(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションするための方法であって、
（ａ）前記大スケール灌流培養物の１０％またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）シミュレーションするべき前記大スケール灌流培養物の１つまたは複数の培養条件を使用して前記細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、前記小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ；
（ｃ）前記小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）前記小スケール細胞培養物中の前記細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、前記小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を前記小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記小スケール細胞培養物において細胞を培養するために使用される、シミュレーションするべき前記大スケール灌流培養物の前記１つまたは複数の培養条件が、培養培地、温度、ｐＨ値、酸素濃度、細胞密度、前記培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力、ガス供給速度、灌流速度ならびに前記培養培地の浸透圧からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および／または細胞クローンをスクリーニングするための方法であって、
（ａ）前記大スケール灌流培養物の１０％またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）前記小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、前記小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ；
（ｃ）前記小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）前記小スケール細胞培養物中の前記細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、前記小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；
（ｅ）新鮮な培養培地を前記小スケール細胞培養物に添加するステップ；および
（ｆ）前記大スケール灌流培養物の所望の特性および／または特徴を提供する培養条件および／または細胞クローンについてスクリーニングされたものを選択するステップ
を含み、個々の前記小スケール細胞培養物は、スクリーニングするべき前記培養条件および／または前記細胞クローンが異なる、方法。
【請求項４】
スクリーニングするべき前記培養条件が、培養培地、温度、ｐＨ値、酸素濃度、細胞密度、前記培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力、ガス供給速度、灌流速度ならびに前記培養培地の浸透圧からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記培養条件および／または細胞クローンが、高い細胞生存率、高いおよび／または安定な細胞密度、前記細胞培養物中の前記細胞によって産生される目的の生体分子の高いおよび／または安定した収率、ならびに前記細胞培養物中の前記細胞によって産生される目的の生体分子の所望の特性を提供する前記スクリーニングにおいて選択される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記大スケール灌流培養物が少なくとも１ｌの容量を有し、および／または前記小スケール細胞培養物が５０ｍｌもしくはそれ未満の容量を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）における撹拌を停止した後、ステップ（ｄ）で前記培養培地の一部を除去する前に、前記細胞の沈降が少なくとも３５分間起きる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）における撹拌を停止した後、ステップ（ｄ）で前記培養培地の一部を除去する前に、前記細胞の沈降が３０分またはそれ未満の間起き、ステップ（ｄ）で、前記細胞培養物中の前記細胞の一部もまた、細胞ブリーディングをもたらすために除去される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｄ）で前記培養培地の１５％〜５０％が除去され；ならびに／または前記培養培地がステップ（ｄ）で前記細胞培養物の上部から除去される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｅ）で添加される新鮮な培養培地の量は、ステップ（ｄ）で除去される培養培地の量と、本質的に同一である、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地中の前記ｐＨ値および／または前記酸素濃度が前記細胞の培養中に制御され、ステップ（ｃ）における前記細胞培養物の撹拌を停止する前に、前記ｐＨ値および／または前記酸素濃度の制御が少なくとも５分間停止される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）〜（ｅ）が１回または複数回、繰り返され、ステップ（ｅ）の後、次のサイクルのステップ（ｃ）で撹拌が停止する前に、少なくとも１時間、撹拌下で前記細胞が培養される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
培養するべき前記細胞が、懸濁状態で成長する真核細胞、好ましくは骨髄性白血病起源の不死化ヒト細胞のような不死化ヒト血液細胞、またはＣＨＯ細胞である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、目的の生体分子、好ましくは糖タンパク質を組換えにより産生する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、懸濁細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションする小スケール細胞培養システムに関する。本発明は、特に、細胞を培養するための方法であって、培養培地の一部を置き換えるために、細胞沈降を使用して培養培地から細胞を分離する方法を提供する。この方法は、大スケール細胞培養をシミュレーションするため、ならびに大スケール細胞培養に使用するための培養条件および細胞クローンをスクリーニングするために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組換えタンパク質の産生は、現代のバイオテクノロジー産業の主要な態様である。市場で大量の高品質タンパク質が必要とされる用途の数が増えるにつれ、ますます、その重要性が高まっている。食品生産および特に薬理学は、組換えタンパク質の必要性が着実に増加する２つの主要な分野である。商業的に実行可能なプロセスを得るためには、より高い生産効率および結果的に最終製品のより低いコストが求められる。
【０００３】
しかしながら、同時に、高い製品品質およびヒトへの適用との適合性が不可欠である。真核細胞、特に高等真核細胞におけるタンパク質の、組換えによる産生が、ますます多くの用途において必要とされた。とりわけ、グリコシル化（糖タンパク質）のような翻訳後修飾を受けているタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞システムで発現させるか、または特にヒト細胞株のような真核細胞システムで発現させるかで顕著に異なる。多くの場合、これらの相違は、産生されたタンパク質の免疫原性と同じく生物学的活性に著しい影響を及ぼす。しかしながら、高等真核細胞株を使用する多くの発現システムは、所望のタンパク質のかなり低い発現率に悩まされており、その結果、組換えタンパク質の低収率および高コストを招く。
【０００４】
真核細胞において産生された組換えタンパク質の収率および品質を改善するために、それらの翻訳後修飾の特徴を含めて、多数の培養条件が最適化され、多数の細胞クローンが試験される。後期の組換えタンパク質の産生に使用される大スケール細胞培養において、このスクリーニングプロセスを行うことは非常に高価であり、煩わしい。したがって、そのようなスクリーニングプロセスは、しばしば、小スケール培養において実施される。しかしながら、そのような小スケール培養は、しばしば、それらがシミュレーションするべき大スケール培養とは挙動が大きく異なっている。小スケール培養で確立された培養条件および細胞クローンは、大スケールに移行する際に、あまり最適でないことが判明する可能性がある。
【０００５】
信頼性の高いダウンスケールモデルは、効率的で迅速なバイオプロセス開発にとって重要である。培地またはプロセス最適化およびクローンスクリーニングなどの主要な操作は、高い操作コストまたは低い処理能力などのいくつかの理由により、プロセス条件下では、通常、実施されない。バイオプロセシングの主要な課題は、できるだけ最善な大きなスケールを代表する、適切なダウンスケールモデルを見出すことである。大スケールに対する主要パラメーターおよび高い処理能力のための満足される同等性が、適用可能なダウンスケールシステムの第一の特徴でなければならない。
【０００６】
高度マイクロバイオリアクター（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｉｃｒｏ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ；ａｍｂｒ）システムは、より大スケールのバイオリアクターに対する優れた再現性を有するそのようなダウンスケールツールを代表する（Hsuら（２０１２年）Cytotechnology  ６４巻：６６７〜６７８頁）。ａｍｂｒシステムは、１０〜１５ｍｌの作業容量を有する単回使用の容器、液体ハンドリングロボットおよび酸素飽和度（ＤＯ）ならびにｐＨをオンラインで測定するモニターからなる。処理能力は、デバイスの設備に応じて２４個または４８個の容器に制限されている。ａｍｂｒシステムは、バッチ培養法および流加培養法のスケールダウンモデルとして広く適用されている。しかしながら、灌流培養はこれまで利用できなかった。１ｌのベンチトップバイオリアクターは、灌流培養のための最小のスケールダウン単位であると考えられている（Shimoniら（２０１４年）BioProcess  Int  １２巻：５４〜６１頁）。より小スケールの灌流システムを開発する上での障害は、細胞保持デバイスのスケールダウンである。典型的な細胞保持デバイスは、Voisardら（２００３年）Biotechol  Bioeng  ８２巻：７５１〜７６５頁において議論されており、濾過または遠心分離に基づく機構は、小容量のバイオリアクターで効率的に働くためには、非常に多くのデッドボリュームを必要とする。灌流細胞培養の開始時に、細胞分離法として沈降を調査し、さらなる開発により傾斜セトラー（ｉｎｃｌｉｎｅｄ  ｓｅｔｔｌｅｒ）のような外部デバイスが得られるに至った。頑強でほとんどせん断応力を生じず、一方、細胞はバイオリアクターの外側に存在し、より低い温度または不十分な酸素供給のような準最適条件の下に置かれている（Voisardら（２００３年）Biotechol  Bioeng  ８２巻：７５１〜７６５頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Hsuら（２０１２年）Cytotechnology  ６４巻：６６７〜６７８頁
【非特許文献２】Shimoniら（２０１４年）BioProcess  Int  １２巻：５４〜６１頁
【非特許文献３】Voisardら（２００３年）Biotechol  Bioeng  ８２巻：７５１〜７６５頁
【非特許文献４】Voisardら（２００３年）Biotechol  Bioeng  ８２巻：７５１〜７６５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の要旨
したがって、とりわけ真核生物発現細胞株を使用する場合に、スクリーニング目的のために大スケール細胞培養を小スケールで効率的にシミュレーションするための方法を提供する必要性が当該技術分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明により実証されるように、懸濁物中の真核細胞の灌流培養は、ある特定の時間間隔の後に、培地の一部を新鮮培地と交換する撹拌細胞培養を使用して効率的に小スケールでシミュレーションすることができる。培養物中の細胞の保持は、培養培地を除去する前に細胞を沈降させることにより達成される。培養物中の細胞濃度、細胞生存率、および特に産生された糖タンパク質のグリコシル化パターンは、小スケール細胞培養とそれがシミュレーションする大スケール灌流培養との間で、非常に類似している。
【００１０】
したがって、本発明は、第１の態様では、本発明は、懸濁物中で細胞を培養するための方法であって、
（ａ）細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、細胞培養物が攪拌されるステップ；
（ｃ）細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を細胞培養物に添加するステップ
を含む方法を提供する。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションするための方法であって、
（ａ）大スケール灌流培養物の１０％またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）シミュレーションするべき大スケール灌流培養物の１つまたは複数の培養条件を使用して、小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ；
（ｃ）小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含む方法を提供する。
【００１２】
第３の態様では、本発明は、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および／または細胞クローンをスクリーニングするための方法であって、
（ａ）大スケール灌流培養物の１０％またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養が攪拌されるステップ；
（ｃ）小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含み、個々の小スケール細胞培養物は、スクリーニングするべき培養条件および／または細胞クローンが異なる、方法を提供する。
【００１３】
本発明の他の目的、特徴、利点および態様は、以下の記載および添付の特許請求の範囲から、当業者に明らかになる。しかしながら、以下の記載、添付の特許請求の範囲、および本出願の好ましい実施形態を示す具体的な例は、例示の手段としてのみ与えられていることが、理解されるべきである。以下の記載を読むことから、開示された発明の精神および範囲内の様々な変更および修正が当業者には容易に明らかとなる。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、小スケールの懸濁物中で細胞を培養するための方法を対象とする。これらの培養方法を使用して、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションすることができる。さらに、前記培養方法を使用して、適切な培養条件および細胞クローンの決定のためのスクリーニング方法を実施することができる。
【００１５】
第１の態様では、本発明は、懸濁物中で細胞を培養するための方法であって、
（ａ）細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、細胞培養物が攪拌されるステップ；
（ｃ）細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を細胞培養物に添加するステップ
を含む方法を提供する。
【００１６】
ステップ（ａ）で提供される細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を撹拌するための手段を備えたバイオリアクターにおいて提供される懸濁細胞培養物である。細胞培養物を撹拌するための手段は、特に、ピッチブレードインペラー（ｐｉｔｃｈｅｄ  ｂｌａｄｅ  ｉｍｐｅｌｌｅｒ）などのインペラーであってもよい。バイオリアクターは、さらに、細胞培養物に気体および／または液体を供給するための手段、ならびに細胞培養物の１つまたは複数の培養条件を測定するための手段を備えることができる。前記培養条件は、細胞培養物の温度、ｐＨ値、酸素濃度、栄養素濃度および二酸化炭素濃度を含むことができる。
【００１７】
細胞培養の自動操作のために、バイオリアクターは、酸素および／もしくは栄養素の供給、細胞培養物の温度ならびに／またはｐＨ値を制御することができる制御ユニットをさらに備えている。制御ユニットは、細胞培養物において測定された１つまたは複数の培養条件の値に基づいたこれらのパラメーターの１つまたは複数を、自動的に制御してもよい。各培養条件の所望の値または範囲は、操作する者によって予め設定されてもよい。本発明による方法において使用するために適したバイオリアクターは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＡＭＢＲ）シリーズＴＡＢ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓのマイクロバイオリアクター、特にＡＭＢＲ２４またはＡＭＢＲ１５である。
【００１８】
ある特定の実施形態では、小スケール細胞培養物が使用される。本発明によれば、小スケール細胞培養物は、特に２５０ｍｌもしくはそれ未満、特に１００ｍｌもしくはそれ未満、５０ｍｌもしくはそれ未満、２５ｍｌもしくはそれ未満または１２．５ｍｌもしくはそれ未満の培養容量を有する。小スケール細胞培養物の容量は、とりわけ、１ｍｌ〜２００ｍｌ、特に、２ｍｌ〜１５０ｍｌ、３ｍｌ〜１００ｍｌ、５ｍｌ〜７５ｍｌ、７ｍｌ〜５０ｍｌ、８ｍｌ〜３０ｍｌ、または９ｍｌ〜２０ｍｌの範囲である。具体的な実施形態では、小スケール細胞培養物は、１０ｍｌ〜１５ｍｌ、特に、約１２ｍｌの容量を有する。
【００１９】
細胞培養物中の細胞は、特に、懸濁細胞、すなわち、懸濁物中で生存および／または増殖することができる細胞である。特に、生存および／または増殖するために、細胞を任意の固体表面に付着させる必要はない。具体的な実施形態では、細胞は真核細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、骨髄性白血病起源の不死化ヒト細胞のような不死化ヒト血液細胞である。骨髄性白血病起源の具体的なヒト細胞は、Ｋ５６２細胞ならびにそれに由来した細胞、例えば、ＮＭ−Ｆ９、ＮＭ−Ｄ４、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６、ＮＭ  Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２、ＧＴ−２Ｘ、ＧＴ−５およびそれらに由来した細胞である。Ｋ５６２は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に存在するヒト骨髄性白血病細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）である。残りの細胞株は、Ｋ５６２細胞に由来し、特異的なグリコシル化の特徴のために選択されている。Ｋ５６２に由来した細胞株は、Ｋ５６２に適した周知の条件下で培養し、維持することができる。Ｋ５６２細胞を除いたこれら全ての細胞株は、ブダペスト条約に従って寄託された。寄託に関する情報は、本明細書の最後に見出すことができる。別の実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。
【００２０】
具体的な実施形態では、細胞培養物中の細胞は、目的の生体分子を産生する。細胞は、目的の生体分子を組換えにより産生してもよい。ある特定の実施形態では、目的の生体分子はタンパク質、特に、抗体のような糖タンパク質である。
【００２１】
ステップ（ｂ）では、細胞培養物中で細胞を培養する。細胞培養物の培養条件は、一般に、培養されるべき細胞に適合するように選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、約３７℃の温度で、特に、３３℃〜４０℃、とりわけ、３５℃〜３８℃の範囲で培養される。さらに、ある特定の実施形態では、細胞は、約７．１のｐＨ値、特に、６．５〜７．７、とりわけ、６．７〜７．５、特には、６．９〜７．３の範囲のｐＨ値で培養される。細胞培養物中の細胞密度は、少なくとも１×１０４細胞／ｍｌ、特に、少なくとも５×１０４細胞／ｍｌまたは少なくとも１×１０５細胞／ｍｌであってもよい。細胞密度は、とりわけ、約１×１０５細胞／ｍｌ〜約５×１０５細胞／ｍｌ、特には、約２×１０５細胞／ｍｌ〜約３×１０５細胞／ｍｌの範囲である。具体的な実施形態では、培養培地中の酸素濃度は、少なくとも１０％、特に、少なくとも２０％、とりわけ、１０％〜８０％、特には、２０％〜６０％の範囲である。
【００２２】
ある特定の実施形態では、培養培地中のｐＨ値および／または酸素濃度は、細胞の培養中に制御される。ｐＨ値の制御は、もしｐＨ値が所望の範囲外であるならば、二酸化炭素またはＮａＯＨを添加することにより実施することができる。すなわち、ｐＨ値が高すぎる場合には、二酸化炭素を添加してｐＨ値を低下させ、すなわちｐＨ値が低すぎる場合には、ＮａＯＨを添加してｐＨ値を上昇させる。酸素濃度の制御は、培養培地に入って行く酸素量を制御することにより実施することができる。ある特定の実施形態では、細胞培養物には、酸素が供給される。
【００２３】
細胞の培養中、細胞培養物が撹拌される。具体的な実施形態では、細胞培養物は、インペラーで撹拌される。細胞培養物を撹拌するために適した任意のインペラー、とりわけ、ピッチブレードインペラーを使用することができる。撹拌速度は、使用したバイオリアクターおよび培養された細胞に合わせて調整するべきである。例えば、約５ｍｌ〜５０ｍｌの容量を有する小スケール細胞培養物中では、例えば、インペラーの撹拌速度は、７５０ｒｐｍ〜１５００ｒｐｍの間のように、約５００ｒｐｍ〜約２０００ｒｐｍの範囲である。
【００２４】
ステップ（ｃ）では、細胞培養物の撹拌が停止される。ある特定の実施形態では、ステップ（ｃ）で撹拌が停止される前、少なくとも１時間、ステップ（ｂ）で細胞は撹拌されながら培養される。特に、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも２．５時間または少なくとも３時間、細胞は撹拌されながら培養される。ある特定の実施形態では、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間または少なくとも１２時間、細胞は撹拌されながら培養される。撹拌を停止した後、細胞を沈降させる。ステップ（ｄ）で培養培地の一部を除去する前に、少なくとも３０分間細胞の沈降が起きてもよい。ある特定の実施形態では、少なくとも３５分間、特に、少なくとも４０分間または少なくとも４５分間、沈降が起きる。とりわけ、３０分間〜４５分間の時間、特に、約４０分間、細胞を沈降させる。ある特定の実施形態では、沈降の時間は、培養された細胞の挙動に合わせて調整される。特に、沈降時間は、少なくとも７５％、特に、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の細胞培養物中の細胞を、培養コンテナの下部７５％、特に、培養コンテナの下半分、とりわけ、培養コンテナの底に沈殿させるために十分に長い。具体的な実施形態では、細胞の沈降は、細胞の沈降を誘導するかまたは亢進する任意の手段または物質の添加または存在なしで起こる。
【００２５】
具体的な実施形態では、ｐＨ値の制御および／または酸素濃度の制御は、ステップ（ｃ）における細胞培養物の撹拌が停止される前に、停止される。特に、ｐＨ値および酸素濃度の両方の制御が停止される。ｐＨ値の制御および／または酸素濃度の制御は、ステップ（ｃ）における細胞培養物の撹拌を停止する前に、少なくとも５分間、とりわけ、少なくとも１０分間または少なくとも１５分間、停止させてもよい。
【００２６】
別の実施形態では、ステップ（ｃ）における撹拌を停止した後の細胞の沈降は、３５分間またはそれ未満の間起きる。より短い沈降時間を使用すると、沈降の終わりに細胞培養物中の全ての細胞が、底に沈殿することはない。ステップ（ｄ）で培養培地の一部を除去する時に、この実施形態では、除去された培養培地はかなりの量の細胞を含有する。したがって、培養培地の一部を除去することにより、細胞ブリーディング（ｃｅｌｌ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ）が達成される。それによって、細胞密度が制御され、これらの細胞は増殖期に保たれる。これらの実施形態では、ステップ（ｄ）でもまた、細胞培養物中の細胞の一部を、細胞ブリーディングをもたらすために除去されてもよい。特に、ステップ（ｄ）で除去した培養培地については、約１％〜約２５％、特に、約２％〜約２０％、約５％〜約１５％、および約７．５％〜約１２．５％の細胞培養物中の細胞を除去するように、沈降時間を調整する。具体的な実施形態では、ステップ（ｃ）における撹拌を停止した後の細胞の沈降は、ステップ（ｄ）で培養培地の一部を除去する前に、３０分間もしくはそれ未満、２５分間もしくはそれ未満または２０分間もしくはそれ未満の間起きる。特に、ステップ（ｃ）における撹拌を停止した後の細胞の沈降は、ステップ（ｄ）で培養培地の一部を除去する前に、約１５分間〜約３５分間、とりわけ、約２０分間〜約３０分間起きる。
【００２７】
ステップ（ｄ）では、細胞培養物の培養培地の一部が除去される。ある特定の実施形態では、培養培地の約１０％〜約７５％が除去される。特に、培養培地の約５０％〜約５０％、とりわけ、約２０％〜約３０％、特には、約２５％がステップ（ｄ）で除去される。培養培地は、好ましくは、ステップ（ｄ）で、細胞培養物の上部から除去される。細胞ブリーディングが意図されない実施形態では、ステップ（ｄ）で除去される培養培地は、特に、細胞培養物中の細胞の１０％未満、とりわけ、５％未満、２．５％未満、または特には、１％未満を含む。
【００２８】
ステップ（ｅ）では、新鮮な培養培地が細胞培養物に添加される。具体的な実施形態では、ステップ（ｅ）で添加される新鮮な培養培地の量は、ステップ（ｄ）で除去される培養培地の量と、本質的に同一である。特に、ステップ（ｅ）で添加される培養培地の量は、ステップ（ｄ）で除去される培養培地の量の７５％〜１２５％、とりわけ、９０％〜１１０％または９５％〜１０５％、特には、約１００％の範囲である。
【００２９】
具体的な実施形態では、ステップ（ｂ）〜（ｅ）は、１回または複数回繰り返される。特に、ある特定の時間、細胞を培養し、具体的な時間間隔の後、撹拌を停止し、細胞を沈降させ、培養培地の一部を除去し、新鮮な培養培地を添加し、再び撹拌を開始する。その後、ステップ（ｂ）〜（ｅ）を含むこのサイクルが、再び始まる。ある特定の実施形態では、ステップ（ｅ）の後、次のサイクルのステップ（ｃ）で撹拌が停止される前に、少なくとも１時間、撹拌しながら細胞を培養する。特に、少なくとも１．５時間、少なくとも２時間、少なくとも２．５時間または少なくとも３時間、撹拌しながら細胞を培養する。ある特定の実施形態では、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間または少なくとも１２時間、撹拌しながら細胞を培養する。本明細書に記載の方法は、１日当たり少なくとも１サイクル、特に、１日当たり少なくとも２サイクル、少なくとも３サイクルまたは少なくとも４サイクル、例えば１日当たり８サイクルまでを含むことができる。
【００３０】
第２の態様では、本発明は、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションするための方法であって、
（ａ）大スケール灌流培養物の１０％またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）シミュレーションするべき大スケール灌流培養物の１つまたは複数の培養条件を使用して、小スケール細胞培養物中で細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養が攪拌されるステップ；
（ｃ）小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含む方法を提供する。
【００３１】
小スケール細胞培養物において細胞を培養するために使用される、シミュレーションするべき大スケール灌流培養物の１つまたは複数の培養条件は、特に、培養培地または特定の培養培地成分、温度、ｐＨ値、酸素濃度、細胞密度、培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｗｅｒ  ｉｎｐｕｔ）、ガス供給速度、灌流速度ならびに培養培地の浸透圧からなる群から選択することができる。
【００３２】
小スケール細胞培養は、大スケール灌流培養の培養容量をシミュレーションしない。具体的な実施形態では、小細胞培養は、大スケール灌流培養で使用される、除去されるべき培養培地から細胞を分離する方法をシミュレーションしない。
【００３３】
小スケール細胞培養による大スケール灌流培養のシミュレーションは、特に、小スケール細胞培養物中で観察される、ある特定の特性および特徴が同様に大スケール灌流培養物中に存在することを意味する。これにより、具体的な培養条件および／または細胞クローンを、小スケール細胞培養物中で試験することができる。これらの培養条件および／または細胞クローンが有利であると判明した場合には、それらは大スケール培養物において使用することができる。ある特定の実施形態では、大スケール灌流培養は、細胞成長、細胞生存率および細胞密度からなる群から選択される、１つまたは複数の特性および／または特徴に関して、小スケール細胞培養によってシミュレーションされる。細胞が目的の生体分子、特に糖タンパク質を産生する実施形態では、小スケール細胞培養によってシミュレーションされる大スケール灌流培養の特性および／または特徴としては、目的の生体分子の収率、細胞の生産性、目的の生体分子の産生の安定性、および目的の生体分子の品質をさらに挙げることができ、特に、それが糖タンパク質である場合、生体分子の１つまたは複数のグリコシル化特徴が含まれる。グリコシル化の特色としては、とりわけ、グリコシル化の相対量、すなわち、糖タンパク質中のグリコシル化部位の何パーセントがグリカン構造によって占有されているか；グリカン構造のタイプの相対量、すなわち、糖タンパク質に付着した全てのグリカン構造の何パーセントが、複合型Ｎ−グリカンのような特定のタイプのグリカン構造であるか；様々な単糖類の相対量、すなわち、糖タンパク質に付着したグリカン構造中の全ての単糖類の何パーセントが、ガラクトース、フコース、シアル酸、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびマンノースのような、特定の種類の単糖であるか；ならびに、特定のグリコシル化モチーフの相対量、すなわち、全てのグリカン構造の何パーセントが、コアフコース、二分岐のＮ−アセチルグルコサミン、少なくとも１つのガラクトース残基、少なくとも２つのガラクトース残基、少なくとも１つのシアル酸残基、少なくとも２つのシアル酸残基ならびに単鎖、二分岐鎖、三分岐鎖および四分岐鎖グリカンのような、特定のグリコシル化モチーフを示すか、が挙げられる。
【００３４】
ある特定の実施形態では、大スケール灌流培養をシミュレーションするための方法は、ステップ（ｅ）の後に以下のさらなるステップ（ｇ）を含む：
（ｇ）ステップ（ｂ）で使用される１つまたは複数の培養条件を使用して、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養物を提供するステップ。
【００３５】
ステップ（ｇ）で提供される大スケール灌流培養物は、上記方法によってシミュレーションするべき大スケール灌流培養物であり、ステップ（ｂ）で使用されるシミュレーションするべき大スケール灌流培養物の１つまたは複数の培養条件を使用する。
【００３６】
第３の態様では、本発明は、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および／または細胞クローンをスクリーニングするための方法であって、
（ａ）大スケール灌流培養物の１０％またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養が攪拌されるステップ；
（ｃ）小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含み、個々の小スケール細胞培養物は、スクリーニングするべき培養条件および／または細胞クローンが異なる、方法を提供する。
【００３７】
ステップ（ａ）では、２種またはそれ超の小スケール細胞培養物が提供される。特に、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも８種または少なくとも１０種の小スケール細胞培養物が提供される。
【００３８】
具体的な実施形態では、スクリーニングされていない培養条件の１つまたは複数、特に全ては、小スケール細胞培養物間で同様または同一である。スクリーニングすることができる適切な培養条件には、特に、培養培地または特定の培養培地成分、温度、ｐＨ値、酸素濃度、細胞密度、培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力、ガス供給速度、灌流速度ならびに培養培地の浸透圧からなる群から選択されるものが含まれる。
【００３９】
方法が、大スケール灌流培養のための細胞クローンをスクリーニングするためのものである実施形態では、様々な小スケール細胞培養で使用される様々な細胞クローンは、特に、同じ親細胞に由来している。細胞が目的の生体分子を組換えにより産生する場合、様々なクローンはとりわけ同じ生体分子を産生し、特に、同じトランスフェクション実験によって得ることができる。
【００４０】
具体的な実施形態では、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および／または細胞クローンをスクリーニングするための方法は、ステップ（ｅ）の後に以下のさらなるステップ（ｆ）を含む：
（ｆ）大スケール灌流培養物の所望の特性および／または特徴を提供するための培養条件および／または細胞クローンについてスクリーニングされたものを選択するステップ。
【００４１】
大スケール灌流培養物の所望の特性および／または特徴は、特に、細胞成長、細胞生存率および細胞密度からなる群から選択することができる。細胞が目的の生体分子、特に糖タンパク質を産生する実施形態では、大スケール灌流培養物の特性および／または特徴としては、目的の生体分子の収率、細胞の生産性、目的の生体分子の産生の安定性、および目的の生体分子の品質をさらに挙げることができ、特に、それが糖タンパク質である場合、生体分子の１つまたは複数のグリコシル化特徴が含まれる。典型的なグリコシル化特徴は、上に記載されている。
【００４２】
ある特定の実施形態では、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および／または細胞クローンをスクリーニングするための方法は、ステップ（ｆ）の後に以下のさらなるステップ（ｇ）を含む：
（ｇ）ステップ（ｆ）で選択された培養条件および／または細胞クローンを使用して、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養物を提供するステップ。
【００４３】
ある特定の実施形態では、ステップ（ｇ）で提供される大スケール灌流培養物のさらなる培養条件は、可能な場合、スクリーニングされない小スケール細胞培養物の培養条件と同様または同一である。大スケール灌流培養物と小スケール細胞培養物との間で同様または同一であり得る適切な培養条件には、特に、培養培地または特定の培養培地成分、温度、ｐＨ値、酸素濃度、細胞密度、培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力、ガス供給速度、灌流速度ならびに培養培地の浸透圧からなる群から選択されるものが含まれる。
【００４４】
ある特定の実施形態では、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および／または細胞クローンをスクリーニングするための方法は、以下のさらなるステップ（ｈ）を含む：
（ｈ）１種または複数の小スケール細胞培養物が、大スケール灌流培養に望ましい特性および／または特徴を有するか否かを決定するステップ。
【００４５】
ステップ（ｈ）は、特に、ステップ（ｅ）と（ｆ）との間に実施してもよい。ステップ（ｈ）で決定された特性および／または特徴は、ステップ（ｆ）に関して上に記載した特性および／または特徴のいずれか１つまたは複数であってもよい。特性および／または特徴を決定するための手段および方法は、当業者に公知である。
【００４６】
ステップ（ｂ）〜（ｅ）が１回または複数回、繰り返される実施形態では、ステップ（ｈ）もまた、各サイクルの間に実施されてもよい。あるいは、ステップ（ｈ）は、ある特定の回数のサイクルが行われた後に、１回または数回行われてもよい。
【００４７】
ある特定の実施形態では、大スケール灌流培養物は、少なくとも１ｌ、好ましくは少なくとも２ｌ、少なくとも５ｌまたは少なくとも１０ｌの容量を有する。具体的な実施形態では、大スケール灌流培養物は、少なくとも１０ｌまたは少なくとも１００ｌの容量を有する。これに関して、灌流は、特に、細胞培養物の培養培地の一部が、培養プロセス中に新鮮な培養培地に交換されることを意味する。したがって、灌流培養はバッチ培養と異なる。大スケール灌流培養における灌流は、任意の公知の手段によって実施することができ、特に濾過または遠心分離システムを使用して実施する。適切な濾過システムは中空繊維フィルターであり、とりわけ交互タンジェンシャルフロー（ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ；ＡＴＦ）システムで使用される。遠心分離システムの場合、特に連続遠心分離機を使用することができる。
【００４８】
具体的な実施形態では、小スケール細胞培養物は、大スケール灌流培養物の７．５％またはそれ未満の培養容量、特に、大スケール灌流培養物の５％もしくはそれ未満、２．５％もしくはそれ未満、１．５％もしくはそれ未満、またはさらに１％もしくはそれ未満の培養容量を有する。ある特定の実施形態では、小スケール細胞培養物は、大スケール灌流培養物の０．５％またはそれ未満、特に、０．２５％の培養容量を有する。
【００４９】
本明細書に記載の懸濁物中の細胞を培養するための方法の特色および実施形態はまた、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションするための方法ならびに懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および／または細胞クローンをスクリーニングするための方法にも、同様に適用される。
【００５０】
さらなる態様では、本発明は、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションするための小スケール細胞培養の使用であって、小スケール細胞培養が、
（ａ）大スケール灌流培養物の１０％またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）シミュレーションするべき大スケール灌流培養物の１つまたは複数の培養条件を使用して、小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ；
（ｃ）小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含んで操作される、使用を対象とする。
【００５１】
別の態様では、本発明は、懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および／または細胞クローンをスクリーニングするための小スケール細胞培養の使用であって、小スケール細胞培養が、
（ａ）大スケール灌流培養物の１０％またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ；
（ｃ）小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）小スケール細胞培養物中の細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含んで操作される、使用を提供する。
【００５２】
ある特定の実施形態では、２種以上の小スケール細胞培養物が使用され、個々の小スケール細胞培養物は、スクリーニングされる培養条件および／または細胞クローンが異なる。
【００５３】
本明細書に記載される方法の特色および実施形態はまた、小スケール細胞培養物の使用にも、同様に適用される。
【００５４】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という表現は、その文字通りの意味の他に、「〜から本質的になる」および「〜からなる」という表現を含み、具体的に指す。したがって、「含む」という表現は、具体的に列挙された要素を「含む」主題がさらなる要素を含まない実施形態、ならびに具体的に列挙された要素を「含む」主題がさらなる要素を包含してもよい、および／または確かに包含する実施形態を指す。同様に、「有する（ｈａｖｅ）」という表現は、「含む」という表現として理解されるべきであり、「〜から本質的になる」および「〜からなる」という表現もまた含み、具体的に指していると理解されるべきである。
【００５５】
本明細書に記載された数値範囲は、範囲を定義する数字を含んでいる。本明細書で提供される表題は、全体として本明細書を参照して読むことができる本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。一実施形態によれば、方法の場合には、ある特定のステップを含むものとして、または組成物の場合には、ある特定の成分を含むものとして本明細書に記載される主題は、それぞれのステップまたは成分からなる主題のことを指す。本明細書に記載される具体的な態様および実施形態を選択し、組み合わせることが好ましく、具体的な実施形態のそれぞれの組合せから生じる具体的な主題もまた、本開示に属する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
懸濁物中の細胞を培養するための方法であって、
（ａ）細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、前記細胞培養物が攪拌されるステップ；
（ｃ）前記細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）前記細胞培養物中の前記細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、前記細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を前記細胞培養物に添加するステップ
を含む方法。
（項目２）
懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養をシミュレーションするための方法であって、
（ａ）前記大スケール灌流培養物の１０％またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）シミュレーションするべき前記大スケール灌流培養物の１つまたは複数の培養条件を使用して前記細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、前記小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ；
（ｃ）前記小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）前記小スケール細胞培養物中の前記細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、前記小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を前記小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含む方法。
（項目３）
前記小スケール細胞培養物において細胞を培養するために使用される、シミュレーションするべき前記大スケール灌流培養物の前記１つまたは複数の培養条件が、培養培地、温度、ｐＨ値、酸素濃度、細胞密度、前記培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力、ガス供給速度、灌流速度ならびに前記培養培地の浸透圧からなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
懸濁物中の細胞の大スケール灌流培養のための培養条件および／または細胞クローンをスクリーニングするための方法であって、
（ａ）前記大スケール灌流培養物の１０％またはそれ未満の培養容量を有する小スケール細胞培養物を提供するステップ；
（ｂ）前記小スケール細胞培養物中の細胞を培養するステップであって、前記小スケール細胞培養物が攪拌されるステップ；
（ｃ）前記小スケール細胞培養物の撹拌を停止するステップ；
（ｄ）前記小スケール細胞培養物中の前記細胞の少なくとも部分的な沈降の後に、前記小スケール細胞培養物の培養培地の一部を除去するステップ；および
（ｅ）新鮮な培養培地を前記小スケール細胞培養物に添加するステップ
を含み、個々の前記小スケール細胞培養物は、スクリーニングするべき前記培養条件および／または前記細胞クローンが異なる、方法。
（項目５）
スクリーニングするべき前記培養条件が、培養培地、温度、ｐＨ値、酸素濃度、細胞密度、前記培養培地中の栄養素の添加時間および目標濃度を含む細胞栄養素の添加、培養時間、比動力入力、ガス供給速度、灌流速度ならびに前記培養培地の浸透圧からなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記培養条件および／または細胞クローンが、高い細胞生存率、高いおよび／または安定な細胞密度、前記細胞培養物中の前記細胞によって産生される目的の生体分子の高いおよび／または安定した収率、ならびに前記細胞培養物中の前記細胞によって産生される目的の生体分子の所望の特性を提供する前記スクリーニングにおいて選択される、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
前記大スケール灌流培養物が少なくとも１ｌの容量を有し、および／または前記小スケール細胞培養物が５０ｍｌもしくはそれ未満の容量を有する、項目２から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
ステップ（ｃ）における撹拌を停止した後、ステップ（ｄ）で前記培養培地の一部を除去する前に、前記細胞の沈降が少なくとも３５分間起きる、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
ステップ（ｃ）における撹拌を停止した後、ステップ（ｄ）で前記培養培地の一部を除去する前に、前記細胞の沈降が３０分またはそれ未満の間起き、ステップ（ｄ）で、前記細胞培養物中の前記細胞の一部もまた、細胞ブリーディングをもたらすために除去される、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
ステップ（ｄ）で前記培養培地の１５％〜５０％の間および３０％が除去され；ならびに／または前記培養培地がステップ（ｄ）で前記細胞培養物の上部から除去される、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ｅ）で添加される新鮮な培養培地の量は、ステップ（ｄ）で除去される培養培地の量と、本質的に同一である、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記培養培地中の前記ｐＨ値および／または前記酸素濃度が前記細胞の培養中に制御され、ステップ（ｃ）における前記細胞培養物の撹拌を停止する前に、前記ｐＨ値および／または前記酸素濃度の制御が少なくとも５分間停止される、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｂ）〜（ｅ）が１回または複数回、繰り返され、ステップ（ｅ）の後、次のサイクルのステップ（ｃ）で撹拌が停止する前に、少なくとも１時間、撹拌下で前記細胞が培養される、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
培養するべき前記細胞が、懸濁状態で成長する真核細胞、好ましくは骨髄性白血病起源の不死化ヒト細胞のような不死化ヒト血液細胞、またはＣＨＯ細胞である、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記細胞が、目的の生体分子、好ましくは糖タンパク質を組換えにより産生する、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１−１】図１は、沈降中（４０分まで）ならびに培養培地の交換および撹拌の再開後（４１分での値）での、骨髄性白血病起源（Ａ＋Ｂ）およびＣＨＯ細胞（Ｃ＋Ｄ）の不死化ヒト血液細胞の生存細胞濃度（Ａ＋Ｃ）および生存率（Ｂ＋Ｄ）を示す。
【図１−２】図１は、沈降中（４０分まで）ならびに培養培地の交換および撹拌の再開後（４１分での値）での、骨髄性白血病起源（Ａ＋Ｂ）およびＣＨＯ細胞（Ｃ＋Ｄ）の不死化ヒト血液細胞の生存細胞濃度（Ａ＋Ｃ）および生存率（Ｂ＋Ｄ）を示す。
【００５７】
【図２】図２は、連続的に撹拌されたおよび不連続的に撹拌された抗体産生クローンについて、生産性（Ａ）およびグルコース（Ｂ−Ｃ）／グルタミン（Ｄ−Ｅ）代謝に対する沈降の効果を示す。細胞は、１１時間、培養された。沈降した細胞（四角）については撹拌を停止したが、対照細胞（円）については停止しなかった（エラーバーはｓ．ｄ．、ｎ＝３である）。
【００５８】
【図３−１】図３は、ＩｇＧ抗体を組換えにより産生するクローン３（ＧＥＸ細胞株）の１２ｍＬの沈降に基づくａｍｂｒ培養（５試行）、１Ｌの灌流培養（７試行）および１０Ｌの単回使用のバイオリアクター培養の生存細胞濃度（Ａ）、生存率（Ｂ）および生成物グリコシル化（Ｃ）を示す。平均±ＳＥＭ（Ａ−Ｂ）および平均±ＳＤ（Ｃ）を示す。培養条件（ＤＯ、ｐＨ、温度、培地）は全てのスケールについて同等である。１０ｍＬの沈降に基づくａｍｂｒ培養および１Ｌ〜１０００Ｌの標準的な培養についての、様々なＩｇＧ抗体を産生する様々なクローンの生成物グリコシル化を（Ｄ）に示す。さらに、ＩｇＧ抗体を組換えにより産生するクローン４（ＧＥＸ細胞株）の、１２ｍＬの沈降に基づくａｍｂｒ培養（２試行）、ステンレススチールバイオリアクターにおける２００Ｌのｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ灌流培養および１０００Ｌの単回使用の灌流バイオリアクター培養の生存細胞濃度（Ｅ）および生存率（Ｆ）を示す。培養条件（ＤＯ、ｐＨ、温度、培地）は全てのスケールについて同等である。
【図３−２】図３は、ＩｇＧ抗体を組換えにより産生するクローン３（ＧＥＸ細胞株）の１２ｍＬの沈降に基づくａｍｂｒ培養（５試行）、１Ｌの灌流培養（７試行）および１０Ｌの単回使用のバイオリアクター培養の生存細胞濃度（Ａ）、生存率（Ｂ）および生成物グリコシル化（Ｃ）を示す。平均±ＳＥＭ（Ａ−Ｂ）および平均±ＳＤ（Ｃ）を示す。培養条件（ＤＯ、ｐＨ、温度、培地）は全てのスケールについて同等である。１０ｍＬの沈降に基づくａｍｂｒ培養および１Ｌ〜１０００Ｌの標準的な培養についての、様々なＩｇＧ抗体を産生する様々なクローンの生成物グリコシル化を（Ｄ）に示す。さらに、ＩｇＧ抗体を組換えにより産生するクローン４（ＧＥＸ細胞株）の、１２ｍＬの沈降に基づくａｍｂｒ培養（２試行）、ステンレススチールバイオリアクターにおける２００Ｌのｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ灌流培養および１０００Ｌの単回使用の灌流バイオリアクター培養の生存細胞濃度（Ｅ）および生存率（Ｆ）を示す。培養条件（ＤＯ、ｐＨ、温度、培地）は全てのスケールについて同等である。
【図３−３】図３は、ＩｇＧ抗体を組換えにより産生するクローン３（ＧＥＸ細胞株）の１２ｍＬの沈降に基づくａｍｂｒ培養（５試行）、１Ｌの灌流培養（７試行）および１０Ｌの単回使用のバイオリアクター培養の生存細胞濃度（Ａ）、生存率（Ｂ）および生成物グリコシル化（Ｃ）を示す。平均±ＳＥＭ（Ａ−Ｂ）および平均±ＳＤ（Ｃ）を示す。培養条件（ＤＯ、ｐＨ、温度、培地）は全てのスケールについて同等である。１０ｍＬの沈降に基づくａｍｂｒ培養および１Ｌ〜１０００Ｌの標準的な培養についての、様々なＩｇＧ抗体を産生する様々なクローンの生成物グリコシル化を（Ｄ）に示す。さらに、ＩｇＧ抗体を組換えにより産生するクローン４（ＧＥＸ細胞株）の、１２ｍＬの沈降に基づくａｍｂｒ培養（２試行）、ステンレススチールバイオリアクターにおける２００Ｌのｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ灌流培養および１０００Ｌの単回使用の灌流バイオリアクター培養の生存細胞濃度（Ｅ）および生存率（Ｆ）を示す。培養条件（ＤＯ、ｐＨ、温度、培地）は全てのスケールについて同等である。
【００５９】
【図４】図４は、バッチモードにおける１２ｍＬスケールのａｍｂｒ培養（白色）、灌流モードにおける小スケールａｍｂｒ培養（赤色）、および１Ｌスケールの培養（灰色、黒色）のについての、クローン１（Ａ）およびクローン２（Ｂ）によって生産されたＩｇＧ抗体のフコシル化の程度を示す。
【００６０】
【図５】図５は、ａｍｂｒシステムにおける沈降に基づく灌流を適用するＣＨＯ細胞培養物の細胞濃度（Ａ）および生存率（Ｂ）を示す。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）マイクロバイオリアクターシステムにおける培養
マイクロバイオリアクター培養は、ａｍｂｒ（商標）（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｉｒｃｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）システム（ＴＡＰ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）において実施する。ａｍｂｒシステムは、２４ウェイまたは４８ウェイとして利用可能である。この作業においては、各々１２個の容器を収容する２つの培養ステーションからなる２４ウェイのみを使用する。各容器は、直径１１ｍｍのピッチブレードインペラーを備えている。ｐＨおよびＤＯは、９０秒ごとに各容器の底の光スポットによって測定する。各容器には、窒素（または空気）、酸素（ＤＯを維持するため）、二酸化炭素（ｐＨを減少させるため）、またはこれらのガスの混合物を個別に供給する。容器は事前に滅菌され、スパージャー（ｓｐａｒｇｅ  ｔｕｂｅ）付き、またはスパージャーなしで利用可能である。ヒト骨髄性白血病由来細胞（ＧＥＸ細胞）の培養においては、散布なし容器を使用する。ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞は、用途に応じて、スパージャー付き、またはスパージャーなしで培養する。各培養ステーション（１２個の容器のセット）について、培養温度および撹拌速度を設定する。全ての細胞株は３７℃で培養する。ＤＯ濃度に応じて、ＧＥＸ細胞は８３０ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍまでで、ＣＨＯ細胞は８３０〜１３００ｒｐｍの間で撹拌する。０．５ＭのＮａＯＨの添加（ｐＨ  ６．９より下で誘発される）およびＣＯ２の供給（ｐＨ  ７．３より上で誘発される）によって、ｐＨを維持する。培地のサンプリングおよび添加ならびにフィードは、最大容量１ｍＬまたは５ｍＬの単回使用チップを使用するプログラム可能な液体ハンドラーによって実施する。各容器の作業容量は１２ｍＬ（最小１０ｍＬ、最大１５ｍＬ）である。細胞濃度および代謝物測定のための試料は、毎日（細胞密度に応じて２５０と〜４５０μＬの間、）採取する。ｐＨは、３〜４日ごとにオフライン測定によって較正した。無菌操作を確認するために、システム全体を生物学的安全キャビネット下に位置させる。ＧＥＸ細胞については２×１０５細胞／ｍＬ、またはＣＨＯ細胞については３×１０５細胞／ｍＬで、容器に播種する。生存率が６５％を下回るまで落ち込んだ時に、培養を終了した。必要な際は、散布された容器に対して消泡剤を供給する。
（実施例２）マイクロバイオリアクターシステムにおける灌流
【００６２】
灌流モードについては、上に記載のように細胞を播種する。灌流は、１２ｍＬで、グルコース濃度が２．５ｇ／Ｌを下回るまで落ち込んだ時に（通常７２〜１２０時間後）に開始する。細胞の保持は沈降によって確認される。細胞を沈殿させるために、培養ステーション全体で撹拌を停止する。撹拌停止の１０分前に、ＮａＯＨでのｐＨ制御を停止し、撹拌停止直前の塩基の添加を防止する。ＤＯ制御は、撹拌と同時に停止する。３０〜４５分間、好ましくは４０分間、細胞を沈殿させる。この時間の後、３ｍＬの回収物を液体の上部から液体ハンドラーにより除去し、２４深のウェルプレート上に置く。ａｍｂｒシステムの試料の深さは、培養液体の上部から回収物が採取されることを確認するように変更する（標準試料の深さは、容器の底の近くで試料を採取するように設定する）。回収物の除去は、各容器について複数のピペッティング操作によって行う。回収物の除去後、撹拌を続け、液体ハンドラーによって深ウェルプレートに供給された新鮮な培地を添加することにより、培養液の容量を１２ｍＬに回復させる。培地の添加後、ＤＯおよびｐＨ制御を続ける。全てのステップは、システムによって自律的に実行される（ユーザー相互作用なし）。全てのステップはまとめて約１時間、持続する。１ステップ当たり３ｍＬ（作業容量の２５％）を交換する。１つのリアクターの容量の灌流速度（Ｖｒ／ｄ）については、１日に４つのステップが必要である。ユーザー相互作用は、日々のサンプリング、単回使用チップのリロード、回収物の除去、およびフィード培地の補充に限られる。
【表１】
0006737813.tif 000002
【００６３】
（実施例３）沈殿時間の決定
【００６４】
以下の実施例は、骨髄性白血病起源の不死化ヒト血液細胞またはＣＨＯ細胞を用いて実施する。細胞の産生および生成物の品質の分析のために、細胞にトランスフェクトして、グリコシル化抗体を組換えにより産生した。
【００６５】
最適な沈殿時間を決定するために、撹拌を停止し、沈殿の前、撹拌停止後１０、１５、２０、２５、３０、３５および４０分後、ならびに撹拌の継続および新鮮な培地の添加直後に、細胞数を計測する。
【００６６】
分離効率（ＳＥ）は、一般に、灌流培養における細胞保持の性能を表現するために使用され、以下のように計算される（ｃリアクターは、バイオリアクター中の培養培地における細胞の濃度であり、ｃ回収物は、沈殿時間の後にバイオリアクターから除去された培養培地における細胞の濃度である）：
【数１】
0006737813.tif 000003
【００６７】
両方の細胞株について、約１×１０７細胞／ｍＬの初期細胞密度で４０分間の沈降時間は、９５％超の分離効率を達成するのに十分であり、ほぼ無細胞の回収物を意味する。９０％を下回る分離効率でさえ満足であり、自動細胞ブリーディングを含むことが、時には好ましい。ブリーディングの程度は、沈殿時間（より短い沈殿時間＝より高いブリーディング率）によって調整することができる。撹拌の継続の後、細胞密度は、開始時細胞密度まで回復し、灌流ステップが細胞を失うことなく作動可能であることを示す（図１Ａを参照のこと）。さらに、細胞生存率も沈降ステップによって影響されない（図１Ｂを参照のこと）。
【００６８】
生産性および主要代謝物における沈降の効果をさらに調査するために、１ｍｌ当たり１×１０７細胞の典型的なプロセス細胞密度でａｍｂｒ試行を開始した。対照培養は連続的に撹拌した一方で、沈降した容器は、１１０分間以内に４０分間の撹拌に対して４回の中断とともに不連続的に混合した。両方の細胞培養セットアップにおいて、培地は交換しなかった。
【００６９】
図２Ｂ、ＣおよびＥに見られるように、グルコース、グルタミンおよびグルタミン酸レベルは、培養条件ならびに生存細胞濃度および生存率（データは示されていない）の間で差異はない。力価および乳酸レベルについては、差異を観察することができる。規則的に沈降させた細胞は、連続的に撹拌した細胞よりも高い乳酸レベルを示す。沈降を開始するために撹拌およびガス補給が停止されると、酸素移動は急速に減少し、低酸素状態に至る。この効果は、よく混合された条件下よりも局所的な細胞濃度がはるかに高い、容器の底に蓄積した細胞にとってさらに強烈である。低酸素状態下では、細胞は、がん起源の哺乳動物細胞は、グルコースの乳酸への変換を意味する嫌気性エネルギー産生に、より依存する。ＣＨＯ細胞中の低酸素状態はまた、図２Ａにおいて示されるＩｇＧ蓄積の減少と一致しているタンパク質生産性を低下させることが示されている。ここで、特異的ｍＡｂ産生速度は、１４．７±０．２μｇ／ｍＬ  ｈから１２．１  ７±０．１μｇ／ｍＬ  ｈまで減少する。
（実施例４）：細胞成長と生成物品質の比較
【００７０】
細胞成長および生成物品質を、上の実施例１および２に記載されるようなマイクロバイオリアクターａｍｂｒシステムと、灌流バイオリアクターにおける１Ｌの培養液との間で比較した。
【００７１】
１Ｌ培養液に、２．０ｘ１０５細胞／ｍＬを播種した。グルコースが２．５ｇ／Ｌを下回って落ち込むと（通常は４〜５日目）、０．５Ｖ／ｄの灌流速度で培地をフィードすることにより連続操作が可能になった。グルコース濃度が２．５ｇ／Ｌを下回ったままの時に、少なくとも１日おきに灌流を増加させた。最大灌流速度は、１日に２リアクター容量であった。０．５Ｍ  ＮａＯＨの添加またはＣＯ２の吹き込みによって、ｐＨを制御した。生存率が６５％を下回って落ち込んだとき、または意図された試行時間に達したときに、培養を終了させた。実験室１Ｌスケールの培養は、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｂ−ＤＣＵ  ２ｌ中で実行した。溶存酸素およびｐＨは、標準電極（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｒｌｅｄｏ  ＩｎＰｒｏ  ６８００およびＭｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｒｌｅｄｏ  ４０５−ＤＰＡＳ−ＳＣ−Ｋ８Ｓ、それぞれＭｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｒｌｅｄｏ、スイス）によって測定する。かき混ぜは、３枚刃セグメントのインペラーによって行う。灌流は、ＡＴＦ２モジュールまたはＣｅｎｔｒｉｔｅｃｈ遠心分離機のいずれかを使用して行う。ＡＴＦ２モジュールは、６０ｃｍのＰＥＳ膜（０．２μｍの孔径および０．１５ｍ２の膜面積、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、米国）を有する。ＡＴＦ２モジュール内のデッドボリュームのために、１００〜１５０ｍＬの細胞懸濁物のブリーディングとともに膜交換を行う。断続的に動作する間欠モードでは、スタンドアロンの連続遠心機Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  Ｌａｂ  ＩＩまたはＬａｂ  ＩＩＩ（Ｌａｂ  ＩＩの後継機）（Ｂｅｒｒｙ  Ｗｅｈｒｍｉｌｌｅｒ、含気性スケール）を使用する。これは小スケール容量に推奨される。サイクル間の待機時間は、灌流速度を制御するように調整する。各ランニングサイクルの終わりに、全てのチューブを上清でフラッシュすることにより、残りの細胞をバイオリアクター内にバックフラッシュさせる。
【００７２】
灌流バイオリアクターにおける１Ｌまたは１０Ｌ培養液およびａｍｂｒシステムにおける小スケール培養の増殖プロファイルは、よく似ている。培養物は同じ最大細胞密度に達する。１Ｌの灌流培養物の生存率は、小スケールａｍｂｒシステムまたは１０Ｌの大スケール培養物における沈降に基づく灌流よりも少し低いが、同等である。生成物グリコシル化のパターンは、小スケールａｍｂｒ培養液と１０００Ｌ（プロセス制御において非関連性の変更を施した様々な試行から得た平均値）の容量までの大スケール培養物との間で、よく似ている（図３を参照のこと）。さらなる品質性状を表２に列挙する。
【００７３】
【表２】
0006737813.tif 000004
【００７４】
図４は、灌流モードにおける小スケールａｍｂｒシステムが、バッチモードにおけるａｍｂｒシステムよりも、より大スケールの培養の経過中のグリコシル化パターンの変化を予測するのにはるかに良く適していることを示している。とりわけ、初期回収物（灌流４日目）と後期回収物（灌流２５日目）とを比較した場合、クローンＰ７４１−Ｅ５は、時間とともにフコシル化の上昇を示している（Ｂの灰色のバー）。フコシル化の上昇は、ａｍｂｒ灌流においてもまた観察されたが、バッチモードにおいては観察されなかった。クローンＰ９１５−Ｄ３は、バッチモードにおいて高いフコシル化を示すが、ａｍｂｒおよび１Ｌスケールの灌流においては低いフコシル化を示す。
【００７５】
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞は、小スケールａｍｂｒシステム中の沈降に基づく灌流において、ガス供給（吹き込みまたは非吹き込み）とは独立して、３．５×１０７細胞／ｍＬまで良好で一貫した成長を示す。２１日間の培養の全体を通して、高い生存率を維持している（９０％超）（図５を参照のこと）。
【００７６】
ＣＨＯ  ＤＧ４４由来の細胞を使用した、１Ｌおよび１２ｍＬスケールで産生されたモノクローナル抗体のグリコシル化は、よく似ている。ａｍｂｒに基づく灌流のためのガラクトシル化は、１０日目の回収物については、わずかに減少している。
【００７７】
【表３】
0006737813.tif 000005
（実施例５）実験のデザイン（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ＤｏＥ）研究
【００７８】
ここで開発したシステムの利点をさらに証明するために、ＤｏＥ研究を実施した。ＤｏＥ因子として、０．５％〜１．５％の濃度範囲における化学シャペロンの添加（ＣＣ５）、標準濃度の０．５〜１．５倍のＧｌｙｃｏＭｉｘの補填、およびプロセスｐＨ（６．８〜７，２）を使用する。４つの中心点を有するＣＣＦ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｆａｃｅ；中央複合面）デザインと１４のデザイン試行が選択される。１回の試行当たり、平均生存率、積分生存細胞密度（ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ；ＩＶＣＤ）および総生成物を応答として使用する。モデルフィットの要約を表４に示す。
【表４】
0006737813.tif 000006
【００７９】
全ての応答についてのＲ２値は高く、１に近く、良好なモデルフィットを示す。将来の予測精度Ｑ２もまた、３つの全ての応答について０．８付近で高い。良好なモデルは、０．５より大きいＱ２値を示す。妥当性（０．２５を超えるべきである）および再現性（０．５を超えるべきである）は、同様に許容範囲である。
寄託された生物学的材料の同定
【００８０】
細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６０６およびＤＳＭ  ＡＣＣ  ２６０５は、２００３年８月１４日に、Ｎｅｍｏｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０、１３１２５  ベルリン（ドイツ）によって、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ、３８１２４  ブラウンシュワイク（ドイツ）に寄託された。その間に、これらはＮｅｍｏｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧからＧｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨに譲渡されたため、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅはこれらの生物学的材料を照会する権利が与えられている。
【００８１】
細胞株ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８０６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８０７、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８５６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２８５８およびＤＳＭ  ＡＣＣ  ３０７８は、下記の表に示される日付に、Ｇｌｙｃｏｔｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｒｏｂｅｒｔ−Ｒｏｓｓｌｅ−Ｓｔｒ．１０、１３１２５  ベルリン（ドイツ）によって、ＤＳＭＺ  −  Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａｓｓｅ  ７Ｂ、３８１２４  ブラウンシュワイク（ドイツ）に寄託された。
【表５】
0006737813.tif 000007
【図１−１】
0006737813.tif 000008
【図１−２】
0006737813.tif 000009
【図２】
0006737813.tif 000010
【図３−１】
0006737813.tif 000011
【図３−２】
0006737813.tif 000012
【図３−３】
0006737813.tif 000013
【図４】
0006737813.tif 000014
【図５】
0006737813.tif 000015