(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチドであって、融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含み、前記少なくとも１つのエピトープが、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５５の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６３の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６４の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体、ならびに／または配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５９の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６８の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体により認識され、前記ポリペプチドが、Ｆ１ドメインおよびＦ２ドメインを含み、かつ前記ポリペプチドが、野生型Ｆ１およびＦ２ドメインに比較して、
（ａ）位置１６１のアミノ酸残基ＥのＰへの突然変異（Ｅ１６１Ｐ）；
（ｂ）位置１８２のアミノ酸残基ＳのＰへの突然変異（Ｓ１８２Ｐ）；
（ｃ）位置１７３のアミノ酸残基ＳのＰへの突然変異（Ｓ１７３Ｐ）；
および
（ｄ）位置４８７のアミノ酸残基ＥのＣへの突然変異（Ｅ４８７Ｃ）と組み合わせた位置４８６のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８６Ｃ）
からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含み、前記アミノ酸位置は、Ａ２株由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質の配列（配列番号１）を参照して付与されるものである、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが三量体である、請求項１に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、位置６７のアミノ酸残基の突然変異および／または位置２１５のアミノ酸残基の突然変異をさらに含む、請求項１又は２に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、位置６７のアミノ酸残基ＮまたはＴの突然変異および／または位置２１５のアミノ酸残基Ｓの突然変異を含む、請求項３に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、前記Ｆ１ドメインとＦ２ドメインを連結する、１〜１０アミノ酸を含む連結配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、短縮されたＦ１ドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、前記短縮されたＦ１ドメインに連結された異種三量体形成ドメインを含む、請求項６に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項８】
前記異種三量体形成ドメインが、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号４）を含む、請求項７に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項９】
前記三量体形成ドメインが、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸残基５１３に連結している、請求項８に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｆ１ドメインおよび／または前記Ｆ２ドメインがＲＳＶ  Ａ株由来である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｆ１ドメインおよび／または前記Ｆ２ドメインがＲＳＶ  Ｂ株由来である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、配列番号９０〜配列番号９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１４】
前記核酸分子が、哺乳動物細胞における発現用にコドン最適化されている、請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、請求項１３もしくは請求項１４に記載の核酸分子、および／または請求項１５に記載のベクターを含む組成物。
【請求項１７】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、請求項１３もしくは請求項１４に記載の核酸分子、または請求項１５に記載のベクター。
【請求項１８】
ワクチンとして使用するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、請求項１３もしくは請求項１４に記載の核酸分子、または請求項１５に記載のベクター。
【請求項１９】
ＲＳＶ感染の予防および／または処置に使用するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、請求項１３もしくは請求項１４に記載の核酸分子、または請求項１５に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学の分野に関する。本発明は、具体的には、組換え融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、および例えば免疫原性組成物におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属のエンベロープ非分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。世界中で、毎年６４００万件のＲＳウイルス感染が発生し、その結果１６０，０００人が死亡していると推定されている（ＷＨＯ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｕｐｄａｔｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００９）。最も重篤な疾患が生じるのは、特に未熟児、高齢および免疫無防備状態の個体である。２歳未満の小児では、ＲＳＶが最も一般的な呼吸器系病原体であり、呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピークは２〜４ヶ月齢で生じる。ほとんどすべての小児が２歳までにＲＳＶに感染したことが報告されている。生涯にわたり繰り返し感染することは、自然免疫が効果をもたないことに起因する。高齢者における、ＲＳＶ疾患の負担、死亡率、および罹患率のレベルは、非パンデミックなインフルエンザＡ型感染症を原因とするものにまさに次ぐものである。
【０００３】
宿主細胞に感染するために、ＲＳＶは、インフルエンザウイルスおよびＨＩＶなどの他のエンベロープウイルスのように、宿主細胞膜とウイルス膜の融合を必要とする。ＲＳＶの場合、保存的な融合タンパク質（ＲＳＶ  Ｆタンパク質）が、ウイルスと宿主細胞の細胞性膜を融合させる。パラミクソウイルス研究に基づく現行のモデルでは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、最初に、「融合前」コンフォメーションにフォールディングする。細胞侵入中に、融合前コンフォメーションは、リフォールディングし、その「融合後」コンフォメーションにコンフォメーション変化する。準安定な構造が、安定化する中和抗体Ｆａｂフラグメントとの複合体で最近解明された（ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０（６１３６）：１１１３−７，２０１３）。細胞侵入中に、融合前コンフォメーションは、リフォールディングし、その「融合後」コンフォメーションにコンフォメーション変化する（ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ８５（１５）：７７８８−９６，２０１０；Ｓｗａｎｓｏｎ，ＰＮＡＳ  １０８（２３）：９６１９−２４，２０１１）。したがって、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、準安定な形態（融合前コンフォメーション）に最初フォールディングすることにより、不可逆的なタンパク質リフォールディングと膜並置を連結することによる膜融合を駆動する準安定なタンパク質であり、これは、その後、よりエネルギーの低いコンフォメーションへの個別的／段階的なコンフォメーション変化を起こす。
【０００４】
これらの観察から、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質と融合後ＲＳＶ  Ｆタンパク質は抗原性が異なることが示唆される（Ｃａｌｄｅｒ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７１，１２２−１３１（２０００））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＲＳＶ感染に対するワクチンは、現在入手可能ではないが所望されている。ＲＳＶ  Ｆタンパク質に基づくワクチン候補は、例えば安定性、純度、再現性、および効力に関する問題のために失敗している。上記に指摘するように、結晶構造から、融合前状態と融合後状態との間に大きな構造変化があることが明らかになっている。再配列の規模から、ＲＳＶ−Ｆの融合後コンフォメーションに対する抗体の一部しか、ウイルス表面上の融合前スパイクの天然コンフォメーションと交差反応できないことが示唆された。したがって、ＲＳＶに対するワクチンを作製する努力が、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前形態を含有するワクチンの開発に集中的に向けられた（例えば、国際公開第２０１０１１４９７４５号パンフレット、国際公開第２０１０／１１４９７４３号パンフレット、国際公開第２００９／１０７９７９６号パンフレット、国際公開第２０１２／１５８６１３号パンフレットを参照のこと）。しかしながら、これらの努力によっても、ヒトで試験するための候補として使用することができる安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを得るには至っていない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、安定な組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチド、すなわち融合前コンフォメーションで安定化する組換えＲＳＶ  Ｆポリペプチドを提供する。本発明のＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合前コンフォメーションのＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む。特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは可溶性である。本発明はまた、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子およびそのような核酸分子を含むベクターを提供する。
【０００７】
本発明はまた、ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターを含む組成物、好ましくは免疫原性組成物、ならびにＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を誘導する際のその使用、具体的にはワクチンとしてのその使用に関する。本発明はまた、被験体に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）免疫応答を誘導するための方法であって、有効量の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを被験体に投与することを含む方法に関する。好ましくは、誘導された免疫応答は、ＲＳＶに対する中和抗体および／またはＲＳＶに対する防御免疫を特徴とする。特定の態様では、本発明は、被験体に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質中和抗体を誘導するための方法であって、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、前記ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを含む有効量の免疫原性組成物を被験体に投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＲＳＶ融合前ＤＭ＝二重突然変異体（Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＝配列番号２１）およびＤＭ＋ＣＣ＝二重突然変異体＋ＤＥ４８６ＣＣ＝配列番号９４）に関する還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図２】レーン２：ＤＭ＝二重突然変異体（Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＝配列番号２１）およびレーン１：ＤＭ＋ＣＣ＝二重突然変異体＋ＤＥ４８６ＣＣ＝配列番号９４）からの上清のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図３−１】図３Ａは、イオン交換カラムからの溶出液ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｅ１６１Ｐ  Ｓ２１５Ｐ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号９１）のセファデックス２００ゲル濾過クロマトグラムを示す図である。図３Ｂは、ＳＥＣクロマトグラムからの融合前Ｆタンパク質含有ピークの還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図３−２】図３Ｃは、精製ＲＳＶ融合前Ｆ二重突然変異体（配列番号２１、レーン１）に比較した、精製ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質（配列番号９１、レーン２）のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図４】表１４に記載の免疫原および用量による、０週目および４週目の初回免疫−追加免疫後の６週目におけるマウスのＶＮＡ力価を示す図である。
【図５】表１５に記載の免疫原および用量による、０週目および４週目の初回免疫−追加免疫後の７週目におけるコットンラットのＶＮＡ力価を示す図である。
【図６】ｉ．ｎ．ＲＳＶチャレンジ後５日目の肺および鼻のウイルス負荷を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆ）は、感染に必要とされる、宿主細胞膜とウイルス膜の融合に関与する。ＲＳＶ  Ｆ  ｍＲＮＡは、小胞体においてシグナルペプチターゼにより除去されるシグナルペプチド配列（例えば、配列番号１のアミノ酸残基１〜２６）をＮ末端に含有するＦ０と称される５７４アミノ酸の前駆体タンパク質に翻訳される。Ｆ０は、細胞プロテアーゼ（具体的にはフューリン、またはフューリン様）により２つの部位（アミノ酸残基１０９／１１０間および１３６／１３７間）で切断され、アミノ酸残基１１０〜１３６を含む短いグリコシル化介在配列（ｐ２７領域とも呼ばれる）が除去され、Ｆ１およびＦ２と称される２つのドメインまたはサブユニットが生成する。Ｆ１ドメイン（アミノ酸残基１３７〜５７４）は、そのＮ末端に疎水性融合ペプチドを含有し、Ｃ末端に膜貫通（ＴＭ）（アミノ酸残基５３０〜５５０）領域および細胞質領域（アミノ酸残基５５１〜５７４）を含有する。Ｆ２ドメイン（アミノ酸残基２７〜１０９）は、２つのジスルフィド架橋によりＦ１に共有結合する。Ｆ１−Ｆ２ヘテロ二量体は、ビリオン中でホモ三量体として集合している。
【００１０】
ＲＳＶ感染に対するワクチンは、現在入手可能ではないが所望されている。ワクチン作製に有望な１つのアプローチは、精製されたＲＳＶ  Ｆタンパク質に基づくサブユニットワクチンである。しかしながら、このアプローチの場合、精製されたＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前状態のコンフォメーションに類似したコンフォメーションにあって、経時的に安定でかつ十分な量で作製できることが望ましい。加えて、サブユニットベースのワクチンの場合、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を、膜貫通（ＴＭ）領域および細胞質領域の欠失により短縮して、可溶性分泌型Ｆタンパク質（ｓＦ）を生成させる必要がある。ＴＭ領域は膜アンカリングおよび三量体形成を担うので、アンカーなしの可溶性Ｆタンパク質は、完全長タンパク質よりもかなり不安定であり、融合後最終状態に容易にリフォールディングすることになる。したがって、高い発現レベルおよび高い安定性を示す安定な融合前コンフォメーションの可溶性Ｆタンパク質を得るために、融合前コンフォメーションを安定化する必要がある。
【００１１】
融合前コンフォメーションにある別のパラミクソウイルスＦタンパク質の安定化が、パラインフルエンザ５型（ＰＩＶ５）について成功している。例えば、Ｙｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：３８−４４（２００６））は、Ｆ１およびＦ２へのプロセシングを遮断する、Ｆ０におけるフューリン切断部位の突然変異により、ＰＩＶ−５  Ｆタンパク質の融合前構造を安定化した。さらに、膜貫通（ＴＭ）および細胞質のドメインは、周知のヘリックス三量体形成ドメイン：ＧＣＮ４ｐＩＩに置き換えられた。このドメインは、三量体ヘリックスコイルドコイル構造を形成し、天然の二量体ヘリックスコイルドコイルペプチドＧＣＮ４を改変したものである（Ｏ’Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：５３８−５４２（１９８９））。ＧＣＮ４ロイシンジッパーのアミノ酸配列が７つ組のａ位置およびｄ位置ごとにイソロイシン残基で置換されたＧＣＮ４−ｐＩＩペプチドが、三本鎖平行α−ヘリックスコイルドコイルを形成することが示された（Ｈａｒｂｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１４０１−１４０７（１９９３））。
【００１２】
融合前コンフォメーションにおけるＲＳＶ  Ｆの安定化のために、同じ戦略、すなわち、フューリン切断部位の突然変異、およびＧＣＮ４ｐＩＩ三量体形成ドメイン（例えば、国際公開第２０１０／１４９７４３号パンフレット、国際公開第２０１０／１４９７４５号パンフレット、国際公開第２００９／０７９７９６号パンフレット、国際公開第２０１２／１５８６１３号パンフレットの開示のように）またはフィブリチン三量体形成ドメイン（ＭＣＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７：２−２４８−２５０（２０１０）；ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０（６１３６）：１１１３−７（２０１３））へのＲＳＶ−Ｆ外部ドメインの融合が試された。このフィブリチンドメインまたは「フォルドン」は、Ｔ４フィブリチンに由来し、人工的な天然三量体形成ドメインとして以前記載された（Ｌｅｔａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍｏｓｃｏｗ  ６４：８１７−８２３（１９９３）；Ｓ−Ｇｕｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３７：９０５−９１５．（２００４））。しかしながら、これらの努力によって、安定な融合前ＲＳＶＦタンパク質は得られてはいない。さらに、これらの努力によって、ヒトで試験するのに適した候補を得るに至っていない。
【００１３】
さて、本発明は、安定な組換え融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、すなわち融合前コンフォメーションに安定化されたＲＳＶ  Ｆポリペプチドを提供する。本発明に導いた研究では、前記安定な可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを得るために、いくつかの改変ステップの導入および／または組合せが行われた。本発明の安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合前コンフォメーションで存在する、すなわち、それらは、融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む（示す）。融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的なエピトープは、融合後コンフォメーションでは現れないエピトープである。いかなる特定の理論にも拘束されたくはないが、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションは、天然ＲＳＶビリオン上で発現されるＲＳＶ  Ｆタンパク質のものと同じエピトープを含有することができ、したがって、予防的中和抗体を誘発する利点を備えることができると考えられる。
【００１４】
本発明のポリペプチドは、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５５の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６３の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６４の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（これ以降ＣＲ９５０１と呼ばれる）、ならびに／または配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５９の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６８の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（ＣＲ９５０２と呼ばれる）により認識される少なくとも１つのエピトープを含む。ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０２はそれぞれ、抗体５８Ｃ５および３０Ｄ８の重鎖および軽鎖可変領域を含み、したがってそれらの抗体の結合特異性を有するが、それらの抗体は、融合後コンフォメーションではなく融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合することが以前に示されている（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレットを参照のこと）。
【００１５】
特定の実施形態では、組換え融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、上記の少なくとも１つの融合前特異的モノクローナル抗体により認識される少なくとも１つのエピトープを含み、かつ三量体である。
【００１６】
本発明による安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、Ｆ１ドメインおよびＦ２ドメインを含み、野生型Ｆ１およびＦ２ドメインに比較すると、
（ａ）位置１６１のアミノ酸残基の突然変異；
（ｂ）位置１８２のアミノ酸残基の突然変異；
（ｃ）位置１７３のアミノ酸残基の突然変異；および
（ｄ）位置４８９のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８９Ｃ）または位置４８７のアミノ酸残基ＥのＣへの突然変異（Ｅ４８７Ｃ）と組み合わせた位置４８６のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８６Ｃ）
からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【００１７】
特定の実施形態では、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、Ｆ１ドメインおよびＦ２ドメインを含み、
（ａ）位置１６１のアミノ酸残基ＥのＰ、Ｑ、またはＧへの突然変異（Ｅ１６１Ｐ、Ｅ１６１Ｑ）またはＥ１６１Ｇ）；
（ｂ）位置１８２のアミノ酸残基ＳのＰへの突然変異（Ｓ１８２Ｐ）；
（ｃ）位置１７３のアミノ酸残基Ｓ、Ｔ、またはＮのＰへの突然変異（Ｓ１７３Ｐ）；および
（ｄ）位置４８９のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８９Ｃ）または位置４８７のアミノ酸残基ＥのＣへの突然変異（Ｅ４８７Ｃ）と組み合わせた位置４８６のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８６Ｃ）
からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【００１８】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドはさらに、位置６７のアミノ酸残基の突然変異および／または位置２１５のアミノ酸残基の突然変異を含む。
【００１９】
特定の実施形態では、したがって、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、Ｆ１ドメインおよびＦ２ドメインを含み、位置６７のアミノ酸残基の突然変異および／または位置２１５のアミノ酸残基の突然変異、ならびに
（ａ）位置１６１のアミノ酸残基の突然変異；
（ｂ）位置１８２のアミノ酸残基の突然変異；
（ｃ）位置１７３のアミノ酸残基の突然変異；および
（ｄ）位置４８９のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８９Ｃ）または位置４８７のアミノ酸残基ＥのＣへの突然変異（Ｅ４８７Ｃ）と組み合わせた位置４８６のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８６Ｃ）
からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。
【００２０】
特定の実施形態では、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、Ｆ１ドメインおよびＦ２ドメインを含み、位置６７のアミノ酸残基ＮまたはＴの突然変異および／または位置２１５のアミノ酸残基Ｓの突然変異を含み、さらに、
（ａ）位置１６１のアミノ酸残基ＥのＰ、Ｑ、またはＧへの突然変異（Ｅ１６１Ｐ、Ｅ１６１Ｑ）またはＥ１６１Ｇ）；
（ｂ）位置１８２のアミノ酸残基ＳのＰへの突然変異（Ｓ１８２Ｐ）；
（ｃ）位置１７３のアミノ酸残基Ｓ、Ｔ、またはＮのＰへの突然変異（Ｓ１７３Ｐ）；および
（ｄ）位置４８９のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８９Ｃ）または位置４８７のアミノ酸残基ＥのＣへの突然変異（Ｅ４８７Ｃ）と組み合わせた位置４８６のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８６Ｃ）
からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。
【００２１】
特定の実施形態では、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、Ｆ１ドメインとＦ２ドメインを連結する、１〜１０アミノ酸残基を含む連結配列を含む。
【００２２】
特定の実施形態では、したがって、本発明による安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、Ｆ１ドメインおよびＦ２ドメイン、ならびに前記Ｆ１ドメインを前記Ｆ２ドメインに連結する、１〜１０アミノ酸残基を含む連結配列を含み、
（ａ）位置１６１のアミノ酸残基ＥのＰ、Ｑ、またはＧへの突然変異（Ｅ１６１Ｐ、Ｅ１６１Ｑ）またはＥ１６１Ｇ）；
（ｂ）位置１８２のアミノ酸残基ＳのＰへの突然変異（Ｓ１８２Ｐ）；
（ｃ）位置１７３のアミノ酸残基Ｓ、Ｔ、またはＮのＰへの突然変異（Ｓ１７３Ｐ）、および
（ｄ）位置４８９のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８９Ｃ）または位置４８７のアミノ酸残基ＥのＣへの突然変異（Ｅ４８７Ｃ）と組み合わせた位置４８６のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８６Ｃ）
からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む。
【００２３】
特定の実施形態では、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドはさらに、位置６７のアミノ酸残基ＮまたはＴの突然変異および／または位置２１５のアミノ酸残基Ｓの突然変異を含む。特定の実施形態では、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドはさらに、位置６７のアミノ酸残基ＮまたはＴのＩへの突然変異（Ｎ／Ｔ６７Ｉ）および／または位置２１５のアミノ酸残基ＳのＰへの突然変異（Ｓ２１５Ｐ）を含む。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、短縮されたＦ１ドメインを含む。
【００２５】
特定の実施形態では、したがって、本発明による安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、短縮されたＦ１ドメインおよびＦ２ドメイン、ならびに場合によっては、前記短縮されたＦ１ドメインを前記Ｆ２ドメインに連結する、１〜１０アミノ酸残基を含む連結配列を含み、
（ａ）位置１６１のアミノ酸残基ＥのＰ、Ｑ、またはＧへの突然変異（Ｅ１６１Ｐ、Ｅ１６１Ｑ）またはＥ１６１Ｇ）；
（ｂ）位置１８２のアミノ酸残基ＳのＰへの突然変異（Ｓ１８２Ｐ）；
（ｃ）位置１７３のアミノ酸残基Ｓ、Ｔ、またはＮのＰへの突然変異（Ｓ１７３Ｐ）；および
（ｄ）位置４８９のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８９Ｃ）または位置４８７のアミノ酸残基ＥのＣへの突然変異（Ｅ４８７Ｃ）と組み合わせた位置４８６のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８６Ｃ）
からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。
【００２６】
特定の実施形態では、このポリペプチドはさらに、位置６７のアミノ酸残基ＮまたはＴの突然変異および／または位置２１５のアミノ酸残基Ｓの突然変異を含む。特定の実施形態では、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドはさらに、位置６７のアミノ酸残基ＮまたはＴのＩへの突然変異（Ｎ／Ｔ６７Ｉ）および／または位置２１５のアミノ酸残基ＳのＰへの突然変異（Ｓ２１５Ｐ）を含む。
【００２７】
したがって、本発明によれば、本発明のポリペプチドは、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質のＲＳＶ  Ｆ１および／またはＦ２ドメインに対して、Ｆ１および／またはＦ２ドメインに少なくとも１つの安定化突然変異を含む。ＲＳＶは２つの抗原性サブグループ：ＡおよびＢを有する単一血清型として存在することが知られている。２つのグループのプロセシングされた成熟Ｆタンパク質のアミノ酸配列は約９３％同一である。本出願の全体にわたって使用されるように、アミノ酸位置は、Ａ２株由来のＲＳＶ  Ｆタンパク質の配列（配列番号１）を参照して付与される。したがって、本発明で使用される場合、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質の位置「ｘ」のアミノ酸」という表現は、配列番号１からなるＲＳＶ  Ａ２株のＲＳＶ  Ｆタンパク質の位置「ｘ」にあるアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。本出願の全体にわたって使用される番号方式では、１は未成熟Ｆ０タンパク質（配列番号１）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意されたい。Ａ２株以外のＲＳＶ株が使用される場合、Ｆタンパク質のアミノ酸位置は、配列番号１のＦタンパク質と他のＲＳＶ株の配列を、必要に応じてギャップを挿入しながらアライメントすることによって、配列番号１からなるＡ２株のＦタンパク質の番号付けに関連して番号が付与されることになる。配列アライメントは、当技術分野で周知の方法、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｂｉｏｅｄｉｔ、またはＣＬＣ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈを使用して行うことができる。
【００２８】
本発明によるアミノ酸は、２０種の天然アミノ酸（もしくは「標準」アミノ酸）または例えばＤ−アミノ酸（キラル中心を有するアミノ酸のＤ−エナンチオマー）などそれらの変異体のいずれであってもよく、あるいは例えばノルロイシンなどタンパク質中に天然には見出されない、いずれの変異体であってもよい。標準アミノ酸は、それらの特性に基づいて、いくつかのグループに分類することができる。重要な因子としては、電荷、親水性または疎水性、サイズ、および官能基がある。これらの特性は、タンパク質構造およびタンパク質間相互作用にとって重要である。アミノ酸の中には、他のシステイン残基とジスルフィド共有結合（またはジスルフィド架橋）を形成することができるシステイン、ポリペプチド骨格のターンを誘導するプロリン、および他のアミノ酸よりもフレキシブルなグリシンなど、特別な特性を有するものがある。表１７に、標準アミノ酸の略語および特性を示す。
【００２９】
突然変異は、ルーチン的な分子生物学手順により行うことができることは、当業者に認識されている。本発明による突然変異は、好ましくは、これらの突然変異を含まないＲＳＶ  Ｆポリペプチドに比較して、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの発現レベルの増大および／または安定性の増大をもたらす。
【００３０】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは完全長である。
【００３１】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは可溶性である。
【００３２】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドはさらに、前記短縮されたＦ１ドメインに連結した異種三量体形成ドメインを含む。本発明によれば、場合によってはＦ１およびＦ２ドメインを連結する連結配列と組み合わせた、短縮されたＦ１ドメインのＣ末端アミノ酸残基への異種三量体形成ドメインの連結ならびに安定化突然変異によって、高発現を示しかつ融合前特異的抗体に結合するＲＳＶ  Ｆポリペプチドが提供されることが示されたが、これによってこのポリペプチドは融合前コンフォメーションにあることが示される。加えて、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、融合前コンフォメーションで安定化される、すなわち、ポリペプチドのプロセシングの後でも、それらは、融合前特異的抗体ＣＲ９５０１および／またはＣＲ９５０２に結合して、融合前特異的エピトープが保持されることが示される。
【００３３】
さらなる実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、
（ａ）位置４６のアミノ酸残基の突然変異；
（ｂ）位置７７のアミノ酸残基の突然変異；
（ｃ）位置８０のアミノ酸残基の突然変異；
（ｄ）位置９２のアミノ酸残基の突然変異；
（ｅ）位置１８４のアミノ酸残基の突然変異；
（ｆ）位置１８５のアミノ酸残基の突然変異；
（ｇ）位置２０１のアミノ酸残基の突然変異；
（ｈ）位置２０９のアミノ酸残基の突然変異；
（ｉ）位置４２１のアミノ酸残基の突然変異；
（ｊ）位置４２６のアミノ酸残基の突然変異；
（ｋ）位置４６５のアミノ酸残基の突然変異；
（ｌ）位置４８６のアミノ酸残基の突然変異；
（ｍ）位置４８７のアミノ酸残基の突然変異；および
（ｎ）位置５０８のアミノ酸残基の突然変異
からなる群から選択される、１つまたは複数のさらなる突然変異（野生型のＲＳＶ  Ｆタンパク質に対して）を含む。
【００３４】
好ましい実施形態では、１つまたは複数のさらなる突然変異は、
（ａ）位置４６のアミノ酸残基ＳのＧへの突然変異（Ｓ４６Ｇ）；
（ｂ）位置７７のアミノ酸残基ＫのＥへの突然変異（Ｋ７７Ｅ）；
（ｃ）位置８０のアミノ酸残基ＫのＥへの突然変異（Ｋ８０Ｅ）；
（ｄ）位置９２のアミノ酸残基ＥのＤへの突然変異（Ｅ９２Ｄ）；
（ｅ）位置１８４のアミノ酸残基ＧのＮへの突然変異（Ｇ１８４Ｎ）；
（ｆ）位置１８５のアミノ酸残基ＶのＮへの突然変異（Ｖ１８５Ｎ）；
（ｇ）位置２０１のアミノ酸残基ＫのＱへの突然変異（Ｋ２０１Ｑ）；
（ｈ）位置２０９のアミノ酸残基ＫのＱへの突然変異（Ｋ２０９Ｑ）；
（ｉ）位置４２１のアミノ酸残基ＫのＮへの突然変異（Ｋ４２１Ｎ）；
（ｊ）位置４２６のアミノ酸残基ＮのＳへの突然変異（Ｎ４２６Ｓ）；
（ｋ）位置４６５のアミノ酸残基ＫのＥまたはＱへの突然変異（Ｋ４６５Ｑ）；
（ｌ）位置４８６のアミノ酸残基ＤのＮへの突然変異（Ｄ４８６Ｎ）；
（ｍ）位置４８７のアミノ酸残基ＥのＱ，Ｎ、またはＩへの突然変異（Ｅ４８７Ｑ／Ｎ／Ｉ）；および
（ｎ）位置５０８のアミノ酸残基ＫのＥへの突然変異（Ｋ５０８Ｅ）
からなる群から選択される。
【００３５】
上記のように、特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、Ｄ４８９ＣまたはＥ４８７Ｃと組み合わせた位置４８６のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８６Ｃ）を含む。２つの追加のシステイン残基へのこれらの二重突然変異により、Ｆ１タンパク質間のサブユニット間ジスルフィド架橋がもたらされて、プロトマー間の共有結合が確立され、融合前ＲＳＶ  Ｆ構造が安定化される。
【００３６】
アミノ酸残基の位置については、配列番号１を参照することに再度留意されたい。当業者ならば、他のＲＳＶ株のＦタンパク質における対応するアミノ酸残基を判定することができよう。
【００３７】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、少なくとも２つの突然変異（野生型のＲＶ  Ｆタンパク質に対して）を含む。
【００３８】
特定の実施形態では、ポリペプチドは少なくとも３つの突然変異を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、ポリペプチドは少なくとも４つ、５つ、または６つの突然変異を含む。
【００４０】
特定の実施形態では、異種三量体形成ドメインは、アミノ酸配列ＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡ（配列番号３）を含む。特定の他の実施形態では、異種三量体形成ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号４）を含む。
【００４１】
上記に記載のように、特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは短縮されたＦ１ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「短縮された」Ｆ１ドメインは、完全長Ｆ１ドメインでないＦ１ドメインを指す、すなわち、Ｎ末端またはＣ末端において、１つまたは複数のアミノ酸残基が欠失している。本発明によれば、少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質側末端は、可溶性外部ドメインとしての発現を可能にするために欠失されている。
【００４２】
特定の他の実施形態では、Ｆ１ドメインは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸残基４９５（配列番号１を参照して）の後が短縮されている、すなわち、アミノ酸残基４９６（配列番号１を参照して）から始まるＦ１ドメインのＣ末端部分が欠失している。特定の他の実施形態では、Ｆ１ドメインはＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸残基５１３の後が短縮されている。特定の実施形態では、Ｆ１ドメインは、アミノ酸残基４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、または５２５の後が短縮されている。
【００４３】
特定の実施形態では、三量体形成ドメインは、ＲＳＶ  Ｆ１ドメインのアミノ酸残基４９５に連結している。特定の実施形態では、三量体形成ドメインは、配列番号４を含み、ＲＳＶ  Ｆ１ドメインのアミノ酸残基４９５に連結している。
【００４４】
特定の他の実施形態では、三量体形成ドメインは、ＲＳＶ  Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１３に連結している。特定の実施形態では、三量体形成ドメインは、配列番号３を含み、ＲＳＶ  Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１３に連結している。
【００４５】
上記の特定の実施形態では、場合によっては短縮されたＦ１ドメインおよびＦ２ドメインは、（場合によっては短縮された）Ｆ２ドメインのＮ末端アミノ酸にＦ２ドメインのＣ末端アミノ酸を連結する連結配列により連結されている。特定の実施形態では、連結配列（またはリンカー）は、１〜１０アミノ酸残基、好ましくは２〜９アミノ酸残基、好ましくは３〜８アミノ酸残基、好ましくは４〜７アミノ酸残基を含み、より好ましくは、リンカーは５または６アミノ酸残基を含む。融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドのコンフォメーションを破壊することなく本発明により使用することができるコンフォメーション的に中立の数多くのリンカーが知られている。好ましい実施形態では、リンカーはアミノ酸配列ＧＳＧＳＧ（配列番号５）を含む。
【００４６】
特定の実施形態では、Ｆ１ドメインおよび／またはＦドメインはＲＳＶ  Ａ株由来である。特定の実施形態では、Ｆ１および／またはＦ２ドメインは、配列番号１からなるＲＳＶ  Ａ２株由来である。
【００４７】
特定の実施形態では、Ｆ１および／またはＦ２ドメインは、配列番号６９からなるＲＳＶ  Ａ２株由来である。
【００４８】
特定の実施形態では、Ｆ１ドメインおよび／またはＦドメインはＲＳＶ  Ｂ株由来である。特定の実施形態では、Ｆ１および／またはＦ２ドメインは、配列番号２からなるＲＳＶ  Ｂ株由来である。
【００４９】
特定の実施形態では、Ｆ１およびＦ２ドメインは同じＲＳＶ株由来である。特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、キメラポリペプチドである、すなわち、異なるＲＳＶ株由来のＦ１およびＦ２ドメインを含む。
【００５０】
特定の実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの発現レベルは、突然変異のない完全長野生型ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたは野生型外部ドメイン（すなわち、膜貫通領域および細胞質領域のない）と比較して、増大している。特定の実施形態では、発現レベルは少なくとも５倍、好ましくは１０倍まで増大している。特定の実施形態では、発現レベルは１０倍超増大している。
【００５１】
本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは安定である、すなわち、例えば精製、凍結融解サイクル、および／または保存など、ポリペプチドの処理の際に融合後コンフォメーションに容易に変化しない。
【００５２】
特定の実施形態では、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、突然変異のないＲＳＶ  Ｆポリペプチドに比較して、４℃での保存時の安定性が増大している。特定の実施形態では、ポリペプチドは、４℃での保存時に、少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも６０日間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、一層より好ましくは少なくとも１年間安定である。「保存時に安定」とは、例えば、実施例８または１０に記載の方法を用いて測定すると、溶液（例えば、培地）中でのポリペプチドの保存時、４℃で少なくとも３０日間、融合前特異的抗体（例えば、ＣＲ９５０１）に特異的な少なくとも１つのエピトープを、ポリペプチドが依然として示すことを意味する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの４℃での保存時に、少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも１年間、少なくとも１つの融合前特異的エピトープを示す。
【００５３】
特定の実施形態では、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、前記突然変異のないＲＳＶ  Ｆタンパク質に比較して、熱に曝されたときの安定性が増大している。特定の実施形態では、融合前ＲＥＶ  Ｆポリペプチドは、５５℃の温度で、好ましくは５８℃で、より好ましくは６０℃で、少なくとも３０分間熱に安定である。「熱に安定」とは、例えば、実施例９に記載の方法を用いて測定すると、上昇した温度（すなわち、５５℃以上の温度）に少なくとも３０分間曝された後に少なくとも１つの融合前特異的エピトープを、ポリペプチドが依然として示すことを意味する。
【００５４】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、適切な製剤緩衝剤中で１〜６回の凍結融解サイクルに供された後に少なくとも１つの融合前特異的エピトープを示す。
【００５５】
特定の好ましい実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号９０〜９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、配列番号９０〜９４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。
【００５６】
本出願の全体にわたって使用される場合、当技術分野での慣例として、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で提示され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で提示される。
【００５７】
特定の実施形態では、本発明によるコード化ポリペプチドはさらに、配列番号１、配列番号２、または配列番号６９のアミノ酸１〜２６に対応する、シグナル配列またはシグナルペプチドとも呼ばれるリーダー配列を含む。これは、分泌経路の方へ進む運命にある新規合成タンパク質の大多数のＮ末端に存在する短い（典型的には５〜３０アミノ酸長）ペプチドである。特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドはリーダー配列を含まない。
【００５８】
特定の実施形態では、ポリペプチドはＨＩＳタグを含む。Ｈｉｓタグまたはポリヒスチジンタグは、多くの場合タンパク質のＮ末端またはＣ末端にある、少なくとも５個のヒスチジン（Ｈ）残基からなる、タンパク質中のアミノ酸モチーフであり、一般には、精製目的のために使用される。
【００５９】
特定の実施形態では、ポリペプチドはＨＩＳタグを含まない。本発明によれば、驚くべきことに、ＨＩＳタグが欠失すると、発現レベルおよび安定性が、ＨＩＳタグ含有ポリペプチドに比較して増大することが示された。
【００６０】
本発明はさらに、本発明によるＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化される。コドン最適化の方法は公知であり、以前に記載されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。野生型配列に比較して、少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンに置換される場合、配列はコドン最適化されると見なされる。本明細書では、好ましくないコドンは、生物において、同じアミノ酸をコードする別のコドンよりも使用頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンは、生物において、好ましくないコドンよりも使用頻度が高いコドンである。特定の生物についてのコドン使用頻度は、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎのコドン度数分布表に見出すことができる。好ましくは２つ以上の好ましくないコドン、好ましくは大部分のまたはすべての好ましくないコドンが、より好ましいコドンに置換される。好ましくは、生物で最も使用頻度が高いコドンが、コドン最適化配列に使用される。好ましいコドンに置換すると、一般には、発現が高まる。
【００６２】
数多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸分子が、遺伝暗号の縮重の結果として同じポリペプチドをコードすることができることは、当業者に理解されている。当業者が、ポリペプチドが発現されることになる、任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように、核酸分子によりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を、ルーチン的な手法を用いて行うことができることも理解されている。したがって、特に明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重形であって、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでも含まなくてもよい。
【００６３】
核酸配列は、ルーチン的な分子生物学手法を用いてクローニングすること、またはＤＮＡ合成によりｄｅ  ｎｏｖｏ生成することが可能であり、これらは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野でビジネスをしているサービス企業によりルーチン的な手法を使用して実施され得る（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）。
【００６４】
本発明はまた、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明による核酸分子はベクターの一部である。このようなベクターは、当業者に周知の方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞および／または真核細胞において複製できるように設計することができる。加えて、多くのベクターは、真核細胞の形質転換に使用することができ、そのような細胞のゲノムに全体としてまたは部分的に組み込まれ、その結果、そのゲノムに所望の核酸を含む安定な宿主細胞が得られる。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに適しかつ目的の核酸の転写に使用することができる任意のベクターとすることができる。本発明による適切なベクターは、例えば、Ａｄ２６またはＡｄ３５などのアデノベクター、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクター等である。当業者は、適切な発現ベクターを選択し、本発明の核酸配列を機能的に挿入することができる。
【００６５】
融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞も、本発明の一部を形成する。融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞株、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、もしくは酵母、真菌、昆虫細胞等、またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物における分子の発現を含む組換えＤＮＡ技術によって生成させることができる。特定の実施形態では、細胞は多細胞生物由来であり、特定の実施形態では、細胞は脊椎動物または無脊椎動物起源である。所定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。所定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一般に、宿主細胞における、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドなどの組換えタンパク質の生成は、発現可能形式でそのポリペプチドをコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入、核酸分子の発現に資する条件下での細胞の培養、および前記細胞におけるポリペプチド発現を可能にすることを含む。発現可能形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態であってもよく、通常、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化シグナル等、核酸の発現をもたらし得る配列を必要とする。当業者は、種々のプロモーターを使用して、宿主細胞で遺伝子を発現させることができることを認識している。プロモーターは構成的であっても調節的であってもよく、ウイルス、原核生物、もしくは真核生物の供給源を含む種々の供給源から入手すること、または人為的に設計することが可能である。
【００６６】
細胞培養培地は種々のベンダーから入手可能であり、適切な培地は、宿主細胞が目的のタンパク質、ここでは融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを発現するように、ルーチン的に選択することができる。適切な培地は血清を含有しても含有しなくてもよい。
【００６７】
「異種核酸分子」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、宿主細胞に天然には存在しない核酸分子である。それは、例えば、標準分子生物学手法によりベクターに導入される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列に機能的に連結されている。これは、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に配置することによって行うことができる。さらなる調節配列を加えることもできる。多くのプロモーターは、導入遺伝子の発現のために使用することができ、当業者には公知であり、例えば、これらは、ウイルス、哺乳動物、合成のプロモーター等を含むことができる。真核細胞において発現を得るのに適したプロモーターの非限定例には、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）、例えばＣＭＶ前初期遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むＣＭＶ前初期プロモーターがある。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を、導入遺伝子の後に存在させることもできる。あるいは、いくつかの広く使用されている発現ベクター、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクター系列、ＢＤ  ＳｃｉｅｎｃｅｓからのｐＭＳＣＶおよびｐＴＫ−Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ等が、当技術分野で商用供給源から入手可能であり、これらは、目的のタンパク質を組換えにより発現させるために、または適切なプロモーターおよび／もしくは転写ターミネーター配列、ポリＡ配列等を得るために使用することができる。
【００６８】
細胞培養は、付着細胞、例えば培養容器の表面またはマイクロキャリアに付着した細胞の培養および懸濁培養を含む、任意のタイプの細胞培養であってよい。大抵の大規模懸濁培養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチまたはフェドバッチ工程として操作される。最近では、灌流原理に基づく連続工程がより一般的になりつつあり、しかも適切でもある。適切な培地はまた、当業者に周知であり、一般に、商用供給源から大量に得ること、または標準プロトコールに従って注文生産することが可能である。培養は、バッチ、フェドバッチ、連続系等を使用して、例えば、ディッシュ、ローラーボトル、またはバイオリアクター中で行うことができる。細胞培養に適した条件は公知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９）を参照のこと）。
【００６９】
本発明はさらに、上記のような融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／もしくは核酸分子、ならびに／またはベクターを含む組成物を提供する。したがって、本発明は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーション中には存在するが、融合後コンフォメーション中には存在しないエピトープを示す融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明はまた、このような融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子および／またはベクターを含む組成物を提供する。本発明はさらに、上記のような融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または核酸分子および／またはベクターを含む免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を被験体に誘導するための、本発明による安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターを提供する。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を被験体に誘導するための方法であって、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または核酸分子および／またはベクターを被験体に投与することを含む方法を提供する。また、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を被験体に誘導する際に使用するための、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または核酸分子および／またはベクターを提供する。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を被験体に誘導する際に使用する薬剤の製造のための、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または核酸分子および／またはベクターの使用を提供する。
【００７０】
本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、またはベクターは、ＲＳＶ感染の防止（予防）および／または処置に使用することができる。特定の実施形態では、防止および／または処置は、ＲＳＶ感染に罹りやすい患者群を標的にすることができる。そのような患者群としては、以下に限定されるものではないが、例えば、高齢（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若齢（例えば、５歳以下、１歳以下）の入院患者、および抗ウイルス性化合物で処置されたが、不十分な抗ウイルス反応を示した患者が挙げられる。
【００７１】
本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターは、例えば、ＲＳＶを原因とする疾患もしくは病態のスタンドアロンの処置および／または予防に、あるいは（既存または将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／またはモノクローナル抗体など、他の予防的処置および／または治療的処置と組み合わせて使用することができる。
【００７２】
本発明はさらに、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターを利用して、被験体のＲＳＶ感染を防止および／または処置するための方法を提供する。特定の実施形態では、被験体のＲＳＶ感染を防止および／または処置するための方法は、上記のような有効量の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターを、それを必要とする被験体に投与することを含む。治療有効量は、ＲＳＶによる感染から生じる疾患または病態を防止、寛解、および／または処置するのに効果的である、ポリペプチド、核酸分子、またはベクターの量を指す。防止は、ＲＳＶの伝播の阻害または低減、あるいはＲＳＶによる感染に関連した症状の１つまたは複数の発症、進展、または進行を阻害または低減することを包含する。本明細書で使用される寛解は、目に見えるもしくは認知できる疾患症状、ウイルス血症、またはＲＳＶ感染の他の任意の計測可能な徴候の低減を指す。
【００７３】
ヒトなどの被験体に投与するために、本発明は、本明細書に記載する融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を使用することができる。本文脈では、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、その使用される投与量および濃度において、投与されている被験体に何ら望ましくない作用も有害な作用も引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照のこと）。ＲＳＶ  Ｆポリペプチドまたは核酸分子は、凍結乾燥調製物を利用することが可能なこともあるが、好ましくは、無菌溶液として製剤化および投与される。無菌溶液は、濾過滅菌または当技術分野でそれ自体公知の他の方法により調製される。次いで、その溶液を凍結乾燥するか、または医薬品投与容器に充填する。溶液のｐＨは、一般に、ｐＨ３．０〜９．５の範囲、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲である。ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、典型的には、薬学的に許容される適切な緩衝剤を含む溶液中にあり、組成物は塩を含有してもよい。場合によっては、アルブミンなどの安定化剤を存在させることもある。特定の実施形態では、界面活性剤を添加する。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは注射可能な調製物に製剤化することができる。
【００７４】
特定の実施形態では、本発明による組成物はさらに、１つまたは複数のアジュバントを含む。アジュバントは、適用された抗原決定基への免疫応答をさらに増強することが、当技術分野では知られている。「アジュバント」および「免疫刺激物質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１つまたは複数の物質として定義される。本文脈では、アジュバントは、本発明のＲＳＶ  Ｆポリペプチドに対する免疫応答を増強するために使用される。適切なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；油−エマルジョン組成物（または水中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照のこと）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照のこと）；細菌または微生物の派生物、これらの例にはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその突然変異体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ等がある；真核生物のタンパク質（例えば、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、抗原それ自体またはＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８０に向けられたもの）および受容体へのリガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦ等）、これらは受容細胞と相互作用すると同時に免疫応答を刺激する）が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、アジュバントとしてアルミニウムを、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、アルミニウムリン酸カリウム、またはそれらの組合せの形態で、１用量当たりのアルミニウム含量について０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇの濃度で含む。
【００７５】
融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドはまた、例えばポリマー、リポソーム、ビロソーム、ウイルス様粒子などのナノ粒子と組み合わせて、またはそれにコンジュゲートさせて投与することができる。融合前Ｆポリペプチドは、アジュバンドを含むまたは含まないナノ粒子と組み合わせるか、その中に封入するか、またはそれにコンジュゲートさせることができる。リポソーム内への封入は、例えば米国特許第４，２３５，８７７号明細書に記載されている。高分子へのコンジュゲーションは、例えば米国特許第４，３７２，９４５号明細書または米国特許第４，４７４，７５７号明細書に開示されている。
【００７６】
他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【００７７】
特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを作製する方法であって、本発明による組成物を準備することと、それを薬学的に許容される組成物の中に製剤化することとを含む方法を提供する。「ワクチン」という用語は、特定の病原体または疾患に対して被験体にある程度の免疫を誘導するのに効果的な活性成分を含有する薬剤または組成物を指し、これにより、病原体による感染に関連した症状または疾患の重症度、期間、または他の徴候が少なくとも低減（最大で完全に消失）する。本発明では、ワクチンは、有効量の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドおよび／または融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子および／または前記核酸分子を含むベクターを含み、これにより、ＲＳＶのＦタンパク質に対する免疫応答がもたらされる。これは、入院に至る重篤な下気道疾患を防止し、被験体のＲＳＶ感染および複製による肺炎および細気管支炎などの合併症の頻度を低減する方法を提供する。本発明による「ワクチン」という用語は、それが医薬組成物であり、したがって、典型的には、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含むことを意味する。それは、さらなる活性成分を含んでも含まなくてもよい。特定の実施形態では、それは、例えばＲＳＶの他のタンパク質および／または他の感染病原体に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組合せワクチンであってもよい。さらなる活性成分の投与は、例えば、別個の投与によって行われても、本発明のワクチンとさらなる活性成分の配合剤を投与することによって行われてもよい。
【００７８】
組成物は、被験体、例えばヒト被験体に投与することができる。単回投与のための組成物中のＲＳＶ  Ｆポリペプチドの総用量は、例えば約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ、例えば１μｇ〜１ｍｇ、例えば１０μｇ〜１００μｇとすることができる。推奨用量の決定は実験により行われ、当業者にはルーチン的である。
【００７９】
本発明による組成物の投与は、標準投与経路を使用して実施することができる。非限定的実施形態としては、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、または例えば鼻腔内、口腔内等の粘膜投与など、非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は筋肉内注射により投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、組成物、例えばワクチンを投与するための種々の可能性を知っている。
【００８０】
本明細書で使用する被験体は、好ましくは哺乳動物、例えば、マウス、コットンラットなどのげっ歯類、または非ヒト霊長類、またはヒトである。好ましくは、被験体はヒト被験体である。
【００８１】
ポリペプチド、核酸分子、ベクター、および／または組成物はまた、初回免疫としてまたは追加免疫として、同種または異種初回免疫−追加免疫レジメンで投与することができる。追加免疫ワクチン接種を実施する場合、典型的には、そのような追加免疫ワクチン接種は、最初に被験体に組成物を投与した後（このような場合には、「初回ワクチン接種」と呼ばれる）、１週〜１年の間、好ましくは２週〜４ヶ月の間のある時点で同じ被験体に投与することになる。特定の実施形態では、投与は初回免疫投与および少なくとも１回の追加免疫投与を含む。
【００８２】
加えて、本発明のポリペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体が個体の血清中にあるか否かを確定することによって、個体の免疫状態を検査するための診断ツールとして使用することができる。したがって、本発明はまた、患者のＲＳＶ感染の存在を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法であって、前記方法が、ａ）前記患者から得られた生体試料を本発明によるポリペプチドと接触させるステップと、ｂ）抗体−ポリペプチド複合体の存在を検出するステップとを含む方法に関する。
【００８３】
本発明はさらに、ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの融合前コンフォメーションを安定化するための方法であって、野生型ＲＳＶ  Ｆ１ドメインに対して、ＲＳＶ  Ｆ１ドメインに１つまたは複数の突然変異を導入することを含み、この１つまたは複数の突然変異が、
（ａ）融合後Ｆ中の大きなコイルドコイルに変換される、融合前Ｆ中の二次構造要素間のＨＲＡ領域中の安定化突然変異；および
（ｂ）三量体中のＦ１サブユニットを共有結合架橋する、融合前基部（残基４９３〜５２５）、ＨＲＢのＮ末端）に対して融合前ＲＳＶ−Ｆ頭部Ｎ末端の下部にある３回軸に近接する２つのシステイン残基の導入。
【００８４】
特定の実施形態では、ＨＲＡ領域の突然変異は位置１６１にある。
【００８５】
特定の実施形態では、ＨＲＡ領域の突然変異は位置１７３にある。
【００８６】
特定の実施形態では、ＨＲＡ領域の突然変異は位置１８２にある。
【００８７】
特定の実施形態では、２つのシステイン残基の導入は、位置４８６および４８９である。
【００８８】
特定の実施形態では、２つのシステイン残基の導入は、位置４８６および４８７である。
【００８９】
このような方法によって得ることができかつ／または得られる安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドはまた、上記のようなその使用と共に、本発明の一部を形成する。
【００９０】
本発明を、以下の実施例においてさらに詳細に説明する。実施例は、本発明を何ら限定するものではない。実施例は、本発明を単に明確にするためのものである。
【実施例】
【００９１】
実施例１
安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの調製−リンカーおよび三量体形成ドメイン
同時係属中特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０５８３５３号明細書では、可溶性融合前Ｆタンパク質（ｓＦ）の安定化された変異体を、リフォールディングを惹起する２つの主要な領域を安定化することにより設計した。最初の戦略は、短いループによりＦ１−Ｆ２ドメインを固定しかつ連結することによって、融合ペプチドをその位置に拘束し、融合ペプチドが頭部領域から放出されるのを防止することであった。融合ペプチドの放出は、Ｆ１のＮ末端のＦ２のＣ末端への共有結合形成を再構築することにより防止することができる。この実施例で示すように、いくつかの異なるリンカーを試みた。具体的にはアミノ酸配列ＧＳＧＳＧ（配列番号５）を含む、Ｆ１とＦ２の間への５アミノ酸ループの挿入が最も好結果が得られた。
【００９２】
他の不安定領域は、融合前Ｆタンパク質において三量体ヘリックス基部領域を形成する第２の７アミノ酸繰り返し（ＨＲＢ）領域である。可溶性Ｆタンパク質中の膜貫通ドメイン（ＴＭ）の欠失により、この領域はさらに不安定化するが、これは種々の異種三量体形成ドメインの付加により補償される。完全にプロセシングされた成熟ＲＳＶ−Ｆ外部ドメインを、種々の三量体形成ドメインとＣ末端側の種々の位置（すなわち、Ｆ１ドメインは種々のアミノ酸残基で短縮された）で融合した。
【００９３】
ＲＳＶ  Ａ２株またはＢ１株のいずれかに基づいて、いくつかのコンストラクトを作製した。種々の三量体形成ドメインを、種々の位置で短縮されたＲＳＶ  Ｆ１ドメインに連結した。試験した三量体形成ドメインには、フィブリチンモチーフ（アミノ酸配列：ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号４）を含む）、およびその天然ヘリックス領域（アミノ酸配列：ＳＳＬＱＧＤＶＱＡＬＱＥＡＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号６）を含む）を含む、より長い、Ｎ末端伸長のフィブリチンドメインである「長いフィブリチン」モチーフが含まれ、これらは、ＨＲＢ領域の推定７アミノ酸繰り返しとインフレーム（インレジスター）でＲＳＶ  Ｆ１ドメインに付加された。
【００９４】
作製したさらなるコンストラクトは、７つ組の理想的ヘリックス三量体コイルドコイル、またはアミノ酸配列：ＩＥＡＩＥＫＫ（配列番号７）を含むイソロイシンジッパードメイン（ＩＺ）（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １１：１０５１−１０５５（１９９８））を含んだ。本発明によれば、アミノ酸配列：（Ｉ）ＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡ（配列番号８）を含むイソロイシンジッパー（Ｌ）およびアミノ酸配列ＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡ（配列番号３）を含むイソロイシンジッパー（Ｓ）と呼ばれる、異なるＩＺドメインが使用された。
【００９５】
これらのＩＺドメインは、構造的にＧＣＮ４と同等であるが、ＩＺドメインは、天然配列ではなく、最適な三量体形成ドメインになるように、したがって、より安定であるように設計されたものである。
【００９６】
以下に示す他の公知の三量体形成ドメインを含む、さらなるコンストラクトを作製した：
【化１】
0006679475.tif 000002
【００９７】
以下のコンストラクトを作製した：
コンストラクトＦ１８は、Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１３に連結されたフィブリチン三量体形成ドメイン（配列番号４）を含んだ。
コンストラクトＦ１９は、Ｆ１ドメインのアミノ酸残基４９９に連結されたフィブリチン三量体形成ドメイン（配列番号４）を含んだ。
コンストラクトＦ２０は、Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１６に連結されたイソロイシンジッパー（Ｌ）ドメイン（配列番号８）を含み、７つ組位置の疎水性を最適化し、ＩＺドメインとのインフレーム融合を容易にするような追加の改変を含んだ。
コンストラクトＦ２１もまた、イソロイシンジッパー（Ｌ）ドメイン（配列番号８）を含んだが、それはＦ１ドメインのアミノ酸残基５０１に連結されたものであり、またＨＲＢ領域に追加の改変はなかった。
コンストラクトＦ２２は、Ｆ１ドメインのアミノ酸残基４９５に連結されたイソロイシンジッパー（Ｌ）ドメイン（配列番号８）を含み、ＨＲＢに追加の改変を含んだ。
コンストラクトＦ２３は、アミノ酸残基４９５に連結されたイソロイシンジッパー（Ｓ）ドメイン（配列番号３）を含んだ。
コンストラクトＦ４６もまた、イソロイシンジッパー（Ｓ）ドメイン（配列番号３）を含んだが、それはより長いＲＳＶ−Ｆ外部ドメインに連結されたものであった、すなわち、Ｆ１ドメインは、アミノ酸残基５１３の後で短縮されたものであった。
すべてのコンストラクトはＨＩＳタグを含んだ。
【００９８】
コンストラクトについて、発現レベル、安定性、抗体ＣＲ９５０１との抗体結合を試験した。この抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および重鎖および軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を以下に示す。ＣＲ９５０１は、国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレット中の５８Ｃ５と呼ばれる抗体の結合領域を含む。
【００９９】
コンストラクトを、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で合成しコドン最適化した。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲに関する分野内で広く知られている標準的方法によって、コンストラクトをｐＣＤＮＡ２００４にクローニングまたは生成し、配列決定した。使用した発現プラットフォームは、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とした。製造業者の説明書に従い、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞に一過性にトランスフェクトし、３７℃および１０％ＣＯ２で５日間培養した。培養上清を回収し、３００ｇで５分間遠心して、細胞および細胞デブリを除去した。次いで、０．２２ｕｍの真空フィルターを用いて、遠心上清を滅菌濾過し、使用するまで４℃に保存した。
【０１００】
５日目の上清について、ＲＳＶ  Ｆ抗体モタビズマブの重鎖および軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体ＣＲ９５０３（ＣＲ９５０３と呼ばれる）を用いるウエスタンブロットにより、Ｆタンパク質発現を評価した。融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質コンストラクトのおよその発現レベルを、ＣＲ９５０３、抗ヒトＩＲ−色素コンジュゲート二次抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）、またはＨＲＰコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて評価した。次いで、段階希釈した精製ＲＳＶ標準タンパク質を用い、視覚によりまたはＯｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ赤外線イメージングシステムを用いて、タンパク質量を評価した。コンストラクト安定性を評価するために、また導入した三量体形成モチーフの正または負の安定化効果を確認するために、ＣＲ９５０１に結合することができるコンストラクトを、４５〜６５℃の温度範囲で３０分間処理して、ＣＲ９５０１エピトープの安定性を試験した。この手順は、実施例９に詳細に記載されている。結果を表１に要約した。
【０１０１】
【表１】
0006679475.tif 000003
【０１０２】
表１でわかるように、発現されたコンストラクトは、フィブリチン変異体（Ｆ１８）およびＦ２３のみであった。Ｆ１８は三量体であり、発現を示したが、４℃での保存で不安定であった。これに対して、Ｆ２３は４℃で安定であり、融合前特異的抗体に結合するが、単量体であるように見えた。したがって、変異体Ｆ１８およびＦ２８の両方を使用して、安定性と三量体形成の両方について最適化した。
【０１０３】
次に、Ｆ１のＮ末端の融合ペプチドがＦ２ドメインのＣ末端に融合することによって固定されるいくつかのコンストラクトを作製した。すべてのコンストラクトはＨｉｓタグを含んだ。両方のフューリン切断部位の突然変異によって、ｐ２７ペプチドを依然として含有する可溶性Ｆタンパク質（すなわち、Ｆ１２、Ｆ１５．１およびＦ１７）を生じるコンストラクトを含む、いくつかのコンストラクトを作製した。他のコンストラクトでは、ＲＳＶ−Ｆの領域をＰＩＶ−５  Ｆ（生成および結晶化に成功した融合前Ｆタンパク質）の「相同」領域に置き換えることによって（Ｆ２５）、またはその領域をＦ２およびＦ１の末端を架橋する最小（ＧＳ）ｎループに置き換えることによって（Ｆ２４）、またはその領域をＲＳＶ−Ｇの中心保存領域に置き換えることによって（Ｆ２６）、前駆体Ｆ０から切断される２７残基領域（Ｐ２７ループ）を別の閉ループに置き換える。ＰＩＶ−５に基づくＲＳＶ−Ｆのホモロジーモデリングによって、残基１０８と１３６との間の５アミノ酸残基の最小ループが選択された。リンカーとして、柔軟性および極性があり、かつ適合する見込みが高いＧｌｙ（Ｇ）およびＳｅｒ（Ｓ）残基を選択した（Ｆ２４）。加えて、このループによって引き起こされる局所的な変化が疎水的なＦを動かして不安定にさせ得るため、Ｆ１３７をＳに突然変異させた。これを下記に示す。また、Ｒ１０６をＱに突然変異させ、２７残基（１０９〜１３５）をＧＳＧＳＧに置き換えている。
【化２】
0006679475.tif 000004
【０１０４】
表２に示すように、野生型ＲＳＶ  Ｆコンストラクト、すなわち、前記リンカーを含まない類似のコンストラクト（Ｆ１１）に比較して、極めて高い発現（４４μｇ／ｍｌ）を示す短いＧＳＧＳＧループを有する変異体（Ｆ２４）以外のすべての変異体は、発現を示さないかほんのわずかな発現しか示さなかった。しかしながら、三量体であるＦ２４は、Ｃ末端フィブリチン三量体形成モチーフを有する他のすべての変異体と同様に、保存時不安定であった。すべての変異体はＨＩＳタグを含有した。
【０１０５】
【表２】
0006679475.tif 000005
【０１０６】
次に、最適な融合前Ｆポリペプチドを見出すために、最も好ましい改変を組み合わせた。ＧＳＧＳＧループ、Ｆ１のＣ末端短縮、およびフィブリチン（配列番号４）またはイソロイシンジッパー（Ｓ）モチーフ（配列番号３）のいずれかの付加を有する変異体から組合せを作製した（表３を参照）。
【０１０７】
【表３】
0006679475.tif 000006
【０１０８】
ＧＳＧＳＧループを付加すると、機能的なコンストラクトの発現およびタンパク質の熱安定性が常に増大した。短縮Ｆおよびイソロイシンジッパー（Ｓ）モチーフ（Ｆ４３、Ｆ４７）とＧＳＧＳＧループの組合せは、良好な発現、熱安定性、および４℃での保存時における良好な安定性を示した。しかしながら、これらの変異体は依然として単量体であった。イソロイシンジッパー（Ｓ）三量体形成モチーフでは、位置４９５でＣ末端短縮されたＦであるＦ変異体が高い発現を示した（Ｆ４３とＦ５６との比較、およびＦ２３とＦ４６との比較）。これに対して、フィブリチン三量体形成ドメインを有する変異体については、位置５１３での短縮体が、発現を示さない位置４９５での短縮体に比較して、高い発現を示した（Ｆ２４とＦ４４との比較）。
【０１０９】
ＨＩＳタグが三量体の天然フォールディングに干渉する可能性があるので、フィブリチンおよびイソロイシンジッパー（Ｓ）変異体について、ＨＩＳタグを有しない変異体を作製した（表４）。
【０１１０】
【表４】
0006679475.tif 000007
【０１１１】
顕著なことには、ＨＩＳタグが欠失すると、Ｆ４７において発現が増大した。さらに、Ｆ４７の場合には、三量体含量がわずかに増大し、Ｆ２４の場合には、発現レベルが中程度増大しただけであった。
【０１１２】
次に、いくつかの別の三量体形成ドメインおよび短縮について、ＧＳＧＳＧループ安定化Ｆ変異体（Ｆ４７）と組み合わせて試験した（表５を参照）。すべての変異体は、ＧＳＧＳＧループを有し、かつＨＩＳタグを含有する。
【０１１３】
【表５】
0006679475.tif 000008
【０１１４】
Ｎ末端ジッパードメインと三量体間ジスルフィド架橋を形成する可能性があるシステイン残基を有するＣ末端部分との両方を含有するマトリリン１ドメイン（Ｄａｍｅｓ−ＳＡ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．，５（８），１９９８）のみが、Ｆ４７よりも高い発現レベルを可能にすることが見出された（表５、長いマトリリン）。さらに、長いマトリリン三量体形成モチーフを有する変異体は、三量体Ｆタンパク質を示す。しかしながら、この生成物は、融合前特異的Ｍａｂ  ＣＲ９５０１に結合せず、さらに、マトリリン１三量体形成ドメインを三量体天然Ｆタンパク質の産生に適さないようにする六量体の化学種を示した。マトリリンベースおよびＧＣＮ４ＩＩベースのジッパーモチーフはいずれも、Ｆ４７に比較して発現および安定性の増大を示さなかった（表５、短いマトリリン、最適化ＧＣＮ４ＩＩ）。再び、４９５での短縮により、発現レベルが高くなる。最適化トリガー配列を含有するＧＣＮ４モチーフを付加しても発現は示されなかった。
【０１１５】
ＧＣＮ４ＩＩは、使用されてパラインフルエンザ５型の融合前三量体の安定化に成功した三量体形成ドメインであり（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：３８−４４，２００６）、ＲＳＶ融合前Ｆを安定化するために他研究者により試みられてきた（例えば、国際公開第２０１０／１４９７４３号パンフレット、国際公開第２０１０／１４９７５号パンフレット、国際公開第２００９／０７９７９６号パンフレット、国際公開第２０１０／１５８６１３号パンフレットに開示のように）。ＧＣＮ４ＩＩ三量体形成ドメインを評価し、イソロイシンジッパー（Ｓ）ドメイン（配列番号３）またはフィブリチン（配列番号４）ドメインを含有するコンストラクトと比較した（結果を表６に示す）。また、これらの変異体について、別の改変、すなわち、単一リジンに基づく短いリンカーおよびＬ５１２Ｋ突然変異と比較した。すべての変異体はＨＩＳタグを含有した。
【０１１６】
【表６】
0006679475.tif 000009
【０１１７】
Ｆ１とＦ２との間の短い連結はＧＳＧＳＧループに匹敵するように見える。ＧＣＮ４ＩＩモチーフを付加した場合、試験したコンストラクトのいずれにおいても（すなわち、国際公開第２０１０／１４９７４３号パンフレットまたは国際公開第２０１０／１４９７４５号パンフレットに記載のＲＳＶ  Ａ２  Ｆ配列、本発明により使用されたＲＳＶ  Ａ２  Ｆ配列、およびＲＳＶ  Ｂ１  Ｆ配列のいずれについても）Ｆタンパク質の発現はまったく得られなかった。
【０１１８】
これらの２つのタイプの改変の導入、すなわち、連結配列および異種三量体形成ドメインの導入は、安定な三量体融合前Ｆタンパク質の発現を可能にするのには十分ではないことが示された。安定化された、不安定性の２つの主要な領域、すなわち、上記のＨＲＢおよび融合ペプチドは別として、融合前Ｆタンパク質の他の領域も、融合後Ｆへの劇的なリフォールディングに寄与および／または適応しており、配列中のより多くの位置を最適化して、融合前Ｆタンパク質のリフォールディングを止められる可能性がある。したがって、以下の実施例に記載のように、ＨＲＡおよびＨＲＢドメイン、ならびに融合前Ｆ中でこれらの領域に接触するすべてのドメインの種々のアミノ酸残基を、融合前構造の安定性を増大させるために突然変異させた。
【０１１９】
実施例２
安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの調製−安定化突然変異
三量体含量（コンストラクトＦ４７について）および保存安定性（コンストラクトＦ２４について）が最適ではなかったので、発現レベル、安定性、および天然三量体構造を増大させるための点突然変異を含有するさらなる変異体を作製した。結果を表７および８に示す。
【０１２０】
【表７】
0006679475.tif 000010
【０１２１】
突然変異の名称は野生型配列（配列番号１）に基づいた。すべてのコンストラクトは、Ｆ４７−：Ａ２型、イソロイシンジッパー（Ｓ）モチーフ（配列番号３）、ＧＳＧＳＧリンカー；末端ポイント４９５、ＨＩＳタグなしの変異体である（配列番号１６）。表７に示すように、多くの突然変異がＦ４７−の発現を増大させたが、変異体Ｆ４７＿Ｓ４６Ｇのみが、高発現に加えてより高レベルの三量体を示した。
【０１２２】
表８に、Ｆ２４変異体の発現および安定性の結果を示す。すべての変異体はＲＳＶ  Ａ２型であり、フィブリチンモチーフ、ＧＳＧＳＧリンカー；末端ポイント５１３を有し、ＨＩＳタグを有していなかった。
【０１２３】
【表８】
0006679475.tif 000011
【０１２４】
【表９】
0006679475.tif 000012
【０１２５】
多くの突然変異により、Ａ２＿Ｆ２４−の発現が増大した。ほとんどの突然変異について、Ｆ４７−バックグラウンド（表７）とＡ２＿Ｆ２４−バックグラウンド（表８）の改善された発現間に明らかな相関があった。Ｎ６７Ｉは、Ａ２＿Ｆ２４−バックグラウンドのＦ発現に対して、より正の影響を及ぼした。発現の最も顕著な増大が、単一点突然変異：Ｓ４６Ｇ、Ｓ２１５Ｐ、Ｎ６７Ｉ、Ｋ８０Ｅ、Ｅ９２Ｄ、Ｄ４８６Ｎ、Ｇ１８４Ｎ、Ｖ１８５Ｎ、Ｅ４８７Ｎ、Ｎ１７５Ｐ、Ｋ２０９Ｑ、Ｅ４８７Ｉ、Ｅ４８７Ｑ、Ｋ７７Ｅ、Ｋ２０１Ｑ、Ｎ４２６Ｓ、およびＫ４６５Ｑで得られた。終了点安定性アッセイを用いる初期スクリーニングでは（実施例８）、最も高い発現を示す変異体は、保存においても最良の安定性を示した（Ｅ９２Ｄ、Ｋ４６５Ｑ、Ｋ４６５Ｅ、Ｎ４２６Ｓ、Ｓ４６Ｇ、Ｓ２１５Ｐ、およびＮ６７Ｉ）。これらの突然変異が実際に融合前コンフォメーションを安定化しているか否かを評価するために、培養上清を、定量的ウエスタンの結果に基づき５および１０μｇ／ｍｌに希釈し、４℃で３３日目まで保存した。単一点突然変異体として、Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐのみが、経時的に完全に安定であった（実施例１０を参照）。
【０１２６】
次いで、融合前コンフォメーションの高発現および良好な安定性を示すいくつかの突然変異を組み合わせて、安定化が相加的であるか、または相乗効果の可能性があるかを評価した（表９）。
【０１２７】
【表１０】
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【０１２８】
すべての変異体は、Ｆ２４−：Ａ２型、フィブリチンモチーフ、ＧＳＧＳＧリンカー；末端ポイント５１３、すべてのＭａｂに結合、ＨＩＳタグなしの変異体である（配列番号１９）。
【０１２９】
前に同定された点突然変異を組み合わせる場合、最も効力のあるものとしてＮ６７Ｉを含む組合せにより、特に発現レベルの点から極めて興味深い相乗効果を観察できる可能性がある。Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐのいずれかが含まれる生成二重突然変異体はすべて、４℃で３０日を超える保存後安定であった（実施例１０）。顕著なことには、突然変異Ｎ６７Ｉは、二重突然変異体に含まれた場合、融合前Ｆの発現レベルに対して最も強力な効果を示すことが見出された。次に、Ｓ２１５Ｐ突然変異との組合せは、妥当な発現をもたらした。Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐの組合せは、極めて高い発現レベルをもたらし、また両方の点突然変異とも保存時安定であったので、この組合せを選択した。加えて、Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐは両方とも、単一突然変異として不安定である突然変異体の一部を安定化する能力を有することが観察され、これらの２つの突然変異が見出される領域が、融合後コンフォメーションへの移行の間にタンパク質が受けるコンフォメーション変化にとって重要であることが示された。
【０１３０】
したがって、少なくとも一部の突然変異は、融合前ＲＳＶタンパク質の発現レベルの増大および安定性の増大をもたらすことが示された。これらの現象が連結されることが期待される。この実施例に記載の突然変異はすべて、融合前Ｆポリペプチドの生成を増大させた。これらのポリペプチドの選択によってのみ、長期保存時に安定性が維持された（実施例１０を参照）。使用した安定性アッセイは、結合アッセイにおける、融合前Ｆタンパク質の上部にある融合前特異的ＣＲ９５０１エピトープの減少に基づいており、タンパク質全体の安定性に寄与するものすべてを測定するのに十分な感度はない可能性がある。したがって、発現の増大のみが観察される突然変異は、他の安定化突然変異と組み合わせて、高い安定性および高い発現レベルを有する融合前Ｆコンストラクトを得ることができる（極めて可能性の高い）有望な突然変異である。
【０１３１】
次に、Ｎ６７Ｉ−Ｓ２１５Ｐ二重突然変異が、単一突然変異のように、使用した基準に基づいて単一突然変異として不安定と考えられる点突然変異を安定化することができるか否かを確認した。追加の突然変異を、表８に記載の好ましい発現レベルおよび安定性に基づいて選択した。三重突然変異のＲＳＶ−Ｆ変異体を構築し、発現レベルおよび安定性について試験した（表１０）。
【０１３２】
【表１１】
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【０１３３】
さらに、発現レベルに対する相加効果が観察された。Ｄ４７９ＮおよびＥ４８７Ｒの三重突然変異体は、これらの単一突然変異体も、選択された突然変異のうちの最低レベルのものであったので（表８）、予想通り、いくぶん低いレベルで発現する。Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ突然変異の安定化効果のために、単一突然変異体としては不安定となる突然変異を追加しても、それらがＡ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐバックグラウンドに加えられた場合には、安定な融合前Ｆ変異体が得られた。極めて例示的な例の一部として、単一突然変異体としては高発現を示すものの安定性が低いが、Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐバックグラウンドに加えられた場合には、一層高い発現を示しかつ高度に安定である、Ｖ１８５Ｎ、Ｇ１８４Ｎ、またはＥ４８７Ｎ（表８）を追加された三重突然変異体がある。
【０１３４】
安定化突然変異はまた、他の株に由来するＲＳＶ−Ｆタンパク質と共に、プロセシングされたＦ変異体のＲＳＶ−Ｆタンパク質も安定化する。
融合前コンフォメーションの高発現および良好な安定性を示すいくつかの突然変異を、他の株のＲＳＶ  Ｆタンパク質に適用し、またフューリン切断部位突然変異を含まないＲＳＶ  Ａ２  Ｆ変異体（Ｆ１８：配列番号７１）に適用して、この改変がＲＳＶ融合前Ｆを安定化するための汎用の解決策であるか否かを評価した（表１１）。
【０１３５】
【表１２】
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【０１３６】
前に同定された点突然変異をＡ２＿Ｆ１８（配列番号７１）に導入した場合、安定性および発現レベルは、Ｆ１とＦ２との間に短いループを含有する単一鎖Ｆ２４（配列番号２１）変異体と比較すると、極めて類似していた。さらに、突然変異が、Ｎ６７Ｉまたは二重突然変異Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐを含有する変異体に追加された場合、より高い発現および安定性を示す相乗作用が観察された。二重点突然変異Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐは、Ａ２株の融合前Ｆを安定化するだけでなく、Ｂ１およびＣＬ５７−ｖ２２４株の融合前も安定化する（表１１）。
【０１３７】
安定化突然変異はまた、完全長ＲＳＶ−Ｆタンパク質を安定化する。
外部ドメインに対応するＲＳＶ−Ｆの可溶性バージョンにおいて融合前コンフォメーションの高発現および良好な安定性を示すいくつかの突然変異を、完全長ＲＳＶ−Ｆタンパク質に適用した。これらの突然変異を、フューリン切断部位の突然変異を含むまたは含まない完全長ＲＳＶ−Ｆに導入した。三量体形成ドメインはこれらの変異体に融合しなかった（表１２）。
【０１３８】
【表１３】
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【０１３９】
【表１４】
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【０１４０】
前に同定された安定化点突然変異はまた、完全長Ｆタンパク質でも安定化していた。発現レベルの増大は、それほど明白ではなかったが、同じ傾向を示した。これは、突然変異が導入されたバックグラウンドが異なることが原因である可能性があるが、定量化方法が異なること（ＦＡＣＳ対ウエスタンブロット）および表面タンパク質の再利用により発現に生物学的最大値があることが原因である可能性もある。連結配列（または短いループ）の導入により、発現および安定性が増大し、また点突然変異によっても増大した。点突然変異は、短いループと相乗的ではないかまたはほとんど相乗的でなかった（可溶性タンパク質について見出されたことに類似（表９〜１１））。
【０１４１】
位置６７の点突然変異が発現レベルおよび安定性に対してこのような正の効果を及ぼしたので、最適なものが選ばれているか否か、またはこれらの位置に改善の余地があるか否かを試験するために、この位置についてすべてのアミノ酸置換を試験した（表１３）。
【０１４２】
【表１５】
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【０１４３】
表１３に示すように、位置６７の主として疎水性残基、特にＩｌｅ、Ｌｅｕ、およびＭｅｔは、発現および安定性を増大させることができた。Ｉｌｅは、発現および安定性を最も増大させた残基である。残基ＧｌｕおよびＧｌｎ、最小残基Ｇｌｙ、ならびに正電荷残基ＡｒｇおよびＬｙｓは、融合前コンフォメーションに対して、位置６７における最大の不安定化効果を示した。
【０１４４】
実施例３
本発明による安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの調製
本発明に導いた研究では、可溶性融合前Ｆタンパク質（ｓＦ）のさらに安定化された変異体を、リフォールディングを惹起する２つの主要な領域を安定化することにより設計した。第１の戦略は、ＨＲＡ領域のコイルドコイルへのリフォールディングを妨げることであった。第２の戦略は、Ｎ末端からＨＲＢへのジスルフィド架橋を構築して、ＨＲＡコイルドコイル上にドッキングすることにより６ヘリックスバンドルを形成するＨＲＢの再配置を妨げることであった。
【０１４５】
コンストラクトについて、発現レベル、安定性、抗体ＣＲ９５０１との抗体結合を試験した。この抗体の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列および重鎖および軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を以下に示す。ＣＲ９５０１は、国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレット中の５８Ｃ５と呼ばれる抗体の結合領域を含む。
【０１４６】
コンストラクトを、Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で合成しコドン最適化した。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲに関する分野内で広く知られている標準的方法によって、コンストラクトをｐＣＤＮＡ２００４にクローニングまたは生成し、配列決定した。使用した発現プラットフォームは、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とした。製造業者の説明書に従い、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞に一過性にトランスフェクトし、３７℃および１０％ＣＯ２で５日間培養した。培養上清を回収し、３００ｇで５分間遠心して、細胞および細胞デブリを除去した。次いで、０．２２ｕｍの真空フィルターを用いて、遠心上清を滅菌濾過し、使用するまで４℃に保存した。５日目の上清について、ＲＳＶ  Ｆ抗体モタビズマブの重鎖および軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体ＣＲ９５０３（ＣＲ９５０３と呼ばれる）を用いるウエスタンブロットにより、Ｆタンパク質発現を評価した。融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質コンストラクトのおよその発現レベルを、ＣＲ９５０３、抗ヒトＩＲ−色素コンジュゲート二次抗体（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）、またはＨＲＰコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を用いて評価した。次いで、段階希釈した精製ＲＳＶ標準タンパク質を用い、視覚によりまたはＯｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ赤外線イメージングシステムを用いて、タンパク質量を評価した。コンストラクト安定性を評価するために、また導入した三量体形成モチーフの正または負の安定化効果を確認するために、コンストラクトについて、４℃での保存後５、１４、または３０日目に融合前特異的抗体への結合を試験した。この手順は、実施例１０に詳細に記載されている。
【０１４７】
次に、最適な融合前Ｆポリペプチドを見出すために、最も好ましい改変を組み合わせた。ＧＳＧＳＧループ、Ｆ１のＣ末端短縮化、およびフィブリチン（配列番号４）の付加を有する変異体から組合せを作製した。発現レベル、安定性、および天然三量体構造を増大させる点突然変異を含有する変異体を作製した。すべての変異体はＲＳＶ  Ａ２型であり、フィブリチンモチーフ、ＧＳＧＳＧリンカー；末端ポイント５１３を有し、ＨＩＳタグを有していなかった。
【０１４８】
本発明によれば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションを安定化するアミノ酸突然変異は、異なる様式でコンフォメーションを安定化する異なるカテゴリに分類することができる。
【０１４９】
アミノ酸残基Ｉ６１、Ｉ７３、Ｉ７４、Ｉ８２、および２１４
融合前から融合後のコンフォメーションにリフォールディングするためには、残基１６０と２１５の間の領域は、ヘリックス、ループ、およびストランドの集合から長い連続ヘリックスに変換しなければならない。この領域は最も劇的な構造移行を示す。この領域の一部については、実際に最も高いαヘリックス予測がある。融合前結晶構造における実際のヘリックス構造を、灰色で強調して以下に示す。この領域全体は、融合後コンフォメーションにリフォールディングすると、１つの大きなヘリックスに変換される。下位配列では、Ａｇａｄｉｒ（ｈｔｔｐ：／／ａｇａｄｉｒ．ｃｒｇ．ｅｓ／）に基づいて最も高いヘリックス予測をされた残基を灰色で強調している。融合前コンフォメーションにおいてβ−ヘアピン、連結ループ、およびヘリックスで維持されているＣ末端部分（残基１８７〜２０２）がα−ヘリックスを形成する傾向が高いことが、この比較から明らかになる。
【化３】
0006679475.tif 000019
【０１５０】
ＲＳＶ−Ｆの残基１５０〜２１２の配列を上記に示す。２番目の行に、１番目の行の二次構造を、結晶構造に基づいて、ｈ（ヘリックスの場合）およびｓ（ストランドの場合）によって示す。ヘリックスは灰色の陰影で強調される。最後の行は、配列のヘリックス傾向に基づいてヘリックスに灰色で陰影をつけた同じ配列である。
【０１５１】
最適化を必要とする領域は、融合前ＲＳＶ−Ｆの不安定なＨＲＡ中の二次構造要素（ヘリックスおよびストランド）間にあるループ領域である。ＲＳＶ−Ｆの融合前コンフォメーションを安定化するために最適化を必要とするＨＲＡ中の位置の１つは、ヘリックスα２（残基１４８〜１５７）とα３（残基１６３〜１７２）の間にあるターン中の位置１６１である。この位置の最適化がこの領域の安定性を増大させることができる根拠がいくつかある：
−このターンでは、Ｇｌｕ１６３の負電荷に近接してＧｌｕ１６１の負電荷が配置されるため、負電荷反発による不安定化が生じる：
−ラマチャンドランプロットから、残基１６１が悪い／好ましくない二面角を有していることが示される；
−残基１６１は、高い運動性を反映する（また不安定性を示唆する）高いＢ因子を有する；
−残基１６０〜１７２は高いヘリックス傾向を示す。
【０１５２】
この実施例では、負電荷反発を低減し、ターンを安定化してそれがリフォールディングすることを妨げるために、残基Ｇｌｕ１６１をＰｒｏに置き換えるか、または負電荷反発を低減するために残基Ｇｌｕ１６１をＧｌｎに置き換えるか、またはＧｌｙが広範囲の二面角を可能にするので、残基Ｇｌｕ１６１をＧｌｙに置き換えた。
【０１５３】
α２−ターン−α３（残基１５３〜１６８）の領域については、好ましくないＧｌｕ１６１に置き換わり得る残基を見出すために、リフォールディングしない安定なタンパク質に由来する構造的に相同なヘリックス−ターン−ヘリックスについてＢｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベースを検索した。１６１に相同な位置がすべてプロリンである、いくつかのタンパク質のヘリックス−ターン−ヘリックス中のターンについて高い構造相同性が発見された（ＰＤＢコード、２ｈｇｓ、３ｋａｌ、２ｏ２ｚ、２ｚｋ３、および２ｚｑｐ）。下記に示すアライメントによれば、Ｇｌｕ１６１のＰｒｏによる置換は、このターンを安定化してそれがリフォールディイングすることを妨げる、良好な構造的解決策である。
【化４】
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【０１５４】
特定の実施形態では、ターンを安定化し、それがリフォールディングすることを妨げるために、残基Ｓｅｒ１７３をＰｒｏに置き換えた。特定の実施形態では、ターンを安定化し、それがリフォールディングすることを妨げるために、残基Ｔｈｒ１７４をＰｒｏに置き換えた。
【０１５５】
ラマチャンドランプロットから、β３とβ４の間のターン中のアミノ酸残基１８２もまた悪い／好ましくない二面角を有することが示される。この位置の最適化により、ターンの安定性が増大し、β−ヘアピンが安定化する可能性がある。
【０１５６】
β３−ターン−β４（残基１７７〜１８９）の領域については、好ましくないＳｅｒ１８２に置き換わり得る残基を見出すために、リフォールディングしない安定なタンパク質に由来する構造的に相同なβ−ヘアピンについてＢｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベースを検索した。１８２に相同な位置にプロリンを有する、推定上の電子伝達タンパク質のβ−ヘアピン中のターンについて高い構造相同性が発見された（ＰＤＢコード３ｍｅ８）。下記に示すアライメントによれば、Ｓｅｒ１８２のＰｒｏによる置換は、このターンを安定化してそれがリフォールディイングすることを妨げる、良好な構造的解決策である。
【化５】
0006679475.tif 000021
【０１５７】
残基４８６、４８７、４８９の間における、頭部領域下部のシスチン架橋形成
負電荷のアミノ酸残基４８６、４８７、および４８９は、融合前と融合後のＲＳＶ−Ｆ構造間の移行を制御するスイッチ機構の一部である。Ｇｌｕ４８７のＧｌｎへの突然変異により、このスイッチは損なわれ、三量体中のプロトマー間の接触が安定化されることになる。これらの同じ残基位置はまた、プロトマー間のジスルフィド架橋を操作するために使用することができる。上記に記載する、システインによる２つの残基の突然変異により、負電荷反発が低減し、融合前三量体をさらに安定化することになるジスルフィド架橋が可能になる。
【０１５８】
融合前コンフォメーションの安定性および発現レベルを増大させるために、ＲＳＶ−Ｆ融合前タンパク質のＨＲＡ領域中の二次構造要素間のターンを安定化する点突然変異を含有する変異体を作製した。結果を表１４に示す。
【０１５９】
【表１６】
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【０１６０】
単一点突然変異のうち、位置１７３、１８２、および特に１６１をプロリンに置換すると、発現レベルおよび安定性が向上した。残基１６１の電荷を除去すると、タンパク質は安定化したが、発現レベルは増大しなかった。同じ点突然変異には、追加の安定化するＮ６７ＩおよびＳ２１５Ｐの突然変異を含有する安定化された融合前Ｆ配列において同様の効果があった。残基１８２、１７３、および特に１６１をプロリンに突然変異させると、安定性および発現レベルが最高に増大することが示された。
【０１６１】
融合前コンフォメーションの高い発現性および良好な安定性を示すＥ１６１Ｐ突然変異を、フューリン切断部位の突然変異（Ｆ１８：配列番号７１）を含まない可溶性ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ外部ドメイン変異体にも適用して、この改変がＲＳＶ融合前Ｆを安定化するための汎用の解決策であるか否かを評価した（表１５）。
【０１６２】
【表１７】
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【０１６３】
また、Ｅ１６１Ｐ突然変異により、プロセシングされたＲＳＶ−Ｆタンパク質の発現レベルが高度に増大することが示された。例えば、位置６７、２１５、および４８７における安定化する点突然変異と組み合わせると、Ｅ１６１Ｐ突然変異は、高い発現レベルおよび高い安定性を有する融合前Ｆ変異体をもたらした。
【０１６４】
残基４８６、４８７、４８９の間における、頭部領域下部のシスチン架橋形成
負電荷のアミノ酸残基４８６、４８７、および４８９は、融合前および融合後のＲＳＶ−Ｆ構造間の移行を制御するスイッチ機構の一部である。Ｇｌｕ４８７のＧｌｎへの突然変異により、このスイッチは損なわれ、三量体中のプロトマー間の接触が安定化されることになる（以前の特許Ｐ００）。これらの同じ残基位置はまた、プロトマー間のジスルフィド架橋を操作するために使用することができる。１つが負電荷の残基４８６、４８６、または４８９である２つの残基のシステインへの突然変異により、負電荷反発が低減し、融合前三量体をさらに安定化することになるジスルフィド架橋が可能になる。このような変異体のいくつかについて、融合前コンフォメーションの発現レベルおよび安定性を試験した（表１６）。
【０１６５】
【表１８】
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【０１６６】
準安定のＦ２４バックグラウンド（配列番号１９）では、残基４８６と４８７の間のジスルフィド架橋のみが妥当な発現および安定性を有する融合前タンパク質をもたらした。プロトマー間のジスルフィドには、相対する側鎖の正確なアライメントが必要とされるので、準安定のＦ２４変異体に比較して、より安定なＦタンパク質においてジスルフィド結合が成功する可能性が高い。したがって、２つの安定化する突然変異Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐを含有するＦ２４変異体において、ジスルフィドのいくつかを操作した。実際、安定化されたバックグラウンドでは、操作されたジスルフィドを有するタンパク質が、はるかに高レベルに発現した。さらに、位置４８６および４８７でのシステイン突然変異を有する変異体は、最高レベルに発現し、発現レベルは、Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐの突然変異を有しない不安的化変異体に比較して１４倍高かった。上清中のタンパク質の安定性は適度であり、依然として７９％の融合前コンフォメーションを含有した。タンパク質が精製されると、安定性がさらに高まる可能性がある。実施例４および５に示すように、１００％のシステインがプロトマー間を結合したわけではないので、安定性が１００％に達した可能性はない。
【０１６７】
実施例４
ウエスタンブロッティング
培養上清を、４〜１２％（ｗ／ｖ）Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で還元泳動し、ｉＢｌｏｔ技術（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてブロットした。ブロットをＣＲ９５０３（下記の表１８に示す配列）でプローブし、コンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）またはＩＲＤｙｅ８００ＣＷコンジュゲート親和性精製抗ヒトＩｇＧ（ウサギ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）で検出した。図１では、ＤＭ＝二重突然変異体（Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＝配列番号２１）およびＤＭ＋ＣＣ＝二重突然変異体＋ＤＥ４８６ＣＣ＝配列番号９４）の発現を見ることができる。還元および非還元で分析すると、２つのタンパク質間の明確な差を観察することができよう。還元されると、両タンパク質は、５５ｋＤａ近辺の単量体化学種として泳動する。非還元の場合、ＤＭの大部分は依然として単量体として見出されるが、ＤＭ＋ＣＣの主たる化学種ははるかに大きく、主として三量体である。これから、残基４８６および４８７をシステインに置換することにより、主としてプロトマー間のジスルフィド架橋を有する三量体が生じることが証明される。
【０１６８】
実施例５
ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ
本発明による融合前Ｆポリペプチドの多量体状態の初期測定のために、一過性にトランスフェクトされた細胞からの培養上清を、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。次いで、ゲルを、製造業者の説明書に従い、ｉＢｌｏｔ技術（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてブロットした。ＲＳＶ  Ｆタンパク質特異的抗体ＣＲ９５０３（下記の表１８に示す配列）を、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の検出用一次プローブとして使用し、次いでＨＲＰコンジュゲートマウス抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）またはＩＲＤｙｅ８００ＣＷコンジュゲート親和性精製抗ヒトＩｇＧ（ウサギ）（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を使用した。ブロットは、標準フィルム（Ｃｏｄａｋ）またはＯｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ赤外線イメージングシステムを用いて検出した。図２に、レーン２：ＤＭ＝二重突然変異体（Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＝配列番号２１）およびレーン１：ＤＭ＋ＣＣ＝二重突然変異体＋ＤＥ４８６ＣＣ＝配列番号５Ａ）からの上清のＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ分析を示す。ＤＭおよびＤＭ＋ＣＣは両方とも、ｎａｔｉｖｅ  ｐａｇｅ上で主として三量体であることから、ジスルフィドの導入により三量体間架橋を形成させなくてもよいことが示される。ＤＭ＋ＣＣは、ＤＭよりも発現性がよくないので、単量体（矢印）が見当たらないことは、検出限界未満であるという事実による可能性がある。
【０１６９】
実施例６
融合前Ｆタンパク質の発現
組換え融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする発現プラスミドを、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲを含む、当技術分野内に広く知られる標準的方法により作製した。使用した発現プラットフォームは、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｎｆｒｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）とした。製造業者の説明書に従い、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞に一過性にトランスフェクトし、３７℃および１０％ＣＯ２で５日間、振盪インキュベーター中で培養した。培養上清を回収し、３００ｇで５分間遠心して、細胞および細胞デブリを除去した。次いで、０．２２ｕｍの真空フィルターを用いて、遠心上清を滅菌濾過し、使用するまで４℃に保存した。
【０１７０】
実施例７
融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の精製
組換えポリペプチドを、初期精製用の陽イオンイオン交換カラム、次いで残存する混入物を除去する洗練ステップ用のセファデックス２００カラムを適用する２ステップ精製プロトコールによって精製した。初期イオン交換ステップのために、培養上清を２容量の５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０で希釈し、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｓカラムに毎分５ｍｌで通した。次いで、カラムを、１０カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５で洗浄し、２ＣＶの２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５で溶出した。スピン濃縮器を用いて溶出液を濃縮し、ランニング緩衝液として４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４を用い、セファデックス２００カラムを使用してタンパク質をさらに精製した。図３Ａに、ゲル濾過カラムからのクロマトグラムを示すが、主要ピークに融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が含有される。このピークを含有する画分を再びプールし、ＯＤ２８０を用いてタンパク質濃度を測定し、使用するまで４℃に保存した。図３Ｂに、最終タンパク質調製物の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示すが、見てわかるように、純度は９５％超であった。バンドの同一性はウエスタンブロッティングおよびタンパク質Ｆ特異的抗体を用いて確認した（図示せず）。次に、精製したタンパク質を、ＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ上で試験し、参照となる安定な三量体融合前Ｆタンパク質（配列番号２１）と比較した（図３Ｃ）。
【０１７１】
実施例８
終了点安定性アッセイ
本発明による発現ポリペプチドの融合前コンフォメーションの確認は、融合前特異的抗体ＣＲ９５０１もしくはＣＲ９５０２、または市販抗体モタビズマブの重鎖および軽鎖可変領域を含む非コンフォメーション特異的抗体ＣＲ９５０３を用い、Ｏｃｔｅｔ技術を使用して行った。標準プロトコールにより抗体をビオチン化し、ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＵＫ）上に固定した。手順は以下のとおり。カイネティック緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中で６０秒間、センサーを平衡化した後、チップを、５ｕｇ／ｍｌの所望の抗体を含むＰＢＳに移した。負荷を２５０秒間行った。次いで、カイネティック緩衝液中で２００秒間のさらなる平衡化ステップを入れた。最後に、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドを含有する発現培養上清にチップを移し、１２００秒後に全結合シグナルを記録した。この段階は結合段階とも呼ばれる。これを、回収直後（１日目）および５日後（５日目）に行い、ＣＲ９５０１結合の差を、融合前コンフォメーションを安定化することができる突然変異を同定するためのスクリーニングツールとして使用した。５日目に２０％未満しか結合減少が観察されなかった場合、コンストラクトは安定であると考えられ、そうでなければ、不安定であると考えられた。次いで、必要に応じて、よりストリンジェントな安定性試験を安定なコンストラクトに課すこともあった。データ解析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析６．４ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて行った。
【０１７２】
実施例９
熱安定性アッセイ
ＲＳＶ  Ｆポリペプチドに導入した形質の安定化能を、熱ストレスにより評価した。この目的のために、一過性にトランスフェクトされた細胞からの培養上清または精製されたタンパク質を一連の温度を用いて加熱した。次いで、さらなる熱誘導コンフォメーション変化を防止するために、試料を氷上で冷却し、実施例１１に記載のように、ｏｃｔｅｔ技術プラットフォーム上でＣＲ９５０１抗体を用いてプローブした。種々の温度での結合段階の終了時に得られた応答を、温度の関数としてプロットし、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、非線形回帰によりフィットさせた。これにより、抗体結合レベルが最大の５０％である温度を評価し、この値を使用して、融合前熱安定性の点から、種々のコンストラクトを比較することができる。
【０１７３】
実施例１０
結合段階安定性アッセイ
種々の点突然変異の安定性を評価するために、結合段階解析を使用することにより、ｏｃｔｅｔ結合アッセイを開発した。ＣＲ９５０１抗体またはＣＲ９５０２抗体を、ＲＳＶ−Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションに対するプローブとして使用した。終了点アッセイの濃度バイアスの可能性を低減するために、実験の結合段階全体からのデータポイントを使用した。データはチップ上の結合抗体の量について補正した。測定は１、５、および３３日目に行い、この３日の曲線の形状を比較した。同一の曲線が得られた場合、このコンストラクトは、安定であると考えられ、そうでなければ、不安定と考えられる。
【０１７４】
実施例１１
定量的Ｏｃｔｅｔ
細胞培養上清中の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の濃度を測定するために、定量的Ｏｃｔｅｔベースの方法を使用した。ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０３抗体を標準プロトコールによりビオチン化し、ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＵＫ）上に固定した。その後、コーティングされたバイオセンサーをｍｏｃｋ細胞培養上清でブロックした。定量的実験を以下のとおりに行った：温度３０℃、振盪速度１０００ｒｐｍ、アッセイ時間３００秒。標準曲線を用いて細胞培養上清中のタンパク質濃度を算出した。ｍｏｃｋ細胞培養上清で希釈したＡ２＿Ｆ２４＿Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ（配列番号２１）タンパク質を用いて、コーティング抗体それぞれについて標準曲線を作成した。測定は、上清回収日（１日目）および４℃で５日間以上の上清保存後に行った。ＣＲ９５０１またはＣＲ９５０２で測定した濃度の差を、融合前コンフォメーションを安定化することができる突然変異を同定するためのスクリーニングツールとして使用した。５日目に２０％未満しか測定濃度の減少が観察されなかった場合、コンストラクトは安定であると考えられた。データ解析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析６．４ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて行った。
【０１７５】
実施例１２
融合前Ｆ免疫原性の前臨床評価
安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆ（Ａ２Ｆ２４、Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ）（配列番号２１）の免疫原性を評価するために、０週目および４週目の初回免疫−追加免疫レジメンで、０．５または５ｕｇを用い、表１９に従ってマウスを免疫した。図４に示すように、融合前Ｆで免疫されたマウスは、融合後ＲＳＶ  Ｆで免疫されたマウスよりも高いＶＮＡ力価を示した。
【０１７６】
【表１９】
0006679475.tif 000025
【０１７７】
次に、融合後または融合前コンフォメーションのＲＳＶ−Ｆの異なる２用量でコットンラットを免疫した（表２０）。動物を０週目および４週目にｉ．ｍ．で免疫した。図５に、チャレンジの日（７週目）の高い中和抗体価を示す。
【０１７８】
【表２０】
0006679475.tif 000026
【０１７９】
チャレンジの５日後に、肺および鼻のウイルス負荷を測定した（図６を参照）。示すように、本発明による融合前Ｆポリペプチドは、肺、さらには鼻においてもウイルス負荷を低減する強力な防御免疫応答を誘導することができる。
【０１８０】
【表２１】
0006679475.tif 000027
【０１８１】
【表２２】
0006679475.tif 000028
【０１８２】
本発明は次の実施態様を含む。
（１）組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチドであって、融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含み、前記少なくとも１つのエピトープが、配列番号５４の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５５の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６２の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６３の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６４の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体、ならびに／または配列番号５８の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５９の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号６０の重鎖ＣＤＲ３領域と、配列番号６６の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６８の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体により認識され、前記ポリペプチドが、Ｆ１ドメインおよびＦ２ドメインを含み、かつ前記ポリペプチドが、野生型Ｆ１およびＦ２ドメインに比較して、
（ａ）位置１６１のアミノ酸残基の突然変異；
（ｂ）位置１８２のアミノ酸残基の突然変異；
（ｃ）位置１７３のアミノ酸残基の突然変異；および
（ｄ）位置４８９のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８９Ｃ）または位置４８７のアミノ酸残基ＥのＣへの突然変異（Ｅ４８７Ｃ）と組み合わせた位置４８６のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８６Ｃ）
からなる群から選択される少なくとも１つの突然変異を含む、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチド。
（２）前記ポリペプチドが三量体である、上記（１）に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（３）  前記少なくとも１つの突然変異が、
（ａ）位置１６１のアミノ酸残基ＥのＰ、Ｑ、またはＧへの突然変異（Ｅ１６１Ｐ、Ｅ１６１Ｑ）またはＥ１６１Ｇ）；
（ｂ）位置１８２のアミノ酸残基ＳのＰへの突然変異（Ｓ１８２Ｐ）；
（ｃ）位置１７３のアミノ酸残基Ｓ、Ｔ、またはＮのＰへの突然変異（Ｓ１７３Ｐ）；
および
（ｄ）位置４８９のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８９Ｃ）または位置４８７のアミノ酸残基ＥのＣへの突然変異（Ｅ４８７Ｃ）と組み合わせた位置４８６のアミノ酸残基ＤのＣへの突然変異（Ｄ４８６Ｃ）
からなる群から選択される、上記（１）または（２）に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（４）  前記ポリペプチドが、位置６７のアミノ酸残基の突然変異および／または位置２１５のアミノ酸残基の突然変異をさらに含む、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（５）  前記ポリペプチドが、位置６７のアミノ酸残基ＮまたはＴの突然変異および／または位置２１５のアミノ酸残基Ｓの突然変異を含む、上記（４）に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（６）  前記ポリペプチドが、前記Ｆ１ドメインとＦ２ドメインを連結する、１〜１０アミノ酸を含む連結配列を含む、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（７）  前記ポリペプチドが、短縮されたＦ１ドメインを含む、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（８）  前記ポリペプチドが、前記短縮されたＦ１ドメインに連結された異種三量体形成ドメインを含む、上記（７）に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（９）  前記異種三量体形成ドメインが、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号４）を含む、上記（８）に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（１０）  前記三量体形成ドメインが、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸残基５１３に連結している、上記（１２）に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（１１）  前記Ｆ１ドメインおよび／または前記Ｆ２ドメインがＲＳＶ  Ａ株由来である、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（１２）  前記Ｆ１ドメインおよび／または前記Ｆ２ドメインがＲＳＶ  Ｂ株由来である、上記（１）〜（１５）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（１３）  前記ポリペプチドが、配列番号９０〜配列番号９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記（１）〜（１２）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド。
（１４）  上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドをコードする核酸分子。
（１５）  前記核酸分子が、哺乳動物細胞における発現用にコドン最適化されている、上記（１４）に記載の核酸分子。
（１６）  上記（１４）または上記（１５）に記載の核酸分子を含むベクター。
（１７）
上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、上記（１４）もしくは上記（１５）に記載の核酸分子、および／または上記（１６）に記載のベクターを含む組成物。
（１８）  ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、上記（１４）もしくは上記（１５）に記載の核酸分子、および／または上記（１６）に記載のベクター。
（１９）  ワクチンとして使用するための上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、上記（１４）もしくは上記（１５）に記載の核酸分子、および／または上記（１６）に記載のベクター。
（２０）  ＲＳＶ感染の予防および／または処置に使用するための上記（１）〜（１３）のいずれかに記載の融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチド、上記（１４）もしくは上記（１５）に記載の核酸分子、および／または上記（１６）に記載のベクター。
融合前ＲＳＶ  Ｆコンストラクトのいくつかのアミノ酸配列を以下に示す。本明細書に記載する種々のコンストラクトのアミノ酸番号は、野生型配列（配列番号１）に基づいており、これは、融合前コンストラクトの位置１０８を含めて、位置１から１０８のすべてのアミノ酸が野生型配列のアミノ酸位置１〜１０８に対応するが、位置１３８から末端までのアミノ酸の番号は、２２アミノ酸だけシフトしている、すなわち、野生型配列（配列番号１）におけるＬ１３８は、すべての融合前コンストラクトにおいてＬ１１６に対応することを意味することに留意されたい。これは融合前コンストラクトで欠失がなされたという事実による、すなわち、ＧＳＧＳＧリンカーの挿入、Ｆ１の実際の番号はコンストラクト間で同じではない。したがって、本発明による特定の突然変異に関して用いられる番号、例えばＳ２１５Ｐは、野生型配列のアミノ酸の位置を指す。
【０１８３】
配列
ＲＳＶ  Ｆタンパク質Ａ２の完全長配列（配列番号１）
【化６】
0006679475.tif 000029
ＲＳＶ  Ｆタンパク質Ｂ１の完全長配列（配列番号２）
【化７】
0006679475.tif 000030
配列番号３
【化８】
0006679475.tif 000031
配列番号４
【化９】
0006679475.tif 000032
配列番号５
【化１０】
0006679475.tif 000033
Ｆ８：ＲＳＶ  Ａ２、野生型外部ドメイン（配列番号１３）
【化１１】
0006679475.tif 000034
Ｆ１１：ＲＳＶ  Ｂ１、野生型外部ドメイン（配列番号１４）
【化１２】
0006679475.tif 000035
Ｆ４７：ＲＳＶ  Ａ２、リンカー安定化、ＩＺ（Ｓ）（配列番号１５）
【化１３】
0006679475.tif 000036
Ｆ４７−：ＲＳＶ  Ａ２、リンカー安定化、ＩＺ（Ｓ）（配列番号１６）
【化１４】
0006679475.tif 000037
Ｆ４３：ＲＳＶ  Ｂ１、リンカー安定化、ＩＺ（Ｓ）（配列番号１７）
【化１５】
0006679475.tif 000038
Ｆ２４：ＲＳＶ  Ｂ１、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号１８）
【化１６】
0006679475.tif 000039
Ａ２＿Ｆ２４：ＲＳＶ  Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号１９）
【化１７】
0006679475.tif 000040
Ｆ２４−：ＲＳＶ  Ｂ１、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号２０）
【化１８】
0006679475.tif 000041
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号２１）
【化１９】
0006679475.tif 000042
Ｆ２４−Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ：ＲＳＶ  Ｂ１、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号２２）
【化２０】
0006679475.tif 000043
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｅ９２Ｄ：ＲＳＶ  Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号２３）
【化２１】
0006679475.tif 000044
Ｆ２４−  Ｎ６７Ｉ＋Ｅ９２Ｄ  ＲＳＶ  Ｂ１、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号２４）
【化２２】
0006679475.tif 000045
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｋ４６５Ｑ  ＲＳＶ  Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号２５）
【化２３】
0006679475.tif 000046
Ｆ２４−  Ｎ６７Ｉ＋Ｋ４６５Ｑ  ＲＳＶ  Ｂ１、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号２６）
【化２４】
0006679475.tif 000047
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ４６Ｇ  ＲＳＶ  Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号２７）
【化２５】
0006679475.tif 000048
Ｆ２４−  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ４６Ｇ  ＲＳＶ  Ｂ１、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号２８）
【化２６】
0006679475.tif 000049
Ａ２＿Ｆ２４  Ｅ９２Ｄ＋Ｓ２１５Ｐ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号２９）
【化２７】
0006679475.tif 000050
Ｆ２４−Ｅ９２Ｄ＋Ｓ２１５Ｐ：ＲＳＶ  Ｂ１、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号３０）
【化２８】
0006679475.tif 000051
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｋ５０８Ｅ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号３１）
【化２９】
0006679475.tif 000052
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｅ４８７Ｉ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号３２）
【化３０】
0006679475.tif 000053
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｅ４８７Ｑ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号３３）
【化３１】
0006679475.tif 000054
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｅ４８７Ｎ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号３４）
【化３２】
0006679475.tif 000055
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｄ４８６Ｎ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号３５）
【化３３】
0006679475.tif 000056
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｋ４６５Ｅ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号３６）
【化３４】
0006679475.tif 000057
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｋ４６５Ｑ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号３７）
【化３５】
0006679475.tif 000058
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｎ４２６Ｓ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号３８）
【化３６】
0006679475.tif 000059
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｋ４２１Ｎ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号３９）
【化３７】
0006679475.tif 000060
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｋ２０９Ｑ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号４０）
【化３８】
0006679475.tif 000061
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｋ２０１Ｑ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号４１）
【化３９】
0006679475.tif 000062
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｖ１８５Ｎ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号４２）
【化４０】
0006679475.tif 000063
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｇ１８４Ｎ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号４３）
【化４１】
0006679475.tif 000064
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｎ１７５Ｐ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号４４）
【化４２】
0006679475.tif 000065
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｅ９２Ｄ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号４５）
【化４３】
0006679475.tif 000066
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｋ８０Ｅ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号４６）
【化４４】
0006679475.tif 000067
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｋ７７Ｅ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号４７）
【化４５】
0006679475.tif 000068
Ａ２＿Ｆ２４  Ｎ６７Ｉ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｓ４６Ｇ：Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号４８）
【化４６】
0006679475.tif 000069
Ａ２＿Ｆ２４：ＲＳＶ  Ｓ４６Ｇ  Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号４９）
【化４７】
0006679475.tif 000070
Ａ２＿Ｆ２４：ＲＳＶ  Ｋ４６５Ｑ  Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号５０）
【化４８】
0006679475.tif 000071
Ａ２＿Ｆ２４：ＲＳＶ  Ｎ６７Ｉ  Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号５１）
【化４９】
0006679475.tif 000072
Ａ２＿Ｆ２４：ＲＳＶ  Ｅ９２Ｄ  Ａ２、リンカー安定化、フィブリチン（配列番号５２）
【化５０】
0006679475.tif 000073
ＲＳＶ  Ｆタンパク質ＣＬ５７−ｖ２２４完全長配列（配列番号６９）
【化５１】
0006679475.tif 000074
外部ドメイン、ＲＳＶ  ＣＬ５７−ｖ２２４（配列番号７０）
【化５２】
0006679475.tif 000075
ＰｒｅＦ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号７１）
【化５３】
0006679475.tif 000076
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号７２）
【化５４】
0006679475.tif 000077
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ、ＲＳＶ  Ｂ１、フィブリチン（配列番号７３）
【化５５】
0006679475.tif 000078
ＲＳＶ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ、ＲＳＶ  ＣＬ５７−ｖ２２４、フィブリチン（配列番号７４）
【化５６】
0006679475.tif 000079
ＰｒｅＦＬ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ、ＲＳＶ  Ｂ１、フィブリチン、ループ（配列番号２２）
【化５７】
0006679475.tif 000080
ＰｒｅＦＬ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ、ＲＳＶ  ＣＬ５７−ｖ２２４、フィブリチン、ループ（配列番号７５）
【化５８】
0006679475.tif 000081
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｅ４８７Ｑ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号７６）
【化５９】
0006679475.tif 000082
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｋ２０１Ｎ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号７７）
【化６０】
0006679475.tif 000083
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｅ９２Ｄ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号７８）
【化６１】
0006679475.tif 000084
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｄ４８６Ｎ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号７９）
【化６２】
0006679475.tif 000085
Ｆｗｔ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ、膜結合型ＲＳＶ  Ｆ、Ａ２、（配列番号８０）
【化６３】
0006679475.tif 000086
Ｆｓｌ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ、膜結合型ＲＳＶ  Ｆ、Ａ２、（配列番号８１）
【化６４】
0006679475.tif 000087
Ｆｗｔ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｅ９２Ｄ、膜結合型ＲＳＶ  Ｆ、Ａ２、（配列番号８２）
【化６５】
0006679475.tif 000088
Ｆｓｌ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｅ９２Ｄ、膜結合型ＲＳＶ  Ｆ、Ａ２、（配列番号８３）
【化６６】
0006679475.tif 000089
Ｆｗｔ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｅ４８７Ｑ、膜結合型ＲＳＶ  Ｆ、Ａ２、（配列番号８４）
【化６７】
0006679475.tif 000090
Ｆｓｌ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｅ４８７Ｑ、膜結合型ＲＳＶ  Ｆ、Ａ２、（配列番号８５）
【化６８】
0006679475.tif 000091
Ｆｗｔ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｄ４８６Ｎ、膜結合型ＲＳＶ  Ｆ、Ａ２、（配列番号８６）
【化６９】
0006679475.tif 000092
Ｆｓｌ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｄ４８６Ｎ、膜結合型ＲＳＶ  Ｆ、Ａ２、（配列番号８７）
【化７０】
0006679475.tif 000093
Ｆｗｔ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｓ４６Ｇ、膜結合型ＲＳＶ  Ｆ、Ａ２、（配列番号８８）
【化７１】
0006679475.tif 000094
Ｆｓｌ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｓ４６Ｇ、膜結合型ＲＳＶ  Ｆ、Ａ２、（配列番号８９）
【化７２】
0006679475.tif 000095
ＣＲ９５０１重鎖（配列番号５３）：
【化７３】
0006679475.tif 000096
ＣＲ９５０１軽鎖（配列番号６１）：
【化７４】
0006679475.tif 000097
ＣＲ９５０２重鎖（配列番号５７）：
【化７５】
0006679475.tif 000098
ＣＲ９５０２軽鎖（配列番号６５）：
【化７６】
0006679475.tif 000099
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｅ１６１Ｐ  Ｓ２１５Ｐ  Ｅ４８７Ｑ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号９０）
【化７７】
0006679475.tif 000100
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｅ１６１Ｐ  Ｓ２１５Ｐ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号９１）
【化７８】
0006679475.tif 000101
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ１７３Ｐ  Ｓ２１５Ｐ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号９２）
【化７９】
0006679475.tif 000102
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ１８２Ｐ  Ｓ２１５Ｐ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号９３）
【化８０】
0006679475.tif 000103
ＰｒｅＦ  Ｎ６７Ｉ  Ｓ２１５Ｐ  Ｄ４８６Ｃ  Ｅ４８７Ｃ、ＲＳＶ  Ａ２、フィブリチン（配列番号９４）
【化８１】
0006679475.tif 000104
【図１】
0006679475.tif 000105
【図２】
0006679475.tif 000106
【図３−１】
0006679475.tif 000107
【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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