(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端に少なくとも1個のマンノースを持つ糖鎖を含むトランスフェリン糖タンパク質又は前記糖鎖を含むトランスフェリン断片からなるアルツハイマー病診断マーカー。
【請求項２】
前記糖鎖が配列番号１で示すアミノ酸配列からなるトランスフェリンタンパク質の432位のアスパラギン残基に付加されている、請求項１に記載のアルツハイマー病診断マーカー。
【請求項３】
初期アルツハイマー病又はアルツハイマー病移行型軽度認知障害の鑑別用である、請求項１又は２に記載のアルツハイマー病診断マーカー。
【請求項４】
アルツハイマー病と他の認知症との鑑別用である、請求項１又は２に記載のアルツハイマー病診断マーカー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアルツハイマー病診断マーカーを検出するための、マンノース結合分子及びトランスフェリン結合分子を含む、アルツハイマー病診断キット。
【請求項６】
前記マンノース結合分子がマンノース結合レクチン、抗マンノース抗体、及びマンノースに対するアプタマーからなる群から選択される、請求項５に記載の診断キット。
【請求項７】
前記マンノース結合レクチンがUDAレクチン又はBC2L-Aレクチンである、請求項６に記載の診断キット。
【請求項８】
前記トランスフェリン結合分子が抗トランスフェリン抗体及び／又はトランスフェリンタンパク質に対するアプタマーである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項９】
アルツハイマー病の罹患鑑別のための方法であって、
被験体及び対照体群から得られた所定量の体液中に存在する請求項１又は２に記載のアルツハイマー病診断マーカーの量をマンノース結合分子及びトランスフェリン結合分子を用いて測定し、測定値を得る測定工程、
前記測定工程で得られた被験体及び対照体群の測定値を比較して、アルツハイマー病診断マーカーの測定値が被験体で有意に高いときに、その被験体がアルツハイマー病に罹患していることを示す比較鑑別工程
を含む前記方法。
【請求項１０】
前記対照体群が健常体群である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記対照体群が初期アルツハイマー病罹患体群である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体が中枢神経疾患に罹患している、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
アルツハイマー病移行型軽度認知障害の鑑別のための方法であって、
被験体及び健常体群から得られた所定量の体液中に存在する請求項１又は２に記載のアルツハイマー病診断マーカーの量をマンノース結合分子及びトランスフェリン結合分子を用いて測定し、測定値を得る測定工程、
前記測定工程で得られた被験体及び健常体群におけるアルツハイマー病診断マーカーの
測定値を比較して、アルツハイマー病診断マーカーの測定値が被験体で有意に高い場合、その被験体がアルツハイマー病移行型軽度認知障害に罹患していることを示す比較鑑別工程
を含み、前記被験体が軽度認知障害に罹患している前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、認知症、特にアルツハイマー病、及びアルツハイマー病に進行し得る軽度認知障害を他の中枢神経疾患と識別するバイオマーカー、またそれを用いた認知症の罹患鑑別方法及び病態判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（Alzheimer's disease：以下、本明細書においてはしばしば「AD」と略称する）は、不可逆的な進行性中枢神経疾患の一種であり、記憶障害や思考障害を伴う認知機能障害（認知症）、行動障害、又は人格変化等の症状を呈する。認知症の中では最も多い疾患であり、認知症患者全体の約60〜80％を占めている。一般には65歳以上の高齢者で発症するが、一部は64歳以下でも発症し、若年性アルツハイマー病と呼ばれている。【０００３】
全世界における認知症の患者数は、2010年時点で3,500万人と推定されており、今後20年ごとに倍増し、2050年には1億１千万人に達すると予想されている。このうち、約70％がAD患者と考えられている。特に先進諸国では、AD患者の増加に伴う医療費の増大や介護問題等で国や患者関係者達の経済的又は精神的負担が深刻化しており、大きな社会的問題となりつつある。【０００４】
家族性（遺伝性）ADは、アミロイド前駆体タンパク質（APP）遺伝子やプレセニリン1（PSEN1）遺伝子の変異を原因とする遺伝子疾患でもあり、疎水性のペプチドであるアミロイドβタンパク質（Aβ）の脳内の神経細胞に凝集蓄積に始まり、その後、微小管タンパク質であるtauタンパク質が過リン酸化されて線維化した後に、神経細胞が破壊され、脳が萎縮することにより発症する。ADの大部分を占める孤発性の症例でも、基本的には同様の病理プロセスにより発症することが知られている。【０００５】
現在、ADの発症機序に基づき、その発症プロセスを阻害するAD治療薬が多数開発されている。しかし、そのほとんどは、臨床治験での十分な有効性が未だに示されていない。これは、治験薬が無効なのではなく、治験対象群が適切でないためだと考えられている。従来臨床治験が行われていた対象群は、ADによる脳病変が進行し、大量の神経細胞死が生じた段階であった。ところが、この段階で治療を開始しても通常、神経の回復は望めない。つまり、治療薬の投与時期が遅すぎたために、有効な治療効果を得ることができなかったと考えられている（非特許文献１）。したがって、適切な投与時期、すなわち、神経細胞死を回避可能な早期の段階でAD治療薬を投与することができれば、その有効性の検証が可能なはずである。【０００６】
ところで、物忘れ外来で認知症が疑われる患者は、通常、認知症スコア等の検査に基づいて正常群、軽度認知障害（mild cognitive impairment：以下、本明細書においてはしばしば「MCI」と略称する）、及びADの3群に分類される。長期観察研究結果から、MCI患者の一部は、将来ADを発症するが、残りはMCIのまま留まることが知られている。つまり、MCI患者の一部は、極めて初期のAD患者と解することができる。このような将来ADに移行し得るMCI（本明細書では、しばしば「アルツハイマー病移行型軽度認知障害（AD移行型MCI）」と表記する）患者では神経細胞死がほとんど生じていない。それ故に、AD移行型MCI患者は、AD治療薬の有効性を確認する治験対象群として非常に望ましい。またAD移行型MCIは、ADの発症の予防する又は進行を遅延させる効果を得る上で、AD治療薬の好適な投与時期でもある。そのためには、ADの早期診断方法やAD移行型MCIの鑑別方法の開発が不可欠である。【０００７】
現在は、MRI又はCT等の画像診断技術の進歩により脳における形態学的変化や病的変化、例えば、微少な出血や腫瘍の発見が可能となっている。ところが、ADのような神経変性疾患は、10〜20年の長期にわたって形態学的な変化が進行するため、脳室拡大（脳萎縮）等のAD特有の変化を画像で捉えることができるのは、大量の神経細胞死が生じた後である。したがって、脳の形態学的変化からADを早期に診断することは難しい。またMCIでは脳の形態学的変化がほとんど認めらないため脳の形態学的変化からAD移行型MCIを鑑別することは困難である。【０００８】
さらに、ADは、一般に死後の剖検脳でアミロイド斑と神経原繊維変化を病理学的に証明することによって確定診断されるが、生存時にアミロイド斑を画像所見として描出することは、これまで困難であった。最近になってポジトロン放射性アイソトープである11Cで標識した[11C]Pittsburgh compound (PiB)を放射性画像診断薬として患者体内に導入して、アミロイドPET（positron emission tomography：陽電子放出断層撮影）により脳内のアミロイドタンパク質の蓄積を描出する方法、又は6-[(3-18F-fluoro-2-hydroxy)propoxy]-2-(4-methylaminophenyl)quinolone(18F-THK5117)を使用したタウPETが行なわれている（非特許文献３）。これらの検査方法は、比較的早期の段階でADを検出できることから、臨床治験におけるAD治療薬の早期投与の検証に有効ではあるが、診断にかかる時間が長く、また費用が高額なことから、通常の診断方法としてはあまり適切でない。【０００９】
したがって、近年では、簡便で低コストなバイオマーカーが求められている。例えば、ADの早期診断マーカーには、ADの原因因子を用いる方法も開発されている。具体的には、過剰にリン酸化されたtauタンパク質、アミロイドβ42（Aβ42）ペプチド、又は炎症性疾患におけるサイトカイン等をAD診断マーカーとする方法が挙げられる（非特許文献２）。しかし、サイトカインは、感度よく測定できるものの、疾患特異性に乏しいという欠点がある。リン酸化tauタンパク質は、優れたAD診断マーカーではあるが、このタンパク質の出現は、神経細胞の死を意味しており、神経細胞死を回避すべきADの早期診断用としては不十分である。また、前頭側頭型認知症や進行性核上麻痺等の認知症でもtauタンパク質は増加するためADに特異的なバイオマーカーとも言い難い。一方、Aβ42ペプチドについても病気が進行した後でなければ変化しないという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Selkoe D.J., 2012, Science 337: 1488-92.
【非特許文献２】Mattsson N et al., JAMA. 2009, 302(4):385-93
【非特許文献３】Li Y et al., 2015, J Nucl Med., 56(2):270-3.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、AD罹患鑑別の指標となるバイオマーカー又はAD進行度や治癒度の病態判定が可能なバイオマーカーを開発し、また、そのバイオマーカーを用いたADの簡易な早期診断方法及び病態判定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
これまでに本発明者らは、中枢神経系には固有の糖鎖構造を有する糖タンパク質が存在すると仮定し、髄液と血清間で糖鎖部分が異なる糖タンパク質を様々な抗体を用いてスクリーニングした。その結果、その様な特徴を有する糖タンパク質として、トランスフェリン（Transferrin）（本明細書では、しばしば「Tf」と略称する）糖タンパク質が同定された。Tf糖タンパク質は、血清中では非還元末端にシアル酸を有するシアル酸化Tf（図１A）として存在するが、髄液中では、シアル酸化Tfと非還元末端にシアル酸を持たない非シアル酸化Tfの2種類のTf糖鎖アイソフォームとして存在する。さらに、シアル酸化Tf／非シアル酸化Tfの比率（Tfインデックス）は、髄液代謝異常に基づく認知症である特発性正常圧水頭症（idiopathic Normal Pressure Hydrocephalus）（本明細書では、しばしば「iNPH」と略称する）の指標マーカーになることを示した（特開2010-121980；Futakawa et al., 2012, Neurobiol Aging, 33: 1807-15.）。【００１３】
本発明者らは、上記知見に基づき、さらなる研究を重ねた結果、それまで1種類のアイソフォームと考えられてきた非シアル酸化Tfには、さらに2つのサブグループ（サブグループ1及びサブグループ2）が包含されていることを見出した（Nagae et al., 2014, Glycobiology, 24, 693-702）。【００１４】
図１で示すように、ヒトTfは、開始メチオニンを1位としたときに432位（N432）及び630位（N630）のアスパラギンに糖鎖が付加されている。非シアル酸化Tfのサブグループ1（図１B）では、N630の糖鎖が非還元末端にN-アセチルグルコサミン（本明細書では、しばしば「GlcNAc」と略称する）を持ち、かつバイセクトGlcNAc及びコアフコースで修飾されている。また、N432の糖鎖も非還元末端にGlcNAcを持つが、バイセクトGlcNAcのみで修飾されており、コアフコースを持たない。一方、本発明者らが新たに見出したサブグループ2（図１C）では、N630の糖鎖はサブグループ1と同様であるが、N432の糖鎖が非還元末端にマンノース（本明細書では、しばしば「Man」と略称する）を持つ。【００１５】
今回、本発明者らは、非還元末端にマンノースを持つ糖鎖を含むTfサブグループ2がAD及びMCIの診断マーカーとなること、髄液中に存在するTfサブグループ2がレクチンや抗体を用いることで定量可能であること、そしてその量がADやMCIの進行度と相関することを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１６】
本発明は上記知見に基づくものであって、以下を提供する。【００１７】
（１）非還元末端に少なくとも1個のマンノースを持つ糖鎖を含むTf糖タンパク質又は前記糖鎖を含むTf断片からなるAD診断マーカー。【００１８】
（２）前記糖鎖が配列番号１で示すアミノ酸配列からなるTfタンパク質の432位のアスパラギン残基に付加されている、（１）に記載のAD診断マーカー。【００１９】
（３）初期AD又はAD移行型MCIの鑑別用である、（１）又は（２）に記載のAD診断マーカー。【００２０】
（４）ADと他の認知症との鑑別用である、（１）又は（２）に記載のAD診断マーカー。【００２１】
（５）（１）〜（４）のいずれかに記載のAD診断マーカーを検出するための、Man結合分子及びTf結合分子を含む、AD診断キット。【００２２】
（６）前記Man結合分子がマンノース結合レクチン、抗マンノース抗体、及びマンノースに対するアプタマーからなる群から選択される、（５）に記載の診断キット。【００２３】
（７）前記マンノース結合レクチンがUDAレクチン又はBC2L-Aレクチンである、（６）に記載の診断キット。【００２４】
（８）前記Tf結合分子が抗Tf抗体及び／又はTfタンパク質に対するアプタマーである、（５）〜（７）のいずれかに記載の診断キット。【００２５】
（９）AD罹患鑑別方法であって、被験体及び対照体群から得られた所定量の体液中に存在する（１）又は（２）に記載のAD診断マーカーの量をMan結合分子及びTf結合分子を用いて測定し、測定値を得る測定工程、前記測定工程で得られた被験体及び対照体群の測定値を比較して、AD診断マーカーの測定値が被験体で有意に高いときに、その被験体がADに罹患していると鑑別する比較鑑別工程を含む前記方法。【００２６】
（１０）前記対照体群が健常体群である、（９）に記載の罹患鑑別方法。【００２７】
（１１）前記対照体群が初期AD罹患体群である、（９）に記載の罹患鑑別方法。【００２８】
（１２）前記被験体が中枢神経疾患に罹患している、（９）又は（１０）に記載の罹患鑑別方法。【００２９】
（１３）AD移行型MCI鑑別方法であって、被験体及び健常体群から得られた所定量の体液中に存在する（１）又は（２）に記載のAD診断マーカーの量をMan結合分子及びTf結合分子を用いて測定し、測定値を得る測定工程、前記測定工程で得られた被験体及び健常体群におけるAD診断マーカーの測定値を比較して、AD診断マーカーの測定値が被験体で有意に高い場合、その被験体がAD移行型MCIに罹患していると鑑別する比較鑑別工程を含み、前記被験体がMCIに罹患している前記方法。【００３０】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-094385号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のAD診断マーカーによれば、ADの罹患又は罹患可能性の診断やADの病態を判定できる。【００３２】
本発明のAD診断キットによれば、容易に、かつ比較的低コストでAD診断マーカーを検出することができ、それによって試料提供者である被験体のADの罹患又は罹患の可能性の鑑別、及び／又は病態の判定ができる。【００３３】
本発明のAD罹患鑑別方法によれば、被験体、特に何らかの中枢神経疾患に罹患している患者が、ADに罹患していること又はADへの罹患可能性を鑑別することができる。また、罹患しているADの病態を判定することもできる。【００３４】
本発明のAD移行型MCI鑑別方法によれば、MCI罹患患者の中でADに移行し得る可能性のあるAD移行型MCI患者を容易に、かつ高い精度で鑑別することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】A〜C：髄液中に存在するTf糖タンパク質の3種のTf糖鎖アイソフォームの構造を示す概念図である。Aはシアル酸非還元末端糖鎖を2本有する末端Sia-Tf糖タンパク質（シアル酸化Tf）を、BはGlcNAc非還元末端糖鎖を2本有する末端GlcNAc-Tf糖タンパク質（非シアル酸化Tfサブグループ1）を、そしてCはMan非還元末端糖鎖とGlcNAc非還元末端糖鎖をそれぞれ1本ずつ有する末端Man-Tf糖タンパク質（非シアル酸化Tfサブグループ2）を示す。D：抗Tf抗体を用いた髄液及び血清のウェスタンブロットの結果を示す図である。髄液及び血清で検出されたaは、末端Sia-Tf糖タンパク質を示す。一方、髄液のみで検出されたbは、見かけ上、1種のTf糖タンパク質に見えるが、末端GlcNAc-Tf糖タンパク質と末端Man-Tf糖タンパク質の2種のTf糖タンパク質（サブグループ1及び2）を含む。
【図２】UDAレクチンの糖鎖結合特異性を示す図である。末端Man-Tf、末端GlcNAc-Tf及び末端Sia-Tfの各Tf糖タンパク質標品を電気泳動した後に、銀染色した図（A)、抗Tf抗体を用いたイムノブロット図（B）、及びUDAレクチンを用いたレクチンブロット図（C)を示す。
【図３】AD群（n=3）及び疾患コントロール群（n=4）から得た髄液中のMan-TfをUDAレクチンブロットで分析した結果を示す。
【図４】髄液中のTfの抗Tf抗体を用いた免疫沈降反応の結果を示す。抗Tf抗体結合ビーズと髄液を反応させた後の上清画分（非結合画分）、抗Tf抗体結合ビーズとの結合画分（溶出画分）、及び出発材料の未調製髄液の電気泳動後のサンプルを銀染色で検出した結果（A）、抗Tf抗体を用いたイムノブロットで検出した結果（B）、及びUDAレクチンブロットで検出した結果（C）を示している。aは末端Sia-Tfを、bは末端Man-Tf／末端GlcNAc-Tf（Cでは末端Man-Tf）を、またcは末端Man-Tf以外のMan糖タンパク質（GP-X）を示す。
【図５】Aは、末端Man-Tfを検出するためのUDAレクチン／抗体サンドイッチELISA法の測定原理図である。図中、aは捕捉抗体である抗Tf抗体を、bはUDAレクチンを示す。Bは、末端Man-Tf（末端Tri-Man-Tf）を用いたときの検量線を示す。マイクロタイタープレートに抗Tf抗体を固定して遊離のTfを捕捉し、末端Man-TfをUDAレクチンにて検出し定量した。末端Sia-Tfは、UDAレクチンと結合しないので検出されない。検量線では標準として末端Tri-Man-Tfを用いている。
【図６】アルツハイマー病（AD）群、軽度認知障害（MCI）群、特発性正常圧水頭症（iNPH）群、レビー小体型認知症／前頭側頭型認知症（DLB/FTD）群、及び健常対照（NC）群の5群において、髄液中の末端Man-TfをUDAレクチン／抗体サンドイッチELISA法にて定量した結果である。
【図７】抗Tf抗体を用いたAD脳（大脳皮質）の免疫組織化学の結果である。図中、aは軟膜を、枠内のｂは陽性繊維束を、そして円で囲んだ領域のcは星状細胞様の細胞を示す。AD脳では、星状細胞様の細胞体が染色されている。また、皮質第Ｉ層(分子層)のニューロピルに陽性線維が観察され、特に軟膜下では束状に配列していた。
【図８】AD群、MCI群、iNPH群、DLB/FTD群、及びNC群の5群において、髄液中の末端Man-TfをBC2LAレクチン／抗体サンドイッチELISA法にて定量した結果である。
【図９】同一髄液試料に対するBC2LAレクチン／抗体を用いたELISA法によるMan-Tfの測定値と既知のAD診断マーカーであるリン酸化tauタンパク質（p-Tau）の測定値の比率（Man-Tf/p-Tau）を示す図である。
【図１０】同一髄液試料に対するUDAレクチン／抗体を用いたELISA法によるMan-Tfの測定値と既知のAD診断マーカーであるリン酸化tauタンパク質（p-Tau）の測定値の比率（Man-Tf/p-Tau）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
１．アルツハイマー病診断マーカー
１−１．概要
本発明の第１の態様は、アルツハイマー病（AD）診断マーカーである。本発明の診断マーカーは、体液中に存在する糖タンパク質又はそのペプチド断片からなり、被験体におけるADの罹患又は罹患可能性の診断やADの病態判定できる。
１−２．定義
本明細書で使用する用語について、以下で定義をする。
【００３７】
本明細書において「アルツハイマー病（Alzheimer's disease；AD）」とは、前述のように、認知症、行動障害、又は人格変化等の症状を呈する不可逆的な進行性中枢神経疾患である。なお、後述するように、本明細書ではアルツハイマー移行型軽度認知障害（AD移行型MCI）はADに包含される。
【００３８】
本明細書において「軽度認知障害（mild cognitive impairment;MCI）」とは、認知機能（記憶、決定、理由付け、実行等）のうち1つに機能障害を生じ、その結果、認知機能の軽微な低下が認められるものの、日常生活には支障がない状態をいう。本明細書においては、MCIを中枢神経疾患に含める。前述のように、MCI患者の一部は、進行に伴い将来的にADに移行するAD移行型MCIに罹患している。AD移行型MCIは最終的にADに移行するため、本明細書においてはAD移行型MCIをMCIのカテゴリーではなく、ADのカテゴリーに包含する。
【００３９】
本明細書において「診断」とは、疾患の罹患鑑別若しくは罹患可能性、又は疾患の病態を判断することをいう。通常、診断行為は、医師、獣医師、又は歯科医の専権業務であるが、本明細書における診断は、医師等の行為を介することなく、医師等による診断を補助する補助的行為を包含する。
【００４０】
本明細書において「罹患（の）鑑別」とは、特定の疾患に罹患しているか、いないかを判断することをいう。病変や病状が類似する他の疾患との識別も含む。
【００４１】
本明細書において「罹患（の）可能性」とは、将来、特定の疾患に罹患する確率をいう。本明細書においては、特定の疾患をADとした場合に、MCIからADへの移行可能性も含む。
【００４２】
本明細書において「疾患（の）病態」とは、特定の疾患の状態、及びその程度や病期をいう。例えば、状態の程度であれば軽症（軽度）、中等症（中度）、及び重症（重度）が挙げられ、病期であれば初期、中期、及び後期が挙げられる。本明細書における「病態」は、患者の特定の時点における疾患の状態だけでなく、ある時点から他の時点までの疾患の状態の推移を含む。例えば、疾患の状態が時間経過と共に悪化する疾患の進行状況やその度合い、または逆に時間経過と共に改善する疾患の治癒状況やその度合いも含み得る。したがって、本明細書において「病態の判定」とは、認知症のような疾患における特定の時点の状態や程度の判定、及びある時点から他の時点までの疾患の状態の推移（進行しているか、又は改善しているか）の判定を含む。
【００４３】
本明細書において、「体液」とは、被験体及び対照体から採取される液状試料をいう。例えば、髄液（脳脊髄液）、血液（血清、血漿及び間質液を含む）、尿、リンパ液、消化液、腹水、胸水、神経根周囲液、各組織若しくは細胞の抽出液等が挙げられる。好ましくは髄液又は血液、より好ましくは髄液である。
【００４４】
本明細書において、「髄液（cerebrospinal fluid：CSF)とは、脳と脊髄の中枢神経系（CNS：Central Nerve System）周囲にのみ存在する無色透明の細胞外液をいう。他の臓器とは硬膜によって、また血液とは血液脳関門や血液脳脊髄液関門によって、隔てられている。髄液は、その大部分が脳の実質より滲出することや、脳細胞と髄液との間には障壁が事実上存在しないことが近年の研究から明らかとなっている（Wang C, et al., 2012, Cerebrospinal Fluid: Physiology, biomarker and methodology. In: V. S, Dolezal, T., editor. Cerebrospinal Fluid: Functions, Composition and Disorders. New York: Nova Science Publishers; pp.1-37.）。この髄液中には、中枢神経系由来のタンパク質が多数存在し、中枢神経系疾患に伴い、その発現が増減することが知られている。
【００４５】
本明細書において「糖タンパク質」とは、一以上の糖鎖が付加したタンパク質をいう。糖タンパク質において糖鎖は、翻訳後修飾の一つとして付加され、生体内のタンパク質の50%以上に存在するとされている。糖鎖は、タンパク質の安定化、保護、生理活性、抗原抗体反応、ウイルス感染及び体内動態等に関与する等、様々な機能をタンパク質に付与する重要な役割を担う。
【００４６】
本明細書において「（その糖鎖を含む）ペプチド断片」とは、前記糖タンパク質の一部からなり、かつ糖鎖が付加されたアミノ酸残基を含むペプチドである。本発明においては、特に後述の「１−３．構成」に記載した第３のTf糖鎖アイソフォームである末端Man-Tfの一部からなり、かつマンノース非還元末端糖鎖が付加した432位のアスパラギン残基を含むペプチドをいう。ペプチド断片のアミノ酸数は特に限定はしない。糖タンパク質の一部であることから下限はエピトープを包含し得る長さ、例えば、8アミノ酸以上、好ましくは10又は15アミノ酸以上、より好ましくは20又は30アミノ酸以上であればよく、上限は糖タンパク質の全長未満のアミノ酸を有していればよい。
【００４７】
本明細書において、「マンノース非還元末端糖鎖（Man非還元末端糖鎖）」とは、非還元末端に少なくとも1個のマンノースを持つ糖鎖をいう。非還元末端Manの数は問わない。直鎖状の糖鎖の非還元末端に1個存在していてもよいし、分岐した複数の非還元末端に1個又は複数個存在していてもよい。本明細書において「複数個」とは、2〜10個、2〜9個、2〜8個、2〜7個、2〜6個、2〜5個、2〜4個、又は2〜3個をいう。全ての非還元末端糖がマンノースであることが好ましい。高Man型（ハイマンノース型）糖鎖や少なくとも1つの非還元末端にマンノースを有する混合型糖鎖は、Man非還元末端糖鎖に該当する。
【００４８】
本明細書において、糖鎖の「非還元末端（糖）」とは、糖タンパク質の糖鎖において、フリーのヒドロキシル基が存在せず、それ故に還元性を示さない末端糖をいう。例えば、非還元末端マンノース（非還元末端Man）、非還元末端GlcNAc、及び非還元末端シアル酸（非還元末端Sia）が挙げられる。一方、糖鎖の「還元末端（糖）」とは、フリーのヒドロキシル基を有した還元性を示す末端糖である。還元糖は、ヘミアセタール又はケタール構造をとり、通常は還元末端糖がタンパク質に結合している。
【００４９】
本明細書において「被験体」とは、本発明の各態様における適用対象をいう。原則として個体であるが、組織や細胞も包含する。具体例として、個体であれば哺乳動物個体、好ましくはヒト、イヌ、ネコ、ウマ等が挙げられる。好ましくはヒトである。個体の場合、生死は問わないが、生体であることが好ましい。また、個体は、何らかの疾患を有する疾患罹患体、疾患の罹患可能性のある個体、又は健常体のいずれであってもよい。
【００５０】
本明細書において「疾患罹患体」とは、特定の疾患に罹患している個体をいう。例えば、本明細書における主な疾患罹患体は、AD罹患体又はMCI罹患体（特にAD移行型MCI罹患体）であり、また、「疾患の罹患可能性のある個体」とは、例えば、MCIからADへの移行可能性のある個体である。
【００５１】
本明細書において「健常体」とは、健常状態にある個体をいう。「健常状態」とは、少なくとも中枢神経疾患、例えばAD及びMCI等に罹患していない状態、好ましくは疾患や障害のない健全な状態を意味する。したがって、後述する実施例に記載の「疾患コントロール」は、本明細書では健常体の一形態に該当する。本明細書において健常体は、主に被験体との比較基準である対照体として使用される。したがって、本明細書において被験体と健常体は、少なくとも同一種である。さらに、亜種（人種を含む）、性別、年齢（月例、週齢を含む）、身長、体重等の条件が同一であることが好ましい。また本明細書では複数の健常体からなる集団を「健常体群」と称する。
１−３．構成
本発明の「アルツハイマー病診断マーカー（AD診断マーカー）」は、糖タンパク質又は糖鎖を含むペプチド断片で構成され、被験体におけるAD又はAD移行型MCIの罹患、又はADの罹患可能性、すなわちMCIからADへの移行可能性を診断可能なバイオマーカーである。
【００５２】
本発明のAD診断マーカーにおいて、糖タンパク質を構成するタンパク質は、トランスフェリン（Transferrin;Tf）タンパク質である。Tfタンパク質は、2個の鉄（Fe）イオンと可逆的に結合し、その生体内輸送を担う分子量約80KDaのキャリアタンパク質である。トランスフェリンの具体例として、698個のアミノ酸残基で構成され、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるヒトTfタンパク質が挙げられる。Tfタンパク質は、通常、糖タンパク質としてその機能を発揮している。このように糖鎖が付加されたTfタンパク質を本明細書では、しばしば「Tf糖タンパク質」と表記する。
【００５３】
糖鎖には、タンパク質のアミノ酸配列におけるアスパラギン（Asn:N）残基の側鎖に付加されたN結合型糖鎖と、セリン（Ser:S）残基又はスレオニン（Thr:T）残基の側鎖に付加されたO結合型側鎖が知られている。本発明のAD診断マーカーを構成するTf糖タンパク質の糖鎖は、前述のように2か所（N432及びN630）のアスパラギン残基に付加されるN結合型糖鎖である。
【００５４】
Tf糖タンパク質には、タンパク質部分が共通で、付加されるN結合型糖鎖の構造のみが異なる3種のアイソフォーム（本明細書では「Tf糖鎖アイソフォーム」と称する）が存在する。本発明のAD診断マーカーは、その1つであり、後述する第３のTf糖鎖アイソフォームに相当する末端Man-Tfで構成されている。以下、Tf糖タンパク質における3種のTf糖鎖アイソフォームについて説明をする。
【００５５】
第１のTf糖鎖アイソフォームは、前述のシアル酸化Tfに相当し、図１のAに示すように、2本のシアル酸非還元末端糖鎖が付加された構造を有するTf糖タンパク質である。「シアル酸非還元末端糖鎖」とは、非還元末端にα2,6シアル酸を持つ糖鎖をいう。本明細書では、シアル酸非還元末端糖鎖が付加されたTf糖鎖アイソフォームをしばしば「末端Sia-Tf（糖タンパク質）」と表記する。末端Sia-Tfは、図１Dのaで示すように血清及び髄液のいずれにも存在しているが、特に血清中に多量に存在することから、「血清Tf（糖タンパク質）」とも言われる。末端Sia-Tfは、他の糖タンパク質との糖鎖構造の類似性から肝臓で生合成されるTf糖タンパク質と考えられている。
【００５６】
第２のTf糖鎖アイソフォームは、前述の非シアル酸化Tfサブグループ1に相当し、図１のBに示すように、2本のGlcNAc非還元末端糖鎖が付加されたTf糖タンパク質である。「GlcNAc非還元末端糖鎖」とは、非還元末端にN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）を持つ糖鎖をいう。本明細書では、GlcNAc非還元末端糖鎖が付加されたTf糖鎖アイソフォームをしばしば「末端GlcNAc-Tf（糖タンパク質）」と表記する。末端GlcNAc-Tfは、脳及び／又は脊髄のような中枢神経系の細胞で産生され、主として髄液中に見られる脳型糖タンパク質と考えられている。
【００５７】
第３のTf糖鎖アイソフォームは、前述の非シアル酸化Tfサブグループ2に相当し、図１のCに示すように、2本の糖鎖のうち一方にMan非還元末端糖鎖が、また他方にGlcNAc非還元末端糖鎖が付加されたTf糖タンパク質である。より具体的には、ヒトTfタンパク質であれば、N432にMan非還元末端糖鎖が付加され、N630にはGlcNAc非還元末端糖鎖が付加されたTf糖タンパク質が該当する。本明細書では、前述の糖鎖構造を有するTf糖鎖アイソフォームをしばしば「末端Man-Tf（糖タンパク質）」と表記する。末端Man-Tfと末端GlcNAc-Tfは、移動度が近似するため、ウェスタンブロットでは図１Dのbで示すように両者のバンドが重複して見かけ上、1種の糖鎖アイソフォームとして検出される。それ故に、これまで髄液特異的なTf糖タンパク質として末端GlcNAc-Tfは知られていたが、末端Man-Tfの存在は知られていなかった。末端Man-Tfも末端GlcNAc-Tfと同様に、脳型糖タンパク質と考えられている。
【００５８】
上述のように、第２及び第３のTf糖鎖アイソフォームは、脳型糖タンパク質であることから、主として髄液中に存在する。ただし、髄液中の成分（髄液成分）の一部は、頭頸部のリンパ管中や脊髄神経根等にも存在し、また微量ながら血清中にも漏出することが知られている。例えば、プロスタグランジンD2合成酵素は、髄液特有の脳型糖タンパク質であるが、その1％程度の濃度が血中から検出され得る。したがって、第２及び第３のTf糖鎖アイソフォームも髄液以外の体液中にも存在し得る。
【００５９】
上述した各Tf糖鎖アイソフォームは、細胞種に特異的であり、その量的変化は由来する細胞種の病的状態を反映する。それ故に、疾患の有用な診断マーカーとなり得る。
【００６０】
例えば、末端GlcNAc-Tfは、iNPHの指標マーカーとなることが知られている（特開2010-121980号）。
【００６１】
一方、末端Man-Tfは、iNPHの指標マーカーにはならないが、本発明のAD診断マーカーを構成するTf糖鎖アイソフォームである。体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量は、健常体又は健常体群と比較して、AD移行型MCI罹患体及びAD罹患体において有意に増加している。このような増加は、他の中枢神経疾患では認められない。したがって、AD移行型MCIとAD非移行型MCIの識別、及びADと病変や病状が類似する他の中枢神経疾患との識別においても有用なマーカーとなり得る。例えば、問診等による初期診察でMCIに罹患していると診断された患者において、健常体又は健常体群と比較して体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量が有意に多い場合、そのMCIはAD移行型MCIであり、将来ADに移行する可能性が高いと判定することができる。一方、末端Man-Tf量に有意差がない場合には、そのMCIはAD非移行型MCIと判定することができる。
【００６２】
また、例えば、初期ADの症状と、レビー小体型認知症（dementia with Lewy bodies）（本明細書では、しばしば「DLB」と表記する）又は前頭側頭型認知症（frontotemporal dementia）（本明細書では、しばしば「FTD」と表記する）の初期症状は、区別が難しく、症候学的差異からの鑑別は容易ではない。特にFTDではADと同様に体液中（主として髄液中）のリン酸化tauタンパク質の増加が見られ、既存の最も有効とされるAD診断マーカーも利用できないとされている。しかし、DLBやFTDでは、健常体又は健常体群と比較して、体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量に有意差が認められない。したがって、体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量を測定することでADと、DLB又はFTDを容易に鑑別することができる。
【００６３】
さらに、例えば、後期ADとiNPHは、共に脳室拡大という顕著な形態変化と認知症が見られる点で極めて類似しており、その鑑別は容易ではない。iNPHは髄液の過剰が原因であることから、簡単な小手術（例えば脳室と腹腔をチューブでバイパスするシャント術）で過剰髄液を排液すれば完治可能である。すなわち“治る”認知症であることからその正確な診断が求められている。ところが、日本におけるiNPH患者数は31万人と推測されているにもかかわらず、本疾患の根治手術を受けている患者は年間1200人（予想患者数の0.4％）にすぎない。これは、多くiNPH患者がADと誤診され、治療の恩恵を受けられないまま放置されていることを示唆している。また、近年、iNPHとADの合併例が多数報告されている。一般に、AD病理は、Aβの凝集によって開始され、このAβの凝集体が早期ADで観察されるアミロイド斑となる。しかし、通常は、髄液の循環でAβを洗い流す生理的メカニズムが働くためAβの凝集は抑制されている。それ故に、iNHPの一部では、髄液の循環不全によるAβの洗い流しの低下が生じ、AD病理が進行しやすくなると考えられている。実際、iNPH患者においてADマーカー陽性例（合併例）と陰性例を比較すると、前者では記憶や遅延想起等の回復が良好ではないことが報告されている(Kazui et al, 2016, J Neurol Sci, 369:236-41. doi: 10.1016/j.jns.2016.08.040. Epub 2016 Aug 19)。したがって、iNPHとADそれぞれの早期診断マーカーを測定し、合併例と非合併例を鑑別することは、治療効果の予測に重要である。ここで、体液中（主として髄液中）の末端Man-Tfは、AD診断マーカーとなる。一方、同じ体液中（主として髄液中）のTf糖鎖アイソフォームの一つである末端GlcNAc-Tfは、前述のようにiNPHの診断マーカーとなる。それ故に、iNPHでは、健常体又は健常体群と比較して体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量に有意差が認められないが、体液中（主として髄液中）の末端GlcNAc-Tf量は有意に少なくなる。一方、ADやAD移行型MCIでは健常体又は健常体群と比較して体液中（主として髄液中）の末端GlcNAc-Tf量に有意差は認められないが、末端Man-Tfが増加する。したがって、体液中（主として髄液中）に存在するそれぞれの診断マーカーを測定することで、両疾患を容易に、かつ高い精度で識別することが可能となる。
【００６４】
なお、本明細書において、「有意」とは、統計学的に有意であることをいう。統計学的に有意とは、被験対象の測定値と対照値の差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。本発明であれば、被験体と健常体群の末端Man-Tf量の測定値の差異を統計学的に処理したときの両者間の有意差が該当する。例えば、得られた値の危険率（有意水準）が小さい場合、具体的には5％より小さい場合（p<0.05）、1％より小さい場合（p<0.01）、又は0.1％より小さい場合（p<0.001）が挙げられる。ここで示す「p（値）」は、統計学的検定において、統計量が仮定した分布の中で、仮定が偶然正しくなる確率を示す。したがって「p」が小さいほど、仮定が真に近いことを意味する。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、共変量分散分析等を用いることができる。
【００６５】
末端Man-Tf量は、疾患の進行度と相関して増加する。すなわち、体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量が健常体又は健常体群と比較して多いほど症状は進行しており、重度であることを示す。逆に、疾患が治癒した場合には、その治癒度に相関して末端Man-Tf量は、減少し、健常体又は健常体群の量に戻り得る。それ故に、末端Man-Tfは、ADの病態を反映する診断マーカーとなり得る。
２．アルツハイマー病診断キット
２−１．概要
本発明の第２の態様は、アルツハイマー病診断キット（AD診断キット）である。本発明のキットは、試料中に含まれ得る第１態様に記載のAD診断マーカーを検出することができ、それによって試料提供者である被験体のADの罹患又は罹患の可能性の鑑別、及び／又は病態の判定ができる。
２−２．構成
本発明のAD診断キットは、必須の構成物としてマンノース結合分子及びトランスフェリン結合分子を含む。また、選択的な構成物として他の構成物を含むことができる。
２−２−１．必須構成物
（１）マンノース結合分子
本明細書において「マンノース結合分子（Man結合分子）」とは、糖タンパク質の糖鎖を構成するマンノースを認識し、結合する分子をいう。標的分子の認識及び結合は、特異性が高いことが好ましい。Man結合分子は、ペプチド、核酸、低分子化合物、又はそれらの組み合わせのいずれであってもよい。本明細書において「低分子化合物」とは、ペプチド又は核酸以外の分子量500以下の有機化合物又は無機化合物をいう。またMan結合分子が認識する糖鎖マンノースは、還元末端マンノース、非還元末端マンノース又は糖鎖内部のマンノースのいずれであってもよい。好ましくは末端マンノースであり、より好ましくは非還元末端マンノースである。
【００６６】
Man結合分子の具体例として、マンノース結合タンパク質やマンノース結合核酸が挙げられる。以下、それぞれについて説明をする。
【００６７】
（Ａ）マンノース結合タンパク質
「マンノース結合タンパク質（Man結合タンパク質）」には、例えば、マンノース結合レクチンや抗マンノース抗体又はその活性断片が挙げられる。
【００６８】
（ｉ）マンノース結合レクチン
「マンノース結合レクチン（Man結合レクチン）」は、マンノースを含む糖鎖、好ましくは末端マンノースを含む糖鎖、より好ましくは非還元末端マンノースを含む糖鎖に結合するレクチンである。例えば、http://jcggdb.jp/rcmg/glycodb/LectinSearchに記載の45種のマンノース結合レクチン等が挙げられる。ところで、レクチンには、標的分子が糖タンパク質の場合と、糖鎖のみの場合とでは、見かけ上の糖鎖結合特異性に差異を生じる場合がある。例えば、イラクサ（Urtica dioica）由来のUDAレクチンは、標的分子が糖鎖の場合にはGlcNAc結合レクチンに分類されるが、図２で示すように標的分子が糖タンパク質の場合、末端Man-Tfの非還元型末端Manには特異的に結合するが、末端GlcNAc-Tfには結合しない性質となる。したがって、レクチンのマンノースへの結合は糖鎖のみでなく標的分子である末端Man-Tfを用いて検討することが好ましい。つまり、本発明のキットを構成するMan結合レクチンは、末端Man-Tfの糖鎖マンノース、好ましくは末端Man-Tfの末端マンノース、より好ましくは末端Man-Tfの非還元末端Manに結合するレクチンである。Man結合レクチンは、市販のレクチンを利用してもよい。例えば、ビオチン化UDAレクチン（Cat No BA-8005-1；EY社）や、細菌由来のBC2L-Aレクチン（Burkholderia cenocepacia lectin-A；和光純薬工業）を利用することができる。
【００６９】
（ｉｉ）抗マンノース抗体又はその活性断片
「抗マンノース抗体（抗Man抗体）」は、マンノースを含む糖鎖、好ましくは末端マンノースを含む糖鎖、より好ましくは非還元型末端Manを含む糖鎖を認識して結合する抗体である。
【００７０】
「その活性断片」とは、抗原結合性や免疫応答活性を保持している抗体の部分断片をいう。
【００７１】
抗Man抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は組換え抗体のいずれであってもよい。より特異的な検出を可能にするためには、モノクローナル抗体又は組換え抗体が好ましい。抗体のグロブリンタイプは、特に限定されるものではなく、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgYのいずれであってもよいが、IgG及びIgMが好ましい。また、本態様の抗体の由来生物種は、特に限定はしない。哺乳動物及び鳥を含めたあらゆる動物由来とすることができる。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ、又はヒトなどが挙げられる。
【００７２】
本明細書において前記「組換え抗体」とは、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体及び合成抗体をいう。
【００７３】
「キメラ抗体」とは、ある抗体において、軽鎖及び重鎖の定常領域（C領域：Constant region）を他の抗体の軽鎖及び重鎖のC領域で置換した抗体である。例えば、マウス抗ヒトモノクローナル抗体において、その軽鎖及び重鎖のC領域を適当なヒト抗体のC領域と置換した抗体が該当する。つまり、この場合、CDRを包含する可変領域（V領域：Variable region）はマウス抗体由来であり、C領域はヒト抗体由来となる。
【００７４】
「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、標的抗原に対するヒト以外の哺乳動物由来の抗体中のCDRとヒト抗体のCDRとを置換したモザイク抗体である。例えば、マウス抗ヒト非還元型末端Man抗体の各CDR領域（CDR１〜CDR3）をコードするDNA配列を、適当なヒト抗体由来の対応する各CDRをコードするDNA配列と置換した組換え抗体遺伝子を調製し、それを発現させることによって得られる抗体が該当する。
【００７５】
「合成抗体」とは、化学的方法又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、適当な長さと配列を有するリンカーペプチド等を介して、特定の抗体の一以上のVL及び一以上のVHを人工的に連結させた一量体ポリペプチド分子、又はその多量体ポリペプチドが該当する。このようなポリペプチドの具体例としては、一本鎖Fv（scFv ：single chain Fragment oｆ variable region）（Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL参照）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ(tetrabody)等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、VL及びVHは、通常別々のポリペプチド鎖（軽鎖と重鎖）上に位置する。一本鎖Fvは、これら2つのポリペプチド鎖上のV領域を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、1本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する合成抗体断片である。一本鎖Fv内において両V領域は、互いに自己集合して1つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。一本鎖Fvは、それをコードする組換えDNAを、公知技術を用いてファージゲノムに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、一本鎖Fvの二量体構造を基礎とした構造を有する分子である(Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様に一本鎖Fv構造を基本としたその三量体、及び四量体構造を有する。それぞれ、三価、及び四価の抗体断片であり、多重特異性抗体であってもよい。
【００７６】
抗Man抗体は、末端Man-Tfとの解離定数が、10-8M以下、好ましくは10-9M以下、より好ましくは10-10M以下の高い親和性を有することが好ましい。上記解離定数は、当該分野で公知の技術を用いて測定することができる。例えば、BIAcoreシステム（GE Healthcare社）により速度評価キットソフトウェアを用いて測定してもよい。
【００７７】
本工程で使用する本態様のポリクローナル抗体は、抗原となる非還元型末端Man糖鎖、又はそれが付加したアスパラギン残基を含む数アミノ酸からなる糖タンパク質断片を適当な動物に免疫した後、免疫動物から当該分野で公知の方法により回収ことができる。また、モノクローナル抗体も当該分野の慣用技術である公知の方法により得ることができる。例えば、前記抗原でマウスを免疫した後、免疫マウスから抗体産生細胞を採取する。その抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして標的分子である末端Man-Tfに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定すればよい。
【００７８】
「抗体フラグメント」とは、前述の抗体の抗原結合活性を有するペプチド断片であって、例えば、Fab、F(ab’)2、Fv等が挙げられる。
【００７９】
本工程で使用する抗体又はその抗体フラグメントは、修飾されていてもよい。ここでいう「修飾」とは、抗体検出に必要な標識、又は抗原特異的結合活性化に必要な機能上の修飾を含む。標識には、例えば、前述の蛍光物質、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。また、修飾には、標的分子である末端Man-Tfの非還元末端Man糖鎖に対する親和性を調整するため行われる抗体のグリコシル化等が挙げられる。具体的には、例えば、抗体のフレームワーク領域（FR：Framework region）において、グリコシル化部位を構成するアミノ酸残基に、置換を導入してグリコシル化部位を除去し、それによって、その部位のグリコシル化を喪失させる改変等がある。
【００８０】
（Ｂ）マンノース結合核酸
「マンノース結合核酸（Man結合核酸）」には、例えば、マンノースに対する核酸アプタマーが挙げられる。
【００８１】
「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、及び三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合する能力を持つリガンド分子をいう。具体的には、マンノース、好ましくは非還元末端マンノース、及びその周辺糖鎖の構造を認識して結合する核酸アプタマーである。
【００８２】
本明細書で使用する核酸アプタマーは、当該分野で公知の方法により作製することができる。例えば、SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法を用いた試験管内選別法が挙げられる。SELEX法とは、例えば、RNAアプタマーを分離する場合であれば、「ランダム配列領域とその両端にプライマー結合領域を有する多数のRNA分子によって構成されるRNAプールから標的分子に結合したRNA分子を選択する。回収したRNA分子をRT-PCR反応によって増幅した後、得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、選択されたRNA分子の増幅産物を得て、それを次のラウンドのRNAプールにする」という一連のサイクルを数〜数十ラウンド繰り返して、標的分子に対して、より結合力の強いRNA分子を選択する方法である。一方、SELEX法で、DNAアプタマーを分離する場合も基本手順は同じであるが、回収したDNA分子を増幅する際にRT-PCR反応を経る必要がない。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。一般的にランダム配列領域は、20〜80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15〜40塩基の範囲が好ましい。標的分子への特異性を高めるためには、予め標的分子に類似する分子とRNAプール又はRNAプールとを混合し、標的分子に類似する分子と結合しなかったRNA分子又はDNA分子からなるプールを用いればよい。なお、SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92：11509-11513）に準じて行えばよい。
【００８３】
本発明では、標的分子を糖鎖マンノースとして、上記の方法を実行することにより最終的に得られた核酸分子をマンノースに対する核酸アプタマーとして利用することができる。
【００８４】
核酸アプタマーは、一般に、RNAアプタマーとDNAアプタマーが知られているが、本明細書における核酸アプタマーを構成する核酸は特に限定はしない。例えば、DNAアプタマー、RNAアプタマー、DNAとRNAの組み合わせで構成されるアプタマー等を含む。一般的にはRNAアプタマーが頻用されるが、安定性、化学合成における製造コスト、及びアプタマー製造における工程数の点ではDNAアプタマーが優れている。
【００８５】
本工程で使用する核酸アプタマーは、標的分子への結合能を阻害しない範囲において、蛍光物質（例えば、FITC、Texas、Cy3、Cy5、Cy7、Cyanine3、Cyanine5、Cyanine7、FAM、HEX、VIC、フルオレサミン及びその誘導体、及びローダミン及びその誘導体等）、放射性同位元素（例えば、32P、33P、35S）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジン等の標識物質により標識することもできる。
（２）Tf結合分子
本明細書において「Tf結合分子」とは、標的分子である末端Man-Tfのタンパク質部分を構成するTfタンパク質を認識して結合する物質をいう。標的分子の認識及び結合は、特異性が高いことが好ましい。このような物質には、ペプチド、核酸、低分子化合物、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８６】
Tf結合分子の具体例として、Tf結合タンパク質やTf結合核酸が挙げられる。以下、それぞれについて説明をする。
【００８７】
（Ａ）Tf結合タンパク質
「Tf結合タンパク質」には、例えば、抗Tf抗体又はその活性断片が挙げられる。
【００８８】
（ｉ）抗Tf抗体
「抗Tf抗体」は、Tfタンパク質、好ましくは末端Man-TfのTfタンパク質部分を認識して結合する抗体である。
【００８９】
本発明の抗Tf抗体の構成やその作製方法については、前記「（１）マンノース結合分子（Ａ）マンノース結合タンパク質」の「（ｉｉ）抗マンノース抗体又はその活性断片」で具体的に記載しており、本発明でもそれに準じることから、ここではその説明を省略する。
【００９０】
（Ｂ）Tf結合核酸
「Tf結合核酸（Tf結合核酸）」には、例えば、Tfタンパク質に対する核酸アプタマーが挙げられる。
【００９１】
核酸アプタマーの構成やその作製方法については、前記「（１）マンノース結合分子（Ｂ）マンノース結合核酸」で具体的に記載しており、本発明でもそれに準じることから、ここではその説明を省略する。なお、本発明では、標的分子をTfタンパク質として、上記の方法を実行することにより最終的に得られた核酸分子をTfタンパク質に対する核酸アプタマーとして利用することができる。
２−２−２．選択構成物
本実施形態のキットは、選択構成物として、さらに、アルブミン結合分子を含んでいてもよい。アルブミン結合分子の具体例としては、例えば、ブルーセファロース又は抗アルブミン抗体若しくはその活性断片が挙げられる。
【００９２】
上記Man結合分子、Tf結合分子及び／又はアルブミン結合分子は、必要に応じて担体に固定化されているか、あるいは蛍光色素又は発光物質等で標識化されていてもよい。
【００９３】
上記構成物の他、本実施形態のキットは、前記Man結合分子、Tf結合分子及び／又はアルブミン結合分子を充填するためのカラム（スピンカラム等）、洗浄用バッファー（PBSバッファー、生理食塩水等）、及び／又はプロトコル等を記載した説明書等を包含することができる。
【００９４】
さらに、本実施形態のキットは、特定中枢神経系疾患診断マーカー結合物質を含んでいてもよい。ここでいう「特定中枢神経系疾患診断マーカー結合物質」とは、既知の中枢神経系疾患用指標マーカーを特異的に認識し、それに結合できる物質を言う。例えば、特定の末端GlcNAc糖タンパク質に対する抗体又はその活性断片が該当する。具体例として、iNPHの指標マーカーである末端GlcNAc-Tfに対する抗体（抗末端GlcNAc-Tf抗体）又はその活性断片が挙げられる。
３．アルツハイマー病の罹患鑑別方法
３−１．概要
本発明の第３の態様は、AD罹患鑑別方法である。本発明のAD罹患鑑別方法は、被験体由来の体液中に存在する第１態様のAD診断マーカーの量を測定し、対照体群由来の体液中に存在するAD診断マーカーの量と比較することによって、被験体のAD罹患を鑑別することができる。
３−２．方法
本発明のAD罹患鑑別方法は、（１）測定工程、及び（２）比較鑑別工程を必須の工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
（１）測定工程
「測定工程」とは、被験体及び対照体群から得られた体液、好ましくは髄液の所定量あたりに含まれる第１態様に記載のADマーカーの量を測定してその測定値を得る工程である。
【００９５】
本態様における「被験体」は、ADの検出を目的として本態様の鑑別方法に供される動物個体をいう。被験体は、例えば健康診断の受診者のように中枢神経疾患の罹患が不明な個体や、疾患名は未同定ながら何らかの中枢神経疾患に罹患していることが判明している個体のいずれであってもよい。前者の場合、被験体におけるAD罹患の有無が鑑別可能となり、後者の場合、被験体における中枢神経疾患がADかそれ以外の中枢神経疾患かを判定することができる。
【００９６】
本態様において「対照体」とは、本態様の鑑別方法において被験体との比較基準となる個体をいう。通常のAD罹患鑑別方法において対照体は健常体で足りるが、本態様の鑑別方法においてADの病態を判定する場合には、比較基準値を高く設定するために対照体をAD移行型MCI罹患体、及び初期AD罹患体にすることもできる。また、本明細書では複数の対照体からなる集団を「対照体群」と称する。ここでいう「複数」とは、好ましくは3以上である。対照体群には、健常体群、AD移行型MCI罹患体群、及び初期AD罹患体群等が挙げられる。対照体群を構成する各対照体は、原則として同様の状態の個体とする。
【００９７】
「から得られた体液」とは、前記被験体及び対照体群のそれぞれから採取された体液をいう。好ましくは髄液又は血液である。髄液及び血液の採取方法は、既知の方法であればよく、特に限定はしない。例えば、髄液であれば腰椎穿刺により採取すればよい。腰椎穿刺は、事前に市販の局所麻酔薬を用いることで、痛みを採血以下にすることが可能であり、また無外傷性針を用いることで、副作用を軽減できることから侵襲性が比較的低く、髄液を採取する場合には好適な方法である。血液であれば、公知の採血方法に従って採取すればよい。なお、被験体と対照体の体液は、一方が髄液であれば他方も髄液とするように、原則として互いに同種の体液とする。
【００９８】
「所定量」は、容量又は重量により予め定められた量をいう。所定量は特に限定はしなが、少なくともAD患者の体液中、好ましくは髄液中に含まれる第１態様に記載のAD診断マーカーが測定可能な量である必要がある。例えば、髄液が5μL〜1mL、又は髄液タンパク質量として、5μg〜200μgあればよい。測定する体液の所定量は、被験体と対照体で同一である。
【００９９】
本明細書において「測定値」とは、本工程で測定されるAD診断マーカーの量を示す値である。測定値は、容量又は重量のような絶対値であってもよく、また濃度、イオン強度、吸光度又は蛍光強度のような相対値であってもよい。
【０１００】
本工程では、被験体由来の体液（「被験体体液」という）、好ましくは髄液（「被験体髄液」という）と対照体群由来の体液（「対照体液」という）、好ましくは髄液（「対照髄液」という）のそれぞれの所定量中に含まれるAD診断マーカーの量をMan結合分子及びTf結合分子を用いて測定する。
【０１０１】
Man結合分子及びTf結合分子の構成については、第２態様で詳述していることから、ここでは具体的な説明を省略する。一例として、Man結合分子にはUDAレクチン又はBC2L-Aレクチン等のMan結合レクチンが、またTf結合分子には抗Tf抗体が挙げられる。
【０１０２】
AD診断マーカーの測定方法は、Man結合分子及びTf結合分子を用いて測定する公知の糖タンパク質の定量方法であればよく、特に限定はしない。例えば、抗体を用いた免疫学的検出法、レクチンを用いたレクチン検出法、質量分析法又はそれらの組み合わせ法が挙げられる。
【０１０３】
免疫学的検出法には、例えば、酵素免疫測定法（ELISA法、EIA法を含む）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（RIA）、発光免疫測定法、表面プラズモン共鳴法（SPR法）、水晶振動子マイクロバランス（QCM）法、免疫比濁法、ラテックス凝集免疫測定法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応法、金コロイド法、キャピラリー電気泳動法、ウェスタンブロット法又は免疫組織化学法（免疫染色法）が挙げられる。
【０１０４】
レクチン検出法には、レクチンブロッティング法が挙げられる。
【０１０５】
質量分析法には、高速液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（LC-MS/MS）、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（ICP-MS）が挙げられる。
【０１０６】
組み合わせ法には、例えば、レクチンと抗体を用いたサンドイッチELISA法及びそれと同様の原理を用いた自動化法、好ましくは、ハイスループットレクチン阻害‐自動ラテックス凝集法を利用することができる。AD診断マーカーを構成する末端Man-Tfにおいて、糖鎖とタンパク質のそれぞれを標的として検出する組み合わせ法は、糖タンパク質を高い精度で定量することができるため、好ましい測定方法である。組み合わせ法の具体例として、抗Tf抗体を吸着させたプレート等の担体にAD診断マーカーである末端Man-Tfを含む体液（例えば、髄液）を通して末端Man-Tfを吸着させ、その後Man結合分子であるUDAレクチンをプローブとして末端Man-Tfを検出する方法が挙げられる。また、逆にUDAレクチンを吸着させたプレート等の担体に体液（例えば、髄液）を通して末端Man-Tfを吸着させ、その後抗Tf抗体で末端Man-Tfを検出する方法もある。
【０１０７】
上記分析法は、いずれも当該分野に公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York；Christopher J., et al., 2005, Chemical Review,105:1103-1169；Iijima Y. et al., 2008,.The Plant Journal, 54,949-962；Hirai M. et al.,2004, Proc Natl Acad Sci USA, 101(27) 10205-10210；Sato S, et al., 2004,,The Plant Journal, 40(1)151-163；Shimizu M. et al., 2005, Proteomics, 5,3919-3931に記載の方法に準じて行うことができる。また、各メーカーからタンパク質定量キットが市販されており、それらを利用することもできる。
【０１０８】
なお、前記測定工程における対照体群の測定値は、被験体の測定値と異なり、必ずしもその都度測定する必要はない。例えば、体液（例えば、髄液）の所定量、AD診断マーカーの測定方法、測定条件を一定にしておけば、以前に測定した対照体群の測定値を再利用することができる。それ故、様々な条件下で対照体の体液から得られたAD診断マーカー量を予め測定しておき、それをデータベース化して、被験体の測定値と比較する際に、同条件で測定した測定値を必要に応じて選択して使用してもよい。
（２）比較鑑別工程
「比較鑑別工程」とは、被験体及び対照体群におけるAD診断マーカーの測定値を比較して、その結果から被験体におけるADの罹患を鑑別する又はADの病態を判定する工程である。
【０１０９】
本工程では、前記測定工程で得られた被験体と対照体群における同種のAD診断マーカーの測定値を比較する。対照体群の測定値は、対照体群を構成する各対照体の平均測定値でよい。また、被験体及び対照体群の測定値を補正するために、髄液中で量的差異のない公知のタンパク質を内在性コントロールとして用いてもよい。このような内在性コントロール用タンパク質として、例えば、アルブミンが挙げられる。
【０１１０】
比較の結果は、対照体群に応じて以下のように鑑別する。
【０１１１】
対照体群が健常体群であれば、被験体の測定値が対照体群の測定値よりも有意に高い場合に、その被験体はADに罹患していると鑑別する。この場合、被験体がいずれかの中枢神経疾患に罹患していることが予め判明していれば、その被験体はADに罹患しており、ADに関連するMCIを除く他の中枢神経疾患ではないと鑑別できる。
【０１１２】
対照体群がMCI罹患体群であれば、被験体の測定値が対照体群の測定値よりも有意に高い場合に、その被験体はMCIからADへ移行可能性が高いと鑑別する。
【０１１３】
対照体群が初期AD罹患体群であれば、被験体の測定値が対照体群よりも有意に高い場合に、その被験体のADは進行していると判定する。有意差がない場合には、その被験体のADの病態は現状維持されていると判定する。
４．アルツハイマー病移行型軽度認知障害罹患鑑別方法
４−１．概要
本発明の第３の態様は、AD移行型MCIの罹患鑑別方法である。本発明のAD移行型MCIの鑑別方法は、被験体由来の体液中、好ましくは髄液中に存在する第１態様のAD診断マーカーの量を測定し、健常体群由来の体液中、好ましくは髄液中に存在するAD診断マーカーの量と比較することによって、MCIに罹患している被験体がAD移行型MCIに罹患していることを鑑別できる。
４−２．方法
本発明のAD移行型MCI罹患鑑別方法も第３態様のAD罹患鑑別方法と同様に測定工程、及び比較鑑別工程を必須の工程として含む。各工程の構成及び手順も原則として第３態様のAD罹患鑑別方法と同じであることから、ここでは第３態様と異なる点についてのみ説明する。
【０１１４】
本発明のAD移行型MCI罹患鑑別方法が第３態様のAD罹患鑑別方法と異なる点として、対照体が健常体に限定されていることと、被験体がMCIに罹患しているMCI罹患体であることが挙げられる。
【０１１５】
前述のようにMCIには症状が進行しないケースと、ADに進行するケースが存在する。後者がAD移行型MCIであるが、通常のMCIとAD移行型MCIを鑑別することは従来技術では困難であった。もしもMCIの中に存在するAD移行型MCI患者を鑑別できれば、AD治療薬を投与する等、早期治療を開始することが可能となり、大量の神経細胞死を回避してADへの移行を阻止することができる。つまり、AD移行型MCIの罹患鑑別ができればAD発症を予防することができる。
【０１１６】
被験体がMCI罹患体である場合、比較判定工程において、被験体の測定値が健常体群の測定値よりも有意に高い場合には、その被験体はAD移行型MCIに罹患していると鑑別する。
【実施例】
【０１１７】
＜実験例１：UDAレクチンの結合特異性＞
（目的）
本実施例で用いるUDAレクチンの糖鎖結合特異性を検証する。
（方法）
3種のTf糖鎖アイソフォームの標品を調製した。α2,6シアル酸を非還元末端に持つ末端Sia-Tfは、血清から精製して得た。この末端Sia-Tfをシアリダーゼ、ガラクトシダーゼで消化した。この処理により末端Sia-Tf糖鎖の非還元末端に、ガラクトース、GlcNAc（末端GlcNAc-Tf）を持ったTf糖鎖アイソフォーム標品が得られた。続いて、末端GlcNAc-Tfを、さらにヘキソサミニダーゼで消化し、マンノース（末端Man-Tf）を持ったTf糖鎖アイソフォーム標品が得られた。なお、ここでの末端Man-Tfは、3つのMan非還元末端糖鎖を有する末端Tri-Man-Tfである。 【０１１８】
これらの標品、すなわち末端Sia-Tf、末端GlcNAc-Tf、及び末端Man-Tfを用いて電気泳動を行った。泳動に用いた各糖タンパク質量は、銀染色法では80ng、イムノブロット法では80ng、UDAレクチンブロット法では160ngとした。各糖タンパク質にLaemmLiサンプルバッファーを加えて加熱した後、5〜20％グラジェント・ポリアクリルアミドゲルを用いてSDS/PAGEに供した。泳動は、20mAの定電流で75分電気泳動した。分離されたタンパク質は市販の銀染色キット（Cat No.291-50301；Wako社）を用いてタンパク染色を行った。同様に分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に350mAで45分間、電気的に転写した。ブロットの1枚は、3%スキムミルク-PBST（Phosphate-buffered saline-0.1% Tween[登録商標]）でブロッキングした後に0.5μg/mLの抗Tf抗体（Cat No.A80-128A；BETHYL社）と24℃で2時間反応させた。検出は、0.13μg/mLのホースラディッシュパーオキシダーゼで標識した二次抗体（抗Goat IgG抗体；Cat No.705-035-147；Jackson社）と反応させた後、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate（Cat No.34075；PCC社）を用いて発色させ、クロマトスキャナー（AE-9300H Ez-Capture MG Quick Manual for ImageSaver6；ATTO社）にて画像解析をした。ブロットの他の1枚は、1%BSA-PBSでブロッキング後に1μg/mLのビオチン化UDA（Cat No.BA-8005-1；EY社）と24℃で90分間反応させた。その後、1mg/mLのHRP標識ストレプトアビジ（StAv-HRP；Cat No.21126；PCC社）と24℃で90分間反応させた後、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate（Cat No.34075 PCC社）で発色させて、上記のイムノブロットと同様にクロマトスキャナーにて検出した。
（結果）
結果を図２に示す。3種の精製Tf糖鎖アイソフォームは電気泳動後の銀染色により主要バンドが単一であることが示された（図２A）。また、3種のTf糖鎖アイソフォームは、抗Tf抗体に対して同程度の反応性を示した（図２B)。ところが、UDAレクチンブロット法では、末端Man-Tfのみがシグナルを与え、末端GlcNAc-Tf及び末端Sia-Tfではシグナルが観察されなかった（図２C）。この結果から、UDAレクチンは、末端Man-Tfに特異的なプローブであることが示された。
＜実施例１：髄液中のTfの検出＞
（目的）
UDAレクチンを用いて実際に髄液中のTfを検出する。
（方法）
インフォームドコンセントを得たAD患者3名、及び対照用の疾患コントロール4名から腰椎穿刺により3mLの髄液を採取した。続いて、採取した髄液サンプルをUDAレクチンブロット法により分析した。UDAレクチンブロット法は実験例１に準じた。なお、「疾患コントロール」とは、中枢神経疾患に罹患していない非中枢神経疾患者をいう。例えば、頭痛、神経痛、めまいのように、神経疾患が疑われて髄液採取を行なったものの結果的に神経疾患の診断がなされなかった患者が該当する。
（結果）
図３に結果を示す。AD患者（AD）及び疾患コントロール（Control）のいずれからもTfの移動度に一致する74kDa付近にバンドが検出された。クロマトスキャナーの定量により、AD患者3名の髄液では、このシグナル強度が約1.5倍に増加していることが示された。
＜実施例２：髄液中の末端Man-Tfの免疫沈降法による分析＞
（目的）
実施例１でUDAレクチンにより髄液中から検出された74kDa付近のTfが末端Man-Tfによるものであることを、免疫沈降法により検証する。
（方法）
UDAレクチンは、非還元末端マンノースを持つ全ての糖タンパク質（末端Man糖タンパク質）に結合する。そこで、現象を利用して、髄液中の末端Man糖タンパク質で、かつ末端M
an-Tfと同じ移動度を示す糖タンパク質（ノイズシグナルを与える糖タンパク質）が存在
するか否かを検証した。
【０１１９】
抗Tf抗体とProtein G Sepharose 4 Fast Flow（Cat No.17-0618-02；GEヘルスケア・ジャパン社）を結合させたイムノビーズを調製した。このビーズと髄液を4℃で3時間インキュベートした。インキュベート後に、上清をビーズの非結合画分として回収した。その後、ビーズをTBST（Tris buffered saline-0.05% Tween[登録商標]）で3回洗浄した後、ビーズにLaemmLiサンプルバッファーを加えて、結合画分を溶出した。未調製の髄液、上清画分、結合画分のそれぞれを、上記実験例1と同様の方法で、電気泳動法（銀染色）、抗Tf抗体を用いたイムノブロット法、及びUDAレクチンを用いたレクチンブロット法にて分析した。
（結果）
図４に結果を示す。
【０１２０】
Ａで示す銀染色において、髄液では74kDa付近に2本のバンドａ及びｂが検出された（レーン１）。この2本のバンドは、免疫沈降の上清画分からは消失し（レーン２）、結合画分に回収された（レーン３）ことから、両者ともTfと考えられた。なお、この電気泳動は還元剤添加で行っているため、髄液中の２本のTfバンドは近接している。【０１２１】
実際、Ｂで示す抗Tf抗体を用いたイムノブロットでは、ａ及びｂのバンドは抗Tf抗体と反応性を示し（レーン３）、Tfであることが確認された。【０１２２】
Ｃで示すレクチンブロット法では、低分子量側のbのみがUDAレクチンと反応性を示した（レーン３）。なお、Nagae et al.（Glycobiology, 2014, 24, 693-702）において、低分子量側のバンドは、末端Man-Tfと末端GlcNAc-Tfの混合物（本明細書では、しばしば「末端Man-Tf／末端GlcNAc-Tf」と表記する）であることが示されており、UDAレクチンが末端Man-Tfのみを検出したことを鑑みれば、上記の結果と矛盾しない。したがって、UDAレクチンにより髄液中から検出された74KDa付近のTfは末端Man-Tfであることが明らかとなった。【０１２３】
なお、上清画分では末端Man-Tfよりも僅かに低分子量側で弱いバンド（ｃ）が検出された。これは、末端Man-Tf以外のマンノース含有糖タンパク質（GP-X）と考えられた。GP-Xが存在してもレクチンブロットによる末端Man-Tfの定量は可能であることがわかった。
＜実施例３：UDAレクチン/抗体サンドイッチELISA法の開発＞
（目的）
レクチンブロット法では20サンプルの分析に2日を要する。そこで、測定効率が高く、末端Man-Tfに特異性の高い定量法としてUDAレクチン/抗体サンドイッチELISA法を開発する。
（方法）
マイクロタイタープレートの各ウェルに0.05M Carbonate-Bicarbonate pH9.6バッファーで希釈した2μg/mLの抗Tf抗体（Cat No.A80-128A;BETHYL社）、又は抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体（クローン7B2；ミクリ免疫研究所（株））を加え、4℃で一晩インキュベートした。プレートをTBS-0.05% Tween[登録商標]バッファーで1回洗浄後、10% N101(Cat No.S410-03012；日油)-TBSで１時間以上ブロッキングを行った。続いて、髄液を界面活性剤の存在下で変性処理した。プレートをバッファーで1回洗浄後に、バッファーで希釈した髄液、又は15〜150ng/mLの末端Man-Tfをウェルに加え、インキュベートした。バッファーで洗浄した後、ビオチン化UDAレクチンを加え、インキュベートした。バッファーで5回洗浄後、Horseradish peroxidase(HRP)で標識したストレプトアビジンを加え、インキュベートした。バッファーで5回洗浄後、発色基質であるTMBを加えて室温で発色させ、1Mリン酸で反応停止した後に、OD450を測定した。末端Tri-Man-Tf標品を用いて検量線を作成し、髄液中の末端Man-Tfの定量を行った。
（結果）
結果を図５に示す。末端Tri-Man-Tf標品を用いた検量線は、10〜150ng/mLの範囲で直線性を示した。この標品の髄液に対する添加回収実験では、78-91％の値を示した。日差再現性は10.5％以内であった。以上により、UDAレクチン/抗体サンドイッチELISA法は髄液中末端Man-Tfの定量に有用であることが示された。
＜実施例４：各種認知症患者の髄液中における末端Man-Tf量の検証＞
（目的）髄液中の末端Man-TfがADの罹患鑑別及び病態指標として有用であることを検証する。
（方法）
実施例３のUDAレクチン/抗体サンドイッチELISA法を用いて各種の認知症、すなわち、アルツハイマー病（AD）、軽度認知障害（MCI）、特発性正常圧水頭症（iNPH）、レビー小体型認知症／前頭側頭型認知症（DLB/FTD）、及び疾患コントロールにおける髄液中の末端Man-Tfの濃度を測定した。濃度は、実施例３で作製した15〜150ng/mLの末端Tri-Man-Tf標品を用いた検量線を利用して決定した。
（結果）
図６に結果を示す。AD患者の髄液中に含まれる末端Man-Tf量は25.543 ±6.526μg/mLであり、これは、疾患コントロールの末端Man-Tf量である20.50 ± 5.41μg/mLに比べて有意に増加していた（p＝0.011）。
【０１２４】
また、AD前病変を含むMCI（本発明におけるAD移行型MCI）群においても末端Man-Tf量は27.264 ± 6.105μg/mLであり、有意な増加が認められた（p＝0.002）。【０１２５】
他の認知症疾患であるDLB／FTDで末端Man-Tf量を測定したところ、20.448 ± 5.338μg/mLであり、疾患コントロールとの有意差は認められなかった。一方、ADの末端Man-Tf量とは有意差を示した（p＝0.003）。【０１２６】
また、認知症を示すiNPHにおける末端Man-Tf量も16.892 ± 6.173μg/mLであり、疾患コントロールとの有意差は認められなかった。iNPHはMan-Tf量が疾患コントロールのそれと比較して減少傾向を示したが、有意差は認められなかった。一方、iNPHの末端Man-Tf量はADの末端Man-Tf量とは有意差を示した（p＜0.001）。結果として、iNPH群とAD群を感度74.1 %、特異度90.0 %で鑑別することができた。【０１２７】
リン酸化Tauは、ADで上昇する髄液マーカーとして確立されているが、FTD等の他のタウオパチーでも上昇するという問題がある。そこで、FTD群（n=10）のみで末端Man-Tfを測定したところ、21.0 ± 45.29μg/mLであった。この測定値は、疾患コントロールとは有意差がないが、ADと有意差が認められた（p＝0.014）。【０１２８】
以上の結果はUDAレクチン/抗体サンドイッチELISA法を用いて末端Man-Tfの定量を行なったものである。他のレクチンを用いた場合も同様の結果が得られるか否かについて検証するため、末端マンノース結合性レクチンであるリコンビナントBC2LAレクチンを用いたBC2LAレクチン/抗体サンドイッチELISA法による測定も行なった。BC2LAレクチン/抗体を用いたELISA法によるMan-Tfの測定では、iNPH群（6.3 ± 2.6 μg/mL: n=27）とAD群（12.3 ± 3.9 μg/mL: n=30）を感度96.4%、特異度77.8%で鑑別することができた。また、MCI群 (14.846 ± 7.101μg/mL: n=20) とも感度90.0%、特異度81.5%で鑑別された（図８）。また、物忘れ外来での髄液採取時には「正常」と診断され、その後、MCIへと進行した症例およびMCIからADに進行した症例（n=7）では、iNPHに比べて、2倍の値（p=0.001）を示した。すなわち、Man-Tfはアルツハイマー病の早期より上昇することが示された。【０１２９】
Man-Tfの測定に用いた髄液試料を使って、代表的なAD診断マーカーであるリン酸化tauタンパク質（p-Tau）を測定した（n=28）。BC2LA／抗体を用いたELISA法によるMan-Tfの測定値とp-Tau値の相関を調べたところ、ADではr＝0.885の極めて強い相関を示し、MCI（n=19）でもr＝0.729の強い相関が示された。Man-Tf/p-Tauの比率は、図９に示すようにAD（147.8 ± 45.3）よりMCI（231.3 ± 89.8）で有意に高く（p < 0.001）、Man-Tfがp-Tauより早期に上昇することが示された。これは、Man-Tfが神経細胞死マーカーであるp-Tauよりも早期のAD病理に相関することを示唆している。【０１３０】
同様に、UDAレクチン／抗体を用いたELISA法によるMan-Tfの測定値とp-Tau値の相関も調べた。その結果、AD（n=28）ではr＝0.710の強い相関を示した。一方、MCI（n=19）でもr＝0.576の相関が認められた。Man-Tf/p-Tauの比率は、図１０に示すようにAD（326.9 ± 122.7）よりもMCI（474.2 ± 215.2）で高く（p=0.011）、Man-Tfがp-Tauよりも早期（MCI期）に増加することが示された。【０１３１】
以上の結果から、末端Man-TfはAD及びその進行に特有の現象と考えられた。また、MCIにおける末端Man-Tfの増加は、末端Man-TfがAD前病変の段階でも増加することを示唆している。したがって、末端Man-TfはAD治療薬の効果判定への応用が期待され得る。【０１３２】
したがって、末端Man-Tfは、他の認知症、特にiNPHとの鑑別に有用であり、また、タウオパチーの補助診断マーカーにもなりうると考えられる。
＜実施例５：抗Tf抗体を用いたアルツハイマー病脳の免疫組織化学＞
（目的）
末端Man-Tfは、ADの進行に伴って増加することが示唆されている。そこで、AD脳におけるTf糖タンパク質の発現変化を免疫組織化学により分析する。
（方法）
ADの脳組織は、15％ホルマリンを含むリン酸バッファーで固定した後、パラフィンブロックを作製した。薄切切片（5μm）を脱パラフィン後、抗Tfポリクローナル抗体（DAKO社；1：1000)と共に4℃で一晩インキュベートした。一次抗体結合部位をヒストファイン試薬（Nichirei社）にて可視化した。具体的には、切片を洗浄後、アミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab'にした第二抗体を結合させた酵素・第二抗体標識ポリマーを一次抗体に結合させて、ペルオキシダーゼ-DAB反応を行った。
（結果）
図７に結果を示す。AD脳では、抗ヒトTf抗体により星状細胞様の細胞（ｃ）が陽性像を示した。また、皮質第Ｉ層（分子層）のニューロピルに陽性線維が観察され、特に軟膜下では束状に配列していた（ｂ）。以上の結果は、TfのAD脳における病的発現を示すものと考えられる。このTfシグナルの糖鎖アイソフォームは未決定であるが、髄液中の末端Man-Tfの増加と矛盾しない結果と考えられる。【０１３３】
なお、Connorらは、抗Tf抗体による免疫組織化学によりADの「cerebral cortical white matter」の星状細胞の陽性像を報告している（J Neurosci Res. 1992 Jan;31(1):75-83）。【０１３４】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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