(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＤＴＡ血漿検体に、２価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えた検体中の、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を指標とすることによる動脈狭窄の程度を検知する方法。
【請求項２】
２価の金属イオンがカルシウムイオンである請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＥＤＴＡ血漿検体に、２価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えることによる動脈狭窄の程度を検知するための検体を調製する方法。
【請求項４】
ＥＤＴＡ血漿検体に、２価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えた検体の、動脈狭窄の程度を検知するための検体としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、動脈狭窄の程度を検知する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳梗塞などの脳血管疾患や心筋梗塞などの心血管疾患の原因となるアテローム血栓症（ＡＴＩＳ：Ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）は、動脈壁肥厚が進行した結果、血管内部に動脈硬化性のプラーク（粥腫）が形成され、内皮の損傷やプラークの破綻などによって血小板が活性化されて血栓が形成されるに至った状態であり、近年、死亡原因となる疾患として著しく増加していることは一般にもよく知られた事実である。従って、そのイベントリスクの判定を正確に行い、リスクが高い患者に対して適切な治療を行うことは、生命の危険や重篤な機能障害の発生を回避する上で非常に重要である。現在、アテローム血栓症の診断は、超音波（エコー）、血管造影、ＭＲＩなどの画像に基づいて行われている。しかしながら、これらの画像による診断は、画像の良し悪しが撮影者の技術によって左右されるため、いずれもゴールドスタンダードになり得ない。こうした点に鑑み、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、動脈壁肥厚の程度を検知するためのバイオマーカーとして、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ（アルギニン欠損型補体成分Ｃ３ａ）が特許文献１において提案されている。Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇは、巨大な補体成分であるＣ３が分解されて産生される分子量が約９０００のＣ３ａのＣ末端のアルギニンが切除されることで生成する物質であることは、当業者に周知の通りである。
【０００３】
アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために、動脈狭窄の程度を検知することは、動脈壁肥厚の程度を検知することと同様に有用である。特許文献１の教示によれば、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇは、動脈狭窄の程度を検知するためのバイオマーカーとしても用いることができることが期待される。しかしながら、被験者由来の血液検体（血清）中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量は、採血してから血清を分離するまでの時間や、血清を分離してからＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量の測定を開始するまでの時間の経過に伴って増加するため、その血中濃度の定量性を担保することができないことが知られている（必要であれば例えば特許文献２を参照のこと）。従って、被験者由来の血清中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量が多いことが、被験者のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの血中濃度が高いことを必ずしも意味しないことから、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが動脈狭窄の程度を検知するためのバイオマーカーとして用いることができたとしても、例えば血清中のＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ量が多いので動脈狭窄の程度が強いといったような判定は一概にすることができない点において改善の余地がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１７８２３７号パンフレット
【特許文献２】特開２０１０−１８１２７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、定量性に優れた動脈狭窄の程度を検知する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）血漿検体に、２価の金属イオンとしてカルシウムイオンと、抗凝固剤としてヘパリンを加えた検体が、動脈狭窄の程度を検知するための検体として有用であること、この検体中の、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量が、動脈狭窄の程度を検知するための定量性に優れた指標となることを見出した。
【０００７】
上記の知見に基づいてなされた本発明の動脈狭窄の程度を検知する方法は、請求項１記載の通り、ＥＤＴＡ血漿検体に、２価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えた検体中の、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を指標とすることによる。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、２価の金属イオンがカルシウムイオンである。
また、本発明の動脈狭窄の程度を検知するための検体を調製する方法は、請求項３記載の通り、ＥＤＴＡ血漿検体に、２価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えることによる。
また、本発明は、請求項４記載の通り、ＥＤＴＡ血漿検体に、２価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えた検体の、動脈狭窄の程度を検知するための検体としての使用である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、定量性に優れた動脈狭窄の程度を検知する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１における、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量に基づいて、頸動脈狭窄の程度が軽度の群と重度の群を区別することができることを示すグラフである。
【図２】同、頸動脈狭窄の程度が軽度の群と重度の群について、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量から予測したＲＯＣ曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の動脈狭窄の程度を検知する方法は、ＥＤＴＡ血漿検体に、２価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えた検体中の、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を指標とすることによるものである。以下、本発明の動脈狭窄の程度を検知する方法を、順を追って説明する。
【００１１】
本発明の動脈狭窄の程度を検知する方法においては、まず、ＥＤＴＡ血漿検体に、２価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンやその塩を加える。ＥＤＴＡ血漿検体は、例えば市販のＥＤＴＡ２ナトリウム入りの採血管を用いて採血した被験者の血液から調製される、一般的な血液検査を行うためのものであってよい。
【００１２】
ＥＤＴＡ血漿検体に加える２価の金属イオンは、血漿中のカルシウムイオンに対するＥＤＴＡによるキレート化によってＣ３カスケードの進行が阻止されている状態を解除することで、検体中においてＣ３カスケードを進行させて、検体中にＣ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質を生成させるためのものである。こうしてＣ３カスケードを進行させることによって生成する物質の存在量が、動脈狭窄の程度を検知するための指標となる。２価の金属イオンとしては、例えばカルシウムイオンが挙げられるが、マグネシウムイオンや亜鉛イオンなどであってもよい。ＥＤＴＡによってＣ３カスケードの進行が阻止されている状態を解除するためには、２価の金属イオンの添加量は、検体に含まれるＥＤＴＡ１モルに対して１モル以上が望ましく２モル以上がより望ましい。
【００１３】
ＥＤＴＡ血漿検体に加える抗凝固剤は、ヘパリンやその塩（ナトリウム塩など）であり、検体に２価の金属イオンを加えることにより、ＥＤＴＡが血漿中のカルシウムイオンをキレート化することによる抗凝固作用が解除されることで検体中に不溶性の血液凝固物が生成することを阻止し、血液凝固物が、検体中のＣ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定に悪影響（ピペッティング操作の妨げなど）を及ぼさないようにするためのものである。抗凝固剤の添加量は、検体中に血液凝固物が生成することを効果的に阻止するために、検体中の濃度が１Ｕｎｉｔ／ｍｌ以上になるように加えることが望ましい（上限は例えば１２Ｕｎｉｔ／ｍｌである）。検体中に血液凝固物が生成することを効果的に阻止するためには、抗凝固剤は２価の金属イオンと同時に検体に加えることが望ましい。
【００１４】
ＥＤＴＡ血漿検体に２価の金属イオンと抗凝固剤を加えた検体中の、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を測定するために用いる、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体や公知の抗体であってもよいし、自家作製した抗体であってもよい。抗体は、容易かつ簡便に動脈狭窄の程度を検知することができるように、洗浄液などとともにキット化してもよい。Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定は、抗原抗体反応を利用する免疫学的手法、具体的には、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法、ウエスタンブロッティング法、ラテックス凝集比濁法、フローサイトメトリー法などにより、それぞれの方法の標準的なプロトコルに従って行うことができる。その測定は、検体中においてＣ３カスケードを進行させて、検体中にＣ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質を生成させるため、ＥＤＴＡ血漿検体を例えばｐＨ５．０〜７．０に調整した後、２価の金属イオンを加えてから（同時に抗凝固剤を加えることが望ましいことは上述の通りである）、３５〜４０℃で３０分間以上保温した後に行うことが望ましい（検体の調製から測定に至るまでの時間と測定に要する時間の合計時間を考慮すれば保温時間は２時間以下が望ましい）。
【００１５】
本発明の動脈狭窄の程度を検知する方法において検知対象とする動脈は、狭窄が起こりうる動脈であれば体内のどの部位に存在する動脈であってもよいが、検知対象とする好適な動脈としては頸動脈が挙げられる。検知対象とする動脈が頸動脈の場合、本発明の方法は、例えば次のようにして利用することができる。健康診断などにおいて頸動脈におけるアテローム血栓症のイベントリスクの判定を行うために、頸動脈狭窄（ＣＡＳ：ｃａｒｏｔｉｄ  ａｒｔｅｒｙ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）の程度を知ることを目的として、被験者由来のＥＤＴＡ血漿検体に２価の金属イオンと抗凝固剤を加えた検体中の、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を測定し、頸動脈狭窄の程度が軽度（例えばＥＣＳＴ法やＮＡＳＣＥＴ法による狭窄率（ＳＲ：ｓｔｅｎｏｓｉｓ  ｒａｔｅ）が３０％より大きく６０％より小さい）と重度（ＳＲが６０％より大きい）のそれぞれの場合の予め定めた標準存在量と比較する。比較の結果、被験者の存在量が、頸動脈狭窄の程度が軽度の場合の標準存在量よりも少なければ治療の必要なし、軽度の場合の標準存在量に相当すれば薬物療法を実施する、重度の場合の標準存在量に相当すれば頸動脈内膜剥離術（ＣＥＡ）を施行するといったように、治療の必要性の有無を判断したり、治療方針を策定したりする。また、頸動脈内膜剥離術を施行する必要性の有無を判断するための測定値の基準値（カットオフ値）を予め定めておけば、健常者やアテローム血栓症患者と頸動脈内膜剥離術対象患者を区別することができる。こうした治療の必要性の有無の判断や治療方針の策定を行う際、現在、アテローム血栓症の診断に利用されている、超音波（エコー）、血管造影、ＭＲＩなどの画像による診断の結果を参考にしてもよい。また、本発明の方法は、所定の治療を行った患者を被験者として、そのＥＤＴＡ血漿検体に２価の金属イオンと抗凝固剤を加えた検体中の、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を測定し、治療前の存在量と比較することで、頸動脈におけるアテローム血栓症に対する治療効果の判定などにも利用することもできる。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１７】
参考例１：Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識するモノクローナル抗体の作製（その１）
（Ａ）ハイブリドーマの作製
Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識するモノクローナル抗体を作製するため、マウスへの免疫を以下のようにして行った。免疫抗原はＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのＣ末端１１アミノ酸ペプチド（ＱＨＡＲＡＳＨＬＧＬＡ：配列番号１）のＫＬＨコンジュゲートとし、１０μｇ（ペプチド相当）をアジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ  ＵＳＡ）とともにＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与した。２〜４週間ごとに同様の追加免疫を行い、さらにＰＢＳに溶解したペプチド１０μｇを最終免疫として尾静脈内に投与した。
【００１８】
最終免疫後３日目にマウスから脾臓を無菌的に摘出し、ハサミおよび金属メッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０−Ａｇ１４をＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄後、この細胞と脾臓細胞を１：５の細胞数比で混合した。２００×ｇで５分間遠心した後、上清を除去し、細胞隗を緩やかに混合しながら５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（Ｍｅｒｃｋ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１ｍｌをゆっくりと加え、さらにＲＰＭＩ−１６４０培地１０ｍｌを加えて細胞融合させた。
【００１９】
得られた融合細胞を、２００×ｇで５分間遠心してＰＥＧを除いた後、１０％ウシ胎児血清およびヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、９６ウエル細胞培養プレートに播種した。約１０日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた後、免疫抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するクローンをＥＬＩＳＡ法により検索し、所望のハイブリドーマを得、限界希釈法により単一クローン化を行い、ハイブリドーマを樹立した。
【００２０】
（Ｂ）Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識するモノクローナル抗体の作製および解析
（Ａ）で樹立したハイブリドーマの１つ（クローン名：Ｃ３ａ−１９）を、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ）を用い、３７℃にて５％炭酸ガス中において７２〜９６時間培養した。培地中に産生されたモノクローナル抗体を精製するため、その培養液を、プロテインＡセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけた。
【００２１】
Ｃ３ａ−１９が産生するモノクローナル抗体について、抗マウスＩｇ各アイソタイプ抗体を用いたアイソタイプタイピングキット（Ｚｙｍｅｄ）により、サブクラスを同定した結果、ＩｇＧ１であることがわかった。また、Ｃ３ａ−１９が産生するモノクローナル抗体は、市販のヒトＣ３ａ精製物（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と市販のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ精製物（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の両方に反応することがわかった。
【００２２】
参考例２：Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識するモノクローナル抗体の作製（その２）
免疫抗原としてＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇのＮ端側１６アミノ酸ペプチド（ＫＲＭＤＫＶＧＫＹＰＫＥＬＲＫＣ：配列番号２）のＫＬＨコンジュゲートを用いること以外は参考例１と同様にして、所望のハイブリドーマを樹立した。その１つ（クローン名：Ｃ３Ｎ−６）が産生するモノクローナル抗体について、参考例１と同様にしてサブクラスを同定した結果、ＩｇＧ１であることがわかった。また、Ｃ３Ｎ−６が産生するモノクローナル抗体は、市販のヒトＣ３ａ精製物と市販のヒトＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ精製物の両方に反応することがわかった。
【００２３】
実施例１：本発明の方法による頚動脈狭窄の程度の検知
（実験方法）
頚動脈狭窄の程度が軽度（ＥＣＳＴ法によるＳＲが６０％未満）で血管イベントの既往がない４８例（ＣＡＳ  ＳＲ＜６０％  ｗ／ｏ  ｅｖｅｎｔｓ群）と、頸動脈狭窄の程度が重度（ＥＣＳＴ法によるＳＲが６０％以上）であることから頸動脈内膜剥離術の施行が必要と判断された７５例（ＣＡＳ  ＳＲ≧６０％群）について、それぞれの患者から同意を得てＥＤＴＡ血漿検体を採取した。検体をリン酸緩衝液によりｐＨ６．０に調整した後、ＣａＣｌ２とへパリンＮａ（ＷＡＫＯ）を最終濃度がそれぞれ１０ｍＭと８Ｕｎｉｔ／ｍｌになるように同時に加え（ＣａＣｌ２の添加量はＥＤＴＡのモル数の２倍モル量）、３７℃で１時間保温してから、後述するプロトコルに従ってＥＬＩＳＡを行い、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定を行った。なお、採血してから血漿を分離するまでの時間や、血漿を分離してからＣ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定を開始するまでの時間の経過の違いにより、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量が変化することはほとんどないことを予め確認していたので、これらの時間は特に定めなかった。
【００２４】
（実験結果）
ＣＡＳ  ＳＲ＜６０％  ｗ／ｏ  ｅｖｅｎｔｓ群の４８例とＣＡＳ  ＳＲ≧６０％群の７５例の両群の、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定結果を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により比較したところ、ｐ＜０．０００１で両群を区分することができた（図１）。また、両群について、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量から予測したＲＯＣ曲線のＡＵＣ（曲線下面積）は０．８９６３であり、頸動脈狭窄の程度の違いによって両群を区別する上において、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を測定することの有用性を確認することができた（図２）。ＲＯＣ解析の結果から、暫定的に設定したカットオフ値（４０．０ｎｍｏｌ／ｌ）を用いて両群を見極めることの可能性を評価すると、表１に示すように、感度８４．０％（６３／７５）、特異度８１．３％（３９／４８）、正診率８２．９％（１０２／１０３）となり、頸動脈狭窄の程度の違いによる両群の見極めが可能であると考えられた。検体にＣａＣｌ２を加えるのと同時にヘパリンＮａを加えたことで、例えばピペッティング操作の妨げとなるような血液凝固物の生成は認められなかった。
【００２５】
【表１】
0006667898.tif 000002
【００２６】
なお、ＥＤＴＡ血漿検体をリン酸緩衝液によりｐＨ６．０に調整した後、ＣａＣｌ２とへパリンＮａを同時に加えてからの３７℃での保温時間と、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の関係を、ＣＡＳ  ＳＲ≧６０％群のＥＤＴＡ血漿検体２例について表２に示す（いずれも保温時間が長くなると存在量は増加する）。
【００２７】
【表２】
0006667898.tif 000003
【００２８】
（Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を測定するためのＥＬＩＳＡ法のプロトコル）
参考例２で作製したモノクローナル抗体（Ｃ３Ｎ−６）を、終濃度が５μｇ／ｍｌになるように０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社）１ウエルにつき１００μｌづつ分注した。４℃で一晩静置した後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを２回洗浄した。その後、０．５％カゼイン−Ｎａを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）（以下「ブロッキング液」）０．３５ｍｌをそれぞれのウエルに添加し、さらに室温で４時間静置した。ブロッキング液を除去した後、０．２Ｍ  ＮａＣｌと１％ＢＳＡと０．０７％カゼイン−Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）９０μｌと、検体または段階的に希釈した標準物質（特許文献１に記載の方法で調製したＴｒｐＥ−Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇ融合抗原）１０μｌを、それぞれのウエルに添加して１００μｌとし、室温で１時間反応させた。反応後、０．１５Ｍ  ＮａＣｌと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）（以下「洗浄液」）０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを５回洗浄した。その後、参考例１で作製したモノクローナル抗体（Ｃ３ａ−１９）をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識して調製した標識抗体液（０．２Ｍ  ＮａＣｌと１％ＢＳＡと０．０７％カゼイン−Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））１００μｌをそれぞれのウエルに添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄液０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを５回洗浄した後、基質（オルトフェニレンジアミン）溶液１００μｌを添加し、室温暗所で３０分間反応させた。反応後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌをそれぞれのウエルに添加し、波長６３０ｎｍの吸光度を対照として波長４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９０）を測定することで、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を測定した。
【００２９】
実施例１の結果からのＣ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質に関する考察
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚらの方法（ＪＢＣ  ２９０，２３３４−２３５０，２０１５）に従い、市販のヒトＣ３精製物（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、２００ｍＭヒドラジンと０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中、３７℃で２時間反応させ、Ｃ３の加水化物であるＣ３（Ｈ２Ｏ）を産生させた。反応終了後の試料について、実施例１に記載したプロトコルに従ってＥＬＩＳＡを行ったところ、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量は７７５．８ｎｍｏｌ／ｌであった。これに対し、ヒドラジンを加えないこと以外は同じ条件で実験を行って得た試料のＣ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量は７５．３ｎｍｏｌ／ｌであったことから、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体によってＣ３の加水化物であるＣ３（Ｈ２Ｏ）が検出されることがわかった。血液中にはＣ３（Ｈ２Ｏ）とともにＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇが存在し、Ｃ３ａ−ｄｅｓＡｒｇも、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出されることと、血液中にＣ３ａが存在したとしてもすぐさまカルボキシペプチダーゼＮによってＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇに変換されることを考えれば、本発明の方法においてＣ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される血液中の物質は、Ｃ３（Ｈ２Ｏ）とＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの２者であり、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量は、両者の存在量の合計量であると推察された。Ｃ３（Ｈ２Ｏ）とＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの存在量の合計量の違いが、動脈狭窄の程度の違いを反映するのは、Ｃ３カスケードの第２経路の進行に関与する酵素、とりわけ、Ｃ３が加水化されることによるＣ３（Ｈ２Ｏ）への構造変換に関与する酵素の量や活性の違いによるものではないかと本発明者らは考察している。
【００３０】
参考例３：ＥＤＴＡ血漿検体にＣａＣｌ２とへパリンＮａを同時に加えることの効果
ＥＤＴＡ血漿検体をリン酸緩衝液によりｐＨ６．０に調整した後、ＣａＣｌ２とへパリンＮａを最終濃度がそれぞれ１０ｍＭと１，４，８，１２Ｕｎｉｔ／ｍｌになるように同時に加え、３７℃で１時間保温してから、実施例１と同様にしてＥＬＩＳＡを行い、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定を行った。ＣＡＳ  ＳＲ≧６０％群のＥＤＴＡ血漿検体３例についての結果を表３に示す。表３には、ＣａＣｌ２とへパリンＮａを加えない、リン酸緩衝液によりｐＨ６．０に調整したＥＤＴＡ血漿検体について、実施例１と同様にしてＥＬＩＳＡを行い、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定を行った結果をあわせて示す（「無処理」のカラム）。表３から明らかなように、ＥＤＴＡ血漿検体にＣａＣｌ２とへパリンＮａを同時に加えて３７℃で１時間保温することで、Ｃ３ａとＣ３ａ−ｄｅｓＡｒｇの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量が増加した。へパリンＮａの最終濃度が１Ｕｎｉｔ／ｍｌの場合でも、例えばピペッティング操作の妨げとなるような血液凝固物の生成は認められなかった。検体にＣａＣｌ２だけを加えてヘパリンＮａを加えなかった場合、例えばピペッティング操作の妨げとなるような血液凝固物の生成が認められた。
【００３１】
【表３】
0006667898.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、定量性に優れた動脈狭窄の程度を検知する方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
0006667898.tif 000005
【図２】
0006667898.tif 000006
【配列表】
0006667898000001.app