(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の配列：
Ｘ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ
からなるＮ末端保護ペプチドであって、Ｘ−Ｇｌｕ基がアミノ酸であるピログルタミン酸であるＮ末端保護ペプチド。
【請求項２】
水性液体中に存在している、請求項１に記載のＮ末端保護ペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドを含有する医薬品。
【請求項４】
遺伝子治療で治療可能な疾患を治療するための遺伝子治療において使用される、請求項３に記載の医薬品。
【請求項５】
ウイルスベクターによる細胞の感染を促進するための方法であって、
有機溶媒に溶解した請求項１に記載のペプチドを提供する工程、
前記ペプチドを水性液体に添加して前記ペプチドの不溶性凝集体を形成する工程、及び
前記ウイルスベクター及び前記不溶性凝集体の存在下で前記細胞を培養する工程を含み、前記ペプチドを酵素が存在しない前記水性液体中で保存する工程を更に含む、方法。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドを含む、ウイルスによる細胞感染の促進剤。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチドを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、Ｎ末端保護ペプチド、上記ペプチドを含有する医薬品、遺伝子治療において使用される上記ペプチド、遺伝子操作したウイルスコンストラクト（ｖｉｒａｌ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）による細胞の感染を促進する方法、及び形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）又は形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）を拡大（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するための上記ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質／ペプチド活性物質の生産ばかりではなく、研究ツールとしての安定な遺伝子による細胞の形質移入、及び究極的には遺伝子欠損の治療法としての細胞内への遺伝子導入も多数の疾患の治療に非常に適切であることが予想できるため、非常に大きな適用法の前進により遺伝子操作の重要性が近年上昇している。
【０００３】
遺伝子移入（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）方法は絶え間なく進歩し、効率が向上しているので、特定の細胞機能を変更するための遺伝物質の導入は最初のヒト遺伝子のクローニングと組換え体作製以来ずっと生物学医学の基礎研究及び応用研究の必要不可欠なツールとなっている。多数の遺伝子導入（ｇｅｎｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）方法が最適化されてきた。最初は非常にゆっくりとしたものであったが、対応する経験が長年にわたって収集されてきた。
【０００４】
Ｆ．ＣｒｉｃｋとＪ．  Ｗａｔｓｏｎによる１９５３年のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の機能の解明よりずっと前にＦ．  Ｇｒｉｆｆｉｔｈは１９２０年代の終わりにかけて非病原性肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）株を病原体に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）する実験に成功した。この形質転換は幸運な状況によるものであった。それは、この肺炎球菌は稀な天然のＤＮＡ取込み能を有していたからである。原核生物へのＤＮＡの特定的な導入は中でもＪ．Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、Ｍ．Ｄｅｌｂｒuｃｋ、及びＳ．Ｌｕｒｉａによりファージを用いて、いわゆる形質導入を用いて達成された。真核細胞のインビトロ条件下での培養である細胞培養の確立と共に、多数の形質移入の物理的方法及び化学的方法が開発されてきた。より頻繁に活用されているが、より高価な装置を必要とする物理的方法には、電気穿孔及び微量注入が含まれ、それらの物理的方法は１９８０年代、そして今でも通常の方法であるリン酸カルシウム沈殿法、又は１９９０年代初頭に広まった陽イオン性脂質若しくは陽イオン性高分子ベースの方法等のより簡単に適用可能な化学的方法と競合した。しかしながら、これらの方法の使用は常に細胞又はＤＮＡに依存してきた。また、細胞に導入されるＤＮＡは通常は染色体外性（一時的形質移入）であり、従って、娘細胞には伝わらなかった。しかしながら、ファージ（例えば、ラムダファージ）はそれらのＤＮＡを宿主ゲノムと一体化（ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）する（プロファージ、溶原感染経路）ことが可能であることが知られていた。ここから（Ｄｏｅｈｍｅｒら、及びＴａｂｉｎらによる）「遺伝子ベクターとしてのレトロウイルスの確立」までは非常に小さなステップ（１９８１年／１９８２年）であった。ウイルスは種特異的及び器官／組織特異的であり、これが全てのウイルスが全ての（真核）細胞に感染するわけではない理由である。ウイルスエンベロープの改変（糖タンパク質の交換、いわゆるシュードタイプウイルス）及び大半が陽イオン性のペプチドの添加によって形質導入効率が向上すると考えられる。
【０００５】
まず、ウイルス粒子の取込み促進因子がＨＩＶの研究において注意を引き付けた。特定の細胞試験によるインビトロ感染の分析中に血液濾過ペプチドによるＨＩＶの融合の阻害が観察された（Ｍuｎｃｈら、ＶＩＲＩＰ）。
【０００６】
これらのタンパク質断片は驚くべきことに天然物であり、ヒト精液中の促進因子「精液由来ウイルス感染促進因子（ＳＥＶＩ）」としてアミロイド線維を特徴とする線維状構造体を形成することが示されている。これらのナノ線維はウイルスのそれらの標的細胞へのドッキングを促進し、１０の数乗倍ウイルス感染率を上昇させる。
【０００７】
基礎研究及び将来の可能性がある治療用途のためにこの因子をレトロウイルス遺伝子移入に活用した。これにより、遺伝子治療に使用されるレンチウイルス及びガンマレトロウイルスが、ＳＥＶＩタンパク質の存在下でヒトＴ細胞、子宮頸癌細胞、白血病細胞、造血幹細胞、及び胚性幹細胞などの様々な細胞種に対して数倍も高い遺伝子移入率を示すことを明らかにすることができた（非特許文献１；非特許文献２）。
【０００８】
ＳＥＶＩ及びセミノゲリン（ｓｅｍｉｎｏｇｅｌｉｎ）などのその他の促進因子を開発するための研究により、ウイルスエンベロープタンパク質由来のペプチドが形質移入の促進因子としても適切であり得るという仮説が導かれ、その仮説は驚くべきことに予期せぬ大成功であった（Ｍａｒａｌ  Ｙｏｌａｍａｎｏｖａ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ誌）。従って、例えば、様々な濃度（１〜１００μｇ／ｍｌ）のプロトランスズジンＡ（シノニム：ＥＦ−Ｃ）と予め培養されたＨＩＶが、１０の数乗倍上昇しているレポーター細胞による感染率を示すことを明らかにすることができた。この作用機序としては、ＥＦ−Ｃが、ウイルスに結合し、且つ、ウイルスを濃縮することが可能であり、それに伴ってウイルスの細胞への侵入を増幅することが可能である原線維構造体を形成することが考えられた。ウイルス粒子による感染に加えて、ＥＦ−Ｃは遺伝子治療に用いられる多種多様なヒト細胞種（Ｔ細胞、グリア細胞、線維芽細胞、造血幹細胞）において高い効率でレンチウイルス粒子及びレトロウイルス粒子の形質導入を促進する（非特許文献３）。特許文献１もプロトランスズジンＡに関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２４５２９４７（Ａ１）号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｗｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．，２０１０，１２，１３７−４６
【非特許文献２】Ｗｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，３９２，８８７−９５
【非特許文献３】Ｊａｎ  Ｍuｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ，，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，２，１３０−１３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述の通り遺伝子技術の重要性が高まっているため、遺伝子移入のより効果的な促進因子が望まれる。本発明の目的は改良型遺伝子移入促進因子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
驚くべきことに、次の配列：
Ｘ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ（配列番号１）
を有するＮ末端保護ペプチドであって、Ｘが前記ペプチドのＮ末端を保護する基であるＮ末端保護ペプチドが本発明の目的を達成することがわかった。特に、Ｘはメチル基、エチル基、プロピル基、又はブチル基などの１つ又は２つのアルキル基であるか、アセチル基若しくはプロピオニル基などのアシル基であるか、又はＸ−Ｇｌｕ基はアミノ酸であるピログルタミン酸である。
【００１３】
【化１】
0006667432.tif 000002
【００１４】
驚くべきことに、（細胞の影響を受けない、特に酵素の存在がない）インビトロでのピログルタミン酸によるＮ末端修飾は、特に水性液体中でのプロトランスズジンの安定性を大いに向上させる修飾であることがわかった。このことは図１に示されている結果から明らかである。
【００１５】
図１（ＨＰＬＣクロマトグラム）の左の列では、−２０℃で０〜１３日間保存したプロトランスズジンＡ及び４℃（１３日間）で保存したプロトランスズジンＡの結果が、同じ条件下のプロトランスズジンＢの結果と比較されている。４℃で１３日間にわたって保存されるとプロトランスズジンＡはほぼ半分に分解されるのに対して、プロトランスズジンＢは同じ保存条件下で全く分解されていないことが明らかである（ピークの高さは試料中に含まれる成分の濃度に対応する）。
【００１６】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８６，Ｎｏ．４５，ｐｐ．３８８２５〜３８８３２において、Ｓ．Ｊａｗｈａｒらはアミロイドペプチド、特にピログルタミン酸修飾型アミロイドポリペプチドに関する科学の現状について報告している。そのようなアミロイドポリペプチドは多数のアミノ酸を有し、本発明に記載のペプチドも属する短鎖ペプチドとは基本的に同等ではない。ついでに、この短編の概論は酵素が存在する中でインビボ条件下において生じる細胞性事象に関しているが、しかしながらそのインビボ条件はプロトランスズジンの安定性が本発明に従って改善されている条件、すなわち、インビトロ条件と決して同等ではない。
【００１７】
本発明によるペプチドは医薬品としても使用され得る。
【００１８】
本発明は、遺伝子治療で治療可能な疾患を治療するための遺伝子治療における本発明によるペプチドの使用にも関する。
【００１９】
本発明は、ウイルスによる細胞の感染を促進するための方法であって、
−有機溶媒に溶解した請求項１に記載のペプチドを提供するステップ、
−上記ペプチドを水性液体に添加して、上記ペプチドの不溶性凝集体を形成するステップ、
−直前のステップの上記液体を混合するステップ、及び
−上記細胞を培養するステップ
を含む上記方法にも関する。
【００２０】
本発明は、ウイルスによる細胞の感染を促進するための本発明に係るペプチドの使用にも関する。
【００２１】
最後に、本発明に係るペプチドを含むキットも請求する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明に係るペプチド（プロトランスズジンＢ）は、例えば、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を使用するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄによる方法によって調製され得る。
【００２４】
この方法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの原理に従う段階的固相合成において、特にＡＢＩ−４３３合成機の固形支持体としてのＦｍｏｃ−Ｌ−グルタミンが予備負荷されたＷａｎｇ樹脂（０．５９ｍｍｏｌ／ｇ、１００〜２００メッシュ）上での段階的固相合成においてＦｍｏｃ保護誘導体、すなわち、（９−フルオレニルメトキシカルボニル）保護アミノ酸によって作用する。
【００２５】
典型的には１０倍モル過剰で使用されたＦｍｏｃ−Ｌ−アミノ酸の活性化は、Ｎ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中に０．５Ｍの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と２Ｍのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加えて室温で［（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート］（ＨＢＴＵ、１００ｍｍｏｌ／ｌ）を用いて実施される。
【００２６】
個々のアシル化反応は４５分かかり、２０％ピペリジンを使用するＦｍｏｃ脱保護は１５分かかる。
【００２７】
次のアミノ酸誘導体及び関連のオルソゴナル性酸切断可能側鎖保護基を合成に使用する：
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｌ−ｐＧｌｕ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｍｅｔ及びＦｍｏｃ−Ｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）。
【００２８】
９４％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、３％のエタンジチオール（ＥＤＴ）及び３％脱ミネラル水を使用してペプチジル樹脂から樹脂支持体を切断した後に、その未処理（ｒａｗ）ペプチドを冷ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルの中で沈殿させ、未処理ペプチドをペレットとして遠心分離し、そして上清を除去する。
【００２９】
次に、未処理ペプチドのクロマトグラフィー精製を濃度勾配溶出により予備的（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｗａｙ）に行う。
【００３０】
欧州特許出願公開第２４５２９４７（Ａ１）号明細書に従うプロトランスズジンＡとプロトランスズジンＢとの間の差異は、プロトランスズジンＢ中の合成Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ）の代わりに合成Ｌ−ピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）がＮ末端に挿入されているという事実にある。もともとのグルタミンが閉環により修飾されて、ラクタムを形成している。
【００３１】
精製：
予備的分離：
Ｇｉｌｓｏｎ社のＨＰＬＣ上で精製を実施する。ＵＶ／ＶＩＳ検出器はＫｒｏｎｗａｌｄ社のものであり、２３０ｎｍの波長で分離を検出する。流速は４０ｍｌ／分である。
【００３２】
カラムはＷａｔｅｒｓ  Ｐｒｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８カートリッジ（４７×３００ｍｍ）である。
【００３３】
溶離液Ａ：脱ミネラル水の中の０．１％ＴＦＡ；溶離液Ｂ：８０％アセトニトリル及び２０％脱ミネラル水の中の０．１％ＴＦＡ。
【００３４】
プロトランスズジンＢ用の濃度勾配は４０分の間に３５％〜５５％の溶離液Ｂ、すなわち、分当たり０．５％の溶離液Ｂである。
【００３５】
プロトランスズジンＢは４０％の溶離液Ｂで溶出し、０．５〜１分の幾つかの画分に収集される。分析的に純粋な（ｃｌｅａｎ）画分をプールし、凍結乾燥する。
【００３６】
適用するための処理：
凍結乾燥：
Ｃｈｒｉｓｔ社のＥｐｓｉｌｏｎ  １／４５ユニットの技術データを次のように設定して凍結乾燥のために使用する：棚面積、３．７８ｍ２；氷収容能、約６０ｋｇ；最大アイスコンデンサ能力、４５ｋｇ／２４時間；真空ポンプの最終分圧、ガスバラスト有り／無しで１×１０−３／１０−４ｍｂａｒ；凍結乾燥データ（ガスバラスト有りでユニットを手動操作）：最終分圧、１×１０−２ｍｂａｒ；アイスコンデンサ温度、−５０℃；棚温度、＋１５℃；棚加熱の動作起点、０．５ｍｂａｒ；凍結乾燥時間、最大で３日。
【００３７】
プロトランスズジンＢを用いる細胞の形質導入
０．５ｍｇのプロトランスズジンＢを５０μｌのＤＭＳＯに溶解する。次に４５０μｌのＰＢＳをこの溶液に添加し、原線維が３分以内に形成する。このストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）をベクターに添加して２５μｇ／ｍｌの濃度のプロトランスズジンＢを得る。その溶液を１分間ボルテックス混合し、その後に５０００ｇで５分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを少量のＰＢＳに懸濁して細胞に添加する。これらの細胞を恒温器の中で２日間培養する。
【００３８】
プロトランスズジンＢによって形質導入率が大いに向上する。プロトランスズジンＢを用いて最大で９６％の細胞が形質導入され得る。
【図１】
0006667432.tif 000003
【配列表】
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