(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活動性微生物感染中に分泌型細胞毒性外毒素を中和するための組成物であって、医薬担体中の血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含み、前記分泌型細胞毒性外毒素を中和するために有効な量で投与される、組成物。
【請求項２】
血漿由来IgMを含む前記組成物が標準的な血液分画プロセスの廃液から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記血漿由来IgMが少なくとも70% (w/v)の純度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記血漿由来IgMが少なくとも90% (w/v)の純度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記血漿由来IgMが少なくとも95% (w/v)の純度を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
患者に投与される前記血漿由来IgMの用量が、該患者1キログラム当たり75 mg〜1 gの範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
患者に投与される前記血漿由来IgMの用量が、該患者1キログラム当たり75 mg〜600 mgの範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
患者に投与される前記血漿由来IgMの用量が、該患者1キログラム当たり75 mg〜300 mgの範囲である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
毎日、隔日、3回/週、又は週1回のレジメンで投与することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
小分子抗生物質、天然若しくは合成ペプチド抗菌剤、若しくは抗菌特性を有するタンパク質、又はこれらの組み合わせから選択される他の分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記小分子抗生物質がバンコマイシン又はメロペネムである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗菌特性を有するタンパク質がラクトフェリンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
対象の感染性疾患を治療するための組成物であって、医薬担体中の血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含み、患者において微生物タンパク質産物を中和するために有効な量で投与される、組成物。
【請求項１４】
活動性微生物感染中の分泌型細胞毒性外毒素に関連する状態を治療するための、医薬担体中の血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含む組成物。
【請求項１５】
前記血漿由来IgMが標準的な血液分画プロセスの廃液から得られる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記血漿由来IgMが少なくとも70% (w/v)の純度を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記血漿由来IgMが少なくとも90% (w/v)の純度を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記血漿由来IgMが少なくとも95% (w/v)の純度を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
患者に投与される前記血漿由来IgMの用量が、該患者1キログラム当たり75 mg〜1 gの範囲である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
患者に投与される前記血漿由来IgMの用量が、該患者1キログラム当たり75 mg〜600 mgの範囲である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
患者に投与される前記血漿由来IgMの用量が、該患者1キログラム当たり75 mg〜300 mgの範囲である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２２】
毎日、隔日、3回/週、又は週1回のレジメンで投与することができる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２３】
小分子抗生物質、天然若しくは合成ペプチド抗菌剤、若しくは抗菌特性を有するタンパク質、又はこれらの組み合わせ等の他の分子をさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２４】
前記小分子抗生物質がバンコマイシン又はメロペネムである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗菌特性を有するタンパク質がラクトフェリンである、請求項２３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2015年8月6日に出願された米国仮特許出願第62/201,910号優先権を主張し、その全ての内容が、参照により本願明細書に具体的に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、それを必要とする患者に血漿由来IgMを含む組成物を投与することを含む、感染性疾患を治療するための方法に関する。また、本発明は、それを必要とする患者に血漿由来IgMを含む組成物を投与することを含む、活動性微生物感染中に分泌型細胞毒性外毒素を中和するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
微生物種は、その個体が感染を除去することができない場合、又はその患者が治療に無反応である場合、感染した患者に非常に有害になることがある。また、感染は、感染した器官から血流に拡散し、敗血症になる可能性がある。これらの敗血症性感染は、患者にとって予後不良であり、一般的には臓器不全及び死をもたらす。
【０００４】
問題は、大部分の抗生物質が、生きている微生物そのものを標的にして感染を治療することである。IgMは、微生物内毒素(エンドトキシン)の全身性作用に起因する、細菌感染の有毒な敗血症的側面を防ぐと特徴付けられている。これらの内毒素は、(特にグラム陰性の細菌の)細胞壁の成分である。これらの治療方法のいずれも、微生物の外毒素(エキソトキシン)、スーパー抗原、又は分泌酵素を標的としていないか、又はこれらを標的とすることが示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国仮特許出願第62/201,910号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血漿由来IgMが患者への内毒素媒介性の毒性に結合し防ぐことができることは十分に特徴付けられているが、これは微生物から活発に分泌される他のタンパク質及び毒素に対処していない。内毒素の毒性作用は、典型的には抗生物質若しくは患者の免疫系により誘導される細菌の死又は溶菌に対する応答である。これらの作用は、微生物から活発に分泌される、外毒素等のタンパク質に起因する、微生物感染中に観察される毒性事象とは別個のものである。内毒素以外の微生物から分泌されるタンパク質及び毒素の毒性作用を予防する、阻害する、又は減少させる組成物及び方法の必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、治療的用量の血漿由来IgMが、活動性微生物感染(active microbial infection)中に分泌型細胞毒性外毒素等の分泌型微生物タンパク質の有害な影響を中和するという、驚くべき中和作用の知見に基づく。本発明は、血漿由来IgMの微生物タンパク質に対する特異性を利用するものである。上述のとおり、IgMが糖タンパク質である微生物内毒素に結合すること、並びにこの結合がIgMの糖タンパク質及び炭水化物への一般的な結合を利用したものであることは、周知である。
【０００８】
従来技術においては、複数のモノクローナル抗体が記述されているが、これらは単一の抗原性標的のみを個別に対象としている。一方、天然の血漿由来IgMは、多数の異なる抗原を同時に標的とすることができる、非常に多くの潜在的抗原結合部位を含んでおり、したがって単一の治療方法に依存しない。
【０００９】
さらに、本発明は、標準的な血液分画プロセス、例えばGrifols社のGamunex分画プロセスの廃液(waste stream)に由来するIgMの供給源を利用する。
【００１０】
したがって、第一の態様において、本発明は、それを必要とする患者に血漿由来IgMを含む組成物を投与することを含む、感染性疾患を治療するための方法に言及する。別の言い方をすれば、本発明の一実施態様は、対象において感染性疾患を治療するための方法を提供し、前記方法は前記対象に組成物を投与することを含み、前記組成物は、医薬担体中に血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含むか、これらから本質的に成るか、又はこれらから成り、前記組成物は、前記患者において微生物タンパク質産物を中和するために有効な量で投与される。
【００１１】
第二の態様において、本発明は、それを必要とする患者に血漿由来IgMを含む組成物を投与することを含む、活動性微生物感染中に分泌型細胞毒性外毒素を中和するための方法に言及する。別の言い方をすれば、本発明の一実施態様は、対象において微生物タンパク質産物を中和するための方法を提供し、前記方法は前記対象に組成物を投与することを含み、前記組成物は、医薬担体中に血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含むか、これらから本質的に成るか、又はこれらから成り、前記組成物は、前記微生物タンパク質産物を中和するために有効な量で投与される。
【００１２】
前記細胞毒性外毒素は、大腸菌(Escherichia coli)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、アスペルギルス・フラバス(Aspergillus flavus)、及びこれらの組み合わせ等の複数の微生物により分泌され得る。
【００１３】
好ましくは、血漿由来IgMを含む組成物は、標準的な血液分画プロセスの廃液から得られる。血漿由来IgMは、少なくとも70% (w/v)、より好ましくは少なくとも90% (w/v)、及び最も好ましくは少なくとも95% (w/v)の純度を有する。
【００１４】
また好ましくは、投与される血漿由来IgMの用量は、患者1キログラム当たり75 mg〜1 g、好ましくは75 mg/kg〜600 mg/kg、より好ましくは75 mg/kg〜300 mg/kgの範囲である。この投与量は、毎日、隔日、3回/週、又は週1回のレジメンで投与することができる。
【００１５】
場合により、血漿由来IgMの組成物は、小分子抗生物質、天然若しくは合成ペプチド抗菌剤、若しくは抗菌特性を有するタンパク質、又はこれらの組み合わせから選択される他の分子をさらに含む。
【００１６】
小分子抗生物質の例は、バンコマイシン及びメロペネムである。抗菌特性を有するタンパク質の例は、ラクトフェリンである。
【００１７】
本発明の方法において、血漿由来IgMの組成物は、単独で用いることができ、又は抗炎症剤を含む治療用分子(therapeutic molecule)及び免疫調節剤から成る群から選択される他の治療学分子(therapeutics molecule)と組み合わせて用いることができる。
【００１８】
本発明の実施態様は以下の図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、IgMの緑膿菌エキソトキシンＡに対する免疫反応性を示す。450nmでの吸光度ODの測定値を、代表的なELISAについて示す。標的抗原である緑膿菌エキソトキシンＡ(P.A. ExA)を、ELISAプレート上にコーティングした。プール血漿又はGammunexプロセスより精製したIgMを、IgMの供給源として用いた。表示しているとおり、このサンプルのPBS中での様々な希釈を試験した。対照は、抗原でコーティングされていないウェルである（未被覆）。各バーについて標準偏差を示す。
【図２Ａ】図2Aは、Ｃ．ディフィシル トキシンB(Toxin B)の細胞毒性の中和を示す。Caco-2細胞(ATCCより入手)を推奨増殖培地中で培養した。細胞を96ウェルプレートにウェルあたり8000細胞で播種した。最初のプレーティングから24時間後、図の凡例に記述するように、細胞を様々なIgM製剤及び/又はクロストリジウム・ディフィシル トキシンBで処理した。細胞の相対数に関するデータを、メーカーの取り扱い説明書に従って行ったCell Titer Glow (Promega Corp.、マディソン、ウィスコンシン州、米国)アッセイにより測定するRLUとして示す。図2Aは、IgGとIgMとの混合物の2つの異なるバッチにおける、Ｃ．ディフィシル トキシンB(Tox B)の中和の特異性を実証する(黒無地のバー及び網掛けのバーについて、それぞれ画分濃度(Frac. Conc.)45%及び70%〜80%のIgM、しかし非特異的対照のヒト血清アルブミン(白抜きのバー)については無し)。
【図２Ｂ】図2Bは、Ｃ．ディフィシル トキシンBの細胞毒性の中和を示す。図2Bは、Ｃ．ディフィシル トキシンB (ToxB)の中和、及び増加する濃度の実質的に純粋なIgMのみ(マイクロモル/L又はuMで；黒無地のバー)による細胞の生存率のレスキューをさらに実証する。
【図３】図3は、Ｃ．ディフィシル 毒素誘導性Caco-2透過性の中和を示す。Caco-2細胞を、Transwellマルチウェルプレートインサートにおいて、典型的な方法により分化させた。分化の21日後、経上皮電気抵抗(TEER)を処理の開始直前に測定した。200より高いTEER測定を有するウェルのみを試験に含めた。16時間の処理後、TEERを測定し、TEERに対する処理の効果を決定した。対照(非処理細胞)を比較対象(コンパレータ―)として100%に設定した。処理群を、対照群TEERと比較した相対的割合として示す。ルシファーイエロー透過性試験については、200より高いTEERを有し、図に記述するように処理した細胞を、ルシファーイエロー(Life Technologies、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国)溶液と共に、1時間、37℃でインキュベートした。Transwellインサートの頂点部分及び基底部分をサンプリングし、ルシファーイエローの存在を評価した。Caco-2単層を通過したルシファーイエローの割合を、サンプルの蛍光測定により決定した。Caco-2単層を通ったルシファーイエローの割合についてのデータを、1の値に設定した対照に対する透過性の増加倍数として表す。Ｃ．ディフィシル トキシンB(Tox B)媒介性の、染料であるルシファーイエロー(A)又は上皮層の電気抵抗(TEER、上記参照)(B)への細胞透過性に対する用量反応が実証される；どちらの場合においても、無トキシンB対照を含める(グラフの左)。IgMとトキシンB(Tox B)との共投与の肯定的な中和作用が、ルシファーイエロー透過性試験において実証される。(C)の代表的な透過性について、対照サンプル(無タンパク質、左端のバー)は、ルシファーイエロー単独の透過性を示し、一方残りのバーは、追加のヒト血清アルブミン(HSA)添加を含むか含まないかに関わらず、Ｃ．ディフィシル トキシンB(Tox B)による増加する透過性を示したが、IgM(画分C)の存在下、右から2番目のバーでは、トキシンB(Tox B)の中和作用を示した。(D)の代表的な経上皮電気抵抗測定(TEER)については、タンパク質を含まない対照サンプル(無地のバー、左端)が、細胞層の平常時の電気抵抗を実証し、この電気抵抗は、ヒト血清アルブミン(HSA)を含まない(無地のバー、左から2番目)及びHSAを含む(無地のバー、右端)、Ｃ．ディフィシル トキシンB(Tox B)の存在下で大幅に減少した。トキシンB(ToxB)の存在下におけるIgM(画分C)によるTEERの回復を図に示す(Tox B + 画分C；右から2番目)。
【図４Ａ】図4Aは、緑膿菌エキソトキシンＡの細胞毒性の中和を示す。Caco-2細胞(ATCCより入手)を推奨増殖培地で培養した。細胞を、96ウェルプレートにウェルあたり4000細胞で播種した。最初のプレーティングの24時間後、図の凡例に記述するように、細胞を様々なIgM製剤及び/又は緑膿菌エキソトキシンＡで処理した。細胞の相対数に関するデータを、メーカーの取り扱い説明書に従って行ったCell Titer Glow (Promega Corp.、マディソン、ウィスコンシン州、米国)アッセイにより測定するRLUとして示す。図4Aは、2つの異なるバッチのIgG及びIgMの混合物(黒無地のバー及び網掛けのバーについて、それぞれ画分濃度45%及び70%〜80%のIgM、しかし非特異的対照のヒト血清アルブミン(白抜きのバー)については無し)による緑膿菌エキソトキシンＡ(Pseudomonas Exotoxin A)(ExA)の中和の特異性を実証する。
【図４Ｂ】図4Bは、緑膿菌エキソトキシンＡの細胞毒性の中和を示す。図4Bは、増加する濃度の実質的に純粋なIgMのみ(マイクロモル/L又はuMで；黒無地のバー)による緑膿菌エキソトキシンＡ(P.A. ExA)の中和及び細胞の生存率のレスキューをさらに実証する。
【図５】図5は、破傷風菌(Clostridium tetani)トキソイド作用の中和を示す。ヒト末梢血単核細胞を、10%熱不活性化ヒト血清を含むRPMI中で培養した。増殖アッセイ用に、培養培地を用いて、3x105細胞を96ウェルプレートの各ウェルに播種した。細胞を、図の凡例に記述しているように処理した。相対細胞増殖を、Cell Titer Glow (Promega Corp.、マディソン、ウィスコンシン州、米国)アッセイにより決定し、メーカーの取り扱い説明書に従って行った。細胞増殖を、実験的対照に対して1の値に標準化した。
【図６】図6は、緑膿菌、肺炎レンサ球菌、及びクレブシエラ・ニューモニエの細菌に対するIgMの免疫反応性を示す。450nmでの吸光度ODの測定値を、代表的な全細胞ELISAについて示す。標的抗原は、ホルムアルデヒド処理した緑膿菌(白いバー)、肺炎レンサ球菌(斜めの縞模様のバー)、及びクレブシエラ・ニューモニエ(黒いバー)であり、全細菌細胞をELISAプレート上にコーティングした。対照：二次抗体のみと共にインキュベートした、細菌コーティングしたウェル、又は抗原をコーティングしていないウェル。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の一実施態様は、対象において感染性疾患を治療するための方法を提供し、前記方法は前記対象に組成物を投与することを含み、前記組成物は、医薬担体中に血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含むか、これらから本質的に成るか、又はこれらから成り、組成物は、前記患者において微生物タンパク質産物を中和するために有効な量で投与される。
【００２１】
本発明の別の実施態様は、対象において微生物タンパク質産物を中和するための方法を提供し、前記方法は前記対象に組成物を投与することを含み、前記組成物は、医薬担体中に血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含むか、これらから本質的に成るか、又はこれらから成り、組成物は、前記微生物タンパク質産物を中和するために有効な量で投与される。
【００２２】
本発明の別の実施態様は、医薬担体中に、血漿由来IgM及び場合により1種以上の賦形剤を含むか、これらから本質的に成るか、又はこれらから成る組成物を提供する。特定の実施態様によれば、1種以上の賦形剤及び/又は医薬担体は合成である、すなわち非天然起源である。
【００２３】
本願明細書で用いられる「中和」微生物タンパク質産物は、対象への微生物タンパク質産物の毒性作用を減少させる、予防する、又は取り除くこと、例えば、患者に対する外毒素媒介性の毒性を減少させる、予防する、又は取り除くことを指す。
【００２４】
特定の実施態様によれば、微生物タンパク質産物は、外毒素、スーパー抗原、及び分泌酵素から成る群から選択される。好ましくは、微生物タンパク質産物は、微生物内毒素を含まない。
【００２５】
特定の実施態様によれば、対象は、組成物の投与の前に、細菌感染と診断されている。
【００２６】
本願明細書で用いられる用語「医薬的に許容される担体」は、本発明の血漿由来IgMと共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを指す。そのような担体は、落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油等、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、若しくは他の合成溶媒等の、石油、動物、植物、又は合成由来のものを含む、水及び油等の無菌の液体であってもよい。また、生理食塩水溶液並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も、液体担体、特に注射溶液として使用することができる。特定の実施態様によれば、医薬的に許容される担体は合成である(すなわち、担体は天然起源でない)。
【００２７】
適切な賦形剤の非限定的な例には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、水、エタノール等が含まれる。また、賦形剤には、湿潤剤若しくは乳化剤、又は酢酸塩、クエン酸塩、若しくはリン酸塩等のpH緩衝化剤；ベンジルアルコール若しくはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；及び塩化ナトリウム若しくはデキストロース等の張性(tonicity)の調整のための剤を含んでもよい。特定の実施態様によれば、1種以上の賦形剤は合成である(すなわち、賦形剤は天然起源でない)。
【００２８】
細胞毒性外毒素は、大腸菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、クレブシエラ・ニューモニエ、肺炎レンサ球菌、クロストリジウム・ディフィシル、ボツリヌス菌、アスペルギルス・フラバス、及びこれらの組み合わせ等の複数の微生物により分泌され得る。
【００２９】
好ましくは、血漿由来IgMを含む組成物は、標準的な血液分画プロセスの廃液から得られる。血漿由来IgMは、少なくとも70% (w/v)、より好ましくは少なくとも90% (w/v)、及び最も好ましくは少なくとも95% (w/v)の純度を有する。
【００３０】
また好ましくは、投与される血漿由来IgMの用量は、患者1キログラム当たり75 mg〜1 g、好ましくは75 mg/kg〜600 mg/kg、より好ましくは75 mg/kg〜300 mg/kgの範囲である。この投与量は、毎日、隔日、3回/週、又は週1回のレジメンで投与することができる。
【００３１】
場合により、血漿由来IgMの組成物は、小分子抗生物質、天然若しくは合成ペプチド抗菌剤、若しくは抗菌特性を有するタンパク質、又はこれらの組み合わせから選択される他の分子をさらに含む。
【００３２】
小分子抗生物質の例は、バンコマイシン及びメロペネムである。抗菌特性を有するタンパク質の例は、ラクトフェリンである。
【００３３】
本発明の方法において、血漿由来IgMの組成物は、単独で用いることができ、又は抗炎症剤を含む治療用分子及び免疫調節剤から成る群から選択される他の治療学分子と組み合わせて用いることができる。
【００３４】
本願明細書に記述される実施態様は、本発明の例示的なものと意図され、その限定ではない。当業者は、本開示の範囲を逸脱することなく、本開示の実施態様及び実施例への改変を行うことができることを理解する。
【００３５】
本発明の実施態様は、用語「を含む」及びその変化形を用いて上に記述される。しかし、発明者の意図は、用語「を含む」が、本発明の範囲を逸脱することなく、本願明細書に記述される任意の実施態様において、「から成る」及び「から本質的に成る」と置換されてもよいということである。別段の特定がない限り、本願明細書において規定される全ての値は、与えられた始点及び終点に至るまでを含み、及びこれらを含む。
【００３６】
以下の実施例は、本願の実施態様をさらに例示し、これらは例示的なものとして解釈されるべきであり、その限定で解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１．IgMの外毒素、分泌型細菌酵素、及びスーパー抗原との免疫反応性
緑膿菌、黄色ブドウ球菌、破傷風菌(Clostridium tetani)、及びＣ．ディフィシルの細菌により生産される様々な標的抗原に対する免疫反応性を評価するために、発明者らによって複数のELISAが開発された(表１を参照)。驚くべきことに、全てのタンパク質性外毒素及び酵素が、血漿由来IgMによって認識された。これらの病原体由来の評価した全てのタンパク質由来抗原についての陽性反応が観察された。精製製剤中及び血漿中でのIgMの反応性を示すELISA例を図1に示す。
【００３８】
【表１】
0006711719.tif 000002
【００３９】
実施例２．Ｃ．ディフィシル トキシンBの細胞毒性作用の中和
本発明の予備的な目標は、IgMの外毒素中和についての概念実証を提供することであった。Ｃ．ディフィシルは腸感染であるので、試験のために生理的に適切な細胞株を利用するために選択された。Caco-2細胞は、腸の透過性試験のために通常用いられる上皮結腸直腸細胞株である。細胞毒性アッセイに用いるためのCaco-2を開発した。インキュベーション時間及びＣ．ディフィシル トキシンB濃度を最適化した(データ示さず)。トキシンBの24時間のインキュベーションでは、毒性は示されず、インキュベーション時間が増加するにつれて、細胞毒性も増加した。加えて、発明者らは、25 ng/mLが48時間で最も高い毒性のアッセイウインドウを与え、この時点でプラトーを示すことを究明した。最終決定したアッセイ条件は、15 ng/mLのトキシンBで、増殖細胞との48時間のインキュベーションに設定された。これらの条件を用いて、IgMについて濃縮された精製画分、及び精製IgMを用いた毒素の中和を評価及び比較した(図2)。画分Aは、40%〜50%のIgMを含み、画分Bは、70%〜80%のIgMを含む。HSAはトキシンBの毒性に何の影響も及ぼさなかったが、一方でIgMを含有する2つの異なる画分は毒素を中和した(図2A)。また、精製IgM(≧95% IgM)も、Ｃ．ディフィシル トキシンBを中和するのに有効であることが示された(図2B)。画分A、画分B、及び精製IgMには、Ｃ．ディフィシルに対する中和抗体が明らかに存在する。
【００４０】
実施例３．Ｃ．ディフィシル トキシンB誘導性の透過性の中和
前記実施例で言及したように、Caco-2細胞は、十分に特徴付けられた、腸上皮の輸送及び透過性のモデルである。Ｃ．ディフィシル毒素の既知の結果の一つは、腸の透過性である。IgMを含有する精製画分がこの毒素作用を中和することができるかを試験するために、腸の透過性モデルとして用いるCaco-2を開発した。このモデルにおいて、Caco-2細胞を、透過性膜を備えたウェルインサート上で21日間単層に分化させた。分化の後、透過性は、蛍光小分子(この場合はルシファーイエロー)が細胞の単層を通過する能力を測定することによって、及び単層により与えられる電気抵抗を測定するためのTEER(経上皮電気抵抗)法を用いることによって、モニタリングすることができる。細胞が増加した透過性を有する場合、膜の基底外側に見出されるルシファーイエローの量も増加する。電気抵抗に関しては、高い透過性を有する細胞ほど低い抵抗性を有する。これらの違いを測定することができることを示すために、Ｃ．ディフィシル トキシンBの用量反応(図3A及び図3B)を行った。ルシファーイエローが単層を通る能力及び単層の電気抵抗の両方が、増加する用量のトキシンBに応答して、適切な対応する変化を有した。(90%〜95% IgMまで濃縮された)画分CがトキシンB媒介性の透過性を中和する能力を試験した。画分C及びトキシンBを1時間予備インキュベートして、IgMを毒素に結合させた。予備インキュベーションに続いて、細胞を画分C及びトキシンBの混合物で16時間処理した。この16時間の期間の後、単層の向こう側へのルシファーイエローの拡散により(図3C)、及び単層TEERに関して(図3D)、、透過性について細胞を評価した。どちらのアッセイ法についても、画分CはトキシンBに対する保護を与えたが、一方でHSAはトキシンBに対して何の効果もなかった。ルシファーイエローは完全に回復したが、一方抵抗は部分的なレスキューのみを示した。これは、恐らくTEERがルシファーイエローアッセイ法よりもより高感度であることに起因する。
【００４１】
実施例４．緑膿菌エキソトキシンＡの細胞毒性作用の中和
Ｃ．ディフィシル トキシンBの中和を伴うCaco-2細胞からの肯定的なデータを考慮して、緑膿菌エキソトキシンＡ(Exotoxin A)を試験するためのCaco-2での類似のアッセイを開発した。画分A又は画分Bをこのモデルで評価すると、エキソトキシンＡの中和が観察された(図4A)。興味深いことに、画分の有効性に関して、エキソトキシンＡではＣ．ディフィシル トキシンBと比べて反対の結果が見出された；エキソトキシンＡの中和について、画分Aは画分Bよりもより強力であった。また、加えて、発明者らは、精製IgMを用いて、緑膿菌エキソトキシンＡの細胞毒性の中和も観察した(図4B)。
【００４２】
実施例５．破傷風菌トキソイドの中和
破傷風毒素は、GABAの放出を阻止する、非常に強力な神経毒である。米国の大部分の個体は、破傷風菌に対するワクチン接種を受けている。破傷風毒素中和のモデルとして、非毒性のトキソイド形態の破傷風毒素を利用して、精製IgMがこのタンパク質を中和することができるか評価した。IgMの破傷風トキソイドへの抗原性の結合が示された(表1を参照)。トキソイドはGABA放出阻止を示さないので、IgMの中和作用を、末梢血単核細胞(PBMC)の増殖により評価した。TCR抗原の刺激により、T細胞の増殖を誘導することができることが知られており、破傷風は、この増殖に対する上述の刺激である。したがって、IgMの存在下及び非存在下で、破傷風トキソイドがPBMC増殖を誘導することを試験した(図5)。破傷風トキソイド単独の存在下において細胞数の3倍の増加が観察されたが、一方IgMとの共処理は、2.5 μMでほとんど完全にこの作用を阻止し、5 μMで完全な阻害を示した。
【００４３】
実施例６．IgMは多様な微生物の抗原性認識を有する
様々な標的の多様性をより良く理解するために、様々なELISAを行った。様々な市販のELISAキットを用いて、細菌性病原体及びウイルス性病原体の両方の反応性を検出した。加えて、熱殺菌したか又はホルムアルデヒド処理した全微生物がELISAプレート上にコーティングされたELISAに基づくアッセイを利用した。この評価により、微生物により生産される「グローバルな」抗原標的に対する反応性の評価が可能になる。全てのELISA及び全細胞(Whole Cell)ELISAについてのデータを表2にまとめ、これらのデータから、IgMがユビキタスな抗原性認識を有していることが結論付けられる。緑膿菌、肺炎レンサ球菌、及びクレブシエラ・ニューモニエの細菌を用いた全細胞ELISAにおけるIgM反応性のELISAデータセットの例を図6に示す。
【００４４】
【表２】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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