(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの異なる鎖：
第１の鎖：ＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）又はＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）と、
第２の鎖：ＶＬ（５Ｔ４）−ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又はＶＬ（５Ｔ４）−ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）と、を組み合わせたもの
［式中、ＶＨ及びＶＬは抗体可変結合ドメインであり、ＣＨ１及びＣＬは抗体定常ドメインであり、Ｌ１及びＬ２はリンカーである。］
を含む融合タンパク質のヘテロ二量体であって、
（ａ）融合タンパク質のヘテロ二量体内に形成された２つの組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインは、５Ｔ４に結合する能力があり；（ｂ）融合タンパク質のヘテロ二量体内に形成された残りの１つの組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインは、Ｔ細胞のＣＤ３受容体複合体に結合する能力があり、
抗体可変結合ドメインＶＨである２つの前記ＶＨ（５Ｔ４）は、配列番号６の配列からなる、配列番号６の配列を含む、又は配列番号６の配列と少なくとも９０％の同一性を有し、
抗体可変結合ドメインＶＬである２つの前記ＶＬ（５Ｔ４）は、配列番号１９の配列からなる、配列番号１９の配列を含む、又は配列番号１９の配列と少なくとも９０％の同一性を有し、
抗体可変結合ドメインＶＨである前記ＶＨ（ＣＤ３）は、配列番号２９の配列からなる、配列番号２９の配列を含む、又は配列番号２９の配列と少なくとも９０％の同一性を有し、
抗体可変結合ドメインＶＬである前記ＶＬ（ＣＤ３）は、配列番号３７の配列からなる、配列番号３７の配列を含む、又は配列番号３７の配列と少なくとも９０％の同一性を有する、融合タンパク質のヘテロ二量体。
【請求項２】
第１の鎖が、配列番号５１の配列を含む、又は配列番号５１の配列と少なくとも９０％の同一性を有し、第２の鎖が、配列番号５２の配列を含む、又は配列番号５２の配列と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質のヘテロ二量体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の融合タンパク質のヘテロ二量体をコードする核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸分子又は請求項４に記載のベクターが形質導入又は形質移入された、宿主細胞。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の融合タンパク質のヘテロ二量体の産生のための方法であって、
請求項５に記載の宿主細胞を、請求項１又は２に記載の融合タンパク質の発現を可能にする条件で培養するステップ、及び
産生された融合タンパク質のヘテロ二量体を培養物から回収するステップを含む方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の融合タンパク質のヘテロ二量体を含む医薬組成物。
【請求項８】
医薬としての使用のための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
増殖性疾患、腫瘍性疾患、及び免疫障害から選択される疾患の予防、治療又は回復における使用のための、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
腫瘍性疾患が、５Ｔ４が腫瘍細胞に発現している癌である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の融合タンパク質のヘテロ二量体、請求項３に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、又は請求項５に記載の宿主細胞を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３つの結合ドメインを含む二重特異性結合分子であって、第１及び／又は第２の結合ドメインが、５Ｔ４細胞外抗原に結合する能力があり、残りの結合ドメイン（複数可）が、Ｔ細胞のＣＤ３受容体複合体に結合する能力がある、二重特異性結合分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体５Ｔ４によって規定される細胞表面抗原は、早くも発生９週間で全ての種類の栄養膜によって発現される７２ｋＤの糖タンパク質である。成体組織では、５Ｔ４の発現は、少数の特殊な上皮細胞型に限られ、成体の肝臓、肺、気管支、心臓、精巣、卵巣、脳又は筋肉から検出されない。上記抗原は、発生学的起源をもつ細胞株を含めた多様な腫瘍細胞株によって選択的に発現される。分子的特徴、相対的に限られた正常組織での分布及び特定の腫瘍細胞型による発現は、この抗原を悪性腫瘍の診断マーカーとして使用する価値があるものにしている（Ｈｏｌｅ＆Ｓｔｅｒｎ、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．（１９８８）５７（３）、２３９〜４６）。
【０００３】
癌及び癌の進行に５Ｔ４が関与していることを支持する明らかな証拠がある。癌細胞表面での高レベルの５Ｔ４発現が、卵巣癌（Ｗｒｉｇｌｅｙ  Ｅ、ＭｃＧｏｗｎ  ＡＴ、Ｒｅｎｎｉｓｏｎ  Ｊら、５Ｔ４  ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９５；５：２６９〜２７４）、結腸癌（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ  Ｔ、Ｍａｒｓｈ  ＰＪ、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ  ＰＦ、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＳＡ、Ｍｙｅｒｓ  ＫＡ、Ｓｔｅｒｎ  ＰＬ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ５Ｔ４  ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９４；６９：８９９〜９０２）、子宮頸癌（Ｊｏｎｅｓ  Ｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｇ、Ｈｏｌｅ  Ｎ、ＭｃＤｉｃｋｅｎ  ＩＷ、Ｓｔｅｒｎ  Ｐ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ５Ｔ４  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９０；６：６９〜１００）、胃癌（Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａ  Ｔ、Ｒａｈｉ  Ｖ、Ｓｔｅｒｎ  ＰＬ．Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ５Ｔ４  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９２；６６：８６７〜８６９及び上記）並びに肺癌（Ｆｏｒｓｂｅｒｇ  Ｇ、Ｏｈｌｓｓｏｎ  Ｌ、Ｂｒｏｄｉｎ  Ｔら、Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００１；８５：１２９〜１３６）について示されている。疾患進行、すなわち転移との関連も実証された（Ｍｕｌｄｅｒ  ＷＭ、Ｓｔｅｒｎ  ＰＬ、Ｓｔｕｋａｒｔ  ＭＪら、Ｌｏｗ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  １  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ５Ｔ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９７；３：１９２３〜１９３０及びＳｔａｒｚｙｎｓｋａ  Ｔ、Ｗｉｅｃｈｏｗｓｋａ−Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ  Ａ、Ｍａｒｌｉｃｚ  Ｋら、５Ｔ４  ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９８；１０：４７９〜４８４及びＮａｇａｎｕｍａ  Ｈ、Ｋｏｎｏ  Ｋ、Ｍｏｒｉ  Ｙら、Ｏｎｃｏｆｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ５Ｔ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２；２２：１０３３〜１０３８）。癌性病変とは対照的に、正常組織での５Ｔ４の発現は限られているので（ＡＮ  Ａ、Ｌａｎｇｄｏｎ  Ｊ、Ｓｔｅｒｎ  ＰＬ、Ｐａｒｔｉｄｇｅ  Ｍ．Ｔｈｅ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ５Ｔ４  ｏｎｃｏｆｏｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｎｏｒｍａｌ，ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｏｒａｌ  ｍｕｃｏｓａ．Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．２００１；３７：５７〜６４）、５Ｔ４は、標的化癌療法に適した標的抗原として示唆されている（Ｗｏｏｄｓ  ＡＭ、Ｗａｎｇ  ＷＷ、Ｓｈａｗ  ＤＭら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ５Ｔ４  ｏｎｃｏｆｏｅｔａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ：ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００２；３６６：３５３〜３６５及びＨｏｌｅ  Ｎ、Ｓｔｅｒｎ  ＰＬ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５Ｔ４，Ａ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９０；４５：１７９〜１８４）。
【０００４】
抗体に基づく癌治療は、有効となるために癌細胞表面に堅固に結合した標的抗原を必要とする。表面の標的に結合することによって、抗体は癌細胞に致命的シグナルを直接的又は間接的に送達することができる。理想的な治療シナリオに必要とされる通り、標的抗原５Ｔ４は、特異的な癌細胞に豊富に存在し、到達可能であり、正常細胞にはないか、遮蔽されているか、又はずっと少ない。そのうえ、５Ｔ４抗原は２０年以上前に腫瘍学の標的として同定されていたものの、抗５Ｔ４免疫療法は癌を治療するために承認されていない。したがって、この抗原を治療的に有効に標的化することが明らかに必要である。
【０００５】
１つのドメインが細胞傷害性細胞、すなわち細胞傷害性Ｔ細胞に結合性で、第２の結合ドメインが腫瘍細胞表面の５Ｔ４に結合性の二重特異性分子の形態の抗体に基づく治療法を提供することは、当技術分野において公知である。より詳細には、国際公開第２０１３／０４１６８７号において、第１及び第２の結合ドメインを含む二重特異性分子であって、（ａ）第１の結合ドメインが、５Ｔ４のエピトープクラスター４に結合する能力があり；（ｂ）第２の結合ドメインが、Ｔ細胞のＣＤ３受容体複合体に結合する能力がある、二重特異性分子が記載されている。
【０００６】
Ｆａｂと呼ばれる、抗体の抗原結合腕の鎖のそれぞれへの２つの同一若しくは異なるタンパク質若しくはペプチドの融合タンパク質又はその誘導体が公知である。Ｆａｂは、その最も伝統的な意味で、ＶＨ及びＣＨ１抗体ドメインを含むＦｄ鎖とＶＬ及びＣＬ抗体ドメインを含むＬ鎖との間のヘテロ二量体である。可変ドメインＶＨ及びＶＬは、異なる種又は抗体サブクラスに由来する可能性がある。定常ドメインＣＨ１及びＣＬも、異なる種及びサブクラスに由来する可能性がある。融合タンパク質は、Ｆａｂ融合タンパク質をヘテロ二量体化するためにＣＨ１：ＣＬヘテロ二量体相互作用を利用する。国際公開第９９／３７７９１号（ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）は、伝統的なコンフォメーションのＦａｂの使用を教示している。ＶＨ−ＣＨ１：ＶＬ−ＣＬヘテロ二量体は、Ｃ末端及び／又はＮ末端に第２及び第３の機能を付けて、又は第４及び第５の機能までも付けて伸長される。伸長された機能は、ペプチド、タンパク質、又はタンパク質の部分若しくは誘導体にコードされている。国際公開第９９／３７７９１号は、ＶＬ可変軽鎖抗体ドメイン、続くＣＬ定常軽鎖抗体ドメインの融合物とヘテロ二量体を形成させるための、ＶＨ重鎖可変ドメイン、続くＣＨ１重鎖定常ドメイン１の融合物の使用を教示している。ＶＨ−ＣＨ１：ＶＬ−ＣＬ（又はＶＨＣＨ１：ＶＬＣＬと表示）ヘテロ二量体は、最大４つのペプチド又はタンパク質を融合させ伸長させることができる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、３つの結合ドメインを含む二重特異性結合分子（「融合タンパク質」又は「トリボディー（Ｔｒｉｂｏｄｙ）融合タンパク質」又は「Ｔｂ−５Ｔ４融合タンパク質」とさらに称される）であって、第１及び／又は第２の結合ドメインが、５Ｔ４細胞外抗原に結合する能力があり、残りの結合ドメイン（複数可）が、Ｔ細胞のＣＤ３受容体複合体に結合する能力がある、二重特異性結合分子に関する。そのうえ、本発明は、融合タンパク質をコードしている核酸配列、上記核酸配列を含むベクター及び上記ベクターを形質転換又は形質移入された宿主細胞に関する。さらに、本発明は、本発明の融合タンパク質の産生方法、上記融合タンパク質の医学的使用及び上記融合タンパク質を含むキットに関する。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
本開示にわたり、様々な刊行物、特許及び公開された特許明細書が、特定する引用により参照される。これらの刊行物、特許及び公開された特許明細書の開示は、本発明が属する技術の現状をより完全に説明するために、本明細書によって参照により本開示に組み込まれている。
【０００９】
本明細書に使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別のものを示さない限り複数の参照を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「試薬」への参照は、そのような種々の試薬のうちの１つ又は複数を含み、「方法」への参照は、本明細書記載の方法のために改変又は置換することができる、当業者に公知の等価のステップ及び方法への参照を含む。
【００１０】
特に示さない限り、ある系列の要素に先行する用語「少なくとも」は、上記系列の各要素を表すことを理解すべきである。当業者は、日常的な実験法にすぎないものを使用して、本明細書記載の本発明の詳細な実施形態との多数の均等物を認識している、又は確認することができる。そのような均等物は、本発明により包含されることが意図されている。
【００１１】
本明細書のどこで使用されようと、用語「及び／又は」は、「及び」、「又は」及び「上記用語により接続される要素の全て又は任意の他の組合せ」の意味を含む。
【００１２】
本明細書に使用される用語「約」又は「およそ」は、所与の値又は範囲の２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内を意味する。
【００１３】
状況が他のことを必要としない限り、本明細書及び後続の特許請求の範囲にわたり、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、述べられた完全体若しくはステップ又は完全体若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の完全体若しくはステップ又は完全体若しくはステップの群の排除を意味しないことが理解されよう。本明細書に使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」若しくは「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」により、又は本明細書に使用する場合、時には用語「有している（ｈａｖｉｎｇ）」により置換することができる。
【００１４】
本明細書に使用する場合、「からなっている」は、請求項の要素に特定されない、いかなる要素、ステップ、又は成分も排除するものである。本明細書に使用する場合、「から本質的になっている」は、請求項の基本的及び新規な特徴に著しくは影響しない材料又はステップを排除しない。
【００１５】
本明細書におけるどの場合にも、用語「含んでいる」、「から本質的になっている」及び「からなっている」のうちのいずれかは、残りの２つの用語のいずれかにより置き換えることができる。
【００１６】
用語「結合ドメイン」は、本発明に関連して、所与の標的エピトープと特異的に結合／相互作用する（所与の標的エピトープと結合／相互作用する能力がある）、ポリペプチドのドメインを特徴付けるものである。「エピトープ」は、抗原性であるので、用語エピトープは、本明細書において時には「抗原構造」又は「抗原決定基」とも呼ばれる。したがって、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。用語「抗原相互作用部位」は、本発明によると、特異的な抗原又は抗原の特異的な群、例えば異なる種における同一の抗原と特異的に相互作用することができる、ポリペプチドのモチーフを規定している。上記結合／相互作用は、「特異的相互作用」を規定するとも理解されている。一例では、所与の標的エピトープと特異的に結合／相互作用する上記ポリペプチドは抗体であり、上記ドメインは、抗体のＶＨ及び／又はＶＬ領域又はドメインである。
【００１７】
用語「エピトープ」は、抗体若しくは免疫グロブリン又は免疫グロブリンの抗体の誘導体などの結合ドメインが特異的に結合する抗原の部位を表す。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって近接された連続アミノ酸又は非連続アミノ酸の両方から形成されている可能性がある。「線状エピトープ」は、アミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを構成するエピトープである。線状エピトープは、非反復配列の中に少なくとも３つ、より通常には少なくとも５つ、例えば、約８〜約１０個のアミノ酸を典型的に含む。
【００１８】
線状エピトープとは対照的に「コンフォメーショナルエピトープ」は、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを規定する唯一の構成成分ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が、エピトープを規定している抗体によって必ずしも認識されないエピトープ）である。典型的には、コンフォメーショナルエピトープは、線状エピトープと比較して増加した数のアミノ酸を含む。コンフォメーショナルエピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチド若しくはタンパク質又はその断片の三次元構造を認識する（本発明に関連して、抗原は、５Ｔ４タンパク質の結合ドメインのうちの１つに対するものである）。例えば、タンパク質分子がフォールディングして三次元構造を形成する場合、コンフォメーショナルエピトープを形成している特定のアミノ酸及び／又はポリペプチド主鎖は、近接するようになり、抗体がエピトープを認識できるようにする。エピトープのコンフォメーションを決定する方法には、これらに限定されないが、例えば、Ｘ線結晶構造解析、二次元核磁気共鳴分光法及び部位特異的スピンラベル法及び電子常磁性共鳴分光法が含まれる。
【００１９】
用語「特異的に結合／相互作用している」、「特異的に認識している」、「に対する」及び「と反応性の」は、本発明により、結合ドメインがエピトープの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つのアミノ酸と特異的に相互作用する及び／又は結合する能力があることを意味する。そのような結合性は、「鍵と鍵穴原理」の特異性によって例示することができる。本明細書に使用される用語「特異的に相互作用すること」、「特異的に結合性の」又は「特異的に結合する」は、結合ドメインが特定のタンパク質又は抗原に対してはっきりと認識できる親和性を示し、一般には、他のタンパク質又は抗原と顕著な交差反応性を示さないことを意味する。「はっきりと認識できる」又は好ましい結合性は、親和性が１０−６Ｍ（ＫＤ）以上の結合性を含む。結合親和性が約１０−１１〜１０−８Ｍ、好ましくは約１０−１１〜１０−９Ｍの場合に、結合は特異的であると考えられることが好ましい。必要ならば、結合条件を変動させることによって特異的結合性に実質的に影響せずに非特異的結合を減少させることができる。結合ドメインが標的と特異的に反応又は結合するかどうかは、とりわけ、上記結合ドメインのうちの１つと標的タンパク質又は抗原との反応を、上記結合ドメインと他のタンパク質又は抗原との反応と比較することによって、容易に試験することができる。
【００２０】
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列における特異的モチーフによって引き起こされると考えられる。したがって、結合は、アミノ酸配列の一次、二次又は三次構造の結果としてだけでなく、上記構造の二次的改変の結果として達成される。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、抗原への上記部位の単純な結合も招く場合がある。そのうえ、抗原相互作用部位とその特異抗原との特異的相互作用は、代替的に、例えば抗原のコンフォメーションの変化、抗原のオリゴマー化などの誘導が原因で、シグナルの開始を招く場合がある。一例では、結合ドメインは抗体である。
【００２１】
用語「本質的に結合しない」は、本発明の融合タンパク質の結合ドメインが別のタンパク質と結合しないこと、すなわち、別のタンパク質と３０％未満、好ましくは２０％、より好ましくは１０％、特に好ましくは９、８、７、６又は５％未満の交差反応性を示すことを意味する。
【００２２】
本明細書に使用される用語「異種間特異性」、「異種間認識」及び「種間特異性」は、ヒト及び非ヒト種において、好ましくは霊長類種において、結合ドメインが同じ標的分子に結合する能力を意味する。したがって、「異種間特異性」又は「種間特異性」は、異なる種に発現されているＸ以外の分子（例えば、５Ｔ４又はＣＤ３類）ではなく、同じ分子Ｘ（例えば、５Ｔ４又はＣＤ３類）に対する種間反応性を説明するものである。
【００２３】
タンパク質（その断片、好ましくは生物学的に活性な断片及び通常３０個未満のアミノ酸を有するペプチドを含む）は、共有ペプチド結合を介して相互に連結された１つ又は複数のアミノ酸を含む（アミノ酸鎖を生じる）。本明細書に使用される用語「ポリペプチド」は、３０個を超えるアミノ酸からなる又はそれを含む分子の群を説明するものである。ポリペプチドは、二量体、三量体及びより高いオリゴマーなどの、すなわち１つを超えるポリペプチド分子からなる又はそれを含む、多量体をさらに形成することができる。そのような二量体、三量体などを形成しているポリペプチド分子は、同一又は非同一の場合がある。したがって、そのような多量体に対応する高次構造は、ホモ二量体又はヘテロ二量体、ホモ三量体又はヘテロ三量体などと呼ばれる。ヘテロ多量体の一例は、その自然形態で２つの同一のポリペプチド軽鎖及び２つの同一のポリペプチド重鎖を含む又はそれからなる抗体分子である。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、改変が例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような翻訳後改変によって引き起こされる、自然改変ポリペプチド／タンパク質も表す。そのような改変は、当技術分野において周知である。
【００２４】
本明細書上述のように、一態様では、融合タンパク質の第１及び／若しくは第２の結合ドメインは、ヒト及びコモンマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ）若しくはリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）の５Ｔ４に結合する能力があり、並びに／又は残りの結合ドメイン（複数可）は、ヒト及びコモンマーモセット、ワタボウシタマリン若しくはリスザルのＣＤ３イプシロンに結合する能力がある。本実施形態によると、本発明の融合タンパク質の全ての３つの結合ドメインは、哺乳類霊長目のメンバーに異種間特異性である。
【００２５】
一実施形態では、第１又は第２又は第３の結合ドメインは、抗体に由来する。別の実施形態では、全ての結合ドメインは、抗体に由来する。
【００２６】
用語「抗体」の定義には、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体などの実施形態だけでなく、とりわけＦａｂ断片のような抗体断片が含まれる。抗体断片又は誘導体は、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片又はドメイン抗体若しくはナノボディーなどの単一ドメイン抗体、他のＶ領域若しくはドメインとは無関係に抗原若しくはエピトープと特異的に結合する、ＶＨＨ、ＶＨ若しくはＶＬであり得るただ１つの可変ドメインを含む単一可変ドメイン抗体若しくは免疫グロブリン単一可変ドメインをさらに含む。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）及び（１９９９）、上記引用文中；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、第２版、２０１０並びにＬｉｔｔｌｅ、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００９を参照されたい。そのような免疫グロブリン単一可変ドメインは、単離された抗体単一可変ドメインポリペプチドだけでなく、抗体単一可変ドメインポリペプチドの配列の１つ又は複数の単量体を含むより大きなポリペプチドも包含する。
【００２７】
様々な手順が当技術分野において公知であり、そのような抗体及び／又は断片の産生のために使用することができる。したがって、（抗体）誘導体は、ペプチド模倣薬によって産生することができる。さらに、単鎖抗体の産生のための記載された技法（とりわけ、米国特許第４９４６７７８号、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ（２０１０）、上記引用文中並びにＬｉｔｔｌｅ（２００９）、上記引用文中を参照されたい）は、選択されたポリペプチド（複数可）に特異的な単鎖抗体を産生するように構成される可能性がある。また、トランスジェニック動物を使用して、本発明のポリペプチド及び融合タンパク質に特異的なヒト化抗体を発現させることができる。モノクローナル抗体の調製のために、細胞株の連続培養によって産生された抗体をもたらす任意の技法を使用することができる。そのような技法の例には、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６（１９７５）、４９５〜４９７）、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４（１９８３）、７２）及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．（１９８５）、７７〜９６）が含まれる。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）システムに採用されているような表面プラズモン共鳴法を使用して、ＣＤ３イプシロンなどの標的ポリペプチドのエピトープに結合するファージ抗体の効率を増加させることができる（Ｓｃｈｉｅｒ、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６）、９７〜１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５）、７〜１３）。本発明に関連して、用語「抗体」が、本明細書下記のように宿主に発現される場合がある抗体構築物、例えば、とりわけウイルス又はプラスミドベクターを介して形質移入及び／又は形質導入される場合がある抗体構築物を含むことも想定されている。
【００２８】
さらに、本発明に採用される用語「抗体」は、記載された抗体と同じ又は類似の特異性を示す、本明細書記載の抗体の誘導体又は変異体にも関する。類似の特異性は、変異体又は誘導体が由来する出発／対照抗体の特異性の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、少なくとも１５０％、少なくとも１６０％である特異性である。「抗体変異体」の例には、非ヒト抗体のヒト化変異体、「親和性成熟された」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４、８８９〜８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０、１０８３２〜１０８３７（１９９１）参照）及び変更されたエフェクター機能（複数可）を有する抗体突然変異体（例えば、米国特許第５６４８２６０号、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ及びＤｕｂｅｌ（２０１０）、上記引用文中及びＬｉｔｔｌｅ（２００９）、上記引用文中を参照されたい）が含まれる。
【００２９】
本明細書に使用される場合の用語「抗原結合ドメイン」、「抗原結合断片」、「抗体結合ドメイン」及び「抗体結合領域」は、抗体と抗原との間の特異的結合を担うアミノ酸を含む抗体分子の部分を表す。抗体によって特異的に認識及び結合される抗原の部分は、本明細書上記の「エピトープ」と呼ばれる。上述のように、抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を典型的に含む場合があるが、両方を含む必要はない。例えば、Ｆｄ断片は、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合に無傷の抗原結合ドメインのいくらかの抗原結合機能を保持する。抗体の抗原結合断片の例には、（１）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインを有する一価断片であるＦａｂ断片；（２）２つのＦａｂ断片がジスルフィド架橋によってヒンジ領域で連結している二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（３）２つのＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片；（４）抗体の単腕のＶＬドメイン及びＶＨドメインを有するＦｖ断片、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（７）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が含まれる。Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているものの、組換え法を用いて、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対形成して一価分子を形成している単一のタンパク質鎖としてそれらを製造できるようにする合成リンカーによって繋ぐことができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３参照）。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技法を用いて得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方式で機能について評価される。本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を表し、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、少量存在するおそれがある可能な天然突然変異及び／又は翻訳後改変（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異性であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養によって合成される点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特性を示すのであって、任意の特定の方法によって抗体を産生する必要があると解釈すべきではない。例えば、本発明により使用されるべきモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）によって記載されたハイブリドーマ法によって製造することができ、又は組換えＤＮＡ法によって製造することもできる（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７（１９９１）に記載された技法を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３０】
詳細には、本明細書におけるモノクローナル抗体には、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）並びに所望の生物学的活性を示す範囲でのそのような抗体の断片が含まれる（米国特許第４８１６５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１〜６８５５（１９８４））。本明細書における関心対象のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍｉｔｉｚｅｄ）」抗体が含まれる。
【００３１】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、大部分はヒト配列のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合性部分配列など）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲとも呼ばれる）からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有する、マウス、ラット又はウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合に、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、本明細書に使用される「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基も含む場合がある。これらの改変は、抗体の性能をさらに精密化及び最適化するために行われる。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部も最適には含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）を参照されたい。
【００３２】
用語「ヒト抗体」には、例えばＫａｂａｔら（Ｋａｂａｔら（１９９１）、上記引用文中を参照されたい）によって記載された配列を含めた、当技術分野において公知のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変領域及び定常領域を有する抗体が含まれる。本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲに、特にＣＤＲ３にヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダム突然変異誘発若しくは部位特異的突然変異誘発によって導入された突然変異又はインビボの体細胞突然変異）を含む可能性がある。ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基によって置き換えられた、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれよりも多い位置を有する可能性がある。
【００３３】
本明細書に使用される「インビトロで作製された抗体」は、可変領域の全て又は部分（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）が非免疫細胞選択（例えば、インビトロのファージディスプレイ、タンパク質チップ又は抗原に結合する能力について候補配列を試験することができる任意の他の方法）で作製される抗体を表す。したがって、本用語は、免疫細胞におけるゲノム再配列によって作製される配列を好ましくは排除するものである。「二重特異性」又は「機能性抗体」は、２つの異なる重／軽鎖対及び２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結を含めた多様な方法によって産生することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ及びＬａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５〜３２１（１９９０）を参照されたい。当業者に公知の多数の方法が、抗体又はその抗原結合断片を得るために利用可能である。例えば、抗体は、組換えＤＮＡ法を用いて産生することができる（米国特許第４８１６５６７号）。モノクローナル抗体は、公知の方法にしたがって、ハイブリドーマの作製によって産生することもできる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９９参照）。次に、この方式で形成されたハイブリドーマを、酵素結合性免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ビアコア（商標））分析などの標準的な方法を用いてスクリーニングして、特定の抗原と特異的に結合する抗体を産生する１つ又は複数のハイブリドーマが同定される。任意の形態の特定の抗原を免疫原、例えば組換え抗原、天然形態、その任意の変異体又は断片、及びその抗原性ペプチドとして使用することができる。
【００３４】
抗体を製造する１つの例示的な方法には、タンパク質発現ライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリー又はリボソームディスプレイライブラリーをスクリーニングすることが含まれる。ファージディスプレイは、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５２２３４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５〜１３１７；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８に記載されている。
【００３５】
抗原の結合に直接には関与しないＦｖ可変ドメインの配列を、ヒトＦｖ可変ドメインからの等価の配列によって置き換えることによって、ヒト化抗体又はその断片を作製することができる。ヒト化抗体又はその断片を作製するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；及び米国特許第５５８５０８９号；同第５６９３７６１号；同第５６９３７６２号；同第５８５９２０５号；及び同第６４０７２１３号によって与えられている。それらの方法には、重鎖又は軽鎖のうちの少なくとも１つからの免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全て又は部分をコードしている核酸配列を単離する、操作する、及び発現させることが含まれる。そのような核酸は、上記のように予め決定された標的に対する抗体を産生しているハイブリドーマ及び他の供給源から得ることができる。次に、ヒト化抗体分子をコードしている組換えＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングすることができる。
【００３６】
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列の置換、生殖細胞系置換及び／又は復帰突然変異の導入によって最適化することができる。そのような変更された免疫グロブリン分子は、当技術分野において公知のいくつかの技法のうちのいずれかによって製造することができる（例えば、Ｔｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：７３０８〜７３１２、１９８３；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２７９、１９８３；Ｏｌｓｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、９２：３〜１６、１９８２、またＥＰ２３９４００の教示にしたがって製造される場合もある）。
【００３７】
抗体又はその断片は、国際公開第９８／５２９７６号及び国際公開第００／３４３１７号に開示された方法によって、ヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失すなわち「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）」によって改変される場合もある。簡潔には、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを分析することができ、これらのペプチドは、潜在的Ｔ細胞エピトープに相当する（国際公開第９８／５２９７６号及び国際公開第００／３４３１７号に規定されている）。潜在的Ｔ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレッディング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と名付けられているコンピューターモデル化アプローチを適用することができ、加えて、国際公開第９８／５２９７６号及び国際公開第００／３４３１７号に記載されているようにＶＨ配列及びＶＬ配列に存在するモチーフについてヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを検索することができる。これらのモチーフは、１８個の主要ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのうちのいずれかに結合するので、潜在的Ｔ細胞エピトープを構成する。検出される潜在的Ｔ細胞エピトープは、可変ドメインの少数のアミノ酸残基を置換することによって、又は好ましくは単一アミノ酸置換によって、除去することができる。これに関連して、「少ない」は、１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸残基を意味する。典型的には、保存的置換が行われる。これらに限定しないが多くの場合に、ヒト生殖細胞系抗体配列における位置に共通のアミノ酸が使用される場合がある。ヒト生殖細胞系の配列は、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｃｏｏｋ、Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１６巻（５）：２３７〜２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１４：４６２８〜４６３８に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の総合ディレクトリをもたらす（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、ＬＡ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫによりコンパイル）。これらの配列は、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲについてヒト配列の供給源として使用することができる。例えば米国特許第６３０００６４号に記載されているような、ヒトコンセンサスフレームワーク領域も使用することができる。
【００３８】
ＶＨ及びＶＬの一緒の対形成は、本明細書下記に「組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメイン」と呼ばれる単一の抗原結合部位を形成する。ＶＨに最も近接したＣＨドメインは、ＣＨ１と称される。各Ｌ鎖は、１つのジスルフィド共有結合によってＨ鎖に連結されており、一方で２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つ又は複数のジスルフィド結合によって相互に連結されている。ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）と呼ばれる相対的に保存された配列の４つの領域からなり、フレームワーク領域は、３つの超可変配列領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）のための足場を形成する。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基のうちの大部分を含有する。ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれる。したがって、重鎖のＣＤＲ構成成分はＨ１、Ｈ２、及びＨ３と呼ばれ、一方で軽鎖のＣＤＲ構成成分は、Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３と呼ばれる。
【００３９】
用語「可変」は、配列に可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性を決定することに関与する免疫グロブリンドメインの部分（すなわち、「可変ドメイン（複数可）」）を表す。可変性は、抗体の可変ドメインの全体にわたり均一に分布するわけではなく、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のそれぞれのサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変」領域又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより大きく保存された（すなわち非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ）と呼ばれる。天然重鎖可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインは、主としてβシート立体配置を採っている４つのＦＲＭ領域が３つの超可変領域によって繋がったものをそれぞれ含み、超可変領域は、βシート構造を連結し、ある場合にはβシート構造の部分を形成しているループを形成する。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭにより隣接してまとまり、他方の鎖からの超可変領域と共に抗原結合部位の形成に貢献する（Ｋａｂａｔら、上記引用文参照）。定常ドメインは、抗原結合に直接には関与しないが、例えば、抗体依存性、細胞介在性細胞傷害作用及び補体活性化などの様々なエフェクター機能を示す。
【００４０】
用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、アラニン（Ａｌａ又はＡ）；アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）；アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）；システイン（Ｃｙｓ又はＣ）；グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）；グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）；イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）：ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）；リシン（Ｌｙｓ又はＫ）；メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）；プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）；セリン（Ｓｅｒ又はＳ）；トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）；トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）；チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）；及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）からなる群から選択されるアミノ酸などの、当技術分野において認識された定義を有するアミノ酸を典型的に表すが、所望により改変、合成、又は稀少アミノ酸を使用することができる。一般には、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；陰性荷電側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；陽性荷電側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；又は非荷電の極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、及びＴｙｒ）を有することにより分類することができる。
【００４１】
本明細書に使用される場合の用語「超可変領域」（「相補性決定領域」又はＣＤＲとしても公知）は、免疫グロブリンのＶ領域ドメインの中にあり、抗原結合部位を形成し、抗原特異性の主な決定基である、抗体アミノ酸残基（通常は極度の配列可変性をもつ３つ又は４つの短い領域）を表す。ＣＤＲ残基を同定するために、少なくとも２つの方法：（１）異種間配列変動性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔら、上記引用文中）；及び（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７（１９８７））がある。しかし、２つの残基同定技法が、同一な領域でなく重複する領域を規定する範囲内で、残基同定技法を組み合わせてハイブリッドＣＤＲを規定することができる。しかし、一般的に、ＣＤＲ残基は、好ましくはいわゆるＫａｂａｔ（番号付け）システムにより同定される。
【００４２】
本発明は、Ｆａｂ（ＶＨＣＨ１：ＶＬＣＬ）又はクロスオーバーＦａｂ（ＶＨＣＬ：ＶＬＣＨ１）又はドメインＦａｂ（Ｖ１ＣＨ１：Ｖ２ＣＬ）の使用を含む。本発明者らは、ＶＨＣＨ１：ＶＬＣＬ；ＶＨＣＬ：ＶＬＣＨ１及びＶ１ＣＨ１：Ｖ２ＣＬに基づく構造を含むＦａｂ由来ヘテロ二量体を参照する。本発明において、Ｆａｂ由来ヘテロ二量体及びＣＨ１：ＣＬ主導ヘテロ二量体に２つだけの伸長が行われる。好ましい立体配置では、ＣＨ１を含む鎖及びＣＬを含む鎖のそれぞれは、ペプチド結合に基づく伸長を有する。最も好ましい立体配置では、これらの伸長は、ＣＨ１を含む鎖及びＣＬを含む鎖のＣ末端にある。この位置で伸長はＦａｂ分子の結合能に影響しないので、完全に機能性の三機能性、三価、二価二重特異性、又は三重特異性分子を生み出す。驚くことに、本発明のＣ末端融合は、図６Ａ、６Ｂに実証されたように最終融合タンパク質の安定性及び全体的な融解温度も増加させる。
【００４３】
本発明の融合タンパク質は、腫瘍抗原に対する二重結合機能及び単一の免疫活性化機能を含むように結合分子又はエフェクター分子を付けてさらに伸長される。
【００４４】
本発明の融合タンパク質は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）５Ｔ４に対する二価結合をＴ細胞活性化機能と組み合わせたものである。Ｔｂ−５Ｔ４トリボディーファミリーの例では、５Ｔ４に対する二価結合性が、ＣＤ３に対する一価結合性と組み合わされる。二価５Ｔ４結合性は、５Ｔ４抗原を過剰発現している腫瘍細胞に対する特異性を増加させる。二価結合性は、標的化複合体の解離速度を減少させることで、経時的な結合性も安定化する。Ｔ細胞ＣＤ３に対する一価結合性は、ＯＫＴ３及びＯＫＴ３由来（Ｆａｂ’）２（ＣＤ３に対する二価結合性Ｆａｂ断片）で見られるような二価ＣＤ３結合分子によるＴ細胞の活性化を回避する。これらの分子は、Ｔ細胞活性化に続く活性化誘導細胞死で、又はＴ細胞をアネルギーにすることで知られおり、移植器官の拒絶を回避することに有用であることが分かった。
【００４５】
したがって、本発明の融合タンパク質は、ＣＨ１：ＣＬ主導ヘテロ二量体を形成する２つの融合鎖から構成されている。さらなる実施形態では、２つの異なる鎖を含む融合タンパク質であって、（ｉ）一方の鎖が２つのＶＨ抗体結合ドメイン、１つのＶＬ抗体結合ドメイン及び１つのＣＨ１抗体ドメイン又はＣＬ抗体ドメインを含み、（ｉｉ）他方の鎖が２つのＶＬ抗体結合ドメイン、１つのＶＨ抗体結合ドメイン及び１つのＣＬ抗体ドメイン又はＣＨ１抗体ドメインを含み、２つの異なる鎖を含む融合タンパク質であって、但し、融合タンパク質が、一方の鎖のＣＨ１抗体ドメインと他方の鎖のＣＬ抗体ドメインとの間に１つのヘテロ二量体相互作用を含有することを条件とし、（ａ）鎖内で形成された１つ又は２つの組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインが５Ｔ４細胞外抗原に結合する能力があり；（ｂ）鎖内で形成された残りの１つ又は２つの組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインが、Ｔ細胞のＣＤ３受容体複合体に結合する能力があることを特徴とする融合タンパク質。
【００４６】
本発明の融合タンパク質は、以下の形態の可能性があり、又は以下のように規定することもできる：
ＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくは
ＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）
を
ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
と組み合わせたもの、
又は
ＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
ＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
を
ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくは
ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）
と組み合わせた形態、
又は
ＶＨ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
ＶＨ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
を
ＶＬ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
ＶＬ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
と組み合わせた形態、
又は
ＶＬ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
ＶＬ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
を
ＶＨ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
ＶＨ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
と組み合わせた形態、
又はクロスオーバーＦａｂ（ＶＨＣＬ：ＶＬＣＨ１）に基づく、
ＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくは
ＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）
を
ＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
ＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
と組み合わせた形態、
又は
ＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
ＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
を
ＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくは
ＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）
と組み合わせたもの。
【００４７】
全てのこれらの融合タンパク質は、図１Ｂ及び１Ｃに示されている。
【００４８】
包含される他のＴｂ−５Ｔ４融合タンパク質は、図１Ｄの（ｘｉｉｉ）及び（ｘｖｉ）に２つの可能な組合せについて図示するように、構造がＣＨ１及びＣＬヘテロ二量体との単一ドメイン結合物融合体（ｄＦａｂ）に基づく融合タンパク質である（図１Ｄも参照）：
Ｖ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
Ｖ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
［式中、Ｖ１は５Ｔ４に特異性を有する単一ドメイン結合体である］を
Ｖ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくは
Ｖ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）
［式中、Ｖ２は５Ｔ４又はＣＤ３に対する特異性と異なる特異性を有する単一ドメイン結合物である］
と組み合わせたもの、
又は、図１Ｄの（ｘｉｖ）及び（ｘｖｉｉ）に２つの可能な組合せについて図示するように
Ｖ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
Ｖ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
を
Ｖ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくは
Ｖ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）
と組み合わせた、異なる形態の編成
［式中、Ｖ２は５Ｔ４又はＣＤ３に対する特異性と異なる特異性を有する単一ドメイン結合物である］、
又は、図１Ｄのモデル（ｘｖ）及び（ｘｖｉｉｉ）に２つの可能な組合せについて図示するように、
Ｖ１（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
Ｖ１（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
を
Ｖ２−ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくは
Ｖ２−ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）
と組み合わせた、異なる形態の編成
［式中、Ｖ２は、５Ｔ４又はＣＤ３に対する特異性と異なる特異性を有する単一ドメイン結合物である］。
【００４９】
図１Ｄに示される組合せの全てにおいて、ｓｃＦｖは、ジスルフィドで安定化された単鎖可変断片（ｄｓＦｖ）の可能性もある。
【００５０】
したがって、好ましい実施形態では、好ましくは上記に規定される融合タンパク質が、本発明によって包含される。この融合タンパク質は、２つの異なる鎖：
ａ）第１の鎖：ＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）又は
ＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）を
第２の鎖：ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）と組み合わせたもの、
ｂ）第１の鎖：ＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
ＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）を
第２の鎖：ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）又は
ＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）と組み合わせたもの、
ｃ）第１の鎖：ＶＨ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
ＶＨ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）を
第２の鎖：ＶＬ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
ＶＬ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）と組み合わせたもの、
ｄ）第１の鎖：ＶＬ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
ＶＬ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）を
第２の鎖：ＶＨ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
ＶＨ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）と組み合わせたもの、
ｅ）第１の鎖：ＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）又は
ＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）を
第２の鎖：ＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
ＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）と組み合わせたもの、
ｆ）第１の鎖：ＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
ＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）を
第２の鎖：ＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）又は
ＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）と組み合わせたもの、
ｇ）第１の鎖Ｖ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
Ｖ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）を
第２の鎖：Ｖ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）又は
Ｖ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）と組み合わせたもの、
ｈ）第１の鎖：Ｖ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
Ｖ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）を
第２の鎖：Ｖ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）又は
Ｖ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）と組み合わせたもの、
ｉ）第１の鎖：Ｖ１（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
Ｖ１（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）を
第２の鎖：Ｖ２−ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）又は
Ｖ２−ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）と組み合わせたもの
［式中、ＶＨ、ＶＬは抗体結合ドメインであり、ＣＨ１及びＣＬは抗体ドメインである］を含み、（ａ）鎖内に形成された１つ又は２つの組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインが、５Ｔ４細胞外抗原に結合する能力があり；（ｂ）鎖内に形成された残りの１つ又は２つの組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインがＴ細胞のＣＤ３受容体複合体に結合する能力があるような融合タンパク質である。
【００５１】
実施形態では、融合タンパク質とも呼ばれるＴｂ−５Ｔ４融合タンパク質は、ＣＨ１：ＣＬを含む部分が５Ｔ４抗原に結合性であって、ＣＨ１を含む鎖及びＣＬを含む鎖のそれぞれが、Ｃ末端に別の結合分子を付けて伸長されている融合タンパク質を含む。ＣＨ１：ＣＬを含む部分が１つの５Ｔ４結合機能を与える場合、追加的な融合型結合物は、少なくとも１つの他の５Ｔ４結合分子及び１つの他のＣＤ３結合分子を含む。
【００５２】
本発明の融合タンパク質は、正常な抗体に見られるようなＶドメインの組合せに由来する可能性がある。それらは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）として形式化することができる。ｓｃＦｖは、形式ＶＨ−リンカー−ＶＬ又は形式ＶＬ−リンカー−ＶＨである可能性がある。両方の形式は、結合特性及び安定性に差を有する可能性がある。両方の形式は、当業者による過度の負担なしに比較することができる。ｓｃＦｖの使用が、国際公開第８８／０１６４９号（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）及び米国特許第５４５５０３０号（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）によって考えられている。
【００５３】
ｓｃＦｖ分子は、当技術分野において記載されているリンカー分子を含む。技術は、リンカー配列をＶＨ及びＶＬの特定の対について最適化できる例を含有している。好ましいリンカーは、第１のＶドメインのＣ末端と第２のＶドメインのＮ末端との間の距離に及ぶ。好ましいリンカーは、可変領域のフォールディングを妨害しないために十分に柔軟でもある。好ましいリンカーは、抗原性抗体エピトープ及び免疫原性Ｔ細胞エピトープを全く含有しない。ｓｃＦｖの２つのＶドメインを繋ぐ好ましいリンカーの例は、多数のグリシン（柔軟な非免疫原性アミノ酸）及びセリン（高い溶解性を有する柔軟な低免疫原性アミノ酸）を含有する１５〜１８アミノ酸長のペプチドである。当技術分野において公知の最も好ましいリンカーの例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳである、又は（ＧＧＧＧＳ）３と記される。
【００５４】
可変ドメインは、一般には、安定な相互作用を有さず、ＶＨ：ＶＬの解離定数は、１０ｍＭと高い可能性がある。結果として、Ｖドメイン二量体は、解離していることが多い。両方のドメインを融合させるリンカーは、再会合の機会を増加させる。
【００５５】
１つの他の技法が、当技術分野において公知である：国際公開第９４／２９３５０号（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍａｋｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｈａｖｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）は、人工ジスルフィド架橋を工学的に作製するための、ＶＨとＶＬとの間の特異的部位における工学操作を教示している。このようにして、共有結合的に安定な二量体を得ることができる。本発明において、可変結合断片が単鎖ポリペプチドであることが好ましい。２つがＴｂ−５Ｔ４トリボディーなどの融合タンパク質のために必要であるので、単鎖形式はＶドメインの誤対合を回避することで産物のばらつき及び非機能性誘導体の産生を回避する。しかし、ＶＨ−ＶＬ対の頻繁な解離及び再会合は、特別な場合にＴｂ−５Ｔ４などの別の融合タンパク質との二量体形成に至る場合がある。これらの産物は、可能な二価抗ＣＤ３結合性を有することで、腫瘍標的細胞に蓄積しない場合であってもＴ細胞の潜在的活性化を有する。
【００５６】
ｓｃＦｖ分子に基づく多くの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）が、オフターゲット毒性を炎症性サイトカイン産生の形で誘導する。誘導される典型的なサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ及びＴＮＦ−アルファである。刺激が高い及び／又はサイトカインストームが臨床的に制御されない場合、そのことは、臓器不全に繋がり、生命を脅かすおそれがある。
【００５７】
本発明は、ジスルフィドで安定化された単鎖可変ドメイン（ｄｓＦｖ）を作り出すために、国際公開第８８／０１６４９号に教示されているような単鎖可変ドメイン技法と、国際公開第９４／２９３５０号に教示されているようなＶ断片のジスルフィド安定化との組合せを使用する可能性がある、又は使用する。
【００５８】
本発明の融合タンパク質を組み立てるために、機能的結合分子を形成する可変ドメインを選択しなければならない。正常組織における交差反応性が記載されていない、５Ｔ４  ＴＡＡに結合性の適切な抗体は、マウスモノクローナル５Ｔ４．Ｈ８として公知である。５Ｔ４．Ｈ８の可変ドメインは、配列番号０１及び配列番号１６に示される、又はそれに含まれる、又はそれからなる。これらの配列の構造的により安定な誘導体は、配列番号０２及び配列番号１７に示される、又はそれに含まれる、又はそれからなる。マウス可変ドメインフレームワーク領域は、当技術分野において公知の様々な方法を使用してヒト化される可能性がある。ヒト化可変ドメインの例は、ＶＨドメインについて配列番号３〜１５（配列番号３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５）及びＶＬドメインについて配列番号１８〜２５（配列番号１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５）に示される、又はそれに含まれる、又はそれからなる。ヒト化フレームワーク残基は、一般には抗原性及び／又は免疫原性がより低いと考えられるので、好ましい。したがって、本発明のＴｂ−５Ｔ４などの好ましい融合タンパク質は、配列番号３〜１５のＶＨ配列と配列番号１８〜２５のＶＬ配列との組合せを有する。したがって、実施形態は、配列番号３〜１５のうちの１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列の１つを含む、又は１つからなるＶＨ配列と、配列番号１８〜２５のうちの１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列の１つを含む、又は１つからなるＶＬ配列との組合せを有する、本発明のＴｂ−５Ｔ４などの融合タンパク質に関する。次に、機能的組合せを、ＶＨ−リンカー−ＶＬ形式若しくはＶＬ−リンカー−ＶＨ形式のジスルフィドで安定化された単鎖可変ドメイン（ｄｓＦｖ）に形式化することができ、又はＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに移植してＶＨＣＨ１：ＶＬＣＬ  Ｆａｂ又はＶＨＣＬ：ＶＬＣＨ１クロスオーバーＦａｂを作り出することができる。
【００５９】
ＣＤ３複合体への適切な結合物を、類似の方法で組み立てることができる。Ｔ細胞を活性化するいくつかのＣＤ−イプシロン結合物が、当技術分野において公知である。ＯＫＴ３は、移植拒絶を予防するために使用されるマウスモノクローナルである。ＯＫＴ３配列（配列番号２６及び配列番号３４又はこれらの配列を含む、若しくはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列）の使用が米国特許第６７５０３２５号（ＣＤ３  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）及び国際公開第２００８／０７９７１３号（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＬＡＤＡ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｄｕｌｔ−ｏｎｓｅｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）によって教示されている。ＯＫＴ３可変配列のヒト化形態は、米国特許第７６３５４７５号（Ｎｏｖｅｌ  ｄｉａｂｏｄｙ−ｔｙｐｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）及び国際公開第２００５／０４０２２０号（Ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ＣＤ３−ｂｉｎｄｅｒｓ）に開示されている。ヒト化ＯＫＴ３由来のＶＨドメイン配列は、配列番号２７；２８；２９（又はこれらの配列を含む、若しくはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列）に示されている。ヒト化ＯＫＴ３由来のＶＬドメイン配列は、配列番号３５；３６；３７（又はこれらの配列を含む、若しくはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列）に示されている。ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ  Ｆａｂ又はクロスオーバーＦａｂ組合せを作り出すためのＯＫＴ３可変ドメインに基づくＣＤ３結合部分は、配列番号２７〜２９（又はこれらの配列を含む、若しくはこれらの配列のうちの１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列）と配列番号３５〜３７（又はこれらの配列を含む、若しくはこれらの配列のうちの１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列）とから製造することができる。
【００６０】
ＣＤ３に対する他の結合物は、米国特許第７７２８１１４号（Ａｎｔｉ−ＣＤ３  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ）（配列番号３０及び３８又はこれらの配列を含む、若しくはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列）；国際公開第９４／０４６７９号（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｔｈｅｍ）（配列番号３２及び４０又はこれらの配列を含む、若しくはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列）、米国特許第７３８１８０３号（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＣＤ３）（配列番号３３及び４０又はこれらの配列を含む、若しくはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列）によって、又はＬｉら（２００５）．「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＣＤ３  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  １２Ｆ６  ｗｉｔｈ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．」Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１６（４）：４８７〜４９８（配列番号３１及び３９又はこれらの配列を含む、若しくはこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列）によって記載されているように当技術分野において公知である。他の種のＣＤ３分子にも結合する適切な抗ＣＤ３結合物の他の例は、国際公開第２００８／１１９５６７号（Ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）に記載されており、国際公開第２０１０／０３７８３５号によって教示されるように、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーの創出における抗ＣＤ３結合物の使用も記載されている。
【００６１】
本発明の実施形態では、次に、ＶＨ及びＶＬの選ばれた組合せは、単鎖可変断片に形式化することができる。これは、配置ＶＨ−Ｌ２−ＶＬ又はＶＬ−Ｌ２−ＶＨの可能性がある［式中、Ｌ２は、第１の可変ドメインのＣ末端アミノ酸を第２の可変ドメインのＮ末端に繋いでいるリンカー配列である］。好ましいリンカーは１５〜３０アミノ酸長であり、最小の疎水性及び免疫原性又は抗原性と共に高い柔軟性を有する。好ましいリンカーの例は、さらに数個（２〜４つ）の小型アミノ酸で伸長されている可能性がある（ＧＧＧＧＳ）３リンカーである。そのような伸長された（ＧＧＧＳ）３リンカーの例は、配列ＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＧである。代替的なリンカーが当技術分野で公知であり、安定性又は溶解性を増加させるために抗体断片への立体障害を最小にするように最適化されている。当技術で公知のリンカーを、より最適なｓｃＦｖ分子を得るために評価することができる。Ｌ２リンカーのさらなる最適化は、選択系と連動した無作為化により得ることができる。そのような最適化の例は、Ｔａｎｇら、１９９６「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｎｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１、１５６８２〜１５６８６に示されている。
【００６２】
本発明のｓｃＦｖは、ｓｃＦｖのジスルフィド安定化形態を導入することによってさらに安定化することができる。国際公開第９４／２９３５０号は、どの位置がＶＨドメインのＣ末端側の半分とＶＬドメインのＣ末端側の半分との間に非天然ジスルフィド結合を工学的に作製するために適格であるかを説明している。他の例が、Ｓｃｈｉｅｄｌら、２０００「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．（２０００）１３（１０）：７２５〜７３４によって例証されている。これらの刊行物の教示とは異なり、驚くことに、本発明の好ましい分子は、適正なＶＨとＶＬとの間に工学的に作製されたジスルフィド結合でさらに安定化された単鎖可変断片である単一のペプチド分子を使用している。これによって、ＣＤ３結合物の多量体化が原因の高度活性化複合体の形成が防止された。驚くことに、融合タンパク質に存在する２つの異なるｓｃＦｖにドメイン間ジスルフィド結合を工学的に作製しても、ミスマッチの対は形成しなかった。融合タンパク質がすでに８つのドメイン内ジスルフィド結合及び１つの鎖間ジスルフィド結合を含有し、今回もう２つのドメイン間ジスルフィド結合が導入されていることを考慮すれば、本発明の融合タンパク質にジスルフィド誤対合が全くなかったことも、同じく驚くべきことであった。本発明の融合タンパク質が分子全体のより高い安定性を有することも、驚くべきことであった。一例は、新規なヒト化形態のＣＤ３結合性ｓｃＦｖ（ＯＫＴ３）をｄｓ安定化させた場合（ｄｓｈｕＯＫＴ３−３１）のＴ細胞活性化能における驚くべき増加である。５Ｔ４結合物に関する組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメイン（すなわち組合せＶＨ／ＶＬとも呼ばれる）についての配列は、配列番号４２（ｓｃＦｖ５Ｔ４）；配列番号４３（ｓｃＦｖｈｕ５Ｔ４）；配列番号４４（ｄｓＦｖｈｕ５Ｔ４）に示されている。結合性がＯＫＴ３に基づく、ＣＤ３に対する組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインについての配列は、配列番号４５（ｓｃＦｖＯＫＴ３）；配列番号４６（ｓｃＦｖｈｕＯＫＴ３ｖ３２）及び配列番号４７（ｄｓＦｖｈｕＯＫＴ３ｖ３２）である。本発明の別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４８におけるＵＣＨＴ１に基づく、ジスルフィドで安定化されたヒト化ＣＤ３結合物（ｄｓＦｖｈｕＵＣＨＴ１−２４）を含有する。言うまでもなく、当業者は、配列番号１〜４１における配列表に基づき他の機能的組合せを製造することができる（すなわち融合タンパク質の人工配列部分とも呼ばれる）。これらの配列を含む配列（すなわち配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８）又はこれらの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列も、本発明によって包含される。異なるフレームワークへの抗原の結合性を担う領域を移植することも、当技術分野において公知である。抗原結合部位は、「バーニア（Ｖｅｒｎｉｅｒ）」ゾーンの構造的疎水性コアによって支持されている６つの別個の相補的決定領域（ＣＤＲ）から構成されている。ＣＤＲ及び不可欠な支持配列の���植は、米国特許第８３９９６２５号の教示にあり、例えば国際公開第９１／０９９６７号；米国特許第５２２５５３９号；米国特許第５６９３７６１号又は同第５８２１３３７号に開示されているように、異なる種からの抗原結合部位をヒトフレームワーク残基と組み合わせるためにしばしば使用される。抗体に応じて、ＣＤＲループの全ての配列が必要なわけでなく、不可欠な位置は、アラニン走査突然変異誘発によって判定することができる。アラニン走査突然変異誘発では、ＣＤＲループの各アミノ酸がＡｌａに変化され、結合性について評価される。抗原結合部位を保存するために最小限の残基を決定する技法の、より最近の好ましい変形は、国際公開第２０１２／０３８６０９号「Ｓｕｐｅｒ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、及びＰｅｌａｔら（２０１１）「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」ＭＡｂｓ  ３（３）：２４３〜２５２に記載されている。当業者は、本発明の融合タンパク質に含有される抗原結合部位を、配列番号１〜４１に挙げられるような異なるフレームワークに容易に変化させることができる。
【００６３】
所望のＶドメインが同定された後、マッチするペアを選択して、Ｆａｂ定常ドメインＣＨ１及びＣＬに移植する必要がある。この技法は、Ｖドメイン（ＶＨ及びＶＬ）並びにＣドメイン（ＣＨ１及びＣＬ）の非天然組合せを含有する「キメラ」Ｆａｂ分子をもたらす。結合性及び安定性に影響する可能性があるＦａｂのフォールディングを破壊しないように、天然Ｆａｂ配列との相同性によって置換を導くことができる。Ｆａｂのキメラ化は、当技術分野において十分に記載されている（例えば、米国特許出願公開第２００３／００９５９６４号「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｃｈｉｍｅｒａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」を参照されたい）。ＶＨＣＬ：ＶＬＣＨ１立体配置のクロスオーバーＦａｂ鎖の創出でさえも、十分に記載されており、Ｖドメインの移植の成功を可能にする（例えば、Ｆｅｎｎら（２０１３）「Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−Ａｎｇ２  ＣｒｏｓｓＦａｂ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ．」ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（４）：ｅ６１９５３を参照されたい）。
【００６４】
本発明の実施形態では、Ｆａｂ由来鎖（一方の腕のＣＨ１含有鎖及び他方の腕のＣＬ含有鎖）のＣ末端アミノ酸は、選択されたｓｃＦｖ又はｄｓＦｖ又は単一ドメイン結合物又はエフェクター分子（抗体由来又は非抗体由来）と選ばれたリンカー配列Ｌ１で結合される。Ｌ１は、単一のアミノ酸と同じ短さの可能性があり、機能的に必要なだけ長い可能性がある。Ｌ１が２つのｓｃＦｖ由来構成ブロックとＦａｂ由来部分との間にいくらかの間隙を導入するべきであることが好ましい。また、Ｌ１がリンカーの柔軟性をいくらか有するべきであることが好ましい。Ｌ１の長さは、エピトープの位置とＣＤ３との間の最適な距離に適合するように最適化することができる。そのような例は、Ｈｏｍｂａｃｈら（２００７）．「Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｉｋｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｔｈｅ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８（７）：４６５０〜４６５７；及びＧｕｅｓｔら（２００５）．「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｃｅｒ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｕｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｃＦｖｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．」Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２８（３）：２０３〜２１１に見出すことができる。リンカー配列の組成は、硬さ、プロテアーゼ耐性について最適化することができ、又は追加的な機能を含有することができる。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、マウス５Ｔ４結合物に基づく融合タンパク質（Ｔｂ５３５Ｃ）についての配列番号４９（ＣＨ１含有鎖）及び配列番号５０（ＣＬ含有鎖）並びにヒト化５Ｔ４結合物に基づく本発明の融合タンパク質（Ｔｂ５３５Ｈ）についての配列番号５１（ＣＨ１含有鎖）及び配列番号５２（ＣＬ含有鎖）を含む。
【００６６】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、マウス５Ｔ４結合物に基づく融合タンパク質（Ｔｂ５３５Ｃ）についての配列番号４９（ＣＨ１含有鎖）と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列及び配列番号５０（ＣＬ含有鎖）と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。別の好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒト化５Ｔ４結合物に基づく本発明の融合タンパク質（Ｔｂ５３５Ｈ）についての配列番号５１（ＣＨ１含有鎖）と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有する配列及び配列番号５２（ＣＬ含有鎖）と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する配列を含む。
【００６７】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、マウス５Ｔ４結合物に基づく融合タンパク質（Ｔｂ５３５Ｃ）についての配列番号４９（ＣＨ１含有鎖）及び配列番号５０（ＣＬ含有鎖）の配列を含む又はそれからなる。別の好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ヒト化５Ｔ４結合物に基づく本発明の融合タンパク質（Ｔｂ５３５Ｈ）についての配列番号５１（ＣＨ１含有鎖）及び配列番号５２（ＣＬ含有鎖）の配列を含む又はそれからなる。
【００６８】
最良の結果がＴｂ５３５Ｈで得られたが、驚くことに、Ｔｂ５３５Ｈはコンパクトな立体配置を有する（図５Ａ）。したがって、Ｔｂ５３５Ｈは実に安定であり（図６Ａｄ）、Ｔｂ５３５Ｈは産生がより容易である（最適な収量は図７Ｄで得られた）と想定することができよう。加えて、驚くことに、そのような融合タンパク質は、大きな分布容積を有し、浄化が遅いことが見出された（図１０）。最終的に、この融合タンパク質の活性は、種々の腫瘍型に対して最適である（図９、１１Ａ、１１Ｂ）。
【００６９】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１〜１５のうちのいずれか１つからなる、又はそれを含む、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する、１つ又は２つのＶＨ結合ドメインを含む。好ましいＶＨは、配列番号６からなる、又はそれを含む、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列によって表される。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号１６〜２５のうちの任意の１つからなる、又はそれを含む、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する、１つ又は２つのＶＬ結合ドメインを含む。好ましいＶＬは、配列番号１９からなる、又はそれを含む、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列によって表される。本発明の融合タンパク質は、配列番号１〜１５のうちのいずれか１つと、配列番号１６〜２５のうちのいずれかとの組合せを含むことが好ましい。より好ましい本発明の融合タンパク質は、配列番号６からなる、それを含む、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列によって表されるＶＨと、配列番号１９からなる、又はそれを含む、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する配列によって表されるＶＬとの組合せを含む。
【００７０】
本発明の別の実施形態では、融合タンパク質は、ｉ）配列番号２６〜３３のうちの任意の１つからなる、若しくはそれを含む、若しくはそれと少なくとも９０％の同一性を有する１つ若しくは２つのＶＨ結合ドメインを含む、又はｉｉ）配列番号３４〜４１のうちの任意の１つからなる、若しくはそれを含む、若しくはそれと少なくとも９０％の同一性を有する１つ若しくは２つのＶＬ結合ドメインを含む。好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号２６〜３３のうちの任意の１つと、配列番号３４〜４１のうちのいずれかとの組合せを含む。融合タンパク質は、ｉ）配列番号２９からなる、若しくはそれを含む、若しくはそれと少なくとも９０％の同一性を有する１つ若しくは２つのＶＨ結合ドメインを含む、又はｉｉ）配列番号３７からなる、若しくはそれを含む、若しくはそれと少なくとも９０％の同一性を有する１つ若しくは２つのＶＬ結合ドメインを含むことが、より好ましい。
【００７１】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、配列番号４２〜４４のうちの任意の１つ又は配列番号４５〜４８のうちのいずれか１つからなる、又はそれを含む、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する、１つ又は２つの組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインを含み、より詳細には１つ又は２つの組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインは、配列番号４２〜４４のうちのいずれか１つからなる、又はそれを含む、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有し、残りの１つ又は２つの組合せＶＨ／ＶＬ結合ドメインは、配列番号４５〜４８のうちのいずれか１つからなる、又はそれを含む、又はそれと少なくとも９０％の同一性を有する。より好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質の一方の鎖は配列番号４９を含むのに対して、他方の鎖は配列番号５０を含む、又は一方の鎖は配列番号５１を含み、他方の鎖は配列番号５２を含む。
【００７２】
本発明は、本明細書記載の本発明の融合タンパク質をコードしている核酸配列だけでなく、そのような核酸配列を含むベクター又はそのような核酸配列若しくはそのようなベクターを形質転換若しくは形質移入された宿主細胞も含む。
【００７３】
本発明は、また、本発明の融合タンパク質を産生させる方法からなる又はそれを含み、前記方法は、上記に規定される宿主細胞を、本発明の融合タンパク質の発現を可能にする条件で培養するステップ及び培養物から産生された融合タンパク質を回収するステップを含む。
【００７４】
好ましい実施形態では、本発明は、医薬として使用するための、より詳細には、増殖性疾患、腫瘍性疾患、及び免疫障害から選択される疾患の予防、治療又は回復における使用のための、本発明の融合タンパク質を含む、又は上記方法により産生された医薬組成物である。本発明は、また、本発明の融合タンパク質、上記の核酸分子、上記のベクター、又は上記の宿主細胞を含むキットを提供するものである。
【００７５】
本発明の融合タンパク質は、好ましくは、「単離された」融合タンパク質である。本明細書に開示された融合タンパク質を説明するために使用された場合の「単離された」は、その産生環境の構成成分から同定、分離及び／又は回収された融合タンパク質を意味する。好ましくは、単離された融合タンパク質は、その産生環境からの全ての他の構成成分との関連を有さない。組換え形質移入細胞に起因する混入構成成分などの、その産生環境の混入構成成分は、ポリペプチドについての診断的使用又は治療的使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性溶質又は非タンパク質性溶質を含む場合がある。好ましい態様では、融合タンパク質は、（１）スピニングカップ配列決定装置（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によってＮ末端アミノ酸配列若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な程度まで、又は（２）クマシーブルー若しくは好ましくは銀染料を使用した非還元条件若しくは還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質となるまで、精製される。しかし通例、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。当業者は、本発明の融合タンパク質が自然界でそれ自体として存在しないことを理解している。本発明の融合タンパク質は、組換え分子生物学的技法によって産生されている。
【００７６】
本発明に関連して、タンパク質は、アミノ酸配列によって表される。本発明に関連して、好ましいタンパク質は、本明細書において同定された融合タンパク質又はその鎖である。
【００７７】
本発明に関連して、そのようなタンパク質若しくは融合タンパク質又はその鎖をコードしている核酸分子としての核酸分子は、核酸又はヌクレオチド配列によって表される。核酸分子は、調節領域を含む場合がある。
【００７８】
本明細書において所与の配列識別番号（配列番号）によって識別される各タンパク質は、開示されたこの特異的配列に限定されず、本明細書上記に規定されたものと類似の活性を示すタンパク質変異体又は誘導体も包含することを理解すべきである。（例えば）所与の配列番号Ｘによって識別され、そのようなタンパク質をコードしている各核酸分子について同じことが当てはまり、本発明は、配列番号Ｘによって最初にコードされているタンパク質のうちの１つと類似の活性を有するタンパク質をコードしている核酸分子変異体又はその誘導体も包含する。これに関連して、活性は、５Ｔ４に対する融合タンパク質の結合性及び／又は５Ｔ４発現細胞の、好ましくは腫瘍細胞の、誘導死の場合がある。より好ましくは、結合性及び／又は死滅の判断は、図８に示される実験で実施される通りである。
【００７９】
本出願にわたり、所与のタンパク質若しくは融合タンパク質又はその鎖をコードしている特異的ヌクレオチド配列の配列番号（例として配列番号Ｘとする）を参照するたびに、ヌクレオチド配列は：
ｉ．配列番号Ｘと少なくとも６０％の配列同一性若しくは類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｉ．相補鎖が、（ｉ）の配列の核酸分子とハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｉｉｉ．配列が、遺伝コードの縮重が原因で、（ｉ）若しくは（ｉｉ）の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列；又は
ｉｖ．ヌクレオチド配列の配列番号Ｘによってコードされているアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列
によって置き換えられる場合がある。
【００８０】
本出願にわたり、特異的アミノ酸配列の配列番号（例として配列番号Ｙとする）を参照するたびに、ヌクレオチド配列は：配列番号Ｙのアミノ酸配列と少なくとも６０％の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質若しくは融合タンパク質又はその鎖によって置き換えられる場合がある。
【００８１】
それぞれ所与のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列との同一性パーセンテージ又は類似性パーセンテージ（少なくとも６０％）に基づき、本明細書に記載された各ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、さらに好ましい実施形態で、それぞれ所与のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の同一性若しくは類似性又はそれを超える同一性若しくは類似性を有する。好ましい実施形態では、配列同一性又は配列類似性は、本明細書において同定された配列の全長を比較することによって決定される。本明細書において特に指示しない限り、所与の配列番号との同一性又は類似性は、上記配列の完全長に基づく（すなわちその全長にわたる又は全体としての）同一性又は類似性を意味する。
【００８２】
「配列同一性」は、本明細書において、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列を比較することによって決定されるような、それらの配列の間の関係として規定される。好ましい実施形態では、配列同一性は、２つの所与の配列番号の完全長又はその部分に基づき計算される。その部分は、両方の配列番号の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％を好ましくは意味する。当技術分野において、「同一性」は、場合によってはそのような配列の列の間のマッチによって決定されるような、アミノ酸配列又は核酸配列の間の配列関連性の程度も意味する。
【００８３】
２つのアミノ酸配列の間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存的アミノ酸置換物を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ、Ｈ．、及びＬｉｐｍａｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９８８）に記載されている方法を非限定的に含めた公知の方法によって容易に計算することができる。
【００８４】
同一性を決定するために好ましい方法は、被験配列の間に最大のマッチを与えるように計画される。同一性及び類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムに暗号化されている。２つの配列の間の同一性及び類似性を決定するために好ましいコンピュータープログラム方法には、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）が含まれる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及び他の入手源から公的に入手可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）が含まれる。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用することができる。
【００８５】
ポリペプチド配列の比較のために好ましいパラメーターには、以下：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０）；比較行列：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５〜１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップ（Ｇａｐ）ペナルティー：１２；及びギャップ長ペナルティー：４が含まれる。これらのパラメーターに有用なプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから「Ｏｇａｐ」プログラムとして公的に入手可能である。上記パラメーターは、アミノ酸比較についてのデフォルトのパラメーターである（末端ギャップについてペナルティーなしに加えて）。
【００８６】
核酸比較のために好ましいパラメーターには、以下：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０）；比較行列：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティー：５０；ギャップ長ペナルティー：３が含まれる。Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓにあるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐからギャッププログラムとして入手可能である。核酸比較のためのデフォルトのパラメーターを上に示す。
【００８７】
任意選択で、アミノ酸の類似度を決定するにあたり、当業者は、当業者に明らかなように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮することができる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を表す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり；アミノ含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり；含硫側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換の群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書開示のアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列における少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその位置に挿入された置換変異体である。アミノ酸変化は、保存的であることが好ましい。天然アミノ酸のそれぞれについて好ましい保存的置換は、以下の通りである：ＡｌａからＳｅｒ；ＡｒｇからＬｙｓ；ＡｓｎからＧｌｎ又はＨｉｓ；ＡｓｐからＧｌｕ；ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａ；ＧｌｎからＡｓｎ；ＧｌｕからＡｓｐ；ＧｌｙからＰｒｏ；ＨｉｓからＡｓｎ又はＧｌｎ；ＩｌｅからＬｅｕ又はＶａｌ；ＬｅｕからＩｌｅ又はＶａｌ；ＬｙｓからＡｒｇ；ＧｌｎからＧｌｕ；ＭｅｔからＬｅｕ又はＩｌｅ；ＰｈｅからＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒ；ＳｅｒからＴｈｒ；ＴｈｒからＳｅｒ；ＴｒｐからＴｙｒ；ＴｙｒからＴｒｐ又はＰｈｅ；及びＶａｌからＩｌｅ又はＬｅｕ。
【００８８】
包含されるいくつかの種類の融合タンパク質変異体を後述する。本明細書記載の融合タンパク質のアミノ酸配列の改変が予期されている。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を改善することが理想的な場合がある。融合タンパク質のアミノ酸配列変異体は、融合タンパク質の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入すること、又はペプチド合成によって調製される。
【００８９】
そのような改変には、例えば、融合タンパク質のアミノ酸配列からの欠失、及び／又はアミノ酸配列への挿入、及び／又はアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴を有するという条件で最終構築物に到達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組合せが行われる。アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置を変化させるなどの、融合タンパク質の翻訳後過程を変更する可能性もある。ＣＤＲの中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が置換される場合があり、一方でＦＲの中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２５個のアミノ酸が置換される場合があることが好ましい。置換は、好ましくは本明細書記載の保存的置換である。追加的又は代替的に、ＣＤＲのそれぞれに１、２、３、４、５、又は６つのアミノ酸が挿入又は欠失される場合があり（もちろん、ＣＤＲの長さに応じて）、一方で、ＦＲのそれぞれに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２５個のアミノ酸が挿入又は欠失される場合がある。
【００９０】
突然変異誘発に好ましい位置である、融合タンパク質の特定の残基又は領域の同定に有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓによってＳｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１〜１０８５（１９８９）に記載されているように「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれている。この方法で、融合タンパク質内の残基又は標的残基の群が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を及ぼすために、中性アミノ酸又は陰性荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。
【００９１】
次に、置換に対する機能的感受性を示しているそれらのアミノ酸位置が、置換部位に又は置換部位について、さらなる変異又は他の変異を導入することによって精密化される。このように、アミノ酸配列変異を導入するための部位が予め決定されているものの、突然変異の性質が、本質的に予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位での突然変異の性能を分析するために、標的コドン又は領域でａｌａ走査又はランダム突然変異誘発が行われ、発現された融合タンパク質変異体が、所望の活性についてスクリーニングされる。
【００９２】
アミノ酸配列の挿入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０残基長から、１００個以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲のアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合、並びに１つ又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含むことが好ましい。融合タンパク質の挿入変異体には、酵素に対する抗体のＮ若しくはＣ末端との融合又は抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドとの融合が含まれる。
【００９３】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、融合タンパク質の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸残基が異なる残基によって好ましくは置き換えられている。置換突然変異誘発にとって最も関心がもたれる部位には、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が含まれるが、重鎖及び／又は軽鎖ＦＲの変更も考えられる。
【００９４】
例えば、ＣＤＲ配列が６つのアミノ酸を包含するならば、これらのアミノ酸のうちの１、２又は３つが置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５個のアミノ酸を包含するならば、これらのアミノ酸のうちの１、２、３、４、５又は６つが置換されることが想定される。
【００９５】
一般には、アミノ酸が重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲの１つ又は複数又は全てで置換されるならば、次に得られた「置換された」配列が、本明細書の上記に規定されたような「本来の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％、より好ましくは６５％、いっそうより好ましくは７０％、特に好ましくは７５％、より際立って好ましくは８０％同一であることが好ましい。これは、ＣＤＲの長さがどの程度までが「置換された」配列と同一であるかに依存することを意味する。例えば５つのアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１つのアミノ酸を置換させるためには、その置換された配列と好ましくは８０％同一である。したがって、融合タンパク質のＣＤＲは、それらの置換された配列と種々の程度の同一性を有する場合があり、例えば、ＣＤＲＬ１が８０％を有する場合がある一方で、ＣＤＲＬ３は９０％を有する場合がある。好ましい置換（又は置き換え）は保存的置換である。しかし、融合タンパク質が第１の結合ドメインを介して５Ｔ４及び第２の結合ドメインを介してＣＤ３に結合する能力を保持し、並びに／又はそのＣＤＲが、その後置換された配列と同一性を有する（「本来の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％、より好ましくは６５％、いっそうより好ましくは７０％、特に好ましくは７５％、より際立って好ましくは８０％同一である）限り、任意の置換（非保存的置換を含む）が想定される。
【００９６】
融合タンパク質の他の改変が、本明細書において考えられている。例えば、融合タンパク質は、多様な非タンパク質性ポリマーうちの１つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーに連結される場合がある。融合タンパク質は、例えば、コアセルベーション技法若しくは界面重合（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル）によって調製されたマイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノパーティクル及びナノカプセル）に、又はマクロエマルションに封入することもできる。そのような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｌｏ、Ａ．、Ｅｄ．、（１９８０）に開示されている。本明細書に開示された融合タンパク質は、イムノリポソームとして製剤化することもできる。「リポソーム」は、薬物を哺乳類に送達するために有用な、様々な種類の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤から構成される小型小胞である。リポソームの構成成分は、生体膜の脂質配置に類似して、二重層を形成して通常配置されている。抗体を含有するリポソームは、例えばＥｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０）；米国特許第４４８５０４５号及び同第４５４４５４５号；並びに１９９７年１０月２３日に公開された国際公開第９７／３８７３１号に記載されたような、当技術分野において公知の方法によって調製される。向上した循環時間を有するリポソームは、米国特許第５０１３５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成で逆相蒸発法によって作製することができる。リポソームは、所定の孔径のフィルターを通して押し出され、所望の直径のリポソームがもたらされる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６〜２８８（１９８２）に記載されているようにジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートすることができる。化学療法剤は、リポソームに任意選択で含有される。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）１４８４（１９８９）を参照されたい。
【００９７】
組換え技法を使用する場合、融合タンパク質を細胞内若しくは細胞周辺腔に産生させる、又は培地中に直接分泌させることができる。融合タンパク質が細胞内に産生するならば、第１のステップとして、宿主細胞又は溶解した断片のいずれかの粒子性残骸が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７（１９９２）は、大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）の細胞周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順を記載している。
【００９８】
細胞から調製された融合タンパク質組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技法である。
【００９９】
さらなる態様では、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸配列に関する。前記核酸分子は、宿主細胞内に好ましくは含まれるベクターに好ましくは含まれる。前記宿主細胞は、例えば本発明の核酸配列を形質転換又は形質移入後に、融合タンパク質を発現する能力がある。そのために、核酸分子は、制御配列と作動的に連結されている。
【０１００】
本明細書に使用される用語「宿主細胞」は、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸に形質転換、形質移入などによって導入されている細胞を表すことが意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫又は潜在的子孫も表すことを理解すべきである。突然変異又は環境の影響のいずれかが原因で特定の改変が後代に発生するおそれがあるので、そのような子孫は、実際には親細胞と同一でないおそれがあるが、それでも本明細書に使用される用語の範囲内に含まれる。
【０１０１】
本明細書に使用される用語「発現」は、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、及び分泌を非限定的に含めた、本発明の融合タンパク質の産生に関与する任意のステップを含む。
【０１０２】
用語「制御配列」は、特定の宿主生物における作動的に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を表す。原核生物に適切な制御配列には、例えば、プロモーター、任意選択でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが公知である。
【０１０３】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「作動的に連結されている」。例えば、予備配列若しくは分泌リーダーがポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現されるならば、予備配列若しくは分泌リーダーに関するＤＮＡはポリペプチドに関してＤＮＡに作動的に連結されており；プロモーター若しくはエンハンサーが配列の転写に影響するならば、それはコード配列に作動的に連結されており；又はリボソーム結合部位が翻訳を促進するように置かれるならば、それはコード配列に作動的に連結されている。一般には、「作動的に連結されている」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダーの場合は隣接しており読取り相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、隣接している必要がない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しないならば、慣例により合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。適切な宿主細胞には、原核生物及び並びに酵母、真菌、昆虫細胞及び哺乳類細胞を含めた真核生物性宿主細胞が含まれる。本発明の融合タンパク質を細菌に産生させることができる。
【０１０４】
本発明の融合タンパク質の発現後、融合タンパク質が、大腸菌細胞ペーストから可溶性画分中に単離され、例えば、アフィニティークロマトグラフィー及び／又はサイズ排除により精製することができることが好ましい。最終精製は、例えば、ＣＨＯ細胞に発現された抗体を精製するための工程に類似して実施することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物が、本発明の融合タンパク質に適切なクローニング宿主又は発現宿主である。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母は、下等真核性宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかし、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）；クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）宿主、例えばＫ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ブルガリクス（Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ウイケラミイ（Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ワルティイ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ドロソフィラルム（Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ３６９０６）、Ｋ．サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウイア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２２２６）；ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３０７０）；カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）；トリコデルマレーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４２３４）；ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）；シュワンニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワンニオマイセスオクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）；並びに糸状菌、例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などのいくつかの他の属、種、及び株が一般的に入手可能であり、この際に有用である。
【０１０５】
本発明のグリコシル化融合タンパク質、好ましくは抗体から得られた融合タンパク質の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。数多くのバキュロウイルス株及び変異体並びにヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（カ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（カ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入のための多様なウイルス株、例えば、オートグラファカリフォニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコガＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、そのようなウイルスは、本発明によりこの際にウイルスとして、特にヨトウガ細胞の形質移入のために使用することができる。
【０１０６】
ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）及びタバコの植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。植物細胞培養物中のタンパク質の産生に有用なクローニングベクター及び発現ベクターは、当業者に公知である。例えば、Ｈｉａｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：７６〜７８、Ｏｗｅｎら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７９０〜７９４、Ａｒｔｓａｅｎｋｏら（１９９５）Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ８：７４５〜７５０、及びＦｅｃｋｅｒら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３２：９７９〜９８６を参照されたい。
【０１０７】
しかし、関心は脊椎動物細胞において最大であり、培養（組織培養）脊椎動物細胞の増殖が、日常的な手順になっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、１４１３  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。組換え技法を使用する場合、本発明の融合タンパク質を、細胞内若しくは細胞周辺腔に産生させる、又は培地中に直接分泌させることができる。融合タンパク質が細胞内で産生するならば、第１のステップとして、宿主細胞又は溶解した断片のいずれかの粒子性残骸が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３〜１６７（１９９２）は、大腸菌の細胞周辺腔に分泌された抗体を単離するための手順を記載している。簡潔には、細胞ペーストが酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分間かけて解凍される。細胞の残骸は、遠心分離によって取り除くことができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清は、一般には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過ユニットを使用してまず濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、上述のステップのうちのいずれかにＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を含ませることができ、外来性混入物の成長を防止するために抗生物質を含ませることができる。
【０１０８】
宿主細胞から調製された本発明の融合タンパク質は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技法である。アフィニティーリガンドが結合しているマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。制御された細孔ガラス又はポリスチレンジビニルベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスが、アガロースで達成できるよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。本発明の融合タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、ベーカーボンド（Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ）ＡＢＸＭ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）が精製に有用である。イオン交換カラムを用いた分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）（商標）クロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂クロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法などのタンパク質精製のための他の技法も、回収されるべき抗体に応じて利用可能である。別の態様では、本発明の融合タンパク質を産生するための方法であって、本明細書において規定された宿主細胞を、融合タンパク質の発現を可能にする条件で培養するステップ、及び産生された融合タンパク質を培養物から回収するステップを含む方法が提供される。代替的な実施形態では、本発明の融合タンパク質を含む組成物が提供される、又は本発明の方法により産生される。前記組成物は、医薬組成物であることが好ましい。
【０１０９】
本明細書に使用される用語「医薬組成物」は、患者、好ましくはヒト患者への投与のための組成物に関する。本発明の特定の好ましい医薬組成物は、本発明の融合タンパク質を含む。医薬組成物は、担体、安定化剤及び／又は賦形剤の適切な製剤を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、医薬組成物は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、くも膜下腔内及び／若しくは鼻腔内投与用又は組織への直接注射による組成物を含む。前記組成物が注入又は注射を介して患者に投与されることが、特に想定される。適切な組成物の投与は、異なる方法により、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所又は皮内投与によって達成される場合がある。特に、本発明は、適切な組成物の中断なしの投与を提供するものである。非限定的な例として、中断なしの、すなわち連続した投与は、患者の体内への治療薬の流入を計量するための、患者によって装着された小型ポンプシステムによって実現することができる。本発明の融合タンパク質を含む医薬組成物は、前記ポンプシステムを使用することによって投与することができる。そのようなポンプシステムは、当技術分野において一般に公知であり、通常、注入されるべき治療薬を含有するカートリッジの定期的な交換に頼っている。そのようなポンプシステムのカートリッジを交換する場合、交換しなかったならば中断されない、患者の体内への治療薬の流れに、一時的中断が生じる可能性がある。そのような場合に、カートリッジの取り替え前の投与相及びカートリッジの取り替え後の投与相は、一緒になってそのような治療薬の１回の「中断なしの投与」を構成する本発明の薬学的手段及び方法の意味の範囲内に依然として入ると考えられる。
【０１１０】
本発明のこれらの融合タンパク質の連続投与又は中断なしの投与は、リザーバーから流体を駆動するための流体駆動メカニズム及び駆動メカニズムを発動させるための発動メカニズムを含む流体送達装置又は小型ポンプシステムによる静脈内又は皮下投与の場合がある。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚を貫通するため及び患者の体内に適切な組成物を送達するための針又はカニューレを含む場合がある。前記ポンプシステムは、静脈、動脈又は血管とは独立して患者の皮膚に直接固定する又は取り付けることにより、ポンプシステムと患者の皮膚との間の直接接触を可能にすることができる。ポンプシステムは、２４時間〜最大数日間、患者の皮膚に取り付けておくことができる。ポンプシステムは、小さな体積用のリザーバーを有する小型の可能性がある。非限定的な例として、投与されるべき適切な医薬組成物のためのリザーバーの体積は、０．１〜５０ｍｌの間の可能性がある。
【０１１１】
連続投与は、皮膚に装着され、間隔をおいて取り替えられるパッチによる経皮的である可能性がある。当業者は、この目的のために適切な薬物送達のためのパッチシステムを認識している。例えば第１の使用済みパッチのすぐ隣の皮膚表面への新しい第２のパッチの配置と同時に、第１の使用済みパッチの交換を第１の使用済みパッチの除去直前に有利に果たすことができるので、経皮投与が中断なしの投与に特に適していることに注目すべきである。流動の中断又は動力電池の故障の問題は発生しない。
【０１１２】
本発明の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む場合がある。適切な医薬担体の例は、当技術分野において周知であり、医薬担体には、溶液、例えばリン酸緩衝食塩水、水、エマルション、例えば水中油型エマルション、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液、リポソームなどが含まれる。そのような担体を含む組成物は、周知の従来方法によって製剤化することができる。製剤は、糖質、緩衝溶液、アミノ酸及び／又は界面活性剤を含むことができる。糖質は、非還元糖、好ましくはトレハロース、スクロース、オクタスルフェート、ソルビトール又はキシリトールの場合がある。一般に、本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合した任意及び全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤を意味する。医薬活性物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、採用された投薬量及び濃度でレシピエントに無毒であり、それらには：追加的な緩衝剤；保存剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ポリエステルなどの生分解性ポリマー；ナトリウム、多価糖アルコールなどの塩形成対イオン；アラニン、グリシン、アスパラギン、２−フェニルアラニン、及びトレオニンなどのアミノ酸；トレハロース、スクロース、オクタスルフェート、ソルビトール又はキシリトール、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ガラクトース、ラクチトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコールなどの糖又は糖アルコール；含硫還元剤、例えばグルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、［アルファ］−モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、又は他の免疫グロブリン；並びに親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンが含まれる。そのような製剤は、ポンプシステムを用いて及び／又は用いずに、静脈内又は皮下の場合がある連続投与のために使用することができる。アミノ酸は、荷電アミノ酸、好ましくはリシン、酢酸リシン、アルギニン、グルタミン酸塩及び／又はヒスチジンの場合がある。界面活性剤は、好ましくは分子量＞１．２ＫＤの洗剤及び／又は好ましくは分子量＞３ＫＤのポリエーテルの場合がある。好ましい洗剤についての非限定的な例は、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ２０、トウィーン４０、トウィーン６０、トウィーン８０又はトウィーン８５である。好ましいポリエーテルについての非限定的な例は、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ４０００又はＰＥＧ５０００である。本発明に使用される緩衝系は、好ましいｐＨ５〜９を有することができ、クエン酸塩、コハク酸塩、リン酸塩、ヒスチジン及び酢酸塩を含む場合がある。
【０１１３】
本発明の組成物は、適切な用量で対象に投与することができ、適切な用量は、例えば非チンパンジー霊長類、例えばマカクに、本明細書記載の種間特異性を示す本発明のポリペプチドの漸増する用量を投与することによる用量漸増研究によって決定することができる。上述のように、本明細書記載の種間特異性を示す本発明のポリペプチドは、非チンパンジー霊長類での前臨床試験に、及びヒトにおける薬物として、同一の形態で有利に使用することができる。これらの組成物は、他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物と組み合わせて投与することもできる。これらの薬物は、本明細書において規定される本発明のポリペプチドを含む組成物と同時に、又は前記ポリペプチドの投与前若しくは投与後に時間的に規定された間隔及び用量で別々に、投与することができる。投薬計画は、担当の医師及び臨床的要因によって決定される。医学分野において周知のように、任意の１人の患者についての投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与されるべき特定の化合物、性別、時間及び投与経路、全身の健康状態、及び同時投与される他の薬物を含めた多数の要因に依存する。
【０１１４】
非経口投与用の製剤には、無菌の水性又は非水性の液剤、懸濁剤、及び乳剤が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、食塩水及び緩衝媒を含めた水、アルコール性／水性の溶液、エマルション又は懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、又は固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、体液補充液及び栄養補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づく補充液など）他が含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤及び他の添加剤も存在する場合がある。加えて、本発明の組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミン又は免疫グロブリンのようなタンパク質性担体を含み得る。本発明の組成物は、本明細書において規定された本発明のポリペプチドに加えて、組成物の意図される使用に応じて、生物学的に活性な薬剤をさらに含み得ることが想定されている。そのような薬剤は、消化系に作用する薬物、細胞増殖抑制剤として作用する薬物、高尿酸血症を予防する薬物、免疫反応を阻害する薬物（例えばコルチコステロイド）、炎症応答を調節する薬物、循環系に作用する薬物及び／又は当技術分野において公知のサイトカインなどの薬剤であり得る。本発明の融合タンパク質は、併用療法に、すなわち、別の抗癌医薬と組み合わせて適用されることも想定されている。
【０１１５】
本明細書に規定された医薬組成物の生物学的活性は、例えば、以下の実施例に、国際公開第９９／５４４４０号に、又はＳｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５）、１〜１２）によって記載されたような細胞傷害アッセイによって決定することができる。本明細書に使用される「有効性」又は「インビボ有効性」は、例えば標準化ＮＣＩ応答基準を使用した、本発明の医薬組成物による治療に対する応答を表す。本発明の医薬組成物を使用した治療の成功又はインビボ有効性は、組成物のその意図される目的についての有効性、すなわち組成物がその所望の効果、すなわち病的細胞、例えば腫瘍細胞の枯渇を引き起こす能力を表す。インビボ有効性は、非限定的に、白血球数、鑑別、蛍光標示式細胞分取、骨髄吸引を含めたそれぞれの疾患実体のための確立された標準法によりモニターすることができる。加えて、様々な疾患特異的臨床化学パラメーター及び他の確立された標準法を使用することができる。さらに、コンピューター断層撮影、Ｘ線、核磁気共鳴断層撮影（例えば、国立癌研究所の基準に基づく応答評価［Ｃｈｅｓｏｎ  ＢＤ、Ｈｏｒｎｉｎｇ  ＳＪ、Ｃｏｉｆｆｉｅｒ  Ｂ、Ｓｈｉｐｐ  ＭＡ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｒｌ、Ｃｏｎｎｏｒｓ  ＪＭ、Ｌｉｓｔｅｒ  ＴＡ、Ｖｏｓｅ  Ｊ、Ｇｒｉｌｌｏ−Ｌｏｐｅｚ  Ａ、Ｈａｇｅｎｂｅｅｋ  Ａ、Ｃａｂａｎｉｌｌａｓ  Ｆ、Ｋｌｉｐｐｅｎｓｔｅｎ  Ｄ、Ｈｉｄｄｅｍａｎｎ  Ｗ、Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ  Ｒ、Ｈａｒｒｉｓ  ＮＬ、Ａｒｍｉｔａｇｅ  ＪＯ、Ｃａｒｔｅｒ  Ｗ、Ｈｏｐｐｅ  Ｒ、Ｃａｎｅｌｌｏｓ  ＧＰ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｔｏ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．ＮＣＩ  Ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９年４月；１７（４）：１２４４］）、陽電子放射型断層撮影スキャン、白血球数、鑑別、蛍光標示式細胞分取、骨髄吸引、リンパ節生検／組織検査、及び様々なリンパ腫特異的臨床化学パラメーター（例えば乳酸脱水素酵素）及び他の確立された標準法を使用することができる。
【０１１６】
本発明の医薬組成物などの薬物の開発における別の主要な課題は、薬物動態特性の予測可能な調節である。この目的のために、薬物候補の薬物動態プロファイル、すなわち特定の薬物が所与の状態を治療する能力に影響する薬物動態パラメーターのプロファイルを確立することができる。薬物がある特定の疾患実体を治療する能力に影響する、薬物の薬物動態パラメーターには、非限定的に：半減期、分布容積、肝初回通過代謝及び血清結合の程度が含まれる。所与の薬剤の有効性は、上述のパラメーターのそれぞれによって影響される可能性がある。
【０１１７】
「Ｔｍａｘ」は、その後に薬物の最大血中濃度が達成される時間であり、「Ｃｍａｘ」は、所与の薬物で得られる最大血中濃度である。薬物の生物学的効果のために必要なその薬物の血中濃度又は組織濃縮を達成するための時間は、全てのパラメーターによって影響される。上に概説したように非チンパンジー霊長類における前臨床動物試験で決定できる種間特異性を示している二重特異性単鎖抗体の薬物動態パラメーターは、例えば、Ｓｃｈｌｅｒｅｔｈら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０（２００５）、１〜１２）による刊行物にも示されている。
【０１１８】
本明細書に使用される用語「毒性」は、有害事象又は重篤な有害事象に顕在化した薬物の毒性作用を表す。これらの副事象は、投与後の全身的な薬物の耐容能の欠如及び／又は局所的な耐容性の欠如を表し得る。毒性は、薬物によって引き起こされる催奇形作用又は発癌作用も含む可能性がある。
【０１１９】
本明細書に使用される用語「安全性」、「インビボ安全性」又は「耐容能」は、投与直後（局所耐容性）及びより長い期間の薬物適用の間に重篤な有害事象を誘導しない薬物の投与を規定する。「安全性」、「インビボ安全性」又は「耐容能」は、例えば治療及び経過観察期間の間に規則的な間隔で評価することができる。測定には、臨床評価、例えば臓器の症状発現、及び検査室異常のスクリーニングが含まれる。臨床評価を実施し、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／又はＭｅｄＤＲＡ標準により正常な所見からの逸脱を記録／コードすることができる。臓器の症状発現は、例えば有害事象共通用語規準ｖ３．０（ＣＴＣＡＥ）に示されるように、アレルギー／免疫、血液／骨髄、心不整脈、凝固などの基準を含む場合がある。試験される可能性のある検査室パラメーターには、例えば血液学、臨床化学、凝固プロファイル並びに尿分析及び血清、血漿、リンパ液又は髄液、液体（ｌｉｑｕｏｒ）などの他の体液の検査が含まれる。このように、検査室パラメーターを測定すること及び有害事象を記録することによって、安全性、例えば身体検査、画像化技法（すなわち超音波、Ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、技術的装置を用いた他の手段（すなわち心電図）、生命徴候を判断することができる。例えば、本発明による使用及び方法での非チンパンジー霊長類における有害事象は、組織病理学的方法及び／又は組織化学的方法によって検討することができる。
【０１２０】
用語「有効用量」又は「有効投薬量」は、所望の効果を達成する又は少なくとも部分的に達成するために十分な量として定義される。用語「治療的有効用量」は、すでに疾患を患っている患者における疾患及びその合併症を治癒する又は少なくとも部分的に停止させるために十分な量として規定される。この使用に有効な量は、感染の重症度及び対象自身の免疫系の状態全般に依存する。用語「患者」には、予防的処置又は治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳類対象が含まれる。
【０１２１】
本明細書に使用される用語「有効で無毒性の用量」は、大きな毒性作用を有さずに又は本質的に有さずに、病的細胞の枯渇、腫瘍の除去、腫瘍の萎縮又は疾患の安定化を起こすために十分に高い、本発明の融合タンパク質の耐容用量を表す。そのような有効で無毒性の用量は、例えば、当技術分野において記載されている用量漸増研究によって決定することができ、重篤な有害副事象（用量制限毒性、ＤＬＴ）を誘導する用量未満であるべきである。
【０１２２】
上記用語は、例えばＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓ６；ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ  Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｊｕｌｙ  １６、１９９７にも言及されている。
【０１２３】
本発明の融合タンパク質の適切な投薬量、又は治療有効量は、治療されるべき状態、状態の重篤度、以前の治療、並びに患者の臨床歴及び治療薬に対する応答に依存する。適正用量は、その用量を患者に１回又は一連の投与にわたり投与することができるように担当医師の判断により調整することができる。医薬組成物は、単独の治療薬として、又は必要に応じて抗癌治療などの追加的治療と組み合わせて、投与することができる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内、関節内及び／又は滑液包内に特に有用である。非経口投与は、大量注射又は連続注入によることができる。医薬組成物が凍結乾燥されているならば、凍結乾燥された物質は、投与の前にまず、適切な液体中で復元される。凍結乾燥された物質は、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又は凍結乾燥の前にタンパク質が入っていたものと同じ配合で復元することができる。
【０１２５】
本発明の融合タンパク質又は本発明の方法によって産生された融合タンパク質が、増殖性疾患、腫瘍性疾患、及び免疫障害から選択される疾患の予防、治療又は回復に使用されることが好ましい。本発明の代替的な実施形態は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、及び免疫障害から選択される疾患の治療又は回復のための方法であって、それを必要とする患者に、本発明の融合タンパク質又は本発明の方法によって産生された融合タンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。腫瘍性疾患を、癌に置き換えることができる。好ましい癌は、細胞外抗原５Ｔ４が腫瘍細胞に発現されている癌である。５Ｔ４の発現は、ＦＡＣＳ分析を使用して判断することができる。より好ましい癌は、中皮腫、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、子宮頚癌、胃癌、肺癌又は結腸癌である。好ましい乳癌は、いわゆるトリプルネガティブ乳癌である。好ましい結腸癌は、ＫＲＡＳ突然変異型結腸癌である。
【０１２６】
本明細書記載の製剤は、本明細書記載の病的医学的状態の治療及び／又は予防を必要とする患者における治療及び／又は予防での医薬組成物として有用である。用語「治療」は、治療的処置と予防的手段又は防止的手段との両方を表す。治療は、疾患、疾患の症状、又は疾患の素因を治癒する、癒やす、緩和する、軽減する、変更する、矯正する、向上させる、改善する、又はそれに影響する目的で、疾患／障害、疾患／障害の症状、又は疾患／障害の素因を有する患者からの身体、単離された組織、又は細胞への製剤の適用又は投与を含む。
【０１２７】
「治療を必要とする」者には、すでに障害を有する者、及び障害が予防されるべき者が含まれる。用語「疾患」は、本明細書記載のタンパク質製剤を用いた治療から恩恵を受けるであろう任意の状態である。これには、哺乳類を問題となる疾患に罹患しやすくする病的状態を含めた、慢性及び急性の障害又は疾患が含まれる。本明細書における治療されるべき疾患／障害の非限定的な例には、増殖性疾患、腫瘍性疾患、又は免疫障害が含まれる。別の態様では、本発明の融合タンパク質、本発明の核酸分子、本発明のベクター、又は本発明の宿主細胞を含むキットが与えられる。キットは、融合タンパク質を含有する１つ又は複数のバイアル及び使用説明書を含む場合がある。キットは、シリンジ、ポンプ、注入器などの、本発明の融合タンパク質を投与するための手段も含有する場合がある。なお別の態様では、本発明は、の使用に関する。
【０１２８】
本発明は、特定の方法論、プロトコール、又は試薬に限定されず、それらは変更される可能性があることを理解すべきである。本明細書に与えられた議論及び実施例は、特定の実施形態を説明する目的で提示されているのにすぎず、本発明の範囲を限定することは意図されておらず、本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ規定される。本明細書の本文全体にわたって引用された全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書など）は、上記であろうと下記であろうと、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本明細書の何物も、本発明が先行発明であることを理由としてそのような開示に先行する資格がないことを承認するものとして解釈されるべきではない。参照によって組み込まれた材料が本明細書と食い違う又は矛盾する範囲では、本明細書はあらゆるそのような材料に取って代わる。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１Ａ】本発明の融合タンパク質（「トリボディー融合タンパク質」とも呼ばれる）を製造する好ましい原理を表す図である。Ａ：５Ｔ４及びＴ細胞活性化ＣＤ３エピトープに対する最小結合領域が単離される、例えば抗体のＶドメイン又は他の結合分子から得られる。これらの最小結合ドメインは、ＣＨ１：ＣＬヘテロ二量体化ドメインのＮ末端伸長として機能するように形式化される、及び／又は単鎖可変ドメインとして形式化されて本発明の融合タンパク質のＮ末端に伸長される。Ｂ：同じ細胞に同時発現された場合にＦａｂヘテロ二量体を形成する、Ｆａｂ  Ｌ（ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む）及びＦａｂ  Ｆｄ（ＶＨ鎖及びＣＨ１鎖を含む）の遺伝子構造の略図である。Ｃ：単鎖可変ドメイン（ｓｃＦｖ）の形態の余分の結合ドメインが、コード遺伝子の遺伝子融合によってｍＲＮＡレベルでＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインのＣ末端に融合されている、本発明の融合タンパク質の形態の遺伝子構造の略図である。例では、遺伝子構造は、イントロンのない連続コード配列に基づいている。Ｄ：リボン及び空間充填表示での本発明の融合タンパク質の分子モデルを示す図である。Ｅ：ＣＨ１とその伸長されたＣ末端結合物との間、及びＣＬとその伸長されたＣ末端結合物との間の両方にアミノ酸１０個のリンカー配列を含有する本発明の融合タンパク質の分子モデルである。分子シミュレーションは、ＳＧＧＧＳＧＧＧＳＳリンカー配列に基づく最大柔軟性を使用している。空間充填で表示し、色の濃いドメインは融合タンパク質であり、銀色のドメインは結合した抗原（モデルでは全部で３つの結合部分に関して同じ抗原）である。
【図１Ｂ】構造が、Ｆａｂ鎖ヘテロ二量体（ＶＨ−ＣＨ１：ＶＬＣＬ）：モデル（ｉ）及び（ｉｖ）で２つの可能な組合せについて示されたようにＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくはＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）がＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）と組み合わされたもの又はモデル（ｉｉ）及び（ｖ）で２つの可能な組合せについて示されたようにＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶＨ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）がＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくはＶＬ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）と組み合わされた異なる形態の編成又はモデル（ｉｉｉ）及び（ｖｉ）で２つの可能な組合せについて示されたようにＶＨ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶＨ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）がＶＬ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶＬ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）と組み合わせた異なる形態の編成に基づく、融合タンパク質の結合構造の編成における種々の変形のいくつかを示す図である。全ての組合せで、ｓｃＦｖは、ジスルフィドで安定化された単鎖可変断片（ｄｓＦｖ）の可能性もある。
【図１Ｃ】構造が、クロスオーバーＦａｂ鎖（ｃＦａｂ）ヘテロ二量体（ＶＨＣＬ：ＶＬＣＨ１）：（ｖｉｉ）及び（ｘ）で２つの可能な組合せについて示されたようにＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくはＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）をＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）と組み合わせたもの、又は（ｖｉｉｉ）及び（ｘｉ）で２つの可能な組合せについて示されたようにＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶＬ（５Ｔ４）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）をＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくはＶＨ（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）と組み合わせた異なる形態の編成、又はモデル（ｉｘ）及び（ｘｉｉ）で２つの可能な組合せについて示されたようにＶＬ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶＬ（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）をＶＨ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶＨ（ＣＤ３）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）と組み合わせた異なる形態の編成に基づく、Ｔｂ−５Ｔ４融合タンパク質の結合構造の編成における種々の変形のいくつかを示す図である。全ての組合せで、ｓｃＦｖは、ジスルフィドで安定化された単鎖可変断片（ｄｓＦｖ）の可能性もある。
【図１Ｄ】構造が、ＣＨ１及びＣＬのヘテロ二量体（ｄＦａｂ）との単一ドメイン結合物融合体：（ｘｉｉｉ）及び（ｘｖｉ）で２つの可能な組合せについて示されたようにＶ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）［式中、Ｖ１は、５Ｔ４に特異性を有する単一ドメイン結合物である］をＶ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくはＶ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）［式中、Ｖ２は、５Ｔ４若しくはＣＤ３に対する特異性と異なる特異性を有する単一ドメイン結合物である］と組み合わせたもの、又は（ｘｉｖ）及び（ｘｖｉｉ）で２つの可能な組合せについて示されたようにＶ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶ２−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）［式中、Ｖ２は、５Ｔ４若しくはＣＤ３に対する特異性と異なる特異性を有する単一ドメイン結合物である］をＶ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＬ（ＣＤ３）若しくはＶ１（５Ｔ４）ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（ＣＤ３）−Ｌ２−ＶＨ（ＣＤ３）と組み合わせた異なる形態の編成、又はモデル（ｘｖ）及び（ｘｖｉｉｉ）で２つの可能な組合せについて示されたようにＶ１（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶ１（ＣＤ３）−ＣＨ１−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）をＶ２−ＣＬ−Ｌ１−ＶＨ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＬ（５Ｔ４）若しくはＶ２−ＣＬ−Ｌ１−ＶＬ（５Ｔ４）−Ｌ２−ＶＨ（５Ｔ４）［式中、Ｖ２は、５Ｔ４若しくはＣＤ３に対する特異性と異なる特異性を有する単一ドメイン結合物である］と組み合わせた異なる形態の編成に基づく、Ｔｂ−５Ｔ４融合タンパク質の結合構造の編成における種々の変形のいくつかを示す図である。全ての組合せで、ｓｃＦｖは、ジスルフィドで安定化された単鎖可変断片（ｄｓＦｖ）の可能性もある。
【図２Ａ】Ａ：フレームワーク領域及び予測されるＣＤＲ領域（枠内）における差異を示す、Ｆｏｒｓｂｅｒｇ  １９９７（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７２：１２４３０〜１２４３６）によって刊行されたようなマウス５Ｔ４．Ｈ８のＶＨ及びＶＬ配列（配列番号２及び１６）とヒト化配列（配列番号６及び１９）との比較を示す図である。
【図２Ｂ】Ｂ：配列番号２及び１６におけるマウスＶ（５Ｔ４）配列を含むＴｂ５３５Ｃ並びに配列番号６及び１９のようなヒト化Ｖ（５Ｔ４）を含むＴｂ５３５Ｈ−１１２０の略図である。
【図２Ｃ】Ｃ：マウス及びヒト化ＶＨ及びＶＬの両方についての平均（ｚスコア）の偏差で表現されたヒト性（ｈｕｍａｎｅｓｓ）スコアにおける有意な増加を示す図である。
【図２Ｄ】Ｄ：異なるヒト化形態のＶＨ（５Ｔ４）及びＶＬ（５Ｔ４）を含み、ＣＨ１含有鎖のＣ末端にＨＩＳタグ（ＨＨＨＨＨＨ）を付けて伸長された、２つのトリボディー融合体のＩＭＡＣ（固定化金属アフィニティークロマトグラフィー）又はＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）後の産物収量を示す図である。
【図３Ａ】Ａ：ヒト化融合タンパク質Ｔｂ５３５Ｈ（配列番号５１及び５２）の略図である。
【図３Ｂ】Ｂ：ｄｓＦｖ形式、Ｆａｂ形式、ＩｇＧ形式又はＢｉＴＥ形式（ｓｃＦｖ（５Ｔ４）−ｓｃＦｖ（ＣＤ３）融合物）のいずれかのヒト化ＶＨ（５Ｔ４）配列番号６及びＶＬ（５Ｔ４）配列番号１９と比較した、Ｔｂ５３５Ｈ及びＴｂ５３５Ｃ（配列番号４９及び５０）のＫＤ平衡解離定数の比較を示す図である。
【図３Ｃ】Ｃ：５Ｔ４の組換え細胞外ドメインに関するＴｂ５３５ＨのＥＬＩＳＡ結合曲線を、その部分Ｆａｂ（５Ｔ４）及びｄｓＦｖ（５Ｔ４）と比較したグラフ表示である。
【図３Ｄ】Ｄ：ＭＳＴＯ−２１１Ｈ  ５Ｔ４陽性中皮腫細胞株へのＴｂ５３５Ｈ並びにその部分Ｆａｂ（５Ｔ４）及びｄｓＦｖ（５Ｔ４）の飽和条件下でのＦＡＣＳ装飾を示す図である。
【図３Ｅ】Ｅ：ＭＳＴＯ−２１１Ｈ  ５Ｔ４陽性中皮腫細胞株へのＴｂ５３５Ｈ結合の力価測定及びＥＬＩＳＡ法との５０％結合濃度（ＫＤ）の比較を示す図である。
【図３Ｆ】Ｆ：３人の異なるドナーの末梢血単球へのＴｂ５３５Ｈ結合の力価測定を示す図である。ＫＤ値は、約２５ｎＭで再現性がある。
【図４Ａ】ａ：タンパク質に存在する全てのジスルフィド結合を表示したＴｂ５３５Ｈの略図である。ｂ：Ｔｂ５３５Ｈにおける全ての天然ジスルフィド結合及び工学的に作製されたジスルフィド結合の表である。ｃ：Ｔｂ５３５Ｈの配列に関する全てのジスルフィド結合の表示である。ｄ：工学的に作製されたジスルフィド結合の形成を比較する図であり、形成は、Ｔｂ５３５ＣよりもＴｂ５３５Ｈで驚くほど良好である（非還元型ＢＯＬＴ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。還元型ゲルは、予想通りの分子量の鎖を示す。中間に分子量の検量線を示す。
【図４Ｂ】ａ：Ｔｂ−５Ｔ４に組み込まれたＣＤ３結合物ＶＨ（ＣＤ３）配列番号２９及びＶＬ（ＣＤ３）配列番号３７のヒト化及び安定化の影響を比較する活性の力価測定曲線を示す図である。ｂ：ジスルフィドで安定化されていないＴｂ−５Ｔ４に対して誘導されたストレスが多量体の形成に及ぼす影響を示す図である。図に、２０℃又は３７℃で３日間インキュベーション後の分析用ゲル濾過溶出のプロファイルを重ね合わせて示す。単量体（１）及び多量体（２〜４）を表示する。ｃ：ジスルフィドで安定化されたＴｂ−５Ｔ４に対して誘導されたストレスが３７℃で３日後に多量体形成に及ぼす影響を示す図である。開始の状況と比較して多量体の形成に変化はなかった。
【図５Ａ】Ｔｂ５３５融合タンパク質の分析を示す図である。Ａ：Ｔｂ５３５Ｃ及びＴｂ５３５Ｈを比較する分析用ゲル濾過の溶出プロファイル。１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、５０ｋＤａ及び２５ｋＤａのＩｇＧ由来分子を使用する検定を示す。表に、検量線から得られたＴｂ５３５Ｈ及びＴｂ５３５Ｃの予測サイズを示す。驚くことに、Ｔｂ５３５Ｈは、よりコンパクトな立体配置を示す。
【図５Ｂ】Ｂ：Ｔｂ５３５Ｈの質量分析は、正確な分子量を示し、ＭＷアイソフォームが同定される。
【図５Ｃ】Ｃ：Ｔｂ５３５Ｈの分析用陽イオン交換分析により、限られた数の電荷異性体が同定される。
【図５Ｄ】Ｄ：等電点電気泳動により、Ｔｂ５３５Ｃ、Ｔｂ５３５ＨがＩｇＧ形態と比較される。
【図６Ａ】タンパク質の融解曲線に基づくＴｂ５３５の安定性を示す図である。ａ：Ｔｂ５３５Ｈの略図である。ｂ：Ｔｂ５３５ＣとＴｂ５３５Ｈとの間のサーモフルオロ（Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ）アッセイによる融解温度による安定性の比較である。ｃ：Ｔｂ５３５Ｈと、とその個別の構成成分（Ｆａｂ（５Ｔ４）；ｄｓＦｖ（５Ｔ４）、ｄｓＦｖ（ＣＤ３））とのサーモフルオロアッセイによる融解曲線の比較である。構成成分の理論的合計も示す。驚くことに、Ｔｂ５３５Ｈは、構成成分の合計ではなく、融合タンパク質の方が安定である。ｄ：Ｔｂ５３５Ｈと、同じＶドメイン配列に基づくＢｉＴＥ（ｄｓＦｖ（５Ｔ４）−ｄｓＦｖ（ＣＤ３）融合物）形式及びＩｇＧ１（５Ｔ４）形式とのサーモフルオロアッセイによる融解曲線との比較である。驚くことに、Ｔｂ５３５Ｈは、ＩｇＧ及びｓｃＦｖ融合物（ＢｉＴＥ）の両方よりも安定である。
【図６Ｂ】３７℃で７２時間インキュベーション後のＴｂ５３５の安定性を示す図である。ａ：  Ｔｂ５３５Ｈ及びＴｂ５３５Ｃ形態をＰＢＳ中で３７℃で７２時間インキュベートし、その前及び後に分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。インキュベーション後に多量体の形成は見られない。ｂ：Ｔｂ５３５Ｈ形態及びＴｂ５３５Ｃ形態を、ヒト血清中で３７℃で７２時間インキュベートし、その後に細胞死アッセイ（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ  ５Ｔ４陽性中皮腫細胞株をＥ：Ｔが５：１のヒトＰＢＭＣと共に４８時間アッセイ）で活性力価測定により分析した。インキュベーション後に活性の差を認めなかった。
【図７Ａ】本発明の融合タンパク質（Ｆａｂ−（ｓｃＦｖ）２及びＢｉＴＥ（ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ）形式の比較を示す図である。Ａ：両方の融合タンパク質の形式を用いた単量体及び二量体の典型的な形成。ＢｉＴＥ形式は、形成された二量体の比率がより高い傾向がある。
【図７Ｂ】Ｂ：本発明の形式の融合タンパク質を１００％に設定し、同じ配列を有するＢｉＴＥ形式と比較した、モル比較の相対収量である。本発明の融合タンパク質の形式は、典型的にはより高い産物収量を有する。
【図７Ｃ】Ｃ：融合タンパク質（Ｔｂ５３５Ｈ−１１２０）の精製後の産物収量と、同じ配列に基づくＢｉＴＥ形式との比較である。
【図７Ｄ】Ｄ：融合タンパク質形式とＢｉＴＥ形式との活性力価測定（混合培養でのヒトＰＢＭＣによる５Ｔ４陽性腫瘍細胞の誘導死）の比較は、同じ範囲にＥＣ５０値を示すが、本発明の融合タンパク質形式を使用すると、Ｔ細胞エンゲージャーよりも高いパーセンテージの腫瘍細胞が死滅する。
【図８Ａ】Ｔｂ５３５Ｃ及びＴｂ５３５Ｈの結合及び活性の比較を示す図である。Ａ：５Ｔ４抗原の組換え細胞外ドメインへのＥＬＩＳＡ結合性を示す。
【図８Ｂ】Ｂ：ヒトＴ細胞株（ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ））へのＥＬＩＳＡの結合性を示す。
【図８Ｃ】Ｃ：ＭＳＴＯ−２１１Ｈ  ５Ｔ４陽性中皮腫細胞の混合培養での細胞傷害性力価測定を示す。
【図８Ｄ】Ｄ：Ｔｂ５３５Ｃ及びＴｂ５３５Ｈの結合性及び活性を比較する表である。
【図９Ａ】Ｔｂ５３５Ｈが一連の異なる腫瘍型で活性であることを示す図である。Ａ：異なる形態の中皮腫、トリプルネガティブ乳癌及びＫＲＡＳ突然変異結腸癌を代表する細胞株を用いたＴｂ５３５の活性力価測定（混合培養でのヒトＰＢＭＣによる５Ｔ４陽性腫瘍細胞の誘導死）である。ＥＣ５０値をピコモル濃度で示す。
【図９Ｂ】Ｂ：ＦＡＣＳ装飾によって決定された５Ｔ４の膜発現レベルと細胞死アッセイで得られたＥＣ５０値との比較である。
【図１０Ａ】Ａ：マウスＣ５７ＢＬ／６における注射後の平衡相及び消失相の半減期の推定を示す図である。屠殺された動物から血液を回収し（ｒｅｃｕｐｅｒａｔｅ）、細胞傷害性誘導活性アッセイを用いて機能的Ｔｂ５３５の濃度を測定した。推定値は、大きな分布容積及び遅い浄化を示唆している。
【図１０Ｂ】Ｂ：抗ＦＬＡＧタグのウエスタンブロット解析により、全血タンパク質をプローブで調べることによってもＴｂ５３５の分解を認めることはできなかった。
【図１１Ａ】ヒトＰＢＭＣを用いて再構成された中皮腫異種移植後のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＴｂ５３５の有効性を示す図である。ａ：皮下に成長している中皮腫の写真を示す。ｂ：エフェクター：標的比１：１での様々な濃度のＴｂ５３５Ｈにおける皮下モデル及び腫瘍成長の進展を示す。ｃ：エフェクター：標的比２：１で様々な濃度のＴｂ５３５Ｈにおける皮下モデル及び腫瘍成長の進展を示す。ｄ：中皮の内側に同所性に成長している中皮腫の写真を示す。ｅ：ヒトＰＢＭＣで再構成されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに同所性に誘導された中皮腫及びＴｂ５３５Ｈを用いた治療は、腫瘍の形成及び死亡（人道的終点屠殺）を完全に予防する。
【図１１Ｂ】示した日に１０Ｅ７ヒトＰＢＭＣ及びＴｂ５３５をＩＰ注射後の樹立皮下腫瘍の治療。腫瘍体積をノギスで測定した。
【図１２Ａ】腫瘍細胞とＰＢＭＣとの混合培養におけるＴｂ５３５ＨによるＴＨ１サイトカインの誘導を示す図である。特にＩＬ−２、インターフェロン−ガンマ及びＴＮＦ−アルファが上方調節されている。陽性対照は、ＯＫＴ３−ＩｇＧ（ムロモナブ−ＣＤ３）（＋）及び無添加（−）である。
【図１２Ｂ】最大１ｍＭ（ミリモル濃度）のＴｂ５３５Ｈ濃度まで、Ｔｂ５３５Ｈを３人のヒトドナーからのＰＢＭＣと共にインキュベートしてもサイトカイン誘導がないを示す図である。陽性対照は、ＯＫＴ３−ＩｇＧ（ムロモナブ−ＣＤ３）（＋）及び無添加（−）である。
【図１２Ｃ】５Ｔ４陽性腫瘍細胞の非存在下では、最大１ｍＭ（ミリモル濃度）の濃度でＰＢＭＣのＴ細胞活性化マーカー（ＣＤ６９及びＣＤ２５）の誘導がないこと（白記号）を示す図である。黒記号は、混合腫瘍細胞／ＰＢＭＣの共培養での対照であり、その場合、活性化マーカーが、１００００分の１濃度から開始して誘導される。
【図１３】ヒトＰＢＭＣにおける主要なエフェクター細胞の分析を示す図である。完全ＰＢＭＣを、精製ＣＤ４陽性Ｔ細胞画分、ＣＤ８陽性Ｔ細胞画分、両方の組合せ及びＣＤ５６陽性ＮＫ細胞画分と比較した。
【図１４Ａ】既知組成培地及び供給原料を使用する流加培養バイオリアクター工程において安定なＣＨＯクローンからＴＢ５３５が最大１ｇ／Ｌ産生することを示す図である。
【図１４Ｂ】捕捉（Ａ）、精製（Ｂ）及び洗練（Ｃ）ステップを用いた、使用済み培地からのＴｂ５３５の単離を示す図である。ゲル濾過分析（Ｄ）及びクマシーブリリアントブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
【発明を実施するための形態】
【０１３０】
本発明の様式を例証するために以下の実施例が含められている。以下の実施例の特定の態様は、本発明の実施において十分に機能することが本共同発明者らによって見出された又は考えられた技法及び手順により記載される。これらの実施例は、共同発明者らの標準的な実験室作業を例証するものである。本開示及び当業者の一般レベルに照らして、以下の実施例は単に例示的であることが意図されることを当業者は認識している。
【０１３１】
実施例１  発現
ＨＥＫ２９３細胞での一過性発現
配列が検証されたヌクレオチド配列を有する発現プラスミドのクローンを、フリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ）−２９３発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）での形質移入及びタンパク質発現のために製造業者のプロトコールにより使用した。発現されたタンパク質を含有する上清を得、遠心分離によって細胞を除去し、上清を−２０℃で保存した。位置（例えば、図１Ｂ：ｉ〜ｉｉｉ））及び／或いはｓｃＦｖ分子に関するＶＨ−ＶＬ組合せ若しくはＶＬ−ＶＨ組合せの使用（例えば、図１Ｂ  ｉｖ〜ｖｉ）、又はＦａｂにおける交差Ｖドメインの使用（例えば、図１Ｃ  ｖｉｉ〜ｘｉｉ）、又はドメイン結合物との併用（例えば、図１Ｄ  ｘｉｉｉ〜ｘｖｉｉｉ）についての、５Ｔ４結合物及びＣＤ３結合物の様々な並べ換えを遺伝子レベルで構築し、他にもいくつか特徴はあるがとりわけＣＭＶプロモーター及びコザック（Ｋｏｚａｋ）翻訳開始部位を組み合わせているｐＥＳ３３ベクターにクローニングした。全ての構築物をＣ末端でＨＩＳタグ（ＨＨＨＨＨＨ）と、Ｎ末端でＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）と融合させた。ＩＭＡＣ捕捉物のＴＣＡ沈殿、それに続く抗ＨＩＳ抗体、抗フラグ抗体、抗ヒトＦａｂ又は抗ヒトカッパ血清のいずれかをプローブとして用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット解析により使用済み培地を分析した。タンパク質をＩＭＡＣ捕捉、イオン交換精製及びゲル濾過での洗練ステップの組合せを用いて精製して、厳密な単量体画分の単離を保証した。
【０１３２】
５Ｔ４×ＣＤ３二重特異性抗体の様々な形態をトリボディー（すなわちＦａｂ−（ｓｃＦｖ）２）又はＢｉＴＥ（すなわちｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ）形式の両方で比較し、産生された単量体性タンパク質の相対収量及び相対割合について点数化した。トリボディー形態は、一般にはより多い二重特異性タンパク質及びより高い割合の単量体性タンパク質をもたらすことが見出された（図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃを参照されたい）。
【０１３３】
ＣＨＯ細胞における安定発現
配列が検証されたヌクレオチド配列を有する発現プラスミドのクローンを、構築物の真核生物発現のためのＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞に形質移入した。ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞における真核生物タンパク質の発現を、Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５、５３７〜５６６によって記載されたように行った。メトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度をＭＴＸの終濃度２０ｎＭまで増加させることによって、構築物の遺伝子増幅を誘導した。静置培養の２回継代後に、細胞をヌクレオシド不含ＨｙＱ  ＰＦ  ＣＨＯ液体ソイ培地（０．１％プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−６８；ＨｙＣｌｏｎｅを有する４．０ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有）が入ったローラーボトル中で７日間成長させ、その後細胞を収集した。細胞を遠心分離によって除去し、発現されたタンパク質を含有する上清を−２０℃で保存した。
【０１３４】
血清／動物構成成分不含の懸濁培養に適合したＣＨＯ細胞を使用して、安定なＴＢ５３５発現細胞株を作り出す。トリボディーのＦｄ遺伝子及びＬ遺伝子をベクターにクローニングし、ＣＨＯ細胞に共形質移入する。プラスミドは、高レベルの発現を発生するための要素と共に選択マーカーを含有する。最高収量をもたらす最も安定なクローンについて選択するために、発現プールから制限希釈クローニングを実施する。既知組成培地及び供給原料を使用する流加培養バイオリアクター工程で安定なクローンから最大１ｇ／ＬのＴＢ５３５を産生する。図１４Ａに、典型的なＴＢ５３５バイオリアクター工程のための細胞成長及びＴＢ５３５の力価を図示する。
【０１３５】
深層濾過による細胞除去を用いてバイオリアクターを採集する。清澄化された使用済み培地相からＴＢ５３５を回収し、クロマトグラフィーステップ、例えばアフィニティー、イオン交換及びサイズ排除（図１４Ｂ）に続く、最終濃縮／保存用製剤化緩衝液へのダイアフィルトレーションの組合せを使用して精製する。この精製工程は、精製され安定に製剤化された約４００ｍｇ／ｌ  ＴＢ５３５トリボディーをもたらす。この工程によって産生するＴＢ５３５は、分析用サイズ排除及び非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥを含めたいくつかの分析方法によって決定される場合、図１４Ｂ〜Ｄ／Ｅに示すように純度＞９８％である。
【０１３６】
組換え型可溶性ヒト５Ｔ４の発現
ヒト５Ｔ４（ＧｅｎＢａｎｋ、受託番号ＮＭ＿００６６７０）のコード配列を、５Ｔ４の細胞外ドメインだけを含むヒト５Ｔ４の可溶性タンパク質をコードしている人工ｃＤＮＡ配列の構築のために使用した。
【０１３７】
ヒトアルブミンとの融合のために、最初に構築物の真核生物発現のためのコザック部位、それに続きフレーム内でフラグ（Ｆｌａｇ）タグのコード配列が先行する、シグナルペプチド及び細胞外ドメインに対応するアミノ酸１〜３５５を含むヒト５Ｔ４タンパク質のコード配列、それに続きフレーム内で改変ヒスチジンタグ（ＳＧＨＨＨＨＨＨ）のコード配列及び停止コドンを含有するように、改変ｃＤＮＡ断片を設計した。
【０１３８】
上述の手順は、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））により全て実施した。
【０１３９】
実施例２  ヒト化
キメラ及びヒト化抗５Ｔ４抗体をマウスＨ８抗体配列及びヒト抗体配列由来の配列を使用して調製した。本発明の代表的な抗体の一部の配列を図２に示す。
【０１４０】
マウスＨ８重鎖配列及び軽鎖可変領域配列（例えば、配列番号０１又は配列番号０２を、配列番号１６又は配列番号１７のいずれか及びヒト定常領域配列ＣＨ１及びＣＬ−カッパと組み合わせたものを有するキメラＨ８抗体を構築した。キメラＨ８抗体及びヒト化Ｈ８抗体を調製するために使用された代表的なヒト定常領域には、ヒトＩｇＧ１、ヒトカッパ、及びヒトＩｇＧ４の定常領域が含まれる。ＩｇＧ定常領域をコードしている配列のクローニングのために、イントロン配列が任意選択で欠失される場合がある。１つの抗体鎖がマウスＨ８可変領域（キメラ抗体と同様に）を含み、他方の抗体鎖がヒト化Ｈ８可変領域、すなわち、半ヒト化抗体を含む抗体も調製した。
【０１４１】
ヒト又は実質的にヒトのフレームワーク領域に移植されたマウスＨ８のＣＤＲを含むようにヒト化Ｈ８可変領域を構築した。配列可変性及び構造ループ領域の位置に基づくＡｂＭ規定を用いて、マウスＨ８抗体のＣＤＲを同定した。マウスＨ８抗体のフレームワーク領域に実質的に類似であったこと、又は可変領域サブファミリーのコンセンサス配列に最も類似していたことに基づき、ヒトアダプターフレームワークを選択した。図２を参照されたい。広範に出現する配列が、数がより少ない配列よりも好まれるように、ヒトにおけるフレームワーク座の内訳も考慮した。例えば、抗原の接触に関与すると考えられるマウス残基及び／又は抗原結合部位の構造完全性に関与する残基を回復させるように、ヒトフレームワークアクセプター配列の追加的な突然変異を行った。ＣＨＯ細胞のコドン選択（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）のため及び制限酵素部位を除去するためにも、アミノ酸配列を最適化した。ヒト化設計によって導入された翻訳後タンパク質改変部位を同定及び回避するために、ペプチド構造予測プログラムを使用してヒト化可変重鎖領域配列及び軽鎖領域配列を分析した。この戦略を使用して、３つのバージョンのヒト化Ｈ８可変領域を構築した。バージョン１は、抗体の完全性及び抗原の結合性に重要と考えられるフレームワーク配列内の位置にマウスＨ８残基を保持する。バージョン２は、ＣＤＲだけにマウス残基を保持する。バージョン３は、コンセンサス可変領域配列が重鎖アクセプターフレームワークとして使用されたことを除き、バージョン２と同様である。バージョン３の抗体の軽鎖可変領域は、バージョン２の抗体の軽鎖可変領域と同じである。
【０１４２】
ヒト化Ｈ８軽鎖可変領域の構築のために、ＤＰＫ２４生殖細胞系配列ＶＬ−ＩＶ／Ｂ３座をアクセプターフレームワークとして使用した。ＤＰＫ２４配列は、マウスＨ８軽鎖可変領域と６８％同一であり、マウスＨ８軽鎖フレームワーク配列と比べて１８個のアミノ酸置換を含有する。
【０１４３】
生殖細胞系クローン亜群ＶκＩＩＩ及びＶκＩの軽鎖可変領域のフレームワーク領域を使用してヒト化抗体も構築した。特に、軽鎖ＶκＩＩＩ亜群フレームワーク領域を含む抗体及び開示されたヒト化Ｈ８抗体バージョン１は、両方とも高度に発現され、安定である。
【０１４４】
ヒト化Ｈ８重鎖可変領域の構築のために、ＤＰ７５生殖細胞系配列ＶＨ−Ｉ／１−０２座をアクセプター配列として使用した。ＤＰ７５配列は、マウスＨ８重鎖可変領域と６５％同一であり、マウスＨ８重鎖フレームワーク配列と比較して２８個のアミノ酸置換を含有する。ヒト化Ｈ８重鎖可変領域バージョン１は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域との抗原の接触に重要なマウスＨ８残基Ｋ３８及びＳ４０、並びに可変領域及びＣＤＲ２との抗原の接触に重要なＩ４８を維持していた。或いは、重鎖可変領域亜群のコンセンサス配列を用いてヒト化Ｈ８重鎖を調製した。コンセンサス配列は、マウスＨ８重鎖フレームワーク配列と比較して２５個のアミノ酸置換を含有する。
【０１４５】
重複するオリゴヌクレオチドを一緒にアニーリングして、ヒト抗体定常領域を含有するｐＵＣ５７クローニングベクターにそれらをライゲーションすることによって、ヒト化Ｈ８重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を構築した。ＰＣＲ突然変異誘発又は部位特異的突然変異誘発を用いてヒト化重鎖可変領域及び軽鎖可変領域も構築することができる。オリゴヌクレオチドの設計は、ＣＨＯ細胞の発現及び制限酵素部位の除去のためのコドン使用頻度の最適化を含んでいた。
【０１４６】
ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＬ  ＣＤＲ１又はＶＬ  ＣＲＤ２のうちのいずれかを最も近い相同生殖細胞系配列により置換することによって、さらなる最適化を行った。収量及び結合活性により変異体を順位付けした。ＥＰ０７０３９２６に記載されているように、ｓｃＦｖの安定化ジスルフィド結合を効果的に形成した分子の数が予想外に増加したので、ＶＨ  ＣＤＲ１置換は特に関心がもたれた（図４Ａ並びに図４Ｂ−ａ、ｂ及びｃを参照されたい）。
【０１４７】
図５に、ヒト化形態が予想通りの挙動を示し、マウスに基づく抗体と同等であることを示している、ゲル濾過、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦ及び分析用イオン交換に基づく分析を示す（図５Ｂ、Ｃ、Ｄ）。分析用ゲル濾過は、また、Ｔｂ５３５Ｃ（キメラ：マウスＶ−ドメイン含有）と比較してＴｂ５３５Ｈ（ヒト化）がわずかにコンパクトな形態であることを示す。
【０１４８】
図８に、Ｔｂ５３５Ｈ（配列番号０６及び配列番号１９に基づく）が、マウス可変ドメイン（配列番号０２及び配列番号１７）に基づくトリボディーと比較して、５Ｔ４だけでなくＣＤ３への同等な結合性及び同等な活性を示す。
【０１４９】
実施例３  結合アッセイ
ＦＡＣＳ分析：装飾、力価測定、ＰＢＭＣの結合性
被験細胞株（腫瘍細胞株、ＰＢＭＣ）を収集し（細胞１×１０６個／試料）、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ／１０％ＦＢＳ中の結合分子（例えば、抗体／トリボディー）１μｇと共に氷上で１時間インキュベートした。腫瘍細胞株による５Ｔ４発現の特徴付けのために、市販の抗５Ｔ４抗体を使用した（カタログ番号：ＭＡＢ４９７５１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１５０】
ヒト５Ｔ４ドメインへの抗５Ｔ４分子（ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びトリボディー形式）の結合にアクセスするために、二相性中皮腫細胞株ＭＳＴＯ−２１１Ｈ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０８１）を、Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のライトニング−リンク（Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ）（登録商標）ＡＰＣキットによってアロフィコシアニン（ＡＰＣ）で直接標識された分子を用いたＦＡＣＳ結合アッセイで、製造業者の説明書にしたがって試験した。平衡解離定数（ＫＤ）の決定に関して、Ｔｂ５３５濃度は０．０５〜５００ｎＭの範囲であった。
【０１５１】
次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、細胞表面への結合性を、ＢＤ  ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣｓａｌｉｂｕｒ）装置を用いたフローサイトメトリーによってアクセスする。
【０１５２】
ジャーカット細胞に基づくＥＬＩＳＡ
ヒトＣＤ３ドメインへの構造物の結合性にアクセスするために、Ｔ細胞リンパ腫（ＣＤ３＋）細胞株を用いた、細胞に基づくＥＬＩＳＡを使用した。ジャーカット細胞を収集し、洗浄し、丸底ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分注する。トリボディー及び単鎖の希釈物をＰＢＳ中に調製し、細胞に添加する。洗浄段階の後に、検出用抗体を試料に添加する（アルカリホスファターゼ結合型モノクローナル抗ＦＬＡＧ、カタログ番号：Ａ９４６９、Ｓｉｇｍａ）。第２の抗体を、ｐ−ＮＰＰ（カタログ番号：Ｎ７６５３、Ｓｉｇｍａ）の添加時の比色反応の発生により検出し、マイクロウェルプレートリーダーで吸光度を定量し、グラフパッドプリズム（ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアを用いた非線形回帰によって処理する。
【０１５３】
細胞に基づくＥＬＩＳＡ又はタンパク質に基づくＥＬＩＳＡを、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））にしたがって行った。
【０１５４】
ヒトＣＤ３ドメインに対する親和性について、Ｔ細胞リンパ腫（ＣＤ３＋）細胞株であるジャーカットを用いた、細胞に基づくＥＬＩＳＡを使用した。ジャーカット細胞を収集し、洗浄し、丸底９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに分注する。トリボディー／試料の希釈物をＰＢＳ中に調製し、細胞に添加し、インキュベートした。洗浄ステップの後に、検出用抗体を試料に添加する（抗ヒトカッパ軽鎖ＡＰ；例えばＳｉｇｍａ、カタログ番号．Ｋ４３７７）。結合した検出用抗体を、ｐ−ＮＰＰ（カタログ番号：Ｎ７６５３、Ｓｉｇｍａ）の添加時の比色反応の発生によって測定し、吸光度をマイクロウェルプレートリーダーで定量し、グラフパッドプリズム（ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアを用いた非線形回帰によって処理する。
【０１５５】
５Ｔ４標的抗原に対する親和性のために、５Ｔ４抗原を用いるＥＬＩＳＡを使用する。施設内で産生された標的抗原である５Ｔ４細胞外ドメインをポリスチレン平底９６ウェルマイクロプレートにコーティングし、ブロッキングする。トリボディー／試料の希釈物を０．２％ｗ／ｖ粉乳を有するＴＢＳ中に調製し、プレートに添加し、インキュベートした。洗浄ステップの後に、検出用抗体を試料に添加する（抗ヒトカッパ軽鎖ＡＰ；例えばＳｉｇｍａ、カタログ番号．Ｋ４３７７）。結合した検出用抗体を、ｐ−ＮＰＰ（カタログ番号：Ｎ７６５３、Ｓｉｇｍａ）の添加時の比色反応の発生によって測定し、吸光度をマイクロウェルプレートリーダーで定量し、グラフパッドプリズムソフトウェアを用いた非線形回帰によって処理する。
【０１５６】
【表１】
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【０１５７】
表１に示すように、二価結合性Ｔｂ５３５は、同等なＢｉＴＥ（ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式）などの一価形式と比較して２〜３倍高い親和性を有する。トリボディー形式を使用して、ＩｇＧ形式に近い５Ｔ４に対する親和性が得られる（図３Ａ、Ｂ及びＣを参照されたい）。図３Ｃ及びＤに、ｓｃＦｖ及びＦａｂなどの一価形式よりもトリボディーの結合性に明らかな利点があることを示す。
【０１５８】
Ｔｂ５３５立体配置での抗ＣＤ３の結合性は、ジャーカット細胞及び異なるドナーのＰＢＭＣへの結合性によって実証されるように有効なままである（図３Ｆ）。
【０１５９】
実施例４  活性のアッセイ
標的細胞の標識化
フローサイトメトリーアッセイにおける細胞溶解の分析のために、蛍光膜色素ＤｉＯＣｉ８（ＤｉＯ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  カタログ番号：Ｖ２２８８６）を使用して、標的細胞としてヒト又はマカク５Ｔ４形質移入ＣＨＯ細胞又は５Ｔ４発現ヒト細胞を標識し、エフェクター細胞からそれらを識別した。簡潔には、細胞を採集し、ＰＢＳで１回洗浄し、２％（ｖ／ｖ）  ＦＢＳ及び膜色素ＤｉＯ（５μｌ／細胞１０６個）を含有するＰＢＳ中に細胞１０６個／ｍＬになるよう調整した。３７℃で３分間インキュベーション後、細胞を完全ＲＰＭＩ培地中で２回洗浄し、細胞数を細胞１．２５×１０５個／ｍＬに調整した。細胞の活力を、０．５％（ｖ／ｖ）等張エオシンＧ溶液（Ｒｏｔｈ  カタログ番号：４５３８０）を使用して決定した。
【０１６０】
ヒトＰＢＭＣを用いたＦＡＣＳに基づく細胞傷害性アッセイ
輸血のために血液を収集している血液銀行の副産物である、濃縮したリンパ球調製物（バフィーコート）からのフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）密度勾配遠心分離によって、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。バフィーコートを地域の血液銀行が供給し、採血と同じ日にＰＢＭＣを調製した。フィコール密度遠心分離及びダルベッコＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を用いた徹底的な洗浄の後、赤血球溶解緩衝液（１５５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、１００ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いたインキュベーションを介して、ＰＢＭＣから残りの赤血球を除去した。ＰＢＭＣを１００×ｇで遠心分離したときの上清により血小板を除去した。残りのリンパ球は、主にＢリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞及び単球を包含している。１０％  ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）を有するＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中にＰＢＭＣを３７℃／５％  ＣＯ２で培養して維持した。
【０１６１】
異なる腫瘍細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１３２）、ＭＳＴＯ−２１１Ｈ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０８１）、ＮＣＩ−Ｈ２０５２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９１５）、ＮＣＩ−Ｈ２４５２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５９４６）、ＮＣＩ−Ｈ２８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−５８２０）、ＭＤＡ−ＭＢ２３１（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２６）、ＨＳ−５７８Ｔ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２６）、ＢＴ−５４９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１２２）、ＳＷ−６２０  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２７）、ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４７）、ＨＣＴ−１５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２５）を標的細胞として使用する、ＦＡＣＳに基づくインビトロ細胞傷害性アッセイによってトリボディーの生物学的活性を分析した。ヒトＰＢＭＣをＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ−２刺激後にエフェクター細胞として使用した。刺激するには、Ｔフラスコ（７５ｃｍ３）にＰＢＳ（１×）７．５ｍｌ中の５μｇ／ｍｌ  αＣＤ３（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ  カタログ番号：２１６２００３０）を３７℃で２時間コーティングした。フラスコをＰＢＳですすぎ、その後、１０％  ＦＢＳ（ＰＡＡ  カタログ番号：Ａ１５−１５１）、５μｇ／ｍｌ  αＣＤ２８（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ  カタログ番号：２１３３０２８０）及び３０Ｕ／ｍＬヒト組換えＩＬ−２（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ  カタログ番号：１１３４００２３）を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：  Ｒ８７５８）に全ＰＢＭＣを添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で３日刺激後に、ＰＢＭＣを未コーティングのＴフラスコに移し、インターナリゼーションしたＴ細胞受容体を細胞表面に再送達させるために、１０％  ＦＢＳ及び３０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を有するＲＰＭＩ−１６４０中でさらに２４時間インキュベートした。標的細胞をＰＫＨ６７色素（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：ＭＩＮＩ６７−１ＫＴ）で製造業者の説明書にしたがって標識し、細胞接着のために一晩インキュベートした。ヒトＰＢＭＣ（Ｔｅｂｕ  カタログ番号：１９２ＰＭＢＣ）をエフェクター：標的比５：１で添加し、トリボディーを２つ組にして１０００〜０．００１ｎｇ／ｍｌの濃度範囲で調製した。標的、エフェクター細胞及びトリボディーを３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。インキュベーション後に、細胞を採集し、トリボディーを有さない細胞を除きヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号：Ｐ４８６４）を含有するＰＢＳ中に再懸濁した。死滅細胞（ＰＩ＋）と比較した無傷の生きた標的細胞（ＰＫＨ６７＋細胞）の関数として比細胞傷害性を決定した。
【０１６２】
ＢＤ  ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣｓａｌｉｂｕｒ）装置を使用するフローサイトメトリーによって、セルクエスト（ｃｅｌｌ  ｑｕｅｓｔ）ソフトウェアを用いて細胞にアクセスした。標的細胞の最大半値溶解が起こった推定トリボディー濃度（ＥＣ５０）の決定のために、比細胞傷害値をトリボディー濃度に対してプロットし、グラフパッドプリズムソフトウェアを用いる非線形回帰によって処理した。
【０１６３】
いくつかの癌性徴候を表わす一連の細胞株で測定されたＴｂ５３５  ５Ｔ４×ＣＤ３トリボディーの活性は、常に、低ピコモル濃度範囲であった（例えば図９Ａ及びＢ）。驚くことに、５Ｔ４×ＣＤ３トリボディーは、飽和結合条件でインビトロ測定した場合であっても、ＢｉＴＥ  ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式よりも高いパーセンテージの細胞死を示した（図７Ｄを参照されたい）。
【０１６４】
Ｔ細胞活性化マーカーの検出
健康なドナーのＰＢＭＣ（Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ）を標的ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞の存在下及び非存在下の２つ組でＴＢ５３５Ｈと共にインキュベートした。ＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩ中で３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を細胞８×１０４個／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、細胞接着のために一晩インキュベートした。一連のトリボディー濃度で、エフェクター：標的が１０：１（非活性化）のＰＢＭＣを添加した。
【０１６５】
ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞株の存在下及び非存在下でｈＰＢＭＣ及びトリボディーを２４時間インキュベーション後に、ＰＢＭＣ（供給業者：Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ）を遠心分離（３００×ｇ、５分、室温）によって採集し、抗体濃度１μｇ／細胞１００万個のＡＰＣ標識抗ＣＤ６９（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ  カタログ番号：２１２７０５６４）及びＦＩＴＣ結合型抗ＣＤ３（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ  カタログ番号：２１６２００３３）で染色した。別のＴ細胞活性化マーカーであるＣＤ２５の決定のために、４８時間インキュベーション後に細胞を採集し、ＡＰＣ−抗ＣＤ２５（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ  カタログ番号：２１２７０２５６）及びＦＴＩＣ抗ＣＤ３で染色した。抗体を４℃で１時間遮光しながらインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、ＦＡＣＳキャリバー装置のフローサイトメトリーによって結果にアクセスした。
【０１６６】
図１２Ｃに、ＰＢＭＣと一緒の腫瘍細胞のエクスビボ共培養が、Ｔｂ５３５濃度依存性のＴ細胞活性化マーカーの発現を誘導するが、最大１μＭの濃度であっても標的細胞の非存在下でこれは存在しないことを示す。
【０１６７】
ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＮＫ亜集団を用いた細胞傷害性アッセイ
ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞の細胞障害活性を評価するために、市販のＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＤ５６＋濃縮細胞を購入した（供給業者：Ｔｅｂｕ−ｂｉｏ）。
【０１６８】
Ｔｂ５３５Ｈの生物学的活性を、エフェクター細胞の調製を変更したＦＡＣＳに基づくインビトロ細胞傷害性アッセイによって評価した。ＰＢＭＣと同じく、これらの細胞集団も解凍し、一晩培養した後、細胞傷害性アッセイに使用した。しかし、ＰＢＭＣについてＥ：Ｔが１０：１という固定比を使用する代わりに、エフェクター細胞の量を各細胞亜集団のために適合させた。典型的には、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞は、ＰＢＭＣの全集団の５０％、２５％及び１０％に相当する。この仮定のもとに、この細胞傷害性アッセイに使用されたＥ：Ｔ比は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞について５：１、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞について２．５：１、及びＮＫ細胞について１：１であった。対照として、Ｅ：Ｔが１０：１のＰＢＭＣの全集団を用いてもアッセイを行った。追加的に、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の混合も試験した
【０１６９】
１００．０００ｐＭのＴｂ５３５のインキュベーションを行ってこれらの細胞集団の細胞傷害性活性を決定した。死細胞（ＰＩ＋）と比べた無傷の生きた標的細胞（ＰＫＨ６７＋細胞）の関数として比細胞傷害性を決定した。
【０１７０】
図１３に実証するように、ＣＤ８＋Ｔ細胞は主なエフェクター細胞であり、有効性はＣＤ４＋細胞を含ませることによって高まる。ＮＫ細胞が刺激されてＴｂ５３５により標的細胞を死滅させることはない。
【０１７１】
実施例５  安定性
サーモフルオロ分析
ｓｃＦｖ−ＰＯ３試料及びｓｃＦｖ−ＳＰ３４試料をｐＨ７．４のＰＢＳに入れて終濃度０．１ｍｇ／ｍｌに希釈した。２００×希釈のシプロレッド（Ｓｙｐｒｏ  Ｒｅｄ）ゲル染料（カタログ番号：Ｓ−６６５３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）５μｌを、希釈した試料５５μｌに添加した。調整済みの各試料２０μｌをキャピラリーに負荷し、７００ｇで５秒間遠心分離した。検出のために、サーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ）１．５）を６４０ｎｍに設定し、第１のステップで３７℃で１０秒間、続いて連続的にデータ取得しながら０．５℃／秒で最大９５℃まで上昇するようプログラムした。
【０１７２】
分析用サイズ排除（ゲル濾過）
トリボディーを定量し、純度、より高い分子量の可溶性凝集形態、例えば二量体、三量体など、及びより小さな分子量の断片化形態、例えば遊離した軽鎖と比較した単量体の比率を決定するための分析を、Ｂｉｏ  ＳＥＣ−５、５ｕｍ、３００Ａ、７．８×３００ｍｍのカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備える、１ｍｌ  ｍｉｎ−１のリン酸ナトリウム／ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液を用いたＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ）で２８０ｎｍのＵＶにより検出して実施した。精製された標準を使用して描いた検量線に対するＡＵＣを使用して定量を実施する。
【０１７３】
特に、ジスルフィドで安定化された単鎖を含有する場合のトリボディー形式は、同等なｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ（ＢｉＴＥ）形式よりも、及び驚くことに同一のＶドメイン配列を含有するＩｇＧ形式と比較した場合であっても、安定であることが見出されている（図６Ａ−ｄ）。
【０１７４】
Ｔｂ５３５の顕著な安定性は、ＰＢＳ又はヒト血清のいずれかの中で３７℃で３日間インキュベートすることによってさらに例証される。単量体性可溶性画分（図６Ｂ−ａ）では変化がなく、活性喪失がない（図６Ｂ−ｂ）。
【０１７５】
実施例６  分析
荷電アイソフォームを特徴付け、その比率を決定するための分析用陽イオン交換分析を、ＭａｂＰａｃ  ＳＣＸ−１０  ３μｍ、４×５０ｍｍカラム（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を備える、０．５ｍｌ  ｍｉｎ−１のＭＥＳ（ｐＨ５．６）緩衝液を用いたＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ）で塩勾配を使用して、２８０ｎｍのＵＶにより検出して実施した。
【０１７６】
ＢＩＯ−ＲＡＤパワーパック（Ｐｏｗｅｒ  Ｐａｃ）ＨＶを備えるエクセルシュアロックミニセル（ＸＣｅｌｌ  Ｓｕｒｅｌｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中で泳動させるＩＥＦ  ３−１０成形済みゲル（Ｓｅｒｖａ）を使用する非平衡ｐＨゲル電気泳動を使用して、等電点電気泳動を実施し、シンプリーブルーセーフステイン（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。
【０１７７】
ＢＩＯ−ＲＡＤパワーパックＨＶを備え、ＭＯＰｓ緩衝液を入れたエクセルシュアロック（商標）ミニセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中で泳動させるＮｕＰＡＧＥノベックス（Ｎｏｖｅｘ）ビストリス４〜１２％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＳＤＳ  ＰＡＧＥを実施し、シンプリーブルー（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ）（商標）セーフステイン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。分析のために試料を負荷緩衝液ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で希釈し、還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥのために追加的にＤＴＴで還元した。
【０１７８】
ウエスタンブロットのために、ＢＩＯ−ＲＡＤパワーパックＨＶを備え、ＭＯＰｓ緩衝液を入れたエクセルシュアロックミニセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の中で泳動させるＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘビストリス４〜１２％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより、試料を最初に分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ヒトカッパ軽鎖ＡＰ；例えばＳｉｇｍａ  カタログ番号Ｋ４３７７を使用して検出する。結合した検出用抗体を、ＡＰコンジュゲートキット、カタログ番号１７０−６４３２（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して発色させる。
【０１７９】
実施例７  マウスモデルにおける薬物動態及び薬力学
細胞傷害性アッセイによる半減期の決定
マウス３０匹（ＦＯＸＰ３−ＧＦＰ；雌雄；１時点あたり雄２匹及び雌１匹）に１０ｍｇ／ｋｇのＴｂ５３５を注射し、異なる時点：注射後５及び３０分、１、２、３、４、６、８、１２及び１６時間にマウス３匹の群で屠殺した。血清試料中のＴｂ５３５Ｈの生物学的活性を上記のＦＡＣＳに基づくインビトロ細胞傷害性アッセイにより評価した。簡潔には、標的細胞（ＭＳＴＯ−２１１Ｈ）を、製造業者の説明書にしたがってＰＫＨ６７色素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識化し、細胞接着のために一晩インキュベートした。市販のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＣＤ３／ＣＤ２８／ＩＬ２で活性化し、エフェクター細胞としてエフェクター：標的比が５：１で使用した。各血清試料について２〜３つの希釈物を調製し、標的細胞に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。対照として、公知の濃度を有するＴｂ５３５Ｈ試料も含めて、トリボディー濃度をこの特異的ＰＢＭＣドナーについての細胞傷害性値と対比する検量線を確立した。インキュベーション後に、細胞を採集し、比細胞傷害性を、ＢＤ  ＦＡＣＳキャリバー装置を使用するフローサイトメトリーによって、セルクエストソフトウェアを使用して判断される、死細胞（ＰＩ＋）に対する無傷の生きた標的細胞（ＰＫＨ６７＋細胞）の関数として決定した。この方法による推定Ｔｂ５３５Ｈ濃度及び半減期の決定のために、時間に対して比細胞傷害性の値をプロットし、α相及びβ相を考慮する線形回帰によって処理した。
【０１８０】
図１０に、大きな分布容積及び相対的に低い浄化を示している、半減期の決定の例を示す。
【０１８１】
有効性の決定：早期治療
早期腫瘍モデルを用いてトリボディー（１０；１；０．１；０．０１ｍｇ／ｋｇ）の有効性を試験するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ヒトＰＢＭＣ２．５×１０６又は５×１０６個と混合した中皮腫細胞２．５×１０６個を皮下注射した。トリボディーを腫瘍注射の０、２、４、７、９及び１１日後にｉ．ｖ．で与えた。腫瘍の成長をノギスで測定した。
【０１８２】
同所性中皮腫モデルを模倣して、中皮腫細胞２．５×１０６個を胸膜内に注射した。呼吸困難及び２０％超の体重減少について動物を定期的に点検して、地域の倫理委員会によって承認されたような人道的終点を決定した。
【０１８３】
図１１Ａ−ａｂｃに、ヒトＰＢＭＣで再構成されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに皮下異種移植後の治療におけるＴｂ５３５の有効性を示し、図１１Ａ−ｄ及びｅに、同所性（胸膜内注射された）中皮腫モデルにおける活性を図示する。
【０１８４】
有効性の決定：晩期治療
ＮＳＧマウス（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒガンマ＜ヌル＞、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）における異種移植試験を使用して樹立腫瘍の治療を実証し、癌細胞５×１０６個の皮下植込みから７日後に、マウスに活性化ＰＢＭＣ１０×１０６個をＩＰにより６日毎に３回注射した。全ての試験について、初回ＰＢＭＣ注入の２日後に、マウスをＴｂ５３５又は食塩水の７回隔日投与で静脈内治療した。腫瘍を週に２回ノギスで測定し、腫瘍体積をＷ×Ｌ×Ｈによって計算した。
【０１８５】
図１１Ｂに、Ｔｂ５３５も樹立腫瘍に活性であることを示す。
【０１８６】
実施例８  エクスビボ細胞傷害性
サイトカイン放出アッセイ
健康なドナー４人からのＰＢＭＣを標的ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞の存在下及び非存在下でＴＢ５３５Ｈと共にインキュベートした。ＰＢＭＣを解凍し、ＲＰＭＩ中に入れて３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。ＭＳＴＯ−２１１Ｈ細胞を２４ウェルプレートに細胞８×１０４個／ウェルで接種し、細胞接着のために一晩インキュベートした。ＰＢＭＣをエフェクター：標的が１０：１（非活性化）のもと、一連のトリボディー濃度で添加した。３７℃及び５％ＣＯ２で２４又は４８時間インキュベートした後に細胞を採集し、遠心分離し（３００×ｇ、５分、室温）、上清を新しいチューブに収集し、サイトカイン放出についてアッセイした。
【０１８７】
以下のキットを製造業者の説明書にしたがって使用するＥＬＩＳＡによって培地へのサイトカイン放出にアクセスした：ＩＬ−２、Ｍａｂｔｅｃｈ  ３４４５−１Ｈ−６；ＩＦＮ−ガンマ  Ｍａｂｔｅｃｈ  ３４２０−１Ｈ−６；ＴＮＦ−アルファ  Ｍａｂｔｅｃｈ  ３５１０−１Ｈ−６；ＴＧＦ−ベータ１  Ｒ＆Ｄ  ＤＹ  ２４０−０５；ＩＬ−４  Ｒ＆Ｄ  ＤＹ２０４−０５及びＩＬ−６  Ｒ＆Ｄ  ＤＹ２０６。結果が標準曲線に適合するように、一部の試料を、すなわちＴＧＦ１−ベータ（１：７希釈）、ＩＬ−６（１：１０希釈）及びＩＦＮ−ガンマ（１０ｎｇ／ｍｌ以上のＴｂ５３５Ｈ濃度についてＮＯＥＬ標的試料に１：４０希釈）で、希釈しなければならなかった。２４時間インキュベーション後に、ＩＬ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ及びＩＬ−６の定量のために試料を測定した。４８時間インキュベーション後にＩＬ−４及びＴＧＦ−ベータ１を培地から定量した。
【０１８８】
図１２Ａに腫瘍細胞とＰＢＭＣとのエクスビボ共培養におけるＩ型応答のサイトカイン誘導を示し、図１２Ｂに標的細胞の非存在下（ＰＢＭＣ＋Ｔｂ５３５のみ）での有意なサイトカイン誘導の欠如を示す。
【０１８９】
【表２−１】
0006709003.tif 000003
【表２−２】
0006709003.tif 000004
【表２−３】
0006709003.tif 000005
【表２−４】
0006709003.tif 000006
【表２−５】
0006709003.tif 000007
【表２−６】
0006709003.tif 000008
【図１Ａ】
0006709003.tif 000009
【図１Ｂ】
0006709003.tif 000010
【図１Ｃ】
0006709003.tif 000011
【図１Ｄ】
0006709003.tif 000012
【図２Ａ】
0006709003.tif 000013
【図２Ｂ】
0006709003.tif 000014
【図２Ｃ】
0006709003.tif 000015
【図２Ｄ】
0006709003.tif 000016
【図３Ａ】
0006709003.tif 000017
【図３Ｂ】
0006709003.tif 000018
【図３Ｃ】
0006709003.tif 000019
【図３Ｄ】
0006709003.tif 000020
【図３Ｅ】
0006709003.tif 000021
【図３Ｆ】
0006709003.tif 000022
【図４Ａ】
0006709003.tif 000023
【図４Ｂ】
0006709003.tif 000024
【図５Ａ】
0006709003.tif 000025
【図５Ｂ】
0006709003.tif 000026
【図５Ｃ】
0006709003.tif 000027
【図５Ｄ】
0006709003.tif 000028
【図６Ａ】
0006709003.tif 000029
【図６Ｂ】
0006709003.tif 000030
【図７Ａ】
0006709003.tif 000031
【図７Ｂ】
0006709003.tif 000032
【図７Ｃ】
0006709003.tif 000033
【図７Ｄ】
0006709003.tif 000034
【図８Ａ】
0006709003.tif 000035
【図８Ｂ】
0006709003.tif 000036
【図８Ｃ】
0006709003.tif 000037
【図８Ｄ】
0006709003.tif 000038
【図９Ａ】
0006709003.tif 000039
【図９Ｂ】
0006709003.tif 000040
【図１０Ａ】
0006709003.tif 000041
【図１０Ｂ】
0006709003.tif 000042
【図１１Ａ】
0006709003.tif 000043
【図１１Ｂ】
0006709003.tif 000044
【図１２Ａ】
0006709003.tif 000045
【図１２Ｂ】
0006709003.tif 000046
【図１２Ｃ】
0006709003.tif 000047
【図１３】
0006709003.tif 000048
【図１４Ａ】
0006709003.tif 000049
【図１４Ｂ】
0006709003.tif 000050
【配列表】
0006709003000001.app