(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
ａ）  抗原及び抗原をコードする核酸からなる群から選ばれる少なくとも１；及び
ｂ）  IL-21をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、当該ヌクレオチド配列が配列番号３からなるヌクレオチド配列、及び配列番号３に９５％以上の同一性であるヌクレオチド配列
を含む、ワクチン。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号３を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記抗原は、第１の核酸によってコードされ、そしてＩＬ−２１は、第２の核酸によってコードされる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
請求項３に記載の抗原と同じコードされた核酸配列および抗原ペプチドと、請求項３に記載のＩＬ−２１と同じコードされた核酸配列およびＩＬ−２１ペプチドと、をさらに含む、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記第２の核酸は、発現ベクターをさらに含む、請求項３に記載のワクチン。
【請求項６】
前記抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、インフルエンザ抗原、熱帯熱マラリア原虫抗原、ディフィシル菌抗原およびそれらの断片からなる前記群から選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項９】
前記インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、ＢＨＡ抗原、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記熱帯熱マラリア原虫抗原は、サーカムスポロゾイト（ＣＳ）抗原を含む、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記ディフィシル菌抗原が、トキシンＡ、トキシンＢおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６に記載のワクチン。
【請求項１２】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ワクチンが免疫応答を必要とする対象に投与され、免疫応答を増強するための請求項１に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ワクチンを投与することは、電気穿孔を含む、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
前記対象における前記免疫応答の増強は、対象における細胞性免疫応答、液性免疫応答、または細胞性および液性免疫応答の両方を含む、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１６】
配列番号３および配列番号３と９５％以上同一であるヌクレオチド配列からなる群から選択される１つ以上の最適化ヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
【請求項１７】
前記核酸分子は、プラスミドである、請求項１６に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６２／０５８，３０４号に対する優先権を主張するものであり、その全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、抗原およびＩＬ−２１を含むワクチン、ならびにそのようなワクチンを投与する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンは、個体において免疫応答を刺激し、特定の疾患に対する保護及び／または治療を提供するために使用される。いくつかのワクチンは、免疫応答を誘導するために抗原を含む。強い免疫応答を誘発する抗原もあれば、弱い免疫応答を誘発する抗原もある。抗原に対する弱い免疫応答は、ワクチンにアジュバントを含めることにより増強することができる。アジュバントには、例えば、アルミニウム塩、油乳剤、細菌または他の病原体の殺菌成分、サイトカイン等の多くの異なる形態がある。
【０００４】
サイトカインは、他の細胞の挙動に影響を及ぼす細胞によって作られるタンパク質であり、多くのアジュバントとは異なり、特定の免疫応答を調節することができる。そのようなサイトカインの１つは、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）であり、これは、リンパ球および骨髄集団ならびに上皮細胞に作用を及ぼし、先天性および適応免疫応答を調節する。ＩＬ−２１は、幾つかのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの機能的分化に寄与し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖と機能的応答を促進し、かつＢ細胞免疫グロブリン応答の発生において役割を果たすことが示されてきた。ＩＬ−２１は、濾胞性ヘルパーＴ（ＴＦＨ）細胞、１７型ヘルパーＴ（Ｔｈ１７）細胞およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含めた、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞集団によって産生される。
【０００５】
また、ワクチンは、多くの異なる様式（例えば、注射、経口的等）で多くの異なる組織（例えば、筋肉内、皮内等）に投与される。しかしながら、全ての送達方法が等しいわけではない。個体集団内におけるより高いコンプライアンスを可能にする送達方法がある一方で、ワクチンの免疫原性及び／または安全性に影響を及ぼし得る送達方法もある。したがって、抗原同一性および投与経路に関係なく抗原反応を増強する、安全かつより効果的なアジュバントの開発の必要性が、依然として当該技術分野に存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、抗原およびＩＬ−２１を含むワクチンを対象とする。ＩＬ−２１は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９５％の同一性を有するヌクレオチド配列および配列番号３に記載のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされてもよい。ＩＬ−２１は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
【０００７】
抗原は、第１の核酸によってコードされてもよく、ＩＬ−２１は、第２の核酸によってコードされ得る。第２の核酸は、発現ベクターをさらに含んでいてもよい。ワクチンは、上記抗原と同じコードされた核酸配列および抗原ペプチドと、上記ＩＬ−２１と同じコードされた核酸配列およびＩＬ−２１ペプチドとをさらに含んでいてもよい。
【０００８】
抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、インフルエンザ抗原、熱帯熱マラリア原虫抗原、ディフィシル菌抗原およびそれらの断片からなる群から選択され得る。ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ１６Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原およびそれらの組合せからなる群から選択される。ＨＩＶ抗原は、ＥｎｖＡ、ＥｎｖＢ、ＥｎｖＣ、ＥｎｖＤ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇおよびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択される。インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  Ｈａ、ＢＨＡ抗原およびそれらのいずれかの組合せからなる群から選択されてもよい。熱帯熱マラリア原虫抗原は、スポロゾイド周囲抗原を含んでいてもよい。ディフィシル菌抗原は、トキシンＡ、トキシンＢおよびそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。
【０００９】
ワクチンは薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでいてもよい。
【００１０】
本発明はまた、免疫応答を必要とする対象において免疫応答を増強するための方法も対象とする。方法は、抗原とＩＬ−２１を含むワクチンの投与を含むことができる。ＩＬ−２１は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９５%の同一性を有するヌクレオチド配列および配列番号３に記載の記載のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされていてもよい。ＩＬ−２１は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【００１１】
ワクチンの投与には電気穿孔が含まれていてもよい。対象における免疫応答の増強には、対象における細胞性免疫応答、液性免疫応答、または細胞性および液性免疫応答の両方の増強が含まれいてもよい。
【００１２】
本発明は、配列番号３および配列番号３と９５％以上同一であるヌクレオチド配列からなる群から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子をさらに対象とする。核酸分子は、プラスミドであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マウスＩＬ−２１をコードする最適化された核酸を含む、プラスミドｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２１  Ｏｐｔのマップを示す。
【図２】トランスフェクトされたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞の上清中のＩＬ−２１の発現を示す。
【図３】Ｂ細胞ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ディフィシル菌（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｌｅ）由来のトキシンＡおよびトキシンＢ抗原をコードするプラスミドを用いて筋肉内経路を介して免疫されたマウスにおける液性免疫応答を示す。
【図４】ＥＬＹＳＡアッセイを用いて筋肉内経路を介して免疫されたマウスの液性免疫応答を示す。
【図５】インターフェロンガンマＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いてＨＩＶ由来のＥｎｖＡおよびＥｎｖＣ抗原をコードするプラスミドで筋肉内経路を介して免疫したマウスにおける細胞性免疫応答を示す。
【図６】ＥＬＹＳＡアッセイを用いて、ＨＩＶ由来のＥｎｖＡおよびＥｎｖＣ抗原をコードするプラスミドにより筋肉内経路を介して免疫されたマウスの液性免疫応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、ＩＬ−２１をアジュバントとして使用することにより、対象において抗原に対する免疫応答を増強するために使用することができるワクチンに関する。ＩＬ−２１は、一本鎖Ｔ細胞誘導サイトカインである。
【００１５】
いくつかの例において、抗原を単独で含むワクチンと比較して、抗原の源または投与経路にかかわらず対象においてより高い免疫応答が誘発されるため、ＩＬ−２１は、汎用アジュバントとして機能することができる。ＩＬ−２１は、ウイルス抗原および細菌抗原の両方、例えば、ＨＩＶ抗原およびディフィシル菌抗原それぞれの免疫応答をさらに増大させることができる。ＩＬ−２１はさらに、抗原を伴うＤＮＡまたはペプチド単独に比べてより大きな免疫応答を得るための核酸／ペプチド組合せである抗原を伴うＤＮＡ／ペプチド組合せの形態をとることができる。いくつかの例において、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生の増加によって示されるように、ＩＬ−２１は、筋組織および皮膚組織の両方において免疫応答をさらに増大させることができる。
【００１６】
１．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が優先する。好ましい方法および材料については後述するが、本明細書に記載されるものと類似するまたは均等な方法および材料も、本発明の実施または試験に使用することができる。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、例示的であるに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
【００１７】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、およびそれらの変形は、本明細書で使用される場合、さらなる行為または構造の可能性を排除しない、開放式の移行句、用語、または語句であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上、そうではないという指示がない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書に存在する実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【００１８】
本明細書で使用される「アジュバント」は、抗原の免疫原性を高めるために本明細書に記載されるワクチンに添加される任意の分子を意味する。
【００１９】
本明細書で用いられる「コード配列」または「コード核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸を投与される個体または哺乳動物の細胞中での発現を指導することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素に機能的に連結された開始および終結シグナルをさらに含み得る。
【００２０】
本明細書に使用される「相補体」または「相補的な」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の間の、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対を意味する。
【００２１】
本明細書に互換的に使用される「電気穿孔」、「電気透過」、または「電気運動強化」（「ＥＰ」）とは、生体膜に微細通路（孔）を誘導する膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水等の生体分子が、細胞膜の一方の側面から反対側に通過することを可能にする。
【００２２】
本明細書で使用される「断片」または「免疫原性断片」は、哺乳動物において免疫応答を誘発及び／または増強することができるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部を意味する。断片は、以下に記載するタンパク質断片をコードする種々のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であってもよい。断片は、以下に記載する核酸配列のうちの１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含むことができる。いくつかの実施形態において、断片は、以下に記載する核酸配列のうちの少なくとも１つの少なくとも２０ヌクレオチド以上、少なくとも３０ヌクレオチド以上、少なくとも４０ヌクレオチド以上、少なくとも５０ヌクレオチド以上、少なくとも６０ヌクレオチド以上、少なくとも７０ヌクレオチド以上、少なくとも８０ヌクレオチド以上、少なくとも９０ヌクレオチド以上、少なくとも１００ヌクレオチド以上、少なくとも１５０ヌクレオチド以上、少なくとも２００ヌクレオチド以上、少なくとも２５０ヌクレオチド以上、少なくとも３００ヌクレオチド以上、少なくとも３５０ヌクレオチド以上、少なくとも４００ヌクレオチド以上、少なくとも４５０ヌクレオチド以上、少なくとも５００ヌクレオチド以上、少なくとも５５０ヌクレオチド以上、少なくとも６００ヌクレオチド以上、少なくとも６５０ヌクレオチド以上、少なくとも７００ヌクレオチド以上、少なくとも７５０ヌクレオチド以上、少なくとも８００ヌクレオチド以上、少なくとも８５０ヌクレオチド以上、少なくとも９００ヌクレオチド以上、少なくとも９５０ヌクレオチド以上、または少なくとも１０００ヌクレオチド以上を含むことができる。
【００２３】
本明細書で使用される断片または免疫原性断片はまた、哺乳動物において免疫応答を誘発及び／または増強することができるポリペプチド配列またはその一部も意味する。断片は、以下に記載する種々のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であってもよい。断片は、以下に記載するタンパク質の１つ以上の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含むことができる。いくつかの実施形態において、断片は、以下に記載するタンパク質のうちの少なくとも１つの少なくとも２０アミノ酸以上、少なくとも３０アミノ酸以上、少なくとも４０アミノ酸以上、少なくとも５０アミノ酸以上、少なくとも６０アミノ酸以上、少なくとも７０アミノ酸以上、少なくとも８０アミノ酸以上、少なくとも９０アミノ酸以上、少なくとも１００アミノ酸以上、少なくとも１１０アミノ酸以上、少なくとも１２０アミノ酸以上、少なくとも１３０アミノ酸以上、少なくとも１４０アミノ酸以上、少なくとも１５０アミノ酸以上、少なくとも１６０アミノ酸以上、少なくとも１７０アミノ酸以上、少なくとも１８０アミノ酸以上、少なくとも１９０アミノ酸以上、少なくとも２００アミノ酸以上、少なくとも２１０アミノ酸以上、少なくとも２２０アミノ酸以上、少なくとも２３０アミノ酸以上、または少なくとも２４０アミノ酸以上を含むことができる。
【００２４】
本明細書で使用される「遺伝子構築物」または「構築物」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞において発現を導くことができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始シグナルおよび終止シグナルを含む。本明細書で使用される場合、用語「発現可能な形態」は、個体の細胞に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結された必要な調節エレメントを含有する遺伝子構築物または構築物を指す。
【００２５】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において、本明細書で用いられる「同一性のある」または「同一性」は、特定領域で同一となる特定割合の残基をその配列が有することを意味する。割合は、２つの配列を最適にアライニングすること、特定領域で２つの配列を比較すること、同一残基が両方の配列内に生じる位置の数を決定して適合位置の数を得ること、適合位置の数を特定領域の位置の総数で割ること、およびその結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ること、により計算することができる。２つの配列が異なる長さであるか、またはアライメントが１つ以上のねじれ型末端を生成していて、比較される特定領域が単一配列のみを含む場合、単一配列の残基は、計算の分子ではなく分母中に含まれる。ＤＮＡとＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は同等であると見なすことができる。同一性は、手作業またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０等のコンピュータ配列アルゴリズムを使用して、行うことができる。
【００２６】
本明細書で用いられる「免疫応答」は、抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞反応もしくは体液反応、または双方の形態であり得る。
【００２７】
本明細書に使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」とは、共有結合で一緒に結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の表示は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸はまた、記述された一本鎖の相補鎖を包含する。核酸の多くの変異体を、所定の核酸と同じ目的で用いることができる。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補配列も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ターゲット配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。つまり核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【００２８】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖および一本鎖の両方の配列の部分を含有してもよい。核酸は、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、インノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む、塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は、化学合成法または組み換え法によって、得ることができる。
【００２９】
本明細書で用いられる「機能的に連結された」は、遺伝子の発現が空間的につながったプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子の間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子内でそれが制御する遺伝子との間の距離と、ほぼ同一であり得る。当業者に公知の通り、この距離の変動は、プロモーター機能を喪失せずに適合させることができる。
【００３０】
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結した配列を意味することができ、天然、合成、または天然および合成の改変または組み合わせであってもよい。
【００３１】
本明細書に使用される「プロモーター」とは、細胞内で核酸の発現をもたらす、活性化する、または強化することが可能な、合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、さらに、その発現を強化する、ならびに／またはその空間的発現および／もしくは一時的発現を変化させる、１つ以上の特定の転写制御配列を含んでもよい。プロモーターは、遠位のエンハンサーまたはレプレッサ要素を含んでいてもよく、それは転写開始部位から何千もの塩基対に位置することができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物をはじめとする供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が生じる成長段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤等の外部刺激に応答して、構造的または特異的に遺伝子の発現を制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクレリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータ−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【００３２】
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書において交換可能に使用され、本明細書に記載されるタンパク質またはアミノ酸配列のアミノ末端に連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を導く。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、それが産生される細胞からのタンパク質の分泌を促進する。シグナルペプチド／リーダー配列は、多くの場合、細胞からの分泌の際に、しばしば成熟タンパク質と称されるタンパク質の残りの部分から切断される。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のアミノ末端に連結される。
【００３３】
本明細書で使用される「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫されることを望むかまたは必要とする哺乳動物を意味することができる。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、またはラットであってもよい。
【００３４】
本明細書に使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸の複合混合物中のように、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が、第２の核酸配列（例えば、ターゲット）にハイブリダイズする条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況においては、異なるであろう。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択してもよい。Ｔｍは、ターゲットに相補的なプローブの５０％が平衡状態でターゲット配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度ｐＨ、および核酸濃度下で）であってもよい（ターゲット配列はＴｍでは過剰に存在するため、平衡状態でプローブの５０％が占領される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、例えば、ｐＨ７．０〜８．３で０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（または他の塩）濃度となり、温度が短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃となり、長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチドを超える）では少なくとも約６０℃となる条件であってもよい。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加により実現してもよい。選択的または特異的ハイブリダイゼーションでは、正のシグナルは、バックグランドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であってもよい。例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件には、次のものが挙げられる：５０％ホルムアミド、５ｘ  ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でのインキュベーション、６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄。
【００３５】
本明細書に使用される「実質的に相補性」とは、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のヌクレオチドの領域で、第１の配列が第２の配列の相補配列に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であること、あるいは２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００３６】
本明細書に使用される「実質的に同一の」とは、第１および第２のアミノ酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味することができる。また、実質的に同一であるとは、第１の核酸配列および第２の核酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることを意味することもできる。
【００３７】
本明細書で使用される「治療」または「治療すること」は、疾患を予防する、抑制する、制圧する、または完全に排除する手段を通して、疾患から動物を保護することを意味する。疾患からの保護は、疾患の発症前に、本発明のワクチンを動物に投与することを含む。疾患の制圧は、疾患の誘導後ではあるが、その臨床的出現の前に、本発明のワクチンを動物に投与することを含む。疾患の制圧は、疾患の臨床的出現の後に、本発明のワクチンを動物に投与することを含む。
【００３８】
核酸に関して本明細書に使用される「変異体」とは、（ｉ）参照ヌクレオチド配列の一部分もしくはフラグメント、（ｉｉ）参照ヌクレオチド配列の相補体もしくはその一部分、（ｉｉｉ）参照ヌクレオチドもしくはその相補体と実質的に同一な核酸、または（ｉｖ）参照核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸を意味する。
【００３９】
変異体は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物活性を保持している、ペプチドまたはポリペプチドとしてさらに定義され得る。「生物学的活性」の代表的な例として、特異的な抗体によって結合される能力、または免疫応答を促進する能力が挙げられる。変異体はまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。アミノ酸の保存的置換、すなわち、１つのアミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）を有する別のアミノ酸と置き換えることは、典型的に小規模な変更を伴うとして、当該技術分野で認識されている。これらの小規模な変更は、当該技術分野において理解されるように、部分的に、アミノ酸の親水性インデックスを考慮することによって、特定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸の親水性インデックスは、その疎水性および荷電の考慮に基づく。類似の親水性インデックスを有するアミノ酸が、置換することができ、タンパク質の機能を依然として保持できることは、当該技術分野で公知である。一態様において、±２の親水性インデックスを有するアミノ酸が、置換されている。アミノ酸の親水性を利用して、生物学的機能を保持したタンパク質を生じる置換を明らかにすることもできる。ペプチドにおいてアミノ酸の親水性を考慮することで、そのペプチドの最大の局所的平均親水性、つまり抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な指標を計算することができる。当該技術分野で理解される通り、類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、生物活性、例えば免疫原性を保持したペプチドを得ることができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて実施できる。アミノ酸の疎水性インデックスおよび親水性値の両方とも、そのアミノ酸の特定の側鎖により影響を受ける。その観察と一致して、疎水性、親水性、荷電、寸法、および他の性質により明らにされた通り、生物学的機能に適合性のあるアミノ酸置換が、アミノ酸、特にそれらアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存することは理解されている。
【００４０】
変異体は、完全な遺伝子配列の全長またはその断片にわたって実質的に同一な核酸配列であってもよい。核酸配列は、遺伝子配列の全長またはその断片にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。変異体は、アミノ酸配列の全長またはその断片にわたって実質的に同一なアミノ酸配列であってもよい。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の全長またはその断片にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であってもよい。
【００４１】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であってもよい。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。ベクターは、１つ以上の異種核酸配列を含有するかまたは含むことができる。
【００４２】
本明細書における数値範囲の列挙の場合、それらの間に介在する同程度の正確さを有する各数値が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲では、６および９に加えて、数値７および８が企図され、範囲６．０〜７．０では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が、明示的に企図される。
【００４３】
２．ワクチン
抗原およびアジュバントを含むワクチンが本明細書に提供される。ワクチンは、個体における抗原提示および抗原に対する全体的な免疫応答を増強することができる。抗原およびアジュバントの組み合わせは、抗原を単独で含むワクチンよりも効率的に免疫系を誘導する。ワクチンは、筋肉および皮膚等の異なる組織に投与された場合に免疫応答をさらに誘導することができる。
【００４４】
本発明のワクチンは、ワクチン自体が疾病または死亡の原因とならないように安全であること；ウイルスまたは細菌等の生病原体への曝露から生じる疾病に対する保護作用があること；細胞の感染を予防するために中和抗体を誘導すること；細胞内病原体に対する保護Ｔ細胞応答を誘導すること；ならびに投与し易さ、少ない副作用、生物学的安定性、および用量当たりの低コストを提供すること等の、有効なワクチンに要求される特徴を有することができる。後述のように抗原とアジュバントとを組み合わせることにより、ワクチンは、これらの特徴の一部または全部を達成することができる。
【００４５】
ａ．アジュバント
ワクチンは、後述のように、アジュバントおよび抗原を含むことができる。アジュバントは、核酸配列、アミノ酸配列、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列はまた、ペプチド結合によってアジュバントに連結されたリンカーまたはタグ配列をコードするさらなる配列も含むことができる。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００４６】
（１）ＩＬ−２１
アジュバントは、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）であってもよい。ＩＬ−２１は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含めたＢおよびＴ細胞サブセットに対して強力な効果を有する一本鎖のＴ細胞由来のサイトカインである。慢性感染の動物モデルは、Ｔ細胞活性およびウイルス複製の制御ならびにＨＩＶといった慢性ウイルス感染を有する患者におけるＩＬ−２１の重要な役割を示唆している。ＩＬ−２１は細胞毒性ＣＤ８Ｔ細胞応答を大幅に改善することが報告されている。ＩＬ−２１は同様に、Ｂ細胞の増殖および分化を補助することが示唆されている。
【００４７】
ＩＬ−２１は、ＩＬ−１２と同様に、ＩＦＮ−γ産生を刺激することができる。ＩＬ−１２は、ナイーブＴ細胞を活性化してＩＦＮ−γ産生を誘導することができ、ＩＬ−２１は、メモリＴ細胞に作用してＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＩＬ−２１を含有することにより、ＩＬ−２３を含まないワクチンと比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、および少なくとも約１０倍ＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＩＬ−２１を含有することにより、ＩＬ−２１を含まないワクチンと比較して、少なくとも約２倍ＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。ワクチンにＩＬ−２１を含有することにより、ＩＬ−２１を含まないワクチンと比較して、少なくとも約３倍ＩＦＮ−γ産生を誘導することができる。
【００４８】
ＩＬ−２１は、対象の抗原に対する免疫応答を増強するかまたはブーストすることができる。抗原については、後により詳細に記載する。いくつかの例において、ＩＬ−２１は、抗原に対する免疫応答を約７５％〜約２００％増強することができる。代替として、ＩＬ−２１は、抗原に対する免疫応答を約９０％〜約１３０％増強することができる。さらに他の代替的な実施形態において、ＩＬ−２１は、抗原に対する免疫応答を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、１１０％、１１１％、１１２％、１１３％、１１４％、１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、１２３％、１２４％、１２５％、１２６％、１２７％、１２８％、１２９％、または１３０％増強することができる。
【００４９】
他の実施形態において、本明細書に記載のワクチンがそれを必要とする対象に投与されると、ＩＬ−２１は、抗原に対する免疫応答を少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増強またはブーストすることができる。
【００５０】
ＩＬ−２１をコードする核酸は、任意の数の生物、例えば、マウス（ハツカネズミ）、およびヒト（ホモサピエンス）に由来してもよい。ＩＬ−２１をコードする核酸を、コドン使用頻度および対応するＲＮＡ転写物に関して最適化することができる。発現のために、ＩＬ−２１をコードする核酸のコドン最適化およびＲＮＡ最適化を行うことができる。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１をコードする核酸は、翻訳の効率を高めるためにコザック配列（例えば、ＧＣＣ  ＡＣＣ）を含むことができる。ＩＬ−２１をコードする核酸は、翻訳終結の効率を高めるために複数の終止コドン（例えば、ＴＧＡ  ＴＧＡ）を含むことができる。ＩＬ−２１をコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列も含むことができる。ＩｇＥリーダー配列は、核酸のＩＬ−２１の５’に位置してもよい。いくつかの実施形態において、ＩＬ−２１をコードする核酸は、ＩｇＥリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含まないかまたは含有しない。別の実施形態において、ＩＬ−２１をコードする核酸は、ＨＡ  ｔａｇ（配列番号９）をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。さらに別の実施形態において、ＩＬ−２１をコードする核酸はＨＡ  ｔａｇをコードするヌクレオチド配列を含まないかまた含有しない。
【００５１】
マウスＩＬ−２１は、配列番号２をコードする、配列番号１の最適化された核酸配列であってもよい。いくつかの実施形態において、マウスＩＬ−２１は、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であってもよい。他の実施形態において、マウスＩＬ−２１は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であってもよい。マウスＩＬ−２１は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００５２】
ヒトＩＬ−２１は、配列番号４をコードする、配列番号３の最適化された核酸配列であってもよい。いくつかの実施形態において、ヒトＩＬ−２１は、配列番号３に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する核酸配列であってもよい。他の実施形態において、ヒトＩＬ−２１は、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列であってもよい。ヒトＩＬ−２１は、配列番号４に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。
【００５３】
いくつかの実施形態は、配列番号１及び／または配列番号３の断片に関連する。断片は、配列番号１及び／または配列番号３の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含むことができる。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００５４】
配列番号１及び／または配列番号３の断片と同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸の断片が提供されてもよい。そのような断片は、配列番号１及び／または配列番号３と９５％以上の同一性を有する核酸の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含むことができる。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＩＬ−２１核酸配列の断片と９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＩＬ−２１核酸配列の断片と９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＩＬ−２１核酸配列の断片と９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＩＬ−２１核酸配列の断片と９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００５５】
配列番号２及び／または配列番号４の断片が提供されてもよい。断片は、配列番号２及び／または配列番号４の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含むことができる。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【００５６】
配列番号２及び／または配列番号４の断片と同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の断片が提供されてもよい。そのような断片は、配列番号２及び／または配列番号４と９５％以上の同一性を有するタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含むことができる。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＩＬ−２１タンパク質配列の断片と９６％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＩＬ−２１タンパク質配列の断片と９７％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＩＬ−２１タンパク質配列の断片と９８％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載のＩＬ−２１タンパク質配列の断片と９９％以上の同一性を有する断片に関する。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列、例えば、ＩｇＥリーダー配列等の免疫グロブリンリーダー配列を含む。いくつかの実施形態において、断片は、リーダー配列を含まない。
【００５７】
ｂ．抗原
前述のように、ワクチンは、抗原またはその断片もしくは変異体と、アジュバントとを含むことができる。抗原は、対象において免疫応答を誘導するものであれば何であってもよい。精製された抗原は、通常、それらだけでは免疫原性が強くないため、前述のようなアジュバントと組み合わされる。抗原によって誘導される免疫応答は、アジュバントと組み合わせた場合にブーストまたは増強することができる。そのような免疫応答は、液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答であり得る。いくつかの実施形態において、アジュバントと抗原の組み合わせは、対象において細胞性免疫応答をブーストまたは増強することができる。他の実施形態において、アジュバントと抗原の組み合わせは、対象において液性免疫応答をブーストまたは増強することができる。
【００５８】
抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。核酸配列はまた、ペプチド結合によって抗原に連結されたリンカーまたはタグ配列をコードするさらなる配列も含むことができる。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００５９】
抗原は、任意の数の生物、例えば、ウイルス、寄生虫、細菌、真菌、または哺乳動物に由来するタンパク質、核酸、またはその断片、またはその変異体、またはそれらの組み合わせに含有されてもよい。抗原は、自己免疫疾患、アレルギー、または喘息に関連し得る。他の実施形態において、抗原は、癌、ヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に関連し得る。後述のように、ワクチンの抗原は、ＨＩＶ抗原、ディフィシル菌抗原、およびそれらの断片からなる群から選択されてもよい。ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。
【００６０】
ある抗原は、強い免疫応答を誘導することができる。他の抗原は、弱い免疫応答を誘導することができる。抗原は、前述のようにアジュバントと組み合わせた場合により高い免疫応答を誘発することができる。
【００６１】
（１）ウイルス抗原
抗原は、ウイルス抗原、またはその断片、またはその変異体であってもよい。ウイルス抗原は、以下の科のうちの１つからのウイルスに由来してもよい：アデノウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パポバウイルス科、パラミクソウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、ラブドウイルス科、またはトガウイルス科。ウイルス抗原は、パピローマウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、天然痘ウイルス（大痘瘡および小痘瘡）、ワクシニアウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、デング熱ウイルス、馬脳炎ウイルス、風疹ウイルス、黄熱病ウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）、ヘアリーセル白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、ハンタウイルス（出血熱）、狂犬病ウイルス、エボラ熱ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、単純ヘルペスウイルス１型（口腔ヘルペス）、単純ヘルペスウイルス２型（性器ヘルペス）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹、別名は水疱瘡）、サイトメガウイルス（ＣＭＶ）、例えば、ヒトＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、フラビウイルス、口蹄疫ウイルス、チクングニアウイルス、ラッサ熱ウイルス、アレナウイルス、または発癌性ウイルスに由来してもよい。
【００６２】
（ａ）肝炎抗原
ＩＬ−２１は、肝炎ウイルス抗原（すなわち、肝炎抗原）、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。肝炎抗原は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、及び／またはＥ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）に由来する抗原または免疫原であってもよい。いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、およびＨＥＶに由来する抗原のうちの１つ以上をコードする、プラスミド（複数可）等の異種核酸分子（複数可）であってもよい。肝炎抗原は、全長タンパク質、または全長タンパク質の免疫原性断片であってもよい。
【００６３】
肝炎抗原は、発現の向上のためにコンセンサス配列及び／または１つ以上の改変を含むことができる。構築物の免疫原性を増強するためのコドン最適化、ＲＮＡ最適化、および高効率の免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝的改変が、改変されたコンセンサス配列に含まれてもよい。コンセンサス肝炎抗原は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含んでもよく、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。免疫原は、対応するコドン最適化免疫原よりも強く広範な細胞性免疫応答を誘発するように設計することができる。
【００６４】
肝炎抗原は、ＨＡＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＡＶカプシドタンパク質、ＨＡＶ非構造タンパク質、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００６５】
肝炎抗原は、ＨＣＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＣＶヌクレオカプシドタンパク質（すなわち、コアタンパク質）、ＨＣＶエンベロープタンパク質（例えば、Ｅ１およびＥ２）、ＨＣＶ非構造タンパク質（例えば、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂ）、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００６６】
肝炎抗原は、ＨＤＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＤＶδ抗原、その断片、またはその変異体であってもよい。
【００６７】
肝炎抗原は、ＨＥＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＥＶカプシドタンパク質、その断片、またはその変異体であってもよい。
【００６８】
肝炎抗原は、ＨＢＶ由来の抗原であってもよい。肝炎抗原は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ、遺伝子ＸによってコードされるＨＢＶタンパク質、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせであってもよい。肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質、その断片、その変異体、またはそれらの組み合わせであってもよい。肝炎抗原は、コンセンサスＨＢＶコアタンパク質、またはコンセンサスＨＢＶ表面タンパク質であってもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＡコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ａコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００７０】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＢコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００７１】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＣコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００７２】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＤコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００７３】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＥコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＦコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００７５】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＧコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型ＨコンセンサスコアＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコアタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサスコアタンパク質配列であってもよい。
【００７７】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ａ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ａコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００７８】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｂコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００７９】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｃ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００８０】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｄ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｄコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｅ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｅコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００８２】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｆ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｆコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００８３】
さらに他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｇ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｇコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００８４】
他の実施形態において、肝炎抗原は、ＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサス表面ＤＮＡ配列構築物、ＨＢＶ遺伝子型Ｈ表面タンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはＨＢＶ遺伝子型Ｈコンセンサス表面タンパク質配列であってもよい。
【００８５】
（ｂ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原
ＩＬ−２１は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。ＨＰＶ抗原は、子宮頸癌、直腸癌、及び／または他の癌を引き起こす、ＨＰＶ  １６、１８、３１、３３、３５、４５、５２、および５８型に由来してもよい。ＨＰＶ抗原は、性器疣贅を引き起こし、また頭頸部癌の原因として知られる、ＨＰＶ  ６および１１型に由来してもよい。
【００８６】
ＨＰＶ抗原は、各ＨＰＶ型のＨＰＶ  Ｅ６またはＥ７ドメインであってもよい。例えば、ＨＰＶ  １６型（ＨＰＶ１６）の場合、ＨＰＶ１６抗原は、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、その断片、変異体、または組み合わせを含むことができる。同様に、ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ  ６  Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ  １１  Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ  １８  Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ  ３１  Ｅ６および／もしくはＥ７、ＨＰＶ  ３３  Ｅ６および／もしくは  Ｅ７、ＨＰＶ  ５２  Ｅ６および／もしくはＥ７、またはＨＰＶ  ５８  Ｅ６および／もしくはＥ７、その断片、変異体、または組み合わせであってもよい。
【００８７】
（ｃ）ＲＳＶ抗原
ＩＬ−２１は、ＲＳＶ抗原、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ融合タンパク質（本明細書において「ＲＳＶ  Ｆ」、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質」、および「Ｆ  タンパク質」とも称される）、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ヒトＲＳＶ融合タンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間に保存することができる。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９４．１）からのＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ａ２株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＢ５９８５８．１）からのＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片もしくは変異体の単量体、二量体、または三量体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、コンセンサスＲＳＶ  Ｆ  アミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｆ  アミノ酸配列をコードする最適化された核酸、またはその断片もしくは変異体であってもよい。
【００８８】
ＲＳＶ  Ｆの融合後形態は、免疫動物において高力価の中和抗体を誘発し、動物をＲＳＶへの曝露から保護する。本発明は、特許請求されるワクチンにおいてこの免疫応答を利用する。本発明によれば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、融合前形態または融合後形態であってもよい。
【００８９】
ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶ付着糖タンパク質（本明細書において「ＲＳＶ  Ｇ」、「ＲＳＶ  Ｇタンパク質」、および「Ｇタンパク質」とも称される）、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ヒトＲＳＶＧタンパク質は、ＲＳＶサブタイプＡとＢとの間で異なる。抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９３）からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５６０１、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１０６８、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５５９８、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１１２３、またはその断片もしくは変異体からのＲＳＶ  Ｇタンパク質であってもよい。ＲＳＶ抗原は、コンセンサスＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列をコードする最適化された核酸、またはその断片もしくは変異体であってもよい。
【００９０】
他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ非構造タンパク質１（「ＮＳ１タンパク質」）、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８７．１）からのＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ヒトＲＳＶ抗原はまた、ＲＳＶ非構造タンパク質２（「ＮＳ２  ｐｒｏｔｅｉｎ」）、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８８．１）からのＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原はさらに、ヒトＲＳＶヌクレオカプシド（「Ｎ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９８９．１）からのＲＳＶ  Ｎタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶリン酸化タンパク質（「Ｐ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９０．１）からのＲＳＶ  Ｐタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶ基質タンパク質（「Ｍ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９１．１）からのＲＳＶ  Ｍタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。
【００９１】
さらに他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶ  小疎水性（「ＳＨ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９２．１）からのＲＳＶ  ＳＨタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原はまた、ヒトＲＳＶ  基質タンパク質２−１（「Ｍ２−１」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９５．１）からのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ＲＳＶ抗原はさらに、ヒトＲＳＶ  基質タンパク質  ２−２（「Ｍ２−２」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９７．１）からのＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。ヒトＲＳＶ抗原は、ＲＳＶポリメラーゼＬ（「Ｌ」）タンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。例えば、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＸ２３９９６．１）からのＲＳＶ  Ｌタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。
【００９２】
さらなる実施形態において、ＲＳＶ抗原は、ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＬタンパク質のコンセンサスアミノ酸配列を有することができる。ＲＳＶ抗原は、ヒトＲＳＶゲノムによってコードされるタンパク質のうちのいずれか１つ等の、ヒトＲＳＶタンパク質または組換え抗原であってもよい。
【００９３】
他の実施形態において、ＲＳＶ抗原は、限定されないが、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、コンセンサスＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｇアミノ酸配列をコードする最適化された核酸、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株のヒトＲＳＶゲノム、コンセンサスＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列、ＲＳＶ  Ｆアミノ酸配列をコードする最適化された核酸、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  ＮＳ１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  ＮＳ２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｎタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｐタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｍタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  ＳＨタンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質、ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株からのＲＳＶ  Ｌタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５６０１からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１０６８からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ５５９８からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、ＲＳＶサブタイプＢ単離菌Ｈ１１２３からのＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはその断片、またはその変異体であってもよい。
【００９４】
（ｄ）インフルエンザ抗原
ＩＬ−２１は、インフルエンザ抗原、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。インフルエンザ抗原は、哺乳動物において１つ以上のインフルエンザ血清型に対する免疫応答を誘発することができる抗原である。抗原は、全長翻訳産物ＨＡ０、サブユニットＨＡ１、サブユニットＨＡ２、その変異体、その断片、またはそれらの組み合わせを含むことができる。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ２の複数の株に由来するコンセンサス配列、インフルエンザＡ血清型Ｈ１の異なるセットの複数の株に由来する２つの異なるコンセンサス配列の一部を含有するハイブリッド配列、またはインフルエンザＢの複数の株に由来するコンセンサス配列であってもよい。インフルエンザヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＢに由来してもよい。
【００９５】
インフルエンザ抗原は、免疫応答が誘導され得る特定のインフルエンザ免疫原に対して効果的であり得る少なくとも１つの抗原エピトープを含有することもできる。抗原は、免疫原性部位の全レパートリーと、インタクトなインフルエンザウイルス中に存在するエピトープとを提供することができる。抗原は、血清型Ｈ１または血清型Ｈ２の複数のインフルエンザＡウイルス株等の、１つの血清型の複数のインフルエンザＡウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列に由来し得るコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であってもよい。抗原は、２つの異なるコンセンサスヘマグルチニン抗原配列またはその一部を組み合わせることによって得ることができる、ハイブリッドコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であってもよい。２つの異なるコンセンサスヘマグルチニン抗原配列の各々は、血清型Ｈ１の複数のインフルエンザＡウイルス株等の、１つの血清型の異なるセットの複数のインフルエンザＡウイルス株に由来してもよい。抗原は、複数のインフルエンザＢウイルス株からのヘマグルチニン抗原配列に由来し得るコンセンサスヘマグルチニン抗原配列であってもよい。
【００９６】
いくつかの実施形態において、インフルエンザ抗原は、Ｈ１  ＨＡ、Ｈ２  ＨＡ、Ｈ３  ＨＡ、Ｈ５  ＨＡ、またはＢＨＡ抗原であってもよい。代替として、インフルエンザ抗原は、コンセンサスＨ１アミノ酸配列またはコンセンサスＨ２アミノ酸配列を含むコンセンサスヘマグルチニン抗原であってもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、それぞれ、互いとは異なるセットの配列に由来する２つの異なるコンセンサスＨ１配列の部分を含む合成ハイブリッドコンセンサスＨ１配列であってもよい。合成ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質であるコンセンサスＨＡ抗原の一例は、Ｕ２アミノ酸配列を含むタンパク質である。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列を含むタンパク質等の、インフルエンザＢ株からのヘマグルチニン配列に由来するコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であってもよい。
【００９７】
コンセンサスヘマグルチニン抗原は、１つ以上のさらなるアミノ酸配列要素をさらに含んでもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、そのＮ末端上に、ＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列をさらに含んでもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、容易に入手可能な抗体によって検出され得る固有の免疫原性エピトープである免疫原性タグをさらに含んでもよい。そのような免疫原性タグの一例は、コンセンサスヘマグルチニンＣ末端上で連結させることができる９アミノ酸インフルエンザＨＡタグである。いくつかの実施形態において、コンセンサスヘマグルチニン抗原は、そのＮ末端上にＩｇＥまたはＩｇＧリーダーアミノ酸配列、そのＣ末端上にＨＡタグをさらに含んでもよい。
【００９８】
コンセンサスヘマグルチニン抗原は、コンセンサスインフルエンザアミノ酸配列またはその断片および変異体からなるコンセンサスヘマグルチニンタンパク質であってもよい。コンセンサスヘマグルチニン抗原は、非インフルエンザタンパク質配列と、インフルエンザタンパク質配列またはその断片および変異体とを含む、コンセンサスヘマグルチニンタンパク質であってもよい。
【００９９】
コンセンサスＨ１タンパク質の例として、コンセンサスＨ１アミノ酸配列からなってもよいタンパク質、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列およびＨＡタグの両方等の追加の要素をさらに含むタンパク質が挙げられる。
【０１００】
コンセンサスＨ２タンパク質の例として、コンセンサスＨ２アミノ酸配列からなってもよいタンパク質、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列およびＨＡタグの両方を含むタンパク質が挙げられる。
【０１０１】
ハイブリッドコンセンサスＨ１タンパク質の例として、コンセンサスＵ２アミノ酸配列からなってもよいタンパク質、またはＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡタグ、もしくはＩｇＥリーダー配列およびＨＡタグの両方を含むタンパク質が挙げられる。
【０１０２】
ハイブリッドコンセンサスインフルエンザＢヘマグルチニンタンパク質の例として、コンセンサスＢＨＡアミノ酸配列からなってもよいタンパク質が挙げられるか、または該例は、ＩｇＥリーダー配列、もしくはＨＡ  Ｔａｇ、もしくはＩｇＥリーダー配列およびＨＡタグを含んでもよい。
【０１０３】
コンセンサスヘマグルチニンタンパク質は、コンセンサスヘマグルチニン核酸、その変異体、またはその断片によってコードされ得る。異なる株および変異体からの複数の異なるヘマグルチニン配列に由来するコンセンサス配列であり得るコンセンサスヘマグルチニンタンパク質とは異なり、コンセンサスヘマグルチニン核酸は、コンセンサスタンパク質配列をコードする核酸配列を指し、使用されるコード配列は、コンセンサスヘマグルチニンタンパク質配列が由来する複数の異なるヘマグルチニン配列中の特定のアミノ酸配列をコードするために使用される配列とは異なり得る。コンセンサス核酸配列は、最適化コドン及び／または最適ＲＮＡであってもよい。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、５’非翻訳領域にコザック配列を含んでもよい。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、リーダー配列をコードする核酸配列を含んでもよい。Ｎ末端リーダー配列のコード配列は、ヘマグルチニンコード配列の５’である。Ｎ末端リーダーは、分泌を促進することができる。Ｎ末端リーダーは、ＩｇＥリーダーまたはＩｇＧリーダーであってもよい。コンセンサスヘマグルチニン核酸配列は、免疫原性タグをコードする核酸配列を含むことができる。免疫原性タグは、タンパク質のＣ末端上にあってもよく、それをコードする配列は、コンセンサスＨＡコード配列の３’である。免疫原性タグは、それに対して容易に入手可能な抗体が存在する固有のエピトープを提供するため、タンパク質の発現を検出および確認するためのアッセイにおいてそのような抗体を使用することができる。免疫原性タグは、タンパク質のＣ末端のＨＡタグであってもよい。
【０１０４】
（ｅ）ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原
ＩＬ−２１は、ＨＩＶ抗原、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。ＨＩＶ抗原は、免疫原について改変されたコンセンサス配列を含むことができる。構築物の免疫原性を増強するためのコドン最適化、ＲＮＡ最適化、および高効率の免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝的改変が、改変されたコンセンサス配列に含まれてもよい。新規免疫原は、対応するコドン最適化免疫原よりも強く広範な細胞性免疫応答を誘発するように設計することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＡエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＡコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【０１０６】
他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＢコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＢエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＢコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【０１０７】
さらに他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＣコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＣエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＣコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【０１０８】
さらなる実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＤコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＤエンベロープタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＤコンセンサスエンベロープタンパク質配列であってもよい。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−ＲｅｖコンセンサスエンベロープＤＮＡ配列構築物、サブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはサブタイプＢ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖコンセンサスタンパク質配列であってもよい。
【０１１０】
他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、サブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ  ＤＮＡ配列構築物のＧａｇコンセンサスＤＮＡ配列、ＧａｇコンセンサスサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤタンパク質についてのコンセンサス配列に連結されたＩｇＥリーダー配列、またはコンセンサスＧａｇサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤタンパク質配列であってもよい。
【０１１１】
さらに他の実施形態において、ＨＩＶ抗原は、ＭＰｏｌ  ＤＮＡ配列またはＭＰｏｌタンパク質配列であってもよい。ＨＩＶ抗原は、Ｅｎｖ  Ａ、Ｅｎｖ  Ｂ、Ｅｎｖ  Ｃ、Ｅｎｖ  Ｄ、Ｂ  Ｎｅｆ−Ｒｅｖ、Ｇａｇ、またはそれらの組み合わせの核酸またはアミノ酸配列であってもよい。
【０１１２】
（２）寄生虫抗原
抗原は、寄生虫抗原またはその断片もしくは変異体であってもよい。寄生虫は、原虫、原生動物、または外寄生生物であってもよい。原虫（すなわち、蠕虫）は、扁形動物（例えば、吸虫およびおよび条虫）、鉤頭虫、または線虫（例えば、蟯虫）であってもよい。外寄生生物は、シラミ、ノミ、マダニ、およびコダニであってもよい。
【０１１３】
寄生虫は、以下の疾患の原因となる任意の寄生虫であってもよい：アカントアメーバ角膜炎、アメーバ症、回虫症、バベシア症、バランチジウム症、アライグマ回虫症、シャーガス病、肝吸虫症、らせん虫感染症、クリプトスポリジウム症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、象皮症、腸蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、片山熱、リーシュマニア症、ライム病、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、疥癬、住血吸虫症、睡眠病、糞線虫症、条虫症、トキソカラ症，、トキソプラズマ症、旋毛虫症、および鞭虫症。
【０１１４】
寄生虫は、アカントアメーバ、アニサキス、回虫、ウマバエ、大腸バランチジウム、トコジラミ、サナダムシ（条虫）、ツツガムシ、ラセンウジバエ、赤痢アメーバ、肝蛭、ランブル鞭毛虫、鉤虫、リーシュマニア、鼻腔舌虫、肝吸虫、ロア糸状虫、パラゴニムス−肺吸虫、蟯虫、熱帯熱マラリア原虫、住血吸虫、糞線虫、コダニ、条虫、トキソプラズマ原虫、トリパノソーマ、鞭虫、またはバンクロフト糸状虫であってもよい。
【０１１５】
（ａ）マラリア抗原
ＩＬ−２１は、マラリア抗原（すなわち、ＰＦ抗原またはＰＦ免疫原）、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。抗原は、マラリアの原因となる寄生虫に由来し得る。マラリアの原因となる寄生虫は、熱帯熱マラリア原虫であってもよい。熱帯熱マラリア原虫抗原は、サーカムスポロゾイト（ＣＳ）抗原を含むことができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、熱帯熱マラリア原虫免疫原ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳ、およびＡｍａ１のうちの１つ以上をコードするプラスミド等の核酸分子であってもよい。免疫原は、全長タンパク質、または全長タンパク質の免疫原性断片であってもよい。免疫原は、発現の向上のためにコンセンサス配列及び／または改変を含むことができる。
【０１１７】
他の実施形態において、マラリア抗原は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース中の全ての全長熱帯熱マラリア原虫ＴＲＡＰ／ＳＳＰ２配列（合計２８配列）のコンパイルから設計された、ＳＳＰ２とも称されるＴＲＡＰのコンセンサス配列であってもよい。コンセンサスＴＲＡＰ免疫原（すなわち、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原）は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含んでもよく、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。
【０１１８】
さらに他の実施形態において、マラリア抗原は、ＣｅｌＴＯＳであってもよく、これはまたＡｇ２とも称され、高度に保存されたマラリア原虫抗原である。コンセンサスＣｅｌＴＯＳ抗原（すなわち、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原）は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含んでもよく、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。
【０１１９】
さらなる実施形態において、マラリア抗原は、高度に保存されたマラリア原虫抗原であるＡｍａ１であってもよい。マラリア抗原はまた、いくつかの例において、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含み、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい、Ａｍａ１（すなわち、ＣｏｎＡｍａＩ免疫原）のコンセンサス配列であってもよい。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、マラリア抗原は、いくつかの例において、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含み、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい、コンセンサスＣＳ抗原（すなわち、コンセンサスＣＳ免疫原）であってもよい。
【０１２１】
他の実施形態において、マラリア抗原は、本明細書に記載されるＰＦタンパク質のうちの２つ以上の組み合わせを含む融合タンパク質であってもよい。例えば、融合タンパク質は、コンセンサスＣＳ免疫原、ＣｏｎＬＳＡ１免疫原、ＣｏｎＴＲＡＰ免疫原、ＣｏｎＣｅｌＴＯＳ免疫原、および互いに直接隣接して連結するか、または間にスペーサーもしくはもう１つのアミノ酸を伴って連結するＣｏｎＡｍａ１免疫原のうちの２つ以上を含んでもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、２つのＰＦ免疫原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、３つのＰＦ免疫原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、４つのＰＦ免疫原を含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、５つのＰＦ免疫原を含む。
【０１２２】
２つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳおよびＬＳＡ１、ＣＳおよびＴＲＡＰ、ＣＳおよびＣｅｌＴＯＳ、ＣＳおよびＡｍａ１、ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ、ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ、ＬＳＡ１およびＡｍａ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１、またはＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含んでもよい。３つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１およびＴＲＡＰ、ＣＳ、ＬＳＡ１およびＣｅｌＴＯＳ、ＣＳ、ＬＳＡ１およびＡｍａ１、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１、またはＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含んでもよい。４つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＣｅｌＴＯＳ、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰおよびＡｍａ１、ＣＳ、ＬＳＡ１、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１、ＣＳ、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１、またはＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含んでもよい。５つのコンセンサスＰＦ免疫原を有する融合タンパク質は、ＣＳまたはＣＳ−ａｌｔ、ＬＳＡ１、ＴＲＡＰ、ＣｅｌＴＯＳおよびＡｍａ１を含んでもよい。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、Ｎ末端に連結したシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結した複数のシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＰＦ免疫原の間にスペーサーが含まれてもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質のＰＦ免疫原の間のスペーサーは、タンパク質分解切断部位であってもよい。いくつかの実施形態において、スペーサーは、ワクチンが投与される及び／または取り込まれることが意図される細胞に見出されるプロテアーゼによって認識されるタンパク質分解切断部位であってもよい。いくつかの実施形態において、スペーサーが融合タンパク質のＰＦ免疫原の間に含まれてもよく、スペーサーは、ワクチンが投与される及び／または取り込まれることが意図される細胞に見出されるプロテアーゼによって認識されるタンパク質分解切断部位であり、切断されると、各コンセンサスＰＦ免疫原のシグナルペプチドが、それぞれのコンセンサスＰＦ免疫原を細胞外に移動させるように、融合タンパク質は、各コンセンサスＰＦ免疫原のＮ末端に連結された複数のシグナルペプチドを含む。
【０１２４】
（３）細菌抗原
抗原は、細菌抗原またはその断片もしくは変異体であってもよい。細菌は、以下の門のうちのいずれか１つであってもよい：アシドバクテリウム門、放線菌門、アクウィフェクス門、バクテロイデス門、カルディセリクム門、クラミジア門、緑色硫黄細菌門、緑色非硫黄細菌門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、ディクチオグロムス門、デイノコックス・テルムス門、フィブロバクター門、ファーミキューテス門、フソバクテリウム門、ジェマティモナス門、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、シネルギステス門、テネリクテス門、サーモデスルフォバクテリア門、テルモトガ門、およびウェルコミクロビウム門。
【０１２５】
細菌は、グラム陽性細菌またはグラム陰性細菌であってもよい。細菌は、好気性細菌または嫌気性細菌であってもよい。細菌は、独立栄養細菌または従属栄養細菌であってもよい。細菌は、中温菌、好中球菌、好極限性細菌、好酸球菌、好アルカリ菌、好熱菌、低温菌、好塩菌、または好濃菌であってもよい。
【０１２６】
細菌は、炭疽菌、抗生物質耐性菌、原因菌、食中毒菌、感染性細菌、サルモネラ菌、ブドウ球菌、連鎖球菌、または破傷風菌であってもよい。細菌は、マイコバクテリア、破傷風菌、ペスト菌、バチルス・アントラシス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、またはクロストリジウム・ディフィシルであってもよい。
【０１２７】
（ａ）結核菌抗原
ＩＬ−２１は、結核菌抗原（すなわち、ＴＢ抗原またはＴＢ免疫原）、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＡｇ８５ファミリー、例えば、Ａｇ８５ＡおよびＡｇ８５Ｂに由来してもよい。ＴＢ抗原は、ＴＢ抗原のＥｓｘファミリー、例えば、ＥｓｘＡ、ＥｓｘＢ、ＥｓｘＣ、ＥｓｘＤ、ＥｓｘＥ、ＥｓｘＦ、ＥｓｘＨ、ＥｓｘＯ、ＥｓｘＱ、ＥｓｘＲ、ＥｓｘＳ、ＥｓｘＴ、ＥｓｘＵ、ＥｓｘＶ、およびＥｓｘＷに由来してもよい。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、ＴＢ抗原は、Ａｇ８５ファミリーおよびＥｓｘファミリーからの結核菌免疫原のうちの１つ以上をコードする、プラスミド等の異種核酸分子であってもよい。免疫原は、全長タンパク質、または全長タンパク質の免疫原性断片であってもよい。免疫原は、発現の向上のためにコンセンサス配列及び／または改変を含むことができる。コンセンサス免疫原は、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含んでもよく、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含んでもよい。
【０１２９】
（ｂ）ディフィシル菌抗原
ＩＬ−２１は、ディフィシル菌抗原（すなわち、ＣＤ抗原またはＣＤ免疫原）、またはその断片、またはその変異体と結合させるかまたは組み合わせることができる。ＣＤ抗原はトキシンＡまたはトキシンＢであり得る。いくつかの実施形態において、ＣＤ抗原は、トキシンＡ、トキシンＢまたはトキシンＡとトキシンＢの両方をコードするプラスミドなどの異種核酸分子であり得る。ＣＤ抗原は、全長タンパク質または全長タンパク質の免疫原性断片であってもよい。ＣＤ抗原は、発現の向上のためのコンセンサス配列及び／または改変を含むことができる。ＣＤ抗原は、例えばＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチド等の免疫グロブリンシグナルペプチド等のシグナルペプチドを含むことができ、いくつかの実施形態において、ＨＡタグを含むことができる。
【０１３０】
（４）真菌抗原
抗原は、真菌抗原またはその断片もしくは変異体であってもよい。真菌は、コウジカビ種、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジタ酵母（例えば、カンジダ・アルビカンス）、コクシジオイデス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クリプトコッカス・ガッティ、皮膚糸状菌、フサリウム種、ヒストプラズマ・カプスラーツム、ケカビ亜門、ニューモシスチス・ジロベシ、スポロトリクス・シェンキイ、エクセロヒルム、またはクラドスポリウムであってもよい。
【０１３１】
ｃ．ベクター
ワクチンは、抗原をコードする１つ以上の異種核酸を含む１つ以上のベクターと、アジュバントとを含むことができる。１つ以上のベクターは、抗原およびアジュバントを発現させることが可能であり得る。１つ以上のベクターは、一般的に、標的細胞に特定の遺伝子を導入するために使用されるプラスミドである、発現構築物であってもよい。一旦、発現ベクターが細胞内に入ると、細胞の転写および翻訳機構であるリボソーム複合体によって、遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される。プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として作用し、発現ベクター上で行われる遺伝子の効率的な転写をもたらす調節配列を含有するように遺伝子操作されることが多い。本発明のベクターは、大量の安定なメッセンジャーＲＮＡ、ひいてはタンパク質を発現する。
【０１３２】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローン化遺伝子との間の距離の調節、ならびに転写終結配列およびＰＴＩＳ（ポータブル翻訳開始配列）の挿入等の発現シグナルを有してもよい。
【０１３３】
（１）発現ベクター
ベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であってもよい。環状プラスミドおよび線状核酸は、適切な対象細胞において特定の異種ヌクレオチド配列の発現を導くことができる。ベクターは、終止シグナルに作動可能に連結されてもよい、抗原をコードするヌクレオチド配列またはアジュバントをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを有することができる。ベクターはまた、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含有することもできる。対象となるヌクレオチド配列を含むベクターは、キメラであってもよく、すなわち、その成分のうちの少なくとも１つが、その他の成分のうちの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がある特定の外的刺激に曝露された時にのみ転写を開始する、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織または器官または発達段階に特異的であってもよい。
【０１３４】
（２）環状および線状ベクター
ベクターは、細胞ゲノムへの取り込みによって標的細胞を形質転換することができるか、または染色体外に存在し得る、環状プラスミドであってもよい（例えば、複製起点を有するプラスミドの自律増殖）。
【０１３５】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または抗原もしくはアジュバントをコードする異種ＤＮＡを発現することが可能であり、かつ細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳できるようにする任意の他の発現ベクターであるか、またはアジュバントであってもよい。
【０１３６】
また、電気穿孔を介して対象に効率的に送達され得、１つ以上の所望の抗原及び／または１つ以上の所望の所望のアジュバントを発現する、線状核酸ワクチンまたは線状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書に提供される。ＬＥＣは、いずれのリン酸主鎖も持たない任意の線状ＤＮＡであってもよい。ＤＮＡは、１つ以上の抗原及び／または１つ以上のアジュバントをコードすることができる。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、及び／またはポリアデニル化シグナルを含有してもよい。抗原またはアジュバントの発現は、プロモーターによって制御されてもよい。ＬＥＣは、いずれの抗生物質耐性遺伝子及び／またはリン酸主鎖も含有しなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現または所望のアジュバント発現と無関係の他の核酸配列を含有しなくてもよい。
【０１３７】
ＬＥＣは、直線化され得る任意のプラスミドに由来してもよい。プラスミドは、抗原及び／またはアジュバントを発現することが可能であり得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であってもよい。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または抗原をコードするかもしくはアジュバントをコードするＤＮＡを発現することが可能であり、かつ細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳できるようにする任意の他の発現ベクターであるか、またはアジュバントであってもよい。
【０１３８】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であってもよい。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであってもよい。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来してもよい。
【０１３９】
（３）プロモーター、イントロン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナル
ベクターは、プロモーターであってもよい。プロモーターは、遺伝子発現を駆動することおよび単離核酸の発現を調節することが可能ないずれのプロモーターであってもよい。そのようなプロモーターは、本明細書に記載の抗原配列またはアジュバント配列を転写する、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用配列要素である。異種核酸の発現を導くために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、その天然環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ距離だけベクターにおける転写開始部位から離れて位置してもよい。しかしながら、プロモーター機能を喪失することなく、この距離の変動は受け入れられ得る。
【０１４０】
プロモーターは、抗原をコードする核酸配列に作動可能に連結されてもよく、転写物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要なシグナルであってもよい。プロモーターは、アジュバントをコードする核酸配列に作動可能に連結されてもよく、転写物の効率的なポリアデニル化、リボソーム結合部位、および翻訳終結に必要なシグナルであってもよい。
【０１４１】
プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞における発現に効果的であることが示されている別のプロモーターであってもよい。
【０１４２】
ベクターは、エンハンサーと、機能的なスプライスドナー部位およびアクセプター部位を有するイントロンとを含んでもよい。ベクターは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結部位を含有してもよい。終止部位は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得られてもよいか、または異なる遺伝子から得られてもよい。
【０１４３】
ｄ．ワクチンの賦形剤および他の成分
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含んでいてもよい。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、ＩＬ−２１以外のアジュバント、担体、または希釈剤等の機能性分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であってもよく、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）等の界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレン等の小胞体、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルス性タンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、あるいは他の既知のトランスフェクション促進剤が挙げられる。
【０１４４】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマート（ＬＧＳ）をはじめとするポリアニオン、ポリカチオン、または脂質であり得る。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタマートであり得、ポリ−Ｌ−グルタマートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチン中に存在し得る。トランスフェクション促進剤は、界面活性剤、例えば免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質ＡをはじめとするＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞も含み得る。ヒアルロン酸も、遺伝子構築物と一体化させて、使用または投与され得る。ＤＮＡプラスミドワクチンは、トランスフェクション促進剤、例えば脂質、レシチンリポソームまたはＤＮＡリポソーム混合物（例えば、国際特許第０９３２４６４０号を参照）として当該技術分野で公知の他のリポソームをはじめとするリポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の公知のトランスフェクション促進剤を含んでいてもよい。ワクチン中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１４５】
薬学的に許容される賦形剤は、ＩＬ−２１のほかに、アジュバントであり得る。追加のアジュバントは、別のプラスミドに発現されるか、またはワクチンにおいて上述のプラスミドと組み合わせたタンパク質として送達される、他の遺伝子であってもよい。アジュバントは、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ΤΝＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、シグナル配列が欠失したＩＬ−１５を含み、かつ任意でＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＣＤ８６からなる群から選択することができる。アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０１４６】
ＩＬ−２１のほかに、アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、Ｃａｓｐａｓｅ  ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏ×４０、Ｏ×４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能性フラグメントをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１４７】
ワクチンは、参照により完全に組み込まれた、１９９４年４月１日出願の米国特許出願第０２１，５７９号に記載されるように遺伝子ワクチン促進剤をさらに含んでいてもよい。
【０１４８】
ワクチンは、用いられる投与様式に従って配合できる。注射可能なワクチン医薬組成物は、滅菌されており、パイロジェンフリーおよび微粒子フリーであり得る。等張性配合剤または溶液を、用いることができる。等張性のための添加剤として、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。ワクチンは、血管収縮剤を含んでもよい。等張溶液には、リン酸緩衝食塩水を挙げることができる。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンをはじめとする安定化剤をさらに含み得る。ＬＧＳまたはポリカチオンまたはポリアニオンなど、安定化剤により、配合剤を室温または周囲温度で長時間安定させることができる。
【０１４９】
３．ワクチン接種の方法
本発明はまた、ワクチンの異なる投与経路により、対象において免疫応答を増強するための方法も対象とする。免疫応答の増強は、対象において疾患を治療及び／または予防するために使用することができる。
【０１５０】
本方法は、本明細書に開示されるワクチンを対象に投与することを含むことができる。ワクチンを投与された対象は、抗原を単独で投与された対象と比較して、増強またはブーストされた免疫応答を有することができる。いくつかの実施形態において、ワクチンを投与された対象における免疫応答を、約１８％〜約６５０％増強することができる。代替として、ワクチンを投与された対象における免疫応答は、約４５％〜約２６０％増強され得る。さらに他の代替の実施形態において、ワクチンを投与された対象における免疫応答は、約９３％〜約１３０％増強され得る。
【０１５１】
他の実施形態において、投与されたワクチンは、対象における免疫応答を少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍増強またはブーストすることができる。
【０１５２】
ワクチンの用量は、１μｇ〜１０ｍｇ活性成分／体重１ｋｇ／時間であってもよく、２０μｇ〜１０ｍｇ成分／体重１ｋｇ／時間であってもよい。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与することができる。効果的な治療のためのワクチン服用回数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回であってもよい。
【０１５３】
ａ．投与
ワクチンは、製薬技術の当業者に周知の標準的技術に従って製剤化することができる。そのような組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重、および状態、ならびに投与経路等の要因を考慮に入れて、医療技術の当業者に周知の投与量で、そのような技術によって投与することができる。対象は、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、またはマウス等の哺乳動物であってもよい。
【０１５４】
ワクチンは、予防的にまたは治療的に投与することができる。予防的投与において、ワクチンは、免疫応答を誘導するのに十分な量で投与することができる。治療的投与において、ワクチンは、治療効果を誘発するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与される。これを達成するための適切な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に効果的な量は、例えば、投与されるワクチン投与計画の特定の組成、投与様式、疾患の段階および重症度、患者の一般的健康状態、ならびに処方医師の判断に依存する。
【０１５５】
ワクチンは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８（１９９７））；Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，５８０，８５９号、１９９６年１２月３日発行）；Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，７０３，０５５号、１９９７年１２月３０日発行）；およびＣａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，６７９，６４７号、１９９７年１０月２１日発行）（これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような当該技術分野で周知の方法によって投与することができる。ワクチンのＤＮＡは、例えば、ワクチン銃を使用して個体に投与することができる粒子またはビーズに複合化することができる。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む薬学的に許容される担体の選択は、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを知っている。
【０１５６】
ワクチンは、様々な経路を介して送達することができる。典型的な送達経路は、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下送達を含む。他の経路は、経口投与、鼻腔内、および膣内経路を含む。特定のワクチンのＤＮＡのために、個体の組織の間質空間にワクチンを送達することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５８０，８５９号および第５，７０３，０５５号）（これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ワクチンはまた、筋肉に投与することができるか、または皮内もしくは皮下注射を介して投与することができるか、または経皮的に投与する（イオン導入法による等）ことができる。また、ワクチンの表皮投与も用いることができる。表皮投与は、刺激物質に対する免疫応答を刺激するために表皮の最外層を機械的または化学的に刺激することを含むことができる（Ｃａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６７９，６４７号、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１５７】
ワクチンはまた、鼻腔を介した投与用に製剤化することもできる。担体が固体である場合、経鼻投与に好適な製剤は、例えば、鼻から吸い込む様式で、すなわち、鼻の近くに維持された粉末の容器から鼻腔を通して急速に吸入することによって投与される、約１０〜約５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末を含むことができる。製剤は、鼻腔スプレー、点鼻薬、または噴霧器によるエアロゾル投与によるものであってもよい。製剤は、ワクチンの水性または油性溶液を含むことができる。
【０１５８】
ワクチンは、懸濁液、シロップ剤、またはエリキシル剤等の液体製剤であってもよい。ワクチンはまた、滅菌懸濁液または乳濁液等の、非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例えば、注射剤の投与）のための製剤であってもよい。
【０１５９】
ワクチンは、リポソーム、微粒子、または他のポリマー基質に組み込むことができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，７０３，０５５号；  Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｓ．Ｉｔｏ  ＩＩＩ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９３）（その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなってもよく、比較的単純に作製および投与される、無毒性の、生理学的に許容される、代謝可能な担体であり得る。
【０１６０】
ワクチンは、米国特許第７，６６４，５４５号（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法等を用いて、電気穿孔により投与することができる。電気穿孔は、米国特許第６，３０２，８７４号、第５，６７６，６４６号、第６，２４１，７０１号、第６，２３３，４８２号、第６，２１６，０３４号、第６，２０８，８９３号、第６，１９２，２７０号、第６，１８１，９６４号、第６，１５０，１４８号、第６，１２０，４９３号、第６，０９６，０２０号、第６，０６８，６５０号、および第５，７０２，３５９号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法及び／または装置によるものであってもよい。電気穿孔は、低侵襲性デバイスによって実行されてもよい。
【０１６１】
低侵襲性電気穿孔デバイス（「ＭＩＤ」）は、前述のワクチンおよび関連する流体を体組織に注入するための装置であってもよい。デバイスは、中空針、ＤＮＡカセット、および流体送達手段を備えてもよく、デバイスは、体組織に針を挿入している間に同時に（例えば、自動的に）ＤＮＡを前記体組織に注入するために流体送達手段を作動させて使用するように構成される。これは、針が挿入されている間にＤＮＡおよび関連する流体を徐々に注入する能力によって、体組織中に流体のより均一な分布をもたらすという利点を有する。注入中に経験される疼痛は、注入されるＤＮＡがより広い領域にわたって分布されるために軽減され得る。
【０１６２】
ＭＩＤは、針を使用することなく、ワクチンを組織に注入することができる。ＭＩＤは、ワクチンを小さな流れまたは噴流として注入することができ、そのような力を用いると、ワクチンは、組織表面を貫通して下層の組織及び／または筋肉に進入する。小さな流れまたは噴流の原動力は、一瞬のうちに微小開口部を通る二酸化炭素等の圧縮ガスの  膨脹によって提供されてもよい。低侵襲性電気穿孔デバイス、およびそれらの使用方法の例は、公開されている米国特許出願第２００８０２３４６５５号、米国特許第６，５２０，９５０号、米国特許第７，１７１，２６４号、米国特許第６，２０８，８９３号、米国特許第６，００９，３４７号、米国特許第６，１２０，４９３号、米国特許第７，２４５，９６３号、米国特許第７，３２８，０６４号、および米国特許第６，７６３，２６４号に記載される（それらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６３】
ＭＩＤは、疼痛を伴わずに液体の高速噴流を形成する注射器を備えてもよい。そのような無針注射器は市販されている。本明細書で利用され得る無針注射器の例は、米国特許第３，８０５，７８３号、第４，４４７，２２３号、第５，５０５，６９７号、および第４，３４２，３１０号に記載されるものを含む（それらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６４】
直接的または間接的な電気輸送に好適な形態の所望のワクチンは、通常、ワクチンを組織内に浸透させるのに十分な力を用いて、薬剤の噴流の送達を始動させるために組織表面に注射器を接触させることにより、無針注射器を使用して治療されるべき組織内に導入（例えば、注入）することができる。例えば、治療されるべき組織が粘膜、皮膚、または筋肉である場合、薬剤は、角質層を通って真皮層内にまたは下層の組織および筋肉に浸透させるのに十分な力で、それぞれ、粘膜表面または皮膚表面に向けて発射される。
【０１６５】
無針注射器は、全ての種類の組織、特に皮膚および粘膜にワクチンを送達するのに非常に適している。いくつかの実施形態において、無針注射器は、表面および対象の皮膚または粘膜内にワクチンを含有する液体を推進するために使用されてもよい。本発明の方法を使用して治療することができる種々の種類の組織の代表的な例は、膵臓、喉頭、鼻咽頭、下咽頭、中鵜咽頭、唇、喉、肺、心臓、腎臓、筋肉、乳房、結腸、前立腺、胸腺、睾丸、皮膚、粘膜組織、卵巣、血管、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１６６】
ＭＩＤは、組織を電気穿孔する針電極を有してもよい。例えば、長方形または正方形のパターンに設定された複数電極アレイにおいて複数対の電極間でパルスを発生させることにより、一対の電極間のパルシングよりも優れた改善された結果を提供する。例えば、米国特許第５，７０２，３５９号、標題「Ｎｅｅｄｌｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｓ」に、治療的処置の間に複数対の針にパルスを印加できる針のアレイが開示されている。参照により完全に記載されるように本明細書に組み込まれるその用途において、針は、環状アレイに配置されるが、対向する針電極間でパルシングを可能にするコネクタおよび切替装置を有する。組換え発現ベクターを細胞に送達するための一対の針電極が使用されてもよい。そのようなデバイスおよびシステムは、米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。代替として、通常の注射針に似た単一針を用いてＤＮＡの注入および電気穿孔を可能にし、現在使用されているデバイスによって送達されるよりも低い電圧のパルスを印加し、そのため患者が経験する電気刺激を軽減する、単一針デバイスが使用されてもよい。
【０１６７】
ＭＩＤは、１つ以上の電極アレイを備えてもよい。アレイは、同じ直径または異なる直径の２本以上の針を備えてもよい。針は、均一または不均一に離間されてもよい。針は、０．００５  インチ〜０．０３インチ、０．０１  インチ〜０．０２５インチ、または０．０１５  インチ〜０．０２０インチであってもよい。針は、０．０１７５インチの直径であってもよい。針は、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、またはそれ以上離間されてもよい。
【０１６８】
ＭＩＤは、パルス発生器と、ワクチンおよび電気穿孔パルスを単一ステップで送達する、２本以上の針を有するワクチン注射器とから構成されてもよい。パルス発生器は、フラッシュカードで操作されるパーソナルコンピュータを介したパルスおよび注入パラメータの柔軟なプログラミング、ならびに電気穿孔および患者データの包括的な記録および格納を可能にし得る。パルス発生器は、短期間の間に様々な電圧パルスを送達することができる。例えば、パルス発生器は、１００ｍｓの期間に１５電圧パルスを３回送達することができる。そのようなＭＩＤの一例は、Ｉｎｏｖｉｏ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによるＥｌｇｅｎ  １０００システムであり、米国特許第７，３２８，０６４号に記載されている（その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６９】
ＭＩＤは、体内または植物内の選択された組織の細胞へのＤＮＡ等の高分子の導入を促進するモジュール電極システムである、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｂｌｕｅ  Ｂｅｌｌ  ＰＡ）デバイスおよびシステムであってもよい。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下注射針、プログラム可能な定電極パルス制御器から複数の針電極に導電性接続を提供する電気コネクタ、および電源を備えてもよい。操作者は、支持構造体に載置された複数の針電極を把持し、それらを体内または植物内の選択された組織へしっかりと挿入することができる。次いで、選択された組織への皮下注射針により高分子が送達される。プログラム可能な定電流制御器が作動し、定電流電気パルスを複数の針電極に印加する。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間において高分子の細胞内への導入を促進する。定電流パルスにより組織内の電力散逸を制限することによって、細胞の過熱による細胞死が最小限に抑えられる。Ｃｅｌｌｅｃｔｒａデバイスおよびシステムは、米国特許第７，２４５，９６３号に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
ＭＩＤは、Ｅｌｇｅｎ  １０００システム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であってもよい。Ｅｌｇｅｎ  １０００システムは、中空針および流体送達手段を提供するデバイスを備えてもよく、該装置は、体組織に針を挿入している間に同時に（例えば、自動的に）本明細書に記載の所望のワクチンを前記体組織に注入するために流体送達手段を作動させて使用するように構成される。針が挿入されている間に流体を徐々に注入する能力によって、体組織を通して流体のより均一な分布がもたらされることは利点である。また、注入中に経験される疼痛は、注入される流体の体積がより広い領域にわたって分布されるために軽減されると考えられる。
【０１７１】
さらに、流体の自動注入が、注入される流体の実際量の自動監視および登録を容易にする。このデータは、必要に応じて文書化の目的で制御装置によって格納されてもよい。
【０１７２】
注入の速度は、直線的または非直線的のいずれかであってもよいこと、ならびに、注入は、治療されるべき対象の皮膚を通して針が挿入された後、およびそれらが体組織内にさらに挿入されている間に実行され得ることを理解されたい。
【０１７３】
本発明の装置によって流体を注入することができる好適な組織は、腫瘍組織、皮膚または肝組織を含むが、筋組織であってもよい。
【０１７４】
装置はさらに、体組織への針の挿入を誘導するための針挿入手段を備える。流体注入の速度は、針の挿入速度によって制御される。これは、挿入の速度が所望の注入の速度と一致し得るように針の挿入と流体の注入の両方を制御することができるという利点を有する。このことはまた、装置をユーザが操作し易くする。必要に応じて、体組織に自動的に針を挿入するための手段が提供されてもよい。
【０１７５】
ユーザは、流体の注入を開始する時を選択することができる。しかしながら、理想的には、針の先端が筋組織に到達した時に注入が開始され、装置は、流体の注入を開始するのに十分な深さまで針が挿入された場合に感知するための手段を含んでもよい。これは、針が所望の深さ（通常、筋組織が始まる深さ）に到達した時に流体の注入が自動的に開始するよう促すことができることを意味する。筋組織が始まる深さは、例えば、４ｍｍの値等の本発明の針の挿入深さであると解釈されてもよく、それは針が皮膚層を通過するのに十分であると見なされる。
【０１７６】
感知手段は、超音波プローブを備えてもよい。感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知するための手段を備えてもよい。この場合、該手段は、それ自体では体組織内の針の深さを記録することはできないかもしれないが、むしろ、針が異なる種類の体組織から筋肉内へと移動した場合にインピーダンスまたは抵抗の変化を感知するように構成される。これらの代替手段のいずれも、注入が開始し得ることを感知する比較的正確で操作が単純な手段を提供する。針の挿入の深さは、必要に応じてさらに記録されてもよく、針挿入の深さが記録されると注入される流体の体積が決定されるように流体の注入を制御するために使用することができる。
【０１７７】
装置は、針を支持するための基部と、その中に基部を受容するための筐体とをさらに備えてもよく、基部が筐体に対して第１の後方位置にある場合、筐体内で針が後退し、基部が筐体内で第２の前方位置にある場合、針が筐体から伸長するように、基部は筐体に対して移動可能である。筐体は、患者の皮膚上に並べることができ、次いで、筐体を基部に対して移動させることによって針を患者の皮膚内に挿入することができるため、これはユーザにとって有利である。
【０１７８】
前述のように、針が皮膚に挿入されると流体が針の長さにわたって均一に分布されるように、制御された流体の注入速度を達成することが望ましい。流体送達手段は、制御された速度で流体を注入するように構成されるピストン駆動手段を備えてもよい。ピストン駆動手段は、例えば、サーボモータによって作動させることができる。しかしながら、ピストン駆動手段は、筐体に対して軸方向に移動させられる基部によって作動されてもよい。流体送達の代替手段が提供されてもよいことを理解されたい。したがって、例えば、制御されたまたは制御されない速度での流体送達のために圧搾できる密封容器が、シリンジおよびピストンシステムの代わりに提供されてもよい。
【０１７９】
前述の装置は、あらゆる種類の注入に使用することができる。しかしながら、電気穿孔の分野において特に有用であることが想定されるため、針に電圧を印加するための手段をさらに備えてもよい。これは、注入のためだけではなく、電気穿孔中の電極としても針が使用されることを可能にする。このことは、注入される流体と同じ領域に電場が印加されることを意味するため、これは特に有利である。従来、電気穿孔には、以前に注入された流体と電極を正確に位置に合わせることが非常に困難であるため、ユーザがより広い領域にわたって必要とされるよりも多くの体積の流体を注入し、注入された物質と電場との重複を確実にするためにより高い領域にわたって電場を印加する傾向があるという問題があった。本発明を使用すると、電場と流体との良好な適合を達成しながら、注入される流体の体積および印加される電場の大きさの両方を減少させることができる。
【０１８０】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって示される複数の態様を有する。
【０１８１】
３．実施例
実施例１
ＩＬ−２１の発現
ＩＬ−２１の発現のために、ＩＬ−２１遺伝子をコードするプラスミド（すなわち、ｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２１  Ｏｐｔ）を構築した（図１）。ＩＬ−２１のＤＮＡ配列を、プラスミドに挿入する前にコドン最適化およびＲＮＡ最適化した。
【０１８２】
プラスミドをＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトしてＩＬ−２１の発現を確認した。ＥＬＩＳＡにより細胞上清を分析した。結果は、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞においてＩＬ−２１が発現されたことを示した（図２）。
【０１８３】
実施例２
ＩＬ−２１増強ＩｇＧおよびＩｇＡ血清力価測定
筋肉内経路を介してワクチンを投与した場合に、ＩＬ−２１がアジュバントとして機能することができるかどうかを決定するためのモデル系としてマウスを使用した。ワクチンは、それぞれのプラスミドによってコードされたディフィシル菌由来のトキシンＡおよびトキシンＢ抗原ならびにＩＬ−２１を含んでいた。
【０１８４】
具体的には、プラスミドｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２１  Ｏｐｔ（図１、および実施例１で前述）と、前述のディフィシル菌由来のトキシンＡおよびトキシンＢ抗原をコードするプラスミドとを用いて、一群のマウスを免疫した。第２の群のマウスは、トキシンＡおよびトキシンＢ抗原をコードするプラスミドのみで免疫した。第３の群のマウスは空の対照プラスミドｐＶＡＸのみを用いて免疫した。マウスは、電気穿孔を使用して筋肉内経路により免疫した。循環する抗原特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体分泌細胞を、次に、免疫した動物の血液中で分析して、ＩＬ−２１アジュバントの影響を決定した。
【０１８５】
図４の上部パネルに示すように、ＩＬ−２１アジュバントは、抗原単独での免疫に比較して、血清抗トキシンＡ  ＩｇＧの総量を増大させ、ＩＬ−２１の群では１：２０００希釈度においてロバストな力価が見られたが、抗原のみを受けた群ではこれは見られなかった。血清ＩｇＡを分析した時点で、ＩＬ−２１アジュバントを含有したことの結果として、１：２０００希釈度で力価を示す抗原特異的ＩｇＡの検知可能なレベルがもたらされることが指摘され、一方、抗原単独での免疫は、ナイーブな動物に比べてロバストなシグナルを示さなかった（図４、下部パネル）。
【０１８６】
上記データは、ＩＬ−２１がディフィシル菌由来のトキシンＡおよびトキシンＢ抗原に対する液性免疫応答を増大させたため、筋肉内経路によって投与された場合に、ＩＬ−２１がアジュバントとして機能する能力を有することを示した。上記データはまた、ＩＬ−２１が、細菌抗原とともにアジュバントとして機能できることも示した。
【０１８７】
実施例３
ＩＬ−２１は、ＨＩＶ抗原に対する細胞性および液性免疫応答を増強した
ＩＬ−２１アジュバントは、同様に、ＨＩＶ由来のＥｎｖＡおよびＥｎｖＣ抗原をコードするプラスミドと組合せても投与された。ワクチン内にＩＬ−２１を含み入れることで、ＥｎｖＣに対する細胞性および液性免疫応答の両方が増強した。ワクチンは、ＨＩＶ由来のＥｎｖＡおよびＥｎｖＣ抗原およびＩＬ−２１を含んでいた。ＥｎｖＡ抗原、ＥｎｖＣ抗原およびＩＬ−２１は別個のプラスミドによりコードされた。
【０１８８】
具体的には、ＥｎｖＡ抗原は、配列番号５に記載のヌクレオチド配列によりコードされたコンセンサスタンパク質（配列番号６）であった。配列番号５に記載のこのヌクレオチド配列は、プラスミド内に取り込まれて。
【０１８９】
ＥｎｖＣ抗原は、配列番号７に記載のヌクレオチド配列によりコードされたコンセンサスタンパク質（配列番号８）であった。配列番号７に記載のこのヌクレオチド配列は、プラスミド内に取り込まれた。
【０１９０】
具体的には、プラスミドｐＶＡＸ−ｍＩＬ−２１  Ｏｐｔ（図１、および実施例１で前述）と、前述のＥｎｖＡおよびＥｎｖＣ抗原をコードするプラスミドとを用いて、一群のマウスを免疫した。第２の群のマウスは、ＥｎｖＡおよびＥｎｖＣ抗原をコードするプラスミドのみで免疫した。第３の群のマウスは、空の対照プラスミドｐＶＡＸを用いて免疫した。マウスは、電気穿孔を使用して筋肉内経路により免疫した。インターフェロンγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、免疫群のマウスにおける細胞性免疫応答を調べた。
【０１９１】
図５に示すように、ＩＬ−２１による免疫化は、ＥｎｖＣ抗原に対する細胞性免疫応答を、抗原単独と比較して２倍より多く増強した。したがって、これらのデータは、ＩＬ−２１がＥｎｖＡおよびＥｎｖＣ抗原に対する細胞性免疫応答を増大させたため、ＩＬ−２１が筋肉組織においてアジュバントとして機能できることを示唆するものであった。
【０１９２】
ＥｎｖＡタンパク質に対するＥＬＩＳＡによる３回目の免疫後に、免疫された動物の血中で抗体応答を測定した（図６）。１：４００の希釈度において、ＨＩＶ  ＥｎｖＡ／Ｃの平均Ｏ．Ｄ．は約０．６であり、その一方でＩＬ−２１アジュバント群は１．０の平均Ｏ．Ｄ．読取り値を有していた。
【０１９３】
これらのデータを合わせて考慮すると、ＩＬ−２１が、抗体分泌細胞の頻度増大、産生されるＩｇＧ量およびクラススイッチング、ＩｇＡ産生量の増大、およびＤＮＡワクチンに含み入れられた場合のＩＦＮ−γ分泌の増大の形での新規アジュバント活性を発揮することが示唆される。
【０１９４】
上記の詳細な説明および付随する実施例は、例示であるに過ぎず、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物によってのみ定義される本発明の範囲に対する制限であると解釈されるべきではないことを理解されたい。
【０１９５】
開示される実施形態に対する種々の変更および改変は、当業者には明白であろう。限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関連するものを含むそのような変更および改変は、その主旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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