(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記において一以上の突然変異を含む、突然変異のたばこ植物細胞であって、
（i）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列から成り、前記配列が配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を持つ、ポリヌクレオチド、
（ii）（i）に記載した前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または
（iii）クロライドチャネルの前記CLCファミリーの一つをコードする配列から成り、前記配列が配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を持つ、ポリペプチド、
ここで上記(i)から(iii)の一以上の突然変異が、配列番号5のG163に相当する位置の置換型突然変異を有し、
前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの発現または活性が、対照たばこ植物細胞を含む対照たばこ植物と比較して低減され、
前記突然変異のたばこ植物細胞を含む突然変異のたばこ植物中の硝酸塩レベルが、前記対照たばこ植物細胞を含む前記対照たばこ植物と比較して低減され、ならびに
前記突然変異のたばこ植物細胞を含む乾燥処理済みの突然変異のたばこ植物中のたばこ特異的ニトロソアミン（TSNA）レベルが、前記対照たばこ植物細胞を含む乾燥処理済みの対照たばこ植物と比較して低減されている、上記突然変異のたばこ植物細胞。
【請求項２】
請求項1に記載の突然変異のたばこ植物細胞を含む、突然変異のたばこ植物またはその構成要素。
【請求項３】
突然変異のたばこ植物またはその構成要素の少なくとも硝酸塩の含有量と合計たばこ特異的ニトロソアミン（TSNA）含有量を低減することにより、前記たばこ植物またはその構成要素を製造する方法であって、
（a）たばこ植物のゲノム内に、クロライドチャネルのCLCファミリーの一つの少なくとも一つの対立遺伝子内で一以上の突然変異を導入することにより、以下の(i)、(ii)または(iii)の発現または活性を低減する工程、
（i）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列から成り、前記配列が、少なくとも配列番号1に対して少なくとも90%の配列同一性を持つ、ポリヌクレオチド、
（ii）（i）に記載した前記ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または
（iii）クロライドチャネルの前記CLCファミリーの一つをコードする配列から成り、前記配列が、配列番号5に対して少なくとも90%の配列同一性を持つ、ポリペプチド、
ここで、上記(i)から(iii)の一以上の突然変異が、配列番号5のG163に相当する位置の置換型突然変異を有し、
（b）任意に行ってもよい工程であって、工程（a）で入手した前記突然変異のたばこ植物の少なくとも一部中の少なくとも前記硝酸塩の含有量を測定する工程と、
（c）前記突然変異によって工程（a）に記載した前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの発現または活性を低減することにより、工程（a）に記載した前記ポリヌクレオチドまたは前記ポリペプチドの発現または活性が調節されていない対照たばこ植物と比較して、それに含まれる少なくとも前記硝酸塩の含有量が低減した、突然変異のたばこ植物を特定する工程とを含む、方法。
【請求項４】
4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)含有量および/またはニコチン含有量が前記突然変異のたばこ植物中で調節され、および/または
少なくともN-ニトロソニコチン(NNN)含有量が、前記対照たばこ植物の含有量と実質的に等しい、
請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記突然変異のたばこ植物の構成要素が葉であり、適切には乾燥処理済みの葉である、請求項3または請求項4に記載の方法。
【請求項６】
請求項3〜5のうちいずれか1項に記載した方法によって入手されるか入手可能な、突然変異のたばこ植物またはその構成要素。
【請求項７】
前記NNK含有量が約110 ng/g以下であり、さらに、前記硝酸塩含有量が約7 mg/g以下であってもよい、請求項2又は6に記載の突然変異のたばこ植物。
【請求項８】
請求項2、6または7のうちいずれか1項に記載の突然変異のたばこ植物に由来するバイオマス、種子、幹または葉を含む、たばこ植物材料。
【請求項９】
請求項1に記載の突然変異のたばこ植物細胞、請求項2、6または7のうちいずれか1項に記載の突然変異のたばこ植物の少なくとも一部、または請求項8に記載のたばこ植物材料を含む、たばこ製品。
【請求項１０】
少なくともNNKレベルが減少した、乾燥処理済みたばこ植物材料（好ましくは乾燥処理済みの葉）を製造するための方法であって、その方法が、
（a）請求項2、6または7のいずれか1項に記載の突然変異のたばこ植物の少なくとも一部か、または請求項8に記載のたばこ植物材料を提供する工程と、
（b）任意に行ってもよい、前記たばこ植物材料を収穫する工程と、
（c）少なくとも前記NNKレベルが減少するのに十分な時間、前記たばこ植物材料を乾燥処理する工程とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たばこ属Nicotianaおよび変異体、相同体、断片およびその突然変異体に由来するクロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする遺伝子の新規ポリヌクレオチド配列を開示する。ポリペプチド配列および変異体、相同体、断片およびその突然変異体も開示されている。これらの遺伝子のうち一つ以上の発現や、それによってコードされ植物体中またはその構成部分中のたばこ特異的ニトロソアミン（TSNA）のレベルを調節するタンパク質の活性の修飾についても、開示されている。
【背景技術】
【０００２】
たばこ特異的ニトロソアミン（TSNA）は主に、たばこ葉の乾燥処理および加工時に形成される。たばこの乾燥処理は、各品種のたばこの芳香および風味を引き出す物理的および生化学的な変化の工程である。乾燥処理済みたばこ葉中のTSNAの量は、植物体細胞が死滅する間に蓄積される亜硝酸塩の蓄積に依存し、また嫌気性（酸素欠乏）環境に進む条件下での硝酸塩の低減による乾燥処理中に形成されると考えられている。硝酸塩から亜硝酸塩への還元は、嫌気性条件下での葉の表面でのバクテリアの作用によって発生すると考えられており、この還元は、ある一定の条件下で特に顕著である。亜硝酸塩が形成されると、これらの化合物は、様々なたばこアルカロイド（ピリジン含有化合物など）と結合してニトロソアミンを形成すると考えられる。
【０００３】
4つの主要TSNA、すなわち、一般に最高濃度で存在しているのは、N-ニトロソニコチン(NNN)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)およびN-ニトロソアナタビン(NAT)である。副次的な化合物、すなわち、一般に主要TSNAよりも著しく低いレベルであるものには、4-(メチルニトロソアミノ)4-(3-ピリジル)ブタナール(NNA)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノール(NNAL)、4-(メチルニトロソアミノ)4-(3-ピリジル)-1-ブタノール(イソ-NNAL)、および4-(メチルニトロソアミノ)-4-(3-ピリジル)-1-酪酸(イソ-NNAC)がある。少なくともNNNおよびNNKは、実験室での研究で動物に適用するときに発癌性であることが報告されてきた。
【０００４】
TSNAに対するアルカロイドのニトロソ化の原因である化合物の濃度を低くすることで、結果的に乾燥処理済みの葉中のTSNAレベルを低下させることができる。たばこ葉中の主なニトロソ化物質は亜硝酸塩（NO2-）であり、これは恐らくは乾燥処理時にバクテリアによって触媒作用を受ける酵素性反応による遊離硝酸塩（NO3-）の還元によるものである。バーレー種植物体での硝酸塩レベルを変化させる肥料の研究の結果、乾燥処理済みの葉および煙で異なるTSNAレベルが得られた。硝酸塩は、土壌中から得られる主な窒素供給源である。植物体では、硝酸塩は根の上皮細胞によって吸収され、植物体全体に運ばれてまず亜硝酸塩に還元され、これがさらにアンモニアに還元された後でアミノ酸に同化される。残念ながら、バーレーの成長中に窒素が制限される結果、低い生物量収量や植物体の成熟の遅れといった好ましくない農学的表現型を招くため、TSNAレベルの低減に対する商業的に実現可能なアプローチではない。たばこ葉中の硝酸塩の蓄積を操作する試みは大きな問題である。
【０００５】
WO98/58555号には、TSNAを低減する目的でマイクロウェーブ加熱することによる、たばこ葉の処理を記載している。US 5,810,020号には、たばこ材料とトラッピングシンクとを接触させることによりたばこからTSNAを除去する工程の記載があるが、ここでトラッピングシンクは、たやすくニトロソ化して運動学的または熱力学的な妨げがわずかしかないニトロシル錯体を形成する、厳選した遷移金属錯体を含む。US 6,202,649号には、数ある中でも、たばこ葉の付近での嫌気性条件を実質的に阻止する十分な気流のある管理された環境内でたばこを乾燥処理することにより、実質的にTSNAの生成を阻止する方法を記載している。管理された環境は、気流、湿度、および温度など、一つ以上の乾燥処理パラメータを管理することにより提供される。ただし、これらのような方法は、たばこの製造にかなりの費用および時間を追加しかねず、従ってたばこ産業によって受け入れられる可能性は低い。それゆえ、TSNAを低減するための効果的かつ比較的安価な方法に対するニーズが残っている。
【０００６】
植物体中のTSNAレベルを低減するための分子ベースの方法は、TSNAレベルの低減を達成するために、高価でしばしば複雑な方法を必要としないため非常に望ましい。こうした一つの分子ベースの方法が、WO2011/088180号に開示されている。たばこ植物体の根内でのニコチンからノルニコチンへの代謝性変換に関与する根特異的ニコチンデメチラーゼポリペプチドの発現または機能を阻害するための組成および方法が開示されている。CYP82E10ニコチンデメチラーゼ遺伝子の遺伝子配列が開示されている。この遺伝子の発現が低減されると、乾燥処理済みたばこ葉中でのNNNレベルが低減されることが分かっている。NNNレベルの低減が得られうる一方で、発癌性が報告されてきた複数のTSNAが依然として変性植物体中に残存することになる。その他のニコチンデメチラーゼ遺伝子は、ニコチンからノルニコチンへの変換に関与するCYP82E4およびCYP82E5を含み、WO2006091194号、WO2008070274号およびWO2009064771号に記載がある。
【０００７】
当該技術分野では、乾燥処理済みたばこ葉中のTSNAレベルを低減するための分子ベースの方法を開発することに対する継続的必要性がある。本発明は、このニーズに対処することを探究するものである。
【発明の概要】
【０００８】
発明者らは、たばこ属（Nicotiana）に属する植物体から、クロライドチャネルの様々なCLCファミリーをコードする新規の遺伝子をクローン化し、CLC-Nt2およびNtCLCeとして表示した。2つの祖先、N. tomentosiformisおよびN. sylvestrisを起源とする直系遺伝子の2つのコピーが、Nicotiana tabacum内に存在し、本明細書ではこれらをそれぞれCLC-Nt2-tおよびCLC-Nt2-sまたはNtCLCe-tおよびNtCLCe-sと表示している。これらの遺伝子のポリヌクレオチド配列は配列番号1〜4、10および11に規定され、またこれらの遺伝子のポリペプチド配列は、配列番号5〜7および12〜14に規定されている。たばこ植物体中でのこれらの遺伝子の発現を低減させることにより、植物体中の硝酸塩レベルの低減がみられる。特に、緑葉中の硝酸塩レベルの低減がみられる。葉の乾燥処理後の合計TSNA含有量は、これらの植物体中で減少する。これは、硝酸塩のレベルが低下すると乾燥処理済み植物材料（乾燥処理済みの葉など）中のTSNAレベルが低下する原因となりうることを示唆している。発明者は予想外にも、NtCLCe-RNAiおよびCLC-Nt2-RNAiの両方の植物体に由来する乾燥処理済み植物材料中で少なくともNNKの低下がみられることを見出した。合計TSNA含有量の低減も観察された。従って、NtCLCeおよび/またはCLC-Nt2の発現を低減させることは、たばこ葉中の硝酸塩レベルの低下に貢献する。乾燥処理の後、少なくともNNKおよび随意にその他のTSNA（これらはNNNまたはNABまたはNATまたはその二つ以上の組み合わせを含みうる）を低減させることができる。さらに、植物体の視覚的外観は実質的に変化しないが、これは、産業から受け入れられるため、ならびに植物体の収量およびこれに類するものを最大化するために、重要な基準である。さらに、バイオマスレベルは実質的に変化しないが、これは、産業から受け入れられるため、ならびに植物体の収量およびこれに類するものを最大化するために、重要な基準である。従って、本発明は、少なくともNNKを含めた植物体中の硝酸塩レベルまたは合計TSNAの調節（例えば、増大または減少）に特に有用でありうる。特に、本発明は、TSNAレベルを低下できるその他の方法と組み合わせたときに、特に有用である。こうして、ある一定の実施形態で、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドの発現を、たばこ植物体中の一つ以上のニコチンデメチラーゼ遺伝子の発現の低減と併せて低減することが望ましいと考えられる。この組み合わせは、乾燥処理済み植物材料中の少なくともNNKおよびNNNのレベルを低下させることが期待されるが、これは、実験室での研究で動物に適用したときにNNKおよびNNNはどちらも発癌性が報告されているため、非常に望ましい。本明細書で説明したたばこ植物体に由来するたばこ製品は、これらのたばこ製品の発癌可能性を低減する方法、および発癌性ニトロソアミンへのヒトの暴露を低減する方法における用途が見出されうる。植物体中の硝酸塩含有量を調節できる本明細書で説明したポリペプチド配列の突然変異体についても、説明している。
【０００９】
〔発明の態様および実施形態〕
本発明の態様および実施形態は、付属されている請求の範囲に記載している。
【００１０】
最初の一つの態様では、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体細胞が提供されているが、これは、 （i）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリヌクレオチドか、（ii）（i）に記載したポリヌクレオチドによりコードしたポリペプチドか、（iii）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリペプチドか、または(iv)（i）に記載した単離ポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターを含み、ここでポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性が対照植物体細胞を含む対照植物体と比較して調節され、また突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体細胞を含む突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体中の硝酸塩レベルが、対照植物体細胞を含む対照植物体と比較して調節される。たばこ植物体中の一つ以上の遺伝子の発現を低減することにより、硝酸塩レベルを低減できる。合計TSNA含有量および/またはNNKレベルは、乾燥処理済み植物材料中で低減できる。
【００１１】
一つの実施形態で、前記突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体細胞は、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体細胞を含む、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体中の硝酸塩のレベルを、対照植物体細胞を含む対照植物体と比較して低減させる、開示されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド中に一つ以上の突然変異を含む。突然変異は、配列番号5の位置G163での置換型突然変異を含むことができる。
【００１２】
一つの実施形態で、前記突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体細胞は、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体細胞を含む、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体中の硝酸塩のレベルを、対照植物体細胞を含む対照植物体と比較して増大させる開示されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド中に一つ以上の突然変異を含む。突然変異は、配列番号13の位置P143での置換型突然変異を含むことができる。
【００１３】
さらなる態様で、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体または本明細書で説明した植物体細胞を含むその構成要素が説明されている。
【００１４】
さらなる態様で、植物体またはその構成要素の少なくとも硝酸塩（例えば、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)）の含有量を調節する方法が説明されており、この方法は、 (a)（i）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリヌクレオチドか、（ii）（i）に記載したポリヌクレオチドによりコードしたポリペプチドか、または（iii）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリペプチドかの発現または活性を調節する工程と、（b）工程（a）によって獲得された突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の少なくとも一部の少なくとも硝酸塩（例えば、NNK）の含有量を測定する工程と、（c）（a）に記載されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性が調節されていない対照植物体と比較して、その中の少なくとも硝酸塩（例えば、NNK）の含有量が変化した、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体を識別する工程とを含む。
【００１５】
さらなる態様で、植物体またはその構成要素の少なくとも硝酸塩（例えば、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)）の含有量を調節するための方法が説明されており、その方法は、 (a)（i）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号1または配列番号2または配列番号3または配列番号10または配列番号11に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリヌクレオチドか、（ii）（i）に記載したポリヌクレオチドによりコードしたポリペプチドか、または（iii）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号5または配列番号6または配列番号7または配列番号12または配列番号13または配列番号14に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリペプチドかの発現または活性を調節する工程と、（b）工程（a）によって獲得された突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の少なくとも一部の少なくとも硝酸塩（例えば、NNK）の含有量を測定する工程と、（c）（a）に記載されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性が調節されていない対照植物体と比較して、その中の少なくとも硝酸塩（例えば、NNK）の含有量が変化した、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体を識別する工程とを含む。
【００１６】
硝酸塩（例えば、NNK）の含有量および/または合計TSNA含有量および/またはニコチン含有量は、植物体（乾燥処理済み植物材料など）中で調節されることが適切である。
【００１７】
NNN含有量は実質的に対照植物体と同一であることが適切である。
【００１８】
植物体の構成要素は葉であることが適切であり、乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこであることが適切である。
【００１９】
さらなる態様で、本明細書に記載した方法により獲得されたかまたは獲得可能な植物体またはその構成要素が説明されている。
【００２０】
さらなる態様で、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体が説明されており、ここでNNK含有量は約110 ng/g以下で、また随意に、硝酸塩含有量は約7 mg/g以下である。植物体は乾燥処理済み植物材料の形態であることが適切である。
【００２１】
さらなる態様で、突然変異体である植物体が説明されており、ここで硝酸塩含有量は約6mg/g以下で、ニコチン含有量は約13 mg/g以下である。
【００２２】
（i）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリヌクレオチドか、（ii）（i）に記載したポリヌクレオチドによりコードしたポリペプチドか、または（iii）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリペプチドかの発現が、対照植物体と比較して調節されることが適切である。
【００２３】
さらなる態様で、本明細書で説明した植物体に由来するバイオマス、種子、幹または葉を含む植物材料が説明されている。
【００２４】
さらなる態様で、本明細書で説明されている植物体細胞、少なくとも植物体の一部または植物材料を含むたばこ製品が説明されている。
【００２５】
さらなる態様で、その中のNNKレベルが低減された乾燥処理済み植物材料（葉など）を製造する方法が説明されているが、その方法は、 （a）本明細書で説明した少なくとも植物体の一部または植物材料を提供する工程と、（b）随意に、植物体から植物材料を収穫する工程と、（c）少なくともNNKレベルが低減されるのに十分な期間、植物材料を乾燥処理する工程とを含む。
【００２６】
さらなる態様で、クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号1に対して少なくとも99.1%の配列同一性または配列番号2に対して少なくとも97.1%の配列同一性または配列番号3に対して少なくとも63%の配列同一性または配列番号4に対して少なくとも61%の配列同一性または配列番号10に対して少なくとも60%の配列同一性または配列番号11に対して少なくとも60%の配列同一性を持つ、単離ポリヌクレオチドが説明されている。
【００２７】
さらなる態様で、本明細書で説明したポリヌクレオチドによりコードされた単離ポリペプチドが説明されている。
【００２８】
さらなる態様で、クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号5に対して少なくとも99.1%の配列同一性または配列番号6に対して少なくとも98.1%の配列同一性または配列番号7に対して少なくとも60%の配列同一性または配列番号12に対して少なくとも60%の配列同一性または配列番号13に対して少なくとも60%の配列同一性または配列番号14に対して少なくとも60%の配列同一性を持つ、単離ポリペプチドが説明されている。
【００２９】
さらなる態様で、一つ以上の単離した本明細書で説明したポリヌクレオチドを含む構築物、ベクターまたは発現ベクターが説明されている。
【００３０】
さらなる態様で、（i）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリヌクレオチドか、（ii）（i）に記載したポリヌクレオチドによりコードしたポリペプチドか、（iii）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリペプチドかのいずれかに一つ以上の突然変異を含み、ここで前記さらに一つの突然変異が、対照植物体細胞を含む対照植物体と比較してポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性を調節し、また突然変異体である植物体細胞を含む突然変異体である植物体中の硝酸塩レベルが対照植物体と比較して調節される、突然変異体である植物体細胞が説明されている。
【００３１】
さらなる態様で、（i）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリヌクレオチドか、（ii）（i）に記載したポリヌクレオチドによりコードしたポリペプチドか、（iii）クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードする配列を含むか、それから成るか、またはそれから本質的に成り、配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリペプチドかのいずれかに一つ以上の突然変異を含み、ここで前記さらに一つの突然変異が、対照植物体細胞を含む対照植物体と比較してポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性を調節し、また突然変異体である植物体細胞を含む突然変異体である植物体中の硝酸塩レベルが対照植物体と比較して調節される、突然変異体である植物体細胞が説明されている。
【００３２】
さらなる態様で、たばこ製品の発癌可能性を低減する方法が提供されており、前記方法は、本明細書で説明されているたばこ植物体、または植物体の部分またはその子孫に由来する前記たばこ製品を準備する工程を含む。
【００３３】
さらなる態様で、対照植物体に対して硝酸塩および/またはNNKおよび/または合計TSNAのレベルが調節されている植物体を製造する方法における、本明細書で説明されている構築物の用途を説明している。
【００３４】
さらなる態様で、植物体中の硝酸塩および/またはNNKおよび/または合計TSNAのレベルを対照植物体に対して調節する目的での、本明細書で説明されているポリヌクレオチドまたはポリペプチドの用途が説明されている。
【００３５】
さらなる態様で、突然変異体である植物体細胞を含む突然変異体である植物体中の硝酸塩レベルを対照植物体細胞を含む対照植物体と比較して低下させる一つ以上の突然変異を含む突然変異体である植物体細胞が説明されているが、ここで前記突然変異は、配列番号5の位置G163での置換型突然変異を含む。
【００３６】
さらなる態様で、突然変異体である植物体細胞を含む突然変異体である植物体中の硝酸塩レベルを対照植物体細胞を含む対照植物体と比較して低下させる一つ以上の突然変異を含む突然変異体である植物体細胞が説明されているが、ここで前記突然変異は、配列番号13の位置P143での置換型突然変異を含む。
【００３７】
さらなる態様で、配列番号5で規定され、置換型突然変異が位置G163（G163Rが適切）である配列を含むか、またはそれにより構成されるポリペプチド配列が開示されている。
【００３８】
さらなる態様で、配列番号13で規定され、置換型突然変異が位置P143（P143Lが適切）である配列を含むか、またはそれにより構成されるポリペプチド配列が開示されている。
【００３９】
さらなる態様で、本明細書で説明した突然変異体ポリペプチドが開示されている。
【００４０】
上記のそれぞれの実施形態は、本発明のそれぞれの態様の実施形態として開示されている。一つまたはそれ以上の実施形態の組み合わせが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】チューブリン（ハウスキーピング遺伝子）、NtCLCeおよびCLC-Nt2転写物の発現を示す、3つの代表的なNtCLCe-RNAi系統（レーン1、2および3）、wt（レーン4、5および6）およびCLC-Nt2-RNAi系統（レーン7、8および9）の半定量的RT-PCR。
【図２】wt（n=11）、NtCLCe-RNAi（n=5）およびCLC-Nt2-RNAi（n=5）植物体の緑葉中のニコチンおよび硝酸塩分析（A）と、空気乾燥処理工程後での対応する葉中の合計TSNA含有量。この実験で、植物体は3リットルポット内で栽培され、最高の合計TSNA値は200 ng/gに対応する。
【図３】CLC-Nt2およびNtCLCe転写物（CLC-RNAi系統）の両方が欠如した、wt（n=4）、NtCLCe-RNAiおよびCLC-Nt2-RNAi植物体（n=8）の緑葉中のニコチン、硝酸塩分析（A）、葉の重量（B）および葉の数（C）。葉は、管理された温室条件下で10リットルポット内で10週間栽培された後に収穫された。この実験で、ニコチンおよび硝酸塩の最大値はそれぞれ29.6 mg/gおよび6.4 mg/gであった。
【図４】図3に示す通り、10リットルポット内で栽培した後での、wt、NtCLCe-RNAiおよびCLC-Nt2-RNAi植物体の空気乾燥処理済みの葉中のNNKパーセント値。この実験で、最高のNNK値は108 ng/gに対応する。
【図５】野外栽培したCLCNt2-s G163R突然変異体である植物体の緑葉中の硝酸塩およびニコチンのレベルの時間的経過。葉全体が、野外栽培したCLCNt2-s G163R同型接合の植物体（三角）およびバーレー種式で栽培したout-segregant野生型（ひし形）植物体から茎の半ばの位置で栽培される。試料は、朝（早朝、午前中半ばおよび昼前）の時間の異なる3回の時点で収穫され、フリーズドライされる。粉末にした薄膜材料を、硝酸塩およびニコチンの含有量について分析する。N=4〜8個体の植物体。標準偏差は、図中に示されている。早朝=8:00am-9:00am、午前中半ば= 9:30am-10:30am、昼前=11:00am-12:00pm。
【図６】野外栽培したNtCLCe-t P143L突然変異体である植物体の緑葉中の硝酸塩およびニコチンのレベルの時間的経過。葉全体が、野外栽培したNtCLCe-t P143L同型接合の植物体（四角）およびバーレー種式の下で栽培したout-segregant野生型（ひし形）植物体から茎の半ばの位置で栽培される。試料は、朝（早朝、午前中半ばおよび昼前）の時間の異なる3回の時点で収穫され、フリーズドライされる。粉末にした薄膜材料を、硝酸塩およびニコチンの含有量について分析する。N=4〜8個体の植物体。標準偏差は、図中に示されている。早朝=8:00am-9:00am、午前中半ば= 9:30am-10:30am、昼前=11:00am-12:00pm。
【００４２】
〔定義〕
本明細書の範囲内で使用される技術的な用語および表現には一般に、植物体および分子生物学の関連分野でそれらに共通して適用される意味が与えられる。以下の用語の定義はどれも、本明細書の全内容に適用される。「含む、備える（comprising）」という語は、それ以外の要素または工程を除外するものではなく、また不定冠詞「a」もしくは「an」は、複数であることを除外するものではない。ある一つの工程が、請求の範囲に列挙された複数の特徴の機能を実現することもある。所定の数値または範囲の文脈での「約」、「本質的に」および「およそ」という用語は、所定の値または範囲の20%以内、10%以内、または5%、4%、3%、2%または1%以内である値または範囲を意味する。
【００４３】
「単離した」という用語は、その自然のままの環境から取り去った任意の実体を意味するが、この用語は、いかなる精製の度合いも暗示してはいない。
【００４４】
「発現ベクター」は、核酸の発現を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む核酸媒体である。適切な発現ベクターには、円形の二本鎖核酸プラスミド、線形の二本鎖核酸プラスミド、およびその他の任意の起源の機能的に等価な発現ベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。発現ベクターは、上流に位置し、下記に定義する通り、核酸、核酸構築物または核酸結合体に作用できるように連結された、少なくともプロモーターを含む。
【００４５】
「構築物」という用語は、一つ以上のポリヌクレオチドを備える二本鎖の組換え体核酸断片を意味する。構築物は、補完的「センス鎖またはコード鎖」と対になった「テンプレート鎖」塩基を含む。所定の構築物を、ベクター（発現ベクターなど）内に位置するプロモーターの向きに対して同一（またはセンス）または反対（またはアンチセンス）のいずれかの方向に、可能性のある2つの方向でベクターに挿入できる。
【００４６】
「ベクター」は、核酸、核酸構築物および核酸結合体、およびこれに類するものの運搬を可能にするための核酸成分の組み合わせを含む、核酸媒体を意味する。適切なベクターには、円形の二本鎖核酸プラスミド、線形の二本鎖核酸プラスミド、およびその他の任意の起源のベクターなど、染色体外の複製が可能なエピソームが含まれる。
【００４７】
「プロモーター」は、一般に上流に位置し、二本鎖DNA断片に作用できるように連結された核酸の要素/配列を意味する。プロモーターは、所定の未変性遺伝子に最も近い領域に完全に由来することも、または異なる未変性のプロモーターまたは合成DNAセグメントに由来する異なる要素から構成することもできる。
【００４８】
「相同性、同一性または類似性」という用語は、配列の整列によって比較した2個のポリペプチド間または2個の核酸分子間の配列の類似性の度合いを意味する。比較対象の2個の不連続な核酸配列間の相同性の度合いは、比較可能な位置での同一または一致するヌクレオチドの数の関数である。同一性のパーセント値は、目視検査および数学的計算によって決定しうる。別の方法として、2個の核酸配列の同一性のパーセント値は、ClustalW、BLAST、FASTAまたはSmith-Watermanなどのコンピュータプログラムを使用して、配列情報を比較することにより決定しうる。これらのプログラム用のデフォルトのパラメータを使用できる。
【００４９】
「植物体」という用語は、そのライフサイクルまたは発育の任意の段階にある任意の植物体、およびその子孫を意味する。一つの実施形態で、植物体は「たばこ植物体」であり、これはたばこ属（Nicotiana）に属する植物体を意味する。好ましい種のたばこ植物体は、本明細書で説明している。
【００５０】
「植物体細胞」は、構造的および生理学的な植物体の単位を意味する。植物体細胞は、細胞壁のない原形質体、単離した単一の細胞または培養した細胞の形態であるか、あるいは、植物体の組織、植物体の器官、または植物体全体などを含むがこれらに限定されない、より高次の組織的単位の一部でもよい。
【００５１】
「植物材料」という用語は、バイオマス、葉、茎、根、花または花の部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、切断物、分泌物、抽出物、細胞または組織培養物、または植物体のその他任意の部分または生成物を含めた、植物体から獲得しうる任意の固体、液体またはガス状の組成、またはその組み合わせを意味する。一つの実施形態で、植物材料は、バイオマス、幹、種子または葉を含むか、またはそれらから構成される。別の実施形態で、植物材料は、葉を含むか、またはそれらから構成される。
【００５２】
「品種」という用語は、同じ種の他の植物体と区別する一定の特性を共有する植物体の母集団を意味する。一つ以上の特有の形質を有しながらも、品種は、その品種内の個体間で非常に些細な全体的変化によって特性付けられる。品種は、しばしば市販されていることがある。
【００５３】
「系統」または「育種系統」という用語は、本明細書で使用されるとき、植物体の育種時に使用される植物体群を意味する。系統は、他の形質について個体間でいくらかの変化がある場合もあるが、一つ以上の所定の形質について個体間での変化はわずかしか現れないため、品種と区別しうる。
【００５４】
「調節する」という用語は、低減、抑制（阻害）、増大またはその他の方法でポリペプチドの発現または活性に影響を及ぼすことを意味しうる。この用語はまた、転写活性の調節を含むがこれに限定されない、ポリペプチドをコードする遺伝子の活性を低減する、抑制する、増大する、またはその他の方法で影響を及ぼすことを意味しうる。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、「減少する」または「低減される」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド活性、転写性の活性およびタンパク質発現などの、量または活性の約10%〜約99%の減少、または少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%以上の減少を意味する。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、「抑制する」または「抑制された」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド活性、転写性の活性およびタンパク質発現などの、量または活性の、約98%〜約100%の減少、または少なくとも98%、少なくとも99%、特に100%の減少を意味する。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、「増加する」または「増加された」という用語は、限定はされないが、ポリペプチド活性、転写性の活性およびタンパク質発現などの、量または活性の約5%〜約99%の増大、または少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも100%以上の増大を意味する。
【００５８】
対照植物体の文脈での「対照」という用語は、酵素の発現または活性が変化しておらず（例えば、増大または減少）、またそれゆえに酵素の発現または活性が変化した植物体との比較を提供できる、植物体または植物体細胞を意味する。対照植物体は、空のベクターを備えうる。対照の植物体または植物体細胞は、野生型植物体または野生型植物体細胞に対応しうる。
【００５９】
〔詳細な説明〕
一つの実施形態で、配列リストに示す任意のポリヌクレオチドを含めた、本明細書で説明した任意の配列に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリヌクレオチド配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成る単離ポリヌクレオチドが提供されている。単離ポリヌクレオチドは、それに対する少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95% 96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成ることが適切である。
【００６０】
別の実施形態で、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリヌクレオチド配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成る単離ポリヌクレオチドが提供されている。単離ポリヌクレオチドは、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11に対して少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%または100%の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成ることが適切である。
【００６１】
別の実施形態で、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11に対して実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を持つポリヌクレオチドを含むか、それから成るか、それから実質的に成るポリヌクレオチドが提供されている。
【００６２】
別の実施形態で、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11の配列に対して少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%または99.9% 配列同一性を持つ、ポリヌクレオチド変異体が提供されている。
【００６３】
別の実施形態で、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11の断片ならびに、対応する配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11の断片に対して少なくとも約60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%または100%の配列同一性を持つ、それに対する実質的な相同性（すなわち、配列の類似性）または実質的な同一性を備えた配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11の断片が提供されている。
【００６４】
別の実施形態で、クロライドチャネルのCLCファミリーの一つとして機能するポリペプチドをコードする配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11に対する十分または実質的な度合いの同一性または類似性を備えたポリヌクレオチドが提供されている。
【００６５】
別の実施形態で、本明細書で配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11として指定されているポリヌクレオチドを含むか、それから成るか、それから実質的に成るポリヌクレオチドの重合体が提供されている。
【００６６】
本明細書で説明したポリヌクレオチドは、クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードすることが適切である。CLCは、電圧ゲート付きチャネルの群を構成する。植物体では、クロライドチャネルは、膨圧の調整、気孔の動き、栄養素の運搬および/または金属耐性およびこれに類するものなど、数多くの植物特異的な機能に貢献する。硝酸塩/プロトン対向輸送体AtCLCaは、植物体空胞内の硝酸塩の蓄積を媒介する（Nature (2006) 442 (7105):939-42を参照）。この刊行物で、そのAtClCa機能が、電気生理学的アプローチを利用した空胞内への硝酸塩の蓄積が可能な2NO3-/1H+交換体として示されている。CLC-Nt2の硝酸塩の運搬活性を試験するために、類似したアプローチが使用できる。「Solute transporters in plant thylakoid membranes: Key players during photosynthesis and light stress」Spetea C, Schoefs B. Communicative & Integrative Biology. 2010; 3(2)122-129およびMonachello等, New Phytol. 2009;183(1):88-94は、AtClCeが間質からチラコイド管腔への亜硝酸塩の転位に関与し、葉緑体包膜の亜硝酸塩輸送体から取り込まれると予測されることが開示されている。同書に記載のあるこの活性を測定するための方法を、NtCLCeの活性の測定に使用しうる。
【００６７】
配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11の組み合わせも意図されている。これらの組み合わせには、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号10および配列番号11の様々な組み合わせが含まれるが、これには配列番号1および配列番号2の組み合わせ、配列番号1および配列番号3の組み合わせ、配列番号1および配列番号4の組み合わせ、配列番号1および配列番号10の組み合わせ、配列番号1および配列番号11の組み合わせ、配列番号2および配列番号3の組み合わせ、配列番号2および配列番号4の組み合わせ、配列番号2および配列番号10の組み合わせや、配列番号2および配列番号11の組み合わせ、配列番号3および配列番号4の組み合わせ、配列番号3および配列番号10の組み合わせ、配列番号3および配列番号11の組み合わせ、配列番号1、配列番号2および配列番号3の組み合わせ、配列番号1、配列番号2および配列番号4の組み合わせ、配列番号1、配列番号3および配列番号4の組み合わせ、配列番号2、配列番号3および配列番号4の組み合わせ、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4の組み合わせや、あるいは配列番号1、配列番号2および配列番号3の組み合わせ、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号10および配列番号11の組み合わせ、配列番号1、配列番号2、配列番号4、配列番号10および配列番号11の組み合わせ、配列番号1、配列番号3 配列番号4、配列番号10および配列番号11の組み合わせ、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号10および配列番号11の組み合わせ、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4の組み合わせ、または配列番号1、配列番号2および配列番号3の組み合わせなどが含まれる。
【００６８】
本明細書で説明したポリヌクレオチドは、未変性または変性のデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）としうるヌクレオチドの重合体を含めることができる。従って、ポリヌクレオチドは、限定はされないが、ゲノムDNA、補完的DNA（cDNA）、mRNA、またはアンチセンスRNAまたはその断片とすることができる。その上、ポリヌクレオチドは、一本鎖のまたは二本鎖のDNA、一本鎖および二本鎖の領域の混合物であるDNA、DNAおよびRNAを含む混成体分子、または一本鎖のおよび二本鎖の領域またはその断片の混合物を持つ混成体分子とすることができる。さらに、ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、またはその両方またはその断片を含む、三重鎖領域で構成されることもできる。ポリヌクレオチドは、ホスホトランスフェラーゼなどの一つ以上の変性塩基を含むことができ、またペプチド核酸とすることができる。一般的に、ポリヌクレオチドは、単離したかまたはクローン化したcDNAの断片、ゲノムDNA、オリゴヌクレオチド、または個別ヌクレオチド、上記の組み合わせから組み立てることができる。本明細書で説明したポリヌクレオチド配列は、DNA配列として示しているが、配列には、それらの対応するRNA配列、およびその逆相補を含む、それらの補完的（例えば、完全に補完的な）DNAまたはRNA配列が含まれる。
【００６９】
本明細書で説明したポリヌクレオチドは、一般的にリン酸ジエステル結合を含むが、一部のケースでは、ポリヌクレオチド類似物は、例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、またはO-メチルホホロアミダイト連鎖、ならびにペプチドポリヌクレオチドのバックボーンおよび連鎖を含む、代わりのバックボーンを持ちうる。その他の類似体ポリヌクレオチドは、陽性のバックボーンを持つもの、非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンを含む。例えば、こうした分子の生理学的環境での、またはバイオチップ上のプローブとしての安定性および半減期を増大させるためなどの様々な理由で、リボース-リン酸塩バックボーンの修飾を行いうる。天然のポリヌクレオチドおよび類似物の混合物を作成することができるが、別の方法として、異なるポリヌクレオチド類似物の混合物、ならびに天然のポリヌクレオチドおよび類似物の混合物を作成しうる。
【００７０】
様々なポリヌクレオチド類似物、例えば、ホスホルアミド酸、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、O-メチルホホロアミダイト連鎖およびペプチドポリヌクレオチドのバックボーンおよび連鎖などが知られている。その他の類似体ポリヌクレオチドは、陽性のバックボーンを持つもの、非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンを含む。一つ以上の炭素環式糖を含むポリヌクレオチドも含まれる。
【００７１】
その他の類似物は、ペプチドポリヌクレオチド類似物であるペプチドポリヌクレオチドを含む。これらのバックボーンは、天然のポリヌクレオチドの多価のリン酸ジエステルバックボーンとは対照的に、中性条件下で実質的に非イオン性である。これは結果的に有利となりうる。まず、ペプチドポリヌクレオチドバックボーンは、ハイブリッド形成動態学を改善しうる。ペプチドポリヌクレオチドは、ミスマッチの塩基対と完全に一致した塩基対を比較すると融解温度でより大きな変化を持つ。DNAおよびRNAは、一般に内部でのミスマッチについて2〜4℃の融解温度の低下を示す。非イオン性ペプチドポリヌクレオチドバックボーンでは、低下は7〜9℃に近い。同様に、それらが持つ非イオン性から、これらのバックボーンに付着した塩基のハイブリッド形成は、塩分濃度に対して比較的鈍感である。さらに、ペプチドポリヌクレオチドは、細胞の酵素によって劣化することも、より小さな範囲に分解されることもないと考えられ、そのためより一層安定性がありうる。
【００７２】
開示されたポリヌクレオチド、およびその断片の用途の中には、核酸ハイブリダイゼーションアッセイでのプローブとしての断片の用途や、核酸増幅アッセイで使用するプライマーがある。こうした断片は、一般的にDNA配列の少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20以上の連続するヌクレオチドを備える。その他の実施形態で、DNA断片は、DNA配列の少なくとも約10、15、20、30、40、50または60以上の連続するヌクレオチドを備える。こうして、一つの態様において、プローブまたはプライマーまたは両方の使用を含む、クロライドチャネルのCLCファミリーの一つをコードするポリヌクレオチドを検出する方法も提供されている。
【００７３】
ハイブリッド形成条件の選択に影響する基本的なパラメータおよび適切な条件を考案するための手引きについては、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に記載がある。遺伝暗号の知識と本明細書で説明したアミノ酸配列との組み合わせを用いて、縮重オリゴヌクレオチドのセットを作成できる。こうしたオリゴヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法鎖反応（PCR）など、プライマーとして有用であり、そこでDNA断片が単離され増幅される。ある一定の実施形態で、縮重プライマーは、遺伝的ライブラリ用のプローブとして使用できる。こうしたライブラリは、cDNAライブラリライブラリ、ゲノムライブラリ、またさらには電子的な発現配列タグまたはDNAライブラリを含むが、これに限定されない。この方法によって識別された相同配列は次に、本明細書で特定した配列の相同体を特定するためのプローブとして使用される。
【００７４】
また、潜在的な用途は、低い厳密度の条件下で、通常はやや厳密な条件で、また一般に高い厳密度の条件下で、本明細書で説明したポリヌクレオチドに対してハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（例えば、プライマーまたはプローブ）の用途である。ハイブリッド形成条件の選択に影響する基本的なパラメータおよび適切な条件を考案するための手引きについては、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に記載があり、当該技術分野の当業者であれば、例えば、ポリヌクレオチドの長さまたは塩基の組成に基づき、簡単に決定できる。
【００７５】
やや厳密な条件の達成の一つの方法は、5×標準クエン酸ナトリウム、0.5%ナトリウムドデシル硫酸塩、1.0 mMエチレンジアミン四酢酸（pH 8.0）、約50%ホルムアミドのハイブリッド形成緩衝液、6×標準クエン酸ナトリウムを含む予洗溶液をハイブリッド形成温度約55℃で（または約50%ホルムアミドを含むものなど、その他の類似したハイブリッド形成溶液をハイブリッド形成温度約42℃で）使用することと、0.5×標準クエン酸ナトリウム、0.1%ナトリウムドデシル硫酸塩中での約60℃の洗浄条件とが関与する。一般的に、高い厳密度の条件は、上記のハイブリッド形成条件として定義されるが、洗浄はおよそ68 ℃で、0.2×標準クエン酸ナトリウム、0.1%ナトリウムドデシル硫酸塩である。SSPE（1× SSPEは、0.15M塩化ナトリウム塩化物、10 mMリン酸ナトリウム、および1.25 mMエチレンジアミン四酢酸、pH 7.4）を、ハイブリッド形成および洗浄緩衝液中で標準クエン酸ナトリウム（1×標準クエン酸ナトリウムは、0.15M塩化ナトリウム塩化物および15 mMクエン酸ナトリウム）と置換でき、洗浄はハイブリッド形成の完了後15分間実施される。当然のことながら、洗浄する温度および洗浄する塩分濃度は、当業者にとって公知であり、下記にさらに説明のある、ハイブリッド形成反応および二重鎖の安定性を支配する基本原則を適用することにより、望ましい度合いの厳密性を達成するために必要に応じて調整できる（例えば、Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yを参照）。ポリヌクレオチドを未知の配列の標的ポリヌクレオチドにハイブリッド形成するとき、混成体の長さは、ポリヌクレオチドのハイブリッド形成の長さであると想定される。既知の配列のポリヌクレオチドをハイブリッド形成するとき、混成体の長さは、ポリヌクレオチドの配列を整列させ、最適な配列の補完性のある領域を識別することにより決定できる。長さが50塩基対未満であると予想される混成体についてのハイブリッド形成温度は、混成体の融解温度よりも5〜10℃低いべきだが、ここで、融解温度は以下の等式によって決定される。長さが18塩基対未満の混成体では、融解温度（℃）=2（A+T塩基の数）+4（G+C塩基の数）である。長さが18塩基対を超える混成体では、融解温度（℃）=81.5+16.6（log10 [Na+]）+0.41（% G+C)-(600/N）であり、式中、Nは混成体中の塩基の数、[Na+]はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオン濃度（1×標準クエン酸ナトリウムの[Na+]=0.165M）である。通常、こうしたそれぞれのハイブリッド形成用ポリヌクレオチドは、ハイブリッド形成の対象となるポリヌクレオチドの長さの少なくとも25%（少なくとも50%、60%、または70%であることが一般で、少なくとも80%が最も一般的）の長さを持ち、またハイブリッド形成の対象となるポリヌクレオチドと少なくとも60%の配列同一性（例えば、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%）を持つ。
【００７６】
当業者であれば理解できるように、直鎖DNAは、5'−3'方向と3'−5'方向の2つの潜在的な方向性を持つ。例えば、基準配列が5'−3'方向に配置されており、かつ第二の配列が同一のポリヌクレオチド分子/鎖内で5'−3'方向に配置されている場合には、基準配列および第二の配列は同一の方向を向いており、すなわち同一の方向を持つ。通常、所定のプロモーターの制御下にある関心のプロモーター配列および遺伝子は、同一の方向に配置される。ただし、5'−3'方向に配置されている基準配列に関して、第二の配列が同一のポリヌクレオチド分子/鎖内で3'−5'方向に配置されている場合には、基準配列および第二の配列は、アンチセンスの方向を向いており、すなわちアンチセンス方向である。相互に対してアンチセンス方向を持つ2つの配列は、これとは別に、基準配列（5'−3'方向）および基準配列の逆相補配列（5'−3'方向に配置されている基準配列）が同一のポリヌクレオチド分子/鎖内に配置されている場合に、同一の方向を持つとも説明できる。本明細書に記載した配列は、5'−3'方向で示されている。
【００７７】
本明細書で提供されている組換え体構築物は、タンパク質の発現または活性レベルを調節するために、植物体または植物体細胞を転換するために使用できる。組換え体ポリヌクレオチド構築物は、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドをコードし、植物体または植物体細胞内にポリペプチドを発現するのに適切な制御領域に作用できるように連結された、ポリヌクレオチドを備えることができる。こうして、ポリヌクレオチドは、本明細書で説明したポリペプチドをコードするコード配列を備えることができる。タンパク質の発現または活性レベルが調節される植物体は、突然変異体である植物体、非天然の植物体、遺伝子組換え植物体、人造の植物体または遺伝子組換え植物体を含むことができる。遺伝子組換え植物体は、組換えDNAの安定した組込みによって改変されたゲノムを含むことが適切である。組換えDNAは、遺伝子組換えされ、細胞の外に構築されたDNAを含み、また天然のDNA、またはcDNA、または合成DNAを含むDNAを含む。遺伝子導入植物体は、当初形質転換された植物体細胞から再生された植物体や、形質転換した植物体の後の世代または交雑種からの子孫遺伝子組換え植物体を含むことができる。遺伝子組換え修飾によって、ポリヌクレオチドまたは本明細書で説明したポリペプチドの発現または活性が対照植物体と比較して改変されることが適切である。
【００７８】
組換え体ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、未変性のポリペプチドとすることも、または細胞に対して異質組織とすることもできる。一部の場合では、組換え体構築物は、発現を調節し、制御領域と作用できるように連結されたポリヌクレオチドを含む。適切な制御領域の例は、本明細書で説明している。
【００７９】
本明細書で説明したものなど、組換え体ポリヌクレオチド構築物を含むベクターも提供されている。適切なベクターバックボーンは、例えば、プラスミド、ウイルス、人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体、またはバクテリオファージ人工染色体など、当該技術分野で日常的に使用されているものを含む。適切な発現ベクターは、例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、およびレトロウイルスに由来するプラスミドおよびウイルスのベクターを含むがこれらに限定はされない。多数のベクターおよび発現システムが市販されている。
【００８０】
ベクターは、例えば、複製の起源、足場アタッチメント領域またはマーカーを含むことができる。マーカー遺伝子は、植物体細胞に対して選択可能な表現型を与えることができる。例えば、マーカーは、抗生物質（例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、またはハイグロマイシン）、または除草剤（例えば、グリホサート、クロルスルフロンまたはフォスフィノスリシン）などの殺生物剤耐性を与えることができる。さらに、発現ベクターは、発現されたポリペプチドの操作または検出（例えば、精製または局在化）を促進するようデザインされたタグ配列を含むことができる。ルシフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ、緑蛍光タンパク質蛍光タンパク質、グルタチオンS-転移酵素、ポリヒスチジン、c-mycまたは赤血球凝集素配列などのタグ配列が、一般にコードされたポリペプチドと融合したものとして表現される。こうしたタグは、カルボキシルまたはアミノのいずれかの終端も含めた、ポリペプチド内のどこにでも挿入できる。
【００８１】
植物体または植物体細胞は、安定して転換されるようにそのゲノムに組み入れられた組換え体ポリヌクレオチドを持つことで転換させることができる。本明細書で説明した植物体または植物体細胞は、安定して転換させることができる。安定して転換された細胞は通常、毎回の細胞分裂でも導入されたポリヌクレオチドを保持する。植物体または植物体細胞はまた、組換え体ポリヌクレオチドがそのゲノムに組み入れられないように、過渡的に転換させることもできる。過渡的に転換された細胞は通常、十分な数の細胞分裂の後で、導入された組換え体ポリヌクレオチドが娘細胞内で検出されないように、導入された組換え体ポリヌクレオチドのすべてまたは一部を毎回の細胞分裂で失う。
【００８２】
植物体細胞を転換するための数多くの方法が当該技術分野で利用でき、微粒子銃、遺伝子銃テクニック、アグロバクテリウム媒介の形質転換、ウィルスベクター媒介の形質転換およびエレクトロポーレーションを含めて、これらすべてを本明細書に含む。外来性DNAを植物体染色体に組み入れるためのアグロバクテリウムシステムが、植物体遺伝子工学で広範にわたり研究、修正、および開発されてきた。センスまたはアンチセンスの方向に作用できるように制御配列に連結された主題の精製済みたばこタンパク質に対応するDNA配列を含む裸の組換えDNA分子は、従来の方法により適切なT-DNA配列に結合される。これらはポリエチレングリコールテクニックによるか、またはエレクトロポーレーションテクニックによってたばこプロトプラストに導入されるが、どちらも標準技術である。別の方法として、主題の精製済みたばこタンパク質をコードする組換えDNA分子を含むこうしたベクターは、生きたアグロバクテリウム細胞に導入され、その後でDNAをたばこ植物体細胞内に移動させる。T-DNAベクター配列を伴わない裸のDNAによる形質転換は、たばこプロトプラストとDNAを含むリポソームとの融合によるか、またはエレクトロポーレーションによって達成できる。T-DNAベクター配列を伴わない裸のDNAは、不活性の高速の微粒子銃によってたばこ細胞を転換するために使用することもできる。
【００８３】
細胞または培養組織が形質転換のための受容体組織として使用される場合、植物体は、希望に応じて、当業者にとって公知の技術によって転換した培養体から再生することができる。
【００８４】
組換え体構築物に含める制御領域の選択は、効率、選択可能性、誘導性、望ましい発現レベル、および細胞優先的または組織優先的な発現を含むがこれに限定されない、いくつかの要因に依存する。コード配列に対して制御領域を適切に選択し配置することにより、コード配列の発現を調節することは、当業者にとって日常的な事柄である。ポリヌクレオチドの転写は、類似した方法で調節できる。一部の適切な制御領域は、転写のみで、または主にある一定の細胞型で開始される。植物体ゲノムDNA内の制御領域の識別および特性付けをするための方法は、当該技術分野において公知である。
【００８５】
適切なプロモーターは、異なる組織にまたは細胞型（例えば、根特異的プロモーター、苗条特異的プロモーター、木部特異的プロモーター）に存在するか、または異なる発育段階で存在するか、または異なる環境的条件に応じて存在する組織特異的要因によって認識される組織特異的プロモーターを含む。適切なプロモーターは、ほとんどの細胞型で特定の誘導物質を必要とせずに活性化できる構成的プロモーターを含む。RNAiポリペプチド製造を制御するための適切なプロモーターの例は、カリフラワーモザイクウィルス35S（CaMV/35S）、SSU、OCS、lib4、usp、STLS1、B33、nosまたはユビキチンプロモーターまたはファゼオリンプロモーターを含む。当業者は、組換え体プロモーターの複数の変形物を生成することができる。
【００８６】
組織特異的プロモーターは、植物体組織または生殖組織など特定の細胞または組織で、植物体の発育中の特定時点にのみ活性である転写制御要素である。組織特異的発現は、例えば、ある一定の組織内のポリヌクレオチドの発現が好ましい時に、有利なことがある。発育管理下の組織特異的プロモーターの例は、植物体組織（例えば、根または葉）、または生殖組織（果実、胚珠、種子、花粉、雌しべ、花、または任意の胚性の組織など）など、ある一定の組織内でのみ（または主として限定的に）転写を開始できるプロモーターを含む。生殖組織特異的プロモーターは、例えば、葯特異的、胚珠特異的、胚特異的、胚乳特異的、外皮特異的、種子および種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、咢片特異的、またはその組み合わせが考えられる。
【００８７】
適切な葉特異的プロモーターは、ビルビン酸塩、C4植物体（トウモロコシ）由来のオルソリン酸ジキナーゼ（PPDK）プロモーター、トウモロコシ由来のcab-m1Ca+2プロモーター、シロイヌナズナmyb関連遺伝子プロモーター（Atmyb5）、リブロースニリン酸カルボキシラーゼ（RBCS）プロモーター（例えば、葉および人工光源で栽培した苗木で発現されるトマトRBCS 1、RBCS2およびRBCS3A遺伝子、栽培中のトマト果実で発現されるRBCS1およびRBCS2、または葉身および葉鞘の葉肉細胞でほぼ排他的に高レベルで発現されるリブロースニリン酸カルボキシラーゼプロモーター）を含む。
【００８８】
適切な老化特異的プロモーターは、果実の成熟、老化および葉の脱離時に活性となるトマトプロモーター、システインプロテアーゼをコードする遺伝子のトウモロコシプロモーターを含む。適切な葯特異的プロモーターを使用することができる。当業者にとって公知の適切な根優先的プロモーターを選択しうる。適切な種子優先的プロモーターは、種子特異的プロモーター（種子の発育時に活性なプロモーターで、種子保存タンパク質のプロモーターなど）と、種子発芽プロモーター（種子の発芽時に活性のプロモーター）の両方を含む。こうした種子優先的プロモーターは、Cim1（サイトカイニン誘発されたメッセージ）、cZ19B1（トウモロコシ19 kDa zein）、milps（ミオ-イノシトール-1-リン酸塩合成酵素）、mZE40-2（別称、Zm-40）、nuclc、およびcelA（セルロース合成酵素）を含むが、これに限定されない。Gama-zeinは、一つの胚乳特異的プロモーターである。Glob-1は、一つの胚特異的プロモーターである。双子葉植物体では、種子特異的プロモーターは、マメβ-ファゼオリン、ナピン、β-コングリシニン、ダイズレクチン、クルシフェリン、およびこれに類するものを含むが、これに限定されない。単子葉植物体では、種子特異的プロモーターは、トウモロコシ15 kDa zeinプロモーター、22 kDa zeinプロモーター、27 kDa zeinプロモーター、g-zeinプロモーター、27 kDa γ-zeinプロモーター（gzw64Aプロモーターなど、Genbank Accession第S78780号を参照）、waxyプロモーター、シュランケン1プロモーター、シュランケン2プロモーター、グロブリン1プロモーター（Genbank Accession第L22344号を参照）、Itp2プロモーター、cim1プロモーター、トウモロコシ end1およびend2プロモーター、nuc1プロモーター、Zm40プロモーター、eep1およびeep2、lec1、チオレドキシンHプロモーター、mlip15プロモーター、PCNA2プロモーター、およびシュランケン-2プロモーターを含むが、これに限定されない。
【００８９】
誘導性プロモーターの例は、病原体の攻撃、嫌気性条件、高温、光、乾燥、低温、または高塩分濃度に反応するプロモーターを含む。病原体誘導性プロモーターは、病原性に関連したタンパク質（PRタンパク質）に由来するものを含み、これは病原体（例えば、PRタンパク質、SARタンパク質、β-1,3-グルカナーゼ、キチナーゼ）による感染に続いて誘発される。
【００９０】
植物体プロモーターに加えて、適切なその他のプロモーターを細菌性の起源（例えば、オクトピン合成酵素プロモーター、ノパリン合成酵素プロモーターおよびTiプラスミドに由来するその他のプロモーターなど）から誘導したり、ウィルスのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）の35Sおよび19S RNAプロモーター、たばこモザイクウイルスの構成的プロモーター、カリフラワーモザイクウィルス（CaMV）19Sおよび35Sプロモーター、またはゴマノハグサモザイクウイルス35Sプロモーター）から誘導しうる。
【００９１】
別の態様で、配列リストに示す任意のポリペプチドを含めた、本明細書で説明した任意の配列に対して少なくとも60%の配列同一性を持つポリペプチド配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成る単離ポリペプチドが提供されている。それに対して少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%または100%の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成る単離ポリペプチドが適切である。
【００９２】
一つの実施形態で、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11によってコードされたポリペプチドが提供されている。
【００９３】
別の実施形態で、配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14に対して少なくとも60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%または100%の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成る単離ポリペプチドが提供されている。
【００９４】
別の実施形態で、配列番号1、または配列番号2、または配列番号3、または配列番号4、または配列番号10、または配列番号11に対して少なくとも約66%、67%、68%、69%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%または99.9%の配列同一性を持つポリヌクレオチド変異体によりコードされたアミノ酸配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成るポリペプチド変異体が提供されている。
【００９５】
別の実施形態で、配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14のポリペプチドの断片、ならびにそれぞれ配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14の対応する断片に対して少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%または100%の配列同一性を持つ配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14の断片が提供されている。
【００９６】
ポリペプチドはまた、配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14に対して、クロライドチャネルのCLCファミリーの一つとして機能するために十分なまたは実質的な同一性または類似性の度合いを備えた配列も含む。ポリペプチドの断片は、一般に、完全長配列の活性のうち一部または全部を保持する。
【００９７】
ポリペプチドはまた、任意のタイプの変更（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、グリコシル化状態の変化、再折り畳みまたは異性化に影響を及ぼす変化、三次元構造、または自己会合状態）の導入により生成される突然変異体も含み、クロライドチャネルのCLCファミリーの一つとしてのそれらの機能または活性の一部または全部がまだある場合には、故意に操作したりまたは自然に単離されることある。
【００９８】
ポリペプチドは、公知の方法を使用して線形または環状にしうる。
【００９９】
配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14に対して100%の配列同一性を持つ配列によりコードされるポリペプチド、あるいは配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14に対して100%の配列同一性を持つ配列を含むか、それから成るか、それから実質的に成るポリペプチドも開示されている。
【０１００】
配列番号5、または配列番号6、または配列番号7、または配列番号12、または配列番号13、または配列番号14の様々な組み合わせも意図されている。これらの組み合わせは、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号12、配列番号13、または配列番号14の任意の組み合わせを含むが、これは、配列番号5および配列番号6の組み合わせ、配列番号5および配列番号7の組み合わせ、配列番号6および配列番号7の組み合わせ、配列番号5、配列番号6および配列番号7の組み合わせ、配列番号5、配列番号6および配列番号7の組み合わせ、配列番号5、配列番号6、配列番号12、配列番号13および配列番号14の組み合わせ、配列番号5、配列番号7、配列番号12、配列番号13および配列番号14の組み合わせ、配列番号6、配列番号7 配列番号12、配列番号13および配列番号14の組み合わせ、配列番号5、配列番号6、配列番号7 配列番号12、配列番号13および配列番号14の組み合わせ、配列番号5、配列番号6および配列番号7、配列番号12、配列番号13および配列番号14の組み合わせなどを含む。
【０１０１】
ポリペプチドは、任意のタイプの変更（例えば、アミノ酸の挿入、欠失、または置換、グリコシル化状態の変化、再折り畳みまたは異性化に影響を及ぼす変化、三次元構造、または自己会合状態）の導入により生成される変異体を含み、これは故意に操作したりまたは自然に単離できる。欠失は、タンパク質からの一つ以上のアミノ酸の除去を意味する。挿入は、一つ以上のアミノ酸残基が、ポリペプチド内の所定の部位に導入されることを意味する。挿入は、単一または複数のアミノ酸の配列内の挿入を含みうる。置換は、ポリペプチドのアミノ酸を類似した性質（類似した疎水性、親水性、抗原性、a-らせん状構造またはβ-シート構造を形成または破損する傾向など）を持つ他のアミノ酸と置き換えることを意味する。アミノ酸置換は、単一の残基の置換であるが、ポリペプチドに対して課された機能的制約に応じてクラスター化することもでき、範囲は約1〜約10個のアミノ酸としうる。アミノ酸置換は、下記に記載した通り伝統的なアミノ酸置換が好ましい。アミノ酸の置換、欠失および/または挿入は、ペプチド合成テクニック（固相ペプチド合成など）または組換えDNA操作を使用して行うことができる。置換、挿入または欠失のあるタンパク質の変異体を生成するためにDNA配列を操作する方法は、当該技術分野において公知である。変異体は、静的な変化を生成する改変を持つことができ、結果的に機能的に等価なタンパク質ができる。物質の二次的な結合活性が保持されている限り、極性、充電、溶解性、疎水性、親水性および残基の両親媒性の類似性に基づき、意図的にアミノ酸を置換しうる。例えば、負の電荷を帯びたアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正電荷を帯びたアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含み、ならびに類似した親水性値を持つ無電荷の極性頭基を備えたアミノ酸は、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンを含む。伝統的な置換は、例えば、下記の表に従い行いうる。第二の列の同一ブロックにあるアミノ酸および好ましくは第三の列の同一系統にあるアミノ酸は、相互に置換しうる。
0006693747.tif 000002
【０１０２】
ポリペプチドは、成熟タンパク質または未成熟タンパク質または未成熟タンパク質に由来するタンパク質としうる。ポリペプチドは、公知の方法を使用して線形または環状にしうる。ポリペプチドは一般に、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも30個、または少なくとも40個の連続するアミノ酸を含む。
【０１０３】
突然変異ポリペプチド変異体は、一つ以上の突然変異ポリペプチド変異体を含む、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体（例えば、突然変異体、非天然の、遺伝子導入、人造または遺伝子組換え植物体）を作成するために使用できる。突然変異ポリペプチド変異体は、未成熟のポリペプチドの活性を保持することが適切である。突然変異ポリペプチド変異体の活性は、未成熟のポリペプチドと比較して、高い、低い、またはほぼ同一でありうる。
【０１０４】
本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、人造の突然変異または合成的な突然変異または遺伝子組換え突然変異を含むことができる。本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、生体外または生体内の操作手順を含む工程によって獲得されるか、または獲得可能な突然変異とすることができる。本明細書で説明したヌクレオチド配列およびポリペプチドでの突然変異は、人による介入を含む工程によって獲得されるか、または獲得可能な突然変異とすることができる。
【０１０５】
本明細書で説明したポリペプチド配列での突然変異の例を表1に示す。従って、さらなる態様は、表1に記載した通りの突然変異ポリペプチドに関連する。
【０１０６】
突然変異は、コードされたポリペプチドの活性を調節できる。突然変異は、植物体中の硝酸塩レベルが調節されるように、コードされたポリペプチドの活性を調節できる。突然変異は、植物体中の硝酸塩レベルが増大または減少されるように、コードされたポリペプチドの活性を調節できる。突然変異は、植物体（乾燥処理済み植物材料など）中のNNKレベルが調節されるように、コードされたポリペプチドの活性を調節できる。突然変異は、植物体（乾燥処理済み植物材料など）中のNNKレベルが増大または減少されるように、コードされたポリペプチドの活性を調節できる。突然変異は、植物体（乾燥処理済み植物材料など）中の全体的TSNAレベルが調節されるように、コードされたポリペプチドの活性を調節できる。突然変異は、植物体（乾燥処理済み植物材料など）中の全体的TSNAレベルが増大または減少されるように、コードされたポリペプチドの活性を調節できる。
【０１０７】
一つの実施形態で、配列番号5は、503、471、659、566、637、597、711、135、151、690、737、135、163、480、520、514、518、476、739、517、585または677またはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸位置での一つ以上の突然変異を含む。この位置での突然変異のタイプは、欠失、挿入、置換またはミスセンス突然変異またはその組み合わせとすることができる。突然変異は、異型接合または同型接合の突然変異とすることができるが、同型接合の突然変異が適切である。一つの実施形態で、突然変異は置換型突然変異である。一つの実施形態で、置換型突然変異は、G503E、G471R、V659I、S566N、P637S、A597T、P711L、G135R、A151V、G690D、G737R、G135R、G163R、P480S、S520F、A514T、A518V、G476E、R739S、G517E、E585KまたはV677Iまたはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択される。
【０１０８】
一つの実施形態で、配列番号6は、514、537、593、749、524、408、503、547、691、478、749、713、550、586、670、678、631、657、737、525、597、674またはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸位置での一つ以上の突然変異を含む。この位置での突然変異のタイプは、欠失、挿入、置換またはミスセンス突然変異またはその組み合わせとすることができる。突然変異は、異型接合または同型接合の突然変異とすることができるが、同型接合の突然変異が適切である。一つの実施形態で、突然変異は置換型突然変異である。一つの実施形態で、置換型突然変異は、A514T、L537F、R593I、A749T、G524D、S408F、G503R、P547S、G691D、A478V、A749V、T713I、M550I、P586S、R670K、R678K、D631N、L657F、G737R、S525L、A597T、E674Kまたはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択される。
【０１０９】
一つの実施形態で、配列番号7は、21、58、141、175、5、34、124、40、8、35、30、177、42、88、155、158、170、174、126または131またはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸位置での一つ以上の突然変異を含む。この位置での突然変異のタイプは、欠失、挿入、置換またはミスセンス突然変異またはその組み合わせとすることができる。突然変異は、異型接合または同型接合の突然変異とすることができるが、同型接合の突然変異が適切である。一つの実施形態で、突然変異は置換型突然変異である。一つの実施形態で、置換型突然変異は、E21K、L58F、P141S、G175E、S5N、A34V、M124I、L40F、D8N、C35Y、A30V、A177V、G42D、G88D、G155R、D158N、A170V、A174V、A126VまたはG131Rまたはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択される。
【０１１０】
配列番号12に示す配列は、5’端に余分な88個のアミノ酸を持つ配列番号7に示す配列に対応する。配列番号12は、配列番号7と同一の対応する突然変異を含むことができる。配列番号12は、109、146、229、263、93、122、212、128、96、123、118、265、130、176、243、246、258、262、214、または219またはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸位置での一つ以上の突然変異を含むことができる。この位置での突然変異のタイプは、欠失、挿入、置換またはミスセンス突然変異またはその組み合わせとすることができる。突然変異は、異型接合または同型接合の突然変異とすることができるが、同型接合の突然変異が適切である。一つの実施形態で、突然変異は置換型突然変異である。一つの実施形態で、置換型突然変異は、E109K、L146F、P229S、G263E、S93N、A122V、M212I、L128F、D96N、C123Y、A118V、A265V、G130D、G176D、G243R、D246N、A258V、A262V、A214VまたはG219Rまたはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択される。
【０１１１】
一つの実施形態で、配列番号13は、184、89、166、18、76、173、143、1、4、154、89、128、137または181またはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸位置での一つ以上の突然変異を含む。この位置での突然変異のタイプは、欠失、挿入、置換またはミスセンス突然変異またはその組み合わせとすることができる。突然変異は、異型接合または同型接合の突然変異とすることができるが、同型接合の突然変異が適切である。一つの実施形態で、突然変異は置換型突然変異である。一つの実施形態で、置換型突然変異は、P184S、G89D、K166N、G18R、G76R、G173R、P143L、M1I、S4N、V154I、G89D、A128V、S137FまたはG181Sまたはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択される。
【０１１２】
配列番号14に示す配列は、5’端に余分な88個のアミノ酸を持つ配列番号13に示す配列に対応する。一つの実施形態で、配列番号14は、272、177、254、106、164、261、231、89、92、242、177、269または225またはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択されるアミノ酸位置での一つ以上の突然変異を含む。この位置での突然変異のタイプは、欠失、挿入、置換またはミスセンス突然変異またはその組み合わせとすることができる。突然変異は、異型接合または同型接合の突然変異とすることができるが、同型接合の突然変異が適切である。一つの実施形態で、突然変異は置換型突然変異である。一つの実施形態で、置換型突然変異は、P272S、G177D、K254N、G106R、G164R、G261R、P231L、M89I、S92N、V242I、G177D、A269V、S225FまたはG269Sまたはその二つ以上の組み合わせから成る群から選択される。
【０１１３】
突然変異は、配列番号5の位置G163での突然変異であることが適切である。突然変異は、配列番号5の位置G163での同型接合の突然変異であることが適切である。突然変異は、置換型突然変異であることが適切である。置換型突然変異はG163Rであることが適切である。突然変異は、G163Rでの同型接合の置換型突然変異であることが適切である。この突然変異を含むポリペプチドが突然変異体である植物体中で発現されるとき、突然変異体である植物体中の硝酸塩レベルは、早朝および午前中半ばの間は対照植物体よりも低い。対応する突然変異は配列番号14で起こすことができ、これはその5’端に追加的なアミノ酸を持つ配列番号7の配列に対応する。
【０１１４】
突然変異は、配列番号5の位置G163での突然変異であることが適切である。置換型突然変異はG163Rであることが適切である。突然変異は、G163Rでの同型接合の置換型突然変異であることが適切である。この突然変異は、この突然変異を含む突然変異体である植物体中の硝酸塩のレベルを減少させることができる。G163R同型接合の突然変異体たばこ植物体は、対照植物体と比較して早朝に硝酸塩のレベルが低下している。硝酸塩のレベルは、対照植物体中の約11 mg/gから、突然変異体である植物体中の約6 mg/gに減少している。硝酸塩レベルは、午前中半ばには引き続き減少している。硝酸塩のレベルは、対照植物体中の約7 mg/gから、突然変異体である植物体中の約4.5 mg/gに減少している。昼前までに、硝酸塩レベルは午前中半ばと比較して突然変異体である植物体中で増加し、早朝での硝酸塩レベルに達している。対照について、対照植物体中の硝酸塩レベルは引き続き減少している。昼前までに、硝酸塩のレベルは突然変異体である植物体中で約6 mg/gに増大し、対照植物体中で約3 mg/gに減少している。ニコチンのレベルは、朝のあいだは幾分類似している。ニコチンのレベルは、突然変異体である植物体については約13 mg/g〜約11 mg/gの間で変動があり、対照植物体については約9 mg/g〜13 mg/gの間で変動がある。ニコチンの結果は、突然変異体である植物体の代謝が正常であることを示す。突然変異体および対照植物体についてのバイオマスレベルも比較可能である。
【０１１５】
突然変異は、配列番号13の位置P143での突然変異であることが適切である。置換型突然変異はP143Lであることが適切である。突然変異は、P143Lでの同型接合の置換型突然変異であることが適切である。この突然変異は、この突然変異を含む突然変異体である植物体中の硝酸塩のレベルを増大させることができる。P143L同型接合の突然変異体たばこ植物体は、対照植物体と比較して早朝に硝酸塩のレベルが増大している。硝酸塩のレベルは、対照植物体中の約7 mg/gから、突然変異体である植物体中の約14 mg/gに増大している。硝酸塩レベルは、午前中半ばに突然変異体である植物体中で減少し、対照植物体中でわずかに増大している。突然変異体である植物体中の硝酸塩レベルは約9 mg/gに減少し、対照植物体中の硝酸塩のレベルは約9 mg/gに増大している。昼前までに、硝酸塩レベルは、午前中半ばと比較して突然変異体である植物体中で引き続き減少した。対照について、対照植物体中の硝酸塩レベルは減少している。昼前までに、硝酸塩のレベルは、突然変異体である植物体中で約2 mg/gに減少し、対照植物体中で約4 mg/gに減少している。ニコチンのレベルは、突然変異体および対照植物体のそれぞれについて、朝のあいだは幾分類似している。ニコチンのレベルは、突然変異体である植物体については約20 mg/g〜約24 mg/gの間で変動があり、対照植物体については約15 mg/g〜17 mg/gの間で変動がある。ニコチンの結果は、突然変異体である植物体の代謝が正常であることを示す。突然変異体および対照植物体についてのバイオマスレベルも比較可能である。
【０１１６】
硝酸塩代謝の日周制御は公知であり、集中的に研究がなされてきた（Stitt & Krapp Plant, Cell and Environment 22, 583-621 (1999)を参照）。窒素充実植物体において、硝酸塩レダクターゼのための転写物のレベルは、夜明け前に高く、日中は急激に低下し、夜のあいだに回復する。NIA活性は、明期の最初の部分で3倍に増大し、明期の第二の部分で減少し、夜のあいだは低いままである。照明の後のNIA活性の増大は、NIAタンパク質の増大によるものである。
【０１１７】
また、たばこ植物体、またはその植物体の部分の硝酸塩のレベル、合計TSNA含有量またはNNKを調節するための方法も開示されているが、前記方法は、 （i）一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド配列の少なくとも一つの対立遺伝子内で、前記植物体のゲノムに一つ以上の突然変異を導入する工程と、（ii）前記突然変異が前記ポリヌクレオチド配列の発現またはそれによってコードされたポリペプチドの活性を対照と比較して調節され、またたばこ植物体またはその植物体の部分の硝酸塩および/または合計TSNA含有量および/またはNNKのレベルが調整されている、突然変異体である植物体を獲得する工程とを含む。ある一定の実施形態で、たばこ植物体またはその植物体の部品は乾燥処理済み植物材料である。
【０１１８】
突然変異体を準備するための工程は、当該技術分野において公知であり、遺伝子材料内で無作為な突然変異を生成する、変異原性、催奇性、または発癌性の有機化合物（例えば、エチルメタンスルホン酸塩（EMS））などの外因的に追加した化学物質を使用した突然変異誘発が含まれうる。さらなる例として、工程は、一つ以上の遺伝子工学工程（本明細書で説明されている一つ以上の遺伝子工学工程など）またはその組み合わせを含みうる。さらなる例として、工程は一つ以上の植物体交雑工程を含みうる。また、本明細書の他の箇所で説明した通り、TILLINGも使用しうる。
【０１１９】
ポリペプチドは、変換したかまたは組換え体である宿主細胞をポリペプチドを発現するのに適切な培養条件下で培養することにより準備しうる。結果的として得られる発現済みのポリペプチドは次に、公知の精製プロセスを使用して、その培養物から精製しうる。ポリペプチドの生成は、ポリペプチドに結合される薬剤を含む親和性カラムか、そうした親和性樹脂に対する一つ以上のカラム工程か、疎水性相互作用クロマトグラフィーが関与する一つ以上の工程か、または免疫親和性クロマトグラフィーを含みうる。別の方法として、ポリペプチドは精製を促進する形態で発現されうる。例えば、これは、マルトース結合ポリペプチド、グルタチオン-5-転移酵素またはチオレドキシンのものなど、融合ポリペプチドとして表現されうる。融合ポリペプチドの発現および精製のためのキットは市販されている。ポリペプチドは、抗原決定基でタグ付けして、その後でこうした抗原決定基を配向する特定の抗体を使用して精製しうる。逆相高速液体クロマトグラフィーなどの一つ以上の液体クロマトグラフィー工程を採用して、ポリペプチドをさらに精製することができる。上述の精製工程のいくつかまたは全部を様々な組み合わせで採用して、実質的に均質な組換え体ポリペプチドを提供することができる。こうして精製したポリペプチドは、他のポリペプチドが実質的に含まれていないものとすることができ、本明細書では「実質的に精製されたポリペプチド」と定義され、こうした精製したポリペプチドは、ポリペプチド、断片、変異体、およびこれに類するものを含む。ポリペプチドおよび断片の発現、単離、および精製は、本明細書に記載した方法を含むが、これに限定されない適切な任意の技術によって達成することができる。
【０１２０】
また、発現したポリペプチドの親和性精製をするために、ポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体などの、親和性カラムを利用することも可能である。これらのポリペプチドは、例えば、高濃度塩溶出緩衝液内に入れた後に使用する低めの濃度の塩緩衝液に透析するか、または利用される親和性基質に応じてpHまたはその他の成分を変化させることにより、従来的なテクニックを使用して親和性カラムから除去するか、または親和性部分の天然の基質を使用して競合的に除去することができる。
【０１２１】
ポリペプチドは、公知の従来的な化学合成によっても生成されうる。合成的な手段によりポリペプチドまたはその断片を構成するための方法は、当業者にとって公知である。合成的に構成されたポリペプチド配列は、一次、二次または三次の構造的特性または配座特性を未変性のポリペプチドと共有することによって、生物活性を含めて、それらと共通の生物学的性質を所有しうる。
【０１２２】
本明細書で使用されるとき、「非天然（の）」という用語は、天然では形成されないかまたは天然には存在しない物質（例えば、ポリヌクレオチド、遺伝子突然変異、ポリペプチド、植物体、植物体細胞および植物材料）を意味する。こうした非天然の物質または人工的な物質は、本明細書で説明したか、または当該技術分野において公知の方法によって、作成、合成、開始、修飾、介在、または操作されうる。こうした非天然の物質または人工的な物質は、人によって作成、合成、開始、修飾、干渉、または操作されうる。こうして、一例として、非天然の植物体、非天然の植物体細胞または非天然の植物材料は、伝統的な植物体育種テクニック（戻し交雑など）を使用して、または遺伝子操作技術（アンチセンスRNA、干渉RNA、メガヌクレアーゼおよびこれに類するものなど）により作成されうる。さらなる例として、非天然の植物体、非天然の植物体細胞または非天然の植物材料は、結果的に得られる植物体、植物体細胞または植物材料またはその子孫が天然では形成されないかまたは天然には存在しない遺伝的構成（例えば、ゲノム、染色体またはそのセグメント）を含むように、一つ以上の遺伝的突然変異（例えば、一つ以上の多型）を第一の植物体または植物体細胞から第二の植物体または植物体細胞（これはそれ自体が天然でありうる）に遺伝子移入するかまたは移動することで作成しうる。結果的に得られる植物体、植物体細胞または植物材料は、こうして人工的なものであるか、または天然のものではない。従って、人工的または非天然の植物体または植物体細胞は、結果的に得られる遺伝子配列が第一の植物体または植物体細胞とは異なる遺伝的背景を備える第二の植物体または植物体細胞内で自然発生する場合であっても、第一の天然の植物体または植物体細胞内での遺伝子配列を修飾することにより作成しうる。ある一定の実施形態で、突然変異は、ヌクレオチド配列またはポリペプチド（遺伝子またはタンパク質など）に天然に存在する天然の突然変異ではない。
【０１２３】
遺伝的背景の差異は、表現型的差異により、または核酸配列決定、遺伝的マーカー（例えば、ミクロサテライトRNAマーカー）の存在または不在など、当該技術分野において公知の分子生物学技術により検出できる。
【０１２４】
本明細書で説明したポリペプチドと免疫反応性のある抗体も提供されている。本明細書に記載のある通り、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド、およびこれに類するものは、それと免疫反応性のある抗体の生成において「免疫原」として採用できる。こうした抗体は、抗体の抗原結合部位を介してポリペプチドに特異的に結合されうる。特異的に結合される抗体は、ポリペプチド、相同体、および変異体を特異的に認識しそれと結合するが、他の分子とは結合しない抗体である。一つの実施形態で、抗体は本明細書に記載したアミノ酸配列酸配列を持つポリペプチドに特異的であり、他のポリペプチドとは交差反応しない。
【０１２５】
さらに具体的に言えば、ポリペプチド、断片、変異体、融合ポリペプチド、およびこれに類するものは、抗体の生成を誘発する抗原決定基またはエピトープを含む。これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖状または立体配置的（不連続）のどちらでもよい。直鎖状の抗原決定基は、ポリペプチドのアミノ酸の単一の部分で構成され、一方、立体配置的または不連続のエピトープは、ポリペプチドの折り畳みに伴い近傍にもたらされたポリペプチド鎖鎖の異なる領域からのアミノ酸の部分で構成される。エピトープは、当該技術分野において公知の任意の方法により識別できる。さらに、ポリペプチドに由来するエピトープは、研究用試薬として、アッセイで、および培養したハイブリドーマからのポリクローナル血清または上澄みなどの物質から特定の結合抗体を精製するために、使用できる。こうしたエピトープまたはその変異体は、固体相合成、化学薬品または酵素によるポリペプチドの切断、または組換えDNA技術の使用など、当該技術分野において公知の技術を使用して作成できる。
【０１２６】
ポリペプチドに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方は、従来的な技術により準備することができる。ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ株細胞も、本明細書で意図されている。こうしたハイブリドーマは、従来的な技術により製造・識別ができる。抗体の製造のために、ポリペプチド、断片、変異体、またはその突然変異体を注射することにより、様々な宿主動物を免疫化しうる。こうした宿主動物は、数例を挙げると、ウサギ、マウス、およびラットを含みうるが、これに限定されない。免疫学的反応を増大させるために様々なアジュバントを使用しうる。宿主の種にもよるが、こうしたアジュバントは、Freund's（完全および不完全）、アルミニウム水酸化物などのミネラルゲルや、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノールなどの界面活性剤、および潜在的に有用なBCG（bacille Calmette-Guerin）やコリネバクテリウム・パルヴムなどのヒトアジュバントを含むが、これに限定されない。モノクローナル抗体は、従来的な技術によって回復できる。こうしたモノクローナル抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgD、およびその任意の下位クラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスに属するものとしうる。
【０１２７】
抗体は、生体外でまたは生体内のいずれかでポリペプチドまたは断片の存在を検出するアッセイで使用することもできる。抗体は、免疫親和性クロマトグラフィーによるポリペプチドまたは断片の精製に採用することもできる。
【０１２８】
本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（または本明細書で説明したその任意の組み合わせ）の発現または活性を調節できる組成は、一つ以上の内在性遺伝子の転写を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチドと、RNA転写物（例えば、二本鎖RNA、siRNA、リボザイム）の翻訳を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチドと、一つ以上のタンパク質の安定性を妨害できる配列特異的ポリペプチドと、一つ以上のタンパク質の酵素活性または基質または調節タンパク質に関する一つ以上のタンパク質の結合活性を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチドと、一つ以上のタンパク質について特異性を示す抗体と、一つ以上のタンパク質の安定性または一つ以上のタンパク質の酵素活性または一つ以上のタンパク質の結合活性を妨害できる小分子化合物と、一つ以上のポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガータンパク質と、一つ以上のポリヌクレオチドに対する活性を持つメガヌクレアーゼを含むが、これに限定されない。遺伝子編集技術、遺伝的編集技術およびゲノム編集技術は、当該技術分野において公知である。
【０１２９】
遺伝子編集の一つの方法には、細胞が修復メカニズムに反応できる二本鎖の分解を誘発する、転写活性化剤様差動因子ヌクレアーゼ（TALEN）の使用が関与する。非相同末端結合により、アニーリングのための配列の重複が非常に少ないかまたは全くない二本鎖切断のうちのどちらかの側からDNAが再結合される。この修復機構は、挿入または欠失、または染色体の再配列によるゲノム内の誤りを誘発する。こうした誤りがあると、その位置で遺伝子産物が非機能的なものにコードされる。
【０１３０】
遺伝子編集の別の方法には、細菌性CRISPR/Casシステムの使用が関与する。バクテリアおよび古細菌は、侵入するウィルスDNAおよびプラスミドDNAに対して保護する適応的免疫系の一部である、群生性等間隔短回文反復配列（CRISPR）と呼ばれる染色体要素を示す。Type II CRISPRシステムで、CRISPR RNA（crRNA）は、トランス活性化crRNA（tracrRNA）およびCRISPR関連（Cas）タンパク質と機能して、標的DNAに二本鎖切断を導入する。Cas9による標的の切断は、crRNAとtracrRNAの間の塩基対だけでなく、crRNAと標的DNAの間の塩基対形成を必要とする。標的認識は、配列NGGと一致する、フォトスペーサー隣接モチーフ（PAM）と呼ばれる短いモチーフの存在によって促進される。このシステムは、ゲノム編集用に利用できる。Cas9は通常は、crRNAおよびtracrRNAで構成される二重RNAによってプログラムされる。ただし、これらのRNAのコア成分は、Cas9ターゲティングのために単一の混成体「案内RNA」に組み入れることができる。部位特異的切断のための標的DNAに対する非翻訳RNAガイドの使用が、TALENなどの既存の技術よりも著しく単純明快であることが約束される。CRISPR/Cas法を使用すると、ヌクレアーゼ錯体の再ターゲティングには、新しいRNA配列の導入のみを必要とし、タンパク質転写因子の特異性を設計し直す必要がない。アンチセンス技術は、ポリペプチドの発現の調節に使用できるもう一つの公知の方法である。抑制される遺伝子のポリヌクレオチドは、RNAのアンチセンス鎖が転写されるように、クローン化され、調整部分に作用できるように連結されている。次に、組換え体構築物は植物体に変形し、RNAのアンチセンス鎖が生成される。ポリヌクレオチドが抑制されるために遺伝子の全配列である必要はないが、通常は抑制の対象となる遺伝子のセンス鎖の少なくとも一部分に対して実質的に相補的である。
【０１３１】
ポリヌクレオチドは、mRNAの発現に影響を及ぼすリボザイムまたは触媒RNAに転写しうる。リボザイムは、実際的に任意の標的RNAと特異的に対をなし、リン酸ジエステルバックボーンを特定の位置で切断し、それによって標的RNAを機能的に不活性化するように設計できる。異質組織ポリヌクレオチドは、特定のmRNA転写物を切断するよう設計されたリボザイムをコードでき、こうしてポリペプチドの発現が阻止される。ハンマーヘッド型リボザイムは特定のmRNAを破壊するのに有用であるが、mRNAを部位特異的認識配列で切断する様々なリボザイムを使用することができる。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的mRNAと補完的塩基対を形成するフランキング領域によって指図される位置でmRNAを切断する。唯一の要件は、標的RNAが5'-UG-3'ヌクレオチド配列を含むことである。ハンマーヘッド型リボザイムの構成および製造は、当該技術分野において公知である。ハンマーヘッド型リボザイム配列は、生体内での切断効率を増大させるために、輸送RNA（tRNA）などの安定したRNAに埋め込むことができる。
【０１３２】
一つの実施形態で、RNA転写物の翻訳を妨害できる配列特異的ポリヌクレオチドは干渉RNAである。RNA干渉またはRNAサイレンシングは、進化的に保守的なプロセスであり、そのプロセスによって特定のmRNAを酵素による劣化の標的にすることができる。二本鎖RNA（二本鎖RNA）は、干渉RNA経路を開始するために、細胞（例えば、二本鎖RNAウイルス、または干渉RNAポリヌクレオチド）によって導入または生成される。二本鎖RNAは、二本鎖RNA特異的エンドヌクレアーゼであるRNases IIIによって、長さが21〜23 bpの複数の低分子干渉RNA二重鎖に転換できる。その後で、低分子干渉RNAは、ATP依存性のプロセスによって低分子干渉RNAの巻き戻しを促進するRNA誘発サイレンシング複合体によって認識できる。巻き戻された低分子干渉RNAのアンチセンス鎖は、活性化したRNA誘発サイレンシング複合体を、低分子干渉RNAアンチセンス鎖に相補的な配列を含む標的とされたmRNAに案内する。標的とされたmRNAおよびアンチセンス鎖は、A型らせんを形成でき、A型らせんの主要な溝は活性化したRNA誘発サイレンシング複合体によって認識できる。標的mRNAは、活性化したRNA誘発サイレンシング複合体によって、低分子干渉RNA鎖の5'端の結合部位によって限定される単一の部位で切断できる。活性化したRNA誘発サイレンシング複合体は、別の切断事象を触媒するために再利用できる。
【０１３３】
干渉RNA発現ベクターは、mRNA、pre-mRNA、または関連するRNA変異体の発現レベルを低減することにより、RNA干渉活性を示す干渉RNAポリヌクレオチドをコードする干渉RNA構築物を備えうる。発現ベクターは、本明細書でさらに説明する通り、上流に位置し、干渉RNA構築物に作用できるように連結されたプロモーターを備えうる。干渉RNA発現ベクターは、適切な最小のコアプロモーター、関心の干渉RNA構築物、上流（5'）制御領域、下流（3'）制御領域（転写終結およびポリアデ二レーションシグナルを含む）、および当業者にとって公知である様々な選択マーカーなどのその他の配列を備えうる。
【０１３４】
ポリヌクレオチドは、二重鎖構造（すなわち、アンチセンス鎖と相補的センス鎖とを備えた二本鎖RNA分子）、二本鎖ヘヤピン様の構造、または一本鎖構造（すなわち、アンチセンス鎖のみを備えたssRNA分子）を含む、様々な形態で生成できる。構造は、二重鎖、非対称二重鎖、自己相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を持つ二次的なヘヤピンまたは非対称ヘヤピン構造を含みうる。二本鎖干渉RNAは、酵素学的に二本鎖低分子干渉RNAに変換できる。低分子干渉RNA二重鎖の一本の鎖は、標的mRNAおよび関連するRNA変異体内でアニールして相補配列にすることができる。低分子干渉RNA/mRNA二重鎖は、RNAを複数の部位で配列に依存した方法で切断できるRNA誘発サイレンシング複合体によって認識され、その結果、標的mRNAおよび関連するRNA変異体の劣化がもたらされる。
【０１３５】
二本鎖RNA分子は、幹ループ構造の単一のオリゴヌクレオチドから組み立てた低分子干渉RNA分子であって、ここで低分子干渉RNA分子の自己相補的センスおよびアンチセンス領域が、ポリヌクレオチドベースあるいは非ポリヌクレオチドベースのリンカーによって連結されたものと、二つ以上のループ構造および自己相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を備えた幹を持つ、環状の一本鎖RNAであって、ここで環状のRNAを生体内または生体外で処理して、干渉RNAを媒介する能力のある活性の低分子干渉RNA分子を生成することができるものとを含みうる。
【０１３６】
小ヘアピンRNA分子の使用も意図されている。これらは、逆相補（センス）配列に加えて特定のアンチセンス配列を備え、これは一般にスペーサーまたはループ配列で分離されている。スペーサーまたはループの切断により、それらがアニールして二本鎖RNA分子を形成しうるように、一本鎖のRNA分子およびその逆相補が提供される（随意に、一方または両方の鎖の3'端または5'端での一つ、二つ、三つまたはそれ以上のヌクレオチドの追加または除去につながりうる追加的な処理ステップがある）。スペーサーは、スペーサーの切断（および、随意に、結果的に一方または両方の鎖の3'端または5'端での1つ、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上のヌクレオチドの追加または除去につながりうるその後の処理ステップ）の前に、二本鎖構造（または幹）のアニールと形成をするために、アンチセンスおよびセンス配列を許容する十分な長さのものとすることができる。スペーサー配列は通常、2つの補完的ヌクレオチド配列領域の間に位置する関連性のないヌクレオチド配列であり、これは、二本鎖ポリヌクレオチドにアニールされたときに小ヘアピンRNAを備える。スペーサー配列は一般的に、約3〜約100個のヌクレオチドを含む。
【０１３７】
関心の任意のRNAポリヌクレオチドは、ヘアピン二重鎖を生成するために適切な配列組成、ループサイズ、および幹の長さを選択することで生成できる。ヘアピン二重鎖の幹の長さを設計するための適切な範囲は、少なくとも約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のヌクレオチドの幹長を含むが、これは、約14〜30個のヌクレオチド、約30〜50個のヌクレオチド、約50〜100個のヌクレオチド、約100〜150個のヌクレオチド、約150〜200個のヌクレオチド、約200〜300個のヌクレオチド、約300〜400個のヌクレオチド、約400〜500個のヌクレオチド、約500〜600個のヌクレオチド、および約600〜700個のヌクレオチドなどである。ヘアピン二重鎖のループ長さを設計するための適切な範囲は、ループの長さが約4〜25個のヌクレオチド、約25〜50個のヌクレオチド、あるいはヘアピン二重鎖の幹が相当に長い場合にはより長くなる。ある一定の実施形態で、二本鎖RNAまたはssRNA分子は、長さが約15〜約40個のヌクレオチドである。別の実施形態で、低分子干渉RNA分子は、長さが約15〜約35個のヌクレオチドである二本鎖RNAまたはssRNA分子である。別の実施形態で、低分子干渉RNA分子は、長さが約17〜約30個のヌクレオチドである二本鎖RNAまたはssRNA分子である。別の実施形態で、低分子干渉RNA分子は、長さが約19〜約25個のヌクレオチドである二本鎖RNAまたはssRNA分子である。別の実施形態で、低分子干渉RNA分子は、長さが約21〜約23個のヌクレオチドである二本鎖RNAまたはssRNA分子である。ある一定の実施形態で、21個ヌクレオチドを上回る二重鎖領域を備えるヘヤピン構造は、ループの配列および長さに関係なく、効果的な低分子干渉RNA依存性のサイレンシングを促進しうる。RNA干渉の模範的配列は、配列番号8または配列番号9に規定されている。
【０１３８】
標的mRNA 配列は通常、長さが約14〜約50個のヌクレオチドである。従って、標的mRNAは長さが約14〜約50個のヌクレオチドの領域についてスキャンできるが、これは標的配列について、A+T/G+C比率が約2:1〜約1:2であること、標的配列の5'端にAA ジヌクレオチドまたはCA ジヌクレオチドがあること、標的mRNAに対して一意の少なくとも連続して10個のヌクレオチドの配列があること（すなわち、配列が、同じ植物体に由来する別のmRNA配列内には存在しない）、ならびに三つ以上の連続的なグアニン（G）ヌクレオチドまたは三つ以上の連続的なシトシン（C）ヌクレオチドの「並び」がないこと、といった基準を一つ以上満たすことが好ましい。これらの基準は、当該技術分野において公知の様々なテクニックを使用して評価でき、例えば、BLASTなどのコンピュータプログラムを公に利用可能なデータベースの検索に使用して、選択した標的配列が標的mRNAに対して一意であるかどうかを判断できる。別の方法として、標的配列は、市販されているコンピュータソフトウェア（例えば、市販品であるOligoEngine、Target Finderおよび低分子干渉RNA設計ツール）を使用して選択できる（また低分子干渉RNA配列を設計できる）。
【０１３９】
一つの実施形態で、標的mRNA配列は、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約14〜約30個のヌクレオチドであるものが選択される。別の実施形態で、標的の配列は、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約16〜約30個のヌクレオチドであるものが選択される。さらなる実施形態で、標的の配列は、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約19〜約30個のヌクレオチドであるものが選択される。別の実施形態で、標的の配列は、上記の基準のうち一つ以上を満たす、長さが約19〜約25個のヌクレオチドであるものが選択される。
【０１４０】
模範的な一つの実施形態で、低分子干渉RNA分子は、本明細書で説明したポリヌクレオチド配列のどれか一つの少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、またはそれ以上の連続するヌクレオチドに対して相補的な特定のアンチセンス配列を備える。
【０１４１】
低分子干渉RNA分子を含む特定のアンチセンス配列は、標的配列の相補体と同一または実質的に同一とすることができる。一つの実施形態で、低分子干渉RNA分子を含む特定のアンチセンス配列は、標的mRNA配列の相補体と少なくとも約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%だけ同一である。配列同一性を決定する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、University of Wisconsin Computer Group（GCG）ソフトウェアのBLASTNプログラム、またはNCBIウェブサイトで提供されているものを使用して決定することができる。
【０１４２】
低分子干渉RNA分子の特定のアンチセンス配列は、標的mRNAの配列の一つ、二つ、三つ、四つまたはそれ以上のヌクレオチドで変化（例えば、ヌクレオチド置換により、移行またはトランスバージョンを含む）をさせることにより、可変性を示しうる。こうしたヌクレオチド置換が二本鎖RNA分子のアンチセンス鎖内に存在するとき、それを用いて置換ヌクレオチドが一般に水素結合塩基対を形成するセンス鎖内の相補的ヌクレオチドは、それに伴い置換されることも置換されないこともある。一つ以上のヌクレオチド置換がセンス配列内で発生しているが、アンチセンス鎖では発生していない、二本鎖RNA分子も意図されている。低分子干渉RNA分子のアンチセンス配列が、上述の通り、低分子干渉RNAのヌクレオチド配列と標的ヌクレオチド配列との間の一つ以上のミスマッチを含むとき、そのミスマッチは、3'終端、5'終端またはアンチセンス配列の中央部分部分に存在しうる。
【０１４３】
別の実施形態で、低分子干渉RNA分子は、天然の標的遺伝子または標的mRNAの一部に対して、厳密な条件の下で選択的にハイブリッド形成する能力を持つ特定のアンチセンス配列を備える。当業者にとって公知の通り、ハイブリッド形成条件の厳密性のばらつきは、ハイブリッド形成および洗浄の工程に使用する時間、温度または溶液の濃度を変化させることにより達成されうる。また、適切な条件は、使用する特定のヌクレオチド配列、例えば、標的mRNAまたは遺伝子の配列に部分的に依存することがある。
【０１４４】
植物体での二本鎖RNA-サイレンシングを誘発するための一つの方法は、ヘアピンRNAを生成する遺伝子構築物を用いた形質転換である（Smith et al. (2000) Nature, 407, 319-320を参照）。こうした構築物は、適切なスペーサーにより分離された標的遺伝子配列の逆の領域を含む。スペーサー断片として機能的植物体イントロン領域を挿入することでさらに、イントロンがスプライスされたヘアピンRNAが生成されるため、遺伝子サイレンシング誘導の効率が高まる（Wesley et al. (2001) Plant J., 27, 581-590）。幹の長さは、約50個のヌクレオチド〜約1キロベースであることが適切である。イントロンスプライスしたヘアピンRNAを生成するための方法は、当該技術分野で十分に説明されている（例えば、Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617を参照）。
【０１４５】
二重鎖または二本鎖構造を持つ干渉RNA分子（例えば、二本鎖RNAまたは小ヘアピンRNA）は、ブラントエンドを持つことができ、また3'または5'オーバーハングを持つことができる。本明細書で使用されるとき、「オーバーハング」は、一方のRNA鎖の3'-終端が他方の鎖の5'-終端を越えて延びるとき（3'オーバーハング）、またはその逆のとき（5'オーバーハング）に、二重鎖構造から突き出している、対をなしていないヌクレオチド（単一もしくは複数）を意味する。オーバーハングを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはそれらの変性バージョンとすることができる。一つの実施形態で、干渉RNA分子の少なくとも一つの鎖は、約1〜約6個のヌクレオチドの3'オーバーハングを持つ。その他の実施形態で、3'オーバーハングは、長さが約1〜約5個のヌクレオチド、約1〜約3個のヌクレオチドおよび約2〜約4個のヌクレオチドである。
【０１４６】
干渉RNA分子が分子の一方の端で3'オーバーハングを含むとき、他方の端は、平滑末端とするか、または同様にオーバーハング（5'または3'）を持つことができる。干渉RNA分子が分子の両方の端にオーバーハングを含むとき、オーバーハングの長さは同一または異なる長さとしうる。一つの実施形態で、干渉RNA分子は、分子の両端で約1〜約3個のヌクレオチドの3'オーバーハングを含む。さらなる実施形態で、干渉RNA分子は、分子の両端に2個のヌクレオチドの3'オーバーハングを持つ二本鎖RNAである。なお別の実施形態で、干渉RNAのオーバーハングを含むヌクレオチドは、TTジヌクレオチドまたはUUジヌクレオチドである。
【０１４７】
一つ以上のオーバーハングを含む干渉RNA分子の標的mRNA配列に対する同一性のパーセント値を決定するとき、オーバーハングは考慮に入れても入れなくてもよい。例えば、3' オーバーハングからのヌクレオチドおよび二本鎖の5'-または3'-終端からの最高2個のヌクレオチドは、低分子干渉RNA分子の活性を大幅に損失することなく修飾しうる。
【０１４８】
干渉RNA分子は、一つ以上の5'または3'-キャップ構造を含むことができる。干渉RNA分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の3'終端に、干渉RNA分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方の5'終端に、キャップ構造を含むことができる。別の方法として、干渉RNA分子は、干渉RNA分子の3'終端および5'終端の両方にキャップ構造を含むことができる。「キャップ構造」という用語は、オリゴヌクレオチドのいずれかの終端に組み入れられる化学的修飾を意味し、これはエキソヌクレアーゼ劣化から分子を保護し、また細胞内での送達または局在化の促進もしうる。
【０１４９】
干渉RNA分子に適用可能な別の修飾は、一つ以上の部分または共役体の干渉RNA分子への化学的連結であり、これは、干渉RNA分子の活性、細胞の分布、細胞の摂取、生物学的利用能または安定性を高める。ポリヌクレオチドは、当該技術分野で十分に確立された方法によって合成または修飾をしうる。化学的修飾は、2'修飾、非天然の塩基の導入、リガンドへの共有結合、およびリン酸塩結合とチオリン酸塩結合の置換を含みうるが、これに限定されない。この実施形態で、二重鎖構造の完全性は、少なくとも一つ、および一般には二つの化学的結合によって強化される。化学的結合は、様々な公知の技術のうちどれかによって達成しうるが、例えば、共有結合、イオン結合または水素結合の導入や、疎水性相互作用、ファンデルワールスまたはスタッキング相互作用や、金属イオン配位によるか、またはプリン類似物の使用によるものなどがある。
【０１５０】
2つの一本鎖の一方または両方でのヌクレオチドは、例えば、限定はされないが、ある一定のヌクレアーゼなど、細胞の酵素の活性化を調節するために修飾しうる。細胞の酵素の活性化を低減または抑制するための技術は、当該技術分野において公知であり、2'-アミノ修飾、2'-フルオロ修飾、2'-アルキル修飾、無電荷のバックボーン修飾、モルホリノ修飾、2'-O-メチル修飾、およびホスホルアミド酸を含むが、これに限定されない。こうして、二本鎖RNA上のヌクレオチドの少なくとも一つの2'-ヒドロキシル基が化学基によって置換される。また、少なくとも一つのヌクレオチドは、ロックトヌクレオチドを形成するために修飾しうる。こうしたロックトヌクレオチドは、リボースの2'-酸素をリボースの4'-炭素と結合するメチレン架橋またはエチレン架橋を含む。オリゴヌクレオチドへのロックトヌクレオチドの導入により、相補配列に対する親和性が改善され、融解温度が数度だけ上昇する。
【０１５１】
リガンドは、例えば、その細胞吸収を高めるために干渉RNA分子に結合されうる。ある一定の実施形態で、疎水性リガンドは、細胞の薄膜の直接的な浸透を促進するために分子と結合される。これらのアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞浸透を促進するために使用されてきた。ある一定の事例で、陽イオン性のリガンドをオリゴヌクレオチドに結合させることで、結果的にヌクレアーゼに対する抵抗性が改善されることがよくある。陽イオン性リガンドの代表例は、プロピルアンモニウムおよびジメチルプロピルアンモニウムを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、陽イオン性リガンドがオリゴヌクレオチド全体に分散されたとき、mRNAに対するそれらの高い結合親和性を保持できる。
【０１５２】
本明細書で説明した分子およびポリヌクレオチドは、固体相合成の公知のテクニックを使用して準備しうる。当該技術分野において公知の合成のためのその他何らかの手段を、追加的にまたは別の方法として採用しうる。
【０１５３】
「Targeted Induced Local Lesions In Genomes（ゲノム中の標的化誘発局所的損傷）」（TILLING）は、発現および/または活性が修飾されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの生成および/または特定に使用できる、もう一つの突然変異誘発技術である。TILLINGでは、こうした突然変異体を持つ植物体の選択も許容される。TILLINGは、高密度の突然変異誘発を、高スループットのスクリーニング方法と組み合わせている。TILLINGの方法は、当該技術分野において公知である（McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457およびStemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50を参照）。
【０１５４】
様々な実施形態は、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドを含む、一つ以上のポリヌクレオチドまたは干渉RNA構築物を備える発現ベクターを対象とする。
【０１５５】
様々な実施形態は、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドまたは一つ以上の干渉RNA構築物を含む、発現ベクターを対象とする。
【０１５６】
様々な実施形態は、自己アニーリングしてヘヤピン構造を形成する能力を持つ、本明細書で説明した一つ以上の干渉RNAポリヌクレオチドをコードする、一つ以上のポリヌクレオチドまたは一つ以上の干渉RNA構築物を含む発現ベクターを対象とするが、ここで構築物は、（a）本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドと、（b）ヘヤピン構造のループを形成する第二の配列と、（c）第一の配列の逆相補配列を含み、第一の配列と同一の方向に位置する第三の配列とを含み、また、第二の配列は、第一の配列と第三の配列の間に配置され、第二の配列は、第一の配列と第三の配列と作用できるように連結されている。
【０１５７】
開示された配列は、ヘヤピン構造を形成しない様々なポリヌクレオチドの構成に利用できる。例えば、二本鎖RNAは、（1）DNAの第一の鎖を第一のプロモーターに作用できるように結合することにより転写し、（2）DNA断片の第一の鎖の逆相補配列を第二のプロモーターに作用できるように結合することにより転写して、形成できる。ポリヌクレオチドのそれぞれの鎖は、同一の発現ベクターから、または異なる発現ベクターから転写できる。RNA干渉活性を持つRNA二重鎖は、酵素学的に低分子干渉RNAに変換してRNAレベルを調節できる。
【０１５８】
こうして、様々な実施形態は、自己アニーリングが可能な干渉RNAポリヌクレオチドをコードする、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドまたは干渉RNA構築物を含む発現ベクターを対象とするが、ここで、構築物は、（a）一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドと、（b）第一の配列と同一の方向に配置された第一の配列の相補的（例えば、逆相補的）配列を含む第二の配列とを含む。
【０１５９】
一つ以上の本明細書で説明したポリペプチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の内在性発現レベルを、遺伝子発現のコサプレッションを促進することにより調節するための様々な組成および方法が提供されている。コサプレッションの現象は、導入遺伝子の複数のコピーを植物体細胞宿主に導入した結果として発生する。導入遺伝子の複数のコピーの組み込みによって、結果的に、導入遺伝子および標的とされた内在性遺伝子の発現が調節されうる。コサプレッションの度合いは、導入遺伝子と標的とされた内在性遺伝子との間の配列同一性の度合いに依存する。内在性遺伝子と導入遺伝子の両方のサイレンシングは、転写を除外できるサイレンスト座位（すなわち、関心の内在性のプロモーターおよび内在性の遺伝子）の広範囲なメチル化によって発生しうる。これとは別に、一部のケースでは、内在性遺伝子および導入遺伝子のコサプレッションは転写後の遺伝子サイレンシングによって発生することがあり、ここで転写物は生成できるものの、劣化の率が高まり、転写物の蓄積が妨げられる。転写後遺伝子サイレンシングによるコサプレッションのメカニズムは、RNAが重要な発動因子でありかつこれらのプロセスにおける標的であると考えられる点で、RNA干渉と似たものであると考えられ、また、同じ分子機構によって少なくとも部分的に、恐らくmRNAのRNA誘導性の劣化によって媒介されうる。
【０１６０】
核酸のコサプレッションは、核酸またはその断片の複数のコピーを、導入遺伝子として関心の植物体のゲノムに組み入れることによって達成できる。宿主植物体は、核酸またはその断片に作用できるように連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて変形させることができる。様々な実施形態は、ポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターを含む内在性遺伝子のコサプレッションを促進するための発現ベクターを対象とする。
【０１６１】
様々な実施形態は、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りのその任意の組み合わせ）の発現レベルを、ポリヌクレオチドの複数のコピーを（たばこ）植物体ゲノムに組み入れることにより調節するための方法を対象とするが、これには、植物体細胞宿主をポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて変形させる工程が含まれる。
【０１６２】
mRNAの翻訳を調節することによって内在性遺伝子の発現レベルを調節するための様々な組成および方法が提供されている。宿主（たばこ）植物体細胞は、ポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターであって、mRNAの一部に対して相補配列を持つRNAポリヌクレオチドの発現を可能にするために、プロモーターに対してアンチセンスの方向に配置されているプロモーターを含む発現ベクターを用いて変形させることができる。
【０１６３】
mRNAの翻訳を調節するための様々な発現ベクターは、ポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターを備えうるが、ここで、その配列はプロモーターに対してアンチセンス方向に配置される。アンチセンスRNAポリヌクレオチドの長さは変動させることができ、約15〜20個のヌクレオチド、約20〜30個のヌクレオチド、約30〜50個のヌクレオチド、約50〜75個のヌクレオチド、約75〜100個のヌクレオチド、約100〜150個のヌクレオチド、約150〜200個のヌクレオチド、および約200〜300個のヌクレオチドとしうる。
【０１６４】
突然変異体のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを獲得するための方法も提供されている。植物体細胞または植物材料を含めた、関心の任意の植物体は、突然変異を誘発することが知られている様々な方法により遺伝的に修飾でき、これには、部位特異的変異誘発、オリゴヌクレオチドを標的とした変異誘発突然変異誘発、化学的に誘発された突然変異誘発、照射誘発された突然変異誘発、修飾塩基を利用した突然変異誘発、ギャップ二重鎖DNAを利用した突然変異誘発、二本鎖分解突然変異誘発、修復欠損宿主系統を利用した突然変異誘発、合計遺伝子合成による突然変異誘発、DNAシャフリングおよびその他の同等な方法が含まれる。
【０１６５】
別の方法として、遺伝子は、トランスポゾン（例えば、IS要素）を関心の植物体のゲノムに導入することにより、不活性化のための標的にすることができる。これらの可動遺伝要素は、有性の交配によって導入でき、挿入変異をタンパク質活性の損失についてスクリーニングできる。親株内で分裂させた遺伝子は、親株をトランスポゾン誘発突然変異誘発の対象ではない植物体と、例えば、有性交配によって交雑させることで、他の植物体に導入できる。当業者にとって公知の任意の標準的な育種テクニックを利用できる。一つの実施形態で、一つ以上の遺伝子は、一つ以上のトランスポゾンの挿入により不活性化できる。突然変異によって、結果的に、一つ以上の遺伝子の同型接合の分裂、一つ以上の遺伝子の異型接合の分裂、または複数の遺伝子が分裂した場合に同型接合および異型接合の破壊の両方の組み合わせにつながることがある。適切な置き換え可能な要素は、レトロトランスポゾン、レトロポゾン、およびSINE様の要素を含む。こうした方法は、当業者にとって公知である。
【０１６６】
別の方法として、遺伝子は、自己切断および複製の能力がある数多くの小さな環状RNAに由来するリボザイムを植物体に導入することにより、不活性化のための標的にできる。これらのRNAは、単独（ウイロイドRNA）で、またはヘルパーウイルス（サテライトRNA）と共にのいずれかで複製ができる。適切なRNAの例には、アボカドサンブロッチウイロイドに由来するもののほか、たばこ輪点ウイルス、ルーサン一過性条斑ウイルス、ベルベットたばこ斑紋ウイルス、テリミノイヌホオズキ斑紋ウイルス、および地下性クローバ斑点ウイルスに由来するサテライトRNAが含まれる。様々な標的RNA特異的リボザイムが、当業者に知られている。
【０１６７】
一部の実施形態で、ポリペプチドの発現は、遺伝子内での突然変異の生成など、非遺伝子組換え手段によって調節される。突然変異を遺伝子配列内に無作為に導入する方法には、化学薬品突然変異誘発、EMS突然変異誘発および放射線突然変異誘発を含めることができる。一つ以上の標的の突然変異を細胞内に導入する方法には、ゲノム編集技術、特にジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発、TILLING（targeting induced local lesions in genomes：ゲノム中の標的化誘発局所的損傷）、相同的組換え組換え、オリゴヌクレオチドを標的とした変異誘発、およびメガヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発が含まれるが、これに限定されない。
【０１６８】
突然変異のいくつかの非限定的な例としては、少なくとも一つのヌクレオチド欠失、挿入およびミスセンス突然変異、単一のヌクレオチド多型および単純な配列繰り返しがある。突然変異の後、早熟の終止コドンまたはそれ以外での非機能的な遺伝子を生成した突然変異を特定するためにスクリーニングを実施できる。突然変異の後、高いレベルで発現される能力を持つ機能的な遺伝子を生成した突然変異を特定するためにスクリーニングを実施できる。突然変異体のスクリーニングは、配列決定により、または遺伝子またはタンパク質に対して特異的な一つ以上のプローブまたはプライマーを使用することにより実施できる。遺伝子発現の調節、mRNAの安定性の調節、またはタンパク質の安定性の調節をもたらすことができる、ポリヌクレオチド内での特定の突然変異も生成できる。こうした植物体は、本明細書では、「非天然の」または「突然変異体」植物体と呼ぶ。一般に、突然変異体または非天然の植物体には、操作される前には植物体内に存在しなかった、外来性または合成的な、または人造の核酸（例えば、DNAまたはRNA）の少なくとも一部が含まれるようになる。外来性の核酸は、単一のヌクレオチド、二つ以上のヌクレオチド、二つ以上の連続するヌクレオチドまたは二つ以上の非連続的なヌクレオチド、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400または1500個またはそれ以上の連続的または非連続的なヌクレオチドなどとしうる。
【０１６９】
突然変異体または非天然の植物体は、結果的にタンパク質レベルが調節される一つ以上の突然変異の任意の組み合わせを持つことができる。例えば、突然変異体または非天然の植物体は、単一の遺伝子内での単一の突然変異、単一の遺伝子内での複数の突然変異、二つ以上または三つ以上の遺伝子内での単一の突然変異、または二つ以上または三つ以上の遺伝子内での複数の突然変異を持ちうる。さらなる例として、突然変異体または非天然の植物体は、タンパク質またはその一部分の活性部位をコードする遺伝子の一領域内でなど、遺伝子の特定の部分内での一つ以上の突然変異を持ちうる。さらなる例として、突然変異体または非天然の植物体は、遺伝子の活性または発現を調節する場合に、それが調節する遺伝子の上流または下流の一領域内などの一つ以上の遺伝子の外側の一領域に、一つ以上の突然変異を持ちうる。上流要素には、プロモーター、エンハンサーまたは転写因子を含めることができる。一部の要素（エンハンサーなど）は、調整する遺伝子の上流または下流に位置することができる。一部の要素は、それが調節する遺伝子の数十万塩基対だけ上流または下流に位置することがこれまでに判明しているため、要素はそれが調節する遺伝子の近くに位置する必要はない。突然変異体または非天然の植物体は、遺伝子の最初のヌクレオチド100個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド200個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド300個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド400個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド500個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド600個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド700個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド800個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド900個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド1000個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド1100個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド1200個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド1300個以内、遺伝子の最初のヌクレオチド1400個以内または遺伝子の最初のヌクレオチド1500個以内に位置する、一つ以上の突然変異を持ちうる。突然変異体または非天然の植物体は、遺伝子の100個のヌクレオチドの第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11、第12、第13、第14または第15番目の組内またはその組み合わせに位置する一つ以上の突然変異を持ちうる。突然変異ポリペプチド変異体を含む突然変異体または非天然の植物体（例えば、本明細書で説明した通り、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体およびこれに類するもの）が開示されている。
【０１７０】
一つの実施形態で、植物体からの種子は突然変異誘発された後、第一世代突然変異体の植物体に栽培される。次に、第一世代の植物体は、自家受粉がなされ、第一世代植物体からの種子が第二世代の植物体に栽培され、次にこれがその座位で突然変異についてスクリーニングされる。突然変異について突然変異を誘発する植物材料をスクリーニングすることはできるが、第二世代の植物体をスクリーニングすることの利点は、細胞体のすべての突然変異が生殖細胞系列変異に対応することである。当業者であれば、突然変異体である植物体を生成するために、種子、花粉、植物体組織または植物体細胞を含むがこれに限定されない様々な植物材料が突然変異誘発しうることを理解することになる。ただし、突然変異誘発した植物材料のタイプは、植物体の核酸がいつ突然変異についてスクリーニングを受けるかに影響しうる。例えば、非突然変異誘発性植物体の受粉前に花粉が突然変異誘発の対象となるとき、その受粉の結果生じる種子は第一世代植物体に栽培される。第一世代の植物体の各細胞は、花粉内で生成された突然変異を含むことになり、こうしてこれらの第一世代の植物体はその後、第二世代まで待たずに突然変異についてスクリーニングを受けうる。
【０１７１】
主に点突然変異および短い欠失、挿入、塩基転換、および/又は遷移を生成する突然変異原は、化学的突然変異原または放射線を含めて、突然変異を生成するために使用しうる。突然変異原は、エチルメタンスルホン酸塩、メチルメタンスルホン酸塩、N-エチル-N-ニトロソウレア、トリエチルメラミン、N-メチル-N-ニトロソウレア、プロカルバジン、クロランブシル、シクロホスファミド、ジエチル硫酸塩、アクリルアミドモノマー、メルファラン、ナイトロジェン・マスタードカラシナ、ビンクリスチン、ジメチルニトロソアミン、N-メチル-N'-ニトロ-ニトロソグアニジン、ニトロソグアニジン、2-アミノプリン、7,12 ジメチル-ベンズ（a）アントラセン、酸化エチレン酸化物、ヘキサメチルホスホルアミド、ビスルファン、ジエポキシアルカン（ジエポキシオクタン、ジエポキシブタン、およびこれに類するもの）、2-メトキシ-6-クロロ-9[3-(エチル-2-クロロ-エチル）アミノプロピルアミノ]アクリジン二塩酸塩およびホルムアルデヒドを含むが、これに限定されない。
【０１７２】
突然変異原が直接原因ではなかったかもしれない座での天然の突然変異も、それらが結果的に望ましい表現型をもたらす場合には意図されている。適切な変異原性物質には、例えば、イオン化放射線（X線、γ線、速中性子照射およびUV放射放射線など）も含めることができる。突然変異スクリーニングのための植物体核酸を準備するために、当業者にとって公知の植物体の核酸を準備する任意の方法を使用しうる。
【０１７３】
個体植物体、植物体細胞、または植物材料から準備した核酸は、随意に、突然変異誘発性の植物体組織、細胞または材料を起源とする植物体の母集団内で、突然変異についてのスクリーニングを促進させるためにプールすることができる。植物体、植物体細胞または植物材料のその後の一世代以上の世代をスクリーニングできる。随意にプールされる群のサイズは、使用するスクリーニング方法の感受性に依存する。
【０１７４】
核酸試料が随意にプールされた後、それらを、ポリメラーゼ連鎖反応などのポリヌクレオチド特異的増幅テクニックの対象とすることができる。遺伝子のすぐ隣にある遺伝子または配列に特異的な一つ以上の任意のプライマーまたはプローブは、随意にプールされた核酸試料内で配列を増幅するために利用しうる。一つ以上のプライマーまたはプローブは、有用な突然変異が最も発生する可能性の高い座の領域を増幅するよう設計されていることが適切である。プライマーは、ポリヌクレオチドの領域内での突然変異を検出するように設計されることが最も好ましい。さらに、プライマーおよびプローブは、点突然変異についてのスクリーニングを容易にするために、既知の多型の部位を避けることが好ましい。増幅生成物の検出を促進するために、一つ以上のプライマーまたはプローブを従来的な任意の標識付け方法を使用して標識付けしうる。プライマーまたはプローブは、当該技術分野でよく理解されている方法を使用して、本明細書で説明した配列に基づき設計できる。
【０１７５】
増幅生成物の検出を促進するために、プライマーまたはプローブを従来的な任意の標識付け方法を使用して標識付けしうる。これらは、当該技術分野でよく理解されている方法を使用して、本明細書で説明した配列に基づき設計できる。
【０１７６】
多型は、当該技術分野において公知の手段により識別しうるが、いくつかがこれまでに文献に記載されている。
【０１７７】
さらなる態様で、突然変異体である植物体を準備する方法が提供されている。方法には、本明細書で説明した機能的ポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）をコードする遺伝子を含む、植物体の少なくとも一つの細胞の提供が関与する。次に、植物体の少なくとも一つの細胞が、本明細書で説明したポリヌクレオチドの活性を調節するのに効果的な条件下で処理される。次に、少なくとも一つの突然変異体である植物体細胞は、突然変異体である植物体内に増殖させられるが、そこで突然変異体である植物体は、対照植物体のそれと比較して調節された説明したポリペプチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）のレベルを持つ。突然変異体である植物体を作成するこの方法の一つの実施形態で、処理手順には、上述の通り、および少なくとも一つの突然変異体である植物体細胞を得るのに効果的な条件下で、少なくとも一つの細胞を化学的突然変異誘発物質に晒す段階が関与する。この方法の別の実施形態で、処理手順には、少なくとも一つの細胞を少なくとも一つの突然変異体である植物体細胞を得るのに効果的な条件下で線源に晒す段階が関与する。「突然変異体である植物体」という用語は、対照植物体と比較して遺伝子型が修飾され、それが遺伝子工学または遺伝的修飾以外の手段によることが適切である、突然変異体である植物体が含まれる。
【０１７８】
ある一定の実施形態で、突然変異体である植物体、突然変異体である植物体細胞、または突然変異体である植物材料は、別の植物体、植物体細胞または植物材料で自然に発生し、望ましい特性を与える一つ以上の突然変異を備えうる。この突然変異は、別の植物体、植物体細胞、または植物材料（例えば、突然変異が誘導された植物体とは異なる遺伝的背景を持つ植物体、植物体細胞または植物材料）に組み込んで（例えば、遺伝子移入）、それに対する特性を与えることができる。こうして一例として、第一の植物体で自然に発生した突然変異が第二の植物体（第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ第二の植物体など）に導入されうる。従って当業者は、本明細書で説明した望ましい特性を与える遺伝子の一つ以上の突然変異体対立形質をそのゲノム内に自然に持つ植物体を、検索し特定することができる。自然に発生する突然変異体対立遺伝子は、本明細書で説明した遺伝子で一つ以上の突然変異を持つ系統、品種または混成体を生成するために、育種、戻し交配および遺伝子移入を含む様々な方法により、第二の植物体に移動させることができる。望ましい特性を示す植物体は、突然変異体である植物体のプールからスクリーニングして除外しうる。選択は、本明細書で説明したヌクレオチド配列の知識を利用して実施されることが適切である。従って、対照と比較した遺伝的特性についてのスクリーニングが可能である。こうしたスクリーニングのアプローチには、本明細書で説明した通り従来的な核酸増幅および/またはハイブリッド形成テクニックの適用が関与しうる。こうして、本発明のさらなる態様は、突然変異体である植物体を識別する方法に関連するが、この方法は、 （a）植物体に由来する核酸を含む試料を提供する工程と、（b）ポリヌクレオチドの核酸配列を決定する工程とを含み、ここで対照植物体のポリヌクレオチド配列と比較したポリヌクレオチドの配列の差異は、前記植物体が突然変異体である植物体であることを示す。別の態様で、対照植物体と比較して、少なくともNNKおよび/または硝酸塩のレベルの低下が蓄積される突然変異体である植物体を識別するための方法が提供されており、この方法は、 （a）スクリーニングの対象となる植物体に由来する資料を提供する工程と、（b）前記試料が一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド内で一つ以上の突然変異を含むかどうかを判断する工程と、（c）（i）硝酸塩含有量、および/または（ii）少なくとも前記植物体のNNK含有量を決定する工程とを含む。少なくともNNKおよび/または硝酸塩含有量は、緑葉中で決定されることが適切である。別の態様で、対照植物体と比較して、少なくともNNKおよび/または硝酸塩のレベルが低下した突然変異体である植物体を準備するための方法が提供されており、この方法は、 （a）第一の植物体に由来する資料を提供する工程と、（b）前記試料が結果的に少なくともNNKおよび/または硝酸塩のレベルが低下した一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド内に一つ以上の突然変異を含むかどうかを判断する工程と、（c）一つ以上の突然変異を第二の植物体に移動させる工程とを含む。NNKおよび/または硝酸塩含有量は、緑葉中で決定されることが適切である。突然変異は、遺伝子組換え、遺伝子操作、遺伝子移入、植物体育種、戻し交配、およびこれに類するものによるなど、当該技術分野において公知の様々な方法を使用して、第二の植物体に移動できる。一つの実施形態で、第一の植物体は、天然の植物体である。一つの実施形態で、第二の植物体は、第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ。別の態様で、対照植物体と比較して、少なくともNNKおよび/または硝酸塩のレベルが低下した突然変異体である植物体を準備するための方法が提供されており、この方法は、 （a）第一の植物体に由来する資料を提供する工程と、（b）前記試料が結果的に少なくともNNKおよび/または硝酸塩のレベルが低下した一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド内に一つ以上の突然変異を含むかどうかを判断する工程と、（c）第一の植物体に由来する一つ以上の突然変異を第二の植物体に遺伝子移入する工程とを含む。NNKおよび/または硝酸塩含有量は、緑葉中で決定されることが適切である。一つの実施形態で、遺伝子移入の工程は、植物体育種を含み、随意に、戻し交配およびこれに類するものを含む。一つの実施形態で、第一の植物体は、天然の植物体である。一つの実施形態で、第二の植物体は、第一の植物体とは異なる遺伝的背景を持つ。一つの実施形態で、第一の植物体は、栽培品種または優良栽培品種ではない。一つの実施形態で、第二の植物体は、栽培品種または優良栽培品種である。さらなる態様は、本明細書に記載した方法によって獲得されたか、または獲得可能な突然変異体である植物体（栽培品種または優良栽培品種の突然変異体植物体を含む）に関連する。ある一定の実施形態で、「突然変異体である植物体」は、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドの配列内など、植物体の特定の領域にのみ局所化された一つ以上の突然変異を持ちうる。この実施形態によれば、突然変異体である植物体の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物体と同一となるかまたは実質的に同一となる。
【０１７９】
ある一定の実施形態で、突然変異体である植物体は、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドの配列内およびゲノムの一つ以上のさらなる領域など、植物体の複数の領域に局所化された一つ以上の突然変異を持ちうる。この実施形態によれば、突然変異体である植物体の残りのゲノム配列は、突然変異誘発前の植物体と同一ではなくなるか、または実質的に同一ではなくなる。ある一定の実施形態で、突然変異体である植物体は、本明細書で説明したポリヌクレオチドの一つ以上、二つ以上、三つ以上、四つ以上または五つ以上のエキソンでは一つ以上の突然変異があってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドの一つ以上、二つ以上、三つ以上、四つ以上または五つ以上のインロロンでは一つ以上の突然変異を持ってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドのプロモーターでは、一つ以上の突然変異をもってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドの3’非翻訳領域では、一つ以上の突然変異をもってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドの5’非翻訳領域では、一つ以上の突然変異をもってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドのコード領域では、一つ以上の突然変異をもってはならないか、または本明細書で説明したポリヌクレオチドの非コード領域またはその二つ以上、三つ以上、四つ以上、五つ以上、または六つ以上のその部分の任意の組み合わせでは、一つ以上の突然変異をもってはならない。
【０１８０】
さらなる態様で、本明細書で説明したポリヌクレオチドをコードする遺伝子内に突然変異を含む植物体、植物体細胞または植物材料を識別するための方法が提供されており、この方法が、 （a）植物体、植物体細胞または植物材料に突然変異誘発を起こさせる工程と、（b）前記植物体、植物体細胞または植物材料またはその子孫から核酸試料を獲得する工程と、（c）本明細書で説明したポリヌクレオチドまたは変異体またはその断片をコードする遺伝子の核酸配列を決定する工程とを含み、ここで、前記配列の差異はその中での一つ以上の突然変異を示す。
【０１８１】
ジンクフィンガータンパク質は、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドの発現または活性を調整するために使用できる。各種の実施形態で、ポリヌクレオチドのコード配列の一部または全部を含むゲノムDNA配列が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発により修飾される。ゲノムDNA配列で、ジンクフィンガータンパク質結合のための一意の部位が検索される。別の方法として、ゲノムDNA配列で、ジンクフィンガータンパク質結合のための2つの一意の部位が検索されるが、ここで、両方の部位は反対の鎖上にあり、例えば、1、2、3、4、5、6またはそれ以上の塩基対だけ離れた互いに近い場所にある。従って、ポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガータンパク質が提供されている。
【０１８２】
ジンクフィンガータンパク質は、遺伝子内の選択した標的部位を認識するよう設計しうる。ジンクフィンガータンパク質は、ファージディスプレー選択、細菌性ツーハイブリッド選択または細菌性ワンハイブリッド選択などがあるがこれに限定されない選択方法に連結された、切断または拡張または部位特異的変異誘発の過程によって、天然のジンクフィンガーDNA結合ドメインと非天然のジンクフィンガーDNA結合ドメインとから得られたモチーフの任意の組み合わせを含むことができる。「非天然のジンクフィンガーDNA結合ドメイン」という用語は、標的の核酸内にあり修飾の対象となる核酸を含む細胞または生物体内では発生しない、3塩基対配列を結合するジンクフィンガーDNA結合ドメインを意味する。標的遺伝子に対して一意である特定のヌクレオチド配列を結合するジンクフィンガータンパク質の設計のための方法は、当該技術分野において公知である。
【０１８３】
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドを結合するジンクフィンガータンパク質についてコードする第一のポリヌクレオチドポリヌクレオチドと、Type IISエンドヌクレアーゼのものなどを含むがこれに限定されない、非特異的エンドヌクレアーゼについてコードする第二のポリヌクレオチドポリヌクレオチドとの融合をすることにより、構成しうる。ジンクフィンガータンパク質とヌクレアーゼの間の融合タンパク質は、2塩基対から成るスペーサーを含みうるが、または別の方法として、スペーサーは3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたはそれ以上の塩基対で構成できる。各種の実施形態で、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、二重鎖切断をポリヌクレオチドのゲノムDNA配列の制御領域、コード領域、または非コード領域に導入し、ポリヌクレオチドの発現レベルが低減するように、またはそれによってコードされるタンパク質の活性が低下するように導く。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる切断によって、結果的に非相同末端結合によるDNAの修復の後、切断部位でDNAの欠失につながることが頻繁にある。
【０１８４】
その他の実施形態で、ジンクフィンガータンパク質は、ポリヌクレオチドの制御配列に結合するよう選択しうる。さらに具体的に言えば、制御配列は、転写開始部位、開始コドン、エクソンの領域、エクソン-イントロンの境界、転写終結区、または終止コドンを備えうる。従って、本発明は、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドの近傍またはその内部でジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発により生成された突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体または植物体細胞と、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介の突然変異誘発によるこうした植物体または植物体細胞を作成するための方法とを提供する。ジンクフィンガータンパク質およびジンクフィンガーヌクレアーゼをたばこ植物体に送達するための方法は、メガヌクレアーゼの送達について後述した内容と類似している。
【０１８５】
別の態様で、メガヌクレアーゼ（I-CreIなど）を使用して、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの、または他の方法で遺伝学的変性のある植物体を生成する方法が説明されている。天然のメガヌクレアーゼと組換え体メガヌクレアーゼは、植物体のゲノムDNA内の単一の部位で、または比較的少ない部位で、特異的に二本鎖切断を起こし、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドの分裂を許容するために使用できる。メガヌクレアーゼは、DNA認識性質が変化した強化メガヌクレアーゼとしうる。メガヌクレアーゼタンパク質は、当該技術分野において公知の様々な異なるメカニズムにより、植物体細胞に送達できる。
【０１８６】
本発明は、植物体細胞または植物体内で本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）を不活性化するためのメガヌクレアーゼの使用を含む。特に、本発明は、メガヌクレアーゼを使用して植物体内でのポリヌクレオチドを不活性化するための方法を提供するが、この方法は、（a）本明細書で説明したポリヌクレオチドを含む植物体細胞を提供する工程と、（b）メガヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼをコードする構築物を前記植物体細胞内に導入する工程と、（c）メガヌクレアーゼに実質的にポリヌクレオチドを不活性化させる工程とを含む。
【０１８７】
メガヌクレアーゼは、ポリヌクレオチドのコード領域内のメガヌクレアーゼ認識部位を切断するために使用できる。こうした切断では、非相同末端結合による変異原性DNA修復の後で、結果的にメガヌクレアーゼ認識部位でのDNAの欠失につながることが頻繁にある。遺伝子コード配列内でのこうした突然変異は、一般に遺伝子を不活性化するのに十分である。植物体細胞を修飾するためのこの方法には、まず、適切な形質転換方法を使用したメガヌクレアーゼ発現カセットの植物体細胞への送達が関与する。最高の効率を得るためには、メガヌクレアーゼ発現カセットを選択マーカーに結合し、選択物質の存在下で、首尾よく転換された細胞を選択することが望ましい。このアプローチによって、結果的にメガヌクレアーゼ発現カセットがゲノムに組み込まれるようになるが、これは、植物体が規制当局の許可を要する可能性が高い場合には望ましくないことがある。こうしたケースでは、メガヌクレアーゼ発現カセット（および結合された選択マーカー遺伝子）は、その後の植物体の世代で従来的な育種テクニックを使用して分離しうる。別の方法として、植物体細胞は、選択マーカーを持たないメガヌクレアーゼ発現カセットを用いて当初転換し、選択物質を欠いた培養液で培養しうる。こうした条件下では、処理した細胞の一部はメガヌクレアーゼ発現カセットを獲得し、メガヌクレアーゼ発現カセットをゲノムに組み込むことなく、強化されたメガヌクレアーゼを過渡的に発現する。形質転換の効率は考慮されていないため、この後者の形質転換処置では、望ましいゲノム修飾を獲得するためにより多くの数の処理済み細胞のスクリーニングが要求される。上記のアプローチは、ジンクフィンガータンパク質またはジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するとき、植物体細胞を修飾するのにも適用できる。
【０１８８】
メガヌクレアーゼ発現カセットを送達した後、植物体細胞は、当初、使用された特定の形質転換処置にとって一般的な条件下で培養される。これは、形質転換した細胞を培養液で、温度26℃未満で暗所で頻繁に培養することを意味しうる。こうした標準条件は、植物体細胞を形質転換過程から回復させるために、ある期間（1〜4日が好ましい）について使用できる。この当初の回復期間後の任意の時点で、強化メガヌクレアーゼの活性を刺激してメガヌクレアーゼ認識部位を切断し突然変異を起こさせるために、培養温度を上昇させうる。
【０１８９】
ある一定の用途では、ポリヌクレオチドを植物体のゲノムから正確に除去することが望ましいことがある。こうした用途は、強化メガヌクレアーゼの対を使用して可能であり、そのそれぞれが意図された欠失のどちらかの側にあるメガヌクレアーゼ認識部位を切断する。遺伝子を認識してそれに結合し、二本鎖切断をゲノムに導入することができるTALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）も使用できる。別の態様で、TALエフェクターヌクレアーゼを使用して、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの、または他の方法で本明細書で説明した遺伝学的変性のある植物体を生成する方法が意図されている。
【０１９０】
遺伝的修飾での使用に適した植物体は、単子葉および双子葉の植物体および植物体細胞系を含み、以下の科のどれかに属する種を含むが、これに限定されない。Acanthaceae、Alliaceae、Alstroemeriaceae、Amaryllidaceae、Apocynaceae、Arecaceae、Asteraceae、Berberidaceae、Bixaceae、Brassicaceae、Bromeliaceae、Cannabaceae、Caryophyllaceae、Cephalotaxaceae、Chenopodiaceae、Colchicaceae、Cucurbitaceae、Dioscoreaceae、Ephedraceae、Erythroxylaceae、Euphorbiaceae、Fabaceae、Lamiaceae、Linaceae、Lycopodiaceae、Malvaceae、Melanthiaceae、Musaceae、Myrtaceae、Nyssaceae、Papaveraceae、Pinaceae、Plantaginaceae、Poaceae、Rosaceae、Rubiaceae、Salicaceae、Sapindaceae、Solanaceae、Taxaceae、Theaceae、またはVitaceae。
【０１９１】
適切な種は、Abelmoschus、Abies、Acer、Agrostis、Allium、Alstroemeria、Ananas、Andrographis、Andropogon、Artemisia、Arundo、Atropa、Berberis、Beta、Bixa、Brassica、Calendula、Camellia、Camptotheca、Cannabis、Capsicum、Carthamus、Catharanthus、Cephalotaxus、Chrysanthemum、Cinchona、Citrullus、Coffea、Colchicum、Coleus、Cucumis、Cucurbita、Cynodon、Datura、Dianthus、Digitalis、Dioscorea、Elaeis、Ephedra、Erianthus、Erythroxylum、Eucalyptus、Festuca、Fragaria、Galanthus、Glycine、Gossypium、Helianthus、Hevea、Hordeum、Hyoscyamus、Jatropha、Lactuca、Linum、Lolium、Lupinus、Lycopersicon、Lycopodium、Manihot、Medicago、Mentha、Miscanthus、Musa、Nicotiana、Oryza、Panicum、Papaver、Parthenium、Pennisetum、Petunia、Phalaris、Phleum、Pinus、Poa、Poinsettia、Populus、Rauwolfia、Ricinus、Rosa、Saccharum、Salix、Sanguinaria、Scopolia、Secale、Solanum、Sorghum、Spartina、Spinacea、Tanacetum、Taxus、Theobroma、Triticosecale、Triticum、Uniola、Veratrum、Vinca、Vitis、およびZeaといった属の一つを含みうる。
【０１９２】
適切な種は、Panicum spp.、Sorghum spp.、Miscanthus spp.、Saccharum spp.、Erianthus spp.、Populus spp.、Andropogon gerardii（big bluestem）、Pennisetum purpureum（オオガマ）、Phalaris arundinacea（クサヨシ）、Cynodon dactylon（ギョウギシバ）、Festuca arundinacea（ヒロハノウシノケグサ）、Spartina pectinata（プレーリーコード-グラス）、Medicago sativa（アルファルファ）、Arundo donax（ダンチク）、Secale cereale（ライ麦）、Salix spp.（ヤナギ）、Eucalyptus spp.（ユーカリ）、Triticosecale（コムギタイムライ麦）、竹、Helianthus annuus（ヒマワリ）、Carthamus tinctorius（ベニバナ）、Jatropha curcas（ジャトロファ）、Ricinus communis（キャスター）、Elaeis guineensis（ヤシ）、Linum usitatissimum（アマ）、Brassica juncea、β vulgaris（サトウキビ）、Manihot esculenta（cassaya）、Lycopersicon esculentum（トマト）、Lactuca sativa（レタス）、Musyclise alca（バナナ）、Solanum tuberosum（ジャガイモ）、Brassica oleracea（ブロッコリ、カリフラワー、芽キャベツ）、Camellia sinensis（茶）、Fragaria ananassa（イチゴ）、Theobroma cacao（ココア）、Coffe45ycliseca（コーヒー）、Vitis vinifera（ブドウ）、Ananas comosus（パイナップル）、Capsicum annum（トウガラシおよび甘トウガラシ）、Allium cepa（タマネギ）、Cucumis melo（メロン）、Cucumis sativus（キュウリ）、Cucurbita maxima（カボチャ）、Cucurbita moschata（squash）、Spinacea oleracea（ホウレンソウ）、Citrullus lanatus（スイカ）、Abelmoschus esculentus（オクラ）、Solanum melongena（ナス）、Rosa spp.（バラ）、Dianthus caryophyllus（カーネーション）、Petunia spp.（ペチュニア）、Poinsettia pulcherrima（ポインセチア）、Lupinus albus（ルピナス）、Uniola paniculata（オート麦）、ベントグラス（Agrostis spp.）、Populus tremuloides（ポプラ）、Pinus spp.（マツ）、Abies spp.（モミ）、Acer spp.（カエデ）、Hordeum vulgare（大麦）、Poa pratensis（ブルーグラス）、Lolium spp.（ドクムギ）およびPhleum pratense（チモシー）、Panicum virgatum（スイッチグラス）、Sorghu45yclise45または（モロコシ、スーダングラス）、Miscanthus giganteus（ススキ）、Saccharum sp.（energycane）、Populus balsamifera（ポプラ）、Zea mays（トウモロコシ）、Glycine max（ダイズ）、Brassica napus（キャノーラ）、Triticum aestivum（コムギ）、Gossypium hirsutum（ワタ）、Oryza sativa（イネ）、Helianthus annuus（ヒマワリ）、Medicago sativa（アルファルファ）、β vulgaris（サトウダイコン）、またはPennisetum glaucum（トウジンビエ）を含みうる。
【０１９３】
様々な実施形態は、遺伝子発現レベルを調節するために修飾し、それによってポリペプチドの発現レベルが対照植物体と比較して関心の植物体組織内で調節される植物体（たばこ植物体など）を生成する、突然変異体たばこ植物体、非天然のたばこ植物体、または遺伝子組換えたばこ植物体を対象とする。開示された組成および方法は、たばこ属（Nicotiana）に属するN. rusticaおよびN. tabacumを含む任意の種に適用できる（例えば、LA B21、LN KY171、TI 1406、Basma、Galpao、Perique、Beinhart 1000-1、およびPetico）。その他の種は、N. acaulis、N462yclise4646ta、N46yclise4646ta var. multiflora、N46yclise46na、N. alata、N. amplexicaulis、N. arentsii、N46yclise4646ta、N. benavidesii、N. benthamiana、N. bigelovii、N. bonariensis、N. cavicola、N. clevelandii、N. cordifolia、N. corymbosa、N. debneyi、N. excelsior、N. forgetiana、N. fragrans、N. glauca、N. glutinosa、N. goodspeedii、N. gossei、N. hybrid、N. ingulba、N. kawakamii、N. knightiana、N. langsdorffii、N. linearis、N. longiflora、N46yclise46ma、N. megalosiphon、N. miersii、N. noctiflora、N. nudicaulis、N. obtusifolia、N. occidentalis、N. occidentalis subsp. hesperis、N. otophora、N. paniculata、N. pauciflora、N. petunioides、N. plumbaginifolia、N. quadrivalvis、N. raimondii、N. repanda、N. rosulata、N. rosulata subsp. ingulba、N. rotundifolia、N. setchellii、N. simulans、N. solanifolia、N. spegazzinii、N. stocktonii、N. suaveolens、N. sylvestris、N. thyrsiflora、N. tomentosa、N. tomentosiformis、N. trigonophylla、N. umbratica、N46yclise46ta、N. velutina、N. wigandioides、およびN. x sanderaeを含む。
【０１９４】
たばこ栽培品種および優良たばこ栽培品種の使用も、本明細書で意図されている。従って、遺伝子組換え、非天然のまたは突然変異体である植物体は、一つ以上の導入遺伝子、または一つ以上の遺伝的突然変異またはその組み合わせを含む、たばこ品種または優良たばこ栽培品種としうる。遺伝子突然変異（例えば、一つ以上の多型）は、個別たばこ品種またはたばこ栽培品種（例えば、優良たばこ栽培品種）内に天然には存在しない突然変異とするか、または個別たばこ品種またはたばこ栽培品種（例えば、優良たばこ栽培品種）で天然に発生しないとする場合に、天然に発生する遺伝子突然変異とすることができる。
【０１９５】
特に有用なNicotiana tabacum品種には、バーレータイプ、ダークタイプ、熱風送管乾燥処理タイプ、およびオリエンタルタイプのたばこが含まれる。非限定的な品種または栽培品種の例は以下の通りである。BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、Coker 319、Coker 371 金、Coker 48、CD 263、DF911、DT 538 LC Galpao tobacco、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、Hybrid 403LC、Hybrid 404LC、Hybrid 501 LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY907LC、KTY14xL8 LC、Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14xL8、Narrow Leaf Madole、Narrow Leaf Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、OXFORD 207、PD 7302 LC、PD 7309 LC、PD 7312 LC‘ 'Periq’e' tobacco、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、Speight 179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR（Tom Rosson）Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi（Mitchell-Mor）、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes  NN、KTRDC number 2 Hybrid 49、Burley 21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、PO1、PO2、PO3、RG 11、RG 8、VA 509、AS44、Banket A1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX 2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、Galpao Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、Kutsage E1、LA BU 21、NC 2326、NC 297、PVH 2110、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar 28、Wislica、Yayaldag、Prilep HC-72、Prilep P23、Prilep PB 156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB 125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、Basma、TKF 4028、L8、TKF 2002、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana。本明細書で具体的に識別されていない場合であっても、上述の低コンバーター亜変種も意図されている。
【０１９６】
実施形態は、本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の発現または活性を調節するために修飾された、突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組換え植物体を生成する組成および方法も対象とする。有利なことに、得られた突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組換え植物体は、全体的な外観において対照植物体と類似しているか、または実質的に同一でありうる。成熟度、植物体当たりの葉の数、茎の高さ、葉の挿入角度、葉のサイズ（幅および長さ）、節間の距離、および葉身と中央脈の比率など、様々な表現型特性を現場での観察により評価できる。
【０１９７】
一つの態様は、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組換え植物体の種子に関連する。種子はたばこ種子であることが好ましい。さらなる態様は、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組換え植物体の花粉または胚珠に関連する。さらに、雄性不稔性を与える核酸をさらに含む、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組換え植物体が提供されている。
【０１９８】
また、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、混成体である植物体、または遺伝子組換え植物体、またはその部分の再生可能な細胞の組織培養も提供されており、培養によって、親のすべての形態学的特性および生理学的特性を発現する能力を持つ植物体が再生される。再生可能な細胞には、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、根、根端、葯、花およびその部分、胚珠、苗条、幹、茎、随およびカプセルに由来する細胞、またはカルスまたはそれに由来する原形質体が含まれるが、これに限定されない。
【０１９９】
一つの目的は、植物材料内（例えば、乾燥処理済みの葉中）のTSNAのレベルを調節（例えば、低減）する突然変異体、遺伝子組換えまたは非天然の植物体またはその部分を提供することである。対照植物体と比較して少なくともNNKおよび/または硝酸塩のレベルを調節（例えば、低減）する突然変異体、遺伝子組換え、または非天然の植物体またはその部分であることが、適切である。ある一定の実施形態で、少なくともNNNのレベルは実質的に同一となる。ある一定の実施形態で、少なくともNNN、NABおよびNATのレベルは実質的に同一となる。ある一定の実施形態で、少なくともNNNのレベルは、対照植物体と比較して実質的に同一であり、NABのレベルは低減される。ある一定の実施形態で、少なくともNNNのレベルは対照植物体と比較して実質的に同一であり、NATのレベルは低減される。ある一定の実施形態で、少なくともNNNのレベルは、対照植物体と比較して実質的に同一であり、NATおよびNABのレベルは低減される。突然変異体、遺伝子組換え、または非天然の植物体またはその部分のニコチン含有量は、対照または野生型植物体と実質的に同一とするか、または対照または野生型植物体よりも低くすることができる。突然変異体、遺伝子組換え、または非天然の植物体またはその部分は、対照植物体と実質的に同一の視覚的外観を持つことが適切である。
【０２００】
4つの主要TSNA、一般に最高濃度で存在しているものは、N-ニトロソニコチン(NNN)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン(NNK)、N-ニトロソアナバシン(NAB)およびN-ニトロソアナタビン(NAT)である。一般に主要TSNAよりも著しく低いレベルである副次的な化合物には、4-(メチルニトロソアミノ)4-(3-ピリジル)ブタナール(NNA)、4-(メチルニトロソアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノール(NNAL)、4-(メチルニトロソアミノ)4-(3-ピリジル)-1-ブタノール(イソ-NNAL)、および4-(メチルニトロソアミノ)-4-(3-ピリジル)-1-酪酸(イソ-NNAC)がある。少なくともNNNおよびNNKは、実験室での研究で動物に適用するときに発癌性であることが報告されてきた。
【０２０１】
従って、対照細胞または対照植物体と比較して少なくともNNKおよび/または硝酸塩のレベルを調節（例えば、低減）する突然変異体、遺伝子組換え、または非天然の植物体またはその部分または植物体細胞であることが、本書で説明されている。ある一定の実施形態で、NNNのレベルは実質的に同一となる。突然変異体、遺伝子組換え、または非天然の植物体または植物体細胞は、対応する一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド配列の発現を調節することにより、一つ以上の本明細書で説明したポリペプチドの合成または活性を調節（例えば、低減）するよう修飾されてきた。少なくともNNKおよび/または硝酸塩の調節されたレベルは、少なくとも緑葉（乾燥処理済みの葉が適切）で観察される。ある一定の実施形態で、植物体（緑葉などであるが、乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこであることが適切）内の合計TSNAのレベルは調節（例えば、低減）しうる。ある一定の実施形態で、植物体（緑葉などであるが、乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこであることが適切）内のニコチンのレベルは調節（例えば、低減）しうる。
【０２０２】
さらなる態様は、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体または細胞に関連するが、ここで、一つ以上の本明細書で説明したポリペプチドの発現または活性は、調節（例えば、低減）され、植物体の一部（例えば、緑葉、乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこが適切）は、前記ポリペプチドの発現または活性が調節されていない対照植物体と比較して、硝酸塩および/または少なくともNNKのレベルが少なくとも5%低下した。ある一定の実施形態で、NNNのレベルは実質的に同一となる。ある一定の実施形態で、植物体（緑葉などであるが、乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこであることが適切）内の合計TSNAのレベルも、例えば、少なくとも約5％調節（例えば、低減）しうる。ある一定の実施形態で、植物体（緑葉などであるが、乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこであることが適切）内のニコチンのレベルも、例えば、少なくとも約5％調節（例えば、低減）しうる。ある一定の実施形態で、植物体（緑葉などであるが、乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこであることが適切）内の合計TSNAレベルは、例えば、少なくとも約5％調節（例えば、還元）でき、また植物体（緑葉などであるが、乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこであることが適切）内のニコチンのレベルも、例えば、少なくとも約5％調節（例えば、還元）しうる。
【０２０３】
なおさらなる態様は、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体または細胞から誘導されるかまたは誘導可能な乾燥処理済み植物材料（乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこなど）に関連するが、ここで、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチドの発現またはそれによってコードされるタンパク質の活性は減少し、硝酸塩および/またはNNKのレベルは、対照植物体と比較して少なくとも5%減少する。ある一定の実施形態で、NNNのレベルは実質的に同一となる。
【０２０４】
A なおさらなる態様は、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの乾燥処理済み植物材料（葉または乾燥処理済みたばこなど）に関連するが、対照植物体と比較して少なくとも5%低減させた硝酸塩および/またはNNKレベルを持つ。ある一定の実施形態で、NNNのレベルは実質的に同一となる。ある一定の実施形態で、乾燥処理済み植物材料中の合計TSNAレベルも、例えば、少なくとも約5%低減されうる。ある一定の実施形態で、乾燥処理済み植物材料中のニコチンレベルも、例えば、少なくとも約5%低減されうる。ある一定の実施形態で、乾燥処理済み植物材料中の合計TSNAレベルも例えば、少なくとも約5%減少し、また乾燥処理済み植物材料中のニコチンのレベル も少なくとも約5%減少しうる。
【０２０５】
なおさらなる態様では、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体または植物体細胞が提供されており、ここで、一つ以上の本明細書で説明したポリペプチドの発現が、対照または野生型植物体と比較して低減され、また（i）硝酸塩含有量は約7 mg/g以下（約6.9 mg/g以下、約6.8 mg/g以下、約6.7 mg/g以下、約6.6 mg/g以下、約6.5 mg/g以下、約6.4 mg/g以下、約6.3 mg/g以下、約6.2 mg/g以下、約6.1 mg/g以下、または約6 mg/g以下など）であり、（ii）NNK含有量は約110 ng/g以下（約109 ng/g以下、約108 ng/g以下、約107 ng/g以下、約106 ng/g以下、約105 ng/g以下、約104 ng/g以下、約103 ng/g以下、約102 ng/g以下、約101 ng/g以下、または約100 ng/g以下など）である。ある一定の実施形態で、ニコチンのレベルは約30mg/g以下（約29.9 mg/g以下、約29.8 mg/g以下、約29.7 mg/g以下、約29.6 mg/g以下、約29.5 mg/g以下、約29.4 mg/g以下、約29.3 mg/g以下、約29.2 mg/g以下、約29.1 mg/g以下、または約29 mg/g以下など）である。ある一定の実施形態で、合計TSNA含有量は約250 ng/g以下（約240 ng/g以下、約230 ng/g以下、約220 ng/g以下、約210 ng/g以下、約200 ng/g以下、約190 ng/g以下、約180 ng/g以下、約170 ng/g以下、約160 ng/g以下、または約150 ng/g以下など）である。
【０２０６】
なおさらなる態様では、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの葉が提供されており、ここで、一つ以上の本明細書で説明したポリペプチドの発現は対照または野生型の葉と比較して低減され、また（i）硝酸塩含有量は約7 mg/g以下（約6.9 mg/g以下、約6.8 mg/g以下、約6.7 mg/g以下、約6.6 mg/g以下、約6.5 mg/g以下、約6.4 mg/g以下、約6.3 mg/g以下、約6.2 mg/g以下、約6.1 mg/g以下、または約6 mg/g以下）などで、（ii）NNK含有量は約110 ng/g以下（約109 ng/g以下、約108 ng/g以下、約107 ng/g以下、約106 ng/g以下、約105 ng/g以下、約104 ng/g以下、約103 ng/g以下、約102 ng/g以下、約101 ng/g以下、または約100 ng/g以下など）である。ある一定の実施形態で、ニコチンのレベルは約30mg/g以下（約29.9 mg/g以下、約29.8 mg/g以下、約29.7 mg/g以下、約29.6 mg/g以下、約29.5 mg/g以下、約29.4 mg/g以下、約29.3 mg/g以下、約29.2 mg/g以下、約29.1 mg/g以下、または約29 mg/g以下など）である。ある一定の実施形態で、合計TSNA含有量は約250 ng/g以下（約240 ng/g以下、約230 ng/g以下、約220 ng/g以下、約210 ng/g以下、約200 ng/g以下、約190 ng/g以下、約180 ng/g以下、約170 ng/g以下、約160 ng/g以下、または約150 ng/g以下など）である。
【０２０７】
なおさらなる態様では、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの乾燥処理済み植物材料（乾燥処理済みの葉または乾燥処理済みたばこなど）が提供されており、ここで、一つ以上の本明細書で説明したポリペプチドの発現は、対照または野生型乾燥処理済み植物材料と比較して低減され、ここで、（i）硝酸塩含有量は約7 mg/g以下（約6.9 mg/g以下、約6.8 mg/g以下、約6.7 mg/g以下、約6.6 mg/g以下、約6.5 mg/g以下、約6.4 mg/g以下、約6.3 mg/g以下、約6.2 mg/g以下、約6.1 mg/g以下、または約6 mg/g以下など）であり、（ii）NNK含有量は約110 ng/g以下（約109 ng/g以下、約108 ng/g以下、約107 ng/g以下、約106 ng/g以下、約105 ng/g以下、約104 ng/g以下、約103 ng/g以下、約102 ng/g以下、約101 ng/g以下、または約100 ng/g以下など）である。ある一定の実施形態で、ニコチンのレベルは約30mg/g以下（約29.9 mg/g以下、約29.8 mg/g以下、約29.7 mg/g以下、約29.6 mg/g以下、約29.5 mg/g以下、約29.4 mg/g以下、約29.3 mg/g以下、約29.2 mg/g以下、約29.1 mg/g以下、または約29 mg/g以下など）である。ある一定の実施形態で、合計TSNA含有量は約250 ng/g以下（約240 ng/g以下、約230 ng/g以下、約220 ng/g以下、約210 ng/g以下、約200 ng/g以下、約190 ng/g以下、約180 ng/g以下、約170 ng/g以下、約160 ng/g以下、または約150 ng/g以下など）である。
【０２０８】
前記植物体またはその部分（例えば、葉）の視覚的外観は、実質的に対照植物体と同一であることが適切である。植物体はたばこ植物体であることが適切である。
【０２０９】
実施形態は、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現または活性を調節するために修飾された突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体を生成する組成および方法も対象とするが、これによって、植物体または植物体成分（例えば、葉（緑葉または乾燥処理済みの葉など）またはたばこ）の対照植物体と比較した硝酸塩および/またはNNKおよび/またはNNNおよび/またはTSNAおよび/またはニコチンのレベルが調節されることになる。
【０２１０】
有利なことに、本明細書に記載した方法に従い獲得された突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体は、視覚的な外観において対照植物体と類似しているかまたは実質的に同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の葉の重量は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の葉数は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の葉の重量および葉数は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の茎の高さは、例えば、野外に移植してから1か月、2か月または3か月以上、または最高の高さまで伸びた後10日、20日、30日または36日またはそれ以上の日数が経過した時点で実質的に対照植物体と同一である。例えば、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の茎の高さは、対照植物体の茎の高さよりも低くない。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体のクロロフィル含有量は、実質的に対照植物体と同一である。別の実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の茎の高さは、実質的に対照植物体と同一であり、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の葉緑素含有量は、実質的に対照植物体と同一である。一つの実施形態で、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の葉のサイズまたは形態または数または彩色は、実質的に対照植物体と同一である。植物体はたばこ植物体であることが適切である。
【０２１１】
別の態様で、硝酸塩および/または少なくともNNKの量を少なくとも植物体（例えば、葉（乾燥処理済みの葉など）またはたばこ）の一部分だけ調節（例えば、低減）するための方法が提供されているが、この方法は、 （i）一つ以上の本明細書で説明したポリペプチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の発現または活性を調節（例えば、減少）する工程で、ここで、ポリペプチドは、本明細書で説明した対応するポリヌクレオチド配列によりコードされるのが適切な工程と、（ii）手順（i）で入手した突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の少なくとも一部（例えば、葉（乾燥処理済みの葉など）またはたばこ）内の硝酸塩および/または少なくともNNKの含有量を測定する工程と、（iii）その硝酸塩および/または少なくともNNK含有量が対照植物体との比較において調節した（例えば、低減）、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体を識別する工程とを含む。前記突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の視覚的外観は、実質的に対照植物体と同一であることが適切である。植物体はたばこ植物体であることが適切である。
【０２１２】
別の態様で、硝酸塩および/または少なくともNNKの量を少なくとも乾燥処理済み植物材料（例えば、葉（乾燥処理済みの葉など））の一部分だけ調節（例えば、低減）するための方法が提供されているが、この方法は、 （i）一つ以上のポリペプチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の発現または活性を調節（例えば、減少）する工程であり、ここで、ポリペプチドは、本明細書で説明した対応するポリヌクレオチド配列によりコードされることが適切である工程と、（ii）植物材料（一つ以上の葉）の収穫とある一定期間の乾燥処理の工程と、（iii）（ii）で入手した乾燥処理済み植物材料の少なくとも一部分の硝酸塩および/または少なくともNNK含有量を測定する工程、および（IV）硝酸塩および/またはその中の少なくともNNK含有量が、対照植物体と比較して調節（例えば、低減）された乾燥処理済み植物材料を識別する工程とを含む。
【０２１３】
対照植物体と比較した発現の増大が約5 %〜約100 %としうるか、または少なくとも10 %、少なくとも20 %、少なくとも25 %、少なくとも30 %、少なくとも40 %、少なくとも50 %、少なくとも60 %、少なくとも70 %、少なくとも75 %、少なくとも80 %、少なくとも90 %、少なくとも95 %、少なくとも98 %、または100 %以上（200%または300%以上など）の増大で、これには、転写性の活性またはタンパク質発現または両方の増大が含まれる。
【０２１４】
対照タイプの植物体と比較した活性の増大は、約5 %〜約100 %としうるか、または少なくとも10 %、少なくとも20 %、少なくとも25 %、少なくとも30 %、少なくとも40 %、少なくとも50 %、少なくとも60 %、少なくとも70 %、少なくとも75 %、少なくとも80 %、少なくとも90 %、少なくとも95 %、少なくとも98 %、または100 %以上（200%または300%以上など）の増大である。
【０２１５】
対照植物体と比較した発現の減少は、約5 %〜約100 %としうるか、または少なくとも10 %、少なくとも20 %、少なくとも25 %、少なくとも30 %、少なくとも40 %、少なくとも50 %、少なくとも60 %、少なくとも70 %、少なくとも75 %、少なくとも80 %、少なくとも90 %、少なくとも95 %、少なくとも98 %、または100 %の減少であり、これには、転写性の活性またはタンパク質発現または両方の減少が含まれる。
【０２１６】
対照タイプの植物体と比較した活性の減少は、約5 %〜約100 %としうるか、または少なくとも10 %、少なくとも20 %、少なくとも25 %、少なくとも30 %、少なくとも40 %、少なくとも50 %、少なくとも60 %、少なくとも70 %、少なくとも75 %、少なくとも80 %、少なくとも90 %、少なくとも95 %、少なくとも98 %、または100 %の低減である。
【０２１７】
本明細書で説明したポリヌクレオチドおよび組換え体構築物は、関心の植物体種（たばこが適切である）での本明細書で説明した酵素の発現の調節に使用できる。
【０２１８】
数多くのポリヌクレオチドをベースにした方法を、植物体内での遺伝子発現を増大させるために使用できる。一例として、形質転換する植物体との適合性のある構築物、ベクターまたは発現ベクターを準備でき、これは、関心の遺伝子と、植物体内の遺伝子を過剰発現する能力のある上流プロモーターとを一緒に備える。模範的プロモーターについては、本明細書で説明した。形質転換の後、および適切な条件下で栽培されたとき、植物体中、その特定の組織中のこの酵素のレベルを調節（例えば、低減）するために、プロモーターは発現を駆動することができる。模範的な一つの実施形態で、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）を持つベクターは、植物体内で遺伝子を過剰発現するために生成される。ベクターは、形質転換の上流に適切なプロモーター（カリフラワーモザイクウィルスCaMV 35Sプロモーターなど）を持ち、植物体のすべての組織内でその構成的な発現を駆動する。ベクターはまた、形質転換されたカルスおよび株細胞の選択肢を与えるために、抗生物質耐性の遺伝子を持つ。
【０２１９】
従って、様々な実施形態は、一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の発現レベルを、ポリヌクレオチドの複数のコピーを植物体ゲノムに組み入れることにより調節（例えば、低減）するための方法を対象とするが、これには、本明細書で説明した一つ以上のポリヌクレオチドに作用できるように連結されたプロモーターを含む発現ベクターを用いて植物体細胞宿主を変形させる工程が含まれる。組換え体ポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、未変性のポリペプチドとすることも、または細胞に対して異質組織とすることもできる。
【０２２０】
一つ以上の本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の突然変異体対立遺伝子を持つたばこ植物体は、有用な系統、品種および混成体を生成するための植物体育種プログラムで使用できる。特に、突然変異体対立遺伝子は、上述した商業的に重要な品種に遺伝子移入される。こうして、本明細書で異なる遺伝的同一性を備えた植物体で説明した、突然変異体である植物体、非天然の植物体、または遺伝子組換え植物体の交雑を含む、植物体を育種するための方法が提供されている。方法は、さらに子孫植物体と別の植物体との交雑を含めることができ、また随意に、望ましい遺伝的形質または遺伝的背景を持つ子孫が得られるまで交雑が繰り返される。こうした育種方法が果たしている一つの目的は、望ましい遺伝的特性を他の品種、育成系統、混成体または栽培品種、特に商業的利害のあるものに導入することである。別の目的は、異なる遺伝子の遺伝的修飾を単一の植物体品種、系統、混成体または栽培品種へ積み重ねることの促進である。種内および種間の交配が意図されている。こうした交雑から発生した子孫植物体は、育成系統とも言うが、本発明の非天然の植物体の例である。
【０２２１】
一つの実施形態で、非天然のたばこ植物体を生成するための方法が提供されおり、この方法は、 （a）突然変異体または遺伝子組換えたばこ植物体を第二のたばこ植物体と交雑して、子孫たばこ種子を得る工程と、（b）子孫たばこ種子を植物体栽培条件下で栽培し、非天然のたばこ植物体を得る工程とを含む。この方法はさらに、以下を含みうる： （c）前の世代の非天然のたばこ植物体を、それ自体または別のたばこ植物体を交雑して、子孫たばこ種子を得る工程と（d）手順（c）の子孫たばこ種子を、植物体栽培条件下で栽培し、追加的な非天然のたばこ植物体を得る工程と、（e）（c）および（d）の交雑および栽培の工程を複数回繰り返して、非天然のたばこ植物体のさらなる世代を生成する工程とを含む。この方法は、随意に、工程（a）の前に、特性付けられ、かつ突然変異体または遺伝子組換え植物体とは同一ではない遺伝的同一性を備えた親株を提供する工程を含みうる。一部の実施形態で、育種プログラムにもよるが、交雑および栽培の工程は、非天然のたばこ植物体の世代を生成するために、0〜2回、0〜3回、0〜4回、0〜5回、0〜6回、0〜7回、0〜8回、0〜9回または0〜10回繰り返される。戻し交雑は、こうした方法の一実施例であり、ここで、親のものと近い遺伝的同一性を持つ次世代の子孫植物体を得るために、子孫はその親またはその親と遺伝的に類似した別の植物体との交雑がなされる。植物体育種の技法、特にたばこ植物体育種はよく知られており、本発明の方法で使用できる。本発明はさらに、これらの方法により生成された非天然のたばこ植物体を提供する。一定の実施形態では、植物体を選択する工程は除外される。
【０２２２】
本明細書に記載した方法の一部の実施形態では、標準現場手続きを使用して、変異体遺伝子のための育種およびスクリーニングからもたらされた系統が現場で評価される。最初の変異誘発されていない親を含む対照遺伝子型が含められ、エントリーが無作為化完全ブロックデザインまたはその他の適切な現場設計で現場で配列される。たばこについては、標準的な農業方法が使用され、例えば、たばこは、収穫され、秤量され、乾燥処理の前およびその途中に化学薬品やその他の一般的な試験用に標本化される。データの統計分析が実行され、選択した系統の親系統に対する類似性が確認される。選択した植物体の細胞遺伝子学的分析が随意に実施され、染色体補体および染色体対合関係が確認される。
【０２２３】
本明細書で説明した通り、遺伝子の突然変異体対立形質を他のたばこに移動または育種するために、マーカー利用選抜（MAS）育種プログラムで、DNAフィンガープリント法、一塩基多型ヌクレオチド多形性、マイクロサテライトマーカー、または類似した技術を使用しうる。例えば、育種家は、農業経済学的に望ましい遺伝子型を備えた突然変異体対立遺伝子を含む遺伝子型をハイブリッド形成したものから、分離母集団を作成できる。F2または戻し交雑の植物体は、ゲノム配列またはその断片から発育させたマーカーを使用して、本明細書でリストした技術のどれか一つを使用して、スクリーニングすることができる。突然変異体対立遺伝子を所有しているものとして識別された植物体は、戻し交雑または自家受粉をして、スクリーニング対象の第二の母集団を形成できる。期待される継承パターンまたは使用するMAS技術に応じて、望ましい個体植物体の識別を助けるために、戻し交雑の各サイクルの前に、選択した植物体を自家受粉することが必要なこともある。戻し交雑またはその他の育種手順は、反復親の望ましい表現型が回復されるまで繰り返すことができる。
【０２２４】
本開示によれば、育種プログラムにおいて、奏功した交配種は稔性のF1植物体を産する。選択したF1植物体は、親のどれか一つと交配でき、最初の戻し交配世代の植物体は自家受粉されて、変異体遺伝子発現（例えば、ヌルバージョンの遺伝子）について再びスクリーニングされる母集団が形成される。戻し交雑、自家受粉、およびスクリーニングの過程が、例えば、少なくとも4回、最終的なスクリーニングによって稔性であり、かつ反復親と合理的に類似した植物体が生成されるまで反復される。希望に応じて、この植物体は自家受粉され、その後で子孫が再びスクリーニングされて、植物体が変異体遺伝子発現を示すことが確認される。一部の実施形態で、F2世代の植物体母集団は、変異体遺伝子発現についてスクリーニングを受け、例えば、植物体は、標準方法（例えば、PCR法）に従い、本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）についてのヌクレオチド配列情報に基づき、プライマーと共に使用して、遺伝子がないためにポリペプチドを発現しないことが識別される。
【０２２５】
混成体たばこ品種は、第一の品種の雌性の親株（すなわち、種子親）の自家受粉を阻止して、第二の品種の雄性の親株からの花粉が雌性の親株と受粉できるようにし、F1混成体種子が雌性の植物体上に形成されるようにすることで生成できる。雌性の植物体の自家受粉は、花の発生の初期段階で花の雄しべを除去することで防止できる。別の方法として、花粉形成は、雄性不稔の形成を使用して、雌性の親株で防止することができる。例えば、雄性不稔は、細胞質雄性不稔（CMS）または遺伝子組換え雄性不稔により生成でき、ここでは、導入遺伝子が小胞子生成および/または花粉生成、または自家不和合性を阻害する。CMSを含む雌性の親株は、特に有用である。雌性の親株がCMSである実施形態で、花粉が雄性の稔性植物体から収穫され、手作業でCMS雌性の親株の柱頭に適用され、結果的なF1種子が収穫される。
【０２２６】
本明細書で説明した品種および系統は、単交雑たばこF1混成体を形成するために使用できる。こうした実施形態で、親品種の植物体は、実質的に均質な隣接した母集団として栽培でき、雄性の親株から雌性の親株への自然な他家受粉が促進される。雌性の親株に形成されたF1種子は、従来的な手段によって選択的に収穫される。2つの親株品種を大量に栽培して、雌性の親に形成されたF1混成体種子と、自家受粉の結果として雄性の親に形成された種子の混合物とを収穫することもできる。別の方法として、三原交雑を行うことができ、ここでは単交雑F1混成体が雌性の親として使用され、異なる雄性の親と交雑される。また別の方法として、二重交雑混成体を作成でき、ここでは異なる2つの端交雑のF1子孫自体の間で交雑される。
【０２２７】
突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体の母集団は、望ましい特性または表現型を持つ母集団を構成するものについてスクリーニングまたは選抜をすることができる。例えば、単一の形質転換事象の子孫の母集団は、それによってコードされる望ましいレベルの発現または活性を持つ植物体についてスクリーニングをすることができる。発現または活性のレベルを特定するために、物理的および生化学的な方法を使用できる。これらには、ポリヌクレオチドの検出のためのサザン分析またはPCR増幅、RNA転写物の検出のためのノーザンブロット、S1 RNase保護、プライマー延長、またはRT-PCR増幅、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素学的アッセイ、ならびにタンパク質ゲル電気泳動法、ウェスタンブロット、免疫沈降、およびポリペプチドを検出するための酵素連鎖イムノアッセイが含まれる。原位置（in situ）ハイブリッド形成、酵素染色、および免疫染色および酵素アッセイなど、その他のテクニックも、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの存在、または発現、または活性を検出するために使用できる。
【０２２８】
一つ以上の組換え体ポリヌクレオチド、一つ以上のポリヌクレオチド構築物、一つ以上の二本鎖RNA、一つ以上の共役体または一つ以上のベクター/発現ベクターを含む、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体細胞および植物体が本明細書で説明されている。
【０２２９】
限定はされないが、本明細書で説明した植物体は、発現または活性が本発明に従い調節される前かその後かのいずれかに他の目的で修飾しうる。以下の一つ以上の遺伝的修飾が、突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体内に存在できる。一つの実施形態で、窒素性代謝性の中間体の変換に関与する一つ以上の遺伝子が修飾され、結果的に、乾燥処理時に、対照植物体またはその部分よりも低いレベルの少なくとも一つのたばこ特異的ニトロソアミンが生成される植物体または植物体の部分（葉またはたばこなど）となる。修飾できる遺伝子の非限定的な例には、ニコチンからノルニコチンへの変換に係わるCYP82E4、CYP82E5およびCYP82E10など、ニコチンデメチラーゼをコードする遺伝子が含まれ、WO2006091194号、WO2008070274号、WO2009064771号およびPCT/US2011/021088号に記載がある。別の実施形態では、重金属摂取または重金属輸送に関与する一つ以上の遺伝子が修飾され、結果的に、修飾のない対照植物体またはその部分よりも低い重金属含有量を持つ植物体または植物体の部分（葉など）となる。非限定的な例には、多剤耐性に関連するタンパク質ファミリー、陽イオン拡散ファシリテーター（CDF）ファミリー、Zrt-、Irt様タンパク質（ZIP）ファミリー、陽イオン交換体（CAX）ファミリー、銅トランスポーター（COPT）ファミリー、重金属P-type ATPasesファミリー（例えば、HMA、WO2009074325号に記載のあるもの）、自然耐性に関連するマクロファージタンパク質（NRAMP）の相同体ファミリー、およびATP-結合カセット（ABC）トランスポーターファミリー（例えば、MRP、WO2012/028309号に記載のあるもので、重金属（カドミウムなど）の輸送に係わる）に属する遺伝子が含まれる。本明細書で使用されるとき、重金属という用語は遷移金属を含む。その他の修飾の例には除草剤耐性が含まれ、例えば、グリホサートは、広分野での数多くの除草剤の有効成分である。グリホサート耐性遺伝子組換え植物体は、aroA遺伝子（ネズミチフス菌および大腸菌に由来するグリホサートEPSP合成酵素）の移入により開発されたものである。スルホニル尿素耐性植物体は、アラビドプシス（シロイヌナズナ）に由来する突然変異体ALS（アセト乳酸合成酵素）遺伝子の形質転換により作成されたものである。突然変異体Amaranthus hybridusに由来する光化学系IIのOBタンパク質が植物体に移入され、アトラジン耐性遺伝子組換え植物体が作成され、またブロモキシニル耐性遺伝子組換え植物体は、バクテリアKlebsiella pneumoniaeに由来するbxn遺伝子を組み入れることにより作成された。別の模範的な修飾によって、昆虫に対する耐性のある植物体がもたらされる。Bacillus thuringiensis （Bt）毒素は、Bt-耐性害虫の発生を遅らせる効果的な方法を提供でき、このことは、最近、ブロッコリで明らかになったが、錐体のcry1Acおよびcry1CBt遺伝子が、どちらかの単一のタンパク質に対する耐性を持つコナガ（diamondback moth）を駆除し、 かつ耐性昆虫の進化を著しく遅らせた。別の模範的な修飾も、病原体 (例えば、ウイルス、バクテリア、菌類) によって生じた疾患に対して抵抗性を持つ植物体をもたらした。Xa21遺伝子（細菌性胴枯れ病に対する耐性）を発現する植物体と、Bt融合遺伝子およびキチナーゼ遺伝子（イッテンオオメイガへの耐性および葉鞘への耐性）の両方を発現���る植物体が作り出された。別の模範的な修飾によって、生殖能力（雄性不稔など）が変更された。別の模範的な修飾によって、非生物的ストレス（例えば、乾燥、温度、塩分）に対する耐性のある植物体がもたらされ、また耐性の遺伝子組換え植物体がアラビドプシス（シロイヌナズナ）に由来するアシルグリセロールリン酸塩酵素を移入することにより作り出され、またマンニトールおよびソルビトールの合成に関与するマンニトール脱水素酵素およびソルビトール脱水素酵素をコードする遺伝子が、乾燥への耐性を改善する。別の模範的な修飾によって、ヒトでの使用について都合の良い免疫原性を持ちうるタンパク質を生成する植物体がもたらされた。例えば、そのN-グリカンにおいてα-1,3-結合したフコース残基、β-1,2-結合したキシロース残基、または両方を実質的に欠くタンパク質を生成する能力を持つ植物体は、有用でありうる。その他の模範的な修飾によって、タンパク質および油の貯蔵能力が改善された植物体、光合成効率が高められた植物体、有効期間が延長された植物体、炭水化物含有量が増えた植物体、および菌類への耐性のある植物体、アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードする植物体をもたすことができる。S-アデノシル-L-メチオニン（SAM）および/またはシスタチオニンγ-合成酵素（CGS）の発現が調節された遺伝子組換え植物体も意図されている。
【０２３０】
一つ以上のこうした形質は、突然変異体、非天然の、または遺伝子組換えのたばこ植物体に別のたばこ栽培品種から遺伝子移入しうるか、または直接それに変化されうる。本発明の突然変異体、非天然のまたは遺伝子組換えのたばこ植物体への特性の移入交雑は、当該技術分野において公知の任意の植物体育種方法により達成することができるが、これには例えば、系統育種法、戻し交雑、倍化した染色体を半数用いる育種、およびこれに類するものがある（Wernsman, E. A, and Rufty, R. C. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp.を参照）。上記で説明した分子生物学ベースのテクニック、特にRFLPおよびマイクロサテライトマーカーは、反復親との最高度の遺伝的同一性を持つ子孫を特定するための戻し交雑で使用できる。これにより、反復親との間に少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも99%の遺伝的同一性を持つ、なおさらに好ましくは反復親に対して遺伝的に同一で、さらにはドナー親から移入交雑された特性を備えたたばこ品種の製造が加速されるようになる。こうした遺伝的同一性の決定は、当該技術分野において公知の分子マーカーに基づいてできる。
【０２３１】
最後の戻し交雑世代は、移入されつつある核酸に純粋な育種子孫を与えるために自家受粉できる。結果的に得られる植物体は通常、移入された特性（例えば、一つ以上の単一の遺伝子形質）に加えて、本発明の突然変異体、非天然の、または遺伝子組換えのたばこ植物体の本質的にすべての形態学的特性および生理学的特性を持つ。正確な戻し交雑プロトコルは、適切な試験プロトコルを決定するために変更されつつある特性に依存する。戻し交雑方法は、移入する特性が優性対立遺伝子であるときには簡略化されるが、劣性対立遺伝子もまた移入しうる。この例で、望ましい特性が首尾よく移入されたかどうかを判断するために、子孫の試験を導入する必要があることもある。
【０２３２】
様々な実施形態が、突然変異体である植物体、非天然の植物体または遺伝子組換え植物体のほか、ポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の発現レベルを調節して、硝酸塩および/または少なくともそのNNK含有量を調節するバイオマスを提供している。
【０２３３】
こうした植物体、具体的にはたばこ植物体の部分は、またさらに具体的にはたばこ植物体の葉身および中央脈は、様々な消費可能製品に組み入れたり、その製造に使用したりでき、これにはエアロゾル形成材料、エアロゾル形成装置、喫煙物品、喫煙可能物品、無煙製品、およびたばこ製品が含まれるが、これに限定されない。エアロゾル形成材料の例には、たばこ組成物、たばこ、たばこ抽出物、刻みたばこ、刻み充填剤、乾燥処理済みたばこ、拡張したたばこ、均質化したたばこ、再生たばこ、およびパイプたばこが含まれるが、これに限定されない。喫煙物品および喫煙可能物品は、エアロゾル形成装置の種類である。喫煙物品または喫煙可能物品の例には、紙巻たばこ、シガリロ、および葉巻たばこが含まれるが、これに限定されない。無煙製品の例は、噛みたばこ、および嗅ぎたばこを含む。ある一定のエアロゾル形成装置では、燃焼ではなく、一つ以上の電気発熱体要素によって、たばこ組成物または別のエアロゾル形成材料が加熱されてエアロゾルを生成する。別のタイプのエアロゾル形成装置では、エアロゾルは、可燃性燃料要素または熱源から、熱源の内部、周囲、または下流に位置しうる物理的に分離されたエアロゾル形成材料に熱を移動することにより生成される。無煙のたばこ製品および様々なたばこを含むエアロゾル形成材料は、乾燥粒子、断片、顆粒、粉末、またはスラリーのほか、薄片、フィルム、タブ、発泡体、またはビーズなど任意の形式の他の成分への蒸着、其れへの混合、それによる包囲、または別の方法でのそれとの組み合わせを含めた、任意の形態のたばこを含みうる。本明細書で使用されるとき、「煙」という用語は、紙巻たばこなどの喫煙物品によって、またはエアロゾル形成材料を燃焼することによって生成される種類のエアロゾルを描写するために使用される。
【０２３４】
一つの実施形態で、本明細書で説明した突然変異体、遺伝子組換え、および非天然のたばこ植物体に由来する乾燥処理済み植物材料も提供されている。たばこ緑葉を乾燥処理する工程は、当業者にとって公知であり、空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風送管乾燥処理、および日光乾燥処理が含まれるがこれに限定はされない。たばこ緑葉を乾燥処理する工程は、収穫されたたばこの種類に依存する。例えば、バージニア・フルー（ブライト）種たばこは一般に熱風送管乾燥処理で、バーレー種およびある種のダーク・ストレインは通常は空気乾燥処理で、パイプたばこ、噛みたばこ、および嗅ぎたばこは普通は火力乾燥処理である。
【０２３５】
別の実施形態で、たばこを含むエアロゾル形成材料を含むたばこ製品は、本明細書で説明した突然変異体たばこ植物体、遺伝子組換えたばこ植物体、または非天然のたばこ植物体に由来する植物材料（葉、好ましくは乾燥処理済みの葉）を含むものとして描写されている。本明細書で説明したたばこ製品は、ブレンドしたたばこ製品とすることができ、未変性のたばこをさらに備えうる。
【０２３６】
これらの喫煙可能物品および無煙製品およびそのエアロゾルに含まれるNNKの量は、突然変異体でないか、非天然であるか、または遺伝子組換えでない対応物に由来する消費可能製品と比較したとき、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、および100%低め（約200%または300%低めなど）としうる。
【０２３７】
これらの喫煙可能物品および無煙製品およびそのエアロゾルに含まれるNNNの量は、突然変異体でないか、非天然であるか、または遺伝子組換えでない対応物に由来する消費可能製品と比較したとき、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、および100%低め（約200%または300%低めなど）としうる。
【０２３８】
これらの喫煙可能物品および無煙製品およびそのエアロゾルに含まれる硝酸塩の量は、突然変異体でないか、非天然であるか、または遺伝子組換えでない対応物に由来する消費可能製品と比較したとき、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、および100%低め（約200%または300%低めなど）としうる。
【０２３９】
これらの喫煙可能物品および無煙製品およびそのエアロゾルに含まれるニコチンの量は、突然変異体でないか、非天然であるか、または遺伝子組換えでない対応物に由来する消費可能製品と比較したとき、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、および100%低め（約200%または300%低めなど）としうる。これらの喫煙可能物品および無煙製品およびそのエアロゾルに含まれるニコチンの量は、突然変異体でないか、非天然であるか、または遺伝子組換えでない対応物に由来する消費可能製品と比較したとき、ほぼ同じとしうる。
【０２４０】
これらの喫煙可能物品および無煙製品およびそのエアロゾルに含まれる合計TSNAの量は、突然変異体でないか、非天然であるか、または遺伝子組換えでない対応物に由来する消費可能製品と比較したとき、少なくとも約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、および100%低め（約200%または300%低めなど）としうる。
【０２４１】
突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体は、例えば、農業においてその他の用途を持ちうる。例えば、本明細書で説明した突然変異体であるか、非天然であるか、または遺伝子組換えの植物体は、動物の飼料およびヒトの食品を製造するために使用できる。
【０２４２】
本発明はまた、本明細書で説明した突然変異体である植物体、非天然の植物体、または遺伝子組換え植物体の栽培、および栽培植物体からの種子の収集を含めた、種子を生産する方法を提供する。本明細書で説明した植物体からの種子は、当該技術分野において公知の手段によって調整され、包装材料内に袋詰めして、製造物品を形成できる。紙および布などの包装材料は、当該技術分野において公知である。種子のパッケージは、標識、例えば、包装材料に固定されたタグまたは標識、その中に入っている種子の性質を描写するパッケージに印刷された標識などを持つことができる。
【０２４３】
識別、選択、または育種のために植物体の遺伝子型判別をするための組成、方法およびキットは、ポリヌクレオチドの試料中のポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）の存在を検出する手段を含むことができる。従って、組成は、増幅または検出を行うための一つ以上のポリヌクレオチド、および随意に一つ以上のプローブ、および随意に一つ以上の試薬の少なくとも一部分を特異的に増幅するための一つ以上のプライマーを含むものとして描写されている。
【０２４４】
従って、本明細書で説明したポリヌクレオチドに対応する約10個以上連続するポリヌクレオチドを含む、遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが開示されている。前記プライマーまたはプローブは、本明細書で説明したポリヌクレオチドにハイブリッド形成（例えば、特異的にハイブリッド形成）するさらに約15、20、25、30、40、45または50個の連続するポリヌクレオチドを含むか、またはそれから構成されうる。一部の実施形態で、プライマーまたはプローブは、配列に依存した遺伝子識別の方法（例えば、サザンハイブリッド形成）または単離（例えば、細菌性コロニーまたはバクテリオファージ プラークのin situハイブリッド形成）または遺伝子検出（例えば、核酸の増幅または検出での一つ以上の増幅プライマーとして）において使用しうる、約10〜50個の連続するヌクレオチド、約10〜40個の連続するヌクレオチド、約10〜30個の連続するヌクレオチドまたは約15〜30個の連続するヌクレオチドを含むか、またはそれによって構成される。一つ以上の特定のプライマーまたはプローブは、一部分または全部のポリヌクレオチドを増幅または検出するために設計して使用することができる。特定の例として、ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで核酸（DNAまたはRNAなど）をコードする核酸断片を増幅するために2つのプライマーを使用しうる。ポリメラーゼ連鎖反応は、核酸配列に由来する一つのプライマーと、その核酸配列の上流または下流の配列（プロモーター配列、mRNA前駆体の3'端またはベクターに由来する配列など）にハイブリッド形成する第二のプライマーとを使用しても実施しうる。ポリヌクレオチドの生体外増幅に有用な温度および等温テクニックの例は、当該技術分野において公知である。試料は、植物体、植物体細胞または植物材料、または本明細書で説明した植物体、植物体細胞または植物材料から製造されたか、もしくはそれに由来するたばこ製品としうるか、またはそれらに由来するものとしうる。
【０２４５】
さらなる態様で、試料中に含まれる本明細書で説明したポリヌクレオチド（または本明細書で説明した通りその任意の組み合わせ）を検出する方法も提供されており、その方法は、（a）ポリヌクレオチドを含むか、またはそれを含むとみられている試料を提供する工程と、（b）ポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出するために、前記試料を一つ以上のプライマーまたは一つ以上のプローブと接触させる工程と、（c）増幅生成物の存在を検出する工程とを含み、ここで、増幅生成物の存在は、試料中のポリヌクレオチドの存在を示すものである。さらなる態様で、ポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出するための一つ以上のプライマーまたはプローブの用途も提供されている。ポリヌクレオチドの少なくとも一部分を検出するためのキットも提供されており、これは、ポリヌクレオチドの少なくとも一部分を特異的に検出するための一つ以上のプライマーまたはプローブを備える。キットは、ポリヌクレオチド増幅（PCRなど）のための試薬、またはプローブ ハイブリッド形成-検出技術（サザンブロット、ノーザンブロット、in-situハイブリッド形成、またはマイクロアレイなど）のための試薬を備えうる。キットは、ウェスタンブロット、ELISA、SELDI質量分析法または試験片などの抗体結合検出技術のための試薬を備えうる。キットは、DNA配列決定のための試薬を備えうる。キットは、硝酸塩含有量、および/または少なくともNNK含有量、および/またはNNN含有量、および/またはニコチン含有量、および/または合計TSNA含有量を決定するための試薬および説明書を備えうる。キットは、植物材料、乾燥処理済み植物材料または乾燥処理済みの葉に、硝酸塩含有量、および/または少なくともNNK含有量、および/またはニコチン含有量、および/またはNNN含有量、および/または合計TSNA含有量を決定するための試薬および説明書を備えることが適切である。
【０２４６】
一部の実施形態で、キットは、説明した一つ以上の方法についての説明書を備えうる。説明したキットは、遺伝的同一性の決定、系統学的研究、遺伝子型判別、ハプロタイプ、系図分析または植物体育種用に、特に共優性評価で有用なものでありうる。
【０２４７】
本発明は、本明細書で説明したポリヌクレオチドを含む植物体、植物体細胞、または植物材料の遺伝子型判別をする方法も提供する。遺伝子型判別は、染色体対の相同体を区別する手段を提供するもので、植物体母集団内の分離個体を差別化するために使用できる。分子マーカー法は、系統学的研究、作物品種間の遺伝的関係の特徴付け、交雑種または体細胞混成体の識別、単一遺伝形質に影響する染色体のセグメントの局所化、マップベースのクローン化、および定量的継承の研究のために使用できる。遺伝子型判別の具体的な方法では、増幅断片長多型（AFLP）を含む、任意の数の分子マーカー分析テクニックを採用しうる。AFLPは、ヌクレオチド配列の可変性に起因する増幅断片間の対立形質の差異によるものである。こうして、本発明はさらに、一つ以上の遺伝子または核酸の分離や、これらの遺伝子または核酸に遺伝的に関連した染色体の配列を、AFLP分析などの技術を使用して追跡する手段を提供する。
【０２４８】
一つの実施形態で、本明細書で説明した突然変異体、遺伝子組換えおよび非天然の植物体に由来する乾燥処理済み植物材料も提供されている。例えば、たばこ葉を乾燥処理する工程は、当業者にとって公知であり、空気乾燥処理、火力乾燥処理、熱風送管乾燥処理および日光乾燥処理が含まれるがこれに限定はされない。たばこ緑葉を乾燥処理する工程は、収穫されたたばこの種類に依存する。例えば、バージニア・フルー（ブライト）種たばこは一般に熱風送管乾燥処理で、バーレー種およびある種のダーク・ストレインは通常は空気乾燥処理で、パイプたばこ、噛みたばこ、および嗅ぎたばこは普通は火力乾燥処理である。
【０２４９】
別の実施形態で、たばこ製品は、本明細書で説明した突然変異体で遺伝子組換えで非天然の植物体に由来する植物材料（葉など。乾燥処理済みの葉などの乾燥処理済み植物材料であることが適切）を含むか、または本明細書に記載した方法で製造されたたばこ製品を含むものとして説明されている。本明細書で説明したたばこ製品は、未変性のたばこをさらに備えうる。
【０２５０】
別の実施形態で、たばこ製品は、本明細書に記載した突然変異体、遺伝子組換え、および非天然の植物体に由来する植物材料（乾燥処理済みの葉などの葉であることが好ましい）を含むものとして描写されている。例えば、植物材料をたばこ製品の内部または外部に加えて、燃焼時に望ましい芳香を放出させうる。この実施形態によるたばこ製品は、さらには未変性のたばこまたは変性たばこともしうる。この実施形態によるたばこ製品は、さらには、本明細書で開示された遺伝子以外の一つ以上の遺伝子に修飾がある、突然変異体、遺伝子組換え、または非天然の植物体に由来するものとしうる。
【０２５１】
本発明について、下記の例でさらに説明するが、これらの例では発明をさらに詳細に説明している。これらの例は、本発明を実施するために現時点で意図されている好ましい様式を規定したもので、本発明を例証するものであって、限定するものではない。
【実施例】
【０２５２】
[実施例1]  NtCLCe-s配列の識別
NtCLCe-sの識別では、RT-PCR分析および潜在的に一致するEST-コンティグの存在により、関連する転写物をN. tabacum葉中で検出する（NtCLCe-s： NCBI_43350-v4ctg-in）。Affymetrixの特注たばこエキソン-アレイ（NtPMIa1g22230e1-stからの配列プローブ）からのデータを使用して、NtCLCe-sがN. tabacumの根、緑葉および老熟した葉で等しく発現されていることを確認する。さらに、寒冷ストレスおよび強力なカドミウムストレスは、NtCLCe-sの発現レベルには影響を及ぼさず、それによってNtCLCe-sは、たばこの根および葉の器官で構成的に発現することが示唆されている。構成的なNtCLCe発現は、恐らくは窒素同化作用経路と連結されている色素体中でのその重要な細胞の役割の維持との相関がありうる。WoLFPSORTソフトウェアによれば、NtCLCe-sは色素体の薄膜タンパク質として高く予想されている。RNAseq研究では、その祖先N. sylvestrisでの転写物の存在を確認する。
【０２５３】
[実施例2]  NtCLCe-t配列の識別
NtCLCe-tの識別では、RT-PCR分析および対応するEST-コンティグの存在により、関連する転写物をN. tabacum葉中で検出する。RNAseq研究では、祖先N. tomentosiformis中の転写物の存在を確認し、それにより、NtCLCe-tコピーの発現が異質四倍体状態に入った後で、恐らくは遺伝子分裂および/または再配列によって、N. tabacumで恐らく失われたことが示唆される。
【０２５４】
[実施例3]  N. tabacum葉でのNtCLCe-sまたはNtCLCe-tの発現
CLC-Nt2-sおよびCLC-Nt2-t遺伝子の両方がN. tabacum葉で発現されたが、これはN. tabacum葉中の両方の転写物の存在（特注のたばこエクソン-アレイ研究、RT-PCRで検証）および対応するEST-コンティグ（CLC-Nt2-s：MIRA_20760-v4ctg-in；CLC-Nt2-t： NCBI_56794-v4ctg-in）によって判定された通りである。さらにRNAseq研究では、2つの祖先N. sylvestrisおよびN. tomentosiformisで対応する転写物の存在を確認する。
CLC-Nt2-tおよびCLC-Nt2-sのための特定のプローブを用いたたばこエクソン-アレイからの転写データをより注意深く見ると、NtPMIa1g19904e2-stおよびNtPMIa1g50210e2-stはそれぞれ、両方のコピーがN. tabacumでは違って発現されていることが見出された。CLC-Nt2-sはバーレー根（TN90）では不完全に発現し、CLC-Nt2-tは概日周期に対する感応性がある。両方の遺伝子は、熱風送管乾燥処理済みたばこの根および葉で発現し、カドミウム処理に対して非感受性である。
【０２５５】
[実施例4]  N. tabacumにおけるCLC-Nt2-t発現のサイレンシング
N. tabacum（Hicks broadleaf）での、CLC-Nt2のコード配列と、イントロンのフランキング（CLC-Nt2-sと100 %の同一性、およびCLC-Nt2-tと97 %の同一性）で識別されたDNA断片（配列番号8）をクローン化して、RNAiアプローチを使用してたばこの両方のCLC-Nt2コピーをサイレンシングする。対応するDNA断片を、製造者（Invitrogen）の詳しい説明にそのまま従い、エントリーベクターによってGatewayベクターpB7GWIWG2（II）に挿入する。このベクターは、植物体のすべての組織での導入遺伝子およびカナマイシン抗生物質耐性のためのkan遺伝子の構成的発現用のプロモーター（カリフラワーモザイクウィルスCaMV 35Sプロモーター）を含む。次に、構築物を、バーレー種たばこケンタッキー14（KY14）のゲノムに、伝統的な葉ディスク処置を使用して、Agrobacterium tumefasciensを介して挿入する。カルスから、個別系統を再生した。遺伝子組換え系統の選択は、小植物体から単離したゲノムDNAについてPCRによって実施する。サイレンシングで使用され、かつ種子製造のために培養されたインサートのフランキングをする特定のプライマーを使用して、RT-PCRによりRNAiサイレンシングT0系統を監視する。T1種子を回収し、寒天プレート上で再び培養し、T0小植物体として厳格に監視した。陽性の植物体を鉢に移し、温室内で栽培する。収穫時（10週間目の植物体）に、茎の中ほどの位置の1枚の葉を試料として採り、硝酸塩比色分析評価キット（Cayman、US）またはSkalarのいずれかを使用して、硝酸塩決定をする。残りのすべての葉を植物体ごとに、小規模な実験用空気乾燥処理室内で、当該技術分野において公知の標準方法を用いて2か月にわたり乾燥処理する。乾燥処理の後、それぞれの植物体の葉を集めて、TSNA分析にかける。
【０２５６】
[実施例5]  N. tabacumにおけるNtCLCe発現のサイレンシング
NtCLCeのコード配列で識別されたDNA断片（配列番号9）をクローン化して、RNAiアプローチを用いて両方のNtCLCeコピーをサイレンシングする。次に、対応するDNA断片を、製造者（Invitrogen）の詳しい説明にそのまま従い、エントリーベクターによってGatewayベクターpB7GWIWG2（II）に挿入する。このベクターは、植物体のすべての組織での導入遺伝子およびカナマイシン抗生物質耐性のためのkan遺伝子の構成的発現用のプロモーター（カリフラワーモザイクウィルスCaMV 35Sプロモーター）を含む。次に、構築物を、バーレーたばこケンタッキー14（KY14）のゲノムに、伝統的葉ディスク処置を使用して、Agrobacterium tumefasciensを介して挿入する。カルスから、個別系統を再生した。寒天プレート上の選択は、小植物体から単離したゲノムDNAについてPCRによって実施する。次に、サイレンシングで使用され、かつ種子製造のために培養されたインサートのフランキングをする特定のプライマーを使用して、RT-PCRによりRNAiサイレンシングT0系統を監視する。T1種子を回収し、寒天プレート上で再び培養し、T0小植物体として厳格に監視した。陽性の植物体を鉢に移し、温室内で栽培する。収穫時（10週間目の植物体）に、茎の中ほどの位置の1枚の葉を試料として採り、硝酸塩比色分析評価キット（Cayman、US）またはSkalarのいずれかを使用して、硝酸塩決定をする。残りの葉を植物体ごとに、小規模な実験用空気乾燥処理室内で、当該技術分野において公知の標準方法を用いて2か月にわたり乾燥処理する。乾燥処理の後、それぞれの植物体の葉を集めて、TSNA分析にかける。
【０２５７】
[実施例6]  CLC-NT2-RNAiおよびNtCLCe-RNAi植物体でのTSNA分析
ゲノムDNAに対するPCRを使用して、遺伝子組換え挿入を特定した後、cDNA（単離した全RNAから獲得）に対してRT-PCRを行い、CLC-NT2-RNAiおよびNtCLCe-RNAiの植物体の選択を行う。図1（半定量的RT-PCR分析）に示す通り、CLC-Nt2またはNtCLCe遺伝子は、野生型植物体（3つの代表的植物体が示されている）と比較して、CLC-Nt2-RNAiおよびNtCLCe-RNAi T1植物体の緑葉で完全にまたは部分的にサイレンシングされていることがわかる。興味深いことに、両方のRNAi植物体で、NtCLCeおよびCLC-Nt2遺伝子は、使用した構築物とは独立してサイレンシングがなされ、それによってこれら2つの葉の遺伝子間での潜在的クロストーク規制が示唆される。最初の実験では、発芽後に小型ポット（3 リットルポット）でT1小植物体を栽培する。収穫時（移植後10週間）に、CLC-Nt2-RNAiおよびNtCLCe-RNAiの両方の緑葉（茎の半ばの位置）で硝酸塩の低減が観察されたが、硝酸塩の低減は、NtCLCe-RNAi植物体（~95%）では、CLC-Nt2 植物体（配列番号について5%、図2Aを参照）と比較して著しく大きな効果（P<0.01）があった。ニコチン低減も、wt植物体（~35%）と比較して両方の遺伝子組換え植物体でみられた。このニコチン低減は、NtCLCeおよびCLC-Nt2がニコチン合成に影響を及ぼす一定の栽培条件下で硝酸塩の根での再分布に影響していることを示唆する。乾燥処理の後、両方のCLC-RNAi植物体で、合計TSNA（NNN、NNK、NAT（N9-ニトロソアナタビン）およびNAB（N9-ニトロソアナバシン）を決定する（図2Bを参照）。NNK、NNN、NABおよびNATは商業的に入手可能で、これは参照基準として有用なことがある。NNK、NNN、NABおよびNATの分析のための標準方法は、当該技術分野において公知である（例えば、Nicotine & Tobacco Research (2006) 2:309-313を参照）。超高速液体クロマトグラフィーを利用した質量分析法（UPLC-MS/MS）を使用できる。ニコチンを測定するための方法も当該技術分野において公知である（例えば、International Journal of Cancer (2005);116:16-19を参照）。データは、硝酸塩レベルの確実な低減によって乾燥処理済みの葉中でのTSNAの生成が抑制されていることを示しているが、これは、硝酸塩が葉中でのTSNA生成に寄与する主要なニトロソ化物質源であるためと考えられる。CLC-Nt2-RNAi植物体でみられた硝酸塩の低減は、NtCLCe-RNAi植物体と比較してそれほど強いTSNA効果にはつながっていない。
【０２５８】
根の成長にあるストレス条件を阻止するために、10リットルポットを使用して前の実験を繰り返す。こうした条件下では、野生型たばこ植物体は、前の実験と比較して約5倍多くのニコチンを蓄積する。遺伝子発現の低下を示すNtCLCe-RNAiおよびCLC-Nt2-RNAi 植物体を、前述通りに選択した。両方の構築物に由来する遺伝子組換え植物体のほとんどで、NtCLCeおよびCLC-Nt2の発現の低下が示されたため（図1を参照）、両方のCLCについての発現の低下を示すRNAi植物体をまとめてグループ化して（CLC-RNAi植物体）、ニコチンおよび硝酸塩分析にかけた（図3Aを参照）。最初の実験でCLC-RNAi植物体で観察されたニコチンの低減はこの実験ではみられず、それによって、小型ポットを使用して根の発育を制限することが、野生型植物体と比較して、NtCLCe-RNAiおよびCLC-Nt2-RNAiの両方の植物体で追加的なニコチンの低減を引き起こしうることが確認される（図2Aおよび3Aを比較）。ただし、それでも野生型植物体と比較して、両方のCLC-RNAi植物体で硝酸塩は著しく低減され（>40%）、こうしてNtCLCeおよびCLC-Nt2の発現が低減されると、たばこ葉中の硝酸塩含有量の低減につながることが確認される。こうした栽培条件下では、遺伝子組換え植物体は、wt植物体と比較して、葉の総重量および葉数を比較できるような表現型的差異を何も示さなかった（図3Bおよび3Cを参照）。
【０２５９】
これらの植物体でのTSNAの分析から、空気乾燥処理済みの葉では、野生型植物体と比較してNNNが低減されないことが示された。ただし、野生型植物体と比較して、NtCLCe-RNAiおよびCLC-Nt2-RNAiの両方の植物体で24%および10%のNNK低減がみられた（図4を参照）。NNKの低減は、NtCLCe-RNAi（P<0.01）では、CLC-Nt2-RNAi植物体でより著しいものであり、それによって最初の実験で合計TSNAについて得られたデータが確認された（図2を参照を参照）。
【０２６０】
遺伝子組換えおよび野生型植物体は現場環境下では栽培されておらず、空気乾燥処理済みたばこ用の伝統的な施設では乾燥処理されていないが、得られたデータは、NtCLCe（NtCLCe-s）およびCLC-Nt2（s および t コピー）の発現を制限することで、効果的な硝酸塩の低減に寄与することを示す。乾燥処理の後、TSNA(NNK)は葉中で低減されることが判明し、緑葉中で硝酸塩含有量を減らすと、乾燥処理時のニトロソ化剤の供給者として対応する乾燥処理済みの葉中でのTSNA生成の低減に効果的に寄与することが示されている。この低減は、NNKの少なくとも20%の低減に対応しうる。
【０２６１】
[実施例7]  N. tabacumにおけるCLC-Nt2-s、CLC-Nt2-t、NtCLCe-sまたはNtCLCe-tのエチル-メタンスルホン酸塩突然変異誘発
無作為な点突然変異を持つ植物体の母集団を形成する目的で、エチル-メタンスルホン酸塩（EMS）を用いて、Nicotiana tabacum AA37のM0種子を、異なる濃度および露光時間sで処理する。殺菌曲線は、死亡率、稔性およびキメラ化のレートと共に、各処理についてM1世代で予測される。M1植物体は、自家受粉して、種子のM2系統を生成し、劣性の対立形質が同型接合として回復し、致命的な対立形質が異型接合として回復されるようにした。EMS変異誘発させた母集団の各系統群について8個のM2植物体に由来するゲノムDNAを抽出して突然変異体についてスクリーニングし、M2植物材料およびM3種子を回収し、将来的な分析用に貯蔵した。突然変異体を特定し特性付けするために、M2植物体に由来するゲノムDNA試料をグループでプールし、標的とされた遺伝子断片の配列決定によってスクリーニングした。標的遺伝子の断片は、表2に示すプライマーを使用して増幅させた。標的遺伝子内の突然変異が、個別DNA断片の配列決定により引き出された。様々な突然変異体を表1に示す。
【０２６２】
[実施例8]  野外栽培したCLCNt2-s G163R同型接合の突然変異体たばこ植物体の分析
野外栽培したCLCNt2-s G163R突然変異体たばこ植物体の緑葉での硝酸塩およびニコチンのレベルの時間的経過を図5に示す。葉全体が、野外栽培したCLCNt2-s G163R同型接合のたばこ植物体（三角）およびバーレー種式の下で栽培したout-segregant野生型（ひし形）たばこ植物体から茎の半ばの位置で栽培される。試料は、朝（早朝、午前中半ばおよび昼前）の時間の異なる3回の時点で収穫され、フリーズドライされる。粉末にした薄膜材料を、硝酸塩およびニコチンの含有量について分析する。N=4〜8個体の植物体。標準偏差は、図中に示されている。
この実験の結果は、NtCLCe-t P143L同型接合の突然変異体たばこ植物体では、対照植物体と比較して早朝に硝酸塩のレベルが増大していることを示す。硝酸塩のレベルは、対照植物体中の約11 mg/gから、突然変異体である植物体中の約6 mg/gに減少している。硝酸塩レベルは、午前中半ばには引き続き減少している。硝酸塩のレベルは、対照植物体中の約7 mg/gから、突然変異体である植物体中の約4.5 mg/gに減少している。昼前までに、硝酸塩レベルは午前中半ばと比較して突然変異体である植物体中で増加し、早朝での硝酸塩レベルに達している。対照について、対照植物体中の硝酸塩レベルは引き続き減少している。昼前までに、硝酸塩のレベルは、突然変異体である植物体中で約6 mg/gに増大し、対照植物体中で約3 mg/gに減少している。ニコチンのレベルは、朝のあいだ幾分類似している。ニコチンのレベルは、突然変異体である植物体については約13 mg/g〜約11 mg/gの間で変動があり、対照植物体については約9 mg/g〜13 mg/gの間で変動がある。ニコチンの結果は、突然変異体である植物体の代謝が正常であることを示す。突然変異体および対照植物体についてのバイオマスレベルも比較可能である。
【０２６３】
[実施例9]  野外栽培したNtCLCe-t P143L同型接合の突然変異体たばこ植物体の分析
野外栽培したNtCLCe-t P143L突然変異体たばこ植物体の緑葉での硝酸塩およびニコチンのレベルの時間的経過を図6に示す。葉全体が、野外栽培したNtCLCe-t P143L同型接合の植物体（四角）およびバーレー種式の下で栽培したout-segregant野生型（ひし形）植物体から茎の半ばの位置で栽培される。試料は、朝（早朝、午前中半ばおよび昼前）の時間の異なる3回の時点で収穫され、フリーズドライされる。粉末にした薄膜材料を、硝酸塩およびニコチンの含有量について分析する。N=4〜8個体の植物体。標準偏差は、図中に示されている。
【０２６４】
この実験の結果は、NtCLCe-t P143L同型接合の突然変異体たばこ植物体では、対照植物体と比較して早朝に硝酸塩のレベルが増大していることを示す。硝酸塩のレベルは、対照植物体中の約7 mg/gから、突然変異体である植物体中の約14 mg/gに増大している。硝酸塩レベルは、午前中半ばに突然変異体である植物体中で減少し、対照植物体中ではわずかに増大している。突然変異体である植物体中の硝酸塩レベルは約9 mg/gに減少し、対照植物体中の硝酸塩のレベルは約9 mg/gに増大している。昼前までに、硝酸塩レベルは、午前中半ばと比較して突然変異体である植物体中で引き続き減少した。対照について、対照植物体中の硝酸塩レベルは減少している。昼前までに、硝酸塩のレベルは突然変異体である植物体中で約2 mg/gに減少し、対照植物体中では約4 mg/gに減少している。ニコチンのレベルは、突然変異体および対照植物体のそれぞれについて、朝のあいだは幾分類似している。ニコチンのレベルは、突然変異体である植物体については約20 mg/g〜約24 mg/gの間で変動があり、対照植物体については約15 mg/g〜17 mg/gの間で変動がある。ニコチンの結果は、突然変異体である植物体の代謝が正常であることを示す。突然変異体および対照植物体についてのバイオマスレベルも比較可能である。
【０２６５】
本明細書で引用または説明した任意の刊行物は、本明細書の出願日より前に開示された関連情報を提供するものである。本明細書に含まれる声明は、発明者がそうした開示事前日付を認めないものとは解釈されないものとする。上記の明細書で言及したすべての出版物は、本明細書に参照によって組み込む。発明についての様々な改良や変形が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、当業者にとって明らかとなる。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明してきたが、当然のことながら、本発明は主張の通り、こうした特定の実施形態に不当に限定されるべきではない。実際に、本発明を実施するための説明したモードについて、細胞生物学、分子生物学および植物体生物学の分野または関連する分野にいる当業者にとって明らかである様々な改良は、以下の請求項の範囲内に収まるものであることが意図される。
【０２６６】
〔配列〕
配列番号1（Nicotiana tabacumに由来するCLC-Nt2のDNA配列、祖先N. sylvestrisを起源とする配列）
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配列番号2（Nicotiana tabacumに由来するCLC-Nt2のDNA配列、祖先N. tomentosiformisを起源とする配列）
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配列番号3（Nicotiana tabacumに由来するNtCLCeのDNA配列、祖先N. sylvestrisを起源とする配列、1個の開始コドン）
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配列番号4（Nicotiana tabacumに由来するNtCLCeのDNA配列、祖先N. tomentosiformisを起源とする配列、1個の開始コドン）
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配列番号5（Nicotiana tabacumに由来するCLC-Nt2のタンパク質配列、配列番号1から翻訳）
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FNCPDGYYNDLATLLLTTNDDAVRNIFSINTPGEFQVMSLIIYFVLYCILGLITFGIAVP
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NNLLLLPITMLVLLIAKSVGDCFNLSIYEIILELKGLPFLDANPEPWMRNITAGELADVK
PPVVTLCGVEKVGRIVEALKNTTYNGFPVVDEGVVPPVGLPVGATELHGLVLRTHLLLVL
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VESLSVAKAMVLFRQVGLRHMLIVPKYQAAGVSPVVGILTRQDLRAHNILSVFPHLEKSK
SGKKGN
配列番号6（Nicotiana tabacumに由来するCLC-Nt2のタンパク質配列、配列番号2から翻訳）
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LDYEINENDLFKHDWRRRSRVQVLQYVFLKWTLAFLVGLLTGVTASLINLAIENIAGYKL
RAVVNYIEDRRYLVGFAYFAGANFVLTLIAALLCVCFAPTAAGPGIPEIKAYLNGVDTPN
MYGATTLFVKIIGSIAAVSASLDLGKEGPLVHIGACFASLLGQGGPDNYRLKWRWLRYFN
NDRDRRDLITCGSSSGVCAAFRSPVGGVLFALEEVATWWRSALLWRTFFSTAVVVVILRA
FIEYCKSGYCGLFGRGGLIMFDVSGVSVSYHVVDIIPVVVIGIIGGLLGSLYNCVLHKVL
RLYNLINEKGKLHKVLLALSVSLFTSICMYGLPFLAKCKPCDSSLQGSCPGTGGTGNFKQ
FNCPDGYYNDLATLLLTTNDDAVRNIFSINTPGEFHVTSLIIYFVLYCILGLITFGIAVP
SGLFLPIILMGSAYGRLLAIAMGSYTKIDPGLYAVLGAASLMAGSMRMTVSLCVIFLELT
NNLLLLPITMLVLLIAKSVGDCFNLSIYEIILELKGLPFLDANPEPWMRNITAGELADVK
PPVVTLCGVEKVGRIVEVLKNTTYNGFPVVDEGVVPPVGLPVGATELHGLVLRTHLLLVL
KKKWFLNERRRTEEWEVREKFTWIDLAERGGKIEDVVVTKDEMEMYVDLHPLTNTTPYTV
VESLSVAKAMVLFRQVGLRHMLIVPKYQAAGVSPVVGILTRQDLRAHNILSVFPHLEKSK
SGKKGN
配列番号7（Nicotiana tabacumに由来するNtCLCeのタンパク質配列、祖先N. sylvestrisを起源とする配列、1個の開始コドン、配列番号3から翻訳）
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VKSVLEPVLKTMAACVTLGTGNSLGPEGPSVEIGTSVAKGVGALLDKGGR
RKLSLKAAGSAAGIASGFNAAVGGCFFAVESVLWPSPAESSLSLTNTTSM
VILSAVIASVVSEIGLGSEPAFAVPGYDFRTPTELPLYLLLGIFCGLVSV
ALSSCTSFMLQIVENIQTTSGMPKAAFPVLGGLLVGLVALAYPEILYQGF
ENVNILLESRPLVKGLSADLLLQLVAVKIVTTSLCRASGLVGGYYAPSLF
IGAATGTAYGKIVSYIISHADPIFHLSILEVASPQAYGLVGMAATLAGVC
QVPLTAVLLLFELTQDYRIVLPLLGAVGLSSWVTSGQTRKSVVKDREKLK
DARAHMMQRQGTSFSNISSLTYSSGSPSQKESNLCKLESSLCLYESDDEE
NDLARTILVSQAMRTRYVTVLMSTLLMETISLMLAEKQSCAIIVDENNFL
IGLLTLGDIQNYSKLPRTEGNFQEELVVAGVCSSKGNKCRVSCTVTPNTD
LLSALTLMEKHDLSQLPVILGDVEDEGIHPVGILDRECINVACRALATRE
QLC
配列番号8（CLC-Nt2のサイレンシングに使用されるRNAi配列）
gtcatcatcaggtgtgtgtgctgctttccgttctccagtaggtggtgtcctatttgctttagaggaagtggcaacatggtggagaagtgcactcctctggagaactttcttcagcacggcagttgtggtggtgatactgagggccttcattgaatactgcaaatctggcaactgtggactttttggaagaggagggcttatcatgtttgatgtgagtggtgtcagtgttagctaccatgttgtggacatcatccctgttgtagtgattggaatcataggcggacttttgggaagcctctacaatcatgtcctccacaaaattctgaggctctacaatctgatcaacgagaagggaaaactacataaggttcttctcgctctgagtgtctcccttttcacctccatttg
配列番号9（CLCeのサイレンシングに使用されるRNAi配列）
gaaatcctttaccagggttttgagaatgttaatattctgctagaatctcgcccactagtgaaaggcctctccgctgatctgttgctccagcttgtagctgtcaaaatagtaacaacttcattatgccgagcctctggattggttggaggctactatgcgccatctctattcatcggtgctgctactggaactgcatatgggaaaattgttagctacattatctctcatgctgatccaatctttcatctttccatcttggaagttgcatccccacaagcttat
配列番号10（Nicotiana tabacumに由来するNtCLCeのDNA配列、祖先N. sylvestrisを起源とする配列、2個の開始コドン）
atgattagcggccaaaacactgtgctgcacaatcctcctaattcgctcttcaattcctta
tctcctcgccatatctgtatatctttctgtaacgacaaagctttaaaaaagtcagtcacg
cactccgcccctcggtttgctcgtctgttaaacaatgaatcacggaagttgttgggtcgt
catccaaattgctggccttgggctcgacgaccatctcttcctccgggacgttcctctgac
ggaaacattgaaaaagaacaagatatgtgcgacagcagcaaagtcgatagtgatagtggc
atccagataggatctctgctcgaggaagttatcccacaaggcaataataccgctataatc
tcggcttgctttgttggcctcttcaccggtatcagtgtcgtgcttttcaacgctgcggta
cgtgcgctataggtctttcatttctcttttcatgtactattcctccttacttacttggcc
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atacatcaaattcacataacttagtaaaatatgctgatattctgaattttaaacttacca
gcttagaacatccaggttagttcagaaacagataatctaaattggtctcatttataagtc
attttgttattcaagacatacaatttggctcttgataaaagattatgcagcgcccgatga
ttacctaatatttatcagcaacccatgtaatttaacaatattgtcaccatataaaagaga
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gagtacattggcaacgtgtaatcttagtaccagcttgtggcggtttggtagtcagctttt
tgaatgccttccgagccactctggaggtttcaactgaaggaagttggacatcatctgtta
aatctgtattggaaccagttttgaagacaatggccgcttgtgtcacattaggaactggga
attccttaggaccagaaggccctagtgttgaaattggcacatctgttgccaagggagttg
gagctctgcttgataaaggtggtcgtagaaagctgtcactcaaggctgctggatcagctg
ctggaatcgcttctggtttgttccccatattattcttggttctgaaccatacatggtaca
ttttccttataattacatgtagcctgttgtatgctttcctctttcccgggaagccttttt
gtaaatacaagtgtgtttgcactcaaaccaataaactgtaaaaaaggtgaactccttaag
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tagaacacgagtgtttccattagagagagaaaagagacttctagatatttctattatctc
tgtaagagtgaatccgttcctatacaaaaaataggccttcattaaatacaagcttgggct
gggtactactgggccaaagtaaaaaataaaaagaatcacccactatcaaatgggcctagt
ctaacaacccccttcaagctggagggtgacacaacccctagcttgcgaatatgaaaatga
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caagacacctctgcaacagccttactcatggacctatactcagcttcaattgatgatagt
gagacaacaggttgcttctttgatttccagctcaccaagctgccccccaagaaaaataca
aaaaccagtgacagacctgcggctgtctgggcaagaagcccaatcactgcacaataaagc
tgcaaagacaagtctggagagttattgcggaagattccaaagtcaaaagtgcccttgagg
tatcttagcaagtgcagggcagcctgcatgttaggaacacagggagactgcataaactga
ctcagatgctgaacaacaaaactaaggtcaggccttgtgcgtatcaaaaagtttagcttg
tgcattagactcctgtactcttcaggcctgggcaaaggagtgccaatcttagcttttaac
ttcacattcaattcaagggggcaagtgacagaagagcaattcgaggaatgaaaatcagcc
agcaaatcatgaatgaactttttctgatgaagaagaaccccagaatcagtgtataaaacc
tcaatgctaaggaagtaattaagagagcccatgtccttaatcttgaactggtcactgaga
aaggacttcaaagcagccaattcagctagatcacacctagtcaatatgatatcattcaca
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gaagccagtcttaaaccataaagagacttctggagtttgcatactaaaggagcagaagaa
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配列番号11（Nicotiana tabacumに由来するNtCLCeのDNA配列、祖先N. tomentosiformisを起源とする配列、2個の開始コドン）
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配列番号12（Nicotiana tabacumに由来するNtCLCeのタンパク質配列、祖先N. sylvestrisを起源とする配列、2個の開始コドン、配列番号10から翻訳）
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QLC
配列番号13（Nicotiana tabacumに由来するNtCLCeのタンパク質配列、祖先N. tomentosiformisを起源とする配列、1個の開始コドン、配列番号4から翻訳）
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配列番号14（Nicotiana tabacumに由来するNtCLCeのタンパク質配列、祖先N. tomentosiformisを起源とする配列、2個の開始コドン、配列番号11から翻訳）
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VSWAFLNTRLETLVEANHEGFDLNAEIAKAKEAIDKTQQRQIFSSPEDEG
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【０２６７】
〔表１〕
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0006693747.tif 000004
0006693747.tif 000005
【０２６８】
CLC-Nt2-sは、配列番号1によってコードされた配列番号5に示すポリペプチド配列に対応する。
【０２６９】
CLC-Nt2-tは、配列番号2によってコードされた配列番号6に示す配列に対応する。
【０２７０】
NtCLCe-sは、配列番号3によってコードされた配列番号7に示す配列に対応する。
【０２７１】
NtCLCe-t は、配列番号4によってコードされた配列番号13に示す配列に対応する。
〔表２〕
0006693747.tif 000006
【図１】
0006693747.tif 000007
【図２】
0006693747.tif 000008
【図３】
0006693747.tif 000009
【図４】
0006693747.tif 000010
【図５】
0006693747.tif 000011
【図６】
0006693747.tif 000012
【配列表】
0006693747000001.app