(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ酵素（４ＣＬ）、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、およびＥＦＰタンパク質を発現する大腸菌細胞であって、
前記４ＣＬは、ダイズに由来する配列番号１のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＣＨＳは、キンギョソウに由来する配列番号４のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＥＦＰは、キンギョソウに由来する配列番号５のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
大腸菌細胞。
【請求項２】
４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ酵素（４ＣＬ）、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、およびＥＦＰタンパク質を発現する大腸菌細胞であって、
前記４ＣＬ、ＣＨＳ、およびＥＦＰは、同一のプラスミド上にある遺伝子から発現され、
前記４ＣＬは、ダイズに由来する配列番号１のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＣＨＳは、ダイズに由来する配列番号２のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＥＦＰは、ダイズに由来する配列番号３のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
大腸菌細胞。
【請求項３】
４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ酵素（４ＣＬ）、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、およびＥＦＰタンパク質を発現する大腸菌細胞であって、
前記４ＣＬ、ＣＨＳ、およびＥＦＰは、同一のプラスミド上にある遺伝子から発現され、
前記４ＣＬは、ダイズに由来する配列番号１のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＣＨＳは、キンギョソウに由来する配列番号４のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＥＦＰは、キンギョソウに由来する配列番号５のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
大腸菌細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の大腸菌細胞を含む、フラボノイド化合物製造用組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の組成物にｐ−クマル酸を加えること含む、ナリンゲニンの製造方法。
【請求項６】
請求項４に記載の組成物にコーヒー酸を加えること含む、エリオジクチオールの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の大腸菌細胞とｐ−クマル酸とを含む、ナリンゲニン製造用組成物。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の大腸菌細胞とコーヒー酸とを含む、エリオジクチオール製造用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、フラボノイド化合物の製造に関する。より具体的には、本開示は、植物由来の遺伝子を発現する大腸菌を使用してフラボノイド化合物を製造することに関する。
【背景技術】
【０００２】
フラボノイド化合物は様々な有用な生理活性を有することが知られており、また、色素またはその前駆体としての産業的有用性も有する。フラボノイドは天然の植物によって産生されるが、フラボノイド生合成に関わる植物の酵素を微生物に発現させることによってフラボノイドを製造した例も知られている。非特許文献１は、ロドトルラ属酵母由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素と、ストレプトマイセス属細菌由来の４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ酵素と、Glycyrrhiza属植物（ロシアカンゾウ）由来のカルコン合成酵素とを大腸菌に発現させることによってフラバノンを産生させることを記載している。特許文献１は、酵母および大腸菌のような宿主微生物細胞に、植物由来のフラボノイド生合成酵素を発現させて、フラボノイド化合物を合成させることを記載している。
【０００３】
別の種類の研究において、非特許文献２は、植物においてフラボノイド生成および花の発色に関与するＥＦＰ（Enhancer of Flavonoid Production）遺伝子の同定を記載している。ＥＦＰ遺伝子は、カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）様タンパク質をコードしているが、ＣＨＩ酵素活性に関わるいくつかのアミノ酸残基を欠いており、非酵素タンパク質であると見られる。非特許文献２は次のように述べている：「ＥＦＰがいかにしてフラボノイド生成を増強するかの詳細な分子的機序は未解明であるが、ＥＦＰは、酵素活性を示すことなく酵素様構造を有し、かつ関連酵素が関わる代謝経路を増強する、ユニークなポジティブ調節因子タンパク質であると見られる。」。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２３９２７２号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, May 2003, Vol. 69, No. 5, p. 2699-2706
【非特許文献２】The Plant Journal (2014) 78, 294-304
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示の実施形態は、大腸菌を用いたバイオコンバージョンによりフラボノイド化合物を製造することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、植物由来のＥＦＰタンパク質をフラボノイド生合成関連酵素とともに大腸菌に発現させることにより、副生成物の生成を抑えて目的のフラボノイド化合物を効率よく製造できることを見出した。
【０００８】
本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ酵素（４ＣＬ）、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、およびＥＦＰタンパク質を発現する大腸菌細胞。
［２］
前記４ＣＬは、ダイズに由来する配列番号１のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＣＨＳは、キンギョソウに由来する配列番号４のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＥＦＰは、キンギョソウに由来する配列番号５のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記［１］に記載の大腸菌細胞。
［３］
前記４ＣＬ、ＣＨＳ、およびＥＦＰは、同一のプラスミド上にある遺伝子から発現される、前記［１］に記載の大腸菌細胞。
［４］
前記４ＣＬは、ダイズに由来する配列番号１のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＣＨＳは、ダイズに由来する配列番号２のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＥＦＰは、ダイズに由来する配列番号３のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記［３］に記載の大腸菌細胞。
［５］
前記４ＣＬは、ダイズに由来する配列番号１のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＣＨＳは、キンギョソウに由来する配列番号４のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記ＥＦＰは、キンギョソウに由来する配列番号５のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記［３］に記載の大腸菌細胞。
［６］
前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の大腸菌細胞を含む、フラボノイド化合物製造用組成物。
［７］
前記［６］に記載の組成物にｐ−クマル酸を加えること含む、ナリンゲニンの製造方法。
［８］
前記［６］に記載の組成物にコーヒー酸を加えること含む、エリオジクチオールの製造方法。
［９］
前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の大腸菌細胞とｐ−クマル酸とを含む、ナリンゲニン製造用組成物。
［１０］
前記［１］〜［５］のいずれか一項に記載の大腸菌細胞とコーヒー酸とを含む、エリオジクチオール製造用組成物。
【発明の効果】
【０００９】
ＥＦＰタンパク質が、４ＣＬ酵素およびＣＨＳ酵素と大腸菌生細胞内で協働することにより、目的とするフラボノイド化合物の生成量の向上、および／または、目的とするフラボノイド化合物と並行して生じる副生成物の生成率の抑制が達成され、持続性、簡便性、低コスト性等で特徴づけられるインビボのフラボノイド化合物製造システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、菌株Ｄ（空ベクターコントロール）、菌株Ｅ（Ｇｍ４ＣＬおよびＡｍＣＨＳを発現する）、ならびに菌株Ｆ（Ｇｍ４ＣＬ、ＡｍＣＨＳおよびＡｍＥＦＰを発現する）をそれぞれ含む組成物にｐ−クマル酸を加えて生成されたナリンゲニン（＊）の検出結果を示す。副生成物ＣＴＡＬ（＊＊）の存在も示されている。
【図２】図２は、菌株Ｈ（Ｇｍ４ＣＬおよびＧｍＣＨＳを発現する）、ならびに菌株Ｉ（Ｇｍ４ＣＬ、ＧｍＣＨＳおよびＧｍＥＦＰを発現する）をそれぞれ含む組成物に、異なる濃度のｐ−クマル酸を加えた場合のナリンゲニン（Ｎａｒ）およびＣＴＡＬの生成濃度を示す。
【図３】図３の左は、菌株Ｇ（空ベクターコントロール）、菌株Ｈ（Ｇｍ４ＣＬおよびＧｍＣＨＳを発現する）、ならびに菌株Ｉ（Ｇｍ４ＣＬ、ＧｍＣＨＳおよびＧｍＥＦＰを発現する）をそれぞれ含む組成物にコーヒー酸を加えて生成されたエリオジクチオール（＃）の検出結果を示す。ＣＴＡＬ様副生成物である化合物５（＃＃）の存在も示されている。図３の右は、菌株Ｈおよび菌株Ｉをそれぞれ含む組成物において得られた、化合物５とエリオジクチオールの生成量比率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
上述したように、フラボノイド生合成関連酵素を異種微生物宿主に発現させてフラボノイドを製造できることが特許文献１および非特許文献１に記載されていた。理論上、細胞質内に個々の酵素活性を存在させれば、基質の単純拡散によっても一定の率で目的産物が生成され得ると考えられる。しかしながら、ＥＦＰのような非酵素タンパク質を植物から細菌に導入して、細菌の生細胞環境中で（すなわち、精製タンパク質を高濃度で混合するインビトロ環境ではなく、インビボ環境で）フラボノイドの合成に関与させるという発想はこれまで見られなかった。
【００１２】
本発明者は、植物由来のＥＦＰタンパク質が、４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ酵素（４ＣＬ）およびカルコン合成酵素（ＣＨＳ）と共に大腸菌細胞内で発現された場合に、インビボで機能できることを発見した。酵素ではないと見られるＥＦＰタンパク質が、分子レベルでどのような場所でどのような機能を果たし、またその機能発揮のためにどのような分子的状態を必要とするか（何らかの細胞内構造への結合の有無、他分子への機能的依存性の有無、他分子による阻害の有無、特に、雑多な異種分子が混在する異種細胞内環境への耐性の有無、等）は未解明であった。そのような正体不明な植物タンパク質が、大腸菌細胞内のインビボ環境で、４ＣＬおよびＣＨＳという酵素の組合せと協働して機能でき、バイオコンバージョンに貢献できることは予測できなかったことである。
【００１３】
大腸菌内で、４ＣＬ酵素およびＣＨＳ酵素に加えてＥＦＰタンパク質を発現させることにより、目的とするフラボノイド化合物の生成と、それと並行して起こる副生成物の生成との比率を、前者の方に傾けることができることが見出された。すなわち、副生成物に対するフラボノイド化合物生成物の割合を増やすことができる。このことは、目的とするフラボノイド化合物の製造量を増やすことに繋がり得るし、また、生成物の分離をより簡略化できることも意味し得る。例えば、ｐ−クマル酸を基質としてナリンゲニンを生成させる場合には、ナリンゲニン生成反応経路から分岐して起こるクマロイル三酢酸ラクトン（ＣＴＡＬ：coumaroyltriacetic acid lactone）の比率を低減させることができる。
【００１４】
本実施形態の大腸菌には、植物由来の４ＣＬ、ＣＨＳ、およびＥＦＰに加えて、さらに他の遺伝子が導入されていてもよい。例えば、プラスミドベクターには通常、抗生物質耐性遺伝子が付随している。また、チロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）およびフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）のようなリアーゼ酵素の遺伝子を導入してもよい。これにより、チロシン、フェニルアラニン等のアミノ酸を出発基質とするフラボノイド合成が可能になり得る。
【００１５】
本開示において、酵素またはタンパク質が「発現」されるとは、その酵素またはタンパク質をコードする遺伝子ＤＮＡから転写および翻訳が起こり、遺伝子産物としてのポリペプチドが細胞内に存在するようになることを意味する。ただし、転写を起こすためのプロモーターは、恒常的発現の（constitutive）プロモーターであるとは限らず、発現誘導可能な（inducible）プロモーターでもあり得る。従って、ある遺伝子産物を「発現する大腸菌」は、その遺伝子産物を常時発現しているとは限らず、その遺伝子産物を発現する能力を有する大腸菌を意味すると解されるべきである。
【００１６】
当業者は大腸菌発現系に適したプロモーターを適宜選択することができる。例としてＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＰＢＡＤプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター等が挙げられるがこれらに限定されない。Ｔ７プロモーターは特に好ましいプロモーターである。１つのプロモーターから複数の遺伝子を転写させるオペロン式にするよりも、４ＣＬ遺伝子、ＣＨＳ遺伝子、およびＥＦＰ遺伝子にそれぞれプロモーターを持たせる方が好ましい。これら３つの遺伝子がそれぞれ有するプロモーターが、同一種類のプロモーターであることが好ましい。これら３つの遺伝子がそれぞれＴ７プロモーターを有することが特に好ましい。
【００１７】
大腸菌における異種遺伝子の発現を補助する手段として当業者に知られるものを適宜利用してもよい。そのような手段は、例えば、ＲＢＳ（リボソーム結合部位）配列の含有、大腸菌に合わせたコード配列のコドン最適化、および追加のｔＲＮＡ遺伝子を有する宿主株の使用のうちの１つ以上であり得る。プロモーター等を伴う外来遺伝子を大腸菌細胞に導入する様々な手法が当業者に知られており、本実施形態の大腸菌を作製するために使用され得る。これらの遺伝子が１つ以上のプラスミドベクターに含まれる状態で大腸菌細胞に導入されていることが好ましい。
【００１８】
特定の微生物（例えば大腸菌）に複数の異種酵素を発現させようとする場合は特に、いかなる生物種からの酵素をどのように組み合わせて導入するかも重要となり得る。例えば、非特許文献１では、ストレプトマイセス属細菌由来の４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）酵素を他種由来の他酵素と組み合わせて用いたことが、大腸菌でのフラボノイド合成成功の鍵となっており、特許文献１におけるフラボノイド合成の実証は、Petroselinum crispum植物種に由来する特定の４ＣＬ酵素を用いて行われている。
【００１９】
実際、本発明者による初期の実験では、ダイズ（Glycine max）由来の４ＣＬ酵素の遺伝子をプラスミドベクターに挿入し、同じくダイズ由来のＣＨＳ酵素の遺伝子をもう１つのプラスミドベクターに挿入して、これらのプラスミドを大腸菌に導入し、複数種類の大腸菌株の使用も試みたが、フラボノイドを効率よく生成させることができなかった。しかしながら本発明者は、大きく分けて２つのアプローチによって、４ＣＬ、ＣＨＳ、およびＥＦＰを発現する大腸菌によるフラボノイド生成の効率を劇的に改善できることを見出した。
【００２０】
第１のアプローチでは、ダイズに由来する配列番号１のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む４ＣＬ酵素と、キンギョソウ（Antirrhinum majus）に由来する配列番号４のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＨＳ酵素と、キンギョソウに由来する配列番号５のアミノ酸配列に対して９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＥＦＰタンパク質との組合せを、大腸菌に発現させる。
【００２１】
これらの配列同一性は、それぞれ、９９％以上であることがより好ましく、１００％であることがさらに好ましい。配列同一性とは、クエリ配列（例えば配列番号１のアミノ酸配列）と標的配列とを、クエリ配列の全長に渡って揃えて整列させて、位置的に対応するアミノ酸残基同士の対を形成させ（このことは一般にアラインメントと呼ばれる）、対の総数のうちアミノ酸の種類が完全一致している対をいくつ見出せるかを示す百分率である。アミノ酸残基の挿入または欠失を伴う場合には、クエリ配列中のアミノ酸と標的配列中のブランク（またはその逆）が対をなすことも含まれ得る。配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴなど当業者に知られるソフトウェアを用いて簡便に算出することができる。なお、キンギョソウのＣＨＳ（配列番号４）とダイズのＣＨＳ（配列番号２）との間の配列同一性は８８％にとどまる。また、キンギョソウのＥＦＰ（配列番号５）とダイズのＥＦＰ（配列番号３）との間の配列同一性は６７％に過ぎない。
【００２２】
ダイズの４ＣＬのアミノ酸配列（配列番号１）はＮＣＢＩ（アメリカ国立生物工学情報センター）データベースにおいてアクセス番号NP_001237270.1のもと登録されている。ダイズのＣＨＳのアミノ酸配列（配列番号２）はＮＣＢＩデータベースにおいてアクセス番号NP_001337038.1のもと登録されている。ダイズのＥＦＰのアミノ酸配列（配列番号３）はＮＣＢＩデータベースにおいてアクセス番号NP_001236782.1のもと登録されている。キンギョソウのＣＨＳのアミノ酸配列（配列番号４）はＮＣＢＩデータベースにおいてアクセス番号P06515.1のもと登録されている。キンギョソウのＥＦＰのアミノ酸配列（配列番号５）はＮＣＢＩデータベースにおいてアクセス番号BAO32071.1のもと登録されている。
【００２３】
本実施形態におけるポリペプチドは、それぞれ示されたアミノ酸配列のみからなるものであってもよいが、Ｎ末端および／またはＣ末端にペプチドタグが付加されていてもよい。ペプチドタグは当業者によく知られており、例としてはＨｉｓタグ（HHHHHH）、ＨＡタグ（YPYDVPDYA）、ＦＬＡＧタグ（DYKDDDDK）、Ｍｙｃタグ（EQKLISEEDL）、Ｓタグ（KETAAAKFERQHMDS）等が挙げられるがこれらに限定されない。１つのペプチドタグの長さは２５アミノ酸以下であることが好ましく、２０アミノ酸以下であることがより好ましく、１５アミノ酸以下であることがさらに好ましく、１０アミノ酸以下であることが特に好ましい。当業者に知られているように、これらのペプチドタグは、通常はポリペプチドの精製および検出などを促進させるために付加されるものであり（ただし、ペプチドタグにそのような特定の用途が意図されていない場合もあり得る）、ポリペプチドの機能は損ねさせないものである。
【００２４】
４ＣＬ、ＣＨＳ、およびＥＦＰを発現する大腸菌によるフラボノイド生成の効率を劇的に改善するための第２のアプローチは、これらの植物由来遺伝子を１つのプラスミドに一緒に含ませることである。これはすなわち、１つのプラスミドベクターにこれら３つの遺伝子を一緒に挿入したものを、大腸菌細胞に導入することを意味する。複数の外来遺伝子を複数のプラスミドにそれぞれクローニングして、適切な抗生物質の存在下でそれら複数のプラスミドを大腸菌に保持させることは比較的簡単であるのに対し、３つの外来遺伝子をあえて１つのプラスミドにクローニングすることは余計な手間を要する。しかしながらあえてこれを行うことによって、４ＣＬ酵素、ＣＨＳ酵素とＥＦＰタンパク質の協働によるフラボノイド生成が顕著に改善することが見出された。特に、ダイズ４ＣＬ、ダイズＣＨＳ、およびダイズＥＦＰの組合せ、または、ダイズ４ＣＬ、キンギョソウＣＨＳ、およびキンギョソウＥＦＰの組合せを、同一のプラスミド上にある対応遺伝子から発現させることができる。本開示において使用される具体的なプラスミドベクターは当業者が適宜選択することができるが、ｐＢＲ３２２複製オリジンもしくはＣｏｌＥ１型複製オリジンまたはＣｏｌＡ複製オリジンを有するもの、例えばｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＣＯＬＡプラスミドベクター、およびｐＣｏｌｄプラスミドベクターは特に好適である。
【００２５】
ここでプラスミドベクターに挿入されるダイズ４ＣＬ、ダイズＣＨＳ、ダイズＥＦＰ、またはダイズ４ＣＬ、キンギョソウＣＨＳ、キンギョソウＥＦＰについては、上記における配列同一性の説明がそのまま適用される。すなわちこれらのポリペプチドは、対応する配列番号に記載のアミノ酸配列に対して９８％以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。
【００２６】
別の側面において本開示は、上記大腸菌の生細胞を含む、フラボノイド製造用組成物を提供する。この組成物は、上記大腸菌の生細胞の他に、少なくとも水を含むことが好ましく、大腸菌の生存を確保するための培地成分をさらに含むことがより好ましい。大腸菌を生存または増殖させることができる多数の培地成分が当業者に知られており、本実施形態において組成物に含ませることができる。そのような培地成分は通常、無機塩と炭素源を少なくとも含む。一例として、組成物は、Ｍ９培地の組成を少なくとも含み得る。Ｍ９培地の組成は、Ｎａ２ＨＰＯ４  ４８ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  ２２ｍＭ、ＮＨ４Ｃｌ  １９ｍＭ、ＮａＣｌ  ８．６ｍＭ、グルコース  ０．４％（ｗ／ｖ）、ＭｇＳＯ４  １ｍＭ、ＣａＣｌ２  １００μＭである。「少なくとも含み得る」というのは、これらの成分のいずれかの濃度がより高くなっている場合も包含されることを意味する。生成物の純度を上げるという観点からは、このようにグルコースのみを炭素源とすることが有利になり得る。組成物は、プラスミドベクターを取り込んだ細胞の選択的増殖を促進するために抗生物質を含み得る。抗生物質の例としてはアンピシリン、カナマイシン、ストレプトマイシン、およびクロラムフェニコールが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
別の側面において本開示は、上記組成物にｐ−クマル酸を加えること含む、ナリンゲニンの製造方法を提供する。
【００２８】
４ＣＬ酵素活性が、ｐ−クマル酸をｐ−クマロイル−ＣｏＡに変換し、さらにＣＨＳ酵素活性が、１分子のｐ−クマロイル−ＣｏＡと３分子のマロニル−ＣｏＡとを用いてナリンゲニンカルコンを生成すると考えられている。ナリンゲニンカルコンは、自発的にナリンゲニン（フラボノイド化合物）に変換されることができる。ただし、大腸菌内に存在する未同定の因子がナリンゲニンへの変換を促進させる可能性は排除されない。
【００２９】
ｐ−クマロイル−ＣｏＡとマロニル−ＣｏＡとからナリンゲニンカルコンに至るまでに生じる中間体が、ナリンゲニンカルコンになる代わりにラクトン化されて、テトラケチドラクトンであるクマロイル三酢酸ラクトン（ＣＴＡＬ）を生じ得る。ＣＴＡＬは、ナリンゲニンと同一の分子量を有し、ナリンゲニンの生成効率および分離効率を低下させ得る副生成物である。しかしながら、ＥＦＰタンパク質を発現する大腸菌を含む本実施形態の組成物は、ＥＦＰタンパク質を有さない大腸菌を含む組成物と比べて、この副生成物の生成比率を抑えることができることが見出された。例えば、ナリンゲニンの生成重量に対するＣＴＡＬの生成重量が１０％以下に抑えられ、好ましくは５％以下、より好ましくは３％以下に抑えられ得る。
【００３０】
別の側面において本開示は、上記組成物にコーヒー酸を加えること含む、エリオジクチオールの製造方法を提供する。コーヒー酸は実質的に全ての植物に含まれているため、フラボノイドの産業的生産のための基質として適し得る。エリオジクチオールはナリンゲニンとは異なるさらなるフラボノイド化合物である。エリオジクチオールの配糖体であるエリオシトリンは、強い抗酸化作用を有し、糖尿病合併症予防、高血圧予防などにおける効果が示唆されている。本実施形態の組成物は、コーヒー酸からエリオジクチオールを産生できるだけでなく、上記ナリンゲニンの場合と同様に、ＥＦＰ発現を欠く組成物と比べて、対応するテトラケチドラクトン副生成物の生成率を低減できることが見出された。このテトラケチドラクトン副生成物は、エリオジクチオールと同一の分子量を有し、エリオジクチオールの生成効率および分離効率を低下させ得るものである。
【００３１】
コーヒー酸基質からの生合成に関する本実施形態の組成物の効果は、ｐ−クマル酸基質を用いた結果を踏まえたとしても、必ずしも予測できるものではなかった。植物においてＥＦＰが関わる代謝経路の本来の基質および産物はあくまでｐ−クマル酸およびナリンゲニンであり、ＥＦＰタンパク質が大腸菌におけるコーヒー酸代謝にいかなる影響を有し得るか全く未知数であったからである。例えば、非特許文献２は、ＥＦＰの発現を欠くｅｆｐ−１変異体植物（アサガオ）について次のように述べている：「（アントシアニン、フラボノールおよびカルコンの減少とは）対照的に、コーヒー酸の誘導体すなわちクロロゲン酸および１−Ｏ−カフェオイルグルコシドのレベルは、ｅｆｐ−１の花弁において著しく増加した（図Ｓ４ｂ）。これらのコーヒー酸誘導体は、ＣＨＳの基質であるｐ−クマロイル−ＣｏＡと共通の生合成経路を部分的に共有している（図１ａ）。」。つまり、ＥＦＰが本来機能する生物学的文脈において、コーヒー酸経路は、ｐ−クマル酸からフラボノイドへの生合成経路と交差はするが全く別方向へと分岐するものとして理解されている。
【００３２】
本実施形態の組成物にｐ−クマル酸またはコーヒー酸を加えることは、培養培地にｐ−クマル酸またはコーヒー酸を含ませることを実質的に意味し得る。組成物に添加した後のｐ−クマル酸またはコーヒー酸の濃度は１０ｍＭ未満であることが好ましく、５ｍＭ以下がより好ましく、３ｍＭ以下がさらに好ましく、２ｍＭ以下が特に好ましい。上述したフラボノイド製造用組成物の特定形態として、上記実施形態の大腸菌細胞とｐ−クマル酸とを含むナリンゲニン製造用組成物、および、上記実施形態の大腸菌細胞とコーヒー酸とを含むエリオジクチオール製造用組成物も提供されることが理解される。これらの組成物は上記基質濃度を有し得る。ｐ−クマル酸またはコーヒー酸を加えた後、バイオコンバージョンを起こさせるための期間中には、通常の大腸菌培養と同様に、振とう、曝気、温度調節などを行い得る。その温度は、例えば１５〜４２℃であり得、好ましくは１８〜３８℃、より好ましくは２０〜３７℃、さらに好ましくは２５〜３２℃であり得る。これらの範囲内で経時的に温度を変動させてもよい。当業者は、大腸菌を持続的に生存させることができる温度条件を適宜決定することができる。
【００３３】
ｐ−クマル酸またはコーヒー酸を加えた後に、例えば３時間以上、好ましくは１０時間以上、より好ましくは２０時間以上経過させることにより、組成物中にナリンゲニンまたはエリオジクチオールが蓄積する。このバイオコンバージョン期間中、培地成分および／または基質を適宜補充してもよい。通常は、大部分のナリンゲニンまたはエリオジクチオールが細胞外、すなわち遠心分離した場合の上清の方に回収されるが、ナリンゲニンまたはエリオジクチオールが細胞内すなわち固形物画分にも含まれ得る。
【実施例】
【００３４】
以下の実施例において、ダイズ（Glycine max）に由来する配列はＧｍと付記され、キンギョソウ（Antirrhinum majus）に由来する配列はＡｍと付記されている。
【００３５】
［Ｇｍ４ＣＬ発現用のプラスミドの調製］
ダイズの４ＣＬには、機能解析されているものが４つ存在する（４ＣＬ１〜４ＣＬ４）。進化系統樹解析によれば、４ＣＬ１と４ＣＬ２はフェニルプロパノイド生合成に関与する酵素群のクレードに含まれ、４ＣＬ３と４ＣＬ４はフラボノイド生合成に関与する酵素群のクレードに含まれる。そこで、後者クレードに属する２つのうち、ダイズにおける発現量がより高い４ＣＬ３を選択した。ダイズ（エンレイ品種）の側根から得られたｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより４ＣＬ３のコード配列を増幅した。以下、このダイズ由来の４ＣＬ３をＧｍ４ＣＬと呼ぶ。このコード配列をｐＥＴ１５ｂベクターに挿入し、プラスミドｐＥＴ１５ｂ−Ｇｍ４ＣＬを得た。このプラスミドからは、Ｎ末端にＨｉｓタグが付けられたＧｍ４ＣＬがＴ７プロモーターにより発現される。Ｇｍ４ＣＬ遺伝子の下流にはＴ７ターミネーターが存在している。
【００３６】
［ＧｍＣＨＳとＧｍＥＦＰ、またはＡｍＣＨＳとＡｍＥＦＰの共発現用のプラスミドの調製］
同様の手法により、ＧｍＣＨＳとＧｍＥＦＰのコード配列を順次ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１ベクターに挿入し、ｐＣＯＬＡ−ＧｍＣＨＳ−ＧｍＥＦＰを得た。このプラスミドにおいては、Ｎ末端にＨｉｓタグを有するＧｍＣＨＳと、Ｃ末端にＳタグを有するＧｍＥＦＰの遺伝子が、それぞれＴ７プロモーターを伴って、タンデムに並んでいる。ＧｍＥＦＰ遺伝子の下流にはＴ７ターミネーターが存在しているが、ＧｍＣＨＳ遺伝子とＧｍＥＦＰ遺伝子との間にはターミネーター配列は挿入されていない。同様の手法により、ダイズ遺伝子がキンギョソウ遺伝子に置き換えられたｐＣＯＬＡ−ＡｍＣＨＳ−ＡｍＥＦＰも得た。また、ＥＦＰ遺伝子を欠くｐＣＯＬＡ−ＧｍＣＨＳおよびｐＣＯＬＡ−ＡｍＣＨＳも作製した。
【００３７】
［Ｇｍ４ＣＬ、ＧｍＣＨＳ、およびＧｍＥＦＰの共発現用のプラスミドの調製］
ｐＣＯＬＡ−ＧｍＣＨＳ−ＧｍＥＦＰから、プロモーターおよびターミネーターを含むＧｍＣＨＳ−ＧｍＥＦＰ発現カセットをＰＣＲ増幅し、これを、上記ｐＥＴ１５ｂ−Ｇｍ４ＣＬのＥａｇＩサイトに挿入して、ｐＥＴ１５ｂ−Ｇｍ４ＣＬ−ＧｍＣＨＳ−ＧｍＥＦＰを作製した。また、ＥＦＰ遺伝子を欠くｐＥＴ１５ｂ−Ｇｍ４ＣＬ−ＧｍＣＨＳも作製した。
【００３８】
［大腸菌へのプラスミドの導入］
上記プラスミドを、常法に従いコンピテントセル化した大腸菌（Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株）に導入して形質転換大腸菌株を得た。複数のプラスミドを導入する場合には、それぞれ適切な抗生物質による選択を行いながら順次導入を行った。下記表に示す実験用大腸菌株が調製された
【００３９】
【表１】
0006635535.tif 000002
【００４０】
［形質転換大腸菌を用いたバイオコンバージョン］
上記表１に示す大腸菌株のそれぞれについて少なくとも３つのレプリカ実験を行った。まず、これら菌株を、適切な抗生物質（菌株Ａ〜Ｆについてはカナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール；菌株Ｇ〜Ｉについてはアンピシリン、クロラムフェニコール）を含む３ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで一晩、前培養した。その後、適切な抗生物質を含む２０ｍＬのＬＢ培地に、２００μＬの前培養液を添加して、３７℃、１２０ｒｐｍで本培養を行った。ＯＤ６００＝０．４〜０．５となった時点で、ＩＰＴＧ（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside）を終濃度１ｍＭにて添加し、１８℃、１８０ｒｐｍで２０時間培養した。この段階において、上記表１に示すポリペプチドの発現が誘導された。
【００４１】
２０時間後の培養液全量を、４℃、１００００×ｇにて５分間遠心分離し、細胞をペレットとして回収した。ペレットを１ｍＬのＭ９培地に再懸濁し、再び遠心分離を行うことで洗浄を行った。この洗浄を２回繰り返した。洗浄後のペレットを１ｍＬのＭ９培地に再懸濁し、ＯＤ６００＝５．０となるようにＭ９培地で調製し、得られた組成物の２００μＬを以下の実験に用いた。
【００４２】
上記組成物に、基質（ｐ−クマル酸またはコーヒー酸、終濃度１〜１０ｍＭ）を添加して、３０℃で３時間インキュベートした。その後、４℃、１５０００×ｇにて１０分間遠心分離することによって、上清（Ｓ）と菌体（Ｉ）に分離した。Ｉ画分は２００μＬの水に再懸濁した。Ｓ、Ｉ画分それぞれにメタノール：クロロホルム（比率２：１。さらにＬＣ−ＭＳ分析用の内部標準として１μＭのApigenin-7-O-glucoside（Ａ７Ｇ）を含む。）を６００μＬ添加して、生成物の抽出を行った。その後、メタノールと水を２００μＬずつ添加して混合し、４℃、１５０００×ｇにて１０分間遠心分離を行った。遠心分離後の上清をＬＣ−ＭＳに供することにより生成物の検出を行った。
【００４３】
［生成物の質量分析］
ＬＣ−ＭＳ分析条件は以下の通りである。
制御ソフト：Lab Solutions LCMS（SHIMADZU）
カラム：CAPCELL CORE C18（2.1 mm I.D. x 100 mm, SHISEIDO）  
カラム温度：40℃
流速：0.2 mL/min  
分析モード：選択イオン検出（SIM）、ネガティブモード
展開溶媒：A液（0.05%ギ酸水溶液）、B液（100% CH3CN）
展開条件：  
平衡化，20% B，2 min
グラジエント，20% B-35% B，18 min
アイソクラティック，35% B，5 min
グラジエント，35% B-90% B，1 min
平衡化，20% B，10 min
【００４４】
本実験で分析されたナリンゲニン、ＣＴＡＬ、エリオジクチオール、および化合物５の脱プロトン化体（[M-H]-）に相当するｍ／ｚはそれぞれ２７１、２７１、２８７、および２８７である。ＬＣ−ＭＳにおけるピーク面積に基づいて各生成物を定量化した。
【００４５】
［結果］
上記の特定の実験条件下では、ｐ−クマル酸を加えた菌株Ｂ、Ｃを含む組成物からは、ナリンゲニンもＣＴＡＬも検出されなかった。これらの組成物は、ポリペプチド発現誘導の増加、および／またはバイオコンバージョン時間の延長を要すると見られた。しかしながら、それと同一の実験条件下において、ｐ−クマル酸を加えた菌株Ｅを含む組成物からは、効率よくナリンゲニンが生成されたことが確認された（図１）。菌株Ｅは、菌株Ｂと比べると、ＣＨＳ酵素の由来がダイズ（Ｇｍ）ではなくキンギョソウ（Ａｍ）である点においてのみ異なるものである。この結果は、異なる植物種に由来する酵素の特定の組合せによって、大腸菌における反応物生成の効率が著しく変化し得ることを例示している。
【００４６】
Ｇｍ４ＣＬおよびＡｍＣＨＳを発現する菌株Ｅを含む組成物は、目的とするフラボノイド化合物であるナリンゲニン（＊）に加えて、相当量のＣＴＡＬ副生成物（＊＊）も生成した（図１）。それに対し、Ｇｍ４ＣＬ、ＡｍＣＨＳ、およびＡｍＥＦＰを発現する菌株Ｆを含む組成物は、ナリンゲニンの高い生成量を維持したまま、ＣＴＡＬの生成を著しく抑制した（図１）。ナリンゲニン生成物に対するＣＴＡＬ生成物の量の割合は、菌株Ｅで１４．１％±１．０％、菌株Ｆで２．０％±０．２％であった（平均±標準偏差、ｎ＝３）。
【００４７】
上述したように菌株Ｂ、Ｃにおいて、ダイズ由来の複数のポリペプチドを別々のプラスミドから発現させても、３時間のバイオコンバージョン時間ではナリンゲニンを検出可能量で生成することができなかった。しかしながら、その同じダイズ由来ポリペプチドのセットを、１つの同じプラスミドから共発現する菌株Ｈ、Ｉにおいては、キンギョソウ由来ポリペプチドを組み合わせた菌株Ｅ、Ｆと同様に、ｐ−クマル酸から高効率でナリンゲニンを生成することができた（図２）。ここでも、菌株Ｈと比べて、ＧｍＥＦＰが追加された菌株Ｉでは、副生成物ＣＴＡＬの生成が著しく抑制されていた（図２）。この例では、ナリンゲニンの収量の著しい向上も得られていた。ナリンゲニン生成物に対するＣＴＡＬ生成物の量の割合は、菌株Ｈで２０．２％±１．３％、菌株Ｉで４．７％±０．３％であった（平均±標準偏差、ｎ＝３）。図２に見られるように、ｐ−クマル酸濃度の上昇に伴って収率が低下していく傾向があったが、これは大腸菌に対するｐ−クマル酸自体の毒性による可能性がある。
【００４８】
ｐ−クマル酸基質からナリンゲニンを生成できるこれらの菌株を含む組成物は、コーヒー酸を基質としてフラボノイド化合物エリオジクチオールを生成することにも有用であることが見出された（図３）。図３において、ＥＦＰを欠く菌株Ｈの組成物では、副生成物である化合物５（＃＃）がエリオジクチオール（＃）を上回る量で生成されている。化合物５は、ＣＴＡＬ様テトラケチドラクトンであって、クマロイル基ではなくカフェオイル基を有するものである。しかしながら、ＥＦＰが追加された菌株Ｉの組成物では、エリオジクチオールの生成割合を化合物５とほぼ同等にすることができた（図３右）。
【００４９】
別の実験において、ｐＥＴ１５ｂ−Ｇｍ４ＣＬ−ＧｍＣＨＳ−ＧｍＥＦＰのＳａｐＩサイトにさらに、Herpetosiphon aurantiacus細菌由来のチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）遺伝子がＴ７プロモーターに連結されたものを挿入し、ｐＥＴ１５ｂ−Ｇｍ４ＣＬ−ＧｍＣＨＳ−ＧｍＥＦＰ−ＨａＴＡＬを作製した。このプラスミドで形質転換された大腸菌をＭ９培地中に含む組成物に、アミノ酸基質であるＬ−チロシンを終濃度０ｍＭ、０．０４ｍＭ、０．５ｍＭ、または１ｍＭで加え、３０℃で３時間インキュベートしたところ、高効率でナリンゲニンを得ることができた。特に０．５ｍＭのＬ−チロシン濃度では、５００ｎＭを超えるナリンゲニンが得られ、ナリンゲニンに対するＣＴＡＬの割合は２％未満であった。
【要約】
【課題】大腸菌を用いたバイオコンバージョンによりフラボノイド化合物を製造する。
【解決手段】４−クマル酸ＣｏＡリガーゼ酵素（４ＣＬ）、カルコン合成酵素（ＣＨＳ）、およびＥＦＰタンパク質を発現する大腸菌細胞が提供される。その大腸菌細胞を含む組成物にｐ−クマル酸またはコーヒー酸を加えてフラボノイド化合物を製造する方法も提供される。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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