペプチドを発現させるため、好ましくは鳥のワクチン接種のために使用されてもよく、１又は数種のポリペプチド又はペプチド、特に鳥病原体の免疫原性ペプチドを発現させるのに好適である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）ゲノム、及び挿入部位を含むリコンビナントDEV/rpsLneo-DsRed2のクローニングされた領域の場所の概略図である。
【図２】ウイルスのゲノム構造を確認するためにＰＣＲ反応で増幅されたジャンクション１、ジャンクション２、及びジャンクション３の場所を示す、リコンビナントDEV/rpsLneo-DsRed2ゲノムの略図である。
【図３】DEVゲノム、並びにpUC18-KAPEVAC-UL4delのUL4遺伝子及びクローニングされた領域の場所の概略図である。
【図４】DEVゲノム、並びにウイルスのゲノム構造を確認するためにＰＣＲ反応で増幅されたジャンクション１、ジャンクション２、及びジャンクション３の場所を示す、UL26/UL27挿入領域の場所の概略図である。
【図５】DEVゲノム、並びにUL23遺伝子と、pUC18-KAPEVAC-UL23del-BacVP2及びpUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2のクローニングされた領域の場所の概略図である。
【図６】DEVゲノム、及びUL45/UL46挿入領域の場所の概略図である。
【図７】DEVゲノム、及びUL50/UL51挿入領域の場所の概略図である。
【図８】DEVゲノム、並びにUS7領域及びpUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2クローニングされた領域の場所の概略図である。
【００３０】
［発明の詳細な説明］
本発明は一般的には、弱毒化ＤＥＶに、さらには、そのゲノム内の特定の挿入部位に位置する外来遺伝子配列（１または複数）を含むＤＥＶに関する。本発明はまた、このようなＤＥＶを含む組成物に、さらには動物、特に家禽、より詳細には若年の家禽（孵化後第３日もしくはそれ以前、又はインオボ）のワクチン接種のための、それらの使用にも関する。
【００３１】
本開示は、以下の定義を参照することにより最大限に理解されよう。
【００３２】
定義
「ウイルス」の用語は特に、カプシド又はカプセル剤内に封入された核酸分子（例えば、ゲノム）を含むウイルス粒子意味する。「ウイルス」の用語はまた、ウイルスベクター又は単離されたウイルスゲノム意味する。
【００３３】
「リコンビナント」の用語は、遺伝的技術を使用して生成、設計又は修飾されている分子を意味する。ウイルスに対して、「リコンビナント」の用語はさらに具体的には、そのゲノム（又はその祖先のゲノム）が少なくとも１つの核酸配列の挿入又は欠失によって修飾されているウイルスを意味する。
【００３４】
「外来核酸」の用語は、ウイルスに対して、そのウイルスのゲノム内に自然には見出されない、又は当該ゲノム内に自然に見出されるが異なるフォーム若しくは異なる位置の核酸を意味する。
【００３５】
本願明細書において、「核酸」又は「核酸（複数）」の用語は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ）などの、任意の核酸分子又は配列を意味し、例えば、一本鎖又は二本鎖であり得る。核酸は、ORFを含んでも、又は含まなくてもよい。核酸分子は、人工的な合成、リコンビナント技術、酵素による技術、宿主細胞での複製、又はこれらの組み合わせによるなど、当技術分野において自体公知の技術によって生成され得る。
【００３６】
「遺伝子」は、ポリペプチド（例えば、ペプチド、タンパク質など）又はＲＮＡなどの産物をコードするオープンリーディングフレームを含む、核酸分子又は配列を意味する。
【００３７】
「弱毒化（された）」の用語は本願明細書で使用する場合、動物モデルにおいて疾病を本質的に引き起こさないウイルスをいう。弱毒化ウイルスは典型的には、宿主内でその死を引き起こすことなく複製できる。弱毒化ウイルスはより詳細には、１×１０３プラーク形成単位（pfu）/卵の投与分で注射されると胚において病原性でないウイルスを意味する。最も好ましい弱毒化ウイルスは、少なくとも７０％の注射された卵中、より好ましくは少なくとも８０％の注射された卵中、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上において１×１０３pfu/卵の投与分で安全である。本発明の弱毒化ウイルスは、第０日を含む孵化後注射（すなわち、孵化後０．１〜４８時間）についても安全である。
【００３８】
「鳥（avian）」の用語は、鳥綱（Aves）のクラスのトリ（bird）類などの、全種類の鳥類、すなわち、羽が生えていて、翼があり、二足の、内温性、且つ卵生の脊椎動物を含むことを意図する。本発明に関連して、鳥類又は鳥種はより詳細には、家禽などの経済的及び／又は農学的関心対象のトリ類、より好ましくはニワトリ及びシチメンチョウ、又はハクチョウ及びオウムなどの鑑賞鳥（ornamental bird）類をいう。
【００３９】
「ワクチン」の用語は本願明細書で使用する場合、生物における免疫応答の惹起、刺激、又は増幅に使用され得る物質を意味する。
【００４０】
「免疫応答」は、宿主における関心対象の組成物又はワクチンへの細胞性及び／又は抗体媒介性免疫応答の発生を意味する。通常「免疫応答」は、対象となる組成物又はワクチンに含まれる抗原（１種又は複数種）に特異的向性のある抗体、B細胞、ヘルパーＴ細胞、及び／又は細胞毒性Ｔ細胞の生成を含む。好ましくは、免疫応答は、新しい感染への抵抗性が増強されることになり、且つ／又はその疾患の臨床的重症度が低減するように保護的である。
【００４１】
「インオボ」投与又は注射の用語は一般的に、卵に含まれる胚内への接種又は注射を意味する。インオボ注射は、好ましくは孵化前の第５日と第１日との間の任意の時点で行なわれる。
【００４２】
アヒル腸炎ウイルス
アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）は、アヒルウイルス性腸炎ウイルス（ＤＶＥＶ）としても公知であり、自然にアヒル及びガチョウに感染する。ＤＥＶの全長ヌクレオチド配列が決定されており、オンラインで利用可能である（例えば、JQ673560参照）。ウイルスゲノムは約１６２Kbを含み、約８０の別異のタンパク質をコードしている。ＤＥＶの様々な血清型、並びにJansen株、ＣＳＣ株、ＣＨｖ株、ＶＡＣ株、及び２０８５株などの株が単離されている。
【００４３】
ＤＥＶはあまりその特徴付けがなされておらず、遺伝子を発現するためのベクターとしてのその使用は深く検討されていない。例えば、Liu et al (2013)及びＷＯ ２０１４／００３６７３５は、ニワトリ内に遺伝子を発現させるためにリコンビナントDEVを使用することを試みている。彼らは、ネイティブな遺伝子発現を変えることなく、ウイルスゲノムのUS7遺伝子とUS8遺伝子との間に核酸がクローニングされているDEV構築体を利用している。このような構築体は、１週齡のニワトリへ筋肉内注射によって転移され得ると報告されているが、しかしながら、家禽のインオボワクチン接種のため、又は若年の家禽、すなわち孵化後第３日以内、特に孵化後第１日若しくは第２日のワクチン接種のためのＤＥＶの何らかの使用の可能性は、当該文献又は他の何れの先行技術文献にも開示されていない。
【００４４】
ＤＥＶを用いてさらなる実験を行うことによって、本発明者らは驚くべきことに、このウイルスが若年のニワトリ（３日以下）又はインオボで投与されると致死的であることを見出した。驚くべきことに、孵化後一週でニワトリに野生型ＤＥＶ（又はＷＯ ２０１４／００３６７３５で提案されるような全てのネイティブな遺伝子を含むDEV構築体）を投与することは、良好な寛容性を示すようであるが、孵化後第１日又はインオボでこのような構築体を投与することは、動物の夥しい大量死（すなわち、８０〜１００％の範囲）を引き起こす（実施例１に報告のとおり）。
【００４５】
さらにいっそう驚くべきことに、本発明者らは、ＤＥＶの構造を改変して、ごく早期（３日以下）のものを含む家禽にて又はインオボで使用されてもよく、且つインビボにて実質的で早期的なタンパク質発現を引き起こすことのできるDEV構築体を生成することを可能としている。さらに詳細には、本発明者らはＤＥＶを用いてさらなる研究を行い、異なる遺伝子欠失又は改変を持つ種々のリコンビナントを生成した。本発明者らは驚くべきことに、これらの構築体の１つが、安定、安全且つ強力なDEVリコンビナントであるものの、その他はインオボで本質的に致死的であることを発見している。さらに詳細には、UL4遺伝子の不活化によって、（ｉ）インビボ、特にニワトリにおいて弱毒化され、また（ｉｉ）安定であって防御免疫を誘発するのに好適な様態で外来遺伝子を発現することのできるリコンビナントDEVを得ることができる。本発明は実際に、UL4遺伝子を不活化することによって、生存能力があり安定且つ複製性のＤＥＶを得ることが可能なこと、及び外来遺伝子材料を挿入するためにこのようなウイルスが使用され得ることを示す。結果はさらに、このようなウイルスから細胞感染に伴ってこのような外来遺伝子材料が高発現されること、及びこのような発現は長期に亘り安定なままであることを示す。さらに、そして顕著に、ネイティブなＤＥＶ又は他のリコンビナントDEVは若年のニワトリ（３日齢未満又はインオボ）にて病原性又は致死性であるが、UL4の不活化は、若年の家禽及びインオボ内にタンパク質又は抗原を発現させるのに安全に使用されることのできる弱毒化ＤＥＶを生成する。ＤＥＶは、例えばニワトリに対する公知な天然の向性を有しないので、ニワトリをワクチン接種するための本発明のDEV構築体の使用は、汎発又はワクチン接種を受けていない動物への混入のリスクを伴うものでない。さらに、ニワトリはＤＥＶに対する母系の抗体又は免疫を有さず、本発明のウイルスは、ワクチン接種を受けた動物においてごく早く免疫の開始を誘発するために使用することができる。
【００４６】
本発明の目的はしたがって、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子を有する。
【００４７】
本発明のさらなる目的は、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子を有し、外来核酸を含む。
【００４８】
別の本発明の目的は、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは、少なくとも第一及び第二の不活性遺伝子を有し、第一の不活性遺伝子はUL4遺伝子であり、第二の不活性遺伝子はUL23及びUS7遺伝子から選択される。
【００４９】
本発明のＤＥＶは、任意のＤＥＶ種又は株から調製され得る。ＤＥＶの株がいくつか報告されており、ＣＳＣ株（Genbank番号：JQ673560）、Jansen株、ＣＨｖ株（Genbank番号：JQ647509）、ＶＡＣ株（Genbank番号：EU082088）、及び２０８５株（Genbank番号：JF999965）などの公的なコレクションから入手できる。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明のＤＥＶは、Jansen株若しくはＣＳＣ株から選択される親株、又はJansen株若しくはＣＳＣ株と少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有する任意のＤＥＶ株より由来するか又は調製される。
【００５１】
本発明は、UL4遺伝子を不活化すること（すなわち、非機能性とすること又は欠失させること）によって、インオボ又は若年の家禽に注射しても安全であり、家禽においてタンパク質を複製及び発現できる、弱毒化ＤＥＶを生成するのが可能であることを示す。ＤＥＶのUL4遺伝子は、核タンパク質をコードすると予測される。しかしながら、ＤＥＶのUL4遺伝子の実際の機能は不明確なままである。本発明までは、UL4欠損ＤＥＶウイルスを生成できることは公知でなく、鳥類にて致死的となることなしにUL4欠損ＤＥＶウイルスが外来遺伝子を複製及び発現する能力は全く公知でなかった。
【００５２】
UL4遺伝子は典型的には、DEVゲノムの７１７bpからなる。ＣＳＣ株を参照することによれば、UL4遺伝子はそのゲノムのヌクレオチド１１２８４５〜ヌクレオチド１１３５６１に対応する。ＤＥＶのJansen型株のUL4遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号：１３に示される。本願に含まれる情報及び一般常識を用いて、又は配列アライメントにより、当業者であれば容易に、任意のＤＥＶ株におけるUL4遺伝子の正確な場所を同定し得ることは理解される。
【００５３】
本発明に関連して、不活性UL4遺伝子を有するＤＥＶは、機能性ＵＬ４タンパク質を発現できないＤＥＶを意味する。不活性UL4遺伝子はしたがって、野生型UL4タンパク質をコードできない、突然変異、欠失、及び／又は割り込みを受けているUL4遺伝子を意味する。
【００５４】
特定の変異は、全長UL4タンパク質の発現を妨げる、UL4コーディング配列における点変異である。このような変異は、その配列に終止コドン若しくは非センスコドンを導入し得るか、又はコードされるタンパク質に必須アミノ酸残基（１または複数）の置換を起こし、結果として不活性タンパク質を生じさせる。
【００５５】
本発明の特定のＤＥＶにおいて、ＵＬ４遺伝子配列の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、１００％までが欠失される。好ましい例において、本発明のＤＥＶは、UL4遺伝子配列の少なくとも４００bp、より好ましくは少なくとも５００bp、少なくとも６００bp、又はそれ以上の欠失を有する。
【００５６】
具体的な実施形態において、本発明のＤＥＶは、UL4遺伝子配列の少なくともヌクレオチド２００〜５００、より好ましくは少なくともヌクレオチド１００〜６００、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド８０〜６５０に亘る欠失を有する。具体例では、本発明のＤＥＶはUL4遺伝子配列のヌクレオチド５１〜ヌクレオチド６６７（すなわち、約８５％）の欠失を有する（例えば、DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2）。
【００５７】
実施例に示されるように、不活性UL4遺伝子を有するDEV構築体は安定であり、培養物中で複製されることができ、そして家禽卵又は若年の家禽に安全に投与されることができる。このようなウイルスはしたがって、外来核酸材料、特に抗原性コーディング遺伝子を含むリコンビナントDEVを生成して、家禽においてこのような遺伝子を発現させるのに使用され得る。
【００５８】
特定の実施形態では、本発明はしたがって、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子を有し、外来核酸を含む。
【００５９】
好ましい実施形態では、外来核酸は、存在しているUL4遺伝子配列（したがって、遺伝子配列に割り込まれていることにより遺伝子が不活性となっているもの）に加えて、又はUL4遺伝子の欠失された配列に代えて、又は突然変異されたUL4遺伝子配列において、のいずれかにて、DEVウイルスゲノムのUL4遺伝子配列に局在する。
【００６０】
好ましい実施形態では、本発明のＤＥＶは、UL4遺伝子配列に欠失を有し、欠失されたヌクレオチドの代わりに局在する外来核酸を含む。
【００６１】
別の特定の実施形態では、外来核酸は、存在している遺伝子配列に加えて、又は欠失された配列に代えて、又は変異遺伝子配列において、のいずれかにて、UL4遺伝子配列と別異のDEVウイルスゲノムのクローニング部位に局在する。このような付加的な挿入部位は、UL44遺伝子、UL27−UL26遺伝子間領域、UL23遺伝子、UL45−UL46遺伝子間領域、UL50−UL51遺伝子間領域、US4遺伝子、US5遺伝子、US7遺伝子、US7−US8遺伝子間領域、又はUS10遺伝子から選択され得る。
【００６２】
本発明のＤＥＶにおいて、外来遺伝子は一般的に、転写プロモーターの制御下にある。好ましくは、プロモーターはその外来遺伝子と共にクローニングされる。プロモーターは、任意の天然又は合成プロモーターであり得、細胞又はウイルス遺伝子から由来してもよい。好適なプロモーターの例として、例えば、Ｃｏａ５などのニワトリβ-アクチン（Ｂａｃ）プロモーター又はその誘導体、Ｐｅｃプロモーター、マウスサイトメガロウイルス（Ｍｃｍｖ）最早期（ｉｅ）１プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（Ｈｃｍｖ）、シミアンウイルス（ＳＶ）４０プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、又はプロモーター活性を保持するその任意のフラグメントが挙げられる。
【００６３】
さらに、本発明のＤＥＶは、様々な外来核酸を含んでもよい。これに関し、様々な外来核酸は、単一又は様々な別異のプロモーターの制御下、先に記載したようなUL4領域に挿入され得る。あるいは、ＤＥＶは、UL4に挿入される外来核酸、及び一以上の別異の挿入部位に挿入される一以上の外来核酸を含み得る。このような付加的な挿入部位は、UL44遺伝子、UL27−UL26遺伝子間領域、UL23遺伝子、UL45−UL46遺伝子間領域、UL50−UL51遺伝子間領域、US4遺伝子、US5遺伝子、US7遺伝子、US7−US8遺伝子間領域、又はUS10遺伝子から選択され得る。
【００６４】
これに関し、特定の実施形態では、本発明は、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子及び不活性UL44遺伝子を有する。さらに詳細には、本発明はＤＥＶに関し、当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL4遺伝子へとクローニングされた第一の外来核酸と、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL44遺伝子へとクローニングされた第二の外来核酸とを含む。UL44遺伝子は典型的には、DEVゲノムの１２９６bpからなる。ＣＳＣ株を参照することによれば、UL44遺伝子はそのゲノムのヌクレオチド２７４１９〜ヌクレオチド２８７１４に対応する。本願に含まれる情報及び一般常識を用いて、又は配列アライメントにより、当業者であれば容易に、任意のＤＥＶ株におけるUL44遺伝子の正確な場所を同定し得ることは理解される。本発明の特定のＤＥＶにおいて、UL44遺伝子配列の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、１００％までが欠失される。好ましい例において、本発明のＤＥＶは、UL44遺伝子配列の少なくとも５００bp、より好ましくは少なくとも６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上の欠失を有する。具体的な実施形態において、本発明のＤＥＶは、UL44遺伝子配列の少なくともヌクレオチド２００〜１０００、より好ましくは少なくともヌクレオチド１００〜１１００、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド１００〜１２００に亘る欠失を有する。具体例では、本発明のＤＥＶはUL44遺伝子配列のヌクレオチド５１〜ヌクレオチド１２４６（すなわち、９０％超え）の欠失を有する。
【００６５】
別の特定の実施形態では、本発明は、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子及び不活性UL23遺伝子を有する。このような本発明のリコンビナントDEVの例として、JK015、JK022、JK023、JK024、及びJK025が挙げられる。本発明は、これら２つの遺伝子の不活化で、高度に弱毒化されたＤＥＶが生成されることを示し、インオボ投与での生存率は約９５％である。得られた結果は、このような弱毒化ウイルスが事実上インビトロで複製でき、また外来遺伝子配列を発現できることも示す。さらに詳細には、本発明はＤＥＶに関し、当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL4遺伝子へとクローニングされた第一の外来核酸と、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL23遺伝子へとクローニングされた第二の外来核酸とを含む。本発明はまた、ＤＥＶであって、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子を含み、且つ当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL23遺伝子へとクローニングされた外来核酸を含むＤＥＶにも関する。本発明はまた、ＤＥＶであって、当該ウイルスは、不活性UL4遺伝子及び不活性US7遺伝子を含み、且つ当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL23遺伝子へとクローニングされた外来核酸を含むＤＥＶにも関する。本発明はまた、ＤＥＶであって、当該ウイルスは、不活性UL4遺伝子及び不活性UL23遺伝子を含み、且つ当該ウイルスは、UL26-27遺伝子間領域へと、又はUL45-46遺伝子間領域へと、又はUL50-51遺伝子間領域へとクローニングされた外来核酸を含むＤＥＶにも関する。ＤＥＶのUL23遺伝子はチミジンキナーゼをコードしており、これはヌクレオチド合成の触媒反応に関わると考えられる。本発明までは、UL23欠損ＤＥＶウイルスを生成できることは公知でなかった。UL23遺伝子は典型的には、DEVゲノムの１０７７bpからなる。ＣＳＣ株を参照することによれば、UL23遺伝子はそのゲノムのヌクレオチド７７９９７〜ヌクレオチド７９０７３に対応する。本願に含まれる情報及び一般常識を用いて、又は配列アライメントにより、当業者であれば容易に、任意のＤＥＶ株におけるUL23遺伝子の正確な場所を同定し得ることは理解される。本発明の特定のＤＥＶにおいて、UL23遺伝子配列の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、１００％までが欠失される。好ましい例において、本発明のＤＥＶは、UL23遺伝子配列の少なくとも５００bp、より好ましくは少なくとも６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上の欠失を有する。具体的な実施形態において、本発明のＤＥＶは、UL23遺伝子配列の少なくともヌクレオチド２００〜９００、より好ましくは少なくともヌクレオチド１００〜１０００、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド８０〜１０００に亘る欠失を有する。具体例では、本発明のＤＥＶはUL23遺伝子配列のヌクレオチド５１〜ヌクレオチド１０２７（すなわち、約９０％）の欠失を有する。
【００６６】
さらなる特定の実施形態では、本発明は、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子及び不活性US4遺伝子を有する。さらに詳細には、本発明はＤＥＶに関し、当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL4遺伝子へとクローニングされた第一の外来核酸と、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUS4遺伝子へとクローニングされた第二の外来核酸とを含む。ＤＥＶのUS4遺伝子は糖タンパク質Ｄをコードしており、これはウイルスエンベロープ上、及び感染細胞の細胞膜上に局在すると考えられる。本発明までは、US4欠損ＤＥＶウイルスを生成できることは公知でなかった。US4遺伝子は典型的には、DEVゲノムの１３８０bpからなる。ＣＳＣ株を参照することによれば、US4遺伝子はそのゲノムのヌクレオチド１４１１２３〜ヌクレオチド１４２５０２に対応する。本願に含まれる情報及び一般常識を用いて、又は配列アライメントにより、当業者であれば容易に、任意のＤＥＶ株におけるUS4遺伝子の正確な場所を同定し得ることは理解される。本発明の特定のＤＥＶにおいて、US4遺伝子配列の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、１００％までが欠失される。好ましい例において、本発明のＤＥＶは、US4遺伝子配列の少なくとも５００bp、より好ましくは少なくとも６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上の欠失を有する。具体的な実施形態において、本発明のＤＥＶは、US4遺伝子配列の少なくともヌクレオチド２００〜１０００、より好ましくは少なくともヌクレオチド１５０〜１１５０、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド１００〜１３００に亘る欠失を有する。具体例では、本発明のＤＥＶはUS4遺伝子配列のヌクレオチド５１〜ヌクレオチド１３３０（すなわち、９０％超え）の欠失を有する。
【００６７】
これに関連し、特定の実施形態では、本発明は、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子及び不活性US5遺伝子を有する。さらに詳細には、本発明はＤＥＶに関し、当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL4遺伝子へとクローニングされた第一の外来核酸と、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUS5遺伝子へとクローニングされた第二の外来核酸とを含む。ＤＥＶのUS5遺伝子は糖タンパク質Ｊをコードしており、その機能は不明のままである。本発明までは、US5欠損ＤＥＶウイルスを生成できることは公知でなかった。US5遺伝子は典型的には、DEVゲノムの１６２０bpからなる。２０８５株及びJansen株などの特定のＤＥＶ株では、遺伝子の変異の結果、US5遺伝子はより短い（約１１９７bp）。ＣＳＣ株を参照することによれば、US5遺伝子はそのゲノムのヌクレオチド１４２６６２〜ヌクレオチド１４４２８１に対応する。本願に含まれる情報及び一般常識を用いて、又は配列アライメントにより、当業者であれば容易に、任意のＤＥＶ株におけるUS5遺伝子の正確な場所を同定し得ることは理解される。本発明の特定のＤＥＶにおいて、US5遺伝子配列の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、１００％までが欠失される。好ましい例において、本発明のＤＥＶは、US5遺伝子配列の少なくとも５００bp、より好ましくは少なくとも６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上の欠失を有する。具体的な実施形態において、本発明のＤＥＶは、US5遺伝子配列の少なくともヌクレオチド２００〜１０００、より好ましくは少なくともヌクレオチド１００〜１１００、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド８０〜１１２０に亘る欠失を有する。具体例では、Jansen株から生成された本発明のＤＥＶはUS5遺伝子配列のヌクレオチド５１〜ヌクレオチド１１４７（すなわち、９０％超え）の欠失を有し、ＣＳＣ株から生成されたＤＥＶはUS5遺伝子配列のヌクレオチド５１〜ヌクレオチド１５７０の欠失を有する。
【００６８】
別の特定の実施形態では、本発明は、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子及び不活性US7遺伝子を有する。このような本発明のリコンビナントDEVの例として、JK016、JK025、JK026、JK027、及びJK028が挙げられる。本発明は、これら２つの遺伝子の不活化で、高度に弱毒化されたＤＥＶが生成されることを示し、インオボ投与で０％の死亡率となっている。得られた結果は、このような弱毒化ウイルスが事実上インビトロで複製でき、また外来遺伝子配列を発現できることも示す。さらに詳細には、本発明はＤＥＶに関し、当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL4遺伝子へとクローニングされた第一の外来核酸と、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUS7遺伝子へとクローニングされた第二の外来核酸とを含む。本発明はまた、ＤＥＶであって、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子を含み、且つ当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUS7遺伝子へとクローニングされた外来核酸を含むＤＥＶにも関する。本発明はまた、ＤＥＶであって、当該ウイルスは、不活性UL4遺伝子及び不活性US7遺伝子を含み、且つ当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL23遺伝子へとクローニングされた外来核酸を含むＤＥＶにも関する。本発明はまた、ＤＥＶであって、当該ウイルスは、不活性UL4遺伝子及び不活性US7遺伝子を含み、且つ当該ウイルスは、UL26-27遺伝子間領域へと、又はUL45-46遺伝子間領域へと、又はUL50-51遺伝子間領域へとクローニングされた外来核酸を含むＤＥＶにも関する。ＤＥＶのUS7遺伝子は糖タンパク質Ｉをコードしており、これはウイルス細胞の細胞伝播に関わると考えられる。本発明までは、US7欠損ＤＥＶウイルスを生成できることは公知でなかった。US7遺伝子は典型的には、DEVゲノムの１１１６bpからなる。ＣＳＣ株を参照することによれば、US7遺伝子はそのゲノムのヌクレオチド１４５７６９〜ヌクレオチド１４６８８４に対応する。本願に含まれる情報及び一般常識を用いて、又は配列アライメントにより、当業者であれば容易に、任意のＤＥＶ株におけるUS7遺伝子の正確な場所を同定し得ることは理解される。本発明の特定のＤＥＶにおいて、US7遺伝子配列の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、１００％までが欠失される。好ましい例において、本発明のＤＥＶは、US7遺伝子配列の少なくとも５００bp、より好ましくは少なくとも６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上の欠失を有する。具体的な実施形態において、本発明のＤＥＶは、US7遺伝子配列の少なくともヌクレオチド２００〜９００、より好ましくは少なくともヌクレオチド１００〜１０００、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド８０〜１１２０に亘る欠失を有する。具体例では、本発明のＤＥＶはUS7遺伝子配列のヌクレオチド５１〜ヌクレオチド１０６６（すなわち、９０％超え）の欠失を有する。
【００６９】
これに関連し、特定の実施形態では、本発明は、アヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）に関し、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子及び不活性US10を有する。さらに詳細には、本発明はＤＥＶに関し、当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL4遺伝子へとクローニングされた第一の外来核酸と、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUS10遺伝子へとクローニングされた第二の外来核酸とを含む。ＤＥＶのUS10遺伝子はビリオンタンパク質をコードすると予測され、その機能は不明のままである。本発明までは、US10欠損ＤＥＶウイルスを生成できることは公知でなかった。US10遺伝子は典型的には、DEVゲノムの約９００〜９７０bpからなるが、株によって異なる。ＣＳＣ株を参照することによれば、US10遺伝子はそのゲノムのヌクレオチド１３６３９１〜ヌクレオチド１３７３２０に対応する。本願に含まれる情報及び一般常識を用いて、又は配列アライメントにより、当業者であれば容易に、任意のＤＥＶ株におけるUS10遺伝子の正確な場所を同定し得ることは理解される。本発明の特定のＤＥＶにおいて、US10遺伝子配列の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、１００％までが欠失される。好ましい例において、本発明のＤＥＶは、US10遺伝子配列の少なくとも５００bp、より好ましくは少なくとも６００、７００、又は８００、又はそれ以上の欠失を有する。具体的な実施形態において、本発明のＤＥＶは、US10遺伝子配列の少なくともヌクレオチド２００〜７００、より好ましくは少なくともヌクレオチド１００〜８００、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド８０〜８５０に亘る欠失を有する。具体例では、ＣＳＣ株から生成された本発明のＤＥＶはUS10遺伝子配列のヌクレオチド５１〜ヌクレオチド８８０（すなわち、８０％超え）の欠失を有し、ＶＡＣ株から生成されたＤＥＶはUS10遺伝子配列のヌクレオチド５１〜ヌクレオチド８４７の欠失を有する。
【００７０】
本発明はまた、ＤＥＶであって、当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL4遺伝子へとクローニングされた第一の外来核酸、及びUL27遺伝子とUL26遺伝子との間に局在する遺伝子間領域へクローニングされた第二の外来核酸を含むＤＥＶにも関する。本発明はまた、ＤＥＶであって、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子を含み、且つ当該ウイルスは、UL27遺伝子とUL26遺伝子との間に局在する遺伝子間領域へクローニングされた外来核酸を含むＤＥＶにも関する。ＣＳＣ株を参照することによれば、UL27とUL26との間に局在する遺伝子間領域は、そのゲノムのヌクレオチド７２１９５〜ヌクレオチド７２６４６に対応する。クローニングは、このようなドメイン内の任意の位置で、より好ましくはヌクレオチド７２３００とヌクレオチド７２５００との間、さらにより好ましくはヌクレオチド７２３５０とヌクレオチド７２４５０との間で実施され得る。具体的な実施形態において、クローニングはヌクレオチド７２４３１とヌクレオチド７２４３２との間で実施される。
【００７１】
本発明はまた、ＤＥＶであって、当該ウイルスは、当該遺伝子の少なくとも２０％に代えてUL4遺伝子へとクローニングされた第一の外来核酸、及びUS7遺伝子とUS8遺伝子との間に局在する遺伝子間領域へクローニングされた第二の外来核酸を含むＤＥＶにも関する。このような遺伝子間クローニング部位は、ＷＯ ２０１４／００３６７３５に記載されている。
【００７２】
本発明はまた、ＤＥＶであって、当該ウイルスは不活性UL4遺伝子を含み、且つ当該ウイルスは、及びUL45遺伝子とUL46遺伝子との間、又はUL50遺伝子とUL51遺伝子との間に局在する遺伝子間領域へクローニングされた外来核酸を含むＤＥＶにも関する。ＣＳＣ株を参照することによれば、UL45とUL46との間に局在する遺伝子間領域は、そのゲノムのヌクレオチド２５１３２〜ヌクレオチド２５３５２に対応する。クローニングは、このようなドメイン内の任意の位置で、より好ましくはヌクレオチド２５２００とヌクレオチド２５３００との間で実施され得る。具体的な実施形態において、クローニングはヌクレオチド２５２７５とヌクレオチド２５２７６との間で実施される。ＣＳＣ株を参照することによれば、UL50とUL51との間に局在する遺伝子間領域は、そのゲノムのヌクレオチド１５９１４〜ヌクレオチド１６０６３に対応する。クローニングは、このようなドメイン内の任意の位置で、より好ましくはヌクレオチド１５９７０とヌクレオチド１６０１０との間で実施され得る。具体的な実施形態において、クローニングは、ヌクレオチド１５９７９とヌクレオチド１５９８０との間で実施される。
【００７３】
ウイルス構築及びクローニングは、当技術分野において自体公知の技術によって成し遂げられ得る。遺伝子クローニング及びプラスミド構築は当業者にとって周知であり、本質的には標準的な分子生物学技術によって実施され得る（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 2012）。典型的には、リコンビナントウイルスは、ウイルスゲノムと、挿入部位からヌクレオチドに隣接して組換えを許容する、挿入すべき核酸を含む構築体（例えば、相同性プラスミド）との間の相同組換えにより調製され得る。クローニングは、内在性の配列の欠失を伴って又は伴わずに行うことができる。特定の実施形態では、リコンビナント配列は、少なくとも50ヌクレオチド以上などの、そのゲノムの配列の少なくとも一部に代えてクローニングされる。このような欠失は、ウイルスのクローニング受容能を高める。
【００７４】
構築のために、ターゲッティングされる挿入領域を含む配列は典型的には、先ず好適なベクターへとクローニングされて相同性ベクターを生成する。ベクターの例としては、pBR322、pBR325、pBR327、pBR328、pUC18、pUC19、pUC7、pUC8、又はpUC9などのプラスミド；ラムダファージ及びM13ファージなどのファージ；又はpHC79などのコスミドが挙げられる。ターゲッティング領域列は、従来のクローニング方法によってベクター内に統合される。使用されるターゲッティング領域配列は、その次のＤＥＶウイルスゲノムとのインビボ相同組換えを許容するために十分な長さであることが好ましい。好ましくは、クローニングされるターゲッティング領域配列は、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さ、典型的には３００を超え、５００から２０００ヌクレオチドの間の長さを有するべきであろう。外来核酸（典型的には、遺伝子及びプロモーターを含むもの）はその後、ベクターへクローニングされたターゲッティング領域内に挿入される。挿入は好ましくは、クローニングされたインサート各々の側に、相同組換えを許容するのに十分な長さ（例えば、少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド）の、ターゲッティング領域の配列の一部を残すように行うべきであろう。制限酵素及びライゲーション手法などの古典的な技術によって、外来核酸をクローニングされたターゲッティング領域へと導入することができる。適切な場合、突然変異（１または複数）をターゲッティング領域の特異的な部位で導入し、制限酵素に対する新しい切断部位を創出してもよい。当業者により周知の、例えば、インビトロ変異生成又はＰＣＲなどの従来の変異生成技術がその目的のために使用されてもよい。外来核酸がターゲッティング領域内に挿入されている相同性ベクターは次いで、電気穿孔、リン酸カルシウム、リポフェクチン・ベースの方法などの公知技術を用いて、ＤＥＶ感染細胞又はＤＥＶゲノムでトランスフェクションされた細胞へと導入され得る。リコンビナントウイルスはこれにより、当該細胞においてウイルスとベクターとの間での組換えによって生成される。得られたリコンビナントウイルスは、例えば、ハイブリダイゼーション、配列決定、ＰＣＲ又は機能性アッセイ法によるなど公知技術を使用し、実施例に記載したように外来核酸によってコードされる任意の産物を検出して、遺伝子型により又は表現型により選択され得る。選択されたリコンビナントウイルスは、細胞培養液において大規模に培養されることができ、その後に、コンビナントウイルスを回収することができる。
【００７５】
外来遺伝子
本発明のＤＥＶは、任意の外来核酸、好ましくは任意の外来遺伝子を含み得る。外来遺伝子は、ＲＮＡ又は生物活性及び／又は免疫原性（例えば、抗原性）のあるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドなどの、対象となる任意の産物をコードし得る。好ましい実施形態では、外来遺伝子は、抗原、さらにより好ましくは動物、特に鳥で感染を引き起こすことができる病原性物の抗原から由来するペプチド又はポリペプチドをコードする。鳥で感染を引き起こす病原体の例としては、ウイルス、細菌、真菌、原虫などが挙げられる。免疫原性の（ポリ）ペプチドは、好ましくは当該病原体の表面タンパク質、分泌タンパク質、若しくは構造タンパク質又はそのフラグメントであり得る（これらに由来し得る）。ポリペプチドは、例えば、ウイルス性、原核性、真核性又は合成によるなど、任意の供給源に由来することができる。
【００７６】
好ましい実施形態では、外来遺伝子は、トリ病原性物質の抗原ペプチドをコードする。
【００７７】
病原性物質の具体的な例としては、鳥インフルエンザウイルス、鳥パラミクソウイルス１型、これはニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）とも呼ばれる、鳥メタニューモウイルス、マレック病ウイルス、ガンボロ（Gumboro）病ウイルス、これは伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）とも呼ばれる、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ILTV）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、Escherichia coli、サルモネラ種、Pasteurella multocida、Riemerella anatipestifer、Ornithobacterium rhinotracheale、Mycoplasma gallisepticum、Mycoplasma synoviae、鳥種に感染するマイコプラズマ微生物又はコクシジウム類が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００７８】
好適には、外来遺伝子は、ＮＤＶのＦタンパク質、ＮＤＶのＨＮタンパク質、ＩＢＤＶのＶＰ２タンパク質、ＩＬＴＶのｇＢタンパク質、Mycoplasma gallisepticumの４０Ｋタンパク質、若しくは鳥インフルエンザウイルスの表面タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）、又はその免疫原性フラグメントから選択される抗原をコードする。本発明に関連して、タンパク質の「フラグメント」の用語は、好ましくは当該タンパク質の少なくとも５の、さらにより好ましくは５〜１００の連続したアミノ酸残基を含むフラグメントを意味する。好ましい実施形態では、このようなフラグメントは、少なくとも１つのエピトープを含み、且つ／又はインビボで免疫原性である、すなわち、全長タンパク質に結合する抗体の生成をもたらすことができる。
【００７９】
免疫原性ペプチドの具体的な例としては例えば、ＶＰ２の１〜４５３、ｇＢの１〜４６９、又はＦの１〜５４０、のアミノ酸残基を含むペプチドが挙げられる。
【００８０】
好ましいＤＥＶ
本発明の好ましいＤＥＶは、全UL4遺伝子の欠失を含む。
【００８１】
本発明の特定のＤＥＶは、DEVUL4ゲノムのヌクレオチド５１〜ヌクレオチド６６７の欠失などの、UL4遺伝子配列の少なくともヌクレオチド１００〜ヌクレオチド６００の欠失を含む。
【００８２】
別の本発明の好ましいＤＥＶは、不活性UL4遺伝子及び不活性UL23遺伝子を含む。
【００８３】
別の本発明の好ましいＤＥＶは、不活性UL4遺伝子及び不活性US7遺伝子を含む。
【００８４】
本発明の好ましいＤＥＶにおいて、外来核酸は鳥抗原、より好ましくはＶＰ２、ＨＮ若しくはＦタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする。
【００８５】
別の本発明の好ましいＤＥＶは、UL4遺伝子配列の少なくともヌクレオチド１００〜ヌクレオチド６００の欠失、及び以下から選択される少なくとも１つのさらなる欠失を含む。
・UL44遺伝子配列の少なくともヌクレオチド１００〜ヌクレオチド１２００の欠失、
・UL23遺伝子配列の少なくともヌクレオチド１００〜ヌクレオチド１０００の欠失、
・US4遺伝子配列の少なくともヌクレオチド１００〜ヌクレオチド１３００の欠失、
・US5遺伝子配列の少なくともヌクレオチド１００〜ヌクレオチド１１００の欠失、
・US7遺伝子配列の少なくともヌクレオチド１００〜ヌクレオチド１０００の欠失、及び／若しくは
・US10遺伝子配列の少なくともヌクレオチド１００〜ヌクレオチド８００の欠失、又はこれらの組み合わせ。
【００８６】
核酸
本発明はまた、不活性UL4遺伝子を有するＤＥＶのゲノムを含む核酸分子にも関する。このような核酸は、一本鎖又は二本鎖の、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。特定の実施形態では、核酸は先に定義したようなＤＥＶのゲノムを含むＤＮＡ分子である。
【００８７】
核酸は、遊離の形態、又はプラスミド、ＢＡＣなどのベクター等の中にあってもよい。核酸は単離されたものでも、又は宿主細胞に含まれるものでもよい。
【００８８】
細胞培養液
本発明のリコンビナントウイルスは、任意のコンピテント細胞培養において増殖され得る。ウイルスの必要とされる成長が成し遂げられた後は、細胞をスクレーパーを使用して又はトリプシンでウェルから剥離させてもよく、そして感染細胞は遠心分離により上清から分離されてもよい。
【００８９】
コンピテント細胞の例としては、ＣＥＦ、胚発育卵、ニワトリ腎臓細胞などが挙げられる。細胞又はウイルスは、Eagle's MEM、Leibowitz-L-15／McCoy 5A（１：１混合）培地などの培地にて約３７℃で３〜６日間培養され得る。感染細胞は典型的には、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する培地に懸濁され、液体窒素下に凍結保存される。
【００９０】
組成物及びワクチン
本発明はまた、一以上の本発明のＤＥＶを含む、ワクチンなどの組成物にも関する。
【００９１】
本発明の組成物及びワクチンは、薬学的又は獣医学的に許容し得る媒質又は賦形剤中にＤＥＶを含み得る。加えて又は代わりに、組成物及びワクチンは好適な佐剤を含み得る。
【００９２】
本発明の組成物及びワクチンは、例えば水性緩衝液又はホスファート緩衝液などの好適な溶媒を含み得る。好ましくは、組成物及びワクチンは、安定化剤、防腐剤、着色剤、界面活性剤などの添加剤等も含む。
【００９３】
例えば、本発明の組成物又はワクチンは、等張性、生理学的ｐＨ及び安定性を維持するため、例えば、生理食塩水（０．８５％）、ホスファート緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）、シトレート緩衝液、Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝性生理食塩水などの緩衝液等、又は抗生物質、例えば、ネオマイシン若しくはストレプトマイシンなどの、一以上のさらなる添加剤と共に製剤化され得る。
【００９４】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、防腐剤を含む。
【００９５】
別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、溶解補助剤を含む。
【００９６】
別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、佐剤を含む。佐剤は、動物由来の種々のタンパク質及びペプチド（例えば、ホルモン、サイトカイン、共刺激性因子）を含むいくつかの供給源のいずれより得られてもよく、またウイルス及び他の供給源（例えば、二本鎖ＲＮＡ、ＣｐＧ）などに由来する新規核酸は、単独又は組み合わせ（１または複数）て、免疫応答を増強するのに十分なものである。
【００９７】
本発明の組成物は、液体（溶液、懸濁液、エマルション）又は固体（粉末、ゲル、ペースト、オイル）であり得、これらは任意の投与経路用に製剤化され得る。好ましくは、インオボ注射、又は例えば、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内の、眼内、皮内及び／若しくは腹腔内注射などの注射用に製剤化され得る。あるいは、経口、眼内（例えば、点眼による）、鼻腔内、又は眼−鼻内投与、例えば、エアロゾル又はスプレー使用のために製剤化され得る。
【００９８】
各ワクチンの投与分は、鳥種において防御免疫応答を誘発するのに十分な、好適な投与分を含有し得る。このような投与分の最適化は、当技術分野において周知である。投与分あたりの抗原の量は、抗原／抗体反応を用いる公知方法により、例えばＬＩＳＡ方法により求められ得る。
【００９９】
本発明のワクチンは、ワクチン接種プロトコールに応じ、単回投与分として、又は反復投与分にて投与されることができる。
【０１００】
特定の実施形態では、本発明は、先に定義したようなウイルス、核酸又は細胞と、好適な賦形剤又は佐剤とを含むワクチンに関する。
【０１０１】
さらなる特定の実施形態では、本発明は、先に定義したようなウイルス、核酸又は細胞の液体組成物と、好適な賦形剤又は佐剤とを含むワクチンに関する。
【０１０２】
本発明はさらには、家禽などの鳥種に免疫付与するための、先に記載したようなウイルス、組成物、ワクチン、核酸又は細胞の使用、及び免疫学的に有効量の、先に記載したようなウイルス、組成物、ワクチン、核酸又は細胞を投与することによる、鳥種に免疫付与する方法に関する。
【０１０３】
本発明のさらなる目的は、鳥類、特に家禽、より詳細にはニワトリ、より詳細には若年の家禽（孵化後第３日又はそれ以前）又はインオボへのワクチン接種又は免疫付与に使用するための、先に定義したような組成物、ＤＥＶ、核酸又は宿主細胞に関する。
【０１０４】
本発明のさらなる目的は、鳥類、特に家禽、より詳細にはニワトリ、より詳細には若年の家禽（孵化後第３日又はそれ以前）又はインオボにおいて防御免疫の誘導に使用するための、先に定義したような組成物、ワクチン、ＤＥＶ、核酸又は宿主細胞に関する。
【０１０５】
本発明はまた、非ヒト動物、特に家禽、より詳細にはニワトリ、より詳細には若年の家禽（孵化後第３日もしくはそれ以前、又はインオボ）にワクチン接種する方法であって、当該非ヒト動物に先に定義したような組成物、ワクチン、ＤＥＶ、核酸又は宿主細胞を投与することを含む方法にも関する。
【０１０６】
本発明の特定の目的は、家禽にワクチン接種する方法であって、先に定義したような組成物、ワクチン、ＤＥＶ、核酸又は宿主細胞のインオボ投与を含む方法である。
【０１０７】
別の本発明の特定の目的は、家禽にワクチン接種する方法であって、先に定義したような組成物、ワクチン、ＤＥＶ、核酸又は宿主細胞を、孵化後第１日又は第２日に投与することを含む方法である。
【０１０８】
さらなる態様において、本発明は、非ヒト動物において一以上の鳥病原体に対して免疫原性又は保護的応答を誘導するための方法であって、当該非ヒト動物、特に家禽、より詳細にはニワトリ、より詳細には若年の家禽（孵化後第３日又はそれ以前）又はインオボに、先に定義したような組成物、ワクチン、ＤＥＶ、核酸又は宿主細胞を投与することを含む方法を提供する。
【０１０９】
実験の項で示すように、本発明のウイルスは、若年の家禽（孵化後第１日、第２日又は第３日）にワクチン接種するため、又はインオボワクチン接種のために特に好都合である。事実、本発明は驚くべきことに、本発明のウイルスがこのような早期投与に際しては安全であるが、ネイティブな又は野生型ＤＥＶは致死的であることを示す。このような早期投与は、これらのウイルスによって引き起こされる免疫の早期発生と相まって、早期防御免疫を、家禽が病原体に実質的に曝される可能性が出る前に誘導するのに特に好都合である。
【０１１０】
これに関し、より一般的な態様において、本発明はまた、鳥、特に家禽、より詳細にはニワトリにワクチン接種又は免疫付与するための方法であって、抗原をコードしている弱毒化ＤＥＶの当該鳥へのインオボ投与を含む方法にも関する。本発明はまた、鳥、特に家禽、より詳細にはニワトリにおいて外来遺伝子を発現させるための方法であって、当該外来遺伝子を含む弱毒化ＤＥＶの当該鳥へのインオボ投与を含む方法にも関する。本発明はまた、外来遺伝子を含む弱毒化ＤＥＶの使用であって、当該ＤＥＶのインオボ投与によって鳥に当該遺伝子を発現させるための使用にも関する。本発明はまた、抗原をコードする弱毒化ＤＥＶであって、当該ＤＥＶのインオボ投与によって免疫応答を誘導又は鳥にワクチン接種をする使用のための弱毒化ＤＥＶにも関する。ＤＥＶは好ましくは、当該ＤＥＶを弱毒化し、且つインオボ注射に際して良好な寛容性を示すものとする、不活性の内在性遺伝子を含む。
【０１１１】
本発明はさらには、鳥種に免疫付与するためのワクチン接種キットであって、有効量の先に記載したような多価ワクチンと、当該成分を当該種に投与するための手段とを含むキットに関する。例えば、このようなキットは、本発明に係るワクチンで満たされた注射デバイスと、皮内、皮下、筋肉内、又はインオボ注射のための指示書とを含む。あるいは、キットは、本発明に係るワクチンで満たされたスプレー／エアロゾル又は点眼デバイスと、眼−鼻内投与、経口又は粘膜投与のための指示書とを含む。
【０１１２】
本発明のさらなる態様及び利点は、請求項に係る発明を例証する、以下の実験の項に開示される。
【実施例】
【０１１３】
実施例１：卵又は若年の家禽における野生型ＤＥＶの病原力
臨床研究を実施して、異なるタイムスケジュールでの注射に際した、ニワトリでのＤＥＶの病原性又は病原力（virulence）を検討した。さらに詳細には、インオボ（孵化前第３日）、孵化後第１日、又は孵化後第４日に、注射を実施した。使用したＤＥＶは、野生型ＤＥＶ Jansen株であった。投与された用量は、１００又は１０００pfu/投与分のいずれかであった。コントロールとして、グループ１ではＰＢＳ溶液が投与された。病原性は、孵化後毎日、死亡率を測定することによって評価された。
【０１１４】
結果を以下の表に示す。
【０１１５】
【表１】
0006802813.tif 000002
【０１１６】
前記結果は、孵化後第４日での野生型ＤＥＶの注射は安全で、１００％生存率である（グループ５参照）ことを示す。著しく対照的に、ＤＥＶのインオボ注射後、１００％のトリが４日齢までに死亡し、一方ＰＢＳのインオボ注射は安全である。これらの結果はしたがって、野生型ＤＥＶは成体の動物への投与は好適であり得るものの、驚くべきことに、若年の動物（孵化後第３日以内）で、又はインオボで投与されると致死的であることを示す。
【０１１７】
実施例２：不活性UL4遺伝子を含むＤＥＶの構築。
【０１１８】
２．１  rpsLneo-DsRed2カセットの構築
rpsLneo-DsRed2カセットの２．８kbのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ反応によって構築した。手短に説明すると、３種のＰＣＲ反応を行った。第一のＰＣＲ反応は、配列番号：１（5’-GGCCTGGTGATGATGGCGGGATCGTTGTAT-3’）及び配列番号：２（5’-CCATGGTGCTGCGCTCAGAAGAACTCGTCA-3’）のプライマー対を使用し、rpsLneoの合成フラグメントの鋳型（配列番号：３）を用いて行われた。第二のＰＣＲ反応は、配列番号：４（5’-ACGAGTTCTTCTGAGCGCAGCACCATGGCC-3’）及び配列番号：５（5’-TCGGAGGAGGCCATCCTTAAGAGCTGTAAT-3’）のプライマー対を使用し、pSI哺乳類の発現ベクターの鋳型プラスミド（Promega、カタログ番号E1721）を用いて行われた。第三のＰＣＲ反応は、配列番号：６（5’-TACAGCTCTTAAGGATGGCCTCCTCCGAGA-3’）及び配列番号：７（5’-GCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAAT-3’）のプライマー対を使用し、pIRES2-DsRed2の鋳型プラスミド（Clontech、カタログ番号632420）を用いて行われた。第一及び第二のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、配列番号：１及び配列番号：５をプライマーとして用いて別のＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ産物と第三のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物を混合して、配列番号：１及び配列番号：７のプライマー対を用いた最終ＰＣＲ反応に用い、結果としてrpsLneo-DsRed2カセットを得た。
【０１１９】
２．２．  挿入カセットの構築
５’及び３’両端のアヒル腸炎ウイルス（ＤＥＶ）UL4領域相同配列（各５０bp）を両端に付加したrpsLneo-DsRed2カセットのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ反応によって構築した（図１）。ＰＣＲ反応は、rpsLneo-DsRed2カセットを鋳型として使用して行われた。使用されたプライマー対は配列番号：８（5’-ATGCAATCGCATCCGGCAACGTTTATAACTTACACTCTGGGGGGTACCGGGGCCTGGTGATGATGGCGGG-3’）及び配列番号：９（5’-TTAAATGTCTATACCGTTCACTGCAATTGGCTCCTGAGACGTTCCATTGCGCAGTGAAAAAAATGCTTTA-3’）である。得られたＰＣＲフラグメントは電気泳動にかけられ精製された。
【０１２０】
２．３．  rpsLneo-DsRed2遺伝子を担持しているリコンビナントDEVの構築
DEVゲノムを担持しており、０．１μgの挿入カセットでトランスフェクションされたE. coli.株における相同組換えにより、UL4領域にrpsLneo-DsRed2遺伝子を担持しているリコンビナントDEVの構築を行った。トランスフェクションは、Gene Pulser Xcell（Bio-Rad Laboratories）を使用して１．７５kV、２５μF、及び２００ohmでエレクトロポレーションにより行った。トランスフェクションの後、E. coli.をLuria-Bertani（ＬＢ）寒天板上に播種し、３０℃で一晩インキュベーションした。rpsLneo-DsRed2遺伝子を含む適切なインサートを担持しているE. coli.クローンを、DEVゲノムの挿入部位領域とrpsLneo-DsRed2遺伝子との間の領域（ジャンクション１、図２）を増幅するプライマー対を使用したＰＣＲによって同定した。プライマーは、配列番号：１０（5’-TGTTTAGCGTTATCCGCCCACTGTGTAAAC-3’）及び配列番号：１１（5’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’）である。修飾されたDEV DNAを、適切なインサートを担持しているE. coli.クローンから抽出し、Nucleofector II（Lonza, Basel, Switzerland）を使用してＣＥＦ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞をLeibovitz’s L-15（Life Technologies Corp., カタログ番号41300-39）、McCoy’s 5A培地（Life Technologies Corp., カタログ番号21500-061）（１：１）及び４％子ウシ血清［ＬＭ（＋）培地］に添加して、９６ウェル組織培養プレートに播種し、次いで３７℃で４〜５％ＣＯ２にて５〜７日間、ＤＥＶ細胞変性効果（ＣＰＥ）が視認できるようになるまでインキュベーションした。
【０１２１】
２．４．  ゲノム構造の確認
挿入された遺伝子の各端部でジャンクション領域（ジャンクション１、ジャンクション２、及びジャンクション３；図２）を増幅する３種のＰＣＲ反応によって、リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2のゲノム構造を確認した。ジャンクション１に対するＰＣＲ反応で使用されるプライマー対を実施例２．３に記載する。ジャンクション２に対するＰＣＲ反応で使用されるプライマー対は、配列番号：６及び配列番号：１２（5’-GGGAGTATTCACAAAATAATAAACAAAC-3’）である。ジャンクション３に対しては、配列番号：１０及び配列番号：１２が使用される。ＰＣＲ産物の予測サイズが観察され、rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2は予測されたゲノム構造を有していたことを確認した。
【０１２２】
実施例３：不活性UL4遺伝子を有するリコンビナントDEVによる外来遺伝子の発現
リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2によるDsRed2タンパク質の発現を、DsRed2に対する刺激（excitation）によって確認した。DsRed2に対する刺激は、リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2で感染されたＣＥＦ細胞を使用して行われた。手短に説明すると、rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2又はその親ＤＥＶ株で６ウェルプレート中のＣＥＦ細胞を約0.01の感染多重度にて感染させた。接種後３日目に、細胞を５６３nmで刺激した。赤色蛍光は、リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2のプラーク中でのみ観察された。
【０１２３】
実施例４：不活性UL4遺伝子を有するリコンビナントDEVの生存率及び安定性
リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2をＣＥＦ細胞中で１５回継代させ、rpsLneo-DsRed2の挿入された遺伝子の安定性を確認した。継代は３〜４日ごとに行った。５継代ごとに、rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2のプラークを蛍光顕微鏡により赤色蛍光につきチェックし、rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2のゲノム構造は実施例２．４に示すプライマーを用いてジャンクション領域（ジャンクション１、ジャンクション２、及びジャンクション３；図２）を増幅するＰＣＲ分析によって確認した。ＰＣＲ産物の赤色蛍光及び予測サイズは、観察されたウイルスの全てに観察され、rDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2は少なくとも１５継代に亘りrpsLneo-DsRed2遺伝子を保持することが確認された。
【０１２４】
実施例５：インオボ投与
リコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2又は親ＤＥＶを、特定病原体除去（ＳＰＦ）のニワトリ又は市販層（白色レグホン種）のニワトリの１８日齢胚へと、母系の抗体と共に接種した。胚の全グループが、２０ゲージ及び１．５インチの針を介して約１０００pfu/0.1ｍＬのリコンビナントDEV/UL4/rpsLneo-DsRed2、親ＤＥＶ又はＰＢＳでインオボのワクチン接種を受けた。１週齡から３週齡の間の各週に、孵化されたニワトリは採血された。ニワトリは、機能低下及び死などのＤＥＶに伴う臨床徴候につき、毎日観察される。孵化後３週間、ニワトリの、体重増加についての検査、及び剖検、及び肉眼で見て観察可能な病変についての観察が行なわれる。
【０１２５】
【表２】
0006802813.tif 000003
【０１２６】
結果は先に示すとおりである。親ＤＥＶを接種したほとんどすべてのトリが死亡したが、DEV/UL4/rpsLneo-DsRed2を接種したトリの６０％より多くが生存していた。
【０１２７】
実施例６：不活性UL4遺伝子、及びUL27とUL26との間に挿入された外来遺伝子配列を有するＤＥＶの構築及びインオボ投与。
不活性UL4遺伝子、及びUL27とUL26との間に挿入された外来遺伝子配列を有するＤＥＶを構築した。
【０１２８】
６．１．  pUC18-KAPEVAC-UL4delの構築
UL5遺伝子及びUL3.5遺伝子に隣接しているDEVゲノムの１．０kbのＤＮＡフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してＰＣＲ反応によりクローニングした（図３）。手短に説明すると、ＤＥＶから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用して、２種のＰＣＲ反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号：１４（5’-gcGCATGCACTATAGCGCGCTCACAG-3’）及び配列番号：１５（5’-CAGACCTAAAGGTTAGGCCGTCTGTGAATG-3’）、及び配列番号：１６（5’-CATTCACAGACGGCCTAACCTTTAGGTCTG-3’）及び配列番号：１７（5’-gcGAATTCCGCAAACTACACAAGTCCG-3’）である。前記２種のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、配列番号：１４及び配列番号：１７をプライマーとして使用して別のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲフラグメントはSphI及びEcoRIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL4delが得られた（図３）。
【０１２９】
６．２．  pUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2の構築
UL26遺伝子及びUL27遺伝子に隣接しているDEVゲノムの１．０kbのＤＮＡフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してＰＣＲ反応によりクローニングした（図４）。手短に説明すると、ＤＥＶから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用して、２種のＰＣＲ反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号：１８（5’-CGGTCGACACTCCCAGGGGTGAAGC-3’）及び配列番号：１９（5’-CGGCCAATAAGGCCAAGAATGCATTCGGCC-3’）、及び配列番号：２０（5’-TGGCCTTATTGGCCGCCGTATGAATTGCGC-3’）及び配列番号：２１（5’-GCGAGCTCCTGCAACCACAGACCGC-3’）である。前記２種のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、配列番号：１８及び配列番号：２１をプライマーとして使用して別のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲフラグメントはSalI及びSacIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIが得られた。次に、標準的なチャレンジ株からのIBDV VP2遺伝子及びプロモーターを含む相同性ベクターを、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIを利用することによって構築した。先ず、SfiIを用いてpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIを切断し、ＰＡＰを用いて脱リン酸化させた。p45/46bacVP2-STC#11のBglI消化によりBacプロモーター-VP2-STCカセットを得て（U.S. Pat. No. 6,764,684）、SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIへと挿入し、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2を得た（図４）。このプラスミドを使用してDEV/UL4del/UL26/BacVP2を構築した。
【０１３０】
６．３．  不活性UL4遺伝子、及びUL27とUL26との間に挿入された外来遺伝子配列を有するＤＥＶの構築
DEVゲノムを担持しており、０．１μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del及びpUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2でトランスフェクションされたE. coli.株における相同組換えにより、不活性UL4遺伝子、及びUL27とUL26との間の領域に挿入された外来遺伝子配列を有するリコンビナントDEVの構築を行った。トランスフェクションは、Gene Pulser Xcell（Bio-Rad Laboratories）を使用して１．７５kV、２５μF、及び２００ohmでエレクトロポレーションにより行った。トランスフェクションの後、E. coli.をLuria-Bertani（ＬＢ）寒天板上に播種し、３０℃で一晩インキュベーションした。rpsLneo-DsRed2遺伝子を含む適切なインサートを担持しているE. coli.クローンを、DEVゲノムのUL3.5遺伝子とUL5遺伝子との間の領域（ジャンクション４；図４）又はBac-VP2遺伝子と挿入部位領域との間の領域（ジャンクション１、図４）を増幅するプライマー対を使用したＰＣＲによって同定した。プライマーは、ジャンクション４に対しては配列番号：１４及び配列番号：１７、並びにジャンクション１に対しては配列番号：２２（5’-GACGCTATACCCAATGACGATGAAAAC-3’）及び配列番号：２３（5’-GAGCAACTTCGAGCTGATCC-3’）である。修飾されたDEV DNAを、適切なインサートを担持しているE. coli.クローンから抽出し、Nucleofector IIを使用してＣＥＦ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞をＬＭ（＋）培地に添加して、９６ウェル組織培養プレートに播種し、次いで３７℃で４〜５％ＣＯ２にて５〜７日間、ＤＥＶ ＣＰＥが視認できるようになるまでインキュベーションした。
【０１３１】
６．４．  ゲノム構造の確認
挿入された遺伝子の各端部でジャンクション領域（ジャンクション１、ジャンクション２、及びジャンクション３；図４）を増幅する４種のＰＣＲ反応によって、リコンビナントDEV/UL4del/UL26/BacVP2のゲノム構造を確認した。ジャンクション１及びジャンクション４に対するＰＣＲ反応で使用されるプライマー対を実施例６．３に記載する。ジャンクション２に対するＰＣＲ反応で使用されるプライマー対は、配列番号：２４（5’-GTACTGCCCGGCCGGTCTAATG-3’）及び配列番号：２５（5’-GCCAGGGAATCCAGGGAAAAAGAC-3’）である。ジャンクション３に対しては、配列番号：２２及び配列番号：２４が使用される。ＰＣＲ産物の予測サイズが観察され、rDEV/UL4del/BacVP2は予測されたゲノム構造を有していたことを確認した。
【０１３２】
６．５．  インオボ投与
rDEV/UL4del/UL26/BacVP2又は親ＫＡＰＥＶＡＣウイルスの１０００プラーク形成単位を、１８日齢ニワトリ胚へインオボでＤＯＡ３に投与した。トリの臨床徴候を、孵化後３５日間観察した。１７羽のトリの結果は、８０％を超える生存率を示している。
【０１３３】
実施例７：不活性UL4遺伝子及び不活性UL23遺伝子を有するＤＥＶの構築及びインオボ投与。
不活性UL4及びUL23遺伝子並びに外来遺伝子を有するＤＥＶを構築した。
【０１３４】
７．１．  pUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2及びpUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2の構築
UL24遺伝子及びUL22遺伝子に隣接しているDEVゲノムの１．０kbのＤＮＡフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してＰＣＲ反応によりクローニングした（図５）。手短に説明すると、ＤＥＶから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用して、２種のＰＣＲ反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号：２６（5’-GCGCATGCCAATTGTCTAATTCCAG-3’）及び配列番号：２７（5’-CCCGGCCAATAAGGCCACAGAAAAAGCGCG-3’）、及び配列番号：２８（5’-CTGTGGCCTTATTGGCCGGGATCTGGAAC-3’）及び配列番号：２９（5’-GCGAATTCATGTGCTACGCCCAG-3’）である。前記２種のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、配列番号：２６及び配列番号：２９をプライマーとして使用して別のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲフラグメントはEcoRI及びSphIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIが得られた。次に、プロモーター及びVP2-STCを含む相同性ベクターを、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIを利用することによって構築した。先ず、SfiIを用いてpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIを切断し、ＰＡＰを用いて脱リン酸化させた。Bac-VP2カセットはプラスミドpUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2からSfiI消化により得られ、SfiIで消化されライゲーションされたpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIへと挿入され、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2が得られた（図５）。加えて、pUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2を、pUC18-KAPEVAC-UL23-SfiIを利用することによって構築した。Coa5プロモーターは、BglI及びXbaI消化によりプラスミドpGICOAから得られ（U.S. Pat. No. 6,866,852）、p45/46bacVP2-STC#11（U.S. Pat. No. 6,764,684）のXbaI-EcoRIフラグメント（６．３kb）及びEcoRI-BglIフラグメント（０．１kb）とライゲーションされ、結果としてp45/46COA5VP2-STC#11が得られた。次いでp45/46COA5VP2-STC#11からBglI消化によりCoa5プロモーター-VP2-STCカセットを切り出し、SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL23del-SfiIとライゲーションされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2（図５）が得られた。
【０１３５】
７．２．  pUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2の構築
SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIを利用することによってpUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2を構築した。Coa5-VP2カセットは、pUC18-KAPEVAC-UL23-Coa5VP2からSfiI消化により得られ、SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL26-SfiIへと挿入され、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2が得られた（図４）。
【０１３６】
７．３．  pUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2の構築
UL45遺伝子及びUL46遺伝子に隣接しているDEVゲノムの１．０kbのＤＮＡフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してＰＣＲ反応によりクローニングした（図６）。手短に説明すると、ＤＥＶから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用して、２種のＰＣＲ反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号：３０（5’-CGGTCGACATAGAACGCGCTTCATCTAA-3’）及び配列番号：３１（5’-TGGCCAATAAGGCCGTTTATTGTTTATTAT-3’）、及び配列番号：３２（5’-CGGCCTTATTGGCCAATCTGATTCATCCAA-3’）及び配列番号：３３（5’-GCGAGCTCCGCCTAATCACAATCGGTATTG-3’）である。前記２種のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、配列番号：３０及び配列番号：３３をプライマーとして使用して別のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲフラグメントはSalI及びSacIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIが得られた。次に、標準的なチャレンジ株からのIBDV VP2遺伝子及びプロモーターを含む相同性ベクターを、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIを利用することによって構築した。先ず、SfiIを用いてpUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIを切断し、ＰＡＰを用いて脱リン酸化させた。pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2からSfiI消化によりCoa5プロモーター-VP2-STCカセットを切り出し、SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL45-SfiIとライゲーションし、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2が得られた（図６）。
【０１３７】
７．４．  pUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2の構築
UL50遺伝子及びUL51遺伝子に隣接しているDEVゲノムの１．０kbのＤＮＡフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してＰＣＲ反応によりクローニングした（図７）。手短に説明すると、ＤＥＶから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用して、２種のＰＣＲ反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号：３４（5’-CCGCATGCGCAACTATATATGTCGGTC-3’）及び配列番号：３５（5’-GGGCCAATAAGGCCCAAAAGTACATTTTGT-3’）、及び配列番号：３６（5’-GGGCCTTATTGGCCCAATTTATTTACTATT-3’）及び配列番号：３７（5’-GCGAATTCTGGATATGATATACCGTTGC-3’）である。前記２種のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、配列番号：３４及び配列番号：３７をプライマーとして使用して別のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲフラグメントはEcoRI及びSphIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIが得られた。次に、標準的なチャレンジ株からのIBDV VP2遺伝子及びプロモーターを含む相同性ベクターを、プラスミドpUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIを利用することによって構築した。先ず、SfiIを用いてpUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIを切断し、ＰＡＰを用いて脱リン酸化させた。pUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2からSfiI消化によりCoa5プロモーター-VP2-STCカセットを切り出し、SfiIで消化されたpUC18-KAPEVAC-UL50-SfiIとライゲーションし、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2が得られた。このプラスミドを使用してDEV/US4US5del/UL50/Coa5VP2を構築した（図７）。
【０１３８】
７．５．  pUC18-KAPEVAC-UL23delの構築
UL24遺伝子及びUL22遺伝子に隣接しているDEVゲノムの１．０kbのＤＮＡフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してＰＣＲ反応によりクローニングした（図５）。手短に説明すると、ＤＥＶから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用して、２種のＰＣＲ反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号：２６及び配列番号：３８（5’-CTTGTTCCAGATCCCACAGAAAAAGCGCG-3’）、及び配列番号：３９（5’-CGCGCTTTTTCTGTGGGATCTGGAACAAG-3’）及び配列番号：２９である。前記２種のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、配列番号：２６及び配列番号：２９をプライマーとして使用して別のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲフラグメントはEcoRI及びSphIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-UL23delが得られた（図５）。
【０１３９】
７．６．  不活性UL4及びUL23遺伝子並びに外来遺伝子配列を有するＤＥＶの構築
DEVゲノムを担持しており、０．１μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del及びpUC18-KAPEVAC-UL23-BacVP2（JK015用）、０．１μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-UL23del、及びpUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2（JK022用）、０．１μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-UL23del、及びpUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2（JK023用）、又は０．１μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-UL23del、及びpUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2（JK024用）でトランスフェクションされたE. coli.株における相同組換えにより、不活性UL4及びUL23遺伝子並びに外来遺伝子配列を有するリコンビナントDEVの構築を行った。トランスフェクションは先に記載したように行い、不活性UL4及びUL23遺伝子並びに外来遺伝子配列を有するＤＥＶを獲得した（JK022〜JK024）。
【０１４０】
【表３】
0006802813.tif 000004
【０１４１】
JK015、JK022、JK023、及びJK024を成功裡に獲得した。
【０１４２】
7.7.  成長速度
これらのＤＥＶの成長速度を評価し、結果を以下に示す。
【０１４３】
【表４】
0006802813.tif 000005
【０１４４】
７．８．  インオボ投与
下記のＤＥＶ又は親ＫＡＰＥＶＡＣウイルスの１０００プラーク形成単位を、１８日齢ニワトリ胚へインオボでＤＯＡ３に投与した。トリの臨床徴候を、孵化後３５日間観察した。結果を以下の表に示す。
【０１４５】
【表５】
0006802813.tif 000006
【０１４６】
この試験では、rDEV/UL4del/UL23/BacVP2を接種したほとんどのニワトリが、観察期間生存したが、親ＤＥＶ株を接種したニワトリは全て死亡した。
【０１４７】
実施例８：不活性UL4遺伝子及び不活性US7遺伝子を有するＤＥＶの構築及びインオボ投与。
不活性UL4及びUS7遺伝子並びに外来遺伝子を有するＤＥＶを構築した。
【０１４８】
８．１．  pUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2の構築
US6遺伝子及びUS8遺伝子に隣接しているDEVゲノムの０．６kbのＤＮＡフラグメントを、挿入部位にSfiI認識部位を付加してＰＣＲ反応によりクローニングした（図８）。手短に説明すると、ＤＥＶから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用して、２種のＰＣＲ反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号：４０（5’-gcGCATGCCCACCCATAGCCTATTAC-3’）及び配列番号：４１（5’-TATGATTGACTGTTTGCCTTTCATTAACATCCAAATATATTTGTACATGAGGTAATAGGCTATGGGTGCCTTATTGGCCA-3’）、及び配列番号：４２（5’-AACAGTCAATCATAACAAAAACATTTACTTTTAGTCATACTGATGTGAATTAggccttattggccTTCTATTTTTGAAAC-3’）及び配列番号：４３（5’-gcGAATTCATGACCATGGACATGC-3’）である。前記２種のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、配列番号：４０及び配列番号：４３をプライマーとして使用して別のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲフラグメントはEcoRI及びSphIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-US7del-SfiIが得られた。次に、プロモーター及びVP2-STCを含む相同性ベクターを、プラスミドpUC18-KAPEVAC-US7del-SfiIを利用することによって構築した。先ず、SfiIを用いてpUC18-KAPEVAC-US7del-SfiIを切断し、ＰＡＰを用いて脱リン酸化させた。Bac-VP2カセットはプラスミドpUC18-KAPEVAC-UL26-BacVP2からSfiI消化により得られ、SfiIで消化されライゲーションされたpUC18-KAPEVAC-US7del-SfiIへと挿入され、結果としてpUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2が得られた（図８）。
【０１４９】
８．２．  pUC18-KAPEVAC-US7delの構築
US6遺伝子及びUS8遺伝子に隣接している、DEVゲノムの０．６kbのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ反応によりクローニングした（図８）。手短に説明すると、ＤＥＶから抽出されたＤＮＡを鋳型として使用して、２種のＰＣＲ反応を行った。使用されたプライマー対は、配列番号：４０及び配列番号：４４（5’-GTGCGCCATATAGACGTAATTCACATCAG-3’）、及び配列番号：４５（5’-CTGATGTGAATTACGTCTATATGGCGCAC-3’）及び配列番号：４３である。前記２種のＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物の混合物を鋳型とし、配列番号：４０及び配列番号：４３をプライマーとして使用して別のＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲフラグメントはEcoRI及びSphIでの消化後にpUC18ベクターへとクローニングされ、結果としてpUC18-KAPEVAC-US7delが得られた（図８）。
【０１５０】
８．３．  不活性UL4及びUS7遺伝子並びに外来遺伝子配列を有するＤＥＶの構築
DEVゲノムを担持しており、０．１μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del及びpUC18-KAPEVAC-US7-BacVP2（JK016用）、０．１μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del、及びpUC18-KAPEVAC-UL23del-Coa5VP2（JK025用）、０．１μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del、及びpUC18-KAPEVAC-UL26-Coa5VP2（JK026用）、０．１μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del、及びpUC18-KAPEVAC-UL45-Coa5VP2（JK027用）、又は０．１μgのpUC18-KAPEVAC-UL4del、pUC18-KAPEVAC-US7del、及びpUC18-KAPEVAC-UL50-Coa5VP2（JK028用）でトランスフェクションされたE. coli.株における相同組換えにより、不活性UL4及びUS7遺伝子並びに外来遺伝子配列を有するリコンビナントDEVの構築を行った。トランスフェクションは先に記載したように行い、不活性UL4及びUS7遺伝子並びに外来遺伝子配列を有するＤＥＶを（JK022〜JK024）を獲得した（JK016、及びJK025-JK028）。
【０１５１】
【表６】
0006802813.tif 000007
【０１５２】
JK016、JK025-JK028を成功裡に構築した。
【０１５３】
８．４．成長速度
これらのＤＥＶの成長速度を評価し、結果を以下に示す。
【０１５４】
【表７】
0006802813.tif 000008
【０１５５】
８．５．  インオボ投与
下記のＤＥＶ又は親ＫＡＰＥＶＡＣウイルスの１０００プラーク形成単位を、１８日齢ニワトリ胚へインオボでＤＯＡ３に投与した。トリの臨床徴候を、孵化後３５日間観察した。結果を以下の表に示す。
【０１５６】
【表８】
0006802813.tif 000009
【０１５７】
この試験では、rDEV/UL4del/US7/BacVP2の接種を受けた全てのニワトリが３５日間生存した。
【０１５８】
配列のリスト
【化１】
0006802813.tif 000010
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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