(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性高分子及びリンカー化合物により改質されたアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、
支持体に固定された前記親水性高分子が、多糖類であり、
支持体に固定された前記リンカー化合物上の活性基を通してタンパク質のリガンドがさらに固定され、
且つ、前記リンカー化合物由来のリンカーが、下記式（９）で表され且つリンカー長の原子数が３０以上のリンカーであることを特徴とする、
アフィニティークロマトグラフィー用担体。
【化１】
0006737579.tif 000008
〔式（９）中、
Ａ1及びＡ2は、それぞれ独立して、単結合、環状エーテル基が開環してなる基、又はカルボニル基を示し、
Ｒ5は、炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、
ｐは、８以上の整数を示し、
＊は、結合手を示す。〕
【請求項２】
前記活性基が、環状エーテル基、ホルミル基、アリールスルホニル基、ハロゲノ基、コハク酸イミドオキシ基、及びマレイミド基から選ばれる少なくとも１種以上である、請求項１に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項３】
前記リンカー長が原子数で６０以上、３００以下である、請求項１又は２に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項４】
前記リンカー長が原子数で１００以上、３００以下である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項５】
前記支持体が、合成高分子系支持体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項６】
前記リガンドがプロテインＡ又はその機能性変異体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填されている、
クロマトグラフィーカラム。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とする、
標的物質の精製方法。
【請求項９】
前記標的物質が、タンパク質又は核酸である、請求項８に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフィニティークロマトグラフィー用担体、クロマトグラフィーカラム、精製方法、及び該方法で精製された標的物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、抗体医薬に代表されるタンパク質製剤は、大量発酵や高力価発酵により生産性が向上しており、それに伴いその精製にも効率化が求められている。斯かる効率化やコスト削減を達成するために、精製に使用されるクロマトグラフィー用担体の流速特性や標的物質捕捉特性の改善が望まれている。
【０００３】
流速特性を改善するために、支持体分子を架橋して強度を上げる手法で製造されたクロマトグラフィー担体が開発されている。また、このような架橋マトリックスに、デキストラン等の親水性高分子を組み合わせることで、標的物質捕捉特性が向上することが知られており、このような親水性高分子を導入した多孔性基材が、クロマトグラフィー用担体の開発領域において注目されている。
【０００４】
例えば、非特許文献１には、ポリスチレン−シリカからなるコア粒子にイオン交換基を付加し、これにデキストラン由来のハイドロゲルを組み合わせたイオン交換吸着剤（Ｂｉｏｓｅｐｒａ社より「Ｓ  ＨｙｐｅｒＤ（商標）」として市販されている）が記載されている。
また、特許文献１には、メタクリレート系ポリマー粒子にポリエチレンイミンを付加してなるクロマトグラフィー用担体を用いることで、タンパク質捕捉特性が向上したとの報告がある。
さらに、特許文献２には、多孔性メタクリレート粒子に分子量５０万のプルランを固定したゲルに、２−ブロモエタンスルホン酸ソーダを用いてリガンドを導入して得た、強カチオンイオン交換型クロマトグラフィー用担体が記載されている。
また、非特許文献２には、アガロースからなるコア粒子にデキストランを用いて表面修飾を施したときの効果について報告されている。これによれば、デキストランを用いてコア粒子の表面を修飾することで、標的タンパク質の担体内における拡散性が向上するため、対象物の物質移動が増大するとされている。そして、このような設計のクロマトグラフィー用担体として、ＧＥヘルスケアサイエンス社から「ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ＸＬ」が市販されている。
さらに、特許文献３には、抗体医薬製造用に利用できる陽イオン交換型クロマトグラフィー用担体として、架橋アガロースゲルに分子量４０ｋＤａのデキストランが共有結合してなる粒子に、ビニルスルホン酸を用いてイオン交換基を導入したゲルが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５２８９６６号公報
【特許文献２】特開２００８−２３２７６４号公報
【特許文献３】国際公開第２００７／０２７１３９号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，６７９  （１９９４）  １１−２２
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１１４６  （２００７）  ２０２−２１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、支持体に親水性高分子を付加させることにより、標的物質捕捉特性が向上することが報告されているものの、支持体に固定されるリガンドは低分子リガンドに限定されていた。このような技術をプロテインＡ等のタンパク質リガンドへ適用する試みはかねてより行われているものの、親水性高分子の排除体積効果によって親和性が極端に低下するため、このような場合でも流速特性と標的物質捕捉特性とを両立したという成功例は未だ報告されていない。そのため、イムノグロブリン等を標的物質とする上においても、流速特性と標的物質捕捉特性とを両立できるアフィニティークロマトグラフィー用担体の開発が望まれる。
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、タンパク質のリガンドが使用されているにも拘らず、流速特性と標的物質捕捉特性に優れたアフィニティークロマトグラフィー用担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意検討した結果、親水性高分子で改質するとともに、タンパク質リガンドを支持体に固定するにあたって、リンカー長が原子数で３０以上となるリンカー化合物を通して固定することによって、流速特性と標的物質捕捉特性に優れたアフィニティークロマトグラフィー用担体が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の＜１＞〜＜１０＞を提供するものである。
【００１１】
＜１＞  親水性高分子及びリンカー化合物により改質されたアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、支持体に固定されたリンカー化合物上の活性基を通してタンパク質のリガンドがさらに固定され、且つ、前記リガンドと前記支持体との間のリンカー長が、原子数で３０以上であることを特徴とする、アフィニティークロマトグラフィー用担体。
＜２＞  前記活性基が、環状エーテル基、ホルミル基、アリールスルホニル基、ハロゲノ基、コハク酸イミドオキシ基、及びマレイミド基から選ばれる少なくとも１種以上である、前記＜１＞に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
＜３＞  前記親水性高分子が、プルラン、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、及びそれらの誘導体から選ばれる少なくとも１種以上である、前記＜１＞又は＜２＞に記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
＜４＞  前記リンカー長が原子数で６０以上、３００以下である、前記＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
＜５＞  前記リガンドがプロテインＡ又はその機能性変異体である、前記＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体。
＜６＞  前記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填されている、クロマトグラフィーカラム。
＜７＞  前記＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とする、標的物質の精製方法。
＜８＞  前記標的物質が、タンパク質又は核酸である、前記＜７＞に記載の精製方法。
＜９＞  前記＜７＞又は＜８＞に記載の精製方法により精製された、標的物質。
＜１０＞  タンパク質又は核酸である、前記＜９＞に記載の標的物質。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、親水性高分子の排除体積効果による親和性の低下が少ないため、プロテインＡ等のタンパク質のリガンドが使用されているにも拘らず、流速特性と標的物質捕捉特性に優れる。また、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、防汚性にも優れる。
したがって、本発明によれば、流速特性、標的物質捕捉特性及び防汚性に優れたクロマトグラフィーカラムを提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
〔アフィニティークロマトグラフィー用担体〕
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、親水性高分子及びリンカー化合物により改質されたアフィニティークロマトグラフィー用担体であって、支持体に固定されたリンカー化合物上の活性基を通してタンパク質のリガンドがさらに固定され、且つ、前記リガンドと前記支持体との間のリンカー長が、原子数で３０以上であることを特徴とする。
【００１４】
＜支持体＞
支持体としては、合成高分子系支持体、天然高分子系支持体等の有機系支持体；無機系支持体；これらを組み合わせた有機−有機複合系支持体や有機−無機複合系支持体等が挙げられる。
合成高分子系支持体としては、例えば、ポリビニルアルコール類、ポリ（メタ）アクリレート類、ポリ（メタ）アクリルアミド類、ポリスチレン類、エチレン−無水マレイン酸共重合物等で構成されるもの挙げられる。
天然高分子系支持体としては、例えば、アガロース、デキストラン、マンナン、セルロース等の多糖類で構成されるものが挙げられる。また、これを物理架橋や化学架橋したものでもよい。
無機系支持体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、金属、金属酸化物等で構成されるものが挙げられる。
これらの中でも、支持体としては、流速特性の観点から、合成高分子系支持体が好ましい。また、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、支持体として合成高分子系支持体を使用した場合でも、防汚性を充分に備える。
【００１５】
支持体は、非多孔質でも多孔質でもよいが、多孔質であることが好ましい。また、支持体の形態は、粒子状、モノリス状、板状、チップ状、繊維状、膜状（中空糸を含む）等のいずれでもよいが、標的物質捕捉特性の観点から、粒子状、モノリス状、板状、繊維状、膜状が好ましく、粒子状がより好ましい。
【００１６】
また、支持体が粒子である場合、その粒径は、流速特性の観点から、好ましくは３０μｍ以上であり、また、標的物質捕捉特性の観点から、好ましくは３００μｍ以下である。斯かる粒径は、重合する際の条件や分級等により調整できる。なお、本発明における「粒径」とは、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置により得られる体積平均粒子径を意味する。
【００１７】
また、支持体が多孔質粒子である場合、その比表面積は、孔径１０〜５０００ｎｍの範囲に相当するポアを測定したときに、ポアサイズ１０ｎｍ〜５０００ｎｍにおける比表面積で、好ましくは７０ｍ2／ｇ以上であり、より好ましくは９０ｍ2／ｇ以上である。
なお、本発明における「比表面積」とは、水銀ポロシメータにより得られる細孔径１０〜５０００ｎｍの細孔の有する表面積を粒子の乾燥質量で除した値である。
【００１８】
支持体は、市販品を用いても、常法に従い合成したものを用いてもよい。例えば、合成高分子系支持体は、特公昭５８−０５８０２６号公報、特開昭５３−０９０９９１号公報等に記載の公知の方法に従い、重合性不飽和モノマーを懸濁重合法（逆相又は順相懸濁重合）等で重合することにより得ることができる。
重合性不飽和モノマーとしては、単官能不飽和モノマー、多官能不飽和モノマーが挙げられる。合成高分子系支持体としては、単官能不飽和モノマーと多官能不飽和モノマーとの共重合体が好ましい。
【００１９】
単官能不飽和モノマーは、不飽和結合を分子内に１つ有する重合性モノマーであれば特に限定はされない。このような単官能不飽和モノマーは、エポキシ基又は開環エポキシ基をもつものと、これら官能基をもたないものに大別される。
【００２０】
エポキシ基又は開環エポキシ基をもつ単官能不飽和モノマーとしては、グリシジル（メタ）アクリレート、４，５−エポキシペンチル（メタ）アクリレート、４−（２，３−エポキシプロピル）−ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、９，１０−エポキシステアリル（メタ）アクリレート、４−（２，３−エポキシプロピル）シクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、３，４−エポキシシクロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、３，４−エポキシシクロヘキシルプロピル（メタ）アクリレート、３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルプロピル（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリレート類；ビニルベンジルグリシジルエーテル等のモノビニル芳香族化合物類の他、アリルグリシジルエーテル、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられる。
エポキシ基や開環エポキシ基をもたない単官能不飽和モノマーとしては、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシペンチル（メタ）アクリレート、２−クロロエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリレート類；ジメチル（メタ）アクリルアミド、ジエチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド類；スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、ヒドロキシスチレン、クロロスチレン等のモノビニル芳香族化合物類の他、ハロアルキル（炭素数１〜４）ビニルエーテル、ヒドロキシアルキル（炭素数１〜４）ビニルエーテル、ビニルアセテート等が挙げられる。
なお、単官能不飽和モノマーは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
【００２１】
これらの中でも、単官能不飽和モノマーとしては、親水性高分子やリンカー化合物を簡便且つ強固に支持体に固定できる点で、エポキシ基又は開環エポキシ基をもつ単官能不飽和モノマーが好ましく、エポキシ基をもつ単官能不飽和モノマーがより好ましい。なお、（メタ）アクリルとはメタクリル化合物とアクリル化合物の総称を意味する。
【００２２】
多官能不飽和モノマーは、不飽和結合を分子内に２つ以上有する重合性モノマーであればよいが、二官能不飽和モノマー、三官能不飽和モノマーが好ましい。多官能不飽和モノマーは、支持体として多孔質粒子を得るのに有用である。
二官能不飽和モノマーは、不飽和結合を分子内に２つ有する重合性モノマーであればよいが、例えば、ジビニルベンゼン等のジビニル芳香族化合物類；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコールジ（メタ）アクリレート類；アルカンジイル（炭素数１〜１１）ビス（メタ）アクリレート類；Ｎ，Ｎ’−メチレンビス（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−エチレンビス（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ヘキサメチレンビス（メタ）アクリルアミド等のアルカンジイル（炭素数１〜１１）ビス（メタ）アクリルアミド類等が挙げられる。
三官能不飽和モノマーは、不飽和結合を分子内に３つ有する重合性モノマーであればよいが、例えば、トリビニルベンゼン等のトリビニル芳香族化合物類の他、グリセリントリ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
なお、多官能不飽和モノマーは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
多官能不飽和モノマーの使用量は、単官能不飽和モノマー１００質量部に対して、通常１〜１００質量部であり、好ましくは１〜５０質量部である。
【００２３】
重合性不飽和モノマーの懸濁重合の具体的な手法としては、例えば、重合性不飽和モノマー及び必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（モノマー溶液）に重合開始剤を溶解し、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して重合させる方法や、重合性不飽和モノマー及び必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（モノマー溶液）に重合開始剤を溶解し、所定温度まで加熱した水系媒体中に添加して重合させる方法、重合性不飽和モノマー及び必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（モノマー溶液）を、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して、重合開始剤を添加し重合させる方法等が挙げられる。
【００２４】
上記重合開始剤としては、過酸化物系開始剤、アゾ系開始剤等が挙げられる。
過酸化物系開始剤としては、ｔ−ブチルパーオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−ブチルパーオキシイソブチレート、２，５−ジメチル−２，５−ジ（ベンゾイルパーオキシ）ヘキサン、ｔ−ブチルパーオキシアセテート、ｔ−ブチルパーオキシベンゾエート等のブチルパーオキサイド系開始剤；ｔ−アミルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ｔ−アミルパーオキシ−ｎ−オクトエート、ｔ−アミルパーオキシアセテート、ｔ−アミルパーオキシベンゾエート等のアミルパーオキサイド系開始剤；ｔ−ブチルパーオキシイソプロピルカーボネート、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキシルカーボネート、ｔ−アミルパーオキシ−２−エチルヘキシルカーボネート、ジ（２−エチルヘキシル）パーオキシジカーボネート、ジ（ｓｅｃ−ブチル）パーオキシジカーボネート等のパーオキシカーボネート系開始剤；ジクミルパーオキサイド、２，５−ジメチル−２，５−ジ（ｔ−ブチルパーオキシ）へキサン、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、ジ−ｔ−アミルパーオキサイド等のジアルキルパーオキサイド系開始剤；１，１−ジ（ｔ−ブチルパーオキシ）シクロヘキサン、２，２−ジ（ｔ−ブチルパーオキシ）ブタン、エチル−３，３−ジ（ｔ−ブチルパーオキシ）ブチレート、１，１−ジ（ｔ−アミルパーオキシ）シクロへキサン等のパーオキシケタール系開始剤が挙げられる。
また、アゾ系開始剤としては、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）、２，２’−アゾビス（２−メチルブチロニトリル）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾニトリル系開始剤；２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−プロペニル）−２−メチルプロピオンアミド］、２，２’−アゾビス［Ｎ−ブチル−２−メチルプロピオンアミド］、２，２’−アゾビス［Ｎ−シクロヘキシル−２−メチルプロピオンアミド］等のアゾアミド系開始剤の他、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミドオキシム）、ジメチル−２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオネート）、４，４’−アゾビス（４−シアノバレリック酸）、２，２’−アゾビス（２，４，４−トリメチルペンタン）等が挙げられる。
重合開始剤の使用量は、モノマー総量１００質量部に対して、通常０．０５〜２０質量部であり、好ましくは０．２〜１０質量部である。
【００２５】
上記多孔化剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、クロロベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン、ジエチルベンゼン、ドデシルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、イソアミルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、オクタノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２−オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸−３−メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。多孔化剤は単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
多孔化剤の使用量は、モノマー総量１００質量部に対して、通常、５０〜１０００質量部程度である。
【００２６】
上記水系媒体としては、例えば水溶性高分子水溶液等が挙げられ、水溶性高分子としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン等が挙げられる。
水系媒体の使用量は、モノマー総量１００質量部に対して、通常、２００〜７０００質量部程度である。
また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、燐酸カルシウム等の分散安定剤を使用してもよい。
また、重合反応には、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩等のアニオン性界面活性剤をはじめとする各種界面活性剤を用いてもよい。
また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、ｔｅｒｔ−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。
【００２７】
＜親水性高分子＞
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、親水性高分子により改質されたものである。斯かる構成により、流速特性と防汚性が改善される。
【００２８】
親水性高分子としては、親水性の非架橋高分子が好ましい。また、親水性高分子は、水酸基又はアミノ基を有するものが好ましく、水酸基を有するものがより好ましく、２級水酸基を有するものが特に好ましい。
親水性高分子としては、具体的には、プルラン、アガロース、デキストラン、セルロース、デンプン等の多糖類又はその誘導体の他、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、これらの誘導体が挙げられる。本発明においては、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
これらの中でも、親水性高分子としては、流速特性や防汚性等の観点から、多糖類又はその誘導体が好ましく、デキストラン又はその誘導体が特に好ましい。
【００２９】
親水性高分子の重量平均分子量は特に限定されないが、好ましくは５，０００〜５，０００，０００、より好ましくは１０，０００〜１，０００，０００、特に好ましくは１０，０００〜５００，０００である。
なお、重量平均分子量は、ゲルパーミュエーションクロマトグラフィ（ＧＰＣ）によるポリスチレン換算重量平均分子量を意味する。
【００３０】
また、アフィニティークロマトグラフィー用担体としては、親水性高分子が上記支持体に固定されているものが好ましい。また、親水性高分子と支持体は、化学結合で固定されているのが好ましい。また、支持体が多孔質である場合、親水性高分子は、支持体の細孔内部及び／又は細孔外部の表面に固定されていてよい。
また、親水性高分子の固定は、親水性高分子のポリマー鎖間に架橋構造が入らないような、常法の支持体表面修飾方法で行うのが好ましい。
例えば、支持体自体が備える反応性官能基（エポキシ基、ハロゲノ基、イソシアネート基、カルボジイミド基等）を用い、これに水等に溶解した親水性高分子を反応させる方法や、支持体表面に反応性官能基（エポキシ基、ハロゲノ基、イソシアネート基、カルボジイミド基等）を導入し、これに水等に溶解した親水性高分子を反応させる方法が挙げられる。このような方法で親水性高分子を固定することにより、親水性高分子のポリマー鎖間に架橋構造が形成されずに、その柔軟性を維持させたまま、親水性高分子を支持体に固定できる。
なお、反応性官能基の支持体表面への導入は、適当な溶媒の存在下公知の方法で行えばよい。例えば、ヒドロキシ基を表面に有するものを支持体として、エピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリン類、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジグリシジルエーテル類、１，７−オクタジエンジエポキシドのようなジエポキシド類を、アルカリ条件下で支持体表面上のヒドロキシ基と反応させるなどすれば、エポキシ基を表面に有する支持体が得られる。
【００３１】
親水性高分子の固定量は、流速特性や防汚性の観点から、支持体の乾燥固形分１ｇに対して、好ましくは５０ｍｇ以上であり、また、好ましくは１００００ｍｇ以下である。
【００３２】
＜リンカー化合物＞
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、リンカー化合物が支持体に固定されたものである。
また、リンカー化合物は、タンパク質リガンドと支持体との間のリンカー長（タンパク質リガンドと支持体との最短距離）が原子数で３０以上となるリンカー化合物であり、これによって、標的物質捕捉特性が改善される。また、親水性高分子がタンパク質リガンドに及ぼす排除体積効果が回避され、タンパク質リガンドの親和性低下が抑制される。
【００３３】
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、リンカー化合物上の活性基を通してタンパク質のリガンドが固定されたものである。このリンカー化合物の活性基は、タンパク質リガンドとの反応に活性を示すものであれば特に限定されないが、環状エーテル基、ホルミル基、アリールスルホニル基（例えば、ｐ−トルエンスルホニル基等）、ハロゲノ基、コハク酸イミドオキシ基、及びマレイミド基から選ばれる少なくとも１種以上が好ましい。これらの中でも、流速特性や防汚性等の観点から、環状エーテル基、ホルミル基、アリールスルホニル基が好ましく、環状エーテル基、アリールスルホニル基がより好ましく、環状エーテル基が特に好ましい。
【００３４】
ここで、「環状エーテル基」としては、環を構成する原子数が３〜７個の環状エーテル基が好ましい。環状エーテル基は、置換基としてアルキル基を有していてもよい。環状エーテル基の具体例としては、以下の式（１）〜（６）で表される環状エーテル基が挙げられ、式（１）で表される環状エーテル基がより好ましい。
【００３５】
【化１】
0006737579.tif 000002
【００３６】
〔式中、Ｒ1〜Ｒ4は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を示し、＊は結合手を示す。〕
【００３７】
Ｒ1〜Ｒ4で示されるアルキル基の炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１又は２である。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
また、Ｒ1〜Ｒ4としては、水素原子が好ましい。
【００３８】
ここで、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体において、タンパク質リガンドと支持体との間のリンカー長は、原子数で３０以上である。
上記「原子数」は、タンパク質リガンドと支持体との間のリンカー化合物由来のリンカー部の原子数を意味し、タンパク質リガンドと支持体との空間的距離に影響を与える。例えば、下記式（７）で表されるポリエチレングリコールジグリシジルエーテルをリンカー化合物として使用した場合、下記式（８）に示すとおりリンカー長は原子数で３４となる。
【００３９】
【化２】
0006737579.tif 000003
【００４０】
【化３】
0006737579.tif 000004
【００４１】
本発明において、上記リンカー長の原子数は、標的物質捕捉特性や排除体積効果回避等の観点から、好ましくは６０以上、より好ましくは１００以上であり、また、好ましくは１０００以下、より好ましくは７５０以下、更に好ましくは５００以下、特に好ましくは３００以下である。
【００４２】
また、リンカー化合物由来のリンカーとしては、標的物質捕捉特性や排除体積効果回避等の観点から、下記式（９）で表されるリンカーが好ましい。ただし、このリンカー（９）のリンカー長は、原子数で３０以上である。
【００４３】
【化４】
0006737579.tif 000005
【００４４】
〔式（９）中、
Ａ1及びＡ2は、それぞれ独立して、単結合、環状エーテル基が開環してなる基、又はカルボニル基を示し、
Ｒ5は、炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、
ｐは、８以上の整数を示し、
＊は、結合手を示す。〕
【００４５】
式（４）中、Ａ1及びＡ2としては、流速特性や防汚性等の観点から、単結合、環状エーテル基が開環してなる基が好ましく、環状エーテル基が開環してなる基がより好ましい。ここにおける「環状エーテル基」としては、リンカー化合物上の活性基における環状エーテル基と同様のものが挙げられる。環状エーテル基が開環してなる基としては、開環エポキシ基が好ましい。
Ｒ5で示されるアルカンジイル基の炭素数は、好ましくは２〜３、より好ましくは２である。アルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体例としては、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基等が挙げられる。
ｐとしては、標的物質捕捉特性や排除体積効果回避等の観点から、好ましくは２０以上、より好ましくは３０以上であり、また、好ましくは３００以下、より好ましくは１５０以下、特に好ましくは１００以下である。
なお、ｐ個のＲ5は同一であっても異なっていてもよい。
【００４６】
リンカー化合物としては、リンカー長が原子数で３０以上となるものであれば特に限定されないが、具体的には、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールビス（ｐ−トルエンスルホナート）、ポリエチレングリコールジアルデヒド等が挙げられる。
【００４７】
また、リンカー化合物は、上記親水性高分子と互いに独立して支持体に固定されているのが好ましい。また、リンカー化合物と支持体は、化学結合で固定されているのが好ましい。また、支持体が多孔質である場合、リンカー化合物は、支持体の細孔内部及び／又は細孔外部の表面に固定されていてよい。また、リンカー化合物は、リンカー化合物上の活性基を通して支持体に固定されているのが好ましい。
リンカー化合物の支持体への固定は、常法の支持体表面修飾方法で行えばよい。なお、支持体が１級水酸基を備えるか、或いは支持体表面に１級水酸基を導入した場合において、親水性高分子がデキストランであるときは、活性基としてエポキシ基等の環状エーテル基を有するリンカー化合物を用いることで、リンカー化合物が支持体の１級水酸基と優先的に反応する。これは、デキストランの２級水酸基が、支持体の１級水酸基と比較して反応性が乏しいことに起因するものである。
【００４８】
リンカー化合物の固定量は、タンパク質リガンドの種類に応じて適宜選択すればよい。
【００４９】
＜タンパク質のリガンド＞
本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、支持体に固定されたリンカー化合物上の活性基を通してタンパク質のリガンドが固定されたものである。
リガンドは標的物質と結合するタンパク質であればよい。本発明において、「タンパク質」とは、天然型タンパク質の部分的断片や天然型タンパク質のアミノ酸配列を人為的に改変したもののような、タンパク質の変異体を含む概念である。タンパク質としては、具体的には、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパク、（ストレプト）アビジン、レクチン、それらの機能性変異体等が挙げられる。本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、親水性高分子の排除体積効果による親和性の低下が少ないため、上記のようなタンパク質リガンドが使用されているにも拘らず、優れた流速特性と優れた標的物質捕捉特性とを両立できる。
イムノグロブリンの分離又は精製に好適なリガンドとしては、イムノグロブリン結合性タンパク質が挙げられる。
イムノグロブリン結合性タンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃ結合タンパク及びそれらの機能性変異体よりなる群から選ばれる少なくとも１種以上が好ましい。中でも、好ましくはプロテインＡ、プロテインＧ、それらの機能性変異体であり、より好ましくはプロテインＡ、その機能性変異体である。
【００５０】
タンパク質リガンドの固定は、常法と同様にして行えばよいが、塩を添加したバッファー存在下で行うのが好ましい。塩の種類としては、クエン酸三ナトリウム、硫酸ナトリウム等が挙げられ、上記バッファーとしては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、ホウ酸等が挙げられる。
【００５１】
そして、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、親水性高分子の排除体積効果による親和性の低下が少ないため、プロテインＡ等のタンパク質のリガンドが使用されているにも拘らず、流速特性と標的物質捕捉特性に優れる。また、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、防汚性にも優れる。
したがって、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体は、イムノグロブリン等のタンパク質の分離精製に特に適する。
【００５２】
〔クロマトグラフィーカラム〕
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体がカラム容器に充填されているものである。該クロマトグラフィーカラムは、タンパク質や核酸の精製に適し、イムノグロブリン等のタンパク質の精製に特に適する。
【００５３】
〔標的物質の精製方法及び標的物質〕
本発明の標的物質の精製方法は、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いることを特徴とする。
精製は、本発明のアフィニティークロマトグラフィー用担体を用いる以外は常法と同様であるが、本発明のクロマトグラフィーカラムに標的物質を含む組成物を通液する方法が挙げられる。具体的な手法としては、標的物質を含む組成物を準備する準備工程と、本発明のクロマトグラフィーカラムに前記組成物を通液する通液工程と、該通液工程により担体に捕捉された標的物質を溶出させる溶出工程とを含む方法が挙げられる。
標的物質としては、抗体、アルブミン、ワクチン等のタンパク質の他、核酸、酵素等の生体分子が挙げられる。また、標的物質を含む組成物としては、組み換え遺伝子技術により培養された培養液や、生体から直接抽出した天然生体分子混合溶液等が挙げられる。
本発明の精製方法によれば、高速で効率よく、多量の標的物質を一度に精製することが可能となる。また、本発明の精製方法は、タンパク質や核酸の精製に適し、イムノグロブリン等のタンパク質の精製に特に適する。
【実施例】
【００５４】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５５】
（実施例１）
（１）支持体（粒子）の作製
３６０ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）３．５８ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した。この溶液に、ドデシル硫酸ナトリウム０．３６ｇ、硫酸ナトリウム０．３６ｇ及び亜硝酸ナトリウム０．１８ｇを添加し、撹拌して水溶液Ｓを調製した。
一方、グリシジルメタクリレート１２．０ｇ及びジビニルベンゼン１．３３ｇからなる単量体組成物を、ジイソブチルケトン４０．０ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、前記水溶液Ｓを、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温した。内温が８５℃に到達したところで２，２’−アゾイソブチロニトリル０．５３ｇを添加し、内温を８６℃にした。８６℃に温度を維持したまま３時間撹拌して重合反応を行った。反応液を冷却した後に反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。斯かる粒子スラリー液をろ過し、湿潤粒子を得た。
（２）親水性高分子の固定
前記湿潤粒子１０ｇに、２５質量％デキストラン（重量平均分子量：４万）水溶液４０ｇを添加し、室温で３０分間撹拌した。次いで、５０質量％水酸化ナトリウム水溶液１２．５ｇを添加し、６０℃で８時間撹拌することで、デキストランの固定とエポキシ基の開環（１級水酸基への変換）を行った。反応後の粒子スラリー液を冷却した後にろ過し、純水で洗浄した。斯かる粒子スラリー液を再度ろ過することで親水化湿潤粒子を得た。
（３）リンカー化合物の固定
前記親水化湿潤粒子１０ｇに、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：５３０）１０ｇ、１，４−ジオキサン４０ｇ、及び５０質量％水酸化ナトリウム水溶液１５ｇを添加し、６０℃で８時間撹拌することで、粒子上の１級水酸基を通してリンカー化合物を導入した。反応後の粒子スラリー液を冷却した後にろ過し、純水及びエタノールで洗浄した。斯かる粒子スラリー液を再度ろ過することで活性化湿潤粒子を得た。
（４）リガンドの固定
改変プロテインＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製  ｒＳＰＡ）０．１５ｇを、１．２Ｍ  硫酸ナトリウム／０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）４０ｍＬに溶解させプロテインＡ水溶液を得た。このプロテインＡ水溶液全量を、前記活性化湿潤粒子５ｇに添加した。この分散液を２５℃で５時間振とう撹拌し、プロテインＡを粒子に固定した。
（５）未反応の活性基の不活性化
生成したプロテインＡ固定粒子を、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）で洗浄した後、０．５Ｍ  ２−アミノエタノール（ｐＨ８．３）水溶液４０ｍＬに分散させ、４０℃で４時間振とう撹拌することで、未反応の活性基を不活性化した。その後、０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）、０．１Ｍ  水酸化ナトリウム水溶液、０．１Ｍ  クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）で順次洗浄し、アフィニティークロマトグラフィー用担体Ａ−１を得た。
【００５６】
（実施例２）
実施例１（３）のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：５３０）をポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：２１３０）に変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用担体Ａ−２を得た。
【００５７】
（実施例３）
実施例１（３）のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：５３０）をポリエチレングリコールビス（ｐ−トルエンスルホナート）（分子量：２３０８）に変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用担体Ａ−３を得た。
【００５８】
（実施例４）
実施例１（３）のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：５３０）をポリエチレングリコールジアルデヒド（分子量：２０８４）に変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用担体Ａ−４を得た。
【００５９】
（比較例１）
実施例１（３）のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：５３０）をエピクロロヒドリンに変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用担体Ｂ−１を得た。
【００６０】
（比較例２）
実施例１（３）のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：５３０）をエチレングリコールジグリシジルエーテルに変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用担体Ｂ−２を得た。
【００６１】
（比較例３）
実施例１（３）のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：５３０）をポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：３３０）に変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用担体Ｂ−３を得た。
【００６２】
（比較例４）
実施例１（３）のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：５３０）をパラトルエンスルホニルクロリドに変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用担体Ｂ−４を得た。
【００６３】
（比較例５）
実施例１（３）のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：５３０）をブロモシアンに変更した以外は、実施例１と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用担体Ｂ−５を得た。
【００６４】
（比較例６）
以下の２点以外は実施例１と同様にして、アフィニティークロマトグラフィー用担体Ｂ−６を得た。
１点目：実施例１（２）の２５質量％デキストラン（重量平均分子量：４万）水溶液４０ｇを１Ｍ硫酸９０ｍＬに変更し、５０質量％水酸化ナトリウム水溶液の添加工程を排した。
２点目：実施例１（３）のポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：５３０）をポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（分子量：２１３０）に変更した。
【００６５】
試験例１（ＤＢＣ測定）
実施例及び比較例で得られた各担体をＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ５／２００カラムに充填高さ約２０ｃｍで充填しカラムを作製した。次いで、ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓを用いて、保持時間４分における標的タンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）に対する各担体のＤＢＣを測定した。標的タンパク質は２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／１５０ｍＭ  塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で５ｍｇ／ｍＬに希釈したものを使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求め、標的物質捕捉特性を以下の基準に従い評価した。結果を表１及び２に示す。
【００６６】
＜標的物質捕捉特性評価基準＞
ＡＡ：３６ｍｇ／ｍＬ以上
Ａ  ：２６ｍｇ／ｍＬ以上３６ｍｇ／ｍＬ未満
Ｂ  ：２６ｍｇ／ｍＬ未満
【００６７】
試験例２（ＨＣＰ測定）
実施例１〜４及び比較例６で得られた各担体をＧＥヘルスケア社製Ｔｒｉｃｏｒｎ１０／５０カラムに充填高さ約５ｃｍで充填しカラムを作製した。次いで、得られたカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓに接続し、２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５カラム容量（カラム容積の５倍）、流速１ｍＬ／分にて通液し、平衡化させた。次いで、モノクローナル抗体Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含有するＣＨＯ細胞培養上清を、約２３ｍｇ抗体／ｍＬ担体の負荷量で、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液した。次いで、２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム／１Ｍ  塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）、及び２０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を、それぞれ５カラム容量、流速１ｍＬ／分にてカラムに順次通液した。その後、５０ｍＭ  クエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．２）を、流速１ｍＬ／分にてカラムに通液し、カラム内に捕捉されていたモノクローナル抗体を溶出させ、Ａｂｓ．２８０＞１００ｍＡｕの溶出フラクションを回収した。分光光度計を用い、回収したフラクション中に含有される抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）を測定した。一方、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ，３Ｇを用い、回収したフラクション中に含有されるＨｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を測定した。ＨＣＰの濃度を抗体濃度で除することにより、単位抗体量当たりのＨＣＰ量を算出し、防汚性を以下の基準に従い評価した。結果を表１及び２に示す。
【００６８】
＜防汚性評価基準＞
ＡＡ：ＨＣＰ量が３０００ｐｐｍ未満
Ａ：ＨＣＰ量が３０００ｐｐｍ以上３５００ｐｐｍ未満
Ｂ：ＨＣＰ量が３５００ｐｐｍ以上
【００６９】
試験例３（測定可能線流速の測定）
実施例及び比較例で得られた各担体を、濃度が１０質量％となるように純水にそれぞれ分散させた。カラム充填後の担体の体積が２０ｍＬとなる量の分散液を、内径１６ｍｍ、長さ１００ｍｍのＨＲ（Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）カラム容器に流し込み、ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｉｌｏｔを用いて、線流速４５０ｃｍ／ｈｒで通液して、カラムに担体を充填した。次いで、純水を通液し、段階的に線流速を上げていき、圧力損失１．９ＭＰａの時の線流速を測定した。この線流速を測定可能線流速とし、流速特性を以下の基準に従い評価した。結果を表１及び２に示す。
【００７０】
＜流速特性評価基準＞
ＡＡ：測定可能線流速が３０００ｃｍ／ｈｒ以上
Ａ：測定可能線流速が２５００ｃｍ／ｈｒ以上３０００ｃｍ／ｈｒ未満
Ｂ：測定可能線流速が２５００ｃｍ／ｈｒ未満
【００７１】
【表１】
0006737579.tif 000006
【００７２】
【表２】
0006737579.tif 000007