(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）試料を、少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｂ）ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｃ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を試料に加えること、および核酸増幅を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法。
【請求項２】
核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに３’および／もしくは５’末端の保護から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、ここでＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、試料中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）が内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、ここでＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＩＰＣ核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに３’および／もしくは５’末端の保護から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）においてプライマー結合に対して競合があるように、ＩＰＣ核酸分子が核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
核酸分子内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが工程（ｃ）において加えられている、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＰＣ核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが工程（ｃ）において加えられている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸プローブがＩＰＣ核酸分子に結合せず、かつさらなる核酸プローブが核酸分子に結合しない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために３’末端での改変を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
３’末端での改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
試料中のヌクレアーゼ活性を不活性化する工程を含まない、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法であって、試料が非微生物起源のポリメラーゼ活性を含有し、かつ該方法が：
（ａ）高ｐＨ条件下で試料を、非微生物起源のポリメラーゼ活性を阻害するために、５分間以内で処理すること、
（ｂ）試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｃ）ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｄ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性の作用から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を試料に加えること、および核酸増幅を含み、ここで、高ｐHが少なくとも１０である、
を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法であって、試料が、非微生物起源のポリメラーゼ活性を含有し、かつ該方法が：
（ａ）
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション、
（ｉｉ）試料中のインタクトな微生物があれば、溶解細胞物質の分離
（ｉｉｉ）試料中の分離されたインタクトな微生物があれば、高ｐＨ試薬と接触させること、および非微生物起源のポリメラーゼ活性を阻害するために５分間以内でインキュベートすること、
（ｉｖ）高ｐＨでのインキュベーションを停止するために、ｐＨ低下試薬を加えること、
（ｖ）試料中に存在する場合には、ｐＨ改変試薬からの微生物の分離、
（ｖｉ）いずれかの分離された微生物の溶解、
（ｖｉｉ）試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｖｉｉｉ）ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および
（ｉｘ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性の作用から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること
ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を試料に加えること、および核酸増幅を含み、かつここで高ｐＨは少なくとも１０である；
または
（ｂ）
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション、
（ｉｉ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離、
（ｉｉｉ）ペレットからの上清の除去、
（ｉｖ）高ｐＨ試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源のポリメラーゼ活性を阻害するために８分間以内でインキュベートすること、
（ｖ）高ｐＨでのインキュベーションを停止するために、ｐＨ低下試薬を加えること、
（ｖｉ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離、
（ｖｉ）ペレットからの上清の除去、
（ｖｉｉ）ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること、
（ｖｉｉｉ）試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｉｘ）ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および
（ｘ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性の作用から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を試料に加えること、および核酸増幅を含み、かつここで高ｐＨは少なくとも１０である
を含む、方法。
【請求項１８】
工程（ａ）（ｖｉ）および（ａ）（ｖｉｉ）またはｂ（ｖｉｉ）およびｂ（ｖｉｉｉ）が共に実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法であって、試料が非微生物起源のヌクレアーゼ活性を潜在的に含有し、かつ該方法が：
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション、
（ｉｉ）試料中のインタクトな微生物があれば、溶解細胞物質の分離および／または溶解細胞物質の不活性化、
（ｉｉｉ）分離および／または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること、
（ｉｖ）試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｖ）ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および
（ｖｉ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性の作用から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を試料に加えること、および核酸増幅を含む；
または
（ａ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離、
（ｂ）ペレットからの上清の除去、
（ｃ）ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること、
（ｄ）試料を、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｅ）ポリメラーゼ活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること、および
（ｆ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子へのポリメラーゼ活性の作用から生じる伸長した核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、伸長した核酸分子の非存在または存在を決定することが、相補鎖におけるウラシル残基を分解するためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を試料に加えること、および核酸増幅を含む、
を含む、方法。
【請求項２０】
工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）または（ｃ）および（ｄ）それぞれが共に実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）微生物に対する薬剤に対する微生物の耐性についてスクリーニングする；
（ｂ）１つ以上の微生物を死滅、または増殖を防ぐことができてもよい、候補薬剤をスクリーニングする；
（ｃ）感染、または試料中の微生物の存在に関連する疾患を検出する；または
（ｄ）試料を含有する血小板または血液試料における微生物汚染の存在を検出する
ための、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項２２】
（ａ）少なくとも１つの核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、試料中の微生物のポリメラーゼ活性のための基質として作用し、かつポリメラーゼ活性により伸長される少なくとも１つの核酸分子、および
（ｂ）核酸分子とＩＰＣの両方を含有する、核酸増幅反応におけるプライマー結合に対して競合があるように、核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、少なくとも１つの内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子
を含む、請求項１から２１のいずれかに記載の方法を実行するためのキット。
【請求項２３】
核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに３’および／もしくは５’末端の保護から選択される、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
核酸分子内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブをさらに含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
ＩＰＣ核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブをさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
核酸プローブがＩＰＣ核酸分子に結合せず、かつさらなる核酸プローブが核酸分子に結合しない、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために３’末端での改変を含む、請求項２２から２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
３’末端での改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、請求項２２から３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
ＩＰＣ核酸分子の改変が合成ヌクレオチドの組み込み、メチル化の組み込み、ならびに３’および／もしくは５’末端の保護から選択される、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、請求項３２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、試料中の微生物の非存在または存在を検出する分野に関する。当該方法は典型的には、試料中に存在する微生物酵素活性（もしあれば）を測定することに依存しており、ポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅技術を使用して実施されることができるような方法に関連してもよい。従って、本発明の方法は、未精製血液、血液培養および他の体液などの試料中の微生物病原体の非存在および存在の決定を可能にする。この発明はまた、かかる方法における使用のための試薬、および当該方法を実施することについて有用な、かかる試薬を含む試験キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞生存能力に関連する或る分子の存在およびレベルを測定することは、多くの状況において重要である。例えば、ＡＴＰのレベルを測定することは、増殖解析および毒性学の目的について、哺乳類細胞において有用である。培養アプローチは少数の細菌を検出するために使用され得るが、かかる技術は、特に少数の細菌を検出しようとする時、およびより遅く増殖する微生物を検出する時にも完了するために数日を必要とする。
【０００３】
生存能力の指標としてのアデニル酸キナーゼの検出も、提唱されている（Ｓｑｕｉｒｒｅｌｌ  ＤＪ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＭＪ，Ｌｅｓｌｉｅ  ＲＬ，Ｇｒｅｅｎ  ＪＣＤ：Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＡＴＰ  ａｎｄ  ａｄｅｎｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ：  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｇａｒ  ｐｌａｔｅ  ｃｏｕｎｔｓ。ＷＯ９６／００２６６５は、試料中のアデニル酸キナーゼの量が、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とそれを混合し、このＡＤＰからの試料により生産されたアデノシン三リン酸エステル（ＡＴＰ）の量を決定し、そして、そのように生産されたＡＴＰの量を、アデニル酸キナーゼの存在／または量と関連させ、かつ微生物および／またはそれらの細胞内物質と関連させることにより推定されることを特徴とする、試料中に存在する微生物の存在および／もしくは量、ならびに／またはそれらの細胞内物質を決定するための方法であって、ここでＡＤＰからＡＴＰへの変換がＡＤＰからＡＴＰへの最大変換を可能にするのに十分なモル濃度のマグネシウムイオンの存在下で実施される方法を記載する。
【０００４】
ＷＯ２００９／００７７１９では、リガーゼとりわけＮＡＤ依存性リガーゼは、試料中の（生存可能な）微生物の存在の有用な指標として開示されている。リガーゼは、核酸分子のライゲーションを触媒する酵素である。ライゲーション反応は、関連するリガーゼに依存して、補因子としてＡＴＰまたはＮＡＤ＋のいずれかを必要とする。この開示では、ＮＡＤ依存性リガーゼ活性の使用は、試料中の（生存可能な）微生物の存在の指標として利用される。
【０００５】
ＷＯ２０１１／１３０５８４は、試料が微生物のポリメラーゼのための基質として作用する核酸基質と接触され、インタクトな微生物由来のポリメラーゼ活性に適切な条件下でインキュベートされ、かつ生じる任意の核酸産物が定量ポリメラーゼ連鎖反応などの核酸増幅技術を使用して決定される、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼの検出に基づく、生存可能な微生物の検出のための方法を記述する。かかるアッセイは、「ＥＴＧＡアッセイ」と呼ばれており、ここでＥＴＧＡは酵素的テンプレート生成および増幅（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を意味する。粗試料中の生存可能な微生物についてのＥＴＧＡアッセイの問題は、宿主（例えばヒト）細胞および死んだ微生物から生じる、微生物以外の汚染ポリメラーゼ活性の存在である。ＥＴＧＡアッセイは、微生物ポリメラーゼ活性を宿主の微生物ポリメラーゼ活性または死んだ微生物の微生物ポリメラーゼ活性と区別できない。
【０００６】
出願人の同時係属中の出願ＷＯ２０１０／１１９２７０は、インタクトな微生物以外の酵素活性（この場合、ＤＮＡリガーゼ）を除去するための方法を記述し、これはまた、汚染核酸ポリメラーゼ活性の除去のためにも使用され得る。
【発明の概要】
【０００７】
発明の説明
しかしながら、汚染活性を除去するための、ＷＯ２０１０／１１９２７０において使用される条件は２０分間の高ｐＨ（約ｐＨ１１）でのインキュベーションを含む。有用である一方で、これらの条件は、Ｈ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の特定の臨床株などの特定の菌株に有害であると、発明者らにより見出された。
【０００８】
高ｐＨでの処理は、全ての場合において血液培養などの試料中の余分な微生物ヌクレアーゼ活性の全てを除去するわけではないこと、およびこのヌクレアーゼ活性が試験で使用される核酸基質を分解することにより、アッセイに有害な影響を及ぼし得ることがさらに見出された。核酸増幅アッセイは、増幅反応の正しい機能をモニターするための内部対照プローブを含んでもよい（例えば、ＷＯ２０１１／１３０５８４のアッセイと同様のＤＮＡポリメラーゼアッセイに適用されるＷＯ２０１３／１０３７４４を参照されたい）。しかしながら、この内部対照は核酸増幅試薬混合物の一部として加えられ、先のヌクレアーゼ活性を検出しないだろう。ＷＯ２０１１／１３０５８４において記述される方法のさらなる問題は、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）およびＣ．グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）などの酵母を検出することにおける感度の相対的な欠如である。
【０００９】
迅速な試験では、当技術分野は、それらの非存在を決定することよりもむしろ微生物の存在の検出に焦点を当ててきた。「それらの非存在を決定すること」という用語は、出願人は試料が必ずしも無菌であることを意味するわけではなく、実用上の目的について陰性であるように十分低い生物負荷を有していてもよい。例えば、血液培養は、未処理のまま放置した場合、急速に致死的となり得る状態である敗血症に関連し得る血流感染を有すると疑われる患者からしばしば取得される。陰性の結果を報告する前に少なくとも５日間、かかる検体をインキュベートすることは臨床微生物研究所にとって日常的であり、この間、患者はしばしば広域抗生物質が続けられる。典型的には最大９０％のそのような患者が陰性であり、かなり多くの患者が、彼らの状態に必要ではない抗生物質療法で５日間放置される。陰性の結果を決定するためのより早い方法（血液培養の５日間と比較して）は、不要な抗生物質療法のコストを削減することにおいて重要な価値があるだろうし、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染、抗生物質毒性のリスクを減少させ、抗菌剤耐性における増加率を低下させる観点で、健康上の利益を提供するだろう。
【００１０】
発明者らは、試料中の微生物の非存在または存在の決定を最適化する観点で既存のＥＴＧＡアッセイの一連の改良を考案し、試験した。本発明の基礎は、試料中の微生物の非存在または存在を検出するこのような方法であって：
（ａ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｂ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｃ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること
を含む、方法である。この基本的なアッセイ形式の様々な開発が本明細書に提示される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｄＮＴＰおよび基質濃度を増加させることによる微生物の改善されたＥＴＧＡ検出。それぞれのチャートは、関連する様々な微生物についてのＥＴＧＡ検出実験において、ＥＴＧＡ標的基質（ＦＡＭチャネル）の検出について得られたＣｔ値を示す。全ての場合において、陰性血液培養対照は＞３９．９Ｃｔユニットであり、陰性試薬陰性対照は＞４０Ｃｔユニットであり、かつ陽性試薬対照は＜２０Ｃｔユニットであった。
【図２】陰性対照試料と比較して、微生物溶解混合物（ＬＭ）またはＰＣＲマスターミックス（ＭＭ）中にのみ加えられたＩＰＣ  ＤＮＡで調製された血液培養試料におけるＩＰＣ分子の検出。ＬＭに加えられたＩＰＣ  ＤＮＡの量は、ＭＭに加えた時と同一のＣｔ値を提供する。データは、ＭＭに加えた時でなく、ＬＭに加えた時に陰性対照（血液無し）と比較して、陰性血液培養試料中のＩＰＣ分子の検出が完全に失われている（４０サイクルＰＣＲ反応において）ことを示す。
【図３】ＭＭの代わりにＬＭにＩＰＣを加えることによるバックグラウンドの増加。チャートにプロットされたデータは、ＦＡＭチャネル（ＥＴＧＡ基質を検出する）におけるＣｔ値  対  ＩＰＣが、ＬＭ（ダイアモンド）およびＭＭ（四角）に加えられたプロトコールを使用して、血液培養試料について得られた総生存数（ＴＶＣ）を示す。ＬＭに加えられたＩＰＣの量は、それぞれのＰＣＲ反応のＭＭより５０ｘ高いものと同等だった。ＭＭ中のＩＰＣの標準濃度を使用する場合と比較して、測定されたバックグラウンドは、ＬＭ中のＩＰＣの５０ｘ正常濃度を使用する場合よりも高かった。バックグラウンドレベルは、いかなる加えられた細菌も含有しない血液培養試料中のＭＭ（青色の破線）またはＬＭ（緑色の点線）中の、ＩＰＣを用いるＥＴＧＡ試験手順により測定された。
【図４】ＥＴＧＡ試験バックグラウンド減少および改善された試験感度。グラフは、血液培養におけるＣ．アルビカンスの希釈系列で実施されたＥＴＧＡ試験からのｑＰＣＲ反応でＦＡＭチャネルにおいて検出された蛍光を示す。ｑＰＣＲ反応は、改変されたＥＴＧＡ基質を検出できるＦＡＭ−標識化されたプローブを含有していたので、増幅は、微生物の存在を示す。図４ａは、標準基質およびＩＰＣオリゴを使用して実施された一連のＥＴＧＡ試験の結果を示す。図４ｂは、ＰＴＯ基質およびＩＰＣを使用して、全く同一の試料から得られた結果を示す。バックグラウンドは図４ｂにおいて、はるかに低いこと、および試験でより低い数の酵母細胞を検出することが可能であることに注意されたい。
【図５】ＰＴＯオリゴの使用による酵母検出の改善。グラフは、ＰＴＯオリゴを使用するＥＴＧＡ試験と比較して、標準オリゴを使用するＥＴＧＡ試験における酵母（Ｃ．アルビカンス）の検出感度を示す。
【図６】ＥＴＧＡによるあまり頑丈でない微生物の検出。チャートは、Ｈ．インフルエンザの繊細な株の検出がＥＴＧＡ試験手順により影響されることを示す。Ｓ．アウレウスおよびＨ．インフルエンザの純粋培養物（１０５ｃｆｕ）を、異なる工程で一般的な試験プロトコール（１０ｍＬ）に加えた。データは、微生物をＮａＯＨ再懸濁工程前に加えると、検出が有意に減少したことを示す。
【図７】ＮａＯＨへの暴露の制御は、Ｈ．インフルエンザの検出を改善する。グラフは、標準手順と比較して、ＥＴＧＡ試験手順において、１０５ｃｆｕ  Ｈ．インフルエンザを含有する培養試料がＮａＯＨに曝される時間の量を制御する効果を示す。１０ｍＬについての一般的なプロトコールが、血液なしのＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴブロスにおけるＨ．インフルエンザの懸濁液で実施された；ＮａＯＨにおける再懸濁および０、０．５、２．５および５分間のインキュベーション後に、１ｍＬの２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．２］を遠心分離前に加えた。
【図８】ｐＨ低下工程による１ｍｌのＥＴＧＡプロトコールの改善。Ａ）無スパイク、Ｂ）Ｈ．インフルエンザ（１０５ｃｆｕ）、Ｃ）Ｈ．インフルエンザ（１０４ｃｆｕ）、Ｄ）Ｓ．アウレウス（１０５ｃｆｕ）、Ｅ）Ｓ．アウレウス（１０４ｃｆｕ）を含有する血液培養試料は、最初の１ｍｌの手順（１ｍＬのＮａＯＨにおける再懸濁に基づく）およびｐＨ−低下工程（０．７５ｍＬのＮａＯＨ、５分のインキュベーション、０．５ｍＬの試薬Ｃにおける再懸濁）を含有する手順により試験された。より低いＣｔ値は、微生物がより強く検出されることを示す。
【図９】図９Ａ−Ｃ。  Ｅ．コリが添加された血液ブロス試料および陽性対照（Ｐｏｌ（＋））のコグニター（ｃｏｇｎｉｔｏｒ）マイナス結果。データは、（Ａ）実験２、（Ｂ）実験３および（Ｃ）実験４について、０、２および２０時間で９５℃工程の有無について解析されるコグニターマイナス試料のために示される。実験１についてのデータは、試料が０時間の時点でＱＰＣＲにより解析されたのみであるから、示されない。
【図１０】Ｅ．コリが添加された血液ブロス試料（ｎ＝４）についての、対数変換された全ｃｆｕ値に対してプロットされたＣｔ値。傾向線は、９５℃（＋）または９５℃（−）データセット内でそれぞれの時点（０時間、２時間および２０時間）についてプロットされた。陽性対照データは、ここに示されない。
【図１１】図１１Ａ−Ｂ。（Ａ）未改変のオリゴヌクレオチド溶解混合物または（Ｂ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド溶解混合物のいずれかを使用して処理された９５℃（＋）および９５℃（−）試料についての、０、２および２０時間での、Ｅ．コリが添加された血液ブロス試料および陽性対照（Ｐｏｌ＋ｖｅ）についてのＣｔ値。示されるデータは、単一の実験（ｎ＝１）からのものである。
【図１２】図１２Ａ−Ｅ。（Ａ）Ｅ．コリ、（Ｂ）Ｓ．アウレウスおよび（Ｃ）Ｃ．アルビカンスが添加された血液ブロス試料、（Ｄ）陽性対照（ＰＣ）および（Ｅ）無スパイク対照（ＮＳＣ）のコグニターマイナス結果。３つの反復実験（ｎ＝３）からのＣｔ値は、試料貯蔵持続時間に対してプロットされた。傾向線は、それぞれの試料セットについてプロットされた：ＰＴＯ９５℃（＋）；ＰＴＯ９５℃（−）；ＵＭＯ９５℃（＋）；およびＵＭＯ９５℃（−）。ほとんどのＰＴＯ  ＬＭ試料が、不十分な増幅に起因して‘Ｃｔなし’を引き起こしたので、ＵＭＯ  ＬＭデータのみがＮＳＣ試料について示される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
第一の態様によれば、本発明は、試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｂ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｃ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。
【００１３】
本発明の文脈において、核酸分子はヌクレアーゼ活性からそれを保護するために予め改変されている、つまり、それが工程（ａ）において試料と接触される前に、核酸分子はヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。
【００１４】
発明者らは、ヌクレアーゼ活性からの基質核酸分子の保護が、本発明のアッセイの状況において有益であると決定した。本明細書に示されるように、より具体的には、保護された核酸分子の、本発明の方法への組み込みは検出感度を改善する。任意の適切な手段が、ヌクレアーゼ活性から核酸分子を保護するために利用されてもよい。非限定例は、核酸分子へのメチル化の組み込み、３’および／もしくは５’末端の保護などの末端改変ならびに合成ヌクレオチドの組み込みを含む。具体的な実施形態では、合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。特定の実施形態では、合成ヌクレオチドは、核酸分子中の少なくとも１から最大で全ての、ヌクレオチドを置換する。
【００１５】
発明者らは、ＥＴＧＡアッセイ前と比較して、反応における核酸分子の濃度を増加させることは、改善された結果につながり得ることをさらに決定した。従って、さらなる態様では、本発明は、試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｂ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｃ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子が少なくとも２ｎＭであるが５０ｎＭ未満の濃度で試料に加えられることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。
【００１６】
以前には、かかるアッセイにおいて、核酸基質は１ｎＭの濃度で利用された。発明者らはこの濃度を５０ｎＭ未満まで、例えば２ｎＭ、５ｎＭ、７．５ｎＭまたは１０ｎＭに増加させることは、改善された検出感度をもたらすことを決定した。５０ｎＭで、またはそれを超えると、改善された感度は、アッセイから生じる偽陽性の増加に起因して喪失される。本明細書に記載の濃度は、典型的には、試料中に存在する場合には、微生物を溶解するために使用される溶解混合物における濃度である。従って、試料を基質核酸分子と接触させる工程（ａ）は典型的には、試料中に存在する場合には、微生物を溶解する溶解混合物中の基質の追加を伴う。溶解試薬／混合物のさらなる詳細は本明細書中に提供される。
【００１７】
発明者らは、反応における遊離のヌクレオチドの濃度を増加させることはアッセイ感度を改善するのにさらに役に立つことを、さらに別に決定した。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、５０μＭ超、例えば５５から３００μＭ、または６０から２５０μＭまたは７５から２００μＭ、とりわけ少なくとも１００μＭの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を試料に加えることを含む。いくつかの実施形態では、ｄＮＴＰは、工程（ａ）および／または工程（ｂ）のいずれかにおいて加えられてもよい。本明細書に記載の濃度は典型的には、試料中に存在する場合には、微生物を溶解するために使用される溶解混合物における濃度である。従って、試料を基質核酸分子と接触させる工程（ａ）は典型的には、試料中に存在する場合には、微生物を溶解する溶解混合物中の基質の添加を伴い、溶解混合物はｄＮＴＰを含有する。溶解試薬／混合物のさらなる詳細は本明細書中に提供される。
【００１８】
上記のように、発明者らは汚染活性を除去するためにＷＯ２０１０／１１９２７０において採用された高ｐＨ条件が有用である一方で、これらの条件は、Ｈ．インフルエンザの或る臨床株などの特定の菌株に対して有害であり得ることを発見した。従って、さらなる態様では、本発明は、試料（非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）高ｐＨ条件下で試料を、非微生物起源の核酸改変活性を阻害する（一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない）ために、８分間以内で処理すること、
（ｂ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｃ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｄ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法を提供する。
【００１９】
高ｐＨ条件の持続時間は２０分未満であり、１０、９、８、７、６または５分未満であってもよく、約５、６、７、８、９または１０分であってもよい。さらに別の実施形態では、処理は約２から１５分間、例えば約５分間実施される。「約」という用語は、プラスまたはマイナス３０秒が意味される。
【００２０】
任意の適切な試薬が、高ｐＨ条件を提供するために試料に加えられてもよい。特定の実施形態では、高ｐＨ条件は、試料をアルカリと接触させることを含む。特定の実施形態では、ＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３が使用される。具体的な実施形態では、ＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３の濃度は約５ｍＭ以上である。
【００２１】
高ｐＨ条件は典型的には、哺乳類細胞などの非微生物起源由来のＡＴＰ−依存性リガーゼおよびポリメラーゼを含む核酸改変酵素の活性を阻害するが、微生物リガーゼまたはポリメラーゼの活性を阻害しない。これは、これらの条件および／または、非微生物酵素のみが高ｐＨ条件に曝されることを確実にする方法において利用される差次的な溶解条件に対する、微生物酵素のより大きい抵抗性に起因し得る。高ｐＨは一般的には、少なくとも約１０、例えば約１０、１１、１２、１３または１４のｐＨである。低ｐＨは一般的には、約４、例えば約４、３、２または１未満か、または等しいｐＨである。「約」という用語は、示された値の両側のｐＨユニットの０．５が意味される。試料のｐＨを変えることは、当業者により容易に理解されるだろう任意の適切な手段を使用して達成されてもよい。哺乳類リガーゼは同一のｐＨ条件下で失活され得るが、ポリメラーゼおよびリガーゼなどの微生物酵素は、極端なｐＨに対して抵抗性であり得る。これは哺乳類細胞と微生物細胞の両方を含有する試料中の微生物のリガーゼの選択的な検出を可能にする。具体的な実施形態では、哺乳類細胞由来のＡＴＰ−依存性リガーゼなどの非微生物核酸改変活性の活性を阻害するが、微生物のリガーゼなどの微生物起源の核酸改変活性の活性を阻害しない条件は、試料を水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）または炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）で処理することを含む。本明細書に示されるように、かかる薬剤は、試料のｐＨを高ｐＨに増加させ、従って微生物の（真菌のおよび細菌性の）リガーゼを活性にしたままにする一方で哺乳類リガーゼ活性を不活性化するために、容易に使用され得る。適切な薬剤の、適切な濃度および容積は、当業者により適用され得る。しかしながら、特定の実施形態では、ＮａＯＨは少なくとも約５ｍＭのＮａＯＨである。いくつかの実施形態では、アルカリ濃度は１０ｍＭ未満、例えば５、６、７、８、９または１０ｍＭである。
【００２２】
さらなる実施形態では、ｐＨは、微生物核酸改変活性（ポリメラーゼおよび／またはリガーゼ活性など）ではなく、哺乳類核酸改変活性（ポリメラーゼおよび／またはＡＴＰ−依存性リガーゼ活性など）を失活させるために約１２である。具体的な実施形態では、ｐＨ条件は、少なくとも約１１、または少なくとも１１．２に増加されてもよい。この処理は試料中の微生物の溶解をもたらしてもよく、従って、試料中への核酸改変活性（例えばポリメラーゼおよび／またはリガーゼ）の放出につながり得る。これは別の細胞溶解工程を必要とせずに、微生物に由来する、試料中の核酸改変活性（例えばポリメラーゼおよび／またはリガーゼ）の検出を可能にする。これらの条件で、哺乳類リガーゼ（血液ＡＴＰ−依存性リガーゼなど）は、失活される。しかしながら、より詳細に本明細書の下記に記載されるように、典型的には、当該方法は試料中の微生物を溶解するための別の工程を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、高ｐＨ条件下での処理はｐＨを低下させるための試薬を加えることにより停止される。適切な試薬は、緩衝液および／または酸を含む。具体的な実施形態では、緩衝液はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（例えばｐＨ７．２または８）を含む。ｐＨを低下させるための他の適切な薬剤は、塩酸（ＨＣｌ）および硫酸（Ｈ２ＳＯ４）などの酸を含む。これらの（および他の）酸は、当業者により容易に理解されるであろう緩衝液に組み込まれてもよい。これらの工程は、上記で概説された方法の工程（ａ）に組み込まれてもよい。
【００２４】
具体的な実施形態では、工程（ａ）は約（プラスまたはマイナス０．５度を意味する）摂氏１５から３０度の間の温度で実施される。特定の実施形態では、工程（ａ）は、室温で実施される。本明細書に記載される方法の全体は、これらの温度で実施されてもよい。
【００２５】
これらの方法のより具体的な説明では、本発明はさらに、試料（非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｉｉ）任意に、試料中のインタクト（ｉｎｔａｃｔ）な微生物（もしあれば）からの溶解細胞物質の分離
（ｉｉｉ）試料中の（分離された）インタクトな微生物（もしあれば）を高ｐＨ試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する（一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない）ために５分間以内でインキュベートすること
（ｉｖ）高ｐＨでのインキュベーションを停止するために、ｐＨ低下試薬を加えること
（ｖ）試料中に存在する場合には、ｐＨ改変試薬からの微生物の分離
（ｖｉ）任意の分離された微生物の溶解
（ｖｉ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｖｉｉ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｖｉｉｉ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、溶解細胞物質は、インタクトな微生物から分離されていることを必要としないため、工程（ｉｉ）は任意の工程である。これは、いずれの場合においても、工程（ｉｉｉ）は溶解細胞物質において見られる核酸改変活性を阻害するために使用されるためである。
【００２７】
「溶解細胞物質」という用語は、非微生物の溶解産物が意味される。これは、細胞膜および溶解細胞の細胞内内容物を含む。
【００２８】
より具体的には、当該方法は、以下の工程を含んでもよい：
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｉｉ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
（ｉｉｉ）ペレットからの上清の除去
（ｉｖ）高ｐＨ試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する（一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない）ために８分間以内でインキュベートすること
（ｖ）高ｐＨでのインキュベーションを停止するために、ｐＨ低下試薬を加えること
（ｖｉ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
（ｖｉ）ペレットからの上清の除去
（ｖｉｉ）ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
（ｖｉｉｉ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｉｘ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｘ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること。
【００２９】
具体的な実施形態では、工程（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）それぞれ、または全方法が摂氏１５から３０度の間の温度で実施される。あるいは、工程（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）それぞれ、または全方法が、室温で実施されてもよい。
【００３０】
試料中に存在する場合には非微生物、とりわけ哺乳類細胞を溶解するが、試料中の微生物を溶解しない試薬は、任意の適切な試薬であってもよい。いくつかの実施形態では、試薬は、界面活性剤または非イオン性洗剤などの洗剤を含んでもよい。適切な例は、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、例えば５％ｗ／ｖを含む。試薬は、サポニンを例えば５％ｗ／ｖで含んでもよい。試薬は、塩化ナトリウムなどの金属ハロゲン化物塩を、例えば８．５ｇ／ｌで含んでもよい。試薬は、全ての３つの成分の混合物を含んでもよい。試料は、試料中に存在する場合には非微生物、とりわけ哺乳類細胞の溶解を確実にするが、試料中に存在する場合には微生物の非（またはわずかな）溶解を確実にするのに適切な条件下で、試薬と混合されてもよい。試料は、約５から３０分間、例えば５、１０、１５、２０、２５または３０分の期間、試薬に曝されてもよい。この工程は、任意の適切な温度、例えば摂氏１５から３０度の間でまたは室温で実施されてもよい。
【００３１】
使用される場合、試料中のインタクトな微生物（もしあれば）からの、溶解細胞物質の分離は、任意の適切な方法により実施されてもよい。それは例えば（ポリクローナル）抗体ベースアプローチなどのアフィニティー精製の一種に依存してもよい。いくつかの実施形態では、それは濾過に依存してもよい。分離は、試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離に依存してもよい。試料の遠心分離は、任意の適切な速度および任意の適切な持続時間で実施されてもよい。例えば、試料は、３０００から１００００ｇの間の速度、例えば約７０００ｇまたは７３００ｇで遠心分離されてもよい。試料は、試料中に存在する場合には非微生物、とりわけ哺乳類細胞の連続的な溶解を確実にするが試料中の微生物の非溶解またはわずかな溶解を確実にする適切な時間で遠心分離されてもよい。これは遠心分離の速度と併せて決定されてもよい。期間は、約１から３０分間、例えば１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５または３０分であってもよい。この工程は、任意の適切な温度、例えば摂氏１５から３０度の間でまたは室温で実施されてもよい。分離後、溶解細胞物質が（上清の形態で）廃棄され、非溶解細胞が保持されてもよい（例えばペレットとして）。
【００３２】
より一般的な方法に関する上記で提供された説明は、ここでは準用する。いくつかの実施形態によれば、高ｐＨ試薬はＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３を含む。いくつかの実施形態では、高ｐＨ試薬の濃度は約５ｍＭ以上である。特定の実施形態では、ｐＨ低下試薬はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などの緩衝液または酸を含む。具体的な実施形態では、緩衝液はｐＨ７．２または８緩衝液であってもよい。
【００３３】
ｐＨ改変試薬への暴露後に、試料中のいずれかの微生物は、ｐＨ改変条件から分離される。これは、試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離、続いてペレットからの上清の除去により達成されてもよい。適切な遠心分離条件は上記に記載される。
【００３４】
次に、当該方法は、核酸改変活性の検出を可能にする任意の分離された微生物の溶解を必要とする。これは溶解混合物の添加により達成されてもよい。溶解混合物は一般に本発明の方法において有用である。溶解混合物は、細胞内の核酸改変活性に悪影響を及ぼすことなく微生物の効率的な溶解を確実にするための成分の、特定の混合物を含んでもよい。成分は、ＢＳＡなどのキャリア／血清タンパク質、界面活性剤／洗剤、金属ハロゲン化物塩、緩衝液、キレート剤等から選択されてもよい。その基本的な形態では、本発明の溶解混合物は、以下の成分を含んでもよい：
１．界面活性剤／洗剤
２．アルブミン（例えばＢＳＡ）などの血清タンパク質
３．緩衝液
４．ｄＮＴＰなどのヌクレオチド
５．核酸分子（本発明のアッセイにおいて基質として作用する）。
【００３５】
適切な溶解混合物は、下記表１に記載され、かつ本発明の別の態様を形成する：
表１．溶解混合物成分
【表１】
0006768645.tif 000002
それぞれの成分の例示的な濃度が記載されているが、当業者により容易に理解されるように改変されてもよい。
【００３６】
溶解はまた、細胞の破壊を必要としてもよい。例えば、細胞は、物理的および／または酵素的手段と組み合わせて、溶解混合物を使用して破壊されてもよい。いくつかの実施形態では、物理的な破壊にはディスラプターを利用する。ディスラプターは、細胞を溶解するためにガラスビーズなどのビーズが組み込まれてもよい。適切な装置は商業的に入手可能であり、かつサイエンティフィックインダストリーズ社製のディスラプターＧｅｎｉｅを含む。いくつかの実施形態では、酵素的破壊は、リゾスタフィン、リゾチームおよび／またはリチカーゼから選択される薬剤の使用を必要としてもよい。
【００３７】
表１に示されるように、試料を試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる工程は、溶解混合物に核酸分子を加えることを含んでもよい。
【００３８】
試料はその後、核酸改変活性に適切な条件下でインキュベートされる。これは核酸改変活性についての最適温度でのインキュベーションを伴ってもよい。例えば、試料は、摂氏約１５から４０度、例えば摂氏約３７度の温度でインキュベートされてもよい。これは、任意の適切な時間、例えば５から６０分間、例えば約５、１０、１５、２０、２５または３０分間であってもよい。これに続いて、核酸改変活性は、改変された核酸分子検出工程前に失活されてもよい。これは、例えば適切な時間、摂氏９５度などの摂氏６０度を超える温度まで温度を上昇させることにより達成されてもよい。これは、１、２、３、４、５、１０、１５分またはそれ以上などの比較的に短い時間であってもよい。
【００３９】
微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することは、本明細書中で説明される任意の適切な方法により実施されてもよい。好ましい方法は、核酸増幅に基づき、かつ試料中の核酸改変活性（従って微生物）の定量化を可能にしてもよい。
【００４０】
発明者らはまた、ＥＴＧＡ法の状況における内部陽性対照（ＩＰＣ）分子の使用を研究した。とりわけ、本発明は、ＩＰＣが同一の条件に曝されるように、基質核酸分子とＩＰＣを含めることに依存してもよい。それらは、試料中の残留ヌクレアーゼ活性は、試料（特に本明細書に定義される溶解混合物）に加えられた基質に影響してもよいことを見出した。従って、ヌクレアーゼ活性由来のＩＰＣを保護することにおいて利点がある。従って、本発明はまた、（液体）試料（潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｉｉ）試料中のインタクトな微生物（もしあれば）からの、溶解細胞物質の分離および／または溶解細胞物質の不活性化
（ｉｉｉ）分離および／または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
（ｉｖ）内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
（ｖ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｖｉ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、溶解細胞物質がインタクトな微生物から分離されていることを必要としないため、工程（ｉｉ）における分離は任意の工程である。いくつかの実施形態では、溶解細胞物質において見られる核酸改変活性を不活性化する、代替的またはさらなる工程が実施される。本明細書で説明されるように、任意の適切な不活性化技術が利用されてもよい。例えば、不活性化は、溶解細胞物質における核酸改変活性および／またはヌクレアーゼ活性についてであってもよい。不活性化は、任意の適切な手段、例えば本明細書中で説明される高ｐＨ処理を使用して達成されてもよい。微生物をインタクトなままにしておくという事実は、不活性化処理からそれらを保護してもよい。
【００４２】
同様に、本発明はまた、（液体）試料（潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
（ｂ）ペレットからの上清の除去
（ｃ）ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
（ｄ）内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
（ｅ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｆ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法を提供する
【００４３】
保護されたＩＰＣは、保護された基質分子の使用の状況において特に有利である。従って、いくつかの実施形態では、（基質）核酸分子も、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。これは両方の核酸分子が保護され、同一の条件に供されることを確実にする。任意の適切な手段が、ヌクレアーゼ活性から核酸分子を保護するために利用されてもよい。非限定例は、核酸分子へのメチル化の組み込み、３’および／もしくは５’末端の保護などの末端改変ならびに合成ヌクレオチドの組み込みを含む。具体的な実施形態では、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。特定の実施形態では、合成ヌクレオチドは、少なくとも１から最大で全ての、核酸分子中のヌクレオチドを置換する。具体的な実施形態では、ＩＰＣおよび基質核酸分子は同一の方法で改変されている。これは、可能な限りヌクレアーゼ活性からの保護を提供する観点である。
【００４４】
本発明の文脈において、もし、ＩＰＣがヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されているならば、ＩＰＣはヌクレアーゼ活性からそれを保護するために予め改変されている、つまり、ＩＰＣが試料と接触される前にヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。
【００４５】
本発明はまた、試料中の潜在的な、汚染ヌクレアーゼ活性をモニターするためにＩＰＣを使用することも企図している。従って、本発明はまた、（液体）試料（潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｉｉ）試料中のインタクトな微生物（もしあれば）からの、溶解細胞物質の分離および／または溶解細胞物質の不活性化
（ｉｉｉ）分離および／または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
（ｉｖ）内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
（ｖ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｖｉ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする、
を含む、方法を提供する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、溶解細胞物質がインタクトな微生物から分離されていることを必要としないため、工程（ｉｉ）における分離は任意の工程である。いくつかの実施形態では、溶解細胞物質において見られる核酸改変活性を不活性化する、代替的またはさらなる工程が実施される。本明細書で説明されるように、任意の適切な不活性化技術が利用されてもよい。例えば、不活性化は、溶解細胞物質における核酸改変活性および／またはヌクレアーゼ活性についてであってもよい。不活性化は、任意の適切な手段、例えば本明細書中で説明される高ｐＨ処理を使用して達成されてもよい。微生物をインタクトなままにしておくという事実は、不活性化処理からそれらを保護してもよい。
【００４７】
同様に、（液体）試料（潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
（ｂ）ペレットからの上清の除去
（ｃ）ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
（ｄ）内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
（ｅ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｆ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする、
を含む、方法がさらに提供される。
【００４８】
典型的には、工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）または（ｃ）および（ｄ）は共に実施される。
【００４９】
具体的な実施形態では、本発明の方法において使用される（基質）核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定する工程は、相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を加えることを含む。
【００５０】
特定の実施形態では、部分的に二本鎖の（基質）核酸分子の第一の鎖は、合成ヌクレオチド（例えばホスホロチオエートヌクレオチド）を含み（または、からなり）、第二の（相補的な）鎖は、ウラシル残基および、任意に合成ヌクレオチド（例えばホスホロチオエートヌクレオチド）を含む（または、からなる）。好ましくは、二本鎖の領域は、第一のおよび第二の（相補的な）鎖の３’末端領域を包含する。好ましくは、二本鎖の領域は少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０または少なくとも２５ヌクレオチドであり；任意に、二本鎖の領域は５０ヌクレオチド以下である。第一の鎖は、本明細書中に記載されるインキュベーション工程の間に、非保護（または標準）のヌクレオチドを含む伸長された第一の鎖を形成するために、試料中の微生物のポリメラーゼ活性により、非保護（または標準）のｄＮＴＰを使用して伸長されてもよい。この工程は、鋳型（第一の鎖と第二の鎖の間の相補性領域の上流）として第二の鎖を使用することに依存する。インキュベーション工程後に、第二の（相補的な）鎖は、試料にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を加えることにより、合成ヌクレオチドおよび非保護ヌクレオチドを含む一本鎖分子として伸長された第一の鎖をそのままにして、分解されてもよい。第二の鎖の分解後、（基質）核酸分子の伸長された第一の鎖は、増幅工程中に検出されてもよい。発明者らは、上述される部分的に二本鎖の（基質）核酸分子の使用は、試料中の微生物の検出を改善することを見出した。
【００５１】
特定の実施形態では、プライマー結合に対して競合があるように、ＩＰＣ核酸分子は核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む（方法の工程（ｖｉ）または（ｆ）における）。
【００５２】
さらなる実施形態では、核酸分子内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが加えられる（工程（ｖｉ）または（ｆ）において）。典型的には、当該プローブは核酸分子のセンス鎖に結合する。他の実施形態では、ＩＰＣ核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが、工程（ｖｉ）または（ｆ）のそれぞれにおいて加えられる。具体的な実施形態では、核酸プローブは、ＩＰＣ核酸分子に結合せず、そしてさらなる核酸プローブは、核酸分子に結合しない。核酸プローブおよび／またはさらなる核酸プローブは標識化されていてもよい。好ましくは、それらは異なって標識化されている。
【００５３】
具体的な実施形態では、核酸分子の相補鎖は、伸長を防ぐために３’末端での改変を含む。この改変は伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含んでもよい。具体的な実施形態では、伸長不可能なヌクレオチドは、ジデオキシシチジンなどのジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）である。
【００５４】
ＩＰＣがヌクレアーゼ活性に感受性である方法において、（基質）核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていてもよい。適切な改変が本明細書中に記載され、メチル化の組み込み、３’および／または５’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択されてもよい。合成ヌクレオチドの例は、ホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。
【００５５】
基本的なアッセイ形式の様々な開発は、特に特異的かつ高感度な方法を作るために、有利に組み合わせられることができる。従って、本発明は、試料（非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｉｉ）任意に、試料中のインタクトな微生物（もしあれば）からの溶解細胞物質の分離
（ｉｉｉ）試料中の（分離された）インタクトな微生物（もしあれば）を高ｐＨ試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する（一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない）ために５分間以内でインキュベートすること
（ｉｖ）高ｐＨでのインキュベーションを停止するために、ｐＨ低下試薬を加えること
（ｖ）試料中に存在する場合には、ｐＨ改変試薬からの微生物の分離
（ｖｉ）任意の分離された微生物の溶解
（ｖｉｉ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｖｉｉｉ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｉｘ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、
を含む、方法をさらに提供する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、溶解細胞物質は、インタクトな微生物から分離されていることを必要としないため、工程（ｉｉ）は任意の工程である。これは、いずれの場合においても、工程（ｉｉｉ）は溶解細胞物質において見られる核酸改変活性を阻害するために使用されるためである。
【００５７】
同様に、本発明はさらに、試料（非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｂ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
（ｃ）ペレットからの上清の除去
（ｄ）高ｐＨ試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する（一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない）ために５分間以内でインキュベートすること
（ｅ）高ｐＨでのインキュベーションを停止するために、ｐＨ低下試薬を加えること
（ｆ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
（ｇ）ペレットからの上清の除去
（ｈ）ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
（ｉ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｊ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｋ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、
を含む、方法を提供する。
【００５８】
従って、これらの方法は、本明細書に記載される他の方法の組み合わせを表す。従って、全ての関連する実施形態はこの全体的な方法に準用する。例えば、核酸が改変されている他の実施形態に関して、改変は、メチル化の組み込み、３’および／または５’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択されてもよい。合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。
【００５９】
特定の実施形態では、核酸分子は２ｎＭ、５ｎＭ、７．５ｎＭまたは１０ｎＭなどの、少なくとも２ｎＭであり、かつ５０ｎＭ未満（例えば２ｎＭから２５ｎＭ、５ｎＭから１５ｎＭ、または７．５から１２．５ｎＭ）の濃度で試料に加えられる。核酸分子は、方法の工程（ｖｉ）または（ｈ）において使用される溶解混合物中に含まれてもよい（つまり、特定の濃度は溶解混合物中の濃度）。従って、いくつかの実施形態では、単一の工程として、工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）または（ｈ）および（ｉ）それぞれは、効率的に組み合わせられてもよい。溶解混合物は、表１により特定されているか、または本開示の他の箇所で詳述されていてもよい。
【００６０】
当該方法は同様に、５０μＭ超、好ましくは少なくとも１００μＭ、例えば５５から３００μＭ、または６０から２５０μＭ、または７５から２００μＭの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸を試料に加えることを含む。また、ｄＮＴＰは、方法の工程（ｖｉ）または（ｈ）において使用される溶解混合物中に含まれてもよい（つまり、特定の濃度は溶解混合物中の濃度）。従って、いくつかの実施形態では、単一の工程として、工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）または（ｈ）および（ｉ）それぞれは、効率的に組み合わせられてもよい。
【００６１】
上記で本明細書より詳細に記載されるように、高ｐＨ試薬は、ＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３であってもよいし、または含んでもよい。具体的な実施形態では、高ｐＨ試薬の濃度が約５ｍＭ以上である。ｐＨ低下試薬はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（例えばｐＨ７．２または８）などの緩衝液または酸を含んでもよい。具体的な実施形態では、工程（ｉｉｉ）または（ｄ）は摂氏１５から３０度の間の温度で実施されるか、または室温で実施される。いくつかの実施形態では、当該方法の、それぞれおよび／または全ての工程は、摂氏１５から３０度の間の温度でまたは室温で実施されてもよい。ＰＣＲなどの核酸増幅工程が利用される場合、それらの工程は、本明細書中に詳述され、当業者により理解される適切な温度で実施される必要があるだろう。
【００６２】
具体的な実施形態では、ヌクレアーゼ感受性ＩＰＣが利用されてもよい。従って、工程（ｖｉｉ）または（ｉ）それぞれは、内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含んでもよく、ここで、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用される。
【００６３】
あるいは、ヌクレアーゼ耐性ＩＰＣが利用されてもよい。従って、工程（ｖｉｉ）または（ｉ）それぞれは、内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含んでもよく、ここで、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。適切な改変は本明細書中に、より詳細に記載され、メチル化の組み込み、３’および／または５’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択されてもよい。合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドであってもよいし、または含んでもよい。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。もし両分子が改変されているならば、ヌクレアーゼ耐性が同等であるように、それらが、同一のまたは同様の方法で改変されていることが好ましい。これにより、ＩＰＣが、基質分子に対するヌクレアーゼ活性の影響を決定するのに最も有用な比較機能を果たすことが可能になる。
【００６４】
既に言及されたように、いくつかの実施形態では、工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）または（ｈ）および（ｉ）は共に実施される。ここで、核酸分子は、溶解混合物を形成するために溶解試薬と共に試料に加えられる。
【００６５】
必要に応じて準用される本明細書中にさらに詳細に記載されるように、改変された核酸分子の検出は、配列決定または核酸増幅を含む様々な方法により検出されてもよい。具体的な実施形態では、工程（ｉｘ）または（ｋ）それぞれは核酸増幅工程を含む。
【００６６】
任意の適切な核酸分子が利用されてもよい。いくつかの実施形態では、核酸分子はウラシル残基を組み込む。具体的な実施形態では、核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含む。かかる実施形態では、当該方法（および、とりわけそれぞれの方法の工程（ｉｘ）または（ｋ））は、相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を加えることを含んでもよい。さらなる実施形態では、核酸分子の相補鎖は、伸長を防ぐために３’末端での改変を含む。「伸長」という用語は、さらなるヌクレオチドの追加が意味される。任意の適切な改変が利用されてもよい。具体的な実施形態では、改変は、伸長不可能なヌクレオチドの組み込みであるか、または含む。任意の適切な伸長不可能なヌクレオチドが利用されてもよい。例えば、伸長不可能なヌクレオチドは、ジデオキシシチジンなどのジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）であってもよいし、または含んでもよい。
【００６７】
特定の実施形態では、改変された核酸分子の検出の工程（工程（ｉｘ）または（ｋ）における）の間に、プライマー結合に対して競合があるように、ＩＰＣ核酸分子は核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む。
【００６８】
明細書中で説明されるように、利用可能な様々な増幅技術があり、それらの多くはプローブ（加水分解性のまたはヘアピンプローブなど）に依存する。いくつかの実施形態では、方法は、とりわけ工程（ｉｘ）または（ｋ）における、プローブの使用を含む。具体的な実施形態では、方法の工程（ｉｘ）または（ｋ）において、核酸プローブが加えられる。このプローブは、核酸分子（のセンス鎖）内で標的プローブ配列に結合する。「結合する」という用語は、当業者により容易に理解されるように、当該方法に適用される条件下でのハイブリダイゼーションが意味される。いくつかの実施形態では、ＩＰＣ核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが利用され、例えば工程（ｉｘ）または（ｋ）において加えられる。具体的な実施形態では、核酸プローブはＩＰＣ核酸分子に結合せず、さらなる核酸プローブは、（基質）核酸分子に結合しない。プローブおよび核酸分子（ＩＰＣまたは基質）は、当技術分野において知られる、技術およびツール（オンラインデザインツールなど）を使用して、不要なクロス−ハイブリダイゼーションを回避するよう設計され得る。
【００６９】
核酸プローブおよび／またはさらなる核酸プローブは標識化されていてもよい。具体的な実施形態では、核酸プローブおよびさらなる核酸プローブは異なって標識化されている。例えば、それらは、最大発光の異なる波長を有する蛍光色素分子で標識化されていてもよい。標識の適切なペアは当業者により容易に選択されることができ、例えばＦＡＭおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄは、異なる標識として使用されてもよい。
【００７０】
本発明の全ての態様では、核酸改変活性は、微生物生存能力を示すために有用である任意の活性であってもよい。核酸改変活性は、微生物により提供される酵素活性である。例は、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼ活性を含む。好ましくは、核酸改変活性はポリメラーゼ活性である。ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ活性を含んでもよい。好ましくは、ポリメラーゼ活性はＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリメラーゼ活性である。リガーゼ活性は、ＡＴＰ依存性またはＮＡＤ依存性であってもよい。ホスファターゼ、キナーゼおよび／またはヌクレアーゼ活性などの、生存能力に関連する他の核酸改変活性が代わりに測定されてもよい。
【００７１】
好ましくは、基質核酸分子への核酸改変活性の作用が、伸長した核酸分子を生産する。
【００７２】
適切な基質分子は本明細書に詳細に記載される。核酸改変活性を検出するために有用な適切な基質分子が開示される場合、ＷＯ２０１１／１３０５８４、ＷＯ２０１０／１１９２７０およびＷＯ２００９／００７７１９（明細書中に組み込まれる関連する開示）もまた、参照することができる。ホスファターゼ活性の場合、開示が出典明示により明細書中に組み込まれるＷＯ２００６／１２３１５４において、適切な核酸分子が開示される。
【００７３】
本発明の、方法における使用およびキット中の包含物のための基質核酸分子は、ＮＡＤ依存性リガーゼが、検出可能な連結された（新規の）核酸分子を生産するための分子に作用できるように、配列および構造でなければならない。
【００７４】
本発明における使用のための適切な基質核酸分子は、下記実験の項でより詳細に説明される。従って、基質は、以下の分子を含んでもよい：
ＡＳ
Ｕａｇｇｃｇｕｃｇｇｕｇａｃａａａｃｇｇｃｃａｇｃｇｕｕｇｕｕｇｕｃｕｃｕ−ＤＤＣ（３’末端はジデオキシ−Ｃである）（配列番号６）
Ｓ１
Ｇｃｃｇａｔａｔｃｇｇａｃａａｃｇｇｃｃｇａａｃｔｇｇｇａａｇｇｃｇａｇａｃｔｇａｃｃｇａｃｃｇａｔａａｇｃｔａｇａａｃａｇａｇａｇａｃａａｃａａｃ（配列番号７）
【００７５】
これは、アンチセンス鎖にウラシル残基を組み込む基質核酸分子の例である。核酸分子は、部分的に二本鎖であり、相補鎖においてウラシル残基を含む。これにより、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）は伸長後に相補鎖におけるウラシル残基を分解することが可能となり、従って、伸長の非存在において（つまり、試料中の核酸改変活性の非存在において）、基質分子が非特異的に増幅されることから防ぐ。さらなる実施形態では、核酸分子の相補鎖は、伸長を防ぐために３’末端での改変を含む。「伸長」という用語は、さらなるヌクレオチドの追加が意味される。任意の適切な改変が利用されてもよい。具体的な実施形態では、改変は、伸長不可能なヌクレオチドの組み込みであるか、または含む。任意の適切な伸長不可能なヌクレオチドが利用されてもよい。例えば、伸長不可能なヌクレオチドは、配列番号６に示されるジデオキシシチジンなどのジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）であってもよいし、または含んでもよい。
【００７６】
これらの配列のバリアントが本発明において利用されてもよいことが留意される。例えば、さらなる隣接配列配列が加えられてもよい。代替のｄｄＮＴＰが利用されてもよい。バリアント配列は、配列番号６および７に記載される基質核酸分子のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有していてもよい。核酸分子は、適切な合成ヌクレオチド類似体を組み込んでもよく、または例えば、ＲＮＡもしくはＰＮＡまたはそれらの混合物をベースとするものであってもよい。例えば、ヌクレアーゼ活性から保護するため適切な改変は、本明細書中に記載される。特定の実施形態では、それらは、検出を促進するために、蛍光標識、またはＦＲＥＴペアなどを使用して標識化されてもよい。適切な検出方法は本明細書中に記載される。
【００７７】
従って、（基質）核酸分子は、（新規の検出可能な）核酸分子を生成するための核酸改変活性により作用されることができる、任意の天然の核酸ならびに天然もしくは合成の類似体を含んでもよい。具体的な実施形態では、基質は伸長され、および／または連結されてもよい。いくつかの実施形態では、核酸基質分子の組み合わせは、ポリメラーゼおよびリガーゼ活性の検出を可能にするために利用されてもよい。
【００７８】
好ましくは、核酸基質は、試料中の核酸改変活性（微生物により提供される）よりも過剰に、とりわけ大モル過剰に存在する。これは、従来の方法に対する重要な技術的な区別である。新規の、伸長された核酸分子または連結された核酸分子が検出されるので、試料中のこの分子の存在のみが、効率的に働く検出方法のために必須である。従って、もし、他の核酸分子が、検出される微生物由来または例えば試験された試料中で見出され得る哺乳類もしくは他の起源由来などの試料に存在するならば、本発明の方法に有害ではない。
【００７９】
いくつかの実施形態では、基質および／またはプライマーは、ゲノムＤＮＡの非特異的な検出を回避するために、互いに塩基対を形成できる相補的な非天然分子を組み込んでもよい。一例として、ｐｙＤＡＤおよびｐｕＡＤＡは、プライマーおよび基質分子に適切に組み込まれてもよい（Ｓｉｓｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．２：７２８−７３５）。
【００８０】
本明細書中にまた説明されるように、本発明の方法は、ＩＰＣ分子を組み込んでもよい。任意の適切なＩＰＣは、当該方法の要件に従って利用されてもよい。一例として、以下のＩＰＣが、本発明において使用されてもよい：
ｇｃｃ  ｇａｔ  ａｔｃ  ｇｇａ  ｃａａ  ｃｇｇ  ｃｃｇ  ａａｃ  ｔｇｇ  ｇａａ  ｇｇｃ  ｇａｇ  ａｔｃ  ａｇｃ  ａｇｇ  ｃｃａ  ｃａｃ  ｇｔｔ  ａａａ  ｇａｃ  ａｇａ  ｇａｇ  ａｃａ  ａｃａ  ａｃｇ  ｃｔｇ  ｇｃｃ  ｇｔｔ  ｔｇｔ  ｃａｃ  ｃｇａ  ｃｇｃ  ｃｔａ（配列番号３）
【００８１】
本発明の全ての方法において、改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することは、核酸増幅工程を含んでもよいし、本質的に核酸増幅工程からなってもよいし、または核酸増幅工程からなってもよい。これは、本発明の方法を最大の感度にするのに役に立つ。かかる増幅技術は当技術分野でよく知られており、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｃｏｍｐｔｏｎ、１９９１）、３ＳＲ（Ｆａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、ローリングサークル複製、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：７７７−７８４、１９９９、ＵＳ６２６１８４６（出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載されるＤＮＡオリゴマー自己集合法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（ＵＳ  ６４１０２７６）、選択的プライムＰＣＲ（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ）（ＷＯ  ９０／０６９９５）、コンセンサス配列プライムイＰＣＲ（ＵＳ  ４４３７９７５）、インベーダーテクノロジー（ｉｎｖａｄｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、鎖置換技術およびニック置換増幅（ＷＯ  ２００４／０６７７２６）などの方法を含む。上記のリストは網羅的なものを意図するものではない。適切な核酸産物特異的に増幅されるならば、任意の核酸増幅技術が使用されてもよい。同様に、いくつかの実施形態では、シーケンシングに基づく方法論は、様々な次世代シーケンシングプラットフォームのいずれかを含むよう、利用されてもよい。
【００８２】
増幅は、検出される改変された核酸分子の配列に特異的な増幅プライマーの使用により達成される。核酸分子について特異性を提供するために、配列の適切な領域に対応するプライマー結合部位が選択されてもよい。当業者であれば、核酸分子はまた、試料中の改変活性により生産された新規の核酸分子の検出のために必要とされるプライマー結合部位以外の配列、例えばＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含んでもよく、またはプロモーター配列が、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲおよびＴＭＡなどの等温性増幅技術のために必要とされてもよいことを認識するだろう。
【００８３】
例えばライゲーション／伸長が起こった場合のみ、増幅産物が生成されるように、１つ以上のプライマー結合部位は、基質核酸分子のライゲーション／伸長境界を架橋しても良い。あるいは、プライマーは、連結され／伸長した核酸分子が形成された場合にのみ増幅産物が生成されるように（指数関数的に）、連結／伸長境界あるいは境界にわたる直接の増幅のどちらかに結合してもよい。プライマーおよび基質核酸分子（複数）は、非特異的な増幅（例えば試料中のゲノムＤＮＡ）を回避するよう設計されてもよい。
【００８４】
本発明の方法における使用のための適切なプライマーは、下記の実験の項に記載される。それらは、配列番号４および／もしくは５を含み、本質的に配列番号４および／もしくは５からなり、または配列番号４および／もしくは５からなるプライマーを含む。これらのプライマーは、本発明の別の態様を形成する。これらの配列のバリアントは、本発明において利用されてもよいことが留意される。とりわけ、例えば、必要に応じて結合特異性を改善するために、さらなる配列特異的な隣接配列配列が加えられてもよい。バリアント配列は、実験の項に記載されるプライマーのヌクレオチド配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有してもよい。プライマーは、適切な合成ヌクレオチド類似体を組み込んでもよく、または例えば、ＲＮＡもしくはＰＮＡまたはそれらの混合物をベースとするものであってもよい。プライマーは、利用される検出様式に依存して蛍光標識および／またはＦＲＥＴペアなどで標識化されていてもよい。必要に応じてまた標識化されてもよいプローブが利用されてもよい。
【００８５】
特定の態様によれば、本発明の方法は、試料中の微生物の存在を示す基質核酸分子に対する核酸改変活性の作用の直接的結果として生産された改変された核酸分子を検出するために核酸増幅技術を使用して実施される。特定の実施形態では、使用される技術は、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲ、ＴＭＡ、ＳＤＡおよびＤＮＡオリゴマー自己集合から選択される。
【００８６】
増幅産物の検出は、例えば、ゲル電気泳動などの日常的な方法によるものであってもよいが、いくつかの実施形態では、リアルタイムまたはエンドポイント検出方法を使用して実施される。
【００８７】
増幅反応の産物のリアルタイムまたはエンドポイント検出のための多くの技術が、当技術分野で知られている。これらは、ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）などのインターカーレーティング蛍光色素の使用を含み、増幅されたＤＮＡの収率が、産生された蛍光の量に基づいて推定されることが可能となる。多くのリアルタイム検出法は、連続的にモニターされ得る蛍光の読み取り値を生成する；分子ビーコンおよび蛍光共鳴エネルギー移動プローブを含む具体的な例が挙げられる。リアルタイムおよびエンドポイント技術「単一チューブ」において反応を維持するので有利である。これは、結果を得るために下流分析を必要とせず、より迅速に得られる結果をもたらすことを意味する。さらに「単一チューブ」環境で反応を維持することは、交差汚染のリスクを減少させ、かつ本発明の方法からの定量的な出力を可能にする。これは、健康および安全性への懸念がもっとも重要であり得る場合（例えば患者試料中の潜在的な微生物感染を検出する場合など）、本発明の文脈において特に重要であってもよい。
【００８８】
ＰＣＲ反応のリアルタイムおよびエンドポイント定量化は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌを参照されたい；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｂｙ  ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ５’−３’  ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８，７２７６−７２８０（１９９１）、Ｇｅｌｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ａｓｓａｙ  ｗｉｔｈ  ｆｌｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  Ｃ−Ｅｒｂ−２  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  ４３，  ７５２−７５８  （１９９７）  ａｎｄ  Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｆｕｌｌｙ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｗｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ９，  ３４１−３４２  （１９９９５）（出典明示により本明細書に組み込まれる）を使用して達成されてもよい。この型のプローブは、一般的に加水分解性プローブと称されてもよい。リアルタイムまたはエンドポイント検出における使用のための適切な加水分解性／Ｔａｑｍａｎプローブもまた、提供される。プローブは、例えば下記に詳述される標識を使用して、適切に標識化されていてもよい。
【００８９】
分子ビーコン系では、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  −  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｈａｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ  ｕｐｏｎ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４，  ３０３−３０８  （１９９６）  ａｎｄ  Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｌｌｅｌｅ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １６，  ４９−５３  （１９９８）（出典明示により本明細書に組み込まれる。）を参照されたい、ビーコンは、その標的に結合すると蛍光が回復する内部消光蛍光色素分子を有するヘアピン型プローブである。これらのプローブは、ヘアピンプローブと称されてもよい。本発明において有用な適切なプローブは、配列番号１および２に記載される。
【００９０】
本発明の方法に組み込まれてもよいさらなるリアルタイム蛍光ベースの系は、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ系、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７，  ８０４  −  ８０７  （０１  Ａｕｇ  １９９９）を参照されたい。当業者によく知られ、かつ商業的に入手可能な、さらなるリアルタイムまたはエンドポイント検出技術は、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）テクノロジー、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｕｒ（登録商標）プライマーテクノロジー、ＤｚｙＮＡプライマー（Ｔｏｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：５，６２５−６３０（２０００））、またはＰｌｅｘｏｒＴＭ  ｑＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲ系を含む。
【００９１】
本発明のさらなる態様によれば、核酸増幅の産物は、リアルタイムまたはエンドポイント技術を使用して検出される。本発明の具体的な実施形態では、リアルタイム技術は、加水分解性プローブ（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）系）、ＦＲＥＴプローブ（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）系）、ヘアピンプライマー（Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｕｒ（登録商標）系）、ヘアピンプローブ（分子ビーコン系）、プライマーに組み込まれるヘアピンプローブ（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（登録商標）プローブ系）、ＤＮＡｚｙｍｅの相補的な配列および切断可能な蛍光ＤＮＡｚｙｍｅ基質（ＤｚＹＮＡ）を組み込むプライマー、Ｐｌｅｘｏｒ  ｑＰＣＲならびにオリゴヌクレオチドブロッキング系のいずれかひとつを使用することからなる。
【００９２】
増幅産物は、試料中の微生物の核酸改変活性、従って試料中の微生物のレベルの近似を与えるように定量されてもよい。従って、「非存在または存在」という用語は、試料中の微生物のレベルの定量化を包含するよう意図される。
【００９３】
特定の実施形態では、反応混合物は、増幅産物のリアルタイムまたはエンドポイント検出を可能にするために必要とされる試薬に任意に加える、改変された核酸分子の増幅のために必要とされる、試験中の試料、基質核酸分子、試薬、緩衝液および酵素の全てを含有するだろう。従って、核酸改変活性（目的の１つ以上の細菌細胞または微生物由来）についての検出方法全体は、定量的な出力を伴い、かついかなる中間の洗浄工程を必要とせずに、単一の反応において、起こってもよい。「単一チューブ」反応の使用は、結果を得るために下流分析を必要とせず、より迅速に得られる結果をもたらすため有利である。さらに「単一チューブ」環境で反応を維持することは、交差汚染のリスクを減少させ、かつ本発明の方法からの定量的な出力を可能にする。また、単一チューブ反応は、例えばハイスループットの状況において、自動化に、より適している。
【００９４】
あるいは、本発明の方法は、段階的な方法で実施されてもよい。第一の工程によれば、本発明の方法における使用に適切な形態で試料を調製することが第一に必要とされてもよい。例えば、本明細書中で説明されるように、選択的な細胞溶解または細胞透過性を増加させることが、必要とされてもよい。本明細書中にまた記載されるように、ポリメラーゼまたはリガーゼなどの特異的な核酸改変活性の捕捉が、望ましくてもよい。ヌクレアーゼ活性などの、他の核酸改変活性（起源）が、阻害等されてもよい。
【００９５】
増幅工程前の本発明の方法の工程は、４０℃超、５０℃超、６０℃超、７０℃超、８０℃超、９０℃超または９５℃超の温度で実施される工程を含まなくてもよい。
【００９６】
あるいは、本発明の方法は、４０℃超、５０℃超、６０℃超、７０℃超、８０℃超、９０℃超または９５℃超の温度で実施される工程を含まなくてもよい。
【００９７】
増幅工程前の本発明の方法の工程は、摂氏１０から５０度の間で、摂氏１５から４５度の間で、摂氏２０から４０度の間で、摂氏２５から４０度の間で、摂氏３０から４０度の間で、摂氏２５から３５度の間で、または摂氏１５から３０度の間の温度で実施されてもよく、任意に、増幅工程前の方法の工程が室温で施されてもよい。
【００９８】
あるいは、本発明の方法の工程は、全て、摂氏１０から５０度の間で、摂氏１５から４５度の間で、摂氏２０から４０度の間で、摂氏２５から４０度の間で、摂氏３０から４０度の間で、摂氏２５から３５度の間で、または摂氏１５から３０度の間の温度で実施されてもよく、任意に、方法の工程の全てが室温で施されてもよい。
【００９９】
本発明の方法は、試料中のヌクレアーゼ活性を不活性化する工程を含んでもよい。あるいは、本発明の方法は、試料中のヌクレアーゼ活性を不活性化する工程を含まない。もし、実施されるならば、ヌクレアーゼ活性を不活性化する工程は、インキュベーション工程後および改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定する工程（例えば増幅による）前に行われる。
【０１００】
本発明の文脈における「試料」という用語は、核酸改変活性を発現する、真菌（例えば酵母）または細菌などの微生物の存在について試験することが望ましい任意の試料を含むと定義される。従って、試料は、血液試料などの臨床試料を含んでもよいし、本質的に血液試料などの臨床試料からなってもよいし、または血液試料などの臨床試料からなってもよい。本発明の方法は、陰性の血液培養の迅速な決定に特に適用可能である。従って、試料は、血流感染に罹患していると疑われているまたは血流感染について検査されている、患者由来の血液培養試料を含んでもよい。試料は、任意の適切な容積、例えば１から１０ｍｌ、好ましくは１ｍｌの血液培養試料であってもよい。
【０１０１】
あるいは、試料は、例えばインビトロアッセイ系であってもよいし、または例えばインビトロアッセイ系を含んでもよい。試料は、以下のものを含んでもよいし、本質的に以下のものからなってもよいし、または以下のものからなってもよい：飲料もしくは食品試料またはそれらの調製物、または医薬品またはシャンプー、コンディショナー、保湿剤を含むパーソナルケア製品などの化粧品等であり、それらの全ては、日常的な問題として微生物汚染について試験される。試料は、組織もしくは細胞を含んでもよいし、本質的に組織もしくは細胞からなってもよいし、または組織もしくは細胞からなってもよく、そして、例えば痰または血液試料もしくは血小板試料を含んでもよいし、本質的に例えば痰または血液試料もしくは血小板試料からなってもよいし、または例えば痰または血液試料もしくは血小板試料からなってもよい。さらに、本発明の方法およびキットは、例えば食品が調製される場所などの表面の汚染をモニターするために使用されてもよい。汚染は、微生物の核酸改変活性の存在により示される。汚染は、いずれかの微生物起源、とりわけ細菌性のまたは真菌の（例えば酵母）汚染由来であってもよい。さらに本発明は、給水、排水、海洋環境などの環境条件をモニターすることにおいても有用である。本発明はまた、細菌または胞子含量を、病院、産業施設または生物防御の用途において評価することができる細菌増殖発酵法および空気サンプリングでモニターすることにおいても有用である。
【０１０２】
本発明の方法は、微生物の非存在または存在について試料をスクリーニングすることに加えて、様々な有用性を有する。従って、さらなる態様では、本発明は、微生物に対する薬剤に対する、微生物の耐性についてスクリーニングするための、本明細書中に記載される方法の使用を提供する。当該方法は、目的の微生物を含有する試料を薬剤に曝し、その後、微生物が耐性であるかどうかを決定するために本発明の方法を実施する工程を伴ってもよい。もし、微生物が耐性であるならば、改変された核酸分子が検出されるだろう。典型的には、かかる方法は、目的の微生物の培養された臨床分離株などの十分に特性が明らかにされた試料を使用して実施される。
【０１０３】
同様に、本発明は、１つ以上の微生物を死滅させ、または増殖を防ぐことができてもよい、候補薬剤をスクリーニングするための本明細書中に記載される方法の使用を提供する。この方法は、微生物を含有する試料を薬剤に曝し、その後本発明の方法を実施することを伴なってもよい。もし、薬剤が有効な死滅薬であるならば、検出される改変された核酸は、ない（または減少している）だろう。典型的には、かかる方法は、目的の微生物の培養された臨床分離株などの十分に特性が明らかにされた試料を使用して実施される。当該方法は、薬剤が微生物の増殖を防ぐことができる（たとえ死滅することができないとしても）かどうかを決定するための時間経過実験として実施されてもよい。薬の非存在下で微生物の増殖を決定するために、薬剤の非存在下で平行反応が実施されてもよい。これは、増殖阻害活性に関して薬剤の有効性についての比較を提供する。
【０１０４】
さらに、本発明は、感染、対象中の微生物の存在に関連する疾患を診断するための、本明細書中に記載される方法の使用を提供する。この文脈では、「試料」という用語は、一般に臨床試料であるだろう。使用される試料は、試験される条件に依存するだろう。本発明を限定することを意図するのではないが、使用されてもよい典型的な試料は、患者、もっとも好ましくはヒト患者から得られる、全血、血清、血漿、血小板および尿試料等を含む。
【０１０５】
好ましい実施形態では、試験は、対象から除去された試料で実施されるインビトロ試験であるだろう。さらなる実施形態では、上述の診断方法は、対象から試料を得る工程をさらに含んでもよい。対象から適切な試料を得る方法は、当技術分野でよく知られている。あるいは、当該方法は、別の手順で患者から既に単離された試料から開始して実施されてもよい。当該診断方法は、もっとも好ましくはヒト由来の試料で実施されるが、本発明の方法は多くの動物について診断上有用性を有し得る。
【０１０６】
本発明の診断方法は、潜在的に初期診断を確認する方法として、既に利用可能な任意の診断技術を補完するために使用されてもよい。あるいは、当該方法は、迅速かつ簡便な診断方法を提供するので、それ自体の予備的な診断方法として使用されてもよい。さらに、それらの本来の感度に起因して、本発明の診断方法は、最小限の試料しか必要とせず、従って、不要な侵襲的手術を防ぐ。また、大きいが、非濃縮の試料もまた、本発明の方法によれば、効率的に試験され得る。
【０１０７】
従って、本発明の方法は、試料中の汚染生物の検出を超えて、複数の用途を有する。本発明の様々な態様に関して上述した説明は、本発明の他の態様について準用し、簡潔さの理由から繰り返されていない。例えば、適切な対照は、本発明のそれぞれ方法について組み込まれてもよい。
【０１０８】
具体的な実施形態では、微生物は病原菌などの病原性微生物である。細菌は、感染または、対象好ましくはヒト対象における疾患を引き起こす能力のある、任意の細菌であってもよい。一実施形態では、細菌は、スタフィロコッカス種、とりわけスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）および好ましくはメチシリン耐性株、エンテロコッカス種、ストレプトコッカス種、マイコバクテリウム種、とりわけマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ビブリオ種、とりわけビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラおよび／またはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の任意の１つ以上を含む、または本質的にそれらからなる、またはそれらからなる。特定の実施形態では、細菌は、クロストリジウム種およびとりわけＣ．ディフィシルを含んでもよいし、本質的にクロストリジウム種およびとりわけＣ．ディフィシルからなってもよいし、またはクロストリジウム種、とりわけＣ．ディフィシルからなってもよい。Ｃ．ディフィシルは、抗生物質に関連する下痢および大腸炎、他の基礎疾患を有する高齢患者に主に影響する医療関連腸感染症の主原因である。Ｃ．アルビカンス、Ｃ．パラプシローシス（ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）およびＣ．グラブラータなどのカンジダ種が、検出されてもよい。Ｃ．ネオフォルマンス（ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）などのクリプトコッカス種が、検出されてもよい。カンジダ血症などの真菌血症が、本発明を使用して検出（存在または非存在）されてもよい。
【０１０９】
特定の実施形態では、本発明のこれらのさらなる態様では、当該方法で試験されている分子（耐性または感染症または細胞毒性を治療する能力のいずれか）は、抗菌化合物である。化合物スクリーニング方法では、任意の分子が試験されてもよい。例は、抗菌薬、ｓｉＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子およびアンチセンス分子を含む核酸分子、小分子、抗体ならびに例えばそれらが結合親和性等を保持するならばＦａｂ断片、可変領域断片および単一ドメイン抗体を含む、それらの全ての誘導体を含む。当該方法は、短時間に多数の分子をスクリーニングするために、ハイスループットの状況において実施されてもよい。
【０１１０】
一実施形態では、抗菌薬は、２つの主要な型の抗菌薬、抗生物質（微生物により生産される天然物質）および化学療法薬（化学的に合成された）から得られてもよく、または、半合成抗生物質（その後改変された自然に生産された抗生物質）または合成抗生物質（天然抗生物質の合成されたバージョン）などの２つのハイブリッドであってもよい。
【０１１１】
適切な候補抗菌薬剤は、本発明の方法における細菌もしくは細菌細胞または他の適切な微生物を殺すまたは増殖を防ぐ能力に関する肯定的な結果に続いて、以下の特性の少なくとも１つ以上について試験されてもよい：
（１）薬剤は、対象に対して無毒で、かつ有害な副作用が無いべきであり、
（２）薬剤は、対象に対して非アレルゲン性であるべきであり、
（３）薬剤は、対象の天然細菌叢を除去しないべきであり、
（４）薬剤は、安定であるべきであり、
（５）薬剤は、好ましくは安価かつ容易に入手可能／製造が容易であるべきであり；かつ
（６）薬剤は、病原体耐性が（顕著な程度まで）発達しないほど強力であるべきである。この特徴は、上記に記載される方法により試験されてもよい。
【０１１２】
一実施形態では、複数の適切な抗菌薬剤の組み合わせは、感染症を治療する能力および／またはそれに対する耐性について試験されてもよい。
【０１１３】
耐性について、および或る感染を治療するそれらの新規の能力についてもおそらく試験されてもよい、抗生物質またはそれらの誘導体は、限定ではなく例として提供される以下の群から選択されてもよい；ペニシリン、とりわけペニシリンＧまたはＶなどのベータ−ラクタム、およびセファロチンなどのセファロスポリン、アンピシリン、メチシリンおよびアモキシシリンなどの半合成ペニシリン、好ましくは半合成ペニシリン製剤（例えばクラバモックスまたはオーグメンチンなど）と併せて使用されるクラブラン酸、アズトレオナムなどのモノバクタム、イミペネムなどのカルバペネム（ｃａｒｂｏｘｙｐｅｎｅｍ）、ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシンおよびゲンタマイシンなどのアミノグリコシド、バンコマイシン、リンコマイシンおよびクリンダマイシンなどの糖ペプチド、エリスロマイシンおよびオレアンドマイシンなどのマクロライド、ポリミキシンおよびバシトラシンなどのポリペプチド、アンホテリシンおよびニスタチンなどのポリエン、リファンピシンなどのリファマイシン、テトラサイクリン類、例えばドキシサイクリン、クロルテトラサイクリンなどのテトラサイクリン、半合成テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ナリジクス酸およびフルオロキノロンなどのキノロンならびにスルホンアミドなどの競合阻害剤、例えばガントリシンおよびトリメトプリム。セフトリアキソンおよび／またはニトロフラゾン（ｎｉｔｒｏｆｌｕｒａｚｏｎｅ）もまた、利用される。
【０１１４】
さらに本発明は、試料を含有する血小板における微生物汚染の存在を検出するための、本明細書中に記載される方法の使用を提供する。かかる態様では、当該方法は、サブステップを組み込んでもよい：
（ｉ）微生物細胞をインタクトなままにしておく条件下での血小板の溶解。これは主に、核酸改変活性の存在について試験する前に微生物の選択的濃縮を可能にする。従って、哺乳類細胞により提供される核酸改変活性は、試験前に除去され得る
（ｉｉ）微生物の濃縮（例えば細菌細胞を含有するペレットを生産するための遠心分離による）
（ｉｉｉ）微生物の溶解または核酸改変活性を放出させるための微生物の透過性を増加させる処理。
【０１１５】
本発明はまた、本発明の方法を実施することにおける有用なキットに関する。従って、
（ａ）少なくとも１つの核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、少なくとも１つの試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子
（ｂ）核酸分子とＩＰＣの両方を含有する、核酸増幅反応におけるプライマー結合に対して競合があるように、核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、少なくとも１つの内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子
を含む、本明細書中に記載される方法を実施するためのキットが提供される。
【０１１６】
キットは、本発明の方法を実施するために必要とされる成分のいずれかを組み込んでもよい。従って、本発明の方法の全ての記載は必要に応じて適用される。
【０１１７】
本発明の文脈において、核酸分子はヌクレアーゼ活性からそれを保護するために予め改変されている。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、キットは核酸分子（のセンス鎖）内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブをさらに含む。キットは、ＩＰＣ核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、核酸プローブは、ＩＰＣ核酸分子に結合せず、そしてさらなる核酸プローブは、核酸分子に結合しない。核酸プローブおよび／またはさらなる核酸プローブは標識化されていてもよい。具体的な実施形態では、核酸プローブおよびさらなる核酸プローブは異なって標識化されている。例えば、それらは、最大発光の異なる波長を有する蛍光色素分子で標識化されていてもよい。標識の適切なペアは当業者により容易に選択されることができ、例えばＦＡＭおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄは、異なる標識として使用されてもよい。
【０１１９】
さらなる実施形態では、核酸分子の相補鎖は、伸長を防ぐために３’末端での改変を含む。「伸長」という用語は、さらなるヌクレオチドの追加が意味される。任意の適切な改変が利用されてもよい。具体的な実施形態では、改変は、伸長不可能なヌクレオチドの組み込みであるか、または含む。任意の適切な伸長不可能なヌクレオチドが利用されてもよい。例えば、伸長不可能なヌクレオチドは、ジデオキシシチジンなどのジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）であってもよいし、または含んでもよい。
【０１２０】
さらなる実施形態では、ＩＰＣはヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。本発明の文脈において、ＩＰＣはヌクレアーゼ活性からそれを保護するために予め改変されている。適切な改変は、本明細書中に、より詳細に記載され、メチル化の組み込み、３’および／または５’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択されてもよい。合成ヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドであってもよいし、または含んでもよい。好ましくは、合成ヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオチドである。もし両分子が改変されているならば、ヌクレアーゼ耐性が同等であるように、それらが、同一のまたは同様の方法で改変されていることが好ましい。これにより、ＩＰＣが、基質分子に対するヌクレアーゼ活性の影響を決定するのにもっとも有用な比較機能を果たすことが可能になる。
【０１２１】
さらなる実施形態では、キットは高ｐＨ試薬をさらに含む。高ｐＨ試薬は、ＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３であってもよいし、または含んでもよい。具体的な実施形態では、高ｐＨ試薬の濃度が約５ｍＭ以上である。キットは、ｐＨ低下剤をさらに含んでもよい。ｐＨ低下試薬はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（例えばｐＨ７．２または８）などの緩衝液または酸を含んでもよい。
【０１２２】
キットは、反応が起こる適切な担体を組み込んでもよい。有利には、かかる担体は、例えば４８または９６穴プレートなどのマルチウェルプレートを含んでもよい。かかる担体は、検出方法が比較的少量で実施されることを可能にし、従って、スケールアップが容易になり、必要とされるサンプル量が最小限に抑えられる。
【０１２３】
キットは、典型的には適切な説明書を組み込むだろう。これらの説明書は、本発明のキットを使用して、本発明の方法が確実に実施されることを可能にする。
【０１２４】
本発明は、以下の一連の番号付きの項にさらに定義されてもよい。
試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｂ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｃ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法。
２．  改変がメチル化の組み込み、３’および／または５’末端の保護および合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項１に記載の方法。
３．  合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項２に記載の方法。
４．  試料中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｂ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｃ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、核酸分子が少なくとも２ｎＭであるが５０ｎＭ未満の濃度で試料に加えられることを特徴とする、
を含む、方法。
５．  工程（ａ）および／または（ｂ）が少なくとも１００μＭの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸を試料に加えることを含む、項４に記載の方法。
６．  試料（非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）高ｐＨ条件下で試料を、非微生物起源の核酸改変活性を阻害する（一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない）ために、５分間以内で処理すること、
（ｂ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｃ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｄ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法。
７．  高ｐＨ条件が、試料をＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３と接触させることを含む、項６に記載の方法。
８．  ＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３の濃度が約５ｍＭ以上である、項７に記載の方法。
９．  高ｐＨ条件下での処理が、ｐＨを低下させるための試薬を加えることにより停止される、項６から８のいずれかに記載の方法。
１０．  ｐＨが緩衝液または酸を加えることにより低下される、項９に記載の方法。
１１．  緩衝液がＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（例えばｐＨ７．２または８）を含む、項１０に記載の方法。
１２．  工程（ａ）が摂氏１５から３０度の間の温度で実施される、項６から１１のいずれかに記載の方法。
１３．  工程（ａ）が、室温で実施される、項６から１２のいずれかに記載の方法。
１４．  方法が、摂氏１５から３０度の間の温度で実施される、項１から１３のいずれかに記載の方法。
１５．  方法が室温で実施される、項１から１４のいずれかに記載の方法。
１６．  試料（非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ａ）
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｉｉ）任意に、試料中のインタクトな微生物（もしあれば）からの溶解細胞物質の分離
（ｉｉｉ）試料中の（分離された）インタクトな微生物（もしあれば）を高ｐＨ試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する（一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない）ために５分間以内でインキュベートすること
（ｉｖ）高ｐＨでのインキュベーションを停止するために、ｐＨ低下試薬を加えること
（ｖ）試料中に存在する場合には、ｐＨ改変試薬からの微生物の分離
（ｖｉ）任意の分離された微生物の溶解
（ｖｉ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｖｉｉ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｖｉｉｉ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること。
または
（ｂ）
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｉｉ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
（ｉｉｉ）ペレットからの上清の除去
（ｉｖ）高ｐＨ試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する（一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない）ために８分間以内でインキュベートすること
（ｖ）高ｐＨでのインキュベーションを停止するために、ｐＨ低下試薬を加えること
（ｖｉ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
（ｖｉ）ペレットからの上清の除去
（ｖｉｉ）ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
（ｖｉｉｉ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｉｘ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｘ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、
を含む、方法。
１７．  高ｐＨ試薬がＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３を含む、項１６に記載の方法。
１８．  高ｐＨ試薬の濃度が約５ｍＭ以上である、項１６または１７に記載の方法。
１９．  ｐＨ低下試薬が緩衝液または酸を含む、項１６から１８のいずれかに記載の方法。
２０．  緩衝液がＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２または８）を含む、項１９に記載の方法。
２１．  工程（ａ）（ｉｉｉ）または（ｂ）（ｉｖ）が摂氏１５から３０度の間の温度で実施される、項１６から２０のいずれかに記載の方法。
２２．  工程（ａ）（ｉｉｉ）または（ｂ）（ｉｖ）が、室温で実施される、項１６から２１のいずれかに記載の方法。
２３．  方法が、摂氏１５から３０度の間の温度で実施される、項１６から２２のいずれかに記載の方法。
２４．  方法が室温で実施される、項１６から２３のいずれかに記載の方法。
２５．  （液体）試料（潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｉｉ）試料中のインタクトな微生物（もしあれば）からの、溶解細胞物質の分離および／または溶解細胞物質の不活性化
（ｉｉｉ）分離および／または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
（ｉｖ）内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
（ｖ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｖｉ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、
または
（ａ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
（ｂ）ペレットからの上清の除去
（ｃ）ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
（ｄ）内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
（ｅ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｆ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定すること、ここで、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性から保護するために改変されていることを特徴とする、
を含む、方法。
２６．  核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項２５に記載の方法。
２７．  改変が、メチル化の組み込み、３’および／または５’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項２５または２６に記載の方法。
２８．  合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項２７に記載の方法。
２９．  （液体）試料（潜在的に非微生物起源のヌクレアーゼ活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｉｉ）試料中のインタクトな微生物（もしあれば）からの、溶解細胞物質の分離および／または溶解細胞物質の不活性化
（ｉｉｉ）分離および／または不活性化後にいずれかの微生物を溶解させること
（ｉｖ）内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
（ｖ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｖｉ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする。
または
（ａ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
（ｂ）ペレットからの上清の除去
（ｃ）ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
（ｄ）内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させる、
（ｅ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｆ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用されることを特徴とする、
を含む、方法。
３０．  工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）または（ｃ）および（ｄ）それぞれが共に実施される、項２５から２９のいずれかに記載の方法。
３１．  核酸分子が、溶解試薬と共に試料に加えられる、項３０に記載の方法。
３２．  改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することが核酸増幅工程を含む、項１から３１のいずれかに記載の方法。
３３．  核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定する工程は、相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を加えることを含む、項３２に記載の方法。
３４．  工程（ｆ）において、プライマー結合に対して競合があるように、ＩＰＣ核酸分子は核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、項２５から３３のいずれかに記載の方法。
３５．  核酸分子（のセンス鎖）内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが工程（ｆ）において加えられる、項２５から３４のいずれかに記載の方法。
３６．  ＩＰＣ核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが工程（ｆ）において加えられる、項２５から３５のいずれかに記載の方法。
３７．  核酸プローブがＩＰＣ核酸分子に結合せず、かつさらなる核酸プローブが核酸分子に結合しない、項３６に記載の方法。
３８．  核酸プローブが標識化されている、項３５から３７のいずれかに記載の方法。
３９．  さらなる核酸プローブが標識化されている、項３５から３８のいずれかに記載の方法。
４０．  核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、項３８または３９に記載の方法。
４１．  核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために３’末端での改変を含む、項３３に記載の方法。
４２．  改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、項４１に記載の方法。
４３．  伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）である、項４２に記載の方法。
４４．  ｄｄＮＴＰがジデオキシシチジンである、項４３に記載の方法。
４５．  核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項２９から４４のいずれかに記載の方法。
４６．  改変がメチル化の組み込み、３’および／または５’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項４５に記載の方法。
４７．  合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項４６に記載の方法。
４８．  試料（非微生物起源の核酸改変活性を含有する試料）中の微生物の非存在または存在を検出する方法であって：
（ｉ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｉｉ）任意に、試料中のインタクトな微生物（もしあれば）からの溶解細胞物質の分離
（ｉｉｉ）試料中の（分離された）インタクトな微生物（もしあれば）を高ｐＨ試薬と接触させること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する（一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない）ために５分間以内でインキュベートすること
（ｉｖ）高ｐＨでのインキュベーションを停止するために、ｐＨ低下試薬を加えること
（ｖ）試料中に存在する場合には、ｐＨ改変試薬からの微生物の分離
（ｖｉ）任意の分離された微生物の溶解
（ｖｉｉ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｖｉｉｉ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｉｘ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている。
または
（ａ）試料中に存在する場合には、非微生物を溶解するが試料中の微生物を溶解しない試薬と試料のインキュベーション
（ｂ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の遠心分離
（ｃ）ペレットからの上清の除去
（ｄ）高ｐＨ試薬中でペレットを再懸濁すること、および非微生物起源の核酸改変活性を阻害する（一方で試料中の微生物の核酸改変活性に影響を与えない）ために８分間以内でインキュベートすること
（ｅ）高ｐＨでのインキュベーションを停止するために、ｐＨ低下試薬を加えること
（ｆ）試料中に存在する場合には、微生物を含有するペレットを形成するための試料の第二の遠心分離
（ｇ）ペレットからの上清の除去
（ｈ）ペレット中のいずれかの微生物を溶解させること
（ｉ）試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させること、
（ｊ）核酸改変活性に適切な条件下で、このように接触された試料をインキュベートすること；および
（ｋ）微生物の非存在または存在を示す、基質核酸分子への核酸改変活性の作用から生じる改変された核酸分子の非存在または存在を特異的に決定することであって、核酸分子は、ヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、
を含む、方法。
４９．  改変が、メチル化の組み込み、３’および／または５’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項４８に記載の方法。
５０．  合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項４９に記載の方法。
５１．  核酸分子が、少なくとも２ｎＭおよび５０ｎＭ未満の濃度で試料に加えられることをさらに特徴とする、項４８から５０のいずれかに記載の方法。
５２．  工程（ｖｉｉ）または（ｉ）それぞれが少なくとも１００μＭの濃度でデオキシリボヌクレオチド三リン酸を試料に加えることを含む、項４８から５１のいずれかに記載の方法。
５３．  高ｐＨ試薬がＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３を含む、項４８から５２のいずれかに記載の方法。
５４．  高ｐＨ試薬の濃度が約５ｍＭ以上である、項４８から５３のいずれかに記載の方法。
５５．  ｐＨ低下試薬が緩衝液または酸を含む、項４８から５４のいずれかに記載の方法。
５６．  緩衝液がＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２または８）を含む、項５５に記載の方法。
５７．  工程（ｉｖ）または（ｄ）のそれぞれが、摂氏１５から３０度の間の温度で実施される、項４８から５６のいずれかに記載の方法。
５８．  工程（ｉｖ）または（ｄ）のそれぞれが、室温で実施される、項４８から５７のいずれかに記載の方法。
５９．  方法が摂氏１５から３０度の間の温度で実施される、項４８から５８のいずれかに記載の方法。
６０．  方法が室温で実施される、項４８から５９のいずれかに記載の方法。
６１．  工程（ｖｉ）または（ｉ）それぞれが、内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、ここでＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性に感受性であり、そしてペレット中の汚染ヌクレアーゼ活性を明らかにするために使用される、項４８から６０のいずれかに記載の方法。
６２．  工程（ｖｉ）または（ｉ）それぞれが、内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子と一緒に、試料を、試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子と接触させることを含み、ＩＰＣ核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項４８から６０のいずれかに記載の方法。
６３．  改変が、メチル化の組み込み、３’および／または５’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項６２に記載の方法。
６４．  合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項６３に記載の方法。
６５．  工程（ｖｉ）および（ｖｉｉ）または（ｈ）および（ｉ）それぞれが共に実施される、項４８から６４のいずれかに記載の方法。
６６．  核酸分子が、溶解試薬と共に試料に加えられる、項６５に記載の方法。
６７．  工程（ｘｉ）または（ｋ）それぞれが、核酸増幅工程を含む、項４８から６６のいずれかに記載の方法。
６８．  核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、かつ工程（ｋ）が相補鎖におけるウラシル残基を分解するために、試料にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を加えることを含む、項４８から６７のいずれかに記載の方法。
６９．  工程（ｘｉ）または（ｋ）それぞれにおいてプライマー結合に対して競合があるように、ＩＰＣ核酸分子は核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、項６４から６８のいずれかに記載の方法。
７０．  核酸分子（のセンス鎖）内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブが工程（ｘｉ）または（ｋ）それぞれにおいて加えられる、項４８から６９のいずれかに記載の方法。
７１．  ＩＰＣ核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブが工程（ｘｉ）または（ｋ）それぞれにおいて加えられる、項７０に記載の方法。
７２．  核酸プローブがＩＰＣ核酸分子に結合せず、そしてさらなる核酸プローブは、核酸分子に結合しない、項７１に記載の方法。
７３．  核酸プローブが標識化されている、項７０から７２のいずれかに記載の方法。
７４．  さらなる核酸プローブが標識化されている、項７１から７３のいずれかに記載の方法。
７５．  核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、項７４に記載の方法。
７６．  核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために３’末端での改変を含む、項６８から７５のいずれかに記載の方法。
７７．  改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む、項７６に記載の方法。
７８．  伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）である、項７７に記載の方法。
７９．  ｄｄＮＴＰがジデオキシシチジンである、項７８に記載の方法。
８０．  核酸改変活性がポリメラーゼ活性を含む、項１から７９のいずれかに記載の方法。
８１．  微生物に対する薬剤に対する微生物の耐性についてスクリーニングするための、項１から８０のいずれかに記載の方法の使用。
８２．  １つ以上の微生物を死滅させ、または増殖を防ぐことができてもよい、候補薬剤をスクリーニングするための、項１から８０のいずれかに記載の方法の使用。
８３．  感染、対象中の微生物の存在に関連する疾患を診断するための、項１から８０のいずれかに記載の方法の使用。
８４．  試料を含有する血小板における微生物汚染の存在を検出するための、項１から８０のいずれかに記載の方法の使用。
８５．  項１から８４のいずれかに記載の方法を実行するための以下を含むキット：
（ａ）少なくとも１つの核酸分子は少なくとも部分的に二本鎖であり、かつ相補鎖においてウラシル残基を含み、核酸分子がヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されていることを特徴とする、少なくとも１つの試料中の微生物の核酸改変活性のための基質として作用する核酸分子
（ｂ）核酸分子とＩＰＣの両方を含有する、核酸増幅反応におけるプライマー結合に対して競合があるように、核酸分子と同一のプライマー結合部位を含む、少なくとも１つの内部陽性対照（ＩＰＣ）核酸分子。
８６．  キットが核酸分子（のセンス鎖）内で標的プローブ配列に結合する核酸プローブをさらに含む、項８５に記載のキット。
８７．  キットがＩＰＣ核酸分子内で標的プローブ配列に結合するさらなる核酸プローブをさらに含む、項８５または８６に記載のキット。
８８．  核酸プローブがＩＰＣ核酸分子に結合せず、そしてさらなる核酸プローブは、核酸分子に結合しない、項８６または８７に記載のキット。
８９．  核酸プローブが標識化されている、項８６から８８のいずれかに記載のキット。
９０．  さらなる核酸プローブが標識化されている、項８７から８９のいずれかに記載のキット。
９１．  核酸プローブおよびさらなる核酸プローブが異なって標識化されている、項８７から９０のいずれかに記載のキット。
９２．  核酸分子の相補鎖が伸長を防ぐために３’末端での改変を含む、項８５から９１のいずれかに記載のキット。
９３．  改変が伸長不可能なヌクレオチドの組み込みを含む項９２に記載のキット。
９４．  伸長不可能なヌクレオチドがジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）である、項９３に記載のキット。
９５．  ｄｄＮＴＰがジデオキシシチジンである、項９４に記載のキット。
９６．  ＩＰＣがヌクレアーゼ活性からそれを保護するために改変されている、項８５から９５のいずれかに記載のキット。
９７．  改変が、メチル化の組み込み、３’および／または５’末端の保護、合成ヌクレオチドの組み込みから選択される、項９６に記載のキット。
９８．  合成ヌクレオチドがホスホロチオエートヌクレオチドおよび／またはロックド核酸ヌクレオチドを含む、項９７に記載のキット。
９９．  キットが高ｐＨ試薬をさらに含む、項８５から９８のいずれかに記載のキット。
１００．  高ｐＨ試薬がＮａＯＨまたはＮａ２ＣＯ３を含む、項９９に記載のキット。
１０１．  高ｐＨ試薬の濃度が約５ｍＭ以上である、項９９または１００に記載のキット。
１０２．  ｐＨ低下剤をさらに含む、項８５から１０１のいずれかに記載のキット。
１０３．  ｐＨ低下試薬が緩衝液または酸を含む、項１０２に記載のキット。
１０４．  緩衝液がＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２または８）を含む、項１０３に記載のキット。
【０１２５】
実験の項
本発明は、以下の非限定的な実施例に関して理解されるだろう：
【実施例１】
【０１２６】
実施例１−ＥＴＧＡ試験改変
方法−一般的なプロトコール
それぞれの試料に関して、１ｍＬの血液培養（加えられた微生物の有無に関わらず、血液の有無に関わらず）を、１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブにおいて０．３３３ｍＬの試薬Ａ（５％ｗ／ｖのサポニン、５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、８．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。それぞれの試料を、３分間、７３００ｇで遠心分離し、その後、上清を注ぎ出し、そしてチューブの縁をきれいな実験用ティッシュペーパーの上にたたいた。次いで、それぞれのペレットを、０．７５ｍＬの試薬Ｂ（５ｍＭのＮａＯＨ）において再懸濁し、５分間インキュベートし、その後０．５ｍＬの試薬Ｃ（１．３２ｇ／Ｌのアンモニウム硫酸、０．４９ｇ／Ｌのマグネシウム硫酸七水和物、０．７５ｇ／Ｌの塩化カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を加えることによりｐＨを低下させた。インキュベーション後、試料を再度遠心分離し、上清を注ぎ出すことにより除去した。残っているペレットを、０．５ｍＬの試薬Ｃにおいて再懸濁し、すぐにガラスビーズの混合物を含有する新しいチューブ（０．１ｍｍおよび０．５ｍｍのガラスビーズ；ＣａｍＢｉｏ  ｃａｔ  １３１１８−４００および１３１１６−４００によってそれぞれ供給される）に移した。さらなる遠心分離を、ガラスビーズと任意の懸濁した細胞をペレット化するために実施し、再度上清を除去し、廃棄した。
【０１２７】
ＥＴＧＡ基質（ＬＭ；試薬Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３を７：２：１の比で含有する、表１を参照されたい）を含有する５０μＬの微生物溶解混合物を、ガラスビーズに加え、微生物細胞を溶解するために、６分間２８００ｒｐｍでディスラプターＧｅｎｉｅ（サイエンティフィックインダストリーズ社）細胞ディスラプターに置いた。破壊後、試料を３７℃のヒートブロックに置き、２０分間インキュベートし、次いで９５℃の別のヒートブロックに移し、５分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を室温まで冷やし、ＰＣＲ試薬を調製した。
【０１２８】
冷却後、３μＬの試料上清を、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ  ＰＣＲチューブ（Ｃｅｐｈｅｉｄ）において２７μＬのＰＣＲマスターミックス（ＭＭ；一般的なＴａｑポリメラーゼＰＣＲマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ−ｃａｔ  ０４９０２３４３００１）、ＥＴＧＡ基質のためのプライマー、内部陽性対照−ＩＰＣ−ＤＮＡ、ＥＴＧＡ基質のためのＦＡＭ−標識化されたプローブ、ＩＰＣのためのＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識化されたプローブ、および（１．２μｌ）ＵＤＧ酵素（Ｂｉｏｌｉｎｅ−ｃａｔ  ｎｏ  ＢＩＯ−２７０４４）を含有する）に加えた。試料を、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ  ＰＣＲに置き、以下の反応条件に供した；
１サイクル；４０℃、１０分、５０℃、１０分、９５℃、５分
４０−５０サイクル：９５℃、５秒、６１℃、２０秒、７２℃、２０秒。
増幅を、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒのＴｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＦＡＭ励起／検出チャネルにおいて、リアルタイムで反応を通してモニターした。
【０１２９】
表１  溶解混合物組成
【表２】
0006768645.tif 000003
【０１３０】
ＰＣＲ反応成分の配列は、以下の通りである；
Ｆａｍ標識化されたプローブ（分子ビーコン）：
ＦＡＭ−ｃｇｃ  ｔｇｃ  ｇａｃ  ｃｇａ  ｃｃｇ  ａｔａ  ａｇｃ  ｔａｇ  ａａｃ  ａｇｇ  ｃａｇ  ｃｇ−ＢＨＱ１
（配列番号１）
Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ標識化されたプローブ（分子ビーコン）：
ＴｘＲ−  ｃｇｃ  ｇａｔ  ｃａｇ  ｃａｇ  ｇｃｃ  ａｃａ  ｃｇｔ  ｔａａ  ａｇａ  ｃａｔ  ｃｇｃ  ｇ−ＢＨＱ２
（配列番号２）
ＩＰＣ
ｇｃｃ  ｇａｔ  ａｔｃ  ｇｇａ  ｃａａ  ｃｇｇ  ｃｃｇ  ａａｃ  ｔｇｇ  ｇａａ  ｇｇｃ  ｇａｇ  ａｔｃ  ａｇｃ  ａｇｇ  ｃｃａ  ｃａｃ  ｇｔｔ  ａａａ  ｇａｃ  ａｇａ  ｇａｇ  ａｃａ  ａｃａ  ａｃｇ  ｃｔｇ  ｇｃｃ  ｇｔｔ  ｔｇｔ  ｃａｃ  ｃｇａ  ｃｇｃ  ｃｔａ
（配列番号３）
フォワードプライマー
ｃｃｇ  ａｔａ  ｔｃｇ  ｇａｃ  ａａｃ  ｇｇｃ  ｃｇａ  ａｃｔ  ｇｇ  （配列番号４）
リバースプライマー
ｔａｇ  ｇｃｇ  ｔｃｇ  ｇｔｇ  ａｃａ  ａａｃ  ｇｇｃ  ｃａｇ  ｃ  （配列番号５）
基質要素は；
ＡＳ
ｕａｇｇｃｇｕｃｇｇｕｇａｃａａａｃｇｇｃｃａｇｃｇｕｕｇｕｕｇｕｃｕｃｕ−ＤＤＣ（３’末端はジデオキシ−Ｃである）（配列番号６）
Ｓ１
ｇｃｃｇａｔａｔｃｇｇａｃａａｃｇｇｃｃｇａａｃｔｇｇｇａａｇｇｃｇａｇａｃｔｇａｃｃｇａｃｃｇａｔａａｇｃｔａｇａａｃａｇａｇａｇａｃａａｃａａｃ  （配列番号７）
である。
【０１３１】
結果および考察１−基質濃度を増加させること
一般的なプロトコールを、ＬＭ中のＥＴＧＡ基質の量を１０倍まで（０．００１μＭから０．０１μＭまで）増加させること、およびｄＮＴＰの量を２倍（５０μＭから１００μＭまで）増加させることにより改変した。
【０１３２】
基質およびｄＮＴＰの量の増加は、Ｃ．アルビカンス（図１ａ）、Ｅ．コリ（図１ｂ）、Ｓ．アウレウス（図１ｃ）、Ｅ．フェカリス（図１ｄ）、Ｐ．エルギノーサ（図１ｅ）、またはＨ．インフルエンザの２つの異なる株（繊細な臨床株を含む）（図１ｆおよび図１ｇ）の改善した検出を可能にした。データは、図１に示される。
【０１３３】
結果および考察２−ＥＴＧＡ試験感度を改善すること、およびオリゴ成分を改変することによりバックグラウンドを低下させること
【０１３４】
ヌクレアーゼ活性の証拠
ＥＴＧＡ基質分子と同時にＩＰＣ分子を加えることは、元のプロトコールの改良であると考えられた。ＩＰＣをＬＭ中に加えた場合、ＩＰＣはＥＴＧＡ基質と全く同一の試験条件の対象であり、したがって、より正確な試験対照を提供するだろう。例えば、基質を消化できるヌクレアーゼ活性などの、基質分子に負の影響を与え得る条件もまた、ＩＰＣに影響する。ＩＰＣが後に加えられる場合（例えばＭＭにおいて）、同一の条件の対象ではなく、データの誤った解釈をもたらし得る。ＥＴＧＡ基質と同時にＩＰＣを加える場合、核酸鋳型への試験条件の影響の大きさが測定され得る。
【０１３５】
これを例示するために、図２は、試験条件がＥＴＧＡ基質の検出に負の衝撃を有し得ることを示し；ＭＭ中よりもむしろＬＭ中のＩＰＣ  ＤＮＡに匹敵する量を加えると、陰性対照試料（血液無し）と比較して、血液培養検体中のＩＰＣを検出する能力が実際に喪失していたことが見出された。同一の検出の喪失は、ＭＭ中のＩＰＣを使用する時には見られなかった。ＬＭ中に加えた場合のＩＰＣの喪失は、ＥＴＧＡプロトコールの３７℃のインキュベーション工程中に活性であり得たヌクレアーゼに起因した。ヌクレアーゼは血液検体に由来する可能性が高かった。
【０１３６】
明らかに、ＩＰＣ分子が試験中に喪失した場合、ＥＴＧＡ基質分子もまた喪失し得る。陽性血液培養試料中のＥＴＧＡ基質分子の喪失は、検出感度の減少を明らかにもたらし、または潜在的に偽陰性の結果につながるだろうが、ＩＰＣをＬＭに加えることにより、疑わしいヌクレアーゼ活性を決定し（そしておそらく定量化し）、それに応じて結果を解釈することができるだろう。ＩＰＣ量の低下が観察された試料（陰性試薬対照と比較してＣｔ値における上昇により見られる）は、‘陰性’よりもむしろ‘未解明’であるとして報告でき、従って、試料がヌクレアーゼ活性の対象であったこと、実際には陽性であってもよいことを示す。
【０１３７】
ＩＰＣ分子をＬＭに加えることはＥＴＧＡ試験を改善することができた。しかしながら、どのようにして一般的なヌクレアーゼ活性が臨床検体に見出されたかということに依存して、これは、未解決の結果の全体の数を高めることができ、高い認識失敗率に起因して、試験を潜在的な利用者にとってあまり魅力的なものでないものにする（および従って、なぜＩＰＣを最初からＬＭよりもむしろＭＭに加えたのかを説明する）。
【０１３８】
試験をすることは、ＩＰＣ分子をＬＭ中の試験に加え、濃度を２０−５０倍に増加させることにより推定されるヌクレアーゼ活性の存在下で依然として検出することができることを示したが、陰性血液培養試料でも高レベルのバックグラウンドが検出された（図３）。この場合、バックグラウンドは、検出ＰＣＲ反応を妨害する部分的に消化されたオリゴヌクレオチドの存在により引き起こされてもよい。特に非常に少数の細菌を検出しようとする場合は、明らかに、高レベルのバックグラウンドが試験の感度を減少させ得る。
【０１３９】
ＬＭ中のＩＰＣの量を増加させることは、ヌクレアーゼ活性に起因する標的ＤＮＡ分子の喪失の問題に対する解決策と考えられるが、それは問題を隠すのみであり、かつ前述のようにより高いバックグラウンドレベルに寄与し得る。汚染ヌクレアーゼ活性が低い試料中のＩＰＣ分子の量を増加させることもまた、検出ＰＣＲにおける反応成分についての競合を増加させることにより試験感度を減少させることができ、それによって標的基質を検出する試験の能力を減少させる。推定上のヌクレアーゼ問題に対するより良い解決策が必要とされた。
【０１４０】
ヌクレアーゼ活性からＥＴＧＡ基質およびＩＰＣを保護すること
ＩＰＣ分子はＬＭ中に含まれるべきであり、ヌクレアーゼ活性はＥＴＧＡ試験に有害な効果を有し得るという仮定に基づいて、ヌクレアーゼ分解からＤＮＡ標的（ＩＰＣおよびＥＴＧＡ基質）を保護する試みがなされた。
【０１４１】
ＤＮＡは、様々な手段により、改変（例えばメチル化、末端改変）により、または合成オリゴヌクレオチド（例えばロックド核酸、ホスホロチオエートヌクレオチド）の合成の間に非標準ヌクレオチドを使用して、ヌクレアーゼ活性から保護され得る。
【０１４２】
ＥＴＧＡ試験は、細菌よりも酵母に対して感受性が低いことがわかっている。この理由は知られていないが、細菌性酵素と比較して、真菌酵素のインビトロ活性もしくは細胞中の絶対的な量における差異、または阻害剤に対する感受性などの理由の組み合わせに起因するようである。
【０１４３】
ＥＴＧＡ試験におけるＰＴＯオリゴの使用の実証
標準ＥＴＧＡ基質およびＩＰＣオリゴは、一般的なプロトコールにおけるＬＭ中の同一のヌクレオチド配列を有するホスホロチオエートオリゴ（ＰＴＯ）と置き換えられた。ＰＴＯ−改変されたＥＴＧＡ基質を、０．０１μＭでＬＭに加え、ＰＴＯ−改変されたＩＰＣを十分な量で加え、５０サイクルＰＣＲ反応において３７−４１のＣｔ値を達成した。
【０１４４】
血液培養中の酵母細胞の希釈系列（１０５、１０４、１０３および０ｃｆｕ／ｍｌ）を、標準オリゴを用いる、およびＰＴＯ改変オリゴを用いる、元のＥＴＧＡ試験プロトコールで試験した。両試験は全く同一の添加された血液培養で行った（図４）。
【０１４５】
データは、標準オリゴを用いるＥＴＧＡ試験は、低レベルの酵母細胞の検出を妨げ得る高レベルのバックグラウンドを含む結果を得た一方で、ＰＴＯ改変オリゴで得られた結果は、同一の効果を受けなかったことを示した。実際、結果は、ＰＴＯオリゴは、同一の培養検体で検出不可能なレベルまで全体のバックグラウンドを減少させ、従ってｑＰＣＲ反応における閾値レベルの低下をさせ、ＥＴＧＡ試験の感度を潜在的に増加させたことを示した。標準オリゴを使用する場合、検出されるバックグラウンド蛍光の量に起因して、閾値レベルを５０ユニットに設定したが、ＰＴＯオリゴを使用する場合には、閾値レベルは必要ならば１０ユニット以下に低下させることができたということを注意されたい。ＰＴＯオリゴは標準オリゴを使用する場合よりも、ＰＣＲ反応の後期に検出されたが、バックグラウンドのレベルが非常に低いので、ＰＴＯ  ｑＰＣＲ反応も、より長く実行できた（４０よりもむしろ５０サイクル）。
【０１４６】
バックグラウンドにおけるこの減少の結果は、標準オリゴを使用した場合に以前には検出不可能だったであろうより低レベルの微生物負荷（この例では１０３ｃｆｕ／ｍｌ）を、ＰＴＯオリゴを用いて検出することができることを意味した。
【０１４７】
さらなる実験では、ヌクレアーゼ耐性のＰＴＯバージョンの基質分子（ＭＷＧ−Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）をＥＴＧＡ試験において使用した。酵母一晩培養の希釈系列を血液培養に人工的に添加して使用した（その後血液培養の試料を総生存数を確認するためにＳＤＡに広げた）。それぞれの懸濁液を、その後標準オリゴを使用するＥＴＧＡ試験およびＰＴＯオリゴを使用するＥＴＧＡ試験で試験した。酵母の検出感度はＰＴＯの使用によりかなり改善された。異なるＰＣＲサイクル数に起因して、ＰＴＯ結果は標準試験とは異なるｙ軸にプロットされたということに注意されたい。破線は、陰性対照（いずれの微生物もない血液培養）のＣｔ値を示す。この実験からのデータは、ＰＴＯ基質は、１０００倍まで酵母の検出を改善することが示されており（図５）、さらに、バックグラウンドレベルを上昇させる効果を示さなかったことを示す。ＰＴＯ基質を、ＥＴＧＡ試験の感度を増加させるために使用できるという知見は非常に重要であった。
【０１４８】
実施例２−ＥＴＧＡ試験における偽陰性試験結果を減少させること
一般的なプロトコール
１０ｍＬの検体に関して
それぞれの試料に関して、１０ｍＬの血液培養（加えられた微生物の有無に関わらず、血液の有無に関わらず）を、１５ｍＬのファルコンチューブにおいて３．３３ｍＬの試薬Ａ（５％ｗ／ｖのサポニン、５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、８．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。それぞれの試料を８分間３６００ｇで遠心分離し、その後、上清を注ぎ出し、そしてチューブの縁をきれいな実験用ティッシュペーパーの上にたたいた。次いで、それぞれのペレットを、５ｍＬの試薬Ｂ（５ｍＭのＮａＯＨ）において再懸濁し、５分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を再度遠心分離分離し、上清を注ぎ出すことにより除去した。残っているペレットを、１ｍＬの試薬Ｃ（１．３２ｇ／Ｌのアンモニウム硫酸、０．４９ｇ／Ｌのマグネシウム硫酸七水和物、０．７５ｇ／Ｌの塩化カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）において再懸濁し、すぐにガラスビーズの混合物を含有する１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブに移した。３分間７３００ｘｇでのさらなる遠心分離を、ガラスビーズと任意の懸濁した細胞をペレット化するために実施し、再度上清を除去し、廃棄した。
【０１４９】
５０μＬの微生物溶解混合物（ＬＭ；ＥＴＧＡ基質を含有する、上記実施例１における表１を参照されたい）を、ガラスビーズに加え、微生物細胞を溶解するために、６分間２８００ｒｐｍでディスラプターＧｅｎｉｅ細胞ディスラプターに置いた。破壊後、試料を３７℃のヒートブロックに置き、２０分間インキュベートし、次いで９５℃の別のヒートブロックに移し、５分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を室温まで冷やし、ＰＣＲ試薬を調製した。
【０１５０】
冷却後、３μＬの試料上清を、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ  ＰＣＲチューブ（Ｃｅｐｈｅｉｄ）において２７μＬのＰＣＲマスターミックス（ＭＭ；一般的なＴａｑポリメラーゼＰＣＲマスターミックス、ＥＴＧＡ基質のためのプライマー、内部陽性対照−ＩＰＣ−ＤＮＡ、ＥＴＧＡ基質のためのＦＡＭ−標識化されたプローブ、ＩＰＣのためのＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識化されたプローブ、およびＵＤＧ酵素を含有する）に加えた。試料を、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒ  ＰＣＲに置き、以下の反応条件に供した；
１サイクル；４０℃、１０分、５０℃、１０分、９５℃、５分
４０−５０サイクル：９５℃、５秒、６１℃、２０秒、７２℃、２０秒。
増幅を、ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒのＴｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＦＡＭ励起／検出チャネルにおいて、リアルタイムで反応を通してモニターした。
【０１５１】
１ｍＬの検体に関して
それぞれの試料に関して、１ｍＬの血液培養を、１．５ｍＬのマイクロ遠心チューブにおいて０．３３３ｍＬの試薬Ａ（５％ｗ／ｖのサポニン、５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ２０、８．５ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。それぞれの試料を、３分間、７３００ｇで遠心分離し、その後、上清を注ぎ出し、そしてチューブの縁をきれいな実験用ティッシュペーパーの上にたたいた。次いで、それぞれのペレットを、１ｍＬの試薬Ｂ（５ｍＭのＮａＯＨ）において再懸濁し、５分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を再度遠心分離し、上清を注ぎ出すことにより除去した。残っているペレットを、０．５ｍＬの試薬Ｃ（１．３２ｇ／Ｌのアンモニウム硫酸、０．４９ｇ／Ｌのマグネシウム硫酸七水和物、０．７５ｇ／Ｌの塩化カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）において再懸濁し、すぐにガラスビーズの混合物を含有する新しいチューブに移した。さらなる遠心分離を、ガラスビーズと任意の懸濁した細胞をペレット化するために実施し、再度上清を除去し、廃棄した。
【０１５２】
微生物の溶解およびＰＣＲ検出は、１０ｍＬのプロトコールについて先に記載されたように、その後実施された。
【０１５３】
ＰＣＲ反応成分および基質は上記の実施例１に従う。
【０１５４】
バックグラウンド
ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）として同定された単一の臨床微生物単離物は臨床性能評価の間にＥＴＧＡ試験において偽陰性結果を示した。微生物がＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ  Ｂａｃｔ／ＡＬＥＲＴ血液培養培地において標準的な自動血液培養により検出された。
【０１５５】
培養微生物細胞のスパイクを、ＥＴＧＡ試験の異なる段階に加えた場合、Ｈ．インフルエンザ株はＮａＯＨ洗浄工程（試薬Ｂ）後に加えた場合のみ検出されたことがわかった。他のより頑丈な細菌株は、開始時から試験に加えた場合に検出可能であることがわかった（図６を参照されたい）。結果は、Ｈ．インフルエンザの株がＮａＯＨ洗浄工程（またはＮａＯＨ洗浄工程まで、およびそれを含む工程の組み合わせ）に特に感受性であることを示した。
【０１５６】
この結果は、Ｈ．インフルエンザの全ての株に典型的なものではなく、これまでのところ、この株にだけ関連していた。当該単離株を、あまり頑丈でない微生物を検出するのにより良い、新規のＥＴＧＡ法を開発するための‘弱い’モデル生物として使用した。
【０１５７】
ＮａＯＨ中でのインキュベーションは、遊離のポリメラーゼを失活させ、汚染物を減少させ、バックグラウンドを減少させるために実施されなければならないＥＴＧＡプロトコールにおける必須の工程である。従って、試験結果に有害な影響を与えずにＮａＯＨの有害な影響を減少させる試みがなされた。当該ＮａＯＨの濃度は十分な汚染物質を除去せず、これは試験の失敗につながるので、ＮａＯＨの濃度を低下させることができなかった。
【０１５８】
結果−ＮａＯＨへの試料暴露を減少させること
一般的な１０ｍＬのプロトコールでは、試料を遠心分離するのに要する時間は、試料がＮａＯＨに曝される合計時間を８分まで増加させるということに注意されたい。時間の短縮は、アルカリの中和により、またはインキュベーション時間の至適な期間後に、ＮａＯＨに１ｍＬの２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．２を加えることにより少なくとも試料のｐＨを低下させることで達成され、制御され得る。
【０１５９】
１０ｍＬの検体についての一般的なプロトコールを、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ  ＳＡビン（血液は加えられていない）から採取した培養培地におけるＨ．インフルエンザの懸濁液について実施した。結果は、ＮａＯＨの中和（またはｐＨを顕著に低下させる）は、より低いＣｔ値（同一の試料から）につながり、検出感度を改善した（図７を参照されたい）ことを示す。
【０１６０】
データはまた、インキュベーション時間がより短いほどより良いだろうが、また、短いインキュベーション時間は、信頼できるＰＣＲ増幅を可能にするための汚染物質の十分な除去ができず、反応の失敗または高いバックグラウンドレベルおよび偽陽性結果をもたらすということも示唆した。
【０１６１】
ＮａＯＨ処理後の試料のｐＨを低下させることは、任意の適切な緩衝液または酸を加えることにより潜在的に達成され得る。試薬Ｃ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８）は既に試験において使用されているので、ｐＨを低下させる好ましい方法は当該試薬を使用することである。
【０１６２】
結果−好ましい実施形態、１ｍＬ
Ｈ．インフルエンザおよびＳ．アウレウスの両方の検出は、元のＮａＯＨ工程を、０．７５ｍＬのＮａＯＨにおける再懸濁、室温で５分間のインキュベーションからなるより複雑な工程に置き換え、その後０．５ｍＬの試薬Ｃを加えてｐＨを低下させることにより、１ｍＬの検体についての一般的なプロトコールで改善することができた。図８に要約された結果は、全ての微生物含有試料でのＥＴＧＡ試験からのＣｔ値は、元の１ｍＬのプロトコールと比較してｐＨ低下プロトコールを使用する場合により低く、これはｐＨ低下プロトコールが検出を改善したことを示すことを示した。
【０１６３】
実施例３−９５℃の重要性およびＰＴＯ基質の使用の解析
目的
この実施例において概説される研究の目的は、コグニターマイナス試験の性能での９５℃工程の影響を評価することであった。コグニターマイナス試験を９５℃工程の有無について細菌添加血液ブロス試料を使用して実施して、以下の特徴を比較した：
・得られたＣｔ値
・試料調製の完了後の異なる時点でのＱＰＣＲにより測定されるＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡの安定性
・溶解混合物（ＬＭ）が、ホスホロチオエート改変オリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＥＴＧＡ基質とは対照的に、未改変のオリゴヌクレオチド（ＵＭＯ）ＥＴＧＡ基質を含有する場合に、得られたＣｔ値およびＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡの安定性。
【０１６４】
導入
コグニターマイナス試験における初期段階は、血液細胞を溶解し、かつ非微生物由来のＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡを生産するＤＮＡポリメラーゼ、および微生物由来のＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡを消化し得るヌクレアーゼ酵素などの血液由来のタンパク質を洗い流すことを目指す。任意の得られたインタクトな微生物をその後、溶解混合物（ＬＭ）およびビーズ粉砕物の添加により溶解した。微生物溶解およびＥＴＧＡ反応の後、試料は、微生物タンパク質、ＬＭ成分、新しく合成されたＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡおよび残留している血液細胞タンパク質の混合物を含有する。９５℃工程は、ＱＰＣＲによりうまく検出され得るように、ヌクレアーゼ消化からＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡおよび内部プロセス対照（ＩＰＣ）ＤＮＡを保護するために全てのタンパク質変性させることを意図している。
【０１６５】
９５℃工程の重要性を評価するために、９５℃工程の有無について細菌添加血液培養を使用して、コグニターマイナス試験を実施した。試料を以下の３時点でＱＰＣＲにより解析した：試料調製直後；室温で２時間後；およびさらに４℃で１８時間後。目的は、ＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡ安定性の指標として、得られたＣｔ値および３時点にわたるＣｔ値の一貫性を比較することであった。さらなる実験をＵＭＯ  ＥＴＧＡ基質を含有するＬＭを使用して実施して、得られたＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡの安定性が、ＰＴＯ  ＥＴＧＡ基質を含有するＬＭの安定性と異なるかどうかを試験した。
【０１６６】
材料および方法
使用した試薬
試薬Ａ−５％（ｗ／ｖ）サポニン、５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０および１４６ｍＭの塩化ナトリウム
試薬Ｂ−５ｍＭの水酸化ナトリウム。
試薬Ｃ−１０ｍＭのアンモニウム硫酸、２ｍＭのマグネシウム硫酸七水和物、１０ｍＭの塩化カリウムおよび２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］。
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、ｄＮＴＰ、ＰＴＯ−ＩＰＣストックを含む溶解混合物（ＬＭ）：
Ｌ１（３６０ｍＬのＬＭ中の２５２ｍＬ）−１．４６％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．１５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００および０．１５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０；
Ｌ２（３６０ｍＬのＬＭ中の３６ｍＬ）−１００ｍＭのアンモニウム硫酸、２０ｍＭのマグネシウム硫酸七水和物、１００ｍＭの塩化カリウムおよび２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］；
Ｌ３（３６０ｍＬのＬＭ中の３６ｍＬ）−０．１μＭのＰＴＯ−ＡＳオリゴ、０．１μＭのＰＴＯ−Ｓ１オリゴ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．５］、１０ｍＭの塩化カリウムおよび１０μＭのＥＤＴＡ；
１０ｍＭのｄＮＴＰ（３６０ｍＬのＬＭ中の３．６ｍＬ）
ＰＴＯ−ＩＰＣストック（３６０ｍＬのＬＭ中の、〜１８０μＬ）＊注釈：可変濃度
Ｈ２Ｏ（３６０ｍＬのＬＭ中において、〜３２．２２ｍＬ）
【０１６７】
方法１：９５℃工程の有無について、Ｅ．コリが添加された血液ブロスでのコグニターマイナス試験
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）２５９２２ＴＭ）を１８時間３７℃で栄養ブロス中で増殖させた。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ  ＳＡ血液ブロス（ヒツジ血液）にＥ．コリを、およそ１ｘ１０７ｃｆｕ／ｍＬ、１ｘ１０６ｃｆｕ／ｍＬ、１ｘ１０５ｃｆｕ／ｍＬ、１ｘ１０４ｃｆｕ／ｍＬ、および１ｘ１０３ｃｆｕ／ｍＬ播種した。２セットの１ｍｌの試料を、９５℃工程の有無についての試験のために調製した。総生存数（ＴＶＣ）プレートを、ｃｆｕ／ｍＬ値を確認するために調製した。２セットの血液ブロスのみ‘無スパイク’対照（ＮＳＣ）、陽性対照（ブロスのみプラスＤＮＡポリメラーゼ）および陰性対照（ブロスのみ）はまた、合計１６試料を与えるよう調製した（表２を参照されたい）。
【０１６８】
各１ｍＬ試料に、３３０μＬの試薬Ａを加え、５回のチューブ反転により混合した。試料を１５分間室温（およそ１９℃）でインキュベートし、その後３分間７３００ＲＣＦで遠心分離した。遠心分離の後、上清を臨床廃棄物容器にデカントし、開放チューブを無菌ティッシュペーパー上に吸い取った。それぞれのペレットを、７５０μＬの試薬Ｂにチップ混合により再懸濁し、５分間室温でインキュベートした。次に、５００μＬの試薬Ｃを加え、それぞれの試料を３回のチューブ反転により混合した。試料を３分間７３００ＲＣＦで遠心分離した。得られた上清を臨床廃棄物容器にデカントし、開放チューブを無菌ティッシュペーパー上に吸い取った。それぞれのペレットを、５００μＬの試薬Ｃにチップ混合により再懸濁し、ガラスビーズ（０．１ｍｍおよび０．５ｍｍのガラスビーズ）を含有するビーズミールチューブに移し、３分間７３００ＲＣＦで遠心分離した。遠心分離の後、上清をピペットで廃棄物に移した。５０μＬのＬＭを、それぞれの試料に加え、さらなる１０μＬのＤＮＡポリメラーゼ溶液を、陽性対照試料に加えた。試料をその後ディスラプターＧｅｎｉｅへ置き、６分間２８００ｒｐｍで運転した。ビーズ粉砕後、試料を３７℃に設定したヒートブロックに移し、２０分間インキュベートした。
【０１６９】
３７℃の微生物溶解（ＥＴＧＡ）工程後に、９５℃（−）試料（試料９−１６）をすぐにＱＰＣＲセットアップに進め、一方で９５℃（＋）試料（試料１−８）は、ＱＰＣＲセットアップ前に９５℃で、５分間インキュベートした。すぐに両方の試料セットをＱＰＣＲにより解析した。室温（およそ１９℃）で２時間後にまた、およびさらに４℃で１８時間後にまた、同一の試料をＱＰＣＲにより解析した。この実験を４回繰り返して結果の統計分析を可能にした。
表２−試験試料
【表３】
0006768645.tif 000004
ＮＳＣ：無スパイク対照
【０１７０】
方法２：ＰＴＯ  ＥＴＧＡ基質対ＵＭＯ  ＥＴＧＡ基質
ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ血液ブロスＳＡにＥ．コリを、およそ１ｘ１０７ｃｆｕ／ｍＬおよび１ｘ１０４ｃｆｕ／ｍＬ播種した。４セットの１ｍｌの試料を、９５℃工程の有無について、ＰＴＯの使用の有無に関するコグニターマイナス試験結果を比較するために調製した。ＴＶＣプレートを、ｃｆｕ／ｍＬ値を確認するために調製した。ＮＳＣおよび陽性対照もまた、調製した（表３を参照されたい）。上記「方法１」に記載される一般的なプロトコールにより全ての試料を処理した。３７℃の微生物溶解（ＥＴＧＡ）工程後に、９５℃（−）試料（試料９−１６）をすぐにＱＰＣＲセットアップに進め、一方で９５℃（＋）試料（試料１−８）を、ＱＰＣＲセットアップ前に９５℃で、５分間インキュベートした。すぐに両方の試料セットをＱＰＣＲにより解析した。室温で２時間後に、およびさらに４℃で１８時間後にまた、同一の試料をＱＰＣＲにより解析した。
表３−試験試料
【表４】
0006768645.tif 000005
ＮＳＣ：無スパイク対照、ＵＭＯ：未改変のオリゴヌクレオチド、ＰＴＯ：ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＬＭ：溶解混合物
【０１７１】
結果および考察
結果１：９５℃工程の除去は、経時的なシグナルにおける減少なしのＥＴＧＡ  ＱＰＣＲシグナルを改善する
試料調製（ｎ＝３）後の０、２および２０時間で９５℃工程を伴って、または伴わずに処理された試料の結果を図９Ａ−Ｃに示す。個々の実験の中で、９５℃工程の除去は、全てのＥ．コリが添加された血液ブロス希釈液および陽性対照について、Ｃｔ値の減少（ＥＴＧＡシグナルの増加）をもたらした（図９Ａ−Ｃ）。０、２および２０時間で同一の試料について得られたＣｔ値は、９５℃（＋）試料について最大ΔＣｔ値０．０７Ｃｔユニットから１．０７Ｃｔユニットまで（０．３０Ｃｔユニットの平均最大ΔＣｔ値）および９５℃（−）試料について最大ΔＣｔ値０．０３Ｃｔユニットから０．５８Ｃｔユニットまで（０．３８Ｃｔユニットの平均最大ΔＣｔ値）で、３つの反復実験にわたって非常に一貫している。全てのＮＳＣおよび陰性対照は、４０より大きいＣｔ値が得られたか、またはＱＰＣＲ増幅を全く有さなかった（データは示されない）。図１０は、共にプロットされたＥ．コリが添加された血液ブロス試料についての全てのデータを示し、いくつかの傾向が明らかである。第一に、９５℃（−）試料と比較して９５℃（＋）試料のＣｔ値間に、９５℃（−）試料のＣｔ値においておよそ１．０Ｃｔユニット減少しており、明らかな差がある。第二に、９５℃（＋）および９５℃（−）試料の両方について異なる時点で得られたＣｔ値間に非常にわずかな差がある。しかしながら、９５℃工程が除去される場合、貯蔵時間が増加するにつれてＣｔ値における小さい減少があり、図１０における傾向線から明らかであり、実験３（図９Ｂ）においてより明白である。
【０１７２】
線形モデリングを実施して（Ｒを使って）、９５℃工程の有無についての、および異なる時点でのＥ．コリが添加された血液ブロス希釈液系列について得られたＣｔ値間に統計学的に有意差があるかどうかを決定した。表４は、異なる比較のために得られたｐ値を示す。４つの実験全てのデータを使用して、９５℃（＋）試料と９５℃（−）試料についてのＣｔ値の比較は、個々の時点からのデータまたは全ての時点からのデータが解析に含まれているかどうかにかかわらず、高度に有意なｐ値（ｐ＜０．００１）を生じた。４つの全ての実験からのデータを使用する、９５℃（＋）または９５℃（−）データセット内の異なる時点Ｃｔ値の比較は、非有意なｐ値（ｐ＞０．０５）を生じた。同一実験内の時点の比較は、０．０１６のｐ値を有した実験３（Ｔ３）における９５℃（−）データセット以外の全てのデータセットについて非有意なｐ値（ｐ＞０．０５）を生じた。この有意なｐ値は、この特定の実験で観察された時間に伴うＣｔ値における、より顕著な減少に起因しているようである。
表４−異なる時点および９５℃工程の有無についての、Ｅ．コリ添加血液培養希釈系列に関するＣｔ値検量線を比較するための線形モデル（Ｒを使った）。
【表５】
0006768645.tif 000006
有意性コード（Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｃｏｄｅ）：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。−：非有意な。Ｔ：実験。
【０１７３】
結果２：コグニターマイナス結果は、ＵＭＯ  ＬＭよりもむしろＰＴＯ  ＬＭを使用する場合、異なる時点にわたって、より一貫している。
図１１Ａ−Ｂは、Ｅ．コリが添加された血液ブロス試料（１ｘ１０７ｃｆｕ／ｍＬおよび１ｘ１０４ｃｆｕ／ｍＬ）ならびに９５℃工程の有無について、ＵＭＯ  ＬＭ（図１１Ａ）もしくはＰＴＯ  ＬＭ（図１１Ｂ）のいずれかを使用して処理された陽性対照について得られたＣｔ値を示す。ここに示されるデータは、単一の実験からのものである。ＵＭＯ  ＬＭを使用するＮＳＣについてのＣｔ値は全て、１ｘ１０３ｃｆｕ／ｍＬのＥ．コリが添加された血液ブロス試料について得られたＣｔ値より、少なくとも５Ｃｔユニット高いが、ＰＴＯ  ＬＭ  ＮＳＣ  Ｃｔ値は全て、４２．０Ｃｔユニットより大きいか、またはＱＰＣＲ増幅を全く有さなかった（データは示されない）。結果は、ＵＭＯ  ＬＭ試料についてのＣｔ値は、ＰＴＯ  ＬＭ試料についてのＣｔ値より平均１０．２Ｃｔユニット低いことを示す。９５℃工程が除去される場合に、ＰＴＯ  ＬＭ試料についてよりも、ＵＭＯ  ＬＭ試料についてのＣｔ値において、より大きい減少もある。もっとも重要なのは、ＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡ安定性に関して、得られたＵＭＯ  ＬＭ試料についてのＣｔ値は、ＰＴＯ  ＬＭ試料についてのＣｔ値よりも異なる時点にわたって、特に一貫していない。ＵＭＯ  ＬＭ  ９５℃（＋）データセットにおけるＥ．コリが添加された血液ブロス試料についてのＣｔ値は、２時間から２０時間までおよそ１．０Ｃｔユニット増加したが、対応する陽性対照は、Ｃｔ値において０．２４Ｃｔユニットの減少を示した。これは、細菌および／または宿主血液細胞が存在する場合、９５℃工程のタンパク質変性の影響にもかかわらずＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡのヌクレアーゼ消化が試料中で生じ得ることを示すが、ＤＮＡポリメラーゼ酵素のみが加えられた陽性対照においては生じない。９５℃工程が除去される場合に、ＵＭＯ  ＬＭ試料についてのＣｔ値は試料貯蔵時間の増加に伴って減少する。これは、タンパク質変性の非存在下において、継続するＥＴＧＡ鋳型生成は、ヌクレアーゼ消化における任意の増加を打ち負かすことができ、それ故にＥＴＧＡ  ＱＰＣＲシグナルの増加をもたらすことを示す。ＰＴＯ  ＬＭデータ（図１１Ｂ）は、９５℃（＋）および９５℃（−）試料の両方についての全ての時点にわたって非常に一貫しているＣｔ値を示す。これらのデータは、ＰＴＯ基質ＤＮＡから形成されたＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡは、３７℃のＥＴＧＡ反応後のヌクレアーゼ分解および／またはさらなるＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡ生成のいずれかによる変化に対してより耐性であることを示す。
【０１７４】
概要
ここに示されるデータは、９５℃工程が除去される場合に、ＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡ検出が改善されることを示す。さらに、ＥＴＧＡ  ＱＰＣＲシグナルは、９５℃工程の非存在下で試料貯蔵時間の増加と共に劣化しない。ＵＭＯ  ＬＭとＰＴＯ  ＬＭの比較は、ＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡの高い安定性は、ＰＴＯ  ＥＴＧＡ基質ＤＮＡの使用に依存していることを示す。全てのここに示されるデータは、コグニターマイナス試験からの９５℃工程の除去を支持する。試験の感度の増加がバックグラウンドシグナル（血液−由来のＥＴＧＡシグナル）を検出する機会を増加させ得ることは注目に値するが、血液溶解／洗浄性能およびＱＰＣＲ結果の解釈などの他の因子の最適化は、この影響を除去するべきである。
【０１７５】
実施例４−９５℃の重要性およびＰＴＯ基質の使用の解析：主要パネル微生物
目的
この報告に掲載された研究の目的：
１．全ての主要パネル微生物（Ｅ．コリ；Ｓ．アウレウス；およびＣ．アルビカンス）についての、９５℃工程の有無についてのコグニターマイナス結果を比較する
２．ホスホロチオエート改変オリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）ＬＭと未改変のオリゴヌクレオチド（ＵＭＯ）ＬＭ間の比較に関する実施例３の知見を確認する
３．ＰＴＯ  ＬＭおよびＵＭＯ  ＬＭを使用するそれぞれの主要パネル微生物のＱＰＣＲ結果に対する延長した試料貯蔵持続時間（７２時間まで）の効果を試験する
【０１７６】
導入
コグニターマイナス試験における初期段階は、血液細胞を溶解し、かつ非微生物由来のＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡを生産するＤＮＡポリメラーゼ、および微生物由来のＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡを消化し得るヌクレアーゼ酵素などの血液由来のタンパク質を洗い流すことを目指す。このプロセスは、血液試料に存在する任意の微生物に害がないべきである。単離されたインタクトな微生物はその後、溶解混合物（ＬＭ）およびビーズ粉砕物の添加により溶解された。微生物溶解およびＥＴＧＡ反応の後、試料は、微生物タンパク質、ＬＭ成分、新しく合成されたＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡおよび残留している血液細胞タンパク質の混合物を含有する。現在のコグニターマイナス試験プロトコールでは、９５℃工程は、ＱＰＣＲによりうまく検出され得るように、ヌクレアーゼ消化からＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡおよび内部プロセス対照（ＩＰＣ）ＤＮＡを保護するために全てのタンパク質変性させることを意図している。９５℃工程はまた、ＤＮＡポリメラーゼを失活させ、それによってＥＴＧＡ反応を停止する。しかしながら、プロトコールに９５℃工程を組み込んで以来、ＬＭ中でＥＴＧＡ基質（およびＩＰＣ）を形成するために使用されたＵＭＯは、ヌクレアーゼ耐性のＰＴＯに置き換えられた。ＥＴＧＡ鋳型を形成するＥＴＧＡ伸長鎖は標準ｄＮＴＰから構築されるが、それがアニールされたＰＴＯ基質ＤＮＡは、ヌクレアーゼ消化に対する保護を与えることができる。プロトコールの簡素化および試験を実行するために必要な時間の短縮などの、９５℃工程を除去することの利点に起因して、９５℃工程の必要性を再評価することが重要であると考えられた。
【０１７７】
９５℃工程の重要性を評価するために、９５℃工程の有無について微生物添加血液ブロスを使用してコグニターマイナス試験を実施した。試料を以下の５時点でＱＰＣＲにより解析した：試料調製直後；２時間室温（およそ１９℃）で保存した後；および４℃で保存した２４時間、４８時間および７２時間後。得られたＣｔ値および５時点にわたるＣｔ値の一貫性を、ＰＴＯ  ＬＭまたはＵＭＯ  ＬＭのいずれかを使用して、それぞれの主要パネル微生物についてコグニターマイナス試験性能および試料安定性に関する９５℃工程の影響を評価するために使用した。
【０１７８】
材料および方法
試薬の詳細に関して。実施例３を参照されたい。
【０１７９】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）２５９２２ＴＭ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）２５９２３ＴＭ）およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）１０２３１ＴＭ）を、およそ１８時間３７℃で液体培地で増殖させた（栄養ブロスではＥ．コリおよびＳ．アウレウス；ならびにサブロー培地ではＣ．アルビカンス）。ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ  ＳＡ血液ブロス（ヒツジ血液；表６を参照されたい）にＥ．コリ、Ｓ．アウレウスおよびＣ．アルビカンスを、それぞれおよそ１ｘ１０４ｃｆｕ／ｍＬ、１ｘ１０４ｃｆｕ／ｍＬおよび１ｘ１０５ｃｆｕ／ｍＬ播種した。４セットの１ｍｌの試料を、ＰＴＯ  ＬＭおよびＵＭＯ  ＬＭについて９５℃工程の有無についての試験のために調製した。血液ブロスのみ‘無スパイク’対照（ＮＳＣ）および陽性対照（ブロスのみプラスＤＮＡポリメラーゼ（ＰＣ））はまた、合計２０試料を与えるよう調製した（表５を参照されたい）。総生存数（ＴＶＣ）プレートを、ｃｆｕ／ｍＬ値および陰性血液ブロスを確認するために調製した（表７を参照されたい）。
【０１８０】
各１ｍＬ試料に、３３０μＬの試薬Ａを加え、５回のチューブ反転により混合した。試料を１５分間室温（およそ１９℃）でインキュベートし、その後３分間７３００ＲＣＦで遠心分離した。遠心分離の後、上清を臨床廃棄物容器にデカントし、開放チューブを無菌ティッシュペーパー上に吸い取った。それぞれのペレットを、７５０μＬの試薬Ｂにチップ混合により再懸濁し、５分間室温でインキュベートした。次に、５００μＬの試薬Ｃを加え、それぞれの試料を３回のチューブ反転により混合した。試料を３分間７３００ＲＣＦで遠心分離した。得られた上清を臨床廃棄物容器にデカントし、開放チューブを無菌ティッシュペーパー上に吸い取った。それぞれのペレットを、５００μＬの試薬Ｃにチップ混合により再懸濁し、ガラスビーズ（０．１ｍｍおよび０．５ｍｍのガラスビーズ）を含有するビーズミールチューブに移し、３分間７３００ＲＣＦで遠心分離した。遠心分離の後、上清をピペットで廃棄物に移した。５０μＬのＬＭを、それぞれの試料に加え、さらなる１０μＬのＤＮＡポリメラーゼ溶液を、陽性対照試料に加えた。試料をその後ディスラプターＧｅｎｉｅへ置き、６分間２８００ｒｐｍで運転した。ビーズ粉砕後、試料を３７℃に設定したヒートブロックに移し、２０分間インキュベートした。
【０１８１】
３７℃の微生物溶解（ＥＴＧＡ）工程後に、９５℃（−）試料（試料１１−２０）をすぐにＱＰＣＲセットアップに進め、一方で９５℃（＋）試料（試料１−１０）を、ＱＰＣＲセットアップ前に９５℃で、５分間インキュベートした。すぐに両方の試料セットをＱＰＣＲにより解析した。室温で２時間後にまた、ならびに４℃で保存した２４時間、４８時間および７２時間後にまた、同一の試料をＱＰＣＲにより解析した。この実験を３回繰り返して結果の統計分析を可能にした。
表５−試験試料
【表６】
0006768645.tif 000007
ＰＣ：陽性対照、ＮＳＣ：無スパイク対照、ＵＭＯ：未改変のオリゴヌクレオチド、ＰＴＯ：ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＬＭ：溶解混合物
表６−材料
【表７】
0006768645.tif 000008
表７−微生物ＴＶＣ
【表８】
0006768645.tif 000009
【０１８２】
結果および考察
０、２、２４、４８および７２時間の時点での、９５℃工程の有無についてＰＴＯ  ＬＭまたはＵＭＯ  ＬＭのいずれかを使用して処理された試料の結果（ｎ＝３）が、図１２Ａ−Ｅに示される。
【０１８３】
９５℃工程の除去は、ＥＴＧＡ  ＱＰＣＲシグナルを改善する
９５℃工程なしで処理された、全ての微生物添加血液ブロス試料および陽性対照試料は、ＰＴＯ  ＬＭおよびＵＭＯ  ＬＭの両方について、対応する９５℃工程で処理された試料よりもより低いＣｔ値（より強いＥＴＧＡシグナル）を生じた。‘０時間’時点でのＰＴＯ  ＬＭ試料についての平均ΔＣｔ値（９５℃（＋）から９５℃（−）を減算する）は、それぞれＥ．コリ、Ｓ．アウレウスおよびＣ．アルビカンスならびに陽性対照について、０．９８Ｃｔユニット、１．４１Ｃｔユニット、０．１２Ｃｔユニットおよび１．２１Ｃｔユニットであった。‘０時間’時点でのＵＭＯ  ＬＭ試料についての平均ΔＣｔ値（９５℃（＋）から９５℃（−）を減算する）は、それぞれＥ．コリ、Ｓ．アウレウスおよびＣ．アルビカンスならびに陽性対照について、３．９１Ｃｔユニット、４．１０Ｃｔユニット、５．３６Ｃｔユニットおよび１．２０Ｃｔユニットであった。ＰＴＯ  ＬＭで処理されたＮＳＣ試料の大部分は、低いＱＰＣＲ増幅に起因して、Ｃｔ値を生産しなかったので、このデータは図１２Ａ−Ｅに示されない。しかしながら、Ｃｔ値についての十分な増幅の発生率は、９５℃（＋）試料よりも９５℃（−）試料についての方が高かった（２／１５Ｃｔ値と比較して７／１５Ｃｔ値は、貯蔵持続時間について明らかな傾向はなく；および全てのＮＳＣ  ＰＴＯ  ＬＭ  Ｃｔ値は、４２．０Ｃｔユニットと４５．０Ｃｔユニットの間だった）。ＵＭＯ  ＬＭで処理されたＮＳＣ試料は、‘０時間’時点でＣｔ値を生じ、９５℃工程無しで平均０．４２Ｃｔユニット低かった。陽性試料について観察されるシグナルにおける一般的な増加を考慮すると、９５℃工程なしで処理されたＮＳＣ試料についてのＱＰＣＲシグナルにおけるこの増加が予想される。
【０１８４】
コグニターマイナス結果は、ＵＭＯ  ＬＭよりもむしろＰＴＯ  ＬＭを使用する場合に、異なる時点にわたってより一貫した
ＰＴＯ  ＬＭデータセット内では、全ての微生物添加血液ブロス試料および陽性対照試料は、試料が９５℃工程で処理されたかどうかに関わらず、７２時間の貯蔵期間にわたって非常に一貫しているＣｔ値を生じた。ＵＭＯ  ＬＭ  ９５℃（＋）データセット内では、Ｅ．コリ、Ｓ．アウレウスおよび陽性対照試料は、７２時間の貯蔵期間にわたってかなり一貫したＣｔ値を生じた一方で、Ｃ．アルビカンスおよびＮＳＣ試料は、経時的なＣｔ値における増加（ＥＴＧＡシグナルにおける減少）を示した。Ｃ．アルビカンスおよびＮＳＣ試料についてのＣｔ値におけるこの増加は、‘０時間’時点でのこれらの試料についてのより高いＣｔ値により示されるように、開始濃度がより低い場合、ＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡ濃度に対するヌクレアーゼ活性のより大きい影響に起因し得る。ＵＭＯ  ＬＭ  ９５℃（−）試料は、Ｃ．アルビカンスおよびＮＳＣ試料を除くＣｔ値における経時的な減少（ＥＴＧＡ  ＱＰＣＲシグナルにおける増加）を全般に示し、Ｃｔ値が７２時間の期間にわたって非常に一貫していた。これは、９５℃工程（タンパク質変性）なしで処理されたＥ．コリ、Ｓ．アウレウスおよび陽性対照試料について、ＥＴＧＡ反応の継続はＱＰＣＲシグナルの増加をもたらし、任意のヌクレアーゼ活性を打ち負かすことを示す。ヌクレアーゼ分解の影響がより明白であると思われるＣ．アルビカンスおよびＮＳＣ試料では、継続するＥＴＧＡ反応は、この分解に対抗して、経時的により安定なＱＰＣＲシグナルを提供してもよい。
【０１８５】
結果の統計分析
線形モデリングを実施して（Ｒを使って）、ＰＴＯ  ＬＭおよびＵＭＯ  ＬＭ９５℃工程を伴って、または伴わずに異なる時点で処理された試料について得られたＣｔ値間に統計学的に有意差があるかどうかを決定した。それぞれのデータセット（例えばＰＴＯ  ＬＭデータセットのＥ．コリ）に関して、‘Ｃｔ’以下の説明変数およびそれらの相互作用に対してモデル化された：‘Ｌｏｇ１０  ｃｆｕ’、‘時間’、および‘９５℃工程’。非有意（ｐ＞０．０５）相互作用および変数を段階的にモデルから除去し、その結果モデルが単純化された。しかしながら、それらの相互作用のうちのいずれかが有意（ｐ＜０．０５）である場合は非有意変数はモデルから除去しなかった。従って、それぞれのデータセットについての最終的なモデルは、有意な相互作用、有意な変数、および有意な相互作用を形成する非有意な変数のみが含有された。それぞれの変数および相互作用についての有意性コード（Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｃｏｄｅ）は、表８に示される（有意性コード（Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｃｏｄｅ）は、もしモデルから、または最終的なモデルから除去されるならば、モデル単純化の時点でのそれぞれの相互作用または変数についてのｐ値に基づく）。
表８−Ｒにおける線形モデリングを使用する、それぞれの説明変数およびそれらの相互作用のｐ値についての有意性コード（Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｃｏｄｅ）
【表９】
0006768645.tif 000010
有意性コード（Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｃｏｄｅ）：＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５、〜ｐ＜０．１、ＮＳ−非有意な。
【０１８６】
９５℃工程は、ＰＴＯ  ＬＭおよびＵＭＯ  ＬＭを用いる全ての微生物および陽性対照についてのＣｔ値に対して有意な効果を有する。試料貯蔵持続時間（‘時間’および‘時間’相互作用）は、ＰＴＯ  ＬＭを用いるいずれかの微生物または陽性対照についてのＣｔ値に対して有意な効果を有しない；また、ＵＭＯ  ＬＭを用いるＣ．アルビカンスおよび陽性対照について非有意である。しかしながら、試料貯蔵持続時間は、ＵＭＯ  ＬＭを用いるＥ．コリおよびＳ．アウレウスについて有意な変数であり：これらの試料セットにおいて９５℃工程なしで処理された試料についての経時的なＣｔ値において観察された減少に起因する可能性がもっとも高そうである。ＮＳＣ  ＵＭＯ  ＬＭデータセットについて９５℃工程の影響は有意ではない；しかし、試料貯蔵持続時間と９５℃工程（‘時間：９５℃’）の間に有意な相互作用がある。低いＱＰＣＲ増幅の結果としてのＣｔ値の欠如に起因して、ＮＳＣ  ＰＴＯ  ＬＭデータセットに対する統計学的な解析は実施できなかった。
【０１８７】
概要
ここに示されるデータは、９５℃工程が除去される場合に、ＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡ検出が改善されることを示す。さらに、ＥＴＧＡ  ＱＰＣＲシグナルは、試料が、ＰＴＯ  ＥＴＧＡ基質ＤＮＡを使用して処理された場合に、９５℃工程の非存在下で試料貯蔵持続時間の増加と共に劣化しない。ＥＴＧＡシグナルは、試料がＵＭＯ  ＥＴＧＡ基質ＤＮＡを使用して処理された場合に、それほど安定ではなく：９５℃工程の非存在下で、ＥＴＧＡ  ＱＰＣＲシグナルは試料貯蔵持続時間と共に増加し続け；および９５℃工程では、ＥＴＧＡ  ＱＰＣＲシグナルは、ＥＴＧＡ鋳型ＤＮＡの継続する産生を伴わずに、ヌクレアーゼ分解の結果として悪化する可能性がより高い。これらの結果は、実施例３で示された結果と一貫している。
【０１８８】
ここに示されるデータの全ては、コグニターマイナス試験からの９５℃工程の除去を支持し、ＬＭ中のＰＴＯ  ＥＴＧＡ基質ＤＮＡを使用する重要性を確認する。これらの結果はまた、ＰＴＯ  ＬＭを使用して処理された試料を試験結果に対して悪影響なしで、４℃で７２時間まで貯蔵できることも確認する。９５℃工程の除去での試験の感度の増加が、バックグラウンドシグナル（血液由来のＥＴＧＡ  ＱＰＣＲシグナル）を検出する機会を増加させ得ることは、注目に値する。しかしながら、ＮＳＣ  ＰＴＯ  ＬＭ試料は、比較のためのＣｔ値の完全なセットを提供しなかったが（低増幅に起因する）、ＮＳＣ  ＵＭＯ  ＬＭデータセットは、９５℃の除去に関連するＥＴＧＡ  ＱＰＣＲシグナルにおける増加は、陽性試料についてよりも、ＮＳＣについての方がより低いことを示す。さらに、血液溶解／洗浄性能およびＱＰＣＲ結果の解釈などの他の因子の最適化は、この影響を除去するべきである。
【０１８９】
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態により範囲が制限されるものではない。実際に、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な改変は、前述の記述および添付の図面から当業者に明らかとなるだろう。かかる改変は、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図している。さらに、本明細書に記載される全ての実施形態は、広く適用可能で、適切に、任意のおよび全ての他の一貫した実施形態と組み合わせ可能であると考えられる。
【０１９０】
様々な刊行物が本明細書に引用され、これらの開示は、その全体が出典明示により組み込まれる。
【図１−１】
0006768645.tif 000011
【図１−２】
0006768645.tif 000012
【図２】
0006768645.tif 000013
【図３】
0006768645.tif 000014
【図４】
0006768645.tif 000015
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006768645.tif 000019
【図９−１】
0006768645.tif 000020
【図９−２】
0006768645.tif 000021
【図９−３】
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【図１０】
0006768645.tif 000023
【図１１−１】
0006768645.tif 000024
【図１１−２】
0006768645.tif 000025
【図１２−１】
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【図１２−２】
0006768645.tif 000027
【図１２−３】
0006768645.tif 000028
【図１２−４】
0006768645.tif 000029
【図１２−５】
0006768645.tif 000030
【配列表】
0006768645000001.app