(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）支持体にカップリングされた耐酸化性タンパク質性リガンドを有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供するステップ、
ｂ）前記マトリックスと、式Ｉ、
Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｈ（Ｉ）
（式中、Ｒは水素またはアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ’は、水素またはメチル、エチルもしくはプロピル基である）
によって定義される少なくとも１種の酸化剤を含む衛生化溶液とを接触させるステップ、
を含む、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを清浄化または衛生化する方法であって、
前記衛生化溶液のｐＨが２〜４であり、かつ
前記タンパク質性リガンドが、細菌タンパク質に由来する１または複数の免疫グロブリン結合ドメインを含むか、または本質的にそれからなる方法。
【請求項２】
ｉ）前記衛生化溶液中の前記酸化剤の濃度が０．０１〜１ｍｏｌ／ｌである；
ｉｉ）前記衛生化溶液のｐＨが２〜３である；
ｉｉｉ）前記酸化剤が、過酸化水素、過ギ酸および過酢酸からなる群から選択される；
ｉｖ）前記衛生化溶液が、式Ｉにより定義される少なくとも２種の酸化剤の混合物、例えば過酸化水素と、過ギ酸もしくは過酢酸との混合物を含む；
ｖ）式Ｉにより定義される酸化剤の総濃度が０．０１〜１ｍｏｌ／ｌである；および／または
ｖｉ）ステップｂ）において、前記マトリックスを前記衛生化溶液と共に１分〜２４時間、例えば５分〜２４時間または１５分〜３時間インキュベートする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マトリックスが、ステップｂ）の後に、免疫グロブリンのような標的タンパク質に対するその結合容量の少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％を保持する；および／または
ステップｂ）において、生存細菌、栄養細菌および／または胞子の含量が少なくとも３ｌｏｇ１０、例えば少なくとも５ｌｏｇ１０または少なくとも６ｌｏｇ１０減少する、請求項１または２に記載の方法
【請求項４】
ｉ）前記細菌タンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡ、ペプトストレプトコッカスプロテインＬおよびストレプトコッカスプロテインＧからなる群、例えばストレプトコッカスプロテインＡおよびペプトストレプトコッカスプロテインＬからなる群から選択される；
ｉｉ）前記リガンドが、細菌タンパク質に由来する免疫グロブリン結合ドメインのホモ多量体またはヘテロ多量体を含むか、または本質的にそれらからなる；および／または
ｉｉｉ）ステップｂ）の後の前記マトリックスのＩｇＧ結合容量が、ステップｂ）の前の前記マトリックスのＩｇＧ結合容量の少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫グロブリン結合ドメインが、
ｉ）ブドウ球菌プロテインＡのドメインＥ、Ｄ、Ａ、ＢもしくはＣと、プロテインＺと、またはペプトストレプトコッカスプロテインＬのドメイン１、２、３、４もしくは５と、少なくとも９０もしくは９５％の同一性を有する；
ｉｉ）配列番号１〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列により定義されるか、またはこれらと少なくとも９０または９５％の配列同一性を有する；および／または
ｉｉｉ）配列番号１２〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列により定義されるか、またはこれらと少なくとも９０％、例えば少なくとも９５または９８％の配列同一性を有する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドが、
ｉ）ブドウ球菌プロテインＡまたはブドウ球菌プロテインＡのアルカリ安定化免疫グロブリン結合変異体を含む；および／または
ｉｉ）ペプトストレプトコッカスプロテインＬまたはペプトストレプトコッカスプロテインＬのアルカリ安定化免疫グロブリン結合変異体を含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記支持体が、
ｉ）多孔性粒子または多孔性膜を含む；
ｉｉ）シリカ、ガラスおよびヒドロキシ官能性ポリマーからなる群から選択される；
ｉｉｉ）架橋多糖類である；および／または
ｉｖ）架橋アガロース、例えば剛性架橋アガロースである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）の前に、ステップａ’）として、前記マトリックスと免疫グロブリンを含む溶液とを接触させ、前記免疫グロブリンを吸着させ、続いて前記マトリックスと溶出溶液とを接触させ、前記免疫グロブリンを脱着させるステップを含み、
場合により、ステップａ’）がステップｂ）の前に少なくとも１０回、例えば少なくとも２５回繰り返される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
式Ｉ、
Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｈ（Ｉ）
（式中、Ｒは水素またはアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ’は、水素またはメチル、エチルもしくはプロピル基である）
によって定義される酸化剤を含む溶液の、支持体にカップリングされた、細菌タンパク質に由来する１または複数の免疫グロブリン結合ドメインを含むか、または本質的にそれらからなるタンパク質性リガンドを有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの衛生化のための使用であって、前記溶液のｐＨが２〜４である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの分野に関し、より詳細には、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを衛生化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンおよび免疫グロブリン断片は、世界中で製造または開発されている最も一般的なバイオ医薬製品である。この特定の治療薬市場の商業的需要の高まりとそれに伴う価値により、製薬会社は、それぞれの製造プロセスの生産性を最大化するとともに、コストを抑え、製品の品質を維持することに重点を置くようになっている。
【０００３】
典型的には、ブドウ球菌プロテインＡまたはこの変異体を含むマトリックスによるアフィニティークロマトグラフィーは、完全型免疫グロブリン分子の精製における重要なステップの１つとして通常使用される。免疫グロブリンのＦｃ鎖へのプロテインＡの高度に選択的な結合は、不純物および混入物質の非常に高いクリアランスを含む一般的なステップを提供する。同様に、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＬまたはこの変異体を含むマトリックスは、例えば、カッパ軽鎖を含むＦａｂまたはｓｃＦｖ、ＢｉＴＥ、ドメイン抗体などの他の抗体断片の精製に有用である。
【０００４】
いずれのバイオプロセスクロマトグラフィーの適用においても、不純物および混入物質を確実に除去するための総合的な注意が必要である。このような不純物／混入物質は、例えば、クロマトグラフィー手順において固定相またはマトリックスに吸着される非溶出分子であり得、例えば、タンパク質、炭水化物、脂質、細菌およびウイルスを含む、望ましくない生体分子または微生物であり得る。通常、所望の生成物の最初の溶出の後、続く使用の前にマトリックスを再生するために、このような不純物／混入物質がマトリックスから除去される。このような除去は、通常、ＣＩＰ（定置清浄化（ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ））として知られている手順を含み、通常アルカリ性溶液を用いる。
【０００５】
さらに、カラムに存在するすべての微生物または胞子を不活性化するために、マトリックスを定期的に衛生化する必要がある。これは、通常、水酸化ナトリウムまたは酸性溶液、例えば、ベンジルアルコールのような静菌剤を含むリン酸／酢酸混合物のいずれかを用いた定置衛生化（ＳＩＰ）法として実施される。しかし、タンパク質性リガンドを有するマトリックスでは、リガンドを損傷することなく微生物および胞子を効果的に死滅させる条件を見出すことは困難である。
【０００６】
したがって、この分野において、リガンドに損傷を与えない効率的なＳＩＰ法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０３４５６６号
【発明の概要】
【０００８】
本発明の一態様は、リガンドの機能を実質的に損なわない、タンパク質性リガンドを用いたアフィニティークロマトグラフィー媒体の衛生化および／または清浄化方法を提供することである。これは、請求項１に記載の方法によって達成される。
【０００９】
１つの利点は、高度の細菌および胞子不活性化が達成できることである。さらなる利点は、緊密に結合した非溶出抗体などの生成物関連不純物または宿主細胞タンパク質などのプロセス関連不純物を除去できることである。
【００１０】
本発明の第２の態様は、アフィニティークロマトグラフィー媒体の衛生化および／または清浄化のための酸化剤溶液の使用を提供することである。これは、特許請求の範囲に記載の使用によって達成される。
【００１１】
本発明のさらに適切な実施形態は従属請求項に記載される。
【００１２】
定義
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用され、抗体の断片、抗体または抗体断片を含む融合タンパク質および抗体または抗体断片を含むコンジュゲートも含むと理解される。
【００１３】
本明細書において、「カッパ軽鎖結合ポリペプチド」および「カッパ軽鎖結合タンパク質」という用語は、抗体のカッパ軽鎖サブクラスに結合可能なポリペプチドまたはタンパク質をそれぞれ意味し、例えばプロテインＬ、および前記結合特性を維持するその任意の変異体、断片または融合タンパク質を含む。
【００１４】
「カッパ軽鎖含有タンパク質」という用語は、「免疫グロブリンカッパ軽鎖含有タンパク質」の同義語として使用され、本明細書では、抗体由来のカッパ軽鎖を含むタンパク質を意味し、カッパ軽鎖を含有する任意の完全抗体、抗体断片、融合タンパク質、コンジュゲートまたは組換えタンパク質を含む。
【００１５】
本明細書において「耐酸化性」という用語は、２２±２℃において０．１Ｍの過酢酸水溶液で２４時間のインキュベーション後にその機能性の少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％を保持する物質を意味する。機能性とは、例えば、免疫グロブリン、ＩｇＧ、モノクローナル抗体または抗体断片のような標的種に対する結合容量であり得る。
【００１６】
「アフィニティークロマトグラフィーマトリックス」という用語は、本明細書において、約１０−５Ｍ未満、例えば１０−１４〜１０−６Ｍの平衡解離定数ＫＤを有する標的種に結合することができるリガンドを有する分離マトリックスを意味する。ＫＤは、ＫＤ＝［Ｌ］×［Ｔ］／［ＬＴ］（式中、［Ｌ］は遊離リガンドの濃度であり、［Ｔ］は遊離標的種の濃度であり、［ＬＴ］はリガンド−標的種複合体の濃度である）として定義される。このようなリガンドの大部分はタンパク質であり、例えば、細菌免疫グロブリン結合タンパク質およびその変異体、抗体、ストレプトアビジン、レクチンなどが挙げられる。標的種は、例えば、免疫グロブリンのようなタンパク質であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】０．１Ｍ過酢酸中で１時間インキュベーションする前（ａ）および後（ｂ）の組換えプロテインＬのクロマトグラム（ＵＶ検出）を示す図である。ｘ軸は時間、ｙ軸はＵＶ吸光度（２８０ｎｍ）である。
【図２】０．１Ｍ過酢酸中で１時間インキュベーションする前（ａ）および後（ｂ）のカッパ鎖に対する一本鎖ラクダ抗体（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔリガンド）のクロマトグラム（ＵＶ検出）を示す図である。ｘ軸は時間、ｙ軸はＵＶ吸光度（２８０ｎｍ）である。
【図３】０．１Ｍ過酢酸中で１時間インキュベーションする前（ａ）および後（ｂ）の組換えプロテインＬのクロマトグラム（ＭＳ検出）を示す図である。ｘ軸は時間、ｙ軸はＭＳ応答である。
【図４】０．１Ｍ過酢酸中で１時間インキュベーションする前（ａ）および後（ｂ）のカッパ鎖に対する一本鎖ラクダ抗体（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔリガンド）のクロマトグラム（ＭＳ検出）を示す図である。ｘ軸は時間、ｙ軸はＭＳ応答である。
【図５】ａ）未処理の剛性アガロースベースマトリックス、およびｂ）３０ｍＭ過酢酸溶液中でインキュベーション後の同じマトリックス試料に対する圧力−流量曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
一態様において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスの清浄化または衛生化のための方法を開示する。この方法は以下のステップを含む：
ａ）支持体に結合された耐酸化性タンパク質性リガンドを有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供するステップ。タンパク質性リガンドは、適切には、細菌タンパク質に由来する１または複数の免疫グロブリン結合ドメインを含むか、または本質的にそれらからなり得る。細菌免疫グロブリン結合タンパク質は当技術分野で周知であり（例えばＥＶ  Ｓｉｄｏｒｉｎ、ＴＦ  Ｓｏｌｏｖｅｖａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍｏｓｃｏｗ  ７６（３）、２９５−３０８、２０１１を参照されたい）、特にグラム陽性細菌の免疫グロブリン結合タンパク質、例えば、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ、配列番号１７）、ペプトストレプトコッカスプロテインＬ（配列番号１８）およびストレプトコッカスプロテインＧ（配列番号１９）により例示される。これらのタンパク質は、３つの異なる領域：細胞質膜を横切るタンパク質の転位を担い、その後切り離されるシグナル伝達ペプチドを含むＮ末端領域；タンパク質の機能活性を決定するいくつかのドメインを含む機能領域；および細胞壁におけるタンパク質のアンカリングを担う選別シグナルとして示されるＣ末端領域、の分子内に存在することによって特徴付けられる共通の一本鎖構造を有する。機能領域は、１または複数のタイプのポリペプチドリピートを含むという単一の原則で構築される。同じタイプの相同性の高いリピートをタンデムとして編成することができる。リピートの数はさまざまであり、分子量および機能活性におけるタンパク質の異種性を決定することができる。親和性リガンドとして使用されるこれらのタンパク質の組換え変異体は、この目的のために必要とされないので、多くの場合Ｃ末端領域を欠いている。それらはまた、異なるＮ末端領域およびタンパク質のアルカリ安定性を改善するためなどの選択された点突然変異をドメイン内に有していてもよい。
【００１９】
ｂ）マトリックスと、式Ｉ、
Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｈ（Ｉ）
（式中、Ｒは水素またはアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ’は水素またはメチル、エチルもしくはプロピル基である）
によって定義される少なくとも１つの酸化剤を含む衛生化溶液とを接触させるステップ。このような酸化剤には、過酸化水素Ｈ２Ｏ２、過ギ酸ＨＣＯ３Ｈ、過酢酸ＣＨ３ＣＯ３Ｈ、過プロピオン酸ＣＨ３ＣＨ２ＣＯ３Ｈおよび過酪酸ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ３Ｈが含まれる。衛生化溶液のｐＨは、例えば、２〜１２、例えば２〜４または２〜３であり、これは衛生化効果に有益であり、少なくとも１種の酸化剤の濃度は、例えば、０．０１〜１．０ｍｏｌ／ｌ、例えば０．０２〜０．２ｍｏｌ／ｌ、０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌまたは０．０３〜０．１ｍｏｌ／ｌであってよい。この溶液は、式Ｉによる単一の酸化剤または酸化剤の混合物、例えば、過酸化水素と、過ギ酸もしくは過酢酸との混合物を含有することができる。混合物の場合、式Ｉにより定義された酸化剤の総濃度は、適切には０．０１〜１ｍｏｌ／ｌ、例えば０．０２〜０．２ｍｏｌ／ｌ、０．０５〜０．５ｍｏｌ／ｌまたは０．０３〜０．１ｍｏｌ／ｌであってよい。この溶液は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸または酪酸のようなカルボン酸をさらに含んでよい。溶液が過酸を含む場合、カルボン酸は適切には対応するカルボン酸であり得、すなわち、過酸Ｒ’Ｃ（Ｏ）ＯＯＨと同じアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）を有するカルボン酸Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−ＯＨであり得る。接触ステップは、マトリックスと衛生化溶液とを、例えば１分〜２４時間、例えば５分〜２４時間または１０分〜２４時間インキュベートするステップを伴うか、または本質的にそれからなってよい。インキュベーションは、マトリックスが充填されたカラム中で、または別法として、非充填カラムからのマトリックスを有する別個の容器中で適切に行うことができ、インキュベーション温度は、例えば、室温または１５〜３０℃であってよい。カラムは、再使用可能なステンレス鋼カラムであってもよいが、単回使用カラム、例えば、熱可塑性およびエラストマー成分で作製されたカラムであってもよい。後者の場合、熱可塑性物質およびエラストマー物質は、酸化剤溶液によって著しく分解されないように適切に選択することができる。特に、適切な濃度とインキュベーション時間を見つけるためにいくつかの実験作業が行われた場合、１５〜３０℃の範囲外の温度も可能です。第１近似として、通常のアレニウス温度依存性を適用して、温度が１０℃上昇した場合、インキュベーション時間を２〜３倍短縮できると仮定することができる。一定温度における適切な濃度とインキュベーション時間との間の関係は、ほぼ線形であると仮定することができる。
【００２０】
特定の実施形態において、免疫グロブリン結合ドメインは、ブドウ球菌プロテインＡ、ペプトストレプトコッカスプロテインＬおよびストレプトコッカスプロテインＧからなる群、例えばブドウ球菌プロテインＡおよびペプトストレプトコッカスプロテインＬからなる群から選択される細菌タンパク質に由来してよい。免疫グロブリン結合ドメインは、例えば、ブドウ球菌プロテインＡのドメインＥ、Ｄ、Ａ、ＢもしくはＣと、プロテインＺ（プロテインＡのドメインＢの変異体）と、またはペプトストレプトコッカスプロテインＬのドメイン１、２、３、４もしくは５と、少なくとも８０％、例えば少なくとも９０もしくは９５％の相同性を有し得る。この文脈において、免疫グロブリン含有ドメインは、配列番号１−１１からなる群より選択されるアミノ酸配列により定義することができるか、またはこれらと少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０または９５％の配列相同性を有することができる。
【００２１】
配列番号１−プロテインＡのドメインＥ
ＡＱＱ  ＮＡＦＹＱＶＬＮＭＰ  ＮＬＮＡＤＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫ
配列番号２−プロテインＡのドメインＤ
ＡＤＡ  ＱＱＮＫＦＮＫＤＱＱ  ＳＡＦＹＥＩＬＮＭＰ  ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫ  ＬＮＥＳＱＡＰＫ
配列番号３−プロテインＡのドメインＡ
Ａ  ＤＮＮＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＮＭＰ  ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＥＳＱＡＰＫ
配列番号４−プロテインＡのドメインＢ
ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号５−プロテインＡのドメインＣ
ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６−プロテインＺ
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号７−プロテインＬのドメイン１
ＳＥＥＥＶＴＩＫＡＮ  ＬＩＦＡＮＧＳＴＱＴ  ＡＥＦＫＧＴＦＥＫＡ  ＴＳＥＡＹＡＹＡＤＴ  ＬＫＫＤＮＧＥＹＴＶ  ＤＶＡＤＫＧＹＴＬＮ  ＩＫＦＡＧＫＥＫＴＰＥＥ
配列番号８−プロテインＬのドメイン２
ＰＫＥＥＶＴＩＫＡＮ  ＬＩＹＡＤＧＫＴＱＴ  ＡＥＦＫＧＴＦＥＥＡ  ＴＡＥＡＹＲＹＡＤＡ  ＬＫＫＤＮＧＥＹＴＶ  ＤＶＡＤＫＧＹＴＬＮ  ＩＫＦＡＧＫＥＫＴＰＥＥ
配列番号９−プロテインＬのドメイン３
ＰＫＥＥＶＴＩＫＡＮ  ＬＩＹＡＤＧＫＴＱＴ  ＡＥＦＫＧＴＦＥＥＡ  ＴＡＥＡＹＲＹＡＤＬ  ＬＡＫＥＮＧＫＹＴＶ  ＤＶＡＤＫＧＹＴＬＮ  ＩＫＦＡＧＫＥＫＴＰＥＥ
配列番号１０−プロテインＬのドメイン４
ＰＫＥＥＶＴＩＫＡＮ  ＬＩＹＡＤＧＫＴＱＴ  ＡＥＦＫＧＴＦＡＥＡ  ＴＡＥＡＹＲＹＡＤＬ  ＬＡＫＥＮＧＫＹＴＡ  ＤＬＥＤＧＧＹＴＩＮ  ＩＲＦＡＧＫＫＶＤＥＫＰＥＥ
配列番号１１−プロテインＬのドメイン５
ＥＫＥＱＶＴＩＫＥＮ  ＩＹＦＥＤＧＴＶＱＴ  ＡＴＦＫＧＴＦＡＥＡ  ＴＡＥＡＹＲＹＡＤＬ  ＬＳＫＥＨＧＫＹＴＡ  ＤＬＥＤＧＧＹＴＩＮ  ＩＲＦＡＧ
いくつかの実施形態において、免疫グロブリン結合ドメインは、国際公開第０３０８０６５５号、国際公開第２００８０３９１４１号、欧州特許第１９９２６９２号、欧州特許第２１５７０９９号、欧州特許第２２０２３１０号、欧州特許第２４１２８０９号、欧州特許第２５５７１５７号、欧州特許第２１５７０９９号および国際公開第２０１３１０９３０２号の１つまたは複数に記載されたドメインなど、配列番号１−１１の天然ドメインの公知の変異体に由来することができ、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。免疫グロブリン結合ドメインは、例えば、配列番号１２〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義することができるか、またはこれらと少なくとも９０％、例えば少なくとも９５もしくは９８％の配列相同性を有することができる。
【００２２】
配列番号１２−プロテインＺ変異体（国際公開第０３０８０６５５号）
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１３−プロテインＺ変異体（国際公開第０３０８０６５５号）
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１４−ドメインＣ変異体（国際公開第２００８０３９１４１号）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１５−ドメインＣ変異体（欧州特許第２５５７１５７号）
ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦ  ＩＱＥＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１６−ドメインＣ変異体（国際公開３０１３１０９３０２号）
ＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１７−プロテインＡ
ＡＱＱ  ＮＡＦＹＱＶＬＮＭＰ  ＮＬＮＡＤＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＶＬＧＥＡＱＫ  ＬＮＤＳＱＡＰＫ
ＡＤＡ  ＱＱＮＫＦＮＫＤＱＱ  ＳＡＦＹＥＩＬＮＭＰ  ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＴＮＶＬＧＥＡＫＫ  ＬＮＥＳＱＡＰＫ  Ａ  ＤＮＮＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＮＭＰ  ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＥＳＱＡＰＫ  ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱ  ＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ  ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱ  ＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰ  ＮＬＴＥＥＱＲＮＧＦ  ＩＱＳＬＫＤＤＰＳＶ  ＳＫＥＩＬＡＥＡＫＫ  ＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号１８−プロテインＬ（米国特許第５９６５３９０号）
ＡＶＥＮＫＥＥＴＰＥＴＰＥＴＤＳＥＥＥＶＴＩＫＡＮＬＩＦＡＮＧＳＴＱＴＡＥＦＫＧＴＦＥＫＡＴＳＥＡＹＡＹＡＤＴＬＫＫＤＮＧＥＹＴＶＤＶＡＤＫＧＹＴＬＮＩＫＦＡＧＫＥＫＴＰＥＥＰＫＥＥＶＴＩＫＡＮＬＩＹＡＤＧＫＴＱＴＡＥＦＫＧＴＦＥＥＡＴＡＥＡＹＲＹＡＤＡＬＫＫＤＮＧＥＹＴＶＤＶＡＤＫＧＹＴＬＮＩＫＦＡＧＫＥＫＴＰＥＥＰＫＥＥＶＴＩＫＡＮＬＩＹＡＤＧＫＴＱＴＡＥＦＫＧＴＦＥＥＡＴＡＥＡＹＲＹＡＤＬＬＡＫＥＮＧＫＹＴＶＤＶＡＤＫＧＹＴＬＮＩＫＦＡＧＫＥＫＴＰＥＥＰＫＥＥＶＴＩＫＡＮＬＩＹＡＤＧＫＴＱＴＡＥＦＫＧＴＦＡＥＡＴＡＥＡＹＲＹＡＤＬＬＡＫＥＮＧＫＹＴＡＤＬＥＤＧＧＹＴＩＮＩＲＦＡＧＫＫＶＤＥＫＰＥＥ
配列番号１９−プロテインＧ
ＡＱＨＤＥＡＶＤＡＮ  ＳＲＧＳＶＤＡＳＥＬ  ＴＰＡＶＴＴＹＫＬＶ  ＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴ  ＴＴＥＡＶＤＡＡＴＡ  ＥＫＶＦＫＱＹＡＮＤ  ＮＧＶＤＧＥＷＴＹＤ  ＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ  ＫＰＥＶＩＤＡＳＥＬ  ＴＰＡＶＴＴＹＫＬＶ  ＩＮＧＫＴＬＫＧＥＴ  ＴＴＫＡＶＤＡＥＴＡ  ＥＫＡＦＫＱＹＡＮＤ  ＮＧＶＤＧＶＷＴＹＤ  ＤＡＴＫＴＦＴＶＴＥ  ＭＶＴＥＶＰＬＥＳＴ  Ａ
本方法の特定の実施形態において、リガンドは、細菌タンパク質に由来する免疫グロブリン結合ドメインのホモ多量体またはヘテロ多量体を含むかまたは本質的にそれらからなる。これは、リガンドが上記の複数のドメインを含むことを意味する。リガンド中のドメインはすべて同じであってもよく（ホモ多量体）、またはそれらの１または複数が他のものと異なっていてもよい（ヘテロ多量体）。これらのドメインに加えて、リガンドは、ドメイン間のリンカー構造、Ｎ末端のリーダー配列またはシグナル配列、およびＣ末端のテール配列を含むことができる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、リガンドは、ブドウ球菌プロテインＡまたはブドウ球菌プロテインＡのアルカリ安定化免疫グロブリン結合変異体を含む。上記のように、プロテインＡは、５つのドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃをその順序で含む。ブドウ球菌プロテインＡリガンドを含む市販のマトリックスの例としては、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＰｒｏＳｅｐ（商標）−ＡおよびＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＡｂＳｏｌｕｔｅ（商標）（Ｎｏｖａｓｅｐ）、ＣａｐｔｉｖＡ（商標）ＰｒｉＭａｂ（商標）（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）ならびにＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉａｍｏｎｄ（Ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ）が挙げられる。プロテインＡのアルカリ安定化変異体は、典型的には、改変されたドメインＣまたはプロテインＺユニットのホモまたはヘテロ多量体であり、国際公開第０３０８０６５５号、国際公開第２００８０３９１４１号、欧州特許第１９９２６９２号、欧州特許第２１５７０９９号、欧州特許第２２０２３１０号、欧州特許第２４１２８０９号、欧州特許第２５５７１５７号、欧州特許第２１５７０９９号および国際公開第２０１３１０９３０２号に記載されている。ブドウ球菌プロテインＡのアルカリ安定化免疫グロブリン結合変異体を含む市販のマトリックスの例としては、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標）Ａ（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＪＳＲ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）ならびにＫａｎＣａｐＡ（商標）（Ｋａｎｅｋａ  Ｃｏｒｐ．）が挙げられる。
【００２４】
本方法の特定の実施形態において、リガンドは、ペプトストレプトコッカスプロテインＬまたはペプトストレプトコッカスプロテインＬのアルカリ安定化免疫グロブリン結合変異体を含む。プロテインＬリガンドを有する市販のマトリックスは、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である。プロテインＬのアルカリ安定化変異体は、同時係属中出願ＰＣＴ欧州特許出願第２０１５／０７９３８７号およびＰＣＴ欧州特許出願第２０１５／０７９３８９号において論じられており、これらは両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。リガンドはまた、配列番号１７〜１９からなる群から選択されるアミノ酸配列によって定義されるアミノ酸配列か、またはこれらと少なくとも９０％、例えば少なくとも９５または９８％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２５】
上述の細菌タンパク質由来リガンドとは対照的に、抗体由来のリガンドは、本発明の方法に使用される衛生化溶液に対して不安定であることが判明している。これは、例えば、国際公開第０１４４３０１号に記載されているように、一本鎖ラクダ抗体に由来するリガンドの場合に特に当てはまる。このようなリガンドを有するマトリックスの例としては、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＬａｍｂｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ（商標）およびＶＩＩＳｅｌｅｃｔ（商標）（すべてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が挙げられる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本方法は、ステップｂ）の前に、ステップａ’）として、マトリックスと免疫グロブリンを含む溶液とを接触させ、免疫グロブリンを吸着させ、続いてマトリックスと溶出溶液とを接触させ、免疫グロブリンを脱着させるステップを含む。ステップａ’）は、例えば、ステップｂ）が適用される前に少なくとも１０回、例えば少なくとも２５回繰り返されてもよいが、ステップｂ）は、ステップａ’）の各段階の後に適用されてもよい。ステップａ’）は、例えば、清浄化溶液として１０〜５００または１０〜１００ｍｍｏｌ／ｌのアルカリ、例えばＮａＯＨを使用する定置洗浄ステップをさらに含むことができる。する。
【００２７】
特定の実施形態において、生存細菌、栄養細菌および／または胞子の含量は、ステップｂ）において少なくとも３ｌｏｇ１０、例えば少なくとも５ｌｏｇ１０または少なくとも６ｌｏｇ１０減少する。
【００２８】
いくつかの実施形態において、ステップｂ）後のマトリックスの免疫グロブリンまたはＩｇＧ結合容量は、ステップｂ）前のマトリックスの免疫グロブリンまたはＩｇＧ結合容量の少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％である。
【００２９】
マトリックスの支持体（ベースマトリックスとも呼ばれる）は、任意の適切な周知の種類の、特に耐酸化性支持体、例えば、０．０３Ｍまたは０．１Ｍの過酢酸水溶液を用いて２２±２℃においてインキュベートした２４時間後に圧力−流量性能が２０％超変化しない支持体などであってよい。従来のアフィニティー分離マトリックスは多くの場合有機性であり、使用する水性媒体に親水性表面を曝露している、すなわちヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキシアミド（−ＣＯＮＨ２、Ｎ−置換型であってもよい）、アミノ（−ＮＨ２、置換されていてもよい）、オリゴ−またはポリエチレンオキシ基をそれらの外部に曝露し、存在する場合にはその内部にも曝露しているポリマーに基づく。固体支持体は、適切には多孔質であり得る。空隙率は、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ６−１３に記載の方法による逆サイズ排除クロマトグラフィーによって測定されたＫａｖまたはＫｄ値（特定のサイズのプローブ分子に利用可能な細孔容積の割合）として表すことができる。定義上、ＫｄおよびＫａｖ値は両方とも常に０〜１の範囲内にある。有利には、分子量１１０ｋＤａのデキストランをプローブ分子として用いて測定した場合、Ｋａｖ値は０．６〜０．９５、例えば、０．７〜０．９０または０．６〜０．８であり得る。この利点は、支持体が、タンパク質性リガンドおよび該リガンドに結合する免疫グロブリンの両方を収容することができ、結合部位への、および結合部位からの免疫グロブリンの質量輸送を提供することができる細孔を大きな割合で有することである。
【００３０】
タンパク質性リガンドは、支持体に共有結合させることができ、例えば、リガンド中に存在するチオール、アミノおよび／またはカルボキシ基を利用する既存のカップリング技術などを使用してそれらを支持体に付着させることができる。ビセポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）などは、周知のカップリング試薬である。支持体とリガンドとの間に、スペーサーとして知られている分子を導入することができ、リガンドの利用可能性が向上し、リガンドと支持体との化学的カップリングが促進される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、マトリックスは、５〜２０、例えば５〜１５ｍｇ／ｍｌ、５〜１１ｍｇ／ｍｌまたは８〜１１ｍｇ／ｍｌの支持体にカップリングされたリガンドを含む。カップリングされるリガンドの量は、カップリングプロセスに使用するリガンドの濃度、使用するカップリング条件および／または使用する支持体の細孔構造によって制御することができる。概して、マトリックスの絶対結合容量は、カップリングされたリガンドの量に伴い、少なくとも細孔がカップリングされたリガンドによって著しく狭窄される点まで増加する。カップリングされたリガンド１ｍｇ当たりの相対結合容量はカップリングレベルが高くなると減少し、上記の範囲内で最適な費用便益をもたらす。
【００３２】
いくつかの実施形態において、タンパク質性リガンドは、多点結合を介して支持体にカップリングされる。これは、リガンド中の複数の反応性基が支持体中の反応性基と反応するようなカップリング条件を使用することによって適切に行うことができる。典型的には、多点結合は、配列中のアミノ酸残基のいくつかの固有の反応基、例えばリジン中のアミンと、支持体上の反応基、例えばエポキシド、シアネートエステル（例えば、ＣＮＢｒ活性化由来）、スクシンイミジルエステル（例えば、ＮＨＳ活性化由来）との反応を伴うことができる。しかし、リガンド中の異なる位置に反応性基を故意に導入して、カップリング特性に影響を及ぼすことも可能である。リジンを介した多点カップリングを提供するために、カップリング反応は、リジンの一級アミンのかなりの部分が非プロトン化求核状態であるｐＨにおいて、例えば、８．０より高い、例えば１０より高いｐＨにおいて適切に実施される。
【００３３】
特定の実施形態において、リガンドは、チオエーテル結合を介して支持体にカップリングされる。このような結合を実施する方法は、この分野において周知であり、標準的な技術および装置を使用して当業者によって容易に実施される。チオエーテル結合は、柔軟で安定であり、一般的にアフィニティークロマトグラフィーでの使用に適している。特に、チオエーテル結合が、リガンド上の末端または近末端のシステイン残基を介している場合、カップリングされたリガンドの可動性が向上し、結合容量および結合反応速度が改善される。いくつかの実施形態において、リガンドは、上記のタンパク質に提供されるＣ末端システインを介してカップリングされる。このことは、システインチオールと支持体上の求電子基、例えばエポキシド基、ハロヒドリン基との効率的なカップリングを可能にし、チオエーテル架橋カップリングをもたらす。
【００３４】
特定の実施形態において、支持体は、ポリヒドロキシポリマー、例えば多糖類を含む。多糖類の例としては、例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロースなどが挙げられる。多糖類は本質的に親水性であり、非特異的相互作用の程度は低く、反応性（活性化可能な）ヒドロキシル基含量が高く、バイオプロセスに使用されるアルカリ清浄化液に対して一般に安定である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、支持体は、寒天またはアガロースを含む。本発明で使用する支持体は、標準的な方法、例えば逆懸濁ゲル化（Ｓ  Ｈｊｅｒｔｅｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ７９（２），３９３−３９８（１９６４））により容易に調製することができる。または、塩基性マトリクッスは、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の名称で販売されている架橋アガロースビーズなどの市販品である。衛生化方法に特に有利な一実施形態において、支持体は剛性架橋アガロースである。このようなアガロース支持体は、米国特許第６６０２９９０号、米国特許第７３９６４６７号または米国特許第８３０９７０９号に記載の方法により高度に架橋されており、当該特許はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。球状ビーズの形態の、ベッド高さ２０ｃｍ、内径２．６ｃｍのカラムに充填した剛性架橋アガロース支持体は、３バールの背圧において少なくとも０．１４×ｄ２（式中、ｄはビーズの体積加重メジアン径（ｄ５０、ｖ）をマイクロメートルで表したものである）の水流速ｖ（ｃｍ／ｈ）をもたらす。剛性架橋アガロースは、本発明の方法に使用する酸化剤に対して著しく安定である。
【００３６】
特定の実施形態において、多糖類またはアガロース支持体などの支持体は、ヒドロキシアルキルエーテル架橋などで架橋される。このような架橋を生成する架橋剤試薬は、例えば、エピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシド、アリルハライドまたはアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬であってよい。架橋は、支持体の剛性に有益であり、化学的安定性を改善する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋はアルカリ安定性であり、著しい非特異的吸着を引き起こさない。
【００３７】
または、固体支持体は、合成ポリマー、例えばポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミドなどに基づく。ジビニルおよびモノビニル置換ベンゼンに基づくマトリックスなどの疎水性ポリマーの場合、マトリックス表面は、多くの場合親水化されて、上で定義した親水性基を周囲の水性液体に曝露する。このようなポリマーは、標準的な方法に従って容易に製造され、例えば、“Ｓｔｙｒｅｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ”（Ｒ  Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ  ｅ  Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ  ７０（９），７０−７５（１９８８））を参照されたい。または、ＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの市販品が使用される。別の代替としては、本発明による固体支持体は、無機性の支持体、例えばシリカ、ガラス、酸化ジルコニウムなどを含む。
【００３８】
さらに別の実施形態において、固体支持体は、表面、チップ、キャピラリー、またはフィルター（例えば、膜または深層フィルターマトリックス）などの別の形態である。
【００３９】
本発明によるマトリックスの形状に関して、一実施形態において、マトリックスは多孔性膜の形態である。別の実施形態において、マトリックスは、適切に多孔性であり得るビーズまたは粒子の形態である。ビーズまたは粒子の形態のマトリックスは、充填床として、または懸濁形態で使用することができる。懸濁形態には、粒子またはビーズが自由に移動する膨張床および純粋な懸濁液として知られている形態が含まれる。
【００４０】
第２の態様において、本発明は、式Ｉ、
Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｈ（Ｉ）
（式中、Ｒは水素またはアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ’は、水素またはメチル、エチルもしくはプロピル基である）
によって定義される酸化剤を含む溶液の、支持体にカップリングされたタンパク質性リガンドを有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの衛生化のための使用を開示する。タンパク質性リガンドは、上記の細菌タンパク質に由来する１または複数の免疫グロブリン結合ドメインを含むか、または本質的にそれらからなる。この使用は、上記の実施形態のいずれかの方法を含むことができる。
【００４１】
さらに、本発明は、
ａ）剛性架橋アガロース支持体にカップリングされた耐酸化性リガンドを有するクロマトグラフィーマトリックスを提供するステップ、
ｂ）該マトリックスと、式Ｉ、
Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｈ（Ｉ）
（式中、Ｒは水素またはアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ’は、水素またはメチル、エチルもしくはプロピル基である）
によって定義される酸化剤を含む衛生化溶液とを接触させるステップ、
を含む、クロマトグラフィーマトリックスを衛生化する方法を開示する。リガンドは、上記のような耐酸化性タンパク質性リガンドであってもよいが、例えば、カチオン交換リガンド（例えば、スルホプロピル、スルホエチルまたはカルボキシメチル基を含むリガンド）、アニオン交換リガンド（例えばトリメチルアンモニウムまたはジエチルアミノエチル基を含むリガンド）、疎水性リガンド（例えばブチル、ヘキシル、オクチルまたはフェニル基を含むリガンド）またはマルチモーダル基（例えば、疎水性基と組み合わせたカチオンもしくはアニオン交換基を含むリガンド）であってもよい。リガンドは、マトリックス上に均一に分布していてもよく、またはマトリックスの１つの領域、例えばビーズ状マトリックスのコアまたはシェルに排他的または主要に位置していてよい。
【００４２】
上述したように、前記衛生化溶液中の前記酸化剤の濃度は、例えば、０．０１〜１ｍｏｌ／ｌであってよく、ｐＨは、例えば、２−１２、例えば２−４または２−３であってよい。ステップｂ）においてマトリックスは、衛生化溶液と共に１分〜２４時間、例えば５分〜２４時間または１５分〜３時間インキュベートされ、マトリックスは、例えば、メジアン径（ｄ５０、ｖ）１０〜２００マイクロメートル、例えば３０〜１００マイクロメートルの球形ビーズの形態であってよい。
【実施例】
【００４３】
（すべて室温＝２２＋／−２℃で実施）
【実施例１】
【００４４】
（Ｃａｐｔｏ  Ｌの衛生化試験）
この調査の目的は、Ｃａｐｔｏ  Ｌ５０％スラリーに添加した８種の消毒剤ならびに基準としてのＰＢＳの、細菌胞子および細菌に対する殺菌および殺胞子効果を評価することであった。この効果を、接触時間０および１５分ならびに１、４および２４時間で試験した。
【００４５】
この試験は、Ｃａｐｔｏ  Ｌ５０％のスラリーおよび消毒剤で行った。微生物を約１０７ｃｆｕ／ｍＬの濃度で懸濁液に添加し、消毒剤を中和することによって所定の時間間隔後に減少効果を評価した。中和剤の有効性および接種した微生物を回収するその能力を、チャレンジ試験と並行してこの方法を検証することによって実証した。結果を、微生物バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（胞子）およびシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（栄養細菌）のｌｏｇ１０減少に関して評価した。
【００４６】
１０７ｃｆｕ／ｍＬの微生物を１０ｍＬのＣａｐｔｏ  Ｌ５０％スラリーに消毒剤と共に加えた。試料を混合し、５０ｍＬの中和剤（０．３％レシチン、３．０％Ｔｗｅｅｎ８０、０．５％チオ硫酸ナトリウムおよび０．１％Ｌ−ヒスチジンを含む０．０７５Ｍリン酸緩衝液）に０．１ｍＬの試料を二連に添加した。全溶液を、１０回連続希釈に相当する画分を濾過することによって分析した。フィルターを１００ｍＬの０．９％ＮａＣｌで３回すすいだ。陽性対照として、消毒剤チャレンジ試験と同じ量の各微生物を５０ｍＬの中和剤に加えた。全溶液を、１０回連続希釈に相当する画分を濾過することによって分析した。フィルターを１００ｍＬの０．９％ＮａＣｌで３回すすいだ。フィルターをＴＳＡ（トリプチケースソイ寒天）上で３０〜３５℃において２〜５日間インキュベートした。予備読み取りは１〜３日後に行った。微生物の減少を、陽性対照のｌｏｇ１０と比較した生存微生物のｌｏｇ１０として計算した。結果を、被験消毒剤の中で、０．１Ｍ過酢酸および３％過酸化水素を含む０．６％ギ酸のみがＢ．ズブチリス胞子を効率的に殺すことができることを示している。
【００４７】
【表１】
0006732292.tif 000002
【００４８】
【表２】
0006732292.tif 000003
【実施例２】
【００４９】
（リガンドのインキュベーション、Ｂｉａｃｏｒｅによる試験）
この活動の目的は、０．１Ｍ過酢酸（ＰＡＡ）による衛生化前後の結合能力保持の尺度として、異なるクロマトグラフィー媒体リガンドの結合動態を研究することであった。動態は、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）機器において表面プラズモン共鳴によって測定した。被験リガンドは、配列番号１３の単量体（Ｚ１）および四量体（Ｚ４）、組換えプロテインＡ（ｒＰｒＡ）、組換えプロテインＬ（ｒＰｒＬ）およびＩｇＧカッパ鎖に対する一本鎖ラクダ抗体（ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔリガンド）であった。Ｚ１、Ｚ４およびｒＰｒＡを、Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定化したモノクローナル抗体を用いて試験し、一方、ｒＰｒＬおよびＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔリガンドは固定化したＦａｂ抗体断片を用いて試験した。
【００５０】
１．  １ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのＺ１、Ｚ４およびｒＰｒＡを還元し、アルキル化し、緩衝液を１０ｍＭのＮａＣｌに交換し、質量分析計（ＭＳ）で分析して還元およびアルキル化を確認した。
【００５１】
２．  １ｍｌのｒＰｒＬおよびＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔリガンドを１０ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【００５２】
３．  参照試料（０時間）１００μｌを採取し、緩衝液を５０ｍＭ重炭酸アンモニウムに交換した。
【００５３】
４．  １０％の１Ｍ  ＰＡＡを加え、インキュベーションを開始した。
【００５４】
５．  １、２、４、８、１６および２４時間後に試料１００μｌを採取し、緩衝液を５０ｍＭ重炭酸アンモニウムと交換して、酸化反応を停止させた。
【００５５】
６．  すべての試料において、２７６ｎｍにおいてＵＶ吸光度を測定することによって濃度を測定した。
【００５６】
７．  次いで、この試料をＬＣ−ＭＳおよびＢｉａｃｏｒｅで分析した。
【００５７】
０．１ＭのＰＡＡ中で０〜１６時間インキュベートしたＺ１リガンドは、ＳＩＰの前後で同様の親和性を有する。２４時間のインキュベーション後のリガンドはオフレートでは変化しないが、オンレートで変化し、親和性のシフトももたらす。
【００５８】
０．１ＭのＰＡＡ中で０〜２４時間インキュベートしたＺ４リガンドは、ＳＩＰの前後で同様の親和性を有する。
【００５９】
０．１ＭのＰＡＡ中で０〜２４時間インキュベートしたｒＰｒＡリガンドは、ＳＩＰ処理の増加に伴っていくらか親和性を失う。このリガンドは、オンレートおよびオフレートの両方で変化し、親和性のシフトをもたらす
０．１ＭのＰＡＡ中で０〜２４時間インキュベートしたｒＰｒＬリガンドは、ＳＩＰの前後で同様の親和性を有する。ＳＩＰ前後のＬＣクロマトグラム（図１ａおよびｂ）は分解の兆候を示さない。
【００６０】
ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔリガンドは、０．１Ｍ  ＰＡＡ中で１時間後に既に著しく分解されており、それについての動態研究を行うことは不可能であった。ＳＩＰ前後のＬＣクロマトグラム（図２ａおよびｂ）もまた、本質的に完全な分解を示す。
【実施例３】
【００６１】
（マトリックスのインキュベーション）
これらの実験の目的は、異なるアフィニティークロマトグラフィー媒体の定置衛生化（ＳＩＰ）適合性を試験することであった。この試験は、ＴＥＣＡＮロボットを用いてＰｒｅＤｉｃｔｏｒ  ＲｏｂｏＣｏｌｕｍｎ  ６００μｌ中に充填された６種の異なるクロマトグラフィー媒体について、０．１Ｍ過酢酸におけるＳＩＰ後の１０％ブレークスルーの動的結合容量（ＤＢＣ）を計算することによって行った。最初のＤＢＣは、ＳＩＰに供されなかった６種の対応する参照カラムにおいて測定した。媒体は、Ｃａｐｔｏ  Ｌ（組換えプロテインＬ）、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＩｇＧカッパ鎖に対する一本鎖ラクダ抗体）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（組換えプロテインＡ）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（アスパラギンが置換されたプロテインＺ変異体の多量体）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ（アスパラギンが置換されたプロテインＺ変異体の多量体）およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ（組換えプロテインＡ）であった。これらすべての媒体の支持体は、剛性架橋アガロースである。
【００６２】
方法
１．  洗浄／保存溶液の除去：１０カラム容量（ＣＶ）（６×１０００μｌ）の２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４
２．  ２０ＣＶ（１２×１０００μｌ）のＳＩＰ溶液（０．１Ｍ過酢酸）の添加
３．  カラムプラグ、パラフィルムおよびアルミホイルによるミニカラムの底面と上面の密封。
【００６３】
４．  ＳＩＰ溶液中で２４時間の室温におけるインキュベーション
５．  ２４時間のＳＩＰインキュベーション後、洗浄：１０ＣＶ（６×１０００μｌ）の２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４
６．  試料の負荷：異なる濃度の１２×６００μｌＦａｂ／Ｍａｂ、滞留時間６分
７．  ＵＶ−読み取り可能なプレートにおける未結合試料の収集および２８０（および３００ｎｍ）におけるＵＶ吸光度の測定
ＳＩＰに供されていないカラムのＤＢＣについては、ポイント１、６、７を実行した。
【００６４】
【表３】
0006732292.tif 000004
【実施例４】
【００６５】
（マトリックスのインキュベーション  Ｃａｐｔｏ  Ｌ）
各ウェルに６マイクロリットルのＣａｐｔｏ  Ｌを含むＰｒｅＤｉｃｔｏｒ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）９６ウェルフィルタープレートを以下の手順に供した：
ＰｒｅＤｉｃｔｏｒ保存溶液（２０％エタノール）の除去
洗浄：３×２００μｌの２０ｍＭリン酸塩塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．４
洗浄  ３×２００μｌのＭｉｌｌｉＱ
６００μｌのＳＩＰ溶液および２０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４（対照）の添加（４８溶液およびプレート中の２連）
パラフィルムでプレートの底面と上面を密封
４５０ｒｐｍで振盪しながら４時間または２４時間、ＳＩＰ溶液中でインキュベート。
【００６６】
液体を遠心分離（５００×ｇ、１分）により除去。
【００６７】
Ｆａｂの静的結合容量（ＳＢＣ）を、
１．ＳＩＰ溶液の除去
２．洗浄：１×６００μｌのＭｉｌｌｉＱ、１×６００μｌのＰＢＳ
３．平衡化：３×２００μｌの２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４
４．サンプル負荷：２．５ｍｇ／ｍＬの濃度の２００μｌのＦａｂ、１１００ｒｐｍで１０分間および９０分間のインキュベーション。
【００６８】
５．ＵＶ−読み取り可能なプレートにおける未結合試料の収集および２８０（および２５４ｎｍ）におけるＵＶ吸光度の測定
によって決定した。
【００６９】
液体を遠心分離（５００×ｇ、１分）により除去した。
【００７０】
フロースルー画分のＵＶ吸光度から、２８０ｎｍにおけるＰＢＳ緩衝液のＵＶ吸光度（経路のチェックオン）を差し引いた（Ａ２８０−ブランク２８０）。
【００７１】
フロースルー画分中の濃度を、標準曲線を使用して計算した（Ａ２８０−ブランク２８０）／１．２７９６
【００７２】
ＳＢＣの計算：
【数１】
0006732292.tif 000005
【００７３】
Ｖｓａｍｐｌｅ＝２００μｌ
Ｖｍｅｄｉｕｍ＝６μｌ
Ｖｒ＝６＋０．６×Ｖｍｅｄｉｕｍ＝９．６
Ｖｒ：保持された体積、すなわち、フィルター体積（６μｌ）および樹脂中の液体体積（０．６×６）
【００７４】
【表４】
0006732292.tif 000006
【実施例５】
【００７５】
（マトリックスのインキュベーションおよびＭＳ分析）
２００ｍｇの湿潤マトリックスを水で洗浄し、０．１Ｍの過酢酸と一緒に２４時間インキュベートした。マトリックスを濾過により除去し、インキュベーション溶液を、ＲＰＬＣ  Ｃ１８  ＲＰＣカラムを備えたＷａｔｅｒｓ  ＡＱＵＩＴＹ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ＋Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｑ−ＴＯＦＭＳ  ＬＣ−ＭＳシステムで分析した。インキュベーション溶液中のタンパク質断片の存在は、過酢酸によるリガンド分解の指標と見なした。
【００７６】
異なるタンパク質性親和性リガンドを有する７種のマトリックスを試験した（すべてＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから）：
Ｋａｐｐａ  Ｓｅｌｅｃｔ（ＩｇＧカッパ鎖に対する一本鎖ラクダ抗体）
ＬａｍｂｄａＦａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（ＩｇＧラムダ鎖に対する一本鎖ラクダ抗体）
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ  Ｓｅｌｅｃｔ（第ＶＩＩ因子に対する一本鎖ラクダ抗体）
Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｓｅｌｅｃｔ（第ＶＩＩＩ因子に対する一本鎖ラクダ抗体）
Ｃａｐｔｏ  Ｌ（組換えプロテインＬ）
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ組換え体（プロテインＡ）
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（アスパラギンが置換されたプロテインＺ変異体の多量体）
【００７７】
【表５】
0006732292.tif 000007
【実施例６】
【００７８】
（ベースマトリックスの安定性）
酸化剤処理がアガロースベースマトリックスにどのような負の特性をもたらすかを見るために、剛性アガロースベースマトリックスの圧力−流量試験を、未処理のマトリックス試料および酸化剤と共にインキュベートした試料に対して行った。
【００７９】
ベースマトリックス
使用したベースマトリックスは、米国特許第６６０２９９０号の方法に従って調製された、メジアン径８８マイクロメートル（体積加重、ｄ５０Ｖ）の、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９１，ｐｐ６−１３に記載されている方法にしたがって、逆ゲル濾過クロマトグラフィーのＫＤ値が分子量１１０ｋＤａのデキストランに対して０．７０に相当する細孔サイズを有する剛性架橋アガロースビーズである。
【００８０】
インキュベーション
ベースマトリックスを３０ｍＭ過酢酸水溶液中で室温において２４時間インキュベートし、次いで蒸留水で洗浄した。
【００８１】
カラムの充填：
３００ｍｌの沈降ゲルを蒸留水でスラリー化して６２０ｍｌのスラリー量とし、内径３５ｍｍのＦｉｎｅＬＩＮＥ（商標）３５／６００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）に充填した。充填圧力は０．１０＋／−０．０２バールであり、ベッド高さは３００±１０ｍｍであった。
【００８２】
圧力−流量試験
蒸留水を、背圧を段階的に７．５バールまで上げてポンプによりカラムに通させた。各圧力上昇ステップ後、ポンプ速度を５分間一定に保ち、体積流量および背圧を測定した。線形流速（体積流量をカラムの内側断面積で割った値として計算される）を背圧に対してプロットし、最大流速を曲線から計算し、最大圧力を最大流速における背圧と見なした。
【００８３】
結果
図５は、ａ）非インキュベートマトリックスおよびｂ）インキュベーション後のマトリックスについての流速対背圧の曲線を示す。最大流速は、インキュベーション前に１．３０×１０３ｃｍ／ｈであり、インキュベーション後に１．１８×１０３ｃｍ／ｈであったが、対応する最大圧力はインキュベーション前後で５．３１および５．４４バールであった。その差は、本方法の実験誤差限界内であり、過酢酸のインキュベーションがマトリックスの圧力−流量特性に影響しないことを示している。このことは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒにおいてビーズのメジアン径を測定することによってさらに確証され、ｄ５０Ｖメジアン径は、インキュベーション前には８８．３マイクロメートルであり、インキュベーション後には８８．５マイクロメートルであった（統計学的有意差なし）ことを示した。また、ビーズの細孔径は、Ｍｗ１１０ｋＤａのデキストランのＫＤ値がインキュベーション前には０．６９６であり、インキュベーション後には０．６９２であることによって示されるように、影響を受けなかった。
【実施例７】
【００８４】
（清浄化、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ）
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅマトリックスのアリコートをモノクローナル抗体（ｍＡｂ）供給物で汚染し、次いで異なる清浄化溶液と共にインキュベートした。清浄化後、マトリックスをＳＤＳ−ＤＴＴ緩衝液中で煮沸してタンパク質を放出させ、上清をＡｍｅｒｓｈａｍ  ＷＢシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）で電気泳動ゲル上を流し、残留汚染タンパク質の量を決定した。
【００８５】
ファウリング
各ウェルに２０マイクロリットルのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅが入った９６ウェルフィルタープレート（ＰｒｅＤｉｃｔｏｒ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を、３×２００マイクロリットル／ウェルのＰＢＳ緩衝液で平衡化し、次いで、２００マイクロリットルのｍＡｂ供給物（４ｇ／ｌのｍＡｂを含むＣＨＯ細胞上清）／ウェルを負荷し、３０分間インキュベートした。２００マイクロリットルのＰＢＳで洗浄した後、これらのウェルを２×２００マイクロリットルの５０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ３．５で溶出した。平衡−負荷−洗浄−溶出サイクルを合計５サイクル繰り返し、次いでウェルを平衡化し、蒸留水を添加した。各ステップ（試料負荷、洗浄、溶出、清浄化）の後、液体を真空濾過または遠心分離によって除去した。
【００８６】
清浄化
ウェルを３×２００マイクロリットルの蒸留水で洗浄し、次いで３００マイクロリットルのＣＩＰ溶液１と共に１５分間インキュベートした。ＣＩＰ１溶液を除去した後、これらを２×３００マイクロリットルのＰＢＳおよび２×３００マイクロリットルの水で洗浄した。次にそれらを３００マイクロリットルのＣＩＰ溶液２と共に１５分間インキュベートし、上記のように洗浄した。ＣＩＰ１およびＣＩＰ２溶液を表６に示す。
【００８７】
【表６】
0006732292.tif 000008
【００８８】
分析
ウェル中のマトリックスを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＷＢ  Ｃｙ５標識キットを用いて、５０マイクロリットルの標識緩衝液＋５マイクロリットルのＣｙ５を加え、３０分間インキュベートすることにより、Ｃｙ５蛍光色素で予め標識した。次に、５０マイクロリットルのＳＤＳ−ＤＴＴ緩衝液を加え、マトリックスと共に５分間煮沸した。上清をＡｍｅｒｓｈａｍ  ＷＢ  Ｇｅｌ  Ｃａｒｄに負荷し、予め標識したｍＡｂおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅリガンド参照＋分子量基準のセットとともに流しさせた。このＧｅｌ  Ｃａｒｄをスキャンし、スキャンしたシグナルを積分して、マトリックスから回収された残留汚染物質の量に対応する数値を得た。
【００８９】
結果は、３０ｍＭの過酢酸が１００ｍＭのＮａＯＨとほぼ同じくらい有効であり、１００ｍＭの過酢酸がより有効であることを示している。特に良好な結果は、酸化剤とアルカリの連続的な組み合わせで得られた。
【実施例８】
【００９０】
（清浄化、Ｃａｐｔｏ  Ｌ）
これは、ウェル中にプロテインＬ機能性Ｃａｐｔｏ  Ｌマトリックスを有する２０マイクロリットルのＰｒｅＤｉｃｔｏｒ  Ｃａｐｔｏ  Ｌプレートを使用したこと、および汚染物質が、ｄＡｂのペリプラズム発現を伴う熱処理大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）培養物の上清からなるドメイン抗体（ｄＡｂ）供給物であることを除いて、実施例７と同様に実施した。
【００９１】
【表７】
0006732292.tif 000009
【００９２】
ここでも、過酢酸はかなりの清浄化効果を有し、その効果は１５ｍＭのアルカリとの連続的な組み合わせによりさらに増強される。
【００９３】
本明細書は、最良の様式を含む本発明を開示するため、およびどのような当業者も、任意の装置または系の作製および使用ならびに任意の組み込まれた方法の実行を含む本発明の実践を可能にするために、実施例を使用している。本発明の特許となり得る範囲は特許請求の範囲により規定され、当業者が思いつく他の実施例を含み得る。このような他の実施例は、特許請求の範囲の文面と異ならない構造要素を有する場合、または特許請求の範囲の文面と非実質的な相違を有する等価の構造要素を含む場合、特許請求の範囲内であることが意図される。本文に述べられたすべての特許および特許出願は、それらが個別に組み込まれたかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［実施態様１］
ａ）支持体にカップリングされた耐酸化性タンパク質性リガンドを有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを提供するステップ、
ｂ）前記マトリックスと、式Ｉ、
Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｈ（Ｉ）
（式中、Ｒは水素またはアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ’は、水素またはメチル、エチルもしくはプロピル基である）
によって定義される少なくとも１種の酸化剤を含む衛生化溶液とを接触させるステップ、
を含む、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスを清浄化または衛生化する方法。
［実施態様２］
前記タンパク質性リガンドが、細菌タンパク質に由来する１または複数の免疫グロブリン結合ドメインを含むか、または本質的にそれからなる、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
前記衛生化溶液中の前記酸化剤の濃度が０．０１〜１ｍｏｌ／ｌである、実施態様１または２に記載の方法。
［実施態様４］
前記衛生化溶液のｐＨが２〜１２、例えば２〜４または２〜３である、実施態様１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様５］
前記酸化剤が、過酸化水素、過ギ酸および過酢酸からなる群から選択される、実施態様１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様６］
前記衛生化溶液が、式Ｉにより定義される少なくとも２種の酸化剤の混合物、例えば過酸化水素と、過ギ酸もしくは過酢酸との混合物を含む、実施態様１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様７］
式Ｉにより定義される酸化剤の総濃度が０．０１〜１ｍｏｌ／ｌである、実施態様１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様８］
ステップｂ）において、前記マトリックスを前記衛生化溶液と共に１分〜２４時間、例えば５分〜２４時間または１５分〜３時間インキュベートする、実施態様１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様９］
前記マトリックスが、ステップｂ）の後に、免疫グロブリンのような標的タンパク質に対するその結合容量の少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％を保持する、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１０］
前記細菌タンパク質が、ブドウ球菌プロテインＡ、ペプトストレプトコッカスプロテインＬおよびストレプトコッカスプロテインＧからなる群、例えばストレプトコッカスプロテインＡおよびペプトストレプトコッカスプロテインＬからなる群から選択される実施態様２乃至９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１１］
前記リガンドが、細菌タンパク質に由来する免疫グロブリン結合ドメインのホモ多量体またはヘテロ多量体を含むか、または本質的にそれらからなる、実施態様２乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１２］
前記免疫グロブリン結合ドメインが、ブドウ球菌プロテインＡのドメインＥ、Ｄ、Ａ、ＢもしくはＣと、プロテインＺと、またはペプトストレプトコッカスプロテインＬのドメイン１、２、３、４もしくは５と、少なくとも８０％、例えば少なくとも９０もしくは９５％の相同性を有する、実施態様２乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１３］
前記免疫グロブリン結合ドメインが、配列番号１〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列により定義されるか、またはこれらと少なくとも８０％、例えば少なくとも９０または９５％の配列相同性を有する、実施態様２乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１４］
前記免疫グロブリン結合ドメインが、配列番号１２〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列により定義されるか、またはこれらと少なくとも９０％、例えば少なくとも９５または９８％の配列相同性を有する、実施態様２乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１５］
前記リガンドが、ブドウ球菌プロテインＡまたはブドウ球菌プロテインＡのアルカリ安定化免疫グロブリン結合変異体を含む、実施態様１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１６］
前記リガンドが、ペプトストレプトコッカスプロテインＬまたはペプトストレプトコッカスプロテインＬのアルカリ安定化免疫グロブリン結合変異体を含む、実施態様１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１７］
前記アフィニティークロマトグラフィーマトリックスが、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｌ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ、ＰｒｏＳｅｐ（商標）−Ａ、ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、ＡｂＳｏｌｕｔｅ（商標）、ＣａｐｔｉｖＡ（商標）ＰｒｉＭａｂ（商標）およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉａｍｏｎｄからなる群から選択されるか、またはＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ＬＸ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標）Ａ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡおよびＫａｎＣａｐＡ（商標）からなる群から選択される、実施態様１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１８］
前記支持体が、多孔性粒子または多孔性膜を含む、実施態様１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様１９］
前記支持体が、シリカ、ガラスおよびヒドロキシ官能性ポリマーからなる群から選択される、実施態様１乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２０］
前記支持体が架橋多糖類である、実施態様１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２１］
前記支持体が、架橋アガロース、例えば剛性架橋アガロースである、実施態様１乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２２］
ステップｂ）の前に、ステップａ’）として、前記マトリックスと免疫グロブリンを含む溶液とを接触させ、前記免疫グロブリンを吸着させ、続いて前記マトリックスと溶出溶液とを接触させ、前記免疫グロブリンを脱着させるステップを含む、実施態様２乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２３］
ステップａ’）がステップｂ）の前に少なくとも１０回、例えば少なくとも２５回繰り返される、実施態様２２に記載の方法。
［実施態様２４］
ステップｂ）において、生存細菌、栄養細菌および／または胞子の含量が少なくとも３ｌｏｇ１０、例えば少なくとも５ｌｏｇ１０または少なくとも６ｌｏｇ１０減少する、実施態様１乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２５］
ステップｂ）の後の前記マトリックスのＩｇＧ結合容量が、ステップｂ）の前の前記マトリックスのＩｇＧ結合容量の少なくとも９５％、例えば少なくとも９７％である、実施態様２乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２６］
前記マトリックスがクロマトグラフィーカラムに充填される、実施態様１乃至２５のいずれか１項に記載の方法。
［実施態様２７］
前記クロマトグラフィーが、単回使用カラムまたは熱可塑性およびエラストマー成分で製造されたカラムである、実施態様２６に記載の方法。
［実施態様２８］
式Ｉ、
Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｈ（Ｉ）
（式中、Ｒは水素またはアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ’は、水素またはメチル、エチルもしくはプロピル基である）
によって定義される酸化剤を含む溶液の、支持体にカップリングされた、細菌タンパク質に由来する１または複数の免疫グロブリン結合ドメインを含むか、または本質的にそれらからなるタンパク質性リガンドを有するアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの衛生化のための使用。
［実施態様２９］
実施態様１乃至２７のいずれか１項に記載の方法を含む、実施態様２８に記載の使用。
［実施態様３０］
前記衛生化が、生存細菌胞子濃度の少なくとも５または６ｌｏｇ減少を提供する、実施態様２８または２９に記載の使用。
［実施態様３１］
前記生存細菌胞子濃度の減少がバチルス・ズブチリス胞子を用いて評価される、実施態様３０に記載の使用。
［実施態様３２］
ａ）剛性架橋アガロース支持体にカップリングされた耐酸化性リガンドを有するクロマトグラフィーマトリックスを提供するステップ、
ｂ）前記マトリックスと、式Ｉ、
Ｒ−Ｏ−Ｏ−Ｈ（Ｉ）
（式中、Ｒは水素またはアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ’は、水素またはメチル、エチルもしくはプロピル基である）
によって定義される酸化剤を含む衛生化溶液とを接触させるステップ、
を含む、クロマトグラフィーマトリックスを衛生化する方法。
［実施態様３３］
前記衛生化溶液中の前記酸化剤の濃度が０．０１〜１ｍｏｌ／ｌである、実施態様３２に記載の方法。
［実施態様３４］
前記衛生化溶液のｐＨが２〜１２、例えば２〜４または２〜３である、実施態様３２または３３に記載の方法。
［実施態様３５］
ステップｂ）において、前記マトリックスを前記衛生化溶液と共に１分〜２４時間、例えば５分〜２４時間または１５分〜３時間インキュベートする、実施態様３２乃至３４のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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