(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に記載の塩基配列を含むプライマーと、配列番号：２に記載の塩基配列を含むプライマーとからなる１，４−ジオキサン分解菌の検出・定量用のプライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットを用いたＰＣＲ法を行い、遺伝子増幅が生じたか否かによりｔｈｍＣ遺伝子を有する微生物が存在しているか否かを判定する１，４−ジオキサン分解菌の検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法で得られたｔｈｍＣ遺伝子の増幅量から、ｔｈｍＣ遺伝子を有する微生物の定量を行うことを特徴とする１，４−ジオキサン分解菌の定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲという。）に用いるプライマーセットと、このプライマーセットを利用して１，４−ジオキサン分解菌を検出、定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，４−ジオキサンは、下記式（１）で表される環状エーテルである。１，４−ジオキサンは、水や有機溶媒との相溶性に優れており、主に有機合成の反応溶剤として使用されている。
【０００３】
【化１】
0006632228.tif 000002
【０００４】
２０１０年度の日本国における１，４−ジオキサンの製造・輸入量は、約４５００ｔ／年であり、約３００ｔ／年が環境中へ放出されたと推測される。１，４−ジオキサンは、水溶性であるため、水環境中へ放出されると広域に拡散してしまう。また、揮発性、固体への吸着性、光分解性、加水分解性、生分解性がいずれも低いため、水中からの除去が困難である。１，４−ジオキサンは急性毒性及び慢性毒性を有する上、発がん性も指摘されていることから、１，４−ジオキサンによる水環境の汚染は、人や動植物に悪影響を及ぼすことが懸念されている。そのため、日本国では、水道水質基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）、環境基準（０．０５ｍｇ／Ｌ以下）及び排水基準（０．５ｍｇ／Ｌ以下）により、１，４−ジオキサンの規制がなされている。
【０００５】
従来の活性汚泥法や活性炭吸着法等の処理方法では、水中から１，４−ジオキサンを十分に除去することができない。過酸化水素を添加してのオゾン処理（Ｏ３／Ｈ２Ｏ２）、紫外線照射下でのオゾン処理（Ｏ３／ＵＶ）、放射線や超音波照射下でのオゾン処理等、複数の物理化学的な酸化方法を併用する促進酸化法においてのみ、１，４−ジオキサン処理の有効性が確認されている。しかし、促進酸化法はイニシャルコストおよびランニングコストが高いことから普及に至っていない。また、非特許文献１では、１，４−ジオキサン以外の有機物が存在すると、促進酸化法による１，４−ジオキサンの処理効率が低下すると報告されている。
【０００６】
低コストかつ安定的に１，４−ジオキサンを含む水を処理する方法が求められており、特許文献１、非特許文献２では、１，４−ジオキサン分解菌による生物処理が提案されている。生物処理は、１，４−ジオキサン分解菌を、曝気槽、土壌、地下水等へ投入し、これらに含まれる１，４−ジオキサンを分解する方法である。しかし、１，４−ジオキサン分解菌の菌体量は日々変動する。１，４−ジオキサン分解菌が減少すると処理能力が低下するため、１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を把握し、菌体量が少なければ追加する必要がある。菌体量を把握する手法として、１，４−ジオキサン分解菌を含むサンプルを寒天平板培地で培養し、数日後に目視でコロニー数をカウントする方法が挙げられる。しかし、培養に時間がかかり、さらに形成されたコロニーが１，４−ジオキサン分解菌であるか、その他の菌であるか不明確であるという問題がある。
【０００７】
１，４−ジオキサン分解菌は、１，４−ジオキサンを単一炭素源として分解及び資化可能な菌と、テトラヒドロフランなどの他の成分の存在下で共代謝反応によって１，４−ジオキサンの分解を行う菌との２種に大別される。非特許文献３、４では、これらの１，４−ジオキサン分解菌が有するＴＨＦモノオキシゲナーゼが１，４−ジオキサンの分解に関与していることが報告されている。ＴＨＦモノオキシゲナーゼは、多様な炭化水素類の初発酸化を担っている可溶性鉄（II）モノオキシゲナーゼ（ＳＤＩＭＯ）の一種に分類されており、ＳＤＩＭＯには他にメタン／プロパンモノオキシゲナーゼ等が含まれている（非特許文献５）。また、非特許文献６では、ＴＨＦモノオキシゲナーゼ以外のＳＤＩＭＯを有する菌も１，４−ジオキサンを分解する可能性のあることが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−３０６９３９号公報
【０００９】
【非特許文献１】K. KOSAKA, H. YAMADA, S. MATSUI, and K. SHISHIDA: The effects of the co-existing compounds on the decomposition of micropollutants using the ozone/hydrogen peroxide process. Water Sci. Technol., 42, pp.353-361, 2000.
【非特許文献２】清和成、池道彦：１，４−ジオキサン分解菌を用いた汚染地下水の生物処理・浄化技術の可能性，用水と廃水，Vol.53, No.7, 2011.
【非特許文献３】H. MASUDA, K. McCLAY, R. J. STEFFAN, and G. J. ZYLSTRA: Biodegradation of tetrahydrofuran and 1,4-dioxane by soluble diiron monooxygenase in Pseudonocardia sp. strain ENV478. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 22(5), pp. 312-316, 2012.
【非特許文献４】A. GROSTERN, C. M. SALES, W.-Q. ZHUANG, O. ERBILGIN, and L. ALVAREZ-COHEN: Glyoxylate metabolism is a key feature of the metabolic degradation of 1,4-dioxane by Pseudonocardia dioxanivorans strain CB1190. Appl. Environ. Microbiol., 78(9), pp. 3298-3308, 2012.
【非特許文献５】N. V. COLEMAN, N. B. BUI, and A. J. HOLMES:  Soluble di-iron monooxygenase gene diversity in soils, sediments and ethane enrichments. Environ. Microbiol., 8(7), pp. 1228-1239, 2006.
【非特許文献６】S. MAHENDRA, and L. ALVAREZ-COHEN: Kinetics of 1,4-dioxane biodegradation by monooxygenase-expressing bacteria. Environ. Sci. Technol., 40(17), pp. 5435-5442, 2006.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
１，４−ジオキサン分解菌の検出・定量を、迅速、かつ高精度に行うことのできるプライマーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
１．配列番号：１に記載の塩基配列を含むプライマーと、配列番号：２に記載の塩基配列を含むプライマーとからなるプライマーセット。
２．１．に記載のプライマーセットを用いたＰＣＲ法を行い、遺伝子増幅が生じたか否かによりｔｈｍＣ遺伝子を有する微生物が存在しているか否かを判定する１，４−ジオキサン分解菌の検出方法。
３．１．に記載のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法で得られたｔｈｍＣ遺伝子の増幅量から、ｔｈｍＣ遺伝子を有する微生物の定量を行うことを特徴とする１，４−ジオキサン分解菌の定量方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のプライマーセットにより、１，４−ジオキサン分解菌が有する１，４−ジオキサン分解に関与する遺伝子である、ＴＨＦモノオキシゲナーゼを構成するタンパク質の一つであるＭｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＭｍｏＢ／ＤｍｐＭをコードすると推定されるｔｈｍＣ遺伝子を特異的に増幅することができる。
ｔｈｍＣ遺伝子が増幅されることで、１，４−ジオキサン分解菌が存在しているかを判定することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法でのＣｔ値から、サンプル中に存在する１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を、精度よく推定することができる。１，４−ジオキサン分解菌の菌体量を迅速に精度よく定量することができるため、菌体量が少なければ、すぐに１，４−ジオキサン分解菌を追加することができ、１，４−ジオキサンの処理能力を安定して維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｄ１７株の定量モニタリングシステムの検量線。
【図２】リアルタイムＰＣＲ法による定量値と濁度との相関関係（Ａ）と、リアルタイムＰＣＲ法による定量値と直接計数法による定量値との相関関係（Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１，４−ジオキサン分解菌（以下、分解菌という。）は自然界に存在しており、１，４−ジオキサンで汚染された汚泥等を、炭素源として１，４−ジオキサンのみを含む培地で培養することでスクリーニングすることができる。例えば、分解菌として、Pseudonocardia sp. D17、Pseudonocardia dioxanivorans CB1190、Afipia sp. D1、Mycobacterium sp. PH-06などが知られている。Pseudonocardia sp. D17（以下、Ｄ１７株という。）は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１９２７として、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８））に、２０１４年８月２９日付で国際寄託されている。Pseudonocardia dioxanivorans CB1190（以下、ＣＢ１１９０株という。）は、米国ＡＴＣＣから購入することができる（ＡＴＣＣ  ５５４８６）。また、米国ＡＴＣＣの他に、ＪＣＭ（独立行政法人  理化学研究所  バイオリソースセンター  微生物材料開発室）やドイツのＤＳＭにおいても購入可能である。
【００１５】
上記非特許文献３、４において、分解菌が有するＴＨＦモノオキシゲナーゼが１，４−ジオキサンの分解に関与していることが報告されている。本発明者らは、分解菌が有する１，４−ジオキサン分解に関与する遺伝子のなかで、ＴＨＦモノオキシゲナーゼを構成するタンパク質の一つであるＭｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＭｍｏＢ／ＤｍｐＭをコードすると推定されるｔｈｍＣ遺伝子により、分解菌を検出、定量することができることを見出した。
具体的には、フォワードプライマーとして配列番号１に示す塩基配列（５’−ＴＧＡＴＴＡＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧ−３’）を含むプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２に示す塩基配列（５’−ＣＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＣＧＴＧＡＴＧ−３’）を含むプライマーとからなるプライマーセットを用いたＰＣＲで、ｔｈｍＣ遺伝子を増幅することにより、１，４−ジオキサン分解菌を検出することができる。
ＰＣＲ法としては、ＭＰＮ−ＰＣＲ法、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法のいずれを用いてもよいが、迅速に高精度な結果が得られることから、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。リアルタイムＰＣＲ法は、増幅産物を蛍光によって検出する。検出方法としては、蛍光を発する色素をインターカレートするインターカレーター法や蛍光色素を結合させる蛍光プローブ法等を特に制限することなく利用することができる。
すなわち、ｔｈｍＣ遺伝子が増幅・検出されることにより、サンプル中にｔｈｍＣ遺伝子を有する微生物である１，４−ジオキサン分解菌が存在しているかを判定することができる。
【００１６】
ここで、リアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅量をリアルタイムでモニタリングして解析する手法である。リアルタイムＰＣＲ法により、サンプルに含まれる特定の塩基配列を有するＤＮＡの濃度の定量分析を行うことができる。
リアルタイムＰＣＲ法により、特定のＤＮＡが増幅され、蛍光検出可能な量に達すると、急激な蛍光強度の増加が観察される。このときのサイクル数をＴｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ（以下、Ｃｔ値という。）という。ＰＣＲ法では１サイクルごとにＤＮＡが２倍となり、ＤＮＡは指数関数的に増幅する。サンプル中に含まれる当初ＤＮＡ量が多いほど、少ないサイクル数で蛍光検出可能な量に達するため、Ｃｔ値は小さくなる。
Ｃｔ値と当初ＤＮＡ量の常用対数との間には直線関係があり、これを基に検量線を作成することができる。すなわち、異なるＤＮＡ濃度を有する複数個のサンプルのリアルタイムＰＣＲ法でＣｔ値を測定し、Ｃｔ値を縦軸に、ＰＣＲ開始前の当初ＤＮＡ量を横軸にプロットすることで、検量線を作成できる。この検量線は、試料のＤＮＡ濃度とＣｔ値との関係を表し、濃度未知のサンプルのＣｔ値をリアルタイムＰＣＲ法により測定することで、サンプルに含まれるＤＮＡ量を決定することができる。
すなわち、定量されたｔｈｍＣ遺伝子量と１，４−ジオキサン分解菌の菌体量との間には直線関係があるため、リアルタイムＰＣＲ法で定量されたｔｈｍＣ遺伝子量から、サンプル中の分解菌の菌体量を推定することができる。
【００１７】
分解菌は、食物連鎖でより上位に位置する生物に捕食されたり、増殖したりするため、菌体量は日々変動する。分解菌による１，４−ジオキサンの汚染処理において、その処理能力は菌体量に比例し、菌体量が減少すると処理能力が低下してしまう。リアルタイムＰＣＲ法でｔｈｍＣ遺伝子のＣｔ値を観測することで、分解菌の菌体量を迅速に、かつ高精度で定量することができるため、菌体量が１，４−ジオキサン処理に必要な量よりも少ないときには、１，４−ジオキサン分解菌を追加することで、処理能力を増大することができる。
次に、本発明を実施例に基づいて、さらに具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【実施例】
【００１８】
「実施例１」１，４−ジオキサン分解に関与する遺伝子群の特定
Ｄ１７株のドラフトゲノムデータからオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を予測し、ＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴＰ）によってアノテーションが付いたＯＲＦを抽出して、アジレント・テクノロジー社のｅＡｒｒａｙシステムを用いて、ＤＮＡプローブの設計を行い、７５１１配列のプローブを設計した。アジレント・テクノロジー社の８×１５Ｋフォーマットを用い、カスタムＤＮＡマイクロアレイスライドを作製した。
【００１９】
５００ｍｇ／Ｌの１，４−ジオキサンを添加した無機塩培地（１ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２００ｍｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３、５０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．０）にＤ１７株のコロニーを植種し、２８℃、１２０ｒｐｍで回転振盪培養を行った。培養期間中は、培養液中の１，４−ジオキサン濃度を経時的に測定した結果、１，４−ジオキサン濃度が６日後に約４０％低下し、７日後に約６０％低下した。そこで、７日後の培養液の一部を１，４−ジオキサンを添加した新たな無機塩培地（１，４−ジオキサン濃度：５００ｍｇ／Ｌ）に植え継ぎ、その培養液を用いてＤＮＡマイクロアレイ発現解析を実施した。
【００２０】
培養液中のＲＮＡは、ＲＮＡｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉキット（ＧＥヘルスケア社製）を用いて抽出し、エタノール沈澱により濃縮した後、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｂａｃｔｅｒｉａ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてｒＲＮＡを除去した。得られたｍＲＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｐｏｌｙ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ社製）を用いてＰｏｌｙ  Ａを付加し、Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（アジレント・テクノロジー社製）を用いてＣｙ３標識ｃＲＮＡを合成し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（キアゲン社製）を用いて精製した。精製後のＣｙ３標識ｃＲＮＡは、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎキット（アジレント・テクノロジー社製）を用いて前処理した後、前述のカスタムＤＮＡマイクロアレイスライドを用いたハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーションオーブン（６５℃、１０ｒｐｍ）内で１６時間ハイブリダイゼーションを行った後、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（アジレント・テクノロジー社製）を用いてカスタムＤＮＡマイクロアレイスライドを洗浄し、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いてスキャンして、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ７ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて各プローブの蛍光強度を数値化した。マイクロアレイ発現解析の結果、シグナルノイズ（Ｓ／Ｎ）比が１５０以上となったプローブ（遺伝子）を強発現遺伝子と定義し、データ解析に用いた。
【００２１】
マイクロアレイに搭載された７５１１プローブの内、２８５プローブのＳ／Ｎ比が１５０以上となり、強発現したものと判定された。この２８５プローブの中で１７５プローブがＢＬＡＳＴＰ検索により機能推定されたため、それらの元になった１７５遺伝子を対象として１，４−ジオキサン分解メカニズムの推定を試みた。既に報告されている１，４−ジオキサン分解菌であるＣＢ１１９０株の全ゲノム解析および１，４−ジオキサン分解関与遺伝子群推定の結果と比較したところ、１７５遺伝子の内の１５２遺伝子がＣＢ１１９０株にも共通して存在していた。表１に、Ｄ１７株による１，４−ジオキサン分解時に強発現したプローブのうち、上記非特許文献４でＣＢ１１９０株による１，４−ジオキサン分解において強発現する遺伝子に含まれるものを示す。上記非特許文献４では、ＣＢ１１９０株では、ｔｈｍ遺伝子群が１，４−ジオキサンから２−ヒドロキシ−１，４−ジオキサンおよび２−ヒドロキシエトキシアセトアルデヒドへの初発酸化反応を担っていることが報告されている。
【００２２】
【表１】
0006632228.tif 000003
【００２３】
Ｄ１７株のゲノム上にはｔｈｍＡ遺伝子（コードする酵素：ｓｏｌｕｂｌｅ  ｄｉ−ｉｒｏｎ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ）が２つ、ｔｈｍＤ遺伝子（コードする酵素：ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ−ＮＡＤ（＋）  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が７つ、ｔｈｍＢ遺伝子（コードする酵素：ｍｅｔｈａｎｅ／ｐｈｅｎｏｌ／ｔｏｌｕｅｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）が４つ、ｔｈｍＣ遺伝子（コードする酵素：ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＭｍｏＢ／ＤｍｐＭ）が４つ（プローブＩＤ：０８６４、３０１６、５４９０、６２６３）存在しており、ゲノム上での位置を見てみると、それらの中でクラスターを形成しているものが２組存在していた（ｔｈｍＡＤＢＣ；プローブＩＤ：０８６１〜０８６４および６２６０〜６２６３）。表１に示すように、これらの中で、プローブＩＤ：０８６１〜０８６４が全て強発現していることが観察されたため、それらに該当するｔｈｍクラスターが１，４−ジオキサン分解時に強発現していることが確認できた。すなわち、Ｄ１７株においても、既に報告されているＣＢ１１９０株と同様に、ｔｈｍクラスターが１，４−ジオキサンの初発酸化に関与していることが示唆された。
【００２４】
「実施例２」ｔｈｍ遺伝子群を標的としたリアルタイムＰＣＲ法による菌体量の定量
Ｄ１７株のドラフトゲノムデータからｔｈｍ遺伝子群の塩基配列を特定し、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（T. KORESSAAR, M. REMM: Bioinformatics, 23, 10, 1289-1291 (2007) “Enhancements and modifications of primer design program Primer3”、A. UNTERGASSER, I. CUTCUTACHE, T. KORESSAAR, J. YE, B.C. FAIRCLOTH, M. REMM, S.G. ROZEN: Nucleic Acids Res. 40, 15, e115 (2012) “Primer3 - new capabilities and interfaces”）を用いてリアルタイムＰＣＲプライマー候補を抽出した。次に、Ｐｒｉｍｅｒ−Ｂｌａｓｔプログラム（J. YE, G. COULOURIS, I. ZARETSKAYA, I. CUTCUTACHE, S. ROZEN, T.L. MADDEN: BMC Bioinformatics, 13, 134 (2012) “Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction”）を用いて、プライマー候補の配列とＧｅｎＢａｎｋ登録配列との相同性を検索し、特異性の高いプライマーを抽出した。抽出された特異性の高いプライマーを対象として、Ｄ１７株のゲノムＤＮＡを用いた検出感度の評価を行い、高感度検出が可能なプライマーについて、リアルタイムＰＣＲ反応条件の最適化を行った。
【００２５】
リアルタイムＰＣＲ法に使用するスタンダードは以下の手順で作製した。まず、シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬ＳＴ（関東化学株式会社製）を用い、Ｄ１７株のゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡから、開発したプライマーを用いて標的遺伝子の部分配列を増幅し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＰＣＲ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ（タカラバイオ社製）を用いて精製した。その後、ＤｙｎａＥｘｐｒｅｓｓ  ＴＡ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  （ｐＴＡＣ−１）  ｗｉｔｈ  Ｊｅｔ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ（バイオダイナミクス研究所社製）を用いたＴＡクローニングに供し、ＰＣＲ産物が挿入されたプラスミドを保有するクローンを選抜して培養し、ＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）を用いてプラスミドを抽出したものをスタンダードとした。調製したスタンダードは、リアルタイムＰＣＲに供し、増幅効率と検量線のｒ２値を求めた。
【００２６】
下記表２に示す１，４−ジオキサン分解に関与すると考えられる９種類の遺伝子を対象としたＰＣＲプライマーを設計し、各々の特異性と検出感度について検討した。その結果、ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＭｍｏＢ／ＤｍｐＭをコードすると推定されるｔｈｍＣ遺伝子（実施例１のプローブＩＤ：０８６４に該当）を検出対象とする、配列番号１に示す塩基配列（５’−ＴＧＡＴＴＡＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧ−３’）を含むプライマーと、配列番号２に示す塩基配列（５’−ＣＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＣＧＴＧＡＴＧ−３’）を含むプライマーとからなるプライマーセットが、Ｄ１７株を最も特異的かつ高感度に検出可能であった。
【００２７】
【表２】
0006632228.tif 000004
【００２８】
なお、上記したように、Ｄ１７株はゲノム上にｔｈｍＣを４つ（プローブＩＤ：０８６４、３０１６、５４９０、６２６３）有している。表３に、それぞれのｔｈｍＣとの配列の相同性（％）を示す。設計したプライマーは、プローブＩＤ：０８６４のｔｈｍＣを標的としたものであり、他のｔｈｍＣは、遺伝子配列が違うため、検出されない
【００２９】
【表３】
0006632228.tif 000005
【００３０】
なお、ＴＨＦ分解菌であるPseudonocardia sp. ENV478株、Rhodococcus sp. YYL株、Pseudonocardia sp. K1株、１，４−ジオキサン分解菌であるＣＢ１１９０株も相同性の高いｔｈｍ遺伝子を有していることから、設計したＰＣＲプライマーを用いてこれらも検出できる可能性がある。
【００３１】
また、設計したＰＣＲプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法の条件について実験的検討を行った結果、下記表４に示す条件において、最も特異的かつ高感度に定量可能であることが明らかになった。そこで、リアルタイムＰＣＲ法による定量解析に使用するスタンダード（Ｄ１７株ゲノムから得られたＰＣＲ増幅産物をプラスミドｐＴＡＣ−１に挿入したもの）を調製し、増幅効率等について検討した。その結果、増幅効率は９５．３％〜１０４．９％、検量線のダイナミックレンジは６オーダー、相関係数ｒ２は０．９９３７〜０．９９９１であり（図１に示す）、定量モニタリングツールとして十分な性能を有すると判断された。
【００３２】
【表４】
0006632228.tif 000006
【００３３】
「実施例３」
配列番号１に示す塩基配列（５’−ＴＧＡＴＴＡＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＴＴＡＴＧ−３’）を含むプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２に示す塩基配列（５’−ＣＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＴＣＧＴＧＡＴＧ−３’）を含むプライマーとからなるプライマーセットを用いたＤ１７株のリアルタイムＰＣＲ法による定量値と、濁度（ＯＤ６００測定値）およびアクリジンオレンジを用いた直接計数法（ＡＯＤＣ）による定量値との関係について調査した。
【００３４】
Ｄ１７株を、ＭＧＹ培地（Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：１０ｇ／Ｌ、グルコース：４ｇ／Ｌ、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：４ｇ／Ｌ）で２週間培養した。その後、遠心分離により菌体を回収し、生理食塩水にて２回洗浄し、異なる濁度（ＯＤ６００）の菌体溶液を作成し、ＡＯＤＣ及びリアルタイムＰＣＲ法に供した。なお、各菌体溶液のＯＤ６００の数値は、０．０００１５、０．００８９、０．１０５８、１．０１３０５及び１０．０１１４５であった。
【００３５】
＜ＡＯＤＣ＞
２．２９ｍＬ染色保存溶液（ＮａＣｌ：１．７５％、アクリジンオレンジ：０．００５％、グルタルアルデヒド：０．８７％）と０．０１ｍＬ菌体溶液を混合し、５分間反応させた。この反応後の混合溶液をＮｕｃｌｅｐｏｒｅメンブランフィルター（ポリカーボネイト製、ブラックタイプ、０．２μｍ）を用いて吸引濾過するとともに蒸留水にて洗浄したものを蛍光顕微鏡に観察し、菌体数を計測した。なお、濁度が高い菌体溶液に対しては、適宜、生理食塩水にて希釈したものを染色保存液と混合させた。
【００３６】
＜リアルタイムＰＣＲ法＞
菌体溶液２ｍＬを遠心分離（８５００×ｇ、４℃、５分）して上清を除去した後、シカジーニアスＤＮＡ抽出試薬ＳＴ（関東化学株式会社製）を１００μＬ添加して混和し、６５℃で２０分間および９４℃で３分間インキュベートした。これを遠心分離（２０４００×ｇ、４℃、５分）し、その上清をＤＮＡテンプレートとして用いた。リアルタイムＰＣＲは、反応系を２０μＬ（ＧｅｎｅＡｃｅ  ＳＹＢＲ  ｑＰＣＲ  Ｍｉｘ  α（ニッポン・ジーン）１０μＬ、フォワードプライマー０．５μＭ、リバースプライマー０．５μＭ、ＤＮＡテンプレート２μＬ）とし、表４の反応条件を用いて実行した。そして、リアルタイムＰＣＲ法の定量値を基に、菌体溶液中のＤ１７株の濃度を遺伝子コピー濃度として求めた。
【００３７】
図２（Ａ）に、リアルタイムＰＣＲ法による定量値と濁度の測定結果との相関関係、図２（Ｂ）にリアルタイムＰＣＲ法による定量値と直接計数法による定量値との相関関係を示す。リアルタイムＰＣＲ法による定量値は、濁度及び直接計数法による定量値のいずれに対しても高い相関を示し、リアルタイムＰＣＲ法が、定量モニタリング手法として有用であることが確かめられた。リアルタイムＰＣＲ法による定量値は、直接計数法の定量値よりも１オーダー低くなったが、これはＤＮＡ抽出効率等による影響であると考えられる。なお、使用したＤＮＡテンプレート調製法は事前検討において最もＤＮＡ抽出効率の高い方法であることから、リアルタイムＰＣＲ法の定量値のこれ以上の向上は容易でない。そのため、図２（Ｂ）に示すリアルタイムＰＣＲ法による定量値と直接計数法による定量値との相関関係から、菌体濃度に換算する方法が好ましい。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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