(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離ペプチドの集団を含む組成物であって、該集団が３種類以上のペプチドを含み、該組成物内の各ペプチドが、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列もしくはその断片であって、該断片が、少なくとも１５アミノ酸を含み、かつ該配列中、Ｘ５が、ＶもしくはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ７が、Ｇ、Ｉ、もしくはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１が、Ｅ、Ｎ、もしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１８が、ＤもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１が、Ｒ、Ｄ、もしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２５が、Ｑ、Ｄ、もしくはＥからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２８が、ＥもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ３１が、ＬもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ４５が、ＫもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ４８が、ＦもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ５１が、ＤもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ５４が、ＥもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ５７が、ＳもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ６０が、ＦもしくはＷからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ６３が、ＩもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ６６が、ＱもしくはＤからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列、
（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列もしくはその断片であって、該断片が、少なくとも１５アミノ酸を含み、かつ該配列中、Ｘ５が、ＳもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ９が、ＦもしくはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１３が、ＲもしくはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１６が、ＷもしくはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１８が、ＳもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２２が、ＫもしくはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２７が、ＮもしくはＤからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列もしくはその断片であって、該断片が、少なくとも１５アミノ酸を含み、かつ該配列中、Ｘ９が、Ｉ、Ｐ、もしくはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１７が、Ｉ、Ｗ、もしくはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１が、Ｒ、Ｄ、もしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２８が、ＥもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ３１が、ＬもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列もしくはその断片であって、該断片が、少なくとも１５アミノ酸を含み、かつ該配列中、Ｘ３が、Ｌ、Ｖ、もしくはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ７が、Ｋ、Ｎ、もしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１が、Ｒ、Ｄ、もしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１５が、Ｅ、Ｎ、もしくはＱからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｖｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列もしくはその断片であって、該断片が、少なくとも１５アミノ酸を含み、かつ該配列中、Ｘ６が、ＫもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ９が、ＦもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１２が、ＤもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１５が、ＥもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１８が、ＳもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１が、ＦもしくはＷからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２４が、ＩもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２７が、ＱもしくはＤからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｖｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列もしくはその断片であって、該断片が、少なくとも１５アミノ酸を含み、かつ該配列中、Ｘ２が、ＩもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１０が、ＳもしくはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２３が、ＥもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｖｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列もしくはその断片であって、該断片が、少なくとも１５アミノ酸を含み、かつ該配列中、Ｘ１０が、Ｖ、Ｌ、もしくはＩからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１が、ＡもしくはＬからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、または
（ｉｘ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列もしくはその断片であって、該断片が、少なくとも１５アミノ酸を含み、かつ該配列中、Ｘ５が、ＶもしくはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ７が、Ｇ、Ｉ、もしくはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１が、Ｅ、Ｎ、もしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１が、Ｒ、Ｄ、もしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２５が、Ｑ、Ｄ、もしくはＥからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２８が、ＥもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ３１が、ＬもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
からなる、前記組成物。
【請求項２】
前記ペプチドの１つまたは複数が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、酵素、または金属ナノ物質にコンジュゲートしている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドの１つまたは複数が、ウシ血清アルブミンにコンジュゲートしている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチド集団が、固体支持体に固定化されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記固体支持体が、複数のビーズ、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具の流路、マイクロタイタープレートのウェル、またはローターの流路である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記断片が、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０アミノ酸長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
アナプラズマ菌種、エーリキア菌種、および／またはボレリア菌種に由来する１つまたは複数の抗原ペプチドを更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチド集団を少なくとも２種類含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ペプチドの少なくとも１つが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドの少なくとも１つが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列からなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドの少なくとも１つが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列からなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドの少なくとも１つが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列からなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
サンプルにおける、アナプラズマ抗原のエピトープに対する抗体の検出方法であって、
サンプルを請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程と、
該組成物中の１つまたは複数のペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出する工程とを含み、該複合体の形成によって、アナプラズマ抗原のエピトープに対する抗体が前記サンプル中に存在することが示される、前記方法。
【請求項１４】
前記アナプラズマ抗原が、アナプラズマ・ファゴサイトフィラム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、アナプラズマ・プラティス（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｌａｔｙｓ）、またはアナプラズマ・マージナーレ（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｍａｒｇｉｎａｌｅ）に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
単離ペプチドの前記組成物が、固体支持体に固定化されている、請求項１３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記固体支持体が、複数のビーズ、ラテラルフローアッセイ用器具の流路、マイクロタイタープレートのウェル、またはローターの流路である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出工程が、（ｉ）ＥＬＩＳＡアッセイを行うこと、（ｉｉ）ラテラルフローアッセイを行うこと、（ｉｉｉ）凝集アッセイを行うこと、（ｉｖ）ウエスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロットを行うこと、（ｖ）波長シフトアッセイを行うこと、（ｖｉ）間接蛍光抗体検査を行うこと、または（ｖｉｉ）前記サンプルを分析もしくは遠心分離ローターにかけることを含む、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが、ヒト、イヌ、またはネコの対象から採ったものである、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、血液、血清、血漿、脳脊髄液、組織抽出液、尿、または唾液サンプルである、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
非ヒト対象におけるアナプラズマ病の診断方法であって、
非ヒト対象から採ったサンプルを、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程と、
該組成物中の１つまたは複数のペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出する工程と、
を含み、
該複合体の形成によって、前記非ヒト対象がアナプラズマ病であることが示される、前記方法。
【請求項２１】
前記非ヒト対象が、イヌ、またはネコである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ヒト対象におけるアナプラズマ病を検査するための方法であって、
ヒト対象から採ったサンプルを、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程と、
該組成物中の１つまたは複数のペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出する工程と、
を含み、
該複合体の形成によって、前記ヒト対象がアナプラズマ病であることが示される、前記方法。
【請求項２３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物と、該組成物中の１つまたは複数のペプチドのエピトープを認識する抗体に結合できる標識試薬とを含むキット。
【請求項２４】
前記組成物中の前記ペプチドが、固体支持体に結合または固定化されている、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記標識試薬が、検出可能な標識にコンジュゲートしている抗ヒト、抗イヌ、または抗ネコＩｇＧまたはＩｇＭ抗体である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
前記検出可能な標識が、酵素、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、または着色ラテックス粒子である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記標識試薬が、検出可能な標識にコンジュゲートしているプロテインＡ、プロテインＧ、および／またはプロテインＡ／Ｇ融合タンパク質である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２８】
前記検出可能な標識が、酵素、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、または着色ラテックス粒子である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
対象が感染しているアナプラズマの菌種の同定方法であって、
（ａ）対象から採ったサンプルを、第１の単離ペプチド集団と第２の単離ペプチド集団とに接触させる工程であって、第１の単離ペプチド集団が、請求項１の（ｉ）からなるペプチドを含む請求項１に記載の単離ペプチド集団であり、第２の単離ペプチド集団が、請求項１に記載の（ｉｉ）〜（ｉｘ）からなるペプチドを少なくとも１つ含む請求項１に記載の単離ペプチド集団であり、第１の単離ペプチド集団が、複数のアナプラズマの菌種に由来する抗原に対する抗体に特異的に結合し、第２の単離ペプチド集団が、単一のアナプラズマの菌種に由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する、工程と、
（ｂ）第１の集団中の１つまたは複数のペプチドを含む第１の抗体・ペプチド複合体の形成を検出する工程と、
（ｃ）第２の集団中の１つまたは複数のペプチドを含む第２の抗体・ペプチド複合体形成を検出する工程とを含み、第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成によって、第２の単離ペプチド集団が特異的に結合する前記アナプラズマの菌種に前記対象が感染していることが示される、前記方法。
【請求項３０】
第１の単離ペプチド集団が、Ａ．ファゴサイトフィラムおよびＡ．プラティスに由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第１の単離ペプチド集団内の各ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３からなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第２の単離ペプチド集団が、Ａ．プラティスに由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
第２の単離ペプチド集団内の各ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７からなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成によって、前記対象がＡ．プラティスに感染していることが示される、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
第１の抗体・ペプチド複合体は形成されるが、第２の抗体・ペプチド複合体は形成されないことによって、前記対象がＡ．ファゴサイトフィラムに感染していることが示される、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
対象が感染しているアナプラズマの菌種の同定方法であって、
（ａ）対象から採ったサンプルを、第１の単離ペプチド集団と、単一のアナプラズマ菌種の細胞抽出物とに接触させる工程であって、第１の単離ペプチド集団が、請求項１の（ｉ）からなるペプチドを含む請求項１に記載の単離ペプチド集団であり、第１の単離ペプチド集団が、複数のアナプラズマの菌種に由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する、工程と、
（ｂ）前記第１の集団中の１つまたは複数のペプチドを含む第１の抗体・ペプチド複合体の形成を検出する工程と、
（ｃ）前記細胞抽出物中の１つまたは複数の成分を含む抗体・細胞抽出物複合体の形成を検出する工程とを含み、第１の抗体・ペプチド複合体と該抗体・細胞抽出物複合体の両方の形成によって、該細胞抽出物を産生したアナプラズマの菌種に前記対象が感染していることが示される、前記方法。
【請求項３７】
第１の単離ペプチド集団が、Ａ．ファゴサイトフィラムとＡ．プラティスに由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
第１の単離ペプチド集団内の各ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３からなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞抽出物がＡ．ファゴサイトフィラムに由来するものである、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ペプチド集団が、金属ナノ層を通じて固体支持体に固定化されている、請求項４に記載の組成物。
【請求項４１】
単離ペプチドの前記組成物が、金属ナノ層を通じて固体支持体に固定化されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物中の前記ペプチドが、金属ナノ層を通じて固体支持体に固定化されている、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１４年１月２１日に出願した米国仮出願番号６１／９２９，６５５と、２０１４年１０月１０日に出願した米国出願番号１４／５１１，９１６に基づく利益を主張するものであり、これらの出願はいずれも、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
電子的に提出したテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出したテキストファイル（配列表のコンピューター可読形式のコピー（ファイル名：ＡＢＡＸ＿０４１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１５年１月２０日、ファイルサイズ：２６３キロバイト））の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）は、脊椎動物宿主の顆粒球、血小板、および赤血球に感染できる偏性細胞内病原体であるグラム陰性菌の１属である。アナプラズマという細菌は、媒介節足動物、特に各種のダニを通じて宿主に伝染する。Ａ．ファゴサイトフィラム（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）は、ヒトを含む哺乳動物において、好中球に感染してアナプラズマ病を発症させる。ヒト顆粒球アナプラズマ病（ＨＧＡ、以前はヒト顆粒球エールリヒア症として知られていた）の発症は、２０００年の１００万人当たり１．４件から、２０１０年には１００万人当たり６．１件へと着実に増えている。Ａ．ファゴサイトフィラムは主に、マダニ属種によって伝染する。これらのマダニ属種は、ボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）（ライム病の病原菌）も伝染させるので、Ａ．ファゴサイトフィラムとＢ．バーグドルフェリの同時感染が一般的である。
【０００４】
Ａ．プラティス（ｐｌａｔｙｓ）は、血小板に感染することによって感染性周期性血小板減少症を発症させ、コイタマダニ属種とカクマダニ属種によって伝染すると考えられている。イヌは、Ａ．プラティス感染の最も一般的な宿主であるが、ネコ、インパラ、およびヒツジを含む他の哺乳動物での感染も報告されている。伝染媒介体が共通するので、Ａ．プラティスとエーリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｃａｎｉｓ）の同時感染が生じることが知られている。
【０００５】
典型的には、アナプラズマへの感染を検出するには、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）と酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が用いられている。これらのアッセイは、対象の血液、血漿、または血清から得た抗アナプラズマ抗体の、感染細胞、細胞溶解液、または部分精製アナプラズマ全タンパク質への結合を検出する。しかしながら、抗アナプラズマ抗体を検出するためのこれらのアッセイは、これらの検査で用いるアナプラズマ抗原の性質に直接関連する感度と特異性の問題により、有用性の面で限界がある。特異性と感度が向上した、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく検査が開発されているが、当該技術分野では、アナプラズマ抗原を検出するための更に感度と特異性の高いアッセイと、アナプラズマ病の血清学的診断法に対するニーズが依然として存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、部分的には、アナプラズマ外膜タンパク質の断片の特定の配列変異体が、アナプラズマの菌種に対する抗体反応を頑強に検出するという発見に基づく。したがって、本発明は、アナプラズマ抗原に結合する抗体の検出と、アナプラズマ病の診断とに有用な組成物、器具、方法、およびキットを提供する。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、アナプラズマ抗原を認識する抗体に結合できるペプチド集団を提供する。特定の実施形態では、その単離ペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000002
というＡｂａｘｉｓ  ＩＤ２の配列またはその断片を含み、その配列中、Ｘ９は、Ｉ、Ｐ、またはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１７は、Ｉ、Ｗ、またはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１は、Ｒ、Ｄ、またはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２８は、ＥまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ３１は、ＬまたはＶからなる群から選択したアミノ酸である。別の実施形態では、集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000003
というＡｂａｘｉｓ  ＩＤ３の配列またはその断片を含み、その配列中、Ｘ３は、Ｌ、Ｖ、またはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ７は、Ｋ、Ｎ、またはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１は、Ｒ、Ｄ、またはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１５は、Ｅ、Ｎ、またはＱからなる群から選択したアミノ酸である。
【０００８】
本発明の別の実施形態では、集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000004
というＡＰＬ−ＩＤ１の配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ５は、ＶまたはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ７は、Ｇ、Ｉ、またはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１は、Ｅ、Ｎ、またはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１は、Ｒ、Ｄ、またはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２５は、Ｑ、Ｄ、またはＥからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２８は、ＥまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ３１は、ＬまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ４５は、ＫまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ４８は、ＦまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ５１は、ＤまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ５４は、ＥまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ５７は、ＳまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ６０は、ＦまたはＷからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ６３は、ＩまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ６６は、ＱまたはＤからなる群から選択したアミノ酸である。更に別の実施形態では、集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000005
というＡＰＬ−ＩＤ２の配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ６は、ＫまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ９は、ＦまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＤまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１５は、ＥまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＳまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１は、ＦまたはＷからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＩまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２７は、ＱまたはＤからなる群から選択したアミノ酸である。別の実施形態では、集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000006
というＡＰＬ−ＩＤ３の配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ２は、ＩまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＳまたはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２３は、ＥまたはＮからなる群から選択したアミノ酸である。特定の実施形態では、集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000007
というＡＰＬ−ＩＤ５．１の配列、またはその断片を含む。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態では、単離ペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000008
というＡＰＬ−ＩＤ６の配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ５は、ＳまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ９は、ＦまたはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＲまたはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１６は、ＷまたはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＳまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＫまたはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２７は、ＮまたはＤからなる群から選択したアミノ酸である。別の実施形態では、集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000009
というＡＰＬ−ＩＤ７の配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ１０は、Ｖ、Ｌ、またはＩからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＡまたはＬからなる群から選択したアミノ酸である。更に別の実施形態では、集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000010
というＡＰＩＤ２−１の配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ５は、ＶまたはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ７は、Ｇ、Ｉ、またはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１は、Ｅ、Ｎ、またはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１は、Ｒ、Ｄ、またはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２５は、Ｑ、Ｄ、またはＥからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２８は、ＥまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ３１は、ＬまたはＶからなる群から選択したアミノ酸である。
【００１０】
特定の実施形態では、アナプラズマペプチド集団は更に、別の菌種由来の抗原ペプチドを１つ以上含んでよい。一実施形態では、アナプラズマペプチド集団は更に、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）の菌種（例えば、Ｅ．ｃａｎｉｓ、Ｅ．ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅ．ｅｗｉｎｇｉｉ、およびＥ．ｍｕｒｉｓ）、ならびに／またはボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の菌種（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂ．ａｆｚｅｌｌｉ、もしくはＢ．ｇａｒｉｎｉｉ）由来の抗原ペプチドを１つ以上含む。
【００１１】
本発明のペプチドは、少なくとも２０個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、またはそれを超えるアミノ酸を含んでよい。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、単離（例えば、合成および／または精製）ペプチドである。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、リガンドにコンジュゲートしている。例えば、特定の実施形態では、本発明のペプチドはビオチン化されている。別の実施形態では、本発明のペプチドは、ストレプトアビジン、アビジン、またはニュートラアビジンにコンジュゲートしている。別の実施形態では、本発明のペプチドは、担体タンパク質（例えば、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、または免疫グロブリンＦｃドメイン）にコンジュゲートしている。更に別の実施形態では、本発明のペプチドは、デンドリマーにコンジュゲートしているか、および／または多抗原ペプチド系（ＭＡＰＳ）の一部である。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、酵素、金属ナノ物質、またはフルオロフォアなどの検出可能な実体または標識にコンジュゲートしている。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、金属のナノ粒子、ナノシェル、ナノプレート、ナノリング、またはナノロッドにコンジュゲートしている。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、固体支持体に結合または固定化されている。一実施形態では、本発明のペプチドは、金属ナノ層を通じて、固体支持体に結合されている。特定の実施形態では、固体支持体は、１つもしくは複数のビーズ（例えば、コロイド粒子、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルのような金属ナノ物質、ラテックスビーズなど）、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具の流路（例えば多孔質膜）、ブロット（ウエスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロット）、分析もしくは遠心分離ローターの流路、または管もしくはウェル（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに適するプレートのウェル）である。
【００１３】
一態様では、本発明は、本明細書に記載されている単離ペプチド集団を１つ以上含む組成物を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は単離ペプチド集団を含み、その集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、もしくは９の配列、またはその断片を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明の組成物は更に、アナプラズマの菌種、エーリキアの菌種、および／またはボレリアの菌種由来の抗原ペプチドを１つ以上含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載されているペプチド集団を少なくとも２種類含む。特定の実施形態では、ペプチド集団の少なくとも１つは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義される。例えば、一実施形態では、ペプチド集団の少なくとも１つは、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列またはその断片を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明の組成物は更に、第２の単離ペプチド集団を含む。いくつかの実施形態では、その第２のペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７によって定義される。いくつかの他の実施形態では、第２のペプチド集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列またはその断片を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は更に、第１および第２のペプチド集団とは異なる第３の単離ペプチド集団を含む。特定の実施形態では、第３のペプチド集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列またはその断片を含む。
【００１９】
別の態様では、本発明は、サンプルにおいて、アナプラズマ抗原のエピトープに対する抗体を検出する方法も提供する。一実施形態では、この方法は、サンプルを本発明のペプチドまたはペプチド集団と接触させることと、そのペプチドまたは集団内の１つ以上のペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出することとを含み、この複合体の形成により、アナプラズマ抗原のエピトープに対する抗体が、そのサンプル中に存在することが示される。この方法を用いて、Ａ．ファゴサイトフィラム、Ａ．プラティス、またはＡ．マージナーレ（ｍａｒｇｉｎａｌｅ）の菌種由来の抗原に対する抗体を検出できる。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、対象において、アナプラズマ病または周期性血小板減少症を診断する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、その対象から採ったサンプルを本発明のペプチドまたはペプチド集団と接触させることと、そのペプチドまたは集団内の１つ以上のペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出することとを含み、この複合体の形成により、その対象がアナプラズマ病または周期性血小板減少症であることが示される。
【００２１】
本発明は、対象が感染しているアナプラズマの菌種を同定する方法も含む。一実施形態では、この方法は、その対象から採ったサンプルを第１のペプチドまたは第１のペプチド集団と第２のペプチドまたは第２のペプチド集団と接触させることであって、その第１のペプチドまたは第１のペプチド集団が、複数のアナプラズマの菌種由来の抗原に対する抗体に特異的に結合し、その第２のペプチドまたは第２のペプチド集団が、単一のアナプラズマの菌種由来の抗原に対する抗体に特異的に結合することと、その第１のペプチドまたは第１の集団内の１つ以上のペプチドを含む第１の抗体・ペプチド複合体の形成を検出することと、その第２のペプチドまたは第２の集団内の１つ以上のペプチドを含む第２の抗体・ペプチド複合体の形成を検出することとを含み、第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成により、第２の単離ペプチド集団が特異的に結合するアナプラズマの菌種に対象が感染していることが示される。
【００２２】
この方法の特定の実施形態では、第１のペプチドまたは第１のペプチド集団は、Ａ．ファゴサイトフィラム、Ａ．プラティス、およびＡ．マージナーレ由来の抗原に対する抗体に特異的に結合する。別の実施形態では、第１のペプチドまたは第１のペプチド集団は、Ａ．ファゴサイトフィラムおよびＡ．プラティス由来の抗原に対する抗体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２のペプチドまたは第２のペプチド集団は、Ａ．プラティス由来の抗原に対する抗体に特異的に結合する。別の実施形態では、第２のペプチドまたは第２のペプチド集団は、Ａ．ファゴサイトフィラム由来の抗原に対する抗体に特異的に結合する。この方法の一実施形態では、第１のペプチドまたは第１のペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義され、第２のペプチドまたは第２のペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によって定義され、第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成により、対象がＡ．プラティスに感染していることが示される。この方法の別の実施形態では、第１のペプチドまたは第１のペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義され、第２のペプチドまたは第２のペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によって定義され、第１の抗体・ペプチド複合体は形成されたが、第２の抗体・ペプチド複合体が形成されなかったことにより、対象がＡ．ファゴサイトフィラムに感染していることが示される。
【００２３】
別の実施形態では、対象が感染しているアナプラズマの菌種を同定する方法は、その対象から採ったサンプルを第１のペプチド集団と単一のアナプラズマの菌種の細胞抽出物と接触させることであって、第１の単離ペプチド集団が、複数のアナプラズマの菌種由来の抗原に対する抗体に特異的に結合することと、第１の集団内の１つ以上のペプチドを含む第１の抗体・ペプチド複合体の形成を検出することと、細胞抽出物中の１つ以上の成分を含む抗体・細胞抽出物複合体の形成を検出することとを含み、第１の抗体・ペプチド複合体と抗体・細胞抽出物複合体の両方の形成により、その細胞抽出物を産出したアナプラズマの菌種に対象が感染していることが示される。
【００２４】
上および本明細書に記載されているいずれの方法でも、ペプチドまたはペプチド集団は、いくつかの実施形態では、固体支持体に結合または固定化できる。このような実施形態の１つでは、ペプチドまたはペプチド集団は、金属（例えば金）ナノ層を通じて、固体支持体に結合されている。特定の実施形態では、固体支持体は、１つまたは複数のビーズ（例えば、コロイド粒子、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、金属ナノシェル、金属ナノロッドのような金属ナノ物質、ラテックスビーズなど）、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具の流路（例えば多孔質膜）、分析もしくは遠心分離ローターの流路、ブロット（ウエスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロット）、または管もしくはウェル（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに適するプレートのウェル）である。いくつかの実施形態では、固体支持体は、金属、ガラス、セルロース系材料（例えばニトロセルロース）、またはポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリスルホンなど）を含む。別の実施形態では、ペプチドまたは様々なペプチドの集団は、デンドリマーに結合されているか、および／または多抗原ペプチド系（ＭＡＰＳ）に組み込まれている。特定の他の実施形態では、ペプチドまたは様々なペプチドの集団は、ＢＳＡ、ＫＬＨ、オボアルブミン、または類似の担体に結合されている。
【００２５】
上および本明細書に記載されているいずれの方法でも、検出工程は、ＥＬＩＳＡアッセイを行うことを含んでよい。別の実施形態では、検出工程は、ラテラルフロー免疫アッセイを行うことを含んでよい。別の実施形態では、検出工程は、凝集アッセイを行うことを含んでよい。別の実施形態では、検出工程は、分析または遠心分離ローターでサンプルを回転させることを含む。別の実施形態では、検出工程は、ウエスタンブロット、スロットブロット、またはドットブロットを用いてサンプルを分析することを含む。更に別の実施形態では、検出工程は、電気化学センサー、光学センサー、またはオプトエレクトロニクスセンサーでサンプルを分析することを含む。特定の実施形態では、検出工程は、波長シフトアッセイを行うことを含む。特定の実施形態では、検出工程は、間接蛍光抗体検査を行うことを含む。
【００２６】
上および本明細書に記載されているいずれの方法でも用いられる、対象から採ったサンプルは、いくつかの実施形態では、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、粘液、または唾液などの体液である。別の実施形態では、サンプルは、組織（例えば組織ホモジネート）または細胞溶解液である。特定の実施形態では、サンプルは、野生動物（例えば、シカ、またはマウス、シマリス、リスなどのような齧歯動物）から採ったものである。別の実施形態では、サンプルは、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、霊長類動物など）から採ったものである。別の実施形態では、サンプルは、家畜または野生化動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）から採ったものである。更に別の実施形態では、サンプルは、ヒトから採ったものである。
【００２７】
本発明は、本発明のペプチドまたはペプチド集団を含むキットも含む。一実施形態では、このキットは、少なくとも１つの本発明のペプチド集団と、その集団内の１つ以上のペプチドのエピトープを認識する抗体に結合できる標識試薬とを含む。この標識試薬は、検出可能な標識にコンジュゲートしている抗ヒト、抗イヌ、または抗ネコＩｇＧまたはＩｇＭ抗体であってよい。別の実施形態では、標識試薬は、検出可能な標識にコンジュゲートしているプロテインＡ、プロテインＧ、および／またはプロテインＡ／Ｇ融合タンパク質である。関連する実施形態では、この検出可能な標識は、酵素、金属ナノ物質、フルオロフォア、または着色ラテックス粒子である。金属ナノ物質の例としては、金属のナノ粒子、ナノシェル、ナノリング、ナノロッド、およびナノプレートが挙げられるが、これらに限らない。
【００２８】
特定の実施形態では、このキットのペプチドは、任意で金属ナノ層を通じて、固体支持体に結合または固定化されている。特定の実施形態では、この固体支持体は、ビーズ（例えば、コロイド粒子、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルのような金属ナノ物質、ラテックスビーズなど）、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具の流路、分析もしくは遠心分離ローターの流路、または管もしくはウェル（例えばプレートのウェル）である。いくつかの実施形態では、そのキットの単一または複数のペプチドは、デンドリマーに結合されており、および／またはＭＡＰＳに組み込まれている。特定の他の実施形態では、ペプチドまたは様々なペプチドの混合物は、ＢＳＡに結合されている。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明のキットは更に、ビーズ集団またはプレート（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに適するプレート）を含む。別の実施形態では、本発明のキットは更に、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具、分析もしくは遠心分離ローター、ウエスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット、電気化学センサー、光学センサー、またはオプトエレクトロニクスセンサーなどの器具を含む。特定の実施形態では、そのビーズ集団、プレート、または器具は、免疫アッセイを行うのに有用である。例えば、特定の実施形態では、そのビーズ集団、プレート、または器具は、サンプル由来の抗体と本発明のペプチドとを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出するのに有用である。特定の実施形態では、本発明のペプチドまたは様々なペプチドの集団は、このビーズ、プレート、または器具に結合または固定化されている。
【００３０】
本発明のキットは更に、例えば、本発明のペプチドまたはペプチド集団を使用して、アナプラズマ抗原に対する抗体を検出するか、または対象において、アナプラズマ病もしくは周期性血小板減少症を診断する方法を示す一連の指示書を含んでもよい。特定の実施形態では、本発明のキットは、ビーズ集団、プレート、または器具（例えば、本発明のペプチドまたは様々なペプチドの集団を含む）を用いて、１つ以上のアナプラズマ抗原に対する抗体を検出するか、またはアナプラズマ病もしくは周期性血小板減少症を診断する方法を示す指示書を含む。
【００３１】
[本発明1001]
単離ペプチドの集団を含む組成物であって、該集団が3種類以上のペプチドを含み、該集団内の各ペプチドが、
（ｉ）Ａｂａｘｉｓ  ＩＤ2（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1）の配列もしくはその断片であって、該配列中、Ｘ9が、Ｉ、Ｐ、もしくはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ17が、Ｉ、Ｗ、もしくはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ21が、Ｒ、Ｄ、もしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ28が、ＥもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ31が、ＬもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｉｉ）Ａｂａｘｉｓ  ＩＤ3（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2）の配列もしくはその断片であって、該配列中、Ｘ3が、Ｌ、Ｖ、もしくはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ7が、Ｋ、Ｎ、もしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ11が、Ｒ、Ｄ、もしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ15が、Ｅ、Ｎ、もしくはＱからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｉｉｉ）ＡＰＬ−ＩＤ1（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3）の配列もしくはその断片であって、該配列中、Ｘ5が、ＶもしくはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ7が、Ｇ、Ｉ、もしくはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ11が、Ｅ、Ｎ、もしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ18が、ＤもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ21が、Ｒ、Ｄ、もしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ25が、Ｑ、Ｄ、もしくはＥからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ28が、ＥもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ31が、ＬもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ45が、ＫもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ48が、ＦもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ51が、ＤもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ54が、ＥもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ57が、ＳもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ60が、ＦもしくはＷからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ63が、ＩもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ66が、ＱもしくはＤからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｉｖ）ＡＰＬ−ＩＤ2（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：4）の配列もしくはその断片であって、該配列中、Ｘ6が、ＫもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ9が、ＦもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ12が、ＤもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ15が、ＥもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ18が、ＳもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ21が、ＦもしくはＷからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ24が、ＩもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ27が、ＱもしくはＤからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｖ）ＡＰＬ−ＩＤ3（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：5）の配列もしくはその断片であって、該配列中、Ｘ2が、ＩもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ10が、ＳもしくはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ23が、ＥもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｖｉ）ＡＰＬ−ＩＤ5．1（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：6）の配列もしくはその断片、
（ｖｉｉ）ＡＰＬ−ＩＤ6（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：7）の配列もしくはその断片であって、該配列中、Ｘ5が、ＳもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ9が、ＦもしくはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ13が、ＲもしくはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ16が、ＷもしくはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ18が、ＳもしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ22が、ＫもしくはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ27が、ＮもしくはＤからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
（ｖｉｉｉ）ＡＰＬ−ＩＤ7（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：8）の配列もしくはその断片であって、該配列中、Ｘ10が、Ｖ、Ｌ、もしくはＩからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ11が、ＡもしくはＬからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、または
（ｉｘ）ＡＰＩＤ2−1（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：9）の配列もしくはその断片であって、該配列中、Ｘ5が、ＶもしくはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ7が、Ｇ、Ｉ、もしくはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ11が、Ｅ、Ｎ、もしくはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ21が、Ｒ、Ｄ、もしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ25が、Ｑ、Ｄ、もしくはＥからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ28が、ＥもしくはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ31が、ＬもしくはＶからなる群から選択したアミノ酸である、前記配列もしくはその断片、
を含む、前記組成物。
[本発明1002]
前記ペプチドの1つまたは複数がリガンドにコンジュゲートしている、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
前記ペプチドの1つまたは複数が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、酵素、または金属ナノ物質にコンジュゲートしている、本発明1001〜1002のいずれかの組成物。
[本発明1004]
前記ペプチド集団が、任意で金属ナノ層を通じて、固体支持体に固定化されている、本発明1001〜1003のいずれかの組成物。
[本発明1005]
前記固体支持体が、複数のビーズ、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具の流路、マイクロタイタープレートのウェル、またはローターの流路である、本発明1004の組成物。
[本発明1006]
前記断片が、少なくとも15、20、25、30、35、40、45、50、55、または60アミノ酸長である、本発明1001〜1005のいずれかの組成物。
[本発明1007]
アナプラズマ菌種、エーリキア菌種、および／またはボレリア菌種に由来する1つまたは複数の抗原ペプチドを更に含む、本発明1001〜1006のいずれかの組成物。
[本発明1008]
本発明1001のペプチド集団を少なくとも2種類含む、本発明1001〜1007のいずれかの組成物。
[本発明1009]
前記ペプチド集団の少なくとも1つがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3によって定義される、本発明1008の組成物。
[本発明1010]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：7によって定義される第2の単離ペプチド集団を更に含む、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
前記組成物が第3の単離ペプチド集団を更に含み、その各ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：6の配列を含む、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
前記組成物が、第2の単離ペプチド集団を更に含み、その各ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：6の配列を含む、本発明1009の組成物。
[本発明1013]
サンプルにおける、アナプラズマ抗原のエピトープに対する抗体の検出方法であって、
サンプルを本発明1001〜1012のいずれかの組成物と接触させる工程と、
該組成物中の1つまたは複数のペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出する工程とを含み、該複合体の形成によって、アナプラズマ抗原のエピトープに対する抗体が前記サンプル中に存在することが示される、前記方法。
[本発明1014]
前記アナプラズマ抗原が、アナプラズマ・ファゴサイトフィラム（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、アナプラズマ・プラティス（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｐｌａｔｙｓ）、またはアナプラズマ・マージナーレ（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｍａｒｇｉｎａｌｅ）に由来する、本発明1013の方法。
[本発明1015]
単離ペプチドの前記組成物が、任意で金属ナノ層を通じて、固体支持体に固定化されている、本発明1013〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記固体支持体が、複数のビーズ、ラテラルフローアッセイ用器具の流路、マイクロタイタープレートのウェル、またはローターの流路である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記検出工程が、（ｉ）ＥＬＩＳＡアッセイを行うこと、（ｉｉ）ラテラルフローアッセイを行うこと、（ｉｉｉ）凝集アッセイを行うこと、（ｉｖ）ウエスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロットを行うこと、（ｖ）波長シフトアッセイを行うこと、（ｖｉ）間接蛍光抗体検査を行うこと、または（ｖｉｉ）前記サンプルを分析もしくは遠心分離ローターにかけることを含む、本発明1013〜1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記サンプルが、ヒト、イヌ、またはネコの対象から採ったものである、本発明1013〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記サンプルが、血液、血清、血漿、脳脊髄液、組織抽出液、尿、または唾液サンプルである、本発明1013〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
対象におけるアナプラズマ病の診断方法であって、
対象から採ったサンプルを、本発明1001〜1012のいずれかの組成物と接触させる工程と、
該組成物中の1つまたは複数のペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出する工程と、
を含み、
該複合体の形成によって、前記対象がアナプラズマ病であることが示される、前記方法。
[本発明1021]
前記対象がヒト、イヌ、またはネコである、本発明1020の方法。
[本発明1022]
本発明1001〜1012のいずれかの組成物と、該組成物中の1つまたは複数のペプチドのエピトープを認識する抗体に結合できる標識試薬とを含むキット。
[本発明1023]
前記組成物中の前記ペプチドが、任意で金属ナノ層を通じて、固体支持体に結合または固定化されている、本発明1022のキット。
[本発明1024]
前記標識試薬が、検出可能な標識にコンジュゲートしている抗ヒト、抗イヌ、または抗ネコＩｇＧまたはＩｇＭ抗体である、本発明1022のキット。
[本発明1025]
前記検出可能な標識が、酵素、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、または着色ラテックス粒子である、本発明1024のキット。
[本発明1026]
前記標識試薬が、検出可能な標識にコンジュゲートしているプロテインＡ、プロテインＧ、および／またはプロテインＡ／Ｇ融合タンパク質である、本発明1022のキット。
[本発明1027]
前記検出可能な標識が、酵素、金属ナノ粒子、金属ナノシェル、金属ナノ層、フルオロフォア、または着色ラテックス粒子である、本発明1026のキット。
[本発明1028]
対象が感染しているアナプラズマの菌種の同定方法であって、
（ａ）対象から採ったサンプルを第1の単離ペプチド集団と第2の単離ペプチド集団とに接触させる工程であって、第1の単離ペプチド集団が、複数のアナプラズマの菌種に由来する抗原に対する抗体に特異的に結合し、第2の単離ペプチド集団が、単一のアナプラズマの菌種に由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する、工程と、
（ｂ）第1の集団中の1つまたは複数のペプチドを含む第1の抗体・ペプチド複合体の形成を検出する工程と、
（ｃ）第2の集団中の1つまたは複数のペプチドを含む第2の抗体・ペプチド複合体形成を検出する工程とを含み、第1の抗体・ペプチド複合体と第2の抗体・ペプチド複合体の両方の形成によって、第2の単離ペプチド集団が特異的に結合する前記アナプラズマの菌種に前記対象が感染していることが示される、前記方法。
[本発明1029]
第1の単離ペプチド集団が、Ａ．ファゴサイトフィラムおよびＡ．プラティスに由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
第1の単離ペプチド集団がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3によって定義される、本発明1029の方法。
[本発明1031]
第2の単離ペプチド集団が、Ａ．プラティスに由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する、本発明1028の方法。
[本発明1032]
第2の単離ペプチド集団がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：4によって定義される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
第1の単離ペプチド集団がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3によって定義され、第2の単離ペプチド集団がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：4によって定義され、第1の抗体・ペプチド複合体と第2の抗体・ペプチド複合体の両方の形成によって、前記対象がＡ．プラティスに感染していることが示される、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
第1の単離ペプチド集団がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3によって定義され、第2の単離ペプチド集団がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：4によって定義され、第1の抗体・ペプチド複合体は形成されるが、第2の抗体・ペプチド複合体は形成されないことによって、前記対象がＡ．ファゴサイトフィラムに感染していることが示される、本発明1028〜1032のいずれかの方法。
[本発明1035]
対象が感染しているアナプラズマの菌種の同定方法であって、
（ａ）対象から採ったサンプルを、第1の単離ペプチド集団と、単一のアナプラズマ菌種の細胞抽出物とに接触させる工程であって、第1の単離ペプチド集団が、複数のアナプラズマの菌種に由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する、工程と、
（ｂ）前記第1の集団中の1つまたは複数のペプチドを含む第1の抗体・ペプチド複合体の形成を検出する工程と、
（ｃ）前記細胞抽出物中の1つまたは複数の成分を含む抗体・細胞抽出物複合体の形成を検出する工程とを含み、第1の抗体・ペプチド複合体と該抗体・細胞抽出物複合体の両方の形成によって、該細胞抽出物を産生したアナプラズマの菌種に前記対象が感染していることが示される、前記方法。
[本発明1036]
第1の単離ペプチド集団が、Ａ．ファゴサイトフィラムとＡ．プラティスに由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する、本発明1035の方法。
[本発明1037]
第1の単離ペプチド集団がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3によって定義される、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記細胞抽出物がＡ．ファゴサイトフィラムに由来するものである、本発明1035〜1037のいずれかの方法。
本発明の更なる態様と実施形態は、下記の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、アナプラズマ抗原に対する抗体を検出するのに使用できる二抗原サンドイッチアッセイの図である。この実施形態では、本発明のペプチドは、検査部位において好適な基材（例えば、ニトロセルロース膜、ＥＬＩＳＡプレートのウェル）に固定化されている。固定化されている本発明のペプチドは、検査サンプル中のアナプラズマ抗原に対する抗体と結合する。続いて、適当なアナプラズマ抗原に対する検査サンプル抗体は、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、または金属ナノシェルのような金属ナノ物質（例えばコロイド金）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、量子ドット）にコンジュゲートしている本発明の第２のセットのペプチドと結合し、これにより、検査部位において固定化されている第１のセットのペプチドに結合した抗体の存在を検出する。特定の実施形態では、検出シグナルを増幅するために、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、または金属ナノシェルのような金属ナノ物質（例えばコロイド金）、ＨＲＰ、ＡＬＰ、β−ＧＡＬ、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、量子ドット）にコンジュゲートしているプロテインＡおよび／またはプロテインＧ分子を検査部位に適用してよく、これらの分子は、アナプラズマ抗原に対するいずれかの抗体であって、固定化されている本発明のペプチドによって捕捉された抗体のＦｃ領域に結合する。
【図２】図２は、アナプラズマ抗原に対する抗体の検出に用いることができる１つのタイプの間接サンドイッチアッセイの図である。この実施形態では、抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ、抗イヌＩｇＧ／ＩｇＭ、または抗ネコＩｇＧ／ＩｇＭ抗体が、検査部位において、好適な基材（例えば、ニトロセルロース膜、ＥＬＩＳＡプレートのウェル）に固定化されている。この固定化されている抗体が、検査サンプル中の、アナプラズマ抗原に対する抗体と結合する。続いて、適当なアナプラズマ抗原に対する検査サンプル抗体は、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、または金属ナノシェルのような金属ナノ物質（例えばコロイド金）、ＨＲＰ、ＡＬＰ、β−ＧＡＬ、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、または量子ドット）にコンジュゲートしている本発明のペプチドと結合する。
【図３】図３は、アナプラズマ抗原に対する抗体の検出に用いることができる別のタイプの間接サンドイッチアッセイの図である。この実施形態では、検査サンプル中の抗アナプラズマ抗体を捕捉するために、本発明のペプチドは、基材（例えば、ニトロセルロース膜、ＥＬＩＳＡプレートのウェル）に固定化できる。検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、または金属ナノシェルのような金属ナノ物質（例えばコロイド金）、ＨＲＰ、ＡＬＰ、β−ＧＡＬ、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、量子ドット）にコンジュゲートしている抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ、抗イヌＩｇＧ／ＩｇＭ、または抗ネコＩｇＧ／ＩｇＭ抗体を用いて、検査部位において、固定化されているペプチドに結合した抗体の存在を検出できる。
【図４】図４は、アナプラズマ抗原に対する抗体の検出に用いることができる免疫アッセイ用器具の図である。この実施形態の免疫アッセイ用器具では、本発明のペプチドは、検査部位において、好適な基材（例えば、ニトロセルロース膜、ＥＬＩＳＡプレートのウェル）に固定化されている。固定化されている本発明のペプチドは、検査サンプル中の抗アナプラズマ抗体と結合する。検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、または金属ナノシェルのような金属ナノ物質（例えばコロイド金）、ＨＲＰ、ＡＬＰ、β−ＧＡＬ，フルオロフォア、着色ラテックス粒子、量子ドット）にコンジュゲートしているプロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＡ／Ｇ融合タンパク質をこの系に加え、捕捉された抗アナプラズマ抗体のＦｃ部分に結合させ、それによって、陽性シグナルを生成する。この実施形態では、この器具は、検出可能な標識がコンジュゲートしたプロテインＡ、検出可能な標識がコンジュゲートしたプロテインＧ、および／または検出可能な標識がコンジュゲートしたプロテインＡ／Ｇ融合体を認識する結合パートナーが固定化されているコントロール部位を更に含むことができる。このような結合パートナーとしては、抗プロテインＡ、抗プロテインＧ、マウスＩｇＧ、および／または他の類似のＩｇＧ分子を挙げてよいが、これらに限らない。
【図５】図５は、Ａ．ファゴサイトフィラムに感染させたイヌ（イヌ３−１３）またはＡ．プラティスに感染させたイヌ（イヌ１５−１３）のいずれかから様々な間隔で採った血漿サンプルの、ＡＰＬ−ＩＤ１ペプチドを用いた場合のＥＬＩＳＡスコア（ＯＤ６５０ｎｍ）の線グラフである。
【図６】図６は、Ａ．ファゴサイトフィラムに感染させたイヌ（イヌ３−１３）またはＡ．プラティスに感染させたイヌ（イヌ１５−１３）のいずれかから様々な間隔で採った血漿サンプルの、ＡＰＬ−ＩＤ２ペプチドを用いた場合のＥＬＩＳＡスコア（ＯＤ６５０ｎｍ）の線グラフである。
【図７】図７は、アナプラズマ抗原に対する抗体の検出に用いることができるラテラルフローアッセイ用器具の一実施例を示している。本発明のペプチドが、担体タンパク質（例えばウシ血清アルブミン）に連結されており、得られたＢＳＡ・ペプチドコンジュゲートが、検査部位において（Ｔ）、ニトロセルロース（ＮＣ）膜に固定化されている。同じＢＳＡ・ペプチドコンジュゲートが、検出可能な標識（例えばコロイド金）にコンジュゲートしており、検査部位の上流に配置されたコンジュゲートパッドに付着されている。金がコンジュゲートしたプロテインＡと、金がコンジュゲートしたプロテインＧ（すなわち増幅剤）をコンジュゲートパッドに加えて、捕捉された抗アナプラズマ抗体のＦｃ部分に結合することによって、シグナルを増強する。この器具は、金がコンジュゲートしたプロテインＡおよび／または金がコンジュゲートしたプロテインＧを認識する結合パートナーが固定化されているコントロール部位（Ｃ）を更に含む。
【図８】図８は、図７のラテラルフローアッセイ用器具の操作を示している。検査サンプルを器具のサンプルポートに適用し、コンジュゲートパッドに存在するペプチドコンジュゲートを動員する。検査サンプル中に存在するいずれかの抗アナプラズマ抗体が、ペプチドコンジュゲートに特異的に結合し、形成された複合体が、検査部位とコントロール部位とを含むニトロセルロース膜に移動することになる。標識ペプチド・抗体複合体が、検査部位において、固定化されている本発明のペプチドによって捕捉される。コンジュゲートパッドに存在する、金がコンジュゲートしたプロテインＡと、金がコンジュゲートしたプロテインＧが、サンプルによって動員され、サンプル中に存在するＩｇＧおよびＩｇＭ分子のＦｃ域に結合する。金がコンジュゲートしたプロテインＡおよび／またはプロテインＧが、捕捉されたペプチド・抗体複合体に結合すると、検査部位においてシグナルが増幅される。金がコンジュゲートしたプロテインＡおよび／または金がコンジュゲートしたプロテインＧは、コントロール部位において固定化されている結合パートナー（例えば抗プロテインＡおよび／または抗プロテインＧ抗体）によって捕捉され、それにより、器具が機能を果たしていることを示すシグナルが生成される。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
詳細な説明
本発明は、部分的には、アナプラズマ外膜タンパク質の断片の特定の配列変異体が、アナプラズマの菌種に対する抗体反応の頑強な検出を実現させるという発見に基づくものである。したがって、本発明は、アナプラズマ抗原に結合する抗体の検出と、アナプラズマ病の診断とに有用な組成物、器具、方法、およびキットを提供する。
【００３４】
「抗原」という用語は、本明細書で使用する場合、抗体が認識できる分子を指す。抗原は、例えば、ペプチドまたはその修飾体であることができる。抗原は、１つ以上のエピトープを含むことができる。
【００３５】
「エピトープ」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原の部分のうち、抗体が特異的に認識する部分である。エピトープは例えば、ペプチド（例えば本発明のペプチド）の一部を含むか、またはそのペプチドの一部からなることができる。エピトープは、線状エピトープ、連続エピトープ、または立体的エピトープであることができる。特定の実施形態では、エピトープは、非連続的な領域を含んでもよい。
【００３６】
「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、一本鎖か二本鎖を問わず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびそれらの化学修飾体を含む。
【００３７】
本明細書で用いられている一文字のアミノ酸略号は、当該技術分野における標準的な意味を有し、本明細書に記載されている全てのペプチド配列は、慣例に従って書かれており、Ｎ末端側が左に、Ｃ末端が右に書かれている。
【００３８】
組成物と器具
本発明は、アナプラズマ抗原を認識する抗体に結合できる単離ペプチドと、このようなペプチドが組み込まれた器具を提供する。一実施形態では、本発明は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を提供し、その集団内の各ペプチドは、Ａｂａｘｉｓ  ＩＤ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、Ａｂａｘｉｓ  ＩＤ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ＡＰＬ−ＩＤ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、ＡＰＬ−ＩＤ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、ＡＰＬ−ＩＤ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＡＰＬ−ＩＤ５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＡＰＬ−ＩＤ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＡＰＬ−ＩＤ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）、ＡＰＩＤ２−１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）の配列、またはそれらの断片を含む。例えば、一実施形態では、この単離ペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000011
という配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ９は、Ｉ、Ｐ、またはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１７は、Ｉ、Ｗ、またはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１は、Ｒ、Ｄ、またはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２８は、ＥまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ３１は、ＬまたはＶからなる群から選択したアミノ酸である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含み、その配列中、Ｘ２８はＮであり、および／またはＸ３１はＶである。別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含み、その配列中、Ｘ９はＰであり、Ｘ１７はＩであり、および／またはＸ２１はＮである。特定の実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、表１の配列のいずれか１つを含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチドを含む。
（表１）Ａｂａｘｉｓ  ＩＤ２のペプチド
0006738274.tif 000012
0006738274.tif 000013
0006738274.tif 000014
0006738274.tif 000015
0006738274.tif 000016
0006738274.tif 000017
【００４０】
別の実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000018
という配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ３は、Ｌ、Ｖ、またはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ７は、Ｋ、Ｎ、またはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１は、Ｒ、Ｄ、またはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１５は、Ｅ、Ｎ、またはＱからなる群から選択したアミノ酸である。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列を含み、その配列中、Ｘ３はＡであり、および／またはＸ７はＮである。別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列を含み、その配列中、Ｘ１１はＲであり、および／またはＸ１５はＱである。特定の実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、表２の配列のいずれかの１つを含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチドを含む。
（表２）Ａｂａｘｉｓ  ＩＤ３のペプチド
0006738274.tif 000019
0006738274.tif 000020
【００４１】
特定の実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000021
という配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ５は、ＶまたはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ７は、Ｇ、Ｉ、またはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１は、Ｅ、Ｎ、またはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１は、Ｒ、Ｄ、またはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２５は、Ｑ、Ｄ、またはＥからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２８は、ＥまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ３１は、ＬまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ４５は、ＫまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ４８は、ＦまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ５１は、ＤまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ５４は、ＥまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ５７は、ＳまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ６０は、ＦまたはＷからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ６３は、ＩまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ６６は、ＱまたはＤからなる群から選択したアミノ酸である。
【００４２】
関連する実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含み、その配列中、Ｘ５はＡであり、Ｘ１８はＤであり、および／またはＸ３１はＶである。別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含み、その配列中、Ｘ４５はＱであり、Ｘ４８はＦであり、および／またはＸ５１はＮである。更に別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含み、その配列中、Ｘ５４はＥであり、Ｘ５７はＳであり、および／またはＸ６０はＷである。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含み、その配列中、Ｘ６３はＩであり、および／またはＸ６６はＤである。特定の実施形態では、単離ペプチド集団は、表３の配列のいずれかの１つを含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチドを含む。
（表３）ＡＰＬ−ＩＤ１のペプチド
0006738274.tif 000022
0006738274.tif 000023
0006738274.tif 000024
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0006738274.tif 000027
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0006738274.tif 000029
0006738274.tif 000030
0006738274.tif 000031
0006738274.tif 000032
【００４３】
いくつかの実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000033
という配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ６は、ＫまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ９は、ＦまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１２は、ＤまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１５は、ＥまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＳまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１は、ＦまたはＷからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２４は、ＩまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２７は、ＱまたはＤからなる群から選択したアミノ酸である。関連する実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含み、その配列中、Ｘ６はＱであり、Ｘ９はＦであり、および／またはＸ１２はＮである。別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含み、その配列中、Ｘ１５はＥであり、Ｘ１８はＳであり、および／またはＸ２１はＷである。更に別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含み、その配列中、Ｘ２４はＩであり、および／またはＸ２７はＤである。特定の実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、表４の配列のいずれかの１つを含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチドを含む。
（表４）ＡＰＬ−ＩＤ２のペプチド
0006738274.tif 000034
0006738274.tif 000035
【００４４】
本発明の別の実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000036
という配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ２は、ＩまたはＶからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１０は、ＳまたはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２３は、ＥまたはＮからなる群から選択したアミノ酸である。関連する実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列を含み、その配列中、Ｘ２はＶである。別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列を含み、その配列中、Ｘ１０はＹである。更に別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５の配列を含み、その配列中、Ｘ２３はＥである。いくつかの実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、表５の配列のいずれかの１つを含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチドを含む。
（表５）ＡＰＬ−ＩＤ３のペプチド
0006738274.tif 000037
【００４５】
一実施形態では、本発明のペプチドは、
0006738274.tif 000038
という配列、またはその断片を含む。本発明の単離ペプチド集団は、３個以上のペプチドを含んでよく、その各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列、またはこの配列の断片を含む。いくつかの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列を含むペプチドを、本明細書に記載されている本発明の他のペプチド集団に含めてよい。
【００４６】
本発明の別の実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000039
という配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ５は、ＳまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ９は、ＦまたはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１３は、ＲまたはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１６は、ＷまたはＹからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＳまたはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２２は、ＫまたはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２７は、ＮまたはＤからなる群から選択したアミノ酸である。
【００４７】
関連する実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列を含み、その配列中、Ｘ５はＱであり、Ｘ９はＹであり、および／またはＸ１３はＨである。別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列を含み、その配列中、Ｘ１６はＷであり、および／またはＸ２２はＫである。更に別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列を含み、その配列中、Ｘ１８はＳであり、および／またはＸ２７はＤである。いくつかの実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、表６の配列のいずれかの１つを含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチドを含む。
（表６）ＡＰＬ−ＩＤ６のペプチド
0006738274.tif 000040
0006738274.tif 000041
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000042
という配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ１０は、Ｖ、Ｌ、またはＩからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１は、ＡまたはＬからなる群から選択したアミノ酸である。このような実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列を含み、その配列中、Ｘ１１はＡである。別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列を含み、その配列中、Ｘ１０はＩである。更に別の実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、表７の配列のいずれかの１つを含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチドを含む。
（表７）ＡＰＬ−ＩＤ７のペプチド
0006738274.tif 000043
【００４９】
本発明の別の実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、
0006738274.tif 000044
という配列、またはその断片を含み、その配列中、Ｘ５は、ＶまたはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ７は、Ｇ、Ｉ、またはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１は、Ｅ、Ｎ、またはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１は、Ｒ、Ｄ、またはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２５は、Ｑ、Ｄ、またはＥからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２８は、ＥまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ３１は、ＬまたはＶからなる群から選択したアミノ酸である。
【００５０】
関連する実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を含み、その配列中、Ｘ５はＶであり、Ｘ７はＧであり、および／またはＸ１１はＮである。別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を含み、その配列中、Ｘ２１はＲであり、および／またはＸ２５はＥである。更に別の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を含み、その配列中、Ｘ２８はＮであり、および／またはＸ３１はＬである。いくつかの実施形態では、本発明の単離ペプチド集団は、表８の配列のいずれかの１つを含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチドを含む。
（表８）ＡＰＩＤ２−１のペプチド
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【００５１】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列と、追加のＮ末端ペプチド配列（例えばＮ末端伸長部）を含む。この追加のＮ末端ペプチド配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、またはそれを超えるアミノ酸を含むことができる。特定の実施形態では、Ｎ末端ペプチド配列は、約５〜約１０個、約１０〜約１５個、約１５〜約２０個、約２０〜約２５個、約２５〜約３０個、約３０〜約４０個、または約４０〜約５０個のアミノ酸の長さである。一実施形態では、Ｎ末端ペプチド配列は、１つ以上の結合残基（例えば１つ以上のグリシン、システイン、またはセリン残基）であることができる。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載されているいずれの配列におけるカルボキシル末端のシステイン残基も、代わりに、アミノ末端に位置することもできる。同様に、本明細書に記載されているいずれの配列におけるアミノ末端のシステイン残基も、代わりに、カルボキシル末端に位置することができる。
【００５２】
追加のＮ末端ペプチド配列は、天然型配列であることができる。本明細書で使用する場合、「天然型」配列は、天然のアナプラズマ主要表面タンパク質２（ＭＳＰ２）／ｐ４４もしくはＯＭＰ／ｐ４４配列、またはその変異体由来のペプチド配列である。特定の実施形態では、このペプチド配列は、天然のアナプラズマＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４配列の断片である。このペプチド配列は例えば、ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４の保存または非保存領域由来のものであることができる。このペプチド配列は例えば、免疫優性エピトープ、または宿主（例えばヒト、イヌなど）の免疫系によって認識可能ないずれかの他のエピトープのようなエピトープを含むことができる。アナプラズマＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４タンパク質およびそのペプチドは、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＯ３００９７．１、ＡＣＶ８５５８０．１、ＡＣＶ８５５５９．１、ＡＥＨ９６２７０．１、ＡＤＵ５６８５０．１、ＡＥＨ９６２７０．１、およびＡＡＱ９１８４９．１、ならびに米国特許番号７，５０７，７８９、同８，３０３，９５９、同８，１５８，３７０、および米国特許公開番号２０１３／００６４８４２に記載されており、これらのそれぞれの内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【００５３】
変異ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５４３に示されているペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であり、本発明のポリペプチドでもある。配列同一性（％）は、当該技術分野において認識されている意味を有し、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の同一性を測定する方法は数多く存在する。例えば、Ｌｅｓｋ，Ｅｄ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）、Ｓｍｉｔｈ，Ｅｄ．，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９３）、Ｇｒｉｆｆｉｎ＆Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，（１９９４）、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）、およびＧｒｉｂｓｋｏｖ＆Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｅｄｓ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９１）を参照されたい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをアラインメントする方法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））、およびＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎによる局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．，２：４８２−４８９（１９８１））を用いるＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）を含むコンピュータープログラムに体系化されている。例えば、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを採用しているコンピュータープログラムＡＬＩＧＮを用いて、ギャップオープンペナルティー−１２、ギャップエクステンションペナルティー−２でアフィンギャップ検索を行うことができる。
【００５４】
これらの配列アラインメントプログラムのいずれかを用いて、特定の配列が、基準配列と例えば約９５％同一であるかを判断するときには、同一性（％）が、基準ポリヌクレオチドの全長にわたって計算されるとともに、基準ヌクレオチドにおけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるようにパラメーターを設定する。
【００５５】
ペプチド配列の変異体は、当業者であれば、その配列の既知の特性に部分的に基づき、容易に選択することができる。例えば、変異ペプチドは、アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、および／またはアミノ酸欠失（例えば、少数もしくは単一のアミノ酸欠失、または２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、もしくはそれを超える連続するアミノ酸を含む欠失）を含むことがきる。したがって、特定の実施形態では、天然型ペプチド配列の変異体は、（ｉ）１つ以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、もしくはそれを超える数）の保存的アミノ酸置換、（ｉｉ）１つ以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、もしくはそれを超える数）のアミノ酸の欠失、または（ｉｉｉ）これらの組み合わせによって、天然の配列とは異なる配列である。欠失したアミノ酸は、連続的であることも、非連続的であることもできる。保存的アミノ酸置換は、側鎖と化学的特性に類似性のあるアミノ酸のファミリー内で行われる置換である。これらのファミリーとしては、例えば、（１）酸性アミノ酸（アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩）（２）塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）、（３）非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、（４）無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）、（５）脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン。ただし、セリンとトレオニンは任意で、脂肪族ヒドロキシルアミノ酸として別個に分類される）、（６）芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、（７）アミドアミノ酸（アスパラギン、グルタミン）、ならびに（９）含硫アミノ酸（システインおよびメチオニン）が挙げられる。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｅｄ．ｂｙ  Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ，Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．：１９８１を参照されたい。変異ペプチドが好適であることを確認する方法は、従来的かつ常法のものである。
【００５６】
ペプチド配列の変異体は、すでに定義済みのペプチド配列に対する変異体を含む。例えば、既知のエピトープを含む上記のペプチド配列を、一端もしくは両端で（例えば約１〜３個のアミノ酸分）延長または短縮してよく、および／または１個、２個、３個、４個、もしくはそれを超えるアミノ酸を保存的アミノ酸などによって置換してよい。さらに、タンパク質のある１つの領域が、対象のエピトープを含むものとされる場合、研究者は、その対象の領域を、最初の大まかな領域の終点から（例えば、いずれかの方向に約５個のアミノ酸分）「シフト」させて、活性を最適化することができる。
【００５７】
特定の実施形態では、追加のＮ末端ペプチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を有する別のペプチドを含むか、またはそのペプチドからなることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を有する配列の多量体であることができる。別の実施形態では、Ｎ末端ペプチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９のいずれか１つの配列のＮ末端に天然において隣接する天然型ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４ペプチド配列である。別の実施形態では、本発明のペプチドは、任意で１つ以上の連結アミノ酸を介して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９のいずれか１つの配列を融合したものを含むことができる。例えば、一実施形態では、本発明のペプチドは、任意で１つ以上の連結アミノ酸（例えばグリシン、セリン、またはシステイン残基）を介して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に連結した配列を含むことができる。別の実施形態では、本発明のペプチドは、任意で１つ以上の連結アミノ酸（例えばグリシン、セリン、またはシステイン残基）を介して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に連結した配列を含むことができる。別の実施形態では、本発明のペプチドは、任意で１つ以上の連結アミノ酸（例えばグリシン、セリン、またはシステイン残基）を介して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に連結した配列を含むことができる。
【００５８】
特定の実施形態では、追加のＮ末端ペプチド配列は、非天然型配列である。本明細書で使用する場合、「非天然型」配列は、アナプラズマタンパク質由来か否かを問わず、天然型ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４ペプチド配列以外のいずれかのタンパク質配列である。特定の実施形態では、追加のＮ末端ペプチド配列は、アナプラズマ表面抗原のエピトープを含む。他のアナプラズマ抗原としては、ＭＳＰ５、ＨＳＰ６０、Ａｓｐ１４（Ｋａｈｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．，Ｖｏｌ．８１（１）：６５−７９，２０１３）、およびＺｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．３５（１０）：２６０６−２６１１，１９９７に記載されている抗原が挙げられるが、これらに限らない。エーリキア抗原およびボレリア抗原を含め、他の微生物由来のポリペプチドまたはペプチドも用いることができる。エーリキア抗原に対応するタンパク質とペプチド配列は、説明がなされている。例えば、米国出願番号１４／０５２，２９６、米国特許番号６，３０６，４０２、同６，３５５，７７７、同７，２０４，９９２、同７，４０７，７７０、同８，８２８，６７５、およびＷＯ２００６／１３８５０９を参照されたい（これらのそれぞれの内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）。ボレリア抗原に対応するタンパク質とペプチド配列は、説明がなされている。例えば、米国特許番号６，７１６，５７４、同５，６１８，５３３、同５，６４３，７３３、同５，６４３，７５１、同５，９３２，２２０、同６，６１７，４４１、同７，８８７，８１５、同８，５６８，９８９、および同８，７５８，７７２を参照されたい（これらのそれぞれの内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）。
【００５９】
特定の実施形態では、追加のＮ末端ペプチド配列は、配列を組み合わせたものである。例えば、追加のＮ末端ペプチド配列は、天然型配列、非天然型配列、またはそのような配列を組み合わせたいずれかのもの（例えば、２つ以上の天然型配列を組み合わせたもの、２つ以上の非天然型配列を組み合わせたもの、または１つ以上の天然型配列を１つ以上の非天然型配列と組み合わせたもの）を含むことができる。
【００６０】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列と、追加のＣ末端配列（例えば、Ｃ末端伸長部）を含む。追加のＣ末端ペプチド配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、２０個、２５個、またはそれを超えるアミノ酸を含むことができる。特定の実施形態では、追加のＣ末端配列は、約５〜約１０個、約１０〜約１５個、約１５〜約２０個、約２０〜約２５個、約２５〜約３０個、約３０〜約４０個、または約４０〜約５０個のアミノ酸の長さである。追加のＣ末端ペプチド配列は、天然型ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４配列であることができる。特定の実施形態では、Ｃ末端ペプチド配列は、天然のアナプラズマＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４配列の断片である。このペプチド配列は、例えば、ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４の保存または非保存領域由来であることができる。このペプチド配列は、例えば、免疫優性エピトープ、または宿主（例えばヒト、イヌなど）の免疫系によって認識可能ないずれかの他のエピトープのようなエピトープを含むことができる。
【００６１】
特定の実施形態では、追加のＣ末端ペプチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を有する別のペプチドを含むか、またはそのペプチドからなることができる。例えば、特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列をそれぞれ有する配列の多量体であることができる。別の実施形態では、本発明の天然型配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列のＣ末端に天然において隣接する配列（例えば、ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４配列）である。
【００６２】
特定の実施形態では、追加のＣ末端ペプチド配列は、非天然型配列である。いくつかの実施形態では、追加のＣ末端ペプチド配列は、ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４以外のアナプラズマ表面抗原のエピトープを含む。他の微生物に由来するポリペプチドまたはペプチドも用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、アナプラズマペプチド配列は、エーリキアまたはボレリア抗原由来のエピトープを更に含むことができる。
【００６３】
特定の実施形態では、追加のＣ末端ペプチド配列は、配列を組み合わせたものである。例えば、追加のＣ末端ペプチド配列は、天然型配列、非天然型配列、またはそのような配列を組み合わせたいずれかのもの（例えば、２つ以上の天然型配列を組み合わせたもの、２つ以上の非天然型配列を組み合わせたもの、または１つ以上の天然型配列を１つ以上の非天然型配列と組み合わせたもの）を含むことができる。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９によって定義される配列を含み、追加のＮ末端ペプチド配列と、追加のＣ末端ペプチド配列を更に含む。追加のＮ末端ペプチド配列とＣ末端ペプチド配列は、上記のとおりであることができる。本発明のペプチドは概ね、完全長ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４タンパク質からなっていない。しかしながら、特定の実施形態では、本発明のペプチドは、完全長ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４タンパク質を含むことができる。別の実施形態では、本発明のペプチドは、完全長ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４タンパク質を含まない。
【００６５】
追加のＮ末端および／またはＣ末端ペプチド配列を含む本発明のペプチドは、アナプラズマ感染症（例えばアナプラズマ病）を感染後早期（例えば、感染症の発症から１〜２週間以内）に診断するように設計できる。例えば、特定の実施形態では、追加のＮ末端および／またはＣ末端ペプチド配列は、アナプラズマ感染症の初期段階と関連する抗原またはエピトープを含む。
【００６６】
上記の配列に加えて、追加のＮ末端配列とＣ末端配列は、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラテラルフロー免疫アッセイ、凝集アッセイなど）での検出の際に、本発明のペプチドの提示を向上させるように設計された柔軟な配列を含むか、またはその配列からなることができる。このような柔軟な配列は、当業者であれば、容易に同定できる。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、２０個以上（例えば、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、またはそれを超える数）のアミノ酸残基を含むか、またはそのアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、３０個以上（例えば、３１個、３２個、３３個、３４個、またはそれを超える数）のアミノ酸残基を含むか、またはそのアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、３５個以上（例えば、３６個、３７個、３８個、３９個、またはそれを超える数）のアミノ酸残基を含むか、またはそのアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、４０個以上（例えば、４１個、４２個、４３個、４４個、またはそれを超える数）のアミノ酸残基を含むか、またはそのアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、４５個以上（例えば、４６個、４７個、４８個、４９個、またはそれを超える数）のアミノ酸残基を含むか、またはそのアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、５０個以上（例えば、５１個、５２個、５３個、５４個、またはそれを超える数）のアミノ酸残基を含むか、またはそのアミノ酸残基からなる。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはそれを超える数のアミノ酸残基を含むか、またはそのアミノ酸残基からなる。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、約２０〜約７５個のアミノ酸、約２５〜約６５個のアミノ酸、または約３０〜約５５個のアミノ酸を含むか、またはそのアミノ酸からなる。
【００６８】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書に記載されているペプチド配列のエピトープを含む。例えば、特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５４３からなる群から選択した配列のエピトープを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書に記載されているペプチド配列の断片を含む。例えば、特定の実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５４３からなる群から選択した配列の断片を含む。その断片は、例えば、少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、または４４個のアミノ酸の長さであることができる。この断片は、少なくとも４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、または６６個のアミノ酸の長さであることもできる。いくつかの実施形態では、この断片は、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、または６６個以下のアミノ酸の長さである。この断片は、連続的であることも、１つ以上の欠失（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを超える数のアミノ酸残基の欠失）を含むこともできる。例えば、一実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の断片を含む。このような断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、または３５個の連続するアミノ酸を含んでよい。いくつかの実施形態では、この断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の１〜３５番目のアミノ酸を含む。したがって、一実施形態では、本発明のペプチドは、
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という配列を含むか、またはその配列からなり、その配列中、Ｘ５は、ＶまたはＡからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ７は、Ｇ、Ｉ、またはＨからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１１は、Ｅ、Ｎ、またはＱからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ１８は、ＤまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２１は、Ｒ、Ｄ、またはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２５は、Ｑ、Ｄ、またはＥからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ２８は、ＥまたはＮからなる群から選択したアミノ酸であり、Ｘ３１は、ＬまたはＶからなる群から選択したアミノ酸である。
【００７０】
本明細書に記載されているペプチド配列の断片を含む本発明のペプチドは、追加のＮ末端ペプチド配列、追加のＣ末端ペプチド配列、またはこれらを組み合わせたものを更に含むことができる。追加のＮ末端ペプチド配列とＣ末端ペプチド配列は、上記のとおりであることができる。
【００７１】
追加のＮ末端ペプチド配列またはＣ末端ペプチド配列を含む本発明のペプチドは、ペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のペプチド、またはその断片）を追加のＮ末端ペプチド配列またはＣ末端ペプチド配列と連結するリンカーを更に含むことができる。このリンカーは例えば、ペプチドスペーサーであることができる。このようなスペーサーは、例えば、約１〜５個（例えば約３個）のアミノ酸残基、好ましくは無電荷アミノ酸、例えば、グリシンまたはアラニンのような脂肪族残基からなることができる。一実施形態では、スペーサーは、３つのグリシンからなるスペーサーである。別の実施形態では、スペーサーは、３つのアラニンからなるスペーサーである。別の実施形態では、スペーサーは、５つのグリシンアミノ酸からなる。更に別の実施形態では、スペーサーは、グリシン残基とアラニン残基の両方からなる。あるいは、リンカーは、化学的な（すなわちペプチドでない）リンカーであることができる。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、合成化学によって作製する（すなわち「合成ペプチド」）。別の実施形態では、本発明のペプチドは、生物学的に（すなわち、リボソームのような細胞機構によって、細胞発現系で、またはインビトロ翻訳系で）作製する。特定の実施形態では、本発明のペプチドは単離されている。本明細書で使用する場合、「単離」ペプチドは、合成的または生物学的に作製してから、ペプチドを作製するために用いた化学物質および／または細胞機構から少なくとも部分的に精製したペプチドである。特定の実施形態では、本発明の単離ペプチドは、実質的に精製されている。「実質的に精製されている」という用語は、本明細書で使用する場合、細胞物質（タンパク質、脂質、炭水化物、核酸など）、培地、化学的前駆体、ペプチドの合成で用いた化学物質、またはこれらの組み合わせを実質的に含まないペプチドのような分子を指す。実質的に精製されているペプチドにおける細胞物質、培地、その他のポリペプチド、化学的前駆体、および／またはペプチドの合成で用いた化学物質は、約４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、１％、またはそれ未満である。したがって、実質的に純粋なペプチドのような分子は、乾燥重量で少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％が対象の分子であることができる。本発明の単離ペプチドは、例えばキットの一部として、水中に存在することも、緩衝液中に存在することも、または再構成するための乾燥形態であることもできる。本発明の単離ペプチドは、製薬学的に許容可能な塩の形態であることができる。本発明のペプチドと塩を形成できる好適な酸および塩基は、当業者に周知であり、無機および有機の酸および塩基を含む。
【００７３】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、アフィニティー精製されている。例えば、特定の実施形態では、本発明のペプチドは、そのペプチドが抗アナプラズマ抗体（例えば、ＭＳＰ２／ｐ４４またはＯＭＰ／ｐ４４タンパク質、および任意で他のアナプラズマ抗原に対する抗体）に結合する能力によって、そのような抗体を本発明のペプチドと接触させて、ペプチド・抗体複合体が形成できるようにし、そのペプチド・抗体複合体を洗浄して不純物を除去してから、ペプチドを抗体から溶出することによって精製されている。この抗体は例えば、固体支持体に結合させることができる。アフィニティー精製の方法は、当業者には周知かつ常法である。
【００７４】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは修飾されている。本発明のペプチドは、熱変性のような様々な技法、および／または界面活性剤（例えばＳＤＳ）によって修飾されていてよい。あるいは、本発明のペプチドは、１つ以上の更なる部分との結合によって修飾されていてよい。この結合は、共有結合または非共有結合であることができ、例えば、リシンもしくはシステインのような末端アミノ酸リンカー、化学的カップリング剤、またはペプチド結合を介したものであることができる。この追加の部分は、例えば、リガンド、リガンド受容体、融合パートナー、検出可能な標識、酵素、またはペプチドを固定化する基材であることができる。
【００７５】
本発明のペプチドは、ビオチン（例えば、システインもしくはリシン残基を介する）、脂質分子（例えば、システイン残基を介する）、または担体タンパク質（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃドメイン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）。例えば、システインまたはリシン残基を介する）のようなリガンドにコンジュゲートしていることができる。ビオチンのようなリガンドへの結合は、ペプチドを、アビジン、ストレプトアビジン、ポリマーストレプトアビジン（例えばＵＳ２０１０／００８１１２５およびＵＳ２０１０／０２６７１６６を参照されたい。いずれの特許出願も、参照により本明細書に援用される）、またはニュートラアビジンのようなリガンド受容体と結合させるのに有用であり得る。そして、アビジン、ストレプトアビジン、ポリマーストレプトアビジン、またはニュートラアビジンは、シグナル伝達部分（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、もしくはβ−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）のような酵素、または金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルのような金属ナノ物質（例えばコロイド金）、蛍光部分、もしくは量子ドットのように可視化できる他の部分）、あるいは固体基材（例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）、ニトロセルロース膜、またはＰｏｒｅｘ（登録商標）膜）に連結できる。あるいは、本発明のペプチドは、アビジン、ストレプトアビジン、ポリマーストレプトアビジン、またはニュートラアビジンのようなリガンド受容体に融合または連結でき、それにより、ペプチドと、ビオチンのような対応するリガンドおよびリガンド受容体に連結するいずれかの部分（例えばシグナル伝達部分）または固体基材との結合を促す。他のリガンド・受容体対の例は、当該技術分野において周知であり、同様に用いることができる。
【００７６】
本発明のペプチドは、精製を高めたり、宿主細胞におけるそのペプチドの発現を強化したり、検出を補助したり、そのペプチドを安定化させるなどのために用いることができる融合パートナー（例えば、ペプチドまたはその他の部分）に融合できる。融合パートナーに適する化合物の例としては、担体タンパク質（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリンＦｃドメイン、ＫＬＨ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒスチジンタグなどが挙げられる。この融合は、例えばペプチド結合によって実現できる。例えば、本発明のペプチドと融合パートナーは、融合タンパク質であることができ、フレームを揃えて直接融合することも、追加のＮ末端ペプチド配列およびＣ末端ペプチド配列との関連で上述したように、ペプチドリンカーを含むこともできる。特定の実施形態では、本発明のペプチド集団は、例えば、ＭＡＰＳ構造におけるように、デンドリマーによって連結できる。
【００７７】
加えて、本発明のペプチドを修飾して、様々な既知の化学基または分子のいずれかを含めてもよい。このような修飾としては、グルコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ポリエチレングリコールへの共有結合（例えばＰＥＧ化）、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グルコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ユビキチン化、脂肪酸による修飾、アルギニル化のようなアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ媒介付加などが挙げられるが、これらに限らない。アミノ酸（非天然アミノ酸を含む）の類縁体と、置換された連結部を有するペプチドも含まれる。本明細書に論じられている配列のいずれかからなる本発明のペプチドは、論じた修飾のいずれかによって修飾されていてもよい。このようなペプチドは、依然としてアミノ酸「からなる」。
【００７８】
上で定めたような修飾は、当業者には周知であり、科学文献に非常に詳細に説明されている。特に一般的ないくつかの修飾、グルコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、およびＡＤＰリボシル化は例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）のような多くの基本的なテキストに記載されている。この件については、Ｗｏｌｄ，Ｆ．，Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １−１２（１９８３）、Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６、およびＲａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２などで、多くの詳細な検討が行われている。
【００７９】
特定の実施形態では、本発明のペプチドは、固体または半固体支持体のような基材に結合または固定化されている。この結合は、共有結合であることも、非共有結合であることもでき、担体、支持体、または表面に結合されている成分に対して高い親和性を有する部分など、共有結合または非共有結合を可能にするペプチドと結び付く部分によって促進できる。例えば、本発明のペプチドは、ビオチンのようなリガンドと結び付くことができ、その表面と結び付く成分は、アビジンのような、対応するリガンド受容体であることができる。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、融合パートナー、例えば、ペプチドの基材への結合を促進するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と結び付くことができる。別の実施形態では、本発明のペプチドは、金属ナノ層を介して、基材に結合または固定化されている。一実施形態では、その金属ナノ層は、カドミウム、亜鉛、水銀、または金、銀、銅、および白金などの貴金属から構成されている。本発明のペプチドまたはペプチド集団は、免疫アッセイ中に、抗体を含むサンプルを加える前または後に、基材に結合または固定化できる。
【００８０】
特定の実施形態では、基材は、コロイド粒子（例えば、金、銀、白金、銅、カドミウム、金属複合材、その他の軟質金属、コア・シェル構造粒子、もしくは中空金ナノスフェアから作られたコロイドナノ粒子）またはその他のタイプの粒子（例えば、磁気ビーズ、またはシリカ、ラテックス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアクリレート、ＰＶＤＦ、もしくはＰＭＭＡを含む粒子もしくはナノ粒子）のような単一または複数のビーズである。このような粒子は、標識（例えば、比色標識、化学発光標識、量子ドット標識、または蛍光標識）を含むことができ、免疫アッセイ中にペプチドの位置を可視化するのに有用であり得る。特定の実施形態では、本発明のペプチドの末端システインを用いて、そのペプチドを金属ナノ物質またはナノ構造体に直接結合させる。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態で用いる金属ナノ物質またはナノ構造体は、金、銀、白金、パラジウム、銅、カドミウム、金属複合材、またはその他の軟質金属で作製できる。いくつかの実施形態では、金属ナノ物質またはナノ構造体（複合ナノ構造体を含む）は、球形ナノ粒子、角錐形ナノ粒子、六角形ナノ粒子、ナノシェル、ナノプレート、ナノチューブ、ナノワイヤ、およびこれらの組み合わせから選択した形状を有する。金属ナノシェルの例としては、金中空スフェア、金被覆シリカナノシェル、およびシリカ被覆金シェルが挙げられる。ナノプレートの横寸法（例えば辺の長さ）は、その厚みよりも大きい。ナノプレートとしては、ナノディスク、ナノポリゴン、ナノヘキサゴン、ナノキューブ、ナノリング、ナノスター、およびナノプリズムが挙げられる。いくつかの実施形態では、金属ナノ構造体は、他の形状または異形を有する。特定の実施形態では、金属ナノ構造体のサイズと形状は均一ではなく、すなわち、金属ナノ構造体は、形とサイズの異なるナノ構造体の不均一混合物である。
【００８２】
球形ナノ粒子の場合、好適な直径範囲としては、約５ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、および約２０ｎｍ〜約６０ｎｍが挙げられる。ナノプレートの場合、辺の長さは、約１０ｎｍ〜約８００ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５００ｎｍ、約５０ｎｍ〜約２００ｎｍ、約３０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または約１０ｎｍ〜約３００ｎｍであってよい。ナノプレートの厚みは、約１〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、または約５ｎｍ〜約２０ｎｍの範囲であることができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ナノプレートのアスペクト比は、２よりも大きい。アスペクト比は、辺の長さの厚みに対する比である。ナノプレートのアスペクト比は、約２〜約２５、約３〜約２０、約５〜約１０、約２〜約１５、または約１０〜約３０であるのが好ましい。
【００８４】
特定の実施形態では、基材は、ドットブロットまたはラテラルフロー免疫アッセイ用器具の流路である。例えば、本発明のペプチドは、ＰＶＤＦ膜（例えばＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）膜）、ニトロセルロース膜、ポリエチレン膜、ナイロン膜、または類似のタイプの膜のような多孔質膜に結合または固定化できる。
【００８５】
特定の実施形態では、基材は、分析または遠心分離ローターの流路である。別の実施形態では、基材は、ＥＬＩＳＡアッセイで用いるのに適するプレート（例えばマイクロタイタープレート）のウェルのような管、またはウェルである。このような基材としては、ガラス、セルロース系材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、もしくはポリエステルのような熱可塑性ポリマー、粒子材（例えば、ガラスもしくは各種の熱可塑性ポリマー）から形成された焼結構造体、またはニトロセルロース、ナイロン、ポリスルホンなどから構成されたキャスト膜フィルムを含むことができる。基材は、ポリエチレンの焼結微粒子（多孔性ポリエチレンとして一般的に知られている）、例えば、Ｃｈｒｏｍｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ニューメキシコ州アルバカーキ）の０．２〜１５マイクロメートルの多孔性ポリエチレンであることができる。これらの基材材料のいずれも、フィルム、シート、またはプレートのような好適な形状で用いることができ、あるいは、これらの材料は、紙、ガラス、プラスチックフィルム、または布のような適切な不活性担体にコーティング、接着、またはラミネートしてもよい。ペプチドを固体相に固定化するのに適する方法としては、イオン相互作用、疎水性相互作用、共有結合性相互作用などが挙げられる。
【００８６】
したがって、別の態様では、本発明は器具を提供する。特定の実施形態では、その器具は、免疫アッセイを行うのに有用である。例えば、特定の実施形態では、その器具はラテラルフロー免疫アッセイ用器具である。本発明のペプチドを含む例示的なラテラルフロー免疫アッセイ用器具が実施例２に説明されている。特定の実施形態では、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具は、ペプチド集団を含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を含む。いくつかの実施形態では、その器具は、ペプチドまたはペプチド集団が結合している複数のビーズから構成されたスライドである。例えば、間接蛍光抗体アッセイで用いるのに適する、本発明のペプチドを含むこのような器具の例は、実施例３で説明されている。別の実施形態では、その器具は、分析もしくは遠心分離ローターである。別の実施形態では、その器具は、ドットブロット、スロットブロット、またはウエスタンブロットである。別の実施形態では、その器具は、管またはウェル、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに適するプレートのウェルである。ＥＬＩＳＡアッセイで用いられる本発明のペプチドを含む例示的な器具は、実施例１で説明されている。更に別の実施形態では、その器具は、電気化学センサー、光学センサー、またはオプトエレクトロニクスセンサーである。
【００８７】
特定の実施形態では、本発明の器具は、本発明のペプチドまたはペプチド集団を含む。別の実施形態では、本発明の器具は、本発明の様々なペプチドの混合物を含む。例えば、特定の実施形態では、本発明の器具は、２種類、３種類、４種類、またはそれ以上の本発明のペプチドを含む。特定の実施形態では、そのペプチドまたは集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列、またはその断片を含む。別の実施形態では、そのペプチドまたは集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列、またはその断片を含む。特定の実施形態では、そのペプチド集団は、任意で金属ナノ層を通じて、本発明の器具に結合または固定化されている。その器具を用いて、同時に、サンプルにおいて、複数の菌種（例えば、Ａ．ファゴサイトフィラム、Ａ．プラティス、およびＡ．マージナーレ）由来のアナプラズマ抗原に対する抗体の存在を検出してよい。一実施形態では、本発明の器具は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含む。別の実施形態では、本発明の器具は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含む。別の実施形態では、本発明の器具は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含む。更に別の実施形態では、本発明の器具は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の配列を含む。別の実施形態では、本発明の器具は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９の配列を含む。
【００８８】
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを１つ以上含む組成物を提供する。例えば、特定の実施形態では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含むペプチド、またはそれらの集団を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、またはそれを超えるペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義されるあらゆる考え得るペプチド）の集団を含む。したがって、本発明は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を提供し、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含む。特定の実施形態では、その集団または混合物内のペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端付加物を含み、ならびに／または本明細書に記載されているように、（例えば、１つ以上の更なる部分との結合によって）修飾されている。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、同じＮ末端および／またはＣ末端付加物を含む。別の実施形態では、本発明のペプチドは、異なるＮ末端および／またはＣ末端付加物を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含むペプチド、またはそれらの集団を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、またはそれを超えるペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によって定義されるあらゆる考え得るペプチド）の集団を含む。したがって、本発明は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を提供し、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含む。特定の実施形態では、その集団または混合物内のペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端付加物を含み、ならびに／または本明細書に記載されているように、（例えば、１つ以上の更なる部分との結合によって）修飾されている。特定の実施形態では、本発明のペプチドは、同じＮ末端および／またはＣ末端付加物を含む。別の実施形態では、本発明のペプチドは、異なるＮ末端および／またはＣ末端付加物を含む。
【００９０】
更に別の実施形態では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４３の配列を含むペプチド、またはそれらの集団を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、またはそれを超えるペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４３によって定義されるあらゆる考え得るペプチド）の集団を含む。したがって、本発明は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を提供し、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含む。別の実施形態では、本発明は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を提供し、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列を含む。別の実施形態では、本発明は、３種類以上のペプチドを含む単離ペプチド集団を提供し、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４３の配列を含む。その集団または混合物内のペプチドは、Ｎ末端および／もしくはＣ末端付加物を含んでよく、ならびに／または本明細書に記載されているように、（例えば、１つ以上の更なる部分との結合によって）修飾されていてよい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、単離ペプチド集団を含み、その集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、または９の配列、またはその断片を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載されている少なくとも２種類のペプチド集団を含む。特定の実施形態では、ペプチド集団の少なくとも１つが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義される（すなわち、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列またはその断片を含む）。
【００９３】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、第２の単離ペプチド集団を更に含む。いくつかの実施形態では、第２のペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７によって定義される。いくつかの他の実施形態では、第２のペプチド集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列またはその断片を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、第１および第２のペプチド集団とは異なる第３の単離ペプチド集団を更に含む。特定の実施形態では、第３のペプチド集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列またはその断片を含む。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義される第１のペプチド集団と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７によって定義される第２のペプチド集団と、各ペプチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列またはその断片を含む第３のペプチド集団という３種類のペプチド集団を含む。
【００９６】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、本発明の１つ以上のペプチド（または１つ以上のペプチド集団）と、１つ以上の追加のペプチド（アナプラズマペプチドもしくは抗原、１つ以上のエーリキアの菌種由来のペプチドもしくは抗原、および／または１つ以上のボレリアの菌種由来のペプチドもしくは抗原など）を含む。アナプラズマペプチドまたは抗原は、いずれかのアナプラズマ表面ペプチドもしくは抗原、または本明細書に記載されているいずれかのペプチドもしくは抗原であることができる。例えば、特定の実施形態では、本発明の組成物は、ペプチドの混合物を含み、その各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列を有する。別の実施形態では、本発明の組成物は、ペプチドの混合物を含み、その各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列を有する。
【００９７】
本発明のアナプラズマペプチドと混合できる好適なエーリキアペプチドとしては、いずれかのエーリキア表面ペプチドまたは抗原が挙げられ、ＯＭＰ−１、ｐ３８、ｐ４３、ｐ１２０、ｐ１４０、ｐ１５３、ｐ１５６、ｐ２００、ｇｐ１９、ｇｐ３６、ｇｐ４７、ｇｐ２００、もしくはＨＧＥ−３タンパク質、またはそれらのいずれかの断片もしくはエピトープが挙げられるが、これらに限らない。その他の好適なエーリキアペプチドとしては、米国出願番号１４／０５２，２９６および米国特許番号８，８２８，６７５に記載されているペプチドが挙げられ、これらの各出願および特許の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。本発明のアナプラズマペプチドと混合できる好適なボレリアペプチドとしては、いずれかのボレリア表面ペプチドまたは抗原が挙げられ、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、ＤｂｐＡ、鞭毛関連タンパク質ＦｌａＡ（ｐ３７）と、ＦｌａＢ（ｐ４１）、ＯｓｐＣ（２５ｋｄ）、ＢＢＫ３２、ＢｍｐＡ（ｐ３９）、ｐ２１、ｐ３９、ｐ６６、もしくはｐ８３タンパク質、またはこれらのいずれかの断片もしくはエピトープが挙げられるが、これらに限らない。その他の好適なボレリアペプチドとしては、米国特許番号８，５６８，９８９および同８，７５８，７７２に記載されているペプチドが挙げられ、これらの各特許の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。その組み合わせは、個々のペプチドまたはポリペプチドのカクテル（単純混合物）を含んでよく、融合ペプチドまたはポリペプチド（例えば多量体ペプチド）の形態であってよく、あるいは、それらのペプチドは、任意で連結残基（例えばリシンまたはシステイン残基）を通じて、（例えば、ＭＡＰＳ構造におけるように）デンドリマーによって連結されていてよい。例えば、特定の実施形態では、組成物は、本発明の１つ以上のペプチド（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４３の配列を有するペプチド）と、１つ以上の抗原エーリキアペプチドおよび／または１つ以上の抗原ボレリアペプチドを含む。
【００９８】
組成物が複数のペプチドまたはペプチド集団を含むときには、例えば感度と選択性の面でその組成物の性能を調整するために、その様々なペプチドまたはペプチド集団の比率を変えることができる。例えば、２つのペプチド集団を含む組成物では、２つのペプチド集団のモル比は、２０：１〜１：２０の間のいずれか、例えば、２０：１、１０：１、５：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：５、１：１０、または１：２０と様々であることができる。あるいは、その重量比（％）は、９５：５〜５：９５の間、例えば、９５：５、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、または５：９５と様々であることができる。３個以上のペプチド集団を含む組成物では、各ペプチド集団のモル比または重量比（％）は、３つの全てのペプチド集団の総モルまたは総重量の１％〜９８％、例えば、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％などと様々であることができる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＡＰＬ−ＩＤ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義される）と、ＡＰＬ−ＩＤ５．１（各ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む）と、ＡＰＬ−ＩＤ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７によって定義される）という３つのペプチド集団を５０：２５：２５の重量比で含む。別の実施形態では、本発明の組成物は、ＡＰＬ−ＩＤ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義される）と、ＡＰＬ−ＩＤ５．１（各ペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む）と、ＡＰＬ−ＩＤ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７によって定義される）という３つのペプチド集団を含み、各ペプチド集団が、重量比で組成物の３分の１を構成する。
【００９９】
本発明のペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端で、別の好適なペプチドに融合されていてよい。本発明のペプチドの２つ以上のコピーを、単独でまたは１つ以上の追加のペプチドと組み合わせて、互いに連結させてもよい。融合および非融合ペプチドまたはポリペプチドを組み合わせたものを用いることができる。一実施形態では、追加のペプチド（単一または複数）は、アナプラズマペプチドもしくは抗原、感染性アナプラズマの菌種由来のペプチドもしくは抗原、またはアナプラズマ病の原因物質由来のペプチドもしくは抗原由来のＢ細胞および／またはＴ細胞エピトープを含む。
【０１００】
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードする配列を含む核酸を提供する。本発明の核酸は、全微生物ゲノムよりも少ない配列を含み、一本鎖であることも、二本鎖であることもできる。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成したＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはこれらの組み合わせであることができる。本発明の核酸は、タンパク質、脂質、および他のポリヌクレオチドのような他の成分を含まないように精製できる。例えば、核酸は、５０％、７５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％精製することができる。本発明の核酸は、本明細書に記載されているペプチドをコードする。特定の実施形態では、本発明の核酸は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜５４３の配列を有するペプチド、またはそれらの組み合わせをコードする。本発明の核酸は、リンカー、シグナル配列、ＴＭＲ輸送停止配列、膜貫通ドメイン、またはタンパク質精製に有用なリガンド（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、ＭＢＰタグ、およびブドウ球菌プロテインＡなど）をコードする配列のようなその他のヌクレオチド配列を含むことができる。
【０１０１】
本発明の核酸は、単離することができる。「単離」核酸は、その核酸が天然において結びついている５'および３'側のフランキングゲノム配列の１つまたは両方と直に連続していない核酸である。単離核酸は、例えば、いずれかの長さの組み換えＤＮＡ分子であることができる。ただし、天然のゲノムにおいて、その組み換えＤＮＡ分子と天然において直に隣接していることが分かっている核酸配列が除去されているか、または存在しないことを条件とする。単離核酸は、天然に存在しない核酸分子も含む。本発明の核酸は、免疫原性ペプチドをコードする断片も含むことができる。本発明の核酸は、完全長ポリペプチド、ペプチド断片、および変異または融合ペプチドをコードすることができる。
【０１０２】
本発明の核酸は、少なくとも部分的に、例えば、感染者から採った血液、血清、唾液または組織のような生体サンプルに存在する核酸配列から単離できる。核酸は、実験室で、例えば自動合成機を用いて合成することもできる。ＰＣＲのような増幅法を用いて、核酸を、少なくとも部分的に、本発明のポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかから増幅できる。
【０１０３】
本発明の核酸は、天然のポリペプチドのコーディング配列を含むことも、天然では生じない改変配列をコードすることもできる。所望の場合、核酸は、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー、または宿主細胞において本発明のポリヌクレオチドの発現を駆動するその他の調節エレメントを含む発現調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングできる。発現ベクターは例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、もしくはＣｏｌＥ１のようなプラスミド、またはアデノウイルス２型ベクターもしくは５型ベクターのようなアデノウイルスベクターであることができる。任意で、他のベクターを用いることができ、シンドビスウイルス、シミアンウイルス４０、アルファウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ならびにサイトメガロウイルスおよびレトロウイルスベクター（マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスなど）が挙げられるが、これらに限らない。ＭＣおよびＭＣ１のようなミニ染色体、バクテリオファージ、ファージミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、コスミド（ラムダファージのｃｏｓ部位が挿入されたプラスミド）、ならびにレプリコン（それ自体の制御下で、細胞内で複製できる遺伝要素）も用いることができる。
【０１０４】
発現調節配列に機能可能に連結したポリヌクレオチドを調製するとともに、それらを宿主細胞内で発現させる方法は、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許番号４，３６６，２４６を参照されたい。本発明の核酸は、そのポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を誘導する１つ以上の発現調節エレメントに隣接して、またはそのエレメントの近くに位置するときに、機能可能に連結されている。
【０１０５】
したがって、例えば、本発明のペプチドは、従来の遺伝子工学技法に従って、遺伝子組み換えによって作製できる。本発明の組み換えペプチドを作製するには、そのペプチドをコードする核酸を適切な発現系に挿入する。概して、所定のペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、そのペプチドの発現を可能にする発現調節配列に機能可能に連結されている組み換え分子またはベクターを構築する。適切な発現ベクターは、多くのタイプが当該技術分野において知られており、例えば、細菌発現系、ウイルス発現系、酵母発現系、糸状菌発現系、昆虫細胞発現系、または哺乳動物発現系を含むベクターが挙げられる。このような発現ベクターを入手および使用する方法は周知である。この技法および本発明の組成物または方法で用いるその他の分子生物学的技法の手引きについては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８：２７７−２９８（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６２，（Ｔｕａｎ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（ｃｕｒｒｅｎｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、ならびに本明細書に引用されている参照文献を参照されたい。
【０１０６】
したがって、本発明は、本発明の核酸を含むベクターと、そのようなベクターを含む宿主細胞も提供する。特定の実施形態では、このベクターはシャトルベクターである。別の実施形態では、このベクターは発現ベクター（例えば、細菌発現ベクターまたは真核細胞発現ベクター）である。特定の実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。
【０１０７】
本発明の組み換え核酸またはベクターの発現に適する宿主細胞もしくは細胞系は、細菌細胞を含む。例えば、バイオテクノロジー分野では、様々なＥ．ｃｏｌｉ株（例えばＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）が宿主細胞として周知である。様々なＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株、およびその他のバチルス株などを用いて、本発明の核酸またはベクターを発現させることもできる。あるいは、本発明のペプチドは、従来の手順を用いて、酵母、昆虫、哺乳動物、またはその他の細胞種の中で発現させることができる。無細胞インビトロ合成および／または酵素を介する合成機構も用いてよい。
【０１０８】
本発明は、組み換えペプチドまたはポリペプチドを作製する方法であって、例えばエレクトロポレーションのような従来の手段によって、発現調節配列（例えば転写調節配列）の制御下で、本発明のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションまたはトランスフォーメーションすることを含む方法も提供する。続いて、本発明のペプチドまたはポリペプチドを発現させる条件下で、トランスフェクションまたはトランスフォーメーションした宿主細胞を培養する。ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどを用いる順相または逆相などの液体クロマトグラフィー、無機リガンドまたはモノクローナル抗体などによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、固定化金属キレートクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含め、当業者に既知の適切な手段によって、発現したペプチドまたはポリペプチドを細胞から（または細胞外で発現させた場合には培地から）回収し、単離し、任意で精製する。当業者は、本発明の範囲から逸脱せずに、最適な単離および精製技法を選択できる。当業者は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、カラムクロマトグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、アミノ末端アミノ酸分析、定量的アミノ酸分析を含む標準的な方法を用いることによって、ペプチドまたはポリペプチドの純度を測定できる。
【０１０９】
方法
別の態様では、本発明は、サンプル中で、アナプラズマ抗原のエピトープに対する抗体を検出する方法を提供する。一実施形態では、この方法は、サンプルを本発明のペプチドと接触させることと、そのペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出することを含み、その複合体の形成によって、そのサンプル中に、アナプラズマ抗原のエピトープに対する抗体が存在することが示される。いくつかの実施形態では、アナプラズマ抗原は、アナプラズマ・ファゴサイトフィラム、アナプラズマ・プラティス、またはアナプラズマ・マージナーレのような感染性アナプラズマの菌種由来のものである。本発明の方法を用いて、アナプラズマ病に関与している他のアナプラズマ菌種も検出できる。ただし、それらの菌種が、本発明のペプチドと特異的に反応できる抗体を誘導することを条件とする。したがって、「病原性アナプラズマ」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒトまたは動物においてアナプラズマ病を引き起こすこのようないずれのアナプラズマの菌種も指すことを理解されたい。特定の実施形態では、この方法によって、サンプルにおいて、複数の菌種に由来するアナプラズマ抗原に対する抗体を同時に検出する。
【０１１０】
特定の実施形態では、サンプルにおいて、アナプラズマ抗原のエピトープに対する抗体を検出する方法は、２種類、３種類、４種類、またはそれ以上（例えば、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１５種類、２０種類、２５種類、３０種類、４０種類、５０種類、６０種類、７０種類、８０種類、９０種類、１００種類、１５０種類、２００種類、２５０種類、３００種類、４００種類、５００種類、またはそれ以上）の本発明のペプチドの集団とサンプルを接触させることと、その集団内のそのペプチドを１つ以上含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出することとを含み、その複合体の形成により、そのサンプル中に、アナプラズマ抗原のエピトープに対する抗体が存在することが示される。例えば、１つの特定の実施形態では、この方法は、２種類以上の単離ペプチドの集団とサンプルを接触させることを含み、その各単離ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含む。別の特定の実施形態では、この方法は、２種類以上の単離ペプチドの集団とサンプルを接触させることを含み、その各単離ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含む。更に別の実施形態では、この方法は、２種類以上の単離ペプチドの集団とサンプルを接触させることを含み、その各単離ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、２種類以上の単離ペプチドの集団とサンプルを接触させることを含み、その各単離ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４３の配列を含む。特定の実施形態では、この方法は、本発明の１つ以上のペプチドと、１つ以上の他のペプチド（例えば、エーリキアペプチド、またはその抗原断片もしくはエピトープ、および／あるいは、ボレリアペプチド、またはその抗原断片もしくはエピトープ）との混合物とサンプルを接触させることを含む。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明のペプチドまたは集団内の各ペプチドは、単離（例えば、合成および／または精製）ペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドまたはペプチド集団は、固体支持体に結合または固定化されている。このような実施形態では、この固体支持体は、１つまたは複数のビーズ（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルのような金属ナノ物質、ナノ粒子、ラテックスビーズなど）、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具の流路（例えば多孔質膜）、分析もしくは遠心分離ローターの流路、ブロット（ウエスタンブロット、ドットブロット、もしくはスロットブロット）、管もしくはウェル（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに適するプレートのウェル）、センサー（例えば、電気化学センサー、光学センサー、またはオプトエレクトロニクスセンサー）である。いくつかの実施形態では、そのペプチドまたはペプチド集団は、金属ナノ層（いくつかの実施形態では、カドミウム、亜鉛、水銀、または貴金属（例えば、金、銀、銅、および白金）から構成されていてよい）を通じて、固体支持体に結合または固定化されている。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドまたはペプチド集団は、複合ナノ層（例えば銀と金を含む）または金被覆銀ナノ層に固定化されている。
【０１１２】
本発明のペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出する従来の方法には、多種多様なものがある。例えば、いくつかの実施形態では、この検出工程は、ＥＬＩＳＡまたは免疫蛍光アッセイを行うことを含む。別の実施形態では、この検出工程は、ラテラルフロー免疫アッセイを行うことを含む。別の実施形態では、この検出工程は、凝集アッセイ（例えば、赤血球凝集または粒子／ビーズ凝集アッセイ）を行うことを含む。更に別の実施形態では、この検出工程は、分析もしくは遠心分離ローター内でサンプルを回転させることを含む。いくつかの実施形態では、この検出工程は、ウエスタンブロット、スロットブロット、またはドットブロットを行うことを含む。特定の実施形態では、この検出工程は、波長シフトアッセイを行うことを含む。このような波長シフトアッセイは、金属ナノ層または金属ナノ粒子／ナノシェル／ナノプレートに結合されているペプチドに抗体が結合することに起因する、表面プラズモン共鳴または局所表面プラズモン共鳴波長の変化を測定するかまたは割り出すことを伴ってよい。別の実施形態では、この検出工程は、間接蛍光抗体検査を行うことを含む。いくつかの実施形態では、間接蛍光抗体検査は、アナプラズマ抗原に対する抗体を含んでいる疑いのあるサンプルと、本発明のペプチドをコートしたビーズ（例えばラテックスビーズ）（このビーズは更に、ガラススライドに固定化されている）とを反応させてから、そのスライドを蛍光標識抗イヌＩｇＧまたはＩｇＭ抗体と反応させて、結合した抗アナプラズマ抗体を検出することを含む。間接蛍光抗体検査の例は、実施例３で説明されている。更に別の実施形態では、この検出工程は、サンプルを電気化学センサー、光学センサー、またはオプトエレクトロニクスセンサーで分析することを含む。これらの様々なアッセイは、本明細書に説明されており、および／または当業者に周知である。
【０１１３】
一実施形態では、この方法は、１つ以上のアナプラズマ抗原（例えば、Ａ．ファゴサイトフィラム、Ａ．プラティス、またはＡ．マージナーレのような病原性アナプラズマ抗原）に対する天然の抗体であって、対象感染者の免疫系によって、その生体液または組織中で産生されるとともに、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドを組み合わせたもの、および任意で１つ以上の好適な追加の抗原ポリペプチドまたはペプチドに特異的に結合できる抗体の存在を検出することを含む。
【０１１４】
好適な免疫アッセイ方法は典型的には、抗体を含んでいる可能性のある体液または組織のサンプルを（例えば患者から）入手または獲得することと、特定のペプチド・抗体複合体（例えば、ペプチドの抗体への特異的結合）の形成に有効な条件で、アッセイ対象のサンプルを本発明のペプチドまたはペプチド集団と接触させる（例えば、インキュベートまたは反応させる）ことと、接触（反応）させたサンプルに、抗体・ペプチド反応が存在するかアッセイする（例えば、抗体・ペプチド複合体の量を割り出す）こととを含む。増量した抗体・ペプチド複合体の存在により、対象が感染性アナプラズマの菌種に暴露されて感染したことが示される。アナプラズマ抗原に対する抗体に「特異的に結合する」（例えば、その抗体に対して「特異的である」か、またはその抗体に「優先的に」結合する）ペプチドは、その修飾体を含め、その抗体の検出を可能にする量および十分な時間で、その抗体と相互作用するか、またはその抗体との物理的結合を形成するか、もしくは生じる。「特異的に」または「優先的に」とは、そのペプチドが、このような抗体に対して、サンプル中の他の抗体よりも高い親和性（例えば高い選択度）を有することを意味する。例えば、本発明のペプチドは、その抗体に対して、サンプル中の他の抗体よりも少なくとも約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、またはそれよりも大きい倍率分、高い親和性を有することができる。このような親和性または特異度は、例えば競合的結合法を含む様々な常法によって割り出すことができる。ＥＬＩＳＡアッセイでは、陽性反応は、健康なコントロール群の平均値よりも値が２または３標準偏差大きいとして定義する。いくつかの実施形態では、アナプラズマ病の明確な血清学的診断を行うには、第２段階のアッセイを必要とする。
【０１１５】
「抗体を含むサンプル」または「サンプル中の抗体を検出する」などの語句は、抗体が含まれないかまたは検出されないサンプルまたは判断（例えば検出の試み）を排除することを意味しない。一般的な意味においては、本発明は、感染性アナプラズマの菌種への感染に応じて産生される抗体が検出されるか否かにかかわらず、その抗体がサンプル中に存在するか判断する検査を含む。
【０１１６】
ペプチドと抗体が特異的に反応するようにする、ペプチドと抗体との反応の条件は、当業者に周知である。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ）を参照されたい。
【０１１７】
本発明の方法は、抗体を含む可能性のある体液または組織のサンプルを対象から入手または獲得することを含む。この抗体は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＡ型抗体であることができる。概して、例えば、感染の初期段階での検出には、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡ抗体を検出する。この方法で、上述した追加のペプチド（例えば、鞭毛タンパク質検出用のペプチド）のいくつかを用いると、ＩｇＧ抗体を検出できる。サンプルは、入手しやすいのが好ましく、静脈血液サンプル、またはさらには指の穿刺に由来する全血、血漿、もしくは血清であってよい。他の身体部分から採った組織、または脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、胃分泌液、粘液、尿などのような他の体液が、抗体を含んでいることが知られており、これらをサンプル源として用いてもよい。サンプルは、組織抽出液または細胞溶解液であってもよい。
【０１１８】
本発明のペプチドまたはペプチド集団とサンプル抗体を好適な培地中で反応可能にしたら、アッセイを行って、抗体・ペプチド反応の有無を判断する。当業者には明らかであろうが、多くの種類の好適なアッセイの中でも、免疫沈降法と凝集アッセイが挙げられる。
【０１１９】
本発明の特定の実施形態では、そのアッセイは、サンプル中の抗体（単一または複数）を固定化することと、本発明のペプチドまたはペプチド集団を加えることと、例えば、標識されているペプチドによって、または標識結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン・ＨＲＰ複合体やストレプトアビジン・コロイド金複合体）や、単一もしくは複数のペプチドを特異的に認識する標識抗体のような標識基質を加えることによって、単一または複数のペプチドまたはペプチドに結合した抗体の程度を検出することとを含む。例えば、図２を参照されたい。別の実施形態では、そのアッセイは、本発明のペプチドまたはペプチド集団を固定化することと、抗体を含むサンプルを加えることと、例えば、標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルのような金属ナノ物質、蛍光標識、酵素（例えば、ホースラディシュペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ））に直接もしくは間接的にコンジュゲートした本発明の別のペプチドもしくはペプチド集団を加えることによって、または、サンプル抗体を特異的に認識する結合パートナーもしくは標識抗体のような標識基質（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗イヌＩｇＧ抗体、抗イヌＩｇＭ抗体、抗ネコＩｇＧ抗体、抗ネコＩｇＭ抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ、もしくはこれらの組み合わせなど）を加えることによって、本発明の単一もしくは複数のペプチドに結合した抗体の量を検出することとを含む。例えば、図１、３、および４を参照されたい。
【０１２０】
別の実施形態では、そのアッセイは、本発明のペプチドまたはペプチド集団を固定化することと、抗体を含むサンプルを加えることと、例えば、サンプル抗体を特異的に認識する第１の結合パートナー（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗イヌＩｇＧ抗体、抗イヌＩｇＭ抗体、抗ネコＩｇＧ抗体、抗ネコＩｇＭ抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬなど）を加え、更に、第２の結合パートナー（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬなど）を加えることによって、本発明の単一または複数のペプチドに結合した抗体の量を検出することとを含み、この第２の結合パートナーは標識されているとともに、その第１の結合パートナーを認識する。更に別の実施形態では、そのアッセイは、固定化されているいずれの反応物質もなしに、本発明のペプチドまたはペプチド集団と、抗体を含むサンプルとを反応させてから、例えば、標識されているペプチドによって、または、本発明のペプチドを特異的に認識する標識結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン・ＨＲＰ複合体もしくはストレプトアビジン・コロイド金複合体）や標識抗体のような標識基質を加えることによって、抗体と単一または複数のペプチドとの複合体の量を検出することを含む。
【０１２１】
本発明のペプチドまたはペプチド集団の固定化は、共有結合であることも、非共有結合であることもでき、非共有結合による固定化は、非特異的であることができる（例えばマイクロタイターウェル内のポリスチレン表面に例えば非特異的に結合する）。固体または半固体担体、支持体、または表面への特異的または半特異的結合は、その結合に関連して、固体もしくは半固体担体、支持体、または表面への共有結合または非共有結合を可能にする部分を有するペプチドによって実現できる。例えば、この部分は、その担体、支持体、または表面に結合されている成分に対する親和性を有することができる。このケースでは、この部分は、例えば、６−アミノヘキサン酸など、そのペプチドのアミノ酸基に結合するビオチンもしくはビオチニル基、またはその類縁体であってよく、そして、その成分は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはその類縁体である。代替的なケースは、上記の部分がヒスチジンタグ（例えば６個の連続するヒスチジンアミノ酸）であり、担体が、Ｎｉ＋＋またはＣｏ＋＋イオンを帯びたニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）誘導体を含む状態である。特定の実施形態では、上記の部分は融合パートナー、例えばＢＳＡである。例示的な実施形態では、本発明のペプチドは、そのペプチドのＮ末端および／またはＣ末端残基を介して、ＢＳＡにコンジュゲートしていてよい。一実施形態では、１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、またはそれを超える本発明のペプチドは、ＢＳＡに置換されていてもよく、例えばＢＳＡとコンジュゲートしていてもよい。当業者であれば分かるように、置換レベルは、アッセイの感度に影響を及ぼすことがある。ペプチド分子の含有量が少ない高濃度のＢＳＡ−ペプチドによってもたらされる感度を得るには、低濃度の高度置換ＢＳＡが必要とされる。特定の他の実施形態では、融合パートナーはＭＡＰＳであってよい。特定の例示的な実施形態では、ＭＡＰＳは、４個、８個、またはそれを超える非対称な分岐からなってよい。
【０１２２】
好適な担体、支持体、および表面としては、金属ナノ層、ビーズ（例えば、磁気ビーズ、コロイド粒子、または金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルのような金属ナノ物質（コロイド金など）、またはシリカ、ラテックス、ポリスチレン、ポリカーボネート、もしくはＰＤＶＦを含む粒子もしくはナノ粒子など）、ラテックス、コポリマー（スチレン−ジビニルベンゼン、ヒドロキシル化スチレン−ジビニルベンゼン、ポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレンなど）、カーボンブラックのビーズ、非活性化またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニル活性化ガラス、エポキシ活性化多孔性磁性ガラス、ゼラチン、多糖粒子、その他のタンパク質粒子、赤血球細胞、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはこのような抗体のＦａｂ断片が挙げられるが、これらに限らない。
【０１２３】
特定の抗体の検出に抗原を用いる免疫アッセイのプロトコールは、当該技術分野において周知である。例えば、従来のサンドイッチアッセイを用いることも、従来の競合的アッセイ形態を用いることもできる。いくつかの好適なタイプのアッセイの考察については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（上記）を参照されたい。特定の実施形態では、本発明のペプチドまたはペプチド集団は、抗体を含むサンプルを加える前か後のいずれかに、共有または非共有結合によって、固体もしくは半固体表面または担体に固定化する。
【０１２４】
特異的結合アッセイ、特に免疫アッセイを行う器具は既知であり、本発明の方法での使用に容易に適合させることができる。固相アッセイは、概して、沈殿、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー、または磁気操作のような分離工程を必要とするヘテロジニアスなアッセイ法よりも、行うのが容易である。固相アッセイの方が、試薬の分離が速く、簡潔であるからである。固相アッセイ用の器具としては、マイクロタイタープレート、フロースルーアッセイ用器具（例えば、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具）、ディップスティック、およびイムノキャピラリーまたはイムノクロマトグラフィー免疫アッセイ用器具が挙げられる。
【０１２５】
本発明の実施形態では、固体もしくは半固体表面または担体は、マイクロタイターウェルの底面もしくは壁、フィルター表面もしくは膜（例えば、ニトロセルロース膜、もしくはＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）膜のようなＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜）、Ｐｏｒｅｘ（登録商標）膜のようなポリエチレン膜、中空糸、ビーズ状のクロマトグラフィー媒体（例えば、アガロースもしくポリアクリルアミドゲル）、磁気ビーズ、繊維状セルロースマトリックス、ＨＰＬＣマトリックス、ＦＰＬＣマトリックス、ペプチドが結合しているその分子が液相に溶解もしく分散されると、その分子がフィルターによって保持可能なサイズの分子を有する基材、ミセルを形成できるか、もしくミセルの形成時に沈殿でき、そのミセルの混入なしに液相を変化または変換可能にする物質、水溶性ポリマー、またはいずれかの他の好適な担体、支持体、もしくは表面である。
【０１２６】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のペプチドは、検出を可能にする好適な標識を備える（例えば、標識にコンジュゲートしている）。単独で、または他の組成物もくしは化合物と連動して、検出可能なシグナルをもたらすことのできる従来の標識を用いてよい。好適な標識としては、酵素（例えば、ＨＲＰ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識、量子ドット、放射性標識、着色ラテックス粒子、および金属がコンジュゲートした標識（例えば、金属ナノ層、金属ナノ物質がコンジュゲートした標識）が挙げられるが、これらに限らない。好適な金属ナノ物質としては、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、および金属ナノシェルが挙げられるが、これらに限らない。好適な金属ナノ物質標識としては、金粒子またはナノプレート、銀粒子またはナノプレート、銅粒子またはナノプレート、白金粒子またはナノプレート、パラジウム粒子またはナノプレート、カドミウム粒子またはナノプレート、複合粒子またはナノプレート、金中空スフェア、金被覆シリカナノシェル、およびシリカ被覆金シェルが挙げられるが、これらに限らない。検出可能な層に適する金属ナノ層としては、カドミウム、亜鉛、水銀、ならびに貴金属（金、銀、銅、および白金など）から構成されたナノ層が挙げられる。いくつかの実施形態では、この金属ナノ層は、複合金・銀、または金をコートした銀ナノ層を含む。
【０１２７】
好適な検出方法としては、例えば、直接または間接的にタグを付加された作用物質の比色アッセイによる検出（例えば、ＨＲＰまたはβ−ガラクトシダーゼ活性の検出）、光学顕微鏡、免疫蛍光顕微鏡（共焦点顕微鏡を含む）を用いた目視確認による検出、またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、オートラジオグラフィー（例えば、放射性標識作用剤の検出）、電子顕微鏡、免疫染色、細胞内分画などによる検出が挙げられる。一実施形態では、放射性要素（例えば放射性アミノ酸）がペプチド鎖に直接組み込まれており、別の実施形態では、蛍光標識が、ビオチン／アビジン相互作用、またはフルオレセインコンジュゲート抗体との結合などを介して、ペプチドと結合している。一実施形態では、当該抗体に対する検出可能な特異的結合パートナーを混合物に加える。例えば、結合パートナーは、検出可能な二次抗体、または第１の抗体に結合するその他の結合作用物質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、またはこれらの組み合わせ）であることができる。この二次抗体またはその他の結合作用物質は、例えば放射性標識、酵素標識、蛍光標識、量子ドット標識、発光標識、金属ナノ物質（金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェル（例えばコロイド金）など）、またはその他の検出可能な標識（アビジン／ビオチン系など）で標識することができる。別の実施形態では、結合パートナーは、本発明のペプチドまたはペプチド集団であり、このペプチドまたはペプチド集団は、直接または間接的に（例えばビオチン／アビジン相互作用を介して）酵素（ホースラディシュペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなど）、またはその他のシグナル伝達部分にコンジュゲートできる。このような実施形態では、検出可能なシグナルは、検出可能なシグナルを生成する酵素の基質（発色基質、蛍光基質、または化学発光基質など）を加えることによって生成される。
【０１２８】
結合したペプチドを検出するための「検出系」は、本明細書で使用する場合、そのペプチドに特異的な抗体のような検出可能な結合パートナーを含んでよい。一実施形態では、結合パートナーは、直接標識されている。別の実施形態では、結合パートナーは、好適な基質の存在下で検出可能なシグナルを生成できる酵素のようなシグナル生成試薬に結合されている。ペプチドを固定化するための表面は、任意で検出系を伴ってもよい。
【０１２９】
本発明のいくつかの実施形態では、検出手順は、抗体・ペプチド複合体の色の変化を目視確認すること、または抗体・ペプチド複合体の物理・化学的変化を確認することを含む。物理・化学的変化は、酸化反応またはその他の化学反応によって生じることができる。これらの変化は、目視で、または分光光度計を用いてなどによって検出してよい。
【０１３０】
特に有用なアッセイ形態は、ラテラルフロー免疫アッセイ形態である。ヒトまたは動物（例えば、イヌ、マウス、シカなど）免疫グロブリンに対する抗体、またはｓｔａｐｈ  Ａ、Ｇ、もしくはＬのタンパク質をシグナル生成体またはレポーター（例えばコロイド金）で標識でき、それを乾燥して、グラスファイバー製パッド（サンプル適用パッドまたはコンジュゲートパッド）上に配置する。本発明の診断用ペプチドまたはペプチド集団をニトロセルロースまたはＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜（例えばＩｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）膜）のような膜に固定化する。サンプル液（血液、血清など）をサンプル適用パッドに適用すると（またはコンジュゲートパッドに流すと）、その液が標識レポーターを溶解し、続いて、そのレポーターが、サンプル中の全ての抗体に結合する。続いて、得られた複合体が、毛細管現象によって次の膜（診断用ペプチドを含むＰＶＤＦまたはニトロセルロース）に運ばれる。診断用ペプチドまたはペプチド集団に対する抗体がサンプルに存在する場合、その抗体は、膜にストライプ状に固定化されている診断用ペプチドまたはペプチド集団に結合し、それによってシグナル（例えば、目に見えるか、可視化できるバンド）を生成する。標識抗体に特異的な追加の抗体、または第２の標識抗体を用いて、コントロールシグナルを生成できる。
【０１３１】
ラテラルフロー免疫アッセイの代替形態は、リガンド（例えばビオチン）にコンジュゲートしているとともに、標識したリガンド受容体（例えば、ストレプトアビジン−コロイド金）と複合体化されている本発明のペプチドまたは組成物を含む。この標識したペプチド複合体をサンプル適用パッドまたはコンジュゲートパッド上に配置できる。抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭもしくは抗動物（例えば、イヌ、マウス、シカ）ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体、または本発明のその他のペプチドが、検査部位（例えばテストライン）において、ニトロセルロースもしくはＰＶＤＦ、またはＰｏｒｅｘ（登録商標）膜のような膜に固定化されている。サンプルをサンプル適用パッドに加えると、サンプル中の抗体が、標識したペプチド複合体と反応し、その結果、本発明のペプチドに結合する抗体が間接的に標識される。続いて、サンプル中の抗体が、毛細管現象によって、次の膜（診断用ペプチドを含むＰＶＤＦ、Ｐｏｒｅｘ（登録商標）膜、またはニトロセルロース）に運ばれ、固定化されている抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭもしくは抗動物ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（またはプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ、もしくはこれらの組み合わせ）、あるいは固定化されている本発明のペプチドに結合する。サンプル抗体のいずれかが、標識した本発明のペプチドに結合した場合、検査部位において、このペプチドと結合している標識を見たり、または可視化したりできる。このタイプのラテラルフロー器具の別の実施形態であって、サンプル中の抗体と反応するように、本発明のペプチドを、検査部位における固定化捕捉物質としても、可溶性標識複合体としても用いる実施形態が、図１に示されている。このような実施形態では、検出シグナルを増幅するように、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルのような金属ナノ物質、ＨＲＰ、β−ＧＡＬ、ＡＬＰ、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、または量子ドット）にコンジュゲートしているプロテインＡ、プロテインＧ、および／またはプロテインＡ／Ｇ融合タンパク質を検査部位に適用し、この検査部位で、これらのタンパク質は、アナプラズマ抗原に対するいずれかの抗体であって、固定化されている本発明のペプチドによって捕捉された抗体のＦｃ領域に結合することになる。このアッセイに適するコントロールとしては、例えば、サンプル適用パッドまたはコンジュゲートパッドに配置したニワトリＩｇＹ−コロイド金コンジュゲート、および検査部位に近接して配置されたコントロール部位に固定化した抗ニワトリＩｇＹ抗体を挙げることができる。ニワトリ抗プロテインＡを手順的なコントロールラインとして用いてもよい。
【０１３２】
血液産物またはその他の生理液もしくは生体液をスクリーニングするための別のアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ、すなわちＥＬＩＳＡである。典型的にＥＬＩＳＡにおいては、本発明の単離ペプチドまたはペプチドの混合物もしくは集団は、直接、または捕捉マトリックス（例えば抗体）を通じて、マイクロタイターウェルの表面に吸着される。続いて、この表面上における残りの非特異的タンパク質結合部位を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、熱不活化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、またはＢＬＯＴＴＯブロッキング緩衝液（保存材、塩、および消泡剤も含む脱脂粉乳の緩衝液、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからＢｌｏｃｋｅｒ（商標）ＢＬＯＴＴＯとして入手可能）のような適切な物質でブロックする。続いて、そのウェルを、特異的抗アナプラズマ（例えば、抗Ａ．ファゴサイトフィラムまたは抗Ａ．プラティス）抗体を含んでいる疑いのある生体サンプルとともにインキュベートする。サンプルは、そのままの形で適用することができ、あるいは、それよりも多くの場合、サンプルは、通常は、少量（０．１〜５．０重量％）のタンパク質を含む緩衝液（ＢＳＡ、ＮＧＳ、またはＢＬＯＴＴＯなど）で希釈することができる。特異的結合を生じさせるのに十分な期間インキュベートした後、ウェルを洗浄して、結合しなかったタンパク質を除去してから、最適な濃度の適切な抗免疫グロブリン抗体（例えばヒト対象では、別の動物（イヌ、マウス、ウシなど）由来の抗ヒト免疫グロブリン（αＨｕＩｇ））または酵素もしくは別の標識に標準的な手順によってコンジュゲートしているとともに、ブロッキング緩衝液に溶解されている本発明の別のペプチドもしくはペプチド集団とともにインキュベートする。標識は、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ、β−ＧＡＬなどを含む様々な酵素から選択できる。再度、特異的結合を生じさせるのに十分な時間を置いてから、ウェルを再度洗浄して、結合しなかったコンジュゲートを除去し、酵素に適する基質を加える。色を発色させ、ウェルの中身の光学密度を目視または計器で割り出す（適切な波長において測定する）。カットオフＯＤ値は、アナプラズマ病が風土性でない区域の個体から採取した少なくとも５０個の血清サンプルの平均ＯＤ＋３標準偏差（ＳＤ）として定義しても、他のこのような従来の定義によって定義してもよい。非常に特異的なアッセイの場合には、ＯＤ＋２ＳＤをカットオフ値として用いることもできる。
【０１３３】
一実施形態のＥＬＩＳＡでは、本発明のペプチドまたはペプチド集団は、ストレプトアビジンまたは同等のビオチン結合化合物（アビジンもしくはニュートラアビジンなど）を、アルカリ性コーティング緩衝液中において最適な濃度でコートした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのような表面、または同様の固相に固定化し、４℃で一晩インキュベートする。標準的な洗浄緩衝液で好適な回数洗浄した後、従来のブロッキング緩衝液に溶解させた最適な濃度のビオチン化形態の本発明のペプチドまたは組成物を各ウェルに適用する。続いて、サンプルを加え、アッセイを上記のように行う。ＥＬＩＳＡアッセイを行う条件は、当該技術分野において周知である。
【０１３４】
別の実施形態のＥＬＩＳＡでは、本発明のペプチドまたはペプチド集団は、融合パートナー、例えばＢＳＡまたはＭＡＰＳを介して、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのような表面または同様の固相に固定化する。続いて、サンプルを加え、アッセイを上記のように行う。
【０１３５】
ＥＬＩＳＡアッセイの代替形態は、ＨＲＰのような適切な酵素に結合（例えば融合）した本発明のペプチド（単一または複数）を特徴とする。このようなＥＬＩＳＡを行う工程は、プレートのウェルに、抗イヌ、抗ネコ、または抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭをコートすることと、本発明のペプチドに対する抗体を含んでいる疑いのあるサンプルを、固定化した抗種ＩｇＧ／ＩｇＭとともにインキュベートすることと、反応しなかったサンプルを除去することと、ウェルを好適な洗浄緩衝液で洗浄することと、酵素に結合（例えば、ＨＲＰに結合）させた本発明のペプチドまたはペプチド集団を適用することと、そのペプチドをいずれかの捕捉抗アナプラズマ抗体と反応させることと、適切な酵素基質（例えばＴＭＢ）を加えることによって、酵素結合ペプチドを可視化することとを含む。
【０１３６】
別の実施形態では、本発明の方法は、凝集アッセイを含む。例えば、特定の実施形態では、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェル（例えばコロイド金など）、またはラテックスビーズを本発明のペプチドまたは組成物にコンジュゲートする。続いて、生体液をこのビーズ／ペプチドコンジュゲートとともにインキュベートし、それによって、反応混合物を形成させる。続いて、この反応混合物を分析して、抗体の存在を調べる。特定の実施形態では、凝集アッセイは、（１）競合的アッセイの場合には、本発明のペプチドもしくは組成物に特異的な抗体、または（２）サンドイッチアッセイの場合には、サンプル抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧもしくはＩｇＭ抗体、抗イヌＩｇＧもしくはＩｇＭ抗体、抗ネコＩｇＧもしくはＩｇＭ抗体など）を検出できる抗体にコンジュゲートしている金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェル（例えばコロイド金など）、またはラテックスビーズのような第２の粒子集団を用いることを含む。好適な凝集方法は、凝集の程度を評価する手段として、遠心分離を含むことができる。
【０１３７】
更に別の実施形態では、本発明のペプチドまたは組成物を、ニトロセルロース紙にエレクトロまたはドットブロットする。続いて、生体液（例えば血清または血漿）のようなサンプルを、ブロットした抗原とともにインキュベートし、その生体液中の抗体をその抗原（単一または複数）に結合させる。続いて、例えば標準的な免疫酵素法によって、あるいは、二次抗体に結合させた金属ナノ物質（金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルなど）またはその他の抗体結合物質（プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ、もしくはこれらの組み合わせなど）を用いる可視化によって、結合した抗体を検出できる。
【０１３８】
多くの従来のタンパク質アッセイ形態、特に免疫アッセイ形態は、対象において、アナプラズマ抗体と病原性アナプラズマ（例えば、Ａ．ファゴサイトフィラム、Ａ．プラティス、またはＡ．マージナーレ）への感染を検出するために、本発明の単離ペプチドまたはペプチド集団を用いるように設計できることは、当業者であれば分かるはずである。したがって、本発明は、特定のアッセイ形態の選択によっては限定されず、当業者に知られているアッセイ形態を含むと考えられる。
【０１３９】
特定の実施形態では、本発明の方法で用いるサンプルは、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、または唾液のような体液である。別の実施形態では、サンプルは、組織（例えば組織ホモジネート）または細胞溶解液である。特定の実施形態では、サンプルは、野生動物（例えば、シカ、またはマウス、シマリス、リスなどのような齧歯動物）から採ったものである。別の実施形態では、サンプルは、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、霊長類動物など）から採ったものである。別の実施形態では、サンプルは、家畜または野生化動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）から採ったものである。更に別の実施形態では、サンプルは、ヒトから採ったものである。
【０１４０】
上記の論議の大半は、病原性アナプラズマに対する抗体の検出に対するものである。しかしながら、議論は、インビトロまたはインビボのいずれかにおける抗原刺激Ｔ細胞の検出にも適用されることを理解されたい。
【０１４１】
ＩｇＧが産生されると、細胞性免疫応答（例えばヘルパーＴ細胞応答）が起こると考えられる。したがって、抗原刺激Ｔ細胞と本発明のペプチドとの間の免疫学的反応性を割り出せると考えられる。インビトロでは、これは、対象から単離したＴ細胞を本発明のペプチドまたはペプチド集団とともにインキュベートして、例えば、インキュベート後のＴ細胞の増殖を測定することによって、または、Ｔ細胞からのサイトカイン（ＩＦＮ−γなど）の放出を測定することによって免疫反応性を測定することにより行うことができる。これらの方法は、当該技術分野において周知である。
【０１４２】
本発明の方法をインビボで行うときには、様々な従来のアッセイのいずれかを用いることができる。例えば対象に本発明のペプチドまたはペプチド集団を皮内注射することによって、例えば皮膚テストの形態でアッセイを行うことができる。注射位置における皮膚の陽性反応によって、その対象が、アナプラズマ病を引き起こすことのできる病原性アナプラズマの菌種に暴露されて感染したことが示され、注射位置における皮膚の陰性反応によって、その対象が、暴露／感染していないことが示される。この検査または他のインビボ検査は、対象におけるＴ細胞応答の検出に依存する。
【０１４３】
本発明は、対象においてアナプラズマ病を診断する方法も提供する。ヒトにおけるアナプラズマ病は、以前はヒト顆粒球エールリヒア症として知られていたものであり、最近は、ヒト顆粒球アナプラズマ病という。いくつかのアナプラズマ種（例えばＡ．プラティス）が、動物において周期性血小板減少症を引き起こす（例えばイヌでは、この疾患は、感染性イヌ周期性血小板減少症（ＩＣＣＴ）という）。したがって、本発明は、対象において周期性血小板減少症、またはＩＣＣＴを診断する方法も提供する。この対象は、アナプラズマ病または周期性血小板減少症の原因物質に対する抗体を有する疑いのある対象であることができる。この診断方法は、アナプラズマ病または周期性血小板減少症の臨床症状を示している対象を診断するのに有用である。ヒトアナプラズマ病（すなわちヒト顆粒球アナプラズマ病）の臨床症状としては、発熱、頭痛、倦怠感、悪寒、筋痛、腹痛、咳、錯乱、血小板減少、白血球減少、血清トランスアミナーゼ値の上昇が挙げられるが、これらに限らない。動物（例えばイヌ）におけるアナプラズマ病または周期性血小板減少症の臨床症状としては、重度の貧血、頻脈、呼吸困難、下痢、食欲不振、体重減少、運動失調、白血球減少、嗜眠、リンパ節腫脹、粘膜蒼白、発熱、粘液膿性鼻漏、欲望欠如、肢の衰弱または疼痛、および跛行が挙げられるが、これらに限らない。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、この方法は、対象から採ったサンプルを本発明のペプチドと接触させることと、そのペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出することとを含み、その複合体の形成によって、対象がアナプラズマ病または周期性血小板減少症であることが示される。特定の実施形態では、この方法は、サンプルを２種類、３種類、４種類、またはそれ以上（例えば、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１５種類、２０種類、２５種類、３０種類、４０種類、５０種類、６０種類、７０種類、８０種類、９０種類、１００種類、１５０種類、２００種類、２５０種類、３００種類、４００種類、５００種類、またはそれ以上）の本発明のペプチドの集団と接触させることと、その集団内のその１つ以上のペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出することを含み、その複合体の形成によって、対象がアナプラズマ病または周期性血小板減少症であることが示される。例えば、特定の一実施形態では、この方法は、サンプルを２種類以上の単離ペプチドの集団と接触させることを含み、その各単離ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含む。別の特定の実施形態では、この方法は、サンプルを２種類以上の単離ペプチドの集団と接触させることを含み、その各単離ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含む。更に別の実施形態では、この方法は、サンプルを２種類以上の単離ペプチドの集団と接触させることを含み、その各単離ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、サンプルを２種類以上の単離ペプチドの集団と接触させることを含み、その各単離ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４３の配列を含む。
【０１４５】
特定の実施形態では、この方法は、サンプルを、本発明の１つ以上のペプチドと１つ以上の他のペプチド（例えば、エーリキアペプチドまたはその抗原断片もしくはエピトープ、あるいは、ボレリアペプチドまたはその抗原断片もしくはエピトープ）との混合物と接触させることを含む。アナプラズマと、エーリキアまたはボレリアの菌種への同時感染は一般的である。したがって、本明細書に記載されているアナプラズマペプチドと、エーリキアまたはボレリアの菌種由来の１つ以上のペプチドとを含むペプチド集団を用いる本発明の診断方法は、このような同時感染を検出するのに有用である。本発明のアナプラズマペプチドとともに用いてよい例示的なエーリキア抗原ペプチドは、米国出願番号１４／０５２，２９６および米国特許番号８，８２８，６７５に記載されており、これらの出願および特許はいずれも、参照により、その全体が本明細書に援用される。本発明のアナプラズマペプチドとともに用いてよい例示的なボレリア抗原ペプチドは、米国特許番号８，５６８，９８９および同８，７５８，７７２に記載されており、これらの特許はいずれも、参照により、その全体が本明細書に援用される。他のエーリキアおよびボレリア抗原は、当該技術分野において既知であり、本発明のアナプラズマペプチドと組み合わせて用いて、対象における同時感染を検出してよい。
【０１４６】
特定の実施形態では、本発明のペプチドまたは集団内の各ペプチドは、単離（例えば、合成および／または精製）ペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドまたは様々なペプチドの集団は、基材（例えば固体または半固体支持体）に結合または固定化されている。例えば、特定の実施形態では、この基材は、１つまたは複数のビーズ（例えば、コロイドもしくは他のタイプの粒子、または金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルのような金属ナノ物質）、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具の流路（例えば多孔質膜）、分析または遠心分離ローターの流路、ブロット（例えば、ウエスタンブロット、ドットブロット、またはスロットブロット）、管またはウェル（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに適するプレートのウェル）、あるいはセンサー（例えば、電気化学センサー、光学センサー、またはオプトエレクトロニクスセンサー）である。いくつかの実施形態では、本発明のペプチドまたはペプチド集団は、いくつかの実施形態ではカドミウム、亜鉛、水銀、または貴金属（例えば、金、銀、銅、および白金）から構成されていてよい金属ナノ層を通じて、固体支持体に結合または固定化されている。
【０１４７】
本発明のペプチドを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出するための従来のアッセイには、多種多様なものがある。例えば、この検出工程は、ＥＬＩＳＡアッセイを行うこと、ラテラルフロー免疫アッセイを行うこと、凝集アッセイを行うこと、波長シフトアッセイを行うこと、ウエスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロットを用いてサンプルを分析すること、間接蛍光抗体検査を行うこと、分析もしくは遠心分離ローターでサンプルを分析すること、または電気化学センサー、光学センサー、もしくはオプトエレクトロニクスセンサーでサンプルを分析することを含むことができる。これらの様々なアッセイは、上述されており、および／または当業者に周知である。
【０１４８】
特定の実施形態では、本発明の診断方法で用いるサンプルは、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、または唾液のような体液である。別の実施形態では、そのサンプルは、組織（例えば組織ホモジネート）または細胞溶解液である。特定の実施形態では、対象は、野生動物（例えば、シカ、またはマウス、シマリス、リスなどのような齧歯動物）である。別の実施形態では、対象は、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、サル、霊長類動物など）である。別の実施形態では、対象は、家畜または野生化動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）である。更に別の実施形態では、対象はヒトである。
【０１４９】
本発明は、対象が感染しているアナプラズマの菌種を同定する方法も含む。このような方法は、対象の感染症の治療を補助する。治療レジメンは、その感染症を引き起こす特定のアナプラズマの菌種に応じて様々であり得るからである。本発明の菌種同定方法は、アナプラズマ感染症およびアナプラズマ病の疫学にも有用である。特定の実施形態では、この方法は、Ａ．ファゴサイトフィラムに起因する感染症とＡ．プラティスに起因する感染症を区別する。一実施形態では、この方法は、対象から採ったサンプルを第１のペプチドまたは単離ペプチド集団と第２のペプチドまたは単離ペプチド集団と接触させることを含み、その第１のペプチドまたは単離ペプチド集団は、複数のアナプラズマの菌種由来の抗原に対する抗体に特異的に結合し、その第２のペプチドまたは単離ペプチド集団は、単一のアナプラズマの菌種由来の抗原に対する抗体に特異的に結合する。その第１のペプチドまたは第１の集団内の１つ以上のペプチドを含む第１の抗体・ペプチド複合体の形成と、その第２のペプチドまたは第２の集団内の１つ以上のペプチドを含む第２の抗体・ペプチド複合体の形成を検出し、第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成によって、第２のペプチドまたは単離ペプチド集団が特異的に結合するアナプラズマの菌種に対象が感染していることが示される。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、第１のペプチドまたは第１のペプチド集団は、Ａ．ファゴサイトフィラム、Ａ．プラティス、およびＡ．マージナーレ由来の抗原に対する抗体に特異的に結合する。特定の実施形態では、第１のペプチドまたは第１のペプチド集団は、Ａ．ファゴサイトフィラムとＡ．プラティスの両方に由来する抗原に対する抗体に特異的に結合する。例えば、一実施形態では、第１のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含む。別の実施形態では、第１のペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列またはその断片を含む。このような実施形態では、第１のペプチド集団は、表３に列挙されている３個以上のペプチド（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９９〜３５０の配列を含むか、その配列からなる３個以上のペプチド）を含んでよい。
【０１５１】
特定の実施形態では、第２のペプチドまたは第２のペプチド集団は、Ａ．プラティス由来の抗原に対する抗体に特異的に結合する。例えば、一実施形態では、第２のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含む。別の実施形態では、第２のペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列またはその断片を含む。このような実施形態では、第１のペプチド集団は、表４に列挙されている３個以上のペプチド（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５１〜３９８の配列を含むか、その配列からなる３個以上のペプチド）を含んでよい。別の実施形態では、第２のペプチドまたは第２のペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜８の配列を含んでよい。関連する実施形態では、第２のペプチド集団は、表６または７に列挙されている３種類以上のペプチド（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０７〜４６４の配列を含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチド）を含む。
【０１５２】
第２のペプチドまたは第２のペプチド集団が、Ａ．プラティス由来の抗原に対する抗体に特異的に結合するような実施形態では、第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成によって、対象がＡ．プラティスに感染していることが示される。関連する実施形態では、第１の抗体・ペプチド複合体は形成されるが、第２の抗体・ペプチド複合体は形成されないことによって、対象がＡ．ファゴサイトフィラムに感染していることが示される。例えば、特定の実施形態では、第１の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義され、第２の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によって定義され、第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成が検出され、それにより、対象がＡ．プラティスに感染していることが示される。別の実施形態では、第１の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義され、第２の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜８のいずれか１つによって定義され、第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成が検出され、それにより、対象がＡ．プラティスに感染していることが示される。いくつかの実施形態では、第１の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義され、第２の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によって定義され、第１の抗体・ペプチド複合体は形成されるが、第２の抗体・ペプチド複合体は形成されないことが検出され、それにより、対象がＡ．ファゴサイトフィラムに感染していることが示される。別の実施形態では、第１の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義され、第２の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６〜８のいずれか１つによって定義され、第１の抗体・ペプチド複合体は形成されるが、第２の抗体・ペプチド複合体は形成されないことが検出され、それにより、対象がＡ．ファゴサイトフィラムに感染していることが示される。
【０１５３】
代替的な実施形態では、第２のペプチドまたは第２のペプチド集団は、Ａ．ファゴサイトフィラム由来の抗原に対する抗体に特異的に結合する。例えば、一実施形態では、第２のペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含む。別の実施形態では、第２のペプチド集団は、３種類以上のペプチドを含み、その集団内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列またはその断片を含む。このような実施形態では、第１のペプチド集団は、表１に列挙されている３個以上のペプチド（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０〜１１７の配列を含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチド）を含んでよい。別の実施形態では、第２のペプチドまたは第２のペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、５、または９の配列を含んでよい。関連する実施形態では、第２のペプチド集団は、表２、５、または８に列挙されている３種類以上のペプチド（すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１８〜１９８、３９９〜４０６、または４６５−５４２の配列を含むか、またはその配列からなる３個以上のペプチド）を含む。
【０１５４】
第２のペプチドまたは第２のペプチド集団が、Ａ．ファゴサイトフィラム由来の抗原に対する抗体に特異的に結合するような実施形態では、第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成によって、対象がＡ．ファゴサイトフィラムに感染していることが示される。関連する実施形態では、第１の抗体・ペプチド複合体は形成されるが、第２の抗体・ペプチド複合体は形成されないことによって、対象がＡ．プラティスに感染していることが示される。例えば、特定の実施形態では、第１の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義され、第２の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によって定義され、第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成が検出され、それにより、対象がＡ．ファゴサイトフィラムに感染していることが示される。別の実施形態では、第１の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義され、第２の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、５、または９のいずれか１つによって定義され、第１の抗体・ペプチド複合体と第２の抗体・ペプチド複合体の両方の形成が検出され、それにより、対象がＡ．ファゴサイトフィラムに感染していることが示される。いくつかの実施形態では、第１の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義され、第２の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によって定義され、第１の抗体・ペプチド複合体は形成されるが、第２の抗体・ペプチド複合体は形成されないことが検出され、それにより、対象がＡ．プラティスに感染していることが示される。別の実施形態では、第１の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義され、第２の単離ペプチド集団は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、５、または９のいずれか１つによって定義され、第１の抗体・ペプチド複合体は形成されるが、第２の抗体・ペプチド複合体は形成されないことが検出され、それにより、対象がＡ．プラティスに感染していることが示される。
【０１５５】
第１および第２の抗体・ペプチド複合体は、様々な方法を用いて検出でき、その方法としては、ＥＬＩＳＡアッセイを行うこと、ラテラルフローアッセイを行うこと、凝集アッセイを行うこと、ウエスタンブロット、スロットブロット、もしくはドットブロットを行うこと、波長シフトアッセイを行うこと、間接蛍光抗体検査を行うこと、またはサンプルを分析もしくは遠心分離ローターにかけることが挙げられるが、これらに限らない。本発明の方法で用いるこのような方法と器具は、上記に詳細に説明されている。
【０１５６】
別の実施形態では、対象が感染しているアナプラズマの菌種を同定する方法は、その対象から採ったサンプルを第１のペプチド集団と、単一のアナプラズマの菌種の細胞抽出物と接触させることであって、その第１の単離ペプチド集団が、複数のアナプラズマの菌種に由来する抗原に対する抗体に特異的に結合することと、その第１の集団内の１つ以上のペプチドを含む第１の抗体・ペプチド複合体の形成を検出することと、その細胞抽出物内の１つ以上の成分を含む抗体・細胞抽出物複合体の形成を検出することを含み、第１の抗体・ペプチド複合体と抗体・細胞抽出物複合体の両方の形成によって、その細胞抽出物を産生したアナプラズマの菌種に対象が感染していることが示される。いくつかの実施形態では、この細胞抽出物は、Ａ．ファゴサイトフィラムに由来するものである。
【０１５７】
細胞抽出物は、細胞の成分を含む。その抽出物は、細胞を（例えば界面活性剤とともに）溶解させて、不要の成分を除去する（例えば、遠心分離を用いて、膜断片、小胞、および核のような不溶物を除去する）ことによって作製できる。細胞抽出物は、全細胞溶解液であることも、部分的な細胞溶解液であることもできる。細胞抽出物は通常、大半が細胞質ゾルからなる。細胞抽出物を作製するための様々な方法は、当業者に周知である。細胞抽出物の作製には、市販のキットを利用できる。
【０１５８】
キット
更に別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている検出および診断アッセイで用いるキットを提供する。いくつかの実施形態では、このキットは、本発明の１つ以上のペプチドを含む。特定の実施形態では、このキットは、本発明のペプチド集団を含む。このペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４３の配列、またはその断片を含むことができる。一実施形態では、このキットは、本発明のペプチド集団を２つ以上含む。例えば、一実施形態では、このキットは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によって定義される第１のペプチド集団と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４によって定義される第２のペプチド集団を含む。特定の実施形態では、このペプチドは、固体支持体に結合または固定化されている。いくつかの実施形態では、このペプチドは、金属ナノ層（例えば、カドミウム、亜鉛、水銀、金、銀、銅、または白金ナノ層）を通じて、固体支持体に結合または固定化されている。特定の実施形態では、この固体支持体は、１つまたは複数のビーズ（例えば、コロイド粒子、または金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルのような金属ナノ物質）、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具の流路、分析または遠心分離ローターの流路、管またはウェル（例えばプレートのウェル）、あるいはセンサー（例えば、電気化学センサー、光学センサー、またはオプトエレクトロニクスセンサー）である。
【０１５９】
特定タイプのアッセイ用の試薬を本発明のキットに供給することもできる。したがって、本発明のキットは、ビーズ集団（例えば、凝集アッセイもしくはラテラルフローアッセイに適するもの）、またはプレート（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに適するプレート）を含むことができる。別の実施形態では、本発明のキットは、ラテラルフロー免疫アッセイ用器具、分析もしくは遠心分離ローター、ウエスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット、電気化学センサー、光学センサー、またはオプトエレクトロニクスセンサーのような器具を含む。そのビーズ集団、プレート、および器具は、免疫アッセイを行うに有用である。例えば、これらは、サンプルに由来する抗体と本発明のペプチドとを含む抗体・ペプチド複合体の形成を検出するのに有用であり得る。特定の実施形態では、本発明のペプチド、本発明の様々なペプチドの集団、または本発明のペプチド組成物は、このビーズ、プレート、または器具に結合または固定化されている。
【０１６０】
加えて、本発明のキットは、様々な希釈剤および緩衝液、標識コンジュゲート、または特異的に結合した抗原もしくは抗体を検出するためのその他の作用剤（例えば標識試薬）、ならびにその他のシグナル生成試薬（酵素基質、補因子、および発色体など）を含むことができる。一実施形態では、本発明のキットは、本発明の１つ以上のペプチドのエピトープを認識する抗体に結合できる標識試薬を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のキットは、標識試薬として、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、もしくは金属ナノシェルのような金属ナノ物質、金属ナノ層、フルオロフォア、量子ドット、着色ラテックス粒子、または酵素）にコンジュゲートしている抗ヒト、抗イヌ、または抗ネコＩｇＧまたはＩｇＭ抗体を含む。別の実施形態では、本発明のキットは、標識試薬として、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、金属ナノシェル、金属ナノ層のような金属ナノ物質、フルオロフォア、量子ドット、着色ラテックス粒子、または酵素）にコンジュゲートしているプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ融合タンパク質、プロテインＬ、またはこれらの組み合わせを含む。例示的なプロテインＡ／Ｇ融合タンパク質は、プロテインＡの４つのＦｃ結合ドメインと、プロテインＧの２つのドメインが組み合わさったものである。例えば、Ｓｉｋｋｅｍａ，Ｊ．Ｗ．Ｄ．，Ａｍｅｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌａｂ，７：４２，１９８９、およびＥｌｉａｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，４３２３−４３２７，１９８８を参照されたい（これらの文献はいずれも、参照により、その全体が本明細書に援用される）。更に別の実施形態では、本発明のキットの標識試薬は、検出可能な標識（例えば、金属ナノ粒子、金属ナノプレート、金属ナノシェル、金属ナノ層のような金属ナノ物質、フルオロフォア、着色ラテックス粒子、または酵素）にコンジュゲートしている本発明の第２のペプチド集団である。この第２のペプチド集団は、第１のペプチド集団と同じであることも、異なることもでき、任意で固体支持体に結合または固定化されていてよい。
【０１６１】
キットの他の構成要素は、当業者であれば容易に判断できる。このような構成要素としては、コーティング試薬、本発明のペプチドに特異的なポリクローナルまたはモノクローナル捕捉抗体、２つ以上の抗体のカクテル、基準物質としてのこれらの抗原の精製または半精製抽出物、モノクローナル抗体検出抗体、検出可能な標識にコンジュゲートしている抗マウス、抗イヌ、抗ネコ、抗ニワトリ、または抗ヒト抗体、色比較用の指標チャート、使い捨て手袋、除染の指示書、アプリケータースティックまたは容器、サンプル調製カップなどを挙げてよい。一実施形態では、キットは、ペプチド・抗体複合体を形成させる反応媒体を構築するのに適する緩衝液またはその他の試薬を含む。
【０１６２】
このようなキットは、Ａ．ファゴサイトフィラム、Ａ．プラティス、またはＡ．マージナーレのような病原性アナプラズマの菌種への感染を診断するための利便的で効率的な方法を臨床実験室に提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明のキットは、指示書を更に含む。例えば、特定の実施形態では、本発明のキットは、本発明のペプチドまたはペプチド集団を使用して、１つ以上のアナプラズマ抗原に対する抗体を検出するか、またはアナプラズマ病もしくは周期性血小板減少症を診断する方法を示す指示書を含む。特定の実施形態では、本発明のキットは、ビーズ集団、プレート、または器具（例えば、本発明のペプチドまたは本発明の様々なペプチドの集団を含むもの）を用いて、１つ以上のアナプラズマ抗原に対する抗体を検出するか、またはアナプラズマ病もしくは周期性血小板減少症を診断する方法を示す指示書を含む。
【０１６３】
本発明のペプチド、本発明のペプチドを含む組成物および器具、本発明のキット、ならびに本発明の方法は、多くの利点をもたらす。例えば、アナプラズマ病または周期性血小板減少症の簡潔、安価、迅速、高感度、かつ正確な検出を可能にし、類似の症状を有する他の状態との血清交差反応性を回避する。これにより、正確な診断を可能にする。さらに、本発明の診断検査（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラテラルフロー免疫アッセイ、または凝集アッセイ）は、抗ＭＳＰ２／ｐ４４もしくは抗ＯＭＰ／ｐ４４抗体、またはアナプラズマの外面タンパク質に基づき、ワクチンに応答して産生されるその他の抗体を含む血清サンプルに有用である。
【０１６４】
下記の実施例は、本発明の様々な態様を示している。当然ながら、これらの実施例は、本発明の特定の実施形態を示しているに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【実施例】
【０１６５】
実施例１：ＥＬＩＳＡアッセイ
標準的な合成手順を用いて２種類のペプチド集団を合成した。第１のペプチド集団（ＡＰＬ−ＩＤ１）内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の配列を含んでいた。第１のペプチド集団は、Ａ．ファゴサイトフィラムとＡ．プラティスの両方によって惹起される抗体に特異的に結合する。第２のペプチド集団（ＡＰＬ−ＩＤ２）内の各ペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の配列を含んでいた。第２のペプチド集団は、主にＡ．プラティスによって惹起される抗体に特異的に結合する。
【０１６６】
この２つの集団内の各ペプチドは、チオエーテルの化学反応を用いて担体タンパク質のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に別々に連結した。得られたＢＳＡ・ペプチドコンジュゲートを９６ウェルＥＬＩＳＡプレートで捕捉体として用いて、２つの別々のＥＬＩＳＡアッセイを行った（１プレート当たりに１つのペプチド集団）。望ましくない非特異的結合を防ぐために、これらのプレートを、２５ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解した５％脱脂粉乳でブロックした。
【０１６７】
Ａ．ファゴサイトフィラムを感染させたダニ細胞培養液をイヌに接種して、イヌのＡ．ファゴサイトフィラムへの暴露を開始した。Ａ．プラティス感染菌が寄生することが知られている動物から得た安定化血液（ＰＣＲと顕微鏡観察によって判断）を別個のイヌ群に接種して、Ａ．プラティスへの感染を開始させた。接種した各イヌ群から採った血液サンプルを様々な接種後日数で回収した。
【０１６８】
上記のＥＬＩＳＡプレートを用いて、これらの血液サンプルから調製した血漿の、ＡＰＬ−ＩＤ１およびＡＰＬ−ＩＤ２ペプチドとの反応性を検査した。これらの血漿サンプルをブロッキング溶液で１：２５０〜１：１０００に希釈し、２つのＥＬＩＳＡプレートのそれぞれのブロックしたウェルに加えた。１時間インキュベートした後、マイクロウェルを洗浄することによって、反応しなかった物質を除去した。特異的に捕捉された抗ペプチドイヌＩｇＧまたはＩｇＭを、ＨＲＰ標識プロテインＡとの反応によって検出した。市販のＴＭＢ基質を用いてＨＲＰをアッセイした。各ウェルの光学密度を６５０ｎｍにてプレートリーダーで計測した。
【０１６９】
Ａ．プラティスに感染させたイヌ（１５−１３）およびＡ．ファゴサイトフィラムに感染させたイヌ（３−１３）から得た血漿サンプルの、ＡＰＬ−ＩＤ１ペプチドとの反応性は、図５に示されており、ＡＰＬ−ＩＤ２ペプチドとの反応性は、図６に示されている。Ａ．ファゴサイトフィラムに感染させたイヌ（イヌ３−１３）から得たサンプルは、ＡＰＬ−ＩＤ１ペプチドとの有意な反応性を示したが、そのサンプルのＡＰＬ−ＩＤ２ペプチドとの反応性は、ＡＰＬ−ＩＤ１ペプチドとの反応性よりもかなり低かった。対照的に、Ａ．プラティスに感染させたイヌ（イヌ１５−１３）から得たサンプルは、両方のペプチド集団に対して同程度の反応性を示した。これらの実験結果によって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＡＰＬ−ＩＤ１）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＡＰＬ−ＩＤ２）によって定義されるペプチド集団は、アナプラズマ抗原に対する抗体の存在の検出において高い感度を有することが示されている。加えて、これらの実験結果によって、これらの２つのペプチド集団を用いて、アナプラズマの感染菌種を同定できることが示されている。ＡＰＬ−ＩＤ１ペプチドとの反応性検査結果は陽性であるが、ＡＰＬ−ＩＤ２ペプチドとの反応性検査結果は陽性ではないサンプルは、Ａ．ファゴサイトフィラムに対して陽性である一方で、両方のペプチドとの反応性検査結果が陽性であるサンプルは、Ａ．プラティスに対して陽性である。
【０１７０】
実施例２：ラテラルフローアッセイ
アナプラズマ抗原に特異的な抗体の存在を検出するように、二抗原サンドイッチ形態のラテラルフロー免疫アッセイを構築した。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＡＰＬ−ＩＤ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＡＰＬ−ＩＤ５．１）、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（ＡＰＬ−ＩＤ６）の配列を有するペプチドを含むペプチド集団をＢＳＡに連結し、得られた複合体を、検査コンジュゲート（金ナノ粒子で標識したペプチド）と捕捉体（器具のテストラインに固定化した）の両方として用いた。標識ペプチドコンジュゲートに加えたプロテインＡおよびプロテインＧ・金コンジュゲート（増幅剤）によって、テストラインで生成されるシグナルを増強した。この器具は、図７に示されている。
【０１７１】
この器具の操作は、図８に示されている。アッセイを行うために、抗凝固全血、血清、または血漿を１滴、器具のサンプルポートに適用する。血液分離パッドが、全血から血液細胞をろ過する。血漿（または血清）が動員され、コンジュゲートパッド上に存在する検査コンジュゲートに特異的に結合し、形成されたいずれかの抗体・ペプチド複合体が、検査領域とコントロール領域を含むニトロセルロース膜に移動する。サンプル適用後に、チェイス緩衝液を適用すると、遊離の検査コンジュゲートと結合した検査コンジュゲートがニトロセルロース膜を通じて、上流の吸収パッドの方に移動する。標識ペプチド・抗体複合体がテストラインに移動し、このテストラインで、固定化されたペプチドが、その抗体の第２の結合部位を介して、標識ペプチド・抗体複合体を捕捉する。コンジュゲート混合物中のプロテインＡ・金コンジュゲートおよびプロテインＧ・金コンジュゲートが、捕捉された抗体に結合して、検出シグナルを増幅する。検査部位における１本の赤いラインの出現と、コントロール部位における第２の赤いラインの出現によって、アナプラズマ菌種（例えば、ファゴサイトフィラムまたはプラティス）に対する抗体がサンプル中に存在することが示される。コントロール部位のみに赤いラインが現れることにより、全てのアナプラズマ菌種に対する抗体がサンプル中に存在しないことが示される。（ｉ）テストラインにおけるシグナルが現れるが、コントロールラインにおけるシグナルが存在しない場合、または（ｉｉ）コントロールラインでもテストラインでもシグナルが観察されない場合には、その検査は、無効とみなす。
【０１７２】
間接免疫蛍光アッセイ、ＩＤＥＸＸ  ＳＮＡＰ  ４ＤＸ  Ｐｌｕｓ（商標）、およびＥＬＩＳＡによって、同じペプチド混合物を用いて測定した場合に、アナプラズマ菌種に対して陽性であった９５個のイヌ血漿サンプルをこのラテラルフロー器具で検査した。加えて、同じ方法によって、アナプラズマ菌種に対して陰性であると判断された５１個のイヌ血漿サンプルも評価した。各サンプルに対して、上記の器具で２回検査を行った。各検査は、異なる作業者が行った。検査期間の最後に、作業者は、各検査を陽性または陰性として記録した。加えて、各検査のスキャン画像を入手し、ＩｍａｇｅＪの方法によって分析した。両方の作業者がその判断について同意した検査は、同じ判断（陽性／陰性）として記録した。作業者が同意しなかった場合には、３人目の作業者が３回目の検査を行い、そのサンプルの最終結果（陽性／陰性）とみなした。これらの結果は、下記の表９にまとめられている。ラテラルフローアッセイの感度は９７．９％、特異度は９０．２％であった。この実施例によって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の配列を有するペプチドを含むペプチド集団が、ラテラルフローアッセイ形態で用いたときに、アナプラズマ抗原に対する抗体を有効に検出できることが証明されている。
（表９）アナプラズマに対して陽性および陰性であることが知られているサンプルのラテラルフローアッセイ結果
0006738274.tif 000050
【０１７３】
実施例３：間接蛍光抗体アッセイ
間接蛍光抗体検査は、１つ以上の本発明のペプチドをコートしたラテックスビーズを用いて構築する。特定の実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ＡＰＬ−ＩＤ１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＡＰＬ−ＩＤ２）、および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（ＡＰＬ−ＩＤ５．１）によって定義されるペプチドを用いる。本発明のペプチドは、チオエーテルの化学反応を用いて、マレイミドで誘導体化したラテックスビーズの上にコーティングする。あるいは、本発明のペプチドは、チオエーテルまたは類似の化学反応を介して、ＢＳＡにコンジュゲートしていてよく、ラテックスビーズに受動的に吸収される。続いて、既知の技法を用いて、このようなビーズ集団をガラススライドに固定化する。
【０１７４】
アッセイを行うには、ラテックスビーズをコートしたガラススライドに、抗アナプラズマ抗体を有している疑いのあるイヌから採った血清または血漿（好適な緩衝液で適切に希釈したもの）を１滴、適用する。好適なインキュベーション時間の経過後、反応しなかった物質を洗い流し、蛍光標識した抗イヌＩｇＧ（またはＩｇＭ）を１滴、適用し、そのスライドを更なる期間インキュベートする。最終調製物を蛍光顕微鏡で観察して、蛍光タグ化ラテックスビーズを測定する。検査血清／血漿を陽性または陰性と判断する際は、適切なコントロールとの比較に基づく。蛍光標識の代わりに、酵素標識を用いてもよく、その場合には、可視化工程では、酵素基質を用いる。例えば、アルカリホスファターゼで標識した抗イヌＩｇＧ／ＩｇＭは、スライドをＢＣＩＰ−ニトロＢＴ基質に暴露することによって可視化できる。標識した抗イヌＩｇＧおよび抗イヌＩｇＭの代わりに、標識したプロテインＡ、プロテインＧ、またはプロテインＡ／Ｇ融合体を用いて、ペプチド被覆ビーズに結合した抗体を検出できる。
【０１７５】
実施例４：未知のサンプルにおける、イヌに感染したアナプラズマ菌種の同定
この実施例では、本発明のペプチド集団とアナプラズマ細胞抽出物を用いて、イヌに感染したアナプラズマ菌種の同定がうまくいくことが証明されている。
【０１７６】
いずれも、ＩＤＥＸＸ  ＳＮＡＰ  ４ＤＸ  Ｐｌｕｓ（商標）アッセイを用いて検査して目視確認によってアナプラズマ感染症に対して陽性であると判断された４１個のイヌ血漿サンプルを、実施例１で説明したものと同様のＥＬＩＳＡアッセイで検査した。３つの９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを各種ペプチドまたは細胞抽出物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの市販のキットを用いて調製）で室温にて１時間コートした。プレート１は、ＡＰＬ−ＩＤ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、終濃度７μｇ／ｍＬ）、ＡＰＬ−ＩＤ５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、終濃度７μｇ／ｍＬ）、およびＡＰＬ−ＩＤ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、終濃度７μｇ／ｍＬ）という３つのペプチド集団の混合物１００μＬ／ウェルでコートした。プレート２は、ＡＰＬ−ＩＤ５．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、終濃度７μｇ／ｍＬ）、およびＡＰＬ−ＩＤ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、終濃度７μｇ／ｍＬ）という２つのペプチド集団の混合物１００μＬ／ウェルでコートした。プレート３は、Ａ．ファゴサイトフィラム全細胞溶解液（終濃度５μｇ／ｍＬ）１００μＬ／ウェルでコートした。プレート１のペプチド混合物は、Ａ．ファゴサイトフィラムとＡ．プラティスの両方によって惹起される抗体に特異的に結合する。プレート２のペプチド混合物は、主にＡ．プラティスによって惹起される抗体に特異的に結合する。プレート３の全細胞溶解液は、主にＡ．ファゴサイトフィラムによって惹起される抗体に特異的に結合する。続いて、プレートを洗浄した。
【０１７７】
続いて、望ましくない非特異的結合を防ぐために、２５０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解させた７％脱脂粉乳３００μＬ／ウェルでプレートを室温で１時間ブロックした。そのプレートを再度洗浄した。
【０１７８】
アナプラズマ感染症であるか、またはアナプラズマ感染症でないイヌの血漿サンプル（「未知のサンプル」）を７％乳で１／１００に希釈し、各サンプルを１００μＬ／ウェル、このＥＬＩＳＡプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。そのプレートを再度洗浄した。
【０１７９】
続いて、プレートをプロテインＡ‐ＨＲＰコンジュゲート（１：１０００希釈液）１００μＬ／ウェルで室温にて１時間インキュベートした。そのプレートを再度洗浄し、基質（ＴＭＢ）を１００μＬ／ウェル加え、室温で１０分間インキュベートした。全てのサンプルのＯＤ測定を行い、検量線と比較した。プレート１とプレート２（２つの「ペプチド」プレート）では、プールした陽性サンプルの段階希釈液を用いて、検量線を作製した。プレート３（溶解液プレート）では、陰性サンプルと、実験によってＡ．ファゴサイトフィラムに感染させたイヌ（「３−１３」）から採ったイヌサンプルを用いて、２点検量線を作成した。
【０１８０】
ペプチド・細胞抽出物ＥＬＩＳＡを用いたこれらのサンプルの菌種同定結果は、ＳＮＡＰ検査と間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）の結果とともに、表１０に示されている。ＳＮＡＰおよびＩＦＡ検査のいずれも、アナプラズマを属レベルで検出したに過ぎず、アナプラズマの菌種を割り出すのには用いることはできなかった。
（表１０）未知のサンプルにおけるアナプラズマ菌種の同定
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ａ：コンボスコアは、プレート１の未知のサンプルのＯＤ測定値を、同じ条件で分析した既知の陽性サンプルで作った段階希釈キャリブレーターのＯＤ測定値によって作成した検量線と比較することによって計算した（ペプチド集団ＡＰＬ−ＩＤ１、ＡＰＬ−ＩＤ５．１、およびＡＰＬ−ＩＤ６を用いた）。
ｂ：ｐｌａｔｙｓスコアは、プレート２の未知のサンプルのＯＤ測定値を、同じ条件で分析した既知の陽性サンプルで作った段階希釈キャリブレーターのＯＤ測定値によって作成した検量線と比較することによって計算した（ペプチド集団ＡＰＬ−ＩＤ５．１およびＡＰＬ−ＩＤ６を用いた）。
ｃ：ｐｈａｇｏ  ＷＣＬスコアは、プレート３の未知のサンプルのＯＤ測定値を、健常なイヌの血漿サンプル（ネガティブコントロール）の結果と、Ａ．ファゴサイトフィラムに実験によって感染させた３−１３のイヌの血漿サンプルの結果であって、同じ条件で分析した結果から構成した２点検量線と比較することによって計算した（Ａ．ファゴサイトフィラム全細胞溶解液を用いた）。
ｄ：コンボスコア、ｐｌａｔｙｓスコア、およびｐｈａｇｏ  ＷＣＬスコアを用いて、未知のサンプルにおいて、イヌが感染しているアナプラズマの菌種を同定：コンボスコアが９以下のサンプルは、アナプラズマ感染症に対して陰性である（「ＮＥＧ」）と判断する。コンボスコアが９を越えるサンプルは、アナプラズマ感染症に対して陽性であると判断し、感染しているアナプラズマの菌種は、ｐｌａｔｙｓスコアをｐｈａｇｏ  ＷＣＬスコアと比較することによって割り当てる。すなわち、ｐｌａｔｙｓスコアの方がｐｈａｇｏ  ＷＣＬスコアよりも高いサンプルは、Ａ．プラティス感染症に対して陽性であると判断し（「ｐｌａｔｙｓ」）、ｐｌａｔｙｓスコアの方がｐｈａｇｏ  ＷＣＬスコアよりも低いサンプルは、Ａ．ファゴサイトフィラム感染症に対して陽性である（「ｐｈａｇｏ」）と判断する。サンプルのｐｌａｔｙｓスコアがｐｈａｇｏ  ＷＣＬスコアと同じであり、そのコンボスコアが９を超える場合には、そのサンプルは、アナプラズマ感染症に対して陽性であり、菌種は不明と判断する。
ｅ：ＩＤＥＸＸ  ＳＮＡＰ  ４ＤＸ  Ｐｌｕｓ（商標）アッセイは、メーカーの指示書に従って行った。ＳＮＡＰカセットの画像のデンシトメトリー分析を通じて、割合（％）を計算した。この割合は、「（検査サンプルの密度）／（検査サンプルの密度＋ポジティブコントロールの密度）」である。
ｆ：ＩＦＡアッセイは、アナプラズマに対する抗体の検出にＡ．ファゴサイトフィラム細胞を用いる市販のキットによって行った。ＩＦＡタイターは、血漿サンプルを段階希釈し、固定化されているＡ．ファゴサイトフィラム細胞で各希釈液を検査することによって割り出した。
【０１８１】
この実施例の結果によって、本発明のペプチド集団と細胞抽出物を用いて、対象が感染しているアナプラズマ菌種をうまく同定できることが証明されている。加えて、この実施例では、Ａ．ファゴサイトフィラムに感染したイヌ３−１３から採ったポジティブコントロールサンプルを正確に同定した（データは不記載）。
【０１８２】
参照により援用されている文書におけるいずれかの定義が、本明細書に示されている定義と矛盾する範囲においては、本明細書に示されている定義に従う。本発明の好ましい実施形態を参照しながら本発明について説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱しなければ、当業者には明らかであるような様々な変更および修正を行うことができると理解されたい。したがって、本発明は、下記の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０１８３】
本明細書で引用した全ての特許、特許出願、および文献の開示内容は、特許請求の範囲、図および／または図面を含め、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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