(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｘを有するテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物、その水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩またはその分割された単一異性体であって、
【化１２】
0006679624.tif 000028
式において、ＺはＯ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＨ−または−ＣＨ２−から選ばれ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立にＨ、Ｃ１−Ｃ１０直鎖炭化水素基、Ｃ３−Ｃ１０分岐炭化水素基、Ｃ３−Ｃ１０シクロ炭化水素基、Ｃ６−Ｃ１０芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基から選ばれ、Ｒ５は、Ｈであり、
あるいはＲ１とＲ２、Ｒ１とＲ３、Ｒ２とＲ３が、これらを連結する構造部分とともに形成する置換または無置換の３〜８員環。
【請求項２】
Ｚは、ＯまたはＳから選ばれ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立にＨ、Ｃ１−Ｃ６直鎖炭化水素基、Ｃ３−Ｃ６分岐炭化水素基、Ｃ３−Ｃ６シクロ炭化水素基、Ｃ６−Ｃ１０芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基から選ばれる請求項１に記載のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物。
【請求項３】
Ｚは、Ｏから選ばれ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立にＨ、Ｃ１−Ｃ６直鎖炭化水素基、Ｃ３−Ｃ６分岐炭化水素基、Ｃ６−Ｃ１０芳香族炭化水素基から選ばれる請求項２に記載のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物。
【請求項４】
化合物は以下から選ばれる請求項３に記載のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物。
【化１３】
0006679624.tif 000029
【請求項５】
化合物は、以下から選ばれる請求項３に記載のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物。
【化１４】
0006679624.tif 000030
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物の調製方法であって、
塩基の存在下で、テノホビルがハロゲン化ベンジルまたはベンジルアルコールと反応してテノホビルモノベンジルエステル中間体を得るステップＡと、
テノホビルモノベンジルエステル中間体と、アミノ酸エステル類化合物又はアミノ酸アミド類化合物とを反応させて、請求項１乃至５のいずれか一項に記載のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物を生成するステップＢとを含むことを特徴とするテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物の調製方法。
【請求項７】
ステップＡにおいて、テノホビルは、臭化ベンジルまたはベンジルアルコールと反応し、塩基は有機塩基である請求項６に記載のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物の調製方法。
【請求項８】
薬物組成物であって、
請求項１乃至４のいずれか一項に記載のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物、またはその水和物、またはその溶媒和物、またはその薬学的に許容可能な塩またはその分割された単一異性体を含有し、ここで、前記薬物組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含有することを特徴とする薬物組成物。
【請求項９】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物、またはその水和物、またはその溶媒和物、またはその薬学的に許容可能な塩またはその分割された単一異性体の、ウイルス感染性疾患を治療する薬物の調製における使用。
【請求項１０】
請求項９に記載のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物、またはその水和物、またはその溶媒和物、またはその薬学的に許容可能な塩またはその分割された単一異性体の、ＨＩＶ感染またはＢ型肝炎あるいはＢ型肝炎ウイルスによる疾患を治療する薬物の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物化学分野に属し、具体的には、新型のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物またはその水和物、溶媒和物、薬用可能な塩または単一キラル異性体、及びその調製方法とその医薬への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
テノホビル（ＴＤＦ）は、水溶性の経口の抗ＨＩＶ及び抗Ｂ型肝炎ウイルスの薬物であり、胃の中で安定し、腸管で吸収された後、血液とともに人体に進入し、かつ均一に人体組織内に分布し、２０％未満が酵素エステルの作用下で、代謝してテノホビルの親薬物に活性化し、かつビスホスホリル化してテノホビルジホスホン酸が生成されてから効果を発揮し、残りの約８０％は原形で尿液を介して体外に排出される。そのバイオアベイラビリティを向上させるために、現在、テノホビルリン酸基に遮断基を加入して、脂溶性のプロドラッグを形成する策略を多く採用するが、そのうちの１つの遮断基はリン酸基とホスファミド構造を形成し、もう１つの基の、リン酸基とリン脂質類構造を形成する化合物は、リンパと肝臓組織のターゲット効果を有することが実証されている。エステル形成基は、各種の芳香環と複素芳香環、特に、置換または無置換フェニル基を含み（ＣＮ２０１３１００４１６４７．４、ＷＯ０２０８２８４１）、特許（ＣＮ０１８１３１６１）には、このようなプロドラッグ策略を採用して得られた化合物ＧＳ−７３４０が開示されており、テノホビル（ＴＤＦ）に比べ、肝臓ターゲットの特性が増えると同時に、活性が強化し毒性が低下している。しかし、遮断基のフェノール基の安定性が不充分で、血液において相変わらず代謝が発生して活性親薬物のテノホビルを生成可能であるため、一定の体系毒性を引き起こすと同時に、代謝によって生成されるフェノール自体も大きな毒性を有する。ベンゼン環に置換されたベンジル基類が存在するテノホビルプロドラッグ化合物は、肝臓ターゲット活性を有することは既に実証されており、特許ＵＳ２０１３０２１０７５７、ＣＮ２０１３８００３００６１．６には、１つの遮断基は、アミノ酸エステルとリン酸基によって形成されるホスファミドで、１つの遮断基は、ベンゼン環上のオルト位またはパラ位にメチルなどの電子供与性基の置換が存在するベンジル基とリン酸基によって形成されるベンゼン環に置換が存在するベンジルエステルである。一方、エステル形成基が無置換ベンジル基であるテノホビルプロドラッグ化合物については、合成及び生物活性の研究報告がなく、ベンゼン環に置換が存在しないベンジル基が５−フルオロウラシルヌクレオシドのプロドラッグの運用において、代謝できず、無活性になってしまう可能性がある（ＷＯ０２０８２８４１）。
【０００３】
ＣＮ２０１３８００３００６１．６に開示されている化合物の構成における遮断基のＯ−メチルベンジル基は、基の脱離の活性が高く、血液の酵素エステル代謝において安定性が低く、ターゲット基が相対的により脱落しやすく、血液における活性親薬物が相対的に増加し、肝臓における活性親薬物は相対的に低下してしまい、活性と体系の毒性に影響を及ぼす。
【化１】
0006679624.tif 000002
【０００４】
テノホビルの生物活性を強化させ、その抗ウイルス活性をレベルアップさせるために、本発明は、ベンジル基ベンゼン環に置換が存在しないテノホビルモノベンジルエステル−アミド類化合物とその調製方法、及びそのリンパターゲットの抗ＨＩＶ感染、肝臓ターゲットの抗Ｂ型肝炎の治療用途を提供し、ＧＳ−７３４０と化合物７に比べ、このようなプロドラッグは酵素エステルに対して、より安定的であり、テノホビル類似物の体系安定性及び肝臓ターゲット性の抗ウイルス作用をさらに強化させている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の発明者は、ベンジル基ベンゼン環に置換が存在しないテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物を発明し、予想外に、本発明の化合物が細胞実験において代謝して活性親薬物のテノホビル（ＴＦＶ）になって、抗ウイルス活性を有することが可能であることを見出した。動物体内の実験において、マウスに胃内投与した後、肝臓部で濃縮し、かつ効果的に代謝して活性生成物のテノホビルになり、さらに、従来技術に比べ、本発明の化合物の抗ＨＢＶウイルス活性がより強く、あるいは血漿においてより安定的であり、その代謝のフラグメントがより安全であることで、血漿の代謝による体系の副作用を低下させている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
具体的には、本発明は、一般式Ｘを有するテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物、その水和物、溶媒和物、薬学的に許容可能な塩またはその分割された単一異性体を提供する。
【化２】
0006679624.tif 000003
式中、Ｚは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＨ−または−ＣＨ２−から選ばれ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ独立にＨ、置換または無置換のＣ１−Ｃ１０直鎖炭化水素基、Ｃ３−Ｃ１０分岐炭化水素基、Ｃ３−Ｃ１０シクロ炭化水素基、Ｃ６−Ｃ１０芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基から選ばれ、ここで、前記置換は、１〜３つの独立にＯ、Ｓ、Ｎ、Ｓｅから選ばれるヘテロ原子による置換、あるいはＲ１とＲ２、Ｒ１とＲ３、Ｒ２とＲ３が、これらを連結する構造部分とともに形成する置換または無置換の３〜８員環。
【０００７】
好ましくは、
Ｚは、ＯまたはＳから選ばれ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ独立にＨ、置換または無置換のＣ１−Ｃ６直鎖炭化水素基、Ｃ３−Ｃ６分岐炭化水素基、Ｃ３−Ｃ６シクロ炭化水素基、Ｃ６−Ｃ１０芳香族炭化水素基またはヘテロアリール基から選ばれる。
【０００８】
より好ましくは、
Ｚは、Ｏから選ばれ、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５は、それぞれ独立にＨ、置換または無置換のＣ１−Ｃ６直鎖炭化水素基、Ｃ３−Ｃ６分岐炭化水素基、Ｃ６−Ｃ１０芳香族炭化水素基から選ばれる。
【０００９】
好ましくは、本発明のテノホビルモノベンジルエステル類化合物は表１の化合物から選ばれる。
【００１０】
【表１】
0006679624.tif 000004
【００１１】
プロドラッグの立体化学は、そのターゲット組織における代謝能力及び抗ウイルス活性に影響を及ぼすことができ、キラル部分はリン原子においても、その遮断基のアミノ酸に見られる。例えば、天然構造のアミノ酸はより良好な代謝活性を有し、化合物３におけるＰ原子の構造がＳである異性体は強い活性を有する。各キラル部位が不純である場合、これらのジアステレオ異性体またはラセミ体に対してキラル濃縮を行う必要があり、よって、選別の結果をより意味のあるものにする。キラル分割、精製によって、上記キラル中心において構造が単一な異性体を得て、各実験化合物が基本的に単一キラル化合物であるようにする。基本的に単一の化合物の形成、またはキラル濃縮は、必要とする立体異性体の構造が化合物重量の約６０％を超えることを意味し、通常、８０％を超え、９５％を超えることが好ましい。本発明は、逆相クロマトグラフィーカラム分離あるいはキラルクロマトグラフィーカラム分離を経て、移動相はアセトニトリル水溶液である。
【００１２】
本発明は、また、テノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物の調製方法の提供を目的とし、以下のステップを含むことを特徴とする。
ステップＡ：塩基の存在下で、テノホビルがハロゲン化ベンジルまたはベンジルアルコールと反応してテノホビルモノベンジルエステル中間体を得る。
ステップＢ：テノホビルモノベンジルエステル中間体と、各種の末端ＮＨ基含有の化合物とを反応させて本発明のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物を生成する。
【００１３】
ここで、ステップＡにおいて、テノホビルは、臭化ベンジルまたはベンジルアルコールと反応することが好ましく、塩基は各種の無機または有機塩基であってもよいが、有機塩基であることが好ましい。ステップＢにおいて、末端ＮＨ基含有の化合物は、アミノ酸エステル類化合物、アミノ酸アミド類化合物から選ばれることが好ましい。
【００１４】
具体的には、テノホビルアセトニトリル懸濁液に、順に、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、臭化ベンジルまたはベンジルアルコールを入れて、該混合物を５０℃〜８０℃まで加熱し、保温しながら２〜２４時間攪拌し、ピリジンを入れて溶解させてから、順にトリエチルアミンとグリシンベンジルエステル塩酸塩、メチルグリシネート塩酸塩、Ｌ−イソプロピルアラニン塩酸塩、Ｌ−フェニルアラニンイソプロピルエステル塩酸塩、グリシンイソプロピルエステル塩酸塩、Ｎ−フェニルグリシンイソプロピルエステル塩酸塩のうちのいずれか１種を入れて、５０℃〜８０℃まで加熱し、１０〜６０分間攪拌してから、該温度で、トリフェニルホスフィンと２，２’−ジチオジピリジンを入れて、５０℃〜１００℃に保温しながら３時間攪拌した後、減圧、スピンドライを行う。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン溶出）によって、白色の固体生成物が得られる。
【００１５】
合成経路は下記の通りである。
【化３】
0006679624.tif 000005
【００１６】
本発明は、化合物のキラル分離の方法をさらに含み、ＨＰＬＣ調製カラム分離（調製カラム：Ｃ１８、移動相：１０％〜５０％アセトニトリル水溶液（Ｖ／Ｖ））あるいはキラルカラム分離によって、各保留時間の溶出液を収集し、乾燥して各キラル異性体を得る。
【００１７】
本発明は薬物組成物をさらに提供し、前記薬物組成物は前記テノホビルモノベンジルエステルリン酸アミド類化合物、またはその水和物、またはその溶媒和物、またはその薬学的に許容可能な塩またはその分割された単一異性体を含む。
【００１８】
必要に応じて、化学分野の通常技術を採用し、酸とアルカリの中和の方法によって、本発明の化合物の薬用塩を得ることが可能である。本発明の化合物と、硫酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、酢酸、ギ酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シュウ酸またはコハク酸とを反応させて、対応する塩を得る。または、本発明の化合物と、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウムなど、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウムなどのようなアルカリ金属炭酸塩とを反応させて、対応する塩を得る。反応は、例えば、水またはエタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、エチレングリコール、酢酸などのような有機溶剤、またはこのような有機溶剤と水の混合物のような溶剤の中で行ってもよい。必要に応じて、該反応は如何なる溶剤無しに行ってもよい。
【００１９】
本発明の薬物組成物は、単位用量の薬物製剤形式であることが好ましく、薬物製剤に作製する際に、任意の薬用可能な剤型に作製してもよく、これらの剤型は、錠剤、コーティング錠剤、フィルムコーティング錠剤、腸溶性錠剤、カプセル剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤、経口液剤、舐剤、顆粒剤、懸濁剤、溶液剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、硬膏剤、クリーム剤、スプレー剤、貼付剤から選ばれる。経口製剤の形式が好ましく、錠剤、カプセル剤が最も好ましい。
【００２０】
さらに、本発明に記載の薬物組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含有する。
【００２１】
本発明のテノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物、またはその水和物、またはその溶媒和物、またはその薬学的に許容可能な塩またはその分割された単一異性体と、薬学的に許容可能な担体とを混合させるような、製剤学的な通常技術を採用して該薬物製剤を調製することが可能である。前記薬学的に許容可能な担体は、マンニット、ソルビトール、ソルビン酸或カリウム塩、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、システイン塩酸塩、チオグリコール酸、メチオニン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ、アゾン、ＥＤＴＡ二ナトリウム、ＥＤＴＡカルシウム二ナトリウム、一価のアルカリ金属の炭酸塩、酢酸塩、リン酸塩またはその水溶液、塩酸、酢酸、硫酸、リン酸、アミノ酸、フマル酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、乳酸ナトリウム、キシリトール、マルチトール、グルコース、フルクトース、デキストラン、グリシン、澱粉、蔗糖、乳糖、マンニトール、シリコン誘導体、セルロース及びその誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、グリセロール、プロピレングリコール、エタノール、ツイーン６０−８０、スパン−８０、ミツロウ、ラノリン、流動パラフィン、ヘキサデカノール、没食子酸エステル類、寒天、トリエタノールアミン、アルカリ性アミノ酸、尿素、アラントイン、炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、界面活性剤、ポリエチレングリコール、シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、リン脂質類材料、カオリン、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムなどを含むが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明の薬物組成物は、薬剤に作製される場合、単位用量の薬剤は本発明の薬物活性物質を０．１〜１０００ｍｇを含有し、残りは薬学的に許容される担体であってもよい。薬学的に許容される担体は、重量で、製剤の総重量の０．１〜９９．９％であってもよい。
【００２３】
本発明の薬物組成物は、使用する際に、患者の状況に応じて用法と用量を確定する。
【００２４】
最後に、本発明は、前記テノホビルモノベンジルエステルホスファミド類化合物、またはその水和物、またはその溶媒和物、またはその薬学的に許容可能な塩またはその分割された単一異性体の、ウイルス感染性疾患を治療する薬物の調製における使用をさらに提供し、ＨＩＶ感染またはＢ型肝炎あるいはＢ型肝炎ウイルスによる疾患を治療する薬物の調製における使用が好ましい。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、具体的な実施例と合わせて、本発明を詳細に説明して、当業者が本特許を十分に理解できるようにする。具体的な実施例は、本発明の技術方案の説明のみに用いられ、如何なる方式で本発明を限定するものではない。
【００２６】
実施例１：化合物１の調製
【化４】
0006679624.tif 000006
【００２７】
テノホビル（５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）懸濁液に、順にＤＩＰＥＡ（１０ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（５ｍｍｏｌ）を入れ、該混合物を８０℃まで加熱し、保温しながら１６時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。ピリジン（２０ｍＬ）を入れて溶解させてから、順にトリエチルアミン（５ｍＬ）及びグリシンイソプロピルエステル塩酸塩（１０ｍｍｏｌ）を入れて、５０℃まで加熱し、３０分間攪拌した後、該温度で、トリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）及び２，２’−ジチオジピリジン（１５ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃に保温しながら３時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン溶出）によって、白色の固体生成物が得られた。収率は４８％であった。
【００２８】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３０（ｓ，１Ｈ），７．９４，７．９１（ｓ，ｓ，１Ｈ），７．３７−７．２８（ｍ，５Ｈ），６．１０，６．０７（ｓ，ｓ，２Ｈ），５．０７−４．８９（ｍ，３Ｈ），４．３８−４．３０（ｍ，１Ｈ），４．１４−４．０５（ｍ，１Ｈ），３．９１−３．８６（ｍ，２Ｈ），３．７１−３．４８（ｍ，４Ｈ），１．２５−１．１８（ｍ，９Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．７６，２５．６６；ＭＳ（ｍ／ｚ）４７７．３２（ＭＨ＋），４７５．１８（ＭＨ−）。
【００２９】
実施例２：化合物２の調製
【化５】
0006679624.tif 000007
【００３０】
テノホビル（５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）懸濁液に、順にＤＩＰＥＡ（１０ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（５ｍｍｏｌ）を入れ、該混合物を８０℃まで加熱し、保温しながら１６時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。ピリジン（２０ｍＬ）を入れて溶解させてから、順にトリエチルアミン（５ｍＬ）及びメチルグリシネート塩酸塩（１０ｍｍｏｌ）を入れて、５０℃まで加熱し、３０分間攪拌した後、該温度でトリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）及び２，２’−ジチオジピリジン（１５ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃に保温しながら３時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン溶出）によって、白色の固体生成物が得られた。収率は５７％であった。
【００３１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２６（ｓ，１Ｈ），７．９３，７．９２（ｓ，ｓ，１Ｈ），７．３１−７．４（ｍ，５Ｈ），６．３７（ｓ，２Ｈ），５．０１−４．８６（ｍ，２Ｈ），４．３３−４．２５（ｍ，１Ｈ），４．１０−４．０１（ｍ，１Ｈ），３．９３−３．８０（ｍ，２Ｈ），３．６７−３．５３（ｍ，４Ｈ），１．４０−１．１４（ｍ，６Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．９６，２５．７３；ＭＳ（ｍ／ｚ）４４９．３０（ＭＨ＋）。
【００３２】
実施例３：化合物３の調製
【化６】
0006679624.tif 000008
【００３３】
テノホビル（５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）懸濁液に、順にＤＩＰＥＡ（１０ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（５ｍｍｏｌ）を入れ、該混合物を８０℃まで加熱し、保温しながら１６時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。ピリジン（２０ｍＬ）を入れて溶解させてから、順にトリエチルアミン（５ｍＬ）及びＬ−イソプロピルアラニン塩酸塩（１０ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃まで加熱し、３０分間攪拌した後、該温度でトリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）及び２，２’−ジチオジピリジン（１５ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃に保温しながら３時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン溶出）によって、白色の固体生成物が得られた。収率は５４％であった。
【００３４】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３４，８．３３（ｓ，ｓ，１Ｈ），７．９３，７．９２（ｓ，ｓ，１Ｈ），７．３６−７．３０（ｍ，５Ｈ），６．００，５．９９（ｓ，ｓ，２Ｈ），５．０６−４．９７（ｍ，２Ｈ），４．９４−４．８９（ｍ，１Ｈ），４．４０−４．２８（ｍ，１Ｈ），４．１４−４．０６（ｍ，１Ｈ），４．０３−３．９２（ｍ，２Ｈ），３．８９−３．７８（ｍ，２Ｈ），３．６７−３．５３（ｍ，２Ｈ），１．３３−１．１８（ｍ，１２Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．０２，２４．１２；ＭＳ（ｍ／ｚ）４９１．３２（ＭＨ＋）。
【００３５】
実施例４：化合物４の調製
【化７】
0006679624.tif 000009
【００３６】
テノホビル（５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）懸濁液に、順にＤＩＰＥＡ（１０ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（５ｍｍｏｌ）を入れ、該混合物を８０℃まで加熱し、保温しながら１６時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。ピリジン（２０ｍＬ）を入れて溶解させてから、順にトリエチルアミン（５ｍＬ）及びＬ−フェニルアラニンイソプロピルエステル塩酸塩（１０ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃まで加熱し、３０分間攪拌した後、該温度でトリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）及び２，２’−ジチオジピリジン（１５ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃に保温しながら３時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン溶出）によって、白色の固体生成物が得られた。収率は６１％であった。
【００３７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３３（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．３０−７．０９（ｍ，１０Ｈ），６．２３（ｓ，２Ｈ），５．０３−４．８８（ｍ，２Ｈ），４．３３−４．２９（ｍ，１Ｈ），４．１５−３．９０（ｍ，３Ｈ），３．８１−３．７１（ｍ，１Ｈ），３．４８−３．４３（ｍ，１Ｈ），３．２１−３．０２（ｍ，３Ｈ），２．９４−２．７６（ｍ，２Ｈ），１．４７−１．４２（ｍ，３Ｈ），１．２６−１．０７（ｍ，９Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２０．７８；ＭＳ（ｍ／ｚ）５６７．３２（ＭＨ＋）。
【００３８】
実施例５：化合物５の調製
【化８】
0006679624.tif 000010
【００３９】
テノホビル（５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）懸濁液に、順にＤＩＰＥＡ（１０ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（５ｍｍｏｌ）を入れ、該混合物を８０℃まで加熱し、保温しながら１６時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。ピリジン（２０ｍＬ）を入れて溶解させてから、順にトリエチルアミン（５ｍＬ）及びグリシンベンジルエステル塩酸塩（１０ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃まで加熱し、３０分間攪拌した後、該温度でトリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）及び２，２’−ジチオジピリジン（１５ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃に保温しながら３時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン溶出）によって、白色の固体生成物が得られた。収率は５８％であった。
【００４０】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３０，８．２９（ｓ，ｓ，１Ｈ），７．９３，７．９２（ｓ，ｓ，１Ｈ），７．３７−７．２７（ｍ，１０Ｈ），６．１４（ｓ，２Ｈ），５．３１（ｓ，１Ｈ），５．１５（ｓ，１Ｈ），５．１０（ｓ，１Ｈ），５．０４−４．８７（ｍ，２Ｈ），４．３４−４．２６（ｍ，１Ｈ），４．０９−４．００（ｍ，１Ｈ），３．９２−３．８１（ｍ，２Ｈ），３．７６−３．５４（ｍ，１Ｈ），３．１７−３．１１（ｍ，２Ｈ），１．１８−１．１６（ｍ，３Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．８１，２５．６１；ＭＳ（ｍ／ｚ）５２５．１９（ＭＨ＋）。
【００４１】
実施例６：化合物６の調製
【化９】
0006679624.tif 000011
【００４２】
テノホビル（５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍＬ）懸濁液に、順にＤＩＰＥＡ（１０ｍｍｏｌ）、臭化ベンジル（５ｍｍｏｌ）を入れ、該混合物を８０℃まで加熱し、保温しながら１６時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。ピリジン（２０ｍＬ）を入れて溶解させてから、順にトリエチルアミン（５ｍＬ）及びＮ−フェニルグリシンイソプロピルエステル塩酸塩（１０ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃まで加熱し、３０分間攪拌した後、該温度でトリフェニルホスフィン（１５ｍｍｏｌ）及び２，２’−ジチオジピリジン（１５ｍｍｏｌ）を入れ、５０℃に保温しながら３時間攪拌してから、減圧、スピンドライを行った。残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノール／ジクロロメタン溶出）によって、白色の固体生成物が得られた。収率は２７％であった。
【００４３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２９（ｓ，１Ｈ），８．０９（ｓ，１Ｈ），７．５０−７．１４（ｍ，１０Ｈ），６．６０（ｓ，２Ｈ），５．０７−４．９０（ｍ，３Ｈ），４．３７−４．３４（ｍ，７Ｈ），３．１７−３．１２（ｍ，３Ｈ），１．４５−１．４１（ｍ，６Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２４．４３，２４．１５；ＭＳ（ｍ／ｚ）５５３．２５（ＭＨ＋）。
【００４４】
実施例７：化合物のキラル分離調製
ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィーカラム分離、あるいはＨＰＬＣキラルクロマトグラフィーカラム分離：実施例２の化合物２（２００ｍｇ）を取って、ＨＰＬＣ調製分離（調製カラム：Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ  Ｃ１８，５μｍ，１５０ｘ２１．１ｍｍ；移動相：２０％アセトニトリル水溶液（Ｖ／Ｖ））を経て、アイソクラティック溶出した後に、化合物２ａ（８３ｍｇ；保留時間１４ｍｉｎ）及び化合物２ｂ（９０ｍｇ；保留時間１７ｍｉｎ）が得られた。
【００４５】
化合物２ａ：ＭＳ（ｍ／ｚ）４４９．２６（ＭＨ＋）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２８（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），７．３２−７．２４（ｍ，５Ｈ），６．５８（ｓ，２Ｈ），５．０２−４．８８（ｍ，２Ｈ），４．３０−４．２６（ｍ，１Ｈ），４．１６−４．０２（ｍ，１Ｈ），３．９０−３．８４（ｍ，２Ｈ），３．６９−３．６５（ｍ，５Ｈ），３．６０−３．５４（ｍ，１Ｈ），１．１６（ｓ，３Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．８７；
【００４６】
化合物２ｂ：ＭＳ（ｍ／ｚ）４４９．３２（ＭＨ＋）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２８（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），７．３２−７．２７（ｍ，５Ｈ），６．６４（ｓ，２Ｈ），５．０３−５．０１（ｍ，２Ｈ），４．３４−４．３０（ｍ，１Ｈ），４．１０−４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９３−３．８４（ｍ，２Ｈ），３．６６−３．５９（ｍ，５Ｈ），１．１４（ｓ，３Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．６４。
【００４７】
化合物１、３、５は、キラルカラム分割化合物２と類似した方法を採用し、キラルカラムを用いて分割を行って、それぞれ化合物１ａ、１ｂ、３ａ、３ｂ、５ａ、５ｂを得た。
【００４８】
化合物１ａ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２５（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｓ，１Ｈ），７．３０−７．２６（ｍ，５Ｈ），６．１７（ｓ，２Ｈ），５．００−４．９０（ｍ，２Ｈ），４．３４−４．２９（ｍ，１Ｈ），４．１１−４．０６（ｍ，２Ｈ），３．９２−３．８１（ｍ，２Ｈ），３．６３−３．５９（ｍ，３Ｈ），１．１８−１．２３（ｍ，９Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．７９；
【００４９】
化合物１ｂ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２８（ｓ，１Ｈ），７．９２（ｓ，１Ｈ），７．３２−７．２７（ｍ，５Ｈ），６．６４（ｓ，２Ｈ），５．０３−５．０１（ｍ，２Ｈ），４．３４−４．３０（ｍ，１Ｈ），４．１０−４．０１（ｍ，２Ｈ），３．９３−３．８４（ｍ，２Ｈ），３．６６−３．５９（ｍ，３Ｈ），１．１６−１．１４（ｍ，９Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．６０。
【００５０】
化合物３ａ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３０（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．３２−７．２７（ｍ，５Ｈ），６．１９（ｓ，２Ｈ），５．０３−４．９６（ｍ，２Ｈ），４．９２−４．８７（ｍ，１Ｈ），４．３０−４．２５（ｍ，１Ｈ），４．０９−４．０３（ｍ，１Ｈ），３．９７−３．９４（ｍ，１Ｈ），３．９０−３．７６（ｍ，２Ｈ），３．５６−３．５０（ｍ，１Ｈ），１．３０−１．１５（ｍ，１２Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２４．１８；
【００５１】
化合物３ｂ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．３０（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｓ，１Ｈ），７．３６−７．２９（ｍ，５Ｈ），６．０９（ｓ，２Ｈ），４．９９−４．９６（ｍ，２Ｈ），４．９４−４．８７（ｍ，１Ｈ），４．３８−４．３４（ｍ，１Ｈ），４．１２−４．０６（ｍ，１Ｈ），３．９６−３．９０（ｍ，２Ｈ），３．８７−３．８１（ｍ，１Ｈ），３．６０−３．５５（ｍ，１Ｈ），３．４５−３．４０（ｍ，１Ｈ），１．３１−１．１６（ｍ，１２Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．０４
【００５２】
化合物５ａ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．２８（ｓ，１Ｈ），７．９５（ｓ，１Ｈ），７．４０−７．２３（ｍ，１０Ｈ），６．３３（ｓ，２Ｈ），５．１０−４．９５（ｍ，４Ｈ），４．３２−４．２８（ｍ，１Ｈ），４．０１−３．８４（ｍ，２Ｈ），３．８２−３．５５（ｍ，４Ｈ），１．２４（ｓ，３Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．８８
【００５３】
化合物５ｂ：１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ；８．２７（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｓ，１Ｈ），７．３４−７．２７（ｍ，１０Ｈ），６．１２（ｓ，２Ｈ），４．９６−４．８４（ｍ，４Ｈ），４．２８−４．２３（ｍ，１Ｈ），３．８３−３．５１（ｍ，６Ｈ），１．１５（ｓ，３Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ２５．５９
【００５４】
【表２】
0006679624.tif 000012
上記化合物において、ａ、ｂ構造は、それぞれ化合物の割合の５０％を占める。
【００５５】
実施例８
実施例７の表２のいずれか１つのキラル化合物１．２ｋｇ、フマル酸２８５ｇ、及び３Ｌアセトニトリルを取って反応器に入れ、混合物を加熱、還流して、固体を溶解させ、熱いうちにろ過し、５℃まで冷却した後、１６時間保存して、生成物をろ過、分離し、アセトニトリルを用いて洗浄し、乾燥して白色の粉末を得た。
【００５６】
試験例：下記試験例によって本発明の有益な効果を証明する。
プロドラッグ化合物にとって、最も重要なことは、プロドラッグの体系における安定性及びターゲット器官部分における代謝活性であり、体系（胃腸管、血液など）における安定性が高ければ高いほど、ターゲット器官（リンパ、肝臓）において親薬物に代謝する活性が高く、化合物の毒性が低く、薬効が高くなる。試験例における本発明の化合物、参照化合物などのプロドラッグは、いずれも活性親薬物のテノホビル（ＴＦＶ）に代謝した後、抗ウイルスの役割を果たす。
【化１０】
0006679624.tif 000013
【００５７】
現在、構造が類似するプロドラッグ化合物は、ＣＮ２０１３８００３００６１．６の請求の範囲の化合物（化合物７及びその単一キラル異性体７ａ、７ｂと略称する）、及び最近Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．がＦＤＡに市販を申請したＢ型肝炎を治療する薬物ＴＡＦ（ＧＳ−７３４０）であり、これらは本発明の化合物と同じ親薬物の構造を有するが、肝臓ターゲットのフラグメントが異なる。
【００５８】
本発明の化合物の長所は、活性がより高く、または構造がより安定的であるため、体系毒性がより低いことである。さらに、ＧＳ−７３４０に対して、本発明の化合物が代謝して生成する安息香酸類化合物は、相対的に安全であり、ＧＳ−７３４０が有毒フェノールを釈放する欠陥を克服し、活性が優れると同時に毒性がより低いという長所を有する。さらに、ＣＮ２０１３８００３００６１．６の請求の範囲における化合物に対して、本発明の化合物の肝臓ターゲット基のベンジル基がＯ−メチルベンジル基より安定的であり、血液酵素エステルの代謝において、ベンジル基が脱落して活性が比較的に低いため、血液における活性親薬物が相対的に減少し、肝臓における活性親薬物が相対的に増加して、より良好な活性を示す。本発明の化合物はベンジル基が脱落した後、毒性がより低く、より優れた体系安定性及びより低い毒性を有する。具体的には以下の通りである。
【００５９】
試験例１：細胞レベル抗ＨＢＶ活性と細胞毒性の比較実験
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法によって、ＨｅｐＧ２．２．１５細胞の上清におけるＨＢＶ  ＤＮＡの含有量を検出して、化合物のＨｅｐＧ２．２．１５細胞における抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を測定し、Ｃｅｌｌ−ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅによって被験化合物のＨｅｐＧ２．２．１５細胞活性に対する影響を検出した。
【００６０】
８．１．化合物の希釈：体外の抗ＨＢＶ活性実験のすべての化合物の初期濃度は１μＭであり、３倍に希釈して、８種類の濃度とした。細胞毒性実験のすべての化合物の初期濃度は１００μＭであり、３倍に希釈し、８種類の濃度とした。ＤＭＳＯを用いて、化合物の母液を希釈した。参照化合物ＴＤＦの体外の抗ＨＢＶ活性実験と細胞毒性実験の初期濃度は、いずれも０．２μＭとし、３倍に希釈し、８種類の濃度とした。
【００６１】
８．２．体外の抗ＨＢＶ活性実験：ＨｅｐＧ２．２．１５細胞（４×１０４細胞／孔）を９６孔板に植え、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。二日目に、異なる濃度の化合物の新鮮な培養液を培養孔に入れた。化合物のリストは表２に示す。五日目に、培養孔の中の古い培養液を吸って除去し、異なる濃度の化合物の新鮮な培養液を入れた。八日目に、培養孔における上清を収集し、上清におけるＨＢＶ  ＤＮＡの抽出に用いた。ｑＰＣＲ実験によって、ＨｅｐＧ２．２．１５の上清におけるＨＢＶ  ＤＮＡの含有量を検出した。
【００６２】
８．３．細胞生存率実験の細胞処理：ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を９６孔板（４×１０４細胞／孔）に植え、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。二日目に、異なる濃度の化合物の新鮮な培養液を培養孔に入れた、化合物のリストは表２に示す。五日目に、培養孔の中の古い培養液を吸って除去し、異なる濃度の化合物の新鮮な培養液を入れた。八日目に、各孔にＣｅｌｌ−ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ試薬を入れて、マイクロプレートリーダーによって各孔の蛍光値を検出した。
【００６３】
８．４．データの分析と、阻害百分率と相対細胞生存率の算出を行う。
下記式を用いて阻害百分率を算出した。
【数１】
0006679624.tif 000014
下記式を用いて細胞活性百分率を算出した。
【数２】
0006679624.tif 000015
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、化合物の５０％有効濃度（ＥＣ５０）値と５０％細胞毒性濃度ＣＣ５０値を算出した。
【００６４】
８．５．実験結果及び結論：
【表３】
0006679624.tif 000016
【００６５】
今回の実験において、合計８つの被験化合物があり、実験結果を以下のとおりにまとめる。２つの被験化合物３ａ、３ｂは、良好な抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を示し、ＥＣ５０値は１０ｎＭレベル以下であり、４つの被験化合物１ｂ、２ａ、５ａ、５ｂの抗Ｂ型肝炎ウイルス活性は相対的に弱く、ＥＣ５０値は２００ｎＭ〜１０００ｎＭの間にあり、もう２つの被験化合物１ａ、２ａの抗Ｂ型肝炎ウイルス活性のＥＣ５０値は最大テスト濃度の１０００ｎＭより高い。
【００６６】
本発明の化合物１、２、４、５、６と化合物３の構造は似ているため、相似する薬効作用を有する。
【００６７】
試験例２、細胞レベル抗ＨＢＶ活性及び細胞毒性の比較実験
９．１薬品：化合物３、参照化合物（ＣＮ２０１３８００３００６１．６、請求項３６に示す化合物を化合物７及びその異性体と略称する）の希釈及び濃度は実施例１と同じであった。
【化１１】
0006679624.tif 000017
【００６８】
９．２実験方法：実施例１に従って行った。
【００６９】
９．３結果と分析：
【表４】
0006679624.tif 000018
【００７０】
表４から分かるように、本発明の化合物３ａ、３ｂは良好な抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を示し、効果は参照化合物７ａ、７ｂ、ＧＳ−７３４０より顕著に優れている。両者のＨｅｐＧ２．２．１５に対する細胞毒性は、いずれも明らかな影響がない（ＣＣ５０＞１００μＭ）。
【００７１】
試験例３：細胞レベル抗ＨＩＶ活性及び細胞毒性実験
９．１．化合物、参照化合物（ＣＮ０１８１３１６１ＧＳ−７３４０、ＴＤＦ）の希釈及び濃度は実施例１と同じであった。
【００７２】
９．２．体外の抗ＨＩＶ活性実験：３７℃で、２４  ＴＣＩＤ５０  ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ／１ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ（２．４ＴＣＩＤ５０／ｗｅｌｌ）を用いて、ＭＴ−４細胞を感染した１時間後、異なる濃度の化合物を含有する９６孔板（４×１０４細胞／孔）に植え、３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養する。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏを用いて、活性を測定し、ＥＣ５０値を算出した。
【００７３】
９．３．細胞生存率実験の細胞処理：９．２と同じ方法で、異なる濃度の化合物を含有する９６孔板を空白９６孔板に代替して平行実験を行い、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏによって細胞生存率を測定し、ＣＣ５０値を算出した。
【００７４】
９．４．データの分析と阻害百分率の算出：下記式を用いて活性百分率を算出した。
【数３】
0006679624.tif 000019
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、化合物の５０％有効濃度（ＥＣ５０）値と５０％細胞毒性濃度ＣＣ５０値を算出した。
【００７５】
９．５．実験結果と結論：
【表５】
0006679624.tif 000020
【００７６】
化合物３ａと３ｂの抗ＨＩＶウイルス活性は、７ｂとＧＳ−７３４０より高く、同時に、３ａ、３ｂのＭＴ−４細胞に対する毒性はＧＳ−７３４０と７ｂの毒性より低い。
【００７７】
結論：実施例２、３から分かるように、薬効の初歩的な研究において、抗ＨＢＶと抗ＨＩＶ活性データに示すように、化合物３ａ、３ｂは良好な抗Ｂ型肝炎ウイルス活性を有すると同時に、良好な抗ＨＩＶウイルス活性を有し、ＴＡＦの活性成分のＧＳ−７３４０の活性に比べ、顕著な優勢を有すると同時に、他の２つの対照化合物７ａと７ｂより明らかに優れている。細胞毒性の研究の結果：ＨｅｐＧ２．２．１５の細胞に対する毒性は、いずれも明らかな影響がないが（ＣＣ５０＞１００μＭ）、ＭＴ−４細胞に対する毒性は、データに示すように、化合物３ａと３ｂは、ＧＳ−７３４０と７ｂに比べ、より低いＭＴ−４細胞毒性を有する。
【００７８】
試験例４：安定性研究結果
下記安定性試験方法は、従来技術に従って行った、安定性実験の表に示すデータはテスト条件下で、被験化合物の培養の異なる時点後の残留百分率である。
【００７９】
１０．１  模擬胃液における安定性（表６）： 
【表６】
0006679624.tif 000021
【００８０】
１０．２  模擬腸液における安定性（テスト濃度：１０μＭ）（表７）：
【表７】
0006679624.tif 000022
【００８１】
１０．３  ヒト血液における安定性（テスト濃度：２μＭ）（表８）：
【表８】
0006679624.tif 000023
【００８２】
１０．４  ヒト肝臓Ｓ９の安定性（テスト濃度：１μＭ）（表９）：
【表９】
0006679624.tif 000024
【００８３】
上記（７−Ｅｔｈｏｘｙｃｕｍａｒｉｎ）７−エトキシクマリン、（７−Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ）７−ヒドロキシクマリン、（Ｅｕｃａｔｒｏｐｉｎｅ）ユーカトロピン、（Ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）クロラムブシル、（Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）オメプラゾールなどの関連対照品の実験データは、本シリーズの実験の有効性を検証できる。
【００８４】
１０．５  データの分析と結論
安定性の初歩的な研究の実験データに示すように、化合物３ａ、３ｂはＧＳ−７３４０、７ｂに比べ、ヒト肝臓Ｓ９における安定性が匹敵し、及び活性親薬物に代謝される速度が匹敵し、肝細胞において、同じ濃度の化合物が相当な活性を有することを示す。
【００８５】
模擬胃液において、３ａ、３ｂの安定性はＧＳ−７３４０と匹敵し、７ｂより高く、模擬腸液における安定性は、３ａ、３ｂが７ｂとＧＳ−７３４０より顕著に高い。ヒト血液においても、３ａと３ｂの安定性は対比化合物７ｂとＧＳ−７３４０より良好である。総合的に比較すると、化合物３ａ、３ｂはＧＳ−７３４０と７ｂに比べ、胃腸管と血液体系のより高い代謝安定性を有して、非病変部分の薬物の濃度がより低く、病変箇所の薬物の濃度がより高く、化合物３ａ、３ｂはＧＳ−７３４０と７ｂに比べ、より良好な肝臓ターゲット性とより低い体系毒性を有することを示す。
【００８６】
試験例５：心臓の毒性研究
１１．１．実験細胞と化合物の調製
実験は、ＡＶｉｖａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から得られる安定的にｈＥＲＧカリウムイオンチャネルを発現することができるＣＨＯ細胞を採用し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で、一定の湿度環境において培養した。
【００８７】
化合物と、陽性対照化合物のアミトリプチリン（Ａｍｉｔｒｉｐｔｙｌｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢＣＢＪ８５９４Ｖ）とを１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した後にアイソクラティック希釈を行った、細胞外液におけるＤＭＳＯの最終濃度は０．３０％未満であり、−２０℃で保存した。
【００８８】
１１．２．手動パッチクランプの記録
化合物を、室温下で、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ上で、全細胞パッチクランプ技術を採用してテストを行い、出力信号は、ＤＩｇｉＤＡｔａ  １４４０Ａ／Ｄ−Ｄ／Ａパネルを採用してデジタル化し、Ｐｃｌａｍｐ１０ソフトウェアで記録制御を行った。最小密封抵抗は５００ＭＯｈｍｓとし、最小特異ｈＥＲＧ電流は０．４ｎＡとして、品質の制御を行った。
【００８９】
１１．３．データの分析
Ｃｌａｍｐｆｉｔ（Ｖ１０．２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を採用して、Ｅｘｃｅｌ  ２００３とＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０に対してデータの分析を行った。電流の算出式は以下の通りである。
【数４】
0006679624.tif 000025
【００９０】
１１．４．実験結果と結論（表１０）：
【表１０】
0006679624.tif 000026
【００９１】
結論：ｈＥＲＧ実験において、化合物３ａ、３ｂとＧＳ−７３４０、７ｂは、ＩＣ５０に対して匹敵し、いずれも１０μＭ以上であり、心臓の毒性の面で安全であり、新薬開発における化合物の薬品性の研究のｈＥＲＧデータの一般性の要求を満たす。
【００９２】
試験例６：マウスの体内代謝と組織分布実験
１２．１．実験動物、薬物調製方法及び投薬方案
１２匹のＩＣＲマウス（雄性、体重３０±５ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ動物センターから購入）をランダムに各組３匹の４組に分け、投薬する前に、１２ｈ断食させ、断食期間に水を自由に飲ませた。分析天秤に精密に３０ｍｇの化合物３を秤量し、１００μＬの７５％エタノールを入れて溶解させ、さらに、生理食塩水を６ｍＬまで入れて、均一にボルラックス混合し、超音波して用意した。テノホビルプロドラッグの投薬剤量は５０ｍｇ／ｋｇで、投薬量は１０ｍＬ／ｋｇであった。
【００９３】
１２．２．サンプルの採集方案と処理方法
サンプルの採集方案：マウスに対して、胃内投与で投薬した後、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ及び３ｈに、眼窩から０．５ｍＬ採血し、犠牲死させ、肝臓組織を取って洗浄し、秤量し、肝臓は、１：１の比例に基づいて、生理食塩水を入れてホモジネートし、−４０℃で冷蔵庫に保存して、待機させた。
【００９４】
血漿サンプルの処理方法：マウスの血漿１００μＬを取って、１．５ｍｌのプラスチックＥＰ管に入れて、１００μＬ内部標準（２００ｎｇ／ｍｌテオフィリン）溶液に入れ、６００μＬのアセトニトリルを入れて、２ｍｉｎボルラックスし、振動し、３ｍｉｎ（１２５００ｒｐｍ）遠心して、上澄みを取り、窒素ガスで乾かし、１００μＬ移動相（水：メタノール＝９５：５）で再溶解させて、１０μＬの検体を取り込んだ。
【００９５】
組織サンプルの処理方法：マウスの組織サンプル２００μＬを取って、１．５ｍＬプラスチックＥＰ管に入れて、１００μＬの内部標準（２００ｎｇ／ｍｌテオフィリン）溶液を入れ、６００μＬのアセトニトリルを入れて、２ｍｉｎボルラックスし、振動し、３ｍｉｎ（１２５００ｒｐｍ）遠心して、上澄みを取り、窒素ガスで乾かし、１００μＬ移動相（水：メタノール＝９５：５）で再溶解し、２０μＬの検体を取り込んだ。
【００９６】
１２．３．サンプルの分析方法
Ｔｈｅｒｍｏ  ＴＳＱｑｕａｎｔｕｍ液質複合計器及びクロマトグラフィーカラム：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ（２．１×１５０ｍｍ）を採用し、内部標準Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅで、ＨＰＬＣ−ＭＳの検体を取り込んだ後、グラジエント溶出分析を行って、内部標準、化合物１と代謝生成物のテノホビル（ＴＦＶ）の保留時間及びピークの面積を記録し、ＳＲＭ定量検出方法によって分析を行った。
【００９７】
１２．４．サンプル分析結果と結論（表１１）
【表１１】
0006679624.tif 000027
【００９８】
結果に示すように、３ｈ後、化合物３とその代謝生成物のテノホビルＴＦＶの肝臓における濃度は、いずれも血液における濃度より高く、肝臓における両者の総濃度は血液における総濃度の３７７倍であり、化合物３が肝臓で有効に濃縮できることを示し、同時に、血液におけるＴＦＶの濃度は親薬物化合物３の濃度の０．７２倍に過ぎず、肝臓における親薬物ＴＦＶの濃度はプロドラッグ化合物３の濃度の１６６倍であり、化合物３がマウスの血液において比較的に安定的であり、肝臓で有効に活性親薬物のテノホビルに代謝することを示す。よって、化合物３は、動物の体内実験において、血液安定性及び肝臓ターゲット性の抗ＨＢＶ活性を有する。