(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロール、コレステロール類似体および誘導体をステロイドホルモン前駆体に変換することができる遺伝子操作された微生物であって、
真核生物起源のチトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、
Ａｄｘをコードする外因性ＤＮＡ配列、および
ＡｄＲをコードする外因性ＤＮＡ配列
を含み、
ここで、前記微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）であり、および
ここで、前記チトクロムＰ４５０は、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ４６Ａ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ１、およびＣＹＰ２１Ａ２からなる群から選択される、
前記遺伝子操作された微生物。
【請求項２】
前記外因性ＤＮＡ配列は、遺伝子操作技法によって前記微生物中に導入されている、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項３】
前記外因性ＤＮＡ配列を含む少なくとも１種のプラスミドで形質転換されている、請求項２に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項４】
前記外因性ＤＮＡ配列は、前記微生物のゲノム中に一体化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカノエート体を構築することができる機能性内因性ポリメラーゼ系をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項６】
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１株である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項７】
ＰｈａＲ、ＰｈａＰ、ＰｈａＣ、ＰｈａＥ、ＰｈａＢ、およびＰｈａＡからなる群から
選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を過剰発現させ、および／または、ＰｈａＺおよびＰｈａＱからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子の発現を下方制御もしくは不活化させる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項８】
ａ．請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物を準備する工程と、
ｂ．前記外因性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養する工程と、
ｃ．前記微生物培養液を、コレステロール、コレステロール類似体および誘導体からなる群から選択される基質と接触させる工程と、
ｄ．ステロイドホルモン前駆体を回収する工程と
を含む、ステロイドホルモン前駆体を生成するための方法。
【請求項９】
ａ．前記基質は、コレステロール、カンペステロール、エルゴスタジエノール、デスモステロール、ベータ−シトステロール、ジェネロール、およびオキシステロールの混合物からなる群から選択され、
ｂ．前記ステロイドホルモン前駆体は、プレグネノロンである、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記基質は、β−シクロデキストリンおよびサポニン中に可溶化されている、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
コレステロール、コレステロール類似体および誘導体からステロイドホルモン前駆体への変換に関して改善された組換え株を製造する方法であって、
ａ．微生物を準備する工程と、
ｂ．前記微生物への遺伝子操作技法によって、真核生物起源のチトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、Ａｄｘをコードする外因性ＤＮＡ配列、およびＡｄＲをコードする外因性ＤＮＡ配列を導入する工程と、
を含み、
ここで、前記微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）であり、および
ここで、前記チトクロムＰ４５０は、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ４６Ａ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２１Ａ１、およびＣＹＰ２１Ａ２からなる群から選択される、
前記方法。
【請求項１２】
前記微生物は、ポリヒドロキシアルカノエート体を構築することができる機能性内因性ポリメラーゼ系を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１株である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物への遺伝子操作技法によって、（ｉ）ＰｈａＲ、ＰｈａＰ、ＰｈａＣ、ＰｈａＥ、ＰｈａＢ、およびＰｈａＡからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を過剰発現させ、および／または、（ｉｉ）ＰｈａＺおよびＰｈａＱからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を下方制御もしくは不活化させる工程をさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の主題は、真核生物起源のチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの基質を有益なバイオテクノロジー産物に変換するための全細胞触媒作用プロセスである。本発明の主題は、高比率でこうした生体内変換を実現するように遺伝子操作された微生物、およびこれらの微生物株を製造するためのプロセスでもある。
【背景技術】
【０００２】
チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０）は、様々な疎水性化合物の代謝において重要な役割を果たす。これらは、ステロイド、脂肪酸、ビタミンの合成、および生体異物の解毒のような他の生物学的プロセスに関与する（非特許文献１、非特許文献２）。Ｐ４５０は、ヒドロキシル化、Ｎ−酸化、Ｎ−、Ｏ−、およびＳ−脱アルキル化、スルホキシド化、脱アミノ化、脱硫化、脱ハロゲン化、過酸化、Ｎ−酸化物還元、転位反応、Ｃ−ＣおよびＣ−Ｏフェノールカップリング、Ｃ−Ｃ結合の切断などを含めた多種多様な反応を触媒する（非特許文献３；非特許文献４）。
【０００３】
膨大な数の基質の位置特異的、化学特異的、および立体化学的酸化を触媒するＰ４５０の能力は、これらの生物学的役割を反映し、これらをバイオテクノロジー応用の重要な候補にする。
【０００４】
特に、ステロイドホルモンは、抗炎症薬、避妊薬、および抗増殖薬として広く使用されている。哺乳動物では、これらのステロイドの合成は、プレグネノロンへのコレステロールの側鎖切断反応から開始する。プレグネノロンは、ヒドロコルチゾンのようなさらなるステロイドホルモンの生成の基盤として機能を果たし（非特許文献５）、大きな関心は、コレステロールおよびその植物由来類似体のような低価格基質からのその工業的大規模変換と関連している。
【０００５】
しかし、プレグネノロンへのコレステロールの側鎖切断反応は、ステロイドの全体的なプロセスにおいて律速段階である。哺乳動物では、これは、電子担体としてアドレノドキシンおよびアドレノドキシン還元酵素を使用する膜結合型ＣＹＰ１１Ａ１酵素によって触媒される。
【０００６】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のような組換え微生物内でステロール側鎖切断酵素系を再構成するために多大な労力が費やされている（特許文献１）が、主に、哺乳動物起源のＣＹＰ１１Ａ１が不溶性膜結合酵素であり、ＣＹＰ１１Ａ１が原核生物宿主内で適切にフォールドしないように思われるという事実のために、十分なレベルの酵素活性を得ることが困難なままである。
【０００７】
Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＤＳＭ３１９の無プラスミド誘導体は、ウシアドレノドキシン還元酵素（ＡｄＲ）、およびアドレノドキシン（Ａｄｘ）とともに、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ１３３６８由来の原核生物チトクロムＰ４５０  ＣＹＰ１０６Ａ２を同時発現させるのに有益な宿主であることが証明された。これは、抗炎症性五環系トリテルペン１１−ケト−β−ボスウェル酸（ＫＢＡ）のようなテルペン構造を有する疎水性酸の全細胞変換に適用されている。本研究では、組換えＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）系を、天然にＣＹＰ１０６Ａ２を発現するＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）株ＡＴＣＣ１３３６８および大腸菌全細胞系と比較して調査した。Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＡＴＣＣ  １３３６８由来の原核生物チトクロムＰ４５０  ＣＹＰ１０６Ａ２は、ほんのわずかなクローン化細菌ステロイドヒドロキシラーゼのうちの１つである。これは、アビエチン酸の一工程位置選択的アリルヒドロキシル化を実行することができる最初に報告された細菌Ｐ４５０ジテルペンヒドロキシラーゼとして最近同定された（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】欧州特許第ＥＰ２３８６６３４Ａ１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｕｒｅｒ  ＳＣ、Ｓｃｈｕｌｚｅ  Ｈ、Ｓｃｈｍｉｄ  ＲＤ、Ｕｒｌａｃｈｅｒ  Ｖ．、２００３年．、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ４５０  ＢＭ−３  ａｎｄ  ａｎ  ＮＡＤＰ+  Ｃｏｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｍｅ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ  ｉｎ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ、３４５巻：８０２〜８１０頁
【非特許文献２】Ｕｒｌａｃｈｅｒ  Ｖ．Ｂ．およびＧｉｒｈａｒｄ  Ｍ．、２０１１年、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ  ｏｎ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．、２０１２年１月、３０巻、Ｎ１：２６〜３６頁
【非特許文献３】Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ  Ｒ．、１９９６年、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ．、Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１２７：１３７〜２２１頁
【非特許文献４】Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ  Ｒ．、２００６年、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  Ｐ４５０  ａｓ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ．、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、６月２５日；１２４（１）：１２８〜４５頁
【非特許文献５】Ｓｚｃｚｅｂａｒａ  ＦＭ、Ｃｈａｎｄｅｌｉｅｒ  Ｃ、Ｖｉｌｌｅｒｅｔ  Ｃ、Ｍａｓｕｒｅｌ  Ａ、Ｂｏｕｒｏｔ  Ｓ、Ｄｕｐｏｒｔ  Ｃ、Ｂｌａｎｃｈａｒｄ  Ｓ、Ｇｒｏｉｓｉｌｌｉｅｒ  Ａ、Ｔｅｓｔｅｔ  Ｅ、Ｃｏｓｔａｇｌｉｏｌｉ  Ｐ、Ｃａｕｅｔ  Ｇ、Ｄｅｇｒｙｓｅ  Ｅ、Ｂａｌｂｕｅｎａ  Ｄ、Ｗｉｎｔｅｒ  Ｊ、Ａｃｈｓｔｅｔｔｅｒ  Ｔ、Ｓｐａｇｎｏｌｉ  Ｒ、Ｐｏｍｐｏｎ  Ｄ、Ｄｕｍａｓ  Ｂ．、２００３年、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２１：１４３〜１４９頁
【非特許文献６】Ｂｌｅｉｆ  Ｓ、Ｈａｎｎｅｍａｎｎ  Ｆ、  Ｚａｐｐ  Ｊ、Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｄ、Ｊａｕｃｈ  Ｊ、Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ  Ｒ．、２０１２年、Ａ  ｎｅｗ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｃａｔａｌｙｓｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｎｔａｃｙｃｌｉｃ  ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ  １１−ｋｅｔｏ−ｂｅｔａ−ｂｏｓｗｅｌｌｉｃ  ａｃｉｄ  （ＫＢＡ）  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｓｙｓｔｅｍ．、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９３：１１３５〜１１４６頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、不溶性ＣＹＰ１１Ａ１によるプレグネノロンへのコレステロールの側鎖切断反応のような真核生物起源のチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼからの基質の生物変換を高比率で発現させ、触媒することを全細胞触媒として可能にする微生物が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
意外にも、本発明者らは、全細胞触媒として微生物を使用し、ポリヒドロキシアルカノエート顆粒に依存するその貯蔵能力を増大させることによって、高比率で真核生物起源のチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼから基質を生物変換することを発現させ、触媒することが可能であることを見出した。
【００１２】
特に、本発明者らは、ウシ起源の不溶性ＣＹＰ１１Ａ１、ウシアドレノドキシン還元酵素（ＡｄＲ）、およびウシアドレノドキシン（Ａｄｘ）をＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１中に同時発現させることによって、コレステロール、コレステロール類似体および誘導体のプレグネノロン、ヒドロキシル化コレステロール類似体、およびセコステロイドへの高比率変換を実現した。
【００１３】
したがって、本発明の第１の態様は、コレステロール、そのコレステロール類似体および誘導体をステロイドホルモン前駆体または誘導体に変換することができる遺伝子操作された微生物であって、真核生物起源のチトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、Ａｄｘをコードする外因性ＤＮＡ配列、およびＡｄＲをコードする外因性ＤＮＡ配列を含む、遺伝子操作された微生物である。
【００１４】
本発明の第２の態様は、
−  上述した微生物を準備する工程と、
−  外因性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養する工程と、
−  前記微生物培養液を、コレステロール、コレステロール類似体および誘導体からなる群から選択される基質と接触させる工程と、
−  ステロイドホルモン前駆体または誘導体を回収する工程と
を含む、ステロイドホルモン前駆体を生成するための方法である。
【００１５】
本発明の第３の態様は、コレステロール、コレステロール類似体および誘導体からステロイドホルモン前駆体または誘導体への変換に関して改善された組換え株を製造する方法であって、
−  微生物を準備する工程と、
−  前記微生物への遺伝子操作技法によって、真核生物起源のチトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、Ａｄｘをコードする外因性ＤＮＡ配列、およびＡｄＲをコードする外因性ＤＮＡ配列を導入する工程と、
を含む、方法である。
【００１６】
本発明の第４の態様は、疎水性または親水性化合物についての微生物の貯蔵能力を増大させるための方法であって、
−  ポリヒドロキシアルカノエート体（ＰＨＡ体）を構築することができる機能性内因性ポリメラーゼ系を含む微生物を準備する工程と、
−  前記微生物への遺伝子操作技法によって、ＰＨＡ体の構築に関与する少なくとも１種の遺伝子の発現を調節する工程と
を含み、それによって疎水性または親水性化合物の貯蔵能力が増大した微生物を得る、方法である。
【００１７】
開示した微生物および方法のこれらおよび他の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲と総合すると以下の詳細な説明からより完全に理解されることになる。
【００１８】
発明の詳細な説明
１．本発明による遺伝子操作された微生物
意外にも、本発明者らは、全細胞触媒として微生物を使用することによって、高比率で真核生物起源のチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼから基質を生物変換することを発現させ、触媒することが可能であることを見出した。
【００１９】
特に、本発明者らは、実施例２および図２〜１２に記載したように、ウシ起源の不溶性ＣＹＰ１１Ａ１、ウシアドレノドキシン還元酵素（ＡｄＲ）、およびウシアドレノドキシン（Ａｄｘ）をＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１中に同時発現させることによって、コレステロール、コレステロール類似体および誘導体のプレグネノロンへの高比率変換を実現した。
【００２０】
したがって、本発明は、コレステロール、そのコレステロール類似体および誘導体をステロイドホルモン前駆体に変換することができる遺伝子操作された微生物であって、真核生物起源のチトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、Ａｄｘをコードする外因性ＤＮＡ配列、およびＡｄＲをコードする外因性ＤＮＡ配列を含む、遺伝子操作された微生物に関係する。
【００２１】
「遺伝子操作された」微生物とは、当業者によって当分野において公知の遺伝子操作技法によって改変された本発明による任意の微生物を意味する。
【００２２】
これらの技法は、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内であるバイオインフォマティクス、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の分野における慣例的な技法である。このような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．ＡＵＳＵＢＥＬ、２０００年、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｓｏｎ  Ｉｎｃ、Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、ＵＳＡ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｒｉｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ｊ．ＡｂｅｌｓｏｎおよびＭ．Ｓｉｍｏｎ、主幹、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、具体的には、１５４巻および１５５巻（Ｗｕら編）ならびに１８５巻、「Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）；ならびにＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６年）を参照。
【００２３】
本発明によるこれらの技法は、当業者による当分野において公知の遺伝子発現の調節を可能にする技術に関する。「遺伝子発現の調節」、または「遺伝子操作技法によって１種の遺伝子を調節すること」、または「１種の遺伝子が調節された遺伝子操作された微生物」とは、目的の１種の遺伝子を過剰発現させ、またはさもなければ目的の１種の遺伝子の発現を下方制御もしくは抑制することを可能にする技術を包含している。目的の１種の遺伝子を「過剰発現させる」または「下方制御する」とは、それぞれ、発現のその正常レベル超または未満に前記遺伝子のレベルを到達させることを意味する。目的の遺伝子の過剰発現は、非限定例として、目的のこのような遺伝子をコードする外因性ＤＮＡ配列を細胞または微生物内に導入することによって実現することができる。目的の遺伝子の下方制御は、遺伝子ノックダウン技術として公知のアンチセンスおよびＲＮＡ干渉技術のような当業者によって公知の遺伝子サイレンシング技術を使用することによって実現することができる。遺伝子の抑制は、非限定例として、目的の標的遺伝子の非機能的コピーによりこのような遺伝子を置き換えることによる前記遺伝子の遺伝子置換実験によって（ｐｈａＣ遺伝子欠失について実施例４に記載されているように）、または非限定例として特定のエンドヌクレアーゼを使用することにより遺伝子の一部またはすべてを欠失させるノックアウト実験によって実現することができる。
【００２４】
「遺伝子操作技法によって１つのＤＮＡ配列を細胞または微生物内に導入すること」とは、実施例１で使用した非限定例のＰＥＧ媒介プロトプラスト変換技法のような当業者によって公知の任意の変換技術によって目的のＤＮＡ配列で前記細胞または微生物を形質転換する行為を意味する（Ｂａｒｇ  Ｈ．ら、（２００５年））。
【００２５】
「外因性ＤＮＡ配列」とは、考慮された微生物内またはそれが微生物の天然株内にある様式（例えば、発現レベルの観点で）で非本来的にかつ／または天然に発現し、上記に参照した遺伝子操作された微生物を得るために前記微生物を形質転換するのに使用されている核酸配列を意味する。具体的な実施形態では、外因性ＤＮＡ配列は、考慮された微生物とは別の種（例えば、微生物または生物の別の種）に由来する。別の特定の実施形態では、外因性配列は、同じ微生物に由来する。
【００２６】
用語「核酸」は一般に、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」、およびシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」、およびＣ）中に見つかる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基のような少なくとも１種の核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの誘導体もしくは模倣体の少なくとも１種の分子または鎖を指すことになる。核酸は、当業者に公知の任意の技法によって作製することができる（上記および例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０００年を参照）。
【００２７】
別の特定の実施形態では、前記外因性ＤＮＡ配列は、遺伝子操作技法によって前記微生物中に導入されている。実施例１で使用した非限定例のＰＥＧ媒介プロトプラスト変換のような当業者によって公知の任意の技法を、こうした配列を導入するのに使用することができる（Ｂａｒｇ  Ｈ．ら、（２００５））。
【００２８】
前記外因性ＤＮＡ配列は、チトクロムＰ４５０ならびに酸化還元パートナーＡｄＲおよびＡｄｘのような目的のタンパク質をコードすることができ、表現「外因性ＤＮＡ」は、それぞれの個々の配列を指定することができ、またはそれぞれの個々の配列を含む全配列を包含する。非限定例として、前記微生物は、実施例１に記載の前記外因性ＤＮＡ配列を含む１つのプラスミドで形質転換されている。別の非限定例として、前記外因性ＤＮＡ配列は、例えば、相同的組換えのような当分野で公知の技法によって前記微生物のゲノム中に一体化される。
【００２９】
「微生物」とは、本発明による前記遺伝子操作された微生物をコンストラクトするのに使用される微生物を意味する。本発明の枠組み内で、微生物は、例えば、大腸菌、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、およびスキゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）からなるリストから選択することができる。
【００３０】
本発明による具体的な実施形態では、微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。本発明による別の特定の実施形態では、微生物は、以下で「ＤＳＭ」と省略されるＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓｔａｍｍｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに寄託され、受託番号ＤＳＭ１５１７、ＤＳＭ１６６８、ＤＳＭ１６６９、ＤＳＭ１６７０、ＤＳＭ１６７１、ＤＳＭ１８０４、ＤＳＭ２８９４、ＤＳＭ３０５８７、ＤＳＭ３０６０１、ＤＳＭ３０７８２、ＤＳＭ３０７８７、ＤＳＭ３０８９７、ＤＳＭ３１９、ＤＳＭ３２、ＤＳＭ３２１、ＤＳＭ３２２、ＤＳＭ３２２８、ＤＳＭ３３３、ＤＳＭ３３７、ＤＳＭ３３９、ＤＳＭ３４４、ＤＳＭ３６４１、ＤＳＭ５０９、ＤＳＭ５１０、ＤＳＭ７８６、およびＤＳＭ９０株を有する株からなる群から選択されるバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）株である。
【００３１】
本発明による具体的な実施形態では、微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＤＳＭ３１９株である。本発明による具体的な実施形態では、微生物は、主要な細胞外プロテアーゼ遺伝子ｎｐｒＭを発現することができないバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）株（例えば、主要な細胞外プロテアーゼ遺伝子ｎｐｒＭが欠失またはサイレンシングされている株）である。本発明による具体的な実施形態では、微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１と呼ばれるバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１株とは、Ｗｉｔｔｃｈｅｎ  Ｋ．Ｄ．およびＭｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｆ．、（１９９５年）ならびにＪｉｎｇｗｅｎ  Ｚ．ら（２０１２年）で参照され、主要な細胞外プロテアーゼ遺伝子ｎｐｒＭをノックアウトすることによって野生型ＤＳＭ３１９株から得られる株を意味する。
【００３２】
本発明の一態様は、コレステロール、そのコレステロール類似体および誘導体をステロイドホルモン前駆体または誘導体に変換することができる遺伝子操作された微生物であって、真核生物起源のチトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、Ａｄｘをコードする外因性ＤＮＡ配列、およびＡｄＲをコードする外因性ＤＮＡ配列を含む、遺伝子操作された微生物に関係する。
【００３３】
「チトクロムＰ４５０」とは、いくつかの反応を触媒することができるモノオキシゲナーゼを意味する（Ｖａｎ  Ｂｏｇａｅｒｔ、Ｉ．Ｎ．ら（２０１１年）、またはＵｒｌａｃｈｅｒ  Ｖ．Ｂ．およびＧｉｒｈａｒｄ  Ｍ．（２０１１年）、またはｈｔｔｐ：／／ｄｍｅｌｓｏｎ．ｕｔｈｓｃ．ｅｄｕ／ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０．ｈｔｍｌに総説されているように）。本発明のチトクロムＰ４５０は、これらのそれぞれの元の宿主中で膜結合型（不溶性）または細胞質（可溶性）である。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明の前記チトクロムＰ４５０は、ＣＹＰ１１Ａ１（ＥＣ番号によればＥＣ：１．１４．１５．６）、ＣＹＰ１７Ａ１（ＥＣ：１．１４．９９．９または４．１．２．３０）、ＣＹＰ２１Ａ１、ＣＹＰ１１Ｂ１（ＥＣ：１．１４．１５．４）、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ４６Ａ１、ＣＹＰ２７Ａ１、およびＣＹＰ２１Ａ２（ＥＣ：１．１４．９９．１０）からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の枠組み内で、微生物中に導入されるチトクロムＰ４５０は、外因性ＡｄＲおよびＡｄｘであり得る真核生物起源のものである。表現「真核生物起源の」とは、非限定例として、ヒト属、クマネズミ属、ハツカネズミ属、イノシシ属、ウシ属、ガルス属、キンカチョウ属、ヒツジ属、アカゲザル属、ヤギ属、オドンテステス属、トリコプラックス属、アリゲーター属、オイブレファリス（Ｅｕｂｌｅｐｈａｒｉｓ）属、マカク属、パピオ属、マーモセット属、アナウサギ属、メソクリセタス属、カニス属、ラナ属、ツチガエル属、サケ属、マハタ属、アカントパグルス属、タウトゴラブルス属、ピメファレス属、フナ属、ゴビオシプリス（Ｇｏｂｉｏｃｙｐｒｉｓ）属、ウナギ属、アカエイ属、ネコ属、およびウマ属の真核生物において、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のためのこれらの生物に由来する細胞ライン、もしくは生きている組織から直接採取され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養について確立された初代細胞内で最初に発現される（すなわちこれらに由来する）タンパク質を意味する。特定の実施形態では、本発明の前記チトクロムＰ４５０は、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、セキショクヤケイ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）、キンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ  ｇｕｔｔａｔａ）、ヒツジ（Ｏｖｉｓ  ａｒｉｅｓ）、キンカチョウ、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、ヤギ（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ  ｃａｂａｌｌｕｓ）、ペヘレイ（Ｏｄｏｎｔｅｓｔｈｅｓ  ｂｏｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、センモウヒラムシ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌａｘ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）、アメリカアリゲーター（Ａｌｌｉｇａｔｏｒ  ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉｅｎｓｉｓ）、ヒョウモントカゲモドキ（Ｅｕｂｌｅｐｈａｒｉｓ  ｍａｃｕｌａｒｉｕｓ）、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、チャクマヒヒ（Ｐａｐｉｏ  ｕｒｓｉｎｕｓ）、コモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、アナウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、ゴールデンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、ウシガエル（Ｒａｎａ  ｃａｔｅｓｂｅｉａｎａ）、ツチガエル（Ｇｌａｎｄｉｒａｎａ  ｒｕｇｏｓａ）、ニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）、チャイロマルハタ（Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ  ｃｏｉｏｉｄｅｓ）、クロダイ（Ａｃａｎｔｈｏｐａｇｒｕｓ  ｓｃｈｌｅｇｅｌｉｉ，）、タウトゴラブルス・アドスペルスス（Ｔａｕｔｏｇｏｌａｂｒｕｓ  ａｄｓｐｅｒｓｕｓ）、ファットヘッドミノー（Ｐｉｍｅｐｈａｌｅｓ  ｐｒｏｍｅｌａｓ）、カラシウス・アウラツス（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ  ａｕｒａｔｕｓ）、ゴビオシプリス・ラルス（Ｇｏｂｉｏｃｙｐｒｉｓ  ｒａｒｕｓ）、ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、およびアメリカアカエイ（Ｄａｓｙａｔｉｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎａ）からなる群から選択される種の真核生物において最初に発現されたタンパク質である��
【００３６】
特定の実施形態では、微生物中に導入されるチトクロムＰ４５０は、ウシに由来するチトクロムＰ４５０である。別の特定の実施形態では、前記チトクロムＰ４５０は、ウシ由来のＣＹＰ１１Ａ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔにおいてＰ００１８９と呼ばれる）であり、非限定例として、プレグネノロンまたは他のステロイドホルモン前駆体および誘導体へのコレステロール、そのコレステロール類似体および誘導体の側鎖切断反応を触媒する。別の特定の実施形態では、前記チトクロムＰ４５０は、２０−ヒドロキシビタミンＤ２、１７，２０−ジヒドロキシビタミンＤ２、および１７，２０，２４−トリヒドロキシビタミンＤ２へのビタミンＤ２のヒドロキシル化（Ｎｇｕｙｅｎ  Ｍ．Ｎ．ら、２００９年）、２０−ヒドロキシビタミンＤ３、２０，２３−ジヒドロキシビタミンＤ３、および１７，２０，２３−トリヒドロキシビタミンＤ３へのビタミンＤ３のヒドロキシル化（Ｔｕｃｋｅｙ  Ｒ．Ｃ．ら、２００８年）を触媒する。別の特定の実施形態では、前記チトクロムＰ４５０は、他の非限定例として、１７，２４−ジヒドロキシエルゴステロール、２０−ヒドロキシ−２２，２３−エポキシ−２２，２３−ジヒドロエルゴステロール、および２２−ケト−２３−ヒドロキシ−２２，２３−ジヒドロエルゴステロールへのエルゴステロールの酸化（Ｔｕｃｋｅｙ  Ｒ．Ｃ．ら、２０１２年）を触媒する。別の特定の実施形態では、前記チトクロムＰ４５０のタンパク質配列は、配列番号２である。別の特定の実施形態では、前記チトクロムＰ４５０のタンパク質配列は、配列番号２のバリアントであり、ただしこれは、生物活性を保持する。
【００３７】
本発明による前記微生物は、真核生物起源のチトクロムＰ４５０または前記チトクロムＰ４５０のバリアントをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む。本発明による真核生物起源のコードされたチトクロムＰ４５０またはそのバリアントは、融合タンパク質でない。
【００３８】
「ＡｄＲ」とは、ミトコンドリアチトクロムＰ４５０電子移動系中の第１の成分として公知であり、すべてのステロイドホルモンの生合成に関与する酵素である、アドレノドキシン還元酵素（ＥＣ：１．１８．１．６）またはアドレノドキシン−ＮＡＤＰ＋還元酵素を意味する。
【００３９】
特定の実施形態では、前記ＡｄＲ酵素は、スキゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）またはサッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＲ（ＮＡＤＰＨ：ａｒｈ１遺伝子によってコードされるアドレノドキシン酸化還元酵素（ＥＣ＝１．１８．１．６））、および大腸菌由来のＦＮＲ（ｆｐｒ遺伝子によってコードされるフェレドキシン−ＮＡＤＰ還元酵素（ＥＣ＝１．１８．１．２））からなる群から選択される。
【００４０】
特定の実施形態では、微生物中に導入されるＡｄＲ酵素は、ウシ由来のＡｄＲである（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔにおいてＰ０８１６５と呼ばれる）。別の特定の実施形態では、前記ＡｄＲのタンパク質配列は、配列番号３である。別の特定の実施形態では、前記ＡｄＲのタンパク質配列は、配列番号３のバリアントであり、ただしこれは、その生物活性を保持する。
【００４１】
「Ａｄｘ」とは、アドレノドキシン還元酵素からＣＹＰＡ１１に電子を移動するその活性について知られているタンパク質である、アドレノドキシンまたはフェレドキシン１を意味する。
【００４２】
特定の実施形態では、前記Ａｄｘ酵素は、哺乳動物起源由来のＦｄｘ、スキゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）由来のＥｔｐ１ｆｄ、サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＹａｈ１からなる群から選択される。
【００４３】
特定の実施形態では、微生物中に導入されるＡｄｘ酵素は、非限定例として、ウシ由来のＡｄｘである（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔにおいてＰ００２５７と呼ばれる）。別の特定の実施形態では、前記Ａｄｘのタンパク質配列は、配列番号４である。別の特定の実施形態では、前記Ａｄｘのタンパク質配列は、配列番号４のバリアントであり、ただしこれは、その生物活性を保持する。
【００４４】
本発明による前記遺伝子操作された微生物は、ポリヒドロキシアルカノエート体を構築することができる機能性内因性ポリメラーゼ系をさらに含む。
【００４５】
「ポリヒドロキシアルカノエート体を構築することができる機能性内因性ポリメラーゼ系」とは、微生物種に関してのＰＨＡ合成酵素レギュロン系または等価な系であって、前記微生物に、非限定例としてポリヒドロキシブチレート体（ＰＨＢ体）またはポリヒドロキシブチレート顆粒のような考慮される微生物種に関してポリヒドロキシアルカノエート体（ＰＨＡ体）もしくはポリヒドロキシアルカノエート顆粒または等価物を産生させる、系を意味する。特定の実施形態では、本発明による遺伝子操作された微生物は、ポリヒドロキシアルカノエート体（ＰＨＡ体）またはポリヒドロキシアルカノエート顆粒を産生することができる。別の特定の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、ポリヒドロキシブチレート体（ＰＨＢ体）またはポリヒドロキシブチレート顆粒を産生することができる。
【００４６】
ＰＨＡ合成酵素レギュロン系とは、ｐｈａ合成酵素の基質である、３〜１４個の間のＣ原子の鎖長を有する（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル補酵素Ａチオエステルのような活性化された前駆体の共有結合性連結を可能にするポリヒドロキシアルカノエート生合成の重要な酵素をコードする遺伝子のコレクションを意味する。４５超の細菌種に由来する高い相同性を伴った５９超のｐｈａ合成酵素遺伝子が単離されており、広い特異性を示している（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｂｉ１．ｕｎｉｍｕｅｎｓｔｅｒ．ｄｅ／Ｂｉｏｌｏｇｉｅ．ＩＭＭＢ．Ｓｔｅｉｎｂｕｅｃｈｅｌ／Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／ＰＨＡ．ｈｔｍｌならびにＳｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ  Ａ．およびＶａｌｅｎｔｉｎ  Ｈ．Ｅ．、１９９５年、Ｓｔｕｂｂｅ  Ｊ．およびＴｉａｎ  Ｊ．、２００３年、Ｓｕｄｅｓｈ  Ｋ．ら、２０００年、Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ、Ｍ．ら、１９９４年に記載されているように）。
【００４７】
本発明によるポリヒドロキシアルカノエート体を構築することができる前記ポリメラーゼ系の活性は、ナイルレッドまたはナイルブルーを用いた染色および蛍光顕微鏡観察によって（Ｏｓｔｌｅ  Ａ．Ｇ．およびＨｏｌｔ  Ｊ．Ｇ．、１９８２年；Ｓｐｉｅｒｋｅｍａｎｎ  Ｐ．ら、１９９９年；Ｄｅｒ−Ｓｈｙａｎ  Ｓ．ら、２０００年に示されているように）、または実施例４で述べたように測定することができる。
【００４８】
表現「ポリヒドロキシアルカノエート体を構築することができる機能性内因性ポリメラーゼ系」では、ポリヒドロキシアルカノエート体を構築する能力が上述した通常の活性の測定によって検出可能でないが、このような内因性ポリメラーゼ系の遺伝子が、ゲノム方法によって検出可能であり、非限定例として別のｐｈａ合成酵素遺伝子が過剰発現されるときのような特定の条件下で検出可能なポリヒドロキシアルカノエート体を形成することに感受性である場合が包含される。
【００４９】
別の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、ＰＨＡ体の構築に関与する少なくとも１種の遺伝子をさらに含み、前記遺伝子発現は、上述したように「調節されている」。特定の実施形態では、前記遺伝子は、過剰発現されている。別の特定の実施形態では、前記遺伝子は、下方制御されている。別の特定の実施形態では、前記遺伝子は、ノックアウトされている。別の特定の実施形態では、前記遺伝子は、上記参考文献で述べられているようにｐｈａ合成酵素遺伝子の１つである。別の特定の実施形態では、前記遺伝子は、ＰｈａＲ（ｐｈａ合成酵素）、ＰｈａＰ（ファシン）、ＰｈａＣ（ｐｈａ合成酵素）、ＰｈａＥ（Ｐｈａ合成酵素）、ＰｈａＱ（ポリ−ベータ−ヒドロキシブチレート応答性抑制因子）、ＰｈａＢ（アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素）、およびＰｈａＡ（３−ケトチオラーゼ）からなる群から選択される。別の特定の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、過剰発現されたＰｈａＣ（ｐｈａ合成酵素）を含む。別の特定の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、過剰発現されたＰｈａＰ（ファシン）を含む。別の特定の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、過剰発現されたＰｈａＡ（３−ケトチオラーゼ）を含む。別の特定の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、Ｐｈａデポリメラーゼ遺伝子（ＰｈａＺ、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）デポリメラーゼ、ＰｈａＺ１、ＰｈａＺ２、およびＰｈａＺ３）についてノックアウトされている。
【００５０】
別の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、ＰＨＡ体の構築に関与する１種を超える遺伝子を含み、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０超の遺伝子のような前記遺伝子発現は、「調節されている」。
【００５１】
別の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、ＰｈａＲ、ＰｈａＰ、ＰｈａＣ、ＰｈａＥ、ＰｈａＢ、およびＰｈａＡからなる群内で選択される少なくとも１種の遺伝子を過剰発現させ、かつ／またはＰｈａＺおよびＰｈａＱからなる群内で選択される少なくとも１種の遺伝子を下方制御もしくは不活化することによって改変されている。
【００５２】
別の特定の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、すべて一緒に過剰発現されたＰｈａＡ（３−ケトチオラーゼ）、ＰｈａＢ（アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素）、ＰｈａＣ（ｐｈａ合成酵素）、およびＰｈａＲ（ｐｈａ合成酵素）を含む。
【００５３】
別の特定の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、同じｐｈａポリメラーゼクラスＩＶのサブユニットとしての過剰発現されたＰｈａＣ（ｐｈａ合成酵素）およびＰｈａＲ（ｐｈａ合成酵素）を含む。
【００５４】
別の特定の実施形態では、本発明による前記遺伝子操作された微生物は、同じｐｈａポリメラーゼクラスＩＩＩのサブユニットとしての過剰発現されたＰｈａＣ（ｐｈａ合成酵素）およびＰｈａＥ（ｐｈａ合成酵素）を含む。
【００５５】
別の実施形態では、本発明による遺伝子操作された微生物内の前記過剰発現遺伝子は、同じ微生物種に由来する遺伝子である。別の実施形態では、本発明による遺伝子操作された微生物内の前記過剰発現遺伝子は、他の微生物種由来の遺伝子である。非限定例として、これらの遺伝子は、ラルストニア・オイトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびアロクロマチウム・ビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）由来のｐｈａ遺伝子系に属する。
【００５６】
別の特定の実施形態では、本発明の前記微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。別の特定の実施形態では、本発明の前記微生物は、株ＭＳ９４１のバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。
【００５７】
本発明の遺伝子操作された微生物が変換することができる基質の中に、シクロアルテノールおよびラノステロールに由来するフィトステロールが包含される。これらの基質の中で、「コレステロール、そのコレステロール類似体および誘導体」とは、コレステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、エルゴスタ５，２２ジエノール、エルゴスタ５，２４（２８）ジエノール、エルゴスタ５，２４（２５）ジエノールのようなエルゴスタジエノール、エルゴスタ５，２２，２４（２５）トリエノール、エルゴスタ５，２２，２４（２８）トリエノール、エルゴスタ５，７，２２トリエノールのようなエルゴスタトリエノール、エルゴスタ５，７，２２，２４（２５）またはエルゴスタ５，７，２２，２４（２８）のようなエルゴスタテトラエノール、デスモステロール、ベータ−シトステロール、ジェネロール、オキシステロールの混合物、スチグマステロール、ビタミンＤ、７−デヒドロコレステロール、およびエルゴステロールからなる群から選択される基質のリストを意味する。
【００５８】
ジェネロール１００およびＡＤＭ９０（異なる比でブラシカステロール＋カンペステロール＋スチグマステロール＋β−シトステロールを含む）のような工業プロセスで現在使用されているステロールミックスも基質の本定義内に包含される。
【００５９】
「バリアント」とは、タンパク質および核酸のバリアントを意味する。バリアントタンパク質は、スプライスバリアント、対立遺伝子、およびアイソフォームのような天然に存在するバリアントであり得る。アミノ酸配列のバリエーションは、タンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらす、タンパク質をコードする核酸配列中への１つまたはそれ以上のコドンの置換、欠失、または挿入によって導入することができる。バリアントタンパク質は、保存的または非保存的置換を有するタンパク質であり得る。例えば、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のバリアントは、特定のアミノ酸残基で少なくとも１つの置換を有するポリペプチドであり得る。バリアントタンパク質は、本明細書に開示のポリペプチド配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を含み得る。好ましくは、バリアントタンパク質は、本明細書に開示のポリペプチド配列の完全長ポリペプチド配列または断片と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有することになる。アミノ酸配列同一性は、配列を整列させ、最大パーセント配列同一性を実現するために必要であればギャップを導入した後に、かつ配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しないで、参照配列内のアミノ酸残基と同一であるバリアント配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列同一性は、バリアント配列の全長、参照配列の全長、または両方にわたって判定することができる。タンパク質配列の同一性のパーセンテージは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅを使用し、１０のギャップ開始ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティを用いてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して、２つの配列のこれらの全長に沿った最適の整列（ギャップを含む）を見つけるためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ整列アルゴリズムに基づいて対での包括的な整列を実施することによって計算することができる。
【００６０】
バリアント核酸配列は、本明細書に開示の核酸配列と少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸配列を含み得る。好ましくは、バリアント核酸配列は、本明細書に開示の核酸配列の全長核酸配列または断片と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の核酸配列同一性を有することになる。核酸配列同一性は、当業者に周知の方法によって計算することができる。同一性のパーセンテージは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅを使用し、１０のギャップ開始ペナルティおよび０．５のギャップ伸長ペナルティを用いてＤＮＡＦＵＬＬマトリックスを使用して、２つの配列のこれらの全長に沿った最適の整列（ギャップを含む）を見つけるためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ整列アルゴリズムに基づいて対での包括的な整列を実施することによって計算することができる。核酸バリアントの例は、配列番号２、配列番号３、および配列番号４のタンパク質をコードする核酸のバリアント、ならびにｐｈａ系遺伝子をコードする核酸のバリアントであり得る。
【００６１】
本明細書において、「アミノ酸」は、２０の標準的なアルファ−アミノ酸、ならびに天然に存在する、および合成の誘導体を指す。ポリペプチドは、ＬもしくはＤアミノ酸、またはこれらの組合せを含有し得る。
【００６２】
２．本発明によるステロイドホルモンを生成する方法
本発明者らは、実施例３〜５および図２〜１２に示したように、ウシ起源の不溶性ＣＹＰ１１Ａ１、ウシアドレノドキシン還元酵素（ＡｄＲ）、およびウシアドレノドキシン（Ａｄｘ）をＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１中に同時発現させることによって、コレステロール、コレステロール類似体および誘導体のプレグネノロン、ヒドロキシル化コレステロール類似体、およびセコステロイドへの高比率変換を実現した。
【００６３】
したがって、本発明の第２の態様は、
−  「本発明による遺伝子操作された微生物」という表題の上記段落で記載した微生物を準備する工程と、
−  前記外因性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養する工程と、
−  前記微生物培養液を基質と接触させる工程と、
−  ステロイドホルモン前駆体および誘導体を回収する工程と
を含む、ステロイドホルモン前駆体および誘導体を生成するための方法に関係する。
【００６４】
特定の実施形態では、前記「ステロイドホルモン前駆体および誘導体」は、プレグネノロン、７−デヒドロプレグネノロン、ヒドロキシエルゴステロール、およびヒドロキシスチグマステロールからなる群から選択される。別の特定の実施形態では、前記ステロイドホルモン前駆体および誘導体は、ヒドロキシル化コレステロール類似体およびセコステロイド（コレステロール類似体７−デヒドロコレステロールおよびエルゴステロールの誘導体としてのビタミンＤ２およびＤ３のような）の群から選択される。
【００６５】
「前記外因性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養する」とは、バイオテクノロジー分野における任意の周知の培養および誘導方法を意味する。説明に役立つ実例として、本発明による微生物の培養条件を、実施例１および２に示す。
【００６６】
本発明の遺伝子操作された微生物が変換することができる「基質」とは、シクロアルテノールおよびラノステロールに由来するフィトステロールが包含される。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明は、
−  「本発明による遺伝子操作された微生物」という表題の上記段落で記載した微生物を準備する工程と、
−  前記外因性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養する工程と、
−  前記微生物培養液をコレステロール、コレステロール類似体および誘導体からなる群から選択される基質と接触させる工程と、
−  ステロイドホルモン前駆体および誘導体を回収する工程と
を含む、ステロイドホルモン前駆体および誘導体を生成するための方法に関係する。
【００６８】
「コレステロール、そのコレステロール類似体および誘導体」とは、実施例３〜５および図２〜１２に例示したような、コレステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、エルゴスタ５，２２ジエノール、エルゴスタ５，２４（２８）ジエノール、エルゴスタ５、２４（２５）ジエノールのようなエルゴスタジエノール、エルゴスタ５，２２，２４（２５）トリエノール、エルゴスタ５，２２，２４（２８）トリエノール、エルゴスタ５，７，２２トリエノールのようなエルゴスタトリエノール、エルゴスタ５，７，２２，２４（２５）またはエルゴスタ５，７，２２，２４（２８）のようなエルゴスタテトラエノール、デスモステロール、ベータ−シトステロール、ジェネロール、ジェネロール１００、ステロールＡＤＭ９０、オキシステロールの混合物、スチグマステロール、ビタミンＤ、７−デヒドロコレステロール、およびエルゴステロールからなる群から選択される化合物のリストを意味する。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明は、
−  「本発明による遺伝子操作された微生物」という表題の上記段落で記載した微生物を準備する工程と、
−  前記外因性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養する工程と、
−  前記微生物培養液を工業プロセスで現在使用されている基質と接触させる工程と、
−  ステロイドホルモン前駆体および誘導体を回収する工程と
を含む、ステロイドホルモン前駆体および誘導体を生成するための方法に関係する。
【００７０】
「工業プロセスで現在使用されているステロールミックス」とは、実施例３〜５および図１２で例示したような、ジェネロール１００およびＡＤＭ９０（異なる比でブラシカステロール＋カンペステロール＋スチグマステロール＋β−シトステロールを含む）のような基質を意味する。
【００７１】
前記微生物培養液を基質と「接触させる」とは、本発明による前記微生物を本発明による基質と物理的に相互作用させることを意味する。この相互作用は、培地内で実現される場合があり、または実現されない場合がある。特定の実施形態では、前記培地は、本発明による微生物の透過処理および／または本発明による基質の可溶化のための作用物質を含有する。これらの作用物質中の基質の溶解は、微生物培養液に添加する前であり得る。
【００７２】
これらの作用物質は、エタノール、Ｔｗｅｅｎ−８０、テルギトール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、サポニン（例えば、ソープバーク樹（ｓｏａｐ  ｂａｒｋ  ｔｒｅｅ）キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）の粗抽出物内に含有されるキラヤサポニンのような）、シクロデキストリンおよびこれらの誘導体（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）からなる群から選択することができる。別の特定の実施形態では、非限定例として、エタノールとＴｗｅｅｎ−８０の混合物、テルギトールとエタノールの混合物、サポニン（例えば、キラヤサポニン）とシクロデキストリンの混合物のようなこれらの作用物質の混合物を使用することができる。非限定例として２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン誘導体を使用することができる。別の特定の実施形態では、基質は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）と共結晶化されている。
【００７３】
別の特定の実施形態では、基質は、微生物培養液に添加する前に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン中に最初に溶解され、前記培養液は、キラヤサポニンを含有する。別の特定の実施形態では、基質は、１０〜６０％、優先的には２０〜５０％、より好ましくは４０〜５０％の範囲のパーセンテージの２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、および１〜１０％、好ましくは２〜８％、より好ましくは、３〜６％の範囲のパーセンテージのキラヤサポニンを含む溶液中に溶解される。別の特定の実施形態では、基質は、実施例２で述べたように、４５％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび４％のキラヤサポニンを含む溶液中に溶解される。
【００７４】
別の実施形態では、微生物培養液中の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの最終濃度は、実施例２で例示したように１から４％の間、好ましくは２から３％の間、より好ましくは２．２５％である。別の実施形態では、微生物培養液中のキラヤサポニンの最終濃度は、実施例２で例示したように０．０５から０．２５％の間、好ましくは０．０７５から０．２２５％の間、より好ましくは０．１から０．２％の間である。
【００７５】
特定の実施形態では、本発明は、
−  「本発明による遺伝子操作された微生物」という表題の上記段落で記載した微生物を準備する工程と、
−  前記外因性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養する工程と、
−  前記微生物培養液を、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびキラヤサポニンを含む溶液中に予め溶解させた基質と接触させる工程と、
−  ステロイドホルモン前駆体および誘導体を回収する工程と
を含む、ステロイドホルモン前駆体および誘導体を生成するための方法に関係する。
【００７６】
別の特定の実施形態では、本発明は、
−  「本発明による遺伝子操作された微生物」という表題の上記段落で記載した微生物を準備する工程と、
−  前記外因性ＤＮＡ配列の発現を可能にする条件下で前記微生物を培養する工程と、
−  前記微生物培養液を基質と接触させる工程であって、
ｉ．前記基質は、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびキラヤサポニンを含む溶液中に予め溶解されており、
ｉｉ．培地中のこれらの成分の最終濃度は、それぞれ２．２５％および０．２％である、
工程と
−  ステロイドホルモン前駆体および誘導体を回収する工程と
を含む、ステロイドホルモン前駆体および誘導体を生成するための方法に関係する。
【００７７】
３．本発明による組換え株を製造する方法
本発明の第３の態様は、コレステロールおよび派生類似体のような基質から上述したステロイドホルモン前駆体への変換に関して改善された組換え株を製造する方法であって、
−  本発明による微生物を準備する工程と、
−  前記微生物への遺伝子操作技法によって、本発明による真核生物起源のチトクロムＰ４５０をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、Ａｄｘをコードする外因性ＤＮＡ配列、およびＡｄＲをコードする外因性ＤＮＡ配列を導入する工程と、
を含む、方法である。
【００７８】
特定の実施形態では、前記方法は、ＣＹＰ１１Ａ１、ＣＹＰ１７Ａ１、ＣＹＰ１１Ｂ１、ＣＹＰ２１Ａ１、ＣＹＰ１１Ｂ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ４６Ａ１、ＣＹＰ２７Ａ１、およびＣＹＰ２１Ａ２（ＥＣ：１．１４．９９．１０）からなる群から選択される真核生物起源のチトクロムＰ４５０を含む。
【００７９】
別の特定の実施形態では、前記方法は、「本発明による遺伝子操作された微生物」という表題の上記段落に記載されたポリヒドロキシアルカノエート体を構築することができる機能性内因性ポリメラーゼ系を含む微生物を含む。
【００８０】
別の特定の実施形態では、本方法の前記微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。別の特定の実施形態では、本方法の前記微生物は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１株である。
【００８１】
別の実施形態では、本発明の方法は、前記微生物への遺伝子操作技法によって、「本発明による遺伝子操作された微生物」という表題の上記段落に記載されたＰＨＡ体の構築に関与する少なくとも１種の遺伝子の発現を調節する工程をさらに含む。
【００８２】
４．本発明による微生物の貯蔵能力を増大させる方法
意外にも、本発明者らは、全細胞触媒として微生物を使用し、ポリヒドロキシアルカノエート顆粒に依存するその貯蔵能力を増大させることによって、高比率で真核生物起源のチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼから基質を生物変換することを発現させ、触媒することが可能であることを現在では見出している。
【００８３】
したがって、本発明の第４の態様は、疎水性または親水性化合物についての微生物の貯蔵能力を増大させるための方法であって、
ａ．上記段落で記載したポリヒドロキシアルカノエート体を構築することができる機能性内因性ポリメラーゼ系を含む微生物を準備する工程と、
ｂ．上記段落で記載したように、前記微生物への遺伝子操作技法によって、ＰＨＡ体の構築に関与する少なくとも１種の遺伝子の発現を調節する工程と、
を含み、それによって疎水性または親水性化合物の貯蔵能力が増大した微生物を得る、方法に関心を寄せる。
【００８４】
特定の実施形態では、前記疎水性化合物は、
−  （ｉ）コレステロール、そのコレステロール類似体および誘導体、ならびに／または
−  （ｉｉ）そのステロイドホルモン前駆体および誘導体
である。
【００８５】
したがって、本発明のこの態様は、（ｉ）コレステロール、そのコレステロール類似体および誘導体、ならびに／または（ｉｉ）そのステロイドホルモン前駆体および誘導体についての微生物の貯蔵能力を増大させるための方法であって、
ａ．上記段落で記載したポリヒドロキシアルカノエート体を構築することができる機能性内因性ポリメラーゼ系を含む微生物を準備する工程と、
ｂ．上記段落で記載したように、前記微生物への遺伝子操作技法によって、ＰＨＡ体の構築に関与する少なくとも１種の遺伝子の発現を調節する工程と
を含み、それによって（ｉ）コレステロール、そのコレステロール類似体および誘導体、ならびに／または（ｉｉ）そのステロイドホルモン前駆体および誘導体についての貯蔵能力が増大した微生物を得る、方法にも関心を寄せる。
【００８６】
本発明によるポリヒドロキシアルカノエート体を構築することができる前記ポリメラーゼ系の活性は、ナイルレッドまたはナイルブルーを用いた染色および蛍光顕微鏡観察によって（Ｏｓｔｌｅ  Ａ．Ｇ．およびＨｏｌｔ  Ｊ．Ｇ．、１９８２年；Ｓｐｉｅｒｋｅｍａｎｎ  Ｐ．ら、１９９９年；Ｄｅｒ−Ｓｈｙａｎ  Ｓ．ら、２０００年）、かつ実施例４で述べたように測定することができる。
【００８７】
特定の実施形態では、前記貯蔵能力は、ＰｈａＣポリメラーゼ遺伝子発現に関して比例して増大する。他の観点では、ＰｈａＣ遺伝子をコードする外因性ＤＮＡ配列を導入すると、顆粒中にポリヒドロキシアルカノエートを貯蔵する本発明による微生物の能力を増大させること、および前記基質を産物に変換する前記微生物の能力を増大させることが可能になる。非限定例として、実施例３〜５に記載したように、ＣＹＰＡ１１およびその酸化還元パートナーを過剰発現するバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１中に外因性ｐｈａＣ遺伝子を過剰発現させることによって、本発明者らは、コレステロール、コレステロール類似体および誘導体をステロイドホルモン前駆体、ヒドロキシル化コレステロール類似体、およびセコステロイドに変換する、前記遺伝子操作された微生物の能力を増大させた。
【００８８】
別の特定の実施形態では、前記貯蔵能力は、ＰｈａＰ遺伝子発現に関して比例して増大する。言い換えれば、ＰｈａＰ遺伝子をコードする外因性ＤＮＡ配列を過剰発現させると、顆粒中にポリヒドロキシアルカノエートを貯蔵する本発明による微生物の能力を増大させること、および前記基質を産物に変換する前記微生物の能力を増大させることが可能になる。
【００８９】
別の特定の実施形態では、前記貯蔵能力は、ＰｈａＡ遺伝子発現に関して比例して増大する。言い換えれば、ＰｈａＡ遺伝子をコードする外因性ＤＮＡ配列を過剰発現させると、顆粒中にポリヒドロキシアルカノエートを貯蔵する本発明による微生物の能力を増大させること、および前記基質を産物に変換する前記微生物の能力を増大させることが可能になる。
【００９０】
別の特定の実施形態では、前記貯蔵能力は、Ｐｈａデポリメラーゼ遺伝子（ＰｈａＺ、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）デポリメラーゼ、ＰｈａＺ１、ＰｈａＺ２、およびＰｈａＺ３）下方制御に関して比例して増大する。言い換えれば、Ｐｈａデポリメラーゼ遺伝子（ＰｈａＺ、ポリ（３−ヒドロキシアルカン酸）デポリメラーゼ、ＰｈａＺ１、ＰｈａＺ２、およびＰｈａＺ３）をノックアウトし、前記遺伝子によってコードされるタンパク質を抑制または下方制御すると、顆粒中にポリヒドロキシアルカノエートを貯蔵する本発明による微生物の能力を増大させること、および前記基質を産物に変換する前記微生物の能力を増大させることが可能になる。
【００９１】
別の特定の実施形態では、前記貯蔵能力は、ＰｈａＡ（３−ケトチオラーゼ）、ＰｈａＢ（アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素）、ＰｈａＣ（ｐｈａ合成酵素）、およびＰｈａＲ（ｐｈａ合成酵素）の同時過剰発現に関して比例して増大する。言い換えれば、ＰｈａＡ、ＰｈａＢ、ＰｈａＣ、およびＰｈａＲ遺伝子をコードする外因性ＤＮＡ配列を過剰発現させると、顆粒中にポリヒドロキシアルカノエートを貯蔵する本発明による微生物の能力を増大させること、および前記基質を産物に変換する前記微生物の能力を増大させることが可能になる。
【００９２】
別の特定の実施形態では、前記貯蔵能力は、同じｐｈａポリメラーゼクラスＩＶのサブユニットとしてのＰｈａＣ（ｐｈａ合成酵素）およびＰｈａＲ（ｐｈａ合成酵素）の同時過剰発現に関して比例して増大する。言い換えれば、ＰｈａＣおよびＰｈａＲ遺伝子をコードする外因性ＤＮＡ配列を過剰発現させると、顆粒中にポリヒドロキシアルカノエートを貯蔵する本発明による微生物の能力を増大させること、および前記基質を産物に変換する前記微生物の能力を増大させることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ＣＹＰ１１Ａ１（Ａ）およびＡｄＲ／Ａｄｘ（Ｂ）の免疫染色を示す図である。レーン１：Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の野生型株；レーン２：ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株。
【図２】ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株による、コレステロール（基質について「Ｓ」）のプレグネノロン（産物について「Ｐ」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株による、７−デヒドロコレステロール（基質について「Ｓ」）の７−デヒドロプレグネノロン（産物について「Ｐ」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図４】ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株による、カンペステロール（基質について「Ｓ」）のプレグネノロン（産物について「Ｐ」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図５】ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株による、エルゴスタジエノール（基質について「Ｓ」）のプレグネノロン（産物について「Ｐ」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図６】ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株による、デスモステロール（基質について「Ｓ」）のプレグネノロン（産物について「Ｐ」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株による、オキシステロールの混合物（異なるオキシステロール基質について「Ｓ１」、「Ｓ２」、および「Ｓ３」）のプレグネノロン（産物について「Ｐ」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株による、エルゴステロール（基質について「Ｓ」）のヒドロキシ−エルゴステロール（異なるヒドロキシル化形態の産物について「Ｐ１」、「Ｐ２」、「Ｐ３」、および「Ｐ４」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図９】Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１（点線）と比較した、ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株（実線）による、ビタミンＤ（基質について「Ｓ」）のヒドロキシル−ビタミンＤ（異なるヒドロキシル−ビタミンＤ形態について「Ｐ１」および「Ｐ２」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１０】ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株による、ベータ−シトステロール（基質について「Ｓ」）のプレグネノロン（産物について「Ｐ」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１１】ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株による、スチグマステロール（基質について「Ｓ」）のヒドロキシル−スチグマステロール（産物について「Ｐ」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１２】ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の株による、ジェネロール１００（一般的な１００中に含有される異なるステロールの３種について「Ｓ１」、「Ｓ２」、および「Ｓ３」）のプレグネノロン（産物について「Ｐ」）への変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図１３】反応して２４および４８時間後のポリヒドロキシブチレート体の非存在下および存在下でのＣＹＰ１１Ａ１のｉｎ  ｖｉｖｏ活性の比較を示す図である（ＫＯ：Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１のＰｈａＣノックアウト株；ＷＴ：Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１株の野生型）。
【図１４】ＣＹＰ１１Ａ１およびその酸化還元パートナーを過剰発現するＰＨＢ枯渇株（ＭＳ９４１＿ｄｅｌｔａｐｈａＣ）中での基質変換活性の修復；ポリヒドロキシブチレート体の非存在下（構造ノックアウト株（ＭＳ９４＿ｄｅｌｔａｐｈａＣ）＋ＣＹＰ１１Ａ１）および存在下（野生型株＋ＣＹＰ１１Ａ１）での、ならびにＰＨＢ体が、構造オペロンをコードするプラスミドで株を形質転換することによって再構成された株（構造ノックアウト株（ＭＳ９４１＿ｄｅｌｔａｐｈａＣ）＋ＣＹＰ１１Ａ１＋構造の再構成（ｐＭＧＢｍ１９＿ＲＢＣＰ））中でのＣＹＰ１１Ａ１のｉｎ  ｖｉｖｏ活性の比較を示す図である。
【図１５】発現ベクターｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡのマップである。
【図１６】異なるチトクロムＰ４５０を発現する異なる微生物中で産生されたプレグネノロンの収率の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
配列の簡潔な記述
配列番号１：ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡのプラスミド配列。
配列番号２：ＣＹＰ１１Ａ１のアミノ酸配列。
配列番号３：ＡｄＲのアミノ酸配列。
配列番号４：Ａｄｘのアミノ酸配列。
【実施例１】
【００９５】
Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）発現プラスミドｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡのコンストラクション
それぞれの遺伝子のクローニングのために、以下の制限酵素を使用した。
・ＣＹＰ１１Ａ１：ＳｐｅＩ／ＭｌｕＩ
・ＡｄＲ：ＫｐｎＩ／ＳａｃＩ
・Ａｄｘ：ＢｓＲＧＩ／ＳｐｈＩ
【００９６】
プラスミドｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡは、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）シャトルベクターｐＫＭＢｍ４（Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ｄｉｅｔｅｒ  Ｊａｈｎ、ＴＵ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのグループから得た、Ｓｔａｍｍｅｎ  Ｓ．ら（２０１０年））に由来する。ｐＫＭＢｍ４を、以下に記載するように改変した。
Ａ）ＰａｃＩ−制限部位を突然変異誘発によって欠失させ、
Ｂ）新しい多数のクローニング部位を挿入し（Ｂｌｅｉｆら、２０１２年）、
Ｃ）アドレノドキシン、アドレノドキシン還元酵素、およびＣＹＰ１１Ａ１をコードする断片を挿入した。
【００９７】
３種すべての遺伝子は、強い誘導プロモーターＰＸｙｌＡのコントロール下にある。各遺伝子は、その自己のリボソーム結合部位を含有する。
【００９８】
大腸菌内で、ベータ−ラクタマーゼが発現され、アンピシリン耐性が付与される。
【００９９】
Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）では、テトラサイクリン耐性タンパク質が発現され、テトラサイクリン耐性が付与される。
【０１００】
ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡのプラスミドマップおよび配列は、それぞれ図１５および配列番号１に提供されている。
【０１０１】
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）株ＭＳ９４１は、ＤＳＭ３１９／Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓｔａｍｍｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに由来して、Ｄ．Ｊａｈｎ／Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇのグループから得た（Ｗｉｔｔｃｈｅｎ  Ｋ．Ｄ．およびＭｅｉｎｈａｒｄｔ  Ｆ．、１９９５年）。
【０１０２】
Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞は、Ｂａｒｇ  Ｈ．ら（２００５年）により、ＰＥＧ媒介プロトプラスト変換によって形質転換された。
【実施例２】
【０１０３】
組換えＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の培養条件および試料処理
ＬＢ−（２５ｇ／Ｌ）、ＴＢ−（２４ｇ／Ｌ  酵母エキス、１２ｇ／Ｌ  トリプトン、０．４％  グリセリン、１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液）、またはＥｎＰｒｅｓｓｏ（商標）タブレット培地を、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の培養に使用した。すべての試薬を以下の表１に列挙する。
【０１０４】
前培養：
１０μｇ／ｍＬ  テトラサイクリンを含有する培地５０ｍＬの接種を、プレートまたはグリセリンストックからの細胞で実施した。
【０１０５】
本培養：
１０μｇ／ｍＬ  テトラサイクリンを含有する培地５０ｍＬの接種を、前培養の試料５００μＬで実施した。
【０１０６】
タンパク質発現の誘導：
本培養物を約０．４の光学密度に到達するまで増殖させた。蒸留水１ｍＬ中に溶解したキシロース０．２５ｇを添加した後にタンパク質発現を誘導した。
【０１０７】
基質可溶化：
４５％  ２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン／４％  キラヤサポニン溶液中にステロイドを溶解させた。溶液２．５ｍｌをタンパク質誘導直後に培養液に添加し、０．２％の最終的なキラヤサポニン濃度および２．２５％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの最終濃度にした。
【０１０８】
ＨＰＬＣ分析のための試料処理：
固有吸収を有さないステロイドをこれらのΔ4-3−ケト−誘導体に変換して、２４０ｎｍでの測光検出を可能にした。
【０１０９】
培養試料１ｍＬを水中で１分間煮沸した。コレステロールオキシダーゼ溶液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７  ５ｍｌ中に溶解したコレステロールオキシダーゼ５ｍｇおよびＮａ−コレート５ｍｇ）２０μｌを添加し、３７℃にて１０００ｒｐｍで振盪させながら１時間、試料をインキュベートした。ＨＰＬＣ分析のために、試料を酢酸エチル１ｍＬで２回抽出し、抽出物を適切な溶媒中に溶解させた。
【０１１０】
【表１】
0006635917.tif 000002
【実施例３】
【０１１１】
ウシＣＹＰ１１Ａ１ならびにその酸化還元パートナーＡｄｘおよびＡｄＲを発現する遺伝子操作されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１によるコレステロール、コレステロール類似体および誘導体からプレグネノロンへの変換
バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）株ＭＳ９４１を、ステロイド産生酵素ＣＹＰ１１Ａ１ならびにその酸化還元パートナーＡｄｘおよびＡｄＲを発現させるように遺伝子的に改変した。実施例１に記載したように強く誘導性のプロモーターＰＸｙｌＡのコントロール下でＣＹＰ１１Ａ１、ＡｄＲ、およびＡｄｘの遺伝子を含み、配列番号２、配列番号３、および配列番号４のタンパク質をそれぞれコードする発現ベクターｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡ（図１）でＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を形質転換した。これまでのところ、ミトコンドリアチトクロムＰ４５０  ＣＹＰ１１Ａ１は、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）中で発現されていない。
【０１１２】
３種すべてのタンパク質の発現は、免疫染色することによって確認した（図１）。
【０１１３】
以下の基質を、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびキラヤサポニンで可溶化し、上述の組換え株を用いてｉｎ−ｖｉｖｏで変換した：コレステロール、７−デヒドロコレステロール、カンペステロール、エルゴスタ−５，２４−ジエノール、デスモステロール、オキシステロールの混合物、エルゴステロール、ビタミンＤ、ベータ−シトステロール、スチグマステロール、ジェネロール（図２〜１２）。
【０１１４】
結論として、この系は、疎水性ステロイドコレステロール、その植物由来類似体およびビタミンＤの全細胞生体触媒作用を可能にする上、高濃度の高度に水不溶性の化合物を吸収し、これらを高比率で変換する能力を有する。この系の産物収率は、他のプレグネノロン産生系より優れている（図１６）。
【実施例４】
【０１１５】
ウシＣＹＰ１１Ａ１ならびにその酸化還元パートナーＡｄｘおよびＡｄＲを発現する遺伝子操作されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１によるコレステロール、コレステロール類似体および誘導体からプレグネノロンへの変換のポリヒドロキシブチレート体（ＰＨＢ体）の役割。
蛍光性コレステロール類似体２５−ＮＢＤコレステロールは、生きているＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞内で炭素貯蔵の機能を果たすＰＨＢ体に局在化することが示された（データを示さず）。Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞内にＣＹＰ１１Ａ１を局在化させるために、蛍光タンパク質ｅＧＦＰおよびＣＹＰ１１Ａ１からなる融合タンパク質を生きているＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞内で発現させた。２５−ＮＢＤコレステロールと同様に、ＣＹＰ１１Ａ１ｅＧＦＰは、ＰＨＢ体内に局在化され、その同一性は、ナイルレッド染色によって確認された（データを示さず）。
【０１１６】
ＰＨＢ体産生ポリメラーゼＰｈａＣを、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のゲノムから欠失させた。簡単に言えば、ＰｈａＣ遺伝子の隣接領域からなる欠失カセットをコンストラクトした。このコンストラクトを、温度感受性複製起点を含有するプラスミド上でクローニングした。２つの相同的組換えイベントの後、プラスミドの硬化を、非許容的複製温度でインキュベートすることによって実現した。遺伝子の欠失をＰＣＲによって検証した。ＣＹＰ１１Ａ１凝集および基質貯蔵におけるＰＨＢ体の役割を検証するために、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞内のＰＨＢ体の結果として生じる欠如を、ナイルレッド染色によって監視した（データを示さず）。この形態学的な変化は、ｐＳＭＦ２．１＿ＳＣＣＡＡで形質転換されたＰｈａＣノックアウト株の全細胞変換活性を劇的に減少させた（図１３）。
【実施例５】
【０１１７】
ウシＣＹＰ１１Ａ１ならびにその酸化還元パートナーＡｄｘおよびＡｄＲを発現する遺伝子操作されたＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１株へのポリヒドロキシブチレート体（ＰＨＢ体）の調節。
ａ−  コレステロール、コレステロール類似体および誘導体からプレグネノロンへの変換
構造体枯渇（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＣＹＰ１１Ａ１発現株の基質変換活性を、ＰｈａＲ、ＰｈａＢ、およびＰｈａＣ遺伝子の元のプロモーターのコントロール下でＰｈａＲ、ＰｈａＢ、ＰｈａＣ、およびＰｈａＰ遺伝子をコードする構造オペロンをコードするプラスミドでこれを形質転換することによって回復させた（ｐＭＧＢｍ１９＿ＲＢＣＰプラスミド、図１４）。補完された株は、構造体枯渇株と比較して４８時間後に１００％超の産物収率の増大を呈した。変換活性は、野生型株と比較して依然として有意により低かった。理由は、構造オペロンの組換え発現は、ＣＹＰ１１Ａ１およびその酸化還元パートナーの発現を低減した可能性があるためである（追加のタンパク質の同時発現に起因して）。
【０１１８】
これらのデータは、全細胞系に対する顆粒構造の重要性を説得力をもって例示する。
【０１１９】
ｂ−  Ｐｈａ系遺伝子の調節によるバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１の貯蔵能力
以下のストラテジーを適用した：
１）ファシン遺伝子（バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ｐｈａＰの場合における）を過剰発現させて、顆粒のサイズを改変した。ファシン遺伝子をキシロース誘導プロモーターのコントロール下でベクター中に挿入した。バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を、得られたプラスミドで形質転換した。ｐｈａＰを過剰発現する株中での産物への基質変換の収率を、実施例２および図２〜１２に記載したように測定した。
２）Ｐｈａデポリメラーゼ遺伝子をノックアウトして顆粒の脱重合を妨害した。Ｐｈａデポリメラーゼゲノム遺伝子座を、非機能性遺伝子をもたらす遺伝子座の欠失を導入することによってＰＣＲを介して増幅させた。遺伝子置換実験において元のゲノムの機能遺伝子を非機能性のものと置き換えるために、この非機能性ＤＮＡ断片を「ノックアウト」ベクター中に挿入した。デポリメラーゼ遺伝子でノックアウトされた株中での産物への基質変換の収率を、実施例２および図２〜１２に記載したように測定した。
３）キシロース誘導プロモーターのコントロール下でベクター中に３−ケトチオラーゼ遺伝子（ｐｈａＡ）を挿入することによって、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）代謝を操作して、顆粒産生のための代謝の主な前駆体であるアセチル−ＣｏＡの産生を増大させた。バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を得られたプラスミドで形質転換した。ｐｈａＡを過剰発現する株中での産物への基質変換の収率を、実施例２および図２〜１２に記載したように測定した。４）顆粒合成に関与する遺伝子（３−ケトチオラーゼ（ｐｈａＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素（ｐｈａＢ）、ファシン（ｐｈａＰ）、およびｐｈａ合成酵素（ｐｈａＣ／ｐｈａＲ））を過剰発現させた。上述した遺伝子を、キシロース誘導プロモーターのコントロール下でベクター中に挿入した。バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を得られたプラスミドで形質転換した。ｐｈａＡ、ｐｈａＢ、ｐｈａＰ、ｐｈａＣ、およびｐｈａＲを過剰発現する株中での産物への基質変換の収率を、実施例２および図２〜１２に記載したように測定した。
５）他の生物由来のより活性なｐｈａ合成酵素を、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）ＭＳ９４１株中に導入してより多くのポリマーを産生させた。ラルストニア・オイトロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、緑膿菌、およびアロクロマチウム・ビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）由来のｐｈａ遺伝子を使用した。外因性ｐｈａ合成酵素遺伝子を、キシロース誘導プロモーターのコントロール下でベクター中に挿入した。バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）を得られたプラスミドで形質転換した。他の微生物由来のｐｈａ合成酵素を過剰発現する株中での産物への基質変換の収率を、実施例２および図２〜１２に記載したように測定した。
【０１２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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