(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キランソウの地上部の抽出物を含む軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物であって、
前記抽出物は、２０−ヒドロキシエクジゾンを１〜１０質量％含み、
前記抽出物は、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂を使用することで前記２０−ヒドロキシエクジゾンの他に前記キランソウの地上部中に含まれる苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分を前記２０−ヒドロキシエクジゾンと分離して除去する分別処理を含む抽出操作を経て得られることを特徴とする軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物。
【請求項２】
前記抽出操作は、前記キランソウの地上部から水あるいは含水アルコールを用いて得られた抽出液に、前記分別処理として、該抽出液中に含まれる２０−ヒドロキシエクジゾンをスチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた後に水あるいは含水アルコールによる洗浄を行い、該分別処理の後に高濃度の含水アルコールを用いて前記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂から２０−ヒドロキシエクジゾンを溶出させることによって行われる請求項１に記載の軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物。
【請求項３】
キランソウの地上部の抽出物を含む間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物であって、
前記抽出物は、２０−ヒドロキシエクジゾンを１〜１０質量％含み、
前記抽出物は、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂を使用することで前記２０−ヒドロキシエクジゾンの他に前記キランソウの地上部中に含まれる苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分を前記２０−ヒドロキシエクジゾンと分離して除去する分別処理を含む抽出操作を経て得られることを特徴とする間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物。
【請求項４】
前記抽出操作は、前記キランソウの地上部から水あるいは含水アルコールを用いて得られた抽出液に、前記分別処理として、該抽出液中に含まれる２０−ヒドロキシエクジゾンをスチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた後に水あるいは含水アルコールによる洗浄を行い、該分別処理の後に高濃度の含水アルコールを用いて前記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂から２０−ヒドロキシエクジゾンを溶出させることによって行われる請求項３に記載の間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物。
【請求項５】
キランソウの地上部の抽出物を含む軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品であって、
前記抽出物は、２０−ヒドロキシエクジゾンを１〜１０質量％含み、
前記抽出物は、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂を使用することで前記２０−ヒドロキシエクジゾンの他に前記キランソウの地上部中に含まれる苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分を前記２０−ヒドロキシエクジゾンと分離して除去する分別処理を含む抽出操作を経て得られることを特徴とする軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品。
【請求項６】
前記抽出操作は、前記キランソウの地上部から水あるいは含水アルコールを用いて得られた抽出液に、前記分別処理として、該抽出液中に含まれる２０−ヒドロキシエクジゾンをスチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた後に水あるいは含水アルコールによる洗浄を行い、該分別処理の後に高濃度の含水アルコールを用いて前記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂から２０−ヒドロキシエクジゾンを溶出させることによって行われる請求項５に記載の軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品。
【請求項７】
キランソウの地上部の抽出物を含む間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品であって、
前記抽出物は、２０−ヒドロキシエクジゾンを１〜１０質量％含み、
前記抽出物は、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂を使用することで前記２０−ヒドロキシエクジゾンの他に前記キランソウの地上部中に含まれる苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分を前記２０−ヒドロキシエクジゾンと分離して除去する分別処理を含む抽出操作を経て得られることを特徴とする間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品。
【請求項８】
前記抽出操作は、前記キランソウの地上部から水あるいは含水アルコールを用いて得られた抽出液に、前記分別処理として、該抽出液中に含まれる２０−ヒドロキシエクジゾンをスチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた後に水あるいは含水アルコールによる洗浄を行い、該分別処理の後に高濃度の含水アルコールを用いて前記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂から２０−ヒドロキシエクジゾンを溶出させることによって行われる請求項７に記載の間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、様々な薬理活性が期待できる有効成分として、植物（但し、ホウレンソウを除く）から抽出された２０−ヒドロキシエクジゾンを所定量含み、味が良く、溶状に優れる２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物及びその製造方法、並びに該２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を含む、軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物若しくは食品、又は間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物若しくは食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、２０−ヒドロキシエクジゾンには、コラーゲン合成促進作用、タンパク合成促進作用、酸化ストレス抑制、コラゲナーゼ阻害などの様々な薬理活性が確認されている。
上記２０−ヒドロキシエクジゾンを含有する植物には、キランソウ（学名：Ａｊｕｇａ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）、カイジンドウ（学名：Ａｊｕｇａ  ｃｉｌｉａｔａ）、白苞筋骨草（学名：Ａｊｕｇａ  ｌｕｐｕｌｉｎａ）、セイヨウキランソウ（学名：Ａｊｕｇａ  ｒｅｐｔａｎｓ）、アカザ（学名：Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ａｌｂａ）、キヌア（学名：Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ）、オドリコソウ（学名：Ｌａｍｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  ｖａｒ．ｂａｒｂａｔｕｍ及びＬａｍｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）、Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ属（Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓ（学名）、Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（学名））、Ａｅｒｖａ属（Ａｅｒｖａ  ｊａｖａｎｉｃａ（学名）、Ａｅｒｖａ  ｌａｎａｔａ（学名））、ワラビ（学名：Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ  ａｑｕｉｌｉｎｉｕｍ  ｖａｒ．ｌａｔｉｕｓｃｕｌｕｍ）、Ｒｈａｇｏｄｉａ  ｂａｃｃａｔａ（学名）、ミルスベリヒユ（学名：Ｓｅｓｕｖｉｕｍ  ｐｏｒｔｕｌａｃａｓｔｒｕｍ）、Ｃｙａｎｏｔｉｓ  ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ（学名）、Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ属（オオバナアザミ（学名：Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ  ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ）、Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ  ｃａｒｔｈａｍｏｉｄｅｓ（学名））、Ｓｅｒｒａｔｕｌａ属（Ｓｅｒｒａｔｕｌａ  ｃｏｒｏｎａｔａ（学名）、Ｓｅｒｒａｔｕｌａ  ｗｏｌｆｆｉｉ（学名）、Ｓｅｒｒａｔｕｌａ  ｔｉｎｃｔｏｒｉａ（学名））、パフィア属（Ｐｆａｆｆｉａ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ（学名）、Ｐｆａｆｆｉａ  ｉｒｅｓｉｎｏｉｄｅｓ（学名））等がある。
通常、上記植物から上記２０−ヒドロキシエクジゾンを効率よく抽出する方法として、水又は任意濃度の含水アルコールを使用した常温又は加温又は加熱抽出が採用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−１５１５３８号公報
【特許文献２】特開２００５−２５５５２７号公報
【特許文献３】特開２００４−１３７１６８号公報
【特許文献４】特開平０７−３０４６８１号公報
【特許文献５】特許２７７９７８０号
【特許文献６】特開２０００−０５３５５７号公報
【特許文献７】特開２００３−２７７２８６号公報
【特許文献８】特開２００４−０７５６２９号公報
【特許文献９】特開２００４−１８９６４４号公報
【特許文献１０】特許第４６７６０４０号
【特許文献１１】特開２００２−１７３４１４号公報
【特許文献１２】特許第５０３５４９４号
【特許文献１３】特開２００３−３３５６２５号公報
【特許文献１４】特開２００６−２７３７３９号公報
【特許文献１５】特許第５２０７６１１号
【特許文献１６】特開２００８−１５６２９４号公報
【特許文献１７】特許第４６６６５３７号
【特許文献１８】特開２０１１−２０７８１４号公報
【特許文献１９】特開２０１２−２５０９２１号公報
【特許文献２０】特開２０１３−１４１４３８号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ  １９８０  Ｓｅｐ  １５，１９０（３）：５３７−５４４
【非特許文献２】Ａｒｃｈ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９９，４１（１）：１８−２３
【非特許文献３】Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍ  Ｈｕｎｇ．  １９９９  Ａｐｒ．６９（２）：７２−７６
【非特許文献４】Ｊ  Ａｓｉａｎ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｓ．  ２０００，２（３）：２２５−２２９
【非特許文献５】Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００１  Ｍａｙ，４９（５）：２５７６−２５７８
【非特許文献６】Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｙｓｔ  Ｅｃｏｌ．２００１  Ｏｃｔ．２９（９）：８９１−９００
【非特許文献７】Ｊ  Ａｓｉａｎ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｓ．２００２  Ｍａｒ，４（１）：７−１０
【非特許文献８】Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｓ．２００３  Ａｐｒ，１７（２）：１０３−１０８
【非特許文献９】Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．２００５  Ｆｅｂ，６８（２）：１６８−１７２
【非特許文献１０】Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２００８  Ｊｕｌ−Ａｕｇ，２２（４）：２４０−２５０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｂｔ．２０２３４
【非特許文献１１】Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．２００９  ＭＡＹ  ２２，７２（５）：９２９−９３２．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｎｐ８００７０８ｇ
【非特許文献１２】Ｓｔｅｒｏｉｄｓ．２０１３  Ｎｏｖ，７８（１１）：１０９８−１１０２．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｒｏｉｄｓ．２０１３．０７．０１２．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ａｕｇ  ８．
【非特許文献１３】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１７（２）３４０−３４２（１９６９）
【非特許文献１４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１  ｖｏｌ．８０  Ｎｏ．４  ３０９  Ｍ．ｔａｋｅｉ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献１５】Ｃｈｉｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｊ．，２００７  ｖｏｌ．４２  Ｎｏ．２４  １８５２−１８５５  Ｚｈａｏ  Ｐｉ−ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献１６】ＦＯＯＤ  ＳＴＹＬＥ  ２００５  ｖｏｌ．９  Ｎｏ．９  ７９−８２  深谷ら
【非特許文献１７】和漢医薬雑誌  ２００３  ２０巻  １４０  伊藤ら
【非特許文献１８】ＦＲＡＧＲＡＮＣＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ２００５  ｖｏｌ．７  １２１−１２３
【非特許文献１９】Ｙａｋｕｒｉ／Ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔｒｉｃｓ  ２００５  ｖｏｌ．６９  ７１−７６  Ｅ．Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．
【非特許文献２０】第５回日本抗加齢医薬学会総会  プログラム抄録集  ２００５  ８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところが、上記植物中における上記２０−ヒドロキシエクジゾンの含量は、植物種によって大きく異なる。例えば、２０−ヒドロキシエクジゾンの含量は、キヌアの種子が０．１３ｍｇ／ｇ(発明者による測定データ)、オオバナアザミの根からなる生薬の漏芦（ろうろ）が０．１５ｍｇ／ｇ(発明者による測定データ)、キランソウの全草が２．５ｍｇ／ｇ（発明者による測定データ）であり、またＳｅｒｒａｔｕｌａ属は２０．０ｍｇ／ｇ以上含まれるとの記述がある。そして、該２０−ヒドロキシエクジゾンの含量のバラツキは、そのまま、抽出物中における２０−ヒドロキシエクジゾンの含量に反映されてしまう。このため、該２０−ヒドロキシエクジゾンの有効性に１００倍以上の開きをもたらす可能性が極めて高くなり、期待される薬理活性にバラツキが生じるという問題があった。
また、上記植物からの抽出物は、上記２０−ヒドロキシエクジゾンの含量に関係なく、苦味やえぐ味が非常に強いため服用し難く、かつ水に対する溶状が悪いため、液状の医薬品や液状の機能性表示食品などのような液剤への配合が困難であるという問題があった。
【０００６】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、服用し易く、液剤への配合が容易であり、一定の期待される薬理活性を有する２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物及びその製造方法、並びに該２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を含む、軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物若しくは食品、又は間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物若しくは食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上述の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物（但し、ホウレンソウを除く）からの抽出操作において、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体からなる樹脂を使用することで、２０−ヒドロキシエクジゾンを損なうことなく、多量に含まれる本発明の抽出物を構成するに好ましくない成分（苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分）を取り除くことができ、目的の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物ができることを知見した。
また、本発明者らは、前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物は、単独で使用した場合でも、軟骨損傷の修復、改善又は予防作用若しくは間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進作用を有することを知見した。
【０００８】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  植物（但し、ホウレンソウを除く）から抽出操作を経て得られた２０−ヒドロキシエクジゾンを、薬理活性を有する有効成分として所定の含量で含み、上記抽出操作には、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂を使用することで上記２０−ヒドロキシエクジゾンの他に上記植物（但し、ホウレンソウを除く）中に含まれる苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分を上記有効成分と分離して除去する分別処理が含まれることを特徴とする２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物である。
＜２＞  上記抽出操作は、上記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物（但し、ホウレンソウを除く）から水あるいは含水アルコールを用いて得られた抽出液に、上記分別処理として、該抽出液中に含まれる２０−ヒドロキシエクジゾンをスチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた後に水あるいは含水アルコールによる洗浄を行い、該分別処理の後に高濃度の含水アルコールを用いて前記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂から２０−ヒドロキシエクジゾンを溶出させることによって行われる前記＜１＞に記載の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物である。
＜３＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を含むことを特徴とする軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物である。
＜４＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を含むことを特徴とする間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物である。
＜５＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を含むことを特徴とする軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品である。
＜６＞  前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を含むことを特徴とする間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品である。
＜７＞  植物（但し、ホウレンソウを除く）から、薬理活性を有する有効成分として２０−ヒドロキシエクジゾンを所定の含量で含む抽出物を得る抽出操作を含み、上記抽出操作には、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂を使用することで上記２０−ヒドロキシエクジゾンの他に上記植物（但し、ホウレンソウを除く）中に含まれる苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分を上記有効成分と分離して除去する分別処理が含まれることを特徴とする２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物の製造方法である。
＜８＞  上記抽出操作は、上記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物（但し、ホウレンソウを除く）から水あるいは含水アルコールを用いて得られた抽出液に、上記分別処理として、該抽出液中に含まれる２０−ヒドロキシエクジゾンをスチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた後に水あるいは含水アルコールによる洗浄を行い、該分別処理の後に高濃度の含水アルコールを用いて前記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂から２０−ヒドロキシエクジゾンを溶出させることによって行われる前記＜７＞に記載の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物の製造方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、服用し易く、液剤への配合が容易であり、一定の期待される薬理活性を有する２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物及びその製造方法、並びに該２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を含む、軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物若しくは食品、又は間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物若しくは食品を提供することができる。
より具体的には、本発明により、服用感を著しく損ねる苦味成分やえぐ味成分が上記抽出物を構成するに好ましくない成分として除かれていることから、服用し易い生成物の創成が可能になる。
また、上記苦味成分やえぐ味成分とともに、溶状を損ねる成分も上記抽出物を構成するに好ましくない成分として除かれていることから、液剤への配合が容易になる。
更に、抽出物中における２０−ヒドロキシエクジゾンの含量を一定濃度に調整していることから、一定の期待される薬理活性のある生成物の創成が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、試験例１における関節軟骨損傷モデルの作製における孔を作成した位置を説明する図である。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例１の肉眼的観察における大腿骨滑車溝の上・下に形成した孔の部分を撮影した結果の一例を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例１の肉眼的観察における肉眼所見を数値化した結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例１の組織学的観察における組織染色画像の一例を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例１の組織学的観察における組織染色画像から軟骨・軟骨下骨の充填量をピクセル数により算出し、軟骨組織修復効果を評価した結果を示す図である。
【図４】図４は、試験例３の細胞培養試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明の具体的内容について詳細に説明する。
【００１２】
［２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物及びその製造方法］
本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物（以下、略して単に「抽出物」とも記載する）は、本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物の製造方法により好適に製造することができる。
以下、本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物の製造方法の説明と併せて、本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を説明する。
【００１３】
〔２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物の製造方法〕
本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物の製造方法は、抽出操作を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の操作を含む。
【００１４】
（抽出操作）
前記抽出操作は、２０−ヒドロキシエクジゾンを含有する植物（但し、ホウレンソウを除く）から、薬理活性を有する有効成分として２０−ヒドロキシエクジゾンを所定の含量で含む抽出物を得る抽出操作である。
前記抽出操作は、分別処理を少なくとも含み、必要に応じて更に抽出処理、溶出処理等のその他の処理を含む。
【００１５】
＜２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物（但し、ホウレンソウを除く）＞
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物としては、ホウレンソウを除く限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、キランソウ（学名：Ａｊｕｇａ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）、カイジンドウ（学名：Ａｊｕｇａ  ｃｉｌｉａｔａ）、白苞筋骨草（学名：Ａｊｕｇａ  ｌｕｐｕｌｉｎａ）、セイヨウキランソウ（学名：Ａｊｕｇａ  ｒｅｐｔａｎｓ）；アカザ（学名：Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ａｌｂａ）、キヌア（学名：Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ）；オドリコソウ（学名：Ｌａｍｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  ｖａｒ．ｂａｒｂａｔｕｍ及びＬａｍｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）；Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ属（Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓ（学名）、Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（学名））；Ａｅｒｖａ属（Ａｅｒｖａ  ｊａｖａｎｉｃａ（学名）、Ａｅｒｖａ  ｌａｎａｔａ（学名））；ワラビ（学名：Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ  ａｑｕｉｌｉｎｉｕｍ  ｖａｒ．ｌａｔｉｕｓｃｕｌｕｍ）；Ｒｈａｇｏｄｉａ  ｂａｃｃａｔａ（学名）；ミルスベリヒユ（学名：Ｓｅｓｕｖｉｕｍ  ｐｏｒｔｕｌａｃａｓｔｒｕｍ）；Ｃｙａｎｏｔｉｓ  ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ（学名）；Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ属（漏芦（オオバナアザミ）（学名：Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ  ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ）、鹿根（学名：Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ  ｃａｒｔｈａｍｏｉｄｅｓ）；Ｓｅｒｒａｔｕｌａ属（Ｓｅｒｒａｔｕｌａ  ｃｏｒｏｎａｔａ（学名）、Ｓｅｒｒａｔｕｌａ  ｗｏｌｆｆｉｉ（学名）、Ｓｅｒｒａｔｕｌａ  ｔｉｎｃｔｏｒｉａ（学名））；パフィア属（Ｐｆａｆｆｉａ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ（学名）、Ｐｆａｆｆｉａ  ｉｒｅｓｉｎｏｉｄｅｓ（学名））等が挙げられる。また、前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物は、上記した植物の同属植物や種間雑種等を用いることもできる。
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１６】
上記植物（但し、ホウレンソウを除く）から２０−ヒドロキシエクジゾンを抽出する場合に、該植物の使用部位（例えば葉、葉柄、茎、花、根、種子、あるいはこれら全てを含む全草）は、特に限定されず、植物毎に適宜用いる部位を選択すればよい。
【００１７】
上記植物（但し、ホウレンソウを除く）の使用部位について例を挙げる。
上記キランソウ（学名：Ａｊｕｇａ  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも地上部、全草が望ましい。
上記カイジンドウ（学名：Ａｊｕｇａ  ｃｉｌｉａｔａ）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも地上部、全草が望ましい。
上記白苞筋骨草（学名：Ａｊｕｇａ  ｌｕｐｕｌｉｎａ）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも地上部、全草が望ましい。
上記セイヨウキランソウ（学名：Ａｊｕｇａ  ｒｅｐｔａｎｓ）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも地上部、全草が望ましい。
上記アカザ（学名：Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ａｌｂａ）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも葉が望ましい。
上記キヌア（キノア）（学名：Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも種子が望ましい。
上記オドリコソウ（学名：Ｌａｍｉｕｍ  ａｌｂｕｍ  ｖａｒ．ｂａｒｂａｔｕｍ及びＬａｍｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも全草又は花が望ましい。
上記Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ属（Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｌｅｕｃｏｔｏｍｏｓ（学名）、Ｐｏｌｙｐｏｄｉｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ（学名））は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも葉が望ましい。
上記Ａｅｒｖａ属（Ａｅｒｖａ  ｊａｖａｎｉｃａ（学名）、Ａｅｒｖａ  ｌａｎａｔａ（学名））は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも根が望ましい。
上記ワラビ（学名：Ｐｔｅｒｉｄｉｕｍ  ａｑｕｉｌｉｎｉｕｍ  ｖａｒ．ｌａｔｉｕｓｃｕｌｕｍ）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも若芽(葉)が望ましい。
上記Ｒｈａｇｏｄｉａ  ｂａｃｃａｔａ（学名）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも種子が望ましい。
上記ミルスベリヒユ（学名：Ｓｅｓｕｖｉｕｍ  ｐｏｒｔｕｌａｃａｓｔｒｕｍ）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも葉が望ましい。
上記Ｃｙａｎｏｔｉｓ  ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ（学名）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも全草が望ましい。
上記漏芦（学名：Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ  ｕｎｉｆｌｏｒｕｍ）及び鹿根（学名：Ｒｈａｐｏｎｔｉｃｕｍ  ｃａｒｔｈａｍｏｉｄｅｓ）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも根が望ましい。
上記Ｓｅｒｒａｔｕｌａ  ｗｏｌｆｆｉｉ（学名）及びＳｅｒｒａｔｕｌａ  ｔｉｎｃｔｏｒｉａ（学名）は、葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも根が望ましい。
上記パフィアは、Ｐａｆｆｉａ属に属する植物種の葉、葉柄、茎、花、根、種子など全ての部位が使用可能であるが、これらの中でも根又は葉が望ましい。
【００１８】
＜抽出処理＞
上記抽出処理は、上記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物（以下、略して単に「素材」とも記載する）から水若しくは含水エタノールを用い、抽出物（抽出液）を得るべく行われる。
上記抽出処理における抽出条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、好ましくは、上記素材の重量の１０〜２０倍量の水、あるいは３０ｖｏｌ％（ｖ/ｖ％）程度までの含水アルコールを用い、室温（ＲＴ）から沸騰（水の場合で１００℃）までの温度条件下で１０分間以上抽出することである。
得られた抽出液は、ろ布ろ過、遠心分離ろ過、ろ紙ろ過等、適切な条件で固液分離することにより、抽出残渣が除かれる。
また、抽出条件として、更に好ましくは、前記抽出残渣に対しても該抽出残渣の重量の５〜８倍量の水、あるいは含水アルコールを用いて上記と同様の抽出を行い、得られた抽出液を前記抽出液と合わせて用いる。
上記抽出処理によれば、２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物（但し、ホウレンソウを除く）から２０−ヒドロキシエクジゾンを効率良く抽出することができる。
【００１９】
＜分別処理＞
上記分別処理は、上記抽出処理によって得られた抽出液中に含まれる本発明の抽出物を構成するに好ましくない成分を、上記２０−ヒドロキシエクジゾンからなる薬理活性を有する有効成分と分離して除去するべく行われる。
ここで、上記抽出物を構成するに好ましくない成分とは、上記抽出物の摂取時に使用者に不快感や悪影響を与える成分、あるいは、上記抽出物の使い勝手を悪くする成分であって、上記２０−ヒドロキシエクジゾンのような薬理活性を有する有効成分を除いた上記植物（但し、ホウレンソウを除く）中に含まれるおよそ全ての成分である。上記抽出物を構成するに好ましくない成分は、具体的に、上記植物（但し、ホウレンソウを除く）中に含まれる苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分である。また、上記抽出物を構成するに好ましくない成分には、上記苦味成分、上記えぐ味成分、上記溶状を損なう成分の他に、辛味成分、渋み成分、酸味成分等の雑味成分や、悪臭成分等が含まれてもよい。
上記分別処理は、上記抽出処理で得られた上記抽出液をスチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂が充填されたカラムに通すことによって行われる。該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂は、合成吸着剤であり、例えばダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０、ＸＤＡ−６など市販のものが使用される。上記抽出液を該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂が充填されたカラムに通すと、該抽出液中の２０−ヒドロキシエクジゾンは該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着されるが、上記抽出物を構成するに好ましくない成分は該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着されずに有効成分である上記２０−ヒドロキシエクジゾンと分離される。そして、該２０−ヒドロキシエクジゾンと分離された上記抽出物を構成するに好ましくない成分を洗浄して除去することで、該抽出物を構成するに好ましくない成分が取り除かれる。
上記分別処理においては、上記抽出処理で得られた上記抽出液を上記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂が充填されたカラムに通すことに加え、更に該カラムの容積の１〜５倍量の水又は３０ｖｏｌ％（ｖ/ｖ％）以下の含水アルコールを該カラムに通すことで、該カラム中に僅かに残った抽出液を押し出して、上記抽出物を構成するに好ましくない成分を完全に除去することが好ましく、更に好ましくは、該カラムの容積の１〜３倍量の水又は１０ｖｏｌ％（ｖ/ｖ％）以下の含水アルコールを上記押し出しに用いる。
【００２０】
＜溶出処理＞
上記溶出処理は、上記分別処理において上記２０−ヒドロキシエクジゾンを吸着した状態の上記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂が充填されているカラムから、該２０−ヒドロキシエクジゾンを高収率で溶出させるべく行われる。
溶出条件として好ましくは、５０ｖｏｌ％（ｖ/ｖ％）以上の含水アルコールを上記カラムの容積の１〜１０倍量で該カラムに流して溶出液を得ることであり、これにより２０−ヒドロキシエクジゾンを９５％以上溶出することができる。溶出条件として更に好ましくは、５０〜７０ｖｏｌ％（ｖ/ｖ％）の含水アルコールを上記カラムの容積の１〜３倍量で該カラムに流すことである。
【００２１】
上記分別処理及び溶出処理によれば、２０−ヒドロキシエクジゾンを損なうことなく、多量に含まれる本発明の抽出物を構成するに好ましくない成分（苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分）を取り除くことができる。
【００２２】
＜その他の処理＞
前記抽出操作におけるその他の処理としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上述した抽出処理、溶出処理等が挙げられる。
【００２３】
上記抽出操作は、上記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物（但し、ホウレンソウを除く）から水あるいは含水アルコールを用いて得られた抽出液に、上記分別処理として、該抽出液中に含まれる２０−ヒドロキシエクジゾンをスチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた後に水あるいは含水アルコールによる洗浄を行い、該分別処理の後に高濃度の含水アルコールを用いて前記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂から２０−ヒドロキシエクジゾンを溶出させることによって行われることが望ましい。
【００２４】
（その他の操作）
前記その他の操作としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抽出素材調製処理、濃縮処理、調製処理等が挙げられる。
【００２５】
＜抽出素材調製処理＞
前記抽出素材調製処理は、前記抽出操作を行う２０−ヒドロキシエクジゾン含有素材を調製する処理である。
前記処理の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記植物（但し、ホウレンソウを除く）の使用部位を主に天日若しくは陰干しにより乾燥したうえで適切な大きさにカットする処理などが挙げられる。
【００２６】
＜濃縮処理＞
前記濃縮処理は、前記溶出処理で得られた２０−ヒドロキシエクジゾンを含む溶出液を濃縮する処理である。
前記濃縮処理の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【００２７】
＜調製処理＞
上記抽出操作で得られた溶出液については、該溶出液に含まれる２０−ヒドロキシエクジゾンと固形分を測定し、固形分中の２０−ヒドロキシエクジゾン濃度を算出したうえで、最終的に２０−ヒドロキシエクジゾン濃度が所定濃度になるように、デキストリン、澱粉、糖質等の賦形剤を適量添加して、噴霧乾燥、凍結乾燥、温風乾燥など適当な方法で乾燥することにより、２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物が得られる。
【００２８】
上記濃縮処理及び調製処理によれば、一定の濃度に調整された２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物とすることができる。
【００２９】
〔２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物〕
本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物は、薬理活性を有する有効成分として２０−ヒドロキシエクジゾンが所定の濃度（含量）で含まれ、該２０−ヒドロキシエクジゾンの他に上記植物（但し、ホウレンソウを除く）中に含まれる苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分が除去されている。
上記２０−ヒドロキシエクジゾンは、例えばコラーゲン合成促進作用タンパクの合成を促進する作用、酸化ストレス抑制、コラゲナーゼ阻害、軟骨損傷の修復、改善又は予防作用、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進作用などといった様々な薬理活性が期待できる有効成分として有用である。
【００３０】
前記２０−ヒドロキシエクジゾンの前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物における含量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１質量％以上が好ましく、１〜１０質量％がより好ましい。
【００３１】
前記苦味成分、えぐ味成分及び溶状を損なう成分からなる群から選択される少なくとも１成分の前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物における含量としては、抽出操作前の上記植物（但し、ホウレンソウを除く）における含量よりも低減されていれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物は、溶状に優れ、水等に溶かすと澄明なエキスとなる。
【００３２】
［軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物］
本発明の軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物は、２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００３３】
〔２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物〕
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物は、上記した本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物である。
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物の前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物は、前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物からなるものであってもよい。
【００３４】
〔その他の成分〕
前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、食品に用いられる成分などが挙げられる。
前記食品に用いられる成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、デキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セルロース、ステアリン酸カルシウム、還元パラチノースなどが挙げられる。
前記その他の成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記その他の成分の前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物は、後述する試験例に示すように、軟骨の損傷を修復、改善又は予防することができる。
前記軟骨としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、関節軟骨、気管軟骨、甲状軟骨などが挙げられる。
前記関節としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、膝関節、肘関節などが挙げられる。
【００３６】
前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物の摂取量（投与量と称する場合もある）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２０−ヒドロキシエクジゾンの量として、１日当たり１００μｇ以上が好ましく、種差や重度の損傷を考慮した場合、５００μｇ／ｋｇ／日以上が好ましく、６００μｇ／ｋｇ／日以上がより好ましく、１ｍｇ／ｋｇ／日以上が特に好ましい。
【００３７】
前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物の摂取方法（投与方法と称する場合もある）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物をそのまま摂取する方法、水やぬるま湯等に溶かして摂取する方法、飲料や食品等に添加して摂取する方法などが挙げられる。
【００３８】
前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物の摂取期間（投与期間と称する場合もある）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３９】
［間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物］
本発明の間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物は、２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４０】
〔２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物〕
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物は、上記した本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物である。
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物の前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物は、前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物からなるものであってもよい。
【００４１】
〔その他の成分〕
前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物における前記その他の成分及びその含有量としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物におけるその他の成分と同様のもの及び含有量等が挙げられる。
【００４２】
前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物は、後述する試験例に示すように、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導を促進することができる。
前記間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：ＭＳＣ）は、間葉ストローマ細胞とも呼ばれ、様々な種類の細胞に分化することができ、自己再生能力を持つ多能性細胞である。前記ＭＳＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏやｉｎ  ｖｉｖｏにおいて脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞へと分化することが報告されており、ニューロン、肝細胞、膵島細胞への分化能も認められている。前記ＭＳＣは、最適化された培地により増殖し、いくつかの異なる系統の細胞へと分化する。また、最近の研究では、起源が異なるＭＳＣの間で多様な細胞への分化能が異なることが示されている。ｈＭＳＣ−ＵＣは正常ヒト臍帯マトリックスから、ｈＭＳＣ−ＢＭは正常ヒト骨髄から、ｈＭＳＣ−ＡＴは正常ヒト脂肪組織から単離されている。これらの細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、神経細胞への分化能が確認されている。
【００４３】
前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物の摂取量（投与量と称する場合もある）、摂取方法（投与方法と称する場合もある）、及び摂取期間（投与期間と称する場合もある）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物の項目に記載した摂取量、摂取方法、及び摂取期間と同様とすることができる。
【００４４】
［軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品］
本発明の軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品は、２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００４５】
〔２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物〕
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物は、上記した本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物である。
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物の前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品は、前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物からなるものであってもよい。
【００４６】
〔その他の成分〕
前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物におけるその他の成分と同様のものが挙げられる。
前記その他の成分の前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４７】
前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品は、後述する試験例に示すように、軟骨の損傷を修復、改善又は予防することができる。
前記軟骨としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物の項目に記載したものと同様のもの等が挙げられる。
【００４８】
前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、錠剤、ハードカプセル、ソフトカプセル、顆粒等のサプリメントの形態、飲料、菓子等の飲食品の形態などが挙げられる。
前記食品には、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品が含まれる。
【００４９】
前記軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品の摂取量、摂取方法、及び摂取期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物の項目に記載した摂取量、摂取方法、及び摂取期間と同様とすることができる。
【００５０】
［間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品］
本発明の間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品は、２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の成分を含む。
【００５１】
〔２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物〕
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物は、上記した本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物である。
前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物の前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品は、前記２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物からなるものであってもよい。
【００５２】
〔その他の成分〕
前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品における前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物におけるその他の成分と同様のものが挙げられる。
前記その他の成分の前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品における含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５３】
前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品は、後述する試験例に示すように、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導を促進することができる。
前記間葉系幹細胞は、上記した間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物の項目に記載したものと同様である。
【００５４】
前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品の形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した軟骨損傷の修復、改善又は予防用食品の項目に記載のものと同様とすることができる。
【００５５】
前記間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用食品の摂取量、摂取方法、及び摂取期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記した軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物の項目に記載した摂取量、摂取方法、及び摂取期間と同様とすることができる。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明について代表的な例を示し具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら制約されるものではない。
【００５７】
［実施例１］
（抽出処理）
セイヨウキランソウの乾燥した葉（２０−ヒドロキシエクジゾン含量２．０ｍｇ／ｇ）１ｋｇに水２０Ｌを加え、沸騰後３０分間抽出を行った。その後、３９０メッシュの金網を介して固液分離を行い、ろ液１２Ｌを得た。
更に、上記固液分離後の残渣に水８Ｌを加え、沸騰後３０分間抽出を行った後、３９０メッシュの金網を介して再び固液分離を行い、ろ液８Ｌを得た。
上記ろ液１２Ｌと上記ろ液８Ｌとを合わせて計２０Ｌの抽出液を得た。
（分別処理）
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂（三菱化学製  ダイヤイオンＨＰ−２０）が２Ｌ（セイヨウキランソウの乾燥した葉１ｋｇ（１，０００ｇ）の２倍量の体積で２，０００ｃｍ３）充填された内径１０ｃｍのカラムに上記抽出液を通し、該抽出液中の２０−ヒドロキシエクジゾンを該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた。更に、該カラムに水６Ｌを通すことで、上記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着されない成分（抽出物を構成するに好ましくない成分）を洗浄除去した。
（溶出処理）
上述したように２０−ヒドロキシエクジゾンが吸着された状態の上記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂が充填されている上記カラムに、５０ｖｏｌ％（ｖ／ｖ％）エタノール８Ｌを流し、該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂から２０−ヒドロキシエクジゾンを溶出させ、溶出液を得た。
（調製処理）
上記溶出液を減圧濃縮し、濃縮エキスを得た。この濃縮エキスの固形分と２０−ヒドロキシエクジゾン量を測定した結果、固形分は２５ｇであり、２０−ヒドロキシエクジゾン量は１．４ｇであった。そこで、この濃縮エキスに対し、デキストリン１１５ｇを熱湯に溶かして加えて混和し、噴霧乾燥して、セイヨウキランソウ葉抽出物の粉末１３５ｇを得た。
上記セイヨウキランソウ葉抽出物の粉末中における２０−ヒドロキシエクジゾン含量は１．０％（ｗ／ｗ％）であった。
上記抽出物の粉末は、苦味やえぐ味がほとんど無く、また水に澄明に溶けることから溶状に優れ、コラーゲン・タンパク合成促進剤などの用途として有用であった。
【００５８】
［実施例２］
（抽出処理）
漏芦の乾燥した根のチップ（２０−ヒドロキシエクジゾン含量１．２ｍｇ／ｇ）１ｋｇに水１０Ｌを加え、沸騰後３０分間抽出を行った。その後、３９０メッシュの金網を介して固液分離を行い、ろ液８Ｌを得た。
更に、上記固液分離後の残渣に水６Ｌを加え、沸騰後３０分間の抽出操作を行った後、３９０メッシュの金網を介して再び固液分離を行い、ろ液６Ｌを得た。
上記ろ液８Ｌと上記ろ液６Ｌとを合わせて計１４Ｌの抽出液を得た。
（分別処理）
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂（鄭州勤實科技有限公司製  ＸＤＡ−６  大孔樹脂）が２Ｌ（漏芦の乾燥した根のチップ１ｋｇ（１，０００ｇ）の２倍量の体積で２，０００ｃｍ３）充填された内径１０ｃｍのカラムに上記抽出液を通し、該抽出液中の２０−ヒドロキシエクジゾンを該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた。更に、該カラムに１０ｖｏｌ％（ｖ／ｖ％）のエタノール３Ｌを通すことで、上記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着されない成分（抽出物を構成するに好ましくない成分）を洗浄除去した。
（溶出処理）
上記実施例１の溶出処理と同様にして、溶出液を得た。
（調製処理）
上記溶出液を減圧濃縮して得た濃縮エキスについて、固形分と２０−ヒドロキシエクジゾン量を測定した結果、固形分は５０ｇであり、２０−ヒドロキシエクジゾン量は１．１ｇであった。そこでこの濃縮エキスに対し、デキストリン６０ｇを熱湯に溶かして加えて混和し、凍結乾燥して、漏芦根抽出物の粉末１０８ｇを得た。
上記漏芦根抽出物の粉末中における２０−ヒドロキシエクジゾン含量は１．０％（ｗ／ｗ％）であった。
上記抽出物の粉末は、苦味やえぐ味がほとんど無く、また水に澄明に溶けることから溶状に優れ、コラーゲン・タンパク合成促進剤などの用途として有用であった。
【００５９】
［比較例１］
（抽出処理）
上記実施例２の抽出処理と同様にして、計１４Ｌの抽出液を得た。
（調製処理）
上記抽出液に対し、上記実施例２の分別処理及び溶出処理を施さず、減圧濃縮し、濃縮エキスを得た。この濃縮エキスについて、固形分と２０−ヒドロキシエクジゾン量を測定した結果、固形分は２５０ｇであり、２０−ヒドロキシエクジゾン量は１．１ｇであった。そこで、この濃縮エキスを噴霧乾燥して漏芦根抽出物の粉末２４５ｇを得た。
上記漏芦根抽出物の粉末中における２０−ヒドロキシエクジゾン含量は０．４４％（ｗ／ｗ％）であり、上記実施例２の２０−ヒドロキシエクジゾン含量１．０％に比べて少なかった。
上記抽出物の粉末は、苦味やえぐ味が非常に強く、また水に溶かそうとすると該水が混濁した。更に、該粉末を空気中に放置したところ、吸湿固化してしまい、取り扱いにくく、コラーゲン・タンパク合成促進剤などの用途として利用しにくかった。
加えて、上記実施例２と上記比較例１とを比較した結果、得られた濃縮エキスの固形分の量は、実施例２が５０ｇ、比較例１が２５０ｇであるのに対し、２０−ヒドロキシエクジゾン量はそれぞれ１．１ｇと同じであり、実施例２と比較例１とで２０−ヒドロキシエクジゾン量に差異が無い。このため、上記分別処理及び上記溶出処理で２０−ヒドロキシエクジゾンは損なわれないことが確認できた。
【００６０】
［実施例３］
（抽出処理）
パフィアの乾燥した葉（２０−ヒドロキシエクジゾン含量１２．２ｍｇ／ｇ）１ｋｇに水２０Ｌを加え、沸騰後３０分間抽出を行った。その後、３９０メッシュの金網を介して固液分離を行い、ろ液１２Ｌを得た。
更に、上記固液分離後の残渣に水８Ｌを加え、沸騰後３０分間の抽出操作を行った後、３９０メッシュの金網を介して再び固液分離を行い、ろ液８Ｌを得た。
上記ろ液１２Ｌと上記ろ液８Ｌとを合わせて計２０Ｌの抽出液を得た。
（分別処理）
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂（三菱化学製  ダイヤイオンＨＰ−２０）が２Ｌ（パフィアの乾燥した葉１ｋｇ（１，０００ｇ）の２倍量の体積で２，０００ｃｍ３）充填された内径１０ｃｍのカラムに上記抽出液を通し、該抽出液中の２０−ヒドロキシエクジゾンを該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた。更に、該カラムに水６Ｌを通すことで、上記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着されない成分（抽出物を構成するに好ましくない成分）を洗浄除去した。
（溶出処理）
上記実施例１の溶出処理と同様にして、溶出液を得た。
（調製処理）
上記溶出液を減圧濃縮して得た濃縮エキスについて、固形分と２０−ヒドロキシエクジゾン量を測定した結果、固形分は５２ｇであり、２０−ヒドロキシエクジゾン量は８．５ｇであった。そこで、この濃縮エキスに対し、デキストリン５１５ｇを熱湯に溶かして加えて混和し、噴霧乾燥して、パフィア葉抽出物の粉末５６７ｇを得た。
上記パフィア葉抽出物の粉末中における２０−ヒドロキシエクジゾン含量は１．５％（ｗ／ｗ％）であった。
上記抽出物の粉末は、苦味やえぐ味がほとんど無く、また水に澄明に溶けることから溶状に優れ、コラーゲン・タンパク合成促進剤などの用途として有用であった。
【００６１】
［実施例４］
（抽出処理）
パフィアの乾燥した根のチップ（２０−ヒドロキシエクジゾン含量５．２ｍｇ／ｇ）１ｋｇに水１０Ｌを加え、沸騰後３０分間抽出を行った。その後、３９０メッシュの金網を介して固液分離を行い、ろ液８Ｌを得た。
更に、上記固液分離後の残渣に水６Ｌを加え、沸騰後３０分間の抽出操作を行った後、３９０メッシュの金網を介して固液分離を行い、ろ液６Ｌを得た。
上記ろ液８Ｌと上記ろ液６Ｌとを合わせて計１４Ｌの抽出液を得た。
（分別処理）
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂（鄭州勤實科技有限公司製  ＸＤＡ−６  大孔樹脂）が２Ｌ（パフィアの乾燥した根のチップ１ｋｇ（１，０００ｇ）の２倍量の体積で２，０００ｃｍ３）充填された内径１０ｃｍのカラムに上記抽出液を通し、該抽出液中の２０−ヒドロキシエクジゾンを該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた。更に、該カラムに１０ｖｏｌ％（ｖ／ｖ％）エタノール３Ｌを通すことで、上記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着されない成分（抽出物を構成するに好ましくない成分）を洗浄除去した。
（溶出処理）
上記実施例１の溶出処理と同様にして、溶出液を得た。
（調製処理）
上記溶出液を減圧濃縮して得た濃縮エキスについて、固形分と２０−ヒドロキシエクジゾン量を測定した結果、固形分は６０ｇであり、２０−ヒドロキシエクジゾン量は４．５ｇであった。そこで、この濃縮エキスに対し、デキストリン２４０ｇを熱湯に溶かして加えて混和し、凍結乾燥して、パフィア根抽出物の粉末３００ｇを得た。
上記パフィア葉抽出物の粉末中における２０−ヒドロキシエクジゾン含量は１．５％（ｗ／ｗ％）であった。
上記抽出物の粉末は、苦味やえぐ味がほとんど無く、また水に澄明に溶けることから溶状に優れ、コラーゲン・タンパク合成促進剤などの用途として有用であった。
【００６２】
［比較例２］
（抽出処理）
上記実施例４の抽出処理と同様にして計１４Ｌの抽出液を得た。
（調製処理）
上記抽出液に対し、上記実施例２の分別処理及び溶出処理を施さず、減圧濃縮し、濃縮エキスを得た。この濃縮エキスの固形分と２０−ヒドロキシエクジゾン量を測定した結果、固形分は２７０ｇであり、２０−ヒドロキシエクジゾン量は４．５ｇであった。そこで、この濃縮エキスに対し、デキストリン３０ｇを熱湯に溶かして加えて混和し、噴霧乾燥して、パフィア根抽出物の粉末３００ｇを得た。
上記パフィア根抽出物の粉末中における２０−ヒドロキシエクジゾン含量は１．５％（ｗ／ｗ％）であった。
上記抽出物の粉末は、苦味やえぐ味が非常に強く、また水に溶かそうとすると該水が混濁した。更に、該粉末を空気中に放置したところ、吸湿固化してしまい、取り扱いにくく、コラーゲン・タンパク合成促進剤などの用途として利用しにくかった。
加えて、上記実施例４と上記比較例２とを比較した結果、得られた濃縮エキスの固形分の量は、実施例４が６０ｇ、比較例２が２７０ｇであるのに対し、２０−ヒドロキシエクジゾン量はそれぞれ４．５ｇと同じであり、実施例４と比較例２とで２０−ヒドロキシエクジゾン量に差異が無い。このため、上記分別処理及び上記溶出処理で２０−ヒドロキシエクジゾンは損なわれないことが確認できた。
【００６３】
［実施例５］
（抽出処理）
キランソウの地上部（２０−ヒドロキシエクジゾン含量２．５ｍｇ／ｇ）１０ｋｇに３ｖｏｌ％（ｖ／ｖ％）のエタノール１５０Ｌを加え、沸騰後３０分間抽出を行った。その後、３９０メッシュの金網を介して固液分離を行い、ろ液１２０Ｌを得た。
更に、上記固液分離後の残渣に３ｖｏｌ％（ｖ／ｖ％）のエタノール５０Ｌを加え、沸騰後３０分間抽出を行った後、３９０メッシュの金網を介して再び固液分離を行い、ろ液５０Ｌを得た。
上記ろ液１２０Ｌと上記ろ液５０Ｌとを合わせて計１７０Ｌの抽出液を得た。
（分別処理）
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂（三菱化学製  ダイヤイオンＨＰ−２０）が２０Ｌ（キランソウの地上部１０ｋｇの２倍量の体積で２０Ｌ）充填された内径３０ｃｍのカラムに上記抽出液を通し、該抽出液中の２０−ヒドロキシエクジゾンを該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着させた。更に、該カラムに水３０Ｌを通すことで、上記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂に吸着されない成分（抽出物を構成するに好ましくない成分）を洗浄除去した。
（溶出処理）
上述したように２０−ヒドロキシエクジゾンが吸着された状態の上記スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂が充填されている上記カラムに、５０ｖｏｌ％（ｖ／ｖ％）エタノール８０Ｌを流し、該スチレン−ジビニルベンゼン共重合体樹脂から２０−ヒドロキシエクジゾンを溶出させ、溶出液を得た。
（調製処理）
上記溶出液を減圧濃縮し、濃縮エキスを得た。この濃縮エキスの固形分と２０−ヒドロキシエクジゾン量を測定した結果、固形分は５２０ｇであり、２０−ヒドロキシエクジゾン量は２１ｇであった。そこで、この濃縮エキスに対し、デキストリン１，０００ｇを熱湯に溶かして加えて混和し、噴霧乾燥して、キランソウの地上部抽出物の粉末１，５００ｇを得た。
上記キランソウの地上部抽出物の粉末中における２０−ヒドロキシエクジゾン含量は１.３８％（ｗ／ｗ％）であった。
上記抽出物の粉末は、苦味やえぐ味がほとんど無く、また水に澄明に溶けることから溶状に優れ、コラーゲン・タンパク合成促進剤などの用途として有用であった。
【００６４】
［試験例１：ウサギ関節軟骨損傷モデルを用いた試験］
前記実施例５で得られた抽出物のウサギ軟骨損傷モデルにおける効果を以下のようにして試験した。
（供与動物）
体重２．０〜２．５ｋｇの臨床的に健康な雌ウサギ（日本白色種  平均１２週齢）を用いた。なお、１供与素材あたり３羽ずつ使用し、搬入後１週間順化し、関節軟骨損傷モデルを作製し、実験に供した。
＜関節軟骨損傷モデルの作製方法＞
ウサギを塩酸メデトミジン（ドミトール、明治製菓；０．１ｍｇ／ｋｇで皮下投与）で鎮静した後、塩酸ケタミン（ケタラール注、三共；２５ｍｇ／ｋｇで筋肉注射）によって麻酔した。ウサギの左側膝関節部を剪毛し、ヒビテン液（ヒビスクラブ、ゼネカ）と７０％アルコール液とで消毒後、膝関節外側からアプローチした。
まず、皮膚を大腿骨中央部から脛骨粗面に向かって切開した。膝蓋直靭帯を確認した後、膝関節包を切開して膝関節に到達し、膝蓋骨を内側に脱臼させることによって大腿骨滑車を完全に露出した。大腿骨の遠位部の内側滑車稜（内側顆の損傷孔）、大腿骨滑車溝の上・下（滑車溝近位・遠位の損傷孔）の計３か所に直径２ｍｍ、深さ４ｍｍの孔を整形外科用ドリル（マイクロエンジンＤ−２，オサダメディカル）で作成した（図１参照）。その後、手術創を生理食塩水でよく洗浄し、関節包を合成吸収糸（３−０  ＰＤＳ、Ｊｈｏｎｓｏｎ  ＆  Ｊｈｏｎｓｏｎ社）を用いて縫合、閉鎖した。また、皮下組織と皮膚はナイロン糸（ＵＳＰ３−０，  Ｓｕｐｒｙｌｏｎ，  Ｖｏｍｅｌ，  ドイツ）を用いて同時に縫合した。手術終了直後に塩酸アチパメゾール（アンチセダン、明治製菓）  ０．５ｍｇ／ｋｇを筋肉内に投与し、塩酸メデトミジンの作用を拮抗した。また、止血剤として塩酸トラネキサム酸（ラノビス、  イセイ）１０ｍｇ／ｋｇを静脈内に投与した。術後１週間は１日１回創面をポビドンヨード（イソジン、明治製菓）で消毒するとともに、抗生物質としてオキシテトラサイクリン（テラマイシン、ファイザー）１０ｍｇ／ｋｇを１日２回、皮下に投与した。
【００６５】
（供与素材）
（１）  筋骨草エキス（松浦薬業株式会社）：キランソウ、カイジンドウ、白苞筋骨草、その他の同属植物、及びそれらの種間雑種の１種の地上部を含水アルコールで抽出したエキスを３０質量％、及びマルトデキストリンを７０質量％含有する。
（２）  前記実施例５で得られた抽出物の粉末
【００６６】
（投与）
以下の４つの群に分け、投与を行った。
＜試験群＞
・  コントロール群  ：  ２１日間水道水を自由飲水させた群。
・  試験群１  ：  前記供与素材（１）の筋骨草エキスを０．５ｇ（２０−ヒドロキシエクジゾン  ２００μｇ）／ｋｇ／日で、２１日間投与した群。なお、前記エキスは、水道水で溶解した水溶液として投与し、完全に飲用したことを確認した後は、水道水を自由飲水させた。
・  試験群２  ：  前記供与素材（２）の実施例５で得られた抽出物の粉末を０．０５ｇ（２０−ヒドロキシエクジゾン  ６９０μｇ）／ｋｇ／日で、２１日間投与した群。なお、前記抽出物の粉末は、水道水で溶解した水溶液として投与し、完全に飲用したことを確認した後は、水道水を自由飲水させた。
・  試験群３  ：  前記供与素材（２）の実施例５で得られた抽出物の粉末を０．５ｇ（２０−ヒドロキシエクジゾン  ６．９ｍｇ）／ｋｇ／日で、２１日間投与した群。なお、前記抽出物の粉末は、水道水で溶解した水溶液として投与し、完全に飲用したことを確認した後は、水道水を自由飲水させた。
【００６７】
（結果）
＜肉眼的観察＞
前記投与後に麻酔薬（ネンブタール、８０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与）の過剰投与による安楽死を行った。大腿骨に作成した欠損孔は当初４ｍｍの深さであるが、自己治癒能力によって３週間後には組織再生によって一部欠損孔の充填が起こるため、修復度について肉眼的に観察した。
図２Ａに大腿骨滑車溝の上・下に形成した孔の部分を撮影した結果の一例を示し、図２Ｂに肉眼所見を数値化した結果を示す。
図２Ａは、左から右の順に、コントロール群、試験群１、試験群２、試験群３の結果の一例を示し、各図中の三角印は、滑車溝近位の損傷孔（上側）、滑車溝遠位の損傷孔（下側）を示す。
図２Ｂは、左から右の順に、コントロール群、試験群１、試験群２、試験群３の結果を示す。なお、肉眼所見の数値化は以下の基準でスコアを決定し、ランダム化された各個体について判定し、それぞれの群を平均値化して評価した。
−基準−
スコア１  ：  修復度５０％未満
スコア２  ：  修復度５０％以上８０％未満
スコア３  ：  修復度８０％以上
【００６８】
肉眼的観察の結果、試験群３では、コントロール群に比べて有意な改善が見られ、その効果は、２０−ヒドロキシエクジゾンの濃度依存的であった。
【００６９】
＜組織学的観察＞
採材した左側大腿骨を１０％中性緩衝ホルマリン水溶液で固定した。固定後、組織片の厚さを５ｍｍにトリミングし、５％ギ酸液によって１日振盪下で脱灰した。脱灰終了後５％硫酸ナトリウム液に１日浸漬して中和し、その後約１０時間水洗した。脱灰の完了した組織片を修復部位が縦断面になるように切り出しを行った。その後、定法どおりパラフィン包埋を実施し、ミクロトームによって５μｍに薄切した。
染色は、サフラニン−Ｏ・ファストグリーン染色を実施した。組織染色画像の一例を図３Ａに示す。また、前記組織染色画像から軟骨・軟骨下骨の充填量をピクセル数により算出し、軟骨組織修復効果を評価した。前記算出した結果を図３Ｂに示す。なお、前記組織染色画像からの算出は、２００倍像をＢＸ５１−ＦＬ（オリンパス）を用いて取り込みＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ５．０（マッキントッシュソフトウェア，  Ａｄｏｂｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデジタル化し、画素数として１２０，０００ピクセル（２０，０００ピクセルを無作為に６か所）を選定し、目的色調のピクセル数を画像処理により選定した。
図３Ａは、左から右の順に、コントロール群、試験群１、試験群２、試験群３の結果の一例を示し、各図中の三角印は、滑車溝近位の損傷孔（上側）、滑車溝遠位の損傷孔（下側）を示す。
図３Ｂは、左から右の順に、コントロール群、試験群１、試験群２、試験群３の結果を示す。
【００７０】
組織学的観察の結果、試験群２及び３では、コントロール群に比べて有意な改善が見られ、その効果は、２０−ヒドロキシエクジゾンの濃度依存的であった。
【００７１】
以上の結果から、従来の筋骨草エキスでは、単独では十分な軟骨損傷修復効果が得られなかったのに対し、本発明の抽出物は、肉眼的観察及び組織学的観察のいずれにおいても、単独で軟骨修復効果を有することが確認された。
【００７２】
［試験例２：ヒト試験］
前記実施例５で得られた抽出物のヒトにおける効果を以下のようにして試験した。
本試験は「ヘルシンキ宣言（２００８年１０月改訂）」の精神に則り、「疫学研究に関する倫理指針（２００８年告示）」を準拠し、試験実施計画書に従って実施した。また、倫理審査委員会である公益財団法人愛世会  愛誠病院上野クリニック倫理審査委員会の審査を受け（２０１４年１０月３０日）、その承認を得た後に実施した。
【００７３】
（被験者）
試験デザインは、無作為化二重盲検プラセボ対照並行群間比較試験とした。
今回の研究に参加した被験者は、年齢が４０〜８０歳程度の自立した日常生活をおくることができる男女であり、自覚症状で一側又は両側に膝関節痛若しくは膝の違和感が認められ、どちらか一方の膝の痛みがＶＡＳ（ｖｉｓｕａｌ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｓｃａｌｅ）で２０ｍｍ以上、Ｋｅｌｌｇｒｅｎ−Ｌａｗｒｅｎｃｅ（Ｋ−Ｌ）分類（Ｋｅｌｌｇｒｅｎ，  Ｈ．；  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｓ．  Ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｏｓｉｓ．  Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ．  １９５７，  １６，  ４９４−５０２．）でグレードが０〜Ｉのもの、さらに日本整形外科学会膝ＯＡ治療成績判定基準（ＪＯＡ）スコア（Ｋｏｓｈｉｎｏ，  Ｔ．；  Ｎｉｗａ，  Ｊ．  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｋｎｅｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．  Ｊ．  Ｊｐｎ．  Ｏｒｔｈｏｐ．  Ａｓｓｏｃ．  １９８８，  ６２，  ９００−９０４．）が７５点以上のものを治療の必要がなく疾病に罹患していないものとして選抜して解析対象とした。
被験者を、被験食品（前記実施例５で得られた抽出物１０ｍｇ配合品）を摂取させた群（１８名）と、プラセボ食品を摂取させた群（１４名）に無作為に割り付けたが、試験開始時、両群の間で、年齢、性別、体重、ＢＭＩ、血圧、ＪＯＡスコア、日本版変形性膝関節症患者機能評価表（ＪＫＯＭ）スコア（Ａｋａｉ，  Ｍ．；  Ｉｗａｙａ，  Ｔ．；  Ｋｕｒｏｓａｗａ，  Ｈ．；  Ｄｏｉ，  Ｔ．；  Ｎａｓｕ，  Ｔ．；  Ｈｙａｓｈｉ，  Ｋ．；  Ｆｕｊｉｎｏ，  Ｋ．  ＪＫＯＭ  （Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｋｎｅｅ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｍｅａｓｕｒｅ）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＱＯＬ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｋｎｅｅ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ：  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｋｎｅｅ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｍｅａｓｕｒｅ  （ＪＫＯＭ）．  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００５，  １６，  ５５−６２．）、ＶＡＳ、Ｋ−Ｌ分類におけるグレード分布などにおいて有意差はなかった。
【００７４】
（食品の摂取）
被験食品として、前記実施例５で得られた抽出物１０ｍｇを含む粉末食品を８週間摂取させた（被験食品群）。前記被験食品には前記実施例５で得られた抽出物の他に、デキストリン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セルロース、ステアリン酸カルシウム、還元パラチノースが含まれていた。
一方、プラセボ食品は、前記実施例５で得られた抽出物の代用としてカラメル色素とデキストリンを含んでおり、前記被験食品と同様に８週間毎日摂取させた（プラセボ食品群）。
前記摂取は、前記被験食品、及び前記プラセボ食品ともに、１日１回朝食後１袋（約１．５ｇ）をオブラートに包み、十分な量の水又はぬるま湯に溶かして摂取させた。
【００７５】
（評価）
摂取８週間後の膝の状態をアンケート評価により比較した。
具体的には、有効性の評価は、自覚症状を中心に評価した。即ち、自覚症状は日本整形外科学会が制定したＪＫＯＭスコアを用いて評価した。ＪＫＯＭスコアは、「Ｉ：膝の痛みの程度」、「ＩＩ：膝の痛みやこわばり」「ＩＩＩ：日常生活の状態」、「ＩＶ：ふだんの活動など」、及び「Ｖ：健康状態について」の１２５点満点で評価した。「Ｉ：膝の痛みの程度」は、ＶＡＳにより膝の痛みの程度を１００ｍｍスケールのＶＡＳ法により被験者に記入させた。各々の点数・数値は低いほど症状が軽い（改善した）ことを示す。結果を表１に示す。
【００７６】
【表１】
0006711682.tif 000002
【００７７】
摂取後の解析の結果、被験食品群では、ＪＫＯＭのＩＩ（膝の痛みやこわばり）とＩＶ（ふだんの活動など）の８週目の測定値が、プラセボ食品群よりも有意な低下（改善）を示した。さらに、被験食品群では、ＪＫＯＭスコアの８週目の測定値が、プラセボ食品群と比べて有意な低下傾向（改善）を示した。
以上より、被験食品群では、軟骨損傷の修復効果により、膝の痛みやふだんの活動性を向上させ、膝の可動性を改善する効果を示すことが確認された。
【００７８】
［試験例３：細胞試験］
前記実施例５で得られた抽出物の間葉系幹細胞の分化における効果を以下のようにして試験した。
【００７９】
（間葉系幹細胞）
本試験では正常ヒト臍帯マトリックスから採材したｈＭＳＣ−ＵＣを用い、前記実施例５で得られた抽出物による軟骨細胞への分化誘導能を評価した。
【００８０】
（培養）
細胞の早期老化や分化を誘導することなく、分化能を維持した状態でｈＭＳＣ−ＵＣを増殖させることができる間葉系幹細胞増殖培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ  Ｃ−２８０１０）を用いてｈＭＳＣ−ＵＣを、培養フラスコを用いて増殖させた。
サブコンフルエントの前記細胞を０．２％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，ＵＳＡ）にてはがし、９６ウェルＵプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルになるよう軟骨誘導培地にて細胞懸濁液を調製して播種した。
前記軟骨誘導培地には、前記実施例５で得られた抽出物が、０μｇ／ｍＬ（コントロール）、１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、又は１００μｇ／ｍＬの濃度になるように加えた。
また、ネガティブコントロールとして間葉系幹細胞増殖培地を添加したウェルも準備した。
その後、細胞ペレット（ｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔ）を壊さないように、１日おきに培養液を交換した。
【００８１】
（評価）
２１日間培養した後に、細胞ペレットを１％アルシアンブルー溶液ｐＨ２．５（ｎａｃａｌａｉ  ３７１５４−４４）にて染色し、６Ｍ塩化グアニジンで抽出後、６３０ｎｍの吸光度で測定して評価した。結果を図４に示す。
その結果、ｈＭＳＣ−ＵＣはプレート底面で白色細胞塊を形成した。また、アルシアンブルー染色によって、細胞塊は前記実施例５で得られた抽出物の濃度依存的な陽性所見を示し、軟骨細胞の分化が誘導された。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明によって、苦味成分やえぐ味成分並びに溶状を損ねる成分等の本発明の抽出物を構成するに好ましくない成分を取り除き、コラーゲン・タンパク合成促進作用など様々な薬理作用が期待できる２０−ヒドロキシエクジゾン含量を一定濃度に調整でき様々な薬理活性が安定して期待できる２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物及びその製造方法を提供することができる。また、本発明の２０−ヒドロキシエクジゾン含有植物抽出物を含む、軟骨損傷の修復、改善又は予防用組成物若しくは食品、又は間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化誘導促進用組成物若しくは食品を提供することができる。
【図１】
0006711682.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0006711682.tif 000005
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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