(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象試料から得た標的細胞を単離、遺伝子改変、及び製剤化する方法であって、前記方法が、
（ｉ）試料投入口、緩衝液投入口及び処理チャンバーを備える前記対象試料のプロセシング用回路と；
前記回路の１個以上の流路を選択的に閉じるための複数の弁と；
前記対象試料の前記標的細胞を前記対象試料の非標的細胞から分離するための１個以上の標的細胞セレクターと；
前記回路の少なくとも一部を通して前記対象試料を灌流させるための少なくとも１個のポンプと；
前記処理チャンバー、前記複数の弁、前記標的細胞セレクター及び前記ポンプの動作を制御するために１個以上のプロセッサにより実行可能な命令
を含むポイントオブケア及び／又はポータブルデバイスに前記対象試料を仕込む工程及び；
（ｉｉ）前記１個以上のプロセッサによる前記命令の実行を開始し、
前記対象試料を前記処理チャンバーから前記標的細胞セレクターへと移送する作業と；
２個以上のセレクターを使用する場合には、前記標的細胞セレクターの動作により前記標的細胞を前記非標的細胞から同時又はタンデムに分離する作業と；
前記標的細胞を前記処理チャンバーに戻す作業と；
前記処理チャンバー及び／又は前記標的細胞セレクター内の前記標的細胞に遺伝子モディファイヤーを導入し、遺伝子改変された標的細胞を作製する作業及び；
望ましくない培地成分を以下の工程により、最終製剤から除去する工程、
遠心により前記処理チャンバー内の遺伝子改変された標的細胞をペレット化し、ペレット化された細胞懸濁液を作り出す工程、
処理チャンバーに接続された少なくとも１つの第１のチューブを通じて、処理チャンバーにおいてペレット化された細胞懸濁液から、事前に設定した上清体積を除去する工程、
ペレット化された細胞懸濁液を、最終製剤培地で洗浄する工程、
少なくとも１つの第１のチューブを通じて処理チャンバーにおいてさらなる上清を除去して、最終細胞産物製剤を最終体積とする工程、及び
処理チャンバーに接続された少なくとも１つの第２のチューブを通じて、最終産物製剤を１以上のクライオバッグに移す工程であって、該１以上のクライオバッグは、少なくとも１つの第２のチューブに無菌溶接され、最終細胞製品製剤は、１つ以上のクライオバッグに移されると、対象へ投与することができる工程、
により、前記遺伝子改変された標的細胞を対象への投与用の最終細胞産物製剤として製剤化する作業を
前記複数の弁のうち少なくとも１個、前記１個以上の標的細胞セレクター、又は前記少なくとも１個のポンプに実施させる工程
を含む前記方法。
【請求項２】
前記対象試料の初期体積を測定する工程、
前記対象試料のヘマトクリット値を測定する工程、
一定体積の緩衝液を前記対象試料に添加し、前記ヘマトクリット値を少なくとも２５％まで低下させる工程であって、
前記対象試料に添加する緩衝液の体積が下式：
【数１】
0006734283.tif 000030
に従って計算され、
緩衝液を前記対象試料に添加されたあと、対象試料の体積を決定する工程、及び、
２５％のヘマトクリット値をデバイスのユーザーインターフェースに入力する工程を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
現行の適正製造規範（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）の適合を確認するための放出試験を実施する工程を含み、前記放出試験が以下の試験を含む、請求項１に記載の方法。
【表１】
0006734283.tif 000031
【請求項４】
遺伝子モディファイヤーの導入が、ＡＢＣＤ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＬ１、ＡＤＡ、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＡＰＰ、ＡＲＳＡ、ＡＲＳＢ、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、Ｃ９ＯＲＦ７２、Ｃ４６又は他のＣペプチド、ＣＡＲ、ＣＡＳ９、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＣＲ５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤＡ、ＣＦＴＲ、ＣＬＮ３、Ｃ−ＭＹＣ、ＣＲＥ、ＣＳＣＲ４、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＬＡ、ＣＴＳ−１、ＣＹＢ５Ｒ３、ＤＣＣ、ＤＨＦＲ、ＤＫＣ１、ＤＬＬ１、ＤＭＤ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆ８、Ｆ９、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＬ、ＦＡＮＣＭ、ＦａｓＬ、ＦＣＣ、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＵＳ、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＴＡ１、ＧＬＢ１、ＧＮＳ、ＧＵＳＢ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＣＲ、ＨＧＳＮＡＴ、ＨＯＸＢ４、ＨＲＡＳ、ＨＹＡＬ１、ＩＣＡＭ−１、ｉカスパーゼ、ＩＤＵＡ、ＩＤＳ、ＪＵＮ、ＫＬＦ４、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＲＲＫ２、ＬＹＮ、ＭＣＣ、ＭＤＭ２、ＭＧＭＴ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＭＹＣ、ＮＡＧＬＵ、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＮＫＸ２．１、ＮＯＴＣＨ、ＯＣＴ４、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ＰＡＬＢ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ７、ｐｈｏｘ、ＰＩＮＫ１、ＰＫ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＲＡＤ５１Ｃ、ｒａｓ、ＲＰＬ３〜ＲＰＬ４０、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＳ２〜ＲＰＳ３０、ＲＰＳＡ、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＳＧＳＨ、ＳＬＸ４、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＯＸ２、ＴＥＲＣ、ＴＥＲＴ、ＴＤＰ４３、ＴＩＮＦ２、ＴＫ、ユビキリン２、ＶＨＬ、ＷＡＳ及びＷＴ−１からなる群から選択される遺伝子を挿入又は改変する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記単離され、遺伝子改変され、及び製剤化された細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、白血球（ＷＢＣ）、単核細胞（ＭＮＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、間質細胞及び／又は骨髄線維芽細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記単離され、遺伝子改変され、及び製剤化された細胞がＣＤ３４＋ＨＳＰＣである請求項１に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子モディファイヤーが、シュードタイプエンベロープ糖タンパク質及びレンチウイルスＲＮＡ分子を含む、レンチウイルスベクターを含み、シュードタイプエンベロープ糖タンパク質が、水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）、Ｃｏｃａｌウイルス糖タンパク質（ｃｏｃａｌ）、ネコ内在性ウイルス糖タンパク質（ＲＤ１１４）又は改変型フォーミーウイルス糖タンパク質（ｍＦｏａｍｙ）を含み、及びレンチウイルスＲＮＡ分子が、組込み欠損型のＨＩＶ−１由来自己不活性化型レンチウイルスバックボーンを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子モディファイヤーが、シュードタイプエンベロープ糖タンパク質及びフォーミーウイルスＲＮＡ分子を含む、フォーミーウイルスベクターを含み、
前記シュードタイプエンベロープ糖タンパク質が、フォーミーウイルスエンベロープタンパク質（Ｆｏａｍｙ）又は改変型フォーミーウイルスエンベロープタンパク質（ｍＦｏａｍｙ）を含み、
前記フォーミーウイルスＲＮＡ分子が、組込み欠損型の自己不活性化型フォーミーウイルスバックボーンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記対象試料を沈降させるために前記チューブセットに仕込むために必要な段階数を入力する工程を含み、前記必要な段階数が、緩衝液が添加された試料の体積（ｍＬ）を段階毎に３００ｍＬで割り、次の整数に切り上げることにより得られる請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
沈降が完了し、ＲＢＣ除去を開始してもよいことを前記デバイスに通知する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＲＢＣ沈降層から除去する初期体積（ｍＬ）を入力する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ９０又はＣＤ１３３と選択的に結合するビーズ又は抗体を前記デバイスに仕込む工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
マイクロビーズとＩＶＩｇを前記デバイスに仕込む工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
標的細胞を収容した標的細胞バッグのルアー接続部の上部にチューブセットをシールする工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
形質導入培地を前記デバイスに仕込む工程を含み、
前記形質導入培地が、
（ｉ）基礎培地、
（ｉｉ）組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｆｌｉｇｈｔｌｅｓｓ  ３リガンド（ｆｌｔ３又はｆｌｔ３Ｌ）及び／又はインターロイキン３（ＩＬ３）及び／又はインターロイキン６（ＩＬ６）から選択されるインターロイキンを含む、サイトカイン及び／又はケモカイン、及び
（ｉｉｉ）細胞生存と遺伝子導入を助長するための下記の剤、
（ａ）ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１、ＧＮＦ３５１及び／又はＣＨ２２３１９１から選択される、芳香族炭化水素受容体拮抗薬、
（ｂ）ＵＭ１７１及び／又はＵＭ１１８４２８から選択される、ピリミドインドール誘導体、
（ｃ）ミフェプリストン、ＲＵ−４３０４４、ミコナゾール、１１−オキサコルチゾール、１１−オキサプレドニゾロン及び／又はデキサメタゾンメシラートから選択されるグルココルチコイド受容体拮抗薬、
（ｄ）プロタミン硫酸塩、
（ｅ）ラパマイシン、
（ｆ）ポリブレン、
（ｇ）フィブロネクチンフラグメント、
（ｈ）プロスタグランジンＥ２、
（ｉ）抗酸化剤及び／又は
（ｊ）セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク及び／又はトルメチンから選択される非ステロイド性抗炎症薬、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第１の体積の濃縮レンチウイルス、又はフォーミーウイルスを適当な寸法のシリンジ内に吸引する工程と、前記シリンジをルアーフィッティングに接続する工程、及び
第２の体積の濃縮レンチウイルス、又はフォーミーウイルスを適当な寸法のシリンジ内に吸引する工程と、前記シリンジをルアーフィッティングに接続する工程を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
無針スパイクアダプターを製剤化用緩衝液のバッグに差し込む工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
標的細胞バッグを製剤化用緩衝液のバッグに交換する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
クライオバッグから廃棄物バッグへの弁経路を手動で開き、チューブセットを通して製剤化用緩衝液を排出させる工程を含む請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所により与えられたAI096111、HL115128及びHL116217による政府支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
本開示は遺伝子改変細胞のエクスビボ単離・作製・製剤化用プラットフォームを提供する。前記プラットフォームはユーザー入力を最小限にして標的細胞の遺伝子改変を半自動的に実施するようにポイントオブケア及び／又はポータブルデバイスへのソフトウェア命令を実行することができ、遺伝子治療をより広く利用できるようにする。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療の途方もない可能性は過去１０年間に多種多様の疾患で実証されている（Ｇｈｏｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，（２０１５）に概説）。遺伝子治療を普及させるために提唱されている最も単純なストラテジーは直接的なインビボ遺伝子改変を利用している。小型及び大型動物モデルでインビボ遺伝子導入を実現する試みが進行中である（Ｂｕｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２３，３５７８−３５８４（２０１４）；Ｋａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，１１７−１１９（１９９３）；Ｐｏｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，１３１０２−１３１０７（２００２）；Ｔｉｎｇ−Ｄｅ  Ｒａｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０７，３０９１−３０９７（２００６）；Ｆｒｅｃｈａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１９，１１３９−１１５０（２０１２））が、このアプローチが被験者での臨床試験を可能にするために現行の安全性と有効性の基準を満たすまでにはしばらく時間がかかりそうである。重要な課題として、非標的細胞への遺伝子導入の厳重なチェックと、十分な治療遺伝子導入レベルの達成のバランスを取ることが挙げられる。
【０００３】
標的細胞へのエクスビボ遺伝子導入は臨床応用されている遺伝子治療法の１つであり、今日までに有効性を実証されている。幹細胞において、このアプローチは導入後に治療遺伝子を保有する全血球種の産生を患者の終生にわたって可能にする。ＣＤ３４＋幹細胞のエクスビボでの単離及び遺伝子改変は非標的細胞への遺伝子導入がなくなるという点と、遺伝子モディファイヤー（例えば核酸担体）の平均量が減るため、担体作製に伴う費用が減るという点の２点で大きな利点がある。しかし、現行の法規制ガイドライン内でこれらの製品を製造するには、一般的に現行の適正製造規範（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）（ｃＧＭＰ）に従う複合的な中央管理施設が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｈｏｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．（２０１５）
【非特許文献２】Ｂｕｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２３，３５７８−３５８４（２０１４）
【非特許文献３】Ｋａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，１１７−１１９（１９９３）
【非特許文献４】Ｐｏｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，１３１０２−１３１０７（２００２）
【非特許文献５】Ｔｉｎｇ−Ｄｅ  Ｒａｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０７，３０９１−３０９７（２００６）
【非特許文献６】Ｆｒｅｃｈａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１９，１１３９−１１５０（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は遺伝子改変細胞のエクスビボ単離・作製・製剤化用プラットフォームを提供する。特定の実施形態において、前記プラットフォームは閉ループ式無菌ソフトウェア駆動型ポータブル及び／又はポイントオブケアデバイスを利用し、種々の研究及び治療環境で遺伝子治療をより広く利用できるようにする。その最も基本的なレベルにおいて、前記デバイスは原料（例えば試料、緩衝液、ガス）投入口と、遠心機能と細胞インキュベーション機能を備える少なくとも１個の処理チャンバーと、閉鎖式チューブセットと、ポンプと、標的細胞セレクターを含む閉鎖系デバイスである。ソフトウェアを制御することにより、前記デバイスは特定の実施形態では標的細胞を対象試料から直接エクスビボで単離・遺伝子改変・製剤化することができる。ユーザー入力を最小限又は不要にしながら３０時間以内でプロセス全体を完了することができる。また、前記方法を実施するため及び本願に記載するデバイスを使用するために必要又は有用な材料を含むキットも本願に開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一般に、試料は対象（例えば患者又はドナー）から得ることができる。代表的な試料としては末梢血、骨髄、並びに／又はアフェレーシス及び／もしくはロイコアフェレーシス（白血球除去療法）産物が挙げられる。試料はプロセシングを受けるデバイスの第１の処理チャンバーに無菌下で投入することができる。プロセシング中に種々の非標的試料成分を試料から除去することができる。例えば、赤血球（ＲＢＣ）又は血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ）の一方又は両方を標的細胞から分離し、試料から除去することができる。
【０００７】
次に、第１の処理チャンバー内で標的細胞をその後の単離に備えて準備することができる。例えば、標的細胞を準備する工程は、第１の処理チャンバーにおいて１種以上の標識物質（例えば直接結合させた免疫磁気ビーズ）と結合させる工程を含むことができる。更に、標識物質と標的細胞の結合を助長するために特定の「インキュベーション」環境を第１の処理チャンバー内に維持することができ、及び／又は試料と標識物質を撹拌して更に結合を誘導できるように第１の処理チャンバーを操作することができる。
【０００８】
特定の実施形態では、標的細胞準備後に第１の処理チャンバーから標的細胞セレクター／アイソレーターを介して試料を移送することができる。特定の実施形態では、単離／選択された標的細胞を標的細胞セレクター／アイソレーターに留め、遺伝子モディファイヤー（例えば、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ウイルスベクター又は本願の他の箇所で記載する他のツール及び手段）に暴露させることができる。特定の実施形態において、標的細胞セレクター／アイソレーターは標的細胞に遺伝子モディファイヤーを導入し易くするためにエレクトロポレーション機能を備える。特定の実施形態では、単離／選択された細胞を第１の処理チャンバー（又は第２の処理チャンバー）に戻し、遺伝子モディファイヤーに暴露させることができる。例えば温度を維持することにより又は混合ガスを導入することにより、（第１及び／又は第２の）処理チャンバーをもう一度インキュベーション環境に維持することができる。更に、遺伝子改変を改善するために遺伝子モディファイヤーを段階的に添加することができる。最後に、遺伝子改変された標的細胞を対象に投与できるように精製及び製剤化する。当然のことながら、以上の説明は一部の代表的な実施形態が遺伝子モディファイヤーとして核酸を利用すると記載しているが、現在公知であるか又は今後開発されるかに関係なく、他の如何なる種類の遺伝子モディファイヤーも本開示の範囲内に含まれる。
【０００９】
上記のように、上記工程のうちで特に本願の他の箇所でより詳細に説明する工程は各々試料受領から３０時間以内に単独のポイントオブケア及び／又はポータブル閉ループ式無菌ソフトウェア駆動型デバイスの内側で実施することができる。
【００１０】
以下、添付図面を参照して詳細な説明を記載する。図面中、異なる図面で同一の参照番号を付している場合には類似又は同一の要素を表す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本願に開示するシステム及び方法の代表的な実施形態に従って実行可能な連動命令により構成されるポイントオブケア及び／又はポータブル遺伝子治療デバイスを使用して標的細胞を遺伝子改変するための代表的な方法のフローチャートである。
【図２Ａ】試料から赤血球（ＲＢＣ）を除去するための代表的なシステムの模式図を示す。
【図２Ｂ】図２Ａの代表的なシステムを使用してＲＢＣを除去するための代表的な方法のフローチャートである。
【図２Ｃ】ＲＢＣ連銭形成下の試料を収容した漏斗形沈降バッグを示す。図面に示すように、ＲＢＣは時間が進むにつれて濃化し、次第に高密度の沈渣となる。
【図３Ａ】標的細胞の後期選択／単離に備えて試料の標的細胞を準備する（例えば標識する及び／又はその健康を維持する）ための代表的なシステムの模式図を示す。
【図３Ｂ】図３Ａの代表的なシステムを使用して標的細胞を準備するための代表的な方法のフローチャートである。
【図４Ａ】標的細胞の代表的な選択／単離システムの模式図を示す。
【図４Ｂ】図４Ａの代表的なシステムを使用して標的細胞を選択／単離するための代表的な方法のフローチャートである。
【図５Ａ】標的細胞の代表的な選択／単離及び遺伝子改変システムの模式図を示す。
【図５Ｂ】図５Ａの代表的なシステムを使用して標的細胞を選択／単離するための代表的な方法のフローチャートである。
【図６Ａ】遺伝子モディファイヤーを標的細胞に導入してその遺伝子改変を助長するための代表的なシステムの模式図を示す。
【図６Ｂ】図６Ａの代表的なシステムを使用して選択された標的細胞に遺伝子モディファイヤーを導入するための代表的な方法のフローチャートである。
【図７Ａ】用途特異的に（例えば遺伝子改変細胞を対象に投与するために）使用される遺伝子改変細胞を培養、精製及び製剤化するための代表的なシステムの模式図を示す。
【図７Ｂ】図７Ａの代表的なシステムを使用して遺伝子改変細胞を培養、精製及び製剤化するための代表的な方法のフローチャートである。
【図８Ａ】磁化状態にある複合細胞セパレーター・遺伝子改変イントロデューサー（ＣＣＳ−ＧＭＩ）を示す。
【図８Ｂ】図８ＡのＣＣＳ−ＧＭＩの第１の電極を示す。
【図９Ａ】磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）の実施中で磁化状態にあるＣＣＳ−ＧＭＩを示す。
【図９Ｂ】磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）の実施中で磁化状態にあるＣＣＳ−ＧＭＩを示す。
【図１０Ａ】エレクトロポレーションの実施中で通電状態にあるＣＣＳ−ＧＭＩを示す。
【図１０Ｂ】エレクトロポレーションの実施中で通電状態にあるＣＣＳ−ＧＭＩを示す。
【図１１】細胞分離又はエレクトロポレーションの一方又は両方を実施することができるデバイスを示す。
【図１２Ａ】どちらのベクターも同一のＨＩＶ−１バックボーンから誘導される第３世代自己不活性化型レンチウイルスである。（図１２Ａ）２種類の抗ＨＩＶ導入遺伝子（ｓｈＣＣＲ５及びＣ４６）と合成Ｏ６−ベンジルグアニン耐性ＭＧＭＴ突然変異体Ｐ１４０Ｋ導入遺伝子をコードする臨床グレードＬＶ。（図１２Ｂ）非ヒト霊長類における遺伝子導入とインビボ追跡に使用した高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）と合成Ｏ６−ベンジルグアニン耐性ＭＧＭＴ突然変異体Ｐ１４０Ｋ導入遺伝子をコードするＬＶ。どちらのベクターもウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ｗｐｒｅ）に存在するＸ’オープンリーディングフレームを欠失する。ＡｍｐＲ（アンピシリン耐性遺伝子）；ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）；ＰＳＩ（キャプシド形成配列）；ＲＲＥ（ｒｅｖ応答エレメント）；ｃＰＰＴ（セントラルポリプリン範囲）；ＳＦＦＶ（脾フォーカス形成ウイルス）；ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）；ＬＴＲ（長い末端反復）。
【図１２Ｂ】どちらのベクターも同一のＨＩＶ−１バックボーンから誘導される第３世代自己不活性化型レンチウイルスである。（図１２Ａ）２種類の抗ＨＩＶ導入遺伝子（ｓｈＣＣＲ５及びＣ４６）と合成Ｏ６−ベンジルグアニン耐性ＭＧＭＴ突然変異体Ｐ１４０Ｋ導入遺伝子をコードする臨床グレードＬＶ。（図１２Ｂ）非ヒト霊長類における遺伝子導入とインビボ追跡に使用した高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）と合成Ｏ６−ベンジルグアニン耐性ＭＧＭＴ突然変異体Ｐ１４０Ｋ導入遺伝子をコードするＬＶ。どちらのベクターもウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ｗｐｒｅ）に存在するＸ’オープンリーディングフレームを欠失する。ＡｍｐＲ（アンピシリン耐性遺伝子）；ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）；ＰＳＩ（キャプシド形成配列）；ＲＲＥ（ｒｅｖ応答エレメント）；ｃＰＰＴ（セントラルポリプリン範囲）；ＳＦＦＶ（脾フォーカス形成ウイルス）；ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）；ＬＴＲ（長い末端反復）。
【図１３Ａ】自動形質導入後に成長因子で動員した末梢血ＣＤ３４＋白血球における遺伝子マーキング。半自動形質導入と回収後に、後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために組換えヒト成長因子ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−３及びＩＬ−６を添加した液体培地（図１３Ａ）、又は後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために同一の組換えヒト成長因子を添加したコロニー形成アッセイ用メチルセルロース培地（図１３Ｂ）で最終細胞産物のアリコートを培養した。
【図１３Ｂ】自動形質導入後に成長因子で動員した末梢血ＣＤ３４＋白血球における遺伝子マーキング。半自動形質導入と回収後に、後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために組換えヒト成長因子ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−３及びＩＬ−６を添加した液体培地（図１３Ａ）、又は後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために同一の組換えヒト成長因子を添加したコロニー形成アッセイ用メチルセルロース培地（図１３Ｂ）で最終細胞産物のアリコートを培養した。
【図１４】ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙデバイスで動員後のアフェレーシスドナーから単離したヒトＣＤ３４＋細胞１×１０６個の静脈内注入の４時間前に８〜１２週齢の成体ＮＳＧマウスに亜致死量（２７０ｃＧｙ）の放射線を照射した。その後１２週間にわたり、移植から６週間後、１０週間後、及び１２週間後にマウスから血液試料を採取した。１２週間後に動物を屠殺し、リンパ組織を合計ヒト細胞濃度と遺伝子改変頻度について分析した。
【図１５Ａ】（図１５Ａ）ＬＶを形質導入したＣＤ３４＋細胞を注入した個々の成体ＮＳＧマウスの末梢血における注入後各種時点でのヒト細胞生着レベル。注入から１２週間後の屠殺時に、骨髄を合計ヒト細胞含有率とヒトＣＤ３４＋細胞濃度について分析した（図１５Ｂ）。（図１５Ｃ）末梢血と骨髄の両者における遺伝子改変ヒト細胞濃度を定量的ＰＣＲにより測定した。
【図１５Ｂ】（図１５Ａ）ＬＶを形質導入したＣＤ３４＋細胞を注入した個々の成体ＮＳＧマウスの末梢血における注入後各種時点でのヒト細胞生着レベル。注入から１２週間後の屠殺時に、骨髄を合計ヒト細胞含有率とヒトＣＤ３４＋細胞濃度について分析した（図１５Ｂ）。（図１５Ｃ）末梢血と骨髄の両者における遺伝子改変ヒト細胞濃度を定量的ＰＣＲにより測定した。
【図１５Ｃ】（図１５Ａ）ＬＶを形質導入したＣＤ３４＋細胞を注入した個々の成体ＮＳＧマウスの末梢血における注入後各種時点でのヒト細胞生着レベル。注入から１２週間後の屠殺時に、骨髄を合計ヒト細胞含有率とヒトＣＤ３４＋細胞濃度について分析した（図１５Ｂ）。（図１５Ｃ）末梢血と骨髄の両者における遺伝子改変ヒト細胞濃度を定量的ＰＣＲにより測定した。
【図１６Ａ】自動形質導入後のヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞における遺伝子マーキング。半自動形質導入と回収後に、後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために組換えヒト成長因子Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−３及びＩＬ−６を添加した液体培地（図１６Ａ）、又は後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために同一の組換えヒト成長因子を添加したコロニー形成アッセイ用メチルセルロース培地（図１６Ｂ）で最終細胞産物のアリコートを培養した。
【図１６Ｂ】自動形質導入後のヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞における遺伝子マーキング。半自動形質導入と回収後に、後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために組換えヒト成長因子Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−３及びＩＬ−６を添加した液体培地（図１６Ａ）、又は後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために同一の組換えヒト成長因子を添加したコロニー形成アッセイ用メチルセルロース培地（図１６Ｂ）で最終細胞産物のアリコートを培養した。
【図１７Ａ】ポイントオブケア及び／又はポータブル製造を使用して作製したヒト定常状態ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞は免疫不全マウスに生着した。（Ａ）ＬＶを形質導入したＢＭ由来ＣＤ３４＋細胞を注入した個々の成体ＮＳＧマウスにおける注入後各種時点でのヒトＣＤ４５＋血球生着レベル。全動物を移植から１４週間後に屠殺し、ＢＭをヒトＣＤ４５＋及びＣＤ３４＋血球含有率（Ｂ）とＬＶ遺伝子マーキング（Ｃ）について分析した。
【図１７Ｂ】ポイントオブケア及び／又はポータブル製造を使用して作製したヒト定常状態ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞は免疫不全マウスに生着した。（Ａ）ＬＶを形質導入したＢＭ由来ＣＤ３４＋細胞を注入した個々の成体ＮＳＧマウスにおける注入後各種時点でのヒトＣＤ４５＋血球生着レベル。全動物を移植から１４週間後に屠殺し、ＢＭをヒトＣＤ４５＋及びＣＤ３４＋血球含有率（Ｂ）とＬＶ遺伝子マーキング（Ｃ）について分析した。
【図１７Ｃ】ポイントオブケア及び／又はポータブル製造を使用して作製したヒト定常状態ＢＭ  ＣＤ３４＋細胞は免疫不全マウスに生着した。（Ａ）ＬＶを形質導入したＢＭ由来ＣＤ３４＋細胞を注入した個々の成体ＮＳＧマウスにおける注入後各種時点でのヒトＣＤ４５＋血球生着レベル。全動物を移植から１４週間後に屠殺し、ＢＭをヒトＣＤ４５＋及びＣＤ３４＋血球含有率（Ｂ）とＬＶ遺伝子マーキング（Ｃ）について分析した。
【図１８Ａ】自動形質導入後に成長因子でプライミングした骨髄非ヒト霊長類ＣＤ３４＋細胞における遺伝子マーキング。半自動形質導入と回収後に、後続するフローサイトメトリー用に組換えヒト成長因子ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−３及びＩＬ−６を添加した液体培地（図１８Ａ）、又はコロニー形成アッセイと後続するフローサイトメトリーもしくはＰＣＲ反応用に同一の組換えヒト成長因子を添加したメチルセルロース培地（図１８Ｂ）で骨髄破壊処置したサルへの輸液用最終細胞産物のアリコートを培養した。
【図１８Ｂ】自動形質導入後に成長因子でプライミングした骨髄非ヒト霊長類ＣＤ３４＋細胞における遺伝子マーキング。半自動形質導入と回収後に、後続するフローサイトメトリー用に組換えヒト成長因子ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−３及びＩＬ−６を添加した液体培地（図１８Ａ）、又はコロニー形成アッセイと後続するフローサイトメトリーもしくはＰＣＲ反応用に同一の組換えヒト成長因子を添加したメチルセルロース培地（図１８Ｂ）で骨髄破壊処置したサルへの輸液用最終細胞産物のアリコートを培養した。
【図１９Ａ】ポイントオブケア及び／又はポータブル製造後のレンチウイルス遺伝子改変ＣＤ３４＋細胞の非ヒト霊長類におけるインビボでの持続的な造血及び生着。骨髄破壊的ＴＢＩ後に半自動条件下で作製した自家レンチウイルス遺伝子改変ＣＤ３４＋細胞を２匹（Ｚ１３１０５及びＺ１３０８３）に移植した。（図１９Ａ）グラフは移植後時間（ｘ軸）の関数として第１のｙ軸上に好中球絶対数（白丸）と血小板数（黒丸）により造血回復を示し、第２のｙ軸上に遺伝子改変末梢血顆粒球（グレー四角）及びリンパ球（グレー縁白抜き四角）の生着と血清中タクロリムス濃度測定値（菱形）を示す。（図１９Ｂ）移植後時間（ｘ軸）に伴って末梢血で観測されたＣＤ３を発現する遺伝子改変（ｅＧＦＰ＋）リンパ球の百分率と、ＣＤ４及び／又はＣＤ８を発現するｅＧＦＰ＋／ＣＤ３＋細胞の百分率（ｙ軸）。
【図２０Ａ】自動形質導入後の非ヒト霊長類赤血球及び血小板におけるインビボでの導入遺伝子発現。動物Ｚ１３１０５及びＺ１３０８３では夫々移植から２５８日後と２２２日後に、対照（非移植）動物に比較してＲＢＣ及び血小板におけるＧＦＰ導入遺伝子の発現がフローサイトメトリーにより判明した（下段図）。上段図は各動物のＲＢＣと血小板の散乱特性を示す。対照動物を使用してゲートを設定した。
【図２０Ｂ】自動形質導入後の非ヒト霊長類赤血球及び血小板におけるインビボでの導入遺伝子発現。動物Ｚ１３１０５及びＺ１３０８３では夫々移植から２５８日後と２２２日後に、対照（非移植）動物に比較してＲＢＣ及び血小板におけるＧＦＰ導入遺伝子の発現がフローサイトメトリーにより判明した（下段図）。上段図は各動物のＲＢＣと血小板の散乱特性を示す。対照動物を使用してゲートを設定した。
【図２１】ポイントオブケア及び／又はポータブル作製及び移植後のＬＶ遺伝子改変非ヒト霊長類ＣＤ３４＋細胞の高度にポリクローン性の生着。棒グラフは自家レシピエントへ移植後＋４０日に採取したレンチウイルス遺伝子改変末梢血白血球のクローン多様性をレンチウイルス組込みのゲノム座位により測定した結果を示す。獲得した全配列の≧１％に相当したクローン組込み部位配列を頻度昇順で枠内に示す。カラーの枠は複数時点で確認されたクローンを示す。この方法により各試料で確認された合計クローン数を各棒の上部に示す。配列決定した全クローンのうち、２時点間で共通のクローンを動物Ｚ１３１０５及びＺ１３０８３について評価した処、夫々合計７９個と２４個の共通のクローンが認められた。
【図２２Ａ】形質導入条件からＵＭ７２９を除外するとベクターコピー数が減るだけでなく、コロニー形成細胞形質導入効率も低下する。ピリミドインドール誘導体ＵＭ７２９の不在下でドナー１及び２に由来する動員ＡＰＨ  ＣＤ３４＋細胞産物の非自動形質導入後に、後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために組換えヒト成長因子ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−３及びＩＬ−６を添加した液体培地（図２２Ａ）、又は後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために同一の組換えヒト成長因子を添加したコロニー形成アッセイ用メチルセルロース培地（図２２Ｂ）で最終細胞産物のアリコートを培養した。
【図２２Ｂ】形質導入条件からＵＭ７２９を除外するとベクターコピー数が減るだけでなく、コロニー形成細胞形質導入効率も低下する。ピリミドインドール誘導体ＵＭ７２９の不在下でドナー１及び２に由来する動員ＡＰＨ  ＣＤ３４＋細胞産物の非自動形質導入後に、後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために組換えヒト成長因子ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＩＬ−３及びＩＬ−６を添加した液体培地（図２２Ａ）、又は後続するリアルタイムＰＣＲでＶＣＮを測定するために同一の組換えヒト成長因子を添加したコロニー形成アッセイ用メチルセルロース培地（図２２Ｂ）で最終細胞産物のアリコートを培養した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
遺伝子治療の途方もない可能性は過去１０年間に多種多様の疾患について実証されている。造血幹・前駆（ＣＤ３４＋）細胞を使用した例については、Ｇｈｏｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，（２０１５）参照。より詳細には、原発性遺伝性免疫不全症、異常ヘモグロビン症、リソソーム蓄積症及び癌を含む種々の疾患でレンチウイルスによるＣＤ３４＋幹・前駆細胞（ＨＳＰＣ）への遺伝子導入の臨床的な成功がこれまでに実証されている。鎌状赤血球貧血症とＨＩＶ等の感染症を治療するための遺伝子治療の臨床試験も現在進行中である。
【００１３】
遺伝子治療を普及させるために提唱されている最も単純なストラテジーは直接的なインビボ遺伝子改変を利用している。小型及び大型動物モデルでインビボ遺伝子導入を実現する試みが進行中である（Ｂｕｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２３，３５７８−３５８４（２０１４）；Ｋａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，１１７−１１９（１９９３）；Ｐｏｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，１３１０２−１３１０７（２００２）；Ｔｉｎｇ−Ｄｅ  Ｒａｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０７，３０９１−３０９７（２００６）；Ｆｒｅｃｈａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１９，１１３９−１１５０（２０１２））が、このアプローチが患者での臨床試験を可能にするために現行の安全性と有効性の基準を満たすまでにはしばらく時間がかかりそうである。この分野における重要な課題として、非標的細胞への遺伝子導入の厳重なチェックと、目的の標的細胞への十分な治療遺伝子導入レベルの達成のバランスを取ることが挙げられる。
【００１４】
レンチウイルス（ＬＶ）によるＣＤ３４＋細胞へのエクスビボ遺伝子導入は最も臨床応用されている幹細胞遺伝子治療法であり、今日までに有効性を実証されている。このアプローチは導入後に治療遺伝子を保有する全血球種の産生を患者の終生にわたって可能にする。ＣＤ３４＋細胞のエクスビボ単離及び遺伝子改変は非標的細胞への遺伝子導入がなくなるという点と、例えばＬＶ粒子等の遺伝子モディファイヤーの平均使用量が減るため、ベクター作製に伴う費用が減るという点の２点で大きな利点がある。しかし、現行の法規制ガイドライン内でこれらの製品を製造するには、一般的に現行の適正製造規範に従う複合的な中央管理施設と熟練したスタッフが必要であるため、この治療はＧＭＰインフラを支えることが可能な高度先進国とそれらの国内の施設に限られている。
【００１５】
現行の適正製造規範に従って製造されるとは、投与用に製造された製剤が管理法規制及び政府公認下でヒト対象に投与できるように十分に安全であることを意味する。一般に、管理法規制及び公認は製剤が同一性、強度、品質及び純度に関して事前承認された合格基準に適合することを要求する。合格基準としては、製剤が現行の適正製造規範に適合するか否かを判定するために使用される試験結果の数値限界、範囲又は他の適切な尺度が挙げられる。仕様書には合格基準の適合を試験するために使用される分析手順を明記する。製剤はバッチ評価することができる。バッチとは合格基準の適合を保証するために試験される製剤の特定量である。
【００１６】
特定の実施形態では、現行の適正製造規範の適合を確認するために、以下の手順を実施する。
１．ＵＳＰ＜７１＞による最終放出無菌試験（細菌、真菌及び酵母）。試験の準備は制御下のクリーンルームで行い、１４日間のインキュベーションと、直接接種法、メンブレンフィルター法及びスワブ法による薬局方無菌検査を含む。
２．最終産物生存率試験は制御下のクリーンルームでトリパンブルー色素排除法とフローサイトメトリーによる７ＡＡＤ染色法により行う。
３．細胞計数は制御下の実験室で手動血球計算盤計測及び／又は自動血球計算盤計測及び／又は自動血球計数器により行う。
４．マイコプラズマ試験は培養法及び／又は高速ＰＣＲ試験及び／又は非高速ＰＣＲ試験により行う。
５．エンドトキシン試験はＬＡＬ（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）アッセイにより行う。
【００１７】
特定の実施形態では、迅速グラム染色法を実施することができる。
【００１８】
他の評価手順としては、遺伝子改変用標的遺伝子の発現、コロニー形成能又は細胞適応度に特異的な他のインビトロ試験（例えば細胞表面マーカー発現、細胞増幅及び／又は異種移植動物モデルへの生着もしくは持続生残）を挙げることができる。レトロウイルスベクターを適用する場合にはベクターコピー数アッセイを実施することができ、遺伝子編集アプローチを適用する場合には細胞ＤＮＡのディープシーケンシングを実施することができ、及び／又は組込み型レトロウイルスベクターを適用する場合には組込み座位のシーケンシングを実施することができる。標的遺伝子改変及び／又は疾患環境に特異的な機能の試験を実施することもできる。例えば、ＦＡ細胞はマイトマイシンＣ投与に非常に感受性である。機能的ＦＡ遺伝子の遺伝子導入後に、遺伝子改変された細胞をマイトマイシンＣに暴露し、感受性が低下又は消失しているか否かの判定を行うことができる。
【００１９】
特定の実施形態では、現行の適正製造規範の適合を確認するために放出試験を実施する。特定の実施形態において、放出試験は以下の試験を含む。
【００２０】
【表１】
0006734283.tif 000002
【００２１】
特定の実施形態において、放出試験は以下の試験を含む。
【００２２】
【表２】
0006734283.tif 000003
【００２３】
特定の実施形態において、放出試験は以下の試験を含む。
【００２４】
【表３】
0006734283.tif 000004
【００２５】
本開示は遺伝子改変細胞のエクスビボ単離・作製・製剤化用プラットフォームを提供する。前記プラットフォームはソフトウェア駆動型ポイントオブケア及び／又はポータブルデバイスを利用し、種々の研究及び治療環境で遺伝子治療をより広く利用できるようにする。特定の実施形態において、ポイントオブケアデバイスは施設（例えば病院又は医院）内、室内（例えば対象の室内）又は対象（例えば患者）を治療するエリア（例えばテント）内に配備されているものである。特定の実施形態において、ポータブルデバイスは施設内もしくは室内で標準的な実験室用カート（例えば寸法３２”Ｌ×３２”Ｗ×３６”Ｈのカート）を使用して又はエリア周辺で電動式運搬車を使用してエリア間を輸送することが可能なものである。特定の実施形態において、ポータブルデバイスは重量が２５０ｌｂ未満、２００ｌｂ未満、１５０ｌｂ未満、又は１００ｌｂ未満のものである。特定の実施形態において、ポータブルデバイスは寸法が１００ｃｍ（ｗ）未満、６０ｃｍ（ｄ）未満、及び８０ｃｍ、６０ｃｍ又は５０ｃｍ（ｈ）未満のものである。
【００２６】
その最も基本的なレベルにおいて、前記デバイスは原料（例えば試料、緩衝液、ガス）投入口と、遠心機能と細胞インキュベーション機能を備える少なくとも１個の処理チャンバーと、閉鎖式チューブセットと、ポンプと、標的細胞セレクターを含む閉鎖系デバイスである。ソフトウェアを制御することにより、前記デバイスは特定の実施形態では標的細胞を対象試料から直接エクスビボで単離・遺伝子改変・製剤化することができる。特定の実施形態では、ユーザー入力を最小限又は不要にしながら３０時間以内、２５時間以内又は２０時間以内でプロセス全体を完了することができる。特定の実施形態では、７２時間以内又は６４時間以内でプロセス全体を完了する。特定の実施形態において、ユーザー入力を最小限にするとは、デバイスへの試料投入から対象投与用に製剤化された遺伝子改変細胞の回収までの間にユーザーがデバイスと接触する回数が２０回以下、１５回以下、１０回以下もしくは５回以下であること、及び／又はデバイスと接触する時間が１２時間以下、１０時間以下、８時間以下、５時間以下、４時間以下もしくは３時間以下であることを意味する。ユーザーからの代表的な接触としては、滅菌済みチューブセットの接続；無菌閉鎖系の維持の確認；ステージ（例えば沈降）を反復する決定；ステージの完了成功の確認；工程品質検査後の新ステージの開始；デバイス投入用試薬の供給；並びに添加もしくは除去する体積の決定及び／又は計算の１種以上を挙げることができる。接触するタイミングは試料受領後にユーザーが準備する時間又は実際にデバイスに接触する時間により決定することができる。
【００２７】
特定の実施形態では、１ラウンド以上の選択の結果として標的細胞が単離される。このため、選択／単離なる複合語を使用する。遺伝子改変された標的細胞の１ラウンド以上の精製の結果として製剤化される。このため、本開示では精製及び製剤化と言う。この説明は上記用語が必ずしも別々の工程を表すのではなく、段階の相違（選択→単離、精製→製剤化）を表す場合もあることを明確にするものである。
【００２８】
本願に開示するプロセスはハードウェア、ソフトウェア、人による入力又はその組合せで実施することができる操作のシーケンスに相当するブロックの集合としてロジカルフローチャートで示すことができる。また、当然のことながら、本願の他の箇所で特に明白明瞭に指定している場合を除き、図示するロジカルフローパスは本願に記載する工程段階を特定の順序で実施する必要があることを示すと解釈すべきではない。換言するならば、本願に示すロジカルフローパスは段階を実施することができる多数の可能な順序のほんの数例に過ぎない。更に、本開示の図面内の特定の操作は非必須の操作として開示しており、特定の実施形態で実施してもよいし、実施しなくてもよい。更に、特定の図面のあらゆる要素及び／又は操作は特定の図面の他のあらゆる要素及び／又は操作と共に（又は実際にその不在下で）実施することができる。ソフトウェアに関して、ブロックとはコンピュータで実行可能な命令を表し、１個以上のコンピュータ読取り可能なストレージ媒体（例えばマシン読取り可能なストレージ媒体）に格納されており、１個以上のハードウェアプロセッサにより実行されたときに、ポイントオブケア及び／又はポータブル標的細胞遺伝子治療デバイスの機械的コンポーネントに指定操作を実施させる。一般に、コンピュータで実行可能な命令としては、特定の機能を実施する又は特定の抽象データ型を実行するルーティン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造等が挙げられる。本願に記載するプロセス又は方法を実施するようにコンピュータ（又は他の電子デバイス）をプログラミングするために使用することができる（圧縮又は非圧縮形態の）命令を格納した非一時的なコンピュータ読取り可能なストレージ媒体を含むコンピュータプログラム製品として所定の実施形態を提供することができる。コンピュータ読取り可能なストレージ媒体としては、限定されないが、ハードドライブ、フロッピーディスク、光ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、磁気もしくは光カード、ソリッドステートメモリデバイス、又は電子命令を格納するのに適した他の型の媒体／コンピュータ読取り可能な媒体が挙げられる。本願に開示するコンピュータで実行可能な命令及び／又はソフトウェアは（本質的にあらゆるソフトウェアがそうであるように）汎用コンピュータにより読取り可能及び／又は実行可能であり得るが、本願に開示する種々の実施形態に従って標的細胞分離及び／又は遺伝子改変を実施するには、試料を形質転換／分離するように及び／又は標的細胞を遺伝子改変するように特別に構成された専用コンピュータを利用する。更に、本開示に従って標的細胞分離及び／又は遺伝子改変を実施すると、伝統的な遺伝子改変実施方法を大幅に改善できる。本開示を精読することにより当業者は多数の利点を認識するはずであるが、例えば、本願に開示する特定の実施形態は試料挿入から最終産物製剤化までの遺伝子改変プロトコール全体を単一の閉鎖回路系で実施することにより試料汚染の危険を大幅に減らし、固定医療施設への依存を大幅に減らし、遺伝子改変プロトコールを実施するために必要な時間を短縮するという利点がある。
【００２９】
図１はコンピュータで実行可能な命令により構成されるポイントオブケア及び／又はポータブルデバイス（ＰＯＣＤ）を使用して標的細胞を遺伝子改変するための代表的な方法１００のフローチャートを示す。ブロック１０２では、標的細胞（例えば遺伝子改変することができ、対象を治療するために使用することができる１種以上の細胞）を含む試料を取得する。特定の実施形態において、標的細胞は造血幹細胞及び／又は造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）を含む。ＨＳＰＣは（ｉ）最終的に単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板もしくは樹状細胞となる骨髄前駆細胞；又は（ｉｉ）最終的にＴ細胞、Ｂ細胞及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）と呼ばれるリンパ球様細胞となるリンパ前駆細胞に自己再生及び／又は分化できることなどから遺伝子治療用に選択することができる。造血及びＨＳＰＣ分化の一般論については、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹの第１７章；Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ５，２００６の第２章及びＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００９，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓの第５章参照。
【００３０】
ＨＳＰＣは他の型の造血細胞に比較してＨＳＰＣで高レベルに発現される特異的マーカーに陽性のものとすることができる。例えば、このようなマーカーとしてはＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ  ＤＲ又はその組合せが挙げられる。また、ＨＳＰＣは他の型の造血細胞に比較して発現されるマーカーに陰性のものとすることもできる。例えば、このようなマーカーとしてはＬｉｎ、ＣＤ３８又はその組合せが挙げられる。ＨＳＰＣはＣＤ３４＋細胞又はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６もしくはその任意の組合せを含む系統特異的マーカーの低下した細胞画分であることが好ましい。
【００３１】
ＨＳＰＣの供給源としては臍帯血、末梢血及び骨髄が挙げられるので、これらの供給源がブロック１０２で取得される代表的な試料である。血液試料の採取、抗凝固処理及びプロセシング等に関する方法は当分野で周知である。例えば、Ａｌｓｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９４１，Ｎ．Ｙ．Ｓｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．４１：１２６；Ｄｅ  Ｇｏｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９４０，Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓ．１１４：８５０；Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９５９，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．３８：５７３；Ｒｏｕｓ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ，１９１６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２３：２１９；及びＨｕｍ，１９６８，Ｓｔｏｒａｇｅ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６−１６０参照。
【００３２】
末梢血のＨＳＰＣは採取前に動員することが好ましい。当分野で公知のあらゆる方法で末梢血ＨＳＰＣを動員することができる。対象の末梢血中を循環するＨＳＰＣ数を増加させる薬剤として本願に記載するもの又は当分野で公知のもののいずれかを対象に投与することにより末梢血ＨＳＰＣを動員することができる。例えば、特定の実施形態では、１種以上のサイトカイン又は成長因子（例えばＧ−ＣＳＦ、ｋｉｔリガンド（ＫＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、トロンボポエチン又はＧＭ−ＣＳＦ（例えばサルグラモスチム））を対象に投与することにより末梢血を動員する。末梢血の動員方法で使用することができる種々のＧ−ＣＳＦとしては、フィルグラスチムと長期作用型Ｇ−ＣＳＦ−ペグフィルグラスチムが挙げられる。特定の実施形態では、１種以上のケモカイン（例えばマクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ１α／ＣＣＬ３））、ケモカイン受容体リガンド（例えばケモカイン受容体２リガンドＧＲＯβ及びＧＲＯβΔ４）、ケモカイン受容体アナログ（例えばＣＴＣＥ−００２１、ＣＴＣＥ−０２１４等の間質細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）タンパク質アナログ又はＭｅｔ−ＳＤＦ−１β等のＳＤＦ−１α）、又はケモカイン受容体拮抗薬（例えばＡＭＤ３１００等のケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）拮抗薬）を対象に投与することにより末梢血を動員する。特定の実施形態では、１種以上の抗インテグリンシグナル伝達剤（例えば機能阻止性抗超後期抗原４（ＶＬＡ−４）抗体又は抗血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１））を対象に投与することにより末梢血を動員する。特定の実施形態では、シクロホスファミド、エトポシド又はパクリタキセル等の１種以上の細胞毒性薬を対象に投与することにより末梢血を動員する。特定の実施形態では、上記薬剤の１種以上を対象に所定期間投与することにより末梢血を動員することができる。例えば、ＨＳＰＣの採取前１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又は１４日間にわたって１種以上の薬剤（例えばＧ−ＣＳＦ）を（例えば皮下、静脈内又は腹腔内）注射により１日１回又は１日２回対象に投与することができる。特定の実施形態では、末梢血へのＨＳＰＣの動員に使用する薬剤の最後の投与後１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、１２時間以内、１４時間以内、１６時間以内、１８時間以内、２０時間以内又は２４時間以内にＨＳＰＣを採取する。特定の実施形態では、成長因子（例えばＧ−ＣＳＦ）とケモカイン受容体拮抗薬（例えばＡＭＤ３１００等のＣＸＣＲ４受容体拮抗薬）、又は成長因子（例えばＧ−ＣＳＦ又はＫＬ）と抗インテグリン剤（例えば機能阻止性ＶＬＡ−４抗体）等の上記又は当分野で公知の２種以上の異なる型の薬剤を対象に投与することによりＨＳＰＣを動員する。特定の実施形態では、異なる型の動員剤を同時又は順次投与する。末梢血の動員方法に関するその他の情報については、例えばＣｒａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ９０（１２）：４７７９−４７８８；Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３９；Ｐｅｌｕｓ，２００８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５（４）：２８５−２９２；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９１（７）：２２３１−２２３９；Ｔｒｉｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９３（１１）：１７３９−１７４２；及びＷｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２７（２）：Ｓ２３−Ｓ２９参照。
【００３３】
末梢血に由来するＨＳＰＣは対象の静脈に挿入したシリンジ又はカテーテルを介して血液から採取することができる。例えば、末梢血はアフェレーシスマシンを使用して採取することができる。血液は静脈からカテーテルを通ってアフェレーシスマシンに流入し、アフェレーシスマシンはＨＳＰＣを含む白血球を残りの血液から分離した後、残りの血液を対象の体内に戻す。アフェレーシスは十分なＨＳＰＣが採取されるまで数日間（例えば１〜５日間）実施することができる。
【００３４】
骨髄に由来するＨＳＰＣは例えば穿刺吸引により後腸骨稜からの骨髄から直接得ることもできる（例えばＫｏｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１３７７−１３８４参照）し、細胞を骨髄区画から放出させるサイトカイン（例えばＧ−ＣＳＦ及び／又はＡＭＤ３１００）の前投与後の血液から得ることもできる。
【００３５】
ブロック１０４では、試料のヘマトクリット値を測定することができる。ヘマトクリット値は処理チャンバー（例えば図２Ａに示す処理チャンバー）内で試料を遠心し、赤血球沈層容積を測定できるように試料のＲＢＣを層に分離することにより測定することができる。当然のことながら、ヘマトクリット値を測定し易くするために試料に抗凝血剤を加えてもよく、このような抗凝血剤は遠心前又は遠心中に処理チャンバーに加えることができる。あるいは、試料の光学特性を測定することによりヘマトクリット値を測定してもよい。例えば、分光光度計を使用して試料を分析してもよい。当然のことながら、ヘマトクリット値の測定法としてはどのような種類の公知の分光測定法を使用してもよく、例えばラマン分光法及び／又は光散乱技術が挙げられる。
【００３６】
判定ブロック１０６では、ブロック１０４で測定したヘマトクリット値が所定の選択／単離・作製・製剤化方法を実施する目的に許容できるか否かについて判定を行うことができる。特定の実施形態では、試料にＲＢＣ除去法を実施する下限としてヘマトクリット値閾値を予め設定する。例えば、特定の実施形態において、ヘマトクリット値が２５％以上の試料は自動的にＲＢＣ除去法を実施される。一般に、代表的なＲＢＣ除去法は、ブロック１０８で試料を希釈する工程と、次にブロック１１０で試料からＲＢＣを除去する工程を含むことができる。
【００３７】
次に図２Ａ及び２Ｂを参照すると、別の代表的なＲＢＣ除去法２００は試料投入に対応する矢印２５２と培地投入に対応する矢印２５４により示すように、ブロック２０２において処理チャンバー内で試料をＨＥＳ溶液と混合する工程を含むことができる。ブロック２０２は更に緩衝液投入に対応する矢印２５６により示すように、緩衝液を処理チャンバーに加える工程を含むことができる。ブロック２０２で加えるＨＥＳ及び／又は緩衝液の具体的な量は試料の初期体積及び／又は処理チャンバーの最大容積に基づいて決定することができる。例えば、特定の実施形態では、試料のヘマトクリット値が２５％を上回る場合に、処理チャンバーの最大容積（例えば３００ｍＬ）まで２０％体積のＨＥＳと緩衝液（例えばＰＢＳ／ＥＤＴＡ）で希釈することができる。
【００３８】
ブロック２０４では、ＲＢＣの連銭形成を開始することができる。特定の実施形態では、処理チャンバー内で低速遠心（例えば３５〜４５×ｇ又は４０×ｇ）を行うことにより連銭形成を開始する。当然のことながら、設定する遠心力（ｇ）（例えば３５〜４５ｇ）は遠心機の回転速度（ｒｐｍ）と回転半径に基づいて計算することができる。ブロック２０６では、矢印２５８により示すように試料を処理チャンバーから沈降バッグへと移すことによりＲＢＣの沈降を開始する。特定の実施形態では、判定ブロック２０８で十分な量の沈降が生じたか否かについての判定を行う。このような判定は沈降バッグとその内容物を目視試験したユーザーからユーザー入力を受け取ることにより行うことができる。特定の実施形態では、十分な沈降がまだ生じていない場合に、方法は「ノー」と記した矢印に沿って進んだ後、ブロック２０８に戻る。他方、十分な沈降が生じている場合に、方法はブロック２１０に進むことができ、矢印２６０により示すように血液試料のＲＢＣ高含有画分（例えば沈降バッグの内側で沈渣として形成された画分）を沈降バッグから除去する。特定の実施形態では、所望のＲＢＣペレットサイズに達するまでユーザーが定義した体積ずつ段階的にＲＢＣ画分除去を行う。例えば、特に図２Ｃを参照すると、連銭形成と沈降を行う漏斗形沈降バッグに試料を移すことができる。時間がｔ＝０からｔ＝Ｎまで進むにつれてＲＢＣ画分は徐々に濃い沈渣／ペレットを形成する。特定の実施形態では、適切な量の沈降が生じたら（図２Ｃに示すような）体積区分を含む漏斗形沈降バッグを目視検査することができ、ユーザーは標的細胞画分が沈降バッグに留まっている間に沈降バッグから移されるＲＢＣペレットに対応するユーザー定義体積を入力することができる。当然のことながら、標的細胞画分は血小板又は他の血液成分を含むことができる。特定の実施形態において、命令２７０は沈降時間のデフォルト値と特定時点で除去すべきデフォルト体積を含むことができ、例えば試料を沈降バッグに移してから３０分後に５０ｍＬ又は７５ｍＬ又は１００ｍＬを除去するように命令をプログラムすることができる。
【００３９】
ブロック２１２では、矢印２６２により示すように上清洗浄のために試料（例えばＲＢＣ低下画分）を第１の処理チャンバーに戻す。処理チャンバーを図のように使用することが好ましいが、特定の実施形態において、ＰＯＣＤは例えば上清洗浄用の１個以上の補助処理チャンバーを備えることができる。上清洗浄は試料の望ましくない全成分（例えばブロック２０２からの残存ＨＥＳ）を除去することができる。例えば、処理チャンバーで試料に緩衝液を再び加えることができ、遠心を行い、残存ＨＥＳを排除する。ブロック２１４では、試料のＲＢＣ低下画分を後続プロセシングに備えて所望の体積まで濃化することができる。例えば、ＲＢＣ低下画分を遠心し、標的細胞を処理チャンバーに残しながら緩衝液を除去することができる。ブロック２１４は更に場合により吸引を含むことができる。
【００４０】
赤血球（ＲＢＣ）除去を行う本願開示の特定の実施形態では、１個以上のメモリに格納されたコンピュータで実行可能な命令を実行し、ＰＯＣＤの１個以上のハードウェアコンポーネントに図２Ａ及び２Ｂに関して記載する１工程以上を実施させる。コンピュータで実行可能な命令の代表的な記述を本願ではＳＷ１で表し、下表１に説明する。
【００４１】
【表４】
0006734283.tif 000005
【００４２】
次に再び図１を参照すると、方法１００は更にブロック１１２で血小板を試料から除去する工程を含むことができる。血小板は方法１００の後期ステージで導入され得る所定の型の試薬と反応する能力及び／又はこのような試薬を吸収する能力があるので、特定の実施形態において血小板除去は有益である。例えば、方法１００の１以上のステージで血小板とは対照的に標的細胞の利益のためにプロタミン硫酸塩、ラパマイシン、ポリブレン、フィブロネクチンフラグメント、プロスタグランジン又は非ステロイド性抗炎症薬を添加する場合があるが、試料中に残存する血小板はこれらの１種以上を吸収することができる。
【００４３】
ブロック１１４では、標的細胞を選択／単離に備えて準備することができる。ブロック１１４における準備は選択する特定の選択／単離方法によって異なる。選択／単離は選択／単離された細胞の生存率に過度に有害とならない任意の適切な技術を使用して実施することができる。例としては、例えば抗体被覆磁気ビーズを使用した磁気分離；蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ；Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１００４；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｌｏｏｄ  ６８（１）：１２６−１３３）；アフィニティークロマトグラフィー；モノクローナル抗体と結合するか又はモノクローナル抗体と併用する細胞毒性薬（例えば補体やサイトトキシン）；例えばプレート等の固相マトリックスに固定化した抗体による「パニング」又は他の適切な技術（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：９３９−９５３）、大豆等のレクチンを使用した凝集法（Ｒｅｉｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７７：１１６４）等が挙げられる。
【００４４】
次に図３Ａ及び３Ｂを参照すると、代表的な血小板除去及び標的細胞選択方法３００は矢印３５０により示すように細胞画分を緩衝液で希釈する工程を含むことができる。ブロック３０２で細胞画分に加える緩衝液は図２Ａ及び２Ｂに含まれると同一の緩衝液製品でもよいし、そうでなくてもよい。特定の実施形態では、ブロック３０４でペレット化する前に細胞画分を緩衝液（例えばＰＢＳ／ＥＤＴＡ）で希釈し、血小板及び／又はその後の選択／単離を妨害する恐れのある他の試料を除去する。図３Ａから明らかなように、ブロック３０４における細胞画分のペレット化工程は処理チャンバー内で細胞画分（例えばＲＢＣ除去が実施されている場合にはＲＢＣ高含有画分等の元の試料の残りの部分）を遠心する工程と、ペレット化後に矢印３５２により示すように血小板を処理チャンバーから廃棄物容器（例えば廃棄物バッグ）に移す工程を含むことができる。試料がアフェレーシス産物である特定の実施形態では、標的細胞選択の前、標的細胞選択と同時、標的細胞選択の後、又はその任意の組合せで血小板除去を実施すると好ましいと思われる。
【００４５】
ブロック３０６では、矢印３５６により示すように一次標識物質を細胞画分に加えることができる。上記開示から明らかなように、一次標識物質は直接結合させた免疫磁気ビーズを含むことができる。当然のことながら、一次標識物質及び／又は（該当する場合に）場合によりブロック３１４で導入することができる二次標識物質は各々処理チャンバーに直接加えることができる。従って、特定の実施形態では、ＲＢＣ及び／又は血小板除去に使用することができる同一の処理チャンバーを残りの標的細胞の標識にも使用することができる。こうして、方法１００は機材及び／又は汚染の可能性を最小限にしながら非常にデリケートで複雑な目的を達成する。特に、本願の開示から明らかなように、好ましい実施形態では方法１００の全体を閉鎖式回路の内側で実施することができる。
【００４６】
ブロック３０８では、一次標識物質と標的細胞の結合を助長するように処理チャンバーの内側にインキュベーション環境を維持することができる。特定の実施形態では、図３Ａ（及び実際には図２Ａ、４Ａ、５Ａ及び６Ａ）のシステムのコンポーネント毎にインキュベーション環境の少なくとも一部を維持する。例えば、システムのコンポーネントの一部又は全部を封入する境界３５８の内側にインキュベーション環境を維持することができる。例えば、境界３５８は、処理チャンバー及び／又は閉鎖式試料回路（例えば矢印３５０、３５２、３５４及び３５６に対応するチューブ）や方法１００の特定の実施形態で使用される種々の物質の容器（例えば緩衝液バックや標識物質バッグ）等の他のあらゆるコンポーネントを含むシステムコンポーネントを覆うガラスフードを含むことができる。特定の実施形態では、他の全システムコンポーネントを封入するものではない境界３６０の内側に処理チャンバーを封入する。更に、特定の実施形態は境界３５８及び境界３６０の各々を含む。
【００４７】
特定の実施形態において、ブロック３０８でインキュベーション環境を維持する工程は図３Ａの温度計記号により示すようにブロック３１０で処理チャンバーの温度を制御する工程を含む。例えば、１個以上の加熱又は冷却装置を境界３６０の内側に封入することができる。更に、特定の実施形態では、所望の温度を迅速に得るために処理チャンバーに流入する液体及び／又は気体を熱交換装置に通してもよい。例えば、特定の実施形態では、標識物質が標的細胞と反応しているインキュベーション時間の間、処理チャンバーの内側の細胞画分を２〜２５℃に維持することができる。
【００４８】
特定の実施形態において、ブロック３０８でインキュベーション環境を維持する工程はブロック３１２で細胞画分を撹拌する工程を含む。例えば、遠心を行うように処理チャンバーを構成する実施形態において、処理チャンバーは低速で回転し、その内容物を撹拌又は混合することができる。特定の実施形態において、ブロック３１２における細胞画分の撹拌は連続的に実施することができる。例えば、図３Ａの縦軸の周囲の交互方向矢印により示すように、処理チャンバーは時計回りと反時計回りの回転を連続的に転換することができる。特定の実施形態において、細胞画分の撹拌は所定時間実施することができ、例えば３０秒毎に１０秒間連続的に撹拌し、各撹拌サイクルの後に非撹拌状態を２０秒間設ける。他の如何なる適切な時間間隔も使用できる。
【００４９】
特定の実施形態では、ブロック３１４で１種以上の二次標識物質を加えてもよい。例えば、方法１００の種々の実施形態は２種以上の異なる細胞種を標的とする場合があるため、標的細胞を選択するために２種以上の標識物質が必要となる場合がある。当然のことながら、１種以上の二次標識物質の添加はブロック３０６における一次標識物質の添加と同時に行ってもよいし、及び／又はブロック３０８におけるインキュベーション環境の維持と同時に行ってもよい。あるいは、ブロック３１４における１種以上の二次標識物質の添加はブロック３０６における一次標識物質の添加後に行ってもよい。更に当然のことながら、種々の実施形態では、ブロック３１４におけるオペレーションを省略し、例えば一次標識物質のみを加える。
【００５０】
ブロック３１６では、細胞画分を処理チャンバーから除去せずに過剰の標識物質を処理チャンバーから除去することにより過剰の標識物質を細胞画分から分離することができる。例えば、標識細胞画分と過剰の標識物質の両方を含む処理チャンバーの内容物を遠心し、これらの成分を別々の層に分離し、過剰の標識物質に対応する層を除去することができる。
【００５１】
特定の実施形態では、好ましい分離方法を使用して標識細胞画分内の残りの非標的細胞から標的細胞を分離するのに適した予め決定された及び／又はユーザーが指定した細胞密度までブロック３１８で標識細胞画分を濃化することができる。標識細胞画分を標的細胞セパレーターに通す速度が低速になるほど高い効率で標的細胞セパレーターが機能する傾向がある場合には、細胞画分を濃化することが望ましいと思われる。例えば、標的細胞セパレーターが磁気標識標的細胞を磁気分離カラムに流さないようにするために磁場を使用する磁気活性化セルソーターである態様では、標識細胞はソーターを通過する速度が遅くなるほど、標的細胞セパレーターの内側に保持され易くなる。従って、標識細胞を除去せずに細胞画分の体積を減らすと、即ち細胞画分を濃化すると、その後の標的細胞分離を改善することができる。更に、特定の実施形態では、細胞濃度が高過ぎると、計器が正しく動作できなくなる可能性があり、例えばＭＡＣＳカラム又はＦＡＣＳマシンが詰まる可能性がある。更に、ＦＡＣＳによる標識細胞の選別が所望される場合には、細胞密度が高いため、分離中に非標識細胞が混入する可能性がある。
【００５２】
当然のことながら、標的細胞の標識は標的細胞及び／又は非標的細胞と選択的に結合する標識物質を使用して（例えば陰性画分を選択して）実施することができる。特定の実施形態において、選択的に結合するとは、ビーズ、抗体又は他の結合性部分が１０−５Ｍ以下、特定の実施形態では１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ又は特定の実施形態では１０−５Ｍ〜１０−１０Ｍの解離定数（１（Ｄ）で細胞上のマーカー（例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１３３）と結合することを意味する。特定の実施形態において、選択的に結合するとは、ビーズ又は抗体が１０−７Ｍ以下、又は特定の実施形態では１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍ、又は特定の実施形態では１０−７Ｍ〜１０−１５Ｍの解離定数（１（Ｄ）で細胞上のマーカーと結合することを意味する。しかし、更に当然のことながら、標識物質を用いずに標的細胞の標識を行うこともできる。例えば、標的細胞は何らかの識別特徴に基づいて標的細胞を区別及び／又は選別する能力により「標識」されているとみなすことができる。特定の実施形態では、例えば蛍光活性化セルソーターに上に構成された光源と光検出器の間に標的細胞と非標的細胞を通過させてそれらの１種以上の特徴を決定することができ、標的細胞及び／又は非標的細胞に（正又は負）電荷を誘導することができる。従って、特定の実施形態では、電荷を誘導されている標的細胞を標識されているとみなすことができる。
【００５３】
更に当然のことながら、１個以上のメモリに格納されたコンピュータで実行可能な命令を実行し、ポイントオブケア及び／又はポータブル標的細胞遺伝子治療デバイスの１個以上のハードウェアコンポーネントに図３Ａ及び３Ｂに関して記載する１工程以上を実施させることができる。コンピュータで実行可能な（ポジティブ又はネガティブ選択用の標的又は非標的）細胞標識命令の代表的な記述を本願ではＳＷ１及び／又はＳＷ２の一方又は両方で表し、下表２に説明する。
【００５４】
【表５】
0006734283.tif 000006
0006734283.tif 000007
【００５５】
次に再び図１を参照すると、方法１００は更にブロック１１６で細胞画分の標的細胞を非標的細胞から単離する工程を含むことができる。ブロック１１６における標的細胞の単離は例えば磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）及び／又はアフィニティークロマトグラフィー等の何らかの適切な手順を含むことができる。
【００５６】
上記のように、当分野で公知のあらゆる細胞選択／単離技術を使用することができる。代表的な方法は細胞サイズ、及び／又は細胞の前方、側方及び後方光散乱特性、及び／又は細胞表面マーカーの発現変動に基づく。細胞表面マーカーと結合する抗体には、特定の細胞種を分離し易くするために、上記のような標識物質（例えば直接分離を可能にする磁気ビーズ、担体に固定化したアビジン又はストレプトアビジンで除去することができるビオチン、蛍光活性化セルソーターと共に使用することができる蛍光色素等）を結合させることができる。特定の実施形態では、抗体を固定化した固体支持体（例えばビーズ、フラスコ、磁気粒子）と標的細胞試料を接触させ、結合していない細胞を除去することにより標的細胞の選択／単離を行い、使用する抗体に応じて固体支持体に結合した細胞中又は結合していない細胞中で標的細胞を検出することができる。
【００５７】
特定の実施形態では、酸化鉄から構成されるナノサイズの超常磁性粒子と、特異的モノクローナル抗体に結合させたデキストランを利用する磁気細胞セパレーターと共に、磁気粒子に直接又は間接的に結合させた抗ＣＤ３４抗体を使用して試料をプロセシングし、ＣＤ３４＋細胞を選択／単離（例えば濃縮）する。細胞セパレーターは単回使用使い捨てチューブを装備した閉鎖式無菌システムとすべきである。あるいは、特定の実施形態はネガティブ選択を含むことができ、非ＣＤ３４細胞を選択し、ＣＤ３４＋細胞のみを選択パラダイムの篩にかける。例えば、ポジティブ選択の実施形態では抗体を使用し、ＣＤ１３３＋細胞、ＣＤ４３＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞、ＣＤ４９ｆ＋細胞、ＣＤ５９＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ１０９＋細胞、ＣＤ１１７＋細胞、ＣＤ１６６＋細胞又はそれらの組合せに選択的な抗体を濃縮することができる。別の例として、ネガティブ選択の実施形態では抗体を使用し、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ１３＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、ＣＤ１５＋細胞、ＣＤ１６＋細胞、ＣＤ１９＋細胞、ＣＤ２０＋細胞、ＣＤ５６＋細胞又はそれらの組合せに選択的な抗体を除去することができる。
【００５８】
従って、選択／単離とは、試料中の標的細胞（例えばＨＳＰＣ）の百分率を（選択／単離手順以前の試料における百分率に対して）増加させる工程を意味する。特定の実施形態において、選択／単離手順以前の試料に対して濃縮後の試料における細胞の百分率として表した標的細胞（又は他の適切な抗原陽性細胞）数の増加は少なくとも２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍であり、１００〜２００倍が好ましい。好ましい実施形態では、磁気ビーズと結合させた抗ＣＤ３４モノクローナル抗体と磁気細胞分離デバイスを使用してＣＤ３４＋細胞を選択／単離し、ＣＤ３４＋細胞を分離する。特定の実施形態では、抗ＣＤ３４抗体を使用し、正常骨髄細胞集団の１〜２％から集団の＞８０％まで標的細胞を濃縮する。
【００５９】
次に図４Ａ及び４Ｂを参照すると、代表的な標的細胞選択方法４００は矢印４５０により示すようにＭＡＣＳ式細胞セレクター等の標的細胞セレクターを緩衝液でプライミングする工程を含むことができる。例えば、ブロック４０４で電源を入れる（例えば磁場を生成させる）前及び／又はブロック４０６で標識細胞画分をロードする前にＭＡＣＳ式標的細胞セレクターの磁気カラム及びプレカラムに緩衝液（例えばＰＢＳ／ＥＤＴＡ）をポンプから流す。特定の実施形態では、ブロック４０２におけるプライミングはブロック４０４でセルソーターの電源を入れた後に行われ、あるいは全く行われず、例えばセルソーターをプライミングしない。
【００６０】
ブロック４０６では、矢印４５２により示すように準備された（例えば標識された）細胞画分を標的細胞セレクターにロードする。例えば、（特定の実施形態では標識されている）標的細胞を収容した処理チャンバーの内容物を標的細胞セレクターに通す。ＭＡＣＳ選別技術を使用した特定の実施形態（標的細胞が免疫磁気ビーズで磁気標識されている）では、標的細胞を標的細胞セレクターの一部に磁気的に結合させることができる。あるいは、非標的細胞を標的細胞セレクターに結合させる一方で標的細胞を通過させて標的細胞を単離するように非標的細胞を標識してもよい。非標的細胞と標識細胞画分の他の「パススルー」成分を矢印４５４により示すように非標的細胞容器及び／又は矢印４５６により示すように廃棄物容器の一方又は両方に採取する。
【００６１】
ＭＡＣＳ式細胞選択を使用する実施形態では、結合した細胞をブロック４０８で洗浄及び／又は溶出させることができる。本願の他の箇所で記載するように、当然のことながら、ブロックにおける標的細胞選択では非ＭＡＣＳ式技術（例えばフローサイトメトリー）を利用してもよい。従って、特定の実施形態では、標的細胞を「結合」させず、例えば標的細胞を標識するために免疫磁気ビーズを使用しない。
【００６２】
ブロック４１０では、選別した細胞を矢印４５８により示すように細胞セパレーターにリロードすることができる。既に選別済みの細胞画分を細胞セパレーターにリロードすると、最終的な選別細胞画分の選択／単離（例えば純度）を助長することができる。特定の実施形態では、ブロック４１０における選別細胞画分のリロードはブロック４０６における初期ロードよりも遅い導入速度で行われる。
【００６３】
ブロック４１２では、（該当する場合に）ブロック４０６における洗浄及び／又は溶出中に除去される成分を矢印４５６により示すように廃棄物容器又はバッグに採取することができる。
【００６４】
特定の実施形態では、ブロック４１４で標的細胞セレクターの電源を切ることができる。例えば、ＭＡＣＳ選別技術を使用する実施形態では、ブロック４１４で標的細胞セレクターをの電源を切って磁場の生成を停止し、標的細胞セパレーターと結合している選択／単離された標的細胞を放出させることができる。ブロック４１６では、標的細胞を標的細胞容器の１個以上（例えば図４Ａの「標的細胞」と記したバッグ）に移した後、矢印４６０により示すように標的細胞容器から処理チャンバーへと移すことにより、標的細胞を採取することができる。コンピュータで実行可能な命令の代表的な記述を本願ではＳＷ４で表し、下表３に説明する。
【００６５】
【表６】
0006734283.tif 000008
【００６６】
特定の実施形態では、遺伝子モディファイヤーを導入する前に標的細胞を標的細胞セレクターから排出する（例えば処理チャンバーに戻す）ことができる。一方、次に図８を参照すると、特定の実施形態において、標的細胞は標的細胞選択及び核酸導入の両工程中に複合細胞セパレーター・核酸イントロデューサー（ＣＣＳ−ＧＭＩ）８００の内側に止まることができる。特定の実施形態では、ＣＣＳ−ＧＭＩ８００で選択した後にその内側で標的細胞に遺伝子モディファイヤーを導入することができる。例えば、ＣＣＳ−ＧＭＩ８００は非標的細胞が標的細胞セパレーターを通って流出する能力に影響を与えることなく、標的細胞を磁気感受性材料又は強磁性材料に磁気的に保持するために磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）技術を利用することができる。このような材料としては、鉄、鋼、コバルト、ニッケル及び他の強磁性希土類金属又はその合金が挙げられる。当業者に自明の通り、このような材料は容易に磁化・脱磁化させることができる。
【００６７】
次に図５Ａ及び５Ｂ（総称して図５と言う。）を参照すると、図５Ａは標的細胞の代表的な選択／単離及び遺伝子改変システムの模式図を示し、図５Ｂは図５Ａの代表的なシステムを使用して標的細胞を選択／単離するための代表的な方法５００のフローチャートである。
【００６８】
ブロック５０２では、矢印５５２により示すようにＣＣＳ−ＧＭＩ８００を緩衝液及び／又は培地溶液でプライミングすることができる。当然のことながら、ＣＣＳ−ＧＭＩ８００をプライミングするには本願に開示する全緩衝液及び／又は培地を含めて適切な全緩衝液及び／又は培地溶液を使用できる。
【００６９】
ブロック５０４では、標的細胞の分離／単離を容易にするためにＣＣＳ−ＧＭＩ８００を磁化することができる。例えば、再び図８を参照すると、ＣＣＳ−ＧＭＩ８００を相反する磁極（例えばＳ極７２とＮ極７４）の間に一時的に配置し、１種以上の磁気感受性材料を磁化させ、磁気標識しておいた標的細胞を吸引することができる。例えば、（図面に示すが、別個に記号を付していない）免疫磁気ビーズで標識しておいた標的細胞７８を第１の磁気感受性材料７６（１）の表面に吸引して保持することができ、非標的細胞８０は磁気標識していないので、試料入口と試料出口の間に少なくとも１本の流路を形成する一連の細孔８２を通過する。ＭＡＣＳの目的で多孔性の磁気感受性材料を磁化するには種々の技術を容易に利用することができる。このような技術としては、永久磁石や電磁石が挙げられる。当然のことながら、本開示のＣＣＳ−ＧＭＩ８００の一般的な説明に反しない限り、多数の容易に利用可能な代替手段から個々の要素を選択し、種々の構成で組合せることができる。
【００７０】
ブロック５０６では、矢印５５４により示すようにＣＣＳ−ＧＭＩ８００に標識細胞画分をロードすることができ、この間に標的細胞７８はＣＣＳ−ＧＭＩ８００の内側に保持され、非標的細胞８０及び他の試料成分はＣＣＳ−ＧＭＩ８００を通過し、非標的細胞バッグ又は廃棄物バッグの一方又は両方に採取される。例えば、図８と同様の図９Ａ及び９Ｂ（総称して図９と言う。）を参照すると、ＭＡＣＳの実施中で磁化された状態のＣＣＳ−ＧＭＩ８００を示しており、図９Ｂは図９ＡのＡ部分の拡大図である。特に図９Ｂを参照すると、標的細胞７８はこの時点で磁化されている第１の電極７６（１）に磁気的に吸引されていることが明らかであり、この電極は上記のように磁気感受性材料と兼用できる。当然のことながら、第１の電極７６（１）と第２の電極７６（２）の間に電位は存在しないので、その間に電界は存在しない。換言するならば、（末端８４（１）及び／又は８４（２）に印加される電圧の結果としての）電界強度は１ミリメートル（ｍｍ）当たり０ボルトである。当然のことながら、エレクトロポレーションを実施する際には、電界の非常に短いパルスに細胞を暴露するのが一般的である。多くの用途において、パルス長はマイクロ秒〜ミリ秒で表される。パルス長は間接的に電界強度と協働して細孔形成を促進し、従って、目的とする遺伝子改変が標的細胞に誘導される可能性が増す。当業者に自明の通り、標的細胞の固有特性に基づいてパルス長と印加電圧の両方を注意深く最適化する必要があり、パルス長が長過ぎると、不可逆的なエレクトロポレーションを生じる可能性があり、例えば標的細胞が死滅する可能性がある。従って、好ましい実施形態では、細胞分離／単離（例えばＭＡＣＳ）の実施中には第１の電極７６（１）と第２の電極７６（２）の間に電圧を印加しない。
【００７１】
特定の実施形態において、ブロック５０６でＣＣＳ−ＧＭＩ８００にロードする工程は矢印５５６により示すように試料をＣＣＳ−ＧＭＩ８００に再循環させる工程を含む。こうして、先にＣＣＳ−ＧＭＩ８００を通過させた際に保持されなかった標識標的細胞を次の通過中に保持することができる。ブロック５０８では、矢印４５６に示すように過剰の緩衝液及び／又は培地を廃棄物バッグに採取することができる。
【００７２】
ブロック５１０では、ＣＣＳ−ＧＭＩ８００を脱磁化することができる。例えば、次に図８と同様の図１０Ａ及び１０Ｂ（総称して図１０と言う。）を参照すると、エレクトロポレーションパルスの実施中で磁化されていない状態のＣＣＳ−ＧＭＩ８００を示しており、図９Ｂは図９ＡのＢ部分の拡大図である。特に図９Ｂを参照すると、標的細胞７８は先に磁化されていた第１の電極７６（１）に磁気的に吸引されなくなり、ＣＣＳ−ＧＭＩ８００の内側で懸濁液（例えば緩衝液又は培地溶液）内を自由に移動する。
【００７３】
ブロック５１２では、標的細胞の選択／単離後に遺伝子モディファイヤーを導入することができる。例えば、遺伝子モディファイヤー（例えば裸のＤＮＡ又はＲＮＡ）を細胞に導入するために、可逆的エレクトロポレーションを使用して標的細胞７８の膜内に一時的な細孔を生成することができる。特定の実施形態では、ＭＡＣＳも実施するＣＣＳ−ＧＭＩ８００の容積の内側に電界を生成する。当然のことながら、電界強度は電極間隙を通って放出される電圧として測定することができ、Ｅ＝電圧／（電極間隙の）距離として表すことができる。
【００７４】
特に図１０Ｂを参照すると、特定の実施形態では、１種以上の磁気感受性材料を相対向する電極としても機能させ、電界を生成することができる。例えば、第１の磁気感受性材料７６（１）を第２の磁気感受性材料７６（１）から間隔をあけて配置し、第１の磁気感受性材料と磁気感受性材料の間に電圧を印加してその間に電界を生成することができる。換言するならば、特定の実施形態において、第１の磁気感受性材料７６（１）は第１の電極としても機能することができ、第２の磁気感受性材料は第２の電極としても機能することができる。特定の実施形態において、第１の電極７６（１）は第１の末端８４（１）を含むことができ、第２の電極７６（２）は第２の末端８４（２）を含むことができる。更に、第１の末端８４（１）と第２の末端８４（２）は電界を生成するために電圧を印加できるように各々ＣＣＳ−ＧＭＩ８００のハウジング８６（図８Ａ参照）から突出することができる。特定の実施形態において、ハウジング８６は金属、ガラス、プラスチック、ポリマー材料又はその組合せを含むことができる。１実施形態において、ハウジング８６はポリカーボネートを含む。
【００７５】
特定の実施形態において、ブロック５１２における核酸の導入はブロック５０６のロードとブロック５１０の脱磁化後に行われる。例えば、（例えばＣＣＳ−ＧＭＩが磁化されている）図９とは対照的に、図１０では第１の電極７６（１）と第２の電極７６（２）の間に電位が存在するので、標的細胞７８は電界に暴露され、標的細胞膜に細孔を形成することができる。図例の実施形態では、電極間の距離が１ｍｍであるので、末端８４（１）及び８４（２）の間に１２５ボルトを印加することにより目的とする１．２５ｋＶ／ｃｍの電界強度が生成される。当然のことながら、電極間隙が２ｍｍであったならば、目的とする１．２５ｋＶ／ｃｍの電界強度を発生するためには２５０ボルトが必要になる。特定の実施形態において、標的細胞に導入するための核酸は標的細胞７８と共にＣＣＳ−ＧＭＩ８００に導入することができ、例えばＭＡＣＳ工程の前に両者を一緒にしておけばよい。一方、当然のことながら、特定の実施形態では、ＭＡＣＳ工程の最終期、例えば適切な量の標的細胞が既に磁気感受性材料と磁気的に結合しているが、まだ放出されていない時点で矢印５５８により示すように導入用の核酸を導入してもよい。例えば、標的細胞７８をＣＣＳ−ＧＭＩ８００に移して磁気的に保持した後、標的細胞７８が保持されている間に核酸をＣＣＳ−ＧＭＩ８００に移し、その後、標的細胞を磁気的に放出する前、放出中又は放出後に電界に暴露することができる。このような実施形態はより小さい体積及び／又はより高濃度の核酸分子を標的細胞７８の近傍に制御可能に配置できるので好ましいと思われる。特定の実施形態では、標的細胞が磁気的に放出される時点の後に標的細胞７８の遺伝子改変用核酸を導入することができる。特定の実施形態では、ＭＡＣＳ工程の前に核酸を導入することができる。特定の実施形態では、エレクトロポレーションではなくＭＡＣＳを実施するためにＣＣＳ−ＧＭＩ８００を使用することができ、一方、特定の実施形態では、ＭＡＣＳではなくエレクトロポレーションを実施するためにＣＣＳ−ＧＭＩ８００を使用することができる。当然のことながら、特定の実施形態において、例えば図８Ａに示す試料入口は図４Ａの矢印４５０、４５２及び４５８に対応することができ、例えば同じく図８Ａに示す試料出口は図４Ａの矢印４５４、４５６、４５８及び４６０に対応することができる。
【００７６】
次に図８Ｂを参照すると、特定の実施形態において、第１の電極７６（１）は第２の電極７６（２）の第２群の突起と嵌合することができる第１群の突起９０（１）〜９０（Ｎ）を含むことができる。電極７６は例えば鋼やアルミニウム等のあらゆる適切な導電性材料を含むことができる。特定の実施形態において、第１の末端８４（１）と第２の末端８４（２）は単一の位置でハウジングから突出する２線式導線の夫々の導線である。例えば、特定の実施形態では、２線式導線がハウジングを貫通して単一の位置で突出し、各個導線を相対向する電極に導電的に固定（例えば半田付け）することができる。
【００７７】
次に再び図８Ａを参照すると、特定の実施形態において、ＣＣＳ−ＧＭＩ８００は第１の電極７６（１）と第２の電極７６（２）の間に１個以上の絶縁体８８（１）〜８８（Ｎ）を含むことができる。好ましい実施形態において、絶縁体８８は電圧が第１の末端８４（１）及び／又は第２の末端８４（２）に供給されるときに電流が絶縁体８８を通って第１の電極７６（１）から第２の電極７６（２）に流れないように電気絶縁体から構成される。更に、好ましい実施形態において、絶縁体８８は電極間に精密及び／又は均一な間隔を生じるように第１の電極７６（１）と第２の電極７６（２）の種々の部分の間に物理的な支持体を提供することができる。当然のことながら、電極間隔の精度及び／又は均一性が増すと、生成される電界の１種以上の特性（例えば電界強度）の制御及び／又は均一性を増すことができる。
【００７８】
特定の実施形態において、電極は磁気感受性材料とは別の構造を含む。例えば、電極間に磁気感受性材料を配置することができる。次に図１０を参照すると、電極７６（１）及び７６（２）の間に多数の磁気感受性材料（ＭＳＭ）９２（１）〜９２（Ｎ）を配置した細胞セパレーター及び／又はエレクトロポレーター１１００を示す。当然のことながら、好ましい実施形態において、磁気感受性材料は試料が自由に流れることができるような多孔性又は他の透過性マトリックスとすることができる。特定の実施形態において、ＭＳＭ９２はワイヤー、金属被覆繊維、スチールウール又は小球とすることができる。ＭＳＭ９２は電極７６（１）及び７６（２）の間に精密な間隔を維持できるように、例えば９２（１２）に示すような小球を含むことが好ましいと思われる。特定の実施形態では、透過性マトリックスを構成するＭＳＭにコーティングを施してもよい。コーティングはＭＳＭを腐食から保護すると共に細胞を損傷させる可能性のあるカチオンがマトリックスから漏出するのを抑えるために実質的にイオン不透過性となるように選択することができる。ＭＳＭ及びＭＡＣＳに関するその他の詳細については一般に米国特許第８，７２７，１３２号を参酌できる。コーティングはコーティングの内部電荷が自由に流れないように、従って、電流がコーティングを通過してＭＳＭに流れることができないように、電気絶縁体とするように選択することができる。従って、コーティングは電流が前記第１の電極から前記第２の電極へと流れるのを防ぐことができる。
【００７９】
特定の実施形態において、細胞セパレーター及び／又はエレクトロポレーター１１００はＭＡＣＳ工程とエレクトロポレーション工程の一方又は両方の際に細胞の温度を維持及び／又は調節するための温度調節装置を含むか又はその近くに配置することができる。当業者に自明の通り、エレクトロポレーション中に標的細胞７８が維持される温度はエレクトロポレーションの効率に影響を与えると思われる。例えば、哺乳動物細胞株には室温で有効にエレクトロポレーションされるものがある。更に、エレクトロポレーションパルスにより実際に試料の温度が上昇する場合がある。細胞株によっては、パルスにより温度が上昇すると、細胞死が亢進し、トランスフェクション効率が低下する場合がある。一方、試料を低温に維持すると、細胞生存率と効率に及ぼす加熱効果が減る可能性がある。更に、可逆的エレクトロポレーションは一時的な細孔形成を生じるので、パルス後に細胞を低温に維持すると、細孔がより長時間開いたままになり、核酸の取り込みを増すと考えられる。従って、特定の実施形態では、電界の生成により生じる熱を消散させることが好ましいと思われる。
【００８０】
特定の実施形態では、ＤＣ電流を制御下に短時間流すこと（例えばＤＣパルス）により電界を生成する。特定の実施形態では、ＡＣ電流を制御下に流すことにより電界を生成し、細胞を集合又は整列させる。例えば、本願に開示するＣＣＳ−ＧＭＩ８００及び／又は細胞セパレーター及び／又はエレクトロポレーター１１００を使用してエレクトロフュージョン及び／又はエレクトロポレーションを実施することができる。エレクトロポレーション装置に関するその他の詳細については米国特許出願公開第２００５／０２７７１８３号、米国特許第８，１０５，８１８号、及び米国特許第８，０４３，８３８号を参酌できる。
【００８１】
次に図４と共に図６を参照すると、特定の実施形態では、遺伝子改変に導入する前に標的細胞を標的細胞セレクターから排出する（例えば処理チャンバーに戻す）ことができる。例えば、特定の実施形態では、方法１００のブロック１１６及び１２０を単一のデバイス（例えばＣＣＳ−ＧＭＩ８００）内で実施し、特定の実施形態では、ブロック１１６を細胞セパレーター内で実施し、ブロック１２０を１個以上の異なるシステムコンポーネント（例えば処理チャンバー）内で実施する。特定の実施形態では、標的細胞を標的細胞セレクターから排出したら、方法１００はブロック１１８に進み、選択／単離された標的細胞を場合により増幅もしくは刺激又はその両方に供することができる。特定の実施形態では、標的細胞がＨＳＰＣであり、増幅を行う場合には、Ｎｏｔｃｈアゴニスト、芳香族炭化水素受容体拮抗薬、ピリミドインドール誘導体（例えばＵＭ７２９又はＵＭ１７１）、サイトカイン、ケモカイン、ステロイド（例えばプロスタグランジンＥ２）及び／又はステロイド誘導体の１種以上の存在下でＨＳＰＣを培養することができる。これらの分子は細胞と接触する液体に配合することができる。特定分子に暴露すると、レンチウイルス感染が増加する。例えば、ＵＭ７２９とラパマイシンはレンチウイルス形質導入効率を増加させる。
【００８２】
Ｎｏｔｃｈアゴニストとしては、Ｎｏｔｃｈ経路活性を促進するようにＮｏｔｃｈタンパク質又はＮｏｔｃｈ経路の他のタンパク質と結合又は他の方法で相互作用するあらゆる化合物が挙げられる。代表的なＮｏｔｃｈアゴニストはＮｏｔｃｈ経路活性化を促進する細胞外結合性リガンドであるＤｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅ（例えばＪａｇｇｅｄ）、ＲＢＰ  ＪκＩ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  Ｈａｉｒｌｅｓｓ、Ｄｅｌｔｅｘ、Ｆｒｉｎｇｅ又はそのフラグメントである。Ｄｅｌｔａファミリーメンバー及びＳｅｒｒａｔｅファミリーメンバーの核酸及びアミノ酸配列は複数の生物種から単離されており、例えばＷＯ１９９３／１２１４１、ＷＯ１９９６／２７６１０、ＷＯ１９９７／０１５７１、及びＧｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５４：７８５−７９４に記載されている。
【００８３】
特定の実施形態において、ＮｏｔｃｈアゴニストはＤｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧである。特定の実施形態では、Ｄｅｌｔａ１ｅｘｔ−ＩｇＧを０．２〜２０μｇ／ｍｌ、１．２５〜１０μｇ／ｍｌ、又は２〜６μｇ／ｍｌの濃度で添加する。
【００８４】
当分野に通常の知識をもつ者により理解される通り、その他の培養条件としては、アンギオテンシン様タンパク質（Ａｎｇｐｔｌ類、例えばＡｎｇｐｔｌ２、Ａｎｇｐｔｌ３、Ａｎｇｐｔｌ７、Ａｎｇｐｔ１５及びＭｆａｐ４）、エリスロポエチン、線維芽細胞成長因子−１（ＦＧＦ−１）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン成長因子−２（ＩＦＧ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、幹細胞因子（ＳＣＦ；別称ｃ−ｋｉｔリガンドないしマスト細胞成長因子）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、及びそのアナログ（前記アナログとしては、天然に存在する成長因子の生物活性をもつ成長因子のあらゆる構造変異体が挙げられる；例えばＷＯ２００７／１１４５２２７及び米国特許公開第２０１０／０１８３５６４号参照）等の１種以上の成長因子の存在下における増幅が挙げられる。
【００８５】
特定の実施形態において、ＨＳＰＣを増幅させるのに適した成長因子の量又は濃度はＨＳＰＣの増殖を促進するために有効であるが、実質的にＨＳＰＣの分化を生じないような量又は濃度である。
【００８６】
ＨＳＰＣを増幅させるのに適した成長因子の量又は濃度は成長因子製剤の活性や、成長因子とＨＳＰＣの間の生物種対応等によって異なる。一般に、成長因子とＨＳＰＣが同一の生物種に由来する場合、培養培地における成長因子の合計量は１ｎｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、又は５ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌである。他の実施形態において、成長因子の量は５〜１０００又は５０〜１００ｎｇ／ｍｌの範囲とすることができる。
【００８７】
特定の実施形態において、上記成長因子はＨＳＰＣを増幅させるための培養条件下にＳＣＦ  ２５〜３００ｎｇ／ｍｌ、Ｆｌｔ−３Ｌ  ２５〜３００ｎｇ／ｍｌ、ＴＰＯ  ２５〜１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６  ２５〜１００ｎｇ／ｍｌ及びＩＬ−３  １０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。より特定的な実施形態では、ＳＣＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は２００ｎｇ／ｍｌ；Ｆｌｔ−３Ｌ  ５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ又は２００ｎｇ／ｍｌ；ＴＰＯ  ５０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌ；ＩＬ−６  ５０ｎｇ／ｍｌ又は１００ｎｇ／ｍｌ；及びＩＬ−３  １０ｎｇ／ｍｌを使用することができる。
【００８８】
特定の実施形態では、ＮｏｔｃｈアゴニストとＳＣＦ  ５０ｎｇ／ｍｌもしくは１００ｎｇ／ｍｌ；ＮｏｔｃｈアゴニストとＦｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−６、ＴＰＯ及びＳＣＦ各５０ｎｇ／ｍｌもしくは１００ｎｇ／ｍｌ；又はＮｏｔｃｈアゴニストと、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−６、ＴＰＯ及びＳＣＦ各５０ｎｇ／ｍｌもしくは１００ｎｇ／ｍｌと、ＩＬ−１１もしくはＩＬ−３  １０ｎｇ／ｍｌにＨＳＰＣを暴露することによりＨＳＰＣを増幅させることができる。
【００８９】
特定の実施形態において、本願に開示するＨＳＰＣ増幅はフィブロネクチン（ＦＮ）もしくはその断片（例えばＣＨ−２９６（Ｄａｏ  ｅｔ．ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９２（１２）：４６１２−２１））又はＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｒ）（組換えヒトフィブロネクチンフラグメント；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）等の細胞外マトリックスタンパク質を利用しない。
【００９０】
ＨＳＰＣを増幅させるための特定の実施形態では、Ｄｅｌｔａリガンドと、ＳＣＦ及びＴＰＯ各５０ｎｇ／ｍｌの存在下で細胞を培養する。ＨＳＰＣを増幅させるための特定の実施形態では、Ｄｅｌｔａリガンドと、好ましくはＳＣＦ及びＦｌｔ−３Ｌ各５０ｎｇ／ｍｌの存在下で細胞を培養する。ＨＳＰＣを増幅させるための特定の実施形態では、Ｄｅｌｔａリガンドと、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ及びＴＰＯ  各５０ｎｇ／ｍｌの存在下で細胞を培養する。ＨＳＰＣを増幅させるための特定の実施形態では、Ｄｅｌｔａリガンドと、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＴＰＯ及びＩＬ−６各５０ｎｇ／ｍｌの存在下で細胞を培養する。特定の実施形態では、更に５〜１５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３の存在下でＨＳＰＣを培養する。特定の実施形態では、更に５〜１５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦの存在下でＨＳＰＣを培養する。特定の実施形態において、使用する１種以上の成長因子はＧＭ−ＳＣＦ又はＩＬ−７以外のものである。
【００９１】
特定の実施形態において、本願に記載する方法を使用して得られる増幅後のＨＳＰＣ試料におけるＣＤ３４＋細胞の百分率は単離後で増幅前のＨＳＰＣにおけるＣＤ３４＋細胞の百分率よりも高い。特定の実施形態では、増幅の結果、増幅後の試料中のＨＳＰＣ数は増幅していない試料に比較して５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍（又はそれ以上）に増加する。特定の実施形態では、ヒト対象に少なくとも１回輸液するために十分な数の細胞、典型的には対象体重１ｋｇ当たり約１０４個〜１０９個又は２×１０６個の細胞が得られるまで細胞集団を増幅させることも好ましい。
【００９２】
適切な培養及び／又は増幅条件に関するその他の情報については、米国特許第７，３９９，６３３号；米国特許公開第２０１０／０１８３５６４号；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９４）；Ｖａｍｕｍ−Ｆｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１７８４−１７８９；Ｄｅｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｌｏｏｄ  １０６：２６９３−２６９９；Ｏｈｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：１１６５−１１７４；Ｄｅｌａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１６（２）：２３２−２３６；ＷＯ２００６／０４７５６９Ａ２；ＷＯ２００７／０９５５９４Ａ２；米国特許第５，００４，６８１号；ＷＯ２０１１／１２７４７０Ａ１；ＷＯ２０１１／１２７４７２Ａ１；及びＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ａｕｇｕｓｔ  ２００６の第２章とその引用文献参照。
【００９３】
次に図６Ａ及び６Ｂを参照すると、標的細胞を処理チャンバー（例えば第１の処理チャンバー）に戻し、該当する場合には増幅を行った後、方法１００はブロック１２０に進むことができ、矢印４６０により示すように所望の核酸を標的細胞に導入することができる。
【００９４】
ブロック６０２では、最適又は所望の標的細胞懸濁液体積を決定することができる。例えば、矢印４６０で処理チャンバーに移す細胞懸濁液の体積を決定することができる。特定の実施形態では、ブロック６０２における決定はユーザー入力により入力される。例えば、ユーザーは処理チャンバーに含まれる標的細胞懸濁液を試験し、その体積を推定することができる。特定の実施形態において、処理チャンバーはブロック６０２でユーザーが体積を決定し易くするために視覚的表示６５０を含むことができる。例えば特に図５Ａを参照すると、視覚的表示６５０によりユーザーは（破線により示すような）細胞懸濁液の液位を視覚的表示６５０と比較することができる。視覚的表示６５０は目盛として示しているが、当然のことながら、視覚的表示は他の形態でもよい。特定の実施形態では、ユーザー入力なしに自動的に決定を行うことができる。例えば、処理チャンバーが遠心を行うように構成され、遠心中に形成される層を識別するためのカメラを装備する実施形態では、細胞懸濁液を遠心し、細胞懸濁液と処理チャンバーの気体容積の間に形成される境界を識別することによりブロック６０２における決定を行うことができる。
【００９５】
特定の実施形態において、所望の標的細胞懸濁液体積はブロック４６０で処理チャンバーに導入される標的細胞懸濁液の初期体積に依存しない。例えば、特定の実施形態において、ユーザーはブロック６０２で所望の標的細胞懸濁液体積を指定することができる。
【００９６】
ブロック６０４では、最適核酸担体体積を決定することができる。最適核酸担体体積は核酸分子と標的細胞の目標比に基づいて決定することができる。例えば、目標比が標的細胞１個に対して核酸分子２０である場合には、ブロック６０２で行われる体積決定と関連して懸濁液単位体積当たりの既知又は推定核酸分子濃度を使用することができ、標的細胞懸濁液単位体積当たりの既知又は推定標的細胞濃度を使用してブロック６０４で最適核酸分子担体体積を決定することができる。理想的には、担体の総体積は細胞毒性を避けるために培養体積の３０％を越えるべきでない。ユーザーは最適細胞濃度を達成するように目標培養体積を定義することができる。ＣＤ３４＋ＨＳＰＣでは、許容細胞濃度は培養培地及びベクター体積１ｍＬ当たり細胞１〜２百万個である。
【００９７】
特定の実施形態において、ブロック６０２及び／又は６０４における決定は標的細胞懸濁液を処理チャンバーに導入する前、導入と同時、又は導入後に行うことができる。
【００９８】
ブロック６０６〜６１０では培地交換を行い、処理チャンバー内で標的細胞懸濁液に１以上の体積の指定培地を導入する。特に、ブロック６０６では矢印６５２により示すように第１の体積の指定培地を標的細胞懸濁液に導入することができる。特定の実施形態において、ブロック６０６で培地を標的細胞懸濁液に導入する工程は培地内で標的細胞懸濁液を撹拌する工程を含むことができる。例えば、標的細胞と指定培地の十分な接触を助長するために、ブロック３１２と同様の撹拌操作を行うことができる。ブロック６０８では、標的細胞と培地の両方を含む処理チャンバーの内容物を遠心し、懸濁液内の細胞をペレット化することができる。特定の実施形態では、ブロック６０８における遠心は段階的に実施する。ブロック６０８では、形成された上清を処理チャンバーから除去することができる。例えば、上清が実質的に指定培地を含む実施形態では、ブロック６１０で培地を除去することができる。特定の実施形態では、除去した培地を矢印６５４により示すように廃棄物容器に移した後、廃棄する。
【００９９】
ブロック６１２では、ブロック６０６〜６１０の培地交換を繰返すことができる。特定の実施形態では、遺伝子モディファイヤーを標的細胞懸濁液に導入する前に培地交換を複数回（例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回又は１０回以上）実施することができ、例えばブロック６１２で２回繰返す。特定の実施形態では、ユーザーにより定義された最終細胞懸濁液体積が得られる。例えば、ユーザーはその後のブロック６１０の最終実施中に得られる最適核酸担体体積をブロック６０４で決定及び／又は定義することができる。
【０１００】
ブロック６１４では、遺伝子モディファイヤーを標的細胞懸濁液に導入することができる。特定の実施形態では、核酸担体を処理チャンバーに直接導入することができる。
【０１０１】
レシピエント細胞の必要な発生と生理機能が損なわれない限り、１種以上の遺伝子モディファイヤーによる遺伝子改変を細胞に導入するための多数の技術を使用することができる。例えばＬｏｅｆｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｈｒ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ，１９８５，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２参照。特定の実施形態では、核酸が細胞により発現可能となり、好ましくは遺伝可能となり、その細胞子孫により発現可能となるように、核酸を細胞に安定的に導入できる技術を使用する。
【０１０２】
代表的な方法としては、トランスフェクション、（上述したような）エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム／リポフェクション（Ｔａｒａｈｏｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｉｖａｎｉｔｓｋｙ，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃ）６３：６０７−６１８）、リボザイム（Ｂｒａｎｃｈ  ａｎｄ  Ｋｌｏｔｍａｎ，１９９８，Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．６：７８−８３）、リン酸カルシウム法によるトランスフェクション、遺伝子配列を担持させたウイルス又はバクテリオファージベクターの感染、細胞融合法、染色体による遺伝子導入法、マイクロセルによる遺伝子導入法、スフェロプラスト融合法、裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体及び／又は三本鎖ＤＮＡの投与（Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｇｌａｚｅｒ，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７５：２６７−２８２）、トランスポゾン／トランスポザーゼ等が挙げられる。
【０１０３】
処理チャンバーの内側で遺伝子モディファイヤーにより遺伝子改変を誘導することができる。例えば裸のＤＮＡ、ＤＮＡ複合体及び／又は三本鎖ＤＮＡの場合には、担体は液体とすることができる。当分野に通常の知識をもつ者に理解される通り、担体としてはリポソーム、ベクター等も挙げられる。当然のことながら、本開示の随所で開示する他の遺伝子モディファイヤー以外に、遺伝子モディファイヤーとしては裸のＤＮＡ、裸のｍＲＮＡ、アデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルスベクター、（例えばＣＲＩＳＰＲ用の）ガイドＲＮＡ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ−ＴＡＬＥＮ融合体（ｍｅｇａＴＡＬ）及び／又は相同領域に挟まれた遺伝子の１種以上も挙げられる。相同領域は任意の適切な長さとすることができ、例えば１００ｂｐ〜３０，０００ｂｐ（例えば少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１，０００ｂｐ、少なくとも２，０００ｂｐ、少なくとも５，０００ｂｐ、少なくとも１０，０００ｂｐ又は少なくとも２０，０００ｂｐ）が挙げられる。標的細胞のゲノムへの組込みを誘導するのに適した任意の長さと、その結果として得られる遺伝子改変を使用することができる。
【０１０４】
「ベクター」とは別の核酸を輸送することが可能な核酸分子である。ベクターは例えばウイルス、ファージ、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、細菌ベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター及び人工染色体ベクターとすることができる。「発現ベクター」とは適切な環境に存在する場合にこのベクターにより担持された１種以上の遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を誘導することが可能な任意の種類のベクターである。
【０１０５】
ウイルスベクターは通常では非複製型又は複製低下型ベクターであり、即ちウイルスベクターは従来の手段（例えばＤＮＡ合成及び／又はウイルス力価の測定）により測定した場合に正常細胞（例えば正常ヒト細胞）で有意な程度まで複製することができない。非複製型又は複製低下型ベクターは自然にその状態になったもの（即ち自然界からその状態で単離されている）でもよいし、（例えばインビトロ交配又は遺伝子操作により）人工的にその状態になったものでもよい。複製低下型ウイルスベクターを増殖させることができる細胞種は一般に少なくとも１種類存在し、例えば改変型ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）はＣＥＦ細胞で増殖させることができる。一般的に、ウイルスベクターは対象、一般的には哺乳動物対象に有意な感染を生じることができない。
【０１０６】
「レトロウイルス」とはＲＮＡゲノムをもつウイルスである。特定の実施形態において、レトロウイルスベクターはウイルスゲノムのパッケージングと組込みに必要な全シス作用配列、即ち（ａ）ベクターの両端の長い末端反復（ＬＴＲ）又はその部分と、（ｂ）マイナス鎖及びプラス鎖ＤＮＡ合成用プライマー結合部位と、（ｃ）ゲノムＲＮＡをビリオンに組込むために必要なパッケージングシグナルを含む。レトロウイルスベクターに関する更に詳細については、Ｂｏｅｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２；Ｃｌｏｗｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１；Ｋｉｅｍ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３；Ｓａｌｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，１９９３，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１；Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９；及びＧｒｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４を参酌できる。
【０１０７】
「ガンマレトロウイルス」とはレトロウイルス科の１属を意味する。代表的なガンマレトロウイルスとしては、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、及びトリ細網内皮症ウイルスが挙げられる。
【０１０８】
広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びその組合せに由来するものが挙げられる（例えばＢｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９，１９９２；Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０，１９９２；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９，１９９０；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８，１９８９；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４，１９９１；及びＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００参照）。
【０１０９】
レンチウイルスベクターが特に適切である。「レンチウイルス」とは分裂細胞と非分裂細胞に感染することができ、一般的に高いウイルス力価を生じるレトロウイルスの１属を意味する。レンチウイルスベクターは多数の疾患の遺伝子治療に利用されている。例えば、レンチウイルスベクター又はガンマレトロウイルスベクターを使用した造血遺伝子治療がＸ連鎖性副腎白質ジストロフィーとβサラセミアに使用されている。例えばＫｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：２４７−５４，２０１０；Ｃａｒｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０７：１８７−１９８，２０１２；及びＣａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６７：３１８−３２２，２０１０参照。レンチウイルスの例をいくつか挙げると、ＨＩＶ（ＨＩＶ１型とＨＩＶ２型を含むヒト免疫不全ウイルス）、馬伝染性貧血ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
【０１１０】
特定の実施形態では、本発明の方法の実施に他のレトロウイルスベクターを使用することができる。これらのベクターとしては、例えばヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）やスプマウイルス（Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）属の他のウイルスに基づくベクターが挙げられる。
【０１１１】
フォーミーウイルス（ＦＶ）は今日知られている最大のレトロウイルスであり、全ての非ヒト霊長類種を含む種々の哺乳動物に広く存在するが、ヒトには存在しない。この完全な非病原性によりＦＶベクターはヒトにおける遺伝子治療用の理想的な遺伝子導入媒体として適格であり、ＦＶベクターは遺伝子送達システムとしてＨＩＶ由来ベクターやガンマレトロウイルス由来ベクターから明白に区別される。
【０１１２】
ＦＶベクターは（１）大型の導入遺伝子（＞９ｋｂ）を担持することができ、（２）分裂の遅い細胞に効率的に形質導入することができ、（３）プロウイルスとして標的細胞のゲノムに組込むことができるため、導入遺伝子の安定した長期間の発現が可能になるという理由から、遺伝子治療用途に適している。ＦＶベクターは組込み前の複合体を核に進入させるために細胞分裂を必要とするが、複合体は少なくとも３０日間安定しており、依然として感染性である。組込み前のＦＶ複合体の細胞内半減期はレンチウイルスと同等であり、ガンマレトロウイルスよりも著しく長いため、ＦＶもＬＶベクターと同様に分裂頻度の低い細胞に形質導入することが可能である。ＦＶベクターは天然自己不活性化型ベクターであり、周辺の遺伝子を活性化する可能性が殆どないと思われることを特徴とする。更に、ＦＶベクターは（受容体はまだ同定されていないが）公知のあらゆる細胞に進入することができ、安定なエンベロープタンパク質により感染性を低下せずに感染性ベクター粒子を１００倍に濃縮することができる。ＦＶベクターは多能性造血幹細胞で高い形質導入効率を達成し、イヌにおける白血球接着不全症（ＬＡＤ）やマウスにおけるファンコーニ貧血等の単一遺伝子病を治療するために動物モデルで使用されている。ＦＶベクターはβサラセミアの前臨床試験でも使用されている。
【０１１３】
ウイルスベクターのその他の例としては、アデノウイルス（例えばアデノウイルス５（Ａｄ５）、アデノウイルス３５（Ａｄ３５）、アデノウイルス１１（Ａｄ１１），アデノウイルス２６（Ａｄ２６）、アデノウイルス４８（Ａｄ４８）又はアデノウイルス５０（Ａｄ５０））、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ；例えば米国特許第５，６０４，０９０号；Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２５７（２０００）；Ｎａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９１：４６００（１９９８）参照）、アルファウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、フラビウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、インフルエンザウイルス、パピローマウイルス（例えばヒト及びウシパピローマウイルス；例えば米国特許第５，７１９，０５４号参照）、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス等に由来するものが挙げられる。Ｋｏｚａｒｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９−５０３，Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４；Ｗａｌｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｉ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００；及びＬｕｎｄｓｔｒｏｍ，１９９９，Ｊ．Ｒｅｃｅｐｔ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．Ｒｅｓ．１９：６７３−６８６参照。例としては、改変型ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）及びＮＹＶＡＣ、又はそれらに由来する株が挙げられる。他の例としては、鶏痘ベクター（例えばＦＰ９）やカナリア痘ベクター（例えばＡＬＶＡＣとそれに由来する株）等のアビポックスベクターが挙げられる。
【０１１４】
他の遺伝子送達方法としては、哺乳動物人工染色体（Ｖｏｓ，１９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．８：３５１−３５９）や酵母人工染色体（ＹＡＣ）等の人工染色体ベクターの使用が挙げられる。ＹＡＣは挿入する核酸が従来型のベクターには大き過ぎる（例えば＞１２ｋｂ）場合に一般的に使用される。
【０１１５】
ベクター及び他の核酸送達方法は、核酸分子の発現を制御するために調節配列を含むことができる。これらの調節配列は真核性でも原核性でもよい。特定の実施形態において、調節配列は１種以上の治療用タンパク質の発現が他の組織種に比較して標的組織種で実質的に高度となるように組織特異的プロモーターとすることができる。特定の実施形態では、ベクターが細胞に進入すると、調節配列により１種以上の治療用タンパク質の構成的発現を生じることができる。あるいは、調節配列は誘導性配列を含むことができる。誘導性調節配列は当業者に周知であり、１種以上の治療用タンパク質の発現を生じるために別の誘導因子の存在を必要とする配列である。適切な調節配列の例としては、内在性核タンパク質に基づく組織特異的転写因子に対応する結合部位、特定細胞種に発現を誘導する配列、ｌａｃオペレーター、テトラサイクリンオペレーター及びステロイドホルモンオペレーターが挙げられる。当業者に公知のあらゆる誘導性調節配列を使用できる。
【０１１６】
特定の実施形態は、核酸をゲノムに安定的に組込む。特定の実施形態では、核酸を別のエピソームセグメントとして細胞内に安定的に維持する。
【０１１７】
特定の実施形態では、トランスポゾンを使用することにより、組込み効率、組込むことができるＤＮＡ配列のサイズ、及びゲノムに組込むことができるＤＮＡ配列のコピー数を改善することができる。トランスポゾンないし転移因子としては、上流と下流に末端反復配列をもつ短い核酸配列が挙げられる。活性なトランスポゾンは核酸の切り出しと標的ＤＮＡ配列への挿入を容易にする酵素をコードすることができる。
【０１１８】
ヒトを含む脊椎動物のゲノムへの核酸の挿入を容易にする多数の転移因子が当分野で記載されている。例を挙げると、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ（例えばサケ科魚類のゲノムに由来するもの）、ｐｉｇｇｙｂａｃｋ（例えば鱗翅類細胞及び／又はトビイロホオヒゲコウモリ（Ｍｙｏｔｉｓ  ｌｕｃｉｆｕｇｕｓ）に由来するもの）、ｍａｒｉｎｅｒ（例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）に由来するもの）、ｆｒｏｇ  ｐｒｉｎｃｅ（例えばヒョウガエル（Ｒａｎａ  ｐｉｐｉｅｎｓ）に由来するもの）、Ｔｏｌ２（例えばメダカに由来するもの）、ＴｃＢｕｓｔｅｒ（例えばコクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）に由来するもの）及びｓｐｉｎＯＮが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを使用してもよい。コンピュータで実行可能な命令の代表的な記述を本願ではＳＷ６で表し、下表４に説明する。
【０１１９】
【表７】
0006734283.tif 000009
【０１２０】
次に再び図１を参照すると、方法１００は更にブロック１２２で標的細胞懸濁液に１種以上の他の液体成分を順次添加する工程を含むことができる。特定の実施形態において、１種以上の他の液体成分は第２の体積の核酸担体、第２の体積の緩衝液、先に添加していない別の培地成分、又は第２の体積の培地（例えば形質導入培地）の少なくとも１種を含むことができる。特定の実施形態において、ブロック１２２における順次添加は処理チャンバー内で実施することができる。例えば、ユーザーは細胞懸濁液に添加する他の各液体成分に対応する体積を指定することができ、ユーザー入力に基づき、（例えば汚染を防止するために）チューブ経路を清浄にすることができ、及び／又は指定した体積の各成分を処理チャンバーに加えることができる。特定の実施形態において、ブロック１２２における順次添加は処理チャンバーの外部（例えばＣＣＳ−ＧＭＩ８００又は細胞セパレーター及び／又はエレクトロポレーター１１００の内側）で実施することができる。例えば、ブロック５１２においてＣＣＳ−ＧＭＩ８００内で標的細胞に核酸担体を導入後、ブロック１２２において液体成分を順次添加しながら標的細胞をＣＣＳ−ＧＭＩ８００の内側に維持することができる。特定の実施形態では、ブロック１２０及び／又は１２２の後に標的細胞増幅及び／又は刺激を行うことができる。コンピュータで実行可能な命令の代表的な記述を本願ではＳＷ７で表し、下表５に説明する。
【０１２１】
【表８】
0006734283.tif 000010
【０１２２】
記載する方法を実施する際の種々の段階で標的細胞を培養することが有用又は必要であると思われる。例えば、核酸導入工程はストレスが多いと思われるので、得られた遺伝子改変後の標的細胞を細胞培養手順に供し、精製及び製剤化前に健康を回復及び／又は増殖を開始させることができる。更に、特定の実施形態では、標的細胞を核酸導入工程の前に遠心し、例えばこの工程の前に健康を増進させてもよい。従って、方法１００は更にブロック１２４で標的細胞産物を培養する工程を含むことができる。
【０１２３】
特定の実施形態において、ブロック１２４で細胞産物を培養する工程は、細胞産物に暴露させる少なくとも１種のガスに対応する１種以上のガスパラメーターを決定する工程を含むことができる。例えば、システムは処理チャンバーに接続された１個以上のガスシリンダーを含むことができ、その個々の分圧は（例えば図７Ａに示す）１個以上のガスレギュレーターによりを独立して調節できる。従って、特定の実施形態において、ガスレギュレーターは第１のガスの第１の分圧からＮ番目のガスのＮ番目の分圧までを選択的に制御することができる。特定の実施形態では、ブロック１２４で細胞産物を培養する工程中に、窒素ガス（Ｎ２）、炭酸ガス（ＣＯ２）及び酸素ガス（Ｏ２）の各々に対応する分圧を調節することができる。更に、特定の実施形態において、細胞産物を培養する工程はブロック７０４で最適処理チャンバー温度を決定する工程を含むことができる。当業者に自明の通り、培養に最適なガスパラメーターと最適な温度は細胞産物の種類と工程の段階に応じて異なる。特定の実施形態では、ブロック７０６で処理チャンバーを最適温度に維持することができる。現在公知であるか又は今後開発されるかに関係なく、処理温度を維持するのに適したあらゆる技術を使用することができる。
【０１２４】
ブロック７０８では、ブロック７０２におけるガスパラメーターの決定に従って１種以上のガスを混合することができる。特定の実施形態では、処理チャンバー内でガスを混合することができ、例えば各ガスを個々に処理チャンバーに導入する。特定の実施形態では、処理チャンバーの外部でガスを混合することができる。各ガスの夫々の分圧をより正確に得るためには、処理チャンバーの外部の別の混合装置でガスを混合すると好ましいと思われる。ブロック７１０では、細胞産物の培養中に混合ガスを周期的に交換することができる。例えば、特定の実施形態では、所定の時間の１以上で又はユーザーがブロック１２４における細胞培養を終了するまで例えば１５分間の一定間隔で混合ガスを完全に交換する。コンピュータで実行可能な命令の代表的な記述を本願ではＳＷ８で表し、下表６に説明する。
【０１２５】
【表９】
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【０１２６】
ブロック１２４及び１２６に対応し、図７Ａは用途特異的に（例えば遺伝子改変細胞を対象に投与するために）使用する遺伝子改変細胞を培養、精製及び製剤化するための代表的なシステムの模式図を示す。図７Ｂは図７Ａの代表的なシステムを使用して遺伝子改変細胞を培養、精製及び製剤化するための代表的な方法のフローチャートである。
【０１２７】
特定の実施形態において、ブロック１２６における細胞産物の精製と最終製剤化は望ましくない培地成分を最終製剤から除去する工程を含むことができる。例えば、細胞と遺伝子改変された標的細胞を対象に投与できるようにＰＯＣＤ内で精製及び製剤化することができる。製剤とは対象に投与するために医薬的に許容される担体と共に調製された細胞又は改変型細胞を意味する。代表的な担体と細胞の投与方式は米国特許公開第２０１０／０１８３５６４号の１４〜１５頁に記載されている。その他の医薬担体はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｖｉｄ  Ｂ．Ｔｒｏｙ，ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）に記載されている。
【０１２８】
特定の実施形態において、ブロック１２６における精製と最終製剤化は細胞産物をペレット化し、得られた上清を除去する工程を含む。得られた上清を除去すると、残存している核酸担体及び／又は不注意で患者に投与された核酸担体（例えばウイルスベクター）を除去できるので、有益であると思われる。当然のことながら、培養目的に適した培地と投与目的に適した培地とは異なる場合がある。従って、特定の実施形態では、ブロック７１４で遺伝子改変細胞を培養培地から精製し、洗浄し、濃縮して治療有効量の担体に懸濁することができる。代表的な担体としては、塩類溶液、緩衝塩類溶液、生理食塩水、水、ハンクス液、リンゲル液、Ｎｏｎｎｏｓｏｌ−Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ）、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ  Ａ（Ｒ）（Ｂａｘｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｒｔｏｎ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）、グリセロール、エタノール及びその組合せが挙げられる。
【０１２９】
特定の実施形態では、担体にヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）もしくは他のヒト血清成分又は胎仔ウシ血清を添加することができる。特定の実施形態において、輸液用担体は５％ＨＳＡ又はデキストロースを添加した緩衝塩類溶液を含む。その他の等張剤としては、多価糖アルコール類が挙げられ、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール又はマンニトール等の三価以上の糖アルコール類が挙げられる。
【０１３０】
担体はクエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、酒石酸緩衝液、フマル酸緩衝液、グルコン酸緩衝液、蓚酸緩衝液、乳酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液及び／又はトリメチルアミン塩等の緩衝剤を含むことができる。
【０１３１】
安定剤とは、増量剤の機能に始まり、容器壁への細胞付着を防ぐのに役立つ添加剤に至るまでの機能に対応することができる広義の医薬品添加剤を意味する。典型的な安定剤としては、多価糖アルコール類；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸及びスレオニン等のアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール及びシクリトール（例えばイノシトール）等の有機糖類又は糖アルコール類；ＰＥＧアミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム等の硫黄含有還元剤；低分子量ポリペブチド（即ち＜１０残基）；ＨＳＡ、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース及びグルコース等の単糖類；ラクトース、マルトース及びスクロース等の二糖類；ラフィノース等の三糖類；並びにデキストラン等の多糖類を挙げることができる。
【０１３２】
必要又は有益な場合には、注射部位の痛みを和らげるためにリドカイン等の局所麻酔薬を製剤に加えることができる。
【０１３３】
製剤内の細胞の治療有効量は細胞１０２個超、１０３個超、１０４個超、１０５個超、１０６個超、１０７個超、１０８個超、１０９個超、１０１０個超、又は１０１１個超とすることができる。
【０１３４】
本願に開示する製剤において、細胞は一般に１リットル以下、５００ｍｌ以下、２５０ｍｌ以下又は１００ｍｌ以下の体積中に含まれる。従って。投与される細胞の密度は一般的に１０４個／ｍｌ超、１０７個／ｍｌ超、又は１０８個／ｍｌ超である。
【０１３５】
本願に開示する製剤は例えば注射、輸液、灌流又は洗浄による投与用に製造することができる。
【０１３６】
ブロック７１６では、製剤化された遺伝子改変産物を用途特異的な使用目的で処理チャンバーから取り出すことができる。例えば、遺伝子改変産物をバイアルに移し、対象投与のためにバイアルからシリンジに充填することができる。本願に開示する組成物及び製剤は例えば注射、輸液、灌流又は洗浄による投与用に製造することができる。コンピュータで実行可能な命令の代表的な記述を本願ではＳＷ９で表し、下表７に説明する。
【０１３７】
【表１０】
0006734283.tif 000012
【０１３８】
次に再び図２Ａを参照すると、当然のことながら、本願に開示する代表的なシステム及び／又はデバイスはいずれも方法１００、２００、３００、４００、５００、６００及び／又は７００、あるいはそのいずれかのサブセットのオペレーションのいずれかを制御することができるプラットフォームコントローラ２６４と通信することができる。プラットフォームコントローラ２６４は１個以上のプロセッサ２６６及び／又は１個以上のコンピュータ読取り可能な媒体２６８を含むことができる。コンピュータ読取り可能な媒体２６８は揮発性記憶装置（例えばランダムアクセスメモリ）及び／又は不揮発性メモリ（例えばハードディスク又は別の型の不揮発性メモリ）を含むことができる。コンピュータ読取り可能な媒体２６８は種々の機能を実施するようにプロセッサ２６６により実行可能なソフトウェア命令２７０（例えばデバイスドライバー、オペレーティングシステム及び／又はソフトウェアアプリケーション）を格納するために使用することができる。
【０１３９】
特定の実施形態において、コンピュータ読取り可能な媒体２６８は１個以上の流路を開く及び／又は閉じるための１個以上の弁（弁記号
【０１４０】
【化１】
0006734283.tif 000013
により示す。）を選択的に切り替えるための弁コントローラ２７２を含むことができる。特定の実施形態において、コンピュータ読取り可能な媒体２６８は１個以上の流路に試料又はその一部を強制的に灌流させるための１個以上のポンプ（ポンプ記号
【０１４１】
【化２】
0006734283.tif 000014
により示す。）を選択的に作動させるためのポンプコントローラ２７４を含むことができる。弁記号とポンプ記号は図例の多数の流路のごく一部にしか示していないが、当然のことながら、流路及び／又は流路を形成するために使用されるチューブのセクションのいずれか１個以上に弁及び／又はポンプを含むことも本開示の範囲内である。特定の実施形態で使用される弁及びポンプの適切な種類に関する更に詳細については、米国特許第５６９１２０８号、６，４６８，４３２号及び８，７２７，１３２号を参酌できる。
【０１４２】
特定の実施形態において、コンピュータ読取り可能な媒体２６８は処理チャンバーの１種以上の機能を制御するための処理チャンバーコントローラ２７６を含むことができる。例えば、遠心を行うように処理チャンバーを構成する特定の実施形態では、遠心速度（例えばＲＰＭ）、撹拌スケジュール（例えば撹拌時間及び強度）及び／又は上清を除去するための１個以上の内部弁の１種以上を制御するように処理チャンバーコントローラ２７６を構成することができる。特定の実施形態では、処理チャンバー内に１種以上のインキュベーション環境を維持するために使用される１個以上の加熱及び／又は冷却素子を制御するように処理チャンバーコントローラ２７６を構成することができる。
【０１４３】
特定の実施形態において、コンピュータ読取り可能な媒体２６８は標的細胞セレクター及び／又は複合セルセレクター／核酸イントロデューサー（ＴＣＳ／ＣＣＳ−ＮＡＩ）コントローラ２７８を含むことができる。ＴＣＳ／ＣＣＳ−ＮＡＩコントローラ２７８は図４Ａの標的細胞セレクター（例えばＭＡＣＳ又はＦＡＣＳ式細胞セレクター）及び／又はＣＣＳ−ＮＡＩ８００及び／又は細胞セパレーター及び／又はエレクトロポレーター１１００に関して本願に開示する１種以上の機能の実施を制御するように構成することができる。例えば、ＴＣＳ／ＣＣＳ−ＮＡＩコントローラ２７８はＣＣＳ−ＮＡＩ８００内に維持されたＭＡＣＳプロトコールとそれに続く選択された細胞のエレクトロポレーションプロトコールを順次実施する際にＣＣＳ−ＮＡＩ８００を制御するように構成することができる。
【０１４４】
本願に開示する方法は対象（ヒト、飼育動物（イヌ、ネコ、爬虫類、鳥類等）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリ等）及び研究動物（サル、ラット、マウス、魚類等））の細胞を作製する方法及び／又は本願に開示する遺伝子改変細胞を前記対象に投与する方法を含む。対象への投与は治療有効量の送達を含む。治療有効量は、有効量、予防処置及び／又は治療処置を提供する量を含む。
【０１４５】
「有効量」とは対象に所望の生理的変化を生じるために必要な細胞数である。有効量は研究目的で投与することが多い。
【０１４６】
「予防処置」とは治療する病態の徴候もしくは症状を示していないか又は治療する病態の初期徴候もしくは症状しか示していない対象に投与し、病態を抑制、防止又は発生の危険を低減する目的で投与する処置を意味する。従って、予防処置は病態に対する未然防止処置の役割を果たす。
【０１４７】
「治療処置」とは病態の症状又は徴候を示す対象に投与する処置を意味し、病態の重症度又は進行を抑制する目的で前記対象に投与される。
【０１４８】
特定の対象に投与する実際の投与量は例えば標的、体重、病態の種類、病態の重症度、事前に分かっている場合に迫っている関連するイベント、過去又は同時治療介入、対象の特発性疾患及び投与経路を含む身体的及び生理的因子等のパラメータを考慮して医師、獣医又は研究者が決定することができる。更に、最適な用量範囲を確認し易くするため場合によりインビトロ及びインビボアッセイを利用することができる。
【０１４９】
投与する治療有効量としては、細胞１０２個超、１０３個超、１０４個超、１０５個超、１０６個超、１０７個超、１０８個超、１０９個超、１０１０個超、又は１０１１個超が挙げられる。特定の実施形態において、最低用量は対象体重１ｋｇ当たり細胞２×１０６個である。
【０１５０】
上記のように、本願に開示する組成物及び製剤は例えば注射、輸液、灌流又は洗浄により投与することができ、より特定的には骨髄、静脈内、皮内、動脈内、リンパ節内、リンパ管内、腹腔内、病変内、前立腺内、膣内、直腸内、局所、髄腔内、腫瘍内、筋肉内、膀胱内及び／又は皮下輸液及び／又はボーラス注射を１回以上行うことによる投与が挙げられる。
【０１５１】
治療遺伝子を含むあらゆる核酸を本願に開示する標的細胞に導入することができる。「遺伝子」なる用語は本願に記載するような１種以上の治療用タンパク質をコードする核酸配列（ポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列と同義に使用する）を意味する。この定義はコードされる１種以上の治療用タンパク質の機能が実質的に変わらない限り、種々の配列多型、突然変異及び／又は配列変異体を包含する。「遺伝子」なる用語はコーディング配列のみならず、プロモーター、エンハンサー及び停止領域等の調節領域も包含し得る。この用語は更に選択的スプライス部位に起因する変異体と共に、ｍＲＮＡ転写産物からスプライシングされる全イントロン及び他のＤＮＡ配列も包含し得る。分子をコードする遺伝子配列は１種以上の治療用タンパク質の発現を誘導するＤＮＡ又はＲＮＡとすることができる。これらの核酸配列はＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列でもよいし、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列でもよい。核酸配列としては、全長核酸配列と全長タンパク質に由来する非全長配列の両方が挙げられる。配列は特定細胞種にコドン優先を提供するために導入することができる天然配列の縮重コドンも包含することができる。
【０１５２】
１種以上の治療用タンパク質をコードする遺伝子配列は関連するアミノ酸配列から合成法又は組換え法により容易に作製することができる。特定の実施形態において、これらの配列のいずれかをコードする遺伝子配列は、この配列をコードする遺伝子配列を切り出して別の配列をコードする別の遺伝子配列に置換するのを容易にするために、更にコーディング配列の５’及び／又は３’末端に１個以上の制限酵素部位を有することができる。特定の実施形態では、前記配列をコードする遺伝子配列を哺乳動物細胞での発現に合わせてコドン最適化することができる。
【０１５３】
１例として、特定の実施形態では遺伝性である病態に対して有効な治療反応を提供するように遺伝子を選択することができる。特定の実施形態において、前記病態はグレーブス病、関節リウマチ、悪性貧血、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）もしくは重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ファンコーニ貧血（ＦＡ）、バッテン病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）もしくは異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、筋ジストロフィー、肺胞蛋白症（ＰＡＰ）、ピルビン酸キナーゼ欠損症、シュワッハマン・ダイアモンド・ブラックファン貧血、先天性角化不全症、嚢胞性線維症、パーキンソン病、アルツハイマー病又は筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病）とすることができる。特定の実施形態では、病態に応じて、治療遺伝子は機能不全になっているタンパク質及び／又は遺伝子をコードする遺伝子でもよい。代表的な治療遺伝子及び遺伝子産物としては、可溶性ＣＤ４０；ＣＴＬＡ；Ｆａｓ  Ｌ；ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２等に対する抗体；ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ６に対する抗体；自己反応性Ｔ細胞に特異的に存在するＴＣＲに対する抗体；ＩＬ４；ＩＬ１０；ＩＬ１２；ＩＬ１３；ＩＬ１Ｒａ、ｓＩＬ１ＲＩ、ｓＩＬ１ＲＩＩ；ｓＴＮＦＲＩ；ｓＴＮＦＲＩＩ；ＴＮＦ、Ｐ５３、ＰＴＰＮ２２及びＤＲＢ１＊１５０１／ＤＱＢ１＊０６０２に対する抗体；グロビンファミリー遺伝子；ＷＡＳ；ｐｈｏｘ；ＦＡＮＣファミリー遺伝子；ジストロフィン；ピルビン酸キナーゼ；ＣＬＮ３；ＡＢＣＤ１；アリールスルファターゼＡ；ＳＦＴＰＢ；ＳＦＴＰＣ；ＮＬＸ２．１；ＡＢＣＡ３；ＧＡＴＡ１；リボソームタンパク質遺伝子；ＴＥＲＴ；ＴＥＲＣ；ＤＫＣ１；ＴＩＮＦ２；ＣＦＴＲ；ＬＲＲＫ２；ＰＡＲＫ２；ＰＡＲＫ７；ＰＩＮＫ１；ＳＮＣＡ；ＰＳＥＮ１；ＰＳＥＮ２；ＡＰＰ；ＳＯＤ１；ＴＤＰ４３；ＦＵＳ；ユビキリン２；及び／又はＣ９ＯＲＦ７２が挙げられる。治療有効量は免疫細胞と他の血液細胞及び／又は小膠細胞に機能を提供する量でもよいし、あるいは治療する病態に応じて、リンパ球活性化を阻害する量、リンパ球にアポトーシスを誘導する量、リンパ球の各種サブセットを排除する量、Ｔ細胞活性化を阻害する量、自己反応性Ｔ細胞を排除もしくは阻害する量、Ｔｈ−２もしくはＴｈ−１リンパ球活性を阻害する量、ＩＬ１もしくはＴＮＦに拮抗する量、炎症を抑制する量、誘発物質に対する選択的耐容性を誘導する量、免疫介在性疾患を抑制もしくは解消する量、及び／又は免疫介在性疾患の症状を抑制もしくは解消する量でもよい。治療有効量は更に機能的ＤＮＡ修復メカニズム、界面活性剤タンパク質発現、テロメア維持、リソソーム機能、脂質やアミロイド等の他のタンパク質の分解を実現する量；リボソーム機能を可能にする量；及び／又は治療有効量以外では発生しないマクロファージや他の白血球種等の成熟血球系統の発生を可能にする量でもよい。
【０１５４】
別の例として、赤血球及び凝血に関連する疾患に対する有効な治療反応を提供するように遺伝子を選択することができる。特定の実施形態において、前記疾患はサラセミアや鎌状赤血球症／形質等の異常ヘモグロビン症である。治療遺伝子は例えばヘモグロビンの産生を誘導もしくは増加する遺伝子；β−グロビンもしくはα−グロビンの産生を誘導もしくは増加する遺伝子；又は体内の細胞の酸素利用性を増加する遺伝子とすることができる。治療遺伝子は例えばＨＢＢ又はＣＹＢ５Ｒ３とすることができる。代表的な有効な治療は例えば患者の血球数を増加することができ、血球機能を改善することができ、又は細胞の酸化を亢進することができる。別の特定の実施形態において、疾患は血友病である。治療遺伝子は例えば凝固／凝血因子ＶＩＩＩもしくは凝固／凝血因子ＩＸの産生を増加する遺伝子、正常型の凝固因子ＶＩＩＩもしくは凝固因子ＩＸの産生を生じる遺伝子、凝固／凝血因子ＶＩＩＩもしくは凝固／凝血因子ＩＸに対する抗体の産生を抑制する遺伝子、又は血餅の適正な形成を生じる遺伝子とすることができる。代表的な治療遺伝子としてはＦ８とＦ９が挙げられる。代表的な有効な治療は例えば対象における凝固／凝血因子ＶＩＩＩ及びＩＸの産生を増加もしくは誘導することができ、凝固／凝血因子ＶＩＩＩ及びＩＸの機能を改善することができ、又は凝血時間を短縮することができる。
【０１５５】
別の例として、リソソーム蓄積症に対して有効な治療反応を提供するように遺伝子を選択することができる。特定の実施形態において、前記リソソーム蓄積症はムコ多糖症（ＭＰＳ）Ｉ型；ＭＰＳ  ＩＩ型ないしハンター症候群；ＭＰＳ  ＩＩＩ型ないしサンフィリッポ症候群；ＭＰＳ  ＩＶ型ないしモルキオ症候群；ＭＰＳ  Ｖ型；ＭＰＳ  ＶＩ型ないしマロトー・ラミー症候群；ＭＰＳ  ＶＩＩ型ないしスライ症候群；α−マンノース症；β−マンノース症；Ｉ型糖原病（別称ＧＳＤＩ、フォン・ギールケ病又はテイ＝サックス病）；ポンペ病；ゴーシェ病；ファブリー病である。治療遺伝子は例えば酵素の産生をコードもしくは誘導する遺伝子、又は他の方法でリソソームにムコ多糖の分解を生じる遺伝子とすることができる。代表的な治療遺伝子としては、ＩＤＵＡないしイズロニダーゼ、ＩＤＳ、ＧＮＳ、ＨＧＳＮＡＴ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＧＵＳＢ、ＧＡＬＮＳ、ＧＬＢ１、ＡＲＳＢ及びＨＹＡＬ１が挙げられる。リソソーム蓄積症に有効な遺伝子治療の代表例としては、例えばリソソームにおける種々の物質の分解に関与する酵素の産生をコードもしくは誘導する方法；頭部（例えば巨頭症）、肝臓、脾臓、舌又は声帯を含む種々の臓器における腫脹を抑制、解消、予防又は遅延させる方法；脳内の髄液量を減少させる方法；心臓弁異常を抑制する方法；気道狭窄を予防又は拡張し、感染症や睡眠時無呼吸等の関連する上気道疾患を予防する方法；ニューロン破壊及び／又は付随する症状を抑制、解消、予防又は遅延させる方法が挙げられる。
【０１５６】
別の例として、過剰増殖性疾患に対して有効な治療反応を提供するように遺伝子を選択することができる。特定の実施形態において、前記過剰増殖性疾患は癌である。治療遺伝子は例えば腫瘍抑制遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、又はホルモンをコードする遺伝子とすることができる。代表的な治療遺伝子及び遺伝子産物としては、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、５３ＢＰ２、ａｂｌ、ＡＢＬ１、ＡＤＰ、ａＦＧＦ、ＡＰＣ、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、ＡＴＭ、ＢＡＩ−１、ＢＤＮＦ、Ｂｅｔａ＊（ＢＬＵ）、ｂＦＧＦ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＦＴＲ、ＣＮＴＦ、ＣＯＸ−１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＳ−１、シトシンデアミナーゼ、ＤＢＣＣＲ−１、ＤＣＣ、Ｄｐ、ＤＰＣ−４、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ｆ、ＥＢＲＢ２、ｅｒｂ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆａｂ、ＦＣＣ、ＦＧＦ、ＦＧＲ、ＦＨＩＴ、ｆｍｓ、ＦＯＸ、ＦＵＳ  １、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ  ２１（ＮＰＲＬ２）、Ｇｅｎｅ  ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭＦ、ｇｓｐ、ＨＣＲ、ＨＩＣ−１、ＨＲＡＳ、ｈｓｔ、ＩＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１  ＩＬ−１２、ＩＮＧ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＲＦ−１、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＵＣＡ−１（ＨＹＡＬ１）、ＬＵＣＡ−２（ＨＹＡＬ２）、ＬＹＮ、ＭＡＤＨ４、ＭＡＤＲ２、ＭＣＣ、ｍｄａ７、ＭＤＭ２、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ｎｅｕ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＮＧＦ、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＮＲＡＳ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＯＶＣＡ１、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ｐ３００、ＰＧＳ、ＰＩＭ１、ＰＬ６、ＰＭＬ、ＰＴＥＮ、ｒａｆ、Ｒａｐ１Ａ、ｒａｓ、Ｒｂ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ｒｋｓ−３、ＳｃＦｖ、ｓｃＦＶ  ｒａｓ、ＳＥＭ  Ａ３、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＴＦＰＩ、トロンボスポンジン、チミジンキナーゼ、ＴＮＦ、ＴＰ５３、ｔｒｋ、Ｔ−ＶＥＣ、ＶＥＧＦ、ＶＨＬ、ＷＴ１、ＷＴ−１、ＹＥＳ及びｚａｃ１が挙げられる。代表的な有効な遺伝子治療は、腫瘍を抑制もしくは消滅させることができ、癌細胞数を減らすことができ、腫瘍サイズを減少させることができ、腫瘍増殖を遅延もしくは解消することができ、又は腫瘍に起因する症状を緩和することができる。
【０１５７】
別の例として、感染症に対して有効な治療反応を提供するように遺伝子を選択することができる。特定の実施形態において、前記感染症はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。治療遺伝子は例えば免疫細胞をＨＩＶ感染に対して抵抗性にする遺伝子、又は免疫再構築により免疫細胞が前記ウイルスを有効に中和できるようにする遺伝子、免疫細胞により発現されるタンパク質をコードする遺伝子の多型、感染に対抗するのに有利であり、患者で発現されない遺伝子、感染病原体、受容体もしくは補助受容体をコードする遺伝子、受容体もしくは補助受容体のリガンドをコードする遺伝子、ウイルス複製に必須のウイルス及び細胞遺伝子とすることができ、例えば、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくは所定の転写因子の作用を阻害するためのデコイＲＮＡをコードする遺伝子、ドミナントネガティブウイルスタンパク質、細胞内抗体、イントラカインをコードする遺伝子及び自殺遺伝子が挙げられる。代表的な治療遺伝子及び遺伝子産物としては、α２β１、αｖβ３、αｖβ５、αｖβ６３、ＢＯＢ／ＧＰＲ１５、Ｂｏｎｚｏ／ＳＴＲＬ−３３／ＴＹＭＳＴＲ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ４、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＸＣＲ４、アミノペプチダーゼ−Ｎ、ＨＨＶ−７、ＩＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＰＲＲ２／ＨｖｅＢ、ＨｖｅＡ、α−ジストログリカン、ＬＤＬＲ／α２ＭＲ／ＬＲＰ、ＰＶＲ、ＰＲＲ１／ＨｖｅＣ、及びラミニン受容体が挙げられる。ＨＩＶ治療の治療有効量は例えば、ＨＩＶに対する対象の免疫を増強する量、ＡＩＤＳもしくはＨＩＶに伴う症状を改善する量、又はＨＩＶに対する先天もしくは適応免疫反応を対象に誘導する量とすることができる。ＨＩＶに対する免疫反応は抗体産生を含むことができ、その結果としてＡＩＤＳを予防することができ、及び／又は対象のＡＩＤＳもしくはＨＩＶ感染の症状を改善することができ、あるいはＨＩＶ感染性及び／又はビルレンスを低下又は消失させることができる。
【０１５８】
細菌も感染病原体なる用語に含まれる。他の感染病原体としては、例えばマラリアの原因となる病原体であるプラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属のメンバー等の寄生虫が挙げられる。寄生虫の感染性に作用する代表的な治療遺伝子としては、赤血球骨格タンパク質４．１、グリコフォリン、ｐ５５、及びケモカイン受容体をコードするＤｕｆｆｙ対立遺伝子が挙げられる。治療有効量は例えば感染症又は病原体を抑制又は消失させる。治療有効量は感染症又は病原体の症状を抑制又は消失させることもできる。
【０１５９】
遺伝子改変細胞は本願に記載するようなエクスビボ単離、改変及び製剤化が可能なあらゆる細胞種とすることができる。代表的な細胞種としては特にＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ１６６、ＨＬＡ  Ｄの１種以上に陽性又はＬｉｎもしくはＣＤ３８に陰性のＨＳＰＣ；Ｔ細胞（例えばαβＴ細胞、γδＴ細胞、成熟Ｔ細胞（例えばＣＤ３＋）、活性化Ｔ細胞（例えば４−１ＢＢ＋（ＣＤ１３７＋））、ヘルパーＴ細胞（例えばＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔ細胞（例えばＣＤ８＋）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、例えばナイーブ細胞に比較してＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７＋、又はＣＣＲ７＋及びＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ４５ＲＡ−のもの）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ、例えばナイーブ細胞に比較してＣＤ６２Ｌ−、ＣＤ４５ＲＡ−のもの）、制御性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ、例えばＣＤ２５＋、ＣＴＬＡ−４＋、ＧＩＴＲ＋、ＧＡＲＰ＋及びＬＡＰ＋のもの）、ナイーブＴ細胞（例えばセントラルメモリー細胞又はエフェクターメモリー細胞に比較してＣＤ６２ＬとＣＤ４５ＲＡを発現し且つＣＤ４５ＲＯを発現しない非抗原感作Ｔ細胞））；ナチュラルキラー細胞（別称ＮＫ細胞、Ｋ細胞及びキラー細胞、例えばＣＤ８＋、ＣＤ１６＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ３−）、マクロファージ、単球、Ｂ細胞が挙げられる。
【０１６０】
代表的なキット：本願に開示するプラットフォームを実施するために必要又は有用な材料を収容した１個以上の容器を含むキットも本願に開示する。このような容器には医薬品又はバイオ製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により定められた形式の文書を添付することができ、前記文書は人体投与用の製造、使用又は販売を前記機関により承認されていることを示す。
【０１６１】
場合により、本願に記載するキットは更に本願に開示する技術で前記キットを使用するための説明書を含む。各種実施形態において、前記キットは試料プロセシング；ソフトウェアプログラム使用；ユーザーインターフェースガイドライン；遺伝子改変され、製剤化された細胞の投与；キットの使用に伴う結果を解釈するのに適した基準レベル；関連する廃棄物の適切な廃棄等に関する説明書を含むことができる。説明書は印刷版説明書としてキットに同梱することもできるし、説明書をキット自体の一部に印刷することもできる。説明書はシート、パンフレット、小冊子、ＣＤ−ＲＯＭ又はコンピュータ読取り可能なデバイスの形態でもよいし、ウェブサイトのように遠隔地で説明書の手引きを提供することもできる。
【０１６２】
キットの特定の実施形態は１個以上の滅菌済みチューブセット；静脈内輸液用塩類溶液（例えばＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ）；２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；６％ヘタスターチ含有塩類溶液（ＨＥＳ）；緩衝液（例えばＰＢＳ／ＥＤＴＡ）；ビオチン化抗ＣＤ３４抗体（クローン１２．８）（別称１２．８抗体）；ＣＤ３４マイクロビーズもしくは他の直接結合抗体−磁気ビーズ複合体；ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（ＩＶＩｇ）もしくは他のブロッキング剤（例えば自家血清）；ストレプトアビジン被覆マイクロビーズ；漏斗形クライオバッグ；無針スパイクアダプター；シリンジ（例えば６０ｍＬ、３０ｍＬ）；完全形質導入培地；濃縮レンチウイルス；医療用手袋；ガウン及び／又はフェイスマスクの１種以上を含む。
【０１６３】
キット又は方法で使用される特定の完全形質導入培地は所望の臨床用途で形質導入に使用する細胞種と核酸担体（例えばウイルスベクター）により決定される。形質導入培地は（１）基礎培地を含み、これに（２）種々のサイトカイン及び／又はケモカインと、（３）小分子又は細胞生存と遺伝子導入を助長するための他の添加物を添加してもよいし、しなくてもよい。造血幹細胞培養及び形質導入用完全形質導入培地の１例としては、ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭもしくはＡＣＦ培地（いずれもＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製品）又は各種Ｘｖｉｖｏ培地（Ｌｏｎｚａ）等の市販基礎培地が挙げられる。この基礎培地に添加するサイトカイン／ケモカインとしては、組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｆｌｉｇｈｔｌｅｓｓ  ３リガンド（ｆｌｔ３又はｆｌｔ３Ｌ）、及びインターロイキン（例えばインターロイキン３（ＩＬ３）、インターロイキン６（ＩＬ６））が挙げられる。他のサイトカイン／ケモカインも効果を上げるために種々の濃度で添加することができる。添加することができる小分子としては、芳香族炭化水素受容体拮抗薬（例えばＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１（例えば４−［２−［［２−ベンゾ［ｂ］チエン−３−イル−９−（１−メチルエチル）−９Ｈ−プリン−６−イル］アミノ］エチル］フェノール）；ＧＮＦ３５１（例えばＮ−（２−（３Ｈ−インドール−３−イル）エチル）−９−イソプロピル−２−（５−メチル−３−ピリジル）−７Ｈ−プリン−６−アミン、Ｎ−（２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル）−９−イソプロピル−２−（５−メチルビリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−６−アミン）；ＣＨ２２３１９１（例えば１−メチル−Ｎ−［２−メチル−４−［２−（２−メチルフェニル）ジアゼニル］フェニル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド））；ピリミドインドール誘導体（例えばＵＭ１７１（例えば（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン）；ＵＭ７２９（４−（（３−（ピペリジン−１−イル）プロピル）アミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボン酸メチル）；ＵＭ１１８４２８（例えばトラニルシプロミン塩酸塩（トランス−２−フェニルシクロプロピルアミン塩酸塩）））；グルココルチコイド受容体拮抗薬（ミフェプリストン（例えばＲＵ−４８６）、ＲＵ−４３０４４、ミコナゾール、１１−オキサコルチゾール、１１−オキサプレドニゾロン、デキサメタゾンメシラート）又はその組合せが挙げられる。添加することができるその他の添加物としては、プロタミン硫酸塩、ラパマイシン、ポリブレン、フィブロネクチンフラグメント、プロスタグランジン又は非ステロイド性抗炎症薬（例えばセレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク、トルメチン）が挙げられる。
【０１６４】
特定の実施形態において、キット又は方法で使用される特定の濃縮レンチウイルス試薬も同様に遺伝子導入の標的である細胞種と臨床用途に特異的である。前記試薬は目的の臨床用途に特異的な治療用導入遺伝子又は遺伝子編集因子をコードするように遺伝子操作されたレンチウイルスＲＮＡ分子を封入するシュードタイプ糖タンパク質等の遺伝子組換えウイルス粒子を、形質導入しようとする細胞種に適した培地製剤に懸濁したものを含む。エンベロープ糖タンパク質の例としては、水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）、Ｃｏｃａｌウイルス糖タンパク質（ｃｏｃａｌ）又は改変型フォーミーウイルス糖タンパク質（ｍＦｏａｍｙ）が挙げられる。レンチウイルスＲＮＡ分子の例としては、全長もしくは部分的なヒトもしくはウイルスプロモーターエレメント、多数の疾患特異的治療用導入遺伝子、ガイドもしくはマイクロＲＮＡ、プロモーターエレメント、選択カセット、エンハンサーエレメント、インシュレーターエレメント、調節エレメント及び場合によりコードされる治療用導入遺伝子の転写と翻訳を強化するための因子（例えばウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントの一部、２Ａウイルス融合エレメント又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列）をコードするＨＩＶ−１由来自己不活性化型レンチウイルスバックボーンが挙げられる。濃縮レンチウイルス調製物用培地製剤の例としてはイスコフ改変ダルベッコ培地やＯｐｔｉ−Ｐｒｏ培地が挙げられるが、他の製剤も使用できる。
【０１６５】
以下、本開示の特定の実施形態を実証するために代表的な実施形態と実施例を記載する。当分野に通常の知識をもつ者であれば、本開示に鑑み、本開示の趣旨と範囲に反しない限り、本願に開示する特定の実施形態に多くの変更を加えることができ、その場合も同等の結果が得られることを理解するはずである。
【０１６６】
代表的な実施形態
【０１６７】
代表的な実施形態
１．対象試料から得た標的細胞を単離・遺伝子改変・製剤化する方法であって、前記方法が、
（ｉ）試料投入口、緩衝液投入口及び処理チャンバーを備える前記対象試料のプロセシング用回路と；
前記回路の１個以上の流路を選択的に閉じるための複数の弁と；
前記対象試料の前記標的細胞を前記対象試料の非標的細胞から分離するための１個以上の標的細胞セレクターと；
前記回路の少なくとも一部を通して前記対象試料を灌流させるための少なくとも１個のポンプと；
前記処理チャンバー、前記複数の弁、前記標的細胞セレクター及び前記ポンプの動作を制御するために１個以上のプロセッサにより実行可能なメモリ格納命令
を含むポイントオブケア及び／又はポータブルデバイスに前記対象試料を仕込む工程と；
（ｉｉ）前記１個以上のプロセッサによる前記命令の実行を開始し、
前記対象試料を前記処理チャンバーから前記標的細胞セレクターへと移送する作業と；
２個以上のセレクターを使用する場合には、前記標的細胞セレクターの動作により前記標的細胞を前記非標的細胞から同時又はタンデムに分離する作業と；
前記標的細胞を前記処理チャンバーに戻す作業と；
前記処理チャンバー及び／又は前記標的細胞セレクター内の前記標的細胞に遺伝子モディファイヤーを導入し、遺伝子改変された標的細胞を作製する作業と；
前記遺伝子改変された標的細胞を対象への投与用製剤として製剤化する作業を
前記複数の弁、前記１個以上の標的細胞セレクター、又は前記少なくとも１個のポンプのうちの少なくとも１種に実施させる工程を含む前記方法。
２．前記実行を開始する工程がＳＷ１、ＳＷ２、ＳＷ３、ＳＷ４、ＳＷ６、ＳＷ７、ＳＷ８及び／又はＳＷ９の１種以上の実行を開始する工程を含む実施形態１に記載の方法。
３．前記実行を開始する工程がＳＷ１、記述１、２、３もしくは４；ＳＷ２、記述１、２、３もしくは４；ＳＷ３、記述１、２、３もしくは４；ＳＷ４、記述１、２、３、４もしくは５；ＳＷ６、記述１、２、３、４もしくは５；ＳＷ７、記述１、２、３、４もしくは５；ＳＷ８、記述１、２、３、４もしくは５；及び／又はＳＷ９、記述１、２、３、４もしくは５の１種以上の実行を開始する工程を含む実施形態１に記載の方法。
４．前記実行を開始する工程がＪ１、Ｊ２、Ｊ３、Ｊ４、Ｊ６、Ｊ７、Ｊ８及び／又はＪ９の１種以上の実行を開始する工程を含む実施形態１に記載の方法。
５．更に前記対象試料の初期体積を測定する工程を含む実施形態１から４のいずれかに記載の方法。
６．更に前記仕込み工程の前に前記対象試料のヘマトクリット値を測定する工程を含む実施形態１から５のいずれかに記載の方法。
７．更に一定体積の緩衝液を前記対象試料に添加し、前記ヘマトクリット値を少なくとも２５％まで低下させる工程を含む実施形態１から６のいずれかに記載の方法。
８．前記対象試料に添加する緩衝液の体積が下式：
【０１６８】
【数１】
0006734283.tif 000015
に従って計算される実施形態７に記載の方法。
９．更に前記緩衝液の添加後に前記対象試料のヘマトクリット値を測定する工程を含む実施形態７又は８に記載の方法。
１０．更に前記希釈後の対象試料の体積を測定する工程を含む実施形態７から９のいずれかに記載の方法。
１１．更に２５％のヘマトクリット値を前記デバイスのユーザーインターフェースに入力する工程を含む実施形態１から１０のいずれかに記載の方法。
１２．現行の適正製造規範（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）の適合を確認するための放出試験を実施する工程を含む実施形態１から１１のいずれかに記載の方法。
１３．前記放出試験が以下の試験を含む実施形態１２に記載の方法。
【０１６９】
【表１１】
0006734283.tif 000016
１４．前記遺伝子モディファイヤーを導入する工程が免疫介在性疾患、遺伝性遺伝子疾患、血液障害、リソソーム蓄積症、過剰増殖性疾患又は感染症を治療するために遺伝子を挿入又は改変する実施形態１から１３のいずれかに記載の方法。
１５．前記免疫介在性疾患がグレーブス病、関節リウマチ、悪性貧血、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、アデノシン・デアミナーゼ欠損ＳＣＩＤ（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）又はウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）である実施形態１４に記載の方法。
１６．前記遺伝性遺伝子疾患が慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ファンコーニ貧血（ＦＡ）、シュワッハマン・ダイアモンド・ブラックファン貧血（ＤＢＡ）、先天性角化不全症（ＤＫＣ）、ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、肺胞蛋白症（ＰＡＰ）、バッテン病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、筋ジストロフィー（ＭＤ）、パーキンソン病、アルツハイマー病又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリッグ病）である実施形態１４に記載の方法。
１７．前記血液障害がサラセミアや鎌状赤血球貧血症等の異常ヘモグロビン症である実施形態１４に記載の方法。
１８．前記リソソーム蓄積症がムコ多糖症（ＭＰＳ）Ｉ型、ＭＰＳ  ＩＩ型、ＭＰＳ  ＩＩＩ型、ＭＰＳ  ＩＶ型、ＭＰＳ  Ｖ型、ＭＰＳ  ＶＩ型、ＭＰＳ  ＶＩＩ型、α−マンノース症、β−マンノース症、テイ＝サックス病、ポンペ病、ゴーシェ病又はファブリー病である実施形態１４に記載の方法。
１９．前記過剰増殖性疾患が癌である実施形態１４に記載の方法。
２０．前記感染症がＨＩＶ、麻疹ウイルス、コロナウイルス、アミノペプチダーゼ−Ｎ、ＬＣＭＶ／ラッサ熱ウイルス、細菌及び／又は寄生虫による感染に起因する実施形態１４に記載の方法。
２１．前記単離・遺伝子改変・製剤化された細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、白血球（ＷＢＣ）、単核細胞（ＭＮＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、間質細胞及び／又は骨髄線維芽細胞である実施形態１から２０のいずれかに記載の方法。
２２．前記単離・遺伝子改変・製剤化された細胞がＣＤ３４＋ＨＳＰＣである実施形態１から２１のいずれかに記載の方法。
２３．前記遺伝子がＡＢＣＤ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＬ１、ＡＤＡ、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＡＰＰ、ＡＲＳＡ、ＡＲＳＢ、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、Ｃ９ＯＲＦ７２、Ｃ４６又は他のＣペプチド、ＣＡＲ、ＣＡＳ９、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＣＲ５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤＡ、ＣＦＴＲ、ＣＬＮ３、Ｃ−ＭＹＣ、ＣＲＥ、ＣＳＣＲ４、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＬＡ、ＣＴＳ−１、ＣＹＢ５Ｒ３、ＤＣＣ、ＤＨＦＲ、ＤＫＣ１、ＤＬＬ１、ＤＭＤ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆ８、Ｆ９、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＬ、ＦＡＮＣＭ、ＦａｓＬ、ＦＣＣ、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＵＳ、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＴＡ１、ＧＬＢ１、ＧＮＳ、ＧＵＳＢ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＣＲ、ＨＧＳＮＡＴ、ＨＯＸＢ４、ＨＲＡＳ、ＨＹＡＬ１、ＩＣＡＭ−１、ｉカスパーゼ、ＩＤＵＡ、ＩＤＳ、ＪＵＮ、ＫＬＦ４、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＲＲＫ２、ＬＹＮ、ＭＣＣ、ＭＤＭ２、ＭＧＭＴ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＭＹＣ、ＮＡＧＬＵ、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＮＫＸ２．１、ＮＯＴＣＨ、ＯＣＴ４、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ＰＡＬＢ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ７、ｐｈｏｘ、ＰＩＮＫ１、ＰＫ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＲＡＤ５１Ｃ、ｒａｓ、ＲＰＬ３〜ＲＰＬ４０、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＳ２〜ＲＰＳ３０、ＲＰＳＡ、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＳＧＳＨ、ＳＬＸ４、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＯＸ２、ＴＥＲＣ、ＴＥＲＴ、ＴＤＰ４３、ＴＩＮＦ２、ＴＫ、ユビキリン２、ＶＨＬ、ＷＡＳ及びＷＴ−１の１種以上である実施形態１４から２２のいずれかに記載の方法。
２４．更に投与を必要とする対象に前記単離・遺伝子改変・製剤化された細胞を治療有効量で投与する工程を含む実施形態１から２３のいずれかに記載の方法。
２５．前記単離・遺伝子改変・製剤化された細胞の前記治療有効量が対象体重１ｋｇ当たり≧２．５Ｅ＋０５である実施形態２４に記載の方法。
２６．前記単離・遺伝子改変・製剤化された細胞の前記治療有効量が対象体重１ｋｇ当たり細胞２×１０６個である実施形態２４に記載の方法。
２７．前記遺伝子モディファイヤーが非組込み型ベクターを含む実施形態１４に記載の方法。
２８．前記遺伝子モディファイヤーがウイルスベクターを含む実施形態１４又は２７に記載の方法。
２９．前記遺伝子モディファイヤーがレンチウイルスベクターを含む実施形態１４、２７又は２８に記載の方法。
３０．前記レンチウイルスベクターがシュードタイプエンベロープ糖タンパク質とレンチウイルスＲＮＡ分子を含む実施形態２９に記載の方法。
３１．前記シュードタイプエンベロープ糖タンパク質が水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）、Ｃｏｃａｌウイルス糖タンパク質（ｃｏｃａｌ）、ネコ内在性ウイルス糖タンパク質（ＲＤ１１４）又は改変型フォーミーウイルス糖タンパク質（ｍＦｏａｍｙ）を含む実施形態３０に記載の方法。
３２．前記レンチウイルスＲＮＡ分子がＨＩＶ−１由来自己不活性化型レンチウイルスバックボーンを含む実施形態３０又は３１に記載の方法。
３３．前記レンチウイルスＲＮＡ分子が組込み欠損型のＨＩＶ−１由来自己不活性化型レンチウイルスバックボーンを含む実施形態３０又は３１に記載の方法。
３４．前記遺伝子モディファイヤーがガンマレトロウイルスベクターを含む実施形態１４、２７又は２８に記載の方法。
３５．前記ガンマレトロウイルスベクターがシュードタイプエンベロープ糖タンパク質とガンマレトロウイルスＲＮＡ分子を含む実施形態３４に記載の方法。
３６．前記シュードタイプエンベロープ糖タンパク質がテナガザル白血病ウイルス糖タンパク質（ＧＡＬＶ）又はネコ内在性ウイルスエンベロープ（ＲＤ１１４）を含む実施形態３５に記載の方法。
３７．前記ガンマレトロウイルスＲＮＡ分子が自己不活性化型ガンマレトロウイルスバックボーンを含む実施形態３５又は３６に記載の方法。
３８．前記ガンマレトロウイルスＲＮＡ分子が組込み欠損型の自己不活性化型ガンマレトロウイルスバックボーンを含む実施形態３５又は３６に記載の方法。
３９．前記遺伝子モディファイヤーがフォーミーウイルスベクターを含む実施形態１４、２７又は２８に記載の方法。
４０．前記フォーミーウイルスベクターがシュードタイプエンベロープ糖タンパク質とフォーミーウイルスＲＮＡ分子を含む実施形態３９に記載の方法。
４１．前記シュードタイプエンベロープ糖タンパク質がフォーミーウイルスエンベロープタンパク質（Ｆｏａｍｙ）又は改変型フォーミーウイルスエンベロープタンパク質（ｍＦｏａｍｙ）を含む実施形態４０に記載の方法。
４２．前記フォーミーウイルスＲＮＡ分子が自己不活性化型フォーミーウイルスバックボーンを含む実施形態４０又は４１に記載の方法。
４３．前記フォーミーウイルスＲＮＡ分子が組込み欠損型の自己不活性化型フォーミーウイルスバックボーンを含む実施形態４０又は４１に記載の方法。
４４．前記遺伝子モディファイヤーがアルファレトロウイルスベクターを含む実施形態１４、２７又は２８に記載の方法。
４５．前記アルファレトロウイルスベクターがシュードタイプエンベロープ糖タンパク質とアルファレトロウイルスＲＮＡ分子を含む実施形態４４に記載の方法。
４６．前記シュードタイプエンベロープ糖タンパク質が水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）、Ｃｏｃａｌウイルス糖タンパク質（ｃｏｃａｌ）、ネコ内在性ウイルス糖タンパク質（ＲＤ１１４）又は改変型フォーミーウイルス糖タンパク質（ｍＦｏａｍｙ）を含む実施形態４５に記載の方法。
４７．前記アルファレトロウイルスＲＮＡ分子が自己不活性化型アルファレトロウイルスバックボーンを含む実施形態４５又は４６に記載の方法。
４８．前記遺伝子モディファイヤーが１種以上のプロモーターエレメント、選択カセット、エンハンサーエレメント、インシュレーターエレメント、調節エレメント及び転写／翻訳エンハンサーエレメントを更に含むレンチウイルス、ガンマレトロウイルス、フォーミーウイルス又はアルファレトロウイルスベクターを含む実施形態１４から４７のいずれかに記載の方法。
４９．前記転写／翻訳エンハンサーエレメントがウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントの一部、２Ａウイルス融合エレメント又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む実施形態４８に記載の方法。
５０．前記遺伝子モディファイヤーが裸のＤＮＡ、裸のｍＲＮＡ、アデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルスベクター、ガイドＲＮＡ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ−ＴＡＬＥＮ融合体（ｍｅｇａＴＡＬ）及び／又は相同領域に挟まれた遺伝子を含む実施形態１４に記載の方法。
５１．前記デバイスに連結したチューブセットに１個以上の漏斗形クライオバッグを無菌溶接する工程を含む実施形態１から５０のいずれかに記載の方法。
５２．予想沈降体積に適したバッグ容積を選択する工程を含む実施形態１から５１のいずれかに記載の方法。
５３．前記対象試料を沈降させるために前記チューブセットに仕込むために必要な段階数を入力する工程を含み、前記必要な段階数が前記希釈後の試料体積（ｍＬ）を段階毎に３００ｍＬで割り、次の整数に切り上げることにより得られる実施形態１から５２のいずれかに記載の方法。
５４．沈降が完了し、ＲＢＣ除去を開始してもよいことを前記デバイスに通知する工程を含む実施形態１から５３のいずれかに記載の方法。
５５．ＲＢＣ沈降層から除去する初期体積（ｍＬ）を入力する工程を含む実施形態１から５４のいずれかに記載の方法。
５６．ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ９０又はＣＤ１３３と選択的に結合するビーズ又は抗体を前記デバイスに仕込む工程を含む実施形態１から５５のいずれかに記載の方法。
５７．マイクロビーズとＩＶＩｇを前記デバイスに仕込む工程を含む実施形態１から５６のいずれかに記載の方法。
５８．標的細胞を収容した標的細胞バッグのルアー接続部の上部にチューブセットをシールする工程を含む実施形態１から５７のいずれかに記載の方法。
５９．形質導入培地を前記デバイスに仕込む工程を含む実施形態１から５８のいずれかに記載の方法。
６０．前記形質導入培地が基礎培地と、サイトカイン及び／又はケモカインと、細胞生存と遺伝子導入を助長するための添加物を含む実施形態５９に記載の方法。
６１．前記サイトカイン／ケモカインが組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｆｌｉｇｈｔｌｅｓｓ  ３リガンド（ｆｌｔ３又はｆｌｔ３Ｌ）及びインターロイキンを含む実施形態６０に記載の方法。
６２．前記インターロイキンがインターロイキン３（ＩＬ−３）及び／又はインターロイキン６（ＩＬ−６）を含む実施形態６１に記載の方法。
６３．前記添加物が芳香族炭化水素受容体拮抗薬、ピリミドインドール誘導体、グルココルチコイド受容体拮抗薬、プロタミン硫酸塩、ラパマイシン、ポリブレン、フィブロネクチンフラグメント、プロスタグランジン、抗酸化剤及び／又は非ステロイド性抗炎症薬を含む実施形態６０から６２のいずれかに記載の方法。
６４．前記芳香族炭化水素受容体拮抗薬がＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１、ＧＮＦ３５１及び／又はＣＨ２２３１９１を含む実施形態６０から６３のいずれかに記載の方法。
６５．前記ピリミドインドール誘導体がＵＭ１７１及び／又はＵＭ１１８４２８を含む実施形態６０から６４のいずれかに記載の方法。
６６．前記グルココルチコイド受容体拮抗薬がミフェプリストン、ＲＵ−４３０４４、ミコナゾール、１１−オキサコルチゾール、１１−オキサプレドニゾロン及び／又はデキサメタゾンメシラートを含む実施形態６０から６５のいずれかに記載の方法。
６７．プロスタグランジンがプロスタグランジンＥ２を含む実施形態６０から６６のいずれかに記載の方法。
６８．前記非ステロイド性抗炎症薬がセレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク及び／又はトルメチンを含む実施形態６０から６７のいずれかに記載の方法。
６９．一定体積の濃縮レンチウイルス、ガンマレトロウイルス、フォーミーウイルス又はアルファレトロウイルスを適当な寸法のシリンジ内に吸引する工程と、前記シリンジをルアーフィッティングに接続する工程を含む実施形態１から６８のいずれかに記載の方法。
７０．第２の体積の濃縮レンチウイルス、ガンマレトロウイルス、フォーミーウイルス又はアルファレトロウイルスを適当な寸法のシリンジ内に吸引する工程と、前記シリンジをルアーフィッティングに接続する工程を含む実施形態１から６９のいずれかに記載の方法。
７１．無針スパイクアダプターを製剤化用緩衝液のバッグに差し込む工程を含む実施形態１から７０のいずれかに記載の方法。
７２．標的細胞バッグを製剤化用緩衝液のバッグに交換する工程を含む実施形態１から７１のいずれかに記載の方法。
７３．クライオバッグから廃棄物バッグへの弁経路を手動で開き、チューブセットを通して製剤化用緩衝液を排出させる工程を含む実施形態１から７２のいずれかに記載の方法。
７４．対象から得た標的細胞を単離・遺伝子改変・製剤化するためのキットであって、前記キットが遺伝子モディファイヤーと、試料プロセシング、ソフトウェアプログラム使用、並びに／又はポイントオブケア及び／もしくはポータブルデバイスで使用するためのユーザーインターフェースガイドラインに関する説明書を含む前記キット。
７５．ＳＷ１、記述１、２、３もしくは４；ＳＷ２、記述１、２、３もしくは４；ＳＷ３、記述１、２、３もしくは４；ＳＷ４、記述１、２、３、４もしくは５；ＳＷ６、記述１、２、３、４もしくは５；ＳＷ７、記述１、２、３、４もしくは５；ＳＷ８、記述１、２、３、４もしくは５；及び／又はＳＷ９、記述１、２、３、４もしくは５の１種以上の使用説明書を含む実施形態７４に記載のキット。
７６．Ｊ１、Ｊ２、Ｊ３、Ｊ４、Ｊ６、Ｊ７、Ｊ８又はＪ９の１種以上の使用説明書を含む実施形態７４に記載のキット。
７７．前記説明書が前記対象試料の出発時の体積を測定するように指示する実施形態７４から７６のいずれかに記載のキット。
７８．前記説明書が前記仕込み工程の前に前記対象試料のヘマトクリット値を測定するように指示する実施形態７４から７７のいずれかに記載のキット。
７９．前記説明書が一定体積の緩衝液を前記対象試料に添加し、前記ヘマトクリット値を２５％まで低下させるように指示する実施形態７４から７８のいずれかに記載のキット。
８０．前記説明書が前記対象試料に添加する緩衝液の体積を下式：
【０１７０】
【数２】
0006734283.tif 000017
に従って計算するように指示する実施形態７９に記載のキット。
８１．前記説明書が前記緩衝液の添加後に前記対象試料のヘマトクリット値を測定するように指示する実施形態７４から８０のいずれかに記載のキット。
８２．前記説明書が希釈後の試料の体積を測定するように指示する実施形態７４から８１のいずれかに記載のキット。
８３．前記説明書が２５％のヘマトクリット値を前記デバイスのユーザーインターフェースに入力するように指示する実施形態７４から８２のいずれかに記載のキット。
８４．前記説明書が前記デバイスに連結したチューブセットに１個以上の漏斗形クライオバッグを無菌溶接するように指示する実施形態７４から８３のいずれかに記載のキット。
８５．前記説明書が予想沈降体積に適したバッグ容積を選択するように指示する実施形態７４から８４のいずれかに記載のキット。
８６．前記説明書が前記対象試料を沈降させるために前記チューブセットに仕込むために必要な段階数を入力することを指示し、前記必要な段階数が前記希釈後の試料体積（ｍＬ）を段階毎に３００ｍＬで割り、次の整数に切り上げることにより得られる実施形態７４から８５のいずれかに記載のキット。
８７．沈降が完了し、ＲＢＣ除去を開始してもよいことを前記デバイスに通知するように前記説明書が指示する実施形態７４から８７のいずれかに記載のキット。
８８．前記説明書がＲＢＣ沈降層から除去する初期体積（ｍＬ）を入力するように指示する実施形態７４から８７のいずれかに記載のキット。
８９．前記説明書が造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞（ＨＰＣ）、造血幹・前駆細胞（ＨＳＰＣ）、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、単球、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、白血球（ＷＢＣ）、単核細胞（ＭＮＣ）、内皮細胞（ＥＣ）、間質細胞及び／又は骨髄線維芽細胞から選択される細胞の単離・遺伝子改変・製剤化を指示する実施形態７４から８８のいずれかに記載のキット。
９０．前記説明書がＣＤ３４＋ＨＳＰＣの単離・遺伝子改変・製剤化を指示する実施形態７４から８９のいずれかに記載のキット。
９１．前記説明書がＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ９０又はＣＤ１３３と選択的に結合するビーズ又は抗体を前記デバイスに仕込むように指示する実施形態７４から９０のいずれかに記載のキット。
９２．前記説明書がマイクロビーズとＩＶＩｇを前記デバイスに仕込むように指示する実施形態７４から９１のいずれかに記載のキット。
９３．前記説明書が標的細胞を収容した標的細胞バッグのルアー接続部の上部にチューブセットをシールするように指示する実施形態７４から９２のいずれかに記載のキット。
９４．前記説明書が形質導入培地を前記デバイスに仕込むように指示する実施形態７４から９３のいずれかに記載のキット。
９５．前記説明書が一定体積の濃縮レンチウイルス、ガンマレトロウイルス、フォーミーウイルス又はアルファレトロウイルスを適当な寸法のシリンジ内に吸引し、前記シリンジをルアーフィッティングに接続するように指示する実施形態７４から９４のいずれかに記載のキット。
９６．前記説明書が第２の体積の濃縮レンチウイルス、ガンマレトロウイルス、フォーミーウイルス又はアルファレトロウイルスを適当な寸法のシリンジ内に吸引し、前記シリンジをルアーフィッティングに接続するように指示する実施形態７４から９５のいずれかに記載のキット。
９７．前記説明書が無針スパイクアダプターを製剤化用緩衝液のバッグに差し込むように指示する実施形態７４から９６のいずれかに記載のキット。
９８．前記説明書が標的細胞バッグを製剤化用緩衝液のバッグに交換するように指示する実施形態７４から９７のいずれかに記載のキット。
９９．前記説明書がクライオバッグから廃棄物バッグへの弁経路を手動で開き、チューブセットを通して製剤化用緩衝液を排出させるように指示する実施形態７４から９８のいずれかに記載のキット。
１００．前記説明書が現行の適正製造規範の適合を確認するために放出試験を実施するように指示する実施形態７４から９９のいずれかに記載のキット。
１０１．前記放出試験が以下の試験を含む実施形態１００に記載のキット。
【０１７１】
【表１２】
0006734283.tif 000018
１０２．前記説明書が投与を必要とする対象に前記単離・遺伝子改変・製剤化された細胞を治療有効量で投与するように指示する実施形態７４から１０１のいずれかに記載のキット。
１０３．前記単離・遺伝子改変・製剤化された細胞の前記治療有効量が対象体重１ｋｇ当たり≧２．５Ｅ＋０５である実施形態１０２に記載のキット。
１０４．前記単離・遺伝子改変・製剤化された細胞の前記治療有効量が対象体重１ｋｇ当たり細胞２×１０６個である実施形態１０２に記載のキット。
１０５．免疫介在性疾患、遺伝性遺伝子疾患、血液障害、リソソーム蓄積症、過剰増殖性疾患又は感染症を治療するために遺伝子を導入又は改変するための遺伝子モディファイヤーを含む実施形態７４から１０４のいずれかに記載のキット。
１０６．前記免疫介在性疾患がグレーブス病、関節リウマチ、悪性貧血、多発性硬化症（ＭＳ）、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、アデノシン・デアミナーゼ欠損ＳＣＩＤ（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）又はウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）である実施形態１０５に記載のキット。
１０７．前記遺伝性遺伝子疾患が慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、ファンコーニ貧血（ＦＡ）、シュワッハマン・ダイアモンド・ブラックファン貧血（ＤＢＡ）、先天性角化不全症（ＤＫＣ）、ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）、肺胞蛋白症（ＰＡＰ）、バッテン病、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、筋ジストロフィー（ＭＤ）、パーキンソン病、アルツハイマー病又は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリッグ病）である実施形態１０５に記載のキット。
１０８．前記血液障害がサラセミアや鎌状赤血球貧血症等の異常ヘモグロビン症である実施形態１０５に記載のキット。
１０９．前記リソソーム蓄積症がムコ多糖症（ＭＰＳ）Ｉ型、ＭＰＳ  ＩＩ型、ＭＰＳ  ＩＩＩ型、ＭＰＳ  ＩＶ型、ＭＰＳ  Ｖ型、ＭＰＳ  ＶＩ型、ＭＰＳ  ＶＩＩ型、α−マンノース症、β−マンノース症、テイ＝サックス病、ポンペ病、ゴーシェ病又はファブリー病である実施形態１０５に記載のキット。
１１０．前記過剰増殖性疾患が癌である実施形態１０５に記載のキット。
１１１．前記感染症がＨＩＶ、麻疹ウイルス、コロナウイルス、アミノペプチダーゼ−Ｎ、ＬＣＭＶ／ラッサ熱ウイルス、細菌及び／又は寄生虫による感染に起因する実施形態１０５に記載のキット。
１１２．前記遺伝子がＡＢＣＤ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＬ１、ＡＤＡ、ＡＫＴ１、ＡＰＣ、ＡＰＰ、ＡＲＳＡ、ＡＲＳＢ、ＢＣＬ１１Ａ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、Ｃ９ＯＲＦ７２、Ｃ４６又は他のＣペプチド、ＣＡＲ、ＣＡＳ９、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＣＲ５、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ４０、ＣＤＡ、ＣＦＴＲ、ＣＬＮ３、Ｃ−ＭＹＣ、ＣＲＥ、ＣＳＣＲ４、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＬＡ、ＣＴＳ−１、ＣＹＢ５Ｒ３、ＤＣＣ、ＤＨＦＲ、ＤＫＣ１、ＤＬＬ１、ＤＭＤ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、Ｆ８、Ｆ９、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＩ、ＦＡＮＣＬ、ＦＡＮＣＭ、ＦａｓＬ、ＦＣＣ、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＵＳ、ＦＵＳ１、ＦＹＮ、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＴＡ１、ＧＬＢ１、ＧＮＳ、ＧＵＳＢ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＥ１、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＣＲ、ＨＧＳＮＡＴ、ＨＯＸＢ４、ＨＲＡＳ、ＨＹＡＬ１、ＩＣＡＭ−１、ｉカスパーゼ、ＩＤＵＡ、ＩＤＳ、ＪＵＮ、ＫＬＦ４、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＲＲＫ２、ＬＹＮ、ＭＣＣ、ＭＤＭ２、ＭＧＭＴ、ＭＬＬ、ＭＭＡＣ１、ＭＹＢ、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＭＹＣ、ＮＡＧＬＵ、ＮＡＮＯＧ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＮＫＸ２．１、ＮＯＴＣＨ、ＯＣＴ４、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ＰＡＬＢ２、ＰＡＲＫ２、ＰＡＲＫ７、ｐｈｏｘ、ＰＩＮＫ１、ＰＫ、ＰＳＥＮ１、ＰＳＥＮ２、ＰＴＰＮ２２、ＲＡＤ５１Ｃ、ｒａｓ、ＲＰＬ３〜ＲＰＬ４０、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２、ＲＰＳ２〜ＲＰＳ３０、ＲＰＳＡ、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＳＧＳＨ、ＳＬＸ４、ＳＮＣＡ、ＳＯＤ１、ＳＯＸ２、ＴＥＲＣ、ＴＥＲＴ、ＴＤＰ４３、ＴＩＮＦ２、ＴＫ、ユビキリン２、ＶＨＬ、ＷＡＳ及びＷＴ−１の１種以上である実施形態１０５から１１１のいずれかに記載のキット。
１１３．前記遺伝子モディファイヤーがウイルスベクターを含む実施形態１０５から１１２のいずれかに記載のキット。
１１４．前記遺伝子モディファイヤーが非組込み型ベクターを含む実施形態１０５から１１３のいずれかに記載のキット。
１１５．前記遺伝子モディファイヤーがレンチウイルスベクターを含む実施形態１０４から１１４のいずれかに記載のキット。
１１６．前記レンチウイルスベクターがシュードタイプエンベロープ糖タンパク質とレンチウイルスＲＮＡ分子を含む実施形態１１５に記載のキット。
１１７．前記シュードタイプエンベロープ糖タンパク質が水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）、Ｃｏｃａｌウイルス糖タンパク質（ｃｏｃａｌ）、ネコ内在性ウイルス糖タンパク質（ＲＤ１１４）又は改変型フォーミーウイルス糖タンパク質（ｍＦｏａｍｙ）を含む実施形態１１６に記載のキット。
１１８．前記レンチウイルスＲＮＡ分子がＨＩＶ−１由来自己不活性化型レンチウイルスバックボーンを含む実施形態１１６又は１１７に記載のキット。
１１９．前記レンチウイルスＲＮＡ分子が組込み欠損型のＨＩＶ−１由来自己不活性化型レンチウイルスバックボーンを含む実施形態１１６又は１１７に記載のキット。
１２０．前記遺伝子モディファイヤーがガンマレトロウイルスベクターを含む実施形態１０５から１１４のいずれかに記載のキット。
１２１．前記ガンマレトロウイルスベクターがシュードタイプエンベロープ糖タンパク質とガンマレトロウイルスＲＮＡ分子を含む実施形態１２０に記載のキット。
１２２．前記シュードタイプエンベロープ糖タンパク質がテナガザル白血病ウイルス糖タンパク質（ＧＡＬＶ）又はネコ内在性ウイルスエンベロープ（ＲＤ１１４）を含む実施形態１２１に記載のキット。
１２３．前記ガンマレトロウイルスＲＮＡ分子が自己不活性化型ガンマレトロウイルスバックボーンを含む実施形態１２１又は１２２に記載のキット。
１２４．前記ガンマレトロウイルスＲＮＡ分子が組込み欠損型の自己不活性化型ガンマレトロウイルスバックボーンを含む実施形態１２１又は１２２に記載のキット。
１２５．前記遺伝子モディファイヤーがフォーミーウイルスベクターを含む実施形態１０５から１１４のいずれかに記載のキット。
１２６．前記フォーミーウイルスベクターがシュードタイプエンベロープ糖タンパク質とフォーミーウイルスＲＮＡ分子を含む実施形態１２５に記載のキット。
１２７．前記シュードタイプエンベロープ糖タンパク質がフォーミーウイルスエンベロープタンパク質（Ｆｏａｍｙ）又は改変型フォーミーウイルスエンベロープタンパク質（ｍＦｏａｍｙ）を含む実施形態１２６に記載のキット。
１２８．前記フォーミーウイルスＲＮＡ分子が自己不活性化型フォーミーウイルスバックボーンを含む実施形態１２６又は１２７に記載のキット。
１２９．前記フォーミーウイルスＲＮＡ分子が組込み欠損型の自己不活性化型フォーミーウイルスバックボーンを含む実施形態１２６又は１２７に記載のキット。
１３０．前記遺伝子モディファイヤーがアルファレトロウイルスベクターを含む実施形態１０５から１１４のいずれかに記載のキット。
１３１．前記アルファレトロウイルスベクターがシュードタイプエンベロープ糖タンパク質とアルファレトロウイルスＲＮＡ分子を含む実施形態１３０に記載のキット。
１３２．前記シュードタイプエンベロープ糖タンパク質が水泡性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶＧ）、Ｃｏｃａｌウイルス糖タンパク質（ｃｏｃａｌ）、ネコ内在性ウイルス糖タンパク質（ＲＤ１１４）又は改変型フォーミーウイルス糖タンパク質（ｍＦｏａｍｙ）を含む実施形態１３１に記載のキット。
１３３．前記アルファレトロウイルスＲＮＡ分子が自己不活性化型アルファレトロウイルスバックボーンを含む実施形態１３１又は１３２に記載のキット。
１３４．前記遺伝子モディファイヤーが１種以上のプロモーターエレメント、選択カセット、エンハンサーエレメント、インシュレーターエレメント、調節エレメント及び転写／翻訳エンハンサーエレメントを更に含むレンチウイルス、ガンマレトロウイルス、フォーミーウイルス又はアルファレトロウイルスベクターを含む実施形態１０５から１３３のいずれかに記載のキット。
１３５．前記転写／翻訳エンハンサーエレメントがウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントの一部、２Ａウイルス融合エレメント又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を含む実施形態１３４に記載のキット。
１３６．前記遺伝子モディファイヤーが裸のＤＮＡ、裸のｍＲＮＡ、アデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ウイルスベクター、ガイドＲＮＡ、ジンクフィンガー、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ−ＴＡＬＥＮ融合体（ｍｅｇａＴＡＬ）及び／又は相同領域に挟まれた遺伝子を含む実施形態１０５に記載のキット。
１３７．更に形質導入培地を含む実施形態７４から１３６のいずれかに記載のキット。
１３８．前記形質導入培地が基礎培地と、サイトカイン及び／又はケモカインと、細胞生存と遺伝子導入を助長するための添加物を含む実施形態１３７に記載のキット。
１３９．前記サイトカイン／ケモカインが組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｆｌｉｇｈｔｌｅｓｓ  ３リガンド（ｆｌｔ３又はｆｌｔ３Ｌ）及びインターロイキンを含む実施形態１３８に記載のキット。
１４０．前記インターロイキンがインターロイキン３（ＩＬ−３）及び／又はインターロイキン６（ＩＬ−６）を含む実施形態１３９に記載のキット。
１４１．前記添加物が芳香族炭化水素受容体拮抗薬、ピリミドインドール誘導体、グルココルチコイド受容体拮抗薬、プロタミン硫酸塩、ラパマイシン、ポリブレン、フィブロネクチンフラグメント、プロスタグランジン、抗酸化剤又は非ステロイド性抗炎症薬を含む実施形態１３８から１４０のいずれかに記載のキット。
１４２．前記芳香族炭化水素受容体拮抗薬がＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ１、ＧＮＦ３５１、及び／又はＣＨ２２３１９１を含む実施形態１３８から１４１のいずれかに記載のキット。
１４３．前記ピリミドインドール誘導体がＵＭ１７１及び／又はＵＭ１１８４２８を含む実施形態１３８から１４２のいずれかに記載のキット。
１４４．前記グルココルチコイド受容体拮抗薬がミフェプリストン、ＲＵ−４３０４４、ミコナゾール、１１−オキサコルチゾール、１１−オキサプレドニゾロン及び／又はデキサメタゾンメシラートを含む実施形態１３８から１４３のいずれかに記載のキット。
１４５．プロスタグランジンがプロスタグランジンＥ２を含む実施形態１３８から１４４のいずれかに記載のキット。
１４６．前記非ステロイド性抗炎症薬がセレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク及び／又はトルメチンを含む実施形態１３８から１４５のいずれかに記載のキット。
１４７．更に滅菌済みチューブセットを含む実施形態７４から１４６のいずれかに記載のキット。
１４８．更に医薬的に許容される担体を含む実施形態７４から１４７のいずれかに記載のキット。
１４９．前記医薬的に許容される担体が静脈内輸液用塩類溶液を含む実施形態１４８に記載のキット。
１５０．ヒト血清アルブミンを含む実施形態７４から１４９のいずれかに記載のキット。
１５１．更にヘタスターチ含有塩類溶液を含む実施形態７４から１５０のいずれかに記載のキット。
１５２．更に緩衝液を含む実施形態７４から１５１のいずれかに記載のキット。
１５３．前記緩衝液がＰＢＳ／ＥＤＴＡである実施形態１５２に記載のキット。
１５４．更にＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ９０又はＣＤ１３３と選択的に結合するビーズ又は抗体を含む実施形態７４から１５３のいずれかに記載のキット。
１５５．更にビオチン化抗ＣＤ３４抗体を含む実施形態７４から１５４のいずれかに記載のキット。
１５６．前記ビオチン化抗ＣＤ３４抗体がクローン１２．８である実施形態１５５に記載のキット。
１５７．更にＣＤ３４マイクロビーズを含む実施形態７４から１５６のいずれかに記載のキット。
１５８．更にブロッキング剤を含む実施形態７４から１５７のいずれかに記載のキット。
１５９．前記ブロッキング剤が自家血清である実施形態１５８に記載のキット。
１６０．更にストレプトアビジンで被覆したマイクロビーズを含む実施形態７４から１５９のいずれかに記載のキット。
１６１．更に漏斗形クライオバッグを含む実施形態７４から１６０のいずれかに記載のキット。
１６２．更に無針スパイクアダプターを含む実施形態７４から１６１のいずれかに記載のキット。
１６３．更にシリンジを含む実施形態７４から１６２のいずれかに記載のキット。
１６４．前記シリンジが６０ｍＬ及び／又は３０ｍＬシリンジである実施形態１６３に記載のキット。
１６５．試料入口と試料出口を備えており、試料に対して不透過性であるハウジングと；
前記ハウジング内に配置された第１の電極及び第２の電極を含むフロースルーエレクトロポレーション装置であって、少なくとも１個の電極間隙を規定するように、前記第１の電極の少なくともの一部が前記第２の電極の少なくとも一部から一定の距離に配置されており、前記対象試料が前記対象試料入口から前記対象試料出口に流れるように、前記電極間隙の少なくとも一部が対象試料通路を形成する前記エレクトロポレーション装置。
１６６．前記第１の電極又は前記第２の電極の少なくとも一方が磁気感受性である実施形態１６５に記載のエレクトロポレーション装置。
１６７．更に前記第１の電極に対応する第１の末端と、前記第２の電極に対応する第２の末端を含み、前記第１の電極と前記第２の電極が各々前記ハウジングから突出している実施形態１６５又は１６６に記載のエレクトロポレーション装置。
１６８．前記少なくとも１個の電極間隙が前記第１の電極と前記第２の電極の間に配置された１個以上の絶縁体により維持されている実施形態１６５から１６７のいずれかに記載のエレクトロポレーション装置。
１６９．前記第１の電極が第１群の突起を含み、前記第２の電極が第２群の突起を含み、前記少なくとも１個の電極間隙が少なくとも２個の電極間隙を含むように、前記第１群の突起の少なくとも一部が前記第２群の突起の少なくとも一部の間に配置されている実施形態１６５から１６８のいずれかに記載のエレクトロポレーション装置。
１７０．前記対象試料通路の少なくとも一部が前記第１群の突起に対応する第１群の細孔と、前記第２群の突起に対応する第２群の細孔により形成される実施形態１６５から１６９のいずれかに記載のエレクトロポレーション装置。
１７１．更に前記第１の電極の少なくとも一部と前記第２の電極の少なくとも一部の間に配置された磁気感受性材料（ＭＳＭ）を含む実施形態１６５から１７０のいずれかに記載のエレクトロポレーション装置。
１７２．前記ＭＳＭが少なくともワイヤー、金属被覆繊維、スチールウール及び／又は金属球を含む実施形態１７１に記載のエレクトロポレーション装置。
１７３．前記ＭＳＭが電気絶縁体で被覆されており、前記ＭＳＭが一定距離を維持している実施形態１７１又は１７２に記載のエレクトロポレーション装置。
１７４．前記第１の電極及び／又は前記第２の電極がアルミニウムであり、前記ＭＳＭが強磁性体である実施形態１７１から１７３のいずれかに記載のエレクトロポレーション装置。
１７５．前記一定距離が０．１ｃｍ以上０．４ｃｍ以下である実施形態１６５から１７４のいずれかに記載のエレクトロポレーション装置。
１７６．標的細胞と非標的細胞を含む試料から標的細胞を単離・遺伝子改変・製剤化するためのデバイスであって、
試料投入口、緩衝液投入口及び処理チャンバーを備える前記対象試料のプロセシング用回路と；
前記回路の１個以上の流路を選択的に閉じるための複数の弁と；
前記対象試料の標的細胞を前記対象試料の非標的細胞から分離するための１個以上の標的細胞セレクターと；
前記回路の少なくとも一部を通して前記対象試料を灌流させるためのポンプと；
前記処理チャンバー、前記複数の弁、前記標的細胞セレクター及び前記ポンプの動作を制御するための１個以上のプロセッサと；
前記１個以上のプロセッサにより実行されたときに、
前記対象試料を前記処理チャンバーから前記標的細胞セレクターへと灌流させる作業と；
複数のセレクターを連携して使用する場合には、前記標的細胞セレクターの動作により前記標的細胞を前記非標的細胞から同時又はタンデムに分離する作業と；
前記標的細胞を前記処理チャンバーに戻す作業と；
前記処理チャンバー及び／又は前記標的細胞セレクター内の前記標的細胞に遺伝子モディファイヤーを導入し、遺伝子改変された標的細胞を作製する作業と；
前記遺伝子改変された標的細胞を対象への投与用製剤として製剤化する作業を前記ポイントオブケア及び／又はポータブルデバイスの１個以上のハードウェアコンポーネントに実施させるメモリ格納命令を含み、
前記デバイスがポイントオブケア及び／又はポータブルデバイスである前記デバイス。
１７７．前記処理チャンバーが遠心機の内部チャンバーを形成する実施形態１７６に記載のデバイス。
１７８．前記標的細胞セレクターが磁気細胞セレクター及び／又はフローサイトメーター及び／又はフロー式セルソーターを含む実施形態１７６又は１７７に記載のデバイス。
１７９．前記標的細胞セレクターが前方、後方及び側方光散乱特性、蛍光色素吸光度並びに発光スペクトルを利用して標的細胞を非標的細胞から分離するフロー式セルソーターを含む実施形態１７６から１７８のいずれかに記載のデバイス。
１８０．前記標的細胞セレクターがフロースルーエレクトロポレーション装置を含み、前記エレクトロポレーション装置が、
試料入口と試料出口を備えており、試料に対して不透過性であるハウジングと；
前記ハウジング内に配置された第１の電極及び第２の電極を含み、
少なくとも１個の電極間隙を規定するように、前記第１の電極の少なくとも一部が前記第２の電極の少なくとも一部から一定の距離に配置されており、前記対象試料が前記対象試料入口から前記対象試料出口に流れるように、前記電極間隙の少なくとも一部が試料通路を形成する実施形態１７６から１７９のいずれかに記載のデバイス。
１８１．更に前記処理チャンバーと連結されたガスレギュレーターを含む実施形態１７６から１８０のいずれかに記載のデバイス。
１８２．前記ガスレギュレーターが窒素ガス（Ｎ２）に対応する第１の分圧と、炭酸ガス（ＣＯ２）に対応する第２の分圧と、酸素ガス（Ｏ２）に対応する第３の分圧を選択的に制御するように構成されている実施形態１８１に記載のデバイス。
１８３．前記メモリ格納命令が、前記１個以上のプロセッサにより実行されたときに、前記処理チャンバー内にインキュベーション環境を形成・維持する作業を前記ポイントオブケア及び／又はポータブルデバイスの１個以上のハードウェアコンポーネントに実施させる実施形態１７６から１８２のいずれかに記載のデバイス。
１８４．前記形成・維持されるインキュベーション環境が特定の温度範囲又は混合ガスを含む実施形態１８３に記載のデバイス。
１８５．前記メモリ格納命令が更に、前記灌流前に前記対象試料に標的細胞一次標識物質を加えて前記処理チャンバー内で標識懸濁液を形成する作業を前記１個以上のハードウェアコンポーネントに実施させる実施形態１７６から１８４のいずれかに記載のデバイス。
１８６．前記メモリ格納命令が更に、前記処理チャンバー内にインキュベーション環境を維持し、前記標的細胞一次標識物質と前記標的細胞の結合を助長する作業を前記１個以上のハードウェアコンポーネントに実施させる実施形態１７６から１８５のいずれかに記載のデバイス。
１８７．前記メモリ格納命令が更に、前記処理チャンバー内で前記標識懸濁液を撹拌し、前記標的細胞一次標識物質と前記標的細胞の結合を誘導する作業を前記１個以上のハードウェアコンポーネントに実施させる実施形態１７６から１８６のいずれかに記載のデバイス。
１８８．前記撹拌が遠心機モーターの運転により前記処理チャンバーを少なくとも部分的に回転させる工程を含む実施形態１８７に記載のデバイス。
１８９．前記撹拌が前記標識懸濁液の超音波撹拌を含む実施形態１８７又は１８８に記載のデバイス。
１９０．前記メモリ格納命令が更に前記撹拌後に、結合していない過剰量の前記標的細胞一次標識物質を除去する作業を前記１個以上のハードウェアコンポーネントに実施させる実施形態１８７から１８９のいずれかに記載のデバイス。
１９１．前記一次標識物質が免疫磁気ビーズ又は抗体を含み、前記標識懸濁液が第１の緩衝溶液を含む実施形態１８５から１９０のいずれかに記載のデバイス。
１９２．前記メモリ格納命令が更に、
［ａ］前記処理チャンバー内の前記標的細胞に形質導入培地を導入する工程と；
［ｂ］遠心により前記処理チャンバー内の前記標的細胞をペレット化する工程と；
［ｃ］前記ペレット化中に形成された上清体積を除去する工程と；
前記遺伝子モディファイヤーを前記処理チャンバーに導入する前に工程［ａ］〜［ｃ］の反復サイクルを少なくとも１回実施する工程を含む作業を前記１個以上のハードウェアコンポーネントに実施させる実施形態１７６から１９１のいずれかに記載のデバイス。
１９３．前記メモリ格納命令が更に、
前記対象試料のヘマトクリット値を測定する工程と；
前記ヘマトクリット値が所定のヘマトクリット値閾値を上回るという判定に基づき、前記血液試料で赤血球（ＲＢＣ）除去プロトコールを実施する工程
を含む作業を前記１個以上のハードウェアコンポーネントに実施させる実施形態１７６から１９２のいずれかに記載のデバイス。
１９４．前記対象試料のヘマトクリット値を測定する工程が前記処理チャンバー内で前記対象試料を遠心して前記対象試料を赤血球層に分離する工程を含む実施形態１９３に記載のデバイス。
１９５．前記対象試料のヘマトクリット値を測定する工程が前方光散乱又は後方光散乱の一方又は両方により前記対象試料の１種以上の光学特性を測定する工程を含む実施形態１９３又は１９４に記載のデバイス。
１９６．前記ＲＢＣ除去プロトコールが、
骨髄及び／又は末梢血を含む前記対象試料に第１の緩衝液を加える工程と；
前記処理チャンバー内で遠心することにより、前記対象試料の複数のＲＢＣの連銭形成を開始する工程と；
前記対象試料を前記処理チャンバーから沈降容器へと灌流させる工程と；
前記沈降容器から前記対象試料のＲＢＣ高含有画分の段階的除去を実施する工程と；
第２の緩衝液で上清を洗浄することにより前記対象試料から前記第１の緩衝液を除去する工程を含む実施形態１９３から１９５のいずれかに記載のデバイス。
１９７．前記所定のヘマトクリット値閾値が２５％であり、前記第１の緩衝液がヘタスターチ系培地であり、前記第２の緩衝液がリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）とエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む実施形態１９３から１９６のいずれかに記載のデバイス。
１９８．前記対象試料から前記第１の緩衝液を除去する工程が前記沈降容器から前記対象試料のＲＢＣ高含有画分の段階的除去の実施の完了を確認するユーザー入力の受信に応答して開始される実施形態１９６又は１９７に記載のデバイス。
１９９．前記ＲＢＣ除去プロトコールが更に、
前記対象試料から前記第１の緩衝液を除去する工程後に、前記処理チャンバー内で前記対象試料の遠心と吸引により前記対象試料を濃縮する工程を含む実施形態１９６から１９８のいずれかに記載のデバイス。
２００．前記単離・遺伝子改変・製剤化された細胞が現行の適正製造規範に適合する実施形態１７６から１９９のいずれかに記載のデバイス。
２０１．現行の適正製造規範の適合が以下の試験を含む放出試験により確認される実施形態２００に記載のデバイス。
【０１７２】
【表１３】
0006734283.tif 000019
【実施例】
【０１７３】
造血幹・前駆（ＣＤ３４＋）細胞遺伝子治療の途方もない可能性は過去１０年間に多種多様の疾患で実証されている［（Ｇｈｏｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，（２０１５））に概説］。ＨＩＶや異常ヘモグロビン症等の世界的に重大な難病は人口統計学的に医療資源の乏しい国に偏っているが、現場がこれらの難病に迫るにつれて、効率的に遺伝子を導入するポータブル技術の不足がこの強力な治療アプローチの採用を制約している。レンチウイルス（ＬＶ）によるＣＤ３４＋細胞へのエクスビボ遺伝子導入は最も臨床応用されているＣＤ３４＋幹細胞遺伝子治療法であり、今日までに有効性を実証されている。このアプローチは導入後に治療遺伝子を保有する全血球種の産生を患者の終生にわたって可能にする。ＣＤ３４＋細胞のエクスビボ単離及び遺伝子改変は非標的細胞への遺伝子導入がなくなるという点と、ＬＶ粒子の必要が減るため、ベクター作製に伴う費用が減るという点の２点で大きな利点がある。
【０１７４】
この方法は（１）標的ＣＤ３４＋細胞を免疫磁気ビーズにより単離する工程、（２）得られたＣＤ３４＋細胞を発育支持培養条件で培養する工程、（３）目的の治療遺伝子をコードする規定濃度のＬＶベクターに暴露する工程、最後に（４）輸液前に最終細胞産物を調製及び試験するために残存ウイルス含有培地からＣＤ３４＋細胞を精製する工程を含む所定の汎用工程を要する。しかし、ＣＤ３４＋細胞源（即ち臍帯血［ＣＢ］、骨髄［ＢＭ］又は成長因子で動員したロイコアフェレーシス［ＡＰＨ］）と、遺伝子導入用ベクターでコードされる治療遺伝子は標的患者集団により異なる。現行の法規制ガイドライン内でこれらの製品を製造するには、現行の適正製造規範（ｃＧＭＰ）に従う複合的な中央管理施設が必要である。従って、造血幹細胞への遺伝子導入を実現するためのポイントオブケア及び／又はポータブルストラテジーが確立されるならば、ＨＩＶ等の世界的な難病を減らすのに大きな進歩となろう。
【０１７５】
世界的規模で遺伝子治療を普及させるために提唱されている最も単純なストラテジーは直接的なインビボ遺伝子改変を利用している。小型及び大型動物モデルでインビボＣＤ３４＋細胞遺伝子導入を実現する試みが進行中である（Ｂｕｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２３，３５７８−３５８４（２０１４）；Ｋａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，１１７−１１９（１９９３）；Ｐｏｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，１３１０２−１３１０７（２００２）；Ｔｉｎｇ−Ｄｅ  Ｒａｖｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０７，３０９１−３０９７（２００６）；Ｆｒｅｃｈａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １１９，１１３９−１１５０（２０１２））が、このアプローチが患者での臨床試験を可能にするために現在の安全性と有効性の基準を満たすまでにはしばらく時間がかかりそうである。この分野における重要な課題として、非標的細胞への遺伝子導入の厳重なチェックと、十分な治療用ＣＤ３４＋遺伝子導入レベルの達成のバランスを取ることが挙げられる。あるいは、ＣＤ３４＋細胞への迅速なエクスビボ遺伝子導入用の移動可能且つ改変可能なプラットフォームが開発されるならば即利用可能となるであろうが、最近までこれは技術的に実現可能ではなかった。
【０１７６】
ファンコーニ貧血（ＦＡ）の遺伝子治療を開発するためのプログラムの一環として３６時間未満でＣＤ３４＋細胞への効率的なエクスビボレンチウイルス遺伝子導入を実現することができる（Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １７，１２４４−１２５２（２０１０））。ＦＡ  ＣＤ３４＋細胞は希少であり、長期操作の影響を受け易く、動員に反応しにくい（Ｋｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５，２１１−２１９（２００７））。そこで、骨髄（ＢＭ）をＣＤ３４＋細胞源として利用するフェーズＩ試験が開始された［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ＩＤ：ＮＣＴ０１３３１０１８］。しかし、ＢＭ産物全体からＣＤ３４＋細胞を首尾よく単離するためには、望ましくない赤血球（ＲＢＣ）を除去しなければならない。ＲＢＣ除去は多糖培地で密度勾配遠心法により広く行われているが、ＦＡでは、遠心せずにヘタスターチ（ＨＥＳ）系培地でより穏和な沈降が好ましい（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｍｕｒｉｌｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２１，６２３−６３０（２０１０））。登録した最初の患者は体重７０ｋｇであり、目標採取体積は体重１ｋｇ当たりＢＭ１５ｍＬ（即ち出発時のＢＭ体積＞１Ｌ）であったので、沈降で直面した課題は如何にして非常に短時間で＞１Ｌの出発時のＢＭ産物からＲＢＣを除去するかであった。
【０１７７】
これを実現するために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰｒｏｄｉｇｙＴＭデバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）の新規なカスタマイズドプログラミングを使用して骨髄１．８ＬまでのＨＥＳ沈降法を開発した。このデバイスは自動プレプロセシング、免疫磁気標識、及びヒトＡＰＨ産物からＣＤ３４＋細胞とＴ細胞を含む標的細胞の分離を可能にするために開発され（Ｋａｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２２，７２−７８（２０１５）；Ｓｐｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  ｐｒｏｄｕｃｔ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，（２０１５））、骨髄からＦｉｃｏｌｌ法による大規模な自動ＲＢＣ除去を可能であることが既に示されている（Ｓｏｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ５５，１２７５−１２８２（２０１５））。カスタムプログラムによると、ヒト骨髄産物で出発時のＣＤ３４＋細胞集団の≧５７％を保持しながらＲＢＣの＞９１％除去と、閉鎖系で合計＜６時間に及ぶ免疫磁気ビーズによるＣＤ３４＋細胞の自動標識が可能であった（表８）。
【０１７８】
【表１４】
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【０１７９】
このデータに基づき、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）への臨床試験実施者による臨床試験実施申請下でこのデバイスのカスタム準自動プログラムの最初の承認が得られた（ＢＢ−ＩＮＤ−１４６７５）。
【０１８０】
この前途有望な出発点に鑑み、ＣＤ３４＋細胞遺伝子導入法として患者の近辺でのポイントオブケア及び／又はポータブルストラテジーをこのデバイスで設計できるならば、特定地点のｃＧＭＰ施設インフラの必要をなくせるであろうと仮定した（図１）。これらの研究の総合的な目的はヒト輸液に適しており、造血再構築能を維持するエクスビボＬＶ遺伝子改変患者特異的細胞産物の迅速な準自動作製であった。本実施例では、ＣＤ３４＋幹細胞をエクスビボレンチウイルスにより遺伝子改変するためのポイントオブケア及び／又はポータブル製造法がこのデバイスで可能であり、最小限のユーザーインターフェース及び他の実験室設備しか必要とせず、現行の輸液の法規制標準に適合する生存可能な遺伝子改変細胞産物が得られるという最初の原理証明を立証する。
【０１８１】
材料及び方法。承認済みプロトコール及び被験動物。全試験はヘルシンキ宣言に従って所内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ））及び治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ））により承認されたプロトコールの下に実施した。細胞産物は商業的供給業者から購入（骨髄；ＨｅｍａＣａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又は所内共有資源から入手（動員アフェレーシス産物）した。
【０１８２】
レンチウイルスベクター。非ヒト霊長類移植で使用したベクター（ｐＲＳＣ−ＳＦＦＶ．Ｐ１４０Ｋ．ＰＧＫ．ｅＧＦＰ−ｓＷ）は第３世代分割パッケージングシステムで作製され、水泡性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ．Ｇ）によりシュードタイプ化されたＳＩＮレンチウイルスベクターである。これらの試験のベクターは検証済みの方法を使用して血液学コアセンターオブエクセレンス（Ｃｏｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）の一環である所内ベクター作製コア（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｃｏｒｅ）（Ｐ．Ｉ．Ｈａｎｓ−Ｐｅｔｅｒ  Ｋｉｅｍ）により作製した。ＨＴ１０８０ヒト線維肉腫由来細胞に研究グレードベクター調製物を滴定下で形質導入後にｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリー評価により感染力価を測定した。ヒト細胞産物（ｐＲＳＣ−Ｈ１．ｓｈＣＣＲ５．ＵｂｉＣ．Ｃ４６．ｓＥｆ１ａ．Ｐ１４０Ｋ−ｓＷ）への遺伝子導入で使用した臨床グレード抗ＨＩＶベクターもＶＳＶ．Ｇタンパク質によりシュードタイプ化されたＳＩＮレンチウイルスベクターである。臨床グレードベクターは検証済みの大規模方法を使用してインディアナ大学ベクター作製施設（Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（ＩＵＶＰＦ；Ｉｎｄｉａｎａ，米国）により作製した。ベクターはＩＵＶＰＦにより提出された承認済みの原薬等登録原簿（Ｄｒｕｇ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｆｉｌｅ）の下に適正製造規範（ＧＭＰ）ガイドラインに従って作製した。要約すると、２９３Ｔ細胞の一過性４プラスミドトランスフェクションにより抗ＨＩＶ  ＬＶを作製した。未濃縮ベクター上清を接線流濾過方式の精製により２００倍に濃縮した。精製後のベクター調製物を４．５ｍＬずつアリコートに分けて−８０℃で保存した。ベクター特徴の一覧を表９に示す。ベクターの段階希釈系列をＨＴ１０８０細胞に形質導入し、細胞１個当たりに組込まれたベクターコピー数を定量的（Ｔａｑｍａｎ（ＴＭ））ＰＣＲにより計算することにより感染力価を測定した。
【０１８３】
【表１５】
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【０１８４】
非ヒト霊長類移植手順。米国実験動物ケア認証協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）により承認された条件下でブタオザル（Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）をワシントン国立霊長類研究センター（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）に収容した。若年サル２匹（Ｚ１３０８３及びＺ１３１０５）を骨髄採取に先立って５日間毎日皮下注射によりＧ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ）及びＳＣＦ（５０μｇ／ｋｇ）でプライミングした。全身麻酔下に上腕部と大腿部から骨髄をクエン酸デキストロースとヘパリンに採取した。Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳデバイスでプログラム２に従って２段階免疫磁気分離を実施し、ビオチン化抗ＣＤ３４（１２．８）抗体とストレプトアビジンを結合させたマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して自家ＣＤ３４＋細胞を単離し、プログラム３〜６に従って最終感染多重度（ＭＯＩ）４０（２０×２）でｓＧｂＧレンチウイルスベクター（ＬＶ）を２回形質導入した。−２日と−１日に１０２０ｃＧｙを分割照射で全身照射（ＴＢＩ）後に、自家遺伝子改変ＣＤ３４＋細胞を輸液により動物の体内に戻した。遺伝子改変細胞の輸液から２４時間後に、安定した好中球生着（ＡＮＣ＞０．５×１０９／Ｌ（５００／μＬ））が得られるまで動物にＧ−ＣＳＦ（１００μｇ／ｋｇ／日）を静脈内投与した。試料輸液、体液・電解液管理及び抗生物質を含む標準支持ケアを必要に応じて実施した。毎日の血球算定により造血回復をモニターした。ｅＧＦＰを発現する細胞の拒絶反応を最小限にするために免疫抑制剤としてタクロリムスも３ｍｇ／ｋｇ／日から開始して血清中１０〜１５ｎｇ／μＬとなるように動物に経口投与した。移植後６カ月〜１年以内に末梢血中で安定した遺伝子マーキングが観測されたらタクロリムスの漸減を開始した。
【０１８５】
免疫不全マウス移植手順。８〜１２週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ  ｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒγ  ｔｍ１Ｗｊ／Ｓｚｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒγｎｕｌｌ，ＮＳＧ）マウスに２７０ｃＧｙを全身照射した。ＴＢＩから４時間後に１％ヘパリン（ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）を添加したＰＢＳに再懸濁した遺伝子改変ＣＤ３４＋細胞１×１０６個を尾静脈輸液によりマウスに注入した。輸液から６週間後、１０週間後及び１２週間後に後眼窩穿刺により血液試料を採取した。１２週目にマウスを屠殺し、脾臓と骨髄を分析用に摘出した。臓器試料を７０ｍｍフィルター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で濾過し、ＰＢＳで洗浄した。血液及び組織試料を適切なＦＡＣＳ抗体で室温にて１５分間染色した。フロー分析前にＰＢＳを使用して希釈しておいたＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中でインキュベーションによりＲＢＣを除去した。ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色細胞を分取し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ１０．０．８（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して解析した。解析は生存可能な細胞集団中の細胞２０，０００個までで実施し、１試薬除外（ｆｕｌｌ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ（ＦＭＯ））染色対照を使用してゲートを設定した。抗非ヒトＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ（クローン２Ｄ１）、ＣＤ３−ＦＩＴＣ（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４−Ｖ４５０（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ２０−ＰＥ（クローン２Ｈ７）及びＣＤ１４−ＡＰＣ（クローンＭ５Ｅ２）を使用して試料を２０倍の希釈倍率で染色した。骨髄も抗ヒトＣＤ３４−ＡＰＣ（クローン５８１）で染色した。全抗体はＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。
【０１８６】
試料の半自動準閉鎖式プロセシング手順。全産物について、ＫＸ−２１Ｎ（Ｓｙｓｍｅｘ）又はＡｃＴｄｉｆｆ２（Ｃｏｕｌｔｅｒ）自動血液分析装置を使用して初期血球算定と変動解析を行った。ＢＭ産物では、自動プロセシングに望ましい％ヘマトクリット値（ＨＣＴ）は≦２５％である。半自動プロセシング前に滅菌済みチューブを介して初期ＨＣＴ＞２５％の産物をＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）で手動希釈した。希釈後に全血球算定と変動解析を繰返し、目標ＨＣＴ含量であることを確認した。半自動プロセシング用に合計９個のプログラム（夫々サブプログラムＪ１〜Ｊ９を含むＳＷ１〜ＳＷ９）を開発し、表１０に詳細に説明する。
【０１８７】
【表１６】
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【０１８８】
特定の実施形態では、ＴＳ１００とＴＳ７３０の機能を統合したチューブセットを使用することもでき、プロセス途中でチューブセットを交換する必要がなくなる。各産物種のプロセシングにこれらのプログラムの種々の組合せを使用した。これらを以下に簡単に説明する。全産物について、使用する初期チューブセット（ＴＳ１００；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を初期プログラムセットアップ（プログラム１又はプログラム５）の一環としてデバイスにプレインストールし、プロセシングのために産物をチューブセットに投入する前にデバイスにより自動チューブセット完全性試験を実施した。インストールの前に、希釈済み産物、緩衝液（例えばＰＢＳ／ＥＤＴＡ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＨＥＳ（Ｈｏｓｐｉｒａ）及び希釈済み細胞産物を既製チューブセットに無菌ドッキングさせた。ヒト産物からのＣＤ３４＋細胞濃縮には、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用した。全標識プログラムでブロッキング剤として静脈内免疫グロブリン（１０％  ＩＶＩｇ；Ｂａｘｔｅｒ）を使用した。ＣＤ３４試薬とＩＶＩｇを別々のシリンジに予め充填し、デバイスプログラミングにより標識を指示されたときに既製チューブセットに無菌ドッキングさせた。全実験の完全形質導入培地は組換えヒト成長因子ＳＣＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＴＰＯ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）及びＦＬｔ３Ｌ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）各１００ｎｇ／ｍＬと５００ｎＭ  ＵＭ７２９（モントリオール大学、Ｇｕｙ  Ｓａｕｖａｇｅａｕ博士から寄贈）を添加したＳｔｅｍＳｐａｎ動物由来成分不含培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から構成した。
【０１８９】
Ｇ−ＣＳＦとＳＣＦでプライミングしたＢＭをＡＣＤ−Ａとヘパリンに採取したサル産物では、使用したプログラム組合せは１、３、４、６、７、８及び９であった。要約すると、プログラム１を使用して希釈済み産物を先ずＨＥＳ沈降法によりＲＢＣ除去した後、ＣＤ３４細胞標識に備えて洗浄・濃縮した。次に、プログラム３を使用する場合には使用する抗ＣＤ３４抗体（１２．８）を磁気ビーズに直接結合させないので、２段階標識プロトコールを実施した。各標識段階はデバイスチャンバー内で低速回転下に４℃で３０分間インキュベーションした。標識後、産物を免疫磁気カラム選択に備えて洗浄・濃縮した。次にプログラム４を使用して磁気カラムによる選択を行った。得られた産物を既製チューブセットに含まれる陰性画分バッグと標的細胞バッグに分けた。次にＴＳ１００チューブセットを取り外し、プログラム６を開始した。このプログラムはＴＳ７３０チューブセット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）のプレインストールとチューブセット完全性試験を含む。インストール後、最初のＴＳ１００からの標的細胞バッグをＴＳ７３０チューブセットの同一位置に無菌ドッキングさせた。完全形質導入培地と濃縮ＬＶベクターを無菌ドッキングによりチューブセットの別々の位置にプレロードした。プログラム６は選択緩衝液を除去して完全形質導入培地に交換するために培地交換を符号化したものである。交換後、予め決定したＬＶベクター体積を細胞懸濁液に加え、デバイスチャンバーで形質導入を開始した。次にプログラム８を使用し、一晩インキュベーションの間に３０分間隔で細胞懸濁液を穏和に混合しながら細胞をデバイスチャンバー内で５％ＣＯ２及び３７℃にて培養した。１２時間後に、プログラム７を使用して第２のベクター用量と追加の培地をチャンバーに加え、１ｍＬ当たり細胞１×１０６個の細胞懸濁液を維持した。次にプログラム８を再開し、少なくとも４時間培養を続けた。最後に、プログラム９を開始し、細胞懸濁液を洗浄して培地とＬＶベクターを除去することにより形質導入を終了した。このプログラムは自家移植対象ＩＤのラベルを予め貼付した２００ｍＬトランスファーパックに５％ヒト血清アルブミン（Ｂａｘｔｅｒ）を添加したＰｌａｓｍａ  Ｌｙｔｅ  Ａを収容し、これに産物を加えて輸液用に最終製剤化する工程を含む。この産物バッグをデバイスに無菌溶接し、最終産物サンプリングと輸液への輸送用に取出した。
【０１９０】
ＡＣＤ−Ａとヘパリンに採取したヒトＢＭ産物では、使用したプログラム組合せはプログラム１、２、４、６、７、８及び９であった。直接結合させた抗ヒトＣＤ３４磁気ビーズをＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手できるので、プログラム２を使用してＣＤ３４＋細胞の１段階標識を行った以外はサルＢＭ産物と同一の半自動プロセシングを実施した。ヒトＢＭ  ＣＤ３４＋細胞のＭＯＩは細胞１個当たり２０ＩＵ（１０×２）とした。
【０１９１】
ヒト動員ＡＰＨ産物では、ＲＢＣ除去は不要であった。従って、完全なプロセシングに必要なプログラム数は減った。ＡＰＨ産物に使用したプログラム組合せはプログラム５、６、７、８及び９であった。プログラム５では先ず産物を洗浄し、血小板を除去する。次に、プログラムはＣＤ３４＋細胞の標識と選択に進み、既製ＴＳ１００チューブセットに含まれる陰性画分バッグと標的細胞バッグに最終産物を移す。サル及びヒトＢＭ産物について記載したようにプログラム６〜９を実施した。ヒト動員ＡＰＨ  ＣＤ３４＋細胞のＭＯＩは細胞１個当たり２０ＩＵ（１０×２）とした。
【０１９２】
コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイと形質導入のＬＶ特異的ＰＣＲ評価。組換えヒト成長因子ＳＣＦ（Ａｍｇｅｎ）、Ｇ−ＣＳＦ（Ａｍｇｅｎ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＴＰＯ、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）−ＣＳＦ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、インターロイキン（ＩＬ）３及びＩＬ−６（いずれもＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製品）各１００ｎｇ／ｍＬを添加したＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  ４２３４（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１．２ｍＬ中で形質導入細胞と、擬似形質導入細胞（ＬＶベクターを添加しない点以外は形質導入細胞と同一の培地及び培養条件に暴露した細胞）を３５ｍｍシャーレ１枚当たり１，０００〜３，０００個の密度で培養した。培養条件は３７℃、相対湿度８５％及び５％  ＣＯ２で１４日間とした。培養後にコロニーを計数し、播種した細胞１００，０００個当たりのコロニー形成細胞（ＣＦＣ）数を求めた。分子生物学研究グレード水（ＨｙＣｌｏｎｅ）とプロテアーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）を加えた滅菌済みチューブにピペットで手動注入することにより実験毎に少なくとも８０個の別個のコロニーを釣菌した。チューブをサーマルサイクラーで９５℃にて２時間インキュベートすることによりゲノムＤＮＡを単離した。次にＬＶ特異的プライマー［Ｆｗｄ：５’−ＡＧＡＧＡＴＧＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡ−３’（配列番号１）及びＲｅｖ：５’−ＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＣＴＡＣＴＣＣＴＡＡ−３’（配列番号２）］と、別個の反応で各生物種に合わせてデザインしたアクチン特異的プライマー［サルＦｗｄ：５’−ＴＣＣＴＧＴＧＧＣＡＣＴＣＡＣＧＡＡＡＣＴ−３’（配列番号３）及びＲｅｖ：５’−ＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴ−３’（配列番号４）とヒトＦｗｄ：５’−ＴＣＣＴＧＴ  ＧＧＣＡＴＣＧＡＣＧＡＡＡＣＴ−３’（配列番号５）及びＲｅｖ：５’−ＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴ−３’（配列番号６）］を使用して粗ＤＮＡ調製物をＰＣＲに供した。ＬＶとアクチンの両方の予想バンドを含むコロニーを形質導入成功として採点した。アクチン産物を生じなかった反応は評価不可能とみなした。
【０１９３】
液体培養アッセイ。１０％熱不活化胎仔ウシ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、組換えヒト成長因子ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ−３及びＩＬ−６各１００ｎｇ／ｍＬを添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で形質導入細胞と擬似形質導入細胞を継代培養した。培養条件は３７℃、相対湿度８５％及び５％  ＣＯ２で１１日間までとした。継代培養後の２時点、一般的には５日後と１０日後に細胞を採取し、滅菌Ｄ−ＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、遺伝子マーキング解析に供した。
【０１９４】
遺伝子マーキング解析。移植後の複数の時点で塩化アンモニウム溶血法により形質導入培養液又はヘパリン化末梢血もしくはＢＭから白血球を単離した。ｅＧＦＰを発現するＳＩＮ  ＬＶを形質導入したサル細胞では、Ｃａｎｔｏ又はＬＳＲＩＩ細胞解析装置（いずれもＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製品）でフローサイトメトリーにより遺伝子マーキングレベルを測定した。フローサイトメトリーデータをＦｌｏｗＪｏバージョン１０．０．７（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．）又はＣＥＬＬＱｕｅｓｔ  Ｐｒｏバージョン５．１ソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により解析した。前方及び直角方向（側方）光散乱特徴又は２色フローサイトメトリー（細胞を抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１）、ＣＤ４抗体（クローンＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８抗体（クローン）、ＣＤ２０抗体（クローン２Ｈ７）もしくはＣＤ３４抗体（クローン５６３）で染色した場合）に基づいて関連領域における対照細胞の０．１％未満を排除するようにゲーティングすることにより全白血球、顆粒球、単球及び／又はリンパ球集団におけるトランスジェニックｅＧＦＰタンパク質発現を測定した。全抗体はＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから購入した。臨床用抗ＨＩＶ  ＬＶベクターを形質導入したヒトでは、ＴａｑＭａｎ  ５’ヌクレアーゼ定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにより遺伝子マーキングを解析した。Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉキット又はＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄキット（いずれもＱｉａｇｅｎ製品）を製造業者の指示に従って使用し、単離した白血球からゲノムＤＮＡを抽出した。ＬＶ特異的プライマー／プローブ組合せ［Ｆｗｄ：５’−ＴＧＡＡＡＧＣＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＡ−３’（配列番号７）、Ｒｅｖ：５’−ＣＣＧ  ＴＧＣ  ＧＣＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ−３（配列番号８）、プローブ：５’−ＡＧＣＴＣＴＣＴＣＧＡＣＧＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣ−３’（配列番号９）］を使用して試料ＤＮＡを少なくとも２回解析した。別の反応で、β−グロビン特異的プライマー／プローブ組合せ［Ｆｗｄ：５’−ＣＣＴＡＴＣＡＧＡＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１０）、Ｒｅｖ：５’−ＴＴＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴ−３’（配列番号１１）、プローブ：５’−ＴＧＧＣＴＡＡＴＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＡＡＧＴＡ−３’（配列番号１２）］を使用し、反応１回当たりのゲノムＤＮＡの仕込み量を等しくするように調整した。標準はＬＶプロウイルスのシングルコピーを形質導入したクローン細胞株から抽出したＤＮＡと、遺伝子改変していない同一の親細胞株に由来するＤＮＡの希釈液から構成した。反応液はゲノムＤＮＡ、適切なプライマー／プローブ組合せ、ＡＢＩ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含むものとし、５０℃で２分間と９５℃で１０分間の後に、９５℃で１５秒間と６０℃で１分間を４０サイクルの熱サイクリング条件下にＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。
【０１９５】
レンチウイルス挿入部位解析。バルク白血球から単離したゲノムＤＮＡを従来記載されているような改変型ゲノムシーケンシング（ＭＧＳ）−ＰＣＲ（Ｂｅａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１８５，３２１−３４４（２０１４））によりプロウイルス−ゲノムジャンクションのＬＶ特異的増幅に供した。ベクター組込み部位解析サーバー（ｈｔｔｐｓ：／／ｖｉｓａ．ｐｈａｒｍａｃｙ．ｗｓｕ．ｅｄｕ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）を使用し、ベクター−ゲノムジャンクションをプロセシングし、ゲノムリファレンスコンソーシアム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）で作成されたヒトゲノムのＧｒｈｇ３８又はベクター北京ゲノム研究所で作成されたアカゲザルゲノムのｒｈｅＭａｃ３にマッピングした（２４）。確信をもって適切なゲノムに位置を割り当てることができなかった配列を解析前にデータセットから取り除いた。配列存在量により各ユニーク挿入部位を分類し、各試料で回収された挿入部位配列読み出し結果のユニーク部位以外の合計位置割り当て数に正規化することによりクローン性を評価した。
【０１９６】
結果。全実験はｃＧＭＰの基準外の実験室でベンチトップ型ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰｒｏｄｉｇｙＴＭデバイスを用いて実施した。その他の機器としては、バイオセーフティキャビネット、冷蔵庫及び冷凍庫、自動血球計数器、無菌チューブウェルダー、一般実験器具（例えばピペット、秤）、及び開発途上国の臨床施設に予想される条件をシミュレートすることを目的とした個人用保護具を利用した。原理証明として、健康なヒトドナーから採取した顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）動員ＡＰＨ産物に由来するＣＤ３４＋細胞を先ず単離し、遺伝子改変した。出発物質としてこの細胞産物を選択したのは、成人遺伝子治療患者における最も一般的なＣＤ３４＋細胞源であり、既存のデバイスソフトウェアがＡＰＨ産物からの自動調製とＣＤ３４＋細胞単離用に設計されているためである。この場合、ＲＢＣ除去は不要であったため、初期プログラミングではＣＤ３４＋標識前に洗浄して血小板を除去した（表１０）。完全なプロセスは合計で４個の製造用カスタムプログラムを必要とし、出発物質であるＡＰＨ産物の受領から最終輸液産物の製造までに２５時間を要した（ＡＰＨドナー１及びＡＰＨドナー２）（表１１）。
【０１９７】
【表１７】
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【０１９８】
プロセシング中に必要な全デバイスコンポーネントに接触するためにこのプロセスでは２種類の異なる既製デバイスチューブセットが必要であった（材料及び方法の欄と表１０参照）。ＡＰＨ産物からのＣＤ３４＋細胞濃縮の結果、ＣＤ３４を発現する濃縮細胞を≧９６％含む高純度集団が得られ、ドナー２人の濃縮効率は４２％と８７％であった（表１２）。
【０１９９】
【表１８】
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【０２００】
これらの数値は第１世代ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（ＴＭ）デバイスで選択されたＡＰＨ産物の予想範囲内である。ＡＰＨドナー１及び２の絶対収率は夫々ＣＤ３４＋細胞１．４×１０８個と３．６×１０８個であった。
【０２０１】
次にフレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）でエイズ関連リンパ腫患者を対象としてフェーズＩ臨床試験［ＮＣＴ０２３４３６６６］で現在試験中の抗ＨＩＶ  ＬＶベクターを使用して遺伝子導入を実施した。これらの試験で使用したＬＶベクターはＨＳＣ遺伝子治療の大半の臨床試験に現在世界中で使用されている自己不活性化型（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１由来バックボーンとした。遺伝子改変後のＬＶは３種類の別個の治療用導入遺伝子をコードするもの、即ち２種類の抗ＨＩＶ導入遺伝子と、低レベルの生着しか観測されない場合に遺伝子改変細胞のインビボ選択を可能にするためのＰ１４０Ｋ突然変異体メチルグアニンメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）導入遺伝子（Ｂｅａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２０，２３４５−２３５４（２０１０））をコードするものとした（図１２Ａ）。抗ＨＩＶ導入遺伝子はＣＣＲ５転写産物に似た短いヘアピンＲＮＡとＣペプチドＣ４６を含んでいた。短いヘアピンＣＣＲ５はこれを発現する細胞内のＲＮＡ干渉経路を活性化させ、ＣＣＲ５転写産物の分解と細胞表面の機能的ＣＣＲ５タンパク質の低下を生じる。ＣＣＲ５は標的細胞へのＨＩＶ侵入の一般的な補助受容体であるので、ＣＣＲ５発現が低下するとＨＩＶ感染を抑制することができる。Ｃ４６ペプチドはｇｐ４１の４６アミノ酸フラグメントであり、標的細胞で発現されると、どの補助受容体を使用するかに関係なく、ＨＩＶ粒子と細胞膜の融合を妨げ、ＨＩＶ侵入を抑制する。感染多重度（ＭＯＩ）は製造用としてＦＤＡにより現在承認されているベクター対細胞比であることから、細胞１個当たり２０感染単位（ＩＵ）とした。これらの実験におけるベクター暴露時間は１２〜１４時間とし、細胞分裂を刺激するための予備培養は行わなかった（材料と方法の欄参照）。特筆すべき点として、ＬＶ形質導入を助長するために通常使用されている組換えヒトフィブロネクチンフラグメント（レトロネクチン）をデバイスの培養チャンバーにプレコートすると、最終回収中にデバイスチャンバーからの細胞を取出しにくくなる可能性があるので、このようなプレコートは行わなかった。また、ピリミドインドール誘導体であるＵＭ７２９は原始的な造血細胞をエクスビボで増幅させると報告されているので、これらの実験の形質導入培養にはこの分子を加えた（Ｆａｒｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４５，１５０９−１５１２（２０１４））。
【０２０２】
１０日間維持したバルク液体培養物から細胞１個当たりの平均ベクターコピー数（ＶＣＮ）にドナー間で大きな変動が認められた（細胞１個当たりベクターコピー数は夫々２．１と１０．１）（図１３）。コロニー形成細胞（ＣＦＣ）遺伝子導入効率は夫々７７．７％と５９．３％であった（図１３）。液体培養物におけるＶＣＮが他方のドナー（ヒトＡＰＨドナー１；２６．２％）に比較して高い場合に産物のＣＦＣ含有量の著しい低下が認められた（ヒトＡＰＨドナー２；０．９％）。産物適合性を評価するために、得られた細胞産物の放出試験と異種移植を亜致死量放射線全身照射（ＴＢＩ）後の免疫不全（非肥満糖尿病（ＮＯＤ）／重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）γ−／−，ＮＳＧ）マウスで実施した（図２）。どちらの産物も輸液用の全てのｃＧＭＰ即放性基準に適合した（表１３）。
【０２０３】
【表１９】
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【０２０４】
更に、輸液後１２週間にわたって異種移植マウスの末梢血と骨髄でどちらの産物に由来するヒトＣＤ４５＋細胞でも確実な生着が認められた（図１５）。輸液から１２週間後に全マウスを安楽死させ、血液とＢＭにおける遺伝子改変細胞生着を測定した。ＡＰＨドナー１及びＡＰＨドナー２で認められた血中細胞１個当たりの平均ＶＣＮ（図１５Ｃ）は夫々０．０８３と１．７であった。細胞１個当たりの平均ＶＣＮは各動物コホートの血液とＢＭで同等であり、ＡＰＨドナー２に由来する細胞を移植したマウスのほうが高く、液体培養物でも高いＶＣＮが認められたことに一致した。これらのデータによると、この自動閉鎖系プラットフォームを用いた一晩での方法で動員ＡＰＨ産物からＣＤ３４＋細胞の単離とＬＶ形質導入が可能であると判断される。
【０２０５】
次にこの自動プロセスをＢＭ産物に拡張した。ＢＭは非常に若年の患者及び動員が禁忌である他の患者（例えばＦＡ）における遺伝子治療のＣＤ３４＋細胞源である。しかし、ＢＭ産物からのＣＤ３４＋細胞の単離について公開されているデータは少ない。３人の健康な成人ドナーからのＢＭを採取し、ＲＢＣのＨＥＳ沈降後にＣＤ３４＋細胞を免疫磁気ビーズにより分離するようにプログラミングを改変した。この結果、合計製造時間は数時間延びたが、合計オペレーター手動介入所要時間の短縮は維持された（表１１）。３種の異なるドナー産物の各々からＨＥＳ沈降とＣＤ３４濃縮後に純度＞７２％で出発時のＣＤ３４＋細胞集団の４２％〜５７％の収率が得られ、ＡＰＨ産物で観測されたＣＤ３４＋細胞収率の範囲の下端側ではあるが、同等であった（表１４）。
【０２０６】
【表２０】
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【０２０７】
入手可能な臨床グレードベクター量により、これらの３種の産物のうちの２種（ヒトＢＭドナー１及びヒトＢＭドナー２）でＬＶによる遺伝子導入を行った。
【０２０８】
遺伝子導入用として、ＡＰＨ産物の形質導入に適用したものと同一の抗ＨＩＶ  ＬＶベクターを同一の形質導入条件下で使用した。第１のドナー（ヒトＢＭドナー１）では、ＣＤ３４＋濃縮後に合計８×１０６個の細胞が得られた。デバイスの培養チャンバー内の最小容積が限られているため、形質導入培養中の細胞密度は最適に達しなかった（細胞２．０×１０５個／ｍＬ）。更に、培地が濃いピンク色になったことから、培養期間中にチャンバー内のガス交換性能が低いことが分かった。驚くことではないが、形質導入後に生存可能な細胞数が全体として（合計細胞数８×１０６個から１２×１０６個に）増加したにも拘わらず、細胞生存率の有意低下（８６％から４０％）が生じた。１０日間にエクスビボ増幅した液体培養物中の平均ＶＣＮは細胞１個当たり１０．６コピーであった（図１６Ａ）。この産物で認められたコロニー形成細胞（ＣＦＣ）含有率は低く（１．５％）、形質導入したＣＦＣの３６．４％に過ぎなかった（図１６Ｂ）。これらのデータによると、この自動半閉鎖系ではヒトＢＭ  ＣＤ３４＋細胞濃縮と形質導入が可能であるが、条件は現在の臨床試験実績に対して最適に達しなかった。
【０２０９】
観測された結果がドナー特異的であるか否かを判定するために、第２の個体（ヒトＢＭドナー２）に由来するＢＭを使用してこのプロセスを繰返した。全体的なＣＤ３４濃縮効率（４２％）と純度（７３％）はヒトＢＭドナー１に比較して同等であった（表１４）が、出発時のＣＤ３４＋細胞集団が大きいため、合計ＣＤ３４＋細胞は３倍（２１．８×１０６）になり、培養及び形質導入中に最適な細胞密度（細胞０．５〜１×１０６個／ｍＬ）が可能になった。半自動プロセシング後の１０日間バルク培養における形質導入効率はＰＣＲ解析によると細胞１個当たりベクターコピー数０．３であった（図１６Ａ）。この場合、ＣＦＣ含有量は３．０％であり、このドナーではヒトＢＭドナー１（３６％）に比較してＬＶ＋ＣＦＣ数の若干の増加（４３％）が認められた（図１６Ｂ）。放出試験を実施した処、全基準項目は患者への輸液に安全であるとみなされる現行の治験規格内であった（表１３）。ＡＰＨ産物について記載したと同一の移植手順に従ってＮＳＧマウスにこれらの細胞の異種移植を行った。これらの動物ではヒトＣＤ４５を発現する血液細胞の安定した生着が輸液後１４週間まで認められた（図１７）。１４週間でレシピエント動物の５％〜１５％のＢＭにヒトＣＤ４５＋及びＣＤ３４＋白血球の有意な生着が認められた（図１７Ｂ）。これらの動物ではＢＭ細胞の１６％までがＬＶ遺伝子改変されていた（図１７Ｃ）。これらのデータによると、ポイントオブケア及び／又はポータブルプラットフォームを使用してＢＭ産物も製造できるが、一貫性のために更に濃縮と培養の最適化を実施すべきであると判断された。
【０２１０】
ＬＶ遺伝子改変ＣＤ３４＋細胞のポイントオブケア及び／又はポータブル製造が可能であるという原理証明が立証されたので、こうして作製された自家細胞産物が骨髄破壊的環境で造血を長期間再構築できることを立証しようと試みた。これを試験するために、オブタザル（Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）移植モデル［（Ｔｒｏｂｒｉｄｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １７，９３９−９４８（２０１０））に概説］を選択した。このモデルはヒト細胞産物製造で使用されるものと同一の成長因子と培地を使用することが可能である。一方、ヒト試料のＣＤ３４＋免疫磁気選択用として利用可能な直接結合試薬はマカク属サル細胞と交差反応性ではない。そこで、ビオチン−ストレプトアビジンアフィニティーによる間接的なビーズ標識を可能とするように改変型２段階標識プログラムを作成した。更に、このモデルはサル／ヒト免疫不全ウイルス（ＳＨＩＶ）に感染し易く、抗ＨＩＶ遺伝子治療を試験するための臨床的に有意義なシステムを提供する。
【０２１１】
半自動プラットフォームを使用して自家レンチウイルス遺伝子改変非ヒト霊長類（ＮＨＰ）ＣＤ３４＋細胞産物を製造し、これらを２匹（Ｚ１３１０５及びＺ１３０８３）に骨髄破壊的ＴＢＩ（１０２０ｃＧｙ）後に移植した。受領から輸液まで各ＮＨＰ  ＢＭ産物の製造に必要な合計時間は平均で３０時間であり、主に初期産物の調製と最終製剤化後のサンプリングを含む直接オペレーター手動介入所要時間は＜４時間であった（表１１）。予想外のことではないが、２段階標識及び濃縮法を利用したため、ＮＨＰ  ＢＭ産物からのＣＤ３４＋細胞濃縮効率は直接結合させたビーズによるヒト細胞産物の１段階標識と濃縮に比較して低い値が観測された（表１５）が、これらの細胞収率は体重＜４ｋｇの若年サルの形質導入と移植にはまだ十分であった。
【０２１２】
【表２１】
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【０２１３】
これらの試験で使用したＬＶベクターはヒト産物製造に使用したものと同一のベクターバックボーンであるが、Ｐ１４０Ｋ突然変異体ＭＧＭＴ導入遺伝子をコードすると共に、移植した細胞をインビボ追跡し易くするために高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）導入遺伝子もコードするものとした（図１２Ｂ）。十分な遺伝子導入レベルを確保するために、２ヒット形質導入法の間は細胞１個当たり４０感染単位（ＩＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）を使用した（細胞１個当たり２０ＩＵ×２）。動物Ｚ１３１０５に形質導入後の細胞絶対数の（合計細胞７．２×１０７個から８．２×１０７個への）増加と動物Ｚ１３０８３に形質導入後の細胞絶対数の（合計細胞３．０×１０７個から１．９×１０７個への）減少を反映し、夫々体重１ｋｇ当たりＣＤ３４＋細胞２７×１０６個及び５．４×１０６個の合計細胞用量が達せられた。コロニー形成能単位で表した形質導入効率は夫々２３％と３９％であり、バルク培養で維持された細胞の夫々２７．６％と１１．９％が形質導入から１１日後にＧＦＰを発現した（図１８）。２匹とも移植から＋２３日以内に持続的な好中球絶対数＞５００／ｍｍ３及び血小板数＞２０，０００／ｍｍ３として定義される生着が認められた（図１９及び表１６）。
【０２１４】
【表２２】
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【０２１５】
特筆すべき点として、２匹とも予測外の支持ケアを必要とせず、また、遺伝子改変輸液細胞産物のベンチトップ式作製に起因する潜在的な汚染を含めた毒性増加の徴候も示さなかった。
【０２１６】
２匹とも輸液から１カ月以内にｅＧＦＰ発現により末梢血白血球に安定した持続的な遺伝子マーキングが認められ、１２％のレベルに達した（図１９Ａ）。移植から６カ月後に、これらの２匹で１．７％までのＧＦＰ＋ＲＢＣと１．４％までのＧＦＰ＋血小板が認められた（図２０）。抗ＨＩＶ遺伝子治療の成功には遺伝子改変リンパ球が必要となるので、移植後のこの区画の再構築（図１９Ｃ）を追跡した。移植後初期（＜１００日）では、２匹ともほぼ全ｅＧＦＰ＋リンパ球がＣＤ２０＋Ｂ細胞であった。しかし、移植後＋１００日目からｅＧＦＰを発現するＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球の割合の増加が認められた。動物Ｚ１３１０５では移植後＋７６日からｅＧＦＰ＋顆粒球の百分率の予想外の低下が認められ、移植後＋１００日で１％ｅＧＦＰ＋顆粒球の底値に達し、（ｅＧＦＰに対する免疫反応を防ぐために投与した）タクロリムスのこの期間の設定用量未満となった（図１９Ａ）。タクロリムスの用量を設定し直すと、ｅＧＦＰ＋顆粒球は２７％まで跳ね上がった。ＧＦＰ＋細胞のクローン多様性を評価するために、改変型ゲノムシーケンシングＰＣＲにより高スループットＬＶ組込み部位解析を行った（Ｂｅａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１８５，３２１−３４４（２０１４））。各動物で遺伝子改変末梢血白血球の高度に多クローン性の分布が認められ、優性クローンに偏ることはなく、化学療法による遺伝子改変細胞のインビボ選択の必要もなかった（図２１）。総合すると、これらのデータは臨床的に有意義な大型動物モデルにおけるＬＶ遺伝子改変ＣＤ３４＋幹細胞のポイントオブケア及び／又はポータブル製造の安全性と実現可能性を実証するものである。
【０２１７】
考察。ポイントオブケア及び／又はポータブル実施に適した小型で内蔵式のベンチトップ型プラットフォームにおけるＬＶ遺伝子改変ＣＤ３４＋再構築細胞の一晩での製造を実証する。この方法でヒトＢＭ及び動員ＡＰＨ産物をプロセシングすることができ、これらの産物は遺伝子治療臨床試験の輸液に関する現行の法規制要件に適合する。このプラットフォームで製造したヒト産物は異種移植の免疫不全マウスモデルでインビボ再構築することが可能である。重要な点として、使用される製造方法に関連する有害なイベントを生じることなく、このシステムを使用して作製した自家ＬＶ遺伝子改変ＣＤ３４＋細胞を用いて骨髄破壊処置後のサル２匹を長期間再建させるのに成功した。
【０２１８】
血液幹細胞遺伝子治療用途の範囲は特に遺伝性疾患、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ及び癌治療の分野で急速に拡大しつつある［（Ｇｈｏｓｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，（２０１５），Ａｄａｉｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２４，４０８２−４０９２（２０１４））に概説］。これらの研究の大半が単独の機関で実施されており、７カ国（米国、スペイン、フランス、英国、イタリー、ドイツ及びオーストラリア）の１２の製造施設に限られていることを考えると、このアプローチの普及が遺伝子治療の効率的な臨床実施化を阻む大きな障害になっている。本技術の柔軟性と小フットプリントは現在の最新技術の細胞製造に大きな利点を提供する。本プラットフォーム及びプロセスを臨床現場で実施するならば、ＬＶによるＣＤ３４＋細胞遺伝子治療の利用可能性はこの治療ストラテジーの成功が初期の試験で実証されている多数の患者にまで大きく拡がるであろう。更に、他の型の遺伝子改変血液細胞産物を単離・製造するためにも同一のプラットフォームを使用することができ、例えば、同様に臨床的有用性が益々明らかになっている２種類の治療アプローチであるＴ細胞又は臍帯血ＣＤ３４＋細胞にも拡大できる［（Ｆｒａｎｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，８５３−８５５（２０１１））及び概説として（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ５０  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ５５−６２（２０１５））］。
【０２１９】
ほぼ全てのＬＶ血液幹細胞遺伝子治療臨床試験は治療レベルの遺伝子改変細胞生着を達成するために輸液前にコンディショニングが必要であることを実証している。しかし、非骨髄破壊的レジメンを含むコンディショニング後に確実に造血を再構築するためには、移植時に患者体重１ｋｇ当たり自家ＣＤ３４＋細胞２×１０６個の最低細胞用量が必要になろう。本試験で製造したヒトＡＰＨ産物からの外挿細胞用量はこの閾値を容易に達成するが、ＢＭ産物からのＣＤ３４＋細胞数は体重≦１０ｋｇの新生児にしか臨床的に有用でないと思われる。従って、ＢＭを望ましいＣＤ３４＋細胞源とする成人患者集団に合わせて濃縮効率と純度を更に最適化する必要があろう。
【０２２０】
広範囲の臨床実施には、一貫性のある十分に制御された製造方法であることを立証するために、システムがｃＧＭＰ原則により保証される安全性、品質及び無菌規格に適合する再現可能な作製を実施できることを実証する必要がある。記載した試験で認められた細胞１個当たりのＶＣＮの範囲は広いので、臨床実施前にドナー間で一貫した形質導入効率が得られるように検討する必要があろう。重要な点として、最適なベクター組込みレベルを追求することは、検出可能な遺伝子導入が存在していないか又は治療レベルに達していない場合にこのような遺伝子導入を達成するよりも多少簡単な作業である。実際に、ピリミドインドール誘導体であるＵＭ７２９を形質導入培養から除外すると、細胞１個当たりのＶＣＮを低下できること（図２２）がインビトロで判明している。更に、培地成分と培養及び形質導入条件の改良はこの製造方法で容易に実施され、統計的有意を証明するためにドナー数を増やして将来の試験で体系的に評価されよう。
【０２２１】
本システムを世界中で効率的に臨床実施化するためには、プロセスを更に合理化することが必要であろう。ロジスティック面では、本願に記載する産物の完全な製造に必要な４〜７個の異なるカスタムプログラムを本デバイスに合わせて単一のモジュラープログラムに圧縮すべきである。最後に、ＲＢＣ除去と培地交換中のデバイスインターフェースが主観的入力を要求するので、熟練したスタッフの必要が減る。より最適なシステムには、前記デバイスと、ユーザーインターフェースの必要を最小限にした単一プログラムと、前記チューブセットと最小限のスタッフで自家患者細胞の単離、形質導入、培養及び回収を行うために必要な全コンポーネントを含む使い捨てキットが必要になろう。更に、医薬品としての自家遺伝子改変血液細胞の区分は現時点では米国とＥＵで異なり、法規制上の課題にも対処する必要があろう。
【０２２２】
これらの課題にも拘わらず、既存のプラットフォームは既にコストの点で大きな利点がある。親デバイスの購入に伴う費用（１４９，５００米ドル）がｃＧＭＰ製造施設の建設費用（数百万米ドル）に比較して著しく少ないことに加え、本ポイントオブケア及び／又はポータブルプラットフォームを使用して自家遺伝子改変ＣＤ３４＋細胞を製造した場合の実際の直接原価は平均で２６，０００ドルであった（表１７）。
【０２２３】
【表２３】
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【０２２４】
これはＧＭＰインフラに基づく同一プロセスの直接原価の推定値（３８，８１３米ドル）を有意に下回る（Ａｂｏｕ−Ｅｌ−Ｅｎｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １５，３６２−３８３（２０１３））。初期細胞産物の取得費用以外に、ＣＤ３４＋細胞選択試薬、濃縮ＬＶベクター及び組換えヒト成長因子は製造インフラに関係なく、このプロセスで最も高価な要素である。更に、費用便益比を遺伝子治療候補疾患毎に考慮すべきである。終生治療費が６００，０００米ドル（Ｓｃｈａｃｋｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ  Ｃａｒｅ  ４４，９９０−９９７（２００６））になると推定されるＨＩＶ＋患者の場合、この経済的負担は細胞治癒的治療により著しく減るが、大半のＨＩＶ＋患者は既存のｃＧＭＰ製造施設のある国に居住していない。
【０２２５】
要するに、本試験はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（ＴＭ）デバイスによる治療用ＬＶ遺伝子改変ＣＤ３４＋細胞の小フットプリントで半自動準閉鎖式製造の原理証明を立証するものである。前臨床異種移植モデルと臨床的に有意義な大型動物モデルにおけるこれらの細胞のポイントオブケア及び／又はポータブル送達、安全性及び生着を実証する。この研究はＬＶによる造血幹細胞遺伝子治療の世界的普及に最初の大きな前進を刻むものである。
【０２２６】
実施例２．Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ閉鎖系細胞プロセシングデバイスを使用したレンチウイルス遺伝子改変非ヒト霊長類骨髄由来ＣＤ３４＋造血幹・前駆細胞の代表的なプロトコール／半自動ベンチトップ式製造。
【０２２７】
試薬及び器具。ＴＳ１００  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙチューブセット；ＴＳ７３０  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙチューブセット；Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ又は他の静脈内輸液用塩類溶液；２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；６％ヘタスターチ含有塩類溶液（ＨＥＳ）；ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液（例えばＰＢＳ／ＥＤＴＡ）又は他の緩衝液；ビオチン化抗ＣＤ３４抗体（クローン１２．８）（本願では１２．８抗体と言う。）；ストレプトアビジン被覆マイクロビーズ；自家血清又は他のブロッキング剤；漏斗形クライオバッグ；無針スパイクアダプター；６０ｍＬシリンジ；３０ｍＬシリンジ；完全形質導入培地；及び濃縮レンチウイルス。
【０２２８】
装置。Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳデバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）（本実施例では「デバイス」と言う。）。デバイスは本願に開示するソフトウェアプログラムと、製造業者の仕様によるＣＯ２及び圧縮空気の調節機能付接続を備える必要がある。層流空気流と、無菌チューブウェルダーと、自動血球分析装置と、冷蔵庫（２〜８℃）及び冷凍庫（−２０℃）を装備したバイオセーフティキャビネット。
【０２２９】
プロトコール。デバイスによるプロセシングを本願の他の箇所で概説する合計７個のカスタムプログラムに分割する。
ステップ／注記。骨髄は常駐施設で獣医学標準実施ガイドラインに従って手術／処置室で採取すべきである。
サブステップ／注記。採取した骨髄はフィルターセットに通し、凝固を防ぐためにＡＣＤとヘパリンで希釈すべきである。
サブステップ／注記。輸送が必要な場合には、バイオハザード・適用免除ヒト由来検体のラベルを付けた温度制御容器に骨髄産物を入れて室温で移送する。
ステップ／注記。プロセシングしようとする骨髄産物の出発時の体積を記録する。
ステップ／注記。インプロセステスト用に出発時の骨髄産物の試料を採取する。
ステップ／注記。出発時の骨髄産物で全血球算定と変動解析を実施する。
ステップ／注記。赤血球（ＲＢＣ）除去に備え、総ヘマトクリット値（ＨＣＴ）が≦２５％となるように出発時の骨髄産物をＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａで希釈する。
サブステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内で骨髄産物バッグにＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを加え、よく混ぜる。
サブステップ／注記。希釈後の骨髄産物の体積を記録する。
ステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内で２５％ＨＳＡ６０ｍＬを加えることによりＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液３Ｌを調製し、よく混ぜる。
ステップ／注記。ＴＳ１００チューブセットパッケージを開封し、「Ｖ５」及び「Ｖ７」のラベルの付いたチューブを夫々弁５及び７に配置する。
ステップ／注記。漏斗形クライオバッグをＶ５でチューブセットに無菌溶接する。
サブステップ／注記。沈降体積に適したバッグ容積を選択する。
サブステップ／注記。無菌溶接中にチューブクランプを取り外す。
サブステップ／注記。溶接部がＶ５で締め付けられないようにするために、溶接部と接合部の間に十分にチューブを残すように注意する。
ステップ／注記。無針スパイクアダプターの雌型末端を滅菌し、利用可能なルアー接続を使用してＶ７でチューブセットに連結する。
ステップ／注記。Ｖ７の無針スパイクアダプターをＨＥＳバッグの滅菌ポートに挿入する。
ステップ／注記。希釈後の骨髄産物をチューブセット上の産物添加バッグに連結する。
サブステップ／注記。希釈後の骨髄体積が≦６０ｍＬの場合には、６０ｍＬシリンジを使用し、ルアーコネクターを介して希釈後の骨髄産物を産物添加バッグに注入する。
サブステップ／注記。希釈後の骨髄体積が＞６０ｍＬの場合には、骨髄産物バッグを産物添加バッグの上部ポートに無菌溶接又は差し込む。
ステップ／注記。Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳデバイスの電源をオンにする。
ステップ／注記。「ユーザープログラム」を選択し、プログラムＪ１を選択する。
ステップ／注記。デバイス命令に従ってＴＳ１００チューブセットのインストールを開始するためのプログラムを実行する。
サブステップ／注記。新しいＴＳ１００チューブセットのインストールを促すプロンプトに従う。
ステップ／注記。デバイスにプロンプトが現れたときに、希釈後の骨髄産物の体積を手動入力する。
ステップ／注記。２５％のＨＣＴ％値を手動入力する。
ステップ／注記。沈降の目的で産物をチューブセットに仕込むために必要な段階数を手動入力する。
サブステップ／注記。必要な段階数を決定するためには、希釈後の骨髄体積（ｍＬ）を段階毎に３００ｍＬで割り、次の整数に切り上げる。
ステップ／注記。ＨＥＳ及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液に適したチューブセット接続を確保するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続を確認し、「イエス」と答える。
ステップ／注記。沈降バッグに適したチューブセット接続を確保するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続を確認し、「イエス」と答える。
サブステップ／注記。デバイスはＲＢＣ沈降用のプロセシングプログラムを自動的に開始する。
ステップ／注記。デバイスがプログラムの自動部分を開始すると、３０分間の沈降時間の終了までユーザー操作の必要はなくなる。
サブステップ／注記。ＲＢＣ除去を開始する準備ができているかどうかのプロンプトがデバイスに現れたときに、沈降が完了しているならば、「イエス」と答え、ＲＢＣ除去を開始する。更に沈降が必要ならば、「ノー」と答え、沈降待機時間を再開する。
サブステップ／注記。沈降を完了させるために更に１０〜３０分間待機する。
サブステップ／注記。所望の沈降時間で「ＯＫ」を押す。
サブステップ／注記。「イエス」と答え、ＲＢＣ除去を続ける。
ステップ／注記。ＲＢＣ沈降層から除去する初期体積（ｍＬ）を入力する。目標除去体積はＲＢＣ層の上の白血球ペレットを乱さず且つＲＢＣ沈降体積を≦３０ｍＬに維持するようにすべきである。
サブステップ／注記。除去されるＲＢＣ沈降の初期体積が沈降バッグ内の利用可能な容積を越えない限り、この目的を達成するために任意数の体積を除去できる。
サブステップ／注記。追加体積のＲＢＣ沈降を除去するためには、ＲＢＣ除去を続けるように促すプロンプトがデバイスに現れたときに「イエス」と答えた後、除去したい体積（ｍＬ）を入力する。
ステップ／注記。満足なレベルのＲＢＣ除去が達成されたら、ＲＢＣ除去を続けるように促すプロンプトがデバイスに現れたときに「ノー」と答える。
ステップ／注記。ＲＢＣ除去を完了し、プログラムを続けたいと確信しているかどうかのプロンプトがデバイスに現れたときに、「イエス」と答える。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりにＲＢＣ低下画分がデバイスチャンバー内に存在する。
ステップ／注記。ツールメニューにある「チャンバーアウト」プログラムを選択し、実行する。
サブステップ／注記。チューブセット上のチャンバーに接続された２本のチューブの各々に雌−雌ルアーカプラーを接続する。
サブステップ／注記。フィッティングからのルアーキャップを使用し、除去前にチャンバーポートにキャップを装着する。
サブステップ／注記。キャップを装着したチャンバーをバイオセーフティキャビネットに移す。
ステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内で、６０ｍＬシリンジをチャンバーの上部ポートに連結する。
ステップ／注記。チャンバーを静かに傾け、ＲＢＣを除去した細胞懸濁液を吸引ポートにプールし、シリンジプランジャーをゆっくりと引き、ＲＢＣを除去した細胞懸濁液の全量をシリンジ内に移す。
ステップ／注記。ＲＢＣを除去した細胞懸濁液の体積を記録する。
ステップ／注記。収率試験用試料を抽出し、全血球算定と変動解析を行う。
ステップ／注記。ＲＢＣ低下細胞画分を効率的に標識するために必要な１２．８抗体とストレプトアビジンマイクロビーズの所要体積を計算する。
ステップ／注記。計算した体積の１２．８抗体と最終体積１ｍＬまでの自家血清を１０ｍＬシリンジ内に移し、プランジャーを引き、空気９ｍＬをシリンジに加える。シリンジにラベルを貼付する。
ステップ／注記。計算した体積のストレプトアビジン被覆マイクロビーズを別の１０ｍＬシリンジに移し、プランジャーを引き、最終体積１０ｍＬまでの空気を加える。
ステップ／注記。デバイスに移すために両方のシリンジに無菌下でキャップを装着し、ラベルを貼付する。
ステップ／注記。デバイスでユーザープログラムの下にプログラムＪ３を選択する。
サブステップ／注記。プロンプトが現れたときに、１２．８抗体／自己血清を入れたシリンジとストレプトアビジンマイクロビーズを入れたシリンジを無菌接続する。
サブステップ／注記。チューブ接続を確認するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続が正しいことを確認し、「イエス」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は４５分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりにＣＤ３４標識画分がデバイスチャンバー内に存在する。
ステップ／注記。デバイスでユーザープログラムの下にプログラムＪ４を選択する。
サブステップ／注記。デバイス命令に従ってプログラムを実行する。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は４５分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりにＣＤ３４高含有細胞画分が「標的細胞バッグ」内に存在する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりに「陰性画分」のラベルを付けたバッグ内にＣＤ３４低下画分が存在する。
ステップ／注記。隣接するルアー接続の真上にチューブをヒートシールすることにより標的細胞バッグをデバイスチューブセットから取り外す。
ステップ／注記。標的細胞バッグをバイオセーフティキャビネットに移し、細胞収率の測定用に０．５ｍＬ試料を抽出する。最終体積は４５ｍＬである。
ステップ／注記。「ツール」メニューを開いて「ＴＳ取り外し」プログラムを選択することによりＴＳ１００チューブセットをデバイスから取り外す。
サブステップ／注記。全チューブ弁が閉じていることを確認し、プログラム開始前に流体バッグに通じる全チューブをヒートシールする。
サブステップ／注記。完了までデバイスプロンプトに従ってプログラムを実行する。
ステップ／注記。弁４（Ｖ４）でチューブのルアーフィッティングに無針スパイクを接続することによりＴＳ７３０チューブセットを準備する。
ステップ／注記。造血幹細胞用完全形質導入培地を入れたバッグにＶ４チューブを差し込む。
＊ステップ／注記。必要な体積の濃縮レンチウイルスを適当な寸法のシリンジ内に吸引し、弁５（Ｖ５）でチューブのルアーフィッティングに接続する。
＊＊ステップ／注記。標準標的細胞バッグをチューブセットから取り外す。
ステップ／注記。標準標的細胞バッグの代わりにＣＤ３４高含有細胞画分を含むＴＳ１００チューブセットからの標的細胞バッグをチューブセットに接続する。
ステップ／注記。ユーザープログラムメニューからプログラムＪ６を選択し、「実行」を押す。
ステップ／注記。ＴＳ７３０チューブセットをインストールするように促すデバイスプロンプトに従い、高含有画分を含む標的細胞バッグを逆さに吊るして排出させる。
ステップ／注記。チューブ接続を確認するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続が正しいことを確認し、「イエス」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は５７分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。オプション：デバイスが濃縮レンチウイルスを細胞に添加後、チャンバーは３０分間の低速遠心（「スピノキュレーション」と言う。）を開始する。「ＯＫ」を押して遠心を停止した後に「イエス」を押してプログラムを中止することによりスピノキュレーションを停止する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりにＣＤ３４高含有細胞画分と形質導入用レンチウイルスベクターがデバイスチャンバー内に存在する。
ステップ／注記。ユーザープログラムメニューからプログラムＪ８を選択し、「実行」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間はフレキシブルである。
ステップ／注記。ユーザーが「ＯＫ」を押した後に「イエス」を押してプログラム中止コマンドを確認することによりプログラムを中止するまでデバイスはプログラムを続ける。その後、完了すると、デバイスはプログラム詳細を保存する。
ステップ／注記。オプション：バイオセーフティキャビネット内で、必要な体積の濃縮レンチウイルスの第２のアリコートを適当な寸法のシリンジ内に吸引し、弁５（Ｖ５）のチューブのルアーフィッティングに接続する。
サブステップ／注記。ユーザープログラムメニューからプログラムＪ７を選択し、「実行」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は５分間である。
サブステップ／注記。プログラムは完了まで実行し、自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。Ｊ７プログラムの完了後に上記ステップ＊、＊＊に従ってＪ８プログラムを再開する。
ステップ／注記。回収に備え、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａの第２の１Ｌバッグに接続されたＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ緩衝液の１Ｌバッグに無針スパイクアダプターを差し込む。
ステップ／注記。無針スパイクルアーを介してＶ４の完全形質導入培地をＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａに交換する。
ステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内で４００ｍＬクライオバッグにＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ６０ｍＬを注入する。
ステップ／注記。ＴＳ７３０の標的細胞バッグを、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを入れたクライオバッグに交換する。
ステップ／注記。クライオバッグから廃棄物バッグへの弁経路を手動で開き、チューブを通してＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを排出させる。
ステップ／注記。形質導入した細胞産物を輸液用に回収するために、ユーザープログラムメニューからプログラムＪ９を選択し、「実行」を押す。
ステップ／注記。チューブ接続を確認するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続が正しいことを確認し、「イエス」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は５０分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
ステップ／注記。放出試験と輸液用の最終細胞産物は弁２２のクライオバッグ内に存在する。
【０２３０】
実施例３．Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ閉鎖系細胞プロセシングデバイスを使用したレンチウイルス遺伝子改変ヒト骨髄由来ＣＤ３４＋造血幹・前駆細胞の代表的なプロトコール／半自動ベンチトップ式製造。
【０２３１】
試薬及び器具。ＴＳ１００  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙチューブセット；ＴＳ７３０  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙチューブセット；Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ又は他の静脈内輸液用塩類溶液；２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；６％ヘタスターチ含有塩類溶液（ＨＥＳ）；ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ  緩衝液又は他のＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液；ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４マイクロビーズ又は他の直接結合抗体−磁気ビーズ複合体；ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（ＩＶＩｇ）又は他のブロッキング剤；漏斗形クライオバッグ；無針スパイクアダプター；６０ｍＬシリンジ；３０ｍＬシリンジ；完全形質導入培地；及び濃縮レンチウイルス。
【０２３２】
装置。Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳデバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）（本実施例では「デバイス」と言う。）。デバイスは製造業者の仕様によるＣＯ２及び圧縮空気の調節機能付接続を備える必要がある。層流空気流と、無菌チューブウェルダーと、自動血球分析装置を装備したバイオセーフティキャビネット。
【０２３３】
プロトコール。デバイスによるプロセシングを本願の他の箇所で概説する合計７個のカスタムプログラムに分割する。
ステップ／注記。骨髄は常駐施設で臨床標準実施ガイドラインに従って手術室で採取すべきである。
サブステップ／注記。採取した骨髄はフィルターセットに通し、凝固を防ぐためにＡＣＤとヘパリンで希釈すべきである。
サブステップ／注記。輸送が必要な場合には、バイオハザード・適用免除ヒト由来検体のラベルを付けた温度制御容器に骨髄産物を入れて室温で移送する。
ステップ／注記。プロセシングしようとする骨髄産物の出発時の体積を記録する。
ステップ／注記。インプロセステスト用に出発時の骨髄産物の試料を採取する。
ステップ／注記。出発時の骨髄産物で全血球算定と変動解析を実施する。
ステップ／注記。赤血球（ＲＢＣ）除去に備え、総ヘマトクリット値（ＨＣＴ）が≦２５％となるように出発時の骨髄産物をＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａで希釈する。
サブステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内で骨髄産物バッグにＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを加え、よく混ぜる。
サブステップ／注記。希釈後の骨髄産物の体積を記録する。
ステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内で２５％ＨＳＡ６０ｍＬを加えることによりＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液３Ｌを調製し、よく混ぜる。
ステップ／注記。ＴＳ１００チューブセットパッケージを開封し、「Ｖ５」及び「Ｖ７」のラベルの付いたチューブを夫々弁５及び７に配置する。
ステップ／注記。漏斗形クライオバッグをＶ５でチューブセットに無菌溶接する。
サブステップ／注記。沈降体積に適したバッグ容積を選択する。
サブステップ／注記。無菌溶接中にチューブクランプを取り外す。
サブステップ／注記。溶接部がＶ５で締め付けられないようにするために、溶接部と接合部の間に十分にチューブを残すように注意する。
ステップ／注記。無針スパイクアダプターの雌型末端を滅菌し、利用可能なルアー接続を使用してＶ７でチューブセットに連結する。
ステップ／注記。Ｖ７の無針スパイクアダプターをＨＥＳバッグ上の滅菌ポートに挿入する。
ステップ／注記。希釈後の骨髄産物をチューブセット上の産物添加バッグに連結する。
サブステップ／注記。希釈後の骨髄体積が≦６０ｍＬの場合には、６０ｍＬシリンジを使用し、ルアーコネクターを介して希釈後の骨髄産物を産物添加バッグに注入する。
サブステップ／注記。希釈後の骨髄体積が＞６０ｍＬの場合には、骨髄産物バッグを産物添加バッグの上部ポートに無菌溶接又は差し込む。
ステップ／注記。Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳデバイスの電源をオンにする。
ステップ／注記。「ユーザープログラム」を選択し、プログラムＪ１を選択する。
ステップ／注記。デバイス命令に従ってＴＳ１００チューブセットのインストールを開始するためのプログラムを実行する。
サブステップ／注記。新しいＴＳ１００チューブセットのインストールを促すプロンプトに従う。
ステップ／注記。デバイスにプロンプトが現れたときに、希釈後の骨髄産物の体積を手動入力する。
ステップ／注記。２５％のＨＣＴ％値を手動入力する。
ステップ／注記。沈降の目的で産物をチューブセットに仕込むために必要な段階数を手動入力する。
サブステップ／注記。必要な段階数を決定するためには、希釈後の骨髄体積（ｍＬ）を段階毎に３００ｍＬで割り、次の整数に切り上げる。
ステップ／注記。ＨＥＳ及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液に適したチューブセット接続を確保するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続を確認し、「イエス」と答える。
ステップ／注記。沈降バッグに適したチューブセット接続を確保するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続を確認し、「イエス」と答える。
サブステップ／注記。デバイスはＲＢＣ沈降用のプロセシングプログラムを自動的に開始する。
ステップ／注記。デバイスがプログラムの自動部分を開始すると、３０分間の沈降時間の終了までユーザー操作の必要はなくなる。
サブステップ／注記。ＲＢＣ除去を開始する準備ができているかどうかのプロンプトがデバイスに現れたときに、沈降が完了しているならば、「イエス」と答え、ＲＢＣ除去を開始する。更に沈降が必要ならば、「ノー」と答え、沈降待機時間を再開する。
サブステップ／注記。沈降を完了させるために更に１０〜３０分間待機する。
サブステップ／注記。所望の沈降時間で「ＯＫ」を押す。
サブステップ／注記。「イエス」と答え、ＲＢＣ除去を続ける。
ステップ／注記。ＲＢＣ沈降層から除去する初期体積（ｍＬ）を入力する。目標除去体積はＲＢＣ層の上の白血球ペレットを乱さず且つＲＢＣ沈降体積を≦３０ｍＬに維持するようにすべきである。
サブステップ／注記。除去されるＲＢＣ沈降の初期体積が沈降バッグ内の利用可能な容積を越えない限り、この目的を達成するために任意数の体積を除去できる。
サブステップ／注記。追加体積のＲＢＣ沈降を除去するためには、ＲＢＣ除去を続けるように促すプロンプトがデバイスに現れたときに「イエス」と答え、除去したい体積（ｍＬ）を入力する。
ステップ／注記。満足なレベルのＲＢＣ除去が達成されたら、ＲＢＣ除去を続けるように促すプロンプトがデバイスに現れたときに「ノー」と答える。
ステップ／注記。ＲＢＣ除去を完了し、プログラムを続けたいと確信しているかどうかのプロンプトがデバイスに現れたときに、「イエス」と答える。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりにＲＢＣ低下画分がデバイスチャンバー内に存在する。
ステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内でバイアル１本（７．５ｍＬ）分のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４マイクロビーズとＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（ＩＶＩｇ）３ｍＬを３０ｍＬシリンジに移し、プランジャーを引いて空気１９．５ｍＬをシリンジに加える。
ステップ／注記。デバイスに移すためにシリンジに無菌下でキャップを装着する。
ステップ／注記。デバイスでユーザープログラムの下にプログラム「Ｊ２」を選択する。
サブステップ／注記。プロンプトが現れたときに、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４マイクロビーズとＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（ＩＶＩｇ）を入れたシリンジを無菌接続する。
サブステップ／注記。チューブ接続を確認するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続が正しいことを確認し、「イエス」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は４５分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりにＣＤ３４標識画分がデバイスチャンバー内に存在する。
ステップ／注記。デバイスでユーザープログラムの下にプログラムＪ４を選択する。
サブステップ／注記。デバイス命令に従ってプログラムを実行する。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は４５分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりにＣＤ３４高含有細胞画分が「標的細胞バッグ」内に存在する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりに「陰性画分」のラベルを付けたバッグ内にＣＤ３４低下画分が存在する。
ステップ／注記。隣接するルアー接続の真上にチューブをヒートシールすることにより標的細胞バッグをデバイスチューブセットから取り外す。
ステップ／注記。標的細胞バッグをバイオセーフティキャビネットに移し、細胞収率の測定用に０．５ｍＬ試料を抽出する。最終体積は４５ｍＬである。
ステップ／注記。「ツール」メニューを開いて「ＴＳ取り外し」プログラムを選択することによりＴＳ１００チューブセットをデバイスから取り外す。
サブステップ／注記。全チューブ弁が閉じていることを確認し、プログラム開始前に流体バッグに通じる全チューブをヒートシールする。
サブステップ／注記。完了までデバイスプロンプトに従ってプログラムを実行する。
ステップ／注記。弁４（Ｖ４）でチューブのルアーフィッティングに無針スパイクを接続することによりＴＳ７３０チューブセットを準備する。
ステップ／注記。造血幹細胞用完全形質導入培地を入れたバッグにＶ４チューブを差し込む。
ステップ／注記。必要な体積の濃縮レンチウイルスを適当な寸法のシリンジ内に吸引し、弁５（Ｖ５）でチューブのルアーフィッティングに接続する。
ステップ／注記。標準標的細胞バッグをチューブセットから取り外す。
ステップ／注記。標準標的細胞バッグの代わりにＣＤ３４高含有細胞画分を含むＴＳ１００チューブセットからの標的細胞バッグをチューブセットに接続する。
ステップ／注記。ユーザープログラムメニューからプログラムＪ６を選択し、「実行」を押す。
ステップ／注記。ＴＳ７３０チューブセットをインストールするように促すデバイスプロンプトに従い、高含有画分を含む標的細胞バッグを逆さに吊るして排出させる。
ステップ／注記。チューブ接続を確認するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続が正しいことを確認し、「イエス」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は５７分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。オプション：デバイスが濃縮レンチウイルスを細胞に添加後、チャンバーは３０分間の低速遠心（「スピノキュレーション」と言う。）を開始する。「ＯＫ」を押して遠心を停止した後に「イエス」を押してプログラムを中止することによりスピノキュレーションを停止する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりにＣＤ３４高含有細胞画分と形質導入用レンチウイルスベクターがデバイスチャンバー内に存在する。
＊ステップ／注記。ユーザープログラムメニューからプログラムＪ８を選択し、「実行」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間はフレキシブルである。
＊＊ステップ／注記。ユーザーが「ＯＫ」を押した後に「イエス」を押してプログラム中止コマンドを確認することによりプログラムを中止するまでデバイスはプログラムを続ける。その後、完了すると、デバイスはプログラム詳細を保存する。
ステップ／注記。オプション：バイオセーフティキャビネット内で、必要な体積の濃縮レンチウイルスの第２のアリコートを適当な寸法のシリンジ内に吸引し、弁５（Ｖ５）のルアーフィッティングのチューブに接続する。
サブステップ／注記。ユーザープログラムメニューからプログラムＪ７を選択し、「実行」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は５分間である。
サブステップ／注記。プログラムは完了まで実行し、自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。Ｊ７プログラムの完了後に上記ステップ＊、＊＊に従ってＪ８プログラムを再開する。
ステップ／注記。回収に備え、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａの第２の１Ｌバッグに接続されたＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ緩衝液の１Ｌバッグに無針スパイクアダプターを差し込む。
ステップ／注記。無針スパイクルアーを介してＶ４の完全形質導入培地をＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａに交換する。
ステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内で４００ｍＬクライオバッグにＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ６０ｍＬを注入する。
ステップ／注記。ＴＳ７３０の標的細胞バッグを、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを入れたクライオバッグに交換する。
ステップ／注記。クライオバッグから廃棄物バッグへの弁経路を手動で開き、チューブを通してＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを排出させる。
ステップ／注記。形質導入した細胞産物を輸液用に回収するために、ユーザープログラムメニューからプログラムＪ９を選択し、「実行」を押す。
ステップ／注記。チューブ接続を確認するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続が正しいことを確認し、「イエス」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は５０分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
ステップ／注記。放出試験と輸液用の最終細胞産物は弁２２のクライオバッグ内に存在する。
【０２３４】
実施例４．Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ閉鎖系細胞プロセシングデバイスを使用したレンチウイルス遺伝子改変ヒトロイコアフェレーシス由来ＣＤ３４＋造血幹・前駆細胞の代表的なプロトコール／半自動ベンチトップ式製造。
【０２３５】
試薬及び器具。ＴＳ１００  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙチューブセット；ＴＳ７３０  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙチューブセット；Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ又は他の静脈内輸液用塩類溶液；２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液又は他のＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液；ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４  マイクロビーズ又は他の直接結合抗体−磁気ビーズ複合体；ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（ＩＶＩｇ）又は他のブロッキング剤；漏斗形クライオバッグ；無針スパイクアダプター；６０ｍＬシリンジ；３０ｍＬシリンジ；完全形質導入培地；濃縮レンチウイルス。
【０２３６】
装置。Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳデバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）（本実施例では「デバイス」と言う。）。デバイスは製造業者の仕様によるＣＯ２及び圧縮空気の調節機能付接続を備える必要がある。層流空気流と、無菌チューブウェルダーと、自動血球分析装置と、（出発時の産物が初期体積＞２７０ｍＬの場合には）バッグプレスを装備したバイオセーフティキャビネット。
【０２３７】
プロトコール。デバイスによるプロセシングを本願の他の箇所で記載する合計５個のカスタムプログラムに分割する。
ステップ／注記。ロイコアフェレーシスは常駐施設で臨床標準実施ガイドラインに従って実施すべきである。
サブステップ／注記。輸送が必要な場合には、バイオハザード・適用免除ヒト由来検体のラベルを付けた温度制御容器に骨髄産物を入れて室温で移送する。
ステップ／注記。プロセシングしようとするアフェレーシス産物の出発時の体積を記録する。出発物質体積が＜２７０ｍＬであるならば、下記＊＊＊に進む。
ステップ／注記。出発物質体積が≧２７０ｍＬであるならば、
＊サブステップ／注記。出発時の骨髄産物を最大産物バッグ容積までＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａで希釈する。
サブステップ／注記。産物バッグをブレーキなしで遠心し、細胞をペレット化する。
サブステップ／注記。バッグプレスを使用し、細胞ペレットを入れた産物バッグの総容積を≦２００ｍＬまで減らす。
＊＊＊ステップ／注記。インプロセステスト用に出発時のアフェレーシス産物の試料を採取する。
ステップ／注記。出発時のアフェレーシス産物で全血球算定と変動解析を実施する。
サブステップ／注記。前記産物のヘマトクリット（ＨＣＴ）含量を記録する。
サブステップ／注記。出発時のＨＣＴ含量が＞２５％であるならば、ＨＣＴ含量を≦２５％まで減らすために十分な体積のＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを加える。
サブステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内で骨髄産物バッグにＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを加え、よく混ぜる。
サブステップ／注記。希釈後の産物体積を記録する。
サブステップ／注記。希釈後の産物体積が≧２７０ｍＬであるならば、上記＊に進む。
サブステップ／注記。希釈後の産物体積が＜２７０ｍＬであるならば、下記ステップ＊＊に進む。
ステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内で２５％ＨＳＡ６０ｍＬを加えることによりＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液３Ｌを調製し、よく混ぜる。
＊＊ステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内でバイアル１本（７．５ｍＬ）分のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４マイクロビーズとＧＡＭＭＡＧＡＲＤ（ＩＶＩｇ）３ｍＬを３０ｍＬシリンジに移し、プランジャーを引いて空気１９．５ｍＬをシリンジに加える。
ステップ／注記。ＴＳ１００チューブセットパッケージを開封し、バイオセーフティキャビネット内に移す。
ステップ／注記。ＨＳＡを添加したＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液を弁４（Ｖ４）でチューブスパイクに連結する。
ステップ／注記。提供されるルアー接続によりマイクロビーズとＩＶＩｇを入れたシリンジを弁５（Ｖ５）でチューブセットに連結する。
ステップ／注記。アフェレーシス産物をチューブセット上の弁８（Ｖ８）の産物添加バッグに連結する。
ステップ／注記。Ｐｒｏｄｉｇｙ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳデバイスの電源をオンにする。
ステップ／注記。「ユーザープログラム」を選択し、プログラムＪ５を選択する。
ステップ／注記。デバイス命令に従ってＴＳ１００チューブセットのインストールを開始するためのプログラムを実行する。
サブステップ／注記。新しいＴＳ１００チューブセットのインストールを促すプロンプトに従う。
ステップ／注記。デバイスにプロンプトが現れたときに、アフェレーシス産物の体積を手動入力する。
ステップ／注記。２５％のＨＣＴ％値を手動入力する。
ステップ／注記。適切なチューブセット接続を確保するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続を確認し、「イエス」と答える。
サブステップ／注記。デバイスは準備、ＣＤ３４標識及び磁気カラム選択のプロセシングプログラムを自動的に開始する。
ステップ／注記。デバイスがプログラムの自動部分を開始すると、ユーザー操作の必要はなくなる。プログラム実行時間は７５分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりにＣＤ３４高含有細胞画分が「標的細胞バッグ」内に存在する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりに「陰性画分」のラベルを付けたバッグ内にＣＤ３４低下画分が存在する。
ステップ／注記。隣接するルアー接続の真上にチューブをヒートシールすることにより標的細胞バッグをデバイスチューブセットから取り外す。
ステップ／注記。標的細胞バッグをバイオセーフティキャビネットに移し、細胞収率の測定用に０．５ｍＬ試料を抽出する。最終体積は４５ｍＬである。
ステップ／注記。「ツール」メニューを開いて「ＴＳ取り外し」プログラムを選択することによりＴＳ１００チューブセットをデバイスから取り外す。
全チューブ弁が閉じていることを確認し、プログラム開始前に流体バッグに通じる全チューブをヒートシールする。
完了までデバイスプロンプトに従ってプログラムを実行する。
ステップ／注記。弁４（Ｖ４）のチューブのルアーフィッティングに無針スパイクを接続することによりＴＳ７３０チューブセットを準備する。
ステップ／注記。造血幹細胞用完全形質導入培地を入れたバッグにＶ４チューブを差し込む。
ステップ／注記。必要な体積の濃縮レンチウイルスを適当な寸法のシリンジ内に吸引し、弁５（Ｖ５）のチューブのルアーフィッティングに接続する。
ステップ／注記。標準標的細胞バッグをチューブセットから取り外す。
ステップ／注記。標準標的細胞バッグの代わりにＣＤ３４高含有細胞画分を含むＴＳ１００チューブセットからの標的細胞バッグをチューブセットに接続する。
ステップ／注記。ユーザープログラムメニューからプログラムＪ６を選択し、「実行」を押す。
ステップ／注記。ＴＳ７３０チューブセットをインストールするように促すデバイスプロンプトに従い、高含有画分を含む標的細胞バッグを逆さに吊るして排出させる。
ステップ／注記。チューブ接続を確認するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続が正しいことを確認し、「イエス」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は５７分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。オプション：デバイスが濃縮レンチウイルスを細胞に添加後、チャンバーは３０分間の低速遠心（「スピノキュレーション」と言う。）を開始する。「ＯＫ」を押して遠心を停止した後に「イエス」を押してプログラムを中止することによりスピノキュレーションを停止する。
サブステップ／注記。プログラムの終わりにＣＤ３４高含有細胞画分と形質導入用レンチウイルスベクターがデバイスチャンバー内に存在する。
ステップ／注記。ユーザープログラムメニューからプログラムＪ８を選択し、「実行」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間はフレキシブルである。
ステップ／注記。ユーザーが「ＯＫ」を押した後に「イエス」を押してプログラム中止コマンドを確認することによりプログラムを中止するまでデバイスはプログラムを続ける。その後、完了すると、デバイスはプログラム詳細を保存する。
ステップ／注記。オプション：バイオセーフティキャビネット内で必要な体積の濃縮レンチウイルスの第２のアリコートを適当な寸法のシリンジ内に吸引し、弁５（Ｖ５）のチューブのルアーフィッティングに接続する。
サブステップ／注記。ユーザープログラムメニューからプログラムＪ７を選択し、「実行」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は５分間である。
サブステップ／注記。プログラムは完了まで実行し、自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
サブステップ／注記。Ｊ７プログラムの完了後に上記に従ってＪ８プログラムを再開する。
ステップ／注記。精製／製剤化に備え、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａの第２の１Ｌバッグに接続したＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ緩衝液の１Ｌバッグに無針スパイクアダプターを差し込む。
ステップ／注記無針スパイクルアーを介して。Ｖ４の完全形質導入培地をＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａに交換する。
ステップ／注記。バイオセーフティキャビネット内でＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａ６０ｍＬを４００ｍＬクライオバッグに注入する。
ステップ／注記。ＴＳ７３０の標的細胞バッグを、Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを入れたクライオバッグに交換する。
ステップ／注記。クライオバッグから廃棄物バッグへの弁経路を手動で開き、チューブを通してＰｌａｓｍａｌｙｔｅ  Ａを排出させる。
ステップ／注記。形質導入した細胞産物を輸液用に精製／製剤化するために、ユーザープログラムメニューからプログラムＪ９を選択し、「実行」を押す。
ステップ／注記。チューブ接続を確認するように促すプロンプトがデバイスに現れたときに、接続が正しいことを確認し、「イエス」を押す。
サブステップ／注記。デバイスは自動的にプログラムを開始する。
サブステップ／注記。合計プログラム実行時間は５０分間である。
ステップ／注記。デバイスは完了するまでプログラムを続け、完了したら自動的に停止し、プログラム詳細を保存する。
ステップ／注記。放出試験と輸液用の最終細胞産物は弁２２のクライオバッグ内に存在する。
【０２３８】
当分野に通常の知識をもつ者に自明の通り、本願に開示する各実施形態は明記しているその特定の要素、工程、成分又はコンポーネントを含むことができ、あるいは本質的にこれらから構成することができ、あるいはこれらから構成することができる。従って、「包含する」なる用語は「含む、〜から構成される、又は本質的に〜から構成される」と同義であると解釈すべきである。本願で使用する前半部と後半部を繋ぐ用語である「含む」とは、包含するが、限定されないという意味であり、明記していない要素、工程、成分又はコンポーネントを包含することも許容しており、その量は多量であってもよい。前半部と後半部を繋ぐ用語である「〜から構成される」とは明記していない要素、工程、成分又はコンポーネントを除外する。前半部と後半部を繋ぐ用語である「本質的に〜から構成される」とは実施形態の範囲を、明記している要素、工程、成分又はコンポーネントと、この実施形態に重大な影響を与えない要素、工程、成分又はコンポーネントに制限するものである。本願で使用する重大な影響とは対象試料からの細胞の単離、遺伝子改変、精製及び製剤化を統計的に有意に低下させるようなものである。
【０２３９】
特に指定しない限り、本明細書と特許請求の範囲で使用する成分の量、分子量等の性質、反応条件等を表す全数値はいずれの場合も「約」なる用語が付いていると理解すべきである。従って、特に指定しない限り、本明細書と特許請求の範囲に記載する数値パラメータは概数であり、本発明により獲得しようとする所望の性質に応じて変動することができる。特許請求の範囲への均等論の適用を制限しようとするものではないが、最低限でも、各数値パラメータは少なくとも報告する有効数字を踏まえて通常の丸め方を適用することにより解釈すべきである。更に明瞭にする必要がある場合には、「約」なる用語は明記する数値又は範囲と共に使用するときに当業者が妥当に割り当てる意味であり、即ち記載値の±２０％、記載値の±１９％、記載値の±１８％、記載値の±１７％、記載値の±１６％、記載値の±１５％、記載値の±１４％、記載値の±１３％、記載値の±１２％、記載値の±１１％、記載値の±１０％、記載値の±９％、記載値の±８％、記載値の±７％、記載値の±６％、記載値の±５％、記載値の±４％、記載値の±３％、記載値の±２％、又は記載値の±１％の範囲内までで明記する数値又は範囲よりも多少大きいか又は多少小さい数値又は範囲を意味する。
【０２４０】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは概数であるが、具体例に記載する数値は可能な限り正確に報告する。但し、如何なる数値もその夫々の試験測定値に存在する標準偏差により必然的に生じる所定の誤差を内在的に含む。
【０２４１】
本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）で使用する不定冠詞、定冠詞及び同類の指示語は本願で特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、単数と複数の両方に対応すると解釈すべきである。本願で数値範囲を記載する場合には、その範囲内に該当する個々の数値を個別に表す省略法として利用する目的に過ぎない。本願で特に指定しない限り、個々の数値を本願に個別に記載しているものとして本明細書に組み入れる。本願で特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、本願に記載する全方法はあらゆる適切な順序で実施することができる。本願に記載するありとあらゆる例又は例示的文言（例えば「等の」）の使用は本発明をより明瞭にする目的に過ぎず、それ以外の内容で請求されている本発明の範囲に制限を加えるものではない。本明細書中の如何なる文言も本発明の実施に不可欠な請求外の要素を表すと解釈すべきではない。
【０２４２】
本願に開示する発明の択一的要素又は実施形態のグループを制限として解釈すべきではない。各グループメンバーを個々に又はそのグループの他のメンバーもしくは本願に記載する他の要素とのあらゆる組合せにおいて言及及び請求することができる。便宜及び／又は特許性の理由からあるグループの１以上のメンバーをあるグループに組み入れることもできるし、削除することもできる。このような組み入れ又は削除が行われる場合には、明細書は変更後のグループを含むものとみなされ、従って、添付の特許請求の範囲で使用される全マーカッシュグループの文言を満足する。
【０２４３】
本発明を実施するために本発明者らが知る限り最良の実施形態を含めて、本願には本発明の所定の実施形態を記載する。当然のことながら、記載するこれらの実施形態の変形も上記記載を通読後に当分野に通常の知識をもつ者に容易に理解されよう。本発明者は当業者がこのような変形を適宜利用するものと予想し、また、本発明者らは本願に具体的に記載する以外の方法で本発明が実施されることも想定している。従って、準拠法により許可される範囲において本発明は添付の特許請求の範囲に記載する主題の全変形及び等価物を包含する。更に、本願で特に指定する場合又は文脈からそうでないことが明白な場合を除き、可能な全てのその変形における上記要素のあらゆる組合せを本発明に包含する。
【０２４４】
更に、本明細書の随所で特許、印刷刊行物、雑誌論文及び他の文書に何度も言及している（本願の参考資料）。これらの参考資料は各々その参考とする教示についてその開示内容全体を個々に本願に援用する。
【０２４５】
終わりに、当然のことながら、本願に開示する発明の実施形態は本発明の原理を例証するものである。利用できる他の変形も本発明の範囲に含まれる。従って、限定するものではないが、例えば本発明の代替構成も本願の教示に従って利用することができる。従って、本発明は厳密に図示及び記載通りの内容に制限されない。
【０２４６】
本願に示す詳細事項は例示であり、本発明の好ましい実施形態を具体的に説明する目的に過ぎず、本発明の種々の実施形態の原理と概念的側面の最も有用で理解し易い説明であると考えられるものを提供するために提示する。この点については、本発明の基本的な理解に必要である以上に詳細に本発明の構造細部を示そうとするものではなく、本発明の複数の形態を実際にどのように具体化できるかは説明を図面及び／又は実施例と勘案することにより当業者に容易に理解されよう。
【０２４７】
後続する実施例で明瞭・明白に変更されている場合又はその意味を適用すると構文の意味が通らなくなる場合もしくは本質的に意味が通らなくなる場合を除き、本開示で使用する定義と説明は後続するあらゆる構文に適用されるものとする。用語の構文により意味が通らなくなる場合又は本質的に意味が通らなくなる場合には、Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ又はＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４）等の当分野に通常の知識をもつ者に公知の辞書から定義を参照されたい。
【図１】
0006734283.tif 000032
【図２Ａ】
0006734283.tif 000033
【図２Ｂ】
0006734283.tif 000034
【図２Ｃ】
0006734283.tif 000035
【図３Ａ】
0006734283.tif 000036
【図３Ｂ】
0006734283.tif 000037
【図４Ａ】
0006734283.tif 000038
【図４Ｂ】
0006734283.tif 000039
【図５Ａ】
0006734283.tif 000040
【図５Ｂ】
0006734283.tif 000041
【図６Ａ】
0006734283.tif 000042
【図６Ｂ】
0006734283.tif 000043
【図７Ａ】
0006734283.tif 000044
【図７Ｂ】
0006734283.tif 000045
【図８Ａ】
0006734283.tif 000046
【図８Ｂ】
0006734283.tif 000047
【図９Ａ】
0006734283.tif 000048
【図９Ｂ】
0006734283.tif 000049
【図１０Ａ】
0006734283.tif 000050
【図１０Ｂ】
0006734283.tif 000051
【図１１】
0006734283.tif 000052
【図１２Ａ】
0006734283.tif 000053
【図１２Ｂ】
0006734283.tif 000054
【図１３Ａ】
0006734283.tif 000055
【図１３Ｂ】
0006734283.tif 000056
【図１４】
0006734283.tif 000057
【図１５Ａ】
0006734283.tif 000058
【図１５Ｂ】
0006734283.tif 000059
【図１５Ｃ】
0006734283.tif 000060
【図１６Ａ】
0006734283.tif 000061
【図１６Ｂ】
0006734283.tif 000062
【図１７Ａ】
0006734283.tif 000063
【図１７Ｂ】
0006734283.tif 000064
【図１７Ｃ】
0006734283.tif 000065
【図１８Ａ】
0006734283.tif 000066
【図１８Ｂ】
0006734283.tif 000067
【図１９Ａ】
0006734283.tif 000068
【図２０Ａ】
0006734283.tif 000069
【図２０Ｂ】
0006734283.tif 000070
【図２１】
0006734283.tif 000071
【図２２Ａ】
0006734283.tif 000072
【図２２Ｂ】
0006734283.tif 000073
【配列表】
0006734283000001.app