(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択されるＲＡＧＥアプタマーを含む、糖尿病性腎症および高血圧性腎障害から選択されるＲＡＧＥ関連疾患を治療または予防するための医薬組成物：
（１）配列番号１または４の配列を含む、一本鎖ＤＮＡ；
（２）配列番号１または４の配列と９０％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ；および、
（３）配列番号１または４の配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ。
【請求項２】
ＲＡＧＥ関連疾患が糖尿病性腎症である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ＲＡＧＥ関連疾患が高血圧性腎障害である、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
ＲＡＧＥアプタマーが、配列番号１または４の配列を含む一本鎖ＤＮＡである、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
ＲＡＧＥアプタマーが、配列番号１または４の配列からなる一本鎖ＤＮＡである、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
ＲＡＧＥアプタマーが配列番号１の配列を含む一本鎖ＤＮＡである、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
ＲＡＧＥアプタマーが配列番号４の配列を含む一本鎖ＤＮＡである、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
以下からなる群から選択される、アプタマー：
（１）配列番号１または４の配列を含む、一本鎖ＤＮＡ；
（２）配列番号１または４の配列と９０％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ；および、
（３）配列番号１または４の配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号１または４の配列を含む一本鎖ＤＮＡである、請求項８記載のアプタマー。
【請求項１０】
配列番号１または４の配列からなる一本鎖ＤＮＡである、請求項８または９記載のアプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＡＧＥアプタマーおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（Advanced Glycation End-products；ＡＧＥ）は、グルコースなどの還元糖のカルボニル基と、タンパク質のアミノ基との非酵素的な反応（メイラード反応）により生じる高分子物質である。糖尿病などで慢性的に高血糖が続くと、循環血液中や組織でＡＧＥの生成が促進される。ＡＧＥは、その受容体であるＲＡＧＥ（Receptor for AGE）を介して、糖尿病合併症の発症や進展に関与することが知られている。また、ＡＧＥは、アルツハイマー病などの神経変性疾患や、悪性腫瘍の増殖、転移、浸潤などへの関与も報告されている。
【０００３】
本発明者らは、これまでに、ＡＧＥに結合するアプタマーを作成し、これらが網膜周皮細胞のアポトーシスを抑制すること（特許文献１、非特許文献１）、２型糖尿病モデル動物において腎保護効果を発揮すること（特許文献２）を報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２００６／０８０２６２号公報
【特許文献２】国際公開２０１２／０７０６２１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Microvascular Research 74 (2007) 65-69
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＲＡＧＥに対するアプタマー、およびＲＡＧＥ関連疾患を治療または予防するための医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＲＡＧＥアプタマーを含む、ＲＡＧＥ関連疾患を治療または予防するための医薬組成物を提供する。
【０００８】
本発明は、以下からなる群から選択される、アプタマーを提供する：
（１）配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む、一本鎖ＤＮＡ；
（２）配列番号１〜１０のいずれかの配列と９０％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ；および、
（３）配列番号１〜１０のいずれかの配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害するアプタマー、およびＲＡＧＥ関連疾患を治療または予防するための医薬組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、ＥＬＩＳＡにおいてＡＧＥまたはＨＭＧＢ１とＲＡＧＥとの結合をＲＡＧＥアプタマーが阻害することを示す。ＡＧＥまたはＨＭＧＢ１を固定化したプレートを使用した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＥＬＩＳＡにおいてＨＭＧＢ１とＲＡＧＥとの結合をＲＡＧＥアプタマーが阻害することを示す。ＲＡＧＥのＶドメイン（ｖ−ＲＡＧＥ）を固定化したプレートを使用した。
【図２】図２は、ＱＣＭ（quartz crystal microbalance）法においてＡＧＥまたはＨＭＧＢ１とＲＡＧＥとの結合をＲＡＧＥアプタマーが阻害することを示す。
【図３】図３は、ヒト近位尿細管細胞（ＲＰＴＥＣ細胞）においてＲＡＧＥアプタマーがアゴニスト作用を有するか否かについて検討した結果を示す。
【図４】図４は、活性酸素（ＲＯＳ）産生に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図５】図５は、線維化促進因子や炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図６】図６は、線維化促進因子のタンパク質発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図７】図７は、糖尿病ラットにおける尿中アルブミンおよび尿中８ＯＨｄＧに対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図８】図８は、糖尿病ラットの糸球体におけるＲＡＧＥのタンパク質発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図９】図９は、糖尿病ラットの糸球体におけるＲＡＧＥおよびＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１０】図１０は、ヒトメサンギウム細胞における活性酸素種（ＲＯＳ）産生に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す（＊＊：ｐ＜０．０１）。
【図１１】図１１は、ヒトメサンギウム細胞におけるＲＡＧＥのｍＲＮＡ発現や炎症性サイトカインや細胞接着因子のｍＲＮＡ発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す（＊：ｐ＜０．０５）。
【図１２】図１２は、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験２の概要を示す。
【図１３】図１３は、高血圧マウスにおける糸球体内ＣＭＬ沈着に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１４】図１４は、高血圧マウスにおけるＯＮＯＯ−発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１５】図１５は、高血圧マウスにおけるポドサイト障害に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１６】図１６は、高血圧マウスの腎臓中の８ＯＨｄＧに対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１７】図１７は、高血圧マウスの腎臓中のＲＡＧＥに対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１８】図１８は、高血圧マウスの血漿ＣＭＬレベルに対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図１９】図１９は、高血圧マウスの糸球体における細胞外基質蓄積に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【図２０】図２０は、高血圧マウスの腎臓におけるＭＲおよびＲａｃ１の発現に対するＲＡＧＥアプタマーの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
「ＲＡＧＥ」（Receptor for AGE）は、膜貫通型の細胞表面タンパク質であり、ＣＭＬ（Nε-(carboxymethyl) lysine）を含む終末糖化産物（ＡＧＥ）の受容体として機能する。ＲＡＧＥのリガンドとしては、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥ−２を含む各種ＡＧＥの他、ＨＭＧＢ−１（High Mobility Group Box 1）およびＬＰＳなどが知られている。
【００１２】
「アプタマー」は、特異的に標的物質に結合する能力を持った一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであり、種々の立体構造をとりタンパク質や化合物に結合して抗体のような機能を発揮する。本明細書において「ＲＡＧＥアプタマー」とは、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。
【００１３】
ＲＡＧＥアプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）法によって調製することができる。一本鎖ＤＮＡをライブラリー源とするＳＥＬＥＸ法の概要を以下に説明する。まず、任意の２つのプライマー配列で挟まれた適当な長さのランダム配列を含むテンプレートＤＮＡを合成する。本発明においては、ランダム配列の長さは、３５塩基〜１２０塩基が適切である。このテンプレートＤＮＡをＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）で増幅して、ランダムＤＮＡアプタマープールを得る。次いで、このランダムＤＮＡアプタマープールを標的物質と会合させ、結合しなかったＤＮＡを除去し、そして結合したＤＮＡアプタマーを抽出する。得られたＤＮＡアプタマーを、上記プライマー配列を用いるＰＣＲによって増幅する。このとき、５〜８ｍＭのＭｇ２＋存在下でＰＣＲを行って、複製の正確性を低下させて変異を導入しやすくすることにより、標的物質との会合前のＤＮＡアプタマープールに存在しない新たなＤＮＡアプタマーを含むＤＮＡアプタマープールが得られる。新たなＤＮＡアプタマーは、結合力がより強い可能性があり、すなわち、ＤＮＡアプタマーが進化する可能性が生じる。この進化したＤＮＡアプタマープールについて、上記の一連の操作を５〜１５ラウンド繰り返すことによって、標的物質に結合するＤＮＡアプタマーが得られる。最終ラウンドの後、得られたＤＮＡアプタマープールは、当業者が通常行う操作によってクローニングされ、次いで配列決定される。このＳＥＬＥＸ法における、テンプレートＤＮＡの合成、ＰＣＲなどの操作、ならびにクローニングおよび配列決定は、当業者が通常用いる方法によって行われる。本発明のＲＡＧＥアプタマーは、このようにして決定された配列に基づいて、当業者が通常用いる方法によって化学合成することができる。
【００１４】
ＲＡＧＥアプタマーは、その安定性を増加させるため、修飾ヌクレオチドにより構成されていてもよい。例えば、ＲＡＧＥアプタマーは、ヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換されたホスホロチオエート（Ｓ化）オリゴヌクレオチドであってよい。
【００１５】
ＲＡＧＥアプタマーは、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡのいずれであってもよいが、好ましくは一本鎖ＤＮＡである。ＲＡＧＥアプタマーは、少なくとも３５塩基からなり、好ましくは３５塩基〜１２０塩基、より好ましくは３５塩基〜７０塩基である、さらにより好ましくは３５塩基〜５０塩基である。
【００１６】
ある態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、以下の配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む一本鎖ＤＮＡである。
CCTGATATGGTGTCACCGCCGCCTTAGTATTGGTGTCTAC  （配列番号１）
TCTGTTCAGGTTGGTACGGTGGAAGGTGTGATTCACGAGG  （配列番号２）
CTTGGGTTGTTTATGTCGACCGCCAGTTTTGTGTTCAGCA  （配列番号３）
CATTCTTAGATTTTTGTCTCACTTAGGTGTAGATGGTGAT  （配列番号４）
TTGGTTCTCTTGCCCTCTTCTATTTTGTACGATGTTTCCT  （配列番号５）
TTCCACTGAGTGCCGCGGACTGTTGTTGGGAGGTGGTGTG  （配列番号６）
ATGGGGAGGAGGGGTGTCGTGGGGGGTGGGGGAGTGGGGA  （配列番号７）
CTGGGGATGACTCGGATAGGATGTACGAGTTTGATGTGTA  （配列番号８）
TTTGATCGAGCTGCGCCCTCCTCGCCGTAGAAGAGTGTGT  （配列番号９）
TTTGGGGTGGAGTTAGGGGTGGATCAAGCGGGATTGTGTA  （配列番号１０）
【００１７】
ＲＡＧＥアプタマーは、配列番号１〜１０のいずれかの配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらにより好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡであってよい。また、ＲＡＧＥアプタマーは、配列番号１〜１０のいずれかの配列において１、２、または３個の塩基が欠失、置換、または付加された配列を含み、ＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害する、一本鎖ＤＮＡであってもよい。
【００１８】
「配列同一性」とは、２つのオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。塩基配列の配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
【００１９】
ＲＡＧＥアプタマーがＲＡＧＥに結合してＲＡＧＥとそのリガンドとの結合を阻害するか否かは、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＱＣＭ（quartz crystal microbalance）法により調べることができる。ＥＬＩＳＡの場合、ＡＧＥと結合するＲＡＧＥのＶドメイン（ｖ−ＲＡＧＥ）とＲＡＧＥアプタマーとを前反応させ、この反応混合物をＲＡＧＥのリガンド（例えばＡＧＥまたはＨＭＧＢ１）を固定化したＥＬＩＳＡプレートに添加して、プレート中のリガンドに結合したＲＡＧＥを抗ＲＡＧＥ抗体で検出する。あるいは、ｖ−ＲＡＧＥをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ＲＡＧＥアプタマーとそのリガンドとを添加して、ｖ−ＲＡＧＥに結合したリガンドを抗体により検出してもよい。ＱＣＭ法では、ＱＣＭセンサープレートにｖ−ＲＡＧＥを固定化し、ＲＡＧＥアプタマーの存在下または非存在下にＲＡＧＥのリガンドを添加して、ｖ−ＲＡＧＥに対するリガンドの結合をモニタリングすればよい。
【００２０】
好ましい態様において、ＲＡＧＥアプタマーは、配列番号１〜１０のいずれかの配列を含む一本鎖ＤＮＡであり、より好ましくは、配列番号１〜１０のいずれかの配列からなる一本鎖ＤＮＡである。
【００２１】
ＲＡＧＥアプタマーは、ＲＡＧＥとそのリガントとの結合を阻害することにより、ＲＡＧＥ関連疾患を治療または予防することができる。ＲＡＧＥ関連疾患としては、糖尿病合併症や高血圧性腎障害が挙げられる。
【００２２】
糖尿病合併症としては、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、および糖尿病性神経障害が挙げられる。糖尿病には、１型糖尿病、２型糖尿病、遺伝子の異常、肝臓や膵臓の病気、感染症、免疫の異常などの他の病気および薬剤が原因となって惹起される糖尿病、および妊娠糖尿病が含まれる。高血圧性腎障害としては、高血圧性腎硬化症が挙げられる。
【００２３】
疾患または症状の「治療」には、当該疾患または症状の改善および寛解、並びに当該疾患または症状の進展の抑制が含まれる。また、疾患または症状の「予防」には、当該疾患または症状の発症の抑制および遅延が含まれる。
【００２４】
ＲＡＧＥアプタマーは、糖尿病性腎症の治療または予防に好適である。糖尿病性腎症は、糖尿病によって腎臓の糸球体が細小血管障害のため硬化して数を減じていく病気である。糖尿病性腎症の治療または予防には、腎機能の悪化の抑制または保護、および腎組織の保護が含まれる。腎機能の指標の非限定的な例としては、尿中アルブミン排出量、尿中アルブミン／クレアチニン比、血中のクレアチニン・クリアランス、血中尿素窒素量、血中クレアチニン量が挙げられる。また、糖尿病性腎症の治療または予防には、メサンギウム基質の増加、糸球体基底膜の肥厚、糸球体の線維化（硬化）、および／または腎肥大（腎臓／体重比の増加）の抑制、および酸化ストレスの抑制が含まれる。酸化ストレスの指標としては、尿中８ＯＨｄＧ（8-Hydroxydeoxyguanosine）排出量が挙げられる。
【００２５】
本発明の組成物は、ＲＡＧＥアプタマーを医薬上許容される担体と配合し、固形製剤（例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤など）、または液状製剤（例えば、シロップ剤、注射剤など）として製造することができる。医薬上許容される担体としては、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エステル等）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明の組成物の投与方法は、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、本発明の組成物は、経口投与、静脈内投与、または皮下投与により投与することができるが、静脈内投与によることが好ましい。本発明の組成物の投与量もまた、投与方法、投与対象の年齢、体重、健康状態等によって適宜選択される。例えば、成人１日当たり、ＲＡＧＥアプタマーの量として１ｍｇ〜１００ｇを投与することができるが、これに限定されない。
【００２７】
本発明は、ＲＡＧＥ関連疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする患者にＲＡＧＥアプタマーを投与することを含む方法、および、ＲＡＧＥ関連疾患を治療または予防するための医薬の製造のため、ＲＡＧＥアプタマーの使用を提供する。
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００２９】
１．ＲＡＧＥアプタマーの合成
ＲＡＧＥに結合するアプタマーを、ＳＥＬＥＸ法により選択した。ＳＥＬＥＸ法は、国際公開２００６／０８０２６２号公報の実施例１と同様にして実施した。５’末端にフォワードプライマー（AGCTCAGAATGGATCCAAACGCTCA）（配列番号１２）と同じ配列、３’末端にリバースプライマー（GATCCGGCCGAATTCTCATGTCGAA）（配列番号１３）に相補的な配列を含み、その間に４０塩基のランダム配列を含む９０塩基のテンプレートＤＮＡを合成し、このテンプレートＤＮＡをフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて増幅して、ランダムＤＮＡアプタマープールを得た。得られたランダムＤＮＡアプタマーを、ＲＡＧＥのＶドメイン（ｖ−ＲＡＧＥ）を付着させたカラムに通し、結合活性の無いアプタマーは除去して、ＲＡＧＥに結合するアプタマーを抽出した。ｖ−ＲＡＧＥは、ＲＡＧＥのｃＤＮＡをテンプレートとして大腸菌用ベクターにサブクローニングした後、発現させ、精製した。使用したｖ−ＲＡＧＥはヒトＲＡＧＥのaa23-121に相当し、アミノ酸配列は以下のとおりである。
Human vRAGE(23-121)
AQNITARI GEPLVLKCKG APKKPPQRLE WKLNTGRTEA WKVLSPQGGG
PWDSVARVLP NGSLFLPAVG IQDEGIFRCQ AMNRNGKETK SNYRVRVYQIP （配列番号１４）
ＲＡＧＥに結合するＤＮＡアプタマーを再度ＰＣＲ増幅し、ＲＡＧＥに対する結合活性のあるＤＮＡアプタマーのみを再度カラムにかけることを繰り返した。
【００３０】
その結果、ＲＡＧＥに結合するアプタマーとして、以下の１０種類の配列が選択された。
CCTGATATGGTGTCACCGCCGCCTTAGTATTGGTGTCTAC  （配列番号１）
TCTGTTCAGGTTGGTACGGTGGAAGGTGTGATTCACGAGG  （配列番号２）
CTTGGGTTGTTTATGTCGACCGCCAGTTTTGTGTTCAGCA  （配列番号３）
CATTCTTAGATTTTTGTCTCACTTAGGTGTAGATGGTGAT  （配列番号４）
TTGGTTCTCTTGCCCTCTTCTATTTTGTACGATGTTTCCT  （配列番号５）
TTCCACTGAGTGCCGCGGACTGTTGTTGGGAGGTGGTGTG  （配列番号６）
ATGGGGAGGAGGGGTGTCGTGGGGGGTGGGGGAGTGGGGA  （配列番号７）
CTGGGGATGACTCGGATAGGATGTACGAGTTTGATGTGTA  （配列番号８）
TTTGATCGAGCTGCGCCCTCCTCGCCGTAGAAGAGTGTGT  （配列番号９）
TTTGGGGTGGAGTTAGGGGTGGATCAAGCGGGATTGTGTA  （配列番号１０）
選択した１０種類の配列に基づき、ヌクレオチド間の結合部位にあるリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換されたアプタマーを合成した。また、コントロールアプタマーとして配列番号１１（TTCGGCCTGGGGGCGGCCAGTTCGGGTCCAGTCGCGGGAG）の配列を有するアプタマーを合成した。合成したＲＡＧＥアプタマーおよびコントロールアプタマーを表１に示す。
【表１】
0006679096.tif 000002
【００３１】
２．ＲＡＧＥアプタマーによるＲＡＧＥとそのリガンドとの結合の阻害
【００３２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Sigma社製）を無菌状態で、Ｄ−グリセルアルデヒドと３８℃にて７日間インキュベートした。未反応の糖を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の透析によって除去した。使用する前に、Endospecy ES-20Sシステム（生化学工業）を用いて、エンドトキシンがないことを確認した。得られたＡＧＥ−２を以下の実験でＡＧＥとして使用した。
【００３３】
ヒトＨＭＧＢ１（全長）を、大腸菌用ベクターにサブクローニングした後、発現させ、精製した。使用したＨＭＧＢ１のアミノ酸配列は以下のとおりである。
Human HMGB1(1-215)
MGKGDPKKPR GKMSSYAFFV QTCREEHKKK HPDASVNFSE FSKKCSERWK
TMSAKEKGKF EDMAKADKAR YEREMKTYIP PKGETKKKFK DPNAPKRPPS
AFFLFCSEYR PKIKGEHPGL SIGDVAKKLG EMWNNTAADD KQPYEKKAAK
LKEKYEKDIA AYRAKGKPDA AKKGVVKAEK SKKKKEEEED EEDEEDEEEE
EDEEDEDEEE DDDDE （配列番号１５）
【００３４】
ＥＬＩＳＡプレートにＡＧＥまたはＨＭＧＢ１を固定化（最終濃度１μｇ／ウェル）した。ＲＡＧＥアプタマー（０．５μＭ）とｖ−ＲＡＧＥ（１．０μＭ）とを３０分間前反応させ、反応混合物を前記ＥＬＩＳＡプレートに添加して、プレート中のリガンドに結合したＲＡＧＥを抗ＲＡＧＥ抗体（Abcam）により検出した（図１Ａ）。同様に、ＥＬＩＳＡプレートにｖ−ＲＡＧＥを固定化（最終濃度１μｇ／ウェル）し、ＲＡＧＥアプタマー（０．５μＭ）とＨＭＧＢ１（１．０μＭ）とをプレートに添加して、プレート中のｖ−ＲＡＧＥに結合したＨＭＧＢ１を抗ＨＭＧＢ１抗体により検出した（図１Ｂ）。
【００３５】
ＱＣＭセンサープレートにｖ−ＲＡＧＥを固定化し（１００ μｇ／ｍＬ溶液を１０μＬ添加）、ＲＡＧＥアプタマーの存在下（１００ｎＭ）または非存在下（０ｎＭ）にＡＧＥ（１μｇ）またはＨＭＧＢ１（１μｇ）を添加して、ｖ−ＲＡＧＥに対するＡＧＥまたはＨＭＧＢ１の結合をモニタリングした。
【００３６】
ヒトＲＰＴＥＣ細胞をＲＡＧＥアプタマー（ＲＡＧＥ−ａｐｔ）（＃４）（０．１μＭ）とともに４時間インキュベートし、ＴＧＦ−β、ＣＴＧＦ、およびＲＡＧＥのｍＲＮＡの発現を定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。
【００３７】
合成したＲＡＧＥアプタマーは、ＲＡＧＥとＡＧＥとの結合、およびＲＡＧＥとＨＭＧＢ１との結合を阻害することが確認された（図１Ａおよび１Ｂ、図２）。また、ＲＡＧＥアプタマーは、ＲＰＴＥＣ細胞においてＲＡＧＥの下流因子であるＴＧＦ−βおよびＣＴＧＦの発現、並びにＲＡＧＥの発現に影響せず、ＲＡＧＥに対するアゴニスト活性を有さないことが確認された（図３）。
【００３８】
３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験１
３．１．方法
ヒトＲＰＴＥＣ細胞に１００μｇ／ｍｌのＡＧＥまたは５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与し、ＲＡＧＥアプタマー（ＲＡＧＥ−ａｐｔ）（＃４）（０．１μＭ）またはコントロールアプタマー（Ｃｔｒ−ａｐｔ）（０．１μＭ）とともに４時間（ＲＯＳまたはｍＲＮＡの測定の場合）または２４時間（タンパク質の測定の場合）インキュベートした。ＲＯＳの産生はＣＭ−Ｈ（２）ＤＣＦＤＡにより測定した。ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、定量的リアルタイムＰＣＲおよびウェスタンブロッティングにより測定した。
【００３９】
３．２．細胞内酸化ストレスの産生に対する効果
ＣＭ−Ｈ（２）ＤＣＦＤＡを用いて細胞内のＲＯＳを測定した結果、ＡＧＥの投与により誘導されるＲＯＳの産生は、ＲＡＧＥアプタマーの投与により抑制された（図４）。
【００４０】
３．３．線維化促進因子および炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現に対する効果
ＡＧＥの投与により誘導される線維化促進因子または炎症性サイトカインであるＴＧＦ−β、ＣＴＧＦ、およびＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現は、ＲＡＧＥアプタマーの投与により、コントロールと同じレベルまで抑制された（図５）。また、ＡＧＥの投与により誘導されるＲＡＧＥのｍＲＮＡ発現も、ＲＡＧＥアプタマーにより抑制された（図５）。
【００４１】
３．４．線維化促進因子のタンパク質発現に対する効果
ＡＧＥの投与により誘導される線維化促進因子のＴＧＦ−βおよびＣＴＧＦの発現がＲＡＧＥアプタマーにより抑制されることが、タンパク質レベルでも確認された（図６）。
【００４２】
４．ｉｎ  ｖｉｖｏ実験１
４．１．方法
８週齢雄ウィスターラットにストレプトゾトシン（Ｓｔｚ）（６０ｍｇ／ｋｇ）（クエン酸緩衝液中）を１回腹腔内投与することで糖尿病を誘発した。コントロールのラットにはクエン酸緩衝液のみを投与した。前記ラットを２群に分け、ＲＡＧＥアプタマー（ＲＡＧＥ−ａｐｔ）（＃１）またはコントロールアプタマー（Ｃｔｒ−ａｐｔ）を、浸透圧ミニポンプを用いた持続注入により投与した（０．８７３μｇ／日）（コントロールラット（Ｃｏｎ）＋Ｃｔｒ−ａｐｔ（ｎ＝４）；コントロールラット（Ｃｏｎ）＋ＲＡＧＥ−ａｐｔ（ｎ＝４）；糖尿病ラット（Ｓｔｚ）＋Ｃｔｒ−ａｐｔ（ｎ＝６）；糖尿病ラット（Ｓｔｚ）＋ＲＡＧＥ−ａｐｔ（ｎ＝６））。２週間のアプタマーの持続注入後、尿、血液、および腎臓を採取した。採取した尿中のアルブミン量および８ＯＨｄＧ量をＥＬＩＳＡにより測定した。アルブミン尿は、糖尿病性腎症の早期マーカーであり、８ＯＨｄＧはＤＮＡの酸化障害マーカーである。また、腎炎のマーカーであるＭＣＰ−１の発現を定量的リアルタイムＰＣＲにより評価した。さらに、採取した腎臓から糸球体切片を作成し、この実験系においてはabcam社製の抗ＲＡＧＥポリクローナル抗体を用いた免疫染色により糸球体におけるＲＡＧＥの発現を検討した。
【００４３】
４．２．尿中アルブミンおよび尿中８ＯＨｄＧ
糖尿病を誘発したラットでは、コントロールのラットと比較して尿中アルブミンと尿中８ＯＨｄＧの値が高かったが、ＲＡＧＥアプタマーを２週間投与することにより、コントロールアプタマーを投与したラットと比較して尿中アルブミンと尿中８ＯＨｄＧの値が有意に減少した（図７）。
【００４４】
４．３．糸球体におけるＲＡＧＥのタンパク質発現
糖尿病を誘発したラットでは、コントロールのラットと比較して糸球体におけるＲＡＧＥの発現が上昇したが、ＲＡＧＥアプタマーの投与によりコントロールのレベルまでＲＡＧＥの発現が減少した（図８）。
【００４５】
４．３．糸球体におけるＲＡＧＥおよびＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現
糖尿病を誘発したラットでは、コントロールのラットと比較してＲＡＧＥおよびＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現が上昇したが、ＲＡＧＥアプタマーの投与によりこれらの発現上昇は有意に抑制された（図９）。
【００４６】
５．ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験２
５．１．方法
ヒトＭｅｓａｎｇｉｕｍｕ細胞に５０μｇ／ｍｌのＡＧＥまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を投与し、ＲＡＧＥアプタマー（ＲＡＧＥ−ａｐｔ）（＃１）（０．１μＭ）またはコントロールアプタマー（Ｃｔｒ−ａｐｔ）（０．１μＭ）とともに４時間（ＲＯＳの測定の場合）または２４時間（ｍＲＮＡの測定の場合）インキュベートした。ＲＯＳの産生はＣａ−Ｈ（２）ＤＦＦＤＡにより測定した。ｍＲＮＡの発現は、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。
【００４７】
５．２．細胞内酸化ストレスの産生に対する効果
Ｃａ−Ｈ（２）ＤＦＦＤＡを用いて細胞内のＲＯＳを測定した結果、ＡＧＥの投与により誘導されるＲＯＳの産生は、ＲＡＧＥアプタマーの投与により抑制された（図１０）。
【００４８】
５．３．ＲＡＧＥおよび炎症性サイトカイン、細胞接着性因子のｍＲＮＡ発現に対する効果
ＡＧＥの投与により誘導されるＲＡＧＥおよび炎症性サイトカインまたは細胞接着性因子であるＭＣＰ−１、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現は、ＲＡＧＥアプタマーの投与により、コントロールと同じレベルまで抑制された（図１１）。
【００４９】
６．ｉｎ  ｖｉｖｏ実験２
６．１．方法
片腎摘した８週齢雄のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに、アルドステロンの前駆体である酢酸デオキシコルチコステロン（ＤＯＣＡ）５０ｍｇを皮下投与し、アルドステロン誘導性高血圧モデルマウスを作成した。図１２に示す投与計画に従って、浸透圧ポンプを用いて、スピロノラクトン（２０ｍｇ／ｋｇ／日、ゾンデにて１日１回経口投与）、ＲＡＧＥアプタマー（＃４）またはコントロールアプタマーを投与した。２１日後に屠殺し、尿、血液、および腎臓を採取した。
【００５０】
６．２．ＣＭＬの組織沈着に対する効果
ＡＧＥの１つであるＣＭＬの組織沈着を調べるために、４μｍの腎組織切片を用いて免疫染色を行った。Abcamより販売されている抗ＣＭＬ抗体を使用し、発色にはＤＡＢのキットを使用した。また、抗ＲＡＧＥポリクローナル抗体（Abcam）を用いた免役染色によりＲＡＧＥの発現を調べた。染色結果をＴＩＦにて取り込み、ImageJ を用いて染色された面積を計算し、群間での比較を行った。結果を図１３に示す。ＤＯＣＡ投与により糸球体内でＣＭＬ沈着が著明に亢進したが、ＲＡＧＥアプタマーによって有意に抑制された。また、ＤＯＣＡ投与によって糸球体内のＲＡＧＥ発現は著明に亢進したが、ＲＡＧＥアプタマーによって有意に抑制された。
【００５１】
６．３．酸化ストレスに対する効果
酸化ストレスの１つであるＯＮＯＯ−のマーカーであるニトロタイロシンを染色することにより、ニトロタイロシンとＣＭＬの二重染色を行った。抗ニトロタイロシン抗体（abcam）と前述の抗ＣＭＬ抗体を１次抗体として、４μｍの腎組織切片をインキュベートし、Alexa fluor の４８８と５６１を二次抗体として、二重染色を行った。結果を図１４に示す。ＤＯＣＡ投与によりポドサイト（糸球体上皮細胞）でニトロタイロシンの増加を認め、それはＣＭＬと共局在していた。ＲＡＧＥアプタマーはニトロタイロシンの発現を有意に抑制した。
【００５２】
６．４．ポドサイト障害に対する効果
４μｍの腎組織切片を１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングした後に、１：１００で希釈した抗ポドシン抗体（京都大学大学院淺沼克彦先生より譲渡）と終夜インキュベーションした。その後、Alexa-fluor488で発色し、ImageJを使用し、蛍光発色量および強度を測定した。また、採取した尿から尿中アルブミン排泄量をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１５に示す。ＤＯＣＡ投与によりポドシンが著明に減少したが、ＲＡＧＥアプタマーによって有意に抑制された。また、ＲＡＧＥアプタマー投与により尿中アルブミン排泄が減少した。
【００５３】
６．５．酸化ストレスに対する効果
酸化ストレスのマーカーである８ＯＨｄＧを用いて、腎組織における酸化ストレスを測定した。トリプルバッファー（Triple buffer）およびプロテアーゼ阻害剤を用いてバッファーを作成し、腎組織をホモジナイズした。ＢＣＡにてタンパク質濃度を一定とした後に、８ＯＨｄＧを１次抗体としてウェスタンブロッティングを行った。結果を図１６に示す。ＤＯＣＡ／食塩群で著明に増加した８ＯＨｄｇは、ＲＡＧＥアプタマー投与にて有意に抑制された。
【００５４】
６．６．ＲＡＧＥ発現に対する効果
６．５．と同様の方法でウェスタンブロッティングを行い、腎組織におけるＲＡＧＥ発現を検出した。結果を図１７に示す。また、コスモバイオ社から販売されているＣＭＬ測定ＥＬＩＳＡキットを使用して、ＣＭＬの血漿中濃度を測定した。結果を図１８に示す。ＤＯＣＡによるＡＧＥ−ＲＡＧＥ系の亢進は、腎臓組織において著明であり、ＲＡＧＥアプタマーによって有意に抑制された。
【００５５】
６．７．腎組織における細胞外基質の増加に対する効果
高血圧性腎障害の代表的な組織障害所見の１つである細胞外基質の増加を調べるために、４μｍの腎組織切片をＰＡＳ染色し、糸球体、特にメサンギウム領域の拡大を、ImageJを用いる面積測定により調べた。結果を図１９に示す。細胞外基質はＤＯＣＡ／食塩群で増加し、ＲＡＧＥアプタマー投与により有意に抑制された。
【００５６】
６．８．ＭＲおよびＲａｃ１の発現に対する効果
４μｍの腎組織切片を１％ＢＳＡ／ＰＢＳにて２時間ブロッキングし、ミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）（Abcam）と終夜インキュベーションした。その後、EnVisionTM G|2 Doublestain System（Dako）にて発色を行い、ImageJを使用し染色面積を測定した。また、M.O.M. Immunodetection Kitで２時間ブロッキングを行った後に、Ｒａｃ１（NewEast Biosciences）に対する抗体を使用し、終夜インキュベーションを行った。その後、EnVisionTM G｜2 Doublestain System（Dako）にて発色し、ImageJを使用し染色面積を測定した。ＭＲの発現は、ウェスタンブロッティングによっても確認した。結果を図２０に示す。ＤＯＣＡによって誘導されるＭＲの過剰発現は、ＲＡＧＥアプタマーによってＡＧＥ−ＲＡＧＥ系を抑制することにより、有意に抑制された。また、ＤＯＣＡによって誘導されるＲａｃ１の過剰発現は、ＲＡＧＥアプタマーにより有意に抑制された。
【００５７】
７．まとめ
ＲＡＧＥアプタマーは、ＲＡＧＥとそのリガンドであるＡＧＥまたはＨＭＧＢ１との結合を阻害し、また、ＲＡＧＥとＡＧＥとの結合を阻害することにより、細胞内の酸化ストレスの産生、およびＲＡＧＥの下流因子である炎症性サイトカインの発現を抑制した。ＲＡＧＥアプタマーは、ＲＡＧＥを介したシグナル伝達を阻害することができ、ＲＡＧＥ関連疾患の治療または予防に有用である。実際に、ＲＡＧＥアプタマーは、糖尿病または高血圧のモデル動物において腎障害の発症を抑制した。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
配列番号１：アプタマー
配列番号２：アプタマー
配列番号３：アプタマー
配列番号４：アプタマー
配列番号５：アプタマー
配列番号６：アプタマー
配列番号７：アプタマー
配列番号８：アプタマー
配列番号９：アプタマー
配列番号１０：アプタマー
配列番号１１：アプタマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：Human vRAGE(23-121)
配列番号１５：Human HMGB1(1-215)
【図１Ａ】
0006679096.tif 000003
【図１Ｂ】
0006679096.tif 000004
【図２】
0006679096.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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