(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする対象者において化学療法剤と組み合わせて急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療する際に使用するための医薬であって、有効量の成熟同種ダブルネガティブ（ＤＮ）Ｔ細胞（ＤＮＴ細胞）を含み、前記ＤＮＴ細胞はin vitroまたはex vivoで増幅されており、前記化学療法剤はシタラビン（ＡｒａＣ）又は別のデオキシシチジン類似体であり、前記ＤＮＴ細胞は前記化学療法剤から７日以内に使用するためのものである、医薬。
【請求項２】
前記使用は、有効量のＤＮＴ細胞の１つ以上の別個の追加用量の投与をさらに含む、請求項１に記載の使用するための医薬。
【請求項３】
前記１つ以上の別個の追加用量の投与は、最後のＤＮＴ細胞投与後３日から２週間の間、または最後のＤＮＴ細胞投与の少なくとも３日後である、請求項２に記載の使用するための医薬。
【請求項４】
前記対象者は、再発性、再燃性、または難治性のＡＭＬを有する対象者である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の使用するための医薬。
【請求項５】
前記対象者は、化学療法抵抗性のＡＭＬを有する対象者である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の使用するための医薬。
【請求項６】
前記ＤＮＴ細胞は、前記化学療法剤の後に使用するためのものである、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の使用するための医薬。
【請求項７】
前記ＤＮＴ細胞は、前記化学療法剤の同日に使用するためのものである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の使用するための医薬。
【請求項８】
前記ＤＮＴ細胞は、前記化学療法剤の後２日から７日の間に使用するためのものである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の使用するための医薬。
【請求項９】
前記ＤＮＴ細胞は、がん細胞に優先結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の使用するための医薬。
【請求項１０】
前記ＤＮＴ細胞は、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、及び／またはＬｅＹに結合する１つ以上の受容体を発現する、請求項９に記載の使用するための医薬。
【請求項１１】
前記化学療法剤がシタラビン（ＡｒａＣ）である、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の使用するための医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本願は、２０１４年８月１５日出願の米国仮特許出願第６２／０３７，８８９号の優先権を主張し、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
［技術分野］
本開示は、ダブルネガティブＴ細胞（double negative T cells）を使用して、急性骨髄性白血病（AML: Acute Myeloid Leukemia）を含む、白血病（leukemia)とリンパ腫（lymphoma)等のがんの治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、成人急性白血病の主な原因であり、成人白血病の全ての約８０％を占める（Menzinら、２００２）。この病気を標的とするより効果的な方法の発展を目的とする研究が広範囲にわたって行われたにも関わらず、ＡＭＬは低い長期生存率に関連する；ＡＭＬの高齢患者の約５％及び若い患者の約３０％のみが５年以上生存する（UngewickellとMedeiros、２０１２；Hoandら、２０１２）。従来の化学療法では、治療されたＡＭＬ患者の＞７０％において、初期の寛解（initial remission）を効果的に達成できる（UngewickellとMedeiros、２０１２）。しかし、病気の高い不均一性（heterogeneity）により、ＡＭＬ患者の約３０％は、化学治療に応答しない（UngewickellとMedeiros、２０１２；Bucisanoら、２０１２）。さらに、化学療法では多くの患者において病気の完全なクリアランスを達成できず、寛解期の患者の７０％超に対して初期治療の２年以内にＡＭＬが再燃（relapse）する（UngewickellとMedeiros、２０１２；Bucisanoら、２０１２）。予後不良に関連する再燃ＡＭＬを患う患者に対しては、標準の治療計画は存在しない（Ferraraら、２００４）。再燃するＡＭＬは、微小残存病変（ＭＲＤ：Minimal Residual Disease）という事象に起因し、それは化学療法に対する抵抗性を有するＡＭＬ細胞集団により媒介される（Garces-Eisele、２０１２；LinとLevy、２０１２）。ＭＲＤは主に白血病幹細胞（ＬＳＣ：Leukemic Stem Cell）集団により貢献されていることは知られ、化学療法のような過酷な環境や条件を耐える能力を有する（Ishikawaら、２０１０；KadowakiとKitawaki、２０１１；Vazら、２０１３）。したがって、病気の無再燃クリアランス（relapse-free clearance）を目的にし、ＡＭＬ−ＬＳＣ及びＭＲＤを標的とする治療の開発は、活動的に研究されてきた領域である。
【０００４】
同種造血幹細胞移植（allo-HSCT: Allogeneic Hematopoetic Stem Cell Transplantation）は、ＡＭＬ患者に対して治癒可能性のある治療法であり、従来の化学療法よりも高い無病生存率に関連する（AlatrashとMolldrem、２００９）。Ｔ細胞が枯渇した移植は、より高い再燃率に至るため、ドナー由来Ｔ細胞で媒介した抗白血病効果は、患者の増加した生存に貢献する（AlatrashとMolldrem、２００９）。しかし、臨床におけるallo-HSCTの使用は、適切なドナーの不足、治療の毒性、及び他の関連する合併症により制限されている（AlatrashとMolldrem、２００９；Shlomchik、２００７）。正常な組織において強力な免疫応答を誘導でき、それにより組織損傷、若しくは重症例の場合は患者の死亡に至ることは（AlatrashとMolldrem、２００９；Shlomchik、２００７）、同種細胞治療の使用を制限する障害となっている。
【０００５】
メラノーマ患者を治療するためのＴ細胞免疫療法の使用に関する早期研究以来、他のがんに対する養子Ｔ細胞治療（adoptive T cell therapy）に関して有意な進歩がみられ、それも無再燃ＡＭＬクリアランスを達成するために細胞治療を用いる可能性を支持する（Rosenbergら、１９８８）。白血病に関連する抗原（ＬＡＡ：Leukemia Associated Antigens）という、白血病細胞において増加調節されている抗原が識別され、ＬＡＡ特異的Ｔ細胞の抗白血病効果は、in vitroおよび動物モデルにおいて示されている（Vazら、２０１３；TeagueとKline、２０１３）。しかし、ＬＡＡ特異的Ｔ細胞の使用は、その細胞の単離及び拡大の難しさにより妨げられている（Kochenderferら、２０１０；Johnsonら、２００９；Parkhurstら、２０１１；Robbinsら、２０１１）。また、ＡＭＬにおいては多くのＬＡＡが過剰発現されるが、胸腺（thymus）等の他の組織にその抗原が発現されるため、Ｔ細胞特異性の胸腺選択により、ＬＡＡに対する高い結合能を有する受容体を持つ成熟Ｔ細胞の発生が妨害される（TeagueとKline、２０１３）。あるいは、それぞれウィルムス腫瘍抗原（Wilm’s tumour antigen）またはルイスＹ（Lewis Y）等の、ＬＡＡに対するトランスジェニックＴＣＲまたはキメラＡｇ受容体を発現するトランスジェニックＣＤ８＋Ｔ細胞を使用することも試みられた（Peinertら、２０１０；Xueら、２０１０）。このＴ細胞は、有意に向上しているＬＡＡに結合する能力を有し、優れた抗腫瘍活性を示す（Kochenderferら、２０１０；Johnsonら、２００９；Parkhurstら、２０１１；Robbinsら、２０１１）。しかし、遺伝子療法に関連する潜在的副作用に併せて、複雑でありかつ長時間にわたる処置によって、ＡＭＬを治療する目的でこれらの戦略を使用することは制限されている。それに加え、超生理学的（supra-physiological）な数の遺伝子組み換えＴ細胞を注入することは、死亡を含む、厳格な有害事象に至り得る。従って、ＬＡＡの識別を要件としない、広範囲のがんに対して強力な効果を有する新規細胞免疫治療法を開発すれば、白血病の免疫治療に革命を起こし得る。
【０００６】
ダブルネガティブＴ細胞（ＤＮＴ細胞またはＤＮＴ：Double Negative T Cells）は、ＣＤ３−ＴＣＲ複合体を発現する一方、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＮＫＴ細胞マーカーであるαＧａｌＣｅｒをロードしたＣＤ１ｄ及びＪα２４〜Ｖα１４を発現しない、成熟末梢性Ｔリンパ球（mature peripheral T lymphocytes）であり、ヒトにおける末梢血単核球（ＰＢＭＣ：Peripheral Blood Mononuclear Cells）の１〜３％を占める（Zhangら、２０００）。化学療法に誘導される完全寛解（complete remission）期間中にＡＭＬ患者からＤＮＴを増幅（expand）するためのプロトコルは以前に記載され、ＡＭＬ患者のＤＮＴは、同患者から取得された原発性ＡＭＬ細胞（primary AML cell）に対して、顕著な抗白血病活性を有することが、in vitroで示された（Youngら、２００３；Merimsら、２０１１）。
【０００７】
以前に、ＤＮＴは、パーフォリン・グランザイムに依存する経路（perforin-granzyme dependent pathway）を介して、用量依存的に同種ＡＭＬ細胞株の死滅を誘導することが示された（Merimsら、２０１１）。動物モデルにおいて、従来のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞とは異なり、同種マウスＤＮＴの輸注（infusion）は、免疫抑制機能（immune inhibitory function）を与える可能性が示された（Zhangら、２０００；Youngら、２００３；Heら、２００７）。しかし、患者の原発性白血病細胞に対してＤＮＴの活性は、in vivoで研究されていなかった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明のある側面において、ダブルネガティブ（ＤＮ）Ｔ細胞（ＤＮＴ）は、リンパ種または白血病などのがんの治療に有効であることが決定された。特に、ＤＮＴを使用する免疫療法は、化学療法に対する抵抗性を有する白血病細胞を死滅させることを含む、急性骨髄性白血病（AML: Acute Myeloid Leukemia）の治療に有効であることが示された。随意的に、ＤＮＴは自家性（autologous）、例えばがんを有する対象者（subject）またはがんの疑いのある対象者からのＤＮＴ、若しくは同種のもの（allogenic）、例えばがんを患わない健常なドナーからのＤＮＴであっても良い。意外なことに、ＤＮＴは、正常な細胞及び正常な組織に検知可能な毒性を与えることなく、異種移植片モデルに、in vitro及びin vivoにおいて、がん細胞に対する細胞毒性効果を有することが観察された。
【０００９】
例２に示されるように、注入されたＤＮＴはin vivoにおいて増殖し生存し、血液、脾臓、肺を含む異なる組織へ移動することが示され、ＤＮＴの集団が肺、肝臓、及び骨髄にも観察されたため、ＤＮＴはこれらの臓器内の腫瘍を標的する可能性が示唆された。また、本発明者は健常なドナーからの同種ＤＮＴは、ＡＭＬ細胞を選択的に標的し、がん致死活性を奏することをも示した。ＤＮＴは、ＡＭＬ異種移植モデルにおいて、生着（engraftment）を阻止することも示し、よってＤＮＴはin vivoで白血病細胞のレベルを低下させることもできることも示した。さらに、例６に示すように、注入されたＤＮＴは血液から骨髄へ移動し、既存のＡＭＬがん細胞を標的するため、ＡＭＬを有する対象者の治療のために、臨床の場で有効であることが示唆されている。
【００１０】
また、Daudi（Ｂ細胞リンパ腫（バーキットリンパ腫［Burkitt’s lymphoma］））、Jurkat（Ｔ細胞性急性リンパ腫）、K562（慢性骨髄性白血病）、U937（慢性骨髄性白血病）、及び原発性と樹立した肺がん細胞株を含む、いくつかのがん細胞株は、in vitroでＤＮＴ細胞媒介細胞傷害（DNT cell mediated cytotoxicity）に高度な感受性を奏することが示された（データは非表示）。
【００１１】
化学療法は、ＡＭＬ患者に使用される標準治療法であり、白血病のロードを低下させること、及び病気の初期寛解を達成することには有効である。しかし、多くの場合、化学療法では完全なクリアランスに至らず、よってＡＭＬ患者における再燃率が高い。したがって、化学療法に対して非応答性であるＡＭＬ細胞を排除し、再燃率を低下させる能力で、ＡＭＬ患者の生存率を有意に増加させることが期待されている。例７に示されているように、本発明者は、ＤＮＴは、化学療法抵抗性のがん細胞、特に化学療法抵抗性のＡＭＬを殺傷することに有効であることを示した。したがって、ＤＮＴは、化学療法に応答しなかった対象者に関する免疫治療、またはＡＭＬ及び／または化学療法抵抗性の最小抵抗疾患（ＭＲＤ：Minimal Resistant Disease）等の再燃または再発（recur）するがんを予防または治療するために有用である可能性がある。
【００１２】
本発明の別の側面において、ＤＮＴは細胞周期阻害剤（cell cycle inhibitor）との組み合わせでがん細胞を殺傷することに有効であることが示された。図９に示されているように、ＤＮＴと細胞周期阻害剤ＡｒａＣを使用した併用療法は、ＡｒａＣのみで治療した場合に比較して、ＡＭＬ生着のレベルを低下させた。
【００１３】
例１０で示されているように、ＤＮＴは、in vitroの化学療法抵抗性がん細胞及び異種移植性モデルを含む、原発性ＡＭＬ患者芽球（blast）に対して、正常な細胞や組織に検知可能な毒性なく、強力な抗白血病効果を有する。同種ＤＮＴについて、正常な末梢血単核球（ＰＢＭＣ）若しくは造血前駆細胞／幹細胞を攻撃すること、またはマウスにおいて異種移植片対宿主病（graft-versus-host disease）の原因となることは観察されていない。
【００１４】
したがって、ある実施形態において、それを必要とする対象者に対してがんを治療する方法であって、ここに記載するようなＤＮＴの有効量を対象者に投与することを含む方法を提供する。また、それを必要とする対象者に対してがんを治療するための、ここに記載するようなＤＮＴの使用を提供する。ある実施形態において、がんは白血病である。ある好ましい実施形態において、がんは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ある実施形態において、がんは慢性骨髄白血病（ＣＭＬ：Chronic Myeloid Leukemia）である。ある実施形態において、がんはリンパ腫である。ある実施形態において、がんは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ：Non-Hodgkin Lymphoma）である。ある実施形態において、がんは、バーキットリンパ腫等のＢ細胞リンパ腫である。ある実施形態において、がんはＴ細胞急性リンパ腫である。ある実施形態において、がんは肺がんである。
【００１５】
ある実施形態において、がんは、化学療法の治療に対して抵抗性のがんである。例えば、ある実施形態において、がんは化学療法抵抗性のＡＭＬである。ある実施形態において、ここに記載の方法及び使用は、再発性（recurring）または再燃性（relapsing）がんを有する対象者の治療のためのものである。ある実施形態において、がんは、再発性、再燃性、または難治性（refractory）の白血病またはリンパ腫である。ある実施形態において、がんは、微小残存病変（ＭＲＤ）または白血病幹細胞に起因する再燃性のＡＭＬ等の再燃性のがんである。ある実施形態において、対象者は完全寛解期にない。例えば、ある実施形態において、対象者は１つ以上の検知可能ながん細胞を有し、任意に１つ以上の検知可能な白血病細胞またはリンパ腫細胞を有する。ある実施形態において、対象者は、以前にがんのための化学療法の治療を受けたが、がん細胞は化学療法の治療に不応（つまり、難治性がん）であった。ある実施形態において、対象者は、以前にがんのための化学療法の治療を受け、１つ以上の検知可能ながん細胞を有する。ある実施形態において、対象者は、以前にがんのための化学療法の治療を受けていない。ある実施形態において、ＤＮＴは、化学療法を受けていないがんを有する対象者またはがんの疑いのある対象者に対する使用または投与のためのものである。
【００１６】
ある実施形態において、１つ以上のＤＮＴでがん細胞に接触することを含む、がん細胞の成長（growth）または増殖（proliferation）を阻害する方法を提供する。また、ここに記載するようなＤＮＴの、がん細胞の成長または増殖を阻害するための使用も提供する。がん細胞は、任意にin vivoまたはin vitroにある。ある実施形態において、がん細胞は白血病細胞である。ある好ましい実施形態において、がん細胞はＡＭＬ細胞である。ある実施形態において、がん細胞はリンパ腫細胞である。ある実施形態において、がん細胞は、化学療法の治療に対して抵抗性の細胞である。例えば、ある実施形態において、がん細胞は、ＡｒａＣ等の細胞周期阻害剤での治療に対する抵抗性を有するＡＭＬ細胞である。ある実施形態において、がん細胞は、白血病幹細胞等のがん幹細胞である。
【００１７】
ここに記載するＤＮＴは、当業者により容易に入手可能なものであってもよく、他の種類のＴ細胞から容易に区別できるものである。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ４及びＣＤ８を発現しない。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ３−ＴＣＲ複合体を発現し、ＣＤ４及びＣＤ８を発現しない。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ３＋、γδ−ＴＣＲ＋またはαβ−ＴｃＲ＋、ＣＤ４−、ＣＤ８−、α−Ｇａｌ−、ＰＤ−１−、ＣＴＬＡ４−の表現型（phenotype）を有する。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ３＋、γδ−ＴＣＲ＋またはαβ−ＴｃＲ＋、ＣＤ４−、ＣＤ８−、α−Ｇａｌ−、ＰＤ−１−、ＣＴＬＡ４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ２８−の表現型を有する。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８−、α−Ｇａｌ−、ＰＤ−１−、ＣＴＬＡ４−、ＣＤ４４＋の表現型を有する。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８−、α−Ｇａｌ−、Ｊα２４−、Ｖα１４−、ＣＤ４４＋、ＰＤ−１−、ＣＴＬＡ４−、ＣＤ４５Ｒｏ＋の表現型を有する。ある実施形態において、ＤＮＴは、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含むサンプルから取得可能である。ある実施形態において、サンプルは血液サンプルである。サンプルは、任意に健常なドナー、またはがんを有する対象者若しくはがんの疑いのある対象者からのものであり、ＤＮＴは対象者を治療するために使用される。
【００１８】
ＤＮＴ細胞は、ここに記載されるようながんの治療のための投与または使用の前に、任意にin vitroまたはex vivoで増殖し得る。ある実施形態において、ＤＮＴは、静脈内注射により対象者に使用または投与されるために調製される。
【００１９】
ある実施形態において、ＤＮＴは、がんを有する対象者またはがんの疑いのある対象者等の対象者から取得された自家性ＤＮＴである。ある実施形態において、ＤＮＴは、１つ以上の検知可能ながん細胞、任意に１つ以上の白血病細胞またはリンパ腫細胞を有する対象者からのものである。ある実施形態において、ＤＮＴは以前にがんの治療を受けた対象者である。ある実施形態において、ＤＮＴは完全寛解期にある対象者からのものである。ある実施形態において、ＤＮＴは、完全寛解期にない対象者からのものである。ある実施形態において、ＤＮＴは、化学療法の前、途中、または後に対象者から取得したものである。例えば、ＤＮＴは化学療法コースの開始前、１回目の化学療法ラウンド後、化学療法のラウンドとラウンドの間、または化学療法の１つ以上のラウンドの後に取得可能である。ある実施形態において、ＤＮＴは、対象者に化学療法剤を投与した同日、３日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、または１か月以内に、対象者から取得される。
【００２０】
ある実施形態において、ＤＮＴは、がんを有さない１つ以上の対象者から取得されたＤＮＴ等のような、同種のものである。ある実施形態において、ＤＮＴは、１つ以上の健常なドナーから取得される。
【００２１】
ある実施形態において、ＤＮＴは、白血病またはリンパ腫の治療等のようながんの治療のために、対象者に使用または投与するためのものである。ある実施形態において、ＤＮＴは、化学療法を受けていない対象者への使用または投与のためのものである。別の実施形態において、ＤＮＴは、化学療法の前、途中、または後に対象者に使用または投与するためのものである。例えば、ＤＮＴは、化学療法コースの開始前、１回目の化学療法ラウンド後、化学療法のラウンドとラウンドの間、または化学療法の１つ以上のラウンドの後に使用または投与するためのものであり得る。ある実施形態において、ＤＮＴは、化学療法と同日、３日以内、１週間以内、２週間以内、３週間以内、または１か月以内に、対象者に投与される。ある実施形態において、化学療法は、ここに記載する細胞周期阻害剤等の、１つ以上の化学療法剤の使用または投与を含む。
【００２２】
随意的に、それを必要とする対象者に、ＤＮＴを２つ以上の別々の用量で、がんの治療のために投与または使用され得る。例えば、ある実施形態において、ここに記載する方法及び使用は、ＤＮＴの第１用量と、ＤＮＴの少なくとも１つの追加用量を含む。ある実施形態において、前記少なくとも１つの追加用量は、ＤＮＴの最後の用量から少なくとも３日後、ＤＮＴの最後の用量から少なくとも５日後、または任意にＤＮＴの最後の用量から３日から２週間後に使用または投与するためのものである。ある実施形態において、前記２つ以上の別々の用量は、化学療法の前、途中、または後の投与または使用のためのものである。
【００２３】
ある実施形態において、ＤＮＴは、１つ以上の外来タンパク質（exogenous protein）を発現するように改変された組換細胞（recombinant cell）である。例えば、ある実施形態において、ここに記載するＤＮＴは、がん細胞の表面に発現されるタンパク質等のような、がんのバイオーマーカーに対する高い結合能を有する受容体を発現する。ある実施形態において、ＤＮＴは、白血病細胞等のがん細胞に優先結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ：Chimeric Antigen Receptor）を発現する。例えば、ある実施形態において、ここに記載するＤＮＴは、ＣＤ３３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１２３、及び／またはＬｅＹに結合する１つ以上の受容体を発現する。
【００２４】
ある実施形態において、ＤＮＴは、正常な細胞に比較して、がん細胞を優先的に殺傷及び／またはその増殖を阻害する。ある実施形態において、ＤＮＴは、正常な細胞に比較して、白血病細胞を優先的に殺傷及び／またはその増殖を阻害する。例えば、ある実施形態において、ＤＮＴは、他の造血細胞または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に比較して、ＡＭＬ芽球を優先的に殺傷及び／またはその増殖を阻害する。ある実施形態において、ＤＮＴは、正常な造血幹細胞に比較して、白血病幹細胞を優先的に殺傷及び／またはその増殖を阻害する。
【００２５】
他の実施形態において、ＤＮＴは、がんの治療のために対象者に使用または投与された際に、同種免疫反応を起こさない。
【００２６】
本発明者は、ＤＮＴと、細胞周期阻害剤等の化学療法剤とを使用する併用療法は、がん細胞、そして特にＡＭＬを殺傷するに驚くほど有力であることを見出した。したがって、ある実施形態は、ＤＮＴと化学療法剤の有効量を対象者に投与することを含む、対象者のがんを治療する方法を提供する。また、がんの治療のために、有効量のＤＮＴ及び化学療法剤の使用も提供する。ある実施形態において、化学療法剤は、細胞周期阻害剤である。ある実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＤＮＡ合成阻害剤である。ＤＮＴと化学療法剤は、任意に、異なる時間または同時に対象者に投与される。
【００２７】
ある実施形態において、化学療法剤は、細胞周期阻害剤である。ある実施形態において、細胞周期阻害剤は、細胞周期に依存する化学療法薬である。例示的な細胞周期阻害剤は、ドキソルビシン、メルファラン、ロスコビチン、マイトマイシンＣ、ヒドロキシ尿素、５０フルオロウラシル、シスプラチン、Ａｒａ−Ｃ、エトポシド、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、スニチニブ、ソラフェニブ、バルプロ酸ナトリウム、ＨＤＡＣ阻害剤、またはダカルバジンを含むが、これらに限定されない。ＨＤＡＣ阻害剤の例は、ＦＲ０１２２８、トリコスタチンＡ、ＳＡＨＡ、及びＰＤＸ１０１を含むが、これらに限定されない。
【００２８】
ある実施形態において、有効量のＤＮＴと化学療法剤を対象者に投与することを含む、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を治療する方法を提供する。ある実施形態において、化学療法剤は、細胞周期阻害剤である。ある実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＡｒａＣである。ある実施形態において、対象者は、微小残存病変（ＭＲＤ）に起因する再発性または再燃性ＡＭＬ等の、再発性または再燃性ＡＭＬを有する。ある実施形態において、対象者は、化学療法に対して難治性である白血病を有する。
【００２９】
別の実施形態において、ＤＮＴと化学療法剤を含む組成物を提供する。ある実施形態において、化学療法剤は、細胞周期阻害剤である。ある実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＡｒａＣである。組成物は、任意に医薬的に許容可能な担体をさらに含む。ある実施形態において、ＤＮＴと化学療法剤を含む組成物の、がんの治療のための使用を提供する。ある実施形態において、組成物は、ＡＭＬの治療用である。ある実施形態において、組成物は、化学療法剤のみでの化学療法に対して抵抗性であるＡＭＬの治療のための組成物である。
【００３０】
本開示の他の特徴や利点は、以下の詳細の説明から明らかになる。しかし、詳細な説明と具体例は、この詳細な説明により、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することのない様々な変更や変形が当業者に明らかになるため、本開示の好ましい実施形態を示す一方、実例としてのみ示されていることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
次に、本開示の１つ以上の実施形態について、図面を参照して説明する。
【図１】図１ａは、ＡＭＬ患者と健常ボランティアの末梢血液からの増幅と、前記ＤＮＴはex vivo及びin vitroにおいて増幅できることを示す。寛解期にある患者２４人とＨＶ７人の２０ｍｌのＰＢからのそれぞれ３６つと７つのＤＮＴ増幅培養から増幅されたＤＮＴの数が測定された。ＮＳＧマウスモデルにおいて、ex vivoで増幅されたＨＶのＤＮＴについて、図１ｂは増殖を示し、図１ｃは移動を示す。２×１０７のＣＦＳＥラベル付きＤＮＴをＮＳＧマウスへ静脈注入し、それに伴い０日目、２日目、３日目、及び７日目に１０５のＩＵ  ＩＬ−２サプリメントを腹腔内に注入した。図１ｂは、注入後の２日目、７日目、１０日目、及び１４日目に測定された、脾臓にあるヒトＣＤ４５＋細胞のＣＦＳＥ蛍光性の変化の代表的なプロットを示す。図１ｃは、血液、脾臓、骨髄、肝臓、及び肺から採取（harvest）されたヒト細胞の頻度（frequency）及び数（number）を示す（ｎ＝３）。数は平均値とＳＥＭを表し、エラーバーは各グループのＳＥＭを表す。（＊＊＊ｐ＜０．００１）
【図２】図２ａは、ＤＮＴ細胞媒介性細胞傷害に対する原発性ＡＭＬサンプルのin vitro感受性を判断するために新しく開発された、フローに基づく殺傷アッセイ（flow-based killing assay）の代表的なプロットを示す。アッセイは、異なるエフェクター対標的の比率で、原発性ＡＭＬサンプル０９０５９６と健常なドナーからの正常ＰＢＭＣで実行された。共培養（co-culture）後に、アポトーシスのレベルを判断するために、アネキシンＶ蛍光を使用した。図２ｂは、同種ＤＮＴを使用して、健常細胞及び白血病細胞に対して実行されたフローに基づく殺傷アッセイの結果を示す。特異的殺傷パーセントを判断するために、フローに基づく殺傷アッセイで、３人の健常ドナー（ＨＤ：Healthy Donor）から増幅された同種ＤＮＴを異なる標的に対して実行した：ＡＭＬ（塗りつぶし）、ＡＭＬ３と２つの原発的ＡＭＬ患者芽球、及び３人の健常ドナーから取得されたＰＢＭＣと造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（塗りつぶしなし）。各プロットは、実行された殺傷アッセイの３つの平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図３Ａ】、
【図３Ｂ】図３ａは、in vitroでＤＮＴ細胞媒介性細胞傷害に対する感受性に関して患者ＡＭＬ芽球をスクリーニングした結果を示し、そして、ある実施形態において、ＨＤ  ＤＮＴは、原発性ＡＭＬ芽球の大半に対して強力な細胞溶解活性（cytolytic activity）を誘導することを示す。４：１のエフェクター対標的比率で、２１つの原発性ＡＭＬサンプルの同種ＤＮＴ媒介性特異的殺傷パーセンテージ。表３ｂは、注射前にＡＭＬをＤＮＴで治療すると、in vivoのＡＭＬ生着レベルが有意に低下することを示す。原発性ＡＭＬ芽球＃０５７８は、ＤＮＴありとＤＮＴなしの状況において１８時間をかけて培養され、亜致死性照射（２２５ｃＧｙ）されたＮＳＧマウスに対して大腿内注射（intrafemoral injection）された（それぞれｎ＝３及びｎ＝５）。芽球移植の３１日後、マウスは犠牲にされ、注入された骨髄細胞を採取し、ヒト抗−ＣＤ４５＋及びヒト抗ＣＤ３３＋で染色し、ＦＡＣＳで解析した。ＡＭＬの生着レベルは、ヒトのＣＤ４５＋及びＣＤ３３＋細胞の頻度により決定された。各グループについて生着の平均％が示され、エラーバーはＳＥＭを表す。＊芽球のみのコントロールに比較して有意差を示す（＊ｐ＜０．０５）。
【図４】図４は、ｎｔｉ−白血病活性は同種ＤＮＴにより媒介されること、及び同種ＤＮＴはin vivoで原発性ＡＭＬ芽球を標的することを示す。亜致死性照射されたＮＳＧマウスは、５×１０６の＃５７８６患者芽球（図４ａ）または＃０９０３９２患者が球（図４ｂ）の大腿内注射によって、原発性ＡＭＬを移植された。＃５７８６または＃０９０３９２の注入それぞれの１０日後または１４日後に、マウスは２×１０７のＨＶ  ＤＮＴまたはＰＢＳで静脈注射された。ＤＮＴ注入の１４〜２１日目にマウスは犠牲にされ、芽球が注入された骨からの細胞は抗ヒトＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ３４、及びＣＤ４５の蛍光タグ付き抗原で染色された。芽球が注入された骨におけるＡＭＬ細胞の頻度は、ヒトＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ３３、及び／またはＣＤ４５の陽性細胞のパーセントにより決定される。
【図５Ａ】、
【図５Ｂ】図５は、複数回投与の治療によってＤＮＴ細胞治療の効能（efficacy）が向上することを示す。上記のように、２．４×１０６の芽球（＃０９０２４０）を移植したＮＳＧマウスは、芽球注入後に１０日間ＤＮＴで治療され、または治療されなかった。芽球が注入された３７日後にマウスは犠牲にされ、脾臓を採取した。ＤＮＴ細胞で治療されたマウス（▲）または治療されていない（■）マウスの脾臓におけるＡＭＬ芽球、及び原発性患者ＡＭＬ芽球０９０２４０（●）は、２人の健常なドナーから増幅されたＤＮＴで実行されたフローに基づく殺傷アッセイの標的として使用され、例３に記載されているように、各標的の特異的殺傷％が決定された。ＤＮＴ治療後の残存ＡＭＬ芽球がＤＮＴ細胞媒介性細胞傷害に対して抵抗性であるかを判断するために、残存芽球をＤＮＴ細胞及びＰＢＳで治療されたマウスの脾臓から単離した。採取された残存ＡＭＬ細胞と、最初に移植に使用された原発性ＡＭＬ芽球とについて、in vitroのＤＮＴ細胞媒介性細胞溶解に対する感受性を、フローに基づく殺傷アッセイを使用して判断した（図５ａ）。この観察に基づいて、複数回投与のＤＮＴ細胞治療の効能を試験した。図５ｂ及び図５ｃは、ＤＮＴは、in vivoで抗白血病活性を用量依存的に媒介できることを示す。２．４×１０６の＃０９０２４０芽球で移植されたＮＳＧマウスは、上記のように、芽球注入後の２０日目に（１×ＤＮＴ）、または１０日目と２０日目に（２×ＤＮＴ）、２×１０７のＤＮＴで治療され、あるいは治療されなかった。芽球注入後の３４日目にマウスは犠牲にされ、上記のように芽球を注入した骨髄（図５ｂ）及び脾臓（図５ｃ）に生着したＡＭＬ細胞の頻度を決定した。ＡＭＬ生着の平均％が示され、エラーバーはＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。
【図６】図６において、ＤＮＴは化学療法感受性のＡＭＬ（chemotherapy-susceptible AML）と化学療法抵抗性のＡＭＬ（chemotherapy resistant AML）の両方を標的できることが示されている。フローに基づく殺傷アッセイを、化学療法抵抗性患者、難治性患者（塗りつぶしなし）または再燃性患者（塗りつぶし）（図６ａ）、若しくは化学療法感受性の患者（図６ｂ）に対して実行した。細胞は、２時間をかけて４：１のエフェクター対標的の比率で共にインキュベートされた。図６ｃにおいて、化学療法抵抗性のサンプル（ｎ＝１０）と化学療法感受性（ｎ＝８）から算出された、４：１のエフェクター対標的の比率での特異的殺傷パーセントの比較を示す。そこの数値は、平均の特異的殺傷パーセント値を表し、ＳＥＭはｎ．ｓ．である（統計的に有意でない）。
【図７】図７は、in vivoにおける、ＤＮＴにより媒介されたＬＳＣが標的される可能性を示す。高悪性度の芽球０９０２４０が移植されたＮＳＧマウスを、芽球注入後の１０日目に２×１０７のＤＮＴまたはＰＢＳで治療した。芽球注入後の３９日目にマウスは犠牲にされ、未注入組織、未注入骨（図７ａ）、及び脾臓（図７ｂ及び図７ｃ）のそれぞれに対して、ＡＭＬ細胞の頻度、または頻度及び数が決定された。各線は平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図８】図８は、ＤＮＴ及び化学療法剤の併用療法の抗白血病活性を示す。０９０２４０芽球を移植したＮＳＧマウスを、ＰＢＳ（治療をしていない、●）、またはＡｒａＣ（ＡｒａＣ、■）、またはＡｒａＣに続けてＤＮＴ（ＡｒａＣ＋ＤＮＴ、◆）で治療した。芽球注入後の３７日目にマウスを犠牲にし、注入された骨（図８ａ）、未注入の骨（図８ｂ）、及び脾臓（図８ｃ）におけるＡＭＬ細胞の頻度を決定した。各線は平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図９】図９ａは、ＤＮＴの細胞傷害性に対するＡＭＬ細胞の感受性に対する、化学療法剤であるＡｒａＣの効果を示す。ＫＧ１ａを、１４時間をかけて１μｇ／ｍｌのＡｒａＣまたはＰＢＳで治療した。その後、ＫＧ１ａと、４時間をかけて４：１のエフェクター対標的の比率で、健常なドナーからの、ex vivoで増幅されたＤＮＴとを共に培養した。各標的に関して誘導された特異的殺傷レベルを前述のように決定した。図９ｂにおいて、ＡｒａＣは、ＤＮＴの細胞傷害性機能と干渉しないことが示されている。Ex vivoで増幅されたＤＮＴは、１４時間をかけてＡｒａＣまたはＰＢＳで前処理され、４時間をかけて４：１のエフェクター対標的の比率で、ＡＭＬ細胞株であるＯＣＩ−ＡＭＬ３に対するin vitroの殺傷アッセイに使用された。各ＤＮＴにより誘導された特異的殺傷レベルは、前述の通りに決定された。
【図１０】図１０は、増幅後のＰＢＭＣ及びＤＮＴの表現型特性を示す。ＰＢＭＣ（上のパネル）または増幅後の１４日目に採取されたＤＮＴ（下のパネル）は、ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びαＧａｌＣｅｒ−ＣＤ１ｄに対する抗体で染色された。塗りつぶしされたヒストグラムは、Fluorescence minus one（ＦＭＯ）コントロールを示す。グラフにおける数値は、各四半部（quadrant）またはゲートにおける集団の頻度を表す（＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図１１】図１１ａ及び図１１ｂは、健常なドナー（ＨＤ）からのＤＮＴは、in vivoで造血幹細胞を攻撃せず、その分化に影響しないことを示す。ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ヒトＨＳＰＣを、亜致死性照射されたＮＳＧマウスに静脈注射した（５×１０６細胞／マウス、ｎ＝１３）。ＨＳＰＣ注入の８週間後に、７匹のマウスに、ex vivoで増幅された同種ＤＮＴを１０７静脈注射した。ＤＮＴ注入の８週間後に、ＰＢから細胞を採取し、抗マウスＣＤ４５、抗ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ３３、及びＣＤ３４の抗体で染色した。ヒト白血球（図１１ａ）及びそのサブセット（図１１ｂ）のパーセントは、フローサイトメトリ分析により決定された。横線は各グループの平均値を、エラーバーは各グループのＳＥＭを表す。
【図１２】図１２において、ＤＮＴ細胞は、致死量のＡＭＬ細胞株を注入されたＮＳＧマウスを救うことができることを示す。亜致死性照射されたＮＳＧマウスは、１０６のＭＶ４−１１を静脈注射され、７日目から開始して、２×１０７のＤＮＴ（ｎ＝９）またはＰＢＳ（ｎ＝１０）の注射を、４日置きに受けた。矢印は、ＤＮＴまたはＰＢＳの注射の時間を表す。＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
［発明の詳細な説明］
ある側面において、本発明者は、がんの治療、そして特に白血病またはリンパ腫の治療のために、ＤＮＴは有用であることを見出した。ある実施形態において、化学療法に抵抗性を有するがん細胞を含めて、がん細胞の成長または増殖を阻害するため、またはがん細胞を殺傷するためにＤＮＴは利用可能であることも見出した。ある好ましい実施形態において、ここに記載するＤＮＴは、ＡＭＬの治療、または微小残存病変を原因とするＡＭＬ等のような再発性ＡＭＬまたは再燃性ＡＭＬの治療のために使用可能である。別の実施形態において、ここに記載するＤＮＴは、リンパ腫の治療に使用可能である。
【００３３】
ここにいう「がん」という用語は、隣接組織または身体の他の部分に転移できる、未制御で異常な細胞の増殖に起因する病気の群のうちの１つを指す。がん細胞は、がん細胞が集まった固形腫瘍を形成できる、あるいは、白血病のように分散した細胞として存在し得る。
【００３４】
「がん細胞」という用語は、未制御で異常な細胞の増殖と、他の組織を浸潤する能力を特徴とする細胞、またはそのような細胞に由来する細胞を指す。がん細胞は、例えば、がんの患者から取得された原発性がん細胞、またはそのような細胞から樹立された細胞株を含む。ある実施形態において、がん細胞は、白血病細胞またはリンパ腫細胞等のような、血液がん細胞である。例えば、ある実施形態において、がん細胞は、ＡＭＬを有する対象者からの白血病細胞、または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ：Non-Hodgkin Lymphoma）を有する対象者からの細胞等のようなリンパ腫細胞であってもよい。ある実施形態において、がん細胞は、ＡＭＬを有する対象者における白血病がん細胞であってもよい。ある実施形態において、ここに記載するＤＮＴは、in vitro、ex vivo、またはin vivoでがん細胞の成長または増殖を阻害するために使用可能である。ある実施形態において、ここに記載するＤＮＴは、in vitro、ex vivo、またはin vivoでがん細胞を殺傷するために使用可能である。
【００３５】
ここにいう「化学療法抵抗性がん」は、化学療法の治療に応答しないがん、または化学療法の治療後に再燃するがんを指す。例えば、化学療法抵抗性の細胞は、化学療法に応答しなかった対象者から取得された原発性がん細胞、または初期は化学療法に応答し、寛解に進んだが、病気の再燃を経験した対象者から取得されたがん細胞であってもよい。一部の対象者において、再燃後にがん細胞は化学療法に応答しなくなり、当該対象者は化学療法抵抗性がんを有する。ある実施形態において、化学療法抵抗性細胞は、対象者から直接取得した原発性白血病細胞である。
【００３６】
ここにいう「白血病」という用語は、造血組織、他の臓器、そして通常は血液において、増加した数で見られる異常な白血球の進行性増殖を含むあらゆる病気を指す。「白血病細胞」とは、そのような細胞の増加した異常な増殖を特徴とする白血球を指す。
【００３７】
ここにいう「急性骨髄性白血病」（「ＡＭＬ」）とは、骨髄に集積し、正常な血液細胞の産生を妨げる異常な白血球の迅速な成長を特徴とする、血液細胞の骨髄株のがんを指す。
【００３８】
ここにいう「慢性骨髄白血病」（「ＣＭＬ」）は、骨髄における、主に骨髄細胞の成長の増加と制御されていない成長、及び血液におけるこの細胞の蓄積を特徴とするがんを指す。
【００３９】
ここにいう「リンパ腫」とは、リンパ性細胞から発展する血液細胞腫瘍により特徴付けられる病気を指す。リンパ腫は任意にホジキンリンパ腫（ＨＬ：Hodgkin Lymphoma）または非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ：Non-Hodgkin Lymphoma）であってもよい。ＮＨＬの例は、バーキットリンパ腫及びＴ細胞リンパ腫を含む。そのような細胞の増加した異常な増殖を特徴とするリンパ球を「リンパ腫細胞」という。
【００４０】
ここにいう「対象者（subject）」との用語は、哺乳動物を含む動物界の全てのメンバーを含み、好適にはヒトを指す。「対象者」という用語は、任意にがんと診断された哺乳動物、または寛解期における哺乳動物を含む。ある実施形態において、「対象者」との用語は、血液がんのヒト、または血液がんの疑いのあるヒトを指す。ある実施形態において、「対象者」との用語は、ＡＭＬのヒト、またはＡＭＬの疑いのあるヒト、任意には再発性若しくは再燃性ＡＭＬのヒトを指す。
【００４１】
ある実施形態において、ここに記載する方法及び使用は、がんの治療のためのものを提供する。ここにいう「治療する」または「治療」との用語は、それが当技術分野においてよく理解されているように、臨床結果を含み、有益な結果または望ましい結果を得るためのアプローチを意味する。有益な臨床結果または望ましい臨床結果は、検知可能または検知不可能であるに関わらず、１つ以上の症状の軽減または改善、病気の進行度の減少、病態の安定化（つまり、悪化させない）（例えば、患者を寛解期に維持する）、病気の予防または病気の広がりの防止、病気の進行を遅延または遅らせること、病態の改善または緩和、病気の再発の減少、及び（部分または完全であるかを問わず）寛解を含むが、それらに限定されない。「治療する」及び「治療」は、治療を受けていない場合に予測される生存期間に比べて生存期間を延期することも意味し得る。ここにいう「治療する」または「治療」は、予防的治療も含む。ある実施形態において、治療方法は、ここに記載するような治療上有効量のＤＮＴを対象者に投与することを含み、任意には単回投与、またはその代わりに一連の投与を含む。一部の実施形態において、ここに記載する治療方法及び使用は、ＤＮＴと細胞周期阻害剤との併合治療方法を含む。
【００４２】
ここにいう「がん細胞の成長または増殖を低下させる」とは、細胞の成長または細胞分裂の結果としてがん細胞に由来する細胞の数の減少を指し、細胞死を含む。ここにいう「細胞死」との用語は、細胞壊死及びアポトーシスを含む、細胞を死滅させる全ての形を含む。
【００４３】
ある実施形態において、ここに記載する方法及び使用は、有効量のＤＮＴ、そして随意的には細胞周期阻害剤の投与または使用を含む。ここにいう「有効量」または「治療上有効量」とのフレーズは、望む結果を達成するために必要な用量及び期間中に有効である量を意味する。例えば、ＡＭＬ等のがんの治療という面において、有効量とは、化合物を投与しない場合に得られる応答と比べて、寛解を誘導する、腫瘍負荷を低下させる、及び／または腫瘍の拡がり若しくは白血病細胞の成長を防止する量である。有効量は、動物の病態、年齢、性別、及び体重等の因子によって変化し得る。そのような量に対応する特定の化合物の量は、特定の医薬または化合物、医薬製剤、投与の用法、病気または障害（disorder）の種類、治療する対象者または宿主（host）の正体（identity）等々のような、様々なファクターに依存して変化する。
【００４４】
ある実施形態において、ここに記載する方法及び組成物は、ダブルネガティブ（ＤＮ）Ｔ細胞の投与または使用を含む。ＤＮＴは、他のＴ細胞との区別となる、いくつかの特徴を奏する。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ４またはＣＤ８を発現しない。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ３−ＴＣＲを発現し、ＣＤ４及びＣＤ８を発現しない。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ３＋、αβ−ＴｃＲ＋、ＣＤ４−、ＣＤ８−、ＣＤ４４−、ＣＤ２８−の表現型を有する。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ３＋、αβ−ＴｃＲ＋、ＣＤ４−、ＣＤ８−、α−Ｇａｌ−、ＰＤ−１−、ＣＴＬＡ４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ２８−の表現型を有する。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８−、α−Ｇａｌ−、ＰＤ−１−、ＣＴＬＡ４−、ＣＤ４４＋の表現型を有する。ある実施形態において、ＤＮＴはＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８−、α−Ｇａｌ−、Ｊα２４−、Ｖα１４−、ＣＤ４４＋、ＰＤ−１−、ＣＴＬＡ４−、ＣＤ４５Ｒ０＋の表現型を有する。ＤＮＴは、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ：Fluorescent Activated Cell Sorting）等のような、しかしそれに限定されない、当分野に知られている技術を使用して取得可能である。ある実施形態において、ＤＮＴは末梢血単核球から単離され得る。随意的に、ＤＮＴは自家細胞または同種細胞であってもよい。
【００４５】
ある実施形態において、ＤＮＴは、がんを有する対象者若しくはがんの疑いのある対象者から取得した同種細胞である。随意的に、ＤＮＴは化学療法の前、途中、または後に対象者から取得される。ある実施形態において、ＤＮＴは、化学療法のコースの前、途中、または後に対象者から取得される。例えば、ある実施形態において、ＤＮＴは１回目の化学療法ラウンド後、または化学療法の１つ以上のラウンドの後に取得される。
【００４６】
一部の実施形態において、ＤＮＴは、対象者への使用または投与の前に、in vitroまたはex vivoで増幅され得る。ＤＮＴを単離し増幅するための例示的な方法は、米国特許第６、９５３、５７６号「Method of Modulating Tumor Immunity」、及び国際公開第ＷＯ２００７／０５６８５４「Method of Expanding Double Negative T Cells」に記載され、それらの全体が本明細書に参考として組み込まれる。
【００４７】
ある実施形態において、ＤＮＴは、がんを治療するため、がん細胞の成長または増殖を低下させるため、またはがん細胞を殺傷するために、後でＤＮＴを投与する対象者から取得し得る（つまり、自家細胞である）。ある実施形態において、ＤＮＴは同種のものであってもよい。ここにいう「同種」との用語は、元々予定の受容者とは別の個人であり、受容者とは同種の動物である個人である対象者から取得された細胞を指す。同種細胞は、随意的に細胞培養からの細胞であってもよい。ある好ましい実施形態において、ＤＮＴは健常なドナーから取得される。ここにいう「健常なボランティア」（「ＨＶ」）または「健常なドナー」（「ＨＤ」）との用語は、がんのない１人以上の対象者を指す。ある実施形態において、健常なドナーは、検知可能ながん細胞を有さない対象者、例えば検知可能な白血病細胞を有さない対象者である。
【００４８】
ある実施形態において、ＤＮＴは当技術分野で知られている医薬的に許容可能な製剤を使用して、対象者への使用のために製剤化される、または対象者への投与のために調製され得る。適切な製剤の選択及び調製のための従来の手順及び材料は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences（２００３、２０版）及び１９９９年発行の米国薬局方（The United States Pharmacopeia: The National Formulary）（USP 24 NF19）に記載されている。「医薬的に許容可能」との用語は、動物、特にヒトの治療と両立可能であることを意味する。
【００４９】
ある実施形態において、ここに記載するＤＮＴは、がん細胞の増殖を低下させる、及び／または化学療法剤と併合してがんを治療することに、驚くほど有効である。ある実施形態において、化学療法剤は、細胞周期阻害剤である。ある実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＤＮＡ合成阻害剤である。したがって、ある実施形態において、対象者のがんを治療する方法であって、対象者にＤＮＴ及び化学療法剤を投与することを含む方法を提供する。また、対象者のがんを治療するためのＤＮＴと化学治療剤を、それを必要とする対象者への使用も提供する。ある実施形態において、化学療法剤は、シタラビン（ＡｒａＣ；cytarabine）である。ある実施形態において、がんは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）等のような白血病である。一部の実施形態において、ＤＮＴと、細胞周期阻害剤等のような化学療法剤との組み合わせを、再発性または再燃性ＡＭＬ等のような化学療法抵抗性のがんを治療するために使用可能である。
【００５０】
ここにいう「細胞周期阻害剤」との用語は、細胞の分裂及び／または複製を阻害または防止する化学療法剤を指す。ある実施形態において、「細胞周期阻害剤」との用語は、ドキソルビシン、メルファラン、ロスコビチン、マイトマイシンＣ、ヒドロキシ尿素、５０フルオロウラシル、シスプラチン、Ａｒａ−Ｃ、エトポシド、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、スニチニブ、ソラフェニブ、バルプロ酸ナトリウム、ＨＤＡＣ阻害剤、またはダカルバジンから選択される化学療法剤を含む。ＨＤＡＣ阻害剤の例は、ＦＲ０１２２８、トリコスタチンＡ、ＳＡＨＡ、及びＰＤＸ１０１を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
ここにいう「ＤＮＴ合成阻害剤」との用語は、がん細胞によるＤＮＡの合成を阻害または防止する化学療法剤を指す。ＤＮＡ合成阻害剤の例は、ＡｒａＣ（シタラビン）、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、５−フルオロウラシル、カペシタビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、デシタビン、ビダーザ、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、ペントスタチン、チアラビン、トロキサシタビン、サパシタビン、またはフォロデシンを含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、ＤＮＡ合成阻害剤は、シタラビンまたはここに記載のような他のデオキシシチジン類似体である。ある実施形態において、ＤＮＡ合成阻害剤は、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、またはクロファラビン等のようなＤＮＡ伸長ターミネーター（DNA elongation terminator）であり、シタバリンと同じように機能する。
【００５２】
ここにいう「ＡｒａＣ」（アラビノフラノシルシチジン：Arabinofuranosyl Cytidine ）は、シトシン塩基とアラビノース糖を含む化合物であって、in vivoでアラビノフラノシルシトシン三リン酸（Arabinofuranosylcytosine triphosphate）に変換される化合物を指す。ＡｒａＣは、シタラビン（cytarabine）またはシトシンアラビノシド（cytosine arabinoside）とも知られている。
【００５３】
ある実施形態において、ＤＮＴと化学療法剤は、同時に対象者に投与され、随意的にはＤＮＴと化学療法剤を含む組成物、若しくは２つの別の投与として投与される。ある実施形態において、ＤＮＴと化学療法剤は、異なる時点で対象者に使用または投与される。例えば、ある実施形態において、ＤＮＴは化学療法剤の前に、または後に投与される。ある実施形態において、ＤＮＴは、少なくとも１分、２分、５分、１０分、３０分、４５分、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、８時間、１０時間、１２時間、１６時間、または２４時間の間隔をおいて、化学療法剤の前または後に投与される。随意的に、一部の実施形態において、ＤＮＴと化学療法剤は、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、１週間、１０日、１２日、２週間、３週間、１か月、６週間、２ヶ月、または２ヶ月超の間隔をおいて投与される。ある実施形態において、ＤＮＴは、化学療法剤後の２日目から７日目の間に投与または使用される。
【００５４】
別の実施形態において、ＤＮＴ及び化学療法剤を含む組成物を提供する。ある実施形態において、化学療法剤は、ＤＮＡ合成阻害剤である。ある実施形態において、ＤＮＡ合成阻害剤は、シタラビンまたはここに記載のような他のデオキシシチジン類似体である。ここに記載の組成物は、随意的に、Remington’s Pharmaceutical Sciences（２００３、２０版）及び１９９９年発行の米国薬局方（The United States Pharmacopeia: The National Formulary）（USP 24 NF19）に記載されているような医薬的に許容可能な担体を含む。また、がんの治療のための、ＤＮＴと化学療法剤を含む組成物の使用も提供する。ある実施形態において、がんは白血病、随意的にはＡＭＬである。ある実施形態において、組成物は、化学療法のみの治療に抵抗性であるがんの治療に使用される。ある実施形態において、対象者は白血病を有する対象者、随意的にはＡＭＬを有する対象者である。
【００５５】
以下の非限定的な例は、本発明の開示を例証する。
［例１］健常なドナーからＤＮＴを増幅する。
化学療法後に完全寛解期におけるＨＤまたはＡＭＬ患者から、２０ｍｌのＰＢを取得した。ＤＮＴは、前述のように増幅された（Merimsら、２０１１）。一時的に、RosetteSep（ＴＭ）を使用することにより、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からＣＤ４＋及びＣＤ８＋の細胞が除去された。残ったＣＤ４−ＣＤ８−ＰＢＭＣは、プレートに結合された抗ＣＤ３抗体で３日間刺激され、洗浄され、そして７日目から１０日目まで溶解性ＣＤ３で再刺激された。３日目、７日目、及び１０日目に、培地をＩＬ−２を含む新しい培地に交換された。細胞は、２週間の増幅の終わりに数えられ、抗ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ｉＮＫＴ  ＴＣＲ（ＴＣＲ  Ｖα２４−Ｊα１８）抗体及びＮＫＴ抗原受容体（α−ガラクトシルセラミド［α-Galactosylceramid］）で染色された。ＨＤのＰＢから増幅された際に得たＤＮＴの数（３．９７±１８．２４×１０８）が患者から得られた数（３．２５±０．９１６９×１０７）よりも有意に高かったため（図１ａ）、完全寛解期におけるＡＭＬ患者のＰＢとＨＤのＰＢを同等の容積で用意された増幅カルチャーにおいて、患者のＤＮＴに対するＨＤのＤＮＴのより高い増幅可能性が示された。なお、ＡＭＬの約５０％の場合、ＤＮＴは増幅せず、ＡＭＬ患者のＰＢを使用した場合の６５．５％±１９．８％に比べてＨＤのＰＢを使用した場合（９０．７４±１．７％）により高い純度のＤＮＴ集団が得られた（表１）。患者のＤＮＴのより低い増幅可能性及び純度は、部分的に、患者の血液でＡＭＬ細胞に遭遇することによる疲労、及び／または厳格な化学療法による異常な生理が原因であり得る。治療のための純粋なＤＮＴの増幅または取得の失敗は、臨床の場におけるＤＮＴの使用に対して重大な制限となり得る。しかし、このデータによって、そのような制限はＨＤのＤＮＴを使用することによって回避できることが示され、同種ＨＤのＤＮＴに集中する理論的根拠が提供された。
【００５６】
【表１】
0006802150.tif 000002
表１：増幅の終わりにおける患者及びＨＶのＤＮＴ細胞頻度。患者またはＨＶの末梢血液でセットアップされた増幅培養の終了におけるＤＮＴ細胞の純度の要約。
［例２］ＮＳＧマウスモデルにおけるヒトＤＮＴの特徴付け。
【００５７】
養子Ｔ細胞治療の成功は、受容者における注入されたＴ細胞が、腫瘍細胞を見つけて排除できるように、Ｔ細胞の生存力及び存続力（persistence）に依存する。理想的には、注入されたＴ細胞は受容者においてさらに複製でき、そのため注入の際に比較的少ない数のＴ細胞を必要とする。ＤＮＴは相対的に短い期間で生成されるため（初期のサンプル収穫から２週間以内）、このＤＮＴは早期エフェクターである可能性が高く、注入後に増殖し存続し得る。この仮説をテストするために、ＮＳＧマウスモデルを使用した。Ex vivoで増幅された１０日目のＤＮＴは、５μＭのＣＦＳＥでラベルされ、２×１０７の細胞を亜致死照射したＮＳＧマウスに静脈注射した。ヒトのＤＮＴを維持するために、受容マウスにｈｒＩＬ−２（１０，０００国際単位（ｉ．ｕ．［international unit］）を腹腔内注射で補充された。In vivoにおけるＤＮＴの増殖、移転、及び存続力を判断するために、２日目、４日目、及び７日目に血液、脾臓、骨髄、肝臓、及び肺を採取した。図１ｂに示すように、２日目から４日目にＣＦＳＥ希釈を観察したが、それは４日目から７日目に観察されず、よって養子移入（adoptive transfer）後にＤＮＴは、注射後の最初の数日において増殖したことが示されている。採取された細胞は抗ヒトＣＤ４５抗原で染色され、時間に渡って異なる組織におけるＤＮＴの頻度を判断するために、ＦＡＣＳを使用して解析された。注射後の血液、脾臓、及び肺に比較的高い頻度のＤＮＴが検知されたが、より少ないけど顕著なＤＮＴ集団が、注射後の７日目まで、肝臓及び骨髄に観察された（図１ｃ）。
［例３］フローに基づく殺傷アッセイの開発。
【００５８】
クロムリリースアッセイ（chromium release assay）は、標的細胞の細胞傷害性レベルを判断するために広く使用されてきた標準アッセイである。しかし、クロム同位体ローディングの低い効率と、原発性ＡＭＬ患者芽球の自発的死滅の高い率により、広く使用されたクロムリリースアッセイは、in vitroのＤＮＴ媒介細胞傷害性に対する原発性ＡＭＬ芽球の感受性を判断するために最適ではなかった。Ex vivoで増幅されたＤＮＴについて、in vitroでＡＭＬに対して細胞毒性活性を誘導する能力を判断するために、新しいフローサイトメトリーに基づく殺傷アッセイが開発された。このアッセイにおいて、ＤＮＴは蛍光性の膜染料であるＰＫＨ−２６でラベルされ、原発性ＡＭＬ芽球と共に、２時間をかけて、異なるエフェクター対標的比率で培養された。自発的細胞死滅のレベルを判断するためのコントロールとして、標的及びエフェクター細胞を単独で培養した。共インキュベーションの２時間後、細胞は、ＣＤ４５ｌｏｗ及び／またはＣＤ３３＋であるＡＭＬを識別するために表面マーカーであるＣＤ３３及びＣＤ４５抗体で染色され、及び細胞死滅のレベルを識別するためにアネキシンＶで染色された（図２）。特異的殺傷パーセントは、次のように決定された。
0006802150.tif 000003
【００５９】
従来のクロムリリースアッセイに比較して、フローに基づく殺傷アッセイは早く、低い背景雑音（background noise）に関連され、そして同位体ローディングなどのような標的細胞の追加的準備を必要としない。この新しいアッセイは、用量依存的にＤＮＴに媒介されるＡＭＬ細胞アポトーシスのレベルを直接監視することを可能としながら、標準のクロムリリースアッセイに関連する制限を回避する。なお、ＡＭＬ集団の異なるサブ集団に対するＤＮＴの影響を判断するために使用できる。しかし、フローに基づく殺傷アッセイは、累積細胞死滅のレベルを決定できない。
［例４］ＨＤから増幅されたＤＮＴは、用量依存的にＡＭＬを選択的に標的するが、in vitroで正常の同種ＰＢＭＣを殺傷しない。
【００６０】
正常なＰＢＭＣに対する白血病細胞への同種ＤＮＴの細胞毒性を判断するために、３つの異なる健常なドナーから増幅された同種ＤＮＴを、２つのＨＤから取得された正常なＰＢＭＣ、２つのＨＤから取得されたＨＳＰＣ、２つの原発性ＡＭＬ患者のサンプル、及びＡＭＬ細胞株であるＯＣＩ−ＡＭＬ３及びＫＧ１ａに対してフローに基づく殺傷アッセイを実行した。全３ドナーからのＤＮＴは、２つの原発性ＡＭＬ芽球及びＡＭＬ細胞株に対して、用量依存的な強力な殺傷活性を示したが、同種ＰＢＭＣ及びＨＳＰＣに対する殺傷活性を示さない（図２ｂ）。例２及び図１ｃで見られるように、ＤＮＴは受容者に存続し得るため、健常なＰＢＭＣ及び同種ＤＮＴの共培養は、１４時間まで延長された。ＤＮＴはまた正常な同種ＰＢＭＣの殺傷を誘導しなかった（データは非表示）。この結果は、マウスにおいて同種ＤＮＴの注入は受容者において病理学的病変（pathological lesion）を起こさないため安全である報告と両立する。正常なＰＢＭＣ標的にせず同種白血病細胞を標的できるＤＮＴの能力は、白血病の患者を治療するために同種ＤＮＴは安全であることを示唆する。
［例５］ＤＮＴはin vitroで原発性ＡＭＬ芽球を殺傷でき、ＮＳＧマウスにおいて白血病の生着を阻害できる。
【００６１】
ＨＤから増幅されたＤＮＴの、白血病細胞を殺傷する能力を決定するために、患者２３人のパネルから取得した原発性ＡＭＬ芽球サンプルに対して細胞毒性アッセイを実行した。感受性のレベルに変動が見られたが、２３件中の１９件において、in vitroで患者の原発性芽球は用量依存的にＤＮＴ媒介細胞毒性に対して感受性であり、一方患者４人の芽球は高いレベルの抵抗性を示した（図３ａ）。このデータによって、同種ＤＮＴは効果的に多くの原発性ＡＭＬ芽球を標的することが示されている。
【００６２】
In vitroのスクリーニングによって、有意なレベルのＤＮＴ媒介細胞毒性が示されたが、これがより低いＡＭＬ生着性もしくは一時的なＡＭＬ数の低下に移るかは不明なままである。次に、in vivoにおいてＡＭＬ生着性に対するＤＮＴの影響を調べるために、ＤＮＴ細胞で治療されたＡＭＬ及びＤＮＴ細胞で治療されていないＡＭＬの生着レベルを、確立されているＡＭＬ−ＮＳＧ異種移植モデル（Barabeら、２００７）を使用して決定した。簡単に言うと、ＡＭＬ芽球＃０５７８は１８時間をかけてＤＮＴと、及びＤＮＴなしで培養され、そして亜致死照射されたＮＳＧマウスの右大腿骨に注射された。移植の３１日後にマウスは犠牲にされ、注射された骨におけるＡＭＬの生着を決定した。未治療のコントロールに比べて、ＤＮＴで前インキュベートされたＡＭＬ芽球を注射されたマウスにおいて、ＡＭＬの生着レベルは有意に低下され、よってＤＮＴで媒介した効果は、in vivoにおいて白血病細胞のレベルを低下させることであることが示された（図３ｂ）。
［例６］ＤＮＴは、in vivoで用量依存的に原発性ＡＭＬに対する抗白血病活性を媒介する。
【００６３】
図３ｂで見られるＡＭＬ生着の低下は、おそらく注入前に、in vitroでＡＭＬ細胞を殺傷した結果である。注入したＤＮＴが、白血病生着の部位に移動し、骨髄における既存のＡＭＬを除去できるか（これは臨床の場の条件により似ている）をさらに決定するために、前述の通りにＡＭＬ芽球を移植されたＮＳＧマウスにＤＮＴ治療を与えた（Barabeら、２００７）。簡単に言うと、マウスの右大腿骨に２．５×１０６〜５．０×１０６の原発性ＡＭＬ芽球である＃５７８６または＃０９０３９２が注入された。ヒト白血病細胞が受容者に生着した時点である１０日から１４日後に、ＡＭＬを移植したマウスはＰＢＳまたは２×１０７のＤＮＴを静脈注射された。ＤＮＴ注射の１４〜２１日後にマウスは犠牲にされ、ＡＭＬ細胞を注入した骨から細胞が採取され、ＦＡＣＳ解析を介してＡＭＬの生着レベルを決定するために、蛍光タグの付いた抗ヒトＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ３４、及びＣＤ３８抗体で染色された。ＤＮＴ及びＰＢＳで治療されたグループの間でＡＭＬ細胞の生着頻度を比較した。ＰＢＳで治療されたグループに対してＤＮＴで治療されたグループの注射された骨におけるＡＭＬ芽球である＃５７８６及び＃０９０３９２の頻度は有意に低下していた（図４ａ及び図４ｂ）。この結果は、ＤＮＴは、血液からＡＭＬが由来する場所である骨髄へ移動できること、そして骨髄における既存のＡＭＬを標的できることを示す。
【００６４】
ＤＮＴ治療は有意にＡＭＬ生着の頻度を低下させたが、ＤＮＴで治療されたグループにおいて、いくつかの残存芽球が観察された。残存ＡＭＬ細胞の説明としては、２つの可能性があり得る：（１）この細胞はＤＮＴ媒介細胞毒性に抵抗性である；（２）単回投与のＤＮＴ治療は、多数の既存ＡＭＬ細胞を除去するためには十分でない可能性がある。残存のＡＭＬ細胞はＤＮＴ媒介細胞毒性に感受性であるかを決定するために、残存ＡＭＬ芽球をＤＮＴで治療したグループと未治療のグループとから単離し、最初にフローに基づく殺傷アッセイにおける移植に使用した原発性ＡＭＬ芽球に加えて、標的として使用した。ＤＮＴで治療したマウスから取得された残存ＡＭＬ芽球は、試験官内において、原発性ＡＭＬ細胞及びＰＢＳで治療したグループから取得したＡＭＬ細胞と同等にＤＮＴ媒介殺傷に対して感受的であったため（図５ａ）、ＡＭＬ細胞の存続は、ＤＮＴ殺傷に対する抵抗性によるものであった可能性は低いことが示された。また、ＡＭＬ生着を低下させるＤＮＴの能力は、受容者における既存ＡＭＬ細胞の頻度と逆に相関することを観察し（図５ｂ）、それは１回より多いＤＮＴ治療はＡＭＬ生着のレベルをより低下させ得る概念を裏付ける。この仮説をテストするために、ＮＳＧマウスに高生着性の芽球である＃０９０２４０を注射した。ＡＭＬ細胞注入の１０日後に、前回と同様に受容者マウスに単回投与でＤＮＴを静脈注入した。そのまた１０日後に、ＤＮＴで治療したマウスの半分に、同じドナーからのＤＮＴの２回目の投与で治療した。コントロールのマウスには、コントロールとして、ＰＢＳを注入した。ＤＮＴを２回投与で治療したグループは、骨髄及び脾臓において、最も低いＡＭＬ生着レベルを示した（図５ｂ及び図５ｃ）。脾臓において、２回目のＤＮＴ投与は、ＤＮＴの単回投与で治療されたグループに比較して芽球の頻度を有意に低下させた。統計的には有意ではなかったが、骨髄についても同じ傾向が見られ（図５ｂ）、これは骨髄における既存のＡＭＬ細胞の頻度が極めて高いからである可能性がある。まとめると、このデータによって、ＤＮＴは異種移植モデルにおいて、ＡＭＬ細胞を除去し、白血病の生着を阻害できることが示された。したがって、ＤＮＴ治療は、複数の注入によって効能を向上できる可能性が高い。なお、ＤＮＴは、従来の化学療法により大多数のＡＭＬ細胞を除去した後に、ＭＲＤを標的するための補助療法（adjuvant therapy）として特に有効であり得る。ＡｒａＣ等のような化学療法の初期の投与または使用によって、がん細胞の大多数の根絶を促進し得、それに追って、化学療法抵抗性である残存する比較的に少ない数の細胞に対しては、ＤＮＴの投与がより効果的である可能性がある。
［例７］化学療法抵抗性ＡＭＬは、ＤＮＴに感受性である。
【００６５】
化学療法は、ＡＭＬ患者に使用される標準治療である。化学療法は、白血病のロードを低下させることと、病気の初期の寛解を達成することに効果的である。しかし、多くの場合、病気の完全クリアランスに達成しないため、ＡＭＬ患者において、高い再燃率につながる。
【００６６】
したがって、ＡＭＬ患者の治療に関する１つの大きい制限は、化学療法抵抗性のＡＭＬを効果的に標的できないことにあり、その結果としてＡＭＬには高い再燃性がある。ＤＮＴが化学療法抵抗性のＡＭＬを標的できるか否かを研究するために、化学療法感受性の患者と化学療法抵抗性の患者から得たＡＭＬサンプルを、ＤＮＴの標的として、我々のin vitroの殺傷アッセイに使用した。驚くべきことに、化学療法抵抗性のＡＭＬ患者サンプル１０つのうち７つ（図６ａ）、そして化学療法感受性のＡＭＬ患者サンプル８つのうち７つ（図６ｂ）が、ＤＮＴに対する有意な感受性を示した。なお、特異的殺傷の平均レベルは、化学療法感受性のグループと、化学療法抵抗性グループとで相当するレベルであり、それぞれ１９．８±３．７％と１６．６±４．１であった（図６ｃ）。ＤＮＴによる化学療法抵抗性のＡＭＬの殺傷は、例６に記載された通りに、化学療法抵抗性で不応の患者（＃５７８６、図４ａ）及び再燃性患者（＃０９０２４０、図５ｂ及び図５ｃ）から得たサンプルで実行されたin vivoの実験により、さらに確証された。両方のサンプルにおいて、ＤＮＴ治療はＡＭＬのロードを有意に低下させた。この結果によって、ＤＮＴは化学療法に応答しない患者を治療するための潜在的な免疫療法として利用できることを示し、そして無再燃寛解を達成するために、化学療法抵抗性のＭＲＤに対するＤＮＴの潜在的な臨床的使用を強調する。
［例８］ＤＮＴに媒介される、ＬＳＣを標的する潜在的な活性。
【００６７】
以前、ＬＳＣに対するＤＮＴの潜在的な細胞毒性活性は、ＬＳＣに発現されるマーカーであるＣＤ３４を発現するＡＭＬを、ＤＮＴが標的したことで示された（Merimsら、２０１１）。しかし、全てのＣＤ３４＋細胞がＬＳＣ集団を表すわけではないため、ＬＳＣに対するＤＮＴの効果は不明のままであった。高悪性のＡＭＬサンプルである＃０９０２４０で実行されたin vivo実験において、未注入組織、脾臓、及び未注入骨における高度のＡＭＬ生着が示された。ＡＭＬの発がん性及び集団化特性のため、未注入組織におけるＡＭＬの生着は、ＬＳＣにより媒介されていると思われる。ここに提供する結果は、ＤＮＴ治療により未注入の骨（図７ａ）及び脾臓（図７ｂ及び図７ｃ）におけるＡＭＬ生着レベルが低下したため、ＤＮＴが媒介するＬＳＣの殺傷の可能性の証拠を示す。この低下が生着の部位で非ＬＳＣ性ＡＭＬの殺傷によるものなのか、若しくは生着を誘導するＬＳＣの殺傷によるものなのかは未知である。
［例９］ＤＮＴと化学療法剤の併合治療の有効性。
【００６８】
化学療法は、数多く白血病のサイズを低下させること、そして病気の初期の寛解を達成することに効果的である。しかし、病気の完全なクリアランスを達成することについてはあまり効果的ではなく、したがってＭＲＤが媒介する再燃性ＡＭＬの制限が伴う。それに対してＤＮＴ治療は、例７で示したように、化学療法により殺傷できないがんを含み、ＡＭＬを特異的に標的することについては効果的である。しかし、ＤＮＴ治療の有効性に関しては、他のがんに対する他の細胞治療の場合と同様に、ＡＭＬロードのレベルが重要な決定的要素のようである。それぞれ個別の治療法と関連する制限を克服するために、ＤＮＴ治療と化学療法を組み合わせて使用できるかを判断するために、＃９０９２４０ＡＭＬを移植したＮＳＧマウスに、標準な化学療法剤であるアラビノフラノシルシチジン（ＡｒａＣ）６０ｍｇ／ｋｇを、芽球注入の１３日後に開始して５日間に渡って腹腔内注射した。最後のＡｒａＣ注射の３日後、マウスは、前述のように、ＤＮＴまたはＰＢＳとＩＬ−２補充剤を注射された。ＤＮＴ注射の１４日後にマウスは犠牲にされ、骨髄と脾臓を採取した。併合治療によって、注射を受けた骨（図８ａ）、未注入の骨（図８ｂ）、及び脾臓（図８ｃ）において、ＡＭＬの頻度が有意的に低下した。統計的に有意ではなかったが、全３組織において、片方の治療のみの場合に対して併合治療の場合では、より低い平均ＡＭＬ生着頻度が得られた。脾臓においては、併合治療を受けたグループは、ＡｒａＣ治療のみを受けたグループに対して有意に低いＡＭＬ生着レベルを有した（図８ｃ）。合わせてこのデータは、ＤＮＴ治療と化学療法により媒介された付加的な抗白血病効果を示し、そして臨床の場において、化学療法後の残存芽球を標的するために、化学療法の後にＤＮＴ治療を利用する可能性を示す。したがって、ＤＮＴとＡｒａＣ等のような化学療法剤の併合治療は、ＤＮＴでの免疫療法または化学療法のみの場合に対して、ＡＭＬをより効果的に治療できる可能性が高い。以前は、化学療法に追ってＤＮＴを与えることで、がん細胞の低下においていかなる利点を得られるかどうかは未知でした。上述のように、ＡｒａＣとＤＮＴは異なるＡＭＬ細胞を標的するようであり、したがって併合治療によって、片方の治療のみの場合に比較して有意な利点を得る可能性がある。
【００６９】
ＡｒａＣとＤＮＴの併合治療の優れた抗白血病活性は、その２つの相乗的な効果によるものであるのか、若しくは２つの異なる治療の相加的な効果によるものであるのかを決定するために、白血病幹細胞に類似するＡＭＬ細胞株であるＫＧ１ａに対して、in vitroの殺傷アッセイを実行した。１４時間をかけてＡｒａＣまたはＰＢＳで治療したＫＧ１ａを、ＤＮＴと共インキュベートした。未治療のＫＧ１ａに対するＤＮＴに誘導された殺傷％は１５．３８±０．５１％に対し、ＡｒａＣで治療したＫＧ１ａに対する殺傷％は４５．５９±２．３４％であったため、ＡｒａＣによってＫＧ１ａのＤＮＴに対する感受性が有意に増加した（図９ａ）。それにもかかわらず、ＯＣＩ−ＡＭＬ３に対するin vitroの殺傷アッセイの１４時間前にＤＮＴ細胞をＡｒａＣで治療しても、ＤＮＴ媒介細胞傷害性には影響がなかったため、ＤＮＴは化学療法剤と同時に使用できることが示唆された。
［例１０］急性骨髄性白血病に対する同種ダブルネガティブＴ細胞の選択的細胞毒性活性。
【００７０】
以下に説明するように、本発明者は、同種ヒトＤＮＴについて、in vitroで、及び異種移植モデルにおいて、正常な細胞及び組織に対する検知可能な毒性なく、化学療法抵抗性のものを含む原発性のＡＭＬ患者の芽球に対して強力な抗白血病効果を有することを決定した。これらの結果により、現在の治療法の制限を克服し、患者の生存率を増加させるＡＭＬ患者の新たな細胞治療法として、ＨＤから増幅されたＤＮＴの使用を裏付ける。
Ex vivoで増幅されたＤＮＴは、in vitro及びin vivoで、原発性ＡＭＬ患者の芽球に対して強力な細胞溶解活性を誘導する。
【００７１】
以前、完全寛解期におけるＡＭＬ患者の末梢血液（ＰＢ）からex vivoで増幅されたＤＮＴの、自家ＣＤ３４＋白血病芽球に対する細胞毒性は、in vitroで示された（Merimsら、２０１１）が、患者のＤＮＴのただ３０％が増幅可能であった（３６のうち１２のカルチャーが３×１０７以上のＤＮＴに増幅された）。
【００７２】
ここに、本発明者は、驚くべきことに、試験されたＨＤの全てからＤＮＴを増幅できることを示し、ＡＭＬ患者の場合に比べて１０倍大きい平均総数のＤＮＴが得られ（図１ａ）、有意に高い純度も得られたことを示した（ＨＤのＤＮＴの場合は９０．７４％±１．７％に対して患者のＤＮＴの場合は６５．０％±１９．８％）（図１０）。
ＤＮＴの注入は、正常な同種ＰＢＭＣ及びＣＤ３４＋のＨＳＰＣを攻撃しない。
【００７３】
正常なＨＳＰＣ生着及び分化に対する同種ＤＮＴの潜在的な影響をさらに決定するために、ＮＳＧマウスをＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋のＨＤのＨＳＰＣを移植することでヒト化し、異なるＨＤからのＤＮＴで治療した。他者に報告されているように（McDermottら、２０１０；Drakeら、２０１１）、移植されたマウスの脾臓及びＢＭにおいて一貫して高いキメラ性（約７０〜８０％）が観察された一方、末梢血液におけるキメラ性は約１５％であった。重要なことに、ＤＮＴで治療したマウスと未治療のマウスの間で頻度（図１１ａ）及び系譜（lineage）の分化（図１１ｂ）に関する差は観察されなかった。この結果によって、ＤＮＴはＨＳＰＣを標的しないこと、そしてＨＳＰＣの造血系譜への分化を阻害しないことが示唆された。まとめてこの結果は、ex vivoで増幅された同種ＤＮＴは強力な抗白血病活性を有する一方、正常な組織及び造血細胞に対して細胞毒性を有さないことを示すことにより、新たながん免疫療法としてＤＮＴの安全性を支持する。
同種ＤＮＴは、致死的なＡＭＬのＮＳＧマウスの生存を延期する。
【００７４】
原発性ＡＭＬ芽球の大多数とは対照的に、ＭＶ４−１１のＡＭＬ細胞株は、ＮＳＧマウスに対して致死的である。ＭＶ４−１１を注入したマウスに３回のＤＮＴ注射を与えた際、ＤＮＴで治療されたグループにおいて、有意な生存利益が観察された（図１２）。これらの結果はまとめて、ex vivoで増幅された同種ＤＮＴはin vitroで化学療法抵抗性の原発性ＡＭＬ芽球に対して細胞毒性であり、異種移植モデルにおいて白血病のロードを低下させることに効果的であることを示す。
討議（Discussion）
【００７５】
過去１０年間にＡＭＬ患者を治療するために化学療法が多く使用されてきたが、化学療法抵抗性による高再燃率は、依然として患者の生存に関する大きなチャレンジである（LinとLevy、２０１２；HouriganとKarp、２０１３）。同種ＨＳＣＴは、ＡＭＬ患者のための潜在的な治療的処置であるが、その応用は毒性及びドナーの利用可能性により制限される（BrissotとMohty、２０１５；Vyasら、２０１５；MacDonaldら、２０１３）。ＨＳＣＴ、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞治療で明白であるように、ドナーの免疫細胞が同種抗原を認識し、形質転換細胞（transformed cell）への強い免疫反応を誘い出すため、同種状況における移植片対白血病の影響は、自家状況における影響よりも強い（ArpinatiとCurti、２０１４；CampbellとHasegawa、２０１３；Ruggeriら、２００２、２００７年７月）。健常人からの異種ＤＮＴは、in vitro（図２ｂ、図３ａ、図６ａ、及び図６ｂ）及びin vivo（図４及び図６ｃ）で原発性ＡＭＬ芽球の大きいアレイを効果的に標的できる。さらに、ＤＮＴ治療後の残存芽球は、ＤＮＴ殺傷に対する高度な感受性を示し、それも未治療のグループと最初に移植に使用した原発性芽球に関連する感受性に相当する感受性である（図５ａ）。このことは、化学療法の場合とは異なり、ＡＭＬ芽球は治療後にＤＮＴに対する抵抗性ができないことを示唆する。これと一貫して、複数のＤＮＴ治療は、白血病の負荷をさらに低下させる（図５ｂ及び図５ｃ）。より重要なことに、ＤＮＴは化学療法抵抗性のＡＭＬ細胞を効果的に標的した（図５ｂ、図５ｃ及び図６）。このデータによって、ＤＮＴは、化学療法とは異なるメカニズムを介してＡＭＬ細胞を標的し、そしてＡＭＬ患者の治療に関する現在の制限を克服するために、単独で化学療法に応答しないＡＭＬに使用可能、または化学療法との組み合わせで再燃を起こす化学療法抵抗性のＡＭＬを標的するために使用可能であることを示唆する。
【００７６】
同種反応のなかったこと（図２ｂ及び図１２）と一致して、１つのドナーからのＤＮＴは原発性ＡＭＬ細胞のアレイを殺傷でき、１人の患者からのＡＭＬ芽球は異なるドナーからのＤＮＴにより同程度に溶解された（データは非表示）。この特徴は、細胞治療としてＤＮＴのより広い応用可能性を示し、各患者から治療的細胞を生成する必要性を回避できることを示す。なお、リンパ腫の治療に関する最近の成功（Maudeら、２０１４）で、ＣＡＲ技術を利用してＡＭＬを標的する研究がより活発的になってきた（Kenderianら、２０１５；Lichteneggerら、２０１５；Tettamantiら、２０１４；Wangら、２０１５）。ＤＮＴの容易な増幅可能性及び構造上抗がん免疫応答を有するエフェクター分子の高い発現性（Merimsら、２０１１）を考えると、ＤＮＴは、抗腫瘍活性をさらに向上させるために、ＣＡＲ技術の良い細胞ベクターとして機能し得る。さらに、化学療法抵抗性の患者と再燃している患者から取得した原発性芽球は、in vitro及びin vivoでＤＮＴ媒介細胞毒性に感受性であるため（図６及び図７）、ＤＮＴは化学療法では難治性の患者を治療するための第１選択治療として、または化学療法抵抗性微小残存病変を標的する従来の化学療法後の強化療法（consolidation therapy）として使用可能である。
【００７７】
本開示は、現時点では好ましい例として考えられる例を参照して記載したが、本開示は開示された例に限定されないことを理解されたい。逆に、本開示は、添付の請求項の趣旨および範囲内に含まれる種々の変形および均等な構成を包含することを意図する。
【００７８】
ここに記載する全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が具体的に、そして個別にその全体が参考として組み込まれることが示された場合と同じ程度に、その全体が参考として組み込まれる。
【００７９】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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