(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ内で２以上のアミノ酸置換を含むＦｃ含有分子であって、前記ＦｃがＳ２３９Ｄ及びＶ２６４Ｌ、Ｓ２３９Ｄ及びＶ２６４Ｄ、又はＳ２３９Ｄ及びＤ２６５Ａの置換の組み合わせを含み、及び、前記ＦｃがヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２に由来する、前記Ｆｃ含有分子。
【請求項２】
前記Ｆｃが、配列番号１又は配列番号５で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＦｃ含有分子。
【請求項３】
前記Ｆｃ含有分子が抗体又はＦｃ融合タンパク質である、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＦｃ含有分子。
【請求項４】
前記Ｆｃ含有分子がＮ結合型グリコシル化を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＦｃ含有分子。
【請求項５】
前記Ｆｃ含有分子が哺乳類宿主細胞における発現によってグリコシル化される、請求項４に記載のＦｃ含有分子。
【請求項６】
前記哺乳類宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項５に記載のＦｃ含有分子。
【請求項７】
Ｆｃ含有分子の４０％を超えるものが成熟Ｎ結合型グリコシル化を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のＦｃ含有分子を含む組成物。
【請求項８】
Ｆｃ含有分子の５０％未満が未成熟のＮ結合型グリコシル化を含む、請求項４〜７のいずれか一項に記載のＦｃ含有分子を含む組成物。
【請求項９】
Ｆｃ含有分子の５％未満がマンノース５（Ｍ５）Ｎ結合型グリコシル化を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が医薬組成物である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物を含むバイアル。
【請求項１２】
請求項１０に記載の医薬組成物を含む注射器。
【請求項１３】
Ｆｃ領域を含むポリペプチドであって、前記Ｆｃ領域がＳ２３９Ｄ及びＶ２６４Ｌ、Ｓ２３９Ｄ及びＶ２６４Ｄ、又はＳ２３９Ｄ及びＤ２６５Ａの置換の組み合わせを含み、及び、前記Ｆｃ領域がヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２に由来する、前記ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１５】
プロモータに作動可能に連結されている請求項１４に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１４に記載の１以上の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１７】
前記核酸がプロモータに作動可能に連結される請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
Ｆｃ含有分子の産生方法であって、前記方法が
（ａ）Ｆｃ含有ポリペプチドの発現を生じる条件下で請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、
（ｂ）前記培養物から前記Ｆｃ含有分子を単離することと
を含む、前記方法。
【請求項２０】
Ｆｃ含有分子の組成物の製造方法であって、前記方法が
（ａ）Ｆｃ含有ポリペプチドの発現を生じる条件下で請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養することと、
（ｂ）前記培養物から前記Ｆｃ含有分子を単離してＦｃ含有分子の組成物を得ることと
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、参照によって本明細書に組み入れられる２０１３年９月５日に出願されたＵＳ６１／８７４，２２２号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる配列表を含有する。２０１４年９月５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＡ−１８５９−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、９８，３０４バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
バイオ医薬品業界では、たとえば、組換えモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のような治療用糖タンパク質は主として哺乳類細胞の培養系で製造される。ヒトｍＡｂ及び組換えｍＡｂを含む抗体は、Ｆｃ  ＣＨ２ドメインにおける高度に保存されたＡｓｎ２９７にてＮ結合型でグリコシル化される。Ｎ結合型グリコシル化の構造は、抗体の三次元構造、生成物の安定性及びＩｇＧ１やＩｇＧ２の生体内クリアランスに影響を与える。加えて、グリカンの構造は、抗体依存性細胞介在性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及びＩｇＧ１クラスの補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の活性を含むＦｃが介在する抗体のエフェクター機能に影響を与える。
【０００４】
グリコシル化の重要な特徴の１つは、種々の高マンノース形態（Ｍａｎ５〜９）、シアル酸、ガラクトース及びＮ−アセチルグルコサミン、及びコアフコースを含む様々な末端糖残基の存在または非存在によって反映されるＮ結合型Ｆｃグリカンの不完全なプロセッシングによる不均一性である（図１）。ｍＡｂの主要な種はＩｇＧ−Ｇ０（ガラクトース無し）、ＩｇＧ−Ｇ１（一方の腕部にガラクトース）及びＩｇＧ−Ｇ２（双方の腕部にガラクトース）である。Ｇ１及びＧ２はさらにシアル化することができる成熟型の糖型である（Ｇ２ＦＳＡ１及びＧ２ＦＳＡ２）（図１）。たとえば、高マンノース（ＨＭ）のグリコール形態（Ｍａｎ５〜９、２〜３５％で変動する）のようなＣＨＯに由来するＩｇＧの未成熟型の糖型は、複合体グリカンに結合するｍＡｂ分子に比べてＨＭを含有するｍＡｂの高い血漿クリアランス速度のために主な懸念であり、それは有効性への潜在的な影響をもたらす（Ｊｏｎｅｓら，（２００７）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１７，５２９−５４０；Ｇｏｅｔｚｅら，（２０１１）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２１，９４９−９５９）。別の未成熟型の糖型は末端のガラクトースがないＧ０の糖型（Ｇ０及びＧ０Ｆ）であり、それはＣＨＯに由来するＩｇＧの大半（３０〜６０％で変動する）である。末端ガラクトースのないＩｇＧは疾患の活動に連鎖することが見いだされており、血清移行試験はそれが疾患を誘導し得ることを示した（Ａｒｎｏｌｄら，（２００７）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，２１−５０）。また、これらの糖型は、たとえば、補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）のようなＩｇＧの特定の重要な特徴を欠く。
【０００５】
グリコシル化の変動が生成物の効能に影響し得るので、それは、規制当局が協調する重要な製品品質特性である。従って、治療用抗体製品で一貫した糖型特性を得ることが高度に望まれる。しかしながら、たとえば、宿主細胞、培地成分及び工程条件（ｐＨ、浸透圧、温度）のような細胞培養及び発現系はグリカンのプロセッシングに有意に影響を与える。従って、固有のグリカンの不均一性の課題に加えて、同一分子の異なる製造工程間でのｍＡｂのグリカン特性の相当なロット間変動性も一般的な状況であった。ｍＡｂのグリコシル化を制御するために製造工程及び比較可能性の課題を最適化することに十分な量の資力が費やされる。ＣＨＯ細胞の産生系の複雑さのために、哺乳類細胞株の開発、培地の最適化及び上流の操作を含むが、これらに限定されない産生条件は通常実験的に導き出される必要がある。さらに、所望のグリカン組成を実現する場合、たとえば、タンパク質力価、上流のロバスト性及び工程内管理のような他の産生開発の目標は犠牲にされることが多い。たとえば、タンパク質生成物における高マンノース形成を出来るだけ抑えるために上流の産生の間でグルコースの供給を制御する必要があってもよく、それはさらに遅い細胞の代謝速度、細胞増殖及び低下した生産性をもたらす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｎｅｓら，（２００７）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１７，５２９−５４０
【非特許文献２】Ｇｏｅｔｚｅら，（２０１１）、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２１，９４９−９５９
【非特許文献３】Ａｒｎｏｌｄら，（２００７）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５，２１−５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、バイオ医薬品業界では、予測可能で、一貫した且つ再現可能な糖型特性を示すＣＨＯ及び他の哺乳類細胞の発現系からのｍＡｂの産生に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書で記載されるのは、Ｆｃ含有分子、たとえば、Ｆｃ融合分子及び抗体のグリコシル化の成熟を改善し、且つその培養工程に依存した影響を出来るだけ抑える組成物及び方法である。高マンノースのプロセッシング及びグリコシル化の成熟を改善することを目的としてＦｃドメイン内で単一及び複数のアミノ酸置換を作ることは、驚くべきことに、さらに良好な製品品質管理と同様に所望の治療有効性の達成を提供するさらに成熟し、且つ不均一性の低いグリカン特性を示すｍＡｂを細胞が一貫して産生するようにした。
【０００９】
第１の態様では、本発明は、２３９位、２４１位、２６２位、２６４位、２６５位、２９６位、または３０１位にてアミノ酸配列を含む、たとえば、抗体またはＦｃ融合分子のようなＦｃ含有分子に関する。２３９位における好まれる置換にはＳ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、及びＳ２３９Ｋが挙げられるが、これらに限定されない。２４１位における好まれる置換はＦ２４１Ａである。２６２位における好まれる置換はＶ２６２Ａである。２６４位における好まれる置換にはＶ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ａ、及びＶ２６４Ｓが挙げられるが、これらに限定されない。２６５位における好まれる置換にはＤ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｖ、及びＤ２６５Ｓが挙げられるが、これらに限定されない。２９６位における好まれる置換はＦ２９６Ａである。３０１位における好まれる置換はＦ３０１Ａである。
【００１０】
一実施形態では、Ｆｃ含有分子はＳ２３９Ｄの置換を含む。
【００１１】
一実施形態では、Ｆｃ含有分子はＦ２４１Ａの置換を含む。
【００１２】
一実施形態では、Ｆｃ含有分子はＶ２６２Ａの置換を含む。
【００１３】
別の実施形態では、Ｆｃ含有分子はＶ２６４Ｄの置換を含む。
【００１４】
別の実施形態では、Ｆｃ含有分子はＶ２６４Ｌの置換を含む。
【００１５】
別の実施形態では、Ｆｃ含有分子はＤ２６５Ａの置換を含む。
【００１６】
別の実施形態では、Ｆｃ含有分子はＤ２６５Ｖの置換を含む。
【００１７】
別の実施形態では、Ｆｃ含有分子はＤ２６５Ｓの置換を含む。
【００１８】
別の実施形態では、Ｆｃ含有分子はＦ２９６Ａの置換を含む。
【００１９】
一実施形態では、Ｆｃ含有分子はＦ３０１Ａの置換を含む。
【００２０】
本発明の範囲内に含まれるのは、２３９位、２４１位、２６２位、２６４位、２６５位、２９６位、または３０１位にて置換の組み合わせを有するＦｃ含有分子である。好まれる組み合わせには、２３９位及び２６４位での置換（たとえば、Ｓ２３９Ｄ及びＶ２６４ＤまたはＳ２３９Ｄ及びＶ２６４Ｌ）、２３９位及び２６５位での置換（たとえば、Ｓ２３９Ｄ及びＤ２６５Ａ）、２６４位及び２９６位での置換（たとえば、Ｖ２６４Ｄ及びＦ２９６Ａ）、並びに２６４位及び２６５位での置換（たとえば、Ｖ２６４Ｌ及びＤ２６５Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
第１の態様の特定の実施形態では、Ｆｃ含有分子は抗体である。他の実施形態では、Ｆｃ含有分子はＦｃ融合タンパク質である。
【００２２】
第１の態様の好まれる実施形態では、Ｆｃ含有分子はグリコシル化される。Ｆｃ含有分子は、たとえば、ＣＨＯ細胞のような哺乳類の宿主細胞における発現を介してグリコシル化されてもよい。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、Ｆｃ含有分子の４０％を超えるものが成熟Ｎ結合型のグリコシル化（Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、Ｇ２Ｆ、Ｇ２  ＦＳＡ１、及びＧ２  ＦＳＡ２）を含む、第１の態様のＦｃ含有分子を含む組成物に関する。好まれる実施形態ではＦｃ含有分子の４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、または８０％を超えるものが成熟Ｎ結合型のグリコシル化を含む。特定の実施形態では、成熟Ｎ結合型のグリコシル化を含むＦｃ含有分子の比率は、４０％〜８５％、４５％〜８５％、５０％〜８５％、５５％〜８５％、６０％〜８５％、６５％〜８５％、７０％〜８５％、７５％〜８５％、または８０％〜８５％の間である。第２の態様の特定の実施形態では、成熟Ｎ結合型のグリコシル化は９０％未満である。
【００２４】
第３の態様では、本発明は、Ｆｃ含有分子の５０％未満が未成熟のＮ結合型グリコシル化（Ｇ０及びＧ０Ｆ）を含む、第１の態様のＦｃ含有分子を含む組成物に関する。好まれる実施形態では、Ｆｃ含有分子の４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が未成熟のＮ結合型グリコシル化を含む。
【００２５】
第３の態様では、本発明は、Ｆｃ含有分子の５０％未満の未成熟のＮ結合型グリコシル化（Ｇ０及びＧ０Ｆ）を含む、第１の態様のＦｃ含有分子を含む組成物に関する。好まれる実施形態では、Ｆｃ含有分子の４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が未成熟のＮ結合型グリコシル化を含む。
【００２６】
第４の態様では、本発明は、Ｆｃ含有分子の５％未満がマンノース５（Ｍ５）Ｎ結合型グリコシル化を含む、第１の態様のＦｃ含有分子を含む組成物に関する。好まれる実施形態では、Ｆｃ含有分子の４％未満、３％未満または２％未満がマンノース５（Ｍ５）Ｎ結合型グリコシル化を含む。
【００２７】
第５の態様では、本発明は、Ｆｃ領域が２３９位、２４１位、２６２位、２６４位、２６５位、２９６位、または３０１位にてアミノ酸置換を含む前記Ｆｃ領域を含むポリペプチドに関する。２３９位における好まれる置換にはＳ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、及びＳ２３９Ｋが挙げられるが、これらに限定されない。２４１位における好まれる置換はＦ２４１Ａである。。２６２位における好まれる置換はＶ２６２Ａである。２６４位における好まれる置換にはＶ２６４Ｄ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ａ、及びＶ２６４Ｓが挙げられるが、これらに限定されない。２６５位における好まれる置換にはＤ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｖ、及びＤ２６５Ｓが挙げられるが、これらに限定されない。２９６位における好まれる置換はＦ２９６Ａである。３０１位における好まれる置換はＦ３０１Ａである。
【００２８】
一実施形態では、ポリペプチドはＦｃ領域にてＳ２３９Ｄの置換を含む。
【００２９】
一実施形態では、ポリペプチドはＦｃ領域にてＦ２４１Ａの置換を含む。
【００３０】
一実施形態では、ポリペプチドはＦｃ領域にてＶ２６２Ａの置換を含む。
【００３１】
別の実施形態では、ポリペプチドはＦｃ領域にてＶ２６４Ｄの置換を含む。
【００３２】
別の実施形態では、ポリペプチドはＦｃ領域にてＶ２６４Ｌの置換を含む。
【００３３】
別の実施形態では、ポリペプチドはＦｃ領域にてＤ２６５Ａの置換を含む。
【００３４】
一実施形態では、ポリペプチドはＦｃ領域にてＤ２６５Ｖの置換を含む。
【００３５】
別の実施形態では、ポリペプチドはＦｃ領域にてＤ２６５Ｓの置換を含む。
【００３６】
別の実施形態では、ポリペプチドはＦｃ領域にてＦ２９６Ａの置換を含む。
【００３７】
一実施形態では、ポリペプチドはＦｃ領域にてＦ３０１Ａの置換を含む。
【００３８】
第６の態様では、本発明は第５の態様のポリペプチドをコードする核酸に関する。
【００３９】
第７の態様では、発現ベクターはプロモータに作動可能に連結された第６の態様の核酸を含む。
【００４０】
第８の態様では、宿主細胞は１以上の第６の態様の核酸を含む。好まれる実施形態では、宿主細胞は１以上の第７の態様の発現ベクターを含む。
【００４１】
第９の態様では、本発明はＦｃ含有分子を産生させる方法に関する。Ｆｃ含有分子の発現を引き起こす条件下で第８の態様の宿主細胞を培養することと、培養物からＦｃ含有分子を単離することとを含む方法。好まれる実施形態では、Ｆｃ含有分子は宿主細胞によって分泌され、増殖培地から単離される。
【００４２】
第１０の態様では、本発明は第２、第３または第４の組成物を製造する方法に関する。Ｆｃ含有分子の発現を引き起こす条件下で第８の態様の宿主細胞を培養することと、培養物からＦｃ含有分子を単離してＦｃ含有分子組成物を得ることとを含む方法。好まれる実施形態では、Ｆｃ含有分子は宿主細胞によって分泌され、増殖培地から単離される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】哺乳類細胞に由来するＩｇＧで見いだされるＮ−グリカンの構造を示す図である。
【図２】ｍＡｂのグリコシル化に潜在的な影響を有するＩｇＧ２のＦｃドメインの残基を示す図である。標識したオリゴ糖と生体内でのグリカンのプロセッシングに潜在的な影響を有する残基を伴ったＩｇＧ２の結晶構造。
【図３】Ｆｃ領域におけるアミノ酸の変異は％マンノース５を減らすことを示す図である。１０日間の流加産生培養によってＦｃ変異体ｍＡｂを生成した。３つの独立した形質移入プールのグリカンマッピングの結果を示す。示されたデータは標準偏差を伴った３つ組の値の平均を表す。（Ａ）増幅せず；（Ｂ）１５０ｎＭのＭＴＸで増幅した。
【図４】グリコシル化の成熟を増やすアミノ酸の変異を示す図である。１０日間の流加産生培養によってＦｃ変異体ｍＡｂを生成した。３つの独立した形質移入プールのグリカンマッピングの結果を示す。示されたデータは標準偏差を伴った３つ組の値の平均を表す。（Ａ）増幅せず；（Ｂ）１５０ｎＭのＭＴＸで増幅した。
【図５】未成熟の糖型を減らすアミノ酸の変異を示す図である。１０日間の流加産生培養によってＦｃ変異体ｍＡｂを生成した。３つの独立した形質移入プールのグリカンマッピングの結果を示す。示されたデータは標準偏差を伴った３つ組の値の平均を表す。（Ａ）増幅せず；（Ｂ）１５０ｎＭのＭＴＸで増幅した。
【図６】Ｆｃ変異体ｍＡｂの示差走査熱量測定を示す図である。
【図７】サイトカイン受容体に対する野生型抗体及びＦｃ変異体抗体の結合親和性を示す図である。
【図８】野生型抗体及びＦｃ変異体抗体のＦｃγＲＩＩＡ（Ｈ１３１）への結合を示す図である。
【図９】野生型抗体及びＦｃ変異体抗体のＦｃＲｎへの結合を示す図である。
【図１０】ヒトＦｃＲｎのトランスジェニックマウスにおける薬物動態試験を示す図である。
【図１１】野生型抗体及びＦｃ変異体抗体のＭ５レベルを示す図である。
【図１２】野生型抗体及びＦｃ変異体抗体の高マンノースグリカン（Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８及びＭ９）を示す図である。
【図１３】野生型抗体及びＦｃ変異体抗体の未成熟種Ｇ０及びＧ０Ｆのレベルを示す図である。
【図１４】野生型抗体及びＦｃ変異体抗体のガラクトシル化された及びシアル化されたグリカン構造のレベルを示す図である。
【図１５】野生型抗体及びＦｃ変異体抗体のシアル化のレベル（ＳＡ１及びＳＡ２）を示す図である。
【図１６】野生型抗体及びＦｃ変異体抗体の親水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ−ＭＳ）によるグリカンのマッピングを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本明細書で使用される節の見出しは構成する目的のみのためのものであり、記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。本明細書の本文内で引用される参考文献はすべてその全体が参照によって明らかに組み入れられる。
【００４５】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチドの合成、組織培養及び形質転換、タンパク質の精製等には標準の技法が使用されてもよい。酵素反応及び精製法は、製造元の仕様書に従って、または当該技術で一般に達成されるようにまたは本明細書で記載されるように実施されてもよい。以下の手順及び技法は一般に、当該技術で周知の従来の方法に従って、及び本明細書全体にわたって引用され、議論される種々の一般的な及びさらに特定の参考文献に記載されたように実施されてもよい。たとえば、任意の目的で参照によって本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋら，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｅｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。特定の定義が提供されない限り、本明細書で記載される分析化学、有機化学、及び医化学及び製薬化学に関連して使用される命名法、並びにそれらの実験室手順及び技法は、当該技術で周知であり、一般に使用されるものである。標準の技法が化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤化及び送達及び患者の治療に使用されてもよい。
定義
【００４６】
用語「高マンノース」（「ＨＭ）」）は本明細書で使用されるとき、５以上のマンノース残基を伴った２つのＮ−アセチルグルコサミンを指す。
【００４７】
用語「Ｍ５」は本明細書で使用されるとき、５つのマンノシル残基を伴ったマンノース５、Ｎ結合型オリゴ糖、Ｍａｎ５ＧｌｃＮａｃ２を指す。
【００４８】
用語「Ｇ０」は本明細書で使用されるとき、ガラクトースまたはフコースを伴わない複合体二分岐オリゴ糖、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を指す。
【００４９】
用語「Ｇ０Ｆ」は本明細書で使用されるとき、コアフコースを含有し、且つガラクトースを伴わない複合体二分岐オリゴ糖、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃを指す。
【００５０】
用語「Ｇ１」は本明細書で使用されるとき、フコースを伴わず、且つガラクトシル残基１つを含有する複合体二分岐オリゴ糖、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を指す。
【００５１】
用語「Ｇ１Ｆ」は本明細書で使用されるとき、コアフコースとガラクトシル残基１つを含有する複合体二分岐オリゴ糖、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃを指す。
【００５２】
用語「Ｇ２」は本明細書で使用されるとき、フコースを伴わず、且つガラクトシル残基２つを含有する複合体二分岐オリゴ糖、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を指す。
【００５３】
用語「Ｇ２Ｆ」は本明細書で使用されるとき、コアフコースとガラクトシル残基２つを含有する複合体二分岐オリゴ糖、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃを指す。
【００５４】
用語「Ｇ２Ｓ１Ｆ」は本明細書で使用されるとき、コアフコースとガラクトシル残基２つとＮ−アセチルノイラミン酸残基１つを含有する複合体二分岐オリゴ糖、ＮＡＮＡＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃを指す。
【００５５】
用語「Ｇ２Ｓ２Ｆ」は本明細書で使用されるとき、コアフコースとガラクトシル残基２つとＮ−アセチルノイラミン酸残基２つを含有する複合体二分岐オリゴ糖、ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ｆｕｃを指す。
【００５６】
用語「抗体」は本明細書で使用されるとき、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原結合部位を介して特異抗原に結合する免疫グロブリン分子を指す。「免疫グロブリン」は四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンでは、各四量体は、各対が「軽」鎖１本（約２５ｋＤａ）と「重」鎖１本（約５０〜７０ｋＤａ）を有するポリペプチドの２つの同一の対で構成される。各鎖のアミノ末端部分には、主として抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。ヒトの軽鎖は、κ軽鎖及びλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥのような抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖及び重鎖の範囲内で、可変領域及び定常領域は約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖はまた約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。一般的に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ、Ｗ．編，第２版．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照のこと。各軽鎖／重鎖の対の可変領域は、インタクトな免疫グロブリンが２つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【００５７】
天然に存在する免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結される相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示す。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖及び重鎖の双方はドメイン、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔら．ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２，１９９１の定義に従う。インタクトな抗体には、完全長の重鎖及び軽鎖を有するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及び完全なヒト抗体が含まれる。
【００５８】
抗体は１以上の結合部位を有してもよい。１を超える結合部位があるのならば、結合部位は互いに同一であってもよいし、または異なっていてもよい。たとえば、天然に存在するヒト免疫グロブリンは通常、２つの同一の結合部位を有する一方で、「二重特異性」または「二重官能性」の抗体は２つの異なる結合部位を有する。
【００５９】
用語「ヒト抗体」には、ヒトの免疫グロブリン配列に由来する１以上の可変領域及び定常領域を有する抗体すべてが含まれる。一実施形態では、可変領域及び定常領域のすべてがヒト免疫グロブリン配列に由来する（完全ヒト抗体）。これらの抗体は、ヒトの重鎖及び／または軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するように遺伝的に操作されるマウスの当該抗原による免疫を介することを含む、その例が以下で記載される種々の方法によって調製されてもよい。特定の実施形態では、ヒト抗体の重鎖をＣＨ２ドメインで変化させて、たとえば、ＣＨＯ細胞のような組換え細胞株で発現させる場合、抗体のグリコシル化特性を変化させる。
【００６０】
ヒト化抗体は１以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／または付加によって非ヒト種に由来する抗体の配列とは異なる配列を有するので、ヒト対象に投与される場合、ヒト化抗体は、非ヒト種抗体に比べて、免疫応答を誘導する可能性が低く、及び／またはさほど重篤ではない免疫応答を誘導する。一実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖及び／または軽鎖のフレームワークドメイン及び定常ドメインにおける特定のアミノ酸を変異させてヒト化抗体を作出する。別の実施形態では、ヒト抗体に由来する定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインに融合させる。ヒト化抗体の作製の仕方の例はＵＳ６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号及びＵＳ同第５，８７７，２９３号にて見いだされ得る。
【００６１】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体に由来する１以上の領域と１以上の他の抗体に由来する１以上の領域を含有する抗体を指す。キメラ抗体の一例では、重鎖及び／または軽鎖の一部は特定の種の抗体または特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体と同一であり、それに対して相同であり、またはそれに由来する一方で、鎖の残りの部分は別の種の抗体または別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体と同一であり、それに対して相同であり、またはそれに由来する。含められるのはまた、所望の生物活性を示すそのような抗体の断片である。
【００６２】
抗体の断片または類似体は、本明細書の教示に従って、当該技術で周知の技法を用いて当業者が容易に調製することができる。断片または類似体の好まれるアミノ末端及びカルボキシ末端は機能的なドメインの境界の近傍に存在する。ヌクレオチド及び／またはアミノ酸の配列データを公的なまたは独占所有権のある配列データベースと比較することによって構造的な及び機能的なドメインを特定することができる。コンピュータによる比較法を用いて既知の構造及び／または機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予想されるタンパク質の構造ドメインを特定することができる。既知の三次元構造に折り畳むタンパク質配列を特定する方法が知られている。たとえば、Ｂｏｗｉｅら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：１６４を参照のこと。
【００６３】
「ＣＤＲ移植抗体」は特定の種またはアイソタイプの抗体に由来する１以上のＣＤＲと同一または異なる種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークとを含む抗体である。
【００６４】
用語「Ｆｃポリペプチド」または「Ｆｃ領域」には、本明細書で使用されるとき、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドのネイティブな形態及び変異タンパク質の形態が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するそのようなポリペプチドの切り詰め形態も含まれる。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。長い血清半減期と併せて、Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（及びそれから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡカラムまたはプロテインＧカラムでのアフィニティクロマトグラフィによる容易な精製という利点を提供する。好まれるＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むヒトのＩｇＧに由来する。本明細書では、Ｆｃ内での特定の残基は位置によって特定される。Ｆｃの位置はすべてＥＵ番号付け方式に基づく。
【００６５】
任意のペプチドまたはポリペプチドをＦｃ領域に共有結合させて「Ｆｃ融合分子」または「Ｆｃ融合タンパク質」を作ってもよい。ポリペプチドまたはペプチドをＦｃのＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインの中の１以上のループに挿入してもよい。通常、ポリペプチドまたはペプチドはＦｃのＮ末端またはＣ末端に共有結合される。好まれる実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドとＦｃは、遺伝子融合の産物、すなわち、単一のオープンリーディングフレーム内にコードされた産物として単一ポリペプチドとして発現される。
【００６６】
特定の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃと目的のペプチドまたはポリペプチドとの間でリンカーを含む。多数の異なるリンカーポリペプチドが当該技術で既知であり、Ｆｃ融合タンパク質の文脈で使用されてもよい。好まれる実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃと目的のペプチドまたはポリペプチドとの間でＧＧＧＧＳ（配列番号４７）、ＧＧＮＧＴ（配列番号４８）、またはＹＧＮＧＴ（配列番号４９）から成るペプチドの１以上のコピーを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域と目的のペプチドまたはポリペプチド領域との間のポリペプチド領域はＧＧＧＧＳ、ＧＧＮＧＴ、またはＹＧＮＧＴの単一コピーを含む。リンカーＧＧＮＧＴまたはＹＧＮＧＴは適当な細胞で発現される場合グリコシル化され、そのようなグリコシル化は溶液にて及び／または生体内で投与される場合、タンパク質を安定化するのに役立ち得る。従って、特定の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ領域と目的のペプチドまたはポリペプチドとの間でグリコシル化されたリンカーを含む。
【００６７】
例となるヒトＩｇＧ１のＦｃのアミノ酸配列は、
ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１）である。
【００６８】
上記配列にて、ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ（配列番号２）はヒンジ領域に相当する。
【００６９】
ＣＨ２ドメインに相当するＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ（配列番号３）及び
ＣＨ３ドメインに相当するＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４）。
【００７０】
例となるヒトＩｇＧ２のＦｃのアミノ酸配列は、
ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号５）である。
【００７１】
上記配列にて、ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ（配列番号６）はヒンジ領域に相当し、ＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＰＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱ（配列番号７）はＣＨ２ドメインに相当し、且つＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８）はＣＨ３ドメインに相当する。
Ｆｃ含有ポリペプチド
【００７２】
好まれるＦｃ含有ポリペプチドには、ＥＵ位置、２３９位、２４１位、２６２位、２６４位、２６５位、２９６位、または３０１位にてアミノ酸置換を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。以下で議論するように、そのようなポリペプチドはＦｃ領域と共に、１以上の追加の欠失、付加または置換を有してもよい。従って、本発明の範囲内にあるのは、ＥＵ位置、２３９位、２４１位、２６２位、２６４位、２６５位、２９６位、または３０１位にてアミノ酸置換を有し、且つ、配列番号１または配列番号５に対して少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、及び少なくとも９９％同一であるＦｃ含有ポリペプチドである。
【００７３】
アミノ酸配列については、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２のローカル配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性配列比較アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性方法のための検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実施（ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５によって記載された、好ましくは初期設定を用いた、または調査によるＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラムを含むが、これらに限定されない、当該技術で既知の標準法を用いて配列の同一性及び／または類似性が決定される。好ましくは、パーセント同一性は、以下のパラメータ：１のミスマッチペナルティ；１のギャップペナルティ；０．３３のギャップサイズペナルティ；及び３０の結合ペナルティ、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ１２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃに基づいてＦａｓｔＤＢによって算出される。
【００７４】
有用なアルゴリズムの例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは累進的な一対配列比較を用いて関連する配列の群から複数の配列の配列比較を作る。それはまた配列比較を作るために使用されるクラスター化関係を示す階層をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰはＦｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０の累進的配列比較法の単純化を用い；方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１−１５３によって記載されたものに類似する。３．００の初期設定ギャップ加重、０．１０の初期設定ギャップの長さ加重及び加重された末端ギャップを含む有用なＰＩＬＥＵＰのパラメータ。
【００７５】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７にて記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：４６０−４８０から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は幾つかの検索パラメータを使用し、そのほとんどは初期設定値に設定される。調整可能なパラメータは以下の値：オーバーラップ距離＝１、オーバーラップ分画＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝ＩＩで設定される。ＨＳＰＳ及びＨＳＰＳ２のパラメータは動的値であり、特定の配列の組成及び目的の配列が検索される特定のデータベースの組成に応じてプログラム自体によって確立されるが、値は感度を高めるように調整されてもよい。
【００７６】
追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２によって報告されたようなギャップＢＬＡＳＴである。ギャップＢＬＡＳＴは、ＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア；９に設定された閾値Ｔパラメータ；ギャップのない伸長を始動させる２ヒット法、ｋの電荷ギャップ長、１０＋ｋのコスト；１６に設定されたＸｕ及びデータベース検索段階のための４０に設定されたＸｇ及びアルゴリズムの出力段階のための６７に設定されたＸｇを使用する。ギャップアルゴリズムは約２２バイトに相当するスコアで始動される。
【００７７】
アミノ酸置換は通常、単一残基のものであり；挿入は、かなり大きな挿入が認容されてもよいが、普通、約１〜約２０のアミノ酸残基のオーダーであろう。欠失は、場合によってはかなり大きくてもよいが、約１〜約２０のアミノ酸残基の範囲である。
【００７８】
置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせを用いて最終的な誘導体または変異体に到達してもよい。一般に、これらの変化はわずかなアミノ酸で行って分子の変化、特に抗原結合タンパク質の免疫原性及び特異性の変化を出来るだけ抑える。しかしながら、特定の状況では大きな変化が認容されてもよい。保存的置換は、表１で描かれる以下のチャートに従って一般に行われる。
【表１】
0006668241.tif 000002
【００７９】
機能または免疫的な独自性における実質的な変化は、表１で示すものより保存的ではない置換を選択することによって作られる。たとえば、変化の領域でのポリペプチド主鎖の構造、たとえば、α−らせんまたはβ−シートの構造；標的部位での分子の電荷若しくは疎水性；または側鎖の嵩高さにさらに有意に影響を与える置換が行われてもよい。一般に、ポリペプチドの特性にて最大の変化を生じることが期待される置換は、（ａ）親水性の残基、たとえば、セリルまたはスレオニルが疎水性の残基、たとえば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルで（によって）置換されるもの；（ｂ）システインまたはプロリンが他の残基で（によって）置換されるもの；（ｃ）電気的陽性の側鎖を有する残基、たとえば、リシル、アルギニルまたはヒスチジルが電気的陰性の残基、たとえば、グルタミルまたはアスパルチル（によって）置換されるもの；または（ｄ）嵩高の側鎖を有する残基、たとえば、フェニルアラニンが側鎖を有さないもの、たとえば、グリシン（によって）置換されるものである。
【００８０】
２３９位での好まれる置換にはＳ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ及びＳ２３９Ｋが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
変異体は必要に応じてＦｃ含有タンパク質の特徴を改変するようにも選択されるが、変異体は、同じ性質上の生物活性を示すことが多く、天然に存在する類似体と同じ免疫応答を引き出すであろう。或いは、変異体はＦｃ含有タンパク質の生物活性を変化させるように設計されてもよい。
【００８２】
２３９位の置換を有する例となるＦｃ含有ポリペプチドには、
Ｓ２３９Ｄ
【化１】
0006668241.tif 000003
【化２】
0006668241.tif 000004
Ｓ２３９Ｅ
【化３】
0006668241.tif 000005
【化４】
0006668241.tif 000006
Ｓ２３９Ｋ
【化５】
0006668241.tif 000007
【化６】
0006668241.tif 000008
が挙げられる。
【００８３】
２４１位の置換を有する例となるＦｃ含有ポリペプチドには、
Ｆ２４１Ａ
【化７】
0006668241.tif 000009
【化８】
0006668241.tif 000010
が挙げられる。
【００８４】
２６２位の置換を有する例となるＦｃ含有ポリペプチドには、
Ｖ２６２Ａ
【化９】
0006668241.tif 000011
【化１０】
0006668241.tif 000012
が挙げられる。
【００８５】
２６４位の置換を有する例となるＦｃ含有ポリペプチドには、
Ｖ２６４Ｄ
【化１１】
0006668241.tif 000013
【化１２】
0006668241.tif 000014
Ｖ２６４Ｌ
【化１３】
0006668241.tif 000015
【化１４】
0006668241.tif 000016
Ｖ２６４Ａ
【化１５】
0006668241.tif 000017
【化１６】
0006668241.tif 000018
Ｖ２６４Ｓ
【化１７】
0006668241.tif 000019
【化１８】
0006668241.tif 000020
が挙げられる。
【００８６】
２６５位の置換を有する例となるＦｃ含有ポリペプチドには、
Ｄ２６５Ａ
【化１９】
0006668241.tif 000021
【化２０】
0006668241.tif 000022
Ｄ２６５Ｓ
【化２１】
0006668241.tif 000023
【化２２】
0006668241.tif 000024
Ｄ２６５Ｖ
【化２３】
0006668241.tif 000025
【化２４】
0006668241.tif 000026
が挙げられる。
【００８７】
２９６位の置換を有する例となるＦｃ含有ポリペプチドには、
Ｆ２９６ＡまたはＹ２９６Ａ
【化２５】
0006668241.tif 000027
【化２６】
0006668241.tif 000028
0006668241.tif 000029
が挙げられる。
【００８８】
３０１位の置換を有する例となるＦｃ含有ポリペプチドには、
Ｒ３０１Ａ
【化２７】
0006668241.tif 000030
【化２８】
0006668241.tif 000031
が挙げられる。
【００８９】
特定の実施形態では、Ｆｃ含有ポリペプチドは、２３９位、２６４位、２６５位または２９６位での置換の組み合わせを有する。好まれる組み合わせには、２３９位と２６４位での置換（たとえば、Ｓ２３９ＤとＶ２６４ＤまたはＳ２３９ＤとＶ２６４Ｌ）、２３９位と２６５位での置換（たとえば、Ｓ２３９ＤとＤ２６５Ａ）、２６４位と２６５位での置換（たとえば、Ｖ２６４ＬとＤ２６５Ａ）、及び２６４位と２９６位での置換（たとえば、Ｖ２６４ＤとＦ２９６Ａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
置換の組み合わせを有する例となるＦｃ含有ポリペプチドには、
Ｓ２３９ＤとＶ２６４Ｄ
【化２９】
0006668241.tif 000032
【化３０】
0006668241.tif 000033
Ｓ２３９ＤとＶ２６４Ｌ
【化３１】
0006668241.tif 000034
【化３２】
0006668241.tif 000035
0006668241.tif 000036
Ｓ２３９ＤとＤ２６５Ａ
【化３３】
0006668241.tif 000037
【化３４】
0006668241.tif 000038
Ｖ２６４ＤとＹ２９６Ａ／Ｆ２９６Ａ
【化３５】
0006668241.tif 000039
【化３６】
0006668241.tif 000040
Ｖ２６４ＬとＤ２６５Ａ
【化３７】
0006668241.tif 000041
【化３８】
0006668241.tif 000042
が挙げられる。
【００９１】
Ｆｃ含有ポリペプチドは自然にホモ二量体を形成する。しかしながら、Ｆｃ領域を操作してヘテロ二量体を形成することができる。本明細書で提供されるのは、本発明のＦｃ含有ポリペプチドのホモ二量体またはヘテロ二量体を含むＦｃ含有分子である。特定の実施形態では、抗体は、抗体の重鎖間で本発明のＦｃ含有ポリペプチドの二量体を含む。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は本発明のＦｃ含有ポリペプチドの二量体を含む。Ｆｃ含有ポリペプチドは安定な単量体を形成するための操作であってもよい。従って、特定の実施形態では、Ｆｃ含有分子は本発明の単一のＦｃ含有ポリペプチドを含む。
【００９２】
好まれる実施形態では、Ｆｃ含有分子はＮ結合型グリコシル化を含む。Ｆｃ含有分子のＮ結合型グリコシル化は哺乳類宿主細胞のような適当な宿主細胞における分子の発現によって得ることができる。特に好まれる実施形態では、宿主細胞はチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００９３】
適当な宿主細胞におけるＦｃ含有分子の発現は、所望のＮ結合型グリコシル化特性を有するＦｃ含有分子の組成をもたらす。通常、宿主細胞によって抗体のようなＦｃ含有分子が産生される場合、Ｆｃ含有分子のＮ結合型グリコシル化の解析は集団内のＦｃ含有分子のグリコシル化の程度が不均一である（多数の異なるＮ結合型糖型を含有する）ことを示す。さらに、Ｆｃ含有分子の集団内での種々の糖型の比率は、同一のＦｃ含有分子が産生される場合でさえ、バッチごとに有意に変化し得る。本発明のＦｃ変異体は、Ｆｃ含有分子の大きな比率が野生型Ｆｃと比べて成熟Ｎ結合型グリコシル化を含有する組成を提供し、その際、Ｆｃ含有分子の小さな比率は未成熟なＮ結合型グリコシル化を含有し、または糖型比率のバッチごとの変動が低下する。
【００９４】
たとえば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析、または２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）標識親水性相互作用液体クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）のような、Ｆｃ含有分子のＮ結合型グリコシル化を解析する方法は当該技術で周知である。
【００９５】
好まれる実施形態では、組成物はＦｃ含有分子を含み、その際、Ｆｃ含有分子の４０％を超えるものが成熟Ｎ結合型グリコシル化（Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、Ｇ２Ｆ、Ｇ２Ｓ１Ｆ、及びＧ２Ｓ２Ｆ）を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ含有分子の４５％を超える、５０％を超える、５５％を超える、６０％を超える、６５％を超える、７０％を超える、７５％を超える、または８０％を超えるものが成熟Ｎ結合型グリコシル化を含む。特定の実施形態では、成熟Ｎ結合型グリコシル化を含むＦｃ含有分子の比率は、４０％〜９０％、４５％〜９０％、５０％〜９０％、５５％〜９０％、６０％〜９０％、６５％〜９０％、７０％〜９０％、７５％〜９０％、または８０％〜９０％の間である。
【００９６】
特定の実施形態では、組成物はＦｃ含有分子の５０％未満が未成熟なＮ結合型グリコシル化（Ｇ０及びＧ０Ｆ）を含むＦｃ含有分子を含む。好まれる実施形態では、Ｆｃ含有分子の４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が未成熟なＮ結合型グリコシル化を含む。
【００９７】
特定の実施形態では、組成物はＦｃ含有分子の５％未満がマンノース５（Ｍ５）Ｎ結合型グリコシル化を含むＦｃ含有分子を含む。好まれる実施形態では、Ｆｃ含有分子の４％未満、３％未満、または２％未満がマンノース５（Ｍ５）Ｎ結合型グリコシル化を含む。
【００９８】
本質的にどんな抗体も本明細書で記載されるグリコシル化を改善するＦｃ変異体を組み込み得ることが熟考される。例となる抗体（及びそれらが特異的に結合する抗原）には、ＵＳ７９４７８０９号及びＵＳ２００９００４１７８４号（グルカゴン受容体）、ＵＳ７９３９０７０号、ＵＳ７８３３５２７号、ＵＳ７７６７２０６号、及びＵＳ７７８６２８４号（ＩＬ−１７受容体Ａ）、ＵＳ７８７２１０６号及びＵＳ７５９２４２９号（セレロスチン）、ＵＳ７８７１６１１号、ＵＳ７８１５９０７号、ＵＳ７０３７４９８号、ＵＳ７７００７４２号、及びＵＳ２０１００２５５５３８号（ＩＧＦ−１受容体）、ＵＳ７８６８１４０号（Ｂ７ＲＰ１）、ＵＳ７８０７１５９号及びＵＳ２０１１００９１４５５号（ミオスタチン）、ＵＳ７７３６６４４号、ＵＳ７６２８９８６号、ＵＳ７５２４４９６号、及びＵＳ２０１００１１１９７９号（表皮増殖因子受容体の欠失突然変異体）、ＵＳ７７２８１１０号（ＳＡＲＳコロナウイルス）、ＵＳ７７１８７７６号及びＵＳ２０１００２０９４３５号（ＯＰＧＬ）、ＵＳ７６５８９２４号及びＵＳ７５２１０５３号（アンギオポイエチン−２）、ＵＳ７６０１８１８号、ＵＳ７７９５４１３号、ＵＳ２００９０１５５２７４号、ＵＳ２０１１００４００７６号（ＮＧＦ）、ＵＳ７５７９１８６号（ＴＧＦ−βＩＩ型受容体）、ＵＳ７５４１４３８号（結合組織増殖因子）、ＵＳ７４３８９１０号（ＩＬ１−Ｒ１）、ＵＳ７４２３１２８号（プロペルジン）、ＵＳ７４１１０５７号、ＵＳ７８２４６７９号、ＵＳ７１０９００３号、ＵＳ６６８２７３６号、ＵＳ７１３２２８１号、及びＵＳ７８０７７９７号（ＣＴＬＡ−４）、ＵＳ７０８４２５７号、ＵＳ７７９０８５９号、ＵＳ７３３５７４３号、ＵＳ７０８４２５７号、及びＵＳ２０１１００４５５３７号（インターフェロン−γ）、ＵＳ７９３２３７２号（ＭＡｄＣＡＭ）、ＵＳ７９０６６２５号、ＵＳ２００８０２９２６３９号、及びＵＳ２０１１００４４９８６号（アミロイド）、ＵＳ７８１５９０７号及びＵＳ７７００７４２号（インスリン様増殖因子Ｉ）、ＵＳ７５６６７７２号及びＵＳ７９６４１９３号（インターロイキン−１β）、ＵＳ７５６３４４２号、ＵＳ７２８８２５１号、ＵＳ７３３８６６０号、ＵＳ７６２６０１２号、ＵＳ７６１８６３３号、及びＵＳ２０１０００９８６９４（ＣＤ４０）、ＵＳ７４９８４２０号（ｃ−Ｍｅｔ）、ＵＳ７３２６４１４号、ＵＳ７５９２４３０号、及びＵＳ７７２８１１３号（Ｍ−ＣＳＦ）、ＵＳ６９２４３６０号、ＵＳ７０６７１３１号、及びＵＳ７０９０８４４号（ＭＵＣ１８）、ＵＳ６２３５８８３号、ＵＳ７８０７７９８号、及びＵＳ２０１００３０５３０７号（表皮増殖因子受容体）、ＵＳ６７１６５８７号、ＵＳ７８７２１１３号、ＵＳ７４６５４５０号、ＵＳ７１８６８０９号、ＵＳ７３１７０９０号、及びＵＳ７６３８６０６号（インターロイキン−４受容体）、ＵＳ２０１１０１３５６５７号（ＢＥＴＡ−ＫＬＯＴＨＯ）、ＵＳ７８８７７９９号及びＵＳ７８７９３２３号（線維芽細胞増殖因子−様ポリペプチド）、ＵＳ７８６７４９４号（ＩｇＥ）、ＵＳ２０１００２５４９７５号（ＡＬＰＨＡ−４ＢＥＴＡ−７）、ＵＳ２０１００１９７００５号及びＵＳ７５３７７６２号（アクチビン受容体−様キナーゼ−１）、ＵＳ７５８５５００号及びＵＳ２０１０００４７２５３号（ＩＬ−１３）、ＵＳ２００９０２６３３８３号及びＵＳ７４４９５５５号（ＣＤ１４８）、ＵＳ２００９０２３４１０６号（アクチビンＡ）、ＵＳ２００９０２２６４４７号（アンギオポイエチン−１及びアンギオポイエチン−２）、ＵＳ２００９０１９１２１２号（アンギオポイエチン−２）、ＵＳ２００９０１５５１６４号（Ｃ−ＦＭＳ）、ＵＳ７５３７７６２号（アクチビン受容体−様キナーゼ−１）、ＵＳ７３７１３８１号（ガラニン）、ＵＳ２００７０１９６３７６号（インスリン様増殖因子）、ＵＳ７２６７９６０号及びＵＳ７７４１１１５号（ＬＤＣＡＭ）、ＵＳ７２６５２１２号（ＣＤ４５ＲＢ）、ＵＳ７７０９６１１号、ＵＳ２００６０１２７３９３号及びＵＳ２０１０００４０６１９号（ＤＫＫ１）、ＵＳ７８０７７９５号、ＵＳ２００３０１０３９７８号及びＵＳ７９２３００８号（オステオプロテゲリン）、ＵＳ２００９０２０８４８９号（ＯＶ０６４）、ＵＳ２００８０２８６２８４号（ＰＳＭＡ）、ＵＳ７８８８４８２号、ＵＳ２０１１０１６５１７１号、及びＵＳ２０１１００５９０６３号（ＰＡＲ２）、ＵＳ２０１１０１５０８８８号（ヘプシジン）、ＵＳ７９３９６４０号（Ｂ７Ｌ−１）、ＵＳ７９１５３９１号（ｃ−Ｋｉｔ）、ＵＳ７８０７７９６号、ＵＳ７１９３０５８号、及びＵＳ７４２７６６９号（ＵＬＢＰ）、ＵＳ７７８６２７１号、ＵＳ７３０４１４４号、及びＵＳ２００９０２３８８２３（ＴＳＬＰ）、ＵＳ７７６７７９３号（ＳＩＧＩＲＲ）、ＵＳ７７０５１３０号（ＨＥＲ−３）、ＵＳ７７０４５０１号（アタキシン−１−様ポリペプチド）、ＵＳ７６９５９４８号及びＵＳ７１９９２２４号（ＴＮＦ−α変換酵素）、ＵＳ２００９０２３４１０６号（アクチビンＡ）、ＵＳ２００９０２１４５５９号及びＵＳ７４３８９１０号（ＩＬ１−Ｒ１）、ＵＳ７５７９１８６号（ＴＧＦ−βＩＩ型受容体）、ＵＳ７５６９３８７号（ＴＮＦ受容体−様分子）、ＵＳ７５４１４３８号（結合組織増殖因子）、ＵＳ７５２１０４８号（ＴＲＡＩＬ受容体−２）、ＵＳ６３１９４９９号、ＵＳ７０８１５２３号、及びＵＳ２００８０１８２９７６号（エリスロポイエチン受容体）、ＵＳ２００８０１６６３５２号及びＵＳ７４３５７９６号（Ｂ７ＲＰ１）、ＵＳ７４２３１２８号（プロペルジン）、ＵＳ７４２２７４２号及びＵＳ７１４１６５３号（インターロイキン−５）、ＵＳ６７４０５２２号及びＵＳ７４１１０５０号（ＲＡＮＫＬ）、ＵＳ７３７８０９１号（炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）腫瘍抗原）、ＵＳ７３１８９２５号及びＵＳ７２８８２５３号（副甲状腺ホルモン）、ＵＳ７２８５２６９号（ＴＮＦ）、ＵＳ６６９２７４０号及びＵＳ７２７０８１７号（ＡＣＰＬ）、ＵＳ７２０２３４３号（単球走化性タンパク質−１）、ＵＳ７１４４７３１号（ＳＣＦ）、ＵＳ６３５５７７９号及びＵＳ７１３８５００号（４−１ＢＢ）、ＵＳ７１３５１７４号（ＰＤＧＦＤ）、ＵＳ６６３０１４３号及びＵＳ７０４５１２８号（Ｆｌｔ−３リガンド）、ＵＳ６８４９４５０号（メタロプロテイナー阻害剤）、ＵＳ６５９６８５２号（ＬＥＲＫ−５）、ＵＳ６２３２��４７号（ＬＥＲＫ−６）、ＵＳ６５００４２９号（脳由来神経栄養因子）、ＵＳ６１８４３５９号（上皮由来Ｔ−細胞因子）、ＵＳ６１４３８７４号（神経栄養因子ＮＮＴ−１）、ＵＳ２０１１００２７２８７号（前駆体タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９））、ＵＳ２０１１００１４２０１号（ＩＬ−１８受容体）、及びＵＳ２００９０１５５１６４号（Ｃ−ＦＭＳ）にて記載されたものが挙げられるが、これらに限定されない。上記の特許及び公開された特許出願は、抗体ポリペプチド、抗体をコードする核酸、宿主細胞、ベクター、抗体を作製する方法、医薬組成物、及び抗体の各標的に関連する疾患を治療する方法を開示する目的で、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
任意のさらなる修飾
【００９９】
本明細書で記載される抗体及びＦｃ融合タンパク質はさらに、１以上のＦｃ受容体へのその結合に影響を与える１以上の突然変異を含んでもよい。抗体のＦｃ部分の機能の１つは抗体が標的を結合する際、免疫系に連絡することである。これは一般に「エフェクター機能」と呼ばれる。連絡は、抗体依存性の細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性の細胞性貪食作用（ＡＤＣＰ）及び／または補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣ）につながる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰには、免疫系の細胞の表面上でのＦｃ受容体へのＦｃの結合が介在する。ＣＤＣには補体系のタンパク質、たとえば、Ｃ１ｑとのＦｃの結合が介在する。
【０１００】
ＩｇＧのサブクラスはエフェクター機能に介在するその能力で異なる。たとえば、ＩｇＧ１はＡＤＣＣ及びＣＤＣへの介在でＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも優れる。Ｆｃに１以上の突然変異を導入することによって抗体のエフェクター機能を高めることができ、または低下させることができる。本発明の実施形態にはエフェクター機能を高めるように操作されたＦｃを有する抗体及びＦｃ融合タンパク質が含まれる（双方ともその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＵＳ７，３１７，０９１及びＳｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：６８５−６９１，２００９）。高いエフェクター機能を有する例となるＩｇＧ１  Ｆｃ分子には以下の置換の１以上を有するものが挙げられる［ＥＵ番号付け方式に基づいた番号］：
Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ
Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｄ
Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｄ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｖ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ
Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ
Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ
Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ
Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ
Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ
Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ
Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ
Ｋ３３４Ｖ
Ｌ２３５Ｓ＋Ｓ２３９Ｄ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｑ３１１Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２３９Ｄ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｆ２４３Ｖ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｅ２９４Ｌ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２９８Ｔ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｅ２３３Ｌ＋Ｑ３１１Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｌ２３４Ｉ＋Ｑ３１１Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２９８Ｔ＋Ｋ３３４Ｖ
Ａ３３０Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ａ３３０Ｆ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｑ３１１Ｍ＋Ａ３３０Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｑ３１１Ｍ＋Ａ３３０Ｆ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２９８Ｔ＋Ａ３３０Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２９８Ｔ＋Ａ３３０Ｆ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２３９Ｄ＋Ａ３３０Ｍ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｓ２３９Ｄ＋Ｓ２９８Ｔ＋Ｋ３３４Ｖ
Ｌ２３４Ｙ＋Ｋ２９０Ｙ＋Ｙ２９６Ｗ
Ｌ２３４Ｙ＋Ｆ２４３Ｖ＋Ｙ２９６Ｗ
Ｌ２３４Ｙ＋Ｅ２９４Ｌ＋Ｙ２９６Ｗ
Ｌ２３４Ｙ＋Ｙ２９６Ｗ
Ｋ２９０Ｙ＋Ｙ２９６Ｗ
【０１０１】
本発明のさらなる実施形態には、エフェクター機能を低下させるように操作したＦｃを有する抗体及びＦｃ融合タンパク質が含まれる。低下したエフェクター機能を有する例となるＦｃ分子には以下の置換の１以上を有するものが挙げられる［ＥＵ番号付け方式に基づいた番号］：
Ｎ２９７Ａ（ＩｇＧ１）
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）
Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ（ＩｇＧ２）
Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ（ＩｇＧ４）
Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ（ＩｇＧ２）
Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ（ＩｇＧ１）
Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）
Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＩｇＧ１）
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＩｇＧ１）。
【０１０２】
ＩｇＧのＦｃ含有タンパク質のエフェクター機能を高める別の方法は、Ｆｃのフコシル化を減らすことによる。Ｆｃに結合した二分岐複合体型オリゴ糖からコアフコースを取り除くことは抗原結合またはＣＤＣのエフェクター機能を変化させないでＡＤＣＣのエフェクター機能を大きく高めた。Ｆｃ含有分子、たとえば、抗体のフコシル化を減らすまたは破壊する幾つかの方法が知られている。これらには、ＦＵＴ８ノックアウト細胞株、変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３、ラットのハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０、ＦＵＴ８遺伝子に特異的な小分子干渉ＲＮＡを含む細胞株、及びβ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩとゴルジβ−マンノシダーゼＩＩを同時発現する細胞株を含む特定の哺乳類細胞株における組換え発現が含まれる。従って、特定の実施形態では、組成物は低下したフコシル化を有する、またはフコシル化を全く欠いている抗体を含む。
操作された抗体及びＦｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
【０１０３】
本発明の中に包含されるのは、本明細書で記載される変異体Ｆｃを含む抗体重鎖またはＦｃ融合タンパク質をコードする核酸である。本発明の核酸分子には、一本鎖及び二本鎖双方の形態でのＤＮＡ及びＲＮＡと同様に相当する相補性の配列が挙げられる。ＤＮＡには、たとえば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが挙げられる。本発明の核酸分子には、完全長の遺伝子またはｃＤＮＡ分子と同様にその断片の組み合わせが含まれる。本発明の核酸はヒト供給源に優先的に由来するが、本発明には非ヒト種に由来するものも同様に含まれる。
【０１０４】
「単離された核酸」は、天然に存在する供給源に由来する核酸の場合、該核酸が単離される生物のゲノムに存在する隣接する遺伝配列から分離されている核酸である。たとえば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子またはオリゴヌクレオチドのような、鋳型から酵素的に、または化学的に合成された核酸の場合、そのような工程から生じる核酸は単離された核酸であることが理解される。単離された核酸分子は、別々の断片の形態での核酸分子を指し、または大きな核酸構築物の成分と呼ぶ。好まれる一実施形態では、核酸は混入する内在性の物質を実質的に含まない。核酸分子は好ましくは、実質的に純粋な形態で且つ標準の生化学の方法による成分ヌクレオチド配列の特定、操作及び回収を可能にする量または濃度で少なくとも１回単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに由来している（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）にて概説されたもの）。そのような配列は、通常真核細胞の遺伝子に存在する内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供される及び／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列はオープンリーディングフレームから５’または３’に存在し、それはコーディング領域の操作または発現を妨害しない。
【０１０５】
本発明にはまた、適度にストリンジェントな条件下で、さらに好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、本明細書で記載されるようなポリペプチドをコードする核酸とハイブリッド形成する核酸も含まれる。ハイブリッド形成条件及び好適な条件を考案するための指針の選択に影響を与える基本的なパラメータは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，及びＭａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，９〜１１章；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２．１０節及び６．３−６．４節）によって言及されており、たとえば、ＤＮＡの長さ及び／または塩基組成に基づいて当業者が容易に決定することができる。適度にストリンジェントな条件を達成する方法の１つには、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する予備洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリッド形成緩衝液、及び約５５℃のハイブリッド形成温度（または、たとえば、約４２℃のハイブリッド形成温度を伴った約５０％ホルムアミドを含有するもののような他の類似のハイブリッド形成溶液）、及び０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける約６０℃での洗浄条件の使用が関与する。一般に、高度にストリンジェントな条件は上記のようなハイブリッド形成条件として定義されるが、洗浄は約６８℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳである。ハイブリッド形成及び洗浄緩衝液にてＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）はＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）で置き換えることができ；洗浄はハイブリッド形成が完了した後１５分間行う。洗浄温度及び洗浄塩濃度を必要に応じて調整し、当業者に既知であるように且つ以下でさらに記載されるように、ハイブリッド形成反応及び二本鎖安定性を左右する基本原理を適用することによって所望の程度のストリンジェント性を達成することが理解されるべきである（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照）。未知の配列の標的核酸と核酸をハイブリッド形成させる場合、ハイブリッドの長さがハイブリッド形成する核酸の長さであると仮定する。既知の配列の核酸とハイブリッド形成させる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並べ、最適な配列相補性の領域（単数）または領域（複数）を特定することによって決定することができる。長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドについてのハイブリッド形成温度はハイブリッドの融点（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くすべきであり、Ｔｍは以下の方程式に従って決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（＃Ｇ＋Ｃ塩基の＃）。長さ１８塩基対を超えるハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０���４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、その際、Ｎはハイブリッドにおける塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリッド形成緩衝液（１×ＳＳＣ＝０．１６５Ｍについての［Ｎａ＋］）におけるナトリウムイオンの濃度である。好ましくは、そのようなハイブリッド形成する核酸はそれぞれ、少なくとも１５ヌクレオチド（またはさらに好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）である長さを有し、または、それがハイブリッド形成する本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（さらに好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％）である長さを有し、且つそれがハイブリッド形成する本発明の核酸に対して少なくとも６０％（さらに好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有し、その際、配列同一性は、上記でさらに詳述したように、配列のギャップを最少化する一方でオーバーラップと同一性を最大化するように並べたとき、ハイブリッド形成する核酸の配列を比較することによって決定される。
【０１０６】
カセット変異誘発またはＰＣＲ変異誘発または当該技術で周知の他の技法を用いて変異体をコードするＤＮＡを作出する、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異誘発、及びその後、本明細書で概略されるように細胞培養にて組換えＤＮＡを発現させることによって変異体は普通に調製される。しかしながら、変異体配列を含む抗体または抗体断片は確立された技法を用いて試験管内の合成によって調製されてもよい。本明細書でさらに完全に概略されるように修飾された特徴を有する変異体も選択できるけれども、変異体は通常、天然に存在する類似体と同じ性質の生物活性、たとえば、抗原への結合を示す。
【０１０７】
当業者によって十分に理解されるように、遺伝子コードの縮重のために、本発明のポリペプチドをコードする、非常に多数の核酸が作られ得る。従って、特定のアミノ酸配列を特定して、当業者は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変えない方法で１以上のコドンの配列を単に改変することによって任意の数の異なる核酸を作ればよい。
【０１０８】
本発明はまた、少なくとも１つの上記のようなポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写カセットまたは発現カセットの形態での発現系及び構築物も提供する。加えて、本発明はそのような発現系または構築物を含む宿主細胞を提供する。
【０１０９】
通常、宿主細胞で使用される発現ベクターはプラスミドの維持のための、及び外来性ヌクレオチド配列のクローニングと発現のための配列を含有するであろう。まとめて「フランキング配列」と呼ばれるそのような配列には、特定の実施形態では通常、以下のヌクレオチド配列：プロモータ、１以上のエンハンサ配列、複製開始点、転写終結配列、ドナー及びアクセプターのスプライス部位を含有する完全なイントロン配列、ポリペプチドの分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択可能なマーカー要素の１以上が挙げられるであろう。これらの配列のそれぞれが以下で議論される。
【０１１０】
任意で、ベクターは、「タグ」をコードする配列、すなわち、ポリペプチドのコーディング配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有してもよく；オリゴヌクレオチド配列は、そのための市販の抗体が存在する、ポリＨｉｓ（たとえば、ヘキサＨｉｓ）または、たとえば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（血球凝集素インフルエンザウイルス）若しくはｍｙｃのような別の「タグ」をコードする。このタグは通常、ポリペプチドの発現の際、ポリペプチドに融合され、親和性精製または宿主細胞からのポリペプチドの検出のための手段として役立つ。親和性精製は、たとえば、親和性マトリクスとしてのタグに対する抗体を用いたカラムクロマトグラフィによって達成することができる。任意で、たとえば、切断のための特定のペプチダーゼを用いた種々の手段によって、タグを精製したポリペプチドからその後取り外すことができる。
【０１１１】
フランキング配列は、同種であってもよく（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／または株に由来する）、異種であってもよく（すなわち、宿主細胞の種または株以外の種に由来する）、ハイブリッドであってもよく（すなわち、１を超える供給源に由来するフランキング配列の組み合わせ）、合成でもよく、またはネイティブでもよい。そのようなものとして、フランキング配列の供給源は、フランキング配列が宿主細胞の装置で機能的であり、且つそれによって活性化することができるという条件で、原核生物または真核生物、脊椎生物または無脊椎生物、または植物であってもよい。
【０１１２】
本発明のベクターで有用なフランキング配列は当該技術で周知の幾つかの方法のいずれかによって得られてもよい。通常、本明細書で有用なフランキング配列は、マッピング及び／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって予め特定されているので、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて適正な組織供給源から単離することができる。場合によっては、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が知られてもよい。ここで、核酸の合成またはクローニングについて本明細書で記載される方法を用いてフランキング配列を合成してもよい。
【０１１３】
フランキング配列の全部または一部のみが知られているかどうかは、同じ種または別の種に由来するオリゴヌクレオチドまたはフランキング配列の断片のような好適なプローブと共にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて及び／またはゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られ得る。フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片を、たとえば、コーディング配列またはさらに別の遺伝子（単数）若しくは遺伝子（複数）を含有し得るＤＮＡの大きな片から単離してもよい。単離は、適正はＤＮＡ断片を生じる制限エンドヌクレアーゼ消化、その後の、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）または当業者に既知の他の方法を用いた単離によって達成されてもよい。この目的を達成するための好適な酵素の選択は当業者に容易に明らかであろう。
【０１１４】
複製開始点は通常、商業的に購入された原核細胞発現ベクターの一部であり、開始点は宿主細胞におけるベクターの増幅に役立つ。選択のベクターが複製部位の開始点を含有しないのであれば、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに連結してもよい。たとえば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）に由来する複製開始点はほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、種々のウイルス（たとえば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶ若しくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）の開始点は哺乳類細胞にてベクターをクローニングするのに有用である。一般に、複製成分の開始点は哺乳類の発現ベクターには必要とされない（たとえば、ＳＶ４０の開始点はそれがウイルスの初期プロモータを含有するためにのみ使用されることが多い）。
【０１１５】
転写終結配列は通常、ポリペプチドをコードする領域の末端に対して３’に位置し、転写を終結するのに役立つ。普通、原核細胞における転写終結配列はＧ−Ｃリッチ断片にポリＴ配列が続く。配列はライブラリから容易にクローニングされ、またはさらにベクターの一部として商業的に購入される一方で、たとえば、本明細書で記載されるもののような核酸合成のための方法を用いて容易にそれを合成することができる。
【０１１６】
選択可能なマーカー遺伝子は、選択培養培地で増殖する宿主細胞の生き残り及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生剤または他の毒素、たとえば、原核宿主細胞のためのアンピシリン、テトラサイクリンまたはカナマイシンに耐性を付与する、；（ｂ）細胞の相補体栄養要求性の欠乏を付与する；または（ｃ）複合体培地または定義された培地から利用できない決定的な栄養を供給するタンパク質をコードする。特定の選択可能なマーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利なことに、ネオマイシン耐性遺伝子は原核宿主細胞及び真核宿主細胞の双方における選択に使用されてもよい。
【０１１７】
他の選択可能な遺伝子を用いて発現されるであろう遺伝子を増幅してもよい。増幅は、増殖または細胞の生存に決定的なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が組換え細胞の連続する世代の染色体の中で並行して反復する工程である。哺乳類細胞のために好適な選択可能なマーカーの例にはジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子及びプロモータのないチミジンキナーゼ遺伝子が挙げられる。ベクターに存在する選択可能な遺伝子のお蔭で形質転換体だけが生き残るように適応する選択圧のもとに哺乳類細胞の形質転換を置く。培地における選択剤の濃度が連続して高まる条件下で形質転換した細胞を培養することによって選択圧を負わせ、それによって選択可能な遺伝子と、別の遺伝子、たとえば、抗体の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの双方の増幅をもたらす。その結果、多量のポリペプチドが増幅したＤＮＡから合成される。
【０１１８】
リボソーム結合部位は普通、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャインダルガノ配列（原核細胞）またはコザック配列（真核細胞）を特徴とする。要素は通常、プロモータに対して３’且つ発現されるポリペプチドのコーディング配列に対して５’に位置する。特定の実施形態では、１以上のコーディング領域が内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結されて、単一のＲＮＡ転写物からの２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能にしてもよい。
【０１１９】
特定の実施形態では、種々のプレ配列またはプロ配列を操作してさらなるグリコシル化または収率を改善してもよい。たとえば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変え、またはプロ配列を付加してもよく、それもグリコシル化に影響を与え得る。最終的なタンパク質生成物は−１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）にて発現に伴う１以上の追加のアミノ酸を有してもよく、それは全体として取り除かれてはならなかった。たとえば、最終的なタンパク質生成物はペプチダーゼ切断部位に見いだされ、アミノ末端に連結される１または２のアミノ酸残基を有してもよい。或いは、一部の酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断するのであれば、所望のポリペプチドのやや切り詰めた形態を生じ得る。
【０１２０】
本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、且つポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されるプロモータを含有するであろう。プロモータは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’）に位置する転写されない配列である。プロモータは従来、２つのクラス：誘導性プロモータ及び構成的なプロモータの１つにグループ分けされる。誘導性プロモータは、たとえば、栄養素の存在若しくは非存在、または温度の変化のような培養条件の変化に応答してその制御下でＤＮＡからの転写のレベルの上昇を開始する。一方、構成的なプロモータはそれらが作動可能に連結される遺伝子を均一に転写し、遺伝子発現に対する制御はほとんどない、またはない。種々の潜在的な宿主細胞によって認識される多数のプロモータが周知である。好適なプロモータは、制限酵素消化及び所望のプロモータ配列のベクターへの挿入により供給源ＤＮＡからプロモータを取り外すことによって、たとえば、重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【０１２１】
酵母宿主とともに使用するのに好適なプロモータも当該技術で周知である。酵母プロモータと共に酵母エンハンサを有利に使用する。哺乳類の宿主細胞とともに使用するのに好適なプロモータは当該技術で周知であり、それには、たとえば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（たとえば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるものが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な哺乳類プロモータには、異種哺乳類プロモータ、たとえば、熱ショックプロモータ及びアクチンプロモータが挙げられる。
【０１２２】
関心があり得る追加のプロモータには、ＳＶ４０早期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ、２９０：３０４−３１０）；ＣＭＶプロモータ（Ｔｈｏｒｎｓｅｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復に含有されるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）；メタロチオニン遺伝子に由来するプロモータ及び調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ、２９６：３９−４２）；及びβラクタマーゼプロモータのような原核細胞プロモータ（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）；またはｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が挙げられるが、これらに限定されない。関心があるのはまた、以下の動物の転写制御領域であり、それは、組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている：膵臓腺房細胞で活性があるエラスターゼＩ遺伝子の制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ，３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，  １９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，７：４２５−５１５）；膵臓β細胞で活性があるインスリン遺伝子の制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：１１５−１２２）；リンパ系細胞で活性がある免疫グロブリン遺伝子の制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ，３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）；精巣細胞、乳腺細胞、リンパ系細胞及び肥満細胞で活性があるマウス乳腺腫瘍ウイルスの制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ，４５：４８５−４９５）；肝臓で活性があるアルブミン遺伝子の制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）；肝臓で活性があるα−フェトタンパク質遺伝子の制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：５３−５８）；肝臓で活性があるα１−アンチトリプシン遺伝子の制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄細胞で活性があるβ−グロビン遺伝子の制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ，４６：８９−９４）；脳の乏突起膠細胞で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子の制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ，４８：７０３−７１２）；骨格筋で活性があるミオシン軽鎖−２���伝子の制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２８３−２８６）；及び視床下部で活性がある性腺刺激放出ホルモン遺伝子の制御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３７２−１３７８）。
【０１２３】
エンハンサ配列をベクターに挿入して本発明の軽鎖またはＦｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写を高めてもよい。エンハンサは、プロモータで作用して転写を高める、普通長さ約１０〜３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサは相対的に独立した配向及び位置にあり、転写単位に対して５’及び３’の双方の位置で見いだされている。哺乳類の遺伝子から利用可能な幾つかのエンハンサ配列が知られている（たとえば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、及びインスリン）。しかしながら、通常、ウイルス由来のエンハンサが使用される。当該技術で既知のＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス早期プロモータエンハンサ、ポリオーマエンハンサ、及びアデノウイルスエンハンサは真核細胞プロモータの活性化のための例となる増強要素である。エンハンサはコーディング配列に対して５’または３’いずれのベクターに位置してもよい一方で、それは通常プロモータから５’の部位に位置する。適当なネイティブのまたは異種のシグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込んで抗体の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体が産生される宿主細胞の種類に左右され、異種のシグナル配列はネイティブなシグナル配列を置き換えることができる。哺乳類の宿主細胞で機能的であるシグナルペプチドの例には、以下：ＵＳ４，９６５，１９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）のためのシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：７６８に記載されたインターロイキン−２受容体のためのシグナル配列；ＥＰ０３６７５６６号に記載されたインターロイキン−４受容体のシグナルペプチド；ＵＳ４，９６８，６０７号に記載されたＩ型インターロイキン−１受容体のシグナルペプチド；ＥＰ０４６０８４６号に記載されたＩＩ型インターロイキン−１受容体のシグナルペプチドが挙げられる。
【０１２４】
ベクターは、ベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれる場合、発現を促進する１以上の要素を含有してもよい。例には、ＥＡＳＥ要素（Ａｌｄｒｉｃｈら．２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１９：１４３３−３８）及びマトリクス結合領域（ＭＡＲ）が挙げられる。ＭＡＲは、クロマチンの構造的組織化に介在し、組み込まれたベクターを「位置」効果から隔離し得る。従って、ＭＡＲはベクターが安定な形質転換体を作るのに使用される場合、特に有用である。多数の天然の及び合成のＭＡＲ含有核酸が当該技術、たとえば、ＵＳ６，２３９，３２８号；同第７，３２６，５６７号；同第６，１７７，６１２号；同第６，３８８，０６６号；同第６，２４５，９７４号；同第７，２５９，０１０号；同第６，０３７，５２５号；同第７，４２２，８７４号；同第７，１２９，０６２号にて既知である。
【０１２５】
本発明の発現ベクターは、たとえば、市販のベクターのような出発ベクターから構築されてもよい。そのようなベクターは所望のフランキング配列のすべてを含有してもよいし、または含有しなくてもよい。本明細書で記載されるフランキング配列の１以上がベクターに前から存在していない場合、それらを個々に入手し、ベクターに連結してもよい。フランキング配列のそれぞれを入手するのに使用される方法は当業者に周知である。
【０１２６】
ベクターが構築され、重鎖またはＦｃ融合タンパク質をコードする核酸分子がベクターの適正な部位に挿入された後、増幅及び／またはポリペプチドの発現のために、完成したベクターを好適な宿主細胞に挿入してもよい。選択した宿主細胞への発現ベクターの形質転換は、形質移入、感染、リン酸カルシウム同時沈殿、エレクトロポレーション、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストランが介在する形質移入、または他の既知の技法を含む周知の方法によって達成されてもよい。選択される方法は部分的には使用される宿主細胞の種類の関数である。これらの方法及び他の好適な方法は技量の有る熟練者に周知であり、たとえば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１で言及されている。
【０１２７】
宿主細胞は、適当な条件下で培養されると、その後培養培地から回収することができる（宿主細胞が培地にそれを分泌するのであれば）、またはそれを産生する宿主細胞から直接回収することができる（それが分泌されなければ）抗体またはＦｃ融合タンパク質を合成する。適当な宿主細胞の選択は、たとえば、所望の発現レベル、活性（たとえばグリコシル化またはリン酸化）にとって望ましいまたは必要なポリペプチドの修飾、及び生物学的に活性がある分子への折り畳みの容易さのような種々の因子に左右されるであろう。宿主細胞は真核細胞であっても原核細胞であってもよい。
【０１２８】
発現のための宿主として利用できる哺乳類の細胞株は当該技術で周知であり、それらには、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化した細胞株が挙げられるが、これらに限定されず、当該技術で既知の発現系で使用される任意の細胞株を用いて本発明の組換えポリペプチドを作ることができる。一般に、宿主細胞は所望のヘテロ二量体抗体をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。採用されてもよい宿主細胞は原核生物、酵母または高等真核生物の細胞である。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、たとえば、大腸菌または枯草菌が含まれる。高等な真核細胞には昆虫細胞及び哺乳類起源の樹立された細胞株が含まれる。例となる宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株またはＤＨＦＲの欠損であるＣＨＯ株ＤＸＢ−１１（Ｕｒｌａｕｂら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６−２０を参照）、無血清培地で増殖するＣＨＯ細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら、１９９８、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２８：３１を参照）、ＤＸＢ−１１ＣＨＯ細胞の誘導体であるＣＳ−９細胞、及びＡＭ−１／Ｄ細胞（ＵＳ６，２１０，９２４号にて記載された）を含むその誘導体が挙げられる。他のＣＨＯ細胞株にはＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ−６１）、ＥＭ９（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１８６１）、及びＵＶ２０（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１８６２）が挙げられる。他の宿主細胞の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら、１９８１、Ｃｅｌｌ、２３：１７５を参照）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１６３）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０）細胞株、アフリカミドリザルの腎細胞株ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）（ＭｃＭａｈａｎら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８２１）、ヒト胚性腎臓細胞、たとえば、２９３、２９３ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換した霊長類の細胞株、正常な２倍体細胞、一次組織、一次外植片の試験管内培養に由来する細胞株、ＨＬ６０、Ｕ９３７、ＨａｋまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。
【０１２９】
或いは、酵母のような下等真核生物または細菌のような原核生物でポリペプチドを産生させることが可能である。好適な酵母には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓの株、Ｃａｎｄｉｄａ、または異種ポリペプチドを発現することが可能である酵母株が挙げられる。好適な細菌株には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種ポリペプチドを発現することが可能である細菌株が挙げられる。しかしながら、好まれる細胞株は、本明細書で記載されるＦｃ変異体の改善されたグリコシル化特性を示すもの、たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒト胚性腎臓細胞株（ＨＥＫ）−２９３（Ｔ）及びＰｅｒＣ６、マウス黒色腫細胞株ＮＳ０、マウスＢ細胞株ＳＰ２／０、たとえば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ）９のようなショウジョウバエ細胞株、幼若ハムスター腎臓線維芽細胞（ＢＨＫ−２１）、ハイブリドーマ細胞株、マウス乳腺腫瘍株Ｃ１２７、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等である。抗体または断片が酵母または細菌で作られるのであれば、機能的な生成物を得るために、たとえば、適当な部位のリン酸化またはグリコシル化によって、その中で産生された生成物を修飾することが望ましくてもよい。そのような共有結合は既知の化学法または酵素法を用いて達成することができる。１以上の昆虫発現系にて好適な制御配列に本発明の単離された核酸を作動可能に連結し、昆虫発現系を採用することによってもポリペプチドを作出することができる。バキュロウイルス／昆虫細胞の発現系のための材料及び方法は、たとえば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（ＭａｘＢａｃキット）からキットの形態で市販されており、そのような方法は、Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７），並びにＬｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）にて記載されたように当該技術で周知である。無細胞翻訳系も、本明細書で記載される核酸構築物に由来するＲＮＡを用いて抗体または断片のようなポリペプチドを作出するのに採用され得る。細菌、真菌、酵母及び哺乳類の細胞宿主と共に使用するための適当なクローニングベクター及び発現ベクターはＰｏｕｗｅｌｓら．（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）によって記載されている。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結される、本発明の単離された核酸を含む宿主細胞は「組換え宿主細胞」である。
【０１３０】
特定の実施形態では、どの細胞株が高い発現レベルを有し、所望のグリコシル化特性を持つ抗体またはＦｃ融合タンパク質を産生するかを決定することを介して細胞株が選択され得る。
医薬組成物
【０１３１】
一部の実施形態では、本発明は、薬学上有効な希釈剤、キャリア、溶解剤、乳化剤、保存剤及び／または補助剤と一緒に治療上有効な量の本発明の抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物には、液状の、凍結された及び凍結乾燥された組成物が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
好ましくは、製剤の材料は採用される投与量及び濃度で非毒性である。特定の実施形態では、治療上有効量の抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物が提供される。
【０１３３】
一部の実施形態では、医薬組成物は、組成物のｐＨ、浸透圧、粘性、透明性、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸収または浸透を改変する、維持する、または保護するための製剤材料を含有してもよい。そのような実施形態では、好適な製剤材料には、アミノ酸（たとえば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、またはリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（たとえば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；増量剤（たとえば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（たとえば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（たとえば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（たとえば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（たとえば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、風味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（たとえば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（たとえば、ナトリウム）；保存剤（たとえば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（たとえば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（たとえば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（たとえば、プルロニクス、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（たとえば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル）；安定性向上剤（たとえば、スクロースまたはソルビトール）；等張性向上剤（たとえば、アルカリ金属ハロゲン化合物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／または医薬補助剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．）、１９９０、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。
【０１３４】
一部の実施形態では、たとえば、投与の意図される経路、送達形式及び所望の投与量に応じて、当業者によって最適な医薬組成物が決定されるであろう。たとえば、上記ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳを参照のこと。特定の実施形態では、そのような組成物は、抗体またはＦｃ融合タンパク質の物理的状態、安定性、生体内放出の速度及び生体内クリアランスの速度に影響を与え得る。特定の実施形態では、医薬組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは事実上、水性であってもまたは非水性であってもよい。たとえば、好適なビヒクルまたはキャリアは、たぶん非経口投与のために組成物で共通する他の物質で補完される注射用水、生理的な生理食塩水溶液または人工の脳脊髄液であってもよい。中性の緩衝化された生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水はさらなる例となるビヒクルである。特定の実施形態では、医薬組成物は、ほぼｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液またはほぼｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、さらに、ソルビトールまたは好適なその代替物を含んでもよい。本発明の特定の実施形態では、組成物は、凍結乾燥塊または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する選択された組成物を任意の製剤化剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ）と混合することによって保存のために調製されてもよい。さらに、一部の実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質はスクロースのような適当な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化されてもよい。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は、非経口送達のために選択することができる。或いは、組成物は、吸入のために、または経口のような消化器を介した送達のために選択されてもよい。そのような薬学上許容可能な組成物の調製は当該技術の技量の範囲内である。製剤成分は好ましくは投与の部位に許容可能である濃度で存在する。特定の実施形態では、緩衝液を用いて生理的なｐＨまたはやや低いｐＨ、通常約５〜約８の範囲のｐＨの範囲内で組成物を維持する。
【０１３６】
非経口投与が企図される場合、本発明で使用するための治療用組成物は、薬学上許容可能なビヒクルにて所望の抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む、発熱物質を含まない、非経口で許容可能な水溶液の形態で提供され得る。非経口の注射用の特に好適なビヒクルは、抗体またはＦｃ融合タンパク質が無菌の等張の溶液として製剤化され、適正に保存される無菌の蒸留水である。特定の実施形態では、調製には、デポー注射を介して送達することができる製品の制御されたまたは持続される放出を提供し得る、たとえば、注射用ミクロスフェア、生体浸食性粒子、高分子化合物（たとえば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームのような作用因子と共に所望の分子を製剤化することが関与する。特定の実施形態では、循環で長く続く持続時間を助長する効果を有するヒアルロン酸も使用してもよい。特定の実施形態では、埋め込み可能な薬剤送達用具を用いて所望の抗体またはＦｃ融合タンパク質を導入してもよい。
【０１３７】
本発明の医薬組成物は吸入用に製剤化することができる。これらの実施形態では、抗体またはＦｃ融合タンパク質は乾燥した吸入可能な粉末として有利に製剤化される。特定の実施形態では、エアロゾル送達のための高圧ガスと共に抗体またはＦｃ融合タンパク質の吸入溶液も製剤化されてもよい。特定の実施形態では、溶液を霧状にしてもよい。従って、肺投与及び製剤化方法は、参照によって組み入れられ、修飾されたタンパク質の肺送達を記載しているＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にてさらに記載されている。
【０１３８】
製剤を経口で投与することができることも企図される。この方法で投与される抗体またはＦｃ融合タンパク質は、たとえば、錠剤またはカプセルのような固形剤形の配合で通例使用されるキャリアと共にまたはそれを伴わずに製剤化することができる。特定の実施形態では、カプセルは、生体利用効率が最大化され、前全身性分解を最少化する時点で消化管にて製剤の活性部分を放出するように設計されてもよい。抗体またはＦｃ融合タンパク質の吸収を促進する追加の作用因子を含めることができる。希釈剤、風味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も採用されてもよい。
【０１３９】
持続するまたは制御された送達製剤にて抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む製剤を含む追加の医薬組成物が当業者に明らかであろう。たとえば、リポソームキャリア、生体浸食性微粒子または多孔性ビーズ及びデポー注射のような種々の持続するまたは制御された送達手段を製剤化する技術も当業者に既知である。たとえば、参照によって組み入れられ、医薬組成物の送達のための多孔性高分子微粒子の制御放出を記載しているＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。持続放出の調製には、成形物品、たとえば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態での半透過性のポリマーマトリクスが含まれてもよい。持続放出マトリクスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（そのそれぞれが参照によって組み入れられるＵＳ３７７３９１９号及びＥＰ０５８４８１にて記載されたような）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ、１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニル酢酸（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１、上記）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８）が含まれてもよい。持続放出組成物にはまた、当該技術で既知の幾つかの方法のいずれかによって調製することができるリポソームも含まれてもよい。たとえば、参照によって組み入れられるＥｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８−３６９２；ＥＰ０３６６７６；ＥＰ０８８０４６及びＥＰ１４３９４９を参照のこと。
【０１４０】
生体内投与に使用される医薬組成物は通常無菌の調製物として提供される。無菌化は、無菌の濾過膜を介した濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いた無菌化は凍結乾燥及び再構成に先立ってまたはそれに続いて実施されてもよい。非経口投与用の組成物は凍結乾燥された形態または溶液で保存することができる。非経口組成物は、無菌のアクセスポートを有する容器、たとえば、皮下注射用の針によって穴開け可能なストッパーを有する静脈内溶液用のバッグまたはバイアルに入れられる。
【０１４１】
本発明の態様は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷＯ２００６／１３８１８１Ａ２（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）にて記載されたような、医薬組成物として使用することができる自己緩衝化するヘテロ二量体の抗体または断片の製剤を含む。
【０１４２】
上記で議論したように、特定の実施形態は、抗体またはＦｃ融合タンパク質以外にこの節及び本明細書のどこかで説明的に記載されているもののような１以上の賦形剤を含む、抗体またはＦｃ融合タンパク質の組成物、特に抗体またはＦｃ融合タンパク質の医薬組成物を提供する。賦形剤は、たとえば、製剤の物理的な、化学的なまたは生物学的な特性を調整すること、たとえば、粘度の調整、及び／または有効性を改善し、及び／またはそのような製剤を安定化する本発明の方法、及び、たとえば、製造、輸送、保存、使用前調製、投与の間に及びその後に生じるストレスによる分解及び損傷に対する処理のような種々の目的のためにこの点で本発明にて使用することができる。
【０１４３】
特に、本発明に係る自己緩衝化するタンパク質製剤のためのその賦形剤及び方法に部分的に関する、特に獣医学での使用及び／またヒト医学での使用のためのタンパク質医薬品及び方法に関する、たとえば、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み入れられる、Ａｒａｋａｗａら，“Ｓｏｌｖｅｎｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．８（３）：２８５−９１（１９９１）；Ｋｅｎｄｒｉｃｋら，“Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ”，ｉｎ：ＲＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＥＳＩＧＮ  ＯＦ  ＳＴＡＢＬＥ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＦＯＲＭＵＬＡＴＩＯＮＳ：ＴＨＥＯＲＹ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍａｎｎｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１３：６１−８４（２００２），及びＲａｎｄｏｌｐｈら，“Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１５９−７５（２００２）のような種々の説明が、この点で有用なタンパク質の安定化及び製剤の材料及び方法に関して利用可能である。
【０１４４】
本発明の特定の実施形態に従って塩を用いて、たとえば、製剤のイオン強度及び／または等張性を調整し、及び／または本発明に係る組成物のタンパク質または他の成分の溶解性及び／または物理的安定性を改善してもよい。
【０１４５】
周知のように、イオンは、タンパク質の表面上の荷電した残基に結合することによって、且つタンパク質における荷電基及び極性基を遮蔽し、その静電相互作用、誘引相互作用及び反発相互作用を減らすことによってタンパク質のネイティブな状態を安定化することができる。イオンはまた、特にタンパク質の変性したペプチド結合（−−ＣＯＮＨ）に結合することによってタンパク質の変性した状態を安定化することができる。さらに、タンパク質における荷電基及び極性基とのイオンの相互作用は分子間の静電相互作用を減らすこともでき、それによってタンパク質の凝集及び不溶性を防ぎ、または減らす。
【０１４６】
イオン種はタンパク質に対するその効果で有意に異なる。本発明に従って医薬組成物を製剤化するのに使用することができる多数のイオンの分類上のランク分け及びタンパク質に対するその効果が開発されている。一例は、イオン性及び極性非イオン性の溶質を溶液におけるタンパク質の構造的安定性に対するその効果によってランク分けするＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒシリーズである。安定化する溶質は「コスモトロピック」と呼ばれる。不安定化する溶質は「カオトロピック」と呼ばれる。コスモトロピックな物質は一般に高濃度（たとえば、＞１モルの硫酸アンモニウム）で使用されて溶液からタンパク質を沈殿させる（「塩析」）。カオトロピックな物質は一般にタンパク質を変性させ及び／または可溶化させるのに使用される（「塩溶」）。「塩溶」及び「塩析」に対するイオンの相対的な有効性はＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒシリーズにおけるその位置を定義する。
【０１４７】
増量剤、安定剤及び抗酸化剤として、同様に他の標準の用途として、本発明の種々の実施形態に係る抗体またはＦｃ融合タンパク質の製剤にて遊離のアミノ酸を使用することができる。リジン、プロリン、セリン及びアラニンは製剤におけるタンパク質を安定化するのに使用することができる。グリシンは正しい塊構造と特性を保証するのに凍結乾燥で有用である。アルギニンは液体製剤及び凍結乾燥製剤の双方でタンパク質の凝集を抑制するのに有用である。メチオニンは抗酸化剤として有用である。
【０１４８】
ポリオールには、糖、たとえば、マンニトール、スクロース及びソルビトール及び多価アルコール、たとえば、グリセロール及びプロピレングリコール、及び本明細書での議論の目的でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び関連する物質が含まれる。ポリオールはコスモトロピックである。それらは液体製剤及び凍結乾燥製剤の双方でタンパク質を物理的な及び化学的な分解過程から保護するのに有用な安定剤である。ポリオールはまた製剤の等張性を調整するのにも有用である。
【０１４９】
本発明の精選実施形態で有用なポリオールは、凍結乾燥製剤における塊の構造的な安定性を確保するのに一般に使用されるマンニトールである。それは塊に対して構造的な安定性を確保する。それは一般に凍結乾燥保護剤、たとえば、スクロースとともに使用される。ソルビトール及びスクロースは、等張性を調整するための、及び製造工程の間、原体の輸送または調製の間での凍結融解のストレスに対して保護する安定剤として好まれる作用因子である。たとえば、グルコース及びラクトースのような還元糖（遊離のアルデヒド基またはケトン基を含有する）は表面のリジン残基及びアルギニン残基を糖化することができる。従って、それらは一般に本発明に従って使用するには好まれるポリオールではない。加えて、酸性条件下でフルクトースとグルコースに加水分解され、その結果、糖化を生じるスクロースのような反応性種を形成する糖もこの点で本発明の好まれるポリオールではない。ＰＥＧはタンパク質を保護するのに、及び凍結乾燥保護剤として有用であり、この点で本発明にて使用することができる。
【０１５０】
抗体またはＦｃ融合タンパク質の製剤の実施形態はさらに界面活性剤を含む。タンパク質分子は、表面上に吸着し易く、且つ変性し易く、その結果、空気／液体、固体／液体及び液体／液体の界面での凝集を起こし易い可能性がある。これらの効果は一般にタンパク質の濃度と逆にスケールを変える。これらの有害な相互作用は一般にタンパク質の濃度と逆にスケールを変え、製品の輸送及び取り扱いの間に生じるもののような物理的な撹拌によって通常悪化する。
【０１５１】
界面活性剤は表面の吸着を防ぐ、最少化するまたは減らすのに日常的に使用される。この点で有用な本発明における界面活性剤には、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル、及びポロキサマー１８８が挙げられる。
【０１５２】
界面活性剤はタンパク質の構造的な安定性を制御するのにも一般に使用される。この点で界面活性剤の使用は、所与の界面活性剤が通常一部のタンパク質を安定化し、他を不安定化するので、タンパク質特異的である。
【０１５３】
ポリソルベートは酸化分解を起こし易く、供給されるとき、十分量の過酸化物を含有してタンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすことが多い。その結果、ポリソルベートは慎重に使用されるべきであり、使用する際、最低有効濃度で用いられるべきである。この点で、ポリソルベートは、賦形剤がその最低有効濃度で使用されるべきであるという原則を例示している。
【０１５４】
抗体またはＦｃ融合タンパク質の製剤の実施形態はさらに１以上の抗酸化剤を含む。周囲の酸素及び温度の適正なレベルを維持し、光への暴露を回避することによって医薬製剤においてタンパク質の有害な酸化をある程度防ぐことができる。抗酸化賦形剤を同様に用いてタンパク質の酸化的分解を防ぐことができる。この点で有用な抗酸化剤は、還元剤、酸素／遊離ラジカル捕捉剤、及びキレート剤である。本発明に従って治療用のタンパク質製剤で使用するための抗酸化剤は好ましくは水溶性であり、製品の保存可能期間全体にわたって活性を維持する。この点でＥＤＴＡは本発明に係る好まれる抗酸化剤である。
【０１５５】
本発明に係る製剤は、タンパク質の補因子であり、タンパク質の配位錯体を形成するのに必要である、たとえば、特定のインスリン懸濁液を形成するのに必要である金属イオンを含んでもよい。金属イオンはタンパク質を分解する一部の工程を阻害することができる。しかしながら、金属イオンはタンパク質を分解する物理的な及び化学的な工程を触媒することもできる。
【０１５６】
マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）を用いてアスパラギン酸からイソアスパラギン酸への異性体化を阻害することができる。Ｃａ＋２＋イオン（１００ｍＭまで）はヒトのデオキシリボヌクレアーゼの安定化を高めることができる。しかしながら、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋及びＺｎ２＋はｒｈＤＮＡ分解酵素を不安定化することができる。同様に、Ｃａ２＋及びＳｒ２＋は第ＶＩＩＩ因子を安定化することができ、それはＭｇ２＋、Ｍｎ２＋及びＺｎ２＋、Ｃｕ２＋及びＦｅ２＋によって不安定化することができ、その凝集はＡｌ＋３イオンによって高めることができる。
【０１５７】
抗体またはＦｃ融合タンパク質の製剤の実施形態はさらに１以上の保存剤を含む。同一容器からの１を超える抽出を含む複数回投与の非経口製剤を開発する場合、保存剤が必要である。その主な機能は、微生物の増殖を阻害し、薬剤製品の保存可能期間または使用の期間の全体にわたって製品の無菌性を確保することである。一般に使用される保存剤には、ベンジルアルコール、フェノール及びｍ−クレゾールが挙げられる。保存剤は小分子非経口剤と共に使用する長い歴史を有するが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発は難題であり得る。保存剤はほとんど常にタンパク質に対して不安定化効果（凝集）を有し、これが、複数回用量のタンパク質製剤での使用を限定する主要な因子になっている。今日まで、ほとんどのタンパク質薬剤は単回使用のみのために製剤化されてきた。しかしながら、複数回用量の製剤が可能である場合、それらは患者の利便性を可能にする追加の利点及び高い市場性を有する。良好な例は、保存される製剤の開発がさらに好都合な複数回使用の注射ペンの提示の商業化をもたらしたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のそれである。ｈＧＨの保存された製剤を含有する少なくとも４種のそのようなペン用具が現在市場で利用できる。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ  ＡＱ（液体、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥された−−二重チャンバーカートリッジ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ）はフェノールを含有する一方で、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）はｍ−クレゾールと共に製剤化される。
【０１５８】
保存される剤形の製剤化及び開発の間に幾つかの態様が考慮される必要がある。薬剤製品における有効な保存剤濃度が最適化されなければならない。これには、タンパク質の安定性を危うくすることなく、抗微生物有効性を付与する濃度範囲で剤形における所与の保存剤を調べることが求められる。
【０１５９】
予想できるように、保存剤を含有する液体製剤の開発は凍結乾燥製剤よりも難題である。凍結乾燥製品は保存剤を含まずに凍結乾燥し、使用の時点で保存剤を含有する希釈剤で再構成することができる。これは保存剤がタンパク質と接触する時間を短縮し、関連する安定性のリスクを有意に最少化する。液体製剤に伴って、保存剤の有効性及び安定性は製品の保存可能期間（約１８〜２４ヵ月）の全体にわたって維持されるべきである。留意する重要な点は、保存剤の有効性が活性薬剤及びすべての賦形剤成分を含有する最終製剤にて明らかにされるべきであるということである。
【０１６０】
抗体またはＦｃ融合タンパク質の製剤は、とりわけ、投与の特定の経路及び方法について、特定の投与の投与量及び投与の回数について、特定の疾患の特定の治療について、生物利用効率及び持続性の範囲で一般に設計されるであろう。従って、製剤は、経口で、耳から、眼に、直腸に及び膣に投与を含むが、これらに限定されない好適な経路によって、及び静脈内や動脈内の注射、筋肉内注射及び皮下注射を含む非経口経路によって送達するために本発明に従って設計されてもよい。
【０１６１】
いったん医薬組成物が製剤化されると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固形物、結晶として、または脱水された若しくは凍結乾燥された粉末として無菌のバイアルに保存されてもよい。そのような製剤は、使用の準備ができた形態で、または投与に先立って再構成される（たとえば、凍結乾燥された）形態で保存されてもよい。本発明はまた単回用量の投与単位を生じるためのキットも提供する。本発明のキットはそれぞれ、乾燥タンパク質を有する第１の容器と水性製剤を有する第２の容器の双方を含有してもよい。本発明の特定の実施形態では、単回及び複数回に区分された事前に充填された注射器（たとえば、液体注射器及びリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ）を含有するキットが提供される。
【０１６２】
採用される抗体またはＦｃ融合タンパク質の医薬組成物の治療上有効な量は、たとえば、治療の背景及び目的に左右されるであろう。当業者は、治療のための適当な投与量レベルが、部分的には、送達される分子、抗原結合タンパク質が使用される適応、投与の経路、及び患者の大きさ（体重、体表面または臓器サイズ）及び／または状態（年齢及び全身状態）に応じて変化することを十分に理解するであろう。特定の実施形態では、臨床医は、投与量を滴定し、投与の経路を改変して最適な治療効果を得てもよい。
キット
【０１６３】
本明細書で記載される１以上の抗体またはＦｃ融合タンパク質を含む医薬組成物を、そのような医薬組成物の使用に関する指示書を提供する包装材と共に、容器（たとえば、バイアルまたは注射器）の中に入れてもよい。一般に、そのような指示書には、抗体またはＦｃ融合タンパク質の濃度を記載する具体的な表現、と同様に特定の実施形態の範囲内では、医薬組成物を再構成するのに必要であり得る賦形剤成分または希釈剤（たとえば、水、生理食塩水またはＰＢＳ）の相対的な量が含まれるであろう。
【実施例】
【０１６４】
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、説明目的のみのために提供されるのであって、本明細書での教示の際、限定として解釈されるべきではない。
実施例１
【０１６５】
以下の実施例はＦｃ変異体抗体の産生及びグリコシル化の解析を記載する。
【０１６６】
［ＤＮＡ構築物］製造元の指示書（Ａｇｉｌｅｎｔ）のとおりに部位特異的変異誘発キットでＣＨ２ドメインの部位特異的変異誘発を行った。変異誘発には以下のオリゴヌクレオチドを使用した：５’−ｃｃｔｇｔｇｇｃａｇｇａｃｃｇｇａｃｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃ−３’（配列番号３７；Ｓ２３９Ｄ）；５’−ｃａｃｃｔｇｔｇｇｃａｇｇａｃｃｇｃａｇｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃ−３’（配列番号３８；Ｓ２３９Ｅ）；５’−ｃａｃｃｔｇｔｇｇｃａｇｇａｃｃｇｃａｇｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃ−３’（配列番号３９；Ｓ２３９Ｋ）；５’−ｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇａｃｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇ−３’（配列番号４０；Ｖ２６４Ｄ）；５’−ｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｃｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃ−３’（配列番号４１；Ｖ２６４Ｌ）；５’−ｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇｃａｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃ−３’（配列番号４２；Ｄ２６５Ａ）；５’−ｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃ−３’（配列番号４３；Ｄ２６５Ｌ）；５’−ｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｔｃｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃ−３’（配列番号４４；Ｄ２６５Ｓ）；５’−ｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｇｃｔａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇ−３’（配列番号４５；Ｆ２９６Ａ）；５’−ｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｃｔｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃ−３’（配列番号４６；Ｖ２６４Ｄ／Ｄ２６５Ａ）；上述の構築物はすべてＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０１６７】
［細胞の培養、形質移入、増幅及び製造］無血清培地でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を維持した。ＣＨＯ宿主細胞に形質移入し、その後、−ＧＨＴ培地で選択することによって安定なＣＨＯ細胞の０ｎＭプールを得た。０ｎＭプールをさらに１５０ｎＭのＭＴＸ含有培地で増幅させて１５０ｎＭの安定なプールを生成した。化学的に定義された産生培地にて１２５ｍＬの振盪フラスコで異なる安定なプールに由来するｍＡｂを流加培養産生アッセイから生成した。供給日にグルコースのレベルを確認し、５０％のグルコースのストック溶液（ＨｙＣｌｏｎｅ）を用いて１０〜１２ｇ／Ｌで維持した。産生培養物はすべて１０日目に回収した。
【０１６８】
［ＭＡｂの精製及び定量］高処理能力プロテインＡアッセイを用いて、分泌されたｍＡｂ濃縮物を精製し、定量した。プロテインＡ親和性カラムによって抗体の力価を測定した。不動化したプロテインＡを詰めたカラムに抗体を含有する試料を注入し、流した。次いで結合した抗体を酸性条件下で溶出し、統合し、検量線を介して最終的に定量した。
【０１６９】
［ＭＡｂ生成物の質的解析］抗体凝集物をＳＥＣによって測定した。試料をＨＰＬＣにかけ、ＳＥＣカラムを用いた流体力学サイズによって分離した。凝集物と単量体についてクロマト図を解析した。２−ＡＡ  ＨＩＬＩＣグリカン解析によってＮ−グリカンを解析した。手短には、抗体Ｎ−グリカンをＰＮＧａｓｅＦによって解放し、２−アミノ安息香酸で標識し、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィによって分離した。種の比率についてクロマト図を解析した。
【０１７０】
［示差走査熱量測定（ＤＳＣ）］タンタル６１セルを備え、それぞれ１３５μＬの有効容量を備えたＶＰキャピラリーＤＳＣシステム（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いてＤＳＣの測定値を得た。１００ｍＭの酢酸を含有する緩衝液、ｐＨ５．０にてタンパク質試料を０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈する一方で、相当する緩衝液を参照として使用した。６０℃／時間の比率で２０℃から１００℃まで試料を走査し、最初の１５分は２０℃での平衡化だった。１６秒のフィルタリング時間を用い、Ｏｒｉｇｉｎ７．０ソフトウエア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いてデータを解析した。緩衝液のみのブランク走査を差し引くことによってサーモグラムを補正した。補正したサーモグラムをタンパク質の濃度に対して基準化した。Ｏｒｉｇｉｎ７．０ソフトウエアに組み込んだＤＳＣの関数を用いて溶融温度Ｔｍを決定した。
結果
【０１７１】
たとえば、ＨＭ及びＧ０のような未成熟のグリカン種が不均一性の主な原因である。従って、グリコシル化の成熟を改善することはｍＡｂのグリカンの不均一性を減らすであろう。他の糖タンパク質とは異なって、オリゴ糖鎖は、ＩｇＧ−Ｆｃの「蹄鉄」形状の内部空間の中に埋め込まれるアスパラギン残基２９７を介して結合される。従って、Ｆｃ構造及び周辺のタンパク質残基は酵素や基質のようなグリカンのプロセッシング装置のアクセス性に影響を及ぼし、最終的にプロセッシングの効率に影響を与えるという仮説が立てられ得る。この仮説に基づいて、我々は、ヒトＩｇＧ２の結晶構造を用いて、コンセンサスＮ−グリコシル化部位に空間的に近いＣＨ２ドメインにおける４つのアミノ酸残基と、オリゴ糖鎖も選択した。ＩｇＧ２の結晶構造は、Ｓ２３９、Ｖ２６４、Ｄ２６５及びＦ２９６が、コアのＮ−アセチルグルコサミンを安定化すること、またはグリコシル化酵素のアクセス性を変化させることに決定的に関与することを示唆した（図２）。これらのアミノ酸残基に相当するヌクレオチド配列を表２に要約するように変異させてこの戦略がグリカンのプロセッシングを変化させるかどうかを調べた。
【表２】
0006668241.tif 000043
［異なるグリカンのプロセッシング効率を持つＦｃ変異体ｍＡｂの生成］
【０１７２】
ｍＡｂ構築物をＣＨＯ細胞に形質移入し、Ａｍｇｅｎプラットフォーム手順を用いてＦｃ変異体ｍＡｂを発現している安定なプールを生成した。Ａｍｇｅｎプラットフォーム流加産生法を用いてＦｃ変異体ｍＡｂを生成し、グリカンのマッピング（材料及び方法）によってｍＡｂのグリコシル化を解析した。
【０１７３】
図３に示すように、野生型ｍＡｂのマンノース５（Ｍ５）のレベルは未増幅（０ｎＭ）細胞（Ａ）で３．５％であるが、１５０ｎＭで増幅した細胞（Ｂ）では６．４％に増加し、それは、グリカンのプロセッシングが培養／発現系の変化に対して高度に影響を受け易いので、ｍＡｂ産生細胞すべてに共通する所見である。一方、単一ＡＡ変異、Ｓ２３９Ｄ、Ｖ２６４Ｄ／Ｌ、Ｄ２６５Ａ及びＦ２９６Ａ並びにＳ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｌ、及びＶ２６４Ｄ／Ｆ２９６Ａの二重変異は、野生型Ｆｃに比べてＭ５レベルを８４％まで低下させるのに十分であり、グリカンのプロセッシングがこれらの変異体ではさらに効率的であることを示している（図３）。重要なことに、Ｖ２６４Ｄ、Ｄ２６５Ａ、Ｆ２９６Ａ、及び二重変異Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ａに由来する高マンノースのプロセッシングは培養／発現系の差異によって影響されないと思われた。これらの変異体に由来する％Ｍ５のレベルは１５０ｎＭ（Ａ）ＭＴＸの増殖を伴わなくても伴っても（Ｂ）同じままだった。
【０１７４】
これらのＦｃ変異体がグリコシル化の変異を改善することができるかどうかをさらに評価するために、たとえば、ガラクトース、フコース及びシアル酸のような末端糖を調べた。図４に示すように、シアル化を伴ってまたは伴わずに１または２のＧａｌ残基を含有するガラクトシル化ｍＡｂでは２．５倍までの増加がある（図４）。同じ傾向は０ｎＭ（Ａ）及び１５０ｎＭ（Ｂ）双方のプールで一貫して見られた。一方、未成熟の糖型Ｇ０及びＧ０Ｆは相当する変異体で有意に低下した（図５）。これらのデータは、特定のＣＨ２  Ｆｃの変異を示すＣＨＯに由来するｍＡｂはＣＨＯ細胞におけるグリコシル化の間に完全に成熟することができることを示唆した。抗体へのこれらの変異体の組み込みは未成熟の糖型レベル、すなわち、高マンノースのＧ０及びＧ０Ｆの産生を、異なる培養／発現系によって影響されないことが一貫している十分に低いレベル（全体で＜５％）に低下させる（図２及び４、Ｖ２６４Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｄ及びＶ２６４Ｄ／Ｆ２９６Ａ）ことが言及された。従って、プロセス開発によるさらなる製品の品質管理に対する要件／ニーズが減る。加えて、これらの成熟糖型及び５％未満までの未成熟の糖型で見られるレベルまでガラクトシル化を高めるのを可能にする細胞操作またはプロセス技術のツールは今日まで記載されていないし／利用可能ではない。比較すると、たとえば、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｋ及びＤ２６５Ｓのような調べた他のＡＡ変異体は、グリカンのプロセッシングに対して反対の影響を有した（図３〜６）ということは変異の影響が設計によって特異的であることを明らかにしている。
［Ｆｃ変異体ｍＡｂは予想された折り畳みを示す］
【０１７５】
ＤＳＣによってｍＡｂ変異体の折り畳みを検証した。野生型及び変異体のタンパク質は双方ともＩｇＧ分子の典型的な熱によるアンフォールド特性を示す。結果（図６）はこれらのＦｃ変異体が構造的完全性を上手く維持する実行可能な生成物候補であることを示している。幾つかの変異はＣＨ２ドメイン溶融の中点を反映する第１のＴｍに影響を与えた。しかしながら、変異の大半はＣＨ２溶融の開始温度に影響を与えなかった。これらの知見は、変異がグリコシル化部位の近傍の局所構造を変え、それによってグリカン修飾の成熟に影響を及ぼし得るという仮説に一致している。一般に、これらの変異の熱安定性は製品製造、保存、分布及び投与に対する追加の難題を提示し得ないが、ＤＳＣの結果は最も所望であるＦｃ変異体を選択するための変異誘発戦略をさらに導き得る。
実施例２
【０１７６】
以下の実施例は追加の変異及びＦｃ変異体抗体のさらなる性状分析を記載する。
［Ｎ−グリコシル化操作のための位置の選択］。
【０１７７】
完全なヒト抗体の高解像構造であるヒトＩｇＧ２のＦｃドメインの結晶構造。Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  （ＭＯＥ）；  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．，  １０１０  Ｓｈｅｒｂｏｏｋｅ  Ｓｔ．  Ｗｅｓｔ，  Ｓｕｉｔｅ  ＃９１０，  Ｍｏｎｔｒｅａｌ，  ＱＣ，  Ｃａｎａｄａ，  Ｈ３Ａ  ２Ｒ７，  ２０１１．，”  ｎ．ｄ．）からのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）を用いてグリコシル化の位置を視覚化した。自動視覚化に使用した構造は１ＨＺＨ（Ｓａｐｈｉｒｅら，２００１）だった。抗体重鎖の双方を構造解析で利用した一方で、視覚化には主としてＨ鎖を使用した。直接原子距離測定及び糖の存在下及び非存在下での残基当たりの溶媒暴露差分計算を含む種々の方法によって、残基の位置決め及び糖との相互反応を行った。
［ＤＮＡ構築物、細胞培養、形質移入、増幅及び産生］。
【０１７８】
製造元の指示書（Ａｇｉｌｅｎｔ）のとおりに部位特異的変異誘発キットでＣＨ２ドメインの部位特異的変異誘発を行った。構築物はすべてＤＮＡ配列決定によって検証した。
【０１７９】
無血清培地でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を維持した。ＣＨＯ宿主細胞に形質移入し、その後、−ＧＨＴ培地で選択することによって安定なＣＨＯ細胞の０ｎＭプールを得た。０ｎＭプールをさらに１５０ｎＭのＭＴＸ含有培地で増幅させて１５０ｎＭの安定なプールを生成した。化学的に定義された産生培地にて１２５ｍＬの振盪フラスコで異なる安定なプールからのｍＡｂを流加培養産生アッセイから生成した。供給日にグルコースのレベルを確認し、５０％のグルコースのストック溶液（ＨｙＣｌｏｎｅ）を用いて１０〜１２ｇ／Ｌで維持した。産生培養物はすべて１０日目に回収した。
［ＭＡｂの精製及び定量］。
【０１８０】
高処理能力プロテインＡアッセイを用いて、分泌されたｍＡｂ濃縮物を精製し、定量した。社内のＳＥＣ及びＨＩＬＩＣアッセイによってＨＭＷ及びグリコシル化を解析した。プロテインＡ親和性カラムによって抗体の力価を測定した。不動化したプロテインＡを詰めたカラムに抗体を含有する試料を注入し、流した。次いで結合した抗体を酸性条件下で溶出し、統合し、検量線を介して最終的に定量した。
［ＭＡｂ生成物の質的解析］。
【０１８１】
抗体凝集物をサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって測定した。試料をＨＰＬＣにかけ、ＳＥＣカラムを用いた流体力学サイズによって分離した。凝集物と単量体についてクロマト図を解析した。２−ＡＡ  ＨＩＬＩＣグリカン解析によってＮ−グリカンを解析した。手短には、抗体Ｎ−グリカンをＰＮＧａｓｅＦによって解放し、２−アミノ安息香酸で標識し、ＨＩＬＩＣクロマトグラフィによって分離した。種の比率についてクロマト図を解析した。
［親水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ−ＭＳ）−グリカンマッピング法］。
【０１８２】
１２０μｇのｍＡｂのアリコートを１×消化緩衝液（１×ＰＢＳ緩衝液）中の３μＬのＰＮＧａｓｅＦで処理した。最終容量は３０μＬであったが、最終ｐＨは１×ＰＢＳ緩衝液塩濃度によって約７．４であるべきである。混合物を３７℃で２時間インキュベートした。グリカン混合物を解放するために、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）蛍光標識溶液（０．０４Ｍのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを伴った１２ｍｇ／ｍＬの２−アミノ安息香酸）を加え、８０℃で加熱した。Ｐｒｏｚｙｍｅプロトコールに従って過剰の２−ＡＡ試薬を取り除いて乾燥させたグリカンを得た。１５μＬのミリＱ水溶液における２−ＡＡ標識したグリカンをＵＰＬＣに負荷し、分離した。分離の間のＨＩＬＩＣカラムの温度は５０℃だった。標識したグリカンの注入容量は３μＬだった。移動相Ａは１００ｍＭのギ酸アンモニウム、ｐＨ３．０であり、移動相Ｂは１００％アセトニトリルだった。分離は、０．４ｍＬ／分の流速及び４０分間の２２％から４５％Ａまでの勾配を使用し、その後の４５分間の合計実行時間を生じる浄化と再平衡化を行った。３６０ｎｍの励起と４２５ｎｍの放射での蛍光検出器によって移動したグリカン種をモニターした。定量されたグリカン含量はＨＩＬＩＣのグリカンマップにおける蛍光ピークから積分される一方で、これらのグリカンのピークの割り当ては質量分光分析（ＭＳ）によって確認される。
［示差走査熱量測定（ＤＳＣ）］。
【０１８３】
タンタル６１セルを備え、それぞれ１３５μＬの有効容量を備えたＶＰキャピラリーＤＳＣシステム（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いてＤＳＣの測定値を得た。１００ｍＭの酢酸を含有する緩衝液、ｐＨ５．０にてタンパク質試料を０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈する一方で、相当する緩衝液を参照として使用した。６０℃／時間の比率で２０℃から１００℃まで試料を走査し、最初の１５分は２０℃での平衡化だった。１６秒のフィルタリング時間を用い、Ｏｒｉｇｉｎ７．０ソフトウエア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いてデータを解析した。緩衝液のみのブランク走査を差し引くことによってサーモグラムを補正した。補正したサーモグラムをタンパク質の濃度に対して基準化した。Ｏｒｉｇｉｎ７．０ソフトウエアに組み込んだＤＳＣの関数を用いて溶融温度Ｔｍを決定した。
［Ｆｃ変異体のＦｃγＲＩＩＡへの相対的な結合の測定］
【０１８４】
ＡｌｐｈａＬＩＳＡ技術（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて結合の相対的潜在力を測定した。ＧＳＴ−でタグを付けたＦｃγＲＩＩＡはＡｍｇｅｎ社によって提供された。常温にて２〜４時間、ＡｌｐｈａＬＩＳＡグルタチオンアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｓｔａｔｅ）を１×免疫アッセイ緩衝液中の５ｎＭのＦｃγＲＩＩＡ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）でコーティングした。変異体Ｆｃ種を１ｎＭのビオチン化抗体競合体分子と組み合わせ、１０μｇ／ｍＬのＦｃγＲＩＩＡでコーティングしたアクセプタービーズと共に常温で２２〜２６時間インキュベートした。１０μｇ／ｍＬのＡｌｐｈａＬＩＳＡストレプトアビジンドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を加え、反応物を常温で２２〜２６時間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて相対的な発光単位としてＡｌｐｈａＳｉｇｎａｌを回収した。調べた抗体のＦｃγＲＩＩＡへの結合はビオチン化競合体分子とＦｃγＲＩＩＡの相互作用を壊し、それによってドナービーズとアクセプタービーズが近接するのを防ぎ、５２０〜６２０ｎＭでの放射の低下を生じる。Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）にて野生型Ｆｃと比べて結合の相対的な潜在力を算出した。
［ＦｃＲｎのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎに基づく結合アッセイ］。
【０１８５】
本試験で利用されるＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）結合アッセイは穏やかに酸性の条件下（〜ｐＨ６）で行われて試験分子のＦｃＲｎ結合を特徴付ける競合阻害アッセイである。それは、生体分子の相互作用を検出するビーズに基づく増幅発光近傍均質アッセイ（アルファ）形式であるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（登録商標）技術（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を利用した。この技術は、２つの型のビーズ、すなわち、アクセプタービーズとドナービーズを必要とした。アクセプタービーズはチオキセン誘導体と同様にニッケルキレート（Ｎｉキレート）を含有するヒドロゲルでコーティングした。ドナービーズはフタロシアニン、光増感剤及びストレプトアビジンを含有するヒドロゲルでコーティングした。アッセイでは、試験分子は、ヒスチジンで標識したヒト組換えＦｃＲｎ（ＦｃＲｎ−ｈｉｓ）の可溶性形態への結合について固定した濃度のビオチン化Ｆｃ（Ｆｃ−ビオチン）と競合した。溶液相でＦｃＲｎ−ｈｉｓがＦｃ−ビオチンに結合した後、２つのビーズ型を反応混合物に加えた。この反応では、アクセプタービーズはＮｉキレートを介してＦｃＲｎ−ｈｉｓのヒスチジンタグに結合し、ドナービーズはストレプトアビジンを介してＦｃ−ビオチンに結合した。これらの結合のお蔭で、それらを近接させる２つのビーズ型の間で架橋が形成された。レーザーをこの複合体に適用すると、ドナーによって周囲の酸素が一重項酸素に変換された。近接したビーズによって、アクセプタービーズへのエネルギー転移が生じ、発光反応が生じた。アッセイでは、試験分子は発光反応で用量依存性の低下を生じ、それはＥｎｖｉｓｉｏｎ（登録商標）プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）によって測定された。変異体試料の活性レベルは、その用量反応曲線を野生型の反応曲線と比較することによって決定され、パーセント相対結合（％相対結合）として報告された。各試料（変異体）は３回の独立したアッセイで調べ、％相対結合の値はその３回の測定で平均した。
［マウスにおける薬物動態（ＰＫ）試験］
【０１８６】
オスＣＤ−１マウス（６〜８週齢）にて薬物動態試験を行った。静脈内投与を介して群当たり３匹のマウスが単回用量のｍＡｂ変異体の投与を受けた。用量は最近得た体重に基づいて０．２５ｍｇ／ｋｇだった。試験物品を０．１２５ｍｇ／ｍＬに希釈して２ｍＬ／ｋｇのおよその投与容量を生じた。ＰＫ分析のための試料は、投与後、０、０．５、２、４、８、２４、４８、７２、１６８、２４０、３３６、５０４及び６７２時間で採取した。血液試料は、眼窩後方静脈叢穿刺（０．０７ｍＬ）を介してＭｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｂｒａｎｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  Ｔｕｂｅｓに採取した。ＧｙｒｏｓＬａｂ（商標）自動化免疫アッセイ（Ｈａｌｌ２０１３；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、３９３（２０１３）７０−７３）を用い、捕捉としてビオチン化マウス抗ヒトＩｇＧＦｃ特異的ｍＡｂ及びＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７マウス抗ヒトＦｃのｍＡｂを伴ったサンドイッチ免疫アッセイ方式を用いてｍＡｂ変異体の定量を行った。アッセイにおける定量の下限（ＬＬＯＱ）は５０ｎｇ／ｍＬだった。生体分析データの解析をＰｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎで行った。
結果
【０１８７】
表面プラスモン共鳴アッセイによって変異体はＦａｂ／抗原の結合に影響を与えなかった（図７）。これらの残基の変異は、たとえば、ＦｃγＲ及びＦｃＲｎの結合のようなｍＡｂの他の特性にほとんど影響を示さない（図８及び９）。ヒトＦｃＲｎトランスジェニックマウスによる薬物動態試験は、野生型に比べて変異体はすべて同じＴｍａｘ及び類似のＣｍａｘを有することを示した（図１０）。
［ｍＡｂのグリカンのプロセッシングに影響を与える残基の選択］
【０１８８】
ヒトＩｇＧ１の結晶構造を用いて、コンセンサスＮ−グリコシル化部位に空間的に近接するＣＨ２ドメインにおける５つのアミノ酸残基と、オリゴ糖鎖も選択した。ＩｇＧ２にて調べられているＶ２６４及びＤ２６５に加えて、追加の残基はＶ２６２、Ｑ２９５及びＲ３０１である。これらのアミノ酸残基に相当するヌクレオチド配列を変異させ、得られたアミノ酸の変化を表３に要約してこれらの残基がグリカンのプロセッシングを変えるかどうか調べた。
【表３】
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［異なるグリカンのプロセッシング効率を持つＦｃ変異体ｍＡｂの生成］
【０１８９】
ｍＡｂ構築物をＣＨＯ細胞に形質移入し、Ｆｃ変異体ｍＡｂを発現している安定なプールを生成した。流加産生法を用いてＦｃ変異体ｍＡｂを生成し、上述のグリカンのマッピングによってｍＡｂのグリコシル化を解析した。
【０１９０】
図１１に示すように、野生型ｍＡｂのマンノース５（Ｍ５）のレベルは未増幅（０ｎＭ）の細胞では２．２５％であり、増幅した（１５０ｎＭ）細胞では４％に増えた一方で、単一ＡＡ変異Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｖ及びＲ３０１Ａは野生型Ｆｃのそれに比べて６７％までＭ５レベルを減らすのに十分である（図１２）。Ｄ２６５Ａ及びＤ２６５Ｖの効果はＩｇＧ２ｍＡｂからの以前の知見をさらに確認した。たとえば、Ｆ２４１Ａ、Ｖ２６２Ａ、Ｒ３０１及びＶ２６４Ｌ／Ｄ２６５Ａのような他の変異も種々の程度でＭ５を減らした。図１３は種々の他のＨＭグルカン（Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８及びＭ９）のレベルでの低下を示すということは、高マンノース構造の改善されたプロセッシングを示唆している。
【０１９１】
加えて、未成熟種、Ｇ０及びＧ０Ｆもこれらの変異体で減った（図１４）。これらには、フコシル化された、ガラクトシル化された、及びシアル化された二分岐グリカン構造（Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ｇ２ＦＳＡ１及びＧ２ＦＳＡ２）、主要な成熟複合体構造のレベルにおける上昇が伴った（図１５及び１７）。ＣＨＯ由来のｍＡｂでは普通非常に低い、シアル化（ＳＡ１及びＳＡ２）はこれらの変異体、特にＦ２４１、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６４Ｌ／Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｖ、Ｒ３０１Ａで有意に上昇する（３０〜６８％）（図１６及び１７）。完全に成熟したグリカンのレベルの全体的な量は９０％まで達したが、それはＣＨＯ由来のｍＡｂでは全く稀である。これらのデータは、特定のＣＨ２Ｆｃの変異を示すＣＨＯ由来のｍＡｂはＣＨＯ細胞におけるグリコシル化の間に完全に成熟することができることを示唆した。これらの変異体の抗体への組み込みは未成熟の糖型のレベル、すなわち、高マンノースのＧ０及びＧ０Ｆの産生を十分に低いレベル（全体で＜１０％）に低下させることが言及された。これらの構造は、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ｇ２ＦＳＡ１及びＧ２ＦＳＡ２のようなさらに成熟した構造の合成への経路の中間体なので、低下はコアフコース、ガラクトースまたはシアル酸の付加による成熟を反映する可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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