(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液中のヒトヘルペスウイルス７の量を指標として、被験者の自然免疫力レベルを評価する方法であり、
前記唾液中のヒトヘルペスウイルス７の量の定量は、前記ヒトヘルペスウイルス７のＤＮＡを前記唾液中から分離し、リアルタイムＰＣＲ法によりＤＮＡ量の測定し、得られた結果をもとに一定量の唾液当たりに含まれているヒトヘルペスウイルス７のウイルス量を算出して指標とし、
前記リアルタイムＰＣＲ法は、Ｑプローブ法ＰＣＲであり、
前記被験者の自然免疫力レベルを、前記唾液中のヒトヘルペスウイルス７量が
０〜１０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、正常ないし高レベルである、
１０，０００〜５０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、やや低レベルである、
５０，０００〜２５０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、低レベルである、
２５０，０００〜８００，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、非常に低レベルである、と評価することを特徴とする自然免疫力レベル評価方法。
【請求項２】
パン酵母ベータグルカンとして、パン酵母からの抽出工程での粒子径調節操作により、粒子径が２〜４ミクロンメーターの粒子を含むように加工された不溶性のベータグルカンと、該不溶性のベータグルカンを更に加工して得られた水溶性のベータグルカンとを含有し、
前記不溶性のベータグルカンと、前記水溶性のベータグルカンとの含有質量割合が５：１〜１：５の範囲であり、
請求項１に記載の自然免疫力レベル評価方法で、自然免疫力レベルが、やや低レベルである、低レベルである、又は非常に低レベルであると評価された被験者に、自然免疫力レベルを改善するために摂取されることを特徴とするパン酵母ベータグルカン含有製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの自然免疫力レベルを評価する自然免疫力レベル評価方法および自然免疫力レベルの改善用パン酵母ベータグルカン含有製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの免疫は、人々の健康維持のために必須の生体防御システムである。健康の維持には免疫、ホルモン、中枢神経の三システムがそれぞれ正常に機能することが大切であり、それぞれのシステムが相互に関連して機能していると考えられている。ヒトの免疫システムは、大別すると自然免疫システムと獲得免疫システムからなり、この両免疫システムは相互に連携してヒトの免疫を担っている。
特に自然免疫システムは、もともと体に備わった外敵に対する生体防御システムである。自然免疫システムには、補体や白血球その他の免疫担当細胞が関与しており、中でも白血球を構成する免疫細胞のマクロファージや好中球が、ウイルスやバクテリアなどの外敵に対する最初の防御を担当している。
【０００３】
高齢化が進展し、ストレスの多い現在社会では、加齢やストレスにより自然免疫力の低下が問題になってきている。感染症に対する抵抗力の低下や、がんや多くの病気に罹患するのは自然免疫力の低下が原因の一つと考えられている。
ちなみに、日本人の５０％は、生涯に一度はがんに罹患し、最近の死亡原因の第１位はがんで約３０％、死亡原因第３位は肺炎で約１０％であり、合計約４０％のこれら２つの死亡原因には自然免疫力の低下が関係していると考えられる。
【０００４】
つまり、現在社会では一般に日々健康に生活している人々において、ストレスや加齢その他の原因により自然免疫力のレベルが低下しており、そのような免疫力レベルが低下した状態で年月が経過するにつれて、がんの芽が増大して、がんが発症したり、肺炎球菌などの病原体による肺炎、インフルエンザその他感染症に罹患し、結果的に免疫力低下により命を落とすことが多くなっていると考えられる。
一見健康状態にあると見える時でも、実は自然免疫力レベルの低下が起こっていることが多く、自然免疫力レベルを高めるための方策を講じて自然免疫レベルを高い状態に保つことが免疫健康の維持に必要である。
【０００５】
近年、免疫の強化や増強に役立つと言われる様々な化合物が提案され、特許出願されている。多くの免疫力強化、免疫力賦活、免疫力増加などの働きをするとされる化合物は、ＮＫ活性、ＩＦＮ−γ産生能、ＩｇＡ産生能、その他それぞれ特定の免疫関連マーカーや指標を基準にしたデータでもって、免疫力の強化・賦活・増強の効果があると主張されているが、それらの化合物を投与する際に予め各免疫関連マーカーや指標を基にして各人の免疫力レベルを把握されることは、ほとんどなされてこなかった。
【０００６】
特許文献１は、採血した血液に含まれる免疫細胞に対する免疫細胞マーカーを用いて免疫力を評価する免疫力評価方法を提示している。免疫細胞マーカーとしては、Ｔ細胞数、Ｔ細胞増殖係数、ＣＤ４Ｔ細胞／ＣＤ８Ｔ細胞比率、ナイーブＴ細胞数、ナイーブＴ細胞／メモリーＴ細胞比率、ＩＬ−２サイトカイン産生能、ＩＦＮ−γサイトカイン産生能、ＩＬ−４サイトカイン産生能、Ｂ細胞数、及びＮＫ細胞数のうち少なくとも２つが挙げられている。その他ＣＤ３再発現量を用いる評価方法も記載されている。
特許文献２に記載の発明では、総合的な免疫力を高精度に評価できる免疫評価方法として、採血した血液における、ＣＤ８陽性且つＣＤ２８陽性又は陰性である特定Ｔ細胞の数を計測し、パラメータや年齢の相関による回帰式からＴリンパ球年齢を算出している。
非特許文献１には、「免疫系は病原体の貪食を主な働きとする顆粒球・マクロファージなどからなる自然免疫系と病原体特異的に働く抗体をつくるＢ細胞、ウイルスに対抗するキラーＴ細胞などからなるリンパ球を中心とした獲得免疫系からなっている。自然免疫系は病原体の種類をあまり問わずに作用し、人の誕生後すぐ機能し始める。その後加齢に伴い、顆粒球やマクロファージは大きな変化を示さない。」と記載され、獲得免疫は、加齢や老化により低下することが説明されている。
【０００７】
一方、パン酵母βグルカンに関しても様々な研究が行われている。
パン酵母ベータグルカンが自然免疫力の強化に役立つ化合物であり、マクロファージや好中球の活性化に関与することが、著明な科学雑誌であるＮＡＴＵＲＥ掲載の論文でも明らかにされている（非特許文献２参照）。
【０００８】
特にパン酵母ベータグルカンが免疫力の強化に関係する健康食品として有用であるとして、世界中で実用に供されている。どのような機序で自然免疫が強化されるかについては、感染防御やがんの治療効果に関する基礎試験で確認されている（非特許文献３〜４参照）。
経口投与されたパン酵母ベータグルカンは、小腸のパイエル板を通じて体内に取り込まれた後、マクロファージにより飲み込まれ、そのマクロファージが脾臓、リンパ節、骨髄へ移行する。骨髄中でマクロファージが飲み込んだパン酵母ベータグルカンは、消化されて小さな可溶性のβ−グルカン断片として放出され、好中球のＣＲ３レセプターに吸着し、好中球を活性化する。活性化された好中球が、ウイルス、バクテリア等の外敵や抗体で覆われたがん細胞を攻撃して殺す。これがパン酵母ベータグルカンの自然免疫力の強化改善および抗体抗がん剤との併用投与による抗がん作用の作用機序である。
【０００９】
食品レベルのパン酵母ベータグルカン原料は、一般に水に不溶性であるが、更に加工して水溶性の原料として飲料などに添加できるものも製造されている。米国Ｂｉｏｔｈｅｒａ社では、不溶性のパン酵母ベータグルカン原料としてＷｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰ  Ｆ３００５を、水溶性の原料としてＷｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰ  Ｆ３０２０  を製造販売している。また、水溶性のパン酵母ベータグルカンのがん治療用注射剤Ｉｍｐｒｉｍｅ  ＰＧＧを製造し、抗体抗がん剤との併用による大腸がんや小細胞性肺がん、その他腫瘍に対するがん治療薬としての臨床試験が海外で実施されている（非特許文献５〜６参照）。
【００１０】
近年、ＨＨＶ−７やＨＨＶ−６と疲労度との関係について研究がなされている。例えば特許文献３では、「ヒトが疲労すると、免疫力が低下することが考えられ、ヒトの免疫力の低下の一つの表現系として、ウイルス感染が挙げられる。しかし、ヒトの疲労とウイルス感染との関係は明らかにはなっていない」として、ＨＨＶ−６やＨＨＶ−７の唾液中のウイルス量が疲労度を評価方法として有用であると記載されている。彼らは、自然免疫力レベルではなく、疲労の評価方法として唾液中のウイルス量に対する研究開発を行っている。唾液中のＨＨＶ−７の測定は、免疫力レベルではなく疲労度の評価指標としての認識がなされていたわけである。
【００１１】
特許文献４は、被験者の病的疲労の疲労度を評価することを特徴とする疲労度評価方法に関する発明である。
特許文献４に記載の実施例２によれば、健常者２０名に対して７日間の通常勤務（内２日は休日）直後とその後の７日間の連休後に唾液検体を採取し、ＨＨＶ−６、ＨＨＶ−７、ヒトサイトメガロウイルス、エプシュタイン・バーウイルスの４種に関しウイルス量を判定量測定している。健常者２０名で就労中５０％、休息時において３０％の被験者においてのみ、ＨＨＶ−７のＤＮＡが検出され、別途大学病院の慢性疲労症候群（ＣＦＳ）外来を受信したＣＦＳ患者２４名では９２％（２２名）においてＨＨＶ−７が検出されたと記載され、特許明細書中に測定結果が示されている。確かに慢性疲労症候群患者では高率にＨＨＶ−７が検出されている。
【００１２】
しかし、健常者２０名では、ＨＨＶ−７の検出者数が通常勤務就労後では１０名、休息時の後には６名であり、休息によりＨＨＶ−７の検出者は４名減少している。個々の症例ごとの測定値の変化が報告されていない。陽性と検出された被験者のＨＨＶ−７の量（単位：ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）と人数は、通常勤務就労後と休息時後では下記の通りである。
通常勤務就労後：    ３×１００：２名、４×１０：３名、１．６×１０：５名
休息時後：    １．４×１０００：１名、３×１００：３名、４×１０：２名
つまり、休息時後の１名は、ＨＨＶ−７の量が１４００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと就労後のどの症例よりも高く、残り４名中２名は先の就労後よりも高い値；３００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌとなっている。
【００１３】
結果的には、休息時後は就労後に比較して、陽性被験者の３名がより高い値になり、４例は検出されなくなった。しかも、陽性被験者中１例は休息時後の値が就労後の値の約８倍も高い値になっていたのである。従って、健常人でＨＨＶ−７の値が群として改善したとの結論にはならない。１週間の休息後に２０例中新たに４名、合計１４名でＨＨＶ−７が検出されなくなったとし、ＨＨＶ−７が検出された６症例の検出値が増加したことを勘案しないで群として疲労が回復した人数が増えたとの評価は妥当性を欠いている。慢性疲労症候群患者でのＨＨＶ−７の値が高く、同患者等での病的疲労の疲労度を評価することを特徴とする疲労度評価方法とすることは理に適っており、その範囲で特許請求項が認められた特許が成立している。一般の健常者の疲労度評価方法としては特許審査では認められなかったのである。
【００１４】
非特許文献７は、特許文献４に記載された実施例の試験結果を一般の学術論文として公表している。「ヘルペスウイルス感染と疲労」と題して主にＨＨＶ−６と疲労の関係についての関係を論じている。全身的な自然免疫力レベルの評価に、唾液中のＨＨＶ−７量が指標として使えることは想定外であったのである。免疫力の低下は、疲労の原因となることもあるが、免疫が低下すると必ず疲労する訳ではない。
【００１５】
本発明者が唾液中のＨＨＶ−７量を測定するにあたって、ＨＨＶ−７の測定に関する先行技術を調査したところ、下記の情報があることが分かった。
特許文献５によれば、ヘルペスウイルスに対するオリゴヌクレオチドを用いるマイクロアレイ遺伝子解析方法であるが、定量的な測定には不向きである。
特許文献６によれば、ＨＨＶ−７  ＤＮＡの配列を同定し、１９３塩基対の各種断片を用いてＰＣＲ反応に使用している。移植患者、ＨＩＶ感染者等の血液や発熱性の病気の子供の唾液でのＨＨＶ−７の定性および定量分析している。
特許文献７によれば、唾液検体にビオチン化レクチンを混合してＨＨＶ−７を結合させ、さらにビオチン結合タンパク質が結合したビーズを添加して、ビオチン化レクチンに結合したＨＨＶ−７をビーズに結合させた後、ＨＨＶ−７をビーズから回収し、ＰＣＲ法で定量する方法を実施している。
【００１６】
従来の定量的ＰＣＲ法よりも、迅速かつ簡便に、かつ高感度で検出・測定できる測定法としてＱプローブ法ＰＣＲが発明されている（特許文献８〜１０参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】再公表ＷＯ２００７／１４５３３３号公報
【特許文献２】特開２０１０−１４５２０５号公報
【特許文献３】特許第４８１２７０８号公報
【特許文献４】特許第５５４２０９３号公報
【特許文献５】特表２００９−５３１０４８号公報
【特許文献６】特表平１１−５０９４１０号公報
【特許文献７】再公表ＷＯ２００９／１２３３４７号公報
【特許文献８】特許第３４３７８１６号公報
【特許文献９】特許第３９８５９５９号公報
【特許文献１０】特許第４７２４３８０号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】廣川勝▲いく▼、「老化と免疫」、日本老年医学会雑誌、２００３年１１月、第４０巻、第６号、ｐ．５４３−５５２
【非特許文献２】Ｈｅｌｅｎ  Ｓ．  Ｇｏｏｄｒｉｄｇｅら、「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄｅｃｔｉｎ−１  ｕｐｏｎ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ‘Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  Ｓｙｎａｐｓｅ’．」、Ｎａｔｕｒｅ、２０１１年、第４７２巻、ｐ．４７１−４７５
【非特許文献３】Ｆｅｎｇ  Ｈｏｎｇら、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｂｙ  Ｗｈｉｃｈ  Ｏｒａｌｌｙ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  β−１，３−Ｇｌｕｃａｎｓ  Ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＡｎｔｉＴｕｍｏｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｏｄｅｌｓ．」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００４年、第１７３巻、ｐ．７９７−８０６
【非特許文献４】Ｊｕｎ  Ｙａｎら、「Ｙｅａｓｔ  Ｗｈｏｌｅ  Ｇｌｕｃａｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  β−Ｇｌｕｃａｎ  ｉｎ  Ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．」、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００５年、第５巻、第５号、ｐ．６９１−７０２．
【非特許文献５】Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｄ．  Ｈｕｈｎら、「Ａ  Ｐｈａｓｅ  ３  Ｏｐｅｎ−Ｌａｂｅｌ，  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｉｍｐｒｉｍｅ  ＰＧＧ  ｉｎ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＫＲＡＳ  Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ」、２０１５年、ＡＳＣＯ年次大会ポスター発表
【非特許文献６】Ｎａｎｄｉｔａ  Ｂｏｓｅら、「Ａ  Ｐｈａｓｅ  （Ｐｈ）  １／２  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  （ＲＸ），  Ｉｍｐｒｉｍｅ  ＰＧＧ  （ＩＰ），  ａｎｄ  Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ  （ＡＬ）  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅａｒｌｙ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  （Ｐｔｓ）  ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｒｉｓｋ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  （ＣＬＬ）」、２０１５年、ＡＳＣＯ年次大会ポスター発表
【非特許文献７】近藤一博、「ヘルペスウイルス感染と疲労」、ウイルス、２００５年、第５５巻、第１号、ｐ．９−１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
先に記述した通り、自然免疫力はストレスや加齢その他の原因により低下することが知られており、健康の維持やがん、感染症の予防に、自然免疫力を強化することが大切であり、そのための対策が必要と言われているものの、各個人が具体的に自然免疫力のレベルが低下した状態であるのか、高い状態にあるのかを容易に判定する実用的な方法が未だ確立されていないのが、大きな問題である。
【００２０】
自然免疫の主たる担い手である顆粒球、中でも好中球やマクロファージは加齢により数が大きく変動しないことから、それらの免疫担当細胞が関与する自然免疫力は、加齢により低下しないと考えられてきた。
しかしながら、本特許発明者は、自然免疫力が加齢やストレスにより低下すると考えるものである。老齢化、加齢による感染防御力の低下には、自然免疫力の低下が大きく関与している。パン酵母ベータグルカンによる好中球の貪食能を強化するメカニズムが明らかにされ、加齢やストレスで低下した感染防御力がパン酵母ベータグルカンの摂取により高まる事実が確認されている。つまり、顆粒球やマクロファージ等の自然免疫担当細胞の数ではなく、それぞれの免疫担当細胞の感染防御機能の低下によって自然免疫力は、低下するのである。
【００２１】
本発明者は、簡便に各個人の免疫力レベルを測定することが出来れば、一見健康そうに見えても、実は加齢やストレスなどの要因で、多くの場合免疫力レベルが低下していることを確認することが可能となり、自然免疫力レベルを高い状態に保つ対策が立てられると考えた。
【００２２】
上記事情を鑑み、本発明の課題は、ヒトの自然免疫力レベルを評価する免疫力レベル評価方法および自然免疫力レベルの改善用パン酵母ベータグルカン含有製品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者は、上記の課題に鑑み鋭意検討した結果、突発性発疹の原因とされるＨＨＶ−７やＨＨＶ−６が幼児時期に感染後も持続潜伏感染し、その後再活性化して唾液中に多く排出されていることは、自然免疫力レベルの低下と関係しているのではないかと考えるに至った。また、唾液中のウイルス量がＨＨＶ−６に比べ特に多いことが特徴であるＨＨＶ−７が測定定量対象として適しているのではないかと考えた。そして、唾液中のウイルス量が多いことが特徴であるＨＨＶ−７量を測定・定量することにより、全身的な自然免疫力レベルを定量的に評価できることを独自に見出し、免疫力レベルの新しい評価方法を発明した。
さらに本発明者は、パン酵母ベータグルカンを連日経口摂取することにより、唾液中のＨＨＶ−７により評価される免疫力レベルの低下に対して免疫力レベルを高め、免疫力レベルを改善することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。パン酵母ベータグルカンとしては、カプセル製剤を用いて試験を行った。
【００２４】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する自然免疫力レベル評価方法および自然免疫力レベルの改善用パン酵母ベータグルカン含有製品に関する。
（１）唾液中のヒトヘルペスウイルス７の量を指標として、被験者の自然免疫力レベルを評価する方法であり、
前記唾液中のヒトヘルペスウイルス７の量の定量は、前記ヒトヘルペスウイルス７のＤＮＡを前記唾液中から分離し、リアルタイムＰＣＲ法によりＤＮＡ量の測定し、得られた結果をもとに一定量の唾液当たりに含まれているヒトヘルペスウイルス７のウイルス量を算出して指標とし、
前記リアルタイムＰＣＲ法は、Ｑプローブ法ＰＣＲであり、
前記被験者の自然免疫力レベルを、前記唾液中のヒトヘルペスウイルス７量が
０〜１０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、正常ないし高レベルである、
１０，０００〜５０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、やや低レベルである、
５０，０００〜２５０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、低レベルである、
２５０，０００〜８００，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌの場合に、非常に低レベルである、と評価することを特徴とする自然免疫力レベル評価方法。
（２）パン酵母ベータグルカンとして、パン酵母からの抽出工程での粒子径調節操作により、粒子径が２〜４ミクロンメーターの粒子を含むように加工された不溶性のベータグルカンと、該不溶性のベータグルカンを更に加工して得られた水溶性のベータグルカンとを含有し、
前記不溶性のベータグルカンと、前記水溶性のベータグルカンとの含有質量割合が５：１〜１：５の範囲であり、
（１）に記載の自然免疫力レベル評価方法で、自然免疫力レベルが、やや低レベルである、低レベルである、又は非常に低レベルであると評価された被験者に、自然免疫力レベルを改善するために摂取されることを特徴とするパン酵母ベータグルカン含有製品。
【発明の効果】
【００２５】
本発明による自然免疫力レベルを評価する方法は、健常人や未病の人達の加齢やストレスにより低下した自然免疫力レベルを簡便に評価できるので、健康増進や健康維持にとって不可欠の判断材料を提供できる。本発明により評価される自然免疫力レベルを知ることで、免疫力レベルの低下が認められた際には、パン酵母ベータグルカンのような自然免疫強化健康食品の摂取や、免疫の増強に効果があるとされる地中海食などの食事や、睡眠、運動、プレバイオティクスやプロバイオテクスの摂取など適切な対策を講じて免疫健康の増進・強化をはかることができる。
【００２６】
がんの発症予防や感染症対策上も、免疫力レベルを高めておくことは非常に大切であり、多くの人々が自らの自然免疫力レベルを確認し、自然免疫力レベルを高めることは、国民的な健康増進と医療行政上の経済性の向上にも役立つものと思われる。
【００２７】
自然免疫力の強化に最も効果的と思われるパン酵母ベータグルカンの摂取を普及するためにも、本発明により自然免疫力レベルを評価し、免疫力レベルの低下が確認された際には、パン酵母ベータグルカンの摂取を開始することが望ましいとの判断が出来る。
【００２８】
現在の高齢化社会において、健康状態を判定する従来の検査手法に加えて、新たに自然免疫に基づく免疫力レベルを判定することができれば、がんや肺炎に罹患するリスクを少なくするために必要かつ適切な全身的な抵抗力の強化を講じることが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
唾液中のＨＨＶ−７を測定・定量する方法は、ＨＨＶ−７のＤＮＡを唾液中から分離し、リアルタイムＰＣＲ法によりＤＮＡ量を測定し、得られた結果をもとに一定量の唾液当たりに含まれているＨＨＶ−７のウイルス量を算出し、ＨＨＶ−７量が多ければ自然免疫力レベルが大きく低下しており、低ければ自然免疫力レベルは高いと判断する免疫力レベルの判定方法である。
本発明者は、Ｑプローブ法ＰＣＲでの唾液中のＨＨＶ−７  ＤＮＡ量測定は、未だ誰も実施したことがないと考えられることに注目した。その結果、実際に、本発明で用いるリアルタイムＰＣＲ法としては、Ｑプローブ法ＰＣＲが好ましく用いられることを見出した。
【００３０】
以下に本発明に至った経緯や根拠について記述する。
唾液中のＨＨＶ−７量をＱプローブ法ＰＣＲ法により測定した結果を示す。日常会社勤務や主婦、学生として健康に過ごしているボランティアの被験者１０名を募り、パン酵ベータグルカンのカプセル製剤の連日４週間投与を行い６週間後まで観察することにし、症例によっては８週目まで追跡測定した。
パン酵ベータグルカンを用いたのは、自然免疫力を強化することが多くの文献や実用化結果から明らかにされており、連日摂取することで自然免疫力の強化が起こり、唾液中のＨＨＶ−７量の含有量がどのように変化するかが解析されると考えたためである。
また、投与期間を、１日１回、４週間連続としたのは、全身的な自然免疫力レベルは、１週間や１０日間の短期間では変化を的確にとらえられないだろうと考えたためである。近藤一博らの２週間内での疲労についての試験とは異なる視点でとらえようとしたのである。
【００３１】
最初に投与開始前の１０名の唾液を採取したＨＨＶ−７量の試験結果は、後述する表１の通りである。
ＨＨＶ−７のＤＮＡ測定値（単位：ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）を数値の大きなものから順に表に示した。被験者１０名のＨＨＶ−７のＤＮＡ測定値でも、約２３０，０００の高値からから９００の低値まで幅広く分布していることが分かる。免疫力レベルが低下した人では、唾液腺皮下細胞に潜伏感染しているＨＨＶ−７の再燃が起こり、結果的に唾液中のＨＨＶ−７量が多くなり、免疫力レベルが本来各人の保有していた高いレベルを保っている人では、ＨＨＶ−７の再活性化が抑制されて唾液中のＨＨＶ−７量が少なくなると考えられる。従って、各人の免疫力レベルの高低を判定するには、唾液中のＨＨＶ−７量は最適の指標であることが明らかになった。１０名の被験者は、それぞれＨＨＶ−７の値が高い人から低い人まで、いずれも疲労を感じてはいなかった。慢性的疲労症候群などの病的疲労や、日常生活で生じる生理的疲労の蓄積による過労状態にある生理的病的疲労状態の被験者はいなく、一般的な疲労とＨＨＶ−７量が関係していないことを示唆している。
【００３２】
次に、被験者１０名から無作為に選んだ５名に対して、不溶性の原料であるアメリカＢｉｏｔｈｅｒａ社製の原料（Ｗｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰ  Ｆ３００５）を１２５ｍｇ含有するパン酵母β−グルカンのカプセル製剤（フィンガルリンク株式会社製「フエルミューン」）を１日１粒、４週間連日投与し、１〜２週間ごとに測定したＨＨＶ−７ＤＮＡ測定値を後述する表２に示す。
５例とも投与開始１週後（１週目）には、いずれも０週目の値よりも低値になった。投与開始前の値が２２９，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと最も高かった症例（Ｎｏ．１）では２週目に一旦値が高くなった後、４週目から５週目に段階的に低下し、６週目には再度上昇した後８週目にはまた減少した。投与開始前の値に比較すると、６週目では、６１．６％であったが、８週目には更に４１．０％まで低下した。
投与開始前の値が２１９，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと２番目に高かった症例（Ｎｏ．２）では、１週目に投与開始前の約半分の値に低下し、２週目には検出限界以下の０になり、６週目までずっと０であった。３番目と４番目の症例では、１週目に低下した後、２週目、３週目と高い値になって５週目から６週目に段階的に低下し、投与開始時よりも大幅に低い値（５．４％、６１．２％）になった。
【００３３】
５例中１例、最も投与開始前の値が１，２７０ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌとＨＨＶ−７値の低い症例（Ｎｏ．５）は、１週目にさらに半分以下の低値５２１ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌになったが、２週目の３日前に急性の腸炎に罹患し、３８℃の発熱、翌日下痢と軽い嘔吐や４０℃の発熱、翌々日にクリニックにて点滴と薬の投与を受け、２週目の翌日からは通常生活にもどった症例である。２週目には最大の７３９，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌに急上昇し、４週目も５９２，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと極めて高い値で継続し高値を持続した後大幅に低下し、第５週目には１５，３００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ、第６週目には３０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌにまで低下した。見たところ病状も回復し、元気になったように見えても増大したＨＨＶ−７量は高値のまま２週間以上経過し、自然免疫力レベルは低下した状態を継続したと考えられる。その後に自然免疫力レベルが高くなり、次第に回復するにつれてＨＨＶ−７量も減少したのである。
【００３４】
このように重度の疾病に罹患後に、唾液中のＨＨＶ−７量が急激に増大することが起こりえることが分かった。しかもＨＨＶ−７量は１０名の被験者の０日目の最大測定値の約４倍近くまで増大したわけであり、驚くべき事実である。しかし、一旦急激にＨＨＶ−７量が増えたが、４週目以降に比較的少ない量に低下したことは、低下した全身的な自然免疫力レベルは、改善向上に時間がかかることを示唆している。
【００３５】
唾液中のＨＨＶ−７が、重度の腸炎に罹患した際に、これほどまでにウイルス量が増えることは、如何に抵抗力、すなわち免疫力レベルが低下したかを示す貴重な臨床結果である。もともと唾液中のＨＨＶ−７が少ない症例では、免疫レベルが高い状態にあったので、パン酵母β−グルカンの連続摂取により元の高い免疫力レベルに回復しつつあることが示唆される。
【００３６】
結論としては、重篤な急性疾患に罹患した症例を除く４症例が全て５週目には０週目に比較して唾液中のＨＨＶ−７の量が少なくなった。また、重篤な急性疾患に罹患した症例では、罹患後直ぐに急激にＨＨＶ−７量が増大し、発病後２週間経過後も高値であったが３週間経過後にかけて急激に低値に減少した。
【００３７】
次に、上記の５症例の他の５名の被験者には、パン酵母不溶β−グルカンの不溶性原料（Ｗｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰ  Ｆ３００５）に可用性の原料（Ｗｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰ  Ｆ３０２０）を２：１（質量比）の割合で混合した原料１２５ｍを含有するカプセル製剤（フィンガルリンク株式会社製「フエルミューンＳＤ」）を１日１粒、４週間連日投与し、１〜２週間ごとに測定したＨＨＶ−７ＤＮＡ測定値を表３に示す。
【００３８】
唾液中ＨＨＶ−７の０週目のＤＮＡ値が８８，４００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと最も大きかった症例（Ｎｏ．６）は、１週目には大幅に低下した後、２週目から４週目にかけて増大を行い、５週目、６週目と低下し、６週目と８週目の値は０週目対比で、それぞれ３２．５％、３４．４％まで低下した。次に値の大きな症例（Ｎｏ．７）では、１週目から５週目まで増減を繰り返した後、６週目、８週目には０週目対比で、４９．１％、４９．２％まで低下した。残りの３例では０週目の値も６，０９０、２，１７０、９１２ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌと小さく、２〜４週目には検出基準以下、つまり０になり、その後も６週目まで０か低値で推移した。
【００３９】
結論として、５症例のいずれもＤＮＡ量の値が５週目以降６週目までに、投与開始前の値対比で大幅に減少していた。０週目のＤＮＡ量値が小さな症例では、６週目にかけて０か低値で推移した。０週目の値が大きな症例も６週目、８週目で約３０％〜５０％まで低下した。つまり、免疫力レベルが高い症例では高い状態を維持し、免疫力レベルが低下した症例では免疫力レベルを高めることが出来たと考えられる。
【００４０】
さらにＨＨＶ−７のＤＮＡ量の低下を達成するためには、継続してパン酵母β−グルカンを摂取することが望ましい。また、いったんＤＮＡの量が少ない値や０まで低下した場合でも、パン酵母ベータグルカンを継続して摂取し、低値を持続することが望ましいと考えられる。
【００４１】
なお、今回試験に使用したパン酵母ベータグルカンは、アメリカのＢｉｏｔｈｅｒａ社が製造している原料粉末を使用したのであり、特許製法により粒子径が２〜４μｍの粒子が多くなるように加工した原料Ｗｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰ  Ｆ３００５および、水に不溶性のＷｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰ  Ｆ３００５を更に加工して製造された水溶性の原料Ｗｅｌｌｍｕｎｅ  Ｆ５０３０とＷｅｌｌｍｕｎｅ  Ｆ３００５との配合物を含有するカプセル製剤である。
カプセル製剤は、１粒にＷｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰが１２５ｇと賦形剤、安定剤として結晶セルロースが含有されたものを使用した。
【００４２】
パン酵母β−グルカンの２種類のサプリメントを使って４週間連日投与効果を検証した結果、０週目と６週目の唾液中のＨＨＶ−７量すなわちＤＮＡ測定量を対比した結果は表４の通りである。
但し、試験期間中に重篤な急性疾患に罹患した１症例を除いて表示した。
９例のいずれの症例もパン酵母β−グルカンの連日４週間投与により、唾液中のＨＨＶ−７  ＤＮＡ量が６週目までに大幅に低下ないし検出基準以下の０となった。
【００４３】
自然免疫力を強化する作用を有するパン酵母β−グルカンの４週間の連日投与で、低下していた免疫力レベルが高められたが、ＨＨＶ−７の量が多くて免疫力レベルが大幅に低下していると考えられる症例では、ＨＨＶ−７量を完全にゼロや極めて低値にまで減少し尽くすことが出来ていないので、さらに再度パン酵母β−グルカンを４週間以上、投与を行って、ＨＨＶ−７の量をさらに低下させ、自然免疫力レベルの改善向上効果を高めることが有用だと考えられる。
【００４４】
また、途中で重篤な急性疾患に罹患した被験者ではＨＨＶ−７量が大幅上昇後高い値をしばらく保った後、低値に低下したものの、元の低い値にまでは低下できていないので、さらにパン酵母β−グルカンを再投与することが望ましいと考えられる。従来から、大病や大手術を行った後は、１〜２カ月は免疫力が低下しているので肺炎その他感染症に罹らないように安静にする必要があると言われている。今回のデータは、まさに自然免疫力のレベルの回復にパン酵母β−グルカンの連日摂取が効果を発揮し、早めに自然免疫力レベルの強化が達成されることを示唆している。
【００４５】
本発明の自然免疫力レベルの評価方法において、唾液の採取方法については、特に限定されるものではなく、市販の採取器具のサリベットや、Ｓａｌｉｖａ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｉｄその他や、飲料水用のストローなどを用いることができる。
時間的には、毎回同じ時間帯で採取することにより、採取時間によるＨＨＶ−７含有量のバラツキが少なくなると思われる。今回の試験では、主に午前中、人によっては午後に同じ時間帯で採取した。
【００４６】
唾液中からＨＨＶ−７のＤＮＡの抽出分離は、唾液中のＨＨＶ−７をプロテナーゼで可溶化し、磁性ビーズを用いてＤＮＡ精製を行って分離した。特に分離方法を限定するものではなく、種々の改良方法を用いることが出来る。
【００４７】
分離したＨＨＶ−７  ＤＮＡ量を指標とするＨＨＶ−７量の測定には、リアルタイムＰＣＲ法が使える。本発明者はＱｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ（Ｑプローブ）法を用いたリアルタイムＰＣＲによりＤＮＡ量の定量を行った。本発明者は、これまで誰もＨＨＶ−７  ＤＮＡの測定にＱプローブ法ＰＣＲを用いたことが知られておらず、はじめて試験した結果、予想以上に本発明に適した測定方法であることを見出した。
【００４８】
Ｑプローブ法ＰＣＲでの検量線作成では、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｕ４３４００として登録されたＨＨＶ−７  ゲノム配列の８４，２０１〜８４，４００ｂｐ領域（全長：２００塩基）を人工的に合成し、配列番号１および配列番号２のベクターのユニバーサルプライマーでＰＣＲ増幅して、標準ＤＮＡが作製される。
（配列番号１  フォワードプライマー；ＨＨＶ７＿Ｆｗ）：ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ（１８塩基）
（配列番号２  リバースプライマー；ＨＨＶ７＿Ｒｖ）：ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ（１９塩基）
【００４９】
唾液中のＨＨＶ−７のＤＮＡ量の算出は、採取した唾液量を唾液採取後のキット重量から、採取前のキット重量を差し引いて算出し、測定に用いて溶液中の唾液の割合を基に、唾液ｍｌ当たりのＤＮＡ量が算出される。
【００５０】
ＨＨＶ−７量と自然免疫力レベルの関係については、自然免疫力レベルが低下している場合は、ＨＨＶ−７の再活性化を抑制する能力が低下していると考えられる。今回測定された各被験者のＤＮＡ量から判断すると５０，０００〜２５０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌはかなり自然免疫力レベルが低下していると考えられる。しかし、１名の急性感染症に罹患した被験者では、重篤な症状をきたした数日後では、約８００，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ近くにまでＤＮＡ量が急激に上昇しており、慢性疲労症候群患者で報告されている高値レベル相当と考えられる。つまり２５０，０００〜８００，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌでは、相当に特別に高い値と考えられ、自然免疫力レベルが非常に低下していると考えられる。１０，０００〜５０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌでは低値レベルであり、０〜１０，０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌでは、さらに低値レベルと考えられる。このようにＨＨＶ−７のＤＮＡ量が少ない場合は、本来の高い自然免疫力レベルが保たれていると考えられる。
【００５１】
本発明に至る一連の唾液中のＨＨＶ−７量の測定・評価のために実施したＱプローブ法ＰＣＲの詳細を記述する。
＜唾液サンプルの採取＞
スワブ存液（日鉄住金環境社製）７５０μｌを添加したスクリューキャップチューブ（１．５ｍｌ容量、イナ・オプティカ社製、Ｎｏ．Ｔ３３４−４）に、唾液を、Ｓａｌｉｖａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ａｉｄ〈ＳＣＡ〉（ＳａｌｉｖａＢｉｏ社）を用いて、スワブ保存液とのトータル液量が大凡１，０００μｌとなるよう採取した。唾液採取量は、唾液採取前後におけるスワブ保存液入りチューブの重量を測定し、その差より求めた。
なお、採取した唾液サンプルは、ＤＮＡ抽出を実施するまでは、冷蔵ないし冷凍保存した。
【００５２】
＜ＤＮＡ抽出＞
唾液を採取したスワブ保存液含有スワブより、６００μｌのサンプルを採取し、これを対象としてＤＮＡ抽出を実施した。ＤＮＡ抽出は、日鉄住金環境社製のＥｘｔｒａｐ  Ｂｕｃｃａｌ  Ｓｗａｂ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（商品コード：２１４−００１）を用いて、唾液を採取したスワブ保存液含有チューブにプロテナーゼＫを１００μｌ添加した。
次に、５５℃のヒートブロック（またはウォーターバス）で１０分間加温した。上清を６００μＬ採取し、１．５  ｍｌチューブに移し、ＭＢｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５０μｌ、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ４００μｌを添加した。
次にチューブを２分間程度転倒混和し、よく撹拌した。
チューブをマグネティックスタンドにセットして集磁したのち、マイクロピペットを使用して上清を除去した。
７０％エタノール溶液４００μｌを添加し、ボルテックスミキサー（低速）で十分に撹拌した。
マグネティックスタンドで集磁したのち、マイクロピペットを使用してエタノールを除去した。
再度７０％エタノール溶液４００μｌを添加し、ボルテックスミキサー（低速）で十分に撹拌し、マグネティックスタンドで集磁したのち、マイクロピペットを使用してエタノールを除去した。
チューブの蓋をあけたまま、室温で磁性粒子を１０分間程度風乾した。
次に溶出液（ＴＥバッファー、滅菌水等）１００μｌを添加後、ボルテックスミキサー（低速）で十分に撹拌した。
途中で数回攪拌しながら、６５℃のヒートブロック（またはウォーターバス）で５〜１０分間加温した。
マグネティックスタンドにチューブをセットして集磁したのち、溶出液を新しいチューブに移した。
【００５３】
＜ＨＨＶ−７検量線用標準ＤＮＡの作成＞
ＨＨＶ−７検量線用標準ＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｕ４３４００として登録されたＨＨＶ−７  ゲノム配列の８４，２０１〜８４，４００ｂｐ領域（全長：２００塩基）を人工的に合成した。配列番号１および配列番号２のベクターのユニバーサルプライマーでＰＣＲ増幅して、標準ＤＮＡを作製した。
（配列番号１  フォワードプライマー；ＨＨＶ７＿Ｆｗ）：ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ（１８塩基）
（配列番号２  リバースプライマー；ＨＨＶ７＿Ｒｖ）：ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧ（１９塩基）
上記ＰＣＲにて得られたＰＣＲ産物は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（アジレント・テクノロジー社製）を用いて定量し、その定量結果より１０〜１０６コピー／μｌとなるよう希釈したものを標準ＤＮＡとして用いた。
【００５４】
＜ＨＨＶ−７定量＞
唾液中のＨＨＶ−７量の定量を目的に、Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ（以下、ＱＰｒｏｂｅ）を用いたリアルタイムＰＣＲを実施した。唾液サンプルのＨＨＶ−７定量を実施する場合、ＰＣＲ反応溶液の全量は２０μｌとし、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（×５０）（タカラバイオ（株）社製）を０．４μｌ／ＰＣＲチューブ、ＴＩＴＡＮＩＵＭ  Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（×１０）  （タカラバイオ（株）社製）を２μｌ／ＰＣＲチューブ、Ｕｒａｃｉｌ  ＤＮＡ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ  （ロッシュ・ライフサイエンス社製）を０．２μｌ／ＰＣＲチューブ（最終濃度：０．０１ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＰＣＲヌクレオチドミックスＰＬＵＳ（ロッシュ・ライフサイエンス社製）を０．４μｌ／ＰＣＲチューブ（最終濃度０．２ｍＭ）、１０μＭフォワードプライマー（配列番号３）溶液を１．０μｌ／ＰＣＲチューブ（最終濃度０．５μＭ）、１０μＭリバースプライマー（配列番号４）溶液を０．３μｌ／ＰＣＲチューブ（最終濃度０．１５μＭ）、５’末端が蛍光色素、３’末端がリン酸基で標識されたＱＰｒｏｂｅ−ＧＰ（配列番号５、日鉄住金環境社製）の１０μＭ溶液を０．１μｌ／ＰＣＲチューブ（最終濃度０．０５μＭ）、ＰＣＲグレードウオーター（ロッシュ・ライフサイエンス社製）を１０．６μｌ／ＰＣＲチューブ、および鋳型ＤＮＡとして唾液サンプル由来抽出ＤＮＡを５μｌ／ＰＣＲチューブほど含むＰＣＲ反応溶液を調整後、リアルタイムＰＣＲによるＨＨＶ−７定量に供した。抽出ＤＮＡの原液を使用した際、ＰＣＲ阻害が確認された場合は、１０倍希釈した抽出ＤＮＡを５μｌ使用した。１０倍希釈は、抽出ＤＮＡを５μｌおよび０．２×ＴＥバファー４５μｌを採取し、１．５ｍｌエッペンドルフチューブで混合することで実施をした。
標準ＤＮＡを用いて検量線作成をする場合のＰＣＲ反応溶液は、ＰＣＲグレードウオーターを１３．６μｌ／ＰＣＲチューブ、鋳型ＤＮＡとして標準ＤＮＡ溶液を２μｌとする以外は、唾液サンプルのＨＨＶ−７定量を実施する場合のＰＣＲ反応溶液と同様とした。
【００５５】
検量線を作成する際は、１０コピー／μｌ、１０２コピー／μｌ、１０３コピー／μｌ、１０４コピー／μｌ、１０５コピー／μｌ、１０６コピー／μｌの６つの希釈系列を調整後、各希釈系列の溶液を２μｌ／ＰＣＲチューブで添加したＰＣＲチューブを６本準備し、これらＰＣＲチューブを検量線作成に使用した。なお、量線は、分析を実施する都度作成をした。
【００５６】
以下にプライマー、ＱＰｒｏｂｅの配列を示す。配列は、５’末端が左端となるよう表記されている。
（配列番号３  フォワードプライマー；ＱＰｒｏｖｅ＿Ｆｗ）：ＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＧＴＴＧＧＴＧ（２６塩基）
（配列番号４  リバースプライマー；ＱＰｒｏｖｅ＿Ｒｖ）：ＴＴＴＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＡＴＣＧ（２２塩基）
（配列番号５  ＱＰｒｏｂｅ＿ＧＰ）：Ｆ−ＣＴＡＴＴＴＴＣＧＧＴＣＴＴＴＣＣＡＡＴＧＣＡＣＧＣＡ−Ｐ（２７塩基）
（Ｆは蛍光色素、Ｐはリン酸を示す）
【００５７】
上記反応溶液をリアルタイムＰＣＲ装置であるＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ（キアゲン社）を用いて以下のＰＣＲ反応に供した。
（１）ホットスタート工程：９５℃、１２０秒間
（２）熱変性工程：９５℃、１５秒間
（３）アニーリング／伸長工程：６０℃、６０秒間
（１）の熱変性工程の後、工程（２）および（３）を５０サイクル繰り返した。
【００５８】
蛍光測定は、（２）の熱変性工程後と（３）のアニーリング／伸長工程後に実施し、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ付属のソフトウエア上で、（３）の蛍光値を（２）の蛍光値でノーマライズをした後に（（３）の蛍光値を（２）の蛍光値にて割る計算をした後に）、ノーマライズした補正蛍光強度データを用い、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ解析モードにて検量線作成およびＨＨＶ−７の定量解析を実施した。
リアルタイムＰＣＲで得られた定量値を、最終的には唾液１ｍｌ中のＨＨＶ−７量に換算し、得られた換算定量値を結果の評価に用いた。
【００５９】
驚くべきことに、唾液を採取後直ちに保存液に入れたり、希釈倍率を１０倍以上にしたり、Ｑプローブ法ＰＣＲで考案工夫した結果、高感度で再現性良く定量出来た。上記Ｑプローブ法ＰＣＲで定量された結果から、本方法は従来実施されて報告されているリアルタイムＰＣＲに比べて、ＨＨＶ−７  ＤＮＡを精度よく測定できていることが分かり、Ｑプローブ法ＰＣＲは、簡便で費用的にも安価であって、本発明のＤＮＡ量定量方法として最適であることが見出された。
【００６０】
パン酵母ベータグルカンのカプセル製剤として、これまで市販実用化されている不溶性の原料を用いた製剤だけでなく、新たに水溶性の原料を不溶性の原料と配合した製剤も用いた。いずれも同様に唾液中のＨＨＶ−７量を低下させて自然免疫力レベルを高めることができた（Ｎａｎｄｉｔａ  Ｂｏｓｅら、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  Ｂｕｒｓｔ  ｂｙ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  β−Ｇｌｕｃａｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１４年、第２４巻、ｐ．３７９−３９１）。
【００６１】
水溶性のパン酵母ベータグルカン原料は、好中球のレセプターに結合して活性化させるメカニズムが不溶性のパン酵母ベータグルカン原料とは異なることも報告されている。
不溶性のパン酵母ベータグルカンはマクロファージに一旦貪食されてから、より小さな水溶性の断片に消化されて放出された後、好中球のＣＲ３レセプターに吸着して好中球を活性化する。一方、水溶性のパン酵母ベータグルカンは小腸のパイエル板から体内に吸収された後、すぐに好中球に吸着できると考えられる。
【００６２】
両者を配合することにより、小腸のパイエル板を経由して体内により早く吸収されて異なる作用機序での好中球の活性化も水溶性のパン酵母ベータグルカンにより付加されるのではないかと考えた。通常は、沈殿物を生じない飲料用に開発され、価格も高くなる原料を、わざわざ不溶性の原料に配合することは、容易に考案実施されるものではない。本発明者がパン酵母ベータグルカン自然免疫力レベルの改善を、効果がより迅速で、かつ持続性もあるようにと工夫して考案した結果の発明である。言われてみれば簡単な発想のようであるが、これまで誰もこのようなパン酵母ベータグルカンの配合製品を考案しなかった。本発明者の臨床試験結果で、本発明配合物を含む製品が、唾液中のＨＨＶ−７量を指標とする免疫力レベルを高める効果があることが確認されたのである。
【００６３】
本発明により、これまで全身的な自然免疫力レベルの低下を判定することが難しかったが、簡便に測定して判定する方法が確立された訳である。唾液中のＨＨＶ−７のウイルス量が多ければ各個人の免疫力が低下した状態であり、少なければ免疫力が高い状態にあると判断される。自然免疫力レベルを高める効果があるパン酵母ベータグルカンを摂取することにより各個人の免疫力レベルが向上し、結果的に唾液中のＨＨＶ−７のウイルス量が少なって、体の抵抗力が高い状態を保持し、がんの発症や感染症に罹る危険性が小さくなり、快適な健康の維持がなされると思われる。
【００６４】
インフルエンザウイルス感染など血中ウイルス量が多くなるウイルス血症の場合は、活性化された好中球細胞がウイルスを攻撃して速やかに殺してしまうので、ウイルスの血中濃度に相関して反応するインターフェロン反応に起因する発熱は、ウイルスが少なくなると速やかに平熱にもどる。ＨＨＶ−７は、唾液腺上皮細胞中に潜伏感染しており、免疫力のレベルの低下に応じて再活性化が起こり、ウイルス産生が生じるので、血中の好中球の貪食能を高めても直接的に唾液中のウイルスを攻撃してウイルス量を少なくするわけではなく、全身的な自然免疫の強化により唾液腺上皮細胞でのウイルスの再活性化を抑制して行くものと考えられる。
【００６５】
つまり、唾液中のＨＨＶ−７量は、自然免疫力レベルの低下により増大し、反対に自然免疫力レベルが高くなると少なくなると考えられる。唾液中のＨＨＶ−７が多く、自然免疫力レベルが大幅に低下している人では、パン酵母ベータグルカンを摂取することによりＨＨＶ−７の産生量は、一旦減少後再度増加した後、また減少することを繰り返しながら、自然免疫力レベルが向上するのに応じて次第に減少してゆくのである。
【００６６】
もともと免疫レベルが高い人が、感染症に罹患したりして体力が消耗し、自然免疫力レベルが低下して一時的にＨＨＶ−７の再活性化が起こってＨＨＶ−７の量が増えていたような場合には、パン酵母ベータグルカンの摂取で自然免疫力が強化され、結果的にＨＨＶ−７の再活性化による産生が抑制されて唾液中のＨＨＶ−７量が次第に低下すると考えられる。
【００６７】
本発明者は、パン酵母ベータグルカンとして従来一般に用いられている不溶性の原料だけでなく、新たに水溶性の原料を混合させて製造したカプセル製剤を使っての試験も行った。体内に取り込まれた後の作用機序が異なるパン酵母ベータグルカン原料の混合組み合わせ使用は、本発明者により初めて実施された発明である。本組み合わせからなる製品は、低下した免疫力レベルの向上改善に役立つことが確認された。不溶性の原料と水溶性の原料の配合割合は、特に限定するものではないが、５：１〜１：５の間で適宜配合できる。
【００６８】
本発明により、唾液中のＨＨＶ−７量を指標とする自然免疫力レベルの改善用パン酵母ベータグルカン含有製品の有用性が確認されたのである。パン酵母ベータグルカンとしては、多くの粒子径が２〜４μｍとなるように加工された不溶性のパン酵母ベータグルカンや、さらに同不溶性の原料をさらに加工して得られる水溶性のパン酵母ベータグルカンとの配合物が好ましく用いられる。
【実施例】
【００６９】
以下に、実際に行った臨床試験の実施例について記述する。
【実施例１】
【００７０】
日常健康で社会生活を行っているボランティア１０人を対象に唾液中のＨＨＶ−７量をＤＮＡ測定により行った。男性７人、女性３人、平均年齢；４８．２±１４．９９才、平均体重；６５．６±１０．７３ｋｇであった。既往歴では、高血圧、糖尿病、花粉症、アレルギー性鼻炎があった。唾液の採取は、原則パン酵母ベータグルカンのカプセル製剤を連日摂取開始する当日または前日に実施した。
先に記載した方法で、リアルタイムＰＣＲ法で得られた唾液中のＨＨＶ−７のＤＮＡ量（単位：ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ）は、前述の表１の通りであった。
【００７１】
【表１】
0006666084.tif 000002
【実施例２】
【００７２】
１０症例中無作為に群別した５症例に、パン酵母ベータグルカンの不溶性タイプの原料（Ｗｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰ３００５）を１２５ｍｇ含むカプセル製剤（フィンガルリンク社製「フエルミューン」）を１日１カプセル、毎日４週間摂取してもらった。１週間後（１週目）、２週間後（２週目）、４週間後（４週目）、５週間後（５週目）、６週間後（６週目）に唾液サンプルを摂取開始前（０週目）と同じように採取し、唾液中のＨＨＶ−７のＤＮＡ量を測定した。さらに１例は８週間後（８週目）にも唾液サンプルを採取してＨＨＶ−７のＤＮＡ量を測定した。
測定結果は、表２の通りである。
【００７３】
【表２】
0006666084.tif 000003
【実施例３】
【００７４】
別の５症例に対しては、パン酵母ベータグルカンの不溶性タイプの原料（Ｗｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰ  Ｆ３００５）と水溶性の原料（Ｗｅｌｌｍｕｎｅ  ＷＧＰ  Ｆ３０２０）との２：１の割合での含有物を１２５ｍｇ含むカプセル製剤を１日１カプセル、毎日４週間摂取してもらった。１週間後（１週目）、２週間後（２週目）、４週間後（４週目）、５週間後（５週目）、６週間後（６週目）に唾液サンプルを原則午前中の空腹時に採取し、唾液中のＨＨＶ−７のＤＮＡ量を測定した。さらに２例は８週間後（８週目）にも唾液サンプルを採取してＨＨＶ−７のＤＮＡ量を測定した。
測定結果は、表３の通りである。
【００７５】
【表３】
0006666084.tif 000004
【００７６】
この途中で重篤な急性腸炎に罹患した１症例を除く９症例で、０週目と６週目の値と対比して表４に示した。９例について０日目と６週目とのＨＨＶ−７  ＤＮＡの定量値を対比して統計処理した。平均±ＳＤは、８７，４０８±９１２４２と２５，３４３±４５，３４４であり、Ｔ検定でのＰ＝０．０３８２３６  であった。有意に６週目のＨＨＶ−７のＤＮＡ量が減少していた。
上記の急性腸炎に罹患してしまった１例を除き、全ての症例でパン酵母ベータグルカンを１日１カプセル（１２５ｍｇ含有）４週間摂取した結果、摂取前の唾液中のＨＨＶ−７のＤＮＡ量よりも６週目では、少ない値になっていた。内３例は０となり、残り５例では、０日目と比べ、５．４％、３２．５％、４９．１％、５２．５％、６１．２％、６１．６％であった。
つまり、パン酵母ベータグルカンを４週間連日投与した効果を６週目で判定すると、ＨＨＶ−７のＤＮＡ量は、平均２６．４％まで低下していた。０まで低下する症例もあれば、６１〜６２％までしか低下していない症例もあり、効果の程度には個体差があった。
【００７７】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、医療業、製薬業、健康食品産業、健康機器産業など免疫にかかわる広範な分野で利用が可能である。
【配列表】
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