(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペクチン酸、１〜４０ｍｏｌ％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸、またはそれらの塩の少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物の内部ゲル化物を含む基質と、
前記ポリガラクツロン酸化合物の表面にある接着性ポリマーと
を含むことを特徴とする細胞培養物品。
【請求項２】
前記ポリガラクツロン酸化合物が、共有結合によって架橋されたもの、イオン結合によって架橋されたもの、またはそれらの混合物である、請求項１記載の物品。
【請求項３】
前記部分的にエステル化されたペクチン酸が、１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基を有するアルキルカルボキシエステルを含む、請求項１または２記載の物品。
【請求項４】
前記ポリガラクツロン酸化合物の表面にある前記接着性ポリマーが、ポリペプチドを含む、請求項１から３いずれか１項記載の物品。
【請求項５】
前記ポリガラクツロン酸化合物の表面にある前記接着性ポリマーが、共役されたポリペプチドを有するポリマーを含む、請求項１から４いずれか１項記載の物品。
【発明の詳細な説明】
【優先権の主張】
【０００１】
本願は、２０１３年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／８３８４５２号による優先権を主張し、その内容の全体を参照して本明細書に組み込む。
【０００２】
本明細書において言及される刊行物および特許文献は、いずれも参照することにより組み込まれるものである。
【関連出願との相互参照】
【０００３】
本願は、本願と同一の出願人に所有・譲渡されている同時係属の以下の特許出願、２０１１年３月１７日に出願された「SYNTHETIC COATING FOR CELL CULTURE（細胞培養のための合成コーティング）」という名称の米国仮特許出願シリアル番号第６１／４５３，６５４号、２０１０年５月２７日に出願された「SWELLABLE SYNTHETIC MICROCARRIERS FOR CULTURING CELLS（細胞培養のための膨潤性の合成マイクロキャリア）」という名称の米国特許出願シリアル番号第１２／７８８９１７号、２０１０年７月２８日に出願された「PRE-POLYMER PREPARATIONS FOR CELL CULTURE COATINGS（細胞培養コーティング用のプレポリマー調合液）」という名称の米国特許出願シリアル番号第ＰＣＴ／ＩＢ１０／００２１６０号、および２０１２年４月１３日に出願された「SYNTHETIC COMPOSITION AND COATING FOR CELL CULTURE（細胞培養のための合成組成物およびコーティング）」という名称の米国特許出願シリアル番号第１３／４４６７３４号と関連し、それらの内容に依拠するものであり、それらの全体を参照して本明細書に組み込むが、それらによる優先権は主張しない。
【技術分野】
【０００４】
本開示は、一般的に、マイクロキャリア等の細胞培養物品、並びに、その物品を製造する方法および用いる方法に関する。
【発明の概要】
【０００５】
複数の実施形態において、本開示は、化学的に修飾された表面を有する基質等の細胞培養物品、並びに、その物品を製造する方法および用いる方法を提供する。
【０００６】
複数の実施形態において、本開示は、既知化学組成培地または無血清培地における細胞培養を可能にするとともに、培養された細胞をプロテアーゼを用いずに採取することを可能にする完全に合成の細胞培養物品を提供する。
【０００７】
好ましい実施形態では、基質はマイクロキャリアである。本開示のマイクロキャリアは、既知化学組成培地における大規模な細胞増殖に特に適している。このマイクロキャリアは、既知化学組成培地における細胞増殖をサポートできる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】スピナーフラスコ内での撹拌培養における３日後の、接着性ポリマーＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩでコーティングされたＰＧＡマイクロキャリア（“ＰＧＡ−ＳＭＩＩ”）上におけるヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の接着および増殖の例示的な位相差顕微鏡画像を示す。
【図１Ｂ】スピナーフラスコ内で５日後に測定された細胞増殖のグラフを示す。
【図２】１００Ｕのペクチナーゼ／５ｍＭのＥＤＴＡで処理してから５分後のＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリアからの細胞の遊離の位相差顕微鏡画像を示す。
【図３】スピナーフラスコ内でＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリア上において６代の継代数で増殖させたｈＭＳＣの累積細胞増殖のグラフを示す。
【図４】ＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリア上において４０日間にわたって増殖させたｈＭＳＣ細胞に対するフローサイトメトリーによって測定された間葉特異的マーカーの発現のチャートを示す。
【図５】ＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリア上におけるｈＭＳＣ細胞の異なる系統の分化の位相差顕微鏡画像を図５Ａ〜図５Ｃに示す。
【図６】ＳＭＩＩコーティングされたエステル化ペクチン（２０〜３２％）、またはＰＧＡ−ＳＭＩＩビーズで上における、ｈＭＳＣの静止状態での接着の位相差顕微鏡画像を示す。
【図７】様々なビーズ表面上における最適ではないプロセスについての、静止状態において播種されたｈＭＳＣの位相差顕微鏡画像の概要を図７Ａ〜図７Ｅに示す。
【図８】選択された処理を用いたＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリアからの細胞の遊離の位相差顕微鏡画像を図８Ａ〜図８Ｃに示す。
【図９】例示的な接着性ポリマーである、従来技術のペプチド共役高分子構造、ｐ（ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）を示す。
【図１０】別の例示的な接着性ポリマーである、従来技術のペプチド共役高分子構造、ｐ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示の様々な実施形態を、図面（あれば）を参照して詳細に説明する。様々な実施形態を参照することは、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、本明細書で述べるいずれの例も、本発明を限定するものではなく、特許請求される発明の多くの可能な実施形態の一部を述べるものに過ぎない。
【００１０】
複数の実施形態において、本開示の装置、並びに、この装置を製造するためおよび用いるための本開示の方法は、例えば以下で論じるものを含む、１以上の有利な特徴または態様を提供する。いずれの請求項に記載される特徴または態様も、概して、本発明のあらゆる面に適用可能である。いずれか１つの請求項に記載されるいずれの単一または複数の特徴または態様も、他の任意の請求項に記載される他の任意の特徴または態様と組み合わせる、または順序を変えることが可能である。
【００１１】
定義
“完全に（wholly）合成の”または“完全に（fully）合成の”とは、完全に合成原料で構成され、動物由来のまたは動物を原料とするいかなる材料も含まない、マイクロキャリアまたは培養容器の表面等の細胞培養物品を指す。本開示の完全に合成の細胞培養物品は、異種混入の危険性をなくすものである。
【００１２】
“含む（include）”または類似の用語は、包含するが、それに限定されないこと、即ち、包含的であって、排他的ではないことを意味する。
【００１３】
本開示の実施形態を説明する際に用いられる“約（about）”（例えば、組成物中の或る成分の量、濃度、体積、処理温度、処理時間、収量、流量、圧力、粘度等の値、およびそれらの範囲、または構成要素の寸法等の値、およびそれらの範囲を修飾する）は、例えば、材料、組成物、複合材料、濃縮物、構成部品、製造物品、もしくは使用処方を調製するために用いられる一般的な測定および処理手順、これらの手順における故意ではない誤り、方法を実行するために用いられる開始材料または成分の製造、供給源、または純度の違い等の考慮すべき事項によって生じ得る数量のばらつきを指す。また、“約”という用語は、特定の初期濃度または混合を有する組成物または処方の熟成に起因して異なる量、および、特定の初期濃度または混合を有する組成物または処方の混合または処理に起因して異なる量を包含するものである。
【００１４】
“任意の（optional）”または“任意に（optionally）”とは、後述する事象または状況が、生じ得るまたは生じ得ないこと、並びに、記載が、その事象または状況が生じる例および生じない例を含むことを意味する。
【００１５】
実施形態における“から実質的になる（consisting essentially of）”または“からなる（consisting of）”とは、例えば、本明細書で定義される、
ペクチン酸、１〜４０ｍｏｌ％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸、またはそれらの塩の少なくとも１つから選択されたポリガラクツロン酸化合物を含む基質と、
選択されたポリガラクツロン酸化合物の表面にある接着性ポリマーと
を含む細胞培養物品であって、
ポリガラクツロン酸化合物の表面にある接着性ポリマーが、例えば、ｐｏｌｙ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）コポリマーの式で表される共役されたポリペプチドを有するポリマーであり、ポリガラクツロン酸化合物が任意に架橋されている、細胞培養物品や、
培養された細胞を採取する方法であって、
細胞を培養する工程と、
物品から細胞を分離するために、上述の培養物品の表面上の培養された細胞を、ペクチナーゼおよびキレート剤（例えばＥＤＴＡ等）の混合物と接触させる工程と
を含む方法を指し得る。
【００１６】
本開示の物品、物品を製造する方法、および物品を用いる方法は、請求項で挙げられた構成要素または工程に加えて、本開示の組成物、物品、装置、またはそれを製造する方法および用いる方法の基本的および新規な特性に実質的に影響しない他の構成要素または工程（例えば、選択された特定の物品の構成、特定の添加剤もしくは成分、特定の溶剤、特定の構造的材料もしくは構成要素、特定の照射条件もしくは温度条件、または類似の構造、材料、もしくはプロセス変数等）を含み得る。
【００１７】
本明細書で用いられる不定冠詞の“a”または“an”、およびそれに対応する定冠詞の“the”は、特に明記しない限り、少なくとも１つ、または１以上を意味する。
【００１８】
当業者に周知の略語（例えば、時間に対して“ｈ”または“ｈｒｓ”、グラムに対して“ｇ”または“ｇｍ”、ミリリットルに対して“ｍＬ”、室温に対して“ｒｔ”、ナノメートルに対して“ｎｍ”等の略語）が用いられ得る。
【００１９】
構成要素、成分、添加剤、寸法、条件等の態様、およびそれらの範囲について開示される具体的な値および好ましい値は、単に例示的なものであり、他の定められた値または定められた範囲内の他の値を除外するものではない。本開示の装置および方法は、本明細書に記載される任意の値またはそれらの値の任意の組み合わせ、具体的な値、より具体的な値、好ましい値（それらの間にある明示的または黙示的な中間値および中間範囲を含む）を含み得る。
【００２０】
培養された細胞が集密状態に達したら、接着性細胞を基質から遊離させるために、トリプシンが適用されることが多い。例えば、米国特許第４,９９４,３８８号明細書は、コラーゲンでコーティングされたマイクロキャリアビーズを用いて足場依存性細胞を培養して収穫する方法を開示している。増殖が完了したら、コラーゲンは消化されてマイクロキャリアから消失し、培養された細胞が不溶性マイクロキャリアから分離される。しかし、トリプシンのタンパク質分解活性に起因して、細胞表面のタンパク質がしばしば開裂され、これは細胞機能の調節異常につながり得る。トリプシンは、プロテオームの変化および細胞の生理学的変化を誘発する能力があることが報告されている。Huangらは、トリプシン処理が、増殖関連および代謝関連のタンパク質の発現を下方制御し、アポトーシス関連のタンパク質の発現を上方制御し、このことは、細胞の継代培養に用いられたトリプシンが、細胞の生理に対して悪影響を有したことを意味することを報告している（Hsiang-Ling Huangらの「Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells（哺乳類の細胞における細胞継代培養中のトリプシンに誘発されたプロテオーム変性」（Journal of Biomedical Science, 2010, 17:36）を参照）。
【００２１】
プロテアーゼの悪影響の別の例として、トリプシン等のプロテアーゼで細胞を処理すると、がん細胞から抗原が除去され、それらを抗がん治療用のワクチンの開発に用いることができなくなり得ることも知られている。Lokhovらは、トリプシン処理によって、細胞表面から糖タンパク質および糖が放出され（「A sialomucopeptide liberated by trypsin from the human erythrocyte（トリプシンによるヒト赤血球からのシアロムコペプチドの遊離）」（Nature, 1960; 188:1011-2）、Gasic, G.の「Removal and regeneration of the cell coating in tumour cells（腫瘍細胞における細胞コーティングの除去および再生）」（Nature, 1962; 196:170）、並びに、Uhlenbruck, G.の「Action of proteolytic enzymes on the human erythrocyte surface（ヒト赤血球表面に対するタンパク質分解酵素の作用）」（Nature, 1961; 190:181）および「The isolation of living cells from animal tissues（動物組織からの生体細胞の分離）」（International Review of Cytology, 1956; 7:587-647）を参照）、それにより、抗原特性の損失につながることを報告している（David, J.R.らの「The In Vitro, Desensitization of Sensitive Cells by Trypsin（トリプシンによる感受性細胞のインビトロの脱感作）」（J Exp Med., 1964;120:1189-200, 40）、Weiss, Lらの「The demonstration of rupture of cell surfaces by an immunological technique（免疫学的技術による細胞表面の破裂の実証）」（Exp Cell Res., 1963; 30:331-8）、Osunkoya, B.O.らの「Synthesis and fate of immunological surface receptors on cultured Burkitt lymphoma cells（培養されたバーキットリンパ腫細胞上の免疫学的表面受容体の合成および結果）」（Int J Cancer, 1969; 4(2):159-65）、Takeichi, Nらの「Accelerated regeneration of trypsin-treated surface antigens of simian virus 40-transformed BALB/3T3 cells induced by X-irradiation（Ｘ線照射によって誘発されたシミアンウイルス４０転換ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞のトリプシン処理された表面抗原の再生の加速）」（Cancer Res., 1976; 36(4):1258-62）を参照）。特に、Takeichiらは、フットパッドアッセイ（footpad assays）において、ＳＶ４０転換３Ｔ３細胞のトリプシン処理が、それらの抗原性を減少させたことを示している。同様に、フットパッドスウェリングアッセイ（footpad swelling assays）において、トリプシンで処理されたポリオーマウイルス転換細胞が、腫瘍特異的抗原に対する遅延型過敏反応を誘発できなかったことが実証されている（Molinari、J.A.らの「Modification of surface membrane antigens by trypsin（トリプシンによる表面膜抗原の修飾）」（Proc Soc Exp Biol Med., 1975; 148(4):991-4）を参照）。
【００２２】
Mundtらの米国特許第５，１００，７９９号明細書は、細胞培養をマイクロキャリアから遊離させる方法を開示しており、この方法では、フロースループロセスにおいて、マイクロキャリアを有する容器にトリプシン溶液が通される。この特許は、採取された細胞に対するプロテアーゼの悪影響を防止するために、容器から出た後のトリプシン溶液の不活性化、除去、またはそれらの両方を行い、遊離した細胞を直ちにキャリアから回収しなければならないと述べている。Mundtは、「高い割合の細胞がかなり迅速に遊離するので、トリプシン溶液中に長時間留まることになる」と述べている。これは、トリプシンの作用がこれらの細胞に対して悪影響を及ぼすという短所となる。特に悪影響を受けるのは、新たなマイクロキャリア上における細胞増殖および細胞再定着能力である。結果として、トリプシンを用いずに、またはトリプシンの非存在下で、細胞を採取することが非常に望ましい。
【００２３】
トリプシンを、多糖類ビーズを消化する非タンパク質分解酵素で置き換える試みが、Hungerfordらの「Cell-culture and polymer constructs（細胞培養およびポリマー構成物）」という名称の米国特許第６，３７８，５２７号明細書（および国際公開第ＷＯ００５６２５１号）において報告されている。Hungerfordは、「用いられている最も一般的な細胞採取方法はトリプシン処理によるものであるが、この方法では、細胞がマイクロキャリアから完全に回収されない場合がある。従って、彼らは、マイクロキャリア上で細胞を増殖させた後、マイクロキャリアを消化する酵素によって細胞をマイクロキャリアから分離させる、マイクロキャリアを提案している。より具体的には、デキストランマイクロキャリア小ビーズ上で軟骨細胞が増殖された後、デキストラナーゼを用いてビーズを消化させて、軟骨細胞をキャリアから分離する」と述べている。また、この特許は、デキストラナーゼによって消化可能なデキストランマイクロキャリアも記載しているが、本開示のように、ペクチナーゼによって消化可能なペクチン酸でビーズを製造できることは述べていない。更に、Hungerfordは、既知化学組成培地または無血清培地において細胞を増殖させる方法は記載していない。実際、用いられたマイクロキャリアは、コラーゲンＩでコーティングされたデキストランビーズ、即ち、Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標）３であり、マイクロキャリア上における細胞増殖は、既知化学組成および無血清培地ではなく、ウシ胎仔血清が補充されたダルベッコ変法イーグル培地において行われた。
【００２４】
より最近では、国際公開第ＷＯ２０１１／０２５４４５号に、Hungerfordらによってそれより前に報告されているように（上記を参照）、デキストラナーゼによって消化されるデキストランビーズが記載されている。また、国際公開第ＷＯ２０１１／０２５４４５号は、アミラーゼによって消化可能なデンプンでコーティングされたマイクロキャリアも記載している。国際公開第ＷＯ２０１１／０２５４４５号は、細胞付着を促進する細胞結合配位子が共有結合により細胞培養面にグラフトされなければならず、この表面は二官能性試薬を用いて活性化されていることを述べている。また、この配位子は、アリルグリシジルエーテルまたは類似の二官能性試薬等の特定の配位子を介して、分解性多糖類に付着されることも述べられている。国際公開第ＷＯ２０１１／０２５４４５号は、デキストラナーゼまたはアミラーゼによってそれぞれ消化可能なデキストランマイクロキャリアおよびデンプンでコーティングされたマイクロキャリアを記載しているが、ペクチナーゼによって消化可能なペクチン酸でビーズを製造できることは述べていない。さらに、国際公開第ＷＯ２０１１／０２５４４５号は、既知化学組成培地または無血清培地において細胞を増殖させる方法は教示していない。さらに、国際公開第２０１１／０２５４４５号は、化学誘導体化を行わずに、合成ペプチドポリマー等の接着性ポリマーでキャリアをコーティングすることによって、細胞付着を容易に達成できることは教示していない。
【００２５】
ハミルトン社（Hamilton）のGlobal Eukaryotic Microcarrier（ＧＥＭ（商標））（例えば、ウェブサイト：hamiltoncompany.comを参照）は、市販されている別のタイプのマイクロキャリアであり、磁気粒子が埋め込まれたアルギン酸の核と、細胞の付着および増殖のために基質に共有結合可能な表面とで構成されている。残念ながら、このマイクロキャリアは、細胞培養に適した表面を作るために、ゼラチンの薄い分子層でコーティングされている。製造者によれば、ＧＥＭからの細胞の除去は、トリプシン、またはマイクロキャリアを溶解させて細胞を穏やかに遊離させることにより単一の細胞の懸濁液を採取できるようにするＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて、容易に行われる。結果として、このタイプのアルギン酸系のマイクロキャリアは、非タンパク質分解酵素（例えば、アルギン酸リアーゼ）を加えることによって消化される可能性はあるが、実際上は、タンパク質分解酵素を用いて細胞を採取しなければならない。
【００２６】
日本国特許第３７７１５１０号公報は、細胞付着性活性材料（Ａ）および生体吸収性材料（Ｂ）で構成されることを特徴とする内部再生可能な組織材料について述べている。（Ａ）は、好ましくは、遺伝子組み換え微生物によって合成されるポリペプチド（Ａ１）である。適切な天然起源の生体吸収性材料のリストが与えられており、このリストはペクチン酸を含む。この特許出願は、イオノトロピーにより架橋されたポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）を用いてマイクロキャリアを調製できることは述べていない。更に、上記の細胞付着性活性材料は、遺伝子組み換え微生物によって合成されるものであり、化学的合成によって調製されるものではない。
【００２７】
本願において開示される、既知化学組成培地における無血清条件での細胞増殖を可能にすると共に、プロテアーゼを加えずに細胞採取を可能にする完全に合成のマイクロキャリアは有用であろう。
【００２８】
２０１３年３月２１日に公開された、本願と同一の出願人に所有・譲渡されているFrutosらの米国特許出願第１２／４２０７３５号明細書（現時点では米国特許出願公開第２０１３／００７１９１６号。国際公開第ＷＯ２０１２／１５８２３５号としても公開されている）は、共有結合により付着されたポリペプチドを有するポリマーを水溶液中に溶かしてポリマー溶液を作ることを含む、細胞培養物品の表面をコーティングする方法を述べている。このポリマーは、単官能モノマーから形成されている（即ち、二官能またはより高次の官能性を有するモノマーは有しない）。ポリペプチドに共役されたポリマーに対するポリペプチドの重量パーセントは、ポリペプチドに共役されたポリマーを水溶性にするのに十分に高いものである。上記の水溶液は、有機溶媒を実質的に含まないものである。この方法は、（ｉ）細胞培養物品の表面にポリマー溶液を配置することによってコーティングされた物品を作る工程と、（ｉｉ）コーティングされた物品を十分な熱または電磁放射に晒すことによって、ポリペプチドに共役されたポリマーを細胞培養物品の表面に付着させる工程とを更に含む。例示的なペプチド共役高分子としては、例えば、ｐ（ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）、およびｐ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）（本願においては図９および図１０として示されている）が挙げられる。
【００２９】
複数の実施形態において、本開示の合成マイクロキャリアは、少なくとも、例えば、ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）としても知られているペクチン酸、（ペクチニン酸としても知られている）部分的にエステル化されたペクチン酸（ＰＥ ＰＧＥ）、もしくはそれらの塩、またはそれらの混合物から選択されたものであってもよい、イオノトロピーにより架橋されたバイオポリマーから調製できる。
【００３０】
部分的にエステル化されたペクチン酸が選択された場合には、エステル化度は、例えば、約４０ｍｏｌ％以下（例えば、１ｍｏｌ％〜３９ｍｏｌ％、５〜３５ｍｏｌ％、１０〜３０ｍｏｌ％（それらの間の中間値および中間範囲を含む））であり得る。
【００３１】
複数の実施形態において、本開示のマイクロキャリアは、細胞が増殖されたマイクロキャリアを、ペクチナーゼおよび任意にキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）と接触させることにより、プロテアーゼを加える必要なく、迅速且つ完全な細胞採取を可能にする。
【００３２】
複数の実施形態において、本開示のマイクロキャリアは、マイクロスフェアの寸法を有するペクチン酸もしくはペクチニン酸ビーズ、またはそれらの塩でできているのが有利であり好ましく、これらのビーズは、細胞接着を促進するペプチドで官能化されており、より好ましくは、接着性ペプチドを担持した合成ポリマーでコーティングされることによって官能化されている。この接着性ペプチドは、培養された細胞の生体特異的接着を可能にするものである。本開示のマイクロキャリアは、無血清培養における接着性細胞の大規模な増殖および回収に適している。
【００３３】
複数の実施形態において、本開示の物品、材料、および方法は、例えば、以下の長所を有する。
−完全に合成の細胞培養基質は、異種混入の危険性を防止する。
−プロテアーゼを用いずに、例えば、ペクチナーゼおよびキレート剤（例えばＥＤＴＡ等）を用いることによって、ＰＧＡビーズから細胞を容易に採取できる（このペクチナーゼは、ＰＧＡビーズを溶解させて細胞を穏やかに遊離させ、その結果、更に下流の処理のために単一の細胞の懸濁液を生じる）。
−例えば、マイクロキャリアとしての合成の細胞培養基質は、体積に対する表面積の割合を最大化し、これにより、コンパクトな設置面積において大規模な細胞培養が可能になる。
−合成の細胞培養基質は、例えば、単純なコーティング処理によって調製でき、これによって試薬の消費が低減されると共に労力が低減される。
【００３４】
細胞培養基質組成物は、例えば、少なくともペクチン酸、部分的にエステル化されたペクチン酸、またはそれらの塩、およびそれらの混合物、並びに、足場依存性細胞の付着を促進する少なくとも１つのペプチドで構成され得る。
【００３５】
上記組成物は、足場依存性細胞の付着を促進するペプチド−ポリマー複合体を含むのが好ましく、このペプチド−ポリマー複合体は、接着性ペプチドを含むポリ（メタ）アクリレートまたはポリ（メタ）アクリルアミドコポリマーであるのがより好ましく、このペプチド−ポリマー複合体はＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩであるのがより好ましい。
【００３６】
複数の実施形態において、上記組成物はイオンによって架橋されるのが好ましい。架橋は、イオノトロピーによるゲル化法によって得られるのが好ましく、少なくとも１つの内部ゲル化法によって得られるのがより好ましい。
【００３７】
複数の実施形態において、本開示は、ペクチン酸、１〜４０ｍｏｌ％のエステル化度を有する部分的にエステル化されたペクチン酸、またはそれらの塩の少なくとも１つから選択された、ポリガラクツロン酸化合物を含む基質と、ポリガラクツロン酸化合物の表面にある接着性ポリマーとを含む、細胞培養物品を提供する。
【００３８】
複数の実施形態において、上記ポリガラクツロン酸化合物は、例えば、共有結合によって架橋されたもの、イオン結合によって架橋されたもの、またはそれらの混合物であり得る。
【００３９】
複数の実施形態において、上記部分的にエステル化されたペクチン酸は、例えば、１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基を有するアルキルカルボキシエステルであり得る。
【００４０】
複数の実施形態において、ポリガラクツロン酸化合物の表面にある上記接着性ポリマーは、例えば、ポリペプチドであり得る。
【００４１】
複数の実施形態において、ポリガラクツロン酸化合物の表面にある上記接着性ポリマーは、例えば、共役されたポリペプチドを有するポリマーであり得る。
【００４２】
複数の実施形態において、ポリガラクツロン酸化合物の表面にある上記接着性ポリマーは、ｐｏｌｙ（ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）ホモポリマー、即ちＳｙｎｔｈｅｍａｘＩ（ＳＭＩ）、ｐｏｌｙ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）コポリマー、即ちＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩ（ＳＭＩＩ）、またはそれらの混合物の少なくとも１つから選択された
共役されたポリペプチドを有するポリマーである（式中、ＭＡＡはメタクリル酸であり、ＨＥＭＡはヒドロキシエチルメタクリレートであり、ＰＥＧ４はポリエチレングリコールテトラオリゴマーであり、ＶＮは共役されたビトロネクチンポリペプチドである）。
【００４３】
ＳｙｎｔｈｅｍａｘＩポリマーおよびＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩコポリマー、並びにそれらを製造する方法は、上述の米国特許出願シリアル番号第１３／４２０，７３５号明細書において開示されている。
【００４４】
複数の実施形態において、上記接着性ポリマーは、例えば、物品の総重量に基づき０.１〜３０重量％の量で存在し得る。
【００４５】
複数の実施形態において、上記接着性ポリマーは、例えば、基質に対する足場依存性生体細胞の付着を促進し得る。
【００４６】
複数の実施形態において、上記基質は、例えば、マイクロキャリア粒子であり得る。
【００４７】
複数の実施形態において、本開示は、培養された細胞を採取する方法であって、細胞を培養する工程と、上述の培養物品から細胞を分離するために、培養物品の表面にある培養された細胞を、ペクチナーゼおよびキレート剤の混合物と接触させる工程とを含む方法を提供する。
【００４８】
複数の実施形態において、上記方法は、例えば、分離された細胞を組成物から単離する工程を更に含み得る。
【００４９】
複数の実施形態において、上記キレート剤は、例えば、ＥＤＴＡ、類似の多座配位性キレート剤、またはそれらの混合物であり得る。
【００５０】
複数の実施形態において、上記接触は、例えば、プロテアーゼを用いずに達成され得る。
【００５１】
複数の実施形態において、上述の細胞培養組成物または物品を製造する方法は、本明細書において開示されるいずれかのポリガラクツロン酸化合物で構成される基質の表面を、接着性ポリマーでコーティングする工程を含む。
【００５２】
複数の実施形態において、上記方法は、例えば、選択されたポリガラクツロン酸化合物を、例えば、イオン架橋によって、内部ゲル化によって、またはそれらの組み合わせによって、架橋する工程を更に含み得る。
【００５３】
複数の実施形態において、上記基質は、例えば、マイクロキャリアであり得る。
【００５４】
ＰＧＡポリマー
本開示の合成マイクロキャリアは、例えば、ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）としても知られているペクチン酸もしくはそれらの塩、またはペクチニン酸として知られている部分的にエステル化されたペクチン酸（ＰＥ ＰＧＡ）もしくはそれらの塩から選択された少なくとも１つのイオノトロピーにより架橋された多糖類から作られ得る。ペクチニン酸が選択された場合には、エステル化度は約４０ｍｏｌ％未満であるのが好ましい。エステル化度がこれより高いと、イオノトロピーによる架橋によるビーズ形成が行えなくなる。理論に縛られたものではないが、許容可能なレベルのイオノトロピーによる架橋を得るには、最小限の量の遊離カルボン酸基が必要とされ得ると思われる。
【００５５】
本開示のマイクロキャリアとして用いられるビーズは、ペクチン酸またはペクチニン酸の混合物から調製されるのが好ましい。ペクチン酸は、ペクチンの或るエステルを加水分解することによって形成され得る。ペクチンは、植物において構造的な役割を有する細胞壁多糖類である。それらは、主として、１，２結合されたＬ−ラムノースがランダムに割り込んだ、１，４結合されたα−Ｄ−ガラクツロン酸骨格に基づく直鎖状ポリマーである。平均分子量は約５０，０００〜約２００，０００ダルトンである。
【００５６】
ペクチンの２つの主要な供給源は、例えば、柑橘類の果皮（大部分はレモンおよびライム）またはリンゴの果皮であり、それらの抽出によって得ることができる。
【００５７】
ペクチンのポリガラクツロン酸鎖は、メチル基によって部分的にエステル化できると共に、遊離酸基は、ナトリウムイオン、カリウムイオン、またはアンモニウムイオン等の一価のイオンで部分的にまたは完全に中和できる。メタノールで部分的にエステル化されたポリガラクツロン酸は、ペクチニン酸と呼ばれ、それらの塩はペクチネートと呼ばれる。
【００５８】
市販の高メトキシ（ＨＭ）ペクチンのメチル化度（ＤＭ）は、一般的に、例えば、６０〜７５ｍｏｌ％であり得、低メトキシ（ＬＭ）ペクチンのメチル化度（ＤＭ）は、１〜４０ｍｏｌ％、１０〜４０ｍｏｌ％、および２０〜４０ｍｏｌ％（それらの間の中間値および中間範囲を含む）であり得る。
【００５９】
本開示のマイクロキャリアは、ＬＭペクチンから調製されるのが好ましく、ポリガラクツロン酸は、２０ｍｏｌ％未満のメトキシ基を含むのが好ましく、ポリガラクツロン酸は、ペクチン酸としてのメチルエステルを含有しないかまたはメチルエステルの含有量が無視できる量であるのがより好ましい。簡単のために、メチルエステルを含まないまたは無視できる量のメチルエステルを含むペクチニン酸、および低メトキシ（ＬＭ）ペクチンの両方を、本開示においてはＰＧＡと称する。
【００６０】
ＰＧＡのイオノトロピーによるゲル化による架橋
本開示のポリガラクツロン酸ビーズは、それらが細胞培養培地中に溶けるのを防止するために、架橋され得る。架橋は、以下に説明するように、イオノトロピーによるゲル化によって行われるのが好ましく、内部ゲル化によって行われるのがより好ましい。イオノトロピーによるゲル化は、高分子電解質が多価対イオンの存在下で架橋することによって架橋されたヒドロゲルを形成する能力に基づくものである。
【００６１】
これらの高分子電解質（例えば、アルギン酸塩およびペクチン酸塩）のゲル化は、カルシウム等の二価のカチオンと、ＰＧＡおよびアルギン酸塩のガラクツロン酸残基またはグルロン酸残基のブロックとの間の強い相互作用から生じる（Alexis J. de Kerchoveらの「Polysaccharide Gel Layers in the Presence of Ca2+ and K+ Ions: Measurements and Mechanisms（Ｃａ２＋イオンおよびＫ＋イオンの存在下における多糖類ゲル層:測定およびメカニズム）」（Biomacromolecules, 2007,8, 113-121）を参照）。イオノトロピーによるゲル化プロセスは、簡単且つ安価である。
【００６２】
複数の実施形態において、何らかの化学的架橋が行われ得るが、化学的架橋のレベルは、不可逆的であることから、ペクチナーゼによるビーズの消化性を保つために十分に低いべきである（例えば、約１０〜２０ｍｏｌ％未満）。従来の研究から、ゲルの構造は、分解に大きく影響し得ることが知られており、例えば、より高度に架橋されたゲルでは、全体の分解時間がより長くなり得る。架橋によってヒドロゲルの細孔径が小さくなり、酵素の接近が制限され、その結果、消化効率が低くなる。
【００６３】
イオノトロピーにより架橋されたペクチン酸塩は、アルギン酸カルシウムゲルを凌駕する多くの長所を提供し得ることが報告されている。ペクチン酸カルシウムゲルは、そのようなゲルが細胞をカプセル化するために用いられる場合には、固定化された細胞の多くの用途において、アルギン酸カルシウムゲルのより良好な代替物であった（P. GemeinerらのProgress in Biotechnology, Vol 11, 1996, Pages 76-83を参照）。ＰＧＡゲルビーズの最も高い機械的強度、最も低い収縮量、および一価のカチオンに対する最良の安定性は、ＰＧＡが、アルギン酸塩とは異なり、二価のカチオンと相互作用して架橋部位を形成可能な１００ｍｏｌ％のガラクツロン酸残基を含むことから説明できる。
【００６４】
結果として、ペクチン酸カルシウムゲルは、イオンおよび化学薬品、特にアルギン酸カルシウムゲルを破壊するキレートアニオンに対する感受性がより低い。
【００６５】
好ましいイオノトロピーにより架橋されたＰＧＡビーズの安定性は、特に、ビーズが細胞培養のための基質として用いられる場合には、（アルギン酸塩ビーズと比較して）顕著な長所である。そのような高い安定性は、細胞培養中、特にマイクロキャリア撹拌懸濁培養中のビーズの遊離を防止する。
【００６６】
比較例２、並びに図７Ｂおよび図７Ｃは、外部ゲル化（図７Ｂ参照）または内部ゲル化（図７Ｃ参照）によって調製され、その後コーニング社（Corning（登録商標））のＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩでコーティングされたアルギン酸塩ビーズ上では細胞が増殖しないことを示している。
【００６７】
ビーズをイオノトロピーにより架橋する方法
ＰＧＡビーズの調製は、例えば、ＰＧＡ溶液の液滴を、多価カチオン（例えば、カルシウム、マグネシウム、亜鉛等のカチオン）を含むゲル化槽に滴下して、上述のようにイオノトロピーによるゲル化を生じさせることにより、マイクロキャリアビーズを形成することによって達成できる。
【００６８】
イオノトロピーによる外部ゲル化および内部ゲル化
イオノトロピーにより架橋されたＰＧＡビーズを製造するには、少なくとも２つの異なる手法または手順、即ち、外部ゲル化および内部ゲル化がある。内部ゲル化および外部ゲル化を組み合わせることも可能であることも知られている。外部ゲル化では、ニードルを通してＰＧＡ水溶液がカルシウムまたはマグネシウム等の二価のカチオンの溶液中に滴下され、それにより、ＰＧＡポリマーのイオン架橋が生じる。外部ゲル化されたビーズは、通常、不均質であり、ポリマー濃度がビーズの表面付近でより高いため、得られたビーズの多孔性が低くなることが報告されている。比較例８は、ＰＧＡポリマーをカルシウムと外部架橋し、その後、コーニング社のＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩでコーティングすることによって製造されたビーズは、無血清培地における細胞増殖をサポートしないことを示している（図７Ａ参照）。更に、工業的な規模拡大が複雑になり、その結果、製造システムが扱いにくいものになる。更に、そのような外部ゲル化法を用いた場合には、より小さいサイズの微小粒子を得ることが困難になり得る。
【００６９】
拡張可能であることが報告されている内部ゲル化では、ビーズは、水相中に分散され油中で乳化された、不溶性カルシウム塩を含むＰＧＡ水溶液のゲル化によって形成される。ゲル化は、油溶性の酸を加えることによって、ＰＧＡ溶液のｐＨを低くして、可溶性のＣａ２＋またはＭｇ２＋を不溶性の塩から遊離させることによって開始される。
【００７０】
様々なカルシウム塩を用いることができ、例としては、シュウ酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、その他類似の有機および無機アニオン、またはそれらの組み合わせが挙げられる。イオン架橋は、金属の塩（例えば、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、ストロンチウム、バリウム、その他類似のカチオン、またはそれらの組み合わせ）を用いて容易に達成できる。好ましい二価のカチオンはカルシウムである。カルシウムは、多糖類ヒドロゲルの架橋剤として広く用いられている不溶化カチオンである。イオン架橋された多糖類ヒドロゲルは、例えば、創傷被覆材に用いられている。カルシウム塩は、治療目的のイオン架橋剤として広く用いられている。
【００７１】
ＰＧＡビーズを調製する技術の限定しない例としては、例えば、シリンジを用いた滴下または押し出し、ニードルの先端からゲル化槽内へと液滴を引っ張る同軸気流によってビーズ形成が達成されるジェット破砕または粉砕、ニードルの先端からゲル化槽内へと液滴を引っ張るために静電界を用いる静電気ビーズ発生器、破砕を生じさせる磁気駆動振動器、および、噴流を均一な円筒形の部分に切断する回転切断器具によってビーズ形成が達成される噴流切断技術（ゲニアラボ社（Genialab, GmbH）から入手可能な技術）が挙げられる。これらの部分は、ゲル化槽内へと落ちながら球形のビーズを形成する。回転円盤式噴霧器を用いて、回転円盤式噴霧ビーズ形成を達成できる。後述するように、乳化も用いられ得る。
【００７２】
ＰＧＡビーズを調製するための乳化／内部ゲル化法（好ましい方法）
ＰＧＡまたはアルギン酸塩の微小粒子を調製する最も一般的な方法は、ＰＧＡまたはアルギン酸塩の溶液を乳化した後、液滴をゲル化することを含む。アルギン酸塩のマイクロスフェアを形成するための乳化／内部ゲル化技術は先に述べた（Poncelet, D.らの「Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology.（乳化／内部ゲル化によるアルギン酸塩ビーズの製造．Ｉ．方法論）」（Appl. Microbiol. Biotechnol, 38, 39-45 1992b）を参照）。
【００７３】
小径のＰＧＡビーズは、有機相（例えば、合成油または植物油）中で乳化された、分散されたカルシウム塩を含むＰＧＡ水溶液または分散液の内部ゲル化によって形成される。ゲル化は、油溶性の酸を加えることによって、ＰＧＡ溶液のｐＨを低くして、可溶性のＣａ２＋を不溶性の塩から遊離させることによって開始される。好ましい塩は炭酸カルシウムである。好ましいカルシウム塩は、狭い粒径分布および小さい粒径を有する沈降炭酸カルシウムであり得、これは、分散された水相中におけるより安定した炭酸カルシウム粒子の分散を提供する。平均粒径は、例えば、約０．０１〜０．５マイクロメートル、好ましくは０．０４〜０．１５マイクロメートル（それらの間の中間値および中間範囲を含む）であり得る。典型的な平均粒径は、例えば、約０．０４〜約０．０８マイクロメートル（それらの間の中間値および中間範囲を含む）であり得る。適切な油は、例えば、植物油、パラフィン油、脂肪族アルコール等の油、またはそれらの組み合わせであり得る。特に適切な油はｎ−オクタノールである。
【００７４】
乳化物の液滴を、合体しないよう安定化させるために、通常、界面活性剤が添加される。低いＨＬＢを有する油溶性界面活性剤としては、例えば、Ｓｐａｎ８５（商標）ソルビタントリエステル、Ｓｐａｎ６０（商標）ソルビタンモノステアレート−ＳＭ、Ｓｐａｎ８０（商標）ソルビタンオレート、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−４、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ−７、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５−Ｓ３、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１５、ＴｒｉｔｏｎＸ−３５、ＴｒｉｔｏｎＸ−４５、セルロースアセテートブチレート等のポリマー分散剤、または類似の界面活性剤、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
細胞付着を促進するＰＧＡビーズの後処理
ＰＧＡビーズは、そのヒドロゲルの性質および負電荷に起因して、特定の処理なくしては、容易に細胞付着をサポートしない。ＰＧＡビーズは、細胞接着を促進する部分（例えば、ペプチド）で官能化され得る。インテグリンファミリー由来のタンパク質によって認識され得るアミノ酸配列を含むペプチド、または、細胞接着を維持する能力がある細胞分子との相互作用を生じるペプチドが、本マイクロキャリアを官能化するための候補である。好ましいペプチドは、例えば、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、その他類似のペプチド、およびそれらの混合物から選択され得る。特に好ましいペプチドは、以下の配列をそれぞれ有するビトロネクチン（ＶＮ）およびＢＳＰペプチドである。Ａｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号：１）、およびＡｃ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−ＮＨ２（配列番号：２）。
【００７６】
本開示のマイクロキャリアは、所望であれば、接着性ペプチド等のポリマーの単純な物理的吸着によって官能化できるのが有利である。
【００７７】
細胞接着を促進する適切なポリマーは、合成ポリマーを含むのが好ましい。そのような、細胞の接着および増殖を促進するペプチドを担持した合成ポリマーの例としては、コーニング社のＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩが挙げられる。化学誘導体化は時間がかかり、労働集約的であり、大量の試薬を必要とし、大量の廃棄化学薬品を生じるため、接着促進ポリマーの物理的吸着を用いることにより、製造プロセスから化学誘導体化をなくすことは、魅力的であると思われる。
【００７８】
接着性ペプチドを含むポリマーから調製されるコーティングは、内部ゲル化によって架橋されたビーズに対して行われる場合には特に効果的であり、一方、外部ゲル化によって架橋されたビーズに対しては失敗する。
【００７９】
比較例８において実証されているように、外部ゲル化によって調製されたビーズについては、ペプチドコポリマーのコーティングは、外部ゲル化によって調製されたＰＧＡビーズ上における細胞増殖をサポートできない。
【００８０】
理論に縛られたものではないが、外部形成されたゲルの表面の稠密度は、コーティングに用いられるペプチドポリマーの拡散に対してより高い抵抗を示すものと思われ、内部ゲル化によって形成される多孔性でより均質なゲルにおけるペプチドポリマーのより良好な吸収／吸着とは対照的である。ペプチドポリマーのより安定した吸着が達成され、その結果、より効率的な細胞付着およびより良好な細胞増殖が生じると思われる。
【００８１】
細胞の採取に適した非タンパク質分解酵素
ペクチン酸ポリマーでできているビーズについては、細胞の採取に適した、マイクロキャリアを消化する、またはそれらの両方である非タンパク質分解酵素としては、ペクチン分解酵素、即ちペクチナーゼが挙げられ、これらは、大部分は植物中に存在するペクチン物質を加水分解する関連酵素の異種群である。
【００８２】
ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ）は、複雑なペクチン分子を、より短いガラクツロン酸の分子に分解する酵素である。ペクチナーゼは、ポリガラクツロン酸からのペクチンオリゴ糖（ＰＯＳ）の遊離を触媒する。
【００８３】
ペクチナーゼは、菌類、酵母、バクテリア、原虫、昆虫、線虫、および植物によって作られる。
【００８４】
市販されているペクチナーゼの供給源は、一般的に多酵素のものであり、例えば、アスペルギルス・アクレアツス（Aspergillus aculeatus）の選択された株から製造されたペクチン分解酵素製剤であるノボザイムス社（Novozymes）のＰｅｃｔｉｎｅｘ（登録商標）ＵＬＴＲＡ ＳＰＬが挙げられる。これは、主に、ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５）、ペクチントランスエリミナーゼ（ＥＣ４．２．２．２）、およびペクチンエステラーゼ（ＥＣ：３．１．１．１１）を含有する。ペクチナーゼは、ペクチンを加水分解することが知られている。これらは、メチルエステル化されたペクチンまたは脱エステル化されたペクチンを攻撃し得る。ＥＣの記号および数字は、その酵素が触媒する化学反応に基づく、酵素委員会（Enzyme Commission）による酵素の分類スキームである。
【００８５】
部分的または完全なビーズの消化
消化時間、温度、および加えられたペクチン分解酵素の量に応じて、ビーズの消化の程度を選択または予め決定することができる。ビーズ全体が完全に消化される前に、細胞が表面から脱離することが観察された。従って、ビーズが完全に消化されなくても、またはビーズが完全に消化された後に、細胞を採取することが可能である。前者の場合には、例えば、濾過、デカンテーション、遠心分離等の処理、またはそれらの組み合わせといった物理的処置を用いて、ビーズを細胞から分離しなければらない。
【００８６】
図面を参照すると、図１Ａおよび図１Ｂは、スピナーフラスコ内での撹拌培養における３日後の、ＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩでコーティングされたＰＧＡマイクロキャリア（ＰＧＡ−ＳＭＩＩ）上におけるｈＭＳＣの接着および増殖の位相差顕微鏡画像（図１Ａ）、および、スピナーフラスコ内で５日後に測定された細胞増殖に対応するグラフ（図１Ｂ）を示す。
【００８７】
図２は、１００Ｕのペクチナーゼ／５ｍＭのＥＤＴＡで処理してから５分後のＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリアからの細胞の遊離の位相差顕微鏡画像を示す。
【００８８】
図３は、スピナーフラスコ内でＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリア上において６代の継代数で増殖させたｈＭＳＣの累積細胞増殖のグラフを示す。
【００８９】
図４は、ＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリア上において４０日間にわたって増殖させたｈＭＳＣ細胞に対するフローサイトメトリーによって測定された間葉特異的マーカーの発現のチャートを示す。
【００９０】
図５Ａ〜図５Ｃは、ＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリア上において４０日間にわたって増殖させたｈＭＳＣの、脂肪生成系統（５Ａ）、骨形成系統（５Ｂ）、および軟骨形成系統（５Ｃ）への分化（それぞれレッドオイルＯ、アリザリンレッド、およびアルシアンブルーで染色された）の位相差顕微鏡画像を示す。
【００９１】
図６は、ＳＭＩＩでコーティングされたエステル化ペクチン（２０〜３２％）、またはＰＧＡ−ＳＭＩＩビーズ上における、静止状態でのｈＭＳＣ接着の位相差顕微鏡画像を示す。可視チャンネルまたはＤＡＰＩ染色後の画像が示されている。
【００９２】
図７Ａ〜図７Ｅは、様々なビーズ表面上における最適ではないプロセスについての、静止状態において播種されたｈＭＳＣの位相差顕微鏡画像の概要を示す。ＣａＣｌ２溶液を硬化溶液として用いて外部ゲル化によって調製されたＰＧＡビーズ（図７Ａ）、ＣａＣｌ２溶液を硬化溶液として用いて外部ゲル化によって調製されたアルギン酸塩ビーズ（図７Ｂ）、乳化／内部ゲル化法によって調製されたアルギン酸塩ビーズ（図７Ｃ）、外部ゲル化に続き内部ゲル化を行う方法によって調製されたＰＧＡビーズ（図７Ｄ）、外部ゲル化によって調製されたエステル化ペクチン（２０〜３２％）（図７Ｅ）。全てのビーズはＳＭＩＩでコーティングされた。
【００９３】
図８Ａ〜図８Ｃは、５０Ｕのペクチナーゼ、５ｍＭのＥＤＴＡ、または５０Ｕのペクチナーゼ／５ｍＭのＥＤＴＡの混合物を用いて５分間処理された、ＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリアからの細胞の遊離の位相差顕微鏡画像を示す。単一の細胞としての細胞の遊離は、ペクチナーゼおよびＥＤＴＡの混合処理ついてのみ観察され（図８Ｃ）、組み合わされた試薬の協働効果または相乗効果を示している。
【００９４】
図９および図１０は、それぞれ、同一出願人が所有する従来技術のペプチド共役高分子構造、ｐ（ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）およびｐ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）を有する例示的な接着性ポリマーを示す。
【実施例】
【００９５】
以下の実施例は、上述した開示を用いる方法をより完全に説明するためのものであり、本開示の様々な態様を実施するために考えられる最良の態様を述べるためのものである。これらの実施例は、本開示の範囲を限定するものではなく、むしろ、例示の目的で示される。これらの実施例は、本開示の細胞培養物品を調製する方法および用いる方法の態様を更に説明するものである。
【００９６】
実施例１：乳化／内部ゲル化技術によって調製されたＰＧＡマイクロスフェア
ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）ナトリウム塩（シグマ社（Sigma）カタログ番号Ｐ３８５０）を、脱イオン水中で８０℃で１６時間にわたって撹拌しながら分散させ、２．０％（ｗ／ｖ）ＰＧＡ懸濁液を得た。ＣａＣＯ３粉末を脱イオン水中に懸濁させることにより、微結晶ＣａＣＯ３（シグマ社カタログ番号２１０６１）の懸濁液（５％、ｗ／ｖ）を調製した。氷酢酸（１滴）を加えることにより、ｐＨを６．５〜７．０に調節した。５００マイクロリットルの上記ＣａＣＯ３懸濁液を、２０ｍＬの２．０％（ｗ／ｖ）ＰＧＡナトリウム塩に加え、この混合物をＩＫＡ社のＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ（商標）分散器を用いて数秒間にわたって均質化した。この混合物を、２％（ｗ／ｗ）のＳｐａｎ８５を含む１００ｇのｎ−オクタノール中で、アンカー型撹拌器を備えたハイドルフ社（Heidolph）のＲＺＲ２０２０混合器を用いて２６０ｒｐｍで撹拌することによって乳化した。ＰＧＡ水溶液と油性相との割合は約１４／８６（ｖ／ｖ）とした。１０分間の乳化後、８０マイクロリットルの氷酢酸を含む２０ｍＬのｎ−オクタノールを加えて、撹拌を４５分間続け、炭酸カルシウムを可溶化させた。４％（ｗ／ｗ）ＣａＣｌ２エタノール溶液を用いて、ＰＧＡゲル化ビーズを３回洗浄した。次に、プルーフエタノールを用いてビーズを３回洗浄し、その次に、脱イオン水で３回洗浄した。コーティング前に、脱イオン水中でビーズを保管した。
【００９７】
実施例２：接着性ポリマー、ＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩ合成コポリマーでのＰＧＡマイクロスフェアのコーティング
実施例１に従って調製された、約９ｍＬの膨潤させたビーズを、５０ｍＬのプラスチック遠心分離管に入れた。また、コーニング社のＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩ−ＳＣコポリマーの脱イオン水溶液を０．２５ｍｇ／ｍＬ調製した。３３ｍＬの上記のコーニング社のＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩ−ＳＣコポリマー溶液を、膨潤させたＰＧＡビーズに加えた。管を穏やかに振り、４０℃で３０分間寝かせて、合成コポリマーによってビーズを官能化させた。冷却後、官能化されたビーズを脱イオン水で３回洗浄した。脱イオン水中のビーズを、滅菌容器内にて４℃で保管した。
【００９８】
比較例３：乳化／内部ゲル化技術によって調製されたアルギン酸塩マイクロスフェア
ＰＧＡナトリウム塩の代わりに、褐藻類から得られた低粘度アルギン酸ナトリウム塩（シグマ社カタログ番号Ａ２１５８）を用いたこと以外は、実施例１で記載されたようにして、乳化／内部ゲル化によって調製されたアルギン酸塩ビーズを調製した。
【００９９】
比較例４：外部ゲル化技術によって調製されたＰＧＡマイクロスフェア
ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）ナトリウム塩（シグマ社カタログ番号Ｐ３８５０）を、脱イオン水中で８０℃で１６時間撹拌しながら分散し、２．０％（ｗ／ｖ）ＰＧＡ懸濁液を得た。凝固液として用いた２５０ミリリットルの３％（ｗ／ｖ）塩化カルシウム水／エタノール（７５／２５（ｖ／ｖ））溶液をビーカーに入れ、磁気撹拌器を用いてゆっくりと撹拌した。１０ミリリットルのＰＧＡ分散液を、３０ゲージのニードルを備えたシリンジポンプを用いて２５０ｍＬ／ｈで凝固液中に滴下した。ビーズを塩化カルシウム中で６０分間硬化させた後、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）水を用いて２回洗浄し、滅菌容器内にて滅菌水中で保管した。
【０１００】
比較例５：外部ゲル化技術によって調製されたアルギン酸塩マイクロスフェア
ＰＧＡナトリウム塩の代わりに、アルギン酸ナトリウム塩（シグマ社カタログ番号Ａ２１５８）を用いたこと以外は、比較例４で記載されたようにして、アルギン酸塩マイクロスフェアを外部ゲル化技術によって調製した。
【０１０１】
実施例６：本開示のマイクロキャリアを用いた撹拌条件下でのｈＭＳＣの増殖
実施例２の接着性ポリマーＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩ−ＳＣでコーティングされたＰＧＡマイクロキャリア（ＰＧＡ−ＳＭＩＩ）上で、ｈＭＳＣを、スピナーフラスコ内における撹拌培養で培養した。図１に示されるように、５日後の細胞の形態および増殖を測定した。期待された細胞形態および細胞増殖が顕著に認められた。１００Ｕのペクチナーゼ／５ｍＭのＥＤＴＡを用いて５分間処理することによって、ＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリアから細胞を採取した（図２参照）。ビーズの消化およびｈＭＳＣ細胞の遊離が顕著に認められた。ＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリア上において６代の継代数で増殖させた累積細胞増殖を、図３のグラフに示す。約４０日間後に１０，０００倍の増殖が達成されている。
【０１０２】
間葉特異的マーカーの発現をフローサイトメトリーによって測定したところ、間葉特異的マーカーＣＤ７３およびＣＤ１０５の測定された発現レベルは９０％を超えており、フラスコ（図示せず）内で増殖させた細胞に匹敵するものであった。期待されたように、ネガティブマーカーＣＤ１４およびＣＤ４５の発現は検出されなかった（図４）。
【０１０３】
ゼノフリー培地において５代の継代後、マイクロキャリアから細胞を採取し、脂肪生成系統、骨形成系統、および軟骨形成系統への分化誘導のために、６ウェルプレート上に移した。
【０１０４】
図５の位相差顕微鏡画像は、３つの各系統へのｈＭＳＣの分化が良好であったことをはっきりと示している。
【０１０５】
実施例７
エステル化ペクチン（２０〜３４％）またはＰＧＡの乳化／内部ゲル化によって調製され接着性ポリマーＳＭＩＩでコーティングされたビーズ上における、ｈＭＳＣの静止状態における接着を評価した。図６の顕微鏡画像は、両者のビーズ上に細胞が接着できることを示している。
【０１０６】
比較例８
比較例４で記載されたように外部ゲル化によって調製されたＰＧＡビーズ、比較例５で記載されたように外部ゲル化によって調製されたアルギン酸塩ビーズ、比較例３で記載されたように乳化／内部ゲル化法によって調製されたアルギン酸塩ビーズ、およびエステル化ペクチン（２０〜３４％）の外部ゲル化によって調製されたビーズ上における、静止状態において播種されたｈＭＳＣの接着を評価した。細胞付着を促進するために、全てのタイプのビーズをＳＭＩＩでコーティングした。図７の顕微鏡画像は、全てのタイプのビーズが最適なｈＭＳＣ細胞付着をサポートするわけではないことを示している。このデータは、アルギン酸塩は本開示のマイクロキャリアを調製するのに適しておらず、たとえＰＧＡを用いた場合でも、外部ゲル化は不適切な方法であることを証明している。
【０１０７】
実施例９：細胞の遊離に対するＥＤＴＡ、ペクチナーゼ、または両者の混合物の効率
接着性ポリマーＳｙｎｔｈｅｍａｘＩＩでコーティングされたＰＧＡビーズについて、ビーズからの細胞の遊離に対するＥＤＴＡのみの効率、ペクチナーゼのみの効率、または両者の混合物の効率を試験した。ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（商標）ＸＦ培地において、３日間、静止状態においてマイクロキャリア上で細胞を増殖させ、５０単位のペクチナーゼ、５ｍＭのＥＤＴＡ、または５０Ｕのペクチナーゼと５ｍＭのＥＤＴＡとの混合物で処理した。図８に示されるように、細胞がペクチナーゼのみ（８Ａ）またはＥＤＴＡのみ（８Ｂ）で処理された場合には、ビーズからの細胞の脱離は観察されたが、細胞は凝集体に留まる傾向があった。ペクチナーゼおよびＥＤＴＡ（８Ｃ）を混合物として用いた場合には、細胞はビーズから脱離し、細胞の凝集体は遊離して、単一の細胞としての細胞の脱離が生じた。多くのタイプの細胞について、細胞の継代培養を行う場合に、均質な細胞播種を得ると共に、更なる培養工程において過剰にコンフルエントなゾーンの形成を防止するためには、凝集を回避することは重要である。また、フローサイトメトリー等の方法を用いた細胞特性評価を用いる場合には、単一の細胞として細胞を採取することが重要である。
【０１０８】
細胞培養のための材料および方法
細胞
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、ステムセルテクノロジーズ社（STEMCELL Technologies）（カタログ番号ＭＳＣ−００１Ｆ）から入手した。Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ（商標）−ＸＦ培地（カタログ番号０５４２９）における日常保守のために、ステムセルテクノロジーズ社のＭｅｓｅｎｃｕｌｔ−ＸＦ付着基質コーティングプレート（カタログ番号０５４２４）上で細胞を増殖させた。
【０１０９】
ペクチナーゼＥＤＴＡ処理
ペクチナーゼ（ノボザイムス社のｐｅｃｔｉｎｅｘ Ｕｌｔｒａ ＳＰＬ（シグマ社Ｐ２６１１））をＰＢＳ（１００Ｕ／ｍＬ）で希釈し、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）を補った。この遊離緩衝液を３７℃でプレインキュベーションした。ビーズの消化および細胞の遊離のために、細胞が接着しているビーズを採取し、１５００ｒｐｍでの２分間の遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳ中で洗浄して、ペクチナーゼおよびＥＤＴＡ溶液中にて３７℃で５分間インキュベーションした。インキュベーション時間が長いほど、ペクチナーゼＥＤＴＡ処理時間が比例して長くなることが示唆される。
【０１１０】
静止培養
マイクロキャリアを１ｍＬの培養培地中に再懸濁させ、ＵＬＡ処理された２４ウェルＵＬＡプレード（コーニング社のｒｅｆ＃３４７３）に移した。次に、５０，０００個のｈＭＳＣ細胞をウェル内に直接播種した。細胞培養インキュベータ内で５％ＣＯ２雰囲気中でプレートを３７℃でインキュベーションした。培養培地（５０〜６０％）は一日おきに交換した。
【０１１１】
スピナーフラスコ培養
マイクロキャリアを培養培地中に再懸濁させ、コーニング社の１２５ｍＬの使い捨てのスピナーフラスコ（コーニング社のカタログ番号３１５２）に移した。ｈＭＳＣを、最終的な体積が１５ｍＬ（スピナーフラスコ１個当たり１Ｅ６個の細胞）となるようマイクロキャリア上に直接播種した。スピナーフラスコを、細胞培養インキュベータ内の３７℃の５％ＣＯ２雰囲気中に配置し、撹拌せずに１８〜２０時間置いた。その後、培地体積を３５ｍＬに調節し（４５ｍＬまで同様に行われる）、培養物を２時間毎に３０ｒｐｍで１５分間撹拌した。培養培地（５０〜６０％）は一日おきに交換した。
【０１１２】
コーニング社のＳｔｅｍｇｒｏ（登録商標）ｈＭＳＣ培地中における連続継代のｈＭＳＣ播種を上述のように行った。７日後、穏やかに均質化した後、培養物の８０％を除去することによって細胞を継代した。スピナーフラスコに新しいＰＧＡ−ＳＭＩＩマイクロキャリアを再び加えた。コーニング社のＳｔｅｍｇｒｏ ｈＭＳＣ培地を用いて最終的な培養体積を３５ｍＬに調節し、２時間毎に３０ｒｐｍで１５分間の撹拌を開始した。採取した細胞−マイクロキャリアを遠心分離によってペレット化し、ｄＰＢＳで洗浄し、ペクチナーゼ／ＥＤＴＡで処理した。血球計を用いたトリパンブルー除外法によって、脱離した細胞を数えた。フローサイトメトリー解析および分化誘導実験のために、全く同じ複数の細胞サンプルを採取した。
【０１１３】
フローサイトメトリー
採取した細胞をｄＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒド溶液中で室温にて１０分間固定し、次に、洗浄してｄＰＢＳ中で保管した。細胞をブロッキング緩衝液中で４℃にて１５分間インキュベーションし、次に、ブロッキング緩衝液中で、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ１０５に対する一次抗体（ミリポア社（Millipore）のＣｈｅｍｉｃｏｎ（商標））または対応するアイソタイプコントロール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（商標））を用いて、ＲＴにて３０分間インキュベーションした。簡単に洗浄した後、１：２００希釈の対応する二次抗体を用いて、細胞を暗室でＲＴにて３０分間インキュベーションした。各サンプルについて、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社（BD Biosciences））を用いて３０，０００の事象を得た。ＢＤ Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（商標）Ｐｒｏソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス社）を用いてヒストグラムオーバーレイサブトラクション解析を行い、マーカーポジティブ細胞の割合を計算した。
【０１１４】
分化誘導
ゼノフリー培地において５代の継代後、マイクロキャリアから細胞を採取し、脂肪生成分化キット（ロンザ社（Lonza）、カタログ番号ＰＴ３１０２Ａ／Ｂ）、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）骨形成分化キット（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号Ａ１００７２−０１）およびＳｔｅｍＰｒｏ軟骨形成分化キット（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号Ａ１００７１−０１）を用いた脂肪生成系統、骨形成系統、および軟骨形成系統への分化誘導のために、６ウェルプレート上に移した。用いた染色剤は、オイルレッド染色キット（ミリポア社）、アリザリンレッド染色剤（ミリポア社）、および１％アルシアンブルー染色剤（フィッシャー・サイエンティフィック社（Fisher Scientific））であった。分化および染色の手順は、製造業者の推奨に従って行った。
【０１１５】
本開示を、様々な具体的な実施形態および技術を参照して説明した。しかし、本開示の範囲内に留まりながら多くの変更および変形を行うことが可能であることを理解されたい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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