(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超複合体を調製するための方法であって、以下のステップ：
１）少なくとも２つの結合部位を有するモノマーに対する結合特異性を有する単一種類の結合ドメインまたは複数種類の結合ドメインが反復されている反復鎖を、調製すること；
２）ステップ１）の反復鎖と、前記反復鎖に結合する少なくとも２つの結合部位を有するモノマーを混合することにより、複数モノマー／反復鎖の基本複合体を調製すること；および、
３）ステップ２）の複数モノマー／反復鎖の基本複合体（複数）の間の交差結合を形成することにより、前記基本複合体の超複合体を形成すること；
を含み、
ここで、前記超複合体を形成する前記基本複合体（複数）の間の前記交差結合は、前記反復鎖に結合する少なくとも２つの結合部位を有するモノマーに媒介される、前記方法。
【請求項２】
モノマーがタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
モノマーが、抗体、リガンド、受容体、それらの断片、それらの組換え体、それらの誘導体、およびそれらと生物学的／化学的エフェクター基とのコンジュゲートからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗体が、抗体断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ断片を含有する断片、Ｆｖ断片、Ｆｖ断片を含有する断片、Ｆｃ断片およびＦｃ断片を含有する断片からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
結合ドメインが、タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
結合ドメインが、微生物のタンパク質に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
結合ドメインが、連鎖球菌のプロテインＧ、Staphylococcus aureusのプロテインＡ、Peptostreptococcus magnusのプロテインＬおよびそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
複数モノマー／反復鎖の基本複合体（複数）の間の交差結合により形成されている超複合体であって、
少なくとも２つの結合部位を有するモノマーに対する結合特異性を有する単一種類の結合ドメインまたは複数種類の結合ドメインが反復されている反復鎖、および、前記反復鎖に結合する少なくとも２つの結合部位を有するモノマーを含み、
ここで、前記超複合体を形成している前記基本複合体（複数）の間の前記交差結合は、前記反復鎖に結合する少なくとも２つの結合部位を有するモノマーに媒介されている、
前記超複合体。
【請求項９】
モノマーの効果を増幅する方法であって、請求項８に記載の超複合体を混合することにより、モノマー標的に結合する超複合体を形成するステップを含む、前記方法。
【請求項１０】
モノマー標的に対するモノマーの効果を測定する追加のステップをさらに含む、請求項９に記載のモノマーの効果を増幅する方法。
【請求項１１】
モノマーの標的が、抗原、抗体、ペプチド、タンパク質、細菌、ウイルスおよび真菌からなる群から選択される、請求項９または１０に記載のモノマーの効果を増幅する方法。
【請求項１２】
細菌が、Helicobacter pylori、Mycobacterium tuberculosisおよびChlamydia trachomatisからなる群から選択される、請求項１１に記載のモノマーの効果を増幅する方法。
【請求項１３】
ウイルスが、インフルエンザ、口蹄疫ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎表面抗原およびＢ型肝炎表面抗体からなる群から選択される、請求項１１に記載のモノマーの効果を増幅する方法。
【請求項１４】
モノマーの効果が、二次プローブ（抗体）−マーカーコンジュゲートとマーカーの生物学的および化学的ラベル付け機能を使用して測定される、請求項１０に記載のモノマーの効果を増幅する方法。
【請求項１５】
マーカーが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、金コロイド、フルオレセイン、量子ドット、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、アセチルコリンエステラーゼ、同位体および色素からなる群から選択される、請求項１４に記載のモノマーの効果を増幅する方法。
【請求項１６】
マーカーの基質が、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート／ヨードニトロテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＩＮＴ）、ニューフクシン（ＮＦ）およびファストレッドＴＲ塩からなる群から選択される、請求項１４に記載のモノマーの効果を増幅する方法。
【請求項１７】
標的に特異的な結合部位を有し、一つのモノマー内に反復鎖に対する２つ以上の結合部位を有するモノマー、
前記モノマーに対する結合特異性を有する結合ドメインが反復されている反復鎖、および、
前記標的に対する前記モノマーの効果を測定するための、標識機能があるマーカーで標識されたニ次プローブコンジュケート、
を含む、分析キット。
【請求項１８】
以下から構成されている、請求項１７に記載の分析キット：
１）モノマーに対する結合特異性を有する結合ドメインが反復されている反復鎖；
２）検出標的に特異的に結合するモノマー；
３）基質との反応により活性化されるマーカーで標識された、二次プローブコンジュゲート；
４）マーカーと反応する基質溶液；
５）各反応段階のための洗浄緩衝液；および、
６）酵素反応を停止させるための停止溶液。
【請求項１９】
免疫組織化学的手法、免疫ブロット法、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、凝集、免疫クロマトグラフィーアッセイおよびラジオイムノアッセイからなる群から選択される分析法のために使用される、請求項１７または１８に記載の分析キット。
【請求項２０】
超複合体を調製するための方法であって、以下のステップ：
１）検出官能基を、モノマーに対する結合特異性を有する結合ドメインが反復されている反復鎖へ、連結するか、コンジュゲートするか、または、融合することにより、検出官能基を有する反復鎖を調製すること；
２）反復鎖に対して少なくとも２つの結合部位を有するモノマーを、ステップ１）で調製した検出官能基を有する反復鎖と混合することにより、複数モノマー／検出官能基を有する反復鎖の基本複合体を調製すること；および、
３）ステップ２）の複数モノマー／検出官能基を有する反復鎖の基本複合体（複数）の間の交差結合を形成することにより、前記基本複合体の超複合体を形成すること；
を含み、
ここで、前記超複合体を形成している前記基本複合体（複数）の間の前記交差結合は、前記検出官能基を有する反復鎖に結合する少なくとも２つの結合部位を有するモノマーに媒介される、
前記方法。
【請求項２１】
検出官能基が、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、ＦＩＴＣ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）およびテキサスレッドからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
複数モノマー／検出官能基を有する反復鎖の基本複合体（複数）の間の交差結合により形成されている超複合体であって、
モノマーに結合する結合ドメインの反復鎖に検出官能基が連結、コンジュゲート、または融合されている、検出官能基を有する反復鎖、および、前記検出官能基を有する反復鎖に結合する少なくとも２つの結合部位を有するモノマーを含み、
ここで、前記超複合体を形成する前記基本複合体（複数）の間の前記交差結合は、前記検出官能基を有する反復鎖に結合する少なくとも２つの結合部位を有するモノマーに媒介されている、
前記超複合体。
【請求項２３】
モノマーの標的を検出する方法であって、モノマーに結合する結合ドメインの反復鎖に検出官能基が連結、コンジュゲート、または融合されている、検出官能基を有する反復鎖、および、前記検出官能基を有する反復鎖に結合する少なくとも２つの結合部位を有するモノマーを含む、複数モノマー／検出官能基を有する反復鎖の基本複合体か、または請求項２２に記載の複数モノマー／検出官能基を有する反復鎖の超複合体を、標的抗原と混合することにより、超複合体を形成するステップを含む、前記方法。
【請求項２４】
モノマーの標的検出レベルを測定する追加のステップをさらに含む、請求項２３に記載のモノマーの標的を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、反復鎖とモノマーの複合体の間の交差結合により形成される超複合体、および、これによる、モノマーの生化学的効果を増幅する方法に関する。
特に、反復鎖／モノマー複合体は、活性成分としてのモノマーに対する結合特異性を有する結合ドメインの反復鎖を含めることにより形成され、これから、前記複合体間の交差結合により、集合体の形態で超複合体が形成される。この超複合体は複数のモノマーを含み、したがって増幅されたモノマー効果を有し、特に、単一のモノマーよりも、モノマー標的に対して数倍も大きい生物学的および化学的効果を提供することができる。
【０００２】
本明細書において、反復鎖は、天然のモノマーへの結合特異性を示すいくつかのドメインまたは物質を用いて、調製することができる。前記結合剤が結合することができるモノマーは、多様である。リガンド、受容体、抗体および酵素などが例として挙げられる。モノマーの効果は、モノマーと反復鎖で調製した複数の複合体および該複合体で調製した超複合体を使用することにより、大幅に増大させることができる。このモノマーにおいて、生物学的および化学的官能基は連結、コンジュゲートおよび融合されて見出され、この時、かかる官能基の効果は大幅に増幅され得る。
【０００３】
２．関連技術の説明
標的を検出するために、モノマーは標的に結合し、検出信号を生成する。この時、検出信号の強度、すなわちモノマーの効果は、標的濃度検出物質と検出プローブの間の結合親和性、プローブ濃度、およびプローブ信号の強度によって決定される。一般に、プローブはモノマーであり、検出標的物質はモノマーの標的物質であり、信号はモノマーの効果を示す。
【０００４】
抗体を用いる検出方法の１つである免疫クロマトグラフィーアッセイは、「迅速抗原検査」、「ラテラルフローテスト」または単に「ストリップテスト」とも呼ばれ、これは広く診断キットの開発に適用されている。前記免疫クロマトグラフィーアッセイによる診断の対象は、これまでの報告によれば、薬物乱用、血液成分分析、Ａ群連鎖球菌抗原、Helicobacter pylori、ヒトMycobacterium tuberculosis、Ｂ型肝炎表面抗原／抗体、デング熱ウイルス、インフルエンザ、寄生虫（マラリアの診断に用いられる熱帯熱マラリア原虫）などが挙げられる。免疫クロマトグラフィーアッセイは簡単であり、アッセイの持続時間は約５〜１０分のみで、非常に迅速である。室温での保存に優れており、試験コストは安価である。したがってこれは、種々の試験に適用することができる、疾患の診断のための最適な方法と考えられる。
【０００５】
金コロイドは、免疫クロマトグラフィーアッセイの色素原として広く使用され、金コロイド標識免疫グロブリンは、疾患の診断に広く使用されている。免疫グロブリンがコンジュゲートした金コロイド粒子は、抗原分子の直接検出のために適用されてきた。１９８１年にLeuveringらは、ゾル粒子免疫アッセイ（ＳＰＩＡ）とも呼ばれる金粒子の凝集アッセイを開発し、さらにそれを用いた妊娠診断キットを開発した。その後、金を用いた膜試験方法が、細菌、ウイルス、寄生虫および真菌などによって引き起こされる疾患の診断用に報告されている。迅速抗原免疫アッセイもまた、金コロイドを用いた迅速なフィールド診断方法として開発され、これは容易かつ簡単で、試験時間も５〜１０分と短い。迅速抗原検査は、これがヒト感染症の早期診断に有用なだけでなく、動物の感染症の早期診断および予防にも有用であるために重要である。
【０００６】
今日使用されている迅速抗原検査キットの問題点は、これが、最初の急性疾患症状から２〜３日以内にのみ、有効であることである。例えば、ウイルスが引き起こす疾患の診断の場合、検査が最初の症状の３日後に実施されると、症状を引き起こした３日後にはウイルスが速やかに消失するため、迅速抗原検査キットは陰性の結果を示す可能性がある。患者が子供である場合は、ウイルス濃度の維持が長くなるため、症状の発生から５日後になっても、検査試料を取得することができる。しかし、患者が成人である場合には、ウイルス濃度は時間が経つにつれて急速に低下するので、検査試料は症状の発生から４〜５日以内に取得する必要があり、抗原診断が年齢により制限されることを示唆する。従来の迅速抗原検査キットのもう１つの問題点は、診断キット試薬の感度が予想よりも低いこと、特に低濃度の抗原濃度に対して低いことである。様々なインフルエンザウイルスの診断のための種々の迅速抗原検査試薬が、世界的に広く開発されており、これらの製品の感度は増加し続けている。しかし、季節性疾患に対する感度はわずか６０〜８３％であり、新たな豚ウイルスに対する感度はわずか４０〜６９％である。今日のアメリカの市場にある３つの診断検査、「BinaxNow」、「EZ flu A+B（Becton, Dickinson and Company）」、および「Quickvue（Quidel）」の効果を試験し、その結果、BinaxNowのＨ１Ｎ１ウイルス検出効率は４０％で最も低く、QuickvueおよびEZ flu A+Bはそれぞれ、６９％および４９％の効率を示した（Centers for Disease Control and Prevention (CDC), Evaluation of rapid influenza diagnostic tests for detection of novel influenza A (H1N1) virus: United States, 2009. Morb Mortal Wkly Rep 2009; 58:826-829）。
【０００７】
従来の迅速抗原検査試薬のこのような低感度の理由は、感染者におけるウイルス濃度が非常に低いか、試料が、検査に十分なウイルスを保証する最高／最適条件下の患者から取得されなかったか、のどちらかのため、ウイルス濃度が十分ではなかったからである。したがって、患者がウイルスに感染していると診断されていたとしても患者からの試料が十分な量の抗原を含まない場合には、疾患の診断は非常に困難である。したがって、試料中の低濃度の抗原の検出に有用な方法および物質に関する研究が必要である。
【０００８】
以前に本発明者らは、モノマーと反復鎖を含む複合体の構築を、かかるモノマーに対する抗原Ｆａｂへの結合特異性を有する結合剤の反復鎖を使用し、抗原−毒素をマトリックス（足場）として実施し；モノマーの局所濃度を増加させることにより、モノマーの衝突頻度を増加させることに成功し；したがって、交差結合の形成を促進することにより、架橋マルチマーの収量を増加させる方法を開発した（韓国特許第10-1161323号）。本発明は、架橋マルチマーを大量生産する方法であって、モノマーに対する結合特異性を有する結合剤の反復鎖を用いて、モノマー間の交差結合の形成を促進することによる、前記方法を提供する。しかしながら、モノマーに対する結合特異性を有するかかる結合ドメイン反復鎖を、免疫アッセイに適用することによる、抗体の効果を増幅する方法は、未だ報告されていない。
【０００９】
本発明者らの研究は、低濃度の抗原の診断の過程における、検出感度の促進に焦点を当てた。その結果本発明者らは、抗体モノマーに対する結合特異性を有する結合ドメインの反復鎖を、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）などの抗原検出方法のための信号増幅器として用いた場合、低濃度の抗原に対する感度を増加できることを確認した。本発明者らはしたがって、抗体を効率的に検出モノマーとして使用して、抗原検出アッセイにおける検出抗体モノマーの効果を増幅できることを確認した。本発明に適用可能なモノマーのペアおよび対応する結合ドメインに、制限は存在しない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、反復鎖とモノマーの複合体の間の交差結合により形成される超複合体を提供すること、正確には、反復鎖とモノマーの複合体を形成することにより生成される超複合体であって、活性成分としての前記モノマーに対する結合特異性を有する結合ドメインの前記反復鎖および前記複合体間の交差結合を含む、前記超複合体を提供することである。
本発明の別の目的は、超複合体の使用による、モノマーの効果を増幅するための方法を提供することであり、ここで超複合体は複数のモノマーを含み、そのため、モノマー標的に対して、単一のモノマーが有し得るよりも何倍も高い生物学的／化学的効果を有し、モノマー効果の増幅をもたらすことができる。
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明は以下の［１］〜［１３］を提供する。
［１］本発明は、超複合体を生産するための反復鎖を調製する方法であって、モノマー中の少なくとも２つの結合部位と該モノマーに対する結合特異性を有する単一種類の結合ドメインまたは複数種類の結合ドメインを含む反復鎖を生産するステップを含む、前記方法を提供する。
［２］本発明は、超複合体を生産するための複数モノマー／反復鎖の複合体を調製する方法であって、以下のステップ：１）モノマー中の少なくとも２つの結合部位と該モノマーに対する結合特異性を有する単一種類の結合ドメインまたは複数種類の結合ドメインが反復されている反復鎖を、調製すること；および、２）ステップ１）の反復鎖と、前記反復鎖に結合する少なくとも２つの結合部位を有するモノマーを混合することにより、複数モノマー／反復鎖の複合体を調製すること；を含む、前記方法を提供する。
【００１２】
［３］本発明は、超複合体を調製するための方法であって、以下のステップ：１）モノマー中の少なくとも２つの結合部位と該モノマーに対する結合特異性を有する単一種類の結合ドメインまたは複数種類の結合ドメインが反復されている反復鎖を、調製すること；２）ステップ１）の反復鎖と、前記反復鎖に結合する少なくとも２つの結合部位を有するモノマーを混合することにより、複数モノマー／反復鎖の複合体を調製すること；および、３）ステップ２）の複数モノマー／反復鎖の複合体の間の交差結合を形成することにより、前記複合体の集合体を形成すること；を含む、前記方法を提供する。
［４］本発明は、［１］に記載の方法により調製される反復鎖を提供する。
［５］本発明は、［２］に記載の方法により調製される、複数モノマー／反復鎖の複合体を提供する。
【００１３】
［６］本発明は、［３］に記載の方法により調製される、超複合体を提供する。
［７］本発明は、モノマーの効果を増幅する方法であって、［４］に記載の反復鎖、［５］に記載の複数モノマー／反復鎖の複合体または［６］に記載の超複合体と、モノマー標的とを混合することにより、モノマー標的に結合した超複合体を形成することによる、前記方法を提供する。
［８］本発明は、生化学的機能の分析、検出、診断および処置のためのキットであって、検出の標的に特異的であるか、または特定の生化学的機能を誘導し、モノマー中に反復鎖に対する２または３以上の結合部位を含むモノマーと、モノマーに対する結合特異性を有する結合ドメインの反復鎖とを含む、前記キットを提供する。
［９］本発明は、反復鎖−生化学的官能基を調製する方法であって、生物学的／化学的エフェクター基または検出官能基を、モノマーに対する結合特異性を有する結合ドメインの反復鎖へ、連結するか、コンジュゲートするか、または、融合するステップを含む、前記方法を提供する。
【００１４】
［１０］本発明は、複数モノマー／反復鎖−生物学的／化学的官能基の複合体を調製するための方法であって、以下のステップ：１）反復鎖−生化学的官能基を調製すること、これは、生物学的／化学的エフェクター基または検出官能基を、モノマーに対する結合特異性を有する結合ドメインの反復鎖へ、連結するか、コンジュゲートするか、または、融合するステップを含む；および、２）複数モノマー／反復鎖−生物学的／化学的官能基の複合体を、ステップ１）で調製された反復鎖−生物学的／化学的エフェクター基をモノマーと混合することにより調製すること、を含む、前記方法を提供する。
［１１］本発明は、［９］に記載の方法により調製された、モノマーに対して特異的に結合する結合ドメインの、反復鎖−生物学的／化学的エフェクター基を提供する。
［１２］本発明は、［１０］に記載の方法により調製された、複数モノマー／反復鎖−生物学的／化学的官能基の複合体を提供する。
［１３］本発明は、標的の生化学的機能の分析、検出、診断および処置のための方法であって、［１２］に記載の複数モノマー／反復鎖−生物学的／化学的官能基の複合体を、モノマー標的と混合するという、超複合体を形成するステップを含む、前記方法を提供する。
【００１５】
発明の効果
本発明においては、複数のモノマーが反復鎖に結合し、複合体の形成をもたらす。その後、不溶性の超複合体が複合体間の交差結合により形成され、これは高濃度で含まれている場合に沈殿する。超複合体の凝集、沈殿、およびサイズは、モノマーおよび反復鎖の構造に依存する。反復鎖における結合ドメインの反復数は、複合体間の交差結合に影響する。一方、モノマーの水溶性と分子サイズは、複合体間の交差結合のチャンスに影響する。前記超複合体は複数のモノマーを含むため、モノマー標的に対して、単一のモノマーよりも何倍も高い生物学的および化学的効果を提供でき、したがって、検出信号の増幅、機能的効果、代表的なモノマーである抗体を使用した治療効果に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
本発明の好ましい態様の適用は、添付の図面を参照して最もよく理解され、ここで：
【図１】図１は、ＧＲ１〜１０を含む発現プラスミドの構築を示す模式図である。図１ａは、ｐＧＲ２ベクター〜ｐＧＲ２０ベクターの構築を示す図である。正確には、ｐＧＲ１ベクターを最初に構築し、ｐＧＲ２〜ｐＧＲ１０ベクターはｐＧＲ１ベクターを用いて構築し、同様にｐＧＲ１１〜ｐＧＲ２０ベクターを構築した。各プラスミドは、ドメインＩＩＩの間に１つのＧ４Ｓリンカーを有する。図１ｂは、例えばｐＧＲ２−２、ｐＧＲ２−３およびｐＧＲ２−４などのｐＧＲ２系が、２つのドメインＩＩＩの間に、それぞれ２、３、および４個のＧ４Ｓリンカーを含むことを示す図である。
【図２】図２は、精製されたプロテインＧドメインＩＩＩ反復鎖を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。精製された反復鎖は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。レーン１〜レーン１３は、それぞれＧＲ１、ＧＲ２、ＧＲ２−２、ＧＲ２−３、ＧＲ２−４、ＧＲ３、ＧＲ４、ＧＲ５、ＧＲ６、ＧＲ７、ＧＲ８、ＧＲ９およびＧＲ１０を示す。
【００１７】
【図３】図３は、ＧＲ系複合体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す図である。２つの垂直矢印は、ジスルフィド二量体（左）［Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２とモノマー（右）Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８のピークを示す。右の表はＧＲ複合体の分子量の比較を示し、ここでモノマー（■）およびジスルフィド架橋二量体（●）の見かけの分子量が提示される。概略図は、ＧＲ３またはＧＲ７とＦａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８の複合体を示す図である。
【図４】図４は、ＧＲ２−２、ＧＲ２−３およびＧＲ２−４複合体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す図である。Ａは、サイズ排除クロマトグラフィーを示す。２つの垂直矢印の１つ、左の矢印は、［Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のピークを示し、右の矢印は、Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８のピークを示す。Ｂは、Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８とＧＲ２−２、ＧＲ２−３またはＧＲ２−４の複合体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す。画分を、非還元８％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動に供した。９ｍｌ〜１５．５ｍｌの溶出量に対応する画分を分析した。矢印は、［Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２を示す。矢じり部は、Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８を示す。Ｃは、還元１２％ポリアクリルアミドゲル上で実施された電気泳動を示す。矢印、矢じり部および白抜きの矢印は、それぞれＦａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８、Ｈ６−ＬおよびＧＲタンパク質を示す。
【００１８】
【図５】図５は、［Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２およびＦａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８と、ＧＲ２またはＧＲ３の複合体の分析結果を提示する図である。Ａは、サイズ排除クロマトグラフィーを示す。３９５μｇの［Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２およびＦａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８の混合物を、ＧＲ２またはＧＲ３タンパク質と混合した。この時、１５μｇのＧＲタンパク質を用いた。垂直矢印および数字は、ピークの位置を示す。Ｂは、溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。［Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２およびＦａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８の混合物を対照として使用し、続いて非還元８％アクリルアミドゲル上で電気泳動を行った。７ｍｌ〜１２．５ｍｌの溶出量に対応する画分（＃１３〜＃２６）を比較した。黒の矢印と白抜き矢印は、それぞれ［Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２およびＦａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８を示す。
【図６】図６は、Ｆａｂ−ＰＥ３８モノマーとＧＲ２−２、ＧＲ２−３またはＧＲ２−４を混合することにより調製されるタンパク質の、サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す図である。垂直矢印は、対照である；右の矢印はＦａｂ−ＰＥ３８のモノマーを示し、左の矢印はジスルフィド架橋二量体を示す。Ｆａｂ−ＰＥ３８モノマーとＧＲ２−２〜ＧＲ２−４の混合物はクロマトグラム上でオーバーラップしており、２つのＦａｂ−ＰＥ３８モノマーが生成された複合体に含まれ、これがモノマー二量体の形態で複合体となっていることを示唆する。
【００１９】
【図７】図７は、ＧＲ反復鎖とＦａｂ−ＰＥ３８タンパク質の複合体の精製のための、サイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す図である。タンパク質は、最終的にサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。すべてのクロマトグラムは、ＯＤ２８０で取得したレコードである。クロマトグラムは、同じ溶出量に従ってオーバーラップさせた。Ａ：Hiload superdex-75 pg (26/60)カラムをＧＲ１〜６の精製に使用した。Ｂ：Hiload superdex-200 pg (26/60)カラムを、ＧＲ７〜１０の精製に使用した。Ｃ：Hiload superdex-200 pg (26/60)カラムを、抗体−毒素の最終精製のために使用した。
【図８】図８は、８％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図であり、Ｆａｂ−毒素モノマーとＧＲ１０またはＧＲ２−２、ＧＲ２−３もしくはＧＲ２−４の複合体における酸化還元反応による、Ｆａｂ−毒素モノマーからのジスルフィド架橋二量体の形成を証明する。第１経路：Ｆａｂ−毒素モノマー、反応出発物質。第２経路：試料を、室温で４０ｍＭの２−メルカプトエタノールを用いて３０分間還元した。第３経路：試料を、５ｍＭのグルタチオン酸化型（ＧＳＳＧ）により３７℃で２時間酸化した。矢印は、上からそれぞれ、ジスルフィド架橋二量体、Ｆａｂ−毒素モノマーおよびＦｄ鎖を示す。
【００２０】
【図９】図９は、従来のウエスタンブロッティング試薬を使用して、ＧＲ１０を用いたウエスタンブロッティングによる、化学発光信号の増幅を示す図である；レーンＡ：２０μｇのＡ４３１全細胞溶解物（ＷＣＬ）；レーン１：２μｇのＡ４３１ ＷＣＬ；レーン２：１μｇのＡ４３１ ＷＣＬ；レーン３：０．５μｇのＡ４３１ ＷＣＬ；ＧＲ１０で処理したウエスタンブロット：ＧＲ１０処理のウエスタンブロッティングは、従来のウエスタンブロッティングと比較して、３２倍増幅された信号を提供する。
【図１０】図１０は、ＧＲ１０反復鎖によって引き起こされるウエスタンブロット化学発光信号の増幅を示す図である。ａ：マウス抗βアクチンモノクローナル抗体とＧＲ１０の複合体により調製された超複合体により提供された、１７倍高い信号。ｂ：ニトロセルロース膜のものと同様の、超複合体による信号増幅、ここで超複合体は、Ａ４３１透明細胞溶解物の１０％変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離の後に、生成物をＰＶＤＦ膜へ移送することにより得た。
【００２１】
【図１１】図１１は、ＧＲ１０によるＥＬＩＳＡ感度の増加を示す図である。ａ：各ウェルは、１ｇのＡＧＳ細胞溶解物でコーティングした。一次抗体は、連続的に希釈した。ｂ：一次抗体のみによる処理と比較した場合の、超複合体形成のために一次抗体の希釈率を考慮して添加された、ＧＲ１０に対して異なるモル比の一次抗体に応じた、Ａ４５０のＯＤの増加を示すグラフである。ｃ：一次抗体を１：１２０の希釈率に固定し、ＡＧＳ細胞溶解物を連続的に希釈した。次に、９６ウェルプレートの各ウェルを細胞溶解物でコーティングした。ｄ：一次抗体のみによる処理と比較した場合の、超複合体形成のために各ウェルをコーティングする細胞溶解物の濃度を考慮して添加された、ＧＲ１０に対する一次抗体のモル比に応じた、Ａ４５０のＯＤの増加を示すグラフである。
【図１２】図１２は、二次抗体の連続希釈に応じた、信号増幅の効果を示す図である。
【００２２】
【図１３】図１３は、ＧＲ１０による、迅速抗原検査キットの検出感度の増加を示す図である。
【図１４】図１４は、ＧＲ１−ＦＩＴＣコンジュゲートの使用による、ヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１を用いた免疫蛍光の結果を示す図である。
【図１５】図１５は、迅速抗原検査の過程における、ＧＲ反復鎖と試験ライン抗体(test line antibody)の間の交差結合を示す図である。
【図１６】図１６は、迅速抗原検査の過程における、ＡＲ、ＬＲまたはＬＡＲ反復鎖と試験ライン抗体の間の交差結合を示す図である。
【図１７】図１７は、ＧＲ５による、迅速抗原検査キットの検出感度の増加を示す図である。
【図１８】図１８は、ＧＲ１０による、迅速抗原検査キットの検出感度の増加を示す図である。
【００２３】
【図１９】図１９は、ＧＲ１５による、迅速抗原検査キットの検出感度の増加を示す図である。
【図２０】図２０は、ＧＲ２０による、迅速抗原検査キットの検出感度の増加を示す図である。
【図２１】図２１は、ＡＲ５による、迅速抗原検査キットの検出感度の増加を示す図である。
【図２２】図２２は、ＬＲ５による、迅速抗原検査キットの検出感度の増加を示す図である。
【図２３】図２３は、ＬＡＲ３による、迅速抗原検査キットの検出感度の増加を示す図である。
【図２４】図２４は、ＧＲ１０がＩｇＧと超複合体を形成し、超複合体が水溶液に溶解せずに析出したことを示す図である。ＩｇＧとＧＲ１０は、左から、１：１、５：１および１０：１のモル比で混合し、続いて反応させた。
【００２４】
【図２５】図２５は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図であり、ＧＲ／ＩｇＧ超複合体沈殿物が、ＩｇＧをＧＲ１０と混合した場合に、ＩｇＧをＧＲ１またはＧＲ２と混合した場合よりもより多いことを確認する。各試料の１／３６を、非還元１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで調べた。レーン１およびレーン２は、それぞれＩｇＧとＧＲ１０の反応から生成した沈殿物および上清である。レーン３〜レーン６は、ＩｇＧと、ＧＲ１とＧＲ２の反応から生成した沈殿物および上清を、この順序で示す。レーン７およびレーン８は、ＢＳＡとＩｇＧの反応により調製した対照試料であり、レーン９およびレーン１０は、ＩｇＧのみを含有する対照試料である。
【図２６】図２６は、ＧＲ／ＩｇＧ超複合体の形成により生成された沈殿物を示す図である。ＧＲ１〜ＧＲ１０を、ＩｇＧと反応させた。対照としては、ＢＳＡをＩｇＧと反応させたものとＩｇＧのみを選択し、これらを１３，０００ｒｐｍで２０℃にて３０分間遠心分離した。微量遠心管を逆さにし、沈殿物を肉眼で確認した。円が、形成された沈殿物を示す。
【００２５】
【図２７】図２７は、ＧＲ／ＩｇＧ超複合体の形成により生成された沈殿物を確認する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。レーン１〜レーン２０は、ＧＲ１〜１０とＩｇＧの反応から生成した沈殿物および上清を、この順序で示す。レーン２１とレーン２２は、ＢＳＡとＩｇＧの反応の結果である対照である。レーン２１とレーン２２は、ＢＳＡとＩｇＧの反応により調製した対照試料であり、レーン２３とレーン２４は、ＩｇＧのみを含有する対照試料である。各試料の１／３０を、還元１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで調べた
【図２８】図２８は、ＧＲ１０よりも大きいＧＲが、ＩｇＧと超複合体を形成可能であるかどうかを調べた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。レーン１〜レーン１２は、ＧＲ１、３、５、１０、１５および２０とＩｇＧの反応から生成した沈殿物および上清を、この順序で示す。レーン１３とレーン１４は、ＩｇＧのみから作製された対照試料沈殿物および上清である。各試料の１／１０を、還元１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで調べた
【００２６】
【図２９ａ】図２９ａは、２つのウエスタンブロッティング結果の比較を示す図であり、ここで、ＧＲにより検出限界を拡張したウエスタンブロッティングを、ＧＲを使用しないウエスタンブロッティング結果と比較した。
【図２９ｂ】図２９ｂには、図２９ａの結果を図式化した。
【図３０】図３０Ａは、等量の抗原の存在下で、ＧＲによる化学発光信号の増幅を確認するウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図３０Ｂは、図３０Ａの結果を示すグラフである。
【図３１】図３１Ａは、ＧＲ超複合体によるウエスタンブロット信号の増幅が、他の抗原を用いて確認されたことを示す図である。図３１Ｂは、ウエスタンブロット信号の増幅が、異なる一次抗体の存在下で反復鎖により達成可能であることを示す図である。
【００２７】
【図３２】図３２Ａは、反復鎖による、ウエスタンブロット信号の増幅レベルの比較を示す図である。正確には、これは、同一条件下での、ＧＲ１０、ＡＲ１０およびＭＡＲ５（Ｌが異なる、ＬＡＲ５反復鎖）によるウエスタンブロット信号の増幅レベルの比較を示す図である。図３２Ｂは、ＬＲ１０を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図３３】図３３は、ＧＲ系タンパク質の反復鎖と、金抗体複合体または超複合体検出ライン抗体(detection line antibody)の間の、交差結合を示す図である。
【図３４】図３４は、ＡＲ系タンパク質の反復鎖と、金抗体複合体または超複合体検出ライン抗体の間の、交差結合を示す図である。
【００２８】
【図３５】図３５は、ＬＲ系タンパク質の反復鎖と、金抗体複合体または超複合体検出ライン抗体の間の、交差結合を示す図である。
【図３６】図３６は、ＭＡＲ系タンパク質の反復鎖と、金抗体複合体または超複合体検出ライン抗体の間の、交差結合を示す図である。
【図３７】図３７は、精製されたＴＲ１、３、５、１０、１５および２０（＝ＧＲ１、３、５、１０、１５、２０）タンパク質と、それに付着されたＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８を、２−メルカプトエタノールにより還元し、次にグルタチオン酸化型（ＧＳＳＧ）に酸化して生成した［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２を用いた、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【００２９】
【図３８】図３８は、精製されたＧＲ５、ＧＲ１０、ＧＲ１５およびＧＲ２０（＝ＴＲ５、ＴＲ１０、ＴＲ１５、ＴＲ２０）タンパク質と、それに付着されたハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８を、２−メルカプトエタノールにより還元し、次にグルタチオン酸化型（ＧＳＳＧ）に酸化して生成した[ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８]２を用いた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図３９】図３９は、ＧＲ反復鎖タンパク質と[ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８]２モノマーの複合体の、ＳＫＢＲ３細胞およびＢＴ４７４細胞に対する細胞毒性効果を示す図である。
【図４０】図４０は、ＧＲ反復鎖タンパク質と[ｅ２３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］モノマーの複合体の、ＳＫＢＲ３細胞およびＢＴ４７４細胞に対する細胞毒性効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
好ましい態様の説明
以下に、本発明で使用される用語を定義する。
本明細書における用語「結合剤反復鎖」は、抗体などのモノマーに対する結合特異性を有する部位が反復されている物質により生成された、組換えタンパク質を指す。本明細書において結合特異性を有する部位とは、モノマーに対して結合特異性を示す結合ドメインを指す。天然のタンパク質においては、モノマーに特異的に結合するドメインが、示された部位である。
本発明で使用する用語「抗体モノマー」は、抗体に由来する分子を指し、抗体断片または他のタンパク質もしくは機能的生物学的−化学的分子とコンジュゲートした抗体を含み、これらは反復鎖に結合すると考えられる。天然の抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を有する。１つの重鎖と１つの軽鎖が１つのユニットで対をなす場合には、これは二量体と呼ばれるが、本発明においては、一般的な天然の抗体が反復鎖とコンジュゲートしている場合、これは「抗体モノマー」と呼ばれる。
【００３１】
本発明において用語「複数抗体モノマー／反復鎖複合体」は、前記抗体モノマーを、前記モノマーに特異的に結合する結合剤の反復鎖に接触させることにより調製される、複合体を指す。
用語「複数抗体モノマー／反復鎖複合体の超複合体」とは、前記抗体モノマーを、前記モノマーに特異的に結合する結合剤の反復鎖に接触させることにより調製される複合体の間の交差結合により形成される、複合体の集合体である超複合体を指す。
また、本発明で使用する用語「抗原／複数抗体モノマー／反復鎖複合体」は、前記複数抗体モノマー／反復鎖複合体を、抗原に接触させることにより調製される複合体を指す。
【００３２】
本発明において用語「抗原／複数抗体モノマー／反復鎖複合体の超複合体」は、超複合体と抗原のコンジュゲートであって、複数抗体モノマー／反復鎖複合体の間の交差結合により形成された複合体の集合体である超複合体を、抗原に接触させることにより生成された、または、抗原／反復鎖混合物を最初に調製し、次のこの混合物を抗原の存在下で抗体モノマーに添加して、超複合体を形成することにより生成された、前記超複合体を指す。
【００３３】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明は、反復鎖を調製する方法であって、モノマーに特異的に結合しかつ１つのモノマー中の少なくとも２つの結合部位を含む単一種類の結合ドメインまたは複数種類の結合ドメインが反復される反復鎖を、生成するステップを含む、前記方法を提供する。
本発明はまた、複数モノマー／反復鎖の複合体を調製する方法であって、複数モノマー／反復鎖複合体を、上記方法により調製された反復鎖を複数のモノマーと混合することにより調製するステップを含む、前記方法も提供する。
本発明はまた、超複合体を調製する方法であって、前記複合体の集合体を、上記方法により調製された複数モノマー／反復鎖複合体の間の交差結合により形成するステップを含む、前記方法も提供する。
【００３４】
上記の方法において、モノマーは、好ましくはタンパク質であり、これはより好ましくは、抗体、リガンドおよび受容体、その断片、その組換えコンジュゲート、その誘導体、および生物学的／化学的エフェクター基のコンジュゲートからなる群から選択される。
上記の方法において、抗体は、好ましくは、抗体断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ断片を含有する断片、Ｆｖ断片、Ｆｖ断片を含有する断片、Ｆｃ断片およびＦｃ断片を含有する断片からなる群から選択される。
上記の方法において、結合ドメインは、好ましくはタンパク質、より好ましくは微生物由来タンパク質であり、これはより好ましくは、連鎖球菌のプロテインＧ、Staphylococcus aureusのプロテインＡ、Peptostreptococcus magnusのプロテインＬおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の反復鎖において、フレキシブルリンカー鎖を含めることができて、これにより、各ドメインがその内部の反復結合ドメインの間で自由に回転し、ドメイン間の距離を維持することができる。モノマーが共に結合すると、モノマー間の衝突は立体的な障害を引き起こし、結合反応速度定数の減少をもたらし、このことは、結合反応の平衡定数の低下が防止されて、高い結合反応の平衡が得られることを示唆する。
【００３６】
結合ドメイン反復鎖において、結合ドメインは自由に回転することができ、鎖の曲げも、結合ドメイン間のフレキシブルリンカーによって可能である。したがって、モノマーと反復鎖により形成された複合体において、各結合モノマーは、回転の自由と振動の自由を、曲げの自由と共に有することができる。したがって、各モノマーは、制限された回転方向または狭い屈曲角度のみではなく、広い方向範囲と広い角度範囲に自由に移動可能であるために、互いの衝突が回避でき、複数のモノマーが同時に反復鎖に結合可能である。フレキシブルリンカー配列は、結合ドメインの間に大きな空間を作るため、コンジュゲーションのために反復鎖に近づいてくる多数のモノマーが、互いの間のいかなる立体障害なしに、反復鎖に結合することができる。本発明の反復鎖のために使用することができる結合ドメインを有する天然タンパク質は、結合ドメイン間にかかるフレキシビリティを有しない。天然のタンパク質は、その内部の結合ドメインにかかる自由度を許容せず、複数モノマーと複合体を形成するためにこれに近づくモノマー、またはこれに既に結合したモノマーは、かかる高レベルの回転の自由および振動の自由を有することができない。
【００３７】
本発明の反復鎖のために使用する結合ドメインは、好ましくは、天然のタンパク質断片であり、この種類の天然のタンパク質断片は、全天然タンパク質よりも低い分子量を有する。比較的高い分子量を有し上記断片が誘導される天然タンパク質よりも、より多くの結合ドメインを有し、かつ低い分子量を有する反復鎖を、かかる低分子量結合ドメインを用いることにより調製された人工的に設計された反復鎖を用いて、構築することができる。したがって、多数のモノマーが、低分子量の反復鎖に結合することができる。多くの結合ドメインを有するが低分子量の反復鎖は、生産および精製が容易であり、これは、天然のタンパク質にはない、大きな利点である。本発明において、結合ドメインが２０回反復される反復鎖が構築されているが、反復の数はこれに限定されない。
多くの結合ドメインと低分子量を特徴とする反復鎖を使用する場合、モノマーの効果を増幅することができ、これは、モノマーの結合分子（天然の微生物タンパク質分子、本発明において反復鎖）に対する割合がこの時点で高いためであり、これは天然分子からは得ることができない。かかる反復鎖は低分子量であるため、合成タンパク質の生産に有用である。
【００３８】
本発明において、モノマーは、異なる部位ａ’およびｂ’を有していなければならず、結合剤は対応する結合部位ａおよびｂを有していなければならず、したがって、複数モノマー／反復鎖複合体を含む超複合体の形成のために、反復鎖は、反復ａおよびｂの少なくとも１つを有していなければならず、モノマーは、各ａ’およびｂ’の少なくとも１つを有していなければならない。
本発明において、モノマーは、ａ’およびｂ’を（ａ’ｂ’）の形態で共に有していなければならず、反復鎖の結合ドメインは、結合部位ａおよびｂを、（ａｂ）−（ａｂ）−（ａｂ）−−−−（ａｂ）の反復を形成するために共に有していなければならないか、または結合部位ａおよびｂは、ａ−ｂ−ａ−ｂ−ａ−ｂ−−−−ａ−ｂの形態の反復を作る異なる結合ドメインに独立して留まっており、これは、独立した結合部位ａおよびｂが、別々に反復されることを意味する。反復鎖の独立したドメインａおよびｂの数および順序は、限定されない。ａ＝ｂの場合、モノマーは（ａ’ａ’）であり、反復鎖は、（ａａ）−（ａａ）−（ａａ）−−−またはａ−ａ−ａ−ａ−ａ−−−−−−の形態である。
【００３９】
本発明において、交差結合による複合体の形成のための反復鎖は、互いに結合する結合ドメイン、ｃおよびｄを有することができ、この時、これらのドメインは独立しており、複数モノマーと反復鎖の間の結合に関与していない。反復鎖がｃ−ａ−ａ−ａ−−−−−−−ｄで構成されている場合、前記モノマーはドメインａに結合し、複合体間の交差結合は、ｃとｄの間の結合によって達成される。例えば、超複合体は、ｃ−ａ−ａ−ａ−−−−−ａ−ｄ．．．ｃ−ａ−ａ−ａ−−−−−ａ−ｄ．．．．ｃ−ａ−ａ−ａ−−−−−ａ−ｄで構成することができ、ここで「．．．」は反復鎖の間の交差結合を示す。その後に形成される超複合体は、反復鎖に結合したモノマーの効果を増幅することができる。この時、反復鎖の構造において、１つの反復鎖中のドメインｃおよびｄは堅固で、互いに結合しないように曲がらないことが必要である。１つの反復鎖中でドメインｃとｄが互いに結合する場合、複数モノマー／反復鎖複合体の間の交差結合のチャンスは非常に低く、したがって、超複合体形成のチャンスも非常に低くなる。１つの反復鎖中のドメインｃが、モノマーと交差結合する前に、別の反復鎖中のドメインｄに結合することは、望ましくない。もし２つの異なる反復鎖の間にかかる結合が作られると、反復鎖の制御が困難であり、したがってモノマーと複合体を形成することは困難である。
【００４０】
本発明はまた、モノマーに特異的に結合しかつ１つのモノマー中の少なくとも２個の結合部位を有する１種類の結合ドメインまたは異なる種類の結合ドメインが反復されている、反復鎖を提供する。
本発明はまた、複数モノマー／反復鎖の複合体であって、複数のモノマーが前記反復鎖に結合されている、前記複合体も提供する。
本発明はまた、複数モノマー／反復鎖複合体の間の交差結合によりもたらされる、複合体の集合体である超複合体も提供する。
【００４１】
本明細書においてモノマーは、好ましくはタンパク質であり、これはより好ましくは、抗体、リガンドおよび受容体、その断片、その組換えコンジュゲート、その誘導体および生物学的／化学的エフェクター基のコンジュゲートからなる群から選択される。
本明細書において抗体は、好ましくは、抗体断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ断片を含有する断片、Ｆｖ断片、Ｆｖ断片を含有する断片、Ｆｃ断片およびＦｃ断片を含有する断片からなる群から選択される。
本明細書において結合ドメインは、好ましくはタンパク質、より好ましくは微生物由来タンパク質であり、これはより好ましくは、連鎖球菌のプロテインＧ、Staphylococcus aureusのプロテインＡ、Peptostreptococcus magnusのプロテインＬおよびそれらの誘導体からなる群から選択される。
【００４２】
本発明はまた、モノマーの効果を増幅する方法であって、モノマーの標的上の超複合体を、本発明の反復鎖、本発明の複数モノマー／反復鎖の複合体、またはそれらの超複合体を混合することにより形成するステップを含む、前記方法を提供する。
上記の方法において、標的に対するモノマーの効果を測定するステップを、さらに含めることができる。
上記の方法において、モノマーの標的は、好ましくは、抗原、抗体、ペプチド、タンパク質、細菌、ウイルス、および真菌、またはそれらの断片からなる群から選択されるが、これらに限定はされない。
前記細菌は好ましくは、ピロリ菌、Mycobacterium tuberculosisおよびChlamydia trachomatisからなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００４３】
前記ウイルスは、好ましくは、インフルエンザ、口蹄疫ウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎表面抗原およびＢ型肝炎表面抗体からなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定されない。
上記の方法において、モノマーの効果の測定は、好ましくは、モノマー−マーカーコンジュゲートまたは二次検出器（抗体）−マーカーコンジュゲートおよびマーカーの基質を用いて行われるが、必ずしもこれに限定されない。
本発明における超複合体の形成は、信号増幅を含むモノマーの効果の増幅に有利であるが、その理由は、本発明の超複合体が複数のモノマーを含み、モノマーの標的に対する生物学的および化学的効果を増加させるからであり、これは、単一のモノマーが提供できるよりも何倍も高い。
【００４４】
本発明は、結合ドメインの反復鎖を含む分析キットを提供し、ここで該結合ドメインは、検出標的に特異的であり、１つのモノマー中に少なくとも２つの結合部位を有する複数のモノマーを含み、該モノマーに対する結合特異性を有する。
キットは好ましくは、以下から構成されている：
１）モノマーに対する結合特異性を有する結合ドメインの反復鎖；
２）検出標的に特異的に結合するモノマー；
３）基質との反応により活性化されたマーカーで標識された、二次プローブコンジュゲート；
４）マーカーと反応する基質溶液；
５）各反応段階のための洗浄緩衝液；および、
６）酵素反応を停止させるための停止溶液；ただし、必ずしもこれらに限定はされない。
【００４５】
本明細書においてキットは、免疫組織化学的手法、免疫ブロット法、免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、凝集、免疫クロマトグラフィーアッセイおよびラジオイムノアッセイからなる群から選択される分析法のために使用することができる。
本明細書においてマーカーは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、金コロイド、フルオレセイン、量子ドット、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）、アセチルコリンエステラーゼ、同位体および色素からなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定はされない。
本明細書において基質は、好ましくは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート／ヨードニトロテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＩＮＴ）、ニューフクシン（ＮＦ）およびファストレッドＴＲ塩からなる群から選択されるが、必ずしもこれらに限定はされない。
【００４６】
本発明は、反復鎖検出官能基を調製するための方法であって、検出官能基を、モノマーに結合する結合ドメインの反復鎖へ、連結するか、コンジュゲートするか、または、融合するステップを含む、前記方法を提供する。
本発明はまた、複数モノマー／反復鎖検出官能基の複合体を調製するための方法であって、以下のステップ：
１）検出官能基を、モノマーに結合する結合ドメインの反復鎖へ、連結するか、コンジュゲートするか、または、融合することにより、反復鎖検出官能基を調製すること；および
２）複数モノマーを、ステップ１）で調製した反復鎖検出官能基と混合することにより、複数モノマー／反復鎖検出官能基の複合体を調製すること；
を含む、前記方法を提供する。
【００４７】
本発明はまた、検出官能基をモノマーに結合する結合ドメインの反復鎖へ連結するか、コンジュゲートするか、または、融合することにより調製された、モノマー結合ドメイン反復鎖検出官能基を提供する。
本発明はまた、複数のモノマーを、モノマー結合ドメイン反復鎖検出官能基へコンジュゲートすることにより調製された、複数モノマー／反復鎖検出官能基の複合体を提供する。
本発明はまた、モノマーの標的を検出する方法であって、本発明の複数モノマー／反復鎖検出官能基複合体とモノマー標的を混合することにより、超複合体を形成するステップを含む、前記方法を提供する。
上記の方法において、モノマーの標的検出レベルを測定する追加のステップを含むことができる。
上記の方法において、検出官能基は、好ましくは、ＣＹ−３、ＣＹ−５、ＦＩＴＣ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）およびテキサスレッドからなる群から選択されるが、これに限定されない。
【００４８】
上記の方法において、モノマーが抗体である場合、抗体は好ましくは、抗体断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ断片を含有する断片、Ｆｖ断片、Ｆｖ断片を含有する断片、Ｆｃ断片およびＦｃ断片を含有する断片からなる群から選択される。
本発明は、癌細胞特異的抗体−毒素超複合体を、抗癌剤である抗体−毒素（免疫毒素）を用いて生産するために使用することができる。こうして生産された抗体−毒素超複合体は、優れた薬効を有し、したがって大量の細胞殺傷官能基の標的癌細胞への送達が可能となり、これにより、積極的な癌処置効果が期待されている。
【００４９】
本発明の実用的で現在好ましい態様は、以下の実施例に示すように、例示である。
しかしながら当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲内で修正および改善を行うことができることが、理解されるであろう。
【００５０】
例１：プロテインＧ抗体結合ドメインＩＩＩ反復鎖ＧＲ８〜ＧＲ２０、ＧＲ２−２、２−３、２−４の調製
プロテインＧドメインＩＩＩ遺伝子は、Korean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）から配布されたＫＣＴＣ３０９８の染色体ＤＮＡから得た。Ｇ４Ｓリンカーが２つのドメインＩＩＩの間に２〜４回反復された、プラスミドｐＧＲ２−２〜ｐＧＲ２−４を構築した。プロテインＧドメインＩＩＩを含有するプラスミドｐＧＲ１（Y. Lee et al, Enhanced Formation of Disulfide-bridged Dimer(Fab-PE38)2 Utilizing Repeats of the Fab Binding Domain of Protein G (2010) J. Biol. Chem. 285, 5127-5131）を、ドメインＩＩＩの端部のＧ４Ｓリンカーの前の追加のＡｇｅＩ制限酵素部位に、部位特異的突然変異誘発を用いて挿入し、ｐＧＲ１−Ａを構築した。
【００５１】
Quick-change部位特異的突然変異誘発は、２つのプライマーＰ３[5'-AGACCTTTAC GGTAACTCAA ACCGGTGGAG GCGGGTCCGG ATA-3'（配列番号１）]およびＰ４[5'-TATCCGGACC CGCCTCCACC GGTTTCAGTT ACCGTAAAGG TCT-3'（配列番号２）]を使用して行った。突然変異誘発後、ｐＧＲ１−Ａの核酸配列をジデオキシＤＮＡ配列決定によって確認した。プラスミドｐＧＲ１−Ａを、ＮｄｅＩおよびＢｓｐＥＩで消化し、それによって得られた断片を精製した。その後、ｐＧＲ１を、ＮｄｅＩ部位および６ Ｈｉｓタグ部位の後ろに位置するＡｇｅＩで消化した。ＰＧＲ２−Ａは、２つの断片をライゲーションすることにより構築した；２つの断片は、ｐＧＲ１をＮｄｅＩおよびＡｇｅＩで消化することによって得られる大断片、および、ｐＧＲ１−ＡをＮｄｅＩおよびＢｓｐＥＩで消化することによって得られる小断片である。得られたｐＧＲ２−Ａを、ＮｄｅＩおよびＡｇｅＩで消化して、プロテインＧの第２ドメインＩＩＩおよびその前のＧ４Ｓリンカーを未だに保有する大断片を得た。この大断片を、ｐＧＲ１−ＡをＮｄｅＩおよびＢｓｐＥＩで消化することによって得た小断片にライゲートし、第１ドメインＩＩＩと第２ドメインＩＩＩの間に２つのＧ４Ｓリンカーを含有する、ｐＧＲ２−２を構築した。さらに、３つのＧ４Ｓリンカーを有するｐＧＲ２−３および、４つのＧ４Ｓリンカーを有するｐＧＲ２−４も、上記ｐＧＲ２−２の構築に用いたのと同じ方法で構築した。
ＧＲ８〜ＧＲ２０は、ｐＧＲ１の論文に記載された方法により調製した（Y. Lee et al, Enhanced Formation of Disulfide-bridged Dimer(Fab-PE38)2 Utilizing Repeats of the Fab Binding Domain of Protein G (2010) J. Biol. Chem. 285, 5127-5131）。発現プラスミドの構築は、図１に示す方法により行い、精製された反復鎖は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図２）。
【００５２】
例２：Ｆａｂ−毒素モノマーと、プロテインＧドメインＩＩＩ反復鎖ＧＲ１〜ＧＲ１０、ＧＲ２−２、２−３および２−４の複合体を用いたサイズ排除クロマトグラフィーおよび複合体中のジスルフィド架橋二量体の形成
免疫グロブリンに結合するプロテインＧドメインＩＩＩは、ＩｇＧのＦｃおよびＦａｂ断片に結合することができる。プロテインＧの免疫グロブリン結合部位（ドメインＩＩＩ）は、以前の報告によると、Ｆａｂ断片ＣＨ１に結合することが知られている。プロテインＧドメインIIIの第２のβ鎖は、Ｆａｂ ＣＨ１ドメインの第７のβ鎖に反平行の位置で結合する。これら２つのタンパク質間のβ／β相互作用は、ＣＨ１ドメインとドメインＩＩＩの間に５つの水素結合を許容する。加えて、他の３つの水素結合もまた、ＣＨ１ドメインの主要な原子の中に見出すことができる。これら２つのタンパク質が複合体を形成するにもかかわらず、ドメインＩＩＩまたはＣＨ１ドメインの構造に変化は見られない。
【００５３】
本発明において、ドメインＩＩＩの反復を有する、２つの異なる種類の反復鎖が調製された。まず、ドメインＩＩＩの間に１つのＧ４Ｓアミノ酸を有する反復鎖を調製した。ドメインＩＩＩがその中に１０回反復されている反復鎖を、Ｆａｂ−ＰＥ３８モノマーとの会合のために使用して、複合体を形成した。本明細書で使用される反復鎖はＧＲ１〜ＧＲ１０である。この種類の反復鎖をモノマーと会合させると、複数モノマー（２、３または４個のモノマー）を含む複合体が調製可能である。
本発明者らはまた、２つのドメインＩＩＩの間に異なる長さのＧ４Ｓリンカーを有する反復鎖を調製した。Ｆａｂ−ＰＥ３８ドメインとドメインＩＩＩの会合において、リンカーによる差が存在する。反復鎖ＧＲ２−２、ＧＲ２−３およびＧＲ２−４をそれに応じて調製し、これらは２つのドメインＩＩＩの間に２、３、および４個のＧ４Ｓリンカーを有していた。したがって、２つのＦａｂ−ＰＥ３８モノマーは、反復鎖に結合されて複合体を形成し、結果として、モノマーの二量体の長さを調整することができた。
【００５４】
ＧＲ２−２、ＧＲ２−３およびＧＲ２−４との非共有結合によって形成された複合体を、サイズ排除カラムクロマトグラフィーで分析した。
ＧＲ系複合体を用いたサイズ排除クロマトグラフィーの結果を、図３に示す。サイズ排除クロマトグラフィーは、Superdex-200 TM HRカラムを用いて行った。Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８とＧＲ系の会合は、異なる比率で実施した。７１５μｇのＦａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８を、各ＧＲタンパク質と会合させた。Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８とＧＲ１〜ＧＲ３の会合は、２：１のモル比で実施した。７１５μｇのＦａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８を、２８μｇのＧＲ４〜ＧＲ１０と会合させた。全てのクロマトグラムを、溶出量に応じてオーバーラップさせて示した。標準物質として用いた［Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２（Ｄ）およびＦａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８（Ｍ）のクロマトグラムは、同一の条件下での溶出により得た。
【００５５】
ＧＲ２−２、２−３および２−４を用いたサイズ排除クロマトグラフィーの結果を、図４に示す。
［Ｆａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２およびＦａｂ−ｅｘｔ−ＰＥ３８のＧＲ２またはＧＲ３との混合物の複合体の調査結果を、図５に示す。
Ｆａｂ−ＰＥ３８モノマーとＧＲ２−２、２−３および２−４の複合体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果を、図６に示す。
ＧＲ反復鎖とＦａｂ−ＰＥ３８タンパク質の複合体の精製のためのサイズ排除クロマトグラフィーの結果を、図７に示す。
Ｆａｂ−毒素モノマーとＧＲ１０またはＧＲ２−２、ＧＲ２−３およびＧＲ２−４の複合体中の還元／酸化混合反応による、Ｆａｂ−毒素モノマーからのジスルフィド架橋二量体の形成を確認する、８％非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図８に示す（図３〜８）。
結果として、２つのＦａｂ−ＰＥ３８モノマーは反復鎖と複合体を形成でき、またそれぞれ二量体を形成できることが確認された。
【００５６】
【表１】
0006668232.tif 000002
【００５７】
例３：ウエスタンブロッティングにより確認したプロテインＧドメインＩＩＩ反復鎖ＧＲ１０による抗体信号の増幅
cell signaling technology（登録商標）により提供されたウエスタンブロッティングプロトコルをわずかに変更して使用し、abcom（登録商標）が提供する直接ＥＬＩＳＡプロトコルの改訂版を使用した。
この実験に使用する溶液および試薬を、次のように調製した：溶液は、Milli-Qで濾過された水または同じ純度の水を用いて調製した。１）１×ＳＤＳ試料緩衝液：６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ（２５℃、ｐＨ６．８）、２％Ｗ／Ｖ ＳＤＳ、１０％グリセロール、５０ｍＭのＤＴＴ、０．０１％Ｗ／Ｖのブロモフェノールブルーまたはフェノールレッド。２）移動緩衝液：２５ｍＭのトリスベース、０．２Ｍのグリシン。３）１０×トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）：１０×ＴＢＳ、１Ｌ：２４．２ｇのトリスベース、８０ｇの塩化ナトリウム、酸性度をＨＣｌ（ｐＨ７．６）（１×）で調整した。４）オボアルブミン：（体積に対する重量［Ｗ／Ｖ］）。５）ブロッキング緩衝液：１×ＴＢＳ、０．１％のTween-20および２％Ｗ／Ｖニワトリ血清アルブミン。６）洗浄緩衝液：１×ＴＢＳ、０．１％のTween-20（ＴＢＳ／Ｔ）。７）一次抗体：抗β−アクチンマウス抗体（Santa Cruz Biotech）。８）一次抗体希釈緩衝液：１×ＴＢＳ、０．１％のTween-20および２％Ｗ／Ｖニワトリ血清アルブミン。９）二次抗体：ヤギ抗マウスβアクチンＨＲＰ。１０）ブロッティング膜：ニトロセルロース膜（Wattman）、ＰＶＤＦ膜（PALL）。１１）ＧＲ組換えタンパク質：ＧＲ１０。１２）腔液：１００ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．８、１．２５ｍＭのルミノール、２ｍＭの４ＩＰＢＡ、５．３ｍＭの過酸化水素。１３）スーパー信号フェムト最大感度試薬（Thermo Scientific）。
【００５８】
以下のようにウエスタンブロッティングを実施した。細胞溶解物は、最初にＡ４３１またはＡＧＳ癌細胞株を用いて調製した後、培養培地を吸引除去した。具体的には、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳも吸引により除去した。その後、１×ＳＤＳ試料緩衝液をこれに添加して細胞を溶解し、続いて９５〜１００℃で５分間加熱した。遠心分離を５分間行い、試料を沈殿させた。その後、沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０ｃｍ×１０ｃｍ）上に置き、電気泳動を行った。その後、試料をニトロセルロース膜またはＰＶＤＦ膜に移した。
膜表面のブロッキングおよび抗体結合反応を次のように行った。溶液の容量は１０ｃｍ×１０ｃｍ（１００ｃｍ２）の膜の大きさに合わせて調整した。容量は、膜の大きさに応じて調節した。
【００５９】
膜表面ブロッキングのために、移動後にニトロセルロースまたはＰＶＤＦ膜を適切な容量のＴＢＳにより室温で５分間洗浄した。膜を適切な容量の膜表面ブロッキング緩衝液に負荷し、これを室温で１時間加温した。膜をＴＢＳ／Ｔで５分間、３回洗浄した。次に、超複合体を調製した。具体的には、ＧＲ１０を、表示の結果にリストされたモル比に応じて一次抗体と混合し、続いて３７℃で１時間加温した。生成された超複合体を氷に入れ、使用するまで氷中に保存した。その後、１０ｍｌの一次抗体希釈緩衝液を、膜／一次抗体複合体または一次抗体／反復鎖複合体と、表示の結果にリストされた希釈比に応じて混合して一次抗体反応を誘導し、続いて室温で１時間加温した。混合物を、１５ｍｌのＴＢＳ／Ｔでそれぞれ５分間、３回洗浄した。一次抗体と一致するように適切に選択されたＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：２０００）を、適切な容量の膜表面ブロッキング緩衝液と混合し、続いて室温で１時間静かに攪拌して暖かいままに維持した。混合物を、１５ｍｌのＴＢＳ／Ｔでそれぞれ５分間、３回洗浄した。区間Ｄでの検出を行った。最後に、抗原タンパク質の検出のために、ルミノール溶液またはスーパー信号フェムト最大感度試薬（Thermo Scientific）を膜と混合し、これを室温で静かに攪拌して暖かいままで維持した。過剰な展開液を除去して、乾燥しないために必要分のみ残し、次に膜をプラスチック製のｌａｂでくるみ、次にＸ線フィルムに曝露した。
【００６０】
ウエスタンブロッティングにより確認した、ＧＲ１０による化学発光信号増幅の結果を、図９に示す（図９）。
ウエスタンブロッティングにより確認した、ＧＲ１０反復鎖による化学発光信号増幅の結果を、図１０に示す（図１０）。具体的には、ＧＲ１０の超複合体および一次抗体は、カッコ内に示すモル比に従って調製し、超複合体を形成した。一次抗体は１：１０００の比で希釈し、超複合体は一次抗体と同じ濃度で調製した。ヤギ−抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体を、両方の実験の二次抗体として使用した。一次および二次抗体は全て、室温で１時間保温した。全ての細胞溶解物試料を、１０％変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、これを次にニトロセルロース膜に移した。この膜を次に３片に切断し、一次抗体で検出した。高感度を表示するThemo Supersignal Femto基質を、蛍光発色試薬として使用した。Ａ４３１透明細胞溶解物を、１０％変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移して、得られた超複合体がニトロセルロース膜と同様の高い信号増幅効果を与えることができるかどうかを調査した。膜は、初めに一次抗体のみで検出され、次いで、二次抗体と従来のＥＣＬ試薬を用いて発色を誘導した。膜をＴＢＳＴ溶液で洗浄し、続いてSupersignal Femto基質を用いて発色を誘導した。
【００６１】
その結果、非常に強いバックグラウンドノイズ信号が、正規の信号の増加に伴って検出された。このバックグラウンドノイズ信号は、二次抗体のＰＶＤＦ膜への非特異的なコンジュゲーションおよびSupersignal Femto基質の高感度に起因した。その後、抗体を、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールを用いて膜から剥離した。一次抗体と反復鎖を混合することによって調製した超複合体を、これに連結し、続いて二次抗体と従来のＥＣＬ発色試薬を用いて検出した。この時、超複合体は従来のものよりも１５倍高い感度を示し、これは、ニトロセルロース膜上で観察されたものと一致する結果であった。この実験では、感度の中間レベルを表示する従来の化学発光試薬を使用し、Haan and Behmann (2007)の方法により調製されたＥＣＬ試薬を使用した。信号増幅効果は、ニトロセルロース膜上で観察されたものと同様であり、増幅された信号は、Supersignal Femto基質を用いた場合と同様に高かった。しかし今回、バックグラウンドノイズ信号は以前のようには増加せず、今回の信号増幅が、より明確な信号を生成したことを示唆した。細胞溶解物は、ＰＶＤＦに容易に付着する傾向がある。そこで、中レベルの感度を表示する発色試薬が、少量の試料を検出するのに十分に良好であった。
【００６２】
例４：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって確認したプロテインＧドメインＩＩＩ反復鎖ＧＲ１０による抗体信号の増幅
間接ＥＬＩＳＡを次のように実施した。
この実験に使用する溶液および試薬を、次のように調製した：溶液は、Milli-Qで濾過された水または同じ純度の水を用いて調製した。１）重炭酸塩／炭酸塩コーティング緩衝液（１００ｍＭ）、抗原または抗体をウェル中で固定するためコーティング緩衝液中に希釈した：３．０３ｇのＮａ２ＣＯ３、６．０ｇのＮａＨＣＯ３、１０００ｍｌの蒸留水（ｐＨ９．６）。２）ＰＢＳ。３）ブロッキング緩衝液：１％ＢＳＡ血清を含むＰＢＳ。４）洗浄緩衝液：０．０５％（ｖ／ｖ）Tween 20を含むＰＢＳ。５）抗体希釈緩衝液：抗体は、一次および二次抗体の非特異的結合を低減するために、１×ブロッキング緩衝液で希釈した。
【００６３】
マイクロプレート上の抗原コーティングのため、Ａ４３１またはＡＧＳ細胞株を、細胞溶解物の調製のために使用した。細胞溶解物を炭酸塩コーティング緩衝液で希釈して、最終濃度２０μｇ／ｍｌとした。その後、５０μｌの希釈細胞溶解物をマイクロプレートウェルの上に分配し、続いてコーティングした。プレートを覆い、４℃で一晩置いた。コーティング緩衝液を除去し、各ウェルを２００μｌのＰＢＳで洗浄した。プレートを上下逆にしてシンク内で振とうし、使用した緩衝液または洗浄緩衝液を除去した。残りの溶液を、ペーパータオルで軽くたたいて除去した。
膜表面ブロッキングのために、２００μｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳブロッキング緩衝液をプレートの各ウェルに添加し、コーティングされたウェル内でコーティングされないで残ったタンパク質結合部位をブロックした。その後、プレートを蓋で覆い、室温で少なくとも２時間保温し、続いてＰＢＳで２回洗浄した。抗体反応を誘導するために、１００μｌの一次抗体を、使用の直前または超複合体をブロッキング緩衝液に添加する直前に、指定された濃度に希釈し、プレートを蓋で覆い、室温で１時間保温した。次に、プレートをＰＢＳで２回洗浄し、最適濃度に希釈した１００μｌの二次抗体−ＨＲＰを、プレートの各ウェルに添加した。プレートを蓋で覆い、室温で１時間保温した。プレートをＰＢＳで２回洗浄した。
【００６４】
検出のために、１００μｌのＴＭＢ基質溶液を、マルチチャンネルピペットを使用して、プレートの各ウェルに添加した。発色が十分に誘導されたとき（３０分）、１００μｌの停止液をプレートの各ウェルに添加した。各ウェルの吸光度（光学密度）を、プレートリーダーを用いて測定した。
その結果、ＥＬＩＳＡの感度はＧＲ１０により大幅に増加され、これは図１１に示される（図１１）。正確には、２つの異なるＥＬＩＳＡを実施した。モノクローナル抗βアクチン抗体とＧＲ１０の超複合体を一次抗体として使用した場合に、ＥＬＩＳＡ信号の顕著な増幅が観察された。ＡＧＳ細胞溶解物を、一般的な９６ウェル細胞培養プレートに入れ、これを４℃で一晩置いた。ＥＬＩＳＡは、標準的なプロトコルに従って行った。ＧＲ１０と一次抗体の超複合体は、括弧内に示すモル比に従って調製した。本明細書で使用する一次抗体は、マウスモノクローナル抗βアクチン抗体であった。ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体を、両方の実験のために二次抗体として使用した。一次および二次抗体の両方は、室温で１時間反応させた。ＴＭＢ基質を室温で３０分間反応させた。
【００６５】
二次抗体の連続希釈による信号増幅効果を、図１２にも示す。ＥＬＩＳＡ信号は、一次抗体とＧＲ１０の超複合体により大幅に増加された。信号は、二次抗体の試験された希釈範囲では非常に正常であった。マウスモノクローナル抗βアクチン抗体とＧＲ１０の超複合体を、上記のＥＬＩＳＡのための一次抗体として使用した場合、顕著な信号増幅が観察された。この時、Ａ４３１細胞溶解物を用いた。ＧＲ１０と一次抗体の複合体は、１：１０のモル比に従って調製した。ヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲートを、二次抗体として使用した。各ウェルに、１ｇのＡ４３１細胞溶解物をコーティングした。一次抗体は、連続的に１０倍に希釈した。一次抗体は、指定された希釈率で希釈し、二次抗体は、連続的に２倍に希釈した。
【００６６】
例５：プロテインＧドメインＩＩＩ反復鎖ＧＲ１０によるインフルエンザ迅速抗原検査キットの感度の増加
抗体を用いた最も代表な診断キットである、インフルエンザ迅速抗原検査キットの感度の、ＧＲ１０による増加が観察された。SD Biolineインフルエンザ迅速抗原検査キットまたはKorea Green Cross Coにより提供されるキットを、本明細書で使用した。キットには、抗原緩衝液、ドロッパー、チューブ、試料収集のための綿棒およびストリップが含まれていた。抗原緩衝液をドロッパーのラインまで吸引し、次いで、抗原緩衝液をチューブに入れた。抗原試料を、抗原緩衝液を含むチューブに負荷し、次に少なくとも５回、十分に混合した。この時ＧＲ１０タンパク質を、抗原緩衝液中の抗原で単純に希釈した。ストリップをチューブに添加し、これを１０〜１５分後に読み取った。
その結果、ＧＲ１０タンパク質を、従来の迅速抗原検査キットの抗原希釈緩衝液中の抗原と共に単純に希釈した場合、ＧＲ１０の非存在下とは異なり、抗原は１０００倍希釈されるまで検出可能であった（図１３）。
【００６７】
実施例６：ＧＲタンパク質を抗体の標識試薬として用いる、癌細胞株による免疫蛍光
ＧＲ１を、蛍光色素であるフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートさせ、コンジュゲートしたＧＲ１−ＦＩＴＣを、培養癌細胞株であるＡ４３１（ヒト扁平上皮癌）の免疫蛍光染色に使用した。マウス抗ＬＣ３抗体を一次抗体として使用した。調製されたＧＲ１−ＦＩＴＣを、検出用に二次抗体の代わりに使用した。蛍光により検出された細胞を、Ｆ−アクチン特異的ローダミン−ファロイジン（Sigma Aldrich）で染色した。発色は、蛍光顕微鏡下で観察された。
【００６８】
その結果、二次抗体−蛍光色素コンジュゲートを用いた場合と比較して、ＧＲ１−ＦＩＴＣコンジュゲートを用いることにより、より少量のタンパク質を検出することができた。明らかな免疫蛍光染色画像を得ることがでた（図１４）。
したがって、ＧＲ１−ＦＩＴＣと同様に、ＧＲタンパク質は、検出官能基と連結する、コンジュゲートする、または融合することができ、得られたコンジュゲートは、任意の種類の抗体に対して使用可能であり、したがって、検出官能基をそれぞれの抗体にコンジュゲートする必要はない。ＧＲタンパク質は非常に小さい分子であり、したがってＧＲタンパク質の生産は容易で、その取り扱いも簡単で容易である。
【００６９】
実施例７：Staphylococcus aureusのプロテインＡ抗体結合ドメインＢの反復鎖を発現するプラスミドの構築
合成プロテインＡドメインＢ（表１）ＤＮＡ配列をベクターに導入することにより調製されたプラスミドは、Bioneer Corporationから配布された。大腸菌ＤＨ５αをプラスミドでトランスフェクトし、クローンニングした。
前記プラスミドをＮｄｅＩとＢｓｐＥＩで消化した。得られたＤＮＡ小断片（２４５ｂｐ）を精製した。ＤＮＡ断片を同じ酵素で消化されたｐＧＲ１（ｐＴＲ１）ベクターにクローニングし、１つのプロテインＡドメインＢを含有するｐＡＲ１の構築がもたらされた。次に、上記ドメインＢのＤＮＡ配列を、ジデオキシＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７０】
各ドメインＢの間に、スペーサーとして１０個のアミノ酸から構成される（Ｇ４Ｓ）２配列がある。プロテインＡドメインＢが２回反復されるｐＡＲ２を構築するために、上記で構築したｐＡＲ１（表２）を、ＮｄｅＩとＢｓｐＥＩで消化した。次に、２つのＧ４ＳおよびドメインＢをコードするＤＮＡ小断片（２４５ｂｐ）を、ＮｄｅＩとＡｇｅＩで消化された同じプラスミドの大断片にコンジュゲートした。得られたｐＡＲ２をＮｄｅＩとＡｇｅＩで消化した。得られた大断片を小断片（２４５ｂｐ）にコンジュゲートし、プロテインＡドメインＢが３回反復されるｐＡＲ３を構築した。上記と同様のクローニング法により、プロテインＡドメインＢが５回反復されるｐＡＲ５を構築した。
【００７１】
【表２】
0006668232.tif 000003
【００７２】
【表３】
0006668232.tif 000004
タンパク質は、前に報告された従来の方法（J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402）により、反復鎖構築物から過剰発現された。
純粋な溶解物は、Ｎｉ２＋−キレート化セファロース高速流クロマトグラフィー（Amersham Bioscience, Sweden）と、続いてHiload Superdex-75 pgまたはHiload Superdex-200 pg(26/60)（Amersham Bioscience, Sweden）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。
【００７３】
例８：Peptostreptococcus magnusのプロテインＬ抗体結合ドメインＢ１の反復鎖を発現するプラスミドの構築
合成プロテインＬドメインＢ１のＤＮＡ配列をベクターに導入することにより調製されたプラスミドは、Bioneer Corporationから配布された。大腸菌ＤＨ５αをプラスミドでトランスフェクトし、クローンニングした。
前記プラスミドをＮｄｅＩとＢｓｐＥＩで消化した。得られたＤＮＡ小断片（２９９ｂｐ）を精製した。ＤＮＡ断片を同じ酵素で消化されたｐＧＲ１（ｐＴＲ１）ベクターにクローニングし、１つのプロテインＬドメインＢ１を含有するｐＬＲ１を構築した。次に、上記ドメインＢ１のＤＮＡ配列を、ジデオキシＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７４】
各ドメインＢ１の間に、スペーサーとして１０個のアミノ酸から構成される（Ｇ４Ｓ）２配列がある。プロテインＬドメインＢ１が２回反復されるｐＬＲ２を構築するために、上記で構築したｐＬＲ１（表５）を、ＮｄｅＩとＢｓｐＥＩで消化した。次に、２つのＧ４ＳおよびドメインＢ１をコードするＤＮＡ小断片（２９９ｂｐ）を、ＮｄｅＩとＡｇｅＩで消化された同じプラスミドの大断片にコンジュゲートした。得られたｐＬＲ２をＮｄｅＩとＡｇｅＩで消化した。得られた大断片を小断片（２９９ｂｐ）にコンジュゲートし、プロテインＬドメインＢ１が３回反復されるｐＬＲ３を構築した。上記と同様のクローニング法により、プロテインＬドメインＢ１が５回反復されるｐＬＲ５を構築した。
【００７５】
【表４】
0006668232.tif 000005
【００７６】
【表５】
0006668232.tif 000006
タンパク質は、前に報告された従来の方法（J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402）により、反復鎖構築物から過剰発現された。
純粋な溶解物は、Ｎｉ２＋−キレート化セファロース高速流クロマトグラフィー（Amersham Bioscience, Sweden）と、続いてHiload Superdex-75 pgまたはHiload Superdex-200 pg(26/60)（Amersham Bioscience, Sweden）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。
【００７７】
例９：Peptostreptococcus magnusのプロテインＬ抗体結合ドメインＢ１およびStaphylococcus aureusのプロテインＡ抗体結合ドメインＢの反復鎖を発現するプラスミドの構築
合成プロテインＬドメインＢ１のＤＮＡ配列をベクターに導入することにより調製されたプラスミドは、ｐＬＲ１の構築のために、Bioneer Corporationから配布された。
前記プラスミドｐＬＲ１をＮｄｅＩとＢｓｐＥＩで消化した。得られたＤＮＡ小断片（２９９ｂｐ）を精製した。ＤＮＡ断片を同じ酵素で消化されたｐＡＲ１（プロテインＡドメインＢを含む）ベクターにクローニングし、プロテインＡドメインＢに結合した１つのプロテインＬドメインＢ１を含有する（Ｂ１−Ｂ）、ｐＬＡＲ１を構築した。次に、上記ドメインＢ１（プロテインＬドメインＢ１）およびドメインＢ（プロテインＡドメインＢ）のＤＮＡ配列を、ジデオキシＤＮＡ配列決定により確認した。
【００７８】
それぞれのドメインＢ１（プロテインＬドメインＢ１）およびドメインＢ（プロテインＡドメインＢ）の間に、スペーサーとして１０個のアミノ酸から構成される（Ｇ４Ｓ）２配列がある。ＬＡ配列（Ｂ１−Ｂ、プロテインＬドメインＢ１−プロテインＡドメインＢ）が２回反復されるｐＬＡＲ２を構築するために、上記で得たプラスミドｐＬＡＲ１（表６）を、ＮｄｅＩとＢｓｐＥＩで消化した。次に、Ｂ１−（Ｇ４Ｓ）２−Ｂ−（Ｇ４Ｓ）２  （Ｂ１−Ｂ）をコードするＤＮＡ小断片（５２１ｂｐ）を、ＮｄｅＩとＡｇｅＩで消化された同じプラスミドの大断片にコンジュゲートした。得られたｐＬＡＲ２をＮｄｅＩとＡｇｅＩで消化した。得られた大断片を小断片（５２１ｂｐ）にコンジュゲートし、ＬＡ配列が３回反復されるｐＬＡＲ３３を構築した。上記と同様のクローニング法により、プロテインＬドメインＢ１−プロテインＡドメインＢ配列が３回反復されるｐＬＡＲ３を構築した。
【００７９】
【表６】
0006668232.tif 000007
【００８０】
【表７】
0006668232.tif 000008
反復鎖構築物は、前に報告された従来の方法（J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402）により過剰発現された。
純粋な溶解物は、Ｎｉ２＋−キレート化セファロース高速流クロマトグラフィー（Amersham Bioscience, Sweden）と、続いてHiload Superdex-75 pgまたはHiload Superdex-200 pg(26/60)（Amersham Bioscience, Sweden）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。
【００８１】
例１０：反復鎖および金抗体複合体または超複合体と、検出ライン抗体との間の交差結合の、迅速抗原検査を用いた調査
抗体を用いる最も代表的な検出方法である、インフルエンザ迅速抗原検査キットを使用して、反復鎖結合金抗体複合体または超複合体と検出ライン抗体との間の交差結合を、抗原の不在のもとで使用することにより、金抗体を検出した。ここで生成される検出ラインは、検出ライン抗体と、反復鎖／金抗体複合体または超複合体の反復鎖の抗体結合ドメインの空の空間との間の交差結合によるものであった。ここで、SD Biolineが提供するインフルエンザ抗原検査キットおよびKorea Green Cross Coが提供するインフルエンザ抗原検査キットを使用した。キットには、抗原緩衝液、試料収集のための綿棒およびストリップを含まれていた。抗原緩衝液を開けて、緩衝液をチューブに注入した。ＧＲ、ＡＲ、ＬＡおよびＬＡＲの複合鎖の系列を抗原緩衝液を含むチューブに添加し、続いて少なくとも５回混合した。ストリップをチューブに添加し、これを１０〜１５分後に読み取った。
【００８２】
ＳＤストリップ上では、ＧＲ４、ＧＲ５、ＧＲ７、ＧＲ１０、ＧＲ１５およびＧＲ２０タンパク質を単純に抗原緩衝液に希釈したもの（１０μｇおよび１μｇ）を使用した場合、バンドが観察され、これらの間に交差結合があったことが示唆された。Korea Green Crossストリップ上では、１μｇのタンパク質を使用した場合に、より強力なバンドが観察された。しかし、０．１μｇの濃度において、両方のストリップ共にいかなるバンドも生成されず、０．１μｇの濃度が、抗原の不在下において検出ラインを生成しない反復鎖の量であることが示唆された。反復鎖のこの濃度は、抗原の存在下での、抗原検出に対する反復鎖の効果を試験するのに適切である（図１５）。
【００８３】
ＳＤストリップ上で、ＡＲ５、ＬＲ３、ＬＲ５、ＬＡＲ１、ＬＡＲ２およびＬＡＲ３を用いた場合、金抗体によって生成された検出バンドが観察された。しかしKorea Green Crossストリップ上では、ＬＲ系を使用した場合に、いかなる検出バンドも観察されなかった。この結果は、Korea Green Crossキットに含められた抗体が、κ軽鎖から構成されたものではなかったことを示し、何故ならば、ＬＲ抗体結合ドメインは、抗体の軽鎖のうちκ軽鎖にのみ特異的に結合するからである。０．１μｇの反復鎖濃度では、ＳＤストリップとKorea Green Crossストリップのどちらもバンドを生成せず、したがってこの量は、抗原検出に対する反復鎖の効果を測定する実験のためにのみ適切である（図１６）。
【００８４】
例１１．インフルエンザ迅速抗原検査キットでの信号増幅に対する反復鎖の効果
抗体を用いる最も代表的な抗原検出キットである、インフルエンザ迅速抗原検査キットの感度の、ＧＲ、ＡＲ、ＬＲおよびＬＡＲタンパク質による増幅を調査した。ここでは、SD Bioline社が提供するインフルエンザ抗原検査キットを使用した。キットには、抽出溶液、試料収集用の綿棒およびストリップが含まれていた。抽出溶液を開け、溶液をチューブに注入した。抗原Ｈ１Ｎ１を、抽出溶液を含むチューブに添加し、続いて少なくとも５回混合した。この時、ＧＲ、ＡＲ、ＬＲおよびＬＡＲタンパク質は、抗原希釈緩衝液中で抗原と共に単純に希釈した。ストリップをチューブに添加し、これを１０〜１５分後に読み取った。
その結果、ＧＲ５を含まない場合と比べて、ＧＲ５を抗原と共に希釈した場合、抗原は、１０−７倍希釈するまで検出された（図１７）。
ＧＲ１０を抗原と共に希釈した場合、ＧＲ１０を含まない場合と比べて、抗原は、１０−８倍希釈するまで検出された（図１８）。
【００８５】
ＧＲ１５を抗原と共に希釈した場合、ＧＲ１５を含まない場合と比べて、抗原は、１０−９倍希釈するまで検出された（図１９）。
ＧＲ２０を抗原と共に希釈した場合、ＧＲ２０を含まない場合と比べて、抗原は、１０−１０倍希釈するまで検出された（図２０）。
ＡＲ５タンパク質を抗原と共に希釈した場合、ＡＲ５を含まない場合と比べて、これによる特別な効果はなかった（図２１）。
ＬＲ５を抗原と共に希釈した場合、ＬＲ５を含まない場合と比べて、抗原は、１０−６倍希釈するまで検出された（図２２）。
ＬＡＲ３を抗原と共に希釈した場合、ＬＡＲ３を含まない場合と比べて、抗原は、１０−８倍希釈するまで検出された（図２３）。
【００８６】
例１２：反復鎖ＧＲ、ＡＲ、ＬＲおよびＬＡＲとＩｇＧの超複合体の沈殿
ＩｇＧ溶液を、ＰＢＳ中でEquitech Bio Coから提供されたマウスＩｇＧ粉末を溶解することにより調製した。ＰＢＳに溶解したＩｇＧ溶液を、ロッカーで２時間揺り動かし、続いて２１，０００ｒｐｍで４℃にて２時間遠心分離して、溶液中に溶解しなかったＩｇＧ粒子を完全に除去した。ＧＲ１〜ＧＲ２０およびＩｇＧは全て、ＢＣＡタンパク質定量法（ビシンコニン酸タンパク質アッセイ）によって定量し、これを実験のために適切な濃度に希釈した。適切な量のＧＲ１〜ＧＲ２０溶液およびＩｇＧ溶液を、微量遠心管中で混合し、これを結合のために室温で一晩置いた。次に、遠心分離を１３，０００ｒｐｍで２０℃にて３０分間実施した。この時、超複合体が形成され沈殿した場合は、肉眼で観察した。上清はマイクロピペットを用いて除去した。５００μｌの７５％エタノールをこれに加えて再び除去し、これにより微量遠心管の壁上のすべての残留溶液を洗い落とした。この中の残りの７５％エタノールを蒸発により、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、除去した。
【００８７】
その結果、ＩｇＧを５：１のモル比でＧＲ１０と混合した場合、ＩｇＧを１：１または１０：１のモル比でＧＲ１０と混合した場合よりも、より多くの沈殿物が形成された（図２４）。
ＩｇＧとＧＲ１０を５：１のモル比で混合した後、ＧＲ１０と同じ濃度のＧＲ１およびＧＲ２をこれに反応させた。ＧＲ１０をこれに加えた場合、ＧＲ１およびＧＲ２を用いた場合よりも、より多くの沈殿物が形成された。この結果は、肉眼だけでなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも観察された（図２５）。等量を添加した場合、反応液中の抗体結合ドメインＤＩＩＩの総モル数は同じであった。ＧＲ１０では、１０個のＤＩＩＩが1つの鎖で反復され一緒に連結された。ＧＲ２において、２個のＤＩＩＩが1つの鎖で反復され一緒に連結された。これに加えられたＧＲタンパク質の合計量が同じであった場合、ドメインＤＩＩＩの総量は同じであった。この時、ＧＲ１０は超複合体の形成を支持し、その理由は、ＧＲ１０がＧＲ１またはＧＲ２より長い鎖だからである。
【００８８】
ＩｇＧを、５：１のモル比でＧＲ１０と混合し、および、ＧＲ１〜ＧＲ９もまた、ＧＲ１０同じ濃度でＩｇＧと混合した。ＧＲタンパク質と混合後のＩｇＧの最終濃度は、４００μｇ／ｍｌであった。ＧＲ３〜ＧＲ１０は、肉眼で観測される沈殿物を生成した（図２６）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでも一貫した結果が得られた（図２７）。以上の結果から、沈殿させることができる超複合体が、ＩｇＧとＧＲタンパク質の複合体の間の交差結合により形成されたことが確認された。
沈殿物は、ＩｇＧのみを含む対照試料においては生成されなかった。沈殿物は、ＧＲタンパク質ではなくＢＳＡで処理された別の対照においても、形成されなかった。したがって、沈殿物は、異種タンパク質の導入によって引き起こされるタンパク質の溶解性の低下によるものではなく、反復鎖から生じる大きな分子量の超複合体の形成によることが示唆された。
【００８９】
ドメインＤＩＩＩ反復がＧＲ１０の数を上回った場合に、超複合体が形成されたかどうかを調べるために、ＩｇＧを、５：１のモル比でＧＲ１０と混合し、次いでＧＲ１、３、５、１５および２０もＧＲ１０と同じ濃度でＩｇＧと混合した。ＧＲ１とＩｇＧを用いた場合を除き、他のすべての場合に、沈殿物が形成された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果も、複合体（ＧＲ３〜ＧＲ２０）が沈殿物を生成することを確認した（図２８）。したがって、ＧＲ１０よりも大きいＧＲ１５またはＧＲ２０もまた、ＩｇＧと超複合体を形成することができ、これは沈殿させることができる。
【００９０】
同様の実験を、ＩｇＧの最終濃度を低減して再度行った。この時、ＩｇＧの最終濃度が２５μｇ／ｍｌ未満に減少した場合、ＧＲによる沈殿物は肉眼で観察されなかった。したがって、超複合体の形成に起因する沈殿物の形成は、ＩｇＧの濃度に依存することが確認された。また、ＧＲに加えて、ＡＲ１、３、５、ＬＲ１、３、５、ＬＡＲ１、２および３も、５：１のモル比でＩｇＧと反応させた。この時、ＩｇＧの最終濃度は５００μｇ／ｍｌであった。ＧＲとは異なり、沈殿物は、ＡＲ、ＬＲまたはＬＡＲによっては生成されず、これは、これらの反復鎖が、ＩｇＧに結合して肉眼で観察できる不溶性の沈殿物を形成しないことを示唆した。
【００９１】
例１３：プロテインＧ抗体結合ドメインＩＩＩ反復鎖と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の間の融合により調製したプラスミドの構築および発現
連鎖球菌のプロテインＧドメインＩＩＩ反復鎖を含むＧＲ１、ＧＲ５およびＧＲ１０を、ＧＦＰ ＤＮＡ配列（表８）と融合させて、プラスミドＧＲ１−ＧＦＰ、ＧＲ５−ＧＦＰおよびＧＲ１０−ＧＦＰを構築した。
ＧＲ１とＧＦＰの配列にオーバーラップ可能なＰＣＲプライマーを構築した（表９および表１０）。最初に、ＧＲ１フォワードおよびリバースプライマーを用い、ＧＲ１を鋳型としてＰＣＲを実施し、結果としてＰＣＲ産物１を得た。
ＧＦＰフォワードおよびリバースプライマーを用い、ＧＦＰを鋳型としてＰＣＲを実施し、結果としてＰＣＲ産物２を得た。ＧＲ１フォワードプライマーおよびＧＦＰリバースプライマーを用い、上記ＰＣＲ産物１およびＰＣＲ産物２を鋳型としてＰＣＲを実施した。
【００９２】
ＧＲ１とＧＦＰを、Ｇ４Ｓリンカーにより共に連結した。ＧＲ１とＧＦＰを共に融合し、得られた増幅断片を、制限酵素Ｎｄｅ１とＥｃｏＲ１Ｎｄｅ１とＥｃｏＲ１で消化した（９５０ｂｐ）。断片を、上記と同じ酵素で消化したベクターに挿入した。プラスミドのＤＮＡ配列を、ジデオキシＤＮＡ配列決定により確認した。
完成したＧＲ１−ＧＦＰプラスミドを制限酵素Ｎｄｅ１とＡｇｅ１で消化し、この実験のためのベクターを調製した。ＧＲ４−ＧＦＰプラスミドをＮｄｅ１とＢｓｐＥ１で消化した。得られた小断片をベクターに挿入し、ＧＲ５−ＧＦＰプラスミドを調製した。
【００９３】
ＧＲ１−ＧＦＰプラスミドを、制限酵素Ｎｄｅ１とＡｇｅ１で上記と同様の方法により消化し、この実験のためのベクターを調製した。ＧＲ９−ＧＦＰプラスミドを、Ｎｄｅ１とＢｓｐＥ１で消化した。得られた断片をベクターに挿入し、ＧＲ１０−ＧＦＰプラスミドを調製した。プラスミドのＤＮＡ配列を、ジデオキシＤＮＡ配列決定により確認した。
タンパク質を、前に報告された従来の方法（J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402）により過剰発現させた。溶解物を、Ｎｉ２＋−キレート化セファロース高速流クロマトグラフィー（Amersham Bioscience, Sweden）と、続いてHiload Superdex-75 pgまたはHiload Superdex-200 pg(26/60)（Amersham Bioscience, Sweden）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。
【００９４】
【表８】
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【００９５】
【表９】
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【００９６】
【表１０】
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【００９７】
例１４：ウエスタンブロッティングにより確認した、反復鎖ＧＲ、ＡＲ、ＬＡおよびＬＡＲによる抗体信号の増幅
ウエスタンブロッティングを、例３に記載したのと同じ方法により実施した。
図２９ａに示すように、ウエスタンブロッティングの検出限界は、ＧＲによって拡張され、これはＧＲを使用しないウエスタンブロッティングの検出限界との比較により確認された。本明細書においては、ＧＲ５、１０、１５および２０を使用した。これらのモル比は、図に示す通りである。また、最適な比は、反復鎖の長さの変化によって変化することも確認された。反復鎖が長くなるにつれて、増幅効果が増加し、これにより感度が増大した。ＧＲ２０を用いた場合、感度は８倍に増加した。図２９ｂに、図２９ａの内容を図式化して、検出可能な最小抗原濃度の比較を表示する（図２９ｂ）。
【００９８】
図３０Ａに示すように、化学発光信号は、ウエスタンブロッティングにより確認されたように、同量の抗原の存在下でもＧＲによって増幅された。ＧＲ２０を用いた場合、一次Ａｂと超複合体を形成し、これは最大で４２倍も高い、信号の増幅を引き起こした（図３０）。図３０Ｂは、図３０Ａの内容を示すグラフである（図３０）。
図３１は、異なる種類の抗原を用いた、ウエスタンブロッティングにおけるＧＲ超複合体の形成による信号増幅を表す。この時、Ａ４３１全細胞溶解物を従来のウシ組織溶解物の代わりに使用し、その結果、信号の増幅も確認された（図３１）。
図３１Ｂは、ウエスタンブロット信号の増幅が、異なる一次抗体の存在下で、反復鎖によって可能であり得ることを示す。この時、抗Ｅカドヘリンマウスモノクローナル抗体を、抗βアクチンマウスモノクローナル抗体の代わりに使用した（図３１）。
【００９９】
図３２Ａは、異なる反復鎖による、ウエスタンブロッティングにおける増幅レベルの比較を示す。増幅は、それぞれＧＲ１０、ＡＲ１０およびＭＡＲ５（ＬＡＲ５からの異なる種類のＬを有する反復鎖）を同じ条件下で比較したことにより引き起こされた。ＡＲ１０をＭＡＲ５と比較すると、増幅効果は、２つの異なるドメイン（ＡおよびＭ）が５回反復されたＭＡＲ５を使用した場合、１つのみのドメイン（Ａ）が１０回反復されたＡＲ１０を使用したよりも、大きかった（図３２）。
図３２Ｂは、ＬＲ１０を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。他の反復鎖とは異なり、ＬＲは、増幅においていかなる大きな変化も引き起こさなかった（図３２）。
【０１００】
例１５：反復鎖と金抗体複合体または超複合体との間の交差結合の迅速抗原検査を用いた調査
抗体を用いる最も代表的な検出方法である、インフルエンザ迅速抗原検査キットを使用して、反復鎖連結金抗体複合体または超複合体と検出ライン抗体との間の交差結合を、抗原の不在のもとで使用することにより、金抗体を検出した。ここで生成される検出ラインは、検出ライン抗体と、反復鎖／金抗体複合体または超複合体の反復鎖の抗体結合ドメインの空の空間との間の交差結合によるものであった。ここで、SD Biolineが提供するインフルエンザ抗原検査キットおよびKorea Green Cross Coが提供するインフルエンザ抗原検査キットを使用した。キットには、抗原緩衝液、試料収集のための綿棒およびストリップが含まれていた。抗原緩衝液を開けて、緩衝液をチューブに注入した。ＧＲ、ＡＲ、ＬＲおよびＭＡＲの複合鎖の系列を、抗原緩衝液を含むチューブに添加し、続いて少なくとも５回混合した。ストリップをチューブに添加し、これを１０〜１５分後に読み取った。
【０１０１】
ＧＲの場合、ＧＲ５、ＧＲ１０、ＧＲ１５およびＧＴ２０は各ストリップ上に金のラインを生成した（図３３）。ＡＲの場合、ＡＲ１０は、すべてのストリップ上に金のラインを生成した。ＡＲ５は、どの濃度でも金のラインを生成しなかった（図３４）。ＬＲの場合、ＬＲ５およびＬＲ１０はＳＤストリップ上に金のラインを生成したが、どのＬＲタンパク質もKorea Green Crossストリップ上に交差結合を示さなかった。これは、Korea Green Cross Coが提供する抗体ＶＬが、ＬＲタンパク質が結合可能なκ鎖ではなかったためであった（図３５）。ＭＡＲの場合（ＬＡＲ５とは異なる種類のＬを有する反復鎖）、ＭＡＲ１、ＭＡＲ５およびＭＡＲ１０は、ＳＤストリップ上に金のラインを生成し、ＭＡＲ５とＭＡＲ１０は、Korea Green Crossストリップ上に金のラインを生成した。上記２種類のストリップの間の金のラインの形成パターンには差があった。はるかに強い金のラインが、Korea Green Crossストリップに比べてＳＤストリップ上で観察された（図３６）。パターンは、検出ライン抗体が、Ｌ結合ドメインが結合可能なＶＬκ鎖であるか否かにより変化した。検出ライン抗体がＶＬκを含まないKorea Green Crossストリップ上では、ＭＡＲ１０の金ラインは、ＳＤストリップ上で見られるよりも弱く、これは、ＭＡＲ１０の金ラインが、プロテインＡドメインＢから調製されるＡ結合ドメインからのみ、生じたからである。
それぞれが１つのドメインを含むＧＲ１、ＡＲ１およびＬＡ１は、これらのいずれのストリップ上でも金ラインを形成せず、これは、金抗体と検出ライン抗体間の交差結合が、１つだけのドメインでは不可能だからであった。
【０１０２】
例１６：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により確認した、ＧＲＮ（１、５、１０、１５、２０）、ＡＲＮ（１、５、１０）、ＬＲＮ（１、５、１０）およびＭＡＲＮ（１、５、１０）による抗体信号の増幅
ウシ組織溶解物を、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌでコーティング緩衝液に希釈した。希釈した溶解物を、ピペットによりマイクロタイタープレートに負荷し（５０μｌ／ウェル）、プレートをコーティングした。プレートに蓋をし、４℃で一晩保温した。次に、コーティング緩衝液を除去し、プレートを２００μｌの洗浄緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水）で２回洗浄した。洗浄緩衝液（０．１％（ｖ／ｖ）のTween 20を含むＰＢＳ）を、プレートをシンク内で振とうすることにより除去した。残りの水滴をペーパータオルでそっと叩いて除去した。プレートをブロッキングするために、２００μｌのブロッキング溶液（３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、リン酸緩衝生理食塩水）をプレートの各ウェルに添加して、コーティングされたウェル上に残ったタンパク質結合部位をブロックした。プレートに蓋をして、プレートを室温で２時間暖かく保ち、次にＰＢＳで２回洗浄した。希釈緩衝液／一次抗体（マウス抗アクチン抗体（Santacruz Biotech））の混合物または一次抗体／反復鎖の混合物１００μｌを、使用の直前にこれに添加した。プレートをカバーした後、プレートを再度室温で１時間暖かく保ち、次にＰＢＳで２回洗浄した。希釈緩衝液／ヤギ抗マウスβアクチン−ＨＲＰ抗体（１：２０００）の混合物１００μｌを、使用の直前に添加した。プレートを再び覆い、室温で１時間暖かく保ち、続いてＰＢＳで２回洗浄した。１００μｌのＴＭＢ（ＨＲＰ基質）をこれに添加し、プレートを室温で２０分間暖かく保った。１００μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４をこれに添加し、プレートの読み取りを、プレートリーダーを用いて４５０ｎｍで行った。
【０１０３】
信号増幅は、ＧＲ５、ＧＲ１０、ＧＲ１５およびＧＲ２０によって誘導されたことが確認された。ＧＲ５を使用した場合、これを一次抗体と１：２のモル比で混合すると、信号増幅効果は最大であり、最も効果的な複合体が形成されたことを示唆した。増幅は、通常の抗体信号よりも６倍高かった。ＧＲ１０を使用した場合、ＧＲ５同様にこれを一次抗体と１：２のモル比で混合すると、増幅は９．８倍高く、ＧＲ１５とＧＲ２０をそれぞれ１：１／２のモル比で添加した場合にも、効果的な複合体が形成された。この時、増幅はそれぞれ１０．５倍および１２．９倍高かった（表１１）。ＡＲとＭＡＲを使用した場合、ＡＲ１０とＭＡＲ１０を１：２および１：１のモル比で添加すると、増幅レベルは、それぞれ１．８倍および１．６倍増加した。一方、ＬＲを用いた場合には、増幅効果は観察されなかった。これは、この発明で使用される一次抗体ＶＬがκ鎖ではなく、したがって増幅が誘導されなかったからである。
１つのみのドメインを含むＧＲ１、ＡＲ１およびＬＲ１は、いずれの濃度でも信号増幅を引き起こさなかった。これは、１つのみのドメインを有する複合体の間の交差結合によって、超複合体が形成されなかったためであった。
【０１０４】
【表１１】
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【０１０５】
例１７：プロテインＧドメインＩＩＩ反復鎖組換えタンパク質とＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８の複合体からの［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の調製
精製されたＴＲ１、３、５、１０、１５および２０（＝ＧＲ１、３、５、１０、１５、２０）タンパク質とＢ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８の複合体を用いて［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２を構築するために、複合体を２−メルカプトエタノールで還元し、次いでグルタチオン酸化型（ＧＳＳＧ）に酸化し、続いて非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図３７）。
【０１０６】
具体的には、タンパク質複合体を、金属キレート化セファロースビーズ上に１０℃で１時間固定した。４０μｌの金属キレート化セファロースビーズ[１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）に５０％の濃度で懸濁]を、各反応混合物に加えた。固定されたタンパク質複合体に、４０ｍＭの２−メルカプトエタノールを補充した１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を室温で添加して、還元を誘導した。Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のシステイン残基の還元に必要な２−メルカプトエタノールの濃度を決定するために、予備実験を最初に行い、ここで、２０〜４０ｍＭの濃度の２−メルカプトエタノールの存在下で、Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８システイン残基の完全な還元を確認した。還元されたタンパク質複合体を、１００ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）を含有する洗浄緩衝液で１回洗浄し、次いで１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）でさらに３回洗浄した。洗浄後、タンパク質複合体を、５ｍＭのＧＳＳＧおよび１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を含む酸化緩衝液で酸化した。酸化が完了すると、複合体を３７℃で２時間、暖かく保った。この後、２×ＳＤＳ試料緩衝液をこれに加え、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色を行った。密度を、濃度計を用いて分析し、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の収量を調べた。［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の増加率は、ＴＲの存在下での、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで酸化／還元を終えた［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のバンドの強度の値（図３７、レーン４）を、ＴＲの不在下で酸化／還元を終えた［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のバンドの強度の値（図３７、レーン５）で割り算することによって計算した（表１２）。
【０１０７】
その結果、［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のバンドの強度は、これが単独であるか、またはＴＲ１との複合体の形態である場合には増加しなかった。ＴＲ３、５、１０、１５および２０との複合体では、モノマー間の衝突頻度の増加は、ジスルフィド架橋二量体の生産を誘導した。ＴＲ３、ＴＲ５、ＴＲ１０、ＴＲ１５およびＴＲ２０との複合体における［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の生産は、４．６倍、３．４倍、１６．７倍、３．５倍および２．７倍増加した。［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の生産は、酸化剤の添加から２時間以内に達成された。しかし、温めるための追加の時間は、生産の大幅な増加を増加させなかった。したがって、ＴＲタンパク質に結合した分子［Ｂ３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］中のシステイン残基は、反復鎖を介してタンパク質に容易に近づき結合できることが確認された。
【０１０８】
【表１２】
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【０１０９】
例１８：プロテインＧドメインＩＩＩ反復鎖組換えタンパク質とハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８の複合体からの［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の調製
精製されたＧＲ５、ＧＲ１０、ＧＲ１５およびＧＲ２０（＝ＴＲ５、ＴＲ１０、ＴＲ１５およびＴＲ２０）タンパク質とハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８の複合体を用いて［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２を構築するために、複合体を２−メルカプトエタノールで還元し、次いでグルタチオン酸化型（ＧＳＳＧ）に酸化し、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１１０】
具体的には、タンパク質複合体を、金属キレート化セファロースビーズ上に４℃で１時間固定した（図３８、レーン１）。４０μｌの金属キレート化セファロースビーズ[１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）に５０％の濃度で懸濁]を各反応混合物に加えた。固定されたタンパク質複合体に、４０ｍＭの２−メルカプトエタノールを補充した１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を室温で添加して、還元を誘導した（図３８、レーン２）。還元されたタンパク質複合体を、１００ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）を含有する洗浄緩衝液で１回洗浄し、次いで１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）でさらに３回洗浄した。洗浄後、タンパク質複合体を、５ｍＭのＧＳＳＧおよび１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）を含む酸化緩衝液で酸化した。酸化が完了すると、複合体を、３７℃で２時間、暖かく保った（図３８、レーン３）。この後、２×ＳＤＳ試料緩衝液をこれに加え、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシー染色を行った。密度を、濃度計を用いて分析し、［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の収量を調べた。［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の増加率は、ＴＲの存在下での、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで酸化／還元を終えた［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のバンドの強度の値（レーン４）を、ＴＲの不在下で酸化／還元を終えた［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２のバンドの強度の値（レーン５）で割り算することによって計算した（表１３）。この時、還元のみされたハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８（図３８、レーン２）、酸化のみされたハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８（図３８、レーン３）およびハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のみ（−ＴＲ）を、陰性対照として使用した。
【０１１１】
その結果、［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の生産は、ＴＲ５、ＴＲ１０、ＴＲ１５およびＴＲ２０との複合体の場合に、ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のみ（−ＴＲ）と比べて、２．３倍、２．３倍、１．７倍および３．３倍高かった。ＴＲ５、ＴＲ１０、ＴＲ１５およびＴＲ２０との複合体において、モノマー間の衝突頻度の増加は、ジスルフィド架橋二量体の生産を誘導した。［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］２の生産は、酸化剤の添加から２時間以内に達成された。しかし、温めるための追加の時間は、生産の大幅な増加を増加させなかった。したがって、ＴＲタンパク質に結合した分子［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］中のシステイン残基は、反復鎖を介してタンパク質に容易に近づき結合することが確認された。
【０１１２】
【表１３】
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【０１１３】
例１９：ＧＲ反復鎖タンパク質と［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］モノマーの複合体の細胞毒性効果
ハーセプチン（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８、Ｈ６−ハーセプチン（Ｌ）、ｅ２３（Ｆｄ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８およびＨ６−ｅ２３（Ｌ）封入体の、過剰発現、調製およびリフォールディングを、前に報告された従来の方法（J.H. Park, et al., Mol Cells 12 (2001) 398-402）で行った。ＧＲタンパク質との会合後の細胞毒性効果を確認するために、［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］をＧＲ５〜ＧＲ２０と会合させた。
具体的には、［ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］とＴＲ５〜ＴＲ２０および［ｅ２３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８］とＴＲ５〜ＴＲ２０を、３７℃で１時間培養した。これらを、種々の濃度で乳癌細胞に処置し、続いて３７℃で２４時間反応させた。その後、ＣＣＫ−８溶液を培地（培地の１／１０）に処置し、続いて３７℃で４時間反応させた。次に、効果を観察した（図３９および図４０、表１４および表１５）。
【０１１４】
ＴＲ５、ＴＲ１０、ＴＲ１５およびＴＲ２０との複合体の、ＳＫＢＲ３細胞に対する細胞毒性効果は、ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のみと比べて、それぞれ２．８倍、２．２倍、１．７倍および２．３倍高かった。ＴＲ５、ＴＲ１０、ＴＲ１５およびＴＲ２０との複合体の、ＳＫＢＲ３細胞に対する細胞毒性効果は、ｅ２３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のみと比べて、それぞれ４．５倍、１．４倍、２．４倍および１．７倍高かった。ＴＲ５、ＴＲ１０、ＴＲ１５およびＴＲ２０との複合体の、ＢＴ４７４細胞に対する細胞毒性効果は、ハーセプチン（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のみと比べて、それぞれ１．９倍、２．８倍、３．４倍および２．９倍高かった。および、ＴＲ５、ＴＲ１０、ＴＲ１５およびＴＲ２０との複合体の、ＢＴ４７４細胞に対する細胞毒性効果は、ｅ２３（Ｆａｂ）−ｅｘｔ−ＰＥ３８のみと比べて、それぞれ３．８倍、５倍、２３倍および１１．３倍高かった。
【０１１５】
【表１４】
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【０１１６】
【表１５】
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当業者は、前述の説明に開示された概念および特定の態様が、本発明の同じ目的を実施するための他の態様を修正または設計するための基礎として、容易に利用され得ることを理解するであろう。当業者はまた、かかる同等の態様が、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の精神および範囲から逸脱しないことも理解する。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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