(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【表１】
0006667435.tif 000017
【請求項２】
以下の群から選択されるペプチドの２つの同一の単量体ペプチドからなる二量体ペプチドであって、
前記単量体ペプチド同士が、前記単量体ペプチド間で形成されるシステイン橋を介して互いに連結されている、二量体ペプチド。
【表２】
0006667435.tif 000018
【請求項３】
神経系疾患の治療において、免疫学の分野において、腫瘍学の分野において、幹細胞の動員、増殖、若しくは遊走の欠如の治療、Ｔ細胞活性化、又は免疫芽細胞の補助のために、抗線維症の治療のために、瘢痕の治療又は予防、心臓障害の治療のために、又は代謝障害の治療のために使用するための、請求項１に記載のペプチド又は請求項２に記載の二量体ペプチドを含む医薬。
【請求項４】
前記神経系疾患が、脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、及び多発性硬化症から選択される、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
前記神経系疾患が脳卒中である、請求項３に記載の医薬。
【請求項６】
前記免疫学の分野における使用が、ＷＨＩｍ症候群又は関節リウマチの治療のための使用である、請求項３に記載の医薬。
【請求項７】
前記腫瘍学の分野における使用が、癌の治療のための使用である、請求項３に記載の医薬。
【請求項８】
前記癌が、ＣＸＣＲ４を示す癌である、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
前記ＣＸＣＲ４を示す癌が、肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、及び乳癌の治療から選択される、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
前記免疫芽細胞がＣＴＬ／ＰＤ−１である、請求項３に記載の医薬。
【請求項１１】
前記心臓障害が心不全である、請求項３に記載の医薬。
【請求項１２】
前記代謝障害が糖尿病である、請求項３に記載の医薬。
【請求項１３】
造血障害の治療のために、創傷の治療において、ウイルス性疾患の治療のために、細菌又は真菌による感染症の治療のために、感染プロセス、異常な感染プロセスの治療のために、成長障害の治療、神経疾患の治療、血液凝固カスケード若しくは造血の障害の治療、血管性疾患の治療、免疫系の疾患の治療、又は創傷若しくは骨の治癒の改善のために使用するための、請求項１に記載のペプチド又は請求項２に記載の二量体ペプチドを含む医薬。
【請求項１４】
前記造血の障害の治療が、幹細胞の動員、増殖、及び遊走の補助、Ｔ細胞活性化、並びに免疫芽細胞の補助から選択される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
前記創傷が熱傷によって生じた創傷である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１６】
前記ウイルス性疾患が、ＨＩＶ−Ｉ感染症、ＨＩＶ−２感染症、サイトメガロウイルス感染症、１型単純ヘルペスウイルス感染症及び２型単純ヘルペスウイルス感染症、水痘帯状疱疹ウイルス感染症、Ａ型肝炎ウイルス感染症及びＢ型肝炎ウイルス感染症、インフルエンザウイルス感染症、ポリオウイルス感染症、ライノウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、麻疹ウイルス感染症、狂犬病ウイルス感染症、ラウス肉腫ウイルス感染症、及びエプスタイン・バーウイルス感染症から選択される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１７】
前記細菌又は真菌による感染症が、シュードモナス感染症、カンジダ感染症、及び黄色ブドウ球菌感染症から選択される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１８】
請求項１に記載のペプチド又は請求項２に記載の二量体ペプチドを含む、ＣＸＣＲ４に対するアンタゴナイズ剤。
【請求項１９】
固相合成による、請求項１に記載のペプチド又は請求項２に記載の二量体ペプチドの少なくとも１つを製造する方法。
【請求項２０】
単量体ペプチドを準備し、ＳＨ結合を酸化して−Ｓ−Ｓ−結合を生じさせることができる酸化反応条件下でカップリングさせる、請求項２に記載の二量体ペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然ＣＸＣＲ４に対するアンタゴニスト活性を有するペプチド、本発明のペプチドの治療的使用、および本発明のペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＸＣケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）は、ストロマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１またはＣＸＣＬ１２）を唯一の発表されているリガンドとするＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＣＸＣＲ４は、幹細胞のホーミング（Mohle and Drost, 2012）および免疫細胞の遊走（Campbell et al., 2003）を含む、複数の発生学的プロセスおよび生理学的プロセスに関わる。ＣＸＣＲ４−ＣＸＣＬ１２系はまた、自然免疫および適応免疫、ならびに癌細胞転移、白血病細胞遊走、関節リウマチ、および肺線維症などの種々の疾患プロセスにも関与する（Nagasawa et al., 1996; Zou et al., 1998; Tachibana et al. 1998; Furze et al., 2008）。人工のＣＸＣＲ４アンタゴニストは、臓器移植または化学療法後の免疫再構築に利用される、造血幹細胞（ＨＳＣ）を動員することができる（Ratajczak and Kim, 2012; Schroeder and DiPersio, 2012)。さらに、ＣＸＣＲ４は、ＨＩＶ−１が標的細胞に侵入するための主要な共受容体でもある（Feng et al., 1996; Bleul et al., 1996）。ＣＸＣＲ４の共受容体利用は非常に効果的であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞の大部分が、リンパ組織においてインビボでこのＧＰＣＲを発現する。それにも関わらず、ほぼＣ−Ｃケモカイン受容体５（ＣＣＲ５）を利用するＨＩＶ−１バリアントのみが、慢性ＨＩＶ−１感染に伴って伝染され、見出される（Alkhatib et al., 1996; Deng et al., 1996; Dragic et al., 1996)。ＣＸＣＲ４指向性（Ｘ４）ＨＩＶ−１株の非効率的な伝染には、複数の因子が寄与することが提唱されている（Margolis and Shattock, 2006）。しかし、免疫能の正常な個体におけるＸ４  ＨＩＶ−１の効果的制御の基礎となるメカニズムは、ほとんど理解されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストに関する研究は近年、多種多様な適応により、大規模な研究分野となっている。特に、癌細胞の増殖、分化、および転移に介入する戦略を発見しようとする努力は、臨床研究において、まだ予想されるほど成功していない。化合物群の１つ、すなわち、以下のＡＭＤ３１００というＣＸＣＲ４アンタゴニスト（ｂｉｃｙｃｌａｍｅ化合物：Hendrix and Flexner 2000）の開発は、毒性副作用のため、長期間の処置について中止されなければならなかった。ＡＭＤは幹細胞動員における短期間の単回投与について認可されているが、それでもなお、標的ＣＸＣＲ４に対する適切なアンタゴニストを見つけることは課題である。
【０００４】
【化１】
0006667435.tif 000002
【０００５】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、以下のアミノ酸一般配列を有し、５０μＭ未満のＩＣ５０値でＸ４指向性ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３感染の阻止に有効なペプチドであって、配列番号１６〜２８のアミノ酸配列からなるペプチドを除くペプチドによって達成される。
【０００７】
【化２】
0006667435.tif 000003
【０００８】
式中、
Ｘ＝Ｉ、Ｐ、Ｌ、または＜Ｅであり、Ｚ１＝０の場合、Ｘ＝Ｉ、ｄＬ、ｄＩ、Ｖ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｖａｌ、Ｃａｐ、β−Ｌ、β−Ｉ、Ｓｕｌ−Ｌ、Ｓｕｌ−Ｉ、Ｓｕｌ−Ｖであり、
Ｘ０＝Ｖであるか、あるいは、Ｘ＝Ｉの場合、Ｘ０は、Ｖもしくはｄ−Ｖ、ｄ−Ｌ、ｄ−Ｉ、ｄ−Ｍ、ｄ−Ｐ、β−Ｖ、β−Ｌ、β−Ｉ、β−Ｍ、β−Ｐ、またはＳｕｌ−Ｖであり；
Ｘ１＝Ｒ、Ｈ、またはＫであり；
Ｘ２＝Ｙ、Ｆ、Ｓ、またはＷであり；
Ｘ３＝Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＳであり；
Ｘ４およびＸ５＝ＫまたはＣであり、但し、Ｘ４＝Ｃの場合、Ｘ５≠Ｃであり、Ｘ５＝Ｃの場合、Ｘ４≠Ｃであり；
Ｘ６＝Ｐ、Ｃ、または欠失であり、且つＸ４およびＸ５の両方がＫであり；
Ｘ７＝Ｑ、Ｃ、または欠失であり；
Ｘ８＝Ｃ、Ｖ、または欠失であり；
Ｘ９＝Ｓ、Ｃ、または欠失であり、
Ｚ１＝０、Ｌ、Ｚ２、または＜Ｅであり、
Ｚ２＝０であるか、または前記ペプチド鎖のＮ末端窒素原子の修飾物であって、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基と共に、構造−ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ２および／またはＲ３は、各々独立に、Ｈ、または置換もしくは無置換のアシルアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、およびヘテロシクロアルキル基である）を有する部分を形成する修飾物であり；
Ｚ３＝０、ＴＰＴＥ−Ｚ４、ＴＰＴ−Ｚ４、ＴＰ−Ｚ４、Ｔ−Ｚ４、またはＺ４であり、
Ｚ４＝０であるか、または前記ペプチド鎖のＣ末端カルボキシル基の修飾物であって、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸のカルボキシル基と共に、構造−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ１または−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ１は、置換または無置換のアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、およびヘテロシクロアルキル基である）を有する部分を形成する修飾物であり；
他の略語は、Ｃａｐ＝カプロン酸（Ｃ６カルボン酸）、＜Ｅ＝ピログルタミン酸塩、Ｖａｌ＝吉草酸（Ｃ５カルボン酸）、およびＳｕｌ＝スルホンアミノ酸を意味する。
【０００９】
当業者には、「含む」または「有する」という用語は、新規事項を追加することなく、「からなる」に置換可能であることが理解される。
【００１０】
本発明は、本発明のペプチドがＴ細胞の遊走および幹細胞の動員に影響を与え、病原性細菌を阻害することを示す。したがって、本発明のペプチドは、Ｘ４  ＨＩＶ−１株の伝染を防ぎ得る天然ＣＸＣＲ４アンタゴニストであり、インビボでのＣＸＣＲ４活性および抗微生物免疫の制御に関与する。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、以下のアミノ酸一般配列を含むが、配列番号１６〜２８のアミノ酸配列からなるペプチドは除く。
【００１２】
【化３】
0006667435.tif 000004
【００１３】
式中、
Ｘ＝Ｉであるか、またはＺ１＝０の場合、Ｘ＝Ｉ、ｄＬ、ｄＩ、Ｖ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｖａｌ、Ｃａｐ、β−Ｌ、β−Ｉ、Ｓｕｌ−Ｌ、Ｓｕｌ−Ｉ、Ｓｕｌ−Ｖであり、
Ｘ０＝Ｖもしくはｄ−Ｖ、ｄ−Ｌ、ｄ−Ｉ、ｄ−Ｍ、ｄ−Ｐ、β−Ｖ、β−Ｌ、β−Ｉ、β−Ｍ、β−Ｐ、またはＳｕｌ−Ｖであり、
Ｘ２＝ＹまたはＷであり；
Ｘ３＝Ｔ、Ｃ、またはＳであり；
Ｘ４およびＸ５＝ＫまたはＣであり、但し、Ｘ４＝Ｃの場合、Ｘ５≠Ｃであり、Ｘ５＝Ｃの場合、Ｘ４≠Ｃであり；
Ｘ６＝Ｐ、Ｃ、または欠失であり、且つＸ４およびＸ５の両方がＫであり；
Ｘ７＝Ｑ、Ｃ、または欠失であり；
Ｘ８＝Ｃ、Ｖ、または欠失であり；
Ｘ９＝Ｓ、Ｃ、または欠失であり、
Ｚ１＝０、Ｌ、Ｚ２、または＜Ｅであり、
Ｚ２＝０であるか、または前記ペプチド鎖のＮ末端窒素原子の修飾物であって、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基と共に、構造−ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ２および／またはＲ３は、各々独立に、Ｈ、または置換もしくは無置換のアシルアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、およびヘテロシクロアルキル基である）を有する部分を形成する修飾物であり；
Ｚ３＝０またはＺ４であり、
Ｚ４＝０であるか、またはＡｃａ以外の前記ペプチド鎖のＣ末端カルボキシル基の修飾物であって、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸のカルボキシル基と共に、構造−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ１または−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ１は、置換または無置換のアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、およびヘテロシクロアルキル基である）を有する部分を形成する修飾物であり；
他の略語は、Ｃａｐ＝カプロン酸（Ｃ６カルボン酸）、Ａｃａ＝アミノカプロン酸、＜Ｅ＝ピログルタミン酸塩、Ｖａｌ＝吉草酸（Ｃ５カルボン酸）、およびＳｕｌ＝スルホンアミノ酸を意味する。
【００１４】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは以下のアミノ酸配列を含む。
【００１５】
【化４】
0006667435.tif 000005
【００１６】
式中、
Ｘ１＝Ｒ、Ｈ、またはＫであり；
Ｘ２＝Ｙ、Ｆ、Ｓ、またはＷであり；
Ｘ３＝Ｔ、Ｃ、またはＳであり；
Ｘ４＝ＫまたはＣであり；
Ｘ５＝ＫまたはＣであり；
Ｘ６＝Ｐであるか、またはＸ１＝Ｒ、且つＸ２＝Ｗ、且つＸ３＝Ｓ、且つＸ４＝Ｋ、且つＸ５＝Ｋの場合、Ｘ６＝Ｃであり；
Ｘ７＝ＱまたはＣであり；
Ｘ８＝ＶまたはＣであり；
Ｘ９＝Ｓ、Ｃであるか、またはＸ１＝Ｒ、且つＸ２＝Ｙ、且つＸ３＝Ｓ、且つＸ４＝Ｋ、且つＸ５＝Ｋの場合、Ｘ９は欠失である。
【００１７】
さらに別の実施形態では、本発明のペプチドは以下のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
【化５】
0006667435.tif 000006
【００１９】
式中、
Ｘ２＝ＹまたはＷであり；
Ｘ３＝Ｔ、Ｃ、またはＳであり；
Ｘ４＝ＫまたはＣであり；
Ｘ５＝ＫまたはＣであり；
Ｘ６＝Ｐであるか、またはＸ１＝Ｒ、且つＸ２＝Ｗ、且つＸ３＝Ｓ、且つＸ４＝Ｋ、且つＸ５＝Ｋの場合、Ｘ６＝Ｃであり；
Ｘ７＝ＱまたはＣであり；
Ｘ８＝ＶまたはＣであり；
Ｘ９＝Ｓ、Ｃであるか、またはＸ１＝Ｒ、且つＸ２＝Ｙ、且つＸ３＝Ｓ、且つＸ４＝Ｋ、且つＸ５＝Ｋの場合、Ｘ９は欠失である。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つを有するペプチドからなる群から選択される。
【００２１】
【表１】
0006667435.tif 000007
【００２２】
Ｘ２＝ＴｙｒのＴｒｐによる置換、またはこれらのペプチドの二量体化により、当業者が予想できないほどＩＣ５０が低くなることを主張し得る。
【００２３】
本発明のさらに別の実施形態は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つを有する本発明のペプチドを含む。
【００２４】
【表２】
0006667435.tif 000008
【００２５】
特に有用な本発明のペプチドは、アミノ酸システインを含む本発明に係るペプチドの２つの同一の単量体ペプチドからなる二量体ペプチドであり、この二量体ペプチドは、単量体ペプチド間で形成されるシステイン橋を介して互いに連結されている。特に、本発明の二量体ペプチドは、アミノ酸システインを含む単量体ペプチドが、以下のアミノ酸配列を有するペプチドの群から選択される。
【００２６】
【表３】
0006667435.tif 000009
【００２７】
本発明の主題はまた、神経系疾患の治療において、特に脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症の治療において；免疫学の分野において、特にＷＨＩｍ症候群および関節リウマチの治療のため；特に癌の治療、特に肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、または乳癌などのＣＸＣＲを示す癌の治療のために、腫瘍学の分野において；幹細胞の動員、増殖、および遊走の欠如の治療、Ｔ細胞活性化、ならびにＣＴＬ／ＰＤ−１などの免疫芽細胞の補助のために；熱傷によって生じた創傷の治療において；抗線維症の治療のために；瘢痕の治療または予防；心臓障害の治療のために、特に心不全の治療のために；代謝障害の治療のために、特に糖尿病の治療のために、使用するための本発明のペプチドであって、
このペプチドは、５０μＭ未満のＩＣ５０値でＸ４指向性ＨＩＣ−１  ＮＬ４−３感染の阻止に有効であり、以下の式を有する。
【００２８】
【化６】
0006667435.tif 000010
【００２９】
式中、
Ｘ＝Ｉ、Ｐ、Ｌ、または＜Ｅであり、Ｚ１＝０の場合、Ｘ＝Ｉ、ｄＬ、ｄＩ、Ｖ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｖａｌ、Ｃａｐ、β−Ｌ、β−Ｉ、Ｓｕｌ−Ｌ、Ｓｕｌ−Ｉ、Ｓｕｌ−Ｖであり、
Ｘ０＝Ｖであるか、あるいはＸ＝Ｉの場合、Ｘ０は、Ｖもしくはｄ−Ｖ、ｄ−Ｌ、ｄ−Ｉ、ｄ−Ｍ、ｄ−Ｐ、β−Ｖ、β−Ｌ、β−Ｉ、β−Ｍ、β−Ｐ、またはＳｕｌ−Ｖであり、
Ｘ１＝Ｒ、Ｈ、またはＫ、特にＸ１＝Ｒであり；
Ｘ２＝Ｙ、Ｆ、Ｓ、またはＷであり；
Ｘ３＝Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＳであり；
Ｘ４およびＸ５＝ＫまたはＣであり、但し、Ｘ４＝Ｃの場合、Ｘ５≠Ｃであり、Ｘ５＝Ｃの場合、Ｘ４≠Ｃであり；
Ｘ６＝Ｐ、Ｃ、または欠失であり、且つＸ４およびＸ５の両方がＫであり；
Ｘ７＝Ｑ、Ｃ、または欠失であり；
Ｘ８＝Ｃ、Ｖ、または欠失であり；
Ｘ９＝Ｓ、Ｃ、または欠失であり、
Ｚ１＝０、Ｌ、Ｚ２、または＜Ｅであり、
Ｚ２＝０であるか、または前記ペプチド鎖のＮ末端窒素原子の修飾物であって、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基と共に、構造−ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ２および／またはＲ３は、各々独立に、Ｈ、または置換もしくは無置換のアシルアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、およびヘテロシクロアルキル基である）を有する部分を形成する修飾物であり；
Ｚ３＝０、ＴＰＴＥ−Ｚ４、ＴＰＴ−Ｚ４、ＴＰ−Ｚ４、Ｔ−Ｚ４、またはＺ４であり、
Ｚ４＝０であるか、または前記ペプチド鎖のＣ末端カルボキシル基の修飾物であって、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸のカルボキシル基と共に、構造−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ１または−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ１は、置換または無置換のアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、およびヘテロシクロアルキル基である）を有する部分を形成する修飾物であり；
他の略語は、Ｃａｐ＝カプロン酸（Ｃ６カルボン酸）、＜Ｅ＝ピログルタミン酸塩、Ｖａｌ＝吉草酸（Ｃ５カルボン酸）、およびＳｕｌ＝スルホンアミノ酸を意味する。
【００３０】
神経系疾患の治療において、特に脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症の治療において；免疫学の分野において、特にＷＨＩＭ症候群および関節リウマチの治療のため；腫瘍学の分野において、特に癌の治療、特に肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、または乳癌などのＣＸＣＲを示す癌の治療のために；造血障害の治療のために、特に幹細胞の動員、増殖、および遊走の補助、Ｔ細胞活性化、ならびにＣＴＬ／ＰＤ−１などの免疫芽細胞の補助のために；創傷の治療において、特に熱傷によって生じた創傷の治療において；抗線維症の治療のために；瘢痕の治療または予防；心臓障害の治療のために、特に心不全の治療のために；代謝障害の治療のために、特に糖尿病の治療のために；ウイルス性疾患の治療のために、特にＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−２、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス（１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、エプスタイン・バーウイルスの感染症の治療のために；細菌および真菌による感染症の治療のために、特にシュードモナス、カンジダ、黄色ブドウ球菌による感染症の治療のために；感染プロセス、異常な感染プロセスの治療のために；成長障害の治療、神経疾患の治療、血液凝固カスケードおよび造血の障害の治療、血管性疾患の治療、免疫系の疾患の治療、ならびに創傷および骨の治癒の改善のために使用するための本発明のペプチドもまた、本発明の主題である。
【００３１】
本発明のさらなる主題は、固相合成による、本発明のペプチドの少なくとも１つを製造する方法である。
【００３２】
さらに、単量体ペプチドを準備し、ＳＨ結合を酸化して−Ｓ−Ｓ−結合を生じさせることができる酸化反応条件下でカップリングさせる、本発明のペプチドの少なくとも１つを製造する方法もまた、本発明の主題である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明のペプチドの典型的な代表として配列番号１６のペプチドを用いて、本発明をさらにより具体的に説明する。本発明の開示に加えて、参照により援用する国際公開第２００９／００４０５４（Ａ２）号が参照される。
【００３４】
本発明のペプチドは、５０μＭ未満のＩＣ５０値でＸ４指向性ＨＩＣ−１  ＮＬ４−３感染を阻止するのに有効である。これらのペプチドは、活性ＣＸＣＲ４によって仲介される生理学的反応を抑制または阻害するのに十分な阻害効果を有すると考えられる。本発明のペプチドは、以下のアミノ酸一般配列を含むが、配列番号１６〜２８のアミノ酸配列からなるペプチドは除く。
【００３５】
【化７】
0006667435.tif 000011
【００３６】
配列番号１６〜２８の配列のペプチドは、国際公開第２００９／００４０５４（Ａ２）号に開示され、本発明のペプチドのアミノ酸一般配列と重複するため、除外される。しかし、本発明のペプチドおよび配列番号１６〜２８のペプチドは、神経系疾患の治療において、特に脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症の治療において；免疫学の分野において、特にＷＨＩＭ症候群および関節リウマチの治療のため；腫瘍学の分野において、特に癌の治療、特に肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、または乳癌などのＣＸＣＲ４を示す癌の治療のために；幹細胞の動員、増殖、および遊走の欠如の治療、Ｔ細胞活性化、ならびにＣＴＬ／ＰＤ−１などの免疫芽細胞の補助のために；熱傷によって生じた創傷の治療において；抗線維症の治療のために；瘢痕の治療または予防；心臓障害の治療のために、特に心不全の治療のために；代謝障害の治療のために、特に糖尿病の治療のために、使用するための医薬として用いることができる。
【００３７】
本発明のペプチドの式中、以下の定義が適用される。
Ｘ＝Ｉ、Ｐ、またはＬである。さらに、タンパク質分解攻撃からペプチドのＮ末端を保護するために、ピログルタミン酸塩を表す＜ＥでＩ、Ｐ、またはＬを置換してもよい。あるいは、Ｚ１が存在しない場合、Ｎ末端アミノ酸は、ｄＬ、ｄＩ、β−Ｌ、β−Ｉ、Ｓｕｌ−Ｌ、Ｓｕｌ−Ｉ、Ｓｕｌ−Ｖなどのスルホンアミノ酸（Ｓｕｌ）、Ｖ、Ｗ、Ｓ、およびＴからなる群から；またはカプロン酸（Ｃ６カルボン酸）、吉草酸（Ｃ５カルボン酸）からなる群から選択されてもよい。
【００３８】
アミノ酸配列のその他の位置は、以下の通りである。
Ｘ０＝Ｖであるか、あるいはＸ＝Ｉの場合、Ｘ０は、Ｖもしくはｄ−Ｖ、ｄ−Ｌ、ｄ−Ｉ、ｄ−Ｍ、ｄ−Ｐ、β−Ｖ、β−Ｌ、β−Ｉ、β−Ｍ、β−Ｐ、またはＳｕｌ−Ｖであり、
Ｘ１＝Ｒ、Ｈ、またはＫ、特にＸ１＝Ｒであり；
Ｘ２＝Ｙ、Ｆ、Ｓ、またはＷであり；
Ｘ３＝Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＳであり；
Ｘ４およびＸ５＝ＫまたはＣであり、但し、Ｘ４＝Ｃの場合、Ｘ５≠Ｃであり、Ｘ５＝Ｃの場合、Ｘ４≠Ｃであり；
Ｘ６＝Ｐ、Ｃ、または欠失であり、且つＸ４およびＸ５の両方がＫであり；
Ｘ７＝Ｑ、Ｃ、または欠失であり；
Ｘ８＝Ｃ、Ｖ、または欠失であり；
Ｘ９＝Ｓ、Ｃ、または欠失である。
【００３９】
Ｎ末端基Ｚ１は、存在する場合、Ｌ、Ｚ２、または＜Ｅであり、Ｚ２＝０であるか、または前記ペプチド鎖のＮ末端窒素原子の修飾物であって、前記ペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基と共に、構造−ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ２および／またはＲ３は、各々独立に、Ｈ、または置換もしくは無置換のアシルアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、およびヘテロシクロアルキル基である）を有する部分を形成する修飾物であり；
Ｃ末端基Ｚ３＝０、ＴＰＴＥ−Ｚ４、ＴＰＴ−Ｚ４、ＴＰ−Ｚ４、Ｔ−Ｚ４、またはＺ４であり、Ｚ４＝０であるか、または前記ペプチド鎖のＣ末端カルボキシル基の修飾物であって、前記ペプチドのＣ末端アミノ酸のカルボキシル基と共に、構造−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ１または−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ２Ｒ３（式中、Ｒ１は、置換または無置換のアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル基、およびヘテロシクロアルキル基である）を有する部分を形成する修飾物である。
他の略語は、Ｃａｐ＝カプロン酸（Ｃ６カルボン酸）、＜Ｅ＝ピログルタミン酸塩、Ｖａｌ＝吉草酸（Ｃ５カルボン酸）、およびＳｕｌ＝スルホンアミノ酸を意味する。
【００４０】
本発明のペプチドのレトロインベルソ型ペプチド、およびペプチダーゼに対してペプチド結合を安定化するその他の誘導体もまた、本発明の範囲内である。
【００４１】
誘導体という用語は、Ｎ末端短縮およびＣ末端短縮、Ｄ−アミノ酸残基および修飾アミノ酸残基を含むアミノ酸残基置換を含む本発明のペプチド、ならびにジスルフィド結合、Ｎ末端延長およびＣ末端延長を含むペプチドを含む、あらゆる長さの断片を意味する。
【００４２】
本発明は、本発明のペプチドがＴ細胞の遊走および幹細胞の動員に影響を与え、病原性細菌を阻害することを実証する。したがって、本発明のペプチドは、Ｘ４  ＨＩＶ−１株の伝染を防ぎ得る天然ＣＸＣＲ４アンタゴニストであり、インビボでのＣＸＣＲ４活性および抗微生物免疫の制御に関与する。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む。
【００４４】
【化８】
0006667435.tif 000012
【００４５】
式中、
Ｘ１＝Ｒ、Ｈ、またはＫ、特にＸ１＝Ｒであり；
Ｘ２＝Ｙ、Ｆ、Ｓ、またはＷであり；
Ｘ３＝Ｔ、Ｃ、またはＳであり；
Ｘ４＝ＫまたはＣであり；
Ｘ５＝ＫまたはＣであり；
Ｘ６＝Ｐであるか、またはＸ１＝Ｒ、且つＸ２＝Ｗ、且つＸ３＝Ｓ、且つＸ４＝Ｋ、且つＸ５＝Ｋである場合、Ｘ６＝Ｃであり；
Ｘ７＝ＱまたはＣであり；
Ｘ８＝ＶまたはＣであり；
Ｘ９＝Ｓ、Ｃであるか、またはＸ１＝Ｒ、且つＸ２＝Ｙ、且つＸ３＝Ｓ、且つＸ４＝Ｋ、且つＸ５＝Ｋである場合、Ｘ９は欠失である。
【００４６】
本発明のさらに別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つを有するペプチドからなる群から選択される。
【００４７】
【表４】
0006667435.tif 000013
【００４８】
本発明のさらに別の実施形態は、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つを有する本発明のペプチドを含む。
【００４９】
【表５】
0006667435.tif 000014
【００５０】
これらのアミノ酸は、自身のシステインを介して連結される二量体の作製に用いられる。これらのペプチドを組み合わせてホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれも合成することができる。
【００５１】
特に有用な本発明のペプチドは、アミノ酸システインを含む本発明のペプチドの２つの同一の単量体ペプチドからなる二量体ペプチドであって、この二量体ペプチドは、単量体ペプチド間で形成されるシステイン橋を介して互いに連結されている。特に、本発明の二量体ペプチドは、アミノ酸システインを含む単量体ペプチドが、以下のアミノ酸配列を有するペプチドの群から選択される。
【００５２】
【表６】
0006667435.tif 000015
【００５３】
さらに、神経系疾患の治療において、特に脳卒中、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症の治療において；免疫学の分野において、特にＷＨＩＭ症候群および関節リウマチの治療のため；腫瘍学の分野において、特に癌の治療、特に肝臓癌、膵臓癌、前立腺癌、または乳癌などのＣＸＣＲを示す癌の治療のために；造血障害の治療のために、特に幹細胞の動員、増殖、および遊走の補助、Ｔ細胞活性化、ならびにＣＴＬ／ＰＤ−１などの免疫芽細胞の補助のために；創傷の治療において、特に熱傷によって生じた創傷の治療において；抗線維症の治療のために；瘢痕の治療または予防；心臓障害の治療のために、特に心不全の治療のために；代謝障害の治療のために、特に糖尿病の治療のために；ウイルス性疾患の治療のために、特にＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−２、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス（１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス、Ａ型肝炎ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、エプスタイン・バーウイルスの感染症の治療のために；細菌および真菌による感染症の治療のために、特にシュードモナス、カンジダ、黄色ブドウ球菌による感染症の治療のために；感染プロセス、異常な感染プロセスの治療のために；成長障害の治療、神経疾患の治療、血液凝固カスケードおよび造血の障害の治療、血管性疾患の治療、免疫系の疾患の治療、ならびに創傷および骨の治癒の改善のために使用するための本発明のペプチドもまた、本発明の主題である。
【００５４】
本発明のペプチドは、薬学的に許容される好適なキャリアと共に医薬として製剤化してもよい。
【００５５】
本発明に係るペプチドは、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、局所（ｌｏｃａｌ−ｔｏｐｉｃ）、皮下、または頬側経路で、ペプチドにとって通常の方法で投与することができる。投与されるペプチドの量は、１日、単位用量あたり、１μｇ〜１ｇである。
【００５６】
本発明のさらなる主題は、固相合成により本発明のペプチドの少なくとも１つを製造する方法である。本発明のペプチドの化学合成は、例えば、既知のＦｍｏｃ化学を利用したペプチド合成装置９０５０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、従来の固相合成によって行うことができる。
【００５７】
さらに、単量体ペプチドを準備し、ＳＨ結合を酸化して−Ｓ−Ｓ−結合を生じさせることができる酸化反応条件下でカップリングさせる、本発明のペプチドの少なくとも１つを製造する方法もまた、本発明の主題である。
【００５８】
Ｘ４  ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３分子クローンを用いて抗ウイルススクリーニングを行った。抗ウイルス活性がウイルス共受容体指向性に依存するかどうかを決定するため、および観察された効果が混入した薬剤によるものである可能性を排除するために、本発明者らは次に、種々のＨＩＶ−１株に対する、化学合成した配列番号１６のペプチドの効果を調べた。合成ペプチドは概して、平均で１５．８μｇ／ｍｌ（８．６μＭに相当）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）でＸ４  ＨＩＶ−１株による感染を阻害した。ＰＢＭＣ中での野生型（ｗｔ）ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３の複製は、≧４μｇ／ｍｌの濃度で顕著に抑制された。特に、約１０μｇ／ｍｌを達成するためには、極めて豊富なＨＳＡ前駆体のたった約１％が配列番号１６のペプチドであるペプチドに変換されればよい。配列番号１６のペプチドであるペプチドは、非常に高濃度でも細胞毒性効果を示さなかった。さらなる実験により、このペプチドがＸ４  ＨＩＶ−２株およびＳＩＶ株による感染も阻害することが確認されたが、これらのウイルスは複数の共受容体を利用するので、効果は比較的小さかった。本発明者らは、ウイルス粒子ではなくウイルス標的細胞の前処理により、ＨＩＶ感染が効果的に低減することを見出した。このことは、配列番号１６のペプチドが標的細胞を有することを示唆している。さらに、細胞をウイルス粒子に曝した後に配列番号１６のペプチドを加えた場合、阻害能力は徐々に低下し、ＨＳＡ前駆体は抗レトロウイルス効果を示さなかった。したがって、データは、ヒト血漿中の最も豊富なタンパク質の断片が、ウイルスの生活環の初期段階を標的とするＸ４  ＨＩＶ−１株の天然の特異的阻害剤であることを示している。
【００５９】
配列番号１６のペプチドは、ＣＸＣＲ４へのＣＸＣＬ１２の結合と用量依存的に競合することが見出された。解離定数（ＤＣ５０）は８±３μＭであり、これは３±１μＭのＫＩ値に相当する。したがって、配列番号１６のペプチドのＤＣ５０値は、ＨＩＶ−１阻害アッセイで得られたＩＣ５０と類似している。しかし、上述のように、豊富なＨＳＡ前駆体のごく一部のタンパク質切断により、これらの濃度は容易に達成することができる。
【００６０】
配列番号１６のペプチドが、恒常性、免疫応答、および種々の癌の転移において主要な役割を果たすＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２を介した細胞遊走に影響を与えるかどうかを調べた。配列番号１６のペプチドが、ＣＸＣＬ１２によって誘導されるＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ヒト幹細胞の遊走を抑制することが見出された。同様に、配列番号１６のペプチドは、インビトロで腫瘍細胞の浸潤を防止した。したがって、このペプチドは、抗炎症効果ならびに抗浸潤効果および抗転移効果を発揮し得る。
【００６１】
ＣＸＣＬ１２−ＣＸＣＲ４系は、移植患者における血液再構築に通常利用される、造血幹細胞（ＨＳＣ）の骨髄保持に関与する（Mohty et al., 2011）。ヒトおよびマウスのＣＸＣＲ４は高度に保存されており、マウスでの予備研究により、配列番号１６のペプチドの単回腹腔内投与によって前駆細胞および好中球の末梢への有意な動員が引き起こされることが明らかになった。配列番号１６のペプチドで処理されたマウスに由来する細胞の移植により生着率が上昇し、このことは、この天然ペプチドによる幹細胞動員の成功をさらに裏付けている。
【００６２】
配列番号１６のペプチドの腹腔内投与により、ＯＶＡを用いたアレルゲン曝露後のマウスの気道への好中球、リンパ球、および好酸球のＣＸＣＲ４依存的浸潤が有意に低減した。この処理により、マクロファージの浸潤も顕著に低減した。対照的に、ＣＸＣＲ４と相互作用しないＡＬＢ４０９−４２３は、有意な効果を示さなかった。したがって、配列番号１６のペプチドは、モデルマウスにおいて幹細胞を動員し、抗炎症効果を発揮する、インビボでのＣＸＣＲ４の効果的なアンタゴニストである。
【００６３】
配列番号１６のペプチドが、グラム陰性の日和見病原菌である緑膿菌を用量依存的に阻害し、≧５μＭの濃度で８０％の有効性があることが見出された。それに比べ、グラム陽性の病原菌である黄色ブドウ球菌または日和見の経口および性器感染症の原因である２倍体の真菌であるカンジダ・アルビカンスに対しては、小さな効果しか観察されなかった。したがって、配列番号１６のペプチドは、Ｘ４  ＨＩＶ−１株を阻害するだけでなく、特異的な抗菌効果も発揮する。
【００６４】
配列番号１６のペプチドとＣＸＣＲ４の相互作用は、多数の他のＧＰＣＲの活性は影響されず、このペプチドはＣＸＣＲ４の２番目の細胞外ループと相互作用するため、高度に特異的である。ＣＸＣＲ４への配列番号１６のペプチドの結合の正確なプロセスはまだ解明されていない。ＣＸＣＬ１２は最初にＣＸＣＲ４のＮ末端と相互作用して立体構造変化を誘導し、これによってＧＰＣＲの２番目および３番目の細胞外ループとリガンドとの相互作用が可能になると報告されている（Brelot et al., 2000; Zhou et al., 2001; Huang et al., 2003）。
【００６５】
【表７】
0006667435.tif 000016
【実施例】
【００６６】
ペプチド
Ｆｍｏｃ化学を利用したペプチド合成装置９０５０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、従来の固相合成により、配列番号１６のペプチドおよびその種々の誘導体を合成した。ペプチドをＲＰクロマトグラフィーで精製し、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳによりその同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および純度を確認した。
【００６７】
ウイルスストック
共受容体の指向性が異なるＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶの分子クローンは、リン酸カルシウム法（ＣａｌＰｈｏｓ（商標）  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）によってプロウイルスＤＮＡを２９３Ｔ細胞に一過的にトランスフェクトすることにより作製した。一晩インキュベートした後、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地でトランスフェクション混合物を置換し、トランスフェクションの４８時間後にウイルスストックを回収した。その後、培養上清を３０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞片を取り除いた。得られたウイルスストックをｐ２４（ＨＩＶ）抗原またはｐ２７（ＳＩＶ）抗原のＥＬＩＳＡにより定量化した。ウイルスストックは、すぐに用いるか、分注して−８０℃で保存した。
【００６８】
ＴＺＭ−ｂｌ感染アッセイ
ＨＩＶ−１プロモーターの制御下にＬａｃＺレポーター遺伝子を含むＴＺＭ−ｂｌレポーター細胞を、９６ウェルＦ底マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社）に播種した。翌日、細胞を、配列番号１６のペプチドまたはその誘導体の種々の希釈物と１時間プレインキュベートし、その後、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、およびＳＩＶを感染させた。１ステップＴｒｏｐｉｘ  Ｇａｌ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを製造業者の推奨に従って用いて、２日後に感染率を決定した。
【００６９】
ＰＢＭＣ感染アッセイ
Ｆｉｃｏｌｌ密度遠心を用いて、ＤＲＫ−Ｂｌｕｔｓｐｅｎｄｅｄｉｅｎｓｔ  Ｂａｄｅｎ−Ｗｕｒｔｔｅｍｂｅｒｇ−Ｈｅｓｓｅｎに由来するバフィーコートから末梢血液単核細胞を単離した。１ｍｌ当たり１×１０６個のＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、Ｏｘｏｉｄ社、＃３０８５２８０）および１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン２（ＩＬ−２、Ｓｔｒａｔｈｍａｎｎ社、＃９５１１１９２）を用いて３日間刺激した。その後、細胞をペレット化し、ＩＬ−２含有培地に再懸濁した。２×１０５個のＰＢＭＣを９６ウェルＦ底マイクロタイタープレートに播種し、ペプチドを加え、１０〜１００ｐｇのＸ４指向性ウイルスまたはＲ５指向性ウイルスのｐ２４抗原を細胞に感染させた。子孫ウイルスを含む上清を感染後２〜３日毎に採取した。ｐ２４抗原のＥＬＩＳＡ（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラム）によりウイルス産生を測定した。平均ｐ２４抗原値（ｎｇ／ｍｌ）は、３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）の感染±標準偏差から得た。
【００７０】
細胞生存率
細胞毒性効果を評価するために、ＴＺＭ−ｂｌ細胞または予備刺激したＰＢＭＣを、ペプチド濃度を増加させてインキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＰＲＯＭＥＧＡ社、Ｇ７５７１）を製造業者の推奨に従って用いて、細胞生存率を決定した。値は３連の測定から得た。細胞を含むＰＢＳ（ペプチドなし）中のＡＴＰレベル（１００％）と比較して生存率を計算した。試薬添加の１０分後にルミノメーターを用いてデータを記録した。
【００７１】
配列番号１６のペプチドであるペプチドは感染の初期段階を阻止する
リガンド−受容体相互作用のリアルタイム蛍光モニタリング
抗ヒトＣＸＣＲ４（クローン１２Ｇ５、ＩｇＧ２ａ）または抗ヒトＣＸＣＲ７（クローン９Ｃ４）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネソタ州、ミネアポリス）から購入した。ＰＥ標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２  Ａｂ（Ｄａｋｏ社、デンマーク、グロストルプ）を用いて非結合の抗ＣＸＣＲ７  ｍＡｂおよび抗ＣＸＣＲ４  ｍＡｂの結合を明らかにし、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で分析した。ヒトケモカインＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＬ１２−ＴｅｘａｓＲｅｄを、説明されているように（Valenzuela-Fernandez, et al. 2001）合成した。ヒトケモカインＣＸＣＬ１１はＣｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＳＡＳ社（フランス）から購入した。
【００７２】
ＨＥＰＥＳ−ウシ血清アルブミンバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１３７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、６ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  グルコース、０．４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．１％ウシ血清アルブミン（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．４）に懸濁した（通常は１ｍＬあたり１０６個の細胞）、ｅＧＦＰ−ＣＸＣＲ４を安定的に発現する細胞を用いて実験を行った。分光蛍光計を用いて０．３秒毎にサンプリングして、５１０ｎｍで放射された蛍光（４７０ｎｍで励起）を２１℃で経時的に記録した。３０秒の時点で１００ｎＭ  ＣＸＣＬ１２−ＴＲを１ｍＬの細胞懸濁液に加えることにより、蛍光結合測定を開始した。競合実験では、ＥＧＦＰ−ＣＸＣＲ４発現細胞を、種々の濃度の非標識薬物の非存在下または存在下で１０分間プレインキュベートした。その後、ＣＸＣＬ１２−ＴＲ（１００ｎＭ）を加え、平衡に達するまで（３００秒）蛍光を記録した。Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ  ３．０８ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、米国、ペンシルベニア州、レディング）を用いてデータを分析した。
【００７３】
ＥＧＦＰ−ＣＸＣＲ４またはＥＧＦＰ−ＣＸＣＲ７の内部移行
ヒトＣＸＣＲ７  ｃＤＮＡをＥＧＦＰ−ｃＤＮＡと融合させて改変ｐＩＲＥＳ  Ｈｙｇ  ３ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にクローニングした。リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法によりＥＧＦＰ−ＣＸＣＲ７を安定的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を作製し、１００ｎＭのＣＸＣＬ１２の非存在下または存在下で９Ｃ４  ｍＡｂの結合について評価した。参照文献（Hachet-Haas et al., 2008）に記載されているように、モノクローナルマウス抗ＧＦＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社；１／１００希釈）を１次抗体として、Ｒ−ＰＥ標識ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社；１／１００）を２次抗体として用いたＥＧＦＰの細胞表面標識を用いて、受容体の内部移行を記録した。サイトメーター（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用い、フローサイトメトリー分析（１サンプルあたり１０，０００個の細胞）によりＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７の染色を定量化した。ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）ソフトウェアを用いて、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７の蛍光強度の平均を計算した。
【００７４】
フローサイトメトリー
市販の抗ヒトＣＸＣＲ４  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐａｈｒｍｉｎｇｅｎ社、クローン：１２Ｇ５；または１Ｄ９）およびＣＣＲ５  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐａｈｒｍｉｎｇｅｎ社、クローン：ＣＤ１９５）を用い、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）により、ＣＸＣＲ４上の配列番号１６のペプチドの結合部位を評価した。２×１０５個のＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を、無血清培地中でペプチドと共に４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋１％ＦＣＳ）で遠心により洗浄して、続いて、ＰＥ標識した抗ヒトＣＸＣＲ４  ｍＡｂまたはＣＣＲ５  ｍＡｂのいずれかで４℃にて染色した。洗浄後、ＦＡＣＳバッファー中の４％パラホルムアルデヒドで、室温で５分間、細胞を固定し、その後、フローサイトメーターで分析した。ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いてデータを処理した。配列番号１６のペプチドの受容体優先性を分析するために、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（非酵素的、１×；Ｓｉｇｍａ社：Ｃ５９１４）を用いてＧｈｏｓｔ細胞（親、Ｘ４、Ｈｉ）を回収し、上述のようにＦＡＣＳ分析のために調製した。
【００７５】
［３５Ｓ］ＧＴＰ［Ｓ］結合アッセイ
組換えバキュロウイルスの産生：ヒトＣＸＣＲ４、ラットＧタンパク質αｉ２サブユニット、ならびにヒトＧタンパク質β１サブユニットおよびウシＧタンパク質γ３サブユニットをコードするバキュロウイルスの産生が記載されている（Moepps et al., 1997）。［３５Ｓ］ＧＴＰ［Ｓ］はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社（米国、ウォルサム）から入手した。ＣＸＣＬ１２はＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（米国、ロッキーヒル）から入手した。
【００７６】
昆虫細胞の培養および膜調製：５９ｃｍ２の細胞培養ディッシュにおいて、１０％ウシ胎仔血清および０．５ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｓｉｇｍａ社、Ｔ１０３２）中で、２７℃でＳｆ９細胞を成長させた。組換え受容体およびヘテロ３量体Ｇｉ２の産生のために、細胞を約６０％の密度まで成長させ、ディッシュあたり組換えバキュロウイルスを含む２ｍｌの培地中で２７℃にて１時間インキュベートした。その後、ディッシュあたり９ｍｌの新鮮な培地を細胞に添加し、２７℃で４８時間この培地中で維持した。粗膜画分を調製するために、細胞を遠心によりペレット化し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３μＭ  ＧＤＰ、２μｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤、１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチン、１００μＭ  ＰＭＳＦ、および１μｇ／ｍｌアプロチニンを含む、ディッシュあたり６００μｌの氷冷溶解バッファー中に再懸濁した。使い捨てシリンジに取り付けた０．５ｍｍ×２３ｍｍの針に懸濁液を６回通すことにより、細胞をホモジナイズした。氷上で３０分後、溶解産物を２，４５０×ｇで４５秒遠心して、破壊されていない細胞および核を除去した。得られた上清から、２６，０００×ｇ、３０分、４℃の遠心により粗膜画分を単離した。３００μｌの溶解バッファーでペレットをすすぎ、３００μｌの新たな溶解バッファーに再懸濁し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。
【００７７】
記載されているように（Moepps et al., 1997）、バキュロウイルス感染昆虫細胞の膜への［３５Ｓ］ＧＴＰ［Ｓ］の結合をアッセイした。簡潔に述べると、膜（１サンプルあたり１０μｇのタンパク質）を、５０ｍＭトリエタノールアミン／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０μＭ  ＧＤＰ、および１．０５ｎＭ  ［３５Ｓ］ＧＴＰ［Ｓ］（１２５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む混合液（１００μｌ）中で、３０℃にて６０分間インキュベートした。孔径が０．４５μｍのニトロセルロース膜（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ社；インド、アンバラ  キャントンメント）で急速ろ過することにより、インキュベーションを終了させた。膜を洗浄し、乾燥し、液体シンチレーション計数により、保持されている放射活性を決定した。非特異的結合は、１００μＭの非標識ＧＴＰ［Ｓ］と競合しない結合として定義した。
【００７８】
配列番号１６のペプチドのＧＰＣＲアンタゴニストの選別
細胞遊走への配列番号１６のペプチドおよび誘導体の影響
５μｍ孔フィルターを備えた直径６．５ｍｍのチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、２４ウェル細胞培養、Ｃｏｓｔｅｒ社、マサチューセッツ州、ボストン）を用いてＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ）の遊走を分析した。２×１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞を２００μｌのＯｐｔｉｍｉｚｅｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭに懸濁し、この細胞懸濁液を上側のチャンバーに加えた。次に、６００μｌのＴ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭ中の１０ｎＭ  ＣＸＣＬ１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社）および／または種々の濃度の配列番号１６のペプチドもしくはその誘導体を、下側のチャンバーに加えた。細胞培養チャンバーを、細胞培養インキュベーター中で３７℃にて１５０分間インキュベートした。インキュベーション後、チャンバーを取り出し、１００μｌの上清を採取し、下側の区画に遊走した細胞を、血球計を用いて直接計数するか、または、上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて分析した。全ての値は、３連の実験±ＳＤから得た、ＣＸＣＬ１２のみで処理した細胞と比べた、遊走細胞の平均数を表す。
【００７９】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）処理した個体のアフェレーシスにより単離した末梢造血幹（ＰＨＳ）細胞は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｕｌｍから得た。凍結細胞を、１／１０希釈したＰＢＳ中１０％ＡＣＤ−Ａバッファー（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより提供）中で注意深く解凍した。２００μｌあたり１×１０５個のＰＨＳ細胞をトランスウェルプレートの上側チャンバー中に入れた。その後、１０ｎＭのＣＸＣＬ１２および／または種々の濃度の配列番号１６のペプチドもしくはその誘導体を含む６００μｌ培養培地を各ウェルに入れた。３時間後、上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙを用いて走化性を測定した。全ての値は、３連の実験±ＳＤから得られた、ＣＸＣＬ１２のみで処理した細胞と比べた遊走細胞の平均数を表す。
【００８０】
癌細胞浸潤アッセイ
Ｂｉｏｃｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ細胞浸潤チャンバー（ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（商標）  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ）を製造業者の推奨に従って用いて、癌細胞の細胞浸潤をアッセイした。５×１０４個のＤＵ１４５細胞（ＡＴＣＣ）を、０．１％ＢＳＡ（ＫＰＬ社）を含む３００μｌの無血清ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ社）に懸濁した後、上側チャンバーに加えた。１００ｎＭのＣＸＣＬ１２、および種々の濃度の配列番号１６のペプチドを含むか、または含まない、７００μｌの無血清培地を下側チャンバーの各々に加えた。チャンバーを５％ＣＯ２／９５％空気の湿潤雰囲気中、３７℃で２４時間インキュベートした。こすり洗うことにより、膜の上側表面から非浸潤細胞を除去した。上述のようにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙキットを用いて、膜の底の方に浸潤した細胞を定量化した。
【００８１】
アクチン細胞骨格へのＣＸＣＬ１２およびＣＸＣＲ４アンタゴニストの影響
培地、ＡＬＢ誘導体、またはＡＭＤ３１００（全て５４５μＭ）のいずれかとプレインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞を、３７℃でＣＸＣＬ１２（１００μｇ／ｍｌ）を用いて記載されている時間刺激し、５％ホルムアルデヒド（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ社；ドイツ、カールスルーエ）で固定し、０．１％サポニン（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ社）で透過処理した。Ｆ−アクチンをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８標識ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社；オレゴン州、ユージーン）で染色した後、相対染色強度のフローサイトメトリー分析を行った。
【００８２】
マウスにおける前駆細胞の動員
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ社；フランス、ル  ジュネスト  サン  ティスル）を、餌および水を不断給餌して、フランクフルトのゲーテ大学メディカルセンターの通常飼育の動物施設で飼育した。１０ｍｇ／ｍＬの配列番号１６のペプチドを含む２００μＬの水または生理食塩水をマウスに腹腔内注射した。注射後、記載の時間に、注意深く皮膚を消毒した後、頬袋から血液を採取した。低張溶解後、サイトカインが豊富な市販の半固体培地（３４３４、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社；ブリティッシュコロンビア州、バンクーバー）中、標準的な条件下で、２連（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で白血球をインキュベートした。説明されているように（Bonig et al., 2006）、７日目にＣＦＵ−Ｃをスコア化した。ＣＦＵ−Ｃは、インキュベートした血液容積を基準に標準化した。全ての動物実験は、研究機関内の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）の許可を得て、実験動物ケア評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）のガイドラインに従って行われた。
【００８３】
動員された細胞の移植
Ｃ５７ＢＬ／８動物に、配列番号１６のペプチド（食塩水中２ｍｇ、腹腔内）または対照食塩水を注射した。末梢血液を注射の１時間後に個別に回収し、計数、混合し、４×１０５個のＣ５７ＢＬ／６  ＣＤ４５．１  ＢＭ細胞と共にＣ５７ＢＬ／６  Ｃｄ４５．１レシピエントに競合的に移植した（６６０μｌの血液に相当）。
【００８４】
喘息モデルマウス
食塩水中の２ｍｇの水酸化アルミニウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、２３９１８−６）に吸着させた５０μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ａ５５０３）を、０日目、１日目、および２日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することによって、マウスを感作した。麻酔（５０ｍｇ／ｋｇケタミンおよび３．３ｍｇ／ｋｇキシラジン、腹腔内）下で、５日目、６日目、および７日目に、食塩水２５μｌ中の１０μｇのＯＶＡ（１２．５μｌ／鼻孔）、または対照マウスでは食塩水のみの鼻腔内（ｉ．ｎ．）注入により、マウスを曝露した。各ＯＶＡ曝露の２時間前に、配列番号１６のペプチドまたはＡＬＢ４０９−４２３を含む食塩水を腹腔内投与（１６μｍｏｌ／ｋｇ）した。以前に報告されているように（Rebber et al., 2012）、最後のＯＶＡ曝露の２４時間後に、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）および細胞分画の測定を行った。
【００８５】
ＮＭＲ分光測定
ＮＭＲスペクトルを得るために、配列番号１６のペプチドの１ｍＭ溶液を、１０ｍＭのリン酸ナトリウムを含むＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏ＝１０：１中に調製し、ＨＣｌで最終ｐＨを７．０に調整した。Ｂｒｕｋｅｒ社製の分光計を用いて８００ＭＨｚ、６００ＭＨｚ、および５００ＭＨｚでＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹ  １Ｈ−ＮＭＲスペクトルを記録した。質が良好であったため、８００ＭＨｚの装置で得られたスペクトルを用いた。スペクトルは、外部ＴＳＰを基準とし、ウォーターサプレッション（ｗａｔｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）のためのｗａｔｅｒｇａｔｅ  ３−９−１９パルスシーケンスを組み込んだＳｔａｔｅｓ−ＴＰＰＩ法（Jeener et al., 1979）を用いて記録した。一般に、２５６個の均等間隔の展開時間ｔ１の値を取得し、平均して２０４８ポイントの１６の過渡現象（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）であった。時間領域データマトリックスは全て、両次元において４Ｋまでゼロフィルして、３．４１Ｈｚ／ｐｔのデジタル分解能が得られた。全ての実験で、フーリエ変換の前に、種々のパラメーターのＬｏｒｅｎｔｚ−Ｇａｕｓｓウィンドウをｔ１次元およびｔ２次元の両方に適用した。混合時間（０．３０ｓ）でＮＯＥＳＹスペクトル（Griesinger et al., 1988）を取得し、０．０６０ｓのＤＩＰＳＩ２混合パルス（Bartels et al., 1995）を用いてＴＯＣＳＹ実験（Braunschweiler et al., 1983; Rucker et al., 1989）を記録した。ＮＯＥＳＹ実験およびＴＯＣＳＹ実験はいずれも、２９８Ｋで行った。
【００８６】
ＮＯＥＳＹクロスピークの帰属および構造計算
ＮＭＲスペクトル中の１Ｈ化学シフトの分散により、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹ分光測定を組み合わせて、標準的な方法を用いて、全てのＮＨ−αおよびＣＨ−αの共鳴、ならびに大多数の側鎖プロトン（９７．７％）を簡単且つ明瞭に帰属することができた。ＣＨｉ−ＮＨｉ＋１およびＮＨｉ−ＮＨｉ＋１のＮＯＥを追跡することにより、連鎖的な骨格結合性が確認された。
【００８７】
０．３０ｓの混合時間で記録されたＮＯＥＳＹスペクトルのピークリストは、ＸＥＡＳＹソフトウェア（Schafer, N. 1996）を用いた双方向的ピーク選択により作製した。ＮＯＥＳＹクロスピークの体積は、ＸＥＡＳＹに実装された自動ピーク積分ルーチン、ｐｅａｋｉｎｔ（Engh 1991）により決定した。構造計算では、４０７個のＮＯＥＳＹクロスピークのセットをＣＹＡＮＡ計算（Herrmann et al., 2002; Guntert et al., 2003; Guntert et al., 2004）に供した。この信号セットのうち、４００個（９８．２％）はＣＹＡＮＡプログラムによって明確に帰属された。選択された２０個の最良の配座異性体は、低いＣＹＡＮＡ標的関数値（平均標的関数：０．０５６）を示した。ＣＹＡＮＡプログラム（バージョン２．１）である、複合的ＮＯＥ自動帰属および構造計算の標準的プロトコールを用いて、配列番号１６のペプチドの３次元構造を決定した（Herrmann et al., 2002; Guntert et al., 2003; Guntert et al., 2004）。７サイクルの複合的自動ＮＯＥＳＹ帰属および構造計算の後、最終構造計算が行われた。構造計算は、各サイクルにおいて１００個のランダム化された配座異性体から開始し、標準的なシミュレーテッドアニーリングのスケジュールを用いた。最終的なＣＹＡＮＡ標的関数の値が最も低い２０個の配座異性体を解析に残し、次のサイクルに進めた。誤った距離制限（ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）による構造の歪みを最小限に抑えるために、最初の２サイクルにおいて少なくとも３残基にまたがるＮＯＥ距離制限の全てに、拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）の組合せを適用した。Ｅｎｇｈ‐Ｈｕｂｅｒの共有結合パラメーター（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を用いた。偶然にメチレンへと縮退する、プロトンの縮退基（例えばメチル）、および等価な芳香環プロトンに関与する制限は、全ての対応する水素原子間の曖昧な（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）距離制限へと拡大した。１〜７回目のサイクルにおいて、シミュレーテッドアニーリング中、非縮退ジアステレオトピック対を最小の標的関数値と定期的に交換した。ラマチャンドラン・プロットおよびねじれ型の回転異性体配置の許容領域に好ましいように、それぞれシミュレーテッドアニーリングスケジュールの高温期および冷却期に四面体炭素原子間のねじれ角対および側鎖ねじれ角についての弱い制限を一時的に適用した。最終構造計算のための最大距離の結合（ｕｐｐｅｒ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｂｏｎｄ）のリストは、明確に帰属された最大距離の結合のみを含み、ジアステレオトピック対の交換可能性を必要としない。
【００８８】
配列番号１６のペプチドの血清安定性
ヒト血清に１ｍＭの配列番号１６のペプチドまたは改良された誘導体を添加して３７℃でインキュベートした。サンプルを２時間毎に採取し、直ちに−２０℃で保存した。インキュベートしたペプチドの血清中における抗ウイルス活性を評価するために、１０μｌのサンプルを５×１０４個／１００μｌのＴＺＭ−ｂｌ細胞に加えた。続いて、細胞に９０μｌのＨＩＶ−１  ＮＬ４−３を感染させ、ペプチドおよび血清の混合物の２０倍希釈物を得た。１ステップＴｒｏｐｉｘ  Ｇａｌ−Ｓｃｒｅｅｎ  Ｋｉｔを用いて、感染の２日後に感染力を測定した。プロテアーゼ阻害剤が配列番号１６のペプチドの分解に与える影響を評価するために、１ＭＭの配列番号１６のペプチドを加える前に、血清に最初にプロテアーゼ阻害剤カクテル（１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ（Ｒｏｃｈｅ社）および１ｍＭ  ＰＭＳＦ（Ｒｏｃｈｅ社））を添加した。
【００８９】
配列番号１６のペプチドを検出および定量化するための間接的ＥＬＩＳＡ
別記（参照文献）されているように、配列番号１６のペプチドであるペプチドを用いたニワトリの免疫処置により配列番号１６のペプチドに対するポリクローナル抗血清を作製し（Ｄａｖｉｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ社、レーゲンスブルク）、マウスの免疫処置によりモノクローナル抗体を作製した（ＶｉｒｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社、ハノーバー）。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の反応性および特異性を特徴付けるために、１００μｌの段階希釈された配列番号１６のペプチド、その誘導体（２０μＭ）、またはＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ社）でＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｏｓｔａｒ）を４℃で一晩コーティングした。翌日、２００μｌのＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（ＫＰＬ社）でプレートを２回洗浄し、１５０μｌのＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で処理して非コーティング表面をブロックした。さらに洗浄した後、１００μｌの段階希釈されたモノポリクローナル抗体またはポリクローナル抗体を加えて１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、１００μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体（抗ニワトリまたは抗マウス）をさらに１時間加えた。その後、プレートを５回洗浄し、１００μｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ  １−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社）を加えた。１００μｌの１Ｎ  ＨＣｌを各ウェルに加えて発色を停止させ、マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、ＶＭａｘ  Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）を用いて、６５０ｎｍを基準として、４５０ｎｍで光学密度を記録した。
【００９０】
参照文献
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