(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子を調製する方法であって、次の工程：
i) 水難溶性薬物と液体可溶化剤を良溶媒に溶解させ；
ii) 前記良溶媒を工程i)の生成物から部分的にまたは完全に除去し；
iii) 工程ii)の生成物を所定のタンパク質と混合し；
iv) 工程iii)の生成物を貧溶媒中に分散させる；
を含み、ここで工程iii)において、前記タンパク質が粉末形であり；かつ前記タンパク質がアルブミンである、方法。
【請求項２】
前記液体可溶化剤がプロパノール（例えばイソプロパノール）、液体ポリエチレングリコール（例えばポリエチレングリコール200、ポリエチレングリコール400、ポリエチレングリコール600またはポリエチレングリコール800から成る群より選択された１もしくは複数）、Tween（例えばTween 20またはTween 80)、Spanおよびグリセロールから成る群より選択された１または複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記良溶媒がエタノール、メタノール、ジエチルエーテル、ジクロロメタンおよびクロロホルムから成る群より選択された１または複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記貧溶媒が、水、生理学的に許容される水溶液、緩衝液、及び塩および／または糖類の水溶液から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ii)が、回転蒸発、加熱および真空ポンプ吸引から成る群より選択された１もしくは複数の操作により、工程i)の生成物から前記良溶媒を部分的にまたは完全に除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アルブミンが、組換えアルブミン、天然アルブミンおよび修飾アルブミンから成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記工程iv)が、攪拌、せん断、超音波処理、ホモジナイズ、粉砕等から成る群より選択された１もしくは複数の操作により、貧溶媒中に工程iii)の生成物を分散させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
液体可溶化剤を工程iv)の生成物から除去する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記液体可溶化剤を工程iv)の生成物から除去する工程が、透析、ゲルろ過、マイクロカラムを通した溶出から選択された１または複数の操作により行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程iv)の生成物からアルブミン粒子を分離する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程iv)の生成物からアルブミン粒子を分離する工程が、遠心分離、ろ過および乾燥（例えば凍結乾燥）から成る群より選択された１または複数の操作により行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記水難溶性薬物がパクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、ラパマイシン、ドキソルビシン、イトラコナゾールおよびニモジピンから成る群より選択された１または複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の１つ以上の特徴：
−前記液体可溶化剤が液体ポリエチレングリコールおよびTweenから成る群より選択される；
−前記貧溶媒がPBS緩衝液またはクエン酸緩衝液である；
−水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子が100〜1000 nmの平均粒径を有する；
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
次の工程：
i) 水難溶性薬物と液体可溶化剤を良溶媒に溶解させ；
ii) 前記良溶媒を工程i)の生成物から部分的にまたは完全に除去し；
iii) 工程ii)の生成物を所定のタンパク質と混合し；
iv) 工程iii)の生成物を貧溶媒中に分散させることにより、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子を得る
を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、薬学の分野に属し、詳しくは水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子およびそれの調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物のナノ輸送システムは、薬物をある物質で封入することにより形成されたナノ粒子を意味する。様々な研究により、薬物をナノ輸送システム中に封入することが、放出、分布および代謝といった薬物の生体内挙動の変化をもたらし得ることが分かっている。表面改質により、標的組織や標的細胞における特異的な取り込み、特異的結合および集積を実現でき、それによって薬物の治療効果を高め、全身投与される薬物によって引き起こされる副作用を軽減し、患者のコンプライアンスを改善することができる。従って、ナノ輸送キャリアは、薬物のより優れた治療効果を獲得するための新しい道を提供する。
【０００３】
アルブミンナノ粒子は、最も脚光を浴びているナノ輸送システムの１つである。アルブミンは内因性物質であるため、非毒性、非免疫原性、生分解性および優れた生体適合性の特徴を有する。従って、アルブミンは理想的な天然薬物キャリアである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本開示の目的は、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子およびその調製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の第一の態様において、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子を調製する方法であって、次の工程：
i) 水難溶性薬物と液体可溶化剤を良溶媒に溶解し；
ii) 前記良溶媒を工程i)の生成物から部分的にまたは完全に除去し；
iii) 工程ii)の生成物を所定のタンパク質と混合し；
iv) 工程iii)の生成物を貧溶媒中に分散させる
を含む方法が提供される。
【０００６】
幾つかの実施形態では、本開示のいずれかの観点による方法は、次の工程：
i) 水難溶性薬物と液体可溶化剤を水難溶性薬物用の良溶媒に溶解し；
ii) 前記水難溶性薬物用の良溶媒を工程i)の生成物から部分的にまたは完全に除去し；
iii) 工程ii)の生成物を所定のタンパク質と混合し；
iv) 工程iii)の生成物を水難溶性薬物用の貧溶媒中に分散させ、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子を得る
を含む方法が提供される。
【０００７】
幾つかの実施形態では、本開示のいずれかの態様による方法は、45℃以下の温度、好ましくは40℃以下の温度、好ましくは35℃以下の温度、更に好ましくは30℃以下の温度で実施される。
【０００８】
幾つかの実施形態では、工程i)の生成物は液体（例えば透明溶液）である。
幾つかの実施形態では、工程ii)の生成物は液体（例えば透明溶液）である。
【０００９】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物は工程ii)の生成物中の溶液の形で存在する。
【００１０】
幾つかの実施形態では、前記液体可溶化剤は、以下：プロパノール（例えばイソプロパノール）、液体ポリエチレングリコール（例えばポリエチレングリコール200、ポリエチレングリコール400、ポリエチレングリコール600またはポリエチレングリコール800から成る群より選択された１もしくは複数）、Tween（例えばTween 20またはTween 80)、Spanおよびグリセロールから成る群より選択された１または複数を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、前記液体可溶化剤は、液体ポリエチレングリコール（例えばポリエチレングリコール200、ポリエチレングリコール400、ポリエチレングリコール600またはポリエチレングリコール800から成る群より選択された１または複数）またはTween（例えばTween 20またはTween 80）を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、前記水難溶性薬物用の良溶媒は、エタノール、メタノール、ジエチルエーテル、ジクロロメタンおよびクロロホルムから成る群より選択された１または複数を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、前記水難溶性薬物用の貧溶媒は、エタノールを含む。
幾つかの実施形態では、前記水難溶性薬物用の貧溶媒は、水を含む。
【００１４】
幾つかの実施形態では、前記水難溶性薬物用の貧溶媒は、生理学的に許容される水溶液を含む。
【００１５】
幾つかの実施形態では、前記水難溶性薬物用の貧溶媒は、緩衝液を含む。
【００１６】
幾つかの実施形態では、前記水難溶性薬物用の貧溶媒は、塩および／または糖類の水溶液を含む。
【００１７】
幾つかの実施形態では、工程ii)は、回転蒸発、加熱および真空ポンプ吸引からなる群より選択された１もしくは複数の操作により、前記水難溶性薬物用の良溶媒を工程i)の生成物から部分的にまたは完全に除去することを含む。
【００１８】
幾つかの実施形態では、前記水難溶性薬物用の良溶媒が、工程ii)の生成物中１重量％以下の含量で存在する。
【００１９】
幾つかの実施形態では、工程iii)において、前記タンパク質が粉末形である。
【００２０】
幾つかの実施形態では、前記タンパク質がアルブミンである。
【００２１】
幾つかの実施形態では、前記アルブミンが組換えアルブミン、天然アルブミンおよび修飾アルブミンから成る群より選択された１もしくは複数を含む。
【００２２】
幾つかの実施形態では、工程iv)が、攪拌、せん断、超音波処理、ホモジナイズ（均質化）、粉砕等から成る群より選択された１もしくは複数の操作により、貧溶媒中の工程iii)の生成物を分散させることを含む。
【００２３】
幾つかの実施形態では、本開示のいずれかの観点による方法は、次の工程：液体可溶化剤を工程iv)の生成物から除去する工程を含む。
【００２４】
幾つかの実施形態では、工程iv)の生成物から液体可溶化剤を除去するために、透析、ゲルろ過、マイクロカラムを通した溶出から成る群より選択された１または複数の操作が使用される。
【００２５】
幾つかの実施形態では、任意の観点による方法は次の工程：工程iv)の生成物からアルブミン粒子を分離する工程を更に含む。
【００２６】
幾つかの実施形態では、遠心分離、ろ過および乾燥（例えば凍結乾燥）から成る群より選択された１または複数の操作が、工程iv) の生成物からアルブミン粒子を分離するために使用される。
【００２７】
幾つかの実施形態では、前記水難溶性薬物が、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、ラパマイシン、ドキソルビシン、イトラコナゾール、ニモジピンから成る群より選択された１または複数を含む。
【００２８】
幾つかの実施形態では、タンパク質粒子（タンパク質ナノ粒子）が100〜1000 nm、例えば200〜2000 nm、更に例えば150〜250 nmの平均粒径を有する。
【００２９】
幾つかの実施形態では、タンパク質粒子（タンパク質ナノ粒子）が50〜100 nm、100〜150 nm、150 nm〜200 nm、200〜250 nm、250〜300 nm、300〜350 nm、350〜400 nm、400〜450 nm、450〜500 nm、500〜600 nm、600〜700 nm、700〜800 nm、800〜900 nm、または900〜1000 nmの平均粒径を有する。
【００３０】
本開示の第二の態様は、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子であって、本開示のいずれかの態様に従った方法により調製されたタンパク質粒子を提供する。
【００３１】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物１g（mL）は、該水難溶性薬物用の良溶媒30 mL未満に溶解することができる。
【００３２】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物１g（mL）は、該水難溶性薬物用の貧溶媒30 mL未満には完全に溶解することができない。
【００３３】
幾つかの実施形態では、液体可溶化剤は、水難溶性薬物の溶解度を改善することができる液体物質を指す。
【００３４】
幾つかの実施形態では、液体可溶化剤は水溶性である。
【００３５】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物用の良溶媒は、水難溶性薬物を効率的に溶解することのできる溶媒を指す。
【００３６】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物用の貧溶媒は水媒質である。
【００３７】
幾つかの実施形態では、前記水難溶性薬物は、アルブミンと薬物との間に共有結合または非共有結合的相互作用をもたらし、そしてアルブミンを該薬物の表面に付着させる、ヒドロキシル基、他の活性基または疎水性基を有する。
【００３８】
幾つかの実施形態では、前記水難溶性薬物は、アルブミンと薬物との間に共有結合または非共有結合的相互作用をもたらすヒドロキシル基、他の活性基または疎水性基を有する。
【００３９】
幾つかの実施形態では、前記アルブミンがヒト由来アルブミンである。
【００４０】
幾つかの実施形態では、前記アルブミンが他の種に由来し、ある生物体の免疫応答をトリガーするのを回避するように修飾されているアルブミンである。
【００４１】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物用の貧溶媒は、薬物送達システム、体内忍容性または安定性等といった性質を改善することができる溶液系である。
【００４２】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物用の貧溶媒は、水、緩衝液、塩溶液、糖類溶液、または生理学的に許容される溶液を含むことができる。
【００４３】
幾つかの実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等であることができる。
【００４４】
幾つかの実施形態では、塩溶液は塩化ナトリウム溶液であってよい。
【００４５】
幾つかの実施形態では、糖類溶液はグルコース溶液、ラクトース溶液またはマンニトール溶液等であることができる。
【００４６】
幾つかの実施形態では、生理学的に許容される溶液は、経口投与、注射による投与、吸入による投与または局所投与される時、生物体により忍容される溶液である。
【００４７】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物用の貧溶媒は、浸透圧調節剤、pH調節剤、凍結乾燥保護剤、懸濁助剤、安定剤等を含んでもよい。
【００４８】
幾つかの実施形態では、工程i)、ii)またはiii)の生成物が水難溶性薬物用の貧溶媒を含有せず、例えば水を含有しない。
【００４９】
幾つかの実施形態では、本開示の任意観点に従った方法は、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子を修飾する工程を含む。
【００５０】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子は、ポリエチレングリコールポリマー（例えばポリエチレングリコール2000またはポリエチレングリコール4000）、標的指向性（ターゲッティング）の改変のためのポリエチレングリコールポリマー等といった材料で修飾することができ、それにより血中滞留性（long-circulating）または血中滞留性標的指向性（ターゲッティング）送達といった機能を付与することができる。
【００５１】
幾つかの実施形態では、中に水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子は、100〜1000 nm、例えば150〜250 nm、更に例えば170〜210 nm、更に例えば140〜160 nm、更に例えば186 nm、173 nm、192 nm、204 nmまたは193 nmの粒径を有する。
【００５２】
幾つかの実施形態では、本開示による任意方法は、水難溶性薬物と液体可溶化剤をまず最初に良溶媒（例えばエタノール）中に溶解させ、次いで該良溶媒を除去して水難溶性薬物と液体可溶化剤との液体複合体を形成させ、ここで該水難溶性薬物は溶液中に存在し；次いで前記液体複合体をタンパク質粉末と混合し、それを貧溶媒中に分散させ、ここで難溶性薬物が分離してタンパク質により内包され、そしてナノ粒子が形成されることを含む。この方法は、高温を用いずに実施されるため、薬物の安定性を高めるのに有利である。
【００５３】
幾つかの実施形態では、工程i)の水難溶性薬物対工程iii)のタンパク質の質量比は、1：0.1〜15、例えば1：0.1〜0.5、例えば1：0.5〜１、例えば1：1〜2、例えば1：2〜3、例えば1：3〜4、例えば1：4〜5、例えば1：5〜6、例えば1.6〜8、例えば1：8〜10、例えば1：10〜15である。
【００５４】
幾つかの実施形態では、工程i)において、水難溶性薬物対液体可溶化剤の質量／容積比は、0.1 g：0.01〜10 mL、例えば0.1 g：0.01〜0.1 mL、例えば0.1 g：0.1〜0.4 mL、例えば0.1 g：0.4〜1 mL、例えば0.1 g：1〜2 mL、例えば0.1 g：2〜3 mL、例えば0.1 g：3〜5 mL、例えば0.1 g：5〜10 mLである。
【００５５】
幾つかの実施形態では、工程iii)において、水難溶性薬物対貧溶媒の質量／容積比が0.1 g：1〜100 mL、例えば0.1 g：1〜2 mL、例えば0.1 g：2〜4 mL、例えば0.1 g：4〜6 mL、例えば0.1 g：6〜8 mL、例えば0.1 g：8〜10 mL、例えば0.1 g：10〜15 mL、例えば0.1 g：15〜20 mL、0.1 g：20〜50 mLまたは0.1 g：50〜100 mLである。
【００５６】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物用の貧溶媒は緩衝液である。
幾つかの実施形態では、緩衝液がクエン酸緩衝液またはPBS緩衝液である。
【００５７】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物用の貧溶媒は5〜8のpH、5〜6、6〜7または7〜8のpH、例えば7.4のpHを有する。
【００５８】
幾つかの実施形態では、本開示に従った任意方法は、難溶性薬物と液体可溶化剤を最初に良溶媒（例えばエタノール）の存在下で溶解し、次いで前記良溶媒を除去して難溶性薬物と液体可溶化剤の液体複合体を形成させ、該複合体では難溶性薬物が溶液中に存在し；次いで前記液体複合体をタンパク質粉末と混合し、混合生成物を貧溶媒中に分散させ、ここで難溶性薬物が分離してタンパク質により内包され、そしてナノ粒子が形成されることを含む。この方法は高温を使用せず実施されるので、薬物の安定性にとって有益である。
【００５９】
幾つかの実施形態では、貧溶媒とは水難溶性薬物用の貧溶媒を指す。
幾つかの実施形態では、良溶媒とは水難溶性薬物用の良溶媒を指す。
【００６０】
幾つかの実施形態では、１gの水難溶性薬物は、水難溶性薬物用の貧溶媒X mL中に完全には溶解することができない。ここでX≧30、例えばX≧100、例えばX≧200、例えばX≧400、例えばX≧600、例えばX≧800、例えばX≧1000、例えばX≧2000、例えばX≧3000、例えばX≧5000、例えばX≧10000である。
【００６１】
幾つかの実施形態では、１gの水難溶性薬物は、水難溶性薬物用の良溶媒Y mL中に完全に溶解することができ、ここでY≦100、例えばY≦80、例えばY≦60、例えばY≦40、例えばY≦30、例えばY≦15である。
【００６２】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物用の良溶媒は、80以下の誘電率、例えば60以下の誘電率、例えば40未満の誘電率、例えば20未満の誘電率、例えば10未満の誘電率を有する溶媒である。
【００６３】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物用の貧溶媒は80より高い誘電率、例えば90以上の誘電率、例えば100以上の誘電率を有する溶媒である。
【００６４】
幾つかの実施形態では、PBS溶液がリン酸緩衝溶液（リン酸緩衝生理食塩水）である。場合により、PBS溶液は7.4のpHを有する。
【００６５】
幾つかの実施形態では、懸濁液が、水難溶性薬物を微小粒子として液体媒質中に分散させることにより形成された不均一液体である。
【００６６】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物が水に難溶である固形薬物を意味する。
【００６７】
幾つかの実施形態では、本開示の方法には架橋剤は全く使用されず、例えばグルタルアルデヒド等のような架橋剤は使用されない。
【００６８】
幾つかの実施形態では、タンパク質粒子の平均粒径はレーザー粒径分析器により（例えばレーザー回析法を通して）測定される。
【００６９】
幾つかの実施形態では、液体ポリエチレングリコールは200〜800の分子量を有する。
【００７０】
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子は、90％以上、例えば92％以上の内封率を有する。
幾つかの実施形態では、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子は、５〜95％、例えば10〜45％、例えば15〜35％の薬物装填率（loading）を有する。
【００７１】
幾つかの実施形態では、「内封された（encapsulated）」とは、水難溶性薬物がタンパク質により部分的にまたは完全に封入されていることを意味する。例えば、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子においては、タンパク質によって完全に封入された水難溶性薬物が存在してもよいし、またはタンパク質によって部分的に封入された水難溶性薬物が存在してもよい。場合により、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子の表面が、タンパク質によって完全に被覆されることがある。場合により、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子の表面が部分的に被覆されることがあるが、これは、該粒子の表面上に水難溶性薬物が露出していることを意味する。
【発明の効果】
【００７２】
１または複数の例は次の有益な効果の１つまたは複数を有する：
i) 調製方法が比較的単純である；
ii) 鍵となるプロセスを容易に制御できる；
iii) アルブミンの凝固（solidification）の必要なしに安定なタンパク質粒子を得ることができる；
iv) 本法により、製造された水難溶性薬物が内封されているタンパク質粒子の薬物装填率および／または内封率が比較的高い；
v) 水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子の粒径を制御することが容易である；
vi) 活性成分を溶解する方法が、活性成分と可溶化剤とを有機溶媒中に一緒に溶解させ、次いで有機溶媒を除去し、活性成分と可溶化剤との複合体を形成させ、該複合体において、有機溶媒によりもたらされる可溶化効果よりも更に良好に、活性成分の溶解度が有意に改善され；
vii) 中に水難溶性薬物が封入されたタンパク質粒子の調製方法において、タンパク質粒子が、水中油型乳剤または油中水型乳剤を生成することなく、攪拌、せん断、超音波処理、ホモジナイズ、粉砕等によりワンステップで（一段階で）得られる。有機溶媒は容易に完全除去することができる。
viii) 調製方法の間に高温処理を全く必要とせず、これは薬物の安定性にとって有益である。
【００７３】
本明細書中の図面は、本開示のより良い理解のために提供され、本開示の一部である。しかしながら、本開示の典型的な実施例とそれの説明が、本開示の説明のために用いられ、それは本開示を限定する意図ではない。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、PBSで50倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の透過光の強度変動を示す曲線である。
【００７５】
【図２】図２は、PBSで50倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の後方散乱光の強度変動を示す曲線である。
【００７６】
【図３】図３は、PBSで100倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の透過光の強度変動を示す曲線である。
【００７７】
【図４】図４は、PBSで100倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の後方散乱光の強度変動を示す曲線である。
【００７８】
【図５】図５は、完全培地で50倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の透過光の強度変動を示す曲線である。
【００７９】
【図６】図６は、完全培地で50倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の後方散乱光の強度変動を表す曲線である。
【００８０】
【図７】図７は、完全培地で100倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の透過光の強度変動を示す曲線である。
【００８１】
【図８】図８は、完全培地で100倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の後方散乱光の強度変動を示す曲線である。
【実施例】
【００８２】
本開示の実施形態を以下の図面と実施例により具体的に説明する。
【００８３】
下記の実施例において使用する機器を下表に示す。
【００８４】
【表１】
0006738500.tif 000002
【００８５】
実施例１
50 mgのパクリタキセルを秤量し、400μLのPEG600を添加し、次いで100 mLの無水エタノールを添加し、その混合物が透明になるまで超音波処理し（水温30〜45℃）、次いでロータリーエバポレーターによりエタノールを減圧留去し、エタノール残量が0.5重量％以下のパクリタキセル−ポリエチレングリコール複合体を形成させた。
【００８６】
100 mgのヒト血清アルブミン粉末を秤量し、前記パクリタキセル−ポリエチレングリコール複合体に添加し、十分に混合して混合物を得た。
【００８７】
上記混合物をpH 7.4のPBS溶液 2 mLに添加し、生じた混合物を、全出力の45％を用いる超音波破砕機中での超音波処理に200秒間かけ（２秒休止と２秒超音波処理のループで）、懸濁液を得た。
【００８８】
前記懸濁液をpH 7.4のPBS溶液の入った透析袋に入れ、繰り返し透析してPEG600と遊離のアルブミンを除去した。その後、該懸濁液を3000 rpmで10分間の遠心分離にかけ、封入されなかった薬物沈殿物を取り除き、生成物を凍結乾燥し、パクリタキセルが内封されたタンパク質粒子を得た。
【００８９】
実施例２
100 mgの10−ヒドロキシカンプトセシンを秤量し、1 mLのPEG400を添加し、適量の無水エタノールを添加し、混合物を透明になるまで超音波処理し、ロータリーエバポレーターによりエタノールを減圧留去し、エタノール残量が0.5重量％以下の10−ヒドロキシカンプトセシン−ポリエチレングリコール複合体を得た。
【００９０】
300 mgのヒト血清アルブミン粉末を秤量し、前記複合体に添加し、十分に混合して混合物を得た。
【００９１】
前記混合物をpH 5.0のクエン酸緩衝液10 mL中に添加し、その混合物を高圧ホモジナイザーを使って膜を通過させることによりホモジナイズし、懸濁液を得た。
【００９２】
その懸濁液を透析袋に入れ、繰り返し透析してPEG400と遊離のアルブミンを除去した。
【００９３】
その懸濁液を3000 rpmの速度で10分間遠心分離し、封入されなかった薬物沈殿物を取り除き、次いで生成物を凍結乾燥し、10−ヒドロキシカンプトセシンが封入されたタンパク質粒子を得た。
【００９４】
実施例３
約100 mgのドセタキセルを秤量し、500μLのPEG400を添加し、次いで適量の無水メタノールを添加し、混合物を透明になるまで超音波処理し、次いで回転式減圧蒸発によりメタノールを除去し、エタノール残量が0.5重量％以下のドセタキセル−ポリエチレングリコール複合体を形成した。
【００９５】
300 mgのヒト血清アルブミン粉末を秤量し、前記複合体に添加し、十分混合して混合物を得た。
【００９６】
前記混合物をpH 5.0のクエン酸緩衝液10 mLに添加し、その混合物を高圧ホモジナイザーを使って膜を通すことによりホモジナイズして懸濁液を得た。
【００９７】
前記懸濁液を透析袋に入れ、繰り返し透析してPEG400と遊離のアルブミンを除去した。その懸濁液を3000 rpmの速度で10分間遠心分離し、封入されなかった薬物沈殿物を取り除き、次いでその生成物を凍結乾燥し、ドセタキセルが内封されたタンパク質粒子を得た。
【００９８】
実施例３ｂ
約100 mgのドセタキセルを秤量し、500μLのPEG400を添加し、次いで適量の無水メタノールを添加し、生じた混合物を透明になるまで超音波処理し、回転式減圧蒸発によりメタノールを留去し、エタノール残量が0.5重量％以下のドセタキセル−ポリエチレングリコール複合体を得た。
【００９９】
300 mgのヒト血清アルブミン粉末を秤量し、前記複合体に添加し、十分混合し、混合物を得た。
【０１００】
前記混合物をpH 7.4のPBS溶液10 mLに添加し、その混合物を高圧ホモジナイザーを使って膜を通すことによりホモジナイズして懸濁液とした。
【０１０１】
前記懸濁液を透析袋に入れ、繰り返し透析することによりPEG400と遊離のアルブミンを除去した。生じた懸濁液を3000 rpmの速度で10分間遠心分離することにより、封入されなかった薬物粒子を取り除き、次いでその生成物を凍結乾燥して、ドセタキセルが内封されたタンパク質粒子を得た。
【０１０２】
実施例４
約100 mgのラパマイシンを秤量し、1 mLのPEG400を添加し、適量のエタノールを添加し、混合物を透明になるまで超音波処理し、次いで回転式減圧蒸発によりエタノールを留去し、エタノール残量が0.5重量％以下のラパマイシン−ポリエチレングリコール複合体を得た。
【０１０３】
300 mgのヒト血清アルブミン粉末を秤量し、前記複合体に添加し、混合することで混合物を得た。
【０１０４】
前記混合物をpH 5.0のクエン酸緩衝液10 mLに添加し、その混合物を高圧ホモジナイザーを使って膜を通過させることによりホモジナイズして懸濁液とした。その懸濁液を透析袋に入れ、繰り返し透析することによりPEG400と遊離のアルブミンを除去した。
【０１０５】
得られた懸濁液を3000 rpmの速度で10分間遠心分離し、封入されなかった薬物沈殿を取り除き、次いで生成物を凍結乾燥し、ラパマイシンが内封されたタンパク質粒子を得た。
【０１０６】
実施例５
約100 mgのイトラコナゾールを秤量し、１mLのPEG400を添加し、次いで適量の無水エタノールを添加し、混合物を透明になるまで超音波処理し、次いで回転式減圧蒸発によりエタノールを除去し、エタノール残量が0.5重量％以下のイトラコナゾール−ポリエチレングリコール複合体を形成した。
【０１０７】
300 mgのヒト血清アルブミン粉末を秤量し、前記複合体に添加し、十分混合して混合物とした。
【０１０８】
前記混合物をpH 5.0のクエン酸緩衝液10 mLに添加し、その混合物を高圧ホモジナイザーを使って膜を通過させることによりホモジナイズし、懸濁液を得た。
【０１０９】
その懸濁液を透析袋に入れ、繰り返し透析することで、PEG400と遊離のアルブミンを除去した。懸濁液を3,000 rpmの速度で10分間遠心分離し、封入されなかった薬物沈澱を取り除き、次いで生成物を凍結乾燥し、イトラコナゾールが内封されたタンパク質粒子を得た。
【０１１０】
実施例５ｂ
約100 mgのイトラコナゾールを秤量し、1 mLのPEG400を添加し、次いで適量の無水エタノールを添加し、その混合物が透明になるまで超音波処理し、回転式減圧蒸発によりエタノールを除去し、エタノール残量が0.5重量％以下のイトラコナゾール−ポリエチレングリコール複合体を形成した。
【０１１１】
300 mgのヒト血清アルブミン粉末を秤量し、前記複合体に添加し、十分混合し、混合物を得た。
【０１１２】
上記混合物をpH 7.4のPBS溶液10 mLに添加し、その混合物を高圧ホモジナイザーを使って膜を通過させることによりホモジナイズし、懸濁液とした。
【０１１３】
その懸濁液を透析袋に入れ、繰り返し透析し、PEG400と遊離のアルブミンを除去した。その懸濁液を3000 rpmの速度で10分間の遠心分離にかけ、封入されなかった薬物沈殿を取り除き、次いで生成物を凍結乾燥し、イトラコナゾールが内封されたタンパク質粒子を得た。
【０１１４】
実施例６
約100 mgのヒドロキシカンプトテシンを秤量し、1 mLのTween 80を加え、次いで適量の無水エタノールを添加し、生じた混合物を透明になるまで超音波処理した。回転式減圧蒸発によりエタノールを除去し、エタノール残量が0.5重量％以下のヒドロキシカンプトテシン−Tween 80複合体を形成した。
【０１１５】
300 mgのヒト血清アルブミン粉末を秤量し、前記複合体に添加し、十分混合し、混合物を得た。
【０１１６】
上記混合物をpH 5.0のクエン酸緩衝液10 mLに添加し、その混合物を高圧ホモジナイザーを使って膜を通過させることによりホモジナイズし、懸濁液とした。
【０１１７】
その懸濁液を透析袋に入れ、繰り返し透析し、Tween 80と遊離のアルブミンを除去した。その懸濁液を3000 rpmの速度で10分間の遠心分離にかけ、封入されなかった薬物沈殿を取り除き、次いで生成物を凍結乾燥し、ヒドロキシカンプトテシンが内封されたタンパク質粒子を得た。
【０１１８】
実施例１〜６の方法により、ほぼ100％の収率が達成された。
【０１１９】
アッセイ１：封入効率と薬物装填率の測定
(1) 約10 mgのアルブミン粒子を用意し、適当量のエタノールを加えてアルブミン粒子を完全に溶解させ、それを移動相で一定容積に希釈し、薬物の濃度をHPLC法により測定し、粒子中の薬物の総量（Ａ）を算出した。
【０１２０】
(2) 別の約10 mgのアルブミン粒子を用意し、適当量の水を加えて十分に混合し、その混合物を3000 rpmで10分間遠心分離した。遠心分離後、存在するのであれば、沈澱を収集し、それを適量のエタノールに溶かし、移動相で一定容積に希釈し、薬物の濃度をHPLC法により測定し、沈澱中の薬物の総量（Ｂ）を算出した。
【０１２１】
遠心分離後、懸濁液の上層を回収し、16,000 rpmの超高速で20分間遠心分離し、その上清を回収し、移動相で一定容積に希釈し、懸濁液の上層中の薬物の濃度をHPLC法により測定し、懸濁液の上層中の薬物の総量（Ｃ）を算出した。
【０１２２】
低速遠心分離後の沈澱中の薬物と、超高速遠心分離後の上清中の薬物は、封入されなかった薬物に該当する。従って、内封率（Encapsulation Efficiency）と薬物装填率は次の通り計算した：
内封率＝（Ａ−Ｂ−Ｃ）／Ａ×100％
薬物装填率＝ＥＥ×Ｗdrug／（Ｗdrug＋Ｗalbumin）
【０１２３】
ここでＥＥは内封率である。Ｗdrugは粒子の調製工程中に供給される薬物の総量である。Ｗalbuminはアルブミン粒子の調製工程中に供給されるアルブミンの総量である。
【０１２４】
【表２】
0006738500.tif 000003
【０１２５】
アッセイ２：アルブミン粒子の粒径の測定
実施例１〜６のアルブミン粒子を用意し、水を加えて懸濁液を作製し、その懸濁液をレーザー粒径分析器に入れ、粒子の粒径を測定した。結果は以下の通りである：
【０１２６】
【表３】
0006738500.tif 000004
【０１２７】
第２表によれば、実施例１〜６の方法により、水難溶性薬物が内封されたタンパク質粒子を得ることができ、例えば、153 nm〜204 nmの粒径を有する、水難溶性薬物が内封されたタンパク質ナノ粒子が得られた。
【０１２８】
アッセイ３：パクリタキセルアルブミン粒子の安定性の測定
実施例１のパクリタキセルアルブミン粒子を用意し、ウシ胎仔血清を含むリン酸塩緩衝溶液（PBS）および最少必須培地（MEM）でそれぞれ50倍および100倍希釈した。原液と希釈溶液の安定性を、安定性測定器により測定した。その結果は図１〜８に示される。図１は、PBSで50倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の透過光の強度変動を示す曲線である。図２は、PBSで50倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の後方散乱光の強度変動を示す曲線である。図３は、PBSで100倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の透過光の強度変動を示す曲線である。図４は、PBSで100倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の後方散乱光の強度変動を示す曲線である。図５は、完全培地で50倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の透過光の強度変動を示す曲線である。図６は、完全培地で50倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の後方散乱光の強度変動を示す曲線である。図７は、完全培地で100倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の透過光の強度変動を示す曲線である。図８は、完全培地で100倍希釈したパクリタキセルタンパク質粒子の後方散乱光の強度変動を示す曲線である。これらの結果は、様々な媒質で希釈したパクリタキセルアルブミン粒子の透過光と後方散乱光の強度変動が、37℃で３％以下であり、このことはパクリタキセルタンパク質粒子が優れた安定性を有することを示す。
【０１２９】
最後に、上記実施例は、本開示の実施形態を例示するためだけのものであり、それらを限定するものではない。本開示を好ましい例に関して具体的に記載してきたが、そのような具体例は変更することができ、技術的特徴の一部は、それらが本開示の実施形態の精神から逸脱しない限り、相当物に置換することができる。これらの改変と置換は全て、本開示の特許請求の範囲内に包含されるべきである。
【図１】
0006738500.tif 000005
【図２】
0006738500.tif 000006
【図３】
0006738500.tif 000007
【図４】
0006738500.tif 000008
【図５】
0006738500.tif 000009
【図６】
0006738500.tif 000010
【図７】
0006738500.tif 000011
【図８】
0006738500.tif 000012