(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における胃腸痛の低減又は予防に使用する乳酸菌株を選択する方法であって：
一過性受容体電位バニロイド１型であるＴＲＰＶ１の自発的及び／又は誘導された活性化を低減することが可能である乳酸菌株をｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択するステップ、又は自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減することが可能である該乳酸菌株からの馴化培地をｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択するステップ
を含む、上記方法。
【請求項２】
さらに、ＴＲＰＶ１発現細胞と被験用の乳酸菌株又は該乳酸菌株からの馴化培地をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ；
前記細胞と前記被験用の前記乳酸菌株又は前記乳酸菌株からの馴化培地をｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ後に、前記細胞において、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するステップ；並びに
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を、対照のＴＲＰＶ１活性化と比較するステップを含み、
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定された自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化が前記対照のＴＲＰＶ１活性化より低い場合に、前記乳酸菌株又は前記乳酸菌株からの馴化培地をｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択するステップが、前記被験用の前記乳酸菌株又は前記乳酸菌株からの馴化培地を、胃腸痛の低減又は予防に有効な前記乳酸菌株又は前記乳酸菌株からの馴化培地として選択するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するステップが、カプサイシン、ｐＨ変化及び／又は加熱により誘導される前記細胞におけるＣａ２＋流入をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、結合腸間膜組織を伴うｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分を被験用の乳酸菌株又は該乳酸菌株からの馴化培地と接触させるステップ；
前記ｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分を前記被験用の前記乳酸菌株又は前記乳酸菌株からの馴化培地と接触させるステップ後に、前記ｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分における自発的及び／又は誘導された腸間膜求心性神経の発火を測定するステップ；並びに
前記測定された自発的及び／又は誘導された腸間膜求心性神経の発火を、対照の腸間膜求心性神経の発火と比較するステップを含み、
前記測定された自発的及び／又は誘導された腸間膜求心性神経の発火が前記対照の腸間膜求心性神経の発火より低い場合に、前記乳酸菌株又は前記乳酸菌株からの馴化培地を選択するステップが、前記被験用の前記乳酸菌株又は前記乳酸菌株からの馴化培地を胃腸痛の低減又は予防に有効な前記乳酸菌株又は前記乳酸菌株からの馴化培地として選択するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記乳酸菌株が、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減することが可能であるラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株がラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＤＳＭ１７９３８である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記対象が、前記対象において前記胃腸痛を引き起こす腸運動障害に罹患している、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が、前記対象において前記胃腸痛を引き起こす疝痛、過敏性腸症候群及び便秘からなる群から選択される疾患に罹患している、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に、胃腸痛の調節、特に、胃腸痛を調節することが可能である作用剤、例えば乳酸菌の選択、及びそのような作用剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃腸痛は、胃腸管に関連する多くの状態、疾患及び障害の症状である。機能性腹痛とは、反復性腹痛を指す。圧倒的大部分の反復性腹痛患者は、「機能性」又は「非器質性」疼痛を有し、その疼痛は身体的異常によって引き起こされたものではないことを意味する。様々な運動障害も、疼痛及び便秘又は下痢に関連する。この用語は、腸が適切に発達していない、又は様々な原因のために筋肉活動を調和させる能力を失っている様々な障害について記述するために使用される。
【０００３】
そのような障害は、様々な様式で現れることがあり、以下を含むが、それらに限定されない：
・腹部拡張
・再発性閉塞
・腹部疝痛
・便秘
・胃食道逆流症
・難治性の反復性嘔吐
・下痢
・過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
・炎症性腸疾患
・便失禁
・乳児疝痛
・頻繁な反復性腹痛（ＦＲＡＰ）
・吐き戻し
・食物不耐症
【０００４】
広い意味で、食物及び分泌液の消化管への輸送におけるあらゆる有意な変化は、腸運動障害と考えることができ、これは、胃腸痛に関連することが多い障害のタイプである。
【０００５】
適正に調和した胃及び腸の運動は、腸の内容物を消化し、消化管に沿って前進させるのに必要とされる。胃腸（ＧＩ）管の適正な運動に必要である収縮及び弛緩のパターンは、複雑であり、ＧＩ壁内で神経及び筋肉を使用する。毎日いつでも、多くの要因、例えば運動及び情動的苦痛がＧＩ運動に影響を与え得る。新生児は、ＧＩ管の運動の複雑な系を発達させなければならない。胃腸の運動機能不全は、ＧＩの疼痛に関連することが多い。
【０００６】
老化、認知症、卒中、パーキンソン病、脊髄損傷、出産中の直腸裂傷、糖尿病、手術の合併症及び神経筋障害、例えば重症筋無力症は、疼痛に関連する運動障害を引き起こし得る。
【０００７】
過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は、一般的に診断される腸の運動障害及びＧＩの疼痛であり、何十年間にも及ぶ大腸の疾患と考えられているが、ＧＩ運動の研究により、根幹をなす運動の乱れは、小腸でも発生し得ることが実証されている。ＩＢＳは、ＧＩの疼痛を伴うことが多いことがあり、ＴＲＰＶ１免疫活性は、ＩＢＳ患者において有意に上昇したことが示されている（Ａｋｂａｒ、Ｙｉａｎｇｏｕら、Ｇｕｔ、２００８年）。
【０００８】
ＧＩの疼痛に関連することが多い便秘は、米国で最も一般的な消化器病訴であるが、その頻度にもかかわらず、患者が、二次障害、例えば肛門直腸障害又は憩室疾患を発症するまで、認識されないままであることが多い。先に言及されているように、ＧＩの疼痛は便秘の一般的症状である。
【０００９】
便秘は、妊娠中にはかなり一般的である。通常、ホルモンであるプロゲステロン、及び場合により、出産前のビタミンとして摂取される追加の鉄の量がより多いため、腸を通して食物を動かす筋肉収縮が遅くなる。これは、より軽度の腹痛も伴うことが多い。
【００１０】
便秘は、加齢、及び、一般的に、とりわけ７０歳超及び慢性疾患治療病院にかかる人々に見出される、いわゆる「老化腸」にも関連する。
【００１１】
加齢の対極にある腸運動障害である乳児疝痛による、持続的又は過剰な泣きは、幼年期の最も苦しい問題の１つである。これが、乳児、親及び関与する健康管理の専門家を苦しめる。疝痛は、突然開始し、突然終了することが多い。
【００１２】
推定自律神経失調に続発する腸の運動過剰も、疝痛の病因の１つとして提示されている。運動活動を調整する機構の多くは、乳児では未熟である。こうした機構の未熟さが、食物不耐症に対する脆弱性の増大につながり得る。したがって、疝痛は、運動調整の１つ又は複数の態様として、成熟機能不全を有する乳児の亜集団に一般的な臨床発現のことがあり、乳児にＧＩの疼痛を引き起こすことが多い。
【００１３】
腸運動障害は、ＧＩの疼痛に関連することが多い異常な腸収縮に当てはまり、様々な障害に対して、様々な種類の処置及び推奨が多く存在し、その一部は、他の多くのものよりも適切に作用する。
【００１４】
そのため、様々な運動障害及び疼痛障害を解決する、すなわち；胃腸痛を予防又は低減する作用剤をどのように最適に選択するかという全般的な必要性、並びに具体的問題が存在する。
【００１５】
一過性受容体電位バニロイド１型（ＴＲＰＶ１）は、例えば末梢神経系（ＰＮＳ）、中枢神経系（ＣＮＳ）、呼吸器系及び胃腸管で発現するＣａ２＋透過カチオンチャネルである。ＴＲＰＶ１は、物理的及び化学的刺激、例えば温度、ｐＨ変化及びカプサイシンにより活性化され、侵害及び熱炎症性疼痛の検出に重要である。胃腸管において、ＴＲＰＶ１免疫活性は、例えば、内臓知覚求心性神経に見出すことができ、ＴＲＰＶ１細胞は、例えば胃の痛覚を、脳の高次中枢に伝播する。ＴＲＰＶ１は、痛覚に関連するいくつかの胃腸の状態に関与すると考えられ、ＴＲＰＶ１の免疫活性は、例えばＩＢＳを著しく上昇させることが示されている（Ａｋｂａｒ、Ｙｉａｎｇｏｕら、Ｇｕｔ、２００８年）。上昇の例として、活動性炎症性腸疾患と診断された患者では、大腸神経線維における、ＴＲＰＶ１免疫活性の大幅な上昇が実証される（Ｗａｎｇ、Ｍｉｙａｒｅｓ及びＡｈｅｒｎ、２００５年、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）。
【００１６】
ＴＲＰＶ１は、様々な様式の疼痛を処置する薬剤を開発するための潜在的標的と考えられるが、受容体の発現が広範だと、胃腸痛を処置する際に、全身ＴＲＰＶ１拮抗薬の使用を限定する有害事象が生じ得る。具体的には、受容体の拮抗により、血管作動性ペプチドの放出が減少した結果として、心血管性合併症が潜在的に生じる恐れがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
総合的な目的は、胃腸痛の低減又は予防に適している作用剤を見出すことである。
【００１８】
具体的な目的は、胃腸痛の低減又は予防に有効な作用剤、好ましくは細菌株、より好ましくは、乳酸菌を選択する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
こうした目的及び他の目的は、本明細書で開示されている実施形態により満たされる。
【００２０】
本実施形態のある態様は、対象における胃腸痛の低減又は予防に有効な作用剤を選択する方法に関する。この方法は、自発的及び／又は誘導された一過性受容体電位バニロイド１型（ＴＲＰＶ１）活性化を低減することが可能である作用剤を選択するステップを含む。
【００２１】
本実施形態の別の態様は、上記で特定されている方法により選択される作用剤に関する。
【００２２】
本実施形態のさらなる態様は、対象における胃腸痛の低減又は予防に使用する、上記で特定されている選択方法により得られる作用剤に関する。
【００２３】
本実施形態のさらに別の態様は、上記で特定されている選択方法により得られる作用剤、並びに、医薬として許容できる担体、医薬として許容できる希釈剤、医薬として許容できる賦形剤、食料品、栄養補助食品及び別の予防剤又は治療剤からなる群から選択される少なくとも１つの追加成分を含む組成物に関する。
【００２４】
本実施形態のある関連した態様は、対象における胃腸痛の低減又は予防に使用する、上記で定義されている作用剤、又は上記で定義されている組成物を定義する。
【００２５】
本実施形態の別の関連した態様は、対象における胃腸痛を低減若しくは予防するための薬、食品製品又は栄養補助食品製品を製造するための、上記で特定されている選択方法により得られる作用剤、又は上記で定義されている作用剤、又は、上記で定義されている組成物の使用を定義する。
【００２６】
本実施形態のさらに別の態様は、対象における胃腸痛を低減又は予防する方法に関する。この方法は、上記で特定されている選択方法により得られる作用剤、又は上記で定義されている作用剤、又は上記で定義されている組成物の有効量を、対象に投与するステップを含む。
【００２７】
本実施形態は、胃腸痛を引き起こす、又はそれに関連する障害又は疾患に罹患した対象、好ましくはヒト対象において、胃腸痛を低減又は予防するために使用できる作用剤、特に細菌株、例えば乳酸菌の選択又は同定に使用できる効率的な技術を示す。
【００２８】
本実施形態は、それらのさらなる目的及び利点と共に、添付の図とまとめられた以下の説明を参照することにより、きわめて適切に理解され得る：
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】１×１０８のＤＳＭ１７９３８単位（ｃｆｕ）／ｍｌを加えたでの、腸間膜マルチユニット自発発火を示す図である。
【図１Ｂ】１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８を加えた後の、腸間膜マルチユニット自発発火を示す図である。
【図１Ｃ】希釈したＤＳＭ１７９３８馴化培地（１：５）を加えた後の、腸間膜マルチユニット自発発火を示す図である。
【図１Ｄ】１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのγ−照射ＤＳＭ１７９３８を加えた後の、腸間膜マルチユニット自発発火を示す図である。及び、
【図１Ｅ】希釈した培地単体（１：５）を加えた後の、腸間膜マルチユニット自発発火を示す図である（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。
【図２】脊髄求心性神経の自発発火率に対するＤＳＭ１７９３８の効果を示す図である。
【図２Ａ】マルチユニット発火率が、１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８が管腔に加えられた場合に減少した図である（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。
【図２Ｂ】左図の、脊髄単一ユニット発火が、ＤＳＭ１７９３８により低減された図である（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。
【図２Ｃ】上図の、代表的なトレースの自発的マルチユニットが、ＤＳＭ１７９３８を加える前後で放電する図である；下図の、時折発生する１つの単一ユニットの上に重なる波形は、上のトレースで「○」で記録された。
【図３】カプサイシンを漿膜灌流液に加えることにより、ＤＳＭ１７９３８が脊髄線維の興奮反応に拮抗したことを示す図である。
【図３Ａ】脊髄の個々の単一ユニット１１３例に由来するカプサイシン用量反応曲線をプロットし（●）、３パラメータロジスティック方程式に一致させた、ＥＣ５０＝２００ｎＭ。Ｍａｘ＝２３８±２７％；１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８の存在下における追加の線維１１６例を用いて、カプサイシンに対する用量反応曲線をさらにプロットし（■）、同一のロジスティック方程式に一致させた、ＥＣ５０＝５００ｎＭ及びＭａｘ＝１２９±１７％（ＥＣ５０及びＭａｘにおけるそれぞれの差に対してＰ＝０．７及びＰ＝０．００４、追加二乗和Ｆ検定）の図である。
【図３Ｂ】１×１０９ｃｆｕ／ｍｌＤＳＭの有無にかかわらず、カプサイシンの用量が増加するにつれて、単一ユニット反応がどのように変動するかを示す、平均及びＳＥＭの要約散布図である。（ｎ）は、各群に対する単一ユニットの比率を表す。
【図４】ＤＳＭ１７９３８又はＴＲＰＶ１拮抗薬が、脊髄単一ユニットにおいて、拡張を誘発する興奮反応を低減することを示す図である。
【図４Ａ】１×１０９のＤＳＭ１７９３８を管腔に加えることにより、管腔内圧力を４８ｈＰａまで上昇させて誘発される脊髄単一ユニットの発火率の上昇を低減することを示す散布図である。
【図４Ｂ】１０μＭのＴＲＰＶ１拮抗薬６−ヨードノルジヒドロカプサイシンを管腔に加えることで、ＤＳＭ１７９３８を加える効果を模倣した図である（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定）。
【図５】後根神経節のニューロン体細胞においてカプサイシンが誘発したＣａ２＋の上昇のＤＳＭ１７９３８による低減を示す図である。
【図５Ａ】カプサイシン１μＭが、ＤＲＧニューロンのＣａ２＋流入増加を誘発し、当該誘発が管腔内のＤＳＭ１７９３８により用量依存的に減少し、１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのＪＢ−１により影響を受けないことを示した図である。
【図５Ｂ】カプサイシンにより誘発される最大Ｃａ２＋蛍光性（Ｆ）対ベースラインＣａ２＋蛍光性（Ｆ０）の比（Ｆ／Ｆ０）が、ＤＳＭ１７９３８濃度又はＪＢ−１に応じてどのように変動するかを示す要約プロットである（Ｐ値、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの多重比較試験）。
【図６】ＤＳＭ１７９３８の９日間の供給により、胃の拡張が誘発する徐脈が低減されたことを示す図である。
【図６Ａ】４０及び６０ｍｍＨｇの胃の拡張により誘発される安静時の心拍におけるパーセント低下の要約値の図である（Ｐ値、不対ｔ検定）。
【図６Ｂ】６０ｍｍＨｇの胃の拡張に反応して、安静時の心拍が長期間にわたってどのように変化したかを示す要約プロットである（Ｐ＝０．０１、２要因ＡＮＯＶＡ検定）。
【図７】ＤＳＭ１７９３８が、ＤＳＭ１７９３８馴化培地で模倣した脊髄求心性神経に対するカプサイシン興奮作用の低減を誘導した図である。要約プロットは、対照の状態において、ＤＳＭ１７９３８馴化培地（１：５）又は１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８と共に、カプサイシン１μＭにより誘導される単一ユニット脊髄線維の発火頻度の増加を示す（Ｐ＝０．０２、１要因ＡＮＯＶＡ検定；ポストホックＰ値、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋの多重比較検定）。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の理解を促進するために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００３１】
「胃腸痛」は、ＧＩの疼痛とも呼ばれ、対象の胃腸系における疼痛を表す。そのような胃腸痛は、典型的には胃腸系の様々な疾患及び障害によって引き起こされる、又は、それらに関連する、すなわち、それらの症状又は病気の構成要素であることが多い。胃腸痛は、胃腸系における一般的な疼痛を含み、この疼痛は、当業界で一般的な胃腸痛、腸運動障害に関連する疼痛、炎症性腸疾患及び過敏性腸症候群からの疼痛、胃痛、一般的な腹痛、内臓痛、機能性腹痛、頻繁な反復性腹痛及び他の機能性胃腸障害での疼痛で表されることが多い。
【００３２】
「機能性腹痛」は、反復性腹痛を指す。圧倒的大部分の反復性腹痛患者は、疼痛が身体的異常によって引き起こされたものではないことを意味する、「機能性」又は「非器質性」疼痛を有する。
【００３３】
「腸運動障害」は、様々な原因のため、腸が適切に発達していない、又は筋肉活動を調和させる能力を失っている、様々な障害の記載に使用される。そのような障害は、様々な様式で現れることがあり、以下を含むが、それらに限定されない：
・腹部拡張
・再発性閉塞
・腹部疝痛
・便秘
・胃食道逆流症
・難治性の反復性嘔吐
・下痢
・過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
・炎症性腸疾患
・便失禁
・乳児疝痛
・頻繁な反復性腹痛（ＦＲＡＰ）
・吐き戻し
・食物不耐症
【００３４】
広い意味で、食物及び分泌液の消化管への輸送におけるあらゆる有意な変化は、腸運動障害と考えることができ、これは、胃腸痛に関連することが多い。
【００３５】
「胃痛」は、上腹部における疼痛又は不快感の記載に使用される総称である。
【００３６】
ある実施形態において、胃痛の原因は、非潰瘍性消化不良、消化性潰瘍、胃食道逆流症及び胃炎を含む、例えばそれらからなる群から選択される。
【００３７】
特定の実施形態において、胃痛の原因は、非潰瘍性消化不良及び／又は胃炎である。
【００３８】
本明細書で使用される「発火頻度」という用語は、脳に対する知覚スパイク列の測定に使用される。
【００３９】
本明細書で使用される、「管腔内ピーク圧力」（ＰＰｒ）という用語は、管腔内圧力の記録に基づき、管腔内圧力の変化は、腸部分の縦軸の中間点で測定される。圧力シグナルが分析され、管腔内ピーク圧力（ＰＰｒ）が特定及び測定される。
【００４０】
本明細書で使用される、「伝播性消化管収縮運動頻度」（ＭＭＣ頻度）という用語は、時空間マップにおける暗色のＭＣバンドの数を計上することで計算される。
【００４１】
本明細書で使用される、「伝播性消化管収縮運動速度」（ＭＭＣ速度）という用語は、伝播性消化管収縮運動により生成される、時空間マップにおける各バンドの傾き（単数又は複数）から測定される。
【００４２】
本明細書で使用される「作用剤」という用語は、細胞全体；微生物；馴化培地；そのような馴化培地に由来するタンパク質、ペプチド、酵素及び／若しくは分子；細胞全体若しくは微生物から分泌される、又はそれらに由来するタンパク質、ペプチド、酵素及び／若しくは分子；又は、哺乳動物の胃腸系における胃腸痛の調節に使用できる他の生物学的若しくは化学的材料を含むいかなる物質又は材料も意味するように使用される。好ましい作用剤の例は、細菌株、例えばプロバイオティクス細菌株、特に乳酸菌株である。好ましい作用剤の別の例は、細菌株、例えばプロバイオティクス細菌株、特に乳酸菌株からの馴化培地である。
【００４３】
馴化培地は、馴化培養培地と呼ばれることもあり、細胞が一定期間にわたり培養されている（培養）培地である。培地で培養されたこの細胞は、様々な成分又は分子、例えばタンパク質、ペプチド、酵素、サイトカイン、ケモカイン、化学的物質等を放出又は分泌することにより培地を「調整する」。
【００４４】
腸の微生物が、いわゆる微生物叢−腸−脳軸の一部として脳にシグナルを出すことが、認められている開始である。しかし、神経系の発達又は機能における腸内微生物叢の役割についてはほとんど知られていない。腸から中枢神経系へとリレーされる神経シグナルの定量的な性質については、現在はごくわずかしか知られていない。
【００４５】
単一の知覚ニューロンは、迷走神経線維のものを含めて、刺激の性質及び強度をコードする、パターン化されたスパイク列として、連続した物理的刺激を表す。これに加えて、刺激は、線維束中の活性な線維の数により判定されるポピュレーションコードで表され得る。一次求心性神経を経由して脳に達する情報はすべて、ニューロンのスパイク列の言葉としてコードされなければならない。したがって、知覚のスパイク列が、様々な作用剤、例えば片利共生生物、プロバイオティクス株及び様々な物質から、どのように影響を受けるかについて知ることで、一次求心性神経の発火に対するそれらの効果、並びに様々な手法でこのシグナル伝達系に介入できる新薬及び他の化合物により、特に、ＴＲＰＶ１活性化を調節することにより、新たな有益な腸微生物及びその活性分子を同定することが可能になる。
【００４６】
本明細書の実施形態の方法は、ＴＲＰＶ１受容体を介したシグナル伝達を阻害することによる、胃腸痛の低減又は予防に使用する作用剤を選択するために用いられる。それにより、本実施形態の方法は、胃腸痛の予防に潜在的に有効になり得る、及び／又は胃腸痛の低減、阻害又は処置に潜在的に有効な作用剤の評価に使用できる。したがって、この方法は、末梢（腸）及び／又は中枢神経系に関連する胃腸痛を調節することが可能である、有効な作用剤の同定に使用できる。
【００４７】
したがって、本実施形態の態様は、対象における胃腸痛の低減又は予防に有効な、すなわちそれに使用する作用剤を選択する方法に関する。この方法は、自発的及び／又は誘導された一過性受容体電位バニロイド１型（ＴＲＰＶ１）活性化を低減することが可能である、作用剤を選択するステップを含む。
【００４８】
それにより、本実施形態は、胃腸痛疾患又は障害で表され得るそのような胃腸痛を伴う、又は引き起こす疾患又は障害に罹患した対象における胃腸痛の調節、特に、予防又は低減、例えば阻害又は処置に有効な作用剤を同定する際における、選択ツールとしてのＴＲＰＶ１シグナル伝達経路の使用に基づく。
【００４９】
本実施形態の方法は、典型的には、本明細書でさらに開示されているようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。しかし、作用剤は、好ましくは、対象に投与される場合、対象において自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減することが可能である。
【００５０】
したがって、本実施形態の方法は、異なる胃腸痛障害及び疾患における胃腸痛の低減又は予防に適切な作用剤を見出すために使用できる。作用剤は、胃腸通を調節、すなわち、好ましくは予防、低減又は処置するために、有益な手法で対象のＴＲＰＶ１活性化に影響を与えるように選択される。
【００５１】
ある実施形態において、この方法により選択される作用剤を用いて予防又は処置される胃腸痛に関連する障害又は疾患は、胃腸痛障害又は疾患である。
【００５２】
ある実施形態において、胃腸痛は胃痛である。
【００５３】
ある実施形態において、胃腸痛は、内臓痛である。
【００５４】
ある実施形態において、胃腸痛は、疝痛に罹患した対象に存在し得る。
【００５５】
ある実施形態において、胃腸痛は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）に罹患した対象に存在し得る。
【００５６】
ある実施形態において、胃腸痛は、便秘に罹患した対象に存在し得る。胃腸痛は、先述のように定義されている腸運動障害に罹患した対象に存在し得る。
【００５７】
したがって、ある実施形態において、対象は、胃腸痛に関連する腸運動障害に罹患した。
【００５８】
本実施形態の方法は、様々な状態及び障害、例えば運動障害に関連し、中心又は末梢に現れる疼痛を含む胃腸痛は、ＴＲＰＶ１活性化につながるが、この活性化は、以前は知られていなかった作用剤、例えば乳酸菌により調節できるという想定外の発見に基づく。
【００５９】
胃腸痛の１種は、腹部内臓（臓器）の侵害受容器が活性化されることに由来する内臓痛である。内臓構造は、拡張（伸縮）、虚血及び炎症に高度に感受性であるが、通常疼痛を誘発する他の刺激には比較的非感受性である。内臓痛は拡散性であり、局所に留めることが困難であり、遠位の、通常は表在性の構造に移ることが多い。内臓痛は、症状、例えば悪心、嘔吐、バイタルサインの変化並びに感情の現れを伴うことがある。疼痛は、不快感、深部痛、圧迫感及び鈍痛として記載され得る。ごく一部の患者におけるこのタイプの疼痛は、独特な構造的病変又は生化学的異常により説明される。こうした疾患は、胃腸神経筋疾患（ＧＩＮＭＤ）に分類されることがある。人々は、内臓痛を経験することもあり、実際疼痛は強烈なことが多いが、構造的な証拠も、そのような症状に対する生化学的又は組織病理学的な理由もない。
【００６０】
侵害受容器は、脊髄の前外側路（と迷走神経の小突起）、次いで視床、及び島状皮質及び帯状皮質を含む前脳に伝播する特定の侵害受容ニューロン（Ａδ又はＣ）に活動電位を送ることにより、潜在的に損傷を与える刺激に反応する知覚受容器である。腸病変に端を発する疼痛知覚に重要なのは、腸から、腸間膜求心性神経線維束に達する外因系の一次求心性神経線維を経由した中枢神経系への、疼痛メッセージの活性化である。
【００６１】
この方法は、望ましい性質、例えば、胃腸痛の低減又は予防に使用するＴＲＰＶ１活性化の低減を有する作用剤を選択するために、作用剤のスクリーニングに使用できる。この方法で測定されるパラメータ、すなわち自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化は、様々なモデル及び系でモニター及び測定できる。この情報を使用して、特定の作用剤が胃腸痛における疼痛のシグナル伝達の際に有する、具体的且つ潜在的に微妙に異なる効果の定義に有用なプロファイルを得ることができる。
【００６２】
この方法で測定できる他のパラメータは、一般的な疼痛のシグナル伝達、神経発火活性、例えば腸間膜神経線維束の分析を含み、胃腸痛の様々なｉｎ  ｖｉｖｏモデルを場合により使用する。
【００６３】
ある実施形態において、ＴＲＰＶ１活性化は、ＴＲＰＶ１発現細胞、例えば後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン、ＣａＣｏ２細胞又は別の標準的なヒト腸の上皮細胞系で測定される。自発的ＴＲＰＶ１活性化及び例えばカプサイシン、ｐＨ変化又は温度による誘導後におけるＴＲＰＶ１活性化をいずれも測定できる。一般的に、ＴＲＰＶ１を発現するいかなる細胞又は組織も、本実施形態によるＴＲＰＶ１活性化の測定に使用できる。
【００６４】
したがって、ある実施形態において、この方法は、ＴＲＰＶ１発現細胞を、被験作用剤と接触させるステップを含む。この方法は、細胞を、被験作用剤と接触させるステップに続いて、すなわちその後、細胞における自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を測定するステップも含む。この方法は、測定された自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を、対照のＴＲＰＶ１活性化と比較するステップをさらに含む。この実施形態において、この方法は、測定された自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化が、対照のＴＲＰＶ１活性化より低い場合、被験作用剤を胃腸痛の低減又は予防に有効な作用剤として選択するステップをさらに含む。
【００６５】
対照のＴＲＰＶ１活性化は、様々な実施形態に従って判定できる。例えば、ＴＲＰＶ１活性化は、例として、実質的に胃腸痛がないことに対応する、通常又はベースラインの活性化を表す活性化値を有するＴＲＰＶ１発現細胞から事前に定義され、判定され得る。
【００６６】
しかし、対照のＴＲＰＶ１活性化を判定するステップの好ましい実施形態は、ＴＲＰＶ１発現細胞を内部対照として使用することである。したがって、ある実施形態において、この方法は、細胞を被験作用剤と接触させるステップの前に、細胞における自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を測定するステップを含む。この方法は、細胞を被験作用剤と接触させるステップの前に、細胞で測定された自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化に基づいて対照のＴＲＰＶ１活性化を判定するステップも含む。
【００６７】
したがって、このアプローチでは、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化の測定は、好ましくは：細胞を被験作用剤と接触させるステップの前に、及び細胞を被験作用剤と接触させるステップに続いて、２回行われる。
【００６８】
或いは、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化の測定は、２つの平行した実験である、細胞が被験作用剤と接触する一方の実験と、細胞が作用剤と接触しないもう一方の対照実験で行うことができる。次いで、２つの実験に使用される細胞は、同一の種類であり、例えばいずれもＤＲＧニューロン、ＣａＣｏ２細胞又は別の標準的なヒト腸の上皮細胞系である。いずれの実験でも自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化が測定され、次いで互いに比較される。
【００６９】
この方法に使用される細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏ調製物、ＴＲＰＶ１発現細胞系、例えばＴＲＰＶ１を発現するヒト腸の上皮細胞系、及びＴＲＰＶ１を発現する初代細胞を含む、ＴＲＰＶ１を発現するいかなる細胞であってもよいが、それらに限定されない。
【００７０】
測定された自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化、並びに対照のＴＲＰＶ１活性化は、一般的に、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化値を表す値を含むそれぞれのパラメータ値又は測定基準として表現され得る。
【００７１】
ある実施形態において、初代細胞、例えば後根神経節（ＤＲＧ）ニューロンが、ＴＲＰＶ１活性化の分析に使用される。
【００７２】
別の実施形態において、ＴＲＰＶ１発現細胞系、例えばＣａＣｏ２又は別の標準的なヒト腸の上皮細胞系が、ＴＲＰＶ１活性化分析に使用される。
【００７３】
他の実施形態において、ＴＲＰＶ１を発現する商用細胞系が、ＴＲＰＶ１活性化の分析に使用される。例えばＣｈａｎｔｅｓｔのｃａｔ：ｎｏ  ＣＴ６１０５を参照されたい。
【００７４】
ＴＲＰＶ１発現並びに／又は自発的及び／若しくは誘導されたＴＲＰＶ１活性化のモニター及び測定に使用できる、当業界でレポーター細胞とも表される、レポーター遺伝子細胞を使用することもできる。
【００７５】
いくつかの異なる方法、例えばカプサイシンにより誘導される、例としてカルシウム流入及び／又は、ＴＲＰＶ１発現細胞における作用剤によるその予防、自発的及び／又は例えばカプサイシンにより誘導された腸間膜神経線維束の発火頻度を使用した機能性分析を含むが、それらに限定されないいくつかの異なる方法を使用して、ＴＲＰＶ１活性化を試験できる。別の実施形態において、Ｒｅｕｂｉｓｈ、Ｅｍｅｒｌｉｎｇら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２００９年に記載されているリアルタイムＰＣＲマシンを使用した温度依存性イオンチャネル活性の機能性の評価を使用して、ＴＲＰＶ１活性化を分析できる。別の実施形態において、ＴＲＰＶ１チャネルに対して、レポーターマウスを使用して、ＴＲＰＶ１活性化を検査できる。様々なｉｎ  ｖｉｖｏ実例を使用して、本発明における疼痛に対する効果を分析することもできる。これらの方法は、例えば胃の拡張及び心拍に対する影響（例３を参照されたい）並びに結腸直腸の拡張モデルを含む。
【００７６】
したがって、ある実施形態において、この方法は、カプサイシン、又はＴＲＰＶ１活性化を誘導できる別の物質、例えばカプサイシン類似体、又はＴＲＰＶ１を活性化することが可能である他の物質により誘導される、細胞におけるＣａ２＋流入を測定するステップを含む。また、ｐＨの変化又は温度を含む、選択された物理的条件への細胞の曝露を使用して、ＴＲＰＶ１活性化を誘導できる。したがって、細胞を酸性ｐＨ、塩基性ｐＨ及び／又は熱（上昇温度、典型的には約４２℃超）に曝露することで、ＴＲＰＶ１活性化が誘導できる。それにより、この実施形態では、ＴＲＰＶ１発現細胞でのＣａ２＋流入は、ＴＲＰＶ１活性化を表すパラメータとして使用される。ＴＲＰＶ１活性化の低減、特にｐＨ誘導、熱誘導及び／又はカプサイシン誘導ＴＲＰＶ１活性化の低減は、その結果Ｃａ２＋流入の低減として測定できる。別の実施形態において、この方法は、細胞における温度依存性イオンチャネル活性を測定するステップを含む。この実施形態では、ＴＲＰＶ１発現細胞における温度依存性イオンチャネル活性は、ＴＲＰＶ１活性化を表すパラメータとして使用される。温度依存性イオンチャネル活性は、自発的であり得る、又は、例えば温度を上昇させることにより誘導され得る。その結果、ＴＲＰＶ１活性化の低減は、細胞における温度依存性イオンチャネル活性の低減として測定できる。
【００７７】
ある実施形態において、ＴＲＰＶ１活性化は、腸間膜求心性神経線維束実験を使用して測定される。したがって、測定できる別のパラメータは、自発的及び／又は例えばカプサイシン、ｐＨ変化又は加熱により誘導された腸間膜求心性神経線維束の発火頻度である。この技術を使用して、様々な被験作用剤により誘導される腸間膜神経線維の興奮性における変化を判定できる。ある実施形態において、ｅｘ  ｖｉｖｏでの神経線維束の記録に対して、胃腸部分は、脊髄及び迷走神経線維の両方から構成されている部分を供給する神経線維束を含有する腸間膜列弓を伴って、又は伴わずに切除される（例１を参照されたい）。
【００７８】
いくつかの実施形態において、胃腸管の領域特異性は重要である。この方法の腸間膜神経分析に適切な部分は、好ましくは、腸間膜求心性神経の発火の測定を可能にする、適切な神経線維束を含む。これは、結合腸間膜組織を伴う胃腸部分を有することにより都合よく得ることができる（例１を参照されたい）。したがって、この実施形態は、適切な実験動物からのｅｘ  ｖｉｖｏ部分、例えばマウス胃腸部分（例えばマウス大腸又は空腸部分）で都合よく実行される。小腸対大腸に対する作用剤の効果の比較ができることは、特に、処置される腸運動障害並びにそれらの臨床段階及び症状に応じて有益になり得、領域特異的な、例えば、小腸又は大腸に特異的な処置は有利になり得る。
【００７９】
ある実施形態では、腸の特定及び選択された部分に対する、求心性腸間膜神経脊髄の交信が分析される。驚くべきことに、様々な作用剤、例えば乳酸菌が、ＧＩ管のある部分では、胃腸痛シグナル伝達系に影響を与える、又は調節することができるが、別の部分では異なる神経経路、例えば迷走神経を経由して、又は内臓痛では後根神経節を介して、影響を与えられず、又は調節できないことが見出されている。
【００８０】
したがって、ある実施形態において、この方法は、結合腸間膜組織を伴うｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分を被験作用剤と接触させるステップを含む。この方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分を被験作用剤と接触させるステップに続いて、ｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分で自発的及び／又は誘導された腸間膜求心性神経の発火を測定するステップも含む。この方法は、測定された自発的及び／又は誘導された腸間膜求心性神経の発火と対照の腸間膜求心性神経の発火を比較するステップをさらに含む。この実施形態において、この方法は、測定された自発的及び／又は誘導された腸間膜求心性神経の発火が、対照の腸間膜求心性神経の発火より低い場合、被験作用剤を胃腸痛の低減又は予防に有効な作用剤として選択するステップをさらに含む。
【００８１】
対照の腸間膜求心性神経の発火は、ｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分を内部対照として使用して、先に論じられているように判定できる。そのような事例では、この方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分を被験作用剤と接触させるステップの前に、ｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分における自発的及び／又は誘導された腸間膜求心性神経の発火を測定するステップを含む。この方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分を被験作用剤と接触させるステップの前に、ｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分で測定された自発的及び／又は誘導された腸間膜求心性神経の発火に基づいて、対照の腸間膜求心性神経の発火を判定するステップも含む。
【００８２】
或いは、２つの平行した実験を実施できる。それらの実験の１つは、ｅｘ  ｖｉｖｏ胃腸部分を被験作用剤と接触させ、対照実験であるもう１つの実験では、ｅｘ  ｖｉｖｏ胃腸部分を作用剤と接触させない。自発的及び／又は誘導された腸間膜求心性神経の発火は、いずれの実験でも測定され、互いに比較される。
【００８３】
こうした上記パラメータの１つ又は複数の分析は、胃腸痛の低減又は予防に有効な作用剤を選択する方法を生じるであろう。
【００８４】
特定の実施形態において、ｅｘ  ｖｉｖｏの胃腸部分は、ｅｘ  ｖｉｖｏの大腸又は空腸部分から選択される。そのような事例では、この方法は、結合腸間膜組織を伴うｅｘ  ｖｉｖｏの大腸又は空腸部分を、被験作用剤と接触させるステップを含む。
【００８５】
自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を分析する適切な方法及び装置の例は、実施例及び図に記載されている。
【００８６】
したがって、好ましい方法では、提示されている分析により、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化に対するデータが得られるであろう。こうしたパラメータの１つ又はいくつかの分析により、胃腸痛の低減及び／又は予防に有効な作用剤を選択する好ましい方法が生じるであろう。
【００８７】
したがって、本実施形態のこの方法は、本明細書のモデルを使用することにより、胃腸痛の処置、予防及び／又は低減に適している作用剤を見出すために使用できる。
【００８８】
提示されているこの方法により、様々なモデルを使用して、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化に対するデータが得られるであろう。このパラメータの分析により、胃腸痛の低減又は予防に有効な作用剤を選択する方法が生じるであろう。
【００８９】
ある実施形態において、この方法は、ＴＲＰＶ１活性化に対する作用剤の効果（自発的及び／又は例えばカプサイシン、ｐＨ変化及び／又は加熱により誘導される、及び作用剤によるその予防）を分析し、ひいては、胃腸痛のシグナル伝達、すなわち作用剤が、胃腸の疼痛、例えば内臓痛に対する効果を有しやすいか否かの読み取りとして使用できる。自発的又は誘導される（例えばカプサイシン、ｐＨ変化及び／又は加熱による）ＴＲＰＶ１活性が上昇すると、又は有意な効果がみられないと、それぞれ、胃腸痛の増悪を生じやすい作用剤、又は胃腸痛に対する有意な効果がみられない作用剤が示される一方、自発的及び／又は誘導された（例えばカプサイシン、ｐＨ変化及び／又は加熱による）ＴＲＰＶ１活性が低減されると、胃腸痛を低減するであろう作用剤が示される。したがって、好ましい作用剤は、自発的及び／又は誘導された（例えばカプサイシンによる）ＴＲＰＶ１活性の低減を生じるものである。
【００９０】
別の実施形態において、この方法は、自発的及び／又は誘導された（例えばカプサイシン、ｐＨ変化及び／又は加熱による）腸間膜求心性神経の発火（疼痛シグナル伝達）を分析することにより、作用剤のＴＲＰＶ１活性に対する効果を分析し、ひいては、胃腸痛の読み取り、すなわち作用剤が、胃腸痛、例えば内臓痛に対する効果を有しやすいか否かの読み取りとして使用できる。求心性神経の発火が増加すると、又は有意な効果がみられないと、それぞれ、胃腸痛の増悪を生じやすい作用剤、又は胃腸痛に対する有意な効果がみられない作用剤が示される一方、求心性神経の発火が減少すると、胃腸痛を低減するであろう作用剤が示される。したがって、好ましい作用剤は、求心性神経の発火の減少、例えば、求心性神経線維束の自発的及び／又は誘導された発火頻度の減少を生じるものである。
【００９１】
被験作用剤は、いかなる適切な手段でも、ＴＲＰＶ１活性分析のために選択された系に加えられる。疼痛シグナル伝達に対する作用剤の効果を分析するために、この方法は、作用剤の存在下で、及び作用剤なしで都合よく実行される。例えば、この方法は、作用剤が加えられる前後のステップで実行される。したがって、そのような方法では、作用剤の効果が適切な対照と比較され、例えば、緩衝液単体に対する作用剤を加えた緩衝液の結果のように試験剤の存在下での結果が、試験剤なしの結果と比較される。
【００９２】
本発明者らは、驚くべきことに、ある乳酸菌株、例えばＤＳＭ１７９３８が、様々なｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルでＴＲＰＶ１活性化を低減し得ることを見出した（例１及び２参照）。したがって、好ましい実施形態において、作用剤は細菌株であり、より好ましくは乳酸菌である。したがって、本実施形態のこの方法は、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減できる観点の方法により判定され、対象における胃腸痛の低減又は予防に有効な１つ又は複数の乳酸菌株を同定及び選択するために、様々な乳酸菌を試験するのに使用すると有利になり得る。
【００９３】
本実施形態の別の態様は、本実施形態の方法により選択される、すなわち、この選択方法により得られる作用剤である。
【００９４】
好ましい作用剤は、微生物、より好ましくは細菌株、好ましくは乳酸菌であり、その一部又は代謝産物も含まれる。
【００９５】
別の好ましい作用剤は、そのような微生物からの馴化培地である。
【００９６】
本実施形態の関連した態様は、対象における胃腸痛の低減又は予防に使用する、本実施形態の選択方法により得られる作用剤を定義する。
【００９７】
特定の実施形態において、作用剤は、対象における胃腸痛の低減又は予防に使用する、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減することが可能である実施形態の選択方法により得られる。
【００９８】
ある実施形態において、胃腸痛を低減又は予防するために、好ましくは、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化に対する作用剤の効果のモニタリングにより評価されている、疼痛シグナル伝達を減少させるように作用する作用剤が選択されるであろう。そのような作用剤は、好ましくは、ＤＲＧニューロン、又は他のＴＲＰＶ１発現細胞若しくは組織におけるＴＲＰＶ１活性化を低減する、又は減少させるように作用するであろう。好ましくは、作用剤は、以前に論じられているようにＴＲＰＶ１受容体を発現する初代細胞及び細胞系を含むが、それらに限定されない様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ系又はモデルを使用して、自発的及び／又は誘導された（例えば、カプサイシン、ｐＨ変化及び／又は加熱による）ＴＲＰＶ１活性を低減するように作用するであろう。
【００９９】
ある実施形態において、好ましくは、腸間膜求心性神経線維束におけるＴＲＰＶ１活性化を低減する、又は減少させるように作用する作用剤が選択されるであろう。作用剤は、腸間膜求心性神経線維束の自発的及び／又は誘導された（例えば、カプサイシン、ｐＨ変化及び／又は加熱による）発火頻度を減少させるように作用するであろう。
【０１００】
本実施形態の方法が、胃腸痛の処置に適切ではない作用剤、例えば、疼痛シグナル伝達の低減に対して有益な効果を有さない作用剤を選択又は同定するために使用できることも、上記から明らかである。特に、このパラメータに対する効果を示さないそのような作用剤は、胃腸痛の低減又は予防に適していないと考えられる。さらに、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性の増加により測定される、疼痛シグナル伝達を増加させる効果を有する作用剤は、胃腸痛の低減又は予防に適していないと考えられる。
【０１０１】
本実施形態のさらなる態様は、本実施形態の方法により選択される作用剤、及び少なくとも１つの追加成分を含む組成物に関する。したがって、少なくとも１つの追加成分は、好ましくは、医薬として許容できる担体、医薬として許容できる希釈剤、医薬として許容できる賦形剤、食料品、栄養補助食品及び別の予防剤又は治療剤からなる群から選択される。
【０１０２】
したがって、ある実施形態は、本実施形態の選択方法により得られる作用剤、及び、医薬として許容できる担体、医薬として許容できる希釈剤、医薬として許容できる賦形剤、食料品、栄養補助食品及び対象における胃腸痛の低減又は予防に使用する、別の予防剤又は治療剤からなる群から選択される、少なくとも１つの追加の成分を含む組成物に関する。
【０１０３】
少なくとも１つの追加成分は、本実施形態に従って選択される作用剤と共に投与され得る、又は別々に投与され得る。さらに、少なくとも１つの追加成分は、本実施形態に従って選択される作用剤と同時に、又は異なる時点で投与され得る。適切な投与レジーム及びタイミングは、当該追加成分に応じて、当業者には容易に判定できる。
【０１０４】
ある実施形態において、少なくとも１つの追加成分は、任意の適切な栄養成分、例えば食料品又は栄養補助食品である。
【０１０５】
ある実施形態において、別の予防剤又は治療剤は、さらに、当該胃腸痛の予防又は低減、例えば処置に有用ないかなる作用剤であってもよい。
【０１０６】
別の実施形態において、別の予防剤又は治療剤は、胃腸運動及び／又は胃腸混合に影響を与えることが可能である作用剤である。次いで、別の予防剤又は治療剤は、好ましくは、胃腸運動及び／又は胃腸混合を調節すること（当業界で公知であるように、及び、以下に記載されているように、処置される状態に応じた増加又は低減）が可能である。
【０１０７】
さらなる実施形態において、本実施形態の作用剤は、２つの機能を有し得る、すなわち、胃腸痛並びに胃腸運動及び／又は胃腸混合の両方に対する機能を有し得る。
【０１０８】
胃腸痛の低減又は予防に有効にする目的で、本実施形態に従って選択される作用剤は、作用剤が、胃腸運動及び／又は胃腸混合の調節にさらに有効かどうかを判定する目的で、別の、又は追加の分析又は選択方法も施してよい。胃腸痛及び運動変化の両方に、連動して対処するため、そのような作用剤は、例えば、運動障害の予防又は処置に使用すると興味深い。運動及び／又は混合を分析する手法は、当業界で公知である。分析されるパラメータは、ＭＭＣ頻度、ＭＭＣ速度、管腔内圧力、例えばＰＰｒ及び他の機能性モデルを含むが、それらに限定されない。
【０１０９】
運動分析において、作用剤により誘導される胃腸運動における変化は、例えば、運動パターン又は収縮振幅の変化として検出できる。一部の作用剤は、効果をまったく有さないであろう。例えば、ＭＭＣ頻度及び／又はＭＭＣ速度及び／又は管腔内圧力、例えばＰＰｒを増加させることにより、胃腸運動を増加させ得る作用剤は、消化管に沿った推進運動の増強に有利と考えられる胃腸痛に関連する障害、例えば便秘及び疝痛の処置に有用な可能性が高いであろう。
【０１１０】
或いは、例えば、処置のために腸運動障害が、腸を介する物質の輸送時間を増加させることが望ましいもの、例えば、迅速な移動輸送を伴う障害、例として、ＩＢＳ又は下痢であり、目的とする作用剤は、胃腸痛の調節に対する効果に加えて、例えば、ＭＭＣ頻度又はＭＭＣ速度又は管腔内圧力、例えばＰＰｒを減少させることによって、胃腸運動を減少させるように作用するであろう。好ましい作用剤は、少なくともＭＭＣ速度を減少させるであろう。好ましい薬剤は、こうしたパラメータの２つ以上を減少させ、例えば、ＭＭＣ速度及びＭＭＣ頻度を減少させ、又はＭＭＣ頻度及び管腔内圧力（例えば、ＰＰｒ）を減少させ、又はＭＭＣ速度及び管腔内圧力（例えば、ＰＰｒ）を減少させる。最も好ましい作用剤は、こうしたパラメータのすべて、例えばＭＭＣ頻度、ＭＭＣ速度及び管腔内圧力（例えば、ＰＰｒ）を減少させるであろう。運動分析は、小腸又は大腸からの適切な胃腸部分、例えば、小腸については空腸部分、大腸については結腸部分で評価され得る。一部の実施形態では、大腸、例えば結腸の部分の使用が好ましい。
【０１１１】
本実施形態のさらなる態様は、本実施形態の方法により選択される作用剤、又は、対象における胃腸痛の低減又は予防に使用する、上記で定義されている組成物に関する。
【０１１２】
本実施形態の関連した態様は、本実施形態の方法により選択される、例えば、本実施形態による選択方法により得られる作用剤、又は、対象における胃腸痛を低減又は予防する薬、食品製品又は栄養補助食品製品を製造するための、上記で定義されている組成物の使用を定義する。
【０１１３】
本実施形態の別の関連した態様は、対象における胃腸痛を低減又は予防する方法を定義する。この方法は、本実施形態の方法により選択される、例えば、本実施形態による選択方法により得られる作用剤、又は上記で定義されている組成物の有効量を対象に投与するステップを含む。
【０１１４】
これらの態様の実施形態において、作用剤は、細菌株、好ましくは乳酸菌株、より好ましくはラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）株であり、例えば、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減することが可能である細菌株、好ましくは自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減することが可能である乳酸菌株、より好ましくは自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減することが可能であるラクトバチルス・ロイテリ株である。
【０１１５】
これらの態様の実施形態では、作用剤は、好ましくはラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８である。他の実施形態では、作用剤は、別の乳酸菌株である、すなわち、作用剤はラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８以外の乳酸菌株、好ましくは、ラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８以外のラクトバチルス・ロイテリ株である。
【０１１６】
これらの態様の実施形態において、作用剤は、細菌株からの馴化培地、好ましくは乳酸菌株からの馴化培地、より好ましくはラクトバチルス・ロイテリ株からの馴化培地であり、例えば、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減することが可能である細菌株からの馴化培地、好ましくは自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減することが可能である乳酸菌株からの馴化培地、より好ましくは自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性化を低減することが可能であるラクトバチルス・ロイテリ株からの馴化培地である。
【０１１７】
ある実施形態において、作用剤は、乳酸菌株からの馴化培地、好ましくはラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８からの馴化培地、又はラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８以外のラクトバチルス・ロイテリ株からの馴化培地である。そのような馴化培地に使用される培地は、当業界で公知の乳酸菌株の培養に適切ないかなる培地であってもよい。ある実施形態において、ＭＲＳ（ｄｅ  Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ＆Ｓｈａｒｐｅ）培地は、乳酸菌株からの馴化培地、好ましくはラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８からの馴化培地を生成するために出発原料として使用される。本発明のある実施形態において、乳酸菌株からの馴化培地、好ましくはラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８からの馴化培地は、組成物に導入される、又は組成物として使用される前に、凍結乾燥される。
【０１１８】
別の実施形態において、乳酸菌株からの馴化培地、好ましくはラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８からの馴化培地の１つ又はいくつかの成分を、単離し、精製及び／又は濃縮した成分として、適切な組成物の形態で対象に投与する。そのような成分の例は、タンパク質、ペプチド、酵素及び他の分子を含み、好ましくは、乳酸菌株から培地へと分泌される。乳酸菌株から直接的に抽出されるそのような成分は、本実施形態に従っても使用できる。
【０１１９】
作用剤又は組成物を投与及び製剤する適切な方式は、疾患の部位に応じて選択される。好ましい方式の投与は、経口投与であるが、同様に一部の処置に関しては、静脈内注射又は筋肉内注射が適切であろう。
【０１２０】
作用剤又は組成物の適切な用量は、処置される障害、投与方式及び関連した製剤に応じて当業者により容易に選択又は決定できる。
【０１２１】
一実施形態において、例えば、胃腸痛に罹患した対象において、ＧＩ管内でＴＲＰＶ１活性化を選択的に調節できる経口投与された乳酸菌を使用し、それによって、前記対象におけるあらゆる副作用を最小限に抑えることにより、ＴＲＰＶ１受容体を局所的に調節する。本実施形態の方法により選択される作用剤、特に乳酸菌株のこの好ましい投与経路は、主に、ＴＲＰＶ１活性化に局所的に、すなわち胃腸系内で影響を与えるであろうと考えられる。その結果、したがって、作用剤は、胃腸系の外側であらゆる望ましくないＴＲＰＶ１調節を最小限に抑えつつ、胃腸痛の予防又は低減に有益な効果を有するであろう。
【０１２２】
本明細書に記載されている実施形態の方法及び使用では、「増加させる」、「減少させる」、「低減させる」などの用語は、レベルの測定可能な変化、好ましくはレベルの有意な変化、より好ましくは、確率値≦０．０５の好ましい統計的に有意な変化を指す。
【０１２３】
好ましい対象は哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１２４】
処置される胃腸痛に関連する腸運動障害が便秘である場合、好ましい対象は高齢患者又は妊婦である。高齢患者は、年齢が７０歳以上の患者であることが一般的に理解されるであろう。
【０１２５】
処置される胃腸痛に関連する腸運動障害が疝痛である場合、好ましくは、疝痛は乳児疝痛である。
【０１２６】
本実施形態の方法に従って選択される作用剤、好ましくは乳酸菌株の使用は、関連する障害又は障害の症状の低減、予防又は緩和（例えば病徴の調節を生じ得る）を含む。それらの障害又は症状のそのような低減、予防又は緩和は、いかなる適切なアッセイによっても測定できる。
【０１２７】
ある実施形態の目的は、自発的及び／又は誘導されたＴＲＰＶ１活性に対する作用剤の効果に基づく、本明細書のモデルを使用することにより、例えば、特定の運動障害及び／又は他の胃腸痛障害／疾患における、胃腸痛の処置、低減、予防又は調節に適している馴化培地に存在する又はそこから抽出される作用剤、例えば乳酸菌を、その一部又は代謝産物を含めて見出すことである。
【０１２８】
ある実施形態において、目的は、ヒト、とりわけ高齢対象又は妊婦の便秘に関連する胃腸痛の予防又は低減に有効になり得るプロバイオティクス細菌株、例えば乳酸菌株を選択することである。
【０１２９】
ある実施形態において、目的は、乳児疝痛に関連する胃腸痛の予防又は低減に有効になり得る作用剤、例えば乳酸菌株を選択することである。
【０１３０】
ある実施形態において、目的は、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）の胃腸痛症状の処置、予防又は低減に有効になり得る作用剤、例えば乳酸菌株を選択することである。
【０１３１】
以下は、本実施形態の一部の例であり、本明細書における実施形態の使用を限定することを意味せず、本発明がどのように使用され得るかについての実用的な例を具体的に示す。例１は、ＤＳＭ１７９３８が腸間膜神経の発火頻度を阻害することを示す、腸間膜神経線維束の実験に関する。例２は、ＤＳＭ１７９３８が、ＤＲＧ初代培養において、カプサイシンに誘導されるカルシウム流入を遮ることを示す。例３は、ＤＳＭ１７９３８が、胃の拡張により誘発される心拍の遅延を阻害することを実証する。
【実施例】
【０１３２】
（例１）
腸間膜神経線維束の実験
細胞外の記録
成体のオスＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（２０〜３０ｇ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から調達した。マウスを頸椎脱臼により屠殺した。その後の手順はすべてｅｘ  ｖｉｖｏであった。
【０１３３】
結合腸間膜組織を伴う遠位空腸（約２．５ｃｍ）部分を、屠殺したばかりのマウスから取り出し、カルボゲン（９５％Ｏ２−５％ＣＯ２）で起泡させたＫｒｅｂｓ緩衝液（ｍＭ単位）（ＮａＣｌが１１８、ＫＣｌが４．８、ＮａＨＣＯ３が２５、ＮａＨ２ＰＯ４が１．０、ＭｇＳＯ４が１．２、グルコースが１１．１及びＣａＣｌ２が２．５）を満たしたＳｙｌｇａｒｄコーティングしたペトリ皿に入れた。各部分の口側末端及び肛門側末端に、プラスチックチューブを用いてカニューレ挿入し、空にした。組織をＳｙｌｇａｒｄにピン留めし、腸間膜神経線維束を曝露した。ペトリ皿を倒立顕微鏡の台に載せ、酸化したＫｒｅｂｓ又は添加剤を含むＫｒｅｂｓを用いて０．５〜１ｍｌ／分で、管腔を重力灌流した（Ｐｅｒｅｚ−Ｂｕｒｇｏｓ  Ａ．、Ｗａｎｇ  Ｂら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１３年；３０４：Ｇ２１１〜２０）。漿膜区画を、事前に温めた（３４℃）Ｋｒｅｂｓを用いて３〜５ｍｌ／分で別々に灌流した。パッチクランプ電極ホルダーに接続したガラスピペットに、神経線維束を静かに引き込み（ＣＶ−７Ｂ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｌａｍｐ７００Ｂ増幅器及びＤｉｇｉｄａｔａ１４４０Ａシグナル変換器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して細胞外神経の記録を行った。電気シグナルは、０．１〜２ｋＨｚでバンドパスフィルタにかけ、２０ｋＨｚで試料を採取し、ｐＣｌａｍｐ１０というソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を動作させてパソコンで保存した。管腔内圧力を２ｈＰａ超に上昇させることにより、部分の拡張を繰り返した。管腔を灌流するＫｒｅｂｓに４８ｈＰａで一定した重力圧力ヘッドを加え、１分間にわたり流出チューブを閉塞することにより圧力を上昇させて、最高で３回連続して拡張させた。部分を、拡張の間９分間にわたりそのままで置いた。管腔内正圧なしで、構成的マルチユニット電気活性を記録した。
【０１３４】
迷走神経切離
横隔膜下迷走神経切離を、以前に記載されているように実行した（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｌｅｉｊ  Ｈ、Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ  Ｃら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ、ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００８年；２９５：Ｒ１１３１〜７）。電気生理学実験のために、空腸及び腸間膜組織を採取する前に、１０〜１４日間にわたりマウスを回復させた。マウス３匹で偽迷走神経切離を行った。手術後、マウスの体重及び全身的な健康を毎日測定した。筆者らは、迷走神経切離したマウス又は偽処置したマウスのいずれにおいても、手術後１週間での体重増加に関する有意差の証拠を見出せなかった（データは示されていない）。各実験後に、コレシストキニン（ＣＣＫ）の漿膜への適用に対する反応を記録することにより、迷走神経切離したすべてのマウスで手順の完全性について試験した。ＣＣＫが腸間膜神経の発火率を上昇させなかった場合は、迷走神経切離を有効と見なすにとどめた（Ｐｅｒｅｚ−Ｂｕｒｇｏｓ  Ａ．、Ｗａｎｇ  Ｂら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１３年；３０４：Ｇ２１１〜２０）。
【０１３５】
薬剤及び細菌
ＤＳＭ１７９３８がＢｉｏＧａｉａ  ＡＢ（Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）により提供され、一方で、ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）のＢｒｉａｎ−Ｂｏｄｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの株からラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＪＢ−１を得た。すべての手順は、以前に報告されている通りであった（Ｋｕｎｚｅ  ＷＡ、Ｍａｏ  ＹＫ  ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００９年；１３：２２６１〜７０、Ｍａ  Ｘ、Ｍａｏ  ＹＫ  ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００９年；２９６：Ｇ８６８〜７５、Ｗａｎｇ  Ｂ、Ｍａｏ  ＹＫ、ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１０年；２４：４０７８〜８８）。細菌の数を光学的に測定し、増殖培地の寒天平板に載せた後、生存能力を確認した。冷凍株からの細菌を解凍し、２０００ｒｐｍで１５分間にわたり遠心分離し、ペレットをＫｒｅｂｓに懸濁し、再度遠心分離し、再懸濁した。使用する前に、Ｋｒｅｂｓを用いて細菌を作用濃度に希釈した。硫酸化コレシストキニン（２５−３３）（ＣＣＫ）はＡｎａＳｐｅｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）から得た；ニカルジピン、カプサイシン及び６−ヨードノルジヒドロカプサイシンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから、ω−コノトキシンＧＶＩＡ（ω−Ｃｇ−ＧＶＩＡ）及びω−コノトキシンＭＶＩＩＣ（ω−Ｃｇ−ＭＶＩＩＣ）はＡｌｏｍｏｎｅ  Ｌａｂｓ（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）から得た。６−ヨードノルジヒドロカプサイシン及びＣＣＫをＤＭＳＯに溶解させ；カプサイシンはエタノールに溶解して、ストック溶液のアリコートを作った。実験日に、アリコートをＫｒｅｂｓで、最終ＤＭＳＯ及びエタノール濃度、それぞれ≦０．０１％及び≦０．１％の作用濃度まで希釈した。
【０１３６】
オフラインデータ分析
Ｃｌａｍｐｆｉｔ１０．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）及びＯｒｉｇｉｎ８．５（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）ソフトウェアを使用して、マルチ及び単一ユニットの自発発火頻度を測定した。腸を様々な刺激又は薬理学的作用剤に曝露することにより誘導される腸間膜神経線維の発火率の変化を判定するために、マルチ及び単一ユニットスパイクの記録を慣例的に使用した（Ｐｅｒｅｚ−Ｂｕｒｇｏｓ  Ａ．、Ｗａｎｇ  Ｂら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１３年；３０４：Ｇ２１１〜２０）。マルチユニットにおけるスパイクのタイミングの記録は、Ｃｌａｍｐｆｉｔのピーク検出モジュールを使用して判定し、スパイク間の間隔から平均発火頻度を計算した。Ｃｌａｍｐｆｉｔのスパイク形状テンプレート検出ツール（コンピュータ化した波形分析）を使用したスパイク形状の一致により、マルチユニットシグナルからシングルユニットを抽出した。テンプレート検出アルゴリズムの実行後、視覚的検査により単一ユニットスパイクの識別を常に確認し、一致しないスパイク事象は破棄した（＜０．２％）（Ｐｅｒｅｚ−Ｂｕｒｇｏｓ  Ａ．、Ｗａｎｇ  Ｂら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１３年；３０４：Ｇ２１１〜２０）。
【０１３７】
統計値
データは、平均±ＳＥとして表現し、Ｎは記録した空腸部分の合計数を指し、ｎはマルチユニットの記録から抽出された単線維活性の数を指す。筆者らは、各マルチユニットの記録から、最高で６つの単一ユニットを抽出した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ又は対応のないｔ検定を、対応のある又は対応のないデータ比較にそれぞれ使用した；一元配置及び二元配置ＡＮＯＶＡとＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉのポストホック検定を使用して、複数の群を適切に比較した。マルチユニット神経活動において、一方の調製物及び別の調製物の間に、自発的活性における大規模な変化が発生し得るため、各神経線維束を自らを対照として、処置記録が行われる前後で比較を対にして、各処置又は薬剤用量における有意な変化が確実にさせた。ベースライン頻度を超える発火の増加百分率をカプサイシン濃度（細菌の有無を問わず）に対してプロットし、これをロジスティック用量反応方程式に一致させた［Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ／１＋１０ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）］。追加二乗和Ｆ検定を使用して、ロジスティックフィットを記載するパラメータを比較した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、すべての統計検定を行った。
【０１３８】
腸間膜神経の自発発火頻度に対するＤＳＭ１７９３８の効果
管腔内ＤＳＭ１７９３８は、腸間膜神経の自発的マルチユニットの放電に影響を与えた（Ｐｅｒｅｚ−Ｂｕｒｇｏｓ  Ａ．、Ｗａｎｇ  Ｂ  ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１３年；３０４：Ｇ２１１〜２０）。１×１０９ｃｆｕ／ｍｌの管腔内ＤＳＭ１７９３８は、自発的マルチユニット発火頻度を３６．３±８．４から２８．２±７．２Ｈｚへと、２２％の減少を引き起こした（Ｎ＝７、Ｐ＝０．０２、図１Ａ）；１×１０８ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８は、自発的放電を２１．６±５．１から１７．６±６Ｈｚへと１９％変化させた、Ｎ＝６、Ｐ＝０．０９、図１Ｂ）。ＤＳＭ１７９３８馴化培地（１：５）も自発的放電を２２．６±４．２から１４．１７±２．４Ｈｚへと３７％減少させた（Ｎ＝７、Ｐ＝０．０３、図１Ｃ）。しかし、γ−照射で殺菌したＤＳＭ１７９３８又はブロス単体は、求心性興奮性が減少しなかった：それぞれ１７．８４±５．３から１８．２５±４．１Ｈｚ（Ｎ＝６、Ｐ＝０．８４）、２０．４８±１．６から２１．４９±２．８Ｈｚ（Ｎ＝６、Ｐ＝０．１０）（図１Ｄ〜Ｅ）。
【０１３９】
迷走神経切離及び筋肉麻痺は、ＤＳＭ１７９３８が腸間膜神経の自発発火を低減することを阻害しなかった
筆者らは、自発的放電に対する１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８の効果は、先の迷走神経切離により否定されるかどうかを検査した。ＤＳＭ１７９３８の平滑筋細胞に対する有望な直接作用を制御するために、筆者らは、ここで、及び後続の自発発火の実験すべてに、筋肉収縮を阻害するＬ−型Ｃａ２＋チャネル遮断薬であるニカルジピン（３μＭ）を加えた。かくして、迷走神経を切離した後及びニカルジピンを加えた後で、ＤＳＭ１７９３８は、マルチユニット発火頻度を、１６．７２±１．９から１３．７７±１．９Ｈｚへと１８％低下させた（Ｎ＝１７、Ｐ＝０．００１、図２Ａ、２Ｃ）。次いで、迷走神経を切離したマウス及び麻痺させた筋肉からのデータを、単一ユニット発火率について分析した。ＤＳＭ１７９３８は、単一ユニット発火頻度を０．３６±０．０５から０．２９±０．０３Ｈｚへと１９％低下させ（ｎ＝３０、Ｐ＝０．０２、図２Ｂ、２Ｃ）；これらの線維のうち、大部分（２０／３０）が、頻度を０．４２±０．０６から０．２７±０．０４Ｈｚ（Ｐ＜０．０００１）へと３６％の減少を示したが、残りのわずかな線維は、発火率が０．２４±０．０４から０．３１±０．０６Ｈｚ（ｎ＝１０／３０、Ｐ＝０．００６）へと２９％上昇した。
【０１４０】
ＤＳＭ１７９３８は、ＴＲＰＶ１受容体の克服できない部分的拮抗作用により、脊髄単一ユニット発火頻度及びカプサイシンに対する反応を減少させた
筆者らは、ＤＳＭ１７９３８が、迷走神経切離したマウスから事前に採取された組織における単一ユニット興奮における、カプサイシンにより誘導された発火頻度の増加を変更できるかどうかを試験した。漿膜区画に適用されたカプサイシンは、約６０ｓの発現潜伏期間及び用量依存手段で、自発的マルチユニット及び単一ユニット発火率を上昇させた。ＴＲＰＶ１カプサイシン感受性受容体が脱感作し、及び後続の作動薬の適用が減少させる効果を向上し得ると考え、筆者らは、個々の空腸部分における一定範囲のカプサイシン用量（１００ｎＭ〜１００μＭ）に対する反応を調査した。筆者らは、２０分間にわたり１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８を管腔内に事前に適用し又は適用せずに、これを行った（各曲線にＮ＝２５、各濃度に対して５つの部分；各部分に対して、約６つの脊髄単一ユニットを分析した）。発火頻度の増加百分率対カプサイシン濃度又はカプサイシンとＤＳＭ１７９３８濃度の増加をプロットし、Ｙ＝Ｂｏｔｔｏｍ＋（Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）の形態の３パラメータロジスティック方程式に一致させた。ＤＳＭ１７９３８の存在下におけるカプサイシンの５００ｎＭに対して、カプサイシン単体のＥＣ５０は２００ｎＭであった（Ｐ＝０．７１）。最大反応（Ｔｏｐ）は、カプサイシンを用いて得られた２３８．４±２７．５％対カプサイシンとＤＳＭ１７９３８を用いて得られた１２９±１７％（Ｐ＝０．００４、図３Ａ）であった。以前の報告に一致して、一部の脊髄線維は、カプサイシンにより興奮しなかった。筆者らは、カプサイシンが脊髄線維を直接的に興奮させた場合に、興奮が、腸のニューロンから神経節内螺旋神経束への壁内シナプス伝達に依存するか否かを検査した。筆者らは、Ｃａ２＋遮断薬ω−Ｃｇ−ＧＶＩＡ及びω−Ｃｇ−ＭＶＩＩＣのそれぞれ５００ｎＭを加えることにより、壁内シナプス伝達が遮断された後でカプサイシン１μＭを漿膜区画に加えた。壁内シナプス遮断により、カプサイシンにより誘発される興奮は減らず、コノトキシンなしで１８７．５±４２．９％（ｎ＝１７）、及びコノトキシンが存在して２１９．１±７２．６（ｎ＝１２）であった（Ｐ＝０．９４７、図３Ｂ）。筆者らは、ＤＳＭ１７９３８の脊髄求心性神経に対する作用は、壁内シナプス伝達に関与しないと結論付けた。
【０１４１】
ＤＳＭ１７９３８細菌放出生成物を含有するＤＳＭ１７９３８馴化培地の作用により、脊髄線維に対するカプサイシン作用が低減された
筆者らは、ＤＳＭ１７９３８の細菌生成物が、腸間膜求心性神経に対するＴＲＰＶ１拮抗作用の根底にあるかどうかを試験した。ＤＳＭ１７９３８により誘導される自発発火頻度の低減の百分率は、事前に迷走神経切離を行っていようといまいときわめて類似していた（それぞれ１８％対２２％）ことを考えると、腸間膜求心性神経におけるＤＳＭ１７９３８の標的は、主に、脊髄線維である；次いで、筆者らは、事前に管腔内にＤＳＭ１７９３８馴化培地を２０分間にわたり適用した、迷走神経切離をしていない腸間膜線維中に１μＭのカプサイシンを適用した。ＤＳＭ１７９３８馴化培地（１：５）は、腸間膜の単一線維における、カプサイシンにより誘導される発火頻度の増加（％）を、１８７．５±４３％（対照群、Ｎ＝１７）から７４．８９±２２％（Ｎ＝１４）へと阻害し、１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８処置を用いて、脊髄線維に対してカプサイシンで誘導される増加の割合は同様であった（８０．２９±２２％、Ｎ＝１７）（Ｐ＝０．０２、１要因ＡＮＯＶＡ試験；図７）。
【０１４２】
ＤＳＭ１７９３８又はＴＲＰＶ１拮抗作用は、拡張誘発性発火を減少させた
筆者らは、筋肉収縮を起こさせためにニカルジピンなしで、侵害受容器と推定される線維のマルチユニット及び単一ユニット発火頻度を記録した（Ｇｒｕｎｄｙ  Ｄ、Ｇｕｔ、２００４年；５３、Ｓｕｐｐｌ２：ｉｉ５〜８）。筆者らは、ＤＳＭ１７９３８が、４８ｈＰａ（３６ｍｍＨｇ）の侵害強度まで管腔内圧力を上昇することにより誘発される興奮反応を低減できるかどうかを試験した（Ｐｅｒｅｚ−Ｂｕｒｇｏｓ  Ａ．、Ｗａｎｇ  Ｂ  ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１３年；３０４：Ｇ２１１〜２０）。腸の拡張に対する、こうした線維の最初の反応は、一般的に、後続の拡張により得られる反応より高いが、３回までのさらなる拡張は一定のまま留まる（Ｐｅｒｅｚ−Ｂｕｒｇｏｓ  Ａ．、Ｗａｎｇ  Ｂ  ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２０１３年；３０４：Ｇ２１１〜２０）。したがって、筆者らは、比較のために３回の連続拡張のうち２回目を使用した。マルチユニット発火は拡張中には１１１．５±１６．７Ｈｚであったが、ＤＳＭ１７９３８を２０分間にわたり加えた後では、拡張により発火はわずか８６．５±１０．６Ｈｚ（Ｎ＝５、Ｐ＝０．３１）に向上した。脊髄単一ユニット発火頻度は、拡張中には３．０１±０．４４Ｈｚであったが、ＤＳＭ１７９３８の存在下では、拡張中に発火は１．７１±０．１６（ｎ＝２８、Ｐ＝０．００８、図４Ａ）であった。先の拡張の発火頻度は、対照対加えられたＤＳＭ１７９３８の、０．３１±０．０５対０．２５±０．０７Ｈｚ（ｎ＝２８、Ｐ＝０．０５３、図４Ａ）であった。ＴＲＰＶ１拮抗薬である６−ヨードノルジヒドロカプサイシン（１０μＭ）は、拡張への反応を、３．２６±０．７３から２．２３±０．５０Ｈｚ（ｎ＝１３、Ｐ＝０．０００２、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定、図４Ｂニカルジピンなし）へと減少することで、ＤＳＭ１７９３８の単一ユニット反応に対する効果を模倣した。
【０１４３】
（例２）
ＤＳＭ１７９３８は、ＤＲＧニューロン初代培養物中のカプサイシンにより誘導されるＣａ２＋上昇をブロックした
後根神経節（ＤＲＧ）初代培養物
脊柱を体から取り出し、氷冷したＫｒｅｂｓを含有するビーカーに移し、縦に分割した。ＤＲＧを曝露し、胸腰部の位置から収集した。無菌Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地（ＧＩＢＣＯ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて、ＤＲＧ全体を２回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼタイプ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）、Ｌ−１５  ２０ｍｌ中のトリプシン（０．２５％、ＧＩＢＣＯ）０．５ｍｌ中にて、３７℃で４０分間にわたりインキュベートした。１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ）を含有するＬ−１５  ５ｍｌをさらに加えた後で、神経節を５分間にわたり１，０００ｒｐｍで遠心分離し、次いで、増殖培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１％ＨＥＰＥＳ及び１％ピルビン酸Ｎａを含有するＬ−１５）を用いて２回洗浄した。ＤＲＧを増殖培地２ｍｌに入れ、１０回すり潰した。次いで、神経節を５００ｒｐｍで１０秒間、遠心分離し、上澄みを無菌チューブに移した。これらを増殖培地２ｍｌ中に再懸濁し、移された上澄みの体積が１０ｍｌになるまで繰り返しすり潰し、５分間にわたり１，０００ｒｐｍで遠心分離し、最終沈殿物を増殖培地３ｍｌ中で再懸濁した。ニューロンを、ポリ−ｄ−リシン（ＭａｔＴｅｋ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）でコーティングしたガラス底ペトリ皿３枚に置いた。３０分後に、各皿に、追加の１．５ｍｌの増殖培地を加え、カルボゲンを用いて２４時間にわたり３７℃で全体をインキュベートした。
【０１４４】
Ｃａ２＋の撮像
プレキシガラスの記録用皿内にＤＲＧニューロンを入れ、０．１％プルロン酸（ＤＭＳＯ中）を含むＫｒｅｂｓで希釈したＣａ２＋標識Ｆｌｕｏ−４−ＡＭ（８μＭ）を３７℃で６０分間にわたり加えた。皿を、記録区画に入れ、新しいＫｒｅｂｓ（約３４℃）を用いて１５分間にわたり灌流して、色素を洗い落とした。倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｓ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）で細胞を観察し、Ｒｏｌｅｒａ−ＸＲカメラ（Ｓｕｒｒｅｙ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用して撮像した。Ｓｉｍｐｌｅ  ＰＣＩ６ソフトウェア（Ｃｏｍｐｉｘ  Ｉｎｃ、Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｅｗｉｃｋｌｅｙ、ＰＡ）を使用して個々のニューロンにおける蛍光強度を記録した。＜１００μｍのチップを有する、電子制御された圧力パルスパファー（Ｐｉｃｏｓｐｒｉｔｚｅｒ  ＩＩ；Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖａｌｖｅ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＮＪ）に接続されたマイクロピペットを経由して細胞から薬剤を送達した。０．９フレーム／秒で記録した画像をローカルハードドライブに保存した。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＮＩＨ、ＵＳＡ、ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）を使用して、画像ファイルをオフラインで分析した。カプサイシンを適用した場合のＦｌｕｏ−４Ｃａ２＋の増加は、カプサイシン適用後の蛍光強度（Ｆ）をカプサイシン適用前の蛍光強度（Ｆ０）で割った比（Ｆ／Ｆ０）として測定した。細菌及び薬剤は、例１と同様に取り扱った。
【０１４５】
結果
脊髄ニューロンに対するＤＳＭ１７９３８の効果の特異性を、ＴＲＰＶ１受容体作動薬であるカプサイシンの反応を阻害する細菌の能力を試験することにより、さらに調べた。これらの実験には、ＪＢ−１も含まれた。ＪＢ−１（ラクトバチルス・ラムノサス）は、胃の拡張により誘導される疼痛及びＤＲＧ単一線維の発火放電を低減することが以前に示されている（Ｄｕｎｃｋｅｒら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、２０１１年）。ＴＲＰＶ１チャネルが開口すると、細胞内のＣａ２＋濃度が上昇するので、これらの実験に対して、筆者らは、ＤＲＧニューロン初代培養物のＣａ２＋撮像を使用した。カプサイシン１μＭをＤＲＧニューロンに吹き付けると、約３０秒以内に細胞内のＣａ２＋増加が誘発された（図５Ａ）。ＴＲＰＶ１チャネルは、反復されるリガンド曝露は脱感作し得るので、筆者らは、カプサイシンを各培養皿に１回のみ適用した。次いで、筆者らは、カプサイシンを適用する前に、ＤＳＭ１７９３８又はＪＢ−１のいずれかを３０分間加えた。１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８は、Ｆ／Ｆ０の蛍光性上昇率を２．３６±０．３１（対照群、Ｎ＝１４）から１．２５±０．０４に減少させた。しかし、１×１０８ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８は、Ｆ／Ｆ０を２．６７±０．３５に変化させ、１×１０８．５ｃｆｕ／ｍｌのＤＳＭ１７９３８は２．０７±０．２７に変化させた。１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのＪＢ−１を加えると、効果はほとんどなく、Ｆ／Ｆ０比は２．４８±０．１９（Ｎ＝９）に変化し、この比は、カプサイシン単体を用いて得られる比と同様である（図５Ｂ）。これらの結果により、ＤＳＭ１７９３８は、ＤＲＧニューロン初代培養物中のカプサイシンにより誘導されるＣａ２＋上昇を遮ることができると実証される。
【０１４６】
（例３）
ＤＳＭ１７９３８は、胃の拡張により誘発される心拍遅延を阻害した
合計１７匹のラットを２群に割り付けた。到着後、ラットを１週間にわたり順応させ、その後１週間にわたり、実験中のストレスの影響を最小限にするように取り扱った（１０分／日）。０．２ｍｌ（１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ）のＫｒｅｂｓ中の生きたＤＳＭ１７９３８又は対照としてＫｒｅｂｓのみ（ビヒクル）のいずれかで、ラットを９日間にわたり毎朝強制飼養した。ＧＤの方法は、以前に発表されている（Ｔｏｕｇａｓ、Ｗａｎｇ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９９９年；２７７：Ｒ２７２〜８）。簡潔には、ラットを終夜絶食させ、塩酸ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ重量）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ重量）の混合物を用いて腹腔内麻酔をかけた。必要に応じて追加の麻酔をかけた。正中開腹術の後で、テフロン（登録商標）カテーテル（２０ｃｍ）に取り付けたボール形状の胃バルーン（２ｃｍ内径）からなる拡張装置を、近位十二指腸の小さい切開を通して、胃に挿入し、圧調節器系（Ｄｉｓｔｅｎｄｅｒ、Ｇ＆Ｊ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａｄａ）につなげた。４０及び６０ｍｍＨｇの圧力まで６０秒間にわたり空気でバルーンを膨らませながら、心臓の反応を測定した。１０分間の安静により、各拡張の後に回復させた。１セットの拡張のみを各ラットに適用して、考えられる補償機構を避け、測定後、意識を回復する前にラットを屠殺した。左右の肩及び右後肢に適用される３本の針電極からなる体表面心電図により、心拍の連続した記録を行った。シグナルを増幅させ、商用のデータ獲得プログラム（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｒ’ｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ，  ＤａｔａＷａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｏｖｅｌａｎｄ、ＣＯ）を使用してパソコンで記録した。各拡張の前、最中及び後で心拍を６０秒間、合計１８０秒にわたり測定した。各拡張の前の心拍（ＨＲ）の記録により、麻酔量の変化のため考えられるベースラインの変化が修正され、拡張に結び付き得るあらゆる心拍反応が確保される。長期間にわたってＧＤの効果を制御するため、拡張中に、１０秒間にわたり記録されている平均ＨＲを使用して安静時のＨＲ（１００％＝安静）からの変化の平均としてデータを提示する（１０、２０、３０、４０、５０及び６０秒）。各拡張中（４０及び６０ｍｍＨｇ）の６０秒間における、同一群の全ラットでのＨＲ変化の平均（安静時のＨＲの割合）を使用して、群を比較した。細菌及び薬剤を例１のように取り扱った。
【０１４７】
結果
４０ｍｍＨｇにより誘発された心拍の減少は、ＤＳＭ１７９３８の強制飼養により変化しなかった（Ｐ＝０．１２１、図６Ａ）（ビヒクル及びＤＳＭ１７９３８を用いて、それぞれＮ＝８及び９）。拡張中に３０秒にわたり持続した心拍が、６０ｍｍＨｇで膨らませると心拍が１０秒以内に減少した（図６Ｂ）。試験の前に、９日間にわたりＤＳＭ１７９３８を用いて強制飼養すると、６０ｍｍＨｇに対する反応は弱まった（Ｐ＝０．０２８、不対ｔ−試験、図６Ａ、６Ｂ）。４０又は６０ｍｍＨｇ（データは示されていない）の胃の拡張圧力に対して、胃の伸展性（体積／圧力）は、ビヒクル又はＤＳＭ１７９３８で処置したマウスの間で異なっていなかった。これらの結果から、細菌による抗侵害効果が実証される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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