(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊婦から採取された血液試料中のマーカーのｍＲＮＡレベルを測定する試薬の、前記マーカーのｍＲＮＡレベルの測定結果を用いて早産のリスクを判定するためのキットの製造における使用であって、
前記マーカーは、Ｂ３ＧＮＴ５、ＣＬＣ、およびＧＢＰ３からなる群から選択され；
前記キットは、標準対照と比較した場合のＢ３ＧＮＴ５のｍＲＮＡレベルの増加、または標準対照と比較した場合のＣＬＣもしくはＧＢＰ３のｍＲＮＡレベルの減少が、女性が増加した早産のリスクを有することを示す、前記使用。
【請求項２】
試料が全血である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
試料が単離された血液細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
試料が血漿である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
試料が血清である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記マーカーがＢ３ＧＮＴ５であり、標準対照と比較した場合の前記ｍＲＮＡレベルの増加が、女性が増加した早産のリスクを有することを示す、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記マーカーがＣＬＣまたはＧＢＰ３であり、標準対照と比較した場合の前記ｍＲＮＡレベルの減少が、女性が増加した早産のリスクを有することを示す、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記ｍＲＮＡレベルが、標準対照と比較される前に同一試料中の参照遺伝子のｍＲＮＡレベルに対して正規化される、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
試薬が、質量分析またはマイクロアレイ、蛍光プローブ、もしくは分子ビーコンへのハイブリダイゼーションのための試薬を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
試薬が、増幅反応のための試薬を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＰＣＲが、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記試薬が、検出可能な部分を含むポリヌクレオチドプローブを利用するポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイのための試薬を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイが、サザンブロット解析、ノーザンブロット解析、またはインサイチュハイブリダイゼーションアッセイである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記ｍＲＮＡレベルが、標準対照と比較される前に同一試料中の参照遺伝子のｍＲＮＡレベルに対して正規化される、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
前記参照遺伝子が、ＧＡＰＤＨである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記キットが、早産について女性を治療するためのデータの収集に使用される、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
２つ以上のマーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルが測定され、それら各々の標準対照と比較されることで、早産のリスクが判定される、請求項１に記載の使用。
【請求項１９】
マーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルの測定結果を用いて早産のリスクを判定するためのキットであって、（１）マーカー遺伝子のｍＲＮＡの平均レベルを提供する標準対照；および（２）マーカー遺伝子のｍＲＮＡを特異的かつ定量的に同定する試薬を含み、前記マーカー遺伝子がＢ３ＧＮＴ５、ＣＬＣおよびＧＢＰ３からなる群から選択され、標準対照と比較した場合のＢ３ＧＮＴ５のｍＲＮＡレベルの増加、または標準対照と比較した場合のＣＬＣもしくはＧＢＰ３のｍＲＮＡレベルの減少が、女性が増加した早産のリスクを有することを示す、キット。
【請求項２０】
前記試薬が、前記マーカー遺伝子ｍＲＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドプローブが、検出可能な部分を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
増幅反応においてマーカー遺伝子ｃＤＮＡまたはその相補鎖の少なくとも１つのセグメントを特異的に増幅するための２つのオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
取扱説明書をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は２０１３年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／８５７，９７５号に基づく優先権を主張し、前記仮特許出願の内容はその全体が参照によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおいて、早産または早期産は在胎齢３７週間未満での出生を指す。世界的に早産は乳児死亡の主な原因の１つである。また、早期に出生した乳児は、短期間および長期間の両方において、能力障害ならびに成長および精神発達における障害を含む様々な合併症を患う可能性が高い。早期に産まれた乳児の生存率および後の発育を向上させるために相当な進展があったが、早産の正確な原因は未だ十分に理解されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
早産の罹患率および影響を考慮して、時宜を得た予防措置をとることで早産の見込みが減少または排除され得るように、妊婦における早産のリスク増加をより正確に検出するための新たな方法が求められている。本発明はこのニーズを満たし、他の関連するニーズも満たす。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、ｍＲＮＡレベルにおいて見られる、妊婦の血液細胞内のある特定のマーカー遺伝子の転写が、早産の可能性と相関して増加または抑制され得ることを発見した。従って、第一の態様において、本発明は、乳児を未熟に出産する妊婦のリスクを判定するための方法を提供する。前記方法は、（ａ）妊婦から採取された血液試料中の、表２に列挙される遺伝子のうちの１つまたはＣＤ１６ＡもしくはＣＤ６２Ｌでもよい、マーカーのｍＲＮＡレベルを測定する工程；および（ｂ）工程（ａ）で得られたｍＲＮＡレベルを標準対照と比較する工程、を含む。標準対照と比較して、ｍＲＮＡレベルで増加または減少が検出された場合、これは女性の早産のリスクが高いことを示す。あらゆる特定のマーカーについて、増加または減少がリスクの増加を示すかどうかは、本願で提供される情報、例えば、表２に基づいて明らかとなる。例えば、マーカーがＢ３ＧＮＴ５、ＣＤ１６Ａ、またはＣＤ６２Ｌである場合、標準対照と比較した場合のｍＲＮＡレベルでの増加が女性の早産のリスクが高いことを示し、一方、マーカーがＣＬＣまたはＧＢＰ３である場合、標準対照と比較した場合のｍＲＮＡレベルの減少が女性の早産のリスクが高いことを示す。全血および血清または血漿または単離血液細胞等の種々の血液画分を本方法に使用することができる。
【０００５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡレベルは段階（ｂ）の前に同一試料中の参照遺伝子のｍＲＮＡレベルに対して正規化される。例えば、マーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルは、参照遺伝子のｍＲＮＡレベルに対する割合として表され得る。参照遺伝子の一例はＧＡＰＤＨである。ある場合には、２つ以上のマーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルが測定され、それら各々の標準対照と比較されて、早産のリスクが判定される。
【０００６】
いくつかの実施形態では、段階（ａ）は、質量分析またはマイクロアレイ、蛍光プローブ、もしくは分子ビーコンへのハイブリダイゼーションを含む。いくつかの実施形態では、段階（ａ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特に逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＴ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）等の増幅反応を含む。いくつかの実施形態では、段階（ａ）は、検出可能な部分を含むポリヌクレオチドプローブを利用するポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを含む。例えば、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイは、サザンブロット解析、ノーザンブロット解析、またはインサイツハイブリダイゼーションアッセイであり得る。
【０００７】
ある実施形態では、妊婦が早産のリスクが高いと示された場合、前記方法は、早産のリスクを減少または排除するための治療工程をさらに含み得る。
【０００８】
第二の態様において、本発明は、妊婦における早産のリスクを判定するためのキットを提供する。前記キットは、以下の成分を含む：（１）マーカー遺伝子ｍＲＮＡの平均レベルを提供する標準対照；および（２）マーカー遺伝子ｍＲＮＡを特異的且つ定量的に同定する試薬。マーカー遺伝子は、表２中の遺伝子、ＣＤ１６Ａ、およびＣＤ６２Ｌからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、前記試薬は、マーカー遺伝子ｍＲＮＡとハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブである。ポリヌクレオチドプローブは所望により検出可能な部分を含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、増幅反応において、マーカー遺伝子ｃＤＮＡの少なくとも１つのセグメントまたは前記マーカー遺伝子ｃＤＮＡの相補鎖の少なくとも１つのセグメントを特異的に増幅するための２つのオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む。しばしば、前記キットは取扱説明書をさらに含有する。
【０００９】
第三の態様において、本発明は、早産のリスクを減少させる、または早産を防止するための方法を提供する。前記方法は、女性に、有効量の、（１）表２中のマーカー遺伝子に対する、もしくはＣＤ１６ＡもしくはＣＤ６２Ｌに対するアンチセンスポリヌクレオチド配列もしくはｓｉＲＮＡ；または（２）表２中のマーカー遺伝子のｃＤＮＡ配列を含み、マーカー遺伝子の転写をする発現カセットを投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、前記発現カセットは、前記マーカーｃＤＮＡ配列に動作可能にに連結したプロモーターを含む。（１）または（２）の選択は、特定のマーカーＲＮＡの、早産に関連した増加が認められるかどうかに基づく。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】在胎３４週より早い出産に帰結した症状を有する女性（試験群）および在胎３７週以降の出産に帰結した女性（対照群）の血液中のＢ３ＧＮＴ５のｍＲＮＡの濃度の箱ひげ図。箱は下端が２５パーセンタイル、上端が７５パーセンタイルを示す。箱の中の線は中央値として示される。ひげは下端が１０パーセンタイル、上端が９０パーセンタイルを示す。ひげの下側および上側の点は各個のドットとして示される。
【図２】症状を有する女性の在胎３４週より早い出生を予測するためのＢ３ＧＮＴ５のｍＲＮＡの受診者動作特性曲線。
【図３】在胎３４週より早い出産に帰結した症状を有する女性（試験群）および在胎３７週以降の出産に帰結した女性（対照群）の血液中のＣＬＣのｍＲＮＡの濃度の箱ひげ図。箱は下端が２５パーセンタイル、上端が７５パーセンタイルを示す。箱の中の線は中央値として示される。ひげは下端が１０パーセンタイル、上端が９０パーセンタイルを示す。ひげの下側および上側の点は各個のドットとして示される。
【図４】症状を有する女性の在胎３４週より早い出生を予測するためのＣＬＣのｍＲＮＡの受診者動作特性曲線。
【図５】在胎３４週より早い出産に帰結した症状を有する女性（試験群）および在胎３７週以降の出産に帰結した女性（対照群）の血液中のＧＢＰ３のｍＲＮＡの濃度の箱ひげ図。箱は下端が２５パーセンタイル、上端が７５パーセンタイルを示す。箱の中の線は中央値として示される。ひげは下端が１０パーセンタイル、上端が９０パーセンタイルを示す。ひげの下側および上側の点は各個のドットとして示される。
【図６】症状を有する女性の在胎３４週より早い出生を予測するためのＧＢＰ３のｍＲＮＡの受診者動作特性曲線。
【図７】在胎３４週より早い出産に帰結した症状を有する女性（試験群）および在胎３７週以降の出産に帰結した女性（対照群）の血液中のＣＤ１６ＡのｍＲＮＡの濃度の箱ひげ図。箱は下端が２５パーセンタイル、上端が７５パーセンタイルを示す。箱の中の線は中央値として示される。ひげは下端が１０パーセンタイル、上端が９０パーセンタイルを示す。ひげの下側および上側の点は各個のドットとして示される。
【図８】症状を有する女性の在胎３４週より早い出生を予測するためのＣＤ１６ＡのｍＲＮＡの受診者動作特性曲線。
【図９】在胎３４週より早い出産に帰結した症状を有する女性（試験群）および在胎３７週以降の出産に帰結した女性（対照群）の血液中のＣＤ６２ＬのｍＲＮＡの濃度の箱ひげ図。箱は下端が２５パーセンタイル、上端が７５パーセンタイルを示す。箱の中の線は中央値として示される。ひげは下端が１０パーセンタイル、上端が９０パーセンタイルを示す。ひげの下側および上側の点は各個のドットとして示される。
【図１０】症状を有する女性の在胎３４週より早い出生を予測するためのＣＤ６２ＬのｍＲＮＡの受診者動作特性曲線。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本開示において、用語「未熟産（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｂｉｒｔｈ）」および「早産（ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ）」は同じ意味を有し、３７週未満の在胎齢における、例えば、３４週以下の在胎齢におけるヒト乳児の出生を指す。
【００１２】
本開示において、用語「または」は、通常、文脈による明確な指示がない限り、「および／または」を含むその意味において使用される。
【００１３】
用語「血液」は、本明細書で使用される場合、試験中の対象から得られた血液の試料または標本を指す。前記用語は全血またはあらゆる血液画分を包含し、前記血液画分は、血液細胞を含有していてもよく、あるいは実質的に無細胞（血漿または血清等）であってもよい。
【００１４】
本開示において、用語「単離」核酸分子は、前記単離核酸分子と通常結合している他の核酸分子から分離された核酸分子を意味する。従って、「単離」核酸分子には、限定はされないが、前記単離核酸が由来する生物のゲノム内の核酸の一端または両端と天然において隣接しているヌクレオチド配列を含有しない核酸分子（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素消化によって生成されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）が含まれる。このような単離核酸分子は通常、操作の便宜上または融合核酸分子を作製するために、ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）内に導入される。さらに、単離核酸分子には、組換え核酸分子または合成核酸分子等の、操作された核酸分子が含まれ得る。制限酵素で消化されたゲノムＤＮＡを含有する、例えば、核酸ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）またはゲル（例えば、アガロース、またはポリアクリルアミン）中の、数百〜数百万の他の核酸分子中に存在する核酸分子は、「単離」核酸ではない。
【００１５】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖形態または二本鎖形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびその重合体を指す。特に限定されない限り、前記用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、自然発生的なヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸も包含する。特に記載がない限り、特定の核酸配列は、保存的に改変されたそのバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、および相補的配列、ならびに明示された前記配列も暗に包含する。特に、縮重コドン置換は、一つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第三位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基と置換された配列を作製することにより、達成され得る（Batzer et l., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka etal., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);およびRossolini etal., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子にコードされるｍＲＮＡと同義的に使用される。
【００１６】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを説明するために使用され；遺伝子は、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の制御に関与するコード領域（リーダーおよびトレーラー）、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）の前後の領域を含む。本願で使用される場合、遺伝子は、その名称（例えば、表２に列挙されるあらゆる名称、ならびにＣＤ１６ＡおよびＣＤ６２Ｌ）によって明確に同定されている場合、その遺伝子のあらゆる自然発生的なバリアントまたは変異体も包含する。例えば、ヒトＢ３ＧＮＴ５遺伝子のｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２０４７に記載される。本願の意味の範囲内の「Ｂ３ＧＮＴ５遺伝子」には、ＮＭ＿０３２０４７のｃＤＮＡ配列に対し少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれより高い配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を有するバリアントが含まれる。表２に提供される遺伝子を含む他の遺伝子に対する配列同一性パーセントも同様に表される。ＣＤ１６ＡのＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号は、ＮＭ＿０００５６９、ＮＭ＿００１１２７５９２、ＮＭ＿００１１２７５９３、ＮＭ＿００１１２７５９５、またはＮＭ＿００１１２７５９６であり、ＣＤ６２ＬのＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号は、ＮＭ＿０００６５５またはＮＲ＿０２９４６７である。
【００１７】
本願において、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用されてアミノ酸残基の重合体を指す。前記用語は、一つまたは複数のアミノ酸残基が対応する自然発生的なアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸重合体、ならびに自然発生的なアミノ酸重合体および非自然発生的なアミノ酸重合体に適用される。本明細書で使用される場合、前記用語は、アミノ酸残基がペプチド共有結合により連結している、完全長タンパク質（すなわち、抗原）を含むあらゆる長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００１８】
用語「アミノ酸」は、自然発生的なアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに自然発生的なアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣剤を指す。自然発生的なアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。本願の目的において、アミノ酸類似体は、自然発生的なアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合した炭素、を有する化合物を指す。このような類似体は修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有するが、自然発生的なアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。本願の目的において、アミノ酸模倣剤は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、自然発生的なアミノ酸と同様の様式で機能する、化学物質を指す。
【００１９】
アミノ酸は、ＷＯ０１／１２６５４に開示されるような、非自然発生的なＤ−鏡像異性を有するアミノ酸を含む場合があり、前記Ｄ−鏡像異性は、このようなＤ−アミノ酸のうちの一つまたは複数を含むポリペプチドの安定性（例えば、半減期）、生物学的利用能、および他の特徴を向上させ得る。いくつかの場合、一つまたは複数の、潜在的には全ての、治療的ポリペプチドのアミノ酸は、Ｄ−鏡像異性を有する。
【００２０】
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会の推奨する、一般的に知られる三文字記号または一文字記号で言及され得る。ヌクレオチドも、同様に、それらの一般的に認められた一文字コードで言及され得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、２つ以上のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を記述する文脈における、用語「同一の」または「同一性」パーセントは、以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、または手動のアラインメントおよび目視検査によって測定される、比較ウィンドウまたは指定領域に渡って最大一致となるように比較および整列された場合に、２つ以上の配列またはサブ配列が、同一であること、または、同一である特定の割合のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有すること（例えば、本発明の方法で使用されるバリアントＢ３ＧＮＴ５遺伝子は、参照配列、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３２０４７に記載される野生型ヒトＢ３ＧＮＴ５  ｃＤＮＡに対して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは８５％、９０％、９１％、９２％、９３、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する）を指す。このような配列は以後、「実質的に同一」であると称される。ポリヌクレオチド配列に関して、この定義は試験配列の相補体にも参照される。同一性は、少なくとも約５０のアミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域に渡って、またはより好ましくは７５〜１００のアミノ酸長もしくはヌクレオチド長の領域に渡って存在することが好ましい。
【００２２】
配列比較においては、通常、１つの配列が参照配列として機能し、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列がコンピュータに入力され、サブ配列座標が指定され、必要であれば、順序アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。デフォルトプログラムパラメータを用いてもよく、または代わりのパラメータを指定してもよい。次に、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが算出される。核酸およびタンパク質の配列比較において、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムならびに以下に論じられるデフォルトパラメータが使用される。
【００２３】
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用される場合、２０〜６００、一般的には約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置の数のいずれか１つのセグメントに対する参照を含み、ここで配列は、２つの配列が最適にアラインメントされた後に、同数の連続位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列アラインメントの方法は当該技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似法の検索により、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューターによる実行により、または手動によるアラインメントおよび目視検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel etal., eds. 1995 supplement)を参照）により、実行され得る。
【００２４】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの例はＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul etal , (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイト、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで公的に入手可能である。前記アルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さの文字列とアラインメントされた場合に、いくつかの正値閾値スコアＴと一致する、またはそれを満たす、問い合わせ配列中の長さＷの短い文字列を同定することにより、ハイスコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、隣接文字列スコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ  ｗｏｒｄ  ｓｃｏｒｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Altschul et al、上記）と称される。これらの最初の隣接文字列ヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見する検索を開始するためのシードとして働く。次いで、この文字列ヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（一対の一致残基に対するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティスコア、常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。各方向での文字列ヒットの伸長は、以下の場合に止められる：累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Ｘまで低下する場合；累積スコアが一つもしくは複数のマイナススコア残基アラインメントの蓄積により０以下になる場合；またはどちらかの配列の末端に到達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、文字列サイズ（Ｗ）２８、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝１、Ｎ＝−２、および両鎖比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、文字列サイズ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用する（Hemkoff and Henikoff, roc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989）参照）。
【００２５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Karlin and Altschul, roc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される１つの類似性の尺度は最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較において最小合計確率が０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似するとみなされる。
【００２６】
句「特異的に結合する」は、タンパク質またはペプチドに対する特定の分子の結合関係を記述する文脈で使用される場合、異種タンパク質集団および他のバイオロジー（ｂｉｏｌｏｇｙ）中の前記タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。従って、指定の結合アッセイ条件下で、特定の結合剤（例えば、抗体）は、特定のタンパク質に対しバックグラウンドの少なくとも２倍結合し、前記試料中に存在する他のタンパク質に対して有意な量では実質的に結合しない。そのような条件下での抗体の特異的結合は、特定のタンパク質またはその類似の「姉妹」タンパク質以外のタンパク質に対するその特異性において選択される抗体を必要とし得る。種々の免疫学的検定形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の、または特定の形態の抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが通例、あるタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用される（特異的な免疫反応性を決定するために使用され得る免疫学的検定形式および条件の記述については、例えば、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988）を参照されたい）。典型的には、特異的または選択的な結合反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドの１０〜１００倍超である。一方、別のポリヌクレオチド配列と二本鎖複合体を形成するポリヌクレオチド配列を言及する文脈で使用される場合の用語「特異的に結合する」は、用語「ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法」の定義で提供される、ワトソン・クリック塩基対形成に基づく「ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション」を説明する。
【００２７】
本願で使用される場合、「増加」または「減少」は、比較対照、例えば、確立された標準対照（妊娠の正常な時間枠内で乳児を出産した妊婦の血液中に存在するマーカー遺伝子ｍＲＮＡの平均レベル等）からの量における検出可能な正または負の変化を指す。増加は、典型的には少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または５０％、または１００％の正の変化であり、対照値の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍高くなり得る。同様に、減少は、典型的には、対照値の少なくとも１０％、または少なくとも２０％、３０％、または５０％の負の変化、さらには少なくとも８０％または９０％もの高さの負の変化である。「より多い（ｍｏｒｅ）」、「より少ない（ｌｅｓｓ）」、「より高い（ｈｉｇｈｅｒ）」、および「より低い（ｌｏｗｅｒ）」等の、比較基準からの量的な変化または差異を示す他の用語は、本願において上記と同様に使用される。対照的に、用語「実質的に同一の」または「実質的に変化の無い」は、標準対照値からの量の変化がほとんどまたは全く無いことを示し、典型的には標準対照の±１０％以内、または標準対照から±５％、２％、もしくはさらにより少ない変化量以内である。
【００２８】
「ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション法」は、本明細書で使用される場合、既知配列のポリヌクレオチドプローブとの、適切なハイブリダイゼーション条件下での、ワトソン・クリック塩基対形成を形成するその能力に基づく、所定のポリヌクレオチド配列の存在および／または量を検出するための方法を指す。このようなハイブリダイゼーション法の例としては、サザンブロット、ノーザンブロット、およびインサイツハイブリダイゼーションが挙げられる。
【００２９】
「プライマー」は、本明細書で使用される場合、マーカー遺伝子（表２に列挙されるいずれか１つ、さらにはＣＤ１６ＡおよびＣＤ６２Ｌも含まれる）に対応するポリヌクレオチド配列、例えば、ヒトＢ３ＧＮＴ５遺伝子またはその部分のｃＤＮＡまたはゲノム配列に基づいてヌクレオチド配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の増幅法に使用され得るオリゴヌクレオチドを指す。通常、ポリヌクレオチド配列の増幅のためのＰＣＲプライマーの少なくとも一方は、そのポリヌクレオチド配列に対して配列特異的である。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および使用される方法を含む多くの要素に依存する。例えば、診断適用および予後診断適用においては、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは通常、少なくとも１０、または１５、または２０、または２５またはそれより多いヌクレオチドを含有するが、より少ないヌクレオチドを含有していてもより多いヌクレオチドを含有していてもよい。プライマーの適切な長さの決定に関与する要素は当業者に既に知られている。本開示において、用語「プライマー対」は、反対の鎖  標的ＤＮＡ分子に、または増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接する標的ＤＮＡの領域ににハイブリダイズするプライマーの対を意味する。本開示において、用語「プライマー部位」は、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡまたは他の核酸領域を意味する。
【００３０】
「標識」、「検出可能な標識」、または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に使用される酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えば、放射性成分をペプチド内に組み込むことにより検出可能となり得る、またはペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用され得るタンパク質が含まれる。通常、検出可能な標識が定められた結合特徴を有するプローブまたは分子（例えば、既知の結合特異性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチド）に結合されることで、前記プローブ（従ってその結合標的も）の存在が容易に検出可能となる。
【００３１】
「標準対照」は、本明細書で使用される場合、健康な妊婦または在胎３７週より前に子宮収縮が頻繁となり、妊娠の正常な時間枠内に乳児を出産する妊婦から採取された血液試料中に存在する、所定の含量または濃度のポリヌクレオチド配列、例えば、表２に列挙されるマーカー遺伝子ならびにＣＤ１６ＡおよびＣＤ６２Ｌのいずれか１つのｍＲＮＡを指す。標準対照値は、本発明の方法の使用のために、試験試料中に存在するマーカー遺伝子ｍＲＮＡの含量を比較するための基準として働くのに適している。標準対照として働く確立された試料は、平均的な健康な妊婦または在胎３７週より前に子宮収縮が頻繁となり、従来の定義の妊娠の正常な時間枠内に乳児を出産する妊婦の血液試料において典型的であるマーカーｍＲＮＡの平均含量を提供する。標準対照値は、試料の性質（例えば、採取後にどのように処理されたか）、別の参照遺伝子のｍＲＮＡのレベルに対してｍＲＮＡレベルが正規化されるかどうか（例えば、マーカーｍＲＮＡレベルおよび参照ｍＲＮＡの比）、ならびにそのような対照値が確立される対象の年齢、在胎齢、および民族性等の他の要素に依存して変動し得る。
【００３２】
用語「参照遺伝子」は、本明細書で使用される場合、血液試料中で容易に検出可能で且つ実質的に一定のレベルで一貫して発現されることが知られている「ハウスキーピング」遺伝子を指す。血液試料用のこのような「ハウスキーピング」遺伝子の例としては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素）、ＳＤＨＡ（コハク酸脱水素酵素）、ＨＰＲＴ１（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）、ＨＢＳ１Ｌ（ＨＢＳｌ様タンパク質）、ＡＨＳＰ（αヘモグロビン安定化タンパク質）、ＡＣＴＢ（βアクチン）、ＲＮＡ１８Ｓ５（ＲＮＡ，  １８Ｓ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ５）、ＦＣＧＲ３Ａ（Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＩｇＧ，  ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＩＩＩａ，  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＦＣＧＲ３Ｂ（Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＩｇＧ，  ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＩＩＩａ，  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、  Ｂ２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）、ＨＵＷＥ１（ＨＥＣＴ，  ＵＢＡ  ａｎｄ  ＷＷＥ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １，  Ｅ３  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｓｅ）、ＴＰＴ１（ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  １）、ＭＹＬ１２Ｂ（ｍｙｏｓｉｎ，  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  １２Ｂ，  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）、ＳＫＰ１（S期キナーゼ関連タンパク質１）および血液試料から得られる発現データの正規化に適していると特定されたあらゆる遺伝子が挙げられる（Chang et al, 201 1; Cheng et al, 2011）。複数の「ハウスキーピング遺伝子」を用いてもよい。
【００３３】
用語「平均」は、健康な妊婦、または在胎３７週より前に子宮収縮が頻繁となり、後に妊娠の正常な時間枠内に出産することが確認された妊婦を記述する文脈において使用される場合、ある特定の特徴、特に、健康な妊婦、または在胎３７週より前に子宮収縮が頻繁となり、後に妊娠の正常な時間枠内に出産することが確認された妊婦の無作為に選択された群に代表的である、女性の血液試料中に存在するある特定のマーカー遺伝子ｍＲＮＡの含量を指す。この選択された群は、これら個体の血液中のマーカーｍＲＮＡの平均含量が、妥当な正確性を伴って、健康な妊婦、または在胎３７週より前に子宮収縮が頻繁となり、妊娠の正常な時間枠内に乳児を出産する妊婦の母集団におけるマーカーｍＲＮＡの対応する含量を反映するように、充分な数の女性を含むべきである。加えて、選択された女性群は、通常、その試料が未熟産のリスクについて試験される対象の在胎齢と同様の在胎齢を有する。さらに、年齢、民族性、病歴等の他の要素も考慮され、試験対象のプロファイルと、「平均」値を確立する選択された個体群のプロファイルの間で正確に一致することが好ましい。
【００３４】
用語「含量」は、本願で使用される場合、試料中に存在する目的ポリヌクレオチド、例えば、マーカー遺伝子ｍＲＮＡの量を指す。このような量は、絶対値（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｔｅｒｍ）、すなわち、試料中のポリヌクレオチドの総量で表されてもよく、あるいは、相対値（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｔｅｒｍ）、すなわち、試料中のポリヌクレオチドの濃度、例えば、いわゆる正規化プロセスにより生じるマーカーｍＲＮＡレベルと参照ｍＲＮＡレベルとの間の比の形式で表されてもよい。
【００３５】
用語「治療する」または「治療」は、本願で使用される場合、関連状態のあらゆる症状の除去、低減、軽減、逆転、または発病もしくは再発の予防もしくは遅延をもたらす行為に対して記載される。言い換えれば、ある状態の「治療」は、前記状態に対する治療的処置および予防的処置の両方を包含する。
【００３６】
用語「有効量」は、本明細書で使用される場合、所望の効果を生むのに、例えば、在胎齢３７週もしくは３４週より前の乳児の早産のリスクを減少するために、またはこのような早産を予防するために、量的に充分である、所与の物質の含量を指す。
【００３７】
Ｉ．序論
未熟なヒト出生、特に在胎齢３７週より前、さらには３４週より前の出生は、乳児死亡率の増加および発達障害を引き起こす。現在までに、頸膣部液中の胎児フィブロネクチンおよび経膣超音波検査を用いる子宮頸部長が、在胎３７週よりも早いヒト出生を予測するための臨床的に有用なマーカーである。例えば、Ｌｏｃｋｗｏｏｄらは、子宮収縮の症状および無傷膜を有する１１７人の女性の子宮頸部液または膣液中の胎児フィブロネクチンの濃度を測定した。５０ｎｇ／ｍＬ超を閾値として用いて、Ｌｏｃｋｗｏｏｄらは、８１．７％の感度および８２．５％の特異度において、在胎３７週より前に出産した女性を予測した（Lockwood et al. 1991）。近年、複数の同様の研究に関する系統的レビューにより、この試験が７４．６％の感度および７９．５％の特異度で症状を有する女性の間で３４週より前の出生を予測し得ると評価されている（Honest et al. 2003）。
【００３８】
一方、Ｍｕｒａｋａｗａらは、３７週より前の子宮収縮の症状を有する３２人の女性において、経膣超音波検査を用いて子宮頸部長を測定した。２５ｍｍ未満を閾値として用いて、Ｍｕｒａｋａｗａらは、６３．６％の感度および８５．７％の特異度において、３７週より前に出産した女性を予測した（Murakawa et al. 1993）。近年、複数の同様の研究に関する系統的レビューにより、この試験が４６．２％の感度および９３．７％の特異度で症状を有する女性の間で３４週より前の出生を予測し得ると評価されている（Sotiriadis et al. 2010）。
【００３９】
胎児フィブロネクチンおよび子宮頸部長に加えて、２２の試験に関与する３１９の研究が、３７週より前の出生の予測におけるそれらの成績について系統的に総括されているが、いずれも優れた精度を有していない（Honest et al. 2012）。従って、利益を得る可能性が最も高い者に予防および治療介入を向けることができるように、より高い感度およびより高い特異度で３７週より前のヒト出生を予測し得る新規のマーカーが切望されている。
【００４０】
本発明者らは、妊婦の血液中に存在するいくつかの生物マーカーのｍＲＮＡが早産の可能性を示す正確なマーカーとして機能し得ることを初めて発見した。この発見は、早産のリスクを判定するための、および早産の予防的治療のための重要な手段を提供する。早産を予測するための本方法は、規則的な子宮収縮を経験していないが、（１）過去の妊娠における３７週より早い出産の既往歴；（２）子宮頸部における子宮頸部長短縮、トンネリング（ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ）もしくはスラッジ（ｓｌｕｄｇｅ）；（３）生殖器系の感染もしくは炎症の徴候；（４）分娩前出血；または（５）多胎妊娠、を有する女性を含む、在胎３７週より前の子宮収縮または前期破水（ｐｒｅｌａｂｏｒ  ｒｕｐｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）等の早産に関連することが知られている症状を有する、または有さない妊婦に適用され得る。
【００４１】
ＩＩ．一般手法
本発明の実施には分子生物学分野の常用手法が利用される。本発明で利用される一般的方法を開示している基本原文には、Sam brook and Russell, Molecuhr Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel etal, eds., 1994)が含まれる。
【００４２】
核酸について、サイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）の単位で与えられる。これらは、アガロースゲル電気泳動もしくはアクリルアミドゲル電気泳動から、配列決定された核酸から、または公開されたＤＮＡ配列から得られる推定である。タンパク質について、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数の単位で与えられる。タンパク質サイズは、ゲル電気泳動から、配列決定されたタンパク質から、由来アミノ酸配列から、または公開されたタンパク質配列から、推定される。
【００４３】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、例えば、Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)に記載される自動合成装置を用いる、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)に最初に記載された固相ホスホラミダイト三エステル法（ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｔｒｉｅｓｔｅｒ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、当該技術分野において認知されているあらゆる戦略を用いて、例えば、Pearson and Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983)に記載される未変性アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、実行される。
【００４４】
本発明で使用される目的配列、例えば、ヒトＢ３ＧＮＴ５遺伝子、ヒトＣＬＣ遺伝子、ヒトＣＤ１６Ａ遺伝子、またはヒトＣＤ６２Ｌ遺伝子のポリヌクレオチド配列、および合成オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）は、例えば、Wallace etal., Gene 16: 21-26 (1981)の二本鎖鋳型を配列決定するためのチェーンターミネーション法を用いて、検証され得る。
【００４５】
ＩＩＩ．血液試料の獲得およびマーカーｍＲＮＡの解析
本発明は、乳児を早期に出産する女性のリスクを評価する手段として、妊婦の血液中、特に血漿または血清試料中に存在するマーカー遺伝子のうちの少なくとも１つから転写されたｍＲＮＡの含量を測定することに関する。前記マーカー遺伝子には、表２で特定されるマーカー遺伝子、ならびにＣＤ１６ＡおよびＣＤ６２Ｌが含まれる。従って、本発明の実施の第一の工程は、試験される妊婦から血液試料を得て、前記試料からｍＲＮＡを抽出することである。
【００４６】
Ａ．血液試料の獲得および調製
血液試料は、本発明の方法を用いて試験するのに適した在胎齢において妊婦から得られる。適切な在胎齢は、以下で論じられる試験される障害に応じて変動し得る。女性からの血液の採取は、病院または診療所が通常従う標準プロトコルに従って行われる。末梢血の適切な量、例えば、典型的には５〜５０ｍｌが採取され、さらなる調製の前に標準手順に従って貯蔵され得る。
【００４７】
本発明による、母体血中に存在する一つまたは複数のマーカー遺伝子から転写されたｍＲＮＡの解析は、例えば、全血または血液細胞を含有する全血のあらゆる調製物を用いて実行され得る。血液細胞は血漿または血清中に存在する核酸の主な供給源である（Lui et al., 2002）ため、血漿または血清等の血液細胞を含有しない血液の調製も本発明を実施する目的に有用である。試料からの血液細胞の調製において、母体血から血漿または血清等の無細胞部分を取り除くための方法は、当業者の間で周知である。例えば、妊婦の血液を、ＥＤＴＡを含有するチューブまたはＶａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ（ベクトン・ディッキンソン社、ニュージャージー州フランクリン・レイクス）等の特殊市販製品内に入れることで血液凝固を防止することができ、次に血漿を、適切な時間の遠心分離または重力のみによる遠心沈降によって、全血の細胞画分から分離した後に取り除くことができる。遠心分離が使用される場合、適切な速度、例えば、１，５００〜３，０００×ｇで行われることが典型的であるが限定はされない。血液試料からの血漿／血清の調製において、その方法も当業者の間で周知である。例えば、ＥＤＴＡ含有チューブ内に採取された血液試料が１６，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心されて血漿が取り除かれ、１，６００×ｇ、４℃で１０分間再遠心されてあらゆる残りの血漿が取り除かれる。さらに、全血、血液細胞、血漿または血清が採取または調製された後に、ＲＮＡを保存するために添加剤を加えてもよい。これらの添加剤には、フェノールおよびグアニジニウムイソチオシアナートの単相溶液、または市販試薬、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（ライフテクノロジーズ社）、Ｔｒｉｚｏｌ  ＬＳ（ライフテクノロジーズ社）、ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ（ライフテクノロジーズ社−Ａｍｂｉｏｎ）、ＲＮＡ  Ｌａｔｅｒ  ＩＣＥ（ライフテクノロジーズ社−Ａｍｂｉｏｎ）およびＰｒｅａｎＡｌｙｔｉＸシステムと関連付けられた血液採取チューブ（キアゲン社／ベクトン・ディッキンソン社）を含んでいてもよい。特に記載がない限り、ＲＮＡを保存および／または抽出するためのこれらの市販試薬は、製造業者の推奨に従って実行される。
【００４８】
Ｂ．ＲＮＡの抽出および定量
生物試料からｍＲＮＡを抽出するための多数の方法が存在する。ｍＲＮＡ調製の一般的方法（例えば、Ｓａｍ  ｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄ．，  ２００１に記載される）は以下であり得る；種々の市販試薬またはキット、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールズバッド）、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｍＲＮＡ  Ｋｉｔ（キアゲン社、カリフォルニア州バレンシア）、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）、およびＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）Ｓｅｒｉｅｓ  ９６００（商標）（プロメガ社、ウィスコンシン州マディソン）が、試験対象から得られた生物試料からｍＲＮＡを得るために使用され得る。これらの方法の２つ以上の組合せも使用され得る。
【００４９】
全ての含有ＤＮＡがＲＮＡ調製から除去されることが必須である。従って、増幅および定量工程において、試料の注意深い取り扱い、デオキシリボヌクレアーゼによる徹底的な処理、および適切なネガティブコントロールが使用されるべきである。
【００５０】
１．ｍＲＮＡレベルのＰＣＲに基づく定量
ｍＲＮＡが試料から抽出された後、表２に確認されるマーカー遺伝子のうちの一つまたは複数から転写されたｍＲＮＡの量を定量してもよい。ｍＲＮＡレベルを決定するための好ましい方法は、増幅に基づく方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、特に、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である。
【００５１】
増幅段階に先立ち、マーカー遺伝子ｍＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を合成しなければならない。これは逆転写により達成され、逆転写は、別々の工程として、またはＲＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応の変更形態である、ホモジニアスな逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の中で、実行され得る。リボ核酸のＰＣＲ増幅に適した方法は、Romero and Rotbart in Diagnostic Molecular Biology: Principles and Applications pp.401 -406; Persing et al, eds., Mayo Foundation, Rochester, MN, 1993; Egger etal, J. Clin. Microbiol. 33: 1442-1447, 1995；および米国特許第５，０７５，２１２号に記載されている。
【００５２】
ＰＣＲの一般的方法は当該技術分野において周知であるため、本明細書には詳細に記載しない。プライマー設計におけるＰＣＲ法、プロトコル、および原理の概説については、例えば、Innis, etal, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990を参照されたい。ＰＣＲの試薬およびプロトコルは、ロシュ・モレキュラー・システムズ社（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）等の商業的供給業者からも入手可能である。
【００５３】
ＰＣＲは、最も一般的には、熱安定酵素を用いる自動プロセスとして実行される。このプロセスにおいて、反応混合物の温度は、変性範囲、プライマーアニーリング範囲、および伸長反応範囲を自動的に繰り返す。この目的に特に適した機械は市販されている。
【００５４】
標的ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅が本発明の実施において通常は使用されるが、母体血試料中のこれらのｍＲＮＡ種の増幅が、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写による増幅、および自立的配列複製または核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）およびループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）等のあらゆる既知の方法によって達成され得、それぞれが充分な増幅を提供することは、当業者によって理解される。つい最近開発された分岐ＤＮＡ技術（ｂｒａｎｃｈｅｄ−ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）も、母体血中のｍＲＮＡマーカーの量を定量的に決定するために使用され得る。臨床試料中の核酸配列の直接的定量化のための分岐ＤＮＡシグナル増幅の総括については、Nolte, Adv. Clin. Chem. 33:201-235, 1998を参照されたい。
【００５５】
２．他の定量法
マーカー遺伝子のｍＲＮＡは、当業者に周知の他の標準的な技術を用いて検出することもできる。通常、検出段階は増幅段階の後に行われるが、本発明の方法では増幅は不要である。例えば、ｍＲＮＡは、増幅段階が先行するかどうかにかかわらず、サイズ分画（例えば、ゲル電気泳動）によって同定され得る。周知の手法（例えば、上記のSambrook and Russellを参照）に従ってアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル中で試料を泳動し、エチジウムブロマイドで標識した後、標準比較と同じサイズのバンドの有無が標的ｍＲＮＡの存在を示し、次いで、その量がバンドの強度に基づいて対照と比較され得る。あるいは、マーカー遺伝子ｍＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用することで、このようなｍＲＮＡ種の存在を検出し、プローブによって与えられるシグナルの強度に基づいて、標準比較との比較で、ｍＲＮＡの量を示すことができる。
【００５６】
配列特異的プローブハイブリダイゼーションは、他の核酸種を含む特定の核酸を検出する周知の方法である。充分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記プローブは実質的に相補的な配列にのみ特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを緩和することで、様々な量の配列ミスマッチを許容することができる。
【００５７】
液相、固相、または混合相ハイブリダイゼーションアッセイなどの当該技術分野において周知のいくつかのハイブリダイゼーション型式を含むがこれに限定はされない。以下の論文により、種々のハイブリダイゼーションアッセイ型式の概要が提供されている：Singer et al, Biotechniques 4:230, 1986; Haase et al, Methods in Virology, pp. 189-226, 1984; Wilkinson, In situ Hybridization, Wilkinson ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford;およびHames and Higgins eds., Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, 1987。
【００５８】
ハイブリダイゼーション複合体は周知の手法に従って検出される。標的核酸、すなわち、ｍＲＮＡまたは増幅されたＤＮＡに特異的にハイブリダイズすることが可能な核酸プローブは、ハイブリダイズした核酸の存在を検出するのに通常使用されるいくつかの方法のうちのいずれか１つによって標識することができる。１つの一般的な検出法は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ等で標識されたプローブを用いるオートラジオグラフィーの使用である。放射性同位元素の選択は、合成のし易さ、安定性、および選択された同位元素の半減期、による研究上の選択による。他の標識には、フルオロフォア、化学発光剤、および酵素で標識された抗リガンドまたは抗体に結合する化合物（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニン）が含まれる。あるいは、プローブはフルオロフォア、化学発光剤または酵素等の標識と直接的に結合されていてもよい。標識の選択は、必要な感度、プローブとの結合のし易さ、安定性要件、および利用可能な計測手段による。
【００５９】
本発明の実施に必要なプローブおよびプライマーは、周知の手法で合成および標識することができる。プローブおよびプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168, 1984に記載される自動合成装置を用いる、Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts., 22: 1859-1862, 1981に最初に記載された固相ホスホラミダイト三エステル法に従って、化学的に合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、Pearson and Regnier, J. Chrom., 255: 137-149, 1983に記載される未変性アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換ＨＰＬＣによる。
【００６０】
ＩＶ．標準対照の確立
本発明の方法を実施するための標準対照を確立するために、常法によって決定される、「健康な」妊婦、または在胎３７週より前に子宮収縮が頻繁となり、妊娠の正常な時間枠内で出産することが後に確認される妊婦の一群が最初に選択される。これらの個体は、特定の在胎齢および類似の健康状態等の、適切なパラメータの範囲内である。所望により、これらの個体は、同様の年齢または類似の民族的バックグラウンドに応じてさらにグループ化される。
【００６１】
選択された個体の正常な出産時間は後で確認され、正常な出産時間枠より早くまたは遅く出生することが判明した選択された個体の中のいずれかが、「標準対照」としてのデータを提供するために前記群から除外される。
【００６２】
さらに、群から得られる血液試料中のマーカーｍＲＮＡの平均含量／濃度が、健康な妊婦、または在胎３７週より前に子宮収縮が頻繁となり、正常な時間枠内に出生する妊婦の母集団間の正常レベルまたは平均レベルを表すものと合理的に見なされ得るように、選択された個体群は適切な大きさでなければならない。選択された群は少なくとも１０人のヒト対象を含むことが好ましい。
【００６３】
対照値を確立する基本的な科学原理に従って、対照群におけるｍＲＮＡレベルは、試験個体のｍＲＮＡレベルを決定するのに使用される同一の方法によって決定される。例えば、マーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルが試験される女性から採取された特定の種類の試料（例えば、血漿）について決定される場合、対照も同一の種類の試料から得なければならない。参照遺伝子のｍＲＮＡレベルに対し正規化された後にマーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルが決定される（例えば、参照遺伝子ｍＲＮＡに対するマーカー遺伝子ｍＲＮＡの比によって表される）場合、標準対照も、同一の参照遺伝子ｍＲＮＡレベルに対する正規化値の形式で表さなければならない。
【００６４】
いずれかの所定のマーカーｍＲＮＡの平均値が選択された対照群の各対象で見られる個々の値に基づいて確立されると、この平均値または中央値が標準対照と見なされる。標準偏差も同プロセスの間に決定される。場合によって、年齢、性別、または民族的バックグラウンド等の異なる特徴を有する別々に定められた群について、別々の標準対照が確立され得る。
【００６５】
Ｖ．早産を予防するための治療法
表２に確認されるマーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルと早産のリスクとの間の相関を示すことにより、本発明はさらに、早産を引き起こし、満期に達するよりかなり前に乳児を出産する可能性が高い妊婦を予防的に処置するための手段を提供する。マーカーｍＲＮＡレベルの増加または減少が検出され、早産のリスク増加が判定されると、主治医は、例えば、呼吸窮迫、脳室内出血、壊死性腸炎、および動脈管開存による新生児の罹患率および死亡率を減少することが示されている出産前の副腎皮質ステロイド（Roberts and Dalziel, 2006, Cochrane Database Syst Rev(3): CD004454; Wapner et al. 2006, Am J Obstet Gynecol 195(3): 633-42）を用いて、女性を予防的に処置する選択肢を有する。また、子宮収縮抑制薬が、早過ぎる出産のリスクが高い女性において妊娠を延長させるために使用され得る。これらの薬剤の使用は４８時間の出産遅延をもたらし、これは、専門医ユニットへの移行ならびに新生児の罹患率および死亡率を減少させるための副腎皮質ステロイドの投与を可能にする（lams et al., 2008 Lancet 371(9607): 164-75）。さらに、経皮三硝酸グリセリンでの処置は、新生児の罹患率を効果的に減少させることが報告されている（Smith et al. 2007, Am J Obstet Gynecol 196(1): 37 el-8）。本明細書で使用される場合、早産の治療は、妊婦が在胎３７週より前のあらゆる時期、例えば在胎３４週より前、に出産する可能性を減少または排除することを包含する。
【００６６】
早産を治療する別の可能性は、標準対照値から逸脱することが示されたマーカー遺伝子のｍＲＮＡレベルを直接的に調節することによるものである。例えば、マーカー遺伝子が標準対照値から増加していることが分かった場合、この遺伝子のｍＲＮＡのレベルを特異的に減少させる処置が取られ得る。アンチセンスポリヌクレオチド配列およびｓｉＲＮＡがこの目的のために妊婦に投与され得る。一方、マーカー遺伝子が標準対照値から減少していることが分かった場合、この遺伝子のｍＲＮＡのレベルを特異的に増加させる処置が取られ得る。マーカー遺伝子のコード配列を含有し、前記配列の転写をする発現カセット等の単離核酸が、この目的のために妊婦に投与され得る。
【００６７】
ＶＩ．キットおよびデバイス
本発明は、妊婦における早産のリスクを判定するための、いずれかのマーカー遺伝子（表２に列挙されるマーカー遺伝子、ならびにＣＤ１６ＡおよびＣＤ６２Ｌ等）のｍＲＮＡレベルを評価するための、本明細書に記載の方法を実施するための組成物およびキットを提供する。
【００６８】
マーカー遺伝子ｍＲＮＡレベルを決定するためのアッセイを実行するためのキットは、通常、マーカー遺伝子コード配列またはその相補的配列の少なくとも１つのセグメントとの特異的なハイブリダイゼーションに有用な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含む。所望により、このオリゴヌクレオチドプローブは検出可能な部分で標識されている。場合によって、前記キットは、ＰＣＲ、特にＲＴ−ＰＣＲによるマーカー遺伝子ＤＮＡまたはｍＲＮＡの少なくとも１つのセグメントの増幅で使用され得る、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーを含み得る。場合によって、前記キットは、２つ以上のマーカー遺伝子ｍＲＮＡが試験および定量され得るように、前述のプローブおよび／またはプライマーの複数のセットを含有し得る。場合によって、前記キットは、参照遺伝子のｍＲＮＡレベルを決定するために使用され得る前述のプローブおよび／またはプライマーをさらに含有し得る。
【００６９】
しばしば、前記キットは適切な標準対照も含む。標準対照は、特定種類の血液試料中の一つまたは複数のマーカー遺伝子ｍＲＮＡの平均値を示す。場合によって、そのような標準対照は設定値の形態で提供され得る。さらに、本発明のキットは、試験試料の分析および試験対象における早産のリスクの評価において使用者を指導するための取扱説明書を提供し得る。
【００７０】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の方法段階の全てまたはいくつかを実行することが可能な、デバイスまたは一つまたは複数のこのようなデバイスを含むシステムも含み得る。例えば、場合によっては、前記デバイスまたはシステムは、早産のリスクについて試験中の妊婦から採取された血液試料、例えば、血漿試料を受け取った後に以下の工程を実行し、早産のリスクを評価する：（ａ）所望により参照遺伝子のｍＲＮＡレベルに対して正規化されてもよい、試料中のマーカー遺伝子ｍＲＮＡの含量または濃度を決定すること；（ｂ）前記含量または濃度を標準対照値と比較すること；および（ｃ）早産のリスク増加が存在するかどうかを示す結果を提供すること。他の場合では、本発明のデバイスまたはシステムは、工程（ａ）が実行され、（ａ）から得られた含量または濃度がデバイスに入力された後に、工程（ｂ）および（ｃ）のタスクを実行する。前記デバイスまたはシステムは部分的または完全に自動化されていることが好ましい。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、限定を目的としてではなく、説明のみを目的として提供される。種々の重要でないパラメータが、本質的に同じまたは同様の結果を生むために変化または変更することでことができることは、当業者に容易に理解される。
【００７２】
序論
現在、頸膣部液中の胎児フィブロネクチンおよび経膣超音波検査により決定される子宮頸部長が、在胎３７週よりも前のヒト出生を予測するための最良の利用可能なマーカーである。これらの方法はそれらの高い特異度のために使用されているが、それらの感度は並程度のものでしかない。
【００７３】
本発明者らは、母体末梢血血漿中で循環している妊娠関連ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（Tsui et al. 2004; Chim et al. 2008）およびＤＮＡメチル化マーカー（Chim et al. 2005; Chim et al. 2008; Tsui et al. 2010）を系統的に発見することに長期に亘って関心を抱いている。本発明者らは、ある特定の循環ＲＮＡ転写物が、子宮収縮を示し、結果として在胎３４週より早く出産する女性にはより頻繁に検出されるが、在胎齢が適切な（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ａｇｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）女性においては検出されないという、臨床的に興味深い発見をした（Chim et al. 2012）。無細胞性母体血漿におけるこれらの有望なデータは、本発明者らに、他の血液区画（例えば血液細胞）が、３４週よりも早い出産を予測し得るＲＮＡ転写物を含有しているかどうかを系統的に研究することを促した。
【００７４】
系統的且つ全ゲノム的なアプローチにおいてこのようなマーカーを特定するために、本発明者らは、エクソンアレイ技術を用いて３０，０００のヒト遺伝子ほぼ全ておよびそれらのバリアントのＲＮＡレベルをプロファイリングした。この技術は、本発明者らが、遺伝子レベルよりも詳細なエクソンレベルの高解像度で、血液の全体的な遺伝子発現（ＲＮＡ）プロファイル、またはトランスクリプトームを作製することを可能にした。本発明者らは、３４週より前の規則的な子宮収縮を示している女性から得られた母体血のトランスクリプトームを系統的にプロファイリングした。これらのうち、３２の遺伝子からのＲＮＡ転写物パネルが、容易に測定可能であり、３７週以後に出産をする女性と比較して、３４週よりも早い出産をする女性の血液中で差次的に発現されることが確認された。
【００７５】
在胎３４週より早いヒト出生は新生児の死亡率および罹患率により影響し易いため、３４週よりも早い出産は、本研究の大部分における結果指標として用いられた。しかし、このような実験計画および結果指標は、３７週より前、または子宮収縮出現の２〜７日以内の出産を予測するためのマーカーの発見を妨げるものではない。
【００７６】
定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、本発明者らは、特定された血中マーカーが、単独で使用した場合に、高感度且つ高特異度で３４週よりも早い出産を予測するのに用いることができたことを示した。
【００７７】
方法および結果
参加者の募集
在胎３４週より前に規則的且つ頻繁な子宮収縮（１０分毎に１回より多い）を有する妊婦を、インフォームドコンセントを得て本研究への参加を勧誘した。早期の子宮収縮の間に、各参加者から末梢血を得た。出産の予後を追跡調査した。３４週よりも早く出産したことが後に確認された女性を試験群として分類し、３７週以後に出産したことが後に確認された女性を対照群として分類した。計画早産（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ  ｐｒｅｔｅｒｍ  ｂｉｒｔｈ）、子癇前症、多胎妊娠、胎児仮死、成長制限、染色体または構造的異常を含む妊娠は除外した。
【００７８】
血液処理
早期子宮収縮を示している妊婦から、１２ｍＬの末梢血をＥＤＴＡ含有チューブ（ベクトン・ディッキンソン社）内に採取し、６時間以内に処理した。簡潔に説明すると、血液を１，６００×ｇで遠心した。血漿を取り除いた。血漿のさらなる除去のために、血液試料を５，０００×ｇで再度遠心した。０．３ｍＬの採取された血液細胞を、０．９ｍＬのＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ（インビトロジェン（Invirtogen）、ライフテクノロジーズ社）と混合し、ＲＮＡ抽出まで−８０摂氏温度で保存した。
【００７９】
エクソンアレイに基づく血液トランスクリプトームのプロファイリング
各血液試料について、ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ−血液細胞から抽出し、ＤＮａｓｅ  Ｉ（インビトロジェン社、ライフテクノロジーズ社）で処理して、ゲノムＤＮＡ混入物を除去した。胎盤組織から得られたＲＮＡ調製物の量および質を分光光度計およびＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント社）で評価した。６つの血液ＲＮＡ試料（３つは試験群から、別の３つは対照群から、表１）を、製造業者の説明書に従ってＥｘｏｎ１．０ＳＴ遺伝子発現アレイ（アフィメトリクス社）を用いて解析した。
【００８０】
エクソンアレイデータの処理
次に、プローブシグナルデータをＰａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ（バージョン６．５、パーテック社（Ｐａｒｔｅｋ  Ｉｎｃ．））を用いて解析した。様々な血液試料から得られたプローブシグナルを正規化するため、Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ  Ａｒｒａｙ（ＲＭＡ）正規化（Irizarry et al. 2003）を行った。各アレイは、重要な全ての３０，０００超のヒト遺伝子および転写変異体のＲＮＡ発現レベルを調べる、１，４００，０００を超えるプローブセットを含有する。プローブシグナルの大部分はいずれのマイクロアレイデータにおいても不変であったが、それらの数の多さは多重仮説検定を含む統計解析を妨害するため、除く必要がある。このために、本発明者らは最初に、全てのプローブに対してＴ検定（多重検定比較調整無し）を行い、９，２６４のみのプローブが試験群と対照群との間で変化していたことを発見した。
【００８１】
データマイニングおよびマーカーの系統的な同定
血液採取においての在胎齢における差異を説明するため、試験群における各試料を、適合する在胎齢（１週間以内）を有する対照群における別の試料と対にした。２群間で変化したプローブを特定するため、９，２６４のプローブに対して対応のあるｔ検定を行った。これらのうち、３，７７８のプローブが２群間で変化した（ｐ値、５．０×１０−６〜０．０４９の範囲）。多重仮説検定を調整するため、ｑ値をＦａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ法（Storey 2002）により算出し、３５００のプローブを選択した（ｑ値＜０．００７６３９）。これらのうち、１５３のプローブの中央値シグナルが２群間で２．６倍を超えて変化した（７２のプローブおよび８１のプローブが、試験群において対照群と比較して、それぞれ発現上昇および発現減少した）。
【００８２】
２群を識別し得る可能性がある、発現上昇したプローブをさらに分離するために、本発明者らは、試験群におけるシグナルの第１四分位点が対照群におけるシグナルの第３四分位点よりも２倍超高かったプローブを調べ、この基準を満たす５２のプローブを選択した。同様に、２群を識別し得る発現減少したプローブをさらに分離するために、本発明者らは、対照群におけるシグナルの第１パーセンタイルが対照群におけるシグナルの第３パーセンタイルよりも２倍超高かったプローブを調べ、この基準を満たす７２のプローブを選択した。従って、２群を識別する可能性を有する１２４のプローブ（＝５２＋７２）が特定された。
【００８３】
血液試料中で容易に検出可能であるＲＮＡ転写物をさらに絞り込むため、本発明者らは、少なくとも１つの群において１６９ユニット（＝２＾７．４ユニット）を超える発現シグナル中央値を有する複数のプローブによって示されるＲＮＡ転写物のみを選択し、４８のプローブ（１４は発現上昇したプローブ、３４は発現減少したプローブ）を特定した。これらのプローブシグナルは、３２の遺伝子（１３は発現上昇した遺伝子、１９は発現減少した遺伝子）からのＲＮＡ転写物に由来するものであった。この３２のＲＮＡ転写物パネルは、血液中で容易に検出可能であり、３４週よりも早く出産する女性を予測するのに使用することができると論証される（表２）。
【００８４】
特定された新規のマーカーのＱＲＴ−ＰＣＲ分析
エクソンアレイ技術および上記データマイニング戦略を用いて特定されたマーカー（表２）が有用であることを示すために、本発明者らは、遺伝子発現プロファイリングにおけるゴールドスタンダードであるｑＲＴ−ＰＣＲを行った。女性から採取された２０の血液ＲＮＡ試料（１０は試験群から、別の１０は対照群から、表３）を解析した。
【００８５】
表２に確認される３つのマーカーＲＮＡ転写物の濃度をｑＲＴ−ＰＣＲにより決定した。すなわち、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ：ｂｅｔａＧａｌ  ｂｅｔａ−１，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｆａｃｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ５（Ｂ３ＧＴＮ５）、Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｌｅｙｄｅｎ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｇａｌｅｃｔｉｎ（ＣＬＣ）、およびｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３（ＧＢＰ３）をコードするｍＲＮＡの濃度を測定した。前者のマーカーＲＮＡ転写物は３７週以後に出産した女性と比較して、３４週よりも早く出産した女性の血液中で発現上昇していることが示され、一方後者２つのマーカーは発現減少していることが示された。各ｑＲＴ−ＰＣＲへのＲＮＡ投入量における変動を調節するため、マーカーＲＮＡ濃度を参照ＲＮＡであるグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡに対して正規化した。
【００８６】
Ｂ３ＧＮＴ５のｑＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、フォワードプライマーは５’−ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＴ−３’であり、リバースプライマーは５’−ＧＣＣ  ＴＧＣ  ＣＧＡ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＧＡ  ＡＧ−３’であり、加水分解プローブは５’（６ＦＡＭ）−ＡＧＧ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＡＴＴ  Ｔ−３’（ＭＧＢ）であり、ここで６ＦＡＭは６−カルボキシフルオレセインレポーター色素であり、ＭＧＢは副溝結合性非蛍光消光剤であった。ＣＬＣのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、フォワードプライマーは５’−ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  Ａ−３’であり、リバースプライマーは５’−ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＣＡＴ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＡＡＣ  Ａ−３’であり、加水分解プローブは５（６ＦＡＭ）’−ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＡＧＧ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＡＣＴ−３’（ＭＧＢ）であった。ＧＢＰ３のｑＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、フォワードプライマーは５’−ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＴＡＧ  ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＴＡＧ  ＴＧ−３’であり、リバースプライマーは５’−ＴＧＣ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＧＣＡ  ＧＧＧ−３’であり、加水分解プローブは５’（６ＦＡＭ）−ＴＧＡ  ＣＣＴ  ＡＴＡ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＣＴＡ  ＴＣＡ  Ｇ−３’（ＭＧＢ）であった。ＧＡＰＤＨのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、プライマーおよびプローブ用の配列は以前に公開されたものであった（Chim et al. 2012）。
【００８７】
ＲＮＡ調製物中のあらゆる混入性ゲノムＤＮＡの影響を最小化するため、Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡを除く全てのｍＲＮＡ標的のｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、イントロンをまたぐ（ｉｎｔｒｏｎ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）ように設計した。しかし、ｍＲＮＡ配列のいくつかの制限のために、Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡのＲＴ−ｑＰＣＲアッセイは、いかなるイントロンもまたがらなかった。
【００８８】
Ｂ３ＧＮＴ５アッセイを除く全てのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて、各ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＥＺ  ｒＴｔｈ  ＲＮＡ  ＰＣＲ試薬セット（ライフテクノロジーズ社）中に供給される構成品を用いて、２５μＬの反応体積にセットアップした。各反応は、５μＬの５×ＥＺ緩衝液、および最終濃度３ｍＭのＭｎ（ＯＡｃ）２、それぞれ３００μΜのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、６００μΜのｄＵＴＰ、２．５ＵのｒＴｔｈポリメラーゼ、０．２５ＵのウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）および５μＬの、血液試料から抽出されたＲＮＡを含有した。Ｂ３ＧＮＴ５アッセイでは、各ｑＲＴ−ＰＣＲは、１２．５μＬの反応体積にセットアップされ、２．５μＬの５×ＥＺ緩衝液、および最終濃度３ｍＭのＭｎ（ＯＡｃ）２、それぞれ３００μΜのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、６００μΜのｄＵＴＰ、２．５ＵのｒＴｔｈポリメラーゼ、０．２５ＵのウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）および２．５μＬの、血液試料から抽出したＲＮＡを含有した。本研究における全てのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、フォワードプライマー、リバースプライマーおよび加水分解プローブの最終濃度はそれぞれ、３００ｎＭ、３００ｎＭおよび２００ｎＭであった。熱サイクル条件は、５０℃２分間、６０℃３０分間、９５℃５分間、その後、４５サイクルの（９４℃２０秒間および６０℃１分間）であった。
【００８９】
標的ｍＲＮＡの増幅を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ社）およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．１（ライフテクノロジーズ社）でモニターおよび解析した。それぞれのアッセイにおいて、既知の濃度の標的単位複製配列を示す、ＨＰＬＣで精製した合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド（シグマ社−Ｐｒｏｌｉｇｏ）の連続希釈物を増幅することによりキャリブレーションを行った。標的ｍＲＮＡの絶対濃度を、血液細胞中の全ＲＮＡ１ｎｇ当たりのコピー数として算出した。それぞれの血液ＲＮＡ試料において、マーカーＲＮＡ（すなわち、Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡ、ＣＬＣ  ｍＲＮＡ、およびＧＢＰ３  ｍＲＮＡ）の絶対濃度を、参照ＲＮＡ（すなわち、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ）の絶対濃度で除算することにより、正規化したマーカーＲＮＡ濃度を算出した。この正規化したマーカーＲＮＡ濃度に単位は存在しない。
【００９０】
表２に列挙されないＲＮＡ転写物のＱＲＴ−ＰＣＲ分析
本研究で特定されたマーカーＲＮＡ転写物（表２）の予測性能を比較および対比するために、表２に列挙されていない２つのＲＮＡ転写物、すなわちＦｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＩｇＧ，  ｌｏｗ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｉｌｉａ，  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＦＣＧＲ３Ａ、異名：ＣＤ１６Ａ）およびｓｅｌｅｃｔｉｎ  Ｌ（ＳＥＬＬ、異名：ＣＤ６２Ｌ）をコードするＲＮＡ転写物を並行して解析した。これら２つのＲＮＡ転写物は、血液細胞において高発現であり、他のヒト細胞では低発現しかないことが示されている（Su et al. 2004）。女性から採取された２０の血液ＲＮＡ試料（１０は試験群から、別の１０は対照群から、表３）を解析した。
【００９１】
ＣＤ１６ＡのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、フォワードプライマーは５’−ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＴＣ−３’であり、リバースプライマーは５’−ＧＡＡ  ＴＡＧ  ＧＧＴ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＣＣＴ  ＴＧＡ  ＡＣＡ−３’であり、加水分解プローブは５’（６ＦＡＭ）−ＴＴＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＣＣＴ−３’（ＭＧＢ）であった。ＣＤ６２ＬのｑＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、フォワードプライマーは５’−ＴＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＣＣＣ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  Ｔ−３’であり、リバースプライマーは５’−ＧＧＴ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＡＧＣ  ＣＡＡ  ＣＴＧ−３’であり、加水分解プローブは５’（６ＦＡＭ）−ＣＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＣＴＣ  ＴＴ−３’（ＭＧＢ）であった。反応条件および熱プロファイルは上記の他のｑＲＴ−ＰＣＲアッセイと同じであった。それぞれの血液ＲＮＡ試料について、ＣＤ１６Ａ  ｍＲＮＡおよびＣＤ６２Ｌ  ｍＲＮＡの正規化濃度を上記と同様に算出した。
【００９２】
本研究の最終候補に残った、Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡを標的とするｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られたデータ（表２）
血液試料を、規則的且つ頻繁な子宮収縮を示している２０人の女性から採取した。このうち、１０人の女性は３４週よりも早く出産し（試験群）、残りの１０人は３７週以後に出産した（対照群）。ＧＡＰＤＨに対し正規化した血中Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡ濃度の中央値（第１四分位点−第３四分位点）は、試験群および対照群それぞれにおいて１．０６（０．６４４−１．４４）および０．３６２（０．２１１−０．３９１）であった（図１）。試験群におけるこの正規化Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡ濃度中央値は、対照群におけるそれよりも２．９９倍高かった（ｐ＝０．００２、マンホイットニー順位和検定）。
【００９３】
３４週よりも早い出産を特定するためのこのマーカーの最適閾値濃度を決定するために、本発明者らは受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線をプロットした（図２、曲線下面積＝０．９１５、９５％信頼区間（ＣＩ）＝０．７８８−１．０４、ｐ＝０．００１７２）。ＧＡＰＤＨに対し正規化した血中Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡ濃度＞０．４９５を、女性を本アッセイ陽性と定義するための閾値として用いて、本発明者らは、９０．０％の感度および９０．０％の特異度で、３４週よりも早く出産する女性を特定することができた。Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡの陽性適中率および陰性適中率はそれぞれ９０．０％および９０．０％である。
【００９４】
本研究の最終候補に残った、ＣＬＣ  ｍＲＮＡを標的とするｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られたデータ（表２）
ＧＡＰＤＨに対し正規化した血中ＣＬＣ  ｍＲＮＡ濃度の中央値（第１四分位点−第３四分位点）は、試験群および対照群それぞれにおいて２．４０（１．６８−４．０３）および６．０５（４．４３−１５．６）であった（図３）。試験群におけるこの正規化ＣＬＣ  ｍＲＮＡ濃度中央値は、対照群におけるそれよりも２．５２倍低かった（ｐ＝０．０１１、マンホイットニー順位和検定）。
【００９５】
ＲＯＣ曲線をプロットした（図４、曲線下面積＝０．８４０、９５％ＣＩ＝０．６３７〜１．０４、ｐ＝０．０１０２）。ＧＡＰＤＨに対し正規化した血中ＣＬＣ  ｍＲＮＡ濃度＜４．１５０を、女性を本アッセイ陽性と定義するための閾値として用いて、本発明者らは、８０％の感度および９０％の特異度で、３４週よりも早く出産する女性を特定することができた。ＣＬＣ  ｍＲＮＡの陽性適中率および陰性適中率はそれぞれ８８．９％および８１．８％である。
【００９６】
本研究の最終候補に残った、ＧＢＰ３  ｍＲＮＡを標的とするｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られたデータ（表２）
ＧＡＰＤＨに対し正規化した血中ＧＢＰ３  ｍＲＮＡ濃度の中央値（第１四分位点−第３四分位点）は、試験群および対照群それぞれにおいて０．０５８７（０．０１３４−０．１３１）および０．４６５（０．１０７−０．８６７）であった（図５）。試験群におけるこの正規化ＧＢＰ３  ｍＲＮＡ濃度中央値は、対照群におけるそれよりも７．９２倍低かった（ｐ＝０．０１７３、マンホイットニー順位和検定）。
【００９７】
ＲＯＣ曲線をプロットした（図６、曲線下面積＝０．８２０、９５％信頼区間＝０．６２４〜１．０２、ｐ＝０．０１５６）。ＧＡＰＤＨに対し正規化した血中ＧＢＰ３  ｍＲＮＡ濃度＜０．０９１４を閾値として用いて、本発明者らは、６０％の感度および９０％の特異度で、３４週よりも早く出産する女性を特定することができた。ＧＢＰ３  ｍＲＮＡの陽性適中率および陰性適中率はそれぞれ８５．７％および６９．２％である。
【００９８】
表２に列挙されていないＣＤ１６Ａ  ｍＲＮＡを標的とするｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られたデータ
ＧＡＰＤＨに対し正規化した血中ＣＤ１６Ａ  ｍＲＮＡ濃度の中央値（第１四分位点−第３四分位点）は、試験群および対照群それぞれにおいて３６５（２６７−５４１）および３４１（３００−４２６）であった（図７）。試験群におけるこの正規化ＣＤ１６Ａ  ｍＲＮＡ濃度中央値は、対照群におけるそれと有意な差異はなかった（ｐ＝０．５７１、マンホイットニー順位和検定）。
【００９９】
ＣＤ１６Ａ  ｍＲＮＡの予測性能を可視化するため、ＲＯＣ曲線をプロットした（図８）。ＣＤＭＡ  ｍＲＮＡのＲＯＣ曲線下面積（曲線下面積＝０．５８０、９５％ＣＩ＝０．３１９〜０．８４１）と一致線（ｉｄｅｎｔｉｔｙ  ｌｉｎｅ）下面積（ｐ＝０．５４５）との間に有意差は確認されなかった。ＧＡＰＤＨに対し正規化した血中ＣＤＭＡ  ｍＲＮＡ濃度＞４３８を、女性を本試験に対し陽性と定義するための閾値として用いて、本発明者らは、３０．０％の感度および９０．０％の特異度で、３４週よりも早く出産する女性を特定することができた。ＣＤ１６Ａ  ｍＲＮＡの陽性適中率および陰性適中率はそれぞれ７５．０％および５６．３％である。
【０１００】
表２に列挙されていないＣＤ６２Ｌ  ｍＲＮＡを標的とするｑＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られたデータ
ＧＡＰＤＨに対し正規化した血中ＣＤ６２Ｌ  ｍＲＮＡ濃度の中央値（第１四分位点−第３四分位点）は、試験群および対照群それぞれにおいて６９．６（５９．７−１１２）および７６．７（７１．４−９１．７）であった（図９）。試験群におけるこの正規化ＣＤ６２Ｌ  ｍＲＮＡ濃度中央値は、対照群におけるそれと有意な差異はなかった（ｐ＝０．６７８、マンホイットニー順位和検定）。
【０１０１】
ＣＤ６２Ｌ  ｍＲＮＡの予測性能を可視化するため、そのＲＯＣ曲線をプロットした（図１０）。ＣＤ６２Ｌ  ｍＲＮＡのＲＯＣ曲線下面積（０．５６０、９５％ＣＩ＝０．２８８〜０．８３２）と一致線下面積（０．５００、ｐ＝０．６５０）との間に有意差は確認されなかった。ＧＡＰＤＨに対し正規化した血中ＣＤ６２Ｌ  ｍＲＮＡ濃度＞６２．４を、女性を本試験に対し陽性と定義するための閾値として用いて、本発明者らは、３０．０％の感度および９０．０％の特異度で、３４週よりも早く出産する女性を特定することができた。ＣＤ１６Ａ  ｍＲＮＡの陽性適中率および陰性適中率はそれぞれ７５．０％および５６．３％である。
【０１０２】
考察
本研究では、エクソンアレイ技術を用いることで、本発明者らは子宮収縮を示している妊婦の血中トランスクリプトームをエクソンレベルの解像度でプロファイリングした。子宮収縮中の血液細胞に関するゲノムワイドなＲＮＡ発現データは、論文審査のある文献で以前に公開されたことがなかった。さらに、本発明者らは初めて、在胎３４週よりも早く出産する女性と、３７週以後に出産する女性との間で、差次的に発現されたＲＮＡ転写物を系統的に比較した。さらに、ＲＮＡ発現レベルの１４０万を超えるデータ点の中から、出産の予測に有用なマーカーＲＮＡ転写物を戦略的に選択するための方法が考案された。これらの新しいデータおよび方法は、本分野の研究者が、母体末梢血の分子解析により、３０，０００を超えるヒト遺伝子の中から、早産の予測に有用な、３２のＲＮＡ転写物パネル（表２）を最終候補リストに挙げることを可能にした。
【０１０３】
本発明者らは、最終候補リストに載せられたマーカーＲＮＡ転写物、すなわちＢ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡ、ＣＬＣ  ｍＲＮＡおよびＧＢＰ３  ｍＲＮＡ（表２から）を標的とするｑＲＴ−ＰＣＲアッセイの臨床的有用性を示した。それらの濃度は、３４週よりも早く出産した女性（試験群）と３７週以後に出産した女性（対照群；マン・ホイットニー検定、Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡ、ＣＬＣ  ｍＲＮＡおよびＧＢＰ３  ｍＲＮＡそれぞれについて、ｐ値＝０．００２、０．０１１および０．０１７３）との間で有意に異なっていた。それだけでなく、３つの試験マーカーのうちの２つである、Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡ、ＣＬＣ  ｍＲＮＡ、の濃度の四分位範囲は、２群間で重複していなかった。
【０１０４】
本研究で最終候補リストに載せられた（表２からの）マーカーＲＮＡ転写物を標的とするｑＲＴ−ＰＣＲアッセイと並行して、本発明者らは、表２に列挙されていないＲＮＡ転写物を標的とするアッセイによって２つの参加者群の血中ＲＮＡ試料も解析した。対照的に、ＧＡＰＤＨに対し正規化された濃度は、２群間で有意な差は無かった（マン・ホイットニー検定、ＣＤＭＡ  ｍＲＮＡおよびＣＤ６２Ｌ  ｍＲＮＡそれぞれについて、ｐ値＝０．５７１および０．６７８）。
【０１０５】
これらの有望な結果に基づき、前記マーカーの予測性能をＲＯＣ解析を用いて調べた。本研究で開発された各マーカー（表２に列挙されるマーカー等）において、ＲＯＣ曲線下面積は、一致線（ｘ＝ｙ）下面積よりも有意に大きかったが、これは、予測に有用である可能性を示している。具体的には、Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡ、ＣＬＣ  ｍＲＮＡおよびＧＢＰ３  ｍＲＮＡの曲線下面積は、それぞれ０．９１５、０．８４０、および０．８２０であった。これは、３つのマーカーを用いて３４週よりも早い出産を正確に予測する確率が、それぞれ９１．５％、８４．０％および８２．０％であることを示す。
【０１０６】
対照的に、ＣＤＭＡ  ｍＲＮＡおよびＣＤ６２Ｌ  ｍＲＮＡのＲＯＣ曲線下面積は、それぞれ０．５８０および０．５６０であった。これらの面積は、一致線下面積である０．５００と有意な差は無かった（それぞれｐ＝０．５４５および０．６５０）。このことは、表２から開発されていないこれらのアッセイが、出産を予測する可能性を有していないことを意味している。
【０１０７】
最も重要なことであるが、上記戦略により特定された３つ中２つのマーカーが高感度且つ高特異度で出産を予測することが示された。特に、Ｂ３ＧＮＴ５  ｍＲＮＡの感度および特異度はそれぞれ９０．０％および９０．０％であり、ＣＬＣ  ｍＲＮＡの感度および特異度はそれぞれ８８．９％および８１．８％であった。これら２つの新規マーカーの性能は、経膣子宮頸部長の性能（感度および特異度がそれぞれ６３．６％および８５．７％）と比べて引けを取らず、あるいは、胎児フィブロネクチンの性能（感度および特異度がそれぞれ８１．７％および８２．５％（Lockwood et al. 1991））と少なくとも同等であった。
【０１０８】
経膣超音波検査および胎児フィブロネクチンを上回る、本研究で最終候補リストに載せられた血中マーカーの別の重要な利点は、それらが、検査を必要とする妊婦に常に許容されるわけではない婦人科内診を必要としないことである。まとめると、本発明者らは、本研究を通じて、現在のマーカーと比較してより良好または同等の性能を有する、３４週よりも早いヒト出生を予測するのに有用な、３２の末梢血ＲＮＡ転写物パネルを作製した。
【０１０９】
本願に記載される全ての特許、特許出願、およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含む他の刊行物は、全ての目的において、その全体が参照によって組み込まれる。
【０１１０】
参考文献のリスト
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【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
【表２−１】
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【０１１３】
【表２−２】
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【０１１４】
【表２−３】
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【０１１５】
【表２−４】
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【０１１６】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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