(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のポリヌクレオチド；および
配列番号２および配列番号３のポリヌクレオチドからなる群から選択される１以上のポリヌクレオチドを含み、前記２以上のポリヌクレオチドが５’から３’方向で結合している核酸分子であって、ここで、哺乳動物細胞において標的遺伝子の転写を誘導できるプロモーターである、核酸分子。
【請求項２】
５’から３’方向で、配列番号１のポリヌクレオチドの３’末端に結合している配列番号２および配列番号３のポリヌクレオチドからなる群から選択される１以上のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
少なくとも１つの末端で制限酵素認識部位をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
配列番号９または配列番号１０のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
哺乳動物細胞の細胞質において発現される標的遺伝子のプロモーターである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
請求項１−５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
ウイルスである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ポックスウイルス科のウイルスに由来する、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
ポックスウイルス科のウイルスが、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、カプリポックスウイルス、およびスイポックスウイルス属のウイルスからなる群から選択される、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
ポックスウイルスが、ワクチニアウイルスである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１１】
核酸分子に結合している標的遺伝子をさらに含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項１２】
標的遺伝子が、腫瘍抗原、免疫応答誘導因子、腫瘍増殖抑制因子、アポトーシス誘導因子、または腫瘍組織におけるウイルスの活性の増強を助けることができる因子をコードするポリヌクレオチドである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１−５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターで形質転換された、ヒトを除く宿主。
【請求項１４】
請求項１−５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクターで形質転換された、細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポックスウイルス由来のプロモーター、プロモーターを含むベクター、プロモーターを使用して導入遺伝子を発現するための方法、および疾患の予防または治療におけるベクターの使用に関する。本発明に係るプロモーターは、導入遺伝子の強い発現の誘導のために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの遺伝物質を人体に投与することにより、遺伝的欠陥、感染症、腫瘍、心臓血管疾患等などの様々な疾患を治療するまたは予防するための方法である。有効な遺伝子送達、ならびに遺伝子発現の誘導もしくは調節は、遺伝子治療において重要である。遺伝子を細胞に送達するために使用される物質は、ベクターと呼ばれる。遺伝子送達ベクターは、非ウイルスベクターとウイルスベクターの２つのカテゴリーに大きく分けられる。
【０００３】
哺乳動物における遺伝子送達または遺伝子発現のためのウイルスベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、およびポックスウイルスが使用されてきた。その中でも、ポックスウイルスは、大きい挿入容量、格別な遺伝子送達および発現効率、および高い安全性を有し、かつ、高い力価を有するウイルスの製造およびを可能にするので、遺伝子送達および治療薬剤開発のために広く使用されている。
【０００４】
ポックスウイルス科に属するウイルスは、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、カプリポックスウイルス、スイポックスウイルス等を含む。そして、オルソポックスウイルスに属するウイルスは、天然痘ウイルス、ワクチニアウイルス等を含む。オルソポックスウイルスに属するワクチニアウイルスは、天然痘の予防のために使用されてきた。そして、オルソポックスウイルスに属するワクチニアウイルスは、遺伝子工学技術を使用する遺伝子送達ベクターとして近年開発されている。
【０００５】
ワクチニアウイルスベクターの主要な利点は、他のウイルスと比較して大きい遺伝子が導入され得ることであり（例えば、アデノ随伴ウイルスと比較して少なくとも１０倍大きい遺伝子が導入され得る）かつ、様々な細胞がウイルスに感染し得ることである。さらに、ワクチニアウイルスは、有効な免疫応答を誘導できるので、ワクチンベクターとして使用するために理想的であると考えられている。例えば、Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ  ｃｏｍｐａｎｙは、がんワクチンとしてＭＶＡベクターを使用してＰＳＡまたはＰＡＰなどの腫瘍抗原を発現する前立腺腫瘍患者に臨床試験を行っている。さらに、炭疽菌ワクチン、出血熱ウイルスワクチン、および流行性口内炎ウイルスワクチン等が開発されてきた。近年、ワクチニアウイルスも、腫瘍溶解性ウイルスとして開発されており、かつ臨床試験において研究中である。一例として、腫瘍溶解性ウイルスＪＸ−５９４が、Ｓｉｌｌａｊｅｎ（旧名：Ｊｅｎｎｅｒｅｘ）により開発されてきており、肝腫瘍、結腸腫瘍、小児腫瘍、および黒色腫患者への様々な臨床試験が行われ、または完了している。
【０００６】
理想的な遺伝子送達ベクターは、高い形質導入効率で標的細胞に遺伝子を送達し、かつ標的遺伝子の高い発現レベルを示し、その結果、良好な治療効果が達成され得るものである。また、ベクターの操作および製造は単純なものである。特に、抗原または治療遺伝子の発現を通して治療効果を高めるために、遺伝子の発現レベルは高いものである。このために、遺伝子送達ベクターによる高い形質導入効率および強いプロモーターによりコントロールされる高いレベルの遺伝子発現が必要とされる。
【０００７】
遺伝子発現のために使用される一般的なプロモーターは、ＨＣＭＶ、ＥＦ−１アルファ、ＣＡＧおよびｐＧＫプロモーターを含む。しかしながら、ポックスウイルスの場合、遺伝子転写は細胞質で行われ、従って、上記プロモーターは、ワクチニアウイルスベクターでは機能せず、ポックスウイルス由来のプロモーターが使用されるものである。代表的なポックスウイルス由来のプロモーターは、ｐ７．５、ｐＥ／Ｌ、ｐＨｙｂおよびｐ１１プロモーターを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の開示
技術的課題
本発明の目的は、高い発現レベルで標的遺伝子を発現できるポックスウイルスのための遺伝子発現調節核酸分子を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、遺伝子発現調節核酸分子を含むベクターを提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、遺伝子発現調節核酸分子および核酸分子に結合された標的遺伝子が導入されているベクターを含む組成物、ならびに疾患の治療もしくは予防のための組成物の使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、標的遺伝子の発現を強く誘導できるポックスウイルス由来のプロモーター、プロモーターを含むプラスミドベクター、およびプラスミドベクターとポックスウイルス（変異体ポックスウイルスを含む）との相同組み換えにより得られたポックスウイルスベクター、およびそれらを生成するための方法に関する。それはまた、治療遺伝子または抗原が導入されたポックスウイルスベクターである、抗腫瘍薬またはワクチンの使用に関する。
【００１２】
本発明に係る遺伝子発現調節核酸分子、すなわちプロモーターは、知られた他のポックスウイルスプロモーターと比較して高いレベルの遺伝子発現を誘導できるプロモーターを指す。従って、それらがポックスウイルスベクターにおいて使用される場合、プロモーターのコントロール下の標的遺伝子の発現レベルは増加され得、かつプロモーターを含有するベクターの治療効果は増強され得る。ポックスウイルスベクター、好ましくはワクチニアウイルスベクターが遺伝子治療のために使用される場合、プロモーターの選択は、ベクターにより送達される遺伝子の発現を増強するために重要である。
【００１３】
以下に、本発明はより詳細に記載される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一態様では、高い効率で標的遺伝子を発現できる、ポックスウイルス例えばワクチニアウイルス由来の遺伝子発現調節核酸分子（すなわちプロモーター）が提供される。
【００１５】
本発明に係るプロモーターは、配列番号１、配列番号２および配列番号３のポリヌクレオチドからなる群から選択される２以上のポリヌクレオチドを含む核酸分子であってもよい。また、それは、配列番号１のポリヌクレオチドを含む核酸分子であってもよく；かつ配列番号２および配列番号３のポリヌクレオチドからなる群から選択される１以上のポリヌクレオチドであってもよい。それは、配列番号１、配列番号２および配列番号３のポリヌクレオチドからなる群から選択される２以上の異なるポリヌクレオチドを組み合わせかつ連結させることにより形成された核酸分子であってもよい。例えば、本発明に係る核酸分子は、５’から３’方向に、配列番号１および配列番号２の融合核酸分子、配列番号１および配列番号３の融合核酸分子、配列番号１、配列番号２および配列番号３の融合核酸分子、配列番号１、配列番号３および配列番号２の融合核酸分子、配列番号２および配列番号１の融合核酸分子、配列番号２、配列番号１および配列番号３の融合核酸分子、ならびに配列番号２、配列番号３および配列番号１の融合核酸分子であってもよい。
【００１６】
配列番号１の核酸分子は、ワクチニアウイルスのＩ１Ｌ遺伝子プロモーターに由来し、下記表１で示される核酸配列を含む。配列番号２の核酸分子は、ワクチニアウイルスのＥ３Ｌ遺伝子プロモーターに由来し、下記表１で示される核酸配列を含む。配列番号３の核酸分子は、ワクチニアウイルスのＢ１９Ｒ遺伝子プロモーターに由来し、下記表１で示される核酸配列を含む。
【００１７】
一実施形態では，本発明に係る核酸分子は、５’から３’方向で、配列番号１のポリヌクレオチドの３’末端に結合している配列番号２および配列番号３のポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。例えば、それは、配列番号９または１０のポリヌクレオチドを含む核酸分子であり得る。
【００１８】
【表１】
0006736665.tif 000002
【００１９】
本明細書中で使用されるように、「ポックスウイルス」という用語は、ポックスウイルス科に属するウイルスを指す。好ましい実施形態によれば、本発明に係るポックスウイルスは、オルソポックスウイルス、アビポックスウイルス、パラポックスウイルス、カプリポックスウイルス、およびスイポックスウイルス、好ましくは天然痘ウイルスおよびワクチニアウイルスを含むオルソポックスウイルス、およびさらに好ましくはワクチニアウイルスを含んでもよい。
【００２０】
本発明に係るポックスウイルスは、野生型ポックスウイルスまたは様々な変異体ポックスウイルスを含む。ウイルスの変異型は、いくつかの遺伝子が欠失され、置換され、または挿入されたものであってもよい。例えば、ワクチニアウイルスの場合、特定の遺伝子の存在または非存在のみに依存して腫瘍細胞において複製する抗腫瘍薬として開発が試みられている。従って、様々な変異型のウイルス並びに野生型ウイルスが、使用されてもよい。
【００２１】
本発明に係るポックスウイルスベクターは、標的遺伝子のポリヌクレオチドをさらに含む。
【００２２】
本発明の一実施形態では、標的遺伝子は、発現が本発明に係るプロモーターのコントロール下で誘導される遺伝子であり、かつ遺伝子送達または遺伝子発現を通して治療効果を有するために使用されてもよい。例えば、標的遺伝子は、腫瘍抗原［例えばＭＵＣ１、ｈＴＥＲＴ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）］、免疫応答インデューサー［例えばインターロイキン（ＩＬ）−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、または可溶性ＰＤ−１］、腫瘍増殖抑制因子［例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）インヒビター、ピルビン酸キナーゼアイソザイムＭ２（ＰＫＭ２）インヒビター、またはピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＫ）インヒビター］、アポトーシス誘導因子［例えばＴＲＡＩＬ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）］、または腫瘍組織においてウイルスの活性の増加に役立ち得る因子［例えばマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ヒアルロニダーゼ、またはリラキシン］をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００２３】
本発明に係るプロモーターは、哺乳動物細胞において標的遺伝子の転写を誘導できるプロモーター、および好ましくは、哺乳動物細胞の細胞質において標的遺伝子の転写を誘導できるプロモーターである。
【００２４】
本発明のさらなる実施形態では、本発明に係るプロモーターを含むベクターが提供される。
【００２５】
ベクターは、プロモーターに結合している標的遺伝子をさらに含んでもよい。ベクターは、選択マーカーであるＥＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＬａｃＺ、またはＧｕｓＡなどの遺伝子をさらに含んでもよい。
【００２６】
本明細書中で使用されるように、「ベクター」、「遺伝子送達ベクター」または「遺伝子ベクター」という用語は、標的細胞または生物に導入遺伝子を送達できる物質を指す。
【００２７】
ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの両方を包含する。非ウイルスベクターは、プラスミドであってもよい。ウイルスベクターは、ポックスウイルスベクター、好ましくはワクチニアウイルスベクターであってもよい。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、本発明に係るプロモーターが導入されているポックスウイルスベクターが提供される。特定の実施形態では、本発明のプロモーターを含むプラスミドベクターと野生型ポックスウイルスまたは様々な変異体ポックスウイルスとの相同組み換えにより構築されたポックスウイルスベクターが提供される。
【００２９】
プラスミドベクターとポックスウイルスとの組み換えは、従来の方法により行われ得る。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、プラスミドベクターまたはポックスウイルスベクターを含む宿主に関し、宿主は、微生物、哺乳動物、哺乳動物細胞、または哺乳動物由来の細胞系列であってもよく、かつ哺乳動物は、ヒトであってもよい。
【００３１】
本発明はまた、ポックスウイルスベクター伝播方法を提供し、当該方法は以下の工程を含む（ｉ）本発明に係るポックスウイルスベクターを細胞に導入する工程（ｉｉ）ポックスウイルスベクターが産生され得るのに適した条件下で細胞を培養する工程、および（ｉｉｉ）細胞培養物からポックスウイルスベクターを回収する工程。
【００３２】
ポックスウイルスは、細胞から回収されてもよく、また、培養上清から回収されてもよい。１つの一般的に使用される方法は、ウイルスに感染した細胞を破壊し、次いで細胞溶解物中のビリオンを収集し、次いで当技術分野で知られた技術（クロマトグラフィー法、超遠心分離法等）を使用してビリオンを精製することである。
【００３３】
本発明はまた、本発明に係るポックスウイルスと共に薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物に関する。
【００３４】
本発明に係る組成物は、様々な疾患、より具体的には遺伝的欠陥、腫瘍、心臓血管疾患および感染症を予防または治療するための遺伝子治療のために使用される。
【００３５】
本発明は、ポックスウイルスベクター好ましくはワクチニアウイルスに治療遺伝子または抗原を導入することにより、様々な疾患の予防または治療のための治療薬剤またはワクチンとして適用されてもよい。また、本発明は、腫瘍溶解性ウイルスの開発のために使用されてもよい。
【００３６】
本発明に係る組成物は、局所もしくは非経口投与、または消化管もしくは他の多数の投与経路用に製剤化されてもよい。例えば、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、鼻腔内、肺内および気管支内経路が、可能であってもよい。投与は、単回投与としてまたは特定の時間間隔で１以上の用量の反復投与として行われてもよい。適切な投与経路および用量は、疾患、患者、送達ベクター、または送達される標的遺伝子などの様々な因子に依存して決定されてもよい。本発明に係るウイルス粒子に基づく薬物は、１０４から１０１４ｐｆｕ（プラークフォーミングユニット（ｐｌａｑｕｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ））、有利には１０５から１０１３ｐｆｕ、および好ましくは１０６から１０１２ｐｆｕの量で製剤化されてもよい。
【００３７】
組成物はまた、薬学的に許容可能な希釈剤、アジュバントもしくは賦形剤、ならびに可溶化剤、安定化剤および防腐剤（ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ）を含んでもよい。注射のためには、水性、非水性または等張溶液中の製剤化が好ましい。これは、使用時に適切な希釈剤で再構成し得る液体または乾燥（粉末、凍結乾燥等）形態で単回用量としてまたは複数用量として提供されてもよい。
【００３８】
本明細書中で使用されるように、「遺伝子送達」は、天然の、合成の、または組み換えの、遺伝子もしくは遺伝子フラグメントの細胞への導入（インビボまたはインビトロ）を指し、導入された遺伝子がその機能を発揮する方法である。本発明に係る導入された遺伝子または遺伝子フラグメントは、特定の配列を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ、または任意の合成等価核酸を含む。
【００３９】
本発明では、遺伝子送達ベクターを伝播させるために使用されるウイルスは、野生型または変異体ウイルスであってもよい。本明細書中で使用されるように、「遺伝子送達効率」はベクターの「遺伝子送達」効率を指し、指標（例えば発現ベクターの場合、コードされたタンパク質の発現および／またはそのタンパク質の活性等）として遺伝子機能の評価を通して検出されてもよい。
【００４０】
本発明のさらなる態様では、標的遺伝子を含む遺伝子送達ベクターを伝播させる工程および遺伝子送達ベクターを通して遺伝子を動物組織に導入する工程を含む、単離動物組織への遺伝子送達のための方法が提供される。
【００４１】
本発明に係る遺伝子送達ベクターが遺伝子治療のための組成物として使用される場合、本発明に係る投与は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）および生理食塩水などの溶液中のベクター懸濁液の直接注射または血管内投与（例えば動脈内、静脈内、または門脈内）を含む局所投与（例えば、腫瘍内、肝内、筋肉内および大脳内投与）により行われてもよい。
【００４２】
一実施形態では、遺伝子送達ベクターは、一般的に注射のための単位剤形（水溶液、懸濁液またはエマルジョン）で製造され、薬学的に許容可能な希釈剤と遺伝子送達ベクターを混合することにより製剤化される。ここで、好ましくは酸化剤および遺伝子送達ベクターに有害であると知られた他の成分は製造中に含まれない。遺伝子送達ベクターを含む医薬組成物は一般的に、水溶液または凍結乾燥形態で、単回または複数用量単位を有する容器で密封されたアンプルまたはバイアル中に保存される。
【００４３】
さらに、本発明は、１以上の本発明に係る医薬組成物が入った１以上の容器を含む医薬品パッケージまたはキットを提供する。さらに、本発明に係るベクターは、他の治療化合物とともに使用されてもよい。
【００４４】
本発明に係る遺伝子送達ベクターを含む医薬組成物は、患者の臨床状態（すなわち予防または治療される状態）、遺伝子送達ベクターを含む組成物の送達部位、標的組織、投与方法、投与スケジュールおよび他の当技術分野で知られた因子を考慮して最適な臨床設計に従って患者に投与されてもよい。従って、本発明に記載される遺伝子送達ベクターの「有効量」または適切な用量は、これらの考慮事項に基づいて決定される。
【００４５】
本発明の有利な効果
本発明は、ポックスウイルスについてのプロモーター、プロモーターを含むウイルスベクター、疾患の治療および予防におけるウイルスベクターの使用に関する。治療薬剤の効能は、高いレベルの遺伝子発現により増強され得る。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、実施例１のシングルプロモーターを含有するプラスミドでヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ細胞）のトランスフェクション後のタンパク質ルシフェラーゼの発現レベルの比較を示すグラフである。
【図２】図２は、組み換えプロモーター、すなわち実施例２のｐＧＬ４．１０−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ、ｐＧＬ４．１０−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ、およびｐＧＬ４．１０−ｐＩ１Ｌ−Ｉ１Ｌを含有するプラスミドでヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ細胞）のトランスフェクション後のルシフェラーゼの発現レベルの比較を示すグラフである。
【図３】図３は、ＤＮＡ制限酵素ＮｈｅＩまたはＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで処理されたワクチニアウイルスＴＫ（−）シャトルベクターにｐ７．５プロモーター（コントロール群）を導入することにより得られたｐＳＰ７２−ｐ７．５−ＬｕｃのＤＮＡフラグメントのサイズを示す。
【図４】図４は、制限酵素ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで同時に処理されたワクチニアウイルスＴＫ（−）シャトルベクターに実施例３のＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌプロモーターを導入することにより得られたｐＳＰ７２−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−ＬｕｃのＤＮＡフラグメントのサイズを示す。
【図５】図５は、制限酵素ＮｈｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで同時に処理されたワクチニアウイルスＴＫ（−）シャトルベクターに実施例３のＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒプロモーターを導入することにより得られたｐＳＰ７２−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−ＬｕｃのＤＮＡフラグメントのサイズを示す。
【図６】図６は、コントロール群プロモーターまたは実施例３で得られた組み換えプロモーターが導入されているワクチニアウイルスＴＫ（−）−ｐ７．５−Ｌｕｃ、ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−Ｌｕｃ、およびＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−ＬｕｃのゲノムＤＮＡのＰＣＲ確認を示す。
【図７】図７は、コントロール群プロモーターまたは実施例３で得られた組み換えプロモーターが導入されているワクチニアウイルスＴＫ（−）−ｐ７．５−Ｌｕｃ、ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−Ｌｕｃ、およびＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−Ｌｕｃの、ＲＴ−ＰＣＲにより確認されるルシフェラーゼ、ＧＦＰおよびベータアクチンのｍＲＮＡ発現レベルを示す。
【図８】図８は、コントロール群プロモーターまたは実施例３で得られた組み換えプロモーターが導入されているワクチニアウイルスＴＫ（−）−ｐ７．５−Ｌｕｃ、ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−Ｌｕｃ、およびＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−ＬｕｃのゲノムＤＮＡの確認のためのサザンブロットの結果を示す。
【図９】図９は、コントロール群プロモーターまたは実施例３で得られた組み換えプロモーターが導入されているワクチニアウイルスＴＫ（−）−ｐ７．５−Ｌｕｃ、ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−Ｌｕｃ、およびＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−Ｌｕｃで処理された、ヒト子宮頸がん細胞系列ＨｅＬａまたはヒト結腸がん細胞系列ＳＷ６２０におけるルシフェラーゼ発現レベルの比較解析を示す。
【図１０ａ−ｃ】図１０ａ−１０ｃは、コントロール群プロモーターまたは実施例３で得られた組み換えプロモーターを導入することにより構築されたワクチニアウイルスＴＫ（−）−ｐ７．５−Ｌｕｃ、ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−Ｌｕｃ、およびＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−Ｌｕｃのベクターマップを示す。
【００４７】
本発明を実施するための最良な形態
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。以下の実施例は、その範囲を限定することなく本発明をさらに説明することを意図する。
【実施例】
【００４８】
実施例１：プロモーターの調製
１−１：プロモーター遺伝子の取得およびプラスミドの構築
各プロモーターを遺伝子合成を通して得た。ヌクレオチド配列は、下記であった。遺伝子合成はＭａｃｒｏｇｅｎに依頼し、かつＢｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，  Ｉｎｃ．のＭＭ１９２Ｅをシンセサイザーとして使用した。プロモーター遺伝子は、ＷＲゲノムＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２４３３１２．１）に基づき、かつ各プロモーターの配列は下記表２で示される。
【表２】
0006736665.tif 000003
【００４９】
プラスミド構築について、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩ配列をｐＥ／ＬおよびｐＩ１Ｌプロモーター配列の末端に加え、かつＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ配列を他のプロモーター配列の末端に加えた。それぞれのｐＥ／ＬおよびｐＩ１Ｌプロモーター遺伝子をＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に挿入し、プラスミドｐＧＬ４．１０−ｐＥ／ＬおよびｐＧＬ４．１０−ｐＩ１Ｌを得た。
【００５０】
ｐ７．５、ｐ１１、ｐＥ３Ｌ、ｐＣ１１Ｒ、ｐＦ１１ＬおよびｐＢ１９Ｒプロモーター遺伝子をＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］ベクターにそれぞれ挿入し、プラスミドｐＧＬ４．１０−ｐ７．５、ｐＧＬ４．１０−ｐ１１、ｐＧＬ４．１０−ｐＥ３Ｌ、ｐＧＬ４．１０−ｐＣ１１Ｒ、ｐＧＬ４．１０−ｐＦ１１ＬおよびｐＧＬ４．１０−ｐＢ１９Ｒを生成した。
【００５１】
１−２：シングルプロモーターの活性の評価
実施例１−１で生成された８種のプラスミドそれぞれにおいて発現されるルシフェラーゼタンパク質の量は、プロモーター活性を評価するために測定した。ｐＩ１Ｌ、ｐＥ３Ｌ、ｐＣ１１Ｒ、ｐＦ１１Ｌ、およびｐＢ１９Ｒプロモーターを含むプラスミド、ならびにコントロール群として既知のｐ７．５、ｐＥ／Ｌおよびｐ１１プロモーターを含有するプラスミドを使用した。
【００５２】
プラスミドのプロモーター活性を試験するために、ＨｅＬａ細胞を実施例１−１において調製された８種のプロモーターの１つを含有するそれぞれのプラスミドでトランスフェクトし、次いでルシフェラーゼの発現の量を決定した。ＨｅＬａ細胞を１０％ウシ胎児血清を補充したＭＥＭ培地で培養し、かつ６ｘ１０４細胞／穴で２４穴培養プレートに接種した。翌日、細胞をワクチニアウイルスに感染させ、６時間後、ウイルス感染細胞を、トランスフェクション溶液を使用してウイルスプロモーターが導入されたプラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、培地を除去し、細胞溶解溶液で細胞を処理することにより得られた細胞溶解物の一部をルシフェラーゼ測定のための９６穴培養プレートに移し、かつルシフェラーゼ酵素の基質であるルシフェリンを処理した。基質分解により生成された光の量は、ルシフェラーゼ測定器を使用して測定し、各プロモーターについての測定結果は、図１に示される。図１は、それぞれのプロモーターを含有するプラスミドでのヒト子宮頸がん細胞系列であるＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後のルシフェラーゼの発現レベルの比較を示す。ｐ７．５、ｐＥ／Ｌ、およびｐ１１は、コントロール群として以前に使用されたプロモーターであり、かつｐＥ３Ｌ、ｐＣ１１Ｒ、ｐＦ１１Ｌ、ｐＢ１９ＲおよびｐＩ１Ｌは、実験群において使用される候補プロモーターである。
【００５３】
図１で示されるように、ｐＩ１Ｌが導入されたプラスミドによる遺伝子の発現レベルは、ｐ７．５、ｐＥ／Ｌまたはｐ１１プロモーターが導入されたコントロールプラスミドと比較して約３倍高く、ｐＥ３ＬまたはｐＢ１９Ｒが導入されたプラスミドによる遺伝子発現の量は、コントロール群と同様であった。
【００５４】
１−３：組み換えプロモーター遺伝子の取得
プロモーターの活性を高めるために、組み換えプロモーターは、実施例１−２におけるシングルプロモーターとして最も高い活性を示したＩ１Ｌプロモーターと比較的高い活性を示したＥ３ＬまたはＢ１９Ｒプロモーターとを組み合わせることにより生成した。各プロモーターは、実施例１−１と同様にして合成し、かつそのヌクレオチド配列は、下記のようにした。
【００５５】
【表３】
0006736665.tif 000004
プラスミド構築について、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ配列を各組み換えプロモーター配列の末端に加えた。
【００５６】
組み換えプロモーター遺伝子ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ、ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９ＲおよびｐＩ１Ｌ−Ｉ１Ｌは、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］ベクターに挿入し、プラスミドｐＧＬ４．１０−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ、ｐＧＬ４．１０−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ、およびｐＧＬ４．１０−ｐＩ１Ｌ−Ｉ１Ｌを生成した。
【００５７】
実施例２：プロモーター活性の評価
実施例１−３において生成された３種のプラスミドにおいて発現されるルシフェラーゼタンパク質の量は、プロモーター活性を評価するために測定した。
【００５８】
具体的に、プラスミドのプロモーター活性を試験するために、プラスミドでＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後にルシフェラーゼの発現レベルを測定した。１０％ウシ胎児血清を補充したＭＥＭ培地で培養したＨｅＬａ細胞を、６×１０４細胞毎穴で２４穴培養プレートに接種した。翌日、細胞をワクチニアウイルスに感染させ、６時間後、ワクチニアウイルスプロモーターが導入されたプラスミドは、トランスフェクション溶液を使用してウイルス感染細胞で処理した。２時間後、細胞周囲の培地を除去し、細胞溶解物を処置することにより得られた細胞溶解物の一部をルシフェラーゼ測定のための９６穴培養プレートに移し、ルシフェラーゼ酵素の基質であるルシフェリンで処置した。基質分解により生成された光の量は、ルシフェラーゼ測定器を使用して測定し、各プロモーターについての測定結果は、図２および表４で示される。図２は、比較的高い活性を有するｐＥ３ＬまたはｐＢ１９Ｒを、実施例１で最も高い活性を示したｐＩ１Ｌと組み合わせることにより産生された組み換えプロモーターの活性の比較を示す。
【００５９】
図２で示されるように、組み換えプロモーターｐＩ１Ｌ−Ｅ３ＬまたはｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒが導入されたプラスミドは、コントロール群としてｐ７．５プロモーターが導入されたプラスミドのものよりも約６倍高い遺伝子発現量を示し、かつ、ｐＩ１Ｌシングルプロモーターが導入されたプラスミドのものより約２．４倍高い遺伝子発現量を示した。さらに、高いプロモーター活性を有するｐＩ１Ｌプロモーターの２コピーを組み合わせることにより調製されたｐＩ１Ｌ−Ｉ１Ｌプラスミドは、ｐＩ１Ｌシングルプロモーターが導入されたプラスミドと比較して約１．５倍の増加した発現レベルを示した。
【表４】
0006736665.tif 000005
【００６０】
実施例１−２で最も高い活性を有するｐＩ１Ｌの２コピーを組み合わせることにより得られたｐＩ１Ｌ−Ｉ１Ｌの場合、ルシフェラーゼの活性は８，６６１，３４９であり、ｐＩ１Ｌと比較して２倍未満増加していた。しかしながら、ｐＩ１ＬをＥ３ＬまたはＢ１９Ｒと組み合わせる場合、活性は２倍以上増加した。図１の結果で示されるように、ｐ７．５の活性は、既存のプロモーターの中で最も高かったが、実験において使用された全てのプロモーターの活性は、ｐ７．５のものより高かったことが図２より確認された。
【００６１】
実施例３：プロモーター導入ウイルスベクター
３−１：ウイルスベクターのためのシャトルベクター構築
組み換えプロモーターが導入されたプラスミドを使用して測定されたプロモーターの活性評価の結果が、同様にウイルスに適用され得るかどうかを試験するために、本発明に係るウイルスプロモーターおよびレポーター遺伝子ルシフェラーゼは、ＴＫ遺伝子が除去されたウイルスシャトルベクターｐＳＰ７２−ＴＫ（−）に共に導入した。
【００６２】
実施例１−１でコントロール群として使用されたｐＧＬ４．１０−ｐ７．５ならびに実施例１−３で得られたｐＧＬ４．１０−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３ＬおよびｐＧＬ４．１０−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９ＲをＮｈｅＩおよびＸｂａＩにより切断し、プロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子を得た。こうして得られた遺伝子は、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩにより切断されたｐＳＰ７２−ＴＫ（−）シャトルベクターに挿入し、ｐＳＰ７２−ＴＫ（−）−ｐ７．５−Ｌｕｃ、ｐＳＰ７２−ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−Ｌｕｃ、およびｐＳＰ７２−ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−Ｌｕｃが最終的に得られた。
【００６３】
３−２：組み換えワクチニアウイルスの生成
野生型ワクチニアウイルスと共に、実施例３−１において調製された組み換えシャトルベクターを細胞に導入して組み換えウイルスを調製した。組み換えワクチニアウイルスは、相同組み換えによりワクチニアウイルスのＴＫ遺伝子位置に挿入することにより調製した。
【００６４】
具体的には、１０％ウシ胎児血清を補充したＭＥＭ培地において培養したＨｅＬａ細胞を３×１０５細胞／穴で６穴培養プレートに接種した。翌日、ワクチニアウイルスシャトルベクターｐＳＰ７２−ＴＫ（−）−ｐ７．５−Ｌｕｃ、ｐＳＰ７２−ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−Ｌｕｃ、およびｐＳＰ７２−ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−Ｌｕｃはトランスフェクション溶液で処理し、ワクチニアウイルスを０．０５ＭＯＩで感染させ、４時間後、培養培地を５％ウシ胎児血清を補充したＭＥＭ培地に交換し、次いで４８時間培養した。培養した細胞を培地から除去し、凍結融解を３回して粗ウイルスを得て、そしてプラーク単離法に３回供して純粋な組み換えウイルスのクローンを得た。
【００６５】
こうして得られたウイルスは、ＴＣＩＤ５０法を使用してＶｅｒｏ細胞におけるポテンシー（ｐｏｔｅｎｃｙ）について測定し、構造をＲＴ−ＰＣＲ、ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ、シーケンシングおよびサザンブロットにより確認し、次いで実験のために使用した。結果として、各プロモーターおよびルシフェラーゼが導入された組み換えワクチニアウイルスであるＴＫ（−）−ｐ７．５−Ｌｕｃ（図１０ａ）、ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−Ｌｕｃ（図１０ｂ）、ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−Ｌｕｃ（図１０ｃ）が、最終的に得られた。
【００６６】
３−３：ウイルスポテンシー（ｐｏｔｅｎｃｙ）の測定
感染性ウイルスの濃度は、培養宿主細胞の５０％に感染するウイルスの希釈濃度、すなわち５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）により示される。ウイルスのポテンシー（ｐｏｔｅｎｃｙ）はＴＣＩＤ５０法を使用して測定し、組み換えウイルスの特性を解析した。
【００６７】
具体的には、Ｖｅｒｏ細胞を５×１０３細胞／穴で９６穴プレートで培養し、ウイルスは、それぞれ１／１０、１／１０２、１／１０３、１／１０４、１／１０５、１／１０６、１／１０７、および１／１０８で希釈し、次いで各穴に感染させた。４日後、ＣＰＥ（細胞変性効果）が現れた穴の数を数え、力価を算出した。ウイルス力価の結果は表５で示される。
【表５】
0006736665.tif 000006
【００６８】
表５で示されるように、３種類全ての組み換えウイルスは同様の力価を示し、同様の生産性を有することを示した。
【００６９】
３−４：組み換えウイルスの構造の解析
ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲを行うためにウイルスのゲノムＤＮＡを抽出し、ＴＫ遺伝子の代わりに挿入された導入遺伝子のサイズをＰＣＲにより確認した。組み換えは、野生型ウイルスＩＨＤ−Ｗとの比較により確認した。
【００７０】
結果は図６に示される。図６に示されるように、野生型ウイルスの場合は９６６ｂｐフラグメントがＰＣＲにより増幅され、組み換えウイルスの場合は遺伝子導入により増幅されるフラグメントの長さが３．１−３．２Ｋｂに増加し、ＤＮＡ構造に異常はないことを示したことを確認した。
【００７１】
ＨｅＬａ細胞を３ｘ１０５細胞／穴で６穴培養皿で培養し、ウイルスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを行い、上記の力価測定に供した組み換えウイルスを０．０５ＭＯＩ処理後に４８時間培養した。そして、細胞をトリゾール処理により溶解し、ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡをインビトロで合成した。導入遺伝子の構造は、鋳型としてＤＮＡを使用してＰＣＲにより解析し、組み換えを確認した。図７は、外来遺伝子が導入されていない野生型ウイルスとは異なり、ルシフェラーゼおよびＥＧＦＰのｍＲＮＡが、３種類全ての組み換えウイルスにおいてよく発現していることを示す。
【００７２】
サザンブロットを行うために、ＨｅＬａ細胞を２ｘ１０６細胞／穴で７５Ｔ培養皿で培養し、上記の力価測定に供した組み換えウイルスは、０．０５ＭＯＩ処理後７２時間培養した。細胞培養培地を除去した後、細胞を凍結融解を３回してウイルスを得た。ウイルスのゲノムＤＮＡを、抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で切断し、かつバンドを０．８％アガロースから分離し、ナイロンメンブレンにトランスファーし、１２０℃で固定化し、ＤＩＧ−ラベル化プローブとハイブリダイズさせた。洗浄およびブロッキング工程後に最終基質と接触させた後、選択的ＤＮＡバンドを同定した。サザンブロット解析の結果は、図８で示される。
【００７３】
図８で示されるように、野生型ウイルスの場合、プローブは５００５ｂｐのＤＮＡフラグメントに結合したが、組み換えウイルスの場合、プローブは遺伝子導入により１３３７ｂｐに減少したＤＮＡフラグメントに結合した。従って、導入遺伝子が導入された部位のＤＮＡ構造に異常はないことがわかった。プローブが結合する部位は青色の矢印で示される。
【００７４】
実施例４：組み換えウイルスによるタンパク質発現レベルの評価
実施例３−２で構築された組み換えワクチニアウイルスＴＫ（−）−ｐ７．５−Ｌｕｃ、ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−Ｌｕｃ、ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−Ｌｕｃをヒト子宮頸がん細胞系列ＨｅＬａまたはヒト結腸がん細胞系列ＳＷ６２０に感染させ、それぞれのプロモーターにより調節されるルシフェラーゼの発現レベルを解析した。
【００７５】
具体的に、１０％ウシ胎児血清を補充したＭＥＭ培地において培養したＨｅＬａ細胞またはＳＷ６２０細胞は、２×１０５細胞／穴で１２穴培養プレートに接種した。翌日、それらは１ＭＯＩでそれぞれの組み換えウイルス（野生型ＷＴ、ｐ７．５、Ｉ１Ｌ−Ｅ３Ｌ、およびＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ）に感染させた。６時間後、細胞を取り囲む培養培地を除去し、細胞溶解溶液を加えた。細胞溶解物の一部をルシフェラーゼ測定のための９６穴培養プレートに移し、ルシフェラーゼ酵素の基質であるルシフェリンで処理した。ルシフェラーゼ測定器を使用して、基質分解により生成された光の量を測定し、結果は図９で示される。図９は、ヒト子宮頸がん細胞系列ＨｅＬａまたはヒト結腸がん細胞系列ＳＷ６２０が組み換えワクチニアウイルスＴＫ（−）−ｐ７．５−Ｌｕｃ、ＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｅ３Ｌ−Ｌｕｃ、およびＴＫ（−）−ｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒ−Ｌｕｃに感染した後の、ルシフェラーゼの発現レベルの解析の結果を示す。
【００７６】
図９で示されるように、ＨｅＬａおよびＳＷ６２０の両方におけるｐＩ１Ｌ−Ｂ１９Ｒプロモーターを含有する組み換えウイルスによるルシフェラーゼ発現レベルは、ｐ７．５プロモーターを含有するコントロールウイルスのルシフェラーゼ発現レベルより約２倍高い。
【図１】
0006736665.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【配列表】
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