(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体の第１のガスの濃度およびｐＨを調節する方法であって、
ａ）前記流体への前記第１のガスの流れを制御することによって、前記流体中の前記第１のガスの濃度を調節するステップと、
ｂ）前記流体への第２のガスの流れを制御することによって、前記流体のｐＨを調節するステップと、
を含み、
前記第１のガスおよび前記第２のガスは、前記流体に溶解されるまで分離された状態で保たれており、前記第１のガスの流れが、前記第１のガスがその中に存在し、前記流体と前記第１のガスを分離する第１の膜を備え、前記膜がガス透過性膜で作製されている、ガスチャンバによって制御され、
前記第１のガスは酸素であり、前記第２のガスは二酸化炭素であり、
前記流体は液体である、方法。
【請求項２】
前記流体が、細胞を培養するための液体培養培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐＨを調節するために二酸化炭素が使用され、かつ／または前記流体中に溶解された酸素および／または前記流体のｐＨが監視される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のガスの濃度を調節する手段が、前記第１のガスまたは前記第１のガスを含むガスの混合物がその中に存在し、前記流体と前記第１のガスを分離する第１の膜を備え、前記膜がガス透過性材料で作製されている、第１のガスチャンバを含み、かつ／または、前記第２のガスの濃度を調節する手段が、前記第２のガスまたは前記第２のガスを含むガスの混合物がその中に存在し、前記流体と前記第２のガスを分離する第２の膜を備え、前記第２の膜がガス透過性材料で作製されている、第２のガスチャンバを含み、好ましくは、前記ガス透過性材料が、シリコーン、シリコーンゴム、エチルセルロース誘導体、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、疎水性ポリプロピレン、ジメチルシロキサン、ポリメチルペンテンからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のガスの濃度を調節する手段および前記第２のガスの濃度を調節する手段が、別々の装置であるか、または第１のガスチャンバおよび第２のガスチャンバが分離されている１つの装置である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
流体容器内の流体中に第１のガスおよび第２のガスを供給する装置であって、
ａ）前記装置内に含まれる前記流体への前記第１のガスの流れをもたらし、かつ調節するための、第１のガスを含む第１のチャンバであって、前記流体と前記第１のガスを分離する第１の膜を備え、前記第１の膜がガス透過性材料で作製されている、第１のチャンバと、
ｂ）前記流体への前記第２のガスの流れをもたらし、かつ調節するための、第２のガスを含む第２のチャンバであって、前記流体と前記第２のガスを分離する第２の膜を備え、前記第２の膜がガス透過性材料で作製されている、第２のチャンバと、
を備え、
前記第１のガスの流れをもたらし、かつ調節するためのチャンバ、および前記第２のガスの流れをもたらし、かつ調節するためのチャンバが互いに分離されており、
前記流体は液体である、装置。
【請求項７】
気相にある間に、前記第１のガスおよび前記第２のガスが分離されており、好ましくは前記第１のガスおよび前記第２のガスが、前記流体に溶解されるまで分離されている、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記流体が、細胞を培養するための液体培養培地である、請求項６または７に記載の装置。
【請求項９】
前記第１のガスの濃度を調節する手段および前記第２のガスの濃度を調節する手段が、ガスの混合物を含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
前記第１のガスが酸素であり、かつ／または前記第２のガスが二酸化炭素である、請求項６から９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
前記ガス透過性材料が、シリコーン、シリコーンゴム、エチルセルロース誘導体、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、疎水性ポリプロピレン、ジメチルシロキサン、ポリメチルペンテンからなる群から選択される、請求項６から１０のいずれか一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、流体中の少なくとも２つのガスのガス濃度を調節する方法、および流体中の少なくとも２つのガスの濃度を調節する装置に関する。本発明は特にヒト細胞、特にヒト幹細胞を培養する細胞培養培地における酸素濃度およびｐＨの調節を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、通常、条件を制御することができるバイオリアクタにおいて培養される。バイオリアクタは、外界からの汚染を避けるために閉鎖システムであり得る。これは、特に哺乳動物細胞の場合、特にヒト細胞の場合に該当する。栄養、酸素、温度、およびｐＨの制御は、細胞の培養にきわめて重要である。
【０００３】
一般的に使用されるバイオリアクタには、液相および気相の両方が存在する。例えば培地中に溶解した酸素の制御は、気相と液相の相間で起こる。ｐＨの制御には二酸化炭素が使用され得る。例えばＷＯ２０１１／１４２６６７を参照するとわかるように、バイオリアクタには、液相のみを有するものもあり、装置は溶解した酸素およびｐＨの制御を必要とする。酸素などのガスの流体培地への移動は、膜を超えて実施され得る。一般的な酸素供給器は、培地が貫流している酸素を含むチャンバを備える。ＥＰ０３４３３５７には、流体が貫流している０．１３２インチの内径（ＩＤ）および０．１８３インチの外径（ＯＤ）のシリコンチューブを使用した酸素供給器が開示されている。エアポンプによって、酸素供給器のシェル側へと空気がポンプ注入される。シリコーンのガス透過特性に起因して、酸素は流体へと移動される。培地中に溶解する二酸化炭素を制御することによって、ｐＨを制御することができる。ＵＳ４，４９３，６９２には、体外血液中の酸素および二酸化炭素を調節するための血液ガス濃度制御装置が開示されている。そこには、酸素供給源（１００％Ｏ２）および二酸化炭素供給源（９５％Ｏ２および５％ＣＯ２）が連結された酸素供給器が開示されている。両ガスは、同一の酸素供給器に供給される。ＷＯ２０１１／０６６４８１には、酸素供給源および二酸化炭素供給源が酸素および二酸化炭素を同一の膜型酸素供給器に提供する体外膜型酸素負荷制御が開示されている。
【０００４】
本発明者は、従来技術において使用されているような酸素および二酸化炭素および窒素の混合物が、流体中に溶解する酸素およびｐＨの制御に大きな変動を与えることを見出した。ガスの混合物を有する場合、ｐＨは、設定値の０．５ｐＨ単位内に制御することができる。同様に、溶解する酸素の設定値の制御は、２５％の空気飽和の範囲であった。哺乳動物細胞、特にヒト細胞、特にヒト幹細胞の培養の場合、この種の制御は、単相バイオリアクタ中の細胞に適切な環境を形成するには十分でない。設定値付近でのｐＨおよび溶解する酸素の両方の大きな変動に加えて、ｐＨおよび溶解する酸素の制御システムは非常に遅い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１４２６６７号
【特許文献２】欧州特許第０３４３３５７号公報
【特許文献３】米国特許第４，４９３，６９２号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１１／０６６４８１号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
驚くべきことに、溶解する酸素の濃度の調節、および／または溶解する二酸化炭素の濃度を調節することによるｐＨの調節の場所が分離されている場合、培養される細胞の環境は、より小さな変動で良好に制御され得ることが見出された。
【０００７】
したがって、第１の態様において、本発明は、流体中の少なくとも２つのガスの濃度を調節する方法であって、
ａ）第１のガスの濃度を調節する手段によって、前記流体中の第１のガスの濃度を調節するステップと、
ｂ）第２のガスの濃度を調節する手段によって、前記流体中の第２のガスの濃度を調節するステップと、
を含み、
前記第１のガスの濃度を調節する手段および前記第２のガスの濃度を調節する手段が互いに分離されている方法を対象とする。
【０００８】
第２の態様において、本発明は、流体中の少なくとも２つのガスの濃度を調節する装置であって、
ａ）流体中の第１のガスの濃度を調節する手段と、
ｂ）流体中の第２のガスの濃度を調節する手段と、
を備え、
前記第１のガスの濃度を調節する手段および前記第２のガスの濃度を調節する手段が互いに分離されている装置を対象とする。
【０００９】
該装置および方法において、ガスは流体へと別々に移動される。そのため、流体に入る前には、第１および第２のガスは互いに接触しない。第１および第２のガスが流体に入り、そこに溶解されて初めて、第１および第２のガスは互いに接触し得る。したがって、第１および第２のガスの混合は、流体中で実施される。そのため、流体に移動される前には第１および第２のガスの混合または接触はない。流体に移動された後に、第１および第２のガスの混合または接触がある。したがって、気相にある間には、第１および第２のガスの混合または接触はない。第１および第２のガスが流体中に溶解された後に、第１および第２のガスの混合または接触がある。本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、第１のガスと第２のガスは異なる。
【００１０】
本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、気相にある間、第１および第２のガスは分離されている。本発明の態様および／または実施形態による好ましい実施形態では、第１および第２のガスは、流体に移動されるまで分離されている。本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、第１および第２のガスは、流体中に溶解されるまで分離されている。
【００１１】
本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、第１のガスおよび／または第２のガスの濃度の調節は、ガスの混合物によって実施され得る。
【００１２】
本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、第１のガスは酸素である。本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、第２のガスは二酸化炭素である。本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、ｐＨを調節するために二酸化炭素が使用される。
【００１３】
本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、流体中に溶解した酸素および／または流体のｐＨが監視される。
【００１４】
本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、第１のガスの濃度を調節する手段は、第１のガスまたは第１のガスを含むガスの混合物がその中に存在し、流体と第１のガスを分離する第１の膜を備え、該膜がガス透過性材料で作製されている、第１のガスチャンバを含む。本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、第２のガスの濃度を調節する手段は、第２のガスまたは第２のガスを含むガスの混合物がその中に存在し、流体と第２のガスを分離する第２の膜を備え、第２の膜がガス透過性材料で作製されている、第２のガスチャンバを含む。本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、第１のガスの濃度を調節する手段および第２のガスの濃度を調節する手段は、別々の装置であるか、第１および第２のガスチャンバが分離されている１つの装置である。
【００１５】
本発明の態様および／または実施形態の好ましい実施形態では、ガス透過性材料は、シリコーン、シリコーンゴム、エチルセルロース誘導体、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、疎水性ポリプロピレン、ジメチルシロキサン、ポリメチルペンテンからなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】第１のガスとしてＣＯ２、第２のガスとしてＮ２およびＯ２の混合物を使用する本発明による装置の構成を示す。
【図２】ガス交換が組み合わせられたバイオリアクタにおける細胞の成長を示す。
【図３】ガス交換が組み合わせられたバイオリアクタにおける測定ｐＨを示す。
【図４】ガス交換が組み合わせられたバイオリアクタにおける測定溶解酸素（ＤＯ）を示す。
【図５】ガス交換モジュールが分離されたバイオリアクタにおける細胞の成長を示す。
【図６】分離されたガス交換モジュールに二酸化炭素および酸素を有するバイオリアクタにおける測定ｐＨを示す。
【図７】分離されたガス交換モジュールに二酸化炭素および酸素を有するバイオリアクタにおける測定溶解酸素（ＤＯ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
第１の態様において、本発明は、流体中の少なくとも２つのガス、例えば溶解する酸素（ＤＯ）および二酸化炭素（ｐＨ）の濃度を調節する方法に関する。
【００１８】
第２の態様において、本発明は、少なくとも２つのガスの濃度を調節する装置に関する。
【００１９】
装置および方法において、ガスは、別々に流体へと運ばれる。そのため、流体に入る前には、第１および第２のガスは互いに接触しない。第１および第２のガスが流体に入り、そこに溶解して初めて、第１および第２のガスは互いに接触し得る。したがって、第１および第２のガスの混合は、流体中で行われる。流体に移動するまでは、第１および第２のガスの混合または接触はない。流体に移動した後にのみ、第１および第２のガスの混合または接触がある。したがって、気相にある間には、第１および第２のガスの混合または接触はない。第１および第２のガスが流体中に溶解した後にのみ第１および第２のガスの混合または接触がある。
【００２０】
本方法および装置は、流体、特に単層として流体を有する閉鎖システムでの細胞培養に非常に適している。本発明のために、流体は応力の印加の下で変形可能な液体である。好ましくは、本発明による流体は、室温で、少なくとも０．１、より好ましくは少なくとも０．５、より好ましくは少なくとも１、より好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも４、より好ましくは少なくとも６、最も好ましくは少なくとも９のボストウィック値を有する。ボストウィック値はセンチメートル毎秒（ｃｍ／ｓ）として表され、特定の時間に特定の温度で液体または流体が流れる距離である。典型的なボストウィック測定プロトコルは、水平に配置された長方形のタブの底部付近に出口が設けられ、垂直バリアで閉鎖された１２５ｍｌの貯蔵器からなるボストウィック装置を使用する。タブの底部には、貯蔵器の出口から延びる２５ｃｍの測定スケールが設けられている。装置およびサンプルの両方が所望の温度を有すると（例えば室温または１５℃）、手動で１０回上下に撹拌された後、貯蔵器に１２５ｍｌのサンプルが充填される。貯蔵器の閉鎖が取り除かれると、サンプルは貯蔵器から流れ出し、タブの底部に広がる。１５秒後にフローの経路長が測定される。センチメートル毎秒で表される値がボストウィック値であり、注出性の基準として使用される。
【００２１】
液体の流動性は、粘度によっても表すことができる。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、室温での流体の粘度は、２５０Ｐａ．ｓ未満、より好ましくは１５０Ｐａ．ｓ未満、より好ましくは１００Ｐａ．ｓ未満、より好ましくは５０Ｐａ．ｓ未満、より好ましくは３０Ｐａ未満である。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、室温での流体の粘度は、０．０１から１０ｍＰａ．ｓの間、より好ましくは０．１から５ｍＰａ．ｓの間、より好ましくは０．２から１ｍＰａ．ｓの間、より好ましくは０．３から０．８ｍＰａ．ｓの間、より好ましくは０．４から０．７ｍＰａ．ｓの間、より好ましくは０．５から０．６ｍＰａ．ｓの間である。
【００２２】
本発明の目的では、ガスのパーセンテージ（％）は、そうでないことが示されていない限り、ｖｏｌ％である。
【００２３】
本発明の方法および装置の好ましい実施形態では、流体は液体培養培地であり、細胞を培養するために使用され得るあらゆる種類の流体であり得る。流体での細胞培養は、培地を補給することができるため、細胞がより長く成長できるという利点を有する。流体の非限定的な例には、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必須培地（ＭＥＭ）、最少必須培地アルファ（ＭＥＭＡ）、グラスゴー改変最少必須培地（ＧＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、リーボビッツＬ１５培地、マッコイ５Ａ培地、Ｆ１０  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘ、Ｆ１２  ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘ、ＭＣＤＢ１５３、培地１９９、ＲＰＭＩ  １６４０培地、ウェイマウスＭＢ  ７５２／１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地、Ｇｒａｃｅ’ｓ昆虫培地、およびＢｉｏｉｎｓｅｃｔ−１無血清培地がある。培養される細胞に応じて、流体は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、血小板溶解物（ＰＬ）、成長因子、ペニシリンまたはストレプトマイシンなどの抗生物質、アスコルビン酸‐２‐リン酸（ａｓａｐ）、ペプチド、および／またはアミノ酸、例えばＧｌｕｔａｍａｘ、例えば塩基性線維芽細胞成長因子ヒト組換えおよびＥＧＦなどのデキサメタゾン成長因子、Ｄ（＋）グルコースなどの炭水化物、ヒポキサンチンナトリウム、アミノプテリン、チミジン、脂質、飽和および不飽和脂肪酸、ＰＵＦＡ、ビタミン、リン脂質、ミネラル、ヒトトランスフェリン、ヒトインシュリン、プロゲステロン、プトレスシン、亜セレン酸、非イオン性界面活性剤などの界面活性剤、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、コレステロール、ホルモン、およびヒドロコルチゾンを含む群から選択される成分などの追加の成分を含み得る。
【００２４】
培養される細胞は、細菌細胞、菌類、酵母細胞、植物細胞、藻類、昆虫細胞、哺乳動物細胞など、任意の種類の細胞であり得る。本発明の好ましい実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞、より好ましくは始原細胞、より好ましくは幹細胞であるが、細胞は、胚細胞、皮膚細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、肝細胞、赤血球、白血球、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、肺細胞、視細胞、卵巣細胞、全能細胞、多能性細胞、がん細胞からも選択され得る。細胞は、一次細胞であり得るが、細胞株からであってもよい。細胞は、粘着細胞または非粘着細胞であり得る。細胞は、一次細胞であり得る。
【００２５】
本発明は、流体中の２つ以上のガスの濃度の調節を対象とする。最も使用されるガスは空気、酸素（Ｏ２）、二酸化炭素、（ＣＯ２）、窒素（Ｎ２）、ヘリウム、およびその他の不活性ガスである。従来技術は、２つ以上のガスの濃度を調節する場合、１つの酸素供給器、または１つのガス交換手段によって行われることを示している。２つ以上のガスの供給源は、同一空間にガスを提供する。しかしながら、本発明者は、２つ以上のガスの濃度を調節する場合に従来の方法で行うと、調節の精度がよくないことを発見した。例えばヒト幹細胞などの「敏感な」細胞での培養では、その精度は十分でない。驚くべきことに、第１のガスの濃度を調節する手段によって流体中の第１のガスの濃度を調節するステップおよび第２のガスの濃度を調節する手段によって流体中の第２のガスの濃度を調節するステップを別々に実施するときに発見された。このことは、第１のガスの濃度を調節する手段と、第２のガスの濃度を調節する別の手段とがあることを意味する。ガスチャンバ内で、第１および第２のガスの混合は行われないことを理解すべきである。第１および第２のガスの混合は、第１および第２のガスが溶解した場合に、膜を超えて流体へと移動した後にのみ行われる。したがって、第１および第２のガスは、気相にある場合には分離されており、気相にある間には、第１および第２のガスは互いに接触しないことを意味する。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、濃度調節手段は、それぞれ別々の装置であり得るか、１つの装置内に配置され得る。２つ以上の濃度調節手段が１つの装置内にある場合には、例えば各濃度調節手段の間に壁を配置することによって、または少なくとも２つのガスの間に接触がないように濃度調節手段を配置することによって、２つ以上のガスが互いに接触しないようにこの装置が設計される。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、第１のガスの濃度の調節および第２のガスの濃度の調節は、同時に実施される。第１および第２のガスは、別々に流体に運ばれる。膜を超えて第１および第２のガスを流体に移動させた後、これらのガスは流体中で混合され得る。したがって、装置内では、または調節手段内にあるときには、第１および第２のガスの接触はない。つまり、膜を超えて移動する前には、第１および第２のガスの混合はない。例えば図３および４を参照するとわかるように、第１および第２のガスが互いに接触する少なくとも２つのガスの濃度を調節する１つの装置を使用すると大きなずれがあることが発見された。また、少なくとも２つのガスの濃度を調節する単一の調節装置を使用するが、第１のガスおよび第２のガスを別々に、つまり「タイムシェアリング」のように同時にではなく順に調節する装置を使用してもよい結果をもたらさないことも発見された。
【００２６】
本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、２つより多くのガスが使用される。追加のガスの各々は、別々の濃度調節手段を必要とすることを理解すべきである。したがって、３つのガスの濃度を調節する場合、各ガスに対して３つの別々の濃度調節手段が必要である。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、第１のガスと第２のガスは異なる。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、第１のガスおよび／または第２のガスの濃度の調節は、ガスの混合物によって実施され得る。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、第１のガスの濃度を調節する手段および／または第２のガスの濃度を調節する手段は、ガスの混合物を含む。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、第１のガスの濃度を調節するガスの混合物は、第２のガスを含まず、第２のガスの濃度を調節するガスの混合物は、第１のガスを含まない。実験において示されているように、１つの装置、または２つ以上のガスを調節する手段を使用する場合、ガスは同時に存在し、濃度の調節は同時にかつ同一の位置で実施される。理論に縛られることを望むものではないが、１つより多くのガスの濃度を同一の位置で同時に調節すると、溶解するガスの値のずれに大きな変動があると考えられる。ガスの混合物が非常によく作用し得ることも見られた。ガス混合物において調節されるガスの濃度は、達成すべきガスの濃度、ガスの濃度を調節する手段、使用されるガスまたはガスの混合物の容量、調節されるガスの分圧、調節されるガスの流体への移動速度、流体へのガスの移動手段等の多くの要因に依存する。特定のケースでは、ガスを流体に移動するために膜が使用され、ガスの混合物において調節されるガスの濃度は膜の種類および膜の表面に依存する。さらに、ガス混合物において調節されるガスの濃度は、ガスの濃度の調節を実施するために使用される流体の容量に依存する。一般的に、流体中のガスの濃度の調節は、流体の一部で実施される。本発明においてガスの濃度を調節する手段は、流体の一部に位置する。ガスの濃度の調節が行われる流体の容量は、濃度の調節のためにガスの混合物が使用される場合に調節されるガスの部分にとって重要である。例えば、ガスの濃度の調節に多量が使用される場合、調節されるガスを含む混合物中の調節されるガスの部分は、容量がより少ない場合に、より少なくなり得る。同様に、調節されるガスの分圧が高い場合、より少ない容量で十分であり得るか、ガスの混合物中に、より低濃度の調節されるガスが必要である。また、調節されるガスの移動速度が速い場合、より少ない容量またはより低濃度の調節されるガスが必要である。また、調節を必要とする濃度にも依存する。高濃度のガスが必要な場合、より多量のガス、またはガスの混合物中により高濃度の調節されるガスが使用され得る。ガスの混合物を使用する場合、その他のガスの存在が認められる場合も見られた。例えば、第１のガスの濃度を調節するためのガスの混合物において、第２のガスが存在してよいが、２０ｖｏｌ％未満、より好ましくは１５ｖｏｌ％未満、より好ましくは１０ｖｏｌ％未満、より好ましくは８ｖｏｌ％未満、より好ましくは５ｖｏｌ％未満、より好ましくは３ｖｏｌ％未満、より好ましくは２ｖｏｌ％未満、より好ましくは１ｖｏｌ％未満の濃度である。また、第２のガスの濃度を調節するためのガスの混合物において、第１のガスが存在してよいが、２０ｖｏｌ％未満、より好ましくは１５ｖｏｌ％未満、より好ましくは１０ｖｏｌ％未満、より好ましくは８ｖｏｌ％未満、より好ましくは５ｖｏｌ％未満、より好ましくは３ｖｏｌ％未満、より好ましくは２ｖｏｌ％未満、より好ましくは１ｖｏｌ％未満の濃度である。ガスの混合物中にその他のガスが存在し得るか否か、またはその程度は、第１および第２のガスの分圧、第１および第２のガスの移動速度、濃度調節のためのガスの混合物またはガスの容量、流体中の調節されるガスの必要な濃度など、上述と同一の要因に依存する。当業者であれば、ガスの混合物を必要に応じて容易に調節することができる。ガスの分圧およびガスの移動速度はガスによって知られているため、当業者であれば、例えば調節されるガスの濃度を調節するために必要な容量を計算する能力が十分にあり、またガスの混合物中の調節されるガスの最少部分を決定することができる。本発明の好ましい実施形態では、第１のガスおよび／または第２のガスの濃度は、ガスの混合物によって調節される。適切なガスは、酸素（Ｏ２）、二酸化炭素（ＣＯ２）、窒素（Ｎ２）、空気、およびヘリウム（Ｈｅ）である。適当なガスの混合物は、空気、酸素（Ｏ２）と窒素（Ｎ２）、酸素と空気、二酸化炭素と空気、酸素とヘリウム（Ｈｅ）、空気と窒素、二酸化炭素と窒素、または二酸化炭素とヘリウムである。本発明の好ましい実施形態では、第１のガスは酸素である。本発明の方法および／または装置の好ましい実施形態では、酸素の濃度を調節するためのガスの混合物は、１〜９９ｖｏｌ％の酸素、より好ましくは２〜９５ｖｏｌ％の酸素、より好ましくは５〜９０ｖｏｌ％の酸素、より好ましくは７〜８８ｖｏｌ％の酸素、より好ましくは１０〜８５ｖｏｌ％の酸素、より好ましくは１５〜８３ｖｏｌ％の酸素、およびさらに好ましくは２０〜８０ｖｏｌ％の酸素、またはさらに好ましくは２５〜７５ｖｏｌ％の酸素、より好ましくは３０〜７０ｖｏｌ％の酸素、より好ましくは３５〜６５ｖｏｌ％の酸素、より好ましくは４０〜６０ｖｏｌ％の酸素、より好ましくは４５〜５５ｖｏｌ％の酸素、およびさらに好ましくは約５０ｖｏｌ％の酸素を含む。好ましい実施形態では、酸素を含むガスの混合物は、窒素、空気、および／またはヘリウムを含む。適切な酸素の混合物は、５０ｖｏｌ％の酸素と５０ｖｏｌ％の空気、または２０ｖｏｌ％の酸素と８０ｖｏｌ％の窒素、または２０ｖｏｌ％の酸素と８０％の空気、または８０％の空気と２０％の窒素である。酸素の供給源として純酸素が使用され得るが、約２０ｖｏｌ％の酸素を含む空気もまた使用され得ることを理解すべきである。本発明の方法および／または装置の好ましい実施形態では、酸素を含む混合物は、好ましくは第２のガスの２０ｖｏｌ％未満、より好ましくは１５ｖｏｌ％未満、より好ましくは１０ｖｏｌ％未満、より好ましくは８ｖｏｌ％未満、より好ましくは５ｖｏｌ％未満、より好ましくは３ｖｏｌ％未満、より好ましくは２ｖｏｌ％未満、より好ましくは１ｖｏｌ％未満含む。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、第２のガスは二酸化炭素である。二酸化炭素混合物は、１〜９９ｖｏｌ％の二酸化炭素、より好ましくは２〜９５ｖｏｌ％の二酸化炭素、より好ましくは５〜９０ｖｏｌ％の二酸化炭素、より好ましくは７〜８８ｖｏｌ％の二酸化炭素、より好ましくは１０〜８５ｖｏｌ％の二酸化炭素、より好ましくは１５〜８３ｖｏｌ％の二酸化炭素、さらに好ましくは２０〜８０ｖｏｌ％の二酸化炭素、またはさらに好ましくは２５〜７５ｖｏｌ％の二酸化炭素、より好ましくは３０〜７０ｖｏｌ％の二酸化炭素、より好ましくは３５〜６５ｖｏｌ％の二酸化炭素、より好ましくは４０〜６０ｖｏｌ％の二酸化炭素、より好ましくは４５〜５５ｖｏｌ％の二酸化炭素、およびさらに好ましくは約５０ｖｏｌ％の二酸化炭素を含み得る。好ましい実施形態では、二酸化炭素の濃度を調節するためのガス混合物は、窒素、空気、またはヘリウムを含む。二酸化炭素を含む適切な混合物は、５０ｖｏｌ％の二酸化炭素と５０ｖｏｌ％の空気、または５０ｖｏｌ％の二酸化炭素と５０ｖｏｌ％の窒素である。本発明の方法および／または装置の好ましい実施形態では、二酸化炭素を含む混合物は、好ましくは第１のガスの２０ｖｏｌ％未満、より好ましくは１５ｖｏｌ％未満、より好ましくは１０ｖｏｌ％未満、より好ましくは８ｖｏｌ％未満、より好ましくは５ｖｏｌ％未満、より好ましくは３ｖｏｌ％未満、より好ましくは２ｖｏｌ％未満、より好ましくは１ｖｏｌ％未満含む。本発明の好ましい実施形態では、流体中の二酸化炭素の濃度は、ｐＨの調節に使用される。どの程度のガスが使用されるかは、流体および溶解されるガスの目的に依存する。当業者であれば、適切なガスの量を見つけることができるであろう。例えば、培養培地では、培地、培養される細胞、および溶解されるガスに依存する。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、ガスの濃度が測定される。より好ましい実施形態では、ガスの濃度の調節が自動的に制御されるように、ガスの濃度が監視され、フィードバックが提供される。好ましい実施形態では、流体中の酸素および／または流体のｐＨが監視される。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、ガスの各々の濃度が調節された後に調節されるガスの濃度が測定される。適切な実施形態では、ガスの濃度を調節する手段の後に、調節されるガスの濃度を測定する手段が配置される。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、ガスの濃度の調節の必要性を決定することができるように、ガスの各々の濃度を調節する前に、調節されるガスの濃度が測定される。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、ガスの各々の濃度が調節される前後に、調節されるガスの濃度が測定される。
【００２７】
本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、第１のガスの濃度を調節する手段は、第１のガスがその中に存在し、ガスと流体を分離する第１の膜を備え、該膜がガス透過性材料で作製されている、第１のガスチャンバを含む。本発明の好ましい実施形態では、第２のガスの濃度を調節する手段は、第２のガスがその中に存在し、ガスと流体を分離する第２の膜を備え、該膜がガス透過性材料で作製されている、第２のガスチャンバを含む。好ましい実施形態では、第１および第２のガスは、ガスチャンバ内で混合されない。
【００２８】
本発明の方法および／または装置の好ましい実施形態では、ガスの濃度を調節する手段におけるガスチャンバは、調節されるガスを含むガスの混合物を含む。例えば、第１のガスの濃度を調節する第１の手段における第１のガスチャンバは、第１のガスを含むガスの混合物を含む。別の例では、第２のガスの濃度を調節する第２の手段における第２のガスチャンバは、第２のガスを含むガスの混合物を含む。本発明および／またはその実施形態による流体中のガスの濃度を調節する適切な手段において、膜は、ガスがその中に保持され得るチャンバ内を通るチューブである。流体は膜チューブの内空間を流れ、ガスは膜チューブの外側に存在する。ガスは、膜のガス透過性材料を通って拡散するため、流体中に溶解されるガスの濃度に影響を及ぼす。膜のガスを含む側のガスの分圧が、膜の流体を含む側のガスの分圧より高い場合、ガスは、膜のガス側から流体側へと拡散し、流体に溶解したガスの濃度が上昇し得る。膜の流体側、すなわち流体が流れる側のガスの分圧が高ければ、ガスは、膜の流体側からガス側へと拡散し、流体に溶解したガスの濃度が低下し得る。本発明の適切な実施形態では、囲まれた容量の表面の少なくとも一部が膜を含む、流体が流れる囲まれた容量が、ガスを含むチャンバ内を通る。囲まれた容量は、流体のための容量を提供するだけでなく、流体とガスとの間の直接の接触を防ぐ。好ましくは、囲まれた容量は、管状の形状である。好ましくは、囲まれた容量の材料は、完全に膜からなる。好ましい実施形態では、囲まれた容量は、ガス透過性膜からなるチューブである。本発明の方法および／または装置の好ましい実施形態では、ガスチャンバから出た後およびガスチャンバに入った後に、流体を保持する囲まれた容量は持続する。本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、ガスチャンバの容量は、０．５から１０００ｍＬの間、より好ましくは１から５００ｍＬの間、より好ましくは２から２５０ｍＬの間、より好ましくは３から１００ｍＬの間、より好ましくは４から８０ｍＬの間、より好ましくは５から７０ｍＬの間、より好ましくは６から５０ｍＬの間、より好ましくは７から４５ｍＬの間、より好ましくは８から４０ｍＬの間、より好ましくは９から３５ｍＬの間、より好ましくは１０から３０ｍＬの間、より好ましくは１１から２５ｍＬの間、より好ましくは１２から２０ｍＬの間、より好ましくは１３から１８ｍＬの間、より好ましくは１４から１６ｍＬの間である。ガスチャンバの容量は、溶解されるガスの目的に依存することを理解すべきである。第１の濃度調節手段のガスチャンバの容量と第２の濃度調節手段のガスチャンバの容量は、ガス、溶解が必要な量、システムの要件等に応じて異なってよい。当業者であれば、方法または装置を要求に合わせて調節することができるであろう。５０〜１０００ｍＬのバイオリアクタに適切には、酸素のガスチャンバは、１０〜６０ｍＬ、より好ましくは２０〜５０ｍＬ、より好ましくは２５〜４５ｍＬ、より好ましくは３０〜４０ｍＬである。５０〜１０００ｍＬのバイオリアクタに適切には、二酸化炭素のガスチャンバは、０．５〜１０ｍＬ、より好ましくは１〜８ｍＬ、より好ましくは２〜６ｍＬ、より好ましくは２．５〜５ｍＬ、より好ましくは３〜４ｍＬである。細胞培養目的では、膜を介してガスチャンバと接触する流体の容量は、バイオリアクタでは約５０〜１０００ｍＬであり、酸素は約１〜３０ｍＬ、より好ましくは２から２５ｍＬ、より好ましくは３から２２ｍＬ、より好ましくは５から２０ｍＬ、より好ましくは７から１５ｍＬ、より好ましくは１０〜１２ｍＬである。細胞培養目的では、膜を介してガスチャンバと接触する流体の容量は、約５０〜１０００ｍＬのバイオリアクタでは、二酸化炭素は、約０．０５〜５ｍＬ、より好ましくは０．１から４．５ｍＬ、より好ましくは０．２から４ｍＬ、より好ましくは０．５から３ｍＬ、より好ましくは０．７から２．５ｍＬ、より好ましくは１〜２ｍＬである。当然、本発明および／またはその実施形態は、方法または装置の目的に応じて、使用するガスに応じて、ガスの濃度の必要条件に応じて異なる範囲を有し得る。当業者であれば、方法または装置の目的の必要性に合わせて、ガスチャンバの容量およびガスチャンバと接する流体の容量を調節することができる。
【００２９】
流体中のガスの濃度を調節する適切な手段は、酸素供給器である。酸素供給器は、二酸化炭素、窒素、およびガスの混合物などのその他のガスにも使用され得ることを理解すべきである。
【００３０】
本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、第１のガスの濃度調節ステップおよび第２のガスの濃度調節ステップは、連続し得る。適切には、少なくとも２つのガスの濃度調節手段は、糸につないだ玉のように隣接して配置されるかまたは、濃度調節手段は、別々のガスチャンバを有する１つの装置に一緒に配置される。
【００３１】
本発明の方法または装置の好ましい実施形態では、ガス透過性材料は、シリコーン、シリコーンゴム、エチルセルロース誘導体、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、疎水性ポリプロピレン、ジメチルシロキサン、ポリメチルペンテンからなる群から選択される。ガス透過性材料は、ガスを透過するが流体は透過しない材料であり、半透過性材料である。
【００３２】
［実施例］
２０ｃｍ２／ｍＬの濃度でマイクロキャリアを含むα−ＭＥＭ液体培地において間充織幹細胞を培養した。システムには、１３５ｍＬのドナーから２．７６×１０６の細胞を植え付けた。細胞は、規則的に観察した。培地は、少なくとも３〜４日毎に更新した。酸素およびｐＨの制御は、９５ｖｏｌ％の空気および５ｖｏｌ％の二酸化炭素の１００ｍＬ／ｍｉｎでのガスフローによって混合ガスチャンバにおいて実施し、制御は、４０％の溶解酸素およびｐＨ７．３に設定した。細胞は、初めはマイクロキャリアによく付着したが、細胞成長は観察されなかった（図２参照）。酸素およびｐＨを測定し、図３および４に見られるように、バイオリアクタの入口および出口の両方で溶解酸素およびｐＨの大きな変動が見られた。代謝物もまた測定し、代謝物が培地から消耗されてないことが見られた。さらに、乳酸およびアンモニアなどの廃棄物は抑制レベルには達していなかった。図１に示すように、酸素用のガスチャンバおよびｐＨを制御するために二酸化炭素用のガスチャンバを設けて、酸素およびｐＨを別々に制御して、実験を繰り返した。図５に見られるように、細胞はよく成長した。図６および７からわかるように、酸素および二酸化炭素を別々に制御するシステムでは、溶解酸素およびｐＨの変動はずっと小さい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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