(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の機能化された表面の存在下に水溶液中で生物学的検体の定量分析を行うための方法であって、前記水溶液は少なくとも１種類の生物学的検体および少なくとも１種類の蛍光マーカーを含有する前記方法において、前記１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度を分析するために未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を測定し、かつ、機能化された表面として、ポリマーまたはポリマー混合物からの機能化された粒子を使用し、該粒子は平均直径２０〜２００μｍを示し、かつ、その表面上にスカベンジャー分子が存在しており、前記スカベンジャー分子が１つ以上の生物学的検体および／または１つ以上の蛍光マーカーと結合し、上部が開放または閉鎖されている１つのチャンバからなる測定チャンバ（１０１）を使用し、前記測定チャンバは側壁を有し、かつ、その基部はデバイスにより形成されており、ここで、該デバイスは少なくとも部分的に透光性である構造要素（１０３）を有し、上方に向かって先細状の突出部として構成されており、前記突出部の横断面は任意の形状を有しており、ここで、前記デバイスの基部とは反対側の構造要素端部（３０４）は平坦または凸状形態をとることで、該端部に粒子が堆積しない状態にあり、かつ、前記測定チャンバの底部は、構造要素の下部に存在する領域、すなわち、構造要素の底面（１１０）を除き非透光性である、前記方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記構造要素がピン、円錐、円錐台、底面がｎ角形である角錐または角錐台の形態を有し、その際、ｎは３〜１０の範囲内の整数であり、かつ透光性である、前記方法。
【請求項３】
以下：
（ａ）少なくとも１種類の機能化された粒子を測定チャンバに導入するステップ；
（ｂ）少なくとも１種類の生物学的検体を含有するサンプルを前記測定チャンバに導入するステップ；
（ｃ）少なくとも１種類の蛍光マーカーを前記測定チャンバに導入するステップ；
（ｃ’）前記機能化された粒子、サンプルおよび蛍光マーカーを前記測定チャンバ内で混合するステップ；
（ｃ’’）未結合の蛍光マーカーと結合した蛍光マーカーとを分離することによって、前記結合した蛍光マーカーが前記分離除去領域（２０５）内に存在するステップ；
（ｄ）前記未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を前記検出領域（１０６）内で測定するステップ；および
（ｅ）前記１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度を分析するステップ
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を逐次的に行うか、または前記ステップの少なくとも２つを同時に行うことを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）および／またはステップ（ｃ）を、その他のステップの前に、かつ前記その他のステップと時間的間隔をあけて行い、該時間的間隔が１２時間を上回ることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法であって、該方法が、直接イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、置換イムノアッセイまたはディスプレイスメントイムノアッセイ、競合イムノアッセイおよび二次イムノアッセイである、前記方法。
【請求項７】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのマイクロタイタープレートであって、請求項１または２に定義される測定チャンバとして少なくとも１個のウェルが具備されている、前記マイクロタイタープレート。
【請求項８】
請求項７に記載のマイクロタイタープレートであって、前記測定チャンバ内で少なくとも１種の機能化された粒子および／または蛍光マーカーが乾燥された状態で存在する、前記マイクロタイタープレート。
【請求項９】
請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法を実施するためのキットであって、請求項７に記載のマイクロタイタープレートと、少なくとも１種類の機能化された粒子と、少なくとも１種類の蛍光マーカーと、反応緩衝液とを含む、前記キット。
【請求項１０】
請求項７に記載のマイクロタイタープレートを製造するための方法であって、以下の工程：
（ｘ）マイクロタイタープレートの底部を、構造要素を有する基部に置き換えるステップであって、ここで、前記基部は、好ましくは前記マイクロタイタープレートウェル中に存在するのと同数の構造要素を有するものとするステップ；
（ｙ）前記基部を前記マイクロタイタープレートと接続させるステップ；および
（ｚ）前記基部の下面に非透光性の層を施与し、その際、前記構造要素の下部に存在する領域、すなわち、構造要素の底面（１１０）を空所にするステップ
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、未結合の発光マーカーの発光を測定することにより生物学的検体を定性的および／または定量的に分析するための方法、およびこのためのデバイス、および該デバイスの使用に関する。
【０００２】
近年の作用物質の開発やその他生命科学の分野における研究において、またバイオ医薬品の製造に際して、重要な手法の一つに、生物学的単位、例えば核酸、タンパク質、抗体、細菌、ウイルスまたは細胞、いわゆる生物学的検体の定量的および／または定性的な分析およびカウントが挙げられる。
【０００３】
生物学的検体を分析するための手法または方法に対する要求は一般的に高く、該要求は特に濃度範囲、測定精度および試料調製に関して極めて多岐にわたる。分析する生物学的検体が同一であっても、測定手法は測定の目的に応じて大きく異なりうる。例えば、診断学においてはタンパク質は血清サンプル中で極めて低濃度で測定されるが、一方でタンパク質は生物工学的製造法においては培地内に存在し、該培地内で数十乗高い濃度で存在する。さらにこうした手法は、検体の分析の他に、例えば活性または親和性および特異性に関するより多くの情報を提供しうる。数十年にわたって、特定の生物学的検体、特にタンパク質および抗体を分析するための標準的な方法として、いわゆる「酵素結合免疫吸着アッセイ」、略して「ＥＬＩＳＡアッセイ」または「ＥＬＩＳＡ法」が確立されている。これは、イムノアッセイと酵素による呈色反応とを組み合わせたものである。ＥＬＩＳＡアッセイの原理は、本質的に、生物学的検体（例えばタンパク質）をスカベンジャー分子により表面（例えばマイクロタイタープレート）に結合させることである。スカベンジャー分子は、典型的には抗体、そのフラグメントであるか、またさらにはプロテインＡまたはプロテインＧである。
【０００４】
広く用いられているいわゆるサンドイッチＥＬＩＳＡ法では、スカベンジャーとして抗体を使用し、次いで検体上の第２の結合部位に検出抗体を結合させる。この検出抗体には酵素が結合されている（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）。この酵素は、該酵素の基質を添加することで酵素反応を生じ、これにより色素が生じる。典型的な基質はテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）またはジアミノベンジジン（ＤＡＢ）であり、これらは溶液を青色または褐色に染色する。こうした染色を分光分析法によって測定しうる前に、停止試薬の添加により酵素反応を停止させる必要がある。ＨＲＰにより生成される色素の量は検体の量に比例しており、適切な検出器で、通常はＵＶ／ＶＩＳ光度計で測定される。これに関して、蛍光生成物（例えばレゾルフィン）を生じる酵素基質も知られており、該蛍光生成物は蛍光測定装置により検出される。酵素反応によって、結合した各検体分子についてのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいて多数の色素分子が生成されうる。こうした増幅作用により、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは通常は極めて高い感度または検出能力を示す。
【０００５】
ＥＬＩＳＡ法も広く用いられている。この方法は、酵素で標識した検出抗体が検体に直接結合するのではなくもう１つのいわゆる一次抗体に結合し、該一次抗体が検体に特異的に結合することを特徴としている。この変法は、酵素で標識した一次抗体を入手することができない場合や、全体的に抗体同士の非特異的な結合が生じ易い場合に用いられる。
【０００６】
直接ＥＬＩＳＡ法は、スカベンジャー分子として抗体ではなく抗原を使用することを特徴としており、該抗原を測定すべき抗体に結合させる。検出は、検出抗体に関して上記した方法と同様に行われる。
【０００７】
ＥＬＩＳＡ法の欠点の一つに、該方法がインキュベーションステップおよび洗浄ステップを複数含んでおり、こうしたステップを数回行う必要が多いことが挙げられる。これらの作業ステップは自動化が不可能であるかまたは部分的にしか可能でないため、現在では主に手動で行われている。これにより、ＥＬＩＳＡアッセイは人員および時間を要するものとなっている。ＥＬＩＳＡ法では実験時間が４〜５時間となることが多いことから、迅速な結果が必要とされるプロセスや複数のサンプルの測定が望ましいプロセス、例えばＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング、Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ−Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）においては、ＥＬＩＳＡアッセイは用いられない。
【０００８】
ＥＬＩＳＡ法の欠点はさらに、作業ステップが複数存在することから、生じるトータルエラーが比較的大きいという点にある。これは、各作業ステップが固有のばらつきを引き起こし、こうしたばらつきが積み重なって全体的なばらつきとなるためである。
【０００９】
ＥＬＩＳＡ法をより迅速にかつより少ない人員および時間で行う試みがすでになされている。ＥＬＩＳＡ法の変法の一つが「蛍光イムノアッセイ」（ＦＩＡまたは”ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”）である。蛍光イムノアッセイは、一般に前述の「古典的な」ＥＬＩＳＡ法よりも実施が容易である。
【００１０】
蛍光色素で標識された検出抗体の使用により、蛍光イムノアッセイでは酵素反応なしで作業することができる。これによって方法ステップ数が減少することから、不安定な酵素活性による変動が排除される。この蛍光イムノアッセイは、均一系内でも不均一系内でも行うことができる。不均一系内で行われる場合には特別な粒子が使用されることが多く、また蛍光が該粒子上で測定されるのに対して、均一系蛍光イムノアッセイでは蛍光測定は溶液中で行われる。それにより古典的なＥＬＩＳＡ法のいくつかのステップが省かれ、また実験時間は通常は２〜３時間に短縮される。しかし、酵素反応を行わないことにより、結果としてこうした手法における感度はＥＬＩＳＡの場合よりも低くなる場合が多い。
【００１１】
均一系蛍光イムノアッセイの一例は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のＤｅｌｆｉａ技術（解離増強型ランタニド蛍光イムノアッセイ）である。この方法では、検出抗体に結合したユーロピウム錯体を溶解させ、次いで、蛍光、特に時間分解蛍光を測定する。もう１つの知られている方法は、Ｃｉｓｂｉｏ社よりＨＴＲＦ技術（「均一時間分解蛍光」”ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”）として提供されているＴＲ−ＦＲＥＴ技術、およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社のＬＡＮＣＥ技術（「ランタニドキレート励起」”Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  Ｃｈｅｌａｔｅ  Ｅｘｃｉｔｅ”）である。
【００１２】
前述のＴＲ−ＦＲＥＴ法は、相互に結合している２つの抗体が空間的に近づけられる場合に、つまり該抗体が互いに結合している場合に、該抗体が蛍光共鳴移動（ＦＲＥＴ）を生じうるように、該抗体が蛍光色素で標識されているという原理に基づく。一方の抗体にはＦＲＥＴドナーが結合しており、他方の抗体にはＦＲＥＴアクセプターが結合している。ＦＲＥＴは、抗体の互いの間隔が１０ｎｍ未満である場合にしか機能しない。前述の抗体が互いに結合すると、ＦＲＥＴドナーは特定の波長の光で励起されて蛍光を発することができる。ＦＲＥＴドナーの放射光によりＦＲＥＴアクセプターが励起されて蛍光放射を発し、これが測定される。すなわち、双方の抗体が（溶液中で）互いに結合している場合にしか、ＦＲＥＴアクセプターの蛍光放射を測定することができない。ここで、そのような溶液を装入し、これに検体を加え、該検体がＦＲＥＴアクセプターまたはＦＲＥＴドナーに結合すると、これら２つのＦＲＥＴパートナーの一方が複合体から排除され、それによりＦＲＥＴアクセプターの蛍光放射が検体の濃度に依存して低減する。
【００１３】
ＦＲＥＴは、２分子の結合を検出するために研究において広く用いられている技術の一つである。しかし、移動効率がサンプル組成に大きく依存することも知られている。この技術をルーチン処理可能な方法とするために、ＴＲ−ＦＲＥＴ技術では、ユーロピウムイオンまたはテルビウムイオンと（例えばトリスビピリジンをベースとする）マクロサイクルとの錯体からなる特別なＦＲＥＴドナーが用いられる。このＦＲＥＴドナーは、サンプル中に存在しうる他の蛍光物質よりも、より長期にわたって持続する蛍光を放射する特性を有する。従って、蛍光の測定は、閃光後に所定の時間的間隔をあけてからでないと行われない。そのため、妨害蛍光がサンプルから減衰してＦＲＥＴ蛍光が生じるまで待機する。それにもかかわらず、ＴＲ−ＦＲＥＴ技術の場合には、マトリックスの影響および蛍光放射の消光（消滅）を算出により補償するために、ＦＲＥＴドナーの放射のみならずＦＲＥＴアクセプターの放射をも測定してその比を求める必要がある。この補償が最適に機能するためには、双方の放射波長を逐次的にではなく同時に測定しなければならない。このことは、正確なＴＲ−ＦＲＥＴ測定を行うための測定装置に２つの検出器が備えられていなければならないことを意味する。ＴＲ−ＦＲＥＴ法のための典型的な測定範囲は、約１０〜５０００ｎｇ／ｍＬ  抗体である。
【００１４】
古典的なＥＬＩＳＡアッセイのもう１つの変法は、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＡｌｐｈａＬＩＳＡ法である。この場合、プローブで標識された抗体ペアが、同一の検体の異なる結合部位への結合によって空間的に近接する。
【００１５】
ＴＲ−ＦＲＥＴとは異なり、この場合にはプローブとして低分子量のフルオロフォアが使用されるのではなく、約２５０〜３５０ｎｍのサイズを有するドナー粒子およびアクセプター粒子（いわゆるドナービーズおよびアクセプタービーズ）が使用される。このドナービーズに６８０ｎｍの波長のレーザー光を照射することによってこれらから一重項酸素が放出され、該一重項酸素が、近傍に存在するアクセプタービーズ上で約６１５ｎｍの波長の光放射を引き起こす。次いで、これを測定して検体の定量化に利用する。ＴＲ−ＦＲＥＴの場合とは異なり、ＡｌｐｈａＬＩＳＡではプローブ担持分子を同時に添加することができないために第２の反応時間（インキュベーション時間）が必要であり、結果的にプロトコールが長くなる。
【００１６】
ドナービーズは光に敏感である。これを用いる場合には暗所かまたは緑色光中でしか作業することができず、このことがこの手法の著しい欠点の一つである。ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイで使用することができるレーザーは、特殊な蛍光プレートリーダー中にしか組み込まれていないことが多く、こうした機器を所有または購入する必要があり、これによって実験のコストが高くなる。
【００１７】
粒子をベースとする不均一系蛍光イムノアッセイでは、古典的なＥＬＩＳＡ法と同様に、最初に生物学的検体をスカベンジャー分子によって表面に（この場合、機能化された不溶性粒体、いわゆる粒子）に結合させる。洗浄ステップ後、蛍光標識された検出抗体をこれに加え、混合し、次いで未結合の蛍光標識された検出抗体を除去する。粒子に結合した蛍光標識された検出抗体の量を測定し、その際、該粒子に結合した蛍光マーカーの蛍光によって、生物学的検体の含有量を分析する。このような手法または分析法は知られている（Ｃ．Ｆ．ＷｏｏｌｌｅｙおよびＭ．Ａ．Ｈａｙｅｓによる総説”Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（２０１３）５（２）参照）。
【００１８】
Ｇｙｒｏｓ  ＡＢ社により用いられた「ＧＹＲＯＳ技術」ではマイクロフルイディクス構造が使用されており、少量のサンプルを遠心分離して（通常は小さな柱体の形態の）粒子堆積物とし、該粒子堆積物の上に蛍光標識されたサンドイッチ複合体を生じさせてこれを測定する。マイクロフルイディクス全体は円形のプラスチックディスク内で実現され、その際、（例えばＣＤ−ＲＯＭの場合のように）該ディスクがその中心軸の周りを回転することによって、液体（例えば、溶解されたスカベンジャー分子、サンプル、洗浄溶液）が流路を通じて外側へと押し出される。ＧＹＲＯＳ技術を用いた場合には１ｎｇ／ｍＬ以上の濃度しか測定できないため、該技術は特にバイオテクノロジーによるプロセスの開発および制御に用いられる。
【００１９】
Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ社はＳＩＭＯＡ（”Ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｒｒａｙ”）と呼ばれる技術を提供しており、その際、粒子上にサンドイッチ免疫複合体が形成される。次いで、数十万のキャビティ（凹部／凸部）（該キャビティはそれぞれ粒子を１つだけ収容することができる）にマイクロフルイディクスにより粒子をチップ上に分配する。その後、検出のためにキャビティを密封し、酵素を活性化させ、該酵素が蛍光色素を生成する。検体濃度が極めて低い場合、１つのキャビティ中に存在する検体分子は平均で１つ未満であり、すなわち蛍光を有するかまたは有しないキャビティのみが存在し、該キャビティをカウントする。従って、このアッセイは「デジタルＥＬＩＳＡ」とも称される。このアッセイにより、１０−１５Ｍ未満の検出限界が達成可能である（Ｒｉｓｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．：”Ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙｓ  ｄｅｔｅｃｔｓ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｔ  ｓｕｂｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８（６），５９５参照）。
【００２０】
ＧＹＲＯＳおよびＳＩＭＯＡは多段法であり、コストの高い微細構造化消耗品（例えば上記のディスク）だけでなく、専用の高価な読取り装置が必要である。
【００２１】
粒子に結合している蛍光標識された免疫複合体の測定には、フローサイトメーターを使用することもできる。この場合、粒子はフローシステムによって個別に測定点へと輸送され、該測定点で該粒子をレーザー光で励起させて蛍光を生じさせる。フローサイトメーターを用いた測定は、異なる検体を同時に分析できるという利点を有する。このために、その内部にカラーコードを有する粒子、すなわち識別可能な蛍光色素がドープされた粒子が使用され、その際、各色は所定の検体との結合を表す。測定には２つのレーザーが同時に使用される。第１のレーザーはカラーコードにより粒子の種類を特定し、第２のレーザーは結合した免疫複合体の含有量を特定する。ＸＭＡＰ技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）では１回の実験実施で１００個までの異なる検体を検出することができ、これはマルチプルユースと称される。
【００２２】
上記の方法に加えて、特に組換え型のタンパク質および抗体を製造するためのプロセスの開発および制御の分野においては、ＥＬＩＳＡよりも簡単な他の測定方法、例えばバイオレイヤー干渉法（Ｂｉｏｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）（ＢＬＩ、Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏより）または表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ＳＰＲ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂｉａｃｏｒｅ）が使用されている。これらの方法、特にＢＬＩは、より高い自動化レベルを可能とし、かつ、典型的にはプロテインＡまたはＧでまたは抗体で被覆された表面への検体の結合に基づいている。
【００２３】
表面への検体の結合によって該表面の光学特性の変化が引き起こされ、これが測定される。これによって、表面に結合した分子の量が算出される。例えば、ＢＬＩの場合には０．５〜２０００μｇ／ｍＬの測定範囲が達成され、ＳＰＲの場合には０．１５〜１０μｇ／ｍＬの測定範囲が達成される。この手法の欠点には、比較的高価で特殊な測定装置が必要であること、そして特殊な消耗品（例えばセンサーおよびチップ）が必要であることが挙げられる。
【００２４】
上記の方法はいずれも、実験実施が煩雑である点で不利である。これらの方法は生物学的検体を定量化するための多数の作業ステップを必要とすることが多いため、実施のコストが高い。同様に、イムノアッセイに基づく単純化された方法が利用可能であって、これによってより高濃度のサンプルを測定することができ、かつ／または、これによって結果が迅速に得られることが望まれるという、適用および学術的な課題が存在する。さらに、様々な液体中で、例えば血清または細胞培養上清中で特定の抗体を分析することができるイムノアッセイが利用可能であることが望ましい。このことは特に抗体の組換えによる（工業的な）製造に際して有利であり、それにより、タンパク質の製造の際に容易に、迅速にかつ安価に定性的および／または定量的な言明を行うことができる。さらに、わずかな作業ステップで済み、それにより時間および試薬を節約することができる、生物学的検体を分析するため方法、特にイムノアッセイが利用可能であることが望ましい。従って、上記の欠点を完全にまたは少なくとも部分的に回避する、好ましくはイムノアッセイとしての、生物学的検体を分析するための単純で容易に実施可能でありかつ迅速な方法が求められている。
【００２５】
従って本発明の課題は、上記の欠点を完全にまたは少なくとも部分的に回避する方法を提供することである。
【００２６】
上記の課題は、特許請求の範囲に記載された方法により、特に本発明によるデバイスまたは該デバイスの使用により解決された。決定的に重要であるのは、未結合の発光マーカーまたは蛍光マーカーの発光放射または蛍光放射を測定するという点であり、それにより、生物学的検体の分析を容易に迅速にかつ安価で実施することができる。
【００２７】
従って本発明は、１つ以上の機能化された表面の存在下に水溶液中で生物学的検体を分析するため（特に定量化するため）の方法であって、前記水溶液は少なくとも１種類の生物学的検体および少なくとも１種類の発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーを含有する前記方法において、前記１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度を分析するために、未結合の発光マーカーの、好ましくは未結合の蛍光マーカーの、発光放射、好ましくは蛍光放射を測定することを特徴とする前記方法に関する。
【００２８】
本発明による方法を用いて、任意のアッセイを行うことができる。好ましくは、本発明による方法はいわゆるイムノアッセイであり、特に、直接イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、置換イムノアッセイまたはディスプレイスメントイムノアッセイ（本明細書中では阻害アッセイとも称される）、競合イムノアッセイおよび二次イムノアッセイからなる群から選択されるイムノアッセイである。
【００２９】
一実施形態［Ｖ−１］においては、本発明による方法において、機能化された表面として、ポリマーまたはポリマー混合物からの機能化された粒子であって該粒子の表面上にスカベンジャー分子が存在している粒子が使用され、該スカベンジャー分子が１つ以上の生物学的検体および／または１つ以上の蛍光マーカーと結合する。機能化された粒子は、有利には、約２０〜約２００μｍの範囲内、または約８０〜約２００μｍの範囲内の平均直径を有する。
【００３０】
一実施形態［Ｖ−２］においては、本発明による方法において、機能化された表面として、機能化された磁性粒子が使用される。この磁性粒子は、有利には約１〜約１００μｍの範囲内の平均直径を有する。磁性粒子は、強磁性または超常磁性の特性を有する。この磁性粒子は通常はフェライトまたはマグネタイトからの磁性コアを含んでおり、該磁性コアはポリマーまたはポリマー混合物からのシェルにより包囲されている。この磁性粒子は非磁性粒子に相応して機能化されており、すなわちスカベンジャー分子を具備している。
【００３１】
一実施形態［Ｖ−３］においては、本発明による方法は以下を含む：
（ａ）少なくとも１種類の機能化された粒子または少なくとも１種類の機能化された磁性粒子を測定チャンバに導入するステップであって、前記測定チャンバは、前記測定チャンバの底部を通じて光が到達する検出領域と光が到達しない分離除去領域とを有するものとするステップ；
（ｂ）少なくとも１種類の生物学的検体を含有するサンプルを前記測定チャンバに導入するステップ；
（ｃ）少なくとも１種類の蛍光マーカーを前記測定チャンバに導入するステップ；
（ｃ’）前記導入された粒子、サンプルおよび蛍光マーカーを前記測定チャンバ内で混合するステップ；
（ｃ’’）未結合の蛍光マーカーと結合した蛍光マーカーとを（好ましくは沈降または遠心分離により）分離することによって、前記結合した蛍光マーカーが前記分離除去領域内に存在するステップ；
（ｄ）前記未結合の蛍光マーカーの蛍光放射を前記検出領域内で測定するステップ；および
（ｅ）前記１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度を分析するステップ。
【００３２】
測定チャンバとは、本明細書中では、本発明により具備されたマイクロタイタープレートウェルとも理解される。本発明による方法は、好ましくは、本発明による測定チャンバとしてウェルが具備されているマイクロタイタープレートを用いて行われる。
【００３３】
ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を、もう１つの方法ステップの前または後に行うことができ、その際、該もう１つの方法ステップには、さらなる試験成分または物質、例えば一次抗体または補助物質、例えば界面活性剤を測定チャンバに導入することが含まれる。
【００３４】
ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を逐次的に行うこともできるし、これらのステップの少なくとも２つを同時に行うこともできる。
【００３５】
本発明による方法の変形［Ｖ−４］においては、ステップ（ａ）および／またはステップ（ｃ）が、その他の方法ステップの前に、好ましくはその他のステップと時間的間隔を大きくあけて行われる。
【００３６】
本発明による方法の変形［Ｖ−５］においては、機能化された粒子は磁性（磁化可能）である。
【００３７】
もう１つの変形［Ｖ−６］においては、機能化された磁性粒子が使用され、かつステップ（ｃ’’）は、沈降により、および一時的または永続的な磁場の印加により行われる。
【００３８】
本発明による方法の一実施形態［Ｖ７］においては、ステップ（ｄ）における未結合の蛍光マーカーの蛍光放射の測定には、蛍光顕微鏡が使用される。使用可能な本発明によるデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレートにおいて、底部上の非透光性の層を省くことができる。蛍光顕微鏡は、検出領域内で生じる蛍光放射のみを測定し、分離除去領域から生じる蛍光放射がカットされるように調整されていなければならない。
【００３９】
マイクロタイタープレートは知られている。これは、互いに孤立した複数のキャビティ（ウェル、カップ、凹部または窪みとも称される）を含む。マイクロタイタープレート上のキャビティの数は可変である。市販されているのは以下の構成である：
２×３（６ウェル）、４×３（１２ウェル）、４×６（２４ウェル）、６×８（４８ウェル）、８×１２（９６ウェル）、１６×２４（３８４ウェル）、３２×４８（１５３６ウェル）。市販のマイクロタイタープレートのカップ内の底部は、様々に形成されていてよい。市販されているのは、以下の底部である：Ｆ底（平底）、Ｃ底（最小限の丸みのついた角を有する平底）、Ｖ底（先が円錐形状の底部）およびＵ底（Ｕ字形の凹部）。本発明により適しているのは、特にＦ底、Ｃ底またはＵ底を有するマイクロタイタープレートであり、この中にデバイスが導入される。
【００４０】
生物学的検体を分析するための粒子をベースとする方法は知られている（ＵＳ４，７３１，３３７Ｂ、ＤＥ１０２００４０３８１６３Ａ、ＷＯ８６／０４６８４、ＷＯ９４／２９７２２、ＵＳ４，１１５，５３５Ｂ、ＷＯ２０１１／０４５０２２参照）。これらの方法はいずれも、結合した蛍光マーカーの蛍光を測定することに基づいている。
【００４１】
水溶液から不溶性成分を分離除去するためのデバイスは知られている。例えば、ＷＯ２０１１／０３１２３６およびＵＳ２０１０／００２８９３５には、透過分光法または吸収分光法における測定精度を向上させるべく水溶液から微粒状の粒子を分離除去するための特別に形成されたデバイスが記載されている。しかし、これらのデバイスは本発明による方法における使用には適さない。なぜならば、これらのデバイスを用いた場合には、未結合の発光マーカーの発光または未結合の蛍光マーカーの蛍光を確実に測定して、分析すべき１つ以上の生物学的検体を定量化することができないためである。
【００４２】
従って、本発明による方法を実施することができる特別なデバイスも、本方法の対象である。
【００４３】
従って、本発明は、未結合の発光マーカーの発光を測定することにより生物学的検体を分析するためのデバイス［０］であって、結合した発光マーカーと未結合の発光マーカーとが水溶液中で１つ以上の機能化された表面の使用下に空間的および光学的に互いに離れているデバイスにも関し、その際、前記デバイスは分離のために少なくとも部分的に透光性である構造要素を有し、前記デバイスの基部は前記構造要素の底面を除いて非透光性であり、かつ前記水溶液は少なくとも１種類の生物学的検体および少なくとも１種類の発光マーカーを含有し、前記少なくとも１種類の生物学的検体および任意に少なくとも１種類の発光マーカーは１つ以上の機能化された表面に結合する。
【００４４】
さらに、本発明は、本発明による方法において使用するための測定チャンバに関し、前記測定チャンバ内で、機能化された磁性粒子が使用される。結合した発光マーカー、好ましくは結合した蛍光マーカーと、未結合の発光マーカー、好ましくは未結合の蛍光マーカーとの分離は、測定チャンバの下方に配置された非透光性の磁性要素を用いた配向的な沈降により行われる。この磁性要素は空所を有し、該空所は、測定チャンバの底部（基部）に測定窓が生じるように配置されている。この磁性要素は基部に固定されていることができるか、または取り外し可能である。測定チャンバは構造要素を有していない。
【００４５】
機能化された磁性粒子の沈降は、測定窓の上方に粒子が沈殿しないように磁場により操作される。発光、好ましくは蛍光の測定は、測定チャンバの底部で測定窓を通じて蛍光測定装置を用いて測定することにより行われる。
【００４６】
本発明はさらに、上記の測定チャンバ、またはそのような測定チャンバを少なくとも１つ具備したマイクロタイタープレートの、本発明による方法における使用に関し、その際、同様に機能性磁性粒子が使用される。
【００４７】
本発明によるデバイス［０］の一実施形態［Ａ］においては、１つ以上の機能化された表面が機能化された粒子として本発明によるデバイスに導入され、その際、結合した発光マーカーは該デバイスの分離除去領域内に存在し、未結合の発光マーカーは検出領域内に存在し、その際、該未結合の発光マーカーは好ましくは均一に分配されている。
【００４８】
本発明によるデバイス［０］の一実施形態［Ｂ］においては、該デバイスの内側には、１つ以上の機能化された表面が、好ましくは基部とは反対側の構造要素端部の下方に存在する領域内に、好ましくは該デバイスの基部に存在する領域内に、存在する。分離は、生物学的検体と、発光マーカーと、デバイス内に存在し任意に固定化された１つ以上の機能化された表面との結合により行われる。
【００４９】
もう１つの実施形態［Ｃ］においては、本発明は、上記のまたは実施形態［Ａ］もしくは［Ｂ］に記載したデバイスに関し、その際、構造要素が突出部として（好ましくは上方に向かって先細状の突出部として）構成されており、前記突出部の横断面は任意の形状を有することができ（例えば、円形、矩形、三角形）、前記デバイスの基部とは反対側の構造要素端部は、前記端部に試験成分、特に粒子が堆積しない状態にある。この端部は例えば平坦であってもよいし凸状形態をとっていてもよく、かつ／または小さい直径を有することができる。
【００５０】
測定チャンバ内に存在する構造要素は、ピン、円錐、円錐台、底面がｎ角形である角錐または角錐台の形態を有することができ、その際、ｎは３〜１０の範囲内の整数を表し、好ましくは３、４、５、６、７または８を表す。この構造要素はさらに、円錐または角錐から誘導される形態、例えば円形の土台上の円錐、または正方形の土台上の四面体の角錐を有することができる。
【００５１】
構造要素はさらに、デバイスの基部とは反対側の端部に、光学部品、例えばレンズを有することができる。
【００５２】
この構造要素は透光性である。この構造要素は、適した透光性の材料または材料混合物からなる。この材料が測定を妨害する自己蛍光を示さないことが重要である。透光性の材料は知られており、当業者により容易に選択されることができる。そのような材料は、例えばポリスチレン、ＣＯＣ（環状オレフィン共重合体）、ポリプロピレンまたはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）である。極めて適しているのはポリプロピレンおよびＰＭＭＡである。ポリスチレンは特に高温加工時にある程度の自己蛍光を示すため（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２０１３  Ｊａｎｕａｒｙ  ２；８５（１）：４４−４９）、本発明によれば好ましくない。
【００５３】
こうした材料または材料混合物を、１ｍｍ以下の厚さ（層厚）で使用することができる。好ましい厚さは、以下の範囲内である：約０．０５〜約０．５ｍｍ、約０．１〜約０．４５ｍｍ、約０．１５〜約０．４ｍｍ、約０．２〜約０．４ｍｍ、または約０．２〜約０．３５ｍｍ。
【００５４】
もう１つの実施形態［Ｄ］においては、本発明は、上記のまたは実施形態［Ａ］、［Ｂ］もしくは［Ｃ］のうちの１つに記載したデバイスに関し、前記デバイス内には分離除去領域および測定領域（検出領域）が存在し、前記測定領域は、透光性の測定窓を有するかまたはそのようなものと光学的に接続されている。
【００５５】
もう１つの実施形態［Ｅ］においては、本発明は、上記のまたは実施形態［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］もしくは［Ｄ］のうちの１つに記載したデバイスに関し、前記デバイス内では構造要素の基部が測定窓として構成されている。その場合、発光の測定は、発光測定装置、好ましくは蛍光測定装置を用いて行われる。励起および放射の検出は、該デバイスの下方で行われる。
【００５６】
デバイスまたは測定チャンバ内に存在する構造要素の基部と端部とが光学的に互いに接続されている場合には、該デバイスの基部からこちらへと放射される励起光が該構造要素を通じて検出領域に到達し、該検出領域において未結合の発光マーカー、好ましくは未結合の蛍光マーカーを励起させて放射を生じさせ、次いで該放射が同様に該デバイスの基部から測定される。その場合、構造要素の端部が基部と共に測定窓を形成する。適した構造要素形状を選択する際には、励起光および放射光が粒子により妨害されないように留意すべきである。従って、構造要素の端部が凸状形態をとり、かつ該構造要素が上方に向かって先細状の突出部として構成されていることが特に好ましい。端部が平坦である場合には、該平坦部が小さく、かつ／または、該平坦部に粒子が堆積することができないかまたは妨害とならない数の粒子しか堆積することができない（本明細書中では「実質的に粒子が堆積することができない」とも称される）状態にあることが好ましい。端部が平坦である場合であっても、突出部が、基部とは反対側の該端部に向かって先細状であることが好ましい。
【００５７】
もう１つの実施形態［Ｆ］においては、本発明は、マイクロタイタープレートであって、前記マイクロタイタープレートの窪み、カップまたは凹部内に、それぞれ上記のまたは実施形態［０］、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］もしくは［Ｅ］のうちの１つに記載したデバイスが組み込まれている前記マイクロタイタープレートに関する。
【００５８】
相応して、一実施形態［Ｆ−１］においては、本発明は、本発明による方法を実施するためのマイクロタイタープレートであって、前記マイクロタイタープレートの少なくとも１つの凹部内にデバイスが導入されており、前記デバイスは少なくとも部分的に透光性である構造要素を有し、前記構造要素は上方に向かって先細状の突出部として構成されており、かつ該突出部の横断面は任意の形状を有することができ、基部とは反対側の構造要素端部は該端部に実質的に試験成分が堆積しない状態にあり、かつ前記デバイスの基部は前記構造要素の底面を除いて非透光性であり、かつ前記凹部の縁部が測定チャンバの側縁部を形成することを特徴とする前記マイクロタイタープレートに関する。
【００５９】
もう１つの実施形態［Ｆ−２］においては、本発明は、実施形態［Ｆ−１］に記載したマイクロタイタープレートであって、前記マイクロタイタープレートの元の底部が、構造要素を有する一体型の基部に置き換えられており、前記マイクロタイタープレートの各々の凹部の中に１つの構造要素が存在し、前記基部は前記構造要素の底面を除いて非透光性となるように被覆されていることを特徴とする前記マイクロタイタープレートに関する。
【００６０】
この場合、基部は構造要素と同一の材料からなり、かつ、該基部を形成する材料の選択に関しては、該構造要素との関連で挙げた材料特性および層厚に関する基準が該当する。
【００６１】
本発明は、以下を含む、実施形態［Ｆ−２］として記載したマイクロタイタープレートの製造にも関する：
（ｘ）マイクロタイタープレートの底部を、構造要素を有する基部に置き換えるステップであって、ここで、前記基部は、好ましくは前記マイクロタイタープレートウェル中に存在するのと同数の構造要素を有するものとするステップ；
（ｙ）前記基部を前記マイクロタイタープレートと接続させるステップ；および
（ｚ）前記基部の下面に非透光性の層を施与し、その際、前記構造要素の底面を空所にするステップ。
【００６２】
基部とマイクロタイタープレートとの接続および非透光性の層の施与は、以下に同様の文脈において記載するように行われる。
【００６３】
構造要素を有する一体型の基部は、成形法により、例えば射出成形法、付加製造法（例えば３Ｄ印刷法）または熱成形法（熱間成形法、深絞り法または真空成形法）により製造可能である。
【００６４】
当然のことながら、マイクロタイタープレートのすべての凹部の中に１つの構造要素が存在しているわけではないこともありうる。同様に、マイクロタイタープレートの複数の凹部の中に異なって形成された複数の構造要素が存在することも可能である。従って、構造要素を有する１つの一体型の基部は、異なって形成された複数の構造要素を有することができる。
【００６５】
もう１つの実施形態［Ｇ］においては、本発明は、上記のまたは実施形態［０］、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］もしくは［Ｅ］のうちの１つに記載したデバイスを含む測定チャンバに関する。
【００６６】
もう１つの実施形態［Ｈ］においては、本発明は、上記のまたは実施形態［０］、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］、［Ｆ］もしくは［Ｇ］のうちの１つに記載したデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレートの、未結合の発光マーカーの発光の測定により生物学的検体を定性的または定量的に分析するための、イムノアッセイ、特に直接イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイ、競合イムノアッセイまたは二次イムノアッセイにおける使用に関し、その際、前記発光マーカーは、好ましくは蛍光マーカーである。
【００６７】
上記の方法の他に、本発明はさらに、以下を含む、本発明によるデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレートを使用して、特に上記のまたは実施形態［０］、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］、［Ｆ］もしくは［Ｇ］のうちの１つに記載したデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレートを使用して生物学的検体を定性的および／または定量的に分析するための方法に関する：
（ａ）少なくとも１種類の機能化された表面をデバイスに導入するステップ；
（ｂ）少なくとも１種類の生物学的検体を含有するサンプルを前記デバイスに導入するステップ；
（ｃ）少なくとも１種類の発光マーカーを前記デバイスに導入するステップ；
（ｄ）未結合の発光マーカーの発光放射を測定するステップ；および
（ｅ）前記生物学的検体の量および／または濃度を分析するステップ。
【００６８】
本発明による機能化された表面は、デバイス中にすでに存在することができるか、または本発明による方法において単独でもしくは測定溶液（サンプル）と一緒にデバイスに導入される。
【００６９】
本発明のもう１つの実施形態においては、機能化された表面として、機能化された粒子が使用される。
【００７０】
本発明による方法においては、複数の種類の機能化された表面／粒子上に、または１つの表面／粒子表面上に、複数の種類の機能化が存在することができる。すなわち、表面の機能化の種類は異なっていてよい。その結果、本発明による方法を用いて、および本発明によるデバイスおよび測定チャンバにおいて、または本発明によるマイクロタイタープレートを用いて、複数の種類の生物学的検体を測定することができる。そのためには、各々の検体に対して、異なる波長で励起するおよび／または放射する固有の１つの発光マーカーを使用しなければならない。
【００７１】
機能化された磁性粒子を使用する場合にも、上記のことが同様に該当する。
【００７２】
「機能化された」という概念は、本発明に関連して、表面上に、好ましくは粒子表面上にスカベンジャー分子（以下、スカベンジャーとも称される）が存在することを意味する。表面または粒子表面の機能化のために、表面は少なくとも１種類のスカベンジャー分子で覆われる。スカベンジャー分子とは、１つ以上の生物学的検体とおよび／または１つ以上の発光マーカーと物理的または化学的に結合する分子をいう。その際、磁性粒子であるか非磁性粒子であるかということは、重要ではない。どちらの種類の粒子とも、本明細書中に記載したとおりに機能化されることができる。
【００７３】
本発明によれば、「機能化された」とは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に関連して以下に説明するように、磁性粒子または非磁性粒子が適切な金属イオンで覆われていることをも意味するため、本明細書中では、形成される金属イオン錯体（例えば、ＮＴＡ−Ｎｉ２＋）がスカベンジャー分子を形成し、その後で該スカベンジャー分子が相応するタグを有する試験成分と結合する。
【００７４】
競合アッセイに関しては、機能化された表面、特に粒子表面がスカベンジャーを有し、該スカベンジャーに、生物学的検体と発光マーカーとが同一の結合部位で物理的および／または化学的に結合しうることが必要である。他のアッセイに関しては、スカベンジャーが１つ以上の生物学的検体のみと結合するか、または所望の場合には１つ以上の発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーと結合する状態にあることが望ましい。
【００７５】
機能化された磁性粒子が使用される場合にも、同様のことが該当する。
【００７６】
機能化の一変形においては、スカベンジャー分子は１種類の生物学的検体に関して特異的に選択された結合部位のみを有し、一方で他の一変形においては、スカベンジャー分子は複数の異なる結合部位を有し、その際、各々の結合部位は、該結合部位が特定の１つの生物学的検体のみと結合するように選択されている。該変形により、機能化された表面に異なる種類の生物学的検体が結合することが可能である。
【００７７】
異なる種類の生物学的検体を同時に測定することが望ましい場合には、本発明による方法において、機能化された異なる（磁性）粒子を１つの測定チャンバ内で使用することもできる。
【００７８】
機能化の一変形には、表面に異なる種類のスカベンジャー分子を具備させることが含まれ、その際、該スカベンジャー分子の各々は、分析すべき生物学的検体のための少なくとも１つの結合部位を有する。
【００７９】
本発明による方法において、複数の種類の生物学的検体と結合しうる機能化された粒子または機能化された磁性粒子が使用される場合には、各々の検体に対して、異なる波長で励起するおよび／または放射する固有の１つの発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーを使用しなければならない。
【００８０】
本発明による方法を確実に実施するためには、特に直接（イムノ）アッセイ、サンドイッチ（イムノ）アッセイまたは二次（イムノ）アッセイの場合には、スカベンジャー分子、さらに表面または粒子表面が、１つ以上の生物学的検体以外の試験成分と特異的または非特異的に結合することが重要である。これに対する例外は、競合（イムノ）アッセイおよび置換アッセイである。競合（イムノ）アッセイでは、スカベンジャーは同一の結合部位において発光マーカーおよび特異的な生物学的検体と結合することができる。置換アッセイでは、スカベンジャーは発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーと結合する。
【００８１】
表面および粒子表面の機能化に適したスカベンジャーは知られており、該スカベンジャーは、１つ以上の所望の試験成分が該スカベンジャーに結合するように選択される。適切なスカベンジャーは主にタンパク質（例えば抗体）であり、該タンパク質は必要に応じてリンカー系を用いて表面または粒子表面に結合される。表面または粒子表面のスカベンジャーでの被覆は、共有結合により行われてもよいし非共有結合により行われてもよい。試験成分のうちの１つ（例えば生物学的検体）が抗体である場合には、スカベンジャーは通常はタンパク質である。抗体に対する知られているスカベンジャーは、例えば黄色ブドウ球菌からのプロテインＡおよびレンサ球菌からのプロテインＧである。
【００８２】
機能化された磁性粒子が使用される場合にも、同様のことが該当する。
【００８３】
リンカー系を具備した表面の例は、以下に詳細に記載するように、ストレプトアビジンで被覆された粒子であり、例えばストレプトアビジン  Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子（ＶＷＲ、品番２８−９８５７−３８）である。もう１つの例は、表面上にニトリロ酢酸基（ＮＴＡ）またはイミノ酢酸基（ＩＤＡ）を有するアガロース粒子であり、該基は金属イオンと極めて安定な錯体を形成し、いわゆるＨｉｓタグで標識されたタンパク質の結合に適している。
【００８４】
機能化された粒子の製造に適しておりかつ多孔質材料からなる慣用の材料の一つにアガロースがあり、これはＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の名称で市販されている。Ｓｅｐｈａｒｏｓｅまたはアガロースは、様々な架橋度で、また様々な結合能で入手可能である。機能化の前に、すなわちスカベンジャー分子での被覆の前に、化学薬品でアガロース粒子を活性化させることにより、スカベンジャー分子との効率的な結合が保証される。活性化に適した化学薬品は、ＣＮＢｒである。
【００８５】
すでに説明したように、慣用のスカベンジャー分子はタンパク質である。タンパク質を表面に、特に粒子表面に結合させるために、該表面とスカベンジャー分子との間のリンカーとして作用する化学薬品（例えばストレプトアビジンまたはそのホモログ（例えばアビジン、ニュートラアビジン））を使用することができる。ストレプトアビジンまたはそのホモログはビオチンと安定な結合を生じ、それにより、ビオチン化プロテインＡの各々が、ストレプトアビジンで処理された（粒子）表面と結合する。機能化された磁性粒子が使用される場合にも、同様のことが該当する。
【００８６】
タンパク質のビオチン化は知られており、生化学における標準的な手法の一つである。通常、ビオチン化には活性エステル（例えば、ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）が利用され、該活性エステルによりビオチンがスカベンジャータンパク質の遊離アミノ官能基に結合される。ビオチン化スカベンジャータンパク質は、通常は、ストレプトアビジンでまたはそのホモログで処理された（磁性）粒子に結合される。
【００８７】
タンパク質親和性タグを含むスカベンジャータンパク質は、金属錯体を介して（粒子）表面に結合されることができる。これには実質的には、所定のアミノ酸が適切な金属イオン（例えば、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋およびＺｎ２＋）と安定な錯体を形成するという原理が用いられる。そのようなアミノ酸は、タンパク質中に天然に存在することもできるし、ポリペプチドとしてタンパク質にいわゆる「タグ」として導入されていてもよい。慣用のタグは、Ａｒｇタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＦｌａｇタグおよびＨｉｓタグである。金属イオンは、ＮＴＡ（ニトリロ酢酸）、ＣＭＡ（カルボキシメチルアスパラギン酸）またはＩＤＡ（イミノ酢酸）を用いて（粒子）表面に結合される。実質的には、上記の機能化の際には、その他ではタンパク質のクロマトグラフィー精製の際に、特に固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）の際に使用されるのと同一の原理が利用される。
【００８８】
上記の原理を利用することにより、機能化された（磁性）粒子を、使用すべきアッセイに、または分析すべき１つ以上の生物学的検体に個々に適合させることができ、それによって、当業者は本発明による方法を自身のそれぞれの要求に容易に適合させることができる。
【００８９】
機能化された表面がデバイス内にすでに存在する場合には、本発明は、もう１つの実施形態において、機能化された表面のデバイスへの導入、すなわちステップ（ａ）を、ステップ（ａ’）として行うことに関し、すなわち、前記デバイス内の少なくとも１つの表面、好ましくは前記デバイスの基部を処理し、その際、前記基部とは反対側の構造要素端部には処理を行わないものとし、ここで、前記処理とは、スカベンジャーと前記基部を支援するコーティング緩衝液とを結合させるための処理であるものとし、かつ少なくとも１種類のスカベンジャーを添加し、その際、前記スカベンジャーを好ましくは溶解させて添加するものとする。
【００９０】
従って、本発明は、デバイス、本発明による測定チャンバおよび本発明によるマイクロタイタープレートであって、前記デバイスの少なくとも１つの表面、好ましくは前記デバイスの基部は機能化されており、前記基部とは反対側の構造要素端部は機能化されていない、前記デバイス、本発明による測定チャンバおよび本発明によるマイクロタイタープレートにも関する。処理されたデバイス表面は、本明細書中では「定置」表面とも称される。
【００９１】
スカベンジャーを添加した後、機能化が予定される所望の箇所にコーティング緩衝液を数時間または一晩作用させることが有利である。スカベンジャー分子での表面の被覆に適したコーティング緩衝液は知られている。この例は塩基性の炭酸塩緩衝液であり、これにより、例えばスカベンジャー分子であるプロテインＡを所望の部位に、例えばデバイスの基部に結合させることができる。
【００９２】
同様に、デバイス、本発明による測定チャンバおよび本発明によるマイクロタイタープレートの基部をストレプトアビジンにより機能化することができ、それにより、予めそれぞれビオチン基が付与（標識）されている複数の異なるスカベンジャーが、所望の部位に結合される。
【００９３】
機能化された適切な表面を選択することにより、試験時間に影響を与えることができる。原則的には、機能化された大表面によって、測定すべき１つ以上の生物学的検体が、また所望であって予定される場合には１つ以上の発光マーカーが、拡散によりスカベンジャーと出会う可能性が高まる。測定の速度は、適切な表面サイズ、ならびに該表面上に存在するスカベンジャーの種類および数の選択に影響を受けうる。本発明による方法を迅速化するためには、好ましくは、大表面であって該表面上に複数のスカベンジャーが存在する表面が使用される。このことは、粒子表面にも定置表面にも該当する。
【００９４】
本発明による方法の速度に影響を与えるもう１つの要因としては、使用される機能化された表面のサイズの他に、該表面の結合能が挙げられる。機能化された粒子の場合、該粒子の結合能とは、該機能化された粒子に所定量の生物学的検体を結合させる能力であって、該存在する機能化された粒子の量または重量、質量に関する能力を指す。本発明による方法において速度を決定づけるもう１つのパラメータは、以下に詳説するように、試験成分の入念な混合である。その際、磁性粒子であるか非磁性粒子であるかということは、重要ではない。
【００９５】
本発明による方法において機能化された表面として使用することができる機能化された（磁性）粒子は、市販されているかまたは本方法のために相応して個別に製造される。
【００９６】
そのような個別に機能化された粒子を製造するために、特に合成または天然のポリマー、例えばポリスチレン、ラテックス、アガロース、ポリラクチドまたはＰＭＭＡならびに多糖類からの粒子を使用することができる。多孔性材料、例えばアガロースからの粒子が好ましい。特に適しているのは、生物学的検体の、例えばタンパク質のクロマトグラフィー精製に使用される市販の粒子である。この粒子は、通常はスラリーとして提供されている。上記のことは磁性粒子にも同様に該当し、その際、合成または天然のポリマーが磁性コアを包囲している。
【００９７】
本発明により使用することができる非磁性粒子は、しばしば球状粒子であり、約０．１〜約２００μｍの範囲内の典型的な平均直径を有する。本発明により好ましい粒子は、約２０〜約２００μｍの範囲内、特に約８０〜約２００μｍの範囲内の平均直径を有し、かつ試験成分との非特異的な結合を生じない。本発明によれば、ＩｇＧまたは検体１ｍＬ当たり２０ｍｇを上回る結合能を有する粒子が好ましい。
【００９８】
本発明により使用することができる磁性粒子（「磁性ビーズ」とも称される）は、通常は生物学的検体の単離または分析に使用されるものである（例えばＷＯ２００６／１１２７７１参照）。磁性粒子のポリマーコーティングは、通常は、糖、ポリビニルアルコールまたはケイ酸塩からなる。磁性粒子は、粒子に関して説明した方法と同様の方法で機能化することができるか、またはすでに機能化された磁性粒子として市販されている（例えば、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのプロテインＡ  Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子、品番２８−９４４０−０６）。本発明により特に適した磁性粒子は、多孔性材料、例えばアガロースからのコーティングを有し、かつフェライトまたはマグネタイトからのコアを有する（例えばＭａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子）。
【００９９】
磁性粒子も同様に球状粒子であり、約１〜約１００μｍの範囲内の典型的な平均直径を有する。
【０１００】
当業者は、分析される生物学的検体と組み合わせて使用することができる機能化された磁性または非磁性の粒子を容易に見出すことができ、かつ、部分的にそのような組み合わせは従来技術のさらに発展したイムノアッセイ法においてすでに使用されている。
【０１０１】
以下の記載は、機能化された磁性粒子が使用される場合にも該当する。
【０１０２】
ステップ（ａ）（場合により（ａ’））、（ｂ）および（ｃ）は、本発明による方法において、連続して、すなわち逐次的に行われてもよいし、ステップ（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくとも２つを同時に行うこともでき、これを、例えばデバイス内に機能化された表面を装入し、次いでサンプルと発光マーカーとを含有する測定溶液を装入することにより行うことができる。またそれに代えて、検体を含有するサンプルが装入され、これに、発光マーカーと、機能化された粒子の形態の機能化された表面とが添加される。逐次的な添加の場合には、通常はステップの順序は重要ではない。ステップ（ｂ）をステップ（ａ）および（ｃ）の前に行うことも、ステップ（ｂ）をステップ（ｃ）および（ａ）の前に行うことも、ステップ（ｃ）をステップ（ａ）または（ｂ）の前に行うことも可能である。競合イムノアッセイの場合には、ステップ（ｂ）とステップ（ｃ）とを同時に行うことが好ましい。すでに機能化された表面を有するデバイスが使用される場合には、ステップ（ａ）は省かれる。
【０１０３】
好ましくは、本発明による方法において、ステップ（ａ）およびステップ（ｃ）は、その他の方法ステップの前に、同時にまたは逐次的に行われる。同様に好ましくは、ステップ（ａ）またはステップ（ｃ）はその他の方法ステップの前に行われる。
【０１０４】
その際、ステップ（ａ）および／または（ｃ）とその他の方法ステップとの時間的間隔は短くても長くてもよい（例えば、数時間、数日間、数週間、数カ月間または数年間）。この間隔が１２時間を上回る場合には、ステップ（ａ）および／または（ｃ）に導入される試験成分、すなわち導入された機能化された（磁性）粒子および／または蛍光マーカーが、測定チャンバ内で乾燥された状態にあることが好ましい。測定チャンバは、室温で、好ましくは最高で３７℃、好ましくは３５℃の高められた温度で乾燥される。乾燥期間は、通常は、測定チャンバに導入される水溶液の量に依存する。通常の乾燥時間は、１２〜２４時間の範囲内である。
【０１０５】
乾燥前に、場合によりさらなる物質を測定チャンバに導入することができ、該物質は、（磁性）粒子および／または発光マーカーまたは蛍光マーカーの機能性／活性が乾燥後にそのまま維持されるためのものであることが望ましい。適当な物質は、ＢＳＡ、糖または界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ  ２０である。
【０１０６】
従って、本発明は、本発明による測定チャンバおよびマイクロタイタープレートであって、
（ｉ）少なくとも１種類の機能化された粒子もしくは機能化された磁性粒子、および少なくとも１種類の蛍光マーカー、または
（ｉｉ）少なくとも１種類の機能化された粒子もしくは機能化された磁性粒子、または
（ｉｉｉ）少なくとも１種類の蛍光マーカー
がそれぞれ乾燥状態にある本発明による測定チャンバおよびマイクロタイタープレート、ならびに本発明による方法におけるその使用にも関する。
【０１０７】
同様に、本発明はその製造にも関する。このために上記のとおりの措置がとられ、すなわちこれは、相応する試験成分を本発明による測定チャンバへの導入後に乾燥または凍結乾燥させることにより行われる。
【０１０８】
少なくとも１種類の機能化された粒子または機能化された磁性粒子および／または少なくとも１種類の蛍光マーカーがすでに乾燥状態にある測定チャンバが使用される場合には、本発明による方法においては、該当する試験成分を添加する１つ以上のステップは省かれる。例えば、機能化された（磁性）粒子がすでに乾燥状態にある場合には、機能化された（磁性）粒子の導入、すなわちステップ（ａ）は省かれる。
【０１０９】
本発明による方法においては試験成分間に結合が形成されるが、該結合は該試験成分同士の親和性およびその濃度に依存する。本発明による方法に関しては、未結合の発光マーカーの量が所与の一定の試験条件で生物学的検体の量のみに依存することが必要である。
【０１１０】
本発明の一実施形態においては、様々な部位（エピトープ）で、発光マーカーおよびスカベンジャーと生物学的検体とがそれぞれ結合する（図６ａ、図６ｃおよび図７ａに概略的に示す）。
【０１１１】
本発明のもう１つの実施形態においては、発光マーカーおよび生物学的検体がそれぞれスカベンジャー分子上の同一の部位に結合することができる（図６ｂに概略的に示す）。
【０１１２】
本発明のもう１つの実施形態においては、生物学的検体に、発光マーカーに代えていわゆる「一次抗体」が結合し、該一次抗体に該発光マーカーが結合する（図７ｂに概略的に示す）。
【０１１３】
結合の生成を加速させるためには、すべての試験成分を導入した後に該試験成分を本発明によるデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレート内で十分に混合することが合理的である。これは、手動で行われてもよいし自動で行われてもよい。試験成分の接触の速度が高いほど、平衡の達成、ひいては生物学的検体の測定／分析がより迅速に進行する。機能化された磁性粒子が使用される場合にも、同様のことが該当する。
【０１１４】
本方法がより迅速に行われることが望ましい場合には、平衡の達成を省くことができる。この場合には、全てのサンプルおよびキャリブレーターに関して同一のインキュベーション時間および条件を維持することが重要である。
【０１１５】
混合を自動化するためには、本発明によるデバイスを中に有するユニット（例えば、測定チャンバまたはマイクロタイタープレート）を、実験室で常用されているシェーカー（振とう装置）に載置する。このような振とう装置は知られている。簡単な手法により、最適な振とう速度を見出すことができる。ボルテックス装置の使用も考えられる。混合の目的は、試験成分同士が衝突する確率を高めることで所望の結合を可能な限りスピーディーに形成させ、それにより該成分の結合の平衡達成を迅速に生じさせることにある。成分の結合の平衡達成に要する時間は可変であり、容易に見出すことができる。通常は、成分が測定に十分な結合の平衡に達するまでには、１５〜３０分間の範囲内の最適な完全混合時間を要する。
【０１１６】
（好ましくは機能化された粒子の形態の）機能化された表面がフルイディクス系またはマイクロフルイディクス系に導入された場合には、自由拡散または振とうに代えて、試験成分同士が衝突する確率を高めることができ、特に生物学的検体とスカベンジャー分子とが衝突する確率を高めることができる。これらの系内では、機能化された表面が分析すべき１つ以上の生物学的検体によって活発に押し流され、それにより該機能化された表面（好ましくは機能化された粒子）上での該１つ以上の生物学的検体の濃縮が生じる。マイクロフルイディクス系は、扱いにくいサンプル、例えばヒト血清における検出感度を高めるためにしばしば使用される。
【０１１７】
本発明による発光マーカーは、所望の試験成分（特に１つ以上の生物学的検体）と結合し、それと同時に光を放射することができる。本発明によるデバイスにおいては、また本発明による方法においては、考えうるあらゆる発光マーカーを使用することができる。好ましくは、蛍光マーカーが使用される。
【０１１８】
本発明の範囲においては、「結合した発光マーカー」という概念は、機能化された表面に、直接またはさらなる試験成分を介して（例えば検体または一次抗体を介して）結合している、あらゆる発光マーカーであると理解される。同時に、「未結合の」という概念は、機能化された表面に直接結合してもいないしさらなる試験成分を介して結合してもいない発光マーカーまたは蛍光マーカーを指す。
【０１１９】
所定の生物学的検体および／または機能化された表面に結合する発光マーカーまたは蛍光マーカーは知られており、市販されている。適しているのは、例えばＡｌｅｘａ  ６４７標識抗体フラグメントまたはＡｌｅｘａ  ４８８標識抗体フラグメント（例えば、Ａｌｅｘａ  ６４７  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ｓｐｅｃｉｆｉｃ、およびｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ  （Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ４８８  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）またはフルオレセイン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体、およびＲ−フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃである。
【０１２０】
発光マーカーまたは蛍光マーカーは、個別での製造も可能である。このために、発光色素または蛍光色素を、適切な結合部位を有しかつ所望の試験成分（好ましくは、分析すべき１つ以上の生物学的検体）と結合しうる生体分子（例えばタンパク質、抗体、抗体フラグメント）と結合させる。この結合は、慣用の手法により、例えば、ＮＨＳ基、エステル基またはマレイミド基を有していることにより抗体およびタンパク質に結合しうる発光色素または蛍光色素を使用することにより行われる。この結合はさらに、上記と同様に、ビオチン化タンパク質にストレプトアビジンを有する発光色素または蛍光色素を結合させることによりストレプトアビジンにより媒介されていてよい。蛍光マーカーとしては、天然の蛍光タンパク質、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）およびその誘導体を、単独で使用することもできるし、他のタンパク質と一緒にいわゆる融合タンパク質として使用することもできる。
【０１２１】
色素および結合部位の選択は、本発明によるデバイスの使用かまたは本発明による方法の実施により分析することができる生物学的検体およびそのために使用することができるアッセイに応じて行われる。
【０１２２】
その他では生物学的サンプルの測定時にも使用されている、知られているあらゆる蛍光色素を使用することができる。そのような色素は、例えばシアニン、クマリン、フルオレセイン、ローダミンおよびそれらの誘導体、例えばフルオレシン−イソチオシアネートである。これらは市販されている（例えば、Ａｌｅｘａ（登録商標）、Ｄｙ−Ｌｉｇｈｔ（登録商標）、Ａｔｔｏ（登録商標）またはＯｙｓｔｅｒ（登録商標））。
【０１２３】
上記の蛍光色素に加えて、蛍光マーカーの製造に蛍光量子ドット（「Ｑドット」）を使用することができる。そのような蛍光マーカーは、蛍光放射が特に高度である点が特徴的である。
【０１２４】
分析すべき生物学的検体自体を蛍光色素と結合させて蛍光マーカーとして使用することも考えられうる。そのような蛍光マーカーは、該蛍光マーカーと蛍光標識されていない同一の生物学的検体とがスカベンジャー分子への結合に関して競合する競合アッセイに適している。
【０１２５】
本発明の一実施形態においては、発光マーカーとして、蛍光標識された異なる抗体が使用され、それにより、異なる検体またはエピトープを異なる蛍光チャネルにおいて同時に検出することができる（マルチプレキシング）。
【０１２６】
別段の記載がない限り、「サンプル」という表記は以下のものであると理解される：少なくとも１種類の生物学的検体を含有する、あらゆる種類の流体、あらゆる種類の緩衝液、細胞培養のためのおよび発酵のための培地、ならびに血液、血漿、尿、血清。本発明により特に適したサンプルは、あらゆる種類の流体、あらゆる種類の緩衝液、細胞培養のためのおよび発酵のための培地である。
【０１２７】
別段の記載がない限り、「水溶液」という表記は以下のものであると理解される：水性の、好ましくはｐＨ緩衝処理された溶液（例えばトリス緩衝液）であって、該溶液中には場合によりタンパク質生化学において慣用の（さらなる）物質、例えばウシアルブミン（ＢＳＡ）、界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ  ２０）等が存在するものとする。この表記には、反応緩衝液および結合緩衝液も含まれる。結合緩衝液は知られており、それぞれの試験要求に適合させることができる。
【０１２８】
別段の記載がない限り、「測定溶液」という表記は、水溶液であって、該水溶液中に本発明による方法の実施中に試験成分が溶解および／または懸濁している水溶液と理解される。
【０１２９】
別段の記載がない限り、「試験成分」という表記は、以下の成分の少なくとも１つと理解される：発光マーカー、機能化された定置表面、機能化された粒子、または機能化された磁性粒子、およびサンプル、ならびにスカベンジャー分子、および一次抗体。
【０１３０】
試験成分を、本発明による方法においては、溶媒に、好ましくは水溶液に溶解または懸濁させて使用することができる。同様に、これらの試験成分を、純粋な状態で、すなわち溶媒を添加せずに、本発明による方法において使用することもできる。このことは例えば、サンプルが、それぞれ少なくとも１つの生物学的検体を含有する流体、緩衝液または細胞培養培地である場合に該当する。好ましい溶媒は、本明細書中に定義される水溶液である。
【０１３１】
別段の記載がない限り、本発明による生物学的検体または「検体」という概念は、本発明による方法により分析または検出されるべき分子であると理解される。そのような生物学的検体の例は、タンパク質、抗体、タンパク質複合体、抗体複合体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１つ以上の生体分子からの複合体、ウイルス、または１つ以上の生体細胞もしくはその成分、ならびに生物学的活性を有するかもしくは生体分子と相互作用を生じる低分子量物質である。本発明による方法において、生物学的検体として特に十分に検出可能であるのは、タンパク質、抗体、タンパク質複合体、抗体複合体、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、１つ以上の生体分子からの複合体、およびウイルスである。
【０１３２】
別段の記載がない限り、「導入」という概念は以下のものであると理解される：通常の措置、例えばピペッティングによる、またはマイクロフルイディクス系の使用による、デバイスまたは測定チャンバの手動によるまたは自動的な充填。
【０１３３】
別段の記載がない限り、「結合」という概念は、少なくとも２つの単位が互いに接触することによってこれらの間に安定な結合平衡が生じることと理解される。そのような結合は一般的には相互作用により促進され、その結果、相応する結合、例えば水素橋かけ結合、塩結合、錯結合および共有結合が生じる。本発明による方法およびデバイスにおいて生じる結合は、上記の相互作用のいくつかが混在したものであることが多い。
【０１３４】
本発明の意味における発光にはあらゆる種類の発光が含まれ、特に、光により励起された蛍光、生物発光および化学発光が含まれ、その際、蛍光が好ましい。蛍光測定の際には、分子が励起光によって励起電子状態に上がり、該分子が放射線を放出（１つ以上の所定の波長または蛍光のいわゆる蛍光放射）してエネルギーを放出することで元のエネルギー基底状態に落ちる。分子の蛍光の測定は、確立された手法である。
【０１３５】
別段の記載がない限り、「磁性要素」という概念は以下のものであると理解される：被覆、または磁性の層、例えばＲｈｅｉｎｍａｇｎｅｔ社のシートＰｅｒｍａｆｌｅｘ  ５１８。層厚およびシートは次のように選択され、すなわち、該シートの磁気強度によって、機能化された磁性粒子が混合後にデバイスの底部の測定窓の外側にしか沈降せず、該測定窓は空いたままであって、（好ましくはシェーカー上での）試験成分の効率的な混合が妨害されることのないように選択される。従って、適切な磁場強度または磁気強度とは、試験成分を混合しうるのに十分な弱さを有しつつも混合後に磁性粒子を引き付けるのに十分な強さを有する強度であって、その際、測定窓に磁性粒子が付いていない状態が維持されなければならない。適切な磁性シートは市販されている。シートから打ち抜きまたはレーザー切断によって測定窓を作製することができる。
【０１３６】
プロテインＡ  Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、品番２８−９４４０−０６）とＲｈｅｉｎｍａｇｎｅｔ社のシートＰｅｒｍａｆｌｅｘ  ５１８とを組み合わせて使用する場合には、層厚は約１ｍｍであることが好ましい。
【０１３７】
別段の記載がない限り、機能化された磁性粒子が使用される本発明による方法についても以下のことが該当する。
【０１３８】
本発明により好ましくは、本発明による方法においては蛍光マーカーが使用され、かつステップ（ｄ）における測定は蛍光測定であり、かつ蛍光測定装置を用いて行われる。
【０１３９】
本発明によるデバイスおよび本発明による方法によって、時間分解運動蛍光測定を行うことが可能となる。このことは、例えば、結合平衡／反応平衡の達成を追跡することが望ましい場合に有利である。
【０１４０】
本発明による方法におけるステップ（ｅ）、すなわち１つ以上の生物学的検体の量および／または濃度の分析は、検量系列を用いて行われる。検量系列に関して、本発明による方法は、検体の所望のまたは予想される濃度範囲を網羅する該検体の様々な所定の濃度／量で、かつその都度、特に発光マーカーの濃度の同一の試験条件で実施される。その後、未結合の発光マーカーの発光放射の測定値から検量線または関数を作成し、それらをもとに検体含有量が不明なサンプル中の検体濃度を求める。こうした検量線を図５ａ〜図５ｅに例示する。値を求めるための上記の検量系列および検量線の作成は、生化学において一般的である。当業者は、確実な結果を得るべくこうした検量線を作成する方法に精通している。
【０１４１】
本発明による方法では、溶液中で未結合の状態にある発光マーカーの発光を調べる。これは初めてのことであり、それというのも、生物学的検体を分析するための知られている方法は、該生物学的検体に結合した発光マーカーの測定に基づくためである。従来技術において未結合の発光マーカーの蛍光が測定される場合には、該測定において酵素反応または分離が生じることが多く、その際、該蛍光マーカーは、検出抗体から分離されるかまたは予めＦＲＥＴもしくは粒子プローブによって作製されている。このような分離は、本発明による方法においては予定されていない。
【０１４２】
本発明による方法により生物学的検体の濃度を分析するためには、そして競合アッセイである場合には、可能な限り高い割合の生物学的検体がスカベンジャー分子に結合していることが有利である。このことは、表面（好ましくは粒子表面）上にスカベンジャー分子が過剰に存在し、かつこれが検体に対して高い親和性を有することによって促進される。理想的には、スカベンジャー分子への検体の結合反応は完全に行われる。
【０１４３】
上記のケースでは、未結合の発光マーカー（例えば蛍光マーカー）の濃度は、検体と発光マーカー（例えば蛍光マーカー）との解離定数Ｋｄ、発光マーカー（例えば蛍光マーカー）の使用濃度、および生物学的検体の分析すべき濃度のみに依存する。
【０１４４】
アッセイにおいて発光マーカー（例えば蛍光マーカー）の濃度が一定に維持される場合には、未結合の発光マーカー（例えば蛍光マーカー）の濃度、ひいては測定される発光強度（例えば蛍光強度）は、生物学的検体の濃度のみに依存する。
【０１４５】
本発明による方法を用いかつ競合アッセイにより生物学的検体の濃度を分析するためには、スカベンジャー分子の数が発光マーカーの数より少ないかまたは同数であることが有利であり、それにより、検体分子のそれぞれの結合によって未結合の発光マーカーの数が増加する。
【０１４６】
検体の濃度の分析に加えて、本発明による方法により、試験成分への検体の結合に関するさらなる情報、例えば解離定数Ｋｄ、またはＩＣ値、またはＥＣ５０値を得ることができる。
【０１４７】
本発明によるデバイスを用いた本発明による方法によって、生物学的検体の分析、特に定量化を、極めて単純な、すなわちワンステップのアッセイプロトコールを用いて行うことができる。このようなワンステップのアッセイは、「ミックス・アンド・メジャー・アッセイ」とも称される。すなわち、本発明による方法においては、単に試験成分を一緒に入れて、結合平衡に達するまで待機するだけである。
【０１４８】
粒子の沈降を待った後、測定を直ちに開始することができる。短時間のうちに、通常は１時間未満で所望のデータが得られ、これにより検量線との相関後に所望の定量的または定性的な結果が得られる。この測定には、実験室内によくある単純な発光検出器または蛍光検出器（蛍光リーダー）で十分である。
【０１４９】
本発明による方法は、非競合アッセイとして構成されていてもよいし、競合アッセイとして構成されていてもよい。また、本発明による方法を用いて、直接的および間接的な検出を伴うサンドイッチイムノアッセイを行うこともできる。本発明による方法を用いて実施することができる好ましいアッセイは、直接アッセイ、直接的または間接的な検出を伴うサンドイッチイムノアッセイ、置換アッセイまたはディスプレイスメントアッセイ、競合アッセイおよび二次アッセイである。
【０１５０】
直接アッセイの場合、生物学的検体は通常は抗体であって、該抗体がスカベンジャー分子に結合し、該スカベンジャー分子自体は抗体ではなく抗原であり、該抗原に、可変部を有する該抗体が特異的に結合する（図６ｃに概略的に示す）か、または、該スカベンジャー分子はプロテインＡおよびＧであり、これらは抗体にそのＦｃ部分で結合する（図６ａに概略的に示す）。
【０１５１】
阻害アッセイ、すなわち置換アッセイまたはディスプレイスメントアッセイにおいては、機能化された表面への発光マーカーの結合が、生物学的検体によって完全にまたは部分的に阻害される。このことは、生物学的検体が発光マーカーの結合部位に結合し、該結合部位がもはやスカベンジャー分子との結合に供されないことによって行われる（図６ｄに概略的に示す）。
【０１５２】
直接的な検出を伴うサンドイッチアッセイの場合には、生物学的検体は通常はタンパク質または抗体であり、これはスカベンジャー分子として作用する抗体の可変部と結合し、その際、発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーが該検体の第２の結合部位（エピトープ）に結合してサンドイッチが形成される（図７ａに概略的に示す）。
【０１５３】
間接的な検出を伴うサンドイッチアッセイの場合には、生物学的検体は通常はタンパク質または抗体であり、これはスカベンジャー分子としての抗体の可変部と結合し、その際、発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーは該検体に直接結合するのではなくもう１つの一次抗体に結合し、該一次抗体が該検体の第２の結合部位（エピトープ）に結合する（図７ｂに概略的に示す）。
【０１５４】
適切ないずれのアッセイ変形においても、それぞれ所定量の機能化された表面と、発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーと、任意に一次抗体とを、本発明によるデバイスまたは測定チャンバに入れる。
【０１５５】
競合アッセイの場合には、所定量のスカベンジャー分子または機能化された表面と、サンプルと、同一の結合部位（エピトープ）でのスカベンジャー分子への結合に関して検体と競合する発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーとを、本発明によるデバイスまたは測定チャンバに一緒に入れる。そこで、反応平衡に達するまで反応を振とう下に行い、粒子の沈降を待機する。次いで、未結合の発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーの量を測定溶液中で測定し、検体の濃度を検量線または校正関数により求める。
【０１５６】
その際、未結合の発光マーカー、好ましくは蛍光マーカーの濃度は検体の量のみに依存し、該検体は、スカベンジャー分子への発光マーカーの結合、好ましくはスカベンジャー分子への蛍光マーカーの結合を完全または部分的に阻害し、そのようにして検出領域内での蛍光シグナルの増大が生じる。
【０１５７】
本発明による方法において使用するための本発明によるデバイスは、機能化された表面に結合した試験成分と未結合の試験成分とを分離することができるように構成されている。このために、デバイスは構造要素を含む。構造要素は特に突出部として構成されており、該突出部の横断面は任意の形状を有することができ（例えば、円形、矩形、三角形）、その際、基部とは反対側の端部は、試験成分が粒子である場合には該端部に該試験成分が堆積しない状態にある。構造要素は好ましくは、デバイスの基部に、上方に向かってまっすぐに延びるかまたは先細状の突出部を有し、かつ少なくとも部分的に透光性である。端部は例えば凸状形態をとっていてもよく、かつ／または小さい直径を有することができる。構造要素は好ましくは円錐、円錐台または角錐として構成されており、かつデバイスの基部から突出している。構造要素はさらに、デバイスの基部とは反対側の端部に、光学部品、例えばレンズを有することができる。好ましくは、これはピン、円錐または円錐台の形状を有する。構造要素はポリプロピレンからなることができ、かつ透光性である。以下に記載する目的を達成する突出部の他の幾何学的形状も考えられる。
【０１５８】
構造要素は、本発明による方法において発光を検出するために予定された光路を空けておくという目的と、結合した発光マーカーの結果を変えてしまう発光が測定装置において生じるのを防ぐという目的とを有する。分離のための構造要素の存在は重要である。なぜならば、未結合の状態にある発光マーカーの発光を通じて生物学的検体の分析が行われるためである。構造要素は、少なくとも部分的に透光性である。
【０１５９】
同様に、本発明によるデバイスは、測定窓として機能する領域を有する。測定窓は、デバイスの基部に存在していてもよいし、基部と向かい合うデバイス端部に存在していてもよい。少なくとも部分的に透光性である構造要素の基部は、測定窓であることができる。この測定窓を通じて、通常は励起および検出が行われる。しかし、測定窓を検出のみに使用することもできる。デバイスまたは測定チャンバ内での測定窓の構成および位置は可変であり、測定の要求に適合させることができる。しかし、未結合の状態にある発光マーカーの発光のみが測定窓を通じて測定されることが保証されることが重要である。測定窓のサイズおよび発光マーカーの種類を適切に選択することにより、デバイスを利用する本方法の感度を調節することができる。
【０１６０】
中で発光マーカーが発光するデバイスまたは測定チャンバ内の領域であって、測定窓を通じて観察することができる／分光分析することができる領域を、以下で「測定領域」または「検出領域」と称する。
【０１６１】
デバイスまたは測定チャンバ内の領域であって、測定窓からの観察／分光分析ができない領域を、以下で「分離除去領域」と称する。
【０１６２】
本発明によるデバイスにおいて、この検出領域と分離除去領域とは、これら２つの領域間での試験成分の交換が効果的かつ容易に可能であるように接続されている。従って、未結合の発光マーカーの濃度は、デバイス／測定チャンバ全体を通して同一である。
【０１６３】
本発明の好ましい一実施形態においては、測定窓は、基部とは反対側の構造要素端部と光学的に接続されており、かつ該構造要素の底面である。例えば、構造要素は、デバイスの基部での上方に向かってまっすぐに延びるかまたは先細状の突出部であり、かつ透光性であり、かつ該デバイスの基部は非透光性の層または被覆を有し、その際、該構造要素の基部面は空所になっている。その際、この非透光性の層（例えば黒色の塗料層）は、デバイスの基部の領域であって構造要素の下方に存在する領域を残して施与されており、それによって測定窓が形成される。
【０１６４】
この時点で、光はデバイスの基部から測定チャンバへと送られ、その後、該放射線は構造要素を通過して測定領域内へと延びる。測定領域内での発光マーカーの励起後に、放射をまた測定窓で測定することができる。
【０１６５】
本方法のもう１つの実施形態においては、非透光性の層を有しない本発明によるデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレート、特に上記のまたは実施形態［０］、［Ａ］、［Ｂ］、［Ｃ］、［Ｄ］、［Ｅ］、［Ｆ］もしくは［Ｇ］のうちの１つに記載した本発明によるデバイス、測定チャンバまたはマイクロタイタープレートを使用することができ、すなわちその場合には蛍光測定装置として蛍光顕微鏡が使用され、その際、例えば適切な結像特性と適切な収集効率と有する対物レンズ（例えば、Ｏｌｙｍｐｕｓ社の１０倍対物レンズを搭載したＮｙＯＮＥ型の自動化蛍光顕微鏡（ドイツ連邦共和国エルムスホルン所在、ＳｙｎｅｎＴｅｃ社））を選択することによって、検出領域からの蛍光放射のみが検出されるように測定光学系が適合されている。
【０１６６】
機能化された粒子が本発明によるデバイスにおいておよび本発明による方法において機能化された表面として使用される場合には、未結合の発光マーカーと粒子に結合した発光マーカーとの分離は、通常は沈降により行われる。このために、測定溶液を負荷したデバイスを所定の時間にわたって動かさない。機能化された粒子であって、該粒子に結合した発光マーカーを伴う粒子は、周囲の測定溶液よりも高い密度を有し、かつ沈降する。未結合の発光マーカーは、溶液中に残る。その後、この結合した発光マーカーはデバイスの基部の構造要素の近傍で沈殿し、それにより該結合した発光マーカーは分離除去領域内に存在する。従って、機能化された（磁性）粒子が本発明による方法において使用される場合には、該方法はさらにステップ（ｃ’）、すなわち所定の時間にわたる、好ましくは１〜３０分間、または１〜２０分間、または１〜１５分間の、特に好ましくは１〜１０分間のデバイスの静置を含むか、または磁性粒子が使用される場合には１〜５分間、特に好ましくは１〜２分間のデバイスの静置を含む。
【０１６７】
総じて、機能化された磁性粒子が使用される場合には、結合した発光マーカーの沈降時間は５分間未満である。磁性粒子が使用されない場合には、沈降時間は３０分間未満であり、通常は５〜２０分間の範囲内である。
【０１６８】
迅速な試験の実施が望まれる場合には、高い密度を有する機能化された粒子を使用することが有利である。非磁性粒子の場合には、約９０μｍの平均直径が有利であることが判明した。
【０１６９】
この文脈における高い密度とは、使用される（磁性）粒子が水性の試験溶液よりも高い密度を有することを意味する。
【０１７０】
本発明による方法において１μｍ未満の非磁性粒子が使用される場合には、粒子の沈降を待機することに代えて、発光測定の前に遠心分離ステップを挿入することが有利であり、それにより粒子がデバイスの基部へと送られる。
【０１７１】
同様に、迅速な試験の実施に関しては、（磁性の）機能化された粒子が大表面を有することが有利であり、それにより、生物学的検体が溶液による拡散時にスカベンジャー分子と出会う確率が高まる。この確率は、デバイスの振とう（撹拌）により高められる。
【０１７２】
デバイスを、知られている実験室機器および消耗材と、例えばマイクロタイタープレート、エッペンドルフ試験管または他の容器およびプレートと、組み合わせることができ、それによって本発明による方法を実施することができる。その場合、上記の材料の側壁と本発明によるデバイスとが一緒になって測定チャンバを構成する。有利には、（例えばマイクロタイタープレートの形態の）同様の複数の測定チャンバが保持器系内に収容され、その際、「生体分子スクリーニング学会（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）」（ＳＢＳ）の規格である１２７．７６ｍｍ×８５．４８ｍｍ×１４．３５ｍｍに相当する寸法であることが好ましく、それにより実験室で常用されている機器で作業することができ、そのようにして高度の自動化を達成することができる。
【０１７３】
本発明のもう１つの実施形態においては、本発明は、上部が開放または閉鎖されている１つのチャンバからなる測定チャンバに関し、ここで、前記測定チャンバは側壁を有しかつその基部はデバイスにより形成される。この測定チャンバは、丸みを帯びた、またはまっすぐな側壁を有することができる。しかし、測定チャンバが複数の基部を有することも可能であり、すなわち、測定チャンバの基部の他にデバイスの基部が存在していることも可能である。
【０１７４】
好ましくは、測定チャンバの側壁とデバイスの基部とは、または測定チャンバの側壁と他の基部（該基部上にデバイスが存在する）とは、液体を透過しないように接続または接着または溶接されている。
【０１７５】
本発明のもう１つの実施形態においては、デバイスはマイクロタイタープレートの凹部に導入されており、その際、該凹部の縁部が測定チャンバの側縁部を形成する。
【０１７６】
本発明のもう１つの実施形態においては、本発明は、マイクロタイタープレートであって、前記マイクロタイタープレートの元の底部を、構造要素を含む一体型の基部と交換した前記マイクロタイタープレートに関し、その際、前記基部は、前記構造要素の底面を除いて、（例えば、相応する空所を有する非透光性のシートの貼り付けによって、または塗装によって）非透光性となるように被覆されている。
【０１７７】
上記のＳＢＳサイズでのデバイスの製造は、例えば底部のないマイクロタイタープレートを使用し、この底部に代えて透光性（透明）でかつ非蛍光性の（例えばポリプロピレンからなる）シートを施与することにより行われ、ここで、該シートにはＳＢＳサイズに相当する配置で構造要素がエンボス加工されている。そのようなシートは、複数の一体型のデバイスを表す。その場合、構造要素はマイクロタイタープレートの開口部に向いている。このようなエンボス加工されたシートは市販されている（例えばＤｏｕｇｌａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＡｒｒａｙｔａｐｅ（登録商標））。
【０１７８】
マイクロタイタープレートの面であってその上に実際に底部が存在する面へのシートの施与は、通常は異なる２つのプラスチックを接着しうる接着剤での接着により行われる。最も簡単な方法は、そのために非蛍光性のＵＶ硬化型接着剤を利用することである。最後に、非透光性でかつ非蛍光性の塗料層が、プラスチックシートの下面に、該下面が構造要素の領域内で空所となるように施与される。まずシートに塗料層を施与し、次いで該シートにマイクロタイタープレートを接着させることも考えられる。
【０１７９】
磁性要素を有するマイクロタイタープレートの製造は、透明な底部（この文脈においては「基部」とも称される）を有する市販のマイクロタイタープレートと適切な磁気強度の磁性シートとの、場合により可逆的な、すなわち固定されているかまたは取り外し可能な接続により行われ、ここで、該シートはマイクロタイタープレートの（測定チャンバに相応する）各凹部につき１つの空所を有し、該空所が測定窓として利用される。この空所は次のように配置されており、すなわち、シートがマイクロタイタープレートの底部と接続されている場合には、該空所は該マイクロタイタープレートのウェルの下方に中心が合った状態となるように配置されている。空所の最適なサイズはウェルのサイズに依存し、以下の実施例をもとに当業者が見出すことができる。空所の直径は、ウェルの寸法、ならびにアッセイにおいて使用される粒子の数およびサイズに応じて寸法決めされていなければならない。３８４ウェルマイクロタイタープレートにおいては、ウェル１つ当たり約１０００の磁性粒子を使用する場合、約２．５ｍｍの直径を有する空所が有利であることが判明した。これは市販の３８４ウェルプレートの底部面積のほぼ半分に相当し、これによって、一方では磁性粒子の分離除去に十分な面積が提供されると同時に、蛍光測定に十分な大きさの測定窓も提供される。
【０１８０】
デバイスまたは測定チャンバの特定の構成に基づき、沈降し、これにより検出領域から移動する結合した発光マーカーまたは蛍光マーカーは、励起により発光または蛍光を生じない。本発明を、以下に図面に示しかつ以下に記載する実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１ａ】構造要素を有する測定チャンバ（１０１）の垂直断面図
【図１ｂ】デバイス（該デバイスは、例えばマイクロタイタープレートに組み込まれていてもよい）の連結体の垂直断面図
【図１ｃ】磁性要素を有する測定チャンバ（１０１）の垂直断面図
【図１ｄ】（例えばマイクロタイタープレートとして仕上げられている）測定チャンバ（１０１）の連結体の垂直断面図
【図２ａ】デバイスの充填後でかつ結合前の、測定溶液の入った図１ａからの測定チャンバの垂直断面図  −  概略図
【図２ｂ】デバイスの充填、結合および分離の後の、測定溶液の入った図１ａからの測定チャンバの垂直断面図  −  概略図
【図２ｃ】デバイスの充填後でかつ結合前の、測定溶液の入った図１ｃからの測定チャンバの垂直断面図  −  概略図
【図２ｄ】デバイスの充填、結合および分離の後の、測定溶液の入った図１ｃからの測定チャンバの垂直断面図  −  概略図
【図３ａ】デバイスの充填、結合および分離の後の、図２ｂからの測定チャンバの上面図  −  概略図
【図３ｂ】デバイスの充填、結合および分離の後の、図２ｄからの測定チャンバの上面図  −  概略図
【図４】複数の測定チャンバ（４０２）を含む３８４ウェルマイクロタイタープレート（４０１）の上面図
【図５ａ】実施例Ａからの検量線
【図５ｂ】実施例Ｂからの検量線
【図５ｃ】実施例Ｃからの検量線
【図５ｄ】実施例Ｄからの２つの蛍光マーカーを用いた測定
【図５ｅ】実施例Ｅからの非透光性の層を有しないマイクロタイタープレートにおけるアッセイの測定
【図６ａ】抗体のＦｃ部分に結合するスカベンジャー分子を用いた、抗体に関する直接イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
【図６ｂ】競合イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
【図６ｃ】スカベンジャー分子として抗原（該抗原に抗体の可変部が結合する）を用いた、抗体に関する直接イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
【図６ｄ】抗体に関する阻害アッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
【図７ａ】直接的な検出（図７ａ）を用いたサンドイッチイムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
【図７ｂ】間接的な検出（図７ｂ）を用いたサンドイッチイムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
【０１８２】
図１ａ：構造要素を有する測定チャンバ（１０１）の垂直断面図
図１ａに、構造要素（１０３）を有する一体型のデバイス（１０２）からなる測定チャンバ（１０１）を示し、該構造要素（１０３）は測定窓（１０４）を有し、該測定窓（１０４）を通じて励起光（１０５）が検出領域（１０６）に到達し、かつ該測定窓（１０４）を通じて発光の放射（１０７）が適切な検出器（該検出器は同時に励起光をももたらす）または検出ユニットを用いて測定される。一体型のデバイス（１０２）は、液体を透過しないように側壁（１０８）と接続されている。デバイスの基部の下面上には非透光性の層（１０９）（例えば塗料またはシート）が存在し、その際、構造要素の底面（１１０）は空所になっている。
【０１８３】
図１ｂ：デバイス（該デバイスは、例えばマイクロタイタープレートに組み込まれていてもよい）の連結体の垂直断面図
図１ｂに、マイクロタイタープレートの窪み／凹部に導入されている複数のデバイス（１０２）を示し、その際、側壁（１０８）はマイクロタイタープレートからのものであり、該デバイスはシート（１１１）であり、該シート（１１１）に構造要素（１０３）がエンボス加工されている。
【０１８４】
図１ｃ：磁性要素を有する測定チャンバ（１０１）の垂直断面図
図１ｃに、透光性の基部（１１２）からなる上方に向かって開放されている測定チャンバ（１０１）を示し、その際、該基部（１１２）の下方には、空所（１１４）を有する非透光性の磁性要素（ここでは、非透光性の磁性の層またはシート）（１１３）が存在し、その際、該空所（１１４）が測定窓（１０４）を形成している。測定窓（１０４）を通じて励起光（１０５）が下方から（すなわち、デバイスの基部から）測定チャンバに到達し、その結果、未結合の発光マーカーの発光の放射（１０７）が生じ、その後、該放射はデバイスの下方の測定窓（１０４）を通じて検出ユニット（１１５）により検出される。好ましくは、そして図示されているように、検出ユニット（例えば蛍光読取り装置）は、励起光の放射および発光の検出を行うことができる。基部（１１２）と、側壁（１０８）および磁性要素（１１３）とは、取り外しできるように接続されていてもよいし、取り外しできないように接続されていてもよい。基部と側壁とは、同一の材料からなってもよいし異なる材料からなってもよい。
【０１８５】
図１ｄ：（例えばマイクロタイタープレートとして仕上げられている）測定チャンバ（１０１）の連結体の垂直断面図
図１ｄに、複数の測定チャンバ（１０１）と、透光性の基部（１１２）と、測定窓（１０４）として利用される空所（１１４）を有する非透光性の磁性の層またはシート（１１３）とを示す。本発明による方法における励起および検出は、測定窓を通じて下方から、すなわち複数の測定チャンバまたはマイクロタイタープレートの基部の下方から、行われる。
【０１８６】
図２ａ：デバイスの充填後でかつ結合前の、測定溶液の入った図１ａからの測定チャンバの垂直断面図  −  概略図
図２ａに、以下の試験成分を含む、測定溶液（２０１）が充填された図１ａからの測定チャンバを示す：生物学的検体（２０４）、機能化された粒子（２０３）および発光マーカー（２０２）。これらは充填の直後に均一に分配され、混合による接触前に未結合の状態にある。機能化された粒子は磁性であってもよい（ここでは図示せず）。
【０１８７】
図２ｂ：デバイスの充填、結合および分離の後の、測定溶液の入った図１ａからの測定チャンバの垂直断面図  −  概略図
図２ｂに、結合させ、かつ結合した発光マーカーと未結合の発光マーカーとを分離したの後の、試験成分（２０２）、（２０３）、（２０４）を含む、測定溶液（２０１）が充填された図２ａからの測定チャンバを示す。未結合の発光マーカー（２０２ｕ）は測定チャンバ内に均一に分配されて存在し、一方で、結合した試験成分（２０２、２０３、２０４）は分離除去領域（２０５）内に存在する。
【０１８８】
図２ｃ：デバイスの充填後でかつ結合前の、測定溶液の入った図１ｃからの測定チャンバの垂直断面図  −  概略図
図２ｃに、以下の試験成分を含む、測定溶液（２０１）が充填された図１ｃからの測定チャンバを示す：生物学的検体（２０４）、機能化された磁性粒子（２０３−Ｍ）および蛍光マーカー（２０２−Ｆ）。これらは充填の直後に均一に分配され、混合による接触前に未結合の状態にある。
【０１８９】
図２ｄ：デバイスの充填、結合および分離の後の、測定溶液の入った図１ｃからの測定チャンバの垂直断面図  −  概略図
図２ｄに、結合させ、かつ結合した蛍光マーカーと未結合の蛍光マーカーとを分離したの後の、試験成分（２０２−Ｆ）、（２０３−Ｍ）、（２０４）を含む、測定溶液（２０１）が充填された図２ｃからの測定チャンバを示す。未結合の蛍光マーカー（２０２ｕ−Ｆ）は測定チャンバ内に均一に分配されて存在し、一方で、結合した試験成分（２０２−Ｆ、２０３−Ｍ、２０４）は分離除去領域（２０５）内に存在する。
【０１９０】
図３ａ：デバイスの充填、結合および分離の後の、図２ｂからの測定チャンバの上面図  −  概略図
図３ａに、図２ｂからの測定チャンバの上面図を示す。結合した試験成分（３０１）は、デバイス／測定チャンバの基部に存在する。デバイスの基部には非透光性の層（３０２）が備えられており、その際、構造要素の底面（３０３）は空所になっている。この空所は、同時に測定窓（３０５）でもある。デバイスの基部とは反対側の端部（３０４）も図示されており、該端部（３０４）は測定窓（３０５）と光学的に接続されている。ここでは、構造要素は、円形の横断面を有しかつ上方に向かって先細状の突出部である。
【０１９１】
図３ｂ：デバイスの充填、結合および分離の後の、図２ｄからの測定チャンバの上面図  −  概略図
図３ｂに、図２ｄからの測定チャンバの上面図を示す。結合した試験成分（３０１）は、測定チャンバの基部に存在する。測定チャンバの基部には、空所（３０７）を有する非透光性でかつ磁性の層またはシート（３０６）が備えられている。この空所は、同時に測定窓（３０５）でもある。
【０１９２】
図４：複数の測定チャンバ（４０２）を含む３８４ウェルマイクロタイタープレート（４０１）の上面図
図５ａ：実施例Ａからの検量線
図５ｂ：実施例Ｂからの検量線
図５ｃ：実施例Ｃからの検量線
図５ａ、図５ｂおよび図５ｃにおいて、ｘ軸上には検体濃度がμｇ／ｍＬで示されており、ｙ軸上には蛍光強度が示されている。（菱形の）測定値により関数が描画されている（破線）。
【０１９３】
図５ｄ：実施例Ｄからの２つの蛍光マーカーを用いた測定
図５ｄにおいて、ｘ軸上には検体濃度がμｇ／ｍＬで示されており、ｙ軸上には同一の検体の異なるエピトープに結合する２つの蛍光マーカーに関する蛍光強度が示されている。蛍光マーカーは２つの異なる波長（５３５ｎｍまたは５８０ｎｍ）で放射する。（それぞれ菱形の）測定値により、相応する関数が描画されている（破線）。
【０１９４】
図５ｅ：実施例Ｅからの非透光性の層を有しないマイクロタイタープレートにおけるアッセイの測定
図５ｅにおいて、ｘ軸上には検体濃度がμｇ／ｍＬで示されており、ｙ軸上には蛍光強度が示されている。（菱形の）測定値により、関数が描画されている（破線）。本実施例では蛍光顕微鏡を用いて測定したため、ｙ軸のスケーリングは前出の実施例のものとは異なる。
【０１９５】
図６ａ：抗体のＦｃ部分に結合するスカベンジャー分子を用いた、抗体に関する直接イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
図６ａに、粒子（６０２）または磁性粒子（６０２−Ｍ）（該粒子上には複数のスカベンジャー分子（６０３）が存在する）からなる、機能化された粒子（６０１）または機能化された磁性粒子（６０１−Ｍ）を示す。生物学的検体（６０４）と、スカベンジャー分子（６０３）および発光マーカー（６０７）または蛍光マーカー（６０７−Ｆ）とが結合する。さらに、未結合の発光マーカー（６０７ｕ）または未結合の蛍光マーカー（６０７ｕ−Ｆ）が存在する。発光マーカーまたは蛍光マーカーは、結合部位（６０６）と、発光色素（６０５）または蛍光色素（６０５−Ｆ）とを有する。
【０１９６】
図６ｂ：競合イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
図６ｂに、粒子（６０２）または磁性粒子（６０２−Ｍ）（該粒子上には複数のスカベンジャー分子（６０３）が存在する）からなる、機能化された粒子（６０１）または機能化された磁性粒子（６０１−Ｍ）を示す。スカベンジャー分子（６０３）は、生物学的検体（６０４）か、または発光マーカー（６０７）もしくは蛍光マーカー（６０７−Ｆ）か、のいずれかと結合し、その際、該生物学的検体（６０４）は、結合した発光マーカーまたは結合した蛍光マーカーをスカベンジャーから排除することができる。
【０１９７】
図６ｃ：スカベンジャー分子として抗原（該抗原に抗体の可変部が結合する）を用いた、抗体に関する直接イムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
図６ｃに、粒子（６０２）または磁性粒子（６０２−Ｍ）（該粒子上には複数のスカベンジャー分子（６０３）が存在する）からなる、機能化された粒子（６０１）または機能化された磁性粒子（６０１−Ｍ）を示す。生物学的検体（６０４）は、スカベンジャー分子（６０３）と結合し、さらに発光マーカー（６０７）または蛍光マーカー（６０７−Ｆ）とも結合する。さらに、未結合の発光マーカー（６０７ｕ）または未結合の蛍光マーカー（６０７ｕ−Ｆ）が存在する。発光マーカーは、結合部位（６０６）と、発光色素（６０５）または蛍光色素（６０５−Ｆ）とを有する。
【０１９８】
図６ｄ：抗体に関する阻害アッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
図６ｄに、粒子（６０２）または磁性粒子（６０２−Ｍ）（該粒子上には複数のスカベンジャー分子（６０３）が存在する）からなる、機能化された粒子（６０１）または機能化された磁性粒子（６０１−Ｍ）を示し、その際、該スカベンジャー分子（６０３）は、結合部位（６０６）と蛍光色素（６０５−Ｆ）とからなる蛍光マーカー（６０７−Ｆ）に結合しうる。生物学的検体（６０４）は蛍光マーカー（６０７−Ｆ）に結合し、それによりスカベンジャー（６０３）への蛍光マーカーの結合が妨害（阻害）される。このタイプの結合の場合、複合体（６０８、６０８−Ｆ）、すなわち生物学的検体（６０４）に結合した発光マーカー（６０７）または蛍光マーカー（６０７−Ｆ）が検出される。
【０１９９】
図７ａおよび７ｂ：直接的な検出（図７ａ）および間接的な検出（図７ｂ）を用いたサンドイッチイムノアッセイにおける試験成分の結合挙動の概略図
双方の図に、それぞれ粒子（７０２）または磁性粒子（７０２−Ｍ）（該粒子上には複数のスカベンジャー分子（７０３）が結合している）からなる、機能化された粒子（７０１）または機能化された磁性粒子（７０１−Ｍ）を示す。スカベンジャー分子は、適切なタンパク質（７０５）から、例えばビオチン化抗体から形成され、該タンパク質はリンカー（７０４）（例えばストレプトアビジン）を介して粒子（７０２）または磁性粒子（７０２−Ｍ）に結合する。タンパク質（７０５）は、生物学的検体（７０９）に結合する。さらに、結合した発光マーカー（７０６）または結合した蛍光マーカー（７０６−Ｆ）、および未結合の発光マーカー（７０６ｕ）または未結合の蛍光マーカー（７０６ｕ−Ｆ）が図示されている。発光マーカー（７０６）または蛍光マーカー（７０６−Ｆ）は、結合部位（７０７）と、発光色素（７０８）または蛍光色素（７０８−Ｆ）とを有する。
【０２００】
図７ｂにおいては、図７ａに示す試験成分の他にさらに一次抗体（７１０）が存在する。この一次抗体（７１０）は検体（７０９）に結合し、さらに発光マーカー（７０６）または蛍光マーカー（７０６−Ｆ）にも結合する。
【０２０１】
本発明による方法を、図１ａに示す本発明による測定チャンバを用いて以下のように実施することができる：
測定チャンバ（１０１）に、生物学的検体（２０４）と、機能化された粒子（２０３）と、未結合の発光マーカー（２０２）とを含有する測定溶液（２０１）を導入する（図２ａ参照）。均質な混合物が生じる。（インキュベーションおよび振とうにより）相応する結合を形成させた後に、結合した試験成分が分離除去領域（２０５）内で沈降し、そこに蓄積する（図２ｂおよび図３ａ参照）。この時点で、検出領域（１０６）内で未結合の発光マーカー（２０２ｕ）を測定することができる。分離除去領域内に存在する結合した発光マーカーが励起光により励起されて放射しうることのないようにし、また該結合した発光マーカーの放射光が測定窓を通じて測定チャンバから検出ユニット／検出器に到達することのないようにするために、非透光性の層（１０９）を使用する。
【０２０２】
本発明による方法を、図１ｃに示す本発明による磁性要素を有する測定チャンバを用いて以下のように実施することができる：
測定チャンバ（１０１）に、生物学的検体（２０４）と、機能化された磁性粒子（２０３−Ｍ）と、未結合の蛍光マーカー（２０２−Ｆ）とを含有する測定溶液（２０１）を導入する（図２ｃ参照）。均質な混合物が生じる。（インキュベーションおよび振とうにより）相応する結合を形成させた後に、結合した試験成分が磁性要素の磁場により配向性をもって分離除去領域（２０５）内で沈降し、そこに蓄積する（図２ｄおよび図３ｂ参照）。この時点で、検出領域内で未結合の蛍光マーカー（２０２ｕ−Ｆ）を測定することができる。分離除去領域内に存在する結合した蛍光マーカー（２０２−Ｆ）が励起光により励起されて放射しうることのないようにし、また該結合した蛍光マーカー（２０２−Ｆ）の放射光が測定窓（１０４）を通じて測定チャンバから検出装置（１１５）に到達することのないようにするために、非透光性の磁性の層またはシート（１１３）を使用する。
【０２０３】
本発明による方法のための検量の例示的な実施を、以下に記載する。検量系列において使用する生物学的検体の分析を、以下の実施例と同様に、検体含有量が不明なサンプルに関して行い、その際、測定された未結合の蛍光マーカーの蛍光強度により、それぞれの検量線を用いて検体濃度を求める。
【０２０４】
実施例Ａ：直接アッセイ変法における検量系列の測定
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する：３８４個のウェル（測定チャンバ）を有する黒色のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯＮＥ社、品番７８１０００−０６）であって、該ウェル内にはそれぞれ高さ１．６ｍｍのポリプロピレンからなる円錐形の構造要素が存在し、該構造要素は上方に向かって先細状であってかつ円形の横断面を有し、該横断面は、基部とは反対側の面で１ｍｍの直径を有する。測定チャンバにはその下面に非透光性の塗料層が設けられており、その際、該層は構造要素の基部面には施与されず、その結果、該基部には約２ｍｍの直径を有する測定窓が生じている。
【０２０５】
機能化された粒子として、９０μｍの平均直径を有するプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ，Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｂｅａｄｓ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、品番Ｐ９４２４）を使用する。
【０２０６】
蛍光マーカーとして、Ａｌｅｘａ  ６４７標識抗体フラグメントを使用する（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ｓｐｅｃｉｆｉｃ、品番１０９−６０６−０９７）。
【０２０７】
水溶液として、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標））、蒸留水中でｐＨ７．４（以下、緩衝液と称する）。検量のための生物学的検体として、組換えにより製造された抗体リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））を使用する。
【０２０８】
マイクロタイタープレートにおいて、合計で１２の異なる検体濃度を用いて検量線を作成する。検体濃度は、０／０．００１／０．００３３／０．００６７／０．０１／０．０３／０．６７／０．１／０．３３／０．６７／１．０および３．３３μｇ／ｍＬ  リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））である。
【０２０９】
このために、以下の措置をとる：各測定チャンバ内にストック溶液５４μＬを入れる。このストック溶液は、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｅａｄｓ  Ｓｌｕｒｒｙ  １５μＬ、および蛍光マーカー（１０μｇ／ｍＬ）６０μＬを、緩衝液８１０μＬ中に含有する。
【０２１０】
検体の濃縮ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）から緩衝液中の１：３００〜１：１，０００，０００の希釈物を作製し、ここからそれぞれ６μＬ［のアリコート］を測定チャンバに入れることにより、検量系列のための検体の目標濃度を得る。
【０２１１】
マイクロタイタープレート全体を、室温でＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｃｏｍｆｏｒｔ上で１４００ｒｐｍで４５分間振とうする。その後、マイクロタイタープレートをサーモシェーカーから取り出し、粒子が沈降するまで５分間待機する。
【０２１２】
次いで、各測定チャンバ内での下方からの蛍光強度の測定（ボトム・リーディング）を、Ｔｅｃａｎ  ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１００蛍光プレートリーダーにおいて６４５ｎｍの励起波長および６７５ｎｍの放射波長で行う。
【０２１３】
得られた蛍光強度についての値を検体濃度に対してプロットし、４パラメータフィットを用いたフィッティングにより校正関数を得る。相応する検量線を図５ａに示す。
【０２１４】
実施例Ｂ：競合アッセイにおける検量系列の測定
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する：３８４個のウェル（測定チャンバ）を有する黒色のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯＮＥ社、品番７８１０００−０６）であって、該ウェル内にはそれぞれ高さ１．６ｍｍのポリプロピレンからなる円錐形の構造要素が存在し、該構造要素は上方に向かって先細状であってかつ円形の横断面を有し、該横断面は、基部とは反対側の面で１ｍｍの直径を有する。測定チャンバにはその下面に非透光性の塗料層が設けられており、その際、該層は構造要素の基部面には施与されず、その結果、該基部には約２ｍｍの直径を有する測定窓が生じている。
【０２１５】
機能化された粒子として、７０μｍの平均直径を有しかつビオチン化プロテインＡフラグメント（Ａｆｆｉｂｏｄｙ社、品番１０．０６２３．０２．００００５）で機能化されているストレプトアビジン  Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子（ＶＷＲ、品番２８−９８５７−３８）を使用する。粒子の機能化は、粒子懸濁液１００μＬを、１ｍｇ／ｍＬの濃度を有するビオチン化プロテインＡフラグメントの溶液０．３μＬと共に３０分間インキュベーションし、次いで該粒子を緩衝液で洗浄することにより行われる。
【０２１６】
蛍光マーカーとして、Ａｌｅｘａ  ４８８  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を使用する（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、品番３０３−５４５−００３）。
【０２１７】
水溶液として、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標））、蒸留水中でｐＨ７．４（以下、緩衝液と称する）。検量系列のための生物学的検体として、組換えにより製造された抗体リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））を使用する。
【０２１８】
マイクロタイタープレートにおいて、合計で１４の異なる検体濃度を用いて検量線を作成する。検体濃度は、０．００１／０．００３３／／０．０１／０．０３／０．６７／０．１／０．３３／０．６７／１．０／３．３３／６．６７／１０／２０および１００μｇ／ｍＬ  リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））である。
【０２１９】
このために、以下の措置をとる：機能化された粒子を測定チャンバに入れ、その際、各測定チャンバ内にストック溶液４８μＬを入れる。このストック溶液は、上記の機能化された粒子の懸濁液８０μＬを緩衝液１８４０μＬ中に含有する。
【０２２０】
それぞれ同一の濃度の蛍光マーカーと異なる濃度の生物学的検体とからの混合物を作製し、その際、検体の濃縮ストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）から緩衝液中の１：１０〜１：１，０００，０００の希釈物を作製する。この希釈物から、それぞれ６μＬのアリコートとそれぞれ６μＬのＲａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｃｈｉｃｋｅｎ  ＩｇＹ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体（１０μｇ／ｍＬのストック溶液から）とを一緒に入れて混合する。
【０２２１】
この蛍光マーカーと生物学的検体とからの混合物を、測定チャンバに充填する。マイクロタイタープレートを室温で１６００ｒｐｍでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＭｉｘＭａｔｅで３０分間振とうさせることにより、試験成分を混合する。この振とうの完了後にマイクロタイタープレートをシェーカーから取り出し、粒子が沈降するまで待機する。これには約１〜２分間を要した。
【０２２２】
プレートを蛍光レコーダーに移す。この蛍光レコーダーは下方からの測定（いわゆるボトム・リーディング）に適しており（例えば、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｄｅｒ）、その際、各測定チャンバに下方から所定の励起波長（ここでは４８８ｎｍ）での照射を行い、生じる蛍光放射または蛍光強度を所定の放射波長（ここでは５３５ｎｍ）で記録する。
【０２２３】
蛍光強度についての得られた値を検体濃度に対してプロットし、４パラメータフィットを用いたフィッティングにより校正関数を得る。相応する検量線を図５ｂに示す。
【０２２４】
実施例Ｃ：磁性要素を有するマイクロタイタープレートにおける検量系列の測定
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する：３８４個のウェルを有する透明な底部を有する黒色のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯＮＥ社、品番７８１０９１）であって、該ウェルの下方に、３８４個の空所を有する磁性シートを、該空所の各々が該マイクロタイタープレートのウェルの下方で中心が合った状態となるように貼り付ける。この永久磁性シート（Ｐｅｒｍａｆｌｅｘ  ５１８、Ｒｈｅｉｎｍａｇｎｅｔ社）は１ｍｍの厚さを有し、かつこれらの空所は２．５ｍｍの直径を有する。
【０２２５】
機能化された磁性粒子として、３７〜１００μｍの直径を有するプロテインＡ  Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、品番２８−９４４０−０６）を使用する。
【０２２６】
蛍光マーカーとして、フルオレシン−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｃｈｉｃｋｅｎ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ａｂｃａｍ社、品番１１２４５３）を使用する。
【０２２７】
水溶液として、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、蒸留水中でｐＨ７．４。生物学的検体として、抗体リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））を使用する。
【０２２８】
実施例Ａに記載したとおりにアッセイを行い、その際、以下の粒子および蛍光マーカーを含有するストック溶液を使用する：緩衝液１７８２μＬ中の、プロテインＡ  Ｍａｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）粒子の懸濁液７５μＬおよび蛍光マーカー１．８６μＬ。
【０２２９】
このうちそれぞれ４７μＬを、リツキシマブの検量系列からの各３μＬのサンプルと共にシェーカーＶａｒｉｏｍａｇ  Ｍｏｎｏｓｈａｋｅ（Ｈ＋Ｐ社）で３０分間インキュベートした。続いて、マイクロタイタープレートを５分間静置することにより粒子の沈降を待ち、次いで測定を行った。
【０２３０】
この測定を、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅａｄｅｒにおいて４９０ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの放射波長で行う。
【０２３１】
実施例Ａに記載したとおりに校正関数を求める。相応する検量線を図５ｃに示す。
【０２３２】
実施例Ｄ：２つの蛍光マーカーを用いた測定
測定のために、以下の本発明によるマイクロタイタープレートを使用する：３８４個のウェル（測定チャンバ）と、熱成形により製造された構造要素を含む一体型の底部とを備えた、黒色のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯＮＥ社、品番７８１０００−０６）。この構造要素は、正方形の土台上の四面体の角錐の形態を有する。測定チャンバにはその下面に非透光性の塗料層が設けられており、その際、該層は構造要素の正方形の基部面には施与されず、その結果、該基部には約２．５ｍｍの直径を有する測定窓が生じている。
【０２３３】
このアッセイを、すでに乾燥された状態でマイクロタイタープレートに装入されている粒子を用いて行う。そのために、それぞれプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｂｅａｄｓの懸濁液３０μＬをマイクロタイタープレート上で摂氏３５度で乾燥させる。１．６μＬの第１の蛍光マーカー、すなわちＡｌｅｘａ  ４８８  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２  ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、品番１０９−５４６−０９７）と、３．９３μＬの第２の蛍光マーカー、すなわちＲ−フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ、Ｆｃγ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、品番１０９−１１６−１７０）とからのストック溶液を１６０７μＬの緩衝液に追加し、そこからそれぞれ５４μＬを、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））の検量系列からの各６μＬのサンプルと共にシェーカーＶａｒｉｏｍａｇ  Ｍｏｎｏｓｈａｋｅ（Ｈ＋Ｐ社）で３０分間インキュベートする。続いて、マイクロタイタープレートを１５分間静置することにより粒子の沈降を待ち、次いで測定を行った。
【０２３４】
水溶液として、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、蒸留水中でｐＨ７．４。
【０２３５】
この測定を、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅａｄｅｒにおいて、４９０ｎｍの励起波長で、かつ、第１の蛍光マーカー（＝Ａｌｅｘａ  ６４７標識抗体フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ４８８）の検出の際には５３５ｎｍの放射波長で、また第２の蛍光マーカー（＝Ｒ−フィコエリトリン）の検出については５８０ｎｍの放射波長で行う。
【０２３６】
実施例ＡおよびＢと同様に、それぞれの校正関数を求める。相応する検量線を図５ｄに示す。図５ｄはさらに、検体（ここではリツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）））上の異なる結合部位を同様の検量線を用いて同時に検出することが可能であることを示す。
【０２３７】
実施例Ｅ：非透光性の層を有しないマイクロタイタープレートにおけるアッセイの測定
この測定のために、実施例Ｄに記載した構造要素を有するマイクロタイタープレートを使用するが、但し、非透光性の塗料層なしで行う。
【０２３８】
水溶液として、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ  トリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％ウシアルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０）、蒸留水中でｐＨ７．４。
【０２３９】
アッセイを、実施例Ａに相応して、機能化された粒子および蛍光マーカーを有する以下のストック溶液を使用して行う：４７８μＬの緩衝液中の、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４Ｂ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｂｅａｄｓの予備希釈懸濁液６００μＬ、および蛍光マーカーＡｌｅｘａ４８８  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，  Ｆ（ａｂ’）２  ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、品番１０９−５４６−０９７）１．０６μＬ。そこからそれぞれ５４μＬを、実施例Ａに記載したとおり、リツキシマブ（Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標））の検量系列からの各６μＬのサンプルと共にシェーカーＶａｒｉｏｍａｇ  Ｍｏｎｏｓｈａｋｅ（Ｈ＋Ｐ社）で３０分間インキュベートする。続いて、マイクロタイタープレートを１５分間静置することにより粒子の沈降を待ち、次いで測定を行う。
【０２４０】
測定のために、ＮｙＯＮＥ型の自動化蛍光顕微鏡（ＳｙｎｅｎＴｅｃ社、ドイツ連邦共和国エルムスホルン所在）を使用する。Ｏｌｙｍｐｕｓ社の１０倍対物レンズを用いて、ウェルの中央に位置する中心の画像をその都度１つ撮影し、該画像内の蛍光強度を測定する。
【０２４１】
実施例Ａと同様に校正関数を求める。相応する検量線を図５ｅに示す。
【図１ａ】
0006667460.tif 000002
【図１ｂ】
0006667460.tif 000003
【図１ｃ】
0006667460.tif 000004
【図１ｄ】
0006667460.tif 000005
【図２ａ】
0006667460.tif 000006
【図２ｂ】
0006667460.tif 000007
【図２ｃ】
0006667460.tif 000008
【図２ｄ】
0006667460.tif 000009
【図３ａ】
0006667460.tif 000010
【図３ｂ】
0006667460.tif 000011
【図４】
0006667460.tif 000012
【図５ａ】
0006667460.tif 000013
【図５ｂ】
0006667460.tif 000014
【図５ｃ】
0006667460.tif 000015
【図５ｄ】
0006667460.tif 000016
【図５ｅ】
0006667460.tif 000017
【図６ａ】
0006667460.tif 000018
【図６ｂ】
0006667460.tif 000019
【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
0006667460.tif 000022
【図７ｂ】
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