(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病および／または加齢により誘発される網膜神経変性を予防および／または治療するための局所用眼科製剤であって、
前記局所用眼科製剤が、
１）有効成分としてのエンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬と、
２）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、グリセリン、およびそれらの混合物からなる群から選択される薬学上許容可能な湿潤溶媒、および／または、ヒマシ油のポリオキシエチレン化誘導体（クレモフォール（登録商標）ＲＨ４０）、ポリオキシエチレン化ステアレート、ポリエチレングリコール、ポリソルベート、ポロキサマー、グリセリン、中鎖Ｃ６−Ｃ１０トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される可溶化剤と、
３）水溶液を３．５〜１０．５のｐＨに調整するための薬学上許容可能なｐＨ緩衝系と、
を含んでなり、
前記エンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬が、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタン、テゾセンタンまたはそれらの混合物から選択され、
前記局所用眼科製剤が水溶液であり、
前記ｐＨ緩衝系が、ホウ酸と、グリシンと、トロメタモール、アルギニン、リシン、メチルグルカミン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるアミンとからなる緩衝系から選択され、
前記局所用眼科製剤が、糖尿病および／または加齢により誘発される網膜神経変性の予防および／または治療を必要とする対象の眼に直接投与される、前記局所用眼科製剤。
【請求項２】
前記エンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬がボセンタンである、請求項１に記載の局所用眼科製剤。
【請求項３】
ボセンタンの含量が前記局所用眼科製剤の総容量に対して０．１％〜５％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の局所用眼科製剤。
【請求項４】
コルチコイド、プロスタグランジン、増殖因子、抗ＶＥＧＦ因子、およびペプチドからなる群から選択される付加的有効成分を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の局所用眼科製剤。
【請求項５】
前記湿潤溶媒がＰＥＧおよび／またはプロピレングリコールであり、かつ／または、前記可溶化剤がヒマシ油のポリオキシエチレン化誘導体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の局所用眼科製剤。
【請求項６】
前記湿潤溶媒がＰＥＧ４０００および／またはプロピレングリコールである、請求項５に記載の局所用眼科製剤。
【請求項７】
前記湿潤溶媒がＰＥＧ４０００である、請求項６に記載の局所用眼科製剤。
【請求項８】
前記湿潤溶媒の含量が前記製剤の総容量に対して１％〜４９％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の局所用眼科製剤。
【請求項９】
前記ｐＨ緩衝系が、ホウ酸とグリシンとトロメタモールとからなる、請求項１に記載の局所用眼科製剤。
【請求項１０】
界面活性剤、補助溶媒、増粘剤、保存剤、等張化剤、等浸透圧化剤、有効成分の吸収促進剤、粘膜接着性ポリマー、非粘膜接着性ポリマー、キレート剤、安定剤、酸化防止剤、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物をさらに含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の局所用眼科製剤。
【請求項１１】
１）０．１％〜５％（ｗ／ｖ）のボセンタン；
２）１％〜４９％（ｗ／ｖ）の、ＰＥＧおよび／またはプロピレングリコールから選択される湿潤溶媒；
３）０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）のホウ酸；
４）０．５％〜２０％（ｗ／ｖ）のグリシン；および
５）０．１％〜２５％（ｗ／ｖ）の、トロメタモール、アルギニン、リシン、メチルグルカミン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるアミン
を含んでなり；
前記水溶液のｐＨが３．５〜１０．５であり；かつ
前記パーセンテージ（ｗ／ｖ）が前記局所用眼科製剤の総容量に対して表される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の局所用眼科製剤。
【請求項１２】
１）０．１％〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２％〜２％、より好ましくは０．５％〜１％のボセンタン；
２）１％〜４９％（ｗ／ｖ）、好ましくは５％〜４０％、より好ましくは１０％〜３０％、さらにより好ましくは１５％〜２５％の可溶化剤としてのヒマシ油のポリオキシエチレン化誘導体、好ましくは、クレモフォール（登録商標）ＲＨ４０；
３）０．５％〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．７５％〜１０％、より好ましくは１．５％〜２．５％のグリシン；および
４）０．１％〜２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％〜１０％、より好ましくは０．７５％〜５％、さらにより好ましくは１％〜２．５％の、トロメタモール、アルギニン、リシン、メチルグルカミン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるアミン、好ましくは、トロメタモール
を含んでなり；
前記水溶液のｐＨが３．５〜１０．５、好ましくは４．０〜８．５、より好ましくは６．０〜８．２、より好ましくは７．０〜８．１、いっそうより好ましくは７．５〜８．０であり；かつ
前記パーセンテージ（ｗ／ｖ）が前記局所用眼科製剤の総容量に対して表される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の局所用眼科製剤。
【請求項１３】
０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）のホウ酸をさらに含んでなる、請求項１２に記載の局所用眼科製剤。
【請求項１４】
前記ボセンタンが、微粒子、ナノ粒子、リポソームまたはニオソームの形態で配合される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の局所用眼科製剤。
【請求項１５】
糖尿病および／または加齢により誘発される網膜神経変性の予防および／または治療のために使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の局所用眼科製剤。
【請求項１６】
糖尿病および／または加齢により誘発される初期段階の網膜神経変性を予防および／または治療するために使用される、請求項１５に記載の局所用眼科製剤。
【請求項１７】
糖尿病により誘発される網膜神経変性を予防および／または治療するために使用される、請求項１５に記載の局所用眼科製剤。
【請求項１８】
糖尿病により誘発される初期段階の網膜神経変性を予防および／または治療するために使用される、請求項１６に記載の局所用眼科製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関し、糖尿病、および／または加齢などの代謝障害により誘発される眼疾患を治療するための、有効成分としてエンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、またはそれらの混合物から選択されるもの、より好ましくは、ボセンタンを含んでなる局所用眼科製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、身体が十分なインスリンを産生するまたはそれを効果的に使用する能力を失った際に誘発される高血糖の存在を特徴とする慢性疾患である。糖尿病には１型と２型の２つの主要なタイプがある。２型糖尿病は、糖尿病の最も多いタイプであり、通常、成人に見られるが、小児および十代の症例も増えている。
【０００３】
２型糖尿病患者の数は世界的に急速に増えている。この増加は経済発展に関連し、これは高齢人口の増加およびライフスタイルの変化（不健康な食生活および運動不足）を暗に含んでいる。
【０００４】
糖尿病は、微小血管障害（網膜症、神経障害および糖尿病性腎症）および大血管障害（心血管疾患）に分類される重篤な後期合併症を生じ得る。
【０００５】
糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、糖尿病の最も多い合併症であり、先進国における労働年齢人口の視力低下および失明の主因である。ＤＲの罹患率は糖尿病の進行経過とともに増加する。よって、１型糖尿病患者の９０％および２型糖尿病患者の６０％が２０年の糖尿病の進行の後にある程度のＤＲを持つ。Yau et al., Meta-Analysis for Eye Disease (META-EYE) Study Group. Global prevalence and major risk factors of diabetic retinopathy, Diabetes Care, 2012, 35, 556-64に記載されているように、西洋諸国におけるＤＲの有病率は酷似していて３０％前後であり、症例の１０％で、ＤＲは視力が深刻に脅かされる進行段階にある。
【０００６】
International Diabetes Federation. Diabetes Atlas (6th Edition, 2014) (http://www.idf.org/diabetesatlas)によれば、世界の糖尿病患者の数は今後数年で指数関数的に増え、２０１４年の糖尿病患者３８７，０００，０００人から２０３５年には５９２，０００，０００人になると推測される。結果的に、ＤＲ患者の数も並行して増えるであろう。
【０００７】
ＤＲの進行を予防または緩徐化するには血糖および血圧の厳密な制御が不可欠である。しかしながら、治療目的は達成困難であり、結果として、ＤＲはやがて高い割合の患者に発症する。
【０００８】
レーザー光凝固、コルチコステロイドもしくは血管内皮増殖因子（抗ＶＥＧＦ：ラニビズマブ、ベバシズマブ、ペガプタニブ、およびアフリバーセプト）遮断薬の硝子体内注射、または網膜硝子体手術などのＤＲの現行治療は疾患のかなり進行した段階で指示されるが、有効性は限られ、重大な有害作用が伴う。例えば、レーザー処置には、中等度の視力低下、視野の縮小、色覚の低下、およびコントラスト感度の低下が伴う。硝子体内注射は、感染、緑内障および白内障形成などの有害作用を含み、反復投与しなければならないので、副作用の発生のリスクが倍増する。有害な局部作用に加えて、抗ＶＥＧＦ剤は、その体循環へ移行する能力のために全身性の合併症も引き起こし得る。要するに、ＤＲに対する現行治療はこの疾患の進行した段階にのみ適用可能であり、重篤な有害作用を伴う。
【０００９】
ＤＲは、従来、網膜の微小循環疾患と見なされてきた。しかしながら、Lieth et al., Retinal neurodegeneration. Early pathology in diabetes, Clin. Exper. Ophthalmol., 2000, 28: 3-8に記載の通り、神経生理学的、精神測定的、組織病理学的および生化学的所見に基づき、網膜神経変性が、ＤＲに見られる微小循環異常に関与するＤＲの病因の初期イベントであることを示唆する証拠が増えている。例えば、網膜神経変性の主要な特徴（アポトーシスおよびグリア細胞の活性化）が、微小血管変化を持たなかった糖尿病ドナーの網膜で検出されている。臨床上、網膜神経変性は、色彩弁別およびコントラスト感度の低下などの機能異常を生じる。これらの変化は糖尿病患者で、眼底検査で傷害が見られる前に検出され得る。
【００１０】
総説Simo et al., Neurodegeneration in the diabetic eye: new insights and therapeutic perspectives, Trends Endocrin. Metab., 2014, 25, 23-33には、神経保護に基づく処置がＤＲの発症を回避または停止する新たなアプローチを開くことが開示されている。この文献には、実験段階にあるいくつかの戦略が記載されているが、これらの治療アプローチの有効性および安全性を裏づける臨床試験にはまだ手が届いていない。
【００１１】
Chou et al., Endothelin Receptor Antagonist-A Attenuates Retinal Vascular and neuroretinal Pathology in Diabetic Mice, Invest. Ophthalmol. Vis., 2014, 55, 2516-2525による文献では、エンドセリン１のＥＴＡ受容体の選択的遮断薬であるアトラセンタン(atrasentan）の経口投与が開示され、糖尿病マウスにおける血管性および神経網膜性の合併症の有意な軽減が見られた。このような経口投与には、全身作用が不随し得るという欠点がある。さらに、血液−網膜障壁を考慮すれば、網膜内で薬理学的濃度を達成するには高い血清濃度が必要となる。
【００１２】
ＵＳ２００３／０１７６３５６には、緑内障などの異なる疾患を治療するという目的ではあるが、ボセンタンなどのエンドセリン拮抗薬を含んでなる医薬組成物が記載されている。この文献には一般製剤が開示されているが、それらの実行可能性は分かっていない。実際に、それらは適用され、生薬の実践が特定の有効成分について開発された同じ製剤が、たとえ同じ薬物系列のものであっても、他の有効成分には適切でないことを示している場合、その分子構造の小さな変化はその薬学的、化学的および物理的特徴の改変を前提とするので、それらはエンドセリンのいずれの阻害剤にも使用可能あると一般に述べられている。この場合、そこに示されている製剤は、眼科適用のためのそれらの適正な調製またはそれらの実行可能性の提供なくして、安定な解決策および時間的な実行可能性を得ることはできないと言える。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来技術において記載されている解決法にもかかわらず、潜在的副作用を最小限にするため、かつ初期および長期に投与されるように、全身処置または硝子体内注射を回避する、ＤＲの予防および／または治療のための新規な薬理療法の継続的な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の目的
本発明の目的は、糖尿病および／もしくは加齢により誘発される網膜神経変性の予防および／もしくは治療用の医薬の製造のための、有効成分としてエンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、もしくはそれらの混合物から選択されるもの、より好ましくは、ボセンタンを含んでなる局所用眼科製剤の使用、または糖尿病および／もしくは加齢により誘発される網膜神経変性の予防および／もしくは治療において使用するための、有効成分としてのエンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、もしくはそれらの混合物から選択されるもの、より好ましくは、ボセンタンを含んでなる局所用眼科製剤、または糖尿病および／もしくは加齢により誘発される網膜神経変性の予防および／もしくは治療の方法であって、治療上有効な量の、有効成分としてのエンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、タキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、もしくはそれらの混合物から選択されるもの、より好ましくは、ボセンタンを含んでなる局所用眼科製剤を投与することを含んでなる方法である。
【００１５】
本発明のもう１つの目的は、エンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、またはそれらの混合物から選択されるもの、より好ましくは、ボセンタンを含んでなる局所用眼科製剤である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、糖尿病および／または加齢により誘発される網膜神経変性の予防および／または治療用の医薬の製造のための、有効成分としてエンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、またはそれらの混合物から選択されるもの、より好ましくは、ボセンタンを含んでなる局所用眼科製剤の使用である。
【００１７】
本発明はさらに、糖尿病および／または加齢により誘発される網膜神経変性の予防および／または治療において使用するためのエンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、またはそれらの混合物から選択されるもの、より好ましくは、ボセンタン成分を含んでなる局所用眼科製剤に関する。
【００１８】
本発明はまた、糖尿病および／または加齢により誘発される網膜神経変性の治療の方法であって、本明細書に開示される種々の実施形態に従って、治療上有効な量の、有効成分としてエンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、またはそれらの混合物から選択されるもの、より好ましくは、ボセンタンを含んでなる局所用眼科製剤を投与することを含んでなる方法に関する。
【００１９】
用語「治療上有効な量」は、１以上の所望の効果、特に、治療効果をもたらす、本明細書に開示される有効化合物または組成物の量または用量に関する。ある物質の有効量または治療上有効な量は、その個体の病状、年齢、性別および体重、ならびにその個体において所望の応答を惹起するその物質の能力などの因子によって異なり得る。投与計画は、最適な治療応答（例えば、長期の有益な効果）を提供するように調整することができる。例えば、１日数回の分割用量を投与してもよく、または用量は治療状況の緊急性により示されるように比例して低減してもよい。
【００２０】
本発明者らは、有効成分としてエンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、またはそれらの混合物から選択されるもの、より好ましくは、ボセンタンを含んでなる局所用眼科製剤は、驚くことに、糖尿病により誘発される網膜神経変性を予防し、それは初期段階の前記神経変性における治療に好適であることを見出した。前記製剤は、有効成分を眼の粘膜へ、網膜に達するまで浸透させ、そこで治療的に働く。
【００２１】
局所的眼経路は、この経路によって投与される薬物は網膜に到達しないと考えられるので、ＤＲを治療するための好適な投与経路とは見なされないが、実施された試験は、本発明の製剤は網膜に到達し、その神経変性を予防することを示す。
【００２２】
本明細書および特許請求の範囲において、単数形「１つの(a)」、「１つの(an)」および「その(the)」は、文脈がそうではないことを明示しない限り、複数の指示物を含む。
【００２３】
本明細書において、パーセンテージは、そうではないことを明示されない限り、重量／容量（ｗ／ｖ）パーセンテージで表される。
【００２４】
網膜神経変性
組織学的観点から、網膜神経変性は、グリア細胞の活性化（反応性神経膠症）およびニューロン、特に、神経節細胞層のニューロンのアポトーシス死を特徴とする。
【００２５】
網膜神経変性の主要な臨床症状は、Di Leo et al., Presence and further development of retinal dysfunction after 3-year follow up in IDDM patients without angiographically documented vasculopathy, Diabetologia, 1994, 37, 911-916およびFrost-Larsen et al., Value of electroretinography and dark adaptation as prognostic tools in diabetic retinopathy, Dev. Ophthalmol., 1981, 2, 222-234により開示されているように、コントラスト感度および視野の欠損、ならびに暗順応の障害である。臨床的観点から、神経保護効果を有する薬物に基づく処置を開始するために、神経変性を早期に同定することが重要である。
【００２６】
初期段階の網膜神経変性は、Ｓｉｍｏら，前掲に記載されるような、周波数領域光干渉断層撮影法(frequency domain optical coherence tomography)（ＦＤ−ＯＣＴ）または多局所網膜電図(multifocal electroretinogram)（ｍｆＥＲＧ）を用いた眼の検査により検出することができる。神経保護に基づくＤＲの治療は今のところないので、これらのスキャンはＤＲを診断するために糖尿病患者に定期的に実施される慣例の眼の検査には含まれていない。
【００２７】
好ましくは、エンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、またはそれらの混合物から選択されるもの、より好ましくは、ボセンタンを含んでなる局所用眼科製剤の使用は、糖尿病により誘発される網膜神経変性を予防および／または治療するためのものである。
【００２８】
好ましくは、前記使用は、糖尿病および／または加齢により誘発される初期段階の網膜神経変性を予防および／または治療するためのものである。
【００２９】
好ましくは、前記使用は、糖尿病により誘発される初期段階の網膜神経変性を予防および／または治療するためのものである。
【００３０】
局所用眼科製剤
本発明の局所用眼科製剤は、液体、半固体または固体剤形であり得る。液体剤形は、例えば、溶液、懸濁液、流体エマルション、流体ゲル、マイクロエマルション、ナノエマルション、またはコロイド系であり得る。半固体剤形は、例えば、軟膏（ointment）、クリーム、軟膏（unguent）、ゲル、またはペーストであり得る。固体剤形は、例えば、眼科用インプラント、湿布、または包帯であり得る。
【００３１】
好ましい実施形態では、本局所用眼科製剤は、液体剤形、より好ましくは、水溶液である。
【００３２】
さらなる好ましい実施形態では、本局所用眼科製剤は、
１）有効成分としてボセンタン、
２）薬学上許容可能な、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、グリセリン、およびそれらの混合物からなる群から選択される湿潤溶媒、および／または
ヒマシ油のポリオキシエチレン化誘導体（それらは、例えば、ＢＡＳＦにより供給されるクレモフォール（登録商標）ＲＨ４０の名称で市販されている）、ポリオキシエチレン化ステアレート、ポリエチレングリコール、ポリソルベート、ポロキサマー、グリセリン、中鎖Ｃ６−Ｃ１０トリグリセリド、およびそれらの混合物からなる群から選択される可溶化剤；
３）水溶液を３．５〜１０．５のｐＨに調整するための薬学上許容可能なｐＨ緩衝系
を含んでなる水溶液である。
【００３３】
前記水溶液は、溶媒として水を含んでなる。
【００３４】
有効成分
本発明の有効成分は、エンドセリン受容体の少なくとも１種類の拮抗薬、好ましくは、シタキセンタン、アンブリセンタン、アトラセンタン、ボセンタン、マシテンタンおよびテゾセンタン、またはそれらの混合物から選択されるものである。
【００３５】
より好ましくは、本発明の製剤において、有効成分は、ボセンタンの国際的一般名に相当する４−（１，１−ジメチルエチル）−Ｎ−［６−（２−ヒドロキシエトキシ）−５−（２−メトキシフェノキシ）［２，２’−ビピリミジン］ベンゼンスルホンアミドである。
【００３６】
ボセンタンの製造は、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅによりカナダ特許出願ＣＡ−Ａ−２０７１１９３に記載されており、抗高血圧薬として医療に、特に、肺動脈性高血圧症の処置に使用されているエンドセリン受容体の１つの拮抗薬である。
【００３７】
本発明に関して、用語「ボセンタン」は、ボセンタン、その水和物および塩、例えば、ボセンタン一水和物またはボセンタンのナトリウム塩を意味する。本発明の製剤では、ボセンタン一水和物が好ましく使用される。
【００３８】
本発明の製剤では、ボセンタンとして表されるボセンタンは一般に、製剤の総容量に対して０．１％〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２％〜２％、いっそうより好ましくは０．５％〜１％で存在する。ボセンタンを一水和物もしくは他の水和物として、またはナトリウム塩もしくは別の塩として使用する場合、当業者は容易に対応する量を計算することができる。
【００３９】
本発明の製剤では、有効成分は、微粒子、ナノ粒子、リポソームまたはニオソームの形態で配合されると見られる。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明の製剤は、ボセンタンを別の有効成分、例えば、ステロイド、プロスタグランジン、増殖因子、抗ＶＥＧＦ因子またはペプチドと組み合わせて含んでなる。好ましくは、ボセンタンは、増殖因子と組み合わせて使用される。
【００４１】
湿潤溶媒
本発明の製剤は、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、およびそれらの混合物からなる群から選択される薬学上許容可能な湿潤溶媒を含んでなる。
【００４２】
湿潤溶媒は、本発明に関して、溶媒および湿潤特性を有する化合物である。
【００４３】
とりわけ、触媒の存在下でエチレンオキシドと水の縮合により得られる、種々の分子量を有する大系列のポリマーを表す名称であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がある。これらのポリマーの式は、Ｈ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨとして表すことができ、式中、ｎはオキシエチレン基の平均数を表す。
【００４４】
ＰＥＧは、皮膚に本質的に刺激のない安定な化合物であることから、非経口、局所、眼用、経口、および直腸製剤を含む医薬組成物に広く使用されている。さらに、ＰＥＧは容易に水に溶ける親水性の化合物である。
【００４５】
本発明の製剤において使用するための適正なＰＥＧは、３００〜３５０００、好ましくは６００〜２００００、より好ましくは１０００〜８０００、いっそうより好ましくは３０００〜６０００、さらにより好ましくは約４０００の分子量を有する。種々のＰＥＧは、用語ＰＥＧに付随する数字によって表される。よって、ＰＥＧ２００は、約２００の平均分子量を有するＰＥＧを意味する。分子量によってＰＥＧは液体または固体である。よって、８００までの平均分子量を有するＰＥＧは室温で液体であり、ＰＥＧ１０００は３７℃〜４０℃の温度で融解し、ＰＥＧ４０００は５０℃〜５８℃の温度で融解する。エチレンオキシド含量が高いほど、ＰＥＧの融点は高くなる。
【００４６】
ＰＥＧは、例えば、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙにより供給されるＣａｒｂｏｗａｘの名称で市販されている。
【００４７】
プロピレングリコールは、プロピレンオキシドの加水分解により得られる透明、粘稠、無色かつ事実上無臭の液体である。
【００４８】
グリセリンもまた、無色、透明、粘稠かつおよび事実上無臭で、やや甘みのある液体である。
【００４９】
本発明の製剤では、ＰＥＧおよび／またはプロピレングリコールが湿潤溶媒として使用され、より好ましくは、ＰＥＧ４０００および／またはプロピレングリコール、さらにより好ましくはＰＥＧ４０００である。
【００５０】
本発明の製剤では、湿潤溶媒の含量は通常、製剤の総容量に対して１％〜４９％（ｗ／ｖ）、好ましくは５％〜４０％、より好ましくは１０％〜３０％、いっそうより好ましくは１５％〜２５％である。
【００５１】
ｐＨ緩衝系
本発明の製剤は、前記水溶液のｐＨを３．５〜１０．５、好ましくは４．０〜８．５、より好ましくは６．０〜８．２、より好ましくは７．０〜８．１、いっそうより好ましくは７．５〜８．０の値に調整するために薬学上許容可能な緩衝系を含んでなる。
【００５２】
このようなｐＨを得るために適当な緩衝は、クエン酸／クエン酸塩緩衝溶液、リン酸塩緩衝溶液、ホウ酸−ホウ酸塩緩衝溶液、およびそれらの混合物などの、医薬製剤において使用される緩衝系の中から当業者により選択され得る。前記緩衝系は、アミノ酸および／またはアミノ化物質を含み得る。
【００５３】
本発明の製剤において、ｐＨ緩衝系は好ましくは、ホウ酸とグリシンと、トロメタモール、アルギニン、リシン、メチルグルカミン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるアミンからなる緩衝系；クエン酸／クエン酸塩系、およびリン酸塩系から選択され得る。好ましくは、ｐＨ緩衝系は、ホウ酸とグリシンと、トロメタモール、アルギニン、リシン、メチルグルカミン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるアミン；またはクエン酸／クエン酸塩系からなる。より好ましくは、ｐＨ緩衝系は、ホウ酸とグリシンと、トロメタモール、アルギニン、リシン、メチルグルカミン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるアミンからなり、さらにより好ましくは、ｐＨ緩衝系は、ホウ酸とグリシンとトロメタモールからなる。
【００５４】
ｐＨを所望の値に調整するために必要なｐＨ緩衝系の量は、当業者に何ら困難を抱かせない一般課題である。ホウ酸とグリシンとアミンからなるｐＨ緩衝系の場合、通常、ホウ酸の含量は製剤の総容量に対して０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．５％〜５％、さらにより好ましくは０．７５％〜１．５％であり；グリシンの含量は、製剤の総容量に対して０．５％〜２０％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．７５％〜１０％、いっそうより好ましくは１．５％〜２．５％であり；およびアミンの含量は、製剤の総容量に対して０．１％〜２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％〜１０％、より好ましくは０．７５％〜５％、さらにより好ましくは１％〜２．５％である。
【００５５】
その他の成分
本発明の局所用眼科製剤は、例えば、界面活性剤、補助溶媒、増粘剤、保存剤、等張化剤、等浸透圧化剤、有効成分の吸収促進剤、粘膜接着性ポリマー、非粘膜接着性ポリマー、キレート剤、安定剤、酸化防止剤、およびそれらの混合物などのその他の成分を含んでもよい。
【００５６】
界面活性剤としては、例えば、ポリエトキシル化グリセリド、ポリソルベート、ポロキサマー、ラウリル硫酸ナトリウム、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリンまたはホスファチジルグリセロールおよびそれらの誘導体）、ポリオキシエチレン化水添ヒマシ油、ポリオキシエチレン化脂肪酸、場合によりポリオキシエチレン化された脂肪酸のモノ、ジおよびトリグリセリドの混合物、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００５７】
補助溶媒または可溶化剤としては、例えば、ヒマシ油のポリオキシエチレン化誘導体（ＢＡＳＦにより供給されるクレモフォール（登録商標）ＲＨ４０の名称で市販されている）、ポリオキシエチレン化ステアレート、ポリエチレングリコール、ポリソルベート、ポロキサマー、グリセリン、中鎖Ｃ６−Ｃ１０トリグリセリド、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００５８】
増粘剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマー、ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００５９】
保存剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、ホウ酸、安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール、水銀の有機金属誘導体、ポリクオタニウム１などのポリクオタニウム、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００６０】
等張化剤および等浸透圧化剤としては、例えば、塩化ナトリウムなどの無機塩、デキストロース、トレハロース、マンニトール、アミノ酸、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００６１】
有効成分の吸収促進剤としては、例えば、サポニン、脂肪酸、脂肪酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、ピロリドン、ポリビニルピロリドン、ピルビン酸、ピログルタミン酸、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００６２】
粘膜接着性ポリマーとしては、例えば、ヒアルロン酸、ポリガラクツロン酸、ポリアクリル酸、カルボキシメチルアミロース、カルボキシメチルキチン、コンドロイチン硫酸、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、キトサン、カーボポール、ポリカルボフィル、ゲランガム、カラギーナン、アルギン酸塩、ペクチン、ポロキサマー、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００６３】
非粘膜接着性ポリマーとしては、例えば、ポリビニルアルコールが挙げられる。
【００６４】
キレート剤としては、例えば、エデト酸二ナトリウム、およびクロモグリク酸二ナトリウムが挙げられる。
【００６５】
有効成分の安定剤としては、例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グリシン、アルギニン、リシン、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００６６】
酸化防止剤としては、例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、アセチルシステイン、アスコルビン酸、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００６７】
ゲル化剤としては、例えば、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロキサマー、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、キサンタンガム、ゲランガム、キシログルカン、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００６８】
エマルションおよびマイクロエマルションの賦形剤としては、例えば、脂肪酸エステルおよびグリセリン、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオキシエチレン化脂肪酸、ヒマシ油のポリオキシエチレン化誘導体、中鎖Ｃ６−Ｃ１０トリグリセリド、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００６９】
軟膏およびクリームの賦形剤としては、例えば、パラフィン、高分子量ポリエチレングリコール、シリコーン、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００７０】
微粒子、ナノ粒子、リポソームまたはニオソームを調製するために使用される化合物は、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸−コ−グリコール）酸、ポリスチレン、キトサン、アルブミン、ゼラチン、レクチン、シアノアクリレート、ポリカプロラクトン、メタクリレート、ポリアクリルアミド、アルギン酸塩、デキストラン、アガロース、ポリオキシエチレンソルビタン誘導体、コレステロール、ポリエトキシル化脂肪アルコール、リン酸ジセチル、ホスファチジルコリンおよびそれらの混合物である。
【００７１】
本発明の眼科用製剤は、上述の保存剤を無視しても無菌であり得る。この場合、本製剤は、無菌調製であれ、除菌濾過であれ、または最終製剤の滅菌であれ、当業者に最も好適な製薬技術に従って調製することができる。
【００７２】
好ましい実施形態では、本発明の局所用眼科製剤は、
１）０．１％〜０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２％〜２％、より好ましくは０．５％〜１％のボセンタン；
２）１％〜４９％（ｗ／ｖ）、好ましくは５％〜４０％、より好ましくは１０％〜３０％、さらにより好ましくは１５％〜２５％の、ＰＥＧおよび／またはプロピレングリコールから、好ましくはＰＥＧ４０００および／またはプロピレングリコールから選択される湿潤溶媒；
３）０．１％〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２％〜５％、より好ましくは０．５％〜１．５％のフェニルエチルアルコール；
４）０．５％〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．７５％〜１０％、より好ましくは１．５％〜２．５％のグリシン；および
５）０．１％〜２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％〜１０％、より好ましくは０．７５％〜５％、さらにより好ましくは１％〜２．５％の、トロメタモール、アルギニン、リシン、メチルグルカミン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるアミン、好ましくは、トロメタモール
を含んでなり、前記水溶液のｐＨは、３．５〜１０．５、好ましくは４．０〜８．５、より好ましくは６．０〜８．２、より好ましくは７．０〜８．１、いっそうより好ましくは７．５〜８．０であり；かつ、前記パーセンテージ（ｗ／ｖ）は、製剤の総容量に対して表される、水溶液である。別のより好ましい実施形態では、本発明の製剤は、水溶液の形態で、表されている量の上記成分から本質的になる。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、本発明の局所用眼科製剤は、
１）０．１％〜０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２％〜２％、より好ましくは０．５％〜１％のボセンタン；
２）１％〜４９％（ｗ／ｖ）、好ましくは５％〜４０％、より好ましくは１０％〜３０％、さらにより好ましくは１５％〜２５％の可溶化剤としてのヒマシ油のポリオキシエチレン化誘導体、好ましくは、クレモフォール（登録商標）ＲＨ４０；
３）０．５％〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．７５％〜１０％、より好ましくは１．５％〜２．５％のグリシン；および
４）０．１％〜２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％〜１０％、より好ましくは０．７５％〜５％、さらにより好ましくは１％〜２．５％の、トロメタモール、アルギニン、リシン、メチルグルカミン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるアミン、好ましくは、トロメタモール；
を含んでなり、前記水溶液のｐＨは、３．５〜１０．５、好ましくは４．０〜８．５、より好ましくは６．０〜８．２、より好ましくは７．０〜８．１、いっそうより好ましくは７．５〜８．０であり；かつ、前記パーセンテージ（ｗ／ｖ）は、製剤の総容量に対して表される。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、本発明の局所用眼科製剤は、
１）０．１％〜０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２％〜２％、より好ましくは０．５％〜１％のボセンタン；
２）１％〜４９％（ｗ／ｖ）、好ましくは５％〜４０％、より好ましくは１０％〜３０％、さらにより好ましくは１５％〜２５％の、ＰＥＧおよび／またはプロピレングリコール、好ましくはＰＥＧ４０００および／またはプロピレングリコールから選択される湿潤溶媒；
３）ｐＨ緩衝系としてのクエン酸／クエン酸塩系
を含んでなり、前記水溶液のｐＨは、３．５〜１０．５、好ましくは４．０〜８．５、より好ましくは６．０〜８．２、より好ましくは７．０〜８．１、いっそうより好ましくは７．５〜８．０であり；かつ、前記パーセンテージ（ｗ／ｖ）は、製剤の総容量に対して表される。別のより好ましい実施形態では、本発明の製剤は、水溶液の形態で、表されている量の上記成分から本質的になる。
【００７５】
調製法
本発明の製剤の調製方法は、製薬分野の標準的手順である。
【００７６】
水溶液を調製するためには、その方法は一般に、水の一部を反応槽に導入することによって始め、次いで、室温で撹拌しながら湿潤溶媒または可溶化剤、ｐＨ緩衝系の成分および有効成分を連続的に添加する。有効成分を、溶解を助けるためにｐＨ緩衝系の成分を散在させて加えることもできる。各添加の後に、反応槽の内容物を、添加した成分の完全な溶解が見られるまで振盪させることが奨励される。
【００７７】
懸濁液、軟膏、クリームおよびエマルションの調製、ならびに適当な賦形剤の選択のためには、共通の一般知識または当業者に周知の製薬技術の手引き書、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000、または総説Souza et al, Topical ocular delivery of therapeutics: carrier systems and physical methods, J. Pharm. Pharmacol., 2013, 66, 507-530を使用することができる。
【００７８】
適用アッセイ
実施例の節に詳細に開示されるように、本発明の局所用眼科製剤を糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）の眼に直接投与した。これらの動物はレプチン受容体をコードする遺伝子に突然変異を有し、例えば、Duval et al., Characterization of db/db mice for efficacy / safety pharmacology assessment of antidiabetic drugs, Safety Pharmacology Society Annual Meeting, Phoenix, 2012に記載されているように、肥満誘導性２型糖尿病モデルである。
【００７９】
本発明の製剤を１日２回１４日間投与し、試験期間後に、ボセンタンで処置した動物のグリア細胞の活性化の低下および総ての網膜層でのアポトーシスの減少が見られた。
【００８０】
グリア細胞の活性化（または反応性神経膠症）は、網膜を傷害する病毒（例えば、糖尿病）が存在する場合に起こる、グリア細胞（ニューロン支持細胞）の炎症性応答である。アポトーシスによる神経細胞死は、網膜の神経変性過程の最終段階に相当する。
【００８１】
これは、ボセンタンの局所投与が糖尿病により誘発される網膜神経炎症および神経細胞死を予防することを意味する。
【００８２】
驚くことに、本発明の局所用眼科製剤は、ボセンタンを眼の粘膜を経て網膜に到達させ、網膜神経変性を予防および／または治療するその治療的作用を発揮させる。
【００８３】
本発明を説明するためにいくつかの例が以下に含まれるが、それらは本発明を限定すると見なされるべきでない。
【実施例】
【００８４】
動物を用いたアッセイに対するデータは、平均±標準偏差として表される。連続的変数の比較は、対応のある、および対応のないスチューデントのｔ検定を用いて行った。カテゴリー変数の比較は、フィッシャーの正確確率検定を用いて行った。統計的有意性のレベルはｐ＜０．０５に設定した。
【００８５】
実施例１：局所用眼科製剤
７５ｍＬの脱イオン水に、２０ｇのクレモフォール（登録商標）ＲＨ４０を磁気撹拌により溶かし、完全に溶解するまで撹拌下で放置した。次に、１．５ｇのトロメタモールを加え、１５分間撹拌して完全な溶解を達成した。０．５ｇのボセンタンに相当する量のボセンタン一水和物をすぐに加え、１５分間撹拌下で放置して完全な溶解を達成した。次に、２ｇのグリシンおよび１ｇのホウ酸を加え、完全に溶解するまで撹拌下で放置した。
【００８６】
この溶液を十分な量の脱イオン水を加えて１００ｍＬの容量とする。この溶液を濾紙で濾過し、ｐＨ８．０６の無色透明の溶液を得た。この溶液を５ｍＬ容量の点眼ボトルに入れた。
【００８７】
実施例２〜７：眼科用局所組成物
実施例１と同様の手順に従い、表１に記載のような眼科用局所組成物を調製した。
【００８８】
【表１】
0006768780.tif 000002
【００８９】
成分の量はグラムで表し、水の量は１００ｍＬに合わせる。
【００９０】
総ての場合で、ｐＨ５〜８．５の間の無色透明の組成物が得られた。
【００９１】
実施例８〜２５：賦形剤の組合せ
実施例１と同様の手順に従い、表２、３および４に記載のような眼科用局所組成物を調製した。
【００９２】
【表２】
0006768780.tif 000003
【００９３】
【表３】
0006768780.tif 000004
【００９４】
【表４】
0006768780.tif 000005
【００９５】
実施例２６〜３０：親油性軟膏
標準的手順に従い、表５に記載のような親油性軟膏の形態の眼科用局所組成物を調製した。
【００９６】
【表５】
0006768780.tif 000006
【００９７】
実施例３１〜３５：親水性軟膏
標準的手順に従い、表６に記載のような親水性軟膏の形態の眼科用局所組成物を調製した。
【００９８】
【表６】
0006768780.tif 000007
【００９９】
実施例３６〜４０：ヒドロゲル
標準的手順に従い、表７に記載のようなヒドロゲルの形態の眼科用局所組成物を調製した。
【０１００】
【表７】
0006768780.tif 000008
【０１０１】
実施例４１：ボセンタンナノ粒子を含む眼科用局所溶液
ナノ粒子は溶媒蒸発技術により調製した。
【０１０２】
６０ｍＬの酢酸エチル中、１２０ｍｇのＰＬＧＡ  ５０：５０溶液を調製した。この溶液に、ターボ撹拌下で、１２ｍｇのボセンタン一水和物および０．５ｍｇのポリビニルアルコールを含む水５０ｍＬの水溶液を配合した。得られた混合物を連続振盪下、真空下で２時間放置した。得られた調製物を、次に、超遠心分離し、水で３回洗浄して媒体からナノ粒子を取り出した。
【０１０３】
これらのナノ粒子を真空炉で乾燥させ、評価の後に、等張水溶液に０．５ｍｇ／１００ｍＬの濃度とするのに十分な量のボセンタン一水和物を分散させた。
【０１０４】
実施例４２：ボセンタンニオソームを含む眼科用局所溶液
ニオソームは薄膜水和技術により調製した。
【０１０５】
１０ｍＬのクロロホルムを含む丸底フラスコにて、ポリオキシエチレン化モノステアリン酸ソルビタンと２０モルのエチレンオキシド、コレステロールおよびリン酸ジセチルをモル比１：０．５：０．１で混合した。
【０１０６】
それを、６０℃、ロータリーエバポレーター、１２０ｒｐｍで減圧下、完全に蒸発するまで放置した。
【０１０７】
フラスコ内に形成した薄膜を、５ｍｇのボセンタン一水和物を含有する、１２ｍＬのｐＨ７．４リン酸バッファーで水和させた。
【０１０８】
このニオソーム懸濁液を１２時間４℃に放冷した後、０．２２μｍナイロンフィルターで濾過した。
【０１０９】
実施例４３：局所用眼科製剤による処置
試験では、１２個体の１０週齢、雄ｄｂ／ｄｂマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い、２群に分け、以下に記載されるように、これらのマウスのうち６個体を本発明の製剤で処置し、６個体のマウスを塩化ナトリウム溶液で処置した。また、齢の適合した６個体の非糖尿病（ｄｂ／＋）マウスも対照群として使用した。
【０１１０】
１日２回１４日間、１滴（５μｌ）の実施例１の製剤または１滴のビヒクル（５μｌの０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム溶液）を１２個体のｄｂ／ｄｂマウスの各眼の上部角膜表面に、シリンジを用いて直接投与した。
【０１１１】
１５日目、剖検のおよそ１時間前に、１滴の本発明の製剤またはビヒクルを動物の眼に注いだ。安楽死の後、眼球を摘出した。眼球の一方から神経網膜を抽出し、液体窒素中で凍結させ、−８０℃の温度で保存した。他方の眼球を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定し、慣例の処理を施し、パラフィンブロックに包埋した。
【０１１２】
実施例４４：グリア細胞の活性化の決定
グリア細胞の活性化は、ＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性タンパク質）に対する特異的抗体を用い、レーザー走査型共焦点顕微鏡によって評価した。網膜切片を−２０℃で２分間、酸性メタノール中で固定した後、リン酸バッファー（ＰＢＳ）で各５分間３回洗浄した。網膜切片に０．０２５％トリトン（登録商標）Ｘ−１００を含むトリスバッファー（ＴＢＳ）で透過処理を施し、１０％ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）および１０％ヤギ血清から構成されるブロッキング溶液中、室温で２時間、インキュベートした。網膜切片を、ウサギ抗ＧＦＡＰ抗体（Ａｂｃａｍ  Ｌｔｄ、ケンブリッジ、ＵＫ；ブロッキング溶液で１：５００希釈）とともに、加湿雰囲気下、４℃で一晩、インキュベートした。ＰＢＳ溶液で各５分３回洗浄した後、網膜切片を、ブロッキング溶液で調製した１：２００希釈で、二次抗体Ａｌｅｘａ  ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ  ＣＡ、ＵＳＡ）とともにインキュベートした。網膜切片をＰＢＳで３回洗浄し、ヘキストで対比染色し、Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｐｒｏｌｏｎｇ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で封入し、カバーガラスをかけた。サンプルからの比較デジタル画像をオリンパスＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ  １０００レーザー走査型共焦顕微鏡で、輝度およびコントラストを同一の設定にして記録した。
【０１１３】
グリア細胞の活性化の程度を評価するために、Anderson et al., Glial and endothelial blood-retinal barrier responses to amyloid-β in the neural retina of the rat, Clin. Ophthalmol., 2008, 2, 801-816に記載のＧＦＡＰ染色の程度に基づくスコアリングシステムを用いた。このスコアリングシステムは次の通りであった。
・スコア１：ミュラー細胞エンドフィート／神経節網膜細胞層（ＧＣＬ）のみ；
・スコア２：ミュラー細胞エンドフィート領域／ＧＣＬおよび少数の近位突起；
・スコア３：ミュラー細胞エンドフィートおよび多くの突起、網膜の外顆粒層（ＯＮＬ）には及ばない；
・スコア４：ミュラー細胞エンドフィートおよび至る所に突起、一部はＯＮＬ中へ；
・スコア５：ミュラー細胞エンドフィートおよびＧＣＬからＯＮＬの外縁まで多数の黒い突起。
【０１１４】
スコアは、各動物の網膜で、１網膜当たり最低１０切片を評価した。
【０１１５】
表８では、示された３種類の動物（対照、ビヒクルで処置したｄｂ／ｄｂ、およびボセンタンで処置したｄｂ／ｄｂ）に関するグリア細胞活性化の程度（ＧＦＡＰ発現の各スコアのパーセンテージ）を示す。
【０１１６】
【表８】
0006768780.tif 000009
【０１１７】
予想されたように、非糖尿病動物では、主としてＧＦＡＰ発現は神経節網膜細胞層（ＧＣＬ）に限られたことが示され、従って、ＧＦＡＰスコアは≦２であった。
【０１１８】
ビヒクルで処置した糖尿病動物は、齢が適合する非糖尿病マウスよりも有意に高いＧＦＡＰ発現を示した。よって、１００％の糖尿病動物がＧＦＡＰ  スコア≧３を有し、その相当な部分（４０％）がスコア４に達した。２週間のボセンタンの投与は、反応性神経膠症の有意な軽減をもたらし、ボセンタンで処置した動物のＧＦＡＰスコアは総ての場合で＜３であり、大多数（８５％）が２未満であった。
【０１１９】
従って、グリア細胞活性化を低下させる本発明の製剤の有効性が証明される。
【０１２０】
実施例４５：アポトーシス評価のための免疫組織化学分析法
アポトーシス評価のための免疫組織化学分析法では、ＤｅａｄＥｎｄ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ＴＵＮＥＬ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、マディソン、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いたＴＵＮＥＬ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｄＵＴＰ  Ｎｉｃｋ−Ｅｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ）染色を行った。
【０１２１】
網膜の凍結切片に、氷上で２分間、新たに調製した０．１％トリトンＸ−１００および０．１％クエン酸ナトリウム溶液を用いてインキュベートすることにより透過処理を施した。二次抗体はＡｌｅｘａ  ４８８ヤギ抗ウサギ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、サンディエゴ  ＣＡ、ＵＳＡ）であった。レーザー走査型共焦点顕微鏡による評価では、励起波長４８８ｎｍおよび緑色に相当する５１５〜５６５ｎｍの範囲での検出とした。
【０１２２】
評価は各動物の網膜で、１網膜当たり最低１０切片で行った。
【０１２３】
表９は、網膜の種々の層におけるＵＮＥＬ染色陽性細胞のパーセンテージに相当する結果を示す。網膜の各層（外顆粒層ＯＮＬ；内顆粒層ＩＮＬ；神経節細胞層ＧＣＬ）のパーセンテージの平均値および標準偏差を括弧内に示す。
【０１２４】
【表９】
0006768780.tif 000010
【０１２５】
この表では、本発明の製剤で処置した動物の網膜の総ての層のアポトーシス率が対照動物（非糖尿病）のアポトーシス率と同等であり、ビヒクルで処置した糖尿病動物よりも有意に低かったことが示される。統計的有意性はｐ＜０．００１とした。
【０１２６】
よって、糖尿病動物に対する本発明の製剤の２週間の投与は、総ての網膜層でアポトーシスの有意な予防をもたらしたことが判明した。