(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表される化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物を含む細胞固定促進剤。
【化１】
0006679085.tif 000018
［式（１）中、Ｘは膜透過性ペプチドであって、該ペプチドを構成するアミノ酸の数が５個以上３０個以下で該ペプチドを構成するアミノ酸の２０％以上または５個以上がアルギニンであり、Ｙは炭素数１０〜５０のリン脂質であり、Ｚは下記式（２）の化合物であって、
【化２】
0006679085.tif 000019
ｎは１２５以上の整数ある。］
【請求項２】
前記Ｘの膜透過性ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の細胞固定促進剤。
【請求項３】
前記リン脂質が、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンのいずれかであることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞固定促進剤。
【請求項４】
下記一般式（１）で表される化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物と共に細胞を培養基材上に播種し、該細胞の培養基材上への固定を促進させるための細胞培養方法。
【化３】
0006679085.tif 000020
［式（１）中、Ｘは膜透過性ペプチドであって、該ペプチドを構成するアミノ酸の数が５個以上３０個以下で該ペプチドを構成するアミノ酸の２０％以上または５個以上がアルギニンであり、Ｙは炭素数１０〜５０のリン脂質であり、Ｚは下記式（２）の化合物であって、
【化４】
0006679085.tif 000021
ｎは１２５以上の整数ある。］
【請求項５】
前記Ｘの膜透過性ペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項４に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
前記リン脂質が、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンのいずれかであることを特徴とする請求項４または５に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、特に浮遊系細胞の培養用基材上への固定を促進する化合物、および当該化合物を用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学、生命科学の分野では、疾患モデル系の構築、または薬剤スクリーニング系の開発などにおいて、種々の細胞を使用して様々な研究が進められている。
細胞を用いた研究開発においては、細胞内へ遺伝子や薬剤など様々な物質を導入したり、細胞内における生体分子などの局在を観察するために免疫染色を行うなど、細胞に対し、何らかの操作を行うことが多い。
【０００３】
細胞への物質の導入方法としては、例えば、リポソームを用いる方法、電気的な刺激により細胞膜を透過化する方法、および、マイクロインジェクション法などを挙げることができる。なかでも、細胞に微細針を差し込み、この微細針を介して検査物質等を細胞内へ導入する方法であるマイクロインジェクション法は、細胞へのダメージが比較的少なく、確実に検査物質等を細胞へ導入する方法として頻繁に用いられている。マイクロインジェクション法は、細胞培養用ディッシュなどの培養基材に接着している細胞であれば、インジェクション操作もそれほど困難なものではない。しかし、浮遊系細胞の場合には、マイクロピペットなどで吸引するなどして細胞を固定した上で、インジェクションを行う必要がある。そのため、技術的にも難しく、かつ、インジェクトできる細胞の数も接着系の細胞に比べると、どうしても少なくなってしまう。浮遊系細胞へのマイクロインジェクションに関しては、培養基材等になんらかの方法で細胞を固定することができれば、接着系の細胞と同様にインジェクション操作が行うことができるため、浮遊系細胞の培養基材への適切な固定方法が望まれている。
また、細胞を免疫染色する場合でも、少なくとも、免疫染色後の細胞を観察する場合には、スライドグラスなどに固定する必要がある。浮遊系細胞を顕微鏡で観察する場合、サイトスピンなどを用いて、遠心力により、強制的にスライドグラスなどに接着させる方法もあるが、このような方法だと、静電相互作用により、強制的にスライドグラスへ接着させることになるために、細胞の形態が維持されず、細胞が破壊されてしまい、細胞本来の状態を観察することが困難になることが少なくない。
【０００４】
このように、浮遊系細胞を培養基材やスライドグラスなどの基材上に接着または固定するための物質、および、接着または固定する方法に対するニーズは高い。
これまでに、細胞の培養基材への接着を促進する物質として、ジスピロトリピペラジン誘導体（特許文献１、非特許文献２および３）が報告されている。ジスピロトリピペラジン誘導体（”adhesamine”）を培養液に添加して、細胞を培養すると、細胞の基材への接着が促進される（接着効率は、最大で60%程度）（特許文献１、非特許文献２および３）。Adhesamineによって誘導される細胞接着により、FAK（focal adhesion kinase）やERK（extracellular signal-related kinase）の活性化、アクチンフィラメントの再構成および細胞増殖の活性化が誘導される。
【０００５】
細胞の中でも、浮遊系細胞は、本来、生体組織に定着せずに存在していることが多い。例えば、血球細胞などは通常血流中を循環している。そのため、浮遊系細胞へ検査物質等を導入して細胞への影響を調べる場合においては、できるだけ、浮遊している細胞の細胞内状態を維持したまま、検査物質等を導入することが望ましい。
そこで、FAKやERKなどの細胞内シグナルを活性化することなく、かつ、効率的に浮遊系細胞の培養基材への固定を促進させ、マイクロインジェクションなどの操作を可能ならしめるような物質等の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2009/154201
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yamazoeら, Chem. Biol. 16:773-782 2009
【非特許文献２】Takemotoら, J. Am. Chem. Soc. 135:11032-11039 2013
【非特許文献３】Uesugiら, Chem. Biol., 16:773-782 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記事情に鑑み、本発明者らは、細胞、特に浮遊系細胞を、その細胞の生理的な状態にできるだけ変化を生じさせずに、細胞表面を修飾して、細胞の培養基材への固定（または接着）を促進する剤の開発を解決課題とし、鋭意研究を進めた。
すなわち、本発明は、細胞、特に血球細胞などの浮遊系細胞の培養基材への固定（または接着）を促進する化合物の提供を目的とする。
さらに、本発明は、当該化合物を含有する細胞の培養基材への固定促進剤、および当該細胞固定促進剤を用いて、浮遊系細胞を培養基材に固定（または接着）させるための細胞培養方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、膜透過性ペプチド、ポリエチレングリコール（PEG）および脂質からなる化合物（以下、「細胞固定促進化合物」とする）を浮遊系細胞と混合し、細胞培養用ディッシュに播種したところ、培養ディッシュ上に接着し、ピペッティング等によっても剥がれないことを見出し、本発明を完成させた。
本発明に係る細胞固定促進化合物は、細胞膜と相互作用して、細胞膜へ導入される化合物であり、その結果、細胞を培養基材上に固定（または接着）させる効果を有する。
発明に係る細胞固定促進化合物は、従来の細胞接着因子よりも高い細胞固定率（９０％以上）を示す。また、本発明に係る細胞固定促進化合物は、細胞の固定を促進する際、カルシウムイオンやマグネシウムイオンなどの二価カチオンを要求せず、細胞相互の接着等には影響を及ぼさない。さらに、無血清培地中でも、細胞の固定化を促進したことから、本発明に係る細胞固定促進化合物の細胞の固定促進には、細胞接着因子や細胞外マトリックスなどは不要である。
【００１０】
すなわち、本発明の以下の（１）〜（１３）である
（１）下記一般式（１）で表される化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
【化１】
0006679085.tif 000002
［式（１）中、Ｘは膜透過性ペプチド、Ｙは酸素、硫黄、リンまたは窒素を含んでいてもよい炭化水素基、Ｚは高分子電解質または水溶性高分子］
（２）前記Ｘの膜透過性ペプチドが以下の（ａ）または（ｂ）のペプチドであることを特徴とする上記（１）に記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、細胞膜を透過する活性を有するペプチド
（３）前記Ｙが酸素、硫黄、リンまたは窒素を含んでいてもよい炭素数１０〜５０の鎖状炭化水素基であることを特徴とする上記（１）に記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくは水和物。
（４）前記Ｙが酸素、硫黄、リンまたは窒素を含んでいてもよい脂質からなる炭化水素基であることを特徴とする上記（１）に記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
（５）前記脂質が、リン脂質であることを特徴とする上記（４）に記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
（６）前記リン脂質が、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンのいずれかであることを特徴とする上記（５）に記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
（７）前記Ｚが酸素、硫黄または窒素を含んでいてもよい炭素数３００〜７５００の水溶性の炭化水素鎖であることを特徴とする上記（１）に記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
（８）前記Ｚが下記の式（２）であることを特徴とする請求項１に記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
【化２】
0006679085.tif 000003
［式（２）中、ｎは１２５以上の整数］
（９）前記Ｘの膜透過性ペプチドが以下の（ａ）または（ｂ）のペプチドであり、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、細胞膜を透過する活性を有するペプチド、
前記Ｚが酸素、硫黄または窒素を含んでいてもよい炭素数３００〜７５００の水溶性の炭化水素鎖であり、および
前記Ｙが、炭素数１０〜５０で、酸素、硫黄、リンまたは窒素を含んでいてもよく、分岐型の鎖状炭化水素鎖からなる脂質であることを特徴とする上記（１）に記載の化合物しくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
（１０）前記Ｘの膜透過性ペプチドが以下の（ａ）または（ｂ）のペプチドであり、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、細胞膜を透過する活性を有するペプチド、
前記Ｚが下記の式（２）であり、および、
【化３】
0006679085.tif 000004
［式（２）中、１２５≦ｎ≦２５００の整数］
前記Ｙが、
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンまたは
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、
のいずれかであることを特徴とする、上記（１）に記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
（１１）前記一般式（１）が下記式（３）、（４）または（５）の化合物であることを特徴とする上記（１）に記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
【化４】
0006679085.tif 000005
［式中のペプチドは配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、細胞膜を透過する活性を有するペプチド］
【化５】
0006679085.tif 000006
［式中のペプチドは配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、細胞膜を透過する活性を有するペプチド］
【化６】
0006679085.tif 000007
［式中のペプチドは配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、細胞膜を透過する活性を有するペプチド］
（１２）上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物を含む、細胞固定促進剤。
（１３）上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物と共に細胞を培養基材上に播種し、該細胞の培養基材上への固定を促進させるための細胞培養方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る細胞固定促進化合物で細胞を処理し、該化合物を細胞表面に導入してから、浮遊系細胞を培養すると、培養基材上への固定（または接着）を促進する事が可能になる。その結果、浮遊系細胞の免疫染色、浮遊系細胞へのマイクロインジェクションなど、細胞を固定して行う操作を簡便に行うことができるようになる。
【００１２】
また、本発明に係る細胞固定促進化合物は、血球細胞の培養基材上への固定（または接着）も促進するため、本化合物を用いることにより、血液中の血漿成分などから、遠心分離機を用いることなく、効率良く、血球細胞を分離することなども可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、浮遊系細胞であるCCRF-CEM細胞を本発明の化合物で処理せずに、培養ディッシュに播種し、培養開始後０時間、１時間、３時間および６時間の細胞の位相差顕微鏡写真である。図中のスケールバーは50μmを示す。
【図２】図２は、化合物５による培養基材上への細胞の固定促進効果を確認したものである。CCRF-CEM細胞と本発明の化合物５を混合し、インキュベーションして、遠心分離機を用いてPBSで洗浄した後、培養ディッシュに播種した。培養開始後、経時的（０、１、３、６、２４および４８時間後）に位相差顕微鏡で細胞の状態を観察した図を示す。図中のスケールバーは50μmを示す。
【図３】図３は、異なる濃度（1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL、1mg/mL）の化合物５で処理したCCRF-CEM細胞を培養ディッシュへ播種し、ディッシュに固定または接着された細胞の割合を経時的に調べた結果である。固定または接着された細胞の割合は、ランダムに写真を撮影し、１視野当たりに細胞が固定されている数から算出した。
【図４】図４は、FITCを結合させた化合物５による細胞の基材上への固定促進効果を確認したものである。CCRF-CEM細胞と本発明の化合物５を混合し、インキュベーションして、遠心分離機を用いてPBSで洗浄した後、培養ディッシュに播種した。培養開始後、６時間後の共焦点レザー顕微鏡写真（左図）微分干渉像写真（真中図）およびこれらの写真を重ねた写真（右図）を示す。
【図５】図５は、化合物２による細胞の固定促進効果を確認した結果である。CCRF-CEM細胞と本発明の化合物２を混合し、インキュベーション後、培養ディッシュに播種した。培養開始後、経時的（０、１、３、６、２４および４８時間後）に位相差顕微鏡で細胞の状態を観察した図を示す。図中のスケールバーは50μmを示す。
【図６】図６は、化合物１（Ａ）、化合物３（Ｂ）、化合物４（Ｃ）、化合物６（Ｄ）および化合物７（Ｅ）による細胞の固定促進効果を確認した結果である。CCRF-CEM細胞と各化合物を混合し、インキュベーション後、培養ディッシュに播種した。培養開始から３時間後に位相差顕微鏡で細胞の状態を観察した図を示す。図中のスケールバーは50μmを示す。
【図７】図７は、化合物９（Ａ）、化合物１０（Ｂ）、化合物１１（Ｃ）、化合物１２（Ｄ）、化合物１３（Ｅ）、化合物１４（Ｆ）および化合物８（Ｇ）による細胞の固定促進効果を確認した結果である。CCRF-CEM細胞と各化合物を混合し、インキュベーション後、培養ディッシュに播種した。培養開始から３時間後に位相差顕微鏡で細胞の状態を観察した図を示す。図中のスケールバーは50μmを示す。
【図８】図８は、化合物１５（Ａ）および化合物１６（Ｂ）による細胞の固定促進効果を確認した結果である。CCRF-CEM細胞と各化合物を混合し、インキュベーション後、培養ディッシュに播種した。培養開始から１時間後に位相差顕微鏡で細胞の状態を観察した図を示す。図中のスケールバーは50μmを示す。
【図９】図９は、ヒトの全血を化合物５（Ｂ）および化合物２（Ｃ）で処理し、赤血球に対する固定促進効果を確認した結果である。ヒト全血と各化合物を混合し、インキュベーションして、遠心分離機を用いてPBSで洗浄した後、培養ディッシュに播種した。培養開始から１時間後に位相差顕微鏡で赤血球の状態を観察した図を示す。Ａは、処理前の浮遊状態のヒト赤血球の写真である。図中のスケールバーは20μmを示す。
【図１０】図１０は、化合物５によるヒト末梢血Ｔ細胞（Human Periphery Blood T Cells (CD4+)）およびヒト末梢血Ｂ細胞（Human Periphery Blood B Cells (CD19+)）の培養基材上への固定促進効果を確認した結果である。ヒト末梢血Ｔ細胞またはヒト末梢血Ｂ細胞と化合物５を混合し、インキュベーションして、遠心分離機を用いてPBSで洗浄した後、培養ディッシュに播種した。培養開始から１時間後（Ｃ）の各細胞の光学顕微鏡による観察結果を示す。Ａは化合物で処理していないＴ細胞とＢ細胞の状態を示す。Ｂは培養開始直後（０時間）におけるＴ細胞とＢ細胞の状態を示す。図中のスケールバーは20μmを示す。
【図１１】図１１は、化合物１〜７のヒト末梢血Ｔ細胞およびヒト末梢血Ｂ細胞の接着促進効果を調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１の実施形態は、
下記一般式（１）で表される化合物（細胞固定促進化合物）もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物。
【化７】
0006679085.tif 000008
［式（１）中、Ｘは膜透過性ペプチド、Ｙは酸素、硫黄、リンまたは窒素を含んでいてもよい炭化水素基、Ｚは高分子電解質または水溶性高分子］
一般式（１）で表される化合物が、本発明にかかる「細胞固定促進化合物」である。
本明細書中、細胞の「固定」とは、細胞が培養基材上の一定の位置に止まって動かない状態が維持されており、培養基材を揺らしても、培養基材の表面から離れない状態を意味する。「接着」よりも弱く培養基材表面と相互作用する概念である。「接着」とは、細胞の形状が変化する（扁平になる）程度に、細胞が強く培養基材上に固定された状態を意味する。なお、一般式（１）の化合物には、細胞を培養基材上に「固定」する程度のものから、「接着」する程度にまで強く「固定」するものの両方が含まれる。
一般式（１）において、Ｘの膜透過性ペプチドは、細胞膜を通過し、細胞内に移行することが知られている塩基性のペプチドであり、細胞膜を透過する能力を有するものであれば如何なるものであってもよいが、例えば、アルギニンを含むペプチド（直鎖型、分岐型いずれであってもよい）が好ましい（例えば、Futakiら, J. Biol. Chem., 276 5836-5840 2001およびFutakiら, Biochemistry, 41 7925-7930 2002などを参照のこと）。本実施形態で使用される膜透過性ペプチドは、該ペプチドを構成するアミノ酸の数が、５個以上３０個以下程度で、該ペプチドを構成するアミノ酸の２０％以上、より好ましくは３０％以上をアルギニンが占めるペプチドである。なお、全てのアミノ酸がアルギニンによって構成される場合、アミノ酸の数は、５個以上２０個程度が好ましい。本実施形態で使用されるペプチド配列を以下に例示するが、これらに限られるものではない（例えば、Futakiら, J. Biol. Chem., 276 5836-5840 2001などを参照のこと）。
また、下記のペプチドの配列と同一の配列ではなくても、細胞膜を透過する活性を有する限り、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、付加もしくは挿入などの変異を有するペプチドであっても、本実施形態の膜透過性ペプチドとして使用可能である。
【００１５】
HIV-1 Tat: YGRKKRRQRRR（配列番号１）
HIV-1 Rev: TRQARRNRRRRWRERQR（配列番号２）
FHV Coat: RRRRNRTRRNRRRVR（配列番号３）
BMV Gag: KMTRAQRRAAARRNRWTAR（配列番号４）
HTLV-II Rex: TRRQRTRRARRNR（配列番号５）
CCMV Gag: KLTRAQRRAAARKNKRNTR（配列番号６）
P22 N: NAKTRRHERRRKLAIER（配列番号７）
λN: MDAQTRRRERRAEKQAQWKAAN（配列番号８）
φ21N: TAKTRYKARRAELlAERR（配列番号９）
酵母PRP6: TRRNKRNRIQEQLNRK（配列番号１０）
R8: RRRRRRRR（配列番号１１）
R12: RRRRRRRRRRRR（配列番号１２）
R16: RRRRRRRRRRRRRRRR（配列番号１３）
【００１６】
一般式（１）のＸには、膜透過性ペプチドの他、Ｚと膜透過性ペプチドを結合するためのリンカー（またはその一部）が含まれていてもよい。例えば、マレイミド基をリンカーとして膜透過性ペプチドとＺを結合させた場合には、マレイミド基を含むリンカーまたはその一部がＸに含まれていてもよく、その他、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アジド基などを含むリンカーまたはその一部がＸに含まれていてもよい。
【００１７】
一般式（１）のＹは「酸素、硫黄、リンまたは窒素を含んでいてもよい炭化水素基」である。Ｙの「炭化水素」とは、鎖状炭化水素（直鎖型または分岐型のいずれであってもよい）、環状炭化水素、芳香族炭化水素など、特にその構造は限定されず、また、飽和炭化水素であっても不飽和炭化水素であってもよく、特に、疎水性または親油性が高い炭化水素が好ましい。
本実施形態におけるＹの「酸素、硫黄、リンまたは窒素を含んでいてもよい炭化水素基」として、限定はしないが、例えば、炭素数１０〜５０の炭化水素であって、場合によっては酸素、硫黄、リンまたは窒素が含まれる置換基、特に、炭素数１０〜５０の炭化水素であって、場合によっては酸素、硫黄、リンまたは窒素を含む鎖状炭化水素からなる置換基などを挙げることができる。
より具体的には、本実施形態におけるＹの「酸素、硫黄、リンまたは窒素を含んでいてもよい炭化水素基」として、脂質からなる（脂質を含んでなる）置換基を挙げることができる。さらに、前記脂質としては、例えば、アシルグリセロール、セラミドなどの単純脂質、リン脂質、糖脂質、リポタンパク質、スルホ脂質などの複合脂質、脂肪酸、テルペノイド、ステロイド（ステロール、コレステロールなど）、カロテノイドなどを挙げることができる。中でも、好ましくは、リン脂質、セラミド、ステロイドなどである。
また、上記脂質としては、例えば、炭素数が１０〜５０で、硫黄、リンまたは窒素を含んでいてもよく、分岐型の鎖状炭化水素鎖からなる脂質などが、好ましい例とし挙げられる。
より具体的な例として、本実施形態で使用可能な脂質として、リン脂質である下記のものを挙げることができる。
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
（1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine(DPPE)）、
１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
（1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine(DSPE)）、
１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
（1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine(DMPE)）、
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
（1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine(DOPE)）などを挙げることができる。
【００１８】
一般式（１）のＹには、「酸素、硫黄、リンまたは窒素を含んでもよい炭化水素」以外に、ＹとＺを結合するためのリンカー（またはその一部）が含まれていてもよい。例えば、マレイミド基、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アジド基などを含むリンカーまたはその一部がＹに含まれていてもよい。
【００１９】
一般式（１）中、Ｚは高分子電解質または水溶性高分子である。より具体的には、酸素、硫黄または窒素を含んでいてもよい炭素数３００〜７５００、好ましくは炭素数５００〜７５００、より好ましくは炭素数１５００〜７５００の直鎖型または分岐型の水溶性の炭化水素鎖である。
Ｚとして使用可能な「酸素、硫黄または窒素を含んでいてもよい水溶性の炭化水素鎖」としては、特に限定はしないが、糖鎖などの水溶性高分子の他、例えば、下記の式（２）で示されるＰＥＧ（polyethylene glycol、ポリエチレングリコール）などが好ましい。
【化８】
0006679085.tif 000009
一般式（１）のＺがＰＥＧの場合、その分子量は、例えば、好ましくは５ｋＤａ〜１００ｋＤａ、より好ましくは２０ｋＤａ〜１００ｋＤａ程度が好ましく、この場合、式（２）中のｎは整数であって、好ましくは１２５≦ｎまたは５００≦ｎ、より好ましくは１２５≦ｎ≦２５００程度または５００≦ｎ≦２５００程度である。
【００２０】
一般式（１）のＺがＰＥＧの場合に、一般式（１）の化合物は、下記の一般式（１’）として表すことができる。
【化９】
0006679085.tif 000010
［式（１’）中、Ｘは膜透過性ペプチド、Ｙは酸素、硫黄、リンまたは窒素を含んでいてもよい炭化水素基、ｎは１２５以上の整数］
【００２１】
一般式（１）のＺの炭化水素鎖とＸの膜透過性ペプチドを結合させる場合、適当なリンカーを介して結合させても、直接結合させてもよい。ペプチドとＺは、当該技術分野における周知技術を用いることで、容易に結合させることができる。ＸとＺの炭化水素鎖を結合させる方法について、ＺがＰＥＧの場合について、以下に例を挙げて説明する。
１．マレイミド基とチオール基の反応を利用する方法
マレイミド基を導入したＰＥＧとチオール基を有する膜透過性ペプチドを反応させる方法である。この方法によると、マレイミド基がリンカーとして機能する。すなわち、マイケル付加反応によりＰＥＧに導入されたマレイミド基と膜透過性ペプチドのチオール基が反応して、ＰＥＧと膜透過性ペプチドが結合する。膜透過性ペプチドへのチオール基の導入は、如何なる方法を用いてもよいが、例えば、システインを膜透過性ペプチドに付加することで、チオール基を膜透過性ペプチドに導入することができる。
あるいは、架橋剤であるN-(6-Maleimidocaproyloxy)succinimide(EMCS)などを用いて、膜透過性ペプチドのアミノ基（Ｎ末端のアミノ基または、膜透過性ペプチドに付加したリシン残基のアミノ基など）にマレイミド基を導入する。このマレイミドを導入した膜透過性ペプチドとチオール基を導入したＰＥＧを反応させることで、ＰＥＧと膜透過性ペプチドを結合させることができる。
マレイミド基を導入したＰＥＧ、チオール基を導入したＰＥＧは、当該技術分野における周知技術を用いて調製可能であり、また、市販のもの（日油株式会社）を使用してもよい。
【００２２】
２．ＰＥＧのCOOH基を利用する方法
COOHを有するＰＥＧと、膜透過性ペプチドのアミノ基またはOH基とのカップリング反応を利用して、ＰＥＧと膜透過性ペプチドを結合させることができる（アミド結合またはエステル結合を形成）。例えば、N,N’-ジクロロヘキシルカルボジイミド(DCC)などのカップリング試薬を用いて、ＰＥＧのCOOH基を活性化し、膜透過性ペプチドのアミノ基（Lysのアミノ基やN末端アミノ基など）またはOH基（SerやThrのOH基など）と結合させることができる。
【００２３】
３．ＰＥＧのNH2基を利用する方法
ＰＥＧのNH2基と膜透過性ペプチドのCOOH基とのカップリング反応を利用して、ＰＥＧと膜透過性ペプチドを結合させることができる（アミド結合を形成）。例えば、N,N’-ジクロロヘキシルカルボジイミド(DCC)などのカップリング試薬を用いて、膜透過性ペプチドのCOOH基を活性化し、ＰＥＧのアミノ基と結合させることができる。
【００２４】
４．ＰＥＧのOH基を利用する方法
ＰＥＧのOH基と膜透過性ペプチドのCOOH基とのカップリング反応を利用して、ＰＥＧと膜透過性ペプチドを結合させることができる（エステル結合を形成）。例えば、N,N’-ジクロロヘキシルカルボジイミド(DCC)などのカップリング試薬を用いて、膜透過性ペプチドのCOOH基を活性化し、ＰＥＧのOH基と結合させることができる。
【００２５】
５．ＰＥＧの-N3とプロパルギル基との反応を利用する方法
クリック反応により、ＰＥＧのアジド基（N3）とプロパルギル基を銅触媒存在下で結合させる。プロパルギル基を有するアミノ酸を含有する膜透過性ペプチドを調製し、アジド基を末端に有するＰＥＧと反応させ、ＰＥＧと膜透過性ペプチドを結合させることができる。
【００２６】
一般式（１）のＺとＹを結合させる場合、適当なリンカーを介して結合させても、直接結合させてもよい。
ＹがCOOH基を有しＺがアミノ基もしくはヒドロキシル基を有する場合、または、Ｙがアミノ基もしくはヒドロキシル基を有しＺがCOOH基を有する場合には、COOHを利用したカップリング反応によりＹとＺを結合させることができる。例えば、Ｙがカルボン酸を有するアルキル鎖からなる場合、ＹのCOOH基をN,N’-ジクロロヘキシルカルボジイミド(DCC)などのカップリング試薬で活性化した後、Ｚのアミノ基またはヒドロキシル基と結合させることができる。
あるいは、Ｙが活性エステル基であるN-ヒドロキシルスクシンイミド基（NHS）を有しＺがアミノ基もしくはヒドロキシル基を有する場合、または、Ｙがアミノ基もしくはヒドロキシル基を有しＺが活性エステル基であるN-ヒドロキシルスクシンイミド基（NHS）を有する場合、NHSを利用して、アミノ基もしくはヒドロキシル基との反応を利用して、ＹとＺを結合させることができる。例えば、実施例で示すように、Ｙが、アミノ基を有するDPPEやDSPEなどの場合には、活性エステル基であるN-ヒドロキシルスクシンイミド基（NHS）を持つＺと結合させることができる。
なお、ＹまたはＺに対する、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基またはN-ヒドロキシルスクシンイミド基の導入は、当該技術分野における周知の方法によって容易に実施することができる。
また、一般式（１）のＺには、「高分子電解質または水溶性高分子」以外に、ＺとＸ、および／または、ＺとＹを結合するためのリンカー（またはその一部）が含まれていてもよい。例えば、マレイミド基、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アジド基などを含むリンカーまたはその一部がＹに含まれていてもよい。
【００２７】
本発明の第２の実施形態は、本発明に係る細胞固定促進化合物もしくはその塩、またはそれらの溶媒和物もしくはそれらの水和物（細胞固定促進化合物等という）を細胞と共に培養基材上に播種し、該細胞が培養記載上に固定するのを促進させる培養方法である。
ここで「細胞」とは、株化された細胞のみならず、動物（ヒトおよび非ヒト動物）の組織から採取した初代培養細胞（プライマリー細胞）であってもよく、細胞が由来する組織も限定されない。本発明の第２の実施形態にかかる方法は、培養基材に固定および接着しない、あるいは、固定または接着性が弱い細胞に適しており、そのような細胞としては、例えば、限定はしないが、浮遊系の株化細胞や動物の組織から採取した血球系の細胞などを挙げることができる。
「培養基材」とは、細胞を接着させて培養する際に使用されるものであればいかなるものであってもよく、少なくとも、細胞が接着し得るような平坦な部分を具備し、典型的には、細胞培養皿、細胞培養ボトル（またはフラスコ）であり、市販される培養用ディッシュなどが使用可能であり、材質も特に限定されない。培養基材の材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ガラスなどが挙げられる。  また、「培養基材」の培養表面は、温度変化等によってその物性が変化する材料（温度応答性材料）で作製されているか、あるいは、該温度応答性材料によって培養基材の培養表面が層状に被覆されていてもよい。
【００２８】
本実施形態において、所望の細胞を培養基材に固定する場合、まず、所望の細胞を、本発明にかかる細胞固定促進化合物等と共に培養基材上へ播種する。この場合、所望の細胞と細胞固定促進化合物等を予め混合し、インキュベートしてから培養基材上へ播種してもよい。所望の細胞と細胞固定促進化合物等を混合したのち、当該細胞に悪影響を及ぼさない温度（例えば、4℃〜37℃程度）にて、適当な時間（例えば、15分間〜1時間程度）インキュベートしてもよい。細胞と細胞固定促進化合物等との混合比率は、特に限定されないが、例えば、104〜106 程度の細胞に対して、細胞固定促進化合物等を終濃度1 mg/mL、50μL程度加えて混合する。その後、細胞を培養基材上へ播種する。細胞を播種する前に、余分な細胞固定促進化合物等を除去するために、適当な溶液（例えば、PBSなど）で洗浄してもよい。細胞を播種する際の細胞密度は、適宜、当該細胞の使用目的および当該細胞の性質に応じて、自由に選択することができる。
【００２９】
さらに、本発明の第３の実施形態は、本発明の第１の実施形態に係る細胞固定促進化合物等を含む細胞固定促進剤である。本実施形態は、一般式（１）で示される細胞固定促進化合物が細胞の培養基材への固定を促進する効果を有することに基づくもので、所望の細胞へのマイクロインジェクションなどを行う際に、当該細胞を固定するための試薬等として使用することができる。本実施形態の細胞固定促進剤は、細胞固定促進化合物等のみを含むものであっても、適当な溶媒に溶解したものであってもよい。
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
１．本発明にかかる細胞固定促進化合物の調製
本発明にかかる細胞固定促進化合物としてその効果を確認した化合物１〜１６を下記の表１に示す。表には、一般式（１’）（一般式（１）中のＺがＰＥＧ）中のＸの膜透過性ペプチドのアミノ酸配列とＹの略称およびｎの値を示している。なお、ＸおよびＹには、ペプチドとＰＥＧ、ＤＰＰＥおよびＤＳＰＥとＰＥＧを結合するリンカー部分も含まれている。
【表１】
0006679085.tif 000011
化合物１〜７、化合物８〜１４および化合物１５〜１６の構造式を、各々、式（３）、式（４）および式（５）に示す。また、ＸおよびＹに相当する構造式とｎの数値も併せて示す。なお、Ｘのスクシンイミド基とペプチドはシステインのＳを介して結合している。
【化１０】
0006679085.tif 000012
【化１１】
0006679085.tif 000013
【化１２】
0006679085.tif 000014
【００３１】
化合物１〜１６は次のように調製した。
α-3-[(3-maleimido-1-oxopropyl) aminopropyl-ω-(succinimidyloxy carboxy), polyoxyethylene（NHS-PEG(40kDa)-Mal）（316mg）（日油株式会社）（化合物１〜７）、α-3-[(3-maleimido-1-oxopropyl) aminopropyl-ω-(succinimidyloxy carboxy)または polyoxyethylene（NHS-PEG(20kDa)-Mal）（316mg）（日油株式会社）（化合物８〜１４）、1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylethanolamine（DPPE）（それぞれ、5.4mg、11mg）（日油株式会社）およびトリエチルアミン（10μL）をジクロロメタン（4mL）に溶解させ、３日間、室温で攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテル（2L）へ滴下し、沈殿を生じさせた。グラスフィルターを通して回収した沈殿にクロロホルムを添加して、その濾液を回収し、エバポレーターで減圧留去し、真空乾燥後、Mal-PEG(20kDaまたは40kDa)-DPPEを得た（それぞれ、300mg、305mg）。
また、DSPE(1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine) (5mg) （日油株式会社）とα-3-[(3-maleimido-1-oxopropyl) aminopropyl-ω-(succinimidyloxy carboxy), polyoxyethylene（NHS-PEG(40kDa)-Mal）（294mg）（日油株式会社）（化合物１５、１６）およびトリエチルアミン（10μL）をジクロロメタン（4mL）に溶解させ、３日間、室温で攪拌した。その後、反応液をジエチルエーテル（2L）へ滴下し、沈殿を生じさせた。グラスフィルターを通して回収した沈殿にクロロホルムを添加して、その濾液を回収し、エバポレーターで減圧留去し、真空乾燥後、Mal-PEG(40kDa)-DSPEを得た（280mg）。
【００３２】
１−１．化合物１〜１４
得られたMal-PEG(40kDa)-DPPEもしくはMal-PEG(20kDa)-DPPE、各種膜透過性ペプチドおよびPBSを、下記の表２（PEG(40kDa)）および表３（PEG(20kDa)）に示す割合で混合し、室温で一日反応させ、化合物１〜７を調製した。
【表２】
0006679085.tif 000015
【表３】
0006679085.tif 000016
表２および表３に示すペプチドの配列番号は、 R4（配列番号４）、R8（配列番号１５）、R12（配列番号１６）、R16（配列番号１７）、Tat（配列番号１８）、HIV-I Rev（配列番号１９）、HTLV-II Rex（配列番号２０）である。
【００３３】
１−２．化合物１５、１６
得られたMal-PEG(40kDa)-DSPEと各種膜透過性ペプチドとPBSを下記の表４に示す割合で混合し、室温で一日反応させ、化合物１５および１６を調製した。
【表４】
0006679085.tif 000017
【００３４】
２．本発明にかかる細胞固定促進化合物の細胞の固定および接着促進効果の確認
ヒトＴリンパ球性白血病由来の浮遊系細胞であるCCRF-CEM（医薬基盤研究所）は、非処理（表面コートなどしていない）の培養ディッシュを用いて、RPMI1640（10%血清、ペニシリン／ストレプトマイシン）を含む培地で、37℃、 5%CO2環境下で培養した。
このような条件下で維持したCCRF-CEMの細胞懸濁液を遠心チューブに入れ、1,000rpmで3分間遠心した。その後、上清を除き、細胞のペレットにPBSを添加し、1,000rpmで3分間遠心後、上清のPBSを十分に取り除いた。得られた細胞ペレット（104〜105 cells）に対して、本発明の化合物１〜７を50μL（最終濃度1mg/mL程度）添加して、室温で30分間インキュベートした。インキュベート後、PBSを添加し、1,000rpmで3分間遠心後、PBSを十分に取り除き、培養液（RPMI1640（10%血清、ペニシリン／ストレプトマイシン））を添加して、培養ディッシュ（IWAKI 組織培養プレート（6 well）9.4cm2）に、化合物と共に、細胞を播種した。
ヒト全血は、自己血糖値測定用に使用される穿刺針器具を用いて採取した100μL程度の血液を、10mM EDTAを含むPBS1mL と混合して、遠心分離（3000rpm, 15min）にて洗浄した後、化合物で処理し、培養ディッシュへ播種した。ヒト末梢血Ｔ細胞とＢ細胞は、各々、初代細胞であるHPBT (Human Periphery Blood CD4+ T Cells) およびHPBB (Human Periphery Blood CD19+ B Cells)をCell Applications Inc社（San Diego, CA, US）から購入し、凍結されていた細胞を融解した後、実験に使用した。
【００３５】
２−１．化合物１〜化合物７のCCRF-CEM細胞に対する固定および接着促進効果
CCRF-CEM細胞は浮遊系細胞であるため、本発明の化合物で処理しないで培養ディッシュに播種すると、ディッシュには固定されずに浮遊状態で維持される（図１）。
化合物５とCCRF-CEM細胞を混合し、インキュベートした後、培養ディッシュに播種した。細胞は播種した直後から、培養ディッシュへ固定（または接着）し始め、１時間以内にはほとんどの細胞が扁平な形態になり、培養基材に接着していた（強く固定されていた）（図２）。接着した細胞に対し、ピペッティングなどを行っても剥がれることはなかった。接着した細胞は、少なくとも６時間程度は、安定に培養ディッシュに接着しており、２４時間経過後くらいから、剥がれ始める細胞が認められた（例えば、図２の「２４ｈ」）。次に、化合物５の使用濃度を変えて、CCRF-CEM細胞のディッシュへの接着効果を経時的に調べた（図３）。浮遊系細胞であるCCRF-CEM細胞は、使用する化合物５の濃度依存的に培養ディッシュに接着し、培養開始後６時間程度までは安定に接着した状態を維持していた。細胞の「接着」の程度は、扁平になった細胞の数を、1視野における全細胞数に対する割合として算出した。
【００３６】
化合物５による細胞固定促進活性は、EDTA存在下においても認められたことから、二価カチオン（カルシウムイオンやマグネシウムイオンなど）はこの活性に関与していないと考えられる。また、化合物５は、無血清培地中においても、細胞固定促進活性が認められたことから、細胞外マトリックスが不要であると考えられる。さらに、化合物５は細胞の培養基材への固定および接着を促進する際に、アクチンフィラメントの再構成を誘導することはなかった。
さらに、FITCを結合させた化合物５でCCRF-CEM細胞を処理して、培養基材に「接着」といえる程度に強く固定された細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞が培養基材と接触している部分に化合物５が局在している様子が認められた。この結果から、化合物５は細胞膜へ導入されるものの、細胞内へ取り込まれず、細胞膜上に存在し、細胞を培養基材上に固定する効果を有すると考えられる（図４）。
【００３７】
化合物２についても、化合物５と同様にその細胞固定促進効果について検討したところ、化合物５とほぼ同様にCCRF-CEM細胞の培養ディッシュへの固定および接着を促進し、「接着」といえる程度に強く固定されていた（図５）。
さらに、CCRF-CEM細胞を用いて、化合物１（図６Ａ）、化合物３（図６Ｂ）、化合物４（図６Ｃ）、化合物６（図６Ｄ）および化合物７（図６Ｅ）についても、その細胞固定促進効果について調べた。各化合物とCCRF-CM細胞を混合し、インキュベート後、培養ディッシュに播種し、培養開始から３時間後の細胞の状態を観察した。その結果、アルギニン４個からなるペプチドである化合物１については、培養ディッシュを揺らすと細胞の位置が移動し、細胞の固定および接着を促進する効果は認められなかったが、その他の化合物については、程度の差は多少あるものの、全ての化合物において、細胞の固定および接着促進効果を確認することができた。各化合物の細胞固定促進効果について検討すると、その効果の程度は、化合物３および化合物４は、化合物２、化合物５、化合物６および化合物７よりは若干弱い効果であるように思われた。ここで、各化合物中のアルギニンの数に着目すると、化合物３（アルギニン１２個）、化合物４（アルギニン１６個）、化合物２（アルギニン８個）、化合物５（アルギニン６個）、化合物６（アルギニン９個）、化合物７（アルギニン８個）であり、ペプチド中のアルギニン数が４程度だと細胞固定促進効果は認められず、アルギニン数が５〜９程度のペプチドにおいて良好な細胞固定促進効果を示し、さらにアルギニン数が増えると若干その効果が弱くなる傾向にあった。
【００３８】
Futakiら（Futakiら, J. Biol. Chem., 276 5836-5840 2001）は、膜透過性ペプチドの膜透過能と、アルギニンの数について相関が認められることを報告している。Futakiらは、アルギニンのみからなるオリゴペプチドを作製し、その膜透過能を調べたところ、アルギニン数４個ではほとんど膜透過性が認められず、アルギニン数６個および８個の場合には良好な膜透過性が認められず、アルギニン数が１０以上になると逆に膜透過性が低下することを確認している。
本発明の細胞固定促進化合物においても、細胞に対する固定促進効果とアルギニンの数との間に明確な相関があり、アルギニン数が１２個および１６個の場合においても細胞固定促進効果は認められているが、特に、アルギニン数が５〜９個程度のときに、良好な細胞固定効果を示していた。
本発明の細胞固定促進化合物に細胞固定促進効果の結果を、Futakiらの報告に照らして検討すると、本発明の化合物中の膜透過性ペプチドの膜透過能が高い程良好な細胞固定促進効果を示すことが強く示唆され、膜透過性ペプチドに含まれるアルギニンの数は、少なくとも５個以上が必要であり、５〜９個程度の場合に特に良好な細胞固定促進効果を示すものと考えられる。
【００３９】
また、Futakiら（Futakiら, Biochemistry, 41 7925-7930 2002）は、膜透過性ペプチドの構造と膜透過能について、直鎖型のペプチドと分岐型のペプチドでは、アルギニン数が同じである場合には同等の膜透過能を示すことを報告している。
従って、本発明の細胞固定促進化合物に含まれる膜透過性ペプチドの構造は、直鎖型に限らず分岐型であっても、良好な細胞固定促進効果を示すものと考えられる。
【００４０】
２−２．化合物８〜１４のCCRF-CEM細胞に対する固定および接着促進効果
一般式（１’）のＸおよびＹについては、化合物１〜７と同じであって、ＰＥＧの長さが異なる化合物を作製し、その細胞固定促進効果について調べた。化合物１〜７においては、ｎ＝１０００（ＰＥＧ部分の分子量が40kDa）であったが、化合物８〜１４については、ｎ＝５００（ＰＥＧ部分の分子量が20kDa）である。
化合物１〜７の場合と同様にCCRF-CEM細胞に対する固定促進効果を確認した結果を図７に示す。アルギニンの数が４個の化合物８については、培養ディッシュを揺らすと細胞の位置が移動し、細胞の固定効果は認められなかった（図７Ｇ）。化合物９〜１４については、化合物２〜８と同様に細胞の固定および接着促進効果を確認することができた。また、ＰＥＧのｎ＝１０００の場合と同様に、膜透過性ペプチドとしてアルギニン数が５〜９個程度のペプチドを使用した場合に、特に細胞の固定および接着促進効果が高かった。
なお、一般式（１）のＰＥＧの部分の分子量が1kDa（ｎ＝２５）および5kDa（ｎ＝１２５）であり、Ｘの膜透過性ペプチドが配列番号１８のアミノ酸配列からなるペプチド、ＹがDPPEである化合物についても細胞の固定促進効果を調べたところ、ＰＥＧの部分の分子量が1kDaの場合には、細胞は固定される様子はなかったが、ＰＥＧの部分の分子量が5kDaの場合には、「接着」の程度にまでは至らなかったものの、培養ディッシュを揺らしても一定の位置から動くことはなく、固定されている状態の細胞が多いことが確認できた（およそ、半数程度の細胞が、固定化状態）。
従って、一般式（１’）の化合物は、ＰＥＧの部分の分子量が、5kDa（ｎ＝１２５）以上であれば、少なくとも、細胞は「固定」され、それよりも大きな分子量の場合（ＰＥＧの分子量が20kDa（ｎ＝５００）の場合に良好な細胞固定促進効果を示していることから、ｎの値が、少なくとも１２５〜５００以上である場合）には、細胞の培養基材への「固定または接着」を促進する効果があることが分かった。
また、一般式（１）において、Ｚの部分がＰＥＧ以外の、酸素、硫黄または窒素を含んでいてもよい水溶性の炭化水素鎖（直鎖型の場合）の場合に、一般式（１）の化合物が細胞の固定化効果を発揮するためには、炭素数（炭化水素鎖の骨格中に酸素、硫黄または窒素などの他の原子が含まれている場合には、その原子の数も「炭素数」に含まれるものとする）が、少なくとも３７５よりも大きい必要があると考えられる（Ｚが炭化水素鎖の場合、Ｚに含まれる炭素数の下限値は、少なくとも３７５より大きく１５００よりは小さい値である）。
【００４１】
２−３．化合物１５および１６のCCRF-CEM細胞に対する固定および接着促進効果
一般式（１’）のＹをDSPE、Ｘの膜透過性ペプチドを配列番号１８（化合物１５）または配列番号１５（化合物１６）、PEG部分の分子量が40kDa（ｎ＝１０００）である化合物につき、細胞固定促進効果を調べた。
他の化合物１〜１４と同様に、CCRF-CEM細胞と混合し、インキュベート後、培養ディッシュに播種し、培養開始後３時間の細胞の状態を顕微鏡観察した結果を図７に示す。
Ｙの部分をDSPEにした場合においても、DPPEの場合と同様に、１時間以内にはほとんどの細胞が接着といえる程度にまで強く固定されていた。図８Ａは化合物１５を、図８Ｂは化合物１６を用いて細胞固定および接着効果を確認した結果である。
【００４２】
２−３．化合物５および２の赤血球に対する固定および接着促進効果
ヒト全血をPBSで洗浄した後、化合物５または化合物２と混合し、インキュベート後、培養ディッシュへ播種した。図９は、培養開始後１時間の赤血球の状態を示す写真である（化合物５（Ｂ）、化合物２（Ｃ））。CCRF-CEM細胞と同様に、培養開始から３０分以内に、すべての赤血球がディッシュに接着といえる程度にまで強く固定することが確認できた。
【００４３】
２−４．化合物１〜７のヒト末梢血Ｔ細胞およびヒト末梢血Ｂ細胞に対する固定および接着促進効果
ヒト末梢血Ｔ細胞およびヒト末梢血Ｂ細胞は、化合物で処理しない状態では、浮遊状態で存在している（図１０Ａ）。
化合物５とヒト末梢血Ｔ細胞またはヒト末梢血Ｂ細胞を混合し、インキュベートした後、各々の細胞を培養ディッシュに播種した。CCRF-CEM細胞と同様に、Ｔ細胞およびＢ細胞共に、１時間以内にはほとんどの細胞が接着といえる程度にまで強く固定しており（図１０Ｃ）、少なくとも６時間程度は、安定に培養ディッシュに接着していた。
他の化合物１〜４、５、６についても同様に固定または接着促進効果を調べたところ、他の細胞と同様に、化合物１による細胞固定効果は確認できなかった。ヒト末梢血Ｔ細胞については、化合物１以外の全ての化合物において細胞固定促進効果を確認できた（図１１）。ヒト末梢血Ｂ細胞についてもＴ細胞同様に、化合物１以外の全ての化合物において細胞固定促進効果を確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、本来浮遊状態で存在する浮遊系細胞を培養ディッシュへ固定または接着させる活性をもつ化合物を提供する。従って、本発明の化合物は浮遊系細胞の実験操作を容易または簡便に行うための優れたツールであり、細胞生物学等に関連する分野の発展に貢献することが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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