(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アコヤガイ外套膜を酸性水溶液で抽出した抽出物を有効成分として含む抗菌剤。
【請求項２】
菌を投与させた後のアコヤガイの鰓を酸性水溶液で抽出した抽出物を有効成分として含む抗菌剤。
【請求項３】
感染させた菌が腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus）である請求項２の抗菌剤。
【請求項４】
アコヤガイ外套膜を酸性水溶液で抽出した抽出物を、Ｃ１８−Ｅカートリッジを用いて精製水２０ｍＬを流したのち０．０５％ＴＦＡで溶出する画分を、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０カラムを用いて０．０５％ＴＦＡのリニアグラジエントで溶出する画分のうちピーク番号１０及び／又は１１を、Ｃ１８逆相カラムを用いて０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルのグラジエントで溶出させた画分を有効成分として含むソラヤシン遺伝子発現促進剤。
【請求項５】
腸炎ビブリオを投与させた後のアコヤガイの鰓を酸性水溶液で抽出した抽出物を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００を充填したカラムを用いてＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液にて１画分５ｍＬで分画し、画分番号４２〜４８を一纏めにし、これをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を充填したカラムを用いてＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液にて１画分５ｍＬで分画し、画分２２〜３７を有効成分として含むソラヤシン遺伝子発現促進剤。
【請求項６】
アコヤガイ外套膜を酸性水溶液で抽出した抽出物を、Ｃ１８−Ｅカートリッジを用いて精製水２０ｍＬを流したのち０．０５％ＴＦＡで溶出する画分を、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０カラムを用いて０．０５％ＴＦＡのリニアグラジエントで溶出する画分のうちピーク番号１０及び／又は１１を、Ｃ１８逆相カラムを用いて０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルのグラジエントで溶出させた画分を有効成分として含むロリクリン遺伝子発現促進剤（但し、シワ形成抑制用途を除く）。
【請求項７】
腸炎ビブリオを投与させた後のアコヤガイの鰓を酸性水溶液で抽出した抽出物を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００を充填したカラムを用いてＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液にて１画分５ｍＬで分画し、画分番号４２〜４８を一纏めにし、これをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を充填したカラムを用いてＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液にて１画分５ｍＬで分画し、画分２２〜３７を有効成分として含むロリクリン遺伝子発現促進剤（但し、シワ形成抑制用途を除く）。
【請求項８】
アコヤガイ外套膜を酸性水溶液で抽出した抽出物を、Ｃ１８−Ｅカートリッジを用いて精製水２０ｍＬを流したのち０．０５％ＴＦＡで溶出する画分を、ＴＳＫｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０カラムを用いて０．０５％ＴＦＡのリニアグラジエントで溶出する画分のうちピーク番号１０及び／又は１１を、Ｃ１８逆相カラムを用いて０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルのグラジエントで溶出させた画分を有効成分として含むトランスグルタミナーゼ−１遺伝子発現促進剤。
【請求項９】
腸炎ビブリオを投与させた後のアコヤガイの鰓を酸性水溶液で抽出した抽出物を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００を充填したカラムを用いてＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液にて１画分５ｍＬで分画し、画分番号４２〜４８を一纏めにし、これをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を充填したカラムを用いてＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液にて１画分５ｍＬで分画し、画分２２〜３７を有効成分として含むトランスグルタミナーゼ−１遺伝子発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌性を有する皮膚外用剤及び抗菌剤に関する。
さらにはソラヤシン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ−１の遺伝子発現を促進する皮膚に有効な製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、皮膚外用剤、食品等の分野において、微生物による製品の汚染を防止し、製品の保存安定性を得るために、種々の殺菌剤や防腐剤が用いられている。また、化粧料、医薬品等の分野において、微生物によって引き起こされる皮膚疾患を予防、改善するために種々の殺菌剤や防腐剤が用いられている。
代表的なものとして、パラオキシ安息香酸エステルが汎用されている。パラオキシ安息香酸エステルは、食品にも汎用されているが、過去アレルギーが認められた経緯があり、皮膚刺激性に問題が指摘されており、化粧料への配合に関しては配合の上限が規定されている。その他、安息香酸塩、サリチル酸塩やデヒドロ酢酸塩もよく使用されるがパラオキシ安息香酸エステルと同様に皮膚刺激の問題が指摘されている。
そこで、安全で抗菌活性の高い抗菌剤の開発が行われており、例えば、ヨモギエキス及び緑茶エキス（特許文献１参照）、各種精油（特許文献２参照）、ソルビン酸エステル（、特許文献３参照）、サポニン（特許文献４、５参照）等が知られているが、抗菌性能が充分とはいえず、今なお安全で、有効な抗菌剤の開発が望まれている。
【０００３】
皮膚は体の最も外側に存在しており、細菌などの外界からの刺激に対するバリアとなっている。皮膚は、角質細胞が基底細胞から有棘細胞、顆粒細胞、さらには角層細胞へと約４週間かけて変化（角化）し、これらの細胞中で細胞間脂質や天然保湿因子（ＮＭＦ）、さらにはコーニファイドエンベローブを形成することによってバリア機能を成し遂げている。しかし老化等によってこの角化の速度が低下すると、皮膚のくすみや肌荒れなどを引き起こすことが知られている。そのため皮膚の角化を促進する角化促進剤が開発されてきた。例えば、皮膚の角化とともにコーニファイドエンベローブの成分として生成されるタンパク質であるソラヤシン（＝Ｓ１００Ａ７）の発現量を指標として、このソラヤシン発現が増強される物質を研究した結果、酪酸またはその誘導体、およびカルシウムイオン供給化合物を含有する皮膚角化促進剤が知られている（特許文献６〜７）。
ソラヤシン（Ｓ１００Ａ７）は、乾癬の皮膚に過剰発現している分泌タンパク質として最初に同定されたタンパク質であり多くの炎症性疾患においても、過剰発現が確認されている。またソラヤシン（Ｓ１００Ａ７）は、体の表面でバクテリアを殺す働きがある。従って抗菌タンパク質であることが明らかとなっている。
【０００４】
ロリクリンは周辺帯(cornified cell envelope)の主要成分でありその発現は顆粒層より始まり次第に周辺帯に組み込まれていく、周辺帯の構成タンパク質の重要な１つであり、天然保湿因子の形成をはじめ種々の角層機能に関わり、シワの形成、肌理の不正常、荒れ肌等の発生を抑制する。
【０００５】
トランスグルタミナーゼ−１は、角化細胞の分化過程において、有棘層から顆粒層にかけてインボルクリン等のタンパク質が発現するが、これらのタンパク質の架橋を促進し、角化細胞を包み込む不溶性の細胞膜様構造体であるコーニファイドエンベロープ（以下「ＣＥ」と略記する）を形成し、角質細胞の細胞骨格及び構造の安定性に寄与する。
しかし、様々な要因で表皮におけるトランスグルタミナーゼ−１の産生量が減少すると、ＣＥ形成が不完全な状態となり、角化が正常に行われなくなる。その結果、角質バリア機能及び皮膚の保湿機能が低下し、肌荒れや乾燥肌等の皮膚症状を呈するようになると考えられる。
このようなことから、角化細胞の表皮におけるトランスグルタミナーゼ−１の産生を高め、ＣＥの形成を促進して角化を正常化することにより、乾燥や紫外線等の外部刺激に伴う皮膚バリア機能の低下を抑制し、肌の乾燥や肌荒れなど、様々な皮膚症状を予防・改善することができると考えられる。
【０００６】
【特許文献１】特開平１１−２２８３２５号公報
【特許文献２】特開２００１−６４１６３号公報
【特許文献３】特開２０００−２５６１０７号公報
【特許文献４】特開平７−１４９６０８号公報
【特許文献５】特開２００１−３９８１２号公報
【特許文献６】特開２００９−１５５２６９号公報
【特許文献７】特開２０１０−１０５９２４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は  抗菌性を有する皮膚外用剤及び抗菌剤を得ることにあり、さらにはソラヤシン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ−１の遺伝子発現を促進する皮膚等に有効な製剤を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが鋭意検討した結果、アコヤガイ外套膜、消化管或いは菌を感染させ刺激した後のアコヤガイの外套膜、消化管や鰓の抽出物又はこれらの分画物より抗菌性がある物質を見出し、さらにこれらの物質にソラヤシン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ−１の遺伝子発現を促進する作用を見出した。
本発明は、アコヤガイ(Pinctada fucata)或いはこれの類縁種のアコヤガイ外套膜、消化管或いはこれらを含む貝身を出発原料に用いる。
また、生きている状態のアコヤガイ或いはこれの類縁種の貝に対して菌を貝身に投与する。投与方法は、注射や管を用いて、貝身に菌が接触する方法を用いればよい。
投与後、３時間〜３日間飼育する。３時間より短くても菌を投与した効果は出ないし、３日間以上でも効果は増加しない。
また、貝身に投与しなくとも、菌を入れた海水で飼育すれば目的は達成できる。
投与する菌数は、投与する方法、菌の種類、飼育時間等々によっても変化するが、１０2〜１０15個程度を投与する。
菌の種類は特に限定されないが、腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus)で充分な効果が認められた。
【０００９】
上記のいずれかのアコヤガイ或いはこれの類縁種の貝の貝身或いは特定の部位から抽出物を得る。水が主成分の溶液で抽出する。
ｐＨは部位によって異なるが酸性水溶液がより有効性の高い抽出物が得られやすい。ｐＨは０．５〜７．０ぐらいが適当である。
【００１０】
さらに、分画することも可能である。
用いる手段は特に限定はない。例示すれば、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられ、これらの手段の１つ或いは複数用いて分画し、より有効な分画物を得ることも可能であるので、コストと効果を考えて分画すればよい。
【００１１】
これらを皮膚外用剤、食品の抗菌剤として、また、ソラヤシン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ−１の遺伝子発現促進剤として利用できる。
勿論、これ以外に食品、皮膚外用剤に用いることができる原料を必要に応じて配合できる。
これらの抽出物の製剤への配合量は固形分として、０．０００００１〜１０．０重量％、好ましくは０．００００１〜３．０重量％、さらに好ましくは０．００００５〜１．０重量％である。
【実施例】
【００１２】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが勿論これに限定されるわけではない。
【００１３】
実施例−１
アコヤガイを採集したのち１週間飼育したのち、各９個体づつ以下の処理をした。
Ｈ．腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus)１×１０12ＣＦＵ／mlの菌液を１個体当たり０．１ml貝身に注射した。（以下、「高投与Ｈ」、或いは「Ｈ」と略す場合がある。）
Ｍ．腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus)１×１０8ＣＦＵ／mlの菌液を１個体当たり０．１ml貝身に注射した。（以下、「中投与Ｍ」、或いは「Ｍ」と略す場合がある。）
Ｌ．腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus)１×１０4ＣＦＵ／mlの菌液を１個体当たり０．１ml貝身に注射した。（以下、「低投与Ｌ」、或いは「Ｌ」と略す場合がある。）
Ｃ．０．８５％生理食塩水を１個体当たり０．１ml貝身に注射した。（以下、「対照Ｃ」、或いは「Ｃ」と略す場合がある。）
Ｎ．無処理（以下、「Ｎ」と略す場合がある。）
【００１４】
注射後、貝身を血リンパ、粘液、外套膜、鰓、消化管、閉殻筋（貝柱）に分けた。
これらを分け、以下の溶液を加え、ホモジナイズしたのち、遠心分離（１２０００rpm、３０分間）し、上清を得た。
・０．１％トリフルオロ酢酸水容液（ｐＨ＝１．７５）（以下「ＴＦＡ（ｐＨ＝１．７５）」と略す場合がある）
・０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（０．１５ＭＮａＣＩ）（ｐＨ＝６．８０）（以下「Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ＝６．８０」と略す場合がある）
【００１５】
抗菌性確認試験
上記の上清を９６ウェルプレートにタンパク質濃度が５.０mg／mlになるように調整したのち、これを２倍希釈、４倍希釈、８倍希釈、１６倍希釈、３２倍希釈、６４倍希釈、１２８倍希釈、２５６倍希釈とし、これに腸炎ビブリオ菌液を加え、３７℃で７２時間培養した。
表１に、鰓と外套膜と消化管をＴＦＡ（ｐＨ＝１．７５）で抽出した結果を、図１に外套膜の結果を、図２に鰓の結果を示す。
なお、以下、特段の記載がない場合は、抗菌性確認試験は腸炎ビブリオ菌を用いて実験した。
【００１６】
【表１】
0006711506.tif 000002
【００１７】
実施例−２
実施例−１の「高投与Ｈ」の鰓のＴＦＡ（ｐＨ＝１．７５）での抽出物をSephacryl S-200を充填したカラム(２．６cmφ×１００cmL)で、０．００２ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（０．０３ＭＮａＣＩ）（ｐＨ＝６．８０）溶液で溶出速度０．６ml／minで溶出させ、１画分５mlずつに分けた。
各画分に関して、抗菌活性として、阻止円の半径(mm)、２８０nmでの吸光度、フェノール−硫酸法で発色させた後の４９０nmの吸光度を測定した。また、ピーク１（画分番号４２〜４８）及びピーク２（画分番号８６〜９０）については電気泳動で挙動を確認した。
結果を図３に示す。
【００１８】
実施例−３
実施例−２の画分番号４２〜４８を一纏めにし、Sephadex G-50を充填したカラム(２．６cmφ×１００cmL)で、０．００２ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（０．０３ＭＮａＣＩ）（ｐＨ＝６．８０）溶液で溶出速度０．４ml／minで溶出させ、１画分５mlずつに分けた。
各画分に関して、抗菌活性、２１４nmでの吸光度、フェノール−硫酸法で発色させた後の４９０nmの吸光度を測定した。
抗菌活性は腸炎ビブリオを用いて放射拡散法で測定した。
さらに画分番号２２〜３７（ＡＧＰｇと命名した）の物質を電気泳動で挙動を確認した。
その結果を図４に示す。
【００１９】
実施例−４
実施例−１と同様に菌を投与し、外套膜に、以下の溶液を加え、５分間煮沸し、放冷後、ホモジナイズしたのち、遠心分離（１２０００rpm、３０分間）し、上清を得た。
１．１．０％酢酸水溶液（0.2mM PMSF含有）
２．１．０％ＴＦＡ水溶液（1M HCI,5%ギ酸, 1%NaCl,0.2mMPMSF）
なお、「５分間煮沸し、放冷後」を行わず、他は同様な処理を行った実験も行った。
これらの試料の抗菌活性について図５、図６に示す。
【００２０】
さらに「高投与Ｈ」の１．０％ＴＦＡでの抽出物をＣ１８−Ｅカートリッジに精製水２０mlを流したのち、０．０５％トリフルオロ酢酸水容液（０．０５％ＴＦＡと略す場合もある）、３０％アセトニトリル水溶液で溶出させた。
これのペプチド量と抗菌活性（阻止円）を測定した。
結果を表２に示す。
なお、溶出画分の名称は以下のようにした。
ＳＰＥ１  精製水で流出する画分
ＳＰＥ２  ０．０５％ＴＦＡで流出する画分
ＳＰＥ３  ３０％アセトニトリル水溶液で流出する画分
【００２１】
【表２】
0006711506.tif 000003
【００２２】
実施例−５
実施例−４で得たＳＰＥ２（０．０５％ＴＦＡで流出する画分）をTSKgel Amide-80 column (250 ×4.6mm, TOSOH)のカラムで０．０５％ＴＦＡの０〜６０％のリニアグラジエントで７０分以上かけて０．４５ml／minの速度で溶出した。
【００２３】
図７に結果を示す。図７に示すピークNo３、６、８、１０、１１の画分に関して最小阻止濃度と最小抗菌濃度を測定した。結果を表３に示す。
【００２４】
【表３】
0006711506.tif 000004
【００２５】
さらにピークNo３、６、８、１０、１１の画分についてＣ１８逆相カラム（４．６mmφ×１５０mmＬ Mightsil）０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルのグラジエントでさらに分画し、ピークNo３からＡＭＰｍ１を、ピークNo６からＡＭＰｍ２を、ピークNo８からＡＭＰｍ３を、ピークNo１０からＡＭＰｍ４を、ピークNo１１からＡＭＰｍ５を得た。
これらの画分について、ペプチドと糖の濃度、最小阻止濃度と最小抗菌濃度を測定した。結果を表４に示す。
【００２６】
【表４】
0006711506.tif 000005
【００２７】
図８に電気泳動の結果を示す。
【００２８】
確認試験
２継代目のヒト包皮由来表皮細胞（クラボウ）を５０−７０％コンフルエントとなるようＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地（フェノールレッド不含）で培養後、前日にカルシウム濃度を１．８ｍＭに変更したＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２培地に、製造例を添加し、３７℃、５％ＣＯ2インキュベータ中で２日間培養した。
【００２９】
＜ＲＮＡの抽出＞
細胞からの Ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出は、トリプシン／ＥＤＴＡで剥離後、ＳＶ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、プロメガ社の添付マニュアル（日本語プロトコールＮｏＴＭ０４８Ｊ２００１年６月作成）に従い調製した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用い算出した。
【００３０】
＜ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ＞
２．５μｇのＴｏｔａｌ ＲＮＡを使い、ＭＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＲＮａｓｅＨ−（東洋紡社）を用い、東洋紡社推奨プロトコール（ＴＯＹＯＢＯ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳ ＦＯＲ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ２００８／２００９のページ１−４２）に従いＲＴ反応を行なった。
リアルタイムＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用い、以下のように実施した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用い（ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，東洋紡社）、７５００ リアルタイムＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの操作マニュアル（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ（△△ＣＴ）法（ｎ＝３）により遺伝子発現比較を実施した。内部標準としてＧＡＰＤＨを使用した。
使用プライマーは特開２０１３−１６６７１０に記載のプライマーを用いた。
【００３１】
ＡＭＰｍ４、ＡＭＰｍ５及びＡＧＰｇについて、ソラヤシン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ−１の遺伝子発現実験を行った結果を図９に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例−１の外套膜の抗菌活性の結果であり、９６穴ウェルプレートの透明な部分が菌の発育が阻止された試料である。  左半分が０．１％トリフルオロ酢酸水容液（ｐＨ＝１．７５）で、右半分が０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（０．１５ＭＮａＣＩ）（ｐＨ＝６．８０）で抽出したものである。  上部のＨＭＬＣＮは段落番号００１３を参照、希釈倍率はタンパク質濃度が５.０mg／mlを基準に２倍希釈、４倍希釈、８倍希釈・・・である。  外套膜は、０．１％トリフルオロ酢酸水容液（ｐＨ＝１．７５）で抽出されるものには、菌の投与の有無や濃度に関わらず、高い抗菌活性がみられた。
【図２】実施例−１の鰓の抗菌活性の結果であり、９６穴ウェルプレートの透明な部分が菌の発育が阻止された試料である。  左半分が０．０１ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（０．１５ＭＮａＣＩ）（ｐＨ＝６．８０）で、右半分が０．１％トリフルオロ酢酸水容液（ｐＨ＝１．７５）で抽出したものである。  上部のＨＭＬＣＮは段落番号００１３を参照、希釈倍率はタンパク質濃度が５.０mg／mlを基準に２倍希釈、４倍希釈、８倍希釈・・・である。  鰓は、０．１％トリフルオロ酢酸水容液（ｐＨ＝１．７５）で抽出されるものに菌の投与の濃度に依存して抗菌活性が増加した。
【図３】実施例−２の試験結果である。各画分に関して、抗菌活性として、阻止円の半径(mm)右側目盛、２８０nmでの吸光度、フェノール−硫酸法で発色させた後の４９０nmの吸光度（いずれも左側目盛）の結果である。  右側の電気泳動は、ピーク１（画分番号４２〜４８）及びピーク２（画分番号８６〜９０）に関して実験したものである。
【図４】実施例−３の試験結果である。  各画分に関して、２１４nmでの吸光度（実線）、フェノール−硫酸法で発色させた後の４９０nmの吸光度（破線）を測定した。吸光度は右側の目盛を用いた。  抗菌活性はＡＧＰｇとしてまとめて測定した。  右側の電気泳動はＡＧＰｇに関して実験したものである。
【図５】実施例−４の１．０％酢酸水溶液での抽出の試験結果である。
【図６】実施例−４の１．０％ＴＦＡ水溶液での抽出の試験結果である。
【図７】実施例−５の試験結果である。  全体は、ＳＰＥ２（０．０５％ＴＦＡで流出する画分）をTSKgel Amide-80 column (250 ×4.6mm, TOSOH)のカラムで０．０５％ＴＦＡの０〜６０％のリニアグラジエントで７０分以上かけて０．４５ml／minの速度で溶出したクロマトの結果で、２１４nmの吸光度のグラフである。  また、５つの小枠は、ピークNo３、６、８、１０、１１の画分についてＣ１８逆相カラムの結果であり、２１４nmの吸光度のグラフである。
【図８】実施例−５の試験結果である。ＡＭＰｍ１〜ＡＭＰｍ５及び分画前のＳＰＥ２の結果を示す。
【図９】ＡＭＰｍ４、ＡＭＰｍ５及びＡＧＰｇのソラヤシン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ−１の遺伝子発現試験の結果を示す。
【図１】
0006711506.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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