(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シミ改善成分のスクリーニング方法であって、
培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程を含み、
被験物質を評価する際に、次の（１）及び／又は（２）を用いる方法。
（１）前記工程を経た培養線維芽細胞
（２）前記工程を経た培養線維芽細胞の培養上清と培養線維芽細胞以外の皮膚細胞
【請求項２】
シミ改善成分のスクリーニング方法のために使用する指標であって、
（１）  メラノソームを培養線維芽細胞に添加する工程
（２）  前記培養線維芽細胞がメラノソームを取り込むことに起因して、当該細胞中の遺伝子発現量が増加する遺伝子及び／又は、それに対応するタンパク質を選択する工程
（３）  （２）の工程で選択されたものの内、メラニン産生への関与が既知である遺伝子及び／又はタンパク質を選択する工程
を含んでなる指標の決定方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法で選択された遺伝子及び／又はタンパク質を指標とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
シミ改善成分のスクリーニング方法であって、
（１）  培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程、
（２）  被験物質を添加する工程、
（３）  ＩＬ−８、ＣＣＬ−２、ＣＸＣＬ−１から選択される１種以上の遺伝子及び／又はＩＬ−８、ＣＣＬ−２、ＣＸＣＬ−１から選択されるタンパク質の1種以上を指標として、発現抑制効果のある被験物質を選定する工程
を含んでなる請求項１又は３記載の方法。
【請求項５】
シミ改善成分のスクリーニング方法であって、
（１）  培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程、
（２）  メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞の培養上清を培養皮膚細胞に添加する工程
又は
メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞と線維芽細胞以外の培養皮膚細胞を共培養する工程、
（３）  被験物質を添加する工程、
（４）  前記培養上清の添加又は前記共培養に起因して、前記培養皮膚細胞中の遺伝子発現量及び／又はタンパク質の発現量が上昇しているものの内、既知のメラニン産生関連遺伝子及び／又はタンパク質を指標として被験物質を評価し、発現抑制効果のある物質を選定する工程
を含んでなる方法。
【請求項６】
シミ改善成分のスクリーニング方法であって、
（１）培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程、
（２）メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞の培養上清を培養メラノサイトに添加する工程
又は
メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞と培養メラノサイトを共培養する工程
（３）被験物質を添加する工程、
（４）培養メラノサイトにおけるメラニン産生量を指標に、被験物質を評価し、メラニン産生抑制効果のある物質を選定する工程
を含んでなる方法。
【請求項７】
シミ改善成分のスクリーニング方法であって、
（１）培養線維芽細胞にメラノソームを取り込ませたときに発現量が上昇する遺伝子及び／又はタンパク質の内メラニン産生への関与が既知である遺伝子及び／又はタンパク質を培養皮膚細胞に添加する工程、
（２）被験物質を添加する工程、
（３）前記遺伝子及び／又はタンパク質の受容体もしくは前記遺伝子及び／又はタンパク質によって誘導される既知のメラニン関連因子の発現を指標として被験物質を評価し、発現抑制効果のある成分を選定する工程を含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シミ改善成分をスクリーニングする方法であって、メラノソームを添加した培養線維芽細胞において発現が増強される特定の遺伝子及び／又はタンパク質を指標とするシミの改善成分のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
シミは、外部から皮膚を観察した際に、表皮に存在するメラニンと真皮に存在するメラニンがそれぞれ影響して「シミ」と認識される。
【０００３】
表皮に存在するメラニンは、表皮角化細胞由来のET-1やSCF、αMSHなどがメラノサイトにおけるメラニン産生を刺激して産生されていると考えられているため、これらの因子の発現を抑制することは表皮に存在するメラニンの影響によるシミの改善に非常に有用であり、その作用を有する成分を含んだ美白化粧品は数多く存在する（非特許文献１、特許文献１）。加えて、角層のターンオーバー機能を高め、表皮からのメラニンの排出を促進することで、シミを改善することが可能である。
【０００４】
一方、真皮においては、表皮のような迅速なターンオーバーがないため、真皮に落ちてしまったメラニンは長期間真皮中に存在すると考えられている。
シミ部位における真皮の組織学的所見では、その周辺部では真皮マトリックスの崩壊、血管、炎症細胞の増加が観察されている。また、メラニンを多く含んだマクロファージと考えられる遊走性を失った細胞も認められている。このことから、真皮に落ちたメラニンはマクロファージによって貪食され、その場に留まってしまうことで消えにくいシミになっていると考えられている（非特許文献２）。
真皮に存在するメラニンを除去する方法としては、レーザー、液体窒素などの美容外科的を用いる方法が主流である。これらの方法では施術に痛みが伴うこと、さらに費用もかかるため心理的にも経済的にも負担が大きい。また、レーザー等でシミを一時的に取り除くことができても、再発する場合も少なくない。
【０００５】
一方、最新の研究では真皮に存在する線維芽細胞もまた貪食細胞であるマクロファージと同様にメラニン顆粒を含むメラノソームを貪食する機能を持つことが確認された。しかしながら、線維芽細胞のメラノソーム貪食がシミにどのように関与しているのかは明らかにされていない（非特許文献３）。
【０００６】
このように、従来のシミ改善は、専ら表皮或いは真皮のいずれか一方で起こっている現象に着目し、その要因を取り除くことが主眼に置かれており、真皮で起った現象が表皮に存在するメラノサイトにどのような影響を及ぼすかについては殆ど検討されてこなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】戸田浄、「肝斑と化粧品色素沈着症」  皮膚科ＭＯＯＫ  Ｎｏ．５  色素異常症  金原出版  昭和６１年７月２０日、ｐ１７７
【非特許文献２】楠田文, 久保利昭, 須藤幸夫, 川渕達雄, 織笠敦, 中村善貞. (2010). 機能性化粧品 「アスタリフト ホワイトニング エッセンス」 の開発. 富士フイルム研究報告, (55), 33-37.
【非特許文献３】安藤秀哉、井上紗由美、大坪佳乃子、小野衣里奈、乗松毅、市橋正光「ケラチノサイトとファイブロブラストのメラノソーム貪食能に関する比較研究」、Ａｅｓｔｈｅｔｉｃ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ２２  Ｎｏ３  ２０１２  ｐ２８４
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−１８４９６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような背景の下、本発明は、シミを改善する成分を選択することができるスクリーニング方法、更に詳しくは、真皮線維芽細胞によって誘発されるメラノサイトの活性化を抑制する成分を選択することができるスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記背景に鑑み、線維芽細胞のメラノソーム貪食とシミに関する研究を進めたところ、メラノソームを貪食した線維芽細胞では、細胞の情報伝達物質であるサイトカインのうち、白血球などの遊走を引き起こし、炎症の形成に関与することが知られているケモカインの発現が大きく増加することを突き止めた。更に詳しく調べたところ、これらのケモカインにはメラノサイトを直接刺激しメラニン産生を亢進させるＣＣＬ−２や、真皮中に存在する血管内皮細胞に作用し、メラノサイトのメラニン産生を亢進させることが知られているエンドセリン１（以下ＥＴ−１）の発現を増強させることが報告されているＩＬ−８などが含まれていることを発見した。
【００１１】
このことから、真皮の線維芽細胞がメラノソームを貪食することによって、真皮側からもメラニン産生刺激物質がつくられ、メラノサイトにおけるメラニン産生が刺激されつづけることで、永遠にシミが消えないシミ増悪ループが形成されていると考えられた。
以上の知見に基づき、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち本発明は、シミ改善成分のスクリーニング方法であって、培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程を含み、更には、メラノソーム添加によって培養線維芽細胞中で増加する遺伝子及び／又は当該遺伝子に対応するタンパク質の発現量を指標とする工程を含むこと等で、上記課題を解決した。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、真皮線維芽細胞によって誘発されるメラノサイトの活性化を抑制する成分の提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】メラノソーム添加（貪食）による線維芽細胞培養上清中に含まれるＩＬ−８タンパク質量変化
【図２】メラノソーム添加（貪食）による線維芽細胞培養上清中に含まれるＣＣＬ−２タンパク質量変化
【図３】３Ｄ皮膚モデル中の総メラニン量比較
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、シミにおけるメラニン産生抑制剤のスクリーニング方法であって、培養線維芽細胞にメラノソームを添加した際、培養線維芽細胞がメラノソーム貪食することによって、培養線維芽細胞中の特定の遺伝子及び／又はタンパク質の発現量が変化していることを発見し、当該遺伝子及び／又はタンパク質がメラニン産生を行うメラノサイトのみならず、種々の細胞に作用し、結果的にメラニン産生の増加を引き起こすという知見に基づくものである。
【００１６】
第１には、培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程を含み、被験物質を評価する際に、前記工程を経た培養線維芽細胞、及び／又は培養線維芽細胞以外の皮膚細胞を用いるシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
第２には、シミ改善成分のスクリーニング方法において用いることのできる指標の決定方法を提供する。
第３には、培養線維芽細胞にメラノソームを添加する工程を含み、第２発明で決定した指標を用いたシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
第４には、特定のメラニン産生関連遺伝子及び／又はタンパク質を指標とするシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
第５には、培養線維芽細胞にメラノソームを添加し、
（１）メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞の培養上清を培養皮膚細胞に添加する又は、
（２）メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞と線維芽細胞以外の培養皮膚細胞を共培養し、
特定のメラニン産生関連遺伝子及び／又はタンパク質を指標とするシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
第６には、培養線維芽細胞にメラノソームを添加し、
（１）メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞の培養上清を培養メラノサイトに添加する又は、
（２）メラノソームを取り込ませた培養線維芽細胞と培養メラノサイトを共培養し、
培養メラノサイトにおけるメラニン産生量を指標とするシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
第７には、培養線維芽細胞にメラノソームを取り込ませたときに発現量が上昇する遺伝子及び／又はタンパク質の内メラニン産生への関与が既知である遺伝子及び／又はタンパク質を皮膚細胞に添加し、前記遺伝子及び／又はタンパク質の受容体もしくは前記遺伝子及び／又はタンパク質によって誘導される既知のメラニン関連因子の発現を指標とするシミ改善成分のスクリーニング方法を提供する。
以下、スクリーニング方法の説明において、使用する細胞に関し、単に「線維芽細胞」等と記載する場合があるが、特に言及をしない限り、培養した細胞を指している。
【００１７】
＜線維芽細胞＞
本発明に用いる培養線維芽細胞は、理化学研究所のCELL BANKやJCRB細胞バンクなど等で購入することができる。例えば、正常ヒト皮膚由来線維芽細胞を使用することができ、培養に用いる培地も各社がそれぞれ細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。試験に用いるこれらの細胞は、細胞活動が正常に行えるという点で、継代数が１〜８までが好ましいが、それ以降のものでも増殖性などが著しく低下せず、細胞形態が異常でなければ使用できる。
【００１８】
＜皮膚細胞＞
本発明に用いる皮膚細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞以外の皮膚細胞であって、ヒト皮膚線維芽細胞周辺に存在する細胞であれば限定されず、正常皮膚由来のケラチノサイト、メラノサイト、血管内皮細胞を用いることが好ましいが、HaCaTのような株化細胞や、メラノーマのようなガン化細胞を用いても問題ない。これらの細胞はクラボウ、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ロンザ等で購入することができる。培養に用いる培地も各社がそれぞれの細胞種に対して推奨している培地を使用して差し支えない。その他継代数に関しては、１〜３までが好ましいが、それ以降のものでも増殖性などが著しく低下せず、細胞形態が異常でなければ使用できる。
本願の目的を達成することができれば、使用する皮膚細胞は１種でも良いし、複数種使用しても問題ない。
例えば、第５の発明において、皮膚細胞を使用する場合には、血管内皮細胞や、ケラチノサイトそれぞれ独立して使用しても良いし、ケラチノサイトとメラノサイトが共存する３次元皮膚モデルを使用することもできる。
又、第６の発明において、メラノサイトを使用する場合には、メラノサイトを単独で使用しても良いし、メラノサイトとケラチノサイトが共存する三次元皮膚モデルを使用することもできる。
三次元皮膚モデルとしては、例えば、ＭＥＬ−３００−Ａ（ＭａｔＴｅｋ社製クラボウ）の皮膚モデルカップ等が使用できる。
【００１９】
＜メラノソーム＞
メラノソームは、培養線維芽細胞が貪食することができれば特に限定されないが、本発明ではメラニンも含む概念で用いる。
メラノソームとしては、特に限定されないが、ヒト、マウスなどのメラノサイトもしくはメラノーマより抽出、精製したもの等が使用できる。
【００２０】
＜線維芽細胞のメラノソーム取り込み＞
培養線維芽細胞にメラノソームを取り込ませるには、培地にメラノソームを添加するだけで良い。メラノソームを適量添加すると、培養線維芽細胞は容易にメラノソームの取り込みを行う。
培養線維芽細胞がメラノソームを取り込んだか否かの確認は、任意の方法で行うことができるが、例えば、フォンタナマッソン染色によりメラニンを染色する方法を用いて確認することができる。また、染色しなくとも、十分な量のメラノソームが添加されている場合、明視野での顕微鏡観察でも細胞内にメラノソームが取り込まれている様子が確認できる。細胞の状態、添加するメラノソームの量にもよるが、線維芽細胞への取り込みが顕微鏡ではっきり確認できるのは、メラノソーム添加後概ね１日程度である。
もっとも、発明者らは、培養線維芽細胞にメラノソームを添加後、遅くとも１時間後には取り込みがされていることをタイムラプス動画撮影にて確認しているので、上記確認作業を行わなくても、メラノソームを添加すれば、線維芽細胞はメラノソームを取り込んでいると判断しても差し支えない。
本願のスクリーニング方法において、線維芽細胞にメラノソームを取り込ませる場合には、用いた培養線維芽細胞の一部がメラノソームを取り込んでいれば良く、すべての線維芽細胞がメラノソームを取り込んでいる必要はない。
【００２１】
＜被験物質＞
被験物質は特に限定されないが、植物乾燥物より抽出したエキスや、市場にある製品化されたエキス等を用いることができる。エキスの抽出の方法は、特に限定されない。又、被験物質は植物エキスに限らず、真皮線維芽細胞に添加出来るものであれば特に限定はなく、動物由来エキス、菌類の培養物、又はこれらの酵素等処理物、化合物又はその誘導体等であっても被験物質として用いることが出来、液状の他、粉末状、ジェル状等であっても差し支えない。また、そのままでは培地に溶解しない場合は、界面活性剤等の可溶化剤を適宜使用することにより溶解させることで被験物質として用いることができる。
添加濃度については、被験物質添加から２４時間後に明らかに細胞が死滅していなければ、どの濃度でも問題ない。なお、被験物質に、抽出溶媒として１，３−ブチレングリコールやエタノールが含まれている場合は、抽出溶媒のみを同濃度になるように細胞に添加したサンプルも用意し、その影響を考慮することが好ましい。
【００２２】
＜遺伝子発現量及び / 又はタンパク質量の測定＞
遺伝子発現量は、回収した培養細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、このＴｏｔａｌ  ＲＮＡ中に含まれる標的遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定することによって定量することができる。  
【００２３】
Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出方法は特に限定されず、たとえば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  １６２，  １５６−１５９，１９８７.）等を採用することができる。例えば、市販品であるＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）などが使用できる。抽出された全Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡは、必要に応じてさらにｍＲＮＡのみに精製して用いてもよい。
【００２４】
遺伝子の発現量は、遺伝子チップ、アレイ等の固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法など公知の方法を用いて測定することができる。
【００２５】
タンパク質量は、培養細胞の細胞内タンパク質もしくは、細胞培養上清に放出された細胞外タンパク質中に存在するタンパク質量を測定することによって定量する。細胞内タンパク質は、市販の細胞抽出液を用いた方法や、物理的に細胞膜を破壊する超音波破砕法などを用いて抽出することができるが、特に限定されない。細胞外タンパク質に関しては、細胞培養上清をそのまま用いても良いが、タンパク質の濃縮、脱塩などの精製を行うことが好ましい。
【００２６】
上述の方法で抽出したタンパク質より、標的タンパク質量を検出、定量するためには、ウェスタンブロッティングやＥＬＩＳＡなどの抗体を用いた方法にて実施することが一般的であるが質量分析計などその他技術を用いても測定することができ、特に限定されない。
【００２７】
＜指標の決定＞
シミ改善効果を有する成分を選別する際に用いる指標は、培養線維芽細胞にメラノソームを添加し、培養線維芽細胞がメラノソームを取り込むことで、遺伝子発現量及び／又はタンパク質発現量が変化しているものを指標にすることができる。更に詳しくは、培養線維芽細胞がメラノソームを取り込むことで、遺伝子発現量が増加しているもの、好ましくは２倍以上、更に好ましくは４倍以上増加している遺伝子を選択することが好ましく、中でも、メラノサイトにおけるメラニン産生促進効果が既知である遺伝子及び／又はそれに対応するタンパク質を指標とすることが好ましい。
【００２８】
＜シミ改善成分の選別＞
シミ改善成分の選別をするには、指標とする遺伝子及び／又はタンパク質の発現量を抑える成分や、指標とする遺伝子及び／又はタンパク質の作用を減じる成分を選択すれば良い。効果成分の選別は、希望する効果の程度に応じて各発現量の抑制の程度を調整すればよい。このとき、メラノソームを添加していない培養線維芽細胞の遺伝子及び／又はタンパク質発現も考慮して、メラノソームを添加していない細胞遺伝子及び／又はタンパク質の発現に変動を与えないものを選択するのがさらに好ましい 。
【００２９】
以下、本発明を実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３０】
＜線維芽細胞のメラノソーム取り込みが遺伝子発現・タンパク質発現に及ぼす影響＞
＜メラノソームの調製＞
ヒト由来メラノーマ細胞ＨＭ３ＫＯを５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で、５％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）を用いて培養した。
１００％コンフルエント近くになり、メラニン産生が進んだ細胞を、トリプシンを用いて７．０×１０６ｃｅｌｌｓ/ ｔｕｂｅになるようにエッペンドルフチューブに回収、遠心（１０００ｇ、４℃、３分）によって細胞ペレットを作成した。その後ペレットをＰＢＳ（−）にて洗浄した。
【００３１】
細胞ペレットに対し、１ｍＬのｃｏｌｄ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（1% octylphenoxy poly (ethyleneoxy）ethanol (IGEPAL CA-630 )、0.01% SDS含有0.1M Tris-HCl溶液pH7.5)を添加した。
これを１０分ごとに攪拌しながら、２０分室温にて静置した。この分散溶液を遠心分離（１０００ｇ、４℃、３分）、不要物を沈殿させ、メラノソームを含む上清を回収した。
回収した上清を再度、遠心分離し（１０００ｇ、４℃、３分）、上清を回収した。
この上清を遠心分離し（２００００ｇ、４℃、３分）、得られた沈殿をメラノソームリッチ画分とした。上清を吸引除去し、メラノソームのペレットをＰＢＳにて２度洗浄した。（２００００ｇ、４℃、３分）これにＰＢＳを添加し、５０回以上ピペッティングすることによってメラノソームを分散させた。このメラノソーム懸濁液をメラノソームとした。
【００３２】
＜線維芽細胞の培養＞
ヒト由来正常真皮線維芽細胞を、１．２５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、１２ウェル細胞培養プレートに播種した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で培養した。
【００３３】
７２時間経過後、細胞が３０−５０％コンフルエントに達していることを確認し、新しい培地に交換した後、前記メラノソームを培地に５０μＬ添加した。なお、用いたメラノソームを５倍希釈した溶液１００μＬのＡｂｓ４０５nmは０．１１０であった。この時、線維芽細胞にメラノソームを添加していないサンプルをコントロールとした。さらに５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で２４時間培養することで、線維芽細胞にメラノソームを取り込ませた。
【００３４】
＜遺伝子発現量の変化確認＞
培養後、メラノソームを添加した線維芽細胞及びメラノソームを添加していない線維芽細胞（コントロール）から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このＴｏｔａｌ  ＲＮＡに対してＰｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ＲＣＲ  Ｋｉｔ  （ＴａＫａＲａ）  を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡにおけるmRNAの発現を次世代シーケンサー（Ｉｏｎ  ＰｒｏｔｏｎＴＭシステム    Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて網羅的に解析した。得られたデータは、ＥｄｇｅＲを用いて解析を行い、メラノソーム添加後の遺伝子発現のリード数が５０以上かつFDR値が０．０５以上かつコントロールに対して、メラノソーム添加時の遺伝子発現量の変化が２倍以上の遺伝子を抽出した（表１）。その結果、１２０個の遺伝子が選択され、その中にはメラノサイトのチロシナーゼ活性をあげることでメラニン産生を増加させることが報告されているＣＣＬ−２、血管内皮細胞に作用し、メラニン産生促進因子として有名なＥＴ−１の遺伝子発現量を増加させることが知られているＩＬ−８等が含まれていた。
一方、線維芽細胞において産生されることが知られており、かつメラニン産生への関与も既知であるKITLGの遺伝子発現量には、殆ど変化はなかった。このことは、線維芽細胞がメラノソームを取り込んだ場合、すべてのメラニン産生関連因子の遺伝子発現を増加させるのではなく、特定の因子にのみ影響を与えていることを示している。
【００３５】
【表１】
0006736364.tif 000002
【００３６】
＜タンパク質発現量の変化確認＞
次にこれらの遺伝子発現変化が、タンパク質発現にまで影響しているかを確認した。以下、代表してＩＬ−８および量について述べる。
［００３２］［００３３］と同様の実験を行い（ただし、ＥＬＩＳＡでのバックグラウンド低減のため培地中の血清は抜いた状態で培養した）、メラノソーム添加から９６時間培養した。なお、遺伝子発現を解析した際には培地に５０μＬのメラノソームを添加したもののみの変動を確認したが、今回の実験ではそれに加えて２５μＬ、１２．５μＬのメラノソームを添加したサンプルも作成した。メラノソームの添加から９６時間後に、培養上清に存在するＩＬ−８およびＣＣＬ−２をＥＬＩＳＡにて測定した。なお、ＩＬ−８の測定には、RayBiotech社のHuman IL-8 ELISA、ＣＣＬ−２の測定にはRayBio Human MCP-1 ELISA kitを使用した。
【００３７】
これらの結果より、遺伝子発現が大きく変化するものではタンパク質発現にも変化が現れることが確認された（図１、図２）。
【００３８】
以上のことから、メラノソームの取り込みにより増加した線維芽細胞の遺伝子及び／又はタンパク質のうち、メラニン産生に関与することが既知である遺伝子及び／又はタンパク質を指標に、その発現抑制をすることができる被験物質を選択することにより、真皮線維芽細胞によって誘発されるメラノサイトの活性化を抑制する成分を選択することができると言える。
【００３９】
＜線維芽細胞のメラノソーム取り込みによるメラニン産生への影響確認＞
＜線維芽細胞の培養＞
ヒト由来正常真皮線維芽細胞を、２×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、６ウェル細胞培養プレートに２ｍＬずつ播種した。５％のＣＯ２下、３７℃のインキュベーター内で培養した。
２４時間後、培地を除去し、Ｅｐｉ−１００ＬＬＭＭ（ＭａｔＴｅｋ社製 クラボウ）培地３ｍＬを加えた。さらに２４時間培養し、その後培地にメラノソームを１００μＬ添加した。なお、用いたメラノソームを５倍希釈した溶液１００μＬのＡｂｓ４０５nmは０．１２３であった。このとき、メラノソームを添加していない線維芽細胞をコントロールとした。
【００４０】
＜共培養＞
ケラチノサイトおよびメラノサイトを含む３次元皮膚モデルであるＭＥＬ−３００−Ａ（ＭａｔＴｅｋ社製クラボウ）の皮膚モデルカップを０．９ｍＬのＥｐｉ−１００−ＬＬＭＭ培地を加えた６ウェル細胞培養プレートに置き、１時間プレインキュベートした。
プレインキュベート後、５ｍＬのＥｐｉ−１００−ＬＬＭＭ培地とステンレスワッシャーが入った６ウェル細胞培養プレートを準備し、そこに皮膚モデルカップを移した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した。
【００４１】
皮膚モデルカップ培養から４８時間後、インサートとして使用するＴｈｉｎｃｅｒｔＴＭ  ６ｗｅｌｌ  （ｐｏｒｅｓｉｚｅ８．０μｍ、ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）の上にワッシャーを１枚置き、その上に皮膚モデルカップを移動させた。このインサートを、線維芽細胞を培養している６ウェル細胞培養プレートの上に置き、さらに培地を２ｍＬ加えた。これにより線維芽細胞とメラノサイトを含む皮膚モデルカップとの共培養を開始した。
共培養は３７℃、５％ＣＯ２条件下で行い２〜３日ごとに培地交換しながら３週間行った。また、線維芽細胞は単層で培養しているため長期間正常な機能を持ったまま維持することが難しいと考えられたため、１週間ごと播種し、メラノソーム添加を繰り返した。
【００４２】
＜メラニンアッセイ＞
共培養終了後、皮膚モデルカップをＰＢＳ（−）で洗浄した。
皮膚モデルカップから細胞を剥離し、１．５ｍＬチューブに移した。そこに２Ｎ  ＮａＯＨを４００μＬ加え、細胞を破砕した。破砕後、溶液が均一になるように１０分加熱し、１０秒ボルテックスした。さらに２００μＬのＮａＯＨを加え、１０分加熱することで均一な溶液を得た。冷却後、９６ウェルプレートにそれぞれのサンプルを３００μＬ移した。プレートリーダーにて４０５ｎｍ，６５５ｎｍの吸光度を測定した。
皮膚モデルカップに含まれていたメラニン量はＡｂｓ４０５ｎｍ−６５５ｎｍで計算することで算出した。
【００４３】
その結果、メラノソームを貪食した線維芽細胞と共培養した皮膚モデルでは、メラニン量の増加が確認された。このことから、メラノソームを取り込んだ培養線維芽細胞が産生する物質は、メラノサイトに直接あるいは、ケラチノサイトを介した間接的な作用により、メラノサイトにおけるメラニン産生を促進すると考えられる（図３）。
【００４４】
以上のことから、メラノソームを取り込むことにより線維芽細胞が産出する物質（培養上澄みも含む）に起因して増加する、線維芽細胞以外の皮膚細胞における特定の遺伝子及び／又はタンパク質を指標に、その発現抑制をすることができる被験物質を選択することにより、真皮線維芽細胞によって誘発されるメラノサイトの活性化を抑制する成分を選択することができると言える。
【実施例１】
【００４５】
ヒト由来正常真皮線維芽細胞を、１．２５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、６ウェル細胞培養プレートに２ｍＬずつ播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した。培養後、ヒト皮膚由来微小血管内皮細胞用の培地（ＥＢＭＴＭ−２基礎培地に成長因子を添加したもの、LONZA）に交換し、メラノソームを培地に１００μＬ添加した。なお、用いたメラノソームを５倍希釈した溶液１００μＬのＡｂｓ４０５nmは０．１１２であった。その後、さらに７２時間培養し、培養上清を得た。
【００４６】
ヒト皮膚由来微小血管内皮細胞を２.０×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように微小血管内皮細胞用の成長因子を添加したＥＢＭＴＭ―２基本培地（ＬＯＮＺＡ）に懸濁し、２４ウェル細胞培養プレートに５００μＬずつ播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した。培養後、培地を除去し、〔００４５〕記載の培養上清に置き換え、２４時間培養した。２４時間後、培地を除去し、被験物質を添加した。さらに２４時間培養後、微小血管内皮細胞のＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。
【００４７】
２４時間経過後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このＴｏｔａｌ  ＲＮＡに対してＰｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ＲＣＲ  Ｋｉｔ  （ＴａＫａＲａ）  を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＥＴ−１、ＧＡＰＤＨの発現量を以下のプライマー及び酵素を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて測定した。
【００４８】
プライマーは、ＥＴ−１用センスプライマー（５‘−CGTCCCTGATGGATAAAGAGTGT−３’）、アンチセンスプライマー（５‘−ACGTGCTCGGGAGTGTTGAC−３’）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸  デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）用センスプライマー（５‘−ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ−３’）、アンチセンスプライマー（５‘−ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡ−３’）を用いた。ＰＣＲの反応にはＳＹＢＲ Ｓｅｌｅｃｔ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を使用し、遺伝子発現の解析は比較Ｃｔ法にて行った。比較Ｃｔ法ではコントロールとして被験物質を添加していない微小血管内皮細胞のＥＴ−１遺伝子発現量用い、被験物質を添加した微小血管内皮細胞のＥＴ−１発現量を計算し、ＥＴ−１発現量を抑制している被験物質をシミ改善成分として選別した。
【００４９】
エンドセリン１（ＥＴ−１）は、メラノサイトに作用し、メラニン産生を増加させることが良く知られていることから、メラノソームを添加した線維芽細胞の培養上清によって誘導される微小血管内皮細胞におけるＥＴ−１の遺伝子発現抑制効果を持つ被験物質に、真皮線維芽細胞によって誘発されるメラノサイトの活性化を抑制する効果が期待できると言える。
【実施例２】
【００５０】
＜線維芽細胞の培養＞
ヒト由来正常真皮線維芽細胞を、１．２５×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、６ウェル細胞培養プレートに２ｍＬずつ播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した。培養後、新しい培地に交換し、メラノソームを１００μＬ添加した。なお、用いたメラノソームを５倍希釈した溶液１００μＬのＡｂｓ４０５nmは０．０９４であった。
【００５１】
＜メラノーマの培養＞
ヒト由来メラノーマ（ＨＭ３ＫＯ）をＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔ（６ウェル用、０．４μｍ、Ｆａｌｃｏｎ）に６×１０４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳ入りＤ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、１ｍＬ播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で２４時間培養した。
２４時間経過後、線維芽細胞を培養している６ウェル細胞培養プレートにインサートとしてＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔを移した。この時、ウェルに含まれている培地は４ｍＬになるように調製し、被験物質を添加することで共培養を開始した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で７２時間培養した。
【００５２】
＜メラニンアッセイ＞
７２時間培養後、培地を捨て、インサートをＰＢＳ（−）で洗浄した。４００μＬの２Ｎ  ＮａＯＨを添加し、細胞を剥離させた。この溶液を１．５ｍＬチューブに回収し、１５分間煮沸した。細胞が完全に溶解したことを確認し、９６ウェルプレートに３５０μＬずつ移し、プレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００５３】
【数１】
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【００５４】
このようにして得られたメラニン産生抑制率が高い被験物質を、真皮線維芽細胞によって誘発されるメラノサイトの活性化を抑制する効果を発揮するものとして選択した。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明によれば、真皮の線維芽細胞がメラノソームを貪食することによって、真皮側からもメラニン産生刺激物質がつくられ、メラノサイトにおけるメラニン産生が刺激されつづけることで、永遠にシミが消えないというシミ増悪ループを断ち切ることができ、恒久的なシミ改善が期待できる化粧料の提供に利用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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