(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γδＴ細胞の集団を増殖させるための方法であって、前記方法が、癌に対する治療活性を有するエフェクターγδＴ細胞の産生に有利となるように、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）及びインターロイキン−２を含む培地中において単離活性化末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を培養するステップを備え、前記培地が、ウシ胎児血清またはウシ胎仔血清を含有しないことを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記培地中にさらなるサイトカインが存在しないことを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、前記培地が血清不含培地であるか、またはヒトＡＢ血清を含有することを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、工程の最初の段階でＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞に対する活性化因子が添加されることを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記活性化因子がゾレドロン酸、アレンドロン酸、パミドロン酸、イバンドロン酸などのアミノビスフォスフォネートまたはその塩であることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、前記活性化因子がゾレドロン酸またはその塩であることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、前記ＰＢＭＣがヒトＰＢＭＣであることを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法において、前記ＰＢＭＣがヒト患者由来であることを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記ＰＢＭＣが健康なヒト由来であることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法において、増殖された生成物からＣＤ１９＋Ｂ細胞および／またはαβＴ細胞が除去されることを特徴とする、方法。
【請求項１１】
インビトロで増殖されるγδＴ細胞の収率を向上させるための方法において、前記方法が、請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法を行うことを備えることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
インビトロで増殖されるγδＴ細胞の抗癌効果を促進するための方法において、前記方法が、請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法を行うことを備えることを特徴とする、方法。
【請求項１３】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法によって得られること特徴とする、γδＴ細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載のγδＴ細胞において、治療での使用のためのものであることを特徴とする、γδＴ細胞。
【請求項１５】
請求項１３に記載のγδＴ細胞において、癌の処置での使用のためのものであることを特徴とする、γδＴ細胞。
【請求項１６】
請求項１３に記載のγδＴ細胞と、活性化因子との組み合わせ。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組み合わせにおいて、前記活性化因子がビスホスホネート薬であることを特徴とする、組み合わせ。
【請求項１８】
請求項１３に記載のγδＴ細胞と、化学療法剤との組み合わせ。
【請求項１９】
請求項１８に記載の組み合わせにおいて、前記化学療法剤がシタラビンであることを特徴とする、組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γδＴ細胞、特に抗腫瘍エフェクター機能を有するヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖のための方法と、本方法での使用のための試薬および組成物ならびに本方法の生成物および治療におけるそれらの使用とに関する。さらに、本方法は、一部の例において細胞増殖効率およびエフェクター機能を促進するのに適切である。
【背景技術】
【０００２】
γδＴ細胞は、最大で循環リンパ球の１０％を占め、自然免疫と適応免疫との間の橋渡しにおいて機能する。これらの多目的細胞の４つの属性により、これらは治療および特に癌免疫療法における実施に直結するものとなっている。第一に、γδＴ細胞は、形質転換された状態に関連する、ゲノム的、代謝的およびシグナル伝達的なゆらぎを認識する［１、２］。第二に、これらは、「通常の」αβＴ細胞により配置されるものと重複し、なおかつ別個である免疫エフェクター活性の多様なネットワークを有する。γδＴ細胞は、パーフォリンおよびグランザイムを放出し、ＦＡＳおよびＴＲＡＩＬの両方を発現し、Ｆｃ受容体依存性エフェクター機能に関与し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−γおよびＩＬ−１７を含む一連の免疫調節性サイトカインを生じさせる。第三に、γδＴ細胞は、適応型の機序を通じて免疫攻撃の永続化を可能にする効率的な抗原提示細胞としての役割を果たす［３］。最後に、これらの細胞はＨＬＡにより制限されないため、移植片対宿主病を誘発しない。これにより、同種間の「容易に利用可能な」状況でそれらを使用するという将来的な見通しが高まる［４］。
【０００３】
ヒトにおける殆どの循環γδＴ細胞は、ＩＰＰおよびその立体異性体ＤＭＡＰＰにより最もよく例示される非ペプチドホスホ抗原（ｐｈｏｓｐｈｏａｎｔｉｇｅｎ）（ＰＡｇ）を認識するＶγ９Ｖδ２受容体を呈示する（図１）［５］。ＰＡｇはメバロン酸代謝の中間体であるため、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、この重要な代謝経路の過剰な活性を検出するための自然機序を提供する。過剰なメバロン酸経路流動は、ｐ２１Ｒａｓと相乗的に作用して細胞形質転換を促進するため、このようなサーベイランスは、進化的な立場から正当化される［６］。これは、ｐ２１Ｒａｓ、Ｃｄｃ４２、Ｒｈｏ、ＲａｂおよびＲａｃを含む、いくつかのＧＴＰａｓｅの翻訳後修飾に必要とされるイソプレノイドの生合成におけるこのネットワークの基本的な役割を反映する。
【０００４】
ゾレドロン酸（ＺＡ）、アレンドロン酸（ＡＡ）、パミドロン酸（ＰＡ）およびイバンドロン酸（ＩＡ）などのアミノ−ビスホスホネート（ＮＢＰ）薬は、直接的に細胞毒性である機序および免疫調節性である機序の組み合わせを通じて抗腫瘍活性を発揮する［７］。後者の重要な例は、これらの薬物がＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を活性化する能力である。これは、メバロン酸経路内のＦＰＰシンターゼの阻害によるものであり、ＰＡｇ蓄積増加につながる（図１）［８］。ＮＢＰを急に適用された腫瘍細胞は、大きいＰＡｇ負荷量を得、したがってＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞による認識に対してより感受性が高くなる［５、９］。この原理の開拓により、γδＴ細胞免疫療法に対する腫瘍感受性を促進するための機会がもたらされる。
【０００５】
γδＴ細胞免疫療法の臨床開発は、２つの確立された知見を基礎とする。第一に、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞のインビボでの増殖を達成するための試みにおいて、多様な悪性腫瘍患者がＺＡおよび低用量ＩＬ−２で処置されてきた。多くの場合、これらの小規模の試験により循環Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞数が疾患進行の停滞と相関付けられた［１０］。第二に、エクスビボで増殖されたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞が、上皮卵巣癌（ＥＯＣ）を含む多様な癌を含め、いくつかの初期フェーズの臨床試験で自家養子免疫療法として試験されている［１１〜１３］。これらの試験から注入されたγδＴ細胞の安全性が明らかになっているにもかかわらず、（ＺＡと併用した場合でさえも）臨床有効性は限定されている。これにより、高い効率でこれらの細胞を増殖させ、抗腫瘍活性向上を示す細胞を得るためのより良好な系が求められていることが強調される。
【０００６】
形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３と呼ばれる少なくとも３つのアイソフォームで存在する分泌型タンパク質である。これは、増殖および細胞分化だけでなく、免疫および癌も含む様々な過程に関与するサイトカインである。これに関連して、それは制御免疫効果を有すると一般に理解されており、これにより、宿主免疫反応を低下させるためにサイトカインを過剰発現するある種の癌において、それが上方制御される理由が部分的に説明され得る。Ｔ細胞へのＴＧＦ−βの添加により、制御性の表現型が促進されることが多くの論文で示されている。例えば、２つの独立するグループが、ＴＧＦ−βを含んだサイトカインの存在下でヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を培養した結果、免疫抑制機能を有する高レベルのＦｏｘｐ３およびＣＤ２５を発現する、制御型のγδＴ細胞が生じることを示した［１４、１５］。
【０００７】
本願は、γδＴ細胞の増殖のための様々なプロトコールの試験を行い、エフェクター活性が促進された高レベルの細胞を生成する特定の一連の条件を見出した。
【発明の概要】
【０００８】
驚くべきことに、本出願人らは、ＴＧＦ−βの存在が、ある培養条件下で、特に癌細胞に対する免疫賦活活性を有するエフェクターＴ細胞の収率を向上させ得ることを見出した。さらに、この方法を使用して生成させた細胞の抗癌効果を上昇させ得る。
【０００９】
本発明によれば、悪性疾患に対する治療活性を有するエフェクターγδＴ細胞の産生にとって有利である条件下で、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）を含む培地中において単離活性化末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を培養することを含む、γδＴ細胞集団を増殖させるための方法が提供される。
【００１０】
特に、本発明の方法を使用して産生されたＴ細胞集団は、悪性疾患に対する治療活性を有するγδ細胞および特にＶγ９Ｖδ２細胞に富む。この場合の悪性疾患としては、特に増殖性疾患、例えば、固形腫瘍、液性腫瘍または血液癌または循環系の他の癌を含む癌などが挙げられる。固形腫瘍の例としては、乳癌、卵巣癌、結腸癌および一般にＧＩ（胃腸）管の癌、子宮頸癌、肺癌、特に小細胞肺癌、および非小細胞肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、前立腺癌またはカポジ肉腫が挙げられる。循環系癌の例としては、白血病、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）およびＢ細胞リンパ腫が挙げられる。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、「エフェクターＴ細胞」という表現は、免疫反応における制御または免疫抑制効果ではなく、抗腫瘍または抗白血病効果を有するＴ細胞を指す。
【００１２】
ある条件下で培地中にＴＧＦ−βを含むことにより、エフェクターＴ細胞の収率および有効性の両方が向上すると思われる。これは、このサイトカインによって主に制御Ｔ細胞の産生が起こるという支配的な理解に反するものである。
【００１３】
本発明の工程において出発物質として使用されるＰＢＭＣは、適切には、ヒトＰＢＭＣなどの霊長類ＰＢＭＣである。これらは、適切には、従来の方法を使用して、ヒトまたは他の霊長類、例えば類人猿などからの血液試料から単離される。
【００１４】
本細胞は、患者から得て、次いでその患者に再導入し得る（自家療法）。しかし、一部の状況において、例えば、トリプルネガティブ乳癌など、固形腫瘍に対して重い処置を以前に受けた患者からの細胞は増殖しにくいか、または全く増殖しないことが分かっている。このような場合、健康なドナーから本発明の方法において出発物質として使用されるＰＢＭＣを得ること、および同種間アプローチをこの治療に対して採用することが必要であり得る。この場合、γδＴ細胞の安全な同種間使用を促進するために、増殖された生成物からγδＴ細胞を精製して、特に有害である可能性があるＢ細胞（ＣＤ１９＋）およびαβＴ細胞を除去することが望ましい。
【００１５】
ＴＧＦ−βは、適切には、０．１〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば約５ｎｇ／ｍＬの濃度で培地中に存在する。しかし、添加されるＴＧＦ−βの正確な量は、使用されるＴＧＦ−βの生物学的活性に依存し得る。これは、活性単位と均等であるＥＤ５０値を生じさせる適切なバイオアッセイを使用して決定され得る。例えば、ＴＧＦ−βに対するＥＤ５０は、ＴＧＦ−βがマウスＨＴ−２細胞のマウスＩＬ−４依存性増殖を阻害する能力によって決定され得る。一般的には５ｎｇ／ｍＬの濃度は２×１０５単位の比活性と同じである。したがって、適切には、４×１０３〜４×１０６単位のＴＧＦ−βを培地に添加し、この単位は上記のように決定される。
【００１６】
本出願人らは、これに関連して、培地の性質が重要であり得ることを見出した。特に、本出願人らにより使用される培地は製造管理および品質管理に関する基準（ＧＭＰ）下で作製されており、従来のＴ細胞培地中に含まれることが多いウシ胎児血清またはウシ胎仔血清を含有しない［１４、１５（パーソナルコミュニケーション、Ｄｒ  Ｒｉｔａ  Ｃａｓｅｔｔｉ）］。培地のこれらの特定の属性は、制御Ｔ細胞よりもむしろ抗腫瘍活性を有するエフェクター細胞の増殖に有利であるＴＧＦ−β存在下でのＴ細胞の発生に影響を与えると思われる。
【００１７】
特に本培地は、血清不含培地、例えばＴｅｘＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）などの合成培地またはＲＰＭＩなどを含み、ヒトＡＢ血清のさらなる存在下で行われ得る。本培地は適切にはＧＭＰグレード培地である。
【００１８】
さらに、使用される培地はインターロイキン−２（ＩＬ−２）をさらに含み得る。さらなるサイトカインが存在し得るが、ただしそれらは、主に抗腫瘍および抗白血病活性があるエフェクター型Ｔ細胞であるものとしてのその生成物の性質を変化させないものとする。しかし、特定の実施形態において、本培地はさらなるサイトカインを全く含有しない。
【００１９】
インターロイキン−２は、適切には、１〜１０００Ｕ／ｍＬ、例えば約１００Ｕ／ｍＬの量で培地中に存在し、Ｕは単位である。これに関連して、１単位のＩＬ−２は、温置２４時間後での、ＩＬ−２−依存性マウスＴ細胞による、それらの最大レベルの５０％の３Ｈ−ＴｄＲの組み込みを誘導する１ｍＬ中のＩＬ−２の量として定義され得る。
【００２０】
存在する場合、ＴＧＦ−βならびにＩＬ−２は、適切には、特に細胞増殖に反応して、培養工程中にある間隔で繰り返し添加され、これは、適切には細胞数を数えることによって期間中にわたり監視される。
【００２１】
出発物質として使用される細胞は活性化される。特定の実施形態において、これは、特にＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を活性化可能な活性化因子を添加することによって達成され得る。適切な活性因子は、ゾレドロン酸（ＺＡ）、アレンドロン酸（ＡＡ）、パミドロン酸（ＰＡ）およびイバンドロン酸（ＩＡ）などのアミノ−ビスホスホネート薬を含み得る。特定の実施形態において、活性化因子はゾレドロン酸またはその塩である。あるいは細胞は、ＢＲＨＰＰまたはＩＰＰなどのホスホ抗原を使用して活性化され得る。
【００２２】
活性化因子は適切には有効量で添加される。添加は、存在する場合、ＴＧＦ−βおよびＩＬ−２の第一の添加とともに行われ得る。添加される活性化因子の濃度は、使用される具体的なタイプの活性化因子などの因子に依存するが、一般的には０．１〜１０μｇ／ｍＬ、例えば約１μｇ／ｍＬの範囲である。
【００２３】
上記のような増殖後、増殖された生成物の精製によってγδＴ細胞が得られ得る。特に、ＣＤ１９およびαβＴ細胞は、陰性選択により、または適切な単離技術もしくはキットの使用により生成物から除去し得る。本出願人らは、γδＴ細胞が増殖前にＰＢＭＣから単離される場合、増殖工程が無効になり得ることを見出した。
【００２４】
上記の方法を用いて、インビトロで増殖されるエフェクターＴ細胞の収率が向上し得るため、Ｔ細胞増殖収率を促進するためのこの方法の適用は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００２５】
同様に、下記のように、この方法を使用して得られるＴ細胞の有効性、特に、抗癌効果における有効性が促進される。結果として、本発明は、上記の増殖方法の使用によりインビトロで増殖されるＴ細胞の抗癌効果を促進するための方法をさらに提供する。
【００２６】
本発明のまたさらなる態様は、エフェクターＴ細胞、および特に上記のような悪性疾患の処置において有用であるヒトＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖を促進するためのＴＧＦ−βの使用を提供する。
【００２７】
さらなる態様において、本発明は、Ｔ細胞の抗癌エフェクター能を促進するためのＴＧＦβの使用を提供する。
【００２８】
上記のような方法により得られるＴ細胞は、本発明のさらなる態様を形成する。これらは、治療においておよび特に癌の処置のために使用され得る。
【００２９】
従来のように患者の処置において細胞を使用し得る。特に、本発明は、上記のように得られるＴ細胞の投与により、処置を必要とする患者を処置するための方法も提供する。特に、Ｔ細胞は、標準的な臨床診療に従って患者に養子導入される。
【００３０】
特に、本明細書中に記載のものなどの活性化因子および／または化学療法剤と併せて細胞を投与し得る。適切な活性化因子としては、ビスホスホネート薬、例えば、ゾレドロン酸、アレンドロン酸およびパミドロン酸などが挙げられる。これらは、Ｔ細胞を活性化し得、またＴ細胞に対して腫瘍を感受性にすることもできる。
【００３１】
ある種の化学療法剤は、γδＴ細胞に対して腫瘍を感受性にし［１８］、したがって、これらを前投与または本発明のγδＴ細胞と同時投与し得ることも分かった。このような化学療法酸の特定の例としては、シスプラチン、エトポシド、アントラサイクリン、および本明細書中で後に例示するようにシタラビンが挙げられる。
【００３２】
抗腫瘍効果を生じさせるために、シタラビンとそれに続いてγδＴ細胞とを連続的に投与したのは本出願人らが最初であり、この新規治療は本発明のさらなる態様を形成する。この治療において、有効量のγδＴ細胞およびシタラビンを、それを必要とする患者に投与する。特に、γδＴ細胞は本発明に従って得られる。
【００３３】
Ｔ細胞の生存を延長させるために、ＩＬ−２などのサイトカインを同時投与することも望ましいものであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
ここで、次の添付の図面を参照して、例として本発明を詳細に記載する。
【００３５】
【図１】図１は、メバロン酸経路を示す概略図である。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞により認識されるホスホ抗原（ＰＡｇ）としては、ＤＭＡＰＰ、ＩＰＰおよびＡｐｐｐｌが挙げられる。アミノ−ビスホスホネートおよびスタチンによる経路の阻害のポイントは、円により示され、ＩＰＰ＝イソペンテニル二リン酸およびＤＭＡＰＰ＝ジメチルアリルである。
【図２】図２は、比較方法（方法１）を使用したＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞のエクスビボ増殖の結果を示す。上記条件を使用した培養後、２０ｍＬ血液試料あたりのγδＴ細胞のパーセンテージ（Ａ）および絶対数（Ｂ）を培養期間の最初および１５日後に評価した。（Ｃ）フローサイトメトリーにより、予想されるＶγ９およびＶδ２Ｔ細胞受容体サブユニットの発現を決定した。健康なドナーおよび新規にＥＯＣと診断された女性由来で、エクスビボで１５日間にわたり増殖されたγδＴ細胞のプール（Ｄ）および代表的（Ｅ）免疫表現型データ（ドナー数は括弧中に示す）。
【図３】図３は、比較方法１を使用したヒトＡＢ血清ありおよびなしの様々な培地中でのＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の増殖の結果を示す。パネルは、培養１４日後の全細胞数（Ａ）、存在するγδＴ細胞の％（Ｂ）およびγδＴ細胞の収量（Ｃ）を示す。
【図４】図４は、次のとおりの一連の卵巣癌細胞株に対するアッセイにおける、比較方法１を用いて増殖された細胞を使用した細胞毒性アッセイの結果を示す：（Ａ）ＩＧＲＯＶ−１；（Ｂ）ＫＯＣ７Ｃ；（Ｃ）ＰＥＯ１；（Ｄ）ＰＥＡ；（Ｅ）ＳＫＯＶ−３；（Ｆ）ＴＯＶ−２１Ｇ。
【図５】図５は、本発明によるエクスビボでＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を増殖させるための方法を使用して得られる結果を示す。結果は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞の濃縮（Ａ）および増殖（Ｂ）を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１３  独立した反復）。製造開始および終了時に存在する％γδＴ細胞も示す（平均±ＳＤ、ｎ＝１０）。＊ｐ＝０．０３、マンホイットニー検定による。
【図６】図６は、方法１および方法２により増殖されたγδＴ細胞の比較抗腫瘍活性を示す。方法１または２の何れかを使用した２週間にわたるγδＴ細胞の増殖後、９６ウェルプレート中で５：１エフェクター：標的比において３つ組で細胞毒性アッセイを確立した。細胞毒性アッセイを行う前に２４時間にわたり指定のアミノビスフォスフォネートを用いて腫瘍細胞を培養した。Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞とともに一晩共培養した後、ＭＴＴまたはルシフェラーゼアッセイにより、残留する腫瘍細胞生存能を測定した。データは、指定の卵巣癌細胞株（Ａ）ＩＧＲＯＶ−１、（Ｂ）ＳＫＯＶ−３、（Ｃ）Ｋｕｒａｍｏｃｈｉおよび（Ｄ）ＴＯＶ−２１Ｇ；骨髄性白血病細胞株（Ｅ）Ｕ９３７および（Ｆ）ＫＧ−１および乳癌細胞株（Ｇ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（Ｈ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８および（Ｉ）ＢＴ−２０を用いて行った、２〜５回の独立した反復実験からの平均±ＳＥＭ腫瘍細胞死滅を示す。
【図７】図７は、方法１および方法２により増殖されたγδＴ細胞によるサイトカイン産生を示す。方法１または２を用いてγδＴ細胞を増殖させ、次いで、図６に記載のようにビスホスホネート添加または未添加腫瘍細胞とともに共培養した。次いで共培養２４時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりインターフェロン−γ（Ａ〜Ｉ）およびインターロイキン−２（Ｊ〜Ｏ）について分析した。インターフェロン（ＩＦＮ）−γ産生を、次の卵巣癌細胞株（Ａ）Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、（Ｂ）ＩＧＲＯＶ−１、（Ｃ）ＳＫＯＶ−３、（Ｄ）ＴＯＶ−２１Ｇ；乳癌細胞株（Ｅ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８；（Ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；（Ｇ）ＢＴ−２０；骨髄性白血病細胞株（Ｈ）Ｕ９３７、（Ｉ）ＫＧ−１について示す。インターロイキン−２産生を、（Ｊ）Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、（Ｋ）Ｕ９３７、（Ｌ）ＫＧ−１、（Ｍ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（Ｎ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８および（Ｏ）ＢＴ−２０腫瘍細胞を用いて行われた共培養実験に対して示す。データは、３〜５回の独立した反復実験からの平均±ＳＥＭを示す。
【図８】図８は、方法１および方法２により増殖されたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の免疫表現型分析の結果を示す。（Ａ）方法２により増殖された細胞は、メモリー（ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ２７）およびホーミング受容体（ＣＣＲ７、ＣＸＣＲ４、皮膚白血球抗原（ＣＬＡ）およびＥ−セレクチン結合受容体のより高いレベルでの個々の免疫表現型を発現する（Ｅ−セレクチン−ＩｇＧ融合タンパク質を用いて検出−Ｂ）。（Ｃ）方法、１と比較して（ｒｅｌ．）、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋  ＣＣＲ７＋）およびセントラルメモリー（ＣＤ４５−ＣＤ２７＋）細胞の割合は、方法２により増殖された細胞においてより高かった。ＮＳ−有意差なし；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図９】図９は、方法１および異なる基礎培地（ＲＰＭＩ＋１０％ヒトＡＢ血清）中の、本発明の方法を使用して得られた培養物中に存在する細胞数（Ａ）およびγδＴ細胞のパーセンテージ（Ｂ）の評価の結果を示す。
【図１０】図１０は、ＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスにおける悪性疾患の確定負荷量（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｕｒｄｅｎ）（Ｕ９３７白血病）に対する、静脈内投与された、方法１および本発明の方法を使用して得られた増殖Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞のインビボ治療活性を示す。
【図１１】図１１は、ＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスにおける悪性疾患の確定負荷量（Ｕ９３７白血病）に対する、静脈内投与された、本発明の方法を使用して得られた増殖Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞のインビボ治療活性を示し、  （Ａ）は、生体発光により示される腫瘍量を示し；および  （Ｂ）は、処置の毒性の指標を提供するマウス体重を示す。
【図１２】図１２は、悪性疾患の確定負荷量（ＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスの乳房脂肪体に移植されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳癌）に対する、静脈内投与された、方法２を使用して得られた増殖Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞のインビボ治療活性を示す。（Ａ）生体発光により示される腫瘍量。（Ｂ）マウスの生存。（Ｃ）処置の毒性の指標を提供するマウス体重。
【図１３】図１３は、様々な精製方法の使用の結果を示し、（Ａ）は、ＣＤ１９およびαβＴ細胞マイクロビーズ単離キットを使用した陰性選択によって新鮮単離ＰＢＭＣからＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞がどのように精製されたかを例示し；（Ｂ）は、これらの細胞を増殖させる試みの結果を示し；（Ｃ）は、陰性選択によるＣＤ１９およびαβＴ細胞の続く枯渇前に本発明の方法を使用してＰＢＭＣからγδＴ細胞を増殖させた実験において得られた％細胞タイプを示し；（Ｄ）は、混入ＣＤ１９およびαβＴ細胞の枯渇後のこれらの細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示し；（Ｅ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（２３１）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（４６８）またはＢＴ２０トリプルネガティブ腫瘍細胞に対する、または（Ｆ）Ｕ９３７もしくはＫＧ−１骨髄性白血病細胞に対する、細胞（５：１エフェクター：標的比）の２４時間細胞毒性試験の結果を示し；（Ｇ）は、処理した乳癌共培養物から回収された上清中のサイトカイン濃度を示し、（Ｈ）は、処理した白血病共培養物から回収された上清中のサイトカイン濃度を示す（ｎ＝２）。
【図１４】図１４は、非形質導入対照（Ａ）と比較した場合の、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティング固体相上にウイルスベクターを予め負荷した技術を用いた（Ｂ）、または細胞へのウイルス上清の添加による（Ｃ）、本発明の方法を使用して得られた遺伝子改変γδＴ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１５】図１５は、本発明の方法を用いて得られたいくつか（Ｍ２）を含む、γδＴ細胞の添加に先駆けて２４時間にわたり様々な濃度で化学療法剤、シタラビンにより処理した場合の、腫瘍細胞（（Ａ）Ｕ９３７細胞および（Ｂ）ＫＧ１細胞）に対するインビトロ細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図１６】図１６は、シアタラビンおよびＩＬ−２単独使用と比較した場合の、シアタラビンおよびＩＬ−２と組み合わせて本発明のγδＴ細胞が投与されるインビボ試験の結果を示す一連のグラフであり、（Ａ）は、投与後のデータ４、１１、１９および２６における、悪性細胞からの生体発光により示される場合の腫瘍量を示し、（Ｂ）は、試験期間中にわたるマウス体重を示す。それぞれの場合に、γδＴ細胞注入２４時間前に単回投与としてシアタラビンを注射した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
比較例Ａ
先行研究において、本出願人らは、健康なドナーが１９，９１６±２９，８８７（平均±ＳＤ、ｎ＝２１）個の循環γδＴ細胞を有することを示している。対して、新規ＥＯＣ診断患者は、１４，２４０±１５，２１５個のγδ細胞／ｍＬ血液を有した（平均±ＳＤ、ｎ＝１３；統計学的に有意差なし（ＮＳ））［１６］。
【００３７】
これらの細胞を濃縮するために、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＺＡで活性化し、ＩＬ−２／ＩＬ−１５を補給したＡＢ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。具体的には、正常（健康な）ドナー（ｎ＝２１名の個別ドナー）およびＥＯＣ患者（ｎ＝１３名の個別のドナー）から単離したＰＢＭＣをＺＡ（１μｇ／ｍＬ、第１日のみ）、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍＬ）とともに培養した。サイトカインおよび培地を毎日添加した。
【００３８】
培養期間の初期および１５日後のγδＴ細胞のパーセンテージ数および２０ｍＬ血液試料あたりのγδＴ細胞の絶対数を評価した。結果を図２（Ａ）および２（Ｂ）でそれぞれ示す。この「研究グレード」方法の結果、γδＴ細胞の平均増殖は、９７倍（ＥＯＣ患者）または１７２倍（健康なドナー；ＮＳ）となった（図２Ｂ）。
【００３９】
フローサイトメトリーにより、予想されるＶγ９およびＶδ２Ｔ細胞受容体サブユニットの発現を決定し、結果を図２（Ｃ）で示す。明らかであるように、患者および健康なドナー由来の増殖γδＴ細胞は、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞受容体を発現した。
【００４０】
健康なドナーおよび新規ＥＯＣ診断女性（ドナー数を括弧内で示す）由来の、１５日間にわたりエクスビボで増殖されたγδＴ細胞のプールおよび代表的免疫表現型データも得、その結果を図２（Ｄ）および２（Ｅ）でそれぞれ示す。γδＴ細胞が殆どであり、少数の混入γδＴ細胞およびナチュラルキラー（ＣＤ１６＋５６＋、ＣＤ３−）細胞がある。増殖細胞は主にエフェクターおよびエフェクターメモリー表現型を呈し、これは患者および健康なボランティアにおいて同様である。本発明者らは、続いてＩＬ−１５の添加により、得られた細胞の収率に対して顕著な差が生じなかったことを見出し、これは、その後の増殖実行から省いた（データは示さない）。
【００４１】
γδＴ細胞生成物の製造を臨床使用に適応させるために、本発明者らは、ＺＡ＋ＩＬ−２を使用して、これらの細胞の増殖を支援する能力について市販のＧＭＰ培地を試験した。臨床グレードの血清不含培地を使用して上記のような方法を繰り返した。１０％ヒトＡＢ血清ありまたはなしで、ＲＰＭＩ＋１０％ヒトＡＢ血清または２種類の市販のＧＭＰグレード培地中でＰＢＭＣを培養した。それぞれの場合に、γδＴ細胞を活性化するためにＺＡ（１μｇ／ｍＬ）を添加し、次いでＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）の添加により、これを増殖させた。結果を図３で示す。これらは、特にＴｅｘＭＡＣＳ培地により、「方法１」において血清不含状態下でこれらの細胞の増殖が可能になることを示す。
【００４２】
９６ウェルプレート中で５：１エフェクター：標的比において３つ組で細胞毒性アッセイを確立し、結果を図４で示す。示される場合、γδＴ細胞の添加前に腫瘍細胞に指定濃度のゾレドロン酸（ＺＡ）またはパミドロン酸（ＰＡ）を２４時間にわたり添加した。（Ａ）ＩＧＲＯＶ−１；（Ｂ）ＫＯＣ７Ｃ；（Ｃ）ＰＥＯ１；（Ｄ）ＰＥＡ；（Ｅ）ＳＫＯＶ−３；（Ｆ）ＴＯＶ−２１Ｇに対するＭＴＴアッセイにより、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞との一晩の共培養後、残留する腫瘍細胞生存能を測定した。結果から、方法１を使用して増殖されたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞は、一連の卵巣および他の腫瘍細胞株に対して広いＮＢＰ促進型の抗腫瘍活性を示したことが示される。
【実施例】
【００４３】
実施例１
本発明によるＴ細胞の増殖
次に、本発明者らは、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−βが常にＩＬ−２と一緒に添加されるように、方法１を改変した。このアプローチは、本明細書中で以後、方法２と呼ぶ。
【００４４】
上記実施例Ａの方法の改変法において、クエン酸抗凝固剤入りのチューブで健康なドナーまたは患者から血液を回収した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ）を使用して、以前に公開されている方法に従い、ＰＢＭＣを単離した［１７］。
【００４５】
次いで、細胞３×１０６個／ｍＬでＧＭＰ  ＴｅｘＭＡＣＳＭｅｄｉａ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で単離ＰＢＭＣ細胞を再構成した。再構成細胞に対して、１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２および５ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−βと一緒に１μｇ／ｍＬゾレドロン酸（Ｚｏｍｅｔａ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を活性化因子として添加した。５％二酸化炭素を含有する空気中で細胞を３７℃で温置した。
【００４６】
第３日に、細胞に１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２および５ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−βを供給した。その後、第４、７、９、１１、１３、１５日に、血球計数器を使用してトリパン排除により細胞数を数えた。Ｔ細胞の数が１×１０６個／ｍＬ未満である場合、さらなる１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２および５ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−βを添加した。Ｔ細胞数が１×１０６〜２×ｌ０６個／ｍＬである場合、１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２および５ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−βと一緒に等体積のＴｅｘＭＡＣＳ培地を添加した。Ｔ細胞数が２×１０６個／ｎＬより多い場合、１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２および５ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−βと一緒に２倍の体積のＴｅｘＭＡＣＳ培地を添加した。
【００４７】
１５日後、これらの培養においてγδＴ細胞の濃縮を確認するために、パンγδ抗体を使用してフローサイトメトリーによって細胞を分析した。結果を図５で示す。これらは、改変法によってＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の濃縮（Ａ）および増殖改善（Ｂ）が達成されることを示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１３、独立した反復）。
【００４８】
さらに、Ｔ細胞を免疫表現型について特徴評価し、機能試験に供した。上記方法１または本発明の方法を使用して得られたＴ細胞の、腫瘍細胞の細胞毒性破壊に介在する相対的能力を評価した。方法１または２の何れかを使用して、２週間にわたるγδＴ細胞の増殖後、９６ウェルプレート中で５：１エフェクター：標的比において３つ組で細胞毒性アッセイを確立した。指示される場合、γδＴ細胞の添加前に腫瘍細胞に指定濃度のゾレドロン酸（ＺＡ）、アレンドロン酸（ＡＡ）またはパミドロン酸（ＰＡ）を２４時間にわたり添加した。（Ａ）ＩＧＲＯＶ−１、（Ｂ）ＳＫＯＶ−３、（Ｃ）Ｋｕｒａｍｏｃｈｉおよび（Ｄ）ＴＯＶ−２１Ｇ；骨髄性白血病細胞株（Ｅ）Ｕ９３７および（Ｆ）ＫＧ−１および乳癌細胞株：（Ｇ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（Ｈ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８および（Ｉ）ＢＴ−２０について、ＭＴＴまたはルシフェラーゼアッセイにより、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞とともに一晩共培養した後、残留する腫瘍細胞生存能を測定した。結果を図６で示す。
【００４９】
ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの放出の測定により、腫瘍細胞と共培養した場合のγδＴ細胞の活性化を評価した。これらの増殖γδＴ細胞が悪性疾患の確定負荷量を制御する能力も、Ｕ９３７骨髄性白血病の確定負荷量があるＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスにおいて評価した。
【００５０】
培養工程中にＴＧＦ−βを含めることに対する元来の論理的根拠は、これらの細胞におけるＣＸＣＲ４などのホーミング受容体の発現を改善しようとすることである。しかし、完全に予想外に、ＴＧＦ−βの添加の結果、図５で示されるようにＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の収率が実質的に向上した。
【００５１】
方法２により増殖された細胞生成物はまた、ＮＢＰ曝露がない状態でも、ＥＯＣ（ＩＧＲＯＶ−１、ＳＫＯＶ−３、Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、ＴＯＶ−２１Ｇ）、乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）および骨髄性白血病細胞（Ｕ９３７）に対して均等な抗腫瘍活性または抗腫瘍活性の向上を示した（図６；図１０）。しかし、予めＮＢＰ感受性を高めることにより、抗腫瘍活性が一貫して促進された（図６）。
【００５２】
方法１または２の何れかを用いた２週間にわたるγδＴ細胞の増殖後、９６ウェルプレート中で５：１エフェクター：標的比において３つ組で共培養を確立した。指示される場合、γδＴ細胞の添加前に腫瘍細胞に指定濃度（μｇ／ｍＬ）のゾレドロン酸（ＺＡ）またはパミドロン酸（ＰＡ）を２４時間にわたり添加した。さらに２４時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってインターフェロン−γまたはインターロイキン−２について分析した。結果を図７で示す。インターフェロン（ＩＦＮ）−γ産生を次の腫瘍細胞単層：卵巣癌細胞株（Ａ）Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、（Ｂ）ＩＧＲＯＶ−１、（Ｃ）ＳＫＯＶ−３、（Ｄ）ＴＯＶ−２１Ｇ；乳癌細胞株（Ｅ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８；（Ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；（Ｇ）ＢＴ−２０；骨髄性白血病細胞株（Ｈ）Ｕ９３７、（Ｉ）ＫＧ−１について示す。さらに、（Ｊ）Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ、（Ｋ）Ｕ９３７、（Ｌ）ＫＧ−１、（Ｍ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、（Ｎ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８および（Ｏ）ＢＴ−２０腫瘍細胞を用いて行った共培養実験について、インターロイキン−２産生を示す。
【００５３】
方法１を用いて増殖された細胞と比較した場合、方法２により増殖された細胞は、腫瘍細胞標的に関与したとき、顕著により高いレベルのＩＦＮ−γを産生した。この効果は、形質転換された細胞に非常に低濃度のＮＢＰ剤を添加した場合に最も顕著であった（図７Ａ〜Ｇ）。方法２によって増殖された細胞はこれらの条件下でＩＬ−２も産生し、この所見は、方法１により増殖された細胞を用いた場合には観察されなかった（図７Ｈ〜Ｋ）。
【００５４】
最後に、従来の方法を使用して方法１および方法２細胞の表現型を調べ、結果を図８で示す。方法２により増殖された細胞は、高レベルのホーミング受容体（ＣＸＣＲ４、ＣＬＡ、Ｅ−セレクチン結合活性）およびメモリーマーカー（ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＯ）とともに特有の表現型を発現することが分かった。さらに、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋およびＣＣＲ７＋）およびセントラルメモリー（ＣＤ４５−およびＣＤ２７＋）細胞の割合は、方法１により増殖された細胞と比較した場合、方法２により増殖された細胞でより高かった。したがって、これらの細胞は他の増殖プロトコールを使用して作製された細胞と識別可能である。
【００５５】
実施例２
代替的な細胞増殖工程
異なる基礎培地、具体的にはＲＰＭＩ＋ヒトＡＢ血清を使用して上記実施例１の方法を反復した。特に、ゾレドロン酸（１μｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ；方法１）またはゾレドロン酸（１μｇ／ｍＬ）＋ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍＬ）＋ＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍＬ；方法２）を含有するＲＰＭＩ＋１０％ヒトＡＢ血清中でＰＢＭＣ（細胞３×１０６個／ｍＬ）を培養した。第１５日に細胞数を評価し、結果を図９Ａで示す。培養開始日（第１日）およびさらに１４日後（第１５日）に各培養中に存在するγδＴ細胞のパーセンテージを評価し、結果を図９Ｂで示す。
【００５６】
前述同様、ＴＧＦ−βの添加により細胞増殖が促進されたことは明確である。
【００５７】
実施例３
インビボ治療活性
さらに、悪性疾患の確定負荷量に対する増殖Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞のインビボ治療活性を比較した。２０匹のＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスに尾静脈注射により１×１０６個のホタルルシフェラーゼ発現Ｕ９３７白血病細胞を接種し、次いでマウスを各５匹の４つの群に分けた。４日後、マウスを次のように処置した：群１は、ＰＢＳのみを投与した対照群である。群２にはパミドロン酸（２００μｇ  ＩＶ）のみを投与した。群３にはパミドロン酸（第４日に２００μｇ  ＩＶ）、続いて、方法１を用いて増殖された２０×１０６個（第５日）および１０×１０６個（第６日）個のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞（ＩＶ）を投与した。群４には、パミドロン酸（第４日に２００μｇ  ＩＶ）、続いて方法２を用いて増殖された２０×１０６個（第５日）および１０×１０６個（第６日）個のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を投与した（ＩＶ投与）。その後、連続生体発光イメージングによって白血病細胞量を監視した。
【００５８】
結果を図１０で示す。本発明の方法２によって得られた細胞の有効性は、このアッセイにおいて顕著により大きいことが明確である。
【００５９】
実施例４
ＩＬ−２と合わせた本発明の細胞のインビボ活性
個別の実験において、静脈内投与された、ＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスにおける悪性疾患の確定負荷量（Ｕ９３７白血病）に対する本発明の方法（Ｍ２）を用いて得られた増殖Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞のインビボ治療活性を測定した。マウスを５匹の４つの群に分け、それぞれ第１日に１００万個のＵ９３７細胞をＩＶ投与した。その後、１つの群に、次のようにまとめられ得る処置を行った。
0006802159.tif 000002
【００６０】
投与する場合、Ｕ９３７細胞での処置から２４時間後に２０μｇゾレドロン酸を静脈内投与した。１日後、Ｍ２細胞を投与したマウスに１５，０００，０００個のγδＴ細胞の静脈内処置を２回行った。ＩＬ−２を投与したマウスにＭ２投与と同時に腹腔内（ＩＰ）経路により１０，０００ＵのＩＬ−２を与えた。続く２日間に、マウスに１０，０００Ｕ  ＩＬ−２  ＩＰを与えた。対照群にはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のみを与えた。
【００６１】
第７、１５、２１および２８日に、腫瘍量の指標として悪性細胞からの生体発光を測定した。結果は１１Ａで示す。この結果から、特に活性化因子とともに投与した場合、本発明の方法を用いて得られたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞が腫瘍量を顕著に減少させることが示される。
【００６２】
処置の毒性の指標を提供するために、一連の処置にわたりマウスの体重を測定した。図１１Ｂで示される結果から、この処置と関連する顕著な毒性はないことが示される。
【００６３】
実施例５
乳癌に対するインビボ治療効果
この実験において、マウスの乳房脂肪体に移植したＭＤＡ−ＭＢ−２３１トリプルネガティブ乳癌の形態の悪性疾患の確定負荷量を有する２０匹のＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスを使用した。再び、マウスを処置に対して４つの群に分けた。マウスを次のように処置した：群１は、ＰＢＳのみを投与した対照群である。群２には２０μｇゾレドロン酸を静脈内投与した。群３には、方法２を使用して増殖された２０×１０６個（第２日）および１０×１０６個（第３日）のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を静脈内投与した。群４には、第１日に２０μｇゾレドロン酸を静脈内投与し、続いて方法２を使用して増殖された２０×１０６個（第２日）および１０×１０６個（第２日）のＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を投与した。
【００６４】
生体発光により判断される得られた腫瘍量を２８日間にわたり測定した。結果を図１２で示す。この場合、本発明の方法を使用して得られた細胞によって腫瘍量が顕著に減少し（図１２Ａ）、それとともに生存期間が延長した（図１２Ｂ）。
【００６５】
処置の毒性の指標を提供するために、一連の処置期間にわたりマウスの体重を測定した。図１２Ｃで示される結果から、この処置と関連する顕著な毒性はないことが示される。
【００６６】
実施例６
増殖γδＴ細胞の精製
第一の実験において、ＣＤ１９および／またはαβＴ細胞マイクロビーズ単離キットを用いた陰性選択により、新鮮単離ＰＢＭＣからＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞を精製した。両キットを使用した場合、図１３（Ａ）で示されるように、残留する混入ＣＤ１９およびαβＴ細胞は＜０．１％であった。
【００６７】
実施例１に記載のように方法２を使用して、精製細胞を増殖に供した。しかし、これらの細胞は、図１３（Ｂ）で示されるように増殖できなかった。したがって、出発物質はＰＢＭＣを含まなければならないと思われる。
【００６８】
他の実験において、１５日間にわたり、方法２を使用してＰＢＭＣからγδＴ細胞を増殖させた。この点で、フローサイトメトリー分析から、少数のＣＤ１９＋細胞を伴い、αβＴ細胞のかなりの数が残留することが明らかになった（ｎ＝４）（図１３（Ｃ））。
【００６９】
次いで、図１３（Ａ）と関連して上記のように、陰性選択により、得られた生成物に対してＣＤ１９およびαβＴ細胞を枯渇させた。枯渇工程の効率を示すために、２つの代表的なフローサイトメトリー分析を図１３（Ｄ）で示す。
【００７０】
実施例１に記載のものと同様の方法を用いて、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８またはＢＴ２０トリプルネガティブ腫瘍細胞またはＵ９３７またはＫＧ−１骨髄性白血病細胞に対して、ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した陰性選択による精製後、２４時間細胞毒性アッセイ（５：１エフェクター：標的比）において、方法２により増殖されたγδＴ細胞を試験した。細胞を単独で、またはゾレドロン酸と組み合わせて試験した。陰性対照および活性化因子のみの対照があった。ルシフェラーゼアッセイおよび／またはＭＴＴアッセイ（ｎ＝２）によって腫瘍細胞生存能を測定した。結果を図１３（Ｅ）および図１３（Ｆ）でそれぞれ示す。明確であるように、Ｔ細胞および活性化因子の組み合わせによって腫瘍細胞生存能が顕著に低下した。
【００７１】
２４時間後、これらの乳癌および白血病共培養物から上清を回収し、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−２の存在について分析した。結果を図１３（Ｇ）および１３（Ｈ）でそれぞれ示す。サイトカインレベルは、本発明に従い増殖されたＴ細胞および活性化因子の組み合わせの場合に実質的に上昇した。
【００７２】
これらの実験から、増殖後に陰性選択により精製された場合、方法２により増殖されたγδＴ細胞が完全に機能的であるが、増殖前に精製された場合にはそうならないことが示される。この精製により、有害な可能性があるＢ細胞（ＣＤ１９＋）およびαβＴ細胞が除去されているため、これらの細胞の安全な同種間使用が促進される。
【００７３】
実施例７
増殖された細胞の遺伝子操作
本発明に従い増殖されたγδＴ細胞の機能性をさらに確認するために、レトロウイルス形質導入によってこれらを遺伝子操作した。ウイルスベクターをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティング固体相に前負荷することによるか、または増殖細胞へのウイルス上清の添加によるかの何れかで細胞に対して形質導入を行った。
【００７４】
増殖中のこれらの細胞の効率的な濃縮を保つために、ウイルス上清の添加（図１４（Ｃ））よりもむしろ、ウイルスベクターをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎコーティング固体相に前負荷すること（図１４（Ｂ））が好ましいことが明白であった。これは、前負荷方法を使用して遺伝子移入が達成される場合、より高い割合の形質転換細胞およびより高い割合のγδＴ細胞が存在することにより示される。
【００７５】
実施例８
化学療法剤とγδＴ細胞の併用の効果
Ｕ９３７腫瘍細胞またはＫＧ−１腫瘍細胞の何れかを含有する９６ウェルプレート中で１：１エフェクター：標的比において３つ組で細胞毒性アッセイを確立した。指示される場合、本発明の方法（Ｍ２）または上記の比較例の方法（Ｍ１）の何れかを使用して作製されたγδＴ細胞の添加前に、腫瘍細胞に指定濃度のシタラビンを２４時間にわたり添加した。Ｍ２細胞に対して３名のドナーおよびＭ１細胞に対して２名のドナーが存在した。対照群にはシタラビンを投与しなかった。
【００７６】
Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞とともに一晩共培養した後、ルシフェラーゼアッセイにより、残留する腫瘍細胞生存能を測定した。図１５で示される結果から、亜致死用量のシタラビンが、ＡＭＬの２種類の細胞モデルに対して、方法２を使用して増殖されたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強させたことが示される（Ｍ２細胞に対して３名のドナーおよびＭ１細胞に対して２名のドナー）。
【００７７】
個別の実験において、１５匹のＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅマウスに尾静脈注射により１×１０６個のホタルルシフェラーゼ発現Ｕ９３７白血病細胞を接種し、次いでマウスをそれぞれ５匹の３つの群に分けた。４日後、マウスを次のように処置した：群１はＰＢＳのみを投与した対照群である。群２にはシタラビン（第４日に４８０ｍｇ／Ｋｇ  ＩＶ）およびＩＬ−２（第５、６、７および８日に１００００ＩＰ）を投与した。群３にはシタラビン（第４日に４８０ｍｇ／Ｋｇ  ＩＶ）、続いて方法２を使用して増殖された２０×１０６個（第５および６日）のＶγ９Ｖδ２（ＩＶ）およびＩＬ−２（第５、６、７および８日に１００００ＩＰ）を投与した。
【００７８】
連続生体発光イメージングにより、その後に白血病細胞量を監視した。腫瘍量の指標として、第４、１１、１９および２６日に悪性細胞からの生体発光を測定した。結果を図１６（Ａ）で示すが、これは、本発明の方法を使用して得られたＶγ９Ｖδ２Ｔ細胞が、シタラビンとともに投与した場合に最も効果的に腫瘍量を減少させることを示す。処置の毒性の指標を提供するために、一連の処置にわたりマウスの体重を測定した。図１６（Ｂ）で示される結果は、この処置と関連する顕著な毒性がないことを示す。
【００７９】
参考文献
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【図１】
0006802159.tif 000003
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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