(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列５’−ＣＰＰＧＣＰＰＰＡＮＧＰＰＰＡＧＣ−３’（配列番号：１０５）又は配列５’−ＮＮＣＰＰＧＲＰＰＰＡＭＧＰＰＰＡＧＳ−３’（配列番号：１４１）（式中、ＲはＡまたはＧであり；各Ｎは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｇ、またはＣであり；ＭはＡまたはＣであり；ＳはＧまたはＣであり、各Ｐは独立して、かつ各存在について、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される）を含む、
ＧＤＦ１１と結合するアプタマー。
【請求項２】
１０ｎＭ未満の親和性でＧＤＦ１１と結合し、同一の条件下で、ＧＤＦ１１に対する前記親和性よりも少なくとも１０分の１の弱い親和性でＧＤＦ８と結合するか、ＧＤＦ８と結合しない、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記アプタマーが、ＧＤＦ１１に対する前記親和性よりも少なくとも２０分の１弱い親和性でＧＤＦ８と結合する、請求項２に記載のアプタマー。
【請求項４】
前記アプタマーが、１００ｎＭ超の親和性でＧＤＦ８と結合する、請求項２または請求項３に記載のアプタマー。
【請求項５】
前記アプタマーが、５ｎＭ未満の親和性でＧＤＦ１１と結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項６】
前記アプタマーがＧＤＦ８と結合しない、請求項２に記載のアプタマー。
【請求項７】
親和性が、ポリアニオン性阻害剤を含む結合アッセイを使用して決定される、請求項２〜６のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項８】
前記ポリアニオン性阻害剤が、デキストラン硫酸、ヘパリン、Ｚ−ブロック、ポリｄＩ／ｄＣ、超音波処理または剪断したサケ精子ＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、及びｄＮＴＰから選択される、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項９】
前記アプタマーが、配列５’−ＮＮＣＰＰＧＲＰＰＰＡＭＧＰＰＰＡＧＳ−３’（配列番号：１４１）を含み、ＲはＡである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１０】
少なくとも１つのＰが５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１１】
各Ｐが、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから独立して選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１２】
前記アプタマーが、配列番号：１２、１３、１５、１６、１９〜２４、２７、２９〜３４、３７、４７、１０６〜１０９、１２０、１２４、１２５、１３１〜１３３、１３６〜１４０、１４２〜１５０及び１５７から選択される配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１３】
前記アプタマーが、配列番号：１２、１５、１０６〜１０９、及び１４２〜１５０から選択される配列を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１４】
前記アプタマーが、１８〜１００のヌクレオチドからなり、各ヌクレオチドが、独立して修飾または非修飾ヌクレオチドであってよい、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１５】
前記アプタマーが検出可能な標識を含む、請求項１〜1４のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１６】
ＧＤＦ１１がヒトＧＤＦ１１であり、ＧＤＦ８がヒトＧＤＦ８である、請求項２〜１５のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１７】
ＧＤＦ１１が、配列番号：１１８の配列を含む成熟ヒトＧＤＦ１１であり、ＧＤＦ８が、配列番号：１１９の配列を含む成熟ヒトＧＤＦ８である、請求項２〜１６のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項１８】
試料中のＧＤＦ１１の検出方法であって、前記試料からのタンパク質を請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアプタマーと接触させることを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記アプタマーが、ＧＤＦ１１に対する前記親和性よりも少なくとも１０分の１の弱い親和性でＧＤＦ８と結合する、またはＧＤＦ８とは結合しない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
試料がＧＤＦ１１を含むかどうかの決定方法であって、前記試料からのタンパク質を請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアプタマーと接触させることを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記試料がＧＤＦ８を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、ストリンジェントな条件下で前記試料を前記アプタマーと接触させることを含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ストリンジェントな条件が、ポリアニオン性阻害剤を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリアニオン性阻害剤が、デキストラン硫酸、ヘパリン、Ｚ−ブロック、ポリｄＩ／ｄＣ、超音波処理または剪断したサケ精子ＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、及びｄＮＴＰから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料がヒト由来の試料である、請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料が、血液、血清、血漿、唾液、尿、及び組織試料から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織試料が、心筋組織、骨格筋組織、膵臓組織、軟骨組織及び神経組織から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記タンパク質が、前記試料の少なくとも１つのその他の成分から分離されている、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記タンパク質が、前記試料のその他の成分から分離されていない、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアプタマーと試料からのタンパク質とを含む、組成物。
【請求項３１】
前記試料がＧＤＦ８を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
ポリアニオン性阻害剤を含む、請求項３０または請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ポリアニオン性阻害剤が、デキストラン硫酸、ヘパリン、Ｚ−ブロック、ポリｄＩ／ｄＣ、超音波処理または剪断したサケ精子ＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、及びｄＮＴＰから選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記試料がヒト由来の試料である、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記試料が、血液、血清、血漿、唾液、尿、及び組織試料から選択される、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組織試料が、心筋組織、骨格筋組織、膵臓組織、軟骨組織及び神経組織から選択される、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記タンパク質が、前記試料の少なくとも１つのその他の成分から分離されている、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記タンパク質が、前記試料のその他の成分から分離されていない、請求項３０〜３６いずれか１項に記載の組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月２４日出願の米国特許仮出願第６２／０８３，５９２号明細書、及び２０１５年２月９日出願の米国特許仮出願第６２／１１３，８６４号明細書の優先権の利益を主張し、その各々の全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、電子形式の配列表と共に出願される。配列表は、２０１５年１１月２３日に作成された「２０１５−１１−２３＿０１１３７−００１１−００ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題したファイルとして提供され、サイズは１２２，８１６バイトである。配列表の電子形式における情報は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は一般に核酸の分野に関し、より具体的には、増殖分化因子１１（ＧＤＦ１１）タンパク質に結合することができるアプタマー；ＧＤＦ１１タンパク質と共にＧＤＦ１１結合アプタマーを含む組成物；ならびにその作製方法及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
増殖分化因子１１（ＧＤＦ１１）または骨形成タンパク質１１（ＢＭＰ−１１）は、Ｈｏｘ遺伝子の発現を制御することにより発達中の前後パターン形成を調整するトランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリーに属する。ＧＤＦ１１は、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃｍｙｏｃｉｔｅ）増殖、腎臓器官形成、膵臓発達の制御において役割を果たし、神経発生及び軟骨形成の負の制御因子として機能することが示された。
【０００５】
ＧＤＦ１１は、ミオスタチン（ＧＤＦ８）と密接に関連し、これは筋成長の負の制御因子である。ＧＤＦ１１のように、ミオスタチンは、心筋細胞増殖の制御に関与する。ＧＤＦ１１とミオスタチンとの間の類似点は、同じ制御機構が筋発達中及び神経発達中の両方で組織サイズを調整するために使用されるという可能性を示唆する。機構的に、ＧＤＦ１１の作用は、ＷＦＩＫＫＮ２というフォリスタチン、免疫グロブリン、プロテアーゼ阻害剤、及びＮＴＲドメインからなる大きな細胞外マルチドメインタンパク質により制御される可能性がある。ＷＦＩＫＫＮ２は、ＧＤＦ１１に対して高親和性を有し、これまでにミオスタチンの生物活性を阻害することが見出されてきた。
【０００６】
ＧＤＦ１１及びＧＤＦ８（ミオスタチン）の両方とも、発達過程において、ならびに成体組織における細胞成長及び分化の制御において重要な役割を果たす。これらの２つのタンパク質を局在化させる、及び／または測定する能力は、発達ならびに成体組織（例えば、心筋及び骨格筋）におけるそれらの寄与をさらに理解し区別するために重要である。しかしながら、それらの相同性ゆえに、現在のタンパク質結合試薬（例えば、抗体）を用いてこれらのタンパク質の存在及び／またはレベルを区別することは困難である。したがって、タンパク質ＧＤＦ１１とＧＤＦ８とを区別することができるタンパク質結合試薬が必要である。本開示は、ＧＤＦ１１タンパク質に対して結合特異性を有するアプタマーを提供することにより、このような必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、増殖分化因子１１（ＧＤＦ１１）タンパク質に結合することができるアプタマーについて記載する。いくつかの実施形態では、１００ｎＭ未満の平衡結合定数（Ｋｄ）でＧＤＦ１１と結合するアプタマーが提供される。別の態様では、Ｋｄは、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ（または約０．１ｎＭ〜約５０ｎＭ、または約０．１ｎＭ〜約１０ｎＭ、または約０．５ｎＭ〜約１０ｎＭ、または約０．５ｎＭ〜約５ｎＭ）である。
【０００８】
いくつかの実施形態では、１０ｎＭ未満の親和性でＧＤＦ１１と結合するアプタマーが提供される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、１０ｎＭ未満の親和性でＧＤＦ１１と結合し、同じ条件下でアプタマーは、ＧＤＦ１１に対する親和性よりも少なくとも１０分の１の弱い親和性でＧＤＦ８と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーはＧＤＦ８と結合しない。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＧＤＦ１１に対する親和性よりも少なくとも２０分の１の弱い親和性で、または少なくとも３０分の１の弱い親和性で、または少なくとも５０分の１の弱い親和性でＧＤＦ８と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、５０ｎＭ超、または１００ｎＭ超、または１５０ｎＭ超、または２００ｎＭ超、または２５０ｎＭ超、または３００ｎＭ超の親和性でＧＤＦ８と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、８ｎＭ未満、または７ｎＭ未満、または６ｎＭ未満、または５ｎＭ未満、または４ｎＭ未満、または３ｎＭ未満、または２ｎＭ未満、または１ｎＭ未満の親和性でＧＤＦ１１と結合する。いくつかの実施形態では、親和性は、ポリアニオン性阻害剤を含む結合アッセイを使用して決定される。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性阻害剤は、デキストラン硫酸、ヘパリン、Ｚ−ブロック、ポリｄＩ／ｄＣ、超音波処理または剪断したサケ精子ＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、及びｄＮＴＰから選択される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１０）または５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＳ−３’（配列番号：１５１）（式中：
各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり；
Ｒは、ＡまたはＧであり；
各Ｗは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｔ、またはＵであり；
各Ｍは独立して、かつ各存在についてＡまたはＣであり；
各Ｓは独立して、かつ各存在についてＧまたはＣであり；
各ｎは独立して、かつ各存在について０または１であり；
各ｍは独立して、かつ各存在について０または１である）を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１と結合するアプタマーが提供され、このアプタマーは、配列５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１０）または５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＳ−３’（配列番号：１５１）（式中：
各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり；
Ｒは、ＡまたはＧであり；
各Ｗは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｔ、またはＵであり；
各Ｍは独立して、かつ各存在についてＡまたはＣであり；
各Ｓは独立して、かつ各存在についてＧまたはＣであり；
各ｎは独立して、かつ各存在について０または１であり；
各ｍは独立して、かつ各存在について０または１である）を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１と結合するアプタマーは、
ａ）５’−ＲＷｎＡＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１１）；
ｂ）５’−ＲＷｎＡＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＳ−３’（配列番号：１５２）；
ｃ）５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＧＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１２）；
ｄ）５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＧＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＳ−３’（配列番号：１５３）；
ｅ）５’−ＲＭＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１３）；及び
ｆ）ＲＭＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＰＡＳｎＧＳ−３’（配列番号：１５４）から選択される配列を含む。
上記配列のいくつかの実施形態では、ＲがＧである場合、最初のＷはＡであってよく、ＲがＡである場合、最初のＷはＣであってよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのｎが、０である。いくつかの実施形態では、各ｎは０である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つのｎが、１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍが、０である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍが、１である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１と結合するアプタマーは、配列５’−ＣＰＰＧＭＰＰＰ−３’（配列番号：１１４）（式中、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり、式中、ＭはＣまたはＡである）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１と結合するアプタマーは、配列５’−ＰＰＰＡＧＣ−３’（配列番号：１１５）または５’−ＰＰＰＡＧＧ−３’（配列番号：１５５）（式中、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンである）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１と結合するアプタマーは、配列５’−ＣＰＰＧＭＰＰＰＮｘＰＰＰＡＧＣ−３’（配列番号：１１６）または５’−ＣＰＰＧＭＰＰＰＮｘＰＰＰＡＧＧ−３’（配列番号：１６０）（式中、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり、式中、ｘは２、３、４、または５であり、式中、ＭはＣまたはＡであり、式中、各Ｎは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵから選択される）を含む。いくつかの実施形態では、ｘは３または４である。いくつかの実施形態では、Ｎｘは、配列５’−ＡＡＧ−３’または５’−ＡＣＧ−３’または５’−ＡＧＧ−３’を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１と結合するアプタマーは、配列５’−ＮＮＣＰＰＧＲＰＰＰＡＭＧＰＰＰＡＧＳ−３’（配列番号：１４１）（式中、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり、ＲはＡまたはＧであり；各Ｎは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｇ、またはＣであり；ＭはＡまたはＣであり；ＳはＧまたはＣである）を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、各Ｐは独立して、かつ各存在について：
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ））プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、各Ｐは独立して、かつ各存在について：
５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのＰは各々、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから独立して選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号：１２、１３、１５〜１０９、及び１１７〜１４０から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号：１２、１５、２６、１０５〜１０９、及び１４２〜１５０から選択される配列を含む。
【００１６】
本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、アプタマーは、１８〜２００のヌクレオチド、または１８〜１５０のヌクレオチド、または１８〜１００のヌクレオチド、または１８〜７５のヌクレオチド、または１８〜５０のヌクレオチド、または２０〜１５０のヌクレオチド、または２０〜１００のヌクレオチド、または２０〜７５のヌクレオチド、または２０〜５０のヌクレオチドからなってよく、各ヌクレオチドは、独立して修飾または非修飾ヌクレオチドであってよい。本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、アプタマーは、検出可能な標識を含んでよい。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１はヒトＧＤＦ１１であり、ＧＤＦ８はヒトＧＤＦ８である。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１は、配列番号：１１８の配列を含む成熟ヒトＧＤＦ１１であり、ＧＤＦ８は、配列番号：１１９の配列を含む成熟ヒトＧＤＦ８である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、試料中のＧＤＦ１１を検出する方法が提供され、これは試料からのタンパク質を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＧＤＦ１１に対する親和性よりも少なくとも１０分の１の弱い親和性でＧＤＦ８と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーはＧＤＦ８と結合しない。
【００１９】
いくつかの実施形態では、試料がＧＤＦ１１を含むかどうかを決定する方法は、試料からのタンパク質を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、試料はＧＤＦ８を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ストリンジェントな条件下で試料をアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ストリンジェントな条件は、ポリアニオン性阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性阻害剤は、デキストラン硫酸、ヘパリン、Ｚ−ブロック、ポリｄＩ／ｄＣ、超音波処理または剪断したサケ精子ＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、及びｄＮＴＰから選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、試料は、ヒト由来の試料である。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、及び組織試料から選択される。いくつかの実施形態では、組織試料は、心筋組織、骨格筋組織、膵臓組織、軟骨組織及び神経組織から選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、タンパク質は、試料の少なくとも１つのその他の成分から分離されている。いくつかの実施形態では、タンパク質は、試料のその他の成分から分離されていない。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるアプタマー及び試料からのタンパク質を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、試料はＧＤＦ８を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ポリアニオン性阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性阻害剤は、デキストラン硫酸、ヘパリン、Ｚ−ブロック、ポリｄＩ／ｄＣ、超音波処理または剪断したサケ精子ＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、及びｄＮＴＰから選択される。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト由来の試料である。いくつかの実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、及び組織試料から選択される。いくつかの実施形態では、組織試料は、心筋組織、骨格筋組織、膵臓組織、軟骨組織及び神経組織から選択される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、試料の少なくとも１つのその他の成分から分離されている。いくつかの実施形態では、タンパク質は、試料のその他の成分から分離されていない。
【００２３】
別の態様では、アプタマーは、少なくとも２５のヌクレオチド長である。別の態様では、アプタマーは、少なくとも３０のヌクレオチド長である。別の態様では、アプタマーは、少なくとも４０のヌクレオチド長である。別の態様では、アプタマーは、約４０〜約１００のヌクレオチド長（または４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００のヌクレオチド長）である。
【００２４】
本開示は、アプタマー及びＧＤＦ１１タンパク質を含む組成物をさらに提供し、このアプタマー及びＧＤＦ１１タンパク質は、非共有結合性相互作用により結合される。
【００２５】
本発明の前述の及びその他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細説明からさらに明らかとなり、これは添付の図面に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ポリアニオン性阻害剤（Ｚ−ブロック）の存在下または不存在下における、ヒトＧＤＦ１１タンパク質及びヒトミオスタチン（ＧＤＦ８）タンパク質に対するアプタマークローン１２０６０−２８＿３の結合親和性の比較を示す。ｘ軸は各タンパク質の濃度を示し、ｙ軸はタンパク質に結合したアプタマーのパーセント（１．０は１００％である）を示す。
【図２】ポリアニオン性阻害剤（Ｚ−ブロック）の存在下または不存在下における、ヒトＧＤＦ１１タンパク質及びヒトミオスタチン（ＧＤＦ８）タンパク質に対するアプタマー１２０５８−６＿３の結合親和性の比較を示す。ｘ軸は各タンパク質の濃度を示し、ｙ軸はタンパク質に結合したアプタマークローンのパーセント（１．０は１００％である）を示す。
【図３】アプタマークローン１２０６０−２８＿３（５０ｍｅｒ配列）の切断分析及びＧＤＦ１１に対する各配列の結合親和性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．用語及び方法
本発明は、ある種の代表的な実施形態に関連して記載されるだろうが、本発明は特許請求の範囲により定義され、それらの実施形態に限定されないことが理解されるだろう。
【００２８】
当業者は、本明細書に記載されるものと類似の、または同等の多くの方法及び材料が、本発明の実施において使用されてよいことを認識するだろう。本発明は、決して記載される方法及び材料に限定されない。
【００２９】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される専門用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。分子生物学における共通用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより出版されたＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、１９９４（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．により出版されたＫｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；及びＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版されたＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出されてよい。本明細書に記載されるものと類似の、または同等の任意の方法、デバイス、及び材料が、本発明の実施において使用され得るが、ある種の方法、デバイス、及び材料が本明細書に記載される。
【００３０】
本明細書で引用される全ての刊行物、公開特許文献、及び特許出願は、個々の刊行物、公開特許文献、または特許出願が、参照によって組み込まれていると具体的かつ個別に示された場合と同程度に参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３１】
添付の特許請求の範囲を含む、本出願で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数を含み、「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ（少なくとも１つ）」及び「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ（１つ以上）」と同じ意味で使用されてよい。したがって、「ａｎ  ａｐｔａｍｅｒ（アプタマー）」への言及にはアプタマーの混合物を含み、「ａ  ｐｒｏｂｅ（プローブ）」への言及にはプローブの混合物を含むなどである。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含める）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含める）」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ（含有する）」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」という用語、及びその任意の変化形は、非排他的包含を含むことを意図し、結果として、要素または要素の一覧を含む、それらを含める、またはそれらを含有するプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、または物質の組成は、明示的に列挙されていないその他の要素を含んでよい。
【００３３】
核酸またはポリペプチドに付与される全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及び全ての分子量値または分子質量値は概算であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。
【００３４】
本開示における様々な実施形態の確認を容易にするために、特定の用語に関する以下の説明が提供される：
【００３５】
アプタマー：本明細書で使用される場合、「アプタマー」は、標的分子に対して特異的結合親和性を有する核酸を指す。親和性相互作用は、程度の問題であることが認識されるが、これに関連して、その標的に対するアプタマーの「特異的結合親和性」は、アプタマーが試験試料中のその他の成分に結合するよりも、一般にはるかに高い度合いの親和性でアプタマーがその標的に結合することを意味する。「アプタマー（単数）」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つの種類または種のコピーの１セットである。アプタマーは、任意の数の化学修飾ヌクレオチドを含む、任意の好適な数のヌクレオチドを含み得る。「アプタマー（複数）」は、２つ以上のこのような分子のセットを指す。異なるアプタマーは、同数または異なる数のいずれかのヌクレオチドを有し得る。アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡまたは化学修飾核酸であり得、一本鎖、二本鎖であり得、または二本鎖領域を含有し得、より高度な秩序構造を含み得る。アプタマーは光アプタマーでもあり得、光反応性または化学反応性官能基がアプタマー中に含まれて、アプタマーがその対応する標的に共有結合されるのを可能にする。本明細書に開示されるアプタマー方法のいずれも、同じ標的分子と特異的に結合する２つ以上のアプタマーの使用を含み得る。以下でさらに記載されるように、アプタマーはタグを含んでよい。アプタマーがタグを含む場合、アプタマーの全てのコピーが同じタグを有する必要はない。さらに、異なるアプタマーの各々がタグを含む場合、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのいずれかを有し得る。
【００３６】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法を含む、任意の既知の方法を使用して同定され得る。一旦同定されたら、アプタマーは、化学合成方法及び酵素合成方法を含む、任意の既知の方法に従って調製または合成され得る。
【００３７】
ＧＤＦ１１アプタマー：ＧＤＦ１１アプタマーは、本明細書で使用される場合、成熟ＧＤＦ１１タンパク質に結合することができるアプタマーを指す。非限定的で例示的な成熟ヒトＧＤＦ１１タンパク質は、以下に示される（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｏ９５３９０．１のアミノ酸２９９〜４０７）：
Ｌ  ＧＬＤＣＤＥＨＳＳＥ  ＳＲＣＣＲＹＰＬＴＶ  ＤＦＥＡＦＧＷＤＷＩ  ＩＡＰＫＲＹＫＡＮＹ  ＣＳＧＱＣＥＹＭＦＭ  ＱＫＹＰＨＴＨＬＶＱ  ＱＡＮＰＲＧＳＡＧＰ  ＣＣＴＰＴＫＭＳＰＩ  ＮＭＬＹＦＮＤＫＱＱ  ＩＩＹＧＫＩＰＧＭＶ  ＶＤＲＣＧＣＳ（配列番号：１１８）。
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、ＧＤＦ１１に対する親和性よりも少なくとも１０分の１の弱い親和性でＧＤＦ８と結合する。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、ＧＤＦ８と結合しない。非限定的で例示的な成熟ヒトＧＤＦ８タンパク質は、以下に示される（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｏ１４７９３．１のアミノ酸２６７〜３７５）：
ＦＧＬ  ＤＣＤＥＨＳＴＥＳＲ  ＣＣＲＹＰＬＴＶＤＦ  ＥＡＦＧＷＤＷＩＩＡ  ＰＫＲＹＫＡＮＹＣＳ  ＧＥＣＥＦＶＦＬＱＫ  ＹＰＨＴＨＬＶＨＱＡ  ＮＰＲＧＳＡＧＰＣＣ  ＴＰＴＫＭＳＰＩＮＭ  ＬＹＦＮＧＫＥＱＩＩ  ＹＧＫＩＰＡＭＶＶＤ  ＲＣＧＣＳ（配列番号：１１９）。
【００３８】
阻害する：阻害するという用語は、本明細書で使用される場合、ペプチドもしくはポリペプチドが測定可能な活性もしくは生物活性をもはや有しない程度までペプチドもしくはポリペプチドの発現を防止する、もしくは減少させること；またはペプチドもしくはポリペプチドが測定可能な活性もしくは生物活性をもはや有しない程度までペプチドもしくはポリペプチドの安定性を減少させること、及び／もしくはその活性を減少させる、もしくは防止することを意味する。本明細書に記載されるように、阻害されてよいタンパク質は、ＧＤＦ１１である。
【００３９】
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、同じ意味で使用されてヌクレオチドのポリマーを指し、これらとしてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾物が挙げられ、様々な実体または部分が任意の位置のヌクレオチド単位に結合することが含まれる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、二本鎖または一本鎖分子に加えて三重らせん分子も含む。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語の上位語であり、したがって、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーであるヌクレオチドのポリマーを含むが、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限定されない。
【００４０】
修飾された：本明細書で使用される場合、「修飾する」、「修飾された」、「修飾」という用語、及びその任意の変化形は、オリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）の少なくとも１つが、天然に存在するヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、アプタマーとタンパク質標的との疎水性相互作用を主に引き起こし、高い結合効率及び安定した共結晶複合体をもたらす。Ｃ−５位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの一例である。修飾としては、骨格修飾、メチル化、珍しい塩基対合の組み合わせ、例えばイソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなどを挙げることができる。修飾としては、キャッピングなどの３’及び５’修飾も挙げることができる。その他の修飾としては、天然に存在するヌクレオチドのうち１つ以上と類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）による修飾及び荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）による修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）による修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、ならびに修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸など）による修飾などを挙げることができる。さらに、通常はヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれも、ホスホネート基もしくはリン酸基によって置き換えられてよい；標準的な保護基によって保護されてよい；または追加のヌクレオチドもしくは固体支持体への追加の連結を調製するために活性化されてよい。５’末端及び３’末端のＯＨ基はリン酸化され得る、またはアミン、約１〜約２０の炭素原子の有機キャッピング基部分、いくつかの実施形態では、約１０〜約８０ｋＤａの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、いくつかの実施形態では、約２０〜約６０ｋＤａの範囲のＰＥＧポリマー、もしくはその他の親水性もしくは疎水性生体ポリマーもしくは合成ポリマーで置換され得る。一実施形態では、修飾は、ピリミジンのＣ−５位のものである。これらの修飾は、Ｃ−５位に直接アミド連結することにより、またはその他の種類の連結により作製され得る。
【００４１】
ポリヌクレオチドはまた、一般に当該技術分野において既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有し、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドなどを含み得る。上述の通り、１つ以上のホスホジエステル連結が、代替連結基によって置き換えられてよい。これらの代替連結基としては、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ’は独立してＨである、またはエーテル（−Ｏ−）連結を場合により含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０のＣ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルである）によって置き換えられる実施形態が挙げられる。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。糖、プリン、及びピリミジンの類似形態の置換は、例えば、ポリアミド骨格のような代替骨格構造のように、最終生成物の設計に有利であり得る。
【００４２】
ヌクレアーゼ：本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指す。本明細書で使用される場合、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチド内の部位でホスホジエステル結合（複数可）を切断する酵素を指す。本明細書で使用される場合、「エキソヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドを連結するホスホジエステル結合（複数可）を切断する酵素を指す。生体液は、典型的にはエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼの両方の混合物を含有する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性の」及び「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの基質として機能するオリゴヌクレオチドの能力の減少を指し、したがって、このような酵素と接触した場合に、オリゴヌクレオチドが分解されない、または非修飾ヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドよりもさらにゆっくりと分解されるかのいずれかである。
【００４４】
Ｃ−５修飾ピリミジン：本明細書で使用される場合、「Ｃ−５修飾ピリミジン」という用語は、Ｃ−５位に修飾を有するピリミジンを指し、本明細書に示されるこれらの部分を含むが、これらに限定されない。Ｃ−５修飾ピリミジンの例としては、米国特許第５，７１９，２７３号明細書及び第５，９４５，５２７号明細書に記載されているものが挙げられる。Ｃ−５修飾の例としては、デオキシウリジンのＣ−５位での、すぐ下で示されるようなベンジルカルボキシアミド（あるいはベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（あるいはナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキシアミド（あるいはトリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、フェネチルカルボキシアミド（あるいはフェネチルアミノカルボニル）（Ｐｅ）、チオフェニルメチルカルボキシアミド（あるいはチオフェニルメチルアミノカルボニル）（Ｔｈ）及びイソブチルカルボキシアミド（あるいはイソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）から独立して選択される置換基による置換が挙げられる。
【００４５】
Ｃ−５修飾ピリミジンの化学修飾はまた、２’−位の糖修飾、環外アミンにおける修飾、及び４−チオウリジンの置換などと、単独でまたは任意の組み合わせで組み合わされ得る。
【００４６】
代表的なＣ−５修飾ピリミジンとしては、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰｅｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ））プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンまたは５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）が挙げられる。
【００４７】
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成前または合成後のいずれかに修飾され得る。オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの配列は、１つ以上の非ヌクレオチド成分により割り込まれてよい。修飾オリゴヌクレオチドは、重合後、例えば任意の好適な標識化成分との複合化などによりさらに修飾されてよい。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つのピリミジン」という用語は、核酸の修飾を指す場合に、核酸中の１つの、いくつかの、または全てのピリミジンを指し、核酸中のいずれかまたは全てのＣ、Ｔ、またはＵのいずれかまたは全ての存在が修飾されてよい、または修飾されなくともよいことを示す。
【００４９】
調節する：調節するという用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド、タンパク質もしくはポリペプチドの発現レベルを、参照発現レベルと比較してその発現レベルを増加もしくは減少させることにより変更すること、ならびに／またはペプチド、タンパク質もしくはポリペプチドの安定性及び／もしくは活性を、参照安定性及び／もしくは活性レベルと比較してその安定性及び／もしくは活性レベルを増加もしくは減少させることにより変更することを意味する。
【００５０】
薬学的に許容される：薬学的に許容されるとは、本明細書で使用される場合、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されていること、または動物での、より具体的にはヒトでの使用について米国薬局方もしくはその他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。
【００５１】
薬学的に許容される塩：化合物（例えば、アプタマー）の薬学的に許容される塩または塩は、本明細書で使用される場合、イオン結合を含有し、典型的には化合物と、個体への投与に好適な酸または塩基のいずれかとを反応させることにより作製される生成物を指す。薬学的に許容される塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、及び酒石酸塩を含む酸付加塩；Ｌｉ、Ｎａ、Ｋなどのアルカリ金属カチオン、ＭｇもしくはＣａなどのアルカリ土類金属塩、または有機アミン塩を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５２】
医薬組成物：医薬組成物は、本明細書で使用される場合、個体への投与に好適な形態でＧＤＦ１１アプタマーを含む製剤を指す。医薬組成物は、典型的にはその意図される投与経路と適合するように製剤化される。投与経路の例としては、経口及び非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、吸入、局所、経皮、経粘膜、及び直腸投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
ＳＥＬＥＸ：「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸ法」という用語は、本明細書において同じ意味で使用され、一般に（１）所望の様式で、例えばタンパク質に高い親和性で結合する様式で標的分子と相互作用するアプタマーの選択と、（２）それらの選択された核酸の増幅との組み合わせを指す。ＳＥＬＥＸ法は、特定の標的またはバイオマーカーに対して高親和性を有するアプタマーを同定するために使用され得る。
【００５４】
配列同一性：配列同一性は、本明細書で使用される場合、２つ以上の核酸配列との関連において、配列により共有される同一ヌクレオチド位置の数の関数（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数×１００）であり、２つ以上の配列のアラインメントを最適化するために導入される必要があるギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れる。配列の比較及び２つ以上の配列間におけるパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ及びギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムなどをそれらのデフォルトパラメータで使用して達成され得る（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴにおけるＢＬＡＳＴＮも参照のこと）。配列比較のために、典型的には１つの配列が試験配列を比較する参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列と参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定プログラムパラメータに基づき、参照配列と比較して試験配列（複数可）のパーセント配列同一性を算出する。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４，１９８８の類似法の検索により、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、サイエンス通り５７５、マディソン、ウィスコンシン州のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータによる実行により、または目視検査（概して、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅにより出版されたＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７）を参照のこと）により実施され得る。本明細書で使用される場合、ＧＤＦ１１アプタマーなどの核酸のパーセント同一性について記載し、その配列が参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば約９５％同一である場合、核酸配列が、参照核酸配列の各１００ヌクレオチド当たり最大５つの点変異を含む可能性があること以外、核酸配列が参照配列と同一であることを意図する。換言すれば、核酸配列が参照核酸配列と少なくとも約９５％同一である所望の核酸配列を得るためには、参照配列中のヌクレオチドの最大５％が欠失されてよい、もしくは別のヌクレオチドで置換されてよい、または参照配列中のヌクレオチド総数の最大５％に相当する、ある数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい（本明細書では挿入と称される）。所望の配列を生成するための参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレ���チド配列の５’末端もしくは３’末端位置で行われてよい、またはこれらの末端位置間のどこにでも、参照配列のヌクレオチド中に個々に散在させるか、もしくは参照配列内に１つ以上の連続した群で散在させるかのいずれかであってよい。
【００５５】
ＳＯＭＡｍｅｒ：ＳＯＭＡｍｅｒという用語は、本明細書で使用される場合、改善されたオフ速度特性を有するアプタマーを指す。ＳＯＭＡｍｅｒは、あるいは遅いオフ速度修飾アプタマーとも称され、その全体が参照によって組み込まれる、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」と題した米国特許出願公開第２００９０００４６６７号明細書に記載される、改善されたＳＥＬＥＸ方法により選択されてよい。いくつかの実施形態では、遅いオフ速度アプタマー（疎水性修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むアプタマーを含む）は、≧２分、≧４分、≧５分、≧８分、≧１０分、≧１５分≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分のオフ速度（ｔ１／２）を有する。
【００５６】
標的分子：「標的」、「標的分子」、及び「アナライト」は、本明細書において同じ意味で使用され、試料中に存在する可能性のある関心対象の任意の分子を指す。この用語には、特定の分子に関する任意のわずかな変形、例えばタンパク質の場合、例えばアミノ酸配列のわずかな変形、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化など、または任意のその他の操作もしくは修飾、例えば分子の同一性を実質的に変更しない標識化成分との複合化などを含む。「標的分子（単数）」、「標的（単数）」、または「アナライト（単数）」は、分子または多分子構造の１つの種類または種のコピーの１セットを指す。「標的分子（複数）」、「標的（複数）」、及び「アナライト（複数）」は、分子または多分子構造の２つ以上の種類または種を指す。例示的な標的分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、ウイルス、病原体、有害物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、増殖因子、細胞、組織、及び前述したもののいずれかの任意の断片または部分が挙げられる。いくつかの実施形態では、標的分子はタンパク質であり、その場合に標的分子は、「標的タンパク質」と称されてよい。
【００５７】
ポリアニオン性阻害剤：ポリアニオン性阻害剤は、核酸分子のポリアニオン性リン酸骨格を含む、または模倣する阻害剤分子である。いくつかの実施形態では、ポリアニオン性阻害剤は、結合条件のストリンジェンシーを高めるためにアプタマーとの結合反応物中に含まれる。非限定的で例示的なポリアニオン性阻害剤としては、デキストラン硫酸、ヘパリン、Ｚ−ブロック、ポリｄＩ／ｄＣ、超音波処理または剪断したサケ精子ＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡ、ｄＮＴＰなどが挙げられる。
【００５８】
Ｚ−ブロック：Ｚ−ブロックは、本明細書で使用される場合、配列５’−（ＡＣ−ＢｎｄＵ−ＢｎｄＵ）７−ＡＣ−３’（式中、ＢｎｄＵは、ベンジル置換デオキシウリジン残基を示す）の一本鎖オリゴヌクレオチドである。Ｚ−ブロックは、従来のホスホロアミダイト化学を使用して合成されてよい。
【００５９】
本明細書で提供される範囲は、その範囲内の値全ての省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０の任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲（加えて、その内容に別段の明確な指示がない限り、その分数）を含むと理解される。いずれの濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲も、別段の指示がない限り、列挙される範囲内のいずれの整数、ならびに適切な場合、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）の値も含むと理解されるだろう。また、任意の物理的特徴、例えばポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどに関する、本明細書で列挙される数値範囲のいずれも、別段の指示がない限り、列挙される範囲内のいずれの整数も含むと理解されるだろう。本明細書で使用される場合、「ａｂｏｕｔ（約）」または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（から本質的になる）は、別段の指示がない限り、示される範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用される場合、「ｉｎｃｌｕｄｅ（含める）」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」という用語はオープンエンド形式であり、同義語として使用される。「ａ」及び「ａｎ」という用語は、本明細書で使用される場合、列挙される成分のうち「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ（１つ以上）」を指すと理解されるべきである。代替物の使用（例えば、「ｏｒ（または）」）は、代替物のうち１つ、両方、またはその任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。
【００６０】
ＩＩ．概要
Ａ．増殖分化因子１１（ＧＤＦ１１）及びミオスタチン（ＧＤＦ８）タンパク質
ＧＤＦ１１及びミオスタチンの天然成熟型はホモ二量体であり、配列アラインメントにより約９０％同一であり、１０９のアミノ酸残基のうち９８がマッチングする。ＧＤＦ１１（タンパク質ＩＤ０９５３９０；アミノ酸１〜４０７；配列番号：４）及びミオスタチン（タンパク質ＩＤ０１４７９３；アミノ酸１〜３７５；配列番号：５）のアミノ酸配列アラインメント、灰色のバーで示される成熟型を参照のこと。ＧＤＦ１１及びミオスタチンプレプロペプチドのアミノ酸配列のアラインメントは、以下に示される。成熟タンパク質部分は、灰色のバーで強調表示される。
【００６１】
【数１】
0006768651.tif 000002
【００６２】
ＧＤＦ１１及びＧＤＦ８は、共通祖先及び共通の制御機構を共有すると考えられているが、それらの組織特異性（それぞれ、主として心臓及び筋肉）に関して分岐している。
【００６３】
成熟ＧＤＦ１１は、ヒトとマウスとでは１００％同一であり、ラットでは９９％同一である。ヒト、マウス及びラットＧＤＦ１１タンパク質（成熟）のアミノ酸配列アラインメントは、以下に示される。ヒトＧＤＦ１１タンパク質ＩＤは、Ｏ９５３９０であり；例示的なヒト成熟ＧＤＦ１１は、以下に示される；配列番号：６）。マウスＧＤＦ１１タンパク質ＩＤは、Ｑ９Ｚ１Ｗ４であり；例示的なマウス成熟ＧＤＦ８は、以下に示される；配列番号：７）。ラットＧＤＦ１１タンパク質ＩＤは、Ｑ９Ｚ２１７であり；例示的なラット成熟ＧＤＦ８は、以下に示される；配列番号：８）。
【００６４】
【数２】
0006768651.tif 000003
【００６５】
ミオスタチン（ＧＤＦ８）は、ヒト、マウス、及びラットとでは１００％同一である。ヒト、マウス及びラットミオスタチンタンパク質（成熟）のアミノ酸配列アラインメントは、以下に示される。ヒトミオスタチン（ＧＤＦ８）タンパク質ＩＤは、Ｏ１４７９３であり；例示的なヒト成熟ＧＤＦ８は、以下に示される；配列番号：９）。マウスＧＤＦ８タンパク質ＩＤは、Ｏ０８６８９であり；例示的なマウス成熟ＧＤＦ８は、以下に示される；配列番号：１０）。ラットＧＤＦ１１タンパク質ＩＤは、Ｏ３５３１２であり；例示的なラット成熟ＧＤＦ８は、以下に示される；配列番号：１１）。
【００６６】
【数３】
0006768651.tif 000004
【００６７】
Ｂ．ＳＥＬＥＸ
ＳＥＬＥＸは一般に、核酸の候補混合物を調製すること、この候補混合物と所望の標的分子とを結合させて親和性複合体を形成すること、この親和性複合体を非結合候補核酸から分離すること、核酸を親和性複合体から分離及び単離すること、この核酸を精製すること、ならびに特異的アプタマー配列を同定することを含む。このプロセスは、選択されたアプタマーの親和性をさらに改良するために複数のラウンドを含んでよい。このプロセスは、プロセス中に１回以上の時点で増幅ステップを含み得る。例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」と題した米国特許第５，４７５，０９６号明細書を参照のこと。ＳＥＬＥＸ法は、その標的と非共有結合するアプタマーに加えて、その標的と共有結合するアプタマーを生成するために使用され得る。例えば、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ」と題した米国特許第５，７０５，３３７号明細書を参照のこと。
【００６８】
ＳＥＬＥＸ法は、改善された特性、例えば、改善されたインビボ安定性または改善された送達特性などをアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性アプタマーを同定するために使用され得る。このような修飾の例としては、リボース位置及び／またはリン酸位置及び／または塩基位置での化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸ法で同定される、修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、「Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題した米国特許第５，６６０，９８５号明細書に記載され、これはピリミジンの５’位及び２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載している。米国特許第５，５８０，７３７号明細書（上記を参照のこと）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する非常に特異的なアプタマーについて記載している。「ＳＥＬＥＸ  ａｎｄ  ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」と題した米国特許出願公開第２００９００９８５４９号明細書も参照し、これは拡張された物理的及び化学的特質を有する核酸ライブラリーならびにＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸにおけるそれらの使用について記載している。
【００６９】
ＳＥＬＥＸはまた、望ましいオフ速度特性を有するアプタマーを同定するために使用され得る。「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」と題した米国特許出願公開第２００９０００４６６７号明細書を参照し、これは標的分子に結合し得るアプタマーを生成する改善されたＳＥＬＥＸ方法について記載している。前述のように、これらの遅いオフ速度アプタマーは、「ＳＯＭＡｍｅｒ」として知られている。それらの各標的分子からの解離速度がより遅いアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ及び光アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒを作製する方法が記載されている。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させること、核酸−標的複合体の形成を発生させること、及び遅いオフ速度濃縮プロセスを実施することを含み、解離速度が速い核酸−標的複合体は解離して再形成されないだろうが、解離速度が遅い複合体はインタクトなままであるだろう。さらに、この方法は、改善されたオフ速度性能を有するアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒを生成するための、候補核酸混合物の作製における修飾ヌクレオチドの使用を含む。
【００７０】
このアッセイの変形形態は、アプタマーがそれらの標的分子と共有結合する、または「光架橋する」ことを可能にする光反応性官能基を含むアプタマーを用いる。例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｉｐ」と題した米国特許第６，５４４，７７６号明細書を参照のこと。これらの光反応性アプタマーは、光アプタマーとも称される。例えば、その各々が「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ」と題される米国特許第５，７６３，１７７号明細書、米国特許第６，００１，５７７号明細書、及び米国特許第６，２９１，１８４号明細書を参照のこと；また例えば、「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」と題した米国特許第６，４５８，５３９号明細書も参照のこと。マイクロアレイを試料と接触させ、光アプタマーがそれらの標的分子と結合する機会を得た後、光アプタマーを光活性化し、固体支持体を洗浄して非特異的結合分子をいずれも除去する。激しい洗浄条件が使用されてよく、その理由としては、光アプタマーに結合する標的分子は、光アプタマー上の光活性化官能基（複数可）により作製される共有結合ゆえに一般に除去されないからである。
【００７１】
これらのアッセイ形式の両方で、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒは、試料と接触させる前に固体支持体上に固定化される。しかしながら、ある種の状況下では、試料と接触させる前のアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの固定化は、最適なアッセイを提供しない場合がある。例えば、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒをあらかじめ固定化すると、固体支持体表面上でのアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒと標的分子との混合が非効率的となる場合があり、これがおそらく反応時間の長期化につながり、それゆえ、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒとそれらの標的分子との効率的な結合を可能にするためにインキュベーション時間の延長につながる。さらに、光アプタマーまたは光ＳＯＭＡｍｅｒがアッセイで用いられる場合、固体支持体として利用される材料に応じて、固体支持体は、光アプタマーまたは光ＳＯＭＡｍｅｒとそれらの標的分子との間に共有結合の形成をもたらすために使用される光を散乱させる、または吸収する傾向がある場合もある。さらに、用いられる方法に応じて、それらのアプタマーまたは光ＳＯＭＡｍｅｒに結合した標的分子の検出は、固体支持体表面が、使用されるいずれの標識化剤にも曝露されてこれらの影響を受ける場合もあるため、不正確になりやすい可能性がある。最後に、固体支持体上でのアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの固定化は、一般に試料へのアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの曝露前にアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ調製ステップ（すなわち、固定化）を含み、この調製ステップは、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの活性または官能性に影響を及ぼす場合がある。
【００７２】
ＳＯＭＡｍｅｒが溶液中でその標的を捕捉することを可能にし、次いで検出前にＳＯＭＡｍｅｒ−標的混合物の特定の成分を除去するように設計された分離ステップを用いるＳＯＭＡｍｅｒアッセイもまた、記載されている（「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｓｔ  Ｓａｍｐｌｅｓ」と題した、米国特許出願公開第２００９００４２２０６号明細書を参照のこと）。記載されているＳＯＭＡｍｅｒアッセイ方法は、核酸（すなわち、ＳＯＭＡｍｅｒ）を検出及び定量化することにより、試験試料中における非核酸標的（例えば、タンパク質標的）の検出及び定量化を可能にする。記載されている方法は、非核酸標的を検出及び定量化するための核酸代用物（すなわち、ＳＯＭＡｍｅｒ）を作製し、それにより増幅を含む多種多様な核酸技術が、タンパク質標的を含む、より広範囲な所望の標的に適用されることを可能にする。
【００７３】
標的がペプチドであるＳＥＬＥＸ法の実施形態は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＳＥＬＥＸ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」と題した米国特許第６，３７６，１９０号明細書に記載されている。本明細書の場合、標的はＧＤＦ１１タンパク質である。
【００７４】
Ｃ．化学修飾アプタマー
アプタマーは、その特質及び特性を改善する修飾ヌクレオチドを含有してよい。このような改善の非限定的例としては、インビボ安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び／または送達特性の改善が挙げられる。
【００７５】
このような修飾の例としては、ヌクレオチドのリボース位置及び／またはリン酸位置及び／または塩基位置での化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸ法で同定される、修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、「Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題した米国特許第５，６６０，９８５号明細書に記載され、これはピリミジンの５’位及び２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載している。米国特許第５，５８０，７３７号明細書（上記を参照のこと）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する非常に特異的なアプタマーについて記載している。「ＳＥＬＥＸ  ａｎｄ  ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」と題した米国特許出願公開第２００９００９８５４９号明細書も参照し、これは拡張された物理的及び化学的特質を有する核酸ライブラリーならびにＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸにおけるそれらの使用について記載している。
【００７６】
Ｃ−５修飾の具体例としては、デオキシウリジンのＣ−５位での、すぐ下で示されるようなベンジルカルボキシアミド（あるいはベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（あるいはナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキシアミド（あるいはトリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、及びイソブチルカルボキシアミド（あるいはイソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）から独立して選択される置換基による置換が挙げられる。
【００７７】
【化１】
0006768651.tif 000005
【００７８】
Ｃ−５修飾ピリミジンの化学修飾はまた、２’−位の糖修飾、環外アミンにおける修飾、及び４−チオウリジンの置換などと、単独でまたは任意の組み合わせで組み合わされ得る。
【００７９】
代表的なＣ−５修飾ピリミジンとしては、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−０−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−０−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−０−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ））プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−０−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンまたは５−（Ｎ−［ｌ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）が挙げられる。
【００８０】
存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドの組み立て前または組み立て後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合後、例えば標識化成分との複合化などによりさらに修飾され得る。
【００８１】
本開示の核酸配列に組み込まれてよい修飾ヌクレオチド（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン）の追加の非限定的例としては、以下のものが挙げられる：
【００８２】
【化２】
0006768651.tif 000006
Ｒ’は、以下の通りに定義される：
【００８３】
【化３】
0006768651.tif 000007
また、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、以下の通りに定義される：
式中、
Ｒ’’’’は、分岐鎖または直鎖低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ２０）；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲ’’）；一級アミド（ＣＯＮＨ２）；二級アミド（ＣＯＮＨＲ’’）；三級アミド（ＣＯＮＲ’’Ｒ’’’）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲ’’）からなる群から選択される。
式中、
Ｒ’’、Ｒ’’’は、分岐鎖または直鎖低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ２））；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；Ｒ’’’’置換フェニル環（Ｒ’’’’Ｃ６Ｈ４）（式中、Ｒ’’’’は上で定義される）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲ’’’’’）（式中、Ｒ’’’’’は分岐鎖または直鎖低級アルキル（Ｃ１〜Ｃ２０）である）；及びシクロアルキルからなる群から独立して選択され、式中、Ｒ’’＝Ｒ’’’＝（ＣＨ２）ｎであり；式中、ｎ＝２〜１０である。
【００８４】
さらなるＣ−５修飾ピリミジンヌクレオチドとしては、以下のものが挙げられる：
【００８５】
【化４】
0006768651.tif 000008
【００８６】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、アプタマーにヌクレアーゼ耐性を付与する。Ｃ−５位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの一例である。修飾としては、骨格修飾、メチル化、珍しい塩基対合の組み合わせ、例えばイソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなどを挙げることができる。修飾としては、キャッピングなどの３’及び５’修飾も挙げることができる。その他の修飾としては、天然に存在するヌクレオチドのうち１つ以上と類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）による修飾及び荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）による修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）による修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、ならびに修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸など）による修飾などを挙げることができる。さらに、通常はヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれも、ホスホネート基もしくはリン酸基によって置き換えられてよい；標準的な保護基によって保護されてよい；または追加のヌクレオチドもしくは固体支持体への追加の連結を調製するために活性化されてよい。５’末端及び３’末端のＯＨ基はリン酸化され得る、またはアミン、約１〜約２０の炭素原子の有機キャッピング基部分、一実施形態では、約１０〜約８０ｋＤａの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、別の実施形態では、約２０〜約６０ｋＤａの範囲のＰＥＧポリマー、もしくはその他の親水性もしくは疎水性生体ポリマーもしくは合成ポリマーで置換され得る。一実施形態では、修飾は、ピリミジンのＣ−５位のものである。これらの修飾は、Ｃ−５位に直接アミド連結することにより、またはその他の種類の連結により作製され得る。
【００８７】
アプタマーはまた、一般に当該技術分野において既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有し、２’−０−メチル−、２’−０−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、ａ−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドなどを含み得る。上述の通り、１つ以上のホスホジエステル連結が、代替連結基によって置き換えられてよい。これらの代替連結基としては、リン酸がＰ（０）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（０）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（０）Ｒ、Ｐ（０）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ’は独立してＨである、またはエーテル（−０−）連結を場合により含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０のＣ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルである）によって置き換えられる実施形態が挙げられる。アプタマー中の全ての連結が同一である必要はない。糖、プリン、及びピリミジンの類似形態の置換は、例えば、ポリアミド骨格のような代替骨格構造のように、最終生成物の設計に有利であり得る。
【００８８】
アプタマー中に含まれてよい、または組み込まれてよいＣ−５修飾ピリミジンの具体例としては、本明細書の構造が挙げられるが、これらに限定されない。構造に使用される命名規則は、Ｘが−Ｈ（すなわち、ＤＮＡ）であることを前提としているが、それらはまた、Ｘが−ＯＨ（ＲＮＡ）、または本明細書に記載されるその他の置換基（例えば、−ＯＣＨ３；−Ｏ−アリル；−Ｆ、−ＯＥｔ；−ＯＰｒ、−ＮＨ２；−アジドもしくは−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）であってよく、Ｒ’は、−Ｈ；−ＯＡｃ；−ＯＢｚ；−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３及び−ＯＳｉＭｅ２ｔＢｕであってよく、Ｒ’’は、−Ｈ；ＤＭＴ及び三リン酸（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）、ならびにそれらの塩であってよい構造を包含する。
【００８９】
例示的なＮａｐｄＵ構造（５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）：
【００９０】
【化５】
0006768651.tif 000009
【００９１】
例示的な２ＮａｐｄＵ構造（５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）：
【００９２】
【化６】
0006768651.tif 000010
【００９３】
例示的なＰＰｄＵ構造（５−［Ｎ−（フェニル−３−プロピル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）：
【００９４】
【化７】
0006768651.tif 000011
【００９５】
例示的なＴｒｐｄＵ構造（５−［Ｎ−（３−インドール−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）：
【００９６】
【化８】
0006768651.tif 000012
【００９７】
例示的な２ＮＥｄＵ構造５−［Ｎ−（２−ナフチル−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン）：
【００９８】
【化９】
0006768651.tif 000013
【００９９】
以下の実施例は、ある種の特定の特徴及び／または実施形態を示すために提供される。これらの実施例は、本開示を記載される特定の特徴または実施形態に限定すると解釈されるべきではない。
【０１００】
Ｄ．例示的なＧＤＦ１１アプタマー
ＧＤＦ１１と結合するアプタマーが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、１０ｎＭ未満の親和性でＧＤＦ１１と結合する。いくつかのこのような実施形態では、アプタマーは、両方の親和性が同じ結合条件下で測定される場合、ＧＤＦ１１に対する親和性よりも少なくとも１０分の１の弱い親和性でＧＤＦ８と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、０．５ｎＭ〜１０ｎＭの親和性でＧＤＦ１１と結合し、５０ｎＭ超、または１００ｎＭ超、または１５０ｎＭ超、または２００ｎＭ超、または３００ｎＭ超の親和性でＧＤＦ８と結合する。いくつかの実施形態では、アプタマーは、アプタマーが１０ｎＭ未満の親和性でＧＤＦ１１と結合する場合と同じ条件下でＧＤＦ８と結合しない。いくつかの実施形態では、アプタマーは、８ｎＭ未満、もしくは７ｎＭ未満、もしくは６ｎＭ未満、もしくは５ｎＭ未満、もしくは４ｎＭ未満、もしくは３ｎＭ未満、もしくは２ｎＭ未満、もしくは１ｎＭ未満；または０．１ｎＭ〜１０ｎＭ、０．１ｎＭ〜８ｎＭ、もしくは０．１ｎＭ〜５ｎＭの親和性でＧＤＦ１１と結合する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、親和性は、本明細書に記載されるアッセイを使用して決定される。いくつかの実施形態では、親和性は、ポリアニオン性阻害剤の存在下で決定される。非限定的で例示的なポリアニオン性阻害剤は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、親和性は、Ｚブロックの存在下で決定される。
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１と結合するアプタマーは、配列：
５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＣ−  ３’（配列番号：１１０）（式中：
各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり；
Ｒは、ＡまたはＧであり；
各Ｗは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｔ、またはＵであり；
各Ｍは独立して、かつ各存在についてＡまたはＣであり；
Ｓは、ＧまたはＣであり；
各ｎは独立して、かつ各存在について０または１であり；
各ｍは独立して、かつ各存在について０または１である）を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１と結合するアプタマーは、
ａ）５’−ＲＷｎＡＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１１）；
ｂ）５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＧＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１２）；及び
ｃ）５’−ＲＭＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１３）
（式中、Ｒ、Ｗ、Ｐ、Ｍ、Ｓ、ｎ、及びｍは、上記の通りに定義される）から選択される配列を含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＲがＧである場合、最初のＷはＡである；またはＲがＡである場合、最初のＷはＣである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのｎが、０である。いくつかの実施形態では、各ｎは０である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つのｎが、１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍが、１である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｍが、０である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーが提供され、このアプタマーは、配列５’−ＣＰＰＧＭＰＰＰ−３’（配列番号：１１４）（式中、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり、式中、ＭはＣまたはＡである）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーが提供され、このアプタマーは、配列５’−ＰＰＰＡＧＣ−３’（配列番号：１１５）（式中、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンである）を含む。いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列５’−ＣＰＰＧＭＰＰＰＮｘＰＰＰＡＧＣ−３’（配列番号：１１６）（式中、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり、式中、ｘは２、３、４、または５であり、式中、ＭはＣまたはＡであり、式中、各Ｎは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、及びＵから選択される）を含む。いくつかのこのような実施形態では、ｘは３または４である。いくつかの実施形態では、Ｎｘは、配列５’−ＡＡＧ−３’または５’−ＡＣＧ−３’または５’−ＡＧＧ−３’を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１と結合するアプタマーは、配列５’−ＮＮＣＰＰＧＲＰＰＰＡＭＧＰＰＰＡＧＳ−３’（配列番号：１４１）（式中、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり、ＲはＡまたはＧであり；各Ｎは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｇ、またはＣであり；ＭはＡまたはＣであり；ＳはＧまたはＣである）を含む。
【０１０６】
本明細書に記載される実施形態のいずれにおいても、各Ｐは、本明細書に記載されるＣ−５修飾ピリミジンから独立して選択される。いくつかの実施形態では、各Ｐは、      ５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから選択される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つのＰは各々、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンから独立して選択される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、配列番号：１２、１３、１５〜１０９、及び１１７〜１４０から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、配列番号：１２、１５、２６、１０５〜１０９、及び１４２〜１５０から選択される配列を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、最大約１００のヌクレオチド、最大約９５のヌクレオチド、最大約９０のヌクレオチド、最大約８５のヌクレオチド、最大約８０のヌクレオチド、最大約７５のヌクレオチド、最大約７０のヌクレオチド、最大約６５のヌクレオチド、最大約６０のヌクレオチド、最大約５５のヌクレオチド、最大約５０のヌクレオチド、最大約４５のヌクレオチド、最大約４０のヌクレオチド、最大約３５のヌクレオチド、最大約３０のヌクレオチド、最大約２５のヌクレオチド、及び最大約２０のヌクレオチドを含んでよい。
【０１０９】
本開示の別の態様では、ＧＤＦ１１アプタマーは、配列番号：１または２のいずれかと少なくとも約９５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約７５％同一であってよい。別の実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、配列番号：１または２のいずれかの配列、及びその断片を含む。関連の態様では、その断片は、約２５〜４９のヌクレオチド長（または約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８もしくは４９のヌクレオチド長）である。
【０１１０】
本開示の別の態様では、ＧＤＦ１１アプタマーは、約１０ｎＭ以下のＧＤＦ１１に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。別の例示的実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、約１５ｎＭ以下のＧＤＦ１１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、約２０ｎＭ以下のＧＤＦ１１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、約２５ｎＭ以下のＧＤＦ１１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、約３０ｎＭ以下のＧＤＦ１１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、約３５ｎＭ以下のＧＤＦ１１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、約４０ｎＭ以下のＧＤＦ１１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、約４５ｎＭ以下のＧＤＦ１１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、約５０ｎＭ以下のＧＤＦ１１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の例示的実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、約３〜１０ｎＭの範囲（または３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｎＭのＧＤＦ１１タンパク質に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。好適な解離定数は、マルチポイント滴定を使用し、本明細書に記載されるような式ｙ＝（最大−最小）（タンパク質）／（Ｋｄ＋タンパク質）＋最小にフィッティングする結合アッセイを用いて決定され得る。その他の実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、配列番号：１２の配列を含むアプタマーのＫｄ以下のＫｄを有するアプタマーである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、アプタマーは、検出可能な標識を含む。
【０１１２】
ＧＤＦ１１を検出する方法
いくつかの実施形態では、試料中のＧＤＦ１１を検出する方法が提供され、これは試料を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ８の存在下でＧＤＦ１１を検出または定量化する方法が提供され、これはＧＤＦ１１とＧＤＦ８の両方を含有すると推測される試料を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、試料中のＧＤＦ１１をＧＤＦ８と区別する方法が提供され、これは試料を本明細書に記載されるアプタマーと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ポリアニオン性阻害剤の存在下で試料を本明細書に記載されるＧＤＦ１１アプタマーと接触させることを含む。
【０１１３】
ＧＤＦ１１アプタマーが結合したＧＤＦ１１を検出及び／または定量化することは、当該技術分野における方法及び／または本明細書に記載される方法を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１１アプタマーは、固体支持体に結合される、または固体支持体上に捕捉されてよい結合対のメンバーを含む（例えば、ビオチン化アプタマーが、ストレプトアビジンを含む固体支持体に結合されてよい）。
【０１１４】
ＧＤＦ１１アプタマー組成物を含むキット
本開示は、本明細書に記載されるＧＤＦ１１アプタマーのいずれかを含むキットを提供する。このようなキットは、例えば、（１）少なくとも１種のＧＤＦ１１アプタマー；及び（２）少なくとも１種の薬学的に許容される担体、例えば溶媒または溶液などを含み得る。追加のキット成分は、例えば：（１）本明細書で同定される薬学的に許容される賦形剤、例えば安定剤、緩衝剤などのいずれか、（２）キット成分を保持及び／または混合するための少なくとも１種の容器、バイアルまたは類似の装置；ならびに（３）送達装置を場合により含み得る。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：ＧＤＦ１１結合特異性を有するアプタマーの選択及び同定
本実施例は、成熟ＧＤＦ１１タンパク質と結合するアプタマーの選択及び作製の代表的な方法を提供する。
【０１１６】
ＧＤＦ１１に対して特異性を有するアプタマーを選択するという以前の試みは、困難であった。ＳＥＬＥＸ法を使用して選択したいくつかのアプタマーの、ＧＤＦ１１及びミオスタチン（ＧＤＦ８）に対するタンパク質結合親和性の比較を、以下の表１に示す。
【０１１７】
【表１】
0006768651.tif 000014
【０１１８】
表１に示すように、ＧＤＦ１１と結合するよう選択したアプタマーは一般に、ミオスタチンに対する親和性も有した。各アプタマーについてのＧＤＦ１１対ミオスタチンの結合親和性比も表１に示す。比は、１（１）未満（すなわち、アプタマーは、ＧＤＦ１１と比較してミオスタチンにより高い親和性を有した）から、約１．６〜約６．３の比（すなわち、アプタマーは、ミオスタチンと比較してＧＤＦ１１により高い親和性を有した）まで変動している。しかしながら、これらの親和性の差は、タンパク質結合アッセイにおいてＧＤＦ１１とミオスタチンとを判別するのに十分ではない。結果として、ＧＤＦ１１及びＧＤＦ８の存在及び／またはレベルを区別することはできない。ＧＤＦ１１とミオスタチンとを判別することができるＧＤＦ１１アプタマーを同定することの問題を考慮して、対抗選択戦略をＳＥＬＥＸ法に導入した。
【０１１９】
遅いオフ速度濃縮プロセスを用いたアプタマー選択
ＧＤＦ１１を用いるＳＥＬＥＸを、本明細書に記載されるＳＥＬＥＸ方法を使用して実施した。加えて、異なる２種類の対抗選択を含むプロトコール変更を、ミオスタチンと結合しない、またはミオスタチンよりもＧＤＦ１１に対してより高い親和性を有するＧＤＦ１１アプタマーを選択するために適用した：すなわち、受動的対抗選択及び能動的対抗選択。
【０１２０】
受動的対抗選択をタグ無し型の望ましくない標的（ミオスタチン）を用いて、選択中にその標的をＰＣＢ（プロトロンビン、カゼイン及びアルブミンを含有するタンパク質競合緩衝剤）に添加することにより行い、ミオスタチンよりもＧＤＦ１１への選好を欠く配列を除去した。ミオスタチン対ＧＤＦ１１の比は、第１ラウンドで１：１（各１００ｐｍｏｌ）、第２ラウンドで２：１（２０ｐｍｏｌのミオスタチン及び１０ｐｍｏｌのＧＤＦ１１）であって、ＧＤＦ１１標的濃度が減少したため、ＳＥＬＥＸのその後のラウンドで増加した（２０ｐｍｏｌのミオスタチン及び０．３ｐｍｏｌのＧＤＦ１１または約６７：１）。
【０１２１】
能動的対抗選択を、ストレプトアビジン（ＳＡ）ビーズ上に固定化したビオチン化ミオスタチンを用いて行った。ＳＥＬＥＸの各ラウンド前に、ライブラリーを３７℃で振盪しながら１０分間対抗選択ビーズでインキュベートした。次いで、上清を回収してＧＤＦ１１を含む選択物に移し、ビーズ上にミオスタチンと結合する配列を残した。第１ラウンドでは、１０００ｐｍｏｌのライブラリーを対抗選択するために１００ｐｍｏｌのミオスタチンを使用し、その後の各ラウンドでは、およそ２０〜５０ｐｍｏｌのライブラリーを対抗選択するために２０ｐｍｏｌのミオスタチンを使用した。
【０１２２】
候補混合物の調製
部分的にランダム化したｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの候補混合物を、ビオチン化ｓｓＤＮＡ鋳型にアニーリングしたＤＮＡプライマーのポリメラーゼ伸長により調製した（以下の表２に示す）。候補混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン三リン酸（ＮａｐｄＵＴＰ）を含有する４０ヌクレオチドのランダム化カセットを含有した。
【０１２３】
【表２】
0006768651.tif 000015
【０１２４】
５ミリリットルのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｌｕｓ  ＵｌｔｒａＬｉｎｋ樹脂（ＰＩＥＲＣＥ）の５０％スラリーを、２．５ｍＬの２０ｍＭのＮａＯＨで１回、２．５ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０５（ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した４０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）緩衝液、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．０５％のＴＷＥＥＮ２０）で２回、ならびに２．５ｍＬの１６ｍＭのＮａＣｌで２回洗浄した。２つのビオチン残基（配列中でＢ’として示される）及び４０のランダム化位置（配列中でＮ４０として示される）を有する、８０ナノモルの鋳型１（配列番号：１）を、洗浄したＵｌｔｒａＬｉｎｋ  ＳＡビーズに添加し、３７℃で２．５時間回転させた。次いで、ビーズを１６ｍＭのＮａＣｌで３回洗浄した。各洗浄の合間に、ビーズを遠心分離により回収した。その時点で捕捉した鋳型を含有するビーズを、８０ｎｍｏｌのプライマー（配列番号：２）、１倍ＳＱ２０緩衝液（１２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭのＫＣｌ、７ｍＭのＭｇＳＯ４、６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．００１％のＢＳＡ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、４７０単位のＫＯＤ  ＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＥＭＤ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）、ならびに各々１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＮａｐｄＵＴＰを含有する、３．７５ｍＬの伸長反応緩衝液中に懸濁した。ビーズを回転させながら６８℃で２時間放置してインキュベートした。次いで、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１（上記のようなＳＢ１８であるが、０．０１％のＴＷＥＥＮ−２０を用いる）で１回、１６ｍＭのＮａＣｌで２回洗浄した。アプタマーライブラリーを、２．５ｍＬの４０ｍＭのＮａＯＨでビーズから溶出した。溶出したライブラリーを、５０μＬの中和剤（７００ｍＭのＨＣｌ、１８０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．４５％のＴＷＥＥＮ−２０）で直ちに中和した。溶出をさらに２回繰り返し、溶出液をプールした。ライブラリーを、ＡＭＩＣＯＮ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−１０フィルターでおよそ０．４ｍＬまで濃縮し、ライブラリーの濃度を紫外吸光分光法により決定した。
【０１２５】
ヒトＧＤＦ１１のビオチン標識化
Ｅ．ｃｏｌｉ中での過剰発現後、ホモ二量体型に精製したタグ無し組換えヒトＧＤＦ１１タンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１２０−１１）を、ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン）と、一級アミンを含有する残基との共有結合によりビオチン化した。タンパク質（８０μＬ中に１６００ｐｍｏｌ）を４倍モル過剰のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンと混合し、反応物を２０℃で１時間放置してインキュベートした。反応が完了した後、未反応のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンを、緩衝液をＳＢ１８Ｔ０．０５に交換してからＺｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（ＰＩＥＲＣＥ）を使用して除去した。
【０１２６】
ヒトミオスタチンのビオチン標識化
Ｅ．ｃｏｌｉ中での過剰発現後、ホモ二量体型に精製したタグ無し組換えヒトミオスタチンタンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号１２０−００）を、上に記載の通りにビオチン化した。
【０１２７】
ミオスタチンの固定化
ＭＹＯＮＥ−ＳＡ常磁性ビーズ（ＭＹＯＮＥ  ＳＡ、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ、または以後ＳＡビーズと称する）を、１４ｍＬの２０ｍＭのＮａＯＨで１回、１４ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０５で２回ビーズを洗浄することにより調製した。最後に、ＳＡビーズをＳＢ１８Ｔ０．０５中に１０ｍｇ／ｍＬで懸濁し、使用するまで４℃で保存した。ビオチン標識ミオスタチンタンパク質（５００ｐｍｏｌ）を、ＳＥＬＥＸの全てのラウンドのために固定化した。これは、ＳＡビーズ（５ｍｇ）をビオチン標識ミオスタチン（５００ｐｍｏｌ）と３０分間振盪しながら混合し、続いてＳＢ１８Ｔ０．０５で３回洗浄することにより達成した。ＳＡ−ミオスタチンビーズを０．５ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０５中に再懸濁し（１μＭのミオスタチンが結合した１０ｍｇ／ｍＬのビーズ）、使用するまで４℃で保存した。
【０１２８】
遅いオフ速度濃縮プロセスを用いたアプタマー選択
合計で１１ラウンドのＳＥＬＥＸ法を、親和性及び遅いオフ速度についての選択により完了した。各ラウンド前に、対抗選択を実施してバックグラウンドを減少させ、タンパク質に非特異的に結合するアプタマーを得る可能性を減少させた。加えて、異なる種類の対抗選択を適用し、密接に関連した９０％同一のタンパク質ミオスタチンと結合しないＧＤＦ１１アプタマーの選択を進めた。対抗選択を以下の通りに実施した。
【０１２９】
ラウンド１では、ＳＢ１８Ｔ０．０５中の、およそ１ｎモルのＤＮＡを含有する１００μＬのＤＮＡ候補混合物を９５℃で５分間加熱し、次いで７０℃まで５分間冷却し、次いで４８℃まで５分間冷却して、次いで３７℃のブロックに５分間移した。次いで、試料を１０μＬのタンパク質競合混合物及び１ｍｇ（１００μＬ）の対抗選択ビーズと混合し、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートした。ビーズを磁気分離により除去した。タンパク質競合混合物及び対抗選択ビーズを、以下の通りに構成した。標準的なＳＥＬＥＸでは、１０μＬの標準的なタンパク質競合混合物（ＳＢ１８Ｔ０．０５中に０．１％のＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及び１０μＭのプロトロンビン）、ならびに１ｍｇ（１００μＬ）のＳＡビーズを使用した。受動的対抗選択を用いるＳＥＬＥＸでは、１０μＬの変更タンパク質競合混合物（ＳＢ１８Ｔ０．０５中に０．１％のＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、１０μＭのプロトロンビン、及び１０μＭの非標識ミオスタチン）ならびに１ｍｇ（１００μＬ）のＳＡビーズを使用した。能動的対抗選択を用いるＳＥＬＥＸでは、１０μＬの標準的なタンパク質競合混合物（ＳＢ１８Ｔ０．０５中に０．１％のＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及び１０μＭのプロトロンビン）、ならびに１ｍｇ（１００μＬ）のＳＡ−ミオスタチンビーズ（１μＭのミオスタチンが結合したＳＡビーズ）を使用した。
【０１３０】
ラウンド２〜１１では、前のラウンドから得られた６８μＬアリコートのＤＮＡ候補混合物（前のラウンドから得られたｅＤＮＡの６８％）を、１３μＬの５倍ＳＢ１８Ｔ０．０５と混合した。試料を９５℃まで３分間加熱し、０．１℃／秒の速度で３７℃まで冷却した。次いで、試料を９μＬのタンパク質競合混合物（ＳＢ１８Ｔ０．０５中に０．１％のＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及び１０μＭのプロトロンビン）、ならびに０．１ｍｇ（１０μＬ）のＳＡビーズと混合し、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートした（標準的なＳＥＬＥＸ）。ラウンド１におけるように、タンパク質競合混合物に１０μＭの非標識ミオスタチンを補充し（受動的対抗選択を用いるＳＥＬＥＸ）、ＳＡ−ミオスタチンビーズ（１μＭのミオスタチンが結合したＳＡビーズ）をＳＡビーズの代わりに使用した（能動的対抗選択を用いるＳＥＬＥＸ）。ビーズを磁気分離により除去した。
【０１３１】
最初の対抗選択後、標的タンパク質をラウンド１選択プロセスのためにＳＡビーズ上にあらかじめ固定化した。これを達成するために、０．５ｍｇのＳＡビーズを５０ｐモルのビオチン標識標的タンパク質（ＧＤＦ１１ホモ二量体）と混合し、振盪しながら３０分間３７℃でインキュベートした。非結合標的を、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０５で２回洗浄することにより除去した。対抗選択したＤＮＡ候補混合物（１００μＬ）をビーズに添加し、混合しながら３７℃で６０分間インキュベートした。第１ラウンドでは、遅いオフ速度濃縮プロセスを用いずに、ビーズを１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０５で２分間ずつ５回簡単に洗浄した。洗浄後、結合したアプタマーを、４５μＬの８ｍＭのＮａＯＨを添加して混合しながら３７℃で５分間インキュベートすることによりビーズから溶出した。アプタマー含有溶出液（４０μＬ）を、ビーズの磁気分離後に新しいチューブに移した。溶出を、４５μＬの８ｍＭのＮａＯＨを用いて混合しながら３７℃で５分間インキュベートしてもう一度繰り返した。溶出液を混合し（８０ｕＬ）、溶液を２０μＬの３２ｍＭのＨＣｌ及び２μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５を添加することにより中和した。
【０１３２】
ラウンド２〜１１では、選択を以下に記載されるようにＤＮＡ候補混合物及び標的タンパク質を用いて実施したが、並行して同一の選択を、ＤＮＡ候補混合物は用いたが標的タンパク質は用いることなく実施した。標的タンパク質を含む試料（シグナルＳ）及び標的タンパク質を含まない試料（バックグラウンドＢ）についてＰＣＲから得られたＣｔ値の比較を目安として使用し、次のラウンドの標的濃度を減少させた。デルタＣｔ値が４超であるが、８未満であった場合、標的タンパク質を次のラウンドでは３分の１に減少させた。デルタＣｔ値が８超であった場合、標的を次のラウンドでは１０分の１に減少させた。
【０１３３】
これらのスキーム後、標準的なＳＥＬＥＸラウンド後のＧＤＦ１１濃度の減少は、３分の１（ラウンド５〜６）、１０分の１（ラウンド７〜８）、３０分の１（ラウンド９〜１０）、及び１００分の１（ラウンド１１）であった。受動的対抗選択を用いる選択では、標的濃度の減少は、３分の１（ラウンド５〜６）、１０分の１（ラウンド７〜１０）、及び３０分の１（ラウンド１１）であった。能動的対抗選択を用いる選択では、標的濃度の減少は、３分の１（ラウンド５〜６）、１０分の１（ラウンド７）、３０分の１（ラウンド８〜１０）、及び１００分の１（ラウンド１１）であった。「ＲＸ」（式中、Ｘは数値）は、ＳＥＬＥＸのラウンド数を表す（例えば、Ｒ３は、ＳＥＬＥＸのラウンド３を示す）。
【０１３４】
【数４】
0006768651.tif 000016
【０１３５】
ラウンド２では、標識標的タンパク質（１０μＬ中に５ｐモルのＧＤＦ１１ホモ二量体）を４０μＬの対抗選択したＤＮＡ候補混合物と混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。遅いオフ速度濃縮プロセスを、５０μＬの１０ｍＭのデキストラン硫酸を添加し、続いて直ちに０．１ｍｇのＳＡビーズを添加することにより開始した。これを、混合しながら１５分間３７℃で放置してインキュベートした。次いで、ビーズを１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０５で５回洗浄した。アプタマー鎖を、１０５μＬの過塩素酸ナトリウム溶出緩衝液（１．８ＭのＮａＣｌＯ４、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．８、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を添加し、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートすることによりビーズから溶出した。ビーズを磁気分離により除去し、１００μＬのアプタマー溶出液を、プライマー捕捉ビーズ（１２．５ｐｍｏｌのプライマー２（配列番号：２）が結合した２５μＬの２．５ｍｇ／ｍＬのＳＡビーズ）を含有する新しいチューブに移し、混合しながら３０分間５０℃で放置してインキュベートした。次いで、ビーズを１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０５で３回洗浄した。アプタマー鎖を、８５μＬの４０ｍＭのＮａＯＨを添加することによりビーズから溶出し、溶出液（８０μＬ）を２０μＬの１６０ｍＭのＨＣｌ及び２μＬの５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で中和した。
【０１３６】
ラウンド３〜１１選択は、ビーズの添加前にデキストラン硫酸を１５分（ラウンド３〜４）、３０分（ラウンド５）、４５分（ラウンド６）、６０分（ラウンド７）、７５分（ラウンド８）、または９０分（ラウンド９〜１１）添加した以外は、ラウンド２に記載されるように実施した。分割を、０．１ｍｇのＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｓｅｒａ−Ｍａｇ  ＳｐｅｅｄＢｅａｄｓ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号０９−９８１−１５５、もしくは以後ＮＡビーズと称する、ラウンド３、５、７、９、１１）を用いて、または０．１ｍｇのＳＡビーズ（ラウンド４、６、８、１０）を用いて行った。
【０１３７】
ＳＥＬＥＸの１１ラウンド後に得られたプールは、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｅＰＣＲ及び配列決定を保証する良好な活性を示した（表３）。各プールから、３８４の配列を比較配列分析、続く主要候補の結合アッセイのために得た。
【０１３８】
【表３】
0006768651.tif 000017
【０１３９】
アプタマー増幅及び精製
各ラウンドからの選択したアプタマーＤＮＡをＱＰＣＲにより増幅し、定量化した。４８μＬのＤＮＡを、１２μＬのＱＰＣＲ混合物（５倍に希釈した１０倍ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ緩衝液；Ｎｏｖａｇｅｎ番号７１１５７、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０μＭのフォワードＰＣＲプライマー（プライマー１、配列番号：２）、１０μＭのビオチン化リバースＰＣＲプライマー（プライマー２、配列番号：３）、５倍ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、０．０７５Ｕ／μＬのＫＯＤ  ＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ならびに各々１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）に添加し、ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＭｙＩＱ  ＱＰＣＲ機器において次のプロトコール：９６℃で１５秒間、５５℃で１０秒間、及び６８℃で３０分間を１サイクル；続いて、９６℃で１５秒間、６８℃で１分間を３０サイクルで熱サイクルを行った。定量化を機器ソフトウェアで行い、標的タンパク質の有無にかかわらず、選択したＤＮＡのコピー数を比較してシグナル／バックグラウンド比を決定した。
【０１４０】
増幅後、ＰＣＲ産物をビオチン化アンチセンス鎖によりＳＡビーズ上で捕捉した。１．２５ｍＬのＳＡビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）を１４ｍＬの２０ｍＭのＮａＯＨで１回、１４ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０５で２回洗浄し、１．２５ｍＬの３ＭのＮａＣｌ＋０．０５％のＴＷＥＥＮ中に再懸濁して４℃で保存した。２５μＬのＳＡビーズ（３ＭのＮａＣｌ中に１０ｍｇ／ｍＬ）を５０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物に添加し、混合しながら２５℃で５分間インキュベートした。「センス」鎖を、１００μＬの４０ｍＭのＮａＯＨを添加し、混合しながら３７℃で５分間インキュベートすることによりビーズから溶出した。溶出した鎖を廃棄し、ビーズをＳＢ１８Ｔで２回、１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄した。
【０１４１】
ＮａｐｄＵＴＰを含有するアプタマーセンス鎖を、固定化アンチセンス鎖からのプライマー伸長により調製した。ビーズを４０μＬのプライマー伸長反応混合物（１倍プライマー伸長緩衝液（１２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭのＫＣｌ、７ｍＭのＭｇＳＯ４、６ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％のＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００及び０．００１％のウシ血清アルブミン）、２．５μＭのフォワードプライマー（プライマー１、配列番号：２）、各々０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びＮａｐｄＵＴＰ、ならびに０．０１５Ｕ／μＬのＫＯＤ  ＸＬ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）に懸濁し、混合しながら６８℃で６０分間インキュベートした。ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０５で３回洗浄し、アプタマー鎖を、４５μＬの４０ｍＭのＮａＯＨを添加し、混合しながら３７℃で５分間インキュベートすることによりビーズから溶出した。磁気分離後に４０μＬのアプタマー溶出液を新しいチューブに移し、溶出を、４５μＬの４０ｍＭのＮａＯＨを用いて混合しながら３７℃で５分間インキュベートしてもう一度繰り返した。溶出液を混合し（８０ｕＬ）、溶液を２０μＬの１６０ｍＭのＨＣｌで中和して、１０μＬの０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で緩衝した。
【０１４２】
選択ストリンジェンシー及びフィードバック
選択ステップの標的タンパク質相対濃度を、以下の規則に従いＱＰＣＲシグナル（ΔＣｔ）に応答して各ラウンドで低下させた。
ΔＣｔ＜４の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）
４≦ΔＣｔ＜８の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）／３．２
ΔＣｔ≧８の場合、［Ｐ］（ｉ＋１）＝［Ｐ］（ｉ）／１０
式中、［Ｐ］＝タンパク質濃度、ｉ＝現ラウンド数。
【０１４３】
各選択ラウンド後、濃縮ＤＮＡ混合物の収束状態を決定した。１０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物を１倍ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを含有する４ｍＭのＭｇＣｌ２で２００μＬまで希釈した。試料を、二本鎖オリゴヌクレオチドの複合混合物のハイブリダイゼーション時間を測定するＣ０ｔ分析を使用して収束について分析した。試料を、次のプロトコール：９８℃で１分間、８５℃で１分間を３サイクル；９８℃で１分間、次いで８５℃で３０分間を２サイクルで熱サイクルを行った。８５℃で３０分の間に、蛍光画像を５秒間隔で測定した。蛍光強度を時間対数の関数としてプロットし、配列収束を示す、各ＳＥＬＥＸラウンドでのハイブリダイゼーション速度の上昇を観察した。
【０１４４】
濃縮プール配列決定及びアプタマー同定
ＳＥＬＥＸの１１ラウンド後、収束したプールを配列決定した。配列調製を以下の通りに実施した。プールを、特有のバーコード／インデックス配列（各プールについての特有の配列識別子）を含有するＳＥＬＥＸライブラリー特異的プライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅した。個々のＰＣＲ産物をＱｕａｎｔ−ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）アッセイを使用して定量化し、等モル濃度で混合して、ＡＭＩＣＯＮ  Ｕｌｔｒａ−０．５遠心式フィルターデバイス（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用して濃縮／緩衝液交換を行った。次いで、混合物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製し、溶出液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５遠心式フィルターデバイスを使用して濃縮し、最終混合物のサイズ、純度及び収率を確認するためにＰＡＧＥで可視化した。試料を、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ配列決定のためにＳｅｑＷｒｉｇｈｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ、ヒューストン、テキサス州）に提出した。４０，０００超の配列を含有する配列プールから、３８４をランダムに選択し、配列数／コピー数を決定し、かつローカルアラインメントアルゴリズムを使用して共通収束パターンを同定するカスタムソフトウェアを使用して収束について分析した。プール内で最高表示／コピー数を有する配列及び全ての収束パターンから少なくとも１つの配列を、さらなる特徴付けのために選択した。留意することとして、「低い」配列クオリティスコア（すなわち、２０以下のＰｈｒｅｄクオリティスコア）を有した、ＳＥＬＥＸアプタマープールからのこれらの配列読み取り結果は、配列分析及びモチーフ同定から除去した。
【０１４５】
機能アッセイによる及び減算配列分析によるアプタマー同定
収束パターン１を、ＧＤＦ１１及びミオスタチンを用いる比較結合アッセイにより配列１２０６０−２８＿３（配列番号：１２）及び１２０６０−１６＿３（配列番号：１３）から最初に同定した（実施例２を参照のこと）。配列中の「Ｐ」という文字は、ＮａｐｄＵを示す。
アプタマーＩＤ  １２０６０−２８＿３：
５’−ｃｃｃｔｇＣＧＣＣＰＰＣＧＧＡＣＰＰＧＣＰＰＰＡＡＧＰＰＰＡＧＣＣＧＣＰＰＧＣＰＣＡＣＡＰｃａｃａａ−３’（配列番号：１２）
アプタマーＩＤ  １２０６０−１６＿３：
５’−ｃｃｃｔｇＰＧＡＧＡＣＰＰＧＡＰＰＰＡＣＧＰＰＰＡＧＣＰＧＣＰＡＡＣＡＰＧＧＧＧＡＡＣＣＡｃａｃａａ−３’（配列番号：１３）
【０１４６】
並行して、収束パターン１を、異なるＳＥＬＥＸ変形形態を用いて得られたプールからの配列の比較及び減算配列分析によりインシリコで同定した。これらは、プール１２０５８（ＧＤＦ１１の標準的なＳＥＬＥＸ）から７６８の配列、プール１２０６０（受動的対抗選択を用いたＧＤＦ１１  ＳＥＬＥＸ）から３８４の配列、プール１２０６１（能動的対抗選択を用いたＧＤＦ１１  ＳＥＬＥＸ）から３８４の配列、及びプール１２０５９（ミオスタチンの標準的なＳＥＬＥＸ）から３８４の配列を含んだ。これらの混合プール中における全ての配列の分析及びアラインメントを使用して、ＧＤＦ１１及びミオスタチンの無差別結合を示している、全てのプール中に存在する共通パターンを有する配列の優先度を下げた（表４を参照のこと）。収束パターン１は、受動的対抗選択を用いたＧＤＦ１１  ＳＥＬＥＸからのプール１２０６０中で高度に濃縮され（１５％）、ＧＤＦ１１の標準的なＳＥＬＥＸからのプール１２０５８中ではより低い存在量を有し（３％）、ミオスタチンの標準的なＳＥＬＥＸからのプール１２０５９中には存在せず、これはＧＤＦ１１特異性を示していた。
【０１４７】
【表４】
0006768651.tif 000018
【０１４８】
実施例２：ＧＤＦ１１と結合するアプタマーのサンドイッチＳＥＬＥＸ
サンドイッチＳＥＬＥＸアッセイを使用し、ＧＤＦ１１と結合する２ＮＥｄＵ含有アプタマーを使用して追加のＧＤＦ１１特異的アプタマーを同定した。サンドイッチＳＥＬＥＸは、ＷＯ２０１５／０４８０８４に記載されている。簡潔に述べると、ＳＥＬＥＸを標的−アプタマー複合体（すなわち、２ＮＥｄＵ含有アプタマーと複合化したＧＤＦ１１）を使用して実施する。サンドイッチＳＥＬＥＸを使用してスクリーニングしたＮａｐｄＵプール中で同定したアプタマーのいくつかが、アプタマー１２０６０−２８と類似していることを見出した。これらのクローンを以下でさらに考察する。
【０１４９】
実施例３：ＧＤＦ１１タンパク質対ミオスタチンに対するアプタマーの平衡結合定数（Ｋｄ）
本実施例は、アプタマー−ＧＤＦ１１及びアプタマー−ミオスタチンタンパク質のタンパク質結合親和性（Ｋｄ）、ならびにミオスタチンよりもＧＤＦ１１と選択的に結合するアプタマーの同定を提供する。
【０１５０】
本明細書に記載される対抗選択ＳＥＬＥＸ方法により、及びサンドイッチＳＥＬＥＸ方法により選択したいくつかのアプタマークローンをさらに特徴付けし、ミオスタチンよりもＧＤＦ１１への選択的結合のために選択した（表５を参照のこと）。結合アッセイを、非特異的競合物として１μＭのＺ−ブロック（ランダムオリゴヌクレオチド配列）の不存在下で及びその存在下で行った。Ｃ−５修飾ピリミジンとしてＢｎｄＵを有するアプタマー（ＢｎｄＵ  ＧＤＦ１１アプタマー）を、対抗選択ステップを用いないＳＥＬＥＸによりあらかじめ選択し、これをＧＤＦ１１とミオスタチンの両方に対する結合の対照として使用した。ＢｎｄＵ  ＧＤＦ１１アプタマーを用いた以前の結合実験では、これは一般にＧＤＦ１１及びミオスタチンに対して無差別的であることを示した。
【０１５１】
【表５】
0006768651.tif 000019
0006768651.tif 000020
【０１５２】
受動的対抗選択を用いたＳＥＬＥＸにより得られたアプタマープール１２０６０（ＮａｐｄＵアプタマー）は、ＧＤＦ１１に対する親和性、及び異なる程度の選択性を有するいくつかのヌクレオチド配列を含有していた（Ｋｄ比を参照し、より大きな数値が、ミオスタチンよりもＧＤＦ１１により高い特異性を示している）。特に、アプタマークローン１２０６０−１６＿３（ＮａｐｄＵ）は、１μＭのＺ−ブロックの存在下で試験した場合、ミオスタチンよりもＧＤＦ１１に対して約５０倍示差的なＫｄ（すなわち、６．５２ｎＭ対＞３２０ｎＭのＫｄ）を示し、ヌクレオチド配列の１２０６０アプタマープールの９％を構成した１２０６０−２８＿３（ＮａｐｄＵ）は、１μＭのＺ−ブロックの存在下で試験した場合、ミオスタチンよりもＧＤＦ１１に対して約１００倍示差的なＫｄ（すなわち、１．７４ｎＭ対＞３２０ｎＭのＫｄ）を示した（図１を参照のこと）。サンドイッチＳＥＬＥＸにより得られたアプタマープール１６１３９（ＮａｐｄＵ）も、ＧＤＦ１１に対して高親和性及び特異性を有するいくつかのヌクレオチド配列を含有していた。
【０１５３】
表５のその他のアプタマークローンは、ミオスタチンに対する親和性の範囲でＧＤＦ１１に対する親和性を示した。例えば、標準的なＳＥＬＥＸからのアプタマープール１２０５８（ＮａｐｄＵ）では、配列１２０５８−６（１７％）が優位を占めた。このアプタマークローンは、ＧＤＦ１１に対して０．０９ｎＭのＫｄを有し、ミオスタチンに対しても０．１２ｎＭのＫｄを有した（図２）。
【０１５４】
実施例４：ＧＤＦ１１アプタマー１２０６０−２８のＳＥＬＥＸ後の切断及び分析
本実施例は、ＳＥＬＥＸ後の、１２０６０−２８＿３アプタマーの切断配列に対するＧＤＦ１１結合親和性及びＧＤＦ１１に結合することができるコア最小配列長の同定を提供する。
【０１５５】
アプタマー１２０６０−２８（ＮａｐｄＵ）切断は、２０ｍｅｒの配列５’−ＧＡＣＰＰＧＣＰＰＰＡＡＧＰＰＰＡＧＣＣ−３’（アプタマー１２０６０−２８＿３７；配列番号：１５６）が、ＧＤＦ１１と結合することができたことを示した。しかしながら、２１ｍｅｒの配列５’−ＧＧＡＣＰＰＧＣＰＰＰＡＡＧＰＰＰＡＧＣＣ−３’（アプタマークローン１２０６０−２８＿３６；配列番号：１５７）の活性は、ＧＤＦ１１に対して比較的良好な結合を示した（４．４３Ｅ−１０のＫｄ）（図３を参照のこと）。このことは、１２０６０−２８に関連する活性クローンのファミリーに見られる保存モチーフＣＰＰＧＣＰＰＰＡＮＧＰＰＰＡＧＣ（配列番号：１０５）と合致する、すなわち、４０ｍｅｒの中央領域（モチーフ配列）の１２〜２４位内のＮａｐｄＵ残基のみが、結合に必要であると思われる。
【０１５６】
実施例５：特異的ＧＤＦ１１アプタマー配列
本実施例は、ＳＥＬＥＸ法により選択したその他のアプタマー配列を有する主要なＧＤＦ１１選択的アプタマーバインダー（１２０６０−２８＿３）の配列アラインメントを提供する。これは、ＳＥＬＥＸにより選択した配列プール中における複数の配列中のモチーフ配列の同定をもたらした。選択した配列についての親和性データをさらに提供する。配列（５０ｍｅｒ）のアラインメント及び結合親和性については表６を参照のこと。表７は、アプタマープール１２０６０及び１２０５８からの追加の配列ならびにそれらのアラインメントを提供する。表７の配列は、配列（４０ｍｅｒ）の５’末端及び３’末端の各々で５つ（５）のヌクレオチドを除去したものを示す。表６及び表７の両方とも、配列中で共有される「コア配列」モチーフの基礎を提供する。この配列は、ＧＡＣＰＰＧＡＰＰＰＡＣＧＰＰＰＡＧＣ（配列番号：１０６）；ＧＡＣＰＰＧＡＰＰＰＡＡＧＰＰＰＡＧＣ（配列番号：１０７）；ＧＡＣＰＰＧＣＰＰＰＡＡＧＰＰＰＡＧＣ（配列番号：１０８）；ＧＡＣＰＰＧＣＰＰＰＡＣＧＰＰＰＡＧＣ（配列番号：１０９）；ＧＣＣＰＰＧＡＰＰＰＡＣＧＰＰＰＡＧＣ（配列番号：１４２）；ＣＡＣＰＰＧＡＰＰＰＡＣＧＰＰＰＡＧＧ（配列番号：１４３）；ＧＡＣＰＰＧＧＰＰＰＡＣＧＰＰＰＡＧＣ（配列番号：１４４）；ＧＣＣＰＰＧＣＰＰＰＡＣＧＰＰＰＡＧＣ（配列番号：１４５）；ＧＣＡＰＰＧＡＰＰＰＡＣＧＰＰＰＡＧＣ（配列番号：１４６）；ＧＧＣＰＰＧＣＰＰＰＡＣＧＰＰＰＡＧＡ（配列番号：１４７）；ＣＧＣＰＰＧＡＰＰＰＡＡＧＰＰＰＡＧＧ（配列番号：１４８）；ＡＡＣＰＰＧＡＰＰＰＡＡＧＰＰＰＡＧＧ（配列番号：１４９）；またはＧＡＣＰＰＧＡＰＰＰＡＧＧＰＰＰＡＧＣ（配列番号：１５０）（式中、各場合においてＰはＮａｐｄＵである）であってよい。いくつかの実施形態では、保存モチーフは、ＮＮＣＰＰＧＲＰＰＰＡＭＧＰＰＰＡＧＳ（配列番号：１４１）（式中、各場合においてＰはＮａｐｄＵであり、ＲはＡまたはＧであり；各Ｎは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｇ、またはＣであり；ＭはＡまたはＣであり；ＳはＧまたはＣである）である。表６の配列１２０６０−２０９＿３は、１２０６０−２８中の１つの保存ＮａｐｄＵの代わりにシトシンを含有し、ＧＤＦ１１と結合しないことを見出した。
【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
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【０１５９】
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【０１６０】
【表７】
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【０１６１】
実施例６：ＧＤＦ１１アプタマー配列
本実施例は、主要なＧＤＦ１１選択的アプタマーバインダー配列（１２０６０−２８＿３）を使用した、ＳＥＬＥＸアプタマープールのＢＬＡＳＴ分析結果を提供する。この分析は、実施例５で実施したアラインメントよりも低ストリンジェントであって、共通モチーフまたはコアモチーフをさらに含有した追加のアプタマー配列の同定をもたらした。配列のアラインメントについては表８を参照のこと。
【０１６２】
表８の配列アラインメントから、いくつかのモチーフ配列を誘導してよく、各モチーフは、実施例３及び実施例４の１０２０６０−２８＿３アプタマー配列のアラインメントから同定したモチーフ（または共通配列）との重複を維持する。
【０１６３】
第１モチーフは、以下の通りに定義されてよい：
５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１０）（式中、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり；ＲはＡまたはＧであり；各Ｗは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｔ、またはＵであり；各Ｍは独立して、かつ各存在についてＡまたはＣであり；ＳはＧまたはＣであり；各ｎは独立して、かつ各存在について０または１であり；各ｍは独立して、かつ各存在について０または１である）。
【０１６４】
第２モチーフは、以下の通りに定義されてよい：
５’−ＲＷｎＡＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１１）。第３モチーフは、以下の通りであってよい：５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＧＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１２）。第４モチーフは、以下の通りであってよい：５’−ＲＭＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＰＡＳｎＧＣ−３’（配列番号：１１３）。第２、第３及び第４モチーフの各々において、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり；ＲはＡまたはＧであり；各Ｗは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｔ、またはＵであり；各Ｍは独立して、かつ各存在についてＡまたはＣであり；ＳはＧまたはＣであり；各ｎは独立して、かつ各存在について０または１であり；各ｍは独立して、かつ各存在について０または１である。
【０１６５】
第１モチーフは、以下の通りに定義されてよい：
５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＳ−３’（配列番号：１５１）（式中、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり；ＲはＡまたはＧであり；各Ｗは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｔ、またはＵであり；各Ｍは独立して、かつ各存在についてＡまたはＣであり；各Ｓは独立して、かつ各存在についてＧまたはＣであり；各ｎは独立して、かつ各存在について０または１であり；各ｍは独立して、かつ各存在について０または１である）。
【０１６６】
第２モチーフは、以下の通りに定義されてよい：
５’−ＲＷｎＡＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＳ−３’（配列番号：１５２）。第３モチーフは、以下の通りであってよい：５’−ＲＷｎＭＣｎＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＧＷｎＰＰＧｎＰＡＳｎＧＳ−３’（配列番号：１５３）。第４モチーフは、以下の通りであってよい：５’−ＲＭＣＰＰＧＭｍＭＰＰＰＡｎＡＣｎＭＣｍＲＷｎＰＰＰＡＳｎＧＳ−３’（配列番号：１５４）。第２、第３及び第４モチーフの各々において、各Ｐは独立して、かつ各存在についてＣ−５修飾ピリミジンであり；ＲはＡまたはＧであり；各Ｗは独立して、かつ各存在についてＡ、Ｔ、またはＵであり；各Ｍは独立して、かつ各存在についてＡまたはＣであり；各Ｓは独立して、かつ各存在についてＧまたはＣであり；各ｎは独立して、かつ各存在について０または１であり；各ｍは独立して、かつ各存在について０または１である。
【０１６７】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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