(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニーマンピック病Ｃ型の処置用の組成物であって、対象に前記組成物を投与することを含み、前記組成物は、
ボリノスタットと；
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、その塩、またはその組み合わせと；
ポリエチレングリコール４００と；
ＤＭＳＯと；
水と；
を含み、
前記ポリエチレングリコール４００は、組成物の重量に基づいて、３０〜５５重量％の量で存在し、
前記組成物が、１：１〜１０：１０〜７０の：ボリノスタット：２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン：ポリエチレングリコール４００のモル比を含む、
組成物。
【請求項２】
前記ボリノスタットが、０．１〜５００ｍｇ／ｋｇの量で投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが、１０００〜４０，０００ｍｇ／Ｋｇの量で投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ボリノスタット：２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン：ポリエチレングリコール４００のモル比が１：３〜１０：１５〜７０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ボリノスタット：２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン：ポリエチレングリコール４００のモル比が１：３〜８：１５〜７０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ボリノスタット：２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン：ポリエチレングリコール４００のモル比が１：３〜８：１５〜３５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコール４００が、組成物の重量に基づいて３５〜５５重量％の量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコール４００が、組成物の重量に基づいて３５〜５０重量％の量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリエチレングリコール４００が、組成物の重量に基づいて４０〜５０重量％の量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが１３９６Ｄａの平均分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが、グルコピラノース単位あたり０．６７のヒドロキシプロピル基の平均置換数を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＤＭＳＯが、組成物の重量に基づいて５重量％の量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本出願は、神経疾患および全身疾患、タンパク質恒常性／リソゾーム障害などを処置するための組成物および方法に関する。詳細には本出願は、ニーマンピック病Ｃ型を処置する際のヒストン脱アセチル化阻害療法に適した組成物および方法に関する。
【０００２】
関連出願
本出願は、内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１４年６月１２日出願の米国特許仮出願第６２／０１１，５５３号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
背景
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、３種の希少な癌に関して認可された重要な分類の新興治療薬である。ＨＤＡＣｉは、ＨＤＡＣ酵素を遮断してヒストンと非ヒストンタンパク質の両方のアセチル化を促進することによって、複雑な細胞応答を誘発する。遺伝子障害において、ＨＤＡＣｉ誘導性ヒストン修飾は、該当する突然変異遺伝子（複数可）の転写発現を増加または減少させ得るが、シャペロンおよびタンパク質恒常性ネットワークを調整する非ヒストンタンパク質（転写因子およびヒートショックプロテインなど）を通して間接的利益も付与し得る。それらが転写に広範囲の影響を及ぼすため、用量を制限しながらＨＤＡＣｉの有効性を最大にすることが、ＨＤＡＣｉ療法における大きな難題である。ＨＤＡＣｉ投与量を減少させるが全身疾患および大脳疾患の両方の処置もする治療戦略を開発および検証する上で、後者はさらなる難題を提起する。なぜなら、それは血液脳関門を通過する効果的なＨＤＡＣｉ透過を必要とし、一方で脳のＨＤＡＣ機能、そして特に、ＨＤＡＣ３を要するプルキンエ細胞修復を可能にする必要があるからである。
【０００４】
ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）は、Ｎｐｃ１またはＮｐｃ２遺伝子のいずれかの欠損によって誘発される常染色体劣性神経変性疾患である。ＮＰＣ例の９５％は、Ｎｐｃ１の欠損によるものである。Ｎｐｃ１およびＮｐｃ２の両方の生理学的機能は、細胞内コレステロールの輸送にある。これらの遺伝子に欠損のある細胞は、リソゾームからＥＲへのコレステロール輸送が遮断されるため、主に後期エンドソームリソゾーム系にコレステロールを蓄積させる。細胞におけるコレステロール輸送を遮断するＮｐｃ１遺伝子中での点突然変異の挿入は、マウスモデルにおいて神経変性疾患を付与し、Ｎｐｃ１タンパク質機能が疾患に重要であるという確定的な分子上のエビデンスを提供する。ＮＰＣの患者において、進行性の神経変性がＮＰＣ疾患の特質である。疾患の進行は不均一である可能性があり、神経変性による衰弱は１０〜２０年に及ぶ場合があるが、一旦開始すると、致命的転帰に至る。早期の兆候では、脾腫大および肝腫大が共通の提示症状であり、神経認知の衰退および神経筋の変性がそれに続く。
【０００５】
現在、ＮＰＣの唯一の利用可能な処置はミグルスタットであり、それはＺａｖｅｓｃａ（商標）の商品名で販売されるイミノ糖である。それは、スフィンゴ糖脂質の蓄積により生じる別のリソゾーム障害であるゴーシェ病１型を処置するために開発された。ミグルスタットは、スフィンゴ脂質を減少させる基質減少療法として作用する。Ｚａｖｅｓｃａ（商標）は、欧州、カナダおよび日本においてＮＰＣ処置に認可されたが、データが不十分という理由でＦＤＡの認可は拒まれた。それゆえ、Ｚａｖｅｓｃａ（商標）は、米国では保険適用外で処方されている。それは、臨床的神経症状において軽度の改善を与えるが、疾患進行の予防はできない。
【０００６】
２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）は、新興治療薬として治験下にある。ＨＰＢＣＤはコレステロールをキレートし、それゆえＮＰＣの潜在的治療法として提案されたが、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般に全身薬物送達は、主として肝臓および他の体腔臓器系に利益をもたらすが、実質的な神経学的改善のためには中枢神経系（ＣＮＳ）への直接的な薬物送達が必要とされる。しかし直接的なＣＮＳ送達には、複数の欠点が内在する。それは、終生治療における処置上のリスクを増大させ、難聴に関連し、全身疾患への利益をほとんど、または全くもたらさない。本発明者らは、ＮＰＣなどの難病の遺伝子疾患において大脳および全身の両方の欠陥の処置を統合する簡便化された治療的アプローチの必要性があることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
複数の実施形態の簡単な説明
幾つかの実施形態において、特に、ヒト疾患を綿密に模倣する、大脳および全身の両方の欠陥を伴う致命的小脳障害：ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）のネズミモデルの開発および検証に基づいた治療戦略が、本明細書に開示される。
【０００９】
一実施形態において、
疎水性薬物、そのプロドラッグ、その塩、そのアイソフォーム、またはその組み合わせと；
シクロデキストリン、そのプロドラッグ、その塩、またはその組み合わせと；
ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、またはその組み合わせと；
場合により、医薬的に許容し得る担体と、
を含む組成物を、対象に投与することを含む、疾患または損傷を処置または予防するための方法が、提供される。
【００１０】
別の実施形態において、
疎水性薬物、そのプロドラッグ、その塩、そのアイソフォーム、またはその組み合わせと；
シクロデキストリン、そのプロドラッグ、その塩、またはその組み合わせと；
ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、またはその組み合わせと；
場合により、医薬的に許容し得る担体と、
を含む医薬組成物が、提供される。
【００１１】
別の実施形態において、
疎水性薬物、そのプロドラッグ、その塩、そのアイソフォーム、またはその組み合わせと；
シクロデキストリン、そのプロドラッグ、その塩、またはその組み合わせと；
ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、またはその組み合わせと；
場合により、医薬的に許容し得る担体と、
を含む医薬組成物であって、
疎水性薬物が０．１〜５００ｍｇ／ｋｇの投与量で存在し；
シクロデキストリンが１０００〜４０，０００ｍｇ／ｋｇの投与量で存在する、医薬組成物が、提供される。
【００１２】
ＨＤＡＣｉには薬物として大きな関心が寄せられているが、それらの使用の主な欠点は、アポトーシス、細胞周期停止、壊死、オートファジーおよび分化（数例を挙げるのみである）などの多数の細胞内経路に影響を及ぼす核ターゲットの遮断に関連する本質的な毒性である。神経変性に関連して、近年の試験で、ＨＤＡＣ３がプルキンエ細胞細胞の機能に必要であり、それは広範囲の小脳障害において低下していることが示されている。これは、神経変性疾患の処置、特に生存および神経行動学的症状を実質的に改善するのに必要とされることの多い長期処置にＨＤＡＣｉが用いられ得るかどうかという論争を起こした。これは、所与のＨＤＡＣに特異的であるよう設計された阻害剤にも当てはまる。なぜなら単独のＨＤＡＣであっても、数百の遺伝子を調節し得るためである（そしてそれにより選択的ＨＤＡＣｉを合成する価値が討論された）。本発明者らのデータは、脳へのそのアクセスを改善する新規配合剤により、かつ著しい休止期間を伴って、Ｐａｎ−ＨＤＡＣ、例えばボリノスタットが、小脳でプルキンエ細胞および神経突起を実際に修復し得ること、そしてＮＰＣの主要な疾患ドメインである歩行／異所運動／嚥下の損失を遅延させ得ることを示す。薬物による短期間のＨＤＡＣ阻害は、ＨＤＡＣノックアウトよりずっと重篤でない。それゆえ、ＨＤＡＣは必須であり得るが、脳における効果的で間欠的な減少が、長期の治療的価値を生じる可能性を有する。
【００１３】
ボリノスタットはＮＰＣの探索的第一相試験のためのＦＤＡ免除を受け、この試験は１８歳以上の患者を現在集めている（ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２１２４０８３）。これは、特に小脳機能に及ぼすＨＤＡＣｉの影響の警告とのバランスにおいて、動物モデルにおけるボリノスタット（または他のＨＤＡＣｉ）の有効性および神経疾患（モデルまたは患者のいずれか）を処置するためのそれらの潜在力に関する情報がなかったためである。本発明者らのデータは、ボリノスタットは、単独で使用される場合、脳内でのＮＰＣ１転写およびしたがってタンパク質発現を直接刺激するのに、または小脳でのＮＰＣ１タンパク質およびプルキンエ細胞機能を間接的に増大させるのに十分なほどにはマウスの脳に浸透しないことを示唆する。さらに、複合体構造の主要成分ＨＰＢＣＤは胃腸管バリアを通過しないため、脳内のアセチル化活性の刺激は、薬物の経口投与よりもむしろ１つの配合剤での同時投与を必要とする。このことから、ヒト疾患のための処置を導くための、ＨＤＡＣｉのエビデンスに基づく動物試験の重要性が強調される。
【００１４】
先に示された通り、ＣＮＳに注射されたＨＰＢＣＤは、ＮＰＣの治療としても評価されている。注目すべきことに、ＣＮＳ送達は、より高いリスクに関連する。第一相試験において、薬物を直接送達するために脳内に植え込まれるオマヤレザーバーが中止され（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｎｐｄｆ．ｏｒｇ／ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ．ｈｔｍｌ）、腰部穿刺に換えられた（それにより脳に達する薬物の濃度を推定することが困難になった）。ＨＰＢＣＤのＣＮＳ送達は難聴に関連し、かつ全身疾患を処置せず、長期的には、この戦略はＮＰＣの包括的処置を制限し得ることを示唆する。これとは逆に、そして意外なことに、簡便にするためにＴＣＦ（「三剤併用配合剤」）と称されることもある、本明細書に記載される組成物は、神経疾患および全身疾患の両方を処置するがＣＮＳ送達を回避し、このことが処置のリスクを望ましく低減し、患者を世界中で、そしてことによると専門治療センター以外で処置する可能性を大きく拡大する見込みがある。
【００１５】
本発明者らは、ＴＣＦ中のＨＤＡＣｉが、転写産物およびタンパク質の直接的増加によるＮＰＣ１レベルの増加を介して防御し得ることを示す。間接的メカニズム（Ｎｐｃ１転写産物を増加させずにＮＰＣ１タンパク質を安定化するヒートショックプロテインおよびシャペロンの発現増加など）が、役割を担う可能性もある。この点からＴＣＦ中のＨＤＡＣｉは、神経疾患の処置においてシャペロン治療単独よりも高い回復効力を有し得る。ＴＣＦに関して、ＨＰＢＣＤはＧＲＡＳであり、限定数のＮＰＣ患者でのそれらの使用については、有害作用はこれまで報告されていない。ＰＥＧもまた耐容性が良好である。幾つかの実施形態において、本発明者らのボリノスタットの現行の用量１５０ｍｇ／ｍ２は、成人の日用量および回数（血液腫瘍および固形腫瘍では１日あたり６〜９００ｍｇ／ｍ２を５〜３日間２１日間）よりも実質的に少ない。幾つかの実施形態において、ＴＣＦ中での本発明者らのボリノスタット用量は、小児科の１週間の用量以内であるが、小児科の日用量９９ｍｇ／ｍ２（癌処置では２８日間毎日静脈内へ与えられる）を超えている。用量調整が、小児科の処置に必要になり得ると考えられる。しかし幾つかの実施形態において、これらは１．５倍以内であり、連続２日の半用量のＴＣＦ投与で調整され適切な休止期間がそれに続く。異なる処置経路もまた用量に影響を及ぼし得るが、ＴＣＦは、成人および小児の両方の疾患の処置に適用可能であると予測される。
【００１６】
幾つかの実施形態において、ＴＣＦの配合は、ＮＰＣ処置に最適であるように設計された。しかしそれは、神経学的欠損を含むまたは含まない、細胞および臓器内での脂質蓄積およびタンパク質凝集を伴う他のタンパク質恒常性／リソゾーム障害に容易に拡張できる。腹腔内ＨＰＢＣＤ単独はまた、アルツハイマー病のネズミモデルにおいて有益であることが示された。腹腔内ＨＰＢＣＤが神経疾患を改善するメカニズムの原理は依然として不明であるが、脳内の機能的ＨＤＡＣｉ活性を刺激するＴＣＦが、アルツハイマー病の大きな処置意義を提供し得ると予測することは、理に適っている。小脳機能が損なわれるパーキンソン病のような他の神経疾患もまた、ＴＣＦから利益を受ける可能性がある。最後に、ＴＣＦはボリノスタットの血漿暴露を増加させるため、ＴＣＦおよびそれに由来する配合剤は、ヒドロキサマート類（ボリノスタットと、近年になりＦＤＡ認可を受けたパノビノスタットが属する）のＨＤＡＣｉの用量を低下させるために適用され得る。多くて２回のボリノスタット注射（図１）は、ＴＣＦを介するボリノスタット血漿暴露における２〜３倍増加の利益を示さなかったため（図２〜４）、配合がＨＤＡＣｉを、組織透過が改善された状態にする可能性があり、そのことは、ＨＤＡＣｉの用量減少が依然として疾患（腫瘍など）治療における主な難題であるため、重要である。
【００１７】
本発明の他の目的、特色および利点は、以下の詳細な説明から明白となろう。しかし、説明から、本発明の主旨および範囲内で様々な変更および修正が当業者に明白となるため、詳細な説明および具体的実施例が、本発明の具体的実施形態を示していて、例示に過ぎないことが理解されなければならない。
【００１８】
添付の図面は、本明細書の一部を形成しており、特定の実施形態をさらに実証するために含まれており、本発明の限定を意図するものではない。本発明は、これらの図面の１つまたは複数を本明細書に提示された複数の実施形態の説明と組み合わせて参照することによって、より理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスにおける比較組成物および例示的実施形態の分析を示す。
【図２】神経変性および動物生存における比較組成物および例示的実施形態の分析を示す。
【図３】ＮＰＣのネズミ神経行動学的疾患スコア、ならびにＮｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの比較組成物および例示的実施形態の分析を示す。
【図４】Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスにおける肝臓炎症での比較組成物および例示的実施形態の分析を示す。
【図５】Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスでの血漿、肝臓、および脳における比較組成物および例示的実施形態の分析を示す。
【図６】大脳疾患および全身疾患を処置する際のＴＣＦの提案されたモデルの一実施形態を表す。
【図Ｓ１】ＮＰＣマウスの脳におけるヒストンＨ３およびＨ４のアセチル化レベルが健常マウスと類似していたことを示すデータを表す。
【図Ｓ２】１００日目で薬物処置Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの脳に示された様々な炎症マーカのｑＰＣＲ分析を表す。
【図Ｓ３】ＮＰＣマウスおよび健常マウスの神経行動学的スコアと、オペレータ独立性を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
複数の実施形態の詳細な説明
複数の利点を提供する組成物および方法が、本明細書に開示される。１つの利点は、有意に改善された脳タンパク質アセチル化ならびに神経突起およびプルキンエ細胞の保持、神経変性症状の大きな遅延、ならびにマウス寿命の４ヶ月からほぼ９ヶ月への延長に関係する。別の利点は、ＨＤＡＣ阻害剤の血漿濃度上昇に関係する。別の利点は、全身発現の指標である肝臓、および脳の両方におけるＮｐｃ１転写産物レベルの血漿濃度上昇に関係する。別の利点は、保持された小脳プルキンエ細胞内のＮＰＣ１タンパク質レベルの上昇に関係する。別の利点は、血液脳関門を通るＨＤＡＣｉアクセスの改善、ならびに大脳疾患と小脳プルキンエ細胞および神経突起に対する有意な随伴的利益に関する。別の利点は、ＨＤＡＣｉ療法における主な難題である、用量有効性の改善に関する。別の利点は、ニーマンピック病Ｃ型および他の難病における大脳疾患および全身疾患の両方の治療的処置の改善に関する。
【００２１】
疎水性薬物は、特に限定がなく、任意の形態であり得る。薬物形態の非限定的例としては、遊離化合物、その塩、そのプロドラッグ、そのアイソフォーム、またはその任意の組み合わせが挙げられる。
【００２２】
幾つかの実施形態において、疎水性薬物は１種のＨＤＡＣ阻害剤であり、または２種以上のＨＤＡＣ阻害剤の組み合わせである。
【００２３】
幾つかの実施形態において、ＨＤＡＣｉはクラスＩ、クラスＩＩａ、クラスＩＩｂ、もしくはクラスＩＶ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組み合わせである。
【００２４】
幾つかの実施形態において、ＨＤＡＣｉはＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、もしくはＨＤＡＣ８型のクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組み合わせである。
【００２５】
幾つかの実施形態において、ＨＤＡＣｉはＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、もしくはＨＤＡＣ９型のクラスＩＩａ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組み合わせである。
【００２６】
幾つかの実施形態において、ＨＤＡＣｉはＨＤＡＣ６もしくはＨＤＡＣ１０型のクラスＩＩｂ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組み合わせである。
【００２７】
幾つかの実施形態において、ＨＤＡＣｉはＨＤＡＣ１１型のクラスＩＶ  ＨＤＡＣ阻害剤である。
【００２８】
幾つかの実施形態において、ＨＤＡＣｉはクラスＩもしくはクラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組み合わせである。
【００２９】
ＨＤＡＣ阻害剤の非限定的例としては、ヒドロキサム酸、脂肪族酸、ヒドロキサマート、ベンズアミド、チオフェンベンズアミド、ブチラート、酪酸ナトリウム、フェニル酪酸、環状テトラペプチド、トラポキシンＢ、デプシペプチド、環状ペプチド、求電子性ケトン、ダシノスタット／ＬＡＱ−８２４、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ギビノスタット／ＩＴＦ−２３５７、ブフェキサマク、ピロキサミド、スルフォラファン、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）およびその類似体、ミグルスタット／  ＯＧＴ−９１８、ＳＡＨＡ／ボリノスタット／ＭＫ−０６８３／Ｚｏｌｉｎｚａ、エンチノスタット／ＭＳ−２７５、パノビノスタット／ＬＢＨ−５８９、ドロキシノスタット／ＣＭＨ、キシノスタット／ＪＮＪ−２６４８１５８５、ＰＣＩ−２４７８１／ＣＲＡ−０２４７８１、ロミデプシン／ＦＫ２２８／ＦＲ９０１２２８／ＮＳＣ６３０１７６／デプシペプチド、バルプロ酸、ＰＣＩ−３４０５１、ＣＩ−９９４／タセジナリン、Ｍ−３４４、ロシリノスタット／ＡＣＹ−１２１５、アピシジン（ａｐｉｃｉｄｉｎ）、Ｒ−３０６４６５、モセチノスタット／ＭＧＣＤ−０１０３、ベリノスタット／ＰＸＤ−１０１、チダミド／ＣＳ−０５５、アベキシノスタット／ＰＣＩ−２４７８１、ＳＢ−９３９、レスミノスタット／４ＳＣ−２０１、ケベトリン、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、４ＳＣ−２０２、ＣＧ−２００７４５、ＡＣＹ−１２１５、ＭＥ−３４４、ＲＧＦＰ−１３６、ＣＢＨＡ、ＡＮ−９、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００３０】
幾つかの実施形態において、ＨＤＡＣｉは、ヒドロキサマート、ヒドロキサム酸、またはそれらの組み合わせである。
【００３１】
幾つかの実施形態において、ＨＤＡＣｉは、ヒドロキサマート、ヒドロキサム酸、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット／ＰＸＤ−１０１、ＬＡＱ−８２４、パノビノスタット／ＬＢＨ−５８９、ギビノスタット／ＩＴＦ２３５７、ピロキサミド、トリコスタチンＡ、ＣＢＨＡ、またはそれらの組み合わせである。
【００３２】
幾つかの実施形態において、ＨＤＡＣｉは、ボリノスタットである。
【００３３】
２種以上のＨＤＡＣｉの混合物が、可能である。
【００３４】
疎水性薬物の投与量は、特に限定がない。幾つかの実施形態において、疎水性薬物は、０．１〜５００ｍｇ／ｋｇの範囲内の量で投与され得る。この範囲は、０．１、０．５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍｇ／ｋｇを含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、投与量は、５０ｍｇ／ｋｇのネズミ用量に基づいており、公知の通り、ヒト処置のために拡大できる。例えば５０ｍｇ／ｋｇのネズミ用量は、小児では１５０ｍｇ／ｍ２に拡大し得る。そのような拡大は、十分に当業者の技術の範囲内にあり、本明細書の任意の化合物、または複数の化合物に関する任意の投与量に適宜、適用される。
【００３５】
シクロデキストリンは、特に限定がない。シクロデキストリンの幾つかの非限定的例としては、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−α−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは複数が挙げられる。
【００３６】
幾つかの実施形態において、シクロデキストリンはβ−シクロデキストリンである。
【００３７】
幾つかの実施形態において、シクロデキストリンはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００３８】
幾つかの実施形態において、シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００３９】
シクロデキストリンは、当該技術分野で知られる通り、例えばシクロデキストリンの型（α、β、またはγ）、および架橋または非架橋のどちらか、置換または非置換のどちらか、置換度などに応じて、例えば約９７０〜６，０００Ｄａの範囲内の任意の平均分子量を有し得る。したがって、シクロデキストリンは、架橋もしくは非架橋、置換もしくは非置換、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００４０】
分子量を参照すると、前述の範囲は、約９７０、９７２、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０３０、１０５０、１０７０、１０９０、１１００、１１２０、１１４０、１１６０、１１８０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１３７０、１３８０、１３９０、１３９５、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４６０、１４８０、１５００、１６００、１８００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、５０００、６０００Ｄａを含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンであり、１３９６Ｄａの平均分子量を有し得る。幾つかの実施形態において、シクロデキストリンはα−シクロデキストリンであり、９７３Ｄａの平均分子量を有し得る。幾つかの実施形態において、シクロデキストリンはβ−シクロデキストリンであり、１１３５Ｄａの平均分子量を有し得る。幾つかの実施形態において、シクロデキストリンはγ−シクロデキストリンであり、１２９７Ｄａの平均分子量を有し得る。
【００４１】
シクロデキストリンは、置換されている場合、０．５〜３の、置換度またはグルコピラノース単位あたりの平均置換数を有し得る。この範囲は、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．２、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３を含む、それらの間の任意の値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００４２】
シクロデキストリンは、好ましくは水溶性である。シクロデキストリンは、２５℃で約１０ｍｇ／ｍｌ以上の水溶性を有し得る。この範囲は、約１０、２０、４０、６０、１００、２００、３００、４００、５００、６００ｍｇ／ｍｌおよびそれ以上を含む、それらの間の全ての値および部分範囲を含む。
【００４３】
異なるシクロデキストリンの混合物が、可能である。
【００４４】
幾つかの実施形態において、シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンであり、１３９６Ｄａの平均分子量およびグルコピラノース単位あたり０．６７のヒドロキシプロピル基の平均置換数を有する。
【００４５】
シクロデキストリンの投与量は、特に限定がない。幾つかの実施形態において、シクロデキストリンは、１０００〜４０，０００ｍｇ／ｋｇの範囲内の量で投与され得る。この範囲は、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３５００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００ｍｇ／ｋｇを含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを含む。幾つかの実施形態において、投与量は、２０００ｍｇ／ｋｇのネズミ用量に基づいており、公知の通り、ヒト処置のため拡大できる。
【００４６】
幾つかの実施形態において、組成物中で前述のシクロデキストリンの代わりに、またはそれらに加えて、シクロデキストリンの誘導体、例えばいわゆるポリロタキサンを使用することが望ましい場合がある。ポリロタキサンは、β−シクロデキストリンを縫うようにポリマー鎖が伸びて嵩高の末端部分でキャップされた超分子材料の新規分類である。ポリロタキサンは公知であり、ＮＰＣの処置におけるコレステロール蓄積に対抗するための潜在的に有用な治療薬として文献に引用されている。ポリロタキサンの非限定的例としては、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン／プルリオニックを基にしたポリロタキサン、生体分解性プルリオニック／β−シクロデキストリンポリロタキサンなどが挙げられる。ポリロタキサンのこれらのおよび他の例は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｔａｍｕｒａ，  Ａ．  ＆  Ｎ．  Ｙｕｉ，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ４：  ４３５６  （２０１４）、およびＭｏｎｄｊｉｎｏｕ，  Ｙ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １４：  ４１８９−４１９７  （２０１３）に開示されている。
【００４７】
ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコールは、特に限定がない。幾つかの実施形態において、ポリエチレングリコールが用いられる。
【００４８】
ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールの分子量は、特に限定がない。幾つかの実施形態において、分子量は、１００〜６０００Ｄａの範囲内であり得る。この範囲は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３５００、４０００、５０００、６０００Ｄａを含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００４９】
幾つかの実施形態において、ポリエチレングリコールが用いられ、その平均分子量は、１００〜６０００Ｄａの範囲内であり得る。この範囲は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３５００、４０００、５０００、６０００Ｄａを含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００５０】
幾つかの実施形態において、１００〜１０００Ｄａの平均分子量を有するポリエチレングリコールが用いられる。幾つかの実施形態において、２００〜６００の平均分子量を有するポリエチレングリコールが用いられる。幾つかの実施形態において、４００の平均分子量を有するポリエチレングリコールが用いられる。
【００５１】
異なる分子量を有するポリエチレングリコールの混合物が、可能である。
【００５２】
ポリエチレングリコールの量は、特に限定がない。幾つかの実施形態において、ポリエチレングリコールの量は、適宜、組成物の１〜８０重量％の範囲内であり得る。この範囲は、組成物の重量に基づいて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０％を含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００５３】
疎水性薬物：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールの相対的量は、特に限定がない。幾つかの実施形態において、疎水性薬物：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールのモル比は、１〜１００：１〜１０００：１〜１０００であり得る。これらの範囲のそれぞれは、それらの間の全ての値および部分範囲を独立して含む。例えば疎水性薬物に与えられる１〜１００の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００を含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを独立して含む。同様に、シクロデキストリンに与えられる１〜１０００の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００を含むはじ、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを独立して含む。同様に、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールに与えられる１〜１０００の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００を含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを独立して含む。
【００５４】
幾つかの実施形態において、疎水性薬物：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールまたはプロピレングリコールのモル比は、１〜１００：１〜１００：１〜１０００であり得る。これらの範囲のそれぞれは、その中の全ての値および部分範囲を独立して含む。例えば疎水性薬物に与えられる１〜１００の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００を含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを独立して含む。同様に、シクロデキストリンに与えられる１〜１００の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００を含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを独立して含む。同様に、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールに与えられる１〜１０００の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００を含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを独立して含む。
【００５５】
幾つかの実施形態において、組成物は、１〜１０：１〜１０００：１〜１０００の疎水性薬物：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールのモル比範囲を有する。幾つかの実施形態において、組成物は、１〜１０：１〜１００：１〜１０００の疎水性薬物：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールのモル比範囲を有する。
【００５６】
幾つかの実施形態において、組成物は、１：１〜１００：１〜５００の疎水性薬物：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールのモル比範囲を有する。幾つかの実施形態において、組成物は、１：１〜１０：１〜１０００の疎水性薬物：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールのモル比範囲を有する。
【００５７】
幾つかの実施形態において、組成物は、１：５〜１００：１０〜１００の疎水性薬物：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールのモル比範囲を有する。幾つかの実施形態において、組成物は、１：５〜１０：１０〜１００の疎水性薬物：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールのモル比範囲を有する。
【００５８】
幾つかの実施形態において、組成物は、１〜１００：１〜１０００：１〜１０００のＨＤＡＣｉ：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールのモル比で、ＨＤＡＣｉ、シクロデキストリン、およびポリエチレングリコールを含む。幾つかの実施形態において、組成物は、１〜１００：１〜１００：１〜１０００のＨＤＡＣｉ：シクロデキストリン：ポリエチレングリコールのモル比で、ＨＤＡＣｉ、シクロデキストリン、およびポリエチレングリコールを含む。
【００５９】
幾つかの実施形態において、組成物は、１〜１００：１〜１０００：１〜１０００のＨＤＡＣｉ：２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン：ポリエチレングリコール４００のモル比で、ＨＤＡＣｉ、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびポリエチレングリコール４００を含む。幾つかの実施形態において、組成物は、１〜１００：１〜１００：１〜１０００のＨＤＡＣｉ：２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン：ポリエチレングリコール４００のモル比で、ＨＤＡＣｉ、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびポリエチレングリコール４００を含む。
【００６０】
幾つかの実施形態において、組成物は、１〜１００：１〜１０００：１〜１０００のボリノスタット：２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン：ポリエチレングリコール４００のモル比で、ボリノスタット、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびポリエチレングリコール４００を含む。幾つかの実施形態において、組成物は、１〜１００：１〜１００：１〜１０００のボリノスタット：２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン：ポリエチレングリコール４００のモル比で、ボリノスタット、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびポリエチレングリコール４００を含む。
【００６１】
疎水性薬物：シクロデキストリンのモル比は特に限定がなく、適宜、０．００１〜１００の範囲内であり得る。この範囲は、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００を含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００６２】
同様に、疎水性薬物：ポリエチレングリコールのモル比は特に限定がなく、適宜、０．００１〜１００の範囲内であり得る。この範囲は、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００を含む、それらの間の全ての値および部分範囲、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００６３】
幾つかの実施形態において、組成物は、適宜、０．２未満、０．１３以下、０．１３未満、０．００１〜０．２未満、０．００１〜０．１３以下、０．００１〜０．１３未満、０．０１〜０．１５、０．０１〜０．１３以下、０．０１〜０．１３未満、０．０１〜０．１以下、０．０１〜０．１未満、０．０１〜０．０６５以下、０．０１〜０．０６５未満、約０．１３、または約０．０６５の疎水性薬物：シクロデキストリンのモル比を有する。
【００６４】
幾つかの実施形態において、組成物は、適宜、０．２未満、０．１３以下、０．１３未満、０．００１〜０．２未満、０．００１〜０．１３以下、０．００１〜０．１３未満、０．０１〜０．１５、０．０１〜０．１３以下、０．０１〜０．１３未満、０．０１〜０．１以下、０．０１〜０．１未満、０．０１〜０．０６５以下、０．０１〜０．０６５未満、約０．１３、または約０．０６５のＨＤＡＣｉ：シクロデキストリンのモル比を有する。
【００６５】
幾つかの実施形態において、組成物は、適宜、０．２未満、０．１３以下、０．１３未満、０．００１〜０．２未満、０．００１〜０．１３以下、０．００１〜０．１３未満、０．０１〜０．１５、０．０１〜０．１３以下、０．０１〜０．１３未満、０．０１〜０．１以下、０．０１〜０．１未満、０．０１〜０．０６５以下、０．０１〜０．０６５未満、約０．１３、または約０．０６５のボリノスタット：２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのモル比を有する。
【００６６】
幾つかの実施形態において、組成物は、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１５、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．１５、０．０１未満の疎水性薬物：ポリエチレングリコールもしくはプロピレングリコールのモル比、またはそれらの組み合わせを有する。
【００６７】
幾つかの実施形態において、組成物は、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１５、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．１５、０．０１未満の疎水性薬物：ポリエチレングリコールのモル比、またはそれらの組み合わせを有する。
【００６８】
幾つかの実施形態において、組成物は、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１５、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．１５、０．０１未満のＨＤＡＣｉ：ポリエチレングリコール４００のモル比、またはそれらの組み合わせを有する。
【００６９】
幾つかの実施形態において、組成物は、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１５、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．１５、０．０１未満のボリノスタット：ポリエチレングリコール４００のモル比、またはそれらの組み合わせを有する。
【００７０】
幾つかの実施形態において、組成物は、線維芽細胞、他の生物体などを含有しない。
【００７１】
組成物は、ＤＭＳＯを含有し得る、または含有し得ない。幾つかの実施形態において、組成物は、ＤＭＳＯを含有しない。
【００７２】
組成物は、単一用量として投与され得、または組成物の成分が、別々に投与され得る。例えば幾つかの実施形態において、シクロデキストリンは、疎水性薬物およびポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールとは別に投与され得る。幾つかの実施形態において、方法は、疎水性薬物およびポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを投与する前または後に、シクロデキストリンを投与することを含む。幾つかの実施形態において、方法は、シクロデキストリンを、残りの成分を投与する前に投与することを含む。幾つかの実施形態において、方法は、疎水性薬物を別に投与することを含む。しかし好ましくは、組成物は、１つの混合物として投与される。
【００７３】
投与のタイミングは、特に限定がない。例えば投与は、１回、または１回よりも多く行われ得る。幾つかの実施形態において、投与は、周期的に、または実質的に周期的に、例えば１日１回、週に１回、月に１回、それらの数倍、それらの数分の一、またはそれらの組み合わせで実行され得る。幾つかの実施形態において、投与は、１日１回、それらの数倍、それらの数分の一、またはそれらの組み合わせで実行され得る。幾つかの実施形態において、投与は、週に１回、それらの数倍、それらの数分の一、またはそれらの組み合わせで実行され得る。幾つかの実施形態において、投与は、規則的に、例えば処置期間を通して毎週実行され得、またはそれは不規則的に、例えば数週間の間は週に１回、その後、数週間の間は週に２回実行されもしくは全く実行されないなどで、実行され得る。同様に、幾つかの実施形態において、非投与の休止期間が、投与と投与の間に存在し得る。休止期間は、規則的または不規則的に存在し得る。
【００７４】
疾患は、特に限定がない。疾患の非限定的例としては、脳の疾患、大脳損傷、脳および全身の疾患、肝臓が読み出される（ｒｅａｄ  ｏｕｔ）脳および全身の疾患、神経疾患、大脳損傷、カルビンジンの損失もしくはレベル低下に関連する疾患、神経毒、ニーマンピック病、ニーマンピック病Ｃ型、神経変性障害、ＴＢＩ、自閉症、アルツハイマー病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、炎症性障害、神経炎症性障害、リソゾーム貯蔵障害による神経炎症、リソゾーム貯蔵障害、セザリー症候群、多形膠芽腫、骨髄異形成症候群、非小細胞肺癌、ＨＩＶ、非神経疾患、脳腫瘍、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤での処置に応答する疾患、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）の血漿濃度に関係する疾患、ＳＡＨＡでの処置に応答する疾患、ＳＡＨＡの影響が動物モデルで観察される疾患、脳症、てんかん、脳血管疾患、血液脳関門を介する薬物の透過に応答する疾患、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アクチベーター欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、ゴーシェ病（Ｉ〜ＩＩＩ型）、ＧＭ１ガングリオシドーシス、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸蓄積症／ＩＳＳＤ、若年性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症疾患、偽性ハーラーポリジストロフィー／ムコリピドーシスＩＩＩＡ、ＭＰＳＩハーラー症候群、ＭＰＳＩシャイエ症候群、ＭＰＳＩハーラーシャイエ症候群、ＭＰＳＩＩハンター症候群、サンフィリポ症候群、モルキオ症候群、ＭＰＳＩＸヒアルロニダーゼ欠損症、ＭＰＳＶＩマロトーラミー、ＭＰＳＶＩＩスライ症候群、ムコリピドーシスＩ／シアリドーシス、多種スルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、サラ病、テイサックス、ウォルマン病、進行固形腫瘍、治療抵抗性多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病もしくはリンパ腫、進行した血液学的適応症、多発性骨髄腫、固形難治性腫瘍、真性多血症、本態性血小板血症、骨髄線維症、急性心筋梗塞、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、脊髄性筋萎縮症、再発卵巣癌、濾胞性リンパ腫、ハンチントン病、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、サルコーマ、リンパ腫、肺癌、乳癌、再発性もしくは転移性前立腺癌、血液細胞癌、卵巣癌の脾臓転移、またはそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数が挙げられる。
【００７５】
幾つかの実施形態において、組成物は、処置が施される疾患もしくはその症状を処置もしくは改善する用量で、単独で、または適切な担体もしくは賦形剤と混合され得る医薬組成物中で、ヒトまたは他の哺乳動物患者に投与され得る。治療有効用量は、処置が施される疾患またはその症状を処置または改善するのに十分な組成物量を指し得るが、当業者が本明細書内の教示に照らして組成物の必要な投与量を決定し得るように、そのような処置または改善が異なる濃度で実行され得ることは、理解されよう。治療有効用量は、単独で、または他の処置と組み合わせた併用療法として投与され得る。組成物の配合および投与の技術の幾つかの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  （１９９０）に見出され得る。
【００７６】
投与経路は、特に限定がない。適切な投与経路の非限定的例としては、例えば経口、直腸、経粘膜、口腔、膣内、または腸内投与；筋肉内、皮下、髄内注射に加え、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、または眼内注射、そして場合によりデポーまたは持続放出性配合剤を含む、非経口送達を挙げることができる。さらに、標的薬送達システム、例えばリポソーム中で組成物を投与できる。
【００７７】
幾つかの実施形態において、組成物は全身的に投与できるが、他の実施形態において、組成物は局所的に投与できる。例えば幾つかの実施形態において、全身投与は、経口、注射、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、または腹腔内注射であり得る。全身投与としては、経皮または吸入投与も含み得る。
【００７８】
幾つかの実施形態において、組成物は、局所投与され得る。例えば幾つかの実施形態において、局所投与は、特に影響を受けた身体部分への局所注射により、例えば組成物をＣＮＳもしくは脳へ、例えば髄腔内へ、または眼球空間へ、直接注射または輸液することにより、完遂され得る。他の実施形態において、局所投与は、ポンプもしくはマイクロポンプなどの持続放出性デバイス、または組成物を含有しそれを所望のエリアに時間をかけて緩やかに放出するビーズもしくはゲルなどの持続放出性インプラントを植え込むことにより完遂される。
【００７９】
医薬組成物および／または化合物は、それ自体が知られる手法で、例えば従来の混合、溶解、糖剤作製（ｄｒａｇｅｅ−ｎａｋｉｎｇ）、浮揚、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥工程によって、製造され得る。したがって医薬組成物は、活性化合物または組成物を医薬的に使用され得る調製物に加工するのを容易にする賦形剤および助剤を含む、１種または複数の生理学的に許容し得る担体を用いて、従来の手法で配合され得る。適当な配合剤は、選択された投与経路に依存し得る。例えば、眼内投与が意図される組成物は、水性担体と、粘性剤、眼球用緩衝液、ｐＨ緩衝液、等張緩衝液などの１種または複数と、を含み得る。
【００８０】
化合物、その塩、その共鳴形態、プロドラッグ、代謝産物、同位体標識化合物、互変異性体、異性体、および／またはアトロプ異性体のうちの１種または複数の任意の組み合わせが、組成物中で可能である。
【００８１】
注射の場合、組成物および／または化合物は、水性溶液中、好ましくはハンクス液、リンガー液、または生理食塩水緩衝液などの生理学的適合性の緩衝液中で配合され得る。経粘膜投与の場合、浸透され得るバリアに適した透過剤が、適宜、配合剤中で用いられ得る。そのような透過剤は、当該技術分野で知られている。
【００８２】
経口投与の場合、組成物および／または化合物は、活性化合物および／または組成物を当業者に周知の医薬的に許容し得る担体と容易に混和することによって配合され得る。そのような担体は、処置される患者による経口摂取のために、化合物および／または組成物が錠剤、丸薬、糖剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして配合されるようにできる。化合物および／または組成物を固体賦形剤と組み合わせ、場合により得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工して、所望なら適切な助剤を添加した後に、錠剤または糖剤コアを得ることによって、経口用の医薬調製物を得ることができる。適切な賦形剤としては、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース調製物、ポリビニルピロリドンなどの充填剤が挙げられるが、これらに限定されない。所望なら、崩壊剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天もしくはアルギン酸、またはそれらの塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加し得る。
【００８３】
糖剤コアは、適切なコーティングと共に提供される。この目的のために、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を場合により含有する濃縮された糖溶液を、幾つかの実施形態で用いることができる。所望なら同定のためまたは活性化合物または組成物用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、染料または顔料が、錠剤または糖剤コーティングに添加され得る。
【００８４】
経口使用され得る医薬調製物の他の非限定的例としては、ゼラチンで作製される押し嵌め式のカプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑化剤とで作製される軟密封カプセルが挙げられる。押し嵌め式のカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、そして場合により安定化剤と混和された有効成分を含有し得る。軟カプセルにおいて、活性化合物および／または組成物は、脂肪油、液体パラフィンなどの適切な液体に溶解または懸濁され得る。加えて、安定化剤が添加され得る。経口投与用の全ての配合剤は、そのような投与に適した投与量でなければならない。
【００８５】
口腔投与の場合、組成物は、従来の手法で配合される錠剤またはトローチの形態をとり得る。
【００８６】
吸入による投与の場合、化合物および／または組成物は、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用により、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形態で、簡便に送達され得る。加圧されたエアロゾルの場合、投与単位は、調量された量を送達する弁を設けることにより決定され得る。吸入器または注入器中での使用のための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが、化合物の粉末混合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末ベースと、を含んで配合され得る。
【００８７】
化合物および／または組成物は、注射、例えばボーラス注射または連続輸液による非経口投与用に配合され得る。注射用の配合剤は、場合により防腐剤を添加されて、単位投与剤形で、例えばアンプル中で、または反復投与用容器で提供され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）を含有し得る。
【００８８】
非経口投与用の他の医薬配合剤としては、水溶性形態の活性化合物または組成物の水性溶液が挙げられる。加えて、活性化合物または組成物の懸濁液が、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。適切な凍結乾燥溶媒またはビヒクルの非限定的例としては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘性を上昇させる物質、例えばポリイオン性ブロック（共）重合体、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有し得る。場合により懸濁液は、適切な安定化剤、または化合物の溶解度を上昇させる薬剤も含有し得る。
【００８９】
あるいは有効成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば滅菌パイロジェンフリー水での構成用の粉末形態であり得る。
【００９０】
化合物および／または組成物は、例えばカカオバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを含有する、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物中で配合することもできる。
【００９１】
化合物および／または組成物は、デポー調製物としても配合され得る。そのような長期作用配合剤は、植え込み（例えば皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与され得る。こうして例えば、化合物および／または組成物は、適切なポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容し得る油中のエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂と共に、または難溶性の誘導体、例えば難溶性の塩として配合され得る。
【００９２】
医薬組成物は、適切な固相またはゲル相の担体または賦形剤も含み得る。そのような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、および医薬的に許容し得るポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
幾つかの実施形態において、化合物は、医薬的に適合性のある対イオンとの塩として提供され得る。医薬的適合性の塩は、非限定的に塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などの多くの酸、または塩基と形成され得る。医薬的に許容し得る塩の非限定的例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩およびマレイン酸塩などが挙げられる。
【００９４】
一般に医薬組成物は、意図する目的を実現するのに有効な量で１種または複数の活性化合物を含有する。一実施形態において、医薬的有効量は、疾患を有すると分かっている対象、または疾患を有する疑いがある対象、または疾患を有するリスクのある対象において、その疾患の発生または進行を予防または阻害するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、本明細書内の教示に照らして当業者の能力内で行われる。
【００９５】
特許請求の範囲および／または特許明細書内で用語「含まれる」と共に用いられる場合の言語「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１」を意味するが、「１または複数」、「少なくとも１」、および「１または１を超える」の意味とも一致する。
【００９６】
用語「約」は、値が誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
【００９７】
他に明確に示されない限り用語「または」は、代替物のみを指す「および／または」を意味するか、または代替物は互いに排他的であるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。
【００９８】
用語「実施形態」または「（複数の）実施形態」は、それぞれ同一または異なる実施形態の１つまたは複数を指し得る。さらに、実施形態に関して用語「含んでいる」、「包含している」、「有する」などは、同義語である。用語「三剤併用配合剤」および「ＴＣＲ」は、本明細書において、簡便さのために用いられ、限定を意図するものではない。それゆえ三剤併用配合剤、ＴＣＲ、またはその他のいずれで称されるかにかかわらず、実施形態の範囲は、特許請求の範囲およびその均等物によって定義される。
【００９９】
実施例
材料と方法
試験計画
本試験では、特に、マウスモデルにおいて、ニーマンピック病Ｃ型の処置のためのＨＤＡＣｉであるボリノスタット（Ｖｏ）の有効性を評価した。Ｖｏは、インビトロで増殖させた皮膚線維芽細胞中の細胞内コレステロール負荷を減少させることに有効であることが見出されたが、ＮＰＣマウスに投与された場合に任意の生存利益を有さなかった。本発明者らは、Ｖｏの低い溶解度、低い血漿暴露および血液脳関門を通る少ない透過が、動物におけるその無効さの背後にある考えられる理由であると仮定した。これらの制限を克服するために、本発明者らは、ＨＰＢＣＤを賦形剤として使用し、Ｖｏ、ＨＰＢＣＤおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する配合剤を作製し、それを三剤併用配合剤（ＴＣＦ）と命名した。ＴＣＦの影響を、示された月齢のＮＰＣマウスにおいて異なる分子学的、生化学的、組織学的および神経行動学的測定を利用して評価した。生存および神経行動学的テストの場合、マウス８〜１０匹を、薬物を注射する群で用いた。少なくとも６匹を、ビヒクル処置群で用いた。生存試験のエンドポイントは、３０％以上の体重減少で設定した。分子学的、生化学的、組織学的分析では、少なくとも３〜４匹のマウスを、各アッセイにおいて少なくとも２つの技術的反復測定で使用した。動物は、無作為に処置群に割り付けた。各群に同数の雄および雌が含まれた。マウスにおける２つの独立したＰＫ実験を、それぞれ１群あたり５匹のマウスを含んで実施した。神経行動学的スコアリングシステムの信頼性および頑健性は、２名の盲検化された研究者が評価した。研究者は、薬物注射に関して盲検化され、神経行動学的機能を評価した。血漿試料中のＶｏの測定は、米国インディアナ州パデュー大学のＭｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにて、盲検化された研究者によって実行された。試料のサイズは、過去の実験または他者が実行した類似の試験に基づいて選択された。全てのデータポイントが統計解析で使用された。
【０１００】
材料
ＨＰＢＣＤ粉末（Ｈ１０７）およびＰＥＧ４００を含む全てのファインケミカルは、他に断りがなければ、Ｓｉｇｍａ（米国ミズーリ州セントルイス所在）から得た。ボリノスタットは、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（米国テキサス州ヒューストン所在）から得た。ＤＭＥＭおよびトリプシンは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国ニューヨーク州ニューヨーク所在）から得た。ＦＢＳは、ＡＴＣＣから入手した。ｑＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（米国カリフォルニア州カールスバッド所在）から購入した。
【０１０１】
動物
Ｎｐｃ１遺伝子における１００５位（Ｄ１００５Ｇ）のアスパラギン酸からグリシンへの突然変異を含むＢＡＬＢ／ｃ系統であるＮｐｃ１ｎｍｆ１６４を、ＮＰＣ疾患モデルとして用いた（Ｍａｕｅ，  Ｒ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２１  ：  ７３０−７５０  （２０１２））。動物が病気に罹って、ホールダー上で提供される飼料に到達できない場合、通常飼料（２０１９  Ｔｅｋｌａｄ  ｄｉｅｔ，  Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、インディアナ州インディアナポリス所在）を、ＤｉｅｔＧｅｌ  ７６Ａ（Ｃｌｅａｒ  Ｈ２Ｏ、メイン州ポートランド所在）と置き換えた。マウスでの試験を、米国インディアナ州ノートルダム大学のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅから認可および承認を受けて実施した。
【０１０２】
薬物の調製およびマウスへの注射
ボリノスタット（５０ｍｇ／Ｋｇ）  −  ボリノスタットを最初、ＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍｌ）中に溶解し、その後、９容量のポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ）で希釈した。この薬物溶液を「溶液Ａ」と命名した。溶液Ａを同容量の水で希釈し、各成分の最終濃度を以下の通りにした；ボリノスタット  ５ｍｇ／ｍｌ；ＤＭＳＯ  ５％；ＰＥＧ  ４５％。２１日目から開始して週１回、マウスに腹腔内（ｉ．ｐ）注射した。ボリノスタット（１００ｍｇ／Ｋｇ）  −  ボリノスタットを最初、ＤＭＳＯ（２００ｍｇ／ｍｌ）中に溶解し、その後、９容量のＰＥＧと混合した。方法および注射計画の残りは、先に記載された通りであった。ＨＰＢＣＤ（４０００ｍｇ／Ｋｇ）  −  水で調製された４０％ＨＰＢＣＤ溶液。７日目から開始して週１回、マウスにｉ．ｐ注射した。ＨＰＢＣＤ（２０００ｍｇ／Ｋｇ）  −  水で調製された２０％ＨＰＢＣＤ溶液。７日目から開始して週１回、マウスにｉ．ｐ注射した。ＴＣＦ（ボリノスタット５０ｍｇ／Ｋｇ＋ＨＰＢＣＤ  ２０００ｍｇ／Ｋｇ、ＤＭＳＯ  ５％＋ＰＥＧ  ４５％）  −  配合剤を調製するために、「溶液Ａ」を先に記載された通り最初に調製し、同容量の４０％ＨＰＢＣＤ溶液を、その上に緩やかに層化させた。溶液を、中速に設定されたロッカー上で、室温で１０分間穏やかに混合した。配合剤中の各成分の最終濃度は、以下の通りであった；ボリノスタット  ５ｍｇ／ｍｌ；ＤＭＳＯ  ５％；ＰＥＧ  ４５％；およびＨＰＢＣＤ  ２０％。７日目および１５日目に、マウスにＨＰＢＣＤ（２０００ｍｇ／Ｋｇ）を２回ｉ．ｐ投与した。ＴＣＦのｉ．ｐ注射を、２１日から開始して週１回マウスに与えた。ビヒクル対照（５％ＤＭＳＯおよび４５％ＰＥＧ）  −  １容量のＤＭＳＯを９容量のＰＥＧと混合しそれから同量の水で希釈することにより作製した。２１日から開始して週１回、マウスにｉ．ｐ注射を与えた。薬物溶液は全て、−８０℃に貯蔵した。凍結原液の新しいバイアルを、異なる日に注射用に解凍した。処置群にわたり注射容量は、１０ｍｌ／Ｋｇ体重であった。マーカ分析のために、マウスを１００日目に殺処分し、臓器を採取した。生存試験のために、死亡するまで注射を継続した。死亡は、動物が死亡したまたは最大体重の３０％以上を喪失した、またはＤｉｅｔＧｅｌ  ７Ａ（Ｃｌｅａｒ  Ｈ２Ｏ、メイン州ポートランド所在）を提供した後でも摂食もしくは飲水が不可能であると見出された場合と定義した。
【０１０３】
定量的ＰＣＲ
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ１−Ｓｔｅｐ  ＫｉｔおよびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国グランドアイランド所在）を用いて実施した。Ｇａｐｄｈ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）を、内因性対照として用いた。転写産物の相対量を、比較ＣＴ法を利用して測定した。未処置Ｎｐｃ１＋／−を参照として用いた。
【０１０４】
臓器採取および免疫蛍光アッセイ
ＣＯ２を用いる窒息により、マウスを殺処分した。採取された臓器は、１０％中性緩衝ホルマリン（約４％ホルムアルデヒド）中に室温で２４時間浸漬して固定した。その後、臓器は、パラフィンに移すまで、７０％アルコール中に室温で貯蔵した。パラフィンに包埋された組織切片（４〜５μｍ）を、キシレンおよびアルコール中で脱ロウさせた。パラフィン除去された試料を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で０．０５％プロテイナーゼＫ（Ｄａｋｏ、ドイツ所在）と共に室温で８分間プレインキュベートすることにより、カルビンジン抗原賦活化を実施した。切片を酸性条件で３０分間煮沸させることにより、ＣＴＳＳおよびＮＰＣ１を賦活化した。２％ヤギ血清（カルビンジンおよびＮＰＣ１の場合）または２％ウサギ血清（カテプシンＳの場合）のいずれかを用いて、室温で３０分間ブロッキングを実施した。切片を抗カルビンジン（１：１０００、Ｃ９８４８、Ｓｉｇｍａ）、抗カテプシンＳ（２０μｇ／ｍｌ、Ｍ−１９、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗−ＮＰＣ１（ヒトＮＰＣ１タンパク質に対して特別に作製、２０μｇ／ｍｌ）と共に４℃で一晩インキュベートした。適切なＦＩＴＣまたはＴＲＩＴＣコンジュゲート二次ＩｇＧ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、米国オハイオ州ソロン所在）抗体を、１：２００希釈で使用した。切片を次に、ＤＡＰＩ（０．５μｇ／ｍｌ）を含有するＰＢＳで洗浄した。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、封入剤として用い、蛍光顕微鏡測定用に処理した。
【０１０５】
ヒストンアセチル化
Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウス（６〜７週齢）に、ボリノスタット（５０ｍｇ／Ｋｇ）またはＴＣＦのいずれかをｉ．ｐ経路で注射した。マウスを、１ｈｐｉ（注射後１時間目）にＣＯ２を用いる窒息により殺処分した。組織をホモジナイズした後、製造業者の使用説明書により、ヒストンをＥｐｉＱｕｉｋ  Ｔｏｔａｌ  Ｈｉｓｔｏｎｅ抽出キット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ、米国ニューヨーク州所在）を用いて抽出した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国カリフォルニア州所在）からのヒストンＨ３（Ｌｙｓ１４）およびＨ４（Ｌｙｓ５／８／１２／１６）に対する抗体を、ウェスタンブロットで用いた。
【０１０６】
マウス線維芽細胞の培養および薬物処置
耳介を７０％アルコールで洗浄し、２〜３枚の小片（３×３ｍｍ）を切り出して７０％アルコール中に２分間入れ、ＤＭＥＭに移した。組織を小片に刻んで、０．２５％トリプシン２ｍｌを添加して２分間、激しくボルテックス処理し、１０分ごとにボルテックス処理しながら３７℃でインキュベートした。培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）２ｍｌを添加することによって、トリプシンを不活性化した。遠心分離（１０００ｒｐｍで５分間）により細胞を回収して、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）の存在下、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で増殖させた。ボリノスタットで処理するために、線維芽細胞（４×１０４）を、スライドガラスを含む２４ウェルプレート中に入れた。Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４線維芽細胞を、５μＭボリノスタットで４８時間処理した。０．０２５％ＤＭＳＯと共にインキュベートされた細胞を、ビヒクル対照として用いた。細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、フィリピン（１００μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートしてコレステロールを染色した。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてスライドを封入し、蛍光顕微鏡測定用に処理した。
【０１０７】
蛍光顕微鏡測定
ＩＦＡ後の組織切片およびフィリピン染色された線維芽細胞を、４０倍油浸対物レンズ（ＮＡ１．３５）で視覚化した。フィリピン染色を、ＤＡＰＩフィルターを用いて視覚化した。デジタル画像の回収を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ倒立蛍光顕微鏡およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（米国ワシントン州シアトル所在）からのＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎソフトウエアにより操作されるＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｘ冷却ＣＣＤカメラ（ＣＨ３５０／ＬＣＣＤ）を用いて実施した。ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎソフトウエア（ｓｏｆｔＷｏＲｘ）を用いて、これらの画像をデコンボルブした。画像は、単一の光学区分である。ＩｍａｇｅＪソフトウエア（ＮＩＨ，米国メリーランド州所在）を用いて、画像を解析した。
【０１０８】
マウスにおけるボリノスタットの分析
Ｎｐｃｌ＋／ｎｍｆ１６４マウス（６〜７週齢）に、ｉ．ｐ経路でＰＥＧ中のボリノスタット（５０ｍｇ／Ｋｇ）またはＴＣＦのいずれかを注射した。マウスを、ＣＯ２を用いる窒息により１ｈｐｉに殺処分した。全ての血液を、１００μｌヘパリンの存在下で心穿刺により採取し、Ｋ２ＥＤＴＡ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ試験管（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国イリノイ州シカゴ所在）に移した。直ちに血液を４℃、１５００ｇで１５分間遠心分離した。血漿を分離管に移して、直ちに液体窒素中で急速冷凍し、分析まで−８０℃で貯蔵した。
【０１０９】
ボリノスタットの分析では、血漿５０μｌ容量に、２ｎｇの重水素内部標準（ｄ５−ボリノスタット、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、カナダ、オンタリオ州所在）を添加した後、液体抽出した。それぞれに、１ｍｌの低温アセトニトリルを添加してタンパク質を沈殿させた後、上清を採取し、真空濃縮器を用いて乾燥させた。ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析の前に、各試料を５０％水／５０％アセトニトリル  １００μｌ中で再構成した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４６０シリーズ  ＱＱＱ質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを用いて、各試料中のボリノスタットを分析した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＸＢＤ−Ｃ１８  ２．１ｍｍ×５０ｍｍ、３．５μｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ所在）を、ＨＰＬＣ分離用に用いた。緩衝液は、（Ａ）水＋０．１％ギ酸、および（Ｂ）アセトニトリル＋０．１％ギ酸であった。直線ＬＣ勾配は、以下の通りであった：０分目  ５％Ｂ；１分目  ５％Ｂ；１０分目  ９５％Ｂ；１１分目  ９５％Ｂ；１２分目  ５％Ｂ；１５分目  ５％Ｂ。ボリノスタット／ｄ５−ボリノスタットの保持時間は、６．７分であった。多重反応モニタリングを、ＭＳ／ＭＳ分析に利用した。ボリノスタットで以下の移行をモニタリングすることにより、ポジティブエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）モードでデータを獲得した：５Ｖの衝突エネルギーで２６５→２３２、５Ｖの衝突エネルギーで２６５→１７２、および４０Ｖの衝突エネルギーで２６５→５５。ｄ５−ボリノスタットでは、以下の移行をモニタリングすることによりデータを獲得した：５Ｖの衝突エネルギーで２７０→２３７、５Ｖの衝突エネルギーで２７０→１７２、および４０Ｖの衝突エネルギーで２７０→５５。ジェットストリームＥＳＩインターフェース（Ｔｈｅ  ｊｅｔ  ｓｔｒｅａｍ  ＥＳＩ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）は、気体温度３２５℃、気体流速８Ｌ／分、ネブライザーの圧力４５ｐｓｉ、シースガス温度２７５℃、シースガス流速７Ｌ／分、キャピラリー電圧４０００Ｖ、およびノズル電圧１０００Ｖを有した。データは全て、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウエア（ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｂ．０６）を用いて獲得および分析した。マウス血漿中の最終的な薬物の計算では、全容量へのヘパリンの寄与を差し引いた後、数値をプロットした。
【０１１０】
マウスの神経行動学的評価
過去に記載された方法（Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）の改変法を、マウスにおける神経行動学的機能を評価するために用いた。マウスの神経行動学的機能に関連する６つの異なるパラメータ（図３Ａ）を、評価した。各マウスを、格子床の観察ボックス（長さ３１．８ｃｍ、幅１９．８ｃｍ、高さ１０．５ｃｍ）中で個別に評価した。マウスを、振戦（０および２）、体位（０、１および２）、歩行（０、１および２）、グルーミング（０、１および２）、四肢の緊張度（０、１および２）、および体重減少（０、１、２および３）について評価した。同等のヒト症状と共に評価のより詳細な説明を、図３Ａに示す。体重以外の各症状について、マウスは、症状が観察されなければスコア０を、機能において最も重度の損傷が観察されればスコア２を受けた。マウスは、５％未満の体重減少でスコア０を、５〜１０％の減少なら１を、１０％を超え２０％以下なら２を、２０％を超え３０％以下なら３を与えられた。０〜３の累積スコアは神経行動学的損傷がないことに相関し、スコア１３は最も損傷された神経行動学的機能である。オペレータ独立性のスコア付けも、ＮＰＣ６匹（Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４）および健常対照（Ｎｐｃｌ＋／ｎｍｆ１６４）マウス４匹について、２名の独立した盲検化オペレータがテストした。
【０１１１】
統計学的検定
ログランク検定を行い、統計学的有意性を決定した。断りがなければ、示された結果は平均±ＳＥＭである。スチューデントｔ検定を実施し、両側解析を利用してデータの統計学的有意性を決定した。ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【０１１２】
結果
細胞試験は、ＨＤＡＣｉが組織培養におけるＮＰＣ細胞中の細胞内コレステロールをＮＰＣ１の発現増加と同時に減少させることを過去に示しているが、動物全体における影響は、検証されていなかった。本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊにおいて近年記載されたＮｐｃ１ｎｍｆ１６４（Ｍａｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）に由来するＮｐｃ１ｎｍｆ１６４ＢＡＬＢ／ｃ系統（Ａｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）を使用した。突然変異は、１００５位でアスパラギン酸からグリシンへの変化（Ｄ１００５Ｇ）を生じる１つのヌクレオチド変化（ｃＤＮＡ  ｂｐ３１６３でのＡからＧへ）であり、これがタンパク質を不安定化してその結果ＮＰＣ１の活性およびレベルが一部損失する。このモデルにおける疾患進行（約１２０日間にわたってモニタリング）はヒト疾患を密接に模倣し、ここで神経変性が主な死因である。
【０１１３】
図１Ａに示された通り、突然変異体Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４動物からの皮膚線維芽細胞は、ヘテロ接合体または野生型対応物に比較して、より低レベルのＮＰＣ１タンパク質を発現する。それゆえ突然変異体線維芽細胞は、高レベルのコレステロールを蓄積し、それはボリノスタットの存在下で減少し（図１Ｂ）、ＨＤＡＣｉ療法への細胞応答性が確認される。動物を処置するために、本発明者らは、癌のネズミモデルを処置するのに用いられるレベルよりも顕著に低い（１００〜２００％）、控えめな用量の５０ｍｇ／Ｋｇボリノスタットを選択した。規模を、マウスでの５０ｍｇ／Ｋｇからヒト小児での１５０ｍｇ／ｍ２に置き換え、これは報告される１週あたりの合計静脈内小児用量３９６ｍｇ／ｍ２よりも十分に低い。本発明者らは、数ヶ月にわたる生存をモニタリングする予定であったため、注射回数は週に１回に制限した。連続ＨＤＡＣ阻害は神経（特に小脳）機能を悪化させ得るため、これによって、所望の休止期間（毎週）も可能になった。ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ）中に可溶化されたボリノスタットを最初、離乳後２１日目に投与し、動物の生涯を通して週に１回それを維持した。マウスにおける５０ｍｇ／Ｋｇでは、動物の生存への有意に有益な影響はなかった（図１Ｃ）。マウスにおいて１００ｍｇ／Ｋｇ（ヒト用量３００ｍｇ／ｍ２と同等）まで用量を倍増させても、生存の利益を示さなかった（図１Ｃ）。これらのデータから、培養細胞でのボリノスタット活性にもかかわらず、小児患者における用量に近づく週１回用量は、離乳直後から開始して動物の生涯を通して維持された４ヶ月の処置の後でさえ、マウスにおける神経疾患を低減するのに不十分であったことが示唆された。
【０１１４】
ボリノスタットは水溶液中の溶解度が低く、それゆえ生物薬剤学分類システム（ＢＣＳ）クラス４薬物と分類される（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ）。本発明者らは、血漿からのその急速なクリアランスが暴露を制限し、したがって血液脳関門の効果的通過を制限し得ると推論した。それゆえ本発明者らは、ＰＥＧ中の低レベルのボリノスタット（５０ｍｇ／Ｋｇ）がＨＰＢＣＤ（２０００ｍｇ／Ｋｇ）と複合体化される（最終モル比０．１３で）配合剤を開発して、三剤併用配合剤（ＴＣＦ；図１Ｄに略図で示す）を作製した。ＨＰＢＣＤは疎水性内部コアおよび親水性外部表面を有し、かつ疎水性化合物と複合体化してそれらの溶解度および生物学的利用度を増強するため、本発明者らは、ＨＰＢＣＤを選択した。加えて、全身送達される場合、ＨＰＢＣＤは血液脳関門を通過しないが、肝臓疾患を改善し、４０００ｍｇ／Ｋｇという高濃度では、主に抗炎症作用を促進することによって神経疾患にも部分的に利益をもたらす。したがってそれは、間接的なメカニズム、および補助的なボリノスタットの（ｎｐｃ１発現の）直接作用を通して、肝臓（および全身）疾患に利益をもたらすと予測される。ＰＥＧは、ＨＰＢＣＤからのボリノスタットの放出を容易にし、生物学的利用度を改善するために保持された。ＰＥＧはまた、破壊された内皮膜の治癒を改善することによって、ＢＢＢ炎症を低減することにも寄与し得る。
【０１１５】
ボリノスタット、ＨＰＢＣＤ、およびＰＥＧを含有するＴＣＦは、ＣＮＳ送達を迂回しながら神経疾患および全身疾患の両方を処置するように設計された。図１Ｅ〜Ｆに示された通り、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路を介する投与の１時間以内に、ビヒクル対照（ＰＥＧ＋ＤＭＳＯ）またはＨＰＢＣＤのいずれも、脳内のヒストン３または４（Ｈ３またはＨ４）のどちらかの有意なアセチル化を刺激しなかった。ＰＥＧ中のボリノスタット（５０ｍｇ／Ｋｇ）は低レベルのアセチル化をもたらしたが、ＴＣＦの投与により、アセチル化はヒストンＨ３では２〜３倍（ｐ＜０．０５）、そしてＨ４では５〜９倍（ｐ＜０．０５）まで刺激された（図１Ｅ〜Ｆ）。ＮＰＣマウスの脳におけるアセチル化ヒストンＨ３およびＨ４の基本レベルは、健常なヘテロ接合突然変異体マウスと同様であった（図Ｓ１）。これらのデータから、ヒストンアセチル化の増加によって測定された通り、脳内で、ＴＣＦがボリノスタット活性の機能的生成レベルを刺激したことが確定され、神経疾患を処置する能力の改善が示唆される。
【０１１６】
長期処置の影響を比較するために、マウスにＴＣＦまたは４０００ｍｇ／Ｋｇ  ＨＰＢＣＤ（ＴＣＦ中に組み込まれたレベルの２倍に相当するため、２×ＨＰＢＣＤとも表す）、ＰＥＧ中の５０ｍｇ／Ｋｇボリノスタットまたはｍｏｃｋ注射（ＰＥＧ＋ＤＭＳＯ）を週１回投与した。動物組織の比較分析を１００日目に行ったが、それは過去の試験でこれが徴候的疾患の期間であることが示唆されたためである（未処置のＮｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスは約１２５日までに死亡した）。図２Ａに示された通り、脳内でＴＣＦは、小脳の分子層に拡張するプルキンエ細胞体および神経突起のマーカであるカルビンジンの発現増加を刺激した。ボリノスタット単独または２×ＨＰＢＣＤは、カルビンジン転写産物レベルの不変または低下を示した。それと一致して、ＴＣＦはプルキンエ細胞の２５〜３０％を回復させたが（ｐ＜０．００１）、ボリノスタット単独では影響を有さなかった（図２Ｂ）。２×ＨＰＢＣＤはプルキンエ細胞のわずかな防御をもたらし、そのメカニズムは未知であるが、ＨＰＢＣＤがＢＢＢを通過するためではない。３種の炎症マーカＧＦＡＰ、ＭＩＰ１αおよびＣＤ６８の分析から、２×ＨＰＢＣＤが脳内でそれらのレベルをＴＣＦと同等に、そしてＶｏよりも良好に低下させることが示唆された（図Ｓ２）。これもまた、ＨＰＢＣＤが神経炎症の低減に一部効果的であるという過去の試験と一致している。さらに本発明者らのデータは、ＴＣＦ中のボリノスタットおよびＨＰＢＣＤは、この組み合わせが２×ＨＰＢＣＤ（ＨＰＢＣＤ単独に対して付加的であると予測された）よりもかなり有効であることから、神経炎症の低減において相乗作用し得ることを示唆する。それゆえ要約すると、脳内のアセチル化活性および組織病理分析のデータを合わせることによって、本発明者らは、ＴＣＦの神経保護能力は脳内のボリノスタット活性上昇と、炎症を包括的に減少させるボリノスタットおよびＨＰＢＣＤの組み合わせた効果と、に関連したと結論づけた（図Ｓ２）。
【０１１７】
本発明者らは次に、大脳病理における改善が、致命的神経変性状態の重要な基準である、生存の改善と相関し得るか否かを評価した。図２Ｃに示された通り、ＴＣＦ処置マウスの寿命中央値は、ＰＥＧ中のボリノスタットで処置された動物の約２００％であった（２５４日対１３４日、ｐ＜０．００１）。これに対して２×ＨＰＢＣＤは、生存を三分の一増加させ（１８０日対１３４日、ｐ＜０．００１）、ボリノスタット単独またはビヒクルで処置した動物は、有意な生存利益を示さなかった。ＴＣＦは、マウスの両方の性に対して同等に効果的であり、雄（２４９日）および雌（２５８日；図２Ｄ、Ｅ）で同等の寿命中央値であった。ＴＣＦ処置動物は９ヶ月〜１０ヶ月まで生存でき、このことは、この時間枠でのマウスがかなりの高齢になるという状況において注目に値する。ＴＣＦ処置動物における生存の改善は、脳内ボリノスタット活性を刺激し神経変性を予防することにおいて三剤併用作用と相関した。
【０１１８】
臨床的にＮＰＣ疾患は、主要な症候性ドメイン（ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎｓ）と微細な症候性ドメインによって定義され、それらの重症度を、少なくとも３つの異なるスケールを利用してスコア付けして、疾患の自然歴をモニタリングしている。血漿バイオマーカが現れつつあるが、症状の定量的評価は、引き続き重要な疾患進行指数であり、累積スコアの集計が貴重な全体的結果の尺度をもたらす。本発明者らは、ヒト疾患の主な相関を有するネズミＮＰＣの疾患重症度スケールを作製するために、過去に記載されたネズミの神経行動学的症状スコアを拡張した（図３Ａ）。図示された通り、マウスにおける６種の症状パラメータのそれぞれを、主要な患者疾患ドメイン（異所運動、認知、運動制御および嚥下障害）に割り付け、示された範囲内で重症度をスコア付けした。個々のスコアの合計が、累積疾患スコアを提供し、可能な最大疾患スコアは１３であった。
【０１１９】
疾患動物および健常動物の両方における独立した盲検化オペレータによるスコア付けの検証が、図Ｓ３に示されている。３以上の累積スコアは、症候性疾患の発生を確実に知らせることが見出された。高齢の健常動物は多くの場合グルーミングをあまり示さず（特に雄）、四肢の緊張がわずかに損なわれるため（１００日〜１４０日）、３という閾値になった。それにもかかわらず、それは許容でき、これらの基準を利用して、４〜５の早期累積疾患スコアが、７７〜８４日目の未処置動物の症候性疾患発生を確実に検出した（図３Ａ）。ＴＣＦ処置は疾患の発生を約４週間遅延させるようであり、１０５〜１１２日目に４〜５のスコアに達した。この時点で、ビヒクルまたはボリノスタット単独での処置は累積スコア９〜１１をもたらしたが、２×ＨＰＢＣＤは中間の、累積スコア６〜８を生じた（図３Ａ）。個々の症状ドメインの分析から、歩行、グルーミング、四肢の緊張および体重における増悪が、ＴＣＦで処置された動物で全て遅延されたことが明らかとなった（図３Ｂ）。歩行、グルーミングおよび体重における増悪は、２×ＨＰＢＣＤによっても遅延されたが、ＴＣＦによるほどではなかった。ボリノスタットは、寿命に関する任意の症候性の読み出しに一貫した有意な利点をもたらさなかった。これらのデータは、ＴＣＦ投与が、神経疾患の主要な症候性ドメインである異所運動、認知、運動制御および嚥下障害に有意な利益を与えることを示唆する。特に、動物は疾患の末期段階であっても体重を維持しており、それらが嚥下障害の遅延によって飲水の能力を保持したことを示唆する（ネズミにおいて、ＮＰＣ末期疾患は、体重減少として認められる脱水によって示される；図３Ｂ）。
【０１２０】
本発明者らは、ＢＢＢの外部の臓器の一例として、肝臓への処置の結果も検査した（マウスにおいて、肝臓疾患はＮＰＣにおいて顕著である）（図４）。処置の１００日後に、組織分析から、ＴＣＦがＨＰＢＣＤと同程度にマクロファージ動員の減少を支援することが示唆された（図４Ａ）。ボリノスタットもまた影響を有したが、ＴＣＦまたはＨＰＢＣＤほどではなかった。ＴＣＦは、炎症マーカであるＣＤ６８、ＩＴＧＡＸ、ＭＩＰ１αおよびＣＴＳＤをＨＰＢＣＤと同等に減少させたが、ＴＣＦにおけるボリノスタットの存在は、ＣＤ６８転写産物をさらに減少させるようである（図４Ｂ〜Ｅ）。ボリノスタット単独はまた、有意な抗炎症活性も有した。これらのデータは、ボリノスタットが、神経学的利益をもたらすことなく全身疾患を低減し得ることを示唆した。その上、図２および３における知見と合わせると、それらは、神経疾患も処置して動物の生存も改善するためにボリノスタットがＴＣＦ形態で投与される必要があることを、強く支持する。
【０１２１】
観察されたＴＣＦの影響のための機構的原理を検証するために、本発明者らは、ボリノスタットで実現された血漿濃度およびＮｐｃ１の発現を比較した。図５Ａに示された通り、ＴＣＦで処置されたマウスにおいて、１時間以内で、血漿中濃度はボリノスタット単独を注射された動物よりも２〜３倍高かった（ｐ＜０．０５）。疾患の進行が１２０日よりも長期に及ぶため（処置がない場合）、本発明者らは、１００日目での（これは、生存および症候のデータが後期段階の疾患に対応することを確認している）作用の直接の機序に関するエビデンスをさらに検証した。本発明者らは、ＴＣＦで処置された動物が１００日目に肝臓において安定に発現されたＮｐｃ１転写産物のより高レベルを示すことを見出した（図５Ｂ；予測された通りＨＰＢＣＤ単独では標的Ｎｐｃ１の発現への影響を有さなかった）。脳において、ＴＣＦ処置はＮｐｃ１転写産物のレベルを有意に上昇させた（図５Ｃ）。しかし、ＨＰＢＣＤまたはＰＥＧ中ボリノスタットのいずれかを投与した後に脳内Ｎｐｃ１転写産物レベルに対しほとんど、または全く影響がなかった。それゆえ、ボリノスタット単独は脳における低レベルのヒストンアセチル化を刺激し得るが（図１Ｅ〜Ｆの初めの方に示される）、これは、より長期間の利益に必要とされるＮｐｃ１の転写的発現を刺激するのに不十分である。むしろ、肝臓および脳の両方における処置を介する持続的Ｎｐｃ１転写産物発現の利益は、ＴＣＦ中のボリノスタットにより誘導されるアセチル化活性の刺激を必要とする。
【０１２２】
最後に、プルキンエ細胞および小脳機能に及ぼすＨＤＡＣノックダウンの有害な影響が、文献で報告されているため、本発明者らは、ＴＣＦ処置マウスの小脳におけるＮＰＣ１タンパク質発現を検査した。図５Ｄに示された通り、脳切片の免疫染色（ＮＰＣ１への抗体を用いる）は、１００日目に、未処置動物に比較してＴＣＦ処置マウスの小脳中のプルキンエ細胞におけるＮＰＣ１回復の５倍増加を示した。これは、対照のヘテロ接合性健常マウスに比較して、プルキンエ細胞におけるＮＰＣ１染色の２５％程度を反映している。注目すべきことに、この１００日目の時点で、ＴＣＦ処置マウスは大部分が無症候性のままであり（図３）、小脳内プルキンエ細胞の部分的な回復であっても大きな利益であり得ることが示唆される。
【０１２３】
この処置モデルのさらなる特徴づけが可能であり、継続しているが、本発明者らのデータは、配合剤の全身送達がＨＤＡＣｉの血漿濃度を上昇させて、脳および身体の残り部分における直接的作用機序によってＨＤＡＣｉ活性を刺激する、というモデルの概念実証のための頑健なエビデンスを提供する（図６）。本発明者らのデータは、ＮＰＣのために収集されたが、本発明者らはこのモデルが他の疾患に一般化され得、そこでＴＣＦが、分子ターゲット遺伝子を増加させることおよび、循環するＨＰＢＣＤによって得られるものを含む他の間接的利益（ヒートショックプロテインまたは他のシャペロンの増加によるなど）を組み合わせることによって、異なる有益なメカニズムと相乗的に働いて大脳疾患および全身疾患を処置することを提案する。
【０１２４】
図１．Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスにおけるボリノスタット単独（Ｖｏ；ＰＥＧ中）および三剤併用配合剤中のボリノスタットの比較分析。
Ａ．野生型、Ｎｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４（ヘテロ接合突然変異体）およびＮｐｃ１ｎｍｆ１６４（ＮＰＣ）マウスから単離された培養マウス皮膚線維芽細胞のウェスタンブロットで検出されたＮＰＣ１タンパク質、ローディング対照、チューブリン。
Ｂ．５μＭ  Ｖｏで４８時間処置されて、フィリピンで標識されたＮｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスからのインビトロ増殖皮膚線維芽細胞。コレステロール蓄積が、未処置のＮＰＣ細胞または溶媒単独に暴露されたＮＰＣ細胞で観察された。ボリノスタットは、ＮＰＣ細胞内のコレステロールレベルを、対照（Ｎｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４）マウスからの線維芽細胞で観察されたレベルまで低下させた。３つの独立した実験を、二重測定のウェルで実施した。
Ｃ．Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスに、５０ｍｇ／ｋｇ（Ｖｏ、１×）または１００ｍｇ／Ｋｇ（Ｖｏ、２×）のボリノスタット、ビヒクルを週に１回、ｉ．ｐ．投与するか、または注射しなかった。マウスの数は、示された通りである。
Ｄ．三剤併用配合剤（ＴＣＦ）の概略図。
Ｅ．ウェスタンブロットで、薬物投与後６０分以内のＮｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの脳内ヒストン３および４のアセチル化を検出する。クーマシーブルー染色ゲル（ＣＢＢ；ブルー）全試料で等しいローディングを確認する。
Ｆ．Ｅのデータの定量。Ｖｏ、４５％ＰＥＧ中ボリノスタット（５０ｍｇ／ｋｇ）；ＨＰＢＣＤ、２−ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（２０００ｍｇ／ｋｇ）；ＴＣＦ、三剤併用配合剤（ボリノスタット５０ｍｇ／ｋｇ＋ＨＰＢＣＤ  ２０００ｍｇ／ｋｇ＋４５％ＰＥＧ）；ビヒクル、ＤＭＳＯ（５％）＋ＰＥＧ４００（４５％）。Ｕｎ、未処置Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウス。
【０１２５】
図２．神経変性および動物生存に及ぼすＴＣＦおよびその成分試薬の影響の比較。
Ａ．１００日目の薬物処置Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの脳におけるカルビンジン１転写産物の相対的発現。未処置健常対照マウス（Ｎｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４）におけるカルビンジン１転写産物のレベルを１００％に設定し、他の動物での量をそれに相対的に示している。各群は、マウス４〜５匹からなった。
Ｂ１〜Ｂ５．１００日目の異なる薬物で処置されたＮｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの小脳切片におけるプルキンエ細胞およびカルビンジン陽性神経突起の存在を示す蛍光顕微鏡像。脳切片を、抗マウスカルビンジン抗体を用いて染色した。白色の矢印で示されるプルキンエ細胞（緑に染色）は、健常対照中で明らかである（Ｂ１）。未処置およびＶｏ注射ＮＰＣマウスの小脳におけるプルキンエ細胞損失（Ｂ２＆Ｂ３）。淡く染色されたわずかなプルキンエ細胞（矢印で示す）および小脳の分子層における軽微なカルビンジン陽性神経突起の染色が、ＨＰＢＣＤ注射されたマウスで認められた（Ｂ４）。複数のプルキンエ細胞（矢印で示す）および分子層において増進したカルビンジン陽性神経突起が、ＴＣＦ処置マウスで認められた（Ｂ５）。示された顕微鏡像は、各群のマウス４匹から得られた小脳の第ＩＸ小葉の代表的画像である。カルビンジン、緑色；ＤＡＰＩ、青色；本来の倍率  ４０倍；スケールバー、４０μｍ。（Ｂ６）１００日目の薬物処置されたＮｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの小脳におけるプルキンエ細胞の半定量分析。カルビンジンで標識された小脳切片（４つ／マウス。各群４匹）におけるプルキンエ細胞の数をカウントした。データは、１００％に設定された未処置健常対照（Ｎｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４）に対するプルキンエ細胞の割合％を表す。
Ｃ〜Ｅ。未処置および薬物処置された（Ａ）Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの雄と雌と合わせたもの、（Ｂ）雄Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウス、ならびに（Ｃ）雌Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウス、のカプランマイヤー生存曲線。マウスにｉ．ｐ経路を通して週に１回注射した（材料と方法を参照）。生存中央値（日）を、各群について示す。ログランク検定を実施して、統計学的有意性を決定した。＊ｐ＜０．００１対２×ＨＰＢＣＤ；ｎ、マウス数；ｄ、日。
Ｖｏ、４５％ＰＥＧ中ボリノスタット（５０ｍｇ／ｋｇ）；ＨＰＢＣＤ、２−ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（２０００ｍｇ／ｋｇ）；２×ＨＰＢＣＤ、２−ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（４０００ｍｇ／ｋｇ）；ＴＣＦ、三剤併用配合剤（ボリノスタット５０ｍｇ／ｋｇ＋ＨＰＢＣＤ  ２０００ｍｇ／ｋｇ＋４５％ＰＥＧ）；ビヒクル、ＤＭＳＯ（５％）＋ＰＥＧ４００（４５％）。Ｕｎ、未処置Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウス。
【０１２６】
図３．ＮＰＣに関するネズミ神経行動学的疾患スコアおよびＮｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスにおけるＴＣＦの影響。
Ａ．Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの神経行動学的機能をテストするのに用いられたパラメータのリスト（上のパネル）。曲線（下のパネル）は、マウスの累積神経行動学的スコアの進行を示す。マウスを異なる薬物で処置し、その神経行動学的機能を３週齢から開始して１週間おきに０〜１３の累積スコアで評価した。
Ｂ．棒グラフは、未処置および薬物処置Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスにおける個々の症状の発生齢を示す。
Ｖｏ、４５％ＰＥＧ中ボリノスタット（５０ｍｇ／ｋｇ）；２×ＨＰＢＣＤ、２−ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（４０００ｍｇ／ｋｇ）；ＴＣＦ、三剤併用配合剤（ＨＰＢＣＤ  ２０００ｍｇ／ｋｇ＋ボリノスタット５０ｍｇ／ｋｇ＋４５％ＰＥＧ）；ビヒクル、ＤＭＳＯ（５％）＋ＰＥＧ４００（４５％）。＊ｐ＜０．０５（処置対未処置）。＊＊ｐ＜０．０５（ＴＣＦ対２×ＨＰＢＣＤ）。
【０１２７】
図４．Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスにおける肝臓炎症に関するＶｏおよびＴＣＦの比較分析。
Ａ．Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの肝臓内マクロファージの標識を示す蛍光顕微鏡像。１００日齢マウスから得られた肝臓切片（４〜５μｍ）を、抗ＣＴＳＳ抗体で染色してマクロファージを染色し（赤色）、白い矢印で示している。マクロファージは、未処置ＮＰＣマウスでは豊富に認められ、集団であることが多い。Ｖｏでの処置は、マクロファージの集団化を減少させた。泡沫状のマクロファージが、ＨＰＢＣＤおよびＴＣＦ処置ＮＰＣマウスにおいてわずかに認められた。ＣＴＳＳ、緑色；ＤＡＰＩ、青色。本来の倍率×４０。
Ｂ〜Ｅ．１００日目の薬物処置Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの肝臓において示された様々な炎症マーカのｑＰＣＲ分析。示された倍率変化は、未処置健常対照（Ｎｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４）マウスにおいて検出された転写産物の平均レベルに対する値である。各群は、マウス４〜５匹からなった。データは、平均±ＳＥＭを表す。
Ｖｏ、４５％ＰＥＧ中ボリノスタット（５０ｍｇ／ｋｇ）；ＨＰＢＣＤ、２−ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（２０００ｍｇ／ｋｇ）；ＴＣＦ、三剤併用配合剤（ＨＰＢＣＤ  ２０００ｍｇ／ｋｇ＋ボリノスタット５０ｍｇ／ｋｇ＋４５％ＰＥＧ）；ビヒクル、ＤＭＳＯ（５％）＋ＰＥＧ４００（４５％）。Ｕｎ、未処置Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウス。
【０１２８】
図５．ＴＣＦ作用の機序。
Ａ．マウスでの血漿Ｖｏ濃度。Ｎｐｃ１ヘテロ接合突然変異マウス（Ｎｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４）に、ｉ．ｐ経路でＶｏまたはＴＣＦを注射した。１ｈｐｉでの心穿刺により血液を採取して、血漿中のＶｏ濃度を質量分析法により測定した。データは、２つの独立した実験（核実験において５匹／群）からの平均±ＳＥＭを表す。＊ｐ＜０．０５、ＴＣＦ対Ｖｏ。
Ｂ〜Ｃ．１００日目の薬物処置Ｎｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４マウスの（Ｂ）肝臓および（Ｃ）脳内のＮＰＣ１転写産物量を示す定量ＰＣＲ。倍率変化は、未処置健常対照（Ｎｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４）マウスに相対的である。各群は、マウス４〜５匹からなった。＊ｐ＜０．０５、ＴＣＦ対ＨＰＢＣＤ。
Ｄ．プルキンエ細胞でのＮＰＣ１タンパク質の標識を示す小脳切片の免疫蛍光顕微鏡像。１００日齢マウスから得られた脳切片を、抗ＮＰＣ１抗体を用いて染色した。白い矢印で示されるプルキンエ細胞中に認められた顕著なＮＰＣ１染色（緑色で染色）が、健常対照において明白である（Ｄ１）。ＮＰＣ１のわずかな染色が、Ｖｏ処置マウスで認められた（Ｄ２）。ＮＰＣ１タンパク質を発現する数多くのプルキンエ細胞が、ＴＣＦ処置マウスのプルキンエ細胞で認められた。示された顕微鏡像は、未処置のマウス２匹およびＴＣＦ処置マウス４匹から得られた小脳の第ＩＸ小葉の代表的画像である。各マウスから得られた４つの切片を分析した。ＮＰＣ１、緑色；ＤＡＰＩ、青色；本来の倍率  ４０倍；Ｄ６。ＮＰＣ１陽性プルキンエ細胞の半定量分析。小脳切片（４つ／マウス。未処置群２匹およびＴＣＦ処置群４匹）におけるＮＰＣ１陽性プルキンエ細胞の数をカウントした。データは、１００％に設定された未処置健常対照マウス（Ｎｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４）に対するＮＰＣ１陽性プルキンエ細胞の割合％を表す。
Ｖｏ、４５％ＰＥＧ中ボリノスタット（５０ｍｇ／ｋｇ）；ＨＰＢＣＤ、２−ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（２０００ｍｇ／ｋｇ）；ＴＣＦ、三剤併用配合剤（ＨＰＢＣＤ  ２０００ｍｇ／ｋｇ＋ボリノスタット５０ｍｇ／ｋｇ＋４５％ＰＥＧ）；Ｕｎ、未処置Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウス。
【０１２９】
図６．大脳疾患および全身疾患を処置する際のＴＣＦに関して提案されるモデル。動物に注射する場合の、ＰＥＧ中に溶解されたボリノスタット（Ｖｏ）は、血液脳関門（ＢＢＢ）の透過を著しく限定するわずかな溶解度および低い血漿暴露を有する。その一方で、ＴＣＦ中でのＶｏの送達は、より良好な溶解度、少量の沈殿および高い血漿暴露をもたらす。ＴＣＦは、複合体からＶｏを緩やかに放出させることもできる。加えてＴＣＦは、血液ＢＢＢを通るその透過も有意に改善する。脳内のＶｏは、標的タンパク質（ヒストンなど）で、遺伝子転写を誘導する。Ｎｐｃ１遺伝子はそれらの１種である。Ｖｏはまた、突然変異体ＮＰＣ１タンパク質を直接的または間接的に（シャペロンの関与を通して）安定化し、過剰発現させる。血流中のＨＰＢＣＤおよびＶｏは、全身疾患を処置し、ＰＥＧは、形質膜修復を促進することによって、内皮炎症の減少を支援する。
【０１３０】
図Ｓ１．ＮＰＣマウスの脳内のヒストンＨ３およびＨ４のアセチル化レベルは、健常マウスと類似していた。脳を６〜７週齢Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウス（ｎ＝２）およびＮｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４（健常、ｎ＝２）マウスから採取して、全てのヒストンを抽出し、図示された通りアセチル化Ｈ３およびＨ４に対する抗体でプローブした。以下に示される通り並行して泳動されたクーマシー（ＣＢＢ）染色ゲル（青色）で、同レベルのヒストンが各レーンでロードされたことが確認される（ローディング対照）
【０１３１】
図Ｓ２．１００日目の薬物処置Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスの脳内に示された様々な炎症マーカのｑＰＣＲ分析。示される倍率変化は、未処置健常対照（Ｎｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４）マウスで検出された平均転写産物レベルに相対的である。Ｇａｐｄｈを、内因性対照として用いた。各群は、マウス４〜５匹からなった。データは、平均±ＳＥＭを表す。Ｖｏ、４５％ＰＥＧ中ボリノスタット（５０ｍｇ／ｋｇ）；ＨＰＢＣＤ、２−ヒドロキシプロピルβシクロデキストリン（２０００ｍｇ／ｋｇ）；ＴＣＦ、三剤併用配合剤（ＨＰＢＣＤ  ２０００ｍｇ／ｋｇ＋ボリノスタット５０ｍｇ／ｋｇ＋４５％ＰＥＧ）；Ｕｎ、未処置Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウス。
【０１３２】
図Ｓ３．ＮＰＣマウスおよび健常マウスの神経行動学的スコア付けおよびオペレータ独立性。２名の盲検化研究者が、８週目以降、死亡するまで週に１回、マウス１０匹（Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４  ６匹およびＮｐｃ１＋／ｎｍｆ１６４  ４匹、全て雄）をスコア付けした。研究者は、異なる２日（離れた日）にマウスをスコア付けした。６種の異なるパラメータ、即ち、振戦、体位、歩行、グルーミング、四肢の緊張、体重を、０〜１３の累積スコアで評価した。０〜３のスケールで評価した体重以外パラメータは全て、０〜２のスケールでスコア付けした。３（点線で示されたベースライン）を超えるスコアは、罹患状態を示唆した。
【０１３３】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、希少な癌の治療に認可されている。それらは、治療法が少ない神経変性障害においても関心を寄せられている。しかし、脳機能、特に小脳プルキンエ細胞は、ＨＤＡＣ活性を必要とする。本発明者らは、ｐａｎＨＤＡＣｉボリノスタット、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する組成物（ＴＣＦ）を投与された難治性小脳障害ニーマンピック病Ｃ型のマウスモデルを検査した。ボリノスタットは、Ｎｐｃ１ｎｍｆ１６４マウスからの培養初代マウス細胞に対して活性があるが、動物に注射した場合、生存利益を示さなかった。これに対して、週に１回投与されたＴＣＦは、脳タンパク質アセチル化、ならびに神経突起およびプルキンエ細胞の保持を有意に改善し、神経変性の症状を大きく遅延させ、かつマウスの寿命を４ヶ月からほぼ９ヶ月に延長した。ＴＣＦが、ボリノスタットの血漿濃度、ならびに肝臓（全身発現の指標）および脳でのｎｐｃ１転写産物レベルを増加させた。重要なことであり意外なこととして、ＮＰＣ１タンパク質のレベル上昇が、保持された小脳プルキンエ細胞で観察された。本試験は、ＴＣＦが血液脳関門を通るＨＤＡＣｉアクセスを改善することを示唆し、かつＨＤＡＣｉ配合剤およびレジメンが大脳疾患全体ならびに小脳プルキンエ細胞および神経突起に有意に利益をもたらし得ることを立証する。それゆえＴＣＦは、ニーマンピック病Ｃ型における大脳疾患および全身疾患の両方を処置するために統合された優れた治療法として非常に有望であり、他の難病への移行の可能性を有する。
【０１３４】
本明細書の記載を本発明の当業者の知識と合わせれば、本明細書に記載された任意の実施形態が、任意の使用、方法、化合物、組成物、キット、その明白な変形例、またはその任意の組み合わせに関して即座に完遂、実行、および／またはさらに履行され得る。
【０１３５】
さらに、特定の実施形態が、本明細書に例示および記載されたが、同じ目的を実現するために計算された非常に様々な代替的および／または均等な実施形態または履行が、本発明の範囲を逸脱することなく図示および記載された実施形態と置換され得ることは、当業者に認識されよう。当業者は、実施形態が様々な方法で履行され得ることを即座に認識するであろう。本出願は、本明細書に議論された実施形態の任意の適合または変形を包含するものとする。それゆえ、実施形態が特許請求の範囲およびその均等物によってのみ限定されることが、明白に意図されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図Ｓ１】
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【図Ｓ２】
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【図Ｓ３】
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