(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中鎖トリグリセリド、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、コレステロール及びサポニンを含み、レシチンを含まず、腹腔内投与以外の投与経路用に製剤化される、アジュバント組成物。
【請求項２】
前記中鎖トリグリセリドが、中鎖トリグリセリドＥＰ、中鎖トリグリセリドＮＦ、中鎖脂肪酸トリグリセリドＪＰＥ、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載のアジュバント組成物。
【請求項３】
前記アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーがカルボマーである、請求項１または２に記載のアジュバント組成物。
【請求項４】
ｉ）前記中鎖トリグリセリドがＬａｂｒａｆａｃ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ＷＬ１３４９であるか；またはｉｉ）前記アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーがＣａｒｂｏｐｏｌ（商標）９７４Ｐ  ＮＦ  Ｐｏｌｙｍｅｒである、請求項１〜３のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項５】
生理食塩水、アルコール、水酸化ナトリウム、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分を更に含む、請求項１〜４のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項６】
前記コレステロールが、植物性由来のコレステロールであるか；または前記サポニンがＱｕｉｌ−Ａである、請求項１〜５のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項７】
前記アルコールがエタノールである、請求項５または６に記載のアジュバント組成物。
【請求項８】
前記中鎖トリグリセリドが約０．０１容積％〜約５容積％の量で存在するか；前記アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーが約０．１容積％〜約３容積％の量で存在するか；前記コレステロールが約０．００１容積％〜約３容積％の量で存在するか；または前記サポニンが約０．００１容積％〜約０．５容積％の量で存在する、請求項１〜７のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項９】
前記アルコールが約０．０１容積％〜約３容積％の量で存在する、請求項５〜８のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項１０】
無針、経皮、静脈内、筋肉内、及び皮下からなる群から選択される投与経路用に製剤化される、請求項１〜９のいずれかに記載のアジュバント組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載のアジュバント組成物と、抗原とを含む、ワクチン組成物。
【請求項１２】
ｉ）前記抗原が、タンパク質、ペプチド、多糖類、及びそれらのサブユニットからなる群から選択されるか；ｉｉ）前記抗原が核酸配列であるか；またはｉｉｉ）前記抗原がｉ）およびｉｉ）のものの組み合わせである、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記抗原が、抗原性部分をコードする改変ＤＮＡ配列である、請求項１１または１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記改変ＤＮＡ配列が、ワクチン用の真核プラスミド骨格を更に含む、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記抗原が、トリ抗原、ブタ抗原、ウシ抗原、ヒト抗原、イヌ抗原、ネコ抗原、サル抗原、ヤギ抗原、及びウマ抗原からなる群から選択される抗原から誘導される生成物である、請求項１１〜１４のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
無針、経皮、静脈内、筋肉内、及び皮下からなる群から選択される投与経路用に製剤化される、請求項１１〜１５のいずれかに記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示の分野は、バイオ医薬品に使用されるアジュバント組成物に関する。本アジュバントは、皮膚経由で吸収される、またはレシピエントに注入されるバイオ医薬品での使用に特に適している。
【背景技術】
【０００２】
アジュバントは、ワクチン組成物の成否を決定する、または少なくとも成否に影響を及ぼす可能性がある。加えて多くの場合、アジュバントは所与の抗原の投与方法を決定または増強する。どの経路のワクチン投与でも有効性の増強及び製剤の制御により利点をもたらすことができ、例えば、少ない抗原を使用した場合でも、同等またはより良好な免疫原性反応を動物に与えることができる。経皮投与は、投与が容易であり、かつレシピエントに与えるストレス量が少ないため、他の投与経路と比較して複数の有利性がある。経皮投与は、動物及び農業従事者にほとんどストレスを与えることなく、農業従事者が多数の動物集団に容易にワクチンを投与できるため、ブタを含む動物に対して有利である。無針投与方法、すなわち針を用いない接種方法は、動物に過度のストレスを引き起こすことなく、多数の動物集団への投与を成功させる１つの選択肢となっている。この投与経路はまた、より人道的でもある。経皮投与は、他のワクチン投与様式に抵抗感を抱きがちな小児及び高齢者に対しても有利である。経皮投与方法は一般化しつつあるとはいえ、この種の投与に適したアジュバントは普及していない。更に、レシチンを含有するアジュバント組成物が一般的であるが、このようなアジュバントが、すべての可能な投与経路、及びブタを含む様々な種に使用される場合に、ある特定の種類の抗原に必ずしも適しているとは限らない。上記のような有効性の増強及び製剤の制御は、他の投与経路と同様に経皮投与に利点をもたらし得る。加えて、免疫開始及び免疫持続時間の改善、ならびに製剤の制御により、経皮ワクチン及び注射可能なワクチン（静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、筋肉内（ＩＭ）及び皮下（ＳＣ）経路）を含む、あらゆる投与経路すべてに利点をもたらし得る。当技術分野では、抗原及び投与経路、特に有効性を理由に一般的に使用されない投与経路、例えば経皮などの投与経路に適合するように製剤化できるアジュバント組成物が必要とされている。レシチン以外の成分を有する製剤を利用できる、動物に適したアジュバント組成物もまた、当技術分野で必要とされている。最後に、免疫開始及び免疫持続時間などの機能が改善された、レシチンを含有しない組成物もまた、当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、従来技術が内包する問題点を解決し、ブタを含む動物での使用に適したアジュバント組成物及びワクチン組成物を提供する。本開示は更に、このようなアジュバント及びワクチン組成物に関連した方法を提供する。本開示のアジュバント組成物はまた、真皮を経由して吸収される医薬品での使用に特に適しており、更に静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、筋肉内（ＩＭ）及び皮下（ＳＣ）などの従来の経路で使用される製剤を増強する。本発明のアジュバントはまた、無針投与技術に特に有用である。更に、いくつかの好ましい形態では、アジュバントはレシチンを含まない。
【０００４】
本開示のアジュバント組成物は、通常経皮吸収が困難である抗原をレシピエントの皮膚を経由して吸収させる能力を付与または増強することから、無針投与技術、例えば経皮送達に特に適している。このアジュバントはワクチン接種される動物のストレス低減を含む、動物での利点をいくつか有する。ヒトに関しては、他の種類の投与経路には抵抗感を抱く場合のある小児及び高齢患者での使用において有利である。部位からの迅速な拡散が可能であるが、循環細胞集団への吸収能を有するワクチン製剤は、屠殺場での肉の損傷及び不適認定の低減に利点を有する。本開示は、アジュバント組成物の組成により、従来のワクチン接種経路で良好に使用することができる。本開示のアジュバント組成物は一般に親油性物質の使用を含み、更に好適な親油性物質は商品名ＬＡＢＲＡＦＡＣ（商標）（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ、Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）として知られる組成物である。
【０００５】
本開示のアジュバント組成物は、注射可能な組成物として抗原と共投与されるまたは抗原と混合される場合でも、皮膚経由で抗原と共投与されるまたは抗原と混合される場合でも、抗原の吸収または反応を好ましくは０．１％〜８０％増加させる。より好ましくは、吸収または反応は約１％〜８０％増であり、例えばこれは、１％〜８０％、５％〜６０％、１０％〜７０％、２％〜１８％、２０％〜４５％、５％〜６５％、０．１％〜３５％、０．５％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、２７％、３０％、３２％、３５％、３７％、４０％、４２％、４５％、４７％、５０％、５２％、５５％、５８％、６０％、６２％、６５％、６７％、７０％、７２％、７５％、７８％及び８０％の範囲及び値を想定する。皮膚経由の、または注射液としての抗原の吸収または反応の上昇値はすべて、同一の抗原と混合または共投与された他のアジュバント組成物と比較した場合の値である。
【０００６】
例えばワクチン中で抗原と混合される場合、本開示のアジュバント組成物はワクチンのレシピエントの免疫系に対して提示されるワクチンの抗原部分に改善をもたらす。このような提示の改善は、本開示の一部ではないアジュバント組成物と混合された同一の抗原に対する比較である。好ましくは、提示の改善により、より少数または低量の抗原を使用して、同一レベルの免疫系反応を達成することが可能である。免疫系反応のレベルは、臨床的徴候を含む免疫応答マーカー（例えば重篤度の軽減及び感染症の臨床的徴候の発生率）、ならびに生物学的マーカー（例えば血清学）によって測定される応答強度で測定することも、免疫もしくは防御の継続時間、または免疫系反応のこれらの指標の組み合わせによって測定することもできる。更により好ましくは、抗原提示の改善により、抗原の９５％の量、より好ましくは９０％、更により好ましくは８５％、８０％、７５％、６０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、ならびにこの群のいずれかの２つの要素によって形成される範囲の量を使用して、同一抗原を異なるアジュバントと混合して同一種の動物に投与したときと同レベルの免疫系反応を達成できる。
【０００７】
本開示のアジュバント組成物及び関連方法の更なる利点は、レシチンを含有していないことである。なぜなら、レシチンはすべての抗原型にとって有用とは限らないことが示されているためである。本開示のアジュバント組成物は、好ましくは、レシチンを利用しない有効なアジュバント組成物及び関連方法を提供し、レシチンがそれに対する免疫応答を誘導しない抗原、及び／またはレシチンが免疫応答をもたらさない動物での免疫応答を増強することが示されている。
【０００８】
本開示のアジュバント組成物は一般に、親油性物質、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、生理食塩水、コレステロール、アルコール、サポニン及び水酸化ナトリウムを含む。このアジュバント組成物は、無針投与、皮膚投与及びその他の投与経路で作用することが示されている。
【０００９】
有利には、本開示のアジュバント組成物は、殺ウイルス性でも細胞毒性でもない。これは、アジュバント組成物が抗原を分解して抗原を無効化させることなく、レシピエントの適切な免疫応答を誘導することを意味する。このアジュバントは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原のスクリーニングに使用することができる。好ましくは、脂質濃度が５％脂質未満のとき、アジュバントの殺ウイルス活性は組織培養でＥＩＤ５０である。細胞培養物での細胞毒性効果は、使用する細胞培養物に応じて変化するが、安全な範囲は０．０２５％〜５％であり得る。好ましい範囲は、５％未満、より好ましくは４％未満、いっそう好ましくは０．２５％〜約３％、更により好ましくは約０．２５％の間である。
【００１０】
本開示のアジュバント組成物の製造方法もまた提供する。本方法は、好ましくはアジュバント組成物の成分を混合する工程と、中和剤を添加する工程を含む。アジュバント組成物の成分を混合する工程には、少なくとも１種のエマルジョンを含むことが好ましい。
【００１１】
本開示は更に、本開示のアジュバント組成物及び抗原を含んでいるワクチン組成物を提供する。抗原は、免疫原性組成物またはワクチンとしての使用に適した、いずれかの抗原であり得る。好ましくは、抗原に対する本開示のアジュバントの比率は、約１：２０、１：１７、１：１５、１：１２、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２及び１：１．５であり、特に好ましくは１：５である。
【００１２】
動物またはヒトにワクチン接種する方法もまた提供する。本方法の工程は、好ましくは、それを必要とするレシピエントに本開示のワクチン組成物を投与することを含む。ワクチンは、無針投与または注入によって投与することができる。レシピエントは、好ましくはヒトまたは動物であり、この場合の動物とは、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ラバ、ヒツジ、サル、愛玩動物及びその他の哺乳動物から選択されるが、これらに限定されない。一実施形態では、ワクチン組成物は、様々な無針投与方法によって投与することができる。無針投与方法は、ワクチン銃、経皮パッチ、エアゾール、粘膜投与方法、皮膚接着方法、乾燥粒子噴射剤、湿式噴射剤、金／不活性粒子銃及び空気銃を含むが、これらに限定されない。
【００１３】
本開示において「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含んでいる）」に関する言及はすべて、特許請求の範囲の語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（からなる）」の意味でも使用されるものとする。例えば、本開示で組成物がＡ及びＢを含むと記載されている場合、組成物はまた、Ａ及びＢから本質的になり得、更にはＡ及びＢからなることもあり得、これらの各々は本開示の各部分について具体的に記述されたかのように完全に開示されると理解される。特許請求の範囲の導入部で使用される場合、これらの用語はそれぞれ、その通常の意味を与えられるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】負荷後２日目の、ワクチン接種されたトリまたは対照トリからの口咽頭排菌を示す散布図。
【図２】負荷後２日目の、ワクチン接種されたトリまたは対照トリからの口咽頭排菌を示す散布図。
【図３】実施例５に概説する調査での動物の生存性プロット。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示のアジュバント組成物は、好ましくは、親油性物質、及びアクリル酸もしくはメタクリル酸のポリマー、または何らかの粒子タイプの成分を含む。他の実施形態では、アジュバント組成物は、生理食塩水、免疫賦活剤、小分子、サイトカイン、コレステロールを含むステロール、アルコール、サポニン及び水酸化ナトリウムのうち少なくとも１つを更に含む。
【００１６】
親油性物質は、中鎖トリグリセリドを有する、いずれかの親油性物質であり得る。好ましくは、親油性物質は、中鎖ＥＰトリグリセリド、中鎖トリグリセリドＮＦ、中鎖脂肪酸トリグリセリドＪＰＥ、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。特に好ましい実施形態では、親油性物質は、ＬＡＢＲＡＦＡＣ（商標）（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ、Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）である。
【００１７】
好ましい実施形態では、親油性物質は本開示のアジュバント組成物中に、組成物の総容積の約０．０１％〜５％の量で存在し、この場合の量は、０．１容積％〜４．７容積％、０．２容積％〜４．５容積％、０．３〜４．４容積％、０．５容積％〜４．３容積％、０．７容積％〜４．２容積％、０．９容積％〜４．１容積％、１容積％〜４容積％、２容積％〜４容積％、２容積％〜５容積％、３容積％〜５容積％、０．１容積％、０．２容積％、０．３容積％、０．４容積％、０．５容積％、０．６容積％、０．７容積％、０．８容積％、０．９容積％、１．０容積％、１．１容積％、１．２容積％  １．３容積％、１．４容積％  １．５容積％、１．６容積％、１．７容積％、１．８容積％、１．９容積％、２容積％、２．２容積％、２．４容積％、２．６容積％、２．８容積％、３．０容積％、３．２容積％、３．４容積％、３．５容積％、３．８容積％、４容積％、４．２容積％、４．５容積％、４．８容積％、及び５容積％を含み、その間の任意の２点からのすべての範囲を想定する。特に好ましい実施形態では、親油性物質は、約１．８容積％の量で存在する。
【００１８】
アクリル酸またはメタクリル酸化合物のポリマーは、好ましくは、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー及び無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択される。このような化合物の例としては、架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、特に糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルが挙げられる。これらの化合物は、用語カルボマー（Ｐｈａｍｅｕｒｏｐａ  Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．２，Ｊｕｎｅ  １９９６）として知られている。当業者はまた米国特許第２，９０９，４６２号を参照することができ、これには、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシ化合物と架橋され、少なくとも３個のヒドロキシル基の水素原子が、少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置換されている、このようなアクリルポリマーについて記載されている。好適なラジカルは、２〜４個の炭素原子を含んでいるもの、例えばビニル基、アリル基及びその他のエチレン系不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体が他の置換基、例えばメチル基を含んでいてもよい。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ，ＵＳＡ）の名称で販売されている製品が特に適している。この製品は、アリルスクロースまたはアリルペンタエリトリトールと架橋されている。本開示での使用に適した様々なＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）製品が存在する。使用に特に好適な製品の１つは、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）９７４Ｐ  ＮＦ  Ｐｏｌｙｍｅｒである。
【００１９】
好ましい実施形態では、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーは、好ましくは、本開示のアジュバント組成物中に、約０．１容積％〜約３．０容積％の量で存在し、この場合の値は、例えば０．１％〜１％、０．１％〜１．５％、０．５％〜１％、０．５％〜２％、０．５％〜３％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、０．９４％、０．９５％、０．９６％、０．９７％、１．０％、１．１％、１．２％  １．３％、１．４％  １．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、及び３．０％を想定する。特に好ましい実施形態では、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーは、約０．９容積％の量で存在する。
【００２０】
生理食塩水の成分は、アジュバント組成物での使用に適した塩化ナトリウムと水の溶液であり得る。通常、生理食塩水とは０．９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ溶液（約３００ｍＯｓｍ／Ｌまたは１リットル当たり９．０ｇ）を指すが、本開示の目的のための生理食塩水はこの溶液に限定されない。特に好ましい実施形態では、生理食塩水は、カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号２１−ＣＶ）である。
【００２１】
好ましい実施形態では、生理食塩水は、本開示のアジュバント組成物の約５０容積％〜９８容積％の量で存在し、この場合の量は、例えば６０％〜９８％、７０％〜９８％、８０％〜９８％、９０％〜９８％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％、９１．６％、９１．７％、９１．８％、９１．９％、９２％、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％、９２．６％、９２．７％、９２．８％、９２．９％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％及び９８％を想定する。特に好ましい実施形態では、生理食塩水は、本開示のアジュバント組成物中に、約９２容積％の量で存在する。
【００２２】
アルコール成分は、好ましくはエタノール、イソプロパノール、ブタノール及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。好ましい実施形態では、エタノールが使用される。好ましくは、エタノールは９０％〜１００％の溶液であるが、１０％〜９０％のエタノール溶液もまた、本開示のために利用することができる。
【００２３】
好ましい実施形態では、アルコールは、本開示のアジュバント組成物の約０．０１容積％〜３容積％の量で存在し、この場合の値は、例えば０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％  １．３％、１．４％  １．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、及び３．０％を想定する。更に、記載されている値のいずれか２つを包含する範囲もまた想定する。例えば、０．０１％〜１％、０．０１％〜２％、０．３％〜１％、０．３％〜１．５％、０．０３％〜０．０７％、０．０５％〜２．４％及び１％〜１．６％はすべて、本開示による範囲内に含まれる。特に好ましい実施形態では、アルコールは、本開示のアジュバント組成物中に、約０．０５容積％の量で存在する。アルコールは、サポニン、好ましくはＱｕｉｌ  Ａの可溶化に有用であり、またアルコールの多くまたは大半（少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、またはそれより多く）は乾燥し、最終生成物中のアルコール最終濃度は非常に低くなる。
【００２４】
本開示の目的のためのサポニンは、どの部類のサポニンからでも選択することができる。通常、サポニンは、種々の植物種で特に豊富に見出される部類の化学化合物である。好ましくは、それらは、現象学的には、水溶液中で振盪すると石鹸様の起泡を生じることにより、また構造的には親油性トリテルペン誘導体と結合された１つ以上の親水性グリコシド部分を有することにより分類される両親媒性グリコシドである。好ましい実施形態では、サポニンは精製または半精製され、凍結乾燥されている。好ましくは、サポニンは、南米産樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉａの樹皮からの抽出物である。最も好ましくは、サポニンはＱｕｉｌ  Ａである。
【００２５】
好ましい実施形態では、サポニンは、本開示のアジュバント組成物中に、約０．００１％〜約０．５％の量で存在し、この場合の値は、例えば０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０１５％、０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０３５％、０．０４％、０．０４５％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％及び０．５％を想定する。更に、上記のいずれか２つの独立した値を含む範囲もまた想定する。例えば、サポニンは、本開示のアジュバント組成物中に、約０．００３％〜０．０１％、０．００３％〜０．０５％、０．０１％〜０．０３％、０．１％〜０．５％、０．０７％〜０．２％などの量で存在してもよい。特に好ましい実施形態では、サポニンは約０．００９％の量で存在する。
【００２６】
本開示のアジュバント組成物は、好ましくはステロールを含む。植物、動物及び真菌に生じるものを含め、どのステロールでも本開示の目的で機能する。ステロールは、好ましくは植物源から取得されるが、ステロールは、限定されないものの、フィトステロール、ゾーステロール、コレステロール、カンペステロール、シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール及びこれらの組み合わせから選択してもよい。特に好ましい実施形態では、ステロールはフィトステロールであり、より好ましくは非動物起源であることが好ましいコレステロールである。コレステロールは、アジュバント組成物での使用に適した、いずれかのコレステロール源であり得る。コレステロールは、好ましくは動物または植物から誘導され、最も好ましくは、コレステロールは植物由来である。
【００２７】
好ましい実施形態では、コレステロールは、本開示のアジュバント組成物中に、約０．００１容積％〜約３容積％の量で存在し、この場合の値は、例えば０．００５％〜０．０５％、０．００８％〜０．００８％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％  １．３％、１．４％  １．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、及び３．０％を想定する。更に、この容積のいずれか２つを含む範囲もまた想定する。特に好ましい実施形態では、コレステロールは、約０．０１容積％の量で存在する。
【００２８】
本開示のアジュバント組成物は、好ましくは組成物のｐＨをｐＨ約６〜８、より好ましくはｐＨ７に中和する成分を含む。従来のどの中和剤も使用できるが、好ましくは、中和剤は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及び水酸化アンモニウムからなる群から選択される。特に好ましい実施形態では、溶液のｐＨを中和する成分は水酸化ナトリウムである。
【００２９】
好ましい実施形態では、アジュバント組成物のｐＨを中和する成分は、約０．１％〜１０％の量で存在し、この場合の値は、例えば０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．２５％、１．５％、１．７５％、２％、２．２５％、２．５％、２．７５％、３％、３．２５％、３．５％、３．７５％、４％、４．２５％、４．５％、４．７５％、５％、５．２５％、５．５％、５．７５％、６％、６．２５％、６．５％、６．７５％、７％、７．２５％、７．５％、７．７５％、８％、８．２５％、８．５％、８．７５％、９％、９．２５％、９．５％、９．７５％、及び１０％を想定する。加えて、これらの値の２つを包含するいかなる範囲も想定され、これには、２％〜８％、２％〜６％、３％〜８％、４％〜６％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、及び９．５％を含むが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態では、アジュバント組成物のｐＨを中和する成分は、約５容積％の量で存在する。
【００３０】
本開示の別の実施形態では、アジュバント組成物は、ＬＡＢＲＡＦＡＣ（商標）、コレステロール及びＱｕｉｌ−Ａを含む。付加的な実施形態では、本発明のアジュバント組成物は、ＬＡＢＲＡＦＡＣ（商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）、生理食塩水、コレステロール、エタノール、Ｑｕｉｌ−Ａ及び水酸化ナトリウムを含む。更に別の実施形態では、本開示のアジュバント組成物は、ＬＡＢＲＡＦＡＣ（商標）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）９７４Ｐ、生理食塩水、植物性由来のコレステロール、エタノール、Ｑｕｉｌ−Ａ及び水酸化ナトリウムを含む。別の実施形態では、本開示のアジュバント組成物は、約２容積％のＬＡＢＲＡＦＡＣ（商標）、約１．０容積％のＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）、約９２容積％の生理食塩水、約０．０１容積％のコレステロール、約０．５容積％のエタノール、約０．０９容積％のＱｕｉｌ−Ａ、及び約５％の水酸化ナトリウムを含む。
【００３１】
本開示のアジュバント組成物の製造方法もまた提供する。方法の一形態では、本方法は、アジュバント組成物の成分を、好ましくはエマルジョンを経由して混合する工程と、アジュバント組成物のｐＨを中和する組成物を添加する工程とを含むことが好ましい。
【００３２】
本開示の更なる実施形態では、本開示のアジュバント組成物の製造方法は、親油性物質、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー及び生理食塩水を混合して、組成物を形成する工程を含む。本開示の更なる実施形態は、第１の組成物のｐＨを調整する前に少なくとも１つの乳化を実施する工程を追加で提供する。
【００３３】
本開示はまた、ワクチン組成物を提供する。ワクチン組成物は、好ましくは本開示のアジュバント組成物及び抗原（複数可）を含む。本開示のアジュバント組成物の量及び抗原の量ならびに抗原産生技術は、選択する投与方法に応じて異なる。当業者は、このような投与方法に適した割合を決定することができる。好ましくは、アジュバント組成物は、ワクチン組成物の総容積中に、約１容積％〜３０容積％の量で存在し、この場合の値及び範囲は、例えば１％〜２５％、１％〜２０％、１％〜１５％、１５％〜３０％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜２０％、１５％〜２５％、２０％〜３０％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％及び３０％を想定する。特に好ましい実施形態では、アジュバント組成物は約２０容積％の量で存在する。代替的実施形態では、ワクチン組成物中の抗原量に対する本開示のアジュバント組成物の比率は、上記及び好ましくは１：５である。
【００３４】
好ましくは、本発明のアジュバントは、単独で、または１つ以上の抗原との混合時に貯蔵安定性である。好ましくは、本発明のアジュバントの貯蔵寿命は、少なくとも４か月間、より好ましくは、少なくとも５か月間、より好ましくは少なくとも６か月間、少なくとも１２か月間、少なくとも１８か月間、及び少なくとも２４か月間、少なくとも３６か月間、貯蔵安定性であり、この場合の範囲は、例えば、６〜１８か月、６〜２４か月、６〜３６か月、１２〜２４か月、１２〜３６か月、１８〜２４か月及び１８〜３６か月を想定する。好ましくは、本発明のアジュバントは、周囲温度でこれらの期間、貯蔵安定性である。好ましくは、温度範囲は約１６〜２６℃である。
【００３５】
本開示は加えて、動物またはヒトへのワクチン接種方法を提供する。方法は、好ましくは、本開示のワクチン組成物をそのレシピエントに投与する工程を含む。あるいは、本開示の方法は、本開示のアジュバントを抗原と混合して、組成物を形成する工程と、その組成物を必要とする動物またはヒトに投与する工程とを含む。好ましくは、抗原は、免疫原性組成物またはワクチン組成物に通常利用されるものであり、好ましくはレシピエントに免疫応答をもたらすことができる。レシピエントは、好ましくはヒトまたは動物である。レシピエントが動物である実施形態では、動物は、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ラバ、サル、愛玩動物及びその他の哺乳動物からなる群から選択されることが好ましい。
【００３６】
本開示のワクチン組成物を目的とする抗原は、レシピエントに免疫原性応答を誘導するのに適した、いずれかの抗原または抗原の組み合わせであり得る。レシピエントは動物であってもヒトであってもよい。本発明に使用される抗原は、上述の定義の範囲内に該当する、いずれかを目的とする抗原であってよい。抗原は市販されており、あるいは当業者が抗原を作製することができる。いくつかの好ましい形態では、ワクチンを構成する抗原性部分は、改変された生存微生物もしくは死滅微生物であり得、または微生物もしくは他の細胞から精製された天然生成物であり得、これには、腫瘍細胞、合成生成物、遺伝子操作されたタンパク質、ペプチド、多糖類もしくは類似の生成物、またはアレルゲンを含むが、これらに限定されない。抗原性部分はまた、タンパク質、ペプチド、多糖類または類似の生成物のサブユニットであり得る。抗原はまた、遺伝子の抗原、すなわち、免疫応答を生じさせるＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。本発明に従って使用できる代表的な抗原としては、予防用または治療用ワクチン及びアレルゲンに使用し得る自己免疫疾患、ホルモンまたは腫瘍抗原に加え、ウイルス、細菌、真菌、寄生体及び他の感染因子に由来する天然、組み換え、または合成生成物が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスまたは細菌生成物は、微生物の酵素的切断によって生成された成分であり得、または当業者に周知である組み換えＤＮＡ技術によって生成された微生物の成分でもあり得る。本発明の性質及びその送達様式ゆえに、本発明は薬物、例えばホルモン、抗生物質及び抗ウイルス剤のための送達系として機能することも十分に考えられる。本開示のワクチン組成物での使用に適した抗原の例としては、これらに限定されないが、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）；マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍ  ｈｙｏ）；豚増殖性腸炎；ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤ）；ボーダー病、レプトスピラ症；ブルセラ菌属の細菌によって生じるブルセラ症；クロストリジウム；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉによって生じる特異的な神経毒によって引き起こされる破傷風毒血症；サルモネラ菌種；大腸菌；豚痘；エペリトロゾーン症；古典的ブタコレラ（ＣＳＦ）もしくはアフリカブタコレラ（ＡＳＦ）；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及び種々の連鎖球菌種、通常はＳ．ｓｕｉｓによって引き起こされる肺パスツレラ症及び連鎖球菌；連鎖球菌性髄膜炎；仮性狂犬病；ブタインフルエンザウイルス；Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｐｉｌｏｓｉｃｏｌｉ細菌によって引き起こされるスピロヘータ大腸炎；Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｈｅｒｉａｅ細菌によって引き起こされるブタ赤痢；コロナウイルス；ブタパルボウイルス；Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ（Ｈｐｓ）細菌によって引き起こされるグレーサー病；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｉｃｕｓ細菌によって引き起こされるブタ滲出性表皮炎；Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ細菌によって引き起こされるブタ丹毒；Ｅｐｅｒｙｔｈｒｏｚｏｏｎｏｓｉｓ  ｓｕｉｓ細菌によって引き起こさ���るエペリトロゾーン症（Ｅｐｅ）；脳心筋炎；ヘルペスウイルス；ヘルペスウイルスによって引き起こされるブタサイトメガロウイルス感染症（ＰＣＭＶ）；日本脳炎Ｂ型ウイルス（ＪＥ）；コロナウイルスによって引き起こされるブタ流行性下痢（ＰＥＤ）；ブタ呼吸コロナウイルス感染症（ＰＲＣＶ）；ロタウイルス；狂犬病；ブタ水疱病（ＳＶＤ）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる結核；ブタ水疱性発疹（ＶＥＳ）のウイルス；水疱性口炎（ＶＳ）ウイルス；及び東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＥＥＥＶ）に由来する抗原が挙げられる。当業者が理解しているように、抗原の種類を問わないワクチンの有用性を考慮し、本開示では、全微生物、巨大分子、サブユニット、核酸、発現タンパク質及びこれらの組み合わせを含む、あらゆる種類の抗原を企図している。
【００３７】
本開示のワクチン接種方法は、好ましくは本開示のアジュバント及び抗原を含む組成物の投与を含み、該投与は無針または注射による。より好ましくは、投与方法は、局所、筋肉内、経鼻、経口、経皮、粘膜及び皮下からなる群から選択される。本開示のアジュバント組成物は、無針投与方法において利点を提供する。該投与は、抗原の経皮吸収を利用しており、したがって好ましい実施形態では、投与方法は経皮または粘膜である。更なる実施形態では、本開示の方法を目的とする投与は、無針投与方法、例えばワクチン銃などによるが、本開示の方法はこの実施形態に限定されない。どの無針投与方法でも機能するため、本発明はワクチン銃に限定されない。無針投与方法は、ワクチン銃、経皮パッチ、エアゾール、粘膜投与方法、皮膚接着方法、乾燥粒子噴射剤、湿式噴射剤、金／不活性粒子銃及び空気銃を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
更に、本開示はブタにワクチン組成物を投与する方法を提供する。この方法は、好ましくは、本開示のアジュバント組成物を抗原と混合する工程と、ワクチン組成物を必要とするブタに経皮送達により投与する工程とを含む。特に好ましい実施形態では、方法は、本開示のワクチン組成物をワクチン銃投与によりブタに送達する工程を含む。
【００３９】
本開示のアジュバント組成物は、通常経皮吸収が困難である抗原を、レシピエントの皮膚または真皮から吸収させることが可能であるため、経皮送達に特に適している。本開示のアジュバントは、他のアジュバント組成物と比較して、皮膚経由の抗原の吸収を好ましくは０．００１％〜８０％高めることができる。
本開示の好ましい実施形態を以下に記載する：
［項１］
親油性物質及びアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーを含むアジュバント組成物と、抗原とを含む、ワクチン組成物。
［項２］
前記アジュバント組成物が、親油性物質、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、生理食塩水、コレステロール、アルコール、サポニン、水酸化ナトリウム、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分を更に含む、上記項１に記載のワクチン組成物。
［項３］
前記親油性物質が、中鎖トリグリセリドを有する、上記項１に記載のワクチン組成物。
［項４］
前記アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーがカルボマーである、上記項１に記載のワクチン組成物。
［項５］
前記コレステロールが、植物性由来のコレステロールである、上記項２に記載のワクチン組成物。
［項６］
前記アルコールがエタノールである、上記項２に記載のワクチン組成物。
［項７］
前記サポニンがＱｕｉｌ−Ａである、上記項２に記載のワクチン組成物。
［項８］
前記ワクチン組成物が、無針、経皮、静脈内、腹腔内、筋肉内、及び皮下からなる群から選択される投与経路用に製剤化される、上記項１に記載のワクチン組成物。
［項９］
前記抗原がブタ抗原またはトリ抗原である、上記項１に記載のワクチン組成物。
［項１０］
前記抗原が、ＤＮＡ、ウイルス、及び細菌からなる群から選択される、上記項９に記載のワクチン組成物。
［項１１］
親油性物質と、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーとを含むアジュバント組成物。
［項１２］
親油性物質、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、生理食塩水、コレステロール、アルコール、サポニン、水酸化ナトリウム、及びこれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの成分を更に含む、上記項１１に記載のアジュバント組成物。
［項１３］
前記親油性物質が、中鎖トリグリセリドを有する、上記項１１に記載のアジュバント組成物。
［項１４］
前記アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーがカルボマーである、上記項１１に記載のアジュバント組成物。
［項１５］
前記コレステロールが、植物性由来のコレステロールである、上記項１２に記載のアジュバント組成物。
［項１６］
前記アルコールがエタノールである、上記項１２に記載のアジュバント組成物。
［項１７］
前記サポニンがＱｕｉｌ−Ａである、上記項１２に記載のアジュバント組成物。
［項１８］
前記アジュバント組成物が、無針、経皮、静脈内、腹腔内、筋肉内、及び皮下からなる群から選択される投与経路用に製剤化される、上記項１２に記載のアジュバント組成物。
［項１９］
上記項９に記載のワクチン組成物を必要とする動物に投与する工程を含む、動物へのワクチン接種方法。
［項２０］
無針投与のためのワクチン組成物を製剤化する工程を更に含む、上記項１９に記載の方法。
【００４０】
本明細書に記載されるすべての最大数値限定は、それよりも小さい数値限定すべてを、それが本明細書に明示的に記載されているかのように包含するものと理解すべきである。本明細書に記載されるすべての最小数値限定は、それよりも大きい数値限定すべてを、それが本明細書に明示的に記載されているかのように包含する。本明細書に記載されるすべての数値範囲は、より広い数値範囲内のすべてのより狭い数値範囲を、このようなより狭い数値範囲が本明細書に明示的に記載されているかのように包含する。
【００４１】
本出願で開示される組成物及び方法は、本明細書に記載する必須要素及び限定、ならびに本明細書に記載する何らかの任意または追加の材料、成分、工程または限定、あるいはそれ以外の本明細書に記載するような組成物及び方法に有用であるものを含有することができ、それらから本質的になり得、またはそれらからなり得る。
【実施例】
【００４２】
実施例１
【００４３】
本実施例は、本開示によって提供される例示的なアジュバントの製造方法を示す。
【００４４】
材料及び方法
【００４５】
使用する材料は以下の通りである。
Ａ．ＬＡＢＲＡＦＡＣ（商標）Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  ＷＬ１３４９（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅカタログ番号３１３９）
Ｂ．ＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）９７４Ｐ  ＮＦ  Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｌｕｂｒｉｚｏｌカタログ番号ＣＢＰ９７４ＰＮＦ）
Ｃ．カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝食塩水（Ｃｅｌｌｇｒｏカタログ番号２１−０３１−ＣＶ）または同等品
Ｄ．植物由来コレステロール（Ａｖａｎｔｉカタログ番号７００１００Ｐ）
Ｅ．１００％のエタノール溶液（Ａｃｒｏｓカタログ番号６１５０９−００１０）または同等品
Ｆ．Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｂｒｅｎｎｔａｇカタログ、精製サポニンＱｕｉｌ−Ａ、凍結乾燥）
Ｇ．５Ｎの水酸化ナトリウム（ＶＷＲカタログ番号ＢＤＨ３２２５−１）または同等品
【００４６】
表１．アジュバント０６原液の調製
0006802790.tif 000002
【００４７】
コレステロール原液
0006802790.tif 000003
【００４８】
次に、コレステロールをエタノールに添加することによりコレステロール原液を調製した。更に溶解するまで混合した。次に、０．２μｍのフィルターを使用して溶液を滅菌濾過した。その後、溶液を２〜７℃で保存した。
【００４９】
Ｑｕｉｌ−Ａ原液
0006802790.tif 000004
【００５０】
次に、Ｑｕｉｌ−ＡサポニンをＲＯ／ＤＩ水に添加し、溶解するまで混合することにより、Ｑｕｉｌ−Ａ原液を調製した。次に、０．２μｍのフィルターを使用して溶液を無菌濾過した。その後、溶液を２〜７℃で保存した。Ｑｕｉｌ−Ａが５倍原液であるとき、この原液は４％であった。
【００５１】
アジュバント０６の調製
【００５２】
アジュバント０６原液を使用して、Ｑｕｉｌ  Ａ原液の１：５希釈液を調製するため、２０ｍＬのＱｕｉｌ  Ａを８０ｍＬのアジュバント０６原液に添加し、かき混ぜて混合した。次に、５６ｍＬのコレステロール原液をバルクのアジュバント０６原液に添加した。更に、１００ｍＬの１：５希釈したＱｕｉｌ  Ａを、既に５６ｍＬのコレステロール原液が含有された残留バルクのアジュバント０６原液に添加した。このアジュバント混合物を更に約１５分間混合した。アジュバントを混合しながら、滅菌された６０ｍＬのＰＥＴＧ瓶に５０ｍＬアリコートずつ無菌的に分取した。次に、各瓶を上部スクリューキャップで密封した。その後、アジュバント０６の瓶を２〜７℃で、２年以下の期間保存した。
【００５３】
使用上の指示
【００５４】
抗原と混合するアジュバント０６の量を計量した。１部のアジュバント０６と４部の抗原を使用する。これは１：９の比率でも行われた。ただし、１：１０または１：２０の比率を使用すると容易に実施できた。
【００５５】
アジュバント０６の容器は、使用前に完全にかき混ぜておく必要がある。少量のアジュバント０６を、滅菌シリンジ及び１８ゲージ針で無菌的に吸い上げた後、シリンジからすべての空気が除去されるまで排気した。続いてアジュバント０６の目的量をシリンジ内に徐々に引き上げた。次に、計量した量のアジュバント０６を抗原に添加し、完全に混合した。
【００５６】
実施例２
【００５７】
本試験の目的は、それぞれ本開示の個別の実施形態である２種類のアジュバント製剤が、ワクチンでの使用を目的とした濃度に希釈されたときマウスで検証可能かどうかを判定することである。
【００５８】
材料及び方法
【００５９】
２通りの死滅Ｋ９９  Ｅ．ｃｏｌｉワクチン（一方はアジュバントあり、もう一方はＰＢＳで調製）も試験に加え、同じアジュバント製剤が単独で試験された場合と比較して、抗原の添加がマウスに異なる影響を及ぼすかどうかを判定した。
【００６０】
最終濃度１倍に希釈した、それぞれ０．５ｍｌの５種類のアジュバント製剤を、平均体重２７ｇ、約６週齢の成熟雌性ＣＦ−１マウスに接種した。マウスには、それぞれ０．５ｍｌの死滅Ｋ９９  Ｅ．ｃｏｌｉワクチンも接種した。アジュバント化した死滅Ｋ９９  Ｅ．ｃｏｌｉワクチンの調製に使用するアジュバントは、カタログ番号７０Ｘ０１０６と同じ製剤であり、その製剤の全成分を最高濃度で含有する。８匹のマウスからなる各処置群に、首後部の皮下注射によって、または腹腔内注射によって接種した。全マウスを接種後７日間収容し、健康状態を観察した。
【００６１】
首後部の皮下注射により接種したマウスはすべて、接種後７日は健康に見えたが、アジュバント化した死滅Ｋ９９  Ｅ．ｃｏｌｉワクチンを与えた８匹のうち３匹には、試験の７日目までに注射部位に病変が生じた。腹腔内注射により接種した各群の８匹のマウスのうちの少なくとも６匹は、接種後２４〜４８時間で死亡した。
【００６２】
動物
【００６３】
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した６４匹の雌性ＣＦ−１マウスは、試験用物品投与時に約６週（４４日）齢であった。受領時のマウスの体重は平均１９グラムであった。マウスの体重を試験用物品の投与前（０日目）に再度計量し、その体重は平均２７グラムであった。
【００６４】
試験用物品
【００６５】
アジュバント
【００６６】
ＶａｘＬｉａｎｔカタログ７０Ｘ０００５―５倍、ロット００００３、使用期限２０１５年１０月７日
【００６７】
ＶａｘＬｉａｎｔカタログ７０Ｘ０１０６―５倍、ロット００００３、使用期限２０１５年１０月７日
【００６８】
ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）；Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ：２１−０３１−ＣＶ、ロット：２１０３１４３９、使用期限２０１６年９月３０日
【００６９】
死滅Ｋ９９  Ｅ．ｃｏｌｉワクチン
【００７０】
アジュバントＣ  ＶａｘＬｉａｎｔカタログ番号７０８１０１、Ｋ９９線毛を発現している死滅Ｅ．ｃｏｌｉを含有するワクチン−ロットＫ９９２８Ｄｅｃ１２Ａ
【００７１】
ＰＢＳ、Ｋ９９線毛を発現している死滅Ｅ．ｃｏｌｉを含有するワクチン−ロットＫ９９２８Ｄｅｃ１２Ｂ
【００７２】
方法
【００７３】
試験予定表
【００７４】
表２．試験予定表
0006802790.tif 000005
【００７５】
試験計画
【００７６】
表３．試験計画
0006802790.tif 000006
１ＳＣ−首後部への皮下注射；ＩＰ＝腹腔内注射
【００７７】
動物の受領、馴化及び無作為化
【００７８】
受領時にマウス５匹を同時に計量し、各マウスを別々のケージに収容した。ケージ当たり４匹のマウスが配置されるまで、このプロセスを繰り返した。
【００７９】
日々の健康状態の観察を７日間の馴化中に実施した。
【００８０】
ケージ１〜１６を処置群Ｔ０１〜Ｔ０８に無作為に割り付けるため、容器から２つのケージ番号を引き、Ｔ０１群に割り付けた。次に引いた２つのケージ番号をＴ０２群に割り付け、全ケージが処置群に割り付けられるまでこれを繰り返した。各処置群に割り付けられたケージ番号は表４を参照のこと。
【００８１】
表４．各処置群に割り付けられたケージ番号
0006802790.tif 000007
【００８２】
試験用物品の調製
【００８３】
すべての試験用物品の調製は、投与日に無菌的に実施した。
【００８４】
アジュバント製剤
【００８５】
該当する５倍アジュバント原液の瓶を室温まで温めた後、最低３０回、上下を逆にして混合した。該当するアジュバントをＤＰＢＳで１：５に希釈（４部のＤＰＢＳ＋１部のアジュバント）して、最低３０回、上下を逆にして混合した。調製した試験用物品を５ｍｌの滅菌移送チューブに２等分に分取し、該当する処置群に応じてラベルで標識した。
【００８６】
死滅Ｋ９９ワクチン
【００８７】
死滅Ｋ９９＋ＰＢＳワクチンは２０１２年１２月２８日に調製し、この試験に使用するまで２〜７℃で保存した。ワクチン瓶を室温まで温めた後、上下を逆にして混合してから、ワクチンバイアル瓶から直に成分を移して、該当する処置群に接種した。
【００８８】
治療投与
【００８９】
試験用物品の投与前にマウスの健康状態を検査した。２つのケージの合計８匹のマウスに、０．５ｍｌの各試験用物品を投与した。皮下（ＳＣ）注射は、２５ｇ、５／８”針または２５ｇ、１”針いずれかを３ｍｌシリンジに使用して首後部に投与した。腹腔内（ＩＰ）注射は、２５ｇ、５／８”針を３ｍｌシリンジに使用して投与した。すべての治療投与及び時間を記録した。
【００９０】
体重
【００９１】
マウスは受領時に５匹の群ごとに卓上型天秤を使用して計量し、その群の平均体重を求めた。
【００９２】
０日目（試験用物品の投与）直前に、受領時と同じ天秤を使用してマウスごとの体重を測定した。各ケージを計量した。そのケージの記録値をそのケージのマウス数（４）で除算した。報告した値は、ケージ平均であった。
【００９３】
健康状態の観察
【００９４】
マウスの健康状態の観察は、７日の試験期間を通じて少なくとも１日１回、実施した。すべての健康状態の観察を記録した。
【００９５】
マウスの健康状態は、最後の試験用物品の投与後、約８２〜８９分後に、０日目の観測結果との比較で観察した。
【００９６】
測定可能な基準
【００９７】
７日の試験期間中の、試験用物品に起因する有害事象の有無を主要な変量または結果とした。アジュバント及び投与経路ごとに、この変量を測定した。次の２つの観察結果を記録した。
【００９８】
注射部位の有害事象：７日の生存段階中に注射部位に観測された病変を記録した。
【００９９】
死亡：死亡は、マウスの死亡を発見した場合、または罹患のため殺処分した場合に記録した。
【０１００】
結果及び結論
【０１０１】
試験用品投与時点の全マウスの平均体重は、２６．８７ｇであった。
【０１０２】
健康状態の観察
【０１０３】
いずれかのアジュバントまたは死滅Ｋ９９＋ＰＢＳワクチンをＳＣ注射によって接種されたマウスはいずれも、７日の試験期間を通じて有害反応を示さなかった。いずれかのアジュバントをＩＰ注射によって接種された各群の８匹のマウスのうちの少なくとも６匹は、接種後２４〜４８時間以内に死亡した。死滅Ｋ９９＋ＰＢＳワクチンをＩＰ注射によって接種されたマウスのみ、７日の試験期間を通じて健康なままだった。表５は、試験期間中に死亡したマウスを示す。
【０１０４】
表５．試験期間中のマウス死の概要
0006802790.tif 000008
＊マウスは、試験期間を通じて健康だったが、７日目までに注射部位に病変を発現した。
【０１０５】
考察
【０１０６】
この試験結果に基づけば、本試験で試験した５つのアジュバント製剤のいずれで調製したワクチンも、最終製品が首後部へのＳＣ注射によって投与された場合、９ＣＦＲ  １１３．３３によるマウス安全性試験に適合でき得ることは明らかである。
【０１０７】
抗原と混合されたアジュバントをこの経路で投与した場合に、注射部位病変の発現が起こり得たが、それ以外にいかなる有害反応も観察されなかったため、この病変が原因で安全性試験に不適合となる可能性は低い。
【０１０８】
ただし、多重抗原の添加によって生じる注射部位の有害反応については、この試験で検討しなかった。
【０１０９】
マウスは必ず所定体重の２２ｇを上回るが、７週齢は超えないように留意した。
【０１１０】
アジュバントをＩＰ注射によって接種された各群の８匹のマウスのうちの少なくとも６匹は、接種後４８時間より長く生存しなかった。これは、この方法で投与されたとき、アジュバントがマウスにとって有毒であることを示す。種々のアジュバント製剤間に共通する成分は１つのみ存在しており、この成分が観察された毒性の原因であり得ることを示唆している。ＰＢＳで調製された死滅Ｋ９９  Ｅ．ｃｏｌｉワクチンを同様の方法で接種されたマウスに、有害反応がなかったことにより、ＩＰ注射による投与時のアジュバントの毒性を裏付けている。
【０１１１】
結論
【０１１２】
カタログ番号７０Ｘ０００５及び７０Ｘ０１０６で表されるＶａｘＬｉａｎｔ，ＬＬＣアジュバント製剤で調製されたアジュバント化ワクチンは、首後部への皮下注射により投与されたとき、９ＣＦＲ  １１３．３３に従って試験した場合にマウス安全性結果に適合可能であり得る。
【０１１３】
この試験結果に基づけば、最終濃度１倍に希釈されたアジュバント製剤はすべて、首後部に皮下注射により投与されたとき、マウス安全性試験に適合する結果を生じ得ることは明らかである。しかしながら、アジュバント製剤の少なくとも１つが抗原とともに試験されたとき、注射部位に有害反応が起こり得る。この試験で試験された２つのアジュバント製剤のいずれかで調製した最終ワクチン製品で行われる処置は、首後部の皮下注射による投与によって実施することを推奨する。
【０１１４】
実施例３
【０１１５】
本実施例では、特許請求するアジュバント組成物をトリインフルエンザＨ５  ＤＮＡワクチンに用いた場合の有効性を示す。
【０１１６】
材料及び方法
【０１１７】
１６０羽の病原体のない雌雄のニワトリをこの試験に利用した。試験計画は以下の表６の通りであった。
【０１１８】
表６．
0006802790.tif 000009
１本試験では、処置群（ＴＧ）の表記によりニワトリ及び試験用物品を特定する。
２ＩＭ−筋肉内注射。
３各ニワトリの左胸部の筋肉に０．２ｍｌ量を、右胸部の筋肉に０．２ｍｌ量を接種する。
【０１１９】
表７．試験予定表
0006802790.tif 000010
【０１２０】
試験方法
【０１２１】
無作為化及び馴化
【０１２２】
馴化段階中、ニワトリの日々の健康状態の観察を、すべての試験用トリについて記録した。トリは最低３日間で馴化する。臨床観察は、毎日実行して記録した。
【０１２３】
投与経路
【０１２４】
左右の側胸部への筋肉内注射により、すべてのトリに試験用物品を投与した。
【０１２５】
試験用物品の投与−０日及び１４日
【０１２６】
０日目にトリを検査し、通常の健康状態及び外観のものを試験に登録した。１つのケージが１つの処置群に相当する。
【０１２７】
Ｔ０１の１０羽のトリは接種せず、陰性対照として使用した。残りの各処置群（Ｔ０５〜Ｔ１６）の１０羽のトリには、試験０日目及び１４日目に、該当する試験用物品を筋肉内注射により接種した。
【０１２８】
サンプルの採取及び試験
【０１２９】
部位の手順に従って、１４日目（１４日目の試験用物品のブースター投与前）及び２８日目に、各トリから血液を採取した。血液は凝固していることがあり、その場合には遠心分離して血清を採取した。更に血清は、採取後４８時間以内に試験を実施しない場合には試験するまで、及び／または血清の試験後、−１８±５℃で保存した。次に、赤血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）によって、血清の血清変換レベルを分析した。
【０１３０】
健康状態の観察及び有害事象
【０１３１】
試験用物品の投与に続いて、試験終了（２８日目）まで少なくとも１日１回臨床観察を記録した。すべての臨床観察を記録した。
【０１３２】
結果の評価／データ解析
【０１３３】
ＢＢＬ  ＳＯＰ  ＬＰ−０５４を使用したＨＡＩによって、血清サンプルの血清変換を分析した。次に、ＨＡＩ力価を各処置群の血清サンプルごとに求めた。更に、１．００倍（２０％）のアジュバントを接種したトリのＨＡＩ力価を、０．５０倍（１０％）及び０．２５倍（５％）の各アジュバント製剤を接種したトリの力価と比較して、各アジュバントのどの濃度が最も有効であるかを決定した。
【０１３４】
試験用物品の調製
【０１３５】
試験用物品は、投与日に調製して臨床現場へ輸送した。
【０１３６】
試験用物品の調製は、無菌技術を使用しているバイオセーフティキャビネットで実行した。全試験用物品の最終製剤は、トリに投与する３０±５分前に室温でインキュベートした。
【０１３７】
試験用物品
【０１３８】
ＡＩＶ  Ｈ５プラスミドＤＮＡ、ロット番号ＤＮＡ１３０４１４ＴＫＷＩ；純度及び品質試験済み。
【０１３９】
ダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）；Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ：２１−０３１−ＣＶ、ロット：２１０３１４３９。
【０１４０】
表８．アジュバント原液の識別
0006802790.tif 000011
２ＢＢＬ  ＳＯＰ  ＱＡＵ−０５３−０１  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ＩＩ，Ｌｏｔ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｕｍｍａｒｙ（ＬＴＳ）での参照番号
３各アジュバント５．００倍原液は純度及びｐＨ試験済みであった。試験用物品はすべて、調製時に無菌的に処理される；最終的な試験用物品には、更なる試験は施さない。
【０１４１】
表９．処置群ごとの試験用物品の調製
0006802790.tif 000012
１アジュバント原液の５．００倍濃縮である。アジュバントの１．００倍（２０％）濃度を標準濃度と見なす。
２ＴＢＤ＝未定；形式：ＮＢＨＯ２５０２（処置群の名称）（調製日）；０日目及び１４日目は調製日によって区別する。
【０１４２】
ＣａＣｌ沈殿物：最終濃度：
プラスミドＤＮＡ：７５ｕｇ／ｍＬ
塩化カルシウム：２．６８ｍＭ
リン酸ナトリウム：２．６８ｍＭ
クエン酸ナトリウム：０．６６９ｍＭ
【０１４３】
結果及び結論
【０１４４】
表１０．血清変換試験の結果
0006802790.tif 000013
【０１４５】
この試験は、本発明のアジュバントをＤＮＡベースのワクチンに用いたとき有効であることを示した。
【０１４６】
実施例４
【０１４７】
本試験では、本発明のアジュバントが１８か月にわたり安定性であることを示す。
【０１４８】
材料及び方法
【０１４９】
試験用物品
【０１５０】
安定性試験用物品の調製
【０１５１】
目的濃度の５０ｕｇのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／用量になるように、２種類のアジュバント製剤をＢＳＡと混合した。調製した試験用物品はすべて、ゴム栓のある滅菌ガラスバイアルに無菌的に分取し、圧着封止した。
【０１５２】
試験用物品ＰＢＯ／ｃｏｌｄは、記載のようなバイアルに市販のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を分取して調製し、冷蔵温度で保存した。試験用物品ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＲＴ及びＢＳＡ／ＰＢＳ／ｃｏｌｄは、目的濃度の５００ｕｇ／ｍｌ（５０ｕｇ／０．１ｍＬ用量）になるように４部のＢＳＡ及び１部のＰＢＳを添加することにより調製し、周囲温度または冷蔵温度で保存した。試験用物品ＢＳＡ／Ａｄｊ０１／ＲＴ及びＢＳＡ／Ａｄｊ０１／ｃｏｌｄは、目標濃度の５００ｕｇ／ｍｌ（５０ｕｇ／０．１ｍＬ用量）になるように４部のＢＳＡ及び１部のアジュバント０１を添加することにより調製し、周囲温度または冷蔵温度で保存した。試験用物品ＢＳＡ／Ａｄｊ０６／ＲＴ及びＢＳＡ／Ａｄｊ０６／ｃｏｌｄは、目的濃度の５００ｕｇ／ｍｌ（５０ｕｇ／０．１ｍＬ用量）になるように４部のＢＳＡ及び１部のアジュバント０６を添加することにより調製し、周囲温度または冷蔵温度で保存した。
【０１５３】
試験方法
【０１５４】
馴化
【０１５５】
馴化段階中、日々の健康状態の観察を、すべての試験動物について記録した。動物は最低６日間で馴化した。
【０１５６】
試験時の配置手順
【０１５７】
マウスを区別するため耳刻した。ケージ当たり５匹のマウス配置で、試験用ケージにマウスを入れた。マウスはまた、６か月の試験期間中、体重を計量した。
【０１５８】
治療投与
【０１５９】
マウスを検査し、通常の健康状態及び外観のものを試験に登録した。それぞれ処置群を代表するマウス５匹を２つのケージに収容し、マウスを処置群に応じて管理した。プラセボ（ＰＢＯ）を受けるマウスは例外として、５匹のマウスを収容した１つのケージで構成した。
【０１６０】
０日目の時点で、「貯蔵条件」を問わず、各処置群の１つのバイアル瓶を３つのアリコートに無菌的に分取した。１アリコートを直ちにマウスに投与した（０日目）。第２のアリコートは、１４日目にマウスに投与するまで２〜７℃で保存した。これは「安定性」サンプルとは見なさなかった。第３のアリコートを保持サンプルとして２〜７℃に維持した。これも「安定性」サンプルとは見なさなかった。試験用物品はすべて、マウスの両肩間の背面に皮下投与した。
【０１６１】
健康状態の観察及び有害事象
【０１６２】
有害事象を含め、臨床観察を試験完了まで毎日記録した。
【０１６３】
投与経路
【０１６４】
すべてのマウスに試験用物品を両肩間の背面への皮下注射によって投与する。
【０１６５】
−４日〜０日目の採取サンプルのプレスクリーニング（基準マウス限定）
【０１６６】
−４日〜０日目に１回、基準マウス（試験に使用しないマウス）から血液を採取してプールし、プレスクリーニング用の血清を得た。この時点のマウスの平均体重に基づいて全血量の１０％以下を採取した。血液は凝固していることがあり、その場合には遠心分離して血清を採取した。血清をプールし、２〜７℃または−１８±５℃で保存した後、ＥＬＩＳＡ法で試験して、研究に使用されるマウスがＢＳＡに対して血清陰性であることを確認した。
【０１６７】
表１１．処置群の説明
0006802790.tif 000014
【０１６８】
表１２．安定性試験用物品の概要
0006802790.tif 000015
１０日目及び１４日目の接種に使用した各アリコートの残量は使用日に廃棄する。残存する保持アリコートはそのまま保管する。
【０１６９】
表１３．アジュバント原液の識別
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３各アジュバント５．０倍原液は純度及びｐＨ試験済みであった。試験用物品はすべて、調製時に無菌的に処理される；最終的な試験用物品には、更なる試験は施さない。
【０１７０】
表１４．安定性試験用物品の内容
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１５００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ原液、５０ｕｇ  ＢＳＡ／用量
２各処置群の記述語
【０１７１】
表１５．新鮮な試験用物品の内容
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１５００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ原液、５０ｕｇ  ＢＳＡ／用量
２処置群の記述語
３新鮮な試験用物品の調製に使用する成分の貯蔵温度
５５倍アジュバント原液を安定性サンプルと同じ保存場所に、同じ１８〜２７℃の温度で保存した。
【０１７２】
表１６：臨床試験計画
0006802790.tif 000019
１本試験では、処置群（ＴＧ）の表記によりマウス及び試験用物品を特定する。
２マウスの両肩間の背面に皮下注射によって接種する。
３追加マウスには試験用物品を接種せず、基準血液サンプルの採取に使用した。
４１８か月試験は１４日目に終了した。
【０１７３】
表１７：試験計画
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＊１８か月試験はブースター投与をせずに１４日目に終了した。
【０１７４】
治療投与―０日目
【０１７５】
マウスを検査し、通常の健康状態及び外観のものを試験に登録した。各ケージが処置群に相当した。
【０１７６】
各処置群の１つのバイアル製剤を３つのアリコートに無菌的に分取した。１つのアリコートを直ちにマウスに投与した（０日目）。１つのアリコートは、１４日目にマウスに投与するまで２〜７℃で保存した。最後のアリコートは保持サンプルとして２〜７℃に維持した。試験計画に従って、全処置群製剤を（ＴＧごとに）、マウスの両肩間の背面に皮下投与した。
【０１７７】
サンプル採取−１日〜２８日目（基準マウスのみ）
【０１７８】
１日目〜２８日目に必要に応じて基準マウス（試験に使用しないマウス）から血液を採取してプールした。３〜４週間以内にマウスの平均体重に基づいて全血量の１０％以下を採取した。血液は凝固していることがあり、その場合には遠心分離して血清を採取した。その後、ＥＬＩＳＡ法で陰性対照として使用するまで、血清をプールし、２〜７℃または−１８±５℃で保存した。
【０１７９】
サンプルの採取及び試験
【０１８０】
１３日目及び２８日目に接種された動物からそれぞれ血液を採取した。３〜４週間以内にマウスの平均体重に基づいて全血量の１０％以下を採取した。血液は凝固していることがあり、その場合には遠心分離して血清を採取した。採取後、試験するまで血清を２〜７℃または−１８±５℃で保存した。次に、ＥＬＩＳＡ法によって血清の血清変換レベルを分析した。
【０１８１】
治療投与―１４日目
【０１８２】
試験計画に従って、全処置群製剤を（ＴＧごとに）、マウスの両肩間の背面に皮下注射により投与した。
【０１８３】
健康状態の観察及び有害事象
【０１８４】
臨床観察は、試験予定表に示すように試験用物品の投与後、毎日記録した。
【０１８５】
マウスは、以下を含み得る注射部位の反応など、何らかの有害反応を試験中に示す可能性がある：膿瘍（身体組織内に蓄積した膿の集合体）、１．５未満〜１．５ｃｍの腫脹、脱毛症（抜け毛）、紅斑（過剰な部位発赤）、肉芽腫（触診可能な硬結節）、出血または潰瘍（皮膚に痛み）。観察された有害反応はすべて記録に残した。
【０１８６】
分析の評価／データ解析
【０１８７】
ＢＢＬ  ＳＯＰ  ＡＮ−０８４を使用したＥＬＩＳＡ法によって、血清サンプルの血清変換を分析した。処置群ごとの各血清サンプルでの抗体産生レベルを測定した。アジュバント＋ＢＳＡを投与したマウスの抗体産生を、ＢＳＡ陽性対照を投与したマウスの抗体産生と比較した。種々のアジュバント製剤を投与したマウスの抗体産生を比較した。安定性分析のために保存された試験用物品を投与したマウスの抗体産生を、本試験の０日目に新しく調製された試験用物品を投与したマウスと比較した。
【０１８８】
本試験での接種マウスの抗体産生レベルを、最初に実施された安定性試験で産生された抗体レベルと比較した。
【０１８９】
必要に応じて記述統計学を使用して、陰性対照と比較した全処置群の有効性を判定した。両側スチューデントｔ検定または他の適切な方法を実施することにより、幾何平均及び統計的有意差を決定する。
【０１９０】
結果及び結論
【０１９１】
表１８−６か月にわたるｉｎ  ｖｉｖｏ安定性試験
0006802790.tif 000021
＊採血は未完了（２０１４年７月２４日予定）
＊＊アジュバント調製時のマイクロフルイダイザーの圧力は１３，０００または１８，０００ｐｓｉを使用
「Ｙｅｓ」＝安定性試験のサンプル；「Ｎｏ」＝６か月時点の０日目に新しいサンプルを調製した
【０１９２】
表１９．６か月間の安定性試験時のＢＳＡ＋ＥＮＡＢＬ  ０６のＥＬＩＳＡ結果から得たマウスの安定性ＧＭＴ値
0006802790.tif 000022
表２０．１８か月間の安定性試験時のＢＳＡ＋アジュバント０６のＥＬＩＳＡ結果から得たマウスの安定性ＧＭＴ値
0006802790.tif 000023
＊対応するＢＳＡ単独のＧＭＴ値により正規化
【０１９３】
表２１：採取した血液から得たデータ
0006802790.tif 000024
１血清変換されたマウス数／処置マウス数
２血清変換以外に使用された１０匹の値
３幾何平均ＢＳＡ／Ａｄｊ０６÷幾何平均ＢＳＡ／ＰＢＳ
４実施せず
【０１９４】
表２２：６か月時点のデータ
0006802790.tif 000025
１血清変換されたマウス数／処置マウス数
２血清変換以外に使用された１０匹の値
３幾何平均ＢＳＡ／Ａｄｊ０６÷幾何平均ＢＳＡ／ＰＢＳ
【０１９５】
表２３．１８か月時点のデータ
0006802790.tif 000026
１血清変換されたマウス数／処置マウス数
２血清変換以外に使用された１０匹の値
３幾何平均ＢＳＡ／Ａｄｊ０６÷幾何平均ＢＳＡ／ＰＢＳ
【０１９６】
表２４．６か月目の幾何平均
0006802790.tif 000027
【０１９７】
表２５．幾何平均＝１８か月
0006802790.tif 000028
【０１９８】
データは、本発明のアジュバントが１８か月間にわたって安定性であったことを示している。データからわかるように、アジュバント０６のサンプルはすべて、１８か月後に安定性であった。このデータは、本発明のアジュバントが少なくとも１８か月間、周囲温度で貯蔵安定性であったことを示している。これにより、抗原とアセンブリされているか否かを問わず、アジュバントの輸送、貯蔵及び使用が容易になる。
【０１９９】
実施例５
【０２００】
材料及び方法
【０２０１】
７１日齢の産卵雛鶏に、０．２ｍｌのＤＮＡワクチンまたは０．２ｍｌのＰＢＳのいずれかを皮下投与により接種した。ＤＮＡワクチンは、ＧｙｒＦａｌｃｏｎ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／４１０８８−６／２０１４由来のＨＡ遺伝子を含んでいるＤＮＡワクチン用の真核プラスミド骨格であった。合計６０羽の雛鳥にＤＮＡワクチンを投与し、１０羽の雛鳥を対照として使用した。最初の予防接種後２週間で、２０羽の雛鳥に０．２ｍｌのＤＮＡワクチンをブースター投与し、２０羽の雛鳥に０．２ｍｌのＧｙｒＦａｌｃｏｎ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／４１０８８−６／２０１４のリバースジェネティクス法による死滅ワクチンをアジュバントとともに接種した。トリが４週齢に達したとき（最後の接種から２〜４週間後）に、１０６．５／ＥＩＤ５０用量のＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／１２５８２／２０１５（Ｈ５Ｎ２）を用量０．５ｍｌで、後鼻孔の接種経路により投与して負荷を誘発した。負荷ウイルスは最近のアウトブレイクに由来したものであり、負荷用量は過酷な負荷として１０００羽のニワトリ致死用量５０を与えるように設計した。
【０２０２】
ウイルス排菌の決定。ニワトリの口咽頭スワブによるサンプルを、１倍抗生物質／抗真菌剤（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）を含有する２ｍｌの無菌ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に懸濁し、ＲＮＡを抽出するまで−７０℃で凍結した。２５０ｕｌのサンプルからの総ウイルスＲＮＡをＴｒｉｚｏｌに添加し、クロロホルム添加後、水相をＭａｇＭＡＸ−９６  ＡＩ／ＮＤ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に使用した。ＲＮＡ単離のための手順は、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ磁性粒子精製システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して実施した。
【０２０３】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＲＲＴ−ＰＣＲ）は、Ａ型トリインフルエンザマトリックス遺伝子に特異的なプライマー及びプローブを使用して実施した（２）。ＡｇＰａｔｈ−ＩＤ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を８μｌのＲＮＡサンプルに使用し、ヌクレアーゼフリー水を添加して、最終容積を２５μｌにした。逆転写反応は、５０℃３０分と、それに続く９５℃１５分を１サイクルとして構成した。ＰＣＲ反応では、９４℃１秒の変性と、それに続く６０℃２０秒のアニーリングを４０サイクル実施した。いずれの反応も、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）リアルタイムＰＣＲ装置で実施した。使用した負荷ウイルスの既知量のＲＮＡから生成した検量線を使用して、サイクル閾値に基づいて、スワブサンプルからのウイルスのＥＩＤ５０ｓを推定した（１）。サイクル実行回数に相当するサイクル閾値を設定して、検量線に基づいて各ＲＲＴ−ＰＣＲ操作の検出限界を算出した。統計目的として、本試験のＲＲＴ−ＰＣＲ−陰性であったサンプルに、検量線の最低検出ポイント未満の１サイクルのサイクル閾値を割り当てた。
【０２０４】
次に、赤血球凝集阻害（ＨＩ）試験を実施した。ＡＩＶに対する血液凝集阻止抗体価を、ＨＩ試験を使用して測定した（３）。相同性ベータプロピオラクトン失活抗原（Ａｇ）をＰＢＳで希釈し、４濃度のＨＡユニットにした。同一源のＡｇは、ウイルスの抗原性に影響を及ぼさない低病原性切断部位を有するようにＲＰ遺伝子が改変されている以外は、ＲＰワクチンに使用されるものと同じ赤血球凝集素遺伝子であるＡ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／４１０８８−６／２０１４  Ｈ５Ｎ８ウイルスを指す。５０マイクロリットルのＡｇを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、試験用血清を順次２倍に希釈した。プレートを１５分間室温でインキュベートした後、０．５％のニワトリ赤血球細胞を各ウェルに添加した。プレートを１５秒間振盪して、４５分間室温でインキュベートした。赤血球凝集活性を完全に阻害した最後のウェルの逆数として結果を解析した。統計目的として、４つの力価の逆数を最低陽性結果と見なした。
【０２０５】
結果及び結論
【０２０６】
最後のワクチン接種後２週または４週で、接種したトリ及び対照トリにＡ／Ｔｕｒｋｅｙ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／１２５８２／２０１５（Ｈ５Ｎ２）を投与した。すべての対照トリは、投与後３日までに重度の臨床疾患または死亡を呈し、平均致死時間（ＭＤＴ）は２．１日であった。重度の臨床疾患を有するトリはＩＡＣＵＣプロトコルの要件に従って安楽死させ、翌日死亡として記録した（図１）。
【０２０７】
負荷日、生後４週、及びワクチン接種後２週または４週に採取した血液で血清検査を実施した。対照トリまたはＤＮＡワクチンを単独接種したトリのいずれも、検出可能なＨＩ抗体価を有しなかった。ワクチン接種したトリのうち、２回のＤＮＡワクチン接種群では２０羽のうちの７羽が、４〜３２の範囲の検出可能な抗体価を有し、ＤＮＡ／ＲＧ群では２０羽のトリのうちの１９羽が抗体価を有した。血清変換したトリの幾何平均力価は、それぞれ８．８（２３．１４）及び１６．６（２４．０５）であった。（表２６）
【０２０８】
攻撃後のウイルス排菌。すべての対照トリは攻撃後３日で死亡するか、または安楽死させたが、生死を問わず、２日目にすべてのトリの口咽頭内をスワブした。ワクチン接種したトリはすべて、２日目にスワブし、それ以外のトリはすべて攻撃後４日目にサンプル採取した。対照トリは、２日目に１０７．１／ＥＩＤ５０の排菌をし、トリの排菌はすべてウイルス力価と類似性があった。２日目にＤＮＡを単独接種したトリは１０６．６／ＥＩＤ５０を排菌し、２回のＤＮＡワクチンを接種した群は、１０５．４／ＥＩＤ５０対数のウイルスを排菌し、ＤＮＡ／ＲＧのワクチン接種群は、それぞれ１０２．９／ＥＩＤ５０対数のウイルスを排菌した（図１）。対照及び２回のＤＮＡワクチン接種群と、２日目にＤＮＡ／ＲＧワクチンを接種したトリ間には、ウイルス排菌の量に、マンホイットニー順位和検定を使用した統計学的差があった（Ｐ＝＜０．００１）。
【０２０９】
２用量のＤＮＡワクチンを与えた処置群が、ワクチン接種されたトリの５５％に防御をもたらしたのに対して、１日齢でＤＮＡワクチンを、２週目でブースターを用いるプライムブーストワクチン手法は攻撃に対して９５％有効であった。ＨＩ試験の血清変換で少なくとも力価４であったトリは攻撃後も生存し、排菌の減少と極めて相関性が高かった。これらの結果は、単独接種試験にも併用接種試験にもＤＮＡワクチンを使用できることを示している。
【０２１０】
表２６．ワクチン接種された個々のトリによる赤血球凝集阻害力価。
0006802790.tif 000029
【０２１１】
ワクチン接種された個々のトリによる赤血球凝集阻害力価。最小の陽性ＨＩ力価が４であったため、計算上、測定力価２を０に変換した。幾何平均力価では、陰性力価であるトリは計算に包含しなかった。
【０２１２】
実施例６
【０２１３】
シチメンチョウにおける、本開示のアジュバントを混合したＤＮＡワクチンの血清学的評価のための有効性試験
【０２１４】
本試験の目的は、本開示のアジュバントを使用した高病原性トリインフルエンザ（ＨＰＡＩ）ＤＮＡワクチンにおいて有効性の合理的予測を立証することであった。これを達成するため、シチメンチョウの免疫応答を誘発するワクチンの能力を評価した。この目的のため、高病原性トリインフルエンザウイルス、Ａ／ｇｒｙｆａｌｃｏｎ／ＷＡ／４１０８８−６／２０１４  Ｈ５Ｎ８の赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質の改変遺伝子を含んでいるプラスミドＤＮＡをＶａｘＬｉａｎｔアジュバントと混合して、皮下及び鼻腔内経路によって投与した。
【０２１５】
改変プラスミド、ＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈ−ＫＰ３０７９８４．１−ＨＡ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄは、高病原性（ＨＰ）トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）株Ａ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／４１０８８−６／２０１４（Ｈ５Ｎ８）由来のＨＡ遺伝子をコードする。Ｈ５配列を改変して、ＨＰ多塩基の切断部位（ＰＬＲＥＲＲＲＫＲＧＬＦ）を一塩基の切断部位に変更した。改変Ｈ５遺伝子を合成的に生成し、ＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈの最適化された真核発現ベクターにクローニングして、その構築物をＥ．ｃｏｌｉ株ＮＴＣ４８６２に形質転換した。
【０２１６】
赤血球凝集阻害アッセイを使用して、非改変ＨＡ遺伝子を含んでいる失活ウイルスへの血清変換を検査し、有効性を測定した。
【０２１７】
材料及び方法
【０２１８】
ｐＨＡ  ＤＮＡ（ＩＶＰ  １及び２）を加えたＥＮＡＢＬ  １、及び０．５倍ＥＮＡＢＬ（商標）５またはｐＨＡ  ＤＮＡ（ＭＰＣ）を加えたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を各トリに皮下（ＳＣ）投与した。各ＩＶＰ処置群に最低２２羽のトリを、ＭＰＣ群に１０羽のトリを含め、０日目に接種した。試験全体を通じてトリの総合的な全身健康状態を観察した。試験０日目にすべてのトリに接種した。各接種の約２週後に血液を採取して、血清変換を検査した。
【０２１９】
表２７．試験の内容
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【０２２０】
１ＳＣ−首の付け根の皮下；ＩＮ−鼻腔内
【０２２１】
表２８．試験用物品
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【０２２２】
表２９．試験予定表
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【０２２３】
投与経路。首後部への皮下注射または鼻孔内への鼻腔滴下のいずれかにより、試験用物品をトリに投与した。試験用物品は０日目及び１４日目に投与した。Ｔ０１のトリにＳＣ経路によってＰＢＳを投与し、ＭＰＣ−１と表示した。残りのトリに試験計画の記載に従って接種した。１４日目にＴ０１群、Ｔ０２群のトリに製品を投与した。これはブースターであった。Ｔ０３群のトリにはブースターを投与しなかった。
【０２２４】
サンプル採取及び試験部位に関する手順に従って、試験用物品のブースター投与の前日及び試験最終日に、Ｔ０１群、Ｔ０２群の各トリから血液を採取した。Ｔ０３群のトリは２１日目及び試験最終日に採血した。血液は凝固していることがあり、その場合には遠心分離して血清を採取した。血清を２〜７℃または−１８±５℃で保存した。ＢＢＬ  ＳＯＰ  ＬＰ−０５４に従って、ウイルスＡ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／ＷＡ／４１０８８−６／２０１４  Ｈ５Ｎ８  ＢＥＩの４〜８単位の赤血球凝集素の阻害による血清の血清変換レベルを分析した。
【０２２５】
結果の評価／データ解析。ＢＢＬ  ＳＯＰ  ＬＰ−０５４に従って、非改変ＨＡ遺伝子を含んだ失活ウイルスＡ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／ＷＡ／４１０８８−６／２０１４  Ｈ５Ｎ８  ＢＥＩの赤血球凝集素の阻害による血清の血清変換レベルを分析した。各処置群の血清サンプルそれぞれの赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価を測定した。簡潔には、段階希釈した血清を４〜８単位の赤血球凝集素とともにインキュベートし、完了後、トリの赤血球に添加した。ＨＡＩ力価は、全複製にウイルス特異的な赤血球凝集の１００％阻害が存在する最後の希釈剤の逆対数として報告した。種々のアジュバント製剤を投与されたトリのＨＡＩ力価を比較した。
【０２２６】
表３０．結果．シチメンチョウでの有効性
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【０２２７】
結果は、シチメンチョウに１日齢でＨＰＡＩ  ＤＮＡ／アジュバントを組み合わせたワクチンを接種できることを示している。更に、本試験で試験した製剤をＳＣ投与したとき、血清変換されたトリは、２つの用量計画による同一源の攻撃から保護された。
【０２２８】
実施例７
【０２２９】
本シチメンチョウ試験で研究用動物医薬品（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ、ＩＶＰ）として試験される本開示のアジュバント成分は、高病原性（ＨＰ）トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）株、Ａ／ｇｙｒｆａｌｃｏｎ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ／４１０８８−６／２０１４（Ｈ５Ｎ８）由来の改変型赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡ（ｐＨＡ）とともに製剤化されたＥＮＡＢＬ（登録商標）１及び６であった。Ｈ５配列を改変して、ＨＰの多塩基切断部位（ＰＬＲＥＲＲＲＫＲＧＬＦ）（配列番号１）を一塩基切断部位に変更した。改変Ｈ５遺伝子を合成的に生成し、ＮＴＣ８６８５−ｅＲＮＡ４１Ｈの最適化された真核発現ベクターにクローニングした。同じｐＨＡをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と混合し、本試験の照合用プラセボ対照（ＭＰＣ）として利用した。
【０２３０】
本試験の目的は、ＥＮＡＢＬ（登録商標）１及びＥＮＡＢＬ（登録商標）６を接種したシチメンチョウにおいてＤＮＡワクチンの休薬期間が２１日間であることを立証することであった。
【０２３１】
材料及び方法
【０２３２】
試験計画
【０２３３】
ｐＨＡ  ＤＮＡ（ＩＶＰ  １及び２）を加えたＥＮＡＢＬ  １、及びＥＮＡＢＬ（商標）６またはｐＨＡ  ＤＮＡ（ＭＰＣ）を加えたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を各トリに皮下（ＳＣ）投与した。各処置群を最低１０羽のトリで構成し、０日目に接種した。２１日間、トリの総合的な全身健康状態を観察した。部位に限定した観察は、１日目〜７日目、１４日目及び２１日目に実施した。試験０日目〜２１日目までに罹患のため安楽死させたトリ、または死亡が発見されたトリをすべて部検して、死亡がＩＶＰまたはＭＰＣの結果であったかどうかを判定した。２１日目に残りすべてのトリの肉眼病変検査と組織検査を行った。試験計画を表３１にまとめる。
【０２３４】
表３１．試験の内容
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【０２３５】
＊各製品は割り当てたロット番号によって区別する。０．２ｍＬ用量の最終製品を首に皮下投与する。
【０２３６】
試験用物品は以下に記載する。試験に使用する前に、試験用物品を物品Ａ〜Ｃと命名し、試験中に適切な盲検を維持するように区別した。
【０２３７】
表３２．ＥＮＡＢＬ（登録商標）１（研究用動物医薬品＃１）を含んでいるｐＨＡ  ＤＮＡ
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【０２３８】
表３３．ＥＮＡＢＬ（登録商標）６（研究用動物医薬品＃２）を含んでいるｐＨＡ  ＤＮＡ
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【０２３９】
表３４．ｐＨＡ  ＤＮＡ＋ＰＢＳ（照合用プラセボ対照）
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【０２４０】
表３５．試験予定表
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【０２４１】
治療投与―０日目
【０２４２】
健康状態の評価、臨床観察、及び提案された注射部位の観察を処置日に記録した。各トリの首後部の中央部分の皮下領域に、指定された製品を１回注射した。用量は１部位当たり０．２ｍＬであった。
【０２４３】
臨床観察、注射部位の観察及び有害事象
【０２４４】
試験予定表に示すように、試験用物品の投与以降、すべてのトリの全身の健康状態を毎日観察した。Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ（ＶＥＤＤＲＡ）により策定された標準的な下層語に従って、臨床的徴候を分類した。
【０２４５】
注射部位を１〜７日目及び１４日目に触診、観察して記録した。２１日目に、安楽死及び剖検直前に、最終的な注射部位の触診及び検査を全注射部位に行った。
【０２４６】
サンプル採取
【０２４７】
組織学的データ収集のために、組織サンプルを注射部位及び周辺組織から採取した。病理学者が、注射部位異常に関連した肉眼病変がないか注射部位を検査した。
【０２４８】
注射部位の検査及び採点
【０２４９】
注射部位を触診して所見を記録した。皮膚を切開して下部組織を検査した。部検時の注射部位のスコアは、排液路、膿瘍形成、浮腫、出血または壊死の存在に基づいて病理学者が定めた。任意の注射部位に表れた最も重篤な徴候によって、病理学者が注射部位ごとに定めた単一注射部位のスコアを決定した。単一の注射部位に複数の徴候が観察される場合、重篤でない方（スコア判定が低い、またはスコア対象外）の徴候は、記録はしたが、この重篤性の少ない所見によって、最も重篤な徴候に基づいて定められたスコアを下げることはしなかった。
【０２５０】
注射部位の組織学的採点
【０２５１】
部位反応の組織学的エビデンスを得るため、採取した各組織を検査した。肉眼での剖検所見と同様、最重篤（ＭＯＳＴ  ＳＥＶＥＲＥ）度を注射部位ごとに定め、部位に対する組織学スコアとして使用した。
【０２５２】
結果及び結論
【０２５３】
処置群ごとに１４羽のトリが、初期配置から試験期間後まで生存し、馴化時の健康状態に基づいた本試験への算入基準を満たした。部位観察及び剖検での肉眼／組織病理学の結果を以下の表に示す。
【０２５４】
表３６．観察及び肉眼／組織病理学の結果
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１２１日の観察期間終了までに、目視できる腫脹を有した動物数
２剖検での顕著な炎症反応（軽度から中度）を有した動物数。
３剖検で顕微鏡的にのみ観察可能な生理学的反応を有した動物数。
【０２５５】
部位観察。プラセボを接種されたトリはいずれも、部位観察または剖検レベルのいずれにおいても何らかの異常反応があると採点されず、どのトリも、ワクチンに対するいかなる種類の臨床的徴候または病変と関連する損傷に対して陰性であると採点された。処置群Ｔ０１及びＴ０２では、１４羽のトリのうちの３羽のみ（合計６羽のトリ）が、２１日間の最後に、接種部位に触診可能な若干の腫脹を示した。残りのトリ（２２羽のトリ）は正常であった。
【０２５６】
剖検。剖検ではＴ０１群に対する全身の肉眼病変の観察から、１４羽のトリのうちの６羽は２１日目にいかなる種類の病変、または注射部位に付随する病変を有せず、残りの８羽のうち２羽のみがより重篤な炎症反応を有し、残りは中度から軽度であったことがわかった。全身の組織学的結果は、１４羽のトリのうちの７羽が２１日目に炎症または免疫応答を表す目視可能な浸潤を有しなかったことを示した。残りの７羽のトリの観察結果は中度であった。いずれのトリにも、注射部位に目視可能な挫傷または損傷に随伴した出血はなかった。
【０２５７】
Ｔ０３処置群に対する全身の肉眼病変観察では、１４羽のトリのうちの７羽は２１日目にいかなる種類の病変、または注射部位に付随する病変を有せず、その群の残りの７羽は概して軽度の反応であった。全身の組織学的結果から、１４羽のトリのうちの３羽は２１日目に炎症または免疫応答を表す目視可能な浸潤を有しなかったが、残りの１１羽は免疫応答または炎症を表す何らかの軽度から中度の浸潤を示したことがわかった。
【０２５８】
本実施例で試験されたアジュバントは、２１日の観察期間中、目視可能な部位反応はごくわずかしか示さず、動物は健康を維持し、いかなる不快感もなかった。一部の病変は熟練した病理学者によって剖検でのみ発見できた。これは、組織切片の顕微鏡検査によっても明らかであった。２１日目（試験最終日）に剖検で肉眼所見により観察された反応はいずれも、養鶏処理における食肉解体ラインに混乱を来すほど重篤であるとは見なされなかった。剖検時にスコアを記録できた病変はいずれも軽度から中度であり、自然に消散すると思われた。これは期間内（数日）で組織が正常な外観に戻ることを示している。これらの結果は、本アジュバントが、ワクチン製剤でのアジュバントの使用に関してＵＳＤＡが許容した最短時間である２１日の休薬期間の安全性承認が得られると見なし得ることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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