(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）フロリジン；および
（ｂ）ケルセチン−７−Ｏ−グルコシドおよびケンペロール−７−Ｏ−グルコシドからなる群より選択される、１つ以上のラクターゼフロリジンヒドロラーゼ阻害剤
を含む、高血糖疾患の処置および／または予防のための方法に使用するための組成物。
【請求項２】
０．０１〜１０ｇのフロリジンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
０．０１〜１０ｇの前記ラクターゼフロリジンヒドロラーゼ阻害剤を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記高血糖疾患が、肥満症、糖尿病、および糖尿病によって引き起こされる二次疾患からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
高血糖疾患の処理および／または予防のための方法に使用するための医薬組成物、ダイエットフードまたはフードサプリメントを調製するための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物を含む、高血糖疾患の処理および／または予防のための方法に使用するための医薬組成物、ダイエットフードまたはフードサプリメント。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物を含み、肥満症、糖尿病、および糖尿病によって引き起こされる二次疾患からなる群より選択される高血糖疾患の処置および／または予防のための方法に使用するための医薬組成物、ダイエットフードまたはフードサプリメント。
【請求項８】
前記糖尿病がＩＩ型糖尿病である、請求項４に記載の使用のための組成物、または請求項７に記載の医薬組成物、ダイエットフードもしくはダイエットサプリメント。
【請求項９】
経口投与、非経口投与または局所投与のために製剤化されていることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物、または請求項７もしくは８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（ａ）フロリジン；および（ｂ）１つ以上のさらなる定義されたラクターゼ−フロリジンヒドロラーゼ酵の阻害剤を含む相乗組成物に関する。特に、本発明は、肥満、糖尿病、または糖尿病に関連する二次疾患等の高血糖疾患の処置および／または予防のための組成物に関する。本発明はさらに、医薬組成物、ダイエット食品および／またはフードサプリメントを調製するための、このような組成物の使用に関する。本発明はさらに、本発明の組成物を含む医薬組成物、ダイエットフードおよびフードサプリメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
連邦統計局によれば、１９８０年以来、糖尿病の死亡者数は２９％増加している。このように、ドイツでは、真性糖尿病は、全死亡者の約３％を占めている（１９８０年：２％）。同時に、ドイツにおける肥満人口が急増している。２人に１人のドイツ人は既に過体重であり、５人に１人は肥満である。これらの人々では、糖尿病を発症するリスクが劇的に増加する。
【０００３】
現在の予測では、ドイツ人の最大７％（非特許文献１）、すなわち約６００万人が糖尿病の処置を受けていると予測されている。新たな症例の数は、年齢の増加と共に増加する。６０歳以上の年齢層では、糖尿病患者の割合は既に１８〜２８％である。同時に、２型糖尿病が発症する年齢は、着実に低下している。２型糖尿病は、プライマリケア内科医の４番目に多い診断であり（約１１％）、全一般開業医の５番目に多い診断である（約８％）（非特許文献２）。現在のＷＨＯの推定では、糖尿病患者の数は、２０２５年までに２倍になると予想されている（非特許文献３）。
【０００４】
食品によって脂肪、炭水化物およびタンパク質が摂取され、必要なエネルギーが人体に提供される。糖の過剰摂取、特に急速な吸収は、代謝にとって重い負担になり、糖尿病、過体重および肥満症の主要なリスク因子であると考えられている。したがって、糖尿病および肥満症などの高血糖障害の処置のための新たな薬剤の継続的必要性が存在する。
【０００５】
真性糖尿病、特にＩＩ型真性糖尿病の処置のための多数のクラスの化合物が提案されている。例えば、様々な国際出願において、ナトリウム依存性グルコーストランスポーター２（ＳＧＬＴ−２）を阻害する物質が示唆されている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４を参照のこと）。この輸送タンパク質は、腎臓の近位尿細管の原尿からグルコースおよびナトリウムを吸収する。特定のＳＧＬＴ−２阻害剤は、腎尿細管へのグルコースの取り込みを阻害して、正常血漿グルコースレベルの回復をもたらすことができる。動物試験では、ＳＧＬＴ−２阻害剤による６カ月超の長期処置は、インスリン感受性の増加、インスリン応答の改善、および糖尿病関連合併症の形成遅延をもたらした。トランスポーターＳＧＬＴ−２の阻害は、グルコースの濃度依存性排泄の増加に基づいており、体内の血糖の低下をもたらす。しかしながら、低血糖症は引き起こされない。血中グルコース低下の機構は、いかなる既存のインスリン抵抗性または膵β細胞によるインスリン産生の欠如とも無関係である。ＳＧＬＴ−２の他に、糖尿病の処置にも関連する別のナトリウム依存性グルコーストランスポーターＳＧＬＴ−１がある。ＳＧＬＴ−１は、小腸および近位尿細管のＳ３セグメントに見られる。それは、グルコースの能動的取り込みに関与する。ＳＧＬＴ−２と比較して、ＳＧＬＴ−１は、いくつかの糖に対する変化した基質特異性を示す。現在、ＳＧＬＴ−１および／またはＳＧＬＴ２の阻害をもたらすいくつかの調製物が臨床試験中である。
【０００６】
特許文献５には、フロリジンまたはフロリジン含有抽出物と組み合わせてＢｒａｓｓｉｃａ属植物の抽出物を含む組成物の使用が記載されている。前記組成物は、高血糖障害の処置のために提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９８／３１６９７号
【特許文献２】国際公開第０２／０８３０６６号
【特許文献３】国際公開第０３／０９９８３６号
【特許文献４】国際公開第０１／３１６９７号
【特許文献５】欧州特許出願第１２１７４５３４．３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｕｎｅｒ  Ｈ．Ｄｔｓｃｈ  Ｍｅｄ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２００５；１３０  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ．６４−６５
【非特許文献２】Ｗｉｔｔｃｈｅｎ  ＨＵ，（ＨＹＤＲＡ）ｓｔｕｄｙ，Ｆｏｒｔｓｃｈｒ  Ｍｅｄ  Ｏｒｉｇ  ２００３；１２１
【非特許文献３】Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ，Ｆａｃｔ  ｓｈｅｅｔ  Ｎｏ．１３８，２００２
【発明の概要】
【０００９】
本発明の過程において、フロリジンによるナトリウム依存性グルコーストランスポーターＳＧＬＴ１の阻害に加えて、本明細書に記載される阻害剤によってラクターゼフロリジンヒドロラーゼ（ＬＰＨ）酵素を阻害すると、血糖レベルに関して有利な相乗効果を得ることができることが今回見出された。本明細書で定義されるフロリジンおよびＬＰＨ阻害剤の併用投与は、高割合の炭水化物（例えば、デンプン）を有する食品を摂取した後に血中グルコース濃度の有意な低下をもたらすので、高血糖代謝疾患（例えば、糖尿病および／または肥満症）の処置および／または予防に非常に適切である。
【００１０】
ＬＰＨ酵素は、従来技術で十分に説明されており、哺乳動物の腸で合成される。当該酵素は、すべての哺乳動物の小腸の絨毛の上皮の主細胞の刷子縁において、必須の膜タンパク質として存在する。それは、腸内腔において、ラクトースなどの炭水化物中のβ−グリコシド結合の切断を触媒する。フロリジンの加水分解に加えて、ＬＰＨはまた、二糖のラクトースを単糖のグルコースおよびガラクトースに切断することができる。当該酵素のこれら２つの異なる活性は、ＬＰＨの異なる反応中心で生じる。本発明によれば、ＬＰＨ阻害剤は、特に、ＬＰＨのフロリジン切断酵素活性、好ましくはヒトＬＰＨのフロリジン切断酵素活性を阻害することができる。当該阻害剤は、ＬＰＨのこの活性を少なくとも５％、１０％、１５％、より好ましくは少なくとも２０％、２５％、３０％またはより好ましくは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％または８０％減少させる。当業者であれば、ＬＰＨの活性およびその阻害も決定し得る方法を熟知している。このような方法はまた、本出願の実施例に記載されている。
【００１１】
本発明で用いられるＬＰＨ阻害剤は、ケルセチンまたはケンペロール骨格を有し、グリコシド結合を介して少なくとも１つの糖基と連結されたフラボノールグリコシドである。したがって、本発明の阻害剤は、ケルセチングリコシドまたはケンペロールグリコシドである。
【００１２】
第１の態様では、本発明は、少なくとも以下の成分：（ａ）フロリジン；および（ｂ）少なくとも１つのラクターゼフロリジンヒドロラーゼ阻害剤を含有する組成物であって、前記阻害剤が、式Ｉの構造を有するフラボノールのグリコシドであり：
【化１】
0006711763.tif 000002
Ｙは、ＨおよびＯＨからなる群より選択される；および前記阻害剤が、前記フラボノールにグリコシド結合された少なくとも１つの糖基を含む、組成物に関する。
【００１３】
フラボノールは、フラボノイドの化学的グループ内のサブグループである。フラボノイドは植物二次生成物のグループに属し、植物起源の食品中に広く存在するポリフェノール化合物の大きなクラスに相当する。
【００１４】
本発明において、式Ｉのフラボノールのグリコシドは、有効なＬＰＨ阻害剤であることが今回見出された。上記式Ｉは、フラボノールケンペロールおよびケルセチンの基本構造を示す。ＹがＨである場合、式Ｉは、ケンペロールに相当する。ＹがＯＨ基である場合、式Ｉは、ケルセチンに相当する。したがって、本発明によれば、ＬＰＨ阻害剤は、ケンペロールグリコシドまたはケルセチングリコシドであることが好ましい。
【００１５】
ＬＰＨ阻害剤として有効な式Ｉの物質は、フラボノールにグリコシド結合された少なくとも１つの糖基を有する。したがって、ＬＰＨ阻害剤は、式Ｉを有するグリコシドである。本発明のグリコシドは、グリコシド結合糖基を含み、一般構造Ｒ−Ｏ−Ｚ（式中、Ｚは糖残基であり、Ｒはアグリコンである）を有する化合物である。グリコシド結合を介して式Ｉに結合し得る任意の種類の糖が、本発明のＬＰＨ阻害剤に用いられ得る。グリコシド結合基は、例えば、単糖または多糖、例えば二糖または三糖であり得る。
【００１６】
本発明によれば、グリコシド結合された基は、単糖であることが好ましい。式Ｉのフラボノールにグリコシド結合された単糖は、例えば、グルコース、フルクトース、ラムノース、グルコピラノース、マンノースおよびガラクトースからなる群より選択される単糖であり得る。単糖は、好ましくはグルコースである。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、（ａ）フロリジン；および（ｂ）少なくとも１つのＬＰＨ阻害剤を含む組成物であって、前記阻害剤が、式Ｉ（式中、Ｙは、ＨおよびＯＨからなる群より選択される）のフラボノールのグリコシドであり；および前記阻害剤が、前記フラボノールにグリコシド結合された少なくとも１つのグルコース基を含む、組成物に関する。したがって、このような実施形態では、ＬＰＨ阻害剤は、グルコシドである。グルコシドは、グリコシド結合グルコース残基を有し、一般構造Ｒ−Ｏ−Ｇｌｃ（式中、前記Ｇｌｃはグルコース残基であり、Ｒはアグリコンである）を有する化合物である。
【００１７】
さらに好ましい実施形態では、式Ｉの化合物にグリコシド結合している糖基は、多糖である。適切な多糖としては、例えば、二糖、三糖、四糖および五糖が挙げられる。適切な二糖は、例えば、セロビオース、ゲンチオビオース、イソマルトース、イソマルツロース、ラクトース、ラクツロース、ラミナリビオース、マルトース、マルツロース、メリビオース、ネオヘスペリドース、ネオトレハロース、ニゲロース、ルチノース、サンブビオース、ソホロース、サッカロースおよびトレハロースである。適切な三糖は、例えば、フコシドラクトース、ゲンチアノース、イソケストース（１−ケストース）、ケストース（６−ケストース）、マルトトリオース、マンニノトリオース、メレジトース、ネオストース、パノース、ラフィノースおよびウンベリフェロースである。好ましい実施形態では、フラボノールに結合している多糖は、ルチノースである。
【００１８】
グリコシド結合糖基は、好ましくは、フラボノールにβ−グリコシド結合されている。糖基のグリコシド結合は、式Ｉに示されている３’位、４’位、３位、５位または７位の
ＯＨ基の１つを介してなされることが特に好ましい。フラボノール中の位置のナンバリングは、以下の式ＩＩに示されているように、一般に公知の化学命名法に従う：
【化２】
0006711763.tif 000003
【００１９】
好ましい実施形態では、阻害剤のグリコシド結合基は、フラボノールの７位にある。さらに好ましい実施形態では、阻害剤のグリコシド結合基は、フラボノールの３位にある。さらに別の好ましい実施形態では、阻害剤は、フラボノールの３位にある単一のグリコシド結合糖基のみを含む。さらに別の好ましい実施形態では、阻害剤は、フラボノールの７位に位置する単一のグリコシド結合糖基のみを含む。これは、フラボノールの３位または７位にあるグリコシド結合基を除いて、これらの実施形態における阻害剤が、いかなる追加のグリコシド結合基も含有しないことを意味する。
【００２０】
本発明によれば、ＬＰＨ−阻害剤はまた、それぞれがグリコシド結合を介して式Ｉのフラボノールに結合された複数の糖基を含み得る。例えば、ＬＰＨ阻害剤は、このように連結された２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の糖基を含み得る。これらのグリコシド結合糖はまた、好ましくは、式Ｉに示されている３’位、４’位、３位、５位または７位
のＯＨ基の１つを介して結合され得る。
【００２１】
ＬＰＨ阻害剤は、特に、以下の分子：ケルセチン−７−Ｏ−グルコシド、ケンペロール−７−Ｏ−グルコシド、ケルセチン−３−Ｏ−ラムノシド、ケルセチン−３−Ｏ−グルコピラノシド、ケンペロール−３−Ｏ−グルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−ルチノシド、ケルセチン−３−ガラクトシド、ケルセチン−４’−グルコシド、ケルセチン−３−Ｏ−
ルチノシド（ケルセチン−３−Ｏ−グルコラムノシド）、ケンペロール−３，７−ジ−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシド、ケンペロール−３−（２Ｇ−キシロシルルチノシド）、３−グルコシル−ケルセチン、３−グルコシル−ケンペロール、ジヒドロケンペロール−３−ラムノシド、ケルセチン−３，４−Ｏ−グルコシド、４’−メチル−ケンペロール、ケンペロ
ール−３−Ｏ−フェルロイル−ジグルコシド−７−Ｏ−グルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−ヒドロキシフェルロイル−ジグルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−ジシナポイル−トリグルコシド−７−Ｏ−ジグルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−シナポイル−トリグルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−シナポイル−ジグルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−ジシナポイル−トリグルコシド−７−Ｏ−グルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−ジグルコシド−７−Ｏ−ジグルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−トリグルコシド−７−Ｏ−グルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−グルコシド−７−Ｏ−グルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−トリグルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−ジグルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−グルコシドなどの１つであり得る。
【００２２】
特に好ましい実施形態では、ＬＰＨ阻害剤は、ケルセチン−７−Ｏ−グルコシドである。別の実施形態では、ＬＰＨ阻害剤は、ケンペロール−７−Ｏ−グルコシドである。
【００２３】
加えて、本発明のＬＰＨ阻害剤はまた、二重効果を発揮するようなＳＧＬＴ１阻害剤であり得る。このような二重阻害剤の例は、例えば、ケルセチン−７−Ｏ−グルコシドおよびケンペロール−７−Ｏ−グルコシドである。
【００２４】
フラボノールにグリコシド結合されている糖基は、さらなる改変を有し得る。したがって、一実施形態では、糖基はアシル化されている（すなわち、糖基は、１つ以上のアシル基を含む）。ラクターゼフロリジンヒドロラーゼの好ましいアシル化された阻害剤は、例えば、ケンペロール−３−Ｏ−ヒドロキシフェルロイル−テトラグルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−ヒドロキシフェルロイル−ジグルコシド−７−Ｏ−ヒドロキシフェルロイル−ジグルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−ヒドロキシフェルロイル−ジグルコシド−７−Ｏ−グルコシド、ケンペロール−３−Ｏ−シナポイル−ジグルコシド−７−Ｏ−ジグルコシドおよびケンペロール−３−Ｏ−シナポイル−ジグルコシド−７−Ｏ−グルコシドからなる群より選択される。特に好ましい実施形態では、阻害剤は、ケンペロール−３−Ｏ−シナポイル−ジグルコシド−７−Ｏ−ジグルコシドである。
【００２５】
本発明によれば、フラボノールにグリコシド結合されている糖基は、アシル化多糖であることが好ましい。
【００２６】
加えて、フラボノールに結合されている糖基は、桂皮酸誘導体であり得る（すなわち、糖基は、桂皮酸、例えばヒドロキシ桂皮酸に由来する１つ以上の基、例えばシナピン酸基（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ−桂皮酸）、α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸（ＨＣＣＡ）基、フェルラ酸基（４−ヒドロキシ−３−メトキシ桂皮酸）およびカフェイン酸基を含む）。この実施形態では、糖基は、例えば、シナポイルグリコシドまたはフェルロイルグリコシドとして存在する。
【００２７】
本発明の組成物は、１つ以上のＬＰＨ阻害剤に加えて、フラボノイドフロリジンを含む。フロリジンは、インビトロでトランスポーターＳＧＬＴ１を阻害する（Ｋｏｔｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ，３２２（２）：８２９−３５）。フロリジンは、静脈内投与した場合、腎臓のグルコース排泄に対して作用することも昔から公知である。しかしながら、フロリジンを経口投与した場合、前記効果は弱い。これはおそらく部分的には、例えば、酵素ＬＰＨによって触媒される腸内のフロリジンの酵素分解が原因である（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｉｅｒ＆Ａｌｐｅｒｓ（１９７４），Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，３５０（１）：１００−１２）。本発明の組成物の摂取後、腸内のフロリジンの酵素分解は、上記に定義されるＬＰＨ阻害剤によって阻害され、それにより、フロリジンは、グルコース取り込み（ＳＧＬＴ１）に対するその阻害特性を発揮する。
【００２８】
本発明の組成物は、経口投与後にグルコーストランスポーターＳＧＬＴ−１を阻害し、および／または腸からの糖吸収を遅延させるのに有効な量のフロリジンを含有する。好ましい実施形態では、腸内に存在するＳＧＬＴ−１トランスポーターの活性は、前記組成物によって、未処置の状態と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少される。さらに好ましい実施形態では、本発明の組成物は、投与後に、未処置の状態と比較して、腸からの糖吸収の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の減少をもたらす。
【００２９】
当業者であれば、簡単な試験シリーズによって達成すべき（治療）効果に必要なフロリジンおよびＬＰＨ阻害剤の量を容易に決定することができる。ここで、当業者であれば、様々な要因、例えば組成物中に存在するＬＰＨ阻害剤の種類および量、組成物中に存在するさらなる成分の種類および量、組成物が投与される者の年齢および体重などを考慮するであろう。
【００３０】
本発明の組成物中のフロリジンの量は、好ましくは、１ｐｐｍ（百万分率）または０．０００１％（ｗ／ｗ）超である。組成物中のフロリジンの量は、１０ｐｐｍ超、１００ｐｐｍ超、１０００ｐｐｍ超、１０4ｐｐｍ超、５×１０4ｐｐｍ超または１０5ｐｐｍ超であることが好ましい。換言すれば、本発明の組成物は、０．０００１％（ｗ／ｗ）超、０．００１％、好ましくは０．０１％超、０．１％超、１％超、２％超、３％超、４％超、５％超、６％超、７％超、８％超、９％超、１０％超、１１％超、１２％超、１３％超、１４％超または１５％超のフロリジンを含有する。本発明の組成物は、２０％（ｗ／ｗ）超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超または６０％超のフロリジンを含むことも好ましい。特に好ましい実施形態では、本発明の組成物は、１〜９５％（ｗ／ｗ）、例えば５〜８０％、１０〜７０％、１５〜６０％、２０〜５０％または３０〜４０％のフロリジン、または例えば５〜９５％、１０〜９５％、１５〜９５％、２０〜９５％または３０〜９５％のフロリジンを含む。
【００３１】
本発明の組成物は、好ましくは、各送達単位（例えば、カプセル、錠剤または規定量の液剤）が０．０１〜１０ｇ、例えば０．０５ｇ超、０．１ｇ超、０．２ｇ超、０．３ｇ超、０．４ｇ超、０．５ｇ超、０．７５ｇ超、１ｇ超、２ｇ超、３ｇ超、４ｇ超または５ｇ超の量のフロリジンを含有するように製剤化される。
【００３２】
本発明の組成物は、さらに経口投与後にラクターゼフロリジンヒドロラーゼを阻害するのに有効な量のＬＰＨ阻害剤を含有する。好ましい実施形態では、腸ＬＰＨの活性は、前記組成物によって、未処置の状態と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上減少される。
【００３３】
本発明の組成物中のＬＰＨ阻害剤の量もまた、好ましくは、１ｐｐｍ（百万分率）または０．０００１％（ｗ／ｗ）超である。組成物中のＬＰＨ阻害剤の量は、１０ｐｐｍ超、１００ｐｐｍ超、１０００ｐｐｍ超、１０4ｐｐｍ超、５×１０4ｐｐｍ超または１０5ｐｐｍ超であることが好ましい。換言すれば、本発明の組成物は、０．０００１％（ｗ／ｗ）超、０．００１％、好ましくは０．０１％超、０．１％超、１％超、２％超、３％超、４％超、５％超、６％超、７％超、８％超、９％超、１０％超、１１％超、１２％超、１３％超、１４％超または１５％超のＬＰＨ阻害剤を含有する。本発明の組成物は、２０％（ｗ／ｗ）超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、５５％超または６０％超の本明細書に定義されるＬＰＨ阻害剤を含むことも好ましい。特に好ましい実施形態では、本発明の組成物は、１〜９５％（ｗ／ｗ）、例えば５〜８０％、１０〜７０％、１５〜６０％、２０〜５０％または３０〜４０％のＬＰＨ阻害剤、または例えば５〜９５％、１０〜９５％、１５〜９５％、２０〜９５％または３０〜９５％のＬＰＨ阻害剤を含有する。
【００３４】
一実施形態では、本発明の組成物中に上記量で存在するＬＰＨ阻害剤は、ケンペロール−７−Ｏ−グルコシドである。別の実施形態では、本発明の組成物中に上記量で存在するＬＰＨ阻害剤は、ケルセチン−７−Ｏ−グルコシドである。
【００３５】
本発明の組成物は、好ましくは、各送達単位（例えば、カプセル、粉末、錠剤または規定量の液剤）が０．０１〜１０ｇ、例えば０．０５ｇ超、０．１ｇ超、０．２ｇ超、０．３ｇ超、０．４ｇ超、０．５ｇ超、０．７５ｇ超、１ｇ超、２ｇ超、３ｇ超、４ｇ超または５ｇ超の量のＬＰＨ阻害剤を含有するように製剤化される。
【００３６】
本発明の組成物は、経口投与のために製剤化され、０．０１〜１０ｇのＬＰＨ阻害剤、好ましくは１〜３ｇのＬＰＨ阻害剤、および０．０１〜１０ｇのフロリジン、好ましくは１〜３ｇのフロリジンを含有することが特に好ましい。
【００３７】
本発明の別の実施形態によれば、組成物中のフロリジンの量は少なくとも０．１ｇであり、組成物中の上記式ＩのＬＰＨ阻害剤の量もまた少なくとも０．１ｇである。本発明の別の実施形態では、組成物中のフロリジンの量は少なくとも１ｇであり、組成物中の上記式Ｉのフラボノールグリコシドの量もまた少なくとも１ｇである。さらに別の実施形態では、組成物中のフロリジンの量は０．１〜１ｇであり、組成物中の上記式ＩのＬＰＨ阻害剤の量もまた０．１〜１ｇである。
【００３８】
フロリジンおよびＬＰＨ阻害剤は、任意の混合比で使用され得る。しかしながら、本発明の組成物中のフロリジンおよびＬＰＨ阻害剤の量は、好ましくは、最適な効果が達成される（すなわち、ＬＰＨおよびＳＧＬＴ１の両方が効率的に阻害される）ように当業者によって組み合わせられる。一実施形態では、本発明の組成物は、約２０：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０または１：２０の比でフロリジンおよびＬＰＨ阻害剤を含む。フロリジンとＬＰＨ阻害剤との混合比は１：１が特に好ましい。
【００３９】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の組成物は、植物または植物部分（例えば、果実）ではない。特に好ましい一実施形態では、本発明の組成物のＬＰＨ阻害剤は、植物抽出物の形態で添加されない。ＬＰＨ阻害剤が植物抽出物に本来的に由来する場合、阻害剤は、本発明の組成物に使用する前に抽出物から精製されたものである。あるいは、ＬＰＨ阻害剤はまた、化学合成によって得られた化合物であり得る。上記に示されている阻害フラボノール化合物の化学合成方法は当技術分野で公知であり、文献に記載されている（例えば、Ｈｉｒｐａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ，９（２）：１３８−６１）を参照のこと）。
【００４０】
さらに、上記に定義されるＬＰＨ阻害剤およびフロリジンは合計で、本発明の組成物中に存在するフラボノイドグリコシドの７０％（ｗ／ｗ）超、好ましくは８０％超、８５％超、９０％超、９５％超または９９％超を占めることが好ましい。これは、本発明の組成物が、上記に定義されるＬＰＨ阻害剤またはフロリジンではない３０％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは２０％未満、１５％未満、１０％、５％未満または１％未満のフラボノイドグリコシドを含有することを意味する。特に好ましい実施形態では、本発明の組成物は、上記に定義されるＬＰＨ阻害剤もしくはフロリジンではないフラボノイドグリコシドを１％（ｗ／ｗ）未満で含有するか、または含有しない。
【００４１】
本発明によれば、本発明の組成物に使用されるフロリジンおよびＬＰＨ阻害剤は両方とも、合成的に調製されることが特に好ましい。さらに特に好ましい実施形態では、フロリジンもＬＰＨ阻害剤も植物抽出物の形態ではない。
【００４２】
別の実施形態では、フロリジンは、フロリジン含有植物抽出物の形態でＬＰＨ阻害剤に添加される。フロリジン含有植物抽出物は、例えば、Ｒｏｓａｃｅａｅ科の少なくとも１つの植物から得られ得る。好ましくは、Ｒｏｓａｃｅａｅ科の植物は、Ｍａｌｕｓ、ＰｙｒｕｓまたはＰｒｕｎｕｓからなる群より選択される属に属する。さらに、フロリジン含有植物抽出物はまた、Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ科の植物に由来し得る。好ましくは、Ｖｅｒｂｅｎａｃｅａｅ科の植物は、Ｌｉｐｐｉａ属に由来する。特に、これらの科の植物は、フロリジンを含有することが公知である。ＲｏｓａｃｅａｅまたはＶｅｒｂｅｎａｃｅａｅ科由来の植物の抽出物は、例えば、植物の樹皮、果実または葉から得られ得る。
【００４３】
Ｍａｌｕｓ、ＰｙｒｕｓおよびＰｒｕｎｕｓ属の植物は、樹皮、果実および葉に比較的多量のフロリジンを含有する。特に、Ｍａｌｕｓ属の果実（すなわち、リンゴ）は、特に高レベルのフロリジンを有する。したがって、本発明の組成物中のフロリジンは、好ましくは、Ｍａｌｕｓ属の抽出物由来の抽出物の形態で、好ましくはリンゴまたは樹皮由来の抽出物の形態で存在することが特に好ましい。Ｍａｌｕｓ属は、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）の植物属である。抽出物は、Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ種の植物から出発して、Ｍａｌｕｓ属の植物から調製されることが特に好ましい。栽培リンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ  Ｂｏｒｋｈ．；Ｐｙｒｕｓ  ｍａｌｕｓ，Ｌ．）は、多数の品種を有する経済的に非常に重要な果実種である。原則として、栽培リンゴの品種はすべて、フロリジン含有抽出物の調製に使用され得る。抽出物は、品種Ｒｅｄ  Ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ、Ｂｒａｅｂｕｒｎ、Ｃｏｘ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｆｉｎｋｅｎｗｅｒｄｅｒ  Ｐｒｉｎｚ、Ｆuｒｓｔ  Ｂｌｕｃｈｅｒ、Ｍａｒｋｉｓｃｈｅｒ  ＣｏｘまたはＲｅｄ  Ｃｈｉｅｆの１つから製造されることが特に好ましい。しかしながら、Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ種の植物に加えて、Ｍａｌｕｓ属の他の種も使用され得る。
【００４４】
Ｒｏｓａｃｅａｅ科由来の植物の少なくとも１つの抽出物、および／またはＶｅｒｂｅｎａｃｅａｅ科由来の植物の少なくとも１つの抽出物は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％またはそれ以上のフロリジン（ｗ／ｗ）を含有する。
【００４５】
さらに好ましい実施形態では、前記組成物は、１つ以上の本発明のＬＰＨ阻害剤、ならびにＲｏｓａｃｅａｅ科の少なくとも１つの植物および／またはＶｅｒｂｅｎａｃｅａｅ科の少なくとも１つの植物由来の少なくとも１つの抽出物を含む。一実施形態では、前記組成物は、１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）の本発明のＬＰＨ阻害剤、および／または複数（例えば、２つ、３つ、４つまたはそれ以上）のＭａｌｕｓ属の植物の抽出物を含有する。ケルセチン−７−Ｏ−グルコシドおよび／またはケンペロール−７−Ｏ−グルコシド、ならびに少なくとも１つのＭａｌｕｓ属の植物の抽出物を含有する組成物が特に好ましい。本明細書で使用される「植物の抽出物」という用語は、同じ種類または同じ種の１つ以上の植物から得られる抽出物を指し、単一の植物に限定されない。
【００４６】
本明細書で使用される「抽出物」という用語は、植物の細胞を破裂させ、細胞汁を回収することによって得られる物質の混合物を指す。提案される本発明の抽出物は、当技術分野で公知の様々な方法によって調製され得る。
【００４７】
本発明の一実施形態では、最初に、植物材料が提供される。本発明の方法の出発材料として、種子から成熟植物までのすべての発達段階の植物が適切である。加えて、植物のすべての部分、例えば植物の果実、茎、葉、樹皮または根が適切である。出発材料は、異なる植物部位の混合物であり得るか、または特定の植物部位のみを含み得る。通常、植物材料は、最初に粉砕される。粉砕は、従来のカッターを用いて植物の各部分を単に切断することによって達成され得る。基本的には、すべての植物部分は、抽出物を調製するための出発材料として使用され得る。Ｍａｌｕｓ属の植物の抽出物の調製のために、果実および樹皮が特に適切であることが見出されている。さらに好ましい実施形態では、Ｍａｌｕｓ属の植物由来の抽出物は、各Ｍａｌｕｓ植物の果実（すなわち、リンゴ）または樹皮から調製される。粉砕する前に、細菌の混入を除去して消化の質を改善するために、植物材料は、４５℃〜１００℃の温度でブランチングされ得る。さらに、ブランチングは、ヒドロラーゼ、リパーゼおよびオキシダーゼなどの酵素の活性を減少させ、それにより、植物材料の安定性および品質を高める。
【００４８】
次の工程では、植物材料が分解される（すなわち、材料の細胞構造が破壊され、細胞の内容物が放出される）。消化は、例えば、植物細胞の消化のための従来の方法によって、例えば、凍結融解の反復によって、または適切なデバイス、例えばホモジナイザー、高圧ホモジナイザーもしくは超音波ホモジナイザーによって達成され得る。また、コロイドミルまたはフレンチプレスが消化に使用され得る。
【００４９】
加えて、細胞の分解は、酵素的に達成され得る。この目的のために、植物材料は、細胞の構造成分の破壊をもたらす適切な酵素で処理される。前記方法のこの段階では、植物材料とペクチナーゼ、コラゲナーゼ、セルラーゼおよび／またはヘミセルラーゼとのインキュベーションは、細胞を有効に分解するために特に適切であることが示されている。インキュベーション時間は、３０分間〜２４時間、好ましくは１時間〜６時間、より好ましくは９０分間〜４時間、例えば２時間であり得る。温度は、２０℃〜６０℃、好ましくは２５℃〜４５℃の範囲内、例えば約３７℃であり得、それは、好ましくは、各場合に使用される酵素の至適温度の範囲内であるべきである。反応混合物の適切なｐＨ値は、適切な緩衝剤、例えばリン酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、炭酸水素ナトリウム緩衝剤および／または適切な酸、例えばクエン酸、乳酸またはアスコルビン酸を使用することによって調整され得る。４〜６のｐＨ、例えばｐＨ５が消化に特に適切である。
【００５０】
細胞の破壊後、このようにして得られた細胞液は、ナトリウム依存性グルコーストランスポーター１（ＳＧＬＴ−１）の阻害に直接使用され得る。しかしながら、細胞の消化後に得られた細胞汁をさらなる精製工程に供することが好ましい。
【００５１】
例えば、細胞分解から得られた材料は、乾燥または凍結乾燥およびそれに続く抽出に供され得る。ここで、例えば、噴霧乾燥を最初に使用し得る。次いで、乾燥または凍結乾燥した植物材料を水性溶媒または有機溶媒で抽出し得る。抽出は、通常の抽出剤を使用して、例えばエタノール、酢酸エチルを用いて、または他の有機溶媒を用いて行われ得る。また、窒素などのガスによる抽出が可能である。液体溶媒を使用する場合、インキュベーション時間は、０．５〜２４時間、好ましくは２〜８時間である。窒素を使用する場合、抽出は、０．２５〜３時間かけて、好ましくは２０〜６０分間かけて４℃〜３７℃の温度で行われる。
【００５２】
本発明によって提案される組成物は、当技術分野で公知の様々な方法によって製造され得る。本発明のＬＰＨ阻害剤およびフロリジンは、当技術分野で公知の方法によって調製され得るか、または様々な製造業者から直接購入され得、そして所望の量で互いに混合され得る（例えば、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ製）。
【００５３】
好ましい実施形態では、フロリジン含有抽出物中のフロリジンは濃縮される。これらの物質の濃度を増加させるための方法は当業者に公知であり、例えば、Ｗｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６，ＬＷＴ−Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４０（８）：１３４４−１３５１）に記載されている。フロリジンの濃縮は、例えば、カラムクロマトグラフィーを使用することによって達成され得る。例えば、様々な吸着カラムが、この目的のために使用され得る。最初の抽出物をクロマトグラフィーカラムにロードし、適切な溶液で洗浄することによって望ましくない成分を除去し、次いで、カラムから濃縮形態で溶出する。例えば、濃縮していない抽出物を吸着カラムにロードした後、脱イオン水で洗浄することによって、親水性物質（塩、アミノ酸、ペプチド、糖など）を排除する。そして、９５％エタノールで溶出した抽出物において、フロリジンが濃縮されている。フロリジン抽出物は、乾燥形態および液体形態の両方で製造され得る。
【００５４】
本発明の組成物は、本発明にしたがって、高血糖疾患の処置および／または予防のために提案される。前記組成物は、それらの成分の相乗作用によって区別される（すなわち、個々の成分の相互作用は、単なる相加効果を超える）。
【００５５】
本発明によって提案される組成物を使用して処置され得る疾患は、高血糖によって引き起こされる（すなわち、正常な生理学的値１４０ｍｇ／ｄｌ（７．８ｍｍｏｌ／ｌ）を超えている、上昇した血糖レベルを特徴とする）すべての疾患を含む。このような疾患としては、特に、肥満症、糖尿病、または糖尿病によって引き起こされる二次疾患（例えば、網膜症、神経障害、腎症および異常創傷治癒）が挙げられる。本発明の組成物によって処置すべき糖尿病は、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病であり得る。好ましくは、それは、ＩＩ型糖尿病である。また、本発明の組成物は、一般に、腸からの糖取り込みを遅延および／または減少させるのにそれが有利な疾患および症状の処置および／または予防のために提案される。
【００５６】
処置または予防のために本発明によって提案される組成物はまた、他の有効成分と共に、例えば、従来技術に記載されている他の抗糖尿病剤、例えばビグアニド、スルホニル尿素、グリコシダーゼ阻害剤、好ましくは、消化管の炭水化物切断酵素の阻害剤（例えば、Ｏ−４，６−ジデオキシ−４−［［１Ｓ−（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−４，５，６−トリヒドロキシ−３−（ヒドロキシメチル）−２−シクロヘキセン−１−イル］−アミノ］−アルファ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−アルファ−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｄ−グルコピラノース）（独国特許出願公開第２３４７７８２号を参照のこと）、チアゾリジンジオン、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰ４）阻害剤、メグリチニド、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、グルコース−６−ホスファターゼ阻害剤、ならびに以下の保護権：国際公開第０２／０８０９３６号、国際公開第０２／０８０９３５号、特許出願公開第２００００８００４１号、欧州特許出願公開第０８５０９４８号（プロピオフェノングルコシド）；国際公開第０２／０４４１９２号、国際公開第０２／０２８８７２号、国際公開第０３／０１１８８０号および国際公開第０１／０６８６６０号（２−グルコピラノシルオキシベンジルベンゼン）；国際公開第０２／０６８４４０号、国際公開第０２／０６８４３９号、国際公開第０２／３６６０２号、国際公開第０１／０１６１４７号、国際公開第０２／０５３５７３号、国際公開第０３／０２０７３７号、国際公開第０３／０９０７８３号、国際公開第０４／０１４９３２号、国際公開第０４／０１９９５８号および国際公開第０４／０１８４９１号（グルコピラノシルオキシピラゾール）；国際公開第０１／０７４８３５号および国際公開第０１／０７４８３４号（Ｏ−グリコシドベンズアミド）；国際公開第０４／００７５１７号（グルコピラノシルオキシチオフェン）；国際公開第０３／０９９８３６号、国際公開第０１／０２７１２８号および米国特許出願公開第２００２／０１３７９０３号（Ｃ−アリールグリコシド）；独国特許出願公開第１０２５８００８号（フッ素グリコシド誘導体）；独国特許出願公開第１０２００４０２８２４１．２号（ピラゾールのフッ素グリコシド誘導体）に記載されているＳＧＬＴ１およびＳＧＬＴ２阻害剤と共に有利に使用され得る。
【００５７】
少なくともフロリジンおよび１つ以上のＬＰＨ阻害剤を含有する本発明の組成物は、併用投与または逐次投与のために製剤化される。したがって、本発明はまた、高血糖疾患の処置および／または予防のための、フロリジンおよび１つ以上の本発明のＬＰＨ阻害剤の使用であって、当該成分が個別投与のために製剤化されている、使用を提供する。
【００５８】
一態様では、本発明は、医薬組成物、ダイエットフードまたはフードサプリメントの製造のための上記組成物の使用に関する。
【００５９】
したがって、またさらなる態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つのＬＰＨ阻害剤およびフロリジンを含む上記組成物を含む医薬組成物、ダイエットフードまたはフードサプリメントに関する。前記医薬組成物、ダイエットフードまたはフードサプリメントは、高血糖疾患、好ましくは肥満、糖尿病または糖尿病によって引き起こされる二次疾患からなる群より選択される高血糖疾患の処置および／または予防の方法に使用するために、特に、ＩＩ型糖尿病の処置および／または予防のために適している。
【００６０】
本発明の組成物を含む医薬組成物は、経口投与、非経口投与または局所投与のために製剤化され得る。このような医薬組成物は、当技術分野で周知の方法によって調製され得る。このような方法ならびに適切な賦形剤および担体は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：
Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，Ｌｉ
ｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）に記載されている。前記医薬組成物は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、坐剤、注射剤、エマルジョン、懸濁液または溶液の形態を有し得る。前記組成物は、様々な投与経路のために、例えば、経口投与、非経口投与、局所投与、口腔投与、舌下投与、経粘膜投与、直腸投与、皮下投与、髄腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、鼻内投与、眼内投与または脳室内投与のために製剤化され得る。経口、非経口または局所用組成物としての製剤が特に好ましい。特に好ましい実施形態では、前記組成物は、経口投与のために製剤化される。前記医薬組成物はまた、徐放剤として製剤化され得る。
【００６１】
経口投与、口腔投与および舌下投与の場合、粉末、懸濁物、顆粒、錠剤、丸剤、カプセルおよびゲルキャップなどの固形製剤が通常使用される。これらは、例えば、有効成分（フロリジンおよび１つ以上の本発明のラクターゼフロリジンヒドロラーゼ阻害剤）を、少なくとも１つの添加剤または少なくとも１つの賦形剤と混合することによって調製され得る。このような賦形剤および担体は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ
Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）に記載されている。例えば、微結晶セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カゼイン、アルブミン、マンニトール、デキストラン、スクロース、ラクトース、ソルビトール、デンプン、寒天、アルギン酸塩、ペクチン、コラーゲン、グリセリドまたはゼラチンが、添加剤または賦形剤として使用され得る。また、経口投与のための組成物は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、トコフェロールまたはシステイン）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、保存剤（例えば、パラベンまたはソルビン酸）、風味増強剤、崩壊剤、結合剤、増粘剤、色素および類似物質を含む。
【００６２】
経口投与に適切な本発明の組成物の液体製剤は、例えば、エマルジョン、シロップ、懸濁液または溶液として提供され得る。これらの製剤は、滅菌液体担体（例えば、油、水、アルコールまたはそれらの組み合わせ）を使用して、懸濁液または溶液の形態で調製され得る。経口投与または非経口投与の場合、薬学的に適切な界面活性剤、懸濁化剤、油または乳化剤が添加され得る。液体剤形で使用するための適切な油としては、例えば、オリーブ油、ゴマ油、ピーナッツ油、菜種油およびコーン油が挙げられる。適切なアルコールとしては、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサデシルアルコール、グリセロールおよびプロピレングリコールが挙げられる。懸濁液はまた、脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、脂肪酸グリセリドおよびアセチル化脂肪酸グリセリドを含み得る。さらに、懸濁液は、多くの場合、鉱油またはペトロラタムなどの物質で処理される。
【００６３】
本発明はさらに、上記に定義される組成物（すなわち、フロリジンおよび１つ以上の本発明のＬＰＨ阻害剤を含有する組成物）を含むダイエットフードまたはダイエットサプリメントに関する。前記ダイエットフードまたはダイエットサプリメントは、上記に定義される肥満、糖尿病（特に、ＩＩ型糖尿病）、または糖尿病によって引き起こされる二次疾患の処置および／または予防に特に適している。フロリジンは、少なくとも１つのフロリジン含有植物抽出物に由来し得る。抽出物は、好ましくは、Ｍａｌｕｓ属の植物、特にＭａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ種の植物に由来する。少なくとも１つの抽出物は、Ｍａｌｕｓ属の植物から、リンゴまたはＭａｌｕｓ植物の樹皮から得られたことが特に好ましい。
【実施例】
【００６４】
以下の実施例では、本発明の組成物の効果を説明する：
【００６５】
実施例１：ケルセチンおよびケンペロール誘導体によるＬＰＨのインビトロ阻害
様々なケルセチンおよびケンペロール誘導体を、ラクターゼフロリジンヒドロラーゼ（ＬＰＨ）の阻害剤としてインビトロで試験した。Ａｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２，Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓ，３５（６）：９４９−５４）にしたがって、試験を行った。ここでは、ＬＰＨを発現するヒト小腸の組織（０．６ｍｇ／ｍｌ）を使用した。フロリジン二水和物は、基質としての役割を果たした。標準的なアッセイ（Ｃｈｕ＆Ｃｈｅｕｎｇ，１９７８，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１１（４）：１８７−９）を使用して、放出されたグルコースを測定した。
【００６６】
結果：
試験したケルセチンおよびケンペロール誘導体は、ＬＰＨに対する高い阻害活性を示し、ＬＰＨを濃度依存的に阻害することができた（表１）。ケルセチン−７−グルコシドおよびケンペロール−７−Ｏ−グルコシドは、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で、特に強い約７０％のＬＰＨ阻害を示した。
【表１】
0006711763.tif 000004
【００６７】
実施例２：ＬＰＨ／ＳＧＬＴ１に対するフロリジンおよびＬＰＨ阻害剤の組み合わせの阻害効果
ＳＧＬＴ１トランスポーターによるグルコース取り込みに対するフロリジンおよびＬＰＨ阻害剤の組み合わせの効果を、ヒト腸内の状況をシミュレートするエクスビボモデルを用いて試験した。エクスビボ試験モデルは、ラクターゼフロリジンヒドロラーゼ（ＬＰＨ）を発現するヒト小腸由来の組織を使用するので、フロリジンおよび他のグリコシドを切断することができる。続いて、このように前処理した反応バッチを、インビトロアッセイにおいて、ＳＧＬＴ１トランスポーターに対する阻害効果について試験した。
【００６８】
ラクターゼフロリジンラーゼ（ＬＰＨ）を発現するヒト小腸組織を調製し、Ａｍｉｒｉ＆Ｎａｉｍ（Ｊ  Ｉｎｈｅｒｉｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓ（２０１２）３５：９４９−９５４）に記載されているように使用した。要約すると、いわゆる「刷子縁膜」を小腸から調製し、フロリジンおよび／または各ＬＰＨ阻害剤と共に適切な緩衝液中で９０分間インキュベートした。
【００６９】
続いて、小腸膜を分離し、Ｋｏｔｔｒａ＆Ｄａｎｉｅｌ（Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００７；３２２（２）：８２９−３５）に記載されている電気生理学的方法を用いて、ＳＧＬＴ１の活性を上清中で決定した。ここでは、ヒトＳＧＬＴ１を発現するアフリカツメガエル卵母細胞を使用した。ＳＧＬＴ１によるグルコースおよびナトリウムの複合輸送は、卵母細胞膜を通じて電流を引き起こすので、ＳＧＬＴ１によるグルコースの輸送を測定できる。「二電極電圧クランプ」法によって、この電流を電気生理学的に決定する。このモデルでは、ＳＧＬＴ１の活性の減少はまた、細胞膜を通過する電流の減少をもたらす。
【００７０】
結果：
フロリジンおよび試験ＬＰＨ阻害剤は、ＳＧＬＴの活性を相乗的に減少させることが示された。表２は、元の活性の阻害率に対する各値によって、試験化合物による阻害を示す。驚くべきことに、フロリジンおよび試験ＬＰＨ阻害剤ケンペロール−７−Ｏ−グルコシドまたはケルセチン−７−グルコシドの組み合わせはそれぞれ、個々の物質の合計よりも有意に強く、ＳＧＬＴの活性を減少させることができた（例えば、バッチＡを参照のこと）。各場合において、フロリジン、ケルセチン−７−グルコシドおよびケンペロール−７−Ｏ−グルコシドは単独で、グルコース取り込みを３２％、２％または２．５％減少させた一方、フロリジンおよびケルセチン−７−グルコシドの組み合わせ、ならびにフロリジンおよびケンペロール−７−Ｏ−グルコシドの組み合わせはそれぞれ、グルコース取り込みを４８％および５２％減少させることができた。
【００７１】
１５％フロリジンを含有するリンゴ抽出物（バッチＢ）を純粋なフロリジンに代えて使用した場合も、同じ効果が観察された。この抽出物は、ＳＧＬＴの活性を３３％阻害した。このアプローチでは、ケルセチン−７−グルコシドおよびケンペロール−７−グルコシドは単独で、ＳＧＬＴ１の活性をそれぞれ２．５％および２．０％減少させた。対照的に、リンゴ抽出物と、ケルセチン−７−グルコシドまたはケンペロール−７−グルコシドとの組み合わせは、それぞれ４９％および５４％の阻害を達成した。
【表２】
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