(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのバイオインターフェース、
少なくとも１つの電磁放射線源及び
少なくとも１つの生物学的標的を含む、細胞の活性化状態を調節するシステムであって、
前記バイオインターフェースは、電磁放射線への曝露に応答して自由電荷キャリアを生成するように構成され、前記バイオインターフェースは、グラファイト；グラフェン；多環芳香族炭化水素；カルボキシル基、エステル、アミド、チオール、ヒドロキシル基、ジオール基、ケトン基、スルホネート基、カルボニル基、アリール基、エポキシ基、フェノール基、ホスホン酸、アミン基、ポルフィリン、ピリジン、ポリマーの1以上で官能化された、官能化グラファイト、グラフェン、多環芳香族炭化水素；炭素原子の一部が非炭素原子で置換された、グラファイト、グラフェン、多環芳香族炭化水素；グラファイトオキサイド；酸素含有官能基を含むグラファイトオキサイド；還元グラフェン酸化物；少なくともいくつかの酸素含有官能基を欠くグラフェン酸化物からなる群から選択された１以上の材料を含み、
前記電磁放射線源は、少なくとも１つのバイオインターフェースを電磁放射線に曝露するように構成され、
前記生物学的標的は、少なくとも１つのバイオインターフェースの電磁放射線への曝露により発生した自由電荷キャリアによって、生細胞の細胞膜電位が遠隔かつ可逆的に操作されるように、少なくとも１つのバイオインターフェースに接触又は十分近接して配置される生細胞を含む、細胞の活性化状態を調節するシステム。
【請求項２】
前記１以上の材料が、グラファイト、グラフェン、酸化グラファイト、酸化グラフェン、還元型酸化グラフェンまたはそれらの組み合わせを含む請求項１に記載の、細胞の活性化状態を調節するシステム。
【請求項３】
少なくとも１以上のバイオオインターフェースは、１つ以上の補助材料の組み合わせと組み合わせられた１以上の材料のハイブリッド構造である請求項１に記載の、細胞の活性化状態を調節するシステム。
【請求項４】
前記補助材料が、金、銀、白金、コバルト、銅、鉄、シリコン、ゲルマニウム、遷移金属、酸化鉄、二酸化チタン、ランタニド酸化物、遷移金属酸化物、ペロブスカイト、シリカ、多孔質シリカ、半導体、結晶性、非晶質、層状物質、タンパク質、ポリマー、ポリマー殻付き無機コア、ポリマー殻付き有機コアもしくは無機殻およびポリマー殻付き無機コアまたはそれらの組み合わせから構成される構造である請求項３に記載の、細胞の活性化状態を調節するシステム。
【請求項５】
前記補助材料が、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、オステオカルシン、ラミニン、カドヘリン、インテルグリン、レクチン、ネクチン、クローディン、Ｉｇスーパーファミリー細胞接着分子、ＲＧＤ細胞接着ペプチド、多糖類コラーゲン（ゼラチン）、アルギン酸塩、セルロース、デンプン、キトサン（キチン）、フィブリン、アルブミン、グルテン、エラスチン、フィブロイン、ヒアルロン酸、スクレロルカン、エルシナン、ペクチン（ペクチン酸）、ガラクタン、カードラン、ジェラン、レバン、エムルサン、デキストラン、プルラン、ヘパリン、絹、コンドロイチン６−硫酸、ポリヒドロキシアルカノエートまたはそれらの組み合わせを含む天然ポリマーである請求項３に記載の、細胞の活性化状態を調節するシステム。
【請求項６】
前記補助材料が、ポリ（リジン）、ポリ（オルニチン）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（バリン）、ポリ（アニリン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（ラクチド）、ポリ（チオフェン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ウレタンアクリレート）、ポリ（Ｎ−メチルピロール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ピロール）、ポリシラン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（Ｙ−ベンジル−Ｌ−グルタメート）−ブロックコポリマー、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのポリマー、ポリ（ｐ−キシリレン）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリヒドロキシブチレート）、ポリ（プロピレンフメレート）、α−ヒドロキシエステル、ポリ（無水物）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（ホスホエステル）、ヒドロゲル、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）およびそれらのコポリマー、ポリ（スチレンスルホネート）、スルホン化ポリ（エーテル−エーテルケトン）、ポリ（スルホン）、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）、ポリ（オクタデシルシロキサン）、ポリ（スチレンブロック−ポリ−４−ビニルピリジン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（Ｎ，Ｎ'−ジメチルアニリン）、ポリ（トランス−３−（３−ピリジル）アクリル酸）またはそれらの組み合わせを含む合成ポリマーである請求項３に記載の、細胞の活性化状態を調節するシステム。
【請求項７】
前記１以上の材料が、連続的、斑点様、ストライプ様パターンまたはそれらの組み合わせで配置される請求項１に記載の、細胞の活性化状態を調節するシステム。
【請求項８】
前記少なくとも１つのバイオンターフェースが、外部の構造支持体がない独立型構造である請求項１に記載の、細胞の活性化状態を調節するシステム。
【請求項９】
前記少なくとも１つのバイオンターフェースが、ガラス材料、金属材料、セラミック材料、半導体材料、誘電材料、プラスチック材料、ポリマー材料、接着分子の層またはそれらの組み合わせからなる群から選択される構造材料をさらに含む請求項１に記載の、細胞の活性化状態を調節するシステム。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのバイオインターフェースが、マイクロタイタープレートのウェルに設置される、請求項１に記載の、細胞の活性化状態を調節するシステム。
【請求項１１】
少なくとも１つの生物学的標的を準備し、
前記少なくとも１つの生物学的標的と、電磁放射線への曝露に応答して自由電荷キャリアを生成するように構成された少なくとも１つのバイオインターフェースとを配置し、
該バイオインターフェースは、グラファイト；グラフェン；多環芳香族炭化水素；カルボキシル基、エステル、アミド、チオール、ヒドロキシル基、ジオール基、ケトン基、スルホネート基、カルボニル基、アリール基、エポキシ基、フェノール基、ホスホン酸、アミン基、ポルフィリン、ピリジン、ポリマーの1以上で官能化された、官能化グラファイト、グラフェン、多環芳香族炭化水素；炭素原子の一部が非炭素原子で置換された、グラファイト、グラフェン、多環芳香族炭化水素；グラファイトオキサイド；酸素含有官能基を含むグラファイトオキサイド；還元グラフェン酸化物；少なくともいくつかの酸素含有官能基を欠くグラフェン酸化物からなる群から選択された１以上の材料を含み、
前記生物学的標的は、少なくとも１つのバイオインターフェースの電磁放射線への曝露により発生した自由電荷キャリアによって、生細胞の細胞膜電位が遠隔かつ可逆的に操作されるように、少なくとも１つのバイオインターフェースに接触又は十分近接して配置される生細胞を含み、
前記少なくとも１つのバイオンターフェースを電磁放射線に曝露することを含むインビトロでの生物学的標的の機能的状態の変化を誘発する方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのバイオンターフェースの電磁放射線への曝露は、可視スペクトル電磁放射線、高周波スペクトル電磁放射線、赤外電磁放射線、テラヘルツ周波数スペクトル電磁放射線、マイクロ波スペクトル電磁放射線またはそれらの組み合わせへの曝露である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのバイオンターフェースの電磁放射線への曝露は、可視光への曝露である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのバイオンターフェースを、幹細胞研究および特定の成熟度の幹細胞由来細胞の作製のために利用することを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのバイオンターフェースを、生体膜のエレクトロポレーションのためにおよび生体膜を通じたエレクトロポレーションに基づく物質の送達のために使用する請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
生細胞を含む、少なくとも１つの生物学的標的を準備し、
前記少なくとも１つの生物学的標的の生細胞と、電磁放射線への曝露に応答して自由電荷キャリアを生成するように少なくとも１つのバイオインターフェースとを配置し、
前記生細胞を、少なくとも１つのバイオインターフェースの電磁放射線への曝露により発生した自由電荷キャリアによって、生細胞の細胞膜電位が遠隔かつ可逆的に操作されるように、少なくとも１つのバイオインターフェースに接触又は十分近接して配置し、
前記バイオインターフェースは、グラファイト；グラフェン；多環芳香族炭化水素；カルボキシル基、エステル、アミド、チオール、ヒドロキシル基、ジオール基、ケトン基、スルホネート基、カルボニル基、アリール基、エポキシ基、フェノール基、ホスホン酸、アミン基、ポルフィリン、ピリジン、ポリマーの1以上で官能化された、官能化グラファイト、グラフェン、多環芳香族炭化水素；炭素原子の一部が非炭素原子で置換された、グラファイト、グラフェン、多環芳香族炭化水素；グラファイトオキサイド；酸素含有官能基を含むグラファイトオキサイド；還元グラフェン酸化物；少なくともいくつかの酸素含有官能基を欠くグラフェン酸化物からなる群から選択された１以上の材料を含み、
前記少なくとも１つのバイオインターフェースを電磁放射線に曝露することにより、前記少なくとも１つのバイオインターフェースに賦活刺激を与え、
細胞膜電位を操作することを通して、少なくとも１つの生物学的標的の機能的状態の変化を誘発させ、
１以上の検出法を用いて、前記少なくとも１つの生物学的標的における得られる変化を監視することを含み、
前記標的を、１以上の無傷細胞、１つ以上の細胞分画または１つ以上の人工膜構造とするインビトロでの生物学的アッセイを行う方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの生物学的標的の監視を、光学的検出方法を用いて行う請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの生物学的標的の監視は、標的の機能的状態を監視することであり、その変化は、形態、細胞遊走、細胞生存能、細胞代謝、細胞内イオン濃度、細胞膜電位、ミトコンドリア膜電位、シグナル伝達分子（例えば、グルタメート、ｃＡＭＰ）の細胞内／細胞外濃度、酵素活性、細胞内分子の移行またはそれらの組み合わせの変化の１以上の変化を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物学的標的の監視を、パッチクランプ技術、平面電気生理学的系、細胞外記録、微小電極アレイ、フィールドトランジスタ、炭素ナノチューブまたはそれらの組み合わせを含む電気生理学的検出法を用いて行う請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの生物学的標的の監視を、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、次世代配列決定、ＤＮＡマイクロアレイ、核型分析、蛍光インサイチュハイブリッド形成、熱量測定インサイチュハイブリッド形成またはそれらの組み合わせを含む遺伝学的検出法を用いて行う請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つのバイオインターフェースを、イメージングもしくは電気的方式の何れかまたはそれらの組み合わせを用いて、少なくとも１つの生物学的標的を刺激し及び結果として起こる生物学的標的の変化を監視することとによって、少なくとも１つの生物学的標的と双方向通信のために利用することをさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
化学物質の薬理学的特性、潜在的な心毒性、神経毒性、代謝毒性またはそれらの組み合わせに関する化学物質の評価のため、または化学物質のスクリーニング、薬理学的プロファイリングのために利用する請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
細胞、膜受容体、イオンチャネル、膜貫通輸送体、キナーゼ、ホスファターゼまたはそれらの組み合わせの薬理学的プロファイリングのために利用する請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
医学的状態を有する動物を処置するためのシステムであって、
電磁放射線への曝露に応答して自由電荷キャリアを生成するように構成された少なくとも１つのバイオインターフェース及び
少なくとも１つのバイオインターフェースを電磁放射線に曝露するように構成された少なくとも１つの電磁放射線源を含み、
前記バイオインターフェースは、グラファイト；グラフェン；多環芳香族炭化水素；カルボキシル基、エステル、アミド、チオール、ヒドロキシル基、ジオール基、ケトン基、スルホネート基、カルボニル基、アリール基、エポキシ基、フェノール基、ホスホン酸、アミン基、ポルフィリン、ピリジン、ポリマーの1以上で官能化された、官能化グラファイト、グラフェン、多環芳香族炭化水素；炭素原子の一部が非炭素原子で置換された、グラファイト、グラフェン、多環芳香族炭化水素；グラファイトオキサイド；酸素含有官能基を含むグラファイトオキサイド；還元グラフェン酸化物；少なくともいくつかの酸素含有官能基を欠くグラフェン酸化物からなる群から選択された１以上の材料を含み、
動物への投与によって、少なくとも１つのバイオインターフェースの電磁放射線への曝露により発生した自由電荷キャリアによって、生細胞の細胞膜電位が遠隔かつ可逆的に操作されるように、生細胞を含む少なくとも1つの生物学的標的が、少なくとも１つのバイオインターフェースに接触又は十分近接して配置され、
前記医学的状態が、アルツハイマー病；パーキンソン病；筋萎縮性側索硬化症；ハンチントン病；化学療法誘発性ニューロパチー；加齢性脳機能障害；ダウン症；自閉スペクトラム障害；脳性麻痺；てんかん、発作性障害；情動障害、うつ、外傷性脳損傷、外傷後ストレス障害（慢性外傷性脳障害）、ストレス性、外傷性もしくは爆風による損傷または疾患；統合失調症および他の精神障害；疼痛、痛覚過敏および侵害受容の障害；嗜癖障害；神経虚血；神経再かん流傷害；神経外傷；神経出血；神経損傷；神経感染；脳卒中；癌；心血管系障害；不整脈；心不全；心筋症；リウマチ性心疾患；冠動脈疾患；先天性心疾患；眼疾患；加齢性黄斑変性症；網膜色素変性症；緑内障：糖尿病性網膜症；カルシウムホメオスタシス障害；グルカゴン産生腫瘍；糖尿病；低血糖；副腎障害；甲状腺障害；成長障害；代謝性骨疾患；性ホルモン障害；性機能障害であり；
前記動物が、哺乳動物、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマまたはブタである医学的症状を有する動物を治療又は予防するためのシステム。
【請求項２５】
神経機能代替物のために少なくとも１つのバイオインターフェースを利用することを含む請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
網膜移植物のために少なくとも１つのバイオインターフェースを利用することを含む請求項２４に記載のシステム。
【請求項２７】
幹細胞補充療法との組み合わせのために少なくとも１つのバイオインターフェースを利用することを含む請求項２４に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、内容全体が本明細書に組み込まれる２０１４年６月１７日出願の米国仮特許出願第６１／９９８，０８９号明細書からの優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の膜電位の変化は、心拍、脳機能、視覚的および嗅覚的伝達および筋肉収縮を含む、多くの基本的な生理学的過程に基づく。細胞は、互いに通信するために、および外部の手がかりに従いそれらの挙動を変化させるために、電気的シグナル伝達を使用していることが多い。
【０００３】
形質膜は、細胞のその構造の完全性を確保し、細胞外周囲から細胞内区画を物理的に分離する。ａ）細胞内と細胞外区画との間のイオン組成の実質的な相違およびｂ）細胞膜を含むリン脂質二重層の絶縁性の物理学的特性のために、細胞膜を挟んで電場（Ｅ−フィールド）勾配が存在する。静止時、細胞の内側は外側よりも強い負荷電状態であり、その結果、様々なタイプの細胞において膜電位が−１０〜−８０ｍＶの範囲となる。電気的および／または化学シグナルによって膜電位の変化が惹起され得る。具体的に、これらのシグナルは電位開口型またはリガンド開口型イオンチャネルの開口につながり、その結果、膜透過性が変化し、形質膜の細胞内側および細胞外側においてイオンの再分布が起こり、最後に膜電位が変化する。
【０００４】
膜電位を調節することは、細胞の活性化状態を調節することである。膜電位の変化は、細胞の興奮性、電位依存性ホスファターゼによるタンパク質の翻訳後修飾、ホルモン分泌、イオンホメオスタシス、タンパク質発現の制御および細胞増殖のような基本的機能に密接につながるため、様々な下流の効果につながり得る。興奮性の細胞（例えばニューロンまたは心筋細胞（ＣＭ））において特別な状況が存在し、ここで、膜電位の比較的小さい変化が増幅され、その結果、協調的な複数のイオンチャネル型の連鎖的な活性化が起こり、活動電位の生成へと至り得る。非興奮性細胞においてさえも、膜電位の変化の結果、電気化学的イオン勾配およびイオン濃度の変化が起こり、これは、多くの外見的に電位依存性の過程を惹起し得る。
【０００５】
細胞膜電位を操作するための高度な方法を必要とする多くのインビトロ応用としては、健康および疾患における分子機序の基礎研究；電位感受性膜タンパク質の機能的探索；シナプス可塑性を含む細胞間の情報交換の研究；心臓病関連プロジェクト；視覚および嗅覚伝達経路；細胞補充療法のための幹細胞由来細胞の作製および特性評価；幹細胞由来細胞の活性化依存性成熟および分化；およびそれらの潜在的心毒性を評価するための、および個別化医療の開発を支援するための、候補薬物のハイスループットスクリーニングが挙げられる。
【０００６】
細胞膜電位を操作するための新規方法は、疾患進行中に損なわれる内因性活性化トリガーを強化することが必要とされる状況下でのインビボ応用でも非常に有用になるであろう。例えば、ＣＭの膜電位全体の調節は、不完全な電気的シグナル伝達を克服するのに役立ち得、したがって異常な心拍リズムを調節し得る。網膜色素変性症または加齢性黄斑変性症中の光受容体の変性は、網膜において次の列にある無傷細胞の光駆動性電気的刺激を介して相殺され得、視覚の回復につながる可能性がある。ニューロンの刺激は、脳血管、神経変性および精神疾患がある患者における神経活性の欠陥を相殺するのに役立ち得る。
【０００７】
電気生理学は、細胞膜電位を調節するための最も直接的で正確な方法である。一般に、電極に基づく技術による電気生理学的刺激（例えば、パッチピペット、多電極アレイまたはＥ−フィールド刺激）は、細胞膜電位に対して高度な調節を示す。しかし、これらの技術は、空間的選択性の制限、侵襲性、低スループット、自動化への対応が容易ではないことおよび最新の多重電極物質の全般的な機械的剛性など、重大な欠点がある。さらに、電極に基づく技術は、静止電極が正常な生理的動態を示す細胞で引き起こす損傷のために、ＣＭを収縮させる研究に対してさらに適切ではない。
【０００８】
膜電位の変化を誘発するための化学的方法は、「高Ｋ＋」細胞外溶液または薬理学的イオンチャネル開口剤の適用のようなアプローチを利用する。この方法の重大な欠点としては、膜電位の調節ができないこと、誘発される変化の不可逆性および時間的および空間的分解能が低いことが挙げられる。
【０００９】
光学的刺激方法は、アクチュエータとして光線を利用し、したがって細胞膜電位に対する長期の非侵襲性調節が可能になり得る。しかし、既存の方法には、深刻な固有の欠点がある。このカテゴリーの最古の方法の１つは、グルタメート、ＡＴＰ、ドーパミン、セロトニン、環状ヌクレオチドなどの化学的修飾を受けたシグナル伝達分子の光誘発性「放出」である。この方法は、時間的分解能が高いにもかかわらず、放出部位からの「放出される」分子の拡散のためにその空間的分解能は限定的である。さらに、「放出される」化学物質は、前駆体の不安定性、光毒性を示し、強いＵＶ照射を必要とする。さらに「放出する」過程は不可逆的であり、非反復性である。
【００１０】
最新で最も有望な光学的刺激方法であるオプトジェネティクスは、光に対する感受性が固有であるかまたは改変されるかの何れかである、遺伝子によりコードされる膜貫通タンパク質を使用することである。オプトジェネティクスにより、比類のない時空間的正確さで、選択された細胞の部分集団において膜電位を調節することが可能となる。しかし、光介在性の調節をもたらすために、オプトジェネティクスは、細胞内機構の不可欠な部分となる外来性の機能的活性タンパク質の発現を必要とする。換言すると、研究者は、細胞の挙動を調節することを可能とするために細胞の生理を変化させなければならず、これは幹細胞由来細胞を用いた研究において支障を来し得る。オプトジェネティクスのいくつかの技術的な課題は、タンパク質工学の多反復過程およびこの数年間にわたる大規模なツール開発中に既に対処が行われている。しかし、一部の問題は、このアプローチに固有である：１）イオン束および最初の膜電位変化は内因性イオンチャネルではなくむしろ外来タンパク質の特性により決定されるため、オプトジェネティクスは生理学的な刺激を提供しない。２）膜電位の所望の変化を達成するために感光性タンパク質の高発現レベルが必要とされる。３）多くの場合において、オプトジェネティックタンパク質の感光性機能には内因性補助因子全トランス型レチナールまたは光異化性化合物の添加が必要である。４）新規薬物は、関心のある標的の代わりにまたはこれに加えてオプシンに直接的に影響し得るため、オプトジェネティクスは、新規薬物の薬理学的プロファイリングに適切ではない。
【００１１】
材料科学：無機バルク半導体、半導体ナノ粒子および有機半導体ポリマーから構成される基板を使用して、ニューロンの光誘導性の電気的興奮が明らかになった。例えば、シリコンウエハ上で培養されるニューロンは、光により活性化可能であるが、これは、ウエハを挟んで適用される特異的な電位の存在下でのシリコンの伝導率の光誘導性の変化がニューロンにおいて容量性の過渡応答を惹起し得、その結果、それらの膜の脱分極が起こるからである。残念ながら、１）このプラットフォームは透明ではなく、したがって光学的検出方法との適合性が限定的であり；２）精巧な調節装置中の非常に高価で非常に強固なシリコンウエハによってその応用性が大きく制限され；３）光電流の拡大の直径により定められる空間的分解能は≧５０μｍである。これらの問題のうちのいくつかは、感光性層が有機半導体ポリマーの混合物から作製された基板において取り上げられた。シリコンに基づく基板と比較して、このプラットフォームは、何ら外部装置を必要とせず、熱放散が低く、柔軟性に富み、製作が非常に容易である。その短所としては、ａ）透過性が低く、励起が可視範囲であるため、光学的検出との不適合性；およびｂ）ポリマー層の機械的脆弱性のための小型化問題の可能性が挙げられる。半導体ナノ粒子に基づく別の光学的刺激プラットフォームは、その製作中、工学的柔軟性が最大であったが、ナノ粒子中のカドミウム含有構成成分の存在のために生体適合性に乏しかった。
【００１２】
まとめると、細胞の遠隔刺激のために新規技術的ツールが必要とされている。最適な生理学的刺激ツールは、これらの変化の幅、持続時間および方向を調節するために；侵害性が少なく、非侵襲的検出方法に適合するように、膜電位を迅速に可逆的に、および反復して変化させることが可能であるべきである。
【００１３】
これらの要件を満たすために、適切な特性を有する新規材料を検討することができる。グラフェン系またはグラフェン関連材料（ここで、「グラフェン系」および「グラフェン関連」という用語は交換可能に使用される）のファミリーは、近年、２０１０年ノーベル物理学賞後に注目されるようになり、続いて、エネルギー、電子工学、センサー、光プロセシング（ｌｉｇｈｔ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、医学および環境分野においてこれらの材料に対する応用の開発が急激に増加した。このファミリーの「当初からの」メンバーであるグラフェンは、六角形のハニカム格子に配置されるｓｐ２−ハイブリッド炭素原子から作製される二次元材料である。グラフェン関連材料の広域ファミリーとしては、グラフェン（単層および多層）、グラファイト、多環式芳香族炭化水素、炭素ナノチューブ、フラーレン、様々な次元の様々なグラフェンナノ構造（例えば、グラフェンナノ粒子またはグラフェン量子ドット：グラフェンナノリボン：グラフェンナノメッシュ；グラフェンナノディスク；グラフェンフォーム；グラフェンナノピラー）、他のグラフェン関連材料、置換グラフェン関連材料（例えばＮ、Ｂ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉなどでの炭素原子の置換）および、反応性官能基（例えば、カルボキシル基、エステル、アミド、チオール、ヒドロキシル基、ジオール基、ケトン基、スルホン酸基、カルボニル基、アリール基、エポキシ基、フェノール基、ホスホン酸、アミン基、ポルフィリン、ピリジン、ポリマーおよびそれらの組み合わせ）で官能化されるグラフェン関連材料の任意の組み合わせが挙げられる。グラフェン関連材料の具体例としては、酸化グラフェン（ＧＯ）、酸化グラファイトおよび還元型酸化グラフェン（ｒＧＯ）が挙げられる。
【００１４】
グラフェンおよびグラフェン関連材料は、驚異的な電子的、機械的および光学的特性を示し、これにより、グラフェンおよびグラフェン関連材料は、電磁放射線を用いた細胞の遠隔刺激のための生体適合性インターフェースの構築を含む、様々な生物医学的応用において貴重なものとなり得る。グラフェンは非常に不活性であり、化学的に安定であるため、生体適合性に優れている。その独自の特性としては、高い電気伝導性、電荷キャリアの高移動性、非常に優れた機械的特性（例えば、高剛性、強度および弾性）、高い熱伝導性、広帯域吸収および可視スペクトルに対する高い透過性が挙げられる。さらに、グラフェンシートの積層パターンの変化、グラフェン構造の形状変化、グラフェン格子中の炭素原子の置換およびグラフェンの官能化などの多くの経路のうちの１つを遂行することによって、具体的な適用に対してグラフェンの電子的および光学的特性を調整することが可能である。
【００１５】
グラフェンはゼロバンドギャップを有し、これは、約３．５ｅＶを下回るエネルギーでの入射光の広帯域吸収につながっている。これは、高い光吸収係数（７×１０５ｃｍ−１）を有するグラフェンが、可視スペクトル、赤外およびさらにテラヘルツ領域全体を含む３００〜２５００ｎｍの範囲の光の波長を効率的に検出し得ることを意味する。
【００１６】
グラフェンの単層は、可視スペクトルに対しては２．３％の吸収で、紫外線では約１０％の吸収ピークを超えて、非常に透明である。グラフェンが光子を吸収する場合、これは、光電性および／または光−熱電性機序を介して光発生励起を生じさせることによって、それらのエネルギーを電流に変換する。グラフェンの光応答性は、単層グラフェンにおいて光吸収が低く、光発生キャリアの（ピコ秒のスケールでの）再結合寿命が短く、内部量子効率が約６〜１６％と低くなるため、幾分低い（＜１０ｍＡＷ−１）。
【００１７】
ＧＯは、多くの酸素含有官能基で高度に酸化されたグラフェン関連材料である。そのゼロバンドギャップおよび高い電子伝導性を有するグラフェンと対照的に、ＧＯは、バンドギャップが＞３．５ｅＶであり、電子伝導性が非常に悪い、広バンドギャップ半導体である。酸素含有官能基を除去すると、光学バンドギャップが＞３．５ｅＶから＜１ｅＶに低下し、光吸収が増加し、電気伝導性が回復する。この低下過程の結果、ｒＧＯまたは化学的に変換されたグラフェンとして知られる別のグラフェン関連材料が得られる。グラフェンおよび他の非官能性グラフェン関連材料（例えば、グラファイト、炭素ナノチューブおよびフラーレン）が疎水性である一方で、ＧＯは酸素含有官能基の存在のために親水性である。ｒＧＯの親水性は中程度であるが、それはｒＧＯ中の残存する酸素含有官能基の数が高度に酸化されたＧＯよりも少ないからである。
【００１８】
グラフェンおよびその誘導体に対する最新の生物医学的応用の中でも、組織工学、抗菌処置、薬物および遺伝子送達のための、およびバイオイメージングのための造影剤としてのそれらの利用が挙げられる。例えば、細胞培養のための平面または三次元足場の両方に対する、構造の構成要素としてのグラフェン関連材料の組み込みは、細胞接着を大きく促進し、細胞増殖を改善し、細胞成熟速度を加速し、神経突起出芽および伸長を促進し、幹細胞分化中の神経系細胞系列を支持した。これらの適用は、純粋なグラフェンおよびその誘導体を利用しただけでなく、多様なナノ構造を有するそれらのハイブリッドナノコンポジット（例えば、半導体量子ドット、炭素ナノチューブ）、タンパク質（例えばキトサン）、ポリマー（例えばポリ（プロピレンカーボネート））または他の化学物質（例えばＰＥＧ）も利用した。好ましい細胞微小環境を生成させることにおけるグラフェン関連材料の好ましい効果は、それらの機械的特性、ミクロスケールのトポグラフィー特性および界面化学の特徴に基づくことが示唆された。
【００１９】
既存の生物医学的応用は全て、グラフェンおよびその誘導体の受動的な定常状態特性を利用する。現在、グラフェン関連バイオインターフェースの物理化学的特性を能動的に変化させるために、続いてこれらのインターフェースと相互作用する細胞の機能的状態を変化させるために外部刺激を利用する適用はない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
インビトロおよびインビボの両方の細胞膜の電気的特性の操作のためのグラフェン関連材料（Ｇ−バイオインターフェース）を含む生体適合性インターフェースの使用が開示される。
【００２１】
ある実施形態において、生体適合性インターフェースは、グラフェン関連材料の１つ以上の構造を含み得る。別の実施形態において、グラフェン関連材料に対して、１つ以上の化学物質が添加され、それらで官能化され、および／またはそれらが追加され得る。ある実施形態において、Ｇ−バイオインターフェースは、独立型構造として利用され得る。他の実施形態において、Ｇ−バイオインターフェース構造を基板上に堆積させ得る。
【００２２】
さらなる実施形態において、Ｇ−バイオインターフェースを介した膜電位の操作の方法は、生物学的標的をＧ−バイオインターフェースの付近に配置するステップと、Ｇ−バイオインターフェースを電磁気的刺激に曝露するステップとを含み得る。ある実施形態において、電磁気的刺激は、可視スペクトル電磁気的刺激であり得る。
【００２３】
生物学的アッセイを行う方法は、Ｇ−バイオインターフェースを介して膜電位の変化を誘発するステップと、１つ以上の検出方法を用いて、結果として起こる変化を監視するステップとを含み得る。ある実施形態において、検出方法は、膜電位を操作するために光によって活性化されるＧ−インターフェースと組み合わせた場合に、結果として生物学的活性を探査する全光学的アッセイが得られ得る光学的方法であり得る。ある実施形態において、検出方法は遺伝学的方法であり得る。ある実施形態において、検出方法は、電気生理学的方法であり得る。
【００２４】
医学的状態を有する動物を処置する方法は、Ｇ−バイオインターフェース構造を動物に投与するステップと、Ｇ−バイオインターフェースを電磁気的刺激に曝露するステップとを含み得、ここで、この医学的状態は、アルツハイマー病；パーキンソン病；筋萎縮性側索硬化症；ハンチントン病；化学療法誘発性ニューロパチー；加齢性脳機能障害；ダウン症；自閉スペクトラム障害；脳性麻痺；てんかんおよび他の発作性障害；情動障害、うつ、ＴＢＩ／ＰＴＳＤ／ＣＴＥ（慢性外傷性脳障害）および他のストレス性、外傷性もしくは爆風による損傷または疾患；統合失調症および他の精神障害；疼痛、痛覚過敏および侵害受容の障害；嗜癖障害；神経虚血；神経再かん流傷害；神経外傷；神経出血；神経損傷；神経感染；脳卒中；癌；心血管系障害；不整脈；心不全；心筋症；リウマチ性心疾患；冠動脈疾患；先天性心疾患；眼疾患；加齢性黄斑変性症；網膜色素変性症；緑内障；糖尿病性網膜症；カルシウムホメオスタシス障害；グルカゴン産生腫瘍；糖尿病；低血糖；副腎障害；甲状腺障害；成長障害；代謝性骨疾患；性ホルモン障害；性機能障害を含むが限定されない様々な病態の何れかである。
【００２５】
本開示およびその長所をさらに完全に理解するために、ここで、本開示の具体的な実施形態を記載する付属の図面と合わせて次の説明が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】電磁気的刺激を用いた細胞の遠隔刺激を実行するための生体適合性光電子工学インターフェース中でのグラフェンおよびグラフェン関連材料の利用の全般的ストラテジーを示す。
【図２】グラフェン（左）およびｒＧＯ（右）でコーティングしたガラスカバースリップ上のＣＭの、明視野光学顕微鏡（Ａ）および走査電子顕微鏡（Ｂ）画像を示す。
【図３】ｒＧＯに基づく基板の高い生体適合性を示す。マークされるとおりの、不均一な基板上で培養したＣＭの、明視野（左）および蛍光（右）光学顕微鏡画像でのＣＭの長期培養（上部はガラスであり、下部はｒＧＯコーティング面である）。ＣＭを核色素ヘキスト（青）および細胞質色素カルセイン（緑色）で標識する。（Ｂ）ガラス面対ｒＧＯコーティング面上で培養したＣＭに対する、正規化細胞密度（左）および膜の完全性（右）の評価を介した細胞生存能の評価。ガラスカバースリップ上で培養した細胞に対する対照値に対して正規化した視野中の細胞数として細胞密度を計算した。膜の完全性の値は、カルセイン−ＡＭおよびエチジウムホモ二量体−１（ＥｔｈＤ−１）で染色した後に蛍光シグナルを呈した細胞のパーセンテージとして与えた。データは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ≧１００個の細胞／各条件）として与える。
【図４】様々な実験条件下のＣＭにおける自発的収縮の頻度に対する光照射（青色バー）の効果を示す：（Ａ）グラフェンコーティングガラスカバースリップ上でのＣＭの長期培養、（Ｂ）ｒＧＯコーティングガラスカバースリップ上でのＣＭの長期培養、（Ｃ）「裸の」ガラスカバースリップ上で培養したＣＭとの、ｒＧＯ薄片の短時間接触。ＣＭの収縮の結果としての細胞の端部付近での光学密度の変化を反映する代表的なトレースを作成するために、明視野顕微鏡画像を使用した。
【図５】ガラスカバースリップ（Ａ）およびｒＧＯコーティングガラスカバースリップ（Ｂ、Ｃ）上で培養したＣＭの活動電位に対する光照射の効果を示す。縦棒は１０ｍＶ。
【図６】ｒＧＯコーティングガラスカバースリップ上で培養し、Ｆｌｕｏ４、蛍光カルシウム感受性指示薬で標識した複数のＣＭでの細胞内カルシウム濃度の光惹起性変化の個々のトレースを示す。
【図７】明視野光学顕微鏡画像（Ａ）および走査電子顕微鏡画像（Ｂ）により表されるように、ｒＧＯコーティングガラスカバースリップ上に播種された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ニューロンの長期培養を示す。
【図８】ｉＰＳＣ由来ニューロンに対するｒＧＯコーティングガラスカバースリップの優れた生体適合性を示す。生細胞（緑色）および死細胞（赤）をそれぞれ標識するために、（Ａ）ガラスカバースリップ（左）およびｒＧＯコーティングガラスカバースリップ（右）上で培養したニューロンをカルセイン−ＡＭおよびＥｔｈＤ−１で染色した。（Ｂ）細胞生存能実験のまとめ。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ≧１００個の細胞／各実験条件）として表す。
【図９】ｒＧＯコーティングガラスカバースリップ上で培養したニューロンの膜電位に対する光照射の効果を示す。（Ａ）実験スキーム：光を用いたニューロンの活性化および電気生理学的方法を用いた電気的活性を確実にすることを監視。（Ｂ）ｒＧＯコーティングガラスカバースリップ上のニューロンにおける光惹起性活動電位。
【図１０】ｒＧＯコーティングガラスカバースリップ上で培養したニューロンにおける、細胞内カルシウムイオンの分布に対する光惹起性効果を示す。（Ａ）実験スキーム：光を用いたニューロンの活性化および光学的方法を用いた細胞内カルシウム濃度の変化を確実にすることの監視。（Ｂ）ｒＧＯコーティングカバースリップ上で培養し、Ｆｌｕｏ４、蛍光カルシウム指示薬で標識した複数のニューロンにおける細胞内カルシウムの光惹起性変化の個々のトレース。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本開示は、これらが変動し得るように、記載の特定の系、装置および方法に限定されない。本記載で使用される用語は、特定の変形形態または実施形態を記載することのみを目的とし、その範囲を限定するものではない。
【００２８】
本開示は、とりわけ、グラフェン関連材料に基づく、ナノ構造の生体適合性切り替え可能インターフェース、このようなバイオインターフェースを調製する方法、細胞の作製、照合および特性評価のためにこのようなバイオインターフェースを利用する方法、細胞および化学物質の薬理学的プロファイリングのためにこのようなバイオインターフェースを利用する方法、ならびにこのようなバイオインターフェースを用いて医学的状態を有する動物を処置する方法を与える。
【００２９】
一般的な設計ストラテジーは、図１で示される次の一連の事象に基づく。１）電磁気的刺激への曝露中に、グラフェン関連材料は、そのエネルギーを吸収し、その結果、励起子が生じ、続いて電子および生孔に解離する。２）細胞膜とグラフェン関連材料の表面との間の容量結合効果のために、Ｇ−バイオインターフェースからの光生成自由電荷キャリア（例えば電子）は、グラフェン／細胞膜インターフェース付近で陽イオンに取って代わる。３）細胞膜のすぐ外側の電荷のこのような再分布が細胞膜電位の変化を惹起する。Ｇ−バイオインターフェースの大きい界面容量により、効果的な容量性刺激が与えられる。したがって、Ｇ−バイオインターフェース付近の外部の光により生じるＥ−フィールドおよび膜間のＥ−フィールド勾配の相互作用は、細胞の非侵襲的な遠隔刺激につながる。
【００３０】
Ｇ−バイオインターフェースにおけるグラフェン関連材料は、一般に、グラフェンから生じたか、または製作、官能化もしくは置換の様々な方法を用いてグラフェンに変換され得る任意の材料であり得る。グラフェン関連材料のファミリーは、グラファイト、グラフェン、多環式芳香族炭化水素、置換グラフェン関連材料（一部の炭素原子がＮ、Ｂ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉなどの原子で置換されている）およびカルボキシル基、エステル、アミド、チオール、ヒドロキシル基、ジオール基、ケトン基、スルホン酸基、カルボニル基、アリール基、エポキシ基、フェノール基、ホスホン酸、アミン基、ポルフィリン、ピリジン、ポリマーおよびそれらの組み合わせなどの官能基で官能化されるグラフェン関連材料を含んでいる。官能化グラフェンの例は、多くの酸素含有官能基を含有するＧＯである。官能性グラフェンの別の例は、ＧＯからの少なくとも一部の酸素含有官能基の除去により生成されるｒＧＯである。
【００３１】
グラフェン関連材料は、あらゆる次元であり得る。グラフェンの場合、ゼロ次元ナノ構造の例は、グラフェンナノ粒子またはグラフェン量子ドットを含み；一次元ナノ構造の例は、グラフェンナノリボンであり；二次元ナノ構造の例はグラフェンシート、グラフェンナノメッシュであり；三次元ナノ構造の例はグラファイト、グラフェンシートの積層物；炭素ナノチューブ、グラフェンのロールアップシート；フラーレン、グラフェンのラップアップシート；グラフェンフォーム；およびグラフェンナノピラーである。
【００３２】
Ｇ−バイオインターフェースに組み込まれる何れのグラフェン関連材料も、単独で使用し得るか、または様々な次元の様々なグラフェン関連材料の様々な数の層のハイブリッドの組み合わせの一部であり得る。
【００３３】
Ｇ−バイオインターフェースにおいて特定の特性を設計するために、グラフェン関連材料を様々な補助材料と組み合わせ得る。このような特性としては、吸収効率の向上、所望のスペクトル活性化プロファイル、ｐ−またはｎ−型の官能性、オン−オフ切り替え速度、処理可能性、耐久性、適合性、電気伝導性、特定のバイオインターフェースを作製するための可能な化学官能化および三次元配置が挙げられ得る。補助材料の例としては、金属（例えば、金、銀、鉄、酸化鉄、二酸化チタン、ランタニド酸化物、遷移金属および遷移金属酸化物）、グラフェン様材料（例えば、二硫化モリブデン、二硫化タングステン、セレン化ニオビウムおよび窒化ホウ素）、半導体、シリカ、ポリマーまたはそれらの組み合わせで作製される構造が挙げられ得る。
【００３４】
グラフェン関連材料は、細胞外マトリクス（例えば、コラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニン）の天然の構成成分または合成ポリマー（例えば、ポリアニリン、ポリピロールおよびポリチオフェン）を含むが限定されないポリマーと組み合わせ得る。
【００３５】
グラフェン関連材料は、任意の外部の構造支持体なく独立型構造として使用し得るか、または基板上に直接堆積させ得る。これらはまた、独立構造支持体を提供し得る他の材料と組み合わせることもできる。Ｇ−バイオインターフェースの具体的な空間的配置は、様々なグラフェン関連材料の固有の次元を活用することおよび適切な補助材料を組み込むことの両方によって達成され得る。
【００３６】
Ｘ−Ｙ平面のＧ−バイオインターフェースの外形寸法は、ナノの大きさ（例えば１ナノのサイズのグラフェン薄片）からマクロの大きさの範囲にわたり得、これは製造能力によってのみ制限される。Ｘ−Ｙ平面の最小寸法は、１ｎｍ×１ｎｍである。Ｚ軸に沿った外形寸法は、Ｇ−バイオインターフェースに組み込まれるグラフェン関連材料の層数に依存する。Ｚ軸に沿った最小寸法は、非官能性グラフェン単層の厚さ、０．３４ｎｍにより定められる。
【００３７】
標的は、１個以上の無傷細胞、１つ以上の細胞分画または１つ以上の人工膜構造であり得る。細胞分画の例としては、任意の管腔状の小器官、例えば核、リボソーム、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ装置、液胞、シナプス小胞およびリソソームなどが挙げられる。人工膜構造の例としては、リン脂質ミセル、マイクロおよびナノカプセルおよび支持構造上の半流動フィルムが挙げられる。
【００３８】
１個以上の細胞は一般に、膜および膜電位を有するあらゆるタイプの細胞であり得る。例えば、細胞は、細菌（グラム陽性またはグラム陰性）、真核、原核、真菌、昆虫、鳥類、爬虫類、卵母細胞、ハエ、ゼブラフィッシュ、魚類、線虫、両生類または哺乳動物細胞であり得る。本方法はまた、人工膜、リポソームおよびリン脂質二重層などの非細胞物質上でも使用し得る。初代哺乳動物細胞の例は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、クマ、ムース、ウシ、ウマ、ブタまたはチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞を含む。細胞タイプの他の例は、免疫系細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞）、卵母細胞、赤血球細胞、白血球細胞、ニューロン、ＣＭ、上皮、グリア、線維芽細胞、幹細胞、癌細胞、分泌型細胞および不死化細胞を含む。
【００３９】
Ｇ−バイオインターフェースを介して活性化されるために、細胞は、グラフェン関連材料の表面と接触するかまたはグラフェン関連材料の表面に極めて接近して配置されなければならない。このような配置を達成するために、何れかの細胞をＧ−バイオインターフェースに添加し得るか、またはＧ−バイオインターフェースを細胞に添加し得る。
【００４０】
細胞を適切に置いた後、Ｇ−バイオインターフェースは、可視スペクトル、高周波スペクトル、赤外線、マイクロ波、テラヘルツ周波数またはそれらの組み合わせを含むが限定されない電磁気的刺激に曝露されなければならない。例えば、Ｇ−バイオインターフェースの可視スペクトルの電磁波（すなわち光）への曝露は、レーザー、水銀ランプ、キセノンランプ、ハロゲンランプ照明またはＬＥＤ照明を含むが限定されない基本的にあらゆる照明方法によって行い得る。
【００４１】
Ｇ−バイオインターフェースを介した細胞の刺激は、電気的刺激、磁気的刺激、化学的刺激、生物学的刺激またはそれらの組み合わせを含むが限定されない他の刺激の手段と組み合わせ得る。
【００４２】
Ｇ−バイオインターフェースは、活性依存性成熟および幹細胞由来ニューロンの分化を先導するための、細胞分化、遊走、増殖および興奮−神経発生カップリングの根底にある過程の研究のために使用し得る。他の実施形態において、Ｇ−バイオインターフェースは、特定の成熟度の幹細胞由来細胞の作製のために利用し得る。このような幹細胞由来細胞は患者特異的な細胞であり得る。幹細胞タイプとしては、胚性幹細胞、成体幹細胞およびｉＰＳＣが挙げられる。細胞の例としては、ニューロン、ＣＭ、光受容体、線維芽細胞、内皮細胞、膵臓細胞、筋肉細胞、分泌型細胞、脂肪細胞、間葉系幹細胞および骨形成幹細胞が挙げられるが限定されない。
【００４３】
Ｇ−バイオインターフェースはまた、軸索伸長の活性化刺激性の加速に依存することによる神経損傷後の機能回復を促進することにより、神経再生研究および電気的、刺激技術への依存が増加している神経障害の処置のための神経ネットワークとの統合を介した神経機能代替物の開発に役立たせるためにも利用し得る。
【００４４】
Ｇ−バイオインターフェースを介した細胞の遠隔刺激は、細胞の活性の監視のための光学的方法と組み合わせ得る。光学的出力シグナルは明視野および／または蛍光光学顕微鏡を用いて捕捉し得、これは、細胞の標識不含実験または蛍光標識の何れかの結果であり得る。蛍光色素および／または蛍光タンパク質は、例えばＣａ２＋感受性蛍光指示薬を用いた細胞内カルシウムの変化または電位感受性蛍光プローブを用いた膜電位の変化など、光によって活性化される生細胞の様々な事象のリアルタイムイメージングのために使用し得る。あるいは、Ｇ−バイオインターフェース刺激細胞の光学的アッセイは、免疫組織化学的方法を介して固定細胞を分析するエンドポイントアッセイであり得る。光学的シグナルは、一般に、任意の適切な光測定または光蓄積機器を用いて監視し得る。このような機器の例としては、光学カメラ、デジタルカメラ、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、ビデオ装置、ＣＩＴイメージング、顕微鏡に装着されるあらゆるデジタルカメラ、光電子増倍管、蛍光光度計、照度計、分光光度計およびさらにはヒトの眼が挙げられる。
【００４５】
Ｇ−バイオインターフェースを介した細胞の遠隔刺激は、パッチクランプ技術、平面電気生理学的系、微小電極アレイ、フィールドトランジスタおよび炭素ナノチューブを含むが限定されない細胞活性の電気的記録と組み合わせ得る。
【００４６】
細胞の刺激をもたらすことに加えて、バイオインターフェースが、イメージングもしくは電気的モダリティの何れかまたはそれらの組み合わせを用いて細胞活性を記録するために同時に使用され得る場合、Ｇ−バイオインターフェースは、細胞との双方向通信のために利用し得る。
【００４７】
Ｇ−バイオインターフェースを介した細胞の遠隔刺激は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、次世代配列決定、ＤＮＡマイクロアレイ、核型分析、蛍光インサイチュハイブリッド形成、熱量測定インサイチュハイブリッド形成またはそれらの組み合わせを含むが限定されない、それらの続く遺伝学的分析と組み合わせ得る。
【００４８】
Ｇ−バイオインターフェースを介した細胞刺激は、ａ）ニューロンネットワークにおけるシナプス可塑性の研究；ｂ）パーキンソン病、アルツハイマー病、自閉症および筋萎縮性側索硬化症などの多くの神経障害において現れる感覚および運動機能障害の根底をなす機序の研究；ｃ）心臓研究；ｄ）膵臓障害の研究を含む多くの研究中の細胞の機能活性の監視を可能にし得る。
【００４９】
Ｇ−バイオインターフェースは、細胞の薬理学的プロファイリングのために利用し得る。この場合、Ｇ−バイオインターフェースの電磁放射線により細胞膜電位を調節しながら、遺伝学的構成が未知の細胞においてベンチマーク化合物を試験し、任意の利用可能な検出法を用いて細胞応答を監視する。
【００５０】
Ｇ−バイオインターフェースは、薬物探索スクリーニング応用、すなわち新規化学物質の薬理学的特性評価のために利用し得る。この場合、Ｇ−バイオインターフェースによって調節される様々な活性化状態で特徴がよく分かっている細胞を新規化学物質に曝露し、任意の利用可能な検出法を用いて細胞応答を監視する。重要なこととして、Ｇ−バイオインターフェースは、薬物スクリーニング中に細胞の膜電位を調節することによって、効率的な使用に依存し、活性に依存する薬物の開発を合理化し得、したがって、オンターゲットおよびオフターゲット効果の両方の特性評価ならびに様々な活性化状態の様々な細胞タイプにおける新規化合物の潜在的毒性の検出のために有益であり得る。
【００５１】
Ｇ−バイオインターフェースは、医学的状態を有する動物を処置するために利用し得る。罹患細胞および領域に極めて近接して配置されるＧ−バイオインターフェースの電磁放射線により惹起される細胞膜電位の変化は、疾患進行中の細胞活性の低下または消失の結果を克服するのに役立つ。Ｇ−バイオインターフェースにより処置し得る疾患の例としては、不整脈、心臓インフラクション（ｃａｒｄｉａｃ  ｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ）後の機能障害、神経変性／神経障害、様々な眼科学的障害および内分泌疾患が挙げられるが限定されない。
【実施例】
【００５２】
本明細書中で開示され、特許請求される組成物および／または方法および／または過程は全て、本開示に照らして不要な実験を行うことなくなされ得、実行され得る。本発明の組成物および方法が好ましい実施形態に関して記載されている一方で、当業者にとって当然のことながら、本発明の概念および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載の組成物および／または方法および／または過程およびステップまたは方法のステップの順序に対して変更が適用され得る。より具体的には、当然のことながら、化学的および物理的の両方で関連するある種の作用物質で本明細書中に記載の作用物質を置き換えながら、同じまたは同様の結果を達成し得る。当業者にとって明らかなこのような同様の置換および修飾は全て、本発明の範囲および概念内であるとみなされる。
【００５３】
実施例１：グラフェン関連材料
寸法１０ｃｍ×１１ｃｍの２５μｍ厚の銅箔（Ａｌｐｈａ  Ａｅｓａｒ，１３３８２，９９．８％）上でグラフェンを合成した。グラフェンの成長前に、次の手順により銅箔を清浄化した。浅いアセトン浴に浸漬し、アセトン中で機械による洗浄を行い、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を満たした同様の浴槽に移し、ＩＰＡ中で機械による洗浄を行い、圧縮空気の気流中で乾燥させ、電解研磨し、ＤＩ水およびＩＰＡですすぎ、圧縮空気の気流下で送風乾燥を行った。次のチューブ寸法：ｄ＝７．６ｃｍ、ｌ＝１００ｃｍの石英チューブ炉（ＭＴＩ  ＯＴＦ−１２００Ｘ−ＨＶＣ−ＵＬ）中で大気圧ＣＶＤグラフェン合成を行った。
【００５４】
本発明者らの実験において、本発明者らは、酸化グラフェン（例えばＧｒａｐｈｅｎｅａ  Ｉｎｃ．より）および酸化グラフェン関連材料の何れかの化学還元（例えばヒドラジン水和物、水素化ホウ素ナトリウムまたはＬ−アスコルビン酸を使用）または熱還元により作製された還元型酸化グラフェンを使用した。一部の場合において、化学還元を行った後に熱還元を行った。
【００５５】
化学還元によりｒＧＯを作製するための典型的な実験には、１ｍＬのヒドラジン水和物を１００ｍＬの超音波処理ＧＯ水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に添加し、続いて、得られた混合物を９５℃で１時間温置し、その後ろ過することが含まれた。
【００５６】
化学還元によりｒＧＯを作製するための別の典型的な実験には、１００ｍｇのＬ−アスコルビン酸を１００ｍＬの超音波処理ＧＯ水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に室温で添加し、続いて、４８時間にわたり激しく撹拌し、遠心することが含まれた。
【００５７】
実施例２：Ｇ−バイオインターフェースの製造
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を用いて２時間、ガラスカバースリップ（ＶＷＲ）を清浄化した後、それらをエタノール中で徹底的に洗浄し、ＵＶ光下で２時間乾燥させた。
【００５８】
グラフェンのガラスカバースリップ上への移動を開始するために、ＣＶＤ成長グラフェンのフィルムを帯びた銅箔に対して、最初に４０００ｒｐｍで６０秒間、トルエン中のポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）の２．５％ｗ／ｗ溶液でのスピンコーティングを行った。スピンコーティング後、ＰＭＭＡとは反対の銅箔側の露出グラフェンに酸素プラズマクリーナー（３０ｓ、３０Ｗ、２００ｍｔｏｒｒ酸素圧）を用いて食刻した。次に、銅に食刻するために、ＰＭＭＡ／グラフェンコーティング銅箔を１Ｍ塩化鉄（ＩＩＩ）（ＦｅＣｌ３）浴中に３０分間浮かせた。次いで、浮遊ＰＭＭＡ支持グラフェンをＤＩ水浴に３回移し、次いで、ＤＩ水浴から自立フィルムを「すくう」ことによってカバースリップ上に置いた。室温で２時間乾燥させた後、ＰＭＭＡを除去するためにカバースリップをアセトン浴中に一晩置いた。次に、カバースリップをＩＰＡ中ですすぎ、圧縮空気中で乾燥させた。
【００５９】
典型的な実験において、ＧＯの化学還元により作製されるｒＧＯを液滴堆積によってガラスカバースリップ上に置いた（１０μＬ／１２−ｍｍカバースリップ）。次に、ｒＧＯカバースリップを３０分間風乾し、次いで滅菌のために一晩、ＵＶ細胞培養フード中に置いた。あるいは、本発明者らは、ａ）上記のようにＧＯ液滴をガラスカバースリップ上に堆積させ、次いでｂ）それらをオーブン（Ｔ＝２００℃）のステージ上に５分間置くことによってガラスカバースリップ上で直接ＧＯの熱還元を行うことによって、ｒＧＯコーティングカバースリップを作製した。
【００６０】
ｒＧＯコーティング９６−ウェルマイクロタイタープレートを製造するために、本発明者らは、Ｌ−アスコルビン酸を用いて化学還元によって調製した２０ｍＬの０．１ｍｇ／ｍＬ  ｒＧＯ溶液を標準的な９６ウェルマイクロプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の各ウェルに堆積させた。次に、ｒＧＯコーティングプレートを乾燥させ、ＵＶ細胞培養フード中で一晩滅菌した。
【００６１】
実施例３：細胞培養手順
四因子プログラミングによってｉＰＳＣを作製し、ＮＰＣに分化させた。次いで、２０μｇ／ｍＬポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ）で一晩、続いてインキュベーター内で５μｇ／ｍＬラミニン（Ｓｉｇｍａ）で少なくとも２時間コーティングしたプラスチック皿上にＮＰＣ培養物を置くか、または１００μｇ／ｍＬポリ−Ｌ−オルニチンでさらにコーティングし、続いて１０μｇ／ｍＬラミニンでコーティングしたグラフェンコーティングガラスカバースリップ上に直接置いた。Ｎ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐおよび２０ｎｇ／ｍＬ繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補給したＤＭＥＭ−Ｆ１２＋Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＮＰＣ基礎培地中でＮＰＣを維持した。培地を２または３日ごとに交換した。ＮＳＣがコンフルエンスに到達したところで、ＦＧＦを培地から除去し、週に２回培地を交換しながら５週間維持した。３週間の分化後、細胞表面抗原符号を使用してＦＡＣＳでニューロンを精製した。１：１混合物Ａｃｃｕｔａｓｅ／Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分化したニューロンを剥離し、ＣＤ１８４、ＣＤ４４およびＣＤ２４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ＣＤ１８４およびＣＤ４４に対して染色が陰性であり、ＣＤ２４に対して陽性染色されたニューロンを選択し、０．５ｍＭ  ｄｂＣＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍＬ  ＢＤＮＦおよび２０ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補給したＮＰＣ基礎培地中でポリ−オルニチン／ラミニン処理グラフェンコーティングカバースリップ上に播種した。
【００６２】
製造者の説明書に従い、ｉＣｅｌｌ  ＣＭ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を凍結融解した。２５μＬの細胞懸濁液（１６０，０００個細胞／ｍＬ）をゼラチンコーティング３８４ウェルプレートに添加した。次いで細胞を５％ＣＯ２で３７℃にて４８時間にわたり静置した。４８時間後、７５μＬの既知組成培地（ＣＤＭ）を各ウェルに全部で１００μＬになるように添加し、次いで体積の半分を１日おきに交換した。培養中１０〜１４日間後にＣＭがその自発的収縮を開始したとき、それらをトリプシンで持ち上げ、５００，０００個細胞／１２−ｍｍカバースリップの密度で再播種した。実験前に、カバースリップ上で２〜３週間、ＣＭを培養した。
【００６３】
実施例４：ＣＭおよびＧ−バイオインターフェースの生体適合性
生体適合性評価のために、本発明者らは、グラフェン関連材料でのコーティングありおよびなしのガラスカバースリップ上で培養した細胞の、形態、細胞密度および膜の完全性を比較した。明視野光学顕微鏡画像から、ＣＭがグラフェンおよびｒＧＯでコーティングしたガラスカバースリップ上で培養した場合、正常な形態を示すことが分かる（図２Ａ）。さらなる知見を得るために、本発明者らは、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）実験で追跡した。これらの実験のために、ＣＭを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、４％ホルムアルデヒド溶液で２時間、室温にて固定し、同じ緩衝液で各５分間、３回洗浄した。段階的な一連のアルコール（５０％エタノール  −  １０分、７０％エタノール  −  １０分、８０％エタノール  −  １０分、９５％エタノール  −  ２回交換、１０分、１００％エタノール  −  ３回交換、１５分）で脱水した後、真空チャンバー中で全試料を凍結乾燥させ、スパッタイリジウムでコーティングした。本発明者らは、１０ｋＶエネルギービームを使用しながら、１０ｍｍの撮影距離でＸＬ３０  ＥＳＥＭ−ＦＥＧ（ＦＥＩ）上で走査電子顕微鏡画像を得た。ＳＥＭ画像から、ＣＭがグラフェンおよびｒＧＯコーティングガラス基板の両方と問題なく調和していることが示される（図２Ｂ）。
【００６４】
細胞密度を評価するために、本発明者らは、明視野光学顕微鏡画像を用いて予め定められた領域中の細胞数を計算した（図３Ａ）。本発明者らは、ＣＭがグラフェンおよびｒＧＯでコーティングされた面を好むと判断した。図３Ｂ（左）は、「裸の」ガラスカバースリップ上よりもｒＧＯコーティングガラスカバースリップ上で細胞密度が顕著に高かったことを示す。
【００６５】
細胞生存能を評価するために、本発明者らは、膜透過性カルセイン−ＡＭおよび膜に不透過性のエチジウムホモ二量体−１（ＥｔｈＤ−１）を含有するＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。このキットで染色した場合、無傷細胞膜および高レベルの酵素活性を有する生細胞は、非蛍光カルセイン−ＡＭから緑色カルセインへの酵素性変換およびＥｔｈＤ−１の拒絶のために、緑色に見える。対照的に、ＥｔｈＤ−１は、膜に傷がある死細胞にのみ侵入し、核酸への結合時に赤い蛍光シグナルを生じさせる。標準的フィルター（フルオレセイン（カルセイン用）、ローダミン（ＥｔｈＤ−１用）およびＤＡＰＩ（ヘキスト用））およびＱＩＣｌｉｃｋ  ＣＣＤカメラ（ＱＩｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．）を備えるＯｌｙｍｐｕｓ  ＩΧ７１蛍光顕微鏡を用いて、標識細胞の画像を無作為に撮影した。ＩｍａｇｅＪ画像解析ソフトウェアを使用してデータを分析した。ＥｔｈＤ−１陽性細胞数をＥｔｈＤ−１陽性およびカルセイン陽性細胞数の合計で除したパーセンテージ比として細胞死を計算した。本発明者らは、コーティング基板対「裸の」基板上で培養した細胞において膜の完全性が統計学的に異ならなかったと判断した（図３Ｂ、右）。
【００６６】
Ｇ−バイオインターフェース上でＣＭを培養することがそれらの機能的活性に有益であるか否かを試験するために、本発明者らは、明視野光学顕微鏡を使用し、標識不含アプローチを用いてＣＭの自発的収縮を監視した。ＣＭ収縮中にＣＭで起こる立体構造変化を検出するために、本発明者らは、自発的収縮の結果としてＲＯＩ内部の光度が変化することを確実にするために、関心領域（ＲＯＩ）をＣＭの端部のすぐ外側に選択した。１秒当たりの収縮数を計算することによって頻度を定量した。本発明者らは、ＣＭの収縮頻度が、Ｇ−バイオインターフェース上で細胞を培養した場合に、より高くなったことを見出した。
【００６７】
実施例５：ＣＭにおける、Ｇ−バイオインターフェースおよび光惹起性効果
実施例４に記載の標識不含アプローチを用いて、本発明者らは、２つの実験的配置においてＣＭの自発的収縮に対するＧ−バイオインターフェースの光照射の効果を研究した：ａ）ＣＭをｒＧＯコーティングガラスカバースリップ上で２〜３週間培養した場合の「長期」（または慢性）調和およびｂ）実験前に直接、対照（例えば非コーティング）カバースリップ上で培養したＣＭ上にｒＧＯ薄片を１０分間堆積させた場合の「短期」（または急性）調和。本発明者らは、光照射の結果、慢性（図４Ａ、Ｂ）および急性（図４Ｃ）実験配置の両方でＣＭの収縮頻度が増加することを見出した。
【００６８】
電気生理学的アプローチを用いて、本発明者らは、グラフェン関連材料でコーティングしたガラスカバースリップの表面上で培養した細胞の膜電位の光惹起性変化を監視した。典型的な実験において、（ｍＭで）ＮａＣｌ、１３５；ＫＣｌ、２．５；ＣａＣｌ２、２；ＮａＨＣＯ３、１；Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３４；ＫＨ２ＰＯ４、０．４４；グルコース、２０；ＨＥＰＥＳ、１０；およびグリシン、０．０１（ｐＨ７．４）からなる電気生理学的細胞外溶液を満たした実験チャンバー中にｒＧＯコーティングカバースリップを置いた。３〜６ＭΩの最終チップ抵抗のパッチピペットに、（ｍＭで）ＣｓＣｌ、１２０；塩化テトラエチルアンモニウム、２０；ＨＥＰＥＳ、１０；ＥＧＴＡ、２．２５；ＣａＣｌ２、１；ＭｇＣｌ２、２（ｐＨ７．４）からなる溶液を満たした。Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２インターフェース、Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器およびｐＣｌａｍｐソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて、全記録を得た。本発明者らは、光照射が「裸の」カバースリップ上で培養したＣＭに影響を与えなかったと判断した（図５Ａ）が、ｒＧＯコーティングカバースリップ上のＣＭにおいて膜脱分極を惹起し、これが一連の活動電位の開始（図５Ｂ）または活動電位生成の頻度の増加（図５Ｃ）につながったと判断した。
【００６９】
全光学的アッセイは、（例えばＧ−バイオインターフェースを介した）細胞の光惹起性活性化および（例えば蛍光バイオセンサーを用いた）細胞活性を監視する光学的方法を組み合わせた。典型的な実験において、本発明者らは、ＣＯ２インキュベーター内で、ローディング緩衝液（１３２ｍＭ  ＮａＣｌ；４．２ｍＭ  ＫＣｌ；１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７．４に調整）中、４５分間、５μＭ  Ｆｌｕｏ−４  ＡＭ、カルシウム感受性蛍光指示薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または２μＭ  ＶＦ１．２、電位感受性色素の何れかをＣＭに負荷した。全光学的アッセイを行うために、本発明者らは、５２０ｎｍの高強度の光の短いパルスを使用して、Ｇ−バイオインターフェースを活性化し、４８０ｎｍの低強度の光で連続照射して、蛍光色素を励起した。フルオレセインフィルターセット（励起４８０／２０ｎｍ、放射５２５／３０ｎｍ）を備える正立蛍光顕微鏡（ｕｐｒｉｇｈｔ  ｌｉｇｈｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）上でイメージング実験を行った。ＣＣＤカメラを用いて３０Ｈｚで数秒間、画像を得て、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて分析した。本発明者らの実験において、本発明者らは、ＣＭにおいて光惹起性活動電位の生成の結果として起こる細胞内カルシウム濃度の変化を検出し（図６）、細胞の光調節性の活性化のためにＧ−バイオインターフェースを組み込む全光学的アッセイの実現可能性を確認した。
【００７０】
実施例６：ニューロンおよびＧ−バイオインターフェースの生体適合性
本発明者らは、明視野光学顕微鏡およびＳＥＭの両方を用いて、グラフェン関連材料でコーティングしたガラスカバースリップ上で培養したｉＰＳＣ由来ニューロンの形態を評価した（図７）。本発明者らは、ｒＧＯコーティングガラスカバースリップ上で６週間培養した後、ｉＰＳＣ由来ニューロンがそれらの形態を変化させなかったと判断した。
【００７１】
ｉＰＳＣ由来ニューロンおよびｒＧＯコーティングガラスカバースリップの生体適合性を評価するために、本発明者らは、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて生存能実験を行った。本発明者らは、実施例４に記載のような結果を分析し、細胞生存能がｒＧＯコーティング上で「裸の」ガラスカバースリップよりも高かったと判断した（図８）。
【００７２】
実施例７：ニューロンにおけるＧ−バイオインターフェースおよび光惹起性の効果
本発明者らは、実施例５に記載の実験プロトコールに従い、ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて電気生理学的研究を行った（（図９Ａ）。本発明者らは、ＣＭの場合のように、ニューロンにおいて光照射が膜脱分極を惹起し、これが活動電位の生成につながったと判断した（図９Ｂ）。
【００７３】
ニューロン活性の全光学的照合を行うために、本発明者らは、実施例６に記載のように、それらのｒＧＯコーティング基板に光を照射し、Ｆｌｕｏ−４、蛍光カルシウム感受性指示薬を用いてそれらの光惹起性の活性を監視することによってニューロンを活性化した（図１０Ａ）。本発明者らは、ｒＧＯコーティング基板上で培養したニューロンでのみ、光照射により惹起される電気的活性中の細胞内カルシウムの変化を問題なく記録した（図１０Ｂ）。
【００７４】
実施例８：統計学的分析
データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。必要に応じて、スチューデント−ニューマン−コイルス（ＳＮＫ）事後検定とともに一元ＡＮＯＶＡを用いて結果を解釈した。スチューデントのｔ検定により遺伝子型／処置間のペアワイズ比較を評価した。差は、Ｐ＜０．０５で統計学的に有意とみなした。
【００７５】
上記の発明を実施するための形態において、本発明の一部をなす添付の図面を参照する。図面において、同様の記号は一般に、内容から別段の断りが示されない限り、同様の構成成分を特定する。詳細な説明、図面および特許請求の範囲に記載の例示的な実施形態は、限定するためのものではない。本明細書中で与えられる主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用し得、他の変更形態をなし得る。本開示の態様は、一般的に本明細書中に記載され、図面で例示されるとおり、多岐にわたる様々な配置において、配置され、置換され、組み合わせられ、分離され、設計され得、これらが全て本明細書中で明確に企図されることは容易に理解されよう。
【００７６】
本開示は、本願に記載の特定の実施形態に関して限定されず、これは様々な態様の説明であるものとする。当業者にとって明らかであるように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、多くの変更形態および変形形態がなされ得る。本明細書中で列挙されるものに加えて、本開示の範囲内の機能的に均等な方法および装置が、前出の記載から当業者にとって明らかとなるであろう。このような変更形態および変形形態は、添付の特許請求の範囲内に包含されるものとする。本開示は、かかる特許請求の範囲が与えられる均等物の範囲全体とともに、添付の特許請求の範囲の条項によってのみ限定される。本開示は、特定の方法、試薬、化合物、組成物または生物系に限定されず、当然ではあるが変化し得ることを理解されたい。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載する目的のものであり、限定するものではないことも理解されたい。
【００７７】
本文書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明示的な別段の指示がない限り、複数形の意味を含む。別段の定めがない限り、本明細書中で使用される技術および科学用語は全て、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示のいかなるものも、本開示に記載の実施形態が、先行発明により、かかる開示に先行しないということの承認として解釈されるべきではない。本文書で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「を含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【００７８】
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語において様々な組成物、方法および装置が記載される一方で、様々な構成成分またはステップ（「を含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味するものとして解釈される）、組成物、方法および装置も様々な構成成分およびステップ「から基本的になり（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」得るか、またはこれら「からなり（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」得、このような用語は、基本的に限定された要素群を定義するものとして解釈されるべきである。
【００７９】
本明細書中での実質的にあらゆる複数および／または単数の用語の使用に関して、当業者は、内容および／または適用に適切であるように、複数から単数および／または単数から複数に変換し得る。明確にするために、様々な単数／複数の変更が明白に示され得る。
【００８０】
一般的に、本明細書中および特に添付の特許請求の範囲（例えば添付の特許請求の範囲の本文）で使用される用語は、一般に「非限定的な」用語とするものである（例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「を含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるべきであり、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、「含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ，ｂｕｔ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈されるべきであるなど）ことが当業者により理解されよう。導入される請求項の列挙の具体的な数が意図される場合、かかる意図は、請求項において明確に記載され、かかる記載がない場合、かかる意図は存在しないことが当業者によりさらに理解されよう。例えば、理解の一助として、次の添付の特許請求の範囲は、請求項の記載を導入するために「少なくとも１つの」および「１つ以上の」という前置句の使用を含有し得る。しかし、かかる句の使用は、同じ請求項が前置句「１つ以上の」または「少なくとも１つの」および「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」などの不定冠詞（例えば「１つの（ａ）」および／または「１つの（ａｎ）」は、「少なくとも１つの」または「１つ以上の」を意味するものとして解釈すべきである）を含む場合であっても、不定冠詞「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」による請求項の記載の導入が、かかる記載のうちの１つのみを含有する実施形態に対して、かかる導入される特許請求の範囲の記載を含有する任意の特定の請求項を限定することを示唆するものと解釈されるべきではなく、請求項の記載を導入するために使用される定冠詞の使用についても同じことが言える。さらに、導入される請求項の記載の具体的な数が明らかに述べられる場合でも、当業者は、このような記載は、少なくとも記載される数を意味するものと解釈されるべきである（例えば、他の修飾語句がない「２つの記載」の単なる記載は、少なくとも２つの記載または２つ以上の記載を意味する）ことを認識しよう。さらに、Ａ、ＢおよびＣなどのうちの少なくとも１つ」と類似の表記が使用される例において、一般に、かかる構文は、当業者がこの表記を理解するであろうという意味で意図されるものである（例えば、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒におよび／またはＡ、ＢおよびＣを一緒になどを有する系を含むが限定されない）。「Ａ、ＢまたはＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似の表記が使用される例において、一般に、かかる構文は、当業者がその表記を理解するであろうという意味で意図される（例えば、「Ａ、ＢまたはＣの少なくとも１つを有する系」は、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒におよび／またはＡ、ＢおよびＣを一緒になどを有する系を含むが限定されない）。実質的に、あらゆる２つ以上の代替用語を与える離接語および／または句は、本明細書、特許請求の範囲または図面の何れであれ、それらの用語のうちの１つ���用語の何れかまたは両用語を含む可能性を企図することを理解すべきであることは、当業者によりさらに理解されよう。例えば、「ＡまたはＢ」という句は、「Ａ」または「Ｂ」または「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解されよう。
【００８１】
さらに、本開示の特性または態様がマーカッシュグループで記載される場合、当業者は、本開示がまた、それにより、マーカッシュグループのあらゆる個々の要素または要素のサブグループに関しても記載されることを認識しよう。
【００８２】
当業者により理解されるであろうように、本明細書を提供することに関してなど、あらゆる目的のために、本明細書中で開示される範囲は全て、あらゆる可能なサブ範囲およびそのサブ範囲の組み合わせも包含する。列挙される範囲は何れも、同じ範囲が、二等分、三等分、四等分、五等分、十等分など、少なくとも等しく分けられることを十分に説明し、それが可能であるものとして容易に認識され得る。非限定例として、本明細書中で論じられる各範囲は、下位の三分の一、中位の三分の一および上位の三分の一などに容易に分けられ得る。当業者によりまた理解されるであろうように、「最大で」、「少なくとも」などの言語は全て、列挙される数を含み、上記で論じるようにサブ範囲に続いて分けられる範囲を指す。最後に、当業者により理解されるであろうように、範囲は、各個々の要素を含む。したがって、例えば１〜３個の細胞を有する群は、１、２または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４または５個の細胞を有する群などを指す。
【００８３】
様々な上記で開示されるおよび他の特性および機能またはその代替形態は、多くの他の異なる系または適用に組み合わせ得る。様々な現在予見できないかまたは予期されない、これにおける代替形態、変更形態、変形形態または改善形態が続いて当業者によりなされ得、これらもそれぞれ開示される実施形態により包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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