(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記(i)のアミノ酸配列を含むペプチド（下記の配列中、直後に記号[D]を付した各アミノ酸記号は該アミノ酸のD体を示す。）。
(i) T[D] I[D] T[D] W[D] P[D] T[D] M[D]のアミノ酸配列
【請求項２】
上記(i)のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドおよび１つ以上の成分を含む、コンジュゲート。
【請求項４】
前記１つ以上の成分が抗がん剤を含む、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記抗がん剤が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管阻害剤、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、分子標的薬、および抗血管新生剤からなる群から選択される、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記１つ以上の成分が検出可能な物質を含む、請求項３に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記検出可能な物質が、X線撮影、コンピュータ断層撮影（CT）、核磁気共鳴画像法（MRI）、超音波検査、シンチグラフィ、ポジトロン断層法（PET）、内視鏡、および腹腔鏡からなる群から選択される手段によりインビボにおける該コンジュゲートの検出を可能にするものである、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記検出可能な物質が、放射性同位体、MRI用増強剤、放射線不透過性物質、造影剤、または蛍光性物質である、請求項６または７に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してはがん生物学の分野に関し、より詳細にはアネキシンＡ１に結合するペプチドおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳腫瘍の中でも髄膜腫や神経鞘腫など、髄膜や脳・脊髄神経から発生する腫瘍は多くが良性脳腫瘍であり、外科手術によって摘出できれば完全治癒が可能である。それに対して、神経膠腫（グリオーマ）を始めとする神経上皮性腫瘍は基本的に悪性脳腫瘍である。特にグレード４の膠芽腫（グリオブラストーマ）に至っては、頭開手術による摘出後、放射線療法と化学療法を行ったとしても、予後は極めて悪い（５年生存率は１０％程度）。脳腫瘍に対して有効な化学療法が実施できていない大きな理由として、血液脳関門の存在が挙げられる。一方、膠芽腫に有効な新薬であるテモゾロミドが２００６年に日本で承認された。この薬は分子量が極めて小さく（１９４Ｄａ）、拡散によって血液脳関門を通過できることが明らかになったものの、平均余命を１２ヶ月から１６ヶ月に延ばすことしかできていない。従って、今後悪性脳腫瘍に対する治療成績を劇的に改善するためには、血液脳関門を低分子の拡散に頼る消極的な方法ではなく、脳腫瘍に圧倒的高濃度で集積し、かつ積極的に血管内皮の壁を越えることのできる治療薬の開発が必須である。【０００３】
最近は研究開発費の高騰や抗体医薬品の普及によって、患者の経済的負担は次第に重くなりつつある。今後、遺伝子情報による診断システムなど、医療の高度化によって、この傾向はさらに加速するものと思われる。また、これら薬価の高騰が国の医療費に与える影響も計り知れない。さらに、高価な抗体医薬品が後進国には手の届かないものになり、世界規模でのさらなる医療格差を招く。以上の問題に対して、より長期的な視野で対策を講じるならば、優れた医薬品シーズの探索を追い求めることに加えて、今後は短鎖ペプチドのような安価なバイオ医薬品の可能性も模索する必要がある。【０００４】
本発明者の一人である福田は２０１４年に産業技術総合研究所に赴任するまでの３０年以上もの間、米国のＳａｎｆｏｒｄ  Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｐｒｅｂｙｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにて研究室を主催してきた。その間、福田は、糖鎖の構造を模倣したペプチドを使って、糖鎖依存性の癌転移を阻害することに世界で初めて成功した（非特許文献１）。さらに、これらの糖鎖模倣ペプチド群が相互作用する血管内皮受容体を調べる過程で、ＩＦ７と名付けたペプチドがアネキシンＡ１（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ１；Ａｎｘａ１）に結合することを見出した（非特許文献２）。Ａｎｘａ１は現在知られている腫瘍血管特異的マーカー分子の中で最も特異性が高いことがＪａｎ  Ｓｃｈｎｉｔｚｅｒらのグループによって明らかにされており、正常細胞では細胞内に発現するが、腫瘍新生血管内皮細胞では血流に接する管腔表面に強発現する（非特許文献３）。福田らは、ＩＦ７に抗癌剤（ＳＮ３８）を結合させた薬剤（ＩＦ７−ＳＮ３８）が低投与量で担癌マウスの腫瘍を消失させることを明らかにした（非特許文献２）。ＩＦ７はマウスＡｎｘａ１のＮ末端領域に結合するが、その領域のアミノ酸配列はマウスとヒトの間で高度に保存されている。従って、ＩＦ７−ＳＮ３８はヒトにおいても有効である可能性があることから、この発見はＰＮＡＳ誌の“Ｉｎ  ｔｈｉｓ  ｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ＰＮＡＳ”に取り上げられ、ＮＩＨが特集記事を紹介、さらには世界中のメディアが報道する等、大きな注目を浴びた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｕｋｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０：４５０−６，２０００
【非特許文献２】Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０８：１９５８７−９２，２０１１
【非特許文献３】Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２９：６２９−３５，２００４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
担癌マウスにＩＦ７を静脈投与すると、ＩＦ７は腫瘍周囲の血管に到達した後、血管内皮細胞の管腔側から小胞に取り込まれて基底側へ移動し、癌細胞が存在する間質へ遊離される。マウス血管内皮Ｆ２細胞においても、Ａｎｘａ１に結合したＩＦ７はトランスサイトーシスで能動的に腫瘍血管内皮細胞を縦断した。従って、ＩＦ７は脳腫瘍内の血管−脳腫瘍関門を通過する活性を有することが示唆された。驚くべきことに、グリオーマ細胞を移植した脳腫瘍モデルマウスに、蛍光ラベルしたＩＦ７を静脈注射したところ、蛍光が脳腫瘍部位に高濃度で集積する様子が観察された。また、蛍光は血管を乗り越えて脳の間質にあるがん細胞へ到達した。さらに、同一マウス内に皮下腫瘍と脳腫瘍を作製し（ｄｕａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）、ＩＦ７−ＳＮ３８の治療効果を検証したところ、脳腫瘍と皮下腫瘍の両方が抑制され、その効果は皮下腫瘍よりも脳腫瘍の方が高かった。Ｂ１６メラノーマの転移脳腫瘍モデルにおいても同様の結果が得られ、ホストマウスをＣ５７ＢＬ／６やＳＣＩＤの系統に変えても結果は変わらなかった。これらの事実は、Ａｎｘａ１を標的とするＤＤＳは効率よく血液−脳腫瘍関門を越えるだけでなく、脳腫瘍で優れた治療効果をあげることを示している。【０００７】
この様に、ＩＦ７は優れた悪性腫瘍標的活性をもつが、臨床開発を目指す上で、難溶解性であることと安定性が低いことの２点に問題がある。すなわち、まずＩＦ７ペプチドはプロテアーゼ感受性であり分解されやすい。実際、Ａ４８８−ＩＦ７を健常マウスの静脈に投与した実験では、末梢血の蛍光シグナルが１時間程度でほとんど消失した。しかし、担癌マウスの尾静脈投与では、Ａ４８８−ＩＦ７は末梢血から回収される蛍光が健常マウスよりも顕著に少なかった。この結果は、Ａ４８８−ＩＦ７が分解を受けつつも大部分が腫瘍に急速に集積することを示唆する。また、ＩＦ７は疎水性が高く抗癌剤と結合させた化合物を静脈投与する際に沈殿を避けるためにＤＭＳＯに溶解した後に界面活性剤を加えるなど剤形に困難が伴う。【０００８】
従って、本発明は、ＩＦ７に付随する上記の問題点を少なくとも部分的に克服し得る、アネキシンＡ１に結合する新規のペプチドおよびその用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行い、アネキシンＡ１に結合し得るＤ型のペプチドを探索することを着想した。そのために、本発明者らは、ＩＦ７と結合することが知られているＡｎｘａ１のＮ末端１５残基に修飾用Ｃｙｓ残基を付加した１６残基のＬ型ペプチド（Ｌ−ＭＣ１６）と鏡像関係にあるＤ型ペプチド（Ｄ−ＭＣ１６）を合成し、Ｔ７ファージライブラリーを用いたスクリーニングにより、Ｄ−ＭＣ１６と結合する７アミノ酸の複数のＬ型ペプチドを同定した。そして、同定されたＬ型ペプチドの中でも特に有望であったＴＩＴ７ペプチドと呼称するペプチドについて更なる試験を行った。本発明者らが予想した通り、このＴＩＴ７ペプチドと鏡像関係にあるＤ型ペプチド（ｄＴＩＴ７ペプチド）はＡｎｘａ１と結合することを本発明者らは確認した。更に、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏの実験により、ｄＴＩＴ７ペプチドは脳腫瘍モデルマウスに尾静脈投与されたときに腫瘍部位に集積すること、抗がん剤（ゲルダナマイシン）と結合させたｄＴＩＴ７ペプチド（ＧＡ−ｄＴＩＴ７）は担癌マウスに静脈投与されたときに腫瘍の増殖を顕著に抑制し、腫瘍部位に大量の壊死を生じさせたこと、ＧＡ−ｄＴＩＴ７はＣ６細胞を脳に移植した脳腫瘍モデルマウスとＢ１６細胞を脳に移植した脳転移モデルマウスのいずれの場合においても経口投与されたときに腫瘍の増殖を抑制し、薬剤の投与を中止した後にも腫瘍が減少し続け、ついには一部の動物において完全治癒が得られたことを実証した。【００１０】
本発明者らは以上の結果に基づき更なる研究を重ね、本発明を完成するに至った。本発明は即ち、以下の通りである。
［１］下記式（Ｉ）−（ＩＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド。
（Ｉ）（Ｘ１）［Ｄ］Ｐ［Ｄ］（Ｘ２）［Ｄ］のアミノ酸配列（該配列中、Ｘ１はＷまたはＦを示し、Ｘ２はＳまたはＴを示し、直後に記号［Ｄ］を付した各アミノ酸記号は該アミノ酸のＤ体を示す。）、
（ＩＩ）Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］（Ｘ）ｎＦ［Ｄ］のアミノ酸配列（該配列中、（Ｘ）ｎは互いに独立して選択されるｎ個の任意のアミノ酸を示し、ｎは０−４の整数を示し、記号［Ｄ］は前記と同義を示す。）、
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列のＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるアミノ酸配列。
［２］下記（ｉ）−（ｖｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド（下記の配列中、記号［Ｄ］は前記と同義を示す。）。
（ｉ）Ｔ［Ｄ］Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｍ［Ｄ］のアミノ酸配列、
（ｉｉ）Ｌ［Ｄ］Ｒ［Ｄ］Ｆ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｖ［Ｄ］Ｌ［Ｄ］のアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）Ｌ［Ｄ］Ｌ［Ｄ］Ｓ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｓ［Ｄ］Ａ［Ｄ］のアミノ酸配列、
（ｉｖ）Ｓ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｓ［Ｄ］Ｌ［Ｄ］Ｌ［Ｄ］Ｆ［Ｄ］のアミノ酸配列、
（ｖ）Ｍ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｌ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｆ［Ｄ］Ｒ［Ｄ］のアミノ酸配列、
（ｖｉ）前記（ｉ）−（ｖ）のいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）前記（ｉ）−（ｖｉ）のいずれかのアミノ酸配列のＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるアミノ酸配列。
［３］上記（ｉ）のアミノ酸配列を含む、［２］に記載のペプチド。
［４］上記（ｉ）のアミノ酸配列からなる、［２］に記載のペプチド。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載のペプチドおよび１つ以上の成分を含む、コンジュゲート。
［６］前記１つ以上の成分が抗がん剤を含む、［５］に記載のコンジュゲート。
［７］前記抗がん剤が、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管阻害剤、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、分子標的薬、および抗血管新生剤からなる群から選択される、［６］に記載のコンジュゲート。
［８］前記抗がん剤が、
エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、クラドリビン、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ドキシフルリジン、ネララビン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メルカプトプリン、メトトレキサート；
シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、チオテパ、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバシン、プロカルバシン、テモゾロマイド、カルムスチン、ストレプトゾトシン、ベンダムスチン；
アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、アムルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ジノスタチンスチマラマー、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、リポソーマルドキソルビシン；
ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、パクリタキセル、タキソール、ドセタキセル；
オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン；
カンプトテシン、イリノテカン、ノギテカン、ＳＮ−３８、ドキソルビシン、エトポシド、レボフロキサシン、シプロフロキサシン；
レゴラフェニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ラムシルマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、クリゾチニブ、アレクチニブ、セリチニブ、レンバチニブ、トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、スニチニブ、ソラフェニブ、アキシチニブ、パゾパニブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、ベムラフェニブ、エベロリムス、テムシロリムス、リツキシマブ、ベバシズマブ、ゲルダナマイシン；
アンギオスタチン、エンドスタチン、メタスタチン、抗ＶＥＧＦ抗体、およびＶＥＧＦＲ−２インヒビター
からなる群から選択される、［６］または［７］に記載のコンジュゲート。
［９］前記１つ以上の成分が検出可能な物質を含む、［５］に記載のコンジュゲート。
［１０］前記検出可能な物質が、Ｘ線撮影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波検査、シンチグラフィ、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、内視鏡、および腹腔鏡からなる群から選択される手段によりインビボにおける該コンジュゲートの検出を可能にするものである、［９］に記載のコンジュゲート。
［１１］前記検出可能な物質が、放射性同位体、ＭＲＩ用増強剤、放射線不透過性物質、造影剤、または蛍光性物質である、［９］または［１０］に記載のコンジュゲート。
［１２］前記検出可能な物質が、
１８Ｆ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、１１０Ｉｎ、１２０Ｉ、１２４Ｉ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂ、１９７Ｈｇ、および２０１Ｔｌから選択される放射性核種；
クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、およびエルビウム（ＩＩＩ）から選択される常磁性イオン、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、ビスマス（ＩＩＩ）；
ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム化合物；
ローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ  ｄｙｅ、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、およびこれらの誘導体、ならびに近赤外線蛍光試薬
からなる群から選択される、［９］〜［１１］のいずれかに記載のコンジュゲート。
［１３］［１］〜［４］のいずれかに記載のペプチドまたは［５］〜［１２］のいずれかに記載のコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
［１４］［６］〜［８］のいずれかに記載のコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む、がんの治療用組成物。
［１５］［９］〜［１２］のいずれかに記載のコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む、がんの検査用組成物。
［１６］がんが固形がんまたは液性がんである、［１４］または［１５］に記載の組成物。
［１７］固形がんが、血管新生する固形がんである、［１６］に記載の組成物。
［１８］固形がんが、脳・神経系のがん、頭頸部がん、消化器がん、泌尿器または生殖器のがん、呼吸器系のがん、乳がん、皮膚がん、骨のがん、または筋肉のがんである、［１６］または［１７］に記載の組成物。
［１９］固形がんが、脳腫瘍、脊髄腫瘍、喉頭がん、口腔がん、唾液腺がん、副鼻腔がん、甲状腺がん、胃がん、食道がん、小腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、肝臓がん、胆道がん、膵臓がん、腎がん、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、腎盂および尿管がん、胆嚢がん、胆管がん、精巣がん、陰茎がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、子宮頚がん、膣がん、外陰がん、卵巣がん、卵管がん、肺がん、乳がん、悪性黒色腫、骨肉腫、または横紋筋肉腫である、［１６］〜［１８］のいずれかに記載の組成物。
［２０］固形がんが良性または悪性の脳腫瘍である、［１９］に記載の組成物。
［２１］脳腫瘍が原発性脳腫瘍または転移性脳腫瘍である、［２０］に記載の組成物。
［２２］脳腫瘍が、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫、星細胞腫（アストロサイトーマ）、乏突起神経膠腫（オリゴデンドログリオーマ）、退形成性星細胞腫、退形成性乏突起膠腫、退形成性乏突起星細胞腫、または膠芽腫（グリオブラストーマ）である、［２０］または［２１］に記載の組成物。
［２３］液性がんがＢ細胞性リンパ腫である、［１６］に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、アネキシンＡ１に結合する新規のペプチドが提供される。
エリスロポエチンや最近の抗ＰＤ−１抗体の例で明らかなように、臨床で成功している医薬品は薬剤が標的とする生体内分子の発現特異性が非常に高い。本発明のペプチドが標的とするアネキシンＡ１は、現在知り得る悪性腫瘍の新生血管標的マーカーの中で最も特異性の高い分子であるので、本発明のペプチドと結合させた抗がん剤は既存の抗がん剤と比べて優れた治療効果を示し得る。
特に、当該ペプチド−抗がん剤コンジュゲートは、悪性腫瘍に高効率で抗がん剤を集積し得るだけでなく、プロテアーゼ耐性であるので、有効投与回数の減少と更なる低投与量が見込まれる。更に免疫機構が温存されると考えられるため、抗がん剤と免疫治療の併用による悪性腫瘍の完全治癒が期待され得る。
アネキシンＡ１の特徴的な点は、腫瘍内にできた新生血管内皮細胞の血液側に発現し、本発明のペプチドのようなリガンドと血液側で結合すると、リガンドをトランスサイトーシスによって基底側に運び、癌細胞が存在する間質へ積極的に放出することである。この性質は血管脳障壁を積極的に乗り越える機序としても働いていると考えられる。アネキシンＡ１を標的とする本発明のペプチドは、従来の血管新生阻害剤（アバスチン）やテモゾロミド（上記）とは異なり、画期的なメカニズムによる悪性脳腫瘍の治療を可能にするものである。即ち、現在、化学療法剤として血液脳関門を通過するもの、腫瘍組織に集積するもの、体内で安定で経口投与可能なものがそれぞれ開発されているが、その全てを兼ね備え得る化学療法剤は本発明のペプチド以外には存在しない（図１０）。
本発明のペプチドは様々な抗がん剤と結合させることができるので、生理活性にも幅を持たせることができる。
本発明は、脳腫瘍の治療にブレークスルーを開くものである。さらにＡＮＸＡ１は様々な悪性腫瘍の血管表面に発現することが公知であり、ｄＴＩＴ７結合抗癌剤は、脳腫瘍のみでなく広範な癌治療薬として臨床応用が期待される。
また、本発明のペプチドは化学合成や修飾が容易であることから、抗体医薬品に代わる中分子バイオ医薬品として将来性が極めて高い。特に、本発明のペプチドは短鎖ペプチド（例えば、アミノ酸７残基）であり得るので、化学合成で安価に製造し得る。
更に、本発明のペプチドや、該ペプチドと他の機能性部分を含むコンジュゲートは、安定性に優れ、また経口投与用医薬としても用い得る。従って、臨床試験も容易である。実際に医療薬として承認された後は、医療施設の乏しい後進国においても医薬品として普及させることが可能である。【００１２】
また、本発明のペプチドと検出可能な物質を含むコンジュゲートは、例えばがんの診断用途において有用である。本発明者らは過去に、ＩＦ７を使ったマウスのＰＥＴ検査を試みたが、腫瘍特異的なイメージは得られなかった。不成功の理由は、ＩＦ７を放射性試薬と結合させたものの、高い疎水性に起因してＩＦ７が化合物の内側に埋没したためと考えられる。本発明のペプチドは水溶性であり得るので、この点を克服し得ると考えられる。また、本発明のペプチドは例えばＮ末端修飾が比較的容易であり、ＰＥＴを始めとする３Ｄイメージング用の試薬の標識ができ、診断薬開発が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＩＦ７の脳腫瘍標的効果を示す図である。ＩＦ７−Ａ４８８を脳腫瘍モデルマウスに静脈投与した後の脳組織切片。Ａ４８８（左）とＨｏｅｃｈｓｔ（右、腫瘍部位）。ＲＱ７はＩＦ７の逆配列ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ。Ｂａｒｓ；５ｍｍ。
【図２】蛍光ラベルＩＦ７を投与したマウスからの脳腫瘍組織切片の蛍光顕微鏡像を示す図である。図１に示した脳腫瘍組織切片の拡大図を示したものである。血管内皮細胞はＣＤ３１特異抗体で染色した（赤）。ＩＦ７−Ａ４８８（緑）は血管を通過して間質のがん細胞まで到達している。ＲＱ７は、ＩＦ７の逆配列コントロール。Ｂａｒｓ；４０μｍ。
【図３】Ｄｕａｌ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｏｕｓｅを説明する図である。血管−脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）の影響を調べるため、一匹のマウスの脳と皮下にルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）発現がん細胞を移植し、腫瘍を作らせた。尾静脈から投与した抗がん剤の脳腫瘍への浸透をＢＢＴＢが阻害する場合（ＢＢＴＢ＋）、抗がん剤の効果は皮下腫瘍にのみ現れる。一方、抗がん剤が脳腫瘍に浸透する場合（ＢＢＴＢ−）、抗がん剤は脳腫瘍にも皮下腫瘍にも効果を示す。
【図４】ＩＦ７−ＳＮ３８の脳腫瘍に対する治療効果を示す図である。Ｃ６−Ｌｕｃ細胞（ラットグリオーマにルシフェラーゼを強制発現した細胞）を免疫不全ＳＣＩＤマウスの脳と皮下に移植して腫瘍を作らせｄｕａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌとした。ＩＦ７−ＳＮ３８を尾静脈から毎日投与して腫瘍中のルシフェラーゼ活性による発光を測定してＣ６−Ｌｕｃ細胞の生存率を測定した。ＩＦ７−ＳＮ３８は脳腫瘍の増殖を抑えるのみならず、脳腫瘍を皮下腫瘍よりもより強く抑制した。
【図５】担癌マウスと健常マウスに静脈投与したＡ４８８−ＩＦ７の血中に残存する蛍光の定量解析を示す図である。メラノーマＢ１６の皮下担癌マウスにＡ４８８−ＩＦ７を尾静脈から投与し、経時的に抹消血を眼静脈から採取して蛍光を測定した。回収される蛍光は腫瘍の大きさに依存して減少した。
【図６】Ａｎｘａ１に結合するＤ−型ペプチドのスクリーニングを説明する図である。（Ａ）鏡像スクリーンによるＤ−型ペプチド配列同定法。アミノ酸１６残基からなるＡｎｘａ１  Ｎ−末端ペプチド（（１）Ｌ−型ＭＣ１６）にＩＦ７は結合する。（２）Ｄ−型ＭＣ１６を合成し、それに結合する配列を選別する。（３）得られたＬ−型ペプチドをＤ−アミノ酸で合成すればＡｎｘａ１に結合するＤ−型ペプチドができる。（Ｂ）Ｄ−ＭＣ１６を標的としたＴ７ファージライブラリーのスクリーニング結果。ファージの濃縮がラウンドごとにみられた。（Ｃ）次世代シーケンサーによるＤ−ＭＣ１６特異的なＴ７ファージの配列解析。（Ｄ）濃縮されたペプチドとその割合。（Ｅ）ＴＩＴ７ファージのＤ−ＭＣ１６に対する結合の確認（プラーク形成実験）。
【図７】ＩＲＤｙｅ−ｄＴＩＴ７投与実験の結果を示す図である。ルシフェラーゼを強制発現させたラットグリオーマ細胞（Ｃ６−Ｌｕｃ）をヌードマウスの脳に移植し脳腫瘍モデルマウスを作製した。近赤外線蛍光試薬（ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ）で標識したｄＴＩＴ７（ＩＲＤｙｅ−ｄＴＩＴ７、未精製品）を尾静脈注射し、時間経過毎にＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｅｒにより蛍光を観察した。２４時間以降に脳腫瘍部位と腎臓に蛍光シグナルが集積している様子が観察された。（Ａ）時間経過毎の全体像（Ｂ）拡大写真（Ｃ）ＩＶＩＳイメージャーのソフトウェアによるシグナルの定量化。
【図８】ＧＡ−ｄＴＩＴ７縮合体の構造を示す図である。ゲルダナマイシンにアミノ基を導入しマレイミドリンカーを結合させる。ｄＴＩＴ７のＣ末端に予めシステインを付加して合成する。システイン残基のスルフヒドリル基を介してマレイミドと反応させ、ＧＡ−ｄＴＩＴ７縮合体を得る。
【図９】ｄＴＩＴ７に抗癌剤ゲルダナマイシン（ＧＡ）を結合させた薬剤（ＧＡ−ｄＴＩＴ７）を脳腫瘍モデルマウスに隔日経口投与した実験の結果を示す。脳腫瘍の生存はルシフェラーゼによる発光で定量した。ＷＩＰＴＴＭＴ（ｄＴＩＴ７を構成するＤ型アミノ酸配列の順序のみを変えたペプチド）にゲルダナマイシンを結合させたＧＡ−ｄＷＩＰ７をコントロールとしてマウスに投与した。悪性腫瘍の生細胞シグナル（左図）を定量したグラフ（右上）、および生存曲線（右下）を示す。
【図１０】ＩＦ７、ｄＴＩＴ７結合抗癌剤による悪性脳腫瘍の標的治療を概念的に説明する図である。便宜上、脳血液関門を首から上とした。一般的な抗癌剤は腫瘍標的能を持たない。テモゾロミドは拡散によって脳腫瘍にある程度浸透するが濃縮されない。またアバスチンは新生血管に働くが直接腫瘍細胞に効くものではない。対照的に、Ａｎｘａ１結合ペプチドは血液脳腫瘍関門を通過し、腫瘍のみに高濃度で集積する。
【図１１】ｄＬＲＦ７、ｄＳＰＴ７、ｄＭＰＴ７およびｄＬＬＳ７ペプチドとＡｎｘａ１の分子間相互作用の結果を示す図である。試験した全てのペプチドが、Ａｎｘａ１への陽性結合を示した。
【図１２】ＩＲＤｙｅ−ｄＬＲＦ７、ＩＲＤｙｅ−ｄＳＰＴ７、ＩＲＤｙｅ−ｄＭＰＴ７およびＩＲＤｙｅ−ｄＬＬＳ７の脳腫瘍モデルヌードマウスへの投与実験の結果を示す図である。ｄＬＬＳ７を注射したマウス以外の全てのマウスで、脳腫瘍部位に強いシグナルを示し、ｄＬＬＳ７以外のｄＬＲＦ７、ｄＭＰＴ７およびｄＳＰＴ７の３つのペプチドが、血管系経路を介した脳腫瘍標的能を有することを示した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．ペプチド
本発明は、下記（Ｉ）−（ＩＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。
（Ｉ）（Ｘ１）［Ｄ］Ｐ［Ｄ］（Ｘ２）［Ｄ］のアミノ酸配列（該配列中、Ｘ１はＷまたはＦを示し、Ｘ２はＳまたはＴを示す。）、
（ＩＩ）Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］（Ｘ）ｎＦ［Ｄ］のアミノ酸配列（該配列中、（Ｘ）ｎは互いに独立して選択されるｎ個の任意のアミノ酸を示し、ｎは０−４の整数を示す。）、
（ＩＩＩ）前記（Ｉ）または（ＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列のＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるアミノ酸配列。
【００１５】
本発明はまた、下記（ｉ）−（ｖｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドも提供する。
（ｉ）Ｔ［Ｄ］Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｍ［Ｄ］のアミノ酸配列、
（ｉｉ）Ｌ［Ｄ］Ｒ［Ｄ］Ｆ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｖ［Ｄ］Ｌ［Ｄ］のアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）Ｌ［Ｄ］Ｌ［Ｄ］Ｓ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｓ［Ｄ］Ａ［Ｄ］のアミノ酸配列、
（ｉｖ）Ｓ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｓ［Ｄ］Ｌ［Ｄ］Ｌ［Ｄ］Ｆ［Ｄ］のアミノ酸配列、
（ｖ）Ｍ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｌ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｆ［Ｄ］Ｒ［Ｄ］のアミノ酸配列、
（ｖｉ）前記（ｉ）−（ｖ）のいずれかのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはこれらの組み合わせを有するアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）前記（ｉ）−（ｖｉ）のいずれかのアミノ酸配列のＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるアミノ酸配列。
【００１６】
本明細書において、鎖状ペプチドのアミノ酸配列は、ペプチド標記の慣例に従って左側がＮ末端側、右側がＣ末端側で記載される。また、アミノ酸配列中の直後に記号［Ｄ］を付した各アミノ酸記号は該アミノ酸のＤ体を示し、アミノ酸配列中の直後に記号［Ｄ］を付していない各アミノ酸記号は、文脈に反しない限り、該アミノ酸のＬ体を示す。本明細書において、上記（Ｉ）−（ＩＩ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドおよび上記（ｉ）−（ｖｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを総称して、本発明のペプチドという。
【００１７】
上記（Ｉ）のアミノ酸配列は、Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｓ［Ｄ］、Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］、Ｆ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｓ［Ｄ］、またはＦ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］のいずれであってもよい。
【００１８】
上記（ＩＩ）のアミノ酸配列において、整数ｎは０−４であり、好ましくは２−３である。Ｘは互いに独立して選択される任意のアミノ酸であってよい。
【００１９】
本発明のペプチドは上記の（Ｉ）−（ＩＩＩ）および（ｉ）−（ｖｉｉ）のいずれかのアミノ酸配列からなるものであってもよいし、これらの配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に１つ以上のアミノ酸が付加されていてもよい。
【００２０】
本明細書において、ペプチドとは、２つ以上のアミノ酸がペプチド結合したものをいう。本発明のペプチドの長さは特に限定されない。本発明のペプチドは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個のアミノ酸を含んでもよい。本発明のペプチドは、５０個まで、４５個まで、４０個まで、３５個まで、３０個まで、２５個まで、２０個まで、１９個まで、１８個まで、１７個まで、１６個まで、１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、または７個までのアミノ酸からなるものであってもよい。本発明のペプチドは、３−１０個、３−１５個、３−２０個、３−２５個、３−３０個、３−４０個、３−５０個、４−１０個、４−１５個、４−２０個、４−２５個、４−３０個、４−４０個、４−５０個、５−１０個、５−１５個、５−２０個、５−２５個、５−３０個、５−４０個、５−５０個、６−１０個、６−１５個、６−２０個、６−２５個、６−３０個、６−４０個、６−５０個、７−１０個、７−１５個、７−２０個、７−２５個、７−３０個、７−４０個、７−５０個、８−１０個、８−１５個、８−２０個、８−２５個、８−３０個、８−４０個、または８−５０個のアミノ酸の長さであってもよい。例えば、本発明のペプチドは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のアミノ酸の長さであってもよい。
【００２１】
本発明のペプチドは、Ｄ型アミノ酸およびＬ型アミノ酸の組み合わせにより構成されていてもよい。より詳細には、上記（Ｉ）−（ＩＩ）および（ｉ）−（ｖｉ）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドを構成するアミノ酸は、全てがＤ型アミノ酸であってもよいし、Ｄ型アミノ酸に加えてＬ型アミノ酸を含んでいてもよく、上記（ＩＩＩ）または（ｖｉｉ）のアミノ酸配列を含むペプチドを構成するアミノ酸は、全てがＬ型アミノ酸であってもよいし、Ｌ型アミノ酸に加えてＤ型アミノ酸を含んでいてもよい。Ｌ型アミノ酸は、天然に存在するＬ型アミノ酸であってよく、例えば、いずれもＬ体である、グリシン、アラニン、ロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、アルギニン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、トリプトファン、バリンなどが挙げられる。Ｄ型アミノ酸としては、例えば、上記したようなＬ型アミノ酸の光学異性体が挙げられる。なお、本明細書において、光学活性を示さないアミノ酸であるグリシンは、文脈に反しない限り、Ｌ型かつＤ型のアミノ酸であるとして読むことができる。
【００２２】
本発明のペプチドは、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１−１．８２２に言及されるものなどの、修飾（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）または異常（ｕｎｕｓｕａｌ）アミノ酸を含んでいてもよい。あるいは、一つの実施形態において、本発明のペプチドは修飾または異常アミノ酸を含まない。修飾または異常アミノ酸としては、例えば、３−アミノアジピン酸、β−アラニン、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、６−Ｎ−メチルリジン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチンなどが挙げられる。
【００２３】
本発明のペプチドのアミノ末端および／またはカルボキシ末端は、改変されていてもよい。アミノ末端の改変としては、メチル化（例えば、−ＮＨＣＨ３、または−Ｎ（ＣＨ３）２）、アセチル化（例えば、酢酸またはそのハロゲン化誘導体による）などであってもよく、あるいはベンジルオキシカルボニル基、カルボキシレート官能基（ＲＣＯＯ−）もしくはスルホニル官能基（Ｒ−ＳＯ２−）（ここでＲは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、およびアルキルアリールなどから選択される。）などの任意の保護基が導入されていてもよい。カルボキシ末端の改変としては、アミド化（−ＣＯＮＨ２）やエステル化（−ＣＯＯＲ）などが挙げられる。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基；α−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
【００２４】
本発明のペプチドは、Ｎ末端またはＣ末端以外においても種々の修飾を受けていてもよい。化学修飾は、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化などであってもよい。本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。あるいは、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されていてもよい。
【００２５】
上記（ｖｉ）のアミノ酸配列を含む本発明のペプチドは、上記（ｉ）−（ｖ）のアミノ酸配列中の、連続する４個のアミノ酸からなる部分配列、連続する５個のアミノ酸からなる部分配列、または連続する６個のアミノ酸からなる部分配列を含んでもよい。具体的には、例えば元となるアミノ酸配列が上記（ｉ）のアミノ酸配列の場合、該ペプチドは、Ｔ［Ｄ］Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］のアミノ酸配列、Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］のアミノ酸配列、Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］のアミノ酸配列、Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｍ［Ｄ］のアミノ酸配列、Ｔ［Ｄ］Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］のアミノ酸配列、Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］のアミノ酸配列、Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｍ［Ｄ］のアミノ酸配列、Ｔ［Ｄ］Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］のアミノ酸配列、またはＩ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｍ［Ｄ］のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２６】
上記（ｖｉ）のアミノ酸配列における変異（即ち、挿入、置換、欠失、およびこれらの組み合わせ）の位置は特に限定されない。当該変異は、（ａ）挿入のみ、（ｂ）置換のみ、（ｃ）欠失のみ、（ｄ）挿入および置換のみ、（ｅ）挿入および欠失のみ、（ｆ）置換および欠失のみ、または（ｇ）挿入、置換および欠失の組み合わせから構成されるものであってもよい。上記（ａ）−（ｇ）の変異の個数は、例えば１−５個、好ましくは１−４個、より好ましくは１−３個、更により好ましくは１または２個、いっそう好ましくは１個である。
【００２７】
上記（ｖｉ）のアミノ酸配列において挿入されるアミノ酸は、上述したような任意のアミノ酸であってよい。該アミノ酸は、Ｌ型またはＤ型のアミノ酸であってよく、例えば、上述したような天然に存在するＬ型アミノ酸、またはその光学異性体であるＤ型アミノ酸であってもよい。また、該アミノ酸は、上述したような様々な化学修飾を受けていてもよい。
【００２８】
上記（ｖｉ）のアミノ酸配列中の置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」は当該技術分野においてよく知られている。例えば、保存的アミノ酸置換は、側鎖の性質が類似するアミノ酸の間の置換として定義することができる。従って、保存的アミノ酸置換は、例えば、（１）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）の間の置換、（２）非極性脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ）の間の置換、（３）非電荷極性アミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ）の間の置換、（４）塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）の間の置換、または（５）酸性アミノ酸（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間の置換であり得る。本明細書において、保存的アミノ酸置換は、Ｄ型アミノ酸をその光学異性体であるＬ型アミノ酸に置換することも包含し得る。従って、保存的アミノ酸置換は、上記（１）−（５）のグループ内での、２つのＬ型アミノ酸の間の置換、２つのＤ型アミノ酸の間の置換、またはＬ型アミノ酸とＤ型アミノ酸との間の置換であってもよい。
【００２９】
一実施形態において、上記（ｖｉ）の配列は上記（Ｉ）または（ＩＩ）の配列に包含されるものであってもよい。その場合、上記（ｖｉｉ）の配列は上記（ＩＩＩ）の配列に包含されるものとなる。当該実施形態において、上記（ｉ）の配列において４番目のアミノ酸はＷ［Ｄ］またはＦ［Ｄ］でありかつ５番目のアミノ酸はＰ［Ｄ］でありかつ６番目のアミノ酸はＴ［Ｄ］またはＳ［Ｄ］であってもよく、上記（ｉｉ）の配列において３番目のアミノ酸はＷ［Ｄ］またはＦ［Ｄ］でありかつ４番目のアミノ酸はＰ［Ｄ］でありかつ５番目のアミノ酸はＴ［Ｄ］またはＳ［Ｄ］であってもよく、上記（ｉｉｉ）の配列において４番目のアミノ酸はＷ［Ｄ］またはＦ［Ｄ］でありかつ５番目のアミノ酸はＰ［Ｄ］でありかつ６番目のアミノ酸はＴ［Ｄ］またはＳ［Ｄ］であってもよく、上記（ｉｖ）の配列において２番目のアミノ酸はＰ［Ｄ］でありかつ３番目のアミノ酸はＴ［Ｄ］でありかつ６番目のアミノ酸はＦ［Ｄ］であってもよく、上記（ｖ）の配列において２番目のアミノ酸はＰ［Ｄ］でありかつ３番目のアミノ酸はＴ［Ｄ］でありかつ５番目のアミノ酸はＦ［Ｄ］であってもよい。
【００３０】
ペプチドのＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ異性体は、元となるペプチドに対して、各アミノ酸残基のキラリティが反対であり（″ｉｎｖｅｒｓｏ″）、かつアミノ酸配列の方向が反転している（″Ｒｅｔｒｏ″）ものをいう。Ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ異性体は、元となるペプチドと類似の構造および機能を示すことが知られている（例えば、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９９３，２６（５），ｐｐ２６６−２７３、及びＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３  Ｄｅｃ  ２；８（１２）：ｅ８０３９０）。具体的には、上記（ｖｉｉ）のアミノ酸配列としては、例えば、上記（ｉ）の配列のＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるＭＴＰＷＴＩＴ（配列番号１）、上記（ｉｉ）の配列のＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるＬＶＴＰＦＲＬ（配列番号２）、上記（ｉｉｉ）の配列のＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるＡＳＰＷＳＬＬ（配列番号３）、上記（ｉｖ）の配列のＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるＦＬＬＳＴＰＳ（配列番号４）、上記（ｖ）の配列のＲｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏであるＲＦＴＬＴＰＭ（配列番号５）が挙げられる。
【００３１】
本発明のペプチドは、上記（Ｉ）−（ＩＩＩ）および（ｉ）−（ｖｉｉ）から選択される配列を２つ以上含んでいてもよい。一実施形態において、本発明のペプチドは、上記（Ｉ）−（ＩＩＩ）および（ｉ）−（ｖｉｉ）のいずれかの配列のタンデムリピート（即ち、同一の配列部分が互いに直接的に連結された構造）を含む。別の実施形態において、本発明のペプチドは、上記（Ｉ）−（ＩＩＩ）および（ｉ）−（ｖｉｉ）の異なる２以上の配列が直接的に連結された構造を含む。具体的なリピート構造として、例えば、Ｔ［Ｄ］Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｗ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｍ［Ｄ］−Ｔ［Ｄ］Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｅ［Ｄ］Ｐ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］Ｍ［Ｄ］、およびＴ［Ｄ］Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］−Ｔ［Ｄ］Ｉ［Ｄ］Ｔ［Ｄ］が挙げられる。あるいは、本発明のペプチドは、デンドリマーにより多価ペプチドを構成していてもよい。
【００３２】
本発明のペプチドは遊離体であってもよいし、塩の形態であってもよい。本発明のペプチドの塩としては、医薬的に許容される酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硫酸、硝酸およびリン酸などの無機酸との塩、酢酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸およびクエン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウムおよびカリウムなどのアルカリ金属との塩、カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩、アンモニウムおよびトリエチルアミンなどのアミン類との塩が挙げられる。
【００３３】
本発明のペプチドはアネキシンＡ１に結合し得る。アネキシンＡ１（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ１；Ａｎｘａ１）はリポコルチン１（ｌｉｐｏｃｏｒｔｉｎ  １）としても知られる、アネキシンファミリーに属する公知のタンパク質である。種々の生物種についてＡｎｘａ１の遺伝子配列およびアミノ酸配列が知られている。例えば、ヒトＡｎｘａ１についてｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００７００．２（配列番号６）、タンパク質のＲｅｆＳｅｑ  Ｎｏ．ＮＰ＿０００６９１．１（配列番号７）；マウスＡｎｘａ１についてｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ  Ｎｏ．ＮＭ＿０１０７３０．２（配列番号８）、タンパク質のＲｅｆＳｅｑ  Ｎｏ．ＮＰ＿０３４８６０．２（配列番号９）が挙げられる。本発明のペプチドはＡｎｘａ１のＮ末端領域に結合するものであり得る。より詳細には、本発明のペプチドは、ヒトＡｎｘａ１中の、配列番号７における１〜１５番目のアミノ酸からなる領域、または、マウスＡｎｘａ１中の、配列番号９における１〜１５番目のアミノ酸からなる領域に結合し得る。本発明のペプチドは、例えばマウスまたはヒトのＡｎｘａ１との分子間相互作用をＱＣＭ（Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）法を用いて測定したときに、好ましくは１０−６Ｍ未満、より好ましくは１０−７Ｍ未満、更により好ましくは５ｘ１０−８Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ値）を有し得る。上記測定のために、ＡＴＧｅｎ社（Ｓｅｏｎｇｎａｍ−ｓｉ，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）から市販されている３４６アミノ酸残基から構成されるヒト組換えＡｎｘａ１タンパク質を用いることができる。
【００３４】
本発明のペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチドを製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）−（８）に記載された方法に従って行うことができる。
（１）Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ＆  Ｍ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（２）Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ＆  Ｌｕｅｂｋｅ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（３）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（４）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＶ  ２０５（１９７７年）
（５）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、廣川書店
（６）Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．＆  Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．，“Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  ｅｄ．）”，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ（１９８４年）
（７）Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．＆  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８９年）
（８）“Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）”，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）
【００３５】
このようにして得られたペプチドは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００３６】
上述したように、アネキシンＡ１は現在知られている腫瘍血管特異的マーカー分子の中で最も特異性が高いことが知られており、正常細胞では細胞内に発現するが、腫瘍新生血管内皮細胞では血流に接する管腔表面に強発現する（Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２９：６２９−３５，２００４）。従って、本発明のペプチドは、インビボにおいて、血管新生する腫瘍に選択的に結合し得る。更に、Ａｎｘａ１は、腫瘍内にできた新生血管内皮細胞の血液側に発現し、本発明のペプチドのようなリガンドと血液側で結合すると、リガンドをトランスサイトーシスによって基底側に運び、癌細胞が存在する間質へ積極的に放出する。従って、本発明のペプチドは、インビボにおいて悪性腫瘍を標的化し得る。このように、本発明のペプチドは、例えば、悪性腫瘍の標的化の用途のために有用である。
【００３７】
２．コンジュゲート
本発明はまた、上記の本発明のペプチドに１つ以上の成分が結合したコンジュゲート（以下、本発明のコンジュゲートともいう。）を提供する。
【００３８】
該成分は、本発明のペプチドに連結させることができる限り特に限定されず、動物（例えばヒト）への投与に適したものであり得、また該動物の体内において何らかの機能を果たし得る。成分は天然物または非天然物であり得る。例えば、成分としては、生物学的材料（例えば、細胞、ファージ、ウイルスなど）、オリゴヌクレオチドおよび核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡキメラなど）、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質、抗体、脂質、多糖、低分子化合物（例えば、１０００Ｄａ以下の、有機または無機化合物）、粒子（例えば、金粒子、各種ナノ粒子など）、およびこれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
該成分は、動物（例えばヒト）体内の標的部位において所与の機能性を果たし得る。該機能性の種類は特に限定されない。本発明のペプチドに対応する部分の働きにより本発明のコンジュゲートは悪性腫瘍に標的化され得るので、該機能性の好ましい例として、抗がん活性、および検出可能性の付与が挙げられる。従って、該成分は、例えば、抗がん剤、または検出可能な物質であってもよい。
【００４０】
（抗がん剤）
本明細書において、抗がん剤とは、悪性腫瘍（がん）の増殖を抑えることを目的とした薬剤をいう。抗がん剤の作用機序は特に限定されない。抗がん剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗がん性抗生物質、微小管阻害剤、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害剤、分子標的薬などであってよい。本発明のコンジュゲートは、２つ以上の同一または異なる抗がん剤を含んでいてもよい。
【００４１】
代謝拮抗剤は、例えば、葉酸代謝拮抗薬、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ阻害薬、ジヒドロ葉酸レダクターゼ阻害薬（ＤＨＦＲ阻害薬）、ピリミジン代謝阻害薬、チミジル酸シンターゼ阻害薬、プリン代謝阻害薬、ＩＭＰＤＨ阻害薬、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬、ヌクレオチドアナログ、Ｌ−アスパラギナーゼなどであってもよい。代謝拮抗剤の具体例としては、エノシタビン（サンラビン）、カペシタビン（ゼローダ）、カルモフール（ミフロール）、クラドリビン（ロイスタチン）、ゲムシタビン（ジェムザール）、シタラビン（キロサイド）、シタラビンオクホスファート（スタラシド）、テガフール（アチロン、アフトフール、テフシール、フトラフール、ルナシンほか）、テガフール・ウラシル（ユーエフティ）、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム（ＴＳ−１：ティーエスワン）、ドキシフルリジン（フルツロン）、ネララビン（アラノンジー）、ヒドロキシカルバミド（ハイドレア）、フルオロウラシル（５−ＦＵ、カルゾナール、ベンナン、ルナコール、ルナボン）、フルダラビン（フルダラ）、ペメトレキセド（アリムタ）、ペントスタチン（コホリン）、メルカプトプリン（ロイケリン）、メトトレキサート（メソトレキセート）などが挙げられる。
【００４２】
アルキル化剤の具体例としては、シクロホスファミド（エンドキサン）、イホスファミド（イホマイド）、メルファラン（アルケラン）、ブスルファン、チオテパ（テスパミン）などのナイトロジェンマスタード系アルキル化剤、ニムスチン（ニドラン）、ラニムスチン（サイメリン）、ダカルバシン（ダカルバシン）、プロカルバシン（塩酸プロカルバシン）、テモゾロマイド（テモダール）、カルムスチン（ギリアデル）、ストレプトゾトシン（ザノサー）、ベンダムスチン（トレアキシン）などのニトロソウレア系アルキル化剤などが挙げられる。
【００４３】
抗がん性抗生物質の具体例としては、アクチノマイシンＤ（コスメゲン）、アクラルビシン（アクラシノン）、アムルビシン（カルセド）、イダルビシン（イダマイシン）、エピルビシン（エピルビシン塩酸塩、ファモルビシン）、ジノスタチンスチマラマー（スマンクス）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ドキソルビシン（アドリアシン）、ピラルビシン（ピノルビン、テラルビシン）、ブレオマイシン（ブレオ）、ペプロマイシン（ペプレオ）、マイトマイシンＣ（マイトマイシン）、ミトキサントロン（ノバントロン）、リポソーマルドキソルビシン（ドキシル）などが挙げられる。
【００４４】
微小管阻害剤は、例えば、ビンブラスチン（エクザール）やビンクリスチン（オンコビン）、ビンデシン（フォルデシン）などのビンカアルカロイド系微小管重合阻害薬、パクリタキセル（タキソール）やドセタキセル（タキソテール）などのタキサン系微小管脱重合阻害薬などが挙げられる。
【００４５】
白金製剤としては、例えば、オキサリプラチン（エルプラット）、カルボプラチン（カルボプラチン、カルボメルク、パラプラチン）、シスプラチン（アイエーコール、コナブリ、シスプラチンなど）、ネダプラチン（アクプラ）などが挙げられる。
【００４６】
トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、カンプトテシンおよびその誘導体（例えば、イリノテカン（カンプト）、ノギテカン（ハイカムチン）、ＳＮ−３８など）などのＩ型トポイソメラーゼ阻害剤；ドキソルビシン（アドリアシン）などのアントラサイクリン系薬物、エトポシド（ラステッド、ベプシド）などのエピポドフィロトキシン系薬物、レボフロキサシン（クラビット）やシプロフロキサシン（シプロキサン）などのキノロン系薬物などのＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤が挙げられる。
【００４７】
分子標的薬としては、例えば、レゴラフェニブ（スチバーガ）、セツキシマブ（アービタックス）、パニツムマブ（ベクティビックス）、ラムシルマブ（サイラムザ）、ゲフィチニブ（イレッサ）、エルロチニブ（タルセバ）、アファチニブ（ジオトリフ）、クリゾチニブ（ザーコリ）、アレクチニブ（アレセンサ）、セリチニブ、レンバチニブ（レンビマ）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、ラパチニブ（タイケルブ）、ペルツズマブ（パージェタ）、スニチニブ（スーテント）、ソラフェニブ（ネクサバール）、アキシチニブ（インライタ）、パゾパニブ（ヴォトリエント）、ニボルマブ（オプジーボ）、ペムブロリズマブ、イピリムマブ（ヤーボイ）、ベムラフェニブ（ゼルボラフ）、エベロリムス（アフィニトール）、テムシロリムス（トーリセル）、リツキシマブ（リツキサン）、ベバシズマブ（アバスチン）、ゲルダナマイシンなどが挙げられる。
【００４８】
抗がん剤はまた、抗血管新生剤であってもよい。抗血管新生剤は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）もしくは他の血管新生因子、またはこれらの受容体を阻害するものであり得る。抗血管新生剤の具体例としては、アンギオスタチン、エンドスタチン、メタスタチン、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、アバスチン）、ＶＥＧＦＲ−２インヒビター（例えば、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８）などが挙げられる。
【００４９】
（検出可能な物質）
本明細書において、検出可能な物質とは、それを含む本発明のコンジュゲートを検出可能にする任意の物質をいう。好ましくは、検出可能な物質は、直接的にまたは適切な可視化もしくは画像化手段を用いて間接的に、インビボにおける本発明のコンジュゲートの検出を可能にする。可視化または画像化手段としては、例えば、Ｘ線撮影、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、超音波検査、シンチグラフィ、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）、内視鏡、腹腔鏡などが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な物質は、例えば、放射性同位体、ＭＲＩ用増強剤（例えば、常磁性イオン）、放射線不透過性物質、造影剤、蛍光性物質などであってもよい。
【００５０】
ＰＥＴに有用な放射性核種としては、例えば、１８Ｆ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５２Ｆｅ、５５Ｃｏ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、１１０Ｉｎ、１２０Ｉ、１２４Ｉなどが挙げられる。γ線の検出のために有用な放射性核種としては、例えば、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂ、１９７Ｈｇ、２０１Ｔｌなどが挙げられる。
【００５１】
好適な常磁性イオンとしては、例えば、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、エルビウム（ＩＩＩ）などが挙げられ、ガドリニウムが特に好ましい。また、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、ビスマス（ＩＩＩ）などの金属もＸ線画像化などの用途において有用である。
【００５２】
放射線不透過性物質および造影剤としては、例えば、ヨウ素化合物（例えば、ヨードカルボン酸などの有機ヨウ素酸、ヨードホルム、トリヨードフェノール、テトラヨードエチレンなど）、バリウム化合物（例えば、硫酸バリウムなど）、ガリウム化合物（例えば、クエン酸ガリウムなど）、タリウム化合物（例えば、塩化タリウムなど）などが挙げられる。
【００５３】
蛍光性物質としては、例えば、ローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ  ｄｙｅ、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、およびこれらの誘導体などが挙げられる。また、インドシアニンなどの近赤外線蛍光試薬も好ましい蛍光性物質として例示される。
【００５４】
（本発明のペプチドと成分との結合）
本発明のコンジュゲートにおける本発明のペプチドと１つ以上の成分との間の結合の様式は特に限定されない。結合は、直接的なものであってもよいし、またはリンカーなどを介した間接的なものであってもよい。結合は、共有結合、非共有結合、またはこれらの組み合わせによるものであってもよい。１つ以上の成分は、直接的または間接的に、本発明のペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはそれ以外の位置において結合していてもよい。ペプチドと他の成分（または第２のペプチド）との連結は当該技術分野において周知であり、本発明のコンジュゲートにおいても、該結合は任意の公知の手段によるものであってよい。
【００５５】
例えば、結合がリンカーを介する場合、ＮＨＳエステル、イミドエステル、マレイミド、カルボジイミド、アリルアジド、ジアジリン、イソシアン、ソラレンなどの公知のクロスリンカー（架橋剤）を用いることができる。用いるクロスリンカーに応じて、本発明のペプチドを適宜改変してもよい。例えば、マレイミドリンカーとの結合のために、本発明のペプチドのＣ末端に予めシステインを付加することができる。
【００５６】
また、上述したような放射性金属または常磁性イオンと本発明のペプチドとの連結のために、適切なキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ−Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）など）および／またはメタロチオネインなどを用いることができる。例えば、Ｃｕｌａｌｉ  Ａｋｔｏｌｕｎ  ｅｔ  ａｌ．編，″Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ″，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２０１３などを参照。
【００５７】
３．組成物
本発明はまた、本発明のペプチドまたはコンジュゲート、および薬学的に許容される担体を含む組成物（以下、本発明の組成物ともいう。）を提供する。該組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供され得る。
【００５８】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含し得る。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、本発明のペプチドまたはコンジュゲートを通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉｌ）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、本発明のペプチドまたはコンジュゲートを通常の坐薬用基剤に混合することによって調製され得る。
【００５９】
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
【００６０】
なお前記した各組成物は、上記ペプチドまたはコンジュゲートとの配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【００６１】
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。ペプチドまたはコンジュゲートの含有量としては、投薬単位剤形当たり通常１〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では１〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記ペプチドまたはコンジュゲートが含有されていることが好ましい。
【００６２】
本発明の組成物は、腫瘍、特には血管新生する悪性腫瘍を標的化し得、好ましくは該腫瘍に該ペプチドまたはコンジュゲートを集積させ得る。従って、該コンジュゲート中に抗がん剤を含む本発明の組成物は、標的化した悪性腫瘍の治療または予防のために有用である。また、該コンジュゲート中に検出可能な物質を含む本発明の組成物は、悪性腫瘍の検査または診断のために有用である。
【００６３】
悪性腫瘍（がん）は任意の種類のがんであってよく、固形がんまたは液性がんであってもよい。固形がんとしては、好ましくはＡｎｘａ１を細胞表面に発現する固形がん、従って血管新生する固形がんが挙げられる。固形がんとしては、例えば、脳・神経系のがん（例えば、脳腫瘍、脊髄腫瘍など）、頭頸部がん（例えば、喉頭がん、口腔がん、唾液腺がん、副鼻腔がん、甲状腺がんなど）、消化器がん（例えば、胃がん、食道がん、小腸がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、肝臓がん、胆道がん、膵臓がんなど）、泌尿器または生殖器のがん（例えば、腎がん、腎細胞がん、膀胱がん、前立腺がん、腎盂および尿管がん、胆嚢がん、胆管がん、精巣がん、陰茎がん、子宮がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、子宮頚がん、膣がん、外陰がん、卵巣がん、卵管がんなど）、呼吸器系のがん（例えば、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、転移性肺がんを含む）、気管支がんなど）、乳がん、皮膚がん（例えば、悪性黒色腫など）、骨のがん（例えば、骨肉腫など）、筋肉のがん（例えば、横紋筋肉腫など）などが挙げられる。
【００６４】
液性がんとしては、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異型性症候群などが挙げられる。白血病としては、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病などが挙げられる。悪性リンパ腫は、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫に分類され、非ホジキンリンパ腫としては、Ｂ細胞性リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫などが挙げられる。
【００６５】
本発明のペプチドまたはコンジュゲートは、効率よく血液−脳腫瘍関門を越えることができるので、特に好ましい標的として脳腫瘍を挙げることができる。脳腫瘍は、原発性脳腫瘍または転移性脳腫瘍であってよい。また、脳腫瘍は良性（例えば、髄膜腫、下垂体腺腫、神経鞘腫など）または悪性の脳腫瘍であってよく、好ましくは悪性の脳腫瘍である。悪性の脳腫瘍としては、星細胞腫（アストロサイトーマ）、乏突起神経膠腫（オリゴデンドログリオーマ）などのグレード２の脳腫瘍、退形成性星細胞腫、退形成性乏突起膠腫、退形成性乏突起星細胞腫などのグレード３の脳腫瘍、膠芽腫（グリオブラストーマ）などのグレード４の脳腫瘍が挙げられる。
【００６６】
本発明の組成物は、アネキシンＡ１を発現する動物、特には哺乳動物に投与され得る。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類やウサギなどの実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンクなどの家畜、イヌ、ネコなどのペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類などを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６７】
本発明の組成物の投与量は、投与目的、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なる。例えば、上述したようながんの治療・予防のために使用する場合には、抗がん剤を含む本発明のコンジュゲートを１回量として、通常０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度を、週１回、静脈注射または経口投与するのが好都合である。あるいは、上述したようながんの検査または診断のために使用する場合には、検出可能な物質を含む本発明のコンジュゲートを通常０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、検査に先立って静脈注射または経口投与するのが好都合である。
【実施例】
【００６８】
以下に実施例などを挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例などにより限定されるものではない。【００６９】
（実験動物の作製）
ラットグリオーマＣ６細胞を１０％ウシ胎仔血清、高グルコースおよび抗生物質を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ  Ｍｅｄｉｕｍ中で培養した。レンチウイルスベクターＰＧＫ−ＬｕｃをＳａｎｆｏｒｄ−Ｂｕｒｎｈａｍ−Ｐｒｅｂｙｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＶｉｒｕｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて作製した。Ｃ６細胞およびＢ１６細胞をＰＧＫ−Ｌｕｃレンチウイルスに感染させ、ルシフェラーゼ陽性細胞を作製した。定位フレームを用いてＣ６−Ｌｕｃ細胞（４μｌ  ＰＢＳに懸濁した４．８ｘ１０４細胞）をＣ５７ＢＬ／６マウスの脳線条体に注射した。２日後、ルシフェラーゼを発現する腫瘍についてマウスを画像化した。そのために、１００μｌのルシフェリン（３０ｍｇ／ｍｌ  ＰＢＳ）を腹膜腔に注射した後、マウスを酸素（１ｍｌ／分）と共にイソフルラン気体（２０ｍｌ／分）を用いて麻酔し、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００ｉｍａｇｅｒを備えたカメラの下に置いた。光子数を１−１０秒間測定した。ｄｕａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌについて、同様にＣ６−Ｌｕｃ細胞をＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの脳に注射し、腫瘍増殖をＸｅｎｏｇｅｎ  ｉｍａｇｅｒによりモニタリングした。
脳腫瘍が検出可能になった時に、Ｃ６−Ｌｕｃ細胞（１００μｌＰＢＳに懸濁した２ｘ１０５細胞）を同マウスの背側脇腹に皮下注射した。脳腫瘍および皮下腫瘍における光子数をＸｅｎｏｇｅｎ  ｉｍａｇｅｒを用いて測定した。同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＢ１６−Ｌｕｃ細胞を用いたｄｕａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌも作製した。Ｃ６−Ｌｕｃ細胞について上述したように８−１０週齢のＣ５７ＢＬ／６雌性マウスの脳にＢ１６−Ｌｕｃ細胞（５ｘ１０４細胞）を注射した。脳のＢ１６−Ｌｕｃ腫瘍が検出可能になった時に、Ｂ１６−Ｌｕｃ細胞（２ｘ１０５細胞）を皮下に注射した。【００７０】
検討例１：担癌マウスへのＩＦ７の投与実験
担癌マウスにＩＦ７（即ち、ＩＦＬＬＷＱＲ（配列番号１０）のアミノ酸配列を有するＬ型ペプチド）を静脈投与すると、ＩＦ７は腫瘍周囲の血管に到達した後、血管内皮細胞の管腔側から小胞に取り込まれて基底側へ移動し、癌細胞が存在する間質へ遊離された。
マウス血管内皮Ｆ２細胞においても、Ａｎｘａ１に結合したＩＦ７はトランスサイトーシスで能動的に腫瘍血管内皮細胞を縦断した。従って、ＩＦ７は脳腫瘍内の血管−脳腫瘍関門を通過する活性を有することが示唆された。
驚くべきことに、グリオーマ細胞を移植した脳腫瘍モデルマウスに、蛍光ラベルしたＩＦ７を静脈注射したところ、蛍光が脳腫瘍部位に高濃度で集積する様子が観察された（図１および２）。また、蛍光は血管を乗り越えて脳の間質にあるがん細胞へ到達した。【００７１】
検討例２：ｄｕａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌへのＩＦ７−ＳＮ３８の投与実験
同一マウス内に皮下腫瘍と脳腫瘍を有するマウス（ｄｕａｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌ）を用いて、ＩＦ７−ＳＮ３８の治療効果を検証した。実験は以下の通りに行った。
脳腫瘍の光子数が〉１．０ｘ１０６となったら（これは通常、２週間後に起こった）、ＩＦ７Ｃ（ＲＲ）−ＳＮ３８を担癌マウスに尾静脈注射した。ＩＦ７Ｃ（ＲＲ）−ＳＮ３８（１４．２ｍｇまたは６．６３ｍモル）を１００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後、１μＬの溶液（１４２ｍｇまたは６６．３ｎｍｏｌｅｓ）を５０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ  ＥＬのエタノール溶液（１０μｌ）で希釈し、更に９０μｌのＰＢＳを加えた。注射あたりのＩＦ７Ｃ（ＲＲ）−ＳＮ３８量は１４２ｍｇ／マウスまたは７．１ｍｇ／ｋｇであった。ＩＦ７の逆配列または同様に作製したＲＱ７Ｃ（ＲＲ）−ＳＮ３８をコントロールとした。ＰＢＳ中に溶解したイリノテカン、およびＰＢＳ単独をネガティブコントロールとした。
その結果、脳腫瘍と皮下腫瘍の両方が抑制され、その効果は皮下腫瘍よりも脳腫瘍の方が高かった（図３および４）。Ｂ１６メラノーマの転移脳腫瘍モデルにおいても同様の結果が得られ、ホストマウスをＣ５７ＢＬ／６やＳＣＩＤの系統に変えても結果は変わらなかった。これらの事実は、Ａｎｘａ１を標的とするＤＤＳは効率よく血液−脳腫瘍関門を越えるだけでなく、腫瘍細胞の種類やマウスの系統に関係なく脳腫瘍で優れた治療効果をあげることを示している。【００７２】
検討例３：ＩＦ７の薬物動態の検討
検討例１および２において実証されたように、ＩＦ７は優れた悪性腫瘍標的活性をもつが、臨床開発を目指す上で、難溶解性であることと安定性が低いことの２点に問題がある。即ち、まずＩＦ７ペプチドはプロテアーゼ感受性であり分解されやすい。実際、Ａ４８８−ＩＦ７を健常マウスの静脈に投与した実験では、末梢血の蛍光シグナルが１時間程度でほとんど消失した（図５）。しかし、担癌マウスへの尾静脈投与では、Ａ４８８−ＩＦ７は末梢血から回収される蛍光が健常マウスよりも顕著に少なかった。この結果は、Ａ４８８−ＩＦ７が分解を受けつつも大部分が腫瘍に急速に集積することを示唆する。また、ＩＦ７は疎水性が高く抗癌剤と結合させた化合物を静脈投与する際に沈殿を避けるためにＤＭＳＯに溶解した後に界面活性剤を加えるなど剤形に困難が伴う。【００７３】
実施例１：ｄＴＩＴ７ペプチドの同定
本発明者らは、ＩＦ７に伴う上述したような弱点を克服できればより優れた治療薬が創り出されると考え、新規配列からなる次世代ペプチドの開発に着手した。
本研究の基礎となる技術は、７残基アミノ酸からなる約１０億種類（２０７種類）のランダムペプチドを表面提示したファージライブラリーをスクリーニングするという方法である。生物を構成するアミノ酸は一部の例外を除いてすべてがＬ型のアミノ酸である。従って、通常のファージライブラリースクリーニングでは、標的に結合するＤ型ペプチドの配列を得ることは不可能である。そこで、新たにＴ７ファージライブラリーを用いた鏡像スクリーニング（Ｆｕｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．２００９，７８３−６）を実施した（図６）。
下記の知見・仮定に基づきスクリーニングを実施し、Ａｎｘａ１と高い結合親和性を有するファージを取得した。ＩＦ７がＡｎｘａ１のＮ末端１５残基（ＭＡＭＶＳＥＦＬＫＱＡＷＦＩＥ；配列番号１１）と相互作用すること、また、ＩＦ７はＡｘｎａ１のＮ末端１５残基に修飾用Ｃｙｓ残基を付加した１６残基のＬ−体ペプチド（Ｌ−ＭＣ１６）と結合することが明らかになっている（Ｓａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，未発表）。まず、Ｌ−ＭＣ１６と鏡像関係にあるＤ−ＭＣ１６（１６塩基が全てＤ−型）を合成し、Ｔ７ファージライブラリーを用いたスクリーニングにより、Ｄ−ＭＣ１６と結合する７アミノ酸（Ｌ−型のＴＩＴ７ペプチド）を同定した。得られた配列を元にＤ−型のアミノ酸で構成されるＴＩＴ７ペプチド（ｄＴＩＴ７）を合成した。このｄＴＩＴ７ペプチドはＡｎｘａ１と結合することが予想される。
また、ファージが提示するペプチド配列を解析する時に、以前はペプチド配列に様々な変異を導入して配列の最適化をするのが一般的であったが、現在我々は、得られたファージ群を次世代ＤＮＡシーケンサーにかけることで、のべ１０，０００種類以上の候補ペプチドの配列の中から最適なペプチド配列を一度に評価、同定できる。
解析の結果、Ａｎｘａ１のＮ末部位に結合する配列として、ＴＩＴ（トレオニン−イソロイシン−トレオニン）で始まる７アミノ酸の出現頻度が多く、中でもＴＩＴ７配列「ＴＩＴＷＰＴＭ」（配列番号１２）が突出していることが明らかになった。ＴＩＴ７の部分配列の頻度も上位に現れた一方、ＴＩＴ７の配列置換体にあたるものは見出されなかった。また、ＴＩＴ７のペプチドはＩＦ７（ＩＦＬＬＷＱＲ；配列番号１０）の配列とは全く異なる新規の配列より構成されていた。
以上の結果は、７つのアミノ酸が全てＤ体アミノ酸で構成される直鎖型ペプチドｄＴＩＴ７の取得に成功したことを示すものであった。
さらに、ｄＴＩＴ７とＡｎｘａ１の分子間相互作用をＱＣＭ法にて測定したところ、解離定数（Ｋｄ値）は４．５７ｘ１０−８Ｍであった。
また、図６Ｄに示す通りＴＩＴ７配列（配列番号１２）以外に、ＬＲＦＰＴＶＬ（配列番号１３）、ＳＰＴＳＬＬＦ（配列番号１４）、ＭＰＴＬＴＦＲ（配列番号１５）、ＬＫＧＭＬＲＩ（配列番号１６）、およびＬＬＳＷＰＳＡ（配列番号１７）の配列のペプチドの出現頻度も高く、１０９種類という膨大な数のランダムペプチドのうち、これら６つのペプチドが全体の５０％程度を占めていた。【００７４】
実施例２：ｄＴＩＴ７ペプチドの脳腫瘍標的能
我々は、近赤外線蛍光試薬ＩＲＤｙｅ８００ＣＷで標識したｄＴＩＴ７（ＩＲＤｙｅ−ｄＴＩＴ７）を作製した。ラットグリオーマをヌードマウスの脳に移植した脳腫瘍ヌードマウスモデルを作製し、マウスの尾静脈からＩＲＤｙｅ−ｄＴＩＴ７を注入した。その結果、ＩＲＤｙｅ−ｄＴＩＴ７が脳腫瘍モデルマウスの腫瘍部位に集積することがｉｎ  ｖｉｖｏイメージングによって観察された（図７）。【００７５】
実施例３：ｄＴＩＴ７結合抗癌剤の脳腫瘍モデルに対する抗腫瘍効果
次に、我々はｄＴＩＴ７−抗癌剤のコンジュゲートが脳腫瘍モデルマウスに与える影響を調べた。
ｄＴＩＴ７ペプチドに抗癌剤ゲルダナマイシンを結合させたＧＡ−ｄＴＩＴ７（図８）は、プロテアーゼにもエステラーゼにも耐性で生体内でより安定であると考えられる。推奨投与量の１／１０量（モル数換算）のＧＡ−ｄＴＩＴ７を担癌マウス（メラノーマＢ１６細胞、皮下投与）に１−２日おきに静脈投与したところ、腫瘍の増殖は顕著に抑制され、病理組織学的観察ではＧＡ−ｄＴＩＴ７投与マウスの腫瘍部位に大量の壊死が観察された。このような効果は、連日投与が必要であったＩＦ７よりも（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０８：１９５８７−９２，２０１１）、ｄＴＩＴ７が優れている可能性を強く示唆する。
さらに驚くべきことに、Ｂ１６細胞を脳に移植した脳腫瘍モデルにＧＡ−ｄＴＩＴ７を経口投与すると腫瘍退縮が観察され、薬剤の投与を中止した後にも腫瘍が減少し続け、ついには完全治癒が４匹中２匹で観察された（図９）。同様の治療効果がＣ６細胞を使った脳腫瘍モデルでも観察された。このことは、ＧＡ−ｄＴＩＴ７が経口投与可能な抗癌剤として脳腫瘍を完全治癒に導く可能性を示すものである。【００７６】
実施例４：ｄＬＲＦ７、ｄＳＰＴ７、ｄＭＰＴ７およびｄＬＬＳ７ペプチドとＡｎｘａ１の分子間相互作用
実施例１に記載のＴＩＴ７配列（配列番号１２）以外の出現頻度が高かったＬＲＦＰＴＶＬ（配列番号１３）、ＳＰＴＳＬＬＦ（配列番号１４）、ＭＰＴＬＴＦＲ（配列番号１５）およびＬＬＳＷＰＳＡ（配列番号１７）の配列のペプチドについても、ｄＴＩＴ７ペプチドと同様に、Ｄ−型のアミノ酸で構成されるペプチド（ｄＬＲＦ７、ｄＳＰＴ７、ｄＭＰＴ７およびｄＬＬＳ７ペプチド）を合成し、下記方法により、Ａｎｘａ１との分子間相互作用を、それぞれ測定した。
センサーチップをピラニア溶液で５分間２回洗浄し、その後、０．９ｍＭヒドロキシ−ＥＧ３−ウンデカンチオール（Ｄｏｊｉｎｄｏ）および０．１ｍＭアミノ−ＥＧ６−ウンデカンチオール（Ｄｏｊｉｎｄｏ）の溶液に一晩浸した。水で洗浄した後、チップを１ｍＭＧＭＢＳ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）で処理し、室温で１時間インキュベートした。残りのＧＭＢＳを洗い流した後、１ｍＭのペプチド溶液をチップ上に加え、３０分間インキュベートした。ペプチド結合センサーチップをＱＣＭ装置（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｑ、ＡＳＯＮＥ）に設置し、０．５ｍｌのＰＢＳをウェルに添加した。種々の投与量のＡｎｘａ１を反応チャンバに注入し、各ペプチドに対する結合親和性（ｋｄ値）を決定した。
結果、試験した全てのペプチドがＡｎｘａ１への陽性結合を示した（表１および図１１）。【００７７】
【表１】
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【００７８】
実施例５：ｄＬＲＦ７、ｄＳＰＴ７、ｄＭＰＴ７およびｄＬＬＳ７ペプチドの脳腫瘍標的能
末端システインを付加して伸長させたｄＬＲＦ７、ｄＳＰＴ７、ｄＭＰＴ７およびｄＬＬＳ７ペプチドを化学合成した。次いで、各ペプチドと近赤外蛍光色素ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷマレイミド（Ｌｉ−Ｃｏｒ）とを、システイン残基を介して結合させた。生じたペプチドコンジュゲートをＨＰＬＣで精製し、次いで、凍結乾燥した。各ペプチド−ＩＲＤｙｅコンジュゲートをＤＭＳＯおよび６％グルコースに溶解し、そして脳腫瘍モデルヌードマウスに、１００μｌ／マウスで静脈注射した。２４時間後、ＩＶＩＳスペクトル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により蛍光画像を測定した。
結果、ｄＬＬＳ７を注射したマウス以外の全てのマウスで、脳腫瘍部位にＩＲＤｙｅの強いシグナルを示し、ｄＬＬＳ７以外のｄＬＲＦ７、ｄＭＰＴ７およびｄＳＰＴ７の３つのペプチドが、血管系経路を介した脳腫瘍標的能を有することを示した（図１２）。【００７９】
本発明は、日本国で出願された特願２０１６−１５９７４３（出願日：２０１６年８月１６日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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