(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取器具を用いて採取された５〜４０μｌの血液を、酵素反応物である色素を含有する標準物質含有緩衝液で希釈して検体を作製する検体作製工程と、
前記標準物質含有緩衝液を精製水で希釈した既知の希釈率を有する多数の希釈系列標本からなる希釈系列を作製し、分析装置を用いて前記希釈系列の吸光度を測定し、前記既知の希釈率と前記吸光度とを座標点として、多数の前記座標点から統計学的手法を用いて前記既知の希釈率と前記吸光度との関係を表す近似直線または近似曲線を算出して検量線とする第１算出工程と、
前記分析装置を用いて、前記検体の吸光度を測定し、前記検体の吸光度から予め算出された前記検量線を用いて前記検体の希釈率を算出すると共に、前記検体の分析項目の分析値を測定し、前記検体の分析値に前記検体の（１／希釈率）で定義される希釈倍数を乗じて前記血液の分析値を算出する第２算出工程と、を含み、
前記標準物質含有緩衝液は、標準物質を緩衝液で希釈したもので、前記標準物質は、試薬と、前記試薬と反応する酵素と、酵素反応によって光を吸収する色素を形成する色原体と、からなり、
前記試薬は、グリセロール−３−リン酸、塩化コリンの少なくとも１種からなり、
前記酵素は、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼの少なくとも１種からなり、
前記色原体は、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、４−アミノアンチピリンの少なくとも１種からなることを特徴とする微量かつ未知量体液の分析方法。
【請求項２】
前記検体作製工程において、前記５〜４０μｌの血液を、前記標準物質含有緩衝液で３〜３０倍の希釈倍数で希釈して検体を作製することを特徴とする請求項１に記載の微量かつ未知量体液の分析方法。
【請求項３】
前記検体作製工程において、前記血液が、前記採取器具を用いて採取後、遠心分離されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微量かつ未知量体液の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体液、特に血液の分析方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、体液、例えば血液の分析は、主に医療施設において行われてきた。そして、医療施設における分析においては、通常、約１０〜２０ｍｌ程度の血液が必要であった。このような多量の血液の採血は、提供者に大きな負担をかけるものであった。また、このような多量の血液の採血は、提供者自ら行うことができず、医療施設で行う必要があり、採血者および採血場所に制限があり、採血の自由度が低いものであった。
【０００３】
このような問題を解決するため、少量の血液で分析が行える簡易採血検査法が検討されてきた。簡易採血検査法では、膜分離によって採取血液を希釈血漿に分離する採取器具を用いて、提供者自らが希釈血漿を採取し、採取した希釈血漿を医療施設に郵送する。そして、医療施設では、郵送されてきた希釈血漿を用いて分析を行う。ただし、希釈血漿が微量な場合には、さらに緩衝液等で規定希釈する。
【０００４】
簡易検査方法では、提供者自らが採血を行うため、規定量の血液が採血されないことがあり、採取血液から分離される血漿量も規定量でないことがあった。また、提供者が規定量の血液を採血しても、提供者個々の血液のヘマトクリット値の違いにより、血漿量が規定量から外れることがあった。特に、このような血漿量が規定量以下の少量の検体では、医療施設における分析の際、実測値および希釈倍数算定に不正確性を生じ、希釈血漿を分析して得られる分析値の分析精度（正確度）が低下するという問題があった。
【０００５】
このような問題を解決するため、例えば、非特許文献１に記載されているような血漿分離輸送検査システムが提案されている。非特許文献１では、グリセロール−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）含有緩衝液に液体である血漿が添加される。ここで、Ｇ３Ｐ含有緩衝液そのもののＧ３Ｐの吸光度と、血漿が添加されたＧ３Ｐの吸光度とに差が生じる。そこで、非特許文献１では、下式（１）を用いて血漿の希釈率を算出し、この希釈率を検体の分析値に乗ずることによって、算出される原血漿の分析値としての分析精度（正確度）を高めている。
【０００６】
ＤＲ＝Ｅ０／（Ｅ０−Ｅ１）・・・（１）
【０００７】
ここで、ＤＲは希釈率、Ｅ０はＧ３Ｐ含有緩衝液のみを発色させた際の吸光度、Ｅ１は液体である血漿が添加された後のＧ３Ｐ含有緩衝液を発色させた際の吸光度を表す。なお、非特許文献１では、上式（１）で希釈率（ＤＲ）が算出されると記載されているが、希釈倍数（ＤＦ）の誤記である。なお、希釈倍数（ＤＦ）と希釈率（ＤＲ）は、ＤＦ＝１／ＤＲの関係にある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】堀田正敏、外３名、「自己採血による即時血漿分離輸送検査システムの構築−採血量の異なる試料への内部標準による希釈率算定法」、臨床病理、日本臨床検査医学会、２００８年７月、第５６巻、第７号、ｐ．５７７−５８３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、非特許文献１に記載された血漿分離輸送検査システムにおいて、式（１）は、除算および減算を有する２変数で定義される式である。そして、式（１）で用いられる吸光度（Ｅ０、Ｅ１）は、分析値と同様に変動幅を有するものである。したがって、式（１）では、吸光度（Ｅ０、Ｅ１）が変動すると、算出される希釈率（ＤＲ）が指数的に変動するため、検体の希釈率（ＤＲ）を精度良く算出することができない。その結果、検体の分析値に希釈率（ＤＲ）を乗じて算出される原血漿の分析値も、精度良く算出できないという問題があった。特に、血漿量が少量の場合には、数学的に希釈率算定は実用不可能と証明されている。
【００１０】
そこで、本発明が解決しようとする課題は、微量かつ未知量体液を希釈して作製した検体を用いて分析を行っても、検体の希釈率を精度良く算出でき、その希釈率から算出される体液の分析値としての分析精度（正確度）に優れる微量かつ未知量体液の分析方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するために、本発明に係る微量かつ未知量体液の分析方法は、採取器具を用いて採取された５〜４０μｌの血液を、酵素反応物である色素を含有する標準物質含有緩衝液で希釈して検体を作製する検体作製工程と、前記標準物質含有緩衝液を精製水で希釈した既知の希釈率を有する多数の希釈系列標本からなる希釈系列を作製し、分析装置を用いて前記希釈系列の吸光度を測定し、前記既知の希釈率と前記吸光度とを座標点として、多数の前記座標点から統計学的手法を用いて前記既知の希釈率と前記吸光度との関係を表す近似直線または近似曲線を算出して検量線とする第１算出工程と、前記分析装置を用いて、前記検体の吸光度を測定し、前記検体の吸光度から予め算出された前記検量線を用いて前記検体の希釈率を算出すると共に、前記検体の分析項目の分析値を測定し、前記検体の分析値に前記検体の（１／希釈率）で定義される希釈倍数を乗じて前記血液の分析値を算出する第２算出工程と、を含み、前記標準物質含有緩衝液は、標準物質を緩衝液で希釈したもので、前記標準物質は、試薬と、前記試薬と反応する酵素と、酵素反応によって光を吸収する色素を形成する色原体と、からなり、前記試薬は、グリセロール−３−リン酸、塩化コリンの少なくとも１種からなり、前記酵素は、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、パーオキシダーゼの少なくとも１種からなり、前記色原体は、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、４−アミノアンチピリンの少なくとも１種からなることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明に係る微量かつ未知量体液の分析方法は、前記検体作製工程において、前記５〜４０μｌの血液を、前記標準物質含有緩衝液で３〜３０倍の希釈倍数で希釈して検体を作製するものである。さらに、本発明に係る微量かつ未知量体液の分析方法は、前記検体作製工程において、前記血液が、前記採取器具を用いて採取後、遠心分離されるものである。
【００１３】
前記構成によれば、第２算出工程で算出される検体の希釈率が、多数の座標点から算出された希釈率と吸光度との関係を表す近似直線または近似曲線からなる多点希釈率検量線を用いて算出されるため、希釈率の算出精度が向上する。その結果、検体作製工程で添加する標準物質含有緩衝液の液量は検体の分析項目によって異なり、検体毎に希釈率（希釈倍数）が異なるが、多点希釈率検量線を用いることによって、精度の高い検体の希釈率（希釈倍数）を得ることが可能となる。それによって、検体の分析値に希釈率を乗じて算出される体液の分析値の分析精度も向上する。その結果、検体の検体量に関係なく正確な体液の分析値を得ることが可能となる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明に係る微量かつ未知量体液の分析方法によれば、検体の希釈率を精度良く算出でき、その希釈率から算出される体液の分析値の分析精度（正確度）も優れたものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】多点希釈率検量線の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明に係る微量かつ未知量体液の分析方法の実施形態について詳細に説明する。
本発明の微量かつ未知量体液の分析方法は、検体作製工程と、第１算出工程と、第２算出工程と、を含むものである。
【００１７】
ここで、微量とは、医療施設等で分析、特に生化学分析、発光分析等を目的として従来採取されている量に対して極めて少量であることを意味し、５〜４０μｌである。体液とは血液、尿等であって、特に血清または血漿である。以下、各工程について説明する。
【００１８】
（検体作製工程）
検体作製工程は、採取器具を用いて採取された微量の体液に、規定量の標準物質含有緩衝液を添加、混和して検体を作製する工程である。標準物質含有緩衝液の添加量は、検体の分析項目によって希釈率が異なるため、一定量ではないが、通常、６０μｌ程度である。
【００１９】
採取器具は、微量の体液を採取できれば特に限定されるものではなく、従来公知の採取器具が用いられる。例えば、採取器具としては、特開２０１５−５２４５９号公報、特開２０１５−１０５９０２号公報に記載されている微量の血液を採取、収納する体液採取器および体液収容器が用いられる。また、体液が血液の場合には、採取器具で採取、収納された血液から、非特許文献１に記載されているように膜分離よって血漿を分離すると、膜通過の際に溶血が発生しやすく、次工程で測定される検体の吸光度に悪影響を与えやすい。また、膜通過の際に特定のタンパク質等が膜に吸着しやすく、次工程で測定される検体の分析項目で測定不可能となる場合もある。したがって、体液として血液を用いる場合には、採取器具によって採取、収納された血液から、溶血、吸着等が生じにくい遠心分離によって血漿を分離することが好ましい。また、体液が血清の場合にも、採取器具によって採取、収納された血液からの血清の分離は、膜分離よりも遠心分離が好ましい。
【００２０】
標準物質は、作製された検体の希釈率を発色によって算出するための指標物質であり、試薬と、試薬と反応する酵素と、酵素反応によって特定波長の光を吸収する色素を形成する色原体とからなる。そして、次工程では、標準物質の酵素反応物である色素の吸光度を測定することによって、検体の希釈率を算出している。
【００２１】
標準物質は、体液の分析において標準物質として従来から知られているものが用いられる。例えば、標準物質は、試薬としてグリセロール−３−リン酸（Glycerol-3-phosphate）、塩化コリン（Choline Chloride）等、酵素としてグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（Glycerol-3-phospate oxidase）、パーオキシダーゼ（Peroxidase）等、色原体としてＮ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（N-ethyl-N-(3-sulphopropyl)-3-methoxyaniline）、４−アミノアンチピリン（4-Aminoantipyrine）等が用いられる。
【００２２】
標準物質含有緩衝液は、微量の体液を希釈する溶液であって、検体の分析値に影響を与えない溶液である。緩衝液としては、体液の分析において緩衝液として従来から知られているものが用いられる。例えば、緩衝液は、塩化ナトリム、リン酸カリウム、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic Acid）、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム等の水溶液で、好ましくは、塩化ナトリウム水溶液（生理的食塩水）である。
【００２３】
標準物質含有緩衝液による体液の希釈度合いは、検体分析の際の分析項目によって異なり、分析項目ごとに規定量に決定される。具体的には、希釈度合いは、希釈倍数（ＤＦ）で３〜３０倍、希釈率（ＤＲ）で０．０３３〜０.３３（％×１０−２）である。そして、希釈倍数（ＤＦ）、希釈率（ＤＲ）とも、体液量にて緩衝液中の標準物質密度が定量的に変化することを原理としたもので、体液量の正確な指標である。そして、ＤＦ＝１／ＤＲの関係にある。
【００２４】
（第１算出工程）
第１算出工程は、検体作製工程で作製された検体の希釈率を算定するために必要な多点希釈率検量線を構築する工程である。具体的には、標準物質含有緩衝液を精製水で希釈した既知の希釈率を有する多数の希釈系列標本からなる希釈系列を作製する。なお、希釈系列の作製は、化学天秤等を用いた重量法で行うことが好ましい。次に、分析装置を用いて希釈系列の吸光度を測定し、すなわち、分析装置にて各々の希釈系列標本の標準物質を発色させて吸光度分析を行い、希釈率と吸光度の較正（キャリブレーション）を行って分析装置内のシステムに多点希釈率検量線を設定する。
【００２５】
分析装置は、従来公知の分析装置が使用される。また、検体の吸光度、すなわち、緩衝液内に溶存している標準物質の吸光度の測定に使用される光の波長は、標準物質の種類によって適宜選択される。体液中の共存物質の影響を避ける５５０〜６５０ｎｍの長波長が望ましい。
【００２６】
多点希釈率検量線としては、多数の座標点から統計学的手法を用いて既知の希釈率と吸光度との関係を表す近似直線または近似曲線を算出（設定）して検量線とする。そして、多数の座標点は、既知の希釈率を有する多数の希釈系列標本からなる希釈系列を用いて、分析装置で吸光度を測定し、多数の既知の希釈率と測定された吸光度を多数の座標点とする。また、希釈系列標本は、標準物質含有緩衝液を精製水で希釈したものを用いる。そして、標準物質含有緩衝液としては、前記検体作製工程で用いられた標準物質含有緩衝液と同様のものを用いる。
【００２７】
近似直線または近似曲線を算出（設定）する際の座標点の数、すなわち、既知の希釈率を有する希釈系列標本の数は、少数であると検量線の近似精度が悪く、多数であると作業効率が悪いため、４〜６が好ましい。近似直線または近似曲線の近似式には、従来公知の近似式が用いられ、スプライン近似式、折れ線近似式等が用いられる。
【００２８】
（第２算出工程）
第２算出工程は、分析装置を用いて検体の吸光度を測定し、検体の吸光度から、予め算出された検量線（多点希釈率検量線）を用いて、検体の希釈率を算出すると共に、分析装置を用いて検体の分析項目の分析値を測定し、検体の分析値に前記検体の希釈率、具体的には「１／希釈率」を乗じて、体液の分析値（原濃度の体液の分析値）を算出する工程である。
【００２９】
分析装置は、第１算出工程で用いた分析装置と同一の装置を用いる。また、測定される分析項目としては、医療施設等で従来から行われている分析項目と同様で、体液が血漿の場合には、蛋白、アルブミン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、γ−ＧＴＰ、中性脂肪、総コレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール、尿素窒素、クレアチニン、尿酸、ブドウ糖、肝炎ウィルス、ＨＩＶ、腫瘍マーカー等である。
【実施例】
【００３０】
本発明の実施例とその比較例によって、本発明の効果を具体的に説明する。
（検体の作製）
塩化コリン、パーオキシダーゼ、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、４−アミノアンチピリンを生理的食塩水に希釈した標準物質含有緩衝液１０００μｌに、ヒトプール血漿を３０〜２５０μｌの範囲で所定量添加して、表１に示す１０段階の希釈倍数（約４〜２２倍）に希釈された検体Ｎｏ．１〜１０を作製した。
【００３１】
（理論希釈倍数の算出）
分析装置（日本電子株式会社製、ＪＣＡ−ＢＭ６０５０）で、検体Ｎｏ．１〜１０の総コレステロール値（ＴＣ）およびＬＤＬコレステロール値（ＬＤＬ）を測定した。測定された（ＴＣ）、（ＬＤＬ）と、原濃度ヒトプール血漿の（ＴＣ）：１９０．４ｍｇ／ｄｌ、（ＬＤＬ）：１１２．８ｍｇ／ｄｌとから、検体Ｎｏ．１〜１０の希釈倍数（ＤＦ）を算出し、（ＴＣ）、（ＬＤＬ）の両者の希釈倍数（ＤＦ）の平均値（平均ＤＦ）を理論希釈倍数（ＴＤＦ）とした。その結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】
0006635814.tif 000002
【００３３】
（実施例）
以下に示す多点希釈率検量線法によって、検体Ｎｏ．１〜１０の希釈倍数（ＤＦ）を算出した。
まず、前記標準物質含有緩衝液を精製水で所定の希釈率：０．００（ブランク）、０．０５、０.１０、０．２０で希釈して希釈系列標本を４種作製し、前記分析装置で吸光度を５重測定した。その結果を表２に示す。ここで、希釈率：０．００（ブランク）は、標準物質含有緩衝液のみで、精製水で希釈していない希釈系列標本であることを示す。そして、表２の希釈率と、吸光度の値から折れ線近似式（図１参照）を設定し、検量線とした。
【００３４】
【表２】
0006635814.tif 000003
【００３５】
次に、前記分析装置で検体Ｎｏ．１〜１０の吸光度を測定し、設定した検量線から希釈率（ＤＲ）を算出した。１検体について、３重測定、算出を行った。その希釈率（ＤＲ）の平均値（Ａｖ）を、下式（２）で希釈倍数（ＤＦ）に変換した。
ＤＦ＝１／ＤＲ・・・（２）
算出された希釈倍数（ＤＦ）と、表１に示す理論希釈倍数（ＴＤＦ）とを比較して、その一致率（％）を算出した。その結果を表３に示す。
【００３６】
【表３】
0006635814.tif 000004
【００３７】
（比較例）
以下に示す計算法によって、検体Ｎｏ．１〜１０の希釈倍数（ＤＦ）を算出した。
前記分析装置で検体Ｎｏ．１〜１０の吸光度（Ｅ１）を測定した。１検体について３重測定した。測定した吸光度（Ｅ１）の平均値（Ａｖ）と、予め測定した前記標準物質含有緩衝液のみの吸光度（Ｅ０）：５４１４．７とから、下式（３）で希釈倍数（ＤＦ）を算出した。
ＤＦ＝Ｅ０／（Ｅ０−Ｅ１）・・・（３）
算出された希釈倍数（ＤＦ）と、表１に示す理論希釈倍数（ＴＤＦ）とを比較して、その一致率（％）を算出した。その結果を表４に示す。
【００３８】
【表４】
0006635814.tif 000005
【００３９】
表３、表４の結果から、実施例の多点希釈率検量線法によって算出される希釈倍数（ＤＦ）は、比較例の計算法によって算出される希釈倍数（ＤＦ）に比べて、理論希釈倍数（ＴＤＦ）との一致率（％）が、比較例と同等または比較例より高かった。特に、１０〜２０倍という高希釈倍数においては、一致率（％）が比較例より高かった。
したがって、実施例の多点希釈率検量線法による分析方法では、微量かつ未知量体液を希釈して作製した検体を用いて分析を行っても、検体の希釈倍数（ＤＦ）および希釈率（ＤＲ）を精度良く算出でき、その希釈率（ＤＲ）から算出される体液の分析値としての分析精度（正確度）に優れることが確認できた。
【図１】
0006635814.tif 000006