(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の行動性能を向上させる処置に使用するための、バクテロイデス属の細菌を含む組成物であって、ここで、
前記バクテロイデス属の細菌が、Ｂ．フラジリス、Ｂ．テタイオタオミクロン、Ｂ．ブルガツス、またはそれらの混合物であり、
該対象が、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を患っており、
処置を必要とする該対象の４−エチルフェニルスルフェート（４ＥＰＳ）の血中レベル
が、ＡＳＤを患っていない対象の血液で観察される４ＥＰＳの血中レベル
に対して増加しており；
該使用が、該処置を必要とする対象において、ＡＳＤのうちの少なくとも１つ以上の症
状における欠陥の改善が観察されるまで、該組成物を投与することによって、該対象の４
ＥＰＳの血中レベルを減少させることを含む、組成物。
【請求項２】
前記バクテロイデス属の細菌が、Ｂ．テタイオタオミクロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記バクテロイデス属の細菌が、Ｂ．フラジリスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記バクテロイデス属の細菌が、Ｂ．ブルガツスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、プロバイオティック組成物、栄養補助食品、医薬組成物、またはそれら
の混合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記４ＥＰＳの血中レベルを減少させることが、前記処置を必要とする対象の胃腸（ＧＩ）窮迫を改善するか、または前記処置を必要とする対象の腸管透過性を低減する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ＧＩ窮迫が、腹部の痙攣、慢性下痢、便秘、腸管透過性またはそれらの組合せを含
む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＡＳＤでない対象群の４ＥＰＳの参照血中レベルをインビトロで判定すること、処置を必要とする対象の４ＥＰＳの血中レベルを減少させる前および後に処置を必要とする対象の行動性能を判定すること、またはそれらの両方をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
処置を必要とする対象の行動性能を判定することが、自閉症行動チェックリスト（ＡＢＣ）、自閉症診断インタビュー−改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）、児童自閉症評価スケール（ＣＡＲＳ）および／または前言語自閉症診断観察スケジュール（ＰＬ−ＡＤＯＳ）を使用することを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
対象の行動性能を向上させる処置に使用するための、バクテロイデス属の細菌を含む組成物であって、ここで、
前記バクテロイデス属の細菌が、Ｂ．フラジリス、Ｂ．テタイオタオミクロン、Ｂ．ブルガツス、またはそれらの混合物であり、
該対象が、ＡＳＤを患っており、
処置を必要とする該対象の４−エチルフェニルスルフェート（４ＥＰＳ）の尿中レベルが、ＡＳＤを患っていない対象で観察される４ＥＰＳの尿中レベルに対して増加しており；
該使用が、前記対象において、ＡＳＤのうちの少なくとも１つ以上の症状における欠陥の改善が観察されるまで、該組成物を投与することによって、前記対象の該４ＥＰＳの尿中レベルを減少させることを含む、組成物。
【請求項１１】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を患っておりプロバイオティック処置に対して感受性がある対象の腸微生物叢を調節する使用のための、バクテロイデス属の細菌を含むプロバイオティック組成物であって、ここで、
前記バクテロイデス属の細菌が、Ｂ．フラジリス、Ｂ．テタイオタオミクロン、Ｂ．ブルガツス、またはそれらの混合物から成る群から選択され、
該使用が、
該対象の４−エチルフェニルスルフェート（４ＥＰＳ）の血中レベルを判定すること；
と、
該対象の４ＥＰＳの血中レベルを、ＡＳＤおよび１つまたは複数の胃腸障害を患っている対象群の４ＥＰＳの参照血中レベルと比較すること、ここで、該対象の４ＥＰＳの血中レベルと該参照血中レベルとの間の実質的な同一性は、該対象が該プロバイオティック処置に対して感受性であることを示す；と、
該対象の腸微生物叢の組成を調整するために該プロバイオティック組成物を投与すること；とを含む、プロバイオティック組成物。
【請求項１２】
前記バクテロイデス属の細菌がＢ．テタイオタオミクロンである、請求項１１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１３】
前記バクテロイデス属の細菌がＢ．フラジリスである、請求項１１に記載のプロバイオティック組成物。
【請求項１４】
前記バクテロイデス属の細菌がＢ．ブルガツスである、請求項１１に記載のプロバイオティック組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
米国特許法第１１９条（ｅ）の下、本出願は、その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる、２０１２年８月２９日に出願の米国特許仮出願第６１／６９４，６７９号の優先権を主張する。
【０００２】
連邦後援研究開発に関する表明
本発明は、軍によって与えられた補助金番号Ｗ８１ＸＷＨ−１１−０５１５、米国国立衛生研究所によって与えられた卒業生訓練補助金番号５Ｔ３２ＧＭ０７７３７、全米科学財団によって与えられた卒業生研究奨励金番号ＤＧＥ−０７０３２６７、および国立精神衛生研究所補助金番号ＭＨ１００５５６の下で、政府の支援によりもたらされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。配列表は、２０１３年８月２８日に作成された、ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ＴＸＴという名称のサイズが４Ｋｂのファイルで提供される。配列表の電子フォーマットの情報は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
本出願は一般に、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の診断および処置の分野に関する。
【背景技術】
【０００５】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、常動行動ならびに言葉および社会的交流の欠陥を特徴とする重大な神経発達障害である。自閉症の報告発病率は２００８年現在の米国で８８例の出産中１例へと速やかに増加し（ＣＤＣ、２０１２年）、来たるべき数十年におけるかなりの医学的および社会的負担を表している。ＡＳＤの再現可能な分子診断は開発されておらず、ＡＳＤの核心的症状を処置するための療法は限定され、再現可能な分子診断は開発されていない。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の多くの研究は疾患の遺伝子、行動および神経学の面に重点を置いているが、ＡＳＤの病原性における環境危険因子（Ｈａｌｌｍａｙｅｒら、２０１１年）、免疫調節不全および追加の末梢破壊の主要な役割が、近年かなりの注目を集めている。同じ診断を共有する個体間の著しい異質性は、ＡＳＤのために様々な病因があるという支配的な概念と一貫している。さらに、ＡＳＤ症状のスペクトラムならびに特定の原因、処置および分子バイオマーカーを同定することの困難性は、ＡＳＤの臨床サブタイプをより明確に定義し、サブクラスのＡＳＤ個体に合わせた処置を提供する必要性を鮮明に示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈａｌｌｍａｙｅｒら、２０１１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本明細書で開示される一部の実施形態は、対象の行動性能を向上させるための方法であって、処置を必要とする対象の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）関連代謝産物の血中レベルを判定することと、対象の行動性能の向上が観察されるまで対象のＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを調整することとを含む方法に関する。
【０００８】
一部の実施形態では、対象は、不安、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、またはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴う病的状態を患っている。一部の実施形態では、対象はＡＳＤを患っている。
【０００９】
一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを調整することは、対象の腸微生物叢の組成を調整することを含む。一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を調整することは、糞便の移植を含む。一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を調整することは、バクテロイデス属の細菌を含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、バクテロイデス属の細菌は、Ｂ．フラジリス、Ｂ．テタイオタオミクロン、Ｂ．ブルガツス、またはそれらの混合物である。
【００１０】
一部の実施形態では、組成物は、プロバイオティック組成物、栄養補助食品、医薬組成物またはそれらの混合物である。
【００１１】
一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を調整することは、対象のクロストリジア綱の細菌のレベルを低減することを含む。一部の実施形態では、クロストリジア綱の細菌は、ラクノスピラ科である。一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を調整することは、対象のルミノコッカス科、エリシペロトリクス科および／またはアルカリゲネス科の細菌のレベルを増加させることを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物は、表１に掲載される代謝産物の１つである。一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物は、トリプトファン代謝に関与する代謝産物、脂肪酸代謝に関与する代謝産物、プリン代謝に関与する代謝産物、グリコレート、イミダゾールプロピオネートまたはＮ−アセチルセリンである。一部の実施形態では、トリプトファン代謝に関与する代謝産物は、４−エチルフェニルスルフェート、インドールピルベート、インドリル−３−アクリロイルグリシンまたはセロトニンである。一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物は、４−エチルフェニルスルフェート、インドールピルベート、グリコレートまたはイミダゾールプロピオネートである。
【００１３】
一部の実施形態では、対象のＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを調整することは、ＡＳＤ関連代謝産物に対する抗体、ＡＳＤ関連代謝産物のｉｎ  ｖｉｖｏ合成の中間体に対する抗体、またはＡＳＤ関連代謝産物のｉｎ  ｖｉｖｏ合成の基質に対する抗体を対象に投与することを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物は、４−エチルフェニルスルフェートまたはインドールピルベートである。
【００１５】
一部の実施形態では、対象のＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを調整することは、ＡＳＤ関連代謝産物のｉｎ  ｖｉｖｏ合成に関与する酵素を阻害することを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを調整することは、対象の胃腸（ＧＩ）窮迫を改善する。一部の実施形態では、ＧＩ窮迫は、腹部の痙攣、慢性下痢、便秘、腸管透過性またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを調整することは、対象の腸管透過性を低減する。
【００１７】
一部の実施形態では、本方法は、自閉症でない対象群の代謝産物の参照レベルを判定することを含む。一部の実施形態では、本方法は、対象のＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを調整する前および後に、対象の行動性能を判定することを含む。
【００１８】
一部の実施形態では、対象の行動性能を判定することは、自閉症行動チェックリスト（ＡＢＣ）、自閉症診断インタビュー−改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）、児童自閉症評価スケール（ＣＡＲＳ）および／または前言語自閉症診断観察スケジュール（ＰＬ−ＡＤＯＳ）を使用することを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、対象の行動性能を向上させるための方法であって、処置を必要とする対象の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）関連代謝産物の尿中レベルを判定することと、対象の行動性能の向上が観察されるまで対象のＡＳＤ関連代謝産物の尿中レベルを調整することとを含む方法も本明細書で開示される。一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物は、４−メチルフェニル、４−メチルフェニルスルフェートまたはインドリル−３−アクリロイルグリシンである。
【００２０】
一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物の尿中レベルを調整することは、対象の腸微生物叢の組成を調整することを含む。一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を調整することは、バクテロイデス属の細菌を含む組成物を対象に投与することを含む。
【００２１】
ここで提供される一部の実施形態は、プロバイオティック処置に対する自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を患っている対象の感受性を評価するための方法であって、対象のＢ．フラジリス応答性代謝産物の血中レベルを判定することと、対象のＢ．フラジリス応答性代謝産物の血中レベルを、ＡＳＤおよび１つまたは複数の胃腸障害を患っている対象の代謝産物の参照レベルと比較することとを含み、対象の代謝産物の血中レベルと参照レベルの間の実質的な同一性は、対象がプロバイオティック処置に感受性であることを示す方法に関する。
【００２２】
一部の実施形態では、本方法は、対象の腸微生物叢の組成を調整することを含む。
【００２３】
一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を調整することは、バクテロイデス属の細菌を含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、バクテロイデス属の細菌は、Ｂ．フラジリス、Ｂ．テタイオタオミクロン、Ｂ．ブルガツス、またはそれらの混合物である。
【００２４】
一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を調整することは、糞便の移植を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、Ｂ．フラジリス応答性代謝産物は、表２に掲載される代謝産物の１つである。
【００２６】
本明細書で開示される一部の実施形態は、対象の腸管透過性を低減することを含む、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を患っている対象の胃腸（ＧＩ）窮迫を軽減するための方法に関する。一部の実施形態では、ＧＩ窮迫は、腹部の痙攣、慢性下痢、便秘、腸管透過性またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、腸管透過性を低減することは、対象の腸微生物叢の組成を調整することを含む。
【００２７】
一部の実施形態では、対象の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法であって、対象の腸のサイトカインのレベルおよび１つまたは複数のＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを判定することと、自閉症でない対象群のサイトカインおよび代謝産物の参照レベルと比較して、対象の腸のサイトカインのレベルおよびＡＳＤ関連代謝産物の少なくとも１つまたは複数の血中レベルに変化があるかどうか検出することとを含み、腸のサイトカインの量および１つまたは複数の代謝産物の少なくとも１つの血中レベルの変化は、対象がＡＳＤを患っていることを示す方法も本明細書で開示される。
【００２８】
一部の実施形態では、対象の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）を診断するための方法であって、対象の２つ以上のＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを判定することと、自閉症でない対象群の代謝産物の参照レベルと比較して、対象の２つ以上のＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルに変化があるかどうか検出することとを含み、２つ以上のＡＳＤ関連代謝産物の少なくとも２つの血中レベルの変化は、対象がＡＳＤを患っていることを示す方法が本明細書にさらに開示される。
【００２９】
一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物の１つまたは複数は、表１に掲載される代謝産物から選択される。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＳＤ関連代謝産物は、トリプトファン代謝に関与する代謝産物、脂肪酸代謝に関与する代謝産物、プリン代謝に関与する代謝産物、グリコレート、イミダゾールプロピオネート、Ｎ−アセチルセリン、またはそれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、トリプトファン代謝に関与する代謝産物は、４−エチルフェニルスルフェート、インドールピルベート、インドリル−３−アクリロイルグリシンまたはセロトニンである。一部の実施形態では、サイトカインは、インターロイキン−６（ＩＬ−６）である。一部の実施形態では、本方法は、対象がＡＳＤを患っていることが示された場合に、対象の行動性能を向上させるために対象の１つまたは複数のＡＳＤ関連代謝産物のレベルを変化させることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＭＩＡ子孫が、欠陥のあるＧＩ障壁の完全性ならびに密着帯構成成分およびサイトカインの異常な発現を示すことを示す図である。図１Ａ。腸管透過性アッセイ、ＦＩＴＣ−デキストランの経口強制栄養の後に血清で検出されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の蛍光強度を測定する。ＤＳＳ：ｎ＝６、Ｓ：成体ｎ＝１６；若い個体ｎ＝４、Ｐ：成体ｎ＝１７；若い個体ｎ＝４。データは、成体生理食塩水子孫で観察された蛍光強度に標準化される。図１Ｂ。成体生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）子孫の結腸でのベータアクチンと比較した密着帯構成成分の発現。各遺伝子のデータは、生理食塩水子孫での発現レベルに標準化される。ｎ＝８。図１Ｃ。成体生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）子孫の結腸でのベータアクチンと比較したサイトカインおよび炎症性マーカーの発現。各遺伝子のデータは、生理食塩水子孫での発現レベルに標準化される。ｎ＝６〜２１。図１Ｄ。成体生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）子孫の結腸での全タンパク質含有量と比較したサイトカインおよびケモカインのタンパク質レベル。ｎ＝１０。データは、平均±ＳＥＭで提示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１．ＤＳＳ＝デキストラン硫酸ナトリウム、Ｓ＝生理食塩水＋ビヒクル、Ｐ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ビヒクル。各実験について、成体生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）子孫を３週齢時にビヒクルで処置し、ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス処置群と同時にデータを収集した。
【図２】Ｂ．フラジリス処置は、小腸での密着帯発現およびサイトカインプロファイルにほとんど影響を及ぼさないことを示す図である。図２Ａ。成体生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）子孫の小腸でのベータアクチンと比較した密着帯構成成分の発現。各遺伝子のデータは、生理食塩水子孫での発現レベルに標準化される。ｎ＝８。図２Ｂ。ＭＩＡ子孫の小腸でのベータアクチンと比較した注目すべき密着帯構成成分の発現に及ぼすＢ．フラジリス処置の影響の数量化。生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）のデータは、パネル（Ａ）の通りである。ｎ＝８。図２Ｃ。成体の生理食塩水、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス子孫の小腸での全タンパク質含有量と比較したサイトカインおよびケモカインのタンパク質レベル。データは、生理食塩水子孫での発現レベルに標準化される。棒の直上のアスタリスクは、生理食塩水対照（黒線で表すように、１に標準化される）と比較した有意性を示し、グラフの最上部のアスタリスクは、ポリ（Ｉ：Ｃ）とポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス群の間の統計的有意性を表す。ｎ＝８〜１０。データは、平均±ＳＥＭで提示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、Ｓ＝生理食塩水＋ビヒクル、Ｐ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ビヒクル、Ｐ＋ＢＦ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス。
【図３】Ｂ．フラジリス処置は、ＭＩＡ子孫での全身の免疫機能不全に影響を及ぼさないことを示す図である。図３Ａ。成体生理食塩水、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス子孫からの脾細胞のフローサイトメトリーで測定された、ＣＤ４＋ＴＣＲｂ＋細胞の親集団からのＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞の頻度パーセント。ｎ＝５。図３Ｂ。成体生理食塩水、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス子孫からの脾細胞のフローサイトメトリーで測定された、ＴＥＲ１１９−細胞の親集団からのＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞およびＣＤ１１ｂ＋およびＧｒ−１＋好中球性および単核球性細胞の頻度パーセント。ｎ＝５。図３Ｃ。ＰＭＡ／イオノマイシンによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の後の、成体生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）子孫から単離した脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７およびＩＬ−６の生成。処置の影響は、ボンフェローニの事後検定による反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによって評価した。ｎ＝５。図３Ｄ。ＰＭＡ／イオノマイシンによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の後の、成体生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）子孫の腸間膜リンパ節から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−１７およびＩＬ−６の生成。処置の影響は、ボンフェローニの事後検定による反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによって評価した。ｎ＝５。図３Ｅ。多糖Ａ（ＰＳＡ）を生成しない突然変異体Ｂ．フラジリスで処置した成体ＭＩＡ子孫の、オープンフィールド探査アッセイにおける不安様および運動行動。データは、１０分の試験中の、５０×５０ｃｍオープンフィールド内で移動した総距離（右）、１７×１７ｃｍ中心四角で費やした持続時間（中央）、および中心四角への立入り回数（左）を示す。生理食塩水、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス群のデータは、図１０の通りである。ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ＰＳＡ欠失Ｂ．フラジリス：ｎ＝１７。図３Ｆ。１０分の試験での６×８アレイへのマーブルの反復埋め込み。生理食塩水、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス群のデータは、図１０の通りである。ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ＰＳＡ欠失Ｂ．フラジリス：ｎ＝１７。データは、平均±ＳＥＭで提示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｓ＝生理食塩水＋ビヒクル、Ｐ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ビヒクル、Ｐ＋ＢＦ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス、Ｐ＋ＢＦΔＰＳＡ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ＰＳＡ欠失Ｂ．フラジリス。
【図４】ＭＩＡは、腸管微生物叢の組成の変化を誘導することを示す図である。図４Ａ。各処置群の配列数に対してフェイスの系統発生多様性（ＰＤ）をプロットした粗鬆化曲線で例示した、腸微生物叢の豊かさ。図４Ｂ。ジニ係数によって示される腸微生物叢の均一性。図４Ｃ。ビヒクルまたはＢ．フラジリスによる成体子孫の処置から１、２および３週間後に収集した糞便試料における、Ｂ．フラジリス１６Ｓ配列（上）および細菌１６Ｓ配列（下）のレベル。Ｂ．フラジリスが定着した無菌マウスを、陽性対照として使用した。データは定量的ＲＴ−ＰＣＲサイクリング閾値［Ｃ（ｔ）］で提示され、そこにおいて、Ｃ（ｔ）＞３４（ハッチ線）は無視できると考えられ、Ｃ（ｔ）＜３４については、より小さいＣ（ｔ）はより高い存在度に等しい。ｎ＝１、各々は３〜５個の独立ケージからプールされた試料を表す。図４Ｄ。ビヒクルまたはＢ．フラジリスによる成体子孫の処置から１、２および３週間後に収集した糞便試料における、Ｂ．フラジリス１６Ｓ配列（上）および細菌１６Ｓ配列（下）のレベル。Ｂ．フラジリスが定着した無菌マウスを、陽性対照として使用した。データは定量的ＲＴ−ＰＣＲサイクリング閾値［Ｃ（ｔ）］で提示され、そこにおいて、Ｃ（ｔ）＞３４（ハッチ線）は無視できると考えられ、Ｃ（ｔ）＜３４については、より小さいＣ（ｔ）はより高い存在度に等しい。ｎ＝１、各々は３〜５個の独立ケージからプールされた試料を表す。データは、平均±ＳＥＭで提示される。Ｓ＝生理食塩水＋ビヒクル、Ｐ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ビヒクル、Ｐ＋ＢＦ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス、ＧＦ＋ＢＦ＝無菌＋Ｂ．フラジリス。
【図５】ＭＩＡ子孫は、腸管微生物叢の生命異常を示すことを示す図である。図５Ａは、全ＯＴＵに基づく非加重ＵｎｉＦｒａｃベースの３Ｄ  ＰＣｏＡプロットであり、成体ＭＩＡと対照子孫の間の腸微生物叢の全体的差を例示する。各主座標（ＰＣ）によって説明される変異パーセントは、軸の上に示す。図５Ｂは、クロストリジア綱およびバクテロイデス綱ＯＴＵの二次サンプリングに基づく非加重ＵｎｉＦｒａｃベースの３Ｄ  ＰＣｏＡプロットである（試料につき２００３個の読取り）。図５Ｃは、クロストリジア綱およびバクテロイデス綱ＯＴＵを引いた後に残されたＯＴＵの二次サンプリングに基づく非加重ＵｎｉＦｒａｃベースの３Ｄ  ＰＣｏＡプロットである（試料につき４７個の読取り）。図５Ｄは、成体生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）子孫からの個々の複製生物（右、ｙ軸）の腸微生物叢の特異なＯＴＵの相対的存在度（下、ｘ軸）を示すヒートマップであり、強度が増加する赤色は、特定の試料の特異なＯＴＵの相対的存在度の増加を表す。処置群を有意に識別する全てのＯＴＵをプロットする。リボソームデータベースプロジェクトによって命名された家族レベルの分類学的帰属を、各ＯＴＵについて示す。図５Ｅは、最も豊富な分類群（左）および最も豊富でない分類群（右）の、クラスレベルでの分類学的帰属によって分類されたＯＴＵの平均の相対的存在度を示す。ｎ＝１０。ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス処置群について、データを同時に収集し、分析した。
【図６】Ｂ．フラジリス処置は、ＭＩＡ子孫において、ＧＩ障壁の完全性ならびに密着帯構成成分およびサイトカインの結腸発現の欠陥を修正することを示す図である。図６Ａ。腸管透過性アッセイ、ＦＩＴＣ−デキストランの経口強制栄養の後に血清で検出されるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の蛍光強度を測定する。データは、成体生理食塩水子孫で観察された蛍光強度に標準化される。ＤＳＳ、生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）のデータは、図１の通りである。ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス：ｎ＝９。図６Ｂ。成体の生理食塩水、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス子孫の結腸でのベータアクチンと比較した密着帯構成成分の発現。各遺伝子のデータは、生理食塩水子孫での発現レベルに標準化される。生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）のデータは、図１の通りである。棒の直上のアスタリスクは、生理食塩水対照（黒線で表すように、１に標準化される）と比較した有意性を示し、グラフの最上部のアスタリスクは、ポリ（Ｉ：Ｃ）とポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス群の間の統計的有意性を表す。ｎ＝８。図６Ｃ。クローディン８の免疫蛍光染色。ｎ＝５の代表的画像。図６Ｄ。ウエスタンブロットで測定された、生理食塩水、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス子孫からの結腸におけるクローディン８（左）およびクローディン１５（右）のタンパク質レベル。同じブロットからの代表的なシグナルを、下に表す。データは、生理食塩水子孫で検出されたシグナル強度に標準化される。ｎ＝３。図６Ｅ。成体の生理食塩水、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス子孫の結腸でのベータアクチンと比較したＩＬ−６の発現。データは、生理食塩水子孫での発現レベルに標準化される。生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）のデータは、図１の通りである。ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス：ｎ＝３。図６Ｆ。成体の生理食塩水、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス子孫の結腸での全タンパク質含有量と比較したサイトカインおよびケモカインのタンパク質レベル。データは、生理食塩水子孫での発現レベルに標準化される。生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）のデータは、図１の通りである。棒の直上のアスタリスクは、生理食塩水対照（黒線で表すように、１に標準化される）と比較した有意性を示し、グラフの最上部のアスタリスクは、ポリ（Ｉ：Ｃ）とポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス群の間の統計的有意性を表す。ｎ＝１０。データは、平均±ＳＥＭで提示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ．ｓ．＝有意でない。ＤＳＳ＝デキストラン硫酸ナトリウム、Ｓ＝生理食塩水＋ビヒクル、Ｐ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ビヒクル、Ｐ＋ＢＦ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス。
【図７】ＩＬ−６は、クローディン８および１５の結腸発現をモジュレートすることを示す図である。図７Ａ。組換えマウスＩＬ−６の漸増濃度とｅｘ  ｖｉｖｏで４時間培養した成体野生型マウスの結腸でのベータアクチンと比較した、クローディン８（左）およびクローディン１５（右）の用量依存的発現。データは、０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６対照で検出された発現レベルに標準化される。ｎ＝３。図７Ｂ。８０ｎｇ／ｍｌの組換えマウスＩＬ−６と培養した成体野生型マウスの結腸でのベータアクチンと比較した、クローディン８（左）およびクローディン１５（右）の時間依存的発現。ｎ＝３。図７Ｃ。組換えマウスＩＬ−６による処置から１２時間後の成体野生型マウスの結腸でのベータアクチンと比較した、クローディン８（上）およびクローディン１５（下）の発現。ｎ＝３。データは、平均±ＳＥＭで提示される。
【図８】Ｂ．フラジリス処置は、ＭＩＡ子孫で腸管微生物叢の組成を変化させ、種レベルの異常を修正することを示す図である。図８Ａは、全てのＯＴＵに基づく非加重ＵｎｉＦｒａｃベースの３Ｄ  ＰＣｏＡプロットである。各主座標（ＰＣ）によって説明される変異パーセントは、軸の上に示す。生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）のデータは、図２の通りである。図８Ｂ。ＭＩＡによって有意に変化し、Ｂ．フラジリス処置によって完全に回復する、ラクノスピラ科（上）およびバクテロイデス目（下）の鍵となるＯＴＵの相対的存在度。データは、平均±ＳＥＭで提示される。図８Ｃは、パネルＢに提示された鍵となるＯＴＵの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の最近接分析に基づく系統樹である。実線で示す分岐はラクノスピラ科のＯＴＵを示し、破線で示す分岐はバクテロイデス目のＯＴＵを示す。６つの数で標識した分類群は、ポリ（Ｉ：Ｃ）子孫で有意に上昇し、Ｂ．フラジリス処置によって修正されたＯＴＵを示す。ｎ＝１０。
【図９】ＭＩＡ子孫の処置の後に、Ｂ．フラジリスの持続的な定着の証拠がないことを示す図である。図９Ａ。ビヒクルまたはＢ．フラジリスによる成体子孫の処置から１、２および３週間後に収集した糞便試料における、Ｂ．フラジリス１６Ｓ配列（上）および細菌１６Ｓ配列（下）のレベル。Ｂ．フラジリスが定着した無菌マウスを、陽性対照として使用した。データは定量的ＲＴ−ＰＣＲサイクリング閾値［Ｃ（ｔ）］で提示され、そこにおいて、Ｃ（ｔ）＞３４（ハッチ線）は無視できると考えられ、Ｃ（ｔ）＜３４については、より小さいＣ（ｔ）はより高い存在度に等しい。ｎ＝１、各々は３〜５個の独立ケージからプールされた試料を表す。図９Ｂ。ビヒクルまたはＢ．フラジリスによる成体子孫の処置から１、２および３週間後に収集した糞便試料における、Ｂ．フラジリス１６Ｓ配列（上）および細菌１６Ｓ配列（下）のレベル。Ｂ．フラジリスが定着した無菌マウスを、陽性対照として使用した。データは定量的ＲＴ−ＰＣＲサイクリング閾値［Ｃ（ｔ）］で提示され、そこにおいて、Ｃ（ｔ）＞３４（ハッチ線）は無視できると考えられ、Ｃ（ｔ）＜３４については、より小さいＣ（ｔ）はより高い存在度に等しい。ｎ＝１、各々は３〜５個の独立ケージからプールされた試料を表す。データは、平均±ＳＥＭで提示される。Ｓ＝生理食塩水＋ビヒクル、Ｐ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ビヒクル、Ｐ＋ＢＦ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス、ＧＦ＋ＢＦ＝無菌＋Ｂ．フラジリス。
【図１０】Ｂ．フラジリス処置は、ＭＩＡ子孫で自閉症関連の行動異常を改善することを示す図である。図１０Ａ。１０分の試験中の、５０×５０ｃｍオープンフィールド内で移動した総距離（右）、１７×１７ｃｍ中心四角で費やした持続時間（中央）、およびフィールドの中心への立入り回数（左）で測定した、オープンフィールド探査アッセイでの不安様および運動行動。ｎ＝３５〜７５。図１０Ｂ。パルスだけへの驚愕反応と５ｄｂまたは１５ｄｂの前パルスが先行したパルスへの驚愕反応の間の差をパーセントで測定した、前パルス阻害アッセイでの知覚運動ゲーティング。処置の影響は、ボンフェローニの事後検定による反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによって評価した。ｎ＝３５〜７５。図１０Ｃ。１０分の試験中の３×６アレイへのマーブルの反復埋め込み。ｎ＝１６〜４５。図１０Ｄ。１０分の社会的遭遇の間に成体雄マウスによって発生された超音波発声の総数（左）、平均持続時間（中央）および総持続時間（右）で測定された伝達行動。ｎ＝１０。図１０Ｅは、Ｂ．フラジリスで処置したＭＩＡ子孫での社交性の欠陥を示す。図１０Ｆは、Ｂ．フラジリスで処置したＭＩＡ子孫での社会的好みの欠陥を示す。グラフは、マウスの３〜６個の独立したコホートで得られた累積結果を表す。データは、平均±ＳＥＭで提示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｓ＝生理食塩水＋ビヒクル、Ｐ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ビヒクル、Ｐ＋ＢＦ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス。ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリスΔＰＳＡおよびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．テタイオタオミクロン処置群について、データを同時に収集した。
【図１１】ＭＩＡ子孫での自閉症関連の行動の改善は、Ｂ．フラジリス処置に特異的でないことを示す図である。図１１Ａ。１０分の試験中の、５０×５０ｃｍオープンフィールド内で移動した総距離（右）、１７×１７ｃｍ中心四角で費やした期間（中央）、およびフィールドの中心への立入り回数（左）で測定した、オープンフィールド探査アッセイでの不安様および運動行動。ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．テタイオタオミクロン：ｎ＝３２。図１１Ｂ。１０分の試験中の３×６アレイへのマーブルの反復埋め込み。ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．テタイオタオミクロン：ｎ＝３２。図１１Ｃ。１０分の社会的遭遇の間に成体雄マウスによって発生された超音波発声の総数（左）、平均持続時間（中央）および総持続時間（右）で測定された伝達行動。ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．テタイオタオミクロン：ｎ＝１０。図１１Ｄ。パルスだけへの驚愕反応と５ｄｂまたは１５ｄｂの前パルスが先行したパルスへの驚愕反応の間の差をパーセントで測定した、前パルス阻害アッセイでの知覚運動ゲーティング。処置の影響は、ボンフェローニの事後検定による反復測定二元配置ＡＮＯＶＡによって評価した。ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．テタイオタオミクロン：ｎ＝３２。全てのパネルについて、生理食塩水、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリスのデータは、図１０の通りである。グラフは、マウスの３〜６個の独立したコホートで得られた累積結果を表す。データは、平均±ＳＥＭで提示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。Ｓ＝生理食塩水＋ビヒクル、Ｐ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ビヒクル、Ｐ＋ＢＦ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス、Ｐ＋ＢＴ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．テタイオタオミクロン。
【図１２】Ｂ．フラジリス処置は、統計的に有意な血清中代謝産物変化を引き起こし、脂肪酸代謝およびプリンサルベージ経路に関連する生化学物質の広範囲にわたる変化を伴うことを示す図である。ＧＣ／ＬＣ−ＭＳによる測定で、生理食塩水対照と比較して、Ｂ．フラジリス処置ＭＩＡ子孫の血清で有意に変化する１０３個の代謝産物のレベル。色は、生理食塩水子孫で検出された代謝産物濃度に対する変化倍率（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）を示し、赤い色相は対照と比較して増加したレベルを表し、緑の色相は対照と比較して減少したレベルを表す（左上の説明文を参照）。示される全ての変化は、対比による二元配置ＡＮＯＶＡによりｐ＜０．０５である。Ｐ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）、Ｐ＋ＢＦ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス。ｎ＝８。
【図１３】Ｂ．フラジリス処置は、不安様行動を十分に誘導する微生物依存性代謝産物である４−エチルフェニルスルフェート（４ＥＰＳ）の、ＭＩＡによって誘導された変化を修正することを示す図である。図１３Ａは、ＭＩＡによって有意に変化し、Ｂ．フラジリス処置によって回復した、ＧＣ／ＬＣ−ＭＳによって検出された代謝産物の相対的数量化を示す。ｎ＝８。図１３Ｂは、従来通り定着させた（特定病原体除去、ＳＰＦ）マウスに対する成体無菌（ＧＦ）マウスの血清でＬＣ−ＭＳによって検出された４ＥＰＳの濃度を示す。Ｕ．Ｄ．＝検出不能。ｎ＝１、各々は３〜５匹のマウスからプールされた血清を表す。図１３Ｃ。４ＥＰＳまたは生理食塩水ビヒクルで処置した従来の野生型マウスの、オープンフィールド探査アッセイにおける不安様および運動行動。データは、１０分の試験中の、５０×５０ｃｍオープンフィールド内で移動した総距離（右）、および１７×１７ｃｍ中心四角で費やした持続時間（左）を示す。４ＥＰＳおよびビヒクルで処置したマウスの間に、フィールドの中心への立入り回数の差はない（データ示さず）。ｎ＝１０。図１３Ｄ。対照と比較した４ＥＰＳ処置マウスにおける、前パルス阻害アッセイでの強化された驚愕反射。データは、１２０ｄｂのパルスに応じて起こった驚愕の平均強度（左）、および５ｄｂまたは１５ｄｂの前パルスが先行したときのパルスの阻害パーセント（右）を示す。ｎ＝１０。データは、平均±ＳＥＭで提示される。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、Ｓ＝生理食塩水＋ビヒクル、Ｐ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋ビヒクル、Ｐ＋ＢＦ＝ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス、ＳＰＦ＝特定病原体除去（従来通りに定着した）、ＧＦ＝無菌、Ｖｅｈ．＝ビヒクル（生理食塩水）、４ＥＰＳ＝４−エチルフェニルスルフェート。
【図１４】宿主−微生物相互作用による自閉症関連代謝産物の合成を示す図である。図１４Ａ。微生物チロシン代謝および宿主硫酸化による、４ＥＰＳ（ＭＩＡ血清で上昇し、Ｂ．フラジリス処置によって回復することが見出されている）およびｐ−クレゾール（ＡＳＤ個体の尿で上昇することが報告されている）の合成を例示する図。図１４Ｂ。微生物トリプトファン代謝および宿主グリシン抱合からの、インドールピルベート（ＭＩＡ血清で上昇し、Ｂ．フラジリス処置によって回復することが見出されている）およびインドリル−３−アクリロイルグリシン（ＡＳＤ個体の尿で上昇することが報告されている）の合成を例示する図。実線矢印は、公知の生物的変換を表す。点線矢印は、予測された生物的変換を表す。
【図１５】４−エチルフェニルスルフェート（４ＥＰＳ）の合成、検出およびｉｎ  ｖｉｖｏ実験を示す図である。図１５Ａ。還流ベンゼン中で４−エチルフェノールを三酸化硫黄−ピリジンで処理してピリジニウム塩を生成し、続いてＫ＋樹脂の上でイオン交換を行ってカリウム塩を生成することによる４ＥＰＳ合成の図。図１５Ｂ。ＬＣ／ＭＳによって分析した、カリウム４ＥＰＳの既知濃度の用量反応曲線および線状回帰分析。図１５Ｃ。成体野生型マウスへの３０ｍｇ／ｋｇのカリウム４ＥＰＳの単回ｉ．ｐ．注射の後の、血清中４ＥＰＳの時間依存的増加。図１５Ｄ。１０分の社会的遭遇の間に成体雄マウスによって発生された超音波発声の総数（左）、平均持続時間（中央）および総持続時間（右）で測定された伝達行動。ｎ＝５。図１５Ｅ。１０分の試験中の３×６アレイへのマーブルの反復埋め込み。ｎ＝１０。データは、平均±ＳＥＭで提示される。Ｖｅｈ．＝ビヒクル（生理食塩水）、４ＥＰＳ＝４−エチルフェニルスルフェート。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付図を参照する。図では、文脈が特に指図しない限り、類似した記号は類似した構成成分を一般的に特定する。詳細な説明、図および請求項に記載される例示的実施形態は、限定するものでない。本明細書に提示される主題の精神または範囲を逸脱しない範囲で、他の実施形態を利用することができ、他の変更を加えることができる。本明細書に一般的に記載され、図で例示される本開示の態様を多種多様な異なる立体配置で配置し、置換し、組み合わせ、分離し、設計することができることは容易に理解され、その全ては本明細書で明示的に企図される。
【００３２】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、常動行動ならびに言葉および社会的交流の欠陥を特徴とする重大な神経発達障害である。本明細書に記載されるように、様々な代謝産物がＡＳＤに関連する。対象におけるこれらの代謝産物のレベルは、ＡＳＤを診断するために判定し、使用することができ、または、例えば対象の行動性能を向上させることによって、ＡＳＤの処置のために調整することができる。さらに、本明細書に記載されるように、様々な代謝産物がＢ．フラジリス処置に応答性であり、それらの代謝産物は、プロバイオティック処置に対するＡＳＤを患っている対象の感受性を評価するために使用することができる。
【００３３】
一部の実施形態では、対象の行動性能を向上させるために、処置を必要とする対象の循環中の代謝産物のレベルを判定し、調整する。処置を必要とする対象は、不安、ＡＳＤ、またはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴う病的状態を患っている対象であってもよい。対象の循環中の代謝産物のレベルは、代謝産物の血中レベル、例えば血清中レベルまたは血漿中レベルであってもよい。一部の実施形態では、対象の行動性能を向上させるために、対象の代謝産物の尿中または糞便中レベルを判定し、調整する。
【００３４】
一部の実施形態では、対象がＡＳＤを有するかどうか診断するために、対象の循環中の代謝産物のレベルを検出し、自閉症でない集団での代謝産物の参照レベルと比較する。対象の循環中の代謝産物のレベルは、代謝産物の血中レベル、例えば血清中レベルまたは血漿中レベルであってもよい。
【００３５】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ  １９９４年）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ  １９８９年）を参照。本開示のために、以下の用語が下で定義される。
【００３６】
本明細書で用いるように、用語「対象」は、哺乳動物などの脊椎動物である。用語「哺乳動物」は哺乳綱に属する個体と定義され、限定されずにヒト、家畜ならびに飼育動物、および動物園、スポーツまたは愛玩動物、例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコまたはウシが含まれる。一部の実施形態では、対象はヒトである。
【００３７】
本明細書で用いるように、用語「状態／障害／症状」または「行動異常」は、対象が表す症状、例えば、それらに限定されないが、不安、脆弱Ｘ、Ｒｅｔｔ症候群、結節硬化、強迫性障害、注意欠陥障害、統合失調症、自閉症（古典的自閉症）、アスペルガー障害（アスペルガー症候群）、他に規定されない広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、児童統合障害（ＣＤＤ）、またはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴う病的状態を指す。
【００３８】
本明細書で用いるように、用語「処置を必要とする対象」は、上で指摘した行動障害／症状の１つまたは複数を表しているか患っている対象を指す。標準の行動試験プロトコル／ガイドラインを使用して、適格者は処置を必要とするそのような個体を同定することができる。個体の障害および／または症状に向上があるかどうか判定するために、同じ行動試験プロトコル／ガイドラインを使用することもできる。
【００３９】
本明細書で用いるように、用語「行動性能の向上」は、いかなる程度であれ、不安、ＡＳＤまたはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴う病的状態を患っている個体が表す行動障害、症状および／または異常の１つまたは複数の予防またはその重症度もしくは頻度の低減を指す。行動症状の非限定的な例には、反復性の行動、前パルス阻害（ＰＰＩ）の減少および不安の増加が含まれる。向上は、処置を受けている個体自身、または別の者（医師その他）によって観察される。
【００４０】
本明細書で用いるように、用語「処置」は、患者、特にＡＳＤを患っている患者が表す疾患、障害または生理的状態に応じて加えられる臨床介入を指す。処置の目的には、症状の軽減または予防、疾患、障害または状態の進行または悪化を減速するか、停止すること、および疾患、障害または状態の寛解の１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、「処置」は、治療的処置および予防的または防止的措置を指す。処置を必要とする者には、疾患または障害または望ましくない生理的状態に既に侵されている者、ならびに疾患または障害または望ましくない生理的状態を予防すべき者が含まれる。例えば、一部の実施形態では、処置は、ＡＳＤ関連の行動を含む、対象の行動性能を向上させることができる。本明細書で用いるように、用語「予防」は、それらの行動症状を後に発現する個体の負担を低減する任意の活性を指す。これは、一次、二次および三次の予防レベルで起こり：ａ）一次予防は、症状／障害／状態の発達を避け；ｂ）二次予防活性は状態／障害／症状の処置の初期段階に向けられ、それによって、状態／障害／症状の進行および症状の出現を予防する介入の機会を増加させる；ｃ）三次予防は、例えば機能回復、および／または任意の状態／障害／症状もしくは関連する合併症を低減することによって、既に確立された状態／障害／症状の悪影響を低減する。
【００４１】
「薬学的に許容される」担体は、用いられる投薬量および濃度で、それに曝露される細胞または哺乳動物に無毒な担体である。「薬学的に許容される」担体は、限定されずに、選択される適用様式、例えば経口適用または注射に適し、従来の医薬用製剤の形、例えば錠剤、顆粒剤、粉末、カプセル剤などの固体、および溶液、乳濁液、懸濁液等の液体で投与される、有機または無機の、固体か液体の賦形剤であってもよい。しばしば、生理的に許容される担体は、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液などのｐＨ緩衝水溶液である。生理的に許容される担体は、以下の１つまたは複数を含むこともできる：抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、炭水化物、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン、ＥＤＴＡなどのキレート化剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、ならびに非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）。補助剤、安定剤、乳化剤、滑沢剤、結合剤、ｐＨ調整剤コントローラ、等張剤および他の従来の添加剤を、担体に加えることもできる。
【００４２】
薬学的に許容されるか適当な担体には、ＧＩ管の障害状況に有益であることが知られている他の化合物（例えば、抗酸化剤、例えばビタミンＣ、ビタミンＥ、セレンまたは亜鉛）；または食物組成物が含まれてもよい。食物組成物は、限定されずに、ミルク、ヨーグルト、凝乳、チーズ、発酵乳、ミルクベースの発酵生成物、アイスクリーム、発酵した穀類ベースの生成物、ミルクベースの粉末、小児処方、錠剤、液体細菌懸濁液、乾燥経口補助食品または湿式経口補助食品であってもよい。
【００４３】
本明細書で用いるように、用語「栄養補助食品」は、健康に有益な食物（強化食品または食事補助食品として）を指す。栄養補助食品は、医薬品と同じ試験および規制の対象でない。
【００４４】
本明細書で用いるように、用語「プロバイオティック」は生きている微生物を指し、適当量で投与されると、それは宿主に健康有益性を与える。プロバイオティクスは、食物および食事補助食品（例えば、限定されずにカプセル剤、錠剤および粉末）で入手することができる。プロバイオティックを含有する食物の非限定的な例には、酪農製品、例えばヨーグルト、発酵および未発酵ミルク、スムージー、バター、クリーム、フーマス、コンブチャ、サラダドレッシング、ミソ、テンペー、栄養バーおよび一部のジュースおよびダイズ飲料が含まれる。
【００４５】
本明細書で用いるように、用語「代謝産物」は、代謝に関与する任意の分子を指す。代謝産物は、代謝過程での生成物、基質または中間体であってもよい。例えば、代謝産物は、一次代謝産物、二次代謝産物、有機代謝産物または無機の代謝産物であってもよい。代謝産物には、アミノ酸、ペプチド、アシルカルニチン、単糖、脂質およびリン脂質、プロスタグランジン、ヒドロキシエイコサテトラエン酸、ヒドロキシオクタデカジエン酸、ステロイド、胆汁酸、および糖脂質およびリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で用いるように、用語「サイトカイン」は、免疫系の細胞の活性をモジュレートする、分泌されたタンパク質またはその活性断片もしくは突然変異体を指す。サイトカインの例には、限定されずに、インターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、腫瘍壊死因子、免疫細胞前駆体のためのコロニー刺激因子等が含まれる。
【００４７】
本明細書で用いるように、用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体、ダイアボディ、ならびに単鎖分子、および抗体断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２およびＦｖ）が含まれる。異なるクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｅｓ．、Ａｂｂａ  Ｉ．ＴｅｒｒおよびＴｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｏｌｗ（編）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．、１９９４年、７１頁および第６章を参照。
【００４８】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、常動行動ならびにコミュニケーションおよび社会的交流の欠陥を特徴とする複雑な神経発達障害である。用語「スペクトラム」は、ＡＳＤ患者が有する可能性がある、多様な症状、技術、および機能障害または身体障害のレベルを指す。ＡＳＤは、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、第四版−テキスト改訂（ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲ）に掲載されるガイドラインに従って一般に診断される。マニュアルは現在、自閉症障害（古典的自閉症）、アスペルガー障害（アスペルガー症候群）、他に規定されない広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、Ｒｅｔｔの障害（Ｒｅｔｔ症候群）および児童統合障害（ＣＤＤ）を含む、時には広汎性発達障害（ＰＤＤ）と呼ばれる５つの障害をＡＳＤとして定義する。一部の患者は症状が軽度の障害であるが、他は重度の障害である。ＡＳＤは、病因が明確に定義されておらず、標的とする治療法がない複雑な障害のセットを包含する。
【００４９】
近年の研究は、自閉症個体における著しい神経および末梢免疫性の調節不全を鮮明にする。その発生率および核心的自閉症行動の重症度との相関を考慮すると、ＡＳＤでのいくつかの併存症の中で、胃腸（ＧＩ）窮迫が特に興味深い（Ａｄａｍｓら、２０１１年；Ｂｕｉｅら、２０１０年；Ｃｏｕｒｙら、２０１２年；Ｇｏｒｒｉｎｄｏら、２０１３年；Ｉｂｒａｈｉｍら、２００９年；Ｗａｎｇら、２０１１年）。ＡＳＤ児童のかなりのサブセットは、腸管透過性の増加（または「漏出性の腸」および腸管微生物叢の変化した組成を含む、胃腸（ＧＩ）合併症を示す（Ｂｕｉｅら、２０１０年；Ｃｏｕｒｙら、２０１２年；Ｄ’Ｅｕｆｅｍｉａら、１９９６年；ｄｅ  Ｍａｇｉｓｔｒｉｓら、２０１０年；ｄｅ  Ｍａｇｉｓｔｒｉｓら、２０１３年；Ｉｂｒａｈｉｍら、２００９年）。さらに、１４，０００人以上のＡＳＤ個体の近年の多施設研究は、対照と比較して炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および他のＧＩ障害のより高い発生率をＡＳＤ患者で報告する（Ｋｏｈａｎｅら、２０１２年）。変化した栄養素摂取量、食事アレルギーおよび代謝破壊もＡＳＤと関連し、抗生物質処置および制限食は、一部の自閉症児に行動の向上を提供することが報告されている（Ｂｕｉｅら、２０１０年）。
【００５０】
母体の免疫活性化（ＭＩＡ）は、ＡＳＤの重要な環境危険因子である。いくつかの大きな疫学研究は、母体のウイルスおよび細菌感染症と子孫での自閉症危険率の増加とを関連づけた（（Ａｔｌａｄｏｔｔｉｒら、２０１０年；Ｇｏｒｒｉｎｄｏら、２０１２年）。妊娠雌にウイルスの模擬ポリ（Ｉ：Ｃ）を注射することによってマウスでこの危険因子をモデル化することは、自閉症の核心的行動症状、例えば反復性／衝動的な行動の特質症状、ならびに一般的な自閉症神経病理（プルキンエ細胞での空間的に制限された欠陥）を示す子孫を生み出すことが示されている（（Ｂｏｋｓａ、２０１０年；Ｍａｌｋｏｖａら、２０１２年；Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｒら、２０１３年；Ｓｈｉら、２００９年）。近年、ＭＩＡ子孫は、免疫系および胃腸管の異常を示すことも見出されている。
【００５１】
ヒトには大きな存在度および多様な微生物が定着し、それは健康および疾患の調節で重大な役割をする。片利共生微生物叢の生命異常は、ＩＢＤ、肥満および心血管疾患を含むヒトのいくつかの病気の病原性と結びつけられている（ＢｌｕｍｂｅｒｇおよびＰｏｗｒｉｅ、２０１２年；Ｃｌｅｍｅｎｔｅら、２０１２年）。片利共生細菌は、社会的、感情的、侵害受容および不安様行動を含む様々な複雑な行動にも影響を及ぼし（Ａｍａｒａｌら、２００８年；Ｂｒａｖｏら、２０１１年；Ｄｅｓｂｏｎｎｅｔら、２０１３年；Ｈｅｉｊｔｚら、２０１１年）、マウス（Ａｌ−Ａｓｍａｋｈら、２０１２年；Ｃｏｌｌｉｎｓら、２０１２年；ＣｒｙａｎおよびＤｉｎａｎ、２０１２年）およびヒト（Ｔｉｌｌｉｓｃｈら、２０１３年）で脳の発達および機能に寄与する。腸微生物叢と脳の間の遠距離相互作用は、マウスで多発性硬化症およびうつ病の症状を処置する微生物ベースの療法の能力（Ｂｒａｖｏら、２０１１年；Ｈｏｏｐｅｒら、２０１２年；Ｏｃｈｏａ−Ｒｅｐａｒａｚら、２０１０年）、ならびにヒトの慢性疲労症候群および精神的窮迫の感情的な症状の処置で報告されたプロバイオティクスの効力の根底にある（Ｍｅｓｓａｏｕｄｉら、２０１１年；Ｒａｏら、２００９年）。
【００５２】
破壊された群集組成（Ａｄａｍｓら、２０１１年；Ｆｉｎｅｇｏｌｄ、２０１１年；Ｆｉｎｅｇｏｌｄら、２０１０年；Ｆｉｎｅｇｏｌｄら、２０１２年；Ｇｏｎｄａｌｉａら、２０１２年；Ｐａｒｒａｃｈｏら、２００５ｂ；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２０１１年；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２０１２年）、および微生物によって誘導された代謝産物の変化した末梢レベル（Ａｌｔｉｅｒｉら、２０１１年；Ｆｒｙｅら、２０１３年；ＭａｃＦａｂｅ、２０１２年；Ｍｉｎｇら、２０１２ｂ；Ｙａｐら、２０１０ａ）を含む、微生物叢に関係がある多数の異常が自閉症個体で同定された。
【００５３】
行動性能を向上させるための方法
処置を必要とする対象の行動性能を向上させるための方法が、本明細書で提供される。処置を必要とする対象は、不安、ＡＳＤ、またはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴う病的状態を患っている対象であってもよい。
【００５４】
一部の実施形態では、本方法は、処置を必要とする対象のＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを判定することと、対象の行動性能の向上が観察されるまで対象のＡＳＤ関連代謝産物の血中レベルを調整することとを含む。
【００５５】
一部の実施形態では、本方法は、処置を必要とする対象の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）関連代謝産物のレベルを判定することと、対象の代謝産物のレベルが自閉症でない対象群の代謝産物の参照レベルと実質的に同じであるように対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルを調整し、それによって対象の行動性能を向上させることとを含む。一部の実施形態では、本方法は、自閉症でない対象の集団でＡＳＤ関連代謝産物の参照レベルを判定することをさらに含むことができる。
【００５６】
一部の実施形態では、本方法は、処置を必要とする対象の自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）関連代謝産物のレベルを判定することと、対象の代謝産物のレベルが、ＡＳＤ、不安またはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴ういかなる病的状態も患っていない対象の集団での代謝産物の参照レベルと実質的に同じであるように対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルを調整し、それによって対象の行動性能を向上させることとを含む。一部の実施形態では、本方法は、ＡＳＤ、不安またはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴ういかなる病的状態も患っていない対象中でＡＳＤ関連代謝産物の参照レベルを判定することをさらに含むことができる。
【００５７】
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法は、処置を必要とする対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルを調整する前に行動性能のベースラインを測定すること、および／または処置を必要とする対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルを調整した後に行動性能を測定することを含むこともできる。一部の実施形態では、本方法は、処置を必要とする対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルを調整する前および後の行動性能を比較することを含むことができ、その比較は、対象の行動性能が向上するかどうか、およびどの程度向上するかについて判定するために使用することができる。
【００５８】
本明細書で開示される方法では、様々なパラメータおよび方法を使用して行動性能を測定および評価することができる。例えば、試験下の対象の制限された反復性の行動および／または常同行動パターンの存在および／または程度を判定するために、行動試験を実行することができる。一部の実施形態では、行動試験のために、自閉症行動チェックリスト（ＡＢＣ）、自閉症診断インタビュー−改訂版（ＡＤＩ−Ｒ）、児童自閉症評価スケール（ＣＡＲＳ）および／または前言語自閉症診断観察スケジュール（ＰＬ−ＡＤＯＳ）が使用される。行動試験には、限定されずに、１）強度または集中のいずれかが異常である、対象の１つまたは複数の常同的および制限されたパターンへの没頭、２）特定の非機能的ルーチンまたは儀式への頑なな執着、ｃ）常同的および反復性の運動マンネリズム（例えば、手フラッピング、指フラッピングなど）、ならびに／またはｄ）物体の部分への持続的な没頭の存在および／または程度を検出することを含めることができる。行動試験に含めることができ、試験下の対象の行動性能を向上させることの必要性を示唆する行動の非限定的な例には、以下のものが含まれる：ａ）感覚に関する行動、例えば学習時の視覚的識別能の低利用、聞こえないようであり、したがって難聴が疑われる、時には、大きい雑音への「驚愕反応」を示さない、時には、あざ、切り傷および注射などの痛みを伴う刺激が反応を呼び起こさない、しばしば、明るい光を目に向けたときに瞬かない、多くの音に耳を塞ぐ、天然光の存在下で、目を細めるか、眉をひそめるか、目を覆う、しばしば、「見知らぬ」人への視覚的反応を示さず、長期間空間を見つめる；ｂ）対人行動：しばしば、社会的／環境的刺激に参加しない、社会的微笑を示さない、手を差し出されたときに手を伸ばさない、他人の表情／感情に非反応性で、能動的に目を合わさない、触られるか抱かれることに抵抗する、腕に抱かれるときにだらける、硬直して、抱くことが困難、遊びで他の子供を模倣しない、友好関係を築いたことがない、しばしばおびえているか非常に不安である、人を「覗き込む」；ｃ）身体および物体の使用に関する行動：長期間自身を回転させる、玩具を適切に使用しない、彼／彼女と特定の物体を譲り合わない、長期間自身を揺らす、突進および疾走をよくする、手をバタバタする、つま先で歩く、頭をぶつける、手を噛むなどによって自己を傷つける、頻繁に物体をクルクル回し、回転させ、たたく、環境中の物体を触り、においを嗅ぎ、および／または味見する、物を揃えるなどの複雑な「儀式」に関係する、非常に破壊的である；ならびにｄ）言葉に関する行動：一度与えられる簡単な命令に従わない、代名詞逆転を有する、会話が無調である、他の二人の間で、大声で呼ばれる自身の名前に応答しない、滅多に「はい」または「私」と言わない、前置詞を含む簡単な命令に従わない、身振りをすることによって所望の物体を得る、語句を何度も反復する、名前を挙げた物体を５つを超えて指摘することができない、欲しい物および必要な物を伝えるために、１日に０〜５個の自発的単語を使用する、音または単語を何度も反復する、他による質問または表明を繰り返す、伝えるために１日に少なくとも１５個から３０個未満の自発的語句を使用する、簡単な作業を学習するが、速やかに「忘れる」、ルーチン／環境の変化への強い反応、発達の１つの領域で「特殊技能」を有し、それは精神発達遅滞を無視するようである、重度のかんしゃくおよび／または頻繁な軽微な立腹、噛む、打つ、けることなどによって他人を傷つける、要求が満たされるのを待たない、トイレをすることに困難である、頻繁な援助がないと着用しない、しばしば周囲に無意識であり、危険な状況に気がつかないことがある、生命のない物を操作し、専念することを好む、ならびに発達の遅延は、３０カ月の年齢またはそれ以前に同定された。主治医ならば本明細書で開示される処置を必要とする対象を特定する方法を知るであろうことを、当業者は理解する。
【００５９】
調整の後、対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルは、自閉症でない対象群の代謝産物の参照レベルの約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、約１００％、約１０１％、約１０２％、約１０５％、約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲であってもよい。一部の実施形態では、対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルは、自閉症でない対象群の代謝産物の参照レベルの約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、約１００％、約１０１％、約１０２％、約１０５％、約１１０％、約１２０％、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲である。一部の実施形態では、対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルは、自閉症でない対象群の代謝産物の参照レベルの約９５％、約９８％、約９９％、約１００％、約１０１％、約１０２％、約１０５％、またはこれらの値の任意の２つの間の範囲である。代謝産物のレベルは、対象の循環中の代謝産物のレベルであってもよい。例えば、代謝産物のレベルは、対象の血液または他の体液（例えば、脳脊髄液、胸膜液、羊水、精液または唾液）の中の代謝産物のレベルであってもよい。一部の実施形態では、代謝産物のレベルは、対象の代謝産物の血中レベルである。代謝産物の血中レベルは、例えば、代謝産物の血清中レベルまたは血漿中レベルであってもよい。一部の実施形態では、代謝産物のレベルは、対象の代謝産物の尿中レベルである。
【００６０】
一部の実施形態では、対象は、不安、ＡＳＤ、またはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴う病的状態を患っている。ＡＳＤの非限定的な例には、自閉症障害（古典的自閉症）、アスペルガー障害（アスペルガー症候群）、他に規定されない広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、Ｒｅｔｔの障害（Ｒｅｔｔ症候群）および児童統合障害（ＣＤＤ）が含まれる。一部の実施形態では、対象はＡＳＤを患っている。一部の実施形態では、対象は自閉症を患っている。
【００６１】
対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベル、例えば血中レベルを調整するために、様々な方法を使用することができる。一部の実施形態では、代謝産物のレベル、例えば血中レベルは、対象の腸微生物叢の組成を調整することによって調整される。対象の腸微生物叢の組成の調整は、例えば、糞便の移植（糞便微生物叢の移植（ＦＭＴ）、糞便細菌療法または大便移植としても知られる）によって達成することができる。糞便の移植は、健全なドナー、例えば自閉症でない対象からレシピエント（例えば、自閉症を患っている対象）への糞便中の細菌の移植の工程を含むことができる。糞便の移植の手順は、ドナーからレシピエントへの細菌糞便フローラの単回または複数回の注入（例えば、浣腸による）を含むことができる。
【００６２】
一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を調整することは、細菌を含む組成物、例えばバクテロイデス属の細菌を含む組成物を対象に投与することを含む。本明細書で開示される方法で使用することができるバクテロイデス属の細菌は、特に限定されない。一部の実施形態では、バクテロイデス属の細菌は、Ｂ．フラジリス、Ｂ．テタイオタオミクロン、Ｂ．ブルガツス、またはそれらの混合物を含む。一部の実施形態では、バクテロイデス属の細菌は、Ｂ．フラジリスであってもよい。細菌を含む組成物、例えばバクテロイデス属の細菌を含む組成物は、様々な経路を通して対象に投与することができる。例えば、組成物は、経口投与、直腸投与、経皮投与、鼻腔内投与または吸入を通して対象に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は経口的に対象に投与される。細菌、例えばバクテロイデス属の細菌を含む組成物は、様々な形であってもよい。例えば、組成物は、プロバイオティック組成物、栄養補助食品、医薬組成物またはそれらの混合物であってもよい。一部の実施形態では、組成物はプロバイオティック組成物である。ヒトおよび動物対象のための各投薬量は、所望の効果を発生させるのに十分な量で計算される細菌の所定量を好ましくは含有する。実際の剤形は、用いられる特定の細菌および達成するべき効果に依存する。細菌を含む組成物、例えばバクテロイデス属の細菌を含む組成物は、単独で、または１つまたは複数の追加のプロバイオティック、栄養補助食品または治療薬と組み合わせて投与することができる。１つまたは複数のさらなる追加のプロバイオティック、栄養補助食品または治療薬「と組み合わせた」投与は、同時（同じ時間の）投与と任意の順序での連続的な投与の両方を含む。投与は、特に疾患状態の何らかの変化または望ましくない副作用を考慮して、監督実務者が適当と考える通り、慢性または間欠的であってもよい。「慢性」投与は継続的な方法での組成物の投与を指すが、「間欠的」投与は中断して行われる処置を指す。
【００６３】
一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を調整することは、対象の１種または複数種の細菌のレベルを低減することを含む。例えば、対象のクロストリジア綱細菌（ラクノスピラ科など）のレベルを低減して、対象の腸微生物叢の組成を調整することができる。一部の実施形態では、ラクノスピラ科はロゼブリア属である。バクテロイデス綱細菌（バクテロイデス目Ｓ２４−７など）のレベルを低減して、対象の腸微生物叢の組成を調整することもできる。一部の実施形態では、クロストリジア綱細菌は、ラクノスピラ科である。対象の１種または複数種の細菌のレベルを低減するために、様々な方法を使用することができる。例えば、１種または複数種の腸内細菌を低減するために、対象に減炭水化物食を提供することができる。いかなる特定の理論にも縛られないが、減炭水化物食は、細菌発酵のために必要な入手できる材料を制限して、腸内細菌種を低減することができると考えられている。
【００６４】
一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を調整することは、対象の１種または複数種の細菌のレベルを増加させることを含む。例えば、対象のルミノコッカス科、エリシペロトリクス科、および／またはアルカリゲネス科細菌のレベルを増加させて、対象の腸微生物叢の組成を調整することができる。
【００６５】
ＡＳＤ関連代謝産物
本明細書で用いるように、用語「自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）関連代謝産物」は、自閉症でない対象および／またはＡＳＤ、不安もしくはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴ういかなる病的状態も患っていない対象と比較して、ＡＳＤ、不安および／またはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴う任意の病的状態を患っている対象中でそのレベルが変化する代謝産物を指す。例えば、自閉症でない対象と比較して、ＡＳＤを患っている対象の循環中で代謝産物のレベルを変化させることができる。一部の実施形態では、自閉症でない対象と比較して、ＡＳＤを患っている対象の血液、血清、血漿、体液（例えば、脳脊髄液、胸膜液、羊水、精液または唾液）、尿および／または糞便で、代謝産物のレベルは変化する。ある場合には、ＡＳＤ関連代謝産物は、ＡＳＤを患っている対象でＡＳＤ関連の行動の発達において原因となる役割を演ずる。ある場合には、ＡＳＤ関連代謝産物のレベルの変化は、ＡＳＤによって引き起こされる。ＡＳＤ関連代謝産物は、自閉症でない対象またはＡＳＤ、不安もしくはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴ういかなる病的状態も患っていない対象と比較して、ＡＳＤを患っている対象において増加または低下したレベルを有することができる。
【００６６】
代謝産物のレベルの変動性が個体間に存在することができること、および比較のための、自閉症以外の集団、またはＡＳＤ、不安もしくはＡＳＤの症状の１つもしくは複数を伴ういかなる病的状態も患っていない対象の集団での代謝産物のレベルを代表する値として、参照レベルを確立することができることを当業者は理解する。参照集団における特定の対象の組入れおよび／または除外を判定するために、様々な基準、例えば対象の年齢（例えば、参照対象は、処置を必要とする対象と同じ年齢群に入ることができる）および対象の性別（例えば、参照対象は、処置を必要とする対象と同じ性別であってもよい）を使用することができる。一部の実施形態では、参照レベルと比較して、ＡＳＤを患っている対象においてＡＳＤ関連代謝産物のレベルは増加する。一部の実施形態では、参照レベルと比較して、ＡＳＤを患っている対象においてＡＳＤ関連代謝産物のレベルは低下する。一部の実施形態では、ＡＳＤを患っている対象の腸微生物叢の組成を調整することによって、ＡＳＤ関連代謝産物のレベルの変化を部分的または完全に回復させることができる。
【００６７】
ＡＳＤ関連代謝産物の非限定的な例は、表１に提供される。
【００６８】
【表１】
0006679309.tif 000002
【００６９】
ＡＳＤ関連代謝産物は、様々な代謝経路に関与する。ＡＳＤ関連代謝産物が関与することができる代謝経路の例には、アミノ酸代謝、タンパク質代謝、炭水化物代謝、脂質代謝、ならびに補因子およびビタミンの代謝が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＡＳＤ関連代謝産物は、グリシン、セリンおよびトレオニン代謝；アラニンおよびアスパラギン酸代謝；グルタミン酸代謝；ヒスチジン代謝；フェニルアラニンおよびチロシン代謝；トリプトファン代謝；バリン、ロイシンおよびイソロイシン代謝；システイン、メチオニン、ＳＡＭおよびタウリン代謝；尿素サイクル；アルギニン、プロリン代謝；および／またはポリアミン代謝に関与する代謝産物であってもよい。ＡＳＤ関連代謝産物は、ジペプチドまたはフィブリノゲン切断ペプチドであってもよい。さらに、ＡＳＤ関連代謝産物は、解糖、糖新生、ピルビン酸代謝；および／またはヌクレオチド糖、ペントース代謝に関与する代謝産物であってもよい。ＡＳＤ関連代謝産物は、必須脂肪酸、長鎖脂肪酸、モノヒドロキシおよび／またはジカルボキシレート脂肪酸、エイコサノイド、イノシトールおよび／またはリゾ脂質の代謝に関与する代謝産物であってもよい。ＡＳＤ関連代謝産物は、ヘモグロビンおよびポルフィリン代謝、パントテネートおよびＣｏＡ代謝、および／またはベンゾエート代謝に関与する代謝産物であってもよい。
【００７０】
一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物は、トリプトファン代謝に関与する代謝産物、脂肪酸代謝に関与する代謝産物、またはプリン代謝に関与する代謝産物である。一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物は、グリコレート、イミダゾールプロピオネートまたはＮ−アセチルセリンである。一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物は、４−エチルフェニルスルフェート（４ＥＰＳ）、４−エチルフェニル、インドールピルベート、インドリル−３−アクリロイルグリシンまたはセロトニンである。一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物は、４−メチルフェニルスルフェートまたは４−メチルフェニルである。
【００７１】
一部の実施形態では、対象の行動性能を向上させるために、１つのＡＳＤ関連代謝産物のレベルが調整される。例えば、対象の４ＥＰＳまたはインドールピルベートのレベル、例えば４ＥＰＳおよびインドールピルベートの血中レベル（例えば、血清中レベル）は、対象の行動性能を向上させるために調整することができる。一部の実施形態では、２つ以上のＡＳＤ関連代謝産物のレベルが、対象の行動性能を向上させるために調整される。例えば、対象の４ＥＰＳおよびインドールピルベートのレベル、例えば４ＥＰＳおよびインドールピルベートの血中レベル（例えば、血清中レベル）は、対象の行動性能を向上させるために調整することができる。
【００７２】
対象の行動性能を向上させるために、対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベル、例えば血中レベル（例えば、血清中レベル）または尿中レベルを調整するために、様々な方法を使用することができる。例えば、ＡＳＤ関連代謝産物、ＡＳＤ関連代謝産物のｉｎ  ｖｉｖｏ合成の中間体、またはＡＳＤ関連代謝産物のｉｎ  ｖｉｖｏ合成の基質に特異的に結合する抗体は、対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルを調整するために対象に投与することができる。例えば、４ＥＰＳおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの４ＥＰＳ合成における基質および中間体の１つまたは複数に特異的に結合する抗体は、対象の４ＥＰＳのレベルを低減するために使用することができる。一部の実施形態では、チロシン、ヒドロキシフェニルピルビン酸、ｐ−クマル酸、ｐ−ビニルフェニノール、ヒドロキシフェニルプロピオネート、および／または４−エチルフェノールに特異的に結合する抗体は、対象の４ＥＰＳのレベルを低減するために対象に投与される。一部の実施形態では、４ＥＰＳに特異的に結合する抗体は、対象の４ＥＰＳのレベルを低減するために対象に投与される。別の例として、４−メチルフェニルスルフェートおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの４−メチルフェニルスルフェートの合成における基質および中間体の１つまたは複数に特異的に結合する抗体は、対象の４−メチルフェニルスルフェートのレベルを低減するために使用することができる。一部の実施形態では、チロシン、ヒドロキシフェニルピルビン酸、ヒドロキシフェニルプロピオネート、ヒドロキシフェニルアセテートおよび／またはｐ−クレゾールに特異的に結合する抗体は、対象の４−メチルフェニルスルフェートのレベル、例えば４−メチルフェニルスルフェートの尿中レベルを低減するために対象に投与される。一部の実施形態では、４−メチルフェニルスルフェートに特異的に結合する抗体は、対象の４−メチルフェニルスルフェートのレベルを低減するために対象に投与される。さらに別の例として、インドリル−３−アクリロイルグリシンおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでのインドリル−３−アクリロイルグリシンの合成における基質および中間体の１つまたは複数に特異的に結合する抗体は、対象のインドリル−３−アクリロイルグリシンのレベルを低減するために使用することができる。一部の実施形態では、トリプトファン、インドールピルベートおよび／またはインドールアクリル酸に特異的に結合する抗体は、対象のインドリル−３−アクリロイルグリシンのレベルを低減するために対象に投与される。一部の実施形態では、インドリル−３−アクリロイルグリシンに特異的に結合する抗体は、対象のインドリル−３−アクリロイルグリシンのレベルを低減するために対象に投与される。さらに別の例として、トリプトファンおよびインドールピルベートに特異的に結合する抗体は、対象のインドールピルベートのレベルを低減するために使用することができる。
【００７３】
小分子に特異的に結合する抗体を生成するための方法が、当技術分野で開発されている。例えば、小分子に対するモノクローナル抗体の生成が、Ｒｕｆｏら、Ｊ．Ａｇ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５２巻：１８２〜１８７頁（２００４年）に記載され、それは参照により本明細書に組み込まれる。例えば、動物、例えばモルモットまたはラット、好ましくはマウスを、ハプテン（例えば、ＫＬＨ）にコンジュゲートさせた小分子、抗体産生細胞、好ましくは脾臓リンパ球で免疫化し、収集して安定した不死化細胞系統、好ましくは骨髄腫細胞系統と融合させてハイブリドーマ細胞を産生することができ、次にそれを単離し、クローニングする。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１５６，８８２号を参照。さらに、小分子特異的抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を細胞からクローニングすることができ、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマからクローニングして、組換えモノクローナル抗体を産生するために使用することができる。
【００７４】
対象の行動性能を向上させるために、ＡＳＤ関連代謝産物のｉｎ  ｖｉｖｏ合成に関与する酵素を阻害することによって、対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベル、例えば血中レベル（例えば、血清中レベル）または尿中レベルを調整することもできる。
【００７５】
本明細書に記載のように、対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベル、例えば血中レベル（例えば、血清中レベル）を調整することは、ＡＳＤを患っている対象の胃腸（ＧＩ）窮迫を改善することができる。ＧＩ窮迫は、腹部の痙攣、慢性下痢、便秘、腸管透過性またはそれらの組合せであってもよい。本明細書で開示されるように、改善は広義で使用され、処置する病的状態に関連するパラメータ、例えば症状の重大さの低減を少なくとも指す。一部の実施形態では、本方法は、病的状態または病的状態を特徴付ける症状の少なくとも１つまたは複数を宿主がもはや患わないように、起こることを完全に阻害、例えば予防すること、または停止、例えば終了することができる。一部の実施形態では、本方法は、検出可能であるか検出不能であるかを問わず、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的であるか全体の）が可能である。
【００７６】
上で議論したように、その発生率および核心的自閉症行動の重症度との相関を考慮すると、胃腸（ＧＩ）窮迫がＡＳＤで重要な併存症である。ＡＳＤを患っている対象の胃腸（ＧＩ）窮迫を軽減するための方法も、本明細書で開示される。この方法は、対象の腸管透過性を低減することを含むことができる。一部の実施形態では、ＧＩ窮迫は、腹部の痙攣、慢性下痢、便秘、腸管透過性またはそれらの組合せを含む。腸管透過性を低減することは、対象の腸微生物叢の組成を変化させることによって達成することができる。一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を変化させることは、バクテロイデス属の細菌などの細菌を含む組成物を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を変化させることは、糞便の移植を含む。一部の実施形態では、対象の腸微生物叢の組成を変化させることは、プロバイオティック処置を含む。
【００７７】
様々な対象を処置することができる。一般に、そのような対象は哺乳動物であり、その用語は、肉食動物（例えば、イヌおよびネコ）、齧歯目（例えば、マウス、モルモットおよびラット）および霊長類（例えば、ヒト、チンパンジーおよびサル）の目を含む哺乳類綱の中にある生物を記載するために広義に使用される。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００７８】
本明細書で開示される方法では、処置を必要とする対象に投与される細菌、例えばバクテロイデス属細菌（例えば、Ｂ．フラジリス）の量は、様々なパラメータ、例えば対象の年齢、体重、応答、処置する対象の状態；不安、ＡＳＤ、またはＡＳＤの１つまたは複数の症状による病的状態のタイプおよび重症度；細菌が含まれる組成物の形；投与経路；ならびに必要なレジメンによって判定することができる。状態の重症度は、例えば、標準的な予後評価方法によって一部評価することができる。上で議論したものと同等のプログラムは、獣医学で使用することができる。例えば、処置を必要とする対象に投与するのに有効な量を判定するために、細菌の量を滴定することができる。主治医ならば、毒性または器官機能不全のために、細菌の投与を終了、中断または調整する方法および時期を知るであろうことを、当業者は理解しよう。反対に、主治医ならば、臨床応答が十分でない（毒性を除外する）場合に、処置をより高いレベルに調整することも知るであろう。
【００７９】
プロバイオティック処置に対するＡＳＤ対象の感受性を評価するための方法
プロバイオティック処置に対するＡＳＤを患っている対象の感受性を評価するための方法が、本明細書で提供される。この方法は、対象のＢ．フラジリス応答性代謝産物のレベルを判定することと、対象のＢ．フラジリス応答性代謝産物のレベルを、ＡＳＤおよび１つまたは複数の胃腸障害を患っている対象の代謝産物の参照レベルと比較することとを含むことができ、対象の代謝産物の血中レベルと参照レベルの間の実質的な同一性は、対象がプロバイオティック処置、例えばＢ．フラジリスのプロバイオティック処置に感受性であることを示す。一部の実施形態では、本方法は、対象の２つ以上のＢ．フラジリス応答性代謝産物のレベルを判定することと、対象の２つ以上のＢ．フラジリス応答性代謝産物の各々のレベルを、２つ以上のＢ．フラジリス応答性代謝産物の各々の参照レベルと比較することとを含み、対象の代謝産物の血中レベルと参照レベルの間の実質的な同一性は、プロバイオティック処置に対する対象の感受性の増加を示す。
【００８０】
代謝産物のレベルは、対象の循環中の代謝産物のレベルであってもよい。例えば、代謝産物のレベルは、対象の血液または他の体液（例えば、脳脊髄液、胸膜液、羊水、精液または唾液）の中の代謝産物のレベルである。一部の実施形態では、代謝産物のレベルは、対象の代謝産物の血中レベルである。代謝産物の血中レベルは、例えば、代謝産物の血清中レベルまたは血漿中レベルであってもよい。一部の実施形態では、代謝産物のレベルは、対象の代謝産物の尿中レベルである。
Ｂ．フラジリス応答性代謝産物
【００８１】
本明細書で用いるように、用語「Ｂ．フラジリス応答性代謝産物」は、そのレベルがＢ．フラジリス処置によって変化すると判定された代謝産物を指す。例えば、Ｂ．フラジリス処置の後の対象の循環中で代謝産物のレベルを変化させることができる。一部の実施形態では、Ｂ．フラジリス処置の後の対象の血液、血清、血漿、体液（例えば、脳脊髄液、胸膜液、羊水、精液または唾液）、尿および／または糞便中で、代謝産物のレベルは変化する。Ｂ．フラジリス応答性代謝産物は、Ｂ．フラジリス処置の後にレベルを増加または低下させることができる。ある場合には、ＡＳＤ関連代謝産物は、Ｂ．フラジリスで処置したＡＳＤ対象の行動性能の向上において原因となる役割を演ずる。ある場合には、Ｂ．フラジリス応答性代謝産物は、ＡＳＤ関連代謝産物でもある。ある場合には、ＡＳＤ関連代謝産物は、Ｂ．フラジリス応答性代謝産物でもある。
【００８２】
本明細書で開示されるように、Ｂ．フラジリス応答性代謝産物は、対象、例えばＡＳＤを患っている対象の代謝産物の前処置レベルをＢ．フラジリス処置の後の対象の代謝産物のレベルと比較することによって、判定することができる。代謝産物のレベルの変動性が個体間に存在することができること、および比較のための、１つまたは複数のＧＩ障害を患っているＡＳＤ対象の集団での代謝産物のレベルを代表する値として、Ｂ．フラジリス応答性代謝産物の参照レベルを確立することができることを当業者は理解する。一部の実施形態では、参照レベルと比較して、ＡＳＤを患っている対象においてＢ．フラジリス応答性代謝産物のレベルは増加する。一部の実施形態では、参照レベルと比較して、ＡＳＤを患っている対象においてＢ．フラジリス応答性代謝産物のレベルは低下する。
【００８３】
Ｂ．フラジリス応答性代謝産物の非限定的な例は、表２に提供される。
【００８４】
【表２−１】
0006679309.tif 000003
【表２−２】
0006679309.tif 000004
【００８５】
ＡＳＤの診断
対象のＡＳＤを診断するための方法も、本明細書で開示される。一部の実施形態では、この方法は、対象の腸のサイトカインのレベルおよび１つまたは複数のＡＳＤ関連代謝産物のレベルを判定することと、自閉症でない対象群のサイトカインおよび代謝産物の参照レベルと比較して、対象の腸のサイトカインレベルおよびＡＳＤ関連代謝産物の少なくとも１つまたは複数のレベルに変化があるかどうか検出することとを含み、腸のサイトカインの量および１つまたは複数の代謝産物の少なくとも１つのレベルの変化は、対象がＡＳＤを患っていることを示す。
【００８６】
一部の実施形態では、本方法は、対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルを判定することと、自閉症でない対象群の代謝産物の参照レベルと比較して、対象のＡＳＤ関連代謝産物のレベルに変化があるかどうか検出することとを含み、ＡＳＤ関連代謝産物のレベルの変化は、対象がＡＳＤを患っていることを示す。一部の実施形態では、本方法は、対象の２つ以上のＡＳＤ関連代謝産物のレベルを判定することと、自閉症でない対象群の代謝産物の参照レベルと比較して、対象の２つ以上のＡＳＤ関連代謝産物のレベルに変化があるかどうか検出することとを含み、２つ以上のＡＳＤ関連代謝産物の少なくとも２つのレベルの変化は、対象がＡＳＤを患っていることを示す。
【００８７】
本明細書で開示されるように、ＡＳＤ代謝産物のレベルは、対象の循環中の代謝産物のレベルであってもよい。例えば、代謝産物のレベルは、対象の血液または他の体液（例えば、脳脊髄液、胸膜液、羊水、精液または唾液）の中の代謝産物のレベルであってもよい。一部の実施形態では、代謝産物のレベルは、対象の代謝産物の血中レベルである。代謝産物の血中レベルは、例えば、代謝産物の血清中レベルまたは血漿中レベルであってもよい。一部の実施形態では、代謝産物のレベルは、対象の代謝産物の尿中レベルである。
【００８８】
代謝産物のレベルおよび／またはサイトカインのレベルの変動性が、自閉症でない集団の個体間に存在することができることを当業者は理解する。したがって、代謝産物の参照レベルは、比較のための自閉症でない集団での代謝産物のレベルを代表する値として確立することができ、サイトカインの参照レベルは、比較のための自閉症でない集団でのサイトカインのレベルを代表する値として確立することができる。一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物の参照レベルと比較して、ＡＳＤを患っている対象においてＡＳＤ関連代謝産物のレベルは増加する。一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物の参照レベルと比較して、ＡＳＤを患っている対象においてＡＳＤ関連代謝産物のレベルは低下する。一部の実施形態では、サイトカインの参照レベルと比較して、ＡＳＤを患っている対象においてサイトカインのレベルは増加する。一部の実施形態では、サイトカインの参照レベルと比較して、ＡＳＤを患っている対象においてサイトカインのレベルは低下する。ＡＳＤ関連代謝産物は本明細書に記載され、本方法で使用することができるＡＳＤ関連代謝産物の非限定的な例は表１で提供される。
【００８９】
一部の実施形態では、サイトカインはインターロイキン−６（ＩＬ−６）である。一部の実施形態では、１つまたは複数のＡＳＤ関連代謝産物は、トリプトファン代謝に関与する代謝産物、脂肪酸代謝に関与する代謝産物、プリン代謝に関与する代謝産物、グリコレート、イミダゾールプロピオネート、Ｎ−アセチルセリン、またはそれらの任意の組合せを含む。トリプトファン代謝に関与する代謝産物の非限定的な例には、４−エチルフェニルスルフェート、インドールピルベート、インドリル−３−アクリロイルグリシンまたはセロトニンが含まれる。一部の実施形態では、ＡＳＤ関連代謝産物は、４−エチルフェニルスルフェート、インドールピルベート、インドリル−３−アクリロイルグリシンまたはセロトニンである。
【００９０】
本開示で開示される方法では、対象の代謝産物のレベルは、当技術分野で公知である任意の従来の方法、例えば、限定されずに、クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー、質量分析、タンデム型質量分析、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析、表面増強レーザー脱離／イオン化−飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析、四極子−飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−フーリエ変換−イオンサイクロトロン共鳴（ＭＡＬＤＩ−ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、放射免疫測定法、微流動チップベースアッセイ、蛍光検出、化学発光検出、またはそれらの組合せによって判定することができる。
【実施例】
【００９１】
上述の実施形態の一部の態様は以下の実施例でさらに詳細に開示されるが、それらは本開示の範囲を限定するものでは全くない。
【００９２】
実験材料および方法
下記の実施例１〜８のために、以下の実験方法を使用した。
【００９３】
動物およびＭＩＡ
妊娠雌のより大きなコホートから妊娠Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を無作為に選択し、Ｓｍｉｔｈら、２００７年、に記載される方法に従って、Ｅ１２．５に生理食塩水または２０ｍｇ／ｋｇポリ（Ｉ：Ｃ）をｉ．ｐ．注射した。全ての動物実験は、Ｃａｌｔｅｃｈ  ＩＡＣＵＣに承認された。
【００９４】
Ｂ．フラジリス処置
３週齢時に、無作為化された実験計画を作成するために、個々の同腹子にわたる生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）の子孫を離乳させ、同じ処置群の４匹の非同腹子子孫のケージに入れた（Ｌａｚｉｃ、２０１３年）。１日おきに６日間のＢ．フラジリスまたはビヒクルによる処置のために、ポリ（Ｉ：Ｃ）対生理食塩水処置群のケージを無作為に選択した。神経発達および行動に及ぼす初期生命のストレスのいかなる交絡影響も除外するために、懸濁液は経口強制栄養によって投与しなかった。Ｂ．フラジリス処置のために、１０＾１０ｃｆｕの新たに生長させたＢ．フラジリスを１ｍＬの１．５％重炭酸ナトリウムに懸濁させ、４ｍｌの無糖アップルソースと混合し、４つの標準の食物ペレットの上に散布した。ビヒクル処置のために、生理食塩水およびポリ（Ｉ：Ｃ）動物に、食物ペレットの上のアップルソース中の１．５％重炭酸ナトリウムを与えた。投与後４８時間までに、アップルソースおよびペレットは各処置群のマウスによって完全に消費された。ＰＳＡ欠損突然変異体Ｂ．フラジリスおよびＢ．テタイオタオミクロンによる処置のために、同じ手順を使用した。
【００９５】
腸管透過性アッセイ
成体マウスを４時間絶食させた後、０．６ｇ／ｋｇの４ｋＤａ  ＦＩＴＣ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を経口強制栄養で与えた。４時間後に、血液試料を心臓穿刺によって収集し、ＳＳＴバキュテーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を通して遠心した。ｘＦｌｕｏｒ４スペクトロメータ（Ｔｅｃａｎ）を使用して、ＦＩＴＣ蛍光強度についてＦＩＴＣ−デキストラン標準および３×希釈血清を５２１ｎｍで直ちに読み取った。大腸炎を化学的に誘導するために、７日の間、飲料水中の３％硫酸デキストランナトリウム塩（ＤＳＳ；ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）をマウスに与えた。
【００９６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫アッセイ
ＴｒｅｇおよびＧｒ−１フローサイトメトリーおよびＣＤ４＋Ｔ細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激のための方法は、Ｈｓｉａｏら、２０１２年、に記載されている。簡潔には、脾臓および腸間膜リンパ節から細胞を完全ＲＰＭＩに採取した。脾細胞の細分類のために、細胞をＧｒ−１  ＡＰＣ、ＣＤ１１ｂ−ＰＥ、ＣＤ４−ＦＩＴＣおよびＴｅｒ１１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。Ｔｒｅｇｓの検出のために、ＧｏｌｇｉＰＬＵＧ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で脾細胞をＰＭＡ／イオノマイシンで４時間刺激し、Ｆｃ受容体のためにブロックし、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ２５−ＰＥ、Ｆｏｘｐ３−ＡＰＣおよびＴｅｒ１１９−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５で標識した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して試料を処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激アッセイのために、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＣＯ２の３７℃で３日の間、１０＾６個のＣＤ４＋Ｔ細胞をＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（７５０ｎｇ／ｍｌ）を含む完全ＲＰＭＩで培養した。毎日、製造業者の指示（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って、ＩＬ−６およびＩＬ−１７を検出するためにＥＬＩＳＡアッセイのために上清を収集した。
【００９７】
ＩＬ−６経口強制栄養およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結腸培養
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのために、成体マウスに、１．５％重炭酸ナトリウム中の５μｇ無担体組換えマウスＩＬ−６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を強制栄養で与えた。上記の通り、強制栄養の４時間後に、遠位、中間および近位結腸の１ｃｍ領域を切除し、ＨＢＳＳで洗浄し、ｑＲＴ−ＰＣＲのために処理した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのために、成体マウスを屠殺し、遠位、中間および近位結腸の１ｃｍ領域を切除し、洗浄し、完全ＲＰＭＩ培地中の０〜８０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６による結腸培養のために二分した。培養４時間後、上記の通り結腸断片を採取し、ｑＲＴ−ＰＣＲのために処理した。
【００９８】
腸管ｑＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロットおよびサイトカインプロファイル
遠位、中間および近位の結腸および小腸の１ｃｍ領域をＨＢＳＳで洗浄し、ａ）ＨｓｉａｏおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ、２０１１年、に従ってＲＮＡ単離および逆転写のために氷冷Ｔｒｉｚｏｌ中でホモジナイズしたか、またはｂ）タンパク質アッセイのために無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する組織抽出試薬Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でホモジナイズした。ＳＹＢＲ緑色ｑＲＴ−ＰＣＲのために、検証されたプライマーセットをＰｒｉｍｅｒｂａｎｋ（Ｈａｒｖａｒｄ）から得た。サイトカインプロファイリングのために、Ｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｏｐｅ（Ｄｕａｒｔｅ、ＣＡ）のＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＦＬＥＸＭＡＰ  ３Ｄプラットホームでマウス２０プレックスサイトカインアレイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が実行された。標準方法によってウエスタンブロットを実行し、１：１００希釈のウサギ抗クローディン８またはウサギ抗クローディン１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で探索した。
【００９９】
微生物ＤＮＡ抽出、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子増幅およびピロシークエンシング
ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔの一環でベンチマーク試験されたプロトコルに従って、ＭｏＢｉｏ  ＰｏｗｅｒＳｏｉｌキットを使用してマウス糞ペレットから細菌ゲノムＤＮＡを抽出した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３〜Ｖ５領域は、４５４−ピロシークエンシングのためのリンカー配列を有する、個々にバーコード化された汎用性プライマーを使用して増幅されたＰＣＲであった。シークエンシングは、多重化された４５４−チタンピロシーケンサーを使用して、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒで実施された。
【０１００】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列分析
ＦＡＳＴＡおよび品質ファイルはＢａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＡｌｋｅｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから得、品質をフィルターにかけた。＜２００ｂｐおよび＞１０００ｂｐの配列、およびいかなるプライマーミスマッチ、バーコードミスマッチ、あいまいな塩基、６塩基を超えるホモポリマーラン、または３０以下の平均品質スコアを有する配列は廃棄された。品質をフィルターにかけた配列は、次にＱＩＩＭＥ  １．６ソフトウェアパッケージを使用して分析した（Ｃａｐｏｒａｓｏら、２０１０ｂ）。配列を次にキメラについてチェックし、９７％の配列類似性指数でＵＳｅａｒｃｈパイプライン（Ｅｄｇａｒ、２０１０年；Ｅｄｇａｒら、２０１１年）を使用して操作的分類単位（ＯＴＵ）に集約した。０．００１の最大ｅ値の小サブユニット非冗長参照データベースリリース１１１（Ｑｕｅｓｔら、２０１３年）に基づいて、その後、基本的ローカルアラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）分類子（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年）を使用してＯＴＵに分類学上の分類を割り当てた。異なる分類レベルで全てのＯＴＵの分類概要を生成するために、これらの分類を次に使用した。樹ベースのアルファおよびベータ多様性分析のために、ＰｙＮＡＳＴ（Ｃａｐｏｒａｓｏら、２０１０ａ）を使用して各ＯＴＵの代表的配列を整列させ、ＦａｓｔＴｒｅｅ（Ｐｒｉｃｅら、２００９年）を使用してこのアラインメントに基づいて系統樹を構築した。アルファ多様性推定値（観察された種およびＦａｉｔｈの系統発生多様性［ＰＤ］による；（Ｆａｉｔｈ、１９９２年））、および均一性（Ｓｉｍｐｓｏｎの均一性およびジニ係数による；（Ｗｉｔｔｅｂｏｌｌｅら、２００９年））を計算し、各試料からの２０８２個の配列の希薄化を使用した１００反復に基づくノンパラメトリック試験を使用して群間で比較した。ベータ多様性のために、１試料につき２１６０個の配列の均一な試料採取を使用し、加重および非加重ＵｎｉＦｒａｃ（ＬｏｚｕｐｏｎｅおよびＫｎｉｇｈｔ、２００５年）を使用して計算した。統計的有意性を判定するために９９９個の順列による類似性の分析（ＡＮＯＳＩＭ；Ｆｉｅｒｅｒら２０１０年）を使用して、ベータ多様性をペアワイズ法（生理食塩水（Ｓ）対ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｐ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｐ）対ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス処置（Ｐ＋ＢＦ））で比較した。
【０１０１】
特異的ＯＴＵの差の同定
生理食塩水とポリ（Ｉ：Ｃ）処置群、およびポリ（Ｉ：Ｃ）とポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス処置群を識別する鍵となるＯＴＵは、以下の３つの補完的分析を使用してＱＩＩＭＥによって生成されたＯＴＵ表からの不偏の方法を使用して同定された：（１）Ｍｅｔａｓｔａｔｓ比較（Ｗｈｉｔｅら、２００９年）、（２）最初はＱＩＩＭＥ（Ｋｎｉｇｈｔｓら、２０１１年）の下の、その後はＢｏｒｕｔａの特色選択と一緒の、Ｇｅｎｂｏｒｅｅ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｔｏｏｌｓｅｔ（Ｒｉｅｈｌｅら、２０１２年）の中のＲａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓアルゴリズム、および（３）ＧａｌａｘｙプラットホームベースのＬＤＡ  Ｅｆｆｅｃｔ  Ｓｉｚｅ分析（ＬＥｆＳｅ；（Ｓｅｇａｔａら、２０１１年））。処置群の間で有意に異なるＯＴＵだけが、さらなる分析の候補であった（（１）および（３）についてのｐ＜０．０５、ならびに＞０．０００１は、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓおよび以後のＢｏｒｕｔａアルゴリズムによる同定の精度の低下を意味する）。Ｍｅｔａｓｔａｔｓ分析は、オンラインインターフェイス（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔａｓｔａｔｓ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ）を使用して任意の２つの処置群のＱＩＩＭＥによって生成されたＯＴＵ表で行った。ＱＩＩＭＥソフトウェアパッケージ（Ｂｒｅｉｍａｎ、２００１年；Ｋｎｉｇｈｔｓら、２０１１年）において差別的なＯＴＵを同定するために、１０００個の樹および１０倍の交差検証に基づいて２つの処置群を一度に比較する、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓアルゴリズムを使用し、Ｇｅｎｂｏｒｅｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ｔｏｏｌｓｅｔ（ＫｕｒｓａおよびＲｕｄｎｉｃｋｉ、２０１０年；Ｒｉｅｈｌｅら、２０１２年）で実施したように、さらに検証して、Ｂｏｒｕｔａ特色選択アルゴリズムと一緒にした。Ｂｏｒｕｔａアルゴリズムによって確認されたＯＴＵだけが、差別的であると定義された。観察された誤差率と計算された誤差率の間の比は、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓ分析の信頼度の尺度として使用した：この比は、生理食塩水対ポリ（Ｉ：Ｃ）では５．０（０．１±０．２１の推定誤差）であり、ポリ（Ｉ：Ｃ）対ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリスでは２．８６であった（０．２３±０．２２の推定誤差）。３つの方法のいずれか１つによるいかなる誤表示も克服するために、上の３つの方法のうちの少なくとも２つによって同定されたＯＴＵだけを、差別的であると定義した。図１の分析については、ＭＩＡによって有意に変化したＯＴＵは、生理食塩水対ポリ（Ｉ：Ｃ）群を比較することによって同定された。図６の分析については、ポリ（Ｉ：Ｃ）対ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス群を比較し、図１の分析によっても同定されたＯＴＵだけを報告するだけである。
【０１０２】
ＳＩＮＡアライナー（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｂ−ｓｉｌｖａ．ｄｅ／ａｌｉｇｎｅｒ／；Ｐｒｕｅｓｓｅら、２０１２年）を使用して鍵となるＯＴＵを次に整列させ、Ａｒｂ（Ｌｕｄｗｉｇら、２００４年）を使用してＳＩＬＶＡ参照データベースリリース１１１（Ｑｕａｓｔら、２０１３年）と比較し、ＦｉｇＴｒｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｔｒｅｅ．ｂｉｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｉｇｔｒｅｅ／）を使用して可視化した。それらの相対的存在度をＯＴＵ表から抽出することによって、鍵となるＯＴＵのヒートマップを生成した。これらのデータは、最初はＯＴＵにより、その後は試料によって次に標準化し（行または列の全ての値の平方和が１に等しいように）、Ｃｌｕｓｔｅｒ３．０を使用して相関によって集約した（ｄｅ  Ｈｏｏｎら、２００４年）。最後に、Ｊａｖａ  ＴｒｅｅＶｉｅｗを使用して存在度データを可視化した（Ｓａｌｄａｎｈａ、２００４年）。
【０１０３】
Ｂ．フラジリス定着アッセイ
Ｂ．フラジリスまたはビヒクルによる処置の開始から１、２および３週間後に、ＭＩＡおよび対照子孫から糞便試料を無菌的に収集した。陽性対照の役割をさせるために、上記の通り無菌マウスをＢ．フラジリスで処置した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｓｔｏｏｌ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＤＮＡを糞便試料から単離した。Ｏｄａｍａｋｉら、２００８年、に従って、Ｂ．フラジリス特異的５’ＴＧＡＴＴＣＣＧＣＡＴＧＧＴＴＴＣＡＴＴ３’（配列番号１）および５’ＣＧＡＣＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣＴＴＣＡＴＣ３’（配列番号２）、ならびに汎用性１６Ｓプライマー５’ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴ３’（配列番号３）および５’ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣ３’（配列番号４）によるｑＰＣＲのために、５０ｎｇのＤＮＡを使用した。
【０１０４】
行動試験
Ｈｓｉａｏら、２０１２年、およびＭａｌｋｏｖａら、２０１２年、に記載されているように、成体のＭＩＡおよび対照子孫を行動について試験した。前パルス阻害、オープンフィールド探査、マーブル埋め込み、社会的交流および成体超音波発声のために、６週齢からその順序で始めてマウスを試験し、行動試験の間は少なくとも５日間であった。Ｂ．フラジリス処置および対照の群の行動データ（図１０）は、ＰＰＩおよびオープンフィールド試験についてはマウスの３〜５個の独立コホート、マーブル埋め込みについては２〜４個のコホート、成体雄超音波発声については２つのコホート、社会的交流については１つのコホートの複数の同腹子から収集された累積結果を表す。行動試験全体の試料サイズの不一致は、我々の実験研究の間に特定の試験がいつ実施されたかについての差を反映する。
【０１０５】
前パルス阻害。ＰＰＩ試験は知覚運動ゲーティングの手段として使用し、ＧｅｙｅｒおよびＳｗｅｒｄｌｏｗ、２００１年、およびＳｍｉｔｈら、２００７年、に記載される手順に従って実行、分析した。簡潔には、マウスを５分の間ＳＲ−ＬＡＢ驚愕反応系（ＳａｎＤｉｅｇｏＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の試験チャンバーに順応させ、ホワイトノイズ（驚愕刺激）の６回の１２０ｄＢのパルスを与え、その後、驚愕なし、驚愕刺激だけ、驚愕と５ｄＢの前パルスまたは驚愕と１５ｄＢの前パルスの１４の無作為化されたブロックに供した。驚愕反応は圧電センサーによって記録し、ＰＰＩパーセントは以下の通りに定義される：［（（驚愕刺激だけ−驚愕と５または１５ｄＢの前パルス）／驚愕刺激だけ）＊１００］。
【０１０６】
オープンフィールド探査。オープンフィールド試験は、齧歯動物で不安様および運動行動を測定するために広く使われている。５０×５０ｃｍの白色プレキシグラスボックスに、マウスを１０分の間置いた。オーバーヘッドビデオカメラでセッションを記録し、移動した距離ならびに中心アリーナ（中心の１７ｃｍ四角）における立入り回数および消費時間を分析するために、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ）を使用した。
【０１０７】
マーブル埋め込み。マーブル埋め込みは、自閉症の個体で観察されるものに類似した、齧歯動物で導き出された反復性の行動である（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２０１０ｂ）。Ｔｈｏｍａｓら、２００９年、およびＭａｌｋｏｖａら、２０１２年、に記載される方法に従って、この試験を実行、分析した。４ｃｍ層のスギチップ材敷料を含有する新規試験ケージにマウスを１０分の間慣れさせ、その後、新しいハウジングケージに移した。試験ケージに、１８個のガラスマーブル（１５ｍｍ直径）を等距離で６×３に整列させた。マウスを試験ケージに戻し、１０分で埋め込まれたマーブルの数を記録した。
【０１０８】
社交性および社会的好み。Ｓａｎｋｏｏｒｉｋａｌら、２００６年、およびＹａｎｇら、２０１１年、から採用した方法によって、社会的交流試験を実行、分析した。簡潔には、側チャンバーの各々に透明な交流円筒を含有する４０×６０ｃｍのプレキシグラス３チャンバー装置に、試験マウスを１０分の間慣れさせた。社交性は次の１０分のセッションで試験し、そこでは、試験マウスは、反対側のチャンバーの他の交流円筒内の新規玩具（緑色の粘着性のボール）に対して１つの交流円筒内の新規同性の年齢をマッチさせたマウス（社会的物体）を探る機会を与えられた。社会的好みは最後の１０分のセッションで試験し、そこでは、試験マウスは、新規のなじみの薄い同性の年齢をマッチさせたマウスに対して今ではなじみのマウス（以前の社交性セッションからの刺激マウス）を探る機会を与えられた。各セッションでは、試験マウスの軌跡は、Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ）で追跡した。社交性データは、玩具に対してよりもマウスへの好み：社会的チャンバー内での時間のパーセント−非社会的チャンバー内での時間パーセントとして提示され、社会的好みのデータは、なじみのマウスに対してよりもなじみの薄いマウスへの好み：なじみの薄いマウスのチャンバー内での時間のパーセント−なじみのマウスのチャンバー内での時間のパーセントとして提示される。チャンバー立入り、ならびに接触ゾーン（交流円筒を囲む７×７ｃｍ四角）への立入りおよび接触ゾーンで費やした持続時間の測定のために、同様の指数を測定した。
【０１０９】
成体超音波発声。雄のマウスは、伝達の重要な形として雌マウスに応じてＵＳＶを発生する（Ｐｏｒｔｆｏｒｓ、２００７年）。新規雌への曝露に応じる成体雄のＵＳＶ発生は、Ｇｒｉｍｓｌｅｙら、２０１１年、Ｓｃａｔｔｏｎｉら、２０１１年、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎら、２０１０ａ、に記載される方法に従って測定した。標準化された異性経験の歴史を提供し、社会的優位性の差を調整するために、成体雄を試験の１週前に単独で収容し、試験の４日前から開始して毎日なじみの薄い成体雌マウスに２０分の間曝露させた。試験日に、マウスを１０分の間新規ケージに慣れさせた後に、新規の年齢をマッチさせた雌に曝露させた。ＵｌｔｒａＳｏｕｎｄＧａｔｅマイクおよびオーディオシステム（Ａｖｉｓｏｆｔ  Ｂｉｏａｃｏｕｓｔｉｃｓ）を使用して、ＵＳＶを３分の間記録した。記録は、５１２ＦＦＴの長さでの高速フーリエ変換および５ｍｓホールド時間での閾値ベースアルゴリズムによる検出の後に、ＡｖｉｓｏｆｔのＳＡＳＬａｂ  Ｐｒｏソフトウェアを使用して分析した。提示されたデータは、３分のセッション中の呼びかけの持続時間および回数を反映する。
【０１１０】
メタボロミクススクリーニング
行動的に検証された成体マウスから、血清を心臓穿刺によって収集した。試料を抽出し、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎ，ＩｎｃによるＧＣ／ＭＳ、ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳプラットホームで分析した。有機水性溶媒による連続抽出によってタンパク分画を取り出し、ＴｕｒｂｏＶａｐシステム（Ｚｙｍａｒｋ）を使用して濃縮し、真空乾燥させた。ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳについては、＞１１の注射標準を含有する酸性または塩基性のＬＣ適合溶媒で試料を再構成し、線形イオントラップフロントエンドおよびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計バックエンドの、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣおよびＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＴＱ質量分析計にかけた。ＧＣ／ＭＳのために、ビストリメチル−シリル−トリフルオロアセトアミドを使用して乾燥窒素の下で試料を誘導体化し、電子衝撃イオン化を使用するＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｔｒａｃｅ  ＤＳＱ高速スキャン単一四重極質量分析計で分析した。精製された標準の代謝ライブラリーエントリーとの比較によって、化学実体を同定した。各化合物の対数変換および最小観測値による転嫁の後、対比による二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析した。
【０１１１】
４ＥＰＳ合成および検出
アリール硫酸の合成についてＢｕｒｌｉｎｇｈａｍら、２００３年、およびＧｒｉｍｅｓ、１９５９年、に報告されている手順の修正版を使用して、カリウム４−エチルフェニルスルフェートを調製した（図１５Ａ）。還流ベンゼン（２０ｍｌ、活性化アルミナカラムを通過させることによって乾燥させた）中で、４−エチルフェノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、５．００ｇ、４０．９ｍｍｏｌ）を三酸化硫黄−ピリジン錯体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、５．９２ｇ、３７．２ｍｍｏｌ）で処理した。３．５時間後に、生じた溶液を室温まで冷却させ、その時点で生成物は結晶化した。濾過による単離により、白い結晶質固体として７．９３ｇの粗ピリジニウム４−エチルフェニルスルフェートを得た。この材料の１．００ｇを、３％トリエチルアミンを含むアセトニトリル１０ｍＬに溶解し、シリカゲル（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ、粒径３２〜６３μｍ）のプラグで濾過し、アセトニトリル中の３％トリエチルアミンで溶出した。濾液を次に濃縮し、生じた残渣を２０ｍＬの脱イオン水に溶解し、ダウエックス５０ＷＸ８イオン交換樹脂（Ｋ＋形）のカラムを通して溶出させ、２０ｍＬの脱イオン水で洗い落とした。イオン交換処理をもう一度繰り返し、生じた溶液を真空下で濃縮して、６１８ｍｇ（５５％の全体収率）のカリウム４−エチルフェニルスルフェートを白い粉末として得た（図１５Ａ）。
【０１１２】
真正のカリウム４−エチルフェニルスルフェートの１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ５００分光計で記録し、内部ＤＭＳＯ−ｄ５に対して報告される（１Ｈ、δ＝２．５０；１３Ｃ、δ＝３９．５２）。高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）は、混合イオン化モードでＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇ１９７８ＡマルチモードソースとＡｇｉｌｅｎｔ６２００シリーズＴＯＦを使用して取得した（エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）および大気圧化学電離（ＡＰＣＩ））。カリウム４−エチルフェニルスルフェートの分光学的データは、以下の通りである：１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，５００  ＭＨｚ）δ  ７．１１〜７．０４（ｍ，４Ｈ）、２．５４（ｑ，Ｊ＝７．６  Ｈｚ，２Ｈ）、１．１５（ｔ，Ｊ＝７．６  Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１２６  ＭＨｚ）δ  １５１．４、１３８．３、１２７．９、１２０．６、２７．５、１６．０；ＨＲＭＳ（マルチモード−ＥＳＩ／ＡＰＣＩ）Ｃ８Ｈ９Ｏ４Ｓ［Ｍ−Ｋ］−２０１．０２２７の計算値、実測値２０１．０２２５。
【０１１３】
真正の４ＥＰＳおよび血清試料は、フォトダイオードアレイ検出器を備え、モデルＧ１９４６Ｃ単一四極子エクスペクトスプレー（expectospray）質量分析計に連結されているＡｇｉｌｅｎｔ１１０シリーズＨＰＬＣ系を使用して、ＬＣ／ＭＳによって分析した。ＨＰＬＣ分離は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×５０ｍｍ×５μｍ粒径）を使用して、２５℃で得られた。４ＥＰＳイオンは、エレクトロスプレー毛細管を３ｋＶに設定して、ｍ／ｚ  ２００．９および５８０ｍｓ／イオンの滞留時間のイオンのための選択イオンモニタリングを使用して検出した。０〜５０％アセトニトリルからの１０分の直線勾配を使用して０．０５％トリフルオロ酢酸およびアセトニトリルで溶出したとき、真正のカリウム４ＥＰＳは、６．２分の保持時間を有することが見出された。マウス血清中の４ＥＰＳの数量化のために、分析物濃度に対して既知濃度の真正カリウム４ＥＰＳの総イオン数ピーク面積をプロットすることによって、用量反応曲線を構築した（Ｒ＾２＝０．９９９８；図１５Ｂ）。マウス血清試料をアセトニトリルで４倍に希釈し、４℃で３分の間、１０，０００ｇで遠心分離した。１０μＬの上清を、ＨＰＬＣ系に直接に注入した。
【０１１４】
４ＥＰＳ十分性実験
野生型マウスに、３から６週齢まで毎日、生理食塩水または３０ｍｇ／ｋｇの４ＥＰＳカリウム塩をｉ．ｐ．注射した。３０ｍｇ／ｋｇの４ＥＰＳのｉ．ｐ．注射後の様々な時間に血清中４ＥＰＳレベルを測定することによって、用量反応曲線を作成した（図１５Ｃ）。上記の通り、６から９週齢までマウスの行動を試験した。
【０１１５】
統計解析
統計解析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して実施した。データを正規分布について評価し、平均±ＳＥＭとして図面にプロットした。２つの処置群（すなわち対照対４ＥＰＳ）の間の差は、Ｗｅｌｃｈの修正による対応のないスチューデントの両側ｔ検定を使用して評価した。複数の群（生理食塩水対ポリ（Ｉ：Ｃ）対ポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス／Ｂ．テタイオタオミクロン）の間の差を、ボンフェローニの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用して評価した。ＰＰＩおよびＣＤ４＋Ｔ細胞刺激データの分析のために、ボンフェローニ事後検定による二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを使用した。代謝産物データの分析のために、対比による二元配置ＡＮＯＶＡを使用した。研究の個々の無作為化計画を考慮し、サンプルサイズは、処置群あたりの個々のマウスの数を表す（Ｌａｚｉｃ、２０１３年）。上の検定から現れる有意な差は、図で＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１によって示される。注目すべき有意に近い差（０．５＜ｐ＜０．１）を図に示す。注目すべき有意でない（有意に近くない）差は、図で「ｎ．ｓ．」によって示される。
【実施例１】
【０１１６】
免疫活性化母体の子孫はヒトＡＳＤのＧＩ症状を示す
ＡＳＤの基本的な行動および神経病理学的症状（Ｍａｌｋｏｖａら、２０１２年）を示す成体ＭＩＡ子孫は、腸上皮層を越えて循環に入る、経口投与されたＦＩＴＣ−デキストランの転流の増加によって反映されるような、腸障壁の完全性のかなりの欠陥を示すことも見出された（図１Ａ、左パネル）。腸管透過性のこのＭＩＡ関連の増加は、実験的大腸炎を誘導するために使用される化学物質であるデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で処置されたマウスで見られるものに類似する（図１Ａ、左パネル）（Ｗｉｒｔｚら、２００７年）。腸管完全性の欠陥は、３週齢のＭＩＡ子孫で検出可能であり（図１Ａ、右パネル）、異常が生命初期に確立されたことを示した。ＭＩＡ子孫で増加した腸管透過性の分子基礎を評価するために、ＭＩＡ子孫の結腸を密着帯構成成分ＺＯ−１（ＴＪＰ１）、ＺＯ−２（ＴＪＰ２）、ＺＯ−３（ＴＪＰ３）、オクルディンおよびクローディン（ＣＬＤＮ）１、２、３、４、７、８、１２、１３および１５について検査した（Ｈｏｌｍｅｓら、２００６年）。ＧＩ異常を示すＡＳＤ児童のサブセットで見出された漏出性腸表現型と一貫して、成体ＭＩＡ子孫からの結腸は、ＺＯ−１、ＺＯ−２、オクルディンおよびクローディン８の転写産物の発現減少ならびにクローディン１５  ｍＲＮＡの発現増加を示した（図１Ｂ）。ＺＯ−１の発現欠損は成体ＭＩＡ子孫の小腸でも観察され（図２Ａ）、腸障壁の完全性の欠陥の広がりを実証する。
【０１１７】
透過性の増加はいくつかの腸管疾患ならびにＡＳＤのサブセットで観察され、一般的に炎症の徴候と関連している（Ｈｅｒｉｎｇら、２０１２年；Ｔｕｒｎｅｒ、２００９年；Ｗｈｉｔｅ、２００３年）。密着帯構成成分の発現の変化に加えて、成体ＭＩＡ子孫からの結腸は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）ｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルの増加（図１Ｃおよび１Ｄ）ならびにサイトカイン／ケモカインＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０、ＩＰ−１０、ＭＩＧおよびＭＩＰ−１ａのレベルの低下（図１Ｄ）を示すことが見出された。ＭＩＡ子孫からの小腸は、変化したサイトカイン／ケモカインプロファイルも示す（図２Ｃ）。腸管サイトカインの変化には、ヘマトキシリンおよびエオシン染色切片からの肉眼的上皮形態の組織学的検査によって評価される、明白なＧＩ病理が付随しなかった。しかし、免疫関連のシグナル伝達因子の変化と一貫して、成体ＭＩＡ子孫からの腸間膜リンパ節および脾臓は、低下したレベルの調節Ｔ細胞ならびにＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によるＩＬ−６およびＩＬ−１７の過応答性産生を有することが見出され、炎症誘発性表現型を示唆している（図３Ａ〜Ｄ）（Ｈｓｉａｏら、２０１２年）。腸免疫活性化を支持する同様の知見が、ＡＳＤ個体のサブセットで見られる（Ｏｎｏｒｅら、２０１２年）。
【０１１８】
前述のものを考慮すると、この実施例は、免疫活性化母体の成体子孫は腸透過性の増加および異常な腸内サイトカインプロファイルを示し、マウスモデルのＡＳＤ関連のＧＩ症状を再現することを示す。
【実施例２】
【０１１９】
ＭＩＡ子孫は、腸微生物叢の生命異常を示す
この実施例では、ＡＳＤマウスモデルにおける正常な腸微生物叢の破壊とＧＩ機能不全の間の潜在的な関連性を検討した。
【０１２０】
ＭＩＡが微生物叢の変化を誘導するかどうか評価するために、ポリ（Ｉ：Ｃ）または生理食塩水で処置した母体の成体子孫から単離された試料の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子シークエンシングによって、糞便の細菌集団を調査した。アルファ多様性、すなわち種の豊富さおよび均一性は、Ｆａｉｔｈの系統発生多様性（ＰＤ）指数、および観察された種の数（それぞれｐ＝１．００００および０．２７９０）、ならびにジニ係数およびＳｉｍｐｓｏｎ均一性指数（それぞれｐ＝０．５４３０およびｐ＝０．２６１０；図４Ａおよび４Ｂ）で測定されたように、対照とＭＩＡ子孫の間で有意に異ならなかった。対照的に、微生物群落の間の系統発生類似性の程度を測定する非加重ＵｎｉＦｒａｃ分析は、成体子孫の腸微生物叢に及ぼすＭＩＡの強大な影響を明らかにする（図５Ａ〜Ｅ）。主座標分析によりＭＩＡ試料は対照とは異なって集約し（ＰＣｏＡ；ＡＮＯＳＩＭ  Ｒ＝０．２８２９、ｐ＝０．００３０）、対照と比較してＭＩＡ子孫からの腸細菌の構成員の頑強な変化を示す（図５Ａ）。腸微生物叢の組成の変化に及ぼすＭＩＡの影響は、我々の調査の総読取り数のおよそ９０．１％（ＳおよびＰ群で５１，５８６中４６，４８４の読取り数）を占める、クロストリジア綱およびバクテロイデス綱からの配列をＰＣｏＡによって排他的に検査したときにさらに明白である（Ｒ＝０．２３３１、ｐ＝０．００７０；図５Ｂ）が、クロストリジア綱およびバクテロイデス綱の配列を他の全ての細菌綱のＰＣｏＡから特異的に排除したときには明白でない（Ｒ＝０．１０５１、ｐ＝０．０７００；図５Ｃ）。このことは、クロストリジア綱およびバクテロイデス綱の操作的分類単位（ＯＴＵ）の多様性の変化が、ＭＩＡ子孫と対照間の腸微生物叢の差の主要な推進体であることを示す。
【０１２１】
試料のいずれかにわたって検出された１４７４ＯＴＵ中６７ＯＴＵは、細菌のラクノスピラ科、ルミノコッカス科、エリシペロトリクス科、アルカリゲネス科、ポルフィロモナス科、プレボテラ科およびリケネラ科、および未分類バクテロイデス目に割り当てられるものを含む処置群を識別する（図５Ｄ）。これらの６７個の差別的なＯＴＵのうち、１９個は対照試料でより豊富であり、４８個はＭＩＡ試料でより豊富である。ＰＣｏＡ結果（図５Ａ〜Ｃ）と一貫して、ＭＩＡ子孫と対照を識別する大多数のＯＴＵは、バクテロイデス綱（６７ＯＴＵのうちの４５個；６７．２％）およびクロストリジア綱（６７ＯＴＵのうちの１７個；２５．４％）に割り当てられ、残りの少数の差別的ＯＴＵは、プロテオバクテリア綱（３ＯＴＵ；４．５％）および他の綱（テネリキューテスおよび未分類、各１ＯＴＵ；３．０％）に属する。興味深いことには、ポルフィロモナス科、プレボテラ科および多くの未分類バクテロイデス目（４５個の差別的バクテロイデスＯＴＵのうちの３６個；８０％）、およびラクノスピラ科（１４個の差別的クロストリジウムＯＴＵのうちの８個；５７％）は、ＭＩＡ子孫でより豊富であった。反対に、ルミノコッカス科（２ＯＴＵ）、エリシペロトリクス科（２ＯＴＵ）およびベータプロテオバクテリアの科のアルカリゲネス科（２ＯＴＵ）は、対照子孫でより豊富であった（図５Ｄ）。これらのデータは、特異的ラクノスピラ科が、他のバクテロイデス種とともにＭＩＡ病原性で重要な役割を演じるが、他の分類群は保護的役割を演じる可能性を示す。重要なことに、ＭＩＡ子孫と対照の間に、クロストリジア綱（１３．６３±２．５４％対１４．４４±２．８４％、平均±ＳＥＭ；スチューデントのｔ検定ｐ＝０．８３４０）およびバクテロイデス綱（７６．２５±３．２２％対７６．２２±３．４６％、平均±ＳＥＭ；スチューデントのｔ検定ｐ＝０．９９４３）の全体の相対的存在度に有意差はなく（図５Ｅ、左パネル）、稀なＯＴＵの構成員の変化が、実験群の間での腸微生物叢の主要な変化を推進することを示す。
【０１２２】
分類上の多様性の差はより顕著でない細菌綱でも見られ、ＭＩＡ子孫は、対照と比較してエリシペロトリックスの有意に低下した相対的存在度を示した（０．１５の±０．０３％対０．７４±０．２５％、平均±ＳＥＭ；スチューデントのｔ検定、ｐ値＝０．０３３４）（図５Ｅ、右パネル）。全体として、ＭＩＡは、細菌綱クロストリジア綱およびバクテロイデス綱の特異的ＯＴＵの変化によって主に推進された、腸微生物叢の生命異常につながることが見出された。クロストリジア目のラクノスピラ科およびルミノコッカス科として分類されたＯＴＵの変化は、ＡＳＤ対象の糞便でのクロストリジウム属の種の増加に関する報告に対応する（Ｆｉｎｅｇｏｌｄら、２０１２年）。全体として、マウスにおける一次自閉症危険因子としてのＭＩＡのモデリングは、ＡＳＤの行動および神経病理学的特色（Ｂｏｋｓａ、２０１０年）だけでなく、ＡＳＤ個体のサブセットで記載されるそれらに類似したＧＩ症状も誘導する。本明細書で提示されるデータは、共存するＧＩ問題を有するヒトＡＳＤのためのモデルとしてＭＩＡを使用することができることを示す。
【実施例３】
【０１２３】
Ｂ．フラジリス処置は、ＭＩＡ子孫で腸障壁の完全性を向上させる
腸内微生物は、腸管上皮の発達、メンテナンスおよび修復で重要な役割を演ずる（Ｓｈａｒｍａら、２０１０年；Ｔｕｒｎｅｒ、２００９年）。腸微生物叢を標的にすることがＭＩＡ関連のＧＩ異常の発達または持続性に影響を与えることができるかどうか判定するために、離乳時に子孫をヒト片利共生細菌Ｂ．フラジリスで処置し、その後、８週齢時にＧＩ異常について検査した。注目すべきことに、Ｂ．フラジリス処置は、ＭＩＡ子孫で腸管透過性を修正した（図６Ａ）。さらに、Ｂ．フラジリス処置はＣＬＤＮ８および１５の遺伝子発現のＭＩＡ関連の変化を改善したが、ＴＪＰ１、ＴＪＰ２またはＯＣＬＮ  ｍＲＮＡの発現レベルに対して有意な影響を及ぼさなかった（図６Ｂ）。結腸においてクローディン８および１５のタンパク質レベルで同様の変化が観察され、Ｂ．フラジリス処置によって回復する（図６Ｃ〜Ｄ）。密着帯発現に及ぼすＢ．フラジリスのそのような影響は、ＭＩＡ子孫からの小腸では観察されず（図２Ｂ）、バクテロイデス属の種が主に結腸で見出されるという事実と一貫している。さらに、プロバイオティック投与より前のＧＩ欠陥の存在（図１Ａ、右パネル）は、Ｂ．フラジリスがＭＩＡ子孫でＡＳＤ関連の病理を処置することができることを示唆する。
【０１２４】
Ｂ．フラジリス処置は、結腸ＩＬ−６のｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルのＭＩＡ関連の増加を、対照マウスで見出されるレベルに回復させもした（図６Ｅ〜Ｆ）。ＭＩＡ子孫の結腸および小腸の両方で他のサイトカインのレベルが変化したが（図１Ｄおよび２Ｃ）、これらはＢ．フラジリス処置の影響を受けず、ＩＬ−６への特異性を明らかにした。この知見は、ＭＩＡモデルでのＩＬ−６の重大な役割と一貫している（Ｓｍｉｔｈら、２００７年）。ＩＬ−６を含むいくつかのサイトカインは密着帯をモジュレートして、腸障壁の完全性を調節することが報告されているので、変化した腸内サイトカインプロファイルは、ＭＩＡ子孫で観察される腸管透過性の増加の基礎を形成することができる（Ｓｕｚｕｋｉら、２０１１年；Ｔｕｒｎｅｒ、２００９年）。組換えＩＬ−６処置がｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ結腸器官培養でクローディン８およびクローディン１５の結腸レベルをモジュレートすることができることがさらに見出され（図７Ａ〜Ｃ）、結腸ＩＬ−６レベルのＢ．フラジリスによって媒介される回復が腸透過性に対するその影響の根底にある可能性が示唆された。総合すると、これらの知見は、ＭＩＡ子孫のＢ．フラジリス処置がＧＩ障壁の完全性の欠陥を元に戻し、密着帯およびサイトカイン発現の変化を修正することを実証する。
【実施例４】
【０１２５】
Ｂ．フラジリス処置はＭＩＡ子孫で微生物叢の変化を回復する
ＭＩＡ子孫でＧＩ生理を改善することに加えて、Ｂ．フラジリス処置は、腸内微生物叢の組成に及ぼす長期影響を誘導する。ＰＣｏＡにより全体レベルで（ＡＮＯＳＩＭ  Ｒ＝０．００６０、ｐ＝０．４４７０）、または微生物叢の豊富さ（ＰＤ：ｐ＝０．２９８０、観察された種：ｐ＝０．５４４０）および均一性（Ｇｉｎｉ：ｐ＝０．６１１０、Ｓｉｍｐｓｏｎ均一性：ｐ＝０．５６００；図８Ａ、４Ａ〜Ｂ）で、有意な差は観察されなかった。しかし、成体ＭＩＡ子孫を対照から識別する特定の鍵となるＯＴＵを評価した結果、Ｂ．フラジリス処置の修正効果は明らかであった（図８Ｂ）。特に、Ｂ．フラジリスで処置したＭＩＡ子孫は、ＭＩＡを対照子孫から識別する６７ＯＴＵ中６つの相対的存在度の完全な回復を示した（ＭＩＡと対照子孫の間で差別的であると同定されなかった他の２８ＯＴＵは、ＭＩＡ子孫とＢ．フラジリスで処置したそれらを識別することができた）。これらの６ＯＴＵは、ラクノスピラ科の未分類のバクテロイデス綱およびクロストリジア綱に分類学上割り当てられる（図８Ｂ）。注目すべきことに、定量的リアルタイムＰＣＲによって評価された通り、処置したＭＩＡ子孫から単離された糞便および盲腸の試料で検出不能のままであるＢ．フラジリスの持続的な定着の不在下で、これらの変化は起こった（図９Ａ〜Ｂ）。興味深いことに、ＭＩＡ子孫で上昇した１０個のラクノスピラ科のうちの４個は、Ｂ．フラジリス処置によって修正された（図５Ｄおよび８Ａ〜Ｃ）。さらに、Ｂ．フラジリス処置は、２つのバクテロイデス綱ＯＴＵの相対的存在度を対照で観察されたレベルに回復させた（図８Ｂ）。ＭＩＡによって変化し、Ｂ．フラジリス処置によって回復した６ＯＴＵの系統発生再構築は、２つのバクテロイデス綱ＯＴＵが単系統群に集まることを明らかにする（図８Ｄ）。さらに、ＭＩＡによって有意に変化し、Ｂ．フラジリスによって修正されたラクノスピラ科ＯＴＵは、２つの別個の単系統群に集まる（図８Ｄ）。これらの結果は、Ｂ．フラジリスによるＭＩＡ子孫の処置はＢ．フラジリス自体の持続的な定着につながることができないが、それが、ラクノスピラ科ならびに未分類のバクテロイデス目の関連微生物の特定の群の相対的存在度を修正することができることを示す。
【０１２６】
全体として、この実施例は、Ｂ．フラジリスによるＭＩＡ子孫の処置が、片利共生微生物叢のＭＩＡ関連の生命異常に関与する特定の変化を改善し、自閉症個体のサブセットで観察されるものに類似するＧＩ異常を修正することができることを実証する。
【実施例５】
【０１２７】
Ｂ．フラジリス処置は、ＡＳＤ関連の行動異常を修正する
中核的ＡＳＤ行動異常へのＧＩ機能不全の潜在的影響を探るために、Ｂ．フラジリス処置がＭＩＡ子孫でＡＳＤ関連の行動に影響を与えるかどうかという問題を調べた。
【０１２８】
様々な行動アッセイで、成体ＭＩＡ子孫は、ＡＳＤの主要な行動特色を示すことが見出された。オープンフィールド探査は、オープンアリーナでの動物の運動を移動および不安の尺度にマッピングすることを含む（ＢａｉｌｅｙおよびＣｒａｗｌｅｙ、２００９年）。ＭＩＡ子孫はアリーナの中央での立入りおよび消費時間の減少を示したが、不安様行動の指標となる総移動距離の差は示さなかった（図１０Ａ；生理食塩水（Ｓ）とポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｐ）を比較）。前パルス阻害（ＰＰＩ）作業は、より低い強度の刺激（「前パルス」）が先行する聴覚音（「パルス」）に対するその驚愕を阻害する動物の能力を測定する。ＰＰＩの欠損は障害のある知覚運動のゲーティングの尺度であり、自閉症を含むいくつかの神経発達障害で観察される（Ｐｅｒｒｙら、２００７年）。ＭＩＡ子孫は、５または１５ｄｂの前パルスに応じて低下したＰＰＩを示した（図１０Ｂ）。マーブル埋め込み試験は、不安が交絡していない自然の穴掘行動に繰り返し従事するマウスの性質を測定する（Ｔｈｏｍａｓら、２００９年）。ＭＩＡ子孫は、対照と比較して増加した常同的マーブル埋め込みを示し（図１０Ｃ）、それは、中核的ＡＳＤ症状としての反復性の行動をモデル化する。異なる社会的パラダイムを越えて異なる構造化モチーフで数種類の呼びかけが発生し、使用されることを想定し、超音波発声はマウスによる伝達を測定するために使用される（Ｇｒｉｍｓｌｅｙら、２０１１年；Ｓｃａｔｔｏｎｉら、２０１１年；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２０１０ｂ）。社会的遭遇に応じて発生した超音波発声の回数および持続時間の低減によって示される通り、ＭＩＡ子孫は伝達においてＡＳＤ関連の欠陥を示した（図１０Ｄ）。最後に、社会的交流でのＡＳＤ関連の機能障害を測定するために、３チャンバー社会的試験を使用する（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２０１０ａ）。社交性は、新規物体よりも新規マウスと交流するマウスの好みによって例示され、社会的目新しさ（社会的好み）は、なじみのマウスに対してなじみのないマウスと交流する好みで特徴付けられる。ＭＩＡ子孫は、社交性および社会的好みの両方の欠陥を示した（図１０Ｅ〜Ｆ）。全体として、それらの行動アッセイは、ＡＳＤ関連の不安および欠陥知覚運動ゲーティングに加えて、ＡＳＤの主要な診断症状を評価し、ＡＳＤマウスモデルの表現型分析のために広く使用されている（Ｈａｎら、２０１２年；Ｎｏｖａｒｉｎｏら、２０１２年；Ｓｃｈｍｅｉｓｓｅｒら、２０１２年；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら、２０１０ａ；Ｔａｂｕｃｈｉら、２００７年；Ｔｓａｉら、２０１２年；Ｗｏｎら、２０１２年）。
【０１２９】
注目すべきことに、Ｂ．フラジリスによる経口処置は、これらのＡＳＤ関連の行動異常の多くを改善した。中央立入り回数およびオープンフィールドの中央での消費時間の回復によって示される通り、Ｂ．フラジリスで処置したＭＩＡ子孫は、オープンフィールドで不安様行動を示さなかった（図１０Ａ；ポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｐ）とポリ（Ｉ：Ｃ）＋Ｂ．フラジリス（Ｐ＋ＢＦ）を比較）。５および１５ｄｂの前パルスに応じた、組み合わせたＰＰＩの増加によって示される通り、Ｂ．フラジリスはＭＩＡ子孫で知覚運動ゲーティングを向上させ（図１０Ｂ）、音声刺激に対する驚愕の強度に有意な影響はなかった（データ示さず）。超音波発声の回数および持続時間の増加で例示される通り、Ｂ．フラジリスで処置したＭＩＡ子孫は、常同的マーブル埋め込みのレベルの低下も示し、伝達行動も回復した（図１０Ｃ〜Ｄ）。興味深いことに、Ｂ．フラジリス処置は、ＭＩＡ子孫によって発生された呼びかけあたりの持続時間を、生理食塩水対照で観察されたそれを超えるレベルに上昇させ（図１０Ｄ）、伝達する性質の正常化にもかかわらず（発生された呼びかけ数に対照と比較して差はなかった）、より長い音節を強化して生成された呼びかけのタイプに質的な差があることを示唆する。
【０１３０】
Ｂ．フラジリスで処置したＭＩＡ子孫は、伝達、反復性、不安様および知覚運動の行動の向上を示したが、それらは社交性および社会的好みの欠陥を保持する（図１０Ｅ）。興味深いことに、これは、ＡＳＤ個体（ＣａｎｉｔａｎｏおよびＳｃａｎｄｕｒｒａ、２００８年）およびＣＮＴＮＡＰ２ノックアウトマウス、ＡＳＤの遺伝子マウスモデル（Ｐｅｎａｇａｒｉｋａｎｏら、２０１１年）、へのリスペリドンの投与によって社会的行動を向上させる能力の欠如に対応する。これらのデータは、他の行動と比較して社会的行動を支配する回路または論理和回路の柔軟性に基本的な差があること、およびＭＩＡ子孫でのＡＳＤ関連の行動欠陥の改善の過程でＢ．フラジリス処置が特定の脳回路をモジュレートすることを示す。
【０１３１】
さらに、Ｂ．フラジリス処置に対応する行動の向上は、ＭＩＡ子孫での全身免疫の変化と関連せず（図３Ａ〜Ｃ）、Ｂ．フラジリスによる免疫調節効果を与えると以前に同定された分子である多糖Ａ（ＰＳＡ）に依存しなかった（図３Ｅ）（Ｍａｚｍａｎｉａｎら、２００８年；Ｏｃｈｏａ−Ｒｅｐａｒａｚら、２０１０年；ＲｏｕｎｄおよびＭａｚｍａｎｉａｎ、２０１０年）。さらに、バクテロイデス・テタイオタオミクロンによる同様の処置もＭＩＡ子孫で、不安様、反復性および伝達の行動を有意に向上させるので、行動の改善はＢ．フラジリスに特異的でない（図１１Ａ〜Ｄ）。これは、Ｂ．フラジリス処置がＧＩ管でのＢ．フラジリスの持続的な定着につながらないとの我々の知見（図９Ａ〜Ｂ）と一貫し、レジデント微生物叢における長期シフトを引き起こすことによって作用しているのかもしれない（図４を参照）。
【実施例６】
【０１３２】
血清メタボローム（metabolome）は、ＭＩＡおよびＢ．フラジリス処置によってモジュレートされる
代謝研究は、腸微生物生成物が多くの腸管外組織で見出され、微生物叢に由来する分子は、マウスおよびヒトで代謝、免疫、行動の表現型に影響することができることを示した（Ｂｅｒｃｉｋら、２０１１年；ＢｌｕｍｂｅｒｇおよびＰｏｗｒｉｅ、２０１２年；Ｈｏｏｐｅｒら、２０１２年；ＭａｃＦａｂｅ、２０１２年；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら、２０１２年；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、２０１２年）。この実施例では、潜在性を検討した。
【０１３３】
血清中代謝産物のＭＩＡ関連の変化を同定するために、質量分析（ＧＣ／ＬＣ−ＭＳ）をベースとした代謝プロファイリングによるガスクロマトグラフィー／液体クロマトグラフィーを使用した。２，４００個の代謝産物を分析し、このうち、アミノ酸（９４）、ペプチド（１５）、炭水化物（２２）、エネルギー（１０）、脂質（１２８）、ヌクレオチド（２３）、生体外物質（１９）ならびに補因子およびビタミン（１１）スーパー経路にわたる３２２個の代謝産物が成体マウスからの血清で検出された（表４）。興味深いことに、ＭＩＡは、検出された全ての血清中代謝産物の８％で統計的に有意な変化をもたらす（表３）。さらに、出産後のＢ．フラジリス処置は、血清中メタボロームに対して有意な影響を及ぼし、検出される全ての代謝産物の３４％を変化させる（表４および図１２）。
【０１３４】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【０１３５】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【実施例７】
【０１３６】
Ｂ．フラジリス処置は、ＭＩＡによって誘導される血清中代謝産物のレベルを修正する
この実施例は、Ｂ．フラジリスによって媒介される腸障壁の完全性の向上が、血清中代謝産物レベルの変化を予防することを示す。
【０１３７】
４−エチルフェニルスルフェート（４ＥＰＳ）、インドールピルベートおよびいくつかの他の血清中代謝産物は、ＭＩＡ処置によってかなり変更され、Ｂ．フラジリス処置によって対照レベルに回復される（図１３Ａ）。ＭＩＡ子孫は、Ｂ．フラジリス処置によって激減した４−エチルフェニルスルフェート（４ＥＰＳ）の血清中レベルの著しい４６倍の増加を示した（図１３Ａ）。さらに、従来通り定着したマウスと比較して、無菌マウスが血清中４ＥＰＳのほとんど検出不能であるレベルを示すことが見出され、血清中４ＥＰＳが片利共生微生物叢に由来するか、きわどくモジュレートされることを示した（図１３Ｂ）。４ＥＰＳは、ヒト自閉症の可能な尿バイオマーカーとして同定された関連代謝産物であるｐ−クレゾール（４−メチルフェノール）と同様に、尿毒症毒素であることが示唆されている（Ａｌｔｉｅｒｉら、２０１１年；ＰｅｒｓｉｃｏおよびＮａｐｏｌｉｏｎｉ、２０１３年）。ＭＩＡ子孫は、血清中ｐ−クレゾールの高いレベルも示したが、その増加は統計的有意性に到達しなかった（表４）。４ＥＰＳが、ｐ−クレゾールの有毒な硫酸化された形（４−メチルフェニルスルフェート；４ＭＰＳ）と緊密な構造類似性を共有するという事実は興味深いが、その理由は、２つの代謝産物が機能的重複を示すことができ（図１４Ａ）、ＭＩＡモデルにおいて見られる代謝産物異常とヒトＡＳＤで観察されるそれらを関連づけるからである。
【０１３８】
４ＥＰＳに加えて、ＭＩＡ子孫はトリプトファン代謝経路の重要な分子である血清中インドールピルベートの有意に高いレベルを示し、それはＢ．フラジリス処置によって対照レベルに回復した（図１３Ａ）。インドールピルベートはトリプトファン異化作用によって生成され、４ＥＰＳと同様に、インドールピルベートは腸内微生物によって産生されると思われている（ＳｍｉｔｈおよびＭａｃｆａｒｌａｎｅ、１９９７年）（図１４Ｂ）。さらに、ＭＩＡ子孫で観察される血清中インドールピルベートの上昇は、ヒト自閉症で観察される別の主要なトリプトファン代謝産物であり、ＡＳＤの尿バイオマーカーであると示唆されたインドリル−３−アクリロイルグリシン（ＩＡＧ）の増加に類似する（Ｂｕｌｌら、２００３年）。興味深いことに、ＩＡＧはＧＩホメオスターシスに関与し、細菌性トリプトファン代謝によって生成される（Ｋｅｓｚｔｈｅｌｙｉら、２００９年）。ＭＩＡ子孫が血清中セロトニンのレベルの増加（０．０５＜Ｐ＜０．１０）を示したことは注目すべきであり、それは、トリプトファン代謝の別の経路の変化を反映し、自閉症の高セロトニン血症の内部表現型を思い出させる（Ｍｕｌｄｅｒら、２００４年）。重要なことに、片利共生微生物叢は、インドール含有トリプトファン代謝産物およびセロトニンの血清中レベルに影響を与えることが知られている（Ｗｉｋｏｆｆら、２００９年）。ＭＩＡは、血清中グリコレート、イミダゾールプロピオネートおよびＮ−アセチルセリンレベルの変化にもつながり（図１３Ａ）、それはＢ．フラジリス処置によって修正された。
【０１３９】
この実施例は、特定の代謝産物がＭＩＡ子孫で変化し、Ｂ．フラジリス処置によって正常化されることを実証する。
【実施例８】
【０１４０】
血清中代謝産物は、ＡＳＤ関連の行動を誘導する
特定の代謝産物の全身の生物学的利用能のＭＩＡ依存的増加、およびＢ．フラジリスによる回復は、これらの分子が、ＭＩＡ子孫でＡＳＤ関連の行動において原因となる役割を演ずることを示唆する。この実施例は、腸内細菌の影響を受ける全ての代謝産物の中で最も劇的なものである血清中４ＥＰＳを実験的に増加させることが、ナイーブマウスで任意のＡＳＤ関連の行動異常を引き起こすのに十分であるかどうかを検査した。
【０１４１】
４ＥＰＳは三酸化硫黄−ピリジン錯体による４−エチルフェノールの処理によって化学的に合成され、それは、イオン交換の後に４ＥＰＳカリウム塩を生み出す（図１５Ａ〜Ｃ）（Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍら、２００３年；Ｇｒｉｍｅｓ、１９５９）。３週齢（ＭＩＡ子孫で腸透過性の増加が検出されたとき、図１Ａを参照）から６週齢（行動試験が始まったとき）まで、マウスを４ＥＰＳまたは生理食塩水ビヒクルで腹腔内に毎日処置した。
【０１４２】
注目すべきことに、ナイーブ野生型マウスへの４ＥＰＳの全身投与は、ＭＩＡ子孫で観察されたものと同様の不安様行動を誘導するのに十分であった（図１３Ｃ）。ビヒクルで処置した対照に対して、４ＥＰＳに曝露させたマウスはオープンフィールドで同等の距離を移動したが、中央アリーナで費やす時間は短かった（図１３Ｃ）。注目すべきことに、未処置の生理食塩水子孫と比較して、ビヒクルで処置した対照は不安様行動の症状を示した（中央立入り：１４．５±１．１対２３．７±１．４；中央での時間（ｓ）：２９．４±５．４対４６．４±４．２；距離（ｍ）：３５．６±１．８対３７．６±１．０、図１３Ｃのビヒクル処置マウス（Ｖｅｈ．）を図１０Ａの生理食塩水子孫（Ｓ）と比較する）。これは、マウスおよびヒトでの不安レベルの上昇に対する慢性ストレス（連日注射）の周知の影響を反映する（ＢａｉｌｅｙおよびＣｒａｗｌｅｙ、２００９年；Ｂｏｕｒｉｎら、２００７年）。また、ＰＰＩ試験では、４ＥＰＳ処置マウスは、無条件一次刺激に対する驚愕の強度の増加を示したが、ＰＰＩで有意な変化は示さず（図１３Ｄ）、驚愕反射の不安関連の増強を表している（Ｂｏｕｒｉｎら、２００７年）。また、４ＥＰＳ処置マウスと対照処置マウスの間に重量の差はなく、したがって、測定された驚愕強度に対する体質量の交絡効果はなかった。反対に、マーブル埋め込みまたはＵＳＶ行動において、４ＥＰＳ処置と生理食塩水処置マウスの間に有意差はなく（図１５Ｄおよび１５Ｅ）、血清中４ＥＰＳレベルを特異的に上昇させることが不安様行動を促進することを示唆した。
【実施例９】
【０１４３】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の処置
この実施例は、ＡＳＤを患っている患者の処置を例示する。
【０１４４】
患者は、ＡＳＤを患っていると確認される。対象の４ＥＰＳの血中レベルを判定する。Ｂ．フラジリスの組成物を、経口投与により患者に投与する。Ｂ．フラジリスの投与は、患者で４ＥＰＳの血中レベルおよび腸微生物叢の組成を変化させると予想される。細菌投与が、患者でＡＳＤの１つまたは複数の症状を軽減すること、例えば行動性能を向上させることも予想される。
【実施例１０】
【０１４５】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の処置
この実施例は、ＡＳＤを患っている患者の処置を例示する。
【０１４６】
患者は、ＡＳＤを患っていると確認される。対象の４−メチルフェニルスルフェートの尿中レベルを判定する。Ｂ．フラジリスの組成物を、経口投与により患者に投与する。Ｂ．フラジリスの投与は、患者で４−メチルフェニルスルフェートの尿中レベルおよび腸微生物叢の組成を変化させると予想される。細菌投与が、患者でＡＳＤの１つまたは複数の症状を軽減すること、例えば行動性能を向上させることも予想される。
【０１４７】
前述の記載および実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳述し、発明者によって企図される最良の様式を記載する。しかし、本文で前述のものがどんなに詳述されているように見えても、本発明を多くの方法で実践することができ、本発明は添付の請求項およびそれらの任意の同等物に従って解釈されるべきであることが理解される。本出願を上に詳述したが、当業者ならば、本発明の精神を逸脱しない範囲で様々な変更を加えることができることを理解する。
【０１４８】
本出願では、特に明記されていなければ、または本開示を考慮して当業者が理解するように単数形が唯一の機能的実施形態でない限り、単数形の使用は複数形を含むことができる。したがって、例えば、「ａ」は２個以上を意味することができ、「一実施形態」はその記載が複数の実施形態に適用されることを意味することができる。さらに、本出願では、「および／または」は、「および」の包括的な意味と、代わりに「または」の排他的意味の両方がリストに適用されることを表す。したがって、リストは、リストの項目の全ての可能な組合せを含み、さらに他の項目からの各項目も排他的に含むと解釈するべきである。この用語の追加は、用語「および」または「または」の単独使用へのいかなる特定の意味も表すものではない。そのような用語の意味は、その特定の開示を読むことにより当業者に明白になる。
【０１４９】
それらに限定されないが公開および未公開の特許出願、特許、テキストブック、参考文献等を含む、本明細書の全ての引用文献は、既にそうでない限り、参照により本明細書に組み込まれる。組み込まれる文献および同様の資料の１つまたは複数が、それらに限定されないが定義された用語、用語使用、記載された技術など含む明細書に含まれる開示と異なるか矛盾する範囲で、本明細書はいかなるそのような矛盾した材料に取って代わり、および／または優先するものとする。
【０１５０】
本明細書で用いられる用語「含む（comprising）」は、「含む（including）」、「含有する」または「によって特徴付けられる」と同義であり、包括的または非限定的であり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを排除しない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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