(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の下流領域（ＤＲ）および上流領域（ＵＲ）を有する標的核酸配列を検出するための方法であって、前記標的核酸は、少なくともＤＲ２またはＵＲ２領域を有し、前記方法は、
（ａ）前記サンプルを
相補的な下流領域（ＤＲ’）を有する下流ディテクターオリゴ（ＤＤ）および
相補的な上流領域（ＵＲ’）を有する上流ディテクターオリゴ（ＵＤ）と接触させ、前記ＤＤまたはＵＤの少なくとも１つが、前記ＤＲ’またはＵＲ’と非相補的領域（ＣＰ１）により分離された第２の相補的領域を有し、前記ＤＤの前記第２の相補的領域は、前記標的核酸の前記ＤＲ２領域に対して相補的であるＤＲ２’であり、かつ／または前記ＵＤの前記第２の相補的領域は、前記標的核酸の前記ＵＲ２領域に対して相補的であるＵＲ２’であり、それにより前記ＤＲ’およびＵＲ’、ならびに前記ディテクターのＤＲ２’またはＵＲ２’の少なくとも１つが、前記ＤＲおよびＵＲ、ならびに前記標的核酸の前記ＤＲ２およびＵＲ２の少なくとも１つと特異的にハイブリダイズすることができるステップと；
（ｂ１）前記ＤＲ’とＵＲ’の両方が標的配列の前記ＤＲおよびＵＲと特異的にハイブリダイズする場合に、前記ＤＲ’とＵＲ’をライゲーションするステップと、
（ｂ２）ハイブリダイゼーション複合体を、一本鎖は分解するが、二本鎖はわずかにしか分解しない少なくとも１つのヌクレアーゼに曝露するステップであって、それにより非特異的にハイブリダイズしたＤＤおよびＵＤが前記ヌクレアーゼによって分解されるステップとを含み、
それにより前記ライゲーション産物は、前記サンプル中の前記標的配列の存在を示す、方法。
【請求項２】
前記サンプルが、組織サンプル、もしくは単一細胞であり、スライド上に載置されるか、またはホルマリン固定パラフィンに包埋された（ＦＦＰＥ）サンプル由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸は、ＲＮＡであり、環状ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、長いノンコーディングＲＮＡ、またはマイクロＲＮＡまたはその一部であってもよく、前記マイクロＲＮＡは、ステップ（ａ）に先立って３’−ポリアデニル化され、前記ＤＤは、前記ＤＲ’と近接したポリ−Ｔ領域を有していてもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＤ（複数）およびＵＤ（複数）のセットは、異なるＤＲ（複数）またはＵＲ（複数）を有し、前記標的配列の異なる部分（複数）の測定を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）前記ＤＤは５’−エキソヌクレアーゼブロッキング基を有するか、（ｉｉ）前記ＵＤは３’−エキソヌクレアーゼブロッキング基を有するか、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ブロッキング基が、逆位ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、またはホスホロチオアート結合を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ディテクターオリゴが、１つ以上の位置で、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）主鎖（backbone）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）ＤＤは、ＤＲ２プロテクターオリゴとハイブリダイズした５’−末端ＤＲ２’領域を有するか、または（ｉｉ）前記ＵＤは、ＵＲ２プロテクターオリゴとハイブリダイズした３’−末端ＵＲ２’配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ヌクレアーゼは、３’→５’活性を有するか、または５’→３’活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）ステップ（ｂ２）がステップ（ｂ１）の前に行われるか、（ｉｉ）ステップ（ｂ２）がステップ（ｂ１）の間に行われるか、または（ｉｉｉ）ステップ（ｂ２）がステップ（ｂ１）の後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸が固相表面に結合されているか、または前記標的配列が原位置にあるときに、ステップ（ａ）、ステップ（ｂ１）、またはステップ（ｂ２）の１つ以上が、液相で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ライゲーション産物またはその増幅産物の存在が、配列決定、ｑＰＣＲ、または標識化分子をカウントするためのフロースルーシステムによって検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ０）前記細胞壁、細胞膜、または細胞下構造を透過性にするステップ、
（ｃ）前記ヌクレアーゼを不活化するステップ、
（ｄ）前記ライゲーション産物を溶出するステップ、
（ｅ）前記ライゲーション産物を増幅するステップ、または前記ＤＲとＵＲとが、少なくとも１つのヌクレオチドによって分離されている場合、（ｂ０）鋳型として前記サンプルを使用して前記ＤＲ’を伸長するステップ、のうちのいずれかをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＤは、前記ＤＲ’の下流に第１の増幅領域（Ｐ１）を有し、前記ＵＤは、前記ＵＲ’の上流に第２の増幅領域（Ｐ２’）を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ステップ（ｂ２）が、一本鎖のＰ１またはＰ２’領域を分解する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
極めて豊富な標的配列（ＨＡＴ）のＤＲ２、ＤＲ２’、ＵＲ２、ＵＲ２’、ＤＲ、またはＵＲの１つ以上の部分に対して相補的である配列を有するアテニュエーターオリゴヌクレオチドがさらに提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
下流領域（ＤＲ）および上流領域（ＵＲ）を有する標的配列に対するディテクターであって、各標的配列について、
下流ディテクターオリゴ（ＤＤ）が相補的な下流領域（ＤＲ’）を有し、
上流ディテクターオリゴ（ＵＤ）が相補的な上流領域（ＵＲ’）を有し、
前記ＤＤまたはＵＤの少なくとも１つが、非相補的領域（ＣＰ１）により前記ＤＲ’またはＵＲ’から分離された第２の相補的領域を有し、前記ＤＤの前記第２の相補的領域が、前記標的核酸の前記ＤＲ２領域に対して相補的であるＤＲ２’であり、かつ／または前記ＵＤの前記第２の相補的領域が、前記標的核酸の前記ＵＲ２領域に対して相補的であるＵＲ２’である、ディテクターと、
一本鎖を分解するが、二本鎖はわずかにしか分解しない少なくとも１つのヌクレアーゼとを含む、請求項１に記載の方法を実施するためのキットであって、リガーゼをさらに含んでいてもよい、キット。
【請求項１８】
前記ＤＤが５’−末端ＤＲ２’領域を有するか、または前記ＵＤが３’−末端ＵＲ２’配列を有し、前記キットがさらにＤＲ２プロテクターオリゴまたはＵＲ２プロテクターオリゴを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
（ｉ）前記ヌクレアーゼに対する阻害剤、（ｉｉ）ポリメラーゼ、または（ｉｉｉ）組織サンプルからオリゴヌクレオチドを除去するための溶出液をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１月２７日に出願された米国特許仮出願第６２／１０８，１６１号および２０１５年６月３０日に出願された米国特許出願第１４／７８８，６７０号の優先権の利益を主張するものであり、その両方の内容の全体を本明細書に組み込んだものとする。
【０００２】
政府支援の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金第１Ｒ４３ＨＧ００７８１５号のもと政府支援を受けてなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、分子生物学に関し、特にサンプル中の核酸配列を検出するためのアッセイに関する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は以下を提供する。
［１］サンプル中の下流領域（ＤＲ）および上流領域（ＵＲ）を有する標的核酸配列を検出するための方法であって、上記方法は、
（ａ）上記サンプルを
相補的な下流領域（ＤＲ’）を有する下流ディテクターオリゴ（ＤＤ）および
相補的な上流領域（ＵＲ’）を有する上流ディテクターオリゴ（ＵＤ）と接触させ、
それにより上記ディテクターが上記標的核酸と特異的にハイブリダイズすることを可能にするステップと；
（ｂ１）上記ＤＲ’とＵＲ’の両方が標的配列の上記ＤＲおよびＵＲと特異的にハイブリダイズする場合に、上記ＤＲ’とＵＲ’を連結するステップと、
（ｂ２）ハイブリダイゼーション複合体を、一本鎖は分解するが、二本鎖はわずかにしか分解しない少なくとも１つのヌクレアーゼに曝露するステップであって、上記ＤＤまたはＵＤのうちの少なくとも１つは上記ヌクレアーゼに抵抗するように構成され、それにより非特異的にハイブリダイズしたＤＤおよびＵＤが上記ヌクレアーゼによって分解されるステップと
を含み、
それによりライゲーション産物は、上記サンプル中の上記標的配列の存在を示す、方法。
［２］ステップ（ａ）、ステップ（ｂ１）もしくはその両方が液相中で実施されるか、または上記標的核酸が固体表面に付着させられていながらステップ（ａ）もしくはステップ（ｂ１）が実施される、上記［１］に記載の方法。
［３］ステップ（ａ）、（ｂ１）または（ｂ２）のうちの少なくとも１つは、先行するステップと同じ反応容器に試薬を添加することによって実施される、上記［１］に記載の方法。
［４］上記標的核酸は、マイクロＲＮＡまたはその一部であり、任意に、上記マイクロＲＮＡは、ステップ（ａ）に先立って３’−ポリアデニル化され、上記ＤＤは、上記ＤＲ’と近接したポリ−Ｔ領域を有する、上記［１］に記載の方法。
［５］上記ヌクレアーゼは、３’→５’活性を有するか、または５’→３’活性を有するか、または５’フラップを消化する、上記［１］に記載の方法。
［６］（ｃ）上記ヌクレアーゼを不活化するステップ、
（ｄ）上記ライゲーション産物を増幅するステップ、または
上記ＤＲとＵＲとが、少なくとも１つのヌクレオチドによって分離されている場合、
（ｂ０）鋳型として上記サンプルを使用して上記ＤＲ’を伸長するステップ、
のうちのいずれかをさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［７］上記下流ディテクター（ＤＤ）または上記上流ディテクター（ＵＤ）のうちの少なくとも１つは、第２の相補的な領域（ＤＲ２’またはＵＲ２’）を有することによって構成され、それにより上記ＤＲ２’またはＵＲ２’が上記標的配列のＤＲ２またはＵＲ２と特異的にハイブリダイズすることができる、上記［１］に記載の方法。
［８］上記ＤＤは、上記ＤＲ’の下流に第１の増幅領域（Ｐ１）を有し、上記ＵＤは、上記ＵＲ’の上流に第２の増幅領域（Ｐ２’）を有する、上記［７］に記載の方法。
［９］ＤＲ２、ＤＲ２’、ＵＲ２、またはＵＲ２’の部分を有するアテニュエーターオリゴヌクレオチドが、ステップ（ａ）において多量の標的配列（ＨＡＴ）に対して提供される、上記［７］に記載の方法。
［１０］上記アテニュエーターは、（ｉ）ＤＲ２の部分およびＤＲの部分を有するか、または（ｉｉ）ＵＲの部分およびＵＲ２の部分を有する、上記［９］に記載の方法。
［１１］（ｉ）上記ＤＤは、５’−エキソヌクレアーゼブロッキング基によって構成されるか、もしくは（ｉｉ）上記ＵＤは、３’−エキソヌクレアーゼブロッキング基によって構成されるか、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、上記［１］に記載の方法。
［１２］上記ブロッキング基は、固相である、上記［１１］に記載の方法。
［１３］ＤＤは、ＤＲ２プロテクターオリゴとハイブリダイズする５’−末端ＤＲ２’領域を有することによって構成されるか、または上記ＵＤは、ＵＲ２プロテクターオリゴとハイブリダイズする３’−末端ＵＲ２’配列を有することによって構成される、上記［１］に記載の方法。
［１４］少なくとも１つのディテクターオリゴは、上記標的配列とハイブリダイズしたときに環状化構造を形成することによって構成される、上記［１］に記載の方法。
［１５］標的配列に対するディテクターと、少なくとも１つのヌクレアーゼとを含む、上記［１］に記載の方法を実施するためのキットであって、任意にリガーゼをさらに含むか、または任意に上記キットの酵素用の反応バッファーのための構成成分をさらに含み、上記構成成分は、上記方法の先行するステップと同じ容器における酵素反応のために添加されるのに適している、キット。
本発明は、サンプル中の目的とする核酸配列の標的配列を検出するための方法を提供し、さらに本方法を実施するためのキットも提供する。
【０００５】
一般的なライゲーションアッセイにおいて、サンプルは、ディテクターオリゴのプールと接触させられ、このプールにおいて、各標的配列に対する下流ディテクター（ＤＤ）および上流ディテクター（ＵＤ）が提供される。ＤＤの部分（ＤＲ’）は、下流領域（ＤＲ）と指定される標的配列の領域と相補的である。上流ディテクターは、標的配列の上流領域（ＵＲ）と相補的な部分（ＵＲ’）を有する。
【０００６】
下流ディテクターおよび上流ディテクターは、サンプルと接触させられ、サンプル中に存在する標的配列の対応する領域とハイブリダイズすることができる。ディテクターが標的配列と特異的にハイブリダイズするとき、それらは、直接的にまたは任意の伸長ステップの後かにかかわらず、近接するディテクター間の合流点で連結することができる。したがって、ライゲーション産物の形成は、標的配列がサンプル中に存在したことの証拠の役割を果たし、ライゲーション産物は、検出可能な標識、マイクロアレイ、ｑＰＣＲ、フロースルーカウンター、および配列決定などのさまざまな方法によって検出することができる。
【０００７】
本発明は、使用されなかったディテクターまたは過剰なディテクターまたは標的配列と特異的にハイブリダイズしていないディテクターを選択的に分解するために本方法のステップの間に１つ以上のヌクレアーゼが提供されるアッセイを提供する。それに応じて、ディテクターおよびアッセイのその他の構成成分は、多くの実施形態において標的配列を検出すると同時にヌクレアーゼに抵抗するように構成される。この構成は、全トランスクリプトームまたは全ｍｉＲＮｏｍｅマルチプレックス、および１つの細胞のレベルにおけるｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡなどの核酸の高感度の検出を可能にする。さらに、各ステップは、移動、分離もしくは固相固定を行う必要なく、単一のウェルまたは容器において実施することができるため、マイクロ流体プラットフォームに理想的である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】標的核酸配列を検出するための代表的なライゲーションアッセイを示す図である。簡単にいえば、下流ディテクター（ＤＤ）および上流ディテクター（ＵＤ）プローブオリゴヌクレオチドは、（ａ）サンプル中のＤＲ領域およびＵＲ領域を有する標的配列とハイブリダイズすることができる。識別の都合上、本明細書では上流領域に下線が引かれていることが多い。標的配列のＤＲおよびＵＲとハイブリダイズすると同時に、ＤＤは（ｂ２）選択的にＵＲと連結される。任意に、（ｂ２）ライゲーションに先立ってＤＤは（ｂ０）伸長される。ライゲーション産物は、Ｐ１およびＰ２などの１つ以上のプライマーにより増幅領域Ｐ１およびＰ２’を介して任意に（ｃ）増幅される。
【図２−１】図２ａは、ＵＤが非相補的な領域（ＣＰ１）によって分離された第２の相補的な領域（ＵＲ２’または「アンカー」）を伴って構成される本発明の「アンカード」アッセイ設計を示す。図２ｂのとおり、ＤＤおよびＵＤは標的配列とハイブリダイズして、ＤＲ’とＵＲ’との間の合流点（Ｌ）におけるライゲーションのための支持部を提供するハイブリダイゼーション複合体（ＨＣ）を形成することができる。ライゲーション後に、図２ｃは、図２ｄの増幅産物（ＡＰ）を得るためにライゲーション産物（ＬＰ）がプライマーによって増幅されてもよいことを示す。
【図２−２】図２ｅのとおり、結合していないＤＤディテクターおよびＵＤディテクターまたは過剰なＤＤディテクターおよびＵＤディテクターなどの望ましくない構成成分を除去するために、一本鎖の３’→５’活性を有するエキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼを用いた処理が本方法のさまざまな段階において使用されてもよい。図２ｆのとおり、標的配列と非特異的にまたは不完全にハイブリダイズしたディテクターは、エキソヌクレアーゼによって分解されてもよく、またはライゲーションまたは増幅産物をもたらさない。  図２ｇに示されるように、特定の多量の標的配列（ＨＡＴ）から得られる産物の形成を減らすために、所定量のＵＲ２’（または代わりにＵＲ２）などのアテニュエーターオリゴヌクレオチドが提供されることが望ましい場合もある。
【図２−３】図２ｈは、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡを分解するエキソヌクレアーゼに抵抗するために一方の末端に修飾を有するように構成された一組のディテクターを示す。ＵＤは、３’末端にＤＮＡ一本鎖に対して３’活性を有するエキソヌクレアーゼによるディテクターの分解に抵抗する修飾を有する。あるいは、ＤＤは、５’−ｓｓ−エキソヌクレアーゼによる分解に抵抗するために５’修飾を有してもよい。  図面２ｉおよび２ｊは、ディテクターの対応するＤＲ２’およびＵＲ２’配列と結合して、片方の末端に二本鎖構造をもたらす配列ＤＲ２またはＵＲ２を有するものなど、プロテクターオリゴとハイブリダイズすることによってエキソヌクレアーゼに抵抗するように構成されたディテクターを示す。示されるとおり、エキソヌクレアーゼに抵抗するようプロテクター自体が５’−または３’−修飾されてもよい。図２ｊもマイクロＲＮＡなどの３’末端がポリアデニル化された比較的短い標的配列（３’−ＤＲ−ＵＲ−５’）を示す。ＤＤは、ＤＲ’と近接した相補的なポリ−Ｔ部分を特徴とする。
【図３−１】図３ａは、（ａ）ＤＲ’領域およびＵＲ’領域を介して標的配列とハイブリダイズして、（非共有結合的に）環状化構造を形成することができるディテクターオリゴプローブ（ＤＯ）を使用した本発明の環状化可能なアッセイ設計を示す。ヌクレアーゼおよびリガーゼによる処理後に、環状化ライゲーション産物が、その後、（ｃ）増幅されてもよい。
【図３−２】図面３ｂ、３ｃ、および３ｄは、ヌクレアーゼによって消化されるか、もしくは指数関数的な増幅には適していない可能性のある、部分的にハイブリダイズしたＤＯディテクター、非標的配列とハイブリダイズしたディテクター、または非特異的にハイブリダイズしたディテクターを示す。
【図４】標的（ＤＲ−ＵＲ）、ＤＯ、および２Ｓが環状化二本鎖構造を形成するように、ハイブリダイゼーションの間に（すべてを含む）第２の鎖（２Ｓ）が提供される本発明のアッセイを示す。リガーゼによる処理により、共有結合的に環状化したライゲーション産物がもたらされる。任意に、過剰なディテクターおよび標的に特異的でないハイブリダイゼーション複合体を分解するためにｓｓ−ヌクレアーゼが使用されてもよい。ヌクレアーゼは、不活化されてもよい。必要に応じて、環状化構造は、例えば、制限エンドヌクレアーゼによって直鎖化されてもよい。
【図５】図５ａは、５’末端に短い非相補的なフラップ（ＣＰ５）、および任意に、３’末端に短い非相補的な配列（ＣＰ３）を有する別の環状化可能なＤＯを使用したハイブリダイゼーション複合体の詳細図を示す。図５ｂは、Ｆｅｎ−１などのフラップヌクレアーゼによってＣＰ５が除去された後のハイブリダイゼーション複合体を示す。図５ｃのとおり、必要に応じて、５’末端はリン酸化されてもよい。図５ｄは、Ｆｅｎ−１によって残された切れ目をＣＰ３がどのようにふさぐことができるかを示し、その結果、図５ｅのように、ＤＯを環状化形態に連結することができる。非相補的なＣＰ５および／またはＣＰ３フラップは、ＤＤおよびＵＤの設計のいずれかに組み込まれてもよい。
【図６−１】図６ａは、目的とする２４のヒト遺伝子に関するｍＲＮＡ発現産物に対するディテクターを設計するために使用した標的配列（配列番号３３〜５６）を提供する。それらの遺伝子を選択し、１０、１、および０．１ｎｇのサンプルＲＮＡ投入を用いて存在量の６桁の予想範囲にわたる検出を実証した。配列決定によって確認された増幅されたライゲーション産物の数を、アンカードディテクター設計（図６ｂ、６ｃ、および６ｄ）ならびに環状化可能な設計（図６ｅ、６ｆ、および６ｇ）に関して示す。ｘ軸は、第１の技術的複製に関し、ｙ軸は、第２の技術的複製に関するものである。
【図６−２】図６ａは、目的とする２４のヒト遺伝子に関するｍＲＮＡ発現産物に対するディテクターを設計するために使用した標的配列（配列番号３３〜５６）を提供する。それらの遺伝子を選択し、１０、１、および０．１ｎｇのサンプルＲＮＡ投入を用いて存在量の６桁の予想範囲にわたる検出を実証した。配列決定によって確認された増幅されたライゲーション産物の数を、アンカードディテクター設計（図６ｂ、６ｃ、および６ｄ）ならびに環状化可能な設計（図６ｅ、６ｆ、および６ｇ）に関して示す。ｘ軸は、第１の技術的複製に関し、ｙ軸は、第２の技術的複製に関するものである。
【図６−３】図６ａは、目的とする２４のヒト遺伝子に関するｍＲＮＡ発現産物に対するディテクターを設計するために使用した標的配列（配列番号３３〜５６）を提供する。それらの遺伝子を選択し、１０、１、および０．１ｎｇのサンプルＲＮＡ投入を用いて存在量の６桁の予想範囲にわたる検出を実証した。配列決定によって確認された増幅されたライゲーション産物の数を、アンカードディテクター設計（図６ｂ、６ｃ、および６ｄ）ならびに環状化可能な設計（図６ｅ、６ｆ、および６ｇ）に関して示す。ｘ軸は、第１の技術的複製に関し、ｙ軸は、第２の技術的複製に関するものである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ライゲーションアッセイ概要
一般的なライゲーションアッセイを図１に模式的に示し、これについては、実施例１においてより詳細に論じる。標的配列を含む可能性のあるサンプルが、ディテクターオリゴヌクレオチドプローブのプール（「プローブ」または「ディテクター」）と接触させられる。各標的配列に対して、一組のディテクター、下流ディテクター（ＤＤ）および上流ディテクター（ＵＤ）が提供される。下流ディテクターは、下流領域（ＤＲ）と指定される標的配列の領域と相補的な部分（ＤＲ’）を有してもよい。上流ディテクターは、上流領域（ＵＲ）と指定される標的配列の領域と相補的な部分（ＵＲ’）を有してもよい。ここで、「下流」および「上流」という用語は、標的配列がｍＲＮＡの一部である場合に転写の５’→３’方向に対して使用され、都合上、上流と呼ばれる領域は、下線を引いて示す場合が多い。
【００１０】
図１に示されるとおり、各標的配列に対するＤＤのＤＲ’およびＵＤのＵＲ’は、サンプル中に存在する場合、標的配列の対応するＤＲおよびＵＲとハイブリダイズすることができる。標的配列のＤＲおよびＵＲが近接しており、ディテクターオリゴの組のＤＲ’およびＵＲ’が標的配列と特異的にハイブリダイズして、ハイブリダイゼーション複合体を形成する場合、近接するディテクターＤＤおよびＵＤは連結することができる。したがって、ＤＤ−ＵＤライゲーション産物の形成は、標的配列（ＤＲ−ＵＲ）がサンプル中に存在した証拠の役割を果たす。標的配列のＤＲとＵＲとが少なくとも１つのヌクレオチドによって分離されている場合、ライゲーションステップに、（ｂ０）鋳型としてサンプルを使用してＤＲ’を伸長するステップを先行させてもよく、伸長したＤＲ’およびＵＲ’は隣接するようになり、連結することができる。ライゲーション産物は、その後、さまざまな手段によって検出することができ、必要に応じて、ライゲーション産物は、検出に先立って増幅されてもよい。
【００１１】
本発明は、ハイブリダイゼーション複合体が１つ以上のステップにおいて、核酸の一本鎖を分解することができる少なくとも１つのヌクレアーゼに曝露される方法を提供する。下でより詳細に述べるとおり、本発明は、標的配列を検出するときにヌクレアーゼに選択的に抵抗するように構成されたディテクターおよびアッセイのその他の構成成分を提供する。ヌクレアーゼは、過剰なディテクターもしくは使用されていないディテクター、またはサンプル中の目的としない構成成分と非特異的もしくは非産生的に結合したディテクターを分解することができる。ヌクレアーゼの戦略的な使用により、サンプルから開始する単一の反応容器に次々と試薬を添加することによって実施されるライゲーションアッセイが可能になる。
【００１２】
サンプル
本方法に使用されるサンプルは、目的とする核酸の標的配列が存在するかどうかを検出することが望まれるあらゆる物質であってよい。そのような物質は、一般に生物学的起源のものであるが、人工的に作り出されたサンプルまたは自然環境のサンプルであってもよい。生物学的サンプルは、生きたまたは死んだ動物、植物、酵母菌およびその他の微生物、原核生物またはその細胞株由来のものであってもよい。動物の特定の例としては、ヒト、霊長類、イヌ、ラット、マウス、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）など）、さまざまな蠕虫（カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）など）および研究室において、または疾患の動物モデルとして研究されている任意のその他の動物が挙げられる。サンプルは、完全な生物もしくは系、組織サンプル、細胞サンプルまたは無細胞サンプルの形態であってもよい。特定の例は、がん細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、初代肝細胞、およびリンパ球ならびにその部分集団である。サンプルは、組織培養物の無細胞ホモジネートもしくは液体培地または懸濁液中の非接着細胞、組織片またはホモジネートなどの液相として、あるいはサンプルがスライドグラスにマウントされているか、またはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織もしくは細胞の形態である場合、あるいは細胞が表面上でまたは表面に増殖させられる場合、ディテクターを起こりうるハイブリダイゼーションのためにサンプル核酸と接触させることができる限り、固相として提供されてもよい。
【００１３】
核酸
サンプル中の検出対象の目的とする核酸としては、ゲノム、トランスクリプトーム、および核酸のその他の機能的なセット、ならびにそれらの部分集合および画分が挙げられる。目的とする核酸は、核ＤＮＡもしくはミトコンドリアＤＮＡ、またはＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡなどのＤＮＡであってもよい。目的とする配列はまた、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（例えば、低分子干渉ＲＮＡ、低分子阻害ＲＮＡ、および合成阻害ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、環状ＲＮＡまたは長いノンコーディングＲＮＡなどのＲＮＡ由来のものであってもよい。目的とする核酸は、プライマリーマイクロＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）、前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）、ヘアピン形成マイクロＲＮＡバリアント（ｍｉＲＮＡ＊）、または成熟ｍｉＲＮＡなどのプロセシングのいずれの段階のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であってもよい。マイクロＲＮＡの検出については、実施例３ａにおいて述べられている。
【００１４】
成熟ｍｉＲＮＡなどの目的とする比較的短い核酸は、ディテクターとのハイブリダイゼーションを向上させるために延長されてもよい。例えば、多くのマイクロＲＮＡは、一方の末端がリン酸化されており、追加のオリゴを用いて化学的または酵素的ライゲーションにより延長することができる。追加のオリゴは、使用されるライゲーション方法に応じて、一本鎖、二本鎖または部分的に二本鎖であってもよい。必要に応じて、追加のオリゴは、各標的配列に固有のものであってもよく、または連結される標的配列の一部もしくはそのすべてに対して汎用のものであってもよい。ディテクターは、その後、追加の配列とハイブリダイズする部分を含む伸長されたＤＲ’および／またはＵＲ’領域とともに設計されてもよい。標的配列はまた、ポリアデニル化によってなどヌクレオチドを付加することにより追加されてもよく、この場合、伸長されたディテクターは、少なくとも追加のポリＡテールとハイブリダイズするための部分を含む。伸長されたディテクターを使用した成熟ｍｉＲＮＡ配列のファミリーの検出については、実施例３ｂにおいて述べられ、図２ｊに示される。
【００１５】
サンプル中の核酸の量は、サンプルのタイプ、サンプルの複雑さおよび相対的な純度により変化することになる。アッセイの感度のため、サンプルは、少数の細胞、例えば１００，０００、１０，０００、１０００、１００、５０、２０、１０、５個未満または１つの細胞からでも採取することができる。サンプル中の核酸の総量はまた、１００、５０、２０、１０、５、２、１マイクログラム未満、５００、２００、１００、５０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．２、０．１ナノグラム未満、５０、２０、１０、５、２、１ピコグラム以下の核酸など非常に少なくてもよい（図６ｄを参照）。サンプル中に存在する特定の標的配列のコピー数は、特に検出のためのライゲーション産物の典型的な増幅と合わせる場合、１００，０００、１０，０００、１０００、１００、５０、２０、１０、５未満または１コピーであってもよい。投入される核酸の量はまた、当然、サンプルの複雑さおよび検出対象の標的配列の数に応じて変化することになる。
【００１６】
ディテクター
特定の標的配列に基づいて、本発明は、標的配列が一般に目的とする全核酸配列の部分配列であるＤＲおよびＵＲに対応する上流ディテクター（ＵＤ）および下流ディテクター（ＤＤ）の組を有するディテクターオリゴのプールを提供する。ディテクターは、個々の一塩基多型（ＳＮＰ）、遺伝子融合、およびエクソンスプライシングバリアントなどの突然変異を含む標的を検出するために提供されてもよい。個々の標的配列は、２セット以上のＤＲおよびＵＲを有してもよく、これは、アッセイの性能を最適化するためにユーザーによって選択されてもよい。複数のセットのＤＲおよびＵＲは、同じ標的配列の複数の測定、または異なるエクソンもしくはエクソン接続部などの標的配列の異なる部分の複数の測定を提供することができるか、あるいは突然変異を持つ可能性のある配列の部分に対して変異していない配列の部分の測定を提供することができる。
【００１７】
標的配列
標的配列は、種もしくは環境のゲノムまたはトランスクリプトームにある配列または部分配列の任意の組み合わせから選択されてもよい。このセットは、細胞または組織タイプなどのサンプルタイプに特異的であってもよい。一部のサンプルタイプに関して、標的配列の数は、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、２０，０００、２３，０００、３０，０００、３８，０００、４０，０００、５０，０００以上の上限および下限の任意の組み合わせに及ぶ場合もある。標的配列の数はまた、ヒトトランスクリプトームのＲＮＡまたはヒトゲノムの遺伝子などの定義されたセットの配列の総数の百分率として表されてもよく、０．１％、０．２％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％の上限および下限の任意の組み合わせに及ぶ。ディテクターオリゴの大きなセットが使用される場合、例えば、１つのオリゴが意図せずに他のディテクターに対して鋳型として働く可能性もある、そのセット中の他のオリゴとのクロスハイブリダイゼーションの可能性に関して各オリゴの全配列を調べることが有用な場合がある。そのような非特異的な人工物は配列によって特定することができ、一般に検出結果からは棄却されるが、これらは、反応資源と競合する無情報ハイブリダイゼーション事象を表す可能性もある。
【００１８】
ディテクターオリゴ自体は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその両方の混合物もしくは混成物であってもよい。必要に応じて、それらは、ジデオキシヌクレオチド、デオキシウリジン（ｄＵ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）、およびイノシンなどの修飾ヌクレオチドを有してもよい。ディテクターオリゴに対するさらに別の修飾としては、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、２−フルオロ塩基（2-fluro bases）、５−ブロモウラシルまたは５−ニトロインドールなどの修飾塩基が挙げられる。その他のディテクターオリゴは、１つ以上の位置に修飾された糖・リン酸主鎖を有してもよい。そのような修飾としては、３’−３’または５’−５’連結逆位、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）主鎖が挙げられる。ＬＮＡは、相補的な塩基に対するそれらのさらに高いハイブリダイゼーション特性のため有用である場合があり、これは、全体としてディテクターオリゴに対する選択性または全般的な結合親和性を向上させる。ライゲーションの箇所から１、２または３個離れた位置に修飾塩基または結合が使用されてもよい。
【００１９】
図１に模式的に示されるとおり、下流ディテクター（ＤＤ）は、相補的な下流領域（ＤＲ’）を有し、これは、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であってもよい。同様に、上流ディテクター（ＵＤ）は、相補的な上流領域（ＵＲ’）を有し、これは、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であってもよい。標的配列に対する所与の組のＤＤおよびＵＤにおいて、ＤＲ’およびＵＲ’は、厳密に同じ長さである必要はないが、一般に類似しているため、同様の条件およびストリンジェンシーにおいて標的とハイブリダイズすることができる。
【００２０】
下でさらに詳細に述べるとおり、ディテクターは、必須ではないが、リガーゼの選択またはその他のライゲーション方法に応じて、ＵＤに５’−リン酸を与えることによってなどライゲーションに対して最適化されてもよい。リボヌクレオチドはまた、ＲＮＡリガーゼが使用される場合などにライゲーションの特異性および効率を高めるために、ＤＤおよびＵＤの連結可能な末端において置換されてもよい。
【００２１】
ディテクター標識
ライゲーションアッセイの次にすぐに検出ステップを行う場合、どちらか一方、または両方のディテクターが検出のために適切に標識化されるよう設計されてもよい。例えば、ディテクターは、色もしくは蛍光色素、ラテックスビーズ、量子ドットまたはナノドットで標識化されてもよい。標識はまた、検出および識別を可能にするように働くバーコード配列などの追加のヌクレオチド配列の形態をとってもよい。例えば、有用なバーコード配列は、測定されているサンプル内の特定の遺伝子もしくは標的配列または選択された遺伝子もしくは標的配列の群を一意的に特定することができる。そのような配列は、ＵＲ’配列とＰ２’配列との間、ならびに／またはＤＲ’配列とＰ１配列との間に配置されてもよく、その結果、それらが近接するプライマーを使用するときに増幅される。この配列はまた、任意の増幅ステップの特定の効率と無関係な、サンプル中のターゲット遺伝子のコピー数を特定するために有用なランダム配列であってもよい。
【００２２】
ハイブリダイゼーション
アッセイのステップに戻って、ディテクターは、ディテクターが標的核酸と特異的にハイブリダイズするのを可能にするために、ディテクターがサンプルと接触するように提供される。ハイブリダイゼーション条件は、所望の程度の特異性もしくはミスマッチでポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを可能にするか、または最適化するために当業者によって選択されてもよく、そのような条件は、ハイブリダイゼーション反応に存在する配列の長さおよび構成、あらゆる修飾の性質、ならびにポリヌクレオチドの濃度およびイオン強度などの条件により変化することになる。特定のハイブリダイゼーション温度としては、３０°、３２．５°、３５°、３７．５°、４０°、４２．５°、４５°、４７．５°、５０°、５２．５°、５５°、５７．５°、６０°、６２．５°、６５°、６７．５°、７０°、７２．５°、７５°、７７．５°、８０°、８２．５°、８５°、８７．５°、および／または９０°が挙げられる。特定のハイブリダイゼーション温度は、時間の決まった温度プラトー、５℃、１０℃もしくは１５℃の１つ以上の漸進的な増加または低下、および２つ以上の温度間における繰り返しの循環などのさまざまな速度およびプロファイルで温度を上げ下げすることによって達成されてもよい。Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋および／またはＭｎ２＋などのイオンも、０、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、および５００ｍＭから存在してもよく、そのようなイオンは、その他のハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす場合がある。ハイブリダイゼーションはまた、分岐ポリサッカライド、グリセロール、およびポリエチレングリコールなどの立体的な込み合いがある構成成分からも影響を受ける。所望の特異性に従ってハイブリダイゼーション（およびそれに続く）反応に、例えば、ＤＭＳＯ、非イオン界面活性剤、ベタイン、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、ホルムアミド、テトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）、および／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などのタンパク質などのさらなる添加物が存在してもよい。
【００２３】
任意に、ハイブリダイゼーションのための条件は、他のステップが同じ環境で行われるのを可能にするために調節または微調整されてもよい。例えば、ハイブリダイゼーションのために使用される同じバッファーは、必要に応じて、サンプル中の細胞を溶解させるため、特定の細胞タイプのハイブリダイゼーションを促進するため、細胞壁、細胞膜もしくは細胞成分分画の除去または浸透を容易にするために使用されてもよい。アッセイに使用されるライゲーション方法に応じて、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションステップからライゲーションステップに移行するときに、そのまま、または１つ以上の構成成分の添加を伴って、好ましくは、反応容器を変える必要なくライゲーションのための条件と適合するよう選択されてもよい。
【００２４】
ライゲーション
ライゲーション反応は、化学的ライゲーションによって、またはリガーゼ酵素もしくはライゲーションを促進する補因子を使用することによって行われてもよい。鋳型とハイブリダイズするときにＤＮＡをＲＮＡと一緒にするためなど、別の一本鎖の鋳型とハイブリダイズするときに近接する一本鎖ポリヌクレオチド間のホスホジエステル結合の形成を触媒するためのさまざまなニック修復リガーゼが商業的に入手可能である。例はバクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼであり、これは、補因子としてＡＴＰを使用することが一般に理解されている。リガーゼ反応の間にＡＴＰが供給されてもよい。他の反応において、リガーゼは、事前にアデニル化されてもよい。さらに別の反応において、５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼを用いる場合、ＵＤは５’末端が事前にアデニル化されてなければならない。必須ではないが、リガーゼの選択およびライゲーション条件に応じて、一般的な反応においてＵＤは、ＤＤとのライゲーションを容易にするために５’−リン酸を有することになる。（効率的なライゲーションのためにＤＤ上に５’−リン酸が必要とされる場合、５’−リン酸化のない同等のオリゴヌクレオチドの使用が望ましくないライゲーションを阻害または低減するために使用されてもよい。）好ましいライゲーション条件は、１０、２５、５０、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、８．０または８．５）；少なくとも１０ｍＭ、５ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；少なくとも２ｍＭ、１ｍＭ、０．７ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ  ＡＴＰ；もしくは少なくとも１０ｍＭ、７ｍＭ、５ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ  ＤＴＴまたはその他の酸化防止剤を含む。Ｔ３  ＤＮＡリガーゼも使用されてよく、これは、さらに広い範囲の基質を連結することができ、さらに広い塩濃度に対して耐性がある。その他のステップと同様に、温度は、反応構成成分の特徴およびイオン強度などの条件に従って選択することができる。
【００２５】
上記のとおり、ライゲーションステップは、図１のステップ（ｂ０）のとおり、任意の伸長ステップが先行してもよい。ライゲーションステップはまた、任意のオーバーハングを除去するための例えば、ヌクレアーゼによる任意の切断ステップが先行してもよい。他の場合には、ＤＤの部分は、ＵＤがハイブリダイズするＵＲ配列と重複してもよく、その結果、ＵＤとＤＤとのハイブリダイゼーションの後、１、２、３個以上の塩基のオーバーハング配列が存在する。オーバーハングを除去するために有用な酵素は、Ｆｅｎ−１などのＦｌａｐエンドヌクレアーゼである。
【００２６】
増幅
必要に応じて、ライゲーション産物は、検出を容易にするために（例えば、ＰＣＲまたはｑＰＣＲによって）増幅されてもよい。増幅方法および器具は、ＰＣＲプレートおよび液滴方式を含め商業的に入手可能であり、増幅酵素（Ｔａｑおよびその市販のバリアントなど）ならびに反応条件は、特定のプラットフォームに対して選択され、調整されてもよい。任意に、増幅のために選択されるポリメラーゼは、鎖置換活性を有してもよい。図１に示されるとおり、ディテクターは、増幅配列として働く、プライマーハイブリダイゼーション配列（例えば、Ｐ１、Ｐ２’）またはその相補体を含む追加の配列（「テール」）を有してもよく、その結果、ライゲーション後に、ライゲーション産物を増幅プライマーの組（Ｐ１、Ｐ２）により増幅することができる。例となる下流増幅配列（Ｐ１）は、
【００２７】
【化１】
0006768706.tif 000002
であり、これは、同じ配列（Ｐ１）を有するプライマーとともに使用することができる。例となる上流増幅配列（Ｐ２’）は、
【００２８】
【化２】
0006768706.tif 000003
であり、これは、プライマーＰ２（３’→５’の向きで示される）：
【００２９】
【化３】
0006768706.tif 000004
とともに使用することができる。
【００３０】
必要に応じて、増幅プライマーは、バーコード配列、例えば、マルチサンプル実験においてサンプルを一意的に特定するバーコード配列を含んでもよく、任意に重複および／またはエラー修正機能を有する。一部の実験において、例えば、異なるサンプルバーコードが、９６、３８４、１５３６または、より一般に２ｎもしくは４ｎの異なるサンプルに使用されてもよく、これは、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および増幅などの一部のステップのために別々に異なるバーコードを用いて作製され、検出などのその他のために組み合わされる。バーコード配列は、３’から増幅配列などプライマーに組み込まれてもよく、その結果、バーコードは増幅された鎖の一部になる。その他の例において、プライマーの増幅配列は、追加の配列によって伸長されて、次の配列決定ステップに使用するために使用できるプライマーハイブリダイゼーション配列をもたらしてもよい。バーコードは、増幅配列、必要に応じて、伸長された増幅配列、配列決定プロセスの一部としての表面への捕捉などの捕捉のためおよび／または配列決定のために使用されるさらに別のプライマーハイブリダイゼーション配列のために使用可能な別の配列の間に入れられてもよい。それぞれの場合において、バーコードは、ディテクター配列の残りとともに増幅されることになり、例えば、配列決定プライマーハイブリダイゼーション配列、サンプルバーコード、および遺伝子特異的な配列を含む、増幅されて、伸ばされた１つの分子を形成し、これは、遺伝子特異的バーコードまたは標的分子特異的バーコードならびにターゲット遺伝子の配列またはその配列に対する相補体を含んでもよい。標的とされるオリゴがｃＤＮＡである場合、遺伝子特異的な配列またはサンプル特異的な配列は、逆転写のために使用されるプライマーの一部として付加されてもよく、ＵＤおよびＤＤによって標的とされる配列の一部であってもよい。
【００３１】
その他の例において、（１）ライゲーション、（２）連結産物を融解してはずすための加熱、（３）ＤＤおよびＵＤの標的とのハイブリダイゼーションを可能にする冷却、（４）ライゲーションの反復サイクル、その後、加熱（２）、冷却（３）、およびライゲーション（４）ステップを繰り返すことによってなど当該技術分野において既知の方法が、連結されたＤＤおよびＵＤ配列を増幅するために使用されてもよい。これらの付加的な増幅ステップは、増幅ステップ（ｃ）の前に実施されてもよく、その間にサンプルバーコードおよびその他の配列が、連結されたＵＤおよびＤＤ配列に付加される。ＲＮＡの全トランスクリプトーム増幅またはｃＤＮＡの増幅によって、ＵＤおよびＤＤハイブリダイゼーションの標的も増幅されてよい。
【００３２】
検出
ライゲーション産物（またはその増幅産物）は、任意にアレイ上における配列決定、ｑＰＣＲもしくは検出のための標識化またはその他の分子検出などの方法によって検出されてもよい。その他の検出方法としては、標識化分子をカウントするためのフロースルーシステムが挙げられる。検出方法に応じて、技術を身につけたユーザーは、配列決定フローセル上でのブリッジ増幅のためなど適切な機能的特徴を含むようディテクターおよび増幅プライマーの設計を変更することができるであろう。増幅および検出のために使用される実験資源を限定することができ、それらは、最も高価なものである場合が多く、アッセイのさまざまな段階に存在する情報を与えてくれないアッセイ構成成分の数を減らすことによってそれらの消費量を最適化することができる。
【００３３】
ヌクレアーゼ
したがって、本発明は、さらに効率的な資源の使用およびさらに高感度の検出を可能にするために、ヌクレアーゼおよび分解に抵抗するように構成されたアッセイ構成成分を提供する。さらなる利点として、本発明は、単一の反応容器において、または完全に液相において実施可能なさらに簡単なアッセイワークフローを可能にする。
【００３４】
ヌクレアーゼは、核酸の一本鎖を消化または分解する酵素であってもよい。好ましくは、ヌクレアーゼは、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドなどの二本鎖を消化しない（またはそれに対する活性が著しく低い）。例えば、ヌクレアーゼは、同じ条件下におけるモル基質比に基づいて一本鎖と比較して二本鎖に対して１０％、５％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満の活性を有してもよい。同様に、ヌクレアーゼは、二本鎖中の一本鎖ニックにおいて容易に測定可能な程、消化しないよう選択されてもよい。ヌクレアーゼは、特定の条件下において一本鎖を分解するマングビーンヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼであってもよい。ヌクレアーゼはまた、ＤＮＡの一本鎖であってもよい一本鎖を分解するエキソヌクレアーゼであってもよい。例えば、一本鎖の３’→５’エキソヌクレアーゼ（３’エキソ）活性を有するヌクレアーゼとしては、大腸菌（E．coli）由来のエキソヌクレアーゼＩ（エキソＩ）およびＴ３エキソヌクレアーゼが挙げられる。ディテクターが連結され、ＲＮＡ鎖がもはやアッセイに必要とされないのであれば、ＤＮＡおよびＲＮＡ一本鎖に対して３’エキソ活性を有するエキソヌクレアーゼＴ（ＲＮａｓｅ  Ｔ）などの酵素を使用することができる。一本鎖の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するヌクレアーゼとしては、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩおよびＲｅｃＪｆが挙げられる。ヌクレアーゼは、Ｆｌａｐエンドヌクレアーゼ１などの５’オーバーハングまたはフラップを消化する酵素であってもよい。ヌクレアーゼは、単独で、または一組の３’および５’エキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼのカクテルとして使用されてもよい。
【００３５】
ヌクレアーゼは、アッセイのさまざまな段階で使用することができる。例えば、ヌクレアーゼは、図２ｅのとおり、連結していないディテクターまたは過剰なディテクターを除去するために、ライゲーションステップ（ｂ１）後の（ｂ２）で与えられてもよい。ヌクレアーゼはまた、図２ｆのとおり、標的配列と部分的にのみまたは非特異的にハイブリダイズしたディテクターを分解してもよい。使用されるライゲーション条件と適合する場合、ヌクレアーゼはまた、ヌクレアーゼが意図される標的配列の検出を妨げないのであれば、ライゲーションステップの間（ｂ１およびｂ２一緒に）、またはさらにはライゲーションステップ前（ｂ２、その後ｂ１）に与えられてもよい。アッセイの設計に応じて、望ましくない標的、ディテクター、他のオリゴまたは任意の産物を除去する所望の目的を成し遂げるために、ヌクレアーゼは、任意の（ｂ０）伸長ステップおよび（ｄ）増幅ステップの前、間もしくは後、または複数のステップにおいて与えられてもよい。
【００３６】
ヌクレアーゼ活性がもはや望まれないとき、ヌクレアーゼは、ライゲーションステップの後などに除去されても、または不活化されてもよい。ヌクレアーゼは、特定のヌクレアーゼに対して選択されるが実質的に残りのアッセイを妨げない方法によって不活化されてもよい。一部のヌクレアーゼに対しては、例えば、Ｍｇ＋＋が必要とされる場合もある次のステップを妨げない（または次のステップに先立って除去できる）のであれば、ヌクレアーゼ阻害剤（図４の右下のとおり）またはＥＤＴＡなどのキレート剤が添加されてもよい。その他のヌクレアーゼは、加熱、例えば、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃もしくは９８℃における１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５分間もしくは１時間の１回または繰り返しのインキュベーションによって不活化されてもよい。２つ以上のヌクレアーゼが使用される場合、どちらか一方、または両方が、個別にまたは同じ手段によって不活化されてもよい。本発明の１つ以上のステップにおいて与えられるヌクレアーゼの活性に抵抗するために、アッセイの構成成分は、標的配列の検出を可能にするさまざまな構成の本発明によって提供される。構成方法の選択は、当然、使用されている特定のヌクレアーゼにより決まることになる。
【００３７】
アンカードディテクター
一構成において、上流ディテクターは、図２ａに記載されているとおり標的配列（ＵＲ２）の第２の領域と相補的な第２の領域（ＵＲ２’）を有する。ＵＤのテールが標的の離れた部分とハイブリダイズすることができるため、この構成は、図２ｂのとおり、「アンカード」ディテクターとして示すことができる。ＵＤの３’末端のアンカーが標的とハイブリダイズして二本鎖を形成するため、エキソＩのような３’エキソヌクレアーゼなどの一本鎖を分解するヌクレアーゼに対して消化に抵抗するように構成される。
【００３８】
離れた標的結合領域として、アイソフォーム間の配列差がＤＲおよびＵＲ標的配列の範囲を超えて見つかる、遺伝子のファミリーのアイソフォームなどの類似した配列間のさらなる識別をもたらすためにアンカーＵＲ２’が使用されてもよい。
【００３９】
ＵＲ２’は、少なくとも４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であってもよい。ＵＲ２’は、非相補的な領域（ＣＰ１）によってＵＲ’から分離されていてもよく、ＣＰ１は、少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長であってもよい。一般に、ＵＲ２’は、ＵＲ’に対して上流にある。増幅領域（Ｐ２’など）が存在する場合、それは、ＣＰ１内またはＵＲ２’の部分などＵＲ’の上流にあってもよく、図２ｃに示されるＵＲ’部分の増幅を可能にして、図２ｄの増幅産物（ＡＰ）を形成する。
【００４０】
鏡像構成では、これは、標的配列の第２の領域と相補的なアンカー領域（ＤＲ２’）を有する下流ディテクターである。ＤＲ２’アンカーは、標的上のＤＲ２とハイブリダイズするため、この構成は、５’ｓｓ−エキソヌクレアーゼの作用に抵抗する。ＤＤのＵＲ２’は、一般にＵＲ’に対して下流にあることになる。増幅領域（Ｐ１など）が存在する場合、ライゲーション後に、ＤＲ’の増幅を可能にするために、増幅領域はＤＲ’の下流にあってもよい。ヌクレアーゼのカクテルに抵抗するように、アンカードＤＤおよびＵＤは、別々にまたは組み合わせて使用されてもよい。
【００４１】
ディテクターの離れたアンカー領域が、単分子動態によりディテクターのハイブリダイゼーション性に影響を及ぼす場合があるため、ＤＲ２’、ＣＰ１（複数可）、ＤＲ’、ＵＲ’およびＵＲ２’の構成および相対的な長さは、ディテクターの組の間およびディテクタープールの組の間の標的選択性を最適化するために調整されてもよい。
【００４２】
ライゲーション反応に使用されないディテクターは、図２ｅに示されるように分解されてもよい。さらに、図２ｆのものなど不完全に結合したディテクターも、ＵＲ’が非標的配列と結合しているためか、または意図される標的ＵＲに関連しているが、ＵＲ２が欠如した標的と結合しているためかにかかわらず、例えば、ＵＤのＵＲ’が標的のＵＲと結合しているが、ＵＲ２’は結合していない場合、分解され得る。同様に、ＤＲ２と結合しているが標的のＤＲとは結合していないアンカードＤＤは、３’ｓｓ−エキソヌクレアーゼに対して影響を受けやすくなる（または対応するＵＤとの適正なライゲーション産物を形成しないことになる）。その他のディテクター、例えば、サンプル中の標的配列を超えるディテクターまたは非標的配列と非特異的に結合しているディテクターは、増幅されないことになる。したがって、アンカードディテクターの使用は、過剰なディテクターまたは使用されていないディテクターをヌクレアーゼが分解することを可能にすると同時に標的配列に対するライゲーションアッセイの特異性を高めることができる。
【００４３】
ブロッキングディテクター
別の構成は、一方の末端にヌクレアーゼブロッキング基または一方の末端に近接するヌクレアーゼブロッキング基を有することによるヌクレアーゼ抵抗性のディテクターを有する。図２ｈは、５’エキソヌクレアーゼと組み合わせて使用することができる、５’−ブロッキング基を有するＤＤを示す。３’エキソヌクレアーゼとともに使用するための３’−ブロッキング基を有するＵＤも示される。好ましくは、複数の標的およびディテクターの複数の組が存在する場合に５’または３’エキソヌクレアーゼが使用されるとき、すべての下流ディテクターまたは上流ディテクターはそれぞれ５’または３’ブロックを有する。
【００４４】
ヌクレアーゼに抵抗するために有用な構成としては、デオキシチミジン（ｉｄＴ）などの逆位ヌクレオチド、ジデオキシチミジン（ｄｄＴもしくはｉｄｄＴ）などのジデオキシヌクレオチドによる終結、または末端ヌクレオチドの２’／３’−Ｏ−アセチル化が挙げられる。選択したヌクレアーゼの基質優先度に応じて、前に記載されている１つ以上のその他の修飾ヌクレオチドが、ブロッキング基として使用されてもよい。あるいは、１つ以上の末端ヌクレオチドが、天然に生じるホスホジエステル結合の代わりに１つ以上のホスホロチオアート結合を介して残りのオリゴと結合される。ヌクレアーゼに抵抗することができるその他の修飾としては、前に述べられているＬＮＡ主鎖またはＰＮＡ主鎖が挙げられる。一部の構成において、ディテクター上のヘアピンループまたはその他の二次構造が、ディテクターに対するヌクレアーゼブロッキング基として働く場合がある。ヘアピンの一方の末端は、ブロッキング基を有してもよい。その他の構成において、ハイブリダイゼーションに先立って、ディテクターに組み込まれたｓｓＦＵＳＥ配列を介してはるか上流のエレメント（ＦＵＳＥ）結合タンパク質（ＦＵＢＰ）のような配列特異的な一本鎖結合タンパク質などのタンパク質またはその他の構成成分が、ＤＤの５’末端またはＵＤの３’末端と結合されてもよい。永続的または可逆的にかにかかわらず、ＤＤディテクターの５’末端またはＵＤディテクターの３’末端が固相に固定されるように構成される場合、固相自体がディテクターへのヌクレアーゼ活性に対するブロックとして働いてもよい。選択したヌクレアーゼの作用に抵抗するため、ならびに安定性およびハイブリダイゼーション特性などのその他の利点をもたらすために、１つのディテクターまたは両方のディテクターにおける上記の任意の機能を組み合わせることが有用な可能性がある。
【００４５】
プロテクター
さらに別の構成は、標的配列と相補的なＤＲ’領域またはＵＲ’領域のハイブリダイゼーションを妨げない領域においてＤＤまたはＵＤとハイブリダイズすることによってディテクターを保護する１つ以上のオリゴを提供する。例えば、図２ｉでは、ＤＤの５’末端においてＤＲ２’領域とハイブリダイズして、５’エキソヌクレアーゼに対して抵抗性の二本鎖の構成（中括弧によって示されている）を形成するＤＲ２プロテクターオリゴが提供される。３’エキソヌクレアーゼが使用される場合には、ＵＤの３’末端に二本鎖を形成するＵＲ２プロテクターが提供されてもよい。上記のとおりのブロッキング基または結合によって、プロテクターオリゴ自体がエキソヌクレアーゼ活性からが保護されてもよい。例えば、３’−ブロッキングしたＵＲ２プロテクターが図２ｉに示され、５’−ブロッキングしたＤＲ２プロテクターが図２ｊに示される。５’エキソヌクレアーゼおよび３’エキソヌクレアーゼのカクテルが使用される場合には、ＤＲ２プロテクターおよびＵＲ２プロテクターの両方に、任意にそれぞれ、５’−ブロッキング基または３’−ブロッキング基が設けられてもよい。
【００４６】
環状化可能なディテクター
１つのディテクターによる環状化可能な構成において、上流の相補的な領域（ＵＲ’）および下流の相補的な領域（ＤＲ’）が、図３ａに示されるとおり、１つの環状化可能なディテクターオリゴ（ＤＯ）上にある。ＤＯは、５’→３’方向に：（Ｂ）上流の相補的な領域（ＵＲ’）；（Ｃ）任意の増幅領域（Ｐ２’）；（Ｄ）標的配列と相補的でない配列を有する非相補的な領域（ＣＰ２）；（Ｆ）下流の相補的な領域（ＤＲ’）；および（Ｅ）任意の増幅領域（Ｐ１）を有してもよい。ＤＯは、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００塩基長であってもよく、分子の柔軟性が環状化するのを可能にする。
【００４７】
２つのディテクターによる別の環状化可能な構成は、５’末端にＣＳ部分を有するＤＤ、および３’末端に逆相補的なＣＳ’部分を有するＵＤを有し、その結果、ＤＤおよびＵＤが、ＣＳ部分およびＣＳ’部分を介して互いに部分的にハイブリダイズする。任意に、ＣＳ部分の５’末端またはＣＳ’部分の３’末端にブロッキング基がある。別の環状化可能な構成は、２つのディテクターおよび１つのブリッジオリゴの３つのオリゴを有し、ＤＤは５’末端にＣＳ１部分を有し、ブリッジオリゴは、ＣＳ１’部分およびＣＳ２’部分を有し、ＵＤは、３’末端にＣＳ２部分を有する。ブリッジオリゴは、任意に５’末端および／または３’末端にブロッキング基を有する。
【００４８】
標的配列ＤＲ−ＵＲの存在下において、環状化可能なディテクター（複数可）は、標的上で（ａ）環状化して、一本鎖のエキソヌクレアーゼに対して抵抗性であり、（ｂ２）連結され得るハイブリダイゼーション複合体（ＨＣ）を形成してもよい。
【００４９】
増幅領域が適切な向きでもたらされる場合、ライゲーション産物（ＬＰ）が（ｃ）Ｐ１プライマーおよびＰ２プライマーにより増幅されて、接続されたＤＲ’領域およびＵＲ’領域を含む増幅産物（ＡＰ）を形成することができる。
【００５０】
標的と特異的にハイブリダイズしないか、または標的と不完全に結合するＤＯは、ヌクレアーゼによる分解を受けやすい（図３ｄ）か、または図３ｂまたは３ｃに示されるとおり、Ｐ１増幅領域およびＰ２’増幅領域がプライマー増幅に対して正しい向きにないことになる。ある場合には、ディテクターが増幅されこともあるが、それは、指数関数的というよりむしろ直線的に増幅されることになる。そのような場合には、少ない配列が検出され、計算的に検出結果から無視または除去することができる。
【００５１】
第２の一本鎖（２Ｓ）
さらに別の構成は、図４に示されるとおり、ディテクターの一本鎖部分とハイブリダイズして、二本鎖ハイブリダイゼーション複合体を形成するための一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（２Ｓ）を提供する。２Ｓオリゴは、ＣＰ１と相補的であってもよく、その結果、全構造が二本鎖になる。アッセイが複数の標的配列を検出することを意図される場合、同じ２Ｓは、標的配列とのハイブリダイゼーションに頼らないため、汎用的に使用されて、環状構造を形成することができる。その構造は、その後、連結されて、環状二本鎖構造が完成し、エキソヌクレアーゼ、ｓｓ−エンドヌクレアーゼ、およびニックエンドヌクレアーゼに対して抵抗することができる。
【００５２】
任意に、この環状構造は、例えば、ニッキングエンドヌクレアーゼによって故意にニックが入れられるか、または切断されてもよい。ＤＯは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有してもよく、その結果、環状構造を必要に応じて直鎖化することができる。標的配列またはディテクターの消化を避けるため、ＣＰ１のために選択される認識部位は、ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、ＡｓｉＳＩに対する部位などの比較的にまれな部位が可能である。必要に応じて、直鎖化された構造は、従来の方法によって環状構造から分離されてもよい。
【００５３】
フラップ
環状化可能なＤＯは、図５ａに示され、実施例４において述べられるとおり、（Ａ）ＵＲ’の５’方向に非相補的な領域（ＣＰ５）および（Ｇ）ＤＲ’の３’方向に任意の非相補的な領域（ＣＰ３）を有するように構成されてもよい。標的核酸、ディテクターオリゴ、および第２の鎖が一緒になって、５’フラップを有するハイブリダイゼーション複合体を形成するように、５’→３’方向にＰ２、ＣＰ２’、Ｐ１’を有する第２の鎖が提供されてもよい。Ｆｅｎ−１などのヌクレアーゼは、５’フラップを除去するために使用することができる（図５ｂ）。環状化可能なディテクターの５’末端はリン酸化されてもよい（図５ｃ）。必要に応じて、任意のＣＰ３領域は、その後、標的配列とハイブリダイズして、近接するＵＲ’と連結されて（図５ｄ）、連結産物（図５ｅ）を形成することができる３’末端を形成することができる。
【００５４】
固相、液相におけるステップ
一部の実施形態では、標的配列が原位置に（in situ）ありながら、ハイブリダイゼーション、ライゲーションまたは伸長ステップが行われてもよい。これは、例えば、サンプルが組織スライドグラス上にあるときに、特に有用な場合があり、その結果、ライゲーションが記録可能な位置で起こることがわかり、スライドグラス上の他の位置における同様の反応と比較することができる。連結されたプローブは、その位置に残存することができると同時に、その位置にあるか、またはその付近にある他の分析物のイメージングまたは検出などのその他のステップが行われる。必要に応じて、連結したプローブは、シアノビニルカルバゾールヌクレオシド類似体（ＣＮＶＫ）を使用するのと同様に、光により切断可能な結合によってなど、永久的または可逆性であってもよいその部位と架橋するためのさまざまな化学的または酵素的方法によってさらに確実に原位置に残存することができる。特定の実施形態において、ライゲーション産物は、回収およびさらなる処理のために原位置のサンプルから溶出されてもよく、位置情報およびライゲーション反応産物の形態学的背景を保持するために小さな区域から溶出するのが好ましい。
【００５５】
他の実施形態において、１つ以上のステップが、マイクロ流体システムなどの液相において行われてもよく、その結果、１つ以上のステップが、ビーズまたはプレート表面などの固相への捕捉を伴わない。例えば、ハイブリダイゼーション、伸長、ライゲーション、ヌクレアーゼ消化、増幅または検出ステップのうちのいずれか１つ、またはそれらの組み合わせが液相で行われてもよい。混合相アッセイにおいて、１つ以上のサンプル、ディテクターオリゴ、ハイブリダイゼーション複合体、伸長産物、ライゲーション産物、または増幅産物を固定するために固相が使用されてもよい。特に、ハイブリダイゼーションステップ、ライゲーションステップまたはそれら両方の間、標的核酸は固体表面に付着させられてもよい。固体表面は、磁気ビーズ、非磁性ビーズ、高分子ビーズ、可逆的固定化ビーズ、もしくはラテックスビーズ、またはそれらの複合ビーズなどのビーズ、あるいはプレートまたはフローセル表面などの比較的平坦な表面であってもよく、任意に同様の材料のコーティングを伴う。混合相方式は、構成成分を１つの反応環境から別の反応環境に移すことができるか、または構成成分が１つの容器にとどまっているので、条件を変えることができる。
【００５６】
同じ反応容器への連続的な添加
あるいは、反応は、少なくとも１つのステップが酵素またはバッファー構成成分などの試薬を連続的に添加することによって行われるように最適化されてもよく、その結果、反応は、任意に洗浄または移動ステップを間に行う必要なく、先行するステップと同じ容器で起こる。好ましくは、一連の添加は、次の反応のための構成成分を希釈するための液体体積の大幅な追加を必要とせず、例えば、最初のサンプルと検出のための調製物との間で１、１．５、２、２．５、３、５、１０、１５または２０倍希釈を超えない。添加される構成成分は、以下に記載されるようにキットとして提供されてもよい。
【００５７】
アテニュエーター
与えられたサンプルに２つ以上の標的配列が存在する場合、それらは異なる量で存在する可能性が高い。さらに、標的配列の量は類似のサンプル間で変化する可能性がある。検出アッセイは、１回の実験において量的に異なる標的配列の存在を測定するのに十分な動力学的範囲を有するのが理想的である。しかしながら、サンプルの一部のタイプに関して、さまざまな標的配列の存在量の範囲は数桁に及ぶ場合がある。例えば、細胞のＲＮＡ発現産物の分布を測定する場合、特に目的とする個々の配列が非常に少ないコピーとして存在することもある一方で、他のものは極めて豊富な標的配列（high-abundance target sequence）（ＨＡＴ）である。ＨＡＴは、それ程豊富でない標的配列の存在を検出するための方法の能力を低下させる可能性がある程多くサンプル中に存在する場合がある。
【００５８】
細胞または組織タイプに応じて、そのような極めて豊富なＨＡＴとしては、一般にハウスキーピング遺伝子と称されるものをコードする配列を挙げることができる。ＨＡＴの例としては、ミオグロビン、アクチン、チューブリン、ユビキチン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、リボソームタンパク質、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）もしくは核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）のすべてまたは一部をコードする配列が挙げられる。ＨＡＴのその他の例は、シトクロムｃ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、リボソームタンパク質Ｌ７（ＲＰＬ７）、リボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐＳ６）、ｓｎＲＮＡ  ＲＮＵ、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）、チロシン３−モノオキシゲナーゼ／トリプトファン５−モノオキシゲナーゼ活性化タンパク質ゼータ（ＹＷＨＡＺ）、β−アクチン、またはβ−チューブリンのすべてまたは一部をコードしてもよい。別の例としては、α−２−ミクログロブリン、ビメンチン、およびフィブロネクチンのすべてまたは一部をコードする配列が挙げられる。ＨＡＴのさらに別の例は、ミトコンドリアにコードされるシトクロムｂ（ＭＴ−ＣＹＢ）、Ｂ型ミトコンドリア外膜シトクロムｂ５、Ａ型ミクロソームシトクロムｂ５（ＡＣＹＢ５Ａ）、およびアスコルビン酸依存性シトクロムｂ３（ＣＹＢＡＳＣ３）などのシトクロムのすべてまたは一部をコードする。どの配列が極めて豊富であるかはサンプルタイプによって、例えば、異なる組織または細胞タイプ間で異なる可能性があるため、特定の標的配列は、そのタイプのサンプルに関する文献の検索に基づいて可能性のあるＨＡＴの所定のセットとして指定されてもよく、またはサンプルタイプにおけるより豊富な配列を確認するための事前のアッセイを実施することによって確認してもよい。検出されるＨＡＴ関連ライゲーション産物の全数を減らすために、さまざまなアテニュエーターオリゴヌクレオチド（「アテニュエーター」）が使用されてもよい。サンプル中のＨＡＴについて陽性検出をもたらすが、より低いレベルのシグナルでもたらすことができるいくつかのアテニュエーターが提供される。
【００５９】
ディテクターと競合してＵＲ２標的とハイブリダイズするようＵＲ２’オリゴが提供される、本発明において有用なアテニュエーターが図２ｇに示される。同様に、アンカードディテクターの部分のＨＡＴとの結合と競合し、それによりＨＡＴ関連ライゲーション産物を形成するディテクターの総数を減らすようＵＲ２、ＤＲ２’、およびＤＲ２オリゴが提供されてもよい。特に有用なアテニュエーターは、ＤＲ２の部分およびＤＲの部分を有してもよく、またはＵＲの部分およびＵＲ２の部分を有してもよく、それにより同じアンカードディテクターの２つの部分と競合する。
【００６０】
環状化可能なディテクター設計に関して、アテニュエーターは、ＵＲもしくはＤＲ、またはその両方と一致するか、またはそれと相補的な部分を有するオリゴヌクレオチドであってもよい。アテニュエーターはまた、図５ｂに示されるような切れ目をふさぐが、連結可能な産物を得るのを妨げるオリゴの形態をとってもよい。
【００６１】
切断可能なディテクター
ディテクターオリゴがライゲーションまたは任意の増幅ステップの後の処理によって選択的に切断され得る１つまたはその他の修飾を含むことが望ましい場合がある。例えば、ディテクターオリゴは、ハイブリダイゼーションまたはライゲーションステップを妨げないように配置されたｄＵを有してもよい。しかしながら、ライゲーション後に、ｄＵオリゴを含む産物は、その後、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼなどのｄＵ特異的な酵素に続くエンドヌクレアーゼＶＩＩＩによって切断されてもよい。別の選択的に切断可能な部位は、検出対象の標的配列には存在しない制限酵素切断部位であってもよい。
【００６２】
キット
本発明は、ディテクターオリゴ、ならびに任意に、ヌクレアーゼ、リガーゼおよび／またはポリメラーゼを含む上記の方法を実施するためのキットを提供する。本キットは、キットの酵素のための反応バッファーまたは酵素に適した反応に添加されるバッファー構成成分をさらに提供することができる。構成成分は、酵素に適した反応バッファーを調製するために酵素反応用の容器に添加するのに適したものであってもよい。構成成分はまた、構成成分が、同じ容器に添加されて、使用される次の酵素のための反応バッファーを形成することができるように、本方法の先行するステップのための反応バッファーと適合するよう選択することができる。したがって、構成成分は、サンプル、オリゴ、酵素および／または溶液を別個の容器間で移動させるのを最小限にするために、アッセイの複数のステップのための「添加−添加−添加」方策を可能にするよう選択されてもよい。
【００６３】
本キットはまた、さらなる分析のための組織サンプル由来の連結されたオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドを除去するのに適した溶離液を有してもよい。本キットは、さらにキットのディテクターとともに使用するのに適した増幅プライマーを有してもよい。
【実施例】
【００６４】
[実施例１]
代表的なライゲーションアッセイ
ライゲーションアッセイを説明するために代表的な方法を示す。ここで、マルチプレックスアッセイ様式を使用して細胞のサンプル中の１００を超えるＲＮＡ発現産物を検出した。それぞれの発現産物に対して、産物の全配列内の１つ以上の標的配列を検出するためにアッセイを設計した。例えば、ヒト細胞において、目的とするＧＡＰＤＨ遺伝子は、酵素グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードし、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＲＮＡ転写物内の３つの異なる部分を標的配列として独立して検出した。ここでＧＡＰＤＨ＿２と特定されたそのようなＲＮＡ標的配列の１つは、
【００６５】
【化４】
0006768706.tif 000005
であり、転写および翻訳の方向に対して５’末端を「上流」（下線を引いた）とし、３’末端を「下流」とした。同じＧＡＰＤＨ＿２標的配列を、後の解説の便宜上３’→５’方向に示すことができる。
【００６６】
【化５】
0006768706.tif 000006
下流領域（ＤＲ）をＧＡＰＤＨ＿２の下流の２５塩基：
【００６７】
【化６】
0006768706.tif 000007
と定義し、これは、ＤＲ’の相補的なＤＮＡ配列：
【００６８】
【化７】
0006768706.tif 000008
を有し、上流領域（ＵＲ）をＧＡＰＤＨ＿２の上流の２５塩基：
【００６９】
【化８】
0006768706.tif 000009
と定義し、これは、ＵＲ’の相補的なＤＮＡ配列：
【００７０】
【化９】
0006768706.tif 000010
を有する。
【００７１】
ＧＡＰＤＨ＿２に対して、ＤＲ’配列を有する下流ディテクター（ＤＤ）、およびＵＲ’配列を有する上流ディテクター（ＵＤ）の一組のディテクターを設計した。アッセイのためのディテクターのプールを得るために標的配列のそれぞれに対して同様の組を設計した。この実施例において、すべての上流ディテクターの５’末端をリン酸化した。
【００７２】
この特定の例において、実験の後の方で２つのプライマー、Ｐ１およびＰ２を使用して増幅ステップを実施したため、実験のすべてのＵＤはプライマー配列（Ｐ１）を含むものとし、すべてのＵＲは、相補的なプライマー配列（Ｐ２’）を含むものとした。しかしながら、増幅は本発明の実施に必須ではないため、特異的なプライマーの配列およびプライマー配列は、使用される場合には特定の増幅方法に適合するための選択が問題である。
【００７３】
ヒト腎細胞株または肝細胞株から単離された少なくとも１０ｎｇのＲＮＡを、それぞれのアッセイ実験のためにマイクロタイタープレートのウェルに入れた。各ウェルに２０μＬの２×結合カクテルを添加し、結合カクテルは、５ｎＭの各ディテクター（各オリゴ当たり０．１ピコモルの最終投入をもたらす）、１００ｎＭのビオチン化オリゴ（ｄＴ）２５、および洗浄バッファー（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．６、１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡジナトリウム、０．２％  ＳＤＳ）中の５μＬのストレプトアビジン被覆磁気ビーズを含むものとした。
【００７４】
そのプレートを６５℃で１０分間加熱して、ＲＮＡを変性させた後、温度を４０分かけて４５℃に下げて、ディテクターがＲＮＡサンプル中の標的配列とアニーリングするのを可能にした。そのプレートを、その後、ビーズを固定するために磁気台に移し、結合していないディテクターおよび過剰なディテクターを含む上清をウェルから吸引するのを可能にした。そのビーズを少なくとも３回５０μＬの洗浄バッファーで洗浄した。
【００７５】
各ウェルに、製造業者によって供給された２０μＬの１×ライゲーションバッファー中の５Ｗｅｉｓｓ  ｕｎｉｔのＴ４  ＤＮＡリガーゼを添加した。ピペットによってビーズを再懸濁させた後、そのプレートを３７℃で６０分間インキュベートして、必要に応じてＤＤのＵＤとの標的依存的なライゲーションを可能にした。ライゲーション反応後、ビーズを固定し、５０μＬの洗浄バッファーで２回洗浄した。連結されたディテクターをそれらのＲＮＡ標的からはずすために、ビーズを３０μＬに再懸濁させ、６５℃で５分間インキュベートした。インキュベーション後、そのビーズを固定し、上清を除去し、保管プレートに移した。
【００７６】
任意の増幅ステップのために、ライゲーション産物を含む５μＬの上清をＰＣＲプレートのウェルに移した。その後、０．４５ＵのＴａｑポリメラーゼ、０．６μＭのＰ１プライマー、０．６μＭのＰ２プライマー、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、および２００μＭのｄＮＴＰを含む１０μＬのＰＣＲカクテルを添加した。サーモサイクラーは以下のプログラムを使用した：９４℃で１０分間に続いて、２０から２５サイクルの９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間。その増幅産物を、その後、製造業者の説明書に従って配列決定した。この代表的なライゲーションアッセイは、以下の実施例のとおり変更してもよい。
[実施例２]
【００７７】
アンカードディテクターおよび環状化可能なディテクター設計
上流および下流ディテクタープローブオリゴヌクレオチドを、図２ａおよび図３ａのとおり、乳癌標的として特定された２４の標的配列に対して作製した：ＡＣＴＢ＿１、ＴＦＦ１＿１、ＧＡＴＡ３＿３、ＧＡＰＤＨ＿３、ＣＤＨ１＿１、ＫＲＴ１９＿２、ＴＩＭＰ１＿２、ＮＦＫＢＩＡ＿１、ＥＳＲ１＿１、ＶＥＧＦＡ＿３、ＬＡＭＰ１＿２、ＭＵＣ１＿３、ＢＡＤ＿３、ＰＴＥＮ＿１、ＢＲＣＡ２＿１、ＢＣＡＴ２＿３、ＩＣＡＭ１＿２、ＩＧＦ２＿３、ＢＲＣＡ１＿２、ＥＧＦＲ＿１、ＢＭＰ４＿１、ＫＩＴ＿３、ＷＮＴ１＿１、およびＥＧＦ＿３（予想される数の降順）。ＡＣＴＢ＿１からＥＧＦ＿３まで６桁に及ぶ発現の範囲に関して標的を選択した。ＤＲおよびＵＲのために使用した標的配列を図６ａに示す。
【００７８】
サンプルとして１００、１０、１、および０．１ならびに０（対照）ナノグラムのＭＣＦ７全ＲＮＡを用いてアッセイを３回行った。ディテクターを１または２μＬの体積のサンプルに添加し、６５℃で１０分間インキュベートし、６５°から４５℃に２０分かけて降温させ、その後、４５℃で２０分間保持されることによってハイブリダイズさせた。エキソヌクレアーゼＩ（大腸菌（E．coli））を６μＬの０．５Ｕｎｉｔでハイブリダイゼーション混合物に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。Ｔ４リガーゼを６μＬの５Ｕｎｉｔで混合物に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。加熱ステップを８０℃で３０分間行った。その混合物を、２×ＰＣＲマスターミックスを添加することによって増幅させた。標的配列に対応する増幅産物を検出し、ｑＰＣＲおよび配列決定によって定量化した。その結果を図６ｂ〜６ｇに示す。
[実施例３ａ]
【００７９】
マイクロＲＮＡに対する環状化可能なディテクター設計
環状化可能なＤＯディテクターを、ｍｉＲＮＡのＬｅｔ−７ファミリーに対して設計した。これらのｍｉＲＮＡは、比較的長い転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として初めに転写されるが、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡにプロセシングされ、その後、比較的短い成熟形態にプロセシングされる。成熟形態において、太字のｌｅｔ−７ａ配列からのバリアントを含む相同性が高いＬｅｔ−７ファミリーを５’→３’で示す。
【００８０】
【化１０】
0006768706.tif 000011
【００８１】
例としてＨｓａ  ｌｅｔ−７ａを使用して、ＤＲ’は、５’−ＡＡＣＴＡＴＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１８）であり、ＵＲ’は、５’−ＣＴＡＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’（配列番号１９）であった。図４に示されるとおり、ＤＯの一本鎖部分とハイブリダイズして、二本鎖ハイブリダイゼーション複合体を形成する約８０ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（２Ｓ）を与える。
【００８２】
ハイブリダイゼーション後、ＤＲ領域およびＵＲの領域は、
【００８３】
【化１１】
0006768706.tif 000012
と表すことができ、ここで、標的ｍｉＲＮＡは小文字である。Ｐ１またはＰ２’などのイタリック体の部分的に示す配列が近接する、ローマン体のＤＲ’および下線を引いたローマン体のＵＲ’を含むＤＯの部分を、上の配列として示す。イタリック体の太字の塩基は、同じ２Ｓオリゴヌクレオチドの３’末端（左側）および５’末端（右側）を表す。
【００８４】
ライゲーション後に、示した部分は、いかなるニックもなく二本鎖構造を構成し、
【００８５】
【化１２】
0006768706.tif 000013
これは、エキソヌクレアーゼによる攻撃に抵抗性がある。
【００８６】
ｌｅｔ−７ａのＤＯが類似のｌｅｔ−７ｃとハイブリダイズすることになる場合、以下の構造：
【００８７】
【化１３】
0006768706.tif 000014
が形成される。ミスマッチを含む複合体には、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩおよび大腸菌（E．coli）エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｓ１ヌクレアーゼもしくはヌクレアーゼＢＡＬ−３１の組み合わせなどのさまざまな酵素を用いてニックが入れられてもよい。ニックが入った複合体は、その後、ステップ（ｂ１）のヌクレアーゼによる処理によって分解され得るため、ライゲーション産物が形成されない。
【００８８】
示したとおり、必要に応じて、共有結合的に環状化された二本鎖構造は、制限エンドヌクレアーゼによる処理によって直鎖化されてもよく、この場合、２Ｓは適した制限部位を含む。直鎖化産物は、プライマーを用いて増幅されてもよい。
[実施例３ｂ]
【００８９】
マイクロＲＮＡに対する伸長されたディテクター設計
ポリアデニル化されたＬｅｔ−７ファミリーマイクロＲＮＡに対する伸長されたディテクターを設計した。マイクロＲＮＡを、ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼを使用して伸長し、３’ポリアデニンテールを付加する。Ｈｓａ  ｌｅｔ−７ａ  マイクロＲＮＡ（配列番号１０）に関して、ポリアデニル化された配列をイタリック体で下に示す（配列番号２８）。配列番号２７を有する上流ディテクターを示し、配列番号２６を有する伸長された下流ディテクターを示し、これは、イタリック体のポリ−Ｔ領域を有する（ディテクターがＤＮＡの場合、通常ポリ−ｄＴ）。
【００９０】
【化１４】
0006768706.tif 000015
【００９１】
追加の３’ポリアデニンテールと伸長されたポリ−Ｔ領域との組み合わせは、標的がディテクターとハイブリダイゼーションするためのさらに長い相補的な領域をもたらし、標的に対するＤＲおよびＵＲの設計にさらなる自由度を与える。例えば、ＤＤおよびＵＤに対して相補的な領域の長さは、さらに類似した長さであってもよい。関連標的配列のファミリーが検出されるとき、ＤＤまたはＵＤは、２つ以上のファミリーメンバーを検出するために使用されてもよい（「汎用ディテクター」）。したがって、Ｈｓａ  ｌｅｔ−  ７ｂに関して、
【００９２】
【化１５】
0006768706.tif 000016
５’方向の１４塩基が一致するため、ｌｅｔ−７ａならびにｌｅｔ−７ｂ（およびｌｅｔ−７ｃ）を検出するために同じ上流ディテクターを使用することができる。当業者は、ディテクターの数および所望のハイブリダイゼーション特性に応じて、ｌｅｔ−７ファミリーなどの関連配列に対する特異的ディテクターおよび汎用ディテクターのさまざまな組み合わせを設計することができるであろう。
【００９３】
伸長されたディテクターをポリアデニル化マイクロＲＮＡとハイブリダイズさせた後、ディテクターを連結して、検出または任意の増幅のためのライゲーション産物を形成する。付加される追加のアデノシンの数がＤＤ中のｄＴの数よりも少ない場合、これは、ライゲーションおよび次のステップを妨げない。追加のＡｓの数が大きい場合、その結果、特異的で標的に適正なライゲーションが起こるために、３’テールの過剰な部分がＤＤの残りの５’部分と完全にハイブリダイズする必要はない。
[実施例４]
【００９４】
フラップ設計
実施例３ａのとおりだが、ＵＤが５’末端に付加的なポリ−Ａ  ＣＰ５配列を有する環状化可能なディテクターオリゴを設計した。
【００９５】
【化１６】
0006768706.tif 000017
ＤＯの標的配列とのハイブリダイゼーションの後、ＤＯのＵＲ’（上記の下線部）は、図５ａに示されるとおり、標的ＵＲとハイブリダイズするが、ポリ−Ａ配列がハイブリダイズしていないフラップのまま残る。この複合体は、ポリ−Ａおよび近接するハイブリダイズした塩基を除去するためにＦｅｎ−１などのフラップエンドヌクレアーゼを用いて処理されてもよい。近接するＤＲとハイブリダイズしたＤＲ’は、図１のステップ（ｂ０）のとおりに伸長された後、ＵＲ’領域と連結されてもよい。
【００９６】
あるいは、ＤＲ’は、下記の下線を引いた１つのＣなどの非相補的な部分（ＣＰ３）：
【００９７】
【化１７】
0006768706.tif 000018
を有してもよく、これは、図５ｄに示されるとおり、ハイブリダイズし、エンドヌクレアーゼによって残された切れ目をうめることができる。ライゲーション後に、図５ｅのとおり、ニックのない二本鎖の複合体が形成される。図４において前に説明したとおり、この環状化構造は、必要に応じて直鎖化され、増幅されてもよい。
【００９８】
上に設けた見出しは、文書内のナビゲーションを容易にすることのみが意図され、別の部分と比較して文章の一部分の意味を特徴づけるために使用されるべきではない。当業者は、さらなる実施形態が本発明の範囲内にあることを認識するであろう。本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ画定され、本明細書またはその例による限定が請求項に持ち込まれるべきではない。
【図１】
0006768706.tif 000019
【図２−１】
0006768706.tif 000020
【図２−２】
0006768706.tif 000021
【図２−３】
0006768706.tif 000022
【図３−１】
0006768706.tif 000023
【図３−２】
0006768706.tif 000024
【図４】
0006768706.tif 000025
【図５】
0006768706.tif 000026
【図６−１】
0006768706.tif 000027
【図６−２】
0006768706.tif 000028
【図６−３】
0006768706.tif 000029
【配列表】
0006768706000001.app