(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被験者においてアルツハイマー病を診断する補助的な方法であって、
（ａ）リンパ球が凝集することを可能にするある期間細胞外基質タンパク質を含む調製物において前記被験者からの前記リンパ球を培養する工程、
（ｂ）４２０個の細胞／１０×画像から５４０個の細胞／１０×画像のリンパ球密度面積内で、複数のリンパ球密度についてのＡ／Ｎ値を決定し、Ａは平均リンパ球凝集体面積およびＮはリンパ球凝集体の数である工程、
（ｃ）工程（ｂ）において決定された前記Ａ／Ｎ値の変化率を細胞密度の関数として評価することにより、凝集率を決定する工程、
（ｄ）工程（ｃ）の前記決定を、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較する工程、および
（ｅ）工程（ｄ）における前記比較に基づき、アルツハイマー病の存在を診断する補助的な工程であって、工程（ｃ）において決定された前記凝集率が、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された前記凝集率と比較して高い場合、アルツハイマー病について陽性であるとする工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記診断が、少なくとも１つのさらなる診断アッセイを用いて確認される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのさらなる診断アッセイが、ＡＤ指標診断アッセイおよび形態学診断アッセイから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記期間が、約１２時間〜約７２時間である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記期間が、約２４時間〜約４８時間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記期間が、約４８時間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記調製物が、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ナイドジェン、および／またはその組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記調製物が、ＥＨＳマウス肉腫から抽出される成長因子をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記調製物が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ヒト被験者においてアルツハイマー病を診断する補助的な方法であって、
（ａ）前記被験者においてアルツハイマー病についての少なくとも３つの診断アッセイを行うこと、
（ｂ）それぞれのアッセイについて、前記アッセイが前記被験者においてアルツハイマー病の存在可能性を示すかどうか、を決定すること、ならびに
（ｃ）前記診断アッセイの単純多数がアルツハイマー病の前記存在可能性を示す場合、前記被験者がアルツハイマー病を有すると診断することを補助すること
を含み、
前記診断アッセイのうちの１つが、
（ｉ）リンパ球が凝集することを可能にするある期間細胞外基質タンパク質を含む調製物において前記被験者からの前記リンパ球を培養する工程、
（ｉｉ）４２０個の細胞／１０×画像から５４０個の細胞／１０×画像のリンパ球密度面積内で、複数のリンパ球密度についてのＡ／Ｎ値を決定し、Ａは平均リンパ球凝集体面積およびＮはリンパ球凝集体の数である工程
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において決定された前記Ａ／Ｎ値の変化率を細胞密度の関数として評価することにより、凝集率を決定すること、および
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の前記決定を、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較することであって、工程（ｉｉｉ）において決定された前記凝集率が、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較して高い場合、アルツハイマー病の存在可能性を示す、
方法。
【請求項１１】
前記診断アッセイのうちの２つが、ＡＤ指標アッセイおよび形態学アッセイである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本出願は、２０１４年１月３日に出願された米国仮特許出願第６１／９２３，３７３号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶および認知機能の進行性の低下により特徴付けられる神経変性障害である。五百万人を越える米国人が、この進行性かつ致命的な疾患と共に生きていると推定される。アルツハイマー病は脳細胞を破壊し、これが、記憶の喪失、ならびにクオリティ・オブ・ライフを低減する思考および行動に関する問題を引き起こす。ＡＤには公知の治療法がないが、症状の処置は、ＡＤに罹患している、何百万もの人々、および彼らの家族のクオリティ・オブ・ライフを改善することができる。ＡＤの早期診断は、クオリティ・オブ・ライフを最大にする選択を行う時間を患者に与え、未知の問題についての不安を低減し、将来について計画するより多くの時間を与え、処置から恩恵を受けるというより良好な機会をもたらす。
【０００３】
しかしながら、ＡＤについての診断の不正確さは、重大な神経変性および認知障害を予防するための、早期段階において特に、その治療介入を困難にする。従って、アルツハイマー病を診断するための高感度かつ特異的な検査が必要である。
【０００４】
ヒト皮膚線維芽細胞凝集の早期研究において、本発明者らは、Ｍａｔｒｉｇｅｌに蒔いた４８時間後における凝集体の数当たりの平均面積（Ａ／Ｎ）である、単位凝集体の面積により、細胞凝集を数量化した。本発明者らは、細胞の凝集がより均一に分布した同年齢対照と比較したとき、ＡＤ患者について大きな凝集体を発見した。
【０００５】
本発明者らは、細胞凝集に関する新規診断方法を開発した。数量的に測定された細胞凝集率に基づきアルツハイマー病を診断する方法が、本明細書において開示される。本発明者らは、細胞密度の増大に伴い細胞凝集の変化率が、非ＡＤ細胞と比較してＡＤ細胞において上昇することを発見した。細胞凝集のより高い変化率の傾向は、ＡＤ細胞が、ＡＣ／非ＡＤＤ細胞より、一貫して大きく、かつ平均して付着がより少ないことが報告された、本発明者らの従前の研究と一致する。
【０００６】
従って、ヒト被験者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
（ａ）ヒト被験者から１つ以上の細胞を得る工程、
（ｂ）１つ以上の細胞をある期間培養する工程、
（ｃ）細胞凝集体の平均面積を決定し、平均面積を凝集体の数で割って凝集体の数当たりの平均面積を得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）において決定された凝集体の数当たりの平均面積の変化率を細胞密度の関数として評価することにより、凝集率を決定する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の決定を、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較する工程、ならびに
（ｆ）工程（ｅ）における比較に基づき、アルツハイマー病の存在または非存在を診断する工程であって、工程（ｄ）において決定された凝集率が、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較して高い場合、診断はアルツハイマー病について陽性である、工程
を含む方法が、本明細書において開示される。
【０００７】
いくつかの態様において、本方法は、少なくとも１つのさらなる診断アッセイを用いて診断を確認することをさらに含む。ある態様において、少なくとも１つのさらなる診断アッセイは、ＡＤ指標診断アッセイおよび形態学診断アッセイから選択される。
【０００８】
少なくとも３つの診断アッセイを用いてＡＤを診断するための単純多数規則も本明細書において開示される。ヒト被験者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ｉ）少なくとも３つの診断アッセイを行うこと、
ｉｉ）それぞれのアッセイがアルツハイマー病の存在または非存在を示すかどか、を評価すること、ならびに
ｉｉｉ）診断アッセイの単純多数がアルツハイマー病の存在または非存在を示すかどうか、に基づき、アルツハイマー病の存在または非存在を診断すること
を含み、
診断アッセイのうちの１つが
（ａ）ヒト被験者から１つ以上の細胞を得ること、
（ｂ）１つ以上の細胞をある期間培養すること、
（ｃ）細胞凝集体の平均面積を決定し、平均面積を凝集体の数で割って凝集体の数当たりの平均面積を得ること、
（ｄ）工程（ｃ）において決定された凝集体の数当たりの面積の変化率を細胞密度の関数として評価することにより、凝集率を決定すること、および
（ｅ）工程（ｄ）の決定を、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較することであって、工程（ｄ）において決定された凝集率が、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較して増大される場合、アルツハイマー病の存在が示されること
を含む方法が開示される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、ＡＣおよび非ＡＤＤと比較した、保存皮膚試料についてのＡＤの凝集率の増大を説明する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＡＣおよび非ＡＤＤと比較した、保存皮膚試料についてのＡＤの凝集率の増大を説明する。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＡＣおよび非ＡＤＤと比較した、保存皮膚試料についてのＡＤの凝集率の増大を説明する。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＡＣおよび非ＡＤＤと比較した、保存皮膚試料についてのＡＤの凝集率の増大を説明する。
【図１Ｅ】図１Ｅは、ＡＤ試料の由来の患者の年齢を考慮して傾きおよび切片をプロットする。
【図１Ｆ】図１Ｆは、ＡＤ試料の由来の患者の年齢を考慮して傾きおよび切片をプロットする。
【図２Ａ】図２Ａは、診療所由来の試料についてのＡＤ凝集率を説明する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、診療所由来の試料についてのＡＤ凝集率を説明する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、診療所由来の試料についてのＡＤ凝集率を説明する。
【図２Ｄ】図２Ｄは、診療所由来の試料についてのＡＤ凝集率を説明する。
【図３Ａ】図３Ａは、Ａ／Ｎ対細胞密度の傾きおよび切片を説明する。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ａ／Ｎ対細胞密度の傾きおよび切片を説明しする。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ａ／Ｎ対細胞密度の傾きおよび切片を説明する。
【図３Ｄ】図３Ｄは、Ａ／Ｎ対細胞密度の傾きおよび切片を説明する。
【図３Ｅ】図３Ｅは、患者の年齢を考慮して傾きおよび切片をプロットする。
【図３Ｆ】図３Ｆは、患者の年齢を考慮して傾きおよび切片をプロットする。
【図４Ａ】図４Ａは、傾きおよび切片確率分布を説明する。
【図４Ｂ】図４Ｂは、傾きおよび切片確率分布を説明する。
【図４Ｃ】図４Ｃは、傾きおよび切片確率分布を説明する。
【図４Ｄ】図４Ｄは、傾きおよび切片確率分布を説明する。
【図５Ａ】図５Ａは、単位凝集体の平均面積（Ａ／Ｎ）対凝集率（傾き）を説明する。
【図５Ｂ】図５Ｂは、単位凝集体の平均面積（Ａ／Ｎ）対凝集率（傾き）を説明する。
【図６Ａ】図６Ａは、ＡＤ指標アッセイおよび形態学アッセイを用いた、凝集率の交差検証を説明する。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＡＤ指標アッセイおよび形態学アッセイを用いた、凝集率の交差検証を説明する。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＡＤ指標アッセイおよび形態学アッセイを用いた、凝集率の交差検証を説明する。
【図６Ｄ】図６Ｄは、ＡＤ指標アッセイおよび形態学アッセイを用いた、凝集率の交差検証を説明する。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＡＤ指標アッセイおよび形態学アッセイを用いた、凝集率の交差検証を説明する。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ＡＤ指標アッセイおよび形態学アッセイを用いた、凝集率の交差検証を説明する。
【図７Ａ】図７Ａは、ＡＤ指標値、形態学値、および凝集率をプロットすることによる、単純多数規則を説明する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＡＤ指標値、形態学値、および凝集率をプロットすることによる、単純多数規則を説明する。
【図８Ａ】図８Ａは、交差検証の数量化を、グラフを使って説明する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、交差検証の数量化を、グラフを使って説明する。
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図９Ａ】図９Ａは、凝集率アッセイについての試験−再試験信頼度を説明する。
【図９Ｂ】図９Ｂは、凝集率アッセイについての試験−再試験信頼度を説明する。説明  略語：ＡＤ：アルツハイマー病、ＡＣ：認知症になっていない同年齢対照、非ＡＤＤ：非アルツハイマー型認知症。
【００１０】
本明細書において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別段指示しない限り、複数の参照物を含む。
【００１１】
本明細書において用いられる場合、「ＡＤ指標」アッセイは、リン酸化された第１と第２のＭＡＰキナーゼタンパク質の比に基づく、アルツハイマー病についての診断アッセイを指す。「ＡＤ指標」アッセイは、（ａ）被験者由来の細胞を、タンパク質キナーゼＣ活性化因子である作用物質と接触させること、（ｂ）リン酸化された第１のＭＡＰキナーゼタンパク質のリン酸化された第２のＭＡＰキナーゼタンパク質に対する比を測定することであって、リン酸化された第１および第２のＭＡＰキナーゼタンパク質は、工程（ａ）における接触後に細胞から得られること、（ｃ）工程（ａ）において用いられた、タンパク質キナーゼＣ活性化因子である作用物質と接触されていない被験者由来の細胞において、リン酸化された第１のＭＡＰキナーゼタンパク質のリン酸化された第２のＭＡＰキナーゼタンパク質に対する比を測定すること、（ｄ）工程（ｂ）において得られた比から工程（ｃ）において得られた比を差し引くこと、および（ｅ）工程（ｄ）において計算された差に基づき、被験者におけるアルツハイマー病の存在または非存在を診断することを含み、差が正の数であれば、被験者においてアルツハイマー病の存在が示される。米国特許第７，５９５，１６７号、および米国特許出願公開第２０１４／００３１２４５号は、ＡＤ指標アッセイのその詳細な開示について参照により本明細書に組み込まれる。従って、ＡＤ指標アッセイは、これらの公報において記載される通り行われてもよい。たとえばある態様において、ＰＫＣ活性化因子はブラジキニンであり、第１および第２のＭＡＰキナーゼタンパク質は、それぞれ、Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２である。
【００１２】
本明細書において用いられる場合、「形態学」アッセイは、（ａ）ヒト被験者から１つ以上の細胞を得ること、（ｂ）１つ以上の細胞をある期間培養すること、（ｃ）細胞凝集体の平均面積を決定し、平均面積を凝集体の数で割って凝集体の数当たりの平均面積を得ること、および（ｄ）工程（ｃ）の決定を、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集体の数当たりの平均面積と比較することであって、工程（ｃ）において決定された凝集体の数当たりの平均面積が、非アルツハイマー病細胞を用いた凝集体の数当たりの平均面積より広い場合、アルツハイマー病の存在が示されることを含む、アルツハイマー病についての診断アッセイを指す。細胞は培養されてもよく、凝集体の面積および数は、「形態学」アッセイのその開示について参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６５８，１３４号において記載される通り、および以下に記載される通り決定されてもよい。
【００１３】
本明細書において用いられる場合、用語「単純多数」は、診断アッセイの多数、たとえば３つの診断アッセイのうちの２つが、同一の診断結果（すなわち、アルツハイマー病の存在または非存在）をもたらす場合を指す。
【００１４】
本発明者らは、ＡＣおよび非ＡＤＤ患者と比較した場合の、ＡＤ患者由来の細胞における細胞密度の増大に伴った細胞凝集率の上昇に基づき、ＡＤを診断する新規方法を発見した。従って、ヒト被験者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
（ａ）ヒト被験者から１つ以上の細胞を得る工程、
（ｂ）１つ以上の細胞をある期間培養する工程、
（ｃ）細胞凝集体の平均面積を決定し、平均面積を凝集体の数で割って凝集体の数当たりの平均面積を得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）において決定された凝集体の数当たりの平均面積の変化率を細胞密度の関数として評価することにより、凝集率を決定する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の決定を、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較する工程、および
（ｆ）工程（ｅ）における比較に基づき、アルツハイマー病の存在または非存在を診断する工程であって、工程（ｄ）において決定された凝集率が、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較して増大される場合、診断はアルツハイマー病について陽性である、工程
を含む方法が開示される。
【００１５】
いくつかの態様において、ヒト被験者から得られた１つ以上の細胞は、末梢細胞（すなわち、非ＣＮＳ組織から得られた細胞）である。いくつかの態様において、１つ以上の細胞は線維芽細胞である。ある態様において、線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である。線維芽細胞の細胞前駆体、たとえば誘導多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）も用いられてもよい。たとえば、ヒト皮膚線維芽細胞からＩＰＳＣを得る最近の技術は、複数種の細胞、たとえば神経細胞へのＩＰＳＣの分化を可能にし、皮膚線維芽細胞とＩＰＳＣが分化した神経細胞との両方においてＡβの不均衡を示した。Ｗｈａｌｌｅｙ  Ｋ．、「Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ：Ｄｉｓｈｉｎｇ  ｕｐ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １３、１４９（Ｍａｒｃｈ  ２０１２）｜ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｎ３２０１。
【００１６】
いくつかの態様において、１つ以上の細胞は、皮膚細胞、血液細胞（リンパ球）、および口腔粘膜細胞から選択される。
【００１７】
非アルツハイマー病細胞は、たとえば同年齢対照から選択されてもよい。いくつかの態様において、同年齢対照は、非ＡＤの認知症になっていない集団から選択される。いくつかの態様において、同年齢対照は、非ＡＤの認知症になっている集団、たとえばハンチントン舞踏病、Ｂ１２欠乏、または甲状腺機能低下症を有する患者から選択される。
【００１８】
１つ以上の細胞は、成長用細胞培地、たとえばタンパク質混合物において培養されてもよい。いくつかの態様において、タンパク質混合物はゼラチン状のタンパク質混合物である。非限定的な典型的ゼラチン状のタンパク質混合物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）は、エンゲルブレス−ホルム−スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm）（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞により分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物の商品名であり、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより販売される。この混合物は、多くの組織において見られる複雑な細胞外環境に類似し、細胞生物学者により細胞培養の基質として用いられる。
【００１９】
いくつかの態様において、１つ以上の細胞は、細胞外基質タンパク質を含む調製物において培養される。いくつかの態様において、調製物は、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ナイドジェン、および／またはその組み合わせを含む。いくつかの態様において、調製物は、腫瘍、たとえばＥＨＳマウス肉腫から抽出される。調製物は、成長因子、たとえばＴＧＦ−ベータ、上皮成長因子、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および／もしくは他の成長因子、またはその組み合わせをさらに含んでもよい。ある態様において、成長因子は、ＥＨＳマウス肉腫において自然に生じる。細胞外基質タンパク質はまた、多数の他のタンパク質も含有してもよい。
【００２０】
いくつかの態様において、１つ以上の細胞は基底膜調製物において培養される。いくつかの態様において、調製物は可溶化される。いくつかの態様において、基底膜調製物は、腫瘍、たとえば細胞外基質タンパク質に富む腫瘍であるＥＨＳマウス肉腫から抽出される。その主要な構成成分は、ラミニン、コラーゲンＩＶ、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、およびエンタクチン／ナイドジェンである。いくつかの態様において、調製物は、ＴＧＦ−ベータ、上皮成長因子、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および／またはＥＨＳ腫瘍において自然に生じてもよいか、または生じなくてもよい他の成長因子を含有する。ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ（ＧＦＲ）は、より高度に定義された基底膜調製物を必要とする適用に特に十分に適合することが分かっている。
【００２１】
培養後短時間のうちに、測定可能な細胞ネットワークが形成される。この期間は、たとえば細胞タイプおよび状態を考慮して変動してもよいが、一般的に、この期間は、約１時間以下の面積、約１０分〜約６０分の面積、たとえば約１０分〜約４５分またはそれらの間の任意の時間にある。ある時間、たとえばおよそ５時間後、これらのネットワークは変性し始め、端が後退して、測定可能な「集塊」または凝集体が残る。いくつかの態様において、１つ以上の細胞を培養するための期間は、約１時間〜約７２時間、たとえば約１２時間〜約７２時間、または約２４時間〜約４８時間から選択される。ある態様において、期間は、約４８時間、またはその任意の１時間の増分区分である。
【００２２】
本方法は、培養された細胞を期間の最後にイメージングすることをさらに含んでもよい。画像は、当該技術分野において公知の技術に従い取得されてもよい。たとえば細胞ネットワークの画像は、倒立顕微鏡、たとえばＷｅｓｔｅｒｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＡＭＩＤ  Ｍｏｄｅｌ  ２０００で取得されてもよく、所望の拡大率において画像取得ソフトウエアを介してコンピューターにより制御されてもよい。適当なイメージング技術は、共焦点顕微鏡、位相差、明視野、蛍光、微分干渉コントラスト、およびロボットシステムを含むが、これらに限定されない。
【００２３】
凝集体の面積は、任意の適当な方法により、たとえば楕円を凝集体にわたり近似することにより、決定することができる。凝集体のカウント、ならびに凝集体面積の決定は、手動で行うことができるか、またはたとえば当該技術分野で公知の画像処理技術により、自動化することができる。
【００２４】
いくつかの態様において、細胞密度は、μｍ2または視野当たりの細胞の数に基づき測定される。ある態様において、細胞密度は、１０×画像当たりの細胞の数を測定することにより測定される。ある態様において、細胞密度の関数としての凝集体の数当たりの平均面積の変化率は、３２０〜５５０個の細胞／１０×画像の境界、またはたとえば３３０〜５００個の細胞／１０×画像の境界内で評価される。
【００２５】
細胞凝集率は、凝集体の数当たりの平均面積の変化率を細胞密度の関数として評価することにより、決定される。いくつかの態様において、細胞密度の関数としての凝集体の数当たりの平均面積の変化率は、凝集体の数当たりの平均面積と細胞密度との間の線形近似の傾きを決定することにより、評価される。
【００２６】
ヒト被験者から得られ培養された細胞の凝集率は、非アルツハイマー病対照細胞を用いて決定された凝集率と比較される。ヒト被験者由来の培養された細胞の凝集率が、非アルツハイマー病対照細胞を用いて決定された凝集率と比較して高い場合、診断はアルツハイマー病について陽性である。
【００２７】
ＡＤ診断は、少なくとも１つのさらなる診断アッセイにより確認されてもよい。いくつかの態様において、少なくとも１つのさらなる診断アッセイは、ヒト被験者から得られた細胞を用いて行われる。すなわち、凝集率アッセイ、および少なくとも１つのさらなる診断アッセイは、同一の細胞株、すなわち、患者を用いる。ある態様において、少なくとも１つのさらなる診断アッセイは、ＡＤ指標診断アッセイおよび形態学診断アッセイから選択される。いくつかの態様において、診断は、ＡＤ指標アッセイと形態学アッセイの両方により確認される。凝集率アッセイはまた、臨床診断、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）−アミロイド画像化、および／またはＡβもしくはタウの脳脊髄液（ＣＳＦ）レベルを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で公知の診断技術と組み合わされてもよい。
【００２８】
いくつかの態様において、ＡＤ診断は、少なくとも３つの診断アッセイの単純多数に基づく。従って、凝集率を用いてヒト被験者においてＡＤを診断する方法であって、たとえばｉ）少なくとも３つの診断アッセイを行うこと、ｉｉ）それぞれのアッセイがＡＤの存在または非存在を示すかどうか、を評価すること、ならびにｉｉｉ）少なくとも３つの診断アッセイの単純多数がＡＤの存在または非存在を示すかどうか、に基づき、ＡＤの存在または非存在を診断することを含み、診断アッセイのうちの１つが、ａ）ヒト被験者から１つ以上の細胞を得ること、ｂ）１つ以上の細胞をある期間培養すること、ｃ）細胞凝集体の平均面積を決定し、平均面積を凝集体の数で割って凝集体の数当たりの平均面積を得ること、ｄ）工程（ｃ）において決定された凝集体の数当たりの面積の変化率を細胞密度の関数として評価することにより、凝集率を決定すること、およびｅ）工程（ｄ）の決定を、非ＡＤ細胞を用いて決定された凝集率と比較することであって、工程（ｄ）において決定された凝集率が、非ＡＤ細胞を用いて決定された凝集率と比較して高い場合、ＡＤの存在が示されることを含む方法が開示される。
【００２９】
いくつかの態様において、少なくとも３つの診断アッセイのうちの２つは、ＡＤ指標アッセイおよび形態学アッセイである。
【００３０】
本明細書において記載される方法は、次の実施例によりさらに記載され、それは説明を意味するが、開示の面積を制限しない。
【００３１】
［実施例］
材料および方法
本研究において用いた、保存細胞株およびｆｒｅｓｈ細胞株。３８人の患者由来の皮膚線維芽細胞試料―Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）により提供された９個の保存事例（補足表１）、およびＭａｒｓｈａｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ、ＷＶ）により提供された診療所由来の２９個の事例（補足表２）―を用いて、実例実験を行った。分析により、細胞凝集率を診断ツールとして用いて、ＡＤとＡＣ／非ＡＤＤとの間の明確な区別が示された。
【００３２】
線維芽細胞を、１２ウェルのプレート上の３−Ｄ  ｍａｔｒｉｘ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）の厚い層（約１．８ｍｍ）に蒔いた。Ｃｈｉｒｉｌａ  Ｆ．Ｖ．ら、「Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  Ｓｃｒｅｅｎｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、３３、１６５−１７６（２０１３）を参照。入手可能な患者情報をＣｏｒｉｅｌｌウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃｃｒ．ｃｏｒｉｅｌｌ．ｏｒｇ／）において掲載する。分析した細胞株（３８）は診療所に大部分由来し（２９／３８）、これは、保存試料を用いた従前の研究についての検証としても役立った。同文献を参照。同年齢対照（ＡＣ）事例は、皮膚生検抽出の日において認知症になっていなかった。全ての試料を生前に採取した。保存皮膚線維芽細胞は、液体窒素下の凍結ストックであった。これらの凍結試料を解凍した後、初代培養を確立し、継続的継代を終始続けた。Ｚｈａｏ  Ｗ．Ｑ．ら、「ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃａｓｃａｄｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．、１１、１６６−１８３（２００２）；Ｋｈａｎ  Ｔ．Ｋ．ら、「Ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｅｒｋ１  ａｎｄ  Ｅｒｋ２  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ  ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０３（３５）、１３２０３−７（２００６）；Ｋｈａｎ  Ｔ．Ｋ．ら、「Ｅａｒｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｕｔｏｐｓｙ−ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ  Ａｌｚｈｅｒｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ」、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、３１（６）、８８９−９００（２００８）；Ｋｈａｎ  Ｔ．Ｋ．ら、「Ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｒｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ：ＰＫＣ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｖｅｓｒｅｓ  Ａｂｅｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ  ｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ」、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．、３４（２）、３３２−９（２００９）；Ｃｈｉｒｉｌａ  Ｆ．Ｖ．ら、「Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  Ｓｃｒｅｅｎｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｒｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．Ａｌｚｈｅｒｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、３３、１６５−１７６（２０１３）を参照。用いた全ての細胞株は初代細胞株であり、不死化させるために処理しなかった。
【００３３】
新たに（ｆｒｅｓｈｌｙ）採取した線維芽細胞を次の通りに得た。患者および対照由来の皮膚組織のパンチ生検（２〜３ｍｍ、上腕）を得た。皮膚生検から線維芽細胞を単離する方法は、Ｔａｋａｓｈｉｍａ，Ａ．、「Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２、２．１．１〜２．１．１２（１９９８）におけるプロトコールに従った。５〜１５回継代の細胞を用いた。
【００３４】
初期の細胞密度を５０個の細胞／ｍｍ3に制御し、それぞれのウェルについて１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地１．５ｍｌと共にホモジナイズした。細胞を、ＣＯ2、水ジャケットインキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において蒔いた後最大７日維持した。
【００３５】
画像取得。１０×および４×対物レンズを用いて、画像収集ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｎ  ２．０．０）を介してコンピューターにより制御した、倒立顕微鏡（Ｗｅｓｔｏｖｅｒ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＡＭＩＤ  Ｍｏｄｅｌ  ２０００、Ｗｅｓｔｏｖｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｔｈｅｌｌ  ＷＡ）で、細胞ネットワークの画像を取得した。ウェル当たり取得した５〜９つの画像、および細胞株当たり４つのウェルを、典型的に用いた。１日目に、画像を播種の３０分後、２日目の２４時間、および３日目の４８時間において取得した。画像を、ＮＩＨ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）から無料で入手可能なソフトウエア、ＩｍａｇｅＪで処理した。
【００３６】
中心画像に対して１画像フィールドを動かすことにより、同一の標準的パターン、中心（１）、上方（２）、下方（３）、左（４）、右（５）を用いて、ウェル当たり５つの画像を最初に採取した。Ｃｈｉｒｉｌａ  Ｆ．Ｖ．ら、「Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  Ｓｃｒｅｅｎｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、３３、１６５−１７６（２０１３）を参照。処理において後に、調べる面積を増大し、診断の判別性に影響することなく変動係数をさらに改善するために、四角形の角を６〜９の画像で埋めることにより、画像の数を５から９に増大させた。同文献を参照。画像１は、ウェルの中心に常に位置した。ウェルの中心を決定するために、次の方法の１つを用いた：ａ）４×拡大率下でのライブ画像は対称であるべきであり、すなわち、４つの角の陰影は、調整された顕微鏡について等しい面積を有すべきであり、ｂ）針で中心をマークし、またはｃ）格子付プレート（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ、ＭＡ）を用い、ここで、中心の正方形は、中心の列またはカラムにおいて常に６番目である。画像の数量化については、２セットのツールを用いた：最初、顕微鏡に付随するソフトウエア、Ｍｉｃｒｏｎにより提供される通り手動、後にＩｍａｇｅＪを用いて自動。
【００３７】
初期の細胞カウントについて、慣習的ＩｍａｇｅＪ  ｐｌｕｇ−ｉｎを用い、「スペックル除去」を３回実施し、画像を半径０．５の最小フィルターを用いて３回フィルター処理し、「バックグラウンド減算」を、回転半径２０を用いて実行した。最後に、画像を二値化し、「粒子解析」をサイズ面積２００〜１００００において実行した。これらのＩｍａｇｅＪコマンドの全てをループの内側で実行し、自動的に１個の細胞株由来の全ての画像の分析が可能になった。同一画像における手動の細胞カウントを用いることにより、ＩｍａｇｅＪ  ｐｌｕｇ−ｉｎを調整し、相対誤差は７％未満であった。
【００３８】
１０×画像当たりの細胞の標的数は、初期細胞濃度、５０個の細胞／ｍｌに対応する４１７であった。Ｂｉｋｆａｌｖｉ  Ａ．ら，「Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙｓ」、Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ、７２、２７５−２７８（１９９１）を参照。４５〜６０個の細胞／ｍｌの細胞濃度の変動を可能にした。画像における細胞分布の不均一性を最小限にするために、１０×画像当たり面積３２０〜５５０個の細胞の面積から外れた画像を除外した。４８時間における細胞凝集体について、Ｍｉｃｒｏｎソフトウエアによる手動楕円近似を用いた。
【００３９】
凝集体の数当たりの平均面積（Ａ／Ｎ）。凝集体の数当たりの平均面積を次の方法で計算した。それぞれの画像（ｉ）について、平均凝集体面積＜Ａ＞iを計算し、凝集体の数Ｎiをカウントした。次に、それぞれの画像について、比＜Ａ＞i／Ｎiを評価した。典型的には、ウェル当たり９つの画像を用い、それぞれのウェルについて、数当たりの平均面積を
【数１】
0006679489.tif 000002
として評価した。さらなる平均値化を４つのウェルについて行った。
【数２】
0006679489.tif 000003
【００４０】
簡単にするために、Ａ／Ｎを＜＜＜Ａ＞i／Ｎi＞＞の代わりに用い、Ａ／Ｎを単位凝集体の面積と呼ぶ。凝集体を、Ｍｉｃｒｏｎ  ２．０ソフトウエアを用いて手動で楕円近似し、その面積および数を記録した。ＩｍａｇｅＪについての自動スクリプトを開発し、これは手動楕円近似と十分に一致した。これら２つのアプローチは、互いの１標準偏差内であった。
【００４１】
凝集率。細胞密度へのＡ／Ｎの依存性を評価し（図１Ａ；図１Ａは、細胞密度（細胞数／１０×画像フィールド）に対する凝集体の数当たりの面積（Ａ／Ｎ）面積の依存性をプロットし、ここで、ＡＤの事例は正方形であり、ＡＣの事例は破線の円であり、非ＡＤＤの事例は、点線の三角形である）、依存性を線形、ｆ（６ｘ）＝ｓ*ｘ＋ｉｎｔに近似した。線形近似から、３８個の事例の集団についての傾き（ｓ）および切片（ｉｎｔ）を評価した。１０×画像フィールド当たり３２０〜５５０個の細胞という境界内で、線形近似を行った。
【００４２】
データ分析については、無料で入手可能なソフトウエア、Ｇｎｕｐｌｏｔ  ４．４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｎｕｐｌｏｔ．ｉｎｆｏ）を用いた。Ｇｎｕｐｌｏｔ由来の作り付けの近似関数は、非線形最小二乗（ＮＬＬＳ）Ｍａｒｑｕａｒｄｔ−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇアルゴリズムの実行に用いられ、生データポイントを近似する。別段特定されない限り、エラーバーは平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。
【００４３】
細胞の凝集体の確率分布。全てのＡＤおよびＡＣ患者について、凝集体の傾き（ｓ）および切片（ｉｎｔ）についての値を等間隔にビニングし、それぞれの変数についてガウス関数を用いて近似し、次に、正規化２次元分布に統合した。
【００４４】
例１：保存試料についてのＡＤ凝集率の増大
本発明者らの従前の研究において示される通り、細胞凝集は、同年齢対照（ＡＣ）および非アルツハイマー病型認知症になった患者（非ＡＤＤ）と比較したとき、アルツハイマー病（ＡＤ）患者において増強される。Ｃｈｉｒｉｌａ  Ｆ．  Ｖ．ら、「Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  Ｓｃｒｅｅｎｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、３３、１６５−１７６（２０１３）を参照。細胞凝集を、Ｍａｔｒｉｇｅｌに蒔いた４８時間後における凝集体の数当たりの平均面積（Ａ／Ｎ）である、単位凝集体の面積により前もって数量化した。同文献を参照。ここで、同年齢対照（ＡＣ）から、および非アルツハイマー病型認知症になった患者（非ＡＤＤ）からアルツハイマー病患者（ＡＤ）をスクリーニングする新規方法は、細胞密度が増大するときに細胞凝集が増大するという本発明者らの発見に基づいた、細胞凝集の傾き切片表示としてここで言及される。
【００４５】
細胞密度（細胞数／１０×画像フィールド）に対する細胞凝集（Ａ／Ｎ）の依存性の例を、保存試料について図１Ａにおいて説明する。３２０〜５５０個の細胞／１０×画像フィールドの細胞密度面積において、依存性を研究した。アルツハイマー病（ＡＤ）の事例を正方形により、同年齢対照（ＡＣ）の事例を破線の円により、非アルツハイマー病型認知症になった事例（非ＡＤＤ）を点線の三角形により表示する。３つの例ＡＤ、ＡＣ、および非ＡＤＤについての線形依存性を、線形近似により説明する（図１Ａ）。ＡＤ（四角形のデータポイント）の傾きは、ＡＣ（円のデータポイント）の傾き、または非ＡＤＤ（三角形のデータポイント）の傾きより急であり、結果として、ＡＤ切片は、ＡＣおよび非ＡＤＤについての切片よりずっと負である（図１Ａ、Ｂ；図１Ｂは、事例の傾きおよび切片をプロットし、これは、ＡＣおよび非ＡＤＤと比較して、ＡＤの事例についてのより大きな傾きおよびより負の切片を示す）。
【００４６】
Ｃｏｒｉｅｌｌ由来の少数の保存事例（９個の細胞株）―３個のＡＤ、３個のＡＣ、および３個の非ＡＤＤは、ＡＤと他の２つの群との間で同一の可分性を示した（図１Ｂ、Ｃ；図１Ｃは、（Ｂ）における四角形のズームイン視野を示し、これは、最小のＡＤの事例と上位のＡＣの事例の間の傾きおよび切片における有意なギャップを示す）。１０×画像当たり３２０〜５５０個の細胞のウインドウにおいて、線形近似を行った。図１Ｃにおいて提示される、図１Ｂにおける四角形についてのズームインは、付近のカットオフＡＣの事例と付近のカットオフＡＤの事例の間の傾き（約３０）と切片（１５０００）との両方におけるギャップを示す。
【００４７】
データはまた、ＡＤ−ＡＣ／非ＡＤＤの分離が、２４時間の時点と比較したとき、４８時間の時点について増大したことも示した（図１Ｄ；図１Ｄは、２４時間におけるＡＤの事例（塗りつぶした記号）と比較して、４８時間におけるＡＤの事例（中空の記号）についての傾きおよび切片をプロットし、これは、４８時間における急な傾き、およびより負の切片を示す）。矢印は、全３個のＡＤの事例について、２４時間の時点と比較したとき、４８時間において傾きが急であり、それ故に、切片がより負であることを示す。言い換えると、ＡＤの事例は、２４時間と比較したとき、４８時間においてカットオフからさらに離れ、これは、４８時間がこのバイオマーカーについての最適な時点であることを示している。
【００４８】
凝集率（傾き）および切片は、図１Ｅ（図１Ｅは、年齢面積５５〜７０歳における患者の年齢に対する傾きの依存性をプロットし、これは、この面積におけるＡＤの事例のより高い凝集率を示す）、および図１Ｆ（図１Ｆは、（Ｅ）において示される同一の事例について患者の年齢に対する切片の依存性をプロットする）において描写する通り、年齢と共に変化し、およそ同一の年齢面積（５５〜７０歳）について、ＡＤの事例はより高い凝集率を示した。年齢に対する細胞凝集（Ａ／Ｎ）の依存性の従前の研究は、ＡＤの診断判別性が、５０〜９０歳の年齢面積において保存されることを示した。
【００４９】
データは、細胞凝集についての傾き切片表示が、単純平均、すなわち、Ａ／Ｎより細胞凝集のより正確な表示であることを示した。これは、Ａ／Ｎ表示においてカットオフラインに非常に近い、ＡＤ／ＡＣ／非ＡＤＤの事例を分解する有用なツールであり得る。典型的には、ＡＤおよびＡＣの集団についてのカットオフラインは、バイオマーカーアウトプットを近似する２個のガウス分布の交差においてである。カットオフライン付近の狭い領域において、ガウス分布の裾は、ある種の確率と共存し、それ故、偽陽性／陰性のグレーゾーンを定義する。Ａ／Ｎ測定についてグレーゾーンにある未知の事例を、Ａ／Ｎの変化率を用いることにより、取り除き得る。
【００５０】
例２：診療所由来のｆｒｅｓｈ試料を用いたＡＤの凝集率の増大の検証
傾き切片分析を用いたＡＣの事例からＡＤの事例の区別を、診療所由来の２９個の試料についてさらに調べた。これらの試料のうち、５個はＡＤの事例であり、２４個はＡＣの事例であった。ＡＤの事例についてより大きな傾きおよびより負の切片（図２Ａ；図２Ａは、診療所由来の２４個のＡＣおよび５個のＡＤ試料についての傾きおよび切片をプロットする）、ならびにＡＤ群とＡＣ群との間のギャップを確認した（図２Ｂ；図２Ｂは、カットオフ（（Ａ）における四角形）付近のズームイン視野を示し、ＡＤとＡＣとの間の傾きにおける、ならびに切片におけるギャップを明らかにする）。保存試料およびｆｒｅｓｈ試料についての傾きおよび切片は、同一の傾向を示した（図２Ｃ；図２Ｃは、保存試料（塗りつぶした記号）および臨床試料（中空の記号）の傾きおよび切片をプロットし、これは、ＡＣ群とＡＣ群との間の類似の傾向および分離を示す）。傾き（〜２）および切片（〜５００）におけるギャップのサイズはまた、これらの２つのデータセットをプロットしたとき保存された（図２Ｄ；図２Ｄは、カットオフ（（Ｃ）における四角形）付近のズームイン視野を示す）。傾きおよび切片におけるギャップの狭小化は、集団に起因して、９個の保存事例から３８個の事例全体まで増大し、これは、診療所由来の２９個の試料を含んでいた。
【００５１】
例３：凝集率はＡＤ群とＡＣ群との間の分離をもたらす
Ａ／Ｎ対細胞密度の傾きおよび切片を個々に分析した。ＡＣ群、ＡＤ群、および非ＡＤＤ群についての切片を見ると、ラージスケールにおいて（図３Ａ；図３Ａは、診療所由来の２４個のＡＣ試料および５個のＡＤ試料（中空の記号）、ならびに３個のＡＣ、３個のＡＤ、および３個の非ＡＤＤの保存試料（塗りつぶした記号）について切片をプロットする）、ならびにカットオフ位置付近にズームインしたとき（図３Ｂ；図３Ｂは、カットオフ（（Ａ）における四角形）付近のズームイン視野を示し、切片におけるオーバーラップした値を明らかにする）、オーバーラップを観察した。しかしながら、傾き、すなわち、変化率は、ＡＤ群とＡＣ／非ＡＤＤ群との間の明確な分離を示し（図３Ｃ、Ｄ；図３Ｃは、（Ａ）におけるのと同一の試料についての傾きをプロットし、図３Ｄは、カットオフ（（Ｃ）における四角形）付近のズームイン視野を示し、これは、傾きにおけるオーバーラップした値をひとつも明らかにしない）。従って、ＡＤ群とＡＣ／非ＡＤＤ群との間で観察した分離を決定するのは、細胞密度の増大に伴った細胞凝集の変化率であった。
【００５２】
図１Ｅおよび図１Ｆにおいて示す通り、年齢に伴った凝集率（傾き）および切片変化を、図３Ｅ（図３Ｅは、年齢面積５５〜７０歳の患者の年齢に対する傾きの依存性をプロットし、これは、この面積におけるＡＤの事例についてより高い凝集率を示す）、および図３Ｆ（図３Ｆは、（Ｅ）におけるものと同一の事例についての患者の年齢に対する切片の依存性をプロットする）において描写し、ならびにほぼ同一の年齢面積５５〜７０歳について、ＡＤの事例は、より高い凝集率を示した。ＡＣおよび非ＡＤＤの事例についてより、ＡＤの事例について、切片はより負であった。図３Ｅおよび３Ｆは、実際の値の自然対数を用い、負の値を示すために、−ｌｎ（−負の値）を用いた。
【００５３】
例４：傾きおよび切片確率分布
ＡＤのバイオマーカーの値は、２つの群、ＡＤおよびＡＣについての確率分布を用いることにより、評価することができる。確率分布に基づき、可能性のあるオーバーラップする確率の程度を推定することができる。２つの群のデータ（８個のＡＤ、２７個のＡＣ）を、傾きおよび切片においてビニングした。出現回数の総数で割ったそれぞれのビンにおける出現頻度に基づき、確率分布を推定した。生の確率データセットを、変動可能な、傾きおよび切片においてガウス曲線を用いて近似した。次に、２次元ガウス確率を、Ｇｎｕｐｌｏｔを用いてプロットした。ＡＣの確率分布は、ＡＤの確率分布より狭かった（図４Ａ、Ｂ；図４Ａは、８個のＡＤおよび２７個のＡＣについての確率分布を示し、図４Ｂは、８個のＡＤおよび２７個のＡＣについての確率分布についての別の図を示す）。ＡＣの確率分布は、ベースラインにおける若干の上方へのシフト（１０％未満）の主な原因となる、ＡＤの確率分布の裾に存する（図４Ｃ、Ｄ；図４Ｃは、２７人のＡＣ被験者についての確率分布を示し、ＡＤ群とオーバーラップする確率は、より大きなデータセットについて可能であり、１０％未満であることを明らかにし、図４Ｄは、２７個のＡＣについての確率分布の別の図を示し、ＡＤ群との低いオーバーラップ確率を強調する）。この上方へのシフトはまた、１０％未満であるオーバーラップ確率であった。２７個のＡＣおよび８個のＡＤの事例由来のデータは、傾き変数においてオーバーラップしなかったが、データは、より大きなデータセットについて可能性のあるオーバーラップを示唆した。推定したオーバーラップ確率は、１０％未満であった。
【００５４】
例５：凝集率対凝集体の数当たりの平均面積
３８個の事例（８個のＡＤ、２７個のＡＣ、および３個の非ＡＤＤ）の集団を、単位凝集体の平均面積（Ａ／Ｎ）および凝集率（傾き）により数量化した２個のバイオマーカーの有効性の観点から評価した。細胞凝集のＡ／Ｎ測定値を、図５において凝集率（傾き）に対してプロットした。Ａ／Ｎ表示（ｙ軸）において、１個のＡＣの事例は、カットオフライン（Ａ／Ｎ＝１０００）である水平ラインより上であったので、それを外れ値としてマークした。（図５Ａ；図５Ａは、３８個の事例についてのＡ／Ｎ対傾きをプロットし、ＡＤ＝四角形および実線の中空の円、ＡＣ＝破線の中空の円および実線の塗りつぶした円、非ＡＤＤ＝三角形、塗りつぶした記号＝保存試料、中空の記号＝臨床試料。長い破線と点の矢印は、Ａ／Ｎ表示におけるＡＣの外れ値を指すが、それを、傾き表示において正しく排除される。実線の矢印は、Ａ／Ｎ表示におけるカットオフラインと非常に近いＡＣ／ＡＤの事例を示すが、それは、傾き表示において正しく排除される）。図５Ａ由来の四角形面積のズームインは、３個のＡＣの事例および１個のＡＤの事例が、カットオフラインに非常に近いことを明らかにした。（図５Ｂ；図５Ｂは、（Ａ）由来の四角形についてのズームイン図を示し、これは、Ａ／Ｎ表示におけるカットオフラインと非常に近い、３個のＡＣ（複数の矢印）および１個のＡＤ（矢印）の事例が、傾き表示において正しく排除されたことを明らかにする）。それ故、３８個の事例のこの集団において、外れ値としての１個の事例、およびカットオフライン（グレーゾーン）に非常に近い４個の事例を含む、５個の事例は、Ａ／Ｎ表示において不確実であった。しかしながら、細胞凝集の凝集率表示（ｘ軸）を用いて、５個の事例についての不確実さを取り除いた。４個のＡＣの事例は、垂直のカットオフラインの左側にあり、１個のＡＤの事例は、垂直のカットオフラインの右側にあり（図５Ｂ）、それ故、臨床診断と同一と診断した。従って、細胞密度の増加に伴った細胞凝集の変化率は、より精密でない測定法である、凝集体の数当たりの平均面積（Ａ／Ｎ）を検査する強力なツールである。
【００５５】
例６：交差検証
ＡＤは、多くの経路が破壊され、および／または影響されている、多因子構造を伴った複雑な疾患である。さらに、ＡＤの孤発形態は、他の疾患との共罹患率の尤度が非常に高いとき、６５歳より上で発症する。それ故、ＡＤについての薬物の有効性が非常に高くてもよいとき、単一のバイオマーカーは、孤発ＡＤの事例をその早期進行においてより高い精度で検出しそうになくてもよい。線維芽細胞の凝集率を数量化する、開示されたバイオマーカーは、他のより成熟した２個のバイオマーカーを用いてＡＤ指標アッセイおよび形態学アッセイにより交差検証したとき、およそ９２％のオーバーラップを示した。
【００５６】
ＡＤ指標を用いた凝集率の交差検証。発展したアッセイ、例えば、ＡＤ指標を用いた凝集率の比較は、成績判定の基準であり得る。Ｈａｄｌｅｙ  ＭＡら、「Ｅｃｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｓｅｒｔｏｌｉ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｃｏｒｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０１、１５１１−１５２２（１９８５）；Ｉｎｇｂｅｒ  Ｄ．ら、「Ｍｅｃｈａｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．    Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ」、Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１０９、３１７−３３１（１９８９）；Ｆｕｒｕｋａｗａ  ＫＳら、「Ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｓｋｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ」、Ｊ．  Ａｒｔｉｆ．  Ｏｒｇａｎｓ、４、３５３−３５６（２００１）；Ｆｕｒｕｋａｗａ  ＫＳら、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  （ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）  ｂｙ  ｒｏｔａｔｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１０、４４１−４４５（２００１）を参照。凝集率アッセイを用いて試験した３８個の事例のうち、２６個をまた、ＡＤ指標アッセイウエスタンブロットを用いても試験した。両方のアッセイを用いて試験したこれらの２６個の事例のうち、２４個は同一の診断を与え、これは、２個のバイオマーカーの間で９２．３％のオーバーラップを表す（図６Ａ、Ｂ；図６Ａは、２６個の事例のそれぞれについてのＡＤ指標アッセイをプロットし（ＡＤ＝四角形、ＡＣ＝破線の中空の円）、ここで、２個の外れ値（１個のＡＤ、１個のＡＣ）をそれぞれの矢印により示し、図６Ｂは、（Ａ）におけるものと同一の２６個の事例のそれぞれについての凝集率の自然対数をプロットし、ここで、それぞれの矢印は、最小のＡＤ値および最大のＡＣ値を示す）。ＡＤ指標は、十分に発展し、８０％を超えて高度に有効な試料について試験したアッセイであるので、それを、凝集率との比較の標準とみなした。凝集率は、２６個の事例のこの集団についての臨床診断と１００％一致した。
【００５７】
形態学アッセイを用いた凝集率の交差検証。形態学アッセイ、研究したアッセイを用いた凝集率の比較もまた、成績判定の基準であり得る。Ｃｈｉｒｉｌａ  Ｆ．  Ｖ．ら、「Ｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  Ｓｃｒｅｅｎｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ．  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ、３３、１６５−１７６（２０１３）を参照。凝集率を用いて試験した３８個の事例の全てをまた、凝集体の数当たりの平均面積（Ａ／Ｎ）というより単純なアッセイを用いて試験した。両方のアッセイを用いて試験したこれらの３８個の試料のうち、３５個が同一の診断を与え、これは、２個のバイオマーカー間で９２．１％のオーバーラップを表す（図６Ｃ、Ｄ；図６Ｃは、３８個の事例のそれぞれについてのＬｎ（Ａ／Ｎ）をプロットし、ここで、２個の外れ値（１個のＡＤ、１個のＡＣ）をそれぞれの矢印で示し、図６Ｄは、（Ｃ）におけるものと同一の３８個の事例のそれぞれについての凝集率の自然対数をプロットし、（Ａ）〜（Ｄ）における水平ラインは、ＡＤ指標、Ｌｎ（凝集率）、およびＬｎ（Ａ／Ｎ）についてのカットオフを表す）。Ａ／Ｎは、より発展し、８０％を超えて高度に有効な試料について試験したアッセイであるので、それを、凝集率との比較の標準とみなした。３８個の事例のこの集団について、凝集率は臨床診断の事例と９７％一致した。図６Ｅは、診断した２６個の事例についての、凝集率アッセイとＡＤ指標アッセイの間、および凝集率アッセイと臨床診断の間でのオーバーラップの百分率を示す。図６Ｆは、診断した３５個の事例についての、凝集率アッセイと形態学アッセイの間、および凝集率アッセイと臨床診断の間の百分率オーバーラップを示す。
【００５８】
単純多数規則。全ての３個のバイオマーカーを用いて試験した２６個の事例を考慮し、単純多数規則、すなわち、２／３のアッセイが同一結果をもたらす単純多数規則を用いることにより、臨床診断との一致を１００％まで増大させた（図７）。図７Ａに示す通り、２個の事例、１個のＡＤおよび１個のＡＣは、ＡＤ指標アッセイにおける外れ値であった。（図７Ａは、ＡＤ指標対Ｌｎ（凝集率）をプロットし、これは、２個の事例、１個のＡＤ（塗りつぶした四角形および矢印）および１個のＡＣ（塗りつぶした円および矢印）を、ＡＤ指標アッセイについての外れ値であることを明らかにする）。しかしながら、図７Ｂに示す通り（図７Ｂは、Ｌｎ（Ａ／Ｎ）対Ｌｎ（凝集率）をプロットする）、ＡＤ指標についての２個の外れ値は、形態学アッセイおよび凝集率アッセイについての外れ値ではなく、すなわち、凝集体の数当たりの面積の対数対凝集率の対数は、臨床診断との１００％の一致をもたらす。従って、ＡＤを診断するため二種以上のアッセイを用いること、ならびに多数規則を用いた交差検証は、最終的な診断の成功率を向上し得る。３つのアッセイの交差検証の方法はまた、臨床診断の信頼度を高めることができる。同一の単純多数規則は、高度に有効な試料、すなわち、検死により確認したＡＤ、および非ＡＤＤ、および認知症になっていないＡＣに関して用いたとき、有効であると予測される。
【００５９】
交差検証および多数規則の数量化。３個のバイオマーカー値を、
【数３】
0006679489.tif 000004
（式中、ｘは、正規化すべきバイオマーカー値であり、ｍａｘは、２６個の事例のデータセットの最大値であり、ｍｉｎは、２６個の事例のデータセットの最小値である）として０〜１に正規化した。この正規化は、全３個のバイオマーカーを同一面積０〜１内にし、これにより、比較をより容易にした（図８Ａ）。
【００６０】
全３個のバイオマーカー値についての曲線近似を、２つの工程で行った。第１に、ＡＣ値について、線形関数、ｆ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂを用い、ＡＤ値について、指数関数、ｇ（ｘ）＝ｃ*ｅｘｐ（ｄ*ｘ）を用いて近似を行った。第２に、接着関数、ｈ（ｘ）＝ｆ（ｘ）＋ｇ（ｘ）＝ａ*ｘ＋ｂ＋ｃ*ｅｘｐ（ｄ*ｘ）を用いて近似を行った。パラメーターａ、ｂ、ｃ、およびｄの初期値については、前の近似の最後の値を用いた。接着関数、ｈ（ｘ）を用いて近似した後、新たな近似パラメーターを記録し、図８Ａにおけるプロットのため用いた（図８Ａは、０〜１の正規化バイオマーカーを示し、ここで、２６個の事例（１９個のＡＣ＝中空の記号、７個のＡＤ＝塗りつぶした記号）について、凝集率＝ＡｇｇＲ（正方形）、ＡＤ指標＝ＡＤＩ（円）、およびＡ／Ｎ＝Ａ／Ｎ（三角形））。
【００６１】
事例当たりの絶対差、｜ｂ1−ｂ2｜、｜ｂ2−ｂ3｜、および｜ｂ3−ｂ1｜（式中、ｂ1＝ＡｇｇＲ、ｂ2＝ＡＤＩ、ｂ3＝Ａ／Ｎ）を用いて、どのバイオマーカーの対が最適に関連したかを評価した。次に、１９個のＡＣの事例について、
【数４】
0006679489.tif 000005
（式中、ｊ、ｋ＝１、３、およびｊ≠ｋ）、全７個のＡＤの事例について、
【数５】
0006679489.tif 000006
（式中、ｊ、ｋ＝１、３、およびｊ≠ｋ）で絶対差の平均値を計算した。全２６個の値について、絶対差の全体平均も計算した。
【数６】
0006679489.tif 000007
【００６２】
これらの群の差分が小さいほど、２個のバイオマーカーはより密接に関連した、図８Ｂ（図８Ｂは、群当たりのバイオマーカー対間の平均距離を示す）。
【００６３】
多数規則を数量化するため、もう１度、バイオマーカー値、ｘを、特定のカットオフ値に関して正規化した。
【数７】
0006679489.tif 000008
【００６４】
例を図８Ｃおよび８Ｄに示す。これは、７個のＡＣおよび７個のＡＤの事例についての垂直の棒を含む。（図８Ｃは、それぞれのバイオマーカーについてのカットオフ値により正規化した（Ａ）由来の７個のＡＣの事例を示し、ここで、ＡｇｇＲ＝破線、ＡＤＩ＝実線、およびＡ／Ｎ＝点線、右のｙスケール上の中身のない黒色の正方形は、バイオマーカーの正（＋１）の結果の「０より大きい場合の集計」を表す）、および（図８Ｄは、７個のＡＤの事例を除いては、（Ｃ）におけるものと同一の分析をプロットし、右のｙスケール上の塗りつぶした黒色の四角形は、バイオマーカーの正（＋１）の結果の「０より大きい場合の集計」を表す）。このカットオフ正規化の３つの可能性のある結果：−１、１、および不確定（Ｕ）が存在する。ｘ値がカットオフ値と等しいとき、不確定状況という結果、すなわち、事例を診断できず、バイオマーカーのアウトプットを不確定（Ｕ）と標識する。カットオフ値に関するこの第２の正規化は、バイオマーカーの結果を３つの状態に単純化した：ＡＤについて＋１、ＡＣおよび非ＡＤＤについて−１、ならびにカットオフ値についてＵ。与えられた３個のバイオマーカー、合計（Ｓ）について可能性のある状態は、表１に示す通り、｛３、２、１、−１、−２、−３、２Ｕ、３Ｕ｝であった。
表１：カットオフ値による３個のバイオマーカーの正規化した値の合計についての可能性のある状態
【００６５】
【表１】
0006679489.tif 000009
【００６６】
Ｕ＝バイオマーカーの値がカットオフ値と等しいときに生じる、不確定な状態。*は、３個のバイオマーカーのうち１個の不確定なバイオマーカーが存在する状況を指す。**は、３個のバイオマーカーのうち２個の不確定なバイオマーカーが存在する状況を指す。この評価基準、Ｓにより、３つの状態が存在する：１）Ｓ＝１、２、３についてＡＤ、２）Ｓ＝−１、−２、−３についてＡＣ／非ＡＤＤ、および３）２個（２Ｕ）または３個（３Ｕ）の不確定、すなわち、カットオフ値について診断していない。
【００６７】
図８において、ＡＣの事例を中空の記号を用いて示し、一方、ＡＤの事例を塗りつぶした記号を用いて示す。ＡＣの事例は、全３個のバイオマーカーについて線形依存性を示し、凝集率およびＡ／Ｎについてほぼフラットであった。ＡＤの事例は、指数曲線を用いた近似について、高度に非線形の依存性を示した。図８Ａにおいて、凝集率（ＡｇｇＲ）値を、最小値０から最大値１までランク付けした。ＡＤ指標バイオマーカー（円）は、特にＡＣの事例について有意なノイズを示した。
【００６８】
３個のバイオマーカーの近さを測定するために、対の値間の絶対差をケースバイケースで（on a case by case basis）考慮した（図８Ｂ）。はるかにノイズの少ない差分は、｜Ａ／Ｎ−ＡｇｇＲ｜であった。他の２個の絶対差、｜ＡｇｇＲ−ＡＤＩ｜および｜ＡＤＩ−Ａ／Ｎ｜のノイズは、ＡＤ指標におけるノイズからもたらされ得る。
【００６９】
３個のバイオマーカーの近さの概観を、図８Ｂに表し、ここで、絶対距離の平均を、ＡＣの事例、ＡＤの事例、および全体的事例について提示する。ＡＤの事例間の絶対差は、ＡＣの事例間の絶対差より大きく、一方、全体的な絶対差はその間であった。再度、Ａ／Ｎと凝集率の間の絶対差、｜Ａ／Ｎ−ＡｇｇＲ｜、は最小であり、これは、２個のバイオマーカーの測定値が、最も強く相関したことを示唆している。
【００７０】
本明細書に提示する同一の多数規則を、４個以上のバイオマーカーに適用することができた。７人のＡＣおよび７人のＡＤ患者についての３個のバイオマーカー値を、上述した（ｘ−カットオフ）／｜ｘ−カットオフ｜（式中、ｘは、バイオマーカーの現在の値であり、カットオフは、ＡＣ群とＡＤ群との間の分離であった。）として正規化した。カットオフ値を、ＡＣデータおよびＡＤデータを近似する２つのガウス分布の交差において決定した。
【００７１】
上述の正規化値は、３つの可能性のある状態、ＡＣおよび非ＡＤＤについて−１、ＡＤについて１、またはカットオフ値について不確定（Ｕ）、のうち１つをとることができる。３個のＡＤバイオマーカーについての正規化ＡＤ値を、図８Ｄに示す。事例１９および２６について、１個のバイオマーカー（ＡＤ指標）は、他の２個のバイオマーカーと反対の正規化値を与えた。それ故、これらの事例を、多数規則に従うことにより、正しく診断した。この規則を数量化する１つの方法は、図８Ｃにおける中身のない黒色の正方形、または図８Ｄにおける塗りつぶした黒色の正方形により示される、単純関数、たとえば、（０より大きい）場合の集計を用いて、＋１の値／事例を全て合計することである。「場合の集計」の結果が、２より大きいか、またはこれと等しい場合、事例はＡＤである（図８Ｄ）。「場合の集計」の結果が２未満である場合、その事例はＡＣ／非ＡＤＤの事例である（図８Ｃ）。２個以上のバイオマーカーがカットオフ値を有する場合、それを、これら３個のバイオマーカーに基づき、診断することはできない。同様に、重複する経路である、（０未満の）「場合の集計」を用いることができる。このアプローチを以下の表２および３、ならびに図８Ｃおよび図８Ｄに要約する。
表２：カットオフ値による３個のバイオマーカーの正規化値の（０より大きい／０未満の）場合の集計についての可能性のある状態
【００７２】
【表２】
0006679489.tif 000010
【００７３】
Ｕ＝バイオマーカーの値がカットオフ値と等しいときの不確定な状態。この基準、二値化値の合計により、３つの状態が存在する：１）（０より大きい）場合の集計＝２、３についてはＡＤ、２）（０より大きい）場合の集計＝０、１についてはＡＣ／非ＡＤＤ、および３）２個以上の不確定、すなわち、カットオフ値について診断していない。
表３：カットオフ値により正規化した３個のバイオマーカーの多数規則の数量化
【００７４】
【表３】
0006679489.tif 000011
【００７５】
例７：試験−再試験信頼度
試験−再試験信頼度を、２つの細胞株（１個のＡＣ、１個のＡＤ）を用いた凝集率アッセイについて検証した（図９）。第１の実験（円）を、異なるＭａｔｒｉｇｅｌロットを用いて同一細胞株について繰り返した。直線は最適な近似を示す。図９Ａは、１個のＡＤの事例および１個のＡＣの事例についての、Ｌｎ（凝集率）対Ｌｎ（細胞数）をプロットする。Ｌｎ（凝集率）およびＬｎ（切片）についての平均値を、図９Ｂに提示し（図９Ｂは、（Ａ）における２個の事例についてのＬｎ（凝集率）対Ｌｎ（切片）をプロットする）、エラーバーは平均の標準誤差を表す。
【００７６】
概要において、ヒト皮膚線維芽細胞凝集の傾き切片表示は、傾きにおける有意な分離を示したが、切片における有意な分離は示さず、これは、ＡＤにおける細胞密度の増大に伴った細胞凝集の変化率の上昇が、この新規バイオマーカーについての実験における推進力であったことを示唆する。
【００７７】
９個が保存事例であり、２９個が診療所由来の事例であった、３８個の事例についての分析は、凝集率（傾き）をバイオマーカーとして用いたとき、ＡＤとＡＣ／非ＡＤＤとの間の明確な分離を示唆した。
【００７８】
３５個の試料についての傾きおよび切片の確率分布の分析は、ＡＣ群（２７）についての確率分布がより狭く、より広い、ＡＤ群（８）の確率分布の裾に存在することを示した。これは、より大きなデータセットについて、２個の群、ＡＤおよびＡＣについての推定オーバーラップ確率が、１０％未満であることを示唆した。
【００７９】
新規バイオマーカー、凝集率（Ａ）を、２個のより成熟したアッセイ、ＡＤ指標（Ｂ）、および凝集体の数当たりの面積（Ｃ）を用いて交差検証した。交差検証は、それぞれアッセイとの９２％のオーバーラップ、および臨床診断との９７％を超えるオーバーラップをもたらした。高度に有効な試料を用いても試験した、２個のより成熟したバイオマーカーＢおよびＣと新規バイオマーカーＡが９２％一致することにより、この新しいバイオマーカーは、この新規バイオマーカーを、ユークリッドの一般的概念を介して高度に有効なバイオマーカーとして確立した。Ｅｕｃｌｉｄ、Ｅｌｅｍｅｎｔｓ：Ｂｏｏｋｓ  Ｉ−ＸＩＩＩ−Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｎｄ  Ｕｎａｂｒｉｄｇｅｄ、（２００６）を参照。つまり、バイオマーカーＢ、Ｃが高度に有効であり、かつＢ、ＣがＡ（９２％）である場合、Ａ＝より高度に検証した（９２％）。
【００８０】
さらに、単純多数規則の下で、すなわち、３つの診断アッセイのうちの２つが一致するとき、バイオマーカーは臨床診断と１００％一致した。
【００８１】
捕足表：
補足表Ｉ：保存患者の詳細な人種、遺伝学的／家族歴および病歴
【００８２】
【表４】
0006679489.tif 000012
【００８３】
【表５】
0006679489.tif 000013
【００８４】
【表６】
0006679489.tif 000014
【００８５】
【表７】
0006679489.tif 000015
【００８６】
【表８】
0006679489.tif 000016
以下に、本願の実施態様を付記する。
［Ｃ１］
ヒト被験者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
（ａ）ヒト被験者から１つ以上の細胞を得る工程、
（ｂ）前記１つ以上の細胞をある期間培養する工程、
（ｃ）細胞凝集体の平均面積を決定し、前記平均面積を凝集体の数で割って凝集体の数当たりの平均面積を得る工程、
（ｄ）工程（ｃ）において決定された凝集体の数当たりの前記平均面積の変化率を細胞密度の関数として評価することにより、凝集率を決定する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の前記決定を、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較する工程、および
（ｆ）工程（ｅ）における前記比較に基づき、アルツハイマー病の存在または非存在を診断する工程であって、工程（ｄ）において決定された前記凝集率が、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された前記凝集率と比較して高い場合、前記診断はアルツハイマー病について陽性である、工程
を含む方法。
［Ｃ２］
前記診断が、少なくとも１つのさらなる診断アッセイを用いて確認される、Ｃ１に記載の方法。
［Ｃ３］
前記少なくとも１つのさらなる診断アッセイが、ＡＤ指標診断アッセイおよび形態学診断アッセイから選択される、Ｃ２に記載の方法。
［Ｃ４］
前記非アルツハイマー病細胞が同年齢対照から選択される、Ｃ１に記載の方法。
［Ｃ５］
前記期間が、約１２時間〜約７２時間から選択される、Ｃ１に記載の方法。
［Ｃ６］
前記期間が、約２４時間〜約４８時間から選択される、Ｃ５に記載の方法。
［Ｃ７］
前記期間が約４８時間である、Ｃ６に記載の方法。
［Ｃ８］
前記培養された細胞を前記期間の最後にイメージングすることをさらに含む、Ｃ１に記載の方法。
［Ｃ９］
前記細胞密度が、１０×画像当たりの細胞の数を測定することにより測定される、Ｃ８に記載の方法。
［Ｃ１０］
細胞密度の関数としての前記凝集体の数当たりの平均面積の変化率が、３２０〜５５０個の細胞／１０×画像の境界内で評価される、Ｃ８に記載の方法。
［Ｃ１１］
細胞密度の関数としての前記凝集体の数当たりの平均面積の変化率が、前記凝集体の数当たりの平均面積と細胞密度との間の線形近似の傾きを決定することにより、評価される、Ｃ１に記載の方法。
［Ｃ１２］
前記１つ以上の細胞が線維芽細胞である、Ｃ１に記載の方法。
［Ｃ１３］
前記線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、Ｃ１２に記載の方法。
［Ｃ１４］
前記１つ以上の細胞が、細胞外基質タンパク質を含む調製物において培養される、Ｃ１に記載の方法。
［Ｃ１５］
前記調製物が、ラミニン、コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン／ナイドジェン、および／またはその組み合わせを含む、Ｃ１４に記載の方法。
［Ｃ１６］
前記調製物が成長因子をさらに含む、Ｃ１４に記載の方法。
［Ｃ１７］
前記調製物が腫瘍から抽出される、Ｃ１４に記載の方法。
［Ｃ１８］
前記腫瘍がＥＨＳマウス肉腫である、Ｃ１７に記載の方法。
［Ｃ１９］
ヒト被験者においてアルツハイマー病を診断する方法であって、
ｉ）少なくとも３つの診断アッセイを行うこと、
ｉｉ）それぞれのアッセイがアルツハイマー病の存在または非存在を示すかどうか、を評価すること、ならびに
ｉｉｉ）前記診断アッセイの単純多数がアルツハイマー病の存在または非存在を示すかどうか、に基づき、アルツハイマー病の存在または非存在を診断すること
を含み、
前記診断アッセイのうちの１つが、
（ａ）ヒト被験者から１つ以上の細胞を得ること、
（ｂ）前記１つ以上の細胞をある期間培養すること、
（ｃ）細胞凝集体の平均面積を決定し、前記平均面積を凝集体の数で割って凝集体の数当たりの平均面積を得ること、
（ｄ）工程（ｃ）において決定された前記凝集体の数当たりの面積の変化率を細胞密度の関数として評価することにより、凝集率を決定すること、および
（ｅ）工程（ｄ）の前記決定を、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較することであって、工程（ｄ）において決定された前記凝集率が、非アルツハイマー病細胞を用いて決定された凝集率と比較して高い場合、アルツハイマー病の存在が示されること
を含む、方法。
［Ｃ２０］
前記少なくとも３つの診断アッセイのうちの２つが、ＡＤ指標アッセイおよび形態学アッセイである、Ｃ１９に記載の方法。
［Ｃ２１］
前記１つ以上の細胞が線維芽細胞である、Ｃ１９に記載の方法。
［Ｃ２２］
前記線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である、Ｃ２１に記載の方法。
【図１Ａ】
0006679489.tif 000017
【図１Ｂ】
0006679489.tif 000018
【図１Ｃ】
0006679489.tif 000019
【図１Ｄ】
0006679489.tif 000020
【図１Ｅ】
0006679489.tif 000021
【図１Ｆ】
0006679489.tif 000022
【図２Ａ】
0006679489.tif 000023
【図２Ｂ】
0006679489.tif 000024
【図２Ｃ】
0006679489.tif 000025
【図２Ｄ】
0006679489.tif 000026
【図３Ａ】
0006679489.tif 000027
【図３Ｂ】
0006679489.tif 000028
【図３Ｃ】
0006679489.tif 000029
【図３Ｄ】
0006679489.tif 000030
【図３Ｅ】
0006679489.tif 000031
【図３Ｆ】
0006679489.tif 000032
【図４Ａ】
0006679489.tif 000033
【図４Ｂ】
0006679489.tif 000034
【図４Ｃ】
0006679489.tif 000035
【図４Ｄ】
0006679489.tif 000036
【図５Ａ】
0006679489.tif 000037
【図５Ｂ】
0006679489.tif 000038
【図６Ａ】
0006679489.tif 000039
【図６Ｂ】
0006679489.tif 000040
【図６Ｃ】
0006679489.tif 000041
【図６Ｄ】
0006679489.tif 000042
【図６Ｅ】
0006679489.tif 000043
【図６Ｆ】
0006679489.tif 000044
【図７Ａ】
0006679489.tif 000045
【図７Ｂ】
0006679489.tif 000046
【図８Ａ】
0006679489.tif 000047
【図８Ｂ】
0006679489.tif 000048
【図８Ｃ】
0006679489.tif 000049
【図８Ｄ】
0006679489.tif 000050
【図９Ａ】
0006679489.tif 000051
【図９Ｂ】
0006679489.tif 000052