(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記ＨＣＶＲが、配列番号３４のアミノ酸配列に含有される３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号４２のアミノ酸配列に含有される３個のＣＤＲ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３６、３８および４０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項３】
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４４、４６および４８のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項４】
配列番号３６／３８／４０／４４／４６／４８のＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列の組み合わせを含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項５】
前記ＨＣＶＲが、配列番号３４のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項６】
前記ＬＣＶＲが、配列番号４２のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項７】
配列番号３４／４２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列ペアを含む、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項８】
請求項７に記載の抗体またはその抗原結合性断片と同じＥＧＦＲｖＩＩＩ上のエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項９】
ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合に関して請求項７に記載の抗体またはその抗原結合性断片と競合する、抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
細胞毒にコンジュゲートされている、請求項１または請求項４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
前記細胞毒が、生体毒素、化学療法剤および放射性同位体からなる群より選択される、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
前記細胞毒が、マイタンシノイド、オーリスタチン、トメイマイシン、デュオカルマイシン、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈおよびこれらのいずれかの誘導体からなる群より選択される、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項１３】
請求項１または請求項４に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１４】
化学療法剤、抗炎症剤および鎮痛薬からなる群より選択される１種または複数の追加的な治療剤をさらに含む、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するがんまたは腫瘍を処置するための、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記がんまたは前記腫瘍が、神経膠芽腫、乳管または乳管内乳癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺がんおよび頭頸部の扁平上皮細胞癌からなる群より選択される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
患者におけるがんを処置するため、腫瘍成長を低下させるため、および／または腫瘍退縮を引き起こすための請求項１３に記載の薬学的組成物であって、抗体またはその抗原結合性断片および細胞毒を含む第１の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含み、前記第１のＡＤＣの前記抗体または前記抗原結合性断片が、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するが、配列番号１４８の接合部ペプチドにも配列番号１６５のペプチドにも結合しない、薬学的組成物。
【請求項１８】
抗体またはその抗原結合性断片および細胞毒を含む第２のＡＤＣをさらに含み、前記第２のＡＤＣの前記抗体または前記抗原結合性断片が、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、かつ配列番号１４８の接合部ペプチドおよび／または配列番号１６５のペプチドにも結合する、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記第１のＡＤＣの前記抗体または前記その抗原結合性断片が、配列番号３６、３８、４０、４４、４６および４８を含む重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域を含む、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記第１のＡＤＣの前記抗体または前記その抗原結合性断片が、配列番号３４を含む重鎖可変領域と、配列番号４２を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記細胞毒がマイタンシノイドである、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記細胞毒が、１−（２クロロエチル）−１，２−ジメタンスルホニルヒドラジド、１，８−ジヒドロキシ−ビシクロ［７．３．１］トリデカ−４，９−ジエン−２，６−ジイン−１３−オン、１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、９−アミノカンプトテシン、アクチノマイシンＤ、アマニチン、アミノプテリン、アングイジン、アントラサイクリン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、オーリスタチン、ブレオマイシン、ブスルファン、酪酸、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルミノマイシン、カルムスチン、セマドチン、シスプラチン、コルヒチン、コンブレタスタチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ダカルバジン、ジアセトキシペンチルドキソルビシン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ジソラゾール、ドラスタチン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、エキノマイシン、エリュテロビン、エメチン、エポチロン、エスペラミシン、エストラムスチン、エチジウムブロマイド、エトポシド、フルオロウラシル、ゲルダナマイシン、グラミシジンＤ、グルココルチコイド、イリノテカン、レプトマイシン、ロイロシン、リドカイン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、マイタンシノイド、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトプテリン、メトトレキセート、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、ポドフィロトキシン、プロカイン、プロプラノロール、プテリジン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）、リゾキシン、ストレプトゾトシン、タリソマイシン、タキソール、テニポシド、テトラカイン、チオテパ、クロラムブシル、トメイマイシン、トポテカン、ツブリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンおよびその誘導体からなる群から選択される、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２３】
前記細胞毒がマイタンシノイドである、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２４】
前記細胞毒がＤＭ１である、請求項１０に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の欠失変異体、特に、クラスＩＩＩ欠失変異体、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するヒト抗体およびヒト抗体の抗原結合性断片、ならびにこれらの抗体を使用する治療および診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体すなわちＥＧＦＲの過剰発現および／または遺伝子増幅は、乳房、卵巣、膀胱、脳における腫瘍および様々な扁平上皮癌を含む複数のヒト腫瘍において報告された（Ｗｏｎｇ，  Ａ．Ｊ．ら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８４巻：６８９９〜６９０３頁；Ｈａｒｒｉｓら、１９９２年、Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  Ｍｏｎｏｇｒ．、１１巻：１８１〜１８７頁）。しかし、多くの正常組織もこの受容体を発現し、新生物標的と共に標的化され得るため、抗新生物治療方法としてのＥＧＦＲの標的化には問題があった。一方、ＥＧＦＲ遺伝子増幅を有する多くの神経膠芽腫が、遺伝子再編成を頻繁に含有することが報告された（Ｅｋｓｔｒａｎｄ，  Ａ．Ｊ．ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：４３０９〜４３１３頁；Ｗｏｎｇ  Ａ．Ｊ．ら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８９巻：２９６５〜２９６９頁）。一研究において、４４種の神経膠芽腫のうち１７種が、ＥＧＦＲコード配列に１個または複数の変更を有することが見いだされ、これらの症例の全てが、増幅されたＥＧＦＲを含有した一方、遺伝子増幅がない２２症例はいずれも、いかなる腫瘍特異的配列異常も示さなかった（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，  Ｌ．ら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０巻：１３８３〜１３８７頁）。同研究は、個々の腫瘍において複数の種類のＥＧＦＲ変異を検出することができたことも示した。
ＥＧＦＲのクラスＩＩＩ改変体（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）は、神経膠芽腫において最も頻繁に見出されるＥＧＦＲ改変体である（Ｂｉｇｎｅｒら、１９９０年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５０巻：８０１７〜８０２２頁；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、１９９０年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７巻：４２０７〜４２１１頁；Ｙａｍａｚａｋｉら、１９９０年、Ｊａｐ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８１巻：７７３〜７７９頁；Ｅｋｓｔｒａｎｄら、１９９２年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９巻：４３０９〜４３１３頁；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５巻：３１４０〜３１４８頁；およびＦｒｅｄｅｒｉｃｋら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０巻：１３８３〜１３８７頁）。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、ＥＧＦＲ遺伝子のエクソン２〜７の欠失によって特徴付けられ、これは、コード領域の８０１塩基対のインフレーム欠失、すなわち、６〜２７３アミノ酸残基の欠失（成熟ＥＧＦＲの残基番号に基づく）、ならびに融合接合部における新たなグリシンの生成をもたらす（Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、１９８８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４８巻：２２３１〜２２３８頁；Ｙａｍａｚａｋｉら、１９９０年、上記参照）。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、リガンド非依存性の、弱いが構成的活性型のキナーゼ活性と、増強された腫瘍形成能を有することが示された（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、１９９４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１巻：７７２７〜７７３１頁；およびＢａｔｒａら、１９９５年、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６巻：１２５１〜１２５９頁）。神経膠腫に加えて、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、乳管（ｄｕｃｔａｌ）および乳管内乳癌（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５巻：３１４０〜３１４８頁）、非小細胞肺癌（Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏら、１９９３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３巻：３２１７〜３２２０頁）、卵巣癌（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５巻：５５３６〜５５３９頁）、前立腺がん（Ｏｌａｐａｄｅ−Ｏｌａｏｐａら、２０００年、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８２巻：１８６〜１９４頁）ならびに頭頸部の扁平上皮細胞癌（Ｔｉｎｈｏｆｅｒら、２０１１年、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７巻（１５号）：５１９７〜５２０４頁）において検出されている。対照的に、上述および他の研究は、正常組織が、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現しないことを報告する（Ｇａｒｃｉａ  ｄｅ  Ｐａｌａｚｚｏら、１９９３年、上記参照；Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら、１９９５年、上記参照；およびＷｉｋｓｔｒａｎｄら、１９９８年、Ｊ  Ｎｅｕｒｏ  Ｖｉｒｏｌ  ４巻：１４８〜１５８頁）。ＥＧＦＲｖＩＩＩの高度に腫瘍特異的な性質は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを、この分子を発現するがんおよび腫瘍の処置に特に有用な標的とする。
ヒトＥＧＦＲの核酸およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１４５および１４６に示し、ＥＧＦＲｖＩＩＩのアミノ酸配列を、配列番号１４７に示す。ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体は、例えば、ＵＳ５，２１２，２９０、ＵＳ７，７３６，６４４、ＵＳ７，５８９，１８０およびＵＳ７，７６７，７９２に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５，２１２，２９０号明細書
【特許文献２】米国特許第７，７３６，６４４号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７年）８４巻：６８９９〜６９０３頁
【非特許文献２】Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．（１９９２年）１１巻：１８１〜１８７頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗体およびその抗原結合性断片を提供する。本発明の抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍細胞の標的化にとりわけ有用である。本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体およびその抗原結合ポーションは、非修飾型で単独で使用しても、抗体−薬物コンジュゲートまたは二重特異的抗体の一部として含まれていてもよい。
【０００６】
本発明の抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）であっても、あるいは抗原結合ポーション（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖ断片）のみを含んでいてもよく、機能性に影響を及ぼすよう、例えば、残存エフェクター機能を排除するよう修飾されていてもよい（Ｒｅｄｄｙら、（２０００年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４巻：１９２５〜１９３３頁）。
【０００７】
本発明の例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、本明細書における表１および２に列挙されている。表１は、例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列識別子を表記する。表２は、例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のＨＣＶＲ、ＬＣＶＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の核酸配列識別子を表記する。
【０００８】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲを含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【０００９】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲを含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１０】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとペアを組んだ表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列ペア（ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙されている例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかの内に含有されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペアは、２／２０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２および１３０／１３８からなる群より選択される。
【００１１】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ１アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１２】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ２アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１３】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１４】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ１アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１５】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ２アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１６】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列または少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。
【００１７】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかとペアを組んだ表１に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかを含むＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペア（ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３）を含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態によると、本発明は、表１に列挙されている例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかの内に含有されるＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ３アミノ酸配列ペアを含む抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００１８】
本発明は、表１に列挙されている例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかの内に含有される６個のＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片も提供する。ある特定の実施形態では、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットは、４−６−８−１２−１４−１６；２０−２２−２４−２８−３０−３２；３６−３８−４０−４４−４６−４８；５２−５４−５６−６０−６２−６４；６８−７０−７２−７６−７８−８０；８４−８６−８８−９２−９４−９６；１００−１０２−１０４−１０８−１１０−１１２；１１６−１１８−１２０−１２４−１２６−１２８；および１３２−１３４−１３６−１４０−１４２−１４４からなる群より選択される。
【００１９】
関連する実施形態では、本発明は、表１に列挙されている例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかによって定義されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内に含有される６個のＣＤＲ（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）のセットを含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を提供する。例えば、本発明は、１８／２６；６６／７４；２７４／２８２；２９０／２９８；および３７０／３７８からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列ペア内に含有されるＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３−ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットを含む、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲを同定するための方法および技法は、本技術分野において周知のものであり、本明細書に開示されている規定のＨＣＶＲおよび／またはＬＣＶＲアミノ酸配列内のＣＤＲの同定に使用することができる。ＣＤＲの境界の同定に使用することのできる例示的な慣例として、例えば、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義およびＡｂＭ定義が挙げられる。一般用語において、Ｋａｂａｔ定義は、配列可変性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造的ループ領域の位置に基づき、ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａアプローチの折衷である。例えば、Ｋａｂａｔ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９９１年）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２７３巻：９２７〜９４８頁（１９９７年）；およびＭａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６巻：９２６８〜９２７２頁（１９８９年）を参照されたい。抗体内のＣＤＲ配列を同定するために、公開データベースを利用することもできる。
【００２０】
本発明は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはそのポーションをコードする核酸分子も提供する。例えば、本発明は、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＶＲ核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＶＲ核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＤＲ１核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＤＲ２核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
本発明は、表１に列挙されているＨＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＤＲ３核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ１アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＤＲ１核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ２アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＤＲ２核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
本発明は、表１に列挙されているＬＣＤＲ３アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する；ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＬＣＤＲ３核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
本発明は、ＨＣＶＲをコードする核酸分子であって、前記ＨＣＶＲが、３個のＣＤＲのセット（すなわち、ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３）を含み、前記ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３アミノ酸配列セットが、表１に列挙されている例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかによって定義される核酸分子も提供する。
【００２９】
本発明は、ＬＣＶＲをコードする核酸分子であって、前記ＬＣＶＲが、３個のＣＤＲのセット（すなわち、ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、前記ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３アミノ酸配列セットが、表１に列挙されている例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかによって定義される核酸分子も提供する。
【００３０】
本発明は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの両方をコードする核酸分子であって、前記ＨＣＶＲが、表１に列挙されているＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＶＲが、表１に列挙されているＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む核酸分子も提供する。ある特定の実施形態では、核酸分子は、表２に列挙されているＨＣＶＲ核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列と、表２に列挙されているＬＣＶＲ核酸配列またはそれに対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有するその実質的に同様の配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列とを含む。本発明の本態様に係るある特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲをコードし、前記ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは両者共に、表１に列挙されている同じ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に由来する。
【００３１】
本発明は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の重または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組換え発現ベクターも提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表１に表記されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲ配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組換え発現ベクターを含む。係るベクターが導入された宿主細胞と共に、前記抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養し、このようにして産生された前記抗体および抗体断片を回収することにより前記抗体またはそのポーションを産生する方法も、本発明の範囲内に含まれる。
【００３２】
本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む。一部の実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去するための修飾、あるいは例えば、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）機能を増加させるために、オリゴ糖鎖に存在するフコース部分を欠く抗体が有用となることもある（Ｓｈｉｅｌｄら（２００２年）ＪＢＣ  ２７７巻：２６７３３頁を参照）。他の適用では、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を修飾するために、ガラクトシル化の修飾を行うことができる。
【００３３】
別の態様では、本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する組換えヒト抗体またはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。関連する態様では、本発明は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体および第２の治療剤の組み合わせである組成物を特色とする。一実施形態では、第２の治療剤は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と有利に組み合わされるいずれかの薬剤である。本発明は、細胞傷害性薬剤にコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）も提供する。本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に関与する例示的な併用療法、同時製剤およびＡＤＣは、本明細書の他の箇所に開示されている。
【００３４】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体または抗体の抗原結合ポーションを使用して、腫瘍細胞を殺傷するためまたは腫瘍細胞成長を阻害もしくは減衰させるための治療方法を提供する。本発明の本態様に係る治療方法は、本発明の抗体または抗体の抗原結合性断片を含む治療有効量の薬学的組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む。処置される障害は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的化することによりおよび／またはＥＧＦＲｖＩＩＩによるリガンド媒介性細胞シグナリングを阻害することにより向上、改善、阻害または予防されるいずれかの疾患または状態である。
【００３５】
他の実施形態は、次の詳細な説明の総説から明らかになるであろう。他の実施形態は、次の詳細な説明の総説から明らかになるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、
（ｉ）配列番号１４８の接合部ペプチドにも、
（ｉｉ）配列番号１６５のペプチドにも
結合しない、抗体またはその抗原結合性断片。
（項目２）
表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される、約５０ｎＭもしくはそれに満たない、約２０ｎＭもしくはそれに満たない、約１０ｎＭもしくはそれに満たない、約５．０ｎＭもしくはそれに満たない、約１．０ｎＭもしくはそれに満たない、または約０．５ｎＭもしくはそれに満たない、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ二量体に対する平衡解離定数（ＫＤ）を示す、項目１に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目３）
表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される、ＥＧＦＲｖＩＩＩ二量体に対するＫＤよりも少なくとも約４倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２０００倍または少なくとも約３０００倍高い、ヒトＥＧＦＲ二量体に対するＫＤを示す、項目２に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目４）
表面プラズモン共鳴アッセイによって検出可能なレベルではＥＧＦＲ二量体に結合しない、項目３に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目５）
前記抗体またはその断片が、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、前記ＨＣＶＲが、配列番号３４のアミノ酸配列に含有される３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＶＲが、配列番号４２のアミノ酸配列に含有される３個のＣＤＲ、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、項目１に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目６）
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が、それぞれ配列番号３６、３８および４０のアミノ酸配列を含む、項目５に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目７）
ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４４、４６および４８のアミノ酸配列を含む、項目５または６に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目８）
ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合性断片であって、配列番号４／６／８／１２／１４／１６、２０／２２／２４／２８／３０／３２、３６／３８／４０／４４／４６／４８、５２／５４／５６／６０／６２／６４、６８／７０／７２／７６／７８／８０、８４／８６／８８／９２／９４／９６、１００／１０２／１０４／１０８／１１０／１１２、１１６／１１８／１２０／１２４／１２６／１２８および１３２／１３４／１３６／１４０／１４２／１４４からなる群より選択されるＨＣＤＲ１／ＨＣＤＲ２／ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１／ＬＣＤＲ２／ＬＣＤＲ３の組み合わせである、抗体またはその抗原結合性断片。
（項目９）
前記ＨＣＶＲが、配列番号２、１８、３４、５０、６６、８２、９８、１１４および１３０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目８に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目１０）
前記ＬＣＶＲが、配列番号１０、２６、４２、５８、７４、９０、１０６、１２２および１３８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目８に記載の抗体または抗
原結合性断片。
（項目１１）
配列番号２／１０、１８／２６、３４／４２、５０／５８、６６／７４、８２／９０、９８／１０６、１１４／１２２および１３０／１３８からなる群より選択されるＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列ペアを含む、項目８に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目１２）
配列番号３４／４２のＨＣＶＲ／ＬＣＶＲ配列ペアを含む、項目８に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目１３）
項目１２に記載の抗体または抗原結合性断片と同じＥＧＦＲｖＩＩＩ上のエピトープに結合する、抗体またはその抗原結合性断片。
（項目１４）
ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合に関して項目１２に記載の抗体または抗原結合性断片と競合する、抗体またはその抗原結合性断片。
（項目１５）
細胞毒にコンジュゲートされている、項目１に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目１６）
前記細胞毒が、生体毒素、化学療法剤および放射性同位体からなる群より選択される、項目１５に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目１７）
前記細胞毒が、マイタンシノイド、オーリスタチン、トメイマイシン、デュオカルマイシン、２２５Ａｃ、２２７Ｔｈおよびこれらのいずれかの誘導体からなる群より選択される、項目１５に記載の抗体または抗原結合性断片。
（項目１８）
項目１に記載の抗体または抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
（項目１９）
化学療法剤、抗炎症剤および鎮痛薬からなる群より選択される１種または複数の追加的な治療剤をさらに含む、項目１８に記載の薬学的組成物。
（項目２０）
ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するがんまたは腫瘍を処置するための方法であって、それを必要とする被験体に、治療有効量の項目１８に記載の薬学的組成物を投与するステップを含む、方法。
（項目２１）
前記がんまたは前記腫瘍が、神経膠芽腫、乳管または乳管内乳癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺がんおよび頭頸部の扁平上皮細胞癌からなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
患者におけるがんを処置するため、腫瘍成長を低下させるため、および／または腫瘍退縮を引き起こすための方法であって、それを必要とする患者に、抗体またはその抗原結合性断片および細胞毒を含む第１の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を投与するステップを含み、前記第１のＡＤＣの前記抗体または前記抗原結合性断片が、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するが、配列番号１４８の接合部ペプチドにも配列番号１６５のペプチドにも結合しない、方法。
（項目２３）
前記患者に、抗体またはその抗原結合性断片および細胞毒を含む第２のＡＤＣを投与するステップをさらに含み、前記第２のＡＤＣの前記抗体または前記抗原結合性断片が、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、かつ配列番号１４８の接合部ペプチドおよび／または配列番号１６５のペプチドにも結合する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のＡＤＣの前記抗体または前記抗原結合性断片が、配列番号３６、３８、４０、４４、４６および４８を含む重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記第１のＡＤＣの前記抗体または前記抗原結合性断片が、配列番号３４を含む重鎖可変領域と、配列番号４２を含む軽鎖可変領域とを含む、項目２４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１ａ】図１は、還元（上パネル）および非還元（下パネル）条件下で、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体［すなわち、図１ａにおけるＨ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）ならびに対照ＩおよびＩＩ；ならびに図１ｂにおけるＨ１Ｈ１９１１、Ｈ１Ｈ１９１２およびＨ１Ｈ１９１５］または抗Ｈｉｓ抗体を使用した、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩのウエスタンブロットの結果を示す。レーン１および６：１０μｌのＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（商標）標準（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））；レーン２および７：４００ｎｇのｈＥＧＦＲ−ｍｍｈ（配列番号１５４）；レーン３および８：４００ｎｇのｈＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｍｈ（配列番号１５２）；ならびにレーン４、５、９および１０：スペース。対照Ｉ：米国特許第７，７３６，６４４号に開示されているヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチド抗体（ＩｇＧ１）；および対照ＩＩ：米国特許第７，５８９，１８０号に開示されているキメラ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＥＧＦＲ抗体。
【図１ｂ】図１は、還元（上パネル）および非還元（下パネル）条件下で、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体［すなわち、図１ａにおけるＨ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）ならびに対照ＩおよびＩＩ；ならびに図１ｂにおけるＨ１Ｈ１９１１、Ｈ１Ｈ１９１２およびＨ１Ｈ１９１５］または抗Ｈｉｓ抗体を使用した、ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩのウエスタンブロットの結果を示す。レーン１および６：１０μｌのＢＥＮＣＨＭＡＲＫ（商標）標準（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））；レーン２および７：４００ｎｇのｈＥＧＦＲ−ｍｍｈ（配列番号１５４）；レーン３および８：４００ｎｇのｈＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｍｈ（配列番号１５２）；ならびにレーン４、５、９および１０：スペース。対照Ｉ：米国特許第７，７３６，６４４号に開示されているヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチド抗体（ＩｇＧ１）；および対照ＩＩ：米国特許第７，５８９，１８０号に開示されているキメラ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ／ＥＧＦＲ抗体。
【００３７】
【図２】図２は、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）の結合特徴を示す。それぞれＣ末端においてリンカーを介してビオチンにタグ付けされた、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチドまたはＥＧＦＲの残基３１１〜３２６のペプチド（「ＥＧＦＲ３１１〜３２６ペプチド」）を、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＲＥＤ機器におけるストレプトアビジンコーティングされたＯＣＴＥＴ（登録商標）チップに捕捉し、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）または対照Ｉ〜ＩＩＩと反応させた。対照ＩおよびＩＩ：上に同じ；ならびに対照ＩＩＩ：米国特許出願公開第２０１０／００５６７６２号に開示されているヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（ｈＩｇＧ１）。（白抜き）：Ｃ末端ビオチン標識ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチド（配列番号１４９）；および（黒塗り）：Ｃ末端ビオチン標識ＥＧＦＲ３１１−３２６ペプチド（配列番号１５１）。
【００３８】
【図３】図３は、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ）による抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍＡｂの内部移行を示す。細胞表面に結合した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体および対照抗体を、色素コンジュゲートされた二次抗体（Ｆａｂ）によって検出した；画像を４０×で取得し、内部移行した小胞を定量化した。対照ＩおよびＩＩ：上に同じ；ならびに対照ＩＶ：米国特許第７，０６０，８０８号に開示されているキメラ抗ＥＧＦＲ抗体。（白抜き）：３７℃における内部移行；および（黒塗り）：４℃における内部移行。
【００３９】
【図４ａ】図４は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて異種移植されたＢ１６Ｆ１０．９腫瘍またはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＢ１６Ｆ１０．９腫瘍（Ｂ１６Ｆ１０．９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ）による、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）の結合および内部移行を示す。細胞表面に結合した（図４ａ）または細胞表面に結合しかつ内部移行した（図４ｂ）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはアイソタイプ対照抗体を、フローサイトメトリーを使用して、アロフィコシアニンコンジュゲートされた抗ヒトＦｃ（ｈＦｃ−ＡＰＣ）抗体によって検出した。抗体注射後１０分目（白抜き）、４時間目（斜線）および２４時間目（黒塗り）の平均蛍光強度（ＭＩＦ）を示す。
【図４ｂ】図４は、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおいて異種移植されたＢ１６Ｆ１０．９腫瘍またはＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＢ１６Ｆ１０．９腫瘍（Ｂ１６Ｆ１０．９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ）による、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）の結合および内部移行を示す。細胞表面に結合した（図４ａ）または細胞表面に結合しかつ内部移行した（図４ｂ）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはアイソタイプ対照抗体を、フローサイトメトリーを使用して、アロフィコシアニンコンジュゲートされた抗ヒトＦｃ（ｈＦｃ−ＡＰＣ）抗体によって検出した。抗体注射後１０分目（白抜き）、４時間目（斜線）および２４時間目（黒塗り）の平均蛍光強度（ＭＩＦ）を示す。
【００４０】
【図５ａ−ｂ】図５は、野生型マウス（黒丸）またはヒトＥＧＦＲを発現するマウス（黒四角）における、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体Ｈ１Ｈ８６３Ｎ２（Ｆｕｃ＋）（図５ｄ）ならびに対照抗体（上述の通り）、すなわち、対照Ｉ（図５ｂ）、対照ＩＩＩ（図５ｃ）および対照ＩＶ（図５ａ）の薬物動態解析の結果を示す。
【図５ｃ−ｄ】図５は、野生型マウス（黒丸）またはヒトＥＧＦＲを発現するマウス（黒四角）における、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体Ｈ１Ｈ８６３Ｎ２（Ｆｕｃ＋）（図５ｄ）ならびに対照抗体（上述の通り）、すなわち、対照Ｉ（図５ｂ）、対照ＩＩＩ（図５ｃ）および対照ＩＶ（図５ａ）の薬物動態解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明について記載する前に、記載されている特定の方法および実験条件は変動し得るため、本発明が、係る方法および条件に限定されないことを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書において使用されている用語法が、単に特定の実施形態を説明するためのものであり、限定を企図しないことも理解されたい。
【００４２】
他に断りがなければ、本明細書において使用されているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において、用語「約」は、特定の列挙されている数値に関連して使用されている場合、値が、列挙されている値から１％以下で変動し得ることを意味する。例えば、本明細書において、表現「約１００」は、９９および１０１ならびにその間のあらゆる値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４等）を含む。
【００４３】
本発明の実施または検査において、本明細書に記載されている方法および材料と類似または同等のいかなる方法および材料を使用してもよいが、好ましい方法および材料を次に説明する。本明細書に言及されているあらゆる特許、出願および非特許刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４４】
定義
用語「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、本明細書において、他に特に指示されていなければ、正常に発現されるＥＧＦＲに共通した特徴とは対照的に、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的ないずれかの特徴を示す、配列番号１４７に示すアミノ酸配列を有するヒトＥＧＦＲクラスＩＩＩ改変体またはその生物学的に活性な断片を指す。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、成熟ＥＧＦＲのアミノ酸残基６から２７３を欠き（すなわち、シグナルペプチド、すなわち、残基１〜２４なしの配列番号１４６）、アミノ酸残基５〜２７４の間の６位に新たなグリシン残基を含有する。
【００４５】
本明細書におけるタンパク質、ポリペプチドおよびタンパク質断片のあらゆる参照は、非ヒト種に由来すると明確に指定されない限り、それぞれのタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質断片のヒトバージョンを指すよう企図されている。よって、表現「ＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、例えば「マウスＥＧＦＲｖＩＩＩ」、「サルＥＧＦＲｖＩＩＩ」等のように非ヒト種に由来すると指定されない限り、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩを意味する。
【００４６】
本明細書において、表現「細胞表面に発現されたＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の少なくとも一ポーションが、細胞膜の細胞外側に露出され、抗体の抗原結合ポーションに到達できるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞の表面に発現される、１種もしくは複数のＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質（複数可）またはその細胞外ドメインを意味する。「細胞表面に発現されたＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を正常に発現する細胞の表面に発現されたＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を含む、またはこれからなることができる。あるいは、「細胞表面に発現されたＥＧＦＲｖＩＩＩ」は、その表面にヒトＥＧＦＲｖＩＩＩを正常には発現しないが、その表面にＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するように人為的に操作された、細胞の表面に発現されたＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を含む、またはこれからなることができる。
【００４７】
本明細書において、表現「抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体」は、単一特異性を有する一価抗体、ならびにＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する第１のアームおよび第２の（標的）抗原に結合する第２のアームを含む二重特異的抗体の両方を含み、前記抗ＥＧＦＲｖＩＩＩアームは、本明細書における表１に表記されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかを含む。表現「抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体」は、薬物または毒素（すなわち、細胞傷害性薬剤）にコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはその抗原結合ポーションを含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）も含む。表現「抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体」は、放射性核種にコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはその抗原結合ポーションを含む抗体−放射性核種コンジュゲート（ＡＲＣ）も含む。
【００４８】
用語「抗体」は、本明細書において、特定の抗原（例えば、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）に特異的に結合するまたはこれと相互作用する、少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むいずれかの抗原結合分子または分子複合体を意味する。用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖である４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲまたはＶＨと省略）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３個のドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲまたはＶＬと省略）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１個のドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と命名されたより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と命名された超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４に配置された、３個のＣＤＲおよび４個のＦＲで構成されている。本発明の異なる実施形態では、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（またはその抗原結合ポーション）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であっても、あるいは天然にまたは人為的に修飾されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２種またはそれを超えるＣＤＲの対比（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ）解析に基づき定義することができる。
【００４９】
用語「抗体」は、本明細書において、完全抗体分子の抗原結合性断片も含む。用語、抗体の「抗原結合ポーション」、抗体の「抗原結合性断片」その他は、本明細書において、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、いずれかの天然に存在する、酵素により得ることができる、合成のまたは遺伝子改変されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合性断片は、例えば、タンパク質分解による消化または抗体可変ドメインおよび任意選択で抗体定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子操作技法等、いずれかの適した標準技法を使用して、完全抗体分子から得られ得る。係るＤＮＡは、公知であるおよび／または例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手することができる、または合成することができる。ＤＮＡを配列決定し、化学的にまたは分子生物学的技法を使用することにより操作して、例えば、適した構成へと１種または複数の可変および／または定常ドメインを配置する、あるいはコドンを導入する、システイン残基を作出する、アミノ酸を修飾、付加または欠失させること等ができる。
【００５０】
抗原結合性断片の非限定例として、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片；（ｉｖ）Ｆｖ断片；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂ断片；および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位（例えば、ＣＤＲ３ペプチド等、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））または制約されたＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ペプチドが挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディ等）、小モジュラー免疫医薬（ｓｍａｌｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（ＳＭＩＰ）およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメイン等、他の操作された分子も、本明細書における表現「抗原結合性断片」の内に包含される。
【００５１】
抗体の抗原結合性断片は、典型的に、少なくとも１個の可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、いかなるサイズまたはアミノ酸組成のものであってもよく、一般に、１個または複数のフレームワーク配列に隣接するまたはこれとインフレームの少なくとも１個のＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインと会合するＶＨドメインを有する抗原結合性断片において、ＶＨおよびＶＬドメインは、いずれか適した配置において互いに対して位置することができる。例えば、可変領域は、二量体となり、ＶＨ−ＶＨ、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＬ二量体を含有することができる。あるいは、抗体の抗原結合性断片は、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有することができる。
【００５２】
ある特定の実施形態では、抗体の抗原結合性断片は、少なくとも１個の定常ドメインに共有結合により連結された少なくとも１個の可変ドメインを含有することができる。本発明の抗体の抗原結合性断片内に見出すことができる可変および定常ドメインの非限定的な例示的構成として、以下が挙げられる：（ｉ）ＶＨ−ＣＨ１；（ｉｉ）ＶＨ−ＣＨ２；（ｉｉｉ）ＶＨ−ＣＨ３；（ｉｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｖ）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉ）ＶＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｖｉｉ）ＶＨ−ＣＬ；（ｖｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１；（ｉｘ）ＶＬ−ＣＨ２；（ｘ）ＶＬ−ＣＨ３；（ｘｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２；（ｘｉｉ）ＶＬ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（ｘｉｉｉ）ＶＬ−ＣＨ２−ＣＨ３；および（ｘｉｖ）ＶＬ−ＣＬ。上に列挙する例示的構成のいずれかを含む、可変および定常ドメインのいずれかの構成において、可変および定常ドメインは、互いに直接的に連結されていても、完全または部分的ヒンジまたはリンカー領域により連結されていてもよい。ヒンジ領域は、少なくとも２個（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個以上）のアミノ酸からなることができ、これにより、単一ポリペプチド分子における隣接する可変および／または定常ドメインの間に可撓性または半可撓性連結がもたらされる。さらに、本発明の抗体の抗原結合性断片は、互いにおよび／または１個または複数の単量体ＶＨまたはＶＬドメインと非共有結合的に会合した（例えば、ジスルフィド結合（複数可）により）、上に列挙する可変および定常ドメイン構成のうちいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含むことができる。
【００５３】
完全抗体分子と同様に、抗原結合性断片は、単一特異的または多特異的（例えば、二重特異的）となり得る。抗体の多特異的抗原結合性断片は、典型的に、少なくとも２個の異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別々の抗原にまたは同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することができるであろう。本明細書に開示されている例示的な二重特異的抗体フォーマットを含むいずれかの多特異的抗体フォーマットは、本技術分野で利用できる慣用的な技法を使用して、本発明の抗体の抗原結合性断片の文脈における使用に適合させることができる。
【００５４】
本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して機能することができる。「補体依存性細胞傷害」（ＣＤＣ）は、補体の存在下における、本発明の抗体による抗原発現細胞の溶解を指す。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）が、標的細胞における結合された抗体を認識し、これにより標的細胞の溶解をもたらす細胞媒介性反応を指す。ＣＤＣおよびＡＤＣＣは、本技術分野で周知かつ利用できるアッセイを使用して測定することができる（例えば、米国特許第５，５００，３６２号および同第５，８２１，３３７号ならびにＣｌｙｎｅｓら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （ＵＳＡ）  ９５巻：６５２〜６５６頁を参照）。抗体の定常領域は、補体を固定し、細胞依存性細胞傷害を媒介する抗体の能力において重要である。よって、抗体のアイソタイプは、抗体が細胞傷害を媒介するのに望ましいか否かに基づいて選択することができる。
【００５５】
本発明のある特定の実施形態では、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ヒト抗体である。用語「ヒト抗体」は、本明細書において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むように企図されている。本発明のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異によって導入された変異）。しかし、用語「ヒト抗体」は、本明細書において、マウス等、別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むようには企図されていない。
【００５６】
本発明の抗体は、一部の実施形態では、組換えヒト抗体となり得る。用語「組換えヒト抗体」は、本明細書において、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体（さらに後述する）、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（さらに後述する）、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０巻：６２８７〜６２９５頁を参照）、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与する他のいずれかの手段によって調製、発現、作出もしくは単離された抗体等、組換え手段によって調製、発現、作出または単離されたあらゆるヒト抗体を含むよう企図されている。係る組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかし、ある特定の実施形態では、係る組換えヒト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列のトランスジェニックである動物が使用される場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞変異誘発）に付され、これにより、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、これに関係するが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しなくてよい配列となる。
【００５７】
ヒト抗体は、ヒンジ不均一性に関連する２種の形態で存在することができる。一形態において、免疫グロブリン分子は、二量体が鎖間重鎖ジスルフィド結合によって結び付けられた、およそ１５０〜１６０ｋＤａの安定的４鎖構築物を含む。第２の形態において、二量体は、鎖間ジスルフィド結合により連結されず、約７５〜８０ｋＤａの分子が、共有結合によりカップリングされた軽および重鎖で構成されて形成される（半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ））。これらの形態は、親和性精製後であっても、分離が極めて困難であった。
【００５８】
様々なインタクトＩｇＧアイソタイプにおける第２の形態の出現頻度は、抗体のヒンジ領域アイソタイプに関連する構造の差によるが、これに限定されない。ヒトＩｇＧ４ヒンジのヒンジ領域における単一のアミノ酸置換は、ヒトＩｇＧ１ヒンジを使用して典型的に観察されるレベルまで、第２の形態の出現を有意に低下させることができる（Ａｎｇａｌら（１９９３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３０巻：１０５頁）。本発明は、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３領域に１個または複数の変異を有する抗体を包含し、これは、例えば、所望の抗体形態の収量を向上するための産生において望ましくなり得る。
【００５９】
本発明の抗体は、単離された抗体となり得る。「単離された抗体」は、本明細書において、その天然の環境の少なくとも１種の構成成分から同定および分離および／または回収された抗体を意味する。例えば、生物の少なくとも１個の構成成分からまたは抗体が天然に存在するもしくは天然に産生される組織もしくは細胞から分離または取り出された抗体は、本発明の目的のための「単離された抗体」である。単離された抗体は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕにおける抗体も含む。単離された抗体は、少なくとも１種の精製または単離ステップに付された抗体である。ある特定の実施形態によると、単離された抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてよい。
【００６０】
本明細書に開示される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、この抗体が得られた相当する生殖系列配列と比較して、重および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域に１個または複数のアミノ酸置換、挿入および／または欠失を含むことができる。係る変異は、本明細書に開示されているアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手できる生殖系列配列と比較することによって容易に確認することができる。本発明は、本明細書に開示されているアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合性断片を含み、１個または複数のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１個または複数のアミノ酸は、抗体が由来する生殖系列配列の相当する残基（複数可）へと、または別のヒト生殖系列配列の相当する残基（複数可）へと、または相当する生殖系列残基（複数可）の保存的アミノ酸置換へと変異されている（係る配列変化は、本明細書において、「生殖系列変異」とまとめて称される）。当業者であれば、本明細書に開示されている重および軽鎖可変領域配列から始めて、１個または複数の個々の生殖系列変異またはその組み合わせを含む多数の抗体および抗原結合性断片を容易に産生することができる。ある特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基の全てが、抗体が由来する本来の生殖系列配列に見出される残基へと逆変異されている。他の実施形態では、ある特定の残基のみが、例えば、ＦＲ１の最初の８アミノ酸の内もしくはＦＲ４の最後の８アミノ酸の内に見出される変異された残基のみまたはＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３の内に見出される変異された残基のみが、本来の生殖系列配列へと逆変異されている。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基（複数可）のうち１個または複数が、異なる生殖系列配列（すなわち、抗体が本来由来する生殖系列配列とは異なる生殖系列配列）の相当する残基（複数可）へと変異されている。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の２個以上の生殖系列変異のいかなる組み合わせを含有することもできる、例えば、ある特定の個々の残基は、特定の生殖系列配列の相当する残基へと変異されるが、本来の生殖系列配列とは異なるある特定の他の残基は、維持される、あるいは異なる生殖系列配列の相当する残基へと変異される。１個または複数の生殖系列変異を含有する抗体および抗原結合性断片を得たら、結合特異性の向上、結合親和性の増加、アンタゴニストまたはアゴニスト性の生物学的特性の向上または増強（場合による）、免疫原性の低下等、１種または複数の所望の特性に関して容易に検査することができる。このような一般的な様式で得られる抗体および抗原結合性断片は、本発明の範囲内に包含される。
【００６１】
本発明はまた、１個または複数の保存的置換を有する、本明細書に開示されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかの改変体を含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む。例えば、本発明は、本明細書の表１に示されているＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかと比べて、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下等の保存的アミノ酸置換を有するＨＣＶＲ、ＬＣＶＲおよび／またはＣＤＲアミノ酸配列を有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む。
【００６２】
用語「エピトープ」は、本明細書において、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域における特異的な抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、２個以上のエピトープを有し得る。よって、異なる抗体は、抗原における異なる区域に結合することができ、異なる生物学的効果を有することができる。エピトープは、コンフォメーション性または直鎖状のいずれであってもよい。コンフォメーション性エピトープは、直鎖状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直鎖状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基によって産生されるエピトープである。ある特定の状況において、エピトープは、抗原における糖類、ホスホリル基またはスルホニル基の部分を含むことができる。
【００６３】
用語「実質的同一性」または「実質的に同一」は、核酸またはその断片について言及する場合、後述するＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐ等、配列同一性のいずれか周知のアルゴリズムによって測定され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を用いて別の核酸（またはその相補ストランド）と最適に整列されたときに、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参照核酸分子に対し実質的同一性を有する核酸分子は、ある特定の事例において、参照核酸分子にコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。
【００６４】
ポリペプチドに適用する場合、用語「実質的類似性」または「実質的に類似の」は、２種のペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴ等により最適に整列されたときに、少なくとも９５％配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基ポジションは、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換される置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させないであろう。２種以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合、パーセント配列同一性または類似性の程度は、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整することができる。この調整を行うための手段は、当業者に周知のものである。例えば、参考として本明細書に援用されるＰｅａｒｓｏｎ（１９９４年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２４巻：３０７〜３３１頁を参照のこと。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例として、（１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；（２）脂肪族−ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；（３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；（４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；（５）塩基性側鎖：リジン、アルギニンおよびヒスチジン；（６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに（７）硫黄含有側鎖がシステインおよびメチオニンであることが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置き換えは、参考として本明細書に援用されるＧｏｎｎｅｔら、（１９９２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６巻：１４４３〜１４４５頁に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有するいずれかの変化である。「中程度に保存的」置き換えは、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有するいずれかの変化である。
【００６５】
配列同一性とも称されるポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して類似の配列を一致させる。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、デフォルトパラメータにより使用して、異なる生物種由来の相同ポリペプチド等、密接に関係したポリペプチドの間、あるいは野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定することのできるＧａｐおよびＢｅｓｔｆｉｔ等のプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、デフォルトまたは推奨されるパラメータを用いてＦＡＳＴＡを使用して比較することもできる。ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラムＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、アライメントならびに問い合わせおよび検索配列間の最良の重複の領域のパーセント配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ（２０００年）上記参照）。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する際の別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用したコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、それぞれ参考として本明細書に援用されるＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３  ４１０頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３８９  ４０２頁を参照のこと。
【００６６】
ｐＨ依存性結合
本発明は、ｐＨ依存性結合特徴を有する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む。例えば、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合低下を示すことができる。あるいは、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合増強を示すことができる。表現「酸性ｐＨ」は、約６．２未満の、例えば、約６．０、５．９５、５．９、５．８５、５．８、５．７５、５．７、５．６５、５．６、５．５５、５．５、５．４５、５．４、５．３５、５．３、５．２５、５．２、５．１５、５．１、５．０５、５．０またはそれに満たないｐＨ値を含む。本明細書において、表現「中性ｐＨ」は、約７．０〜約７．４のｐＨを意味する。表現「中性ｐＨ」は、約７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５および７．４のｐＨ値を含む。
【００６７】
ある特定の事例において、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合低下」は、中性ｐＨにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩへの抗体結合のＫＤ値に対する、酸性ｐＨにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩへの抗体結合のＫＤ値の比の観点から表現される（または逆もまた同じ）。例えば、抗体またはその抗原結合性断片が、約３．０またはそれより大きい酸性／中性ＫＤ比を示す場合、抗体またはその抗原結合性断片は、本発明の目的のため、「中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合低下」を示すと考慮することができる。ある特定の例示的な実施形態では、本発明の抗体または抗原結合性断片の酸性／中性ＫＤ比は、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、４０．０、５０．０、６０．０、７０．０、１００．０またはそれより大きくなることができる。
【００６８】
ｐＨ依存性結合特徴を有する抗体は、例えば、中性ｐＨと比較して、酸性ｐＨにおける特定の抗原への結合低下（または増強）に関して抗体の集団をスクリーニングすることにより得ることができる。その上、アミノ酸レベルにおける抗原結合ドメインの修飾は、ｐＨ依存性特徴を有する抗体を生じることができる。例えば、抗原結合ドメイン（例えば、ＣＤＲ内の）の１個または複数のアミノ酸をヒスチジン残基に置換することにより、中性ｐＨと比べて酸性ｐＨにおいて抗原結合が低下した抗体を得ることができる。
【００６９】
Ｆｃ改変体を含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体
本発明のある特定の実施形態によると、例えば、中性ｐＨと比較して酸性ｐＨにおいて、ＦｃＲｎ受容体への抗体結合を増強または減弱化する１個または複数の変異を含むＦｃドメインを含む、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が提供される。例えば、本発明は、ＦｃドメインのＣＨ２またはＣＨ３領域に変異を含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含み、前記変異（複数可）は、酸性環境（例えば、ｐＨが約５．５〜約６．０に及ぶエンドソーム）におけるＦｃＲｎに対するＦｃドメインの親和性を増加させる。係る変異は、動物に投与される際に、抗体の血清半減期の増加をもたらすことができる。係るＦｃ修飾の非限定例として、例えば、２５０（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８（例えば、ＬまたはＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（例えば、ＳまたはＴ）および２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）位における修飾；または４２８および／もしくは４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／もしくは４３４（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、ＦまたはＹ［Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｗ、Ｎ４３４Ｈ、Ｎ４３４ＦまたはＮ４３４Ｙ］）位における修飾；または２５０および／もしくは４２８位における修飾；または３０７もしくは３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４位における修飾が挙げられる。一実施形態では、修飾は、４２８Ｌ（例えば、Ｍ４２８Ｌ）および４３４Ｓ（例えば、Ｎ４３４Ｓ）修飾；４２８Ｌ、２５９Ｉ（例えば、Ｖ２５９Ｉ）および３０８Ｆ（例えば、Ｖ３０８Ｆ）修飾；４３３Ｋ（例えば、Ｈ４３３Ｋ）および４３４（例えば、４３４Ｙ）修飾；２５２、２５４および２５６（例えば、２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ）修飾；２５０Ｑおよび４２８Ｌ修飾（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ）；ならびに３０７および／または３０８修飾（例えば、３０８Ｆまたは３０８Ｐ）を含む。さらに別の実施形態では、修飾は、２６５Ａ（例えば、Ｄ２６５Ａ）および／または２９７Ａ（例えば、Ｎ２９７Ａ）修飾を含む。
【００７０】
例えば、本発明は、２５０Ｑおよび２４８Ｌ（例えば、Ｔ２５０ＱおよびＭ２４８Ｌ）；２５２Ｙ、２５４Ｔおよび２５６Ｅ（例えば、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）；４２８Ｌおよび４３４Ｓ（例えば、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ）；２５７Ｉおよび３１１Ｉ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＱ３１１Ｉ）；２５７Ｉおよび４３４Ｈ（例えば、Ｐ２５７ＩおよびＮ４３４Ｈ）；３７６Ｖおよび４３４Ｈ（例えば、Ｄ３７６ＶおよびＮ４３４Ｈ）；３０７Ａ、３８０Ａおよび４３４Ａ（例えば、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ）；ならびに４３３Ｋおよび４３４Ｆ（例えば、Ｈ４３３ＫおよびＮ４３４Ｆ）からなる群より選択される変異の１種または複数のペアまたは群を含むＦｃドメインを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む。前述のＦｃドメイン変異および本明細書に開示されている抗体可変ドメイン内の他の変異のあらゆる可能な組み合わせは、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００７１】
本発明は、キメラ重鎖定常（ＣＨ）領域を含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体も含み、前記キメラＣＨ領域は、２種以上の免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ３ドメインの一部または全部と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４分子に由来するＣＨ２ドメインの一部または全部を含むキメラＣＨ領域を含むことができる。ある特定の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラＣＨ領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「下ヒンジ」配列（ＥＵ番号付けに従った２２８〜２３６位のアミノ酸残基）と組み合わせた、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４ヒンジ領域に由来する「上ヒンジ」アミノ酸配列（ＥＵ番号付けに従った２１６〜２２７位のアミノ酸残基）を含むことができる。ある特定の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４上ヒンジに由来するアミノ酸残基と、ヒトＩｇＧ２下ヒンジに由来するアミノ酸残基とを含む。本明細書に記載されているキメラＣＨ領域を含む抗体は、ある特定の実施形態では、抗体の治療または薬物動態特性に有害に影響することなく、修飾されたＦｃエフェクター機能を示すことができる（例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１３年２月１日に出願された米国特許仮出願第６１／７５９，５７８号を参照）。
【００７２】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明は、細胞傷害性薬剤、化学療法薬または放射性同位体等、治療部分にコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはその抗原結合性断片を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
【００７３】
細胞傷害性薬剤は、細胞の成長、生存率または繁殖に有害な任意の薬剤を含む。本発明の本態様に従って抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体にコンジュゲートすることができる適した細胞傷害性薬剤および化学療法剤の例として、例えば、１−（２クロロエチル）−１，２−ジメタンスルホニルヒドラジド、１，８−ジヒドロキシ−ビシクロ［７．３．１］トリデカ−４，９−ジエン−２，６−ジイン−１３−オン、１−デヒドロテストステロン、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、９−アミノカンプトテシン、アクチノマイシンＤ、アマニチン、アミノプテリン、アングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ）、アントラサイクリン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、オーリスタチン、ブレオマイシン、ブスルファン、酪酸、カリチアマイシン、カンプトテシン、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルムスチン、セマドチン、シスプラチン、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎ）、コンブレタスタチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ジアセトキシペンチルドキソルビシン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ジソラゾール（ｄｉｓｏｒａｚｏｌｅ）、ドラスタチン、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、エキノマイシン、エリュテロビン、エメチン、エポチロン、エスペラミシン、エストラムスチン、エチジウムブロマイド、エトポシド、フルオロウラシル、ゲルダナマイシン、グラミシジンＤ、グルココルチコイド、イリノテカン、レプトマイシン、ロイロシン（ｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）、リドカイン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、マイタンシノイド、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｔｏｐｕｒｉｎｅ）、メトプテリン、メトトレキセート、ミスラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、ポドフィロトキシン、プロカイン、プロプラノロール、プテリジン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）、リゾキシン、ストレプトゾトシン、タリソマイシン（ｔａｌｌｙｓｏｍｙｃｉｎ）、タキソール、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、テトラカイン、チオテパ（ｔｈｉｏｅｐａ）、クロラムブシル、トメイマイシン（ｔｏｍａｙｍｙｃｉｎ）、トポテカン、ツブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンおよび前述のいずれかの誘導体が挙げられる。ある特定の実施形態によると、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体にコンジュゲートされる細胞傷害性薬剤は、ＤＭ１もしくはＤＭ４等のマイタンシノイド、トメイマイシン誘導体またはドラスタチン誘導体である。本技術分野で公知の他の細胞傷害性薬剤は、本発明の範囲内であるとみなされ、例えば、リシン、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素、シュードモナス外毒素、リシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、ブリオジン（ｂｒｙｏｄｉｎ）、サポリン、ヨウシュヤマゴボウ毒素（すなわち、ファイトラッカトキシン（ｐｈｙｔｏｌａｃｃａｔｏｘｉｎ）およびファイトラッキゲニン（ｐｈｙｔｏｌａｃｃｉｇｅｎｉｎ））等のタンパク質毒素、およびＳａｐｒａら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１３年、１３８巻：４５２〜４６９頁に表記されているもの等のその他を含む。
【００７４】
本発明は、１種または複数の放射性核種にコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む抗体−放射性核種コンジュゲート（ＡＲＣ）も含む。本発明の本態様の文脈において使用することができる例示的な放射性核種として、例えば、２２５Ａｃ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２２７Ｔｈ、２２２Ｒｎ、２２３Ｒａ、２２４Ｒａおよび９０Ｙが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７５】
本発明のある特定の実施形態では、リンカー分子を介して細胞傷害性薬剤（例えば、上に開示されている細胞傷害性薬剤のいずれか）にコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含むＡＤＣが提供される。本技術分野で公知のいかなるリンカー分子またはリンカー技術を使用して、本発明のＡＤＣを作出または構築してもよい。ある特定の実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。他の実施形態によると、リンカーは、切断不能リンカーである。本発明の文脈において使用することができる例示的なリンカーは、例えば、ＭＣ（６−マレイミドカプロイル）、ＭＰ（マレイミドプロパノイル）、ｖａｌ−ｃｉｔ（バリン−シトルリン）、ｖａｌ−ａｌａ（バリン−アラニン）、プロテアーゼ切断可能リンカーにおけるジペプチド部位、ａｌａ−ｐｈｅ（アラニン−フェニルアラニン）、プロテアーゼ切断可能リンカーにおけるジペプチド部位、ＰＡＢ（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）、ＳＰＰ（Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート）、ＳＭＣＣ（Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート）ならびにこれらの改変体および組み合わせを含む、またはこれらからなるリンカーを含む。本発明の文脈において使用することができるリンカーの追加的な例は、例えば、それらの内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、ＵＳ７，７５４，６８１およびＤｕｃｒｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２０１０年、２１巻：５〜１３頁ならびにこれらに引用されている参考文献に開示されている。
【００７６】
本発明は、リンカーが、抗体または抗原結合分子内の特定のアミノ酸における付着により抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体または抗原結合分子を薬物または細胞毒に接続するＡＤＣを含む。本発明の本態様の文脈において使用することができる例示的なアミノ酸付着は、例えば、リジン（例えば、ＵＳ５，２０８，０２０；ＵＳ２０１０／０１２９３１４；Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２００８年、１９巻：３５８〜３６１頁；ＷＯ２００５／０８９８０８；ＵＳ５，７１４，５８６；ＵＳ２０１３／０１０１５４６；およびＵＳ２０１２／０５８５５９２を参照）、システイン（例えば、ＵＳ２００７／０２５８９８７；ＷＯ２０１３／０５５９９３；ＷＯ２０１３／０５５９９０；ＷＯ２０１３／０５３８７３；ＷＯ２０１３／０５３８７２；ＷＯ２０１１／１３０５９８；ＵＳ２０１３／０１０１５４６；およびＵＳ７，７５０，１１６を参照）、セレノシステイン（例えば、ＷＯ２００８／１２２０３９；およびＨｏｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、２００８年、１０５巻：１２４５１〜１２４５６頁を参照）、ホルミルグリシン（例えば、Ｃａｒｒｉｃｏら、Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２００７年、３巻：３２１〜３２２頁；Ａｇａｒｗａｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、２０１３年、１１０巻：４６〜５１頁およびＲａｂｕｋａら、Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０１２年、１０巻：１０５２〜１０６７頁を参照）、非天然アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１３／０６８８７４およびＷＯ２０１２／１６６５５９を参照）および酸性アミノ酸（例えば、ＷＯ２０１２／０５９８２を参照）を含む。リンカーは、炭水化物（例えば、ＵＳ２００８／０３０５４９７およびＲｙａｎら、Ｆｏｏｄ  ＆  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１年、１３巻：１２７〜１３０頁を参照）およびジスルフィドリンカー（例えば、ＷＯ２０１３／０８５９２５、ＷＯ２０１０／０１０３２４、ＷＯ２０１１／０１８６１１およびＳｈａｕｎａｋら、Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、２００６年、２巻：３１２〜３１３頁を参照）への付着により、抗原結合タンパク質にコンジュゲートすることもできる。
【００７７】
ペプチド、ポリペプチドまたは他の高分子に化学部分をコンジュゲートするための本技術分野で公知のいかなる方法を本発明の文脈において使用して、本明細書に記載されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＡＤＣを作製してもよい。リンカーを介した抗体−薬物コンジュゲーションのための例示的な方法は、本明細書における実施例１２に表記されている。この例示的な方法に関する変種は、当業者であれば認めることができ、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００７８】
ある特定の実施形態によると、本発明は、本明細書に記載されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（例えば、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２と命名された抗体）が、これによりその開示全体が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１４５０９０に表記されているリンカー−薬物組成物（例えば、本明細書において「Ｍ００２６」とも称される、化合物「７」）にコンジュゲートされたＡＤＣを提供する（本明細書における実施例１２も参照）。
【００７９】
エピトープマッピングおよび関連技術
本発明の抗体が結合するエピトープは、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の３個またはそれを超える（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれを超える）アミノ酸の単一の近接配列からなることができる。あるいは、エピトープは、ＥＧＦＲｖＩＩＩの複数の非近接アミノ酸（またはアミノ酸配列）からなることができる。一部の実施形態では、エピトープは、ＥＧＦＲｖＩＩＩのリガンド結合ドメインにまたはその付近に位置する。他の実施形態では、エピトープは、ＥＧＦＲｖＩＩＩのリガンド結合ドメインの外側に、例えば、係るエピトープに結合される場合、抗体が、ＥＧＦＲｖＩＩＩへのリガンド結合に干渉しないＥＧＦＲｖＩＩＩの表面における位置に位置する。
【００８０】
本発明は、ある特定の実施形態によると、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する（かつＥＧＦＲに結合しない）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含み、前記抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチド（例えば、配列番号１４８）を認識する。係る抗体は、本明細書において、「接合部ペプチド結合剤」、「ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合抗体」その他と称することができる。本発明は、他の実施形態によると、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する（かつＥＧＦＲに結合しない）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含み、前記抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチドを認識しない（例えば、配列番号１４８の接合部ペプチドを認識しない、および／または配列番号１６５のペプチドを認識しない）。係る抗体は、本明細書において、「コンフォメーション性結合剤」、「ＥＧＦＲｖＩＩＩコンフォメーション性エピトープ結合剤」その他と称することができる。
【００８１】
当業者に公知の様々な技法を使用して、抗体が、ポリペプチドまたはタンパク質内の「１個または複数のアミノ酸と相互作用」するか決定することができる。例示的な技法は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．、ＮＹ）に記載されているもの等の慣用的なクロスブロッキングアッセイ、アラニン走査変異解析、ペプチドブロット解析（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４８巻：４４３〜４６３頁）およびペプチド切断解析を含む。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出および化学修飾等の方法を用いることができる（Ｔｏｍｅｒ、２０００年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ９巻：４８７〜４９６頁）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用することのできる別の方法は、質量分析により検出される水素／重水素交換である。一般用語において、水素／重水素交換方法は、目的のタンパク質を重水素標識するステップと、続いて抗体を重水素標識タンパク質に結合させるステップを含む。次に、タンパク質／抗体複合体を水に移して、抗体によって保護された残基（重水素標識されたままになる）を除く全残基において水素−重水素交換を行わせる。抗体の解離後に、標的タンパク質を、プロテアーゼ切断および質量分析による解析に付し、これにより、抗体が相互作用する特異的なアミノ酸に相当する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９年）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７巻（２号）：２５２〜２５９頁；ＥｎｇｅｎおよびＳｍｉｔｈ（２００１年）Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．７３巻：２５６Ａ〜２６５Ａ頁を参照されたい。
【００８２】
本発明は、本明細書に記載されている特異的な例示的な抗体（例えば、本明細書における表１に表記されているアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと同じエピトープに結合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をさらに含む。同様に、本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合に関して、本明細書に記載されている特異的な例示的な抗体（例えば、本明細書における表１に表記されているアミノ酸配列のいずれかを含む抗体）のいずれかと競合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体も含む。
【００８３】
本技術分野で公知かつ本明細書で例証されている慣用的な方法を使用することにより、抗体が、参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と同じエピトープに結合するか、またはこれと結合に関して競合するか容易に決定することができる。例えば、被験抗体が、本発明の参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と同じエピトープに結合するか決定するために、参照抗体を、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に結合させる。次に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子に結合する被験抗体の能力を評価する。被験抗体が、参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体との飽和結合後にＥＧＦＲｖＩＩＩに結合することができる場合、被験抗体が、参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。他方では、被験抗体が、参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体との飽和結合後にＥＧＦＲｖＩＩＩ分子に結合できない場合、被験抗体は、本発明の参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに結合し得る。続いて、追加の慣用的な実験法（例えば、ペプチド変異および結合解析）を実行して、観察された被験抗体の結合の欠如が、実際に、参照抗体と同じエピトープへの結合によるものであるか、あるいは立体的遮断（または別の現象）が、観察される結合の欠如の原因であるかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリーまたは本技術分野で利用できる他のいずれかの定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用して行うことができる。本発明のある特定の実施形態に従って、例えば、１、５、１０、２０または１００倍過剰な一方の抗体が、競合的結合アッセイ（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９０年：５０巻：１４９５〜１５０２頁を参照）において測定される通り、他方の結合を少なくとも５０％、ただし好ましくは７５％、９０％さらには９９％阻害する場合、２種の抗体は、同じ（または重複する）エピトープに結合する。あるいは、一方の抗体の結合を低下または排除する抗原における基本的にあらゆるアミノ酸変異が、他方の結合を低下または排除する場合、２種の抗体は、同じエピトープに結合すると考慮される。一方の抗体の結合を低下または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが、他方の結合を低下または排除する場合、２種の抗体は、「重複するエピトープ」を有すると考慮される。
【００８４】
抗体が、参照抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と結合に関して競合（または結合に関して交差競合）するか否か決定するために、２種の配向性において上に記載されている結合手法を行う：第１の配向性において、参照抗体を、飽和条件下でＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に結合させ、続いてＥＧＦＲｖＩＩＩ分子への被験抗体の結合を評価する。第２の配向性において、被験抗体を、飽和条件下でＥＧＦＲｖＩＩＩ分子に結合させ、続いてＥＧＦＲｖＩＩＩ分子への参照抗体の結合を評価する。両方の配向性において、第１の（飽和）抗体のみが、ＥＧＦＲｖＩＩＩ分子に結合することができる場合、被験抗体および参照抗体が、ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合に関して競合すると結論付けられる。当業者によって認められる通り、参照抗体と結合に関して競合する抗体は、参照抗体と同じエピトープに必ずしも結合しないが、重複するまたは隣接するエピトープに結合することにより、参照抗体の結合を立体的に遮断することができる。
【００８５】
ヒト抗体の調製
本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、完全ヒト抗体となり得る。完全ヒトモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体を生成するための方法は、本技術分野で公知である。いずれかの係る公知の方法を本発明の文脈において使用して、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するヒト抗体を作製することができる。
【００８６】
例えばＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（商標）技術、または完全ヒトモノクローナル抗体を生成するための他のいずれかの同様の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する高親和性キメラ抗体が、最初に単離される。後述する実験セクションにおける通り、抗体は、親和性、リガンド遮断活性、選択性、エピトープ等を含む望ましい特徴に関して特徴付けされ、選択される。必要に応じて、マウス定常領域を、所望のヒト定常領域、例えば、野生型または修飾型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４と置き換えて、完全ヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を生成する。選択される定常領域は、特定の用途に応じて変動し得るが、高親和性抗原結合および標的特異性特徴は、可変領域に属する。ある特定の事例において、完全ヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、抗原陽性Ｂ細胞から直接的に単離される。
【００８７】
生物学的同等物
本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体および抗体断片は、記載されている抗体のアミノ酸配列から変動するがヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する能力を保持するアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。係る改変体抗体および抗体断片は、親配列と比較してアミノ酸の１個または複数の付加、欠失または置換を含むが、記載されている抗体の生物学的活性と基本的に同等な生物学的活性を示す。同様に、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示されている配列と比較してヌクレオチドの１個または複数の付加、欠失または置換を含むが、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体または抗体断片と基本的に生物学的に同等である抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。係る改変体アミノ酸およびＤＮＡ配列の例は、上記で検討されている。
【００８８】
２種の抗原結合タンパク質または抗体が、例えば、同じモル濃度の用量にて類似の実験条件下、単一用量（ｄｏｅｓ）または複数用量のいずれかで投与された際に、その吸収の速度および程度が有意差を示さない薬学的同等物または薬学的代替物である場合、両者は生物学的に同等であるとみなされる。いくつかの抗体が、その吸収の程度において同等であるが、その吸収速度においては同等ではない場合において、これら抗体は、同等物または薬学的代替物であるとみなされ、そして係る吸収速度における差が意図的であり、標識において反映され、例えば慢性使用における有効な体内薬物濃度の到達に必須ではなく、試験される特定の薬物製品にとって医学的に無意味であるとみなされるため、これらが生物学的に同等であると依然としてみなされ得る。
【００８９】
一実施形態では、２種の抗原結合タンパク質は、その安全性、純度および効力において臨床的に有意義な差がない場合、生物学的に同等である。
【００９０】
一実施形態では、参照産物および生物学的産物の間で切り替えない継続的療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減弱化を含む有害効果のリスクにおいて増大が予想されずに、患者に対して、参照産物および生物学的産物の間でこのような切り替えを１回または複数回行うことができる場合、２種の抗原結合タンパク質は、生物学的に同等である。
【００９１】
一実施形態では、２種の抗原結合タンパク質が両者共に、使用条件（単数または複数）に対し共通の作用機序（単数または複数）によって、係る機序が公知の程度まで作用する場合、２種の抗原結合タンパク質は、生物学的に同等である。
【００９２】
生物学的同等性は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法によって示すことができる。生物学的同等性の測定は、例えば、（ａ）時間の関数として血液、血漿、血清または他の生体液における抗体またはその代謝物の濃度を測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ検査；（ｂ）ヒトｉｎ  ｖｉｖｏバイオアベイラビリティデータと相関され、これを合理的に予測するｉｎ  ｖｉｔｒｏ検査；（ｃ）時間の関数として抗体（またはその標的）の適切な急性薬理学的効果を測定する、ヒトまたは他の哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏ検査；および（ｄ）抗体の安全性、有効性またはバイオアベイラビリティまたは生物学的同等性を確立する十分に制御された臨床治験における検査を含む。
【００９３】
本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の生物学的に同等な改変体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うことによりまたは生物学的活性に必要とされない末端もしくは内部残基もしくは配列を欠失させることにより、構築することができる。例えば、生物学的活性に必須ではないシステイン残基を欠失または他のアミノ酸と置き換えて、復元における不要なまたは不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することができる。他の文脈において、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特徴を修飾するアミノ酸変化、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体改変体を含むことができる。
【００９４】
種選択性および種交差反応性
本発明は、ある特定の実施形態によると、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するが、他の種由来のＥＧＦＲｖＩＩＩには結合しない抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を提供する。本発明は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩおよび１種または複数の非ヒト種に由来するＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体も含む。例えば、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合することができ、場合により、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）、マーモセット、アカゲザルまたはチンパンジーのＥＧＦＲｖＩＩＩのうち１種または複数に結合しても結合しなくてもよい。本発明のある特定の例示的な実施形態によると、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩおよびカニクイザル（例えば、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が提供される。本発明の他の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するが、カニクイザルＥＧＦＲｖＩＩＩには結合しない、またはごく弱く結合する。
【００９５】
多特異的抗体
本発明の抗体は、単一特異的または多特異的（例えば、二重特異的）となり得る。多特異的抗体は、１種の標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的となり得る、あるいは２種以上の標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７巻：６０〜６９頁；Ｋｕｆｅｒら、２００４年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２巻：２３８〜２４４頁を参照されたい。本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、別の機能分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結するまたはこれと同時発現させることができる。例えば、抗体またはその断片は、別の抗体または抗体断片等、１種または複数の他の分子実体へと機能的に連結して（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合的会合または他の方法により）、第２の結合特異性を有する二重特異的または多特異的抗体を産生することができる。
【００９６】
本発明は、免疫グロブリンの一方のアームがヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、免疫グロブリンの他方のアームが第２の抗原に特異的な二重特異的抗体を含む。ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合アームは、本明細書における表１に表記されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲアミノ酸配列のいずれかを含むことができる。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合アームは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合し、ＥＧＦＲｖＩＩＩへのリガンド結合を遮断する。他の実施形態では、ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合アームは、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩに結合するが、ＥＧＦＲｖＩＩＩへのリガンド結合を遮断しない。
【００９７】
本発明の文脈において使用することのできる例示的な二重特異的抗体フォーマットは、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインの使用であって、第１および第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインが、互いに少なくとも１個のアミノ酸が異なり、少なくとも１個のアミノ酸の差異が、アミノ酸の差異を欠く二重特異的抗体と比較してプロテインＡへの二重特異的抗体の結合を低下させる使用を含む。一実施形態では、第１のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合し、第２のＩｇ  ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ修飾（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）等、プロテインＡ結合を低下または消失させる変異を含有する。第２のＣＨ３は、Ｙ９６Ｆ修飾（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）をさらに含むことができる。第２のＣＨ３内に見出すことのできるさらなる修飾は、ＩｇＧ１抗体の場合、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）；ならびにＩｇＧ４抗体の場合、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）を含む。上に記載されている二重特異的抗体フォーマットにおける変種は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００９８】
本発明の文脈において使用することのできる他の例示的な二重特異的フォーマットとして、例えば、ｓｃＦｖに基づくまたはダイアボディ二重特異的フォーマット、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）、共通軽鎖（例えば、ノブイントゥーホールを有する共通軽鎖等）、ＣｒｏｓｓＭａｂ、ＣｒｏｓｓＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、ロイシンジッパー、デュオボディ（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧおよびＭａｂ２二重特異的フォーマットが挙げられるがこれらに限定されない（例えば、前述のフォーマットの総説に関して、Ｋｌｅｉｎら、２０１２年、ｍＡｂｓ  ４巻：６号、１〜１１頁およびこれに引用されている参考文献を参照）。二重特異的抗体は、ペプチド／核酸コンジュゲーションを使用して構築することもでき、例えば、直交性の化学反応性を有する非天然アミノ酸を使用して、部位特異的抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成すると、これは、特定された組成、結合価および幾何学を有する多量体の複合体へと自己集合する（例えば、Ｋａｚａｎｅら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．［Ｅｐｕｂ：２０１２年１２月４日］を参照）。
【００９９】
治療製剤および投与
本発明は、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはその抗原結合性断片を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、適した担体、賦形剤および移動、送達、耐性その他の向上をもたらす他の薬剤と共に製剤化される。多数の適切な製剤は、あらゆる薬剤師に公知の処方集に見出すことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ。これらの製剤は、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ等）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲルならびにカーボワックスを含有する半固体混合物を含む。Ｐｏｗｅｌｌら、「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ５２巻：２３８〜３１１頁も参照されたい。
【０１００】
患者に投与される抗体の用量は、患者の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路その他に応じて変動し得る。好まれる用量は、典型的には、体重または体表面積に従って計算される。成体患者において、通常、約０．０１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．０２〜約７、約０．０３〜約５または約０．０５〜約３ｍｇ／ｋｇ体重の単一用量で、本発明の抗体を静脈内投与することが有利となり得る。状態の重症度に応じて、処置の頻度および持続時間を調整することができる。抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を投与するための有効投薬量およびスケジュールは、経験的に決定することができる；例えば、患者の進行を定期的評価によってモニターすることができ、これに従って用量を調整することができる。さらに、投薬量を種間で一定の基準で決めることは、本技術分野で周知の方法を使用して行うことができる（例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉら、１９９１年、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．  Ｒｅｓ．８巻：１３５１頁）。
【０１０１】
様々な送達系が公知であり、本発明の薬学的組成物の投与に使用することができ、例えば、リポソーム中のカプセル化、マイクロパーティクル、マイクロカプセル、変異体ウイルスを発現することのできる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスが挙げられる（例えば、Ｗｕら、１９８７年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２６２巻：４４２９〜４４３２頁を参照）。導入の方法として、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が挙げられるがこれらに限定されない。組成物は、いずれかの簡便な経路により、例えば、注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜等）を通した吸収により投与することができ、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与することができる。投与は、全身性であっても局所性であってもよい。
【０１０２】
本発明の薬学的組成物は、標準的な針およびシリンジにより皮下にまたは静脈内に送達することができる。加えて、皮下送達に関して、ペン型送達装置（ｐｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｄｅｖｉｃｅ）は、本発明の薬学的組成物の送達において容易に適用される。係るペン型送達装置は、再使用可能または使い捨てとなり得る。再使用可能なペン型送達装置は、一般に、薬学的組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の薬学的組成物が全て投与され、カートリッジが空となったら、空のカートリッジを容易に廃棄し、薬学的組成物を含有する新しいカートリッジと交換することができる。続いて、ペン型送達装置を再使用することができる。使い捨てペン型送達装置において、交換可能なカートリッジは存在しない。寧ろ、使い捨てペン型送達装置は、装置内のリザーバーに保たれた薬学的組成物を予め充填した状態で届けられる。リザーバーから薬学的組成物が空になったら、装置全体が廃棄される。
【０１０３】
多数の再使用可能なペン型および自動注入送達装置が、本発明の薬学的組成物の皮下送達において適用される。例として、ほんの数例ではあるが、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．、英国ウッドストック）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、スイス、ブルグドルフ）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ  ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ  ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、インディアナ州インディアナポリス）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク、コペンハーゲン）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、デンマーク、コペンハーゲン）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ニュージャージー州フランクリンレイクス）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、ドイツ、フランクフルト）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物の皮下送達において適用される使い捨てペン型送達装置の例として、ほんの数例ではあるが、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注入装置（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ、Ｌ．Ｐ．）およびＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ  ＩＬ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０４】
ある特定の状況において、薬学的組成物は、放出制御系において送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上記参照；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．１４巻：２０１頁を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる；Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、１９７４年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａを参照されたい。さらに別の実施形態では、放出制御系は、組成物の標的に近接して置くことができ、このため、全身性用量の一部分のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、１９８４年、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記参照中、２巻、１１５〜１３８頁を参照）。他の放出制御系は、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９巻：１５２７〜１５３３頁による総説で検討されている。
【０１０５】
注射用調製物は、静脈内、皮下、皮内および筋肉内注射、点滴注入等のための剤形を含むことができる。これらの注射用調製物は、公に知られた方法によって調製することができる。例えば、注射用調製物は、例えば、注射のために従来から使用されてきた無菌水性媒体または油性媒体において、上に記載されている抗体またはその塩を溶解、懸濁または乳化することにより調製することができる。注射用の水性媒体として、例えば、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、水素化ヒマシ油のＨＣＯ−５０（ポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］等、適切な可溶化剤と組み合わせて使用することのできる、生理食塩水、グルコースを含有する等張性溶液および他の補助的薬剤等が存在する。油性媒体として、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等、可溶化剤と組み合わせて使用することができる、ゴマ油、ダイズ油等が用いられている。このように調製された注射液は、好ましくは、適切なアンプル内に充填される。
【０１０６】
有利には、上に記載されている経口または非経口的使用のための薬学的組成物は、活性成分の用量を適合させるのに適した単位用量の剤形へと調製される。単位用量の係る剤形として、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、注射（アンプル）、坐剤等が挙げられる。含有されている先述の抗体の量は一般に、単位用量の剤形当たり約５〜約５００ｍｇである；特に注射形態において、先述の抗体は、約５〜約１００ｍｇで、他の剤形では約１０〜約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
【０１０７】
抗体の治療的使用
本発明は、それを必要とする被験体に、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート（例えば、本明細書における表１に表記されているＨＣＶＲ／ＬＣＶＲまたはＣＤＲ配列のいずれかを含む抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはＡＤＣ）を含む治療組成物を投与するステップを含む方法を含む。治療組成物は、本明細書に開示されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、その抗原結合性断片またはＡＤＣのいずれかと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含むことができる。
【０１０８】
本発明の抗体およびＡＤＣは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現または活性に関連するまたはこれに媒介される、あるいはＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＥＧＦＲリガンドの間の相互作用を遮断すること、またはＥＧＦＲｖＩＩＩ活性および／またはシグナリングを他の仕方で阻害すること、および／または受容体内部移行を促進すること、および／または細胞表面受容体数を減少させることによって処置できるいずれかの疾患または障害の処置、予防および／または改善にとりわけ有用である。例えば、本発明の抗体およびＡＤＣは、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する、および／またはリガンド媒介性シグナリングに応答する腫瘍の処置に有用である。本発明の抗体および抗原結合性断片を使用して、脳および髄膜、口腔咽頭部、肺および気管支樹、胃腸管、雄性および雌性生殖器管、筋肉、骨、皮膚および付属器、結合組織、脾臓、免疫系、造血性細胞および骨髄、肝臓および尿路ならびに眼等の特殊な感覚器官に生じる原発性および／または転移性腫瘍を処置することもできる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体およびＡＤＣを使用して、次のがんのうち１種または複数を処置する：腎細胞癌、膵癌、頭頸部がん、前立腺がん、悪性神経膠腫、骨肉腫、結腸直腸がん、胃がん（例えば、ＭＥＴ増幅による胃がん）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、滑膜肉腫、甲状腺がん、乳がんまたはメラノーマ。
【０１０９】
本明細書に記載されている処置方法の文脈において、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、単独療法として（すなわち、唯一の治療剤として）、または１種もしくは複数の追加的な治療剤と組み合わせて（その例は、本明細書の他の箇所に記載されている）投与することができる。
【０１１０】
具体的な実施形態によると、本発明は、患者におけるがんを処置するため、腫瘍成長を低下させるため、および／または腫瘍退縮を引き起こすための方法を提供する。本発明の本態様に係る方法は、単独で、または第２の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体もしくはＡＤＣと組み合わせて第１の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を患者に投与するステップを含む。第１のＡＤＣは、典型的には、抗体または抗体の抗原結合性断片と細胞毒とを含み、前記第１のＡＤＣの前記抗体または抗原結合性断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合するが、配列番号１４８の接合部ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドにも配列番号１６５のペプチドにも結合しない（すなわち、前記第１のＡＤＣは、コンフォメーション性ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合抗体を含む）。第２の抗体またはＡＤＣが投与される実施形態では、第２の抗体またはＡＤＣは、典型的には、抗体または抗体の抗原結合性断片と細胞毒とを含み、前記第２の抗体または抗原結合性断片は、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的に結合し、配列番号１４８の接合部ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドおよび／または配列番号１６５のペプチドにも結合する（すなわち、前記第２の抗体またはＡＤＣは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチド結合抗体を含む）。本発明の本態様の文脈において２種の別々の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＡＤＣが使用される場合、両方のＡＤＣは、ある特定の実施形態では、同じ細胞傷害性薬剤または同じクラスの細胞傷害性薬剤を含むことができる。２種の別々の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＡＤＣが使用される他の実施形態では、各ＡＤＣは、異なる細胞傷害性薬剤および／または異なるクラスの細胞傷害性薬剤を含むことができる。本発明の本態様の非限定的な例示的な実施形態は、本明細書の実施例１４に表記されている。ある特定の実施形態によると、第１のＡＤＣの抗体または抗原結合性断片（すなわち、コンフォメーション性ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合抗体）は、配列番号３６、３８、４０、４４、４６および４８を含む重および軽鎖相補性決定領域、または配列番号３４を含む重鎖可変領域ならびに配列番号４２を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１１１】
併用療法および製剤
本発明は、１種または複数の追加的な治療的に活性な構成成分と組み合わせた本明細書に記載されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかを含む組成物および治療製剤、ならびにそれを必要とする被験体に係る組み合わせを投与するステップを含む処置方法を含む。
【０１１２】
本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ＰＲＬＲアンタゴニスト（例えば、抗ＰＲＬＲ抗体またはＰＲＬＲの小分子阻害剤）、ＥＧＦＲアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体［例えば、セツキシマブまたはパニツムマブ］またはＥＧＦＲの小分子阻害剤［例えば、ゲフィチニブまたはエルロチニブ］）、Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４等、別のＥＧＦＲファミリーメンバーのアンタゴニスト（例えば、抗ＥｒｂＢ２［例えば、トラスツズマブまたはＴ−ＤＭ１｛ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）｝］、抗ＥｒｂＢ３もしくは抗ＥｒｂＢ４抗体、またはＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３もしくはＥｒｂＢ４活性の小分子阻害剤）、ｃＭＥＴアンタゴニスト（ａｎａｇｏｎｉｓｔ）（例えば、抗ｃＭＥＴ抗体）、ＩＧＦ１Ｒアンタゴニスト（例えば、抗ＩＧＦ１Ｒ抗体）、Ｂ−ｒａｆ阻害剤（例えば、ベムラフェニブ、ソラフェニブ、ＧＤＣ−０８７９、ＰＬＸ−４７２０）、ＰＤＧＦＲ−α阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−α抗体）、ＰＤＧＦＲ−β阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦＲ−β抗体または例えば、イマチニブメシレートもしくはスニチニブマレート等の小分子キナーゼ阻害剤）、ＰＤＧＦリガンド阻害剤（例えば、抗ＰＤＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃまたは−Ｄ抗体、アプタマー、ｓｉＲＮＡ等）、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、アフリベルセプト等、ＶＥＧＦトラップ、例えば、ＵＳ７，０８７，４１１を参照（本明細書において、「ＶＥＧＦ阻害性融合タンパク質」とも称される）、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ）、ＶＥＧＦ受容体の小分子キナーゼ阻害剤（例えば、スニチニブ、ソラフェニブまたはパゾパニブ））、ＤＬＬ４アンタゴニスト（例えば、ＲＥＧＮ４２１等、ＵＳ２００９／０１４２３５４に開示されている抗ＤＬＬ４抗体）、Ａｎｇ２アンタゴニスト（例えば、Ｈ１Ｈ６８５Ｐ等、ＵＳ２０１１／００２７２８６に開示されている抗Ａｎｇ２抗体）、ＦＯＬＨ１アンタゴニスト（例えば、抗ＦＯＬＨ１抗体）、ＳＴＥＡＰ１またはＳＴＥＡＰ２アンタゴニスト（例えば、抗ＳＴＥＡＰ１抗体または抗ＳＴＥＡＰ２抗体）、ＴＭＰＲＳＳ２アンタゴニスト（例えば、抗ＴＭＰＲＳＳ２抗体）、ＭＳＬＮアンタゴニスト（例えば、抗ＭＳＬＮ抗体）、ＣＡ９アンタゴニスト（例えば、抗ＣＡ９抗体）、ウロプラキンアンタゴニスト（例えば、抗ウロプラキン［例えば、抗ＵＰＫ３Ａ］抗体）、ＭＵＣ１６アンタゴニスト（例えば、抗ＭＵＣ１６抗体）、Ｔｎ抗原アンタゴニスト（例えば、抗Ｔｎ抗体）、ＣＬＥＣ１２Ａアンタゴニスト（例えば、抗ＣＬＥＣ１２Ａ抗体）、ＴＮＦＲＳＦ１７アンタゴニスト（例えば、抗ＴＮＦＲＳＦ１７抗体）、ＬＧＲ５アンタゴニスト（例えば、抗ＬＧＲ５抗体）、一価ＣＤ２０アンタゴニスト（例えば、リツキシマブ等、一価抗ＣＤ２０抗体）、ＰＤ−１抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体、ＣＤ３抗体、ＣＴＬＡ−４抗体等からなる群より選択される１種または複数の追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）と同時製剤化することができるおよび／またはこれらと組み合わせて投与することができる。本発明の二重特異的抗原結合分子と組み合わせて有益に投与することができる他の薬剤は、例えば、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤、ならびに小分子サイ���カイン阻害剤およびＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８等のサイトカインまたはこれらそれぞれの受容体に結合する抗体を含むサイトカイン阻害剤を含む。
【０１１３】
本発明は、１種または複数の化学療法剤と組み合わせた、本明細書に記載されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかを含む組成物および治療製剤を含む。化学療法剤の例として、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））等、アルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（ｐｉｐｏｓｕｌｆａｎ）等、スルホン酸アルキル；ベンゾドパ（ｂｅｎｚｏｄｏｐａ）、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）およびウレドパ（ｕｒｅｄｏｐａ）等、アジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン（ｐｈｅｎｅｓｔｅｒｉｎｅ）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等、ナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン等、抗生物質；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等、代謝拮抗薬；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート等、葉酸アナログ；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン等、プリンアナログ；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン等、ピリミジンアナログ；カルステロン（ｃａｌｕｓｔｅｒｏｎｅ）、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等、アンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等、抗副腎薬（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）；フロリン酸等、葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（ｂｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）；エダトレキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン；ジアジコン；エルフォルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセテート（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標）；Ａｖｅｎｔｉｓ  Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチン等、白金アナログ；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（ｔｒｉｏｘｉｆｅｎｅ）、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ  １１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）およびトレミフェン（フェアストン）を含む抗エストロゲン剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセレリン等、抗アンドロゲン剤；ならびに上述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体等、腫瘍におけるホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれる。
【０１１４】
本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、ステロイド、酸素、抗酸化剤、ＣＯＸ阻害剤、心保護薬（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、金属キレート剤、ＩＦＮ−ガンマおよび／またはＮＳＡＩＤと組み合わせて投与および／または同時製剤化することもできる。
【０１１５】
追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）、例えば、上に列挙されている薬剤またはその誘導体のいずれかは、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の投与の直前に、それと同時発生的に、またはその直後に投与することができる；（本開示の目的のため、係る投与レジメンは、追加的な治療的に活性な構成成分「と組み合わせた」抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の投与とみなされる）。本発明は、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が、本明細書の他の箇所に記載されている追加的な治療的に活性な構成成分（複数可）のうち１種または複数と同時製剤化された薬学的組成物を含む。
【０１１６】
投与レジメン
本発明のある特定の実施形態によると、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（または抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体および本明細書に言及されている追加的な治療的に活性な薬剤のいずれかの組み合わせを含む薬学的組成物）の複数用量は、規定の時間経過にわたって被験体に投与することができる。本発明の本態様に係る方法は、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の複数用量を被験体に逐次的に投与するステップを含む。本明細書において、「逐次的に投与する」は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の各用量が、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日間、数週間または数ヶ月間）によって隔てられた異なる日に被験体に投与されることを意味する。本発明は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の単一の初回用量、続いて抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の１または複数の二次用量と、任意選択で、続いて抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の１または複数の三次用量を患者に逐次的に投与するステップを含む方法を含む。
【０１１７】
用語「初回用量」、「二次用量」および「三次用量」は、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の投与の時系列を指す。よって、「初回用量」は、処置レジメンの初めに投与される用量であり（「ベースライン用量」とも称される）；「二次用量」は、初回用量の後に投与される用量であり；「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初回、二次および三次用量は全て、同じ量の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含有することができるが、一般に、投与頻度の観点から互いに異なっていてもよい。しかし、ある特定の実施形態では、初回、二次および／または三次用量に含有されている抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の量は、処置過程において互いに変動する（例えば、適宜、上方または下方に調整される）。ある特定の実施形態では、処置レジメンの初めに「負荷用量」として２以上の（例えば、２、３、４または５）用量が投与され、続いてより少ない頻度で投与されるその後の用量（例えば、「維持用量」）が投与される。
【０１１８】
本発明の例示的な特定の実施形態では、各二次および／または三次用量は、直前の用量から１〜２６（例えば、１、１１／２、２、２１／２、３、３１／２、４、４１／２、５、５１／２、６、６１／２、７、７１／２、８、８１／２、９、９１／２、１０、１０１／２、１１、１１１／２、１２、１２１／２、１３、１３１／２、１４、１４１／２、１５、１５１／２、１６、１６１／２、１７、１７１／２、１８、１８１／２、１９、１９１／２、２０、２０１／２、２１、２１１／２、２２、２２１／２、２３、２３１／２、２４、２４１／２、２５、２５１／２、２６、２６１／２またはそれより長い）週間後に投与される。語句「直前の用量」は、本明細書において、一連の複数の投与において、介在する用量が存在しない順番において丁度次の用量の投与の前に患者に投与される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の用量を意味する。
【０１１９】
本発明の本態様に係る方法は、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のいずれかの数の二次および／または三次用量を患者に投与するステップを含むことができる。例えば、ある特定の実施形態では、単一の二次用量のみが、患者に投与される。他の実施形態では、２もしくはそれより多い（例えば、２、３、４、５、６、７、８もしくはそれより多い）二次用量が、患者に投与される。同様に、ある特定の実施形態では、単一の三次用量のみが、患者に投与される。他の実施形態では、２以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８もしくはそれより多い）三次用量が、患者に投与される。投与レジメンは、特定の被験体の生涯にわたり無期限に、または係る処置がもはや治療上の必要がなくなるもしくは有利でなくなるまで行うことができる。
【０１２０】
複数の二次用量を含む実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与することができる。例えば、各二次用量は、直前の用量の１〜２週間または１〜２か月後に患者に投与することができる。同じく、複数の三次用量を含む実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与することができる。例えば、各三次用量は、直前の用量の２〜１２週間後に患者に投与することができる。本発明の特定の実施形態では、二次および／または三次用量が患者に投与される頻度は、処置レジメンの過程にわたって変動し得る。投与の頻度は、医師によって、臨床検査後に個々の患者の必要に応じて処置過程の間に調整することもできる。
【０１２１】
本発明は、２〜６負荷用量が第１の頻度で（例えば、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月間に１回、２ヶ月間に１回等）患者に投与され、続いて２またはそれを超える維持用量がより低い頻度で患者に投与される投与レジメンを含む。例えば、本発明の本態様によると、負荷用量が、１ヶ月間に１回の頻度で投与される場合、維持用量は、６週間に１回、２ヶ月間に１回、３ヶ月間に１回等で患者に投与することができる。
【０１２２】
抗体の診断的使用
本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を使用して、例えば、診断目的で、試料におけるＥＧＦＲｖＩＩＩまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞を検出および／または測定することもできる。例えば、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体またはその断片を使用して、ＥＧＦＲｖＩＩＩの異常発現（例えば、過剰発現、過小発現、発現の欠如等）によって特徴付けられる状態または疾患を診断することができる。ＥＧＦＲｖＩＩＩの例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られた試料を本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と接触させるステップを含むことができ、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている。あるいは、未標識の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、それ自体が検出可能に標識されている二次抗体と組み合わせて診断適用において使用することができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓもしくは１２５Ｉ等、放射性同位元素；フルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミン等、蛍光もしくは化学発光部分；またはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼもしくはルシフェラーゼ等、酵素となり得る。試料におけるＥＧＦＲｖＩＩＩの検出または測定に使用することのできる特異的な例示的アッセイとして、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０１２３】
本発明に係るＥＧＦＲｖＩＩＩ診断アッセイにおいて使用することのできる試料は、正常または病的状態における、検出可能な量のＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質またはその断片を含有する、患者から得ることができるいずれかの組織または流体試料を含む。一般に、健康な患者（例えば、異常なＥＧＦＲｖＩＩＩのレベルまたは活性に関連する疾患または状態に罹患していない患者）から得られる特定の試料におけるＥＧＦＲｖＩＩＩのレベルを測定して、ＥＧＦＲｖＩＩＩのベースラインまたは標準レベルを最初に確立するであろう。続いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩのこのベースラインレベルは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ関連疾患または状態を有すると疑われる個体から得られる試料において測定されたＥＧＦＲｖＩＩＩのレベルに対して比較することができる。
【実施例】
【０１２４】
次の実施例は、本発明の方法および組成物を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供できるように示されており、本発明者らが自身の発明として考慮する範囲の限定を企図しない。使用された数に対する正確度を確保するための努力をしたが、一部の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。他に断りがなければ、分子量は、平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧またはその近辺である。
【０１２５】
（実施例１）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の生成
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（すなわち、ヒト免疫グロブリン重およびカッパー軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む操作されたマウス）を、ＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞外ドメインを含む免疫原で免疫化することにより、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を得た。第１のセットの抗体は、Ｈ１Ｈ２１９４Ｐ、Ｈ１Ｈ２１９５Ｐ、Ｈ２Ｍ１８６３Ｎ２、Ｈ２Ｍ１９１１Ｎ、Ｈ２Ｍ１９１２Ｎ、Ｈ２Ｍ１９１５Ｎ、Ｈ２Ｍ１９１７Ｎ、Ｈ２Ｍ１９１８ＮおよびＨ３Ｍ１９１３Ｎと命名された抗体を含む（表１および２に示す通り）。
【０１２６】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的イムノアッセイにより抗体免疫応答をモニターした。所望の免疫応答が達成されたら、脾細胞を収集し、マウス骨髄腫細胞と融合してその生存能を保ち、ハイブリドーマ細胞株を形成した。ハイブリドーマ細胞株をスクリーニングおよび選択して、ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的抗体を産生する細胞株を同定した。この技法を使用して、数種類の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを保有する抗体）を得た。加えて、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されている通り、数種類の完全ヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を、骨髄腫細胞へ融合することなく抗原陽性Ｂ細胞から直接的に単離した。
【０１２７】
別々に、特に参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１０／０３０４４３６Ａ１号において「８０８８」と記載されているＣＨＯ宿主細胞株において、フコシル化が低下したＨ１Ｈ１８６３Ｎ２［「Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）」］も調製した。簡潔に説明すると、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２の軽鎖および重鎖配列を発現ベクターにクローニングした。軽および重鎖プラスミドならびにＣｒｅをコードする遺伝子を含有するｐＲ４００４ベクターにより、２百万個の８０８８細胞をトランスフェクトした。４００μｇ／ｍｌハイグロマイシンによる選択を生き延びたトランスフェクト細胞を、無血清フコース不含培地における懸濁下の成長に適応させた。トランスフェクト細胞から、蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現したが、ＤｓＲｅｄもＥＣＦＰも発現しなかった細胞をフローサイトメトリーにより単離した。選別された細胞を、４×１０５細胞／ｍｌでシェーカーフラスコに播種し、３日後に培養培地を収集し、その中にある抗体タンパク質［すなわち、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）］をプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。得られたＨ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）の質量分析による解析は、本来の抗体であるＨ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ＋）と比べてコアフコースが除去されていることを確認した。本明細書における名称「Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２」および「Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ＋）」は両者共に、フコシル化修飾なしの本来の抗体を示す。
【０１２８】
本実施例の方法に従って生成された例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の特定の生物学的特性を、下に記す実施例において詳細に説明する。
【０１２９】
（実施例２）重および軽鎖可変領域アミノ酸および核酸配列
表１は、本発明の選択された抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の重および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲのアミノ酸配列識別子を表記する。対応する核酸配列識別子を表２に表記する。
【表１】
0006632984.tif 000002
【表２】
0006632984.tif 000003
【０１３０】
抗体は典型的には、本明細書において、次の命名法に従って参照される：表１および２に示す通り、Ｆｃ接頭語（例えば、「Ｈ１Ｈ」、「Ｈ２Ｍ」、「Ｈ３Ｍ」等）と、続く数的識別子（例えば、「２１９４」、「２１９５」、「１８６３」等）と、続く「Ｐ」または「Ｎ」接尾語。よって、この命名法に従って、抗体は、本明細書において、例えば、「Ｈ１Ｈ２１９４Ｎ」、「Ｈ２Ｍ１９１１Ｎ」、「Ｈ３Ｍ１９１３Ｎ」等と称することができる。本明細書に使用されている抗体名称におけるＨ１Ｈ、Ｈ２ＭおよびＨ３Ｍ接頭語は、抗体の特定のＦｃ領域アイソタイプを示す。例えば、「Ｈ１Ｈ」抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを有し、「Ｈ２Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ２  Ｆｃを有し、「Ｈ３Ｍ」抗体は、マウスＩｇＧ３  Ｆｃを有する（全ての可変領域は、抗体名称における最初の「Ｈ」によって表示される通り、完全にヒトのものである）。当業者であれば認められる通り、特定のＦｃアイソタイプを有する抗体は、異なるＦｃアイソタイプを有する抗体に変換することができるが（例えば、マウスＩｇＧ１  Ｆｃを有する抗体は、ヒトＩｇＧ４を有する抗体に変換することができる等）、いずれにせよ、可変ドメイン（ＣＤＲを含む）（これは表１および２に示す数的識別子によって示される）は、同じままであり、結合特性は、Ｆｃドメインの性質にかかわらず、同一または実質的に同様であると予想される。
【０１３１】
以下の実施例において使用される対照構築物
比較目的のために対照構築物を次の実験に含めた：対照Ｉ：米国特許第７，７３６，６４４号に開示されている「１３．１．２」抗体のそれぞれ配列番号１４２および１４４に相当するアミノ酸配列を有する重および軽鎖可変ドメインを有するヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（ＩｇＧ１）；対照ＩＩ：米国特許第７，５８９，１８０号に開示されている「ｃｈ８０６」抗体のそれぞれ配列番号１１および１２に相当するアミノ酸配列を有する重および軽鎖可変ドメインを有するキメラ抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（ｈＩｇＧ１）；対照ＩＩＩ：米国特許出願公開第２０１０／００５６７６２号に開示されている「ｈｕ８０６」抗体のそれぞれ配列番号４２および４７に相当するアミノ酸配列を有する重および軽鎖可変ドメインを有するヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（ｈＩｇＧ１）；対照ＩＶ：ＵＳ７，０６０，８０８に表記されている「Ｃ２２５」の相当するドメインのアミノ酸配列を有する重および軽鎖可変ドメインを有するキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；ならびに対照Ｖ：米国特許第７，７３６，６４４Ｂ２号の「１３１」抗体のそれぞれ配列番号２および１９に相当するアミノ酸配列を有する重および軽鎖可変ドメインを有するヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（ＩｇＧ１）。「１３．１．２」抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩの接合部ペプチド（配列番号１４８）に特異的であることが公知であり；「ｃｈ８０６」および「ｈｕ８０６」抗体は、増幅または過剰発現されるＥＧＦＲ（配列番号１４６）の残基３１１〜３２６（配列番号１６５）、またはＥＧＦＲｖＩＩＩの残基４４〜５９（配列番号１４７）に結合することが公知である。
【０１３２】
（実施例３）ＥＧＦＲｖＩＩＩ結合親和性の決定
３７℃における表面プラズモン共鳴により、ヒトモノクローナル抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の結合親和性および動態学的定数を決定した。Ｔ１００  ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）機器において測定を行った。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃとして発現された抗体（すなわち、「Ｈ１Ｈ」名称）を抗ヒトＦｃセンサー表面（ｍＡｂ捕捉フォーマット）に捕捉し、可溶性単量体［ＥＧＦＲ−ｍｍｈ（配列番号１５４）およびＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｍｈ（配列番号１５２）］または二量体［ＥＧＦＲ−ｍＦｃ（配列番号１５５）およびＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍＦｃ（配列番号１５３）］タンパク質を表面にわたって注入した。受容体捕捉フォーマットにおいて、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍＦｃまたはＥＧＦＲ−ｍＦｃのいずれかがＢＩＡＣＯＲＥ（商標）チップ上に捕捉され、それぞれの抗体が流れた。Ｓｃｒｕｂｂｅｒ  ２．０カーブフィッティングソフトウェアを使用して１：１結合モデルへとデータを加工および適合させることにより、動態学的会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度定数を決定した。次の通り、動態学的速度定数から結合解離平衡定数（ＫＤ）および解離半減期（ｔ１／２）を計算した：ＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；およびｔ１／２（分）＝ｌｎ２／（６０＊ｋｄ）。
【０１３３】
結果を表３および４に示す。ＮＢ＝検査した条件下で結合なし；ＮＴ＝検査せず。
【表３】
0006632984.tif 000004
【表４】
0006632984.tif 000005
【０１３４】
表３および４に示す通り、数種類の抗体が、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する選択性を示し、ｍＡｂ捕捉フォーマットにおいて野生型ＥＧＦＲに結合しなかった。受容体捕捉フォーマットにおいて（表４）、Ｈ１Ｈ８６３Ｎ２、Ｈ１Ｈ１９１５Ｎおよび対照Ｉは、最大の選択性を示した。
【０１３５】
（実施例（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）４）ＥＬＩＳＡによって決定される抗体特異性
抗ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍＡｂをさらに特徴付けるために、その結合特異性をＥＬＩＳＡによって試験した。次のうち１種でプレートをコーティングした：ＥＧＦＲ−ｍｍｈ（配列番号１５４）；ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｍｈ（配列番号１５２）；および接合部ペプチド（Ｊ−ペプチド）（配列番号１４８）。リンカーを介してＣ末端（配列番号１４９）またはＮ末端（配列番号１５０）のいずれかでビオチンに連結された接合部ペプチドのため、プレートをアビジンで予めコーティングした。また、そのＮ末端にビオチンありまたはなしの無関係ペプチド（対照ペプチド）をコーティングした。コーティングされたプレートに抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とアイソタイプ対照抗体を加え、１時間２５℃でインキュベートした。次にプレートを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をコンジュゲートされた抗ヒトＦｃ抗体により、結合した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍＡｂを検出した。テトラ−メチル−ベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液によりプレートを発色させて、比色反応を生じ、ＶＩＣＴＯＲ（商標）Ｘ５プレートリーダーにおいて４５０ｎｍの吸光度を読み取る前に硫酸で中和した。データ解析は、ＰＲＩＳＭ（商標）ソフトウェア内のシグモイド曲線用量応答モデルを使用した。最大応答の発生に要求される抗体濃度の５０％として定義される、計算されたＥＣ５０値を、結合効力の指標として使用した。結果を表５に示す。ＮＴ：検査せず。対照Ｉ〜ＩＩＩ：上述の通り。
【表５】
0006632984.tif 000006
【０１３６】
抗体Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２、Ｈ１Ｈ１９１５および対照Ｉは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する強い結合を示したが、野生型ＥＧＦＲに対する結合は示さなかった（＞１０ｎＭ）。対照Ｉ（接合部ペプチドで免疫化したマウスに由来する「１３．１．２」抗体の重および軽鎖配列に相当する配列を有する（米国特許第７，７３６，６４４号））を除く抗体のいずれも、接合部ペプチドに対する結合を示さなかった。
【０１３７】
（実施例５）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を使用したＥＧＦＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩのウエスタンブロット
還元および非還元条件下の両方におけるウエスタンブロットにより、抗体のうち１種であるＨ１Ｈ１８６３Ｎ２をその結合特徴に関して検査した。ＥＧＦＲ−ｍｍｈ（配列番号１５４）またはＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｍｈ（配列番号１５２）をＴｒｉｓ−グリシンＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにロードし、泳動し、続いてニトロセルロースに移した。ブロッキング後に、メンブランを半分にカットし、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体または抗Ｈｉｓ抗体のいずれかでプローブした。対照ＩおよびＩＩは、上述の通りである。
【０１３８】
図１ａに示す通り、Ｈ１Ｈ１８６２Ｎ２（Ｆｕｃ−）は、還元または非還元ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｍｈまたはＥＧＦＲ−ｍｍｈに結合しないことから、ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するコンフォメーション性エピトープを有する。対照的に、対照ＩＩは、還元および非還元条件下で野生型および改変体ＩＩＩ  ＥＧＦＲの両方に結合する一方、接合部ペプチド結合剤である対照Ｉは、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的である。Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２とは対照的に、対照ＩおよびＩＩは両者共に、直鎖状結合エピトープを有する。図１ｂは、ウエスタンブロットにおいて混合型の挙動を示す他のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を示す。
【０１３９】
（実施例６）ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合および抗体競合アッセイ
ペプチド結合および抗体競合アッセイを使用して、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）をその結合特徴に関して検査した。ペプチド結合実験のため、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標）ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＲＥＤ機器におけるストレプトアビジンコーティングされたＯＣＴＥＴ（登録商標）チップを使用して、そのＣ末端においてリンカーを介してビオチンをタグ付けしたＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチド（配列番号１４８）［すなわち、ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＧＧＧＧＳＫ（配列番号１４９）−ビオチン］またはそのＣ末端においてリンカーを介してビオチンをタグ付けしたＥＧＦＲの残基３１１〜３２６からなるペプチド（「ＥＧＦＲ  ３１１〜３２６ペプチド」；配列番号１６５）［すなわち、ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣＧＧＧＧＳＫ（配列番号１５１）−ビオチン］をほぼ０．４ｎＭの濃さ（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）まで捕捉した。ペプチド捕捉後に、コーティングされたチップを抗体の１μＭ溶液に置き、結合応答を記録した（図２を参照）。対照Ｉ〜ＩＩＩは、上述と同じものである。
【０１４０】
予測される通り、対照Ｉは、Ｃ末端ビオチンを有する接合部ペプチドに結合し、対照ＩＩおよびＩＩＩは、Ｃ末端ビオチンを有するＥＧＦＲ  ３１１〜３２６ペプチドに結合した。Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）は、該ペプチドのどちらにも結合できなかった。
【０１４１】
抗体交差競合のため、ほぼ２００共鳴単位（ＲＵ）のｈＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｍｈ（配列番号１５２）を、高密度の抗ペンタ−ヒスチジンポリクローナル抗体（ｃａｔ．＃３４６６０、ＱＵＩＡＧＥＮ）でコーティングしたＢＩＡＣＯＲＥ（商標）表面に捕捉した。同時注入方法論を使用して、５００ｎＭの第１のｍＡｂの５分間注入により、捕捉されたｈＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｍｈを飽和させ、その後直ちに、５００ｎＭの第１のｍＡｂを補充した第２のｍＡｂ（５００ｎＭ）のさらなる５分間注入を行った。第２のｍＡｂの、ＲＵとして表現される有意な結合は、これが、結合に関して第１のｍＡｂと競合しないものと解釈した。対照実験のため、アイソタイプマッチしたｍＡｂを、第１のｍＡｂまたは第２のｍＡｂのいずれかとして使用した。結果を表６に示す。
【表６】
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【０１４２】
Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）は、ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｍｈ捕捉表面への結合に関して対照抗体Ｉ〜ＩＩＩのいずれとも競合しなかった。予想される通り、両者共にＥＧＦＲの残基３１１〜３２６に結合することが公知の対照ＩＩおよびＩＩＩは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ｍｍｈ捕捉表面への結合に関して互いに競合した。
【０１４３】
（実施例７）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の細胞結合選択性
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍＡｂの特異性を決定するために、ＨＥＫ２９３、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ）およびＡ４３１細胞に対するその結合を蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）により解析した。ＨＥＫ２９３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００トランスフェクション試薬（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））を使用して、全長ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号１４７）を構成的に発現するネオマイシン抵抗性ＤＮＡベクターによりＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトすることにより調製した。トランスフェクション後２日目に、およそ２週間のＧ４１８選択下に細胞を置いた。ＥＧＦＲｖＩＩＩを陽性発現する集団を蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）により単離した。細胞当たりほぼ３×１０６コピーのＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＨＥＫ２９３細胞を実験に使用した。簡潔に説明すると、１０μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を細胞と共に３０分間室温でインキュベートし、洗浄し、二次抗体、すなわち、ヒトＩｇＧに対するフィコエリトリン（ＰＥ）標識ヤギＦ（ａｂ’）２（ｃａｔ＃１０９−１１６−１７０、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートし、続いてＦＡＣＳ解析前に最終洗浄した。実験の別のセットにおいて、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、そのリジン残基を介して蛍光色素ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８色素（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標））に直接的にコンジュゲートし、これにより、二次抗体を使用するステップを排除した。直接的に標識した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を使用したＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結果を表７に示し、二次ＰＥ標識抗Ｆｃ（ヒトまたはマウス）を使用した結果を表８に示す。直接的に標識した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を使用したＡ４３１細胞の結果を表９に示し、二次ＰＥ標識抗Ｆｃ（ヒトまたはマウス）を使用した結果を表１０に示す。対照Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶについては上述されている。ＭＦＩ：平均蛍光強度。
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【０１４４】
数種類の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、直接的に標識された抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（表７）または二次ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ（表８）のいずれかを使用して検出した場合、親ＨＥＫ２９３細胞を上回るＨＥＫ２９３／ＥＧＦＲＶＩＩＩ細胞株に対する別個の結合優先性を示した。大部分の抗体は、Ａ４３１細胞と共にインキュベートした場合（３０分間４℃で）、対照ＩＩＩおよびＩＶ抗体を除いて、最小結合から結合なしを呈した（表９および１０）。
【０１４５】
（実施例８）ＨＥＫ２９３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞による抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍＡｂの内部移行
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ｍＡｂ（１０ｕｇ／ｍｌ）を、ＨＥＫ２９３／ＥＧＦＲＶＩＩＩ（実施例７を参照、上記参照）細胞と共に２時間氷上でインキュベートし、続いて２回ＰＢＳ洗浄した。次に、細胞を二次ＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に氷上の３０分間インキュベーションに付し、続いて２回の追加的なＰＢＳ洗浄を行った。抗体を内部移行バッファー（ＰＢＳ＋ＦＢＳ）において１時間３７℃で内部移行させた、または４℃で維持した。細胞を４％ホルムアルデヒドにおいて固定し、核をＤＲＡＱ５（登録商標）ＤＮＡ色素（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で染色した。ＩＭＡＧＥＸＰＲＥＳＳ（商標）ハイコンテンツシステム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において４０×で画像を取得し、Ｃｏｌｕｍｂｕｓソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、内部移行した小胞を定量化した。結果を表１１および図３に示す。
【表１１】
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【０１４６】
確固とした内部移行は、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２、対照ＩＩおよび対照ＩＶに３７℃で生じた。内部移行は、Ｈ１Ｈ１９１１Ｎ、Ｈ１Ｈ１９１２Ｎおよび対照Ｉにも観察された。
【０１４７】
（実施例９）Ｕ８７／ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍異種移植片への抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の結合
Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２の特異性をさらに決定するために、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するヒト神経膠芽腫細胞株Ｕ８７を、実施例７においてＨＥＫ２９３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に関して記載されている通りに調製した。細胞当たりほぼ１．５×１０５コピーのＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＵ８７細胞（Ｕ８７／ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を実験に使用した。Ｕ８７／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（３×１０６細胞）を重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに異種移植し、２００〜３００ｍｍ３のメジアンサイズが得られるまで腫瘍を成長させた。次に、マウスに、尾静脈経由でＨ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）またはアイソタイプ対照を注射した。抗体の注射後１０分、４時間および２４時間目にマウスを屠殺し、腫瘍を除去し、ＰＢＳに置いた。腫瘍を直ちに解離させ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲートした抗ヒトＦｃ（ｈＦｃ−ＡＰＣ）抗体で染色した。染色した細胞を、２％ウシ胎仔血清および０．１％アジ化ナトリウムを含有する流れるＰＢＳで３回洗浄した。１０分目および４時間目の時点における腫瘍を一晩固定し、続いてフローサイトメーターにより測定した。２４時間目の時点で収集した腫瘍は、固定せずに測定した。全試料をＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６  ＦＬＯＷ  ＣＹＴＯＭＥＴＥＲ（登録商標）（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．）において収集し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。結果を表１２に示す。ＭＦＩ値は、２〜３つの生物学的複製物の平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。
【表１２】
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【０１４８】
アイソタイプ対照と比較して、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）抗体は、時間依存的様式で効率的にＵ８７／ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍細胞に結合した。
【０１４９】
（実施例１０）Ｂ１６Ｆ１０．９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ腫瘍異種移植片への抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の結合
ＳＣＩＤマウスに、５万個のマウスメラノーマ細胞Ｂ１６Ｆ１０．９またはＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するＢ１６Ｆ１０．９（Ｂ１６Ｆ１０．９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ）を植え込んだ。Ｂ１６Ｆ１０．９／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞は、実施例７においてＨＥＫ２９３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に関して記載されている通りに調製した。細胞当たりほぼ１．５×１０５コピーのＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＢ１６Ｆ１０．９細胞を本実験に使用する。２００〜３００ｍｍ３のメジアンサイズが得られるまで、腫瘍をおよそ１４日間成長させた。次に、マウスに、尾静脈経由でＨ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）またはアイソタイプ対照を注射した。抗体の注射後１０分、４時間および２４時間目に、マウスを屠殺し、腫瘍を除去し、ＰＢＳに置いた。腫瘍を直ちに解離させ、アロフィコシアニンコンジュゲートした抗ヒトＦｃ（ｈＦｃ−ＡＰＣ）抗体で染色した。染色した細胞を、流れるＰＢＳ（１×ＰＢＳ、２％ウシ胎仔血清、０．１％アジ化ナトリウム）で３回洗浄し、標準方法を使用して固定および透過処理（ｐｅｒｍｅａｌｉｚｅ）した。フローサイトメトリーを使用して、細胞表面に結合したＨ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）を検出し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を使用して解析を行った。結果を表１３および図４ａに示す。細胞表面に結合および細胞内部に結合した抗体の両方を検出するために、細胞を、固定および透過処理ステップ後に同じ抗ヒトＦｃ（ｈＦｃ−ＡＰＣ）抗体を使用して２回目染色した。これにより、細胞内部抗体を検出することができた。結果を表１４および図４ｂに示す。全試料をＡＣＣＵＲＩ（登録商標）Ｃ６  ＦＬＯＷ  ＣＹＴＯＭＥＴＥＲ（登録商標）において収集し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定した。未染色対照のＭＦＩの減算後に試料毎のＭＦＩを報告した。ＭＦＩ値は、２つの生物学的複製物（Ｎ＝２）の平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）である。＊この時点に対しＮ＝１。
【表１３】
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【表１４】
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【０１５０】
Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）は、時間依存的様式でＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＢ１６Ｆ１０．９細胞の表面に効率的に結合した一方、アイソタイプ対照の結合は最小であった。細胞表面のみへのその結合と比較した、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ−）の総結合（すなわち、細胞表面結合プラス内部結合）の増加は、細胞表面に結合した抗体が、Ｂ１６Ｆ１０．０細胞により有効に内部移行したことを示した。
【０１５１】
（実施例１１）マウスにおける抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の薬物動態
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ選択性を決定するために、マウスＥＧＦＲを天然に発現する野生型マウス（「ＷＴマウス」）およびヒトＥＧＦＲを発現するヒト化ＥＧＦＲマウス（「ｈＥＧＦＲマウス」）を使用した薬物動態試験を行った。マウスは、Ｃ５７ＢＬ６（７５％）および１２９Ｓｖ（２５％）を含有するバックグラウンドを有する交雑系統に由来した。コホートは、それぞれＷＴまたはｈＥＧＦＲマウスのいずれか５匹を含有した。全ての抗体は、０．２ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。投与後０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、７日、１０日、１４日、２１日および３０日目に血液（Ｂｌｅｅｄ）を収集した。サンドイッチＥＬＩＳＡによりヒト抗体の血清レベルを決定した。簡潔に説明すると、１μｇ／ｍｌ濃度のヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を９６ウェルプレートにコーティングし、一晩４℃でインキュベートした。ＢＳＡでプレートをブロッキングした後に、６用量系列希釈における血清試料および１２用量系列希釈におけるそれぞれの抗体の参照標準をプレートに加え、１時間室温でインキュベートした。洗浄して、結合していない抗体を除去した後に、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした同じヤギポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、捕捉されたヒト抗体を検出し、メーカーの推奨するところに従って標準比色テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質により発色させた。４５０ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーに記録し、試料プレートにおいて作成された参照検量線を使用して、血清試料におけるｈＩｇＧの濃度を計算した。標準方法を使用してマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）を測定したところ、全般に低かった。
【０１５２】
図５ａ〜図５ｄは、４種の被験抗体の抗体濃度ｖｓ．時間プロットを示す。対照ＩＶ（「Ｍａｂ  Ｃ２２５」）は、ヒトＥＧＦＲに結合するが、そのマウスホモログには結合しないことが公知である。予想される通り、この抗体は、ｈＥＧＦＲマウスにおける速いクリアランスおよびＷＴマウスにおける遅いクリアランス（すなわち、標的媒介性クリアランスなし）を呈した（図５ａ）。対照Ｉ（「Ｍａｂ  １３．１．２」）は、ヒトＥＧＦＲにもマウスＥＧＦＲにも存在しないＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチド「ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ」に結合することが公知である。この抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＥＧＦＲにもマウスＥＧＦＲにも結合しない。予想される通り、この抗体は、両方の種類のマウスにおいて同一の遅い薬物動態クリアランス速度を呈し（図５ｂ）、標的媒介性クリアランスは観察されなかった。対照ＩＩＩ抗体（「Ｍａｂ  ｈｕ８０６」）は、ＷＴマウスと比べてｈＥＧＦＲマウスにおけるクリアランス増加を示した（図５ｃ）。この知見は、Ｂｉａｃｏｒｅ（実施例３、表４を参照）およびＦＡＣＳ（実施例７、表９）によって決定される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＥＧＦＲに結合するその能力と合致した。図５ｄは、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２（Ｆｕｃ＋）のクリアランスを示す。この抗体は、対照Ｉと同様に、両方の種類のマウスにおいて同一の遅いクリアランス速度を呈した。よって、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２は、ｉｎ  ｖｉｖｏでヒトＥＧＦＲにもマウスＥＧＦＲにも結合しない。
【０１５３】
（実施例１２）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体−薬物コンジュゲートは、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性乳がん同種移植モデルにおける腫瘍成長を阻害する
本実施例において、例示的な抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２の２種の異なる抗体−薬物コンジュゲートを、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を阻害するその能力に関して検査した。切断不能ＭＣＣリンカー（例えば、ＵＳ５，２０８，０２０および米国特許出願公開第２０１０／０１２９３１４号を参照）を介してマイタンシノイド毒素ＤＭ１へとＨ１Ｈ１８６３Ｎ２をコンジュゲートして、「Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−ＭＣＣ−ＤＭ１」を産生することにより、第１のＡＤＣを産生した。「Ｍ００２６」（その開示全体が参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１４／１４５０９０における「化合物７」としても公知）と称される新規切断可能リンカーに付着させたＤＭ１の修飾バージョンへとＨ１Ｈ１８６３Ｎ２をコンジュゲートして、「Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−Ｍ００２６」を生じることにより、第２のＡＤＣを産生した。ＭＭＴ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞傷害性を検査した際に、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−ＭＣＣ−ＤＭ１は、１２ｎＭのＩＣ５０を示した一方、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−７は、薬物当量に基づく０．８ｎＭのＩＣ５０を示した。
【０１５４】
ＤＭ１およびＭ００２６にコンジュゲートされた抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を比較するために、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性乳がん同種移植片を有する免疫無防備状態のマウスにおいて試験を行った。
【０１５５】
簡潔に説明すると、雌ＣＢ１７  ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＹ）の左側腹部への０．５×１０６個のＭＭＴ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の皮下植え込みにより、腫瘍同種移植片を確立した。腫瘍が１４０ｍｍ３の平均体積に達したら（ほぼ８日目）、マウスを７匹の群にランダム化し、ＭＣＣ−ＤＭ１またはＭ００２６リンカー−薬物フォーマットのいずれかを使用した抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＡＤＣを投薬した。ＭＣＣ−ＤＭ１またはＭ００２６リンカー−薬物フォーマットのいずれかを使用した非結合ＡＤＣを含む対照試薬と、ＰＢＳビヒクルも評価した。１および５ｍｇ／ｋｇのＡＤＣを１週間にわたり３回投薬し、その後、ビヒクル単独を投与した群においておよそ２０００ｍｍ３の平均腫瘍サイズが達成されるまでモニターした。この時点で、後述の通りに腫瘍成長阻害を計算した。
【０１５６】
ビヒクル処置群と比べた平均腫瘍サイズを次の通りに計算した：ビヒクル群の平均サイズが１０００ｍｍ３に達するまで、カリパスで１週間に２回腫瘍を測定した；式（長さ×幅２）／２を使用して、腫瘍サイズを計算した。次式に従って、腫瘍成長阻害を計算した：（１−（（Ｔｆｉｎａｌ−Ｔｉｎｉｔｉａｌ）／（Ｃｆｉｎａｌ−Ｃｉｎｉｔｉａｌ）））＊１００（式中、Ｔ（処置群）およびＣ（対照群）は、ビヒクル群が１０００ｍｍ３に達した日の平均腫瘍量を表す）。結果は表１５に概要を述べる。
【表１５】
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【０１５７】
表１５に要約されるように、５ｍｇ／ｋｇ  Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−Ｍ００２６を投薬したマウスにおいて最大の腫瘍阻害が観察され、初期腫瘍の退縮が観察された。５ｍｇ／ｋｇ  Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−Ｍ００２６による処置に起因する１０２％の腫瘍成長阻害は、５ｍｇ／ｋｇ  Ｈ１Ｈ１８６２Ｎ２−ＭＣＣ−ＤＭ１による腫瘍処置後に観察されるもの（８３％）と比べて有意に大きかった。Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−ｍｃｃ−ＤＭ１と比較した、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−Ｍ００２６によって誘導される腫瘍成長阻害の優位性は、１ｍｇ／ｋｇ用量で同様に維持された。ＭＣＣ−ＤＭ１またはＭ００２６を使用した対照ＡＤＣで処置した群において、抗腫瘍効果は観察されなかった。
【０１５８】
本実施例は、したがって、本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が、抗体−薬物コンジュゲートの形態で投与されると、腫瘍成長の阻害において高度に強力であることを示す。本実施例は、その上、特に、新規リンカー／薬物分子Ｍ００２６にコンジュゲートされた本発明の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（例えば、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２）の文脈において、腫瘍退縮を実際に促進する本発明のＡＤＣの役割を支持する。
【０１５９】
本発明は、本明細書に記載されている具体的な実施形態による範囲内に限定されるべきではない。実際に、本発明の様々な修正が、本明細書に記載されているものに加えて、前述の記載および添付の図面から、当業者には明らかになるであろう。係る修正は、添付の特許請求の範囲内に収まることを企図する。
【０１６０】
（実施例１３）抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＤＭ１抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に対する特異性を示し、強力な細胞殺傷活性を実証する
本実施例において、細胞生存率を低下させる、マイタンシン毒素ＤＭ１にコンジュゲートされた抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイを使用して決定した。
【０１６１】
全長ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（配列番号１４７）または野生型ヒトＥＧＦＲ（配列番号１４６）を、ＨＥＫ２９３（２９３／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ、２９３／ｈＥＧＦＲｗｔ）、Ｕ２５１（Ｕ２５１／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ）およびＭＭＴ０６０５６２（ＭＭＴ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ）細胞株に安定的に導入した。全細胞は、リポフェクタミン２０００に基づく方法論により生成し、Ｇ４１８の存在下で完全成長培地において培養した。
【０１６２】
ＥＧＦＲ  ｗｔまたはＥＧＦＲｖＩＩＩの細胞表面発現をＦＡＣＳ解析により測定した。簡潔に説明すると、１×１０６個の細胞を、１０μｇ／ｍｌの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２、抗ＥＧＦＲｗｔ対照ｍＡｂ（対照ＩＶ）またはアイソタイプ対照と共に３０分間氷上で、抗体希釈バッファーにおいてインキュベートした。抗体希釈バッファーによる２回の洗浄後に、細胞を１０μｇ／ｍｌのＰＥコンジュゲート抗ヒト二次抗体と共に３０分間氷上でインキュベートした。２回の追加的な洗浄後に、試料をＡｃｃｕｒｉ  Ｃ６（ＢＤ）またはＨｙｐｅｒｃｙｔ（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ）サイトメーターにおいて流し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを解析した。結果は、表１６に概要を述べる。ｎ．ｄ．＝決定されず。
【表１６】
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【０１６３】
これらの結果は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ表面発現が、ＨＥＫ２９３／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＭＭＴ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株において匹敵した一方、Ｕ２５１／ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現レベルが、ＨＥＫ２９３／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＭＭＴ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞系のおよそ２０分の１であったことを示す。Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２によるＥＧＦＲｖＩＩＩ結合は、親細胞株において検出できなかった。対照的に、抗ＥＧＦＲｗｔ対照抗体（対照ＩＶ）は、アイソタイプ対照を４９倍上回ってＨＥＫ２９３親細胞に結合した。ＨＥＫ２９３細胞へのＥＧＦＲｗｔ発現ベクターの安定的取り込みは、バックグラウンドを３３２倍上回るまで発現を増加させ、ＨＥＫ２９３／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＭＭＴ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現に匹敵した。
【０１６４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩへの抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２の選択的結合を、ＨＥＫ２９３親、ＨＥＫ２９３／ｈＥＧＦＲｗｔ、ＨＥＫ２９３／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＡ４３１細胞株を使用したＦＡＣＳにより評価した。結果を表１７に示す。
【表１７】
0006632984.tif 000018
【０１６５】
表１７に示す通り、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２および抗ＥＧＦＲｗｔ対照抗体（対照ＩＶ）の両方が、アイソタイプ対照と比べて、ＨＥＫ２９３／ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞への強い結合（バックグラウンドの＞６５０倍）を示した。対照的に、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２は、ｗｔ−ＥＧＦＲ  ＨＥＫ２９３細胞株（バックグラウンドを３倍上回る）および内在性発現ＥＧＦＲ細胞株Ａ４３１（対照を１３倍上回る）に弱く結合した。抗ＥＧＦＲ−ｗｔ対照抗体は、ｗｔ  ＥＧＦＲ発現細胞に強く結合し、野生型ＥＧＦＲを上回るＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＨ１Ｈ１８６３Ｎ２の選択性を確認した。
【０１６６】
次に、細胞生存率を低下させる、マイタンシン毒素ＤＭ１にコンジュゲートされた抗ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイを使用して決定した。細胞をＰＤＬコーティングした９６ウェルプレートに、ウェル当たり２５０〜２０００細胞となるよう完全成長培地において播種し、一晩増殖させた。細胞生存率曲線のため、ＡＤＣまたは遊離薬物（ＤＭ１−ＳＭｅ）を、５００ｎＭ〜５ｐＭに及ぶ最終濃度で細胞に加え、３日間インキュベートした。細胞をＣＣＫ８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）と共に最後の１〜３時間インキュベートし、４５０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４５０）をＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）において決定した。ジギトニン（４０ｎＭ）処理細胞由来のバックグラウンドＯＤ４５０レベルを、全ウェルから減算し、未処理対照のパーセンテージとして生存率を表現する。１０ポイント応答曲線にわたる４パラメータロジスティック方程式からＩＣ５０値を決定した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）。結果を表１８Ａおよび１８Ｂに示す。ＩＣ５０値は、ｎＭ単位であり、特定の薬物／抗体比（ＤＡＲ）に対し正規化される。
【表１８】
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【０１６７】
表１８Ａおよび１８Ｂに示す通り、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−ＭＣＣ−ＤＭ１は、１．０〜４．０ｎＭに及ぶＩＣ５０で、ＨＥＫ２９３／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｕ２５１／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＭＭＴ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞株の生存率を低下させた。対照的に、ＤＭ１にコンジュゲートされたアイソタイプ対照は、１００ｎＭを超えるＩＣ５０で、２９３／ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＭＭＴ／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の、そして３５ｎＭのＩＣ５０で、Ｕ２５１／ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の生存率を低下させた。Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−ＭＣＣ−ＤＭ１は、野生型ＥＧＦＲを発現するＨＥＫ２９３細胞（２９３／ｈＥＧＦＲｗｔ）にも対照親細胞株にも影響がなく、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞に対する特異性を示唆した。
【０１６８】
よって、本実施例は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞株に対する特異性を有することを実証し、ＤＭ１毒素にコンジュゲートされた場合に、特異的細胞殺傷能力を実証する。
【０１６９】
（実施例１４）ＥＧＦＲｖＩＩＩコンフォメーション性結合抗体−薬物コンジュゲートが、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチド結合抗体−薬物コンジュゲートと組み合わせて投薬されると、向上した細胞殺傷効力が達成される
本実施例において、２種の異なる型の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体−薬物コンジュゲートを同時投与することにより、細胞殺傷を増強する能力を決定した。本実施例のため、検査した組み合わせは、２種の異なる抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体からなった：（１）ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチドＡＤＣを認識しない抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的抗体（本明細書において、「コンフォメーション性結合剤」と称される）；および（２）ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチドを認識する抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的抗体（本明細書において、「ペプチド結合剤」と称される）。実施例６において実証される通り、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチドにもヒトＥＧＦＲの残基３１１〜３２６にも結合せず、したがって、「コンフォメーション性結合剤」であると考慮される。
【０１７０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける交差競合
先ず、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチドに結合する抗体と交差競合するＨ１Ｈ１８６３Ｎ２の能力を、結合競合アッセイにより決定した。本実施例において使用した接合部ペプチド結合性抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、対照Ｖであった。
【０１７１】
Ｏｃｔｅｔ  ＨＴＸバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．、Ａ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるリアルタイム無標識バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）アッセイを使用して、交差競合を決定した。０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０、１．０ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡで構成されたバッファー（Ｏｃｔｅｔ  ＨＢＳＴバッファー）において２５℃で、１０００ｒｐｍのスピードでプレートを振盪しつつ実験全体を行った。２種の抗体が、組換えヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ（ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ．ｍｍｈ；配列番号１５２）における結合に関して交差競合したか否かを評価するために、およそほぼ０．３５ｎｍのｈＥＧＦＲｖＩＩＩ．ｍｍｈを、抗ペンタ−ＨｉｓコーティングされたＯｃｔｅｔバイオセンサー上に捕捉した。次に、抗原捕捉したバイオセンサーを、第１の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体（以降ｍＡｂ−１と称される）の５０μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェルにおける５分間の浸漬により、ｍＡｂ−１で飽和させた。次に、バイオセンサーをその後、第２の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体（以降ｍＡｂ−２と称される）の５０μｇ／ｍＬ溶液を含有するウェルに３分間浸した。各実験ステップ間に、全バイオセンサーをＯｃｔｅｔ  ＨＢＳＴバッファーにおいて洗浄した。実験の経過において、リアルタイム結合応答をモニターし、全ステップの終わりに結合応答を記録した。ｍＡｂ−１と予め複合体形成したｈＥＧＦＲｖＩＩＩへのｍＡｂ−２結合の応答を比較し、異なる抗ＥＧＦＲｖＩＩＩモノクローナル抗体の競合的／非競合的挙動を決定した。
【０１７２】
この実験的交差競合フォーマットを使用して、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２は、検査したＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチド結合剤と交差競合を示さず、ＥＧＦＲｖＩＩＩへの結合に関して対照ＩＩまたは対照ＩＶと交差競合しなかった。この交差競合アッセイの結果は、したがって、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２が、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部ペプチド結合剤ならびに対照ＩＩおよびＩＶとは別個の結合エピトープを有することを示す。
【０１７３】
個々の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体−薬物コンジュゲートの細胞殺傷活性
次に、組み合わせて投与した場合の、細胞生存率を低下させるＨ１Ｈ１８６３Ｎ２−ＭＣＣ−ＤＭ１および抗ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合性ＡＤＣの能力を評価した。ＳＭＣＣ−ＤＭ１にコンジュゲートした場合の、細胞殺傷を誘導する対照Ｖの能力（すなわち、対照Ｖ−ＭＣＣ−ＤＭ１）を、実施例１３に記載されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイを使用して決定した。結果は、表１９に概要を述べる。
【表１９】
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【０１７４】
表１９に要約されるように、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＡＤＣは、０．２５ｎＭ〜３．２５ｎＭに及ぶＩＣ５０値で、様々なＥＧＦＲｖＩＩＩ過剰発現細胞株の細胞生存率を低下させた。
【０１７５】
抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体−薬物コンジュゲートの対になった組み合わせの細胞殺傷活性
次に、１：１比で、抗ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合性ＡＤＣとペアを組んだＨ１Ｈ１８６３Ｎ２−ＭＣＣ−ＤＭ１の細胞殺傷効力を、ＥＧＦＲｖＩＩＩ過剰発現細胞株において検査した。結果を表２０に示す。
【表２０】
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【０１７６】
表２０に要約されるように、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２−ＭＣＣ−ＤＭ１（コンフォメーション性エピトープ結合剤）および対照Ｖ−ＭＣＣ−ＤＭ１（接合部ペプチド結合剤）の組み合わせは、単一ＡＤＣ処置と少なくとも等しい、またはある特定の事例においてはそれと比較して増強された、細胞殺傷効力をもたらした。２種の抗体の間の干渉の欠如は、別個の作用機序を有する異なる細胞毒または異なるクラスの細胞毒を有する２種の非競合抗体の有効使用を示唆する。
【０１７７】
要約すると、本実施例は、Ｈ１Ｈ１８６３Ｎ２が、対照ＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合抗体と交差競合しないことを実証する。この独特のエピトープは、細胞殺傷効力を向上するための、それとＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド結合性ＡＤＣとの組み合わせを可能にする。このようなＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＡＤＣの新規組み合わせは、より優れた治療有効性を可能にし得る。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ−ｂ】
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【図５ｃ−ｄ】
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【配列表】
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