(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＨＩＶ−１株のプロウイルスＤＮＡの長鎖末端反復配列内の、配列番号１の非対称標的配列を組み換えることが可能であるテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸であって、テーラーメイドリコンビナーゼが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、核酸。
【請求項２】
テーラーメイドリコンビナーゼが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列に関して、配列番号１１〜１３のうちのいずれかの中に存在するアミノ酸のうちの１つを関連する位置においてもたらす交換を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
テーラーメイドリコンビナーゼが、配列番号１１〜１３に記載のアミノ酸配列、または前記配列のうちのいずれかの組合せを含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
テーラーメイドリコンビナーゼが、配列番号１１〜１３のアミノ酸配列を含む、請求項１−３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項５】
テーラーメイドリコンビナーゼが、検出可能な活性を伴ってｌｏｘＰ（配列番号４）またはｌｏｘＨ（配列番号５）配列を組み換えないように、配列番号１の組換えに対して高度に特異的である、請求項１から４のいずれかに記載の核酸。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の核酸によりコードされるテーラーメイドリコンビナーゼ；または請求項１から５のいずれかに記載の核酸を含む形質転換された細胞。
【請求項７】
融合タンパク質として発現される、請求項６に記載のテーラーメイドリコンビナーゼ。
【請求項８】
造血系列に由来する幹細胞である、請求項６に記載の形質転換された細胞。
【請求項９】
請求項１から５のいずれかに記載の核酸、請求項６または７に記載のテーラーメイドリコンビナーゼ、および／または請求項６または８に記載の形質転換された細胞を含む医薬組成物。
【請求項１０】
対象におけるレトロウイルス感染の処置または予防における使用のための医薬組成物であって、レトロウイルスが、ＨＩＶ−１である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
対象から得られた試料中に見出されるプロウイルスＤＮＡが、配列番号１の非対称標的配列を含む場合、対象への投与のために製剤化された、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞のゲノムへと挿入されうる複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡの、長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）内の非対称標的配列を組み換えることが可能である、十分に寛容化され高度に特異的なテーラーメイドリコンビナーゼ（ｔａｉｌｏｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）をコードする発現ベクターを調製するための方法のほか、得られた発現ベクター、これらの発現させたリコンビナーゼをトランスフェクトした細胞、ならびに発現ベクター、細胞、および／またはリコンビナーゼを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、例えば、レトロウイルス感染、特に、ＨＩＶ感染の処置および／または予防において有用である。特に、本発明は、ＨＩＶ−１株のうちの９０％超における非対称標的配列を組み合わせ、これにより、ＨＩＶ−１配列を切り出すことが可能な、十分に寛容化され高度に特異的なテーラーメイドリコンビナーゼ、およびそれらをコードする発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染などのレトロウイルス感染は、依然として、最も重要であり、かつ、最も蔓延するヒト疾患のうちの１つである。
【０００３】
レトロウイルス、例えば、ＨＩＶを処置する１つの手法は、宿主細胞のゲノムへと挿入されるプロウイルスをターゲティングすることである。プロウイルスＤＮＡの、宿主のゲノムからの切出しは、例えば、さらなるＨＩＶの複製を防止し、宿主のゲノム内に存在する休眠ウイルスであってもなお、根絶する潜在的可能性を有するという点で、現行の方法論と異なるであろう。
【０００４】
この代替的手法における使用のために検討された、タンパク質の１つのクラスは、部位特異的リコンビナーゼ（ＦＬＯＷＥＲＳ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７）である。部位特異的リコンビナーゼは、遺伝子再配列からゲノム分離に至る、例えば、規定されたＤＮＡ単位の切出し、反転、または組込みなどの、天然における多数の機能を媒介する（ＳＴＡＲＫ  ｅｔ  ａｌ，  １９９２において総説されている）。
【０００５】
最も簡略で、最もよく理解されたリコンビナーゼのうちの１つは、特定の配列のうちの、２つの同一な、すなわち、対称な二本鎖ＤＮＡ部位の間の組換えにより、ゲノム二量体をゲノム単量体へと分解する、バクテリオファージであるＰＩに由来するＣｒｅリコンビナーゼである（ＨＯＥＳＳ  ＆  ＡＢＲＥＭＳＫＩ，  １９８５）。Ｃｒｅリコンビナーゼは、マウス遺伝学において広範な使用がなされている（ＮＡＧＹ，  ２０００）。Ｃｒｅとは、組換えを引き起こすので、その機能にちなんで命名された、３８ｋＤａのタンパク質である（ＳＴＥＲＮＢＥＲＧ  ＆  ＨＡＭＩＬＴＯＮ，  １９８１）。この組換えの必須条件は、Ｃｒｅによりアンチパラレルの配向性にあることが認識される２つの組換え部位のアライメントであり、これは次いで、接合して、各サブユニットが、２つの隣接するサブユニットおよび１つの組換え部位の１つの半部位に接触するリングを形成する４つの同一なＣｒｅサブユニットによって結合する（ＨＯＥＳＳ  ＆  ＡＢＲＥＭＳ  Ｉ，  １９８５）。Ｃｒｅにより認識される組換え部位は、ｌｏｘＰ［交差遺伝子座由来｛ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｏｖｅｒ（ｘ），Ｐ１｝；ＳＴＥＲＮＢＥＲＧ  ＆  ＨＡＭＩＬＴＯＮ，  １９８１］として既知の、３４ｂｐの二本鎖ＤＮＡ配列であり、これは、その最も内側の８塩基対（スペーサーと称する）を除き、パリンドロームであり、部位に指向性を付与する。
【０００６】
Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系を含む、一部の部位特異的組換え系は、アクセサリータンパク質または共同因子を伴わずに機能し、多種多様な細胞条件下で機能する。しかし、部位特異的リコンビナーゼは、リコンビナーゼ酵素のサブユニットの、それらのコグネイトのＤＮＡ標的配列との特異的相互作用を介して機能するので、これらの酵素の使用は、ターゲティングされるＤＮＡ領域が、適切に位置づけられた標的部位を含有しなければならないという要件により制限される（ＬＥＷＡＮＤＯＳＫＩ，  ２００１）。現在のところ、天然のレトロウイルス配列を、それらのＤＮＡ標的配列として認識する野生型リコンビナーゼは、同定されていない。
【０００７】
近年になって、それらの特性を変化させ、これらの酵素の複雑な機構についての良好な理解を達成するように、部位特異的リコンビナーゼについての、広範にわたる突然変異解析および構造解析が実行されている（総説については、ＶＡＮ  ＤＵＹＮＥ，  ２００１；およびＣＯＡＴＥＳ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５を参照されたい）。多くの研究は、その進化可能性について探索するように、Ｃｒｅリコンビナーゼに焦点を当てていた。いくつかの研究が、そのｌｏｘＰ認識部位内の少数のヌクレオチドを変更した場合、Ｃｒｅの標的特異性が変化しうることを実証した（ＢＵＣＨＨＯＬＺ  ＆  ＳＴＥＷＡＲＴ，  ２００１；ＳＡＮＴＯＲＯ  ＆  ＳＣＨＵＬＴＺ，  ２００２；ＲＵＦＥＲ  ＆  ＳＡＵＥＲ，  ２００２）。さらなる研究は、ＨＩＶ−１のＬＴＲに由来する配列を含有する突然変異させたｌｏｘＰ標的部位を操作して、Ｃｒｅをアンチウイルス戦略として使用するための、可能な標的部位を開発することに取り組んでいる（ＬＥＥ  ＆  ＰＡＲＫ，  １９９８；ＬＥＥ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００）。
【０００８】
定方向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の方法は、特異性を変化させた酵素を選択する、強力な方法である（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；およびＪＯＨＡＮＮＥＳ  ＆  ＺＨＡＯ，  ２００６において総説されている）。当初、この方法は、基質部位を変化させてＲＮＡ分子を選択することにより、ＲＮＡをベースとして、改善された酵素を単離するのに使用された。ＰＣＲベースの方法の使用は、非常に大型のライブラリーのスクリーニングおよび候補のプールからの有望なコード領域の回収を可能とする。これに対し、タンパク質の定方向進化では、タンパク質の特性を変化させることにより同定される、改善された突然変異体についてのスクリーニングおよびこれらの回収は、タンパク質をコードする核酸配列を取り出すための方法を要求する。タンパク質とそのコード配列との連関（ｌｉｎｋ）は、コンパートメント化により維持されていることが多い。結果として、定方向タンパク質進化におけるライブラリースクリーニングは、コンパートメントを維持する「一つずつ」の手法に限定されており、候補のスクリーニングプールと関連する利点は、利用可能となっていない。
【０００９】
この限界は、ｍＲＮＡ−タンパク質融合体およびリボソームディスプレイを使用して、タンパク質の、それらのそれぞれのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への架橋を可能とする方法を開発することにより克服されている。こうして、タンパク質特性の改善についての機能的スクリーニングが、対応するコード分子の直接的な取出しへとカップリングされ、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において、大規模なプールがスクリーニングされている（例えば、ＢＵＣＨＨＯＬＺ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８を参照されたい）。定方向タンパク質進化のさらなる改善は、リコンビナーゼの基質を、タンパク質のコード領域と同じＤＮＡ分子上に配置する、いわゆる基質連結型タンパク質進化（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）（ＳＬｉＰＥ；ＢＵＣＨＨＯＬＺ  ＆  ＳＴＥＷＡＲＴ，  ２００１）により達成された。このようにして、リコンビナーゼをコンパートメント内で発現させたところ、その作用は、それ自身のコード領域の隣のＤＮＡ基質を変化させた。結果として、ライブラリーは、変化した基質の隣にある、候補のコード領域だけを増幅するＰＣＲにより、プールとしてスクリーニングされうる。これは、大規模なライブラリーのスクリーニングを可能とし、有望なコード領域の迅速な取出しに好都合である。この方法は、ＣｒｅリコンビナーゼのＤＮＡ特異性を変化させ、これを新たな認識標的部位へと適合させるために適用された（ＢＵＣＨＨＯＬＺ  ＆  ＳＴＥＷＡＲＴ，  ２００１）。
【００１０】
部位特異的リコンビナーゼの潜在的可能性およびＨＩＶ−１プロウイルスを宿主細胞のゲノムから根絶するＡＩＤＳ治療を見出す必要を考慮し、ＷＯ２００８／０８３９３１は、宿主細胞のゲノムへと挿入される、レトロウイルスのプロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内の非対称標的部位を組み換え、こうして、プロウイルスを宿主細胞のゲノムから切り出すことが可能な、テーラーメイドリコンビナーゼ（ＴＲＥ）の作出について開示した。例において開示された、操作型リコンビナーゼであるＴｒｅは、特定のＨＩＶ−１株内に存在する、特異的な非対称部位を認識する。非対称標的部位は、Ｃｒｅにより認識される対称ｌｏｘＰ部位に対する、ある特定の相同性を有する。ＷＯ２００８／０８３９３１では、レトロウイルス、特に、ＨＩＶの高度な配列可変性に起因して、異なるＨＩＶ株を有する患者を処置するためには、異なるテーラーメイドリコンビナーゼを適合させるか、または様々な標的配列に特異的なテーラーメイドリコンビナーゼを含有する、リコンビナーゼのコレクションを調製しなければならない可能性もあることが察知された。
【００１１】
これに対し、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２は、複数のレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ株を切り出すことが可能な、テーラーメイドリコンビナーゼを提示する。こうして、作出されたリコンビナーゼは、あらゆる株に対する新たなリコンビナーゼの作出を伴わずに、複数のＨＩＶ感染のために用いることができる。本発明者らは、レトロウイルスの高度な配列可変性にも拘らず、革新的な手法を使用して、特定の亜型のウイルスのうちの高比率において存在する、非対称標的配列を同定することが可能であることを見出した。驚くべきことに、ＨＩＶ−１亜型Ｂ株、すなわち、欧米において蔓延する株のうちの９６％において存在する、標的配列（配列番号１）を同定することが可能であった。また、ＨＩＶ−１株のうちの低百分率において存在する、さらなる標的配列（配列番号２）も同定された。分子定方向進化のためのベースとしてのＣｒｅ（配列番号６）を使用して、彼らはまた、前記非対称標的配列を組み換えることが可能な、いくつかのテーラーメイドリコンビナーゼも同定し、これらのテーラーメイドリコンビナーゼのコンセンサス配列、例えば、配列番号７またはＴｒｅ  ３．０（配列番号８；配列番号１を組み換えることが可能）も提示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これに照らして、本発明者らは、複数のＨＩＶ−１株内に存在する非対称標的配列を組み換えることが可能な、改善されたテーラーメイドリコンビナーゼを提供（ｐｒｏｖｉｄｅ）する問題に取り組んだ。本発明者らは、驚くべきことに、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２により教示される、コンセンサス配列である配列番号８と異なる配列を有するテーラーメイドリコンビナーゼもまた、全てのＨＩＶ−１亜型Ｂ株、すなわち、欧米において蔓延する株のうちの９６％において存在する、非対称標的配列である配列番号１に対して、高度に活性であり、特徴が改善されていることを見出した。本発明によるテーラーメイドリコンビナーゼは、好ましくは、配列番号９のコンセンサスアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号１０のより特異的なコンセンサス配列、または配列番号１１〜１３のうちのいずれかを含む。本発明のテーラーメイドリコンビナーゼは、特異性が改善されており、したがって、当技術分野の最新技術によるテーラーメイドリコンビナーゼより、ヒトにより、特に、ヒトＴ細胞において良好に寛容化されている。リコンビナーゼは、それらの開発元である、リコンビナーゼの既知の標的配列、例えば、ｌｏｘＰ（配列番号４）、ｌｏｘＨ（配列番号５）に対して、またはｌｏｘＬＴＲ  Ｔｒｅ  １．０（配列番号３）に対しても、どのような検出可能な残存活性も有さないように、高度に特異的であることが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は初めて、宿主細胞のゲノムへと挿入される、１つの種の複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡの、ＬＴＲ内の非対称標的配列を組み換えることが可能な、十分に寛容化され高度に特異的なテーラーメイドリコンビナーゼをコードする発現ベクターを作出するための方法を提供する。リコンビナーゼは、基質を、元の標的からの小さな差違を伴う、多数の新たなサブセットへと分割し、これらのサブセットを認識するように、リコンビナーゼを段階的にテーラーメイドすることにより、複数のレトロウイルス株において存在しうる、それらの天然の対称標的部位と異なる、非対称標的部位を認識するように、テーラーメイドされている（ＷＯ２００８／０８３９３１およびＷＯ２０１１／１４７５９０）。コンビナトリアル手法は、所与の配列内の非対称標的部位を認識する機能的分子の選択を可能とする。こうして、定方向分子進化において、基質中間体を通して精査して、遠隔性、新規で、非対称性の、標的特異性を伴う酵素を作製することが可能となっている。この手法はまた、本発明によっても用いられる。本発明は、ヒト細胞、特に、ヒトＴ細胞により十分に寛容化されたテーラーメイドリコンビナーゼを選択する工程を導入するので、ＷＯ２００８／０８３９３１およびＷＯ２０１１／１４７５９０により教示されている方法を増補する。
【００１４】
具体的に、本発明は、宿主細胞のゲノムへと挿入されうる複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡの、ＬＴＲ内の非対称標的配列を組み換えることが可能である、十分に寛容化されたテーラーメイドリコンビナーゼをコードする発現ベクターを調製するための方法であって、複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡのＬＴＲの配列内の少なくとも１つの既知のリコンビナーゼ標的部位の左半部位（ｌｅｆｔ  ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）配列および右半部位（ｒｉｇｈｔ  ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）配列に対して少なくとも３０％の相同性を有する配列を同定する工程であって、相同な配列が、５〜１２ヌクレオチドのスペーサーにより隔てられており、非対称標的配列が、複数のレトロウイルス株において見出される、工程と；
レトロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内の非対称標的配列に対して活性である、少なくとも１つのリコンビナーゼを得るまで、
ｉ）非対称標的配列の配列に基づいて修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）されているが、既知の標的配列からの、限定された数の変異だけを含有するように修飾された標的配列を基質として使用して、既知の相同な標的部位を認識する少なくとも１つのリコンビナーゼに対する分子定方向進化の工程であって、各ラウンドにおいて、リコンビナーゼが、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドにおいて作用することが既知である標的配列から標的配列が変異しうる、工程；および
ｉｉ）リコンビナーゼライブラリーをシャッフルして、標的配列を非対称標的配列とより相同となるように組み換えることが可能なリコンビナーゼライブラリーを得る工程
の反復を介して、これを作出する工程と；
ライブラリーの分子定方向進化およびシャッフリングにより、既知の標的部位の組換えに対して陰性選択する工程の反復と；
ライブラリーを、ヒト細胞内、特に、ヒトＴ細胞内で発現させ、テーラーメイドリコンビナーゼを発現する前記ヒト細胞を、少なくとも１週間、好ましくは、少なくとも２週間培養し、リコンビナーゼの核酸を、選択マーカーを発現する培養された細胞から単離することにより、前記テーラーメイドリコンビナーゼまたはリコンビナーゼを選択する工程と；
リコンビナーゼをコードする核酸を適切な発現ベクターへと適宜クローニングする工程と
を含む方法を提供する。
【００１５】
本発明は特に、複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内の非対称標的配列を組み換えることが可能である、十分に寛容化され高度に特異的なテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸または発現ベクターを調製するための方法であって、
（ａ）複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡのＬＴＲの配列内の少なくとも１つの既知のリコンビナーゼ標的部位の左半部位配列および右半部位配列に対して少なくとも３０％の相同性を有する配列を同定する工程であって、相同な配列が、５〜１２ヌクレオチドのスペーサーにより隔てられており、非対称標的配列が、複数のレトロウイルス株において見出される、工程と；
（ｂ）２つの配列を同定する工程であって、第１の配列が、前記既知の標的部位の左半部位に相同な工程（ａ）の非対称標的配列の配列に対応し、これを「半部位配列（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）１」と称し、第２の配列が、右半部位に相同な工程（ａ）の非対称標的配列の配列に対応し、これを「半部位配列（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）２」と称する、工程と；
（ｃ）工程（ａ）の少なくとも１つの既知の相同な標的部位の対応する相同な左半部位配列および右半部位配列から逸脱する、工程（ｂ）の配列内のヌクレオチドを決定する工程と；
（ｄ）標的配列を含む２つの標的核酸の第１のサブセットを作出する工程であって、第１の標的配列が、部分部位１（ｓｕｂｓｉｔｅ  １）と命名され、互いと隣接し、５’から３’の順序で、工程（ｂ）の半部位配列１、非対称標的配列のスペーサー配列、および半部位配列１の反転リピートを含み、第２の標的配列が、部分部位２（ｓｕｂｓｉｔｅ  ２）と命名され、互いと隣接し、５’から３’の順序で、半部位配列２の反転リピート、非対称標的配列のスペーサー配列、および工程（ｂ）の半部位配列２を含む、工程と；
（ｅ）修飾された標的配列を含む標的核酸の第２のサブセットを、工程（ｄ）の第１のサブセット内の標的配列をベースとして作出する工程であって、
部分部位１に基づく配列内で、左半部位配列において、工程（ａ）の少なくとも１つの既知の標的部位の対応する相同な半部位配列から逸脱するヌクレオチドのうちの一部を、前記既知の標的部位内で見出される天然ヌクレオチドにより、前記半部位配列が、前記既知の標的部位から逸脱する１つ、２つ、または３つのヌクレオチドを含有するまで置きかえ、非対称標的配列のスペーサー配列により、前記修飾された左半部位配列から隔てられた、前記修飾された左半部位配列の反転リピートにより、前記修飾された標的配列の右半部位を形成し、
部分部位２に基づく配列内で、右半部位配列において、工程（ａ）の少なくとも１つの既知の標的部位の対応する相同な半部位配列から逸脱するヌクレオチドのうちの一部を、前記既知の標的部位内で見出される天然ヌクレオチドにより、前記半部位配列が、前記既知の標的部位から逸脱する１つ、２つ、または３つのヌクレオチドを含有するまで置きかえ、非対称標的配列のスペーサー配列により前記修飾された右半部位配列から隔てられた、前記修飾された右半部位配列の反転リピートにより、前記修飾された標的配列の左半部位を形成し、
その結果、工程（ｄ）の第１のサブセットの１つの標的配列に由来する、全ての修飾された半部位配列内にまとめて、全ての逸脱ヌクレオチドを見出しうる一方で、前記修飾された半部位配列のうちのいずれも、単独では全ての逸脱ヌクレオチドを含まない、工程と；
（ｆ）工程（ｅ）において得られた、第２のサブセットの各核酸を基質として使用して、工程（ａ）による既知の相同な標的部位を認識する少なくとも１つのリコンビナーゼに対して、分子定方向進化を個別に適用する工程と；
（ｇ）工程（ｆ）において進化させたリコンビナーゼライブラリーをシャッフルする工程であって、部分部位１に基づく配列に対して進化させた全てのリコンビナーゼライブラリーを、組み合わせかつシャッフルし、部分部位２に基づく配列に対して進化させた全てのリコンビナーゼライブラリーを組み合わせかつシャッフルする、工程と；
（ｈ）工程（ｄ）によるサブセットの各核酸を基質として使用して、工程（ｇ）において得られた、シャッフルされたライブラリーに対して、分子定方向進化、好ましくは、基質連結型タンパク質進化を適用する工程と；
（ｉ）工程（ｈ）において進化させたリコンビナーゼライブラリーをシャッフルする工程と；
（ｊ）工程（ａ）の非対称標的配列を含む核酸を基質として使用して、工程（ａ）の、レトロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内の非対称標的配列に対して活性である、少なくとも１つのリコンビナーゼを得るまで、工程（ｇ）において得られた、シャッフルされたライブラリーに対して、分子定方向進化、好ましくは、基質連結型タンパク質進化を適用する工程と；
（ｋ）工程（ｊ）において得られた少なくとも１つのリコンビナーゼをコードする核酸をライブラリーから単離し、これを、工程（ａ）による既知の標的部位を組み換えるテーラーメイドリコンビナーゼの陰性選択を可能とする進化ベクターへとクローニングし、これによりライブラリーを得る工程と；
（ｌ）分子定方向進化、好ましくは、基質連結型タンパク質進化を、工程（ｋ）において得られたライブラリーに対して適用する工程と；
（ｍ）工程（ｌ）において得られたライブラリーをシャッフルする工程と；
（ｎ）工程（ｍ）において得られた少なくとも１つのテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸を単離し、これを、コードされるリコンビナーゼおよび選択マーカーをヒト細胞内で発現させるためのベクターへとクローニングし、これによりベクターライブラリーを得る工程と；
（ｏ）ヒト細胞、好ましくは、ヒトＴ細胞を、工程（ｎ）において得られた前記ベクターライブラリーで形質転換する工程と；
（ｐ）前記選択マーカーを発現する細胞を、少なくとも１週間培養し、選択マーカーの高発現について選択する工程と；
（ｑ）リコンビナーゼをコードする核酸を、工程（ｐ）において得られた、前記選択マーカーを発現する細胞から単離する工程と；
（ｒ）工程（ａ）の非対称標的配列を組み換えることが可能なリコンビナーゼをコードする核酸について選択する工程と；
（ｓ）工程（ｆ）において得られた少なくとも１つのリコンビナーゼをコードする核酸をライブラリーから単離する工程と；
（ｔ）工程（ｓ）において得られた核酸を適切な発現ベクターへと適宜クローニングする工程と
を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、（ａ）Ｃｒｅリコンビナーゼである配列番号６；（ｂ）ＷＯ２０１１／１４７５９０による、ＨＩＶ−１ＬＴＲ内の非対称標的部位に対して特異的なＴｒｅリコンビナーゼのコンセンサス配列である、配列番号７のＴｒｅ共通コンセンサス配列；（ｃ）ＷＯ２０１１／１４７５９０による、配列番号１に対して特異的なＴｒｅリコンビナーゼである、配列番号８のＴｒｅリコンビナーゼ３．０コンセンサス配列；（ｄ）Ｃｒｅ配列と対比したコンセンサス配列内の個々の突然変異が、本発明の方法により作出され、ハイスループットシークエンシング（固有の２００ｂｐの配列についての３３，０００リード）により解析された全てのクローンのうちの８５％において存在する、配列番号９の８５％のＴｒｅリコンビナーゼ３．１コンセンサス配列；（ｅ）配列番号１［ｌｏｘＰ、ｌｏｘＨ、またはｌｏｘＬＴＲ  Ｔｒｅ  １．０（配列番号３〜５）に対して活性を伴わない］に対する高度な特異性およびヒトによる寛容性について選択された、３つのＴｒｅリコンビナーゼ３．１のコンセンサス配列である、配列番号１０の１００％のＴｒｅリコンビナーゼ３．１コンセンサス配列；ならびに（ｆ）配列番号１に対して高度に特異的であり、ヒトにより十分に寛容化されている、配列番号１１の、例示的なＴｒｅ  ３．１リコンビナーゼであるｕＴｒｅ（この配列によるテーラーメイドリコンビナーゼを、ｕＴｒｅ、すなわち、「ユニバーサルＴｒｅ」と命名する）のタンパク質配列のアライメントを提示する。太字区画は、保存的アミノ酸を指し示し、可変的位置および非特異的位置は、Ｘにより指し示す。配列番号９、１０、および／または１１において突然変異しているＣｒｅの位置には、Ｃｒｅ配列内に下線を付し、突然変異の位置を、配列の上方に提示する。Ｔｒｅ３．１内で固有に見出されるＱ８９Ｌ交換には、斜字体によりマークする。
【図２】図２は、ｌｏｘＰにおける組換えに対して、進化的に選択するための、例示的な進化ベクターを示す。ｌｏｘＨにおける組換えに対して選択するための、対応するベクターは、容易に構築することができる。ｌｏｘＬＴＲは、配列番号１を含む。Ｔｒｅ３の進化サイクル５１〜６９は、ｐＥＶＯｌｏｘＬＴＲ−ｌｏｘＰおよびｐＥＶＯｌｏｘＬＴＲ−ｌｏｘＨを交互に用い、１００〜１μｇ／ｍＬの転写活性化因子Ｌ−ａｒａを用いて実施し、２ラウンドのＤＮＡシャッフリングを含んだ。
【図３】図３は、ｕＴｒｅの、Ｔｒｅ３と対比した高度な特異性を示す。Ｔｒｅ３：クローンは、Ｔｒｅ３．０ライブラリーのサイクル４３から単離した。ｕＴｒｅ：クローンは、Ｔｒｅ３．１ライブラリーのサイクル７１から単離した。組換え産物には、１つの三角によりマークし、非組換え産物には、２つの三角によりマークする。テーラーメイドリコンビナーゼを発現させる条件（Ｌ−アラビノースによる誘導）下において、ｕＴｒｅは、イーコリ内で、配列番号１を含むｌｏｘＬＴＲを組み換える。これに対し、Ｔｒｅ３は、ｌｏｘＬＴＲおよびｌｏｘＰおよびｌｏｘＨを組み換える、すなわち、Ｔｒｅ３は、比較的緩やかな特異性を有する。
【図４】図４Ａは、ヒト細胞内の、選択マーカー、ＥＧＦＰ、およびｔｒｅライブラリーの構成的発現のための、例示的なレンチウイルス発現ベクターを示す。図４Ｂは、十分に寛容化され高度に特異的なＴｒｅについての細胞スクリーニングの流れ図を示す。活性が高度なＴｒｅについての最終的なスクリーニングにより、ヒト細胞内の活性が確認される。リコンビナーゼの単一のクローンを選択し、さらなる解析にかけた。
【図５】図５は、２つの代表的な培養物中の組織培養物中の、ｕＴｒｅのアンチウイルス活性を示す。ＰＭ１  Ｔ細胞に、ＧＦＰを単独でコードするベクター（対照、白丸）またはｕＴｒｅおよびＧＦＰをコードするベクター（ｕＴｒｅ、黒四角）を形質導入した。その後、培養物に、ＨＩＶ−１を感染させ、ｐ２４抗原についてのＥＬＩＳＡを使用して、時間経過にわたり、ウイルス負荷をモニタリングした。実験は、テーラーメイドリコンビナーゼが、ウイルス負荷を低減するのに効率的であることを示す。数週間（８または９週間）後、ウイルス負荷はもはや、ｐ２４抗原についてのＥＬＩＳＡにより検出されない。
【図６】ＨＩＶ感染患者に由来する初代ヒトＣＤ４＋細胞内の、ｕＴｒｅの顕著なアンチウイルス活性が示される。細胞に、ＧＦＰを単独で発現するベクター（対照実験；左パネル）またはｕＴｒｅおよびＧＦＰを発現するベクター（ｕＴｒｅ；右パネル）を形質導入した。ウイルスの複製は、ＨＩＶ−１  ｐ２４抗原の放出（白丸）によりモニタリングし、形質導入された（ＧＦＰ＋）ヒトＣＤ４＋細胞のパーセント（黒四角）は、ＦＡＣＳによりモニタリングした。ｕＴｒｅの発現は、顕著なアンチウイルス効果およびＣＤ４＋細胞の保護を結果としてもたらした。対照実験の１５日目〜２０日目の間における、ウイルス負荷の減殺が、非阻害のウイルス複製に起因する細胞死を反映することは注目に値する。
【図７】図７は、ＨＩＶ感染ヒト化マウスにおける、ｕＴｒｅのアンチウイルス活性を示す。免疫不全マウスに、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞／ＨＳＣ（対照）、またはｕＴｒｅ発現ＣＤ３４＋ＨＳＣ（動物１および２）を生着させた。その後、動物に、ＨＩＶ−１感染させ、ウイルス負荷（ＨＩＶ−１  ＲＮＡコピー数／ｍｌとして検出される；白丸）および全リンパ球のうちの、ヒトＣＤ４５＋ＣＤ４＋細胞の百分率（黒四角）を、時間経過にわたりモニタリングした。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の方法の工程（ａ）では、プロウイルスＤＮＡのＬＴＲの配列を、例えば、鎖終結阻害剤を使用するＤＮＡシークエンシング（ＳＡＮＧＥＲ  ｅｔ  ａｌ，  １９７７）などにより決定することができる。しかし、宿主のゲノムへと挿入される、レトロウイルスＤＮＡのＬＴＲの配列が、既に決定されている場合は、配列は、データベースを参照することにより決定することができる。配列情報をベースとして、配列情報についての、コンピュータベースの解析を実施して、その中において、５〜１２ヌクレオチドの適切なスペーサーにより隔てられており、既知のリコンビナーゼの既知の標的部位のそれぞれの左半部位配列および右半部位配列に対して少なくとも３０％の相同性を有する配列であって、非対称標的配列が、複数のレトロウイルス株において見出される配列を同定する。既知の標的部位の左半部位配列および右半部位配列に対する相同性は、少なくとも４０％または少なくとも５０％であることが好ましい。これらのレトロウイルス株は、１つの種またはその１つの亜型のウイルス株であることが好ましい。複数の株は、１０株を超え、より好ましくは、１００株を超えるか、１３０株を超えるか、２００株を超えるか、または３００株を超える、例えば、ＨＩＶ株を含むことが好ましい。株は、ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１の１つの亜型、ＨＩＶ−１亜型Ａ、ＨＩＶ−１亜型Ｂ、およびＨＩＶ−１亜型Ｃ、好ましくは、ＨＩＶ−１亜型Ｂに由来しうる。こうして、得られたリコンビナーゼ、またはこれをコードする発現ベクターを、複数の株、例えば、レトロウイルス、またはそれらの亜型のうちの、５０％を超えるか、７０％を超えるか、８０％を超えるか、９０％を超えるか、または全ての既知の株による感染を処置するために使用することができる。
【００１８】
本明細書で使用される「リコンビナーゼ」という用語は、組換えに関与するタンパク質を指す。それ自体、リコンビナーゼは、「組換え部位」または「標的部位」と名付けられる、２つの特異的なＤＮＡ配列を認識し、これらに結合し、これらの２つの標的部位の間の組換えを媒介する。したがって、「リコンビナーゼ」という用語は、特異的なＤＮＡ遺伝子座におけるＤＮＡ再配列を媒介する任意の組換え系の、任意のタンパク質構成要素を指すことを意図する。自然発生のリコンビナーゼは、反転リピートを形成する、約９〜２０ｂｐの、「半部位」（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅ）と名付けられた、２つの同一な配列からなる対称標的部位を認識し、この場合、半部位配列は、５〜１２ｂｐのスペーサー配列により隔てられている。チロシンインテグラーゼファミリーに由来するリコンビナーゼが、ＤＮＡ切断のために活用される活性部位求核剤として、チロシンを有することを特徴とするのに対し、セリンインテグラーゼファミリーに由来するリコンビナーゼは、チロシンの代わりにセリンを使用する。
【００１９】
本発明の一実施形態では、工程（ａ）においてその標的配列を使用し、工程（ｈ）および（ｊ）において分子定方向進化をそれに対して適用する少なくとも１つの既知のリコンビナーゼは、セリンインテグラーゼのファミリーに属する。セリンインテグラーゼのファミリーに属する、好ましいリコンビナーゼは、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ（ＣＯＭＢＥＳ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、Ｇｉｎ組換え系もしくはＨｉｎ組換え系の任意の構成要素である、Ｔｎ３レゾルバーゼ（ＫＲＡＳＮＯＷ  ＆  ＣＯＺＺＡＲＥＬＬＩ，  １９８３）、または大型のセリンリコンビナーゼである、Ｒａｇ１、Ｒａｇ２の他の任意のメンバー、またはＶＤＪ組換え系の他の任意の構成要素、またはこれらの変異体からなる群から選択される。
【００２０】
別の実施形態では、前記リコンビナーゼは、チロシンインテグラーゼのファミリーに属する。チロシンインテグラーゼのファミリーに属する、好ましいリコンビナーゼは、ファージＰ１に由来するＣｒｅ（ＡＢＲＥＭＳＫＩ  ｅｔ  ａｌ，  １９８３，  １９８４）、酵母に由来するＦＬＰリコンビナーゼ（ＶＯＬＥＲＴ  ＆  ＢＲＯＡＣＨ，  １９８６）、ファージＤ６に由来するＤｒｅ（ＳＡＵＥＲ  ＆  ＭＣＤＥＲＭＯＴＴ，  ２００４）、チゴサッカロミセス・ルーキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）によるプラスミドであるｐＳＲ１に由来するＲリコンビナーゼ、クルイベロミセス・ドロソフィラルム［Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｉｕｍ）］によるプラスミドであるｐＫＤ１（ｐＫＤｌ）に由来するリコンビナーゼ、クルイベロミセス・ウォルティイー［Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｗａｌｔｉｉ（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｗａｌｔｉｉ）］によるプラスミドであるｐＫＷ１に由来するリコンビナーゼ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のトランスポゾンであるＴｎ４４３０に由来するＴｎｐＩ、λＩｎｔ組換え系の任意の構成要素、またはこれらの変異体からなる群から選択される。前記リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、またはこれらの変異体であることが好ましい。
【００２１】
この文脈における変異体という用語は、アミノ酸の欠失、置換、および／または付加により、上記のタンパク質から導出され、それらが導出されるタンパク質において固有の機能の一部または全部を保持するタンパク質を指す。
【００２２】
好ましい実施形態では、既知のリコンビナーゼは、例えば、ＣＲＡＭＥＲＩ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）により記載される、「ファミリーシャッフリング」により得られる、キメラリコンビナーゼである。ファミリーシャッフリングを用いるための必須条件は、キメラリコンビナーゼを作出するために使用されるリコンビナーゼの間の著明な相同性である。本発明において使用しうるキメラリコンビナーゼの例は、リコンビナーゼであるＣｒｅおよびリコンビナーゼであるＤｒｅのそれぞれの配列からなる、キメラリコンビナーゼである。
【００２３】
より好ましい実施形態では、リコンビナーゼは、ｌｏｘＰとして既知の、３４ｂｐの対称標的部位を認識する、Ｃｒｅリコンビナーゼである。ｌｏｘＰ部位は（およびまた、野生型リコンビナーゼの他の組換え部位も）、部位に指向性を付与する、いわゆるスペーサーを表す、最も内側の８塩基対により隔てられた、１３ｂｐずつの２つのリピートを伴うパリンドロームである。組換えは、スペーサー配列内の切断により生じる。関与する２つのｌｏｘＰ部位の相対的な位置および配向性に応じて、Ｃｒｅは、ＤＮＡの組込み、切出し、または再配列を触媒する（ＨＯＥＳＳ  ＆  ＡＢＲＥＭＳＫＩ，  １９８５）。
【００２４】
１つの有用なリコンビナーゼは、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）から単離されたＺｒｅ、またはその変異体、断片、および相同体であって、例えば、野生型配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％の相同性を有し、リコンビナーゼ機能を有する。Ｚｒｅリコンビナーゼは、ｚｏｘ部位において、ＤＮＡを組み換える。これらは、単独で、またはライブラリーの文脈で、本発明の方法を開始するために使用することができる。
【００２５】
最も好ましい実施形態では、リコンビナーゼライブラリー、例えば、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の実施例２において、例えば、記載されている、異なる野生型リコンビナーゼ、および／または適合させたリコンビナーゼ／シャッフルされたリコンビナーゼを含む、例えば、リコンビナーゼライブラリーを、分子進化のための出発点として使用する。このようなライブラリーは、配列番号１、または代替的に、配列番号２を認識することが可能なテーラーメイドリコンビナーゼを作出するために使用される出発点として使用することが好ましい。
【００２６】
本発明の方法により得られるテーラーメイドリコンビナーゼは、複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡの、ＬＴＲ内の非対称標的配列を組み換えることが可能である。リコンビナーゼによりターゲティングされるプロウイルスＤＮＡは、宿主細胞のゲノムへと挿入することができる。代替的に、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼは、（いまだ）宿主細胞のゲノムへと組み込まれていない、すなわち、非組込みプレインテグレーション複合体（ＰＩＣ）として存在する、複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡの、ＬＴＲ内の非対称標的配列も組み換えうる。こうして、既に組み込まれたＨＩＶのほか、宿主細胞のゲノムへといまだ組み込まれていないＨＩＶも、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼにより不活化させることができる。
【００２７】
本発明では、「標的配列」、「標的部位」、および「組換え部位」という用語を互換的に使用し、当技術分野でもまた、そうすることに注目されたい。
【００２８】
対称標的部位を認識する自然発生のリコンビナーゼとは対照的に、本発明の方法は、スペーサーにより隔てられたパリンドローム配列からならない標的部位を認識するテーラーメイドリコンビナーゼを提供する。それどころか、非対称標的部位において、配列は、対称反転リピートを形成しない。したがって、非対称標的部位を認識することが可能なテーラーメイドリコンビナーゼは、変動する配列の半部位からなる標的部位を認識し、かつ、組み換えるものとする。
【００２９】
非対称標的部位内の、「左半部位」および「右半部位」と称する配列は、それぞれ、既知の標的部位の左半部位および右半部位に対するそれらの相同性により規定される。既知の標的部位の左半部位および右半部位と相同な配列の間に場所づけられた配列を、スペーサーと称する。
【００３０】
しかし、配列が、既知の標的部位のうちの左半部位配列または右半部位配列のいずれかだけに対して相同性を有するＬＴＲにおいて見出される場合、これらの配列は、それでも、本発明の実施において使用されうる。当業者には、その天然の標的配列が、ＬＴＲ内の配列に対する相同性を示す、リコンビナーゼに属する標的部位のサイズが既知である。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される標的配列に対する相同性が、ＬＴＲ配列内で見出される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される非対称標的部位は、８ヌクレオチドのスペーサーにより隔てられた、１３ヌクレオチドずつで２つの半部位配列を伴う３４ヌクレオチドからなるものとする。したがって、ＬＴＲ内の相同な配列は、既知の標的部位の配列に対する相同性に応じて、非対称標的部位の左半部位もしくは右半部位またはスペーサーとして規定される。こうして、既知の標的配列の左半部位に対する相同性を有する配列は、左半部位として規定され、既知の標的配列の右半部位に対する相同性を有する配列は、右半部位として規定される。この規定から出発して、既知の標的部位の構造についての検討下にある、非対称標的部位の他の部分も規定される。こうして、例えば、ＬＴＲ内の右半部位配列を、ｌｏｘＰ部位（Ｃｒｅリコンビナーゼにより認識される）に対する相同性について規定したら、非対称標的配列のスペーサーおよび左半部位に対応する他の配列も、容易に規定することができる。スペーサー配列は、例えば、右半部位配列として規定された配列の５’末端の上流にある８ヌクレオチドをカウントすることにより規定されるが、左半部位配列も同様に、以前に規定されたスペーサー配列の５’末端の上流にある１３ヌクレオチドをカウントすることにより規定される。
【００３１】
相同性は、この文脈のほか、全ての適用においても、配列同一性を意味する。相同性を目的とする好ましい比較は、ＳＭＩＴＨ  ＆  ＷＡＴＥＲＭＡＮ  （１９８１）による局所相同性アルゴリズム、ＮＥＥＤＬＥＭＡＮ  ＆  ＷＵＮＳＣＨ  （１９７０）による相同性アライメントアルゴリズム、またはＰＥＡＲＳＯＮ  ＆  ＬＩＰＭＡＮ  （１９８８）による類似性検索法を含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知の標準的な技法を使用して、少なくとも２つの配列を比較することである。本出願の目的では、配列相同性は、そうでないことが言明されない限りにおいて、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）から入手可能な、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータプログラムを使用して決定することが好ましい。
【００３２】
リコンビナーゼが、これらの２つの標的部位の間の配列を切り出すことを可能とするように、プロウイルスのゲノム内に、２つの同一な標的部位が存在しなければならないという要件を考慮し、本発明の方法の工程（ａ）では、ゲノム内に少なくとも２回現れる、プロウイルスＤＮＡの配列について走査する。このような配列は、例えば、プロウイルスＤＮＡのＬＴＲ配列である。したがって、プロウイルスＤＮＡの５’−ＬＴＲと、３’−ＬＴＲとは同一であるので、ＬＴＲの配列は、走査することが好ましい。５’−ＬＴＲ内に存在する非対称標的部位はまた、３’−ＬＴＲ内にも存在し、こうして、ＬＴＲの間に場所づけられたプロウイルスＤＮＡの切出しを可能とする。
【００３３】
既知の標的部位に対する十分な相同性を有するＬＴＲ配列内で同定された配列の外側でも、既知のリコンビナーゼの標的部位の配列に対して最大の相同性を有する配列が、選択されることが好ましい。しかし、また、最大の相同性を有する配列以外の配列、例えば、最大数のレトロウイルス株において存在する配列、または、例えば、患者が特定の株に感染している場合、目的のレトロウイルス株において存在する配列を選択することも可能である。
【００３４】
本発明の方法の潜在的可能性は、既知の標的部位に対する相同性が３０％未満、例えば、相同性が少なくとも１１％または少なくとも２０％である、非対称標的部位を認識するリコンビナーゼをテーラーメイドすることであってもなお可能とすることに注目されたい。しかし、それぞれの非対称標的部位またはその部分部位について、残存する組換え活性の存在を確認するには、既知のリコンビナーゼの既知の標的部位の左半部位配列および右半部位配列に対して少なくとも３０％の相同性を有する配列について走査することが好ましい。さらに好ましい実施形態では、既知のリコンビナーゼの既知の標的部位の左半部位配列および右半部位配列に対する、少なくとも３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０％、より好ましくは、８５％、特に好ましくは、９０％、最も好ましくは、９５％の相同性を有する非対称標的配列を選択する。
【００３５】
本発明の一実施形態では、ＬＴＲ内で選択される配列は、部位特異的リコンビナーゼであるＣｒｅにより認識される対称ｌｏｘＰ標的部位に対する相同性を有する。
【００３６】
好ましい一実施形態では、リコンビナーゼライブラリー、例えば、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の実施例２において記載されているライブラリーなど、異なる野生型リコンビナーゼおよび／または適合させたリコンビナーゼ／シャッフルされたリコンビナーゼを含むリコンビナーゼライブラリーを、分子進化のための出発点として使用する。例示的なライブラリーは、Ｃｒｅおよびこれに由来するリコンビナーゼを含む。例示的なライブラリーはまた、Ｔｒｅ、Ｄｒｅ、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属およびシェワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属に由来するリコンビナーゼ、ならびに／またはこれらから導出されたリコンビナーゼも含みうる。ライブラリーは、例えば、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２において開示されている通り、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、「Ｃｒｅ処理後の」Ｄｒｅ、シェワネラ属リコンビナーゼ（Ｓｈｅｗ）、「Ｃｒｅ処理後の」Ｓｈｅｗ、および／またはＺｒｅを含みうる。Ｔｒｅとは、ＷＯ２００８／０８３９３１により開示されている通り、テーラーメイドリコンビナーゼであり、さらにまた、Ｔｒｅ  １．０とも称する。
【００３７】
一実施形態では、ライブラリー内の全てのリコンビナーゼは、同じ長さのスペーサーを伴う標的配列を認識する。スペーサーを含む半部位配列１および半部位配列２の全長は、３４ヌクレオチドであることが好ましい。
【００３８】
少なくとも１つのリコンビナーゼが、リコンビナーゼライブラリーである場合、相同性とは、既知のリコンビナーゼ標的部位のプールに対する相同性（すなわち、所与の位置における、標的配列のうちの少なくとも１つに対する相同性を、相同性として規定する）である。結果として、工程（ｃ）では、既知の標的配列のうちの少なくとも１つにおけるヌクレオチドに対応しないヌクレオチドだけを、逸脱ヌクレオチドとして規定する。リコンビナーゼライブラリーの場合、工程（ｅ）における「天然ヌクレオチド」とは、既知の標的配列のうちのいずれかの中のその位置に存在するヌクレオチドでありうる。好ましくは、「天然ヌクレオチド」とは、既知の標的配列のうちのいくつかまたは大半の中のその位置に存在するヌクレオチドである。
【００３９】
複数のレトロウイルス株内に存在する標的配列を同定するために、文献において記載されている、リコンビナーゼの既知の認識部位を、ゲノムの連なりに対する、保存的非対称標的配列を検索するためのクェリーとして使用することができる。しかし、領域の反復的性格を踏まえ、標準的な配列類似性検索ツールの使用は除外する。Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７は、ＢＬＡＳＴ（ＡＬＴＳＣＨＵＬ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）を使用して、ＨＩＶ株にわたり、ｌｏｘ様結合性部位を見出した。ＨＩＶ−１  ＬＴＲ配列にわたり実施した場合の、ｌｏｘ様部位についてのＢＬＡＳＴ検索が結果としてもたらしたのは、単一の株内に存在する１つの部位だけの発見であった。ＢＬＡＳＴは、このような短い冗長配列に対しては良好に機能せず、また、ＨＭＭＥＲ（ＥＤＤＹ  ｅｔ  ａｌ，  １９９８）、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ、またはＥｍｂｏｓｓシリーズのパッケージによるパリンドロームプログラムなどの代替的プログラムも、適切でないことがわかっている。リコンビナーゼの既知の認識部位に基づき、フランキング領域についての位置重み行列に基づくアルゴリズムを使用し、配列をビット列へと変換した後に、配列に対する二項演算を使用する特殊なプログラムにより、複数のレトロウイルス株において見出される非対称標的配列を同定した（ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２）。
【００４０】
ＨＩＶ−１について、下記で配列番号１または配列番号２として示される配列を有する、適切な非対称標的配列を決定した。これらのリコンビナーゼ標的認識部位は、可能な限り多くのレトロウイルス株にわたり存在するので、これにより、相当数の患者におけるレトロウイルスゲノムに対する治療剤として実際的に有用なリコンビナーゼを作出することが可能となる。
【００４１】
配列番号１および２の左半部位配列および右半部位配列に下線を付し、スペーサーを太字で印字する。
配列番号１
【化１】
0006668264.tif 000002
配列番号２
【化２】
0006668264.tif 000003
配列番号１は、検索したＨＩＶ−１亜型Ｂ株のうちの９６％（１０６７例中１０２４例）、検索したＨＩＶ−１亜型Ｃ株のうちの９２％（６７９例中６２４例）、検索したＨＩＶ−１亜型Ａ株のうちの８２％（８７例中７１例）において存在する。配列番号２は、亜型Ｂ株および亜型Ｃ株のうちの低百分率において同一である。
【００４２】
配列番号１は、既知のリコンビナーゼ標的部位のプールに対して５４％の相同性を有し、配列番号２は、これらの配列のプールに対して４２％の相同性を有する（それぞれ、左半部位および右半部位に関して）。個々の既知の標的部位に対する相同性は、低度であり、例えば、配列番号１については少なくとも３０％であり、配列番号２については少なくとも１１％である。特に既知の標的部位に対する個々の相同性が低度である場合、リコンビナーゼのライブラリーを出発材料として使用することは、例えば、配列番号１または配列番号２、Ｃｒｅ、Ｆｒｅ、Ｄｒｅ、Ｚｒｅ、およびＴｒｅを含むライブラリーを組み換えることが可能なテーラーメイドリコンビナーゼを作出するために有利でありうる。
【００４３】
本発明の方法の工程（ｂ）では、既知の標的部位の左半部位と相同な、プロウイルスのＬＴＲ内の非対称標的部位の配列を、「半部位配列１」と規定する。既知の標的部位の右半部位と相同な、プロウイルスのＬＴＲ内の非対称標的部位の配列を、半部位配列２と規定する。左半部位を表す配列と、右半部位を表す配列との間の配列を、スペーサーと称する。
【００４４】
工程（ｃ）では、対応する既知の標的の、相同な左半部位配列および右半部位配列の配列から逸脱する、工程（ｂ）の配列の、「半部位配列１」および「半部位配列２」のそれぞれの中のヌクレオチドを、配列アライメントおよび配列比較により決定する。この文脈では、「半部位配列１」の配列を、好ましくは、左半部位配列である、対応する天然半部位と比較する一方で、「半部位配列２」の配列を、好ましくは、右半部位配列である、パリンドロームの天然標的部位を形成する、他の半部位と比較する。
【００４５】
ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の図１は、リコンビナーゼのライブラリーと比較した、配列番号１および２についてのこの比較の結果を示す。逸脱ヌクレオチドを、暗色のバックグラウンドの手前に示す。
【００４６】
この比較は必ずしも、本発明の方法の工程（ｂ）の後および工程（ｄ）の前に実施しなければならないわけではなく、また、方法の異なるフェーズである、工程（ａ）の後および工程（ｅ）の前に実施することもできる。
【００４７】
工程（ｄ）では、標的配列を含む２つの標的核酸による第１のサブセットが作出され、第１の標的配列が、部分部位１と命名され、互いと隣接し、５’から３’の順序で、工程（ｂ）の半部位配列１、非対称標的配列のスペーサー配列、および半部位配列１の反転リピートを含み、第２の標的配列が、部分部位２と命名され、互いと隣接し、５’から３’の順序で、半部位配列２の反転リピート、非対称標的配列のスペーサー配列、および工程（ｂ）の半部位配列２を含む。第１のサブセットの標的配列は、対称標的部位の構造を有する、パリンドロームのオリゴヌクレオチド配列である。これらの人工的対称標的部位は、工程（ｂ）の半部位配列をベースとして、各オリゴヌクレオチド配列内で逸失する半部位配列を、反転リピートとして補完することにより合成するが、この場合、「半部位配列１」および「半部位配列２」のそれぞれの配列を、スペーサー配列の反対側の末端において、第２の半部位配列を補完するのに使用する。したがって、第１のサブセット内の第１の標的配列（「部分部位１」と称する）が、スペーサー配列により隔てられた、「半部位配列１」と反転して反復した「半部位配列」とからなる反転リピートを含む一方で、  第１のサブセット内の第２の標的配列（「部分部位２」と称する）は、スペーサー配列により隔てられた、反転して反復した「半部位配列２」と「半部位配列２」とからなる反転リピートを含む。「部分部位１」では、配列は、以下：５’−「半部位配列１」−スペーサー−「半部位配列１の反転リピート」−３’の通りに配列し、「部分部位２」では、配列は、以下：５’−「半部位配列２の反転リピート」−スペーサー−「半部位配列２」−３’の通りに配列する。
【００４８】
第１のサブセットの２つずつの合成標的配列内のスペーサー配列は、同一であり、ＬＴＲの配列に対応し、非対称標的部位のスペーサー配列を表すか、または非対称標的部位のスペーサー配列として規定されていることが好ましい。しかし、さらなる実施形態では、スペーサー配列は、ヌクレオチド置換に由来する、１つまたは２つの配列の逸脱を含みうる。
【００４９】
一般に、この工程は、特異的なリコンビナーゼをテーラーメイドするために選択される非対称標的部位の配列の第１の分割を表す（参照により本明細書に完全に組み込まれる、ＷＯ２００８／０８３９３１の図１、および、これもまた参照により本明細書に完全に組み込まれる、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の図２を参照されたい）。この工程では、特異的なリコンビナーゼをテーラーメイドするために選択される、非対称標的部位の半部位から導出される対称標的部位を保有する配列を作出する。結果として、前記非対称標的部位の１つの半部位内に存在する各突然変異［すなわち、元の（野生型）リコンビナーゼにより認識される標的部位に対する差違］は今や、第１のサブセット内の対称標的配列の間に分散されている。
【００５０】
本発明の方法の工程（ｅ）では、修飾された標的配列を含む標的核酸による第２のサブセットを、工程（ｄ）の第１のサブセット内の標的配列をベースとして作出する。部分部位１に基づく配列内の、左半部位配列において、工程（ａ）の、少なくとも１つの既知の標的部位の、対応する相同な半部位配列から逸脱するヌクレオチドのうちの一部を、前記既知の標的部位内で見出される天然ヌクレオチドにより、前記半部位配列が、前記既知の標的部位から逸脱する１つ、２つ、または３つ（好ましくは、２つ）のヌクレオチドを含有するまで置きかえ、非対称標的配列のスペーサー配列により、前記修飾された左半部位配列から隔てられた、前記修飾された左半部位配列の反転リピートにより、前記修飾された標的配列の右半部位を形成する。
【００５１】
部分部位２に基づく配列内の、右半部位配列において、工程（ａ）の、少なくとも１つの既知の標的部位の、対応する相同な半部位配列から逸脱するヌクレオチドのうちの一部を、前記既知の標的部位内で見出される天然ヌクレオチドにより、前記半部位配列が、前記既知の標的部位から逸脱する１つ、２つ、または３つ（好ましくは、２つ）のヌクレオチドを含有するまで置きかえ、非対称標的配列のスペーサー配列により、前記修飾された右半部位配列から隔てられた、前記修飾された右半部位配列の反転リピートにより、前記修飾された標的配列の左半部位を形成する。
【００５２】
例えば、配列番号１に基づく部分部位の両方、または配列番号２の部分部位２など、１つの部分部位が、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の図１に示されるリコンビナーゼのライブラリーに関して、６つの逸脱ヌクレオチドを含む場合、部分部位に基づいて３つの修飾された標的配列を作出することができ、各々が、左半部位内（部分部位１に基づく場合）または右半部位内（部分部位２に基づく場合）に、２つの（異なる）逸脱ヌクレオチドを含有する。結果として、各修飾された標的配列内では、それぞれの部分部位の配列を、４つのヌクレオチドにおいて、既知の標的配列（または少なくとも１つの既知の標的配列）の配列に対応するように修飾する（ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の図２）。当然ながら、また、各々が逸脱ヌクレオチドのうちの１つを含有する、６つの修飾された標的配列、または各々が逸脱ヌクレオチドのうちの３つを含有する、２つの標的配列を作出することも可能である。
【００５３】
別の例では、配列番号２の部分部位１など、１つの部分部位が、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の図１に示されるリコンビナーゼのライブラリーに関して、９つの逸脱ヌクレオチドを含む場合、部分部位に基づいて３つの修飾された標的配列を作出することができ、各々が、半部位内に、３つの（異なる）逸脱ヌクレオチドを含有する。
【００５４】
結果として、工程（ｄ）の第１のサブセットの１つの標的配列に由来する、全ての修飾された半部位配列内にまとめて、全ての逸脱ヌクレオチドを見出しうる一方で、前記修飾された半部位配列のうちのいずれも、単独では全ての逸脱ヌクレオチドを含まない。
【００５５】
ここでもまた、スペーサー配列が、両方の配列を隔てて、反転リピートを形成するように、修飾された半部位配列をベースとして、反転リピートを作出する（ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の図２を参照されたい）。高次のサブセットの標的配列から導出される新たなサブセットの各修飾された標的配列内のスペーサー配列は、同一であり、ＬＴＲの配列に対応し、非対称標的部位のスペーサー配列を表すか、または非対称標的部位のスペーサー配列として規定されていることが好ましい。しかし、さらなる実施形態では、スペーサー配列は、ヌクレオチド置換に由来する、１つまたは２つの配列の逸脱を含みうる。この手法を使用すると、各サブセットを表す、標的配列内の突然変異（すなわち、野生型リコンビナーゼにより認識される標的部位に対する差違）の数は、出発非対称標的配列内より小さいが、標的配列のうちの１つにおける全ての突然変異は、依然として表されている（ＷＯ２００８／０８３９３１の図１、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の図２を参照されたい）。
【００５６】
本明細書で使用される「逸脱ヌクレオチド」という用語は、ＬＴＲ内で同定もしくは規定された非対称標的配列内または本発明に従い作出されたサブセットの標的配列内のヌクレオチドであって、本発明の方法の工程（ａ）において選択される、既知のリコンビナーゼの、既知の相同な対称標的配列の、対応する相同な配列内と同じ位置に存在するヌクレオチドから逸脱する（すなわち、これと異なる）ヌクレオチドを指す。この文脈では、「逸脱ヌクレオチド」および「突然変異」という用語を、互換的に使用する。
【００５７】
ＷＯ２００８／０８３９３１は、基質として使用される標的配列の、天然の標的配列との差違が、３ヌクレオチドを超えない場合、標的配列を基質として使用する分子定方向進化を使用して、リコンビナーゼをテーラーメイドしうることについて教示する。こうして、上記で記載した、異なる順序のサブセットの作出は、逸脱ヌクレオチドの数を、標的配列１つ当たり３またはこれ未満に低減するのに用いられる（ＷＯ２００８／０８３９３１の図１を参照されたい）。逸脱ヌクレオチドの数の段階的な低減は最終的に、異なる順序の標的配列の、多数のサブセットをもたらし、分子定方向進化のための基質として使用しうる最終的なサブセットが創出されるまで、逸脱ヌクレオチドの数を減少させる。異なるサブセットを創出し、これにより、逸脱ヌクレオチドの数を低減しながら、野生型リコンビナーゼにより認識される標的部位に対する差違を、各々が、これらの逸脱ヌクレオチドのうちの３つを超えて含まない、いくつかの標的配列の間に分散させながら、最終的な順序の標的配列が、全体としては、全ての逸脱ヌクレオチドを依然として表す。
【００５８】
本発明の方法では、第２のサブセットの標的配列から出発して、工程（ｅ）の過程を段階的に反復することにより、すなわち、標的配列を、それぞれの半部位配列へと分割し、第２のサブセットの標的配列から導出された半部位の配列を変化させた後で、これらの半部位配列をベースとして、新たなパリンドローム構造を作出し、そのたびに標的配列の新たなサブセットを作出することにより、標的配列のさらなるサブセットを作出してもよく、この場合、反転リピートを作出するために使用される半部位配列は、少なくとも１つの既知の標的部位の、対応する相同な半部位配列から逸脱するヌクレオチドをほとんど含有しない。これらのさらなる標的配列は、リコンビナーゼライブラリーの定方向分子進化およびシャッフリングのさらなる工程のために使用することができる。当然ながら、このようなさらなる工程はまた、配列のうちの一部、例えば、組換え効率の低いリコンビナーゼが得られる配列のためだけに実施することもできる。さらなるサブセットを作出し、リコンビナーゼを、これらにおいて進化させる場合、進化させたリコンビナーゼのライブラリーは、本発明の方法の工程（ｆ）において使用する。
【００５９】
工程（ｅ）において得られた標的配列の第２のサブセットから出発して、第３のサブセットを作出することができ、必要な場合は、これに続いて、第４、第５、第６のサブセットなども作出することができる。しかし、第３のサブセットの作出は一般に、第２のサブセットの標的配列が依然として、３つを超える逸脱ヌクレオチドを含有する場合に限り必要である。同じことは、前のサブセットの標的配列が依然として、３つを超える逸脱ヌクレオチドを含有する場合に限り必要な、次のサブセットの作出にも当てはまる。一実施形態では、標的配列のサブセットは、最終的なサブセットの標的配列が、ただ１つの逸脱ヌクレオチドを含むまで作出されることに注目されたい。したがって、各半部位配列内の逸脱ヌクレオチドの数に応じて、非対称標的部位の各半部位配列のために作出されるサブセットの数は異なりうる。例えば、左半部位配列については、作出することが必要なサブセットが２つのだけでありうるのに対し、単一の標的配列が、これらの逸脱ヌクレオチドのうちの３つを超えて含まないように、逸脱ヌクレオチドをいくつかの標的配列の間で分散させるために、右半部位については、３つまたは４つのサブセットを作出しなければならない。
【００６０】
逸脱ヌクレオチドの数を、３つを下回る数まで低減するために、標的配列のさらなるサブセットを作出する原理は、ＷＯ２００８／０８３９３１の図１に例示されており、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の図２は、修飾された標的配列の具体例を提示している。
【００６１】
工程（ｆ）では、前記既知の相同な標的部位の、対応する相同な半部位配列から逸脱する、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドを含有する、工程（ｅ）において得られた、最終的なまたは第２のサブセットの標的配列を、基質として使用して、工程（ａ）の、既知の相同な標的部位を認識する、少なくとも１つのリコンビナーゼに対して、分子定方向進化の方法を適用する。
【００６２】
本明細書で使用される「最終的なサブセット」という用語は、工程（ｅ）において作出された最後のサブセット、すなわち、さらなるサブセットが作出されない場合は、第２のサブセットを指す。非対称標的部位内の逸脱ヌクレオチドの数および標的配列１つ当たりの逸脱ヌクレオチドの数を低減して３を下回るように作出しなければならなかったサブセットの数に応じて、「最終的なサブセット」は、任意のサブセット、例えば、第２、第３、第４、または後続のサブセットに対応することが可能であり、ＬＴＲ内の非対称標的配列の半部位配列について異なりうる。リコンビナーゼを、前記既知の相同な標的部位の、対応する相同な半部位配列から逸脱するヌクレオチドをほとんど有さない、修飾された標的配列のさらなるサブセットにおいて、既に進化させた場合は、その工程で得られたリコンビナーゼを使用する。
【００６３】
当然ながら、本発明の過程を、特異的な、修飾された標的配列に対して特異的なリコンビナーゼにより開始することが可能であり、別の特異的な、修飾された標的配列に対する、別のリコンビナーゼ（またはライブラリー）により開始することも可能である。当技術分野では、実験室における進化またはインビトロにおける進化ともまた称する、分子定方向進化の方法が既知である（総説については、ＹＵＡＮ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５、およびこの中の参考文献；ＪＯＨＡＮＮＥＳ  ＆  ＺＨＡＯ，  ２００６を参照されたい）。
【００６４】
分子定方向進化の第１の工程では、当技術分野で既知の方法により、例えば、エラープローンＰＣＲおよびＤＮＡシャッフリング（例えば、ＹＵＡＮ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５において総説されている）、または国際特許出願公開第ＷＯ２００２／４４４０９号において開示されている方法を使用することにより、ランダムに突然変異させたリコンビナーゼ配列のライブラリーを作出する。突然変異させたリコンビナーゼを含む各ライブラリーのプラスミドはまた、工程（ｆ）において得られた、最終的なサブセットの標的配列のうちの１つも含有する。作出されたプラスミドライブラリーの、適切な細胞へのトランスフェクションの後で、リコンビナーゼの発現を可能とし、当業者に既知の通りに、分子定方向進化を実行する。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明の方法の工程（ｆ）において用いられる分子定方向進化は、基質連結型タンパク質進化（ＳＬｉＰＥ；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  ＆  Ｓｔｅｗａｒｔ，  ２００１；国際特許出願公開第ＷＯ０２／４４４０９号）である。基質連結型タンパク質進化は、ＷＯ２００８／０８３９３１またはＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２の実施例において詳細に記載されている通りに実行することができる。略述すると、工程（ｅ）において得られた標的配列を、プラスミド（いわゆる進化ベクター）へと、ランダムに突然変異させた、リコンビナーゼのコード配列と併せてクローニングする。ランダム突然変異は、エラープローンＰＣＲ（ＢＵＣＨＨＯＬＺ  ＆  ＳＴＥＷＡＲＴ，  ２００１を参照されたい）により実行する。次いで、作出されたプラスミドライブラリーを、イーコリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へとトランスフェクトして、リコンビナーゼの発現を可能とする。リコンビナーゼの発現を駆動する誘導的プロモーターを使用することにより、発現レベルを調整することが可能である。一晩にわたるインキュベーションの後で、プラスミドＤＮＡを、細胞から単離し、ＮｄｅＩにより消化して、組み換えられなかったプラスミドを切断し、組み換えられたプラスミドだけを、その後、プライマーにより増幅する。プラスミドの組換え形態のＰＣＲ産物は、１．７Ｋｂのバンドをもたらす。ＰＣＲ産物は、ＢｓｒＧＩおよびＸｂａＩにより消化し、次の進化サイクルのための、同様に消化された進化ベクターへと戻してサブクローニングする。
【００６６】
工程（ｇ）では、工程（ｆ）において進化させたリコンビナーゼライブラリーを、組み合わせ、かつ、シャッフルする。当技術分野では、ＤＮＡシャッフリング技術が既知である（総説については、ＭＩＮＳＨＵＬＬ  ＆  ＳＴＥＭＭＥＲ，  １９９９；ＳＴＥＭＭＥＲ，  １９９４を参照されたい）。部分部位１に基づいて修飾された標的配列において進化させたリコンビナーゼライブラリーを組み合わせ、かつ、シャッフルし、別個に、部分部位２に基づいて修飾された標的配列において進化させたリコンビナーゼライブラリーを、組み合わせ、かつ、シャッフルする。次いで、組み合わされ、かつ、シャッフルされたライブラリーを、次の高次のサブセット、すなわち、２つのサブセットを作出する場合は、工程（ｄ）において作出されたサブセットの標的配列を含む、新世代のベクターへとクローニングする。例えば、部分部位１に基づく配列において進化させたライブラリーのためのベクターは、部分部位１の配列を、標的配列として含み、部分部位２に基づく配列において進化させたライブラリーのためのベクターは、部分部位２の配列を、標的配列として含む。
【００６７】
工程（ｈ）では、論じられている通り、工程（ｄ）によるサブセットでありうる、次の高次のサブセットの標的配列を使用して、工程（ｇ）において得られた、シャッフルされたライブラリーに対して、分子定方向進化の方法を適用する。この工程では、工程（ｆ）において既に適用された方法と同じ分子定方向進化の方法を使用しうるが、本発明の方法のこの工程ではまた、異なる分子定方向進化の方法を使用することも可能である。異なる分子定方向進化の方法の例は、例えば、ＹＵＡＮ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）により記載されている。基質連結型タンパク質進化の方法はまた、組み合わされ、かつ、シャッフルされたライブラリーにも適用することが好ましい。
【００６８】
この工程は、低次のサブセットの異なる標的配列に由来する突然変異の組合せ（および、こうして、数を増大させる）を保有する標的配列を認識し、組み換えるリコンビナーゼをもたらす。標的配列の低次のサブセットによる異なるライブラリーに由来する突然変異の組合せは、相乗的効果を結果としてもたらし、今や、高次のサブセットの標的配列を組み換える、リコンビナーゼの作出をもたらすことから、中間体を通して精査する進化戦略を使用して、所望の活性を達成しうることが実証される。
【００６９】
工程（ｉ）では、工程（ｇ）、すなわち、リコンビナーゼライブラリーを組み合わせ、かつ、シャッフルする工程と、工程（ｊ）、すなわち、組み合わされ、かつ、シャッフルされたライブラリーに対して、分子定方向進化を適用する工程を、プロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内に存在する非対称標的配列に対して活性である、少なくとも１つのリコンビナーゼを達成するまで反復する。
【００７０】
１つ、２つ、または３つだけのヌクレオチド逸脱を伴う標的配列を作出するのに、２つの標的配列のサブセットの作出が必要な方法では、例えば、標的配列の第２のサブセットについて進化させたリコンビナーゼライブラリーを、組み合わせ、かつ、シャッフルし、第１のサブセットの標的配列を使用して、このシャッフルされたライブラリーに対して、分子定方向進化を適用する。次の工程では、プロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内の、工程（ａ）の非対称標的配列を使用して、分子定方向進化により、レトロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内の非対称標的配列に対して活性である、少なくとも１つのリコンビナーゼを得るように、第１のサブセットの標的配列を認識するリコンビナーゼを含む、リコンビナーゼライブラリーを進化させる。この工程では、分子定方向進化の方法は、基質連結型タンパク質進化の方法であることが好ましい。
【００７１】
「少なくとも１つのリコンビナーゼ」とは、本発明の方法が、各々がそれ自体、非対称標的配列の組換えにおいて活性である、１つまたは複数の（単一の）リコンビナーゼをもたらしうるという事実を指す。併せた場合に限り、非対称標的配列を組み換えることが可能な、いくつかの異なるリコンビナーゼを包含することは意図しない。実際、本発明の方法は、個々の細胞１つ当たり１つのリコンビナーゼだけを発現させるため、非対称標的配列を組み換えるのに、他の異なるリコンビナーゼと組み合わせることを必要とするリコンビナーゼの選択をもたらさない。
【００７２】
当技術分野では、特に、ＷＯ２０１１／１４７５９０により、方法の工程（ａ）〜（ｊ）が本質的に既知である。
【００７３】
工程（ｊ）の後で、テーラーメイドリコンビナーゼのライブラリーを、工程（ａ）による既知の対称標的部位の組換えについて、例えば、ｌｏｘＰおよび／またはｌｏｘＨの組換えについて陰性選択する。
【００７４】
この選択は、ベクターライブラリーの、ターゲティングされた分子進化およびシャッフリングを含む、１つまたは複数の工程の、少なくとも１つのサイクルにより行うことができる。
【００７５】
この目的のために、前述の工程において進化させた、少なくとも１つのテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸を、その中において使用されるベクターから単離し、適切な進化ベクターへとクローニングすることができる。前記ベクターは、例えば、ｌｏｘＰ（配列番号４）および／またはｌｏｘＨ（配列番号５）の組換えのための、工程（ａ）による、既知の標的部位を組み換える、テーラーメイドリコンビナーゼの陰性選択を可能とする。これにより、ベクターのライブラリーが得られる。次いで、分子定方向進化、好ましくは、基質連結型タンパク質進化（ＳＬｉＰＥ）を、当業者に知られている通りに、かつ、上記の原理に従い用いる。
【００７６】
例えば、進化ベクターは、組換えを可能とするよう、最終的な非対称標的配列（例えば、配列番号１）および既知の標的部位（例えば、ｌｏｘＰおよび／またはｌｏｘＨ）の両方を、各々２回ずつ含むように構築することができる。既知の標的部位における組換えおよび後続の制限消化（ｄｉｇｅｓｔ）は、産物のＰＣＲ増幅を可能とする順序で、２つの特異的なプライマー部位を含まない、直鎖状の産物をもたらす。組換えが全く生じない場合、ベクターは、制限消化により直鎖化され、ＰＣＲによる増幅が生じない。これに対し、最終的な非対称標的部位（例えば、配列番号１）における組換えが、制限部位を切り出す、すなわち、ベクターが制限消化により直鎖化されず、ＰＣＲにより、テーラーメイドリコンビナーゼを増幅することができる。本来的にエラーをもたらすＰＣＲを使用して、可変性を作出する。進化は、イーコリにおいて実行することができる。
【００７７】
分子定方向進化の、１つまたは複数のサイクル、好ましくは、約１０サイクルの後で得られたライブラリーをシャッフルすることができる。分子定方向進化の１つもしくは複数のさらなるサイクルおよび／またはシャッフリングを実行することができる。
【００７８】
いくつかの既知の標的部位の組換えについて、例えば、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＨの組換えについての陰性選択を、交互に実行してもよく、例えば、ｌｏｘＰに対する陰性選択を伴う１サイクルの進化を、ｌｏｘＨに対する陰性選択を伴う１サイクルの進化と交互に行うことができる。例えば、約２ラウンドのＤＮＡシャッフリングと組み合わせた、約１０〜約３０または約１５〜２０サイクルの陰性選択を、実行することができる。これらの進化サイクルの間、転写活性化因子であるＬ−アラビノースの量は、例えば、１００μｇ／ｍＬ〜１μｇ／ｍＬ変動させることができる。好ましいベクターおよび方法を、図２および実施例に示す。
【００７９】
多数の進化サイクルを実行した後で、テーラーメイドリコンビナーゼの、最終的な非対称標的配列に対する特異性および既知の標的配列に対する潜在的な残存活性を、１つまたは複数のクローンについて点検することができる。
【００８０】
特異性がいまだ満たされていない場合は、さらなる進化サイクルを実行するものとする。
【００８１】
図３に示される通り、陰性選択は、ＷＯ２０１１／１４７５９０Ａ２により教示されるテーラーメイドリコンビナーゼ（ＴＲＥ３）などのテーラーメイドリコンビナーゼの、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＨの既知の標的配列に対する残存活性を除去する。作出された本発明のリコンビナーゼの、既知の標的部位、例えば、ｌｏｘＰおよび／またはｌｏｘＨに対する残存活性は、高量（５０または１００μｇ／ｍｌ）の転写活性化因子であるＬ−アラビノースの存在下、すなわち、高量のリコンビナーゼの存在下であってもなお、検出されない。特異的な非対称標的配列は、組み換えられるが、既知の対称標的配列は、組み換えられないので、これは、得られたテーラーメイドリコンビナーゼが、それらの標的配列に対して、この場合には、配列番号１に対して、高度に特異的であることを示す。
【００８２】
これは、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼを、ヒトの治療に適用する場合、宿主細胞内のヒト配列との交差反応、および宿主細胞内のヒト配列の組換えの危険性が最小限となる利点を有する。これは、ヒト細胞内の、テーラーメイドリコンビナーゼの寛容性に寄与する１つの因子である。しかし、ここでは、リコンビナーゼの発現の短期的な帰結だけが問題となるのではなく、また、有効性が低度であってもなお、非特異的組換えの、可能な発がん効果など、安全性の側面も問題となる。こうして、テーラーメイドリコンビナーゼの残存活性の消失さえもが、結果として得られるテーラーメイドリコンビナーゼの、治療的状況における安全性および信頼性に寄与する。
【００８３】
既知の対称標的配列の組換えに対する選択に続いて、ヒト細胞内で十分に寛容化されたテーラーメイドリコンビナーゼについての選択を行う。
【００８４】
本発明の方法の工程（ｎ）では、工程（ｍ）において得られた、少なくとも１つのテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸を単離し、コードされるリコンビナーゼおよび選択マーカーを、真核細胞内、好ましくは、ヒト細胞内で発現させるためのベクターへとクローニングし、これにより、ベクターライブラリーを得る。核酸は、適切な制限酵素を使用して、ライブラリー内のそれぞれのプラスミドから単離することができる。当業者には、制限エンドヌクレアーゼ消化の方法が知られている。次いで、リコンビナーゼをコードする核酸を、例えば、ゲル電気泳動など、既知の方法により回収することができる。当技術分野の最新技術で知られている通り、または下記の通り、核酸は、真核細胞内、例えば、ヒト細胞内で発現させるのに適切な発現ベクターへとクローニングすることができる。例えば、図４Ａに示される通り、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを使用することができる。コードされるテーラーメイドリコンビナーゼおよび選択マーカーの発現は、構成的であることが好ましいが、適切な薬剤により誘導することもできる。
【００８５】
選択マーカーは、抗生剤に対する耐性を付与する場合もあり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその誘導体（例えば、ＥＢＦＢ、ＥＣＦＰ、ＹＦＰ）などの蛍光タンパク質の場合もある。ＧＦＰなどの蛍光タンパク質は、発現の強度に依存する、容易な細胞分取を可能とする。
【００８６】
工程（ｌ）では、真核細胞、好ましくは、ヒト細胞、好ましくは、ヒトＴ細胞を、工程（ｋ）において得られた前記ベクターライブラリーにより形質転換する。当技術分野の最新技術で既知の方法を使用することができる。形質転換される細胞は通例、ヒト細胞であるが、非ヒト患者のための治療を意図する場合は、その患者の種の細胞内の寛容性について調べることが妥当である。ヒト細胞は、造血細胞、例えば、好ましくは、Ｔ細胞、特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞であることが好ましいが、また、ＣＤ３４＋幹細胞などの幹細胞も使用することができる。初代細胞、例えば、初代Ｔ細胞、好ましくは、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を使用しうるが、また、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞などの細胞系も用いることができる。
【００８７】
工程（ｐ）では、前記選択マーカーを発現する細胞を、ヒト細胞により十分に寛容化されたＴＲＥリコンビナーゼについて選択するのに十分な期間培養する。選択は、マーカーと、テーラーメイドリコンビナーゼとの発現は相関するという仮定に基づく。細胞は、マーカーの発現について選択する、例えば、ＧＦＰ陽性細胞、好ましくは、ＧＦＰの発現が強い細胞を選択する。選択マーカーの発現と、テーラーメイドリコンビナーゼの発現とは、相関するので、これらの細胞はまた、テーラーメイドリコンビナーゼも発現する。したがって、それらの生存またはそれらの増殖のための能力に有害なテーラーメイドリコンビナーゼを発現する細胞は、消失するか、または量が低減される。マーカーを発現する細胞は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、または少なくとも４週間培養することが好ましい。したがって、Ｔ細胞内で発現させたテーラーメイドリコンビナーゼは、ヒト細胞、例えば、ヒトＴ細胞により十分に寛容化され、すなわち、前記細胞に対して毒性でないか、または、そうでなくともまた、前記細胞の生存および増殖に有害でないことが好ましい。この培養期間中に、細胞を、選択マーカーの高発現について、少なくとも１回、好ましくは、２、３、または４回選択することが好ましい。例えば、蛍光タンパク質による場合、選択は、蛍光標識型細胞分取により実施されうる。抗生剤耐性遺伝子による場合、抗生剤の量を増大させて、培養培地へと添加することができる。
【００８８】
ヒト細胞内の野生型Ｃｒｅリコンビナーゼの発現が、長期間確立された、妥当な発現レベルにおいて、問題がないことが示されていても、Ｃｒｅの過剰発現は、毒性でありうる（ＬＯＯＮＳＴＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。本発明者らは、相当数の、突然変異させた、本発明によるテーラーメイドリコンビナーゼは、強く過剰発現させると、ヒトＴ細胞の生存および／または増殖に対して有害であることを見出した。興味深いことに、たとえ、ヒト細胞内の低度な寛容性をもたらすのは、テーラーメイドリコンビナーゼの比較的低度な特異性、ならびにｌｏｘＰおよびｌｏｘＨ（ヒトゲノム内に存在する配列）などの標的部位に対する残存活性であることが予測される場合であっても、高度な特異性についての前述の選択を伴わない、ヒトＴ細胞内の寛容性についての選択単独では、ｌｏｘＰまたはｌｏｘＨに対して残存する交差反応性を消失させるのに十分ではなかった。こうして、既に知られている本発明の方法による両方の選択工程の組合せだけが、十分に寛容化され、かつ、高度に特異的であるテーラーメイドリコンビナーゼをもたらす。
【００８９】
工程（ｑ）では、培養および選択の工程に続いて、少なくとも１つのリコンビナーゼをコードする核酸の、工程（ｐ）において得られた、前記選択マーカーを発現する細胞からの単離を行う。
【００９０】
工程（ｒ）は、適宜になされ、工程（ａ）の非対称標的配列を組み換えることが可能な、リコンビナーゼをコードする核酸について、好ましくは、高度な活性による組換えについての別の選択を増補する。組換え活性は、ヒト細胞内、特に、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞内で調べることが好ましいが、また、イーコリにおいて調べることもできる。
【００９１】
工程（ｓ）では、レトロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内の、工程（ａ）の非対称標的配列に対する活性を有するリコンビナーゼの核酸を、ライブラリーから単離する。核酸は、適切な制限酵素を使用して、ライブラリー内のそれぞれのプラスミドから単離することができる。当業者には、制限エンドヌクレアーゼ消化の方法が知られている。次いで、リコンビナーゼをコードする核酸を、例えば、ゲル電気泳動など、既知の方法により回収することができる。
【００９２】
核酸は、保存することもでき（好ましくは、−８０℃を下回る温度において）、工程（ｔ）において、タンパク質発現法によるさらなる解析における使用のために、またはレトロウイルス感染、特に、ＨＩＶ感染および／もしくはＡＩＤＳを処置および／もしくは予防するための、対象への投与のために、発現ベクターへとクローニングしてもよい。適切な発現ベクターについては、当技術分野の最新技術において知られているか、または下記で開示される。
【００９３】
複数のＨＩＶ−１  ＬＴＲ内の配列番号１など、非対称配列を特異的にターゲティングするテーラーメイドリコンビナーゼの開発は、ＨＩＶ−１に感染した対象の大部分について、その染色体の組込みからのそれぞれのプロウイルスの切出しを可能とする。このようなリコンビナーゼをコードする発現ベクター、これをトランスフェクトした細胞、および／またはこれから導出されたリコンビナーゼタンパク質は、例えば、ＨＩＶ−１感染の処置および／または予防において医療的使用を有する。このようなテーラーメイドリコンビナーゼまたはこれをコードする発現ベクターを調製する好ましい方法については、ＷＯ２０１１／１４７５９０において教示されている。本発明者らは、ＷＯ２０１１／１４７５９０において記載されている方法に、高度な特異性、すなわち、工程（ａ）の既知の標的配列に対して（または、例えば、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＨに対して）検出可能な交差反応性が見られないことについて、およびヒトＴ細胞など、ヒト細胞内の、テーラーメイドリコンビナーゼの寛容性についての能動的選択の工程を追加する。記載される通り、これは、ＨＩＶプロウイルスゲノムをヒトＴ細胞から切り出すためのテーラーメイドリコンビナーゼの医療的使用を著明に改善する。
【００９４】
宿主細胞のゲノムへと挿入されうるプロウイルスＤＮＡ、またはいまだ挿入されていないプロウイルスＤＮＡは、レトロウイルスのＤＮＡであることが好ましい。レトロウイルスは、エンベロープＲＮＡウイルスの、大規模かつ多様なファミリーを含む。ファミリーの顕著な特徴は、その複製戦略であり、これは、不可欠の工程として、ウイルスのＲＮＡの、直鎖状の二本鎖ＤＮＡへの逆転写と、その後における、このＤＮＡ（プロウイルスＤＮＡ）の、宿主細胞のゲノムへの組込みとを含む。レトロウイルスは、進化における類縁性により規定される、７つの群へと細分化されている。これらの群のうちの５つ（アルファ−レトロウイルス、ベータ−レトロウイルス、デルタ−レトロウイルス、イプシロン−レトロウイルス、およびガンマ−レトロウイルス）は、発がん可能性を伴うレトロウイルスを表し、他の２つの群は、レンチウイルスおよびスプマウイルスである。ヒト病原性ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型およびＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩ）が、デルタ−レトロウイルス群に属するのに対し、ＡＩＤＳウイルスであるヒト免疫不全ウイルス１型および２型（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）は、レンチウイルス群に属する（総説については、標準的な教科書である、“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”  ｏｆ  ＣＯＦＦＩＮ  ＪＭ，  ＨＵＧＨＥＳ  ＳＨ，  ＶＡＲ  ＵＳ  ＨＥ  （Ｅｄｓ．）  １９９７，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
【００９５】
一実施形態では、宿主細胞のゲノムへと挿入されうるプロウイルスＤＮＡは、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、メイソンファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、サルＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＳＴＬＶ−Ｉ）、サルＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型（ＳＴＬＶ−ＩＩ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）からなる群から選択される、レトロウイルスのＤＮＡである。
【００９６】
別の実施形態では、レトロウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、マエディ−ビスナウイルス（ＭＶＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）からなる群から選択される、レンチウイルスである。上で言明した通り、ＨＩＶ、特に、ＨＩＶ−１が好ましい。
【００９７】
本発明の方法の工程（ａ）において同定される非対称標的配列は、ＨＩＶプロウイルスの５’−ＬＴＲおよび３’−ＬＴＲの両方に局在化する。ＨＩＶプロウイルスの５’−ＬＴＲおよび３’−ＬＴＲの両方に局在化した前記非対称標的配列は、配列番号１または配列番号２として示される配列を有することが好ましい。
【００９８】
好ましい実施形態では、本発明の方法において適用される分子定方向進化の方法は、基質連結型タンパク質進化（ＳＬｉＰＥ；ＢＵＣＨＨＯＬＺ  ＆  ＳＴＥＷＡＲＴ，  ２００１；ＷＯ０２／４４４０９もまた参照されたい）の方法である。
【００９９】
本発明の方法を、本明細書で記載される通りに実行することにより、本発明者らは、十分に寛容化されたテーラーメイドリコンビナーゼをコードする複数の核酸、およびテーラーメイドリコンビナーゼ自体を作出した。こうして、本発明は、配列番号９〜１３のうちのいずれかに記載の配列を含むかもしくはこれからなる十分に寛容化されたテーラーメイドリコンビナーゼ、またはこれをコードする核酸を提供する。
【０１００】
驚くべきことに、これらのテーラーメイドリコンビナーゼは、ＷＯ２０１１／１４７５９０により教示される非対称標的配列、および他の全ての、既に知られているリコンビナーゼに由来する非対称標的配列を組み換えることが可能な、テーラーメイドリコンビナーゼのコンセンサス配列である配列番号７および８と異なることが見出された。
【０１０１】
特に、高度な特異性により、配列番号１の非対称標的配列を組み換えることが可能な、新規の、解析される、十分に寛容化されたテーラーメイドリコンビナーゼは、驚くべきことに、Ｑ８９Ｌ突然変異を含む。
【０１０２】
一実施形態では、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼは、配列番号９に記載の配列（８５％のＴｒｅ  ３．１コンセンサス配列）を含む。配列番号９は、各突然変異（Ｃｒｅアミノ酸配列と比較した）を伴うコンセンサス配列が、８５％の確率により存在することを表す。この決定のために、本発明の方法により作出された１００の個々のクローンを、サンガーシークエンシングにより解析したほか、作出されたＴｒｅ  ３．１ライブラリーの全体を、次世代シークエンシング（固有の２００ｂｐの配列についての３３，０００リード）により解析した。可変的アミノ酸を、Ｘにより表すが、これは、任意の自然発生のアミノ酸を表しうる（図１を参照されたい）。配列番号９のアミノ酸のうちの約３分の１は、高度に可変的である、すなわち、これらの位置は、リコンビナーゼが、配列番号１の非対称標的配列を組み換えることが可能であり、かつ、ヒトにより十分に寛容化されているために保存的であることを必要としない。他方、アミノ酸位置のうちの約３分の２は、配列番号１の非対称標的配列を高度な特異性により組み換え、かつ／またはヒトにより十分に寛容化されているために重要であると考えられる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼは、配列番号１１〜１３のうちのいずれかに記載の配列、最も好ましくは、配列番号１１を含む。これらのテーラーメイドリコンビナーゼを、それらの特異性について選択した、すなわち、本発明に従い作出された他のリコンビナーゼが、ｌｏｘＰ、ｌｏｘＨ、またはｌｏｘ  ＬＴＲ  １．０に対して、低度ではあるが、検出可能な組換え活性を依然として有したのに対し、実施例において示される通り、配列番号１１〜１３のリコンビナーゼによるこのような組換え活性は、検出されなかった。こうして、本発明は、宿主細胞のゲノムへと挿入されうる、複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡの、ＬＴＲ内の非対称標的配列を組み換えることが可能である、十分に寛容化され高度に特異的なテーラーメイドリコンビナーゼであって、配列番号１１〜１３、好ましくは、配列番号１１を含むことが好ましい、テーラーメイドリコンビナーゼ（すなわち、機能的なテーラーメイドリコンビナーゼ）を提供する。このようなテーラーメイドリコンビナーゼは、例えば、本発明の方法に従い得られうる。
【０１０４】
一実施形態では、テーラーメイドリコンビナーゼは、配列番号１０に記載の配列を含みうる。１００％（３つのクローン）のＴｒｅ  ３．１コンセンサス配列であるこの配列は、配列番号１１〜１３による３つの好ましいリコンビナーゼのコンセンサス配列である。
【０１０５】
テーラーメイドリコンビナーゼはまた、配列番号１０に対して、少なくとも９５％のアミノ酸同一性、好ましくは、少なくとも９９％のアミノ酸同一性、もしくは１００％のアミノ酸同一性も有しうるか、または配列番号１０から、１つもしくは２つのアミノ酸だけにおいて変異することが可能であり、Ｃｒｅ配列（配列番号６）と比較して規定される以下のアミノ酸交換：Ｖ７Ｌ、Ｐ１２Ｓ、Ｐ１５Ｌ、Ｍ３０Ｖ、Ｈ４０Ｒ、Ｍ４４Ｖ、Ｓ５１Ｔ、Ｙ７７Ｈ、Ｋ８６Ｎ、Ｑ８９Ｌ、Ｇ９３Ａ、Ｓ１０８Ｇ、Ｃ１５５Ｇ、Ａ１７５Ｓ、Ａ２４９Ｖ、Ｒ２５９Ｄ、Ｅ２６２Ｒ、Ｔ２６８Ａ、Ｄ２７８Ｇ、Ｐ３０７Ａ、Ｎ３１７Ｔ、Ｉ３２０Ｓを含む。テーラーメイドリコンビナーゼはまた、交換：Ｎ１６０Ｔ、Ｒ２４１Ｑ、Ｋ２４４Ｉ、Ｎ３１９Ｅも含みうる。テーラーメイドリコンビナーゼは、Ｃｒｅと比較した以下のアミノ酸交換：Ｎ３Ｉ、Ｖ７Ｌ、Ｎ１０Ｓ、Ｐ１２Ｓ、Ｐ１５Ｌ、Ｖ２３Ａ、Ｍ３０Ｖ、Ｆ３１Ｌ、Ｈ４０Ｒ、Ｍ４４Ｖ、Ｓ５１Ｔ、Ｙ７７Ｈ、Ｋ８６Ｎ、Ｑ８９Ｌ、Ｇ９３Ａ、Ｓ１０２Ｆ、Ｓ１０８Ｇ、Ｎ１１１Ｄ、Ｋ１２２Ｒ、Ａ１３１Ｔ、Ｓ１４７Ａ、Ｄ１５３Ｅ、Ｃ１５５Ｇ、Ｎ１６０Ｔ、Ｆ１６３Ｌ、Ｉ１６６Ｖ、Ｉ１７４Ｖ、Ａ１７５Ｓ、Ｖ１８２Ｉ、Ｇ１９８Ｓ、Ｄ２３２Ｓ、Ｒ２４１Ｑ、Ｋ２４４Ｉ、Ａ２４９Ｖ、Ｑ２５５Ｒ、Ｒ２５９Ｄ、Ａ２６０Ｖ、Ｅ２６２Ｒ、Ｇ２６３Ｋ、Ｔ２６８Ａ、Ｄ２７８Ｇ、Ｐ３０７Ａ、Ｎ３１７Ｔ、Ｎ３１９Ｅ、Ｉ３２０Ｓを含むことが好ましい。
【０１０６】
これらの特異的な交換は、酵素を、配列番号１の標的配列または配列番号１に対して高度な配列同一性（例えば、配列番号１に対する、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性）を有する標的配列における組換えに特に適切とする。本発明者らは、驚くべきことに、単一のアミノ酸変異、すなわち、Ｑ８９Ｌは、テーラーメイドリコンビナーゼが、ヒト細胞内、例えば、ヒト造血細胞内またはヒトＴ細胞内で十分に寛容化され、かつ、元の標的配列、ｌｏｘＰまたはｌｏｘＨの組換えにおいて、検出可能な活性を有さず、好ましくはまた、ｌｏｘＬＴＲ  Ｔｒｅ  １に対しても、何ら検出可能な活性を有さないので、高度な特異性を有することを確保すると示すことができた。活性は、各々をテーラーメイドリコンビナーゼと接触させた、ｌｏｘＰ（配列番号４）、ｌｏｘＨ（配列番号５）、または、比較のために、配列番号１を含むｌｏｘＬＴＲ  Ｔｒｅ  ３を含む試料についてのゲル電気泳動により、例えば、実施例および図３において示される通り、適切なベクターからのその発現を誘導することにより検出することができる。前記の図において見ることができる通り、Ｔｒｅ  ３．０リコンビナーゼ（ＷＯ２０１１／１４７５９０に従い作製された）が、他のリコンビナーゼと比較して、既にある程度は特異的であるが、示される条件下において、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＨに対して残存活性を有するのに対し、本発明のリコンビナーゼであるｕＴｒｅによる場合、組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅｄ）産物が見られるのは、配列番号１を含むｌｏｘＬＴＲについてだけである。この高度な特異性は、ヒトゲノム内の所望されない組換えの危険性を最小化する。
【０１０７】
本発明のテーラーメイドリコンビナーゼの配列は、ＷＯ２００８／０８３９３１またはＷＯ２０１１／１４７５９０において開示されていない。特に、先行技術は、配列番号１の非対称標的配列を組み換えることが可能なテーラーメイドリコンビナーゼが、アミノ酸交換であるＱ８９Ｌを有することについて教示または示唆していない。これに対し、ＷＯ２０１１／１４７５９０は、この位置を、Ｑとして維持すべきことについて明示的に教示している（前記公開の、全ての特異的な配列またはコンセンサス配列を参照されたい）。本発明のテーラーメイドリコンビナーゼの配列はまた、Ｃｒｅ、Ｄｒｅ、Ｆｒｅ、またはＺｒｅなど、自然発生のリコンビナーゼからも変動し、これは、宿主細胞のゲノムへと挿入されうる、複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内の非対称標的配列、好ましくは、配列番号１を組み換えることが可能であるという特徴から明らかである。
【０１０８】
宿主細胞のゲノムへと挿入される、複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡの、ＬＴＲ内の非対称標的配列を組み換えることが可能なテーラーメイドリコンビナーゼが、配列番号１の標的配列を組み換える場合、これは、８５％のＴｒｅ  ３．１コンセンサス配列である配列番号９、または１００％のＴｒｅ  ３．１コンセンサス配列である配列番号１０、または特異的配列である配列番号１１〜１３のうちの１つを含むことが好ましい。
【０１０９】
宿主細胞のゲノムへと挿入されうる、複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡの、ＬＴＲ内の非対称標的配列を組み換えることが可能である、機能的なテーラーメイドリコンビナーゼであって、例えば、本発明の方法により得られうるテーラーメイドリコンビナーゼは、前記配列から変動しうるが、配列は、本発明の方法を実行しない場合であってもなお、当業者に、配列番号１など、標的の非対称的側面を組み換えることが可能なテーラーメイドリコンビナーゼを作製するための貴重な指針をもたらす。
【０１１０】
好ましくは、基準配列に関するアミノ酸交換は、保存的置換であり、これらは、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ  （１９８４），  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （Ｅｄ．））。例えば、保存的置換は、負に帯電したアミノ酸の基に由来する１つのアミノ酸を、別のアミノ酸により置換する。交換は、配列番号１１〜１３のうちのいずれかの中に存在するアミノ酸のうちの１つを、関連する位置においてもたらすことが最も好ましい。
【０１１１】
宿主細胞のゲノムへと挿入されうる、複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡの、ＬＴＲ内の非対称標的配列を組み換えることが可能なテーラーメイドリコンビナーゼはまた、配列番号１１〜１３、例えば、これらの配列のうちのいずれか、例えば、配列番号１１のＣ末端部分、およびこれらの配列のうちの他のいずれか、例えば、配列番号１２のＮ末端部分からなる群から選択される、２つまたはこれを超える配列の組合せも含みうる。Ｃ末端部分は、１〜３４２アミノ酸の長さでありうる。２つの配列の組合せにおいて、Ｎ末端部分は、１〜３４２アミノ酸の長さでありうる。テーラーメイドリコンビナーゼはまた、これらの配列から導出される、３つまたはこれを超える部分の組合せでもありうる。組合せは、ＴＲＥ  ３．１コンセンサスモチーフ、例えば、配列番号１０、または好ましくは、配列番号９を含む。
【０１１２】
本発明はまた、宿主細胞のゲノムへと挿入されうる、複数のレトロウイルス株のプロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内の配列番号１などの非対称標的配列を組み換えることが可能なテーラーメイドリコンビナーゼであって、上記で規定されたアミノ酸配列を含むテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸も提供する。
【０１１３】
本発明の文脈では、配列を含む核酸またはタンパク質は、前記配列からなりうる。
【０１１４】
テーラーメイドリコンビナーゼは代替的に、さらなる配列、例えば、配列番号１４（核局在化シグナルは、配列番号１４の２〜９位にある）内の核局在化シグナルなど、特異的な細胞コンパートメントにおける発現／局在化をもたらすシグナル配列も含みうる。タンパク質を、医薬組成物中で使用する場合、それを、標的細胞へのタンパク質の形質導入を可能とする、ｔａｔタンパク質形質導入ドメインなどのタンパク質形質導入ドメインとの融合タンパク質として発現させることがとりわけ好ましい。医薬組成物中で使用しようとする、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼは、核局在化配列との融合タンパク質として調製し、例えば、ｔａｔに由来する、タンパク質形質導入ドメインとの融合タンパク質として調製することが好ましく、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸は、このような融合タンパク質をコードしうる。例えば、以下のタンパク質形質導入ドメイン：
・ＨＩＶ−１  Ｔａｔトランス活性化因子の塩基性ドメイン（Ｆａｗｅｌｌ  Ｓ，  Ｓｅｅｒｙ  Ｊ，  Ｄａｉｋｈ  Ｙ，  Ｍｏｏｒｅ  Ｃ，  Ｃｈｅｎ  ＬＬ，  Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  Ｂ，  Ｂａｒｓｏｕｍ  Ｊ．，  Ｔａｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９４  Ｊａｎ  １８；９１（２）：６６４−８．）
・ドロソフィラ・アンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｈｉｌａ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）（Ａｎｔｐ）のホメオドメイン（Ｄｅｒｏｓｓｉ  Ｄ，  Ｊｏｌｉｏｔ  ＡＨ，  Ｃｈａｓｓａｉｎｇ  Ｇ，  Ｐｒｏ−  ｃｈｉａｎｔｚ  Ａ．，  Ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９４  Ａｐｒ  ８；２６９（１４）：  １０４４４−５０．）
・ＨＳＶ  ＶＰ２２転写因子（Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｇ，  Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｐ．，  Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ａ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ．，  Ｃｅｌｌ．  １９９７  Ｊａｎ  ２４；８８（２）：２２３−３３．）
・Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＰｒｅＳ２表面抗原の細胞透過性転座モチーフ（ＴＬＭ）（Ｏｅｓｓ  Ｓ，  Ｈｉｌｄｔ  Ｅ．，  Ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｍｏｔｉｆ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＰｒｅＳ２−ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ−Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０００  Ｍａｙ；７（９）：７５０−８．）
を、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼとの融合タンパク質内で使用することができ、これは、好ましくは、核局在化シグナルをさらに含む。
【０１１５】
タンパク質を精製しようとする場合はまた、Ｈｉｓタグなど、タンパク質の精製を容易とするタグも、付加することができる。
【０１１６】
上記で規定された、Ｔｒｅリコンビナーゼをコードする本発明の核酸のコドン使用は、当業者により選択されうる。例えば、治療的目的で、特に、ヒト細胞内の発現を意図する場合は、例えば、ヒト細胞内の発現に適切なコドン使用を選択することができる。コドン使用はまた、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのコドン使用にも基づきうる。
【０１１７】
テーラーメイドリコンビナーゼまたは前記テーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸は、本明細書で記載される本発明の方法により得ることができるか、またはこの方法により得られうる。テーラーメイドリコンビナーゼはまた、本明細書で開示される配列に基づき、適宜、これらの配列を組み合わせ、かつ／またはこれらの配列をさらに変動させ、適宜、配列番号１など、非対称標的部位の組換えにおける活性について調べることにより得ることもできる。
【０１１８】
本発明はさらに、上記で規定されたテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸、例えば、配列番号９に記載の、好ましくは、配列番号１０または配列番号１１〜１３のうちのいずれかに記載の、異なる配列を含む、２またはこれを超えるテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸のうちの２つまたはこれ超を含む組成物、例えば、ライブラリーも提供する。一実施形態では、組成物は、配列番号９〜１３のうちのいずれかに記載の配列、またはこれらの配列の組合せを含む、２つもしくはこれを超えるか、３つもしくはこれを超えるか、４つもしくはこれを超えるか、５つもしくはこれを超えるか、１０もしくはこれを超えるか、２０もしくはこれを超えるか、または２５もしくはこれを超えるリコンビナーゼを含む、テーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸を含む。このような組成物、特に、核酸が発現ベクターである組成物は、下記の医薬組成物として特に適切でありうる。
【０１１９】
本発明の方法では、レトロウイルスＤＮＡのＬＴＲ内の非対称標的配列に対して活性であるテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸を、発現ベクターへとクローニングすることが好ましい。発現ベクターとは、ベクター内の核酸によりコードされるタンパク質を発現する遺伝子コンストラクトである。このような発現ベクターは、自己複製型染色体外ベクターまたは宿主ゲノムへと組み込まれるベクターのいずれかでありうる。一般に、これらの発現ベクターは、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸へと作動可能に連結された、転写調節核酸および翻訳調節核酸を含む。
【０１２０】
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物内で、作動可能に連結されたコード配列を発現させるために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適切な制御配列は、例えば、プロモーター、適宜、オペレーター配列、およびリボソーム結合性部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを活用することが知られている。
【０１２１】
核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、「作動可能に連結」されている。例えば、プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼすとき、コード配列へと作動可能に連結されているか；またはリボソーム結合性部位は、それが翻訳を容易とするように位置づけられるとき、コード配列に作動可能に連結されている。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドによるアダプターまたはリンカーを、従来の慣行に従い使用する。転写調節核酸および翻訳調節核酸は一般に、テーラーメイドリコンビナーゼを発現させるのに使用される宿主細胞に適切である。当技術分野では、様々な宿主細胞のための、多数の種類の適切な発現ベクターおよび適切な調節配列が知られている。
【０１２２】
本発明において使用される発現ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、スプマウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターでありうる。しかし、好ましい実施形態では、発現ベクターは、ＨＩＶ−１由来、ＳＩＶ由来、ＦＩＶ由来、またはＥＩＡＶ由来のレンチウイルスベクターからなる群から選択されるレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、例えば、ＳＣＨＡＭＢＡＣＨ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）により、または欧州特許出願第１１０００７５１．５号において記載されている。
【０１２３】
本発明の好ましい実施形態では、発現ベクターは、細胞プロモーター、細菌プロモーター、ウイルスプロモーター、またはハイブリッドプロモーターを含む。
【０１２４】
一般に、本発明の目的では、プロモーターは、構成的または誘導的プロモーターでありうる。さらに、プロモーターは、細菌、細胞もしくはウイルスのプロモーターなど、自然発生のプロモーターまたはハイブリッドプロモーターのいずれかでありうる。当技術分野では、１つを超えるプロモーターのエレメントを組み合わせるハイブリッドプロモーターが知られており、本発明で有用である。さらに、本発明において使用されるプロモーターはまた、自然発生のプロモーターの誘導体でもありうる。本明細書で使用される、自然発生のプロモーターの「誘導体」は、由来の異なるプロモーターまたは配列から得られる、シス活性エレメントの組合せの場合もあり、代替的に、特異的な自然発生のプロモーター内のシス活性エレメントの欠失または突然変異により得ることもできる（ＥＤＥＬＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００；ＡＬＰＥＲ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６；ＨＡＲＴＥＮＢＡＣＨ  ＆  ＦＵＳＳＥＮＥＧＧＥＲ，  ２００６）。
【０１２５】
本発明の実施形態では、構成的プロモーターまたはその誘導体を、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス、マウス白血病ウイルス関連レトロウイルス、ホスホグリセロキナーゼ遺伝子、マウス脾臓フォーカス形成ウイルス、またはヒト伸長因子１アルファのプロモーターからなる群から選択または導出する。
【０１２６】
本発明のさらなる実施形態では、誘導的プロモーターまたはその誘導体を、レンチウイルス、スプマウイルス、およびデルタレトロウイルスから導出されたＬＴＲまたはその誘導体からなる群から選択または導出する。
【０１２７】
この文脈では、「ＬＴＲ」という用語は、プロモーター機能を有する、プロウイルスの５’および３’の長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）の両方［総説については、標準的な教科書である、“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”  （ＣＯＦＦＩＮ  ＪＭ，  ＨＵＧＨＥＳ  ＳＨ，  ＶＡＲＭＵＳ  ＨＥ  （Ｅｄｓ．）  １９９７，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい］を指す。
【０１２８】
好ましくは、誘導的プロモーターまたはその誘導体を、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＭＶＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩから導出されたＬＴＲまたはその誘導体から選択または導出する。
【０１２９】
本発明はさらに、テーラーメイドリコンビナーゼを調製するための方法であって、テーラーメイドリコンビナーゼをコードする発現ベクターを調製するための前述の方法と、前記テーラーメイドリコンビナーゼ（または前記テーラーメイドリコンビナーゼのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド）を、適切な宿主細胞内の前記発現ベクターから発現させるさらなる工程とを含む方法も提供する。
【０１３０】
最終的に得られたリコンビナーゼは、それらが、哺乳動物細胞環境において機能することを確認するように、哺乳動物細胞内で調べることが好ましい。さらに、哺乳動物細胞内の良好な発現を得るために、リコンビナーゼを、これらの細胞内の発現について最適化することもでき（例えば、当技術分野で周知の方法を使用する、コドン使用の最適化。例えば、ＳＨＩＭＳＨＥ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２を参照されたい）、ＮＬＳ配列（ＭＡＣＡＲＡ，  ２００１）など、タンパク質を哺乳動物細胞の核へと方向付けるために必要なシグナル配列を、テーラーメイドリコンビナーゼの核酸へと付加することもできる。例えば、テーラーメイドリコンビナーゼをコードする発現ベクターを調製するための方法の工程（ｌ）に従い、発現ベクターへとクローニングされた、テーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸の発現は、例えば、細菌、昆虫、または哺乳動物の発現系を使用して実行することができる。しかしまた、当技術分野で既知の他の発現系も用いることができる。当技術分野ではまた、外因性核酸を、哺乳動物、昆虫、または細菌の宿主ならびに他の宿主へと導入する方法も周知であり、使用される宿主細胞により変動する。技法は、デキストラン媒介型トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介型トランスフェクション、プロトブラスト融合、電気穿孔、ウイルス感染、ポリヌクレオチドのリポソームへの封入、およびＤＮＡの核への直接的なマイクロインジェクションを含む。
【０１３１】
融合タンパク質は、当技術分野で周知の方法により調製する。例えば、テーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸をクローニングする発現ベクターは既に、第２のポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を含んでいる。テーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸を、第２のポリペプチドまたはタンパク質の配列とインフレームでクローニングすることにより、両方の配列を、融合タンパク質として発現させる。
【０１３２】
テーラーメイドリコンビナーゼを、発現ベクターから発現させるために使用される宿主細胞は、例えば、細菌細胞もしくは酵母細胞などの原核細胞、または、好ましくは、例えば、昆虫細胞もしくは哺乳動物などの真核細胞、最も好ましくは、ヒト細胞を含む。宿主細胞は、造血細胞、例えば、成体造血幹細胞、またはＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋細胞でありうる。細胞は、レトロウイルスを感染させた対象から導出することができ、細胞は、形質転換、ならびに、適宜、培養および／または増殖の後で対象へと戻して投与することができる。
【０１３３】
本発明はさらに、形質転換された成体幹細胞を調製するための方法であって、テーラーメイドリコンビナーゼをコードする発現ベクターを調製するための前述の方法と、テーラーメイドリコンビナーゼをコードする発現ベクターをインビトロにおいて調製するための前述の方法において得られた発現ベクターを適切な成体幹細胞へと導入するさらなる工程とを含む方法も提供する。
【０１３４】
さらなる態様では、本発明は、本明細書で開示される核酸および／または本発明の前述の方法から得られうる核酸を対象とする。本明細書ではまた、配列により規定されるテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸も提示される。
【０１３５】
本明細書で使用される「核酸」とは、ヌクレオチドと呼ばれる、共有結合的に連結されたサブユニットから構成されるポリマー化合物である。核酸は、それらの両方が一本鎖または二本鎖でありうる、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、ｍＲＮＡ、およびポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含む。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムのＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡを含む。
【０１３６】
さらなる態様では、本発明はまた、本発明の前述の方法から得られうる発現ベクター、および本明細書で規定されるテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸を含む発現ベクターも対象とする。
【０１３７】
本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む。当業者により察知される通り、本発明の核酸配列を使用して、タンパク質配列を作出することができる。本発明のさらなる態様は、例えば、本発明の前述の方法から得られうる、テーラーメイドリコンビナーゼタンパク質であって、このリコンビナーゼは、機能的なリコンビナーゼを含む融合タンパク質であってもよい。一実施形態では、テーラーメイドリコンビナーゼタンパク質は、当技術分野で周知の技法を使用して、融合ポリペプチドとして調製することができる。好ましい実施形態では、テーラーメイドリコンビナーゼタンパク質を、第２のポリペプチドへと連結する。融合ポリペプチドは、本発明の前述の方法から得られ、この場合、テーラーメイドリコンビナーゼは、第２のポリペプチドへと連結されていることが好ましい。
【０１３８】
一実施形態では、テーラーメイドリコンビナーゼタンパク質を、融合ポリペプチドとして調製して、発現を増大させる。さらなる実施形態では、テーラーメイドリコンビナーゼタンパク質を、融合ポリペプチドとして作り、ポリペプチドの、生細胞への導入を可能とする。精製されたタンパク質は、それらのサイズに起因して、細胞膜を通過することが可能でないため、細胞に入れないことが典型的である。しかし、特異的なペプチド配列の、タンパク質への融合の結果として、これらの融合タンパク質の、細胞への取込みがもたらされうる。次いで、細胞内では、タンパク質は、その機能を果たすことができる。Ｃｒｅリコンビナーゼを含む部位特異的リコンビナーゼは、この手法により、細胞へのデリバリーに成功している（ＰＥＩＴＺ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。細胞透過性リコンビナーゼはさらに、ＮＯＬＤＥＮ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）およびＬＩＮ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）により記載されている。よって、この戦略を使用して、感染細胞からプロウイルスを除去するように、テーラーメイドリコンビナーゼを、細胞へとデリバリーすることができる。したがって、融合ポリペプチド内の第２のポリペプチドは、シグナルペプチドを含みうる。シグナルペプチドは、ＴＡＴペプチドまたはアンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）属ホメオドメインの第３のヘリックスに由来するペプチド（ＤＥＲＯＳＳＩ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４，  １９９６；  ＶＩＶＥＳ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７；  ＶＩＶＥＳ，  ２００３；  ＲＩＣＨＡＲＤ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５）または融合ポリペプチドを真核細胞の核へとデリバリーするためのＮＬＳ（核局在化配列）（ＭＡＣＡＲＡ，  ２００１）などのタンパク質形質導入ドメインでありうる。
【０１３９】
本発明のさらなる態様は、本発明の、前述の形質転換された成体幹細胞を調製するための方法から得られうる、成体幹細胞を対象とする。幹細胞には、本発明による発現ベクターを、感染させるかまたはトランスフェクトすることが好ましい。好ましい実施形態では、成体幹細胞は、テーラーメイドリコンビナーゼ、前述の融合ポリペプチドを発現するか、または前述の発現ベクターを含む造血系列に由来する幹細胞である。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、例えば、常套的な白血球除去により、ドナー（例えば、ＨＩＶ感染患者）の、Ｇ−ＣＳＦによる動員を受けた末梢血（Ｇ−ＣＳＦ−ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ）から精製されうる、骨髄由来の（ｄｅｒｉｖｅｄ）ＣＤ３４＋細胞（ＳＣＨＥＲＲ  ＆  ＥＤＥＲ，  ２００２）である。次いで、インビトロにおける遺伝子改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）細胞を、患者への再注入のために製剤化することができる。
【０１４０】
当技術分野の最新技術では、「幹細胞」という用語は、（ａ）自己再生能と、（ｂ）それらの非対称性の分裂能に起因して、少なくとも１つであるが、多数であることが多い、特化した細胞型を形成する能力とを有する（ＤＯＮＯＶＡＮ  ＆  ＧＥＡＲＨＡＲＴ，  ２００１）細胞を指示する（ｄｅｓｉｇｎａｔｅ）。成体幹細胞は、成体の異なる組織から、すなわち、分化した個体から単離することができる。当技術分野の最新技術では、このような幹細胞を、「多能性成体幹細胞」と称する。胚性多能性幹細胞と、成体多能性幹細胞との本質的な差違は、それぞれの細胞から得られうる分化組織の数にある。
【０１４１】
さらなる実施形態では、本発明の発現ベクターを、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染患者のＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋初代細胞（血液細胞）を形質転換するために使用する。
【０１４２】
代替的に、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）によるデリバリーのために製剤化することができる。ＶＬＰを使用して、Ｔｒｅ  ｍＲＮＡ、Ｔｒｅタンパク質、例えば、融合タンパク質、またはＤＮＡ、例えば、Ｔｒｅを発現するＤＮＡプラスミド、またはプロモーター−Ｔｒｅ  ｃＤＮＡ−ポリＡ部位を含むコンストラクトをパッケージングすることができる。したがって、本発明の核酸はさらに、パッケージングシグナルも含有しうる。
【０１４３】
本発明の方法のさらなる工程では、本発明の核酸、本発明のテーラーメイドリコンビナーゼをコードする核酸配列を含む発現ベクター、本発明の方法により得られる、リコンビナーゼタンパク質、融合タンパク質、または成体幹細胞を、レトロウイルス感染の予防および／もしくは処置における使用のための、ならびに／またはレトロウイルス、例えば、ＨＩＶ、特に、ＨＩＶ−１に感染した対象におけるウイルス負荷を低減するための医薬組成物として製剤化する。本発明のさらなる目的は、前述の方法により得られる医薬組成物である。医薬組成物は、静脈内適用（注入）に適切な溶液の形態で存在することが好ましい。
【０１４４】
医薬調製物は、１つまたは複数の、薬学的に許容される担体、賦形剤、および／またはアジュバントをさらに含みうる。当技術分野では、医薬組成物中の使用に適切な担体、賦形剤、およびアジュバントが知られている。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、対象へと投与されると、レトロウイルスに感染した対象におけるウイルス負荷を、５．０００ゲノム当量／ｍｌ血漿を下回るように、好ましくは、５００ゲノム当量／ｍｌ血漿を下回るように、より好ましくは、５０ゲノム当量／ｍｌ血漿を下回るように低減することが好ましい。したがって、テーラーメイドリコンビナーゼをコードする発現ベクター（またはタンパク質もしくは融合ポリペプチドもしくは発現ベクターを含む幹細胞としてのテーラーメイドリコンビナーゼ）を含む、本発明の医薬組成物は、宿主細胞内のレトロウイルスの遺伝子レザバーを根絶し、これにより、ウイルスのさらなる生活環を防止することにより、レトロウイルスに感染した対象におけるウイルス負荷を低減することが可能である。
【０１４６】
本明細書で使用される「ウイルス負荷」という用語は、例えば、患者の血漿１ｍｌと関連するＨＩＶ  ＲＮＡ当量（すなわち、ゲノム）（ＤＹＢＵＬ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２）を指す。したがって、ウイルス負荷は、患者から得られた試料中のウイルスＤＮＡ含量を測定することにより決定する。現在のところ、３つの主要な種類のウイルス負荷アッセイ：
１）ＨＩＶ  ＲＮＡ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ：Ａｍｐｌｉｃｏｒ（商標）ＨＩＶ−１  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｔｅｓｔ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ
２）分枝状鎖ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ：Ｖｅｒｓａｎｔ（商標）ＨＩＶ  ＲＮＡ  Ａｓｓａｙ；Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ；および
３）核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）アッセイ：ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ（商標）Ａｓｓａｙ；ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ
が利用可能である。
【０１４７】
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、レトロウイルスに感染した対象におけるウイルス負荷を、５．０００ゲノム当量／ｍｌ血漿を下回るように、好ましくは、５００ゲノム当量／ｍｌ血漿を下回るように、より好ましくは、５０ゲノム当量／ｍｌ血漿を下回るように低減することが可能である。ウイルス負荷が血漿１ｍｌ当たり５０００ゲノム当量を下回る患者は、医薬による処置に比較的良好に適応していると考えられる。しかし、現今のＡＩＤＳ治療における目標は、ウイルス負荷アッセイの検出限界を下回る、ウイルス負荷の低減であって、これは現在のところ、約５０ゲノム当量／ｍｌ血漿を下回る。医薬組成物は、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、メイソンファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、サルＴ細胞白血病ウイルスＩ型（ＳＴＬＶ−Ｉ）、サルＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型（ＳＴＬＶ−ＩＩ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）からなる群から選択されるレトロウイルスのウイルス負荷を低減することが好ましい。なおさらに好ましい実施形態では、本発明の医薬品により処置されるレトロウイルスは、レンチウイルスである。前記レンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、マエディ−ビスナウイルス（ＭＶＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）からなる群から選択されることが好ましい。最も好ましくは、レトロウイルスは、ＨＩＶ、特に、ＨＩＶ−１である。しかし、当業者には、本発明はまた、上で言及されたレトロウイルス以外のレトロウイルスによるレトロウイルス感染にも適用可能であることが明らかである。
【０１４８】
レトロウイルスに感染した対象であって、医薬組成物が投与される対象は、ヒト、霊長動物、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、および愛玩用ネコからなる群から選択される。しかし、対象は、ヒトであることが好ましい。
【０１４９】
一般に、有効量の、本発明の発現ベクター、テーラーメイドリコンビナーゼ、または形質転換された細胞を、対象へと投与するものとする。投与は、例えば、静脈内投与または筋内投与でありうる。
【０１５０】
一実施形態では、医薬組成物を、高活性抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）による、他の活性薬剤との同時投与のために製剤化する。高活性抗レトロウイルス治療（ＨＡＡＲＴ）とは、ウイルスの逆転写酵素、プロテアーゼ、および融合をターゲティングする組合せ治療（ＧＵＬＩＣ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７；ＬＡＬＥＺＡＲＩ  ｅｔ  ａｌ，  ２００３）である。
【０１５１】
別の実施形態では、医薬組成物を、グローバル免疫活性化治療またはプロウイルス遺伝子発現の特異的な活性化との同時投与、またはこれらに後続する投与のために製剤化する。免疫活性化治療の前提は、潜伏性のＨＩＶ感染細胞の意図的な活性化により、遷延するウイルスレザバーの根絶を加速化させうるという仮説に基づく。根絶は、ＨＩＶ−１（アポトーシス促進性）産物を能動的に発現する細胞のプログラム死による免疫クリアランスを介して生じる（ＫＵＬＫＯＳＫＹ  ＆  ＢＲＡＹ，  ２００６）。グローバル免疫活性化（静止細胞を含む免疫細胞の活性化）は通例、例えば、免疫毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）、またはＴ細胞活性化抗体（例えば、ＯＫＴ３）の投与により達成される。
【０１５２】
ＨＡＡＲＴ抵抗性の潜伏性レザバーを意図的に活性化させるようになされた免疫活性化は残念ながら、ＨＩＶ−１を恒久的に消失させることができなかったという事実、および、グローバルなＴ細胞の活性化も見かけ上、ウイルスの複製を誘導し、潜在的なＨＩＶ−１標的細胞の数を、ＨＡＡＲＴにより含有されうるレベルを超えて増大させるという事実（ＦＲＡＳＥＲ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００）に起因するウイルスリバウンド（総説については、ＫＵＬＯＳＫＹ  ＆  ＢＲＡＹ  ２００６；ＭＡＲＣＥＬＬＯ，  ２００６；ＳＨＥＨＵ−ＸＨＩＬＡＧＡ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５を参照されたい）も考慮すると、ＨＩＶを処置するには、さらなる特異的な処置が必要である。１つの手法は、そうしなければ休止しているウイルスゲノムの転写の活性化である。潜伏性プロウイルス遺伝子発現の特異的活性化は、いずれも、細胞増殖の非存在下において、潜伏性のＨＩＶ−１を再活性化させると考えられる、ホルボールエステルプロストラチンまたはヒトサイトカインであるＩＬ−７の投与により達成することができる（ＭＡＲＣＥＬＬＯ，  ２００６）。さらに、ＨＩＶ−１の選択的な転写の活性化はまた、例えば、細胞活性化の非存在下において、静止細胞からのＨＩＶ−１の繁殖を最終的に誘導する、バルプロ酸など、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ１）阻害剤によっても達成することができる（ＭＡＲＣＥＬＬＯ，  ２００６；ＬＥＨＲＭＡＮ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５）。
【０１５３】
しかし、グローバル免疫活性化治療、またはプロウイルス遺伝子発現の特異的活性化、または同様の治療戦略は、プロウイルスＤＮＡの同時除去から大きな利益を得、これにより、患者において、感染細胞のプールを低減する。
【０１５４】
本発明はまた、対象における、レトロウイルス感染、特に、ＨＩＶ感染の処置および／または予防の方法も提供する。一実施形態では、対象から得られた試料中の、対象に感染しているレトロウイルスの配列を解析し、対象に由来するプロウイルスＤＮＡが、リコンビナーゼを選択した工程（ａ）において同定された非対称標的配列を含む場合、テーラーメイドリコンビナーゼをコードする少なくとも１つの発現ベクター、少なくとも１つのテーラーメイドリコンビナーゼ、または前記発現ベクターにより形質転換された少なくとも１つの細胞、例えば、１つの成体幹細胞を、対象へと投与するものとする。対象から得られた試料は、例えば、感染ＣＤ４＋細胞を含む血液試料でありうる。
【実施例】
【０１５５】
実施例１
そうでないことが指定されない限りにおいて、ＷＯ２００８／０８３９３１、ＷＯ２０１１／１４７５９０、およびＢＵＣＨＨＯＬＺ  ＆  ＳＴＥＷＡＲＴ，  ２００１において記載されている材料および方法を使用する。複数の異なるＨＩＶ−１株内の非対称標的配列を組み換えることが可能なテーラーメイドリコンビナーゼは、ＷＯ２０１１／１４７５９０において記載されている通りに調製した。結果として得られる  ｔｒｅ  ライブラリーを、さらなる実験において用いた。
【０１５６】
実施例２
ｕＴｒｅの特異性を増強するために、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＨにおける組換え活性に対して選択する、さらなる進化サイクルを実施した。この目的のために、進化サイクル５０から得られる、進化させたＴｒｅライブラリーを、それぞれ、２つのｌｏｘＰ部位または２つのｌｏｘＨ部位と結びつけられた、２つのｌｏｘＬＴＲ部位（配列番号１）を含有する進化ベクターへとクローニングした。例示的なベクターを、図２に示す。リコンビナーゼの発現を誘導したところ、ｌｏｘＬＴＲにおける組換えの結果として、存在するＮｄｅＩ部位だけが除去されたのに対し、ｌｏｘＰまたはｌｏｘＨにおける組換えでは、そうならなかった。各進化サイクルの後で単離されたプラスミドＤＮＡを、ＮｄｅＩにより消化し、ｌｏｘＰまたはｌｏｘＨではなく、ｌｏｘＬＴＲの組換えに成功したリコンビナーゼコード配列を、ＰＣＲにより増幅し、次の進化サイクルのために、進化ベクターへと戻してサブクローニングした。２ラウンドのＤＮＡシャッフリングを含む、合計１９のさらなるＴｒｅ３進化サイクルを実施し、ｌｏｘＰおよびｌｏｘＨにおける組換えに対して交互に選択した。
【０１５７】
実施例３
細胞毒性（すなわち、細胞壊死性）を著明に低下させたｕＴｒｅリコンビナーゼについてスクリーニングするために、ｔｒｅライブラリーを、内部ＳＦＦＶ  ＬＴＲプロモーターからＥＧＦＰを構成的に発現するレンチウイルスベクター、および構成的ＥＦ１アルファプロモーターからのｔｒｅライブラリーへとライゲーションした（図４Ａ）。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞への形質導入により、高度なＧＦＰ発現細胞の逐次的分取（ＦＡＣＳによる）と、その後における非毒性ｕＴｒｅクローンの単離とを可能とした（図４Ｂ）。このために、形質導入後３日目、１０日目、および２４日目において、ＥＧＦＰ発現についてのストリンジェンシーを増大させながら、形質導入されたＴ細胞培養物に対する細胞分取を実施した。さらに１週間の培養の後で、残ったｔｒｅライブラリーを単離し、選択されたクローンを、Ｔｒｅ活性の増強に関して解析した。
【０１５８】
実施例４
細胞系内のｕＴｒｅ活性を解析するために、ＰＭ−１  Ｔ細胞の培養物に、ｕＴｒｅおよびＧＦＰを発現する、またはＧＦＰを単独で発現するＡＳＬＶ由来のレトロウイルスベクター（陰性対照ベクター）を形質導入した。ＧＦＰ発現により、形質導入された細胞の追跡が可能となったことは注目に値する。形質導入の１０日後において、細胞に、ＨＩＶ−１Ｂａｌを感染させた。ｕＴｒｅの発現の、ＨＩＶ−１の複製に対する効果を、培養物上清中のウイルスのｐ２４抗原の量についての毎週のＥＬＩＳＡ測定によりモニタリングした。示される（図５）通り、ｐ２４の放出は、ｕＴｒｅ形質導入培養物中で著しく減少したのに対し、対照培養物（ＧＦＰを単独で発現する）中では、安定を保つかまたはさらに増大した。
【０１５９】
実施例５
ＨＩＶ−１感染患者に由来する初代ＣＤ４＋細胞内の、ｕＴｒｅ活性についての解析。ＣＤ４＋細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズにより、４８時間刺激した。その後、細胞に、ＧＦＰを単独で発現する（陰性対照として用いられる）またはＧＦＰと併せてｕＴｒｅも発現するいずれかのレンチウイルスベクターを形質導入した。細胞は、１００ＩＵのＩＬ２の存在下において、２０日間培養した。ウイルス負荷（ｐ２４抗原についてのＥＬＩＳＡにより測定される）およびヒト形質導入ＣＤ４＋細胞カウント（ＦＡＣＳにより解析される）を、形質導入の表示の日数後においてモニタリングした。図６に示される通り、ｕＴｒｅの発現は、顕著なアンチウイルス効果（白丸により指し示される）と、ＣＤ４＋細胞の保護（黒四角により指し示される）とを結果としてもたらす。これに対し、対照実験の１５日目〜２０日目の間における、ウイルス負荷の減殺は、非阻害のウイルス複製に起因する細胞死を反映する。
【０１６０】
実施例６
インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるｕＴｒｅ活性についての解析。免疫不全ＮＯＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）に、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞／ＨＳＣ（対照）、またはｕＴｒｅ発現ＣＤ３４＋ＨＳＣを生着させた。その後、動物に、ＨＩＶ−１Ｂａｌを感染させ、ウイルス負荷（超高感度のＰＣＲベースのアッセイにより検出される）およびヒトＣＤ４５＋ＣＤ４＋細胞のパーセント（ＦＡＣＳにより解析される）を、時間経過にわたりモニタリングした。示される（図７）通り、ｕＴｒｅの発現は、インビボにおける著明なアンチウイルス活性を結果としてもたらした。
【０１６１】
参考文献一覧
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Ａｂｒｅｍｓｋｉ  Ｋ，  Ｈｏｅｓｓ  Ｒ  （１９８３）  “Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＰＩ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５９，  １５０９−１５１４．  
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Ａｌｐｅｒ  Ｈ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｃ，  Ｎｅｖｏｉｇｔ  Ｅ，  Ｓｔｅｐｈａｎｏｐｏｕｌｏｓ  Ｇ  （２００６）  “Ｔｕｎｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２，  １２６７８−１２６８３．  
Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．，  Ｍａｄｄｅｎ，  Ｔ．Ｌ．，  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，  Ａ．Ａ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．  （１９９７）  Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２５，  ３３８９−３４０２．  
Ｂｅｙｅｒ  ＷＲ，  Ｗｅｓｔｐｈａｌ  Ｍ，  Ｏｓｔｅｒｔａｇ  Ｗ，  ｖｏｎ  Ｌａｅｒ  Ｄ  （２００２）“Ｏｎｃｏｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ：  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｒｏａｄ  ｈｏｓｔ  ｒａｎｇｅ．”  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７６，  １４８８−１４９５．  
Ｂｌａｃｋａｒｄ  ＪＴ，  Ｒｅｎｊｉｆｏ  ＢＲ，  Ｍｗａｋａｇｉｌｅ  Ｄ，  Ｍｏｎｔａｎｏ  ＭＡ，  Ｆａｗｚｉ  ＷＷ，  Ｅｓｓｅｘ  Ｍ  （１９９９）  “Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｙｐｅ  １  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｓｕｂｔｙｐｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５４，  ２２０−２２５．  
Ｂｌｏｏｍ  ＪＤ，  Ｍｅｙｅｒ  ＭＭ，  Ｍｅｉｎｈｏｌｄ  Ｐ，  Ｏｔｅｙ  ＣＲ，  ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｄ，  Ａｒｎｏｌｄ  ＦＨ  （２００５）  “Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｎｚｙｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．”  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １５，  ４４７−４５２．  
Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  Ｆ，  Ｒｉｎｇｒｏｓｅ  Ｌ，  Ａｎｇｒａｎｄ  ＰＯ，  Ｒｏｓｓｉ  Ｆ，  Ｓｔｅｗａｒｔ  ＡＦ  （１９９６）  “Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＦＬＰ  ａｎｄ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．”  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２４，  ４２５６−４２６２．  
Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  Ｆ，  Ａｎｇｒａｎｄ  ＰＯ，  Ｓｔｅｗａｒｔ  ＡＦ  （１９９８）  “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ＦＬＰ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｅｖｏｌｖｅｄ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．”  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６，  ６５７−６６２．  
Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  Ｆ，  Ｓｔｅｗａｒｔ  ＡＦ  （２００１）  “Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−  ｌｉｎｋｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．”  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９，  １０４７−１０５２．  
Ｃｈｉｕ  ＹＬ，  Ｓｏｒｏｓ  ＶＢ，  Ｋｒｅｉｓｂｅｒｇ  ＪＦ，  Ｓｔｏｐａｋ  Ｋ，  Ｙｏｎｅｍｏｔｏ  Ｗ，  Ｇｒｅｅｎｅ  ＷＣ  （２００５）  “Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５，  １０８−１１４  
Ｃｈｕｎ  Ｔ−Ｗ，  Ｅｎｇｅｌ  Ｄ，  Ｂｅｒｒｅｙ  ＭＭ，  Ｓｈｅａ  Ｔ，  Ｃｏｒｅｙ  Ｌ，  Ｆａｕｃｉ  ＡＳ  （１９９８）  “Ｅａｒｌｙ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｏｏｌ  ｏｆ  ｌａｔｅｎｔｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ，  ｒｅｓｔｉｎｇ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｉｍａｒｙ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５，  ８８６９−８８７３．  
Ｃｏａｔｅｓ  ＣＪ，  Ｋａｍｉｎｓｋｉ  ＪＭ，  Ｓｕｍｍｅｒｓ  ＪＢ，  Ｓｅｇａｌ  ＤＪ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＡＤ，  Ｋｏｌｂ  ＡＦ  （２００５）  “Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｏｏｌｓ．”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３，  ４０７−４１９．  
Ｃｏｌｌｉｎｓ  ＣＨ，  Ｙｏｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｙ，  Ｕｍｅｎｏ  Ｄ，  Ａｒｎｏｌｄ  ＦＨ，  （２００３）  “Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ，  ｍｏｖｅ，  ｍａｋｅ  ａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ＤＮＡ．”  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４，  ６６５．  
Ｃｏｍｂｅｓ  Ｐ，  Ｔｉｌｌ  Ｒ，  Ｂｅｅ  Ｓ，  Ｓｍｉｔｈ  ＭＣ  （２００２）  “Ｔｈｅ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｓｅｕｄｏ−ａｔｔＢ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  （ｐｈｉ）Ｃ３１  −ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．”  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８４，  ５７４６−５７５２．  
Ｃｒａｍｅｒｉ  Ａ，  Ｒａｉｌｌａｒｄ  ＳＡ，  Ｂｅｒｍｕｄｅｚ  Ｅ，  Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰ  （１９９８）  “ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．”  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，  ２８８−２９１．  Ｄｅｒｏｓｓｉ  Ｄ，  Ｊｏｌｉｏｔ  ＡＨ，  Ｃｈａｓｓａｉｎｇ  Ｇ，  Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ  Ａ  （１９９４）  “Ｔｈｅ  ｔｈｒｉｄ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２６９，  １０４４４−１０４５０．  
Ｄｅｒｏｓｓｉ  Ｄ，  Ｃａｌｖｅｔ  Ｓ，  Ｔｒｅｍｂｌｅａｕ  Ａ，  Ｃｈａｓｓａｉｎｇ  Ｇ，  Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ  Ａ  （１９９６）  “Ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｉｒｄ  ｈｅｌｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｉｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，  １８１８８−１８１９３．  
Ｄｏｎｏｖａｎ，  Ｐ．Ｊ．，  Ｇｅａｒｈａｒｔ，  Ｊ．  （２００１）  “Ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ  ４１４，  ９２−９７．  
Ｄｏｎｚｅｌｌａ  ＧＡ，  Ｓｃｈｏｌｓ  Ｄ，  Ｌｉｎ  ＳＷ，  Ｅｓｔｅ  ＪＡ，  Ｎａｇａｓｈｉｍａ  ＫＡ，  Ｍａｄｄｏｎ  ＰＪ，  Ａｌｌａｗａｙ  ＧＰ，  Ｓａｋｍａｒ  ＴＰ，  Ｈｅｎｓｏｎ  Ｇ，  Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ  Ｅ，  Ｍｏｏｒｅ  ＪＰ  （１９９８）  “ＡＭＤ３１００，  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｅｎｔｒｙ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＣＸＣＲ４  ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ．”  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４，  ７２−７７．  
Ｄｙｂｕｌ  Ｍ，  Ｆａｕｃｉ  ＡＳ，  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ＪＧ，  Ｋａｐｌａｎ  ＪＥ，  Ｐａｕ  ＡＫ  （２００２）  “Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉ−  ｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｍｏｎｇ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ａｄｕｌｔｓ  ａｎｄ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ．”  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３７，  ３８１−４３３．  
Ｅｄｄｙ，  Ｓ．Ｒ．  （１９９８）  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  （Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ），  １４，  ７５５−  ７６３．  
Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭ，  Ｍｅｅｃｈ  Ｒ，  Ｏｗｅｎｓ  ＧＣ，  Ｊｏｎｅｓ  ＦＳ  （２０００）  “Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７，  ３０３８−３０４３．
Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｇ，  Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｐ．，  Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ａ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ．，  Ｃｅｌｌ．  １９９７  Ｊａｎ  ２４；８８（２）：２２３−３３  
Ｅｍｅｒｍａｎ  Ｍ，  Ｍａｌｉｍ  ＭＨ  （１９９８）  “ＨＩＶ−ｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ／ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｇｅｎｅｓ：  ｋｅｙｓ  ｔｏ  ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，  １８８０−１８８４．  
Ｆａｗｅｌｌ  Ｓ，  Ｓｅｅｒｙ  Ｊ，  Ｄａｉｋｈ  Ｙ，  Ｍｏｏｒｅ  Ｃ，  Ｃｈｅｎ  ＬＬ，  Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  Ｂ，  Ｂａｒｓｏｕｍ  Ｊ．，  Ｔａｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９４  Ｊａｎ  １８；９１（２）：６６４−８．  
Ｆｉｎｚｉ  Ｄ，  Ｈｅｍａｎｋｏｖａ  Ｍ，  Ｐｉｅｒｓｏｎ  Ｔ，  Ｃａｒｒｕｔｈ  ＬＭ，  Ｂｕｃｋ  Ｃ，  Ｃｈａｉｓｓｏｎ  ＲＥ，  Ｑｕｉｎｎ  ＴＣ，  Ｃｈａｄｗｉｃｋ  Ｋ，  Ｍａｒｇｏｌｉｃｋ  Ｊ，  Ｂｒｏｏｋｍｅｙｅｒ  Ｒ，  Ｇａｌｌａｎｔ  Ｊ，  Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  Ｍ，  Ｈｏ  ＤＤ，  Ｒｉｃｈｍａｎ  ＤＤ，  Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ  ＲＦ  （１９９７）  “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｎ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏ  ｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８，  １２９５−１３００．  
Ｆｌｏｗｅｒｓ  ＣＣ，  Ｗｏｆｆｅｎｄｉｎ  Ｃ，  Ｐｅｔｒｙｎｉａｋ  Ｊ，  Ｙａｎｇ  Ｓ，  Ｎａｂｅｌ  ＧＪ  （１９９７）  “Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．”  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１，  ２６８５−２６９２．  
Ｇｕｌｉｃｋ  ＲＭ，  Ｍｅｌｌｏｒｓ  ＪＷ，  Ｈａｖｌｉｒ  Ｄ，  Ｅｒｏｎ  ＪＪ，  Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｃ，  ＭｃＭａｈｏｎ  Ｄ，  Ｒｉｃｈｍａｎ  ＤＤ，  Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ  ＦＴ，  Ｊｏｎａｓ  Ｌ，  Ｍｅｉｂｏｈｍ  Ａ，  Ｅｍｉｎｉ  ＥＡ，  Ｃｈｏｄａｋｅｗｉｔｚ  ＪＡ  （１９９７）  “Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｉｎｄｉｎａｖｉｒ，  ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ，  ａｎｄ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｉｏｒ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．”  Ｎ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３３７，  ７３４−７３９．  
Ｇｕｚｍａｎ  ＬＭ，  Ｂｅｌｉｎ  Ｄ，  Ｃａｒｓｏｎ  ＭＪ，  Ｂｅｃｋｗｉｔｈ  Ｊ  （１９９５）  “Ｔｉｇｈｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ＰＢＡＤ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．”  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  Ｉｌｌ，  ４１２１−４１３０．  
Ｈａｒｔｅｎｂａｃｈ  Ｓ，  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ  Ｍ  （２００６）  “Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ．”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９５，  ５４７−５５９．  
Ｈａｕｂｅｒ  Ｉ，  Ｂｅｖｅｃ  Ｄ，  Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ  Ｊ，  Ｋｒａｔｚｅｒ  Ｆ，  Ｈｏｒｎ  Ｆ，  Ｃｈｏｉｄａｓ  Ａ，  Ｈａｒｒｅｒ  Ｔ，  Ｈａｕｂｅｒ  Ｊ  （２００５）  “Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｏｘｙｈｙｐｕｓｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．”  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１５，  ７６−８５．  
Ｈａｚｕｄａ  ＤＪ，  Ｙｏｕｎｇ  ＳＤ，  Ｇｕａｒｅ  ＪＰ，  Ａｎｔｈｏｎｙ  ＮＪ，  Ｇｏｍｅｚ  ＲＰ，  Ｗａｉ  ＪＳ，  Ｖａｃｃａ  ＪＰ，  Ｈａｎｄｔ  Ｌ，  Ｍｏｔｚｅｌ  ＳＬ，  Ｋｌｅｉｎ  ＨＪ，  Ｄｏｒｎａｄｕｌａ  Ｇ，  Ｄａｎｏｖｉｃｈ  ＲＭ，  Ｗｉｔｍｅｒ  ＭＶ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＫＡ，  Ｔｕｓｓｅｙ  Ｌ，  Ｓｃｈｌｅｉｆ  ＷＡ，  Ｇａｂｒｙｅｌｓｋｉ  ＬＳ，  Ｊｉｎ  Ｌ，  Ｍｉｌｌｅｒ  ＭＤ，  Ｃａｓｉｍｉｒｏ  ＤＲ，  Ｅｍｉｎｉ  ＥＡ，  Ｓｈｉｖｅｒ  ＪＷ  （２００４）  “Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ．”  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，  ５２８−５３２．  
Ｈｏｅｓｓ  ＲＨ，  Ａｂｒｅｍｓｋｉ  Ｋ  （１９８５）  “Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｒｅ−ｌｏｘ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．”  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １８１，  ３５１−３６２．  Ｊｏｈａｎｎｅｓ  ＴＷ，  Ｚｈａｏ  Ｈ  （２００６）  “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ．”  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９，  ２６１−２６７．  
Ｋｒａｓｎｏｗ  ＭＡ，  Ｃｏｚｚａｒｅｌｌｉ  ＮＲ  （１９８３）  “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｎ３  ｒｅｓｏｌｖａｓｅ：  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｐａｔｈ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ｒｅｓ  ｓｉｔｅｓ．”  Ｃｅｌｌ  ３２，  １３１３−１３２４．  
Ｋｕｌｋｏｓｋｙ  Ｊ，  Ｂｒａｙ  Ｓ  （２００６）  “ＨＡＡＲＴ−ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ＨＩＶ−１  ｌａｔｅｎｔ  ｒｅｓｅｒｖｏｉｒｓ：  ｔｈｅｉｒ  ｏｒｉｇｉｎ，  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ．”  Ｃｕｒｒ．  ＨＩＶ  Ｒｅｓ．  ４，  １９９−２０８．  
Ｌａｌｅｚａｒｉ  ＪＰ，  Ｈｅｎｒｙ  Ｋ，  Ｏ’Ｈｅａｒｎ  Ｍ，  Ｍｏｎｔａｎｅｒ  ＪＳ，  Ｐｉｌｉｅｒｏ  ＰＪ，  Ｔｒｏｔｔｉｅｒ  Ｂ，  Ｗａｌｍｓｌｅｙ  Ｓ，  Ｃｏｈｅｎ  Ｃ，  Ｋｕｒｉｔｚｋｅｓ  ＤＲ，  Ｅｒｏｎ  Ｊｒ．  ＪＪ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｊ，  ＤｅＭａｓｉ  Ｒ，  Ｄｏｎａｔａｃｃｉ  Ｌ，  Ｄｒｏｂｎｅｓ  Ｃ，  Ｄｅｌｅｈａｎｔｙ  Ｊ，  Ｓａｌｇｏ  Ｍ  （２００３）  “Ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ，  ａｎ  ＨＩＶ−１  ｆｕｓｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ．”  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８，  ２１７５−２１８５．  
Ｌｅｅ  ＹＳ，  Ｐａｒｋ  ＪＳ  （１９９８）  “Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｎｔ  ｌｏｘ？  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｏｆ  ＨＩＶ  −  １  ｉｎ  ｓｐａｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ：  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．”  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２５３，  ５８８−５９３．  
Ｌｅｅ  ＹＳ，  Ｋｉｍ  ＳＴ，  Ｋｉｍ  ＧＷ，  Ｌｅｅ  Ｍ，  Ｐａｒｋ  ＪＳ  （２０００）  “Ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｌｏｘ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐａｒｔ  ｏｆ  ａ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｐｅｒｍｉｔｓ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ．”  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７８，  ６５３−６５８．  
Ｌｅｈｒｍａｎ  Ｇ，  Ｈｏｇｕｅ  ＩＢ，  Ｐａｌｍｅｒ  Ｓ，  Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  Ｃ，  Ｓｐｉｎａ  ＣＡ，  Ｗｉｅｇａｎｄ  Ａ，  Ｌａｎｄａｙ  ＡＬ，  Ｃｏｏｍｂｓ  ＲＷ，  Ｒｉｃｈｍａｎ  ＤＤ，  Ｍｅｌｌｏｒｓ  ＪＷ，  Ｃｏｆｆｉｎ  ＪＭ，  Ｂｏｓｃｈ  ＲＪ，  Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ＤＭ  （２００５）  “Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｔｅｎｔ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：  ａ  ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｓｔｕｄｙ”  Ｌａｎｃｅｔ  ３６６，  ５４９−５５５．  
Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ，  Ｍ．  （２００１）  “Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．”  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２，  ７４３−７５５．  
Ｌｉｎ  Ｑ，  Ｊｏ  Ｄ，  Ｇｅｂｒｅ−Ａｍｌａｋ  ＫＤ，  Ｒｕｌｅｙ  ＨＥ  （２００４）  “Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｎｔ  Ｃｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．”  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ４，  ２５．  
Ｌｉｔｔｌｅ  ＳＪ，  Ｈｏｌｔｅ  Ｓ，  Ｒｏｕｔｙ  ＪＰ，  Ｄａａｒ  ＥＳ，  Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  Ｍ，  Ｃｏｌｌｉｅｒ  ＡＣ，  Ｋｏｕｐ  ＲＡ，  Ｍｅｌｌｏｒｓ  ＪＷ，  Ｃｏｎｎｉｃｋ  Ｅ，  Ｃｏｎｗａｙ  Ｂ，  Ｋｉｌｂｙ  Ｍ，  Ｗａｎｇ  Ｌ，  Ｗｈｉｔｃｏｍｂ  ＪＭ，  Ｈｅｌｌｍａｎｎ  ＮＳ，  Ｒｉｃｈｍａｎ  ＤＤ  （２００２）  “Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｍｏｎｇ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｎｔｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ．”  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４７，  ３８５−３９４．  
Ｌｏｏｎｓｔｒａ  Ａ，  Ｖｏｏｉｊｓ  Ｍ，  Ｂｅｖｅｒｌｏｏ  ＨＢ，  Ａｌｌａｋ  ＢＡ，  ｖａｎ  Ｄｒｕｎｅｎ  Ｅ，  Ｋａｎａａｒ  Ｒ，  Ｂｅｒｎｓ  Ａ，  Ｊｏｎｋｅｒｓ  Ｊ  （２００１）  “Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ． ”  ＰＮＡＳ  ９８，  ９２０９−９２１４．
Ｍａｃａｒａ  ＩＧ  （２００１）  “Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎｔｏ  ａｎｄ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ．”  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ６５，  ５７０−５９４．  
Ｍａｌｉｍ  ＭＨ，  Ｈａｕｂｅｒ  Ｊ，  Ｆｅｎｒｉｃｋ  Ｒ，  Ｃｕｌｌｅｎ  ＢＲ  （１９８８）  “Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖ  ｔｒａｎｓ−  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｇｅｎｅｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ  ３３５，  １８１−１８３．  
Ｍａｒｃｅｌｌｏ  Ａ  （２００６）  “Ｌａｔｅｎｃｙ：  ｔｈｅ  ｈｉｄｄｅｎ  ＨＩＶ−１  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．”  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３，  ７．  
Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｉ，  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ＡＤ  （２００１）  “Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｉｎｔｏ  ａ  ｂｅｔａ−  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｐｒｏｃｅｅｄｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．”  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０５，  ３３１−３３９．  
Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  Ｊ，  Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰ．  （１９９９）  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ．”  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ３，  ２８４−２９０．  
Ｎａｇｙ  Ａ  （２０００）  “Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ：  ｔｈｅ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｔａｉｌｏｒｉｎｇ．”  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ２６，  ９９−１０９．  
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＳＢ，  Ｗｕｎｓｃｈ  ＣＤ  （１９７０）  “Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８，  ４４３−４５３．  
Ｎｏｌｄｅｎ  Ｌ，  Ｅｄｅｎｈｏｆｅｒ  Ｆ，  Ｈａｕｐｔ  Ｓ，  Ｋｏｃｈ  Ｐ，  Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ  ＦＴ，  Ｓｉｅｍｅｎ  Ｈ，  Ｂｒｕｓｔｌｅ  Ｏ．  （２００６）  “Ｓｉｔｅ−  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｎｔ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．”  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３，  ４６１−４６７．  
Ｏｅｓｓ  Ｓ，  Ｈｉｌｄｔ  Ｅ．，  Ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｍｏｔｉｆ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＰｒｅＳ２−ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ−Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０００  Ｍａｙ；７（９）：７５０−８
Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ  Ｕ，  Ｓｗｉｇｇａｒｄ  ＷＪ，  Ｍａｌｉｍ  ＭＨ  （２０００）  “Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｖｉｒｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ．”  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７４，  １００７４−１００８０．  Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷＲ，  Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ  （１９８８）  “Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ．”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５，  ２４４４−２４４８．  
Ｐｅｉｔｚ  Ｍ，  Ｐｆａｎｎｋｕｃｈｅ  Ｋ，  Ｒａｊｅｗｓｋｙ  Ｋ，  Ｅｄｅｎｈｏｆｅｒ  Ｆ．  （２００２）  “Ａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ＦＧＦ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃ  ＴＡＴ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ：  Ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ．”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９，  ４４８９−４４９４．  
Ｒａｔｎｅｒ  Ｌ，  Ｓｔａｒｃｉｃｈ  Ｂ，  Ｊｏｓｅｐｈｓ  ＳＦ，  Ｈａｈｎ  ＢＨ，  Ｒｅｄｄｙ  ＥＰ，  Ｌｉｖａｋ  ＫＪ，  Ｐｅｔｔｅｗａｙ  ＳＲ，  Ｊｒ．，  Ｐｅａｒｓｏｎ  ＭＬ，  Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ  ＷＡ，  Ａｒｙａ  ＳＫ，  （１９８５）  “Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３’  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ．”  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３，  ８２１９−８２２９．  
Ｒｉｃｈａｒｄ  ＪＰ，  Ｍｅｌｉｋｏｖ  Ｋ，  Ｂｒｏｏｋｓ  Ｈ，  Ｐｒｅｖｏｔ  Ｐ，  Ｌｅｂｌｅｕ  Ｂ，  Ｃｈｅｍｏｍｏｒｄｉｋ  ＬＶ  （２００５）  “Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＴＡＴ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．”  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８０，  １５３００−１５３０６．  
Ｒｕｆｅｒ  ＡＷ，  Ｓａｕｅｒ  Ｂ  （２００２）  “Ｎｏｎ−ｃｏｎｔａｃｔ  ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｉｍｐｏｓｅ  ｓｉｔｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．”  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０，  ２７６４−２７７１．
Ｒｕｈｌ  Ｍ，  Ｈｉｍｍｅｌｓｐａｃｈ  Ｍ，  Ｂａｈｒ  ＧＭ，  Ｈａｍｍｅｒｓｃｈｍｉｄ  Ｆ，  Ｊａｋｓｃｈｅ  Ｈ，  Ｗｏｌｆｆ  Ｂ，  Ａｓｃｈａｕｅｒ  Ｈ，  Ｆａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＧＫ，  Ｐｒｏｂｓｔ  Ｈ，  Ｂｅｖｅｃ  Ｄ，  Ｈａｕｂｅｒ  Ｊ  （１９９３）  “Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ５  Ａ  ｉｓ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  Ｒｅｖ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １２３，  １３０９−１３２０．  
Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ，  Ｎｉｃｋｌｅｒ  Ｓ，  Ｃｏｕｌｓｏｎ  ＡＲ  （１９７７）  “ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４，  ５４６３−５４６７．  
Ｓａｎｔｏｒｏ  ＳＷ，  Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ  （２００２）  “Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９９，  ４１８５−４１９０．  
Ｓａｒａｆ−Ｌｅｖｙ  Ｔ，  Ｓａｎｔｏｒｏ  ＳＷ，  Ｖｏｌｐｉｎ  Ｈ，  Ｋｕｓｈｎｉｒｓｋｙ  Ｔ，  Ｅｙａｌ  Ｙ，  Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ，  Ｇｉｄｏｎｉ  Ｄ，  Ｃａｒｍｉ  Ｎ  （２００６）  “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｌｏｘ  ｓｉｔｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．”  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １４，  ３０８１−３０８９．  
Ｓａｕｅｒ  Ｂ，  ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  Ｊ  （２００４）  “ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｒｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｃ−ｃｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ＰＩ  −ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｈａｇｅｓ．”  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ３２，  ６０８６−  ６０９５．  
Ｓｃｈａｍｂａｃｈ  Ａ，  Ｂｏｈｎｅ  Ｊ，  Ｃｈａｎｄｒａ  Ｓ，  Ｗｉｌｌ  Ｅ，  Ｍａｒｇｉｓｏｎ  ＧＰ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＤＡ，  Ｂａｕｍ  Ｃ  （２００６）  “Ｅｑｕａｌ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｇａｍｍａｒｅｔｒｏ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｌｅｎｔｉ  ｖｉｒａｌ  ＳＩＮ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｏ６−  ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ−ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３，  ３９１−  ４００．
Ｓｃｈｅｒｒ  Ｍ，  Ｅｄｅｒ  Ｍ  （２００２）  “Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．”  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２，  ４５−５５．  
Ｓｈｅｈｕ−Ｘｈｉｌａｇａ  Ｍ，  Ｔａｃｈｅｄｊｉａｎ  Ｇ，  Ｃｒｏｗｅ  ＳＭ，  Ｋｅｄｚｉｅｒｓｋａ  Ｋ．  （２００５）  “Ａｎｔｉｒｅｔｒｏ  ｖｉｒａｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｏｆ  ＨＡＡＲＴ  ｔｏ  ｅｒａｄｉｃａｔｅ  ＨＩＶ−１．”  Ｃｕｒｒ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  １２，  １７０５−１７１９．  
Ｓｈｉｍｓｈｅｋ  ＤＲ，  Ｋｉｍ  Ｊ，  Ｈｕｂｎｅｒ  ＭＲ，  Ｓｐｅｒｇｅｌ  ＤＪ，  Ｂｕｃｈｈｏｌｚ  Ｆ，  Ｃａｓａｎｏｖａ  Ｅ，  Ｓｔｅｗａｒｔ  ＡＦ，  Ｓｅｅ−  ｂｕｒｇ  ＰＨ，  Ｓｐｒｅｎｇｅｌ  Ｒ  （２００２）  “Ｃｏｄｏｎ−ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  （ｉＣｒｅ）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ．”  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ３２（１），  １９−２６．  
Ｓｍｉｔｈ  Ｔｆ，  Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＭＳ  （１９８１）  “Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｅｏｒｙ．”  Ｊ  Ｔｈｅｏｒ．  Ｂｉｏｌ．  ９１，  ３７９−３８０．  
Ｓｔａｒｋ  ＷＭ，  Ｂｏｏｃｏｃｋ  ＭＲ，  Ｓｈｅｒｒａｔｔ  ＤＪ  （１９９２）  “Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ．”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ８，  ４３２−４３９．  Ｓｔｅｍｍｅｒ  ＷＰＣ  （１９９４）  “Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ．”  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，  ３８９−３９１．  
Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  Ｎ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｄ  （１９８１）  “Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＰＩ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．  Ｉ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｌｏｘＰ  ｓｉｔｅｓ．”  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５０，  ４６７−４８６．  
Ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅ  ＧＤ  （２００１）  “Ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｒｅ−ｌｏｘｐ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．”  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  ３０，  ８７−１０４．  
Ｖｉｖｅｓ  Ｅ，  Ｂｒｏｄｉｎ  Ｐ，  Ｌｅｂｌｅｕ  Ｂ  （１９９７）  “Ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＨＩＶ−１  Ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ．”  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２，  １６０１０−１６０１７．  
Ｖｉｖｅｓ  Ｅ  （２００３）  “Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＡＴ  ｐｅｐｔｉｄｅ：  ａｎ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ＜”＞  ｉｏｎｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  １６，  ２６５−２７１．  
Ｖｏｌｋｅｒｔ  ＦＣ，  Ｂｒｏａｃｈ  ＪＲ  （１９８６）  “Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｌａｓｍｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ．”  Ｃｅｌｌ  ４６，  ５４１−５５０．  
Ｖｏｚｉｙａｎｏｖ  Ｙ，  Ｋｏｎｉｅｃｚｋａ  ＪＨ，  Ｓｔｅｗａｒｔ  ＡＦ，  Ｊａｙａｒａｍ  Ｍ  （２００３）  “Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  Ｆｌｐ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ：  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ  ａｄａｐｔｉｎｇ  Ｆｌｐ  ｔｏ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｔｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅ．”  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３２６，  ６５−７６．  
Ｙｕａｎ  Ｌ，  Ｋｕｒｅｋ  Ｉ，  Ｅｎｇｌｉｓｈ  Ｊ，  Ｋｅｅｎａｎ  Ｒ  （２００５）  “Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ６９，  ３７３−９２．  
ＷＯ  ２００２／４４４０９
ＷＯ  ２００８／０８３９３１
ＷＯ  ２０１１／１４７５９０
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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