(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼで炭化水素系基質を水酸化するための剤であって、
前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、
フッ素化されていないアルキル鎖である第２の部位と、
前記末端構造と前記アルキル鎖とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、
を備える、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼで炭化水素系基質を水酸化するためのデコイ分子を含む剤。
【請求項２】
前記第１の部位は、水素原子、水酸基、アルデヒド基、カルボキシル基及びカルボキシル誘導体基からなる群から選択される、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
以下の式（１）で表される、請求項１又は２に記載の剤。
【化５】
0006679084.tif 000008
（上記式（１）中、Ａは、第１の部位を表し、Ｂは第２の部位を表し、Ｒは、水素原子、アルキル基、チオアルキル基、アルキケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基及びアラルキル基から選択される１又は２以上の基を含む有機官能基を表し、ｎは１以上の整数を表す。）
【請求項４】
前記Ｒは、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸の側鎖を表す、請求項３に記載の剤。
【請求項５】
前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、以下の（ａ）及び（ｂ）のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼから選択される１種又は２種以上である、請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
（ａ）シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ
（ｂ）シトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ
【請求項６】
前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、シトクロムＰ４５０ＢＭ３又はシトクロムＰ４５０ｃａｍにおける１種又は２種以上のアミノ酸置換変異を有する変異体であって、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を有する変異体である、請求項５に記載の剤。
【請求項７】
前記炭化水素系基質は、シクロヘキサン、ブタン、プロパン、ベンゼン及びエタンからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１〜５のいずれかに記載の剤。
【請求項８】
炭化水素系基質の水酸化方法であって、
請求項１〜７のいずれかに記載の剤、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ及び炭化水素系基質の存在下で、前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼにより前記炭化水素系基質を水酸化する工程、
を備える、方法。
【請求項９】
炭化水素系基質の水酸化物の生産方法であって、
請求項１〜７のいずれかに記載の剤、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ及び炭化水素系基質の存在下で、前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼにより前記炭化水素系基質を水酸化する工程、
を備える、方法。
【請求項１０】
シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼで炭化水素を水酸化するためのデコイ分子のスクリーニング方法であって、
シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、フッ素化されていないアルキル鎖である第２の部位と、前記第１の部位と前記第２の部位とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、を備える、１又は２以上のデコイ分子候補及び炭化水素系基質の存在下で、前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを前記炭化水素系基質に作用させる工程、
を備え、
前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによる前記炭化水素系基質の水酸化を評価する、スクリーニング方法。
【請求項１１】
変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼでメタンを水酸化するための剤であって、
前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、
少なくとも一部がフッ素化されたアルキル鎖である第２の部位と、
前記末端構造と前記アルキル鎖とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、
を備える、変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼでメタンを水酸化するためのデコイ分子を含む剤。
【請求項１２】
前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１種又は２種以上のアミノ酸置換変異体であって、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を備える、請求項１１に記載の剤。
【請求項１３】
メタンの水酸化物の生産方法であって、
請求項１１に記載の剤、変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ及びメタンの存在下で、前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによりメタンを水酸化する工程、
を備える、方法。
【請求項１４】
前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、配列番号１で表されるアミノ酸配列における１種又は２種以上のアミノ酸置換変異であって、配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有し、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼでメタンを水酸化するためのデコイ分子のスクリーニング方法であって、
変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、少なくとも一部がフッ素化されたアルキル鎖である第２の部位と、前記第１の部位と前記第２の部位とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、を備える、１又は２以上のデコイ分子候補、前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ及びメタンの存在下で、前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼをメタンに作用させる工程、
を備え、
前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによるメタンの水酸化を評価する、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、炭化水素系基質を水酸化するための材料及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌由来の酵素であるシトクロムＰ４５０は、真核生物由来のシトクロムＰ４５０に比べて高い触媒活性を持つことが知られている。細菌由来のシトクロムＰ４５０として、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のシトクロムＰ４５０ｃａｍや、バチルス属菌細菌の一種であるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のシトクロムＰ４５０ＢＭ３等の、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼが知られている。
【０００３】
これらの細菌由来のシトクロムＰ４５０は、脂肪酸等の基質を水酸化する高い触媒活性を備えている。また、水に対する親和性が比較的高いため、取得及び取扱が容易である。
こうした理由から、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、バイオ触媒として適していると考えられる。
【０００４】
こうした野生型のシトクロムは、工業的に有用な炭化水素系基質を水酸化するのにあたっては必ずしも触媒活性が高いわけでない。このため、種々の変異型シトクロムＰ４５０が提案されている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００５】
一方、本発明者らは、高い触媒活性を呈しない炭化水素に対してシトクロムＰ４５０を誤作動させるように擬似基質（ダミー分子又はデコイ分子）を取り込ませることで、水酸化反応を高効率で触媒することを既に報告している（特許文献４）。デコイ分子は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの結合部位に結合可能な末端構造と、アルキル鎖、とを備えており、アルキル鎖に含まれる少なくとも１つの分子がフッ素で置換されていることを特徴としている。
【０００６】
ここで、アルキル鎖の水素分子をフッ素で置換したものをデコイ分子として用いるのは、フッ素原子半径が水素に近いため、基質の水素をフッ素で置換したフッ素化物が本来の基質に類似すると同時に、シトクロムＰ４５０はＣ−Ｈ結合を水酸化できないため、それ自身は基質とならないからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０００−５０８１６３号公報
【特許文献２】特表２００３−５１７８１５号公報
【特許文献３】特表２００３−５２１８８９号公報
【特許文献４】特開２０１２−２４００９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らが提案したデコイ分子は、フッ素を含有するため、製造コストが高いほか、その難分解性、環境残留性及び生体蓄積性等といった問題が生じうる。
【０００９】
しかし、本発明者らが、フッ素化していない脂肪酸をデコイ分子として利用すると、炭化水素系基質を水酸化することはできなかった。
【００１０】
また、変異型のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、活性部位等が改変されているため、野生型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに適用されるデコイ分子を適用して機能することは当業者でも予測できなかった。
【００１１】
そこで、本明細書は、炭化水素系基質の水酸化のための材料としてより実用的なデコイ分子及びその利用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、まず、フッ素を含まなくてもデコイ分子として機能させることを鋭意検討した。その結果、デコイ分子中のアルキル鎖のフッ素化を一切しなくても、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造と、非フッ素化アルキル鎖とを、ペプチド結合を含むリンカーを介して備えることで、デコイ分子として用いて、炭化水素系基質基質を水酸化できるという知見を得た。
【００１３】
また、本発明者らは、変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに対して、フッ素アルキル鎖をペプチドリンカーを介して備えるデコイ分子が、デコイ分子として機能するという知見も得た。
【００１４】
本明細書は、こうした知見に基づき以下の手段を提供する。
【００１５】
（１）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼで炭化水素系基質を水酸化するためのデコイ分子であって、
前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、
フッ素化されていないアルキル鎖である第２の部位と、
前記末端構造と前記アルキル鎖とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、
を備える、デコイ分子。
（２）前記第１の部位は、水素原子、水酸基、アルデヒド基、カルボキシル基及びカルボキシル誘導体基からなる群から選択される、（１）に記載のデコイ分子。
（３）前記デコイ分子は、以下の式（１）で表される、（１）又は（２）に記載のデコイ分子。
【化１】
0006679084.tif 000002
（上記式（１）中、Ａは、第１の部位を表し、Ｂは第２の部位を表し、Ｒは、水素原子、アルキル基、チオアルキル基、アルキケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基及びアラルキル基から選択される１又は２以上の基を含む有機官能基を表し、ｎは１以上の整数を表す。）
（４）前記Ｒは、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファンからなる群から選択されるアミノ酸の側鎖を表す、（３）に記載のデコイ分子。
（５）前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、以下の（ａ）及び（ｂ）のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼから選択される１種又は２種以上である、（１）〜（４）のいずれかに記載のデコイ分子。
（ａ）シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ
（ｂ）シトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ
（６）前記不活性化炭化水素は、シクロヘキサン、ブタン、プロパン及びベンゼンからなる群から選択される１種又は２種以上である、（１）〜（５）のいずれかに記載のデコイ分子。
（７）炭化水素系基質の水酸化方法であって、
（１）〜（６）のいずれかに記載のデコイ分子、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ及び炭化水素系基質の存在下で、前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼにより前記炭化水素系基質を水酸化する工程、
を備える、方法。
（８）炭化水素系基質の水酸化物の生産方法であって、
（１）〜（６）のいずれかに記載のデコイ分子、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ及び炭化水素系基質の存在下で、前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼにより前記炭化水素系基質を水酸化する工程、
を備える、方法。
（９）シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼで炭化水素を水酸化するためのデコイ分子のスクリーニング方法であって、
シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、フッ素化されていないアルキル鎖である第２の部位と、前記第１の部位と前記第２の部位とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、を備える、１又は２以上のデコイ分子候補及び炭化水素系基質の存在下で、前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを前記炭化水素系基質に作用させる工程、
を備え、
前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによる前記炭化水素系基質の水酸化を評価する、スクリーニング方法。
【００１６】
（１０）変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼで炭化水素系基質を水酸化するためのデコイ分子であって、
前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、
少なくとも一部がフッ素化されたアルキル鎖である第２の部位と、
前記末端構造と前記アルキル鎖とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、
を備える、デコイ分子。
（１１）炭化水素系基質の水酸化物の生産方法であって、
（１０）に記載のデコイ分子、変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ及び炭化水素系基質の存在下で、前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼにより前記炭化水素系基質を水酸化する工程、
を備える、方法。
（１２）前記炭化水素系基質は、メタン又はエタンである、（１１）に記載の方法。
（１３）変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼで炭化水素系基質を水酸化するためのデコイ分子のスクリーニング方法であって、
変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、少なくとも一部がフッ素化されたアルキル鎖である第２の部位と、前記第１の部位と前記第２の部位とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、を備える、１又は２以上のデコイ分子候補、前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ及び炭化水素系基質の存在下で、前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを前記炭化水素系基質に作用させる工程、
を備え、
前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによる前記炭化水素系基質の水酸化を評価する、スクリーニング方法。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼで炭化水素系基質を水酸化するためのデコイ分子及びその利用に関する。
【００１８】
シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（以下、単に、Ｐ４５０という。）の活性中心には、基質が結合する結合部位が存在する。基質が結合部位に結合すると、活性中心に存在する水分子が活性中心から押し出される。以下、この状態を活性化スイッチが入る、と呼ぶ。活性中心は、その後、電子や酸素分子等の作用を受けた後に、基質の水酸化を触媒する。したがって、活性化スイッチが入らないと、Ｐ４５０の触媒反応は開始しないと考えられている。なお、野生型のＰ４５０の基質としては、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸が知られている。これらの基質は、概して、結合部位に結合する末端構造と、アルキル鎖とを持つ。
【００１９】
（第１の態様のデコイ分子）
本明細書に開示するデコイ分子は、Ｐ４５０の結合部位に結合可能な第１の部位（末端構造）と、アルキル鎖である第２の部位とを備える。さらに、これらを連結するペプチド結合を含むリンカーを有している。デコイ分子は、第１の部位と第２の部位とを備えるために、Ｐ４５０とを共存させると、ダミー分子が基質のかわりにＰ４５０の結合部位に結合し、活性化スイッチが入ると考えられる。
【００２０】
このデコイ分子においては、第１の部位と第２の部位とが、リンカーによって連結されている。推論であって本明細書の開示を拘束するものではないが、こうしたデコイ分子は、活性中心に到達しやすく、水分子を速やかに活性中心から排除すると考えられる。また、こうしたリンカーを備えることで、フッ素化されていなくても、デコイ分子の水酸化を抑制又は回避して、炭化水素系基質基質を水酸化できる。
【００２１】
本来、炭化水素系基質に対する野生型Ｐ４５０の触媒活性は非常に低い。しかし、デコイ分子が活性化スイッチを入れることで、炭化水素系基質に対する野生型Ｐ４５０の触媒活性が向上する。したがって、野生型のＰ４５０を用いて炭化水素系基質を水酸化できる。
【００２２】
以上説明したように、本明細書に開示されるデコイ分子を用いることで、フッ素の使用を排除して、炭化水素系基質を野生型のＰ４５０によって水酸化できる。よって、本明細書に開示されるデコイ分子を用いることで、炭化水素系基質を工業的に水酸化して有用な水酸化物を取得できる。
【００２３】
（第２の態様のデコイ分子）
本明細書に開示される他のデコイ分子は、変異型Ｐ４５０で炭化水素系基質を水酸化するために好適なデコイ分子である。このデコイ分子によれば、変異型Ｐ４５０に対してもデコイ分子として良好に機能させることができる。このため、このデコイ分子を用いることで、変異型Ｐ４５０の機能をさらに増強させることができる。
【００２４】
本明細書の開示を拘束するものではないが、このデコイ分子は、ペプチドリンカーを介して末端構造とフッ素化されたアルキル鎖とを備えることで、変異型Ｐ４５０であってもその基質結合部位及び活性中心と良好に相互作用でき、その結果、変異型Ｐ４５０による触媒能を一層高めることができると考えられる。
【００２５】
以上説明したように、本明細書に開示される第２の態様のデコイ分子は、変異型Ｐ４５０に好適に適用可能であって、その触媒能を一層増強して有用な水酸化物を取得することができる。
【００２６】
なお、本明細書において、炭化水素系基質としては、芳香族化合物、アルカン、アルケン、シクロアルカン、シクロアルケン等を包含することができる。芳香族化合物としては、一置換されてもよいし多置換されていてもよい。置換基としては、炭素数１〜４のアルキル、炭素数２〜４のアルケニル、水酸基、ハロゲン原子等が挙げられる。アルキル置換基又はアルケニル置換基は、ケト基又はアルデヒド基を有していてもよい。芳香族化合物、単核であってもよい多核であってもよい。好ましくは単核又は２核である。また、芳香族化合物は、２以上の核が縮合していてもよいし、非芳香族環と縮合していてもよい。こうした芳香族化合物としては、単核又は二核の芳香族化合物が挙げられ、より具体的には、置換されていてもよいベンゼン、ナフタレン、インデン等が挙げられる。
【００２７】
アルカンとしては、例えば、炭素数１〜１５程度の直鎖状又は分岐鎖状のアルカンが挙げられる。例えば、メタン、エタン、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン、ｎ−ペンタン、んーヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカン及びｎ−ドデカン等並びにこれらの２以上の分岐を有する分岐鎖体が挙げられる。
【００２８】
アルケンとしては、上記したアルカンにおいて１又は２以上の不飽和結合を備えるものが挙げられる。例えば、１不飽和を備えるアルケンが挙げられる。
【００２９】
シクロアルカン及びシクロアルケンとしては、置換されていてもよい、炭素数４〜８個の炭素原子からなるシクロアルカン及びシクロアルケンが挙げられる。例えば、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、シクロヘプタン、シクロヘプテン等が挙げられる。シクロアルカン及びシクロアルケンは、１又は２以上の置換基を有していてもよく、例えば、１〜５個以下の置換基を有していてもよい。置換基としては、既述の置換を適用できる。シクロアルカン及びシクロアルケンとしては、無置換又は１〜３個程度の置換基を備えるシクロヘキサン、シクロヘキセン等が挙げられる。
【００３０】
本明細書において、炭化水素系基質の水酸化とは、炭化水素系基質のＣ−Ｈ結合を酸化反応により酸化し結果として炭素原子に水酸基を導入することを意味している。
【００３１】
以下、本明細書に開示される各種の実施形態を詳細に説明する。
【００３２】
（第１の態様のデコイ分子）
本明細書に開示される第１の態様のデコイ分子（以下、第１のデコイ分子という。）は、Ｐ４５０で炭化水素系基質の炭素原子に水酸基を導入することができる。
【００３３】
（Ｐ４５０：シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ）
Ｐ４５０としては、公知のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを包含できる。Ｐ４５０としては、細菌由来のＰ４５０を好ましく用いることができ、なかでも、緑膿菌由来のＰ４５０やバチルス属由来のＰ４５０を用いることができる。こうしたＰ４５０としては、例えば、シトクロムＰ４５０ＢＭ３（ＣＹＰ１０２Ａ１）、シトクロムＰ４５０ｃａｍ（カンファー５−モノオキシゲナーゼ、ＣＹＰ１０１）が挙げられる。
【００３４】
Ｐ４５０は、アミノ酸配列が既知のＰ４５０とアミノ酸配列の同一性が４０％以上のＰ４５０を用いることもできる。例えば、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と４０％以上の同一性を持つＰ４５０（シトクロムＰ４５０ＢＭ３のファミリー酵素）や、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を持つＰ４５０（シトクロムＰ４５０ＢＭ３のサブファミリー（ＣＹＰ１０２Ａ等）の酵素）を好ましく用いることができる。或いは、シトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸配列と４０％以上の同一性を持つＰ４５０（シトクロムＰ４５０ｃａｍのファミリー酵素）や、シトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸配列と５５％以上の同一性を持つＰ４５０（シトクロムＰ４５０ｃａｍのサブファミリー酵素）を好ましく用いることができる。なお、シトクロムＰ４５０ＢＭ３のファミリー酵素またはサブファミリー酵素は脂肪酸を水酸化可能であるのが好ましく、シトクロムＰ４５０ｃａｍのファミリー酵素またはサブファミリー酵素はカンファー（Ｃ10Ｈ16Ｏ）を水酸化可能であるのが好ましい。
【００３５】
こうしたシトクロムＰ４５０ＢＭ３のアミノ酸配列は、例えばＪ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６４（１９），１０９８７−１０９９８（１９８９）や、ＮＣＢＩのベータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐ１４７７９．２）に開示されている。また、シトクロムＰ４５０ｃａｍのアミノ酸もまた、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＹＰ_７１４０２９）に開示されている。
【００３６】
Ｐ４５０は、野生型のほか変異型であってもよい。変異型としては、例えば、細菌由来のＰ４５０の変異型を好ましく用いることができる。例えば、シトクロムＰ４５０ＢＭ３やシトクロムＰ４５０ｃａｍの変異型を用いることができる。これらの変異型の詳細及び取得方法については、例えば、既述の特許文献１〜３のほか、C. J. C. Whitehouse, S. G. Bell, L. L. Wong, Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 1218-1260（以上、シトクロムＰ４５０ＢＭ３の変異型全般）、F. Xu, S. G. Bell, J. Lednik, A. Insley, Z. H. Rao, L. L. Wong, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 4029-4032、H. Joo, Z. L. Lin, F. H. Arnold, Nature 1999, 399, 670-673（以上、シトクロムＰ４５０ｃａｍの変異型）等に開示されている。
【００３７】
第１のデコイ分子については、野生型のＰ４５０を用いることが好ましい場合がある。
【００３８】
（デコイ分子の構成）
第１のデコイ分子は、前記シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、フッ素化されていないアルキル鎖である第２の部位と、前記末端構造と前記アルキル鎖とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、を備えることができる。
【００３９】
（第１の部位：Ｐ４５０の基質結合部位に結合可能な末端構造）
第１の部位は、用いるＰ４５０の基質結合部位に結合可能な末端構造である。より具体的には、Ｐ４５０の基質結合部位の開口部に結合可能な末端構造である。一般に、Ｐ４５０の基質結合部位は分子表面からヘム分子まで到達し、主として疎水性アミノ酸残基により構成されるトンネル状となっている。そして、例えば、シトクロムＰ４５０ＢＭ−３等の基質結合部位が開口する分子表面のアルギニン残基とチロシン残基のプラス帯電アミノ酸配列残基と基質との水素結合が酸化反応に必須であると考えられている。
【００４０】
第１の部位は、こうした基質結合部位の開口部と相互作用可能に水素結合を形成可能な構造を有していることが好ましい。第１の部位は、例えば、水素原子、水酸基、アルデヒド基、カルボキシル基及びカルボキシル誘導体基からなる群から選択される１又は２以上の原子又は基を備えることができる。カルボキシル誘導体基としては、例えば、炭素数１〜４程度のアルキルエステル、アミド及び無水物が挙げられる。また、カルボキシル誘導体基としては、カルボキシル基に１又は２以上アミノ酸を導入したアミノアシル基が挙げられる。これらの原子及び基は、１又は２以上を組み合わせてもよい。第１の部位としては、少なくとも、カルボキシル基を含んでいることが好ましい。
【００４１】
（第２の部位：フッ素化されてないアルキル鎖）
第２の部位におけるアルキル鎖の鎖長は特に限定されないで、必要に応じて、例えば、用いるＰ４５０や水酸化対象である炭化水素系基質に応じて適宜設定することも可能である。また、アルキル鎖は、直鎖状であってもよいし分岐鎖状であってもよい。分岐鎖状とする場合、分岐鎖は、炭素数１〜４程度のアルキル基とすることができる。アルキル鎖の形態も、用いるＰ４５０や水酸化の対象となる炭化水素系基質等に応じて適宜設定することも可能である。アルキル鎖は、環状であってもよく、環状部を備えていてもよい。
【００４２】
典型的には、アルキル鎖の炭素数は５個以上とすることが好ましく、６個以上とすることがより好ましく、さらに好ましくは７個以上であり、なお好ましくは８個以上であり、さらにまた好ましくは９個以上であり、また好ましくは１０個以上である。また、アルキル鎖の炭素数は、好ましくは１５個以下であり、より好ましくは１４個以下であり、さらに好ましくは１３個以下であり、なお好ましくは１２個以下である。また、アルキル鎖は、好ましくは直鎖状である。
【００４３】
（リンカー）
第１のデコイ分子は、第１の部位と第２の部位との間にこれらを連結するペプチド結合を含むリンカーを備えることができる。このようなリンカーを備えることで、理論的には必ずしも明らかではないが、フッ素化されていないアルキル鎖を備えるデコイ分子であっても機能させることができるようになっている。
【００４４】
リンカーは、ペプチド結合を備えていればよく、さらに、例えば、第１の部位との間に、１又は数個以下（好ましくは１個又は２個）のアルキレン基を備えていてもよい。アルキレン鎖は、メチレン基、エチレン基、プロピレン基等が挙げられる。このようなリンカーを備える第１のデコイ分子としては、例えば、以下の式（１）で表される。リンカーは、式（１）における［］で表される単位である。
【００４５】
【化２】
0006679084.tif 000003
【００４６】
上記式（１）において、Ａは第１の部位を表し、Ｂは第２の部位を表し、Ｒは、水素原子、アルキル基、チオアルキル基、アルキケニル基、シクロアルキル基、シクロアルケニル基、アリール基及びアラルキル基から選択される１又は２以上の基を含む有機官能基を表し、ｎは１以上の整数を表すことができる。
【００４７】
式（１）におけるＲのアルキル基、チオアルキル基におけるアルキルには、既述のアルカンの定義を適用することができる。また、チオアルキル基は、アルキル基中の１又は２程度の炭素原子を硫黄原子で置換した形態を有することができる。
【００４８】
Ｒにおけるアルケニル基におけるアルケニルには、既述のアルケンの定義を適用することができる。また、シクロアルキル基及びシクロアルケニル基におけるシクロアルキル及びシクロアルケニルには、既述のシクロアルカン及びシクロアルケンの定義を適用できる。
【００４９】
アリール基におけるアリールについては、既述の芳香族の定義を適用することができる。また、アラルキル基には、アルキル基の定義とアリール基の定義を適用することができる。
【００５０】
Ｒは、好ましくは、アミノ酸の側鎖である。アミノ酸は、Ｌ体であってもＤ体であってもよいが、Ｌ体を好ましく用いることができる。アミノ酸としては、タンパク質の主体となる２０種類の天然アミノ酸のほか、各種の天然及び非天然のアミノ酸を用いることができる。
【００５１】
Ｒは、より好ましくは、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基の当該側鎖である。こうしたアミノ酸残基としては、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリンが挙げられる。疎水性の観点からは、より好ましくは、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファンが挙げられる。さらに、好ましくは、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファンが挙げられる。
【００５２】
式（１）におけるｎは、特に限定しないが、数個以下であることが好ましく、例えば、１個又は２個である。
【００５３】
式（１）で表される第１のデコイ分子は、例えば、第２の部位のアルキル鎖を備えるカルボン酸に対して、アミノ酸を１つ導入することによって製造することができる。こうして得られる「Ｎ−アシルアミノ酸」のカルボキシル基（第１の部位）が、式（１）のＡに対応し、アシル基のアルキル基（第２の部位）が、同Ｂに対応し、アミノ酸の側鎖が、同Ｒに対応する。さらに、アルキルカルボン酸に２つ以上のアミノ酸を導入することもできる。
【００５４】
この反応は、例えば、アミノ酸のカルボキシル基をエステル化するなどして保護した後、カルボン酸とアミノ酸のカルボキシル保護体とを縮合し、その後、脱保護することにより、式（１）で表される「Ｎ−アシルアミノ酸」を取得できる。以下に、典型的なスキームとして、アミノ酸のメチルエステルを介したＮ−アシルアミノ酸の合成スキームを例示する。
【００５５】
【化３】
0006679084.tif 000004
【００５６】
（アミノ酸のメチルエステル化）
例えば、50 mLナスフラスコにアミノ酸（19 mmol）を入れてメタノール（19 mL）に溶かし、−20°Cに冷却し、この溶液に塩化チオニル（20 mmol, 1.45mL）をゆっくりと滴下し、0°Cで1時間撹拌した後、室温で16時間撹拌する。反応液を減圧留去し、得られた白色固体をジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥させる。
【００５７】
（カルボン酸とアミノ酸の縮合反応）
その後、50 mL二口フラスコに、例えば、アミノ酸のメチルエステルとしてL-フェニルアラニンメチルエステル塩酸塩（4 mmol, 863 mg）、ノナン酸（4 mmol, 643 mg）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt・H2O）（5 mmol, 676 mg）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC-HCl）（5 mmol, 978 mg）を加えて、アルゴン下でジメチルホルムアミド（5 mL）を加えて溶解させる。つづいて、N,N'-ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）（10 mmol, 1.29 g）を加え、室温で6時間撹拌し、その後、反応溶液と同体積のイオン交換水を加え、酢酸エチルで3回抽出を行う。抽出した有機相を合わせ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄した後、硫酸マグネシウムを加えて30分間乾燥し、ろ過後、溶媒をエバポレーターにより留去する。酢酸エチル:ヘキサン=3:7を展開溶媒として用いて、シリカゲルカラムで精製した。対応するフラクションを集めて溶媒を留去し、真空乾燥して固体を得る。
【００５８】
（メチルエステルの脱保護）
合成したN-アシルアミノ酸メチルエステルに1.0 M LiOH/THF = 4:1溶液を加え、室温で24時間撹拌する。氷浴上で2M HClを加えpHを1にして、Et2Oで3回抽出を行い、硫酸マグネシウムを加えて30分間乾燥し、ろ過後、溶媒をエバポレーターにより留去する。得られた固体を少量の酢酸エチルに溶かし、70°Cの水浴上で固体が析出する寸前までヘキサンを加えた後、室温で放置し再結晶化を行った。析出した固体を吸引ろ過し、真空乾燥して固体を得る。
【００５９】
また、「Ｎ−アシルアミノ酸」においては、第１の部位はカルボン酸となるが、アルキルカルボン酸と縮合するアミノ酸に替えて非天然アミノ酸を用いることにより、第１の部位をカルボン酸以外の官能基とすることができる。例えば、アルキルエステルやアミドなどのカルボキシ基誘導体とするには、アミノ酸のカルボキシル基を保護基のメチルエステル基に変えて、エタノールや対応するアルコールによるエステル化したものを、アルキルカルボン酸と縮合することにより得ることができる。また、例えば、第１の部位をアミド基とするには、メチルアミンやエチルアミンなどをアミノ酸のカルボキシルと縮合させた上で、アルキルカルボン酸と縮合することにより得ることができる。さらに、例えば、第１の部位をアルデヒド基とするには、アミノ酸のカルボキシル基を還元してアルデヒド基とした後にアセタール保護し、アルキルカルボン酸との縮合反応の後に、酸で脱保護することにより得ることができる。
【００６０】
式（１）におけるＲは、アミノ酸の側鎖を利用してさらに種々の形態に改変することが可能である。
【００６１】
以上のとおり、第１のデコイ分子は、第１の部位と、第２の部位と、これらを連結するリンカーを備えている。リンカーは、第１のデコイ分子の第１の部位とＰ４５０の基質結合部位又はその開口部との相互作用を向上させているものと考えられる。
【００６２】
第１のデコイ分子は、Ｐ４５０によって炭化水素系基質に水酸基が導入されることにより、炭化水素系基質の親水性が向上して速やかに疎水性の基質結合部位から排出される。このため、１つのみのあるいは特定の炭素原子への水酸基導入が生じやすくなる傾向がある。このため、第１のデコイ分子は、こうした水酸化に好ましく用いうる。
【００６３】
また、第１のデコイ分子は、カップリング効率(％)、すなわち、生成したアルコールなどの水酸化量（モル数）に対する消費したＮＡＤＰＨのモル数の割合（％）が高くなる傾向があり（例えば、後述する第２のデコイ分子等よりも）、副反応が少なく、酵素の寿命を延長させることができる。
【００６４】
（炭化水素系基質の水酸化方法及び炭化水素系基質の水酸化物の生産方法）
本明細書に開示されるこれらの方法は、第１のデコイ分子、Ｐ４５０及び炭化水素系基質の存在下で、Ｐ４５０により前記基質を水酸化する工程を備えることができる。これらの方法によれば、より実用的に、フッ素による種々の不都合を回避して各種の基質を水酸化し、水酸化物を得ることができる。
【００６５】
第１のデコイ分子、炭化水素系基質、及びＰ４５０については、既に記載した各種態様を適用できる。炭化水素系基質の水酸化にあたっては、当業者は、公知のＰ４５０から適切なＰ４５０を選択し、第１のデコイ分子を設計し取得し、水酸化反応を実施することができる。
【００６６】
本方法においては、Ｐ４５０の酵素活性を持続させる等の目的でＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ）、酸素分子等を適宜存在させた状態で行うことが好ましい。また、炭化水素系基質の状態（気体、ガス等）において、基質の供給形態等を適宜変更することができる。
【００６７】
本方法は、バッチ式でおこなっても良いし、連続的におこなっても良い。Ｐ４５０は、公知の固定化手段を用いて固定化して用いてもよいし、その他、酵素を用いた工業的方法に適用される公知の手法を適宜適用することができる。
【００６８】
これらの方法は、炭化水素系基質を限定するものではないが、エタン、プロパン、ブタン、ヘプタン、シクロヘキサン、ベンゼン等の水酸化に好適に用いることができる。
【００６９】
（Ｐ４５０で炭化水素系基質を水酸化するためのデコイ分子のスクリーニング方法）
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、Ｐ４５０、前記Ｐ４５０の基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、フッ素化されていないアルキル鎖である第２の部位と、前記第１の部位と前記第２の部位とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、を備える、１又は２以上のデコイ分子候補及び炭化水素系基質の存在下で、前記Ｐ４５０を前記炭化水素系基質に作用させる工程、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、デコイ分子候補によるＰ４５０の炭化水素系基質の水酸化を評価することができ、所望の炭化水素系基質を水酸化するためデコイ分子をスクリーニングすることができる。なお、本スクリーニング方法において、Ｐ４５０についても１又は２以上の候補を組み合わせることで、好適なＰ４５０をスクリーニングできる。
【００７０】
本スクリーニング方法においては、既述の水酸化方法と同様にして上記作用工程を実施することができる。
【００７１】
本スクリーニング方法においては、第１のデコイ分子における、アルキル鎖長、アルキル鎖の形態、第２の部位の種類、リンカーの形態を適宜組み合わせた第１のデコイ分子候補を準備することができる。また、既述のように、Ｐ４５０についても種々の公知のＰ４５０候補を準備することができる。第１のデコイ分子を用いる場合には、Ｐ４５０は野生型を用いることが好ましい場合がある。
【００７２】
（第２態様のデコイ分子）
本明細書に開示される第２の態様のデコイ分子（以下、第２のデコイ分子という。）は、変異型Ｐ４５０を用いて炭化水素系基質の炭素原子に水酸基を導入することができる。
【００７３】
第２のデコイ分子は、変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位を備えるとともに、既述の第１のデコイ分子においてアルキル鎖である第２の部位の少なくとも一部がフッ素化されている点において相違する以外は、同様の構成を採ることができる。
【００７４】
こうした第２のデコイ分子が、変異型Ｐ４５０に対して好適に機能しうるため、第２のデコイ分子によって変異型Ｐ４５０による触媒活性を改変したり増強することが可能となる。
【００７５】
第２のデコイ分子における第１の部位は、変異型Ｐ４５０の基質結合部位、より詳しくはその開口部近傍に結合可能な末端構造である。変異型Ｐ４５０の当該部位は、野生型Ｐ４５０と基本的に同等であるので、実質的には、第２のデコイ分子の第１の部位は、第１のデコイ分子と同一であってもよい。
【００７６】
第２のデコイ分子における第２の部位は、炭素原子に結合する少なくとも一部の水素原子がフッ素原子で置換されてフッ素化されていればよい。すべての水素原子がフッ素原子で置換されていてもよい。好ましくは、少なくともアルキル鎖の末端から数えて１〜３番目の炭素原子に結合される水素原子がフッ素で置換されている。また、好ましくは、少なくとも、アルキル鎖の末端から数えて１〜７番目の炭素原子に結合される水素原子がフッ素で置換されている。
【００７７】
第２のデコイ分子は、変異型Ｐ４５０に対して用いることが好ましい。ここで変異型Ｐ４５０は既に述べた各種のＰ４５０の変異型が挙げられる。例えば、Ｐ４５０ＢＭ−３のＡ３２８Ｆの変異型が挙げられる。Ａ３２８Ｆ変異型は、A. Seifert, S. Vomund, K. Grohmann, S. Kriening, V. B. Urlacher, S. Laschat and J. Pleiss, ChemBioChem, 2009, 10, 853-861、A. Rentmeister, T. R. Brown, C. D. Snow, M. N. Carbone and F. H. Arnold, ChemCatChem, 2011, 3, 1065-1071、E. Weber, A. Seifert, M. Antonovici, C. Geinitz, J. Pleiss and V. B. Urlacher, Chem. Commun., 2011, 47, 944-946等に記載されている。また、Ｐ４５０ＢＭ−３のＡ３２８Ｆと同様に好ましい変異型Ｐ４５０としては、Ｐ４５０ＢＭ−３A264V、同A264I、同A82W、同A328V、同A328Iが挙げられる。Ａ２６４Ｖ／Ａ３２８Ｆ、Ａ２６４Ｖ／Ａ３２８Ｖ、Ａ２６４Ｖ／Ａ３２８Ｉなどの二重変異体も挙げられる。これらは、活性中心のヘム近傍に配置されている。
【００７８】
第２のデコイ分子は、変異型Ｐ４５０に対しても適用できるため、従来野生型では困難であった炭化水素系基質を、効率的に水酸化できるようになる。例えば、メタン、エタン、プロパンなどの炭素数１〜３程度のアルカンに好適に適用することができる。より好ましくは、メタン及びエタンである。第２のデコイ分子を変異型Ｐ４５０ＢＭ３等に適用してメタン及びエタン、なかでもメタンを酵素的に酸素を用いて酸化できることは有意義である。従前、メタンについては、Ｐ４５０を含むヘム鉄を活性中心とする酵素で酸化して水酸基を導入したことは報告されていない。
【００７９】
そのほか、第２のデコイ分子については、第２の部位の少なくとも一部がフッ素化されている以外の態様については、第１のデコイ分子の各種態様をそのまま適用できる。
【００８０】
（炭化水素系基質の水酸化方法及び炭化水素系基質の水酸化物の生産方法）
本明細書に開示されるこれらの方法は、第２のデコイ分子を用いるほか、変異型Ｐ４５０を用いる以外は、第１のデコイ分子についての水酸化方法及び水酸化物の生産方法を適用することができる。
【００８１】
（変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼで炭化水素系基質を水酸化するためのデコイ分子のスクリーニング方法）
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、前記変異型Ｐ４５０の基質結合部位に結合可能な末端構造である第１の部位と、少なくとも一部がフッ素化されたアルキル鎖である第２の部位と、前記第１の部位と前記第２の部位とを連結する、ペプチド結合を含むリンカーと、を備える、１又は２以上の第２のデコイ分子候補及び炭化水素系基質の存在下で、前記変異型シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを前記炭化水素系基質に作用させる工程を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、第２のデコイ分子候補による変異型Ｐ４５０の炭化水素系基質の水酸化を評価することができ、所望の炭化水素系基質を水酸化するための第２のデコイ分子をスクリーニングすることができる。なお、本スクリーニング方法において、変異型Ｐ４５０についても１又は２以上の候補を組み合わせることで、好適な変異型Ｐ４５０をスクリーニングできる。
【００８２】
本スクリーニング方法においては、既述の水酸化方法と同様にして上記作用工程を実施することができる。
【００８３】
本スクリーニング方法においては、第１のデコイ分子におけるのと同様に、アルキル鎖長、アルキル鎖の形態、第２の部位の種類、リンカーの形態を適宜組み合わせた第１のデコイ分子候補を準備することができる。また、既述のように、変異型Ｐ４５０についても種々の公知のＰ４５０候補を準備することができる。
【００８４】
（デコイ分子を含む水酸化のためのキット及びデコイ分子組成物）
本明細書は、さらに、既に説明した第１の態様のデコイ分子及び／又は第２の態様のデコイ分子を備える、水酸化のためのキットを提供することができる。こうしたキットは、第１の態様及び第２の態様の各態様のデコイ分子につき、１又は構造の異なる２以上のデコイ分子を備えることもできる。さらに、こうしたキットは、１又は２以上のＰ４５０及び変異型Ｐ４５０を含むこともできる。
【００８５】
デコイ分子は、単独の試薬として提供されてもよいが、予め、適用するＰ４５０及び／又は変異型Ｐ４５０とを組み合わせた組成物として提供されてもよい。組成物として提供されることで、水酸化反応を簡易に行えるようになる。
【実施例】
【００８６】
以下、本明細書の開示について具体例を挙げて説明するが、本明細書の開示は以下の実施例に拘束されるものではない。
【実施例１】
【００８７】
（Ｐ４５０の発現精製）
大腸菌BL21(DE3)株に、シトクロムＰ４５０BM3（ＣＹＰ１０２Ａ１）全長をコードするＤＮＡ（アミノ酸配列、配列番号１）（C. J. C. Whitehouse, S. G. Bell, L. L. Wong, Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 1218-1260.のＦｉｇ．２に開示されるＣＹＰ１０２Ａサブファミリーのアライメント結果におけるＡ１である。）をコードするＤＮＡを挿入したｐＵＣベクターを組み込んで、P450BM3遺伝子を発現させた。産生したP450BM3を大腸菌から抽出、精製するため、大腸菌を超音波で破砕し、破砕液を遠心分離して上清を回収し、この上清を陰イオン交換カラム（DE-52）に一旦結合させ、0〜250mM KClの濃度勾配を用いて溶出し、P450BM3を示す茶色のピーク画分を回収した。
【００８８】
溶出したピーク画分の精製度をSDS-PAGEで確認し、精製度が高い画分を混合し、分画分子量（MWCO）が30,000の限外濾過キットで濃縮した後、緩衝液A(20mM Tris-HCl(pH7.4))で希釈してKCl濃度を5mM 以下にして脱塩した。続いて、陰イオン交換カラム（DEAE650S）を用いてKClを0〜1000mMの範囲で濃度勾配をかけてBM3を溶出させ、同様に精製を行った。最後に、ゲル濾過カラム（Sephacryl S-300HR）に緩衝液B(20mM Tris-HCl(pH7.4)、100mM KCl)を流してP450BM3を溶出させ、得られた茶色のピーク画分を回収し、これを野生型のP450BM3試料として、以下の反応に用いた。
【実施例２】
【００８９】
（ベンゼンの水酸化反応１）
本実施例では、Ｃ９アルキルカルボン酸（ノナン酸）を各種アミノ酸で修飾したN-アシルアミノ酸を合成し、これらのＮ−アシルアミノ酸をデコイ分子として用いて野生型P450BM3に添加することで、野生型P450BM3にベンゼンの水酸化活性を付与できることを確認した。以下、濃度は全て終濃度で示す。
【００９０】
ノナン酸を、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）を修飾して、各種のＮ−アシルアミノ酸を合成した。ノナン酸へのアミノ酸の導入については、既に説明したとおり、アミノ酸をメチルエステル化後、ノナン酸と縮合し、その後、脱保護することにより、各種のＮ−アシルアミノ酸を得た。スキームを以下に示す。なお、アミノ酸１当量に対して、以下に示す割合で各種試薬を用いた。
【００９１】
【化４】
0006679084.tif 000005
【００９２】
高純度酸素ガスを吹き込み飽和させた緩衝液Bで反応溶液の全体積の90%以上を満たし、500nM 野生型P450BM3、10mMベンゼン、100μＭの各N-アシルアミノ酸を加え、最後に5mM NADPHを添加し反応を開始した。なお、N-アシルアミノ酸を溶解するのにDMSO溶液を用いる必要があるため、結果として、反応液は0.5v/v%のDMSOを含有していた。
【００９３】
反応は、密閉したバイアルで行い、25℃以下で反応液を撹拌しながら進行させた。10分間の反応後、1M塩酸0.15mL を加えて反応を停止し、10分間撹拌した。反応液を1M水酸化ナトリウム水溶液0.15mLで中和し、アセトニトリル1.3mLを加えた後、フィルター濾過をしてHPLCで分析した。HPLCは島津社製のLC-10ADVPを用い、カラムはGL Sciences社製の逆相カラムInertsil ODS-3（内径4.6 mm、カラム長250mm、粒子径5μm）を用いた。溶離液には緩衝液B／アセトニトリル=1：1を用いて、流速0.5 mL/minで35分間測定を行った。
【００９４】
なお、Ｎ−ノナノイルアミノ酸に替えてノナン酸を用いる以外は同様の操作を行い、比較例とした。また、N-アシルアミノ酸を添加せず、代わりに0.5v/v%のDMSOのみを添加した系として同様の操作を行った。
【００９５】
各反応液のＨＰＬＣのクロマトグラム上には、比較例及び対照例には見られない新しいピークが観察された。新ピークの保持時間は、フェノールの保持時間と一致することを確認できたため、本反応液には、反応生成物としてフェノールが生成していることがわかった。各反応液におけるフェノール量及びＮＡＤＰＨの消費量も測定した。表１に、添加したＮ−ノナノイルアミノ酸に対する１分間あたりのフェノールの生成量、ＮＡＤＰＨの消費量おＮＡＤＰＨの消費量のうちフェノールの生成に利用された割合（カップリング率）を示す。
【００９６】
【表１】
0006679084.tif 000006
【００９７】
表１に示すように、ノナン酸を、グリシン、アラニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン及びトリプトファンという疎水性側鎖を有するアミノ酸で修飾して得たデコイ分子は、いずれも、ベンゼンをフェノールに酸化できることがわかった。これに対して、アミノ酸で修飾していない単なるノナン酸（比較例）及び対照例では、全くフェノールは生成していなかった。
【００９８】
また、N-アシルアミノ酸のアミノ酸部位を変えることでフェノ―ル水酸化活性とNADPHの消費量が変化することがわかった。ベンゼンの水酸化反応では、炭素数９のアルキル鎖を持つノナン酸をアミノ酸で修飾したデコイ分子を用いた場合、フェニルアラニンで修飾したC9-Pheが最も高い酸化活性を示した。
【実施例３】
【００９９】
（ベンゼンの水酸化反応２）
本実施例では、Ｎ-アシルアミノ酸のアルキル鎖の鎖長とベンゼンの酸化活性とについて評価した。本実施例では、実施例２に準じて、オクタン酸、（Ｃ８）、ノナン酸（Ｃ９）、デカン酸（Ｃ１０）及びウンデカン酸（Ｃ１１）にフェニルアラニンで修飾して各種Ｎ−アシルフェニルアラニンを合成した。これらの各種デコイ分子につき、実施例２と同様にしてベンゼンの水酸化反応を実施した。結果を表２に示す。
【０１００】
【表２】
0006679084.tif 000007
【０１０１】
表２に示すように、アミノ酸の種類によってフェノ―ル水酸化活性とNADPHの消費量が変化した。ベンゼンの水酸化反応では、フェニルアラニンを修飾したN-アシルフェニルアラニンの中で、炭素数10のアルキル鎖を持つN-デカノイルフェニルアラニン（C10-Phe）を加えた際に最も高い酸化活性を示した。さらに、フェニルアラニンに替えてロイシンで修飾したN-アシルロイシンの中でも、炭素数10のアルキル鎖を持つN-デカノイルロイシン（C１０-Leu）を加えた際に最も高い酸化活性を示した。
【０１０２】
なお、シトクロムＰ４５０BM3（ＣＹＰ１０２Ａ５）（C. J. C. Whitehouse, S. G. Bell, L. L. Wong, Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 1218-1260.のＦｉｇ．２に開示されるＣＹＰ１０２Ａサブファミリーのアライメント結果におけるＡ５である。）をコードするＤＮＡについても実施例１と同様にして操作して、Ａ５野生型のＰ４５０ＢＭ３を取得し、N-デカノイルロイシン（C１０-Leu）を用いて上記と同様にしてベンゼンの酸化活性を評価したところ、Ａ１野生型と同様、フェノールへの酸化を確認できた。
【実施例４】
【０１０３】
（プロパンの水酸化反応）
本実施例では、ノナン酸をロイシンで修飾したＮ−ノナノイルロイシン（C9-Leu）が野生型P450BM3に対してプロパンの水酸化活性を有するどうかを評価した。
【０１０４】
高純度プロパンガスと高純度酸素ガスの混合ガスを緩衝液Ｂに吹き込み飽和させて、混合ガス飽和緩衝液Bを得た。この混合ガス飽和緩衝液Ｂで反応溶液の全体積の90%以上を満たし、500nM P450BM3、100μＭ N-ノナノイルロイシンを加え、最後に5mM NADPHを添加し反応を開始した。
【０１０５】
反応は、密閉したバイアルで行い、バイアルをプロパンガスと酸素ガスの混合ガスで満たしたバルーンと接続し、バルーンの加圧下で反応液を撹拌しながら進行させた。10分間の反応後、生成したアルコールを検出、定量するため、アルコールを亜硝酸エステルに誘導体化した。亜硝酸エステルへの誘導体化は、文献Nguyen et al., Anal. Sci. 2001, 17, 639-643及びPeters et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13442-13450にならって、反応試料1mlに対して、0.20gの亜硝酸ナトリウムを加え、1.0mLのヘキサンを加えた後、氷上で20%硫酸を150μｌ滴下し、15分間反応させて行った。誘導体化後、ヘキサン相を回収し、これを純水で洗浄した。洗浄後のヘキサン相をガスクロマトグラフィーで分析した。ガスクロマトグラフは島津社製のFID検出器を有するGC-2014を用い、カラムはRestek社製のRtx-1カラム（内径0.53mm、膜厚3μｍ、カラム長60m）を用いた。分離の条件は、試料注入口温度を250℃とし、カラムオーブンの温度プログラムは50 ℃で5分維持し、その後6分かけて200℃まで昇温し、そのまま3分間維持するよう設定した。検出器は250 ℃に設定した。対照はN-ノナノイルロイシンを添加せず、代わりに0.5v/v%のDMSOのみを添加した系とし、全て同じ手順で行った。
【０１０６】
本反応で得られた試料をガスクロマトクラフィーで調べると、対照には見られない新しいピークがひとつだけ得られた。プロパンの酸化反応では1-プロパノールもしくは2-プロパノールが生成する可能性がある。そこで、2-プロパノールを直接打ち込み、その保持時間を決定すると、ちょうど反応生成物と重なる位置に検出された。これより、反応生成物が2-プロパノールであることがわかった。また、亜硝酸エステルに誘導体化したプロパノールが、本条件下では誘導体の不安定性のため亜硝酸エステルとして検出することはできず、分解してプロパノールそのものとして検出されることが明らかになった。
【０１０７】
内部標準に1mM 3-ペンタノールを用いて2-プロパノールの定量を行ったところ、上記条件により、220μＭを超える2-プロパノールが生じており、そのカップリングレート(％)は44％であった。
【実施例５】
【０１０８】
（メタンの水酸化反応）
本実施例では、デカン酸をフェニルアラニンで修飾したN-デカノイルフェニルアラニン（C10-Phe）が、P450BM3の変異体であるＰ４５０ＢＭ３ A328F変異体に対してメタンの水酸化活性を有するどうかを評価した。なお、P450BM3 A328Fは、既述のP450BM3のアミノ酸配列に対してQuikChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA)を用いることにより、A328Fの点置換変異を導入して作製した。
【０１０９】
高純度13Cメタンガスと高純度酸素ガスの混合ガスを緩衝液Ｂに吹き込み飽和させた、混合ガス飽和緩衝液(20mM Tris-HCl(pH 7.4)、100mM KCl)で反応溶液の全体積の90%以上を満たし、2μM P450BM3 A328F変異体、100μＭ N-デカノイルフェニルアラニン、カタラーゼ5×107 unit、SOD（スーパーオキシドディスミューターゼ）2×103 unitを加え、最後に5 mM NADPHを添加し反応を開始した。カタラーゼ及びＳＯＤは、Ｐ４５０の失活を抑制するために添加した。なお、N-デカノイルフェニルアラニンを溶解するのにDMSO溶液を用いたため、反応液は0.5v/v%のDMSOを含有していた。
【０１１０】
反応は、密閉したバイアルで行い、10分間の反応後、GC-MSで分析した。
【０１１１】
本反応で得られた試料をGC-MSで調べると、13Cメタノールに由来するピークが得られた。内部標準の100μM tert-ブチルアルコールを用いて13Cメタノールの定量を行ったところ、上記条件で10分間反応させると、6.8μＭの13Cメタノールが生じており、10分間で3.4回転の触媒回転数を示した。
【０１１２】
また、上記のN-デカノイルフェニルアラニンに替えてN-パーフルオロノナノイルトリプトファン（フッ素置換したデコイ分子）とする以外は、上記と同様にしてメタンの水酸化反応を行ったところ、メタノールが生成し、その触媒回転数は２０回であった。
【０１１３】
なお、同様にして、Ｐ４５０ＢＭ−３A 264V、同264I、同A82W、同A328V、同A328I、Ａ２６４Ｖ／Ａ３２８Ｆ、Ａ２６４Ｖ／Ａ３２８Ｖな、Ａ２６４Ｖ／Ａ３２８Ｉなどの二重変異体についても、メタンの酸化を確認したところ、メタノールの生成を確認できた。
【０１１４】
なお、P450BM3 A328F変異体に替えてその野生型を使う以外は、上記と同様にしてN-デカノイルフェニルアラニン及びN-パーフルオロノナノイルトリプトファンをデコイ分子として用いてメタンの水酸化反応を実施しても、全くメタノールを生じないことを確認した。
【０１１５】
以上のことから、アルキルカルボン酸にアミノ酸を導入して得たデコイ分子は、野生型及び変異型のいずれのＰ４５０にも適用可能であることがわかった。また、フッ素原子を水素原子に替えて備えるフルオロカルボン酸にアミノ酸を導入して得たデコイ分子は、変異型Ｐ４５０に対してより高い水酸化活性の増強活性を有していることがわかった。すなわち、フルオロカルボン酸にアミノ酸を導入して得たフルオロＮ−アシルアミノ酸は、変異型Ｐ４５０に対してより適合性が高いことがわかった。また、こうしたデコイ分子により、酵素的にメタンをメタノールに変換できることがわかった。
【実施例６】
【０１１６】
（エタンの水酸化反応）
本実施例では、デカン酸をフェニルアラニンで修飾したN-デカノイルフェニルアラニン（C10-Phe）が、P450BM3の変異体であるＰ４５０ＢＭ３ A328F変異体に対してメタンの水酸化活性を有するどうかを評価した。
【０１１７】
高純度13Cエタンガスと高純度酸素ガスの混合ガスを緩衝液Ｂに吹き込み飽和させた、混合ガス飽和緩衝液(20 mM Tris-HCl(pH 7.4)、100 mM KCl)を用いる以外は、実施例５と同様にして水酸化反応を行い、10分間の反応後、GC-MSで分析した。その結果、エタノールが生成していることがわかった。
【配列表】
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