(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性抗ウイルス成分としての０．１〜０．５重量％のイオタカラギーナン、水、マンニトールまたはソルビトールから選択される浸透圧調節剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤、および、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）を含む眼科用医薬組成物であって、前記組成物は、ハロゲン化金属塩を含まない、Ｄ種アデノウイルスまたはインフルエンザＡウイルスＨ７亜型により引き起こされるウイルス性眼感染症の局所予防処置もしくは局所治療処置における薬物として使用するための組成物。
【請求項２】
前記エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）が０．０５％〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で存在する、請求項１に記載の薬物として使用するための組成物。
【請求項３】
前記エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）が０．１％（Ｗ／Ｖ）の濃度で存在する、請求項１に記載の薬物として使用するための組成物。
【請求項４】
前記緩衝剤がＮａ２ＨＰＯ４／クエン酸の混合物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬物として使用するための組成物。
【請求項５】
１０〜５０ｍＰａ・ｓの範囲の粘度、６．０〜８．０の範囲のｐＨ値、および２８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧を有する、請求項１〜４いずれか１項に記載の薬物として使用するための組成物。
【請求項６】
イオタカラギーナンが０．２％〜０．４重量％の濃度、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）が０．１％（Ｗ／Ｖ）の濃度、マンニトールまたはソルビトールが３重量％〜４重量％の濃度であり、前記緩衝剤がＮａ２ＨＰＯ４／クエン酸の混合物である、請求項１に記載の薬物として使用するための組成物。
【請求項７】
界面活性剤、抗菌性保存剤、および抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１種の眼科学的に適合性のある添加剤をさらに含む、請求項１に記載の薬物として使用するための組成物。
【請求項８】
活性抗ウイルス成分としての０．２〜０．４重量％の範囲の濃度のイオタカラギーナン、水、マンニトールまたはソルビトールから選択される浸透圧調節剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤およびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）を含む局所投与用の眼用医薬組成物であって、ハロゲン化金属塩を含まない、Ｄ種アデノウイルスまたはＨ７亜型インフルエンザＡウイルスにより引き起こされる感染性結膜炎の予防処置または局所処置における薬物として使用するための組成物。
【請求項９】
前記エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）が０．０５％〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）が０．１％（Ｗ／Ｖ）の濃度で存在する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記緩衝剤がＮａ２ＨＰＯ４／クエン酸の混合物である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
１０〜５０ｍＰａ・ｓの範囲の粘度、６．０〜８．０の範囲のｐＨ値、および２８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧を有する、請求項９〜１１いずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
イオタカラギーナンが０．２％〜０．４重量％の濃度、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）が０．１％（Ｗ／Ｖ）の濃度、マンニトールまたはソルビトールが３重量％〜４重量％の濃度であり、前記緩衝剤がＮａ２ＨＰＯ４／クエン酸の混合物である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
界面活性剤、抗菌性保存剤、および抗酸化剤からなる群から選択される少なくとも１種の眼科学的に適合性のある添加剤をさらに含む、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
次の組成を有する点眼薬の形態の、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の組成物：
イオタカラギーナン：３．２ｍｇ／ｍｌ
ソルビトール：４０．０ｍｇ／ｍｌ 
Ｎａ２ＨＰＯ４：３．６７ｍｇ／ｍｌ
クエン酸：０．４６ｍｇ／ｍｌ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）：１ｍｇ／ｍｌ
調整量の水を加えて１００％とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス学および使用薬の分野に属し、イオタカラギーナンを含む組成物およびウイルス誘導結膜炎の予防的処置または治療処置におけるそれらの薬物としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
流行性角結膜炎（ＥＫＣ）は、結膜および角膜の両方に影響を及ぼす重篤な伝染性の眼感染症であり、Ｄ種アデノウイルスの主として血清型８、１９、３７により引き起こされる。５０を越えるアデノウイルスの血清型が単離されており、少なくとも、１９の血清型が眼感染症を引き起こすことが実証されている。ＥＫＣを引き起こすとして最も多く関連付けられる血清型には、アデノウイルス８、１９、および３７が含まれ、より頻度が少なく、重症度の低い型には、血清型２〜５、７、９、１０、１１、１４、１６、２１、および２９が含まれる。母集団おけるアデノウイルスに対する自然免疫のレベルが低い、すなわち、米国で母集団の５％未満にのみアデノウイルス８型抗体が認められているために、全ての人が感染し易いと考えられる。
【０００３】
ＥＫＣは、結膜炎の典型的症状、例えば、流涙と充血、異物感および激痛の急性発症により特徴付けられる。症状には、疼痛、浮腫、視力の減少、流涙、感光性、異物が眼の中にあるような感じまたは感覚、および偽膜の発生を伴う、結膜の炎症（結膜炎）および角膜の炎症（角膜炎）がさらに含まれる。約２〜３週間続く急性期中は、ウイルスが存在し、複製している。典型的な症例では、最初に片方の眼が感染し、その後、２〜３日の内に感染がもう一方の眼に広がる。６０％の症例で両眼が罹患する。通常、最初の眼の感染がより重症である。約２０〜５０％の患者では、角膜混濁が発症し、視力低下が生じ、これが数週間および数ヶ月間残り、まれなケースでは数年間残ることがある。多くの場合、疾患は性質上流行性であるので、流行性角結膜炎（ＥＫＣ）と呼ばれる。アデノウイルス結膜炎は、ドイツでは申告義務のある感染症であり（例えば、非特許文献１を参照）、また、法律により義務づけられた発生届けの収集、分析および刊行を含む、日本の感染症サーベイランスシステム（ＮＥＳＩＤ）にカテゴリーＩＶ感染症として収載されている。
【０００４】
ＥＫＣは未だに効果的処置がなく、したがって、未充足の大きな医学的ニーズが存在する。ポビドン−ヨウ素点眼薬が唯一の限定された効力を有すると思われるが、同時に、充血した眼にさらなる刺すような痛みの感覚が生じ、結膜の変色までも生ずることがある。したがって、疾患に罹患している患者、ならびにこのような患者と接触する親族、友人、同僚、医師などの個々人のための、ＥＫＣの処置およびその伝染の予防に使用可能なより適合性のある医薬組成物が強く望まれる。
【０００５】
ヒトに対し主に呼吸器疾患を引き起こす他のインフルエンザウイルス亜型と異なり、Ｈ７インフルエンザウイルスウイルス感染症は、呼吸の症状ではなく眼の症状を生ずる（非特許文献２）。したがって、眼疾患を生ずるインフルエンザの大流行の間に、ウイルス性眼感染症の処置のために設計された抗ウイルス製剤が効果的であることが強く望まれる。
【０００６】
眼科学における賦形剤および増粘剤としてカラギーナンの使用は十分に確立されている。特許文献１は、薬学的活性成分の点眼薬製剤の調製に有用なカラギーナンベース溶液について記載している。涙膜と接触すると、溶液は結膜との長期の接触を維持するゲルを形成し、眼の表面から有効成分の急速な除去を防止し、有効成分の局所送達を促進する。カラギーナンまたは他の荷電ポリマーをベースにした眼用のインサイツゲル化系に関する広範囲にわたる概説については、例えば、非特許文献３を参照されたい。カラギーナンを含むポリマー系も同様に高分子の薬剤の経強膜的送達に有用である（非特許文献４）。カラギーナンの固有の薬剤活性については、上記のいずれの文献にも言及または示唆されていない。
【０００７】
賦形剤および／または粘液模倣薬としてカラギーナンを用いた一部の眼医薬品は抗ウイルス薬を含んでいる。例えば、特許文献２は、ヘルペス性角膜炎を処置するための、ブリブジンの光安定性製剤を請求している。カラギーナンおよび関連アニオン性ポリマー粘液模倣薬は、コンタクトレンズの洗浄および貯蔵のために溶液中で使用することができることも知られており、この場合、それらは、過酸化水素、ホウ酸塩、または塩化セチルピリジニウムなどの広範な抗菌活性を有する低分子量薬剤を含む前記溶液の収れん性を改善する（特許文献３および特許文献４を参照）。抗ウイルス性または抗炎症性作用のいずれもこれらの溶液のカラギーナン成分に起因するとはされていない。
【０００８】
天然有機ポリマーをベースにした眼科用製剤が、結膜炎症を処置するために系統的に設計されていることは知られている。例えば、特許文献５は、このような治療目的のために、硫酸化ヒアルロン酸を請求している。この開示には、カラギーナンは言及されていない。
【０００９】
Ｓｔｉｌｅｓら（非特許文献５）は、実験的に誘導されたヘルペス性角膜炎のネコの、ラムダカラギーナンの眼製剤による処置により、動物の感染力の持続期間を減らしたが、結膜炎の臨床経過は短縮されなかったことを報告している。この論文は、ネコ科動物ヘルペスウイルスにより引き起こされる結膜炎症のみを取り扱っており、アデノウイルスおよびラムダクラス以外のカラギーナンについては言及されていない。
【００１０】
特許文献６には、Ｂ種（呼吸器）アデノウイルスに対するイオタカラギーナンの抗ウイルス効果が開示されている。しかし、同じ用途で、Ａ、Ｃ、およびＤ種に対する有意な効果は特定できていないことが言及されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第５，４０３，８４１号明細書
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００７／０３９２０１号
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００９／１５２０２８号
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２０１０／０３８１２９号
【特許文献５】国際公開第ＷＯ２００５／０４６５６２号
【特許文献６】国際公開第ＷＯ２００９／０２７０５７号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｅｙｅｒ−Ｒｕｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｔｓｃｈ  Ａｒｚｔｅｂｌ  Ｉｎｔ  ２０１１；１０８（２７）：４７５−８０
【非特許文献２】Ｂｅｌｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２００９；１５：８５９−８６５
【非特許文献３】Ｒｕｐｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．２０１１；４１１（１−２）：６９−７７および７８−８５
【非特許文献４】Ｔｈｒｉｍａｗｉｔｈａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２０１１；４４（３）：３９９−４０９
【非特許文献５】Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００８；４９（４）：１４９６−１５０１
【発明の概要】
【００１３】
意外にも、上記に考察した現状知識とは対照的に、これまでに、カラギーナン、特にイオタカラギーナンを新規医薬組成物として処方して、Ｄ種アデノウイルスおよび前記Ｄ種アデノウイルスにより引き起こされる感染に対して抗ウイルス効果を得ることができるということが明らかになった。
【００１４】
したがって、独立クレームで請求されるように、本発明は特に、流行性角結膜炎の予防または処置に有用と思われるこのような新規組成物に関する。
【００１５】
既に国際公開第ＷＯ２００９／０２７０５７号で報告されているように、イオタカラギーナンは、生理学的条件下、すなわち、このポリマーが０．９％のＮａＣｌ水溶液中に溶解される場合ではＤ種アデノウイルスに対し効果的ではない。しかし、偶然にも、イオタカラギーナンがＮａＣｌのない水中に溶解される場合、ポリマーはＤ種アデノウイルスに対し驚くべき効力を示すことが明らかになった。
【００１６】
これらの予想外の知見に関するさらなる調査から、すぐに使用できる状態の局所点眼液における、生理的（０．９％）ＮａＣｌ溶液に比べた塩化ナトリウム含量の低減により、インフルエンザＡウイルスのＨ７Ｎ７亜型に対し要求されるイオタカラギーナンのＩＣ５０値が劇的に低下するということが明らかになった。これらの特徴により、Ｈ７インフルエンザＡウイルスにより引き起こされる眼の感染の予防と処置のためにポリマーの使用が可能となり、また、その使用が推奨される
【００１７】
したがって、Ｄ種アデノウイルスまたはＨ７亜型インフルエンザＡウイルスにより引き起こされる感染性結膜炎の予防処置または局所処置における薬物として使用するための、より具体的には、アデノウイルスにより引き起こされる流行性角結膜炎の、およびインフルエンザ株Ｈ７Ｎ７の感染の過程で発生する結膜炎の、予防処置または局所処置における薬物として使用するためのカラギーナン、好ましくはイオタカラギーナンを含む製剤を提供することが本発明の１つの目的である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、実施例６の試験結果のグラフ表示で、イオタカラギーナンの抗ウイルス効果を、鳥インフルエンザウイルスＡ／Ｈ７Ｎ７を眼内感染させたマウスの生存を試験したものである；各群１０匹のマウスをインフルエンザＡ／七面鳥／ドイツ／Ｒ１１／０１  Ｈ７Ｎ７に感染させて、実施例４に記載の医薬組成物またはプラセボを使って、それぞれ、１日２回、１０日間にわたり処置した。処置は感染症直後に開始した。ｘ軸に生存時間（日数）およびｙ軸に生存マウス％を示す；Ｉ＝イオタカラギーナン製剤（黒線）；Ｐ＝プラセボ（点線）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
第１の実施形態では、本発明は、前記ウイルス性結膜炎に罹患しているかまたはその発症のリスクのある眼への投与を介したウイルス性結膜炎の予防処置または治療処置に好適する医薬組成物に関する。「ウイルス性結膜炎」という用語は、国際疾病分類バージョン１０（ＩＣＤ−１０）のコードグループＢ３０により定義されたウイルスにより引き起こされる結膜の感染症を意味するものとする。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ウイルス性結膜炎は、アデノウイルスによる感染が原因の結膜炎または角結膜炎である（それぞれ、ＩＣＤ−１０コードＢ３０．１およびＢ３０．０）。他の実施形態では、ウイルス性結膜炎はその他のまたは特定されていないウイルスによって引き起こされる場合があり（ＩＣＤ−１０コードＢ３０．８およびＢ３０．９）、また、例えば、インフルエンザＡウイルスのＨ７Ｎ７株により引き起こされる場合もある。
【００２１】
本発明との関係においては、用語の「処置する（ｔｒｅａｔ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、眼の充血と疼痛、視力障害と流涙などの重症度が本発明による製剤を使わない場合より低くなるように；または前記臨床症状の持続がより短い期間になるように；または前記症状のある感染した個人がウイルス性結膜炎を引き起こす病原菌を別の個人に伝染させることができる期間がより短縮されるように；または前記効果の組み合わせが達成されるように、ウイルス性結膜炎の臨床経過を変更することを意図した治療的介入を意味するものとする。
【００２２】
さらに、本発明との関係においては、用語の「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、本発明による製剤に最初に暴露されていて、その後に、そうでない場合、すなわち、このような前処置がない場合にはウイルス性結膜炎を引き起こすのに十分であると思われる一定量の感染性ウイルス病原体に暴露されている健康な眼において、ウイルス感染が発生しない、または臨床的に関連するウイルス感染の症状が発生しないことを意味するものとする。「部分的に予防する」という用語は、本発明の製剤による眼の前処置にもかかわらず感染性ウイルス病原体が誘因となって、ウイルス性結膜炎が、前処置を行わない場合より低い重症度の、または遅延された発症の、またはより速く解消する症状を顕在化させることを意味するものとする。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、ウイルス性結膜炎の後期合併症を防ぐか、または回復させる医薬組成物に関する。このような合併症は科学的および臨床的文献において知られており、限定されないが、角膜混濁、上皮下浸潤、および眼の偽膜を含む。
【００２４】
本発明による製剤は、典型的には、活性抗ウイルス成分としてまたは唯一の活性抗ウイルス成分として、すぐに使用できる状態の製剤の、０．０５重量％〜１重量％、好ましくは０．１重量％〜０．５重量％、最も好ましくは０．１重量％〜０．３重量％の濃度のカラギーナン、好ましくはイオタカラギーナンを含む。また、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウムなどの金属ハロゲン化物塩を実質的に不含であるか、または０．５％（Ｗ／Ｖ）以下、好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）以下の１種または複数種の金属ハロゲン化物塩を含む。金属ハロゲン化物塩は生薬製剤でイオン性張性調節剤として使用されることが多い。例えば、「生理的な」塩化ナトリウム溶液をベースにした液体医薬組成物は通常、０．９％Ｗ／Ｖの塩化ナトリウムを含む。
【００２５】
これに関して、「実質的に不含」という用語は、本発明の組成物が、組成物中に存在する他の成分の不純物に由来すると思われる微量程度の金属ハロゲン化物塩を含むことを意味する。
【００２６】
局所に投与可能な本発明による眼用組成物は、３．５〜８．０の範囲のｐＨ値、通常は４．０〜８．０の範囲のｐＨ値、および約２２０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧であってよい。しかし、種々の用途に対しては、疾患または結膜炎を罹患している患者の過剰な蒸発に起因する涙膜の高浸透圧性を打ち消すために、浸透圧をわずかに低浸透圧の値に調節することが好ましい場合があり、前記値は、典型的には、１７０〜２５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、より具体的には１９０〜２２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。本発明では、浸透圧の調節は、イオン性等張化剤を使用しないで、特にＮａＣｌまたはＫＣｌなどの金属ハロゲン化物塩を使用しないで行われる。その代わりに、所望の浸透圧は、少なくとも１種の低分子量糖および低分子量多価アルコール（「ポリオール」）を添加することにより調節することができる。適切な糖は、単糖類、二糖類、およびオリゴ糖からなる群から、通常はグルコース、フルクトース、マンノース、およびスクロースからなる群から選択することができる。適切な多価アルコール、通常、３〜１２炭素原子の骨格を有する短鎖糖アルコールは、グリセリン、エリスリトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、トレイトール、イノシトール、およびマルチトールからなる群から選択される。
【００２７】
本発明による局所眼製剤には、１種または複数種の眼科学的に適合性のある、貯蔵中にｐＨのずれを防止するｐＨ調整剤または緩衝剤を含めることができる。このような薬剤としては、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸、重炭酸ナトリウム、および種々の無機リン酸緩衝液、例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いずれかのこのようなｐＨ調節剤により導入される極小限のイオン強度が、本発明の本質を妨げることはない。
【００２８】
また、本発明の局所眼製剤には、１種または複数種の眼科学的に適合性のある界面活性剤を含めることができる。界面活性剤は眼の表面全体への製剤の拡散を促進するものであり、非イオン性またはアニオン性であってよい。代表的非イオン性界面活性剤には、チロキサポール、ポリオキシエチレンソルビタンエステル、ポリエトキシ化ヒマシ油、ポロキサマー、ポリオキシエチレン／ヒドロキシアルキルホスホネート、ラウリン酸またはパルミチン酸エステルおよびエーテル、トリエタノールアミンオレート、または前述の試薬の組み合わせ、または当業者に既知のその他の試薬が挙げられる。界面活性剤を加える場合には、通常、組成物の０．０２％（Ｗ／Ｖ）〜０．１％（Ｗ／Ｖ）の濃度で存在する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本局所眼製剤には、微生物の増殖を抑制し、保存可能期間を延ばすための１種または複数種の防腐剤を含めることができる。代表的防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、エデト酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ポリクオタニウム−１、ポリヘキサメチレンビグアニド、および過ホウ酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。防腐剤の量は通常、全組成物の約０．０１％（Ｗ／Ｖ）未満である。
【００３０】
上記の成分に加えて、本発明の医薬組成物中に種々の追加のまたは代わりの成分が存在することができることが意図されており、代わりの成分には、限定されないが、ビタミンＥまたはその市販の誘導体、例えば、トコフェロールポリエチレングリコール１０００スクシネート（ＴＰＧＳ）、アスコルビン酸、またはメタ重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤が含まれる。
【００３１】
本発明の別の実施形態は、局所投与用の眼用医薬組成物に関し、この組成物は、活性抗ウイルス成分として、抗ウイルス的に有効な量のイオタカラギーナン、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）、マンニトールまたはソルビトールから選択される浸透圧調節剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤および水を含む。但し、すぐに使用できる状態の製剤としての組成物は、０．５％Ｗ／Ｖ以下の金属ハロゲン化物塩含量である。
【００３２】
上記実施形態の組成物は、すぐに使用できる状態の製剤の０．０５重量％〜１重量％、好ましくは、すぐに使用できる状態の製剤の０．１重量％〜０．５重量％、好ましくは０．１重量％〜０．４重量％、最も好ましくは０．２重量％〜０．４重量％の濃度のイオタカラギーナンを含む。
【００３３】
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）は、０．０５％〜０．２％（Ｗ／Ｖ）の濃度、好ましくは０．１％（Ｗ／Ｖ）の濃度で存在する。
【００３４】
ｐＨ調整剤または緩衝剤としては、限定されないが、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸、重炭酸ナトリウム、および種々の無機リン酸緩衝液、例えば、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、およびこれらの混合物が挙げられ、好ましくはＮａ２ＨＰＯ４／クエン酸の混合物が挙げられる。
【００３５】
この実施形態による眼用医薬組成物は、１０〜５０ｍＰａ・ｓの範囲の粘度、６〜８．０の範囲のｐＨ値、および２８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧を有する。
【００３６】
本発明の別の実施形態は、眼用医薬組成物に関し、この組成物は、活性抗ウイルス成分として、すぐに使える製剤の重量の０．２重量％〜０．４重量％の濃度のイオタカラギーナン、０．１％（Ｗ／Ｖ）の濃度のエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）、３重量％〜４重量％の範囲の濃度のマンニトールまたはソルビトール、およびＮａ２ＨＰＯ４／クエン酸の混合物を含む。但し、すぐに使用できる状態の製剤としての組成物は、０．５％Ｗ／Ｖ以下の金属ハロゲン化物塩含量である。
【００３７】
この実施形態による眼用医薬組成物は、１０〜５０ｍＰａ・ｓの範囲の粘度、６〜８．０の範囲のｐＨ値、および２８０〜３２０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲の浸透圧を有する。
【００３８】
意外にも、ＥＤＴＡの存在によりイオタカラギーナンを含む局所眼用組成物の粘度が調節され、特にＥＤＴＡがイオタカラギーナンの量の増加に伴い上昇する組成物の粘度を低下させる。
【００３９】
このＥＤＴＡの効果により、高濃度のイオタカラギーナンを有する局所眼用組成物の調製が可能となり、また、組成物が患者にとって快適であり、霧視を生じないことを保証する適切な粘度が可能となる。
【００４０】
ＥＤＴＡの存在の別の効果は、製剤がＥＤＴＡを含まない対応する製剤より高い抗ウイルス活性を有するＥＤＴＡを含むことである。
【００４１】
上記報告された眼用組成物の利点は、感染したヒトの眼は、高い流涙速度を有し、通常、局所的に適用された治療薬は極めて急速に洗い流されるので、高濃度のイオタカラギーナンを含む製剤は、有効量のイオタカラギーナンを感染した眼に送ることを可能とするという点である。
【００４２】
本発明による医薬組成物は通常、眼の前面部への局所投与用の無菌形態で提供され、それを必要としている個人による自己投与用として調節されていることが好ましい。一実施形態では、製剤は粒子不含の点眼薬である。前記液滴の自己投与中に個人により容易に制御することができる方式の、ノズルを通して眼表面へ液体を滴下分注するのに適する種々の容器が当技術分野において既知である。典型的な容器＋ノズルのシステムが、反復使用中の点眼薬の無菌を維持するように設計されているのが好ましい。
【００４３】
本発明の範囲に入るその他の生薬製剤には、眼科学的に許容可能な綿棒、軟膏、またはスプレーもしくはエアロゾルとして眼に適用可能なゲル、または結膜嚢中に投与可能なゲルが含まれる。これらの製剤のそれぞれに対し、このような製剤を眼表面に対する機械的な損傷のリスクを生ずることなく、眼の前面に分注するように設計されている種々の製品または適用システムが当技術分野において既知である。
【００４４】
特殊な用途としては、本医薬組成物はまた、結膜嚢中に一時的に配置される、または本発明によるカラギーナン製剤を放出する間にインサイツで溶解する徐放装置としても処方することができる。
実施例１
【００４５】
アデノウイルスに対するＩＣ５０値の決定手順
Ａ５４９細胞を、ウエル当たり１．７＊１０４細胞の細胞密度で９６ウエルプレートに播種し、４．５ｇ／ｌのグルコースを含む標準的ＤＭＥＭ組織培地中で２４時間培養した。種々の量のカラギーナンポリマーおよびＮａＣｌを含むウイルス懸濁液を調製し、２０分の最少時間、インキュベートした。細胞を所定濃度およびウエル当たり１．３＊１０３感染単位のウイルス力価で試験物質（＝カラギーナンポリマー）を含むウイルス懸濁液に感染させた。感染の１時間後、ウイルス接種を解除し、２．５％Ｗ／Ｖのカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、試験する量の濃度のカラギーナンポリマーおよびＮａＣｌ塩を含む半液体オーバーレイを加えた。細胞を３７℃で５日間インキュベートした。その後に、上清を取り除き、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、氷冷メタノール／アセトン（１：１）混合物を使って免疫染色用に固定した。細胞をブロッキング緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で４５分間さらにインキュベートし、さらに、１：１０００希釈のマウス抗アデノウイルス抗体と共にインキュベートした。１時間のインキュベーション後、再度細胞を０．１％ツイーン２０を含む洗浄緩衝液を使って３回洗浄し、その後、１：１０００希釈のＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体と共に１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、ＴＭＢ基質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を添加した。１０分間の反応時間後に、１Ｎの硫酸を加えて、反応を停止させた。
【００４６】
吸光度を４５０ｎｍで測定した。未処置の感染細胞の吸光度を１００％に設定し、非感染処置細胞の吸光度を０％に設定した。標準的フィッティングソフトウェアＥｘｃｅｌＦｉｔを使ってＩＣ５０値の計算を行った。同時に、４％ホルムアルデヒドを含むクリスタルバイオレット溶液を使って細胞の染色および固定を行うことにより、非感染細胞に対する処置の効果を測定した。ポリマーおよび種々の試験塩濃度の、非感染細胞に対する有意な負の効果は検出されなかった。
【００４７】
表１：イオタカラギーナンの３つの型のアデノウイルスに対するＩＣ５０値はＮａＣｌの濃度に依存する。
【００４８】
【表１】
0006635343.tif 000002
全ての値はμｇ／ｍｌ単位。［ＭＡ＝マンニトール］
【００４９】
表１に示すように、塩化ナトリウムが生理的な濃度で存在する場合、イオタカラギーナンはアデノウイルス８、１９、および３７に対して有効ではない。０．５％のＮａＣｌの濃度で、抗ウイルス効果が検出可能である。ＮａＣｌが存在しない場合は、イオタカラギーナンのＩＣ５０は、実験的オーバーレイ溶液の１ｍｌ当たり２９〜３８μｇのイオタカラギーナンである。
【００５０】
マンニトールが２００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのモル浸透圧濃度になるまで添加される場合は（０％ＮａＣｌ＋２００ｍＯｓｍ／ＬＭＡ）、抗ウイルス効果が保持される。表１に示す結果を達成するために、３６．４ｍｇ／ｍｌの濃度のマンニトールを、１．２ｍｇ／ｍｌのイオタカラギーナンを含む溶液に加えた（１９３ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧に相当）。
実施例２
【００５１】
インフルエンザＡウイルスＨ７Ｎ７に対するＩＣ５０値の決定手順
ウイルスおよび実験試験用試料の予防的プレインキュベーション、細胞の感染および２．２５％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む半液体オーバーレイ培地を使った感染後処置を含む設定に基づき、ＭＤＣＫ細胞に対しアッセイを行った。アッセイマトリックスを、貯蔵溶液の最初の１：３希釈から得られた２：１の比率の培地および試料マトリックスから構成した。
【００５２】
各試験試料濃度に対して、ならびに感染および非感染対照に対して、６回の繰り返しを行うアッセイを設定した。模擬感染（毒性対照）を３回の繰り返しで行った。最終のイオタカラギーナン濃度を、４００、１２０、３６、１０．８、３．２、０．９７、０．３、０．０９μｇ／ｍｌとした（１：３．３３系列希釈）。２４〜２８時間後に約９０％集密度になるように、１．７ｘ１０４細胞を９６ウエル組織培養皿に播種した。等容積の２倍濃縮ウイルスの希釈系列および２倍濃縮試験試料の希釈系列を混合し、室温で１０分間インキュベートした。試験試料および培地を含まないウイルスを、感染および非感染対照にそれぞれ加えた。プレートを、室温で４５分間インキュベートした。その後、接種菌液を希釈し、１ｍｌの一定分量で５ｍｌの丸底チューブに分注し、それぞれの試験試料濃度に対し１つのチューブを調製した。各アッセイプレート当たり４ｍｌのＣＭＣ培地を５０ｍｌのコニカルチューブに移し、感染および非感染対照に対するオーバーレイ培地を調製した。
【００５３】
貯蔵溶液を、トリプシンを補充したアッセイ培地を使って８００μｇ／ｍｌのイオタカラギーナンに希釈し、１：５００のトリプシンを含む培地と試料マトリックスの１：２の比率の混合物を得た。マトリックス条件を固定して、その後の系列希釈を行った。１ｍｌの試験試料希釈液を１ｍｌのＣＭＣ培地に加え、激しくボルテックスした。感染／非感染対照に対するＣＭＣ培地を等容積の、アッセイ培地およびトリプシン１：５００を含むマトリックス１：２の混合物と合わせて、激しく混合した。オーバーレイ培地を水浴中で３７℃に保持した。使用の少し前に、溶液を短時間ボルテックスし、深いウエルプレートのウエルに注ぎ込んだ。最終のオーバーレイ培地：４ｍＭのＬ−グルタミン、ＡＢＡＭ、トリプシン１：１０００および２．２５％ＣＭＣを含むＯｐｔｉ−ｐｒｏ。毒性対照としてのウイルスの存在しない場合も、同一手順を行った。
【００５４】
免疫染色法用として、オーバーレイ培地を１００μｌのＰＢＳで希釈し、吸引した。１００μｌのＰＢＳを各ウエルに加えた。ＰＢＳを吸引する前に、プレートを、マイクロプレート振とう機上で最大速度で激しく短時間撹拌した。ＣＭＣ結晶がまだ細胞層上に残っている場合には、洗浄を２回以上繰り返した。１００μｌの冷メタノール／アセトン固定液を加えて、プレートを−２０℃で２０〜３０分間インキュベートし、固定液の除去後、乾燥させた。
【００５５】
１００μｌのブロッキング緩衝液と共に１時間のインキュベーションした後、プレートをＰＢＳで洗浄し、５０μｌの抗体希釈液（抗ＮＰ１：５００）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄後、検出抗体（希釈１：１０００）を加えて、室温で１時間接触を保持し、その後、プレートを空にし、再度洗浄緩衝液で３回、ＰＢＳで１回洗浄した。１００μｌの基質を添加した。細胞不含の６ウエルを基質で満たし、ブランクとして使用した。１０〜１５分後、１００μｌの１Ｎ硫酸で反応を停止させた。１００μｌを９６ウエル平底プレートに移し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００５６】
評価：すべての測定値からブランク試料の平均値を差し引き、６回繰り返しの平均値を計算した（生データ）。全ての測定値から感染していない試料の平均値を差し引いた。値を感染試料の平均値に正規化し、得られた値を１００から差し引いて、感染していない試料のパーセントとして抑制を得た。図では、抑制およびブランク補正生データをイオタカラギーナン希釈の濃度に対しプロットした。ＩＣ５０値をアデノウイルスについて前述したように計算した。
【００５７】
表２：インフルエンザＨ７Ｎ７ウイルスに対するイオタカラギーナンのＩＣ５０値は、ＮａＣｌの濃度に依存する。
【００５８】
【表２】
0006635343.tif 000003
全ての値はμｇ／ｍｌ単位。［ＭＡ＝２００ｍＯｓｍ／Ｌマンニトール］
実施例３
【００５９】
眼感染症の処置のための抗ウイルス点眼製剤
イオタカラギーナン：：２．４ｍｇ／ｍｌ
マンニトール：３６．４ｍｇ／ｍｌ
モル浸透圧濃度：２００ｍＯｓｍ／Ｌ（浸透圧：１９２ｍＯｓｍ／ｋｇ）
粘度：７６ｍＰａ・ｓ
調整量の水を加えて１００％とする
実施例４
【００６０】
眼感染症の処置のための抗ウイルス点眼製剤
イオタカラギーナン：１．２ｍｇ／ｍｌ
マンニトール：３６．４ｍｇ／ｍｌ
モル浸透圧濃度：２００ｍＯｓｍ／Ｌ（浸透圧：１９３ｍＯｓｍ／ｋｇ）
粘度：８〜１５ｍＰａ・ｓ
調整量の水を加えて１００％とする
実施例５
【００６１】
男性ボランティアは、約１０連続日の間、角結膜炎に罹患していた。患者は、ほとんどがウイルス感染により引き起こされたと思われる、眼の充血、流涙の増加、両眼のそう痒感および灼熱感を訴えた。ボランティアは、各眼に５滴を１日３回、５日間の投与計画により、実施例３の点眼溶液で処置された。既に第１日目の後に、ボランティアから、そう痒感および充血などの症状減少の報告があった。治療中、病理学的状態は連続的に改善され、臨床関連症状が完全になくなったので、５日目に治療を中断した。１４日間の観察期間内に再発は発生しなかった。
実施例６
【００６２】
鳥インフルエンザウイルスＡ／Ｈ７Ｎ７に角膜内感染したマウスに対するイオタカラギーナンの抗ウイルス効果
Ｈ７Ｎ７亜型のインフルエンザウイルスは眼の感染を介して、主に身体に侵入する。Ｈ７Ｎ７亜型は、ヒトおよびマウスに対し高度な病原性があることが示されている。最悪のケースとして、ウイルスが感染の一次部位から肺に広がると、致死という結果になる可能性がある。Ｃ５７ＢＬ６マウスでは、インフルエンザウイルスＨ７Ｎ７Ａ／七面鳥／ドイツ／Ｒ１１／０１の眼内感染により、致死の結果になる。このモデルを使って、実施例４に記載の医薬組成物の試験を行った。
【００６３】
３週齢のＣ５７ＢＬ６マウス（各群１０匹）を、インフルエンザウイルスＨ７Ｎ７Ａ／七面鳥／ドイツ／Ｒ１１／０１の１．５ｘ１０５プラーク形成単位（ｐｆＵ）を含む５μｌの懸濁液で眼内感染させた。３６．４ｍｇ／ｍｌマンニトールを含むプラセボ製剤、または実施例４に記載の製剤を使って、感染後直ちに治療を開始した。マウスを１日２回、１０日間にわたりイオタカラギーナン製剤またはプラセボでそれぞれ処置した。１４日後、プラセボ処置マウスの８０％が死亡した。対照的に、イオタカラギーナン処置マウスの５０％が生存し、感染症から回復した（図１参照）。ログランク検定による統計的評価（Ｐｒｉｓｍ５バージョン５．０２）は、２つの群間で有意差を示した（０．０４９２のｐ値）。したがって、実施例４に記載のイオタカラギーナン製剤を使ったマウスの眼内処置は、インフルエンザＨ７Ｎ７ウイルスの致死用量で眼内感染したマウスの生存において、有意な効果をもたらすと結論付けることができる。
実施例７（ｆ２）
【００６４】
眼感染症の処置のための抗ウイルス点眼製剤
イオタカラギーナン：２．４ｍｇ／ｍｌ
マンニトール：２３．５０ｍｇ／ｍｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４：３．６７ｍｇ／ｍｌ
クエン酸：０．４６ｍｇ／ｍｌ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）：１ｍｇ／ｍｌ
調整量の水を加えて１００％とする
モル浸透圧濃度：１９５ｍＯｓｍ／ｋｇ
粘度：７．９ｍＰａ・ｓ
ｐＨ＝６．８
実施例８（ｆ４）
【００６５】
眼感染症の処置のための抗ウイルス点眼製剤
イオタカラギーナン：２．４ｍｇ／ｍｌ
マンニトール：３８．４ｍｇ／ｍｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４：３．６７ｍｇ／ｍｌ
クエン酸：０．４６ｍｇ／ｍｌ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）：１ｍｇ／ｍｌ
調整量の水を加えて１００％とする
モル浸透圧濃度：２９１ｍＯｓｍ／ｋｇ
粘度：１２．４ｍＰａ・ｓ
ｐＨ＝６．７０
実施例９（ｆ４Ｓ）
【００６６】
眼感染症の処置のための抗ウイルス点眼製剤
イオタカラギーナン：２．４ｍｇ／ｍｌ
ソルビトール：４０．０ｍｇ／ｍｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４：３．６７ｍｇ／ｍｌ
クエン酸：０．４６ｍｇ／ｍｌ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）：１ｍｇ／ｍｌ
調整量の水を加えて１００％とする
モル浸透圧濃度：２９１ｍＯｓｍ／ｋｇ
粘度：１５．７ｍＰａ・ｓ
ｐＨ＝６．７９
実施例１０（ｆ５ｄ）
【００６７】
眼感染症の処置のための抗ウイルス点眼製剤
イオタカラギーナン：３．２０ｍｇ／ｍｌ
マンニトール：３８．４ｍｇ／ｍｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４：３．６７ｍｇ／ｍｌ
クエン酸：０．４６ｍｇ／ｍｌ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）：１ｍｇ／ｍｌ
調整量の水を加えて１００％とする
モル浸透圧濃度：２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ
粘度：４４．８ｍＰａ・ｓ
ｐＨ＝６．７７
実施例１１（ｆ５Ｓ）
【００６８】
眼感染症の処置のための抗ウイルス点眼製剤
イオタカラギーナン：３．２ｍｇ／ｍｌ
ソルビトール：４０．０ｍｇ／ｍｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４：３．６７ｍｇ／ｍｌ
クエン酸：０．４６ｍｇ／ｍｌ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）：１ｍｇ／ｍｌ
調整量の水を加えて１００％とする
モル浸透圧濃度：２８９ｍＯｓｍ／ｋｇ
粘度：４３．６ｍＰａ・ｓ
実施例１２
【００６９】
製剤の一般的調製方法
一定速度の撹拌下、イオタカラギーナンを水中に溶解して、２．４ｍｇ／ｍｌの溶液を得た。その後、全ての他の化合物を加え、一定速度の撹拌下で溶解した。最終の溶液を約８０℃に加熱し、ガラス繊維プレフィルターを備えた０．２２μｍセルロースアセテート膜を通して濾過滅菌した。
【００７０】
製剤の粘度測定
粘度計Ｒｅｏｐｌｕｓ／３２Ｖ３．４０２１００４５９０−３３０２４を使って粘度を測定した。分析は各試料に対し２つの異なる測定により行い、それぞれ３つの記録時点（２０、４０および６０秒）を含めた。
実施例１３
【００７１】
実施例７〜１１の製剤のアデノウイルス８および１９（ＡｄＶ８およびＡｄＶ１９）に対する抗ウイルス活性の評価。
ＡｄＶ８およびＡｄＶ１９のインビトロ複製抑制により、製剤７〜１１の抗ウイルス活性を試験した。
【００７２】
（ｆ２）、（ｆ４）、（ｆ４Ｓ）、（ｆ５）および（ｆ５Ｓ）製剤の存在下でＡ５４９細胞をＡｄＶに感染させ、試験製剤を含む半液体オーバーレイと共に、さらに５日間インキュベートした。感染を５０％のそれぞれの製剤マトリックスの存在下で、およびインキュベーションを１７％のそれぞれの製剤マトリックスの存在下で行った。ウイルス複製の抑制を免疫染色法により検出されたＡｄＶタンパク質の相対量により評価した。
【００７３】
アッセイは、９６ウエルプレートで、それぞれの試験試料希釈液ならびに感染および非感染対照について５回繰り返して行った。ウイルスおよび試料希釈液を１００％のそれぞれのプラセボ中でインキュベートし、感染させるために混合物を細胞に添加する前に、培地で希釈した。感染後培地は、ＡＢＡＭおよび２％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の１７％のそれぞれのプラセボから構成され、２．５％のＣＭＣが補充された（Ｌ−グルタミン含有高グルコース（ＤＭＥＭ）で１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含む）。イオタカラギーナンの濃度は４００〜２．３μｇ／ｍｌの範囲であった（希釈１：１．７７）。
【００７４】
感染後５日目に、ウイルス複製の抑制を免疫染色法により検出された生成ＡｄＶタンパク質の相対量により評価した。非感染細胞を使った毒性対照を同時に実施した。
細胞：
アッセイの２４時間前に、１．７ｘ１０４細胞を９６ウエル組織培養皿に播種した。
【００７５】
試験試料の希釈：
それぞれのプラセボ中で、試験試料の４倍濃縮１：１．７７希釈系列を調製した。
【００７６】
予防的処置および感染：
一定分量のウイルスストックを冷たい水道水中で解凍し、ボルテックスで短時間撹拌した。それぞれのプラセボ中で４倍濃縮ウイルスを調製した。
【００７７】
等容積の４倍濃縮の系列希釈試験試料またはそれぞれのプラセボ（陽性対照＝感染、陰性対照＝非感染）および４倍濃縮ウイルスの希釈液を混合し、室温で３０分間インキュベートした。ウイルスおよび試料混合物またはプラセボ（感染、非感染対照）を等容積のＤＭＥＭ＋ＡＢＡＭ＋２％ＦＢＳで希釈した。等容積の試料希釈液および特定のマトリックスを毒性対照として混合した。
【００７８】
３０μｌのウイルス（１５００（ＡｄＶ８）または１３００（ＡｄＶ１９）ＴＣＩＤ５０）／試料混合物、ウイルスのみ（感染、ｉｎｆ）またはウイルス不含マトリックス（非感染、ｎｉ）、またはウイルス不含試料（ｔｏｘ）を細胞に添加する前に、細胞を培地＋ＦＣＳ不含ＡＢＡＭで洗浄した。アッセイマトリックスはＡＢＡＭおよび２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中の５０％プラセボであった。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。その後、接種菌液を１００μｌの培地＋ＡＢＡＭ＋２％ＦＢＳで希釈し、吸引した。
【００７９】
感染後処置：
等容積の２倍濃縮の系列希釈試験試料または希釈培地（感染対照、非感染対照）を混合することにより、オーバーレイ培地を調製した。
細胞を１００μｌのオーバーレイ培地と共に、３７℃で５日間インキュベートした。
【００８０】
免疫染色：
オーバーレイ培地を１００μｌのＰＢＳ（ダルベッコのＣａ、Ｍｇ不含ＰＢＳ）で希釈し、吸引した。プレートを９００ｒｐｍのマイクロプレート振とう器で短時間撹拌することにより、１００μｌのＰＢＳで２回洗浄した。ペーパータオル上でプレートをタッピングすることにより残留液体を除去した後、１００μｌの冷メタノール／アセトン混合物を細胞に加えた。プレートを−２０℃で２０〜３０分間インキュベートした。その後、固定液を吸引し、プレートを乾燥させた。
【００８１】
１００μｌのブロッキング緩衝液と共に４５分間のインキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液で１回洗浄し、その後、５０μｌの抗体希釈液（洗浄緩衝液で１：１０００希釈）と共に室温で１時間インキュベートした。その後、プレートを空にし、洗浄緩衝液で３回洗浄した後、検出抗体（洗浄緩衝液で１：１０００希釈）を加えた。室温で１時間後、プレートを空にし、洗浄緩衝液で２回、ＰＢＳで２回、洗浄した。１００μｌの基質を添加した。細胞不含の６ウエルを基質で満たし、ブランクとして使用した。１０分後、１００μｌの１Ｎ硫酸で反応を停止させた。１００μｌを９６ウエル平底プレートに移し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００８２】
未処置の感染細胞の吸光度を１００％に設定し、非感染処置細胞の吸光度を０％に設定した。標準的フィッティングソフトウェアＥｘｃｅｌＦｉｔを使ってＩＣ５０値の計算を行った。
【００８３】
抑制曲線に基づいて、試験製剤における、５０％ウイルス抑制（ＩＣ５０）に到達するのに必要なイオタカラギーナンの濃度を計算した。結果を表３にまとめている。
【００８４】
【表３】
0006635343.tif 000004
９５％ＣＩ＝９５％信頼区間、観察された信頼区間の９５％はパラメータの真の値を保持すると推定される。
実施例１４
【００８５】
ＡｄＶ８に対する抗ウイルス活性に与えるＥＤＴＡの影響ＥＤＴＡを含む製剤（ｆ２／ＥＤＴＡ）対対応するＥＤＴＡ不含製剤（ＥＤＴＡ不含ｆ２）の抗ウイルス活性をＡｄＶ８の抑制を調査するインビトロアッセイにより比較した。
試験製剤：
（ｆ２／ＥＤＴＡ）：
イオタカラギーナン：２．４ｍｇ／ｍｌ
マンニトール：２３．５０ｍｇ／ｍｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４：３．６７ｍｇ／ｍｌ
クエン酸：０．４６ｍｇ／ｍｌ
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ）：１ｍｇ／ｍｌ
調整量の水を加えて１００％とする
（ＥＤＴＡ不含ｆ２）：
イオタカラギーナン：２．４ｍｇ／ｍｌ
マンニトール：２３．５０ｍｇ／ｍｌＮａ２ＨＰＯ４：３．６７ｍｇ／ｍｌ
クエン酸：０．４６ｍｇ／ｍｌ
調整量の水を加えて１００％とする
【００８６】
少し変更したプロトコルを含む実施例１４に記載された手順に従ってアッセイを行った。
【００８７】
このアッセイ設定では、ウイルスを対応するプラセボ中で希釈した製剤の存在下で、最終濃度の培地中３３％の製剤マトリックスと共に１０分間インキュベートした。それに応じて、Ａ５４９細胞を培地中１７％の製剤マトリックスの存在下でアデノウイルス（ＡｄＶ８）に感染させて、試験製剤（再度、培地中１７％のマトリックス）を含む半液体オーバーレイと共に、５日間さらにインキュベートした。ウイルス複製の抑制を、免疫染色法により検出された生成ＡｄＶタンパク質の相対量により評価した。
【００８８】
抑制曲線に基づいて、試験製剤における、５０％ウイルス抑制（ＩＣ５０）に到達するのに必要なイオタカラギーナンの濃度を計算した。結果を表４にまとめている。結果は、点眼製剤へのＥＤＴＡの添加により、ＥＤＴＡ不含の対応する製剤より高い抗ウイルス活性が生じたことを示している。
【００８９】
【表４】
0006635343.tif 000005
【図１】
0006635343.tif 000006