(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的化シークエンシング反応におけるオフターゲット配列捕捉用のプローブを提供する方法であって、
試料をシークエンシングするために一組の標的特異的ハイブリダイゼーションプローブの要求をリクエスタから受信するステップと、
前記標的特異的ハイブリダイゼーションプローブをリファレンス試料から生成された複数の核酸フラグメントを含むリファレンス核酸ライブラリと接触させて前記標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに結合した標的特異的及びオフターゲット核酸フラグメントのリファレンス群を生成するステップと、
未結合核酸フラグメントから前記標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに結合した前記核酸フラグメントの前記リファレンス群を分離するステップと、
核酸フラグメントの前記リファレンス群をシークエンシングしてリファレンスシークエンシングデータを生成するステップと、
前記リファレンスシークエンシングデータ内のオフターゲット配列を同定するステップと、
前記同定したオフターゲット配列に基づいて、複数のオフターゲット配列に特異的に結合する一組のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを前記リクエスタに提供するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記同定したオフターゲット配列に基づいて前記一組のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを提供するステップは、前記シークエンシングデータ内の複数のオフターゲット配列の頻度をランク付けするステップ及び複数の最も高い頻度のオフターゲット配列を選択し、前記オフターゲットハイブリダイゼーションプローブを前記最も高い頻度のオフターゲット配列に対して特異的になるように設計するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の最も高い頻度のオフターゲット配列を選択するステップは、前記ランクに従って所定の数のオフターゲット配列を選択するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の数は５０００以下の異なるオフターゲット配列である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記標的特異的ハイブリダイゼーションプローブは１０，０００以上の異なる標的配列に対して特異的である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の最も高い頻度のオフターゲット配列を選択するステップは、前記リファレンスシークエンシングデータ内の少なくとも５０％のオフターゲット配列リードと関連するオフターゲット配列のサブセットを選択するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記同定したオフターゲット配列に基づいて一組のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを提供するステップは、前記リファレンス試料内のオフターゲット配列に対応する遺伝子位置を同定し、所定の遺伝子位置と関連する複数のオフターゲット配列を選択し、前記オフターゲットハイブリダイゼーションプローブを前記所定の遺伝子位置に対して特異的になるように設計するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記所定の遺伝子位置はイントロン位置又は遺伝子間位置である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記一組の標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを提供するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一組の標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを合成する要求を受信するステップ及び前記標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを合成するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記一組の標的特異的ハイブリダイゼーションプローブは標的特異的ハイブリダイゼーションプローブのユーザ定義カスタムセットである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記オフターゲットハイブリダイゼーションプローブと前記リファレンス試料の併用と関連するシークエンシングコストの推定削減を提供するステップを含み、前記シークエンシングコストの推定削減はオフターゲット配列の削減に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ユーザ試料に対するシークエンシング予算を含むユーザ入力を受信するステップと、前記予算、前記標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いるシークエンシングのコスト及び前記シークエンシングコストの推定削減に基づいて、前記ユーザ試料に対して前記オフターゲットハイブリダイゼーションプローブのサブセットの使用を勧めるステップを含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本願は、２０１５年１０月７日に出願された「ＤＡＴＡ−ＧＵＩＤＥＤ ＤＥＳＨＩＧＮ  ＯＦ  ＨＹＢＲＩＤ  ＣＡＰＴＵＲＥ  ＯＦＦ−ＴＡＲＧＥＴ  ＲＥＤＵＣＥＲＳ」と題する米国仮出願第６２／２３８，４１１号の優先権を主張するものであり、その仮出願の開示内容はあらゆる目的のために参照することにより本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明は概して核酸シークエンシングの分野に関する。特に、本発明は、標的化シークエンシングワークフローにおいてシークエンシングすべき核酸の標的捕捉を高め、オフターゲット捕捉を低減する技術に関する。
【０００３】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）プラットフォームのシークエンシング技法は一般的に核酸フラグメントライブラリを利用する。標的化シークエンシング技術では、ゲノムの関心のある遺伝子又は部位を含むフラグメントのサブセットを核酸ライブラリから分離し、シークエンシングする。ＮＧＳを用いる標的化アプローチは、研究員が時間、費用及びデータ解析を特定の関心領域に集中することを可能にする。このような標的化解析は、エクソーム（ゲノムの蛋白質コーディング部分）、関心のある特異遺伝子、遺伝子内の標的、又はミトコンドリアＤＮＡを含む。標的化アプローチは、より包括的であるがすべてのユーザに関心があるわけではないゲノムの部位のシークエンシングも含む全ゲノムシークエンシングアプローチと対比をなすものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
標的化シークエンシング技術の一例では、ハイブリッドキャプチャ法は核酸ライブラリ内の標的配列にハイブリダイズするプローブのパネル又はセットを使用する。プローブの標的配列へのハイブリダイゼーションはこれらの配列をシークエンシング用ライブラリ内のフラグメントの残部から分離することができる。核酸ライブラリの一部分のみを標的化することによって、ハイブリッドキャプチャ法は関心のある配列を含まないオフターゲット核酸のフラグメントのシークエンシングを避ける。しかし、アンプリコンベースの標的濃縮法と異なり、ハイブリッド法は高率のオフターゲットシークエンシングを示し、ひいては低いオンターゲット（的中）特異性を示す。例えば、一部のハイブリッドキャプチャ法は、Ｃｏｔｌ、ｔＲＮＡ、鮭の精子ＤＮＡ、ｐｏｌｙ（ｄＩｄＣ）等の市販のハイブリダイゼーションブロッカー及びライブラリフラグメントの万能アダプタを標的化するブロッカーを使用するにもかかわらず、一般的に４０％−６０％の効率を達成するのみである。オフターゲットリードはシークエンシングの収率を浪費するのみならず、低い頻度の体細胞変異を必要とする変異体を損なう可能性もある。それゆえ、標的化シークエンシング技術においてより高い特異性をもたらす改良された濃縮方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書には、一組の標的ハイブリダイゼーションプローブによりオフターゲット配列の捕捉を低減して核酸ライブラリ内の標的配列を濃縮する技術が提示される。標的ハイブリダイゼーションプローブはそれらの核酸標的に対して不完全な特異性を有するために、一組の標的ハイブリダイゼーションプローブを用いるシークエンシングランはオフターゲットである配列を表すリードもある程度を含み得る。例えば、エクソームシークエンシング反応では、いくつかのハイブリダイゼーションプローブは核酸ライブラリから標的配列と一緒にイントロン又は遺伝子間配列をプルダウンし得る。これらのオフターゲットフラグメントは、プルダウンされると、その後、シーケンスされた核酸フラグメントのプールに含まれる。オフターゲットリードを表すシークエンシング情報は一般的に廃棄されるが、本発明の技術は、これらのオフターゲット配列の取得シークエンシング情報を用いて、オフターゲット配列を含むフラグメントを標的特異的ハイブリダイゼーションプローブでキャプチャされるフラグメントのプールから分離又は除去するために使用するオフターゲット配列に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを設計する。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは、一組のハイブリダイゼーションプローブを用いて実行したハイブリッドキャプチャシークエンシングのオフターゲットリードに基づいて設計される。所定の実施形態では、オンターゲットプローブの設計も、それらの所望の標的に対する標的ハイブリダイゼーションプローブの特異性を向上させるために、複数の試料にわたってシステマティックなオフターゲット解析に基づいて行われる。
【０００６】
本明細書には、標的化シークエンシング反応におけるオフターゲット捕捉を低減する方法が提示される。本方法は、試料から生成された、複数の核酸フラグメントを含む核酸ライブラリに存在する複数のオフターゲット配列に特異的に結合する一組のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを提供するステップと、前記核酸ライブラリに存在する複数の標的配列に特異的に結合する標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを提供するステップを含む。本方法は更に、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブをオフターゲットハイブリダイゼーションプローブがオフターゲット配列にハイブリダイズする条件下で核酸ライブラリと接触させるステップ及び標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを標的特異的ハイブリダイゼーションプローブが標的配列にハイブリダイズする特定の条件下で核酸ライブラリと接触させるステップも含む。本方法は更に、核酸ライブラリから標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに結合した核酸フラグメントの群を選択するステップ及び標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに結合した核酸フラグメントの群をシークエンシングするステップも含む。
【０００７】
本明細書には、標的化シークエンシング反応においてオフターゲット配列捕捉のためのプローブを提供する方法も提示される。本方法は、一組の標的特異的ハイブリダイゼーションプローブの要求を受信するステップを含む。本方法は更に、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブをリファレンス試料から生成された複数の核酸フラグメントを含むリファレンス核酸ライブラリと接触させて標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに結合した標的特異的及びオフターゲット核酸フラグメントのリファレンス群を生成するステップ、並びに未結合核酸フラグメントから標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに結合した核酸フラグメントのリファレンス群を分離するステップを含む。本方法は更に、リファレンス群の核酸フラグメントをシークエンシングしてリファレンスシークエンシングデータを生成するステップ及び同定したオフターゲット配列に基づいて一組のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを提供するステップを含む。
【０００８】
本明細書には、標的化シークエンシング反応においてオフターゲット捕捉を低減するためのシークエンシングキットも提示される。このシークエンシングキットは、試料から生成された核酸ライブラリに存在する複数のオフターゲット配列に特異的に結合する一組のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを含む。前記核酸ライブラリは、複数の核酸フラグメントと核酸ライブラリに存在する複数の標的配列に特異的に結合する一組の標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを備える。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】核酸ライブラリのオフターゲットフラグメントに結合する標的特異的ハイブリダイゼーションプローブの概略図である。
【図２】２つ細胞系の６つの試料からのゲノムブラウザビューを示し、標的化部位（左側）及びオフターゲット部位（右側）におけるリード分布は同等のカバレッジを有する。
【図３】オフターゲットリードのゲノム分布を示すグラフである。
【図４】第１の試料に対する標的プローブとオフターゲットピークとの間の類似性を実証するグラフである。
【図５】第２の試料に対する標的プローブとオフターゲットピークとの間の類似性を実証するグラフである。
【図６】本開示の実施形態による、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブを提供する方法のフロー図である。
【図７】本開示の実施形態による、標的化シークエンシング反応におけるオフターゲット補足を低減する方法のフロー図である。
【図８】本開示の実施形態による、標的化シークエンシング反応におけるオフターゲット補足を低減する競合的ブロッキング方法の概略図である。
【図９】本開示の実施形態による、標的化シークエンシング反応におけるオフターゲット補足を低減するプレブロッキング方法の概略図である。
【図１０】本開示の実施形態による、標的化シークエンシング反応におけるオフターゲット補足を低減するプレクリアリング方法の概略図である。
【図１１】本開示の実施形態による、アダプタブロッカーを併用する標的化シークエンシング反応におけるオフターゲット補足を低減するプレブロッキング方法の概略図である。
【図１２】本開示の実施形態による、アッテネータを併用する標的化シークエンシング反応におけるオフターゲット補足を低減するプレブロッキング方法の概略図である。
【図１３】本開示の実施形態によるプローブ結合に従って分離された核酸ライブラリのフラグメントの概略図である。
【図１４】プレクリアリング後のオフターゲットピークの有意のカバレッジ低下を実証するグラフであり、各点は対照標準（ｘ軸）及びプレクリアリングプロトコルからの同一試料（ｙ軸）におけるオフターゲットピークのリードカバレッジを表す。
【図１５】プレクリアリング後のオフターゲットピークの有意のカバレッジ低下を実証するグラフであり、各点は対照標準（ｘ軸）及びプレクリアリングプロトコルからの同一試料（ｙ軸）におけるオフターゲットピークのリードカバレッジを表す。
【図１６】プレクリアリング後のオフターゲットピークの有意のカバレッジ低下を実証するグラフであり、各点は対照標準（ｘ軸）及びプレクリアリングプロトコルからの同一試料（ｙ軸）におけるオフターゲットピークのリードカバレッジを表す。
【図１７】オンターゲット部位に関するカバレッジ増加及び低下を実証するグラフであり、各点は対照標準（ｘ軸）及びプレクリアリングを有する同一試料（ｙ軸）におけるオンターゲット部位のリードカバレッジを表す。
【図１８】オンターゲット部位に関するカバレッジ増加及び低下を実証するグラフであり、各点は対照標準（ｘ軸）及びプレクリアリングを有する同一試料（ｙ軸）におけるオンターゲット部位のリードカバレッジを表す。
【図１９】オンターゲット部位に関するカバレッジ増加及び低下を実証するグラフであり、各点は対照標準（ｘ軸）及びプレクリアリングを有する同一試料（ｙ軸）におけるオンターゲット部位のリードカバレッジを表す。
【図２０】開示の実施形態と併用し得るシークエンシング装置のブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
１つ以上の実施形態の詳細が添付図面に示され、以下で説明される。他の特徴、目的及び利点は、発明の詳細な説明、図面及び請求の範囲の記載から明らかになる。
【００１１】
標的配列をハイブリダイゼーションプローブによる結合によって選択するハイブリッドキャプチャ法は、高いオフターゲット結合率及び低いオンターゲット特異性と関連する。本発明の技術は、ハイブリッドキャプチャシークエンシングワークフローにおけるオフターゲット配列の存在をデータガイドアプローチを用いて低減することによってシークエンシング効率を向上させる。いくつかの技術はプローブ結合を制御するためにブロッカー又は結合アッテネータを使用することができるが、このようなアプローチはデータガイドではない。例えば、鮭精子ＤＮＡは反応表面へのプローブの非特異的結合を阻止するために使用することができる。しかしながら、非特異的ブロッカーは標的配列に類似するオフターゲット配列への標的特異的プローブの非特異的結合を阻止しない。標的特異的プローブはそれらの目的標的に対して特異性を有する。しかしながら、オフターゲット部位に存在する配列は標的配列に十分に類似し（例えば、標的とホモロジーで高いストリング類似性を有する短いストレッチを有し）、標的配列結合に対して低い特異性を有するにも関わらず、少なくとも一部のオフターゲットが標的プローブに結合することが起こり得る。オフターゲット結合は、他の標的化シークエンシング技法に比べてハイブリッドキャプチャ技術においてよりプレバレント（高発現）である。その理由は、一つには、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブはＰＣＲベース法におけるプライマー（２５−３０ｍｅｒ）と比較して一般的に長いオリゴヌクレオチド（８０−１２０ｍｅｒ）であり、標的配列に十分な類似性を有するオフターゲットへのプローブ結合を容易にするためである。ＰＣＲベース標的化シークエンシングは一般的に特異的部位へのプライマーの両端の結合を必要とする。このダブル結合はオンターゲット結合と比較して増幅のためにランダムなオフターゲット結合を遅くする必要があり、ひいてはオフターゲット増幅を低減する。別の例では、長いオリゴヌクレオチドは短いオリゴヌクレオチドよりも、統計的にオリゴヌクレオチド内にオフターゲット配列に類似する連続塩基ストレッチを有する可能性が高い。このような相補性又は高い類似性を有する連続ストレッチはオフターゲット結合に寄与し得る。
【００１２】
本発明の技術は、ハイブリッド捕捉を向上させ、オフターゲット捕捉の割合を低減するためにオフターゲット配列に関する情報を利用する。ハイブリッド捕捉シークエンシング反応は、オフターゲット配列からの配列データを標的特異的ハイブリダイゼーションプローブの望ましくないオフターゲット結合の結果として取得し得る。このようなオフターゲットシークエンシングデータは一般的に廃棄されるが、本発明の技術はオフターゲット配列のシークエンシング情報をこれらのオフターゲット部位に対して特異的なプローブを設計するために利用する。オフターゲットに対して高い特異性を有するプローブを使用することによって、シークエンシングされたフラグメントのプールに存在するオフターゲット部位の総数を低減することができる。データガイドアプローチの結果として、所定のシークエンシングランにおけるオフターゲットシークエンシングリードの割合が低減される。従って、本発明の技術は、シークエンシングランで生成される生データの総量を低減することによってシークエンシング装置の効率を向上する利点をもたらす。更に、シークエンシングデータに存在するオフターゲットリードの低減は、同定し解析から除外すべきオフターゲット配列の量の低減によってデータ解析の効率も向上する。
【００１３】
次に図面につき説明すると、本発明技術の実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブのデータガイド設計のための入力としてオフターゲット配列データを取得する。図１は、オフターゲット配列データの取得をもたらす、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブによるオフターゲット結合を概略的に示す。最初に図１を参照するに、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブによるオフターゲット結合を用いるハイブリッドキャプチャのワークフローの概略図が示される。図１に示されるこのようなオフターゲット結合は、本明細書で提供されるオフターゲット配列を特性化するために使用されるシークエンシングデータを取得するために使用することができる。標的化シークエンシングハイブリッドキャプチャワークフローにおいて、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブは試料の関心部位に存在する配列にハイブリダイズするよう設計される。このワークフローは、試料、例えばゲノムＤＮＡ（例えば、ヒトゲノム、動物ゲノム、細菌ゲノム）又は他の核酸を含む試料、からの複数の核酸フラグメント１２からなる核酸ライブラリ１０の調製を含む。核酸ライブラリは、標的配列１４を含む関心部位からの配列を有するフラグメント（フラグメント１２ａ）並びにオフターゲット配列１６のみを有するオフターゲット（例えば、フラグメント１２ｂ）であるフラグメントを含む。標的配列１４を含むフラグメント１２は完全に関心部位からなることも、関心のない他の部位を含むこともあることを理解されたい。標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０はフラグメント１２の１つ以上の標的配列に相補的に設計される。従って、ハイブリダイゼーション条件下では、１つ以上の標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０（例えば、プローブ２０ａ，２０ｂ）は相補的標的配列１４に結合する。これは、標的配列１４を有するフラグメント１２の、標的配列１４を有しないフラグメント１２（例えば、オフターゲット配列１６のみを有するフラグメント）からの分離を容易にし、シークエンシング用の標的濃縮試料の生成を容易にする。
【００１４】
本明細書で提供されるように、標的配列１４は核酸ライブラリに存在する核酸配列であり、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０に相補的である。所望のシークエンシング結果に応じて、標的配列１４はエクソームシークエンシングのためのエクソン配列とすることができる。従って、いくつかの実施形態では、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０はエクソンの標的配列１４を対象とする。別の実施形態では、標的配列１４はカスタム配列、又は疾患特異的又はアレル（対立遺伝子）特異的配列とすることができる。標的配列１４は核酸試料の関心部位の一部とすることができ、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０は様々な評価指数に基づいて関心部位の一部に対して特異的となるように設計することができる。
【００１５】
本明細書で提供されるように、プローブ（例えば、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０）はオリゴヌクレオチド、例えば単鎖の核酸分子、である。標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０は１セット又はパネルの標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０の一部分とすることができる。標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０は８０−１２０塩基の長さ、８０−１００塩基の長さ、９０−１１０塩基の長さ、１００−１２０塩基の長さ、その他としてよい。いくつかの実施形態では、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０が８０−１２０塩基の長さである場合、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０の少なくとも３０−５０の塩基が標的配列１４と相補的である。ハイブリッドキャプチャシークエンシング反応は一組の標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０を用いて実行することができ、異なるプローブは核酸ライブラリ内の異なる標的配列１４を代表し得る。例えば、一組の標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０は少なくとも２０００の異なる標的配列１４、少なくとも５０００の異なる標的配列１４、少なくとも１０，０００の異なる標的配列１４、その他を代表し得る。更に、開示の実施形態はハイブリッドキャプチャ技法と関連して説明されるが、本明細書で提供される技術の適用はＰＣＲ又はアンプリコンベースのシークエンシング技術で実施することもできる。このような実施形態では、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０は２０−４０塩基程度の長さとすることができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０は未結合フラグメント１２からの結合フラグメント１２の分離を容易にする修飾を有してよい。このような修飾はスプレプトアビジン（例えば、スプレプトアビジンビーズ）による選択を容易にするためにプローブのビオチン化を含んでよい。しかし、本発明により提供されるプローブは結合ペアの一部である親和結合分子の他方に結合し得ることを理解されたい。例えば、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、又はジゴキシニゲンとジゴキシニゲンを結合する特異抗体、は特異結合ペアである。親和結合分子はヌクレオチドに結合し得る抗体リガンドとし得る。いくつかの実施形態では、修飾はプローブの５’末端又は３’末端に与えられる。更に、他の実施形態では、プローブは未修飾としてよい。標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０は同定を容易にする固有のバーコード又は配列を含んでもよい。このような配列は、プローブ２０の部位の、標的配列１４と非相補的な部分としてよい。標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０は溶液中に存在させても、固体支持体（例えばアレイ）上に固定してもよい。
【００１７】
図１に示すように、フラグメント１２ｂはオフターゲット配列１６を含み、オフターゲット結合の一例ではこのオフターゲット配列には標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０ｃが結合する。一旦標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０ｃに結合すると、オフターゲットフラグメント１２は標的配列１４を含むフラグメント１２と一緒に核酸ライブラリ１０の残部から分離され、シークエンシング反応処理される。従って、フラグメント１２ｂからのオフターゲット配列リードはシークエンシングデータに含まれる。プローブ２０ｃはオフターゲット配列と比べてその標的配列に対して高い特異性を有するが、それにも係わらず、結合条件が標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０ｃの一部分のオフターゲット配列１６への結合を可能にする。換言すれば、一部のオフターゲット配列１６はプローブ２０ｃに対して標的配列１４との十分な類似性を共有し結合を生じる可能性がある。
【００１８】
本明細書で提供されるように、オフターゲット配列１６は１つ以上の標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０の対象標的でない配列である。一例では、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０がエクソームシークエンシング用である場合、オフターゲット配列１６はイントロン配列又は遺伝子間配列とし得る。いくつかの実施形態では、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０は対象標的配列よりも低い特異性を有するオフターゲット配列１６に結合し得る。
【００１９】
オフターゲット配列は試料相互間で相対的に安定であることを証明するためにオフターゲット配列の試験を行った。図２は系統的オフターゲット部位に対するシークエンシング結果を示し、その結果は異なる試料間で高度に再現可能であって、同等のカバレッジを有する（ａ）標的化部位及び（ｂ）オフターゲット部位におけるリード分布のゲノムブラウザビューで示されるように、２つの細胞系の６つの試料からの複製間で高度に再現可能である。各トラックが１つの試料である。図２は、オフターゲット結合は安定であること、及びオフターゲットの発生、分布及び表示はランダムでなく系統的であることを実証している。
【００２０】
図３は、オフターゲットリードのゲノム分布を示すグラフである。オフターゲット部位は異なる複製に対して同等のカバレッジを示している。試験した試料において、オフターゲット配列の４５％はイントロン部位であり、４８％は遺伝子間領域であり、７％はエクソンであった。
【００２１】
オフターゲット部位とキャプチャプローブとの間の配列類似性は、オフターゲットリードはランダム結合よりもプローブによりプルダウンされる可能性が高いことも示している。図４及び図５は、標的プローブとオフターゲットピークとの類似性を証明するグラフを示す。系統的オフターゲット部位は異なる試料に示される標的プローブと類似する配列を有する。１０ｋｂ下流部位は同じ分析をネガティブ制御として受けている。各点はオフターゲットピーク（ｘ軸）と及びその１０ｋｂ下流部位（ｙ軸）と配列類似性を共有するプローブの数を示す。従って、このデータは、オフターゲット配列は所定のセットの標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに対して試料相互間で特異的であり且つ再現可能であることを示す。このシークエンシングデータから、一般的背景より著しく高く且つ実際の標的に匹敵するかそれよりも高いカバレッジを有するオフターゲット部位が存在することが観測された。カバレッジへの寄与でランク付けされる場合、オフターゲット遺伝子座の一部がオフターゲットリードの大多数に寄与する。これらの部位のフラグメントをシークエンシング中に低減できれば、その結果として実際の標的に関するカバレッジを向上させることができる。この目的のために、本発明技術は試料相互間で安定及び／又はプリバレント（高発現）であるオフターゲット配列に対して特異的なオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを含む。さらに、いくつかの実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブはオフターゲットリードの大多数に寄与するオフターゲット遺伝子座用に設計することができる。
【００２２】
図６は本明細書で提供される、オフターゲット配列を同定する方法のフロー図である。１セットの標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを用いて標的化シークエンシング（例えば、ハイブリッドキャプチャシークエンシング）を実行し（ステップ３２）、シークエンシングデータを取得し（ステップ３４）、ハイブリッドキャプチャシークエンシングデータ内の高頻度オフターゲットリードの遺伝子座を同定する（ステップ３６）。オフターゲットリードの遺伝子座に基づいて、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブを設計し（ステップ３８）、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブと併用するために提供する（ステップ４０）。
【００２３】
本明細書で与えられるように、シークエンシングデータは核酸ライブラリのシークエンシングされたフラグメントに関する生データ並びにベースコールデータを含み得る。更に、シークエンシングデータは、アセンブルされたフラグメントのゲノム遺伝子座を同定できるように、アライメント及びアセンブリを受けることができる。従って、配列データはアセンブルされたフラグメントに対する配列情報及び位置情報を含むため、オフターゲットデータはシークエンシングされたフラグメントに少なくとも部分的に基づいて同定可能である。更に、シークエンシングデータはオフターゲット配列リードのカバレッジデータを含み得るため、オフターゲットのプレバレンス並びに位置を評価することができる。このように、様々なオフターゲット遺伝子座に対して最高プレバレンス（即ち、最高カバレッジ）の配列リードを同定することができる。いくつかの実施形態では、オフターゲットリードは、最高頻度のオフターゲット遺伝子座を同定するために、カバレッジに従ってランク付けされる。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは最高５０，１００，１０００、又は２０００遺伝子座に基づいて設計される。一実施形態では、この設計はランク付けされた配列のユーザ指定数に基づく。
【００２４】
一実施形態では、方法３０は標的特異的ハイブリダイゼーションプローブのパネルを生成するワークフローの一部として実行することができる。方法３０は、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブの特定のパネルの要求に基づいて、オフターゲット配列を同定し評価するためにリファレンス試料に関して開始される。リファレンス試料は高品質試料であることが知られている内部標準としてよい。別の実施形態では、方法３０は標的特異的ハイブリダイゼーションプローブのカスタムパネルのカスタマ要求の受信時に開始される。カスタマパネルの合成の一部として、方法３０は潜在的なオフターゲット配列を同定するために開始される。従って、方法３０はユーザ又はカスタマ入力に応答して実行される。
【００２５】
同定されたオフターゲット配列に基づいて、１セットのオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを同定し合成して、シークエンシングキットの一部として提供することができる。これらのオフターゲットハイブリダイゼーションプローブは、シークエンシング収率を向上しオフターゲット配列捕捉を低減するための任意選択のアドオンアイテムとし得る。別の実施形態では、方法３０は、オフターゲットシークエンシングリードの推定低減に基づいてリファレンス試料に対するシークエンシングコスト低減の推定値を生成するステップを含んでもよい。例えば、一般的なハイブリッドキャプチャシークエンシングランが６０％の標的リード及び４０％のオフターゲットリードを生成する場合、そのシークエンシングコストの４０％はオフターゲット配列に起因する。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブのセットが、リファレンスシークエンシングデータのオフターゲットカバレッジの約５０％を示すオフターゲット配列に対応するように設計されていれば、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブはオフターゲットリードを５０％低減することができる。従って、オフターゲット捕捉を低減するためにオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを用いるシークエンシングランは対象標準と比較してコストが２０％低下することが推定される。このように、ユーザは、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブのコストがシークエンシングに十分な節約を生むかどうかを決定することができる。方法３０は可変のユーザ入力に基づいて動的推定も可能である。例えば、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブのオフターゲット配列の総数の低減はプローブコストを低減するが、オフターゲット配列捕捉の僅かな増加を生じ、この増加に関連する推定シークエンシングコストの増加がオフターゲットハイブリダイゼーションプローブのより多数のオフターゲット配列を選択する場合に比較して大きくなる可能性がある。別の実施形態では、ユーザは所定の試料に対して任意の標的及びオフターゲットコストを含むトータルシークエンシング経費を用意し、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブを用いてコスト低減を達成することができるかどうかを決めることができる。
【００２６】
本明細書で提供される、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ（例えばオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０、図８−１３参照）は、如何なる標的配列よりも、オフターゲット配列（例えば、オフターゲット配列１６、図１参照）に対して高い特異性を有する。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブはオリゴヌクレオチド、例えば単鎖酢酸分子である。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは１セットのオフターゲットハイブリダイゼーションプローブの一部とし得る。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは、８０−１２０塩基の長さ、８０−１００塩基の長さ、９０−１１０塩基の長さ、１００−１２０塩基の長さ等としてよい。いくつかの実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブが８０−１２０塩基の長さである場合、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブの少なくとも３０−５０の塩基はオフターゲット配列と相補的である。更に、開示の実施形態はハイブリッドキャプチャ技術と関連して説明するが、本明細書で提供される技術はＰＣＲ又はアプリコンベースのシークエンシング技術に組み込み、実装することもできる。このような実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ２０は約２０−４０塩基としてよい。一実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは標的特異的ハイブリダイゼーションプローブとほぼ同じ長さとしてよい。別の実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに対して異なる長さ（例えばそれより短い又は長い）にしてよい。
【００２７】
標的化シークエンシング反応は１セットの標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０をオフターゲットハイブリダイゼーションプローブと一緒に（例えば、並列に又は順に）用いて実行することができ、ここでオフターゲットハイブリダイゼーションプローブは核酸ライブラリの複数の異なるオフターゲット配列を表すことを理解すべきである。例えば、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブのセットは、少なくとも５０の異なるオフターゲット配列、少なくとも１００の異なるオフターゲット配列、少なくとも１００００の異なるオフターゲット、等を表してよい。別の実施形態では、標的配列のセットは、本明細書で提供されるハイブリッドキャプチャシークエンシングで使用されるプローブに対するオフターゲット配列のセットより多数の異なる配列を表す。例えば、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ内の異なる標的配列の数対オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ内の異なるオフターゲット配列の数の比は、いくつかの実施形態では、２：１，３：１，４：１，５：１又はそれより大きい比としてよい。使用する追加のプローブの生成コストのために、制限された数のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを提供するのが有利である。従って、オフターゲット配列のプレバレンスのランク付けを用いて所望のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブの数のユーザ選択を可能にすることができる。更に、いくつかの高度にプレバレントなオフターゲット配列をオフターゲット配列の全プールに高度に存在させて、高度にプレバレントなオフターゲットに対して特異的な限定数のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブがそれにもかかわらずオフターゲット配列捕捉の高い低減をもたらすようにすることができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは未結合フラグメントからの結合フラグメントの分離を容易にする修飾を有してよい。このような修飾は、ストレプトアビジン（例えば、ストレプトアビジンビーズ）による選択を容易にするためのプローブのビオチン化を含み得る。しかしながら、本明細書で提供されるプローブは結合ペアの一部である親和結合分子の他方に結合し得る。例えば、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、又はジゴキシニゲンとジゴキシニゲンを結合する特異抗体は特異結合ペアの例である。いくつかの実施形態では、修飾はプローブの５’末端又は３’末端で与えられる。更に、他の実施形態では、プローブは未修飾としてよい。
【００２９】
オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは同定を容易にする固有のバーコード又は配列を含んでもよい。このような配列はオフターゲット配列と非相補的な当該プローブの部位の一部としてよい。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは溶液中に存在させても、固体支持体（例えば、アレイ）上に固定してもよい。別の実施形態では、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブとオフターゲットハイブリダイゼーションプローブは同等の長さ、即ちすべて一定の範囲内のプローブとして提供される。従って、特定の実施形態では、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブはとオフターゲットハイブリダイゼーションプローブはすべて８０−１２０塩基の長さの範囲に含まれる。別の実施形態では、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブとオフターゲットハイブリダイゼーションプローブはすべて２０−４０塩基の長さの範囲に含まれる。更に別の実施形態では、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブはすべて第１の範囲内の長さを有し、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブはすべて第１の範囲と異なる第２の範囲内の長さを有する。一実施形態では、第１の範囲は第２の範囲よりも長いプローブ長さを包含する。別の実施形態では、第１の範囲は第２の範囲よりも短いプローブ長さを包含する。
【００３０】
開示のいくつかの実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブの提供は、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブとともに使用するためのシークエンシングキットの一部分としてオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを提供することを含む。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブはいくつかのタイプのオフターゲット配列（例えば、イントロン、遺伝子間領域）に対してのみ特異的とし得る。このようにすると、ユーザは関心のあるオフターゲット配列を選択することができる。別の実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブの提供は、カスタム標的特異的プローブパネルの要求又は注文の一部としてオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを提供することを含む。カスタムパネルの要求を受けると、合成設備も方法３０のステップを実行して、カスタムパネルに関係するオフターゲット配列（例えば、高度にプレバレントなオフターゲット配列）決定し、同定したこれらのオフターゲット配列からのオフターゲットリードを低減するためにオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを提供することができる。
【００３１】
別の実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブの汎用セットを提供することができる。即ち、使用する特定のパネルの標的特異的ハイブリダイゼーションプローブと関係なく、いくつかのオフターゲットリードを種を超えて共通にし得る。一実施形態では、細菌学、感染症、食品安全性、及び品質監視等において試料をデホストするために、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブの種特異的セットを用いることができる。汎用セット及び／又は種特異的セットは本明細書で提供されるデータガイド技術を用いて決定することができる。例えば、汎用セット又は種特異的セットは、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブの異なるパネルを用いて（例えば、複数のヒト特異的パネル又は複数の癌特異的パネルを用いて）リファレンス試料に対してシークエンシングを実行し、すべての異なるパネルからのシークエンシングデータからトップランク（最もプリバレント）のオフターゲット配列を選択してオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを設計することによって、選択することができる。別の実施形態では、トップランクのセットで異なるパネルを用いたシークエンシングデータのすべてのオフターゲット配列のプールを代表することによって、プール内の一部の配列のみが所定のパネルのオフターゲットであるとすることができる。しかし、トップランクセットは、それにもかかわらず、各試料に対するシークエンシングデータに表われる複数のオフターゲットリードを含むため、汎用セットは、使用時に、上記のパネルのいずれかと併用するとき、オフターゲット捕捉を低減することができる。
【００３２】
本明細書で提供されるオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを用いて標的化シークエンシングを実行する方法も本明細書で提供される。図７は標的化シークエンシング反応においてオフターゲット捕捉を低減する方法５０である。核酸ライブラリは、適切なサイズのフラグメント形成を促進するために所望の技術に従って調製することができる（ステップ５２）。核酸ライブラリは、調製後すぐに、プローブ結合を許可する条件下で、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ及び標的特異的ハイブリダイゼーションプローブと順に又は並列に接触させる（ステップ５４）。例えば、２本鎖フラグメントは単鎖フラグメンを生じるように変性してよい。標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに結合したフラグメントを、シークエンシングのために、例えば図８−１０に開示する技術によって選択する（ステップ５６）。一実施形態では、この選択は標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに結合したフラグメントをオフターゲットハイブリダイゼーションプローブに結合したフラグメントから並びにどのプローブにも結合してないフラグメントから分離することによって達成される。別の実施形態では、この選択は、最初にオフターゲットハイブリダイゼーションプローブに結合したフラグメントを除去し、次いでどのプローブにも結合してないフラグメントを除去することによって達成される。選択後すぐに、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブに結合したフラグメントをシークエンシングして、標準対象と比較してオフターゲット配列リードが低減されたシークエンシングデータを得る（ステップ５８）。例えば、試料の標準対象は標的特異的ハイブリダイゼーションプローブのみと接触されオフターゲットハイブリダイゼーションプローブと接触されてないものである。
【００３３】
図８は競合ブロッキングを用いる方法５０の実施形態の概略図である。図示の実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０は５’非修飾（ビオチンなし）として合成され、ビオチン末端６２を有する標的特異的ハイブリダイゼーションプローブと一緒に（即ち、同時に又は同じ溶液内で）ハイブリダイゼーション反応に使用される。非修飾オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０はオフターゲット遺伝子座への結合に関して標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０と競合する。これはオフターゲット遺伝子座を標的ハイブリダイゼーションプローブ２０にアクセス不能にするかアクセスし難くする。フラグメント１２に結合した標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０の分離は、ビオチン化された末端６２に結合しオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０に結合しないストレプトアビジンを用いて達成することができる。その結果得られる、分離されたフラグメント１２に結合した標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０の群は標的配列１４に対して濃縮され、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０を使用しない標準対照群と比較してオフターゲット配列１６の低減を示す。
【００３４】
図９はプレブロッキングを用いる方法５０の実施形態の概略図である。図示の実施形態では、非修飾オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０が最初にライブラリと接触され、対応するオフターゲット配列１６をプレブロックする。標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０は、プレブロッキングが起こった後、即ちオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０が結合した後でのみライブラリと接触される。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０は５’非修飾（ビオチンなし）として合成されるが、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０はビオチン化末端６２を有する。フラグメント１２に結合された標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０の分離は、ビオチン化された末端６２に結合しオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０に結合しないストレプトアビジンを用いて達成することができる。その結果得られる、分離されたフラグメント１２に結合した標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０の群は標的配列１４に対して濃縮され、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０を使用しない標準対照群と比較してオフターゲット配列１６の低減を示す。
【００３５】
図１０はプレクリアリングを用いる方法５０の実施形態の概略図である。図示の実施形態では、ビオチン化末端６８で示される修飾オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０が最初にライブラリと接触され、対応するオフターゲット配列に結合することが許可される。オフターゲット配列１６を含むフラグメントに結合したオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０はストレプトアビジンビーズを用いて取り出され、望ましくないオフターゲット遺伝子座を反応からプレクリア、即ち除外する。プレクリアされた浮遊物はビオチン化末端６２を有する修飾標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０とのその後のハイブリッドキャプチャ反応のために保持される。標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０に結合した残存する標的配列１４は如何なる未結合フラグメントからも分離され、シークエンシングされる。その結果得られる、プレクリアされ且つ分離されたフラグメント１２に結合した標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０の群は標的配列１４に対して濃縮され、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０を使用しない場合の標準対照群と比較してオフターゲット配列１６の低減を示す。
【００３６】
本明細書で提供される標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０及びオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０は、プローブの自己アニーリング、スティッキープローブ又は非特異的結合を低減するために、ハイブリッドキャプチャで使用されるブロッカー又は他のアプローチと共に使用することができる。図１１−図１２は、結果向上のために本明細書に開示のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０及び実施形態と並列に又は順に組み合わせることができるアプローチの例を示す。これらの例は単なる例示であり、限定を意図しない。図１１は、アダプタ７２が自己アニールするのを防ぐアンチセンスアダプタブロッカー７０の一例を示す。図１２は、「ハイパー」又はスティッキー標的配列１４に対する標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０に対してアンチセンスである１以上のプローブアッテネータ７６の一例を示す。
【００３７】
一実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは、最もプレバレントなオフターゲットリードの低減を提供するために高度に濃縮されたオフターゲット部位に特異的である。オフターゲット配列が実際の標的部位に高度に類似する配列を有する場合、該高度に類似する配列に対して特異的なオフターゲットプローブの使用は類似の配列を有する標的部位の意図せぬカバレッジの低下を生じ得る。この低下を防ぐために、一実施形態では、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは、１以上の類似評価指数（例えば、Ｄａｍｅｒａｕ−Ｌｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ距離、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、ＢＬＡＳＴスコア）に基づく標的配列との閾類似性よりも低い類似性を有するオフターゲット部位のみから選択することができる。一実施形態では、閾同一度又は同一スコアを用いてオフターゲットハイブリダイゼーションプローブをクウォリファイし、所定の同一度（例えば、５０％未満、２５％未満）より低い同一度を有するオフターゲット配列のみをクウォリファイする。例えば、一実施形態では、標的配列と１５以上の連続する塩基が一致しないオフターゲット配列のみがオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ設計のためにクウォリファイされる。１５以上の連続する塩基が標的配列と共通するこれらのオフターゲット配列は、たとえこれらのオフターゲット配列が高度にプレバレントであっても、いかなるオフターゲットハイブリダイゼーションプローブの根拠として使用されない。別の実施形態では、オフターゲット配列の遺伝子座が既知であるため、その配列に対して特異的なオフターゲットハイブリダイゼーションプローブは、標的化部位が低い類似スコアを有するように、高度に類似する部位から５’又は３’シフトしてよく、例えば２０−５０塩基の５’又は３’移動してよい。
【００３８】
図１３に示すように、本明細書で提供されるハイブリッドキャプチャシークエンシングにおいて使用される核酸ライブラリは標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０及びオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０と順に又は並列に接触される。この接触は、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０に結合した標的配列１４を含むフラグメント１２の群８０と、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０に結合したオフターゲット配列を含むフラグメント１２のオフターゲット群８２と、どのプローブとも結合しないフラグメント１２を含む未結合群８４とを生成する。未結合群８４は標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０又はオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０の設計対象でない配列を含む。シークエンシングのための標的群８０の選択及びオフターゲット群８２及び／又は未結合群８４の非選択は、本明細書に開示の技術によって達成できる。例えば、ビオチン修飾を含む標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ２０はビーズ又は支持体に結合されたアビジン又はストレプトアビジンと結合することによって選択することができる。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０が修飾されていない場合、オフターゲット群及び未結合群８４は洗浄により除去することができる。
【００３９】
別の実施形態では、プローブ品質を評価するためにオフターゲット群８２を保持するのが望ましい。プレクリアリング技術（図１０）を用いてオフターゲットハイブリダイゼーションプローブ６０に結合したフラグメント１２、即ちオフターゲット群８２を引き出すことができる。オフターゲット群のこれらのフラグメント１２をシークエンシングし、標的配列の存在に関して評価することができる。オフターゲット群に存在する標的配列はその後１以上のオフターゲットハイブリダイゼーションプローブに対する類似性に関して評価し、それらをセットから除去する又はそれらを再設計することができる。
【００４０】
一例では、一致オフターゲット部位を検出するために、代表的試料のセット、例えば良い品質でシークエンシングされる異なる細胞系／組織の試料のセット、が選択される。最初に、オンターゲットリードがシークエンシングデータからフィルタリングされ、その後オフターゲットリードに対して高度に濃縮された部位がＥＮＣＯＤＥプロジェクトのためにピークコーリングツールＧＥＭを用いてコールされる。しかしながら、他のピークコーリングアルゴリズムを使用してもよい。異なる試料からの重複するピークがその後抽出され、５０ｂｐ内のピークが融合され、標的から４００ｂｐ以上離れたピークのみが維持される。予め同定したオフターゲットピークは平均カバレッジで分類される。著しく高いカバレッジを有するオフターゲットピークがランキングに従って、レデューサの再設計のために選択される。オフターゲットハイブリダイゼーションプローブは総オフターゲットリードの約５０％に寄与したオフターゲット部位に特異的であるように設計される。約２０００のオフターゲット配列を代表するオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを設計するためにデザインスタジオ（イルミナ社、登録商標）が使われた。
【００４１】
図１４−図１６は、本明細書で概説したオフターゲットプローブ設計の使用はプレクリアリング後のオフターゲットピークのカバレッジが大きく低下することを実証するグラフを示す。各点は対照標準（ｘ軸）における及びプレクリアリングプロトコルからの同じ試料（ｙ軸）におけるオフターゲットピークのリードカバレッジを示す。図１４のボックス１００は対照対プレクリアリングプロトコルのリードカバレッジの有意差を強調表示している。
【００４２】
図１７−図１９は、オンターゲット部位に関するカバレッジの増加及び低下を実証するグラフを示す。各点は対照標準（ｘ軸）における及びプレクリアリングを含む同じ試料（ｙ軸）におけるオンターゲットのリードカバレッジを示す。図１７に示すように、エリア１０４はカバレッジの増加を強調表示するが、ボックス１０２はカバレッジの低下を強調表示している。
【００４３】
本明細書で提供される技術は、高いオフターゲット捕捉率の問題をオフターゲット部位に関するデータ分析からのガイド情報を用いることによって解決しようとするものである。この問題を解決する従来の試みは、Ｃｏｔｌ，ｔＲＮＡ，ｐｏｌｙ（ｄＩ―ｄＣ）、アダプタブロッカー及び代用的な遺伝子のブロッカー（例えば、抗ミトコンドリア遺伝子ブロッカー）を使用している。これらの技法と対照的に、本明細書に提示される方法は最初のデータ駆動型アプローチを表す。更に、標的特異的結合前にオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを用いて試料から不所望のＤＮＡフラグメントを除去又は取り除くことは新規なアプローチである。更に、試料間並びにハイブリダイゼーションプローブの異なるセット又はパネル間で安定な同定された系統的なオフターゲット部位は必ずしも一般的な知識で同定することができるわけではない。例えば、それらは必ずしもＡＬｕ，ＳＩＮＥ，ＬＩＮＥ等のような同定可能な反復要素ではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるアプローチは、メタゲノムアプリケーション用又は試料調製の汚染除去用の種特異的オフターゲットハイブリダイゼーションプローブを提供するために他のゲノムに適用することができる。
【００４４】
本明細書に開示される技術はシークエンシング装置及び／又はシークエンシング分析装置と関連して実装することができる。図２０はシークエンシング装置１２０の概略図であり、このシークエンシング装置１２０は、例えば、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブを設計するために使用し得るオフターゲットリードを取得し評価するために使用することができる。別の例では、シークエンシング装置１２０はオフターゲットハイブリダイゼーションプローブを使用した後でシークエンシングデータを取得し評価するために使用することができる。取得したシークエンシングデータは、オフターゲットハイブリダイゼーションプローブと接触してない対照標準と比較して低減したオフターゲットリードを有する。シークエンシング装置１２０は、例えば米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号、同第２００６／０１８８９０１号、同第２００６／０２４０４３９号、同第２００６／０２８１１０９号、同第２００５／０１００９００号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第ＷＯ０５／０６５８１４号パンフレット、国際公開第ＷＯ０５／０６４１９９号パンフレット、国際公開第ＷＯ０７／０１０２５１号パンフレットなど任意のシークエンシング技術に従って実装することができ、これらの出願の開示内容は参照することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。代わりに、ライゲーション技術によるシークエンシングをシークエンシング装置１２０で使用することもできる。これらの技術はＤＮＡリガーゼを用いてオリゴヌクレオチドを取り込み、このようなオリゴヌクレオチドの取り込みを同定するものであり、米国特許第６，９６９，４８８号、同第６，１７２，２１８号、及び同第６，３０６，５９７号に開示され、それらの内容は参照することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態はナノポアシークエンシングを利用することができ、それにより標的核酸鎖又は標的核酸からエキソ核酸分解的に除去されたヌクレオチドがナノポアを通過する。標的核酸又はヌクレオチドはナノポアを通過するので、ポアの導電性のバラツキを測定することによって各タイプの塩基を同定することができる（米国特許第７，００１，７９２号；Ｓｏｎｉ＆Ｍｅｌｌｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３，１９９６−２００１（２００７）；Ｈｅａｌｙ，Ｎａｎｏｍｅｄ．２，４５９−４８１（２００７）;及びＣｏｃｋｒｏｆｔ他、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，８１８−８２０（２００８）、それらの内容は参照することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）。更に他の実施形態はエクステンションプロダクトへの核酸の取り込み時に解放されるプロトンの検出を含む。例えば、解放されたプロトンに基づくシークエンシングは、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，ＣＴ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓｕｂｓｉｄａｒｙ）から市販されている電気検出器及び関連技術又は米国特許出願公開第ＵＳ２００９／００２６０８２号；米国特許出願公開第２００９／０１２７５８９号；米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３号又は米国特許出願公開第２０１０／０２８２６１７号に開示されているシークエンシング方法を使��することができ、それらの開示内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。特定の実施形態はＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を利用する。ヌクレオチド取り込みは、蛍光プローブ保有ポリメラーゼとγフォスフェイト標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）相互作用により検出することができ、或いは、例えばＬｅｖｅｎｅ他、ｓｃｉｅｎｃｅ２９９，６８２−６８６（２００３）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ他、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３，１０２６−１０２８（２００８）；Ｋｏｒｌａｃｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５，１１７６−１１８１（２００８）に開示されているゼロモード導波路で検出することができ、それらの開示内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。他の適切な代替技術は、例えば、蛍光インサイチュシークエンシング（ＦＩＳＳＥＱ）及び大規模並列シグネイチュアシークエンシング（ＭＰＳＳ）を含む。特定の実施形態では、シークエンシング装置１２０はイルミナ社（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＨｉＳｅｑ(登録商標），ＭｉＳｅｑ又はＨｉＳｃａｎＳＱとしてよい。
【００４５】
図示の実施形態では、シークエンシング装置１２０は、別個の試料処理装置１２２と関連のシークエンシング分析装置１２４とを含む。更に、シークエンス分析装置１２４は試料処理装置１２２と関連しない独立した形態に実装してもよい。従って、このような実施形態では、シークエンス分析装置１２４は遠隔試料処理装置１２２からデータを受信する。しかしながら、これらの装置は単一装置として実装してもよい。更に、関連のシークエンス装置１２４は試料処理装置１２２に対するローカル装置としても、試料処理装置１２２とネットワーク化してもよい。図示の実施形態では、生体試料は試料処理装置１２２内に試料スライドとして装填し、撮像してシークエンスデータを生成することができる。例えば、生体試料と反応する試薬が撮像モジュール１２８により発生される励起ビームに応答して特定の波長で蛍光を発生し、その戻り放射が撮像される。例えば、蛍光成分は蛍光タグ核酸により発生され、該蛍光タグ核酸は蛍光成分の相補的分子又は蛍光タグヌクレオチドにハイブリダイズし、それらはポリメラーゼを用いてオリゴヌクレオチドに取り込まれる。当業者に理解されるように、試料の染料が励起される波長及びそれらが蛍光を発する波長は特異的染料の吸収及び発光スペクトルに依存する。このような戻り放射は指向光学系を通して戻される。このレトロビームは一般的に撮像モジュール１２８の検出光学系に向けることができる。
【００４６】
撮像モジュールの検出光学系は任意の適切な技術に基づくものとしてよく、例えば、光子衝突位置に基づくピクセル画像データを発生する電荷結合デバイス（ＣＣＤ）センサとしてよい。しかしながら、様々な他の検出器、例えば限定されないが、時間遅延積分（ＴＤＩ）動作するように構成された検出器アレイ、相補金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）検出器、アバランシフォトダイオード（ＡＰＤ）検出器、ガイガーモード検出器など、又は他の任意の検出器のいずれかを使用してもよいことは理解されよう。ＴＤＩモード検出器は米国特許第７，３２９，８６０号に開示されるようにライン走査と結合することができ、該特許の開示内容は参照することにより本明細書に組み込まれる。他の有用な検出器も、例えば、本明細書において様々な核酸シークエンシング方法の文脈で先に挙げた参考文献に記載されている。
【００４７】
撮像モジュール１２８はプロセッサ制御、例えばプロセッサ１３０の制御下に置くことができ、試料調製装置１２２は、Ｉ／Ｏコントローラ１３２、内部バス１３４、実行可能な命令を格納し得るように構成された不揮発性メモリ１３６、ＲＡＭ１３８及び任意の他のメモリ構造、及び図２０に関して記載したものに類似する他の適切なハードウェアコンポーネントを含むことができる。更に、関連のシークエンス分析装置１２４は、プロセッサ１４０，Ｉ／Ｏコントローラ１４４、通信モジュール１５２、及びＲＡＭ１４６及び不揮発性メモリ１４８を含み、実行可能な命令１５０を格納し得るように構成されたメモリ構造を含むことができる。ハードウェアコンポーネントは内部バス１５３で相互接続することができ、内部バス１５３はディスプレイ１５４にも接続することもできる。シークエンス装置１２２をオールインワン装置として実装する実施形態では、いくつかの冗長ハードウェア要素は除去することができる。
【００４８】
シークエンシング装置１２０は、標的特異的ハイブリダイゼーションプローブを要求するために使用することができる。更に、シークエンシング装置１２０はオフターゲットハイブリダイゼーションプローブの調製のためのユーザ入力を提供するために使用することができる。ユーザはオフターゲットハイブリダイゼーションプローブセットとして調製すべき最高ランクの配列の所望数を指定する入力を与えればよい。この選択は交互に又は付加的に所望の割合のオフターゲット低減に基づいて行うことができる。
【００４９】
本願を通して、様々な刊行物、特許及び／又は特許出願を参照した。これらの刊行物の全開示内容は参照することにより本願に組み込まれる。用語「含む」は非限定的であることを意図し、記載の要素のみを含むのではなく、任意の追加の要素も包含する。本明細書では本発明のいくつかの特徴のみを図示し説明したが、当業者には多くの修正及び変更が想起されるであろう。従って、添付の特許請求の範囲は、このような全ての修正及び変更を本発明の真の思想に含むものと意図していることを理解されたい。更に、開示の実施形態の要素は様々に組み合わせ又は交換可能である。従って、他の実施形態も後記の請求の範囲の範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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