(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性型ＧＩＰに結合し、且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗活性型ＧＩＰ抗体であって、配列番号５で示されるアミノ酸配列の８〜１０番目のアミノ酸から選ばれる１以上を少なくとも認識し、Ｈ鎖可変領域として、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、Ｌ鎖可変領域として、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体を用いる活性型ＧＩＰの検出又は測定方法。
【請求項３】
以下の１）〜２）の工程を含む、試料中の活性型ＧＩＰの検出又は測定方法。
１）固定化抗ＧＩＰ抗体及び標識された請求項１に記載の抗体を、一緒に又は別々に試料含有液に接触させる工程
２）試料中の活性型ＧＩＰと前記固定化抗ＧＩＰ抗体と標識抗体とで形成された複合体中の標識量を測定する工程
【請求項４】
請求項１に記載の抗体を含む活性型ＧＩＰの検出又は測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性型ＧＩＰに特異的に反応する抗体その利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＩＰ(Gastric inhibitory polypeptideまたはglucose-dependent insulinotropic polypeptide）は、グルカゴン・セクレチンファミリーに属する消化管ホルモンの１つである。ＧＩＰはＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）と共にインクレチンと称され、脂質や糖質の摂食時に小腸に存在するＫ細胞より分泌される。
ＧＩＰは、膵β細胞からのインスリン分泌を促進し、インスリン存在下でのグルコースの脂肪細胞への取り込みを亢進することが知られている。そのため、ＧＩＰの作用が肥満の一要因になっているとも考えられ、実際、ＧＩＰの機能を阻害すると、肥満が抑制されるとの報告がある（非特許文献１）。
【０００３】
さらに、ＧＩＰはインスリン抵抗性の一因となることが報告されている（非特許文献１照）。インスリン抵抗性を発症すると、インスリンによる糖の吸収作用が低下し、その結果、高インスリン血症を引き起こす。高インスリン血症は、肥満をはじめとする様々な生活習慣病の発症につながる根本的な原因であるとも言われており、インスリン抵抗性の予防・改善は生活習慣病のリスク軽減の面からも重要である。
【０００４】
また、ＧＩＰは、胃酸分泌抑制作用や胃運動抑制作用を有することが知られており（特許文献１〜３）、ＧＩＰの上昇抑制は、食後の消化促進や胃もたれの改善に有効であると考えられる。
【０００５】
したがって、血液中のＧＩＰの濃度を測定することは、このような疾患やその治療薬の評価において重要である。
ところで、ＧＩＰには、生理活性を有する活性型と生理活性を有しない非活性型が存在することが知られている。すなわち、ヒトにおいては、プレプロＧＩＰが胃、十二指腸、小腸上部に分布するＫ細胞でプロセッシングを受けて活性型ＧＩＰ（「ＧＩＰ（１−４２）」とも表記する）となり、その後、ＤＰＰ−４によりＮ末の２アミノ酸が切断されることにより非活性型のＧＩＰ（「ＧＩＰ（３−４２）」とも表記する）になるとされている。したがって、生体内ＧＩＰの定量は、活性型と非活性型の総量を測定することでは、治療薬の効果や、生活習慣病のリスク等を正確に知ることはできない。
【０００６】
従来、活性型ＧＩＰを測定する手段として、活性型ＧＩＰ定量キット（ＩＢＬ社）が市販されているが、１）食後の血中活性型ＧＩＰ濃度は当該キットの定量限界より高い、２）希釈率が異なる場合変動係数は１０％を超える、３）希釈率が高いほど測定値が高くなる、という問題があった。また、最近、ＧＩＰ（１−４２）のＮ末端側６アミノ酸残基からなるペプチドを免疫原として作成された抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体が、ＥＬＩＳＡ法により５〜４０００ｐｇ／ｍＬ濃度の活性型ＧＩＰを定量できることが報告されている（非特許文献２）。また、ＧＩＰ（１−４２）のＮ末端側７アミノ酸残基からなるペプチドを免疫原として作成された抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体が、ＥＬＩＳＡ法により７〜５００ｐｇ／ｍＬ濃度の活性型ＧＩＰを定量することが報告されている（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０１／８７３４１号
【特許文献２】特表２００６−２１３５９８号公報
【特許文献３】特開平５−９５７６７号公報
【特許文献４】特開２０１３−１３８６３８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Miyawaki Kら、Nat Med．8(7)：738-42，2002
【非特許文献２】Jason S.Trouttら、Clinical Chemistry,57(6):849-855(2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、活性型ＧＩＰを精度よく検出可能な抗活性型ＧＩＰ抗体を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、活性型ＧＩＰを特異的に認識する抗体の取得に関し、種々検討したところ、これまでの抗体とは異なるエピトープを認識し、高い特異性を有する新規な抗活性型ＧＩＰ抗体を取得することに成功した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の１）〜３）に係るものである。
１）活性型ＧＩＰに結合し、且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗活性型ＧＩＰ抗体であって、配列番号５で示されるアミノ酸配列の８〜１０番目のアミノ酸から選ばれる１以上を少なくとも認識し、且つＨ鎖に、下記（１）で表されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体。
ＥＭＮＰＳＤＧＲＴＨＦＮＥ    （１）
２）上記１）の抗体を用いる活性型ＧＩＰの検出又は測定方法。
３）上記１）の抗体を含む活性型ＧＩＰの検出又は測定試薬。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の抗体を用いることにより、高い精度で活性型ＧＩＰを非活性型ＧＩＰと区別して検出することができる。従って、本発明によれば、生体試料中の活性型ＧＩＰの測定、活性型ＧＩＰ値の異常の検出、更には活性型ＧＩＰを指標とした治療薬の奏効性評価等が可能となる。また、Ｔｏｔａｌ  ＧＩＰに対する活性型ＧＩＰの割合を算出することにより、ＤＰＰ−４活性の見積もりが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の抗活性型ＧＩＰ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる検量線。
【図２】本発明の抗活性型ＧＩＰ抗体を用いた健常者ヒト血中活性型ＧＩＰの定量。対照食及び試験食摂取後の（Ａ）血中ＧＩＰ（１−４２）、（Ｂ）血中Ｔｏｔａｌ  ＧＩＰ値（Ｎ＝５、同一被験者のクロスオーバー試験）。（Ｃ）食後ＧＩＰ（１−４２）のＴｏｔａｌ  ＧＩＰに対する割合（％）
【図３】本発明抗活性型ＧＩＰ抗体のエピトープ解析。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において「活性型ＧＩＰ」とは、哺乳類の活性型ＧＩＰを意味し、好ましくはヒトの活性型ＧＩＰである。ヒト活性型ＧＩＰは４２個のアミノ酸からなるペプチド（「ＧＩＰ（１−４２）」）である（配列番号５）。一方、「非活性型ＧＩＰ」とは、活性型ＧＩＰのＮ末端の２アミノ酸（ＹＡ）が切断されたペプチド（「ＧＩＰ（３−４２）」）を意味する。
【００１５】
本発明における抗活性型ＧＩＰ抗体は、活性型ＧＩＰに結合し、且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体である。
非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しないことは、被験抗体と非活性型ＧＩＰとの結合を、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学染色、及びＥＬＩＳＡ等の方法を用いて測定することにより判断することができる。具体的には、被験抗体の非活性型ＧＩＰに対する結合量が、活性型ＧＩＰに対する結合量を１００％とした場合、多くとも１０％以下、好ましくは５％以下、更に好ましくは１％以下、更により好ましくは０．１％であれば、「非活性型ＧＩＰに実質的に結合しない」とすることができる。
尚、サンドイッチＥＬＩＳＡによる測定は、非活性型ＧＩＰ溶液に対し、例えば捕捉抗体として抗ｔｏｔａｌ  ＧＩＰ抗体、検出抗体としてビオチン化抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体を用いて行うことができる。
【００１６】
また、本発明の抗体は、活性型ＧＩＰ（配列番号５）のＮ末端から８番目以降のアミノ酸を認識する抗体であり、少なくも８〜１０番目（ＳＤＹ）から選ばれる１以上のアミノ酸を認識する抗体である。
【００１７】
更に、本発明の抗体は、Ｈ鎖に、下記（１）で表されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものである。
ＥＭＮＰＳＤＧＲＴＨＦＮＥ    （１）
（１）中のアルファベット文字は、アミノ酸の一文字表記を意味し、配列はＮ末からＣ末方向の順に記載している。ここで、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｆはフェニルアラニン、Ｖはバリン、Ａはアラニン、Ｔはスレオニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｓはセリン、Ｇはグリシン、Ｒはアルギニン、Ｈはヒスチジンを示す。
【００１８】
本発明において、「保存的配列改変」とは、改変前のアミノ酸配列からなる抗体の反応性に有意な影響を及ぼさない又は変化させないアミノ酸改変を意味する。そのような保存的配列改変には、１〜数個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１個のアミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。当該保存的配列改変がなされたアミノ酸配列としては、改変前のアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。当該改変は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発のような、当技術分野において公知の標準的な技術によって本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換としては、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基（アミノ酸残基のファミリー）に置換されることが挙げられる。斯かるアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
【００１９】
上記（１）で表されるアミノ酸配列は、Ｈ鎖可変領域を示す配列番号２で示されるアミノ酸配列の５０〜６２番目の１３アミノ酸残基からなる領域をコードするものである。
【００２０】
本発明の抗体は、上記反応性を有する限り、当該抗体のフラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ'）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合しているジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、又はｓｃＦｖが二量体化した二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）であっても良い。更に、上記反応性を有する限り、抗活性型ＧＩＰ抗体の一部を含むペプチド、すなわち抗体を構成するアミノ酸配列の一部を備えるペプチドであって上記反応性を有するものも当該抗体のフラグメントに含まれる。
【００２１】
また、本発明抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。
【００２２】
また本発明の抗体は、非ヒト動物の抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体の何れであっても良い。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の抗体を挙げることができ、好ましくはマウスの抗体である。
ここで、「ヒト型キメラ抗体」とは、非ヒト動物由来であって活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体の定常領域をヒトの抗体と同じ定常領域を有するように遺伝子工学的に改変した抗体のことであり、好ましくは、ヒト・マウス・キメラ抗体である。また、「ヒト化抗体」とは、非ヒト動物由来であって活性型ＧＩＰと特異的に結合する抗体のＨ鎖とＬ鎖の相補認識領域（ＣＤＲ）以外の一次構造をヒトの抗体に対応する一次構造に遺伝子工学的に改変した抗体のことである。また、「ヒト抗体」とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体を意味する。
【００２３】
本発明の抗体としては、更に、Ｈ鎖可変領域として配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものであるのが好ましい。
そして更に、Ｈ鎖可変領域として配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含み、且つＬ鎖可変領域として配列番号４で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含むものが好ましい。
【００２４】
本発明においては、別の一態様として以下の１）及び２）で示される抗体構成成分及びその遺伝子が提供される。特に配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなるポリペプチド（Ｈ鎖可変領域）は、上記（１）で表されるアミノ酸配列を含むことから、本発明の抗体としての機能を担う抗体フラグメントとして好ましい。
１）以下のポリペプチド及びそれをコードする遺伝子
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は当該アミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、活性型ＧＩＰに結合し且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体としての機能を担うポリペプチド。
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、活性型ＧＩＰに結合し且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体としての機能を担うポリペプチドをコードするＤＮＡ。
２）以下のポリペプチド及びそれをコードする遺伝子
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は当該アミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、活性型ＧＩＰに結合し且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体としての機能を担うポリペプチド。
（ｄ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、活性型ＧＩＰに結合し且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体としての機能を担うポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００２５】
上記の配列番号１又は３で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１又は３で示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。この場合のハイブリダイズの条件は、例えば６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）又は６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０，２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、その後４２℃で０．５×ＳＳＣで洗浄する条件が挙げられる。
【００２６】
尚、本発明において、アミノ酸配列又は塩基配列間の同一性とは、２つのアミノ酸配列又は塩基配列をアラインメントしたときに両方の配列において同一のアミノ酸残基又は塩基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数又は塩基数に対する割合（％）をいう。具体的には、例えばリップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size
to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出できる。
【００２７】
Ｈ鎖可変領域として配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる領域を含み、且つＬ鎖可変領域として配列番号４で示されるアミノ酸配列からなる領域を含む抗活性型ＧＩＰ抗体としては、後記実施例１に示すハイブリドーマ９Ｂ９Ｈ５−Ｂ９株から産生されるモノクローナル抗体が挙げられる。
【００２８】
本発明の抗活性型ＧＩＰ抗体は、公知の手段を用いてモノクローナル抗体として得ることができる。哺乳動物由来のモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマから産生されるもの、及び抗体遺伝子又は抗体フラグメント遺伝子を設計し周知の遺伝子工学的手法を用いて生産されるものが包含される。
遺伝子工学的手法としては、Ｈ鎖可変領域をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ）と、Ｌ鎖可変領域をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ）を、それぞれ適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞に導入した形質転換体からＨ鎖及びＬ鎖を製造し、これらを可能性のあるペプチドで連結させる、或いはＨ鎖可変領域をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ）とＬ鎖可変領域をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ）を、公知のリンカーをコードするＤＮＡで繋いで適当なベクターのプロモーター下流に挿入した組換え体ベクターを造成し、それを宿主細胞内で発現させる、等により抗原結合能を持った一本鎖の組換え抗体タンパク質(scFv)を生産することが挙げられる。（MacCfferty, J. et al., Nature, 348, 552-554, 1990、Tim Clackson et al, Nature, 352, 642-628, 1991等参照）。また、更に、可変領域をコードするＤＮＡと定常領域をコードするＤＮＡとを結合させて発現させたものを生産することであってもよい。この場合、定常領域は、可変領域の由来する抗体と同一のものであっても、あるいは異なる抗体に由来するものであってもよい。
上記の如く機能的に同等なポリペプチドを調製するためのアミノ酸変異の導入は、例えば、部位特異的変異誘発法などを用いて行うことができる。
【００２９】
抗活性型ＧＩＰ抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。
例えば、活性型ＧＩＰ又はそのＮ末端のアミノ酸配列を有するペプチド（配列番号５の１〜１５番目のアミノ酸配列からなるペプチド）を、必要に応じて、適当なキャリアー蛋白質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）やウシ血清アルブミンなどと結合することによって、より免疫原性を高め、非ヒト哺乳動物に免疫することにより作製することができる。尚、感作抗原（免疫源）として用いられる活性型ＧＩＰ又は上記ペプチドは、遺伝子工学的手法又は化学合成により作製することができる。
【００３０】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞である哺乳動物のミエローマ細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
【００３１】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、動物の皮下、皮内、腹腔などに投与して一時刺激後、必要に応じて同様の操作を繰り返し行う。抗原の投与量は投与経路、動物種に応じて適宣決定されるが、通常の投与量は１回当たり１０μｇ〜１ｍｇ程度が好ましい。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、抗体レベルが上昇した哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合を行う。細胞融合を行う際の好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えばＰ３Ｘ６３、ＮＳ−１、ＭＰＣ−１１、ＳＰ２／０等が適宜使用される。
【００３２】
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は公知の方法、たとえば、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）等に準じて行うことができる。すなわち、ポリエチレングリコール（平均分子量１０００〜６０００のＰＥＧ、３０〜６０％濃度）、センダイウィルス（ＨＶＪ）等の細胞融合促進剤の存在下、所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を添加し、ＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液等の栄養培養液中で、免疫細胞とミエローマ細胞を混合することによって、融合細胞（ハイブリドーマ）の形成が行われる。
【００３３】
融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日〜７日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体（活性型ＧＩＰに結合し、且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体）により更に選択する。
選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマが産生する抗体の活性を検出する方法は、公知の方法を使用することができる。例えばＥＬＩＳＡ法、凝集反応法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。
【００３４】
得られたハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従って培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。
【００３５】
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法又はアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行なうことができる。
【００３６】
本発明の抗活性型ＧＩＰ抗体を任意の免疫学的測定方法に用いることにより、検体中の活性型ＧＩＰを特異的に検出又は測定することができる。すなわち、本発明の抗活性型ＧＩＰ抗体と検体を接触させ、当該抗体への結合を検出して活性型ＧＩＰのレベルを免疫学的に測定することにより、生体試料又は生体内における活性型ＧＩＰを検出又は測定することができる。
これにより、生体試料中の活性型ＧＩＰの測定、活性型ＧＩＰ値の異常の検出、更には活性型ＧＩＰを指標とした治療薬の奏効性評価等が可能となる。
【００３７】
ここで、免疫学的測定法としては、特に制限されないが、定性的分析としては、免疫組織染色法、蛍光抗体法、吸着法、及び中和法を挙げることができ、定量的分析としては、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法、及びウエスタンブロッティング法等を挙げることができる。このうち、ＥＬＩＳＡ法は、簡便性の点から好適に用いられる。ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ法には、競合法、サンドイッチ法、直接吸着法がある。
【００３８】
競合法は、抗活性型ＧＩＰ抗体をアッセイ用プレートに結合させ、これに、仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）やセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素や放射性同位元素等で標識した一定濃度の活性型ＧＩＰと共に、試料を添加するものである。試料中の活性型ＧＩＰと標識した活性型ＧＩＰが、抗活性型ＧＩＰ抗体への結合をめぐって競合し、試料中の活性型ＧＩＰの濃度に応じて、標識活性型ＧＩＰが抗活性型ＧＩＰ抗体に結合することから、当該標識活性型ＧＩＰの抗体への結合量により、試料中の活性型ＧＩＰの濃度を推定することができる。
【００３９】
サンドイッチ法は、抗ＧＩＰ抗体と標識抗活性型ＧＩＰ抗体を用いるものであり、抗ＧＩＰ抗体としては、抗活性型ＧＩＰ抗体とはエピトープの異なる抗体が好ましく、そのような抗体としては抗ｔｏｔａｌ  ＧＩＰ抗体が挙げられる。また、固定化抗ＧＩＰ抗体と標識抗活性型ＧＩＰ抗体を用いる方法が好ましい。
固定化抗ＧＩＰ抗体としては、ポリスチレンプレート、ラテックス粒子、磁性粒子、ガラス繊維膜、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、酢酸セルロース膜等の不溶性支持体に抗体を固定化したものが好ましい。
また、標識抗活性型ＧＩＰ抗体の標識としては、例えば、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ）、タンパク（例えば、アビジン）、低分子化合物（例えば、ビオチン）、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ）、化学発光物質（例えば、アクリジニウム）、ラテックス粒子（例えば、着色ラテックス粒子、蛍光ラテックス粒子）、金属（例えば、金、銀、白金等の貴金属）コロイド粒子、炭素原子等を用いることができる。
【００４０】
また、直接吸着法（直接法）は、固相に抗原を吸着させて、標識抗活性型ＧＩＰ抗体と反応させる方法である。
【００４１】
検体（生体試料）中の活性型ＧＩＰの検出は、試料中の活性型ＧＩＰを固定化抗ＧＩＰ抗体と反応させることにより行われるが、例えばサンドイッチ法による場合には、試料含有液と固定化抗ＧＩＰ抗体を反応させ、次いで前記標識抗体を反応させること、或いは固定化抗ＧＩＰ抗体と標識抗体とを同時に反応させることにより行うことができる。反応終了後、試料中の活性型ＧＩＰと固定化抗ＧＩＰ抗体と標識抗体とで形成された複合体中の標識量を測定すれば、試料中の活性型ＧＩＰ量が測定できる。標識量の測定は、標識体の種類に応じた手段で行うことができる。例えば、標識として酵素を用いた場合には、反応後、基質を加え、酵素活性を測定する。また、標識として蛍光（蛍光ラテックス粒子を含む）又は化学発光物質を用いた場合には、消光が起こらない条件で信号を測定する。着色ラテックス粒子、金属コロイド粒子、及び炭素粒子等は、目視或いは反射光等で信号を測定する。
【００４２】
本発明の抗活性型ＧＩＰ抗体を含む検出又は測定試薬（キット）は、本発明の抗活性型ＧＩＰ抗体を用いて検体中の活性型ＧＩＰを測定又は検出する方法に使用されるものであり、被験者から採取した生体試料（例えば、組織、血液、血漿、血清、リンパ液等）や生体内における活性型ＧＩＰを定性的、定量的又は半定量的に検出又は測定するための試薬である。
当該抗活性型ＧＩＰ抗体を含む検出又は測定試薬は、標識化された本発明の抗活性型ＧＩＰ抗体の他、例えば検体用希釈液、固定化抗ＧＩＰ抗体、反応基質、必要に応じて発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬、ブロッキング試薬等を含んで構成されるのが好ましい。また、抗活性型ＧＩＰ抗体は、樹脂、膜、フィルム、容器等に含まれ若しくは固定され、又は、溶媒に溶解されていてもよい。
【００４３】
上述した実施形態に関し、本発明においては以下の態様が開示される。
＜１＞活性型ＧＩＰに結合し、且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗活性型ＧＩＰ抗体であって、配列番号５で示されるアミノ酸配列の８〜１０番目アミノ酸から選ばれる１以上を少なくとも認識し、且つＨ鎖に、下記（１）で表されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む抗体。
ＥＭＮＰＳＤＧＲＴＨＦＮＥ    （１）
＜２＞Ｈ鎖可変領域として配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む＜１＞の抗体。
＜３＞保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものである、＜２＞の抗体。
＜４＞Ｈ鎖可変領域として配列番号２で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含み、且つＬ鎖可変領域として配列番号４で示されるアミノ酸配列又はその保存的配列改変からなる領域を含む＜１＞又は＜２＞の抗体。
＜５＞配列番号２で示されるアミノ酸配列に対する保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものであり、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対する保存的配列改変されたアミノ酸配列が、配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものである、＜４＞の抗体。
＜６＞＜１＞〜＜５＞のいずれかの抗体を用いる活性型ＧＩＰの検出又は測定方法。
＜７＞以下の１）〜２）の工程を含む、試料中の活性型ＧＩＰの検出又は測定方法。
１）固定化抗ＧＩＰ抗体及び標識された＜１＞〜＜５＞のいずれかの抗体を、一緒に又は別々に試料含有液に接触させる工程
２）試料中の活性型ＧＩＰと前記固定化抗ＧＩＰ抗体と標識抗体とで形成された複合体中の標識量を測定する工程
＜８＞＜１＞〜＜５＞のいずれかの抗体を含む活性型ＧＩＰの検出又は測定試薬。
【００４４】
＜９＞以下のポリペプチド及びそれをコードする遺伝子
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は当該アミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、活性型ＧＩＰに結合し且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体としての機能を担うポリペプチド。
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、活性型ＧＩＰに結合し且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体としての機能を担うポリペプチドをコードするＤＮＡ。
＜１０＞以下のポリペプチド及びそれをコードする遺伝子
（ｃ）配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は当該アミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、活性型ＧＩＰに結合し且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体としての機能を担うポリペプチド。
（ｄ）配列番号３で示される塩基配列からなるＤＮＡ、又は当該塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、活性型ＧＩＰに結合し且つ非活性型ＧＩＰとは実質的に結合しない抗体としての機能を担うポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【実施例】
【００４５】
実施例１  抗体の作成
１）免疫用ペプチドの合成
活性型ＧＩＰのＮ末端１５アミノ酸（ＧＩＰ（１−１５））をＰＥＧ化後、ＫＬＨを化学的に結合させて、ＫＬＨ結合ＰＥＧ化ＧＩＰ（１−１５）を作製し、免疫抗原とした。活性型ＧＩＰのＮ末端１５アミノ酸（ＧＩＰ（１−１５））をＰＥＧ化したものを測定用抗原（１）、非活性型ＧＩＰのＮ末端１３アミノ酸（ＧＩＰ（３−１５））をＰＥＧ化したものを測定用抗原（２）とした。
【００４６】
２）免疫
ＢＡＬＢ／ｃマウス３匹を用い、背部皮下に免疫した。初回の免疫では、上記で作成した抗原と完全フロイントアジュバンドとを混合したエマルジョンを投与した。初回免疫から２週間毎に抗原と不完全フロイントアジュバンドを混合したエマルジョンを用いて追加免疫を実施した。一度に免疫する抗原量は０．１〜０．２ｍｇの範囲で行った。初回免疫実施７週後、マウスより採取した血清を用いて抗体価測定を実施し、抗体価の上昇を確認した。
【００４７】
３）細胞融合
抗体価の上昇したマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を得た。得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｕ１をＰＥＧ法により融合した。その後、９６ウェルプレート２０枚へ播種（１×１０５ｃｅｌｌｓ／ウェル）した。
【００４８】
４）スクリーニング
測定用抗原（１）及び（２）を１  μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（―）で希釈してプレートに固相化し、２次抗体としてＨＲＰ標識した抗マウスＩｇ抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にて、ハイブリドーマ培養上清と抗原（１）及び（２）との反応を評価し、抗原（１）に陽性かつ抗原（２）に陰性を示したハイブリドーマを抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択した。
【００４９】
５）クローニング
上記で得られたハイブリドーマを限界希釈法によって単一のコロニーが得られるように培養することにより、抗体産生ハイブリドーマのクローニングを行い、シングルコロニー形成ウェルを再びＥＬＩＳＡ測定し、抗原（１）に陽性かつ抗原（２）に陰性を示す抗体を産生する９Ｂ９Ｈ５−Ｂ９株を樹立した。
得られた抗体産生ハイブリドーマの保存は、当該ハイブリドーマを培養し、対数増殖期に回収した後、ＦＢＳ含有細胞凍結液にて細胞濃度が１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した後、１×１０６ｃｅｌｌｓ／チューブとなるように凍結チューブに分注し、バイセル中にて−８０℃で保存した。
【００５０】
６）抗体生産
得られた抗体産生ハイブリドーマの凍結バイアルを起眠し、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭへ無血清馴化した。拡大培養後、ローラーボトル２本（５００ｍＬ×２本、１Ｌ）で培養し、培養上清を回収した。回収した培養上清を用いてＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ精製を行い、モノクローナル抗体を精製した。
【００５１】
実施例２  ＥＬＩＳＡ法による活性型ＧＩＰとの反応性
実施例１で得られたモノクローナル抗体と活性型ＧＩＰとの反応性をＥＬＩＳＡ法により確認した。ＮＨ２基ビオチン化キット（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）にて抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体のアミノ基のビオチン化を行った。Ｈｕｍａｎ  （ｔｏｔａｌ）  ＧＩＰ
ＥＬＩＳＡキット  （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に付属の検出抗体’ＧＩＰ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ’（ビオチン化抗  ｔｏｔａｌ  ＧＩＰモノクローナル抗体）の代替として、作製したビオチン化抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体１  μｇ／ｍＬを用いてＥＬＩＳＡを行った。ＧＩＰ（１−４２）あるいはＧＩＰ（３−４２）の２０００  ｐｇ／ｍＬ溶液を最高濃度とした４倍希釈系列を６段階（８．２〜２０００  ｐｇ／ｍＬ）まで作製し、捕捉抗体として抗ｔｏｔａｌ  ＧＩＰモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製  Ｈｕｍａｎ  ＧＩＰ  （ｔｏｔａｌ）  ＥＬＩＳＡキットに付属）、検出抗体としてビオチン化抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体、検出にペルオキシダーゼ‐ストレプトアビジン結合物を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系により、ＧＩＰ濃度をＸ軸、吸光度４５０ｎｍ−５９０ｎｍをＹ軸とした検量線を作製した（図１）。
図１のように、ＧＩＰ（３−４２）では高濃度域においても吸光度が上昇せず、ＧＩＰ（１−４２）にのみ濃度依存的に吸光度が上昇したことから、本ＥＬＩＳＡ系はＧＩＰ（３−４２）には交差性がなく、ＧＩＰ（１−４２）を特異的に検出できることを確認した。
【００５２】
実施例３  ヒト活性型ＧＩＰの測定
実施例２で構築したＧＩＰ（１−４２）  ＥＬＩＳＡ法を、実際にヒト血中ＧＩＰ（１−４２）測定に用いることができるか否かを評価するため、ヒト血漿サンプルを用いて検討を行った。
健常者に対して、対照食（標準食）、または試験食（ＧＩＰ低減食）を摂取させた後の各時間における血中ＧＩＰ（１−４２）値を図２Ａに、比較として測定した血中Ｔｏｔａｌ  ＧＩＰ値を図２Ｂに示す。血中ＧＩＰ（１−４２）値は、食後３０分値でピークが認められたが（図２Ａ）、食後１２０分値まで高値を維持しているＴｏｔａｌ  ＧＩＰ（図２Ｂ）と比較して、早期に血中濃度が減少することが示唆された。対照食と試験食の比較では、食後３０分値、及び６０分値において、試験食は対照食に対して有意な血中ＧＩＰ（１−４２）値の低減を認め（図２Ａ）、Ｔｏｔａｌ  ＧＩＰ値（図２Ｂ）と同様の傾向を認めた。また、食後のＴｏｔａｌ  ＧＩＰに対するＧＩＰ（１−４２）の割合を求めた（図２Ｃ）。食後３０、６０、１２０及び１８０分において各時間の平均値は４３％、２８％、２７％、及び１９％であり、食後早期に活性型ＧＩＰの割合が高く、その後経時的に減少することが示唆された。
【００５３】
実施例４  活性型ＧＩＰモノクローナル抗体のエピトープ解析
実施例１で作製したモノクローナル抗体のエピトープを特定するため、下記の合成ペプチドを作製した。
（１）ＧＩＰ（１−１０）：ＮＨ２−ＹＡＥＧＴＦＩＳＤＹ−ＣＯＯＨ
（２）ＧＩＰ（１−９）：ＮＨ２−ＹＡＥＧＴＦＩＳＤ−ＣＯＯＨ
（３）ＧＩＰ（１−８）：ＮＨ２−ＹＡＥＧＴＦＩＳ−ＣＯＯＨ
（４）ＧＩＰ（１−７）：ＮＨ２−ＹＡＥＧＴＦＩ−ＣＯＯＨ
（５）ＧＩＰ（１−６）：ＮＨ２−ＹＡＥＧＴＦ−ＣＯＯＨ
（６）ＧＩＰ（１−６）＋ＧＩＰ非特異的４ａａ（ランダム４ａａ）：ＮＨ２−ＹＡＥＧＴＦＶＮＬＶ−ＣＯＯＨ
【００５４】
合成した６種のペプチドを１  μｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）で希釈して９６ウェルプレートに固相化し、ビオチン化抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体、検出にペルオキシダーゼ‐ストレプトアビジン結合物を用いてＥＬＩＳＡを行った。結果を図３に示す。
図３より、ＧＩＰ（１−８）以上、すなわちＮ末端より８アミノ酸以上の長さの活性型ＧＩＰペプチドが抗活性型ＧＩＰモノクローナル抗体の認識部位として必要であることがわかった。
【００５５】
実施例５  Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域のアミノ酸配列の解析
（１）配列決定
常法に従い、９Ｂ９Ｈ５−Ｂ９ハイブリドーマからのｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出を行ない、これを鋳型としてｃＤＮＡを調製した。表１に示すプライマーを用いて、表２に示す条件で、ＰＣＲを行い、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域を含むＰＣＲ産物を増幅した。
すなわち、得られたｃＤＮＡ（Ｈ鎖特異的なｐｒｉｍｅｒにより合成）を鋳型として、マウス抗体（ＩｇＧ）Ｈ鎖特異的なｐｒｉｍｅｒをｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ、表１に示されるＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒをｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒとしてＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応を行なった。同様にｃＤＮＡ（Ｌ鎖特異的なｐｒｉｍｅｒにより合成）を鋳型に、Ｌ鎖特異的なｐｒｉｍｅｒを用いてＲＡＣＥ  ＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ酵素にはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬを使用した。得られたＰＣＲ産物をＣｌｏｎｉｎｇ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｐＭＤ２０−Ｔにライゲーションを行い、常法の形質転換により、ＰＣＲ産物ごとに４８  ｃｌｏｎｅ取得した。
【００５６】
【表１】
0006737592.tif 000002
【００５７】
【表２】
0006737592.tif 000003
【００５８】
取得したＣｌｏｎｅはプライマーＭ１３−４７（cgccagggttttcccagtcacgac；配列番号１０）を用いてＰｌａｓｍｉｄ領域の片側から解析した。シーケンシングは、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ社）を用いて付属のプロトコールに従って行ない、配列を決定した。決定された配列のうち、実験試料に由来する塩基配列から推定されるアミノ酸配列について、BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)による相同性検索を行い、Ｈ鎖及びＬ鎖の可変領域をコードしていると推定される塩基配列（開始コドン以降）、及びアミノ酸配列を確定した（配列番号１〜４）。ここで、配列番号１及び２：モノクローナル抗体のＨ鎖可変領域をコードする塩基配列及びアミノ酸配列、配列番号３及び４：モノクローナル抗体のＬ鎖可変領域をコードする塩基配列及びアミノ酸配列を示す。
【００５９】
また、Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列について、BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)にて相同性の検索を行った結果、そのＮ末端から５０〜６２番目のアミノ酸残基「ＥＭＮＰＳＤＧＲＴＨＦＮＥ」については、それと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドは発見されなかった。
【図１】
0006737592.tif 000004
【図２】
0006737592.tif 000005
【図３】
0006737592.tif 000006
【配列表】
0006737592000001.app