(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重膜構造体を捕捉可能な第１の分子構造体と自己組織化する第２の分子構造体とを含む第１の機能性分子を有する足場を用意する工程と、
前記脂質二重膜構造体を有する細胞と前記足場とを細胞培養用生理活性環境下で接触させ、前記第１の分子構造体を介して前記細胞を前記足場上に接着させる工程と、
前記細胞培養用生理活性環境下を保持し、前記足場上で前記細胞を増殖させる工程と、
前記増殖させた細胞を前記足場から分離する工程と、を有し、
前記第１の分子構造体は、前記脂質二重膜構造体の親水性部と結合又は吸着する第１の部分と、前記脂質二重膜構造体の疎水性部と結合又は吸着する第２の部分と、を有し、
前記第２の分子構造体は、単分子膜を形成することができる分子構造を有し且つアルファーへリックスを形成しているポリペプチドであることを特徴とする細胞の培養方法。
【請求項２】
前記足場は担持体をさらに有し、
前記第１の機能性分子は、前記第２の分子構造体を前記担持体に連結するリンカー分子を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞の培養方法。
【請求項３】
前記足場は、
前記第２の分子構造体と前記リンカー分子とを含み、かつ前記第１の分子構造体は含まない第２の機能性分子、をさらに有することを特徴とする請求項２に記載の細胞の培養方法。
【請求項４】
前記第１の機能性分子の分子数と前記第２の機能性分子の分子数の比は、１０００：１から１：１０の範囲内であること特徴とする請求項３に記載の細胞の培養方法。
【請求項５】
前記第１の機能性分子の分子数と前記第２の機能性分子の分子数の比は、１００：１〜１：９の範囲内であること特徴とする請求項３に記載の細胞の培養方法。
【請求項６】
前記第１の機能性分子の分子数と前記第２の機能性分子の分子数の比は、１０：１〜１：５の範囲内であること特徴とする請求項３に記載の細胞の培養方法。
【請求項７】
前記第１の分子構造体は、天然又は人工アミノ酸で構成されたポリペプチドと、炭素鎖６以上１８以下のアルカンのうち少なくとも一つ以上と、を有することを特徴とする請求項１から請求項６の何れか一項に記載の細胞の培養方法。
【請求項８】
前記細胞は、接着性細胞を少なくとも一種類以上含むことを特徴とする請求項１から請求項７の何れか一項に記載の細胞の培養方法。
【請求項９】
前記細胞は、動物由来細胞を少なくとも一種類以上含むことを特徴とする請求項１から請求項８の何れか一項に記載の細胞の培養方法。
【請求項１０】
第１の機能性分子と、
前記第１の機能性分子を担持する担持体と、を備え
前記第１の機能性分子は、
脂質二重膜構造体を捕捉可能な第１の分子構造体と、
自己組織化する第２の分子構造体と、
前記第２の分子構造体を前記担持体に連結するリンカー分子と、を含み、
前記第１の分子構造体は、前記脂質二重膜構造体の親水性部と結合又は吸着する第１の部分と、前記脂質二重膜構造体の疎水性部と結合又は吸着する第２の部分と、を有し、
前記第２の分子構造体は、単分子膜を形成することができる分子構造を有し且つアルファーへリックスを形成しているポリペプチドであることを特徴とする細胞の培養キット。
【請求項１１】
前記第２の分子構造体と前記リンカー分子とを含み、かつ前記第１の分子構造体は含まない第２の機能性分子、をさらに備えることを特徴とする請求項１０に記載の細胞の培養キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養方法及び細胞の培養キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
＜従来の細胞培養用足場材と大量培養技術＞
従来用いられている細胞培養用足場材としては、シャーレ、フラスコ、ローラーボトル、フォローファイバー、アルギン酸ゲル、マイクロキャリア等が開発されている。浮遊性細胞については、ローラーボトルやそれに類似するバイオリアクター等を用いた製品が開発されており、自動化システム等の報告もあり、近年注目を集める浮遊性ＩＰＳ細胞等の大量生産等にも用いられるようになっている。接着性細胞については、接着面をスタックしたシステムを用いたものがある。そのほか、三次元高次構造或いはマイクロキャリア等を用いた製品も知られているが、一般化には至っていない。
【０００３】
＜マイクロキャリアを用いた接着細胞培養＞
マイクロキャリアに関しては、近年、種々の形状（粒子状担体、多孔性担体等）のマイクロキャリアが開発されている。
また、細胞を担体に接着させるため、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン等及びこれらの蛋白質の接着シークエンスペプチドとして、ＲＧＤ（Ｓ）（ペプチドの一文字表記；アルギニン−グリシン−アスパラギン−（セリン））ペプチド等の細胞接着因子を培養液に添加するか、又は、これらを予めマイクロキャリアにコーティングした機能性マイクロキャリアもいくつか製品化されている。これらの蛋白質或いはＲＧＤペプチドをコーティング或いは化学結合により固定化した例も報告されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１参照）。また、温度応答性ゲルをコーティングしている例も報告されている（特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２０１４−５３３３０９号公報
【特許文献２】特開２００６−１３６２１２号公報
【特許文献３】特開２００４−２３６５５３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｅ．  （１９８３）．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０，  １２２４−１２２７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記した機能性マイクロキャリアを大量培養へ応用する場合、接着面積が大きい方がより多くの細胞を培養可能である為、３次元空間を有効に利用でき、かつ、操作性に優れる粒子形状のマイクロキャリアが選択されている。
しかしながら、現状、既存の機能性マイクロキャリアでは、大量生産体制を構築できるような安定的な手法、製品は確立されていない。その理由としては、既存の機能性マイクロキャリアでは、細胞表面−マイクロキャリア表面間の相互作用のみで細胞を接着させる機構であるが故に、流動的な培養環境下において細胞の接着状態を維持することができないことが影響していると考えられる。或いは、細胞の接着様態も外力に弱い伸展した状態である為、流動環境下に耐えられず、細胞の生存率が低いことも影響していると考えられている。
そこで、この発明はこのような事情に鑑みてなされたものであって、より多くの細胞を安定的に生産できるようにした細胞の培養方法及び細胞の培養キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明の一態様に係る細胞の培養方法は、脂質二重膜構造体を捕捉可能な第１の分子構造体と自己組織化する第２の分子構造体とを含む第１の機能性分子を有する足場を用意する工程と、前記脂質二重膜構造体を有する細胞と前記足場とを細胞培養用生理活性環境下で接触させ、前記第１の分子構造体を介して前記細胞を前記足場上に接着させる工程と、前記細胞培養用生理活性環境下を保持し、前記足場上で前記細胞を増殖させる工程と、前記増殖させた細胞を前記足場から分離する工程と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の一態様によれば、より多くの細胞を安定的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本実施形態に係る第１の機能性分子１００及び第２の機能性分子２００の各構成例を示す模式図である。
【図２】本実施形態に係る第１の足場３００及び第２の足場４００の各構成例を示す模式図である。
【図３】本実施形態に係る第１の複合体５００及び第２の複合体６００の各構成例を示す模式図である。
【図４】本実施形態に係る細胞５の培養の過程を模式的に示す断面図である。
【図５】本実施形態に係る第２の分子構造体２の分子構造を模式的に示す平面図である。
【図６】本実施形態に係る第２の分子構造体２の自己組織化様式を模式的に示す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
近年、国内においては医薬品医療機器等法の施工などにより法規制からの面からもｉＰＳ細胞等を柱とした再生医療産業が本格化し、より安定的で効率的かつ簡便な細胞培養方法が望まれている。特にｉＰＳ幹細胞は、そのほとんどが接着性細胞であるが、現状、生産向けに適した製品・システムがないのが現状である。本発明の培養方法はこのような接着性細胞及び／又は細胞塊の大量培養に適した方法である。
以下、本発明の実施形態に係る細胞の培養方法及び細胞の培養キットについて、それぞれ説明する。
【００１１】
＜細胞の培養方法＞
〔概要〕
本発明の実施形態（以下、本実施形態と称する）に係る足場は、第１の機能性分子と、任意の担持体とを有する。また、本実施形態に係る足場は、第１の機能性分子に加えて、第２の機能性分子を有してもよい。本実施形態では、第１の機能性分子と、任意の担持体とを有し、第２の機能性分子を有さない足場を「第１の足場」と称する。また、第１の機能性分子と、第２の機能性分子と、任意の担持体とを有する足場を「第２の足場」と称する。
【００１２】
ここで、第１の機能性分子は、脂質二重膜構造体を捕捉可能な第１の分子構造体と、自己組織化する第２の分子構造体と、第２の分子構造体と担持体とを連結するリンカー分子と、を含む。また、第２の機能性分子は、自己組織化する第２の分子構造体と、第２の分子構造体と担持体とを連結するリンカー分子とを含み、脂質二重膜構造体を捕捉可能な第１の分子構造体は含まない。
【００１３】
第１の足場は、第１の機能性分子のみを担持体上で自己組織化させることで形成することができる。また、第２の足場は、第１の機能性分子及び第２の機能性分子を担持体上で自己組織化させることで形成することができる。
上記した足場を、細胞培養用生理活性環境下で細胞及び／又は細胞塊（以下、単に細胞と称する）を含む懸濁液と接触させることで、細胞が高密度かつ本来の形態を保持する状態で接着する複合体を形成することができる。ここで、細胞は、例えば接着性細胞を少なくとも一種類以上含む。また、細胞は、例えば動物由来細胞を少なくとも一種類以上含む。以下の説明では、第１の足場に細胞が接着した複合体を「第１の複合体」と称し、第２の足場に細胞が接着した複合体を「第２の複合体」と称する。
【００１４】
本実施形態では、第１の複合体又は第２の複合体を細胞培養用生理環境下で一定時間保持することで、足場上にて表面積を最大限有効に使用し、かつ、生体に近い形態で細胞を培養することができる。また、この培養後、足場上より細胞を分離・回収することができる。
次に、本実施形態について、図面を参照しながら説明する。
【００１５】
〔構成〕
図１（ａ）は、本実施形態に係る第１の機能性分子１００の構成例を示す模式図である。図１（ａ）に示すように、第１の機能性分子１００は、細胞の脂質二重膜構造体を構成しているリン脂質の親水性極性頭部と疎水性部を認識して脂質二重膜構造体に侵入する形態で捕捉することができる第１の分子構造体１と、分子間の相互作用により自己組織化することができる第２の分子構造体２と、任意の担持体４へ結合することができるリンカー分子３とを含む。第１の分子構造体１は、親水性極性頭部を捕捉する（例えば、結合又は吸着する）第１の部分１１と、疎水性部を捕捉する（例えば、結合又は吸着する）第２の部分１２とを含む。
【００１６】
図１（ｂ）は、本実施形態に係る第２の機能性分子２００の構成例を示す模式図である。図１（ｂ）に示すように、第２の機能性分子２００は、分子間の相互作用により自己組織化することができる第２の分子構造体２と、任意の担持体４へ結合することができるリンカー分子３とを含む。第２の機能性分子２００と第１の機能性分子１００との相違点は第１の分子構造体１の有無のみであり、第２の機能性分子２００には第１の分子構造体１が無い。
【００１７】
図２（ａ）は第１の足場３００の構成例を示す模式図である。図２（ａ）に示すように、第１の足場３００は、第１の機能性分子１００と担持体４とを有する。第１の機能性分子１００は、その構成要素であるリンカー分子３を介して担持体に結合／吸着している。また、第１の足場３００において、第１の機能性分子１００は、その構成要素である第２の分子構造体２の相互作用（図２（ａ）の矢印参照）によって自己組織化することができ、第１の機能性分子１００の高密度な構造体を形成することができる。
【００１８】
図２（ｂ）は第２の足場４００の構成例を示す模式図である。図２（ｂ）に示すように、第２の足場４００は、第１の機能性分子１００と、第２の機能性分子２００と、担持体４とを有する。第１の機能性分子１００は、その構成要素であるリンカー分子３を介して担持体４に結合／吸着している。同様に、第２の機能性分子２００も、その構成要素であるリンカー分子３を介して担持体４に結合／吸着している。
【００１９】
また、第２の足場４００において、第１の機能性分子１００と第２の機能性分子２００は、それらの構成要素である第２の分子構造体２の相互作用（図２（ｂ）の矢印参照）によって自己組織化することができ、第１の機能性分子１００と第２の機能性分子２００とが混在した高密度な構造体を形成することができる。例えば、第１の機能性分子１００と第２の機能性分子２００は、担持体４上でそれぞれ隣り合うように配置された、高密度な構造体を形成することができる。
【００２０】
図３（ａ）は第１の複合体５００の構成例を示す模式図である。図３（ａ）に示すように、第１の複合体５００は、第１の足場３００と、第１の足場３００に接着した細胞５とを有する。第１の複合体５００では、第１の足場３００にその構成要素である第１の分子構造体１を介して細胞５が接着する。細胞５は、脂質二重膜構造体を構成しているリン脂質の親水性極性頭部（親水性部の一例）５１と疎水性部５２とを有する。第１の分子構造体１の第１の部分１１が、細胞５の親水性極性頭部５１を認識して捕捉する。また、第１の分子構造体１の第２の部分１２が、細胞５の疎水性部５２を認識して捕捉する。
【００２１】
図３（ｂ）は第２の複合体６００の構成例を示す模式図である。図３（ｂ）に示すように、第２の複合体６００は、第２の足場４００と、第２の足場４００に接着した細胞５とを有する。第１の複合体５００と同様、第２の複合体６００でも、第１の足場３００にその構成要素である第１の分子構造体１を介して細胞５が接着する。
図４は、本実施形態に係る細胞５の培養の過程を模式的に示す断面図である。なお、図４の破線で囲む部分を拡大した図が、上述の図３（ａ）（又は、図３（ｂ））に相当する。図４に示すように、本実施形態に係る細胞の培養方法は、既存の機能性マイクロキャリア上に細胞が接着する際と比較して、一細胞当たりの接着面積が小さく、細胞の形状が変化することなく生体内（Ｉｎ  ｖｉｖｏ）に近い状態で、細胞が高密度に接着が可能である。このため、足場面積をより有効に活用して、細胞の培養を行うことができる。
【００２２】
〔具体例〕
次に、本実施形態について、具体例を挙げて説明する。
（１）第１、第２の機能性分子とその合成方法
まず、第１の機能性分子１００及び第２の機能性分子２００について説明する。
第１の機能性分子１００は、以下の３つの分子構造１〜３を含むことを特徴とする。
・脂質二重膜の親水性極性頭部と疎水性部分の両方を認識して細胞を結合することができる第１の分子構造体１
・自己組織化することができる第２の分子構造体２
・任意の担持体と結合することができる分子構造（すなわち、リンカー分子３）
【００２３】
また、第２の機能性分子２００は、上記第２の分子構造体２、リンカー分子３を含むことを特徴とする。
第１の機能性分子１００及び第２の機能性分子２００は、例えば設計自由度が高く生体親和性の高いポリペプチドを用いることができる。但し、同じ機能を得られるものであればこれに限定されるものではない。
【００２４】
第１の分子構造体１は、天然又は人工アミノ酸で構成されたポリペプチドと、炭素鎖６以上１８以下のアルカンのうち少なくとも一つ以上と、を有する。例えば、第１の構造体１は、設計自由度が高く生体親和性の高いポリペプチドを用いる。脂質二重膜構造体の親水性極性頭部５１を捕捉する部分（第１の部分１１）には、例えば酸性アミノ酸（グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ））或いは、塩基性アミノ酸（リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）の群からなら１つ以上のアミノ酸を組み合わせて１〜１０残基繰り返し配列したものを用いることができる。一例としては、リジン（Ｋ）９残基で構成されたアミノ酸配列（以下、親水性極性頭部認識配列と呼ぶこともある。）がある。ここで、残基とは、ペプチドを構成しているアミノ酸1単位を意味する。
【００２５】
また、脂質二重膜構造体の疎水性部の認識には、例えば非極性アミノ酸（アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、プロリン（Ｐ））の群からなる１つ以上のアミノ酸を組み合わせて１〜１０残基繰り返し配列したものを用いることができる。一例としては、アラニン（Ａ）５残基とトリプトファン（Ｗ）１または２残基で構成されたアミノ酸配列（以下、疎水性部認識配列と呼ぶこともある。）がある。
【００２６】
第２の分子構造体２は、自己組織化能があり、かつ、生体適合性があればよい。また、第２の分子構造体２は、単分子膜を形成することができる分子構造を有してもよい。第２の分子構造体２は、最も一般的な６鎖以上のアルカン誘導体でもよく、第１の分子構造体１と同じくポリペプチドであってもよい。
図５は、第２の分子構造体２の分子構造を模式的に示す平面図である。一例としては、第１の分子構造体１と同じくポリペプチドであり、図５に示すように、
酸性アミノ酸であるグルタミン酸（Ｅ）４残基、塩基性アミノ酸であるリジン（Ｋ）４残基、非極性アミノ酸であるロイシン（Ｌ）５残基、アラニン（Ａ）２残基で構成され、二次構造としてアルファーへリックスを形成する。
【００２７】
図６は、第２の分子構造体２の自己組織化様式を模式的に示す平面図である。第２の分子構造体２の自己組織化様式としては、図６に示すように、酸性、塩基性アミノ酸（すなわち、荷電性アミノ酸）による分子間の静電相互作用と、非極性アミノ酸による分子間の疎水性相互作用とにより、均一に自己組織化することができる。
リンカー分子３は、担持体４と結合できればよく、例えば担持体４が金であればチオール基、ジスルフィド基を持っていればよく、担持体４がシリカであればシランカップリングにより結合可能なリンカー分子を持っていれば良い。また、担持体４の素材に係らず表面処理によりあらかじめ官能基が修飾されている場合は、その官能基と結合可能なリンカー分子を持っていればよい。
【００２８】
担持体４は、有機、無機分子で構成された固相体或いはゲル／ゾル体であればよく、大きさや形は特に制限されず、平板、立体物（粒子等）、フィルム等いずれも使用することができる。
次に、第１の機能性分子１００及び第２の機能性分子２００がポリペプチドである場合を例として、その合成方法の概略について説明する。
【００２９】
第１の機能性分子１００及び第２の機能性分子２００の合成方法は一般的なペプチド合成法である液相法、固相法にいずれの方法で合成されてもよい。以下の例は、タンパク質（例えば、ビオチン）で修飾された第１の機能性分子１００及び第２の機能性分子２００タンパク質共役体の合成例であり、以下の５つの工程で合成することができる。
（工程１）この工程は、固体担体を準備する工程である。固体担体は、樹脂（Ｒ）上にアミノ基を有するリンカー（Ｌ）を有する。ここで、固体担体は、アミノ基が直接に樹脂に存在する場合、リンカーはなくてもよい。固体担体は、樹脂にアミノ基を有するリンカーを修飾することで調製できる。調製法は一般的に知られている方法を採用すればよい。例えば、固体担体の樹脂としてポリスチレン等の樹脂を用いることができる。リンカーは、一般的に用いられるものを用いても良い。
【００３０】
（工程２）次に、目的とする第１の機能性分子及び第２の機能性分子の合成に必要なアミノ酸を用意する。これらのアミノ基の保護基は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）および９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等を挙げることができる。保護基の導入は、既知の方法を用いればよい。
（工程３）この工程は、上記工程１で準備した固体担体に工程２で準備した各種アミノ酸を結合させていく工程である。まず、アミノ基が保護された第１のアミノ酸残基を、固体担体のアミノ基に結合させる。次いで、第１のアミノ酸残基のアミノ基を脱保護し、次のアミノ酸残基を結合させる。このアミノ基の脱保護と、単量体の結合を繰り返すことによって、固体担体とアミノ保護基を有する、目的の第１の機能性分子及び第２の機能性分子を得る。アミノ基の脱保護と、アミノ酸の結合・伸長は、既知の方法を用いることができる。
【００３１】
（工程４）上記工程３で得られた第１の機能性分子及び第２の機能性分子の樹脂（Ｒ）とリンカーを除去し、アミノ保護基を有する第１の機能性分子及び第２の機能性分子を得る。
（工程５）第１の機能性分子及び第２の機能性分子のアミノ保護基（Ｐ）を脱保護し、第１の機能性分子及び第２の機能性分子のそれぞれの末端に、リンカー分子を結合させる。リンカー分子の結合は、既知の方法を用いることができる。
以上の工程１〜５を経て、第１の機能性分子１００及び第２の機能性分子２００を得ることができる。
第１の機能性分子１００及び第２の機能性分子２００の合成方法の他の例は、以下に説明するものである。
【００３２】
上記工程１および２において、固体担体のアミノ基をカルボキシル基に置き換え、構成アミノ酸のカルボキシル基を保護し、構成のアミノ基と固体担体のカルボキシル基をまず結合する。次いで、保護したカルボキシル基を脱保護して、工程３と同様に、カルボキシル基の脱保護と適切な単量体のアミノ基の結合を繰り返すことで固体担体と保護基を含む第１の機能性分子及び第２の機能性分子を得ることができる。その後、上記工程４および５と同様の手順でリンカー分子を導入する。また、さらなる他の例としては、リンカー分子を端所として、構成アミノ酸を順次結合させてもよい。
【００３３】
（２）細胞の培養方法
次に、細胞の培養方法について説明する。
本実施形態に係る細胞の培養方法は、以下の４つの工程１〜４を有する。
工程１：第１の機能性分子１００の自己組織化集合体を含む足場を形成する工程
工程２：足場と細胞を含む懸濁液を細胞培養用生理活性環境下で接触させ、第１の機能性分子１００の第１の分子構造体１を介して細胞５を足場上に接着させる工程
工程３：細胞培養用生理活性環境下で保持し、足場上で細胞を増殖させる工程
工程４：足場と細胞とを分離する工程
以下に各工程について説明する。
【００３４】
（工程１）
工程１は、第１の足場３００又は第２の足場４００を形成する工程である。本工程では、第１の機能性分子１００のみ（又は、第１の機能性分子１００及び第２の機能性分子２００）をバッファーに溶解した状態で担持体４に接触させることで、第１の足場３００（又は、第２の足場４００）を形成することができる。本工程は、第１の機能性分子１００等が吸着することのない反応容器で行うことを必要とする。
【００３５】
バッファーに関しては、担持体４及び第１の機能性分子１００、又は、第２の機能性分子２００のリンカー分子及び結合様式によって自由に選択することができる。例えば、第１の機能性分子及び第２の機能性分子がポリペプチドであれば、自己組織化及びリンカー分子―担持体の結合反応が進行する条件であればよい。反応に必要な分子数に関しては、均一な自己組織化集合体が形成できればよく、担持体４の大きさ、表面積に応じて自由に選択することができる。
【００３６】
第２の足場４００を形成する場合に関しては、第１の機能性分子１００と第２の機能性分子２００の量比（すなわち、第１の機能性分子１００の分子数と、第２の機能性分子２００の分子数との比）も、必要に応じて自由に選択することができる。この比は、１０００：１〜１：１０の範囲内であればよく、好ましくは１００：１〜１：９の範囲内、より好ましくは１０：１〜１：５の範囲内である。反応時間に関しては、均一な自己組織化集合体が形成できればよく、担持体４の大きさ、表面積に応じて自由に選択することができる。一例は、実施例に記載するとおりである。
【００３７】
（工程２）
工程２は、第１の複合体５００（又は、第２の複合体６００）を形成する工程である。本工程では、第１の足場３００（又は、第２の足場４００）と、試料である細胞とを細胞培養用生理環境下で接触させることで、第１の複合体５００（又は、第２の複合体６００）を形成する。本工程は、第１の複合体５００（又は、第２の複合体６００）や試料である細胞等が吸着することのない反応容器で行うことを必要とする。
細胞培養用生理環境下に関しては、細胞の種類によって自由に選択することがでる。例えば、細胞が市販のものであれば、販売元が推奨する培地、培養条件を選択すればよい。
【００３８】
接触させる際の第１の足場３００（又は、第２の足場４００）と、細胞の量比に関しては、細胞培養用環境の体積、第１の足場３００（又は、第２の足場４００）のサイズ、形状、或いは、細胞の種類、性質等に応じて自由に選択することができる。例えば、細胞の量が全て接着できる面積を担保できる分の第１の足場３００（又は、第２の足場４００）があればよく、好ましくは培養後必要な細胞が全て接着できる面積を担保できる分の第１の足場３００（又は、第２の足場４００）があればよく、さらに好ましくは培養後必要な細胞が全て接着できる面積を十分に超えた分の第１の足場３００（又は、第２の足場４００）であるとよい。一例は、実施例に記載するとおりである。
反応時間に関しては、第１の足場３００（又は、第２の足場４００）上に、試料である細胞が十分量接着できていればよく、必要に応じて自由に設定することができる。一例は、実施例に記載するとおりである。
【００３９】
（工程３）
工程３は、第１の複合体５００（又は、第２の複合体６００）を細胞培養用生理環境下で一定時間保持し、試料とした細胞を培養し、増幅させる工程である。本工程は、工程２と同じく、第１の足場３００や試料である細胞等が吸着することのない反応容器で行うことを必要とする。また、工程２と同じ容器を用いてもよく、必要に応じて別の容器に移し替えてもよい。
細胞培養用生理環境下に関しては、工程２と同じ条件を適用できる。反応時間に関しては、細胞の種類や必要量に応じて自由に設定することができる。例えば、通常のシャーレ等の容器の上での培養同様、１００％コンフルエントにならない程度であればよい。一例は、実施例に記載するとおりである。
【００４０】
（工程４）
工程４は、工程３の後、培養後増幅した細胞と第１の足場３００（又は、第２の足場４００）とを分離する工程である。本工程では、工程２と同じく第１の足場３００や試料である細胞等が吸着することのない反応容器で行うことを必要とする。また、工程２と同じ容器を用いてもよく、必要に応じて別の容器に移し替えてもよい。
【００４１】
分離方法に関しては、一般的な方法として知られているトリプシンやアクターゼ等の酵素で処理して、第１の足場３００（又は、第２の足場４００）から細胞を剥離した後、第１の足場３００（又は、第２の足場４００）のみ、或いは、細胞のみを容器から取り出すことで達成しうる。例えば、第１の足場３００（又は、第２の足場４００）を構成する担持体４が磁性体である場合、磁石を用いて、細胞が懸濁した溶液と第１の足場３００（又は、第２の足場４００）とを分離することができる。また別の方法として、第１の足場３００（又は、第２の足場４００）を構成する担持体４が磁性体である場合、磁石で担持体４を固定しながら遠心、或いは、流体力学的な力を加えることで、特別な試薬を用いることなく、第１の足場３００（又は、第２の足場４００）から細胞を分離してもよい。
【００４２】
＜培養キット＞
次に、本実施形態に係る細胞の培養キットについて説明する。
本実施形態に係る細胞の培養キットは、例えば、上述の第１の足場３００又は第２の足場４００である。培養キットは、第１の機能性分子１００（又は、第１の機能性分子１００及び第２の機能性分子２００）と、担持体４とを含む。また、培養キットは、上記の他に、必要に応じて容器等を含んでもよい。この培養キットが第１の機能性分子１００と第２の機能性分子２００とを備える場合、その量比（第１の機能性分子１００の分子数と第２の機能性分子２００の分子数との比）は、１０００：１〜１：１０の範囲内であればよく、好ましくは１００：１〜１：９の範囲内、より好ましくは１０：１〜１：５の範囲内である。
【００４３】
培養キットに含まれる担持体４は、有機、無機分子で構成された固相体或いはゲル／ゾル体であればよく、大きさや形は特に制限されず、平板、立体物（粒子等）、フィルム等いずれの形態でもよい。また、必要に応じて操作性、自動化等を考慮して磁性体としてもよい。例えば無機粒子様磁性体を用いることで容器・容量を自由に選択することができ、かつ、より簡単な操作で細胞を大量に培養することができる。
本実施形態で用いる容器は、容器内部に試料である細胞や材料が吸着しないような加工がされているものが好ましい。別の実施形態では容器を担持体４として用いてもよい。
【００４４】
＜本実施形態の効果＞
本実施形態は、以下の効果（１）〜（３）を奏する。
（１）脂質二重膜構造体を捕捉する機能を有し、かつ、自己組織化する機能性分子を含む足場（第１の足場３００又は第２の足場３００）を用いて、細胞５を培養する。足場に細胞を接着した状態（以下、細胞接着状態）で細胞を培養することができ、細胞同士のインタラクションで、細胞を増殖させる。このため、従来の細胞表面−マイクロキャリア表面間の相互作用のみで接着させる機構と比較して、足場と細胞との接着力が大きく、外力に強い。したがって、例えば流動環境下でも細胞を生存率高く培養することが可能である。また伸展による培養ではなく、細胞接着状態で細胞を培養するため、細胞を高密度に培養することができる。従って、より多くの細胞を安定的に生産することができる。
【００４５】
（２）また、第２の足場４００を用いる場合には、第１の機能性分子１００と第２の機能性分子との量比を調整することにより、１細胞当たりの接着面積を制御することができる。これにより、例えば、１細胞当たりの接着面積を小さくすることができ、より多くの細胞を効率的に培養することが可能である。操作性に優れ、かつ、効率的な細胞培養が可能である。
【００４６】
（３）また、第１の機能性分子１００と第２の機能性分子２００は、それぞれ第２の分子構造体２を有する。隣り合う第２の分子構造体２間には、分子間の静電相互作用や、分子間の疎水性相互作用が働く。これにより、第１の機能性分子１００と第２の機能性分子２００は均一に自己組織化することができる。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４７】
＜実施例１：第１の機能性分子及び第２の機能性分子の合成＞
第１の機能性分子及び第２の機能性分子に関しては、アミノ酸で構成されたポリペプチドを用いた。リンカー分子としてはチオール基を有するシステインを導入した。合成法には、アミノ基をＦＭＯＣ基で保護したＦＭＯＣ固相法で実施した。固相として市販のペプチド合成用樹脂を用いて実施した。以下に詳細な手順について説明する。
【００４８】
［Ｃ末端アミノ酸残基のポリスチレン固相への結合］
（１）約１５０ｍｇ（１×１０−４ｍｏｌ  ）のペプチド合成用樹脂を合成用カラムに投入し、４ｍＬのＮ−メチルピロリドン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ：ＮＭＰ）  で５ｍｉｎ（分）保持し膨潤させると共に洗浄した。さらに２ｍＬのＮＭＰを用いて洗浄を３回程度行った。
【００４９】
（２）合成用樹脂の末端アミノ基からＦｍｏｃ基を脱保護するために２ｍｌのピペリジン  （  Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ：ＰＰＤ  ）  ／  ＮＭＰ  （  １  ／  ４  ，  ｖｏｌ  ／  ｖｏｌ  ）  溶液（塩基性脱保護溶液）をカラムに注入し、１ｍｉｎ保持した。同様に、２  ｍｌの塩基性脱保護溶液  を用いて１５ｍｉｎ保持し、３ｍｉｎ毎に振動を与え攪拌し脱保護を終了させた。
【００５０】
（３）カラム内のＦｍｏｃ基、及び塩基性脱保護溶液を除去するために２ｍｌのＮＭＰで５回洗浄した。
（４）（１）、（３）の塩基性脱保護溶液、洗浄廃液を２０ｍｌメスフラスコに回収した。
【００５１】
（５）Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを０．１３４ｇ  （  ３×１０−４ｍｏｌ  ）、ベンゾトリアゾリルテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフォン（  ２−（  １−Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ  ）−１，１，３，３−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  ｕｒｏｎｉｕｍ  Ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＨＢＴＵ  ）  を０．１１４ｇ  （  ３×１０−４ｍｏｌ  ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール  （  １−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ  Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ：ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ  ）  を０．０４６ｇ  （  ３×１０−４ｍｏｌ  ）、ＮＭＰを２ｍｌ、ジイソプロピルエチルアミン  （  Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ：ＤＩＥＡ  ）  ０．１１ｍｌをカラムに投入し２４ｍｉｎ保持した。３ｍｉｎ毎に振動を与え攪拌した。
（６）カラム内の残存試薬を除去するために２ｍｌのＮＭＰで５回洗浄した。
【００５２】
［ペプチド鎖の伸長］
前項で固相上に結合させたＣ末端アミノ酸残基を基に、設計したアミノ酸配列に従って順次アミノ酸を結合し、ペプチド鎖を固相上で伸長した。その手順は以下の通りである。また、アミノ酸の配列を表１に示す。
（１）合成用樹脂に結合しているアミノ酸のα−アミノ基からＦｍｏｃ基を脱保護するために２ｍｌの塩基性脱保護溶媒を注入し１ｍｉｎ保持した。
【００５３】
（２）同様に２  ｍｌの塩基性脱保護溶媒を注入して１５ｍｉｎ保持し、３ｍｉｎ毎に振動を与え攪拌し、残存試薬を除去するために２ｍｌのＮＭＰを用いて５回洗浄を行った。
（３）設計したアミノ酸配列に従ってＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ  （  ０．０９４ｍｇ，  ３×１０−４ｍｏｌ  ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ  （  Ｂｏｃ  ）−ＯＨ  （  ０．１４１ｇ，  ３×１０−４ｍｏｌ  ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ  （  ０．１２８ｇ，  ３×１０−４ｍｏｌ  ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−ＯＨ  （０．１２７ｇ，  ３×１０−４ｍｏｌ  ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（０．１８７ｇ，  ３×１０−４ｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（０．１２５ｇ，  ３×１０−４ｍｏｌ）  及び、上述したＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ、ＤＩＥＡ、ＮＭＰをカラムに投入し、５ｍｉｎ毎に攪拌し６０ｍｉｎ保持した。
【００５４】
（４）カラム内の残存試薬を除去するために２ｍｌのＮＭＰで５回洗浄を行った。
（５）（１）〜（４）の工程を繰り返し設計したアミノ酸配列に従って、ペプチド鎖を伸長した。
（６）最後のアミノ酸脱保護溶液及び、洗浄廃液を２０ｍｌメスフラスコに回収した。
（７）２ｍｌのクロロホルムで５回洗浄し、減圧乾燥を行った。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
［アミノ酸側鎖官能基の脱保護及び固相からの切出し］
側鎖官能基の脱保護及び、固相からの切出しを行う事で実際に分析に用いる状態に精製した。合成したペプチドを遊離ペプチドとして使用する際には、脱保護・切出し工程を以下の手順に従って行った。
（１）合成したペプチド修飾ポリスチレン粒子を合成用カラムに投入した。カラムとは別に１０ｍｌスリ付きガラスにジエチルエーテルを５ｍｌ投入し冷蔵保存した。
【００５７】
（２）（１）のカラムにトリフルオロ酢酸（  Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ：  ＴＦＡ  ）を１．８５ｍｌ、トリイソプロピルシラン（  Ｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌａｎｅ  ）を０．０５ｍｌ、純水を０．１ｍｌ、投入し、始めの１ｈ（時間）は１０ｍｉｎ毎に振動を与え攪拌し、その後４ｈ保持した。
【００５８】
（３）保持した後、（２）の切出し溶液を（１）の冷蔵保存したジエチルエーテルへ投入した（  エーテル沈殿  ）。得られた溶液及び、沈殿物を１．５ｍｌ用チューブに分割した。
（４）分割した沈殿物、溶液を攪拌（  振動、超音波処理  ）した後、２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離を行う事で沈殿物と溶液を分離した。
【００５９】
（５）チューブ中の沈殿物を除去しないように上澄み液を取り除き、再度ジエチルエーテルを１ｍｌ程度加え攪拌洗浄した後、再度２０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離を行い、上澄み液を除去した。
（６）得られた沈殿物をＨ２Ｏ  ／  アセトニトリル  （  １  ／  １，  ｖｏｌ  ／  ｖｏｌ  ）で溶解し、ＨＰＬＣにて精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分子量を確認した。
【００６０】
＜実施例２：第１の足場または第２の足場の作製＞
第１の足場または第２の足場の作製について説明する。第１の機能性分子または第２の機能性分子については実施例１で合成したポリペプチドを用い、足場材としては、金でコートした磁性シリカ粒子（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｄ社カスタム品）を用いて作製した。金でコートした磁性シリカ粒子５０ｍｇと表２に示す条件で第１の機能性分子または第２の機能性分子をＥｔＯＨ／ＭｅＯＨ（  １  ／  １，  ｖｏｌ  ／  ｖｏｌ  ）溶液中でチューブローテーターで１時間混合し、磁石を用いて磁性シリカ粒子を回収した。足場における第１の機能性分子と第２の機能性分子の量比（分子数の比）を表２に示す。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
＜実施例３：第１の複合体または第２の複合体の作製及び細胞の培養＞
第１の複合体または第２の複合体の作製及び細胞培養については、試料としてヒト由来肺がん細胞ＭＣＦ−７、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞（ＮｏｒｍａｌＨｕｍａｎ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＮＨＤＦ）の２種を用い、足場としては、実施例２で作製した第１の足場また第２の足場を用いた。また、培養用生理環境については、ＭＣＦ−７は、Ｄ−ＭＥＭ（１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清、１ｖｏｌ％ＮＥＡＡ、１ｖｏｌ％ペニシリン／ストレプトマイシン）、ＮＨＤＦはＤ−ＭＥＭ（１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清、１ｖｏｌ％ペニシリン／ストレプトマイシン）の培地をそれぞれ用い、容器としては５０ｍＬ容量のポリスチレン製チューブを用いて繰り返し３回ずつ実施した。また、比較のため既存の機能性マイクロキャリアの代表例として、Ｇｌｏｂａｌ  ｃｅｌｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ社製Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ：ＧＥＭＴＭビーズを用いて実施した。評価については培養後、トリパンブルー溶液を用いてライフテクノロジーズ社製セルカウンター（ＣｏｕｎｔｅｓｓIIＴＭ）で生細胞数をカウントして比較した。詳細な手順は以下に示すとおりである。
【００６３】
（１）容器内に培地を４０ｍＬ添加し、１×１０５個／ｍＬで細胞を懸濁した。
（２）容器内に第１の複合体または第２の複合体（ＧＥＭＴＭビーズ）を５０ｍｇ添加し、ピペッティングでよく攪拌する。
（３）ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で５日間培養する。
実施例３の結果を表３に示す。
【００６４】
【表３】
0006736851.tif 000004
【００６５】
表３に示すように、第１の足場及び第２の足場を用いた場合は、いずれの条件においても既存の機能性マイクロキャリアを用いた場合より、細胞数、生存率について良い結果が得られた。ＭＣＦ−７の場合であれば、最大で細胞数は、既存の機能性マイクロキャリアの１．４倍、生存率（％）は１．２倍上回ることが示された。また、ＮＨＤＦの場合であれば、最大で細胞数は１．５倍、生存率（％）は、１．２倍上回る事が示された。また、標準偏差についても、その値はいずれも小さくなり安定的であることが示された。
【符号の説明】
【００６６】
１  第１の分子構造体
２  第２の分子構造体
３  リンカー分子
４  担持体
５  細胞
１１  第１の部分
１２  第２の部分
５１  親水性極性頭部
５２  疎水性部
１００  第１の機能性分子
２００  第２の機能性分子
３００  第１の足場
４００  第２の足場
５００  第１の複合体
６００  第２の複合体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0006736851.tif 000009
【図６】
0006736851.tif 000010
【配列表】
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