(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化細胞のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２またはＮａｎｏｇの発現を増加させる方法であって、
（ａ）前記分化細胞を容器の中で培養すること、
（ｂ）前記分化細胞を機械的に撹拌して細胞凝集体を形成すること、および、
（ｃ）前記細胞凝集体を、有効量の、下記式ＩＩ〜ＩＸに示される構造のうちいずれか一つを有する化合物に曝すことによって、前記細胞凝集体の細胞のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２またはＮａｎｏｇの発現を増加させること、
を含む方法。
【化１】
0006736253.tif 000014
【請求項２】
工程（ａ）の分化細胞が対象または細胞系から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が哺乳動物対象である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞系が哺乳動物細胞系である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記分化細胞が線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分化細胞が前駆細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）の分化細胞が１×１０５〜１×１０６細胞／ｃｍ２の密度である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞凝集体が前記容器の内面に接着しない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記容器の内面が非接着性基質でコーティングされている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
機械的撹拌が、前記分化細胞を摩擦（ｔｉｔｕｒａｔｅ）すること、撹拌すること、または振とうすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
増幅を基としたアッセイ、ハイブリダイゼーションを基としたアッセイ、イムノアッセイ、またはフローサイトメトリーアッセイによってＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＮａｎｏｇの分化細胞における発現を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞凝集体の細胞において、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＮａｎｏｇのより高い発現レベルが、前記分化細胞に比して少なくとも２０〜２００倍高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）の後に、前記細胞凝集体の細胞におけるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＮａｎｏｇの発現レベルを検出することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）の後に、前記細胞凝集体を単離することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１４のいずれか一項に記載の方法により得られる、細胞または細胞系。
【請求項１６】
細胞凝集体を、分化細胞から作製する方法であって、
（ａ）前記分化細胞を１×１０５〜１×１０６細胞／ｍｌの密度で容器中で培養すること、
（ｂ）前記分化細胞を機械的に撹拌して前記細胞凝集体を形成させること、および
（ｃ）有効量の下記式ＩＩ〜ＩＸに示される構造のうちいずれか一つを有する化合物の存在下で前記細胞凝集体を培養することによって、前記細胞凝集体の細胞のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２またはＮａｎｏｇの発現を増加させること、
を含む方法。
【化２】
0006736253.tif 000015
【請求項１７】
工程（ｃ）の後に、前記細胞凝集体の細胞を増殖させることを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｃ）の後に、前記細胞凝集体の細胞を単離することを更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
下記に示される構造のうちいずれか一つを有する化合物。
【化３】
0006736253.tif 000016
【請求項２０】
請求項１９に記載の化合物および医薬的に許容される塩を含む、分化細胞のＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＮａｎｏｇの発現を増加させるための医薬組成物。
【請求項２１】
分化細胞と、下記に示される構造のうちいずれか一つを有する化合物と、を含む混合物：
【化４】
0006736253.tif 000017
。
【請求項２２】
前記分化細胞が細胞凝集体にある、請求項２１に記載の混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胚様体様細胞体を形成するための体細胞の機械的凝集の利用、および、体細胞をリプログラミングして多能性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｉｄ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌ  ｂｏｄｙ）を産生するためのプログラミンまたはその誘導体を用いたこれらの凝集体の処理に関する。そのようなリプログラミングされた細胞は再生医療の分野で有用である。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、移植用の組織および臓器の深刻な不足を軽減するための解決策として大々的に公表された。今日まで、多くの種類の天然および人工的に産生された幹細胞が同定および創出されている。しかし、それらのいずれにも欠点がある。皮膚線維芽細胞等の体細胞のリプログラミングにより作製された誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Takahashi and Yamanaka, Cell, 126(4):663-76 (2006)）が現在、再生医療における使用の最有力候補と考えられている。しかし、ｉＰＳＣ作製はまだ、異種細胞集団を生じ且つヒト多能性細胞培養における特別な専門知識を必要とする、非常に遅く（約４週間）且つ非効率的（＜０．０１％）なプロセスである（Takahashi et al., Cell, 131, 861-72 (2007); Yu et al., Science, 318, 1917-20 (2007)）。代替的なアプローチでは、多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇを直接活性化できる小化学分子を用いる。
【０００３】
プログラミンはChen et al. (J. Am. Chem. Soc., 2004 126: 410-411)によって最初に合成された。これは、Ｃ２Ｃ１２筋原細胞を骨細胞および脂肪細胞に分化転換するために用いられた。その後、プロテオーム比較技術を用いて、Ｃ２Ｃ１２中のポリコーム遺伝子がおそらく分化転換プロセスに関与していることが示された（Shen et al., Proteomics, 2007, 7(23): 4303-4316）。更に、リバーシンで線維芽細胞を処理することにより骨格筋細胞への分化転換を誘導できることが報告された（Luigi et al., 2007, Cell Death and Differentiation, 13(12): 2042-2051; Chiara et al., 2009, Electrophoresis, 30(12): 2193-2206）。Mandal et al. (Biochip Journal, 2013, 7(3): 278-287)は、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞の骨芽細胞へのリバーシン媒介分化転換のトランスクリプトームプロファイルを調べた。研究は、リバーシンがＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ等の多能性遺伝子の発現を活性化することを示さなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ｉＰＳＣを作製するための小分子化合物の使用に基づく簡便且つ効率的な方法に対するニーズが存在する。本発明はこのニーズおよび他のニーズを満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある態様では、本発明は、分化細胞から多能性幹細胞を作製する方法を提供する。方法は、（ａ）前記分化細胞を容器の中で培養すること、（ｂ）前記分化細胞を機械的に撹拌して細胞凝集体を形成すること、（ｃ）前記細胞凝集体を、有効量の、下記式ＩＩ〜ＩＸに示される構造のうちいずれか一つを有する化合物に曝すこと、（ｄ）前記凝集体の細胞中におけるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＮａｎｏｇの発現レベルを検出すること、（ｅ）前記凝集体の細胞中におけるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＮａｎｏｇの発現レベルが分化細胞中における対応する発現レベルより高い場合に、細胞が多能性幹細胞であると決定すること、および（ｆ）前記多能性幹細胞を単離すること、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）および（ｃ）は同時に実施される。別の実施形態では、工程（ｂ）および（ｃ）は連続して実施される。例えば、工程（ｃ）は、工程（ｂ）の約２４〜約９６時間、またはそれ以上後、例えば約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、約７２時間、約８４時間、約９６時間、またはそれ以上後に実施され得る。
【０００６】
【化１】
0006736253.tif 000002
【０００７】
工程（ａ）の分化細胞は、対象または細胞系から得ることができる。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物対象である。細胞系は哺乳動物細胞系であり得る。いくつかの実施形態では、分化細胞は線維芽細胞または前駆細胞である。工程（ａ）の分化細胞は、約１×１０５〜１×１０６細胞／ｃｍ２の密度であり得る。
【０００８】
細胞凝集体は容器の内面に接着しない。いくつかの実施形態では、容器の内面は、非接着性物質（例えば、当該箇所への細胞の接着を防止又は妨害する基質）でコーティングされている。
【０００９】
いくつかの実施形態では、機械的撹拌（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ  ａｇｉｔａｔｉｎｇ）は、例えば、細胞が維持されている培養容器をシェイクする（ｓｈａｋｉｎｇ）か又は回転することにより、分化細胞を摩擦すること（ｔｉｔｕｒａｔｉｎｇ）、撹拌すること（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）、または振とうするすこと（ｒｏｃｋｉｎｇ）を含む。例えば、孔径の大きいピペットチップを用いて細胞をピペッティングして細胞または細胞凝集体に機械的力を加えて培養容器へのそれらの付着が防止されるまたは妨げられるようにすることができる。
【００１０】
いくつかの実施形態では、上記方法の工程（ｄ）は、増幅を基としたアッセイ、ハイブリダイゼーションを基としたアッセイ、イムノアッセイ、またはフローサイトメトリーアッセイを含む。工程（ｅ）の後、方法は、多能性幹細胞を増殖（ｅｘｐａｎｄ）（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ）させることを更に含み得る。更に、方法は、工程（ｅ）の後に、多能性幹細胞の分化を誘導することを含み得る。
【００１１】
場合によっては、前記Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＮａｎｏｇのより高い発現レベルが、前記分化細胞に比して少なくとも約２０〜約２００倍高い。
【００１２】
本発明の別の態様では、上記方法の実施形態例のいずれかにより得られる多能性の細胞または細胞系が提供される。
【００１３】
更に別の態様では、本発明は、少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞凝集体を、分化細胞から作製する方法を提供する。当該方法は、（ａ）前記分化細胞を約１×１０５〜約１×１０６細胞／ｍｌの密度で容器中で培養すること、（ｂ）前記分化細胞を機械的に撹拌して前記細胞凝集体を形成させること、および（ｃ）少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーを発現する細胞を生じる条件下で前記細胞凝集体を培養すること、を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前記方法は、有効量の、下記式ＩＩ〜ＩＸに示される構造のうちいずれか一つを有する化合物に曝す工程を更に含む。
【００１５】
【化２】
0006736253.tif 000003
【００１６】
前記方法は、工程（ｃ）の後に、前記少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーを発現する細胞を増殖させることを更に含み得る。所望であれば、前記方法は、工程（ｃ）の後に、前記少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーを発現する細胞を分離することを含んでよい。前記少なくとも１つの多能性幹細胞マーカーは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、またはＮａｎｏｇであり得る。
【００１７】
別の態様では、本発明は、下記式ＩＩ〜ＩＸに示される構造のうちいずれか一つを有する化合物を提供する。
【００１８】
【化３】
0006736253.tif 000004
【００１９】
場合によっては、化合物は、分化細胞を含む混合物中に存在する。例えば、式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、またはＩＸの化合物および分化細胞が一緒に混合されて混合物を形成してもよい。いくつかの実施形態では、混合物の分化細胞は凝集体中に存在する。
【００２０】
別の態様では、本明細書は、前述の化合物および医薬的に許容される塩を含む、分化細胞から多能性幹細胞を作製するための医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明者らは驚くべきことに、線維芽細胞が、機械的に胚様体様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ−ｌｉｋｅ  ｂｏｄｙ）を形成させて非接着性培養ディッシュ上に４日間維持された時に、多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇを発現できることを発見した。更に、これらの凝集体が小分子化合物プログラミンまたはその誘導体で処理された場合、これら３つの多能性遺伝子の発現が非凝集非処理分化細胞と比べて２５〜２００倍増加した。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】線維芽細胞から多能性を誘導する方法の例の模式図である。
【図２】単層で培養したマウス線維芽細胞へのプログラミンの影響を示す図である。線維芽細胞は、Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの尾に由来した。図２（Ａ）は、ＣＤ３４＋線維芽細胞を示している。図２（Ｂ）は、ＧＦＰ＋線維芽細胞がないことを示している。図２（Ｃ）および図２（Ｄ）は、プログラミンに２日間曝した後の線維芽細胞を示している。
【図３】凝集体または胚様体様体で培養したマウスＯｃｔ４−ＥＧＦＰ線維芽細胞へのプログラミンの影響を示す図である。図３（Ａ）は、非接着性培養プレート上での培養３日目の凝集体を示している。図３（Ｂ）は、プログラミンに２４時間曝した後の凝集体を示している。ＧＦＰ＋が顕微鏡で検出可能である。図３（Ｃ）は、プログラミンに４８時間曝した後の凝集体を示している。図３（Ｄ）は、プログラミンに９６時間曝した後の凝集体を示している。
【図４】単層で培養したＣＤ３４＋マウス線維芽細胞がｑＰＣＲによる測定でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇを発現しないことを示す図である。これらの多能性マーカーの発現は、細胞凝集体でより高く、プログラミンで処理された凝集体で最大であった。
【図５】プログラミン誘導体がＣＤ３４＋マウス線維芽細胞の細胞凝集体中におけるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ発現を増加させることができることを示すｑＰＣＲデータを示す図である。試験した小分子には、２３７（式ＩＩ）、４００（式ＩＩＩ）、５９４（式ＩＶ）、６４８（式ＶＩＩＩ）、６６８（式Ｖ）、９５７（式ＩＸ）、９５８（式ＶＩ）、９５９（式ＶＩＩ）、およびプログラミン（式Ｉ）が含まれる。
【図６】ヒト臍帯血管周囲間葉系前駆（ＨＵＣＰＶ）細胞の凝集体が、０〜５μＭプログラミン処理後に、単層で培養された同様な細胞より高レベルのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇを発現することを示す図である。
【図７】図６のｑＰＣＲデータをより高い分解能で示す図である。
【図８】単層または凝集体（例えば、胚様体様体）として成長させ、５μＭプログラミンで４日間処理された、ヒト皮膚線維芽細胞中でのＯｃｔ４（図８（Ａ））、Ｎａｎｏｇ（図８（Ｂ））、Ｓｏｘ２（図８（Ｃ））、ｃ−Ｍｙｃ（図８（Ｄ））、およびＫＬＦ４（図８（Ｅ））のレベルを示すｑＰＣＲの結果を示す図である。
【図９】骨形成原（骨）細胞に分化したプログラミン処理凝集体（例えば、胚様体様体）を示す図である。図９（Ａ）は、分化前の凝集体を示している。図９（Ｂ）は、１０μＭのＷｎｔアゴニストで処理した後の細胞を示している。Ｗｎｔアゴニストに２日間曝した後に骨原性小結節（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｎｏｄｕｌｅ）が見えた。図９（Ｃ）は、小結節のＡｌｉｚｅｎ  Ｒａｄ  Ｓ染色を示している。図９（Ｄ）は、機械的に凝集体を形成させなかったプログラミン処理細胞で細胞死が起こったことを示している。
【図１０】神経細胞に分化したプログラミン処理凝集体（例えば、胚様体様体）を示す図である。図１０（Ａ）は、分化前の凝集体を示している。図１０（Ｂ）は、Ｂ２７の補充により処理された細胞を示している。図１０（Ｃ）および図１０（Ｄ）は、分化細胞からの神経突起の成長を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
Ｉ．イントロダクション
本発明は、一部、体細胞に由来する細胞凝集体（例えば、胚様体様体）を小分子化合物に曝すことにより、係る細胞における多能性誘導効率が大幅に向上するという驚くべき発見に基づく。したがって、本発明は、分化系列決定（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）哺乳動物細胞を多能性幹細胞へと分化させる（例えば、リプログラミングする）ための化合物、組成物、および方法を提供する。より具体的には、本発明は、分化系列決定細胞の分化または分化系列決定細胞からの多能性幹細胞の誘導に有用である、式Ｉ〜ＩＸの化合物（例えば、プログラミンおよびその誘導体）を提供する。更に、本明細書に記載の方法は、機械的手段により細胞凝集体（例えば、胚様体様体）を形成させることを含む。この方法により作製された誘導多能性幹細胞は分化系列決定細胞へと分化し得る。
【００２４】
本発明は、分化細胞から多能性幹細胞を作製するためのプログラミンおよびその誘導体の使用を含む。プログラミン単独の使用は、体細胞中での多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、およびＥ−カドヘリンの発現を活性化できない。細胞、例えばヒトおよびマウス線維芽細胞は、プログラミンまたはその誘導体のリプログラミング活性に反応できるようになる前に、約４日間、最初に胚様体様細胞体へと機械的に凝集させなければならない。細胞凝集プロセスは単独で、線維芽細胞に基底レベルのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇを発現させる。更に、凝集により、線維芽細胞がプログラミンまたはその誘導体に反応できるようになる。２〜５μＭのプログラミンに胚様体様細胞体を３０時間曝すと、非処理対照線維芽細胞と比べてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ発現が２５〜２００倍増加した。
【００２５】
ＩＩ．一般的方法
本発明の実施には、分子生物学分野の通常の技術が用いられる。本発明に有用な一般的方法を開示している基本的なテキストとしては、Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))が含まれる。
【００２６】
核酸のサイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）のいずれかで示される。これらは、アガロースもしくはアクリルアミドゲル電気泳動、シークエンシングされた核酸、または公開ＤＮＡ配列に由来する推定値である。タンパク質のサイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で示される。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動、シークエンシングされたタンパク質、由来アミノ酸配列、または公開タンパク質配列からの推定値である。
【００２７】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)に記載されているように自動合成装置を用いて、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)により最初に報告された固相ホスホラミダイトトリエステル法に従い、化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、任意の当該技術分野で公知の戦略、例えば未変性アクリルアミドゲル電気泳動、またはPearson and Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)に記載されているように陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行われる。
【００２８】
ＩＩＩ．定義
本開示中、「または」、「もしくは」という用語は通常、本文中に明白にそうでないと述べていない限り、「および／または」を含む意味で使用される。
【００２９】
「Ｏｃｔ４」または「Ｏｃｔ−４」という用語は、ＰＯＵファミリーに属する転写因子を指す。Ｏｃｔ４は未分化細胞のマーカーである（Okamoto et al., Cell 60:461-72, 1990)。Ｏｃｔ４は多能性の維持に関わることも報告されている（Nichols et al., Cell 95:379-91, 1998）。ヒトＯｃｔ４ポリペプチド配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１６７００２、ＮＰ＿００１２７２９１５、ＮＰ＿００１２７２９１６、ＮＰ＿００２６９２、およびＮＰ＿０９７６０３４に示されている。ヒトＯｃｔ４  ｍＲＮＡ（コード）配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１７３５３１  ＮＭ＿００１２８５９８６、ＮＭ＿００１２８５９８７、ＮＭ＿００２７０１、およびＮＭ＿２０３２８９に示されている。当業者には、Ｏｃｔ４のバリアント、アイソフォーム、代替的配列も本発明において有用であることが理解されよう。
【００３０】
「Ｓｏｘ２」または「Ｓｏｘ−２」という用語は、胚発生の制御および細胞運命の決定に関わる転写因子のＳＲＹ関連ＨＭＧボックス（ＳＯＸ）ファミリーのメンバーを指す。ヒトＳｏｘ２ポリペプチド配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００３０９７に示されている。ヒトＳｏｘ２  ｍＲＮＡ（コード）配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３１０６に示されている。当業者には、Ｓｏｘ２のバリアント、アイソフォーム、代替的配列も本発明に有用であることが理解されよう。
【００３１】
「Ｎａｎｏｇ」という用語は、胚性幹細胞および内部細胞塊の増殖および自己複製に関わる転写制御因子を指す。ヒトＮａｎｏｇポリペプチド配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００７９１４１に示されている。ヒトＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡ（コード）配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０２４８６５に示されている。当業者には、Ｎａｎｏｇのバリアント、アイソフォーム、代替的配列も本発明に有用であることが理解されよう。
【００３２】
「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」または「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」という用語は、３つの胚層（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）全てに由来する細胞系統に関連する特性を集団的に示す細胞型へと適切な条件下で分化できる子孫細胞を生じる能力を有する細胞を指す。多能性幹細胞は、出生前、出生後、または成体動物の全ての胚由来組織に寄与し得る。８〜１２週齢ＳＣＩＤマウスにおいて奇形腫を形成する能力等の標準的な当該技術分野で受け入れられている試験を用いて細胞集団の多能性を証明することができるが、種々の多能性幹細胞の特性を同定することにより多能性細胞を検出することもできる。
【００３３】
「多能性幹細胞の特性」とは、多能性幹細胞を他の細胞から区別する細胞の特性を指す。３つの胚層（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）全てに由来する細胞系統に関連する特性を集団的に示す細胞型へと適切な条件下で分化できる子孫細胞を生じる能力は多能性幹細胞の特性である。特定の組合せの分子マーカーの発現も多能性幹細胞の特性である。例えば、ヒト多能性幹細胞は、以下の非限定的なリストのマーカーの少なくとも一部、いくつかの実施形態では全てを発現する：ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１  −６０、ＴＲＡ−１  −８１、ＴＲＡ−２−４９／６Ｅ、ＡＬＰ、Ｓｏｘ２、Ｅ−カドヘリン、ＵＴＦ−１、Ｏｃｔ４、Ｒｅｘｌ、およびＮａｎｏｇ。多能性幹細胞に関連する細胞形態も多能性幹細胞の特性である。
【００３４】
「非多能性細胞」という用語は、多能性細胞でない哺乳動物細胞を指す。そのような細胞の例としては、分化細胞および前駆細胞が含まれる。分化細胞の例としては、限定されるものではないが、骨髄、皮膚、骨格筋、脂肪組織、および末梢血液から選択される組織に由来する細胞が含まれる。細胞型の例としては、限定されるものではないが、線維芽細胞、肝細胞、筋芽細胞、ニューロン、骨芽細胞、破骨細胞、およびリンパ球が含まれる。
【００３５】
「分化系列決定細胞（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｃｅｌｌ）」という用語は、特定の細胞型または関連する細胞型を示すまたはそれに分化する任意の細胞を指す。分化系列決定細胞としては、例えば、骨芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、神経細胞、および脂肪細胞が含まれる。
【００３６】
本明細書において、「脱分化する」、「脱分化」、または「リプログラミング」という用語は、分化系列決定細胞（例えば、筋芽細胞または骨芽細胞）がその分化系列決定を逆転し、前駆体細胞、前駆細胞、多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞、または多能性幹細胞等の新たな細胞型の子孫を生じることができるようになるプロセスを指す。例えば、充分な増殖後、測定可能な割合の子孫が新たな細胞型の表現型的特性を示し得、この割合は、脱分化またはリプログラミング前より測定可能な程度に大きい。特定の条件下で、新たな細胞型の特性を有する子孫の割合は、好ましさが増す順に少なくとも約１％、５％、２５％、またはそれ以上であり得る。脱分化細胞は、分化系列決定細胞に関連する遺伝子発現および細胞表面タンパク質発現のパターンの消失によって同定され得る。
【００３７】
「容器（ｖｅｓｓｅｌ）」という用語は、細胞の培養、維持、または成長に用いることができる入れ物（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、ディッシュ、プレート、フラスコ、ボトル、細胞培養チューブ等を指す。
【００３８】
「機械的撹拌」という用語は、細胞の集団または細胞凝集体等の対象に機械的な力を加えることを指す。
【００３９】
「細胞凝集体」という用語は、互いに接触しており且つ細胞の単一層（ｓｉｎｇｌｅ  ｌａｙｅｒ）、例えば単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成しない、少なくとも３つの細胞の塊を指す。
【００４０】
本明細書において、「培養」という用語は、細胞が増殖、分化、および老化回避できる特定の条件下に細胞を維持することを指す。細胞は、適切な成長因子を含む成長培地中で培養することができる。
【００４１】
本明細書において、「促進する（ｐｒｏｍｏｔｅ）」もしくは「増加する・上昇する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」または「促進する（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ）」もしくは「増加する・上昇する（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ）」は本明細書中で交換可能に用いられる。これらの用語は、非処理細胞（組織または対象）との比較で、処理された細胞（組織または対象）における測定パラメーター（例えば、活性、発現、解糖、解糖代謝、グルコース取込み、解糖の下流の生合成）の上昇を指す。比較は、処理の前後間で同じ細胞、組織、または対象で行われてもよい。上昇は充分に検出可能である。いくつかの実施形態では、処理細胞における上昇は、非処理細胞との比較で少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、２倍、３倍、４倍、またはそれ以上である。
【００４２】
本明細書において、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、もしくは「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」または「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、もしくは「低減する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」は本明細書中で交換可能に用いられる。これらの用語は、非処理細胞（組織または対象）との比較で処理細胞（組織または対象）における測定パラメーター（例えば、活性、発現、ミトコンドリア呼吸、ミトコンドリア酸化、酸化的リン酸化）の低下を指す。比較は、処理の前後間で同じ細胞、組織、または対象で行われてもよい。低下は充分に検出可能である。いくつかの実施形態では、処理細胞における低下は非処理細胞と比べて少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または完全な阻害である。いくつかの実施形態では、測定されるパラメーターは、非処理細胞との比較において、処理細胞で検出不能である（すなわち、完全に阻害されている）。
【００４３】
「医薬的に許容される塩」という用語は、本明細書に記載の化合物上に見られる特定の置換基に応じて比較的非毒性の酸または塩基を用いて製造される活性化合物の塩を指す。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含む場合、そのような化合物の中性形態を充分な量の所望の塩基とニート（ｎｅａｔ）でまたは好適な不活性溶媒中で接触させることにより塩基付加塩を得ることができる。医薬的に許容される塩基付加塩の例としては、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、またはマグネシウム塩、または同様な塩が含まれる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合、そのような化合物の中性形態を充分な量の所望の酸とニートでまたは好適な不活性溶媒中で接触させることにより酸付加塩を得ることができる。医薬的に許容される酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、リン酸、一水素リン酸（ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、二水素リン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、または亜リン酸等の無機酸に由来するものおよび酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等の比較的非毒性の有機酸に由来する塩が含まれる。更に、アルギン酸塩（ａｒｇｉｎａｔｅ）等のアミノ酸の塩およびグルクロン酸またはガラクツロン酸（ｇａｌａｃｔｕｎｏｒｉｃ  ａｃｉｄ）等の有機酸の塩（例えば、Berge, S. M., et al, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19参照）も含まれる。本発明の特定の具体的化合物は、塩基付加塩または酸付加塩への化合物の変換を可能にする塩基性官能基および酸性官能基の両方を含む。
【００４４】
化合物の中性形態は、塩を塩基または酸と接触させ、従来の方法で親化合物を単離することにより再生成し得る。化合物の親形態（ｐａｒｅｎｔ  ｆｏｒｍ）は、極性溶媒中での溶解度等の特定の物理的性質において種々の塩形態と異なるが、その他の点では、本発明の目的のためには、塩は化合物の親形態と同等である。
【００４５】
塩形態に加え、本発明は、プロドラッグ形態の化合物を提供する。本明細書に記載の化合物のプロドラッグは、生理的条件下で容易に化学的に変化して本発明の化合物を供給する化合物である。更に、プロドラッグは、エクスビボ環境で化学的または生化学的方法により本発明の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは好適な酵素または化学的試薬と共に経皮パッチリザーバー中に置かれた場合、ゆっくりと本発明の化合物に変換され得る。
【００４６】
ＩＶ．プログラミンおよびその誘導体
本発明は、リバーシン、プログラミン、または２−（４−モルホリノアニリノ）−６−シクロヘキシルアミノ−プリンとして知られる化合物に由来する化合物を提供する。ある態様では、化合物は式（Ｉ）で表される。
【００４７】
【化４】
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【００４８】
別の態様では、化合物は式（ＩＩ）で表される。
【００４９】
【化５】
0006736253.tif 000006
【００５０】
別の態様では、化合物は式（ＩＩＩ）で表される。
【００５１】
【化６】
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【００５２】
更に別の態様では、化合物は式（ＩＶ）で表される。
【００５３】
【化７】
0006736253.tif 000008
【００５４】
別の態様では、化合物は式（Ｖ）で表される。
【００５５】
【化８】
0006736253.tif 000009
【００５６】
別の態様では、化合物は式（ＶＩ）で表される。
【００５７】
【化９】
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【００５８】
いくつかの態様では、化合物は式（ＶＩＩ）で表される。
【００５９】
【化１０】
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【００６０】
別の態様では、化合物は式（ＶＩＩＩ）で表される。
【００６１】
【化１１】
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【００６２】
別の態様では、化合物は式（ＩＸ）で表される。
【００６３】
【化１２】
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【００６４】
化合物は、その全ての医薬的に許容される塩、異性体、溶媒和物、水和物、およびプロドラッグを含み得る。
【００６５】
当業者には、２−（４−モルホリノアニリノ）−６−シクロヘキシルアミノ−プリン（プログラミンまたはリバーシン）およびその誘導体が固相合成または液相合成のいずれかにより製造され得ることが理解される。そのような化合物の合成方法の詳細は例えば、あらゆる目的のためにその開示全体を参照により本明細書に援用するDing et al., J. Am. Chem. Soc., 124:1594 (2002)；米国特許第７，１７６，３１２号；同第７，２７３，８６４号；および同第７，５９２，１７７号に見出される。
【００６６】
簡潔に述べると、プログラミンの液相合成では、２−フルオロ−６−クロロプリンのｎ−ブタノール溶液にシクロヘキシルアミンおよびジイソプロピルエチルアミンが加えられ得る。混合物は、激しく撹拌しながら１２時間８０℃に加熱され得る。次いで、溶媒は減圧下で除去され得、クルードはそれ以上精製せずに次の工程の反応に直接用いられ得る。粗２−フルオロ−６−シクロヘキシルアミノ−プリンはエタノールに溶解され得、次いで、４−モルホリノアニリンが添加され得る。混合物は、密封チューブ中で激しく撹拌しながら２４時間７５℃に加熱され得る。次いで、溶媒は減圧下で除去され得、粗材料をフラッシュクロマトグラフィーにより直接精製して２−（４−モルホリノアニリノ）−６−シクロヘキシルアミノ−プリンを淡い白色の固体として得ることができる。式ＩＩ〜ＩＸの構造を有する化合物等の２−（４−モルホリノアニリノ）−６−シクロヘキシルアミノ−プリンの誘導体が液相合成または固相合成により製造され得ることは当業者に明らかであろう。
【００６７】
Ｖ．非多能性細胞において多能性を誘導するためのリプログラミング
非多能性哺乳動物細胞を誘導多能性幹細胞へと誘導するための複数の異なる方法およびプロトコールが確立されている。ｉＰＳＣは、形態、増殖、および多能性の点でＥＳＣに類似しており、奇形腫形成およびキメラ寄与（ｃｈｉｍｅｒａ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）により判断される。リプログラミングのプロトコールは、Ｏｃｔポリペプチド（限定されるものではないが、例えばＯｃｔ３／４）、Ｓｏｘポリペプチド（限定されるものではないが、例えばＳｏｘ２）、Ｋｌｆポリペプチド（限定されるものではないが、例えばＫｌｆ４）、および／またはＭｙｃポリペプチド（限定されるものではないが、例えばｃ−Ｍｙｃ）から選択される１または複数のリプログラミング転写因子の導入を含む。
【００６８】
研究により、ＥＳＣ中で高度に発現する４つの転写因子（Ｏｃｔ−３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、およびｃ−Ｍｙｃ）を用いたマウス線維芽細胞のレトロウイルス形質導入によりＩＰＳＣが作製されることが示されている。Takahashi, K. & Yamanaka, S. Cell 126, 663-676 (2006); Okita, K., Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Nature 448, 313-317 (2007); Wernig, M. et al.  Nature 448, 318-324 (2007); Maherali, N. et al. Cell Stem Cell 1, 55-70 (2007); Meissner, A., Wernig, M. & Jaenisch, R. Nature Biotechnol. 25, 1177-1181 (2007); Takahashi, K. et al. Cell 131, 861-872 (2007); Yu, J. et al. Science 318, 1917-1920 (2007); Nakagawa, M. et al. Nature Biotechnol. 26, 101-106 (2007); Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J. P. & Jaenisch, R. Cell Stem Cell. 2, 10-12 (2008)参照。更に、研究により、ＥＳＣにおいて高度に発現している転写因子によるヒト体細胞のリプログラミングが示されている：Hockemeyer et al. Cell Stem Cell. 11;3(3):346-53 (2008); Lowry et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 105(8):2883-8 (2008); Park et al. Nature. 10;451(7175):141-6 (2008); Nakagawa et al. Nat Biotechnol. Jan;26(1):101-6 (2008); Takahashi et al. Cell. 131(5):861-72 (2007); およびYu et al. Science. 318(5858):1917-20 (2007)。
【００６９】
例えばShi, Y., et al (2008) Cell-Stem Cell 2:525-528, Huangfu, D., et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):795-797, Marson, A., et al (2008) Cell-Stem Cell 3:132-135により示されているように、種々の小分子の添加によりリプログラミングの効率（例えば、リプログラミングされた細胞の数）を高めることができる。本明細書に記載の方法は、リプログラミングされる細胞の生成の効率を高める追加的な単一小分子（または小分子の組合せ）と組み合わせても使用され得ると考えられる。いくつかの実施形態では、リプログラミング効率を高める薬剤のいくつかの非限定的な例として、とりわけ、可溶性Ｗｎｔ、Ｗｎｔ条件培地、ＢＩＸ−０１２９４（Ｇ９ａヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ＰＤ０３２５９０１（ＭＥＫ阻害剤）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、バルプロ酸、５’−アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリド、ヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、およびトリコスタチン（ＴＳＡ）が含まれる。更に、本明細書中、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害剤（例えば、Ｒｅｐｓｏｘ、Ｅ−６１６４５１、またはＳＢ４３１５４２、および抗ＴＧＦβ抗体またはＲＮＡｉ薬剤）、ＳＲＣシグナル伝達の阻害剤、例えばＥＩ−２７５、またはＭＥＫ／ＥＲＫ細胞シグナル伝達のアゴニスト（例えば、プロスタグランジン２）；Ｃａ２＋／カルモジュリンシグナル伝達の阻害剤またはＥＧＦ受容体型チロシンキナーゼ阻害剤；Ｎａ２＋チャネルまたはＡＴＰ依存性カリウムチャネルの阻害剤またはＭＡＰＫシグナル伝達経路のアゴニストが、単独でまたは別の小分子（または小分子の組合せ）と組み合わせて本明細書に開示されているように分化細胞からのリプログラミングされた細胞の生成効率を高めるまたは上昇させるために用いられ得ると考えられる。更なる薬剤としては、ＰＤＫ１活性化因子、解糖代謝を促進する化合物、および／またはＲｈｏ  ＧＴＰアーゼ／ＲＯＣＫ阻害剤が含まれる。
【００７０】
本明細書に記載の小分子は、ｉＰＳＣを作製するための基本的にあらゆる方法と組み合わせて用いることができ、それにより方法の効率を改善することができると考えられる。
【００７１】
Ａ．非多能性細胞の獲得および培養
本明細書に記載の方法に従ってｉＰＳＣの作製に用いることができる非多能性哺乳動物細胞は、任意の好適な哺乳動物（例えば、齧歯類、例えば、マウス、ラット、モルモット、およびウサギ；非齧歯類哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウマ、雌ウシ、およびヤギ；霊長類、例えば、チンパンジーおよびヒト）に由来する分化細胞であり得る。
【００７２】
分化細胞は、生殖系列細胞（例えば、精子および卵子を含む配偶子）と対照的に、生物の体を形成する任意の細胞である。哺乳動物体中の他の全ての細胞型は（精子および卵子、生殖母細胞、および未分化幹細胞は別として）分化細胞である。
【００７３】
細胞は、例えば、培養物中、組織中、流体中等にあり得、且つ／または生物に由来するか生物中であり得る。いくつかの実施形態では、分化細胞は、初代細胞系であり、または初代もしくは第２世代の細胞系の子孫である。多能性に誘導され得る細胞としては、限定されるものではないが、線維芽細胞、血液細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、骨髄前駆細胞等、線維芽細胞、腫瘍細胞、骨髄細胞、胃細胞、肝臓細胞、上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞、粘膜上皮細胞、濾胞細胞、結合組織細胞、筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、胃腸細胞、脾細胞、腎細胞、肺細胞、精巣細胞、および神経組織細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は線維芽細胞であり、これはパンチ生検により簡便に対象から得ることができる。別の実施形態では、ヒト細胞は、サンプル、例えば毛包、血液サンプル、スワブサンプル（例えば、口腔スワブサンプル）等から得られる。リプログラミングされた細胞（例えば、誘導多能性幹細胞）が疾患の治療的処置に用いられる場合、患者から単離された分化細胞（例えば、体細胞）を用いることが望ましい。
【００７４】
ヒトおよび哺乳動物細胞の単離および培養方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Humason, ANIMAL TISSUE TECHNIQUES, 4th ed., W. H. Freeman and Company (1979); Freshney et al., CULTURE OF ANIMAL CELLS (3rd ed. 1994); およびRicciardelli et al., (1989) In Vitro Cell Dev. Biol. 25: 1016に記載されている。
【００７５】
好適な細胞培養方法および条件は、公知の方法を用いて当業者に決定され得る（例えば、前述のFreshney et al., 1994参照）。一般的に、細胞培養環境としては、細胞成長のための基質、細胞密度、および細胞接触（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒａｃｔ）、気相、培地、および温度等の因子の考慮が含まれる。細胞のインキュベーションは通常、細胞成長に最適であることが知られている条件下で行われる。そのような条件は、例えば、約３７℃の温度および約５％のＣＯ２を含む湿った大気を含み得る。インキュベーション期間は、所望の結果に応じて幅広く変わり得る。一般的に、インキュベーションは、好ましくは、細胞が好適な発現をするまで続けられる。増殖は好ましくは３Ｈチミジン取込みまたはＢｒｄＵ標識化により測定される。本発明の方法に従って細胞を培養するためにプラスチック製のディッシュ、フラスコ、またはローラーボトルが用いられ得る。好適な培養容器としては、例えば、マルチウェルプレート、ペトリディッシュ、組織培養チューブ、フラスコ、ローラーボトル等が含まれる。
【００７６】
限定（ｄｅｆｉｎｅｄ）細胞培地が、パッケージングされた、予め混合された粉末または予め滅菌された溶液として利用可能である。一般的に用いられる培地の例としては、ＭＥＭ−α  ＤＭＥ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｉｓｃｏｖｅの完全培地、またはＭｃＣｏｙの培地（例えば、ギブコＢＲＬ社（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）／ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のカタログおよび参照ガイド；シグマ社のカタログ参照）が含まれる。典型的には、ＭＥＭ−αまたはＤＭＥＭが本発明の方法で使用される。限定細胞培養培地はしばしば、５〜２０％血清、典型的には非働化血清、例えばヒト、ウマ、仔ウシ、およびウシ胎児血清が補われる。典型的には、１０％ウシ胎児血清が本発明の方法で使用される。培養培地は通常、細胞が好ましくは約７．２〜約７．４のｐＨに維持されるように緩衝化される。培地へのその他の補充物質としては、例えば、抗生物質、アミノ酸、糖、および成長因子が含まれる。
【００７７】
Ｂ．細胞凝集体の形成
多能性を誘導するために、体細胞を懸濁液中で培養して胚様体様体を形成する。いくつかの実施形態では、体細胞は、約１×１０５〜約１×１０６細胞／ｃｍ２の密度で懸濁される。別の実施形態では、細胞は、約３０，０００〜約５００，０００細胞／ｍｌの密度である。細胞は、非組織培養処理容器または低細胞結合容器（ｌｏｗ  ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｖｅｓｓｅｌ）等の非接着性培養容器中で培養され得る。細胞は、細胞による単層形成を防止する任意の容器中で成長され得る。
【００７８】
凝集体または胚様体様体を形成するために、体細胞または非多能性細胞を、細胞がゆるくまとまった（ｌｏｏｓｅｌｙ  ｃｏｍｐａｃｔ）細胞塊を形成できる条件下で懸濁液中で培養する。場合によっては、細胞懸濁液を機械的に操作、例えば混合、撹拌、振とう、スピン、摩擦、およびピペッティングして、細胞同士が凝集して別個の３次元凝集体を形成するようにする。細胞は、容器、例えばローラーボトルまたは撹拌ボトル中で培養され得、凝集体形成を促進するために定期的または連続的に撹拌され得る。
【００７９】
細胞が培養容器表面に接着するのを防止する又は妨げるために、体細胞に機械的力が加えられ得る。機械的力の大きさは、細胞の完全性を変化させるべきではなく、または細胞死を誘導するべきではない。しかし、力は、分離した細胞および凝集体を非接着性培養容器の表面から剥がすのに充分であるべきである。
【００８０】
凝集体は、凝集開始の後および小分子処理の前に約２〜約５日間、例えば、約２日間、約３日間、約４日間、または約５日間形成および培養され得る。
【００８１】
Ｃ．プログラミン化合物中での凝集体の培養
多能性を誘導するために、凝集体はプログラミン（式Ｉの化合物）の誘導体で処理（例えば、暴露またはその中で培養）され得る。いくつかの実施形態では、約０〜約１０μＭ、例えば、約０μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、または約１０μＭのプログラミンの誘導体を用いて凝集体を処理して多能性幹細胞を誘導する。いくつかの実施形態では、約０〜約１０μＭ、例えば、約０μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、または約１０μＭの式ＩＩの小分子化合物を用いて凝集体を処理して多能性を誘導する。いくつかの実施形態では、約０〜約１０μＭ、例えば、約０μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、または約１０μＭの式ＩＩＩの小分子化合物を用いて凝集体を処理して多能性を誘導する。いくつかの実施形態では、約０〜約１０μＭ、例えば、約０μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、または約１０μＭの式ＩＶの小分子化合物を用いて凝集体を処理して多能性を誘導する。いくつかの実施形態では、約０〜約１０μＭ、例えば、約０μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、または約１０μＭの式Ｖの小分子化合物を用いて凝集体を処理して多能性を誘導する。いくつかの実施形態では、約０〜約１０μＭ、例えば、約０μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、または約１０μＭの式ＶＩの小分子化合物を用いて凝集体を処理して多能性を誘導する。いくつかの実施形態では、約０〜約１０μＭ、例えば、約０μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、または約１０μＭの式ＶＩＩの小分子化合物を用いて凝集体を処理して多能性を誘導する。いくつかの実施形態では、約０〜約１０μＭ、例えば、約０μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、または約１０μＭの式ＶＩＩＩの小分子化合物を用いて凝集体を処理して多能性を誘導する。いくつかの実施形態では、約０〜約１０μＭ、例えば、約０μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、または約１０μＭの式ＩＸの小分子化合物を用いて凝集体を処理して多能性を誘導する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、式ＩＩ〜ＩＸの化合物を凝集体に少なくとも８時間、例えば、約８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、またはそれ以上曝す。凝集体は、式Ｉ〜ＩＸの化合物のいずれか１つで少なくとも１日、例えば、１日、２日、３日、４日、５日  ６、日、７日、８日、９日、１０日、またはそれ以上処理され得る。
【００８３】
凝集体は、式Ｉ〜ＩＸの化合物のいずれか１つまたは１もしくは複数の式Ｉ〜ＩＸの化合物の組合せで処理され得る。例えば、２つの式Ｉ〜ＩＸの化合物、例えば式ＩおよびＩＩ、式ＩおよびＩＩＩ、式ＩおよびＩＶ、式ＩおよびＶ、式ＩおよびＶＩ、式ＩおよびＶＩＩ、式ＩＩおよびＩＩＩ、式ＩＩおよびＩＶ、式ＩおよびＶ、式ＩＩおよびＶＩ、式ＩＩおよびＶＩＩ、式ＩＩおよびＶＩＩＩ、式ＩＩおよびＩＸの化合物等を用いることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも２、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９個の異なる式Ｉ〜ＩＸの化合物が、凝集体における多能性の誘導に有用である。
【００８４】
リプログラミング効率は、従来の方法と比べて５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上上昇し得る。場合によっては、リプログラミング効率は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％または５０％（例えば、開始体細胞の総数と比べた誘導多能性細胞のパーセント）という高さであり得る。
【００８５】
本発明において作製される誘導多能性幹細胞の培養では、米国特許第７，４４２，５４８号に記載されているように霊長類多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された種々の培地および技術を用いることができる。当業者に知られるように、ヒト多能性幹細胞を培養および維持するための更なる方法が本発明と共に用いられ得ると理解される。特定の実施形態では、非限定（ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ）条件が用いられ得、例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態に維持するために線維芽細胞フィーダー細胞上または線維芽細胞フィーダー細胞に曝した培地上で培養され得る。あるいは、多能性細胞は、限定された（ｄｅｆｉｎｅｄ）フィーダーが関係しない（ｆｅｅｄｅｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）培養系、例えばＴｅＳＲ培地（Ludwig et al., 2006a; Ludwi  g et al., 2006b）を用いて本質的に未分化状態で培養および維持され得る。フィーダーが関係しない培養系および培地を用いて多能性細胞が培養および維持され得る。本明細書に記載されているように、望まれるようにコストを下げるためにこれらの方法に種々の改変がなされ得る。
【００８６】
例えば、ヒト胚性幹細胞同様、ｉＰＳ細胞は、８０％ＤＭＥＭ（ギブコ社、＃１０８２９−０１８または＃１１９６５−０９２）、２０％限定ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（またはヒトＡＢ血清）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール中に維持され得る。あるいは、ｉＰＳ細胞は、８０％Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ  ＤＭＥＭ（ギブコ社、＃１０８２９−０１８）、２０％血清代替物（ギブコ社、＃１０８２８−０２８）、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ  βメルカプトエタノールで構成される無血清培地中に維持され得る。ヒトｂＦＧＦが、約４ｎｇ／ｍＬの終濃度で添加されてもよく、または代わりにゼブラフィッシュｂＦＧＦが用いられてもよい。
【００８７】
Ｄ．多能性幹細胞の特徴解析方法
本明細書に開示されているように化学的に誘導されたリプログラム細胞は、形態、増殖、遺伝子発現、および奇形腫形成の点で胚性幹細胞または他の多能性細胞と区別できない。例えば、化学的に誘導されたヒトリプログラム細胞は、形態および増殖の点でヒト胚性幹細胞と区別できず、増殖可能である。更に、これらの化学的に誘導されたリプログラム細胞は、インビトロおよび奇形腫において３つの胚葉の細胞型に分化することができる。
【００８８】
リプログラム細胞の多能性特性を評価するための分析が行われ得る。細胞は、種々の成長特性および胚性幹細胞様形態について分析され得る。本明細書に記載の方法に従う由来する多能性幹細胞は、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、およびＳＳＥＡ−４（Developmental Studies Hybridoma Bank, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda Md.．）、ならびにＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１（Andrews et al., 1987）に対する抗体を用いた免疫組織化学またはフローサイトメトリーにより同定または確認できる特徴的な抗原を有する。８〜１２週齢の雄ＳＣＩＤマウスの後ろ足の筋肉に約０．５〜１０×１０６細胞を注射することにより幹細胞の多能性を確認することもできる。奇形腫の出現により、幹細胞が分化して３つの胚葉のそれぞれの少なくとも１つの細胞型になることが示される。
【００８９】
多能性に関連する個々の遺伝子の発現プロファイルも調べ得る。更に、胚性幹細胞表面マーカーの発現を分析し得る。多能性幹細胞に関連することが当該技術分野で知らている種々の遺伝子または遺伝子産物の検出および分析としては、遺伝子または遺伝子産物、例えば、限定されるものではないが、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＡＢＣＧ２、Ｅ−カドヘリン、β−チューブリンＩＩＩ、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、Ｃｒｉｐｔｏ、Ｄａｘ１、ジンクフィンガータンパク質２９６（Ｚｆｐ２９６）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ−１（Ｎａｔ１）、ＥＳ細胞関連転写産物１（ＥＣＡＴ１）、ＥＳＧ１／ＤＰＰＡ５／ＥＣＡＴ２、ＥＣＡＴ３、ＥＣＡＴ６、ＥＣＡＴ７、ＥＣＡＴ８、ＥＣＡＴ９、ＥＣＡＴ１０、ＥＣＡＴ１５−１、ＥＣＡＴ１５−２、Ｆｔｈｌｌ７、Ｓａｌｌ４、未分化胚細胞転写因子（Ｕｔｆ１）、Ｒｅｘ１、ｐ５３、Ｇ３ＰＤＨ、テロメラーゼ、例えばＴＥＲＴ、サイレントなＸ染色体遺伝子、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＴＲＩＭ２８、Ｆボックス含有タンパク質１５（Ｆｂｘ１５）、Ｅｓｒｒｂ、ＴＤＧＦ１、ＧＡＢＲＢ３、Ｚｆｐ４２、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、ＣＹＰ２５Ａ１、ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ２（ＤＰＰＡ２）、Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔ  １（Ｔｃｌ１）、ＤＰＰＡ３／Ｓｔｅｌｌａ、ＤＰＰＡ４、および多能性のその他の一般的マーカー、例えば細胞のリプログラム誘導中に使用される任意の遺伝子または遺伝子産物の分析が含まれ得る。
【００９０】
細胞は、多能性細胞が誘導される分化細胞に特徴的なマーカーの減少によっても特徴付けることができる。内胚葉細胞のマーカーの非限定的な例としては、Ｇａｔａ４、ＦｏｘＡ２、ＰＤＸ１、Ｎｏｄａ１、Ｓｏｘ７、およびＳｏｘ１７が含まれ、中胚葉細胞のマーカーとしては、Ｂｒａｃｈｙｃｕｒｙ、ＧＳＣ、ＬＥＦ１、Ｍｏｘ１、およびＴｉｅ１が含まれ、外胚葉細胞のマーカーとしては、Ｃｒｉｐｔｏ１、ＥＮ１、ＧＦＡＰ、Ｉｓｌｅｔ  １、ＬＩＭ１、およびネスチンが含まれる。３つの胚葉のマーカーに対する抗体は、例えばアブカム社（Ａｂｃａｍ）、ＥＭＤミリポア社、サンタクルーズバイオテクノロジー社等から市販されている。
【００９１】
いくつかの実施形態では、リプログラム細胞におけるＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２の発現レベル（例えば、量）は、リプログラム細胞が由来する分化細胞における同じ遺伝子または遺伝子産物の発現レベル（量）より、少なくとも約少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約５００倍、またはそれ以上高い。
【００９２】
Ｅ．リプログラム細胞の濃縮および／または単離方法
本発明の別の態様は、リプログラム細胞とリプログラム細胞が由来した分化細胞とを含む混合細胞集団等の異種細胞集団からのリプログラム細胞集団の単離に関する。本明細書に記載の方法のいずれかにより生産されたリプログラム細胞の集団は、リプログラム細胞が由来した分化細胞上に存在せずリプログラム細胞上に存在する任意の細胞表面マーカーを用いて、濃縮、増殖、単離、および／または精製することができる。そのような細胞表面マーカーは、リプログラム細胞に特異的なアフィニティータグとも呼ばれる。リプログラム細胞に特異的なアフィニティータグの例としては、リプログラム細胞の細胞表面上に存在するが他の細胞型の上（例えば、分化細胞上）には実質的に存在しないポリペプチド等のマーカー分子に特異的な抗体、リガンド、または他の結合剤が挙げられる。いくつかの方法では、リプログラム細胞（例えば、ヒトリプログラム細胞）上の細胞表面抗原に結合する抗体が、本明細書に記載の方法により作製された化学的に誘導されたリプログラム細胞の濃縮、単離、または精製のためのアフィニティータグとして使用される。いくつかの実施形態では、リプログラム細胞は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、アフィニティーに基づく方法、およびその組合せにより分化細胞から単離することもできる。
【００９３】
化学的に誘導されたリプログラム細胞は、細胞単離のための他の技術によって単離されてもよい。更に、リプログラム細胞は、リプログラム細胞の選択的生存または選択的増殖を促進する成長条件での連続継代培養法によって濃縮または単離することもできる。そのような方法は当業者に公知である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、リプログラム細胞を含む細胞培養物または細胞集団は、少なくとも約１〜１００％、例えば、少なくとも約少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９０％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の多能性幹細胞を含む。
【００９５】
Ｆ．リプログラム細胞の分化方法
誘導幹細胞の多能性を評価するもう１つの方法は、インビトロで細胞を特定の体細胞型に分化させることである。例えば、特定の細胞型への分化を駆動（ｄｒｉｖｅ）することが知られている特定の成長因子が用いられ得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って作製された幹細胞は、その後、例えば造血（幹／前駆）細胞、神経（幹／前駆）細胞（および所望により、更に分化した細胞、例えばサブタイプ特異的ニューロン、オリゴデンドロサイト等）、膵臓細胞（例えば、内分泌前駆細胞または膵臓ホルモン発現細胞）、肝細胞、心血管（幹／前駆）細胞（例えば、心筋細胞、内皮細胞、平滑筋細胞）、網膜細胞等を形成するように誘導される。所望の細胞型への多能性幹細胞の分化を誘導する種々の方法が知られている。種々の細胞運命への幹細胞の分化を誘導する方法の非限定的な例は、例えば、米国特許第８，１８７，８７８号；同第７，７８１，２１４号；同第７，７５７，７６２号；同第７，５４１，１８６号；Kaiming Ye and Sha Jin, eds., Human Embryonic and Induce Pluripotent Stem Cells: Lineage-specific Differentiation Protocols, New York: Humana Press, 2011; およびSchlaeger et al., Current Protocols in Stem Cell Biology, New York: Wiley, 2014に記載されている。
【００９７】
Ｇ．医薬製剤
医薬的用途で使用される場合、本発明の小分子化合物は通常、好適なバッファー中に製剤化され、そのようなバッファーは、リン酸緩衝食塩水またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリスバッファー、グリシンバッファー、滅菌水、およびGood et al. Biochemistry 5:467 (1966)に記載されているもの等の当業者に公知の他のバッファー等の任意の医薬的に許容されるバッファーであり得る。
【００９８】
組成物は、安定剤、エンハンサー、または他の医薬的に許容されるキャリアもしくは媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を更に含んでよい。医薬的に許容される塩またはキャリアは、例えば小分子化合物を安定化するように作用する、生理学的に許容される化合物を含み得る。生理学的に許容される化合物は、例えば、炭水化物、例えばグルコース、スクロース、またはデキストラン、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸またはグルタチオン、キレート化剤、低分子量タンパク質、または他の安定剤もしくは補形剤を含み得る。他の生理学的に許容される化合物としては、微生物の成長または作用の防止に特に有用な湿潤剤、乳化剤、分散剤、または保存剤が含まれる。種々の保存剤が周知であり、例えばフェノールおよびアスコルビン酸が含まれる。キャリア、安定剤、または補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）の例はRemington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)に見出すことができる。
【実施例】
【００９９】
ＶＩ．実施例
以下の実施例は、特許請求される発明を説明するために提供されるものであって、限定する趣旨のものではない。
【０１００】
実施例１：マウス体細胞中で多能性遺伝子発現を活性化するためのプロトコール
本発明者らは、ＥＧＦＰレポーターに連結した導入遺伝子Ｏｃｔ４プロモーター（Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ）を保有する線維芽細胞から作った胚様体様体のハイスループットスクリーニングにより小分子を同定した。本発明者らが「プログラミン」（例えば、リバーシン）と名付けたこの合成異種環状（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）分子は、マウス体細胞でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇの２５〜２００倍強い発現を誘導することができた。更に、Ｅ−カドヘリン（胚細胞の多能性維持に重要な細胞接着遺伝子）の発現が誘導され、最初の線維芽細胞と比べて５倍増加した。リプログラミング効率は約２０％であり、達成までに７日かかる。線維芽細胞を単層として通常の接着性培養ディッシュ上で従来法により成長させた場合にはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇの発現は誘導（活性化）されなかった。
【０１０１】
これらの体の形成プロセス自体が、低い基底レベルのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ発現を活性化する（成長中の培養ディッシュ接着性線維芽細胞より２倍高い）。この機械的に誘導される生物活性はｑＰＣＲ分析により確認された。細胞凝集体をプログラミンで処理すると、これら３つの多能性遺伝子の発現が更に例えば対照と比べて２０〜２００倍増加した。これらの結果は更に多数回再現され、ヒト線維芽細胞を用いても再現された。要約すると、プログラミンまたはその誘導体は単独では、体細胞が凝集するように機械的に誘導されて培養ディッシュへの接着が防止されない限り、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ発現を活性化できない。
【０１０２】
プログラミン誘導多能性（ＰＩＰ）幹細胞は、骨形成誘導性培地により誘導された時に骨細胞を形成することができ、神経誘導性補充物質で処理された時に神経細胞を形成することができる。多能性幹細胞を作製するためのこの新規なアプローチは、簡便、迅速、効率的であり、費用対効果が高い。したがって、ＰＩＰ幹細胞は、再生医療に用いるための臓器および組織移植片の作製に用いるための価値ある多用途の細胞源を提供する。更に、ヒトＰＩＰ幹細胞は、医薬業界による薬物の毒性および生物活性試験のために、肝臓、心臓、および神経細胞等の特異的細胞型への分化を誘導することができる。
【０１０３】
本実施例は、多能性幹細胞マーカーを発現する誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へのマウス体細胞のリプログラミングを可能にする新規化合物の使用を説明するものである。
【０１０４】
必要な材料：１０％ＦＢＳ、１％ＰＳを含むＤＭＥＭ（インビトロジェン社）を補った培養培地；１×Ｂ２７（インビトロジェン社）、１，０００Ｕ／ｍＬのマウス白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地（インビトロジェン社）を補ったマウスＥＳＣ培地；プログラミン（ＤＭＳＯに溶解した凍結ストック）；作用濃度＝１〜５μＭ；滅菌３５ｍｍ非接着性培養ディッシュ（ＳＰＬ；１１０３５）。
【０１０５】
手順
ＰＩＰ幹細胞作製の１日目：
【０１０６】
１．マウス尾線維芽細胞（第２〜６継代且つ成長対数期）を調達する。培養培地中の細胞懸濁液を得るための標準的なプロトコールを用いて線維芽細胞をトリプシン処理する。
【０１０７】
２．線維芽細胞または他の体細胞を滅菌３５ｍｍ非接着性培養ディッシュ上に３ｍＬの培養培地中１×１０５〜１×１０６細胞／ｃｍ２の密度で播種する。
【０１０８】
３．細胞インキュベーター中で細胞を３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。
【０１０９】
４．培養ディッシュ表面に細胞が接着するのを防止するために培養培地を穏やかにピペッティングする。１日２回、それぞれ２分間、行わねばならない。標準的な１ｍＬピペットおよびプラスチック製のチップを培養物のピペッティングに用いた。ピペッティングは非常にゆっくりと行う必要がある（およそ０．５〜１ｍＬ／秒で、非接着性培養ディッシュ表面から細胞を剥がすのに充分な力が生じる）。
【０１１０】
ＰＩＰ幹細胞作製の２日目。
【０１１１】
１．細胞は１日目の後に胚様体様体へと凝集し始める。培養期間中、これらの体の数およびサイズが増える。
【０１１２】
２．培養ディッシュ表面に胚様体様細胞体が付着するのを防止するために培養培地を穏やかにピペッティングする。
【０１１３】
３．１ｍＬの新鮮な培養培地を加える。
【０１１４】
ＰＩＰ幹細胞作製の４日目。
【０１１５】
１．８００ｒｐｍで５分間の遠心により細胞懸濁液およびペレット細胞を回収する。穏やかな遠心およびピペッティングは胚様体様体を脱凝集しない。マウスＥＳＣ培地およびプログラミン（１〜５μＭ）またはプログラミン誘導体で細胞を１回洗浄する。
【０１１６】
２．胚様体様体を再度ペレット化し、それらを３ｍＬマウスＥＳＣ培地およびプログラミンまたはその誘導体に再懸濁する。
【０１１７】
３．胚様体様細胞体を滅菌３５ｍｍ非接着性培養ディッシュに播種する。細胞インキュベーター中で胚様体様体を３７℃、５％ＣＯ２で２〜３日インキュベートする。
【０１１８】
４．１日２回のピペッティングを毎日行って培養ディッシュに胚様体様細胞体が固着するのを防止する。
【０１１９】
５．５日目（プログラミン処理後２日目）に１ｍＬの新鮮なマウスＥＳＣ培地を加える。
【０１２０】
ＰＩＰ幹細胞作製の６〜７日目。
【０１２１】
１．共焦点分析のためのＰＩおよびＨｏｅｃｈｓｔ染色用に胚様体様細胞体を回収する。細胞中の緑色蛍光およびＨｏｅｃｈｓｔ染色の存在が、Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰを発現している生きたＰＩＰ細胞の存在を示す。
【０１２２】
２．多能性遺伝子の発現、すなわちＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇの発現、また更に、他の主要な幹細胞関連遺伝子の発現を検証するため、ｑＰＣＲ分析用に胚様体様細胞体を回収する。
【０１２３】
結果
本発明の方法例の模式図を図１に示す。Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの尾から抽出されてＣＤ３４で染色された尾線維芽細胞（図２）。表面マーカーＣＤ３４を発現する細胞だけをフローサイトメトリーにより分取した。図２（Ｂ）は、接着性培養ディッシュ上で３日間成長させたＣＤ３４＋線維芽細胞を示している。接着性培養ディッシュ上で成長させて５μＭプログラミンで３日間処理したＣＤ３４＋線維芽細胞は死滅し、Ｏｃｔ４を発現しなかった（図２（Ｃ）および図２（Ｄ））。
【０１２４】
Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰトランスジェニックマウスの尾から回収されたＣＤ３４＋線維芽細胞を機械的にピペッティングし、非接着性培養プレート上に維持して、細胞が凝集して胚様体様体を形成するようにした（図３（Ａ））。本実験中の胚様体様体をＰＩ色素で染色して死細胞の存在（赤い矢印）を決定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素で染色して生細胞の存在（青い矢印）を決定した（図３（Ａ）〜（Ｄ））。共焦点顕微鏡下で、Ｏｃｔ４−ＥＧＦＰ発現（緑色の矢印）は、非処理胚様体様体の生細胞中では検出不能であった（図３（Ａ））。５μＭのプログラミンで２４時間（図３（Ｂ））、４８時間（図３（Ｃ））、および６９時間（図３（Ｄ））処理された胚様体様細胞体はＯｃｔ４−ＥＧＦＰを発現した。プログラミンは、処理の２４〜６９時間後のＣＤ３４＋線維芽細胞においてＯｃｔ４−ＥＧＦＰ発現を活性化することができた（緑色の矢印）。
【０１２５】
ｑＰＣＲの結果は、ＣＤ３４＋マウス線維芽細胞が単層として培養された時にＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇを発現しないことを示している（図４）。対照的に、胚様体様細胞体を形成するように線維芽細胞を機械的に操作した場合、これらはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ等の多能性遺伝子を低い基底レベルで発現するように誘導される。これらの胚様体様細胞体を５μＭのプログラミンで処理すると、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ発現が有意に高まる。
【０１２６】
ｑＰＣＲの結果は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ発現を高める種々のプログラミン誘導体の有効性を示している（図５）。誘導体２３７、４００、５９４、６４８、６６８、９５７、９５８、および９５９は、ＣＤ３４＋マウス線維芽細胞の胚様体様細胞体中でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇ発現を有意に増加させた。多能性幹細胞マーカーのレベルは、プログラミンまたはその誘導体で処理された胚様体様細胞体中で、単層として培養されたＣＤ３４＋マウス線維芽細胞および非処理胚様体様細胞体と比べて高かった。
【０１２７】
実施例２：ヒト臍帯血管周囲間葉系前駆細胞において多能性遺伝子発現を活性化するためのプロトコール
本実施例では、多能性幹細胞マーカーを発現するｉＰＳＣへのヒト前駆細胞、例えばヒト臍帯血管周囲間葉系前駆細胞のリプログラミングを促進する新規化合物の使用が説明される。
【０１２８】
必要な材料：プログラミンまたはその誘導体（ＤＭＳＯに溶解した凍結ストック）、１００ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（インビトロジェン社）を補ったＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（インビトロジェン社）、１５％ＥＳＱ−ＦＢＳ（インビトロジェン社）および１％ＰＳを含むＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社）からなるＨＵＣＰＶ培地；作用濃度＝１〜５μＭ；滅菌非接着性２４ウェル培養プレート（ＳＰＬ；３２０２４）。
【０１２９】
手順
１．初代ヒト臍帯血管周囲（ＨＵＣＰＶ）細胞をＨＵＣＰＶ培養培地中に維持し、トリプシン処理により継代した。第６細胞継代未満のＨＵＣＰＶ細胞のみを用いた。
【０１３０】
２．ＨＵＣＰＶ培養をトリプシン処理し、単一細胞に解離させる。
【０１３１】
３．解離させたＨＵＣＰＶ細胞を、６００μＬのＨＵＣＰＶ培地中に３×１０５細胞で再懸濁し、非接着性２４ウェル培養プレートの各ウェルに播種する。
【０１３２】
４．細胞を細胞インキュベーター中で３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートする。
【０１３３】
５．翌日、実験の最後まで、細胞が培養プレート上に付着しないように細胞を１日２回ピペッティングしてＨＵＣＰＶ細胞を胚様体様細胞体へと凝集させた。
【０１３４】
６．２日毎に２００μＬの新鮮なＨＵＣＰＶ培地を培養液に加えた。
【０１３５】
７．４日間の培養後、胚様体様細胞体を８００ｒｐｍで５分間遠心して培養培地を取り除いた。遠心およびピペッティングは胚様体様体が脱凝集しないように穏やかにするようにする。
【０１３６】
８．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６および１〜５μＭのプログラミンまたはその誘導体を補ったＨＵＣＰＶ培地で胚様体様細胞体を１回洗浄する。遠心により培地を除去する。
【０１３７】
９．滅菌非接着性２４ウェル培養プレートの各ウェル中のＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６および１〜５μＭプログラミンまたはその誘導体で補った６００μＬのＨＵＣＰＶ培地中に胚様体様体を再懸濁する。
【０１３８】
１０．プログラミン処理の３０時間後、多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇの発現を検証するためのｑＰＣＲ分析用にプログラミン処理胚様体様細胞体を回収した。他の主要な幹細胞関連遺伝子も分析した。
【０１３９】
結果
ヒト臍帯血管周囲間葉系前駆（ＨＵＣＰＶ）細胞を培養ディッシュに接着させた後、０〜５μＭのプログラミンで３０時間処理した。ｑＰＣＲ分析により、単層として培養された細胞中でプログラミンがＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＮａｎｏｇ発現を活性化しないことが示された。
【０１４０】
胚様体様体に凝集させたＨＵＣＰＶ細胞は、単層として培養された細胞と比べてより高いＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、およびＮａｎｏｇの発現を示した（図６）。しかし、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃ発現は活性化されなかった。
【０１４１】
ＨＵＣＰＶ細胞から形成された胚様体様体を１〜５μＭのプログラミンで３０時間処理した。試験された全ての濃度でプログラミンに曝した胚様体様体は非処理胚様体様体対照（０μＭ）と比べてＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＮａｎｏｇ発現の有意な増大を示した（図６および７）。４μＭプログラミンは、他の濃度と比べて、最高レベルのＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびＮａｎｏｇを誘導した。
【０１４２】
データは、ＨＵＣＰＶ細胞が、物理的に胚様体様体へと凝集された時に、細胞中でＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、およびＮａｎｏｇ発現を活性化することによりプログラミンに反応することを示している。最初ＨＵＣＰＶ細胞から形成された胚様体様体は、非接着性培養ディッシュ上で成長させてディッシュ表面への固着が防止された時に、多能性幹細胞に分化する。
【０１４３】
実施例３：ヒト皮膚線維芽細胞中で多能性遺伝子発現を活性化するためのプロトコール
本実施例では、ヒト皮膚線維芽細胞からのｉＰＳＣの形成を誘導する方法が説明される。方法は、ヒト線維芽細胞に細胞凝集体を形成させ、次いで凝集体を化合物プログラミンまたはその誘導体、例えばプログラミン２〜９に暴露することを含む。
【０１４４】
必要な材料：１５％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸、１％ＰＳを含むイーグルＭＥＭ培地（インビトロジェン社）を補った線維芽細胞培地、２０％ノックアウト血清代替物（インビトロジェン社）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、０．１ｍＭメルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞成長因子−塩基性（ｂＦＧＦ）、１％ＰＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン社）、プログラミンまたはその誘導体（ＤＭＳＯに溶解した凍結ストック）を補ったヒトＥＳＣ培地；作用濃度＝５μＭ、および滅菌３５ｍｍ非接着性培養ディッシュ（ＳＰＬ；１１０３５）。
【０１４５】
手順
１．初代ヒト皮膚線維芽細胞を線維芽細胞培地中で培養し、トリプシン処理により継代した。第５継代の線維芽細胞を実験に用いた。
【０１４６】
２．トリプシンを用いて培養物を単一細胞に解離させた後、２×１０６細胞を非接着性３５ｍｍディッシュ中の３ｍＬの線維芽細胞培地に再懸濁し、３７℃のインキュベーター中５％ＣＯ２で維持した。
【０１４７】
３．数時間後、凝集体が形成された。過度に大きな凝集体をピペッティングにより穏やかに壊す。
【０１４８】
４．翌日、緻密な（ｃｏｍｐａｃｔ）凝集体が形成された。再度、ピペッティングにより凝集体をより小さなサイズ（直径１００〜１２０μｍ）に穏やかに壊す。
【０１４９】
５．細胞凝集体／胚様体様細胞体形成の３日後、５μＭプログラミンまたはその誘導体を補ったヒトＥＳＣ培地に培地を変換する。
【０１５０】
６．２日後、培地に新鮮なプログラミンまたはその誘導体を補充する。
【０１５１】
７．プログラミンまたはその誘導体による４日間の処理後、細胞を回収する。トータルＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬を用いて抽出し、カラムを用いて精製する。
【０１５２】
８．主要な幹細胞関連遺伝子について逆転写およびｑＰＣＲを行う。
【０１５３】
結果：
４日間の化合物処理後、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫＬＦ４等の幹細胞関連遺伝子が、プログラミンで処理された胚様体様体において、媒体で処理された胚様体様体、プログラミンで処理されたヒト線維芽細胞の単層、および媒体で処理されたヒト皮膚線維芽細胞の単層より高いレベルで発現されている（図８（Ａ）〜（Ｅ））。したがって、プログラミンは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ＫＬＦ４、およびｃ−Ｍｙｃを含む多能性関連遺伝子を強く発現するように、凝集体で培養された線維芽細胞は活性化するが、単層で培養された線維芽細胞は活性化しない。
【０１５４】
実施例４：上記実施例に従って作製された胚様体様体の発生可能性の試験方法
本実施例では、実施例１〜３に記載の方法に従って作製されたｉＰＳＣを骨形成原細胞または神経細胞へと分化させる方法が説明される。
【０１５５】
骨形成（骨）誘導の方法
プログラミン処理胚様体様細胞体（１×１０６細胞／１０ｃｍ２）を、非接着性培養ディッシュ上のＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ、および１×Ｂ２７中に懸濁培養物として４日間維持した。その後、０．１％ゼラチンでコーティングされた培養ディッシュに胚様体様細胞体を移した（図９（Ａ））。１０μＭ  Ｗｎｔアゴニスト（カタログ番号６８１６６５、カルビオケム社）を培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦおよび１×Ｂ２７）に加えた。２〜３日後の培養物中に骨様の小結節が見られた（図９（Ｂ））。小結節のＡｌｉｚｅｎ  Ｒｅｄ染色により、分化細胞が骨細胞であることが確認された（図９（Ｃ））。凝集しなかったプログラミン処理細胞はＷｎｔアゴニストに曝した後に細胞死した（図９（Ｄ））。
【０１５６】
神経細胞の誘導方法
プログラミン処理胚様体様細胞体（１×１０６細胞／１０ｃｍ２）を、非接着性培養ディッシュ上のＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ、および１ｘＢ２７中の懸濁培養物として４日間維持した。その後、０．１％ゼラチンでコーティングされた培養ディッシュに胚様体様細胞体を移した（図１０（Ａ））。培養培地中のＢ２７は神経新生を誘導できるので、神経誘導小分子は培地に添加しなかった（図１０（Ｂ））。３日間の培養後、０．１％ゼラチンコーティング培養プレート上にニューロンが見られ、これは７日後にはより明らかであった（図１０（Ｃ）および（Ｄ））。
【０１５７】
本願で引用される全ての特許、全ての特許、特許出願、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含む他の出版物の全体をあらゆる目的のために参照により援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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