(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｐ２）で表わされる重合体、
【化１】
0006736278.tif 000057
ただし、上記式（Ｐ２）においてＤは近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格であり、下記式（ｄ１）乃至（ｄ４）のいずれかで表わされ、Ａは重合体の主鎖、Ｌ１、Ｌ２は各々独立のリンカーで、Ｌ１、Ｌ２は存在しなくてもよく、ｘは１以上の整数であり、Ｅは官能基を表し、Ｂは、下記式（ｓ１）で表わされる。
【化２】
0006736278.tif 000058
【化３】
0006736278.tif 000059
【化４】
0006736278.tif 000060
【化５】
0006736278.tif 000061
［上記式（ｄ１）において、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ１５を表しＲ１５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ１−ＳＯ３−、−ＲＥ１−ＳＯ３Ｘ１１を表す。ＲＤ１、ＲＥ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ１１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ１−ＳＯ３−、−ＲＧ１−ＳＯ３Ｘ１５、または、−ＲＦ１−ＣＯ２Ｘ１４を表す。Ｘ１４、Ｘ１５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ１、ＲＦ１、ＲＧ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ１が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｚ１１は水素原子、−ＳＯ３Ｘ１２、またはＺ１１に結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−ＳＯ３Ｘ１３で置換されていてよい。Ｘ１２、Ｘ１３は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかであり、＊はＬ１に結合する、または重合体がＬ１を含まない場合は、式（Ｐ２）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
上記式（ｄ２）において、Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ１０５を表しＲ１０５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ１１−ＳＯ３−、−ＲＥ１１−ＳＯ３Ｘ１０１を表す。ＲＤ１１、ＲＥ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ１０１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ１１−ＳＯ３−、−ＲＧ１１−ＳＯ３Ｘ１０５、または、−ＲＦ１−ＣＯ２Ｘ１０４を表す。Ｘ１０４、Ｘ１０５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ１１、ＲＦ１１、ＲＧ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ１１が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。また、本色素骨格Ｄは、ＲＡ１１を介して、式（Ｐ２）における繰り返し単位の末端の炭素原子、または、リンカーＬ１に結合していても良い。ＲＢ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｚ１０１は水素原子、−ＳＯ３Ｘ１０２、またはＺ１０１に結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−ＳＯ３Ｘ１０３で置換されていてよい。Ｘ１０２、Ｘ１０３は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかであり、＊はＬ１に結合する、または重合体がＬ１を含まない場合は、式（Ｐ２）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
上記式（ｄ３）において、Ｒ２０１乃至Ｒ２１２は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＳＯ３Ｘ２４を表す。Ｘ２４は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ２５を表しＲ２５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ２−ＳＯ３−、−ＲＥ２−ＳＯ３Ｘ２１を表す。ＲＤ２、ＲＥ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ２１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ２−ＳＯ３−、−ＲＧ２−ＳＯ３Ｘ２５、または、−ＲＦ２−ＣＯ２Ｘ２４を表す。Ｘ２４、Ｘ２５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ２、ＲＦ２、ＲＧ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ２が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。また、本色素骨格Ｄは、ＲＡ２を介して、式（Ｐ２）における、繰り返し単位の末端の炭素原子、または、リンカーＬ１に結合していても良い。ＲＢ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。＊はＬ１に結合する、または重合体がＬ１を含まない場合は、式（Ｐ２）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
上記式（ｄ４）において、Ｒ３０１乃至Ｒ３１２は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＳＯ３Ｘ３４を表す。Ｘ３４は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ３７は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ３５を表しＲ３５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ３７は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ３−ＳＯ３−、−ＲＥ３−ＳＯ３Ｘ３１を表す。ＲＤ３、ＲＥ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ３１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ３−ＳＯ３−、−ＲＧ３−ＳＯ３Ｘ３５、または、−ＲＦ３−ＣＯ２Ｘ３４を表す。Ｘ３４、Ｘ３５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ３、ＲＦ３、ＲＧ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ３が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。また、本色素骨格Ｄは、ＲＡ３を介して、式（Ｐ２）における、繰り返し単位の末端の炭素原子、または、リンカーＬ１に結合していても良い。ＲＢ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。＊はＬ１に結合する、または重合体がＬ１を含まない場合は、式（Ｐ２）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。］
【化６】
0006736278.tif 000062
［上記式（ｓ１）においてａは１以上６以下の整数であり、ｎ、ｍ、ｌは各々独立に１から３の整数であり、＊はＬ２またはＡに結合することを示す。］
【請求項２】
下記式（Ｐ２）で表わされる重合体、
【化７】
0006736278.tif 000063
ただし、上記式（Ｐ２）においてＤは近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格であり、下記式（ｄ２−１）乃至（ｄ２−７）のいずれかで表わされ、Ａは重合体の主鎖、Ｌ１、Ｌ２は各々独立のリンカーで、Ｌ１、Ｌ２は存在しなくてもよく、ｘは１以上の整数であり、Ｅは官能基を表し、Ｂは、下記式（ｓ１）で表わされる。
【化８】
0006736278.tif 000064
【化９】
0006736278.tif 000065
【化１０】
0006736278.tif 000066
【化１１】
0006736278.tif 000067
【化１２】
0006736278.tif 000068
【化１３】
0006736278.tif 000069
【化１４】
0006736278.tif 000070
［上記式（ｄ２−１）〜（ｄ２−７）において＊はＬ１またはＡに結合することを示す。Ｒはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。］
【化１５】
0006736278.tif 000071
［上記式（ｓ１）においてａは１以上６以下の整数であり、ｎ、ｍ、ｌは各々独立に１から３の整数であり、＊はＬ２またはＡに結合することを示す。］
【請求項３】
下記式（Ｐ２）で表わされる重合体、
【化１６】
0006736278.tif 000072
ただし、上記式（Ｐ２）においてＤは近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格、Ａは重合体の主鎖、Ｌ１、Ｌ２は各々独立のリンカーで、Ｌ１は下記式（ｌ１）乃至（ｌ２１）のいずれかであり、Ｌ２は存在しなくてもよく、ｘは１以上の整数であり、Ｅは官能基を表し、Ｂは、下記式（ｓ１）で表わされる。
【化１７】
0006736278.tif 000073
【化１８】
0006736278.tif 000074
【化１９】
0006736278.tif 000075
［上記式（ｌ１）乃至（ｌ２１）において＊は前記Ｄまたは前記Ａと結合することを示す。］
【化２０】
0006736278.tif 000076
［上記式（ｓ１）においてａは１以上６以下の整数であり、ｎ、ｍ、ｌは各々独立に１から３の整数であり、＊はＬ２またはＡに結合することを示す。］
【請求項４】
前記Ａが、下記式（ｍ１）乃至（ｍ３）のいずれかで表わされる構造である請求項１乃至３のいずれか一項に記載の重合体。
【化２１】
0006736278.tif 000077
［上記式（ｍ１）乃至（ｍ３）においてＲ１乃至Ｒ４はそれぞれ独立に、水素原子、または、置換もしくは無置換の炭素数１以上４以下の炭化水素基であり、Ｒ５は置換もしくは無置換の炭素数１以上９以下の炭化水素基であり、Ｒ５が炭素数２以上の炭化水素基である場合、どの炭素が側鎖である−Ｌ２−Ｂ、またはＢと結合してもよく、Ｒ１乃至Ｒ５における置換基は、ハロゲン原子、酸素原子、窒素原子から選択される少なくとも１種を含む官能基であり、上記式（ｍ１）乃至（ｍ３）において＊はＬ２あるいはＢに、＊＊はＬ１あるいはＤに結合することを、記号を付さない末端はＥに結合することを示す。］
【請求項５】
前記Ａが下記式（ｍ１−１）で表わされる構造である請求項１乃至４のいずれか一項に記載の重合体。
【化２２】
0006736278.tif 000078
［上記式（ｍ１−１）において＊はＬ２あるいはＢに、＊＊はＬ１あるいはＤに結合することを、記号を付さない末端はＥに結合することを示す。］
【請求項６】
前記Ｂが下記式（ｓ１−１）で表わされる請求項１乃至５のいずれか一項に記載の重合体。
【化２３】
0006736278.tif 000079
［上記式（ｓ１−１）において、ａは１以上４以下の整数であり、＊はＡまたはＬ２に結合することを示す。］
【請求項７】
前記式（Ｐ２）中のＬ２−Ｂが下記式（ｓ１−２）で表わされる請求項１乃至６のいずれか一項に記載の重合体。
【化２４】
0006736278.tif 000080
［上記式（ｓ１−２）において、Ｌ１は存在しなくてもよく、ａ、ｂは各々独立に１以上４以下の整数であり、Ｒ６は酸素原子、またはＮＨ基のいずれかであり、＊はＡに結合することを示す。］
【請求項８】
前記式（Ｐ２）中の
【化２５】
0006736278.tif 000081
が下記式（ｐ１−１）で表わされる請求項１乃至７のいずれか一項に記載の重合体。
【化２６】
0006736278.tif 000082
［上記式（ｐ１−１）において、ａ、ｂは各々独立に、１以上４以下の整数であり、＊はＬ１またはＤと結合することを、記号を付さない末端はＥに結合することを示す。］
【請求項９】
前記式（Ｐ２）中の
【化２７】
0006736278.tif 000083
が下記式（ｐ１−２）で表わされる請求項１乃至８のいずれか一項に記載の重合体。
【化２８】
0006736278.tif 000084
［上記式（ｐ１−２）において＊はＬ１またはＤと結合することを、記号を付さない末端はＥに結合することを示す。］
【請求項１０】
前記Ｄが下記式（ｄ１−１）乃至（ｄ１−６）のいずれかで表わされる請求項１に記載の重合体。
【化２９】
0006736278.tif 000085
［上記式（ｄ１−１）乃至（ｄ１−６）において、＊はＬ１またはＡに結合することを示し、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。
上記式（ｄ１−２）において、Ｙ−はハロゲンイオン、または有機酸イオンのいずれかである。］
【請求項１１】
前記Ｌ２が下記式（ｌ１）乃至（ｌ２１）のいずれかである請求項１乃至６、及び１０のいずれか一項に記載の重合体。
【化３０】
0006736278.tif 000086
【化３１】
0006736278.tif 000087
【化３２】
0006736278.tif 000088
［上記式（ｌ１）乃至（ｌ２１）において＊は前記Ａまたは前記Ｂと結合することを示す。］
【請求項１２】
前記Ｅがハロゲン、低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体のいずれかから選ばれる請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項１３】
下記式（１）〜（７）のいずれかで表わされる重合体。
【化３３】
0006736278.tif 000089
【化３４】
0006736278.tif 000090
【化３５】
0006736278.tif 000091
【化３６】
0006736278.tif 000092
【化３７】
0006736278.tif 000093
【化３８】
0006736278.tif 000094
【化３９】
0006736278.tif 000095
［上記式（１）〜（７）においてｘはそれぞれ１以上の整数を示す。］
【請求項１４】
前記重合体の数平均分子量が５０００以上で１０００００以下である請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項１５】
前記重合体の数平均分子量が９０００以上で５００００以下である請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項１６】
前記重合体の数平均分子量が１６０００以上で２００００以下である請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の重合体。
【請求項１７】
請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の重合体と分散媒とを含む光音響イメージング用造影剤。
【請求項１８】
腫瘍の造影に用いられる請求項１７に記載の光音響イメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重合体、および前記重合体を有する光音響イメージング用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算した画像を得ることができる。
【０００３】
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものをも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子を体内に投与し、造影剤として利用することもできる。ＩＣＧは、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高い近赤外波長領域の光をよく吸収することから、ＰＡＴ装置における造影剤（光音響造影剤と略すことがある）として好適に用いることができる。なお、本明細書において、ＩＣＧとは下記式の構造で示される化合物を指す。
【化１】
0006736278.tif 000002
ただし、対イオンはＮａ＋でなくてもよく、Ｈ＋あるいはＫ＋など任意の対イオンを用いることができる。
【０００４】
しかし、ＩＣＧは血中での半減期が数分程度と非常に短いことが知られている。
【０００５】
また、特許文献１では、近赤外蛍光色素にポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、以下ＰＥＧと略すことがある）を共有結合させた造影剤を用いて腫瘍集積を確認した例が報告されている。近赤外蛍光色素をＰＥＧに結合させることで、近赤外蛍光色素単独に比べて、血中での半減期を長くすることができる。
【０００６】
非特許文献１では、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣと略すことがある）ポリマーの末端にローダミン色素（最大吸収波長は５３０ｎｍ）を結合させた化合物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１２−５２０８５６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＢＩＯＭＡＣＲＯＭＯＬＥＣＵＬＥＳ，１２，２２２５−２２３４（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１に開示された近赤外蛍光色素を結合させたＰＥＧでは、高い腫瘍集積性を示す一方で、血中滞留性も高いため、その腫瘍血中比（腫瘍選択性）が低いという課題がある。
【００１０】
非特許文献１に開示されたローダミン色素を結合させたＭＰＣポリマーでは、その最大吸収波長は５３０ｎｍ付近である。この可視領域の波長帯域の光に対して、血中のヘモグロビン由来の吸収が大きいため、ローダミン色素を結合させたＭＰＣポリマーのｉｎ  ｖｉｖｏでの光音響信号の検出は困難である。
【００１１】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの信号検出ができ、かつ、より高い腫瘍集積性を有する光音響造影剤として、高い近赤外波長領域の吸収係数、高い腫瘍集積性、ならびに高い腫瘍血中比を示す化合物が望まれていた。
【００１２】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、高い近赤外波長領域の吸収係数、高い腫瘍集積性、ならびに高い腫瘍血中比を示す新規な近赤外色素結合ホスホリルコリン含有重合体、前記重合体を用いた光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に係る重合体は、主鎖にリンカーを介してまたは直接に側鎖が結合した、式（Ｐ２）で表わされる重合体である。
【化２】
0006736278.tif 000003
【００１４】
ただし、Ｄは近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格、Ａは重合体の主鎖、Ｌ１、Ｌ２は各々独立のリンカーで、Ｌ１、Ｌ２は存在しなくてもよく、ｘは１以上の整数であり、Ｅは官能基を表し、Ｂは、下記式（ｓ１）で表わされる。
【化３】
0006736278.tif 000004
上記式（ｓ１）においてａは１以上６以下の整数であり、ｎ、ｍ、ｌは各々独立に１から３の整数であり、＊はＬ２またはＡに結合することを示す。なお、本明細書中、アスタリスク記号として、放射線が５本のものと、６本のものがあるが、これらは同義である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る重合体によれば、親水性のホスホリルコリン含有ポリマーと、ＩＣＧなどの近赤外波長領域に吸収がある有機色素とが共有結合した構造であるため、腫瘍への集積性が高く、速やかに血中濃度が低下する。そのため、本発明に係る重合体は、体内に投与した場合、腫瘍存在量／血中存在量の比率（腫瘍血中比と略すことがある）が高い。したがって、高い感度、かつ、高いコントラストで腫瘍を光音響造影することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）の投与後２４時間目の担癌マウスの近赤外蛍光像と明視野像を重ね合わせた図（図中の黒矢印は腫瘍部位を示す）。
【図２】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２の水中における吸収スペクトルを示す図。
【図３】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２水溶液の光音響信号強度の波形を示す図。
【図４】（ａ）本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２投与前にイメージングされた担癌マウスの光学写真、ならびに、白い四角の枠で示された光音響イメージング像（ＭＩＰ像）の重ね合わせ像。（ｂ）本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２投与１日後にイメージングされた担癌マウスの光学写真、ならびに、白い四角の枠で示された光音響イメージング像（ＭＩＰ像）の重ね合わせ像。
【図５】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、本発明の実施例に係るＰＭＰＣ−ＮＨ２およびＩＣＧ色素のそれぞれのＧＰＣチャートを重ねた図。
【図６】（ａ）本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）投与前にイメージングされた担癌マウスの光学写真、ならびに、白い四角の枠で示された光音響イメージング像（ＭＩＰ像）の重ね合わせ像。（ｂ）本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）投与１日後にイメージングされた担癌マウスの光学写真、ならびに、白い四角の枠で示された光音響イメージング像（ＭＩＰ像）の重ね合わせ像。白矢印は腫瘍の位置を示す。
【図７】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）の投与前および投与後４８時間目のそれぞれのマウスの近赤外蛍光像と明視野像を重ね合わせた図（図中、投与前のマウス右肩部の円は腫瘍部位を示す）。
【図８】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）と比較例のＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）の投与前および投与後の４８時間目のそれぞれのマウスの近赤外蛍光像と明視野像を重ね合わせた図（図中、投与前のマウス右肩部の円は腫瘍部位を示す）。
【図９】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）、比較例のＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）の差分強度の経時変化を示す図。
【図１０】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）、比較例のＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）のＳＮＲの経時変化を示す図。
【図１１】担癌マウスの肝臓（腹部）における、本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）ならびに比較例のＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）の蛍光強度値（関心領域（Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、以下ＲＯＩと略す）の定量値）の経時変化を示す図。
【図１２】ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）を投与した担癌マウスの光学写真と光音響イメージング画像の重ね合わせ像。（ａ）投与前の担癌マウスの光学写真と光音響画像の重ね合わせ像。（ｂ）投与２日後の同一マウス個体の光学写真と光音響画像の重ね合わせ像。図中の矢印は腫瘍位置を示す。
【図１３】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）を投与した担癌マウス腫瘍領域の光音響イメージング画像。それぞれ、投与前、および投与２日後の同一マウス個体の腫瘍領域の光音響画像を示す。
【図１４】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）を投与した担癌マウスから摘出された腫瘍の光音響イメージング画像。図中の点線は腫瘍位置を示す。
【図１５】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４８ｋ）、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、ならびに７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）の投与後２４時間目の担癌マウスの近赤外蛍光像と明視野像を重ね合わせた図（図中の白矢印は腫瘍部位を示す）。各蛍光画像はそれぞれで任意にコントラスト調整したグレースケール画像であり、蛍光強度は、黒が弱く、白が強いことを示す。
【図１６】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４８ｋ）、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）ならびに比較例のＩＣＧの励起波長（Ｅｘ）と蛍光発光波長（Ｅｍ）のリスト。図中、それぞれをＩＣＧ−ＰＭＰＣ、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ、８００ＲＳ−ＰＭＰＣ、８００ＣＷ−ＰＭＰＣ、７００ＤＸ−ＰＭＰＣならびにＩＣＧと示す。
【図１７】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４８ｋ）、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、ならびに比較例としてのＩＣＧの、レーザー照射における光褪色を示す図である。レーザー照射前後の、それぞれの規格化蛍光強度を示したものである。図中、それぞれをＩＣＧ−ＰＭＰＣ、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ、８００ＲＳ−ＰＭＰＣ、８００ＣＷ−ＰＭＰＣ、７００ＤＸ−ＰＭＰＣならびにＩＣＧと示す。
【図１８】本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４８ｋ）、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、ならびに７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）からの一重項酸素生成量とレーザー照射回数の関係を示す図である。レーザー照射前後の、それぞれの溶液の規格化蛍光強度（４８０ｎｍ励起で、５３６ｎｍ の蛍光強度）を示す。図中、それぞれをＩＣＧ−ＰＭＰＣ、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ、８００ＲＳ−ＰＭＰＣ、８００ＣＷ−ＰＭＰＣ、ならびに７００ＤＸ−ＰＭＰＣと示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明するが本発明はこれらに限られない。なお、本明細書において、ｋと記載したら１０００という意味である。例えば、１８ｋは１８０００を意味する。また、本明細書中において、繰り返し単位を表わすｘまたはｎは１以上の整数を表わす。
【００１８】
（重合体）
本実施形態に係る重合体は、ホスホリルコリン（誘導体）を側鎖として有する重合体であって、この重合体にさらに近赤外波長領域に吸収を有する色素（近赤外色素）が結合している。
【００１９】
すなわち、式（Ｐ２）で表わされる重合体、
【化４】
0006736278.tif 000005
ただし、上記式（Ｐ２）においてＤは近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格、Ａは重合体の主鎖、Ｌ１、Ｌ２は各々独立のリンカーで、Ｌ１、Ｌ２は存在しなくてもよく、ｘは１以上の整数であり、Ｅは繰り返し構造の末端を表わし構造は特に限定されないが、例えばカチオン重合開始剤に由来する残基、官能基のいずれかを表す。また、上記式（Ｐ２）においてＢは、下記式（ｓ１）で表わされる。
【化５】
0006736278.tif 000006
上記式（ｓ１）においてａは１以上６以下の整数であり、ｎ、ｍ、ｌは各々独立に１から３であり、＊はＬ２またはＡに結合することを示す。
【００２０】
ここで、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣ）はホスホリルコリン基を側鎖に有する親水性ポリマーであり、タンパク質吸着を抑える性質を有することから、生体適合材料として使われている。
【００２１】
一方、生体適合性の親水性ポリマーとしてＰＥＧが知られているが、ＰＥＧは極性溶媒、無極性溶媒いずれにも幅広く溶解できるのに対して、ＰＭＰＣはＰＥＧとは異なり水、メタノールに良く溶解するが、無極性有機溶媒や、ＤＭＳＯやＤＭＦなどの極性有機溶媒に溶けないという特徴を有している。
【００２２】
また、ＩＣＧは水、メタノール、ＤＭＳＯなどに溶解し、また色素間で会合しやすいという両親媒性の性質を有する。
【００２３】
上記のことから、血中において、ＩＣＧを結合したＰＥＧでは、ＩＣＧとＰＥＧの相溶性が高い結果、ＩＣＧがＰＥＧで有効に被覆された状態になると考えられる。一方、ＰＥＧに比べると、ＩＣＧとＰＭＰＣの相溶性は低いと思われるため、ＩＣＧがＰＭＰＣで有効に被覆されない状態になると考えられる。
【００２４】
したがって、ＩＣＧ結合ＰＭＰＣでは、ＩＣＧと血中タンパクが確率的に接触し、異物認識され、肝臓や脾臓に運ばれることで、血中濃度が低下すると考えられる。腫瘍への集積はＥＰＲ効果によるものと考えられ、速やかに腫瘍に蓄積する。また、ホスホリルコリンは細胞膜の材料であるため、ホスホリルコリン（誘導体）を側鎖として含む本実施形態に係る重合体は、腫瘍が増殖する際の細胞膜の形成時に取り込まれ、腫瘍に集積すると考えられる。
【００２５】
これらの結果、本実施形態に係る重合体は、腫瘍血中比が高くなると考えられる。
【００２６】
本実施形態では、親水性ポリマーのステルス効果（タンパク非結合性）やその分子量に加え、ポリマーと近赤外色素の相互作用が、その腫瘍集積性と血中濃度（血中滞留性）において重要であることを見出しており、従来技術では困難であった、腫瘍集積性と腫瘍血中比の向上を両立できるものである。
【００２７】
（主鎖）
本実施形態における重合体の主鎖、すなわち前記式（Ｐ２）中のＡの例としては、下記式（ｍ１）乃至（ｍ３）のいずれかで表わされるものが挙げられる。
【化６】
0006736278.tif 000007
【００２８】
上記式（ｍ１）乃至（ｍ３）においてＲ１乃至Ｒ４はそれぞれ独立に、水素原子、または、置換もしくは無置換の炭素数１以上４以下の炭化水素基であり、Ｒ５は置換もしくは無置換の炭素数１以上９以下の炭化水素基であり、Ｒ５が炭素数２以上の炭化水素基である場合、どの炭素が側鎖である−Ｌ２−Ｂ、またはＢと結合してもよく、Ｒ１乃至Ｒ５における置換基は、ハロゲン原子、酸素原子、窒素原子から選択される少なくとも１種を含む官能基であり、上記式（ｍ１）乃至（ｍ３）において＊はＬ２あるいはＢに、＊＊はＬ１あるいはＤに結合することを、記号を付さない末端はＥに結合することを示す。
本実施形態における重合体の主鎖は、上記式（ｍ１）乃至（ｍ３）の他には、ポリウレタン、ポリカーボネートなどが挙げられる。
【００２９】
また、本実施形態に係る主鎖Ａとして下記式（ｍ１−１）で表わされるものが好ましい。
【化７】
0006736278.tif 000008
上記式（ｍ１−１）において＊はＬ２あるいはＢに、＊＊はＬ１あるいはＤに結合することを、記号を付さない末端はＥに結合することを示す。
【００３０】
（側鎖）
本実施形態に係る重合体の側鎖、すなわち前記式（Ｐ２）中のＢの例としては、下記式（ｓ１−１）で表わされるホスホリルコリン構造が挙げられる。
【化８】
0006736278.tif 000009
上記式（ｓ１−１）において、ａは１以上４以下の整数であり、＊はＡまたはＬ２に結合することを示す。
【００３１】
上記式（ｓ１−１）を含む式（Ｐ２）中のＬ２−Ｂの具体例として、下記式（ｓ１−２）で表わされる構造が挙げられる。
【化９】
0006736278.tif 000010
上記式（ｓ１−２）において、ａ、ｂは各々独立に１以上４以下の整数であり、Ｒ６は酸素原子、またはＮＨ基のいずれかである。＊はＡに結合することを示す。
【００３２】
本実施形態に係る実施形態の一つとして、
式（Ｐ２）中の
【化１０】
0006736278.tif 000011
が下記式（ｐ１−１）で表わされる構造を含む重合体が挙げられる。
【化１１】
0006736278.tif 000012
式（ｐ１−１）において、ａ、ｂは各々独立に、１以上４以下の整数であり、＊はＬ１またはＤと結合することを、記号を付さない末端はＥに結合することを示す。
【００３３】
本実施形態に係るホスホリルコリン含有ポリマーとして例えば上記式（ｐ１−１）においてａ，ｂが２の重合体（下記の式（ｐ１−２））が挙げられる。式（ｐ１−２）で表わされる重合体は、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ＰＭＰＣと略すことがある）骨格を含む重合体である。すなわち、前記式（Ｐ２）中の
【化１２】
0006736278.tif 000013
が下記式（ｐ１−２）で表わされる重合体を挙げることができる。
【化１３】
0006736278.tif 000014
上記式（ｐ１−２）において、＊はＬ１またはＤと結合することを、記号を付さない末端はＥに結合することを示す。
【００３４】
（近赤外色素）
本実施形態における近赤外色素としては、近赤外波長領域の光を吸収して音響波を発するものであれば特に限定されない。ここで、近赤外波長領域とは、６００ｎｍ以上１３００ｎｍ以下の範囲である。
【００３５】
本実施形態における近赤外色素としては、例えば、アジン系色素、アクリジン系色素、トリフェニルメタン系色素、キサンテン系色素、ポルフィリン系色素、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、スチリル系色素、ピリリウム系色素、アゾ系色素、キノン系色素、テトラサイクリン系色素、フラボン系色素、ポリエン系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、インジゴイド系色素を挙げることが出来る。
【００３６】
上記シアニン系色素としては、例えば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ａｌｅｘａ  ７５０などのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素（インビトロジェン社製）、Ｃｙ（登録商標）系色素（ＧＥ  ヘルスケア  バイオサイエンス社製）、ＩＲ−７８３、ＩＲ−８０６、ＩＲ−８２０（シグマ  アルドリッチ  ジャパン株式会社製）、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ（登録商標）（ＬＩ−ＣＯＲ社製）、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ７９５ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、ＡＤＳ８３２ＷＳ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｙｅ  Ｓｏｕｒｃｅ社製）、Ｓｕｌｆｏ−Ｃｙａｎｉｎｅ７（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ社製）、ならびにＩＲＤｙｅ７００ＤＸ（登録商標）（ＬＩ−ＣＯＲ社製）、を挙げることが出来る。
【００３７】
すなわち、本実施形態において、前記式（Ｐ２）中の色素骨格Ｄは、下記式（ｄ１）または（ｄ２）で表わされることが特に好ましい。
【化１４】
0006736278.tif 000015
【化１５】
0006736278.tif 000016
上記式（ｄ１）において、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ１５を表しＲ１５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ１−ＳＯ３−、−ＲＥ１−ＳＯ３Ｘ１１を表す。ＲＤ１、ＲＥ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ１１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ１−ＳＯ３−、−ＲＧ１−ＳＯ３Ｘ１５、または、−ＲＦ１−ＣＯ２Ｘ１４を表す。Ｘ１４、Ｘ１５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ１、ＲＦ１、ＲＧ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ１が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｚ１１は水素原子、−ＳＯ３Ｘ１２、またはＺ１１に結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−ＳＯ３Ｘ１３で置換されていてよい。Ｘ１２、Ｘ１３は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかであり、＊はＬ１に結合する、または重合体がＬ１を含まない場合は、式（Ｐ２）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
上記式（ｄ２）において、Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ１０５を表しＲ１０５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ１１−ＳＯ３−、−ＲＥ１１−ＳＯ３Ｘ１０１を表す。ＲＤ１１、ＲＥ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ１０１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ１１−ＳＯ３−、−ＲＧ１１−ＳＯ３Ｘ１０５、または、−ＲＦ１−ＣＯ２Ｘ１０４を表す。Ｘ１０４、Ｘ１０５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンいずれかを表す。ＲＣ１１、ＲＦ１１、ＲＧ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ１１が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。また、本色素骨格Ｄは、ＲＡ１１を介して、式（Ｐ２）における繰り返し単位の末端の炭素原子、または、リンカーＬ１に結合していても良い。ＲＢ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｚ１０１は水素原子、−ＳＯ３Ｘ１０２、またはＺ１０１に結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−ＳＯ３Ｘ１０３で置換されていてよい。Ｘ１０２、Ｘ１０３は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかであり、＊はＬ１に結合する、または重合体がＬ１を含まない場合は、式（Ｐ２）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
【００３８】
【化１６】
0006736278.tif 000017
【化１７】
0006736278.tif 000018
更に（ｄ１）および（ｄ２）は、上記（ｄ３）および（ｄ４）で表わすこともできる。
【００３９】
上記式（ｄ３）において、Ｒ２０１乃至Ｒ２１２は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＳＯ３Ｘ２４を表す。Ｘ２４は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ２５を表し、Ｒ２５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ２−ＳＯ３−、−ＲＥ２−ＳＯ３Ｘ２１を表す。ＲＤ２、ＲＥ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ２１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ２−ＳＯ３−、−ＲＧ２−ＳＯ３Ｘ２５、または、−ＲＦ２−ＣＯ２Ｘ２４を表す。Ｘ２４、Ｘ２５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ２、ＲＦ２、ＲＧ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ２が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。また、本色素骨格Ｄは、ＲＡ２を介して、式（Ｐ２）における、繰り返し単位の末端の炭素原子、または、リンカーＬ１に結合していても良い。ＲＢ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。＊はＬ１に結合する、または重合体がＬ１を含まない場合は、式（Ｐ２）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
上記式（ｄ４）において、Ｒ３０１乃至Ｒ３１２は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＳＯ３Ｘ３４を表す。Ｘ３４は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ３７は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨ又はＣＲ３５を表しＲ３５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ３７は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＤ３−ＳＯ３−、−ＲＥ３−ＳＯ３Ｘ３１を表す。ＲＤ３、ＲＥ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ３１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ３−ＳＯ３−、−ＲＧ３−ＳＯ３Ｘ３５、または、−ＲＦ３−ＣＯ２Ｘ３４を表す。Ｘ３４、Ｘ３５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＣ３、ＲＦ３、ＲＧ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ３が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。また、本色素骨格Ｄは、ＲＡ３を介して、式（Ｐ２）における、繰り返し単位の末端の炭素原子、または、リンカーＬ１に結合していても良い。ＲＢ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。＊はＬ１に結合する、または重合体がＬ１を含まない場合は、式（Ｐ２）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
【００４０】
本実施形態において、上記式（ｄ１）〜（ｄ４）の具体例として、下記式（ｄ１−１）乃至（ｄ１−６）が挙げられる。
【化１８】
0006736278.tif 000019
【００４１】
上記式（ｄ１−１）乃至（ｄ１−６）において、＊はＬ１またはＡに結合することを示し、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。
【００４２】
上記式（ｄ１−２）において、Ｙ−は塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンのいずれかである。
【００４３】
また、色素骨格Ｄの一例として下記式（ｄ２−１）〜（ｄ２−７）で表わされる近赤外色素が挙げられる。
【化１９】
0006736278.tif 000020
【化２０】
0006736278.tif 000021
【化２１】
0006736278.tif 000022
【化２２】
0006736278.tif 000023
【化２３】
0006736278.tif 000024
【化２４】
0006736278.tif 000025
【化２５】
0006736278.tif 000026
（ｄ２−１）〜（ｄ２−７）において＊はＬ１またはＡに結合することを示す。Ｒはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかに由来する陽イオンである。
【００４４】
（リンカー部位）
前記式（Ｐ２）中、Ｌ１およびＬ２はリンカーを表わす。
本実施形態において、リンカー部位であるＬ１は、主鎖Ａと色素骨格を、Ｌ２は、主鎖Ａと側鎖Ｂを共有結合により連結するリンカーである。
Ｌ１およびＬ２は、その一部に例えば、下記式（ｌ１）乃至（ｌ２１）のいずれかで表わされるものが挙げられる。下記式（ｌ１）乃至（ｌ２１）において＊は他の原子と結合することを示す。
【化２６】
0006736278.tif 000027
【化２７】
0006736278.tif 000028
【化２８】
0006736278.tif 000029
前記の化学構造の中で非対称のものについては、その方向はいずれでもよく、上に例示した化学構造の逆の並びであってもよい。
前記Ｌ１、Ｌ２の形成は、前記のＤ、ＡあるいはＢに、例えば、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボキシル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシ基、Ｎ−スルホスクシンイミジル基、Ｎ−マレイミドアルキル基、ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基、イソチオシアノ基、スルホン酸塩化物基、およびカルボン酸塩化物基等の反応性基を有するものを用い、結合反応を起す組合せで選ばれた前記反応性基の間で結合を生じさせることにより行うことができる。また、前記で生じた結合がシッフ塩基やカルボニル基を含む場合には、それらを還元して結合のさらなる安定化を図ることができる。
前記のＤ、ＡあるいはＢと前記反応性基とは直接結合していてもよいし、１つまたは複数の原子を介して結合していてもよい。具体的には、例えば１つまたは複数のメチレンを介して結合してもよい。
Ｌ１はホスホリルコリン含有ポリマーの末端に位置することが好ましい。
【００４５】
（末端）
上記式（ｐ２）において、Ｅは末端を表わし、特に限定されない。Ｅの例としては、官能基である。
本実施形態に係る重合体におけるＥとしての官能基としてはあらゆる基が含まれ、一例として、ハロゲン、アルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、アジド基、ジアミン、スクシニミジルエステル基、マレイミド基、スクシンイミド基を挙げることができる。ハロゲンの例としては、臭素や塩素である。また、Ｅとしての化合物の例として、低分子化合物、レポーター分子、標的結合性分子、他の重合体等を挙げることができる。低分子化合物の例としてゲフィチニブのような阻害薬が挙げられる。レポーター分子の例として、放射性信号、磁場信号、超音波信号、蛍光信号、光超音波信号などの物理的な信号を発生する分子、治療用薬剤である、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、色素、抗癌剤などを挙げられる。色素の例として蛍光性化合物、燐光性化合物、近赤外光吸収性化合物が挙げられる。標的結合性分子の例としては、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。Ｅとしての他の重合体の例としては、ポリエチレングリコールが挙げられるが、重合度は任意であり、エチレングリコールであってもよい。
【００４６】
（重合体の例）
本実施形態に係る重合体の例として、下記式（１）〜（７）で示される重合体が挙げられる。
【化２９】
0006736278.tif 000030
【化３０】
0006736278.tif 000031
【化３１】
0006736278.tif 000032
【化３２】
0006736278.tif 000033
【化３３】
0006736278.tif 000034
【化３４】
0006736278.tif 000035
【化３５】
0006736278.tif 000036
上記式（１）、〜（７）において、ｘはそれぞれ１以上の整数を示す。
【００４７】
（分子量（重合度））
本明細書において分子量は数平均分子量である。数平均分子量はプロトンＮＭＲ法やＧＰＣ法によって測定することができる。
以下、数平均分子量は単に分子量と記載することがある。また、以下の好ましい分子量の範囲はいずれもプロトンＮＭＲ法によって測定した分子量の範囲である。
本実施形態に係る重合体の分子量としては、５０００以上で１０００００以下であることが好ましい。分子量１０００００を超える重合体では、生体への投与の際に、その投与液の高い粘性が生体への負担になる場合があるからである。また分子量５０００以下では、サイズが小さくなる場合があり、速やかな腎排泄で血中滞留性が低くなり、その結果、腫瘍集積性が低くなる場合があるからである。
本実施形態に係る重合体の分子量としては、９０００以上で５００００以下であることが好ましい。本実施例で示すように、ＰＭＰＣの分子量が９０００以上であれば腫瘍への高い集積が見られるからである。さらに、ＰＭＰＣの分子量の増大に伴い、腫瘍集積の選択性が増大する。例えば、分子量５００００のＰＭＰＣを骨格とするＩＣＧ−ＰＭＰＣでは、１００００〜４００００の分子量のＰＭＰＣに比べて、より高い腫瘍選択性を示す。つまり、正常組織への集積が低い一方で、腫瘍へは高い集積を示すため、腫瘍選択性の観点では、分子量５００００の化合物が特に好ましい。また、腫瘍血液比の観点では、分子量が１６０００以上で２００００以下が特に好ましい。血液濃度が比較的低いにもかかわらず腫瘍集積性が高いためである。
【００４８】
また、本実施形態に係るポリマーは、重合度が１０以上であることが好ましく、３０以上であることがさらに好ましい。重合度が３０以上であれば、該ポリマーの分子量はおよそ１００００になり、ＥＰＲ効果による腫瘍集積性を示しやすいために有利である。
【００４９】
本実施形態に係る重合体の重合度は、３５０以下であることが好ましい。重合度が３５０以下であれば十分に粘性が低く、本実施形態に係る重合体を生体内に投与する場合に好ましい。したがって、本実施形態に係る重合体の重合度は、好ましくは３０以上３５０以下である。
【００５０】
（モノマー）
本実施形態に係る重合体を合成するためのモノマーの一例である、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣと略すことがある）は、例えば、下記の反応式１に従って合成することができる。
反応式１
【化３６】
0006736278.tif 000037
【００５１】
モノマーの重合は、モノマーの種類に応じて従来公知の重合方法を適宜選択することができる。例えば、モノマーがビニルモノマーである場合、重合方法としてリビングラジカル重合法、とりわけ原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ；Ａｔｏｍ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）法を挙げることができる。ＡＴＲＰ法は簡便であり、分子量制御が容易であることから好ましい。モノマーがエステルやアミドである場合、重合方法として縮合重合を挙げることができる。縮合重合の際、縮合剤を適宜使用しても良い。モノマーがラクチド、ラクトン、ラクタムである場合、重合方法として開環重合を挙げることができる。開環重合の際、触媒を適宜使用しても良い。
【００５２】
（原子移動ラジカル重合）
ＡＴＲＰ法は、反応性の高い炭素−ハロゲン結合を有する重合開始剤と、重合触媒となる遷移金属錯体とを用いてビニルモノマーを重合させる方法である。
本発明に係るホスホリルコリン含有ポリマーの一例である重合体のＰＭＰＣ骨格は、下記の反応式２に示すように、原子移動ラジカル重合によって得ることができる。
反応式２
【化３７】
0006736278.tif 000038
【００５３】
ビニルモノマーを原子移動ラジカル重合する場合、例えば、下記式（ｉ１）から（ｉ１２）で表わされるいずれかの重合開始剤を用いることができる。
【化３８】
0006736278.tif 000039
【００５４】
これらの重合開始剤は各種官能基を含んでいてもよい。たとえば、上記式（ｉ１）〜（ｉ３）の開始剤を用いた場合では、ポリマーの末端に保護されたマレイミド基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を導入することができる。上記式（ｉ１２）の開始剤を用いた場合では、ポリマーの末端に保護されたアミノ基を導入することが出来る。これらの官能基を介して、近赤外色素を結合させることで、本実施形態に係る重合体を得られる。
【００５５】
不活性ガス下、ビニルモノマーを含む反応溶媒中に重合開始剤、遷移金属錯体を添加し、原子移動ラジカル重合を行う。重合はリビング的に進行し、分子量分布の狭いポリマーを得ることができる。
【００５６】
反応溶媒としては、特に限定されないが、例えば、水、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル等を使用することができる。これらは単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
【００５７】
使用する遷移金属錯体はハロゲン化金属とリガンドからなる。ハロゲン化金属の金属種としては、原子番号２２番のＴｉから３０番のＺｎまでの遷移金属が好ましく、特にＦｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕが好ましい。その中でも、塩化第一銅、臭化第一銅が好ましい。
【００５８】
リガンドとしては、ハロゲン化金属に配位可能であれば特に限定されないが、例えば、２，２’−ビピリジル、トリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン、エチレンジアミン、ジメチルグリオキシム、１，４，８，１１−テトラメチル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン、１，１０−フェナントロリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタメチルジエチレントリアミン、ヘキサメチル（２−アミノエチル）アミン等を使用することができる。
【００５９】
重合温度は、０℃から８０℃の範囲であり、好ましくは１０℃から６０℃の範囲である。
【００６０】
（重合体の調製方法）
本実施形態において、近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーの調製方法は、近赤外色素とホスホリルコリン含有ポリマーをリンカー分子を介して、公知のカップリング反応によって結合することによって調製する。一例としては、ホスホリルコリン含有ポリマーの末端のマレイミド基に、リンカー分子のシステインを結合させ、その後、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基を有する近赤外色素をカップリングさせる。前記のようなカップリング反応により得られた近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーは、限外濾過法、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法等の公知の精製法により洗浄、精製することができる。
【００６１】
（光音響イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光音響イメージング（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ、以下ＰＡＩと略すことがある）用造影剤は、上記重合体と分散媒とを有する。なお、ＰＡＩは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。分散媒として例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖水溶液が挙げられる。また本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、必要に応じて薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤などを有していても良い。
【００６２】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、上記の分散媒に予め分散させておいてもよいし、キットにしておき、生体内に投与する前に分散媒に分散させて使用してもよい。
【００６３】
本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、粒子を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波を正常部位から発せられる音響波よりも大きくすることができる。したがって、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は腫瘍の造影に用いられることが好ましい。
【００６４】
また、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤はリンパ節、リンパ節の造影に用いることもできる。さらに、センチネルリンパ節（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ、以下ＳＬＮと略すことがある）の造影剤に用いることが特に好ましい。これは色素単独と比べてもサイズが大きいためにセンチネルリンパ節により留まりやすく集積性が向上することが期待されるためである。
【００６５】
（光音響イメージング方法）
生体内に投与された本実施形態に係る重合体を、ＰＡＴ装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーを検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本実施形態に係る光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本実施形態に係る近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーが投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｂ）前記検体内に存在する前記近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーから発生する音響波を検出する工程
また、本実施形態に係る近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーは、前記（ｂ）で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなもの構わないし、２次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
【００６６】
上記（ａ）の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係る近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーを投与された検体を用いることができる。また、上記（ｂ）の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係る近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーから発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。
【００６７】
上記（ｂ）の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４  ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
【００６８】
音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販のＰＡＴ装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ  Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。
【００６９】
本実施形態に係る近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーを用いたイメージング方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍、リンパ節あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。
【実施例】
【００７０】
以下、本発明の実施例に係る重合体を作製する際に用いる具体的な試薬や反応条件等を挙げているが、これらの試薬や反応条件等は、変更が可能であり、それらの変更は本発明の範囲に包摂されるものとする。したがって以下の実施例は、本発明の理解を助けることが目的であり、本発明の範囲を何ら制限するものではない。以下で説明する各実施例において数平均分子量の測定方法は、プロトンＮＭＲ法である。
【００７１】
（実施例１）ＰＭＰＣ（式（４０））の合成
式（４０）で表わされるＰＭＰＣは、反応式５に従って合成した。
反応式５
【化３９】
0006736278.tif 000040
【００７２】
以下の操作はグローブボックス内（窒素雰囲気下）で行った。２０ｍＬバイアルに式（３８）で表わされるＭＰＣ（東京化成社製）（４９９．８ｍｇ，１．６９４ｍｍｏｌ）と脱水メタノール（和光純薬工業社製）２．５ｍＬを加えた。式（１１）で表わされる重合開始剤（１４．５ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）、ＣｕＢｒ（５．７４ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ、和光純薬工業社製）と２，２’−ビピリジン（１２．４ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ，ナカライテスク社製）の０．５ｍＬ脱水メタノール溶液をそれぞれ調製した。この溶液を式（３８）を含む反応溶液に加え、６４時間室温で撹拌した。溶液は赤褐色を呈した。反応終了後、溶液を薄いシリカゲル層に通してＣｕを除去し（展開液：メタノール）、溶出液をエバポレーターで濃縮した。残渣にメタノールと脱水ＴＨＦを加え析出した沈殿物をろ取し、脱水ＴＨＦで洗浄後、減圧乾燥した。粗生成物をＧＰＣ（使用カラム：ＳＢ−８０３ＨＱ，展開溶媒：超純水，送液速度：１ｍＬ／ｍｉｎ，カラム温度：４０℃）で分取・精製し、凍結乾燥後、式（４０）で表わされるＰＭＰＣ（白色固体、Ｍｎ＝１８０００）を得た。単離収率７５％。式（４０）で表わされるポリマーをＰＭＰＣ−１８ｋと略す場合がある。
【００７３】
式（４０）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータを以下に示した。
１Ｈ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（４００  ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ／ｐｐｍ＝６．５５（ｍ，ｆｕｒａｎ），５．２１（ｍ，ｆｕｒａｎ），４．１９（ｂｒ，−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＰ−，−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｏ−），４．１２（ｂｒ，−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＰ−），３．９８（ｂｒ，ＰＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ−，  −ＮＣＨ２ＣＨ２Ｏ−），３．５８（ｂｒ，−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３），３．１４（ｓ，−Ｎ（ＣＨ３）３），２．３９−２．５０（−ＣＨＣＯＮ），１．８２（ｂｒ，−ＣＨ２−，ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ，−Ｃ（ＣＨ３）２），０．８１−０．９８（ｂｒ，−ＣＨ３，ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ）．
【００７４】
（実施例２）数平均分子量の異なるＰＭＰＣ（ＰＭＰＣ−１８ｋ、ＰＭＰＣ−４６ｋ）の合成
重合開始剤（式（１１））に対するモノマー（式（３８））の等量を変化させ、実施例１と同様の操作を行って、数平均分子量（Ｍｎ）が１８０００のＰＭＰＣ−１８ｋ、Ｍｎ＝４６０００のＰＭＰＣ−４６ｋを得た。
【００７５】
（実施例３）近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーの調製
（ポリマー末端の保護基のＲｅｔｒｏ−Ｄｉｅｌｓ  Ａｌｄｅｒ反応）
実施例１と２で得られたＰＭＰＣ−１１ｋ、ＰＭＰＣ−１８ｋ、ならびにＰＭＰＣ−４６ｋを、それぞれガラス製反応管に入れ、１２５℃、真空下で５時間加熱することで、式（４１）で表わされるマレイミド末端ＰＭＰＣを得た。１Ｈ  ＮＭＲを測定した結果、フラン環のピークが消失し、マレイミド基由来の６．８５ｐｐｍのシグナルを観測した。
【化４０】
0006736278.tif 000041
【００７６】
（ＩＣＧ誘導体のカップリング反応）
１．５ｍＬ  Ｍｉｃｒｏ−ｔｕｂｅに、式（４１）で表されるマレイミド末端ＰＭＰＣを入れ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶解させた。次に、ＰＭＰＣのマレイミド基に対して２０等量のＬ−システインを加えて室温で４時間、ゆっくり混合した。反応液を  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ限外ろ過フィルターチューブ（分画分子量１０Ｋ）に移し、２０分遠心（１４０００ｇ）、濃縮した。濃縮溶液に１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）を加え、再度２０分遠心（１４０００ｇ）した。この操作を２回繰り返して、溶媒を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）に置換した。
【化４１】
0006736278.tif 000042
【００７７】
次に、このＰＭＰＣ水溶液に、ＰＭＰＣのマレイミド基に対して、１．５等量の近赤外色素ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃｏｄｅ：Ｉ２５４、上記式（４２）で示される化合物。以後ＩＣＧ誘導体と略すことがある。）を加えた。ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（ＩＣＧ誘導体）の入手元は、特に記載しない場合は以下同じである。
ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのストック溶液はＤＭＳＯ溶液として調製された。具体的には、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕの１ｍｇ（１．２５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ  １００μＬで溶解させたものを用いた。
【００７８】
ＰＭＰＣとＩＣＧ誘導体のカップリング反応は、遮光下、室温で２４時間回転撹拌した。その後、０．２２μｍシリンジフィルターで反応溶液をろ過し、ＩＣＧ誘導体が結合したＰＭＰＣを得た。ＰＭＰＣ−１１ｋ、ＰＭＰＣ−１８ｋ、ならびにＰＭＰＣ−４６ｋそれぞれに対してＩＣＧ誘導体のカップリング反応を行った。得られた近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーをそれぞれ、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１１ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）、ならびにＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４６ｋ）と略すことがある。
【００７９】
得られたＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１１ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）、ならびにＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４６ｋ）の水溶液の吸収スペクトル測定の結果、それぞれ７８８ｎｍ、７８９ｎｍ、ならびに７８８ｎｍに最大吸収波長を有することがわかった。
【００８０】
（親水性近赤外色素のカップリング反応）
前記ＩＣＧ誘導体のカップリング反応と同様にして、近赤外シアニン色素ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）をＰＭＰＣにカップリングさせた。この反応のために、ＰＭＰＣ−１１ｋとＰＭＰＣ−１８ｋの２種類を用いた。こられの得られた化合物をそれぞれ、ＩＲＤ−ＰＭＰＣ（１１ｋ）、ならびにＩＲＤ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）と略すことがある。
【００８１】
得られた、ＩＲＤ−ＰＭＰＣ（１１ｋ）、ならびにＩＲＤ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）の水溶液の吸収スペクトル測定の結果、それぞれ７７５ｎｍ、ならびに７７５ｎｍに最大吸収波長を有することがわかった。
【００８２】
（比較例１）近赤外色素が結合したポリエチレングリコールの調製
モノアミン直鎖状ＰＥＧ  ＭＥ−１００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ１００００）、モノアミン直鎖状ＰＥＧ  ＭＥ−２００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ２００００）、ならびにモノアミン直鎖状ＰＥＧ  ＭＥ−４００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ４００００）をそれぞれ、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で溶解させＮＨ２濃度を０．６２５ｍＭとした。一方で、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ１ｍｇ（１．２５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ１００μｌで溶解させた。ＰＥＧの炭酸緩衝液（４００μｌ）に、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのＤＭＳＯ溶液２０μｌを加え、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとＰＥＧの反応比１で反応させた。遮光下、室温で２４時間回転撹拌した後、０．２２μｍシリンジフィルターで反応溶液をろ過し、分子量の異なるＰＥＧとＩＣＧ誘導体の結合体を得た。以後、ＩＣＧ誘導体が結合したＰＥＧ分子量１００００のものをＩＣＧ−ＰＥＧ（１０ｋ）、ＰＥＧ分子量２００００のものをＩＣＧ−ＰＥＧ（２０ｋ）、ならびにＰＥＧ分子量４００００のものをＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）と略すことがある。
後述するように、本発明の近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーと同じ方法で、ＩＣＧ−ＰＥＧ（１０ｋ）、ＩＣＧ−ＰＥＧ（２０ｋ）、ならびにＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）の腫瘍集積量と血液中の色素量を定量した。
【００８３】
（比較例２）近赤外色素の調製
ポリマーを結合していない近赤外色素の性能を比較するため、ＩＣＧ誘導体とＩＲＤｙｅ８００ＣＷの活性基の不活化を行った。比較例１と同様にして、グリシンのＨＥＰＥＳ緩衝液（４００μｌ）に、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのＤＭＳＯ溶液２０μｌを加え、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとグリシンの反応比１で反応させた。遮光下、室温で２４時間回転撹拌した後、０．２２μｍシリンジフィルターで反応溶液をろ過し、グリシンで不活化されたＩＣＧ誘導体を得た。同様にして、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷについてもグリシンで不活化したものを得た。以後、これらをＩＣＧ−Ｇ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−Ｇと略すことがある。後述するように、本発明の近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーと同じ方法で、ＩＣＧ−Ｇ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−Ｇの腫瘍集積量と血液中の色素量を定量した。
【００８４】
（実施例４）蛍光イメージングによる腫瘍造影能評価
上記実施例３で得られた近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーの腫瘍造影能を担癌マウスを用いた蛍光イメージングにより評価した。蛍光イメージング実験においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  Ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約１週間前に１×１０６個のｃｏｌｏｎ２６マウス腸癌細胞（理研）を、マウスの肩と大腿部に皮下注射した。
【００８５】
ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１１ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）、ＩＲＤ−ＰＭＰＣ（１１ｋ）、ならびにＩＲＤ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）を投与した担癌マウスの全身蛍光像を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、投与２４時間後にマウスの明視野像と蛍光像を取得した。ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１１ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）、ＩＲＤ−ＰＭＰＣ（１１ｋ）、ならびにＩＲＤ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）の投与量はマウス当たり、色素量として、それぞれ、２０、５、１、３ｎｍｏｌであり、１００μＬのＰＢＳ溶液としてマウス尾静脈に注射した。比較のために、比較例１、２で得られたＩＣＧ−ＰＥＧ（１０ｋ）、ＩＣＧ−ＰＥＧ（２０ｋ）、ならびにＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）、ＩＣＧ−Ｇ、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ−Ｇについても同様に評価した。比較のためのこれらの投与量はマウス当たり、色素量として、１３ｎｍｏｌであり、１００μＬのＰＢＳ溶液としてマウス尾静脈に注射した。
【００８６】
図１は本発明の化合物の投与後２４時間目のマウスの蛍光イメージの代表的な例である。このマウスにはＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）が投与された。図１中、黒矢印で示される２か所の腫瘍部位（肩と大腿部）での強い蛍光信号が認められた。一方で、腫瘍以外の組織からの強い蛍光信号は見られなかった。
【００８７】
腫瘍造影能を評価するために、図１で示されるような蛍光イメージングデータから、腫瘍部位（計測面積０．５×０．５ｃｍ）の蛍光強度と足の付け根の蛍光強度（正常部位として選択、計測面積０．５×０．５ｃｍ）を定量化した。これらの比、つまり腫瘍部位の蛍光強度の値を正常部蛍光強度の値で割った値をＳＮＲ（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）として数値化した。ＳＮＲは、それぞれの化合物の腫瘍造影能を示すパラメータであり、ＳＮＲが高いほど腫瘍の造影剤として有効であることになる。表１に各化合物のＳＮＲを示す。本発明の近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーのＳＮＲは１．９以上であり、比較例の化合物に比べても高かった。この結果より、本発明の実施例に係る、近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーは、腫瘍造影能に優れていることが示された。
【００８８】
【表１】
0006736278.tif 000043
【００８９】
（実施例５）化合物の腫瘍集積性と血中残存率の評価
実施例４で実施した腫瘍造影実験のマウスの腫瘍中色素量と血中色素量を定量することで、化合物の腫瘍集積性と血中残存率を評価した。
【００９０】
腫瘍集積性は、腫瘍１ｇあたりの色素投与量に対する腫瘍への色素移行率（％ＩＤ／ｇ）で表わした。まず、投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、腫瘍を外科的に摘出した。腫瘍をプラスチックチューブに移し、腫瘍重量に対し１．２５倍量の１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いて破砕した。次いで、腫瘍組織重量の２０．２５倍量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えた。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、前記の通り処理された腫瘍破砕溶液の蛍光強度を測定することで腫瘍中の色素量を測定した。
【００９１】
血中残存率は、血液１ｇ（比重を１として１ｍＬ）あたりの色素投与量に対する血液への色素移行率（％ＩＤ／ｇ）として表わした。投与２４時間後にマウス尾静脈から血液を採取し、プラスチックチューブ内で血液、１％Ｔｒｉｔｏｎ、ＤＭＳＯを２：９：９で混合した。ＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて、プラスチックチューブの状態で、前記の通り処理された血液溶液の蛍光強度を測定することで血中の色素量を測定した。
【００９２】
以上の測定より、腫瘍血中比を算出した。これは腫瘍集積性と血中残存率の比であり、この値が高いほど、腫瘍造影能が高いことを意味する。
【００９３】
結果を表２に示す。本発明の近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーの腫瘍集積性は１．１から９．７％ＩＤ／ｇであり、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）では最も高い腫瘍集積性９．７％ＩＤ／ｇを示した。本発明の実施例に係る、近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーの中でも、色素の違いで腫瘍集積性が変化した。つまり、ＩＣＧ−ＰＭＰＣの方がＩＲＤ−ＰＭＰＣに比べて、腫瘍集積性が高くなった。この結果は、ＩＣＧ誘導体は比較的会合しやすい性質を有しており、一方でＩＲＤｙｅ８００ＣＷはスルホン酸が多数導入されており、分散性の高い色素である。このような色素の性質の違いを反映している可能性がある。本発明の実施例に係る、ＩＣＧ−ＰＭＰＣは比較例のＩＣＧ−Ｇに比べ、十分な腫瘍集積性の増加が認められた。
【００９４】
驚くべきことに、本発明の実施例に係る、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ、ならびにＩＲＤ−ＰＭＰＣの腫瘍血中比は、比較例と比べ、高くなった。これは、本発明の実施例に係る、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ、ならびにＩＲＤ−ＰＭＰＣは、腫瘍集積性を示す一方で、血中残存率が低いためである。つまり、腫瘍の造影能が高いことを意味している。この結果は実施例４の蛍光イメージングのＳＮＲの値と傾向が一致している。比較例のＩＣＧ−ＰＥＧでは腫瘍集積性は高いが、血中残存率も高いため、腫瘍血中比は高くならない。以上の結果より、本発明の実施例に係る、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ、ならびにＩＲＤ−ＰＭＰＣは、高い感度、かつ、高い腫瘍集積性で腫瘍を光音響造影することが可能になるものと思われる。
【００９５】
【表２】
0006736278.tif 000044
【００９６】
（実施例６）近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーの調製（２）
実施例２で得られたＰＭＰＣ−１８ｋを、ガラス製ナスフラスコに入れ、１２５℃、真空下で５時間加熱することで、マレイミド末端ＰＭＰＣを得た。１Ｈ  ＮＭＲを測定した結果、フラン環のピークが消失し、マレイミド基由来の６．８５ｐｐｍのシグナルを観測した。
次に、得られたマレイミド末端ＰＭＰＣを１．５ｍＬ  Ｍｉｃｒｏ−ｔｕｂｅに入れ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で溶解させた。ＰＭＰＣのマレイミド基に対して２０等量のＬ−システインを加えて４℃で１６時間、ゆっくり撹拌した。反応液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ限外ろ過フィルターチューブ（分画分子量１０Ｋ）に移し、６０分遠心（２６００ｘｇ）、濃縮した。濃縮溶液に５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ８．２）を加え、再度６０分遠心（２６００ｘｇ）した。この操作を２回繰り返して、溶媒を５０ｍＭ  炭酸バッファー（ｐＨ８．２）に置換した。ここで得られたシステイン化ＰＭＰＣを以後、Ｃｙｓ−ＰＭＰＣと略す。
次に、このＣｙｓ−ＰＭＰＣ水溶液に、ＰＭＰＣのマレイミド基に対して、１．５等量のＩＣＧ誘導体を加えた。Ｃｙｓ−ＰＭＰＣとＩＣＧ誘導体のカップリング反応は、遮光下、室温で２４時間回転撹拌することで行った。その後、反応溶液を分画分子量３５００のポアサイズを有する透析チューブに移し、メタノールに対して透析を行うことで、反応溶液から未反応ＩＣＧ誘導体を除去した。その後、メタノールに置換された反応溶液をエバポレーターで乾固させたのち、緑色の固形物を水で溶解後、０．２２μｍシリンジフィルターで溶液をろ過することで、ＩＣＧ誘導体が結合したＰＭＰＣを得た。得られた近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーをＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２と略す。水中におけるＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２の吸収スペクトルを図２に示す。図２に示すように７８８ｎｍに最大吸収波長を有することがわかった。
ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２の水溶液の動的光散乱測定（測定装置：マルバーン社製ゼータサイザーナノ）を行った結果、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２は水中において、ナノ粒子を形成していることが示された。そのＺ平均粒子径は平均７５ナノメートルであった。多分散度指数（ＰＤＩ）は０．４であった。
【００９７】
（実施例７：光音響信号の測定）
実施例６で得られたＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２の水溶液の光音響信号を測定した。光音響信号の計測は、パルスレーザー光をサンプル水溶液に照射し、圧電素子を用いてサンプルから光音響信号を検出し、高速プリアンプで増幅後、デジタルオシロスコープで取得した。具体的な条件は以下の通りである。光源として、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）を用いた。レーザー波長は７９０ｎｍとした。エネルギー密度はおよそ１０から２０ｍＪ／ｃｍ２、パルス幅は約２０ナノ秒、パルス繰返し周波数は１０Ｈｚの条件とした。光音響信号を検出する圧電素子には、エレメント径１．２７ｃｍ、中心帯域１ＭＨｚの非収束型超音波トランスデューサー（Ｖ３０３、Ｐａｎａｍｅｔｒｉｃｓ−ＮＤＴ製）。測定容器としては、ポリスチレン製キュベットで、光路長０．１ｃｍ、サンプル容量は約２００μｌであった。水を満たしたガラス容器に前記の測定容器と圧電素子とを浸け、その間隔を２．５ｃｍとした。光音響信号強度を増幅する高速プリアンプは増幅度＋３０ｄＢの超音波プリアンプ（Ｍｏｄｅｌ５６８２、オリンパス製）を用いた。増幅された信号をデジタルオシロスコープ（ＤＰＯ４１０４、テクトロニクス製）に入力した。ガラス容器の外からパルスレーザー光を前記ポリスチレン製キュベットに照射した。この際に生じる散乱光の一部をフォトダイオードで検出し、デジタルオシロスコープにトリガー信号として入力した。デジタルオシロスコープを３２回平均表示モードとし、レーザーパルス照射３２回平均の光音響信号強度の測定を行った。
図３に、本発明の実施例に係るＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２水溶液の光音響信号強度の波形を示した。図３から明らかなように、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２は光音響信号を発することが示された。
【００９８】
（実施例８：ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２の体内動態評価）
実施例４と同様の方法で、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２の、腫瘍造影能を評価した。蛍光イメージングデータより、腫瘍部蛍光強度と正常部蛍光強度の比をＳＮＲ（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）として算出した結果、２．６であった。実施例４の結果と同様、比較例と比べて高いＳＮＲを示した。また、実施例５と同様の方法で、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２の腫瘍集積性を測定した結果、６．４％ＩＤ／ｇであった。
【００９９】
（実施例９：ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２による腫瘍の光音響イメージング）
実施例４に記載の方法で調製した担癌マウスに対してＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２を色素量４５ｎｍｏｌで投与し、市販のＰＡＴ装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ．Ｉｎｃ．製）を用いて、計測は投与前、投与１日後でそれぞれ実施した。計測波長は７９０ｎｍとした。図４（ａ）には、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２投与前にイメージングされた担癌マウスの光学写真、ならびに、白い四角の枠で示された光音響イメージング像（ＭＩＰ像）の重ね合わせ像を示した。図４（ａ）中、黒い点線で囲まれた領域に腫瘍がある。図４（ｂ）には、図４（ａ）で示されたものと同じ担癌マウスであり、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２投与１日後にイメージングされた、担癌マウスの光学写真、ならびに、白い四角の枠で示された光音響イメージング像（ＭＩＰ像）の重ね合わせ像を示した。図４から明らかなように、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１８ｋ）＃２投与前に比べて、その投与１日後において、腫瘍領域の光音響信号が増加していることがわかった。光音響信号強度解析の結果、投与前に比べ、投与後は２．９倍まで信号強度が増加していることがわかった。以上の結果より、ホスホリルコリンを側鎖として有するポリマーに近赤外波長領域に吸収を有する色素が結合した化合物は、光音響の腫瘍造影剤として機能することが示された。
【０１００】
（実施例１０：ＰＭＰＣ−Ｆｍｏｃの合成）
式（４４）で表わされるＰＭＰＣ−Ｆｍｏｃは、反応式６に従って合成した。
反応式６
【化４２】
0006736278.tif 000045
以下の操作はグローブボックス内（窒素雰囲気下）で行った。５ｍＬバイアルに式（３８）で表わされるＭＰＣ（東京化成社製）（４６９．４ｍｇ，１．５９ｍｍｏｌ）と脱水メタノール（和光純薬工業社製）２．０ｍＬを加えた。式（４３）で表わされる重合開始剤（１３．２ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ）、ＣｕＢｒ（３．３７ｍｇ，０．０２３ｍｍｏｌ、和光純薬工業社製）と２，２’−ビピリジン（７．３３ｍｇ，０．０４６ｍｍｏｌ，ナカライテスク社製）の０．１ｍＬ  脱水メタノール溶液をそれぞれ調製した。この溶液を式（３８）を含む反応溶液に加え、９６時間室温で撹拌した。溶液は赤褐色を呈した。反応終了後、溶液を薄いシリカゲル層に通してＣｕを除去し（展開液：メタノール）、溶出液をエバポレーターで濃縮した。残渣にメタノールと脱水ＴＨＦを加え析出した沈殿物をろ取し、脱水ＴＨＦで洗浄後、減圧乾燥した。粗生成物を超純水に溶解し、溶液を  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  限外ろ過フィルターチューブ（分画分子量３Ｋ）に移し、３０分遠心（５０００ｇ）、濃縮した。濃縮溶液に超純水を加え、再度３０分遠心（５０００ｇ）した。これを２回繰り返し、得られた残渣を凍結乾燥後、式（４４）で表わされるＰＭＰＣ−Ｆｍｏｃ  （白色固体、Ｍｎ＝５００００）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ／ｐｐｍ＝７．９２―７．６８（ｍ，９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌ），３．９８−４．１９（ｂｒ，−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＰ−，−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｏ−，−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＰ−，−ＰＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ−，−ＮＣＨ２ＣＨ２Ｏ−，−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−），３．５８（ｂｒ，−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３），３．１４（ｓ，−Ｎ（ＣＨ３）３），１．８２（ｂｒ，−ＣＨ２−，ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ，−Ｃ（ＣＨ３）２），０．８１−０．９８（ｂｒ，−ＣＨ３，ｍａｉｎ  ｃｈａｉｎ）．
【０１０１】
（実施例１１：ＰＭＰＣ−ＮＨ２の合成）
式（４５）で表わされる末端にアミノ基を有するＰＭＰＣ−ＮＨ２は、反応式７に従って合成した。
反応式７
【化４３】
0006736278.tif 000046
２０ｍＬバイアルに式（４４）で表わされるＰＭＰＣ−Ｆｍｏｃ（１０２．３ｍｇ，２．０μｍｏｌ），ＤＢＵ（４０μＬ）と脱水メタノール（和光純薬工業社製）４．０ｍＬを加え、室温で２４時間攪拌した。反応進行は、ニンヒドリン呈色法により確認した。反応終了後、反応溶液を超純水で希釈し、溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ限外ろ過フィルターチューブ（分画分子量１０Ｋ）に移し、３０分遠心（５０００ｇ）、濃縮した。濃縮溶液に超純水を加え、再度３０分遠心（５０００ｇ）した。これを２回繰り返し、得られた残渣を凍結乾燥後、式（４５）で表わされるＰＭＰＣ−ＮＨ２を定量的に得た。１Ｈ  ＮＭＲ測定により、９−フルオレニル環のピーク（７．９２−７．６８ｐｐｍ）の消失を確認した。
【０１０２】
（実施例１２：ＩＣＧ誘導体のカップリング反応）
１０ｍＬバイアルに式（４５）で表わされるＰＭＰＣ−ＮＨ２（８４ｍｇ，１．６８μｍｏｌ），近赤外色素ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（２．９ｍｇ，３．１９７μｍｏｌ）と脱水メタノール（和光純薬工業社製）２．０ｍＬを加え、室温遮光下で４８時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を超純水で希釈し、溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ限外ろ過フィルターチューブ（分画分子量１０Ｋ）に移し、３０分遠心（５０００ｇ）、濃縮した。濃縮溶液に超純水を加え、再度３０分遠心（５０００ｇ）した。これを２回繰り返し、得られた粗生成物をＰＤ−１０カラム（展開溶媒：超純水）により分取・精製し、凍結乾燥後、式（４６）で表わされるＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）を得た（緑色固体、Ｍｎ＝４３０００）。
１Ｈ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ／ｐｐｍ＝８．２１−８．２３（ｍ），７．９９−８．００（ｍ），７．６０−７．６６（ｍ），６．３２−６．６４（ｍ），４．３３（ｂｒ），４．２３（ｂｒ），４．０８（ｂｒ），３．７５（ｂｒ），３．３０（ｓ）１．８２−２．３６（ｂｒ），０．９６−１．３２（ｂｒ）．
【化４４】
0006736278.tif 000047
【０１０３】
ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）の水溶液（５０μＭ）の動的光散乱測定（測定装置：マルバーン社製ゼータサイザーナノ）を行った結果、Ｚ平均粒子径は平均１５７ナノメートルであった。
ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）のＧＰＣ（使用カラム：ＳＢ−８０３ＨＱ，展開溶媒：０．１Ｍ  ＮａＮＯ３，０．２％ＮａＮ３水溶液，送液速度：１ｍＬ／ｍｉｎ，カラム温度：４０℃）測定の結果、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）は７．４６ｍｉｎに溶出ピークが観測された。一方、ＰＭＰＣ−ＮＨ２およびＩＣＧは同様の条件下において７．５３ｍｉｎ、１０．１５ｍｉｎにそれぞれ溶出ピークが観測された（図５）。
【０１０４】
（実施例１３：ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）による腫瘍の光音響イメージング）
Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ−ｎｕ雌マウス（６週齢）の右肩部に、ｃｏｌｏｎ２６大腸癌細胞（０．８×１０６ｃｅｌｌ，５０％  Ｇｅｌｔｒｅｘ  生理食塩水溶液）を５０μＬ皮下注射して担癌マウスを作製した。担癌後８日目のマウスに、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）の生理食塩水溶液（２０ｎＭ）１００μＬを尾静脈から投与した。投与前および投与１日後の担癌マウス個体の光音響イメージング（検出波長７９７ｎｍおよび８５０ｎｍ）を行った。図６に、担癌マウスの光学写真と光音響イメージング画像の重ね合わせ像を示す。図６（ａ）に投与前の担癌マウスの光学写真と光音響画像の重ね合わせ像、図６（ｂ）に投与１日後の同一マウス個体の光学写真と光音響画像の重ね合わせ像を示した。図６中、白矢印は腫瘍の位置を示す。図６から明らかなように、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）投与前に比べて、その投与１日後において、腫瘍領域の光音響信号が増加していることがわかった。
【０１０５】
（実施例１４：分子量の異なるＩＣＧ−ＰＭＰＣの合成）
実施例１０〜１２と同様にして、式（４６）で表わされるＰＭＰＣの分子量の異なる化合物ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ならびにＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）を合成した（いずれも緑色固体）。ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）の数平均分子量は、それぞれ１２０００、４３０００、５００００であった。
【０１０６】
（実施例１５：分子量の異なるＩＣＧ−ＰＭＰＣの粒子径測定）
実施例１４で得られた、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）の水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の動的光散乱測定（測定装置：マルバーン社製ゼータサイザーナノ）を行った結果、Ｚ平均粒子径はそれぞれ平均、１０５、１２５、１３７ナノメートルであった。
【０１０７】
（実施例１６：比較例としてのＩＣＧ結合ＰＥＧ（ＰＥＧ分子量４万）の合成）
モノアミン直鎖状ＰＥＧ  ＭＥ−４００ＥＡ（日油社製，Ｍｗ４００００）（３５ｍｇ，０．８８μｍｏｌ）と近赤外色素ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（１ｍｇ，１．０８μｍｏｌ）と脱水メタノール（和光純薬工業社製）１．０ｍＬを加え、室温遮光下で４８時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を超純水で希釈し、溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ限外ろ過フィルターチューブ（分画分子量１０Ｋ）に移し、３０分遠心（５０００ｇ）、濃縮した。濃縮溶液に超純水を加え、再度３０分遠心（５０００ｇ）した。これを２回繰り返し、得られた粗生成物をＰＤ−１０カラム（展開溶媒：超純水）により分取・精製し、凍結乾燥後、ＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）を得た（緑色固体、Ｍｎ＝４００００）。
【０１０８】
（実施例１７：比較例としてのＩＣＧ結合ＰＥＧ（ＰＥＧ分子量１万２千）の合成）
実施例１６と同様の手法で、モノアミン直鎖状ＰＥＧ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ（日油社製，Ｍｗ１２０００）と近赤外色素ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕを反応させ、ＩＣＧ−ＰＥＧ（１２ｋ）を得た。
【０１０９】
（実施例１８：比較例としてのＩＣＧ結合ＰＥＧの粒子径測定）
実施例１６および１７で得られた化合物、ＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）、ＩＣＧ−ＰＥＧ（１２ｋ）の水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の動的光散乱測定（測定装置：マルバーン社製ゼータサイザーナノ）を行った結果、Ｚ平均粒子径はそれぞれ平均、１９４、１３２ナノメートルであった。ＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）、ＩＣＧ−ＰＥＧ（１２ｋ）のＰＢＳ緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ）でのＺ平均粒子径を同様に測定した結果、その平均粒子径はそれぞれ平均、１３６、１３０ナノメートルであった。
【０１１０】
（実施例１９：蛍光イメージングによる腫瘍造影能の評価）
実施例１４で得られたＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）、実施例１６で得られた比較例のＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）について、蛍光イメージングによる腫瘍造影能の評価を行った。
Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ−ｎｕ  雌マウス（６週齢）の右肩部に、ｃｏｌｏｎ  ２６  大腸癌細胞（１．０×１０６ｃｅｌｌ，５０％  Ｇｅｌｔｒｅｘ  生理食塩水溶液）を５０μＬ皮下注射して担癌マウスを作製した。担癌後７日目のマウスにＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）、ＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）の生理食塩水溶液（２００μＭ）１００μＬ（２０ｎｍｏｌ）を尾静脈から投与した。投与した担癌マウスの全身蛍光像を、ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＸＥＮＯＧＥＮ）を用いて、投与前、投与直後、投与０．５、１．５、２．５、２４、および４８時間後にマウスの明視野像と蛍光像を取得した。
【０１１１】
図７にＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）の投与前および投与後４８時間目のそれぞれのマウスの蛍光イメージングの例を示した。ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）では、丸で示される１か所の腫瘍部位（右肩）での強い蛍光信号が認められた。一方で、正常部位である左肩での蛍光信号は微弱であった。さらに、ＩＣＧ−ＰＭＰＣの分子量の増大とともに、腫瘍部位の蛍光信号が増強されている様子が観測された。
【０１１２】
図８にＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）、ＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）の投与前および投与後の４８時間目のそれぞれのマウスの蛍光イメージングの例を示した。腫瘍部位（右肩）は丸で示した。ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）を投与したマウスからは、投与後４８時間目には、丸で示される腫瘍部位から蛍光信号が観測される一方で、正常部位である左肩やマウス腹部での蛍光信号は微弱であった。一方で、ＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）を投与したマウスからは、投与後４８時間目には、丸で示される腫瘍部位に加えて正常部位である左肩やマウス腹部からの強い蛍光信号が観測された。
【０１１３】
腫瘍造影能を評価するために、実施例１９での図７および８で示されるような蛍光イメージングデータから、腫瘍部（右肩）、担癌していない左側臥位（正常部位として選択）、および肝臓（腹部）のＲＯＩの蛍光強度を定量し、投与前マウスの腫瘍部（右肩）の蛍光強度（自家蛍光強度として選択）を定量した値を引いて数値化した。ただし、正常部位の蛍光強度は左側臥位上の３点のＲＯＩの平均値として定量した。
【０１１４】
腫瘍造影能の指標として、差分強度とＳＮＲを用いた。ここで差分強度とは数値化した腫瘍部の蛍光強度から正常部位の蛍光強度を引いた数値を示す。本実施例１９でのＳＮＲは、上述のとおり、実施例１９における腫瘍部蛍光強度の値を正常部蛍光強度の値で割った値を示す。ＳＮＲは、それぞれの化合物の腫瘍造影能を示すパラメータであり、ＳＮＲが高いほど腫瘍の造影剤として有効であることになる。図９にＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）およびＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）の差分強度を示した。この結果より、ＩＣＧ−ＰＭＰＣは、分子量の増大とともに腫瘍造影能が向上することが示された。また、図１０に、これら化合物のＳＮＲを示した。この結果より、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）はＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）よりも腫瘍選択性が高いことが示された。
【０１１５】
以上のことから、本発明の実施例に係る、近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーは、近赤外色素が結合したポリエチレングリコールにくらべ、クリアランスが速く、腫瘍造影能に優れていることが示された。
【０１１６】
図１１に肝臓（腹部）のＲＯＩの定量結果を示す。ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）に比べＩＣＧ−ＰＥＧ（４０ｋ）のほうが肝臓部位からの蛍光シグナルが強く観測された。この結果から、近赤外色素が結合したホスホリルコリン含有ポリマーは、近赤外色素が結合したポリエチレングリコールにくらべ、肝臓集積性が低く、腫瘍造影能に優れていることが示された。
【０１１７】
（実施例２０：腫瘍の光音響イメージング）
実施例１４で得られたＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）、について、実施例１３に記載の腫瘍の光音響イメージングを行った。Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ−ｎｕ雌マウス（６週齢）の右肩部に、ｃｏｌｏｎ２６大腸癌細胞（１．０×１０６ｃｅｌｌ，５０％  Ｇｅｌｔｒｅｘ  生理食塩水溶液）を５０μＬ皮下注射して担癌マウスを作製した。担癌後７日目のマウスに、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）の生理食塩水溶液（２００μＭ）２００μＬ（４０ｎｍｏｌ）を尾静脈から投与した。投与前および投与１日後の担癌マウス個体の光音響イメージング（検出波長７９７ｎｍおよび８５０ｎｍ）を行った。図１２に、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）を投与した担癌マウスの光学写真と光音響イメージング画像の重ね合わせ像を示す。図１２（ａ）に投与前の担癌マウスの光学写真と光音響画像の重ね合わせ像、図１２（ｂ）に投与２日後の同一マウス個体の光学写真と光音響画像の重ね合わせ像を示した。図１２中、矢印は腫瘍の位置を示す。図１２から明らかなように、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）は投与前に比べて、その投与２日後において、腫瘍領域の光音響信号が増加しており、腫瘍を造影することが可能であることがわかった。
【０１１８】
図１３に、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（１２ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４３ｋ）、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）を投与した担癌マウス腫瘍領域の光音響イメージング画像を示す。図１３に投与前の担癌マウスの光音響画像、および投与２日後の同一マウス個体の光音響画像を示した。図１３から明らかなように、ＩＣＧ−ＰＭＰＣのＰＭＰＣ分子量の増大とともに、腫瘍部位の光音響信号が増強されている様子が観測された。
【０１１９】
（実施例２１：ＩＣＧ−ＰＭＰＣの腫瘍内局在評価）
実施例２０で実施した担癌マウスの摘出腫瘍を光音響イメージングすることにより、ＩＣＧ−ＰＭＰＣの腫瘍内局在を評価した。実施例２０で得られたＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）を投与した担癌マウスを投与４８時間目にソムノペンチルで安楽死させた後、腫瘍を外科的に摘出した。摘出した腫瘍の光音響イメージング（検出波長７９７ｎｍおよび８５０ｎｍ）を行った。図１４に摘出した腫瘍の光音響イメージング画像を示す。腫瘍部位を点線で示した。図１４から明らかなように、腫瘍に集積したＩＣＧ−ＰＭＰＣ（５０ｋ）は腫瘍表面に局在することがわかった。
【０１２０】
（実施例２２：Ｓｕｌｆｏ−Ｃｙａｎｉｎｅ７  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒのカップリング反応）
５ｍＬバイアルに上記式（４５）で表わされるＰＭＰＣ−ＮＨ２（９６．５ｍｇ，１．６４μｍｏｌ），近赤外色素Ｓｕｌｆｏ−Ｃｙａｎｉｎｅ７  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ社製）（３．７ｍｇ，４．５μｍｏｌ）と脱水メタノール（和光純薬工業社製）１．０ｍＬを加え、室温遮光下で５０時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を超純水で希釈し、溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ限外ろ過フィルターチューブ（分画分子量１０Ｋ）に移し、３０分遠心（５０００ｇ）、濃縮した。濃縮溶液に超純水を加え、再度３０分遠心（５０００ｇ）した。これを２回繰り返し、得られた粗生成物をＰＤ−１０カラム（展開溶媒：超純水）により分取・精製し、凍結乾燥後、下記式（４７）で表わされるＣｙ７−ＰＭＰＣを得た（緑色固体、Ｍｎ＝５８０００）。
１Ｈ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ／ｐｐｍ＝７．７５−７．９１（ｍ），７．５０−７．５７（ｍ），６．１９−６．２６（ｍ），４．５６−４．５９（ｍ），４．３２（ｂｒ），４．２１（ｂｒ），４．０７（ｂｒ），３．７４（ｂｒ），３．１６（ｓ）１．７５−２．１２（ｂｒ），０．８２−１．１８（ｂｒ）．
【化４５】
0006736278.tif 000048
【０１２１】
（実施例２３：ＩＲＤｙｅ（登録商標）  ７００ＤＸ  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒのカップリング反応）
５ｍＬバイアルに上記式（４５）で表わされるＰＭＰＣ−ＮＨ２（６７．４ｍｇ，１．１４μｍｏｌ），近赤外色素であるＩＲＤｙｅ（登録商標）  ７００ＤＸ  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）（３．７ｍｇ，４．５μｍｏｌ）と脱水メタノール（和光純薬工業社製）１．０ｍＬを加え、室温遮光下で６８時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を超純水で希釈し、溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ限外ろ過フィルターチューブ（分画分子量１０Ｋ）に移し、３０分遠心（５０００ｇ）、濃縮した。濃縮溶液に超純水を加え、再度３０分遠心（５０００ｇ）した。これを２回繰り返し、得られた粗生成物をＰＤ−１０カラム（展開溶媒：超純水）により分取・精製し、凍結乾燥後、下記式（４８）で表わされる７００ＤＸ−ＰＭＰＣを得た（緑色固体、Ｍｎ＝５７０００）。
１Ｈ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ／ｐｐｍ＝９．７４−９．７９（ｂｒ），９．６０−９．６３（ｍ），９．４０−９．４４（ｍ），８．４４−８．５４（ｍ），８．０５−８．０９（ｍ），４．３３（ｂｒ），４．２２（ｂｒ），４．０７（ｂｒ），３．７４（ｂｒ），３．３２（ｓ）１．７５−２．１２（ｂｒ），０．８１−１．２１（ｂｒ）．
【化４６】
0006736278.tif 000049
【０１２２】
（実施例２４：ＩＲＤｙｅ（登録商標）  ８００ＣＷ  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒのカップリング反応）
５ｍＬバイアルに上記式（４５）で表わされるＰＭＰＣ−ＮＨ２（２９．６ｍｇ，０．５０μｍｏｌ），近赤外色素であるＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）（１．０ｍｇ，０．８６μｍｏｌ）と脱水メタノール（和光純薬工業社製）１．０ｍＬを加え、室温遮光下で５３時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を超純水で希釈し、溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ限外ろ過フィルターチューブ（分画分子量１０Ｋ）に移し、２０分遠心（５０００ｇ）、濃縮した。濃縮溶液に超純水を加え、再度２０分遠心（５０００ｇ）した。これを２回繰り返し、得られた粗生成物をＰＤ−１０カラム（展開溶媒：超純水）により分取・精製し、凍結乾燥後、下記式（４９）で表わされる８００ＣＷ−ＰＭＰＣを得た（緑色固体、Ｍｎ＝５７０００）。
１Ｈ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ／ｐｐｍ＝７．９２−８．０３（ｍ），７．７７−７．８８（ｍ），７．３５−７．４１（ｍ），７．２５−７．３３（ｍ），７．１７−７．２２（ｍ）, ６．２７−６．３３（ｍ），６．１５−６．２３（ｍ），４．３３（ｂｒ），４．２２（ｂｒ），４．０７（ｂｒ），３．７４（ｂｒ），３．３０（ｓ）１．７２−２．１２（ｂｒ），０．８４−１．２２（ｂｒ）．
【化４７】
0006736278.tif 000050
【０１２３】
（実施例２５：ＩＲＤｙｅ（登録商標）  ８００ＲＳ  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒのカップリング反応）
５ｍＬバイアルに上記式（４５）で表わされるＰＭＰＣ−ＮＨ２（６０．５ｍｇ，１．０３μｍｏｌ），近赤外色素ＩＲＤｙｅ（登録商標）  ８００ＲＳ  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）（２．１ｍｇ，２．２μｍｏｌ）と脱水メタノール（和光純薬工業社製）１．０ｍＬを加え、室温遮光下で５１時間攪拌した。反応終了後、反応溶液を超純水で希釈し、溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ限外ろ過フィルターチューブ（分画分子量１０Ｋ）に移し、３０分遠心（５０００ｇ）、濃縮した。濃縮溶液に超純水を加え、再度２０分遠心（５０００ｇ）した。これを３回繰り返し、得られた粗生成物をＰＤ−１０カラム（展開溶媒：超純水）により分取・精製し、凍結乾燥後、下記式（５０）で表わされる８００ＲＳ−ＰＭＰＣを得た（緑色固体、Ｍｎ＝５７０００）。
１Ｈ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（５００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δ／ｐｐｍ＝７．８８−８．００（ｍ），７．８３−７．８７（ｍ），７．１４−７．４２（ｍ），６．２１−６．２６（ｍ），６．１１−６．１５（ｍ），４．３３（ｂｒ），４．２２（ｂｒ），４．０７（ｂｒ），３．７４（ｂｒ），３．３０（ｓ）１．７５−２．１３（ｂｒ），０．８５−１．２２（ｂｒ）．
【化４８】
0006736278.tif 000051
【０１２４】
（実施例２６：色素結合型ＰＭＰＣの粒子径測定）
実施例２２、２３、２４、２５で得られた、上記式（４７）で表わされるＣｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、上記式（４８）で表わされる７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、上記式（４９）で表わされる８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、上記式（５０）で表わされる８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）の水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）の動的光散乱測定（測定装置：マルバーン社製ゼータサイザーナノ）を試みたが、測定不可能であった。一方、塩酸水溶液中（ｐＨ  ０．４６）Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）の動的光散乱測定を行った結果、Ｚ平均粒子径は平均１２．３ｎｍであった。
【０１２５】
（実施例２７：色素結合型ＰＭＰＣの吸収スペクトル測定）
実施例２２、２３、２４、２５で得られた、上記式（４７）で表わされるＣｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、上記式（４８）で表わされる７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、上記式（４９）で表わされる８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、上記式（５０）で表わされる８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）の水溶液（２μＭ）の吸収スペクトル測定（測定装置：株式会社日立製作所製  Ｕ−３０１０  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）の結果、それぞれ７５３ｎｍ、６８９ｎｍ、７７７ｎｍ、７７１ｎｍに最大吸収波長を有することがわかった。
【０１２６】
（実施例２８：色素結合型ＰＭＰＣの蛍光イメージングによる腫瘍造影能の評価）
実施例２２、２３、２４、２５で得られた、上記式（４７）で表わされるＣｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、上記式（４８）で表わされる７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、上記式（４９）で表わされる８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、上記式（５０）で表わされる８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、ならびに実施例１２に記載の式（４６）で表わされる分子量が４８ｋのＩＣＧ−ＰＭＰＣ（以後、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４８ｋ）と略す）について、実施例４の記載の方法に従って、蛍光イメージングによる腫瘍造影能を評価した。各化合物の投与量はマウス当たり、色素量として、５０ｎｍｏｌとして、約１００μＬのＰＢＳ溶液としてマウス尾静脈に注射した。実施例４に記載の方法に従って、本発明の色素結合型ＰＭＰＣの投与後２４時間目のマウスの蛍光イメージから、腫瘍部位と正常部位の蛍光強度を定量化した。蛍光イメージングにおいて、７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）では、励起フィルター６７５ｎｍ、蛍光フィルター７２０ｎｍを、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）では、励起フィルター７４５ｎｍ、蛍光フィルター８００ｎｍを、ＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４８ｋ）では、励起フィルター７４５ｎｍ、蛍光フィルター８４０ｎｍを使用した。
【０１２７】
図１５に、各色素結合型ＰＭＰＣの投与後２４時間目の担癌マウスの近赤外蛍光像と明視野像を重ね合わせた図の一例を示した。図１５では、同じマウスの腫瘍側と腹側を示した。腫瘍側の画像中の白矢印は腫瘍部位を示している。全ての色素結合型ＰＭＰＣにより、腫瘍が蛍光で造影できた。また、腹側の画像から明らかなように、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）ならびに７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）では、膀胱からの蛍光が認められるため、これらの色素結合型ＰＭＰＣの腎排泄が示唆された。
【０１２８】
表３に、各色素結合型ＰＭＰＣの腫瘍造影能の指標であるＳＮＲを示す。全ての色素結合型ＰＭＰＣにおいて、ＳＮＲは１．７以上であり、腫瘍造影が可能であった。特に、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）ならびに８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）では、２．０以上であり、腫瘍造影能に優れている色素結合型ＰＭＰＣであることが示された。
【０１２９】
【表３】
0006736278.tif 000052
【０１３０】
（実施例２９：色素結合型ＰＭＰＣの蛍光イメージングによる腫瘍肝臓比の評価）
実施例２８で得られた蛍光イメージングデータから、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、ならびにＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４８ｋ）の腫瘍肝臓比（Ｔｕｍｏｒ／Ｌｉｖｅｒ）を算出した。腫瘍肝臓比は、腫瘍の蛍光強度と肝臓の蛍光強度（計測面積：０．２ｃｍ２）の比で表わされ、色素結合型ＰＭＰＣの腫瘍選択性の指標の一つである。
【０１３１】
表４に、各色素結合型ＰＭＰＣの腫瘍肝臓比を示す。全ての色素結合型ＰＭＰＣにおいて、腫瘍肝臓比は１．８以上であり、高い値を示した。特に、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）では、２．９であり、これらの色素結合型ＰＭＰＣの中で最も高い値を示した。
【０１３２】
【表４】
0006736278.tif 000053
【０１３３】
（実施例３０：色素結合型ＰＭＰＣの腫瘍集積性と血中残存率の評価）
実施例２８で実施した腫瘍造影実験のマウスの腫瘍中色素量と血中色素量を定量し、Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、ならびにＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４８ｋ）の腫瘍集積性、血中残存率、ならびに腫瘍血中比を、実施例５に記載の方法に従って、評価した。
【０１３４】
結果を表５に示す。本発明の色素結合型ＰＭＰＣは、高い腫瘍集積性を示し、特に７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）においては、高い値を示した。本発明の実施例に係る、色素結合型ＰＭＰＣは、結合させる色素の違いで体内動態が変化することがわかった。色素の親水性、疎水性がその体内動態に影響するものと考えられる。以上の結果より、本発明の実施例に係る、色素結合型ＰＭＰＣは、色素種やポリマーの分子量によって機能制御することが可能であり、診断目的に応じて、その実施形態を最適化できることが示された。
【０１３５】
【表５】
0006736278.tif 000054
【０１３６】
（実施例３１：色素結合型ＰＭＰＣの体内分布の評価）
色素結合型ＰＭＰＣの体内分布を調べるために、実施例２８で実施した腫瘍造影実験のマウスの組織を摘出し、実施例３０で摘出した腫瘍組織と合わせて、その蛍光量を測定した。具体的には、各組織の規格化蛍光強度を測定した。ここで規格化蛍光強度とは、蛍光イメージング装置に付属の解析ソフトを用いて定量された平均放射効率（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｒａｄｉａｎｔ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ、［ｐ／ｓ／ｃｍ2／ｓｒ］／［μＷ／ｃｍ2］）である。平均放射効率は、計測面積と照射励起光量で規格化された発光量である。また、腫瘍と各組織の蛍光強度比（腫瘍／正常組織と略す）も算出した。腫瘍／正常組織は、色素結合型ＰＭＰＣの腫瘍選択性を表す指標の一つであり、この値が高いと腫瘍への選択性が高いことになる。
【０１３７】
表６に、色素結合型ＰＭＰＣの各組織の規格化蛍光強度と腫瘍／正常組織を示す。全ての色素結合型ＰＭＰＣにおいて、正常組織への分布が認められたが、腫瘍はそれらと同等あるいはそれ以上の蛍光強度を示すことから、本発明の色素結合型ＰＭＰＣの高い腫瘍選択性を反映していると思われる。Ｃｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）では、その腫瘍／正常組織が、高い値を示しており、腫瘍選択性の高い色素結合型ＰＭＰＣであることがわかった。
【０１３８】
【表６】
0006736278.tif 000055
【０１３９】
（実施例３２：色素結合型ＰＭＰＣの光褪色過程の評価）
実施例２２、２３、２４、２５で得られた、上記式（４７）で表わされるＣｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、上記式（４８）で表わされる７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、上記式（４９）で表わされる８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、上記式（５０）で表わされる８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、ならびに実施例１２に記載の式（４６）で表わされるＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４８ｋ）について、それぞれの色素結合型ＰＭＰＣの濃度を、最大吸収波長における吸光度が０．１５になる様、調製した２．０ｍＬのサンプルを準備した。比較例としてのＩＣＧ単独のサンプルも準備した。なお、ＰＡＴ装置を用いる近赤外パルスレーザー光の照射波長、および蛍光スペクトル測定における励起波長は、それぞれの色素結合型ＰＭＰＣならびにＩＣＧの最大吸収波長に設定した。なお、色素結合型ＰＭＰＣならびにＩＣＧの励起波長と蛍光発光波長を図１６にまとめた。近赤外パルスレーザー光を各波長において８〜９ｍＪに設定し、２０回ごとに１２０点（ｄｅｔｅｃｔｏｒ位置）での照射を一回として、最大４回照射した。各照射後に１５０μＬずつサンプリングした。それらを１００μＬキュベットに入れ、蛍光スペクトル（日本分光（株）社製  ＦＰ−６３００）を測定し、光褪色について検討した。結果を図１７に示す。最も光褪色が起こらなかった安定な色素結合型ＰＭＰＣは、近赤外蛍光色素としてシリコンフタロシアニン骨格を有する７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）であった。一方、他のシアニン系色素を有する色素結合型ＰＭＰＣでは、明確な光褪色が観測され、その安定性は、
【数１】
0006736278.tif 000056
の順に低下した。さらに、比較例としてのＩＣＧ単独では４回の照射で１５％程度まで光褪色したことから、ＰＭＰＣへの結合によりシアニン系色素の安定性は飛躍的に向上したことが明らかとなった。
【０１４０】
（実施例３３：色素結合型ＰＭＰＣからの一重項酸素生成量の評価）
実施例２２、２３、２４、２５で得られた、上記式（４７）で表わされるＣｙ７−ＰＭＰＣ（５８ｋ）、上記式（４８）で表わされる７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、上記式（４９）で表わされる８００ＣＷ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、上記式（５０）で表わされる８００ＲＳ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）、ならびに実施例１２に記載の式（４６）で表わされるＩＣＧ−ＰＭＰＣ（４８ｋ）について、それぞれの色素結合型PMPCの濃度を、最大吸収波長における吸光度が０．１５になる様、調製した２．０ｍＬのサンプルを準備した。次に、１．０ｍＭに調製したＳｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰＲＯＢＥＳ  社製）の水溶液を２．０μＬずつ、色素結合型ＰＭＰＣ水溶液に加え、実施例３２と同様にＰＡＴ装置を用い、近赤外パルスレーザー光を最大４回照射し、各照射後に１５０μＬずつサンプリングした。それらを１００μＬキュベットに入れ、蛍光スペクトル（日本分光（株）社製ＦＰ−６３００）を測定し、一重項酸素の生成量を明らかにした。なお、一重項酸素が存在しない場合のＳｉｎｇｌｅｔ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｇｅｎｔは、弱い青色の蛍光を示すが（Ｅｘ：３７２ａｎｄ３９３ｎｍ；Ｅｍ：３９５ａｎｄ４１６ｎｍ）、一重項酸素が存在する場合には、緑色の蛍光（Ｅｘ：〜５０４ｎｍ；Ｅｍ：５２５ｎｍ）を示す。
【０１４１】
従って、光照射後の各色素結合型ＰＭＰＣについて、４８０ｎｍの励起光で励起し、５３６ｎｍの蛍光強度を比較する蛍光スペクトル測定を行い、一重項酸素の発生量を評価した。結果を図１８に示した。近赤外蛍光色素として、シリコンフタロシアニン骨格を有する７００ＤＸ−ＰＭＰＣ（５７ｋ）が、他のシアニン系色素を有する色素結合型PMPCに比べ、はるかに大量に一重項酸素を生成することが明らかとなった。実際、フタロシアニン系色素は、臨床現場で癌の光線力学療法に使用されており、光照射により、強い細胞毒性を示すことが予想される。一方、シアニン系色素を有する色素結合型ＰＭＰＣでは、いずれも光照射による一重項酸素生成量が極めて少ないことが明らかとなった。これらの結果は、シアニン系色素を有する色素結合型ＰＭＰＣでは、近赤外パルスレーザー光の照射より褪色するが、光褪色するシアニン系色素の分解過程には、一重項酸素の生成は含まれないことを示しており、光毒性はほとんどないことを示唆した。
【図１】
0006736278.tif 000096
【図２】
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【図３】
0006736278.tif 000098
【図４】
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【図５】
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【図６】
0006736278.tif 000101
【図７】
0006736278.tif 000102
【図８】
0006736278.tif 000103
【図９】
0006736278.tif 000104
【図１０】
0006736278.tif 000105
【図１１】
0006736278.tif 000106
【図１２】
0006736278.tif 000107
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0006736278.tif 000111
【図１７】
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【図１８】
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