(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の検体を分析する方法であって、該方法は、検体中のｘ種の異なるバイオマーカーのレベルを測定するステップ、および被験者の検体中のｘ種の異なるバイオマーカーのレベルに基づいて被験者が子宮内膜症であるかどうかの診断上の指標を提供するステップを含み、前記ｘは２以上であり、ｘ種の異なるバイオマーカーが、表１に記載のhsa-miR-150およびその他の１以上のバイオマーカーである、方法。
【請求項２】
１以上のバイオマーカーが、ebv-miR-BART2-5p、hsa-let-7f、hsa-let-7g、hsa-miR-1260、hsa-miR142-3p、hsa-miR-197、hsa-miR-215、hsa-miR-223、hsa-miR-30b、hsa-miR-320c、hsa-miR34a、hsa-miR-497、hsa-miR-630、hsa-miR-663およびhsa-miR-720から成る群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｘが5以上である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ｘが10以上である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
方法が、被験者からの検体が、CA125および／またはCA19-9に対する自己抗体を含むかどうかを決定するステップを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
方法が、被験者検体中のバイオマーカーのレベルを、（i）子宮内膜症である患者からの検体および／または（ii）子宮内膜症ではない患者からの検体におけるレベルと比較することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
方法が、子宮内膜症である患者と子宮内膜症ではない患者とを区別するため、測定されたレベルを使用する分類器アルゴリズムを用いて、検体中のバイオマーカーのレベルを分析することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
被験者が（i）子宮内膜症の発症前である、または（ii）既に子宮内膜症の臨床症状を示している、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
検体が体液である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
検体が子宮頸管分泌または腹水である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗体の存在を免疫測定法により測定する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
免疫測定法が、（i）表１に開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む抗原、および／または（ii）表１に開示されたアミノ酸配列から少なくとも１つのエピトープを含む抗原を用いる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
免疫測定法が、第一領域および第二領域を有する融合ポリペプチドを用いる方法であって、該第一領域は検体中の自己抗体と反応することができ、該第二領域は、融合ポリペプチドを固定する基質と反応することができる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
被験者の検体がヒトの検体である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
2種以上の異なるバイオマーカーが、
ａ）2種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１から選ばれるバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｂ）2種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１から選ばれるバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｃ）2種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１から選ばれるバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｄ）3種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１１から選ばれる2種のバイオマーカーおよび（ii）表１から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｅ）3種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１１から選ばれる2種のバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｆ）3種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１１から選ばれる2種のバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｇ）3種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１１から選ばれる2種のバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｈ）4種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１２から選ばれる3種のバイオマーカーおよび（ii）表１から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｉ）4種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１２から選ばれる3種のバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｊ）4種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１２から選ばれる3種のバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｋ）4種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１２から選ばれる3種のバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｌ）5種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１３から選ばれる4種のバイオマーカーおよび（ii）表１から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｍ）5種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１３から選ばれる4種のバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｎ）5種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１３から選ばれる4種のバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｏ）5種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１３から選ばれる4種のバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｐ）6種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１４から選ばれる5種のバイオマーカーおよび（ii）表１から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｑ）6種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１４から選ばれる5種のバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｒ）6種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１４から選ばれる5種のバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｓ）6種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１４から選ばれる5種のバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｔ）7種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１５から選ばれる6種のバイオマーカーおよび（ii）表１から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｕ）7種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１５から選ばれる6種のバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｖ）7種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１５から選ばれる6種のバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
ｗ）7種の異なるバイオマーカー、すなわち、（i）表１５から選ばれる6種のバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、または、
ｘ）表１０から選ばれる12種の異なるバイオマーカーを含む、もしくは、から成るパネル、
である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮内膜症の診断および／または予知に有用なバイオマーカーに関する。該バイオマーカーは、本疾患の治療のモニタリングにも有用であり、治療的介入の標的としても使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
子宮内膜症は一般的な婦人科疾患であり、人体の様々な部位や組織において、子宮内膜または子宮内膜様間質細胞が子宮の外部に見いだされる。これらの部位は非常に多く、骨盤浸潤（表面的であるか深部に浸潤している）から卵巣嚢胞（子宮内膜腫としても知られる）、膣、外陰部、腸および膀胱浸潤、皮膚および瘢痕病変、ならびにリンパ系、脳および肺病変（これらは稀であるが）まで多種多様である。子宮内膜または子宮内膜様間質細胞は、人体のいかなる部位においても見つけ出される可能性があり、非特異的な兆候および症状を伴って見つかる。子宮内膜症の症状は千差万別であり、非常に多くの身体的および心理社会的共存症の原因となり、また患者の生活の質を大きく制限する骨盤痛などの痛み、月経困難症、性交疼痛症、排便障害、排尿障害、倦怠感および不妊にまで及ぶ（Strathy et al, Fertil Steril. 1982;38(6):667-672）。子宮内膜症は、慢性の、場合によりホルモン反応性の疾患であり、侵された組織に潜在的に瘢痕や線維症を残しながら再発する。
【０００３】
子宮内膜症は、ほとんどの場合、生殖可能期間の女性にほぼ例外なく見つかる。診断時の平均年齢は25〜29歳であるが、疾患診断の遅れが推定されており、１つの多施設臨床試験（Nnoaham et al, Fertil Steril. 2011;96(2):366-373 e368）においては約6.7年の遅れと見積もられている。米国での研究では平均11.7年の診断の遅れが報告されており、英国での研究では診断遅延は8年と推定されている（Hadfield et al, Hum Reprod. 1996;11(4):878-880）。本疾患自体は、出産年齢にある女性の約5%〜15%に影響を及ぼしているが、有病率は集団間で変動する。世界的には7000万人以上の女性に影響を与えていると推定されている（Endometriosis Research Center. Understanding endometriosis: past present and future. The National women's health information council; 2005）。診断出現率は、アフリカで26.4%（95% CI: 20〜32.7%）、南米諸国で54.5%（95% CI: 44.2〜64.7%）と見積もられている（Nnoaham et al, Human Reproduction. 2010;25(suppl 1):i9-i11）。子宮内膜症は、妊娠可能な女性の0.5〜5%に、また不妊女性の25〜40%に広まっており、不妊症の主な原因となっている（Augoulea et al, Gynecol Endocrinol. 2009;25(2):75-81およびMissmer SA & Cramer DW. Obstet Gynecol Clin North Am. 2003;30(1):1-19, vii）。ノルウェーでの１つの研究において、生涯有病率は2.2%であることが示された（Moen MH & Schei B. Acta Obstet Gynecol Scand. 1997;76(6):559-562）。
【０００４】
本疾患の明らかな原因要素はないが、疾患に関連する危険因子は多様であり、年齢（初経前および閉経後は稀である）、社会階級および人種が示唆されている（上流階級では発生率が増加する）（Risk factors for pelvic endometriosis in women with pelvic pain or infertility. Gruppo Italiano per lo Studio dell' endometriosi. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 1999;83(2):195-199）。複数の妊娠およびジエチルスチルベストロールへの子宮内暴露（Missmer et al, Fertil Steril. 2004;82(6):1501-1508）、不妊（Parazzini et al, J Epidemiol Community Health. 1995;49(1):61-64）、少ない経産回数（Parazzini et al, J Epidemiol Community Health. 1995;49(1):61-64）、経口避妊薬使用および開始年齢または経口避妊薬の中止（Missmer et al, Obstet Gynecol. 2004;104(5 Pt 1):965-974）、家族歴（Moen MH & Magnus P. Acta Obstet Gynecol Scand. 1993;72(7):560-564およびMoen MH. Acta Obstet Gynecol Scand. 1994;73(1):59-62）、喫煙（Vessey et al, BMJ. 1993;306(6871):182-184）、ダイエット（Missmer SA & Cramer DW. Obstet Gynecol Clin North Am. 2003;30(1):1-19, vii）、運動（Vitonis et al, Epidemiology. 2010;21(1):16-23）、肥満度指数（Sangi-Haghpeykar H & Poindexter AN, 3rd. Obstet Gynecol. 1995;85(6):983-992）、ダイオキシン（Koninckx et al, Hum Reprod. 1994;9(6):1001-1002）、免疫疾患歴（Sinaii et al, Hum Reprod. 2002;17(10):2715-2724）、非ホジキンリンパ腫との関連（Matalliotakis et al, J BUON. 2009;14(4):699-701）、色素形質との関連（Kvaskoff M et al, Int J Epidemiol. 2009;38(4):1143-1153）、メラノーマとの関連（Hornstein et al, Hum Reprod. 1997;12(1):143-145）、ならびに卵巣がん（漿液性がん、粘液性がん、類内膜がん、明細胞がん、その他のサブタイプのがん）および子宮内膜がんとの関連が発表されている。食事、運動および家族の遺伝的形質との関連を記述したほとんどの研究は、証拠が矛盾しており、決して明確ではない。
【０００５】
因果関係学説はそれぞれ支持または反論する文献によって異なる。学説には、上皮内進行mullerianosis（Signorile et al, J Exp Clin Cancer Res. 2009;28:49）、生殖管異常による強調（Sanfilippo et al, Am J Obstet Gynecol. 1986;154(1):39-43）、遺伝性素因（Simpson et al, Obstet Gynecol Clin North Am. 2003;30(1):21-40, vii）、体腔上皮化生（Cullen TS. Adenomyoma of the Uterus. WB Saunders. Philadelphia; 1908）、誘導（Levander G & Normann P. Acta Obstet Gynecol Scand. 1955;34(4):366-398）、移植（Javert CT. Cancer. 1949;2(3):399-410）、逆行性月経（Sampson JA. Am J Pathol. 1927;3(2):93-110 143）、子宮内膜幹細胞（Gargett CE. Hum Reprod Update. 2007;13(1):87-101）、生理現象（Donnez J et al, Obstet Gynecol Clin North Am. 2003;30(1):83-93, viii）、子宮内膜変化（Garai et al, Front Biosci. 2006;11:595-619）、外因性子宮内膜ホルモン産生（Noble et al, J Clin Endocrinol Metab. 1996;81(1):174-179）、血管新生（Taylor RN & Yu J, Torres PB, et al. Reprod Sci. 2009;16(2):140-146）、免疫機構からの子宮内膜組織の回避（Oosterlynck et al, Fertil Steril. 1991;56(1):45-51）、アポトーシスからの細胞保護（Vinatier  et al, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2001;96(1):21-34およびTabibzadeh et al, Hum Reprod. 1996;11(3):633-640）、子宮内膜が埋め込まれる可能性（Lessey et al, J Clin Endocrinol Metab. 1994;79(2):643-649）および侵入する可能性（Sharpe-Timms et al, Fertil Steril. 1998;69(6):1128-1134）、ならびに腹水の相違（McLaren et al, Hum Reprod. 1997;12(6):1307-1310）が含まれる。
【０００６】
子宮内膜症の診断は、医師の注意と知識、患者病歴、診察での臨床症状／兆候および放射線医学の利用（子宮内膜腫または肉眼的病変を評価するための経膣的および経腹壁的超音波検査を含む）の組み合わせである。MRI およびCTスキンは深部病変のために使用され、最も多く使用される血清マーカーは非特異的CA125であるが、これは疾患の存在および重症度との相関性が乏しい。文献で報告されているバイオマーカーは、サイトカインの利用、非サイトカイン、血清および子宮内膜バイオマーカー、組織中の神経線維の存在（Al-Jefout et al, Hum Reprod. 2009;24(12):3019-3024）、遺伝子異常およびmiRNAに及ぶ。しかしながらこれらのどれも現在使用されておらず、臨床背景において実証されていない。
【０００７】
2-DIGEおよびSELDI-TOF MS技術を用いる、子宮内膜および患者血液のプロテオーム解析の想定的な使用がある（非特許文献１〜４）。今までのところ、これからバイオマーカーは同定されていない。SELDI TOF MSを用いた末梢血の研究で、子宮内膜症で変化したタンパク質が報告されている（非特許文献５〜９）。しかしながら、これらのどれも、臨床の場における使用に対して十分な感度と特異性を与えていない。
【０００８】
子宮内膜腹膜病変の診断と治療の代表的なものは、侵襲的な外科的腹腔鏡検査であり、病変の視覚化を可能にする。子宮内膜症は、ジアテルミーまたは／および腹膜および／または嚢胞剥離により取り除かれる。これには相当の患者の罹患率と場合により相当の死亡率が伴う。
【０００９】
早期の非侵襲的検査は、疾患の早期の診断と治療を可能にし、疼痛、瘢痕化、精神的トラウマおよび不妊を含む疾患の慢性的な影響を防止し、手術の結果としての患者の罹患率と死亡率を減少させ、また治療と管理に対する疾患の反応のモニタリングを可能とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kyama et al, Fertil Steril. 2011;95(4):1338-1343 e1331-1333
【非特許文献２】Kyama et al, Fertil Steril. 2006;86(1):203-209
【非特許文献３】Fassbender et al, Reprod Biol Endocrinol. 2010;8:123
【非特許文献４】Fassbender et al, Obstet Gynecol. 2012;119(2 Pt 1):276-285
【非特許文献５】Jing J, et al, Fertil Steril. 2009;92(4):1221-1227
【非特許文献６】Liu et al, Fertil Steril. 2007;87(4):988-990
【非特許文献７】Seeber et al, Fertil Steril. 2010;93(7):2137-2144
【非特許文献８】Wolfler et al, Fertil Steril. 2009;91(6):2331-2337
【非特許文献９】Zhang et al, Chin Med J (Engl). 2009;122(4):373-376
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
子宮内膜症の非侵襲的診断を可能にする、優れた特異性と感度を有する新規の、または改良されたインビトロ検査が必要である。本発明の目的は、子宮内膜症の診断に対して、例えばインビトロ検出技術を用いて、さらなる、また改良されたバイオマーカーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、子宮内膜症と特定のタンパク質および低分子非翻訳性miRNAのレベルの上昇または減少との間の相関の同定に基づく。
【００１３】
本発明では、その発現プロファイルから、被験者が子宮内膜症であることを示すのに使用することができるmiRNAを特定した。子宮内膜症である被験者および子宮内膜症ではない被験者において、3種類のmiRNAが有意に異なるレベルで存在する。したがって、これらのmiRNAの存在または非存在、および／またはそれらのレベルの経時的な変化の検出は、被験者が子宮内膜症であること、または将来子宮内膜症を発症する可能性を有することを示すのに用いることができる。これらのmiRNAは、子宮内膜症のバイオマーカーとして機能する。
【００１４】
また発明者らは、それに対する自己抗体のレベルが、被験者の子宮内膜症を示すのに用いることができる抗原を同定した。これらの抗原に対する自己抗体は、子宮内膜症である被験者および子宮内膜症ではない被験者において有意に異なるレベルで存在する。したがって、これらの自己抗体の存在または非存在の検出および／またはそれらのレベルの経時的な変化の検出は、被験者が子宮内膜症であることを示すのに用いることができる。また自己抗体およびその抗原は、子宮内膜症のバイオマーカーとして機能する。
【００１５】
被験者の検体において、これらのバイオマーカーの検出は、子宮内膜症の診断、予後診断およびモニタリングを改善するのに用いることができる。有利には、本発明は子宮内膜症と他の病型の腹腔内炎症とを区別するのに用いることができる。
【００１６】
発明者らは、そのような343種のバイオマーカーを特定した（表１）。また本発明では、バイオマーカーのレベルを測定することにより子宮内膜症の診断を支援するため、これらの少なくとも1種を使用する。バイオマーカーはたんぱく質またはmiRNAである。タンパク質バイオマーカーは、（i）表１に記載の抗原に結合する自己抗体、および／または（ii）表１に記載の抗原であるが、前者が好ましい。
【００１７】
本発明は、被験者の検体を分析する方法を提供する。該方法は、検体中の、表１に記載のバイオマーカーのレベルを測定するステップを含み、バイオマーカーのレベルは、被験者が子宮内膜症であるかどうかの診断上の指標を与える。
【００１８】
表１に記載の単一のバイオマーカーの分析は実行することができ、また自己抗体／抗原またはmiRNAの検出は、表１に記載の他のいずれかのバイオマーカーを考慮しない場合でも、子宮内膜症に対する有用な診断指標を提供することができる。
【００１９】
しかしながら、診断の感度と特異性は、複数のバイオマーカーに対するデータを組み合わせることにより改善することができる。したがって、表１に記載のバイオマーカーの2種以上を分析することが好ましい。2種以上の異なるバイオマーカー（パネル）の分析は、単一のバイオマーカーの分析と比べて、診断の感度および／または特異性を高める。パネルのそれぞれ異なるバイオマーカーは、表１の異なる列に示される。例えば、表１に記載の抗原に結合する自己抗体と抗原自体の両方を測定することは、パネルの測定ではなく、単一のバイオマーカーの測定である。
【００２０】
発明者らは、タンパク質バイオマーカーおよびmiRNAバイオマーカーからの情報の組み合わせは、感度、特異性および／または受信者動作特性（ROC）曲線下面積を測定することで、診断有用性を増大させることを見いだした。したがって、本発明では、子宮内膜症の診断を支援するため、表１より少なくとも1種のタンパク質バイオマーカーおよび表１より少なくとも1種のmiRNAバイオマーカーを使用することが好ましい。
【００２１】
本発明は、被験者の検体を分析する方法を提供する。該方法は、表１に記載のｘ種の異なるバイオマーカーのレベルを測定するステップを含み、バイオマーカーのレベルは、被験者が子宮内膜症であるかどうかの診断上の指標を与える。ｘの値は2以上であり、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15またはそれ以上（例えば最大で343まで）である。これらのパネルは、（i）表１の343種のバイオマーカーのいずれか具体的な1種と、（ii）表１の他の342種のいずれかとの組み合わせを含んでもよい。好ましくは、パネルには、表１から少なくとも1種のタンパク質バイオマーカー（例えば、自己抗体または抗原）および表１から少なくとも1種のmiRNAバイオマーカーを含める。好ましくは、パネルは、表１からのタンパク質バイオマーカーのみ（例えば、自己抗体または抗原）を含む。好ましくは、パネルは、表１からのmiRNAバイオマーカーのみを含む。
【００２２】
適切なパネルは以下に記載する。特に興味が持たれるパネルは、表１１〜１５に記載のパネルを含む。好ましいパネルは2〜6種のバイオマーカーを有し、6種を超えるバイオマーカーの使用は、感度および特異性に付加するものはほとんどない。
【００２３】
表１のバイオマーカーは、1種以上の（a）自己抗体、抗原またはmiRNAであってもよい子宮内膜症に対する既知のマーカー；および／または（b）被験者に関する他の情報であって、被験者の検体から得られる情報、例えば、年齢、遺伝子型（遺伝的変異は自己抗体プロファイルに影響し（Pappworth et al. (2009) Mol Immunol 46:1042-9）、子宮内膜症の遺伝的特徴の解明は著しく進歩した（Guerra et al. (2012) Arthritis Res Ther. 29;14(3):21）。）、体重、他の臨床関連データまたは表現型情報；および／または（c）子宮内膜症に対する他の臨床検査または臨床指標と組み合わせて使用することができる。かかる組み合わせは、診断の感度および／または特異性を高める。特に興味がもたれる既知の子宮内膜症バイオマーカーには、CA125、CA19-9および／または表５に記載のいずれかの抗原に対する自己抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明は、被験者の検体を分析する方法を提供する。該方法は、下記を測定するステップを含む：
（ａ）表１に記載のｙ種のバイオマーカーのレベル；ここで該バイオマーカーのレベルは、被験者が子宮内膜症であるかどうかの診断指標を与える；および、以下の１つ以上：
（ｂ）被験者からの検体が、CA125、CA19-9および／または表５に記載のいずれかの抗原（および任意に他の既知のバイオマーカー、例えば上記参照）に対する自己抗体から成る群より選ばれる既知のバイオマーカーを含むかどうか；ここで該既知のバイオマーカーの検出は、被験者が子宮内膜症であるかどうかの第２の診断指標を与える；
（ｃ）被験者の年齢および／または性別、
および、被験者が子宮内膜症であるかどうかの集計診断指標を与えるための、異なる診断指標（ならびに任意に年齢および／または性別）との組み合わせ。
【００２５】
上記（ａ）および（ｂ）で用いられる検体は、同一または相違してもよい。
【００２６】
ｙの値は1以上であり、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15（例えば最大で343まで）である。ｙが1を超える場合、本発明では表１に記載の種々のバイオマーカーのパネルを用いる。ｙが1を超える場合、好ましくは、パネルには、表１から少なくとも1種のタンパク質バイオマーカー（例えば、自己抗体または抗原）および表１から少なくとも1種のmiRNAバイオマーカーを含める。
【００２７】
また本発明は、被験者が子宮内膜症であるかどうかを診断する方法において、被験者からの検体について、表１に記載のｙ種のバイオマーカーのレベルを測定することから成る改良を提供する。ここで、該バイオマーカーレベルは、被験者が子宮内膜症であるかどうかの診断指標を与える。表１のバイオマーカーは、上記のように、既知の子宮内膜症バイオマーカーと組み合わせて使用することができる。
【００２８】
本発明は、被験者を子宮内膜症であると診断する方法も提供する。該方法は、（i）被験者の検体中の、表１に記載のｙ種のバイオマーカーのレベルを測定するステップ；および（ii）ステップ（i）での測定値と、子宮内膜症ではない被験者の検体および／または子宮内膜症の被験者の検体から得られたデータとを比較するステップを含み、比較することにより、被験者が子宮内膜症であるかどうかの診断指標が与えられる。以下でさらに詳しく述べるように、ステップ（ii）における比較では、分類器アルゴリズムを使用することができる。ステップ（i）で測定されたバイオマーカーは、上記のように、既知の子宮内膜症バイオマーカーと組み合わせて使用することができる。
【００２９】
また本発明は、被験者における子宮内膜症の進行を監視する方法を提供する。該方法は、（i）被験者から初回に採取された最初の検体中の、表１に記載のｚ１種のバイオマーカーのレベルを測定するステップ；および（ii）被験者から第２回に採取された２番目の検体中の、表１に記載のｚ2種のバイオマーカーレベルを測定するステップを含む。ここで：（ａ）第２回は初回以後であり；（ｂ）1種以上のｚ2バイオマーカーが最初の検体中に存在し；および（ｃ）初回の検体と比較した２番目の検体中のバイオマーカーのレベルの変化は、子宮内膜症が寛解しているのかまたは進行しているのかを示す。したがって、本方法は、レベルの変化に伴って該疾患が好転しているのかまたは悪化しているのかを示すバイオマーカーを経時的にモニタリングする。
【００３０】
疾患の進行は、疾患の改善または悪化のいずれかであり、本方法は、例えば疾患の自然な経過をモニタリングするため、または被験者に施された治療の効果をモニタリングするためなど、様々な形で使用してよい。したがって被験者は治療薬を受けてもよく、または、前記初回の最初の検体採取の前に、もしくは初回と第２回との間に子宮内膜症を取り除くための外科手術を受けてもよい。特定の自己抗原に対する自己抗体のレベルが上がることは、抗体反応が既に高まった抗原に対して付加的な抗体または抗体クラスが高まる「エピトープ拡散」に起因している可能性がある（Vanderlugt&Miller (1996) CurrOpinImmunol. 8:831-6）。
【００３１】
ｚ１の値は1以上であり、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15（例えば最大で343まで）である。ｚ２の値は1以上であり、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15（例えば最大で343まで）である。ｚ１およびｚ２の値は同一でもよく、また異なっていてもよい。これらが異なる場合、後の分析（ｚ２）は先の分析で既に検出しているバイオマーカーに着目するため、通常ｚ１＞ｚ２である；しかしながら他の実施形態において、例えば、前のデータが拡大されたパネルを使用すべきことを示す場合、ｚ２はｚ１より大きくてもよい；他の実施形態において、ｚ１＝ｚ２であれば、便宜上、両方の分析に同じパネルを使用することができる。ｚ１＞1またはｚ２＞1である場合、バイオマーカーは異なるバイオマーカーである。ｚ１種および／またはｚ２種のバイオマーカーは、上記のように、既知の子宮内膜症バイオマーカーと組み合わせて使用することができる。
【００３２】
本発明は、被験者における子宮内膜症の進行をモニタリングする方法を提供する。該方法は、（i）被験者から初回に採取された最初の検体中の、表１に記載の少なくともｗ１種のバイオマーカーのレベルを測定するステップ；および（ii）被験者から第２回に採取された２番目の検体中の、表１に記載の少なくともｗ２バイオマーカーのレベルを測定するステップを含む。ここで：（ａ）第２回は初回以後であり；（ｂ）少なくとも1種のバイオマーカーは、ｗ１種およびｗ２種のバイオマーカーの両方に共通しており；（ｃ）ｗ１種およびｗ２種のバイオマーカーの両方に共通する少なくとも1種のバイオマーカーのレベルは、最初および２番目の検体中で異なっており、それによって、子宮内膜症が進行しているのかまたは寛解しているのかを示す。したがって、本方法は、経時的にバイオマーカーの範囲をモニタリングし、疾患がさらに悪化していることを示すバイオマーカーの検出数を拡大する。上記のように、本方法は、様々な方法で疾患の進行をモニタリングすることに用いることができる。
【００３３】
ｗ１の値は1以上であり、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15（例えば最大で343まで）である。ｗ２の値は2以上であり、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15（例えば最大で343まで）である。ｗ１およびｗ２の値は同一でもよく、また異なっていてもよい。これらが異なる場合、先の分析で既に検出している数と少なくとも同程度の広がりがあるバイオマーカーパネルに着目するため、通常ｗ２＞ｗ１である。ｗ１種およびｗ２種のバイオマーカー間には通常重複があるが（これらが同じであり、２つの時間ポイントで同じバイオマーカーが測定されるという状況を含む）、ｗ１種およびｗ２種が共通するバイオマーカーを持たないことも可能である。ｗ１種および／またはｗ２種バイオマーカーは、上記のように、既知の子宮内膜症バイオマーカーと組み合わせて使用することができる。
【００３４】
本方法が初回と第２回に伴う場合、これらの機会は少なくとも１日、１週、１ヵ月または１年異なる。検体は定期的に採取してもよい。本方法は、２つの時間ポイントを超えて採取された、2個を上回る検体のバイオマーカーの測定を伴う。すなわち、第３回の検体、第４回の検体、第5回の検体などがあってもよい。
【００３５】
本発明は、子宮内膜症の診断に用いる診断装置を提供する。ここで本装置は、表１に記載のｙ種のバイオマーカーのレベルの測定を可能にする。ｙの値は上記に定義される。また本装置は、検体が、1種以上の上記した既知の子宮内膜症バイオマーカーを含むかどうかの決定を可能にする。
【００３６】
本発明は、（i）本発明の診断装置、および（ii）表１のバイオマーカーのｙ種を検出する本装置を使用するための取扱説明書を含むキットを提供する。ｙの値は上記に定義される。本キットは子宮内膜症の診断に有用である。
【００３７】
本発明は、表１に記載の異なるｘ種のバイオマーカーのレベルを測定する試薬を含むキットを提供する。本キットは、検体が、1種以上の上記した既知の子宮内膜症バイオマーカーを含むかどうかの決定を可能にする試薬も含む。ｘの値は上記に定義される。本キットは子宮内膜症の診断に有用である。
【００３８】
本発明は、本発明の診断装置を使用可能にする構成要素を含むキットを提供する。例えば、本キットは、ｘ種の異なるバイオマーカーに対する個々の検出試薬を含み、これらｘ種のバイオマーカーの配列を用意することができる。
【００３９】
本発明は、（i）表１に記載のｘ種の異なるバイオマーカーの測定を可能にする、1種以上の検出試薬、および（ii）被験者からの検体を含む製品を提供する。
【００４０】
本発明は、（i）検体に帰するデータであって、表１に記載のｙ種のバイオマーカーの測定結果を含むデータにアクセスするプログラム、および（ii）検体中のｙ種のバイオマーカーのレベルを表示するために、データを評価するためのアルゴリズムを実行するプログラムを含むソフトウェア製品を提供する。また本ソフトウェア製品は、（iii）ステップ（ii）の結果を評価し、被験者が子宮内膜症であるかどうかの診断指標を与えるためのアルゴリズムを実行するプログラムを含んでもよい。以下に述べるように、（iii）の一部における使用のために適切であるアルゴリズムは、サポートベクターマシンアルゴリズム、人工的神経回路網、ツリーベース法、遺伝的プログラミングなどを含む。アルゴリズムは、好ましくは、（ii）の一部のデータを分類し、被験者から採取された検体中の測定されたバイオマーカーレベルに基づき、子宮内膜症の被験者とそうではない被験者を区別する。また本発明は、かかるアルゴリズムの学習のための方法を提供する。上記のように、ｙ種のバイオマーカーは、既知の子宮内膜症バイオマーカーと組み合わせて使用することができる。
【００４１】
本発明は、本発明のソフトウェア製品を読み込みおよび／または実行するコンピューターを提供する。
【００４２】
本発明は、本発明の方法による結果を伝達する方法にまで及ぶ。この方法は、分析結果および／または診断結果を伝達することを含む。かかる伝達は、例えば、技術者、医師または患者に対するものである。一実施形態において、本発明の検出方法は一国で実施することができ、その結果は、異なる国の受取人に伝達することができる。
【００４３】
本発明は、表１に記載の抗原の１つを認識する、単離された抗体（好ましくはヒト抗体）を提供する。また本発明は、その抗体の重鎖および／または軽鎖をコード化している、単離された核酸を提供する。また本発明は、該核酸および該ベクターを含む宿主細胞から成るベクターを提供する。また本発明は、抗体産生を可能とする条件下での宿主細胞の培養を含む、抗体の発現方法を提供する。また本発明は、ヒト抗体の誘導体を提供する。例えば、F(ab')2およびF(ab)フラグメント、Fvフラグメント、一本鎖Fv分子（scFv）などの一本鎖抗体、ミニボディ（minibody）、dAbsなどである。
【００４４】
本発明は、子宮内膜症のバイオマーカーとして、表１に記載のバイオマーカーの使用を提供する。
【００４５】
本発明は、子宮内膜症のバイオマーカーとして、表１に記載のｘ種の異なるバイオマーカーの使用を提供する。ｘの値は上記に定義される。これらは、（i）表１に記載の343種のバイオマーカーのいずれか具体的な1種を、表１に記載の他の342種のバイオマーカーのいずれかと組み合わせて含んでもよい。好ましくは、本発明は、表１から少なくとも1種のタンパク質バイオマーカー（例えば、自己抗体または抗原）および表１から少なくとも1種のmiRNAバイマーカーを使用する。好ましくは、パネルは、表１からのタンパク質バイオマーカーのみ（例えば、自己抗体または抗原）を含む。好ましくは、パネルは、表１からのmiRNAバイオマーカーのみを含む。
【００４６】
本発明は、（ａ）表１より少なくともｙ種のバイオマーカー、および（ｂ）CA125、CA19-9および／または表５のいずれかの抗原（任意に、その他の既知のバイオマーカー、例えば上記参照）に対する自己抗体を含むバイオマーカーの、子宮内膜症のための組み合わせたバイオマーカーとしての使用を提供する。ｙの値は上記に定義される。ｙ＞1の場合、本発明は、本発明のバイオマーカーのパネルを用いる。ｙ＞1の場合、好ましくは、パネルは、少なくとも1種の表１に記載のタンパク質バイオマーカー（例えば、自己抗体または抗原）および少なくとも1種の表１に記載のmiRNAバイオマーカーを含む。かかる組み合わせは、上記で述べたものを含む。特に興味深いパネルは、表１０〜１５に記載されたものを含む。
【００４７】
〔本発明のバイオマーカー〕
抗原
本発明では、121種の異なるヒト抗原（表１に記載）に対する自己抗体を特定したが、これらは子宮内膜症のバイオマーカーとして使用することができる。121種の抗原のさらなる詳細は、表２に示される。121種の抗原のうち、表６および７に記載されたヒト抗原は、子宮内膜症の被験者からの検体と子宮内膜症ではない被験者からの検体とを区別するのに特に有用である。追加的な自己抗体バイオマーカーは、これらの121種に加えて使用することができる（例えば、表５に記載のバイオマーカーのいずれか）。
【００４８】
配列リストは、これらの抗原の天然コード配列の実例を提供する。しかしながら、これらの具体的なコード配列は本発明を限定せず、自己抗体バイオマーカーは、これらの天然配列によりコード化されたポリペプチド変異体（例えば、対立遺伝子多型、多形相、突然変異体、スプライス変異または遺伝子融合）を認識する。これは、この変異体が、自己抗体により認識されるエピトープを有する場合である。ヒト遺伝子の対立遺伝子多型または突然変異の詳細は、アルフレッド（ALFRED）データベース（Cheung et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):361-3. http://alfred.med.yale.edu/alfred/）、または、疾患関連性において、OMIM（McKusick (1998) Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders. Baltimore: Johns Hopkins University Press, 1998 (12th edition). See also http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/）およびHGMD（Stenson et al. (2009) Genome Med 1:13）データベースなどの種々の情報源から入手できる。ヒト遺伝子のスプライス変異体の詳細は、ASDなどの種々の情報源から入手できる（Stamm et al. (2006) Nucleic Acids Res 34: D46-D55）。
【００４９】
miRNA
本発明では、222種の個々のヒトmiRNA（表１に記載）を特定し、これらは子宮内膜症のバイオマーカーとして使用することができる。これらmiRNAに関する詳細は、表３および表４に示される。222種のmiRNAの中で、表８、９および１６〜２１に記載のmiRNAは、子宮内膜症の被験者からの検体と子宮内膜症ではない被験者からの検体とを区別するのに特に有用である。
【００５０】
好ましくは、本発明は、表９および１６〜１８に記載されたmiRNAのいずれかを使用する。
【００５１】
好ましくは、本発明は、ebv-miR-BART2-5p、hsa-let-7f、hsa-let-7g、hsa-miR-1260、hsa-miR142-3p、hsa-miR-197、hsa-miR-215、hsa-miR-223、hsa-miR-30b、hsa-miR-320c、hsa-miR34a、hsa-miR-497、hsa-miR-630、hsa-miR-663およびhsa-miR-720から成る群に含まれるmiRNAのいずれかを使用する。
【００５２】
表３および４に記載された具体的な配列は、本発明をなんら限定しない。本発明は、これらmiRNAの多形変異体のレベルを検出し、測定することを含む。明細書に記載されたmiRNAをより詳細に概説したデータベースが入手可能である：MiRBase（Griffiths-Jones (2004) Nucleic Acid Res 32(Database Issue):D109-11、Griffiths-Jones et al. (2006) Nucleic Acid Res 34 (Database Issue):D140-4、Griffiths-Jones et al. (2008) Nucleic Acid Res 36 (Database Issue):D154-8およびKozomara & Griffiths-Jones (2011) Nucleic Acid Res 39 (Database Issue):D152-7. http://www.mirbase.org/）、または、標的予測に関して、DIANA-microT（Maragkakis et al. (2009) Nucleic Acid Res 37 (Web Server Issue):W273-6およびMaragkakis et al. (2011) Nucleic Acid Res 39 (Web Server Issue):W145-8. http://diana.cslab.ece.ntua.gr/DianaTools/index.php?r=microtv4/index）、microRNA.org（Betel et al. (2008) Nucleic Acid Res 36 (Database Issue):D149-53. http://www.microrna.org/microrna/home.do）、miRDB（Wang & El Naqa (2008) Bioinformatics 24:325-32およびWang (2008) RNA 14:1012-7. http://mirdb.org/miRDB/index.html）、argetScan（Grimson et al. (2007) Mol Cell 27:91-105. http://www.targetscan.org/vert_50/）およびPicTar（Krek et al. (2005) Nat Genet 37:495-500. http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrate.cgi）の各データベースである。
【００５３】
上記の通り、表１に記載の単一のバイオマーカーの検出は、有用な診断情報を与えるが、各バイオマーカーは、個々には情報を与えない可能性がある。すなわち、表１に記載の抗原に対する自己抗体が、子宮内膜症の被験者の一部には存在するが、全員にではないというように有用である。単一のバイオマーカーでは被験者全員に共通する診断結果を与えることができないことは、このバイオマーカーが診断的有用性を持たないということを意味するのではない。むしろ、できないということは、検査結果（すべての診断検査として）は適切に理解され、解釈されるべきということを意味する。
【００５４】
単一のバイオマーカーが普遍的な診断結果を与えない可能性に対処するため、また、分析が、患者集団全体で高感度で特異的な結果を与えるという全般的な信頼性を増すため、複数の表１に記載のバイオマーカー（すなわちパネル）を分析することは有利である。例えば、表１に記載の特定の抗原に対する陰性シグナルは、必ずしも子宮内膜症がないことを示すわけではなく、陰性の結果数が増加するにつれて、被験者の子宮内膜症が増加しないという確かさを示すわけではない。例えば、343種すべてのバイオマーカーが検査され、陰性であった場合、その結果は、1種のバイオマーカーのみが検査され、陰性であった場合より、より高い確かさを与える。したがって、バイオマーカーパネルは、疾患検体と非疾患検体との間に見られる差異を強めることに対して最も有用である。
【００５５】
上記のように、より多くのバイオマーカーを測定することの負担が、より優れた感度または特異性という利益に結び付かないことが多いので、好ましいパネルは、2〜6種のバイオマーカーを有する。
【００５６】
発明者らは、タンパク質バイオマーカーおよびmiRNAバイオマーカーからの情報の組み合わせは、感度、特異性および／または受信者動作特性（ROC）曲線下面積を測定されるように、診断能力を改善することを見いだした。したがって、本発明では、子宮内膜症の診断を支援するため、表１より少なくとも1種のタンパク質バイオマーカーおよび表１より少なくとも1種のmiRNAバイオマーカーを使用することが好ましい。
【００５７】
適切なパネルは以下に与えられ、表１１〜１５に記載される。
【００５８】
本発明のある種のバイオマーカーは、子宮内膜症の検体において、対照と比較して、異なる相対的な差次的発現プロファイルを有する。これらのバイオマーカーの組み合わせは、同じ対照検体と比較して、１つのバイオマーカーは発現増加しており、他のバイオマーカーは発現減少しているというように、子宮内膜症を診断または予知するのに有用な方法を提供する。例えば、発明者らは、ebv-miR-BART2-5pが、非子宮内膜症検体（陰性対照）に対し、子宮内膜症の検体で発現増加しており、hsa-miR-564では、非子宮内膜症検体（陰性対照）に対し、子宮内膜症の検体で発現減少しているというように、この組み合わせが有用であることを見いだした。この互いに異なる挙動は、バイオマーカーの組み合わせが同一の検体について評価される場合、子宮内膜症の診断または予知を強化する。
【００５９】
〔被験者〕
本発明は、単独または被験者に関する他の測定結果もしくはデータと組み合わせて、被験者について疾患の診断のために用いられる。
【００６０】
被験者は、子宮内膜症の発症前でもよく、または、骨盤痛、月経困難症、性交疼痛症、排便障害、倦怠感および不妊などの臨床症状を既に示していてもよい。発症前の被験者に対して、本発明は、予防的処置を取らなければ、将来、症状が発現する可能性を予測するのに有用である。臨床症状を既に示している被験者に対しては、本発明は、他の診断結果を確認し、決定することに用いることができる。被験者は、子宮内膜症の治療を既に始めていてもよい。
【００６１】
一実施形態において、被験者は、家系や遺伝的連関などによって、子宮内膜症になる素因があることが既に分かっていてもよい。他の実施形態において、被験者は、かかる素因を有さなくてもよく、特定の化学物質（毒素、薬剤など）への暴露の結果、ダイエットの結果、また感染の結果など、環境因子の結果として本疾患を発症してもよい。
【００６２】
被験者は通常ヒトであるが、一実施形態において、本発明は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、ウシまたは非ヒト霊長類（サルまたはマカクもしくはチンパンジーなどの類人猿）など、ヒト以外の哺乳類において有用である。非ヒトの実施形態において、本発明で使用されるすべての検出抗体は、通常、本明細書で開示されるヒト自己抗体の、関連する非ヒトオルソログに基づく。一実施形態において、特定のバイオマーカーに関して、治療における効果を観察するため、動物を実験的に使用することができる。
【００６３】
〔検体〕
本発明は、被験者からの検体を分析する。多種類の検体は、本発明による検出に適した自己抗体および／または抗原、またはmiRNAを含む。検体は、例えば子宮または膣組織の部位からの組織検体でもよい。または、検体は、子宮頸管分泌または腹水などの体液検体でもよい。
【００６４】
一実施形態において、本発明の方法は、被験者からの検体を得るステップを含む。しかしながら他の実施形態において、検体は、本発明の方法とは別に、また本発明を実施する前に得られる。
【００６５】
本発明によるバイオマーカーの検出は、被験者から採取された検体について直接行われるか、または、検体は、被験者からの採取と分析との間に処理されてもよい。例えば、血液検体を、細胞を除き、抗体を含む血漿を分析に供してもよく、または、細胞および種々の凝固因子の除き、抗体を含む血清を分析に供してもよい。体液検体（例えば血液検体）は、血中の子宮内膜細胞を抽出し、分析するために処理することができる。種々の検体は、被験者からの採取と分析との間で、希釈、等分、二段抽出、加熱、凍結、照射などの処理をしてもよい。種々の検体タイプに対して処理試薬を添加すること、例えば血液検体に抗凝固剤を添加することは、代表的なことである。
【００６６】
〔バイオマーカーの検出〕
自己抗体の検出
本発明は、検体中の、表１に記載の抗原に結合する自己抗体のレベルを測定することを含む。特定の抗原に対する抗体を検出する免疫化学的手法は、特異的な抗原自体を検出するための手法として当該技術分野で周知である。抗体の検出は、通常、検体と検出抗原との接触を含み、ここで、検体と検出抗原との間の結合反応は、着目する抗体の存在を示す。抗原の検出は、通常、検体と検出抗体とを接触させることを含み、検体と検出抗体との間の結合反応は、着目する抗原の存在を示す。抗原の検出は、抗原の種類によって非免疫学的方法により測定してもよい。例えば、抗原が酵素であれば、その酵素活性を評価することができ、または、抗原が受容体であれば、結合活性を評価することができる等である。例えば、CLK1キナーゼは、当該技術分野で周知の方法で評価することができる。
【００６７】
検出抗原は、自己抗体で認識される天然の抗原であり（例えば、表１に開示された成熟したヒト・タンパク質）、または、自己抗体により認識されるエピトープを含む抗原でもよい。検出抗原がポリペプチドである場合、そのポリペプチドが本発明の自己抗体に特異的に結合する能力があれば、そのアミノ酸配列は、上記に開示した天然の配列と異なってもよい（すなわち、結合が非特異的ではないと、検出抗原は検体中の抗体へ任意に結合しない。）。そのポリペプチドが、天然の配列と共通点がほとんどなくてもよい（例えば、ミモトープ、アプタマーなど）。しかしながら検出抗原は、一般的に、（i）明細書中で開示した関連するSEQ ID NO（すなわち、SEQ ID NO：1〜121のいずれか）と、検出抗原の全長にわたって少なくとも90%（例えば、≧91%、≧92%、≧93%、≧94%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%）の配列同一性を有する、および／または（ii）明細書中で開示した関連するSEQ ID NO（すなわち、SEQ ID NO：1〜121のいずれか）から、少なくとも１つのエピトープを含むアミノ酸配列から成る。したがって検出抗原は、上記のように変異形のいずれかでよい。
【００６８】
エピトープは、抗体により認識され、抗体の抗原結合部位に結合する抗原の部分であり、抗原決定基として知られる。エピトープを含むフラグメントは、SEQ ID NOの中から線上エピトープを含む可能性があるので、SEQ ID NOの少なくともｎ個の連続したアミノ酸のフラグメントを含むことができ、ｎは7またはそれ以上（例えば、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250またはそれ以上）でよい。Ｂ細胞エピトープは実験的に同定することができ（例えば、PEPSCAN（Geysen et al. (1984) PNAS USA 81:3998-4002およびCarter (1994) Methods Mol Biol 36:207-23）または類似の方法の使用）、または、例えばジェームソン‐ウォルフ（Jameson-Wolf）抗原インデックス（Jameson, BA et al. 1988, CABIOS 4(1):181-186）、ADEPT（Maksyutov & Zagrebelnaya (1993) Comput Appl Biosci 9(3):291-7）、親水性（Hopp (1993) Peptide Research 6:183-190）、抗原インデックス（Welling et al. (1985) FEBS Lett. 188:215-218）、MAPITOPE（Bublil et al. (2007) Proteins 68(1):294-304）、SEPPA（Sun et al. (2009) Nucleic Acids Res 37:W612-6）、マトリクス・ベースアプローチ（Raddrizzani & Hammer (2000) Brief Bioinform 1(2):179-89）、アミノ酸対抗原性スケール（Chen et al. (2007) Amino Acids 33(3):423-8）もしくは他の適当な方法（例えばReimer (2009) Methods Mol Biol 524:335-44を参照）を用いて予測することができる。予測されたエピトープは、検体との免疫科学的反応性を容易に検査することができる。
【００６９】
検出抗原はヒト供給源から精製することができるが、組換え抗原（特に、検出抗原が吸着のために天然の抗原に存在しない配列を使用する場合など）を使用するのがより一般的である。組換え発現のために種々の系が入手でき、系の選択は検出すべき自己抗体により決まる。例えば、原核生物発現（例えば大腸菌を用いる）は多くの自己抗体の検出に有用であるが、自己抗体が糖タンパク質を認識する場合、真核生物発現が必要である。同様に、自己抗体が、特異的な非連続のエピトープを認識する場合、正確なタンパク質の折り畳み構造を与える組換え発現系が必要である。
【００７０】
検出抗原は、第一領域および第二領域を有する融合ポリペプチドであってもよく、第一領域は検体中の自己抗体と反応することができ、第二領域は、融合ポリペプチドを固定する基質と反応することができる。
【００７１】
バイオマーカー抗原に対する検出抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であるが、通常はモノクローナル抗体である。検出抗体は、表１に記載の抗原（すなわち、結合が非特異的でなければ、検出抗体は、検体中の他の抗原と任意に結合しない。）と特異的に結合する能力を持たなければならない。
【００７２】
検体中のバイオマーカーを検出するために、種々の測定型式を用いることができる。例えば、本発明は、1種以上のウェスタンブロット、免疫沈降、銀染色、質量分析（例えば、MALDI-MS）、電導度に基づく方法、ドットブロット、スロットブロット、比色法、蛍光に基づく検出法、またはいずれかの型式の免疫測定法などである。抗原への抗体の結合は、ELISA、放射免疫測定法（RIA）、免疫放射定量測定法（IRMA）および免疫酵素測定法（IEMA）などの酵素結合測定法、DELFIA（登録商標）測定法、表面プラズモン共鳴またはその他のエバネッセント光法（例えば平面導波路法を用いるもの）、無標識電気化学センサーなどを含むあらゆる方法によって検出することができる。免疫学的方法としてサンドイッチ分析法が一般的である。
【００７３】
多数のバイオマーカーが検出される実施形態においては、アレイに基づく測定型式が好ましく、その中では、バイオマーカーを含む可能性のある検体は、単一の反応区画で同時に多数の検出試薬（抗体および／または抗原）と接触する。抗原および抗体アレイは当該技術分野で周知であり（Boutell et al. (2004) Proteomics 4:1950-8、Tassinari et al. (2008) Curr Opin Mol Ther 10:107-15、Stoevesandt et al. (2009) Expert Rev Proteomics 6:145-57、Tao et al. (2007) Comb Chem High Throughput Screen 10:706-18、Gnjatic et al. (2009) J Immunol Methods 341:50-8、Hartmann et al. (2009) Anal Bioanal Chem 393:1407-16およびFall & Niessner (2009) Methods Mol Biol 509:107-22を参照）、自己抗体を検出するためのアレイが含まれる。かかるアレイは、参考文献（WO01/57198、WO02/27327、Blackburn & Hart (2005) Methods Mol Biol. 310:197-216、WO03/064656およびWO2004/046730）に開示される種々の方法により調製することができる。これらの方法は、自己抗体との結合相互作用を促進する正しく折り畳まれたポリペプチドのマイクロアレイを調製するのに特に有用である。大部分のＢ細胞エピトープは非連続であると推定されており、このようなエピトープは、自己免疫要素を伴う疾患において重要であることが知られている。例えば、自己免疫性甲状腺疾患において、甲状腺ペルオキシダーゼの表面の免疫優性領域上の非連続エピトープに対する自己抗体が現れる。また、グッドパスチャー症候群において、２つの主要立体配座に対する自己抗体が現れる。したがって、天然の構造を示すその正しく折り畳まれたポリペプチドおよび非連続エピトープに対して開発されたタンパク質アレイは、自己抗体反応が生じる疾患の研究には特によく適合する（Gnjatic et al. (2009) J Immunol Methods 341:50-8）。
【００７４】
抗原アレイ上での結合反応を検出する方法および装置は、現在では技術的に標準である。好ましい検出方法は、蛍光に基づく検出方法である。固定化された抗原に結合した自己抗体を検出するためにはサンドイッチ測定法が一般的である。ここでは一次抗体が検体からの自己抗体であり、二次抗体は標識された抗検体抗体（例えば、抗ヒト抗体）である。
【００７５】
バイオマーカーが自己抗体である場合、本発明では通常IgG抗体を検出するが、他のタイプの自己抗体の検出も、例えば、適切な自己抗体クラス（IgGではなくIgA、IgM、IgEまたはIgD）を認識する検出試薬を使用することにより可能である。測定型式は、異なる抗体サブタイプおよび／またはアイソタイプを識別することが可能である場合がある。異なるサブタイプ（Stahl et al. (2006) Immunol Lett 102:50-9）およびアイソタイプ（Quintana (2008) PNAS USA 105:18889-94）は、自己抗体レパートリーに影響を与える。例えば、サンドイッチ測定法は、差次的に標識した二次抗体、例えば分別標識した抗IgG抗体および抗IgM抗体を用いて、種々のサブタイプを識別することができる。
【００７６】
上記のように、本発明は、検体が表１に記載のバイオマーカーを含むかどうかを決定することができる診断装置を提供する。かかる装置は、固体基質（例えば、ガラス、プラスチック、ナイロンなど）上に固定化された1種以上の抗原および／または抗体を含む。固定化は、共有結合または非共有結合（例えば、アビジン（Blackburn & Hart (2005) Methods Mol Biol. 310:197-216）またはブレオマイシン群抗生物質（WO2004/046730）などの固定化された官能基への、上記の融合ポリペプチドの非共有結合）による。抗原アレイは、個々に規定することができる検出抗原を有する好ましい形式である。固定化された抗原は、表１に記載の抗原を認識する自己抗体と反応することができる。
【００７７】
一実施形態において、固体基質には、ストリップ、スライド、ビーズ、マイクロタイタープレートのウェル、質量分析の実行に適した導電性表面（Koopmann & Blackburn (2003) Rapid Commun Mass Spectrom.17:455-62）、半導体表面（WO01/61040およびOleinikov et al. (2003) J Proteome Res. 2:313-9）、表面プラズモン共鳴支持体、平面導波路法支持体、マイクロ流体装置、または、抗体‐抗原結合に適した他の装置もしくは方法のいずれかが含まれる。
【００７８】
本発明が、明細書に開示されるように、自己抗体のパネルを検出するための抗原アレイを提供または使用する場合、一実施形態において、アレイは、これらの自己抗体を検出するための抗原のみを含む。しかしながら他の実施形態において、アレイは、自己抗体の検出に有用な抗原に加え、ポリペプチドを含んでもよい。例えば、アレイは1種以上の対照ポリペプチドを含んでもよい。適切な陽性対照ポリペプチドは、抗IgM抗体、抗IgG抗体、抗IgA抗体、抗IgE抗体またはこれらの組み合わせなどの抗ヒト免疫グロブリン抗体を含む。検体の抗体に結合することのできる他の適切な陽性対照ポリペプチドは、通常は、組換え型のプロテインＡまたはプロテインＧを含む。適切な陰性対照ポリペプチドは、β‐ガラクトシダーゼ、血清アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）またはヒト血清アルブミン（HSA））、タンパク質タグ、細菌タンパク質、酵母タンパク質、シトルリン化ポリペプチドなどを含むが、これらに限定されない。アレイ上の陰性対照の特徴は、緩衝液のみ、DNAなどの無タンパク質であることである。アレイの対照の特徴は、本発明の方法を実行する間に使用し、この方法が、予期した通りに実行されることを調べることであり、例えば、予期したタンパク質が存在すること（例えば、血清検体中の血清タンパク質からの陽性シグナル）、および予期しない物質が存在しないこと（例えば、緩衝液のみのアレイスポットからの陽性シグナルが予期されない。）を保証することである。
【００７９】
本発明の抗原アレイにおいて、アレイ上に存在する異なるタンパク質の総数の少なくとも10%（例えば、≧20%、≧30%、≧40%、≧50%、≧60%、≧70%、≧80%、≧90%、≧95、またはそれ以上）が、明細書で開示される通り、自己抗体を検出するためのものである。
【００８０】
本発明の抗原アレイは、検出抗原および／または対照の特徴の１以上の反復、例えば、２重反復、３重反復、４重反復を含んでもよい。反復は重複性を与え、またアレイ内対照を与え、さらにアレイ内比較を容易にする。
【００８１】
本発明の抗原アレイは、明細書に記載される121種以上の異なる自己抗体に対する検出抗原を含むが、好ましくは、10000種未満（例えば、＜5000、＜4000、＜3000、＜2000、＜1000、＜500、＜250、＜100など）の抗原に対する抗体を検出することができる。
【００８２】
アレイは、検体中の多数のバイオマーカーの同時検出ができるため有利である。かかる同時検出は必須ではないが、バイオマーカーのパネルは順次評価することもできる。例えば、検体を小口検体に分けることができ、小口検体は順次分析することができる。この実施形態において、全パネルの分析を完了する必要はない。例えば、パネルのサブセットで得られた診断指標が、患者は子宮内膜症であるが、さらにパネル項目を分析する必要はないということを示すことがある。かかる不完全なパネルの分析は、本発明に完全なパネルの分析の意図または可能性があるため、本発明に含まれる。
【００８３】
上記のように、本発明の一実施形態は、CA125、CA19-9および／または表５に記載の抗原のいずれかなど、子宮内膜症に対する既知の検査からの寄与を含む。あらゆる既知の試験、例えば、腹腔鏡検査、超音波検査、磁気共鳴断層撮影などを使用することができる。
【００８４】
〔miRNA検出〕
表１に222種のヒトmiRNAが記載され、本発明の方法は、検体中のこれらのmiRNAバイオマーカーのレベルを検出し、決定することを含む。これらのmiRNAに関する詳細は、表３および４に示される。また表３および４は、これらのmiRNAのヌクレオチド配列を含むが、miRNAの多型は当該技術分野で知られている。このため本発明は、記載されたmiRNA配列の多型miRNA変異体のレベルを検出し、測定することも含む。
【００８５】
特異的miRNAの検出技術は、例えば、マイクロアレイ分析およびNanoString社のnCounter技術、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に基づく方法（例えば、逆転写PCR、RT-PCR）、in-situハイブリダイゼーション（ISH）に基づく方法（例えば、蛍光ISH、FISH）、ノーザンブロット法、シークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）、蛍光に基づく検出法などが当該技術分野で周知である。上記の検出技術のいずれも本発明で使用することができる。予後が基本的な関心事である場合、定量的検出技術（例えば、リアルタイム定量的PCR（qPCR）、TaqMan（登録商標）またはSYBR（登録商標）グリーン）が好ましい。
【００８６】
miRNAの検出は、通常、検体と相補的検出プローブ（例えば合成オリゴヌクレオチド鎖）との接触（「ハイブリダイゼーション」）を含み、検体と相補的プローブとの間の特異的（非特異的ではなく）結合反応は、着目するmiRNAの存在を示す。ある場合には、検体中のmiRNAは検出前に増幅される。例えば、miRNAの逆転写により相補的DNA（cDNA）鎖を産生させ、得られたcDNAを、次のPCR反応において鋳型として使用することができる。
【００８７】
このように本発明は、例えば、生物検体中のmiRNA特異的検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして、またはmiRNAを増幅するための一本鎖プライマーとして使用することができる核酸を提供する。
【００８８】
「核酸」の用語は、一般に、あらゆる長さのヌクレオチドの重合型の意味を含み、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類似体を包含する。「核酸」はDNA、RNAおよびDNA／RNAハイブリッドを含む。また「核酸」は、修飾された主鎖（例えば、ペプチド核酸（PNA）またはホスホロチオエート）または修飾された塩基を含む、DNAまたはRNA類似体を包含する。本発明に記載された核酸は、種々の形態（例えば、一本鎖、プライマー、プローブ、標識体など）を取ることができる。プライマーおよびプローブは、通常一本鎖である。
【００８９】
核酸は、表３および４に記載された成熟したmiRNA配列（すなわち、SEQ ID NO：122〜343のいずれか）と同一または相補的である。
【００９０】
核酸は、SEQ ID NO：122〜343のいずれかと、≧50%、≧60%、≧70%、≧75%、≧80%、≧85%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%またはそれ以上の同一性のあるヌクレオチド配列から成る。配列間の同一性は、好ましくはスミス‐ウォーターマン（Smith-Waterman）相同性検索アルゴリズムにより測定される。
【００９１】
核酸は、SEQ ID NO：122〜343のいずれかと、≧50%、≧60%、≧70%、≧75%、≧80%、≧85%、≧90%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%またはそれ以上の相補性のあるヌクレオチド配列から成る。
【００９２】
核酸との関連で使用する場合、「相補性」の用語は、ワトソン‐クリック塩基の対形成を指す。したがって、Ｃの相補体はＧであり、Ｇの相補体はＣであり、Ａの相補体はＴ（またはＵ）であり、そしてＴ（またはＵ）の相補体はＡである。また、例えば、ピリミジン（ＣまたはＴ）に相補的であるＩ（プリンであるイノシン）などの塩基を使用することも可能である。
【００９３】
核酸がDNAである場合、RNA配列中の「Ｕ」は、DNA中の「Ｔ」により置き換えられると認識される。同様に、核酸がRNAの場合、DNA中の「Ｔ」は、RNA中の「Ｕ」により置き換えられると認識される。
【００９４】
核酸は、長さが12以上のヌクレオチド、例えば12、13、14、15、16、17または18など（例えば最大で50まで）のヌクレオチドでよい。核酸は、長さが15〜30ヌクレオチド、長さが10〜25ヌクレオチド、長さが15〜25ヌクレオチド、または長さが20〜25ヌクレオチドでよい。
【００９５】
核酸は、miRNAバイオマーカーにハイブリダイズしない配列、および／またはその配列を増幅した産物を含んでもよい。例えば、核酸は、5’末端または3’末端に追加的な配列を含んでもよい。追加的な配列は、例えばクローニングまたはPCRの目的で、リンカーであることがある。
【００９６】
本発明の核酸は、固相支持体（例えばビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、マイクロアレイ支持体、樹脂など）に結合させてもよい。本発明の核酸は、例えば放射性もしくは蛍光標識またはビオチン標識により標識することができる。この標識は、例えば核酸がプライマーまたはプローブである検出技術において使用される場合、特に有用である。例えば蛍光in-situハイブリダイゼーションFISH分析のために、蛍光標識プローブを調製する方法は当該技術分野で知られており、FISHプローブは商業的に、例えばExiqonから入手することができる。
【００９７】
本発明は、in-situハイブリダイゼーション（ISH）に基づく方法（例えば蛍光in-situハイブリダイゼーション（FISH））を利用することができる。ハイブリダイゼーション反応は、洗浄が続く、異なる「ストリンジェンシー」の条件下で行うことができる。好ましくは、本発明の核酸は、核酸が非特異的ハイブリダイゼーションより強く検出される量でmiRNAに特異的にハイブリダイズするような、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。相対的に高いストリンジェンシー条件は、例えば、約0.02〜0.1 Mもしくは同等の低塩濃度および／または約50〜70℃の高温条件を含む。ストリンジェントな洗浄は、非特異的なプローブ結合および過剰なプローブを除去する。相対的にストリンジェントな洗浄条件は、例えば低塩濃度および／または界面活性剤の存在、例えば1×生理食塩水‐クエン酸ナトリウム（SSC）中の0.02% SDS、約50℃という条件を含む。
【００９８】
多数のバイオマーカーが検出される実施形態においては、アレイに基づく分析またはPCR型式が好ましい。そこでは、バイオマーカーを含む可能性のある検体は、単一の反応区画内で、同時に多数のオリゴヌクレオチド、相補的検出プローブまたはPCRプライマー／プローブ（「マルチプレックス」）と接触する。反応区画は、マイクロタイターウェル、マイクロ流体チャンバーまたは検出ポアと定義されるが、これらに限定されない。他の実施形態において、これらの多数のバイオマーカーは、その相補的検出プローブと分離した個別の反応区画内で接触させる、および／または；実験を経時的に独立させ、マルチプレックスとした単一反応区画内または分離した個別の反応区画内のどちらかで、異なるプラットフォーム技術を用いる。miRNAの検出のためにマイクロアレイおよびPCRの使用は当該技術分野で周知である（例えば、参考文献Pradervandet al. (2010) Biotechniques 48:219-22を参照）。マイクロアレイは種々の技術により調製することができ、例えば参考文献（WO93/22480、WO03/020415およびWO2005/037425）に開示される通りである。核酸増幅に基づく方法は当該技術分野で周知である。
【００９９】
DNAマイクロアレイでの結合反応を検出するための方法および装置は、現在では当該技術分野で一般的である。好ましい検出方法は、蛍光に基づく検出方法である。ガラス基質上に固定化したオリゴヌクレオチド鎖に結合したバイオマーカーを検出することは一般的であり、例えば、標的miRNAは蛍光標識され、次に、相補的オリゴヌクレオチド鎖（プローブ）にハイブリダイズさせる。
【０１００】
アレイは、検体中の多数のバイオマーカーの同時検出ができるため有利である。かかる同時検出は必須ではないが、バイオマーカーのパネルは順次評価することもできる。例えば、検体を小口検体に分けることができ、小口検体は順次分析することができる。この実施形態において、全パネルの分析を完了する必要はない。例えば、パネルのサブセットで得られた診断指標が、患者は子宮内膜症であるが、さらにパネル項目を分析する必要はないということを示すことがある。かかる不完全なパネルの分析は、本発明に完全なパネルの分析の意図または可能性があるため、本発明に含まれる。
【０１０１】
〔データ解釈〕
本発明は、表１に記載のバイオマーカーのレベルを測定するステップを含む。本発明の一実施形態において、この特定のマーカーの測定は、単純なイエス／ノーの判定であるが、他の実施形態では、定量的または半定量的測定を必要とし、さらに他の実施形態では、相対的測定（例えば他のマーカーと比較した比率）が含まれる。他の実施形態は、閾値測定を含む（例えば、レベルが閾値より上または下かどうかのイエス／ノー判定）。通常、バイオマーカーは、定量的または半定量的結果（相対的濃度、絶対的濃度、倍率変化、力価、相対的蛍光などを問わない）を与えるように測定され、分類器アルゴリズムによる使用に対してより多くのデータを与える。
【０１０２】
通常、存在、非存在またはレベル（絶対的または相対的）を決定する測定から得られた生データは、使用する前にある種の操作を必要とする。例えば、大部分の検出技術の性質は、バイオマーカーが実際に存在していなくても若干のシグナルが見られるというものであるので、結果を解釈する前に、このノイズは除去される。同様に、一般集団においては、バイオマーカーの背景レベルというものが存在し、これを補正する必要がある。データは、実験間比較を容易にするため、比例または正規化する必要がある。これらや類似した問題、およびこれらを扱う技術は、免疫診断領域において周知である。
【０１０３】
背景シグナルを補正するための種々の技術が、特定の実験において入手することができる。例えば、反復測定は、通常、分析間のばらつきを測定するために行われ（例えば、単一アレイ上での同一検出プローブの複数の特性を利用する）、反復したものからの平均値は比較することができる（例えば、四重のアレイ特徴への結合の中央値）。さらに、分析間のばらつきを測定し、較正および／または正規化を可能にするために、標準マーカーを使用することができる。例えば、アレイは、測定されたシグナルが比例的に増加するのかまたは減少するのかを示すために、1種以上の標準を含むことができる。例えば、分析は、検体中の1種以上の対照マーカーのレベル、例えば、子宮内膜症に無関係の抗原または抗体のレベルを分析するステップを含むことができる。シグナルは、１つの試験における分布に従って調整される。例えば、１つのアレイ試験におけるシグナルは、（観察されたシグナル−25番目の百分位数）／（75番目の百分位数−25番目の百分位数）のように、四分位差の百分率として表示される。次に、この百分率は、例えば参考文献（Bolstad et al. (2003) Bioinformatics 19:185-93）などに開示されるように、標準分位正規化マトリックスを用いて正規化される。ここでは、１つのアレイ上のすべての百分率値は順位付けされ、すべてのアレイ上の同一順位にある抗原に対する百分率の平均で置き換えられる。全体としては、このプロセスは、同一の中央値および四分位値を持つデータ分布を与える。この形式のデータ変換は、異なる試験間でのばらつきにもかかわらず、妥当なアレイ間比較を可能にするために当該技術分野で一般的である。
【０１０４】
単一のベースラインレベルに比較した自己抗体のレベルは、倍差として定義することができる。通常は、少なくとも1.5倍、例えば≧1.75倍、≧2倍、≧2.5倍、≧5倍などの変化を表示することのできる技術を使用することが望ましい。
【０１０５】
対照検体は、データ正規化のために使用することもできる。例えば、子宮内膜症に関係のない抗体またはmiRNAのレベルは、検体と陰性対照の両方について測定することができ、他の抗体からのシグナルは、それに応じて調整することができる。陰性対照検体は、子宮内膜症の臨床所見をなんら持たない被験者からのものである。
【０１０６】
一実施形態において、バイオマーカーを「正常」ベースラインに対して比較するのではなく（または、比較するのに加えて）、子宮内膜症であり、特有のバイオマーカーを持つことが分かっている被験者からの検体で認められるレベルと比較する（すなわち、陽性対照との比較）。この比較は、あるバイオマーカーに対して、陰性対照のより低いレベルを用いて比較するより容易である。陰性または陽性対照に対して比較することの選択は、陰性シグナルと陽性シグナルとの間のダイナミックレンジによって決まる。
【０１０７】
対照におけるバイオマーカーのレベルは、検体中のレベルの測定と並行して測定される。しかしながら、並行して測定するのではなく、実験によるデータに基づく絶対対照レベルを用いれば利便性が向上する。例えば、特定のバイオマーカーのレベルは、子宮内膜症のない様々な被験者から採取した検体で測定することができる。これらのレベルは、様々な被験者にまたがるベースラインの作成に用いることができる。これには基準抗体に対する正規化が含まれる。陰性対照被験者の集団は、性差、年齢差、民族差、習慣差（例えば喫煙者、非喫煙者）などがある被験者のベースライン・レベルの収集に用いることができ、その結果、その集団について変動がある場合、対照は、できる限り細かく特定の被験者に適合させることができる。したがって、十分に多数の被験者からの健常検体を分析することにより、特定の自己抗体またはmiRNAのいずれに対しても実験によるベースラインを確立することができ、これは、本発明による比較に関して、対照レベルとして役立つ。対照レベルは単一の値であるとは限らず、どの検定値を比較するのかについては幅がある。例えば、特定の自己抗体力価が健常被験者全体で変動するが、常に20〜100（任意の）ユニットの幅にある場合、検体中の400ユニットの力価は疾患状態を示す。
【０１０８】
異なる実験間で固有である変動を相殺するのと同様に、一般集団に存在するバイオマーカーのバックグラウンドレベルを相殺することも重要である。適切な技術は周知である。例えば、検体中の特定のバイオマーカーのレベルは、そのバイオマーカーのバックグラウンドレベルとの比較を可能にするため、通常、定量的にまたは半定量的に測定される。種々の対照が、比較のための適切なベースラインを与えるために使用され、適切なベースラインの選択は、診断領域では日常的である。適切な対照についてのさらなる詳細を以下に示す。
【０１０９】
相殺／正規化などの後、測定されたバイオマーカーのレベルは、様々な方法で、診断結果に変換される。この変換には、測定されたレベルの関数としての診断結果を与えるアルゴリズムが含まれる。パネルが使用される場合、個々のバイオマーカーは総合的な診断結果に対して異なった寄与をするので、２つのバイオマーカーには異なった重みが加えられる。
【０１１０】
測定されたレベルまたは生データをスコアまたは結果に変換するアルゴリズムの構築は、当該技術分野で周知である。例えば、線形または非線形分類器アルゴリズムが用いられる。これらのアルゴリズムは、マーカーを測定するための個別の技術のいずれかからのデータを用いて学習することができる。適切な学習データは、「症例」検体および「対照」検体、すなわち、子宮内膜症を患っていることが分かっている被験者からの検体、および子宮内膜症を患っていないことが分かっている被験者からの検体のバイオマーカーを測定することにより得られる。最も有用であるのは、対照検体が、関連疾患を伴う被験者からの検体をも含むことである。かかる関連疾患は、着目する疾患と区別されるものであり、例えば、関節リウマチ患者からのデータおよび／または子宮内膜症以外の結合組織疾患を患う被験者からのデータで、アルゴリズムを学習させることは有用である。分類器アルゴリズムは、例えば、分析におけるマーカーの付加または削除により、または重みづけを変えるなどにより、症例検体と対照検体とを区別できるまで修正される。このように、本発明の方法は、被験者から採取された検体で測定されたバイオマーカーレベルに基づき、子宮内膜症患者と非子宮内膜症患者とを区別する分類器アルゴリズムを用いて、被験者検体中のバイオマーカーレベルを分析するステップを含む。
【０１１１】
様々な適切な分類器アルゴリズム、例えば、線形判別分析、単純ベイズ分類器、パーセプトロン、サポートベクターマシン（SVM）（Meyer et al. (2003) Neurocomputing 55:169-86）および遺伝的プログラミング（GP）（Koza (1992), Genetic Programming: On the Programming of Computers by Means of Natural Selection, MIT Press）が利用できる。GPは、一般的に比較的少数のバイオマーカーを選択し、他の多くの分類法において固有である極大に閉じ込められるという問題を克服するので、特に有用である。SVMに基づく方法は、以前は、子宮内膜症データセット（Wang & Japkowicz (2008) Lecture Notes in Computer Science 4994/2008, 38-47）に適用されていた。発明者らは、以前、SVMおよびGPに基づく方法は両方とも、同じバイオマーカーパネル上で学習させることができ、類似した感度と特異性を持つ症例群および対照群の自己抗体／抗原バイオマーカープロファイルを区別することができること、すなわち、自己抗体バイオマーカーは、ただ１つの分析方法によって決まるわけではないことを確認している。さらに、これらの方法は、子宮内膜症患者を、（i）他の型の自己免疫疾患および（ii）関節リウマチである患者から区別できる可能性を有している。表１に記載のバイオマーカーは、その区別を確実にするため、かかるアルゴリズムを学習するために用いることができる。推定バイオマーカーの分類能力（感度および特異性、ROC分析）は、さらに検証する前に、入れ子交差検定および並べ替え検定を使用して、厳密に評価することができる。推定バイオマーカーに対する生物学的支持は、は、Genespring（バージョン11.5.1）、GSEA 分析のためのBiopaxパスウェイおよびパスウェイ Studio（バージョン9.1）を含むツールとデータベースとを用いて探すことができる。
【０１１２】
陰性対照検体と接触した場合、常に陰性絶対シグナルを与える（したがって、陽性シグナルは直ちに子宮内膜症を示す）表１に記載のバイオマーカーがあってもよいが、バイオマーカーは、少なくとも低い絶対シグナルを与える（したがって、疾患を示す陽性シグナルは、バックグラウンドレベル以上の自己抗体レベルが検出されることを必要とする）ということがより一般的であると認識されている。したがって、バイオマーカーを検出する基準は、絶対検出の基準ではなく、むしろ（当該技術分野で標準であるように）適切な陰性対照で認められるレベルより上のレベルの基準である。そのような対照は、検査検体と並行して分析されるが、実験データに基づいて絶対的な対照レベルを使用すること、または、疾患患者からの検体と非疾患患者からの検体とを区別するためのバイオマーカーレベルを（事前の学習によって）使用することのできるアルゴリズムを用いてデータを分析することがより便利である。
【０１１３】
子宮内膜症患者からの検体中の特定のバイオマーカーレベルは、陰性対照検体中に認められるレベルより上または下である。自己抗原と反応する抗体は健常人に自然に発生し、これは、末梢免疫系におけるT細胞およびB細胞の生存にとって必要であると信じられている（Elkon & Casali (2008) Nat Clin Pract Rheumatol. 4(9):491-8）。このため、健常人の対照集団において、表１に開示された抗原の一部に対する血中自己抗体が有意なレベルで存在する可能性があり、またその集団において、かなりの頻度で生じる可能性がある。これらのバイオマーカーのレベルと頻度は、対照群と比較して、疾患群で変化する可能性がある。疾患群および対照群におけるこれらのバイオマーカーのレベルと頻度の分析は、診断情報を与える差を特定する。特定の抗原に対する自己抗体のレベルは、健常人検体と比較して、子宮内膜症患者検体で上昇または低下する。
【０１１４】
タンパク質および核酸バイオマーカーの組み合わせを検出する場合、各クラスのバイオマーカーは、そのクラスに対して必要に応じた分析と処理（例えば正規化）を行った後、タンパク質および核酸バイオマーカーは、検体を分類するアルゴリズムを用いて一緒に分析される。
【０１１５】
一般的に本発明の方法は、検体が、子宮内膜症と関連しているバイオマーカーのレベルを含んでいるかどうかを決定することを伴う。したがって、本発明の方法は、被験者検体中のバイオマーカーレベルを、（i）子宮内膜症患者からの検体中のレベルおよび／または（ii）子宮内膜症ではない患者からの検体中のレベルと比較するステップを含む。この比較は、被験者が子宮内膜症であるかどうかの診断指標を与える。子宮内膜症でない患者からの検体中のバイオマーカーに対する既知または標準の発現レベルと比較することにより、1種以上のバイオマーカーの異常レベルは、被験者が子宮内膜症であることを示す。
【０１１６】
バイオマーカーレベルは、陰性対照で認められるものより有意に異なる必要がある。２つのレベルが同じか異なっているかを決定するために、高度な統計手法（例えば、主成分分析、教師なし階層的クラスタリングおよび線形モデリング）を使用することができる。例えば、インビトロ診断は単一測定の比較に基づくことは滅多にない。むしろ適切な測定数は、精度の適正水準と一体となって用意され、許容される感度および／または特異性をもって、要求される統計的確実性を与える。抗原および／または抗体レベルは定量的に測定され、正確な比較を可能にする。また十分な測定数は、レベルの差を、統計的優位性がp≦0.05かそれ以上の水準にすることを確実にする。測定数は、様々な基準（例えば、ベースラインにおける変動の程度、疾患状態の発現増加の程度、ノイズの程度など）により変動するが、この場合もやはり、当業者の通常の計画能力の範囲内に収まる。例えば、正規化データの四分位差が評価され、陽性シグナルの閾値（すなわち、特定の自己抗体の存在を示す）は、検体中の抗体が、75番目の百分位数を超える四分位差より少なくとも2.5倍以上強く診断抗原と反応することが必要として定義される。
【０１１７】
他の基準は当業者によく知られており、用いられる分析法にもよるが、分位正規化より適切である。データを正規化する他の方法には、当該技術分野で周知のデータ変換戦略があり、例えばスケーリング、対数正規化、中央値正規化などである。例えば、タンパク質アレイの生データは、反復したものを統合し、データを変換し、さらに、この種の分析に適切であることが示されている中央値正規化を適用することにより、正規化することができる。遺伝子発現データは、二次元空間補正によるバックグラウンド補正およびMvA回帰スムージング法による色素バイアス正規化法（Dudoit, S, et al. (2002) Statistica Sinica 12, 111-139、Yang, YH, et al. Normalization for Two-color cDNA Microarray Data. Science and Statistics: A Festschrift for Terry Speed, Monograph SeriesおよびYang, YH et al. in Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation）にかけられる。正規化された遺伝子発現データおよびプロテオームデータは、統計的有意差の水準（通常p<0.05）、多重検定補正および生物学的効果を示す発現データを伴う倍率変化（通常、基準値と比較したmRNAが2倍）を示しながら、患者集団の間の差に関連するあらゆる潜在的な特徴を分析することができる。
【０１１８】
これらのデータ解釈技術の基本的な目的は、表１に記載のバイオマーカーの存在と、任意の対照バイオマーカーとを区別することであり、また、子宮内膜症患者からの検体の反応を、対照被験者からのものと区別することである。本発明の方法は、感度が少なくとも70%（例えば、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%、>96%、>97%、>98%、>99%）である。本発明の方法は、特異性が少なくとも70%（例えば、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%、>96%、>97%、>98%、>99%）である。本発明の方法は、有利には、特異性と感度の両方とも、少なくとも70%（例えば、>70%、>75%、>80%、>85%、>90%、>95%、>96%、>97%、>98%、>99%）である。実施例に示されるように、本発明は、常に、約70%を上回る特異性を与え、また約70%を上回る感度を与える。
【０１１９】
本発明の方法で得られたデータおよび／またはこれらのデータに基づく診断情報は、コンピュータ媒体（例えば、RAM、不揮発性コンピュータメモリ、CD-ROM）に記憶され、および／または、インターネットを通じてコンピュータ間で送信される。
【０１２０】
本発明の方法が、被験者が子宮内膜症であることを示す場合、さらにステップが続く。例えば、被験者は、被験者の身体検査を含む確定診断手続きを受けてもよく、および／または、子宮内膜症治療に適した治療薬による治療を受けてもよい。
【０１２１】
好ましくは、本発明のバイオマーカーは、被験者が腹膜子宮内膜症であるかどうかを確定することができる。したがって本発明は、腹膜子宮内膜症の検出方法をも提供する。この方法は、表１６、１８、２０および２１のいずれか、好ましくは表１６または１８に記載されたバイオマーカーのいずれかを使用することができる。
【０１２２】
また本発明のバイオマーカーは、被験者が、子宮内膜腫のような卵巣子宮内膜症であるかどうかを確定することができる。したがって本発明は、卵巣子宮内膜症の検出方法をも提供する。この方法は、表１７〜２１のいずれか、好ましくは表１７または１８に記載されたバイオマーカーのいずれかを使用することができる。
【０１２３】
〔治療効果のモニタリング〕
上記のように、本発明の一方法は、同一の被験者から、2点以上の異なる時間ポイントでの検体を検査することを含む。一般に、上記本文が抗体の有無を指す場合、本発明には、経時的に増加または減少する抗体レベル、または付加的な抗体または抗体クラスが単一の自己抗原に対して上昇する抗体の拡大を含める。例えば、経時的に抗体の変化を測定する方法は、被験者に施される治療（例えばセラノスティクス）の効果をモニタリングするために用いることができる。治療は、最初の検体が採取される前、最初の検体が採取されるのと同時、または最初の検体が採取された後に施すことができる。
【０１２４】
本発明は、ホルモン療法を受ける被験者を観察するために用いることができる。ホルモン療法は、経口避妊薬、プロゲステロン単独薬もしくは子宮内プロゲステロン（レボノルゲストレルICU）、プロゲスチン類、ゲストリノン、ダナゾール（男性化の副作用にもかかわらず）、およびGnRH類縁体を含む。
【０１２５】
本発明の関連する実施形態において、治療のモニタリングの結果は、将来の治療予測に使用される。例えば、特定の治療を伴う処置が、被験者における疾患症状の減弱または除去に有効である場合、および、その被験者における特定の自己抗体のレベルを減少させることも示された場合、他の被験者における自己抗体の検出は、この他の被験者は同じ治療に反応するであろうことを示す可能性がある。逆に、特定の治療が、特定の自己抗体または自己抗体プロファイルを持つ被験者における疾患症状の減弱または除去に有効ではない場合、他の被験者におけるその自己抗体または自己抗体プロファイルの検出は、この他の被験者は同じ治療に反応しないであろうことを示す可能性がある。
【０１２６】
他の実施形態において、特定の自己抗原に対する自己抗体の存在は、特定の治療を提案するか、または開始する根拠として使うことができる。例えば、特定の自己抗体のレベルが、特定の治療を施すことにより減少することが知られている場合、その自己抗体が検出されることは、その治療を開始しなければならないことを示唆する。したがって、本発明は、セラノスティクスの設定に有用である。通常は、治療を開始する前に、少なくとも１つの検体が被験者から採取される。
【０１２７】
〔免疫療法〕
新たに暴露された自己抗原に対する自己抗体の発現が疾患の原因となる場合、免疫反応の早期プライミングは、抗原暴露細胞が現れるとその細胞を除去するように身体を準備させ、その結果、自己抗体が危険なほど発現する前に疾患の原因を取り除く。したがって、表２に記載の自己抗原は、子宮内膜症を治療するための治療標的である。例えば、自己抗体により認識されることが知られている１つの抗原はp53であり、このタンパク質は、がんの調節に対するワクチン標的および治療標的の両方になると考えられている（Chada et al. (2003) CurrOpin Drug DiscovDevel. 6(2):169-73、Chene(2003) Nature Reviews Cancer 3, 102-109およびWang &El-Deiry (2008) CurrOpinOncol. 20(1):90-6）。
【０１２８】
したがって本発明は、表２に記載の自己抗原を認識する抗体を誘導する免疫原を被験者に誘発させることを含む、被験者における抗体反応を高める方法を提供する。本方法は、子宮内膜症の免疫学的予防に適している。
【０１２９】
また本発明は、医薬に使用する免疫原を提供し、ここで該免疫原は、表２に記載の自己抗原を認識する抗体を誘導する。同様に本発明は、子宮内膜症の免疫学的予防のための薬剤の製造における免疫原の使用を提供し、ここで該免疫原は、表２に記載の自己抗原を認識する抗体を誘導する。
【０１３０】
抗原の検出について上記したように、免疫原は自己抗原自体であってもよく、または、同一性のあるおよび／または自己抗原からのエピトープを含むアミノ酸配列を含んでもよい。したがって、この免疫原は、（i）本明細書で開示される関連SEQ ID NO（すなわち、SEQ ID NO：1〜121のいすれか）に対して、少なくとも90%（例えば、≧91%、≧92%、≧93%、≧94%、≧95%、≧96%、≧97%、≧98%、≧99%）の配列同一性を有するアミノ酸配列、および／または（ii）本明細書で開示される関連SEQ ID NO（すなわち、SEQ ID NO：1〜121のいすれか）からの、少なくとも１つのエピトープを含むアミノ酸配列を含む。他の免疫原も、それが、着目した自己抗原を認識する抗体を誘導することができるのであれば使用することができる。
【０１３１】
被験者をポリペプチド免疫原で免疫する代替手段として、ポリペプチドをコードする核酸免疫原（例えばDNAまたはRNA）を、被験者におけるin-situ発現のために投与することが可能であり、それによって抗体反応の発達に至る。
【０１３２】
免疫原は、免疫学的アジュバントと併用（例えば混合剤）して送達することができる。かかるアジュバントには、不溶性アルミニウム塩、油中水型エマルジョン、MF59およびAS03などの水中油型エマルジョン、サポニン、イスコム、3-O-脱アシル化MPL（3dMPL）、免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えば１つ以上のCpGモチーフを含むもの）、細菌ADPリボシル化毒素およびその無毒化誘導体、サイトカイン、キトサン、生分解性微小粒子、リポソーム、イミダゾキノリン、ホスファゼン（例えば子宮内膜症PP）、アミノアルキルグルコサミンリン酸、ガンマ‐イヌリンなどが含まれるが、これらに限定されない。かかるアジュバントの組み合わせも使用することができる。アジュバントは、CD4またはCD8 T細胞を伴う免疫反応を誘導するように選択することができる。アジュバントは、免疫反応をTH1表現型またはTH2表現型に偏らせるために選択することができる。
【０１３３】
免疫原は適切な経路により送達することができる。例えば、非経口的な注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内）、または、経口（例えば、錠剤、スプレー）、局所、経皮、経皮膚、経鼻、眼内、耳、肺または他の粘膜など粘膜的に送達することができる。
【０１３４】
免疫原は、液状または固形で投与することができる。免疫原は、例えば、局所投与用（例えば、軟膏、クリームまたは粉末剤）、経口投与用（例えば、錠剤もしくはカプセル剤、スプレー剤またはシロップ剤）、肺投与用（例えば、微粉末またはスプレーを用いる吸入剤）、坐剤またはペッサリー、点滴剤、注射溶液剤または注射懸濁剤に製剤化することができる。
【０１３５】
〔RNAによる治療〕
表３および４に記載されたmiRNAは、アンチセンス治療などRNAによる治療に有用である。がんを扱うアンチセンス治療の使用の概要を説明した先行文献がある（Gleave & Monia (2005) Nat Rev Cancer 5:468-79）。表３または表４に記載のmiRNAに相補的な合成核酸は、がん細胞（子宮内膜症および／または悪性子宮内膜症に関連する細胞）の細胞死を刺激するために使用することができる。さらに、インビボ・アンチセンス治療は、子宮内膜症および／または悪性子宮内膜症に関連する特異的なmiRNAに特異的に結合するため、およびその過剰発現を抑制するため、表３または表４に記載のmiRNAに相補的な核酸を導入することに使用することができる。
【０１３６】
したがって本発明は、表３または表４に記載のmiRNA（すなわち、SEQ ID NO：122〜343のいすれか）にハイブリダイズする核酸を提供し、この核酸は細胞毒性薬に結合する。miRNAは、好ましくはヒトmiRNAである。適切な細胞毒性薬はいずれも使用することができる。これらの複合体miRNAは、治療方法において使用することができる。
【０１３７】
本発明は、RNAによる治療、例えばアンチセンス治療の目的のために、表３または表４に記載のmiRNAを認識する相補的核酸を提供する。
【０１３８】
〔画像診断〕
表１に記載のバイオマーカーは、画像診断に有用である。
【０１３９】
表２に記載の自己抗原に対する標識抗体は、インビボで注射することができ、その結果、抗原の分布を検出することができる。この方法では、自己抗原の出所（例えば、抗原が高濃度で存在する体内の領域）を特定することができ、病態の早期同定を可能にする。画像診断技術は、疾患の進行もしくは寛解、または治療効果をモニタリングすることにも使用することができる。
【０１４０】
本発明は、表２に記載の自己抗原を認識する標識抗体を提供する。この抗体は、上記のように、ヒト抗体でよい。適切な標識はいずれも使用することができ、例えば、量子ドット、スピン標識、蛍光標識などがある。
【０１４１】
表３または表４に記載のmiRNAに相補的で標識された合成核酸は、子宮内膜症および／または悪性子宮内膜症に関連するmiRNAの、エクスビボ検体（例えば、生検から採取された組織検体）およびインビボ検体（例えば、患者の磁気共鳴イメージング（MRI）、ポジトロン断層撮影（PET）コンピュータ断層撮影（CT）スキャン）における同定に使用することができる。これは、子宮内膜症および／または悪性子宮内膜症の早期同定のための方法を潜在的に提供する。画像診断技術は、疾患の進行もしくは寛解、または治療効果をモニタリングすることにも使用することができる。
【０１４２】
表３または表４に記載のmiRNAは、例えば標準FISHを用いる染色により、組織検体を分析することに有用である。表３または表４に概要を示したmiRNAに相補的な配列を持つ蛍光標識した核酸を組織検体と接触させ、miRNAの位置を可視化することができる。１つの検体は複数のmiRNAについて染色することができ、これらの異なるmiRNAは別個に標識され、区別することができる。別の方法として、複数の異なる検体を、それぞれ単一の標識miRNAで標識することができる。
【０１４３】
このように、本発明は、表３または表４に記載のmiRNAとハイブリダイズする標識核酸を提供する。このmiRNAは、好ましくはヒトmiRNAである。あらゆる適切な標識を使用することができ、例えば、量子ドット、スピン標識、蛍光標識、色素などである。これらの標識核酸は、インビボおよび／またはインビトロ画像診断法に使用することができる。
【０１４４】
〔他のバイオマーカー〕
本発明は、抗原自体の分析に優先して使用される、抗原に対する自己抗体の分析と同時に、自己抗体および抗原バイオマーカーに関する。これらのバイオマーカーに加えて、本発明は、表２に記載の抗原の他の生物学的所見とともに使用される。例えば、表２に記載の抗原をコード化するmRNA転写物のレベルを、特に遺伝子が通常転写されない組織（潜在的な疾患組織等）で測定することができる。同様に、表２に記載の抗原をコードする遺伝子の染色体コピー数を、例えば、遺伝子重複事象を検査するために測定することができる。表２に記載の抗原の制御因子のレベルを、例えば、抗原をコードする遺伝子のマイクロRNA制御因子を調べるために測定することができる。さらに、表２に記載の抗原によって制御されるまたは反応するものを評価することができる。例えば、抗原が代謝経路の制御因子である場合、その経路の障害を測定することができる。
【０１４５】
また本発明は、miRNAバイオマーカーに関する。これらのバイオマーカーに加えて、本発明は、表３および表４に記載のmiRNAの他の生物学的所見とともに使用される。例えば、表３または表４に記載のmiRNAの標的であるmRNA転写物の発現レベルを、特に転写レベルの変化が容易に測定できる組織（潜在的な疾患組織等）で測定することができる。同様に、表３または表４に記載のmiRNAの染色体位置のコピー数変動を、例えば、遺伝子欠失または重複事象を検査するために測定することができる。
【０１４６】
表３または表４に記載のmiRNAに対する転写制御因子のレベルを、例えば、miRNAの染色体領域のメチル化状態を測定することができる。
【０１４７】
単一の前miRNA前駆体は、ヘアピンの5’および3’腕から切り取られた配列等の１以上の成熟miRNA配列につながる。本発明は、同じ前miRNA前駆体から他の成熟したmiRNA配列を探すために使用することができる。例えば、同じ前駆体からの他の成熟したmiRNA配列は、同様に適切なバイオマーカーである。
【０１４８】
他の可能性は、当業者に明らかである。
【０１４９】
〔好ましいパネル〕
本発明の好ましい実施形態は、少なくとも2種の異なるバイオマーカー、すなわちパネルに基づく。特に着目するパネルは、1種以上の表１に記載のバイオマーカーの組み合わせからなり、または含み、任意に、表５等からの少なくとも1種以上のバイオマーカーと組み合わせる。好ましいパネルは、合計で2種から6種までのバイオマーカーを含む。特に着目するパネルは、表１０〜１５のいずれかに記載のバイオマーカーの組み合わせから成る、または含む。本発明に有用なパネル（例えば、表１０〜１５に記載のパネル）は、さらに（すなわち1種以上の）バイオマーカーを加えることにより拡張し、より大きなパネルを作り出すことができる。さらなるバイオマーカーは、既知のバイオマーカー（上記、例えば表５を参照）から選択することができる。一般にバイオマーカーの追加は、表に示したパネルの感度または特異性を減ずることはない。かかるパネルは下記のものを含むが、これらに限定されない。
【０１５０】
・表１から選ばれるバイオマーカーを含むパネル。
・表２、表３または表４から選ばれるバイオマーカーを含むパネル。
・2種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１から選ばれるバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・2種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１から選ばれるバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・2種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１から選ばれるバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・3種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１１から選ばれる2種のバイオマーカーおよび（ii）表１から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・3種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１１から選ばれる2種のバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・3種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１１から選ばれる2種のバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・3種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１１から選ばれる2種のバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・4種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１２から選ばれる3種のバイオマーカーおよび（ii）表１から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・4種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１２から選ばれる3種のバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・4種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１２から選ばれる3種のバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・4種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１２から選ばれる3種のバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・5種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１３から選ばれる4種のバイオマーカーおよび（ii）表１から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・5種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１３から選ばれる4種のバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・5種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１３から選ばれる4種のバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・5種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１３から選ばれる4種のバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・6種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１４から選ばれる5種のバイオマーカーおよび（ii）表１から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・6種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１４から選ばれる5種のバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・6種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１４から選ばれる5種のバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・6種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１４から選ばれる5種のバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・7種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１５から選ばれる6種のバイオマーカーおよび（ii）表１から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・7種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１５から選ばれる6種のバイオマーカーおよび（ii）表２から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・7種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１５から選ばれる6種のバイオマーカーおよび（ii）表３から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・7種の異なるバイオマーカー、すなわち（i）表１５から選ばれる6種のバイオマーカーおよび（ii）表４から選ばれるさらなるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。
・表１０から選ばれる12種の異なるバイオマーカーを含む、または、から成るパネル。このパネルは診断に特に有用である。
【０１５１】
好ましいパネルは、全体で2〜6種のバイオマーカーを含む。
【０１５２】
好ましいパネルはhsa-miR-150およびhsa-miR-574-5pを含む。他の好ましいパネルはhsa-miR-342-3pおよびhsa-miR-574-5pを含む。他の好ましいパネルはhsa-miR-150およびhsa-miR-342-3pを含む。他の好ましいパネルはhsa-miR-150、hsa-miR-122およびhsa-miR-574-5pを含む。他の好ましいパネルはTPM1、hsa-miR-150およびhsa-miR-574-5pを含む。
【０１５３】
異なるバイオマーカーは、子宮内膜症検体において、対照検体と比較して異なる相対的な差次的発現プロファイルを有する。これらのバイオマーカーの対（すなわち、同じ対照と比較して、１つは発現増加しており、他は発現減少している場合）は、子宮内膜症を診断するのに有用な方法を提供する。例えば、発明者らは、子宮内膜症検体および対照検体（健常な非子宮内膜症検体）において、ebv-miR-BART2-5pおよびhsa-miR-564が、それぞれ発現増加および発現減少しており、この組み合わせが有用であることを見いだした。この分岐的挙動は、バイオマーカーの組み合わせが同一の検体について評価される場合、子宮内膜症の診断を向上させる。
【０１５４】
このように、本発明の方法は、被験者検体中の本発明の第１および第２のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップを含み、第１のバイオマーカーは、子宮内膜症検体において、非子宮内膜症検体と比較して発現増加しており、第２のバイオマーカーは、子宮内膜症検体において、同じ非子宮内膜症検体と比較して発現減少している。
【０１５５】
本発明の方法は、（i）被験者検体中の本発明の第１のバイオマーカーの発現レベルを測定すること、（ii）被験者検体中の本発明の第２のバイオマーカーの発現レベルを測定すること、ここで、第１のバイオマーカーは、子宮内膜症検体において、非子宮内膜症検体と比較して発現増加しており、第２のバイオマーカーは、子宮内膜症検体において、同じ非子宮内膜症検体と比較して発現減少している；および（iii）非子宮内膜症検体、内膜症検体および／または絶対値を用いて、（i）および（ii）の測定値を比較すること、ここで、比較は、被験者が子宮内膜症であるかどうかの診断指標を与える；を含む。第１および第２のバイオマーカーの異常なレベルは、非子宮内膜症検体または子宮内膜症検体中の既知または標準のそれらの発現レベル、および／または絶対値と比較することにより、被験者が子宮内膜症であることを示す。
【０１５６】
〔一般〕
「含む」の用語は、「含む」と「から成る」とを包含する。例えば、組成物がＸを「含む」は、Ｘだけから成る可能性があり、または、追加的ななにか、例えばＸ＋Ｙを含む可能性がある。
【０１５７】
抗原に「結合」する抗体の能力という言及は、抗体と抗原とが強く相互作用し、当該分析において、標準的な洗浄手順に十分に抵抗することを意味する。したがって、非特異的結合は最小になるか除去される。
【０１５８】
分析の「感度」は、正しく同定された、すなわち、関連抗原に対する自己抗体が陽性の結果となった被験者のうち、子宮内膜症の被験者の比率である真の陽性の割合である。
【０１５９】
分析の「特異性」は、正しく同定された、すなわち、関連抗原に対する抗体が陰性の結果となった被験者のうち、子宮内膜症ではない被験者の比率である真の陰性の割合である。
【０１６０】
特に記載しない限り、2種以上の成分を混合するステップを含む方法は、特定の混合順序を必要とはしない。したがって、成分はいかなる順序でも混合することができる。3種の成分がある場合、2種の成分をお互いに混合した後、この混合物を、第３の成分と混合することができるなどである。
【０１６１】
２つのアミノ酸配列間のパーセント配列同一性という言及は、一直線に並べた場合に、２つの配列を比較して、アミノ酸が同一である百分率である。この配列比較とパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野で周知のソフトウェア・プログラムを用いて決定される。例えば、文献（Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubelet al., eds., 1987) Supplement 30）のセクション7.7.18に記載されている。好ましい配列比較は、12個のギャップオープンペナルティおよび2個のギャップ伸長ペナルティ、ならびにBLOSUM62マトリックスによるアフィン（affine）ギャップ検索を用いるスミス‐ウォーターマン（Smith-Waterman）相同性検索アルゴリズムによって測定した。スミス‐ウォーターマン相同性検索アルゴリズムは文献（Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math.2: 482-489）に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、ｙ軸のマイクロアレイt-検定のp値対ｘ軸の症例と対照との間の抗体レベルの倍率変化を示す火山プロットである。最も興味のある特徴は、火山プロットの左上および右上の領域に見いだされた。可能性のあるマーカーと、重要ではない事象との間を区別するため、点線をグラフ上に描画した。これらのカットオフは変動し得るが、0.05未満のp値および0.585のlog2（1.5倍）より大きい倍率変化という代表的な最小選択基準を用いて、候補バイオマーカーを同定した。倍率変化値を導き出すためには、生データではなく、全体中央値で正規化したデータを使用した。生RFUにおける大きな差は、正規化の前に、この値における小さな変化に置き換える。この分析における最適なマーカーのいくつか（CCNB1IP1、TPM1およびSept9）を示した。
【０１６３】
【図２】図２は、（Ａ）RAN、（Ｂ）STUB1、（Ｃ）TPM1および（Ｄ）HSPD1について、正規化データのボックスプロットを示す。
【０１６４】
【図３】図３は、ｙ軸のマイクロアレイt-検定のp値対ｘ軸の症例と対照との間のmiRNAレベルの倍率変化を示す火山プロットである。この分析における最適なマーカーのいくつか（hsa-miR-150、hsa-miR-122、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-483-3p、hsa-miR-1290、hsa-miR-3194-5p、hsa-miR-3683-5p、hsa-miR-3937、hsa-miR-1224-5pおよびhsa-miR-3648）を明らかにした。
【０１６５】
【図４】図４は、組織の種類（すなわち、症例対対照）に従った、有意なmiRNAの階層的クラスタ分析を示し、黒色は高発現を、白色は中程度の発現を、また灰色は低発現を表示する。
【０１６６】
【図５】図５は、マイクロアレイからのデータとTaqMan（登録商標）miRNA qPCRアッセイとの間の相関関係を示す散布図である。
【０１６７】
【図６】図６は、マイクロアレイデータから、個々のmiRNAに対する受信者動作特性（ROC）曲線を示す：（Ａ）hsa-miR-150；感度=0.8、特異性=0.65、AUC=0.8；（Ｂ）hsa-miR-574-5p；感度=0.73、特異性=0.71、AUC=0.8；（Ｃ）hsa-miR-342-3p；感度=0.66、特異性=0.76、AUC=0.78。
【０１６８】
【図７−１】と
【図７−２】図７−１と図７−２は、マイクロアレイデータから、パネルに対する受信者動作特性（ROC）曲線を示す：（Ａ）hsa-miR-150およびhsa-miR-574-5p；感度=0.86、特異性=0.76、AUC=0.91；（Ｂ）hsa-miR-342-3pおよびhsa-miR-574-5p；感度=0.76、特異性=0.76、AUC=0.86；（Ｃ）hsa-miR-150およびhsa-miR-342-3p；感度=0.68、特異性=0.76、AUC=0.81；（Ｄ）hsa-miR-150、hsa-miR-122およびhsa-miR-574-5p；感度=0.83、特異性=0.76、AUC=0.9。
【０１６９】
【図８】図８は、TPM1、hsa-miR-150およびhsa-miR-574-5pの組み合わせに対する受信者動作特性（ROC）曲線を示す；感度=0.9、特異性=0.75、AUC=0.92。
【０１７０】
【図９】図９は、正常子宮内膜（NE）、正常腹膜（NP）、腹膜子宮内膜症（ES）および卵巣子宮内膜腫（OvES）において、統計的に有意に、差次的に発現（p<0.05）したmiRNAを示すベン（Venn）図である。1群以上で統計的に有意に発現されたmiRNA数は、しかるべき群に対応する領域を重ね合わせて示している。領域Ａ〜Ｆは、かかる重ね合わせ領域の例示である。
【０１７１】
【図１０】図１０は、子宮内膜症、子宮内膜症である被験者の正常子宮内膜および子宮内膜症ではない被験者の正常子宮内膜におけるebv-miR-BART2-5p miRNA発現の定量的PCRの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１７２】
１．子宮内膜症を患った被験者の血清における自己抗体の検出
（ａ）アレイの調製
実施例は、天然型の非連続エピトープを表示する能力のある「機能タンパク質」アレイ技術の使用に関する（Boutellet al. (2004) Proteomics 4:1950-8およびGnjatic et al. (2009) J Immunol Methods 341:50-8）。タンパク質は全長であり、昆虫細胞で折り畳みタグとともに発現され、天然型エピトープを保存するように設計された特有の方法で配列する前に、正しい折り畳み構造について検査される。各アレイは、対照タンパク質とともに、多機能性や４重に表示された疾患経路から選ばれた、〜1500個の異なる遺伝子を代表する約1550種のヒト・タンパク質を含む。各アレイ上のタンパク質の加えて、BCCP-mycタグについて4個の対照タンパク質（BCCP、BCCP-myc、β-ガラクトシダーゼ-BCCP-mycおよびβ-ガラクトシダーゼ-BCCP）を、Cy3標識ビオチン-BSA、ビオチン化IgGおよびビオチン化IgMの希釈系列ならびに緩衝液のみのスポットを含む追加対照とともに配列した。
【０１７３】
アレイと血清検体のインキュベーションは、アレイ上の特定のタンパク質への免疫グロブリンの結合の検出を可能にし、自己抗体およびそれらの同種抗原の同定を可能にする（Gnjatic et al. (2009) J Immunol Methods 341:50-8）。
【０１７４】
（ｂ）バイオマーカーの確認
血清検体は２群の被験者から得た。
（１）子宮内膜症と診断された被験者からの血清検体（n=36）
（２）年齢を適合させた健常人ドナーからの血清検体（n=35）
【０１７５】
自己抗体プロファイリングに関して、血清検体はアレイと別々にインキュベートした。すべてのアレイは、室温（RT、20℃）で2時間インキュベートし、その後、RTで20分間、新鮮なトリトン（Triton）-BSA緩衝液で3回洗浄した。洗浄したスライドは、RTで2時間、標識した抗ヒトIgG抗体中でインキュベートした。スライドは、RTで5分間、トリトン-BSA緩衝液で3回洗浄してすすぎ、240 gで2分間遠心分離した。
【０１７６】
探索されて乾燥させたアレイは、Agilent社高解像度マイクロアレイ・スキャナーを用い、10 μmの解像度でスキャンした。得られた20ビットtiffイメージは、Agilent社特徴抽出ソフトウェア・バージョン10.5または10.7.3.1を用いて特徴抽出した。マイクロアレイスキャンは、アレイデータを正規化および点数化するために用いた各タンパク質スポットに結合した蛍光強度を測定することに供された各アレイに対して画像を作成した。
【０１７７】
アレイ上の各タンパク質の特徴（スポットまたは抗原とも呼ばれる）の、生のシグナル強度（相対蛍光単位、RFUとも呼ばれる）の中央値は、局所的な背景強度の中央値から差し引いた。他の分析法では、当該技術分野で知られた平均蛍光、総蛍光などのスポット強度の他の基準を使用する。QC分析の結果、このプラットフォームは、技術的変動が相対的に低く、予期されたパラメータの範囲内でうまく機能することが示された。
【０１７８】
アレイ生データは、反復したものを統合すること（中央値統合）により正規化した後、通常変換し、その後、全体中央値正規化した。外れ値を特定し、除去した。例外なく妥当な正規化法はなく、研究デザインや検体性状などの要素を考慮しなければならない。本研究においては、中央値正規化を用いた。他の正規化法には、SAM、分位標準化（Bolstad et al. (2003) Bioinformatics 19:185-93）、検体のすべての強度の第１の四分位数の積およびすべての検体の第１の四分位数の平均から成る正規化要素による正味蛍光強度の乗算、ならびに「VSN」法（Huber et al. (2002) Bioinformatics 18 suppl. 1 S96-S104）がある。そのような正規化法は、マイクロアレイ分析の技術分野で周知である。
【０１７９】
この正規化データは、個々の候補バイオマーカーの特定と、バイオマーカーの組み合わせ（「パネル」）の開発に用いられる。火山プロット（図１）、散布図（図２）およびボックスプロットなどのツールは、症例群と対照群を比較する場合に、強いp値および強い倍率変化と組み合わせて、候補バイオマーカー（表６および８）の特定に用いられる。子宮内膜症と関連していることが分かっているいくつかのタンパク質が特定され（表５）、これにはCDC42、EGFR、KIT、PPARGおよびWT1が含まれるので、この方法は有効である。
【０１８０】
２．マイクロアレイを使用する、子宮内膜症を患った被験者の血清におけるmiRNAの検出
（ａ）アレイの調製
マイクロアレイの製作と使用に関して、Agilent Technologies社（Agilent社）のmiRNAマイクロアレイを使用した。マイクロアレイの内容は、知られているすべてのヒトmiRNAおよび知られているすべてのヒト・ウイルスmiRNAを代表しているmiRBaseデータベース（Pradervand et al. (2010) Biotechniques 48:219-22、WO93/22480、WO03/020415およびWO2005/037425）からの公開とともに継続的に整列させた。これらのアレイは、Agilent社のインクジェットin situ合成マイクロアレイ製作機を用いて印刷される。
【０１８１】
（ｂ）バイオマーカーの確認
子宮内膜症患者（「症例」；n=36）および通常の患者（「対照」；n=35）から得られた一連の71個の血清検体を、全RNA（miRNAを含む）を抽出するため、標準的なカラム濾過法を用いて処理した。抽出された血清検体は、Agilent社標準プロトコル（説明書部分番号G4170-90011、バージョン2.4）に従い、Agilent社miRNAマイクロアレイ（G4870A-031181）を用いて分析した。しかしながら標準プロトコルからの逸脱には、2.25 μLのシアニン3-pCpを用いて検体を標識することとマイクロアレイスライドを44時間ハイブリダイズすることが含まれる。
【０１８２】
探索されて乾燥させたアレイは、標識miRNAの検出に適した励起波長を用い、相補的な検出プローブに結合するmiRNA量を測定するため、マイクロアレイ・スキャナーを用いてスキャンした。マイクロアレイスキャンは、アレイデータを正規化および点数化するために用いた各オリゴヌクレオチドスポットに結合した蛍光強度を測定することに供された各アレイに対して画像を作成した。
【０１８３】
生のマイクロアレイスキャン画像は、アレイ上の各オリゴヌクレオチドスポット（特徴とも呼ばれる）に関する生のシグナル強度（相対蛍光単位、RFUとも呼ばれる）を含む。これらの画像から、Agilent社の特許製品である特徴抽出ソフトウェアを使用して特徴抽出した。代わりの分析法では、当該技術分野で知られた平均蛍光、総蛍光などのスポット強度の他の基準を使用する。
【０１８４】
各アレイ上のすべてのオリゴヌクレオチド特徴について得られた平均強度は、技術的片寄り（例えば、レーザー出力変動、表面変化、投入miRNA濃度など）の影響を減らすため、百分位数正規化法により正規化した。このデータに適したデータ正規化法には、他に、分位正規化（Bolstad et al. (2003) Bioinformatics 19:185-93）がある。かかる正規化法は、マイクロアレイ分析の技術分野で周知である。
【０１８５】
miRNA発現における症例と対照の間の統計的有意差を評価するには、線形モデルが適合した。miRNAマイクロアレイデータの火山プロット分析を図３に示す。火山プロット（図３）に関して、ｘ軸は、症例と対照の間のlog2倍率変化を示し、ｙ軸は、統計的有意差（低を10とするp値の負の対数）を示す。水平破線より上側の点は、重要なヒットを選んだものである。
【０１８６】
有意なmiRNAを、組織の種類（すなわち、症例対対照）に従って階層的クラスタリングしたものを図４に示した。ここでは、黒色は高発現を、白色は中程度の発現を、また灰色は低発現を表示する。
【０１８７】
３．qPCRを利用する、子宮内膜症を患った被験者の血清におけるmiRNAの検証
定量的PCR（「qPCR」）の利用にあたり、Life Technologies社（「LifeTech社」）TaqMan（登録商標）miRNAアッセイを使用した。これらのアッセイでは、知られているすべてのヒトmiRNAおよび知られているすべてのヒト・ウイルスmiRNAを代表しているmiRBaseデータベースからの公開とともに継続的に調整した。TaqMan miRNAアッセイは、成熟miRNAの長さが短いという課題に対応するため、新規の標的特異的ステムループ逆転写プライマーを使用する。プライマーは、標的の3’末端を伸長させ、標準のTaqManアッセイに基づくリアルタイムPCRに使用することのできる鋳型を生成する。また、プライマーの尾部におけるステムループ構造は、このアッセイに対して重要な利点、すなわち成熟した生物活性のあるmiRNAの特異的検出という利点を与える。
【０１８８】
miRNAマイクロアレイ実験で特定された有意なマーカーを用いて、LifeTech社 TaqMan miRNA qPCRアッセイにより、その標準プロトコル（説明書部分番号4465407、改訂日2012年3月30日（Rev. B））に従い、miRNAのサブセレクションを分析した。
【０１８９】
TaqMan miRNAアッセイは、標識（例えば6-FAM（商標）色素であるが、これに限定されない）miRNAの検出に適した励起波長で、ViiA（商標）7リアルタイムPCRシステムを用いてスキャンした。qPCRスキャンは、適用される場合に、使用された各TaqMan miRNAアッセイに対して追跡を生成し、受動的基準色素（例えばROXであるが、これに限定されない）と比較して、与えられた検体中の特異的miRNA量を決定する。
【０１９０】
生のqPCR追跡は、生のシグナル強度（ΔRnとも呼ばれる）を含み、異常シグナルの除去に必要な生追跡の基準値正規化後に、そこに分析閾値（水平線）が当てはめられる。この閾値線は、追跡が対数関数で表されるqPCR追跡上の点で、qPCR追跡と交差する。これより、qPCRサイクル（Ct）が決定される。これらのqPCR追跡は、LifeTech社の特許製品である分析ソフトウェアを用いて分析される。代わりの分析法や分析技術は、当該技術分野で知られている。
【０１９１】
3個の検体について、TaqMan miRNAアッセイをそれぞれについて２重に行って、中央値Ctおよび平均量を得た。2群（症例対対照）間の統計的に有意な関連性の検定は、症例検体と対照検体との間の大まかなmiRNA変化を同定するために、正規化検体データに線形モデルを適用することにより行った。統計的有意差はt-検定により算出した。
【０１９２】
マイクロアレイおよびTaqMan miRNA qPCRアッセイからのデータは、得られた結果（図５）のプラットフォーム間の頑健性を評価するため、ピアソン相関係数を解析した。図５は、qPCRに使用されたmiRNAプローブのサブセット間での良好な相関関係を示し、マイクロアレイ上で同定されたものと比較した。
【０１９３】
４．多変量解析：子宮内膜症を患った被験者の血清におけるmiRNAと自己抗体との組み合わせ
自己抗体のみ、miRNAのみまたは自己抗体およびmiRNAの両方を含む組み合わせのいずれかで構成される推定バイオマーカーのパネルを開発した。多変量解析は、変数としてのガレクチン-3およびCA125に対するデータを組み込みながら実行したが、それらの組み入れは、本明細書中で特定されたmiRNAおよび自己抗体の性能を改善しなかった。どの分類子が、与えられたデータセットにより最高の性能を発揮するかを演繹的に予測することは不可能であり、そのため、データ分析を、5種の特徴序列法（1〜5）に、前方および後方特徴選択を加えて実行した：
１．エントロピー
２．バッタチャリャ
３．t-検定
４．ウイルコクソン
５．ROC
６．前方選択
７．後方選択
【０１９４】
当該技術分野で知られた他の分類法を使用することもあり得た。分類子は、組み合わされた感度および特異性（S＋Sスコア）ならびに曲線下面積（AUC）を参照することにより性能を評価した。データは繰り返し分割し、分析サイクルは、安定した分類子セット（「パネル」）が特定されるまで繰り返した。入れ子交差検定は、研究データの過剰適合を避けるため、分類手順に適用した。分類性能は、予測性能を与えるものではないが、分析における背景の指標を与える症例対照状況検体（順列分析）の無作為化セットに匹敵した。1.0に近い数値は、ヌル分析（感度＋特異性（S＋S）スコアがそれぞれ0.5＋0.5に相当する）に期待されるが、2.0のS＋Sスコアは、100%の感度と100%の特異性を示す。順列分析に対する数値と分類子性能との間の差は、分類子の相対的強弱度を示す。この研究で特定された抗原およびmiRNAは、表２および３で与えられる。
【０１９５】
表６は、p値、倍率変化、感度、特異性およびAUCにより判断される、良好な性能を与えるタンパク質バイオマーカーを示す。最高の性能を発揮するタンパク質バイオマーカーは、表７に示される。表８は、p値、倍率変化、感度、特異性およびAUCにより判断される、良好な性能を与えるmiRNAバイオマーカーを示す。最高の性能を発揮するmiRNAバイオマーカーは、表９に示される。最高の性能を発揮するmiRNAバイオマーカーのいくつか（hsa-miR-150、hsa-miR-574-5pおよびhsa-miR-342-3p）に対するROC曲線が図６に示される。最高の性能を発揮するタンパク質バイオマーカーおよびmiRNAバイオマーカーは、表１０に示される。これらは、最高の予測特性を有するバイオマーカーのサブセットに一致するように、特に着目するバイオマーカーを表す。
【０１９６】
上記の分析方法は、表１に開示された個々のバイオマーカーより高い感度、特異性またはAUCを持つバイオマーカーの組み合わせを構築し、検査し、また特定するために使用される。
【０１９７】
各々の分析に対して、推定バイオマーカーの複数の組み合わせを導き出し、次に、導き出されたパネルの性能を順位付けた（表１１〜１５）。表１１〜１５は、良好な性能を与える2量体、3量体、4量体、5量体および6量体のパネルを示す。最高の性能を発揮する組み合わせのいくつかに対するROC曲線が図７に示される（Ａ= hsa-miR-150およびhsa-miR-574-5pによる2量体パネル；Ｂ= hsa-miR-342-3pおよびhsa-miR-574-5pによる2量体パネル；Ｃ= hsa-miR-150およびhsa-miR-342-3pによる2量体パネル；Ｄ= hsa-miR-150、hsa-miR-122およびhsa-miR-574-5pによる3量体パネル）。
【０１９８】
p値、倍率変化、感度、特異性、AUCおよび／または導き出されたパネルにおける出現頻度により判断される、最高の診断能力を有するバイオマーカーを特定し、抗原およびmiRNAの単一リストに組み合わせた。図８は、最高の性能を発揮する組み合わせの１つであるTPM1、hsa-miR-150およびhsa-miR-574-5pによる3構造パネルに対するROC曲線を示す。したがって、タンパク質バイオマーカーおよびmiRNAバイオマーカーの混ざりを含むパネルは、良好な診断性能を与える。
【実施例２】
【０１９９】
１．NanoString技術を利用する、子宮内膜症を患った被験者の組織検体におけるmiRNAの検出
本研究において使用した新鮮組織検体には、腹腔子宮内膜症（ES）、卵巣子宮内膜腫（OvES）、正常子宮内膜（NE）および正常腹膜（NP）が含まれる。
【０２００】
〔miRNAの抽出〕
検体からの全RNAは、mirVana（商標）PARIS（商標）キット（Ambion社）を用いて、提供されるプロトコルに従って抽出した。RNAの定量と完全性は、Aligent Technologies社の真核生物全RNAナノアッセイを用いて評価した。次の検証では、すべての生物学的発現レベルにわたって、逆転写または増幅を用いることなく全RNAにおける超高感度miRNA検出を可能にするnCounter（登録商標）miRNA発現アッセイ（NanoString Technologies社）において、100 ngの全RNAを使用した。miRBaseから得た、735個のヒトおよびヒト関連ウイルスmiRNAをスキャンした。特定のオリゴヌクレオチドタグの固有の多重アニーリングを、その標的miRNA上に連結した後、すべての非連結タグを除去するため酵素的に精製した。過剰の非結合プローブおよびRNAを、nCounter Prepステーションの二段階磁気ビーズに基づく精製システムを用いて洗浄した。残ったmiRNAをカートリッジ表面に付着させ、極性を持たせた。カートリッジをスキャンし、データ収集をnCounterデジタルアナライザーで行った。デジタル画像を処理し、miRNA数を表にした。
【０２０１】
〔統計解析〕
Ｒプロジェクト（Ｒバージョン2.12.1）（http://www.R-project.org）を統計解析およびクラスタリング解析に使用した。nCounter（登録商標）miRNA発現アッセイ（NanoString Technologies社）から得られた定量化した遺伝子発現シグナルレベルは対数変換（底2）し、さらに探査する前に分位正規化した。miRNA発現検出能閾値を決定するため、log2シグナル値を増加順に順位付けし、0.5発現レベル区分ごとに分けた。次に、連続発現レベル頻度の差を算出し、最も大きなシグナル増加に続く発現値を、miRNA発現検出能閾値と見なした。いかなるレベルでも、miRNA発現（log2発現値が3.25より上）を各グループで計数し、続いて、その数が期待平均とは有意に差があるかどうかを評価するため、カイ二乗検定を行った。全群間のmiRNA全体発現は、有意差があるとは示されなかった（カイ二乗p値0.82664147）。
【０２０２】
分散分析（ANOVA）は、差動的に発現されたmiRNAを特定するために、適切な群に割り当てたすべての検体にわたって、各遺伝子について行った。Benjamini & Hochberg多重仮説検定補正を適用し、偽発見率（FDR）を抑制した。統計的に有意（補正p値< 0.05）なままである遺伝子を、スピアマン（Spearman）相関係数およびウォード（ward）凝集法を用いて算出された距離に基づいて実行された教師なし階層的クラスタリングのために選択した。
【０２０３】
続いて、多重検定のための補正のある対t-検定を、事後解析として適用した。t-検定は、特定の検体群と他のすべての検体群との間で実行した。例えば、ES検体を他のすべての群（OvES、NPおよびNE）と比較し、OvES検体を他のすべての群（ES、NPおよびNE）と比較するなどである。算出されたt-統計値およびシグナル強度倍率変化はさらに使用して、各検体群で有意に発現増加および減少したmiRNAを特定し、また、調査群において差次的に発現したmiRNA間での重複を描いたベン図を作成した（図９）。
【０２０４】
図９の領域Ａは、2種のmiRNA（ebv-miR-BART2-5pおよびhsa-miR-564、表１６にも記載）のレベルが、OvES、NEおよびNPの各検体と比較して、ES検体において有意差があることを示している。したがって、これらのmiRNAは、腹腔子宮内膜症の検出に特に有用である。腹腔子宮内膜症は、子宮内膜腫と比較して、超音波またはMRIなどの従来技術を用いて検出することが相対的により難しいので、これらのmiRNAは、実際問題として特に有用である。
【０２０５】
図９の領域Ｃは、1種のmiRNA（表１８に記載）のレベルが、NEおよびNPの各検体と比較して、ESおよびOvESの各検体において有意差があることを示している。したがって、これらのmiRNAは、子宮内膜症の存在場所に関わらず、子宮内膜症の検出に特に有用である。
【０２０６】
図９の領域Ｆは、表１７に記載のmiRNAレベルが、ES、NEおよびNPの各検体と比較して、OvES検体において有意差があることを示している。したがって、これらのmiRNAは、子宮内膜腫など、卵巣における子宮内膜症の検出に特に有用である。
【０２０７】
図９の領域Ｂは、表２０に記載のmiRNAレベルが、NE検体と比較して、ES、OvESおよびNPの各検体において有意差があることを示している。
【０２０８】
図９の領域Ｄは、2種のmiRNA（表２１に記載）のレベルが、NP検体と比較して、ES、OvESおよびNEの各検体において有意差があることを示している。
【０２０９】
図９の領域Ｅは、表１９に記載のmiRNAレベルが、ESおよびNPの各検体と比較して、OvESおよびNEの各検体において有意差があることを示している。
【０２１０】
２．qPCRを利用する、子宮内膜症を患った被験者の組織検体におけるmiRNAの検証
PCRはマイクロアレイデータを検証するために行った。TaqMan（登録商標）マイクロRNAアッセイ（Applied Biosystems社）を使用した。
【０２１１】
cDNAは、市販の特定のEBV-miR-bart2-5pアッセイを用いて、全RNAから合成した。RNU-44およびhsa-miR-26bを、成熟miRNA内在性対照として使用した。miRNA 26bは、一般的に発現している脊椎動物miRNAであり、反応の対照プライマーとして使用した。リアルタイムPCR増幅は、TaqMan 2×ユニバーサルPCRマスターミックス（Applied Biosystems社）を用い、各検体につき３重で行った。
【０２１２】
ebv-miR-BART2-5p miRNAの有意差のある発現が、対照からの正常な子宮内膜、子宮内膜症の被験者からの正常な子宮内膜および子宮内膜症の間で観察された（図１０）。非子宮内膜症被験者からの正常な子宮内膜におけるebv-miR-BART2-5pの発現レベルは、子宮内膜症でのその発現レベルと有意に異なる（p=0.0067）。子宮内膜症の被験者からの正常な子宮内膜検体と非子宮内膜症被験者からの正常な子宮内膜検体との間には、統計的有意性はなかった。
【０２１３】
本発明は例証のみによって説明されており、本発明の範囲と精神の範囲内において、修正される可能性があることが理解される。
【０２１４】
【表１】
0006667446.tif 000002
0006667446.tif 000003
0006667446.tif 000004
0006667446.tif 000005
0006667446.tif 000006
0006667446.tif 000007
0006667446.tif 000008
0006667446.tif 000009
0006667446.tif 000010
【０２１５】
〔カラム〕
（i）この番号は、配列リストで示されるSEQ ID NOである。自己抗原バイオマーカーに関して、配列リストのSEQ ID NOは、自己抗原バイオマーカーに対するコード配列を与える。miRNAバイオマーカーに関して、配列リストのSEQ ID NOは、表３および４で示すように、成熟した、発現されたmiRNAバイオマーカーの配列を与える。
（ii）「記号」カラムは、HGNCにより承認された遺伝子記号を与える。HGNCは、すべてのmiRNAおよびヒト遺伝子に、固有かつ意味が分かる名称を付与することを目的とする。付加的なダッシュ番号接尾語は、同一の成熟したmiRNAをもたらすが、ゲノムの中で異なる場所に位置するプレmiRNAを示す。
（iii）自己抗原の名称は、NCBIにより与えられる公式フルネームから取られる。自己抗原は、先行技術における１つ以上の仮名で示される可能性がある。本発明は、命名法に関わらず、これらの自己抗原に関する。miRNAの名称は、専門的データベースmiRBase、バージョン16（2010年8月公開）から取られる。
【０２１６】
【表２】
0006667446.tif 000011
0006667446.tif 000012
0006667446.tif 000013
0006667446.tif 000014
【０２１７】
〔カラム〕
（i）この番号は、自己抗原バイオマーカーに対するコード配列のための配列リストで示されるSEQ ID NOである。
（ii）「記号」カラムは、HGNCにより承認された遺伝子記号を与える。HGNCは、すべてのmiRNAおよびヒト遺伝子に、固有かつ意味が分かる名称を付与することを目的とする。
（iii）「ID」カラムは、抗原マーカーに対するEntrez GeneID番号を示す。Entrez GeneID値は、すべての分類群にわたって固有である。
（iv）この名称は、NCBIにより与えられる公式フルネームから取られる。自己抗原は、先行技術における１つ以上の仮名で示される可能性がある。本発明は、命名法に関わらず、これらの自己抗原に関する。
（v）HUGO遺伝子命名法委員会は、すべてのヒト遺伝子に、固有かつ意味が分かる名称を付与することを目的とする。したがってHGNC番号は、固有のヒト遺伝子を特定する。付加的なダッシュ番号接尾語は、同一の成熟したmiRNAをもたらすが、ゲノムの中で異なる場所に位置するプレmiRNAを示す。
（vi）「GI」番号または「GenInfo識別子」は、配列がデータベースに加えられた場合、NCBIによって処理される各配列記録に連続的に割り当てられる一連の数字である。GI番号は、配列記録の受入番号に類似性を持たない。配列が更新される場合（例えば訂正のため、またはさらに注釈もしくは情報を加えるため）、新たなGI番号を受ける。このように、与えられたGI番号と関連した配列は、変わることがない。
【０２１８】
【表３】
0006667446.tif 000015
0006667446.tif 000016
0006667446.tif 000017
0006667446.tif 000018
0006667446.tif 000019
0006667446.tif 000020
【０２１９】
〔表３および４のカラム〕
（i）SEQ ID NO：成熟した、発現されたmiRNAバイオマーカーの配列に関する。
（ii）「miRNA名」カラムは、専門的データベースmiRBase、バージョン16（2010年8月公開）によるヒトmiRNAの名称を与える。
（iii）「記号」カラムは、HGNCにより承認された遺伝子記号を与える。HGNCは、すべてのmiRNAおよびヒト遺伝子に、固有かつ意味が分かる名称を付与することを目的とする。付加的なダッシュ番号接尾語は、同一の成熟したmiRNAをもたらすが、ゲノムの中で異なる場所に位置するプレmiRNAを示す。
（iv）HGNCは、すべてのmiRNA（およびヒト遺伝子）に、固有かつ意味が分かる名称を付与することを目的とする。したがってHGNC番号は、固有のヒト遺伝子を特定する。HUGOへの組み入れは、ヒト遺伝子のみである。
【０２２０】
【表４】
0006667446.tif 000021
0006667446.tif 000022
0006667446.tif 000023
0006667446.tif 000024
0006667446.tif 000025
【０２２１】
【表５】
0006667446.tif 000026
【０２２２】
〔カラム〕
（i）〜（vi）は表２のものと同一である。
【０２２３】
【表６】
0006667446.tif 000027
【０２２４】
〔カラム（表６および７）〕
（i）「ID」カラムは、抗原マーカーに対するEntrez GeneID番号を示す。Entrez GeneID値は、すべての分類群にわたって固有である。
（ii）「記号」カラムは、HGNCにより承認された遺伝子記号を与える。HGNCは、すべてのmiRNAおよびヒト遺伝子に、固有かつ意味が分かる名称を付与することを目的とする。
（iii）「p値」は、実施例１で決定されるように、症例と対照との比較により導き出された、マイクロアレイにおけるt-検定のp値を表す。
（iv）バイオマーカーは、実施例１で決定されるように、発現増強（すなわち、対照検体と比較した場合の倍率変化の増加）または発現減少（すなわち、対照検体と比較した場合の倍率変化の減少）する。
【０２２５】
【表７】
0006667446.tif 000028
【０２２６】
【表８】
0006667446.tif 000029
0006667446.tif 000030
0006667446.tif 000031
【０２２７】
〔カラム（表８および９）〕
（i）「miRNA名」カラムは、専門的データベースmiRBase、バージョン16（2010年8月公開）によるヒトmiRNAの名称を与える。
（ii）「p値」は、実施例１で決定されるように、症例と対照との比較により導き出された、マイクロアレイにおけるt-検定のp値を表す。
（iii）バイオマーカーは、実施例１で決定されるように、発現増強（すなわち、対照検体と比較した場合の倍率変化の増加）または発現減少（すなわち、対照検体と比較した場合の倍率変化の減少）する。
【０２２８】
【表９】
0006667446.tif 000032
【０２２９】
【表１０】
0006667446.tif 000033
【０２３０】
〔カラム（表１０〜１４）〕
（i）S＋Sは、実施例１で決定されるように、感度カラムと特異性カラムの和である。
（ii）および（iii）これら２つのカラムは、実施例１で使用される検体に適用される場合、同一の列における左側のカラムに示された関連するバイオマーカー（または、表１１〜１５のパネルのために）だけに基づく検査の感度と特異性を示す。
（iv）miRNA分析のために、データは、実施例１で記載されるように、マイクロアレイ（「microarray」）またはqPCRプラットフォームを用いて作り出された。自己抗体（「autoAb」）バイオマーカーは、実施例１で記載されるように、タンパク質アレイプラットフォームを用いて特定された。パネルが、変数（実施例１を参照）としてmiRNAバイオマーカーと自己抗体バイオマーカーとを組み込んで開発された場合、これらは「combiAbMir」と言われる。
【０２３１】
【表１１】
0006667446.tif 000034
0006667446.tif 000035
【０２３２】
【表１２】
0006667446.tif 000036
0006667446.tif 000037
0006667446.tif 000038
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【０２３３】
【表１３】
0006667446.tif 000040
0006667446.tif 000041
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【０２３４】
【表１４】
0006667446.tif 000050
【０２３５】
【表１５】
0006667446.tif 000051
【０２３６】
【表１６】
0006667446.tif 000052
【０２３７】
【表１７】
0006667446.tif 000053
【０２３８】
【表１８】
0006667446.tif 000054
【０２３９】
【表１９】
0006667446.tif 000055
0006667446.tif 000056
【０２４０】
【表２０】
0006667446.tif 000057
【０２４１】
【表２１】
0006667446.tif 000058
【図１】
0006667446.tif 000059
【図２】
0006667446.tif 000060
【図３】
0006667446.tif 000061
【図４】
0006667446.tif 000062
【図５】
0006667446.tif 000063
【図６】
0006667446.tif 000064
【図７−１】
0006667446.tif 000065
【図７−２】
0006667446.tif 000066
【図８】
0006667446.tif 000067
【図９】
0006667446.tif 000068
【図１０】
0006667446.tif 000069