(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号５からなる群から選択される１種以上の外因性プロモーターに作動可能に連結されたシスタチン又はシスタチンの活性断片をコーディングするポリヌクレオチドと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含む遺伝子コンストラクトで形質転換され、胃腸管でシスタチンを発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用ペジオコックスペントサセウス菌株。
【請求項２】
前記分泌信号ペプチドは、ＵＳＰ４５分泌信号ペプチド、Ｕｓｐ４５  Ｎ４又はラクトバシラスブレビスＳ層タンパク質信号ペプチドであることを特徴とする、請求項１に記載のシスタチンを発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用ペジオコックスペントサセウス菌株。
【請求項３】
前記シスタチンは、シスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンＣ、シスタチンＤ、シスタチンＳ、卵白シスタチン、牛乳シスタチン、及びキニソゲンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のシスタチンを発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用ペジオコックスペントサセウス菌株。
【請求項４】
前記シスタチンはシスタチンＡであることを特徴とする、請求項３に記載のシスタチンを発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用ペジオコックスペントサセウス菌株。
【請求項５】
前記遺伝子コンストラクトは、前記プロモーターの下流に、二番目プロモーター、二番目分泌信号ペプチド及び二番目異種核酸配列をさらに含み、前記二番目プロモーターは前記外因性プロモーターと互いに同一であるか異なることを特徴とする、請求項１に記載のシスタチンを発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用ペジオコックスペントサセウス菌株。
【請求項６】
前記胃腸管疾患は、大膓癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性胃腸管疾患、赤痢、腸血管異形成症、憩室症、過敏性大腸症候群、又はクローン病であることを特徴とする、請求項１に記載のシスタチンを発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用ペジオコックスペントサセウス菌株。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のシスタチン又はシスタチンの活性断片を生産及び分泌するペジオコックスペントサセウス菌株を含む、胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物。
【請求項８】
ペジオコックスペントサセウス菌株を含む胃腸管疾患治療用組成物であって、前記ペジオコックスペントサセウス菌株は少なくとも一つの胃腸管疾患に対する治療効果を有する治療ペプチドをコーディングする異種核酸を含み、前記異種核酸は異種核酸に作動可能に連結された配列番号１〜配列番号５及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上のプロモーターと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含むことを特徴とする、胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物。
【請求項９】
前記組成物は薬学的に許容可能な担体又は薬学的に許容可能な塩をさらに含むことを特徴とする、請求項７又は８に記載の胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記組成物が化学療法化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載の胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物。
【請求項１１】
前記治療ペプチドは、シスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンＣ、シスタチンＤ、シスタチンＳ、卵白シスタチン、牛乳シスタチン、及びキニソゲンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシスタチンを発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物及びそれを含む胃腸管疾患予防又は治療用組成物に係り、より詳しくは胃腸管疾患治療用ポリペプチドを胃腸管に伝達するための微生物及びこれを含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【０００２】
本発明は、大韓民国の中小ベンチャー企業部の監督の下に、産業通商資源部によって後援されたＷＣ３００プロジェクト技術開発支援の一環として行った研究から導き出されたものである［課題固有番号：Ｓ２367890、研究課題名：内臓疾患の治療用薬物伝達プロバイオティックスの開発、課題期間: 2016.02.01.~2020.12.31］。
【背景技術】
【０００３】
乳酸菌は自然界に広く分布する微生物であり、炭水化物を嫌気的に用いて乳酸を生産し、乳酸菌が非病原性菌（ｎｏｎｐｈａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）であるという利点で最近には産業分野はもちろんのこと、医学分野に至るまでその利用範囲が広く増加している。このような乳酸菌は胃膓の健康を維持するのに重要な役割をすると知られているだけではなく、乳酸菌を摂取することによって健康を増進させることができることが報告されている。例えば、乳酸菌が大腸で腫瘍を抑制することができるという内容が報告された後、癌のような食生活に関連した晩成的な疾病の治療においても乳酸菌の重要性が高まっている。
【０００４】
乳酸菌の坑癌作用は腸内微生物叢の改善による発癌物質の生成抑制と腸内免疫機能の活性化による癌細胞増殖抑制によるもので、動物実験などで立証されている。一方、乳酸菌が宿主細胞の免疫作用を促進させて、坑癌効果以外にも癌細胞に対する直接的な細胞毒性の効果があることが報告された。このような活性の本体はペプチドグリカンであると報告されたことがある（Fichera, G. A., and Giese, G., Cancer Lett., 85:93-103, 1994）。
【０００５】
乳酸菌の研究は現在まで蓄積された研究成果を基にして加速化しており、本格的に乳酸菌を活用した高付加価値製品の研究が活発に行われている。最近には、生粘膜ワクチンベクター（ｌｉｖｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ）に対する関心が高まっている。しかし、乳酸菌によって外来タンパク質を生産することには、乳酸菌に効果的で安定的な発現システムが必要であった。今日まで乳酸菌からいくつかの外来タンパク質を発現させたという研究報告はあったがいまだ産業的に用いるのにはその発現量があまりにも少ない実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上述した従来技術の限界を克服するためのもので、本発明の一目的は、胃腸管疾患に有効なシスタチンを胃腸管の特定の部位に伝達するための、シスタチンをコーディングする遺伝子によって形質転換されて薬物伝達システムとして作用することができる微生物を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、胃腸管疾患治療に有益なシスタチンをその胃腸管の特定の部分に伝達するための、生物学的に活性なポリペプチドを胃腸管の所定位置で治療に効果的な高レベルで発現及び分泌することができる薬物伝達システムとしての微生物を含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するための本発明の一様相は、外因性プロモーターに作動可能に連結されたシスタチン又はシスタチンの活性断片をコーディングするポリヌクレオチドと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含む遺伝子コンストラクトで形質転換され、胃腸管でシスタチンを発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物に関する。
【０００９】
前記外因性プロモーターは、ペジオコックスペントサセウスに来由した配列番号１（Ｃｈｏｓプロモーター）、配列番号２（ＰＫプロモーター）、配列番号３（ＧＫプロモーター）、配列番号４（Ｇ６Ｐｉプロモーター）、配列番号５（Ｌ−ＬＤＨプロモーター）、及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上のプロモーターである。
【００１０】
前記菌株は、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラトコックス（Ｌａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペジオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、又はビフィドバクテリアム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株であってもよい。
【００１１】
前記菌株の具体的な例は、ラクトバシラスラムノスス、ラクトバシラスアシドフィルス、ラクトバシラスパラカセイ、ラクトバシラスプランタルム、ペジオコックスペントサセウス、又はラクトバシラスブレビス菌株を含み、好ましくは前記菌株はペジオコックスペントサセウス菌株であってもよい。
【００１２】
前記分泌信号ペプチドは、ＵＳＰ４５分泌信号ペプチド、Ｕｓｐ４５  Ｎ４又はラクトバシラスブレビスＳ層タンパク質信号ペプチドである。
【００１３】
前記シスタチンは、シスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンＣ、シスタチンＤ、シスタチンＳ、卵白シスタチン、牛乳シスタチン、及びキニソゲンからなる群から選択される。
【００１４】
薬物伝達システム（Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）としての微生物菌株に形質転換される前記遺伝子コンストラクトは、前記プロモーターの下流に、二番目プロモーター、二番目分泌信号ペプチド及び二番目異種核酸配列をさらに含み、前記二番目プロモーターは一番目プロモーターと同一であっても異なってもよい。
【００１５】
本発明の菌株は、大膓癌、大腸ポリープ、大腸炎、虚血性胃腸管疾患、赤痢、腸血管異形成症、憩室症、過敏性大腸症候群、及びクローン病のような胃腸管疾患の予防又は治療に用いられることができる。
【００１６】
上述した目的を達成するための本発明の他の様相は、シスタチン又はシスタチンの活性断片を生産する菌株を含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【００１７】
上述した目的を達成するための本発明のさらに他の様相は、ペジオコックスペントサセウス菌株を含む胃腸管疾患治療用組成物であって、前記ペジオコックスペントサセウス菌株は少なくとも一つの胃腸管疾患に対する治療効果を有する治療ペプチドをコーディングする異種核酸を含み、前記異種核酸は異種核酸に作動可能に連結されたペジオコックスペントサセウスに由来する配列番号１〜配列番号５及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上のプロモーターと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含むことを特徴とする胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明による乳酸菌の該当経路から分離されたプロモーターを含む薬物伝達用微生物菌株は腸内に滞留するうちに治療活性ペプチドを持続的に高レベルで発現及び分泌して薬物伝達システムとして効果的に機能することができる。
【００１９】
また、本発明の微生物は癌細胞増殖を抑制して転移を抑制するものであると確認されたヒト来由の天然タンパク質をコーディングする遺伝子コンストラクトを乳酸菌に形質転換させて副作用なしに治療効果を極大化することができる。
【００２０】
本発明の薬剤学的組成物によれば、大膓癌細胞において優れた癌細胞増殖抑制効果を示すだけでなく、正常細胞に対する毒性がない安全な物質であり、大膓癌の予防及び治療に非常に有用に活用することができる。
【００２１】
本発明で、経口投与経路を通して組み換え微生物によるｉｎ  ｓｉｔｕ合成による治療ペプチドの局所的伝達によって、治療に必要な投与量及びタイミングを正確に調節することができ、全身投与の必要性をなくす。
【００２２】
本発明は不安定であるか大量生産が難しい物質の局所的伝達に有用に用いられることができ、本発明によれば、副作用の問題なしに全身伝達によって収得されるものより高い濃度の治療ペプチドを持続的に局所的に伝達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施例で、ペジオコックスペントサセウス菌株を形質転換させるのに使用された単独及び二重プロモーターを含む発現ベクターの構成図である。
【図２】本発明の実施例で、ペジオコックスペントサセウス菌株を形質転換させるのに使用された発現ベクターの開裂地図である。
【図３】本発明の遺伝子コンストラクトにシスタチンＡをコーディングする遺伝子をクローニングした場合の発現量をウエスタンブロッティング法で定性的に分析した結果を示した写真である。
【図４】本発明の胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物を経口投与した後の腫瘍の大きさを比較して示したグラフである。
【図５】本発明の胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物を経口投与した後の坑癌活性を比較して示したグラフ及び写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
以下で添付図面を参照して本発明についてより詳細に説明する。
【００２５】
他に定義しない限り、本発明で使用された全ての技術的用語及び科学的用語は本発明が属する技術分野の熟練者によって通常に理解されるものと同じ意味を有する。
【００２６】
“核酸”と言う用語は一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド重合体を指称し、別途の制限がない限り、天然的に発生するヌクレオチドと類似した方式で核酸にハイブリッドされる天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む。別途の指示がない限り、特定の核酸配列はその相補配列を含む。
【００２７】
本明細書で、“プロモーター”という用語はコーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター部位は当業者であれば容易に認識することができる。プロモーターは近位及び遠位の上流エレメント（ｅｌｅｍｅｎｔ）から構成されている。近位エレメントとしては、通常的にＲＮＡ重合酵素ＩＩが適切な転写開始位置でＲＮＡの合成を開始することができるようにするＴＡＴＡボックスを含む。
【００２８】
“生物学的に活性な物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ、ＢＡＭ）”と言う用語は遺伝子治療に関与するか又は免疫反応を調節することができる物質であり、細胞内信号伝達機構（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）又は他の特定遺伝子の発現を調節することができる物質を含む。このような物質としては、成長因子、癌治療用物質、腫瘍抑制物質、サイトカイン、インターフェロンなどを含むことができる。
【００２９】
本発明で、“異種配列”又は”異種核酸”とは外来供給源（又は種）から由来するか、又は同じ供給源から由来する場合、その固有形態から改質されたものを意味する。したがって、プロモーターに作動可能に連結された異種核酸はプロモーターが誘導される供給源とは違う供給源から誘導されるか、あるいは同じ供給源の場合、その固有の形態から改質される。
【００３０】
“作動可能に連結される”と言う用語は核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、信号配列又は一連の転写因子結合部位）と異種核酸配列間の機能的連結を指称する。ここで、発現調節配列は異種核酸配列に相応する核酸の転写及び／又は翻訳に影響を与える。
【００３１】
本明細書で使われる“タンパク質”と“ポリペプチド”という用語は互いに互換的な意味として使われる。“ポリペプチド”はアミノ酸のポリマーを意味し、特定の長さの分子を意味しない。このような用語はポリペプチドの解読後の変形、例えばグリコシル化、リン酸化及びアセチル化したものも含む意味である。
【００３２】
明細書で、“予防”という用語は疾患の治療又は治癒よりは予防を目的とする医学的又は公衆衛生手続を意味する。
【００３３】
本明細書で使われる“治療”という用語は疾患の治療又は治癒を目的とする医学的又は公衆衛生手続を意味する。
【００３４】
本明細書で、“治療有効量”という用語は、被検体、例えばヒト又は動物において疾患又は障害を治療するための、すなわち所望の局所又は全身の効果及び性能を得るために有効な治療用物質又は組成物の量を示す。
【００３５】
本明細書で、“製薬学的に許容可能である”という用語は薬剤学的組成物の他の成分と適合性であり、その受容体に有害ではないことを意味する。
【００３６】
本発明の一様相は、外因性プロモーターに作動可能に連結されたシスタチン（Ｃｙｓｔａｔｉｎ）又はシスタチンの活性断片をコーディングするポリヌクレオチドと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含む遺伝子コンストラクトで形質転換され、胃腸管でシスタチンを発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物に関する。
【００３７】
本発明の微生物は医薬として使うことができる。このような医薬は治療剤として単独で投与することもできるが、通常は薬理学的に許容される一つ又はそれ以上の担体とともに混合し、製剤学の技術分野で公知の任意方法で製造した医薬製剤として提供されることが好ましい。
【００３８】
シスタチン（Ｃｙｓｔａｔｉｎ）は細胞内タンパク質分解酵素の作用を阻害する物質であり、タンパク質の大きなスーパーファミリーに属し、その多数がＣ１クラスのシステインプロテアーゼ（カテプシン）を抑制する。事実上、全ての生物体はシスタチンスーパーファミリーの一つ以上の構成員を生成する。基本的に、３種の主要シスタチン群であるＩ、ＩＩ、ＩＩＩシスタチンと多くのシスタチン関連タンパク質群がある。シスタチンはファミリーＩ（シスタチンＡ、シスタチンＢ）、分泌性のファミリーＩＩ（シスタチンＣ、シスタチンＤ、シスタチンＳ、卵白シスタチン、牛乳シスタチン）、及びファミリーＩＩＩ（キニノゲン）などに分類されることができる。シスタチンは多様な癌の力強い抑制剤として機能し、またシスタチンは癌類型の転移性向を促進させる重要な酵素であるタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性を抑制する。
【００３９】
一例として、前記シスタチンＡタンパク質は下記の表１に記載したようなアミノ酸配列を有することが好ましいが、必ずしもこれに限定されない。
【００４０】
【表１】
0006802924.tif 000002
【００４１】
本発明では標的タンパク質の乳酸菌での発現のための力強いプロモーターの５種を選別した。前記外因性プロモーターはペジオコックスペントサセウスに来由した配列番号１（Ｃｈｏｓプロモーター、Ｌ−ｃａｒｎｉｔｉｎｅ、ｃｈｏｌｉｎｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）、配列番号２（ＰＫプロモーター、ｐｙｒｕｖａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）、配列番号３（ＧＫプロモーター、ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）、配列番号４（Ｇ６Ｐｉプロモーター、ｇｌｕｃｏｓｅ６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、配列番号５（Ｌ−ＬＤＨプロモーター、Ｌ−ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）及びこれらの組合せから選択されることができる。
【００４２】
【表２】
0006802924.tif 000003
【００４３】
前記遺伝子コンストラクトは、微生物細胞に導入される場合、生物学的に活性な外来タンパク質をコーディングする異種核酸の発現を促進するプロモーターを含む。配列番号１〜配列番号５のプロモーターのうち４種（Ｃｈｏｓプロモーター、ＰＫプロモーター、ＧＫプロモーター、Ｇ６Ｐｉプロモーター）は該当作用代謝経路から選別され、１種（Ｌ−ＬＤＨプロモーター）は二次代謝産物であるラクテート生産経路から選別されたもので、乳酸菌（例えば、ペジオコックスペントサセウス）内で異種核酸を高濃度に発現するようにする力強いプロモーターである。このようなプロモーターによって本発明の微生物は薬物伝達システムとして機能して十分な量のシスタチンを生産して分泌することができる。
【００４４】
本発明の遺伝子コンストラクトは異種核酸の発現量を増加させるだけでなく分泌も向上させることができる。本明細書で、タンパク質が“分泌される”と言う表現はタンパク質が微生物細胞から細胞外に伝達されることを意味するもので、タンパク質の全体分子が全く遊離した形態で培地に実際に存在する場合を含み、またタンパク質の全ての分子が細胞の表面層に存在する場合、及びタンパク質分子の一部が培地に存在し、分子の残部は細胞の表面層に存在する場合を含む。
【００４５】
遺伝子コンストラクトには、微生物によって発現する外来タンパク質を微生物細胞の分泌経路内に誘導するために、分泌信号ペプチドが含まれる。分泌信号ペプチド配列は普通外来タンパク質をコーディングするＤＮＡ配列において５’に位置する。
【００４６】
前記遺伝子コンストラクトは微生物細胞内で複製可能な複製基点を含むこともできる。これはベクターの操作が乳酸菌株内でより効率的であるからであり、好ましい複製基点としては、例えばＣｏｌＥ１、Ｏｒｉ、ｏｒｉＴなどがある。
【００４７】
前記遺伝子コンストラクトは治療ポリペプチドが微生物薬物伝達システム（例えば、ペジオコックスペントサセウスシステム）から分泌又は放出されるようにするのに適した分泌信号ペプチド配列を含むことができる。治療ペプチドが分泌されるようにするために、ペジオコックスペントサセウスにおける使用に適した分泌信号ペプチドをコーディングする断片を異種核酸配列の５’末端又は３’末端に添加することができる。
【００４８】
前記分泌信号ペプチドはＵＳＰ４５分泌信号、野生型Ｕｓｐ４５分泌信号の位置４にあるリシンがアスパラギンに置換されたＵｓｐ４５  Ｎ４又は、ラクトバシラスブレビスＳ層タンパク質信号ペプチドなどの強いタンパク質分泌を指示する分泌信号ペプチドを含むことができる。このような分泌信号ペプチドは目的とする外来タンパク質の分泌を提供することができる。このような分泌信号ペプチド配列は目的とする治療ポリペプチドの生産及び分泌をさらに制御することができるようにする。
【００４９】
本発明の他の実施例の遺伝子コンストラクトは、前記プロモーターの下流に、上述した配列番号１〜配列番号５のいずれか一つのプロモーター以外に、二番目プロモーター、二番目分泌信号ペプチド及び生物学的に活性なポリペプチドをコーディングする二番目核酸配列をさらに含むことができる。
【００５０】
本発明の他の実施例の遺伝子コンストラクトは発現させようとする異種核酸の上流に必ず第１プロモーターを有し、また発現させようとする異種核酸の下流に第２プロモーターを含むことができる。これらの第１プロモーターと第２プロモーターは互いに同一であっても異なってもよい。大部分の細胞又は組職で外来遺伝子の発現を促進させることができる非特異的プロモーターも組職又は器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生又は分化特異的プロモーターなどの特異的又は選択的プロモーターも用いることができる。例えば、第１プロモーターとして特異的プロモーターを用い、第２プロモーターとして非特異的プロモーターを用いることができる。このように、二重プロモーターを含む遺伝子コンストラクトによって形質転換された微生物は非常に高い収率で所望の異種ポリペプチド又はタンパク質を発現することができる。
【００５１】
前記微生物菌株は、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラトコックス（Ｌａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストク（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペジオコックス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、又はビフィドバクテリアム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する菌株であってもよい。前記菌株の具体的な例は、ラクトバシラスラムノスス、ラクトバシラスアシドフィルス、ラクトバシラスパラカセイ、ラクトバシラスプランタルム、ペジオコックスペントサセウス、又はラクトバシラスブレビス属に属する菌株を含むが、必ずしもこれらに制限されるものではない。
【００５２】
好ましくは、前記菌株はペジオコックスペントサセウス菌株であってもよい。ペジオコックスペントサセウスは耐酸性及び耐胆汁性に優れて胃腸管を通過する過程で生存して生きている形態で腸粘膜に到逹してよく定着し、薬物伝達システムとしての機能を持続的に遂行することができる。
【００５３】
前記薬物伝達システムとして使われる菌株は受託番号ＫＣＣＭ１２１８０Ｐとして寄託されたペジオコックス属ＰＰ  ＣｙｓＡであることが好ましいが、本発明のシスタチンタンパク質を発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用菌株であればいずれも本発明の範囲に含まれる。
【００５４】
本発明の微生物は遺伝子コンストラクトを挿入した発現ベクターで微生物菌株をトランスフェクションすることにより、胃腸管の所定位置で微生物菌株によって目的とする治療ペプチドをコーディングする異種核酸を発現させ、治療ペプチドを生産することができる。
【００５５】
本発明の他の様相は、シスタチン又はシスタチンの活性断片を生産及び分泌する上述した微生物菌株を含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【００５６】
本発明のさらに他の様相は、ペジオコックスペントサセウス菌株を含む胃腸管疾患治療用組成物であって、前記ペジオコックスペントサセウス菌株は少なくとも一つの胃腸管疾患に対する治療効果を有する治療ペプチドをコーディングする異種核酸を含み、前記異種核酸は異種核酸に作動可能に連結されたペジオコックスペントサセウスに由来する配列番号１〜配列番号５及びこれらの組合せからなる群から選択される１種以上のプロモーターと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含むことを特徴とする胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【００５７】
前記異種核酸は、好ましくは治療用又は疾病に関連したポリペプチドをコーディングすることができる。また、異種核酸はワクチン用途の抗原性ポリペプチドをコーディングすることができる。本発明で、前記異種核酸は、ホルモン、サイトカイン、酵素、凝固因子、輸送タンパク質、受容体、調節タンパク質、構造タンパク質、転写因子、抗原、抗体などを暗号化する遺伝子であってもよい。その具体的な例としては、トロンボポエチン、成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、インターフェロン受容体、コロニー刺激因子、グルカゴン様ペプチド、Ｇ−タンパク質連結型受容体、インターロイキン、インターロイキン受容体、酵素、インターロイキン結合タンパク質、サイトカイン結合タンパク質、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制因子、細胞怪死糖タンパク質、抗毒素、リンホトキシン、腫瘍怪死因子、腫瘍抑制因子、形質転換成長因子、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖化赤血球生成因子、アンジオポエチン、ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩＩ、プラスミノゲン活性因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板来由成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン、アンジオテンシン、骨形成成長因子、骨形成促進タンパク質、カルシトニン、インシュリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合織活性因子、組職因子経路抑制剤、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状線ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インシュリン類似成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵膓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、コルチココロピン放出因子、甲状腺刺戟ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体、受容体拮抗物質、細胞表面抗原、ウイルス来由抗原、単一クローン抗体、多重クローン抗体及び抗体断片などを暗号化する遺伝子であってもよく、これらに制限されない。
【００５８】
本発明の薬剤学的組成物で治療するのに適した胃腸管疾患には、口腔、食道、胃、小腸、大腸、直腸、及び膵膓、肝及び胆嚢のような臓器に影響を及ぼす疾患又は障害が含まれる。例えば、口内乾燥、口腔潰瘍、歯肉疾患、胃食道逆流性疾患、胃潰瘍、炎症性腸疾患、炎症性大腸炎、クローン病、ミコシチス（ｍｙｃｏｓｉｔｉｓ）、胃癌、大膓癌を含み、特に大膓癌、大腸炎、過敏性大腸症侯群、クローン病の治療に有利に用いられることができる。
【００５９】
ペジオコックスペントサセウス菌株は耐酸性及び耐胆汁性に優れて胃腸管を通過する過程で生きている状態で腸粘膜に到逹してよく定着し、薬物伝達システムとしての機能を持続的に遂行することができる。
【００６０】
本発明のさらに他の様相は、本発明の菌株、すなわち外因性プロモーターに作動可能に連結されたシスタチン又はシスタチンの活性断片をコーディングするポリヌクレオチドと分泌信号ペプチドをコーディングする遺伝子を含む遺伝子コンストラクトで形質転換され、胃腸管でシスタチンを発現及び分泌する胃腸管疾患治療薬物伝達用微生物を含む胃腸管疾患予防又は治療用薬剤学的組成物に関する。
【００６１】
本発明の薬剤学的組成物は薬学的に許容可能な担体又は薬学的に許容可能な塩をさらに含むことができる。一方、前記薬剤学的組成物は化学療法化合物をさらに含むこともできる。
【００６２】
本発明の組成物の投与経路は治療時に最も効果的なものを使うことが好ましく、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内などの非経口投与を挙げることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などを挙げることができる。
【００６３】
経口投与のために胃耐性経口剤形を製剤化しても良く、この剤形は宿主細胞の制御放出を提供する化合物を含み、そこにコーディングされる目的治療ペプチドの制御放出を提供することができる。例えば、経口剤形（錠剤、ペレット、料粒、粉末含み）は胃内での溶解又は破壊に耐性を有するが、腸内では耐性を有しなく、これによって腸内での崩壊、溶解及び吸収に有利な、胃を介しての移行ができるようにする賦形剤（一般に、ポリマー、セルロース誘導体及び／又は親油性物質）の薄層でコーティングしても良い。
【００６４】
経口剤形を、例えば制御放出、持続放出、延長放出、持続作用錠剤又はカプセルに、宿主細胞及びその組み換えタンパク質の徐放ができるように設計しても良い。これらの剤形には、一般的に親油性、ポリマー性、セルロース性、不溶性、膨潤性賦形剤などの従来の周知の賦形剤が含有される。制御放出製剤は、腸、結腸、生体接着又は舌下伝達（すなわち、歯牙粘膜伝達）及び気管支伝達を含む他の任意の伝達部位にも使うことができる。前記製剤のそれぞれは当該技術分野に知られている。
【００６５】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などを挙げることができる。乳剤及びシロップ剤のような液体調剤物は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、豆油などの油類、パラオキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、いちごフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造することができる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは乳糖、葡萄糖、蔗糖、マンニトールなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造することができる。
【００６６】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などを挙げることができる。注射剤は、塩溶液、葡萄糖溶液、又は両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。もしくは、菌株を常法で凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調剤することもできる。座剤は、カカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸などの担体を用いて調剤される。また、噴霧剤は、前記化合物そのもの又は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激しなく、かつ前記化合物を微細な粒子に分散させて吸収を容易にする担体などを用いて調剤される。
【００６７】
担体としては、具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。前記化合物及び用いられる担体の性質によってエアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口製剤においても前記経口製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【００６８】
本発明による薬学組成物の有効成分である治療ペプチドを生産する菌株の使用量は、患者のお年、性別、体重、疾患によって変わるが、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇで一日１回〜数回投与することができる。
【００６９】
また、本発明による菌株の投与量は、投与経路、疾病の程度、性別、体重、お年などによって増減することができる。よって、前記投与量は何の面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００７０】
以下で本発明を実施例に基づいて見て詳細に説明する。しかしこれら実施例は本発明を例示的に説明するためのことで本発明の範囲がこれら実施例によって限定されるのではない。
【００７１】
以下で本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７２】
実施例
実施例１．乳酸菌来由タンパク質過発現及び分泌のためのシステム構築
実施例１−１．過発現誘導のための遺伝子プロモーターの選別
標的タンパク質（シスタチンＡ）の乳酸菌での発現のための力強いプロモーター５種（ＣｈｏＳ、Ｌ−カルニチン、コリンＡＢＣトランスポーター、パーミアーゼタンパク質；ＰＫ、ピルビン酸キナーゼ；ＧＫ、グルコキナーゼ；Ｇ６Ｐｉ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ；Ｌ−ＬＤＨ、Ｌ−乳酸脱水素酸素）を解糖作用代謝経路から選別した。標的タンパク質の発現ホストはペジオコックスペントサセウスＳＬ４（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ  ＳＬ４）（受託番号：ＫＣＴＣ  １０２９７ＢＰ）であり、糖の消費速度が非常に早いことを以前の実験で確認したことがあり、また消費された糖のほぼ１００％が二次代謝産物であるＬ−ラクテートに転換されることをＨＰＬＣ分析で確認したから、プロモーターの４種は解糖作用代謝経路から、そして１種は二次代謝産物であるラクテート生産経路から選別した。
【００７３】
実施例１−２．標的タンパク質の過発現及び分泌システム構築
プラスミドｐＣＢＴ２４−２（配列番号６）（ＫＣＣＭ１２１８２Ｐ）をシスタチンのクローニングに使った。実施例１−１で選別されたプロモーターをラトコックスラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）から由来したｕｓｐ４５分泌信号ペプチド［Ｎ−ＭＫＫＫＩＩＳＡＩＬＭＳＴＶＩＬＳＡＡＡＰＬＳＧＶＹＡ−Ｃ］を暗号化するＤＮＡ配列を用いてプロモーター分泌信号ペプチド−シスタチンＡ（ＣｙｓＡ）形態のＤＮＡをクローニングした。プロモーターと分泌信号ペプチドにＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ制限酵素部分を挿入した。完成されたプラスミドの種類は
ｐＣＢＴ２４−２−ＣｈｏＳ−ｕｓｐ４５−ＣｙｓＡ、
ｐＣＢＴ２４−２−ＰＫ−ｕｓｐ４５−ＣｙｓＡ、
ｐＣＢＴ２４−２−ＧＫ−ｕｓｐ４５−ＣｙｓＡ、
ｐＣＢＴ２４−２−Ｇ６Ｐｉ−ｕｓｐ４５−ＣｙｓＡ、
ｐＣＢＴ２４−２−Ｌ−ＬＤＨ−ｕｓｐ４５−ＣｙｓＡをペジオコックスペントサセウスＳＬ４（受託番号：ＫＣＴＣ  １０２９７ＢＰ）に形質転換した。各プロモーターによる発現／分泌量を測定した後、高い活性を示したプロモーターどうしの結合によって図２の発現ベクター（ｐＣＢＴ２４−２−Ｇ６Ｐｉ−ｕｓｐ４５−ＣｙｓＡ−ｕｓｐ４５−Ｇ６Ｐｉ−ＣｙｓＡ）を製作した。
【００７４】
図２の発現ベクターをペジオコックスペントサセウスＳＬ４に形質転換し、形質転換体を選別した。前記形質転換体をＬＢ液体培地に混合した後、３７℃で１時間培養させた。前記１時間培養した培養液をエリスロマイシン（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を含有したＬＢ寒天培地に平板塗抹して、耐性を示す菌株を１次選別した。
【００７５】
前記形質転換体をＰＰＣｙｓＡと名付け、韓国ソウル特別市西大門区ホンゼネ−２ガ−ギル４５のユリムビル所在の韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１７年１１月３０日付で寄託番号ＫＣＣＭ１２１８０Ｐとして寄託した。
【００７６】
実施例１−３．ペジオコックスペントサセウスＳＬ４形質転換体の培養
ＭＲＳ固体培地（ａｇａｒ  ｐｌａｔｅ）で育った形質転換体を１０ｍｌ  ＭＲＳ液体培地（エリスロマイシン、１０ｍｇ／ｍｌ）に接種し、３７℃で１５時間静置培養（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）した。この培養液１ｍｌを１０ｍｌ  Ｍ９最小培地（エリスロマイシン、１０ｍｇ／Ｌ）に接種した後、３７℃で４８時間静置培養し、培養液５ｍｌを遠心分離して上澄み液を得た。上澄み液５ｍｌはＴＣＡ沈澱法で総タンパク質を濃縮した。これをウエスタンブロッティング法でシスタチンＡタンパク質の発現及び分泌量を比較分析した。菌体の場合、緩衝溶液で希釈し、超音波粉砕機を用いて菌体を破砕した後、細胞抽出物をウエスタンブロッティング法で発現した後、分泌されることができなかったシスタチンＡタンパク質の量を分析した。
【００７７】
実施例１−４．シスタチンＡタンパク質の分離及び検出
乳酸菌形質転換体を培養した後、培養上澄み液５ｍｌに１００％ＴＣＡ（Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ  Ａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）を添加して最終濃度が２０％となるようにした。混合後、氷で３０分間反応し、４℃、１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して全てのタンパク質の沈澱を誘導した。遠心分離後、上澄み液を除去し、アセトン２００μｌを添加し、さらに４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈澱したタンパク質を洗浄した。常温で乾燥によって残ったアセトンを全く除去した後、培養上澄み液に存在する目的タンパク質分泌量を測定した。分泌量のはウエスタンブロッティング法で測定し、測定結果、新しいプロモーターの使用時、発現／分泌量が著しく増加することを確認した（図４参照）。
【００７８】
実施例２．生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）乳酸菌発現／分泌システムを用いたシスタチンＡタンパク質の坑癌効果確認
実施例２−１．腫瘍細胞移植と腫瘍増殖
韓国細胞株銀行（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から分譲された大膓癌細胞株ＤＬＤ−１は１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮＹ、ＵＳＡ）、ペニシリン（０．０２ＵＩ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）、ストレプトマイシン（０．０２μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）、グルタミン（２ｍＭ：Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）、非必須アミノ酸（１％；Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）が添加されたＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで継代培養して維持した。培養されたＤＬＤ−１細胞を懸濁して獲得した腫瘍細胞懸濁液を雄ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＮａｒｌ；５週齢）の背中皮下に０．２ｍｌ（２×１０６ｃｅｌｌ／ｍｏｕｓｅ）ずつ移植して固形腫瘍を形成した。継代群で形成された腫瘍組職を解剖するため、動物を犠牲して腫瘍塊（ｔｕｍｏｒ  ｌｕｍｐ）を摘出し、表面に分布した血管と脂肪層を除去した後、新鮮な腫瘍組職のみを選別し、套管針を用いて無処置動物の皮下に移植した。
【００７９】
実施例２−２．実験群分離及び物質投与
腫瘍塊の移植後、個別腫瘍の容積が１００〜１５０ｍｍ３に至れば、体重と腫瘍の大きさを測定し、無作為に群分離した。実験動物は群当たり１０匹ずつ下記の表３のように陰性対照群（腫瘍移植対照群：Ｇ１）、陽性対照群（５−Ｆｕ抗癌剤投与群４０ｍｇ／Ｋｇ  ５−Ｆｕ；５−フルオロウラシル、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ：Ｇ２）、試験群｛腫瘍細胞移植後、１×１０９ＣＦＵ／Ｈｅａｄ投与群（野生型Ｐ．ペントサセウス投与群：Ｇ３）、１×１０９ＣＦＵ／Ｈｅａｄ投与群（Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ（ＤＤＳ）Ｐ．ペントサセウス（Ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ）投与群：Ｇ４）、１×１０８ＣＦＵ／Ｈｅａｄ投与群（低濃度のＤＤＳ  Ｐ．ペントサセウス（Ｇ６Ｐｉ−ｕｓｐ４５−ＣｙｓＡ）投与群：Ｇ５）、１×１０９ＣＦＵ／Ｈｅａｄ投与群（中濃度のＤＤＳ  Ｐ．ペントサセウス（Ｇ６Ｐｉ−ｕｓｐ４５−ＣｙｓＡ）投与群：Ｇ６）、１×１０１０ＣＦＵ／Ｈｅａｄ投与群（高濃度のＤＤＳ  Ｐ．ペントサセウス（Ｇ６Ｐｉ−ｕｓｐ４５−ＣｙｓＡ）投与群：Ｇ７）｝に総７ヶ群に区分し、一日一１回で７週間経口投与して試験した。ここで、形質転換体はＭＲＳ培地で培養し、これを１０１０／２００μｌとなるように懸濁して経口で投与した。一日に一回ずつ総６週間投与した。
【００８０】
【表３】
0006802924.tif 000004
【００８１】
実施例２−３．固形癌の容積変化測定
大膓癌細胞株ＤＬＤ−１を移植したヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮ．Ｃｇ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ／ＣｒｌＮａｒｌ；５週齢）７群（群当たり１０匹）で腫瘍の増殖を確認し、右側わき腹の皮下に移植された腫瘍の容積は移植後に５日経過時に皮下結節として現れた。
【００８２】
腫瘍組職を移植した後、前記表３のように個体分類し、投与計画に従って腫瘍組職を移植した後、投与前０日から投与後４９日まで週１回ずつ腫瘍組職の大きさをノギス（ｖｅｒｎｉｅｒ  ｃａｌｉｐｅｒ）で測定した。試験後の第４９日にＸｅｎｏｇｒａｆｔモデル（固形癌モデル）を犠牲して組職サンプルを得、腫瘍の転移を確認した。腫瘍容積（ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）の計算は広さ２×長さ／２（ｍｍ３）の公式を使った。測定された腫瘍の大きさを図４及び図５にグラフで示した。
【００８３】
図４及び図５を参照すると、薬物伝達システム（ＤＤＳ）であるペジオコックスペントサセウス（Ｇ６Ｐｉ−ｕｓｐ４５−ＣｙｓＡ）から発現及び分泌するシスタチンＡタンパク質の効能検証結果、陰性対照群に比べて４９．０％の癌細胞成長阻害活性があることを確認し、陽性対照群に比べて９３．５％の坑癌活性があることを確認した。また、図５の下端の写真を参照すると、本発明の菌株を投与した場合、陰性対照群、陽性対照群に比べて腫瘍の大きさが著しく減少し、特に高濃度投与群の場合には、腫瘍の大きさが５−フルオロウラシルを投与した場合に近く大幅に減少し、抗癌剤に劣らない優れた坑癌活性を確認した。
【００８４】
以上で本発明の好適な実施例について詳細に記述したが、本発明は上述した実施例に限定されるものではない。本発明が属する技術分野の通常の技術者は上述した実施例に基づいて多様な変形及び変更を容易になし得ることを理解することができるであろう。したがって、本発明の真正な保護範囲は後述する特許請求範囲及びそれと均等な範囲内で決定されなければならないであろう。
【００８５】
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【００８６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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