(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
７５ｖｏｌ％の値のエタノール濃度のエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分からワサビ抽出物を抽出する抽出工程と、
該抽出工程で抽出された前記ワサビ抽出物を濃度６．２５−２５μｇ／ｍｌに調整する調整工程とを備える、
保湿効果を有するワサビ抽出物からなる保湿剤の製造方法。
【請求項２】
７５ｖｏｌ％の値のエタノール濃度のエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分からワサビ抽出物を抽出する抽出工程と、
該抽出工程で抽出された前記ワサビ抽出物を濃度６．２５−２５μｇ／ｍｌに調整する調整工程とを備える、
保湿効果を有するワサビ抽出物からなる整肌剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、保湿剤の製造方法及び整肌剤の製造方法に関する。詳しくは、安全性が高く、肌の状態を整えることができる保湿剤の製造方法及び整肌剤の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ワサビは、独特の辛さ及び香りから、古来より薬味として珍重され、近代においては、刺身や寿司などを食する際には、不可欠な食材である。
【０００３】
また、ワサビの茎は、ワサビの醤油漬けや粕漬けとして利用され、花は高値で刺身を盛り付ける際の飾り花として使われる。
【０００４】
しかし、葉の部分は、硬くて苦みがあるので、食べづらく、廃棄処分にされており、いわゆる未利用資源であった。このため、ワサビの葉の部分を有効に活用する方法の発明が期待されており、例えば、特許文献１に示すように、ワサビの等の根菜類の根、茎及び葉から選択される１または２以上の部位からの抽出物に痩身の効果が見出されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１１１７４０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献１の発明は、ワサビの根、茎及び葉の部分について、詳細な各部位ごとの比較を行ったものではなく、ワサビを全体として、単に根菜類の中の一つとして挙げているにすぎない。このため、ワサビの葉部分の機能を十分に解明したものとは言えず、ワサビの葉部分を有効に活用するには至っていない。
【０００７】
本発明は、以上の点に鑑みて発明されたものであり、保湿剤の製造方法及び整肌剤の製造方法に関する。詳しくは、安全性が高く、肌の状態を整えることができ、かつ効率的な抽出が可能な保湿剤の製造方法及び整肌剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的を達成するために、本発明の保湿効果を有するワサビ抽出物は、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出される。
【０００９】
ここで、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質が抽出されやすくなる。
【００１０】
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
【００１１】
また、保湿効果を有するワサビ抽出物が、２０ｖｏｌ％から３０ｖｏｌ％の間の値のエタノール濃度で抽出される場合には、ヒアルロン酸生産能を高めることができる。
【００１２】
また、保湿効果を有するワサビ抽出物が、７０ｖｏｌ％から８０ｖｏｌ％の間の値のエタノール濃度で抽出される場合にも、ヒアルロン酸産生能を高めることができる。
【００１３】
また、上記の目的を達成するために、本発明の抗菌活性を有するワサビ抽出物は、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出される。
【００１４】
ここで、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質が抽出されやすくなる。
【００１５】
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
【００１６】
また、抗菌活性を有するワサビ抽出物が、７０ｖｏｌ％以上のエタノール濃度で抽出される場合には、菌の増殖を効果的に抑えることができる。
【００１７】
また、上記の目的を達成するために、本発明の抗酸化活性を有するワサビ抽出物は、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉の部分から抽出される。
【００１８】
ここで、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質が抽出されやすくなる。
【００１９】
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
【００２０】
また、抗酸化活性を有するワサビ抽出物が、４０ｖｏｌ％から８０ｖｏｌ％の間の値のエタノール濃度で抽出された場合には、活性酸素の発生を効果的に抑えることができる。
【００２１】
また、上記の目的を達成するために、本発明のリパーゼ阻害活性を有するワサビ抽出物は、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出される。
【００２２】
ここで、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質が抽出されやすくなる。
【００２３】
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
【００２４】
また、リパーゼ阻害活性を有するワサビ抽出物が、９０ｖｏｌ％から１００ｖｏｌ％の間の値のエタノール濃度で抽出される場合には、脂肪の分解、吸収を抑えることができる。
【００２５】
また、抗菌活性、抗酸化活性、リパーゼ阻害活性及び保湿効果のうち、２以上の機能を有する場合には、多機能なワサビ抽出物及び整肌剤を製造することができる。
【００２６】
また、上記の目的を達成するために、本発明の整肌剤は、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて、ワサビの葉部分から抽出された、抗菌活性、抗酸化活性、リパーゼ阻害活性及び保湿効果のうち、少なくとも１つの機能を含むワサビ抽出物を有する。
【００２７】
ここで、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質が抽出されやすくなる。
【００２８】
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
【００２９】
また、抗菌活性、抗酸化活性、リパーゼ阻害活性及び保湿効果のうち、少なくとも１つの機能を含むことによって、特定の機能に特化した整肌剤を製造することができる。
【００３０】
また、上記の目的を達成するために、本発明のワサビ抽出物の製造方法は、ワサビの葉部分を乾燥、粉末化したものからエタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いて抽出する工程を備える。
【００３１】
ここで、ワサビの葉部分を乾燥、粉末化することによって、効率的に抽出できる。
【００３２】
また、エタノール若しくはエタノール含有溶媒を用いることによって、ワサビの葉部分に含まれる脂溶性の物質を抽出しやすくする。
【００３３】
また、ワサビの葉部分から抽出されることによって、自然由来の天然成分を抽出することとなり、安全性を確保しやすくなる。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の保湿剤の製造方法及び整肌剤の製造方法は、安全性が高く、肌の状態を整えることができ、かつ効率的な抽出が可能な方法となっている。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】葉ワサビの抗酸化活性を、部位別に表した図である。
【図２】葉ワサビの抗菌活性を、部位別に表した図である。
【図３】葉ワサビの、メラノーマ細胞の細胞生存率とメラニン生合成量との対比図である。
【図４】葉ワサビのリパーゼ活性を、部位別に表した図である。
【図５Ａ】葉ワサビ抽出物にＡ２３１８７を加え、βヘキソサミニダーゼの放出量を表した図である。
【図５Ｂ】葉ワサビ抽出物に、抗原であるＤＮＰを加え、βヘキソサミニダーゼの放出量を表した図である。
【図５Ｃ】ＭＴＴ試験による、葉ワサビ抽出物の細胞毒性を測定した結果を表した図である。
【図６】葉ワサビの葉部分のヒアルロン酸産生量と、神経が細胞の細胞生存率との対比図である。
【図７】葉ワサビの葉部分の抗菌活性を表した図である。
【図８】葉ワサビの葉部分のリパーゼ活性を表した図である。
【図９】葉ワサビの葉部分の抗酸化活性を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、本発明の実施の形態について図１ないし図５を参照しながら説明し、本発明の理解に供する。
【００３７】
葉ワサビの各部位の機能性試験
本発明のワサビの抽出物について、発明者はまず、抗酸化活性、抗菌活性、メラニン生合成阻害活性、リパーゼ阻害活性、抗アレルギー、抗炎症の各機能性などの、肌の状態を整える機能の有無を調べるため、葉ワサビの葉、茎、根の部位をそれぞれ比較し、評価した。
【００３８】
〔抽出物の抽出方法〕
以下に行う試験に共通して用いられる試料は、以下のようにして得た。
葉ワサビを葉、茎、根に分け、マイナス２０度で冷凍した後、凍結乾燥機にてフリーズドライになるまで凍結乾燥を行った。
【００３９】
凍結乾燥した各部位を、それぞれ２〜３ｇずつ秤量し、５０ｖｏｌ％エタノール水溶液を１００ｍｌずつ添加した。その後、１８０ｒｐｍの速度で、４８時間、振とう抽出した。
【００４０】
次に、この抽出物を濃縮し、乾固物を得た。
具体的には、上記の振とう抽出後、吸引濾過にて抽出液を回収した。そして、ロータリーエバポレータにて抽出液を濃縮し、溶媒除去を行った。その後、溶媒除去した濃縮液をマイナス８０℃のディープフリーザにて冷凍後、凍結乾燥機で乾固し、試料を得た。
【００４１】
〔抗酸化活性試験〕
体内に取り入れられた酸素の一部は、活性酸素となることはすでに知られている。この活性酸素が過剰に生成されると、フリーラジカルとなり、細胞機能を攻撃し、慢性疾患や疫病が発生する。
【００４２】
一方、抗酸化物質などを用いて、活性酸素が過剰に生成されることを抑えることができれば、フリーラジカルの生成を抑えることができ、生体恒常性の維持を図ることができる。
【００４３】
＜試験方法＞
ＯＲＡＣ法を用いて、蛍光強度を図ることで抗酸化活性を測定した。
ＯＲＡＣ法は、フルオレセインの、４８５ｎｍの波長を当てられて励起すると、５２０ｎｍ付近の波長の光を発するという性質を利用して行う測定法である。
【００４４】
具体的には、まず、ラジカル発生剤であるＡＡＰＨ（２，２'−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩）を用いて、ペルオキシラジカルを発生させる。ペルオキシラジカルによって、標識物質であるフルオレセインが酸化されると、フルオレセインから発していた光は、消光する。
【００４５】
ここで、抗酸化物質が存在すると、ペルオキシラジカルは消失され、ペルオキシラジカルによって酸化されるフルオレセインの消光スピードが遅くなる。この消光スピードの遅延する程度を測定し、抗酸化活性として評価する方法である。
【００４６】
＜サンプル溶液の調整＞
試料を秤量し、濃度が（１ｍｇ／１ｍＬ）になるよう、リン酸緩衝液に溶解し、これを原液として、希釈した。
【００４７】
＜試験結果＞
各部位の、抗酸化活性試験を行った結果を、図１に示す。図１は、抽出物 １ｍｇ中の相対ＯＲＡＣ値（平均±ＳＤ）（ｎ＝４）を表す。
図１において、もっとも高い、相対ＯＲＡＣ値を示したのが、葉部分の「０．０４１±０．００２２（ｍｇＴＥ／ｍｇ）」であった。
【００４８】
このことから、葉ワサビの葉部分から高い抗酸化活性を有する成分が含まれていることが分かった。
【００４９】
〔抗菌活性試験〕
抗菌活性は、皮膚表面の常在菌である、アレルギーの原因となる菌の増殖を防ぐ性質を有する。本試験では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖に与える影響から、各部位の抗菌活性を評価した。
【００５０】
＜試験方法＞
各部位の抽出物を、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ  ジメチルスルホキシド）に溶解させ、８０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。また、抽出物を含まないＤＭＳＯをネガティブコントロールとして、ソルビン酸をポジティブコントロールとして用いた。
【００５１】
黄色ブドウ球菌や大腸菌を、５ｍＬのＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ  普通ブイヨン）培地に浸して菌液を作り、これを１２０ｒｐｍ、３７℃で約１８時間、浸透培養させ、定常期の菌体を得た。
【００５２】
得られた定常期の培養液をＮＢ培地で希釈し、ＯＤ６６０＝０．４になるよう調製した（Ｅ．ｃｏｌｉ：１０９ＣＦＵ／ｍＬ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ:１０８ＣＦＵ／ｍＬ）。さらに、これを滅菌水で希釈し、菌濃度が１０４ＣＦＵ／ｍＬである菌液として、抗菌試験に用いた。なお、菌濃度は、６６０nmの波長の光を当て、菌液の濁り度から、菌液の濁度を測定して行った。この場合、濁り度が高いほど、菌の数が多いことになる。
【００５３】
更に、この菌液４０μ?に、ＮＢ培地２５６μ?と葉ワサビの各部位の試料４μ?を加え、約５秒間攪拌した。なお、上記を混合した溶液の濃度は８００μｇ／ｍｌである。
【００５４】
その後、菌の濃度を均一に保ちながら、３７℃で１８時間、１１５０ｒｐｍの回転速度で、振とう培養し、６３０nmの波長の光を当て、菌液の濁度を測定した。
【００５５】
＜試験結果＞
黄色ブドウ球菌による濁度を、各部位ごとの試料を用いて測定した結果を図２示すように、葉部分の試料が、最も濁度が低いという結果が出た。なお、図２の（  ）内は最終濃度(μｇ／ｍＬ)を表し、コントロールと各抽出物間の有意差はｔ検定により判定した。（ :＊Ｐ＆ｌｔ；０．０５  ＊＊Ｐ＆ｌｔ；０．０１）
【００５６】
これにより、葉部分には、根部分や茎部分と比べて、黄色ブドウ球菌及び大腸菌に対して、強い増殖抑制作用（抗菌活性）を有することが分かった。
【００５７】
〔メラニン生合成阻害試験〕
皮膚に紫外線を浴びると、皮膚の基底層にあるメラノサイトからメラニンが作られ、シミの原因となる。メラニンは、メラノーマ細胞で作られるため、メラノーマ細胞のメラニン生合成を阻害することができれば、シミの発生を防止することができる。
【００５８】
＜試験方法＞
葉ワサビの各部位の５０％エタノール抽出物をＤＭＳＯに溶解させ、濃度を８０ｍｇ／ｍＬ、濃度４０ｍｇ／ｍＬ、及び濃度２０ｍｇ／ｍＬの、３種類の試料を、葉、茎及び根の部位ごとに全部で９種類作った。
【００５９】
濃度１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬのＢ１６メラノーマ細胞を、ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬずつ播種し、３７℃に設定された、５％ＣＯ２インキュベータ内で、２４時間静置培養した。
【００６０】
ここで、培養したメラノーマ細胞の一部を、メラニン生成量を測定するための試験に用い、残りを、細胞生存率を測定するための試験に用いた。以下、それぞれに説明する。
【００６１】
〔メラニン生合成量  測定試験〕
上記のウェルプレートからＥＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ'Ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  イーグル最少必須培地）を除き、ＮａＯＨ水溶液を加える。ＮａＯＨ水溶液が強アルカリ性である性質を利用して、メラニンを溶出させるためである。
【００６２】
＜細胞還元力  測定試験＞
上記のウェルプレートからＥＭＥＭ培地を除き、ＭＴＴ−ＰＢＳ溶液を加える。ＭＴＴ−ＰＢＳ溶液は、生きている細胞の中に取り込まれると、還元されて、色を発して沈殿する。この性質を利用して、生きた細胞の還元力を測定する。
【００６３】
また、細胞の還元力というのは、細胞の数に比例するので、細胞の還元力を測定することで、細胞の生存率を測定することができる。なお、塩酸を加えて、発色を強めることができるので、より測定しやすくしている。
【００６４】
＜試験結果＞
以上の試験を行ったサンプルを、プレートリーダで測定した。その結果を、図３に示す。
なお、図３の白い棒グラフは、細胞生存率を示し、黒い棒グラフは、メラニン含有量を示す。
【００６５】
図３から、根部分の、濃度１６０μｇ／ｍｌのサンプルに、約８０％の細胞生存率を保ったまま、メラニン生合成を約５０％に抑える成分が含まれていることが分かった。
【００６６】
次に、葉部分の、濃度４０μｇ／ｍｌのサンプルに、根部分の、濃度１６０μｇ／ｍｌのサンプルと同程度の細胞生存率（約８０％）を保ちながら、メラニン生合成を約６５％に抑える成分が含まれていることが分かった。
【００６７】
葉部分の、濃度１６０μｇ／ｍｌ及び濃度８０μｇ／ｍｌのサンプルでは、細胞生存率が約３０％と極めて低いため、細胞毒性を有する成分が含まれていることが推認される。
【００６８】
また、茎部分は、全ての濃度において、細胞生存率は約９０％と高いが、メラニン含有量も８５〜１１０％と高いため、メラノーマ細胞のメラニン生合成を阻害する成分は含まれていないと考えられる。
【００６９】
また、根部分の濃度８０μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍｌのサンプルでは、細胞生存率は９０〜９５％と高いが、メラニン含有量が８０〜９０％と高いため、メラノーマ細胞のメラニン生合成を充分に阻害するする成分は含まれていないと考えられる。
【００７０】
以上により、濃度１６０μｇ／ｍｌの根部分、及び濃度４０μｇ／ｍｌの葉部分において、細胞にダメージを与えずに、効果的にメラニン生合成阻害する成分が含まれていることが確認された。
【００７１】
＜リパーゼ阻害活性試験＞
リパーゼは脂肪（トリグリセライド）を分解する酵素であることは、良く知られている。人間の皮膚に存在するリパーゼが、皮膚の脂肪分を分解すると、脂肪酸が産生され、毛穴の閉塞やニキビの原因となる。
【００７２】
ニキビが一旦発生してしまうと、ニキビ菌がリパーゼを出し、トリグリセライドを分解して、脂肪酸を遊離させる。このため、更にニキビ菌が繁殖しやすい環境が作られ、肌が荒れてしまう。
【００７３】
したがって、リパーゼが脂肪を分解する働きを阻害することができれば、ニキビ菌の繁殖を抑えることができ、肌の状態が整えられる。
【００７４】
＜試験方法＞
トリグリセライドが膵リパーゼ溶液と反応し、エステル結合の部分で分離すると、蛍光物質が生じる。この蛍光物質は、３５５ｎｍの波長の光を当てると、励起し、４６０ｎｍの蛍光色の光を発する。この光の蛍光強度を測定することで、リパーゼ活性に与える影響を評価する。
【００７５】
葉ワサビの葉部分の抽出物溶液２５μＬに、０．１ｍＭ４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ  ｏｌｅａｔｅ（４−メチルウンベリフェリルオレアート；４−ＭＵＯ  １３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２緩衝液）溶液５０μＬと、１５０μｇ／ｍＬ膵臓由来リパーゼ２５μＬとを混合した。
【００７６】
その後、２５℃に設定されたインキュベータ内で約３０分静置した。
【００７７】
＜試験結果＞
葉、茎及び根の各部位ごとにそれぞれ、濃度０．６ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ及び２．４ｍｇ／ｍｌの、３種類の濃度について測定した結果を、図４に示す。なお、ポジティブコントロールとして用いたｏｒｌｉｓｔａｔの濃度の単位は、μｇ／ｍｌである。
【００７８】
図４から、リパーゼ活性は、葉部分の濃度２．４ｍｇ／ｍｌのサンプルが最も低い値を（約１０％）を示した。また、葉部分の濃度１．２ｍｇ／ｍｌのサンプルにおいても、リパーゼ活性が約３５％という低い値を示した。
【００７９】
特に、葉部分のサンプルの中で最も高いリパーゼ活性を示した、濃度０．６ｍｇ／ｍｌのサンプルであっても、根部分や茎部分のサンプルと比較すると、同等若しくはやや強いリパーゼ阻害活性を示し、根部分や茎部分と比較すると、非常に顕著な結果が得られた。
【００８０】
以上のことから、葉部分には、リパーゼ活性を阻害する成分が多く含まれることが考えられる。
【００８１】
＜抗アレルギー・抗炎症試験＞
細胞内にカルシウムが入り込み、生体内のカルシウムの濃度が高まると、アレルギー反応が引き起こされることは、既に知られている。
【００８２】
Ａ２３１８７（カルシウムイオノホア）は、カルシウムの透過性を高めるための試薬である。ＲＢＬ−２Ｈ３細胞にＡ２３１８７を加えると、培地中に含まれるカルシウムが、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞の中に入り込み、βヘキソサミニダーゼという酵素が放出（アレルギー反応）され、いわゆる脱顆粒という現象が起こる。
【００８３】
βヘキソサミニダーゼの放出を抑えることができる物質があれば、抗アレルギー作用があるとして、花粉症やアレルギー対策として用いることができると考えられる。
【００８４】
＜試験方法＞
アレルギーの反応は、現在さまざまなタイプのものが確認されている。このため、本試験においては、アレルギー反応の主要なメカニズムである、Ａ２３１８７によるβ―ヘキソサミニダーゼの放出率と、ＤＮＰ−ＢＳＡと抗ＤＮＰ  ＩｇＥによるβ―ヘキソサミニダーゼの放出率について試験を行った。
【００８５】
ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ラット肥満細胞様細胞株）からＩｇＥ刺激によって放出される、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞に含まれる顆粒中のβヘキソサミニダーゼ活性を測定し、その抑制作用を検討した。
【００８６】
ウェルプレートにＲＢＬ−２Ｈ３細胞を分注し、葉ワサビの試料に３０分浸した後、Ａ２３１８７を加え、さらに３０分浸した。そして、基質（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ｎ−ａｃｅｔｈｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）を５０μ?添加し、室温で１時間、培養し、その後、４０５ｎｍの波長を当て、吸光度を測定した。
【００８７】
ウェルプレートに、抗ＤＮＰ  ＩｇＥを分注し、葉ワサビの試料に３０分浸した後、ＤＮＰ−ＢＳＡを添加し、３０分浸した。そして、基質（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−ｎ−ａｃｅｔｈｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）を５０μＬ添加し、室温で１時間培養し、その後、４０５ｎｍの波長を当て、吸光度を測定した。
【００８８】
＜試験結果＞
上記の試験の結果を図５Ａないし図５Ｃに表わす。図５Ａは、葉ワサビ抽出物にＡ２３１８７を加え、βヘキソサミニダーゼの放出量を表した図である。図５Ｂは、葉ワサビ抽出物に、抗原であるＤＮＰを加え、βヘキソサミニダーゼの放出量を表した図である。図５Ｃは、ＭＴＴ試験による細胞毒性を測定した結果を表した図である。
【００８９】
なお、ネガティブコントロールは、Ａ２３１８７を添加していない試料を用いた結果であり、ポジティブコントロールは、Ａ２３１８７を添加した試料を用いた結果である。
【００９０】
また、試験結果の比較のため、抗炎症作用を有する医薬品である、Ｇａｌｌｉｃ  ａｃｉｄ（没食子酸）、及びＱｕｅｒｃｅｔｉｎ（クエルセチン）のデータを掲載した。
【００９１】
図５Ａ及び図５Ｂから、葉部分の試料を用いた場合に、根部分及び茎部分よりも、βヘキソサミニダーゼ活性に対するもっとも強い抑制が見られた。
なお、図５Ｃに示すように、葉ワサビの抽出物の細胞毒性は確認されなかったことを付言する。
【００９２】
以上の、抗酸化試験、抗菌試験、メラニン生合成阻害活性試験、リパーゼ阻害活性試験、抗アレルギー、抗炎症試験において、葉部分の抽出物を試料として用いた場合が、もっとも顕著な値を示すことがわかった。
【００９３】
そこで、出願人は、葉ワサビの葉部分に着目し、葉部分の機能を、更に詳細に調べるため、エタノールの濃度を変えて抽出した試料を用いて、以下の試験を行った。
【００９４】
〔抽出物の抽出方法及び試料〕
葉ワサビの凍結乾燥物を約２ｇ秤量し、エタノール０ｖｏｌ％（水１００ｖｏｌ％）、エタノール２５ｖｏｌ％（水７５ｖｏｌ％）、エタノール５０ｖｏｌ％（水５０ｖｏｌ％）、エタノール７５ｖｏｌ％（水２５ｖｏｌ％）、エタノール１００ｖｏｌ％（水０ｖｏｌ％）の、５種類の抽出溶媒それぞれについて、抽出を行った。
【００９５】
具体的な抽出方法を以下に述べる。
１８０ｒｐｍの回転速度で、４８時間、浸透抽出を行った後、吸引濾過にて抽出液を回収した。さらに、抽出液をロータリーエバポレータにて濃縮後、デシケータ内でエタノールを完全に除去し、乾固物を得た。なお、エタノール０ｖｏｌ％（水１００ｖｏｌ％）抽出の場合は、抽出後、遠心分離し、上澄みを凍結乾燥させて水抽出物とした。
【００９６】
〔ヒアルロン酸産生試験〕
繊維芽細胞は、ヒアルロン酸などの真皮の部分をつくりだすことで知られている。神経芽細胞の働きが落ちると、ヒアルロン酸は失われ、肌が保有する水分量が減少し、しわなどの原因となる。
【００９７】
神経芽細胞の働きを活発にし、ヒアルロン酸の産生能を高める物質があれば、肌の保湿やハリを保つことができる。
【００９８】
＜試験方法＞
上記の、５種類の各エタノール濃度で得た抽出物それぞれを、さらに、３つの濃度に調整し、合計で１５個の試料を得た。
【００９９】
神経芽細胞をウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で、２４時間インキュベートした後、上記の試料を添加し、さらに７２時間インキュベートした後、ヒアルロン酸量を、ＥＬＩＳＡという方法で測定した。また、細胞生存率は、ＭＴＴ法により行った。
【０１００】
＜試験結果＞
上記の試験の結果を、図６に示す。黒の棒グラフは、ヒアルロン酸産生量を示し、白の棒グラフは、細胞生存率を示す。折れ線グラフは、生存する細胞１個あたりのヒアルロン酸量を示す。
【０１０１】
図６から、細胞生存率当たりのヒアルロン酸量が、最も高いサンプルは、エタノール７５％抽出物（濃度１２．５μｇ／ｍｌ）であり、コントロール（ＤＭＳＯ）を１００％として、約１３５％であった。
【０１０２】
また、細胞生存率当たりのヒアルロン酸量が二番目に高い試料は、エタノール２５％抽出物（濃度２５μｇ／ｍｌ）の試料であり、コントロール（ＤＭＳＯ）を１００％として、約１２８％であった。
【０１０３】
本試験により、葉ワサビの葉部分を、エタノール濃度７５％で抽出し、濃度１２．５μｇ／ｍｌに調整すると、最も高いヒアルロン酸生産能を示すことがわかった。
【０１０４】
〔抗菌活性試験〕
葉ワサビの各部位の機能性試験で行ったように、本試験においても、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）と、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖に与える影響から、各抽出濃度の試料の抗菌活性を評価した。
【０１０５】
＜試験方法＞
各エタノール濃度の抽出物を、ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解させた。また、抽出物を含まないＤＭＳＯをネガティブコントロールとして、保存料であるソルビン酸をポジティブコントロールとして用いた。
【０１０６】
黄色ブドウ球菌や大腸菌を、５ｍＬのＮＢ（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ）培地に浸して菌液を作り、これを１６０ｒｐｍ、３７℃で約１８時間、浸透培養させ、定常期の菌体を得た。
【０１０７】
得られた定常期の培養液をＮＢ培地で希釈し、ＯＤ６６０＝０．４  になるよう調製した（Ｅ．ｃｏｌｉ：１０９ＣＦＵ／ｍＬ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ:１０８ＣＦＵ／ｍＬ）。さらに、これを滅菌水で希釈し、菌濃度が１０５ＣＦＵ／ｍＬである菌液として、抗菌試験に用いた。
【０１０８】
更に、この菌液５０μ?に、ＮＢ培地４４５μ?  と葉ワサビの試料５μ?を加え、約５秒間攪拌した。なお、本試験における、サンプルの濃度は８００μｇ／ｍｌである。
【０１０９】
その後、ウェルプレートに１５０μ?ずつ分注し、３７℃で１８時間、１１５０ｒｐｍの回転速度で、振とう培養した。その後、６３０nmの波長の光を当て、菌液の濁度を測定した。
【０１１０】
＜試験結果＞
大腸菌及び黄色ブドウ球菌による濁度を、抽出濃度ごとの試料を用いて測定した結果を図７示す。なお、黒い棒グラフが大腸菌の濁度であり、白い棒グラフが黄色ブドウ球菌の濁度である。
【０１１１】
図７に示すように、大腸菌及び黄色ブドウ球菌に対して、エタノール７５ｖｏｌ％（水２５ｖｏｌ％）の試料が、最も濁度が低く、強い抗菌活性を示すことがわかった。特に、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性は、ソルビン酸よりも強く表れている。
【０１１２】
また、大腸菌に対する抗菌活性も、エタノール濃度が５０ｖｏｌ％以下の試料と比較すると、約３分の１から約２分の１であり、顕著な抗菌作用を示すことが分かった。
【０１１３】
また、エタノール１００ｖｏｌ％（水０ｖｏｌ％）で抽出された試料も濁度が低く、強い抗菌活性を示すことがわかった。特に、大腸菌に対する抗菌活性は、エタノール７５ｖｏｌ％（水２５ｖｏｌ％）の試料よりも強く表れている。
【０１１４】
以上の試験結果から、葉ワサビの葉部分を、エタノール７５％（水２５％）から、エタノール１００ｖｏｌ％（水０ｖｏｌ％）の間の濃度で抽出すると、黄色ブドウ球菌及び大腸菌に対して、強い抗菌活性を有することが分かった。
【０１１５】
〔リパーゼ阻害活性試験〕
本試験においては、葉ワサビの葉部分の効率的な利用のため、上記の、５種類の各エタノール濃度で得た抽出物それぞれを、さらに２つの濃度（４００ｍｇ／ｍｌ、８００ｍｇ／ｍｌ）に調整し、合計で１０個の試料を得た。
＜試験方法＞
抽出物溶液２５μＬを０．１ｍＭ４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙ  ｏｌｅａｔｅ（４−メチルウンベリフェリルオレアート；４−ＭＵＯ  １３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２緩衝液)溶液５０μＬと、１５０μｇ／ｍＬ濃度の膵臓由来リパーゼ２５μＬを混合し、緩衝液に溶かした。
【０１１６】
その後、２５℃の条件下で約３０分インキュベートした。そして、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μ?を加えて反応を停止させた後、３５５ｎｍの光を当て、４６０ｎｍの蛍光強度を測定した。
【０１１７】
＜試験結果＞
上記の試験結果を図８に示す。なお、葉ワサビの葉部分の抽出物を含まずに試験を行った結果を、コントロール（ＢＬ）１００％として表示し、抗肥満薬として用いられるオルレイスタット（Ｏｒｌ）の値も表示した。
【０１１８】
図８から、抽出溶媒のエタノール濃度が高いほど、リパーゼ阻害活性が強いことが分かった。特に、エタノール１００ｖｏｌ％（水０ｖｏｌ％）の濃度８００ｍｇ／ｍｌの試料においては、最もリパーゼ阻害活性が高く、コントロール値の約５分の１である。
【０１１９】
以上の試験結果から、葉ワサビの葉部分を、より高いエタノール濃度で抽出すれば、より高いリパーゼ阻害活性が得られることがわかった。
【０１２０】
〔抗酸化活性試験〕
＜試験方法＞
ラジカル発生剤であるＡＡＰＨ（２，２'−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩）を用いて、ペルオキシラジカルを発生させる。ペルオキシラジカルによって、蛍光色素の一種であるフルオレセインが酸化されると、フルオレセインから発していた光は、消光する。
【０１２１】
ここで、抗酸化物質が存在すると、ペルオキシラジカルは消失され、ペルオキシラジカルによって酸化されるフルオレセインの消光スピードが遅くなる。この消光スピードの遅延する程度を、試料の抗酸化活性と関連付け、評価する方法である。
【０１２２】
＜サンプル溶液の調整＞
試料を秤量し、濃度が（１ｍｇ／１ｍＬ）になるよう、リン酸緩衝液に溶解し、これを原液として、希釈した。
【０１２３】
＜試験結果＞
上記の試験結果を図９に示す。エタノール濃度５０ｖｏｌ％（水５０ｖｏｌ％）で抽出した試料が最も抗酸化活性が高かった。なお、エタノール濃度７５ｖｏｌ％（水２５ｖｏｌ％）で抽出した試料は、二番目に抗酸化活性が高かった。
【０１２４】
以上の試験結果から、葉ワサビの葉部分を、エタノール濃度５０ｖｏｌ％（水５０ｖｏｌ％）から７５ｖｏｌ％（水２５ｖｏｌ％）の間の値の濃度で抽出すれば、抗酸化活性を含む抽出物を抽出することができる。
【０１２５】
＜まとめ＞
以上のすべての試験結果から、葉ワサビの葉部分は、抽出溶媒のエタノール濃度約７５ｖｏｌ％（水２５ｖｏｌ％）で抽出することで、ヒアルロン酸産生能、抗菌活性、リパーゼ阻害活性、抗酸化活性の機能を最も効率良く抽出することができることが明らかとなった。
【０１２６】
上記の条件下で、葉ワサビの抽出物を抽出することで、ヒアルロン酸産生能の成分を含む抽出物を抽出することができる。
【０１２７】
また、ヒアルロン酸産生能の成分を含む抽出物を化粧品の成分として利用すれば、肌の調子を効果的に整えることができる。
【０１２８】
また、ヒアルロン酸産生能の成分は、葉ワサビという植物に含まれた成分であるので、合成薬品などが含まれる化粧品に比べて、安全性が高く、安心して利用することができる。
【０１２９】
また、このような抽出方法により、葉ワサビの葉部分の機能を詳細に調べた文献は見当たらず、かつ、抽出溶媒を変えることで、葉ワサビの葉部分の機能を効率的に利用することはされていなかった。
【０１３０】
したがって、化粧品等を扱う業界において、このような葉ワサビ抽出物を化粧品などの整肌剤として利用することは予測することは不可能であったと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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