(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１７Ａに特異的に結合することが可能な抗体、又はＩＬ−１７Ａに特異的に結合することが可能なその断片であって、
前記の抗体又はその断片は、軽鎖及び重鎖を含み、
前記軽鎖は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３からなる軽鎖ＣＤＲを含み；前記重鎖は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３からなる重鎖ＣＤＲを含み、
前記のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２及び３で表され；前記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５及び６で表される
ことを特徴とするＩＬ−１７Ａに特異的に結合する可能な抗体又はその断片。
【請求項２】
ＩＬ−１７Ａキメラ抗体、ＩＬ−１７Ａヒト化抗体、又はそれらの断片である、請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項３】
前記抗体は、ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ及びＩｇＤからなる群より選ばれるいずれか１種の定常領域配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗体又はその断片。
【請求項４】
前記断片は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、及び抗体の最小認識単位からなる群より選ばれる１種又は複数種を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の抗体又はその断片。
【請求項５】
前記ＩＬ−１７Ａキメラ抗体又はその断片の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８で表されることを特徴とする請求項２又は４に記載の抗体又はその断片。
【請求項６】
前記ＩＬ−１７Ａキメラ抗体又はその断片の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０で表されることを特徴とする、請求項５に記載の抗体又はその断片。
【請求項７】
請求項２又は４に記載の抗体又はその断片であって、前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖フレームワーク領域は、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４を含み、重鎖フレームワーク領域は、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４を含み、
前記ＦＲ−Ｌ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１１で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
１番目のアミノ酸Ｄは、Ｉに置き換えられ、
２番目のアミノ酸Ｖは、Ｉに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｌ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１２で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
４番目のアミノ酸Ｆは、Ｙに置き換えられ、
１４番目のアミノ酸Ｒは、Ｌに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｌ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１３で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
３５番目のアミノ酸Ｙは、Ｆに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｌ４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１４で表されるアミノ酸配列から選ばれ、
前記ＦＲ−Ｈ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１５で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
４番目のアミノ酸Ｌは、Ｖに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｈ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１６で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
１５番目のアミノ酸Ｉは、Ｍに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｈ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１７で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
２番目のアミノ酸Ｖは、Ｉに置き換えられ、
６番目のアミノ酸Ｖは、Ｒに置き換えられ、
前記ＦＲ−Ｈ４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１８で表されるアミノ酸配列から選ばれる、
ことを特徴とする、抗体又はその断片。
【請求項８】
前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９−２６のいずれか１つで表されることを特徴とする、請求項７に記載の抗体又はその断片。
【請求項９】
前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７−３４のいずれか１つで表されることを特徴とする、請求項７に記載の抗体又はその断片。
【請求項１０】
請求項７に記載の抗体又はその断片であって、
（ａ）前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で表され、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７で表される；
（ｂ）前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０で表され、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で表される；
（ｃ）前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１で表され、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９で表される；
（ｄ）前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で表され、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０で表される；
（ｅ）前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で表され、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１で表される；
（ｆ）前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で表され、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２で表される；
（ｇ）前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４で表され、重鎖の可変領域の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３で表される；
（ｈ）前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５で表され、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２で表される；或いは、
（ｉ）前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６で表され、その対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４で表されることを特徴とする、抗体又はその断片。
【請求項１１】
前記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体又はその断片の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０で表されることを特徴とする、請求項７に記載の抗体又はその断片。
【請求項１２】
前記抗体又はその断片は、少なくとも１種の診断薬及び/又は治療薬とカップリングして免疫複合体を形成する、ことを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体又はその断片。
【請求項１３】
前記診断薬は、放射性核種、放射性造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識物、超音波造影剤、光増感剤からなる群より選ばれる１種又は複数種である、請求項１２に記載の抗体又はその断片。
【請求項１４】
前記治療薬は、裸抗体、細胞毒性薬、薬物、放射性核種、ホウ素原子、免疫調節剤、抗アポトーシス剤、光増感性治療薬、免疫複合体及びオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる１種又は複数種である、請求項１２に記載の抗体又はその断片。
【請求項１５】
前記薬物は、デキサメタゾン、ジクロフェナク、ナブメトン、メロキシカム、セレコキシブ、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ及びビンクリスチンからなる群より選ばれる１種又は複数種である、請求項１４に記載の抗体又はその断片。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれる１種又は複数種である、請求項１４に記載の抗体又はその断片。
【請求項１７】
前記免疫調節剤は、サイトカイン、ケモカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び幹細胞増殖因子からなる群より選ばれる１種又は複数種である、請求項１４に記載の抗体又はその断片。
【請求項１８】
前記放射性核種は、 １１１Ｉｎ、 １１１Ａｔ、 １７７Ｌｕ、 ２１１Ｂｉ、 ２１２Ｂｉ、 ２１３Ｂｉ、 ２１１Ａｔ、 ６２Ｃｕ、 ６７Ｃｕ、 ９０Ｙ、 １２５Ｉ、 １３１Ｉ、１３３Ｉ、 ３２Ｐ、 ３３Ｐ、 ４７Ｓｃ、 １１１Ａｇ、 ６７Ｇａ、 １５３Ｓｍ、 １６１Ｔｂ、 １５２Ｄｙ、 １６６Ｄｙ、 １６１Ｈｏ、 １６６Ｈｏ、 １８６Ｒｅ、 １８８Ｒｅ、 １８９Ｒｅ、 ２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、 ２２３Ｒａ、 ２２５Ａｃ、 ７７Ａｓ、 ８９Ｓｒ、 ９９Ｍｏ、 １０５Ｒｈ、 １４９Ｐｍ、 １６９Ｅｒ、 １９４Ｉｒ、 ５８Ｃｏ、 ８０ｍＢｒ、 ９９ｍＴｃ、 １０３ｍＲｈ、 １０９Ｐｔ、１１９Ｓｂ、 １８９ｍＯｓ、 １９２Ｉｒ、 ２１９Ｒｎ、 ２１５Ｐｏ、 ２２１Ｆｒ、 ２５５Ｆｍ、 １１Ｃ、 １３Ｎ、 １５Ｏ、 ７５Ｂｒ、 １９８Ａｕ、 １９９Ａｕ、 ２２４Ａｃ、 ７７Ｂｒ、 １１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、 ９７Ｒｕ、 １０３Ｒｕ、 １０５Ｒｕ、 １０７Ｈｇ、 ２０３Ｈｇ、 １２１ｍＴｅ、 １２２ｍＴｅ、 １２５ｍＴｅ、 １６５Ｔｍ、 １６７Ｔｍ、 １６８Ｔｍ、 １９７Ｐｔ、 １０９Ｐｄ、 １４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、 １６１Ｔｂ、 ５７Ｃｏ、 ５８Ｃｏ、 ５１Ｃｒ、 ５９Ｆｅ、 ７５Ｓｅ、 ２０１Ｔｌ、 ７６Ｂｒ及び １６９Ｙｂからなる群より選ばれる１種又は複数種である、請求項１４に記載の抗体又はその断片。
【請求項１９】
有効成分として、請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体又はその断片を含有する、或いは該抗体又はその断片と他の成分とからなる化合物を含有する、ことを特徴とする組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の抗体又はその断片並びに薬学的に許容されるキャリヤーを含有する、ＩＬ−１７Ａの過剰発現及び/又は過剰放出に関連する疾患を予防及び/又は治療するための薬物。
【請求項２１】
請求項１９に記載の組成物及び薬学的に許容されるキャリヤーを含む、ＩＬ−１７Ａの過剰発現及び/又は過剰放出に関連する疾患を予防及び/又は治療するための薬物。
【請求項２２】
前記疾患は、気道炎症、喘息、気管支喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患、 特発性肺線維症、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬、多発性硬化症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、ブドウ膜炎、ヘリコバクター・ピロリ感染胃炎、骨粗鬆症、骨びらん、腹腔内膿瘍・癒着、アジソン病、低ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、セリアック病、シャーガス病、クローン病、同種移植拒絶反応、ベーチェット病、敗血症、敗血症性または内毒素性ショック、および虚血からなる群より選ばれるいずれか１種以上である、ことを特徴とする、請求項２０又は２１に記載の薬物。
【請求項２３】
単離された核酸分子であって、以下の核酸から選ばれることを特徴とする核酸分子：
Ａ）請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体又はその断片をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ；
Ｂ）Ａ）で定義された核酸に相補的な核酸。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【０００１】
本願は、２０１６年０９月１４日に中国特許庁へ提出された、出願番号がＣＮ２０１６１０８２７０９７．２、発明の名称が「ＩＬ−１７Ａに特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片」である中国特許出願に基づき優先権を主張し、その全内容は、援用により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、医学・生物学的技術及びヒト化抗体修飾の研究分野に関し、具体的には、ＩＬ−１７Ａに特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片に関する。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７又はＩＬ−１７Ａ）は、主にＴｈ１７細胞から産生される炎症促進性サイトカイであり、ＩＬ−１７ファミリーにおける最も代表的なメンバーである（Ｍｉｏｓｓｅｃ Ｐ,Ｋｏｌｌｓ ＪＫ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．,２０１２,１１:７６３−７７６）。ＩＬ−１７Ａは、その受容体（ＩＬ−１７ＲＡ）に結合した後、多種の細胞（例えば、線維芽細胞、上皮細胞、及び内皮細胞）による炎症性サイトカイン及びケモカインの発現を誘導し、生体の免疫防御において重要な役割を果たす（Ｌｉｎ Ｙ,Ｒｉｔｃｈｅａ Ｓ,Ｌｏｇａｒ Ａ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ,２００９,３１:７９９−８１０）。
【０００４】
しかしながら、過剰発現したＩＬ−１７Ａは、多くの炎症性疾患を引き起こす可能性がある。例えば、ＩＬ−１７Ａは、マクロファージ、樹状細胞に作用してＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＣＲＰの高発現を誘導し、炎症反応を起こし、乾癬及び移植後拒絶反応の病理学的過程に関与し、ＩＬ−１７Ａは、内皮細胞に作用してＩＬ−６、ＭＭＰ、血液凝固因子の高発現を誘導し、血管の活性化を起こし、再灌流障害、血栓症、及びアテローム性動脈硬化症の病理学的過程に関与し、ＩＬ−１７Ａは、線維芽細胞に作用してＩＬ−６、ケモカイン、成長因子、ＭＭＰの高発現を誘導し、基質破壊を起こし、多発性硬化症、クローン病の病理学的過程に関与し、ＩＬ−１７Ａは、骨芽細胞および軟骨細胞に作用してＲＡＮＫＬ、ＭＭＰ、破骨細胞形成を誘導し、骨侵食、軟骨損傷を起こし、リウマチ性関節炎、歯周病の病理学的過程に関与する（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９Ａｕｇ２７；３６１（９）:８８８−９８．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２Ｏｃｔ；１１（１０）:７６３−７６．Ｓｅｍｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２０１３Ｏｃｔ；４３（２）:１５８−７０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１６Ｍａｒ；２２（３）:２３０−４１．）。
【０００５】
ＩＬ−１７Ａの中和抗体は、関節リウマチ患者の滑膜組織におけるＩＬ−１７Ａの高発現を抑制し、重要な炎症性因子であるＩＬ−６の産生を低減させることができる（Ｃｈａｂａｕｄ Ｍ,Ｄｕｒａｎｄ ＪＭ,Ｂｕｃｈｓ Ｎ,ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１９９９,４２:９６３−７０）。多くの自己免疫疾患の動物モデルの実験は、抗体を使用してＩＬ−１７Ａを中和するのは、炎症の病理学的進展を効果的に抑制できることことを実証した（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ Ｅ,Ｋｏｅｎｄｅｒｓ ＭＩ,Ｏｐｐｅｒｓ−Ｗａｌｇｒｅｅｎ Ｂ,ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、２００４,５０:６５０−６５９）。
【０００６】
現在では、ＩＬ−１７Ａに関連する抗体薬は、承認・販売されており、それぞれＳｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ（抗ＩＬ−１７Ａ抗体）、Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ（抗ＩＬ−１７Ａ抗体）であり、いずれも乾癬の治療に適用する。しかしながら、医薬品の臨床試験の結果は、これらの医薬品は、ある慢性炎症性疾患、例えば、関節リウマチに対して期待される治療効果を示さないことを示した（Ｋｅｌｌｎｅｒ Ｈ,Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔ Ｄｉｓ．,２０１３,５:１４１−１５２）。
これに鑑みて、特に本発明はを提案した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、得られたヒトＩＬ−１７Ａのタンパク質に特異的に結合する親抗ヒトＩＬ−１７Ａマウスモノクローナル抗体に基づき、クローニング、同定、および遺伝子構造の分析により、そのＣＤＲ領域の配列を確認し、対応するキメラ抗体及びヒト化抗体を構築しつつ、対応する真核細胞発現系を樹立し、そのキメラ抗体及びヒト化抗体を生産して精製する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る上記の目的を達成するために、特に、以下の技術案を採用する。
特異的にＩＬ−１７Ａに結合する可能な抗体及びその機能的断片において、前記の抗体又は抗体の機能的断片には、軽鎖及び重鎖を含み、
前記軽鎖は、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３からなる軽鎖ＣＤＲを持ち、前記重鎖は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３からなる重鎖ＣＤＲを持ち、
前記のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１、２及び３で表され、前記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:４、５及び６で表される。
好ましくは、前記の抗体又はその機能的断片は、ＩＬ−１７Ａキメラ抗体及びその機能的断片、並びにＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片を含む。
【０００９】
前記の抗体又はその機能的断片は、ＩＬ−１７Ａキメラ抗体及びその機能的断片を含み、或いは、前記抗体又はその機能的断片は、ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片を含むことも理解されてもよい。
抗体の結合特異性および親和性はいずれも主にＣＤＲ配列によって決定されることは、当技術分野において周知であり、非ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を周知の成熟した既存技術により容易に変更して、類似の生物学的活性を有する変異体を取得する。本発明に係る上記ＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を有するモノクローナル抗体の変異体は、それが本発明に係るヒト化抗体と同一のＣＤＲ配列を有するために、類似する生物学的活性を持つ。
【００１０】
好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片において、上記抗体は、ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤからなる群より選ばれるいずれか１種の定常領域の配列を含む。
好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片において、上記機能的断片は、Ｆ（ａｂ’） ２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、及び抗体の最小認識単位(ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｕｎｉｔｓ，ＭＲＵ)からなる群より選ばれる１種又は複数種を含む。
【００１１】
本発明に係る「機能的断片」とは、特に、ＩＬ−１７Ａに対して親抗体と同じな特異性を持つ抗体断片を意味する。上記機能的断片に加えて、半減期が延長した任意の断片も含まれる。
ｓｃＦｖ（ｓｃ＝一本鎖）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）。
【００１２】
これらの機能的断片は、通常、それらが由来する抗体と同じな結合特異性を有する。当業者は、本発明に係る抗体の断片は、例えば、酵素消化の方法（ペプシンまたはパパインを含む）、及び/又はジスルフィド結合を化学的に還元して開裂させる方法により上記機能的断片を取得することができることを本発明の説明に記載の内容から推測する。
抗体の断片は、当業者に周知の遺伝子組換え技術、又は自動ペプチド合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓなどにより販売される自動ペプチド合成装置により、ペプチド合成により取得されることもできる。
【００１３】
好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片において、上記ＩＬ−１７Ａキメラ抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列及び重鎖可変領域配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:７及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:８で表される。
更に好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片において、上記ＩＬ−１７Ａキメラ抗体及びその機能的断片の軽鎖定常領域配列及び重鎖定常領域配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０で表される。
【００１４】
好ましくは、上記のような抗体及びその機能的断片において、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖フレームワーク領域は、ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４を含み、重鎖フレームワーク領域は、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４を含み、
上記ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３及びＦＲ−Ｌ４のアミノ酸配列は、順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１１−１４で表され、
上記ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３及びＦＲ−Ｈ４のアミノ酸配列は、順にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１５−１８で表される。
【００１５】
一般的に、マウス抗体のＣＤＲをヒト抗体フレームワークに移植し、配列相同性が高いヒト抗体フレームワークを選択することはある程度の成功率を有する。しかしながら、多くのＣＤＲ移植は、一定の抗体活性を回復させるために復帰突然変異を必要とすることが研究により示されている。如何に適切なヒト抗体フレームワークを選択するのは、主なボトルネックである。
ＣＤＲは、抗原結合に主な関連部位であるが、多数の場合には、ＦＲ（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）は結合部位コンフォメーションに大きな影響を及ぼす。高親和性ヒト化抗体を得るために、本発明は、適切なＦＲ領域を選択し、関連するＦＲ残基をマウス由来アミノ酸又は同じ作用があるヒトに見出されるアミノ酸に復帰させる必要がある。
【００１６】
好ましくは、上記ＦＲ−Ｌ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１１で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
１番目のアミノ酸Ｄは、Ｉに置き換えられ、
２番目のアミノ酸Ｖは、Ｉに置き換えられ、
上記ＦＲ−Ｌ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１２で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ：
４番目のアミノ酸Ｆは、Ｙに置き換えられ、
１４番目のアミノ酸Ｒは、Ｌに置き換えられ、
上記ＦＲ−Ｌ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１３で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
３５番目のアミノ酸Ｙは、Ｆに置き換えられ、
上記ＦＲ−Ｌ４は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１４で表されるアミノ酸配列から選ばれ、
上記ＦＲ−Ｈ１は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１５で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
４番目のアミノ酸Ｌは、Ｖに置き換えられ、
上記ＦＲ−Ｈ２は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１６で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
１５番目のアミノ酸Ｉは、Ｍに置き換えられ、
上記ＦＲ−Ｈ３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１７で表されるアミノ酸配列、又は以下の置換及びそれらの組合せにより得られたアミノ酸配列から選ばれ、
２番目のアミノ酸Ｖは、Ｉに置き換えられ、
６番目のアミノ酸Ｖは、Ｒに置き換えられる。
【００１７】
好ましくは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９−２６のいずれか１つで表され、
好ましくは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の重鎖可変領域の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７−３４のいずれか１つで表され、
より好ましくは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９で表され、その対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７で表され、
或いは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０で表され、その対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８で表され、
或いは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１で表され、その対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９で表され、
或いは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で表され、その対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０で表され、
或いは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２で表され、その対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１で表され、
或いは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片における軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で表され、その対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２で表され、
或いは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４で表され、その対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３で表され、
或いは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５で表され、その対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２で表され、
或いは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６で表され、その対応する重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４で表され、
最も好ましくは、上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖定常領域配列及び重鎖定常領域配列のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０で表される。
【００１８】
上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の軽鎖定常領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:９で表される、ヒト抗体Ｋａｐｐａ軽鎖定常領域から選ばれ、
上記ＩＬ−１７Ａヒト化抗体及びその機能的断片の重鎖定常領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０で表される、ヒト抗体ＩｇＧ１重鎖定常領域から選ばれる。
【００１９】
本願で上記に開示されているアミノ酸配列の以外は、キメラ抗体及びヒト化抗体の産生は、当業者が任意の公知の方法、例えば、免疫されたマウスまたは骨髄腫細胞と融合した他の種の脾臓細胞の骨髄腫細胞によって分泌されるマウス抗体の配列決定されたＣＤＲにより設計された組換えヒト化抗体により達成することができる。上記免疫された動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有してヒト抗体を直接産生するトランスジェニックマウスを含んでもよい。他の可能な実施形態は、ファージディスプレイ技術を使用してライブラリーをスクリーニングすることを含んでもよい。
【００２０】
単離された核酸分子であって、前記核酸分子は、以下の核酸から選ばれる。
Ａ）上記のような抗体及びその機能的断片をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ、
Ｂ）Ａ）で定義された核酸に相補的な核酸。
【００２１】
上記のような核酸分子を含むベクター。
本発明は、さらに、上記のような核酸分子をコードする少なくとも１つの核酸構築物を含み、好ましくはベクター、さらに好ましくは発現ベクター、例えば、プラスミドであり、そのベクターの構築方法は本願に係る１つの実施例において説明する。
【００２２】
上記のようなベクターで形質転換された宿主細胞。
上記宿主細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞である。
【００２３】
ＩＬ−１７Ａに特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片を生産できる方法において、
培地において適切な培養条件下で上記のような宿主細胞を培養するステップと、
培地又は培養された宿主細胞からこのようにして産生された抗体及びその機能的断片を回収するステップと、
を含む方法。
【００２４】
上記のような抗体及び/又はその機能的断片、若しくはそれらと他の成分とからなる化合物を有効成分とする組成物。
好ましくは、上記のような組成物において、上記抗体及びその機能的断片は少なくとも１種の診断薬及び/又は治療薬とカップリングして免疫複合体を形成する。
好ましくは、上記のような組成物において、上記診断薬は、放射性核種、放射性造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識物、超音波造影剤、光増感剤からなる群より選ばれる１種又は複数種である。
【００２５】
好ましくは、上記放射性核種は、 １１０Ｉｎ、 １１１Ｉｎ、 １７７Ｌｕ、 １８Ｆ、 ５２Ｆｅ、 ６２Ｃｕ、 ６４Ｃｕ、 ６７Ｃｕ、 ６７Ｇａ、 ６８Ｇａ、 ８６Ｙ、 ９０Ｙ、 ８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、 ９４Ｔｃ、 ９９ｍＴｃ、 １２０Ｉ、 １２３Ｉ、 １２４Ｉ、 １２５Ｉ、 １３１Ｉ、 １５４−１５８Ｇｄ、 ３２Ｐ、 １１Ｃ、 １３Ｎ、 １５Ｏ、 １８６Ｒｅ、 １８８Ｒｅ、 ５１Ｍｎ、 ５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、 ７２Ａｓ、 ７５Ｂｒ、 ７６Ｂｒ、 ８２ｍＲｂ及び ８３Ｓｒからなる群より選ばれる１種又は複数種を含む。
好ましくは、上記常磁性イオンは、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム （ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム （ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）及びエルビウム （ＩＩＩ）からなる群より選ばれる１種又は複数種を含む。
【００２６】
好ましくは、上記蛍光標識は、Ａｌｅｘａ ３５０、Ａｌｅｘａ ４０５、Ａｌｅｘａ ４３０、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５５５、Ａｌｅｘａ ６４７、ＡＭＣＡ、アミノアクリジン 、ＢＯＤＩＰＹ ６３０/６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０/６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、５−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ−２’,７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’,４’,５’,７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、６−ＦＡＭ、ダンシルクロリド、フルオレセイン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、ＮＢＤ（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１,３−ジアゾール）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルファーストバイオレット、クレシルバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリスロシン、フタロシアニン、アゾメチン、シアニン、キサンチン、スクシニルフルオレセイン、希土類金属クリプテート、トリス（ビピリジル)ジアミン-ユウロピウム（三双■■基二■■）、ユウロピウムクリプテート又はキレート、ジアミン、ビシアニン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ  Ｄｙｅ、アロフィコシアニン、ａｌｌｏｃｏｃｙａｎｉｎ Ｂ、フィコシアニンＣ、フィコシアニンＲ、チアミン、Ｒ-フィコエリトリン、Ｃ-フィコシアニン、フィコエリスリンＲ、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンイソチオシアネート、ローダミンレッド、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、テトラメチルローダミン及びテキサスレッドからなる群より選ばれる１種又は複数種である。
【００２７】
好ましくは、上記のような組成物において、上記治療薬は、裸抗体、細胞毒性薬、薬物、放射性核種、ホウ素原子、免疫調節剤、抗アポトーシス剤、光増感性治療薬、免疫複合体及びオリゴヌクレオチドからなる群より選ばれる１種又は複数種である。
好ましくは、上記薬物は、デキサメタゾン、ジクロフェナク、ナブメトン、メロキシカム、セレコキシブ、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ及びビンクリスチンからなる群より選ばれる１種又は複数種である。
【００２８】
好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡからなる群より選ばれる１種又は複数種である。
好ましくは、上記免疫調節剤は、サイトカイン、ケモカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び幹細胞増殖因子からなる群より選ばれる１種又は複数種である。
【００２９】
ここで、上記サイトカインは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニールヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、サイロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝細胞増殖因子、プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、ミュラー管阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＮＧＦ−β、血小板由来成長因子、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、ＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子及びＬＴからなる群より選ばれる１種又は複数種であることが好ましい。
【００３０】
上記ケモカインは、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β及びＩＰ−１０からなる群より選ばれる１種又は複数種であることが好ましい。
好ましくは、上記放射性核種は、 １１１Ｉｎ、 １１１Ａｔ、 １７７Ｌｕ、 ２１１Ｂｉ、 ２１２Ｂｉ、 ２１３Ｂｉ、 ２１１Ａｔ、 ６２Ｃｕ、 ６７Ｃｕ、 ９０Ｙ、 １２５Ｉ、 １３１Ｉ、 １３３Ｉ、 ３２Ｐ、３３Ｐ、 ４７Ｓｃ、 １１１Ａｇ、 ６７Ｇａ、 １５３Ｓｍ、 １６１Ｔｂ、 １５２Ｄｙ、 １６６Ｄｙ、 １６１Ｈｏ、 １６６Ｈｏ、 １８６Ｒｅ、 １８８Ｒｅ、 １８９Ｒｅ、 ２１１Ｐｂ、 ２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、 ２２５Ａｃ、 ７７Ａｓ、 ８９Ｓｒ、 ９９Ｍｏ、 １０５Ｒｈ、 １４９Ｐｍ、 １６９Ｅｒ、 １９４Ｉｒ、 ５８Ｃｏ、 ８０ｍＢｒ、 ９９ｍＴｃ、 １０３ｍＲｈ、 １０９Ｐｔ、 １１９Ｓｂ、１８９ｍＯｓ、 １９２Ｉｒ、 ２１９Ｒｎ、 ２１５Ｐｏ、 ２２１Ｆｒ、 ２５５Ｆｍ、 １１Ｃ、 １３Ｎ、 １５Ｏ、 ７５Ｂｒ、 １９８Ａｕ、 １９９Ａｕ、 ２２４Ａｃ、 ７７Ｂｒ、 １１３ｍＩｎ、 ９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、 １０３Ｒｕ、 １０５Ｒｕ、 １０７Ｈｇ、 ２０３Ｈｇ、 １２１ｍＴｅ、 １２２ｍＴｅ、 １２５ｍＴｅ、 １６５Ｔｍ、 １６７Ｔｍ、 １６８Ｔｍ、 １９７Ｐｔ、 １０９Ｐｄ、 １４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、 １６１Ｔｂ、 ５７Ｃｏ、 ５８Ｃｏ、 ５１Ｃｒ、 ５９Ｆｅ、 ７５Ｓｅ、 ２０１Ｔｌ、 ７６Ｂｒ及び １６９Ｙｂからなる群より選ばれる１種又は複数種である。
【００３１】
上記のような組成物の、ＩＬ−１７Ａの過剰発現及び/又は放出に関連する疾患を予防及び/又は治療するための薬物の調製における応用。
好ましくは、上記疾患は、気道炎症、喘息、気管支喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬、多発性硬化症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、ブドウ膜炎、ヘリコバクター・ピロリ感染胃炎、骨粗鬆症、骨びらん、腹腔内膿瘍・癒着、アジソン病、低ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、セリアック病、シャーガス病、クローン病、同種移植拒絶反応、ベーチェット病、敗血症、敗血症性または内毒素性ショックおよび虚血からなる群より選ばれるいずれか１種である。
【００３２】
上記のようなＩＬ−１７Ａに特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片の、ＩＬ−１７Ａの過剰発現及び/又は放出に関連する疾患を予防及び/又は治療するための薬物の調製における応用。
【００３３】
ＩＬ−１７Ａの過剰発現及び/又は放出に関連する疾患を予防及び/又は治療するための薬物であって、前記薬物は、上記のようなＩＬ−１７Ａに特異的に結合する可能な抗体及びその機能的断片、並びに薬学的に許容されるベクターを含み、
或いは、前記薬物は、上記のような組成物及び薬学的に許容されるベクターを含む。
【００３４】
ここで、「薬学的に許容される」という用語とは、化合物がヒトに投与された場合に生理学的に許容され、胃腸障害、めまいなどのアレルギー反応、またはそれらのアレルギー反応と類似する全身性アレルギー反応を引き起こさないことを意味する。
【００３５】
本発明では、「薬学的に許容されるベクター」は、バインダー（例えば、微結晶セルロース、アルギン酸塩、ゼラチン及びポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば、デンプン、ショ糖、グルコース及び無水乳酸）、崩壊剤（例えば、架橋ＰＶＰ、架橋カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋カルボキシルメチルセルロースナトリウム、及び低置換度ヒドロキシプロピルセルロース）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウ）、湿潤剤（例えば、グリセリン）、界面活性剤（例えば、セチルアルコール）、及び吸収促進剤、矯味剤、甘味剤、希釈剤、コーティング剤などを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
上記のような疾患は、気道炎症、喘息、気管支喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬、多発性硬化症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、ブドウ膜炎、ヘリコバクター・ピロリ感染胃炎、骨粗鬆症、骨びらん、腹腔内膿瘍・癒着、アジソン病、低ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、セリアック病、シャーガス病、クローン病、同種移植拒絶反応、ベーチェット病、敗血症、敗血症性または内毒素性ショックおよび虚血からなる群より選ばれるいずれか１種である。
【００３７】
ＩＬ−１７Ａの過剰発現及び/又は放出に関連する疾患を予防及び/又は治療する方法において、上記のような薬物を個体に投与する。
好ましくは、上記個体は、ヒトであり、さらに、ＩＬ−１７Ａの過剰発現及び/又は放出に関連する疾患を予防及び/又は治療する必要があるヒトである。
【００３８】
上記のような疾患は、気道炎症、喘息、気管支喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬、多発性硬化症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、ブドウ膜炎、ヘリコバクター・ピロリ感染胃炎、骨粗鬆症、骨びらん、腹腔内膿瘍・癒着、アジソン病、低ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、セリアック病、シャーガス病、クローン病、同種移植拒絶反応、ベーチェット病、敗血症、敗血症性または内毒素性ショックおよび虚血からなる群より選ばれるいずれか１種である。
【００３９】
本発明の具体的な実施形態又は従来技術に係る技術案をより明らかに説明するために、以下、具体的な実施形態又は従来技術の説明で使用する必要がある図面を簡単に述べ、下記の説明における図面は、本発明の幾つかの実施形態であり、当業者は、いかなる創造的な作業もなしにそれらの図面に従って他の図面を得ることが明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、本発明に係る実施例１における番号８８のクローンによって分泌されたモノクローナル抗体のヒトＩＬ−１７Ａに対する結合活性を示す図である。
【図２】図２は、本発明に係る実施例１における番号８８のクローンによって分泌されたモノクローナル抗体が、ヒトＩＬ−１７Ａの刺激によるＨＦＦ−１細胞から分泌されたヒトＩＬ−６に対する中和活性を示す図である。
【図３】図３は、本発明に係る実施例４における抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体の種特異性を示す図である。
【図４】図４は、本発明に係る実施例４における抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体の結合特異性を示す図である。
【図５】図５は、本発明に係る実施例５における抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ中和活性を示す図である。
【図６】図６は、本発明に係る実施例６における抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ中和活性を示す図である。
【図７】図７は、本発明に係る実施例７における単回静脈内注射後の薬物血中濃度−時間曲線を示す図である。
【図８】図８は、本発明に係る実施例９における抗ヒトＩＬ−１７Ａヒト化モノクローナル抗体の抗原結合活性を示す図である。
【図９】図９は、本発明に係る実施例１０における抗ヒトＩＬ−１７Ａヒト化モノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ中和活性を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明に係る実施例１５における単回皮下注射後の薬物血中濃度−時間曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、実施例を参照しながら本発明の実施態様を詳細に説明し、しかしながら、当業者は、下記の実施例が、本発明を説明するために過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解すべきである。実施例において具体的な条件を明記されないものは、通常の条件又は製造業者によって推奨される条件に従って行われる。使用する試薬又は機器が製造元を明記していないものは、いずれも市販で入手可能な通常の製品である。
【００４２】
実施例１ マウス由来抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の調製
１．１、動物免疫
実験動物は、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入された６〜８週齡の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスを選択した。マウスを環境に慣れさせ１週間後、免疫し始めた。組換えヒトＩＬ−１７Ａタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され、封入体を収集した後、封入体に変性・再生処理を行い、可溶性ＩＬ−１７Ａタンパク質を取得した。初回免疫は、組換えヒトＩＬ−１７Ａタンパク質  １００μｇと完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、品番Ｆ５８８１）を使用し、十分に混合してエマルジョンを形成し、マウスに腹腔内注射した。２週間後、追加免疫を行った。追加免疫は、組換えヒトＩＬ−１７Ａタンパク質  ５０μｇと不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、品番Ｆ５８０６）を使用し、十分に混合してエマルジョンを形成し、マウスに腹腔内注射した。２週間おきに同様の方法で追加免疫し、追加免疫を合計で３回行った。最終免疫後７日目に、マウスの後眼窩静脈叢から採血して血清を遠心分離し、抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定した。高い力価のマウスを選択して融合させてハイブリドーマを作製した。融合の３日前に、組換えヒトＩＬ−１７Ａタンパク質  ５０μｇをアジュバントなしで腹腔内注射した。融合当日に、脾臓を無菌的に取り出し、単一脾臓細胞懸濁液を作製し、融合のために用意した。
【００４３】
１．２、ハイブリドーマ細胞の調製
対数増殖期の骨髄腫細胞ＳＰ２/０を採用し、１０００ｒｐｍで５分間遠心させ、上清を捨て、細胞を不完全ＤＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ Ｎｏ．１１９６５）で懸濁した後、計数し、必要な細胞数を取り出し、不完全培養液で２回洗浄した。同時に免疫脾臓細胞の懸濁液を調製し、不完全培養液で２回洗浄した。骨髄腫細胞と脾臓細胞とを割合で１：１０又は１：５の比率で混合させ、５０ｍｌのプラスチック製遠心分離管中で不完全培養液で１２００ｒｐｍで、８分間で１回洗浄した。上清を捨て、スポイトで残存液を吸い出した。沈殿した細胞をほぐして均一化させるために、手掌上に遠心管の底を軽くタップし、４０℃水浴に置いて予熱した。１ｍｌのスポイトで１分間程度（最適時間が４５秒間）をかけて４０℃に予熱された４５％のＰＥＧ−４０００（ＰＨ ８．０、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ Ｎｏ．Ｐ７１８１）１ｍｌを添加しながら軽く撹拌し（スポイトで撹拌し）、目視観察で目に見える粒子が見えるはずである。１０ｍｌのスポイトを用いて９０ｓ内で３７℃に予熱された不完全培地  ２０〜３０ｍｌを添加してＰＥＧの作用を停止させ、２０〜３７℃で１０分間静置した。１０００ｒ/ｍｉｎで５分間遠心し、上清を捨てた。５ｍｌのＨＡＴ培地（ＤＭＥＭ+ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ、ｃａｔ Ｎｏ．１Ｈ０２６２−１０ＶＬ）を加え、沈殿した細胞を軽く吹かし・吸い（融合した細胞が広がらないように強く吹かないことを注意）、懸濁させ、均一に混合し、その後、脾臓細胞の濃度が１〜２×１０ ６/ｍｌとなるように、８０〜１００ｍｌとなるまでにＨＡＴ培地を追加した。９６ウェル細胞培養プレートを１ウェル当たり０．１ｍｌずつ分注し、２４ウェルプレートを１ウェル当たり１．０〜１．５ｍｌずつ分注し、その後、培養プレートを３７℃、６％  ＣＯ ２インキュベーター内で培養した。一般的に、９６ウェルプレートを６枚敷いた。５日後、１/２の培地をＨＡＴ培地と交換した。さらに、７〜１０日後でＨＡＴ培地をＨＴ培地（ＤＭＥＭ+ＨＴ、Ｓｉｇｍａ ｃａｔ Ｎｏ．Ｈ０１３７−１０ＶＬ）と交換した。ハイブリドーマ細胞の増殖状況をしばしば観察し、ウェルの底部の面積の１/１０を超えるまで増殖する時に上清を吸い出して抗体の検出に供した。陽性クローンの細胞を拡大培養大して凍結保存した。
【００４４】
１．３、クローンのグスクリーニング及び同定
ＥＬＩＳＡは、ハイブリドーマ培養上清における抗ヒトＩＬ−１７Ａ抗体をグスクリーニングするために用いられる。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液で高吸着型ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに組換えヒトＩＬ−１７Ａを被覆し、被覆濃度は１μｇ/ｍＬであり、被覆量は、１ウェル当たり１００μＬであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで３００μＬ/ウェルでブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。培養上清サンプル及び陽性対照を加え、１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、１％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで１:１００００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ、品番Ａｂ７０６８）を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１００μＬ/ウェルで比色基質ＴＭＢを加え、室温で１０分間発色させた。１００μＬ/ウェルで１Ｍ  Ｈ ２ＳＯ ４を加え、発色を停止させた。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ４５０ｎｍの強さに基づいて抗ヒトＩＬ−１７Ａ結合抗体を分泌することができる陽性クローンを選択した。
【００４５】
細胞アッセイは陽性クローンによって分泌された抗ヒトＩＬ−１７Ａ抗体が中和抗体であるか否かを測定した。抗ヒトＩＬ−１７Ａ抗体のサンプルを１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、品番ＳＨ３００８４．０３）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、品番１１９９５−０７３）完全培地に希釈し、サンプルの初期濃度は、１６０ｎＭ（最終濃度が４０ｎＭ）であり、５倍段階希釈し、細胞培養プレートに１ウェル当たり５０μＬ加えた。さらに、細胞培養プレートに同じな完全培地に希釈した濃度が２０ｎｇ/ｍＬ（最終濃度５ｎｇ/ｍＬ）のヒトＩＬ−１７Ａを１ウェル当たり５０μＬ加えた。３７℃で、５％  ＣＯ ２インキュベーター内で１時間インキュベートした。そして、ＨＦＦ−１細胞を完全培地に再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレートに、１ウェル当たり１００μＬ、１ウェル当たり５０００個の細胞を播種した。細胞を３７℃、５％  ＣＯ ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。インキュベート終了後、細胞培養プレート  ２５０ｇを５分間遠心し、培養上清を取り出し、ヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、品番Ｓ６０５０）を使用し、取扱説明書に従ってヒトＩＬ−６のレベルを測定した。ヒトＩＬ−１７Ａの刺激によりＨＦＦ−１細胞からヒトＩＬ−６を分泌することを阻害できる抗体は、抗ヒトＩＬ−１７Ａの中和抗体である。中和能の強さに基づいて抗ヒトＩＬ−１７Ａの中和抗体を分泌することができる陽性クローンを選択した。
図１に示すように、番号８８のクローンは、強いヒトＩＬ−１７Ａ結合活性を持ち、図２に示すように、番号８８のクローンは、同時に強いヒトＩＬ−１７Ａ中和活性も持つ。
【００４６】
１．４、モノクローナル抗体配列の決定
グスクリーニングされた抗原結合活性と抗原中和活性とを併せ持つクローンについて抗体ＤＮＡ配列の決定を行った。まず、ＲＮＡｐｒｅｐ  Ｐｕｒｅキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＤＰ４３０）を用いて細胞ｍＲＮＡを抽出した。手順は以下の通りであり、即ち、懸濁細胞１×１０ ７を収集して３００×ｇで５ｍｉｎ遠心させ、細胞を遠沈管に収集し、全ての培地上清を慎重に吸い出した。すぐに溶解ステップを行った。遠沈管の底部を軽く弾いて細胞ペレットをはぐし、適量のライセートＲＬ  ６００ｕＬを加え、旋回・振動させた。全ての溶液をろ過カラムＣＳ上（ろ過カラムＣＳが収集チューブにセットされている）に移し、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）で２ｍｉｎ遠心し、濾液を収集された。濾液に７０％  エタノールを１倍体積（一般的に、３５０μｌ又は６００μｌ）で加え、均一に混合して得られた溶液を沈殿とともに吸着カラムＣＲ３に移し（吸着カラムＣＲ３が収集チューブにセットされている）、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）で３０〜６０ｓｅｃ遠心し、収集チューブ中の廃液を排出し、吸着カラムＣＲ３を収集チューブに戻した。吸着カラムＣＲ３に除蛋白液ＲＷ１を３５０μｌ加え、１２,０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）で３０〜６０ｓｅｃ遠心し、収集チューブ中の廃液を排出し、吸着カラムＣＲ３を収集チューブ中に戻した。吸着カラムＣＲ３の中央に８０μｌの  ＤＮａｓｅ  Ｉ溶液を加え、室温で１５ｍｉｎ放置した。吸着カラムＣＲ３に３５０μｌの除蛋白液ＲＷ１を加え、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）で３０〜６０ｓｅｃ遠心し、収集チューブ中の廃液を排出し、吸着カラムＣＲ３を収集チューブ中に戻した。吸着カラムＣＲ３に５００μｌの洗浄液ＲＷ（使用前にエタノールを加えるか否かを検査）を加え、室温で２ｍｉｎ静置し、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）で３０〜６０ｓｅｃ遠心し、収集チューブでの廃液を排出し、吸着カラムＣＲ３を収集チューブ中に戻した。１２,０００ｒｐｍ（〜１３,４００×ｇ）２ｍｉｎ遠心し、廃液を排出した。吸着カラムＣＲ３を室温で数分間放置し、吸着材に残った洗浄液を徹底的に乾かした。吸着カラムＣＲ３を新たなＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ遠沈管に移し、３０〜１００μｌのＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ｄｄＨ ２Ｏを加えて室温で２ｍｉｎ放置し、１２，０００ｒｐｍ（〜１３，４００×ｇ）２ｍｉｎ遠心し、ＲＮＡ溶液を得た。
【００４７】
ＱｕａｎｔＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Ｔｉａｎｇｅｎ、ＫＲ１０３）を用いてｃＤＮＡの第一鎖を合成した。手順は以下の通りであり、即ち、氷上でテンプレートＲＮＡを解凍し、プライマー、１０×ＲＴ  ｍｉｘ（ここで、ＲＮａｓｉｎ及びＤＴＴを含み）、Ｓｕｐｅｒ  ｐｕｒｅ  ｄＮＴＰ混合液、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ｄｄＨ ２Ｏを室温（１５〜２５℃）で解凍した後、すばやく氷上にセットした。使用前に、各種の溶液を旋回・振動させて均一に混合し、短時間遠心して管壁に残った液体を収集した。表１に示すプライマーを使用して逆転写システムの混合液（天根生物Ｑｕａｎｔ  ｃＤＮＡの第一鎖合成キット、品番ＫＲ１０３−０４、１０倍濃度の逆転写バッファー  ２ｕＬ、超純ｄＮＴＰ  ２ｕＬ、ランダムプライマー  ２ｕＬ、逆転写酵素  １ｕＬ）を調製し、よく均一に混合し、旋回・振動時間が５ｍｉｎ以下である。短時間遠心し、氷上に置き、最後にテンプレートＲＮＡ（５０ｎｇ〜２μｇ）を混合液に加え、よく均一に混合し、旋回・振動時間が５ｓｅｃ以下であり、短時間遠心して管壁に残った液体を収集した。３７℃で６０ｍｉｎインキュベートした。逆転写により産生されたｃＤＮＡの第一鎖を次のＰＣＲ反応に使用した。
【００４８】
ＰＣＲ反応で用いられるプライマーは、表１に示した。
【表１】
0006802381.tif 000002
プライマーを使用する場合に、ＶＨ  ｐｒｉｍｅｒ中のいずれかの上流プライマーは、いずれかの下流プライマーと配合されて使用することができ、同様にＶＬ  ｐｒｉｍｅｒ中のいずれかの上流プライマーは、いずれかの下流プライマーと配合されて使用することもできる。ＰＣＲ増幅で得られた目的のバンドをｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングした。単一クローンを選別してＤＮＡシークエンシングを行った。
【００４９】
実施例２  キメラ抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の調製
ＰＣＲ増幅により得られた抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:７で表され、抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:８で表される。マウス可変領域配列からフレームワーク領域配列を除外した後、その相補性決定領域配列を取得し、そのうち、軽鎖の３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１、２及び３で表され、重鎖の３つの相補性決定領域ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸配列は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:４、５及び６で表される。抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:９で表され、抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０で表される。上記抗体軽鎖（軽鎖の全長配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:７とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:９を連結することによって得られる）及び重鎖（重鎖の全長配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:８とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０を連結することによって得られる）をコードする核酸配列を真核細胞発現ベクターＸ０ＧＣ（ここで、抗体軽鎖の全長核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３で表され、抗体重鎖の全長核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４で表され）にクローンニングし、さらに、発現ベクターを２９３Ｆ細胞株（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＴＭ ２９３−Ｆ Ｃｅｌｌｓ、品番Ｒ７９００７、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの１日前に細胞を接種し、トランスフェクション当日に細胞を遠心して收集し、細胞を新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＴＭ ２９３発現培地（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＴＭ ２９３Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ、品番１２３３８００１、Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、細胞密度が２００×１０ ５ｃｅｌｌｓ/ｍＬであった。トランスフェクション容量に従って最終濃度が３６．６７ｕｇ/ｍＬとなるように、プラスミドを加え、軽く混合して均一化した後、最終濃度が５５ｕｇ/ｍＬとなるように、線状ＰＥＩ（ポリエチレンイミン、線状、Ｍ．Ｗ．２５０００、品番４３８９６、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を加え、軽く混合して均一化した。その後、細胞培養インキュベーター内に入れ、１２０ｒｐｍのシェーカーで３７℃で１時間インキュベートした。そして、１９倍のトランスフェクション容量の新鮮な培地を加えた。１２０ｒｐｍのシェーカーで３７℃でインキュベートし続けた。５〜６日にトランスフェクトした細胞培養上清を遠心して収集した。
【００５０】
実施例３  キメラ抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体とヒトＩＬ−１７Ａの結合動力学定数
Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００を使用して抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体とその抗原ヒトＩＬ−１７Ａの結合動力学定数を検出した。その装置は、光学的な表面プラズモン共鳴技術によりバイオチップに架橋・被覆された分子と被験分子の間の結合及び解離を検出した。用いられた主な試薬は、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１０００−１４）及びＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ−１０００−５０）である。実験過程は、簡単に説明すると、ヒトＩＬ−１７ＡをｐＨ＝５．０の酢酸ナトリウム緩衝液に溶解させ、１０μＬ/ｍｉｎの速度で注入してＣＭチップにカップリングさせ、１Ｍ  エタノールアミンを１０μＬ/ｍｉｎの速度で注入してブロッキングを行った。結合階段では、異なる濃度の抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体及び対照をそれぞれ３０μＬ/ｍｉｎの速度で１８０秒間注入し、解離階段では、ＰＢＳ緩衝液を３０μＬ/ｍｉｎの速度で６００秒間注入した。再生条件は、１０ｍＭ  グリシン塩溶液、ｐＨ  ２．０であった。結合動力学定数及び解離動力学定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００  コントロールソフトウェアにより解析して算出した。抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラ抗体の結合動力学定数、解離動力学定数、及び解離平衡定数は、表２に示された。ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂに比べて、抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、より小さい解離平衡定数、より強い親和性を持ち、特に、ＩＬ−１７Ａ抗原と結合した後、結合状態を長期間維持でき、解離しにくく、その生物学的機能に対して非常に有利である。
【００５１】
【表２】
0006802381.tif 000003
【００５２】
実施例４  キメラ抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の種特異性及び結合特異性
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体の種特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液を用いて高吸着型ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに組換えヒトＩＬ−１７Ａ、サルＩＬ−１７Ａ、ラットＩＬ−１７Ａ及びマウスＩＬ−１７Ａ（いずれもＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．社から購入）を被覆し、被覆濃度が１μｇ/Ｍｌであり、被覆量が１００μＬ/ウェルであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴを用いて３００μＬ/ウェルでブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴに段階希釈した抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体サンプル及び対照を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴに１:２０００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗人ＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、品番ＡＰ３０９Ｐ）を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ/ウェルで加え、室温で１０分間発色させた。１Ｍ  Ｈ ２ＳＯ ４を１００μＬ/ウェルで加え、発色を停止した。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
【００５３】
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体の結合特異性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液を用いて高吸着型ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに組換えヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＦＮ−ｇ及びＴＮＦａ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．社又はＲ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから購入）を被覆し、被覆濃度が１μｇ/ｍＬであり、被覆量が１００μＬ/ウェルであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴを用いて３００μＬ/ウェルでブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴに希釈した抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体サンプル及び対照を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、１％  ＢＳＡ含有ＰＢＳＴに１:２０００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗人ＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、品番ＡＰ３０９Ｐ）を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ/ウェルで加え、室温で１０分間発色させた。１Ｍ  Ｈ ２ＳＯ ４を１００μＬ/ウェルで加え、発色を停止した。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図３に示すように、抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体は、ヒトＩＬ−１７Ａ、サルＩＬ−１７Ａに結合できるが、ラットＩＬ−１７Ａ、マウスＩＬ−１７Ａに結合せず、種特異性がある。同時に、図４に示すように、抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体は、強い結合特異性も持ち、ＩＬ−１７Ａにのみ結合し、ＩＬ−１７ファミリーの他のサイトカイン及び関連しないサイトカインに結合しない。
【００５４】
実施例５．キメラ抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ中和活性
抗ヒトＩＬ−１７Ａ抗体サンプルを１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、品番ＳＨ３００８４．０３）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、品番１１９９５−０７３）完全培地に希釈し、サンプルの初期濃度が１６０ｎＭ（最終濃度４０ｎＭ）であり、５倍段階希釈し、細胞培養プレートにウェル当たり５０μＬずつ加えた。さらに、細胞培養プレートに同じな完全培地に希釈した濃度が２０ｎｇ/ｍＬ（最終濃度５ｎｇ/ｍＬ）のヒトＩＬ−１７Ａを１ウェル当たり５０μＬ加えた。３７℃、５％  ＣＯ ２インキュベーターに１時間インキュベートした。そして、ＨＦＦ−１細胞を完全培地に再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレート内にウェル当たり１００μＬ、１ウェル当たり５０００個の細胞を播種した。細胞を３７℃、５％  ＣＯ ２インキュベーター内に２４時間インキュベートした。インキュベート終了後、細胞培養プレート  ２５０ｇを５分間遠心し、培養上清を取り出し、ヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  キット（Ｒ&Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、品番Ｓ６０５０）を使用し、取扱説明書に従ってヒトＩＬ−６のレベルを測定した。
結果は、図５に示するように、抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体は、ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂよりも、強いｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−１７Ａ中和活性を持ち、ヒトＩＬ−１７Ａの刺激によりＨＦＦ−１細胞からヒトＩＬ−６を分泌されることをより強力に阻害した。
【００５５】
実施例６  キメラ抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｖｏ中和活性
実験材料は、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入された６〜８週齡の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスを選択した。マウスを環境に慣れさせ１週間後、無作為に群分けし、１群当たり６匹である。各群は、それぞれ抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体、対照モノクローナル抗体であるｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂを投与し、０．７ｎｍｏｌ/ｋｇ、７ｎｍｏｌ/ｋｇ、７０ｎｍｏｌ/ｋｇの３つの投与量レベルで、静脈内注射で単回投与した。投与１時間後、ヒトＩＬ−１７Ａを１匹のマウス当たり１０μｇ皮下注射した。さらに２時間経過した後、眼窩から採血し、抗凝固処理を行わず、血液サンプルを室温で３０分間〜１時間放置し、血液凝固後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、血清サンプルを取得した。マウス  ＣＸＣＬ１  ＥＬＩＳＡ  キット（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ、品番ＥＬＭ−ＫＣ）を用いて、取扱説明書に従って血清中のマウスＣＸＣＬ１（Ｃ−Ｘ−Ｃ  Ｍｏｔｉｆ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｌｉｇａｎｄ、ＫＣとも称する）の濃度を測定した。
結果は、図６に示すように、抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体は、ヒトＩＬ−１７Ａの刺激によるマウスから分泌されるＣＸＣＬ１のレベルを阻害でき、対照モノクローナル抗体であるｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂよりも、強い活性を示した。
【００５６】
実施例７．キメラ抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体のラット体内での薬物動態研究
実験材料は、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入された６〜８週齡の雌性ＳＤラットを選択した。ラットを環境に慣れさせてから１週間後、無作為に群分けし、１群当たり３匹である。各群は、それぞれヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体、対照モノクローナル抗体であるｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂを投与し、投与量がいずれも２０ｎｍｏｌ/ｋｇであり、静脈内注射で単回投与した。０時に投与後５分間、３０分間、１時間、３時間、６時間、１０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間、３１２時間で眼窩から採血し、抗凝固処理を行わなず、血液サンプルを室温で３０分間〜１時間放置し、血液凝固後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られた血清サンプルを−８０℃で凍結保存し、測定のために用意した。
【００５７】
ＥＬＩＳＡにより血清中の抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体、対照モノクローナル抗体であるｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂの濃度を測定した。簡単に説明すると、ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液を用いて４℃でヒト組換えＩＬ−１７Ａタンパク質を高吸着型ＥＬＩＳＡプレートに一晩被覆した。ＰＢＳＴで洗浄した。非特異的結合を防止するために、５％  脱脂粉乳含有ＰＢＳＴでそのプレートをブロッキングし、ＰＢＳＴで洗浄した。そして、１０％  混合ラット血清、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈した被検血清サンプルを加えて２５℃で１時間インキュベートし、そのプレートをＰＢＳＴで洗浄した。５％  脱脂粉乳含有ＰＢＳＴに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗人ＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、品番ＡＰ３０９Ｐ）を加えて２５℃で１時間インキュベートし、そのプレートをＰＢＳＴで洗浄した。最後に、比色基質ＴＭＢを用いて室温で１０分間発色させた。１Ｍ  Ｈ ２ＳＯ ４を加え、発色を停止した。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図７に示すように、用量が２０ｎｍｏｌ/ｋｇである抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体、対照モノクローナル抗体であるｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂの単回静脈内投与は、ラット体内において類似する薬物血中濃度−時間曲線及び薬物動態学的特性を示した。抗ヒトＩＬ−１７Ａキメラモノクローナル抗体の薬物動態学的パラメータは、半減期ｔ １/２が４５８時間であり、薬物血中濃度−時間曲線下面積ＡＵＣ ｌａｓｔが４４２８６ｎＭ．ｈｒであり、推定ゼロ濃度Ｃ０が４１３ｎＭであり、見かけの分布容積Ｖｄが１１５ｍＬ/Ｋｇであり、クリアランスＣＬが０．１７ｍＬ/ｈｒ/ｋｇであり、平均滞留時間ＭＲＴ ｌａｓｔが１４０時間である。
【００５８】
実施例８．ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の調製
ヒト化型の抗ＩＬ−１７抗体は、Ｌｅｕｎｇ者ら（１９９５、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２:１４１３−２７）の方法により得られたものである。
Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースからその非ＣＤＲ領域と最もマッチするヒト化テンプレートを選別した。そのうち、重鎖可変領域のテンプレートは、配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３５で表されるＩＧＶＨ４−５９*０１である。軽鎖可変領域のテンプレートは、配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３６で表されるＩＧＫＶ２−３０*０２である。マウス由来抗体ＣＤＲ領域を選別されたヒト化テンプレートに移植し、ヒト由来テンプレートのＣＤＲ領域を置き換えた。配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３７で表される移植されたヒト化抗体の重鎖可変領域、配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３８で表される移植されたヒト化抗体の軽鎖可変領域を得る。配列アラインメントにより９つの部位を選択して復帰突然変異を行い、中でも、Ｌ４Ｖ、Ｉ４９Ｍ、Ｖ６８Ｉ、Ｖ７２Ｒという４つの重鎖があり、Ｄ１Ｉ、Ｖ２Ｉ、Ｆ４１Ｙ、Ｒ５１Ｌ、Ｙ９２Ｆという５つの軽鎖がある。復帰突然変異部位数を減らし、異なるヒト化配列を構築し、重鎖配列及び軽鎖の可変領域配列は、表３に示された。ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７〜３４）とヒト抗体ＩｇＧ１重鎖の定常領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０）を連結し、それぞれ対応する重鎖全長配列を得た。ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の軽鎖可変領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９〜２６）とヒト抗体Ｋａｐｐａ軽鎖の定常領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:９）を連結し、それぞれ対応する軽鎖全長配列を得た。重鎖全長配列と軽鎖全長配列を組合せてヒト化抗体全長配列を得、全長配列をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ酵素により消化し、ベクターＸ０ＧＣに連結した。
【００５９】
【表３】
0006802381.tif 000004
【００６０】
実施例９．ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の抗原結合活性
ＥＬＩＳＡにより抗ヒトＩＬ−１７Ａヒト化モノクローナル抗体の抗原結合活性を測定した。ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液で組換えヒトＩＬ−１７Ａ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．社から購入）を高吸着型ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレートに被覆し、被覆濃度が１μｇ/ｍＬであり、被覆量が１００μＬ/ウェルであり、４℃で一晩被覆した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴを用いて３００μＬ/ウェルでブロッキングし、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴに段階希釈した抗ヒトＩＬ−１７Ａヒト化モノクローナル抗体サンプル及び対照を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴに１:２０００で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗人ＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、品番ＡＰ３０９Ｐ）を１ウェル当たり１００μＬ加え、２５℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで５回洗浄した。比色基質ＴＭＢを１００μＬ/ウェルで加え、室温で１０分間発色させた。１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を１００μＬ/ウェルで加え、発色を停止した。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図８に示すように、抗ヒトＩＬ−１７Ａヒト化モノクローナル抗体ＡＳ１５７９９、ＡＳ１５８０２、ＡＳ１５８０３、ＡＳ１５８０５、ＡＳ１５８１０、ＡＳ１５８１５、ＡＳ１５８２０はいずれもヒトＩＬ−１７Ａに結合でき、高い親和活性を持つ。
【００６１】
実施例１０．ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ中和活性
抗ヒトＩＬ−１７Ａ抗体サンプルを１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、品番ＳＨ３００８４．０３）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ、品番１１９９５−０７３）完全培地に希釈し、サンプルの初期濃度が１６０ｎＭ（最終濃度４０ｎＭ）であり、５倍段階希釈し、細胞培養プレートに１ウェル当たり５０μＬ加えた。さらに、細胞培養プレートへ同じな完全培地に希釈した濃度が２０ｎｇ/ｍＬ（最終濃度５ｎｇ/ｍＬ）であるヒトＩＬ−１７Ａを加え、１ウェル当たり５０μＬである。３７℃、５％  ＣＯ ２インキュベーター内で１時間インキュベートした。そして、完全培地にＨＦＦ−１細胞を再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレート内に、１ウェル当たり１００μＬ、１ウェル当たり５０００個の細胞を播種した。細胞を３７℃、５％  ＣＯ ２インキュベーター内で２４時間インキュベートした。インキュベート終了後、細胞培養プレート  ２５０ｇを５分間遠心し、培養上清を取り出し、ヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡ  キット（Ｒ&Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、品番Ｓ６０５０）を用いて、取扱説明書に従ってヒトＩＬ−６のレベルを測定した。
結果は、図９に示すように、抗ヒトＩＬ−１７Ａヒト化モノクローナル抗体であるＡＳ１５７９９、ＡＳ１５８０２、ＡＳ１５８０３、ＡＳ１５８０５、ＡＳ１５８１０、ＡＳ１５８１５、ＡＳ１５８２０は、ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂよりも、強いｉｎ ｖｉｔｒｏでのＩＬ−１７Ａ中和活性を持ち、ヒトＩＬ−１７Ａの刺激によるＨＦＦ−１細胞から分泌されるヒトＩＬ−６を強く阻害した。
【００６２】
実施例１１．モレキュラーシーブ高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によるヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の純度及びその熱安定性の検出
ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００  クロマトグラフ用カラム（品番：００１８６７５）を使用し、移動相は０．１ｍｏｌ/Ｌ  リン酸塩緩衝液（ＮａＨ ２ＰＯ ４−Ｎａ ２ＨＰＯ ４）、０．１ｍｏｌ/Ｌ  硫酸ナトリウム緩衝液であり、ｐＨが６．７となり、流速は０．３５ｍＬ/ｍｉｎであり、カラム温度は２５℃であり、サンプルセル温度は４℃であり、検出波長は２８０ｎｍであり、サンプル緩衝液でサンプルを１ｍｇ/ｍＬに希釈し、サンプルロード量は５μｇである。実験結果はＡｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフ１２６０システムワークステーションによりデータ処理を行い、面積正規化法によりメインピークの割合を純度として算出した。上記調製されたヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体はＳＥ−ＨＰＬＣ純度検出を行った。それらのモノクローナル抗体の熱安定性を確認するために、上記サンプルを４０℃の高温条件下で置き、２週目及び４週目にそれぞれ試料を採取し、ＳＥ−ＨＰＬＣ検出を行って熱安定性を観察した結果は以下の表４に示された。ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、いずれも良い熱安定性を示した。
【００６３】
【表４】
0006802381.tif 000005
【００６４】
実施例１２．ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体のＴｍ値の測定
示差走査型蛍光定量法（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＦ）を採用してヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の変性温度（Ｔｍ）を測定した。ＤＳＦは、蛍光指示薬の蛍光強度変化によりサンプルにおけるタンパク質の熱変性過程を検出する方法であり、タンパク質変性温度の測定を実現した。使用した試薬は、米国のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入されたＳＹＰＲＯ  Ｏｒａｎｇｅタンパク質蛍光色素（品番：Ｓ５６９２、５０００倍濃度、溶媒ＤＭＳＯ）である。装置は、米国のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入されたＡＢ  ７５００Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムである。タンパク質蛍光色素をサンプル緩衝液で１：５０に希釈し、希釈後の色素１μｌをそれぞれタンパク質溶液１９μｌと混合し、蛍光色素の最終希釈倍率が１：１０００であり、９６ウェルプレートに加え、各サンプルは３つの平行なウェルを設けた。光学封止フィルムでプレートを封止し、１０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心し、気泡を除去した。ＲＴ−ＰＣＲ装置の設定は以下の通りであり、即ち、融解曲線は、連続取り込みモードを採用し、走査温度範囲が２５〜９９℃であり、昇温速率が１％（約１℃/ｍｉｎ）であり、２５℃で２ｍｉｎ平衡化させ、昇温中にデータを収集し、レポーターとしてＲＯＸを選択し、クエンチャーとしてＮｏｎｅを選択し、反応容量が２０μｌである。サンプルの測定濃度は、１ｍｇ/ｍｌであり、参照溶液は、サンプルの緩衝液である。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ ＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．３ソフトウエアを用いて蛍光曲線及びその一次微分曲線をプロットした。ＤＳＦ試験では、通常、タンパク質の第一転移中点温度をタンパク質製剤の熱安定性の変性温度とする。下記の表５に示すように、上記調製されたヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体はＴｍ値を測定した。ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体は、いずれも良いＴｍ値を持つ。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
実施例１３．イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によるヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の電荷変異体の検出
陽イオン交換クロマトグラフ用カラムＭａｂＰａｃ  ＳＣＸ−１０、４ｍｍ×２５０ｍｍ（品番：７８６５５）を用いて、移動相Ａとして２０ｍｍｏｌ/Ｌ  ２-モルホリノエタンスルホン酸（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ、ＭＥＳ）（ｐＨ５．６）及び６０ｍｍｏｌ/Ｌ  塩化ナトリウムを使用し、移動相Ｂとして２０ｍｍｏｌ/Ｌ  ＭＥＳ（ｐＨ５．６）及び３００ｍｍｏｌ/Ｌ  塩化ナトリウムを使用し、流速が０．５ｍＬ/ｍｉｎであり、カラム温度が２５℃であり、サンプルセル温度：４℃、検出波長が２８０ｎｍであり、サンプルロード量が５０μｌ（１ｍｇ/ｍＬ）であり、５〜５０％の直線的濃度勾配で６０分間溶出させた。実験結果は、Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフ１２６０システムワークステーションによりデータ処理を行い、面積正規化法でピーク面積百分率を算出した。上記調製されたヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体はＣＥＸ検出を行った。それらのモノクローナル抗体の化学的安定性を確認するために、上記サンプルを４０℃高温条件下で置き、２週目及び４週目にそれぞれ試料を採取してＣＥＸ検出を行い、電荷変異体の割合の変化を観察した結果は、表６に示された。ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ抗体は、いずれも電荷変異体の割合変化が低い。
【００６７】
【表６】
0006802381.tif 000007
【００６８】
実施例１４．ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体の低ｐＨウイルス不活化条件下での安定性
被検サンプル  ２００μｇを採取してそれぞれ１ｍｏｌ/Ｌ  クエン酸母液でｐＨを３．４±０．０５に調整し、サンプルの最終濃度が１ｍｇ/ｍＬである。室温でセットし、それぞれ０、１、２、４及び６時間でサンプリングし、２ｍｏｌ/Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ９．５）母液でｐＨを７．５に調整した。サンプルを上記ＳＥＣ方法により分析した結果は、表７に示された。ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａ抗体は、少なくとも６時間の低ｐＨウイルス不活化条件に耐えることができ、安定性が良い。
【００６９】
【表７】
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【００７０】
実施例１５．ヒト化抗ヒトＩＬ−１７Ａモノクローナル抗体のラット体内での薬物動態研究
実験材料は、北京華阜康生物科技股フン有限公司から購入された６〜８週齡の雌性ＳＤラットを選択した。ラットを環境に慣れさせてから１週間後、無作為に群分けし、１群当たり３匹である。各群は、それぞれ異なる抗ヒトＩＬ−１７Ａヒト化モノクローナル抗体、対照抗体を投与し、用量がいずれも１５ｎｍｏｌ/ｋｇであり、皮下注射で単回投与した。０時に投与後１時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間、３１２時間、３６０時間、４０８時間、４８０時間で眼窩から採血し、抗凝固処理を行わず、血液サンプルを室温で３０分間〜１時間放置し、血液凝固後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、得られた血清サンプルを−８０℃で凍結保存し、測定のために用意した。
【００７１】
ＥＬＩＳＡにより血清中の抗ヒトＩＬ−１７Ａヒト化モノクローナル抗体、対照抗体の濃度を測定した。簡単に説明すると、ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液を用いて４℃で人組換えＩＬ−１７Ａタンパク質を高吸着型ＥＬＩＳＡプレートに一晩被覆した。ＰＢＳＴで洗浄した。非特異的結合を防止するために、５％  脱脂粉乳含有ＰＢＳＴでそのプレートをブロッキングし、ＰＢＳＴで洗浄した。そして、１０％  混合ラット血清、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳＴで希釈した被検血清サンプルを加えて２５℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでそのプレートを洗浄した。５％  脱脂粉乳含有ＰＢＳＴに希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗人ＩｇＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、品番ＡＰ３０９Ｐ）を加え、２５℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでそのプレートを洗浄した。最後に、比色基質ＴＭＢを用いて室温で１０分間発色させた。１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて発色を停止した。４５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った。
結果は、図１０に示すように、単回皮下注射の用量が１５ｎｍｏｌ/ｋｇの異なる抗ヒトＩＬ−１７Ａヒト化モノクローナル抗体、対照モノクローナル抗体であるｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ、対照モノクローナル抗体であるｉｘｅｋｉｚｕｍａｂは、ラット体内で類似する薬物血中濃度−時間曲線及び薬物動態学的特性を示した。
【００７２】
最後に、以上の各実施例は、本発明に係る技術案を説明するためのみであり、制限的ではなく、上記各実施例を参照して本発明を詳しく説明したものの、当業者は、上記各実施例に記載の技術案を修正したり、そのうちの一部又は全部の技術特徴を同等に置き換えることができ、それらの修正又は置き換えは、対応する技術案の主旨が本発明に係る各実施例の技術案の範囲から逸脱することなくなされることを理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明で提供された抗体及びその機能的断片は、ＩＬ−１７Ａに特異的に結合し、ＩＬ−１７Ａの過剰発現及び/又は放出に関連する疾患、例えば、気道炎症、喘息、気管支喘息、アレルギー性喘息、慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、乾癬、多発性硬化症、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、強皮症、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、ブドウ膜炎、ヘリコバクター・ピロリ感染胃炎、骨粗鬆症、骨びらん、腹腔内膿瘍・癒着、アジソン病、低ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、セリアック病、シャーガス病、クローン病、同種移植拒絶反応、ベーチェット病、敗血症、敗血症性または内毒素性ショックおよび虚血などの予防及び/又は治療に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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