(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の循環半減期を延長する方法であって、
前記タンパク質の循環半減期が延長されるように、
タンパク質を重合性アクリロイル基とコンジュゲートすることと；
該コンジュゲートを含む溶液中で２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンをインサイチュー重合させて、前記タンパク質が該アクリロイル基を介してポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）の層にコンジュゲートした、該ｐＭＰＣでカプセル化されたタンパク質を得ることと
を含み、
該カプセル化されたタンパク質が、その活性の少なくとも９５％を、３７℃で少なくとも９０分間、０．１ｍｇ／ｍＬのトリプシンとインキュベートされた場合に保持する、
前記方法。
【請求項２】
前記ｐＭＰＣの層が、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合した複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カプセル化されたタンパク質が、その活性の少なくとも９０％を、３７℃で少なくとも５日間インキュベートされた場合に保持する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カプセル化されたタンパク質が、ポリエチレングリコールに結合されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質をｐＭＰＣの層でカプセル化することが、インビボでの免疫系による前記タンパク質のクリアランスを遅延させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質をｐＭＰＣの層でカプセル化することが、インビボでのオプソニンとの、マクロファージとの、または抗体とのタンパク質結合を減少させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｐＭＰＣの層が、前記カプセル化されたタンパク質に双性イオン構造を付与するように選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ｐＭＰＣの層が、８〜１１ｎｍの厚さを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質ナノカプセルを形成する方法であって、
タンパク質を重合性アクリロイル基とコンジュゲートすることと；
該コンジュゲートを含む溶液中で２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンをインサイチュー重合させて、前記タンパク質が該アクリロイル基を介してポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）の層にコンジュゲートした、該ｐＭＰＣでカプセル化されたタンパク質を得ることと
を含み、
該カプセル化されたタンパク質が、その活性の少なくとも９５％を、３７℃で少なくとも９０分間、０．１ｍｇ／ｍＬのトリプシンとインキュベートされた場合に保持する、
前記方法。
【請求項１０】
前記ｐＭＰＣの層が、複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）をＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合させることにより形成される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐＭＰＣの層が、８〜１１ｎｍの厚さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
カーゴ物質；及び
ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）
からなる物質を含む組成物であって、
前記カーゴ物質は、重合性アクリロイル基とコンジュゲートされており、
前記カーゴ物質は、該アクリロイル基を介して前記ｐＭＰＣの層にコンジュゲートして、該ｐＭＰＣでカプセル化されており、
該カプセル化されたカーゴ物質が、その活性の少なくとも９５％を、３７℃で少なくとも９０分間、０．１ｍｇ／ｍＬのトリプシンとインキュベートされた場合に保持する、
前記組成物。
【請求項１３】
前記カーゴ物質が、タンパク質またはポリペプチドである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ｐＭＰＣが、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合した複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ｐＭＰＣの層が、８〜１１ｎｍの厚さを有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
タンパク質の循環半減期を延長する方法であって、
タンパク質の循環半減期が延長されるように、
前記タンパク質を、重合性アクリロイル基とコンジュゲートすることと；
該コンジュゲートを含む溶液中で２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンをインサイチュー重合させて、前記タンパク質が該アクリロイル基を介してポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）の層にコンジュゲートした、該ｐＭＰＣでカプセル化されたタンパク質を得ることと
を含み、
該カプセル化されたタンパク質が、その活性の少なくとも９５％を、３７℃で少なくとも９０分間、０．１ｍｇ／ｍＬのトリプシンとインキュベートされた場合に保持する、
前記方法。
【請求項１７】
カーゴ物質；及び
ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）
からなる物質を含む組成物であって、
前記カーゴ物質は、重合性アクリロイル基を介してｐＭＰＣにコンジュゲートされて、該ｐＭＰＣが前記カーゴ物質をカプセル化しており；
該カプセル化されたカーゴ物質が、その活性の少なくとも９５％を、少なくとも９０分間トリプシンとインキュベートされた場合に保持する、
前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、Ｙｕｎｆｅｎｇ  Ｌｕらによる「ＳＴＥＡＬＴＨ  ＮＡＮＯＣＡＰＳＵＬＥＳ  ＦＯＲ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ」と題した２０１４年１１月２６日出願の米国特許仮出願第６２／０８４，８８７号の優先権を主張し、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、タンパク質ナノカプセル及び特にタンパク質の循環半減期を延長することに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
タンパク質療法は、個体において存在しないかまたは不十分である可能性のあるタンパク質を治療レベルで送達するため、多くの不治の疾患に対する最終的な希望であると考えられる。しかしながら、ペプチド薬物及び治療用タンパク質の適用は、生理的環境におけるそれらの不十分な安定性及び透過性により制限される。したがって、治療用タンパク質を送達するための担体として機能することができるナノ構造を設計することにより、これらの問題を回避する取り組みが増加している。
【０００４】
治療用タンパク質の全身送達のために、ナノ粒子は、それらの構造及び特性制御の容易さゆえに、理想的な担体として長きにわたり望まれてきた。さらに、ナノ粒子は、治療剤を特定の病理学的部位に標的送達するために使用される場合があり、これは所望の部位における用量効果の増加を可能にし、加えて任意の副作用を低減させる。しかしながら、現時点では臨床的な使用または臨床試験における使用を認可されているナノ製剤はほとんどない。ナノ粒子のインビボ使用における１つの主な障害は、免疫系によるナノ粒子の急速なクリアランスであり、これは望ましくない薬物動態及び生体内分布を招く。この問題は、大半の標的化戦略を無効にし、認可されたナノ製剤及び開発中のそれらの両方の有効性を減少させる。
【０００５】
現在、ナノ粒子の循環時間を延長するための主な戦略は、粒子をポリエチレングリコールでコーティング（ＰＥＧ化）し、細胞のグリコカリックスを模倣する「ステルス性」ブラシを作製することである。事実、ＰＥＧ化は、インビボで粒子の循環時間を延長することが分かっている。しかしながら、最大で２５％の患者が、処置前に抗ＰＥＧ抗体を示すこと、またはＰＥＧ化ナノ粒子の初回投与後に抗ＰＥＧ抗体を発現することが分かっている。したがって、ナノ粒子のＰＥＧ化は、ナノ粒子に基づく治療薬の開発において実用的なビヒクルとなる見込みはほとんどない。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、循環時間を延長する方法及び／または静脈内に投与される治療用タンパク質の免疫原性を低下させる方法に関する。複数の実施形態では、異種タンパク質のインビボ循環寿命を、そのタンパク質をポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）でカプセル化することにより有意に延ばす。タンパク質をカプセル化することにより、タンパク質表面は、オプソニン及び細胞への接着を最小限に抑えるｐＭＰＣシェルにより完全に覆われて、免疫認識及びクリアランスの劇的な遅延をもたらす。以下の実施例セクションでさらに記載されるように、生体内分布研究では、ある種の実施形態においてｐＭＰＣでカプセル化された注入タンパク質（ｐＭＰＣ−タンパク質）の５０％超が、器官内に捕捉される代わりに血流中に留まることを見出した（例えば、ｐＭＰＣでカプセル化された注入タンパク質の５０％超が、少なくとも１、２、３、または４時間血流中に留まる）。したがって、これらの方法は、治療剤の静脈内送達に対する従来のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に基づく戦略に、より良い代替案を提供する。
【０００７】
本発明の一態様では、タンパク質の循環半減期を延長する方法が提供される。本方法は、タンパク質を不飽和ビニル基とコンジュゲートすること、及びタンパク質をポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）の層でカプセル化することを含む。１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣの層は、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合した複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）を含む。典型的には、不飽和ビニル基は、重合性アクリロイル基である。一実施形態では、ｐＭＰＣの層は、カプセル化されたタンパク質に双性イオン構造を付与するように選択される。１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣの層は、８〜１１ｎｍの厚さを有する。その他の実施形態では、ｍＭＰＣの層は、１、２、３、４、または５ｎｍ未満の厚さを有する。
【０００８】
一実施形態では、タンパク質をｐＭＰＣの層でカプセル化することは、インビボでのタンパク質の半減期を延長する。別の実施形態では、タンパク質をｐＭＰＣの層でカプセル化することは、インビボでの免疫系によるタンパク質のクリアランスを遅延させる。さらなる実施形態では、タンパク質をｐＭＰＣの層でカプセル化することは、インビボでオプソニンとの、マクロファージとの、または抗体とのタンパク質結合の可能性を減少させる。一例では、カプセル化されたタンパク質は、その活性の少なくとも９５％を、少なくとも９０分間トリプシンとインキュベートされた場合に保持する。別の例では、カプセル化されたタンパク質は、その活性の少なくとも９０％を、３７℃で少なくとも５日間インキュベートされた場合に保持する。
【０００９】
本発明の別の態様では、タンパク質ナノカプセルを形成する方法が提供される。本方法は、タンパク質を不飽和ビニル基とコンジュゲートすること、及びタンパク質をポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）の層でカプセル化することを含む。１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣの層は、複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）をＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合させることにより形成される。典型的には、タンパク質は、重合性アクリロイル基とコンジュゲートされる。一実施形態では、ｐＭＰＣの層は、カプセル化されたタンパク質に双性イオン構造を付与するように選択される。１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣの層は、８〜１１ｎｍの厚さを有する。その他の実施形態では、ｍＭＰＣの層は、１、２、３、４、または５ｎｍ未満の厚さを有する。
【００１０】
本発明の別の態様では、物質の組成物が提供される。組成物は、カーゴ物質及びポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）を含み、ｐＭＰＣはカーゴ物質をカプセル化する。１つ以上の実施形態では、カーゴ物質は、タンパク質またはポリペプチドである。一実施形態では、ｐＭＰＣは、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合した複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）を含む。典型的には、カーゴ物質は、重合性アクリロイル基とコンジュゲートされる。１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣの層は、８〜１１ｎｍの厚さを有する。その他の実施形態では、ｍＭＰＣの層は、１、２、３、４、または５ｎｍ未満の厚さを有する。一例では、カプセル化されたタンパク質またはポリペプチドは、その活性の少なくとも９５％を、少なくとも９０分間トリプシンとインキュベートされた場合に保持する。別の例では、カプセル化されたタンパク質またはポリペプチドは、その活性の少なくとも９０％を、３７℃で少なくとも５日間インキュベートされた場合に保持する。
【００１１】
[本発明1001]
タンパク質の循環半減期を延長する方法であって、
タンパク質を不飽和ビニル基とコンジュゲートすることと；
前記タンパク質をポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）の層でカプセル化することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記ｐＭＰＣの層が、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合した複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記不飽和ビニル基が重合性アクリロイル基である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
カプセル化された前記タンパク質が、その活性の少なくとも95％を、少なくとも90分間トリプシンとインキュベートされた場合に保持する、本発明1001の方法。
[本発明1005]
カプセル化された前記タンパク質が、その活性の少なくとも90％を、37℃で少なくとも5日間インキュベートされた場合に保持する、本発明1001の方法。
[本発明1006]
カプセル化されたタンパク質が、ポリエチレングリコールに結合されていない、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記タンパク質をｐＭＰＣの層でカプセル化することが、インビボでの免疫系による前記タンパク質のクリアランスを遅延させる、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記タンパク質をｐＭＰＣの層でカプセル化することが、インビボでのオプソニンとの、マクロファージとの、または抗体とのタンパク質結合を減少させる、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記ｐＭＰＣの層が、カプセル化された前記タンパク質に双性イオン構造を付与するように選択される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記ｐＭＰＣの層が、8〜11ｎｍの厚さを有する、本発明1001の方法。
[本発明1011]
タンパク質ナノカプセルを形成する方法であって、
タンパク質を不飽和ビニル基とコンジュゲートすることと；
前記タンパク質をポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）の層でカプセル化することと
を含む、前記方法。
[本発明1012]
前記ｐＭＰＣの層が、複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）をＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合させることにより形成される、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記タンパク質が、重合性アクリロイル基とコンジュゲートされる、本発明1010の方法。
[本発明1014]
前記ｐＭＰＣの層が、8〜11ｎｍの厚さを有する、本発明1010の方法。
[本発明1015]
カーゴ物質；及び
ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）
からなる、物質の組成物であって、
前記ｐＭＰＣが前記カーゴ物質をカプセル化する、前記組成物。
[本発明1016]
前記カーゴ物質が、タンパク質またはポリペプチドである、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
前記ｐＭＰＣが、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合した複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）を含む、本発明1015の組成物。
[本発明1018]
前記カーゴ物質が、重合性アクリロイル基とコンジュゲートされる、本発明1015の組成物。
[本発明1019]
カプセル化された前記タンパク質または前記ポリペプチドが、その活性の少なくとも95％を、少なくとも90分間トリプシンとインキュベートされた場合に保持する、本発明1016の組成物。
[本発明1020]
前記ｐＭＰＣの層が、8〜11ｎｍの厚さを有する、本発明1014の組成物。
本発明のその他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から当業者に明らかとなるだろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示す一方で、限定ではなく実例として与えられていることが理解されるべきである。本発明の範囲内で多くの変更及び修正がその趣旨から逸脱することなく行われてよく、本発明は全てのこのような修正を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
ここで図面を参照し、これらの図面において同様の参照番号は、全体を通して対応する部分を表す。
【図１】本発明の１つ以上の実施形態に従った、ｐＭＰＣタンパク質ナノカプセル（ｐＭＰＣ−ｎタンパク質）の合成に関する概略図である。タンパク質のｐＭＰＣによるカプセル化は、２ステップにより達成される。タンパク質は、コンジュゲート反応により表面上で重合性アクリロイル基と結合され（Ｉ）；その後、タンパク質は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンのインサイチュー重合によりｐＭＰＣポリマーネットワークで包まれる（ＩＩ）。得られたタンパク質ナノカプセルは、完全にｐＭＰＣシェルにより覆われて、これはオプソニンタンパク質（ｉ）、マクロファージを含む様々な種類の細胞（ｉｉ）、及び抗体（ｉｉｉ）に付着することはない。
【図２】図２Ａ〜図２Ｆは、本発明の１つ以上の実施形態に従って、ｐＭＰＣタンパク質ナノカプセルの構造及び独特な特性を示す。図２Ａ及び図２Ｂは、透過型電子顕微鏡写真を示し、これは均一なサイズのｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（ａ）及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ（ｂ）を示している。図２Ｃは、ＨＲＰ、ＧＯｘ、ＵＯｘ、及びＡＯｘの、それらの天然型とそれらのｐＭＰＣタンパク質ナノカプセルとの間の活性比較を示す。これらの酵素で、カプセル化後に有意な活性損失を示すものはない。図２Ｄは、３７℃でインキュベートする場合の天然ＡＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの熱安定性を示す。図２Ｅは、３７℃で０．１ｍｇ／ｍＬのトリプシンに曝露した場合の天然ＵＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＵＯｘの活性変化を示す。図２Ｆは、マウス全血清とのインキュベーション後、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ、ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ、及び天然ＥＧＦＰにより吸着されたタンパク質量を示す。データは、３回の独立した実験からの平均±標準誤差（ＳＥＭ）（２Ｃ、２Ｄ、及び２Ｅ）ならびに平均±標準誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）（ＳＤ）（２Ｆ）を表す。
【図３】図３Ａ〜図３Ｈは、本発明の１つ以上の実施形態に従って、ｐＭＰＣ−カプセル化によるタンパク質の細胞取り込み及び食作用の減少を示す。図３Ａは、天然ＯＶＡ及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡと２４時間インキュベートした後の細胞生存率アッセイを示す。細胞増殖率は、同じ条件で培養した未処理細胞の増殖率で正規化した。生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを用いてアッセイした。図３Ｂは、Ｕ８７細胞による天然トランスフェリン（Ｔｆ）及びｐＭＰＣ−ｎＴｆの受容体媒介エンドサイトーシス（ＲＭＥ）レベルを示す。ＴｆのＲＭＥは、カプセル化により大幅に阻害される。図３Ｃは、天然ＥＧＦＰ及び異なる表面を有するＥＧＦＰナノカプセルの細胞取り込みレベルを示す。図３Ｄは、Ｊ７７４Ａ．１マウスマクロファージ細胞との１時間のインキュベーション後、天然ＯＶＡ（ｉ）では食作用を示すが、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ（ｉｉｉ）では食作用を示さない蛍光画像を示す。マウス血清を含む場合（＋ＭＳ）のオプソニン化が、天然ＯＶＡ（ｉｉ）の食作用を高めるのに対して、血清とのインキュベーション後のｐＭＰＣ−ｎＯＶＡからは有意な食作用を観察することができない。細胞は、細胞核を撮像するためにヘキスト３３３４２で染色した。スケールバー：５０μｍ。図３Ｅは、天然ＯＶＡ、天然ＯＶＡ＋ＭＳ、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ、及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ＋ＭＳとインキュベートした後に、マクロファージの蛍光支援細胞選別（ＦＡＣＳ）分析から得た平均蛍光強度を比較するヒストグラムである。図３Ｆは、６人のドナーからの静止及び刺激ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の両方によるＯＶＡ及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ取り込みの定量分析を示す。図３Ｇ及び図３Ｈは、ＰＢＳ（ブランク）、天然ＯＶＡ及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡで処理されたマウスの血液ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ（ＯＶＡ−ｓＩｇＧ）、及びＯＶＡ−ｓＩｇＥのレベル比較を示し、カプセル化後のＯＶＡは免疫原性が低下していることを示している。データは、３回の独立した実験からの平均±ＳＥＭ（３Ａ）、ＦＡＣＳデータからの平均±％ロバスト変動係数（ＣＶ）（３Ｅ）、いくつかの独立した実験からの平均±ＳＤ（３Ｂ、３Ｃについてはｎ＝６；３Ｆ、３Ｇ、３Ｈについてはｎ＝５）を表す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｄは、本発明の１つ以上の実施形態に従って、インビボでのｐＭＰＣタンパク質ナノカプセルの長期循環及び低免疫原性を示す。図４Ａは、放射性１２５Ｉ−ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰの静脈内投与後、異なる時間での動物の単一光子放射型コンピュータ断層撮影／Ｘ線コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ／ＣＴ）画像を示す。図４Ｂは、異なる時間での血中及び器官内における１２５Ｉ−ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰの相対量の定量分析を示す。全ての放射活性強度は、各動物の３時間での心臓における強度で正規化した。図４Ｃは、注入後の異なる時間におけるｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰの総量と比較した、血中及びその他の主要器官内に分布したｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰの相対量をまとめたヒストグラムである。図４Ｄは、全身投与後のマウスにおける天然ＡＯｘ、ｐＡＡｍ−ｎＡＯｘ、及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを示す。データは、独立した実験からの平均±ＳＥＭ（４Ｂ及び４Ｃについてはｎ＝３、ならびに４Ｄについてはｎ＝４）を表す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｋは、本発明の１つ以上の実施形態に従って、様々なｐＭＰＣタンパク質ナノカプセルのサイズ分布を示す。図５Ａは、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（平均粒径：１２．１６ｎｍ）を示し、図５Ｂは、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（＋）（平均粒径：１１．６２ｎｍ）を示し、図５Ｃは、ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（平均粒径：１３．２５ｎｍ）を示し、図５Ｄは、ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（＋）（平均粒径：１０．８２ｎｍ）を示し、図５Ｅは、ｐＭＰＣ−ｎＨＲＰ（平均粒径：１２．４６ｎｍ）を示し、図５Ｆは、ｐＭＰＣ−ｎＧＯｘ（平均粒径：１０．６１ｎｍ）を示し、図５Ｇは、ｐＭＰＣ−ｎＴｆ（平均粒径：１０．７８ｎｍ）を示し、図５Ｈは、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ（平均粒径：１３．４６ｎｍ）を示し、図５Ｉは、ｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ（平均粒径：９．５５６ｎｍ）を示し、図５Ｊは、ｐＭＰＣ−ｎＡＯｘ（平均粒径：１０．６８ｎｍ）を示し、図５Ｋは、ｐＡＡｍ−ｎＡＯｘ（平均粒径：１０．５４ｎｍ）を示す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｄは、本発明の１つ以上の実施形態に従って、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ、ｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ、及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘならびにそれらの対応する天然タンパク質で処理された細胞の生存率を示す。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、本発明の１つ以上の実施形態に従って、ｐＭＰＣ−ｎＢＳＡの生体内分布を示す。図７Ａは、異なる時間での血中及び器官内における１２５Ｉ−ｐＭＰＣ−ｎＢＳＡの相対量の定量分析を示す。全ての放射活性強度は、各動物の３時間での心臓における強度で正規化した。図７Ｂは、注入後の異なる時間におけるｐＭＰＣ−ｎＢＳＡの総量と比較した、血中及びその他の主要器官内に分布したｐＭＰＣ−ｎＢＳＡの相対量をまとめたヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本明細書で記載または参照される技術及び手順の多くは、当業者により十分に理解され、従来の手法を使用して一般的に用いられる。好ましい実施形態の記載において、添付図面を参照してよく、図面はその一部を形成し、図面において本発明が実施される場合もある特定の実施形態が実例として示される。その他の実施形態が利用されてよく、構造変化が本発明の範囲から逸脱することなく行われてよいことが理解されるべきである。
【００１４】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術に関する全ての用語、表記及びその他の科学用語または専門用語は、本発明が関連する当業者によって一般的に理解される意味を有することを意図する。いくつかの場合には、一般的に理解される意味を有する用語は、明確にするために、及び／または迅速な参照のために本明細書で定義され、本明細書におけるこのような定義の包含が、必ずしも当該技術分野において一般に理解されるものとの実質的な差を表すと解釈されるべきではない。
【００１５】
今日まで、ナノ粒子に基づく治療薬は、不溶性かつ脆弱なタンパク質の安定化を可能にする画期的な送達戦略として大きな可能性を示してきた。しかしながら、ナノ粒子の適用は、免疫系によるそれらのクリアランスに起因する短いインビボ循環時間によって通常は制限される。タンパク質に基づく治療薬の循環時間を延ばす現在の方法は、主にＰＥＧ化により達成され、例えば米国特許第４，１７９，３３７号に記載されている。しかしながら、大半の人々が、食品及び化粧品におけるＰＥＧの広範な使用に部分的に起因して、抗ＰＥＧ応答を発現する傾向があることが分かっている。
【００１６】
体からのナノ粒子の除去（すなわち、クリアランス）は、主に細網内皮系（ＲＥＳ）としても知られる単核食細胞系（ＭＰＳ）により達成される。ＭＰＳのマクロファージは、外来粒子を直接識別する、または外来粒子の表面に結合したオプソニンタンパク質によりそれらを認識するかのいずれかを行うことができる。明らかに、どちらの経路もナノ粒子とマクロファージ及びオプソニンなどの生物学的内容物との結合により開始される。したがって、結合の可能性を最小限に抑えることにより、血液からのナノ粒子のＭＰＳクリアランスを遅延させ、それによってそれらの循環寿命を延ばし、それらの免疫原性を抑制することが可能である。
【００１７】
一態様では、本明細書で開示される本発明は、血中において任意のタンパク質またはポリペプチドの循環寿命を延ばすことができるタンパク質及びポリペプチドナノカプセルの合理的な設計を提供する。さらなる態様では、単純な湿式化学手法を使用することにより、非付着性タンパク質ナノカプセルが広範囲な臨床応用に提供される。一般に、これはタンパク質をポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）の薄層でカプセル化し、タンパク質の最上部に非付着性表面を作製することにより達成される。
【００１８】
ｐＭＰＣカプセル化タンパク質ナノ粒子（ｐＭＰＣ−ｎタンパク質）の合成戦略は、タンパク質カプセル化技術の修正版を使用することにより達成される。図１に示されるように、１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣ−ｎタンパク質の合成戦略は、２ステップ法で達成される。タンパク質を最初に不飽和ビニル基とコンジュゲートし（Ｉ）、次いでモノマー（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ＭＰＣ）と架橋剤（Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、ＢＩＳ）とを水溶液中で共重合させることによりｐＭＰＣポリマーネットワークで包む（ＩＩ）。ｐＭＰＣの耐吸着特性ゆえに、ｐＭＰＣコーティングは、オプソニン（ｉ）、マクロファージ（ｉｉ）、または抗体（ｉｉｉ）とのタンパク質結合の可能性を有意に減少させ、それによって免疫系によるクリアランスを遅延させて、それらの循環半減期を延長する。さらに、ｐＭＰＣコーティングはまた、内部タンパク質が直接プロテアーゼと相互作用するのを防ぐことで、血流での循環中にタンパク質の安定性を高める（それによってタンパク質を投与した個体におけるタンパク質の循環半減期の時間を延長する）。
【００１９】
本発明は、多くの治療用タンパク質について血液循環半減期の延長及び免疫原性の低下などの利点を提供する。以下の実施例セクションに示されるように、本発明は、静脈内に投与された治療用タンパク質の循環時間を有意に増加させることができる。本発明はまた、投与された後に免疫系による識別をより困難にさせる生体適合性材料を利用する。このタンパク質療法技術は、様々な疾患（例えば、痛風）ならびに組織再構築及び組織再生に適用されてよい。現在の技術（例えば、従来のＰＥＧ化戦略）と比較して、本発明は、より安定した構造を提供し、使用される材料が十分に生体適合性であって免疫応答を引き起こすことがない。結果として、本発明は、治療用タンパク質がより有利な薬物動態プロファイル及びより高いバイオアベイラビリティを有することを可能にする。
【００２０】
本発明の一態様では、タンパク質の循環半減期を延長する方法が提供される。本方法は、タンパク質を不飽和ビニル基とコンジュゲートすること、及びタンパク質をポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）の層でカプセル化することを含む。１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣの層は、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合した複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）を含む。典型的には、不飽和ビニル基は、重合性アクリロイル基である。一実施形態では、ｐＭＰＣの層は、カプセル化されたタンパク質に双性イオン構造を付与するように選択される。１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣの層は、８〜１１ｎｍの厚さを有する。その他の実施形態では、ｍＭＰＣの層は、１、２、３、４、または５ｎｍ未満の厚さを有する。
【００２１】
一実施形態では、タンパク質をｐＭＰＣの層でカプセル化することは、インビボでのタンパク質の半減期を延長する。別の実施形態では、タンパク質をｐＭＰＣの層でカプセル化することは、インビボでの免疫系によるタンパク質のクリアランスを遅延させる。さらなる実施形態では、タンパク質をｐＭＰＣの層でカプセル化することは、インビボでオプソニンとの、マクロファージとの、または抗体とのタンパク質結合の可能性を減少させる。一例では、カプセル化されたタンパク質は、その活性の少なくとも９５％を、少なくとも９０分間トリプシンとインキュベートされた場合に保持する。別の例では、カプセル化されたタンパク質は、その活性の少なくとも９０％を、３７℃で少なくとも５日間インキュベートされた場合に保持する。
【００２２】
本発明の別の態様では、タンパク質ナノカプセルを形成する方法が提供される。本方法は、タンパク質を不飽和ビニル基とコンジュゲートすること、及びタンパク質をポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）の層でカプセル化することを含む。１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣの層は、複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）をＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合させることにより形成される。典型的には、タンパク質は、重合性アクリロイル基とコンジュゲートされる。一実施形態では、ｐＭＰＣの層は、カプセル化されたタンパク質に双性イオン構造を付与するように選択される。１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣの層は、８〜１１ｎｍの厚さを有する。その他の実施形態では、ｍＭＰＣの層は、１、２、３、４、または５ｎｍ未満の厚さを有する。
【００２３】
本発明の別の態様では、物質の組成物が提供される。組成物は、カーゴ物質及びポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）（ｐＭＰＣ）を含み、ｐＭＰＣはカーゴ物質をカプセル化する。１つ以上の実施形態では、カーゴ物質は、タンパク質またはポリペプチドである。一実施形態では、ｐＭＰＣは、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）架橋剤と重合した複数の２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンモノマー（ＭＰＣ）を含む。典型的には、カーゴ物質は、重合性アクリロイル基とコンジュゲートされる。１つ以上の実施形態では、ｐＭＰＣの層は、８〜１１ｎｍの厚さを有する。その他の実施形態では、ｍＭＰＣの層は、１、２、３、４、または５ｎｍ未満の厚さを有する。一例では、カプセル化されたタンパク質またはポリペプチドは、その活性の少なくとも９５％を、少なくとも９０分間トリプシンとインキュベートされた場合に保持する。別の例では、カプセル化されたタンパク質またはポリペプチドは、その活性の少なくとも９０％を、３７℃で少なくとも５日間インキュベートされた場合に保持する。
【実施例】
【００２４】
実施例１：ｐＭＰＣシェルによるカプセル化は、タンパク質構造を損なうことがない
ｐＭＰＣタンパク質ナノカプセル調製の成功を、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）及びオボアルブミン（ＯＶＡ）を使用して実証した。ｐＭＰＣによるカプセル化後、タンパク質ナノカプセルは、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（図２Ａ）及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ（図２Ｂ）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像によると、平均粒径が２５±５ｎｍの均一な球状形態を示した。ＥＧＦＰ及びＯＶＡの粒子サイズがおよそ８ｎｍであることを考慮すると、ｐＭＰＣシェルの平均厚さは、およそ８〜１１ｎｍである。ｐＭＰＣコーティングは、水性媒体中において非常に穏やかな反応を使用して形成されるため、内部にカプセル化されるタンパク質は、それらの構造及び生物学的機能を保持することができる。
【００２５】
これを検証するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、ウリカーゼ（ＵＯｘ）、及びアルコールオキシダーゼ（ＡＯｘ）を含む４つの酵素を同じ方法でカプセル化し、それらの酵素活性をそれらの天然対応物とそれぞれ比較した。図２Ｃは、ｐＭＰＣ−ｎタンパク質をそれらの天然型と比較した相対触媒効率を示す。結果によると、カプセル化の前後で全体的な触媒効率に有意差はなかったが、全てのｐＭＰＣカプセル化酵素が、それらの天然型と比較してわずかに低い活性を示した。この活性損失は、基質がｐＭＰＣシェルを通り抜けて移動し、内部の酵素と結合する場合に、拡散率を低減させる８ｎｍ厚のｐＭＰＣコーティングに起因する可能性があり、これは見かけのミカエリス定数（ＫＭ）の増加をもたらす（表１）。ＫＭの増加及び酵素活性において有意な損失がないことのどちらも、カプセル化がタンパク質構造を損なうことがないことを示唆している。これはさらに、ｐＭＰＣ−カプセル化方法が、大半のタンパク質及び酵素に対して、それらの生物学的機能を損なうことなく一般に適用できることを示している。
【００２６】
（表１）ｐＭＰＣ−ｎＨＲＰ、ｐＭＰＣ−ｎＧＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＡＯｘ、及びそれらの天然対応物の動態パラメータ
0006802157.tif 000002
【００２７】
実施例２：ｐＭＰＣシェルによるカプセル化は、タンパク質の安定性を高める
スキームで示すように、タンパク質の外側を包んだｐＭＰＣシェルは、ＭＰＣモノマーから直接合成する。タンパク質をコーティングするための従来の自己組織化及び「グラフトオン」法とは異なり、この重合法は、剪断力が高く、生理学的状態が継続的に変化しているような血中における循環中でも、内部タンパク質を完全に覆うことを確実にする架橋した密なポリマーネットワークを調製する。結果として、本明細書で開示されるナノカプセルは、内部のタンパク質に安定した微小環境を提供し、効果的にその安定性を高める。
【００２８】
これを検証するために、タンパク質ナノカプセルの安定性を最初に熱変性で試した。モデルタンパク質としてＡＯｘを使用し、天然ＡＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘを３７℃で５日間インキュベートし、それらの酵素活性を異なる時間でモニターした。活性比較（図２Ｄ）によると、天然ＡＯｘは、その活性の６０％超を損失し、これはその構造がインキュベーション中に損なわれたことを示唆している。しかしながら、ｐＭＰＣ−ｎＡＯｘは、その活性の９０％を保持し、これはカプセル化が実際にタンパク質の安定性を高めたことを示している。
【００２９】
実施例３：ｐＭＰＣシェルによるカプセル化は、タンパク質分解を防ぎ、タンパク質の吸着を低下させる
ｐＭＰＣシェルはさらに、カプセル化されたタンパク質を外部環境から分離する。循環中、タンパク質、細胞、組織及び器官は、内部タンパク質表面の代わりにｐＭＰＣシェルと相互作用せざるを得なく、このことは分子レベルでタンパク質の循環寿命を延ばすのに２つの主な利益を提供する。第１に、ｐＭＰＣシェルは、プロテアーゼの結合を阻害することによりタンパク質をタンパク質分解から防ぐ。ＵＯｘで例示すると（図２Ｅ）、天然ＵＯｘは、その活性を、トリプシンとインキュベートした場合に４０分以内で完全に損失したのに対して、ｐＭＰＣ−ｎＵＯｘは、その活性の９５％超を、９０分のインキュベーション後でも保持した。第２に、ｐＭＰＣシェルは、タンパク質表面を双性イオン構造に置き換えることで、ｐＭＰＣタンパク質ナノカプセル上へのタンパク質吸着の低下をもたらす。図２Ｆでは、３７℃でマウス血清（ＭＳ）と３０分間インキュベートした後に、異なるＥＧＦＰ試料により吸着されたタンパク質の量を比較している。明らかに、天然ＥＧＦＰが多量の血清タンパク質を吸着したのに対して、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰは、対照と比較して有意なタンパク質吸着を示さなかった。予想通り、非双性イオンポリマーによるカプセル化（ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ）はまた、血清タンパク質の有意な吸着を招き、ｐＭＰＣシェルがタンパク質吸着の低下に重要な役割を果たすことを確認した。タンパク質吸着が、通常はＭＰＳクリアランスを促進させるオプソニン化及び凝集をもたらすことを考慮すると、ｐＭＰＣコーティングは、マクロファージによるカプセル化されたタンパク質の識別を著しく遅延させて、それにより体内でのカプセル化されたタンパク質の循環半減期を延長するのだろう。
【００３０】
実施例４：ｐＭＰＣシェルによるカプセル化は、生体適合性を改善する
ｐＭＰＣシェルはまた、タンパク質ナノカプセルに良好な生体適合性を付与し、これは送達戦略にとって最小限の副作用で確実に送達を成功させるために重要である。ｐＭＰＣは非毒性かつ生体適合性の材料であるため、ｐＭＰＣによるカプセル化が、さらなる毒性をもたらすことはない。これを例示的な実験で確認し、この実験では、天然タンパク質及びｐＭＰＣ−ｎタンパク質にそれぞれ２４時間曝露した後、ごくわずかな細胞生存率の差を示した（例えば、図３Ａを参照のこと）。さらに、ｐＭＰＣカプセル化は、タンパク質が細胞表面と直接相互作用するのを防ぎ、細胞内へのそれらの内在化を有意に遅延させる。例えば、トランスフェリン（Ｔｆ）は、受容体媒介エンドサイトーシス（ＲＭＥ）によりＵ８７細胞内に内在化できるタンパク質である。しかしながら、ｐＭＰＣカプセル化は、ＴｆとＴｆ受容体（ＴｆＲ）との間の結合をブロックしてＲＭＥの阻害をもたらし、それによってＵ８７細胞内へのＴｆ内在化の量を減少させる（図３Ｂ）。
【００３１】
ｐＭＰＣタンパク質ナノカプセルと細胞表面との間の相互作用に関するさらなる調査を、Ｕ８７細胞と、等量の天然ＥＧＦＰならびに異なる表面材料及びゼータ電位を有するＥＧＦＰナノカプセルとをそれぞれインキュベートすることにより達成した。図３Ｃでは、インキュベーション後に細胞内に内在化したＥＧＦＰの量を比較している。結果によると、負荷電表面を有するナノカプセル（ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（−）及びｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（−））は、細胞取り込みにとって好ましくなく、文献で報告されていることと一致する。正荷電表面については、ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（＋）が高レベルの細胞取り込みを示したのに対して、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（＋）は、両方の正荷電ナノカプセル上に有する正電荷がほぼ同量（ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（＋）、ζ＝＋１．２７ｍＶ；ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（＋）、ζ＝＋１．０８ｍＶ）であるにもかかわらず、対照（ＥＧＦＰなし）及び天然ＥＧＦＰのレベルと比較して、有意ではない非常に低レベルの取り込みを示した。明白に、ｐＭＰＣシェルは細胞取り込みを遅延させ、これはナノカプセルが細胞膜と結合するのを防ぐその非付着性の特徴に起因する可能性がある。安定した結合なしに、細胞が高曲率の膜を安定させるのは不可能であり、これはエンドソームの形成に必須である。
【００３２】
実施例５：ｐＭＰＣシェルによるカプセル化は、食作用を遅延させる
ｐＭＰＣシェルが細胞取り込みを遅延させることができるのに加えて、オプソニン化も阻害することができるという事実に基づいて、ｐＭＰＣ−カプセル化を使用し、オプソニンの存在にかかわらずマクロファージの食作用も遅延させる可能性があると考えられる。これを検証するために、Ｊ７４４Ａ．１マウスマクロファージ細胞、ローダミンＢ（ＲｈＢ）標識天然ＯＶＡ、及びＲｈＢ標識ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡを用いて、食作用のレベルを評価した。天然ＯＶＡ及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡの両方を、マクロファージに曝露する前にそれぞれＰＢＳ（−ＭＳ）及びマウス血清（＋ＭＳ）とインキュベートした。
【００３３】
予想通り、これらの試料はマクロファージとの１時間のインキュベーション後、食作用レベルに大きな差をもたらした。顕微鏡画像（図３Ｄ）によると、天然ＯＶＡ試料の両方は、明白にローダミンＢ蛍光シグナルを示し（図３Ｄ、ｉ及びｉｉ）、これは高レベルの食作用を示している。対照的に、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ試料では非常に低レベルの食作用を観察した（図３Ｄ、ｉｉｉ及びｉｖ）。マウス血清とインキュベートした後、天然ＯＶＡ試料からは有意な食作用の強化も観察し、これは天然ＯＶＡのオプソニン化が食作用を促進させたことを示唆している。しかしながら、血清インキュベーション後のｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ試料では、ｐＭＰＣシェルの非付着性能がナノカプセルをオプソニン化から防いだために、明白な食作用レベルの差を観察することはなく、これはまた、その低タンパク質吸着によって確認した（図２Ｆ）。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析は、それぞれ天然ＯＶＡ＋ＭＳ／−ＭＳで処理したマクロファージと比較して、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ＋ＭＳ／−ＭＳで処理したマクロファージの平均蛍光強度を最大で６倍低減させたことを示した（図３Ｅ、及び表２）。これはまた、オプソニン化の阻害及び食作用の遅延におけるｐＭＰＣ−カプセル化の有効性を裏付ける。食作用はナノカプセルのＭＰＳクリアランスにとって重大であるため、ｐＭＰＣ−カプセル化によりタンパク質の循環半減期を延長することが可能である。
【００３４】
（表２）ＦＡＣＳ結果の概要
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【００３５】
実施例６：ｐＭＰＣシェルによるカプセル化は、免疫原性を低減させる
ＭＰＣクリアランスに加えて、異種タンパク質及びそれらのナノ製剤はまた、適応免疫系により効果的に排除され得、免疫系は対応する抗体を生成することにより異物を識別して中和することができる。さらに、適応免疫は通常、抗原を直接識別して迅速に抗体を産生することができるメモリーＢ細胞を生成することで、異物の血液クリアランスの促進（ＡＢＣ）をもたらす。今日まで、広く使用されているＰＥＧ化ナノ構造を含む、大半の静脈内ナノ製剤がＡＢＣ現象に悩まされている。しかしながら、適応免疫系の活性化及びメモリーＢ細胞の生成は、初めて異物を取り入れる場合には抗原提示と呼ばれる不可欠なステップを必要とする。抗原提示は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の識別、貪食、及び消化により開始される。したがって、ＡＰＣによる取り込みを阻害するナノ製剤は、免疫活性化を回避することができ、免疫原性の低減、最小限のＡＢＣ現象の発生、及びそれゆえ血液循環寿命の有意な延長をもたらす。
【００３６】
ｐＭＰＣ−ｎタンパク質の貪食を評価するために、６人のドナーからの静止及び刺激ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の両方を用いて、ＲｈＢ標識天然ＯＶＡ及びＲｈＢ標識ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡのそれぞれとインキュベートした。図３Ｆは結果をまとめたもので、これらはｐＭＰＣ−カプセル化が、刺激後であってもＰＢＭＣによるＯＶＡの貪食を効果的に妨害することができることを示している。ＰＢＭＣが多くの主要な種類のＡＰＣからなることを考慮すると、ｐＭＰＣ−ｎタンパク質は最小限の免疫原性を提示するだろうと予想して、次いで、マウスへのｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ及び天然ＯＶＡのインビボ投与後に抗体レベル（ＩｇＧ及びＩｇＥ）を測定することによりこれを得た。図３Ｇは、ＰＢＳ（対照）、天然ＯＶＡ、及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡで処理したマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ）のＩｇＧ及びＩｇＥレベルを比較している。ＯＶＡの強力な免疫原性ゆえに、天然ＯＶＡで処理したマウスは、注入後に高レベルのＩｇＧ及びＩｇＥを発現した。しかしながら、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ処理群では、ＩｇＧ及びＩｇＥレベルの有意な上昇を観察することはなく、これはｐＭＰＣ−カプセル化が実際に免疫活性化を抑制したことを示唆している。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＥレベル（ＯＶＡ−ｓＩｇＧ及びＯＶＡ−ｓＩｇＥ）でも同様の結果（図３Ｈ）を観察し、これはＯＶＡの外側を包んでいるｐＭＰＣシェルが、ＡＰＣによるその提示をブロックしたことを示している。マクロファージ及びＡＰＣの食作用及び貪食を最小限に抑えることにより、ｐＭＰＣ−ｎタンパク質は、ＭＰＳクリアランス及び適応免疫を含む主なクリアランス経路による識別及び中和を回避することに成功した。したがって、ｐＭＰＣ−ｎタンパク質は、静脈内投与後に血液循環半減期の延長、及び理想的な生体内分布を示すことが可能である。
【００３７】
実施例７：ｐＭＰＣでカプセル化したタンパク質のインビボ循環能の評価
ｐＭＰＣ−ｎタンパク質のインビボ循環能を評価するために、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰを放射性１２５Ｉで標識し、ナノカプセルをマウス（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｋｕｎ  Ｍｉｎｇマウス）に、それらの尾静脈から注入した。ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰの分布及び循環を単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）で追跡した。７日以内に収集したＳＰＥＣＴ／Ｘ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像を図４Ａに示す。画像（図４Ａ）及びヒストグラム（図４Ｂ）から、注入後７２時間で血流中のｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ循環において有意な部分を明らかに観察した。ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ循環挙動のさらなる理解のために、異なる組織及び器官での放射活性強度をそれらの対応する総放射活性強度で正規化し、異なる時間でのｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰの生体内分布を得た（図４Ｃ）。明らかに、血中及び器官内のｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰの分布は、異なる時間でもほぼ同一であり、血中のｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ量は、肝臓、脾臓、及び腎臓で検出した量よりも有意に高かった。これは、現在の全てのナノ粒子に基づく送達戦略の中でも非常に特有な生体内分布であり、典型的には投与直後の器官内における蓄積によりナノ製剤の９０％を損失する。
【００３８】
現在のナノ粒子に基づくビヒクルとの主な差は、ｐＭＰＣ−ｎタンパク質が、高密度で安定した非付着性の、すぐに内部タンパク質を完全にカプセル化するｐＭＰＣシェルを有することである。前述したように、このｐＭＰＣシェルは、マクロファージによる食作用を遅延させることができ、マクロファージは主として肝臓、腎臓、脾臓、肺、リンパ節、及び中枢神経系に位置する。食作用の遅延は、タンパク質ナノカプセルが捕捉される可能性を低減し、それによって器官内におけるそれらの蓄積を減少させ、血中におけるそれらの循環半減期を延長する。ｐＭＰＣ−ｎＢＳＡでも同様の結果が得られ（図７Ａ〜図７Ｂ）、特有の循環及び分布挙動は、カプセル化されたタンパク質ではなく、ｐＭＰＣシェルに起因していたことを確認した。
【００３９】
さらにこれを検証するために、ｐＭＰＣ−ｎＡＯｘをマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に注入し、その薬物動態（ＰＫ）を注入後７２時間以内に血中のＡＯｘ活性を測定することにより決定した。比較として、天然ＡＯｘ及びｐＡＡｍ−ｎＡＯｘのＰＫも並行して測定した。図４Ｄは結果をまとめたもので、これらは天然ＡＯｘ及びｐＡＡｍ−ｎＡＯｘで処理したマウスと比較して、ｐＭＰＣ−ｎＡＯｘ処理マウスの血清ＡＯｘ濃度がはるかに高いことを示している。２コンパートメントモデルによるデータ分析（表３）により、ｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの消失半減期（ｔ１／２、α相＝２．１３４時間、ｔ１／２、β相＝８８．１１時間）が、天然ＡＯｘの消失半減期（ｔ１／２、α相＝０．６０７４時間、ｔ１／２、β相＝０．６０８７時間）及びｐＡＡｍ−ｎＡＯｘの消失半減期（ｔ１／２、α相＝０．４２９７時間、ｔ１／２、β相＝１３．８３時間）と比較して６倍高いことが明らかとなり、ｐＭＰＣ−ｎタンパク質の長期循環能を確認し、これはＳＰＥＣＴ／ＣＴ結果と一致する。さらに、ＰＫ研究では、ｐＭＰＣシェルがカプセル化したタンパク質の生物活性を保持することができることも裏付け、これは治療用タンパク質の送達に必須である。
【００４０】
（表３）天然ＡＯｘ及びナノカプセルの薬物動態パラメータ
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【００４１】
結論として、治療用タンパク質をｐＭＰＣでカプセル化することにより、治療用タンパク質の循環半減期を延長するという一般的かつ実用的な戦略を実証した。この戦略を用いると、循環半減期の延長及び免疫原性の抑制において現在のステルス性戦略よりも優れている、密で安定した非付着性ｐＭＰＣシェルでタンパク質をカプセル化することができる。多数の治療用タンパク質及び酵素が、それらの低バイオアベイラビリティ及び強力な免疫原性ゆえに臨床的に使用できないことを考慮すると、ｐＭＰＣ−カプセル化方法は、多くの疾患に対する臨床治療薬としてそれらの開発を促進させることができる単純明快な解決策を提供する。さらに、長期循環を特定の組織及び器官内における治療剤の蓄積を達成するための、ナノ担体の極めて重要な特性として証明したので、本明細書で提供されるｐＭＰＣ−カプセル化方法は、高度な標的送達戦略の設計におけるこの根本的な問題の対処に役立ち得る。
【００４２】
実施例８：方法
タンパク質吸着の定量化
異なる試料のタンパク質吸着量を以下の方法で決定した。ＥＧＦＰを上記の方法及びこれまでの報告により、それぞれｐＭＰＣ及びポリアクリルアミド（ｐＡＡｍ）でカプセル化した。１０μＬのＰＢＳ（対照）、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（１ｍｇ／ｍＬ）、ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（１ｍｇ／ｍＬ）、及び天然ＥＧＦＰ（１ｍｇ／ｍＬ）を３０μＬのマウス全血清と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を濾過して遠心濾過（分画分子量、ＭＷＣＯ＝１００ｋＤａ）を用いてＰＢＳで３回洗浄し、非吸収血清タンパク質を除去した。５０μＬのＰＢＳで再構成した後、全ての試料におけるＥＧＦＰ量を、４５０ｎｍの波長におけるそれらの吸光度をナノドロップで測定することにより決定した。吸着タンパク質量のより良い定量化のために、特定量の天然ＥＧＦＰを試料それぞれに添加して全試料中のＥＧＦＰ濃度を確実に同じにした。最後に、吸着したタンパク質量を、標準物としてＢＳＡを使用するＢＣＡアッセイを用いて各試料の総タンパク質濃度を測定することにより決定した。統計分析を一元配置ＡＮＯＶＡに続いてテューキーのポスト検定を使用して実施した。Ｐ＜０．０５またはそれ未満を有意と見なした。
【００４３】
細胞取り込み及び食作用研究
Ｔｆの受容体媒介エンドサイトーシス（ＲＭＥ）に関する研究を、蛍光標識した天然Ｔｆ及びｐＭＰＣ−ｎＴｆをＵ８７細胞とインキュベートすることにより達成し、次いで細胞蛍光強度を測定することにより取り込みを評価した。簡潔に述べると、Ｕ８７細胞を天然Ｔｆ及びｐＭＰＣ−ｎＴｆに曝露する１日前に５ｋ細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。３７℃で４時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳ（１倍）で３回すすぎ、過剰な試料及び培養培地を除去した。細胞の蛍光強度をプレートリーダー（富士フイルム製ＢＡＳ−５０００）を使用して読み取った。蛍光の測定後、細胞を細胞溶解緩衝液で溶解し、各ウェルの細胞における総タンパク質濃度を、標準物としてＢＳＡを使用するＢＣＡアッセイを用いて決定した。次いで、各ウェルの蛍光強度を対応するタンパク質濃度で正規化した。異なる表面を有するＥＧＦＰの細胞取り込みを同様の方法で達成し、これを補足情報で詳述している。全ての統計分析を一元配置ＡＮＯＶＡに続いてテューキーのポスト検定を使用して実施した。Ｐ＜０．０５またはそれ未満を有意と見なした。
【００４４】
モデル細胞としてＪ７７４Ａ．１マウスマクロファージを使用し、モデルタンパク質としてローダミンＢ（ＲｈＢ）標識天然ＯＶＡ／ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡを使用して食作用を研究した。マクロファージ細胞を標準的なプロトコール（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、３７℃、５％二酸化炭素）により培養し、食作用研究の２４時間前に９６ウェルプレートに播種した（５ｋ細胞／ウェル）。Ｊ７７４Ａ．１細胞は、補体受容体（Ｃ３Ｒ）を発現するので、オプソニン化の主な種類である補体活性化も、マクロファージ細胞に曝露する前に天然ＯＶＡ及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡを、それぞれ３７℃で３０分間マウス全血清（天然ＯＶＡ＋ＭＳ及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ＋ＭＳ）とインキュベートすることにより試験した。次いで、天然ＯＶＡ、天然ＯＶＡ＋ＭＳ、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ＋ＭＳをそれぞれ細胞培養物に添加し、１時間インキュベートした。良好な撮像のために、ヘキスト３３３４２を細胞の各ウェルに添加し、さらに２０分間インキュベートして細胞核を染色した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ（１倍）で３回すすぎ、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ製Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ）を使用して観察した。食作用のより良い定量化のために、本発明者らはまた、Ｊ７７４Ａ．１細胞を２４ウェルプレート中において３０ｋ細胞／ウェルの密度で培養し、次いでこれらの細胞を上記４種類のＯＶＡに基づく試料に曝露した。スクレーピングにより細胞を剥離した後、食作用レベルをフローサイトメトリー分析（ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析装置）で得た。全てのフローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。
【００４５】
薬物動態研究及びデータ分析
天然ＡＯｘ、ｐＡＡｍ−ｎＡＯｘ、及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを、静脈内投与後の血漿中における残存ＡＯｘ活性をモニターすることにより得た。簡潔に述べると、１２匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を３つの群に分けて、それぞれ１００μｇの天然ＡＯｘ、ｐＡＡｍ−ｎＡＯｘ、及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘ（１ｍｇ／ｍＬ）を尾静脈から注入した。陰性対照として、別の３匹のマウスに１００μＬのＰＢＳを注入した。次いで、血液試料（２０μＬ）を注入後１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、及び７２時間で尾部から採取した。次いで、血液試料を２０ｋｒｐｍで５分間遠心分離して血液細胞を除去し、血漿中のＡＯｘ活性を、ＡＯｘ酵素活性アッセイを使用して測定した。詳細な実験手順及びＡＯｘ活性測定値を補足情報で提供する。ＰＫデータ分析を、Ｙ０＜０．１の制約（最大ＡＯｘ濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬよりも高くできない）及びプラトー＝０．００５３５４（陰性対照からの平均バックグラウンド値）を用いた２相指数関数的減衰モデルを使用してデータをフィッティングすることにより達成した。
【００４６】
オボアルブミン（ＯＶＡ）及びトランスフェリン（Ｔｆ）の蛍光標識
撮像のために、２種類のタンパク質、すなわちＯＶＡ及びＴｆをローダミンＢ（ＲｈＢ）及び蛍光（ＦＩＴＣ）でそれぞれ蛍光標識した。これらのタンパク質の蛍光標識は、コンジュゲーション方法を使用して達成した。簡潔に述べると、最初にタンパク質を水で溶解し、炭酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．５）に対して透析し、通常ストックタンパク質粉末中に存在する硫酸アンモニウムを全て除去した。透析後、タンパク質を炭酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．５）で５ｍｇ／ｍｌまで希釈した。ローダミンＢイソチオシアネート（ＲｈＢ−ＴＩＣ）及び蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）をＤＭＳＯで溶解し、それぞれ１％（ｗ／ｖ）ストック溶液を作製した。次いで、ＲｈＢ−ＴＩＣ及びＦＩＴＣストック溶液をＯＶＡ及びＴｆ溶液に、それぞれ５：１（色素：タンパク質）のモル比で添加した。反応物を４℃で一晩置き、次いで炭酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．５）に対して透析し、非コンジュゲート色素を除去した。
【００４７】
タンパク質のアクリロキシ化
ｐＭＰＣポリマーナノカプセル中へのタンパク質の組み込みを可能にするために、最初にタンパク質をＮ−アクリロキシスクシンイミド（ＮＡＳ）とコンジュゲートし、アクリロイル基をそれらの表面上に取り付けた。コンジュゲーションの典型的な手順を以下の通りに記載する。最初にタンパク質（約１０ｍｇ／ｍＬ）を炭酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．５）に対して透析し、通常ストックタンパク質粉末中に存在する硫酸アンモニウムを全て除去した。透析後、タンパク質溶液を炭酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ８．５）で５ｍｇ／ｍＬまで希釈し、続いてＮＡＳ溶液（ＤＭＳＯ中１０％、ｍ／ｖ）を添加してコンジュゲーションを実施した。使用したＮＡＳの量は、２０：１のモル比（ＮＡＳ対タンパク質）であり、反応物を４℃で１時間置くことによりコンジュゲーションを達成する。次いで、溶液をｐＨ７．０のリン酸緩衝液（２０ｍＭ）に対して透析チューブ膜（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて完全に透析し、未反応のＮＡＳを全て除去した。アクリロイル化酵素溶液を４℃でさらなる使用のために保存した。
【００４８】
タンパク質上にコンジュゲートしたアクリロイル基の平均数を、タンパク質分子上の残留（未反応）リジンをフルオレスアミンアッセイで測定することにより決定した。簡潔に述べると、最初にフルオレスアミンを無水ＤＭＳＯ中に溶解し、３ｍｇ／ｍＬのストック溶液を作製した。天然タンパク質及びそのアクリロイル化対応物を、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を用いてそれぞれ１ｍｇ／ｍＬの溶液として調製した。次いで、天然及びアクリロイル化タンパク質を０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）で希釈し、濃度が０．００７８１、０．０１５６３、０．０３１２５、０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、及び１ｍｇ／ｍＬの一連の溶液を作製し；１００μＬの各溶液をそれぞれ不透明９６ウェルプレートにピペットで分注した。次いで、３０μＬのフルオレスアミン溶液を各ウェルに添加し；次いで、プレートを１時間室温（２５℃）でインキュベートした。インキュベーション後、蛍光強度（Ｅｘ＝３６０ｎｍ、Ｅｍ＝４６５ｎｍ）をプレートリーダーで読み取った。次いで、残留リジン数をアクリロイル化酵素と天然酵素の蛍光強度を比較することにより推定した。タンパク質上にコンジュゲートしたアクリロイル基の数を表４に列挙する。
【００４９】
（表４）タンパク質にコンジュゲートしたアクリロイル基の平均数
0006802157.tif 000005
【００５０】
ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ、ｐＭＰＣ−ｎＨＲＰ、ｐＭＰＣ−ｎＧＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＡＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＴｆ、及びｐＭＰＣ−ｎＢＳＡの合成
アクリロキシ化後、インサイチュー重合法を使用してタンパク質をｐＭＰＣでカプセル化した。重合のために、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）及びビス−メタクリルアミド（ＢＩＳ）を、それぞれＤＩ水及び無水ＤＭＳＯ中の１０％（ｗ／ｖ）ストック溶液として最初に調製した。次いで、ＭＰＣ及びＢＩＳを特定のモル比（表５に列挙した）でカプセル化するタンパク質の溶液に添加した。最終タンパク質濃度をリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で希釈することにより１ｍｇ／ｍＬに調整した。重合を過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）及びテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）の添加により開始し、室温で２時間置いた。重合後、溶液をＰＢＳに対して透析し、未反応モノマー及び副生成物を除去した。ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ、ｐＭＰＣ−ｎＨＲＰ、ｐＭＰＣ−ｎＧＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＡＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＴｆ、及びｐＭＰＣ−ｎＢＳＡの詳細な合成パラメータを表５に列挙した。
【００５１】
（表５）様々なｐＭＰＣタンパク質ナノカプセルの合成パラメータ
0006802157.tif 000006
＊全ての数値はモル比を示す。
【００５２】
正荷電ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（＋）の合成
正荷電ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（＋）の合成は、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰの合成と同様である。モノマーとしてＭＰＣのみを使用する代わりに、ＭＰＣとＮ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰｍ）との混合物を９：１のモル比でモノマーとして重合ステップで用いた。モノマー対ＥＧＦＰの最終モル比を３０００：１として維持した。ＥＧＦＰ濃度をリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で１．０ｍｇ／ｍＬに調整した後、ＡＰＳ／ＴＥＭＥＤ（１：２５０：５００、ＥＧＦＰ：ＡＰＳ：ＴＥＭＥＤ、ｎ／ｎ／ｎ）を使用して重合ステップを開始し、反応物を室温で２時間置いた。次いで、反応溶液をＰＢＳに対して透析し、反応副生成物を除去した。
【００５３】
ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ及びｐＡＡｍ−ｎＡＯｘの合成
ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ及びｐＡＡｍ−ｎＡＯｘを、本発明者らが以前に記載した方法を使用して調製する。本明細書では、アクリルアミド（ＡＡｍ）をモノマーとしてＥＧＦＰ及びＡＯｘのカプセル化に用いた。簡潔に述べると、アクリロキシル−ＥＧＦＰ及びアクリロキシル−ＡＯｘをＡＡｍ及びＢＩＳと、それぞれ特定の比（ＥＧＦＰ：ＡＡｍ：ＢＩＳ＝１：２０００：３００、ＡＯｘ：ＡＡｍ：ＢＩＳ＝１：５００００：７０００）で最初に混合した。タンパク質濃度をリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で１．０ｍｇ／ｍＬに調整した後、ＡＰＳ／ＴＥＭＥＤ（ＥＧＦＰ：ＡＰＳ：ＴＥＭＥＤ＝１：２５０：５００、ＡＯｘ：ＡＰＳ：ＴＥＭＥＤ＝１：４０００：８０００、ｎ／ｎ／ｎ）をそれぞれ使用して反応を開始し、反応物を室温で２時間置いた。次いで、反応溶液をＰＢＳに対して透析し、反応副生成物を除去した。
【００５４】
正荷電ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（＋）の合成
正荷電ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（＋）の調製をｐＡＡｍ−ｎＥＧＰＦの合成と同様の方法で達成した。ＡＡｍとＡＰｍとの混合物を９：１のモル比でモノマーとしてカプセル化に用いた。モノマーをＥＧＦＰと混合した後、ＥＧＦＰ及び２種類のモノマーの最終モル比は、１：１８００：２００（ＥＧＦＰ：ＡＡｍ：ＡＰｍ）である。タンパク質濃度をリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で１．０ｍｇ／ｍＬに調整した後、ＡＰＳ／ＴＥＭＥＤ（ＥＧＦＰ：ＡＰＳ：ＴＥＭＥＤ＝１：２５０：５００、ｎ／ｎ／ｎ）を使用して重合ステップを開始し、反応物を室温で２時間置いた。次いで、反応溶液をＰＢＳに対して透析し、反応副生成物を除去した。
【００５５】
タンパク質ナノカプセルの精製
透析後、タンパク質ナノカプセルを重力によりカラムを通過させて非カプセル化タンパク質を除去した。異なる物理的特性に基づいて、ｐＭＰＣに基づくタンパク質ナノカプセル及びｐＡＡｍに基づくタンパク質ナノカプセルを、それぞれ疎水性相互作用カラム（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ）及びサイズ排除カラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−６Ｂ）で精製した。ｐＭＰＣ−ｎタンパク質の精製のために、５ｍＬのＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂをガラスカラム内にピペットで分注することによりカラムを調製した。試料を負荷する前に、カラムを２．５Ｍの硫酸ナトリウムであらかじめ平衡化した。ｐＭＰＣ−タンパク質を硫酸ナトリウム粉末と最初に混合し、硫酸ナトリウムの最終濃度を２．５Ｍにした。次いで、試料をカラム上に負荷し、２．５Ｍの硫酸ナトリウム溶液で溶出した。ｐＭＰＣ−タンパク質粒子は超親水性表面（ｐＭＰＣ）を有するため、それらのカラムに対する結合親和性は、特に高塩濃度（２．５Ｍの硫酸ナトリウム）のような条件では、天然タンパク質よりもはるかに弱い。したがって、ｐＭＰＣカプセル化タンパク質は、２．５Ｍの硫酸ナトリウムで溶出するのに対して、天然タンパク質はカラム上に結合する。２．５Ｍの硫酸ナトリウムによる溶出液を収集し、遠心濾過を使用して濃縮した。次いで、試料をＰＢＳに対して透析し、硫酸ナトリウムを除去して４℃でさらなる研究のために保存した。
【００５６】
ｐＡＡｍ−ｎタンパク質の精製を、本発明者らが以前に記載した方法を使用して達成した。これは、試料を重力によりＳｅｐｈａｒｏｓｅ−６Ｂカラムを通過させることにより達成した。５ｍＬのＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ６Ｂビーズをガラスカラム内にピペットで分注することによりＳｅｐｈａｒｏｓｅカラムを調製した。次いで、カラムをＰＢＳであらかじめ平衡化した。平衡化後、試料をカラム内に負荷し、次いでＰＢＳで溶出した。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−６Ｂの分画範囲は１０，０００〜４，０００，０００Ｄａであるため、カプセル化されたタンパク質（ｐＡＡｍ−ｎタンパク質）は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズの孔を通り抜けるには大きすぎて、結果として、溶出中に最初に溶出する。溶出液を画分当たり１００μＬの体積で収集し、２８０ｎｍでの各画分の吸光度を、バックグラウンドとして溶出緩衝液（ＰＢＳ）を使用することによりＵＶ／Ｖｉｓメーターで測定した。カプセル化されたタンパク質の画分（最初のＡ２８０ピーク）を収集して組み合わせ、次いで遠心濾過を使用して濃縮した。タンパク質ナノ複合体溶液を４℃でさらなる研究のために保存した。
【００５７】
タンパク質濃度の測定
ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（＋）、ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ、ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（＋）、ｐＭＰＣ−ｎＨＲＰ、ｐＭＰＣ−ｎＧＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＡＯｘ、ｐＡＡｍ−ｎＡＯｘ、及びｐＭＰＣ−ｎＴｆを含む、タンパク質ナノカプセルのタンパク質濃度を、ＢＣＡマイクロアッセイを使用して測定した。試験前に、２種類のＢＣＡ試薬を、以下のレシピを使用して調製した。試薬Ａは、１０ｍＬのＤＩ水中に０．１ｇのビシンコニン酸二ナトリウム塩水和物（ＢＣＡ）、０．３２ｇの炭酸ナトリウム、０．０１ｇの酒石酸を溶解させて、続いてｐＨを１ＭのＮａＯＨ溶液で１１．２５に調整することにより調製した。試薬Ｂは、５ｍＬのＤＩ水中に０．２ｇの
0006802157.tif 000007
を溶解させることにより調製した。ＢＣＡワーキング溶液（ＢＷＳ）は、５０体積の試薬Ａ及び１体積の試薬Ｂを合わせて混合することにより調製した。
【００５８】
各タンパク質の標準曲線を、一連の濃度（０．００７８１２５、０．０１５６２５、０．０３１２５、０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、１ｍｇ／ｍＬ）を有する天然タンパク質を使用して確立した。これは、３８４ウェルプレート中においてＰＢＳでの１ｍｇ／ｍＬタンパク質溶液の２倍希釈を繰り返すことにより達成した。ＢＣＡアッセイは、異なる濃度を有する１０μＬの天然タンパク質溶液を、それぞれ３８４ウェルプレートの各ウェルに添加し、続いて１０μＬのＢＣＡワーキング溶液（ＢＷＳ）を添加することにより実施した。その間に、１０μＬのタンパク質ナノカプセル溶液も同じプレートに添加し、続いて１０μＬのＢＷＳを添加した。次いで、プレートを６５℃で１時間インキュベートした。５５０ｎｍでの各ウェルの吸光度を、プレートリーダーを使用することにより読み取った。カプセル化されたタンパク質の濃度を、５５０ｎｍでのその吸光度及び同じ条件で確立した標準曲線を使用することにより算出した。
【００５９】
タンパク質ナノカプセルのＴＥＭ及びＤＬＳ研究
ＴＥＭ試料を、炭素コーティングした銅グリッド上にそれぞれ２μＬのｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ溶液及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡをドロップコーティングすることにより調製した。試料の液滴をグリッドと４５秒間接触させて、次いで過剰量の試料をキムワイプで除去した。次いで、グリッドをすすぎ、ｐＨ７．０の１％リンタングステン酸ナトリウムで染色した。次いで、グリッドを再度すすぎ、続いて過剰な染色剤をキムワイプで除去した。グリッドを真空下で乾燥し、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｔ１２透過型電子顕微鏡で観察した。
【００６０】
ＤＬＳ測定値を、Ｍａｌｖｅｒｎ製Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ機器を用いて１７３’の散乱角で得た。ＤＬＳから得られた粒子サイズを図５Ａ〜図５Ｋにまとめた。
【００６１】
ｐＭＰＣ−ｎＨＲＰ、ｐＭＰＣ−ｎＧＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ、及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの活性アッセイ及び安定性
ｐＭＰＣ−ｎＨＲＰ及び天然ＨＲＰの活性を、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を基質として使用し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の酸化速度をモニターすることにより決定した。簡潔に述べると、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００６％、０．００８％（ｗ／ｖ）の濃度を有する一連のＨ２Ｏ２ストック溶液を、０．５ｍＭのＴＭＢを含む０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０１）で５０％Ｈ２Ｏ２（ｗ／ｖ）を希釈することにより調製した。１ｍＬの基質溶液を１μＬのｐＭＰＣ−ｎＨＲＰ（０．１ｍｇ／ｍＬ）または天然ＨＲＰと混合した後、６５５ｎｍでの反応溶液の吸光度（Ａ６５５）をＵＶ−Ｖｉｓ分光計で３分間モニターした。吸収曲線を時間に対してプロットし、曲線の直線部からΔＡ６５５／分を算出した。活性アッセイを一連の濃度の基質で繰り返して触媒速度を得て、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−ＢｕｒｋプロットによりＫＭａｐｐ及びｋｃａｔａｐｐを得た。
【００６２】
天然ＧＯｘ、ｐＭＰＣ−ｎＧＯｘ、天然ＡＯｘ、及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの活性を同様の方法で決定した。簡潔に述べると、反応初速度を、それぞれ異なる濃度の基質を含むアッセイ溶液とインキュベートした場合のＧＯｘ及びＡＯｘによるＴＭＢの酸化速度をモニターすることにより決定した。天然ＧＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＧＯｘについては、アッセイ溶液を、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でＴＭＢ（０．５ｍＭ）、天然ＨＲＰ（０．００１ｍｇ／ｍＬ）、及び異なる量のＤ−グルオコース（ｇｌｕｏｃｏｓｅ）（０．００５％、０．０１０％、０．０１５％、０．０２０％、０．０３０％、０．０４０％、ｗ／ｖ）を混合することにより調製した。天然ＡＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘについては、アッセイ溶液を、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中のＴＭＢ（０．５ｍＭ）、天然ＨＲＰ（０．００１ｍｇ／ｍＬ）、及び異なる量のエタノール（０．００２５％、０．００５％、０．００７５％、０．０１０％、０．０２０％、０．０３０％、ｗ／ｖ）により構成した。測定値は、１μＬの天然酵素またはｐＭＰＣ−ｎタンパク質（天然ＧＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＧＯｘについては０．５ｍｇ／ｍＬ、天然ＡＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘについては１ｍｇ／ｍＬ）とそれらの対応するアッセイ溶液とのインキュベーション中に反応溶液のＡ６５５をモニターすることにより得た。
【００６３】
天然ＵＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ活性を、１μＬの天然ＵＯｘまたはｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ（０．７１４ｍｇ／ｍＬ）と一連の尿酸溶液（ｐＨ＝８、０．１Ｍのホウ酸緩衝液、尿酸濃度：０．００５％、０．０１０％、０．０１５％、０．０２０％、０．０３０％、０．０４０％、ｗ／ｖ）とのインキュベーション中にＵＶ分光計でＡ２９０の低下をモニターすることにより決定した。初速度は、２９０ｎｍでの吸収を時間に対してプロットし、曲線の直線部（lｉｎｅａｒ  ｐｏｔｉｏｎ）からΔＡ２９０／分を算出することにより得た。
【００６４】
天然ＡＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの熱安定性を、以下の手順を使用して実施した：天然ＡＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの溶液（１ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を３７℃で一定時間（１〜９６時間）最初にインキュベートし、続いて氷浴でクエンチしてから室温に戻した。次いで、ＡＯｘ活性アッセイをこれらの試料で実施し、天然ＡＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの残存活性を決定した。
【００６５】
プロテアーゼに対する天然ＵＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＵＯＸの安定性を、以下のプロトコールを使用して実施した：天然ＵＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＵＯｘの溶液（０．７１４ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＣａ２＋）をトリプシンストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合し、最終トリプシン濃度を０．１ｍｇ／ｍＬにした。天然ＵＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ溶液の対照群は、ストック溶液をトリプシン溶液の体積と同じ体積のＰＢＳと混合することにより調製した。これらの４種類の溶液調製を氷浴中で実施して、トリプシンの活性化を回避した。調製後、４種類の溶液を３７℃で一定時間（２０〜１８０分）インキュベートし、続いて氷浴でクエンチした。次いで、ＵＯｘ活性アッセイをこれらの試料で実施し、天然ＵＯｘ及びｐＭＰＣ−ｎＵＯｘの残存活性を決定した。
【００６６】
細胞生存率アッセイ
ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ、ｐＭＰＣ−ｎＵＯｘ、及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘを含む、ｐＭＰＣ−ｎタンパク質の毒性を、Ｕ８７細胞と異なる量のｐＭＰＣ−ｎタンパク質（０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１０ｍｇ／ｍＬ、０．２０ｍｇ／ｍＬ）との２４時間のインキュベーション後に細胞生存率を測定することにより評価した。より良い比較のために、天然ＥＧＦＰ、ＯＶＡ、ＵＯｘ、及びＡＯｘの毒性も同じ方法で試験した。Ｕ８７細胞を９６ウェルプレート中に播種し（１０４細胞／ウェル、１００μＬ／ウェル）、試料に曝露する前にＤＭＥＭ（培地中のグルコースは通常レベルで、１０％ＦＢＳを含有する）中で１日培養した。ｐＭＰＣ−ｎタンパク質及びそれらの天然対応物をそれぞれ添加した後、細胞をさらに２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（２０μＬ）を各ウェルに添加し、さらに３時間インキュベートした。次いで、プレートを振盪台に載せて１５０ｒｐｍで５分間、溶液を完全に混合した。生細胞はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅを減少させて、赤みを帯びた蛍光色を示す。細胞生存率の定量化は、蛍光強度をプレートリーダーで測定することにより達成した（Ｅｘ＝５３５ｎｍ、Ｅｍ＝５８５ｎｍ）。未処理細胞の生存率を１００％としてデータ分析中に使用した。
【００６７】
異なる表面を有するＥＧＦＰタンパク質ナノ粒子の細胞取り込み
タンパク質ナノカプセルの、それらの細胞内在化における表面特性の効果を評価するために、本発明者らはＥＧＦＰをｐＡＡｍ及びｐＭＰＣでカプセル化し、それぞれｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（ゼータ電位ζ＝−３．３８ｍＶ）及びｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（ゼータ電位ζ＝−０．２２２ｍＶ）を得て、重合中にＡＰｍを導入することにより、正荷電ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（＋）（ゼータ電位ζ＝＋１．２７ｍＶ）及びｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（＋）（ゼータ電位ζ＝＋１．０８ｍＶ）も調製した。研究は、Ｕ８７細胞をこれらのＥＧＦＰナノカプセルとインキュベートすることにより達成した。Ｕ８７細胞を９６ウェルプレート中に播種し（１０４細胞／ウェル、１００μＬ／ウェル）、試料に曝露する前にＤＭＥＭ（培地中のグルコースは通常レベルで、１０％ＦＢＳを含有する）中で１日培養した。次いで、ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ、ｐＡＡｍ−ｎＥＧＦＰ（＋）、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ、及びｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ（＋）を含む、ＥＧＦＰナノカプセルを細胞に添加して（１０μｇ／ウェル）、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ（１倍）で３回すすぎ、過剰な試料及び培養培地を除去した。細胞の蛍光強度をプレートリーダー（富士フイルム製ＢＡＳ−５０００）を使用して読み取った。蛍光の測定後、細胞を細胞溶解緩衝液で溶解し、各ウェルの細胞における総タンパク質濃度を、標準物としてＢＳＡを使用するＢＣＡアッセイを用いて決定した。次いで、各ウェルの蛍光強度を対応するタンパク質濃度で正規化した。全ての統計分析を一元配置ＡＮＯＶＡに続いてテューキーのポスト検定を使用して実施した。Ｐ＜０．０５またはそれ未満を有意と見なした。
【００６８】
ヒト血液末梢細胞（ＰＢＭＣ）によるｐＭＰＣ−ｎＯＶＡの貪食
天然ＯＶＡ及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡを、観察及び定量化のためにローダミンＢで最初に標識した。識別情報のないヒトＰＢＭＣを、ＵＣＬＡ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＦＡＲ）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙからＵＣＬＡ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）承認のプロトコールに従って、ＩＲＢ承認の書面による同意書と共に入手した。３人のドナーからのＰＢＭＣをｌｅｕｋｏｐａｃｋからＦｉｃｏｌｌにより導入の４８時間前に単離した。細胞の半分をＲＰＭＩ培地、２０％ＦＢＳ、１％ＧＰＳ（Ｌ−グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン）中で培養して静止状態を２日間維持したのに対して、他方の半分は、ＲＰＭＩ培地、２０％ＦＢＳ、１％ＧＰＳ中で２０単位／ｍｌのＩＬ−２及び２５μｇ／ｍＬのＰＨＡで２日間刺激した。ＰＢＭＣを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地中１ウェル当たり細胞１×１０５個の密度で４８ウェルプレートに播種した。ＰＢＭＣにＰＢＳ、天然ＯＶＡ、及びｐＭＰＣ−ｎＯＶＡをそれぞれ４時間導入した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で２回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ホルムアルデヒドで固定した。蛍光強度をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で検査した。データをＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）ソフトウェアにより分析した。生細胞ゲートでは、リンパ球集団をＦＳＣ−Ａ対ＦＳＣ−Ｈプロット及びＦＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ａプロットに基づいて分離した。蛍光分析をリンパ球集団内で実施した。ローダミンＢ陽性ゲート（ＲｈＢ＋）をＰＢＳ処理対照試料に基づいて設定した。
【００６９】
マウスにおけるｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの薬物動態研究
天然ＡＯｘ、ｐＡＡｍ−ｎＡＯｘ、及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを、静脈内投与後の血漿中の残存ＡＯｘ活性をモニターすることにより得た。簡潔に述べると、１２匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）を３つの群に分けて、それぞれ１００μｇの天然ＡＯｘ、ｐＡＡｍ−ｎＡＯｘ、及びｐＭＰＣ−ｎＡＯｘ（１ｍｇ／ｍＬ）を尾静脈から注入した。陰性対照として、別の３匹のマウスに１００μＬのＰＢＳを注入した。次いで、血液試料（２０μＬ）を注入後１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、及び７２時間で尾部から採取した。次いで、血液試料を２０ｋｒｐｍで５分間遠心分離して血液細胞を除去し、血漿中のＡＯｘ活性を、ＡＯｘ酵素活性アッセイを使用して測定した。残存ＡＯｘ活性を、１μＬの血漿と１００μＬのアッセイ溶液（０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ＝７．０中の１％ＥｔＯＨ、０．０２ｍｇ／ｍＬのＨＲＰ、及び０．５ｍＭのＴＭＢ）とをインキュベートし、６２０ｎｍでの吸光度変化をプレートリーダーでモニターすることにより決定した。次いで、異なる濃度（０．４６８８μｇ／ｍＬ、０．９３７５μｇ／ｍＬ、１．８７５μｇ／ｍＬ、３．７５μｇ／ｍＬ、７．５μｇ／ｍＬ、１５μｇ／ｍＬ及び３０μｇ／ｍＬ）を有する一連の天然ＡＯｘストック溶液を調製し、これらを使用して反応速度とＡＯｘ濃度との間の関連性を確立した。
【００７０】
ＰＫデータ分析を、Ｙ０＜０．１の制約（最大ＡＯｘ濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬよりも高くできない）及びプラトー＝０．００５３５４（陰性対照からの平均バックグラウンド値）を用いた２相指数関数的減衰モデルを使用してデータをフィッティングすることにより達成した。全てのデータ分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して達成した。
【００７１】
マウスにおけるｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ、ｐＭＰＣ−ｎＢＳＡ、ｐＡＡｍ−ｎＢＳＡ、及びｐＡＡｍ−ｎＢＳＡ（＋）の生体内分布
マウスにおけるｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ、ｐＭＰＣ−ｎＢＳＡ、ｐＡＡｍ−ｎＢＳＡ、及びｐＡＡｍ−ｎＢＳＡ（＋）の生体内分布を、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）／Ｘ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ）撮像方法を使用して得た。注入後に試料の追跡を可能にするために、ｐＭＰＣ−ｎＥＧＦＰ、ｐＭＰＣ−ｎＢＳＡ、ｐＡＡｍ−ｎＢＳＡ、及びｐＡＡｍ−ｎＢＳＡ（＋）を、注入前にヨードゲン（ｉｏｄｏｇｅｎ）法を使用して１２５Ｉで放射性標識した。次いで、試料をマウス（ＫＭ）に尾静脈から動物１匹当たりそれぞれ１００μＬ（約０．１ｍｇタンパク質）の投与量で注入した。次いで、動物を投与後３時間、２４時間、７２時間、１２０時間、及び１６８時間で影像した。撮像のために、最初に動物を１００μＬのペントバルビタールナトリウム（２．５％）の腹腔内注射により麻酔し、次いでＣＴ（平均で約７分）、続いてＳＰＥＣＴ走査（平均で約２４分）により撮像した。ＣＴ及びＳＰＥＣＴ走査で使用した詳細なパラメータを以下の通りに記載した。ＣＴ：フレーム解像度、２５６×５１２；管ボテージ（ｖｏｔａｇｅ）、４５ｋＶｐ；電流、０．１５ｍＡ；露光時間、５００ｍｓ／フレーム。収集画像のリアルタイム３Ｄ再構成を、Ｎｕｃｌｉｎｅソフトウェア（ｖ１．０２、Ｍｅｄｉｓｏ、ハンガリー）を使用して実施した。ＳＰＥＣＴ：高解像度のための、９つのピンホールプレートを備えた円錐コリメータ；エネルギーピーク、２８ｋｅＶ；ウィンドウ幅、１０％；解像度、１ｍｍ／ピクセル；マトリックス、２５６×２５６；投影、２４；走査時間、６０秒／投影。サブセット化による期待値最大化３次元画像を、ＨｉＳＰＥＣＴ（Ｂｉｏｓｃａｎ、米国）を使用して再構成した。再構成アルゴリズムには４つのサブセット及び６次反復法を含み、解像度は０．４ｍｍ／ピクセルであった。
【００７２】
マウスにおけるｐＭＰＣ−ｎＯＶＡの免疫原性研究
ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡの免疫原性を、ｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ注入後のマウスにおけるＩｇＧ、ＩｇＥ、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ（ＯＶＡ−ｓＩｇＧ）、及びＯＶＡ特異的ＩｇＥ（ＯＶＡ−ｓＩｇＥ）の血清濃度を測定することにより得た。簡潔に述べると、３つのマウス群（ＢＡＬＢ／Ｃ、１群当たり５匹の動物）にＰＢＳ（ブランク対照）、１００μｇの天然ＯＶＡ（陽性対照）、及び１００μｇのｐＭＰＣ−ｎＯＶＡ（重量は、ＯＶＡタンパク質の重量を示す）をそれぞれ尾静脈から投与した。次いで、血液試料を各動物から注入後１５日目に採取した。次いで、血液試料を遠心分離して血液細胞を除去し、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＯＶＡ−ｓＩｇＥ、ＯＶＡ−ｓＩｇＧの濃度をＥＬＩＳＡアッセイで決定した。
【００７３】
結論
これは、本発明の好ましい実施形態の記載を結論付ける。本発明の１つ以上の実施形態に関する前述の記載は、例示及び説明の目的で提示されている。網羅的であること、または本発明を開示される正確な形態に制限することを意図するものではない。上記の教示に照らして、多くの修正及び変更が可能である。
【００７４】
本明細書で引用された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のためにその内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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