(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単鎖融合ポリペプチドを含むＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
（ｉ）第一の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン、
（ｉｉ）第一のペプチドリンカー、
（ｉｉｉ）第二の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン、
（ｉｖ）第二のペプチドリンカー、および
（ｖ）第三の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン、および
（ｖｉ）抗体Ｆｃフラグメント、ここで前記抗体Ｆｃフラグメント（ｖｉ）は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列または配列番号１３のアミノ酸１〜２１７からなる、
を含み、
前記抗体Ｆｃフラグメント（ｖｉ）は、配列番号１６および１９〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列からなるヒンジリンカーを介して、前記第三の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｖ）のＣ末に融合される、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項２】
請求項１のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
実質的に非凝集性である、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記の第二および／または第三の可溶性ＣＤ４０Ｌドメインは、Ｎ末が短縮されたドメインであり、アミノ酸配列突然変異を含むか、または、アミノ酸配列突然変異を含まない、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記可溶性ＣＤ４０Ｌドメインの少なくとも１つは、配列番号１に係るヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸Ｇｌｎ１２１またはＩｌｅ１２２で始まるＮ末配列、または、Ｇｌｎ１２１がＳｅｒおよびＧｌｙから選択される中性アミノ酸によって置換されているＮ末配列、を有する、可溶性ＣＤ４０Ｌドメインである、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項５】
請求項４のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）の少なくとも１つは、
（ａ）Ｇｌｎ１２１またはＩｌｅ１２２、および
（ｂ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１２１
から選択されるＮ末配列を有する可溶性ＣＤ４０Ｌドメインである、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項６】
請求項４または５のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記可溶性ＣＤ４０Ｌドメインは、配列番号１に係るヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸Ｌｅｕ２６１で終わり、および、
前記アミノ酸配列は突然変異を含まないか、Ｅ１２９位、Ｓ１３２位、Ｔ１３４位、Ｅ１４２位、Ｙ１４５位、Ｙ１４６位、Ｃ１７８位、Ｃ１９４位、Ｃ２１８位、Ｑ２２０位またはＮ２４０位に、または、前記位置の２つ以上に突然変異を含む、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項７】
請求項４から６のいずれか一項のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）は、配列番号１に係るヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸１２１〜２６１からなる、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記の第一および第二のペプチドリンカー（ｉｉ）および（ｉｖ）は、独立に、３〜８個のアミノ酸の長さを有する、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項９】
請求項８のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記の第一および第二のペプチドリンカー（ｉｉ）および（ｉｖ）は、グリコシル化されている、または、グリコシル化されていないアスパラギン残基を含んでよい、グリシン／セリンリンカーである、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項１０】
請求項９のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記の第一および前記の第二のペプチドリンカー（ｉｉ）および（ｉｖ）は、配列番号２に係るアミノ酸配列からなる、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
Ｎ末シグナルペプチドドメインをさらに含み、前記シグナルペプチドはプロテアーゼ切断部位を含まないか、プロテアーゼ切断部位を含む、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
認識または精製ドメインを含むか、認識または精製ドメインに結合するＣ末エレメントをさらに含む、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
配列番号１５、２５、２７〜２８、３１〜３５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
配列番号２７、２８、３２または３４に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有する２つのポリペプチドを含む、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質
【請求項１５】
請求項１４のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
配列番号２７、２８、３２または３４に記載のアミノ酸配列をそれぞれ含む前記の２つのポリペプチドは、それぞれのポリペプチドのシステイン残基４５３、４５９および４６２の間に形成される３つの鎖間ジスルフィド結合を通して共有結合される、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項１６】
請求項１４または１５のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記ポリペプチドの１４７位および２９６位のアスパラギン残基の１つまたは複数は、Ｎグリコシル化される、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項１７】
請求項１６のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記ポリペプチドの１４７位および２９６位の両方の前記アスパラギン残基は、Ｎグリコシル化される、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記ポリペプチド（単数または複数）は、さらに翻訳後修飾される、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項１９】
請求項１８のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、
前記の翻訳後修飾は、前記Ｎ末グルタミンの、ピログルタミン酸への改変を含む、
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれか一項のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２１】
発現制御配列と作動可能に連結している、請求項２０の核酸分子を含む、
発現ベクター。
【請求項２２】
請求項２０の核酸分子または請求項２１のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、細胞または非ヒト生物であって、
前記細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞である、
細胞または非ヒト生物。
【請求項２３】
医薬組成物または診断組成物であって、
活性剤として、請求項１から１９のいずれか一項のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質、請求項２０の核酸分子、または、請求項２１のベクターを含む、
医薬組成物または診断組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の医薬組成物または診断組成物であって、
１つまたは複数の薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、またはこれらの組み合わせ、をさらに含む、
医薬組成物または診断組成物。
【請求項２５】
請求項２３または２４に記載の医薬組成物であって、
ＣＤ４０Ｌの機能障害に起因する、関連する、および／または、伴う障害の、予防および／または治療での使用のための、
医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の医薬組成物であって、
前記障害が、腫瘍；感染性疾患；炎症性疾患；代謝疾患；自己免疫疾患；変性疾患；アポトーシス関連疾患または移植拒絶反応、から選択される増殖性疾患である、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３つの可溶性ＣＤ４０Ｌドメインおよび１つのＦｃフラグメントを含む特定のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸分子、および、それらの使用を提供する。ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、実質的に非凝集性であり、治療、診断および／または研究の適用に適切である。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）サイトカインの三量体化は、効率的な受容体結合および活性化に必要であることが知られている。ＴＮＦスーパーファミリーサイトカインの三量体複合体は、しかしながら、組み換え単量体ユニットから調製するのが困難である。
【０００３】
ＷＯ０１／４９８６６およびＷＯ０２／０９０５５は、ＴＮＦサイトカインおよび多量体化コンポーネントを含む組み換え融合タンパク質、具体的には、Ｃ１ｑタンパク質ファミリー由来のタンパク質またはコレクチンを開示する。しかしながら、これらの融合タンパク質の不利な点は、三量体化ドメインが通常、大きな分子量を有すること、および／または、三量体化がむしろ非効率であることである。
【０００４】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７（１９８９），１２０５−１２１３）は、ＴＮＦサイトカインの三量体は、Ｎ末に配置された安定化モチーフによって安定化されることを記載する。ＣＤ９５Ｌでは、受容体結合ドメイン三量体の安定化は、おそらく、細胞質膜の近くに位置するＮ末アミノ酸ドメインによって引き起こされる。
【０００５】
Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３２２（２００４），１９７−２０２）は、ＣＤ９５Ｌの受容体結合ドメインが、Ｎ末に配置された人工α−らせんコイルドコイル（ロイシンジッパー）モチーフによって安定され得ることを記載する。しかしながら、互いに対するポリペプチド鎖の方向、例えば平行または逆平行の方向は、ほとんど予測できないことが見いだされた。さらに、コイルドコイルジッパーモチーフ内の７アミノ酸繰り返しの最適な数は、決定するのが困難である。加えて、コイルドコイル構造は、ｐＨおよび／またはイオン強度の変更後に高分子凝集体を形成する傾向がある。
【０００６】
ＷＯ０１／２５２７７は、細胞受容体の細胞外リガンド結合ドメインに結合する単鎖オリゴマーポリペプチドに関し、ここで、ポリペプチドは、少なくとも３つの受容体結合部位を含み、そのうち、少なくとも１つは、細胞受容体のリガンド結合ドメインに結合することができ、少なくとも１つは、細胞受容体のリガンド結合ドメインに効率的に結合することができず、それにより、単鎖オリゴマーポリペプチドは、受容体に結合することができるが、受容体を活性化することができない。例えば、単量体は、ＴＮＦファミリーのサイトカインリガンドから、具体的にはＴＮＦ−αから得られる。
【０００７】
ＷＯ２００５／１０３０７７は、ＴＮＦファミリーリガンドメンバーの少なくとも３つの単量体、および、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの単量体を互いに連結する少なくとも２つのペプチドリンカーを含む、単鎖融合ポリペプチドを開示する。しかしながら、最近の実験は、これらの単鎖融合ポリペプチドは望ましくない凝集を示すことを示している。
【０００８】
ＷＯ２０１０／０１００５１は、３つの可溶性ＴＮＦファミリーサイトカインドメインおよび少なくとも２つのペプチドリンカーを含む、単鎖融合ポリペプチドを開示する。記載される融合ポリペプチドは、実質的に非凝集性である。
【０００９】
最近の研究は、現在のところ病院で調査されている抗−ＣＤ４０−ｍＡｂのＦ（ａｂ’）２−フラグメントは、さらなる架橋をしなければアゴニストでないことを示している（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ（２０１３）「Ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９（５）：１０３５−１０４３を参照。
【００１０】
インビボでのＦｃ−γ−Ｒに基づく架橋とは独立した高い生物学的活性、高い安定性を示し、および、効率的な組み換え製造を可能にする、新規のＣＤ４０受容体アゴニストに関する必要性が当分野に存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、インビボでのＣＤ４０：ＣＤ４０Ｌ相互作用を模倣し、低いタンパク質分解および延長されたインビボ半減期を示す、特定のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、概して：（ｉ）第一の可溶性ＣＤ４０Ｌサイトカインドメイン；（ｉｉ）第一のペプチドリンカー；（ｉｉｉ）第二の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン；（ｉｖ）第二のペプチドリンカー；（ｖ）第三の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン；（ｖｉ）第三のペプチドリンカー（例えば、ヒンジ−リンカー）および（ｖｉｉ）抗体Ｆｃフラグメントを含む。
【００１３】
一実施態様では、抗体Ｆｃフラグメント（ｖｉ）は、第一のＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）のＮ末、および／または、第三のＣＤ４０Ｌドメイン（ｖ）のＣ末に位置する。別の実施態様では、抗体Ｆｃフラグメントは、第三のＣＤ４０Ｌドメイン（ｖ）のＣ末に位置する。一実施態様では、ポリペプチドは、実質的に非凝集性である。別の実施態様では、第二および／または第三の可溶性ＣＤ４０Ｌドメインは、Ｎ末が短縮されたドメインであり、場合により、アミノ酸配列突然変異を含む。
【００１４】
一実施態様では、可溶性ＣＤ４０Ｌドメインの少なくとも１つ、具体的には、可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）の少なくとも１つは、ヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸Ｇｌｎ１２１またはＩｌｅ１２２でスタートするＮ末配列を有する可溶性ＣＤ４０Ｌドメインであり、ここで、Ｇｌｎ１２１は、ＳｅｒまたはＧＩｙのような中性アミノ酸によって置換され得る。別の実施態様では、可溶性ＣＤ４０Ｌドメインの少なくとも１つ、具体的には、可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）の少なくとも１つは、（ａ）Ｇｌｎ１２１−Ｉｌｅ１２２および（ｂ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１２１−Ｉｌｅ１２２から選択されるＮ末配列を有する可溶性ＣＤ４０Ｌドメインである。一実施態様では、可溶性ＣＤ４０Ｌドメインは、ヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸Ｌｅｕ２６１で終わり、および／または、場合により、Ｅ１２９位、Ａ１３０位、Ｓ１３２位、Ｋ１３３位、Ｔ１３４位、Ｅ１４２位、Ｙ１４５位、Ｙ１４６位、Ｃ１７８位、Ｃ１９４位、Ｒ２００位、Ｆ２０１位、Ｃ２１８位、Ｑ２２０位、Ｎ２４０位に１つまたは複数の突然変異を含む。一実施態様では、可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）は、配列番号１に係るヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸Ｇｌｎ１２１−Ｌｅｕ２６１を含む。
【００１５】
一実施態様では、第一および第二のペプチドリンカー（ｉｉ）および（ｉｖ）は、独立に、３〜８個のアミノ酸の長さ、具体的には、３、４、５、６、７、または８個のアミノ酸の長さを有し、好ましくは、グリシン／セリンリンカーであり、場合により、グリコシル化されてよいアスパラギン残基を含む。一実施態様では、第一および第二のペプチドリンカー（ｉｉ）および（ｉｖ）は、配列番号２に係るアミノ酸配列からなる。別の実施態様では、ポリペプチドは、例えば配列番号１７のＮ末シグナルペプチドドメインをさらに含み、それはプロテアーゼ切断部位を含んでよく、および／または、認識／精製ドメイン、例えば、配列番号１８に係るセリンリンカーに付加されたＳｔｒｅｐ−ｔａｇを含み得るおよび／または結合し得るＣ末エレメントをさらに含む。
【００１６】
一実施態様では、抗体Ｆｃフラグメント（ｖｉｉ）は、可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）および／または（ｖ）に、好ましくは配列番号１６のヒンジ−リンカーを介して融合される。別の実施態様では、抗体Ｆｃフラグメント（ｖｉｉ）は、配列番号１３または１４に示されるアミノ酸配列からなる。
【００１７】
一実施態様では、本発明の単鎖融合ポリペプチドは、配列番号１５、および２５〜３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
一実施態様では、本発明は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する２つの単鎖融合ポリペプチドを含むＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質を提供する。一実施態様では、前記の２つのポリペプチドは、それぞれのポリペプチドのシステイン残基４５３、４５９、および４６２の間に形成される３つの鎖間ジスルフィド結合を通して共有結合される。
【００１９】
一実施態様では、成熟ポリペプチド（単数または複数）配列番号２７、２８、２９、３０、３２、または３４の、１４７位および２９６位におけるアスパラギン残基の１つまたは複数は、Ｎ−グリコシル化される。別の実施態様では、ポリペプチド（単数または複数）の１４７位および２９６位におけるアスパラギン残基は、両方ともＮ−グリコシル化される。
【００２０】
別の実施態様では、ポリペプチド（単数または複数）は、さらに翻訳後修飾される。別の実施態様では、翻訳後修飾は、ピログルタミン酸に改変されたＮ末グルタミンを含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本明細書に開示されるＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質、および、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、および／またはアジュバントを含む、医薬組成物を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸分子を提供する。別の実施態様では、本発明は、核酸分子を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、本発明は、核酸分子を含む細胞を提供する。さらなる実施態様では、細胞は真核生物細胞である。別の実施態様では、細胞は哺乳類細胞である。別の実施態様では、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。他の実施態様では、細胞は、ＣＨＯ−ＤＢＸ１１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｓ、およびＣＨＯ−Ｋ１細胞からなる群より選択される。他の実施態様では、細胞は、Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ−２９３、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、Ｔ４７Ｄ、ＮＳ０、ＣＲＬ７０３０、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０−Ａｇｌ４、およびハイブリドーマ細胞からなる群より選択される。
【００２３】
別の態様では、本発明は、ＣＤ４０Ｌ関連の疾患または障害を有する対象を治療する方法を提供し、当該方法は、有効量のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質を対象に投与するステップを含む。一実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、単独で投与される。別の実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、第二の薬剤の投与の前、同時、または後に投与される。別の実施態様では、疾患または障害は：腫瘍、感染性疾患、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫疾患、変性疾患、アポトーシス関連疾患、および、移植拒絶反応からなる群より選択される。一実施態様では、腫瘍は固形腫瘍である。一実施態様では、腫瘍は、肉腫、食道癌、および胃癌からなる癌の群から生じる。別の実施態様では、腫瘍は、ユーイング肉腫または線維肉腫から生じる。別の実施態様では、腫瘍は、非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）、膵癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、頭頚部癌、および、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）からなる癌の群より生じる。別の実施態様では、腫瘍はリンパ性腫瘍である。一実施態様では、腫瘍は血液腫瘍である。別の実施態様では、腫瘍は、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、または、有毛細胞白血病から生じる。別の実施態様では、自己免疫疾患は、リウマチ疾患、関節疾患、またはリウマチおよび関節の疾患である。さらなる実施態様では、疾患または障害は、関節リウマチである。別の実施態様では、変性疾患は神経変性疾患である。さらなる実施態様では、神経変性疾患は多発性硬化症である。
【００２４】
一実施態様では、第二の薬剤は、化学療法、放射線療法、または生物学的薬剤である。一実施態様では、第二の薬剤は、デュベリシブ（Ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ）、イブルチニブ、ナビトクラックス、および、ベネトクラックスからなる群より選択される。別の実施態様では、第二の薬剤は、アポトーシスの薬剤である。一実施態様では、アポトーシスの第二の薬剤は、ボルテゾミブ、アザシチジン、ダサチニブ、および、ゲフィチニブからなる群より選択される。特定の実施態様では、本明細書において開示される医薬組成物は、静脈内または皮下投与によって患者に投与される。他の実施態様では、開示される医薬組成物は、経口、非経口、筋肉内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、腔内（ｉｎｔｒａｃｅｌｉａｌ）、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、髄腔内、関節滑液嚢内、胸郭内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内、または、経皮投与によって患者に投与される。
【００２５】
一実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、単回ボーラスとして投与される。別の実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、数回に分けられた投与量にわたって投与され得る。ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇで投与することができる。一実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は：約０．１〜０．５、０．１〜１、０．１〜１０、０．１〜２０、０．１〜５０、０．１〜７５、１〜１０、１〜１５、１〜７．５、１．２５〜１５、１．２５〜７．５、２．５〜７．５、２．５〜１５、５〜１５、５〜７．５、１〜２０、１〜５０、７〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、１０〜２０、１０〜５０、１０〜７５、および、１０〜１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される用量で投与することができる。他の実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌで医薬組成物中に存在する。一実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は：約０．１〜０．５、０．１〜１、０．１〜１０、０．１〜２０、０．１〜５０、０．１〜７５、１〜１０、１〜２０、１〜５０、１〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、１０〜２０、１０〜５０、１０〜７５、または、１０〜１００ｍｇ／ｍｌからなる群より選択される量で医薬組成物中に存在する。他の実施態様では、治療的に有効量のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質が対象に投与される。別の実施態様では、予防的に有効量のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質が対象に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】３つのＣＤ４０Ｌドメインを含む、単鎖融合ポリペプチドのドメイン構造。Ｉ．，ＩＩ．，ＩＩＩ．可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン。
【図２】ＣＤ４０Ｌの全体構造を示す模式図。  ■■■細胞膜、細胞内に位置するＮ末、  １．受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の逆平行β折り畳み、  ２．細胞膜およびＲＢＤの界面、  ３．プロテアーゼ切断部位。
【図３】さらなるＦａｂ抗体フラグメントを含む、単鎖融合ポリペプチド。
【図４】３つのジスルフィド架橋を介して２つのＣ末で融合されたｓｃＦｃ融合ポリペプチドの二量体化。
【図５】六価ｓｃＣＤ  ４０Ｌ−ＲＢＤ−ＦＣ融合タンパク質ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ、およびＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃの分析ＳＥＣのクロマトグラム。
【図６】非還元および還元条件下での、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ、およびＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃの発現されたタンパク質の、ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル電気泳動。レーン１：ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ、非還元；レーン２：ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ、還元；レーン３：分子量マーカー；レーン４：ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ、非還元；レーン５：ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ、還元；レーン６：ブランク、レーン７、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ、非還元；レーン８：ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ、還元。
【図７】ＣＤ４０発現Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞を、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｃ）、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｄ）、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ（ｅ）、またはＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ（ｆ）とインキュベートして、結合活性を蛍光ユニットで示した。（ａ）は細胞のみである。（ｂ）は、蛍光標識抗体とインキュベートした細胞のみである。
【図８】ＣＤ４０発現Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞を、１μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｂ）、１０μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｃ）、１μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｄ）、または１０μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｅ）とインキュベートして、結合活性を、いかなるＣＤ４０受容体アゴニストともインキュベートしなかった（ａ）に標準化したＣＤ８６発現で示した。
【図９】２ｍｌの血液を、１μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｂ）、５０μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｃ）、１μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｄ）、または５０μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｅ）とインキュベートした。ＣＤ８３陽性細胞のパーセンテージを決定して、ＣＤ４０受容体アゴニストとインキュベートしなかったコントロールサンプル（ａ）に標準化した。
【図１０】本発明の六価単鎖ＣＤ４０受容体アゴニスト融合タンパク質の略図。内側表面領域に存在するＣＨ２−炭水化物（５）は、通常、「オープンのＦｃ−構造転移」のあいだＣＨ２−サブドメインを立体的に（２）プロテアーゼから保護し、ここで、ヒンジ−鎖間ジスルフィド結合（４）は還元されて、共有鎖間結合が破壊される。このことは、ＣＨ２−解離を可能にし、および、内側表面領域および上側ヒンジリジンＫ２２３（６）をプロテアーゼに対して曝露するのを可能にする。「オープン状態」の二量体の関連性は、ＣＨ３ドメイン（３）の互いに対する高親和力に起因して損なわれないままである。（１）ｓｃＣＤ４０Ｌ−ＲＢＤ；（２）ＣＨ２ドメイン；（３）ＣＨ３ドメイン；（４）ヒンジ−システイン（左側：ジスルフィド架橋に酸化される；右側は、フリーのチオールを有する還元状態）；（５）Ｎ２９７位（ＥＵ−ナンバリング）に付加されたＣＨ２−炭水化物；（６）上側ヒンジリジン（Ｋ２２３）
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明者らは、単鎖ＣＤ４０Ｌ受容体結合ドメインを、抗体由来の二量体化ドメインに融合することは、良好な安定性と合わせて高い生物学的活性を提供する六価ＣＤ４０受容体アゴニストをもたらすことを発見した。したがって、２つのペプチドリンカーによって連結された少なくとも３つの可溶性ＣＤ４０Ｌドメインを含み、Ｎ末および／またはＣ末が抗体由来の二量体化ドメインである、単鎖融合ポリペプチドが提供される。
【００２８】
好ましくは、単鎖融合ポリペプチドは、非凝集性である。用語「非凝集性」は、製剤の≧５０％、好ましくは≧７０％およびより好ましくは≧９０％の単量体含有量を指す。凝集体含有量に対する単量体含有量の比は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて凝集体形成の量を調べることにより決定され得る。凝集に関する安定性は、異なる保管条件、例えば４℃または２５℃で、規定された期間、例えば２、３日〜数日、数週および数ヶ月後に、ＳＥＣによって決定され得る。融合タンパク質に関しては、実質的に非凝集性であると分類されるためには、「単量体」含有量は、４℃、または２５℃での保管の数日、例えば１０日後、より好ましくは数週、例えば２、３または４週間後、最も好ましくは数ヶ月、例えば２または３ヶ月の期間後に、上記のとおり定義されることが好ましい。ＦＣ−融合タンパク質の場合における「単量体」の定義に関しては、２つのポリペプチド鎖の凝集は、２つの鎖からなる生じる凝集タンパク質のＦＣ−部分および機能性ユニットによって動かされる（ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ）。このユニットは、Ｆｃ−融合タンパク質の場合においては、二量体化された単鎖融合ポリペプチドであるにもかかわらず「単量体」と定義される。
【００２９】
単鎖融合ポリペプチドは、そのＮ末および／またはＣ末に位置し得るさらなるドメインを含んでよい。さらなる融合ドメインの例は、例えば、プロテアーゼ切断部位を含み得るＮ末シグナルペプチドドメイン、または、認識／精製ドメインを含み得るおよび／または結合し得るＣ末エレメントである。好ましい実施態様によれば、融合ポリペプチドは、そのＣ末に、リンカーを介して融合されたＳｔｒｅｐ−ｔａｇを含む。短いセリンリンカーを含む例示的なＳｔｒｅｐ−ｔａｇを配列番号１８に示す。
【００３０】
本発明のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、ＣＤ４０Ｌに由来する３つの可溶性ドメインを含む。好ましくは、これらの可溶性ドメインは、哺乳類、特に、対立遺伝子多型を含むヒトＣＤ４０Ｌおよび／またはその誘導体に由来する。可溶性ドメインは、膜配置ドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｏｃａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）を有さない受容体結合ドメインを含むＣＤ４０Ｌの細胞外部分を含む。ＴＮＦスーパーファミリーの他のタンパク質と同様に、ＣＤ４０Ｌは、１５〜３０アミノ酸のＮ末部分、いわゆるｓｔａｌｋ領域を介して膜に固定される。ｓｔａｌｋ領域は、三量体化に寄与し、細胞膜まで特定の距離を提供する。しかしながら、ｓｔａｌｋ領域は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の部分ではない。
【００３１】
重要なことに、ＲＢＤは、そのＮ末およびＣ末アミノ酸の特定の局在によって特徴付けられる。前記アミノ酸はすぐ隣接していて、そして、三量体の軸中央に位置する。ＲＢＤの第一のＮ末アミノ酸は、ＲＢＤのＣ末アミノ酸と逆平行β鎖を形成する（図２）。
【００３２】
したがって、ＲＢＤの逆平行β鎖は、細胞膜と界面を形成し、それは、ｓｔａｌｋ領域のアミノ酸を介して細胞膜に連結されて、その中に固定される。ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質の可溶性ＣＤ４０Ｌドメインは、ｓｔａｌｋ領域から任意のアミノ酸を欠くＣＤ４０Ｌの受容体結合ドメインを含むことが非常に好ましい。それ以外では、可溶性ドメインの１つのＣ末を次の可溶性ドメインのＮ末と連結する長いリンカーは、次の可溶性ドメインのＮ末ｓｔａｌｋ領域を補うことが必要とされて、それは、不安定性および／または凝集体の形成をもたらし得る。
【００３３】
そのような可溶性ドメインのさらなる利点は、ＲＢＤのＮ末およびＣ末アミノ酸は、いかなる抗−薬剤抗体もアクセスできないことである。好ましくは、単鎖融合ポリペプチドは、それぞれのＣＤ４０Ｌ受容体に関する少なくとも１つの機能性結合部位を含む正しく並べられた三量体構造を形成することが可能である。
【００３４】
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、３つの機能性ＣＤ４０受容体結合部位、すなわち、ＣＤ４０受容体と複合体を形成することが可能なアミノ酸配列を含む。したがって、可溶性ドメインは、対応するＣＤ４０受容体に結合することが可能である。一実施態様では、少なくとも１つの可溶性ドメインは、受容体を活性化することが可能であり、それにより、アポトーシスおよび／または増殖性活性が影響を受け得る。さらなる実施態様では、１つまたは複数の可溶性ドメインは、受容体を活性化することができないように選択される。
【００３５】
可溶性ＣＤ４０Ｌドメインは、配列番号１に示されるヒトＣＤ４０Ｌに由来し得る。好ましくは、可溶性ＣＤ４０Ｌドメインは、ヒトＣＤ４０Ｌに由来し、具体的にはアミノ酸１２１または１２２から始まり、具体的には配列番号１のアミノ酸１２１〜２６１または１２２〜２６１を含む。場合により、配列番号１のアミノ酸Ｇｌｎ１２１は、非荷電のアミノ酸、例えばＳｅｒまたはＧｌｙによって置換され得る。
【００３６】
【表１】
0006738831.tif 000002
【００３７】
上記に示されるように、可溶性ＣＤ４０Ｌドメインは、配列番号１に示される野生型配列を含んでよい。しかしながら、これらの可溶性ドメインの１つまたは複数に、可溶性ドメインの結合特性を変更（例えば増大または低減）する突然変異のような突然変異を導入することが可能であることに注意すべきである。一実施態様では、対応するサイトカイン受容体に結合することのできない可溶性ドメインを選択することができる。
【００３８】
本発明のさらなる実施態様では、可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）は、ＣＤ４０受容体の低減した親和力および／または低減した活性化をもたらす、ＣＤ４０Ｌの突然変異体またはその受容体結合ドメインを含む。
【００３９】
突然変異体の結合および／または活性は、例えば、Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６（１３）：１１２２６−１１２３５）；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７（５）：１１２４−１１３５）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６（１３）：１１２２６−１１２３５；または、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７（５）：１１２４−１１３５に記載の分析によって判定され得る。
【００４０】
突然変異体は、任意の技術によって生産され得て、当業者によって知られている。置換は、ＣＤ４０Ｌ、例えば、本明細書に記載のヒトＣＤ４０Ｌ（例えば、配列番号１）またはその受容体結合ドメインの少なくとも１つのアミノ酸に影響し得る。この点について、好ましい置換は、配列番号１のヒトＣＤ４０Ｌの以下のアミノ酸の少なくとも１つ：Ｅ１２９、Ｓ１３２、Ｔ１３４、Ｅ１４２、Ｙ１４５、Ｙ１４６、Ｒ２００、Ｆ２０１、Ｑ２２０、例えば、Ｅ１２９Ｇ、Ｓ１３２Ｅ、Ｓ１３２Ｎ、Ｔ１３４Ｅ、Ｔ１３４Ｎ、Ｅ１４２Ｇ、Ｅ１４２Ｓ、Ｙ１４５Ｓ、Ｙ１４６Ｓ、Ｒ２００Ｓ、Ｑ２２０Ｅ、およびＱ２２０Ｓ；特に、Ｅ１２９ＧおよびＥ１４２Ｇに影響する。
【００４１】
アミノ酸置換（単数または複数）は、ヒトＣＤ４０ＬのようなＣＤ４０Ｌの結合および／または活性に、ＣＤ４０結合またはＣＤ４０によって誘導されるシグナル伝達に対して影響を与え得る。ＣＤ４０の結合および／または活性は、ポジティブに、すなわち、受容体の、より強く、より選択的またはより特異的な結合、および／または、より高い活性化に、影響を受け得る。あるいは、ＣＤ４０の結合および／または活性は、ネガティブに、すなわち、受容体の、より弱く、より低い選択性またはより低い特異性の結合、および／または、より低い活性化または非活性化に、影響を受け得る。
【００４２】
ＣＤ４０の結合および／または活性化に影響を与える、本発明のアミノ酸置換（単数または複数）によるＣＤ４０Ｌの突然変異体の例は、例えば、Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）の図１に見られ得る。
【００４３】
したがって、一実施態様は、本明細書に記載のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であり、ここで、少なくとも１つの可溶性ドメインは、野生型ＣＤ４０Ｌよりも低い程度にＣＤ４０に結合するおよび／または活性化する、ＣＤ４０Ｌの突然変異体またはその受容体結合ドメインを含む。
【００４４】
低減されたＣＤ４０Ｌ誘導性の受容体凝集／およびまたは低減されたシグナル伝達を示す、ＣＤ４０Ｌの突然変異体のさらなる例は、Ｓ１３２Ｅ、およびＴ１３４Ｅである。
【００４５】
一実施態様は、本明細書に記載のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であり、ここで、少なくとも１つの人工Ｎ−グリコシル化コンセンサス部位が、Ｅ１２９−Ｓ１３６によって規定される配列領域内に導入されて、低減された受容体凝集／およびまたは低減されたシグナル伝達をもたらす。この領域内に人工Ｎ−グリコシル化コンセンサス部位をもたらすＣＤ４０Ｌの突然変異体の例は、Ｅ１２９Ｎ、Ａ１３０Ｎ、Ｓ１３２Ｎ、Ｋ１３３ＮおよびＴ１３４Ｎである。
【００４６】
本発明のさらなる実施態様では、１つまたは複数の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｖ）は、低減された自己凝集および／または延長されたインビボ安定性をもたらすＣＤ４０Ｌの突然変異体またはその受容体結合ドメインを含んでよい。この点について、好ましい置換は、配列番号１のヒトＣＤ４０Ｌの以下のアミノ酸：Ｃ１７８、Ｃ１９４、Ｃ２１８、Ｎ２４０；例えば、Ｃ１７８（Ａ、Ｓ、Ｇ）；Ｃ１９４（Ａ、Ｓ、Ｇ）、Ｆ２０１（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｄ）、Ｃ２１８（Ａ、Ｓ、Ｇ）およびＮ２４０（Ｅ、Ｓ、Ｄ、Ｔ）の少なくとも１つに影響を与える。それぞれのＣＤ４０Ｌドメインの突然変異（単数または複数）は、同一または異なってよい。
【００４７】
本発明の単鎖融合分子は、３つの可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン、すなわち、コンポーネント（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）を含む。第二および／または第三の可溶性ＣＤ４０Ｌドメインが、Ｎ末が短縮されたドメインである場合（場合によりアミノ酸配列の突然変異を含む）、凝集に対する単鎖ＣＤ４０Ｌ融合ポリペプチドの安定性が高められる。したがって、好ましくは、第二および第三の可溶性ＣＤ４０Ｌドメインの両方とも、Ｎ末が短縮されたドメインである（場合によりＮ末領域内、好ましくは、可溶性ＣＤ４０ＬドメインのＮ末の最初の５個のアミノ酸内に、アミノ酸配列突然変異を含む）。これらの突然変異は、中性アミノ酸、特に、セリンまたはグリシンによる塩基性アミノ酸の置換を含んでよい。
【００４８】
それと対照的に、第一の可溶性ＣＤ４０Ｌドメインの選択は重要ではない。ここで、Ｎ末配列全長を有する可溶性ドメインが用いられ得る。しかしながら、第一の可溶性ＣＤ４０Ｌドメインは、Ｎ末が短縮された、および場合により、突然変異された配列を有してもよいことに注意すべきである。
【００４９】
本発明のさらに好ましい実施態様では、可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）は、可溶性ヒトＣＤ４０Ｌドメインである。第一の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）は、生来の、短縮された、および／または突然変異された配列から選択され得る。したがって、第一の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）は、ヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸Ｇｌｎ１２１またはＩｌｅ１２２でスタートしてよいＮ末配列を有し、およびここで、Ｇｌｎ１２１は、中性アミノ酸によって、例えばＳｅｒまたはＧＩｙによって、置換されてよい。第二および第三の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）は、好ましくはヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸Ｇｌｎ１２０またはＩｌｅ１２２でスタートする短縮されたＮ末配列を有し、ここで、Ｇｌｎ１２１は、別のアミノ酸、例えばＳｅｒまたはＧｌｙによって置換されてよい。
【００５０】
好ましくは、可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）のＮ末配列は、
（ａ）Ｇｌｎ１２１またはＩｌｅ１２２
（ｂ）（Ｇｌｙ／Ｓｅｒ）１２１
から選択される。
【００５１】
可溶性ＣＤ４０Ｌドメインは、好ましくは、ヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸Ｌｅｕ２６１で終わる。特定の実施態様では、ＣＤ４０Ｌドメインは、上述の内部突然変異を含んでよい。
【００５２】
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質のコンポーネント（ｉｉ）および（ｉｖ）は、それぞれ、コンポーネント（ｉ）および（ｉｉｉ）または（ｉｉｉ）および（ｖ）の間に位置するペプチドリンカーエレメントである。フレキシブルリンカーエレメントは、３〜８個のアミノ酸の長さ、具体的には、３、４、５、６、７、または８個のアミノ酸の長さを有する。リンカーエレメントは、好ましくは、グリシン／セリンリンカーであり、すなわち、ペプチドリンカーは、アミノ酸グリシンおよびセリンから実質的になる。可溶性サイトカインドメインがＳまたはＧでスタートする場合は（Ｎ末）、リンカーは、このＳまたはＧの前で終わる。
【００５３】
リンカー（ｉｉ）およびリンカー（ｉｖ）は、同一の長さである必要はないことに注意すべきである。潜在的な免疫原性を減らすためには、より短いリンカーを用いることが好ましくあり得る。加えて、より短いリンカーは、凝集体を形成する傾向が低い単鎖分子をもたらすことが分かった。一方で、ここに開示されるものよりも実質的に長いリンカーは、好ましくない凝集特性を示し得る。
【００５４】
必要に応じて、リンカーは、グリコシル化部位Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒを形成し得るアスパラギン残基を含んでよい。特定の実施態様では、リンカー、例えばリンカー（ｉｉ）またはリンカー（ｉｖ）の１つは、グリコシル化部位を含む。他の実施態様では、リンカー（ｉｖ）は両方とも、グリコシル化部位を含む。ＣＤ４０Ｌアゴニストタンパク質の溶解度を増大するため、および／または、潜在的な免疫原性を低減するために、リンカー（ｉｉ）またはリンカー（ｉｖ）または両方は、グリコシル化部位を含むことが好ましくあり得る。
【００５５】
好ましいリンカー配列を表２に示す。好ましいリンカーはＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号２）である。
【００５６】
【表２】
0006738831.tif 000003
【００５７】
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、第一のＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）のＮ末および／または第三のＣＤ４０Ｌドメイン（ｖ）のＣ末に位置してよい抗体Ｆｃフラグメントドメインをさらに含む。好ましくは、抗体Ｆｃフラグメントドメインは、Ｆｃ−γ−Ｒ受容体とインビボで相互作用する能力が低い。好ましくは、抗体Ｆｃフラグメントドメインは、配列番号１３または１４に示されるアミノ酸配列を含む、またはからなる。Ｆｃフラグメントドメインの例を表３に示す。
【００５８】
【表３】
0006738831.tif 000004
【００５９】
グリコサイトの合計数および三次元での炭水化物の個々の位置は、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質のインビボでの安定性に影響を与える。さらに、炭水化物認識は、末端糖類の局所密度、炭水化物ツリーの分岐、および、炭水化物マター（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ｍａｔｔｅｒ）の相対的位置に依存する。
【００６０】
ＣＨ２−ドメイン炭水化物の枯渇は、インビボでのＦｃ−受容体に基づく架橋および潜在的なＣＤ４０Ｌ−受容体スーパークラスタリングに基づく毒性を避けるために必要である。さらに、部分的に分解された炭水化物は、レクチンによって駆動されるメカニズムを通してＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質のインビボでの半減期を減らす。分子上のグリコシル化部位の合計数を減らすことによって、生じる化合物は、これらのメカニズムに対するアクセスがより低く（ｌｅｓｓ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）、半減期を増大させる。したがって、一実施態様では、本発明のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質上のグリコサイトの合計数は、ＣＨ２グリコサイトの枯渇を通して低減されて、配列番号１５（ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ）のＮ２９７Ｓ同等突然変異（ＥＵナンバリングシステムによる）を含むＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質をもたらし、アグリコシル（ａｇｌｙｃｏｓｌ）−ＣＨ２ドメインを作った。
【００６１】
内側表面領域に存在するＣＨ２−グリコサイトは、通常、「オープンのＦｃ−構造転移」のあいだ、サブドメインをプロテアーゼから保護し、ここで、ヒンジ−鎖間ジスルフィド結合は還元されて、共有鎖間結合は破壊される（図１０）。このことは、ＣＨ２−解離および内側表面領域のプロテアーゼに対する曝露を可能にする。
【００６２】
アグリコシルＣＨ２を作る配列番号１５（ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ）のＮ２９７Ｓ同等突然変異（ＥＵナンバリングシステムによる）を含むＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、したがって、野生型ＣＨ２グリコシル化を有する同等の構造よりも（ｔｈａｔ）タンパク質分解の安定性が低い可能性がある。このことは、宿主細胞プロテアーゼが存在し、構造に長期のアクセスを有する場合、ＵＳＰ／ＤＳＰ／保管のあいだの化合物の安定性に影響を与える。したがって、特定の実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストは、ＣＨ２グリコサイトを欠くが、それぞれのポリペプチド鎖のリンカー配列内にグリコサイトを含む（例えば、ＧＳＧＳＧＮＧＳ、配列番号２）。特定の例示的な実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストは、二量体内に合計１０個のグリコサイトのために、ポリペプチド鎖あたり５個のグリコサイトを含む。
【００６３】
本発明の好ましい実施態様によれば、抗体Ｆｃフラグメントドメインは、ヒンジ−リンカーエレメントを介して融合される。ヒンジ−リンカーエレメントは、１０〜３０個のアミノ酸の長さ、具体的には、１５〜２５個のアミノ酸、例えば２２個のアミノ酸の長さを有する。ヒンジリンカーエレメントは、好ましくは、免疫グロブリンのヒンジ領域配列を含み、本明細書において「Ｉｇヒンジ領域」と呼ばれる。用語「Ｉｇヒンジ領域」は、システイン残基を含む（そこでジスルフィド結合が免疫グロブリンの２つの重鎖を連結する）、天然起源のＩｇヒンジ領域配列の一部と配列同一性または類似性を共有するアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドを意味する。
【００６４】
ヒンジ領域の誘導体およびアナログは、突然変異によって得ることができる。本明細書において言及される誘導体またはアナログは、欠失、挿入および／または置換に起因し得る１つまたは複数のアミノ酸配列の違いを有することを除き、野生型（または天然起源のタンパク質）の全長配列と配列同一性または類似性を共有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。しかしながら、本発明によれば、用語「ヒンジ−リンカー」は、Ｉｇヒンジ領域またはその誘導体を含むこれらのリンカーに制限されないが、ヒンジ−リンカーエレメントによって付加されたドメインが生物学的に活性の確証（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を達成するのを可能にするのに十分長い任意のリンカーである。
【００６５】
個々のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質内にオープンＦｃ−構造を有する分子の数は、ヒンジ領域内に存在する鎖間−ジスルフィド結合の数に依存する。したがって、一実施態様では、ＣＨ２−グリコサイトの枯渇の効果を改善するために、第三のシステインを本発明のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質のヒンジ領域中に導入した。
【００６６】
六価ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質のホモ二量体を安定化するヒンジ領域の鎖間−ジスルフィド連結性は、ＣＤ４０Ｌサブシーケンスのフリーのチオール基によっても影響を受ける（二量体当たり合計６個）。これはまた、製剤の内因性のフリーのチオールによる構造のヒンジジスルフィド架橋の自己還元に起因して、前述のオープンＦＣ−構造をもたらす。その結果、酸素およびプロテアーゼに対する長期間の曝露が生じた場合に、６個のフリーのチオールを含む単鎖ＣＤ４０Ｌ−ＦＣ融合タンパク質は、製造および保管のあいだ、より安定性が低いことが予測される。
【００６７】
したがって、六価ＣＤ４０受容体アゴニストの製造を可能にするためには、Ｃ１９４残基は、好ましくは、受容体結合に影響を与えずに異なるアミノ酸に突然変異される。
【００６８】
さらに、本発明のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、上側ヒンジリジンの、グリシンへの突然変異をさらに含み、この部位でのタンパク質分解のプロセスを低減させる。したがって、一実施態様では、本発明のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、上側ヒンジリジン（Ｋ２２３、ＥＵナンバリングシステムによる）の、グリシンへの突然変異をさらに含み、この部位でのタンパク質分解のプロセスを低減させて、それにより、融合タンパク質の全体的な安定性を高める。第三のシステイン（Ｃ２２５、ＥＵナンバリングシステムによる）の前述の導入を、ヒンジ領域内の前述のリジンからグリシンへの突然変異（Ｋ２２３Ｇ、ＥＵナンバリングシステムによる）と組み合わせて、全体的に安定化された本発明のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質をもたらす。
【００６９】
特に好ましいヒンジ−リンカーエレメントは、前述のシステインＣ２２５およびリジンからグリシンへの突然変異Ｋ２２３Ｇを含む、配列番号１６（表４）に示されるアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【００７０】
ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、Ｎ末シグナルペプチドドメインをさらに含んでよく、それは、適切な宿主細胞において、例えば細胞外分泌を処理するのを可能にする。好ましくは、Ｎ末シグナルペプチドドメインは、プロテアーゼ切断部位、例えば、シグナルペプチダーゼ切断部位を含み、したがって、成熟タンパク質を得るために、発現前または発現中に取り除かれ得る。特に好ましいＮ末シグナルペプチドドメインは、配列番号１７（表４）に示されるアミノ酸配列を含む。
【００７１】
さらに、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、認識／精製ドメイン、例えばＦＬＡＧドメイン、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇまたはＳｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩドメイン、および／または、ポリ−Ｈｉｓドメインを含み得る、または結合し得る、例えば１〜５０個、好ましくは１０〜３０個のアミノ酸の長さを有するＣ末エレメントをさらに含んでよい。特に好ましい実施態様によれば、融合ポリペプチドは、配列番号１８（表４）に示される短いセリンリンカーを介したＣ末に融合されたＳｔｒｅｐ−ｔａｇを含む。
【００７２】
例示的なヒンジ−リンカーエレメント（配列番号１６、１９〜２４）、Ｎ末シグナルペプチドドメイン（配列番号１７）およびセリンリンカー−ｓｔｒｅｐ  ｔａｇ（配列番号１８）を表４に示す。
【００７３】
【表４】
0006738831.tif 000005
【００７４】
本発明の一実施態様では、融合ポリペプチドは、配列番号２のペプチドリンカーエレメントによって融合された３つの可溶性ＣＤ４０Ｌドメインを含む。第一の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）は、配列番号１に係るヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸１２１〜２６１からなり、可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉｉｉ）および（ｖ）は、配列番号１に係るヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸１２１〜２６１からなる。
【００７５】
加えて、融合ポリペプチドは、配列番号１６に係るヒンジ−リンカーを介して可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｖ）にＣ末で融合した、配列番号１３に係る抗体Ｆｃフラグメントドメインを含む。発明者らは驚くべきことに、この特定の融合ポリペプチドが、改善された生物学的活性を提供すること、および、特に安定性であることを見いだした。本発明のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質の例示的な実施態様のアミノ段配列を、配列番号２７に示す。
【００７６】
さらに、融合ポリペプチドは、例えば配列番号１７に係る、Ｎ末シグナルペプチドドメインを含んでよい。本発明のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質の具体例を、配列番号２５に示す。
【００７７】
別の好ましい実施態様によれば、融合ポリペプチドは、配列番号１８に示される短いセリンリンカーを介して本発明のポリペプチドに融合された、Ｃ末Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇをさらに含んでよい。本発明のこの態様によれば、Ｆｃフラグメントは、好ましくは、配列番号１３または１４に示されるアミノ酸配列からなる。さらに、Ｆｃフラグメントは、例えば配列番号１３のアミノ酸１〜２１７を含む、より短いＦｃフラグメントからなり得る。Ｃ末Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇを含む融合ポリペプチドの特に好ましい例を、配列番号１５に示す（ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ）。
【００７８】
配列番号１５、２５、および２６に示される例示的なＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、それぞれ、Ｎ末シグナルペプチドドメインを含む。シグナルペプチドドメインは、アミノ酸１〜２０を含む。それぞれの場合において、成熟タンパク質は、アミノ酸２１でスタートする。本発明の成熟の例示的なＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質（シグナルペプチドを有さない）を、配列番号２７〜３０、３２、および３４に示す。上述の例示的なＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質を、表５に示す。
【００７９】
本発明の一実施態様によれば、単鎖ＣＤ４０Ｌ融合ポリペプチドドメインは、配列番号２のペプチドリンカーエレメントによって融合された３つの可溶性ＣＤ４０Ｌドメインを含む。可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｉ）、（ｉｉｉ）および（ｖ）は、それぞれ、Ｃ１９４Ｓ突然変異を有する配列番号１に係るヒトＣＤ４０Ｌのアミノ酸１２１〜２６１からなる。前述のＣＤ４０Ｌ  １２１−２６１  Ｃ１９４Ｓ突然変異（ｍｕｔｅｉｎ）を含むこの単鎖−ＣＤ４０Ｌポリペプチドを配列番号３６に示し、それは、野生型と比較して高い安定性で、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかでの融合タンパク質を産生するのに十分に適している。好ましい実施態様では、配列番号１３に係る抗体Ｆｃフラグメントドメインは、配列番号１６に係るヒンジリンカーを介して、配列番号３６の可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（ｖ）にＣ末で融合される。
【００８０】
配列番号２７に記載のＣＤ４０受容体アゴニストは、低減した合計数のグリコシル化部位（ＣＨ２領域内のＮ２９７Ｓ突然変異は、アグリコシル化ＣＨ２ドメインを与える）、ヒンジ領域内の増大した数の鎖間ジスルフィド結合、および、上側ヒンジリジンのグリシンへの突然変異を有する。これらの変更は、ＣＤ４０Ｌ受容体スーパークラスタリングおよび潜在的な分解の減少をもたらす（付随する毒性とともに）。一部の実施態様では、Ｎ末グルタミンは、ピログルタミン酸に改変される（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：１１２１１−１１２１７）。
【００８１】
【表５】
0006738831.tif 000006
0006738831.tif 000007
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【００８２】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸分子に関する。核酸分子は、ＤＮＡ分子、例えば二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子であってよい。核酸分子は、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質またはその前駆体、例えば、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質のプロ−またはプレ−プロフォームをコードしてよく、それは、好ましくはＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質のＮ末および／またはＣ末に位置する、分泌または精製のためのシグナル配列または他の異種アミノ酸部分を含んでよい。異種アミノ酸部分は、プロテアーゼ切断部位、例えば、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘ３、トロンビンまたはＩｇＡプロテアーゼ切断部位を介して、第一および／または第二のドメインに連結され得る。本発明の核酸配列の具体例を、表６に配列番号３７として示す。この核酸分子は、配列番号２５の融合ポリペプチドをコードする。
【００８３】
【表６】
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【００８４】
核酸分子は、発現制御配列、例えば、所望の宿主細胞において核酸分子の発現を可能にする発現制御配列に、作動可能に結合され得る。核酸分子は、ベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、ウイルスベクター、染色体組込みベクターなどに位置してよい。適切な発現制御配列およびベクターの適切な例は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、および、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、または、それらのより最近版によって記載される。
【００８５】
本発明のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質をコードする核酸配列を発現するために、様々な発現ベクター／宿主細胞系を用いてよい。適切な宿主細胞は、限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌などの原核生物細胞、酵母細胞などの真核生物宿主細胞、昆虫細胞、植物細胞または動物細胞、好ましくは哺乳類細胞および、より好ましくは、ヒト細胞を含む。さらに、本発明は、上述の核酸分子で形質転換またはトランスフェクトされた非ヒト生物に関する。そのようなトランスジェニック生物は、相同組み換えを含む遺伝的伝達の公知の方法によって生産され得る。
【００８６】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載される全ての、少なくとも１つのＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質、それをコードするそれぞれの核酸、または、形質転換またはトランスフェクトされた細胞を活性剤として含む、医薬組成物または診断組成物に関する。
【００８７】
本明細書において用いられる用語「ＣＤ４０Ｌ関連の疾患または障害」は、ＣＤ４０受容体アゴニストの添加によって寛解され得る任意の疾患または障害である。本明細書に記載される全ての、少なくとも１つのＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質、それをコードするそれぞれの核酸、または、形質転換またはトランスフェクトされた細胞は、治療において、例えば、ＣＤ４０Ｌの機能障害、具体的には、増殖性疾患、例えば固形またはリンパ系腫瘍のような腫瘍；感染性疾患；炎症性疾患；代謝疾患；リウマチおよび／または関節疾患のような自己免疫疾患；変性疾患、例えば、多発性硬化症のような神経変性疾患；アポトーシス関連疾患または移植拒絶反応に起因する、関連する、および／または伴う障害の、予防および／または治療において用いられ得る。
【００８８】
本明細書において用いられる用語「ＣＤ４０Ｌの機能障害」は、ＣＤ４０Ｌの正常な機能または発現から外れたＣＤ４０Ｌの任意の機能または発現、例えば、ＣＤ４０Ｌ遺伝子またはタンパク質の過剰発現、ＣＤ４０Ｌの正常な生理学的発現レベルと比較したＣＤ４０Ｌ遺伝子またはタンパク質の低減または消失した発現、ＣＤ４０Ｌの正常な生理学的活性または結合と比較して、ＣＤ４０Ｌの増大した活性、ＣＤ４０Ｌの低減または消失した活性、任意の結合パートナー、例えば、受容体（具体的にはＣＤ４０Ｌ受容体）または別のサイトカイン分子に対するＣＤ４０Ｌの増大した結合、任意の結合パートナー、例えば受容体（具体的にはＣＤ４０Ｌ受容体）または別のサイトカイン分子に対する低減または消失した結合として理解される。
【００８９】
様々な実施態様では、ヒト対象における、標的（単数または複数）の活性に対する効果がアゴニストであり、１つまたは複数の症候が緩和され、および／または、治療が達成されるように、本明細書に開示されるＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質をヒト対象に投与するステップを含む、ＣＤ４０Ｌ受容体の標的化によって診断および／または治療することのできる障害を患っているヒト対象を診断および／または治療するための方法が提供される。本明細書において提供されるＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、乳癌、大腸癌、直腸癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌「ＳＣＬＣ」および非小細胞肺癌「ＮＳＣＬＣ」）、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢および胆管の癌、小腸癌、尿路（腎臓、膀胱および尿管上皮を含む）の癌、女性生殖管の癌（頸部、子宮、および卵巣の癌、ならびに、絨毛癌および妊娠性絨毛の疾患を含む）、男性生殖管の癌（前立腺、精嚢、精巣および胚細胞の腫瘍を含む）、内分泌腺の癌（甲状腺、副腎、および脳下垂体を含む）、および、皮膚癌、ならびに、血管腫、メラノーマ、肉腫（骨および軟組織から生じるもの、ならびにカポシ肉腫を含む）、脳、神経、眼、および髄膜の腫瘍（星状細胞腫、グリオーマ、グリア芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫、および髄膜腫を含む）、以下から生じる腫瘍、造血性悪性腫瘍、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、ＤＬＢＣＬ、小胞リンパ腫、造血性悪性腫瘍、カポシ肉腫、悪性リンパ腫、悪性組織球症、悪性メラノーマ、多発性骨髄腫、悪性腫瘍の腫瘍随伴症候群／高カルシウム血症、または固形腫瘍を含む、原発性癌および転移性癌を患っているヒトを診断および／または治療するために用いることができる。
【００９０】
本明細書に開示されるＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質および薬学的に許容できる担体を含む、医薬組成物が提供される。一部の実施態様では、医薬組成物は、障害を治療するための少なくとも１つのさらなる治療剤を含む。例えば、さらなる薬剤は、治療剤、化学療法剤；イメージング剤、細胞傷害性薬剤、血管新生阻害剤、キナーゼ阻害剤（制限されないが、ＫＤＲおよびＴＩＥ−２阻害剤を含む）、共刺激分子モジュレーターまたは免疫チェックポイント阻害剤（制限されないが、抗−Ｂ７．１、抗−Ｂ７．２、抗−Ｂ７．３、抗−Ｂ７．４、抗−ＣＤ２８、抗−Ｂ７ＲＰ１、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗−ＣＴＬＡ−４、抗−ＰＤ−１、抗−ＰＤ−Ｌ１、抗−ＰＤ−Ｌ２、抗−ＩＣＯＳ、抗−ＬＡＧ−３、抗−Ｔｉｍ３、抗ＶＩＳＴＡ、抗−ＨＶＥＭ、抗−ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ融合タンパク質、抗−ＣＤ１３７、抗−ＣＤ１３７Ｌ、抗−ＯＸ４０、抗−ＯＸ４０Ｌ、抗−ＣＤ７０、抗−ＣＤ２７、抗−ＧＡＬ９、抗−Ａ２ＡＲ、抗−ＫＩＲ、抗ＩＤＯ−１、抗−ＣＤ２０を含む）、樹状細胞／抗原提示細胞モジュレーター（制限されないが、抗−ＣＤ４０抗体、抗−ＣＤ４０Ｌ、抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ、抗−Ｄｅｃｔｉｎ−１、抗−ＣＤ３０１、抗−ＣＤ３０３、抗−ＣＤ１２３、抗−ＣＤ２０７、抗−ＤＮＧＲ１、抗−ＣＤ２０５、抗−ＤＣＩＲ、抗−ＣＤ２０６、抗−ＩＬＴ７を含む）、Ｔｏｌｌ様受容体に関するモジュレーター（制限されないが、抗−ＴＬＲ−１、抗−ＴＬＲ−２、抗−ＴＬＲ−３、抗−ＴＬＲ−４、抗−ＴＬＲ−４、抗−ＴＬＲ−５、抗−ＴＬＲ−６、抗ＴＬＲ−７、抗−ＴＬＲ−８、抗−ＴＬＲ−９を含む）、接着分子ブロッカー（制限されないが、抗−ＬＦＡ−１抗体、抗−Ｅ／Ｌセレクチン抗体、小分子阻害剤を含む）、抗−サイトカイン抗体またはその機能性フラグメント（制限されないが、抗−ＩＬ−１８、抗−ＴＮＦ、または抗−ＩＬ−６／サイトカイン受容体抗体を含む）、二重特異性リダイレクトＴ細胞またはＮＫ細胞毒性（制限されないが、ＢｉＴＥ（登録商標）を含む）、キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ−Ｔ）に基づく治療、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に基づく治療、治療用癌ワクチン、メトトレキサート、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、検出可能なラベルまたはレポーター、ＴＮＦ拮抗薬、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤、乾癬治療薬、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｉｏｄ）、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫付与、免疫グロブリン、免疫抑制薬、成長ホルモン、ホルモン置換薬、放射性医薬品、抗鬱薬、抗精神病薬、興奮剤、喘息医薬品、βアゴニスト、吸入ステロイド、エピネフリンまたはアナログ、サイトカイン、またはサイトカイン拮抗薬であってよい。
【００９１】
一実施態様では、癌を治療する方法において、または、本明細書に記載の腫瘍からの転移の予防または阻害において、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質（単数または複数）は、単独で、または、１つまたは複数のさらなる薬剤、例えば、化学療法、放射線療法、または生物学的薬剤と組み合わせて、用いることができる。一部の実施態様では、薬剤は、以下：１３−ｃｉｓ−レチノイン酸；２−ＣｄＡ；２−クロロデオキシアデノシン；５アザシチジン；５−フルオロウラシル；５−ＦＵ；６−メルカプトプリン；６−ＭＰ；６−ＴＧ；６−チオグアニン；アブラキサン；アキュテイン（登録商標）；アクチノマイシン−Ｄ；アドリアマイシン（登録商標）；アドルシル（登録商標）；アフィニトール（登録商標）；アグリリン（登録商標）；Ａｌａ−Ｃｏｒｔ（登録商標）；アルデスロイキン；アレムツズマブ；ＡＬＩＭＴＡ；アリトレチノイン；アルカバン−ＡＱ（登録商標）；アルケラン（登録商標）；全トランス型レチノイン酸、；αインターフェロン；アルトレタミン；アメトプテリン；アミホスチン；アミノグルテチミド；アナグレリド；Ａｎａｎｄｒｏｎ（登録商標）；アナストロゾール；アラビノシルシトシン；Ａｒａ−ＣＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）；アレディア（登録商標）；アリミデックス（登録商標）；アロマシン（登録商標）；アラノン（登録商標）；三酸化ヒ素；アーゼラ（商標）；アスパラギナーゼ；ＡＴＲＡ；アバスチン（登録商標）；アザシチジン；ＢＣＧ；ＢＣＮＵ；ベンダムスチン；ベバシズマブ；ベキサロテン；ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）；ビカルタミド；ＢｉＣＮＵ；ブレノキサン（登録商標）；ブレオマイシン；ボルテゾミブ；ブスルファン；ブスルフェクス（登録商標）；Ｃ２２５；ロイコヴォリンカルシウム；キャンパス（登録商標）；キャンプトサー（登録商標）；カンプトテシン−１１；Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ  Ｃａｒａｃ（商標）；カルボプラチン；カルムスチン；Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ  Ｗａｆｅｒ；カソデックス（登録商標）；ＣＣ−５０１３；ＣＣＩ−７７９；ＣＣＮＵ；ＣＤＤＰ；ＣｅｅＮＵ；セルビジン（登録商標）；セツキシマブ；クロラムブシル；シスプラチン；シトロボラム因子；クラドリビン；コーチゾン；コスメゲン（登録商標）；ＣＰＴ１１；シクロホスファミド；シタドレン（登録商標）；シタラビン；リポソーム性（Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ）シタドレン；Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標）；シトキサン（登録商標）；ダカルバジン；Ｄａｃｏｇｅｎ；ダクチノマイシン；ダルベポエチンα；ダサチニブ；ダウノマイシン；ダウノルビシン；ダウノルビシンハイドロクロライド；リポソーム性ダウノルビシン；ダウノキソーム（登録商標）；デカドロン；デシタビン；Ｄｅｌｔａ−Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標）；デルタゾン（登録商標）；デニロイキン；ジフチトクス；ＤｅｐｏＣｙｔ（商標）；デキサメタゾン；デキサメタゾンアセテート；デキサメタゾンリン酸ナトリウム；デキサゾン；デクスラゾキサン；ＤＨＡＤ；ＤＩＣ；ジオデックス；ドセタキセル；ドキシル（登録商標）；ドキソルビシン；リポソーム性ドキソルビシン；Ｄｒｏｘｉａ（商標）；ＤＴＩＣ；ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）；Ｄｕｒａｌｏｎｅ（登録商標）；デュ���リシブ（Ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ）；エフデックス（登録商標）；エリガード（商標）；Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標）；エロキサチン（商標）；エルスパー（登録商標）；Ｅｍｃｙｔ（登録商標）；エピルビシン；エポエチンα；アービタックス；エルロチニブ；エルウィニアＬ−アスパラギナーゼ；エストラムスチン；エチオールエトポホス（登録商標）；エトポシド；リン酸エトポシド；エウレキシン（登録商標）；エベロリムス；エビスタ（登録商標）；エキセメスタン；フェアストン（登録商標）；フェソロデックス（登録商標）；フェマーラ（登録商標）；フィルグラスチム；フロクスウリジン；フルダラ（登録商標）；フルダラビン；フルオロプレックス（登録商標）；フルオロウラシル；フルオロウラシル（クリーム）；フルオキシメステロン；フルタミド；ホリニン酸；ＦＵＤＲ（登録商標）；フルベストラント；ゲフィチニブ；ゲムシタビン；ゲムツズマブオゾガマイシン；ジェムザール；グリベック（商標）；ギリアデル（登録商標）Ｗａｆｅｒ；ＧＭ−ＣＳＦ；ゴセレリン；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Ｇ−ＭＣＳＦ）；ハロテスチン（登録商標）；ハーセプチン（登録商標）；ヘキサドロール；ヘキサレン（登録商標）；ヘキサメチルメラミン；ＨＭＭ；ハイカムチン（登録商標）；ハイドレア（登録商標）；Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔ  Ａｃｅｔａｔｅ（登録商標）；ヒドロコルチゾン；ヒドロコルチゾンリン酸ナトリウム；コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム；リン酸ハイドロコートン；ヒドロキシ尿素；イブルチニブ；イブリツモマブ；イブリツモマブチウキセタン；イダマイシン（登録商標）；イダルビシンＩｆｅｘ（登録商標）；インターフェロン−α；インターフェロン−α−２ｂ（ＰＥＧコンジュゲート）；イホスファミド；インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）；インターロイキン−２（ＩＬ−２）；メシル酸イマチニブ；イミダゾールカルボキサミド；Ｉｎｔｒｏｎ  Ａ（登録商標）；イピリムマブ、イレッサ（登録商標）；イリノテカン；イソトレチノイン；イキサベピロン；イグゼンプラ（商標）；ＫＡＤＣＹＣＬＡ（登録商標）；キドロラーゼ（ｔ）ラナコート（登録商標）；ラパチニブ；Ｌ−アスパラギナーゼ；ＬＣＲ；レナリドマイド；レトロゾール；ロイコボリン；ロイケラン；Ｌｅｕｋｉｎｅ（商標）；リュープロリド；ロイロクリスチン；ロイスタチン（商標）；リリルマブ；リポソーム性Ａｒａ−Ｃ；Ｌｉｑｕｉｄ  Ｐｒｅｄ（登録商標）；ロムスチン；Ｌ−ＰＡＭ；Ｌ−Ｓａｒｃｏｌｙｓｉｎ；リュープロン（登録商標）；リュープロンデポット（登録商標）；マチュラン（登録商標）；マキシデックス；メクロレタミン；塩酸メクロレタミン；メドラロン（登録商標）；Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）；Ｍｅｇａｃｅ（登録商標）；メゲストロール；酢酸メゲストロール；ＭＥＫ阻害剤；メルファラン；メルカプトプリン；メスナ；メスネックス（商標）；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メチルプレドニソロン；メチコルテン（登録商標）；マイトマイシン；マイトマイシン−Ｃ；ミトキサントロンＭ−Ｐｒｅｄｎｉｓｏｌ（登録商標）；ＭＴＣ；ＭＴＸ；ムスタルゲン（登録商標）；ムスチン；ムタマイ���ン（登録商標）；ミレラン（登録商標）；ミロセル（Ｍｙｌｏｃｅｌ）（商標）；ミロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（登録商標）；ナビトクラックス；ナベルビン（登録商標）；ネララビン；Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）；ニューラスタ（商標）；ニューメガ（登録商標）；ニューポジェン（登録商標）；ネクサバール（登録商標）；ニランドロン（登録商標）；ニロチニブ；ニルタミド；ニペント（Ｎｉｐｅｎｔ）（登録商標）；Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍｕｓｔａｒｄ  Ｎｏｖａｌｄｅｘ（登録商標）；ニボルマブ；ノバントロン（登録商標）；Ｎｐｌａｔｅ；オクトレオチド；酢酸オクトレオチド；オファツムマブ；オンコスパー（Ｏｎｃｏｓｐａｒ）（登録商標）；オンコビン（登録商標）；オンタック（登録商標）；オンキサール（Ｏｎｘａｌ）（商標）；オプレルベキン；オラプレッド（Ｏｒａｐｒｅｄ）（登録商標）；オラソン（Ｏｒａｓｏｎｅ）（登録商標）；オキサリプラチン；パクリタキセル；パクリタキセルタンパク質結合；パミドロネート；パニツムマブ；パンレチン（登録商標）；パラプラチン（登録商標）；パゾパニブ；ペディアプレッド（Ｐｅｄｉａｐｒｅｄ）（登録商標）；ＰＥＧインターフェロン；ペグアスパラガーゼ；ペグフィルグラスチム；ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（商標）；ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ；ペメトレキセド；ペンブロリズマブ；ペントスタチン；ペルツズマブ；フェニルアラニンマスタード；ピディリズマブ；プラチノール（登録商標）；プラチノール−ＡＱ（登録商標）；プレドニゾロン；プレドニゾン；プレロン（登録商標）；プロカルバジン；ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標）；プロロイキン（登録商標）；Ｐｒｏｌｉｆｅｐｒｏｓｐａｎ  ２０  ｗｉｔｈ  Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ  Ｉｍｐｌａｎｔ；プリネトール（登録商標）；ＢＲＡＦ阻害剤；ラロキシフェン；リブリミド（登録商標）；リウマトレックス（登録商標）；リツキサン（登録商標）；リツキシマブ；ロフェロン−Ａ（登録商標）；ロミプロスチム；ルベックス（登録商標）；塩酸ルビドマイシン；サンドスタチン（登録商標）；サンドスタチンＬＡＲ（登録商標）；サルグラモスチム；Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（登録商標）；Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（登録商標）；ソラフェニブ；ＳＰＲＹＣＥＬ（商標）；ＳＴＩ−５７１；ＳＴＩＶＡＧＲＡ（商標）、ストレプトゾシン；ＳＵ１１２４８；スニチニブ；スーテント（登録商標）；タモキシフェンタルセバ（登録商標）；タルグレチン（登録商標）；タシグナ（登録商標）；タキソール（登録商標）；タキソテレ（登録商標）；テモダール（登録商標）；テモゾロミドテムシロリムス；テニポシド；ＴＥＳＰＡ；サリドマイド；サロミド（登録商標）；ＴｈｅｒａＣｙｓ（登録商標）；チオグアニン；チオグアニンタブロイド（登録商標）；チオホスホアミド；チオプレックス（登録商標）；チオテパ；ＴＩＣＥ（登録商標）；Ｔｏｐｏｓａｒ（登録商標）；トポテカン；トレミフェン；トーリセル（登録商標）；トシツモマブ；トラスツズマブ；トレアンダ（登録商標）；トレメリムマブ；トレチノイン；トレキサール（Ｔｒｅｘａｌｌ）（商標）；トリセノックス（登録商標）；ＴＳＰＡ；ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）；ウレルマブ；ＶＣＲ；ベクチビックス���商標）；ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（登録商標）；ベルケイド（登録商標）；ベネトクラックス；ベプシド（登録商標）；ベサノイド（登録商標）；ビアデュール（Ｖｉａｄｕｒ）（商標）；ビダーザ（登録商標）；ビンブラスチン；ビンブラスチンサルフェート；Ｖｉｎｃａｓａｒ  Ｐｆｓ（登録商標）；ビンクリスチン；ビノレルビン；酒石酸ビノレルビン；ＶＬＢ；ＶＭ−２６；ボリノスタット；ヴォトリエント；ＶＰ−１６；Ｖｕｍｏｎ（登録商標）；ゼローダ（登録商標）；ザノサー（登録商標）；ゼヴァリン（商標）；ジネカード（Ｚｉｎｅｃａｒｄ）（登録商標）；ゾラデックス（登録商標）；ゾレドロン酸；ゾリンザ；またはゾメタ（登録商標）、および／または、同様のパスウェイを標的化するここに具体的に挙げられない任意の他の薬剤を含むことができる。
【００９２】
２以上の物質または原理が組み合わせた治療レジメンの一部として用いられる場合、それらは、本質的に同時に、または異なる時に（例えば、本質的に同時に、連続的に、または交互のレジームに従って）、同一の投与経路または異なる投与経路を介して投与され得る。物質または原理が同一の投与経路を介して同時に投与される場合は、当業者に明らかであるように、それらは、異なる医薬製剤または組成物、または、組み合わされた医薬製剤または組成物の一部として、投与され得る。
【００９３】
また、２以上の活性の物質または原理が、組み合わされた治療レジメンの一部として用いられる場合、物質または原理のそれぞれは、化合物または原理がそれ自体で用いられる場合に用いられるのと同量かつ同一のレジメンに従って投与され得て、そのような併用は、相乗効果をもたらしてよく、またはもたらさなくてよい。しかしながら、２以上の活性の物質または原理の併用が相乗効果をもたらす場合は、所望の治療作用をなおも達成しながら、投与される物質または原理の１つ、１つよりも多く、または全ての量を低減させることも可能であり得る。このことは、例えば、所望の製剤または治療効果をなおも得ながら、それらの通常の量でそれらが用いられる場合の１つまたは複数の物質または原理の使用と関連する任意の不要な副作用を、避ける、制限する、または低減するのに有用であり得る。
【００９４】
本発明によって用いられる治療レジメンの有効性は、臨床医に明らかなように、関与する疾患または障害に関してそれ自体で公知の任意の様式で、判定および／またはフォローされ得る。また、臨床医は、適切な場合にケースバイケースで、不要な副作用を避ける、制限する、または低減する所望の治療効果を達成するため、および／または、一方では所望の治療効果を達成して、他方では望ましくない副作用を避ける、制限する、または低減する、適切なバランスを達成するために、特定の治療レジメンを変更または改変することも可能である。
【００９５】
一般に、治療レジメンは、所望の治療効果が達成されるまで、および／または、所望の治療効果が維持される限り、フォローされる。再度、これは臨床医によって判定され得る。
【００９６】
様々な実施態様では、１つまたは複数のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質を、単独で、または、予防用薬剤、治療用薬剤、および／または薬学的に許容できる担体と組み合わせて含む医薬組成物が、本明細書において提供される。様々な実施態様では、本明細書に開示される医薬組成物の使用の非限定的な例は、障害の診断、検出、および／またはモニタリング、障害または１つまたは複数のその症候の予防、治療、管理、および／または改善、および／または、研究を含む。単独または予防用薬剤、治療用薬剤、および／または薬学的に許容できる担体と組み合わせた、医薬組成物の製剤は、当業者に公知である（米国特許公開２００９０３１１２５３Ａ１）。
【００９７】
様々な実施態様では、医薬製剤は、１つまたは複数のアミノ酸、１つまたは複数の多糖類および／またはポリソルベート、および、約０．１と１００ｍｇ／ｍｌの間でエンドポイントを含む濃度（例えば、０．１〜１０、１〜１０、．０１〜５０、１〜５０、１〜１００、１０〜１００、２５〜１００、２５〜５０、または５０〜１００ｍｇ／ｍｌ）で存在するＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質を含んでよく、ここで、製剤は、約５．０と７．０の間のｐＨであってエンドポイントを含む（例えば、約５．０〜６．０、５．５〜６．０、５．０〜６．５、５．５〜６．５、または６．０〜７．０のｐＨ）。一実施態様では、製剤中の少なくとも１つのアミノ酸はヒスチジンであり、約１０〜２０ｍＭ、１０〜１５ｍＭ、１５〜２０ｍＭ、または約１５ｍＭの濃度で存在する。一実施態様では、製剤中の少なくとも１つの多糖類はスクロースであり、約０〜８．０％重量／体積（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施態様では、製剤中のポリソルベートはポリソルベート８０であり、約０〜０．０６％ｗ／ｖの濃度である。一実施態様では、製剤中の少なくとも１つのアミノ酸はアルギニンであり、約０〜１．５％ｗ／ｖ（例えば、０．５〜１．５、１．０〜１．５、または０．５〜１．０ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、製剤中に、約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約１〜１００ｍｇ／ｍｌ、または約１〜１５ｍｇ／ｍｌ、または約１〜７．５ｍｇ／ｍｌ、または約２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、または約５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、または約２５〜１００ｍｇ／ｍｌ、または約２０〜６０ｍｇ／ｍｌ、または約２５〜５０ｍｇ／ｍｌ、または約２５ｍｇ／ｍｌ、または約５０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１〜６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１〜２５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０〜６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５〜６０ｍｇ／ｍｌ、または約０．１〜２．０ｍｇ／ｍｌ、または約０．５〜２．０ｍｇ／ｍｌ、または約１〜５ｍｇ／ｍｌ、または約１〜７．５ｍｇ／ｍｌ、または約１〜１５ｍｇ／ｍｌ、または約０．５ｍｇ／ｍｌ、または約１．０ｍｇ／ｍ）の濃度で存在する。
【００９８】
本明細書において用いられる語句「有効量」は、ＣＤ４０Ｌの機能障害またはＣＤ４０Ｌ関連の疾患または障害と関連する１つまたは複数のパラメーターにおいて、検出可能な（例えば、ベースラインから、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、またはそれよりも高い）改善をもたらす、ＣＤ４０Ｌアゴニストタンパク質の量を意味する。
【００９９】
様々な実施態様では、医薬製剤は、水性の製剤、凍結乾燥された製剤、または、凍結乾燥および再水和された製剤である。一実施態様では、水和溶液は、ブドウ糖および／または生理食塩水（例えば、約５％ｗ／ｖの濃度のブドウ糖および／または約０．９％ｗ／ｖの濃度の生理食塩水）である。一実施態様では、医薬製剤は、約１５ｍＭのヒスチジン、約０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、約４％（ｗ／ｖ）のスクロース、および、約０．１〜２５ｍｇ／ｍｌのＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質、または、約１〜１５ｍｇ／ｍｌのＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質を含み、ｐＨは約６である。一実施態様では、製剤は、少なくとも１つのさらなる薬剤をさらに含む。
【０１００】
様々な実施態様では、約２５ｍｇ／ｍｌのＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質、約１５ｍＭのヒスチジン、０．０３％のポリソルベート８０（重量／体積、ｗ／ｖ）、４．０％のスクロース（ｗ／ｖ）を含み、ｐＨが約６．０である製剤が用いられる。一部の実施態様では、製剤は、アルギニンを含まない。一部の実施態様では、製剤は、他のコンポーネントまたは濃度を含む他の製剤と比較して、予想外に改善された凍結融解の安定性、液体製剤の安定性、および／または、凍結乾燥された製剤の安定性を示す。
【０１０１】
本明細書において提供される治療用薬剤を投与する方法は、限定されないが、経口投与、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与、粘膜投与（例えば、鼻腔内および経口経路）および肺の投与（例えば、吸入器または噴霧器を用いて投与されるエアロゾル化された化合物）を含む。特定の投与経路のための医薬組成物の製剤、および、様々な投与方法に必要な材料および技術が利用可能であり、当業者に公知である（米国特許公開２００９０３１１２５３Ａ１）。
【０１０２】
様々な実施態様では、投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療的または予防的反応）を与えるように調整され得る。例えば、単回ボーラスが投与され得て、何回かに分けられた投与量が時間をかけて投与され得て、または、投与量は、治療的状況の緊急性によって示されるように比例的に低減または増大され得る。一部の実施態様では、非経口組成物は、投与の簡易性および投与量の統一性のために、投与単位形態で処方される。用語「投与単位形態」は、治療される哺乳類対象に関する単位用量として適した物理的に別々のユニットを指し；それぞれのユニットは、必要な調剤担体と関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含む。
【０１０３】
本明細書で提供される、治療的または予防的に有効量のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質に関する、例示的な、非限定の範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、（例えば、約０．１〜０．５、０．１〜１、０．１〜１０、０．１〜２０、０．１〜５０、０．１〜７５、１〜１０、１〜１５、１〜７．５、１．２５〜１５、１．２５〜７．５、２．５〜７．５、２．５〜１５、５〜１５、５〜７．５、１〜２０、１〜５０、７〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、１０〜２０、１０〜５０、１０〜７５、または１０〜１００ｍｇ／ｋｇ、または、その間の任意の濃度）である。一部の実施態様では、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、医薬組成物中に、治療的に効果的な濃度、例えば、約０．１〜１００ｍｇ／ｍｌ（例えば、約０．１〜０．５、０．１〜１、０．１〜１０、０．１〜２０、０．１〜５０、０．１〜７５、１〜１０、１〜２０、１〜５０、１〜７５、１〜１００、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜５０、５〜７５、１０〜２０、１０〜５０、１０〜７５、または１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、またはその間の任意の濃度）の濃度で存在する。投与量の値は、緩和すべき状態のタイプおよび／または重症度によって変化し得ることに注意する。任意の特定の対象にとっては、特定の投与計画は、個々の必要性および／または組成物を投与または組成物の投与を監督する人の専門的な判断に従って時間と共に調整され得ること、および、本明細書において示される投与量の範囲は例示のみであり、特許請求の範囲に記載される組成物の範囲または実施を制限することを意図しないことが、さらに理解されるべきである。
【実施例】
【０１０４】
実施例１：ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質の製造
１．１  ポリペプチド構造
Ａ）アミノ酸Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ２０
Ｉｇ−κ−シグナルペプチド、アミノ酸ＧＩｙ２０の後ろの仮定のシグナルペプチダーゼ切断部位。
Ｂ）アミノ酸Ｇｌｎ２１−Ｌｅｕ１６１
ヒトＣＤ４０Ｌリガンドの第一の可溶性サイトカインドメイン（ＣＤ４０Ｌ、配列番号１のアミノ酸１２１〜２６１）。
Ｃ）アミノ酸ＧＩｙ１６２−Ｓｅｒ１６９
配列番号２の第一のペプチドリンカーエレメント。
Ｄ）アミノ酸Ｇｌｎ１７０−Ｌｅｕ３１０
ヒトＣＤ４０Ｌリガンドの第二の可溶性サイトカインドメイン（ＣＤ４０Ｌ、配列番号１のアミノ酸１２１〜２６１）。
Ｅ）アミノ酸ＧＩｙ３１１−Ｓｅｒ３１８
配列番号２の第二のペプチドリンカーエレメント。
Ｆ）アミノ酸Ｇｌｎ３１９−Ｌｅｕ４５９
ヒトＣＤ４０Ｌリガンドの第三の可溶性サイトカインドメイン（ＣＤ４０Ｌ、配列番号１のアミノ酸１２１〜２６１）。
Ｇ）アミノ酸Ｇｌｙ４６０−Ｃｙｓ４８２
配列番号１６のヒンジ−リンカーエレメント。
Ｈ）アミノ酸Ｐｒｏ４８３−Ｌｙｓ７００
配列番号１３の抗体Ｆｃフラグメントドメイン。
【０１０５】
上記のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質は、配列番号２５に示される。
【０１０６】
示されるリンカーは、例えば配列番号３〜１２に示される他の好ましいリンカーによって置き換えられ得る。
【０１０７】
示されるヒンジ−リンカーエレメントは、例えば配列番号１９および２０に示される他の好ましいヒンジ−リンカーによって置き換えられ得る。
【０１０８】
第一および第二のペプチドリンカーは、同一である必要はないことに注意すべきである。
【０１０９】
シグナルペプチド配列（Ａ）は、任意の他の適切な、例えば哺乳類のシグナルペプチド配列によって置き換えられ得る。
【０１１０】
１．２  ポリペプチドをコードする遺伝子カセット
合成遺伝子は、適切な宿主細胞、例えば昆虫細胞または哺乳類細胞における発現に関するそのコドン使用頻度を考慮して最適化され得る。好ましい核酸配列は、配列番号３７に示される。
【０１１１】
実施例２：発現および精製
２．１  融合ポリペプチドのクローニング、発現および精製
前述の融合タンパク質を、２つの異なる真核生物宿主細胞において、組み換えによって発現した：
前述のＣＤ４０受容体アゴニスト融合タンパク質の初期解析のために、１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００［ｍｕ］ｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充されたＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＧｉｂＣｏ）中で増殖したＨｅｋ２９３Ｔ細胞を、適切な選択マーカーおよび融合ポリペプチドに関する発現カセット、例えば、ブラスチサイジン、ピューロマイシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子を含む機能性発現カセットを含む、プラスミドを用いて一時的にトランスフェクトした。最終産物を得るために複数のポリペプチド鎖が必要な場合では、トランスフェクションの間、発現カセットは、１つのプラスミド上に組み合わせるか、または、異なるプラスミド上に配置した。組み換え融合ポリペプチドを含む細胞培養上清を、トランスフェクションの３日後に採取し、３００×ｇでの遠心分離によって浄化して、０．２２μｍ滅菌フィルターを通した濾過を続けた。
【０１１２】
インビボで用いるＣＤ４０受容体アゴニスト融合タンパク質のより大きなスケールの発現のために、前述のタンパク質をコードする合成ＤＮＡカセットを、適切な選択マーカー（例えば、ブラスチサイジン、ピューロマイシンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子を含む機能性発現カセット）および、宿主細胞ゲノム内の転写的活性挿入部位の数を増やすのに適切な遺伝因子を含む、真核生物発現ベクター中に挿入した。配列が確認された発現ベクターを、エレクトロポレーションによって、懸濁液に適応されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に導入した。適切な選択圧を、トランスフェクションの３日後に、トランスフェクトされた細胞に与えた。ベクター由来の耐性遺伝子（単数または複数）を保有する生き残った細胞を、選択圧下で、その後の培養によって回収した。軌道シェイカーインキュベーター中（１００ｒｐｍ、５０ｍｍシェイキングスロー（ｓｈａｋｉｎｇ  ｔｈｒｏｗ））、３７℃および７％ＣＯ２雰囲気で、既知組成培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２−ＣＤ，Ｌｏｎｚａ）中の選択された細胞プールの安定した増殖の際に、前述のタンパク質を検出するＥＬＩＳＡアッセイによって個々の上清を分析して、最も高い特定の生産性を有する細胞プールを、タンパク質生産（軌道シェイカー、１００ｒｐｍ、シェイキングスロー５０ｍｍ）の前に、振とうフラスコ中で拡張した。
【０１１３】
ラボスケールのタンパク質生産のために、個々の細胞プールを、Ｗａｖｅバイオリアクター２０／５０  ＥＨＴ（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で３７℃および７％ＣＯ２雰囲気にて、既知組成培地（ＰｏｗｅｒＣＨＯ２−ＣＤ，Ｌｏｎｚａ）中で７〜１２日間培養した。基礎培地は、４ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘで補充されたＰｏｗｅｒＣＨＯ２−ＣＤであった。Ｗａｖｅ培養を、０．３〜０．４×１０ｅ６細胞／ｍｌの生存細胞濃度および以下の設定（５または１０リットル袋について）：振とう振動数１８ｒｐｍ、振とう角度７度、ガス電流０．２〜０．３Ｌ／分、７％ＣＯ２、３６．５℃で開始した。Ｗａｖｅランの間、細胞培養にＰｏｗｅｒＦｅｅｄ  Ａ（Ｌｏｎｚａ）を通常、２日目（２０％供給）および５日目（３０％供給）に、２回供給した。２回目の供給後に、振とう振動数を２２ｒｐｍならびに振とう角度を８度に上げた。
【０１１４】
細胞生存能力が８０％よりも低く低下した場合、バイオリアクターを通常７日目〜１２日目の間で採取した。まず、培養上清を、手動の深層濾過システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  Ｐｏｄ，ＭＣ０ＨＣ  ０．０５４ｍ２）を用いて浄化した。Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇｇｅｄタンパク質については、Ａｖｉｄｉｎを０．５ｍｇ／Ｌの終濃度まで加えた。最後に、ＣＤ４０受容体アゴニスト融合タンパク質を含む培養上清を、ボトルトップフィルター（０．２２μｍ、ＰＥＳ，Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて滅菌濾過して、さらに処理するまで２〜８℃で保管した。
【０１１５】
親和性精製のために、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅをカラムに詰めて（ゲルベッド１ｍｌ）、１５ｍｌのバッファーＷ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）またはＰＢＳ  ｐＨ７．４を用いて平衡化して、細胞培養上清を、４ｍｌ／分の流速でカラムにアプライした。続いて、１５ｍｌのバッファーＷを用いてカラムを洗浄して、結合したポリペプチドを、７×１ｍｌのバッファーＥ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＩ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭのデスチオビオチン、ｐＨ８．０）の添加によって段階的に溶出させた。交互に（Ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、２．５ｍＭのデスチオビオチンを含むＰＢＳ  ｐＨ７．４を、このステップに用いることができる。
【０１１６】
Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに基づく方法の代わりに（Ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ  ｔｏ）、親和性精製を、親和性リガンドとして固定化Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａを含むカラム、および、Ａｋｔａクロマトグラフィーシステム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行なった。融合タンパク質のＦＣ−ドメインに高親和力を有する固相材料を選択した：ＭＡＢＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。手短には、浄化した細胞培養上清を、洗浄バッファー−１（２０ｍＭ  Ｐｉ、９５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中で平衡化されたＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅカラム（ＣＶ＝５ｍｌ）にロードした（カラムベッドのｍｌあたり１０ｍｇの融合タンパク質のロードを超えない）。１０カラムボリューム（１０ＣＶ）の前述の平衡化バッファーを用いてカラムを洗浄して、４カラムボリューム（４ＣＶ）の洗浄バッファー−２（２０ｍＭ  Ｐｉ、９５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を続けて、宿主−細胞タンパク質および宿主−細胞ＤＮＡを枯渇させた。それからカラムを、溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｐｉ、９５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５）で溶出させて、溶出液を、カラムベッド容量（５ｍｌ）と等しい容量を有するそれぞれの画分で１０画分まで集めた。それぞれの画分を、等しい容量の前述の洗浄バッファー−２を用いて中和した。線速度を１５０ｃｍ／ｈに設定して、前述のアフィニティクロマトグラフィー法のあいだ、一定に維持した。
【０１１７】
溶出液画分のタンパク質量を定量化して、ピーク画分を限外濾過によって濃縮して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製した。
【０１１８】
ＳＥＣは、Ａｋｔａクロマトグラフィーシステム（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬまたはＨｉＬｏａｄ  ２６／６０カラムで行なった。リン酸緩衝生理食塩水を用いてカラムを平衡化して、濃縮されて親和性精製されたポリペプチドを、カラムボリュームの２％（ｖ／ｖ）を超えないサンプル容量でＳＥＣカラムにロードした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の場合、０．５ｍｌ／分の流速をアプライした。ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの場合、２．５ｍｌ／分の流速をアプライした。ポリペプチドの溶出プロファイルを、２８０ｎｍでの吸光度によってモニターした。
【０１１９】
六価ｓｃ  ＣＤ４０Ｌ−ＲＢＤ−ＦＣ融合タンパク質ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ、およびＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃの分析ＳＥＣのクロマトグラムを図５に示す。
【０１２０】
生来の条件下での精製された融合ポリペプチドの見かけ分子量の決定のために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムに、公知の分子量の標準的なタンパク質をロードした。標準的なタンパク質の溶出容量に基づいて検量線をプロットして、精製された融合ポリペプチドの見かけ分子量を決定した。ＣＤ４０受容体アゴニスト融合タンパク質を含むＦＣ−ドメインを、典型的に、およそ１６０〜１８０ｋＤａの見かけ分子量でＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムから溶出して、Ｆｃドメインによる成熟ＣＤ４０受容体アゴニスト融合ポリペプチドのホモ二量体化を確認した。
【０１２１】
実施例３：ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ、Ｂ、およびＣから発現された二量体タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果
ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ、Ｂ、およびＣを発現して、実施例１および２に従って精製した。３つの精製されたタンパク質を、非還元（レーン１、４、および７）またはジチオスレイトールによって還元し（レーン２、５、８）、４〜１２％のｂｉｓ−ｔｒｉｓ中でＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル電気泳動を行なった。結果を図６に示す。レーン１は、非還元条件下では、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａを発現したタンパク質は、単量体（８５ｋＤａ）および二量体（１７０ｋＤａ）のバンドの両方を有することを示し、ポリペプチド自体に存在する内因性のフリーのチオールによる鎖間ヒンジジスルフィドの自己還元を示す。それにひきかえ、レーン４および７は、非還元条件下では、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＢおよびＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃを発現したタンパク質は、二量体（１７０ｋＤａ）バンドのみを有することを示し、ヒンジ領域の鎖間ジスルフィド架橋が損なわれないままで、ポリペプチド自体の自己還元特性が無いことを示す。
【０１２２】
実施例４：三価コントロールタンパク質
六価ＣＤ４０受容体アゴニスト融合タンパク質およびバクテリオファージＲＢ６９−ＦＯＬＤＯＮによって安定化された三価ＣＤ４０の間の相対的結合を比較するために、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（配列番号３８）をＣＨＯ−Ｓ細胞内で発現して、前のセクションで説明したとおりに精製した。ＳＥＣ−精製したタンパク質を、以下の実施例においてコントロールとして使用した。ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘの配列（配列番号３８）を表７に示す。ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘのアミノ酸１〜２０はシグナルペプチドを示し、成熟タンパク質はアミノ酸Ｇｌｎ２１でスタートする。このタンパク質は、１つの可溶性ＣＤ４０Ｌドメイン（配列番号１のＱ１２１〜Ｌ２６１）をそれぞれ含む３つの同一のポリペプチドからなり；この集合体は、フレキシブルリンカーによってＣＤ４０ＬのＣ末に融合されたバクテリオファージＲＢ６９フィブリチンの三量体化ドメインによって安定化される。
【０１２３】
【表７】
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【０１２４】
実施例５：細胞アッセイ
５Ａ．  Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞の表面上での、ＣＤ４０受容体アゴニストのそれらの生来の受容体ＣＤ４０への結合を示すための、細胞結合アッセイ
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を用いて得られたＣＤ４０受容体アゴニストに関する我々のアフィニティデータを完成させるために、我々は、我々のＣＤ４０受容体アゴニストが、細胞の表面上のそれらの生来の受容体に結合することができるかどうかを調べたかった。Ｂ細胞は完全な活性化のためにＣＤ４０シグナリングに依拠するので、我々は、このアッセイにヒトＢ細胞株Ｒａｍｏｓを用いた。Ｒａｍｏｓ細胞は、それらの表面上にＣＤ４０を発現することが知られていて、ＣＤ４０受容体アゴニストによるインキュベーション後、抗体によって、我々のＣＤ４０受容体アゴニストに結合したＣ末ＳｔｒｅｐＴａｇ  ＩＩを、検出することが可能であると想像することができた。それから、この抗体は、順々に、蛍光抗体を用いて検出することができ、および細胞をフローサイトメーター上で分析することができた。
【０１２５】
表面上にＣＤ４０を発現しているＲａｍｏｓ  Ｂ細胞を、氷上で３０分間、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｃ）、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｄ）、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ（ｅ）またはＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ（ｆ）とインキュベートして、受容体リガンド結合を可能にした。細胞を氷冷洗浄バッファーで洗浄して、氷上で３０分間、ポリクローナルウサギ抗−ＳｔｒｅｐＴａｇＩＩ抗体を用いたインキュベーションを続けて、細胞表面上にエンゲージしたＣＤ４０受容体アゴニストを検出した。Ｆｃ−受容体を、染色および洗浄バッファーへの１％ヒトＩｇＧ（Ｇａｍｕｎｅｘ）の添加によってブロックした。氷冷洗浄バッファーを用いて細胞を再度洗浄して、氷上および暗所で２０分間、ポリクローナルＡｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗−ウサギ抗体を用いたインキュベーションを続けた。続いて、細胞を、氷冷ＰＢＳで洗浄することによって、フローサイトメトリーのために処理した。細胞をＧｕａｖａ  Ｅａｓｙｃｙｔｅフローサイトメーター上で分析して、グリーンチャンネル内の蛍光を取得した。生細胞上でゲートすることによって、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、生のフローサイトメトリーデータから平均蛍光ユニットを最終的に取得して、このゲート内のＡｌｅｘａ４８８蛍光を分析した。細胞のみ（ａ）、および、二次ヤギ抗−ウサギ抗体とインキュベートした細胞のみ（ｂ）を、コントロールとして使用した。
【０１２６】
図７に見ることができるように、細胞のみまたは蛍光二次抗体とインキュベートした細胞のみと比較した場合、全てのＣＤ４０受容体アゴニストは、細胞の蛍光の有意な上昇をもたらす。このアッセイでは、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂが最も高い蛍光シグナルを生産して（ｅ）、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＢがＲａｍｏｓ細胞により良好に結合することを示した。ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂのシグナル強度の次にＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｄ）およびＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｃ）が続き、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ（ｆ）は最も弱いシグナルを与えた。まとめると、全てのＣＤ４０受容体アゴニストが、インビトロで、細胞状況でそれらの生来の受容体に結合し、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂが最も良好のバインダーであると仮定することができる。
【０１２７】
５Ｂ．  ＣＤ４０受容体アゴニストによってトリガーされるＣＤ４０シグナリングのリードアウトとしての、Ｂ細胞上のＣＤ８６上方制御
ＣＤ８６は、ヒトＢ細胞上の活性化マーカーであり、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ４およびＣＤ２８のリガンドである。ＣＤ８６表面発現は、しばしば、Ｂ細胞の活性化状態を説明する手段として用いられる。Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体およびＣＤ４０ライゲーションを含む完全な活性化のためにいくつかのシグナルを必要とするので、我々は、ＣＤ４０受容体アゴニストがＣＤ８６表面発現の上方制御をもたらすことができるのかどうか考えた。
【０１２８】
その目的のために、Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞を、２４ウェルプレート中で３７℃および５％ＣＯ２で一晩、１μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｂ）、１０μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｃ）、１μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｄ）または１０μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｅ）とインキュベートした。未処理細胞をコントロールとして使用した（ａ）。次の日に、全てのサンプルを、３０分間、氷上および暗所で、ＰＥ−標識抗−ヒトＣＤ８６抗体とインキュベートした。Ｆｃ−受容体を、染色および洗浄バッファーへの１％ヒトＩｇＧ（Ｇａｍｕｎｅｘ）の添加によってブロックした。続いて、サンプルを、Ｇｕａｖａ  Ｅａｓｙｃｙｔｅフローサイトメーター上で、フローサイトメトリーのために処理した。平均蛍光ユニットを、生細胞上でゲーティングすることによって、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて、生のフローサイトメトリーデータから最終的に取得して、このゲート内のＰＥ−蛍光を分析した。平均蛍光値を用いてＣＤ８６表面レベルを表現して、ＣＤ４０受容体アゴニスト（ａ）とインキュベートしていないコントロールサンプルに対して値を標準化した。
【０１２９】
図８に見ることができるように、全てのＣＤ４０受容体アゴニストは、ＣＤ８６表面発現の増大をもたらし、全ての化合物がＣＤ４０シグナリングをトリガーしたことを示す。重要なことに、この増大は、バーｂおよびｃまたはｄおよびｅを比較した場合、用量依存的であった（同一化合物の、それぞれ１μｇ／ｍｌ対１０μｇ／ｍｌ）。加えて、ＣＤ８６の上方制御は、六価であるＰＲＯＴＥＩＮ  Ａに関して、より強かった。このことは、三価のみであるＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘと比較した明白な結合性効果を暗示した。結果は、ここで用いたＣＤ４０受容体アゴニストは、用量依存的な様式で生物学的活性を有することを示す。
【０１３０】
５Ｃ．  ＣＤ４０受容体アゴニストによるＣＤ８３上方制御に付随する免疫細胞刺激を示すための、全血アッセイ
【０１３１】
ＣＤ８３は、ヒト免疫細胞の増殖および成熟プロセスのあいだ上方制御される表面分子である。ＣＤ８３は、元々、樹状細胞およびＴ細胞上に発見され、免疫細胞刺激のマーカーとして用いることができる。Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，ｄｏｉ：１０．１１５８／２３２６−６０６６．ＣＩＲ−１３−００７０）によって示されるように、ＣＤ８３上方制御は、抗体によるＣＤ４０ライゲーション後の免疫細胞活性化を研究するための手段として用いることができる。我々は、したがって、我々のＣＤ４０受容体アゴニストが、全血を用いたアッセイにおいてＣＤ８３上方制御をもたらすこともできるかどうか考えた。
【０１３２】
その目的のために、全血を健康なドナーからＥＤＴＡチューブ内に集めた。２ｍｌの血液を、２４ウェルプレート中で４時間、３７℃および５％ＣＯ２で、１μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｂ）、５０μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ（ｃ）、１μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｄ）または５０μｇ／ｍｌのＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ（ｅ）とインキュベートした。未処理の血液をコントロールとして使用した（ａ）。４時間後、全てのサンプルを、２０分間、室温および暗所で、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５−標識抗−ヒトＣＤ８３抗体とインキュベートした。続いて、サンプルを、製造元の説明書に従ってＢＤ  ＦＡＣＳ溶解溶液を用いて、固化および赤血球溶解によって、フローサイトメトリーのために処理した。サンプルをＧｕａｖａ  Ｅａｓｙｃｙｔｅフローサイトメーター上で分析して、細胞集団（顆粒球、リンパ球および単球）を、それらの散乱プロファイルに基づいてゲートした。ｆａｒ−ｒｅｄチャンネル内の蛍光をそれぞれの集団に関して取得して、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。ＣＤ８３陽性細胞のパーセンテージを決定して、ＣＤ４０受容体アゴニストとインキュベートしていないコントロールサンプルに対して標準化した。
【０１３３】
図９に見ることができるように、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＸおよびＰＲＯＴＥＩＮ  Ａの両方とも、未処理の血液細胞（ａ）と比較した場合、新たなＣＤ８３陽性集団の産生をもたらす。この新たなＣＤ８３陽性集団は、分析した全ての細胞集団（リンパ球、単球および顆粒球）に現れ、リンパ球の場合において最も目立っていた。重要なことに、ＣＤ８３陽性細胞のパーセンタイルシェアは、バーｂおよびｃまたはｄおよびｅを比較した場合、用量依存的であった（同一化合物の、それぞれ１μｇ／ｍｌ対５０μｇ／ｍｌ）。加えて、ＣＤ８３陽性集団のサイズは、同一投与量をＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘに対して比較した場合、六価ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａに関してより強かった。結果は、三価ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘと比較した六価ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａの明白な結合性効果を示す。また、結果は、ここで用いたＣＤ４０受容体アゴニストが、新鮮なヒト血液を用いて、用量依存的な様式で生物学的活性を有したことも示す。
【０１３４】
実施例６：固定化ＣＤ４０受容体に対するインビトロ結合アッセイ
ＣＤ４０Ｌの三価構築物（例えば：ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘ）およびＣＤ４０Ｌの六価構築物（例えばＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ、ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ、およびＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ）の、ＣＤ４０に対する平衡結合定数（ＫＤ）を、自動化バイオセンサーシステム（Ａｔｔａｎａ  Ａ１００）を用いて決定された動態学的結合データ（ｋｏｎおよびｋｏｆｆ）に基づいて計算した。Ａ１００は、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）技術に基づいて、リアルタイムで、分子相互作用を調べるのを可能にする。
【０１３５】
この目的のために、Ｅｎｚｏ（カタログ番号：ＡＬＸ−５２２０１６−Ｃ０５０）から購入したヒトＣＤ４０−Ｆｃを、カルボキシル−活性化ＱＣＭ−チップの表面上に固定化した。三量体および六量体ＣＤ４０Ｌ−構築物を、１、５、および１０μｇ／ｍｌの濃度で可溶性分析物として用いた。結合（ｋｏｎ）および解離（ｋｏｆｆ）を分析した。リアルタイムの測定およびその計算されたＫＤ・・は、全ての六価のＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ、ＢおよびＣのあいだで同程度の結合活性を明らかにしたが、三価のＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘよりも六価タンパク質の結合が優れていた。
【０１３６】
【表８】
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【０１３７】
実施例７：半減期の決定
分子ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ／ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ／ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃは、それぞれ、３つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合された２つのポリペプチドで構成され、全て、Ｆｃ領域の２９７位にＮ２９７Ｓ突然変異を含み（ＥＵインデックスに従う）、ＣＨ２ドメインのアグリコシル化をもたらす。可溶性ＣＤ４０Ｌドメインの外側表面システインはセリンに突然変異されて（配列番号１に示されるＣＤ４０ＬのＣ１９４等価位置）、配列番号１５（ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ）と比較してＣ９４Ｓ、Ｃ２４３Ｓ、Ｃ３９２Ｓを有する配列番号３１（ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ）をもたらした。あるいは、可溶性ＣＤ４０Ｌドメインの外側表面システインはアラニンに突然変異されて（配列番号１に示されるＣＤ４０ＬのＣ１９４等価位置）、配列番号１５（ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ）と比較してＣ９４Ａ、Ｃ２４３Ａ、Ｃ３９２Ａを有する配列番号３５（ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ）をもたらした。生じたＦＣ−融合タンパク質の半減期を、これらの変更によって導入された効果について評価した。
【０１３８】
雌ＮＭＲＩマウスを、１．０ｍｇ／ｋｇのそれぞれの化合物（ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ／ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ／ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ）を用いて、単回静脈内ボーラス注射として処置した。全血を、適用前（投与前）および試験項目投与後３１２時間まで集めた。血清を調製して、血清濃度の決定までサンプルを−８０℃で保管した。
【０１３９】
マウス血清におけるＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ／ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂ／ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ濃度の定量化を、表７に示される個々のＣＤ４０アゴニストを検出するＥＬＩＳＡ−アッセイによって行った。プレートをＣＤ４０−Ｆｃでコーティングした。それから、その受容体ＣＤ４０に特異的に結合するＣＤ４０リガンド構築物を、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ−ＨＲＰを用いてそれらのＳｔｒｅｐ−Ｔａｇを介して検出した。ＥＬＩＳＡアッセイを、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡまたはＰＲＯＴＥＩＮ  ＢまたはＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃをキャリブレーションおよびコントロールサンプルとして用いて行なった。標準的な濃度の測定データを、５−パラメーターフィットを用いて検量線を作成するのに使用した。これは、それぞれのマウス血清サンプルにおける未知のＰＲＯＴＥＩＮ  ＡまたはＰＲＯＴＥＩＮ  ＢまたはＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃ濃度の決定を可能にした。
【０１４０】
薬物動態パラメーターを、平均血清濃度および非コンパートメント薬物動態データ分析のための薬物動態評価プログラムＰＫ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（Ｓｕｍｍｉｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｍｏｎｔｒｏｓｅ，ＣＯ）を用いて計算した。ＰＫ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓは、自動化された、Ｅｘｃｅｌに基づくアプリケーションであり、薬物動態パラメーターを、静脈内または血管外の投与経路後の、例えば生物学的サンプルの分析から得られる濃度−時間データから計算する。ＰＫ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓは、任意の特定のコンパートメントモデルを仮定せずに結論する。
【０１４１】
薬物動態評価による結果を表９に要約する。
【表９】
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【０１４２】
結果は、Ｃ１９４Ｓ突然変異Ｑ１２１−Ｌ２６１サブシーケンスを含むＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂは、野生型（ＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ）またはＣ１９４Ａ−突然変異を含むＰＲＯＴＥＩＮ  Ｃと比較して、延長されたインビボ安定性を有したことを示す。
【０１４３】
実施例８：安定性／凝集試験（予測的実施例）
単量体および凝集体の含有量は、実施例２に記載の分析ＳＥＣによって決定される。この特定の目的のために、分析は、生理学的ｐＨで生理学的塩濃度を含むバッファー中で行なわれる（例えば０．９％  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４；ＰＢＳ  ｐＨ７．４）。典型的な凝集分析は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行われる。このカラムは、１０〜８００ｋＤａの範囲内のタンパク質を分離する。
【０１４４】
生来の条件下での精製された融合ポリペプチドの見かけ分子量の決定のために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムに公知の分子量の標準的なタンパク質をロードした。標準的なタンパク質の溶出容量に基づいて検量線をプロットして、未知の分子量の精製された融合タンパク質の見かけ分子量を、溶出容量に基づいて計算する。
【０１４５】
可溶性、非凝集タンパク質のＳＥＣ分析は、典型的に、規定された溶出容量で明瞭な単一のタンパク質ピークを示す（２８０ｎｍでのＯＤまたは２１４ｎｍでのＯＤで測定される）。この溶出容量は、特定のタンパク質の見かけの生来の分子量に相当する。ＦＣ−融合タンパク質の場合における「単量体」の定義に関して、２つのポリペプチド鎖の集合は、タンパク質のＦＣ部分によって動かされて、機能性ユニットは、２つの鎖からなるタンパク質である。２つのＦＣリンクポリペプチド鎖を含むこのユニットは、二量体した化単鎖融合ポリペプチドであるにもかかわらず、Ｆｃ−融合タンパク質の場合において「単量体」と定義される。
【０１４６】
タンパク質凝集が生じる場合、ＳＥＣ分析は、より低い保持容量を有するさらなるタンパク質のピークを示す。タンパク質オリゴマーは、潜在的に、凝集シードとしての役割を果たし、オリゴマーの高い含有量は、潜在的に、タンパク質の凝集をもたらす。凝集体およびオリゴマーの大きい分子量は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムの空隙容量内に溶出して、それらの生来の分子量に関してはＳＥＣによって分析することができない。
【０１４７】
ＣＤ４０受容体アゴニスト融合タンパク質の精製された製剤は、好ましくは、規定された単量体タンパク質のみ、および、非常に少量のオリゴマータンパク質のみを含むべきである。特定のＣＤ４０受容体アゴニスト融合タンパク質製剤の凝集／オリゴマー化の度合いは、規定された単量体およびオリゴマー／凝集体画分のそれぞれに関するＯＤ２８０ダイアグラムのピーク面積を計算することによって、ＳＥＣ分析に基づいて決定される。ピーク面積全体に基づいて、定義された単量体タンパク質のパーセンテージは以下のように計算される：
単量体含有量［％］＝［ピーク面積単量体タンパク質］／［ピーク面積全体］×１００）
【０１４８】
この文書で用いられる可溶性タンパク質に関する定義は、０．２〜１０．０ｍｇ／ｍｌの範囲の典型的なタンパク質濃度内で＞９０％の定義された可溶性タンパク質含有量を含む、生理学的塩濃度のバッファー中、生理学的ｐＨでの、精製されたＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質のタンパク質調製を示す。
【０１４９】
実施例９：ＣＤ４０受容体アゴニストによってトリガーされるＣＤ４０シグナリングは、Ｍ２−極性化マクロファージ上の活性化マーカーの発現を増大させる。
Ｍ２様マクロファージは、活性化マーカー／Ｔ細胞活性化分子、例えばＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡの低発現、およびＩＬ−１０のような免疫調節分子の高発現によって特徴付けられる。このため、Ｍ２様マクロファージは、「抗−腫瘍」Ｍ１様マクロファージとは対照的に、腫瘍促進性としばしば呼ばれる。我々は、ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂ（配列番号３１）を用いた治療が、通常Ｍ２−極性化する条件において、Ｍ１様マクロファージの発達を増大させることができるかどうか試験することにした。これを達成するために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離して、製造元の説明書に従って、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、健常者から得られたバフィーコートから精製した。培地（ＲＰＭＩ）中で、１２ウェルプレート中で、２時間３７℃でＰＢＭＣを培養することによって、単球を単離した。単球を、Ｍ２極性化条件で、ＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、または培地のみで、３日間インキュベートした。このインキュベーション期間のあいだ、ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）または培地コントロールをウェルの半分に加えた。３日目に、細胞懸濁液を、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ４（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むモノクローナル抗体のカクテルを用いて染色した。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロリド）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造元の説明書に従って用いて、死んだ細胞を分析から取り除いた。Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  １２フローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて細胞を解析した。抗体の質をチェックして、アイソタイプコントロールを用いてゲーティングを行なった。Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  ＦｌｏｗＪｏおよびＧｕａｖａ  ＩｎＣｙｔｅソフトウェアを、フローサイトメトリーデータの分析のために用いた。ゲートおよびメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を用いて発現を定量化した。ＩＬ−４およびＩＬ−１０（Ｍ２−極性化マクロファージ）を用いた処理は、ＣＤ２０６およびＣＤ１６３（Ｍ２様マクロファージの古典的マーカー）の単球上の発現を増大させた（表１０参照）。対照的に、ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂを用いた同時的な処理は、ＣＤ２０６およびＣＤ１６３発現を３７％から２２％に低下させた。ＣＤ８６（Ｂ７．２）は、古典的なＴ細胞共刺激分子であり、ＣＤ２８の結合パートナーであり、一方で、ＣＤ８３は、抗原提示細胞の成熟のマーカーである。重要なことに、ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂの処理は、ＩＬ−４／ＩＬ−１０のみと比較して、ＣＤ８６およびＣＤ８３の共発現を５％から２０％に増大させた。加えて、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰの発現は、ＩＬ−４／ＩＬ−１０のみと比較して、ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂ処理後により高かった、９４〜１６２（ＭＦＩ）。これらの結果は、ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂ処理が、Ｍ２−極性化マクロファージの活性化状態を増大させることを示し、それらをより強力な抗原提示細胞にさせる。
【０１５０】
【表１０】
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【０１５１】
実施例１０：ＣＤ４０受容体アゴニストによって処理されたＭ２−極性化マクロファージは、アロジェニック共培養システムにおけるナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞活性化のためのより強力な抗原提示細胞である。
Ｍ２様マクロファージは、ＨＬＡおよび共刺激分子（例えば、ＣＤ８６）の低発現に起因して、Ｔ細胞応答を刺激する低い能力によって特徴付けられる。我々は、ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂによる処理が、Ｍ２様マクロファージの効能を増大させることができるかどうか試験したかった。これを試験するために、Ｍ２様マクロファージを、ＩＬ−１０およびＩＬ−４（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて上述のように生産した。製造元の説明書に従って、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、第二の（アロジェニック）ドナー由来のＰＢＭＣからナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。製造元の説明書に従って、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、Ｔ細胞を標識化した。３日間処理された単球を、１単球に対して１０リンパ球の比でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に添加した。Ｔ細胞の増殖およびブラスティング（細胞分裂前の増殖）を、ＣＦＳＥおよびＦｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ）をそれぞれ用いて、３日後に測定した。培地のみでインキュベートしたＴ細胞のたった２％が、増殖（ＣＦＳＥの希釈）またはブラスティング（ＦＳＣの増大）の証拠を示した（表１１を参照）。対照的に、刺激無しのアロジェニック単球とインキュベートしたＴ細胞の２３％が、活性化の証拠を示した。Ｍ２−極性化マクロファージとのＴ細胞のインキュベーションは、Ｔ細胞応答を１６％まで低下させた。興味深いことに、Ｍ２−極性化状態へのＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂの添加は、アロジェニックマクロファージの効能を増大させて、Ｔ細胞の３１％が応答した。このデータは、ＡＧＰ１２３３を用いた単球の処理は、通常Ｍ２−極性化する条件において（ｉｎ  ｗｉｔｈ  ＡＧＰ１２３３  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｍ２−ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）、より強力な抗原提示細胞をもたらすことを示す。
【０１５２】
【表１１】
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【０１５３】
実施例１１：六価ＣＤ４０受容体アゴニストによってトリガーされるＣＤ４０シグナリングは、活性化マーカーの発現の増大に最も効率的であり、精製されたヒト単球による培養後に、Ｍ２様マクロファージの発達を低減させる。
下流シグナリングおよび受容体クラスタリングの効率を試験するために、我々は、本発明の六価アゴニストＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂを、当技術分野で知られている共通の工学概念を表わす２つのホモ三量体の三価ＣＤ４０受容体アゴニストと比較した。ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｘ２（配列番号３９）は、ホモ三量体の安定化されていないＣＤ４０Ｌ−ＲＢＤ自体を表わし、ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｘ（配列番号３８）は、バクテリオファージＲＢ６９に由来するＣ末融合された三量体化足場によって安定化されたホモ三量体のＣＤ４０Ｌ−ＲＢＤを表わす。我々は、生産的なＣＤ４０受容体シグナリングが、活性化マーカーの上方制御およびＭ１様マクロファージ発達の増大をもたらすことを示しているので、我々は、ヒト単球をバフィーコートから上述のように精製した。精製された単球を、３つの異なる濃度（１０、１００および１０００ｎｇ／ｍＬ）の３つの異なる構築物（表１２参照）で補充された培地中で３日間インキュベートして、活性化および表現型マーカーの発現について、フローサイトメトリーによって細胞を解析した。全ての３つの濃度の六価ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂによる処理は、コントロールと比較して用量依存的なＣＤ８６発現の増加を生じさせた（ＭＦＩおよび陽性パーセンテージの両方として）。対照的に、三価ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｘ２のいずれの濃度も、コントロールと比較して違いを示さなかった。ＲＢ６９−足場安定化三価ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｘの場合、最も高い濃度のみが、ＣＤ８６発現のわずかな増大を生じさせた。加えて、同一の化合物および投与量の効果が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ発現で見られた（それは、六価構築物は低い投与量でさえ受容体クラスタリングおよび生産的シグナリングに十分であるが、三価構築物は、非常に高い濃度において活性を示さないまたは低い活性を示すことを確認する）。最後に、培地中の単球のおよそ２０％は、一般に、３日でＣＤ２０６およびＣＤ１６３発現を上方制御し、それは、Ｍ２様マクロファージ発達を示す。全ての３つの濃度の六価ＰＲＯＴＥＩＮ−Ｂを用いた処理は、これを３％未満に低減させた。活性化マーカーデータと一致して、高濃度の三価タンパク質−Ｘのみが、Ｍ２様マクロファージ発達の任意の低減を示した。まとめると、データは、本発明のＰＲＯＴＥＩＮ  Ｂの優れた生物学的活性を示す。
【０１５４】
【表１２】
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【０１５５】
本発明は、さらに、以下の項目１〜２２に関する。
１．配列番号１５、および２５〜３５からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
２．配列番号２７、２８、２９、３０、３２、または３４に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有する２つのポリペプチドを含む、ＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質。
３．項目２のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、２つのポリペプチドは、それぞれのポリペプチドのシステイン残基４５３、４５９、および４６２の間に形成された３つの鎖間ジスルフィド結合を通して共有結合される。
４．項目２または３のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、ポリペプチド（単数または複数）の１４７位および２９６位のアスパラギン残基の１つまたは複数は、Ｎグリコシル化される。
５．項目２または３のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、ポリペプチド（単数または複数）の１４７位および２９６位の両方のアスパラギン残基は、Ｎ−グリコシル化される。
６．項目１〜５のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、ポリペプチド（単数または複数）は、さらに翻訳後修飾される。
７．項目６のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質であって、翻訳後修飾は、Ｎ末グルタミンの、ピログルタミン酸への改変を含む。
８．項目１〜７のいずれか１つのＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質、および、１つまたは複数の薬学的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤、および／またはアジュバントを含む、医薬組成物。
９．項目１のＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質をコードする、核酸分子。
１０．項目９の核酸分子を含む、発現ベクター。
１１．項目９の核酸分子を含む、細胞。
１２．真核生物細胞である、項目１１の細胞。
１３．項目１１の細胞であって、細胞は哺乳類細胞である。
１４．項目１１の細胞であって、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
１５．ＣＤ４０Ｌ関連の疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、当該方法は、有効量の項目１〜７のいずれか１つのＣＤ４０受容体アゴニストタンパク質を対象に投与するステップを含む。
１６．項目１５の方法であって、疾患または障害は：腫瘍、感染性疾患、炎症性疾患、代謝疾患、自己免疫疾患、変性疾患、アポトーシス関連疾患、および移植拒絶反応からなる群より選択される。
１７．項目１６の方法であって、腫瘍は固形腫瘍である。
１８．項目１６の方法であって、腫瘍はリンパ系腫瘍である。
１９．項目１６の方法であって、自己免疫疾患は、リウマチ疾患、関節疾患、またはリウマチおよび関節の疾患である。
２０．項目１６の方法であって、疾患または障害は、関節リウマチである。
２１．項目１６の方法であって、変性疾患は神経変性疾患である。
２２．項目２１の方法であって、神経変性疾患は多発性硬化症である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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