(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブクレード  アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株で固体発酵により発酵させた、小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物である主たる基質を含み、
（ｉ）組成物１ｇ当たり５００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性、
（ｉｉ）組成物１ｇ当たり５００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性、および、
（ｉｉｉ）組成物１ｇ当たり５０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性、を示す、
酵素組成物。
【請求項２】
前記菌株は、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株またはアスペルギルス  ネオニガーの菌株である、請求項１に記載の酵素組成物。
【請求項３】
前記小麦ふすまと前記菜種ケーキとは、２０／８０から５０／５０までの範囲の質量割合である、請求項１又は２に記載の酵素組成物。
【請求項４】
前記固体発酵中に用いられる前記基質は、付加的な基質として、トウモロコシ胚芽又はトウモロコシ胚芽ケーキをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の酵素組成物。
【請求項５】
（ｉ）組成物１ｇ当たり１０００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性、
（ｉｉ）組成物１ｇ当たり８００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性、および、
（ｉｉｉ）組成物１ｇ当たり１２０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性、を示す、
請求項１から４のいずれか１項に記載の酵素組成物。
【請求項６】
少なくとも、発酵産物が以下の酵素活性の最小値、
（ｉ）組成物１ｇ当たり５００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性の最小値、
（ｉｉ）組成物１ｇ当たり５００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性の最小値、および、
（ｉｉｉ）組成物１ｇ当たり５０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性の最小値、を示すまで、
前記菌株で、前記基質を固体発酵する工程を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の酵素組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか１項に記載の酵素組成物を含む、反芻動物の飼料用の添加物。
【請求項８】
反芻動物の飼料用の飼料組成物またはプレミックスの原料としての、請求項７に記載の添加物の使用。
【請求項９】
請求項７に記載の添加物を含む、反芻動物の飼料用のプレミックス。
【請求項１０】
反芻動物に適した飼料と一緒に、請求項７に記載の添加物の有効量または請求項９に記載のプレミックスの有効量を含む、反芻動物用の補充された飼料組成物。
【請求項１１】
請求項７に記載の添加物または請求項９に記載のプレミックスを、反芻動物に適した飼料と混合することを含む、反芻動物用の補充された飼料組成物の製造方法。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか１項に記載の酵素組成物、請求項７に記載の添加物、請求項９に記載のプレミックスまたは請求項１０に記載の飼料組成物の、反芻動物の畜産学的性能を改善するための使用。
【請求項１３】
乳生産量の増加、消費指数および／もしくは食品効率の改善、体重増加の促進、反芻活動の増加、飼料および濃厚飼料の消化率の増加、ならびに／または、メタン生成の減少のための、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
請求項１から５のいずれか１項に記載の酵素組成物の有効量、請求項７に記載の添加物の有効量、請求項９に記載のプレミックスの有効量、または、請求項１０に記載の飼料組成物の有効量を、反芻動物に摂取させる、反芻動物の畜産学的性能を改善するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、飼料中への非薬用食品添加物の添加による反芻動物の畜産学的性能の改善に関する。
【背景技術】
【０００２】
反芻動物における遺伝的進歩は、非常に高い畜産学的性能に特徴付けられる家畜動物の取得の可能性を与えてきた。これは、非常に高い乳生産水準（４０ｋｇより重い／牛（１頭当たり）／日）および肥育用牛での非常に高い体重増加（１５００ｇより重い／動物（１頭当たり）／日）で表される。それらの管理および生産ニーズをカバーするためには、このような性能は、動物によるより多くの飼料摂取および非常に豊富な飼料が必要となる。
【０００３】
摂取水準の増加および反芻動物の配合飼料中の濃厚飼料（ｃｏｎｃｅｎｔｒｅ）部分の増加は、動物の代謝効率を低下させる影響を有する。その動物では、輸送が加速されるので、あまり栄養素が使用されず、そのため効果的ではない。従って、配合飼料（飼料および濃厚飼料）の産物（乳（ミルク）または肉）への変換収率を改善させ得る栄養面での解決策を見出すことに、重要な必要性が存在する。
【０００４】
反芻動物の配合飼料の全体的な消化率を制限しているものは、繊維、セルロースおよびヘミセルロースの消化率であることが知られており、一方、反芻動物の飼料中における酵素の使用については従来技術に記載されている（非特許文献１）。更に、反芻動物におけるデンプン（スターチ）の消化率の増加させるための、細菌アミラーゼの使用（特許文献１）または真菌アミラーゼの使用（特許文献２）が提案されている。しかしそれにもかかわらず、著者らは、一方では、酵素補充についての動物の応答での重大な可変性と、そのための反芻動物用に特定された添加物の発見の必要性とを認識しており、他方では、反芻動物の飼料中の主な多糖類（セルロースおよびヘミセルロース）の消化率の改善を標的とする添加物の発見の必要性を認識している。従って、摂取飼料の消化率を増加させるために、セルラーゼ、キシラナーゼ活性、β‐グルカナーゼ活性、ペクチナーゼ活性、マンナナーゼ活性およびα‐ガラクトシダーゼ活性を含む精製した酵素複合体を、反芻動物の飼料へ添加することが提案された（特許文献３）。しかし、これらの添加物は飼料（かいば（ｆｏｕｒｒａｇｅｓ））と一緒の場合でのみ使用され、濃厚飼料（穀物（ｃｅｒｅａｌｅｓ）、副産物（ｃｏｐｒｏｄｕｉｔｓ）、圧搾ケーキ（ｔｏｕｒｔｅａｕｘ））と一緒の場合では使用することができない。一方で、濃厚飼料の添加は反芻動物の畜産学的性能を改善するために使用される主要な手段である。
【０００５】
従って、例えば濃厚飼料を含む最適な飼料と一緒に供給される場合であっても動物の畜産学的性能を改善することができる反芻動物の飼料への新規な添加物について、重要な必要性が存在する。
【０００６】
反芻動物の畜産学的性能を改善するために、酵素を産生する異なる種類の微生物の使用が提案されている（非特許文献２）。これらの酵素の産生がもたらす発酵が完了すると、一般的に、酵素は発酵残留物から、および産生微生物から分離される。しかし、産生される酵素の種類および活性は、使用される微生物の種類、使用される基質および使用される培養条件によって大きく変化し、これは動物で観察される効果において強い異質性をもたらし、そのため農業従事者にとっての利益を制限することになる。具体的には、酵素活性の効果的な組み合わせでの使用については、特に、液体発酵において遺伝子的に改変された生物により産生される酵素を使用する場合、判定することは困難である。酵素が液体形態で使用される時は、急速に溶出し第一胃（ルーメン）で不活性化してしまうので、酵素の投与方法もまた問題となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０３２４５７１号明細書
【特許文献２】国際公開第０３／０６８２５６号
【特許文献３】国際公開第２００９／０００６３６２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３年）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．Ｅ．Ｓｕｐｐｌ．  ２：Ｅ３７−Ｅ４７頁
【非特許文献２】Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４年）Ｃａｎ．Ｊ．Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ．  ８４：２３−３６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、本発明者らによる予測不可能な発見からもたらされたものである。本発明者らは、アスペルギルス  セクション（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ）  Ｎｉｇｒｉの糸状菌、特にアスペルギルス  ツビンゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）の糸状菌株で、穀物、穀物副産物および／または油糧種子（ｄ’ｏｌｅａｇｉｎｅｕｘ）副産物を固体発酵することによって、所定の水準でのセルラーゼ酵素活性、キシラナーゼ酵素活性およびβ‐グルカナーゼ酵素活性を示す複数酵素組成物を再現可能に得ることができることを発見した。更に、この酵素組成物は、反芻動物の配合飼料中に入れた時、その配合飼料がどのようなものであっても畜産学的性能を改善することができ、特に乳生産量、食品効率、消費指数および体重増加を改善し、反芻活動を増加させ、飼料摂取能力を増加させ、飼料および／もしくはその濃厚飼料の消化率を増加させ、ならびに、メタン生成を減少させることができることを発見した。
【００１０】
従って、本発明は、アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株、特にアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株で発酵させた、小麦（ｂｌｅ）、小麦ふすま（ｓｏｎ  ｄｅ  ｂｌｅ）、菜種ケーキ（ｔｏｕｒｔｅａｕ  ｄｅ  ｃｏｌｚａ）、小麦と小麦ふすまとの混合物、小麦と菜種ケーキとの混合物、小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物、および、小麦と小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物からなる群から選択される主たる基質を含む酵素組成物に関し、酵素組成物は、（ｉ）組成物１ｇ当たり５００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性、（ｉｉ）組成物１ｇ当たり５００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性、および、（ｉｉｉ）組成物１ｇ当たり５０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性、を示す。
【００１１】
更に、この酵素組成物の製造方法にも関連する。方法は、少なくとも、発酵産物が以下の酵素活性の最小値、（ｉ）組成物１ｇ当たり５００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性の最小値、（ｉｉ）組成物１ｇ当たり５００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性の最小値、および、（ｉｉｉ）組成物１ｇ当たり５０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性の最小値、を示すまで、サブクレード  Ａ．ツビンゲンシスの菌株で、特にアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株またはアスペルギルス  ネオニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｅｏｎｉｇｅｒ）の菌株で、より好ましくはアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株で、小麦、小麦ふすま、菜種ケーキ、小麦と小麦ふすまとの混合物、小麦と菜種ケーキとの混合物、小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物、および、小麦と小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物からなる群から選択される主たる基質を固体発酵する工程を含む。発酵は好ましくは培養培地中で最初の胞子の出現時に停止される。
【００１２】
この酵素組成物を含む、反芻動物の飼料用の添加物にも関する。
【００１３】
本発明の目的はまた、反芻動物の飼料用の、原料、特に非薬用原料としての添加物、飼料組成物またはプレミックスの使用でもある。
【００１４】
反芻動物に適した飼料と一緒に、この添加物の有効量またはこのプレミックスの有効量を含む反芻動物用の補充された飼料組成物を取り扱うだけでなく、この添加物を含む反芻動物の飼料用のプレミックスについてもまた取り扱う。
【００１５】
本発明の別の目的は、上記の添加物または上記のプレミックスを反芻動物に適した飼料と混合することを含む、反芻動物用の補充された飼料組成物の製造方法に関する。
【００１６】
本発明はまた、上記の酵素組成物、上記の添加物、上記のプレミックスまたは上記の飼料組成物の、反芻動物の畜産学的性能を改善するための使用にも関する。
【００１７】
最後に、上記の酵素組成物の有効量、上記の添加物の有効量、上記のプレミックスの有効量または上記の飼料組成物の有効量を、反芻動物に摂取させる、反芻動物の畜産学的性能を改善するための方法にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
「反芻動物」
本発明の文章中において、用語「反芻動物」は、飼料摂取後の飼料の再咀嚼過程を通して全体的または部分的に消化が行われる、任意の多胃草食哺乳動物を示す。
【００１９】
反芻動物の消化管は、第一胃、第二胃、第三胃および第四胃の４つの区画で構成されている。これらの４つの区画の間では、ほとんどの栄養素が第一胃の中で消化されるので、第一胃が最も重要である。この中での消化は、セルロース分解、ヘミセルロース分解、タンパク質分解、酸生成、メタン生成およびビタミン合成等をもたらす重要かつ多様な微生物叢が関与する発酵プロセスに対応する。第一胃内の細菌叢の一次的役割のため、反芻動物の消化生理は、細菌叢が二次的役割を果たす単胃動物のものとはかなり異なっている。
【００２０】
そのような動物は当業者に周知であり、例えば、ウシ科動物、ヒツジ属動物、ヤギ属動物、シカ科およびラクダ科を含む。好ましくは、本発明の背景では、反芻動物はウシ科動物である。
【００２１】
「ウシ（牛）」または「ウシ科動物」は、ここでは、いくつかの重要な家畜の種を含むウシ科のサブファミリーを意味する。ウシ科動物は、牛、特に乳牛、哺乳牛、未経産牛、子牛、離乳牛、去勢牛、育成牛（ｂｏｅｕｆ）、肥育用牛、雄牛（ブル）（ｔａｕｒｅａｕ）、バッファロー、ヤク、ガウルおよびバンテン、を特に含む。好ましくは、本発明の範囲内で使用される反芻動物がウシ科動物である場合、特に、乳牛、子牛、離乳牛、乳飲み子牛、育成牛および肥育用牛のうちの牛から選択される。
【００２２】
「ヒツジ」は、ここでは、オビス属の反芻動物の草食動物を意味する。ヒツジ動物は、野生の羊、羊、雌羊、若い雌羊および子羊を特に含む。
【００２３】
「ヤギ属動物」は、ここでは、キャプラ属の反芻動物の草食動物を意味する。ヤギ属動物は、ヤギ、雄ヤギ、子ヤギおよびアイベックスを特に含む。
【００２４】
「シカ」は、ここでは、角を保有するシカ科ファミリーの反芻動物を意味する。シカは、スタッグ、子鹿（ｈｅｒｅ）、若いスタッグ、雌ジカ（ｂｉｃｈｅ）、（１歳未満の）子鹿（ｆａｏｎ）、雄ノロジカ（ｃｈｅｖｒｅｕｉｌ）、雄ジカ（ｂｒｏｃａｒｄ）、雌ノロジカ（ｃｈｅｖｒｅｔｔｅ）、トナカイ、ダマジカ（ｄａｉｍ）、雌ダマジカ（ｄａｉｎｅ）およびヘラジカ（ｌ’ｅｌａｎ）を特に含む。
【００２５】
「ラクダ」は、ここでは、ラクダ科ファミリーの偶蹄類の哺乳動物を意味する。ラクダは、ヒトコブラクダ、キャメル、雌キャメル、ラマおよびアルパカを特に含む。
【００２６】
好ましくは、本発明の文脈の範囲において、反芻動物は家畜動物である。
【００２７】
「酵素組成物」
本発明の酵素組成物は、アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株、好ましくはアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株で発酵させた、小麦、小麦ふすま、菜種ケーキ、小麦と小麦ふすまとの混合物、小麦と菜種ケーキとの混合物、小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物および小麦と小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物からなる群から選択される主たる基質を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、酵素組成物は、（ｉ）組成物１ｇ当たり５００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性、（ｉｉ）組成物１ｇ当たり５００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性、および、（ｉｉｉ）組成物１ｇ当たり５０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性、を示す。
【００２８】
上記の酵素活性は、乾燥させた組成物１ｇ当たりで示されている。
【００２９】
「キシラナーゼ」は、ここでは、国際生化学・分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の酵素の命名法での分類ＥＣ３．２．１．８の酵素を意味し、線状多糖類のβ−１，４−キシランをキシロースに分解し、特にそれによってヘミセルロースを分解する。
【００３０】
キシラナーゼ活性を測定するための技術は当業者に周知である。典型的に、この活性を証明するためには、酵素溶液を、発色団であるレマゾールブリリアントブルーＲに結合した可溶性オート麦キシラン溶液に作用させ、酵素溶液の作用によって放出されたオリゴマーを測定することが可能である。オリゴマーは、エタノールでの沈澱後の可溶性画分中で見つけられる。この方法で使用される好ましい反応培地は、オート麦のアゾキシラン溶液（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）１０ｇ／Ｌを１３０μＬと、ｐＨ４．７０の酢酸緩衝液０．４Ｍ中に希釈させた酵素溶液５０μＬとで構成される。反応は、好ましくは３１℃で２０分間行われる。反応は、典型的に、９６％エタノール５００μＬを添加することによって停止される。遠心分離（１０分間、３０００ｒｐｍ、２０℃）後に得られる上清の光学密度を、５９０ｎｍで読み取る。そして、キシラナーゼ活性単位（ＡＸＣ）は、ｐＨ４．７０および３０℃でレマゾールブリリアントブルーＲキシランの溶液からオリゴマーを放出し（このオリゴマーはエタノール中で沈殿しない）、その上清の光学密度が５９０ｎｍで０．９３となるような、１ｍＬ当たりの単位（量）に希釈された酵素の量を、その１単位（１ＡＸＣ）として定義し得る。
【００３１】
好ましくは、本発明の酵素組成物は、組成物１ｇ当たり５００ＡＸＣより大きいキシラナーゼ活性を示し、より好ましくは組成物１ｇ当たり７５０ＡＸＣより大きいキシラナーゼ活性を示し、より好ましくは組成物１ｇ当たり１０００ＡＸＣより大きいキシラナーゼ活性を示し、とりわけ好ましくは組成物１ｇ当たり２０００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性を示す。
【００３２】
「β−グルカナーゼ」は、ここでは、国際生化学・分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の酵素の命名法での分類ＥＣ３．２．１．６の酵素を意味し、グルカンを切断する。β−グルカナーゼは、カロースまたはカードラン等のβ−１，３−グルカンを切断するβ−１，３−グルカナーゼ、β−１，６−グルカンを切断するβ−１，６−グルカナーゼ、セルラーゼ、キシログルカンに特異的なエンド−β−１，４−グルカナーゼ、または、キシログルカンに特異的なエキソ−β−１，４−グルカナーゼを特に含む。
【００３３】
β−グルカナーゼ活性を測定するための技術は当業者に周知である。典型的に、この活性を証明するためには、酵素溶液を、発色団であるレマゾールブリリアントブルーＲに結合した大麦β−グルカンの溶液に反応させることが可能である。β−グルカナーゼ活性によるこの基質のｐＨ４．８での加水分解では、発色団に結合したオリゴマーを放出し（このオリゴマーはエタノール中で沈殿しない）、５９０ｎｍでの吸光度を測定することによってその濃度を評価する。好ましくは、この方法で使用される反応培地は、０．１Ｍ酢酸・リン酸希釈緩衝液中において４／５に希釈されｐＨ４．７５に調整されたアゾ大麦グルカン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）の溶液１３０μＬと、ｐＨ４．６０の酢酸・リン酸緩衝液０．１Ｍ中に希釈した酵素溶液５０μＬとで構成される。好ましくは、反応は３１℃で２０分間行われる。反応は、典型的に、沈殿溶液（９６％エタノール１Ｌ中に酢酸ナトリウム三水和物３０ｇおよび酢酸亜鉛３ｇを含む）６２０μＬを添加することによって停止される。遠心分離（１０分間、３０００ｒｐｍ、２０℃）後に得られる上清の光学密度を５９０ｎｍで読み取る。そして、β−グルカナーゼ活性単位（ＢＧＵ）は、３０℃およびｐＨ４．８の分析条件下でレマゾールブリリアントブルーＲに結合した大麦β−グルカンのオリゴマーを放出し（このオリゴマーはエタノール中で沈殿しない）、その上清の吸光度が５９０ｎｍで０．９となるような、１ｍＬ当たりの単位（量）の濃度に希釈された酵素の量を、その１単位（１ＢＧＵ）として定義し得る。
【００３４】
好ましくは、本発明の酵素組成物は、組成物１ｇ当たり５００ＢＧＵより大きいβ−グルカナーゼ活性を示し、より好ましくは組成物１ｇ当たり６００ＢＧＵより大きいβ−グルカナーゼ活性を示し、より好ましくは組成物１ｇ当たり１０００ＢＧＵより大きいβ−グルカナーゼ活性を示し、とりわけ好ましくは組成物１ｇ当たり１５００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性を示す。
【００３５】
「セルラーゼ」は、ここでは、国際生化学・分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の酵素の命名法での分類ＥＣ３．２．１．４の酵素を意味し、セルロース、リケニン、穀物のβ−グルカン、β−１，４で結合しているグルコースのポリマーを切断する。セルラーゼは、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、β−１，４−グルカナーゼ、β−１，４−エンドグルカンヒドロラーゼ、セルラーゼＡ、セルロシンＡＰ、エンドグルカナーゼＤ、アルカリセルラーゼ、セルラーゼＡ３、セルデキストリナーゼ、９．５セルラーゼ、アビセラーゼ、パンセラーゼＳＳおよび１，４−（１，３，１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼを特に含む。
【００３６】
セルラーゼ活性を測定するための技術は当業者に周知である。典型的に、この活性を証明するためには、酵素溶液を、部分的に解重合し発色団であるレマゾールブリリアントブルーＲに結合したカルボキシメチルセルロースの溶液に作用させることが可能である。セルラーゼ活性によるこの基質のｐＨ４．５での加水分解では、発色団に結合したオリゴマーを放出し、このオリゴマーはエタノールでは沈殿できず、５９０ｎｍでの吸光度を測定することによってその濃度を評価する。好ましくは、この方法で使用される反応培地は、２０ｇ／ＬおよびｐＨ４．５におけるアゾ−カルボキシメチル−セルロース溶液（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  ９０５０４ａ）１００μｌと、ｐＨ４．６０の０．１Ｍ酢酸緩衝液中に希釈した酵素溶液１００μＬとで構成される。好ましくは、反応は４１℃で１０分間行われる。反応は、典型的に、沈殿溶液（９６％エタノール１Ｌ中に酢酸ナトリウム三水和物４０ｇおよび酢酸亜鉛４ｇを含む）５００μＬを添加することによって停止される。遠心分離（１０分間、３０００ｒｐｍ、２０℃）後に得られる上清の光学密度を５９０ｎｍで読み取る。そして、カルボキシメチルセルラーゼ活性単位（ＣＭＣ）は、４１℃およびｐＨ４．５の分析条件下で部分的に解重合しレマゾールブリリアントブルーＲに結合したカルボキシメチルセルロースのオリゴマーを放出し（このオリゴマーは沈殿溶液中で沈殿しない）、その上清の吸光度が５９０ｎｍで１．０となるような、１ｍＬ当たりの単位（量）の濃度に希釈された酵素の量を、その１単位（１ＣＭＣ）として定義し得る。
【００３７】
好ましくは、本発明の酵素組成物は、組成物１ｇ当たり５０ＣＭＣより大きいセルラーゼ活性を示し、より好ましくは組成物１ｇ当たり７５ＣＭＣより大きいセルラーゼ活性を示し、より好ましくは組成物１ｇ当たり１２０ＣＭＣより大きいセルラーゼ活性を示し、とりわけ好ましくは組成物１ｇ当たり１８０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性を示す。
【００３８】
特に好ましい実施の形態では、本発明の酵素組成物は、組成物１ｇ当たり２０００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性を示し、組成物１ｇ当たり１５００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性を示し、および、組成物１ｇ当たり１８０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性を示す。
【００３９】
本発明の酵素組成物は、上記のキシラナーゼ活性、β−グルカナーゼ活性およびセルラーゼ活性以外の酵素活性を更に含んでもよいが、非常に低い水準である。好ましくは、本発明の酵素組成物は、ペクチナーゼ活性、マンナナーゼ活性、アミラーゼ活性および／またはα−ガラクトシダーゼ活性が全く無い。好ましくは、本発明の酵素組成物は、フェルラ酸エステラーゼ活性が全く無い。
【００４０】
「酵素活性Ｘが全く無い組成物」は、ここでは、酵素活性を検出するための慣例技術を用いても酵素活性Ｘが検出できない組成物を意味する。即ち、酵素活性Ｘが全く無い組成物は、酵素活性Ｘを有するタンパク質を全く含まないか、または、対応する酵素活性Ｘが酵素活性を検出するための慣例技術を用いても測定できないごく低い（例えばプロテオミクス技術によって決定される）濃度において酵素活性Ｘを有するタンパク質を含む。
【００４１】
上記のキシラナーゼ活性、β−グルカナーゼ活性およびセルラーゼ活性は、アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株、特にアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株での、本発明の酵素組成物中に含まれる基質、特に主たる基質の発酵に由来するものである。
【００４２】
「主たる基質」は、ここでは、アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株、特にアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株での発酵の間に使用される基質の、少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％に相当する基質を意味する。
【００４３】
この基質、特にこの主たる基質は、小麦、小麦ふすま、菜種ケーキ、小麦と小麦ふすまとの混合物、小麦と菜種ケーキとの混合物、小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物および小麦と小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物からなる群から選択される。好ましくは、基質は、小麦ふすま、菜種ケーキおよびそれらの混合物からなる群から選択される。とりわけ好ましくは、基質は、特に主たる基質は、小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物である。小麦ふすまと菜種ケーキは、１０／９０（即ち、小麦ふすま１０％に対して菜種ケーキ９０％）から９０／１０（即ち、小麦ふすま９０％に対して菜種ケーキ１０％）まで、好ましくは１５／８５（即ち、小麦ふすま１５％に対して菜種ケーキ８５％）から８０／２０（即ち、小麦ふすま８０％に対して菜種ケーキ２０％）まで、好ましくは２０／８０（即ち、小麦ふすま２０％に対して菜種ケーキ８０％）から７０／３０（即ち、小麦ふすま７０％に対して菜種ケーキ３０％）まで、好ましくは２５／７５（即ち、小麦ふすま２５％に対して菜種ケーキ７５％）から６０／４０（即ち、小麦ふすま６０％に対して菜種ケーキ４０％）まで、更により好ましくは２０／８０（即ち、小麦ふすま２０％に対して菜種ケーキ８０％）から５０／５０（即ち、小麦ふすま５０％に対して菜種ケーキ５０％）まで、更により好ましくは３０／７０（即ち、小麦ふすま３０％に対して菜種ケーキ７０％）から５０／５０（即ち、小麦ふすま５０％に対して菜種ケーキ５０％）までの範囲の質量割合で混合物に存在し得る。
【００４４】
アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株、特にアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株での発酵の間に使用される基質は、付加的な基質として次のものを単独で又は任意に組み合わせて更に含んでもよい。
・大豆ケーキ、トウモロコシ胚芽（ｇｅｒｅｍｓ  ｄｅ  ｍａｉｓ）ケーキ、ヒマワリ（サンフラワー）ケーキ、パルミストケーキ、亜麻（フラックス）ケーキ、落花生（グラウンドナッツ）ケーキ、ココアケーキ、コプラケーキ、綿ケーキ、ブドウ種子ケーキ、オリーブ搾りかす、カメリナケーキ、ジャトロファ種子ケーキ、または、胡麻（セサミ）ケーキ、等の油糧種子ケーキ。
・小麦粉（ｆａｒｉｎｅ）、シャープス、ブラウンリモールディング、ふすま、グルテンフィード、グルテンミール、蒸留所／エタノールプラント由来の乾燥穀類、蒸留所／エタノールプラント由来の乾燥可溶性穀類、ビール醸造穀類、コーン穂、オート麦、小麦、大麦、ライ小麦、米、ライ麦またはトウモロコシの細根、胚芽またはミール、等の小麦ふすま以外の穀物副産物。
・アミノ酸、大豆タンパク質の濃厚飼料、ジャガイモタンパク質の濃厚飼料、小麦グルテンまたはトウモロコシグルテン、等の有機窒素源。
・尿素、アンモニア、アンモニウム塩または蒸留残渣、等の無機窒素源。
・ナトリウム、カリウム、塩素、カルシウムまたはリン鉱物塩。
・鉄、銅、亜鉛、マンガン、コバルト、ヨウ素またはセレン、等の微量元素。
【００４５】
好ましくは、アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株、特にアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株での発酵の間に使用される基質は、付加的な基質として油糧種子ケーキ、特にトウモロコシ胚芽ケーキを含み得る。
【００４６】
上記の基質は、上記のキシラナーゼ活性、β−グルカナーゼ活性およびセルラーゼ活性を得るために、アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株、好ましくはアスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉ  クレード  Ａ．ニガー（ｃｌａｄｅ  Ａ．ｎｉｇｅｒ）の菌株、より好ましくはアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株またはアスペルギルス  ネオニガーの菌株、より好ましくはアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株で発酵される。代替の実施の形態では、上記の基質は、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株ではないアスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株で発酵される。発酵は、浸漬発酵（もしくは液体発酵）、固体発酵または固体／液体発酵であってもよい。好ましくは、発酵は固体発酵である。
【００４７】
本発明の文章中では、「固体発酵」は、炭素およびエネルギー源として使用できる湿った固体基質、不活性基質または不溶性基質上での微生物の培養として定義される。発酵工程は、基質粒子間の隙間内の遊離水の不在下または準不在下で行われる。これに対して、「浸漬発酵」は、ここでは、栄養素および微生物の両方が水性培地中に浸漬される微生物の培養を示す。
【００４８】
好ましくは、上記の基質は、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株で、固体発酵により発酵される。
【００４９】
「アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉ」は、ここでは、Ａ．ニガー群として従来から指定されているアスペルギルス属のセクションを意味し、典型的に、Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１年）Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  ６９：１−１７頁に記載されている２６種を含み、５つの主たるクレードに分類される。クレード  Ａ．ニガーは、Ａ．ネオニガー、Ａ．コスタリカエンシス（Ａ．ｃｏｓｔａｒｉｃａｅｎｓｉｓ）、Ａ．バデンシス（Ａ．ｖａｄｅｎｓｉｓ）、Ａ．ユーカリプチコラ（Ａ．ｅｕｃａｌｙｐｔｉｃｏｌａ）、Ａ．ピペリス（Ａ．ｐｉｐｅｒｉｓ）、Ａ．アシダス（Ａ．ａｃｉｄｕｓ）、Ａ．ツビンゲンシス、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．ニガーおよびＡ．ブラジリエンシス（Ａ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）の種を含む。クレード  Ａ．カーボナリウス（Ａ．ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓ）は、Ａ．イベリカス（Ａ．ｉｂｅｒｉｃｕｓ）、Ａ．スクレロチカーボナリウス（Ａ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｉｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓ）、Ａ．カーボナリウスおよびＡ．スクレロチオニガー（Ａ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｎｉｇｅｒ）の種を含む。クレード  Ａ．ヘテロモルファス（Ａ．ｈｅｔｅｒｏｍｏｒｐｈｕｓ）は、Ａ．エリプティカス（Ａ．ｅｌｌｉｐｔｉｃｕｓ）およびＡ．ヘテロモルファスの種を含む。クレード  Ａ．ホモモルファス（Ａ．ｈｏｍｏｍｏｒｐｈｕｓ）は、Ａ．ホモモルファスの種を含む。クレード  Ａ．アキュレータス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）は、Ａ．フィジエンシス（Ａ．ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ）、Ａ．アキュレータス、Ａ．アキュレアティヌス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｉｎｕｓ）、Ａ．ウバルム（Ａ．ｕｖａｒｕｍ）、Ａ．インドロゲネス（Ａ．ｉｎｄｏｌｏｇｅｎｕｓ）、Ａ．ジャポニカス（ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）およびＡ．ヴィオラセオファスカス（Ａ．ｖｉｏｌａｃｅｏｆｕｓｃｕｓ）の種を含む。好ましくは、本発明の範囲内で使用されるアスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株は、クレード  Ａ．ニガーの菌株である。特定の実施の形態では、本発明の範囲内で使用されるアスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株は、Ａ．ツビンゲンシスの菌株ではないクレード  Ａ．ニガーの菌株である。
【００５０】
上記に示したように、クレード  Ａ．ニガーは３つのサブクレードに分類される１０種を含む。サブクレード  Ａ．ツビンゲンシスは、Ａ．ネオニガー、Ａ．コスタリカエンシス、Ａ．バデンシス、Ａ．ユーカリプチコラ、Ａ．ピペリス、Ａ．アシダスおよびＡ．ツビンゲンシスの種を含む。サブクレード  Ａ．ニガーは、Ａ．アワモリおよびＡ．ニガーの種を含む。サブクレード  Ａ．ブラジリエンシスは、Ａ．ブラジリエンシスの種を含む。好ましくは、本発明の範囲内で使用されるアスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株は、サブクレード  Ａ．ツビンゲンシスの菌株である。本発明の特定の実施の形態では、本発明の範囲内で使用されるアスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株は、Ａ．ツビンゲンシスの菌株ではないサブクレード  Ａ．ツビンゲンシスの菌株である。より好ましくは、本発明の範囲内で使用されるアスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株は、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株またはアスペルギルス  ネオニガーの菌株であり、更により好ましくはアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株である。
【００５１】
「アスペルギルス  ツビンゲンシス」は、ここでは、アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉのメンバーを意味し、そのうちの特徴的な菌株は、Ｌａ  Ｃｅｌｌｕｌｅ（１９３４年）４３：２４５−２４７頁に記載されている、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙの菌株である。当該菌株は、腐生性であり多くの複雑な天然基質上で成育でき、地上に偏在しており、黒色分生胞子を産生する糸状菌である。アスペルギルス  ツビンゲンシスは、労働での生物学的物質に関連するリスクに対する労働者保護に関する指令２０００／５４／ＥＣの附属書ＩＩＩの病原性物質リストには挙がっていない。
【００５２】
アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株の例は当業者に周知であり、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−８１、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−８３、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−８４、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−４８７９、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−７７、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−７８、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−７９、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−８２、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ＭＹＡ−８０、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  １０５５０、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ７６６０８、および、アスペルギルス  ツビンゲンシス  Ｍｏｓｓｅｒａｙ  ＡＴＣＣ  ２０１２５５を含む。
【００５３】
「アスペルギルス  ネオニガー」は、ここでは、アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉのメンバーを意味し、そのうちの特徴的な菌株は、Ｖａｒｇａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１年）Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  ６９：１−１７頁に記載されている、アスペルギルス  ネオニガー  Ｖａｒｇａの菌株である。
【００５４】
アスペルギルス  ネオニガーの菌株の例は当業者に周知であり、アスペルギルス  ネオニガー  ＣＢＳ  １１５６５６またはＮＲＲＬ  ６２６３４、および、アスペルギルス  ネオニガー  ＣＢＳ  １１５６５７を含む。
【００５５】
好ましくは、上記の基質は、低温殺菌または滅菌するために、発酵前に前処理される。加熱処理は、例えばオートクレーブ内における加熱からなり得る。従って、基質は、９０℃と１２５℃との間の温度、好ましくは９５℃と１１５℃との間の温度、より好ましくは１０５℃の温度で、１５から４５分間、好ましくは２０から４０分間、より好ましくは３５分間、オートクレーブ処理され得る。
【００５６】
より好ましくは、上記の基質は、乾燥物質が４０から１００％まで、好ましくは乾燥物質が４５から９０％まで、好ましくは乾燥物質が５０から８０％まで、好ましくは乾燥物質が５５から７０％まで、好ましくは乾燥物質が６０％までとなるように、予め加湿されている。
【００５７】
加熱処理の殺菌効果および所望の発酵の開始を改善するために、加湿の間にｐＨを、４．８から６．２の範囲まで、好ましくは５．０から６．０の範囲まで、好ましくは５．２から５．８の範囲まで、とりわけ好ましくは５．６に調整すると、有益である。
【００５８】
上記の基質の接種は、任意の適切な接種材料で行い得る。当業者であれば、アスペルギルス  ツビンゲンシスの選択された菌株からの適切な接種材料を調製するための複数の方法を知っている。接種用量は、基質の初期乾燥物質１ｇ当たり少なくとも１×１０７胞子とすると有益である。
【００５９】
発酵開始における基質の含水量は、基質および水の総質量の、好ましくは４０％と５０％との間に、より好ましくは４５％に調整して、そして、例えば培地の水の損失を補うため定期的に水の添加を続けることにより、好ましくは発酵中にこの間での範囲を実質的に維持する。「実質的に維持」との表現は、湿度水準の２つの連続調整の間の比較的短い期間の間または発酵の終わりに、その含湿量が４０％から５０％の間での範囲から５単位％離れている値を有することが許容される、ということを意味する。基質の湿度水準は、真菌の増殖により生じる温度上昇の影響下での蒸発により、発酵の間に実際に減少する傾向があり得る。
【００６０】
発酵は任意の適切な反応器で行うことができる。使用され得る反応器の例は、Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ（Ｍａｉ−Ｊｕｉｎ  １９９７年、３９−４２頁）で公開されているＡ．Ｄｕｒａｎｄらの記事に記載されているものでよい。
【００６１】
発酵は、１から３日間、好ましくは３０から６０時間、より好ましくは４８時間の期間で行われ得る。好ましくは、胞子の存在はそれらの揮発性の性質のために摂取時に動物を悩ませ得ることがあるため、発酵は培養培地中の最初の胞子の出現時に停止される。
【００６２】
培地の温度は、２８℃と３８℃との間、好ましくは３０℃と３６℃との間、より好ましくは３３℃に、好ましくは維持される。
【００６３】
好ましくは、発酵は、好気的条件下で、および好ましくは暗所で行われる。
【００６４】
これによって得られた発酵産物は、湿った固体産物である。これを、酵素活性に影響を及ぼさないように、好ましくは中程度の温度、例えば４５℃未満で、乾燥または脱水してもよい。乾燥または脱水は、流動床、凍結乾燥、蒸気処理、真空での蒸気処理またはゼオドレーションの使用等の、当業者に周知の任意の適切な技術で実行することができる。
【００６５】
また、低温、例えば−２０℃で、好ましくは湿った状態において凍結させてもよい。
【００６６】
発酵産物はまた、水中で抽出して、当業者に周知の任意の適切な技術によって液体形態で回収することができる。発酵産物の抽出は、当業者に周知の任意の技術によって、特に水溶液中での抽出、アルコール溶液中での抽出、溶媒を用いた抽出、高圧均質化、超臨界抽出、流動床を用いた抽出、粉砕、極低温粉砕、減圧、キャビテーション、バブリング、超音波を用いた抽出、樹脂またはゼオライトでの吸着によって、実行することができる。液体形態の酵素（１または複数）は、その後、当業者に周知の任意の技術によって、特に遠心分離、濾過、限外濾過、クロマトグラフィー、膜の使用または沈殿によって、精製することができる。
【００６７】
本発明の酵素組成物は、添加物中のその使用に適した任意の形態としてもよい。好ましくは、抽出されていない粗製の形態である。
【００６８】
「粗製の形態」は、ここでは、上記の酵素活性、発酵された基質、および、アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉ菌、特に上記のアスペルギルス  ツビンゲンシス菌を含む発酵培地を意味する。アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株、特にアスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株による基質の発酵後の発酵培地は、本発明の酵素組成物において直接的に使用される前に、特に脱水および／または粉砕され得る。この粉砕は、微細化、せん断での粉砕、衝撃による粉砕、低温ミリングまたは細片化等の、当業者に周知の任意の適切な技術によって実行することができる。
【００６９】
本発明の酵素組成物は、更に標準化してもよい。そのような標準化は、組成物の優れた均質化を確保し、飼料製造の工程の間におけるその使用を容易にすることができ、有益である。
【００７０】
「反芻動物の飼料用の添加物」
本発明は、上記の「反芻動物」のセクションに規定する反芻動物の飼料用の添加物、好ましくは非薬用添加物に関し、この添加物は、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物を含むか、実質的にそれから構成されるか、またはそれから構成される。
【００７１】
「添加物」は、ここでは、動物の飼料、配合飼料または食餌に添加され得るか、または動物に摂取されるように与えられ得る成分または成分の混合物を意味する。
【００７２】
本発明の添加物は、プロテアーゼ、フィターゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼおよび／またはペクチナーゼ等の追加の酵素だけでなく、生理学的に許容される担体、安定剤、酸化防止剤または防腐剤等の追加の原料を更に含んでもよい。
【００７３】
本発明の添加物は、その後の使用に適した任意の形態、特に液体、粉末または顆粒の形態とすることができる。
【００７４】
本発明の添加物は、上記の「反芻動物」のセクションに規定する反芻動物の飼料用の飼料組成物またはプレミックスの原料、特に非薬用原料として、使用されてもよい。
【００７５】
「プレミックス」
「プレミックス」は、ここでは、反芻動物の完全飼料を構成させるために異なる原材料に低い割合で添加される、酵素と、任意での微量元素、ビタミンおよびミネラルとの濃厚飼料を意味する。
【００７６】
酵素活性を標準化して、標的動物でのその使用を容易にするために、プレミックスは、好ましくは上記の「添加物」のセクションに規定する添加物をベースとした希釈物または堆積物から構成されている。
【００７７】
このように、本発明は、上記の「反芻動物」のセクションに規定する反芻動物の飼料用のプレミックスに関し、プレミックスは、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物を含む。
【００７８】
本発明のプレミックスは、動物、特に反芻動物の飼料中に従来的に使用されている他の添加物を含んでもよい。
【００７９】
そのような添加物は当業者に周知であり、防腐剤、抗酸化剤、乳化剤、安定剤、増粘剤、ゲル化剤、結合剤、放射性核種の汚染制御用物質、抗凝集剤、酸性度（ｐＨ）調整剤、サイレージ用添加物、変性剤等の工学的添加剤を含み、着色剤（動物用の飼料に色をドーピングするか色を変化させる、動物の飼料中に含まれる物質であって、これらの動物から産生される食品に色を与え得る物質）、芳香物質等の感覚的添加物を含み、ビタミン、プロビタミン、オメガ３脂肪酸、類似した効果を有する化学的によく定義された物質、微量元素の化合物、アミノ酸、尿素等の栄養添加物を含み、酵素類の消化率改善剤、腸内細菌叢の安定化剤、環境に改善効果を有する物質等の脂肪酸および畜産学的添加物を含む。
【００８０】
１つの例では、本発明のプレミックスは次の組成物を有し得る。
・本発明の酵素組成物  ０．３−３％。
・ビタミン類（Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、ニコチン酸等）の混合物  ０．１−１％。
・鉱物塩（ＣａＨＰＯ４、ＣａＣＯ３、ＮａＣｌ、ＣｕＯ、ＭｎＯ、ＦｅＳＯ４、ＺｎＯ等）  ０−９９．６％。
・穀物由来の物質（ふすま、リモールディング、飼料用小麦粉、トウモロコシの穂軸、大麦細根等）  ０−９９．６％。
【００８１】
本発明のプレミックスは、その後の使用のために適合する任意の形態、特に液体、粉末または顆粒の形態であり得る。
【００８２】
「飼料組成物」
本発明はまた、上記の「反芻動物」のセクションに規定する反芻動物用の補充された飼料組成物に関し、この補充された飼料組成物は、上記の「反芻動物」のセクションに規定する反芻動物に適した飼料と一緒に、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物の有効量または上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスの有効量を含む。
【００８３】
反芻動物に適した飼料は当業者に周知であり、例えば、油糧種子ケーキ、シロップ、ならびに、尿素とその誘導体（ビウレット、ウレイド）およびアンモニア塩等の窒素含有飼料材料だけでなく、牧草、他のかいば牧草、飼料用穀物類（大麦、トウモロコシ、オート麦、小麦、モロコシ、大豆、ライ麦）、マメ科植物類（エンドウ、ソラマメ、ルピナス、大豆、ルツェルン、イガマメ、クローバー）、根類、塊茎、それらの副産物（ビート、ビートパルプ、ポテト、ポテトパルプ等）、キャベツ、菜種、ヒマワリ、野菜くず（上部、茎、穀物の外被、ふすま、トウモロコシの穂軸の外皮、バガス）、農業食品産業（デンプン製造、デンプン生産、エタノールプラント、ビール醸造、粉砕等）のデンプン類副産物、等の、任意の種類の飼料の全ての形態（蔬菜、脱水、サイレージ、凝集等）を含む。
【００８４】
好ましくは、本発明の範囲内で使用される反芻動物に適した飼料は、好ましくは乾草、藁、牧草または穀物サイレージ等の他の飼料と一緒に、好ましくは穀物、油糧種子ケーキまたは構成飼料等の濃厚飼料で補充され、好ましくは毎日において、好ましくは摂取される乾燥物質の１０％から５０％までがトウモロコシサイレージで典型的に示される飼料を含む。
【００８５】
反芻動物用の配合飼料は、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物を、特に次のように含み得る。
・湿った飼料、乾燥させた飼料、または乾燥飼料を、０％から１００％まで、好ましくは４０％から７０％までの範囲の割合において含む。
・濃厚飼料（濃縮させた原材料または構成飼料）を、０％から１００％まで、好ましくは３０％から６０％までの範囲の割合において含む。
【００８６】
好ましくは、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物または上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスは、下記の「１日当たりの有効用量」のセクションに規定する１日当たりの有効用量が動物に供給されるような量において、飼料組成物中に存在する。
【００８７】
本発明の飼料組成物は、反芻動物、特に家畜反芻動物の飼料用の任意の適切な形態であり得る。特に、フレーク、顆粒、クラムまたは粉の形態にすることができる。
【００８８】
本発明はまた、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物または上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスを、上記の反芻動物、特に家畜反芻動物に適切な飼料と混合する工程を含む、上記の反芻動物用の補充された飼料組成物の製造方法に関する。
【００８９】
添加物またはプレミックスを飼料と混合する工程は、当業者に周知の任意の技術により実行することができる。
【００９０】
本発明の飼料組成物の製造方法は、調整工程だけでなく、飼料組成物の製剤化工程を更に含んでもよい。これらの工程は、当業者に周知の任意の従来の技術により実行することができる。従って、添加物またはプレミックスは、それらが粉末形態である場合は、製剤化（または混合）工程の時点において飼料に添加され得るし、またはそれらが液体形態である場合は、飼料の顆粒化後に噴霧され得る。
【００９１】
「１日当たりの有効用量（有効量）」
上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物は、標的動物に酵素活性の有効量を供給するように製剤化される。添加物、プレミックスまたは飼料組成物の製剤化は、とりわけ混合、希釈、担体への堆積、顆粒への噴霧もしくは粉末付与、または、動物への直接配給等の当業者に周知な任意の技術を用いて実行され得る。
【００９２】
適用される製剤は標的動物に依存し、好ましくはβ−グルカナーゼ活性の水準によって決められ得る。
【００９３】
１日当たりの有効用量は典型的に次の通りである。
・乳牛：２２５０から９０００ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日、好ましくは４５００ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日。
・肥育用牛：２２５０から９０００ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日、好ましくは５００ｋｇの生体重までで２２５０ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日および５００ｋｇの生体重超で３３７５ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日。
【００９４】
他の種類の反芻動物の１日当たりの有効用量は、特に生体重に応じて、代謝生体重（ＰＶ０．７５）に応じて、第一胃の容積に応じて、１日当たりの摂取乾燥物質の総量に応じて等の当業者に周知な技術手法によって、乳牛または肥育用牛と比較することで当業者であれば計算することができ、特に生体重が１００ｋｇ未満の動物では、最小量が好ましくは１１２５ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日である。
【００９５】
「畜産学的性能を増大させるための使用」
本発明者らは、乳牛または肥育用牛の配合飼料への本発明の酵素組成物の補充が、畜産学的性能を顕著に増大させ得、特に、生産された乳バター水準および乳タンパク質水準を含む乳生産量を改善し、体重増加を増大させ、反芻活動を増加させ、食品効率および消費指数を改善し、飼料摂取能力を増加させ、飼料および／または濃厚飼料の消化率を増加させ、ならびに、メタン生成を減少させ得るということを示した。
【００９６】
従って、本発明の目的はまた、上記の「反芻動物」のセクションに規定する反芻動物の畜産学的性能を増大させるための、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物の使用である。
【００９７】
「畜産学的性能」は、ここでは、動物の品質、特に様々な機能についてのその生物学的能力（成育、働き、繁殖．．．）を評価することができる指標を意味する。畜産学的性能は、動物の体重増加、特に１日当たりの平均体重増加、その消費指数または食品効率、典型年齢での体重、枝肉収量、枝肉重量、枝肉構造、食物摂取量、飼料摂取能力、飼料および／もしくは濃厚飼料の消化率、乳生産量、乳タンパク質水準、乳脂肪水準、反芻活動、メタンの生成、産子数、または、毛生産を特に含む。好ましくは、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物は、上記の「反芻動物」のセクションに規定する反芻動物において、体重増加の促進、消費指数の改善、食物摂取量の促進、枝肉収量、枝肉重量、枝肉構造、乳生産量、乳タンパク質水準、乳脂肪水準、産子数および／もしくは毛生産の改善、反芻活動の増加、飼料摂取能力の増加、飼料および／もしくは濃厚飼料の消化率の増加、ならびに／または、メタン生成の減少を可能とする。より好ましくは、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物は、上記の「反芻動物」のセクションに規定する反芻動物において、乳生産量の増加、消費指数の改善、体重増加の促進、反芻活動の増加、飼料摂取能力の増加、飼料および／もしくは濃厚飼料の消化率の増加、ならびに／または、メタン生成の減少を可能とする。とりわけ好ましくは、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物は、上記の「反芻動物」のセクションに規定する反芻動物において、乳生産量の増加、消費指数の改善、体重増加の促進、および／または、反芻活動の増加を可能とする。
【００９８】
「体重増加」または「１日当たりの平均（体重）増加」は、ここでは、ｇ／日で表される、動物の体重増加における進化を意味する。
【００９９】
「消費指数」は、ここでは、食物変換の効率を意味する。この指数は、肥育用反芻動物の場合には、消費される飼料の量と生体重増加との間の比率によって、および、乳生産反芻動物の場合には、消費される飼料の量と乳生産量との間の比率によって決定される。
【０１００】
「食品効率」は、ここでは、産物への反芻動物の配合飼料の変換の測定を意味する。これは、上記の消費指数の逆の比率である。
【０１０１】
「典型年齢での体重」は、ここでは、比較を容易にし得る基準年齢（例えば１年または１８ヶ月）での動物の重量を意味する。
【０１０２】
「枝肉収量」は、ここでは、「実際の収量」を推定可能とする枝肉の重量と動物の生重量との間の比率を意味する。
【０１０３】
「枝肉重量」は、ここでは、冷却後の枝肉の重量を意味する。
【０１０４】
「食物摂取量」は、ここでは、動物に摂取される飼料の量を意味する。
【０１０５】
「飼料摂取能力」は、ここでは、動物に自発的に摂取される飼料の量を意味する。
【０１０６】
「飼料および／または（および／もしくは）濃厚飼料の消化率」は、ここでは、動物に効果的に保持されるか、または消化される飼料および／または濃厚飼料の割り当てを意味する。
【０１０７】
「乳生産」または「乳生産量」は、ここでは、容量単位または重量単位で表される１日当たりに産生される乳量を意味する。本発明の文脈において、乳生産量の改善は、産生される乳量の増加によって表され得るが、乳バター水準および／または乳タンパク質水準の改善によってもまた表され得る。
【０１０８】
「乳タンパク質水準」は、ここでは、乳中に含まれているタンパク質物質の量を意味する。
【０１０９】
「乳脂肪水準」は、ここでは、乳中に含まれている脂肪の量を意味する。
【０１１０】
「産子数」は、ここでは、子、すなわち、生まれてすぐの子の出生数および出生時の重量を意味する。
【０１１１】
「反芻活動」は、ここでは、食塊の咀嚼にあてる１日当たりの分単位の時間を意味する。
【０１１２】
「毛生産」は、ここでは、毛用に繁殖させた哺乳動物（例えばカシミヤヤギ）によって生産される毛の量を意味する。
【０１１３】
好ましくは、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物は、上記の「反芻動物」のセクションに規定する反芻動物において、有意な方法で、乳生産量の改善、特に乳バター水準および／または乳タンパク質水準の改善、消費指数または食品効率の改善、体重増加の促進、反芻活動の改善、飼料摂取能力の増加、飼料および／もしくは濃厚飼料の消化率の増加、ならびに／または、メタン生成の減少を可能とする。
【０１１４】
具体的には、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物は、トウモロコシサイレージを含む飼料、好ましくは藁または乾草等のかいば、油糧種子ケーキ、ビートパルプおよび窒素含有エネルギー源濃厚飼料を含む飼料を、好ましくは上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物が４５００ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日で供給されるように当該飼料に存在させて、反芻動物、特にウシ科動物、好ましくは乳牛に供給すると、１％から５％、好ましくは３％乳生産量を改善するか、および／または、０．５％から１．５％、好ましくは１％、乳タンパク質水準を改善することができる。
【０１１５】
具体的には、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物はまた、トウモロコシサイレージを含む飼料、好ましくはトウモロコシサイレージおよび窒素含有エネルギー源濃厚飼料を含む飼料を、好ましくは上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物が５００ｋｇまでの生体重で２２５０ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日および５００ｋｇ超の生体重で３３７５ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日で供給されるように当該飼料に存在させて、反芻動物、特にウシ科動物、好ましくは肥育用牛に供給すると、１％から１５％まで、好ましくは１０％、体重増加を改善することができる。
【０１１６】
具体的には、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物はまた、トウモロコシサイレージを含む飼料、好ましくはトウモロコシサイレージおよび窒素含有エネルギー源濃厚飼料を含む飼料を、好ましくは上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物が４５００ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日で供給されるように当該飼料に存在させて、反芻動物、特にウシ科動物、好ましくは乳牛に供給すると、５％から１５％、好ましくは８％から１１％、反芻活動を増加させることができる。
【０１１７】
具体的には、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物はまた、牧乾草、トウモロコシサイレージおよび／または牧草サイレージを含む飼料、好ましくは牧乾草を含む飼料を、好ましくは上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物が３３７５ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日で供給されるように当該飼料に存在させて、反芻動物、特にウシ科動物、好ましくは淘汰牛に供給すると、０．５％から９％、好ましくは２．５％から８％、メタン生成を減少することができる。
【０１１８】
上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物は、更に、それらを投与した反芻動物または反芻動物の群の優れた一般的な状況を維持することができ、特に農業従事者に許容される群の生殖能、罹患率および／または死亡率を維持することができ、また、この生殖能を促進して、ならびに／またはこの罹患率および／もしくはこの死亡率を減少させることさえもできる。
【０１１９】
本発明はまた、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物、上記の「添加物」のセクションに規定する添加物、上記の「プレミックス」のセクションに規定するプレミックスまたは上記の「飼料組成物」のセクションに規定する飼料組成物の有効量を、好ましくは配合飼料で反芻動物に摂取させることを特徴とする反芻動物の畜産学的性能を増大させる方法に関する。
【０１２０】
「有効量」は、ここでは、上記の畜産学的性能を増大させ得る、プレミックス、飼料組成物または添加物中に任意で存在する酵素組成物の量を意味する。当業者であれば明らかであるように、この量は、関連反芻動物、その年齢、その性別、その遺伝子型、その生理学的段階、その重量、その期待される性能水準およびその配合飼料に依存するだろう。
【０１２１】
典型的には、ウシ科動物の場合、摂取される有効量は、摂取されるβ−グルカナーゼ活性が、乳牛では２２５０ＢＧＵ／日と９０００ＢＧＵ／日との間、好ましくは４５００ＢＧＵ／日で含まれ、肥育用牛では２２５０ＢＧＵ／日と９０００ＢＧＵ／日との間、好ましくは５００ｋｇまでの生体重を有する肥育用牛では２２５０ＢＧＵ／日、および、５００ｋｇ超の生体重を有する肥育用牛では３３７５ＢＧＵ／日で含まれるような量である。
【０１２２】
一般的に、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物は、例えば毎日、隔週、毎週または隔月のリズムによる、時間的に広がる連続摂取の形で反芻動物に供給される。好ましくは、反芻動物は、毎日の用量によって上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物の有効量を摂取させられる。
【０１２３】
放牧によって専ら飼料を供給される反芻動物では、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物は、好ましくはそれらの主たる飼料とは別々に供給されるだろう。
【０１２４】
新鮮な飼料または保存飼料（例えば乾草）、あるいは濃厚飼料を含む他の産業用飼料を供給される反芻動物では、上記の「酵素組成物」のセクションに規定する酵素組成物は、これらの飼料との混合物の形で、またはこれらの飼料とは別々の形で供給され得る。
【０１２５】
本発明は、以下の実施例でより詳細に説明されるだろう。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：固体発酵による本発明の酵素組成物の製造
【０１２７】
この実施例では、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株の存在下での、菜種ケーキおよび小麦ふすまの混合物の固体発酵による、本発明の酵素組成物を得るための方法を記載する。
【０１２８】
栄養培地は、重量で７／３の割合において、粉末での菜種ケーキと小麦ふすまとの混合物で形成した。次いで、この混合物を乾燥物質６０％となるまで予め加湿して、１０５℃で３５分間オートクレーブ処理した。冷却後、乾燥物質１ｇ当たり１×１０７胞子濃度および４５％の初期湿度を得るために、培地にアスペルギルス  ツビンゲンシスの胞子溶液を接種した。ｐＨは硫酸を添加することにより４．９に調整した。これによって得られた培養培地を、１バイアル当たり乾燥物質１０ｇの量で三角バイアル中に分配した。その後、三角バイアルを攪拌することなく４８時間暗所にて好気的条件下で３３℃においてインキュベートした。培養培地中の最初の胞子の発生時に培養を停止した（胞子の存在はその揮発性のために摂取の間に動物を悩ませ得るので、発酵産物は可能な限り最小量の胞子を含むように設計される）。
【０１２９】
発酵の終わりに得られた混合物は乾燥させて動物の飼料にそのまま使用してもよいし、または液体形態で添加されるように水中に抽出してもよい。
【０１３０】
実施例２：乳牛の生産性能についての本発明の酵素組成物の効果の測定
【０１３１】
この実施例では、高生産性乳牛の群の生産性能についての本発明の酵素組成物の効果を記載する。
【０１３２】
材料および方法
Ｐｒｉｍ’Ｈｏｌｓｔｅｉｎ品種の３８頭の高生産性乳牛を２つのグループに分けて、互いにペアを作った。それらのバッチングは、乳生産量、乳タンパク質水準、乳脂肪水準、乳汁分泌ランク、生体重、を基準に行った。
【０１３３】
動物には、トウモロコシエンシレージの乾燥材料（ｄｒｙ  ｍａｔｅｒｉａｌ、以下ＤＭともいう）９．５ｋｇ、繊維質飼料（藁とルツェルン（長い束））のＤＭ２．１ｋｇ、窒素含有調整剤（表１に記載の組成物）のＤＭ４．９ｋｇ、製造飼料（表１に記載の組成物）８．０ｋｇから構成される混合配合飼料を与えた。
【０１３４】
実施例１に記載の方法により得られた酵素組成物を、組成物の優れた均質性を確保して飼料製造の工程の間でのその使用を容易にするために、プレミックスとして標準化した。これにより標準化されたプレミックスを、４５００ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日で供給するために、０．２５％の量で製造飼料中へ取り入れた。これによって標準化されたプレミックスの特徴は、１３０ＡＸＣ／ｇ、２９０ＢＧＵ／ｇおよび３５ＣＭＣ／ｇである。テスト期間は８週間である。
【０１３５】
モノプロピレングリコールを含む飼料（Ｓａｎｄｉ＋、エネルギー源）１ｋｇ／日での供給により、牛に３０日未満での乳分泌が達成される。
【０１３６】
配合飼料の平均特徴は（％／乾燥物質）、合計で、窒素含有物質１７．７％、中性デタージェント不溶性繊維（ＮＤＦ）３５．８％、および、デンプン１７．６％、である。
【０１３７】
【表１】
0006667454.tif 000002
【０１３８】
動物のバッチの特徴を表２に記載する。
【表２】
0006667454.tif 000003
【０１３９】
結果
両グループの生産結果を表３に詳述する。
【表３】
0006667454.tif 000004
【０１４０】
本発明者らは、酵素組成物の提供は多くの基準について非常に顕著な効果を有することを見出した。
・乳生産量における顕著な増加。
・タンパク質水準における顕著な増加（＋０．３ｇ／ｋｇ）と生産されるタンパク質物質における顕著な増加。
・ＭＰ７％（水準で調整された乳生産量＝ＭＰ＊（ＢＬ＋ＰＬ）／７０）における顕著な増加（＋０．７ｋｇ）。
【０１４１】
これらの効果は摂取される乾燥物質の増加を伴わず、従って、より優れた食品効率（乳生産量／摂取される乾燥物質）を示す。
【０１４２】
この実施例は、本発明の酵素組成物の提供により、乳生産量の畜産学的性能の改善および高生産性乳牛の配合飼料の優れた価格設定を可能にすることを示している。
【０１４３】
実施例３：肥育用牛の成育性能についての本発明の酵素組成物の効果の測定
【０１４４】
この実施例では、肥育用牛の成育性能についての本発明の酵素組成物の効果を記載する。
【０１４５】
材料および方法
Ｃｈａｒｏｌａｉｓ品種の４０頭の肥育用牛を２つのグループに分けた。バッチングは、生体重の基準について行った。
【０１４６】
動物には、表４に詳述する組成である混合完全配合飼料を与えた。
【０１４７】
実施例１に記載の方法により得られた酵素組成物を、組成物の優れた均質性を確保して動物への分配工程の間でのその使用を容易にするために、プレミックスとして標準化した。これにより標準化されたプレミックスを、９０００ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日で供給するために、混合完全配合飼料中へ取り入れた。これによって標準化されたプレミックスの特徴は、８０ＡＸＣ／ｇ、１５０ＢＧＵ／ｇおよび１７ＣＭＣ／ｇである。テストは１０ヶ月にわたり続けた。
【０１４８】
【表４】
0006667454.tif 000005
【０１４９】
結果
両グループの生産結果を表５に詳述する。
【表５】
0006667454.tif 000006
【０１５０】
本発明者らは、肥育用の若い牛の飼料中に酵素組成物を添加することによって、１日平均体重増加（ＤＡＷＧ）を１０％改善し得ることを見出した。これは、食肉処理時の枝肉重量に表れており、本発明の酵素組成物を補充した動物のバッチで２％改善されている。
【０１５１】
この実施例は、本発明の酵素組成物の提供により、肥育用牛の成育の畜産学的性能を改善できることを示している。
【０１５２】
実施例４：乳牛の生産性能および反芻活動についての本発明の酵素組成物の効果の測定
【０１５３】
この実施例では、高生産性乳牛の群の生産性能および動物の反芻活動についての本発明の酵素組成物の効果を記載する。
【０１５４】
材料および方法
Ｐｒｉｍ’Ｈｏｌｓｔｅｉｎ品種の３６頭の高生産性乳牛を２つのグループに分けた。動物のバッチングは、乳生産量、生体重、乳汁分泌ランクおよび乳汁分泌日数期間を基準に行った。テストは８５日間にわたり続けた。
【０１５５】
動物には、主に、トウモロコシサイレージ、ルツェルン乾草、ライグラス乾草、コーングルテン飼料、製造濃厚飼料および水からなる混合完全配合飼料を与えた。組成の詳細は表６に示す。
【０１５６】
実施例１に記載の製造方法により調製した酵素組成物を、組成物の優れた均質性を確保して、動物への分配（トップフィーディングでの分配）工程の間でのその使用を容易にするために、プレミックスとして標準化した。得られたプレミックスを、４５００ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日で供給するように、総配合飼料中に混合した。これによって標準化されたプレミックスの特徴は、４００ＡＸＣ／ｇ、２７０ＢＧＵ／ｇおよび６９ＣＭＣ／ｇである。
【０１５７】
３６頭の牛の反芻活動を、音響検出器（ＲｕｍｉｎＡｃｔ、Ｍｉｌｋｌｉｎｅ、イタリア）で毎日記録した。
【表６】
0006667454.tif 000007
【０１５８】
混合完全配合飼料の栄養価を分析すると、乾燥物質４８．６９％、粗製のタンパク質：１５．７５％／乾燥物質（ドライ）、脂肪：２．７０％／乾燥物質、粗製のセルロース：１８．４５％／ドライ、ＮＤＦ：３７．８６％／ドライ、ＡＤＦ：２１．１５％／ドライ、および、デンプン：２５．５７％／ドライ、であった。
【０１５９】
このテストの間、両方のバッチの間に摂取の差異はなかった。
【０１６０】
結果
両グループの乳生産量結果を表７に詳述する。
【表７】
0006667454.tif 000008
【０１６１】
乳生産量は、乳汁分泌段階でのテストの間では減少した。テストの間、本発明の酵素組成物を受けるバッチは、コントロールグループと比較すると、動物１頭当たり、および１日当たり乳＋１．５ｋｇの乳生産量における改善を示した。
【０１６２】
乳組成（脂肪およびタンパク質）の結果を表８に詳述する。
【表８】
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【０１６３】
テストの間、コントロールグループではバター水準が安定して維持されていたが、その一方、（本発明の酵素組成物を補充された）処置グループでは増加していた。バター水準は、コントロールの牛のバッチよりも処置された牛のバッチにおいて常により高くなっていた。８５日のテスト後、処置グループの牛は、コントロールグループの牛のものよりも０．１２ポイント大きいバター水準を有していた。
【０１６４】
テストの間、乳タンパク質水準は、コントロールグループよりも処置グループにおいて、より速く増加した。統計的には、Ｄ５３およびＤ６９での、それぞれ＋０．２１および＋０．１７ポイントのタンパク質水準の顕著な増加を本発明者らは見出した。これはまた、（テストの終わりでの＋０．０８ｋｇ／日の）タンパク質のより大きな排出によっても表れている。
【０１６５】
反芻活動は乳牛の代謝活動のために非常に重要なものであり、動物の健康を監視するための有用なツールとなり得る。反芻は唾液の生成を刺激し、従って、第一胃内のセルロース分解活性のための最適な条件を確保する。
【０１６６】
１日平均反芻活動データを表９に示す。反芻活動は、動物１頭当たり、および１日当たりでの反芻の分単位の時間で表される。
【表９】
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【０１６７】
両グループはテストの開始時にはいかなる統計的差異も示していない（コントロールグループと処置グループとで、それぞれ、５００．６分／動物（１頭当たり）／日と５１１．６分／動物（１頭当たり）／日）。それにもかかわらず、テスト１６日後、反芻活動は処置バッチにおいて、数値的に増加する。テストの最後の期間（Ｄ６９−Ｄ８５）では、交互作用（処置×期間）が有意であり（Ｐ＝０．０１３２）、コントロールグループの反芻活動よりも処置グループの反芻活動が大きい（＋５２．２分／動物（１頭当たり）／日）。期間Ｄ２１−Ｄ８５にわたる統計分析でも同様に交互作用効果が示されており、処置グループの牛において＋３９分／動物（１頭当たり）／日の反芻活動である。
【０１６８】
この実施例は、本発明の酵素組成物の提供により、乳生産（毎日の乳生産量、乳タンパク質および乳脂肪の生産）の畜産学的性能の改善、高生産性乳牛の配合飼料の優れた価格設定、および、改善された反芻活動を可能にすることを実証している。
【０１６９】
実施例５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの第一胃発酵（気体放出）についての本発明の酵素組成物の効果の測定
【０１７０】
この実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの第一胃発酵、特に気体の放出、とりわけメタン生成についての本発明の酵素組成物の効果を記載する。
【０１７１】
材料および方法
動物
第一胃にカニューレを挿入した２頭の淘汰牛を使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験期間の全体の間、動物には、牧草ヘイレージ（４ｋｇ）、トウモロコシサイレージ（５ｋｇ／ｄ）、刻み藁（１ｋｇ）および濃厚飼料（１ｋｇ）の混合物を与えた。
【０１７２】
原料
牧乾草、牧草サイレージ、トウモロコシサイレージおよび大豆ケーキの４つの飼料においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで実験した。実験原料の化学組成を表１０に示す。
【表１０】
0006667454.tif 000011
【０１７３】
これらの異なる原料は凍結乾燥して、実験室用粉砕機を用いて１ｍｍまで粉砕した。
【０１７４】
アスペルギルス  ネオニガーの菌株を使用して実施例１に記載の製造方法により調製した酵素組成物を、組成物の優れた均質性を確保して、動物への所謂トップフィーディングでの分配工程の間でのその使用を容易にするために、プレミックスとして標準化した。得られたプレミックスを、３３７５ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日で供給するように、総配合飼料中に混合した。これによって標準化されたプレミックスの特徴は、７０ＡＸＣ／ｇ、２１３ＢＧＵ／ｇおよび２８ＣＭＣ／ｇである。
【０１７５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発酵は、ＭｅｎｋｅとＳｔｅｉｎｇａｓｓ（１９８８年）に記載された方法によって達成した。接種材料は、１／３の分量の、カニューレを挿入した２頭の牛で収集された第一胃液と、２／３の分量の、ＭｅｎｋｅとＳｔｅｉｎｇａｓｓのバッファー（Ｍｅｎｋｅ  Ｋ  Ｈ，Ｓｔｅｉｎｇａｓｓ  Ｈ．（１９８８年）Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｆｅｅｄ  ｖａｌｕｅ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇａｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｒｕｍｅｎ  ｆｌｕｉｄ．Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２８，７−５５頁）とで構成した。基質２００ｍｇを接種材料の存在下の１００ｍｌガラスシリンジ中に取り入れた。気体容量の読み取りを定期的に行った。
【０１７６】
第一胃液は、通常の飼料食を与えた動物（コントロール）と、その後、１ｇ／ｋｇ飼料（飼料１ｋｇ当たり１ｇ）の量（〜１５ｇ／動物（１頭当たり）／日）で本発明の酵素組成物を補充した食餌を３週間適用した後の同じ動物（テスト）とから採取した。
【０１７７】
実験スキームは次の通りとした。４つの基質×２つの処置（コントロールまたはテスト）×３つのシリンジ＋３つのブランク＝１シリーズ当たり２７シリンジ。メタン（ＣＨ４）およびアンモニア性窒素（Ｎ−ＮＨ３）生成を決定するために、２つのシリーズを行った（即ち５４シリンジ）。
【０１７８】
専らＣＨ４およびＮ−ＮＨ３生成のためのシリーズの発酵を２４時間にわたり行った。２４時間の終わりに、ガスクロマトグラフィーによってＣＨ４の生成を決定するために発酵ボトルの気相のサンプルを採取し、Ｎ−ＮＨ３の生成を決定するために液相のサンプルを採取した。発酵開始時には、接種材料の３つのサンプルを遠心分離し、それらのＮ−ＮＨ３含有量を分析しておいた。
【０１７９】
ＣＨ４生成は発酵させるように設定された基質のＤＭのｇ（グラム）に関連しており、その値は接種材料およびブランクによって補正した。
【０１８０】
結果
発酵の２４時間後に生成されたメタンの量の観点から、表１１に示すように、第一胃の微生物によって、飼料原材料（乾草、ヘイレージおよびトウモロコシサイレージ）について本発明の酵素組成物と一緒の場合ではより少ないメタンを生成する傾向が見られ、アンモニアのより多い使用（より低いＮＨ３含有量）が見られるようである。
【表１１】
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【０１８１】
本発明者らは、２４時間後に行われた測定（メタンおよびＮＨ３）で、第一胃の微生物によるメタン生成の減少および発酵バッファーのアンモニアのより多い使用という全ての繊維飼料（飼料：乾草、トウモロコシサイレージおよび牧草ヘイレージ）についての一貫した傾向を観察することができた。これは、発酵の最初の数時間で、本発明の酵素組成物の存在下でインキュベートされた飼料は、より細菌増殖を促進することができ、その結果、微生物由来のタンパク質およびアミノ酸の牛への優れた供給が確保され得るということを意味している。
【０１８２】
この実施例は、本発明の酵素組成物の提供により、反芻動物の第一胃に含まれる微生物によるメタン生成を減少できることを示している。
【０１８３】
実施例６：反芻動物用の飼料のｉｎ  ｓａｃｃｏでの消化率についての本発明の酵素組成物の効果の測定
【０１８４】
この実施例では、反芻動物の飼料中の種々の一般的な原材料のｉｎ  ｓａｃｃｏでの消化率についての本発明の酵素組成物の効果を記載する。
【０１８５】
材料および方法
動物
第一胃にカニューレを挿入した２頭の淘汰牛を使用した。ｉｎ  ｓａｃｃｏでの実験期間の全体の間、動物には、牧草ヘイレージ（４ｋｇ）、トウモロコシサイレージ（５ｋｇ／日）、刻み藁（１ｋｇ）および濃厚飼料（１ｋｇ）の混合物を与えた。
【０１８６】
原料
牧乾草、乾草サイレージ、トウモロコシサイレージおよび大豆ケーキの４つの飼料をｉｎ  ｓａｃｃｏで実験した。実験原料の化学組成を表１２に示す。
【表１２】
0006667454.tif 000013
【０１８７】
これらの異なる原料は凍結乾燥して、実験室用粉砕機を用いて１ｍｍまで粉砕した。
【０１８８】
アスペルギルス  ネオニガーの菌株を使用して実施例１に記載の製造方法により調製した酵素組成物を、組成物の優れた均質性を確保して、動物への所謂トップフィーディングのような分配工程の間でのその使用を容易にするために、プレミックスとして標準化した。得られたプレミックスを、３３７５ＢＧＵ／動物（１頭当たり）／日で供給するように、総配合飼料中に混合した。これによって標準化されたプレミックスの特徴は、７０ＡＸＣ／ｇ、２１３ＢＧＵ／ｇおよび２８ＣＭＣ／ｇである。
【０１８９】
動物の第一胃の代謝についての本発明の酵素組成物により誘導される変化を検討するために、ナイロンバッグでの技術を使用したｉｎ  ｓａｃｃｏでの実験を行うため、カニューレを挿入した２頭の乳が出なくなった（ｄｒｙ）乳牛を使用した（Ｏｒｓｋｏｖ，Ｅ．Ｒ．，Ｈｏｖｅｌｌ，Ｄ  ａｎｄ  Ｍｏｕｌｄ，Ｆ．Ｌ．（１９８０年）．Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｙｌｏｎ  ｂａｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ５：１９５−２１３頁）。４つのテスト飼料について、ｉｎ  ｓａｃｃｏでの消化率の２つのシリーズ、上記の飼料食を与えた動物でのシリーズ（コントロール）と、それに続けて約１ｇ／ｋｇの飼料（飼料１ｋｇ当たり約１ｇ）の量（約１５ｇ／動物（１頭当たり）／日）で本発明の酵素組成物を補充した食餌を３週間適用させた後の同じ動物でのシリーズ（テスト）とを行った。実験スキームは次の通りとした。４つの原料×２つの処置（コントロールまたはテスト）×４つのバッグ×７つの測定時間（０、３、６、９、１２、２４、４８時間）＝２２４バッグ。バッグ中の発酵飼料（０、６、１２、２４、４８時間）を、それらの粗製のタンパク質含有量、ＮＤＦ、エネルギーおよびデンプン含有量（専らトウモロコシサイレージ用のデンプン）について分析した。
【０１９０】
加水分解前後の原料の乾燥物質および粗製のタンパク質の含有量は、参照方法により決定した（メソッド９６７．０３；メソッド９８１．１０；”Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，ＡＯＡＣ，１９９０年，Ｅｄ．Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｈｅｌｒｉｃｈ）。トウモロコシサイレージのデンプン含有量は、酵素比色法により決定した（Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｌｔｄ、アイルランド）。Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔらの方法によるＮＤＦ（中性デタージェント繊維）の含有量は（Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ  Ｐ．Ｊ．，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｊ．Ｂ．，Ｌｅｗｉｓ  Ｂ．Ａ．（１９９１年）：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｆｉｂｅｒ，ｎｅｕｔｒａｌ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｆｉｂｅｒ，ａｎｄ  ｎｏｎｓｔａｒｃｈ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，７４，３５８３−３５９７頁）、ＡＮＫＯＭシステムで熱安定性アミラーゼを用いて決定した。
【０１９１】
ｉｎ  ｓａｃｃｏでの消化の終わりに、乾燥物質、タンパク質、エネルギー、ＮＤＦおよびデンプンの消化率を計算し、その値を、関連原料と補充の有無（Ｎ＝８）とによって統計的に比較した。分解動態は、ＯｒｓｋｏｖとＭｃＤｏｎａｌｄのモデル手法によってモデル化した（Ｏｒｓｋｏｖ，Ｅ．Ｒ．ａｎｄ  ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｙ．１９７９年，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｕｍｅｎ  ｗａｓ  ｅｓｔｉｍａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｆｅｅｄｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｕｍｅｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ９２：４９９−５０３頁）。牛はランダム要因とみなした。
【０１９２】
結果
カニューレを挿入した牛の第一胃内でインキュベートしたナイロンバッグ中に含まれる原料の乾燥物質の最終的な分解性は、本発明の酵素組成物の分配によって顕著に各牛について変化していなかった（表１３）。しかし、飼料に関して、特に牧草ヘイレージに関して、２４時間後の分解性が本発明の酵素組成物の存在下では０．８２０に達しているのに対し非存在下では０．６４５となっているので（Ｐ＜０．０５）、分解動態は実際に影響を受けていた。
【０１９３】
この傾向は中性デタージェント中の不溶性繊維（ＮＤＦ）の画分のより急速な分解において確認された（表１４）。事実、本発明の酵素組成物の添加は、牧草ヘイレージでのＮＤＦの２４時間後の分解性を０．３７０から０．６８５にしており（Ｐ＜０．０５）、トウモロコシおよび乾草でも同様の傾向が観察される。窒素（表１５）についてはしかしながら同様に有意差が無い（Ｐ＞０．０５）。
【０１９４】
６時間後および１２時間後の大豆中に含まれる粗製のエネルギーの分解性は、本発明の酵素組成物を補充していない牛と比べて、補充した牛の場合、大きくなっていた（０．６００および０．５４０対０．４２０および０．４９０）（表１６）。
【０１９５】
【表１３】
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【０１９６】
【表１４】
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【０１９７】
【表１５】
0006667454.tif 000016
【０１９８】
【表１６】
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【０１９９】
これらのｉｎ  ｓａｃｃｏでの分解測定で、繊維飼料での本発明の酵素組成物の重要な影響の仮説が確認される。本発明の酵素組成物は３つの繊維飼料の分解工程を加速し、牧草ヘイレージ、特にその繊維画分（ＮＤＦ）の発酵を有意に加速させる。乳牛でのこの結果は、第一胃でのかさ高さの低減および飼料の摂取能力の増加になり得る。飼料消費により食品用のニーズを満たすことに困難性を有し、その結果、飼料資源よりも高価である製造濃厚飼料による有意な方法で補充しなければならない乳汁分泌動物では、この効果は特に興味深いものとなるだろう。
【０２００】
この実施例は、本発明の酵素組成物の提供により、動物での飼料資源の優れた価格設定を可能とし、そのため、優れた食品効率を可能にすることを証明する。
【０２０１】
実施例７：オーバーフロー嫌気性反応器（ＯＡＲ）中および培養チューブ中での第一胃の微生物の代謝についての本発明の酵素組成物の効果の測定
【０２０２】
この実施例の目的は次の通りである。
１）ウシ家畜の３つの特徴的な配合飼料について、６つのオーバーフロー嫌気性反応器（ＯＡＲ）中で培養した、ウシ第一胃の微生物の代謝についての本発明の酵素組成物の効果を定量すること。ＯＡＲは二重流出での連続発酵槽である。
２）培養チューブ中における２４時間インキュベート後の揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）および気体生成物についての、粗製の酵素組成物の影響、その可溶性画分と不溶性画分の影響、および、オートクレーブ処理により不活性化した酵素組成物の影響を測定することによって、第一胃の発酵についての本発明の酵素組成物の作用機序を特定すること。
【０２０３】
材料および方法
オーバーフロー嫌気性反応器（ＯＡＲ）におけるテスト
固相および液相の更新速度をそれぞれ０．０３／時間および０．０６／時間に調整した、１Ｌの作動容積を有する６つの発酵槽を使用した。これらの発酵槽を１ｍｍ網で濾過した乳牛第一胃含有物で接種した。発酵槽のｐＨは、緩衝溶液（炭酸塩およびリン酸塩）の連続注入により６．０以上に維持する。基質（飼料）の供給は、１１時間および２３時間での設定時間に行う。測定および採取段階前の最初の５日間において発酵槽の平衡化段階を行う。
【０２０４】
本発明の酵素組成物を、配合飼料のＤＭ１ｋｇ当たり１０ｇの水準で導入する。１日毎の供給は（１つの）発酵槽当たり０．２５ｇである。実施例１に記載の製造方法により、一方で、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株を使用して（ｎｏ．１）、他方で、アスペルギルス  ネオニガーの菌株を使用して（ｎｏ．２）、酵素組成物の２つのバッチを調製した。これによって得られた酵素組成物は、次の特徴を有する。バージョンｎｏ．１では、１０３７ＡＸＣ／ｇ、１０６３ＢＧＵ／ｇおよび２６２ＣＭＣ／ｇであり、バージョンｎｏ．２では、３３９９ＡＸＣ／ｇ、３６２３ＢＧＵ／ｇおよび８４６ＣＭＣ／ｇである。両方の得られた組成物を、発酵槽へのその取り入れを容易にするために、２つのプレミックスとして標準化した。これによって標準化されたプレミックスの特徴は、バージョンｎｏ．１では、１７１ＡＸＣ／ｇ、２２５ＢＧＵ／ｇおよび６７ＣＭＣ／ｇであり、バージョンｎｏ．２では、１２２ＡＸＣ／ｇ、２８０ＢＧＵ／ｇおよび７５ＣＭＣ／ｇである。
【０２０５】
配合飼料は、等窒素および等エネルギー源の食餌が配合されるように小麦および大豆ケーキを含む。
【０２０６】
種々のテスト要因は次の通りである。
１）３つの水準での生産物要素：非存在下／酵素組成物ｎｏ．１／酵素組成物ｎｏ．２。
２）３つの水準での食餌要素：トウモロコシサイレージベース／牧草サイレージベース／オーチャードグラス乾草ベース。
【０２０７】
選択した実験計画は、それぞれ５日間の平衡化段階と２日間の測定および採取段階とを含む７日間の３つの実験期間に対応する、３つの均衡した不完全ブロックにおける計画である（表１７）。
【表１７】
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【０２０８】
テストの間に実行される測定および採取物は次の通りである。
・ｐＨ、酸化還元電位。
・発酵槽の含有物（原生動物のカウントおよび発酵概形の決定のため（ＶＦＡ、アンモニア性窒素））。
・気体（２日間で回収）（生成した容積およびその組成の測定のため）。
・流出物（２日間で回収）（配合飼料の分解産物、微生物の発酵およびタンパク質の合成のため）。
・新鮮な流出物の二重の遠心分離による微生物ペレット。
【０２０９】
採取物について次の分析を行った。
・ＶＦＡ（クロマトグラフィー）（サイレージ中、流出物中および発酵槽含有物中のもの）。
・アンモニア性窒素（特異的プローブ）。
・気体（クロマトグラフィー）。
・有機材料のＤＭ（飼料中および凍結乾燥流出物中のもの）。
・デンプン（飼料中および凍結乾燥流出物中のもの）。
・Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ法による細胞壁の区分分画（ＮＤＦ、ＡＤＦ、ＡＤＬ）（飼料中および凍結乾燥流出物中のもの）。
・窒素（Ｄｕｍａｓ法）（飼料中、凍結乾燥流出物中および微生物ペレット中のもの）。
・核酸塩基（クロマトグラフィー）（凍結乾燥流出物中および微生物ペレット中のもの）。
【０２１０】
統計分析は次の分散分析モデルを用いて行う。Ｙｉｊｋｌ＝Ｐｉ＋Ｒｊ＋Ｐｉ＊Ｒｊ＋Ｂｋ＋ｅｉｊｋｌ。ここで、Ｐ、Ｒ、Ｂおよびｅは、それぞれ、生産物要素、食餌要素、ブロックおよび実験誤差である。
【０２１１】
培養チューブでのテスト
ブチルテフロン製のセプタムで栓を取り付けた７２ｍＬの６０個の培養チューブに、最後の配合飼料の供給の１２時間後に採取した発酵槽の含有物を接種して、標準的な手順によって２４時間インキュベートした。この実験の要素は次の通りである。
１）５つの水準でのＰ（生産物）要素：非存在下／組成物ｎｏ．２／組成物ｎｏ．２の不溶性画分／組成物ｎｏ．２の液体画分（発酵基質なし）／オートクレーブ処理により不活性化した酵素組成物。組成物ｎｏ．２の液体画分は、組成物ｎｏ．２の残留物から水相に抽出された酵素に対応する。
２）３つの水準でのＲ（接種材料）要素：トウモロコシサイレージベース／牧草サイレージベース／ダクチル（ｄａｃｔｙｌ）乾草ベース、の食餌に合わせて培養チューブ中に同様の食餌を導入。
【０２１２】
本発明の酵素組成物ｎｏ．２は、配合飼料のＤＭ１ｋｇ当たり１０ｇの水準で配合飼料と一緒に導入される。
【０２１３】
実験計画は、各接種材料について２日連続の２つの期間において構成される。接種材料は、平衡化期間後、酵素組成物を導入していないＯＡＲについて採取される（ＯＡＲにおける実験計画での生産物（Ｐ）要素の水準が０となっているもの）。処置毎に（生産物と接種材料との組み合わせ毎に）、およびインキュベート１日毎に、２個の培養チューブを開始させる。
【０２１４】
テストの間に行う測定および採取物は次の通りである。
・接種材料（そのＶＦＡ組成物の決定のため）。
・チューブでの２４時間インキュベート後の培養培地（ＶＦＡ組成の決定のため）。
・気体（２４時間インキュベート後の生成量の測定およびその組成の決定のため）。
【０２１５】
採取物について次の分析を実行する。
・ＶＦＡ（クロマトグラフィー）（サイレージ中、流出物中および発酵槽含有物中のもの）。
・気体（クロマトグラフィー）。
【０２１６】
統計分析は分散分析モデルを用いて行う。
【０２１７】
この分析では、この代謝についての発酵基質の単離酵素の効果と比較した、第一胃の微生物の代謝についての本発明の酵素組成物の有益な効果が示される。
【０２１８】
実施例８：固体発酵による本発明の酵素組成物の製造
【０２１９】
この実施例では、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株の存在下での、菜種ケーキおよび小麦ふすま（主たる基質）とトウモロコシ胚芽ケーキ（付加的な基質）との混合物から構成される基質の固体発酵による、本発明の酵素組成物を得るための方法を記載する。
【０２２０】
栄養培地は、菜種ケーキ３６％、小麦ふすま３６％およびトウモロコシ胚芽ケーキ２８％での重量割合で、粉末の菜種ケーキおよび小麦ふすまの混合物で形成し、トウモロコシ胚芽ケーキで完成させる。その後、この混合物を乾燥物質６０％に予め加湿し、１０５℃で３５分間オートクレーブ処理した。冷却後、乾燥物質１ｇ当たり１×１０７胞子の濃度および初期湿度４５％を得るために、培地にアスペルギルス  ツビンゲンシスの胞子溶液を接種する。硫酸を添加することによってｐＨを４．９に調整する。これによって得られた培養培地を、１バイアル当たり乾燥物質１０ｇの量で三角バイアル中に分配する。その後、三角バイアルを攪拌することなく７２時間にわたり暗所にて３３℃の好気的条件下でインキュベートする。培養培地中の最初の胞子の発生時に培養を停止する（胞子の存在はその揮発性のために摂取の間に動物を悩ませ得るので、発酵産物は可能な限りそれらを最小量で含むように設計される）。
【０２２１】
発酵の終わりに得られた混合物は乾燥させて動物の飼料にそのまま使用してもよいし、または液体形態で添加されるように水中に抽出してもよい。
【０２２２】
これによって得られた７２時間発酵後の組成物の特徴は、２６５０ＡＸＣ／ｇ、４８０８ＢＧＵ／ｇおよび１０５０ＣＭＣ／ｇである。
【０２２３】
（付記）
（付記１）
アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株で発酵させた、小麦、小麦ふすま、菜種ケーキ、小麦と小麦ふすまとの混合物、小麦と菜種ケーキとの混合物、小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物、および、小麦と小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物からなる群から選択される主たる基質を含み、
（ｉ）組成物１ｇ当たり５００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性、
（ｉｉ）組成物１ｇ当たり５００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性、および、
（ｉｉｉ）組成物１ｇ当たり５０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性、を示す、
酵素組成物。
【０２２４】
（付記２）
前記アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株は、クレード  アスペルギルス  ニガーの菌株である、付記１に記載の酵素組成物。
【０２２５】
（付記３）
前記アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株は、サブクレード  アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株である、付記１または２に記載の酵素組成物。
【０２２６】
（付記４）
前記アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株は、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株またはアスペルギルス  ネオニガーの菌株である、付記１から３のいずれか１つに記載の酵素組成物。
【０２２７】
（付記５）
前記アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株は、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株である、付記１から４のいずれか１つに記載の酵素組成物。
【０２２８】
（付記６）
前記基質は、固体発酵により、前記アスペルギルス  セクション  Ｎｉｇｒｉの菌株で発酵される、付記１から５のいずれか１つに記載の酵素組成物。
【０２２９】
（付記７）
前記基質は、小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物からなる、付記１から６のいずれか１つに記載の酵素組成物。
【０２３０】
（付記８）
前記小麦ふすまと前記菜種ケーキとは、２０／８０から５０／５０までの範囲の質量割合である、付記７に記載の酵素組成物。
【０２３１】
（付記９）
（ｉ）組成物１ｇ当たり１０００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性、
（ｉｉ）組成物１ｇ当たり８００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性、および、
（ｉｉｉ）組成物１ｇ当たり１２０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性、を示す、
付記１から８のいずれか１つに記載の酵素組成物。
【０２３２】
（付記１０）
少なくとも、発酵産物が以下の酵素活性の最小値、
（ｉ）組成物１ｇ当たり５００ＡＸＣ以上のキシラナーゼ活性の最小値、
（ｉｉ）組成物１ｇ当たり５００ＢＧＵ以上のβ−グルカナーゼ活性の最小値、および、
（ｉｉｉ）組成物１ｇ当たり５０ＣＭＣ以上のセルラーゼ活性の最小値、を示すまで、
サブクレード  アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株で、小麦、小麦ふすま、菜種ケーキ、小麦と小麦ふすまとの混合物、小麦と菜種ケーキとの混合物、小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物、および、小麦と小麦ふすまと菜種ケーキとの混合物からなる群から選択される主たる基質を固体発酵する工程を含む、付記３に記載の酵素組成物の製造方法。
【０２３３】
（付記１１）
前記サブクレード  アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株は、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株またはアスペルギルス  ネオニガーの菌株である、付記１０に記載の製造方法。
【０２３４】
（付記１２）
前記サブクレード  アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株は、アスペルギルス  ツビンゲンシスの菌株である、付記１１に記載の製造方法。
【０２３５】
（付記１３）
付記１から９のいずれか１つに記載の酵素組成物を含む、反芻動物の飼料用の添加物。
【０２３６】
（付記１４）
反芻動物の飼料用の飼料組成物またはプレミックスの原料としての、付記１３に記載の添加物の使用。
【０２３７】
（付記１５）
付記１３に記載の添加物を含む、反芻動物の飼料用のプレミックス。
【０２３８】
（付記１６）
反芻動物に適した飼料と一緒に、付記１３に記載の添加物の有効量または付記１５に記載のプレミックスの有効量を含む、反芻動物用の補充された飼料組成物。
【０２３９】
（付記１７）
付記１３に記載の添加物または付記１５に記載のプレミックスを、反芻動物に適した飼料と混合することを含む、反芻動物用の補充された飼料組成物の製造方法。
【０２４０】
（付記１８）
付記１から９のいずれか１つに記載の酵素組成物、付記１３に記載の添加物、付記１５に記載のプレミックスまたは付記１６に記載の飼料組成物の、反芻動物の畜産学的性能を改善するための使用。
【０２４１】
（付記１９）
乳生産量の増加、消費指数および／もしくは食品効率の改善、体重増加の促進、反芻活動の増加、飼料および濃厚飼料の消化率の増加、ならびに／または、メタン生成の減少のための、付記１８に記載の使用。
【０２４２】
（付記２０）
付記１から９のいずれか１つに記載の酵素組成物の有効量、付記１３に記載の添加物の有効量、付記１５に記載のプレミックスの有効量、または、付記１６に記載の飼料組成物の有効量を、反芻動物に摂取させる、反芻動物の畜産学的性能を改善するための方法。