(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質を有効成分として含むＣＭＬ癌幹細胞の成長抑制用または増殖抑制用の組成物であり、
前記慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質が、ＧｌｙＳａｒ、セファドロキシル、及びＳｌｃ１５ａ２に対する核酸からなる群から選択される１以上のジペプチドトランスポーター阻害剤であることを特徴とするＣＭＬ癌幹細胞の成長抑制用または増殖抑制用の組成物。
【請求項２】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、Ｓｌｃ１５ａ２タンパク質に対する特異的基質として、Ｓｌｃ１５ａ２のジペプチド輸送機能を阻害するものであることを特徴とする請求項１に記載のＣＭＬ癌幹細胞の成長抑制用または増殖抑制用の組成物。
【請求項３】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、Ｓｍａｄ３のＳｅｒ２０８のリン酸化を阻害するものであることを特徴とする請求項１に記載のＣＭＬ癌幹細胞の成長抑制用または増殖抑制用の組成物。
【請求項４】
有効成分として、さらにＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤を含むことを特徴とする請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載のＣＭＬ癌幹細胞の成長抑制用または増殖抑制用の組成物。
【請求項５】
前記Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤は、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される１以上であることを特徴とする請求項４に記載のＣＭＬ癌幹細胞の成長抑制用または増殖抑制用の組成物。
【請求項６】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質およびＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤を有効成分として含む慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物であり、
前記慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質が、ＧｌｙＳａｒ、セファドロキシル、及びＳｌｃ１５ａ２に対する核酸からなる群から選択される１以上のジペプチドトランスポーター阻害剤であることを特徴とする慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ジペプチドトランスポーターは、Ｓｌｃ１５ａ２の遺伝子によってコーディングされることを特徴とする請求項６に記載の慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項８】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、Ｓｍａｄ３のＳｅｒ２０８のリン酸化を阻害することを特徴とする請求項６に記載の慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項９】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、Ｓｌｃ１５ａ２タンパク質に対する特異的基質として、Ｓｌｃ１５ａ２のジペプチド輸送機能を阻害することを特徴とする請求項６に記載の慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤は、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される１以上であることを特徴とする請求項６に記載の慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記慢性骨髄性白血病は、ＣＭＬ癌幹細胞が原因であることを特徴とする請求項６ないし１０のうちいずれか１項に記載の慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記慢性骨髄性白血病は、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼの耐性によって再発されたことを特徴とする請求項６ないし１１のうちいずれか１項に記載の慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項１３】
ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質を、ＣＭＬ癌幹細胞と接触させる段階と、
ＣＭＬ癌幹細胞内Ｓｌｃ１５Ａ２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、またはジペプチドのレベルを測定する段階と、
前記抑制剤候補物質が処理されていない対照群と比較し、抑制剤候補物質を加えた群において、Ｓｌｃ１５Ａ２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルが有意に低下する場合、前記抑制剤候補物質がＣＭＬ癌幹細胞の成長抑制剤及び増殖抑制剤であると判断する段階と、を含むＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法。
【請求項１４】
ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質を、ＣＭＬ癌幹細胞と接触させる段階と、
ＣＭＬ癌幹細胞において、Ｓｍａｄ３のＳ２０８のリン酸化のレベルを測定する段階と、
前記抑制剤候補物質が処理されていない対照群と比較し、抑制剤候補物質を加えた群において、Ｓｍａｄ３のＳ２０８のリン酸化が有意に低下する場合、前記治療剤候補物質が、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤であると判断する段階と、を含むＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄性白血病癌幹細胞の成長抑制用または増殖抑制用の組成物、慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物、慢性骨髄性白血病の予防方法または治療方法、及び慢性骨髄性白血病癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大人白血病の約１５〜２０％を占めている慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療方法は、現在、大きく見て、抗癌化学療法と造血幹細胞移植とに区分される。抗癌化学療法として、過去には、インターフェロンアルファ、水酸化尿素、及び低容量のシタラビンを利用した治療によって、過度に増加した白血球数、脾臓腫大などの症状を調節したが、最初の標的治療剤であるグリベックが慢性骨髄性白血病治療に導入された後、グリベックは、慢性骨髄性白血病の標準治療として定着した。しかし、グリベックは、高価であり、高濃度での投与時、副作用が大きく、使用によって耐性が生じ、グリベックに対する感受性の落ちるという問題点が発見された。それだけではなく、グリベックの最大短所は、再発の原因になる癌幹細胞形成を抑制することができないので、完治のための治療剤にはなれないという点である。造血幹細胞移植において、同種造血幹細胞移植は、慢性骨髄性白血病完治の唯一の方法であるが、造血幹細胞移植後の生存率は、患者の年齢、移植当時の疾病状態、非近親供与者からの移植、供与者及び移植受恵者の性別差、そして診断時点から移植時までの期間によって影響され、最大の短所は、移植自体による死亡率及び罹患率が１０〜７０％に達するという点である。従って、さらに効率的な慢性骨髄性白血病の治療剤開発が至急である。
【０００３】
一方、ＣＭＬ癌幹細胞は、ＣＭＬ癌細胞の起源である同時に、ＣＭＬ疾患の発病原因であり、ＣＭＬ癌幹細胞の生成を抑制する場合、慢性骨髄性白血病の再発を防ぐことができ、この疾病を有する個体の生存率も上昇させることができる。ＣＭＬ癌幹細胞生成抑制のために、正常造血幹細胞（ＨＳＣ）では必要ないが、ＣＭＬ癌幹細胞の維持に重要な栄養獲得経路がＣＭＬ幹細胞の除去、及び慢性骨髄性白血病治療のための標的にもなる。しかし、慢性骨髄性白血病の治療と、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹との関連性については、まだ開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一様相は、慢性骨髄性白血病癌幹細胞の成長または増殖を抑制するための組成物を提供することである。
【０００５】
他の様相は、慢性骨髄性白血病を予防または治療するための組成物を提供することである。
【０００６】
さらに他の様相は、個体の慢性骨髄性白血病を予防または治療する方法、及び慢性骨髄性白血病癌幹細胞を抑制する方法を提供することである。
さらに他の様相は、慢性骨髄性白血病癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一様相は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質を有効成分として含む、慢性骨髄性白血病癌幹細胞の成長または増殖を抑制するための組成物を提供する。
【０００８】
他の様相は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質を有効成分として含む慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
【０００９】
さらに他の様相は、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質の薬学的有効量を個体に投与する段階を含む、個体の慢性骨髄性白血病の予防方法または治療方法、または個体において、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖を抑制する方法を提供する。
【００１０】
さらに他の様相は、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質を、ＣＭＬ癌幹細胞と接触させる段階、及びＣＭＬ癌幹細胞内Ｓｌｃ１５Ａ２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、またはジペプチドのレベルを測定する段階を含むＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法を提供する。
【００１１】
さらに他の様相は、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質を、ＣＭＬ癌幹細胞と接触させる段階、及びＣＭＬ癌幹細胞において、Ｓｍａｄ３のＳ２０８のリン酸化レベルを測定する段階を含むＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
一様相によるＣＭＬ癌幹細胞の成長抑制用または増殖抑制用の組成物によれば、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断することにより、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖を効果的に抑制することができる。
【００１３】
他の様相による慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物によれば、個体のＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断することにより、慢性骨髄性白血病の治療に効率的に使用される。
【００１４】
さらに他の様相による慢性骨髄性白血病予防または治療する方法によれば、個体の慢性骨髄性白血病を効率的に予防または治療することができる。
【００１５】
さらに他の様相による慢性骨髄性白血病治療剤のスクリーニング方法によれば、慢性骨髄性白血病治療剤の探索及び開発に有用に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＤＯＸ中断５週目、ＣＭＬ発病の（Ｔａｌ１−ｔＴＡｘＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１）マウス（３個の独立した実験において、それぞれｎ＝４）由来、及び正常健康（Ｔａｌ１−ｔＴＡ）リタメイト（littermate）（２個の独立した実験において、それぞれｎ＝６）由来のＫＬＳ＋，ＫＬＳ−及びＬｉｎ＋細胞のメタボロミック分析結果を示すものであり、ＣＭＬ癌幹細胞が、正常ＨＳＣ、または分化されたＣＭＬ細胞で発見されない特異的ジペプチドを蓄積するということを示す；（ａ）当該過程と関連した代謝物質、（ｂ）アミノ酸及び（ｃ）ジペプチドに対する尺度強度値（scaled intensity value）を示す［＋：平均値；ボックス：四分位数限界；ボックスを横切る水平線：中間値；エラーバー：分布の最大及び最小；ドット：極値データ地点］。
【図２】ＤＯＸ中断５週目、ＣＭＬ発病の（Ｔａｌ１−ｔＴＡｘＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１）マウス（３個の独立した実験において、それぞれｎ＝４）由来、及び正常健康（Ｔａｌ１−ｔＴＡ）リタメイト（littermate）（２個の独立した実験において、それぞれｎ＝６）由来のＫＬＳ＋，ＫＬＳ−及びＬｉｎ＋細胞のメタボロミック分析結果を示すものであり、ＣＭＬ癌幹細胞が、正常ＨＳＣ、または分化されたＣＭＬ細胞で発見されない特異的ジペプチドを蓄積するということを示す；表示されたサブセットのＣＭＬ対正常造血幹細胞の表示されたジペプチドレベルの比を示す。赤色陰影処理された値は、ＣＭＬ細胞での発現において、＞１０倍の増加を示す；明るい赤色：＞５倍；明るい青色：＜０．５倍。＊：Ｐ＜０．０５。
【図３】ＣＭＬ癌幹細胞が、ジペプチドトランスポーターを介してジペプチドを内在化させることを示す；ビヒクル（Ｃｏｎｔ）、ＧｌｙＳａｒ（５μＭ）またはセファドロキシル（Ｃｅｆａ；５μＭ）で３０分間処理されたＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞でのRaptor−Ｓｅｒ８６３及びＳ６リン酸化のDuolink（登録商標）インサイチュ（in situ）ＰＬＡ（Ｄ−ＰＬＡ）イメージングである。Ｒａｐａ（ラパマイシン；１００ｎＭ）は、ｍＴＯＲＣ１信号伝逹の阻害、及びそれによるＳ６リン酸化に対する技術的陽性対照群である。ＤＡＰＩを利用して、核を視覚化した。スケールバー：１０μｍ。
【図４】ＣＭＬ癌幹細胞が、ジペプチドトランスポーターを介してジペプチドを内在化させることを示す；Duolinkイメージツールソフトウェアを利用して、図３の実験から測定された単一ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞当たりｐ−Ｓ６のドット数定量結果を示す。赤色線：ドット／実験された（ｎ）／グループの総細胞平均数。＊：Ｐ＜０．００００５（対照群との比較）。
【図５】ＣＭＬ癌幹細胞が、ジペプチドトランスポーターを介してジペプチドを内在化させることを示す；ビヒクル（Ｃｏｎｔ）またはセファドロキシル（Ｃｅｆａ）を投与された正常健康なリタメイト（２個の独立した実験で、それぞれｎ＝６）、及びＣＭＬ発病のマウス（３個の独立した実験で、それぞれｎ＝４）から単離されたＫＬＳ＋細胞内のジペプチド種のメタボロミック分析結果を示す。
【図６】ＣＭＬ癌幹細胞が、ジペプチドトランスポーターを介してジペプチドを内在化させることを示す；低酸素条件（３％Ｏ２）下において、ＯＰ−９間質細胞で共培養され、ビヒクル（Ｃｏｎｔ）またはセファドロキシル（Ｃｅｆａ；５μＭ）で５日間処理されたＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞、及び正常ＨＳＣのインビトロ（in vitro）コロニー形成能の定量結果である。データは、平均コロニー数±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）であり、３回の実験を代表する。
【図７】ＣＭＬ癌幹細胞が、ジペプチドトランスポーターを介してジペプチドを内在化させることを示す；Ｓｌｃ１５ａ２ジペプチドトランスポーター遺伝子のｍＲＮＡ発現の次世代ＲＮＡシーケンシング分析結果を示すものであり、表示された細胞サブセットのＳｌｃ１５ａ２に対して、マウスｃｈｒ．１６に係わる、（ａ）ＲＰＫＭの比率、及び（ｂ）マッピングされた転写体（transcriptome）データを示す。
【図８】非正規Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化がインビボ（in vivo）で、ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞維持を支持するところを示す：（ａ）は、ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞において、（上）Ｓｍａｄ２／３ Ｃ末端リン酸化、及び（下）Ｆｏｘｏ３ａと、Ｓｍａｄ２またはＳｍａｄ３との相互作用のDuolink（登録商標）インサイチュＰＬＡ（Ｄ−ＰＬＡ）イメージング結果である［Ａｂ（−）：単一マウス抗Ｓｍａｄ３抗体を利用した技術的陰性対照群；核は、ＤＡＰＩを利用して視覚化する；スケールバー：１０μｍ］。（ｂ）は、（ａ）の下パネルの３個の実験から測定されたドット数／単一ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞の定量結果である。
【図９】非正規Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化がインビボ（in vivo）で、ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞維持を支持するところを示す：新鮮に単離されたＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞内提示された部位でのＳｍａｄ３リン酸化のＤ−ＰＬＡイメージング（ａ）及び定量（ｂ）結果を示す。
【図１０】非正規Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化がインビボ（in vivo）で、ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞維持を支持するところを示す：表示されたＣＭＬ細胞サブセットにおいて、Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ４２３／４２５及びＳｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化のＤ−ＰＬＡイメージング（ａ）及び定量（ｂ）結果を示す。
【図１１】非正規Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化がインビボ（in vivo）で、ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞維持を支持するところを示す：レシピエントマウスから単離された、（上端）全体ＧＦＰ＋ＣＭＬ細胞内で表示されたＧＦＰ＋ＫＬＳ＋ＣＭＬ細胞サブ集団（赤色四角形）、及び（下端）ＧＦＰ＋ＣＭＬ−ＫＬＳ＋細胞内ＧＦＰ＋ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞（赤色四角形）の流細胞分析的定量結果である。
【図１２】非正規Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化がインビボ（in vivo）で、ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞維持を支持するところを示す：図８（ｂ）でのように測定された、ＧＦＰ＋ＣＭＬ−ＫＬＳ＋細胞内でのＧＦＰ＋ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞頻度の定量結果であり、データは、ＧＦＰ＋ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）の平均パーセントである。
【図１３】ＣＭＬ癌幹細胞に必須な栄養供給の破壊が新規治療的アプローチ策になる可能性があるということを示す図面である：ＤＭＳＯ（対照群）、Ｌｙ３６４９４７（ＬＹ；５μＭ）で３０分間処理されたＬＴ−ＣＭＬ幹細胞のＳｍａｄ３ Ｓｅｒ４２３／４２５及びＳｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化のＤ−ＰＬＡイメージング（ａ）及び定量（ｂ）結果を示す［スケールバー：１０μｍ。＊：Ｐ＜０．００００５（対照群との比較）］。
【図１４】ＣＭＬ癌幹細胞に必須な栄養供給の破壊が新規治療的アプローチ策になる可能性があるということを示す図面である：ビヒクル（Ｃｏｎｔ）、ＧｌｙＳａｒ（５μＭ）またはセファドロキシル（Ｃｅｆａ；５μＭ）で３０分間処理されたＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞でのＳｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化のＤ−ＰＬＡイメージング（ａ）及び定量（ｂ）結果を示す。Ｒａｐａ（ラパマイシン；１００ｎＭ）は、ｍＴＯＲＣ１経路の阻害のために利用される［＊：Ｐ＜０．００００５は、対照群との比較；ＮＳ：有意ではない；スケールバー：１０μｍ］。
【図１５】ＣＭＬ癌幹細胞に必須な栄養供給の破壊が新規治療的アプローチ策になる可能性があるということを示す図面である：ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞及びＬＴ−正常ＨＳＣでのＳｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８及びＳｍａｄ３ Ｓｅｒ４２３／４２５リン酸化のＤ−ＰＬＡイメージング（ａ）及び定量（ｂ）結果を示す。
【図１６】ＣＭＬ癌幹細胞に必須な栄養供給の破壊が新規治療的アプローチ策になる可能性があるということを示す図面である：ＩＭ（１μＭ）の存在または不在において、ビヒクル（Ｃｏｎｔ）またはセファドロキシル（Ｃｅｆａ；５μＭ）と共に、インビトロで５日間培養されたＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞のインビトロコロニー形成能の定量結果を示す。データは、平均コロニー数±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）であり、３個の実験を代表する。
【図１７】ＣＭＬ癌幹細胞に必須な栄養供給の破壊が新規治療的アプローチ策になる可能性があるということを示す図面である：ＩＭ及び／またはセファドロキシルが投与されたＣＭＬ発病のマウスの生存曲線である。移植８日目、ＣＭＬ発病のマウスは、（１）ビヒクル単独；（２）ビヒクル＋セファドロキシル（３６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）；（３）ビヒクル＋ＩＭ（１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）；または（４）ＩＭ＋セファドロキシルを投与された。示された結果は、３個の独立実験から得た累積データである。
【図１８】ＣＭＬ癌幹細胞に必須な栄養供給の破壊が新規治療的アプローチ策になる可能性があるということを示す図面である：ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞維持において、ジペプチド信号伝達の提案された役割を概略化した図式である。Ｓｌｃ１５ａ２ジペプチドトランスポーターによって摂取ジペプチド種は、Ｓｍａｄ３経路を活性化させる栄養信号伝逹を初期化することができる。
【図１９】ＣＭＬ発病（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）マウス及び正常リタメイト対照群（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋）マウス（ＤＯＸ中断５週目後のＣＭＬ発病（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）マウス及び正常リタメイト対照群（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋）マウス）からの、ＬＴ−幹細胞、ＳＴ−幹細胞、ＣＤ４８＋，ＭＰＰ及びＫＬＳ−細胞において、相対的Ｓｌｃ１５Ａ２ ｍＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ測定結果を示すものであり、データは、Ａｃｔｂ（β−アクチン）発現に正規化された発現レベルの平均比±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。
【図２０】ジペプチドトランスポーター活性の定量化結果を示す。
【図２１】ＣＭＬ発病マウス（３個のそれぞれの独立実験において、ｎ＝８マウス）から単離され、ボルテゾミブ（Ｂｏｒｔ；１００ｎＭ）またはバフィロマイシンＡ１（Ｂａｆｉ；１００ｎＭ）で、インビトロで２時間処理されたＫＬＳ＋細胞におけるジペプチド種のメタボロミック分析結果である。
【図２２】スクランブルド、ｓｈＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ Ｓｌｃ１５Ａ２を標的化するｓｈＲＮＡを発現するように、レンチウイルスで形質導入されたＣＭＬ−ＫＬＳ＋細胞及びＣＭＬ−ＫＬＳ−細胞のコロニー形成能を定量化した結果である。
【図２３】Ｆｏｘｏ３ａ＋／＋ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞において、フォクソ−Ｓｍａｄ３−Ｓｅｒ２０８及びＦｏｘｏ３ａ間の相互作用のＤ−ＰＬＡイメージング及び定量結果を示すものであり、Ｆｏｘｏ３ａ−／−ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞を陰性対照群として利用した。
【図２４】３０日間ビヒクルまたはＩＭ（１００ｍｇＫｇ−１ｄａｙ−１）を投与したＣＭＬ発病マウス（３個の各独立実験においてｎ＝４）由来ＣＭＬ−ＫＬＳ＋細胞のジペプチドに対するメタボロミック分析結果を示す。
【図２５】移植後３０日間、毎日ビヒクル（−）、ビヒクル＋ＩＭ、ビヒクル＋Ｃｅｆａ（＋）またはＩＭ＋Ｃｅｆａを投与されたＣＭＬ発病マウスにおいて、ジペプチド吸収抑制が、ＣＭＬ癌幹細胞を減少させる可能性があることを示すものであり、全体ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ細胞内におけるＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ−ＫＬＳ＋細胞の平均数±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）である。
【図２６】移植後３０日間、毎日ビヒクル（−）、ビヒクル＋ＩＭ、ビヒクル＋Ｃｅｆａ（＋）またはＩＭ＋Ｃｅｆａを投与されたＣＭＬ発病マウスにおいて、ジペプチド吸収抑制が、ＣＭＬ癌幹細胞を減少させる可能性があることを示すものであり、連続移植実験結果において、ビヒクルまたはＣｅｆａで処理された図２５のＣＭＬ発病マウス由来ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ−ＫＬＳ＋細胞（レシピエント当たり３ｘ１０４細胞）の連続移植を受けた新たなレシピエントマウスの生存率を示す。
【図２７】ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−ＣＭＬ−ＬＩＣのコロニー形成能の定量結果であり、ビヒクル（−）または５μＭ Ｃｅｆａ（＋）で、５日間インビートで処理した結果である。
【図２８】ヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−ＣＭＬ−ＬＩＣのコロニー形成能の定量結果であり、ビヒクル（−）または５μＭ Ｃｅｆａ（＋）で３日間インビトロで処理した結果を示す（Ｃｅｆａ処理２４時間後、ビヒクル、１μＭ ＩＭまたは５００ｎＭダサチニブ（Ｄａｓａ）をそれぞれ添加する）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一様相は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質を有効成分として含む、慢性骨髄性白血病癌幹細胞の成長または増殖を抑制するための組成物を提供する。
【００１８】
用語「慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ：chronic myelogenous leukemia）」は、骨髄において骨髄細胞が増加し、調節されない成長、及び過度な白血球の蓄積によって引き起こされた血液学的幹細胞疾患を意味するものであり、フィラデルフィア染色体を有した造血幹細胞の骨髄内非正常的な増殖によって生ずる疾患を含む。
【００１９】
用語「慢性骨髄性白血病癌幹細胞（ＣＭＬ stem cell）」とは、慢性骨髄性白血病を開始させることができる細胞を意味し、成熟（mature）ＣＭＬ細胞の根源になる。前記「慢性骨髄性白血病癌幹細胞」は、「慢性骨髄性白血病幹細胞」または「白血病−開始細胞（ＬＩＣ：leukaemia-initiating cell）」とも命名される。
【００２０】
用語「有効成分」とは、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断するに十分な量で含まれることを示し、不純物として含まれることを除く。
【００２１】
用語「栄養信号伝逹（nutrient signaling）」は、細胞の増殖または生存のために、細胞の合成及び分解代謝の均衡と密接に関連するＡＴＰ、アミノ酸、酸素のような栄養源状態の維持または変化調節と係わる細胞内の全反応を意味する。
【００２２】
用語「ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質」とは、ＣＭＬ癌幹細胞の維持または増殖に必須な栄養源の調節と係わるＣＭＬ癌幹細胞内反応を減少、変形、非活性または抑制させることができる物質を意味する。
【００２３】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、ジペプチドトランスポーター阻害剤でもある。
【００２４】
用語「ジペプチドトランスポーター（dipeptide transporter）」は、２つのアミノ酸からなる分子であるジペプチドを、細胞内に運送する活性を有するタンパク質またはポリペプチドなどを意味する。前記ジペプチドトランスポーターは、Ｓｌｃ１５ａファミリのジペプチドトランスポーターでもあり、例えば、Ｓｌｃ１５ａ１、Ｓｌｃ１５ａ２、Ｓｌｃ１５ａ３及びＳｌｃ１５ａ４からなる群から選択される１以上の遺伝子によってコーディングされるタンパク質でもある。また、前記ジペプチドトランスポーターは、具体的に、Ｓｌｃ１５ａ２遺伝子によってコーディングされるタンパク質でもある。
【００２５】
用語「ジペプチドトランスポーター阻害剤（dipeptide transporter inhibitor）」は、ジペプチドトランスポーターがＣＭＬ癌幹細胞内にジペプチドを輸送する機能を阻害する物質を意味する。ジペプチドトランスポーター阻害剤は、ＣＭＬ癌幹細胞のジペプチド内在化を減少させたり妨害したりすることができる。前記ジペプチドトランスポーター阻害剤は、ＣＭＬ癌幹細胞のジペプチド内在化を減少させたり妨害したりする物質であるならば、化合物、タンパク質、アミノ酸、ペプチド、ウイルス、炭水化物、脂質、核酸など制限なしに使用可能である。かような阻害は、ジペプチドとジペプチドトランスポーターとの結合を妨害するか、あるいはジペプチドによる特定代謝経路のリン酸化を阻害してもなされる。
【００２６】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、ジペプチドトランスポーターの特異的基質でもある。前記阻害剤は、ジペプチドトランスポーターに特異的であり、ジペプチドと競争的に結合するものでもある。それにより、ジペプチドトランスポーターとジペプチドとの結合を妨害し、それにより、細胞内でジペプチドの吸収が抑制されもする。また、前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、例えば、Ｓｌｃ１５ａ２タンパク質の特異的基質であって、Ｓｌｃ１５ａ２タンパク質のジペプチド輸送機能を阻害するものでもある。
【００２７】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、ジペプチドによって引き起こされるＳｍａｄ３経路の活性化を阻害するものでもある。ＣＭＬ癌幹細胞は、ジペプチドトランスポーターを介してジペプチド種を内在化し、内在化されたジペプチドは、ＣＭＬ癌幹細胞において、Ｓｍａｄ３経路を活性化させることができる。従って、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、ＣＭＬ幹細胞において、Ｓｍａｄ３経路を不活性化させることができ、例えば、Ｓｍａｄ３のＳｅｒ２０８位置のリン酸化を阻害することができる。前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、具体的には、Ｓｍａｄ３のＳｅｒ２０８のリン酸化を阻害するものでもある。
【００２８】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、ベータ−ラクタム系抗生物質（β−lactam antibiotics）でもある。前記ベータ−ラクタム系抗生物質は、ベータ−ラクタマーゼ（β−lactamase）阻害活性を有する物質を総称するものであり、分子内にベータ−ラクタム構造を含む。前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹遮断する物質は、ペニシリン系抗生物質またはセファロスポリン系抗生物質でもあり、例えば、セファドロキシル、セファクロロ、シクラシリン（cyclacillin）、セフラジン、セファレキシンン、モキサラクタム、セフチブテン、ジクロキサシリン、アモキシシリン、メタンピシリン、クロキサシリン、アンピシリン、セフィキシム、セファマンドール、オキサシリン、セフメタゾール、７−アミノセファロスポラン酸、セファロリジン及びセフロキシム・アキセチルからなる群から選択される１以上でもある。また、前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、具体的には、セファドロキシルでもある。前記ベータ−ラクタム系抗生物質は、その薬学的に許容可能な塩で代替されもする。
【００２９】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、ジペプチド類似体でもある。前記ジペプチド類似体は、ジペプチドと類似した構造を有し、ジペプチドトランスポーター、特に、Ｓｌｃ１５Ａ系トランスポーターの基質として作用するが、細胞によって代謝されない物質でもある。また、前記ジペプチド類似体は、例えば、グリシルサルコシン、またはその薬学的に許容可能な塩でもある。
【００３０】
前記慢性骨髄性白血病癌幹細胞の成長または増殖を抑制するための組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ：tyrosine kinase inhibitor）をさらに含んでもよい。すなわち、前記薬学的組成物の有効成分は、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養供給を遮断する物質、例えば、ジペプチドトランスポーター阻害剤とチロシンキナーゼ阻害剤との組み合わせでもある。
【００３１】
チロシンキナーゼ阻害剤は、チロシンキナーゼを阻害する物質を意味する。前記チロシンキナーゼ阻害剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤でもある。前記ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼは、染色体転位によって生成されたＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子によって生産されたチロシンキナーゼ活性を有するＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質を意味する。
【００３２】
前記チロシンキナーゼ阻害剤は、４−［（４−メチル−１−ピペラジニル）メチル］−Ｎ−［４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］−ベンズアミド、Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−［［６−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−２−メチル−４−ピリミジニル］アミノ］−５−チアゾールカルボキシアミドモノヒースレート、４−メチル−Ｎ−［３−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−３−［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］ベンズアミド、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル、及びその薬学的に許容可能な塩でもある。また、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される１以上でもあり、具体的には、イマチニブ、またはその薬学的に許容可能な塩でもある。前記イマチニブの薬学的に許容可能な塩は、例えば、イマチニブメシル酸塩でもある。
【００３３】
他の様相は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質を有効成分として含む慢性骨髄性白血病の予防用または治療用の薬学的組成物を提供する。
【００３４】
前記ＣＭＬ幹細胞の影響信号伝達を遮断する物質は、前述の通りである。
【００３５】
前記薬学的組成物において、前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、ジペプチドトランスポーター阻害剤でもある。前記ジペプチドトランスポーター阻害剤は、前述の通りである。前記ジペプチドトランスポーター阻害剤は、阻害剤で処理されていないＣＭＬ癌幹細胞と比較し、ＣＭＬ癌幹細胞内ジペプチドレベルを低くするものでもある。
【００３６】
前記ジペプチドトランスポーター阻害剤は、ベータ−ラクタム系抗生物質でもあり、セファドロキシル、セファクロロ、シクラシリン（cyclacillin）、セフラジン、セファレキシンン、モキサラクタム、セフチブテン、ジクロキサシリン、アモキシシリン、メタンピシリン、クロキサシリン、アンピシリン、セフィキシム、セファマンドール、オキサシリン、セフメタゾール、７−アミノセファロスポラン酸、セファロリジン及びセフロキシム・アキセチルからなる群から選択される１以上でもある。
【００３７】
前記薬学的組成物において、前記慢性骨髄性白血病は、例えば、ＣＭＬ癌幹細胞が原因でもある。また、前記慢性骨髄性白血病は、個体のＢｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼに対する耐性によって再発されたものでもある。
【００３８】
前記慢性骨髄性白血病癌幹細胞の成長または増殖を抑制するための組成物は、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ：tyrosine kinase inhibitor）をさらに含んでもよい。すなわち、前記薬学的組成物の有効成分は、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養供給を遮断する物質と、チロシンキナーゼ阻害剤との組み合わせでもある。
【００３９】
前記チロシンキナーゼ阻害剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害剤でもある。ＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼは、染色体転位によって生成されたＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子によって生産されたチロシンキナーゼ活性を有するＢＣＲ−ＡＢＬ融合タンパク質を意味する。
【００４０】
前記チロシンキナーゼ阻害剤は、４−［（４−メチル−１−ピペラジニル）メチル］−Ｎ−［４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］フェニル］−ベンズアミド、Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−［［６−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−２−メチル−４−ピリミジニル］アミノ］−５−チアゾールカルボキシアミドモノヒースレート、４−メチル−Ｎ−［３−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−５−（トリフルオロメチル）フェニル］−３−［（４−ピリジン−３−イルピリミジン−２−イル）アミノ］ベンズアミド、４−［（２，４−ジクロロ−５−メトキシフェニル）アミノ］−６−メトキシ−７−［３−（４−メチルピペラジン−１−イル）プロポキシ］キノリン−３−カルボニトリル、及びその薬学的に許容可能な塩でもある。また、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、及びその薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される１以上でもあり、具体的には、イマチニブ、またはその薬学的に許容可能な塩でもある。前記イマチニブの医薬学的に許容可能な塩は、例えば、イマチニブメシル酸塩でもある。
【００４１】
前記薬学的組成物は、任意の薬学的形態を有することができる。例えば、錠剤、カプセル、丸剤、粉末、除放性剤形、溶液または懸濁液としての経口投与に適する形態であるか、滅菌溶液、懸濁液または乳化液としての非経口注射に適する形態であるか、軟膏またはクリームとしての局所投与に適する形態であるか、あるいは坐剤としての直腸投与に適する形態でもある。前記組成物は、錠剤、丸剤、注射剤、またはそれらの組み合わせでもある。前記薬学的組成物は、正確な投与量を単一投与するのに適する単位投与型でもある。
【００４２】
前記薬学的組成物は、従来の薬学的に許容可能な担体または賦形剤、及び活性成分としての本願に記載された化合物を含む。適する担体としては、不活性希薄剤または充填剤、水、及び多様な有機溶媒が含まれる。前記薬学組成物は、前記有効成分以外にも、追加の構成成分、例えば、着香料、結合剤、賦形剤などを含んでもよい。
【００４３】
前記薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。
【００４４】
さらに他の様相は、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質の薬学的有効量を個体に投与する段階を含む、個体の慢性骨髄性白血病の予防方法または治療方法、または個体において、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖を抑制する方法を提供する。
【００４５】
前記方法において、前記「慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）癌幹細胞」、「慢性骨髄性白血病」または「栄養信号伝逹を遮断する物質」については、前述の通りである。
【００４６】
前記方法は、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質、またはジペプチドトランスポーター阻害剤を個体に投与する段階を含んでもよい。前記ジペプチドトランスポーター阻害剤は、前述の通りである。また、前記ジペプチドトランスポーター阻害剤は、例えば、ジペプチドのＣＭＬ癌幹細胞内吸収を阻害するものでもあり、またはＳｍａｄ３のＳｅｒ２０８位置のリン酸化を阻害するものでもある。
【００４７】
本発明において「個体」とは、疾病の治療または予防、またはＣＭＬ癌幹細胞の成長抑制または増殖抑制を必要とする対象を意味する。具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（mouse）、ネズミ（rat）、犬、猫、馬及び牛などの哺乳類動物でもあり、さらに具体的には、ヒトでもある。
【００４８】
前記個体は、慢性骨髄性白血病、またはＣＭＬ癌幹細胞を有しているか、あるいは有する可能性がある個体でもある。
【００４９】
前記「薬学的有効量」は、投与される疾患の種類及び重症度、患者の年齢及び性別、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の比率、治療期間、同時使用される薬物を含んだ要素、及びその他医学分野に周知の要素によって決定され、前記要素をいずれも考慮し、副作用なしに、最大効果を得ることができる量であり、当業者によって容易に決定されるであろう。
【００５０】
前記「投与」は、目的組織または細胞に逹することができる限り、投与方法には制限がなく、当業界に知られた任意の方法によって遂行される。例えば、経口または非経口を介して投与される。一日投与量は、約０．０００１ないし１００ｍｇ／ｋｇであり、望ましくは、０．００１ないし１０ｍｇ／ｋｇであり、一日に一回ないし数回に分けて投与することができるが、それに制限されるものではなく、一般の技術者が適して調節することができるものである。
【００５１】
また、前記方法は、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質の薬学的有効量を個体に投与する段階の代わりに、チロシンキナーゼ阻害剤、及びＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質の組み合わせの薬学的有効量を個体に投与する段階を含んでもよい。前記チロシンキナーゼ阻害剤、及びＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、それぞれ前述の通りである。前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質は、具体的には、ジペプチドトランスポーター阻害剤でもある。前記ジペプチドトランスポーター阻害剤は、前述の通りである。
【００５２】
また、前記方法において、チロシンキナーゼ阻害剤、及びＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質、例えば、ジペプチドトランスポーター阻害剤は、併用投与もされる。前記併用投与は、チロシンキナーゼ阻害剤の有効性を強化するように、前記ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質が、十分に近い時間に投与されることを意味する。例えば、前記チロシンキナーゼ阻害剤がまず投与され、次に、ＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質、例えば、ジペプチドトランスポーター阻害剤が投与もされ、またはその反対でもある。また、チロシンキナーゼ阻害剤、及びＣＭＬ癌幹細胞の栄養信号伝逹を遮断する物質、例えば、ジペプチドトランスポーター阻害剤が同時に投与されもする。
【００５３】
さらに他の様相は、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質を、ＣＭＬ癌幹細胞と接触させる段階、及びＣＭＬ癌幹細胞内Ｓｌｃ１５Ａ２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベル、またはジペプチドのレベルを測定する段階を含む、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法を提供する。
【００５４】
用語「スクリーニング」は、抗生物質、酵素、または低分子化学物質などの特定の化学物質に対して、感受性または活性などの特定の性質を有している物質を探し出すことを意味する。
【００５５】
用語「ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質」は、一般的な選定方式により、慢性骨髄性白血病癌幹細胞の成長を抑制したり増殖を防いだりすることができると推定されるか、あるいはランダムに選定された個別的な核酸、タンパク質、その他抽出物または天然物、または化合物などにもなる。
【００５６】
前記Ｓｌｃ１５Ａ２のｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法は、例えば、逆転写酵素重合酵素反応、競争的逆転写酵素重合酵素反応、リアルタイム逆転写酵素重合酵素反応、ＲＮａｓｅ保護分析法、ノーザンブロッティングまたはＤＮＡチップを利用することができるが、それらに制限されるものではない。前記Ｓｌｃ１５Ａ２のｍＲＮＡの発現レベルを測定する方法、タンパク質の発現レベルを測定する方法は、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳまたはタンパク質チップを利用することができるが、それらに制限されるものではない。
【００５７】
前記ＣＭＬ癌幹細胞内ジペプチドレベルを測定する方法は、当該技術分野において公知された方法を利用することができ、例えば、ＲＴ−ＰＣＲウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳを利用することができる。
前記ＣＭＬ癌幹細胞は、ＳＴ（short term）−ＣＭＬ癌幹細胞またはＬＴ（long term）−ＣＭＬ癌幹細胞でもあり、具体的には、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞でもある。
【００５８】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法は、前記抑制剤候補物質が処理されていない対照群と比較し、抑制剤候補物質を加えた群において、Ｓｌｃ１５Ａ２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルが、有意に低下する場合、前記抑制剤候補物質が、ＣＭＬ癌幹細胞の成長抑制剤及び増殖抑制剤であると判断する段階をさらに含んでもよい。用語「抑制剤候補物質が処理されていない対照群」とは、当該ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質を加えていないＣＭＬ癌幹細胞において、前記候補物質を加えた群と並列関係に属するＣＭＬ癌幹細胞を意味する。すなわち、前記対照群は、もともと何の物質も添加されていないか、あるいはＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤ではない他の陰性物質が加えられたＣＭＬ癌幹細胞でもある。
【００５９】
また、前記ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法は、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤として知られている物質を加えた陽性対照群と比較し、抑制剤候補物質を加えた群において、Ｓｌｃ１５Ａ２のｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルが類似しているか、あるいはさらに低い場合、前記抑制剤候補物質がＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤であると判断する段階をさらに含んでもよい。ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤として知られている物質を加えた陽性対照群は、従来ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制効果を示すと知られた化合物を加えたＣＭＬ癌幹細胞を意味する。
【００６０】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法は、慢性骨髄性白血病癌幹細胞において、ジペプチドトランスポーター、Ｓｌｃ１５Ａ２のｍＲＮＡが、Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８位置のリン酸化が、慢性骨髄性幹細胞の維持を支持するが、正常ＨＳＣにおいては、Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８のリン酸化が影響を及ぼさないという点に基づく。
【００６１】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法は、インビトロまたはインビボにおいて、いずれも可能である。インビボの場合、前記ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質を、ＣＭＬ癌幹細胞と接触させる段階は、候補物質がＣＭＬ癌幹細胞を有する個体に投与することでもって代替することができる。前記個体は、ＣＭＬ動物でもあり、例えば、ヒトを除いた哺乳動物、具体的には、マウスでもある。
【００６２】
さらに他の様相は、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質を、ＣＭＬ癌幹細胞と接触させる段階、及びＣＭＬ癌幹細胞において、Ｓｍａｄ３のＳ２０８のリン酸化レベルを測定する段階を含むＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法を提供する。
【００６３】
前記リン酸化レベルを測定する方法は、制限がないが、例えば、電気泳動法、蛍光分析法、質量分析法、免疫分析法、ＰＣＲ法、ウェスタンブロットを利用することができる。
【００６４】
前記ＣＭＬ癌幹細胞は、ＳＴ（short term）−ＣＭＬ癌幹細胞またはＬＴ（long term）−ＣＭＬ癌幹細胞でもあり、具体的には、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞でもある。
【００６５】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法は、抑制剤候補物質が処理されていない対照群と比較し、抑制剤候補物質を加えた群において、Ｓｍａｄ３のＳ２０８のリン酸化レベルが有意に低下する場合、前記抑制剤候補物質が、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤であると判断する段階をさらに含んでもよい。用語「治療剤候補物質が処理されていない対照群」とは、当該ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤候補物質を加えていないＣＭＬ癌幹細胞において、前記候補物質を加えた群と並列関係に属するＣＭＬ癌幹細胞を意味する。すなわち、前記対照群は、もともと何らの物質も添加されていないか、あるいはＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤ではない他の陰性物質が加えられたＣＭＬ癌幹細胞でもある。
【００６６】
また、前記ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法は、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤として知られている物質を加えた陽性対照群と比較し、抑制剤候補物質を加えた群において、Ｓｍａｄ３Ｓ２０８のリン酸化が類似レベルを示す場合、前記抑制剤候補物質が、ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤であると判断する段階をさらに含んでもよい。ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤として知られている物質を加えた陽性対照群は、従来ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制効果を示すと知られた化合物を加えたＣＭＬ癌幹細胞を意味する。
【００６７】
前記ＣＭＬ癌幹細胞の成長または増殖の抑制剤スクリーニング方法は、インビトロまたはインビボの慢性骨髄性白血病癌幹細胞において、Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８位置のリン酸化が慢性骨髄性幹細胞の維持を支持するが、正常ＨＳＣにおいては、Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８のリン酸化が影響を及ぼさないという点に基づく。本発明のスクリーニング方法によれば、新たな慢性骨髄性白血病の治療剤を低廉であって簡単な方法で容易に開発することができる。
【実施例】
【００６８】
以下、本発明について、実施例によって、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって制限されるものではない。
実験方法：
取り立てて言及がない限り、以下の実施例においては、次の実験方法を使用した。
【００６９】
１．ＣＭＬマウスモデル製造
研究のために、ＣＭＬ類似疾患のさまざまに異なるマウスモデルを利用した。
【００７０】
まず、ＣＭＬ疾患誘導のために、テトラサイクリン（ｔｅｔ）誘導性ＣＭＬマウスモデルを利用した。ＦＶＢ／Ｎ遺伝的背景をそれぞれ有する、Ｔａｌ１−ｔＴＡマウス（ＪＡＸデータベースストレイン＃００６２０９）及びＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１形質転換マウス（ＪＡＸデータベースストレイン＃００６２０２）を、Jackson実験室から購入した。Ｔａｌ１−ｔＴＡ ｘ ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１二重形質転換マウスを生産するように、Ｔａｌ１−ｔＴＡ及びＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１形質転換マウスを相互交配させた。二重形質転換マウスを２０ｍｇ／Ｌのドキシサイクリン（Sigma−Aldrich）を含んだ飲用水が供給されるケージで飼育した。出生５週目、ドキシサイクリン含有飲用水を一般飲用水で代替することにより、ＢＣＲ−ＡＢＬ１発癌遺伝子（oncogene）の発現を誘導した。ドキシサイクリン中断後約５週目、二重形質転換突然変異体において、ＣＭＬ類似疾患が発病した。この動物を「テトラサイクリン誘導性ＣＭＬ発病マウス」と命名した。
【００７１】
Ｆｏｘｏ３ａ欠乏ｔｅｔ誘導性ＣＭＬマウスモデルを確立するために、Ｆｏｘｏ３ａ欠乏マウス４２（Ｃ５７ＢＬ／６；Ｆ５）と、Ｃ５７ＢＬ／６背景で、５世代の間逆交配されたＴａｌ−ｔＴＡ及びＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１形質転換マウスとをそれぞれ交配させた。
【００７２】
ＢＣＲ−ＡＢＬ１形質導入／移植基盤ＣＭＬモデル（ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ＣＭＬマウス）をまた利用した。簡略には、正常ＫＬＳ＋細胞（レシピエントマウス当たり４−５ｘ１０３細胞）を、ヒトＢＣＲ−ＡＢＬ１−ｉｒｅｓＧＦＰレトロウイルスで形質導入し、放射線照射された（９Ｇｙ）レシピエントＣ５７ＢＬ／６マウスに移植した（Sankyo−Ｌａｂ Service、Tsukuba、日本）。ＣＭＬ類似疾患が、移植１２−２０日目にレシピエントに発病した。
【００７３】
ＩＭ＋セファドロキシルの組み合わせ投与のインビボ効果を調査するために、ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ＣＭＬ発病マウスに、ビヒクル［人工胃液溶液（２．０ｇ ＮａＣｌ、７ｍｌ ｃｏｎｃ．ＨＣｌ及び３．２ｇペプシンを含んだ９００ｍｌ ｄｄＨ２Ｏ）］、またはビヒクル中のイマチニブメシレート（ＩＭ；Gleevec（登録商標）１００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ；Novartis）、及び／またはビヒクル中のセファドロキシル（３６ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ；Sigma−Aldrich）を投与した。移植８ないし９０日目まで、経口摂食（oral gavage）によって処理した。Ｌｙ２２２８８２０単独投与の効果を調査するために、ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ＣＭＬ発病マウスに、移植８ないし６０日目まで経口摂食によって、ビヒクル、またはビヒクル中のＬｙ２２２８８２０（３日ごとに、２．５ｍｇＫｇ−１；Axon Medchem）を投与した。ダサチニブ＋Ｌｙ２２２８８２０の組み合わせ投与の効果を調査するために、ｔｅｔ誘導性ＣＭＬ発病マウスに、ＤＯＸ中断後１−３０日、ビヒクル単独、またはビヒクル中のダサチニブ（５ｍｇＫｇ−１ｄａｙ−１；Brystol−Myers Ｓｑｕｉｂｂ）を投与し、かつ／またはＤＯＸ中断７−２８日、経口摂食によって、ビヒクル中のＬｙ２２２８８２０（３日ごとに、２．５ｍｇＫｇ−１；Axon Medchem）を投与した。全ての動物ケアは、神奈川大学の動物及び組み換えＤＮＡ実験指針を守った。
【００７４】
２．細胞分離（cell sorting）
ドキシサイクリン中断５週目、骨髄（ＢＭ）単核細胞（ＭＮＣ）を、テトラサイクリン誘導性ＣＭＬ発病マウス（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）及び正常健康なリタメイト（littermate）マウス（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋）の２本の後足から分離した。ＢＭ ＭＮＣを、最初に、抗ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ受容体（２．４Ｇ２）抗体（ＢＤBiosciences）でインキュベーションさせ、その次に、抗Ｓｃａ−１（Ｅ１３−１６１．７）−ＰＥ、抗ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ８（５３−６．７）−ＦＩＴＣ、抗Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）−ＦＩＴＣ、抗ＴＥＲ１１９（Ｌｙ−７６）−ＦＩＴＣ、抗Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）−ＦＩＴＣ及び抗Ｍａｃ１（Ｍ１／７０）−ＦＩＴＣ（いずれも、ＢＤ Biosciences製）；抗ＣＤ４８（ＨＭ４８−１）−ＡＰＣ−Ｃｙ７及び抗ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ（ＴＣ１５−１２Ｆ１２．２）−Pacific blue（二つとも、BioLegend製）；及び抗ｃＫｉｔ（ＡＣＫ２）−ＡＰＣ及び抗ＣＤ１３５／Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３（Ａ２Ｆ１０）−ビオチン（二つとも、ｅBiosciences製）抗体でインキュベーションした。ビオチン化された一次抗体を、ストレプトアビジン−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ Biosciences）を利用して視覚化した。
【００７５】
メタボロミックス（metabolomics）分析のために、ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩセルソーター（ＢＤ Biosciences）を利用して、公表された標準システムによって、非成熟ＫＬＳ＋（ｃＫｉｔ＋Lineage−Ｓｃａ−１＋）細胞、前駆細胞（progenitor）ＫＬＳ−（ｃＫｉｔ＋Lineage−Ｓｃａ−１−）細胞、及び分化されたＬｉｎ＋（Lineage＋）細胞を含む分画で、免疫染色された細胞を分離した。
【００７６】
次世代ＲＮＡシーケンシング及びDuolink（登録商標）インサイチュＰＬＡ分析のために、ＫＬＳ＋細胞を初生（the most primitive）長期（ＬＴ：long−term）癌幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ１３５−ＫＬＳ＋）、短期（ＳＴ：short−term）癌幹細胞（ＣＤ１５０−ＣＤ４８−ＣＤ１３５−ＫＬＳ＋）、ＣＤ４８＋細胞（ＣＤ４８＋ＣＤ１３５−ＫＬＳ＋）及び多能性前駆細胞類似（ＭＰＰ：multipotent progenitor-like）細胞（ＣＤ１３５＋ＫＬＳ＋）で精製した。
【００７７】
ＣＭＬ癌幹細胞の連続移植（serial tranplantation）のために、ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞をＢＣＲ−ＡＢＬ１ ＣＭＬ発病マウスのＢＭ ＭＮＣから精製した。レトロウイルス及びレンチウイルスの形質導入のために、ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞及びＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ ＫＬＳ−を、ＢＣＲ−ＡＢＬ１ ＣＭＬ発病マウスのＢＭ ＭＮＣから精製した。ＨＳＣ競争的再構成分析（competitive reconstitution assay）のために、正常ＫＬＳ＋細胞を、Ｃ５７ＢＬ６コンジニック（ＣＤ４５．１）マウスのＢＭ ＭＮＣから精製した。
【００７８】
３．メタボロミックス（metabolomics）
メタボロミックスプロファイリングのために、ドキシサイクリン中断５週目、ＣＭＬ発病Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋マウス（３個の独立実験それぞれにおいて、ｎ＝４マウス）、及びリタメイト正常健康（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋）マウス（２個の独立実験それぞれにおいて、ｎ＝６マウス）から、１．８−２．５ｘ１０５ＫＬＳ＋非成熟造血幹細胞、ＫＬＳ−前駆細胞及びＬｉｎ＋分化細胞を単離した。また、８週齢及び２４週齢（２個の独立実験それぞれにおいて、ｎ＝６マウス）のＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した１．０−１．８ｘ１０５非成熟ＫＬＳ＋細胞において、代謝産物（metabolite）を測定した。
【００７９】
また、インビボにおいて、ジペプチド吸収阻害のために、３０日間経口摂食によって、ビヒクルまたはセファドロキシル（３６ｍｇＫｇ−１ｄａｙ−１）を投与したｔｅｔ誘導性ＣＭＬ発病（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）マウス（３個の独立実験それぞれにおいて、ｎ＝４マウス）、及びリタメイト正常健康（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋）マウス（２個の独立実験それぞれにおいて、ｎ＝６マウス）から、非成熟ＫＬＳ＋細胞を単離した。インビボにおいて、ＩＭ投与のために、健康なリタメイトマウス（２個の独立実験それぞれにおいて、ｎ＝６マウス）、及びビヒクルまたはセファドロキシル（３６ｍｇＫｇ−１ｄａｙ−１）を投与されたＣＭＬ発病マウス（３個の独立実験それぞれにおいて、ｎ＝４マウス）から、非成熟ＫＬＳ＋細胞を単離した。インビトロにおいて、タンパク質分解／ターンオーバーの抑制のために、ＣＭＬ発病マウス（各３個の独立実験において、ｎ＝８マウス）由来ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞を、低酸素（３％Ｏ２）条件下で、無血清ＳＦ−０３筋細胞培地（Sanko Junyaku）中にプレーティングし、２時間、ビヒクル、１００ｎＭボルテゾミブ（Cell Signaling、＃２２０４）または１００ｎＭバフィロマイシンＡ１（Sigma、Ｂ１７９３）で処理した。全ての場合において、単離された細胞ペレットは、得られた後、すぐに−８０℃で凍結させた。
【００８０】
メタボロミックプロファイリングを、超高速遂行液体クロマトグラフィー／質量分析機（ＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）、及び気体クロマトグラフィー／質量分析機（ＧＣ／ＭＳ）を利用して、Metabolon Ｉｎｃ．（Durham、ＮＣ）によって行った。Metabolon ＬＩＭＳ（Laboratory Information Management System）を利用して、データをコンパイリングした。プラットホームのＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ領域は、Waters Acquity ＵＰＬＣ（Waters）、熱処理された電気噴霧イオン化（ＨＥＳＩ−ＩＩ）ソース、及びOrbitrap質量分析機（mass analyzer）に連結されたＱ−Exactive high resolution／accurate mass spectrometer（Thermo Scientific）に基づいた。ＧＣ／ＭＳは、electron impact ionization（Thermo-Finnigan）を利用して、Trace ＤＳＱ fast-scanning single-quadrupole mass spectrometerによって遂行した。
【００８１】
４．次世代ＲＮＡシーケンシング（next-generation ＲＮＡ sequencing）
全体正常造血幹細胞及びＣＭＬ細胞から単離されたＬＴ−癌幹細胞、ＳＴ−癌幹細胞及びＫＬＳ−前駆細胞を、２００μｌ Isogene（Nippon Gene）溶液で直接分離した。Hokkaido System Science Ｃｏ．Ｌｔｄ．（札幌、日本）によって、ＲＮＡ抽出及びシーケンシングを行った。ＲＮＡ定性分析を、Nanodrop（Thermo Fisher Scientific）及びAgilent ２１００ Bioanalyzer（Agilent Technologies）を利用して確認した。全てのＲＮＡ試料は、＞８．５のＲＮＡインテグリティナンバー（ＲＮＡ integrity number）を有し、ＲＮＡシーケンシングに対する品質臨界値を凌駕した。Illumina Sequencing（Takara Clontech）のＳＭＡＲＴｅｒ Ultra Low Input ＲＮＡ Kitを利用して、全体ＲＮＡからライブラリを構築した。ＲＮＡを断片化し、オリゴ−ｄＴプライミング（priming）を利用して、単一鎖ｃＤＮＡに転換させた。ＨｉＳｅｑ２０００（Illumina）を利用して、１００塩基のペアドエンド（paired-end）判読を行った。FastＱ formatで判読された配列を、FastＱＣを利用して品質を評価した。該配列を、ＤＮＡｎｅｘｕｓ Ｉｎｃ．（Mountain View、ＣＡ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｄｎａｎｅｘｕｓ．ｃｏｍ／）によって、ＳｅｑＮｏｖａＴＭ ＣＳを利用して、マウスゲノム標準（Musmusculus；ｍｍ９、ＮＣＢＩBuild ３７）からマッピングした。
【００８２】
５．定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＮｅａｓｙキット（QIAGEN）を利用して、ＲＮＡ試料を、ＤＯＸ中断５週目、６匹のｔｅｔ誘導性ＣＭＬ発病（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）マウス、及び８匹のリタメイト対照群（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋）マウスから単離した４−５ｘ１０４ＬＴ−幹細胞、ＳＴ−幹細胞、ＣＤ４８＋ＫＬＳ＋細胞、ＭＰＰ及びＫＬＳ−前駆細胞から精製した。ＲＮＡ試料を、Advantage ＲＴ−for−ＰＣＲキット（Takara-Clontech）を利用して逆転写した。Ｍｘ３０００Ｐ（登録商標）Real-time ＰＣＲシステム（Stratagene）によって、ＳＹＢＲグリーンプレミックスＥＸＴａｑ（Takara）に利用して、リアルタイム定量ＰＣＲを遂行した。
【００８３】
６．［３Ｈ］ＧｌｙＳａｒ吸収によるＳｌｃ１５Ａ２トランスポーター活性の分析
Ｓｌｃ１５Ａ２トランスポーター活性を、酸性トランスポーター培地（ｐＨ．６．０）中に浮遊した細胞による［３Ｈ］ＧｌｙＳａｒ吸収を測定する、良好に確立された分析法を利用して測定した。簡略には、正常ＫＬＳ＋細胞またはＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞（１ｘ１０５）を、１００μＭセファドロキシル（Sigma−Aldrich）の存在または不存在のトランスポーター培地（１２５ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣｌ、５．６ｍＭ Ｄ−グルコース、１．２ｍＭ ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ、１．２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ及び２５ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ．６．０）に浮遊させた。［３Ｈ］ＧｌｙＳａｒ（Moravek Biochemicals、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を、トランスポーター反応開始のために、前記細胞懸濁液に添加した。６０分または１２０分後、細胞によって内在化された［３Ｈ］ＧｌｙＳａｒの放射能を液体シンチレーションカウンターを利用して測定した。
【００８４】
７．ｃＤＮＡ構築及びレトロウイルス製造
テンプレートで、ヒトＷＴ Ｓｍａｄ３ ｃＤＮＡ（Ｄｒ．Anita Ｂ．Roberts、ＮＣＩ、ＮＩＨ、Bethesda、ＭＤによって提供される）を利用して、ヒトＳｍａｄ３野生型（ＷＴ）、Ｓｍａｄ３ ３ＳＡ（Ｓｅｒ４２２、Ｓｅｒ４２３及びＳｅｒ４２５は、いずれもＡｌａに転換される）、及びＳｍａｄ３ Ｓ２０８Ａ（Ｓｅｒ２０８は、Ａｌａに転換される）をコーディングするレトロウイルス発現ベクターを構築した。簡略には、Ｓｍａｄ３ ３ＳＡ及びＳ２０８Ａ突然変異をコーディングするｃＤＮＡを、ｐＣＲ２ ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）中において、High−Fidelity ＤＮＡポリメラ−ゼＫＯＤ Plus２キット（Toyobo）またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位指定突然変異誘発キット（Stratagene）を利用して構築した。ＤＮＡ配列を、ＡＢＩ−３７３０ｘｌinstrument（Applied Biosystems）を利用して、Operon Biotechnology（東京、日本）によって確認した。
【００８５】
ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ切断されたｃＤＮＡ断片を、レトロウイルスベクターＭＳＣＶ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ中に挿入した。レトロウイルスパッケージング細胞（Ｐｌａｔ−Ｅ）を、ＦｕＧｅｎｅ６（Roche）を利用して、対照群ＧＦＰベクター（ＭＳＣＶ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ）またはＭＳＣＶ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ−Ｓｍａｄ３ＷＴ，ＭＳＣＶ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ−Ｓｍａｄ３ ３ＳＡまたはＭＳＣＶ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰ−Ｓｍａｄ３ Ｓ２０８Ａプラスミドで一時的に形質感染させた。形質感染２日目、培養上澄み液を０．４５μｍフィルタで濾過し、１６時間６，５００ｘｇで遠心分離した。ウイルス含有ペレットを、０．１％ ＢＳＡ（＃０９３００；幹細胞Technology）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco）を含んだ無血清ＳＦ−０３培地（Sanko Junyaku）である幹細胞培地で再懸濁し、ＫＬＳ＋細胞感染のために利用されるレトロウイルス溶液を生産した。
【００８６】
８．ＫＬＳ＋細胞のレトロウイルス感染及びマウス移植
ＫＬＳ＋ＣＭＬ開始（initiating）細胞を、テトラサイクリン誘導性ＣＭＬ発病マウスの２本の後足から得たＢＭ ＭＮＣから精製した。この細胞を、１００ｎｇ／ｍｌヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ、PeproTech）及び１００ｎｇ／ｍｌマウス幹細胞因子（ＳＣＦ、和光純薬）に補充された２００μｌ幹細胞培地を含んだ９６ウェルプレート内で、３７℃、３％Ｏ２インキュベータで一晩培養した。翌日、この細胞を、レトロネクチン（TakaraBio）であらかじめ処理された９６ウェルプレートに移し、マグネチックプレート（ＯＺ Biosciences）上で、Ｃｏｍｂｉｍａｇ（ＯＺ Biosciences）を利用して、前記１５０μｌのレトロウイルスと共に、３０分間インキュベーションさせた。上澄み液の上側半分を注意深く除去した後、感染された細胞に、ＴＰＯ及びＳＣＦで補充された１００μｌの新鮮な幹細胞培地を追加し、３７℃、３％インキュベータで一晩中培養した。レトロウイルス感染されたＣＭＬ開始細胞（約１．０−１．５ｘ１０５cells／mouse）を、致命的放射能処理された（９．０Ｇｙ）ＦＶＢコンジェニック（congenic）レシピエントマウスに静脈注射した。
【００８７】
９．インビボでのＬＴ−ＣＭＬ幹細胞維持
移植３０日目、レシピエントマウスにおいて、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞のインビボ維持を評価した。移植レシピエントのＢＭから単離された全体ＭＮＣを、抗Ｓｃａ−１（Ｅ１３−１６１．７）−ＰＥ、抗ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）−ビオチン、抗ＣＤ８（５３−６．７）−ビオチン、抗Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）−ビオチン、抗ＴＥＲ１１９（Ｌｙ−７６）−ビオチン、抗Ｇｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５）−ビオチン、抗Ｍａｃ１（Ｍ１／７０）−ビオチン抗体（いずれもＢＤ Biosciences）；抗ＣＤ１３５／Ｆｌｋ２／Ｆｌｔ３（Ａ２Ｆ１０）−ビオチン及び抗ｃ−Kit（ＡＣＫ２）−ＡＰＣ抗体（二つとも、ｅBiosciences）；及び抗ＣＤ４８（ＨＭ４８−１）−ＡＰＣ−Ｃｙ７及び抗ＣＤ１５０／ＳＬＡＭ（ＴＣ１５−１２Ｆ１２．２）−Pacific blue（二つともBioLegend）で免疫染色した。ビオチン化された一次抗体を、ストレプタビジン−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢＤ Biosciences）で視覚化した。
【００８８】
全体ＧＦＰ（Ｓｍａｄ３）＋ＫＬＳ＋ＣＭＬ開始細胞内において、ＧＦＰ（Ｓｍａｄ３）＋ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞の頻度を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩセルソーター（ＢＤ Biosciences）を利用して測定した。
【００８９】
１０．Duolink（登録商標）インサイチュ近接接合分析（Duolinｋ（登録商標） in situ proximity ligation assay（ＰＬＡ））
Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ３、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＡＭＰＫ及びＳ６リボソームタンパク質のリン酸化、及びＦｏｘｏ３ａ−Ｓｍａｄ２及びＦｏｘｏ３ａ−Ｓｍａｄ３相互作用を調査するために、Duolink（登録商標）インサイチュＰＬＡ分析法（Olink Bioscience）を利用した。ＣＭＬ発病マウスから新鮮に単離されたＬＴ−ＣＭＬ幹細胞、ＳＴ−幹細胞、ＣＤ４８＋，ＭＰＰ及びＫＬＳ−ＣＭＬ細胞、並びに正常健康なリタメイトから新鮮に単離されたＬＴ−正常ＨＳＣを、直ちに４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定化した。
【００９０】
インビトロ阻害剤実験のために、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞を、ビヒクル（対照群；人工胃液溶液（２．０ｇ ＮａＣｌ、７ｍｌ ｃｏｎｃ．ＨＣｌ及び３．２ｇペプシン含有９００ｍｌ ｄｄＨ２Ｏ））、５μＭ Ｌｙ３６４９４７（ＴＧＦ−βタイプＩ受容体カイネースＡｌｋ５阻害剤；Ｍｅｒｃｋ）、５μＭ ＳＢ２０３５８０（ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤；ＬＣ Laboratories）、５μＭ ＧｌｙＳａｒ（ジペプチドトランスポーター阻害剤；Sigma−Aldrich）、５μＭセファドロキシル（ジペプチドトランスポーター阻害剤；Sigma−Aldrich）または１００ｎＭラパマイシン（ｍＴＯＲＣ１阻害剤；Cell Signaling Technologies）でインキュベーションし、３％Ｏ２、３７℃で３０分間培養した。処理された細胞を、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定化し、０．２５％トリトン−Ｘ１００で１５分間処理し、洗浄した後、１時間５％ ＦＢＳ ＴＢＳ内でインキュベーションすることにより遮断させた。
【００９１】
ブロッキングされた細胞を、下記表１に羅列された抗体の組み合わせと共に、４℃で一晩インキュベーションした。該抗体の近接結合を、一つは、マイナスストランドＰＬＡプローブに連結され、他の一つは、プラスストランドに連結された２個の二次抗体セットを使用する、Duolink（登録商標）インサイチュＰＬＡシステムを利用して測定した。核を、ＤＮＡマーカーＤＡＰＩ（Sigma）で染色した。染色されたスライドを、Fluoromount Plus（Diagnostic Biosystems）を利用して装着し、蛍光イメージを、共焦点顕微鏡（ＦＶ１０ｉ、Olympus）及びPhotoshopソフトウェア（Adobe）によって得た。単一細胞当たり蛍光焦点（fluorescent foci）の数をDuolink（登録商標）Image Toolソフトウェア（Olink Bioscience）を利用して定量した。
【００９２】
【表１】
0006768232.tif 000002
【００９３】
Ｓｍａｄ３リン酸化のための陽性及び陰性の対照群として、インビトロにおいて、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞に、ＴＧＦ−β１（１ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Systems）またはＬｙ３６４９４７（５μＭ；Merck）をそれぞれ添加し、３％Ｏ２において、３０分間インキュベーションした。ｍＴＯＲＣ１活性化のための陰性対照群として、インビトロにおいて、ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞に、ラパマイシン（１００ｎＭ；Cell Signaling Technologies）を添加してインキュベーションした。図３、及び図１３ないし図１５に示されているように、適切な蛍光焦点が、この対照群実験で探知された（あるいは、探知されていない）。Ｄ−ＰＬＡのための技術的陰性対照群として、インビトロにおいて、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞を、単一抗マウス一次抗体で処理し、図８及び図９に示されているように、いかなる蛍光焦点も探知することができないということを確認した。
【００９４】
１１．コロニー形成分析
ＬＴ−ＣＭＬ幹細胞またはＬＴ−正常ＨＳＣ（１ｘ１０３／plate）を、ビヒクル（対照群）またはジペプチドトランスポーター阻害剤セファドロキシル（５μＭ）の存在下で、ＯＰ−９ストローマ細胞上で、５日間共培養した。細胞を収去し、ＰＢＳで洗浄した後、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びエリスロポエチン（Methocult ＧＦ Ｍ３４３４；Stem Cell Technologies）を含んだ半固体メチルセルロース培地にプレーティングした。３７℃、５％ＣＯ２を含んだ湿潤大気中で７日間成長させた後、コロニー数を光学顕微鏡でカウンティングした。
【００９５】
ジペプチドトランスポーター阻害剤＋チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の組み合わせ処理のために、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞（３ｘ１０３）のセファドロキシル（５μＭ）の存在下で、ＯＰ−９ストローマ細胞上にプレーティングした。培養２４時間後、細胞にさらなるＤＭＳＯまたは１μＭ ＩＭ（Axon Medchem）を処理し、さらにもう４日間インキュベーションした（総５日）。処理された細胞をＰＢＳで洗浄し、半固体培地に移した後、７日後、コロニー形成を前述のように評価した。
【００９６】
１２．短いヘアピン（ｓｈ：short hairpin）ＲＮＡ targetting Ｓｌｃ１５Ａ２ ｍＲＮＡ
ｐＧＦＰ−Ｃ−ｓｈＬｅｎｔｉに基づいて、マウスＳｌｃ１５Ａ２遺伝子を標的化する２９−ｍｅｒｓｈＲＮＡ配列（マウスＳｌｃ１５Ａ２ｓｈＢ：5’-GAA CCG TTC TGA GGA CAT TCC AAA GCG AC-3’、マウスＳｌｃ１５Ａ２ｓｈＤ：5’-TAT CGG CTG ATC TCC AAG TGC GGA GTT AA-3’）を保有する３世代（third generation）ＨｕＳＨＴＭ ｓｈＲＮＡレンチウイルスベクター、及び対照群スクランブルド（scrambled）ｓｈＲＮＡを、Origene（Rockville、ＭＤ）から購入した。ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ及びｐＣＭＶ−ｄＲ８．２ ｄｖｐｒ Addgene（Cambridge、ＭＡ）から提供された。ＫＳＬ＋細胞のレトロウイルスの形質導入において、前述のように２９３ＴＮ生産者細胞（System Biosciences；Mountain View、ＣＡ）を、ＦｕＧｅｎｅ６（Roche）を利用して、ｐＧＦＰ−Ｃ−ｓｈＬｅｎｔｉベクター（１００ｍｍプレート当たり６μｇ）、ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（１．５μｇ）及びｐＣＭＶ−ｄＲ８．２ｄｖｐｒ（４．５μｇ）で一時的に形質感染させた。形質感染２日目、培養上澄み液を０．４５μｍフィルタで濾過し、１６時間６，５００ｘｇで遠心分離した。ウイルス含有ペレットを幹細胞培地で再懸濁し、マウスＳｌｃ１５Ａ２ ｍＲＮＡまたはスクランブルドｓｈＲＮＡを標的化するｓｈＲＮＡを保有するレンチウイルス溶液を生産した。ｔｅｔ誘導性ＣＭＬ発病マウスから単離されたＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞及びＣＭＬ ＫＬＳ−細胞を前記レンチウイルスで感染させ、ＧＦＰ＋ＣＭＬ ＫＬＳ＋及びＧＦＰ＋ＣＭＬ ＫＬＳ−細胞を、感染３日目に細胞分離（cell sorting）によって単離した。インビトロにおいて、コロニー形成能を調査するために、該細胞を低酸素条件（３％Ｏ２）下で、ＯＰ−９ストローマ細胞上で５日間共培養し、コロニー形成を前述のように評価した。
【００９７】
１３．正常ＨＳＣに対する競争的再構成分析（competitive reconstitution assay）
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｌｙ５ローカスに対するＣＤ４５．２）マウス及びコンジェニックＣ５７ＢＬ／６（Ｌｙ５ローカスに対するＣＤ４５．１；Ｂ６−Ｌｙ５．１）マウスを、Sankyo−Ｌａｂ Service（Tsukuba、日本）から購入した。致死量に照射された（９ Ｇｙ）Ｃ５７ＢＬ／６（ＣＤ４５．２）レシピエントマウスを、コンジェニックＣ５７ＢＬ／６（ＣＤ４５．１）（Ｂ６−Ｌｙ５．１）マウス由来１ｘ１０４個の正常ＫＬＳ＋細胞（ＨＳＣ）で、Ｃ５７ＢＬ／６（ＣＤ４５．２）マウス由来５ｘ１０５個の未分画化ＢＭ ＭＮＣと競争させて再構成した。０ないし８週目、移植されたレシピエントに、ビヒクルまたはセファドロキシル（３６ｍｇＫｇ−１ｄａｙ−１）を投与した。ドナー由来細胞（ＣＤ４５．１）の再構成を、移植４週目及び８週目に、ＣＤ４５．２（１０４）−ＦＩＴＣ及びＣＤ４５．１（Ａ２０）−ＰＥに対するｍＡｂで染色した末梢血液単核細胞の流細胞分析によってモニターした。
【００９８】
１４．ＣＭＬ癌幹細胞の連続移植（serial transplantation）
インビトロにおいてセファドロキシル、及び／またはインビボにおいてＩＭでマウスを処理した後、疾患誘導能のＣＭＬ癌幹細胞の維持を調査するために、処理されたＢＣＲ−ＡＢＬ１ ＣＭＬ発病マウスにおいて、ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞数を測定し、該細胞の後続二次移植を行った。簡略には、ＣＭＬ発病マウスに、経口摂食によって、ＢＭ移植３０日間、前述のように投与した。処理されたＣＭＬ発病マウスの２本の後足から得たＢＭ ＭＮＣから単離した全体ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ細胞内において、ＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞の数を流細胞分析法によって評価した。その後、新鮮に精製されたＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞（３ｘ１０４）を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来５ｘ１０５個の正常ＢＭ ＭＮＣと共に、致死量に照射されたコンジェニックレシピエントマウスの二次セットに連続的に移植した。マウス生存及び疾患再発を９０日間モニターした。
【００９９】
１５．ヒトＣＭＬ患者でのＳＬＣ１５Ａ２ ｍＲＮＡ発現
ヒトＣＭＬ患者において、ＳＬＣ１５Ａ２ ｍＲＮＡレベルに係わるデータを、９人の健康なドナー、９人のＣＭＬ患者、及びＩＭで治療後１月が経過した同一の９人のＣＭＬ患者のマイクロアレイ分析を含む共用データベース遺伝子発現（ＧＥＯ、ＩＤ：ＧＳＥ３３０７５）から得た。ワンサイド標本ｔ検定（one-sided paired t-test）を、ＣＭＬ患者及びＩＭ治療後のＳＬＣ１５Ａ２発現を比較するために利用した。独立試料に係わる、ＣＭＬ患者及び健康なドナーのＳＬＣ１５Ａ２発現を比較するために利用した。
【０１００】
１６．ヒトＣＭＬ白血病開始細胞のコロニー形成能
慢性段階ＣＭＬを有する３人のヒト患者由来の生きているＢＭ ＭＮＣを、Allcells（＃０６−２５５、＃０６−６２０及び＃１４７７４２、Alameda、ＣＡ、米国）から購入した。該患者の公知に立脚した同意を確認する文書は、http://www.veritastk.co.jp/attached/3978/AllCells_BM_Informed_Consent_Form.pdfで利用可能である。該細胞を、抗ＣＤ３４（８Ｇ１２）、抗ＣＤ３８（ＨＩＴ２）、抗ＣＤ３（ＳＫ７）、抗ＣＤ１６（３Ｇ８）、抗ＣＤ１９（ＳＪ２５Ｃ１）、抗ＣＤ２０（Ｌ２７）、抗ＣＤ１４（ＭμＰ９）及び抗ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１６．２）Ａｂ（いずれも、ＢＤ Biosciences）で染色した。ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１４及びＣＤ５６を認識するｍＡｂの混合物を、Ｌｉｎ−細胞を確認するために利用し、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−細胞を精製した。セファドロキシル（５μＭ）単独、またはセファドロキシルと、ＩＭ（１μＭ；Axon Medchem）またはダサチニブ（５００ｎＭ；ＬＣ laboratories）との組み合わせでの処理効果を調査するために、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−細胞を、低酸素条件（３％Ｏ２）下で、ＯＰ−９ストローマ細胞上で培養した。収去及びＰＢＳによる洗浄後、初生ヒトＣＭＬ白血病開始細胞（ＬＩＣｓ）のコロニー形成能を、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ及びエリスロポエチン（Methocult ＧＦ＋Ｈ４４３５；Stem Cell Technologies）を含む半固体メチルセルロース培地で、培養によって評価した。低酸素（３％Ｏ２）条件下で、３７℃で７日間成長後、コロニー数を光学顕微鏡でカウンティングした。
【０１０１】
１７．統計分析
統計的差を、ｐ値については、アンペアドスチューデントｔ−検定（Student’s t-test）を利用し、生存曲線については、ロングランク非母数的検定（long-rank non-parametric test）を利用して測定した。メタボロミックデータに対する統計的分析は、プログラム「Ｒ」（http://cran.r-project.org/）を利用して遂行した。
【０１０２】
実施例１：ＣＭＬ癌幹細胞は、さまざまなジペプチド種（species）を蓄積
ＣＭＬ癌幹細胞維持（maintenance）のために要求される栄養供給は、ＣＭＬ癌幹細胞を根絶するための新規治療剤の標的候補でもある。標的候補の正常造血幹細胞に対する有害な効果を減らすために、ＣＭＬ癌幹細胞と正常ＨＳＣとを区別させる、変更された作用メカニズムを理解することが本質的である。従って、栄養信号伝逹差を確認するために、正常ＨＳＣと、テトラサイクリン誘導性ＣＭＬ発病マウスから単離したＣＭＬ癌幹細胞との全般的な代謝比較を行った。
【０１０３】
テトラサイクリン誘導性ＣＭＬマウスモデルは、Ｔａｌ１−ｔＴＡ形質転換マウス及びＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１形質転換マウス（ＦＶＢ／Ｎ背景）を交配し、Ｔａｌ１−ｔＴＡ ｘ ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１二重形質転換マウスを得た。それら子孫は、ドキシサイクリン（ＤＯＸ：doxycycline）投与を中断する場合、ＣＭＬ癌幹細胞の生成と共に、ＣＭＬ疾患の誘導が同時に発生する。健康な対照群（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋）マウス及びＣＭＬ発病マウス（Ｔａｌ１−ｔＴＡ＋ＴＲＥ−ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋）から、正常ＨＳＣ及びＣＭＬ癌幹細胞（白血病開始細胞（ＬＩＣ）でも知られる）を含む非成熟ＫＬＳ＋（ｃＫｉｔ＋Ｌｉｎｅａｇｅ−Ｓｃａ−１＋）集団、コミティッド（committed）前駆細胞ＫＬＳ−（ｃＫｉｔ＋Ｌｉｎｅａｇｅ−Ｓｃａ−１−）集団；成熟Ｌｉｎ＋（Ｌｉｎｅａｇｅ＋）集団の細胞サブセット（subset）を単離した。
【０１０４】
この細胞の代謝物質を調査するために、複雑なメタボロミック技法を適用した。報告されたところによれば、静止した正常ＨＳＣが、嫌気性当該過程を介して、アデノシン５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）を生産するが、正常ＫＬＳ＋細胞及びＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞の間で、グルコース、フラクトース１，６−ビスホスフェート（Ｆ−１，６−ｂＰ）、またはピルベートのレベル差がほぼないことを観察した（図１ａ）。アデノシン５’−モノホスフェート（ＡＭＰ）レベルは、ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞で若干高かったが、ＡＴＰは、両細胞集団において検出されなかった。従って、正常ＫＬＳ＋細胞及びＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞は、いずれも相対的エネルギー欠乏状態を示す高いＡＭＰ／ＡＴＰ比を示した（データ未表示）。
【０１０５】
多様な単一アミノ酸レベルを測定したとき、正常ＫＬＳ＋細胞及びＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞の間において、いかなる差も観察することができなかった（図１ｂ）。しかし、驚くべきことに、さまざまなジペプチド種は、健康なリタメイト（ＦＶＢ／Ｎ）マウス（図１ｃ）、または８及び２４週齢の健康なＣ５７ＢＬ／６対照群マウス（データ未表示）から単離された正常ＫＬＳ＋細胞と比較したとき、ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞において、劇的に増加するということを見い出した。各段階において、ＣＭＬ細胞対正常細胞のジペプチドレベル比の計算は、非成熟ＣＭＬ ＫＬＳ＋集団が、成熟ＣＭＬ細胞と比較し、最も高いジペプチド含量を有する傾向を示した（図２）。一部ジペプチドが、ＣＭＬ ＫＬＳ−前駆細胞集団において増加したが、かような増加は、ＣＭＬ前駆細胞増殖支持のために増加されたタンパク質のターンオーバー（turn over）／分解によると推定される。従って、正常ＨＳＣ及び成熟ＣＭＬ細胞とは異なり、ＣＭＬ癌幹細胞は、ジペプチドプールにアミノ酸を保存する。
【０１０６】
実施例２：ＣＭＬ癌幹細胞は、ジペプチドトランスポーターを介してジペプチド内在化
非成熟ＣＭＬ細胞になぜジペプチドが蓄積されるかということを調査するために、上流遺伝子発現パターンを分析した。健康なリタメイト対照群及びＣＭＬ発病マウスから、初生長期（ＬＴ：long−term）ＣＭＬ癌幹細胞（ＣＤ１５０＋ＣＤ４８−ＣＤ１３５−ＫＬＳ＋ cells）、短期（ＳＴ：short−term）幹細胞（ＣＤ１５０−ＣＤ４８−ＣＤ１３５−ＫＬＳ＋ cells）及びＫＬＳ−前駆細胞を単離し、次世代ＲＮＡシーケンシングを利用して、遺伝子発現プロファイリングを行った。ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞においては、上向き調節されるが、ＣＭＬ ＫＬＳ−細胞または正常ＬＴ−ＨＳＣではない遺伝子をスクリーニングし、１０７個のそのような遺伝子を同定した。それらのうち、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を介して、オリゴ／ジペプチドトランスポーターをコーディングするＳｌｃ１５Ａ２遺伝子が、ＣＭＬ ＫＬＳ−前駆細胞及び正常ＬＴ−ＨＳＣと比較し、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞において、高く発現されることを確認した（図１９）。
【０１０７】
Ｓｌｃ１５Ａ２活性が、実際に前記実施例１で確認されたジペプチドの蓄積に対する原因になるか否かということを分析するために、ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞を、［３Ｈ］標識されたグリシルサルコシン（［３Ｈ］ＧｌｙＳａｒ）で、インビトロにおいて、インキュベーションした。前記グリシルサルコシンは、Ｓｌｃ１５Ａファミリトランスポーターの基質として作用するが、代謝されることがないジペプチド類似体である。その結果、ＣＭＬＫＬＳ＋細胞は、正常ＫＬＳ＋細胞よりさらに多くの［３Ｈ］ＧｌｙＳａｒを内在化し、かような吸収は、Ｓｌｃ１５Ａ２特異化学的抑制剤、セファドロキシルの存在下で著しく減少した（図２０）。
【０１０８】
また、欠陥があるタンパク質分解が、ＣＭＬ癌幹細胞のジペプチド蓄積に寄与する可能性を評価した。この細胞を、ボルテゾミブ（２６Ｓプロテアソーム抑制剤）またはバフィロマイシンＡ１（オートファジー阻害剤）で処理する場合、単一アミノ酸レベルは、低下する傾向を示したが、一方ジペプチド蓄積が有意に増大するということを確認した（図２１）。従って、プロテアソーム分解またはオートファジーは、ＣＭＬ癌幹細胞において、ジペプチド蓄積の主要原因ではないということが分かった。
【０１０９】
前記インビトロ結果に基づき、セファドロキシルが、インビボにおいて、ＣＭＬ癌幹細胞のジペプチド内在化を低減させることができるか否かということを調査した。ＣＭＬ発病マウスに、３０日間セファドロキシルを経口で投与し、細胞内ジペプチドを測定するために、ＣＭＬ癌幹細胞のメタボロミック分析を行った。その結果、セファドロキシルに対する露出は、非成熟ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞において、さまざまなジペプチドレベルを低下させるということを見い出し、それは、ジペプチド種の低減された吸収を意味する（図５）。前記インビトロデータ結果及びインビボ結果の組み合わせは、Ｓｌｃ１５Ａ２トランスポーター活性が、ＣＭＬ癌幹細胞において、ジペプチド蓄積の主要推進者であるということを意味する。
【０１１０】
ＣＭＬ癌幹細胞において、ジペプチド吸収の生物学的役割を理解するために、ジペプチドトランスポーターの抑制が、ＣＭＬ癌幹細胞にいかなる影響を及ぼすかということを、インビトロにおいて調査した。セファドロキシル処理は、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞のコロニー形成能を有意に低下させたが、一方セファドロキシル処理されたＨＳＣは、正常レベルのコロニー形成能を維持した（図６）。Ｓｌｃ１５Ａ２ ｍＲＮＡをターゲットにする短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のレンチウイルス形質転換も、ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞のコロニー形成能を低下させたが、ＣＭＬ ＫＬＳ−細胞では、低下させなかった（図２２）。このデータは、ジペプチドＳｌｃ１５Ａ２トランスポーターを介するジペプチド吸収が、インビトロにおいて、ＣＭＬ癌幹細胞生存を維持させるということを示唆する。
【０１１１】
次に、インビトロにおいて、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞の自己再生能に対する阻害されたジペプチド吸収の効果を、正常ＨＳＣと比較することによって調査した。ジペプチド吸収と関連した細胞内栄養信号伝逹を媒介する経路を確認するために、まずＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞に対する、ＧｌｙＳａｒまたはセファドロキシルのインビトロ処理が、ｍＴＯＲＣ１経路を介する信号伝逹に影響を及ぼすか否かということを調査した。５μＭ ＧｌｙＳａｒまたはセファドロキシルに、ＬＴ−ＣＭＬを３０分間露出させた後、高敏感Duolink（登録商標）インサイチュ近接接合分析（Ｄ−ＰＬＡ）を利用して、Raptor−Ｓｅｒ８６３及びＳ６リボソームタンパク質のリン酸化を調査した。予想通り、処理されていない対照群ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞は、フォクソ−Raptor−Ｓｅｒ８６３及びフォクソ−Ｓ６の二つをいずれも示したが（図３）、ＧｌｙＳａｒ処理後またはセファドロキシル処理後のＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞は、ｍＴＯＲＣ１阻害剤、ラパマイシンの処理と類似した結果である、Raptor Ｓｅｒ８６３及びＳ６のリン酸化の低減を示した（図３及び図４）。該結果は、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞において、競争的または化学的な阻害剤によるＳｌｃ１５Ａ２媒介されたジペプチド吸収の妨害が、ｍＴＯＲＣ１媒介された栄養信号伝達を低下させるということを示す。
【０１１２】
ＡＭＰＫは、低エネルギー状態または栄養飢餓状態を経る細胞においてリン酸化され、それは、下流ｍＴＯＲＣ１経路の抑制をもたらす。公知されたＡＭＰＫの活性剤であるメトホルミンによるＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞処理は、ＡＭＰＫ及びRaptor−Ｓｅｒ７９２のリン酸化を増大させ、フォクソ−Raptor−Ｓｅｒ７９２は、ｍＴＯＲＣ１活性を抑制する。ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞のＧｌｙＳａｒまたはセファドロキシルの処理が、リン酸化ＡＭＰＫを増加させるが、該物質は、Raptor−Ｓｅｒ７９２のリン酸化を増大させない。従って、ＡＭＰＫ経路は、Ｓｌｃ１５Ａ２媒介されたジペプチド吸収の抑制を経るＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞で示されるｍＴＯＲＣ１経路の抑制に対して、不要であるということを確認した。
【０１１３】
実施例３：Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化は、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞生存を支持
ジペプチドがｍＴＯＲＣ１経路（図３及び図４参照）を介して、栄養信号伝達が影響を及ぼすということを見い出したが、ラパマイシン処理は、ＣＭＬ発病マウスの生存を延長させないということが報告された。それは、ｍＴＯＲＣ１信号伝逹が、インビボにおいて、ＣＭＬ幹細胞の維持に対して重要ではないということを示唆する。ＴＧＦ−β−ＦＯＸＯ−ＢＣＬ６信号伝逹経路が、ＣＭＬ癌幹細胞維持に本質的であるために、ジペプチド仲裁された栄養信号伝逹と、インビボにおいて、ＣＭＬ癌幹細胞維持を増進させることができる軸（axis）との連結関係があるか否かということを調査した。栄養信号伝逹とＴＧＦ−β−ＦＯＸＯ−ＢＣＬ６軸との潜在的相互交差（cross-talk）、及びそれによるＣＭＬ癌幹細胞能の原因になる核心分子を確認するために、ＴＧＦ−β信号伝逹の下流エフェクタ、Ｓｍａｄ２／３がＣＭＬ癌幹細胞において、栄養信号伝逹の原因になるか否かということをどうかを調査した。その結果、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のいずれも、関連Ｃ末端部位でリン酸化されるということを見い出したが、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞のＤ−ＰＬＡ分析は、以前の報告と一致するように、Ｓｍａｄ３だけがＦｏｘｏ３ａと相互作用するということを示した（図８）。当該結果は、ＣＭＬ癌幹細胞維持の原因になるＴＧＦ−β−ＦＯＸＯ信号伝逹カスケードに、Ｓｍａｄ３が含まれもよいということを示唆する。
【０１１４】
Ｓｍａｄ３は、知られた幹細胞能成長因子であるために、Ｓｍａｄ３が、ＣＭＬ癌細胞の幹細胞能維持を増進させるか否かということを測定することが関心対象であるので、従って、ＴＧＦ−β−処理及び対照群ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞において、Ｓｍａｄ３のリン酸化の位置を調査した。Ｄ−ＰＬＡは、ＴＧＦ−β処理されたＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞において、Ｔｈｒ１７９、Ｓｅｒ２０４、Ｓｅｒ２０８、Ｓｅｒ２１３及びＳｅｒ４２３／４２５残基において、Ｓｍａｄ３の全体リン酸化を検出した一方、新鮮に精製されたＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞は、Ｓｅｒ４２３／４２５及びＳｅｒ２０８でのみＳｍａｄ３のリン酸化を示した（図９）。興味あることとして、Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ４２３／４２５位置は、またＳＴ−ＣＭＬ癌幹細胞、並びにＣＤ４８＋、ＭＰＰ（ＣＤ１３５＋ＫＬＳ＋）及びＫＬＳ−ＣＭＬ細胞でリン酸化されたが、Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化は、Ｓｍａｄ３−Ｆｏｘａ３ａ相互作用であるインビボにおいて、初生ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞で特異的であった（図１０）。該データは、Ｓｍａｄ３のＳｅｒ２０８位置でのリン酸化が、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞において、Ｆｏｘｏ３ａを活性化させることを許容するということを示唆する。前記Ｆｏｘｏ３ａ全社的活性は、インビボにおいて、ＣＭＬ癌幹細胞維持を支持することができる。
【０１１５】
Ｓｅｒ４２３／４２５及びＳｅｒ２０８において、Ｓｍａｄ３リン酸化の関連性を調査するために、リン酸化されることがない２個のヒトＳｍａｄ３の突然変異体を利用した：Ｓｅｒ４２２／４２３／４２５が、いずれもＡｌａに転換されたＳｍａｄ３ ３ＳＡ；及びＳｅｒ２０８がＡｌａに転換されたＳｍａｄ３ Ｓ２０８Ａ。対照群ＧＦＰ、Ｓｍａｄ３野生型（ＷＴ）、Ｓｍａｄ３−３ＳＡまたはＳｍａｄ３−Ｓ２０８Ａを発現するレトロウイルスベクターでＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞を感染させ、コンジェニック（congenic）レシピエントマウスにこの細胞を移植した。その後、インビボにおいて、ＣＭＬ癌幹細胞維持を、流細胞分析によって評価した。移植３０日目、Ｓｍａｄ３突然変異は、ＧＦＰ＋（Ｓｍａｄ３＋）ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞集団の大きさに影響を及ぼさなかった（図１１の上端）。しかし、Ｓｍａｄ３−Ｓ２０８Ａを発現するＣＭＬＫＳＬ＋細胞に移植されたマウスの初生ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞頻度の著しい低下を見い出した（図１１の下段及び図１２）。従って、非正規Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化の阻害は、インビボにおいて、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞での自己再生能の維持を損傷させる。
【０１１６】
Ｓｍａｄ３−Ｓｅｒ２０８リン酸化及びＳｍａｄ３−Ｆｏｘｏ３ａ相互作用は、いずれもＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞でのみ検出されるために（図１０）、ＣＭＬ癌幹細胞において、Ｓｍａｄ３−Ｓｅｒ２０８のリン酸化が最近報告されたＦｏｘｏ３ａの機能規制に含まれるか否かということを調査するために、セファドロキシルによって誘導されたＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞コロニー形成能の抑制が、Ｆｏｘｏ３ａ破壊されたＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞で減減されるか否かということを分析した。
【０１１７】
Ｆｏｘｏ３ａ欠乏ＣＭＬマウスモデルを確立するために、Ｆｏｘｏ３ａ−／−ｔｅｔ誘導性ＣＭＬマウス及びＦｏｘｏ３ａ＋／＋リタメイト対照群を生産した。Ｆｏｘｏ３ａ−／−及びＦｏｘｏ３ａ＋／＋ＣＭＬ発明リタメイトか、らＤＯＸ中断５週後、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞を単離した。Ｆｏｘｏ３ａ−／−ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞は、Ｆｏｘｏ３ａ＋／＋ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞と比較し、インビトロコロニー形成能で低下を示したが、Ｆｏｘｏ３ａ−／−ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞によって形成されたコロニー数は、セファドロキシル処理によっては変更されなかった。また、Ｄ−ＰＬＡは、Ｆｏｘｏ３ａ＋／＋ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞において、Ｆｏｘｏ３ａ−／−ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞で発生しないフォクソ−Ｓｍａｄ３−Ｓｅｒ２０８及びＦｏｘｏ３ａ間の相互作用を示した（図２３）。かような結果は、内在化されたジペプチドによるＳｍａｄ３−Ｓｅｒ２０８リン酸化が、Ｆｏｘｏ３ａ依存方式で、ＣＭＬ癌幹細胞を維持するということを示唆する。
【０１１８】
Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化が、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞維持に重要であるために、癌幹細胞での増加したジペプチド摂取が、Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８の活性化が関連性があるか否かということを調査した。そのために、ＧｌｙＳａｒまたはセファドロキシルによって処理されたＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞を、Ｄ−ＰＬＡ分析に適用させた。興味あることに、ＧｌｙＳａｒまたはセファドロキシルによる処理は、Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８のリン酸化を遮断した（図１４）。対照的に、ラパマイシン処理は、Ｓｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８リン酸化を阻害せず、それは、内在化されたジペプチドが、ｍＴＯＲＣ１及びＳｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８による栄養信号伝逹経路をいずれも同時に刺激するということを示唆する。かような結果は、少なくとも、ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞において、ジペプチド種が、ｐ３８ＭＡＰＫを介する栄養信号伝逹の活性化を誘発することができ、そのＳｍａｄ３ Ｓｅｒ２０８の下流リン酸化を推進することができるということを示す。
【０１１９】
インビボにおいて、セファドロキシル投与が、正常ＨＳＣの機能を変更しないということを確認するために、良好に確立された競争的再構成分析（competitive reconstitution assay）を利用した。放射線照射されたＣＤ４５．２レシピエントマウスに、１ｘ１０４個のコンジェニックＣＤ４５．１マウス由来精製された正常ＫＬＳ＋細胞＋５ｘ１０５個の健康なＣＤ４５．２マウス由来未分画ＢＭ単核細胞（ＭＮＣｓ）を共移植させた。該動物は、移植８週間、セファドロキシルまたはビヒクルを毎日投与された。重要なこととして、セファドロキシル投与の４または８週後、レシピエントの末梢血液（ＰＢ）から、ドナー由来ＣＤ４５．１ＭＮＣの頻度においては、いかなる増加もなかった。付随的に、セファドロキシルが存在するにせよ存在しないにせよ、ドナー由来正常ＫＬＳ＋細胞に起源するキメリズムの程度においては、比較するほどの増加があった。結局、セファドロキシルのインビボ投与は、正常ＨＳＣの再構成力において、何ら検出するほどの効果を示していない。
【０１２０】
実施例４：ジペプチド栄養信号伝逹は、ＣＭＬ癌幹細胞を根絶
ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞に対するジペプチド誘導栄養信号伝達の特異性は、該経路が、可能な治療的ターゲットにもなるか、すなわち、ジペプチド内在化の破壊が、ＣＭＬ癌幹細胞の根絶及び疾患再発において、低減を誘導することができるか否かということを調査するように刺激した。まず、ＣＭＬ発病マウスでのように、ヒトＣＭＬ患者において、ＳＬＣ１５Ａ２遺伝子が上向き調節されるか否かということを調査するために、共用データベース遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ：ＧＳＥ３３０７５）に記録されたＣＭＬ患者細胞のＳＬＣ１５Ａ２のレベルに係わるデータを収集した。興味深いことに、ＩＭ療法以前、ＳＬＣ１５Ａ２ ｍＲＮＡレベルは、実際に９人の健康な個人ＢＭ造血細胞においてよりも、９人のＣＭＬ患者のＢＭ白血病細胞（leukaemia cell）においてさらに高かった。しかし、驚くべきことに、ＩＭ療法後、同一９人のＣＭＬ患者のＳＬＣ１５Ａ２ ｍＲＮＡレベルが、健康な個人のものよりも、比較に値するレベルに低下した。前記発見についてさらに深く調査するために、ＣＭＬ ＫＬＳ＋を、１ヵ月ビヒクルまたはＩＭを投与されたＣＭＬ発病マウスから単離されたＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞のジペプチドレベルを比較した。ヒトＣＭＬ患者で観察したところと一致するように、前記マウスに対するメタボロミック分析は、ＩＭ処理が、ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞において、ジペプチドレベルを低下させる傾向があるというのを示した（図２４）。また、インビトロにおいて、murine ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞に対するＩＭ処理は、フォクソ−Ｓｍａｄ３−Ｓｅｒ２０８のレベルを低下させた。この結果は、ジペプチド種の蓄積が、疾患再発の原因になるＣＭＬ癌幹細胞集団において、ＴＫＩ耐性の直接的原因ではないということを示す。しかし、それは、確認されたＳＬＣ１５Ａ２媒介栄養供給が、ヒトＣＭＬ白血病誘発（leukemogenesis）において支援の役割を行うということを示唆する。
【０１２１】
次に、Ｓｌｃ１５Ａ２媒介栄養信号伝逹を抑制するセファドロキシルと共に、ＢＣＲ−ＡＢＬ１キナーゼの活性を遮断する、ＴＫＩの組み合わせ投与に対する潜在的治療的利点を評価した。インビトロにおいて、セファドロキシル＋ＩＭと共に、murine ＬＴ−ＣＭＬ癌幹細胞を培養したとき、コロニー形成は、ＩＭ単独処理と比較して減少した（図１６）。インビボにおいて、ＣＭＬ発病マウスのＩＭ単独処理は、ビヒクル処理群と比較し、疾患発病を遅延させたが、予想した通り、該動物は、治療中断後、結局ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋疾患の再発を経た（図１７）。不思議なことに、セファドロキシル単独投与は、疾患発病を促進すると分かった。しかし、ＩＭ＋セファドロキシルの組み合わせ投与は、ＩＭ単独処理群と比較し、ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋再発率を有意に低下させた（図１７）。
【０１２２】
セファドロキシル投与が、実際にインビボにおいて、ＣＭＬ発病マウスの初生ＣＭＬ癌幹細胞をなくすことができるか否かということを調査した。明らかに、ＣＭＬ発病マウスのＢＭから単離されたＧＦＰ／ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋ＣＭＬ細胞内において、ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞数は、インビボにおいて、セファドロキシル露出によって有意に減少した（図２５及び図２６）。たとえＩＭ単独も、ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞の数を減少させるにしても、ＩＭ＋セファドロキシルの組み合わせ投与は、該細胞集団において、はるかに大きい抑制効果を有する（図２５）。
【０１２３】
特に、連続移植実験において、セファドロキシル処理されたＣＭＬ発病マウスから単離されたＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞は、完璧に新たなレシピエントにおいて、ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋疾患を推進する能力を喪失し、９０日を越えるほど生存するように許容した（図２６）。対照的に、ビヒクル処理されたＣＭＬ発病動物由来ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞を投与された全てのマウスは、ＢＣＲ−ＡＢＬ１＋疾患が発病し、８０日になる前に死亡した。それは、非処理ＣＭＬ ＫＬＳ＋細胞が、それらのＣＭＬ開始能を保有しているということを立証する。該結果は、ジペプチド吸収を抑制するセファドロキシルの経口投与が、インビボにおいて、ＣＭＬ癌幹細胞の維持に重要な栄養信号伝達を遮断することができ、またＴＫＩと組み合わせたセファドロキシルは、ＣＭＬ癌幹細胞をなくすことにより、ＣＭＬ発病マウスの生存を改善することができることを示唆する。
【０１２４】
最後に、ヒトＣＭＬ治療と本発見との関連性を調査するために、インビトロにおいて、ヒト慢性段階ＣＭＬ患者から得たＣＭＬ−ＬＩＣに対するセファドロキシル処理効果を評価した。３人のＣＭＬ患者のＢＭ ＭＮＣから、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−Ｌｉｎ−ＣＭＬ−ＬＩＣを単離し、インビトロにおいて、この細胞をセファドロキシルで処理した。予想通り、セファドロキシルは、インビトロにおいて、全ての３人のヒトＣＭＬ−ＬＩＣ試料のコロニー形成能を抑制した（図２７）。重要なこととして、ＴＫＩ（ＩＭまたはダサチニブ）＋セファドロキシルの組み合わせで、ヒトＣＭＬ−ＬＩＣの併用処理が、ＴＫＩ単独の抑制効果よりはるかにコロニー形成を有意に低減させた（図２８）。総合して見れば、前記結果は、内在化されたジペプチド種によって活性化されたＳｍａｄ３を介する栄養信号伝逹が、ＣＭＬ癌幹細胞で本質的であるということを示す。従って、かような栄養供給、及びその下流信号伝逹経路がＣＭＬ癌幹細胞をなくす新規治療的ターゲットの候補を提供することができる。前記データは、ＴＫＩ療法との組み合わせに利用される該経路の阻害剤が、ヒトＣＭＬ患者に対する具体的な臨床利益を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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