(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の制御配列に操作可能に連結されたＯＸＴ２タンパク質をコードする組み換え核酸配列が導入されたことで、ＯＴＸ２タンパク質を過剰発現してＯＸＴ２タンパク質の細胞内レベルを増加させるように改変された初代網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ、ＲＰＥ）細胞を含む網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項２】
ＯＴＸ２タンパク質は、天然哺乳動物ＯＴＸ２タンパク質である、請求項１に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項３】
ＯＴＸ２タンパク質は、配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１５若しくは配列番号１６に示される配列に対して少なくとも９９％の同一性を有するそれらの機能性変異体からなる又は含む、請求項１に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項４】
ＯＴＸ２タンパク質は、配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項５】
前記ＲＰＥ細胞は、１つ以上の制御配列に操作可能に連結されたＯＴＸ２タンパク質をコードする核酸配列を含む組み換えウイルスベクターを導入することで遺伝子的に改変された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項６】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項５に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項７】
前記ＲＰＥ細胞におけるＯＴＸ２タンパク質のレベルは、正規化後に、非改変ＲＰＥ細胞におけるＯＴＸ２タンパク質のレベルよりも少なくとも１．５倍高い、請求項１〜６のいずれか１項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項８】
眼内注入によって、前記ＲＰＥ細胞を必要とする対象に投与される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項９】
前記眼内注入は、目の網膜下腔への注入である、請求項８に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項１１】
眼内注入用に製剤化された、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項１２】
前記網膜変性はＲＰＥ機能障害に関する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項１３】
前記網膜変性は、網膜色素変性、加齢性黄斑変性、網膜剥離、レーベル（Ｌｅｂｅｒ）先天黒内障、糖尿病網膜症、ベスト病、スタルガルト病、及びコロイデレミアからなる群から選択される疾患によるものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【請求項１４】
前記網膜変性は網膜色素変性によるものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の網膜変性の処置に使用するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学分野に関し、特に網膜変性の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
網膜色素変性は、臨床的には２つの連続するフェイズで特徴づけられる先天的な網膜変性である。第１の症状をなす夜盲又は鳥目は、患者にとっては中程度のハンディキャップに相当し、これは、失明をもたらすことがある視界の狭窄である第２フェイズと比較されるものである。これらの２つのフェイズは、低輝度における視力を担う桿体細胞と、日中の視力の拠りどころである錐体細胞との、光受容体変性の２つの高まりからもたらされる。
【０００３】
網膜色素変性は、遺伝性網膜変性の最も一般的な形態である。これらの疾患は、その極端な異質性によって遺伝的に特徴づけられる。劣性遺伝性網膜変性の重症形態であるレーベル（Ｌｅｂｅｒ）先天黒内障は、ＲＰＥ６５遺伝子の変異からもたらされる場合に、矯正遺伝子治療による処置が成功し得るが、疾患における全体的な影響はこれらの患者に限定されるものである（Ｂｅｎｎｅｔｔ等、２０１２年）。
【０００４】
個別化治療の費用を背景として、原因遺伝子とは関連のない手法の発展がもたらされている。毛様体神経栄養因子（ciliary neurotrophic factor、ＣＮＴＦ）としての栄養因子は、ｒｄ１マウスなどの網膜色素変性のいくつかのモデルにおいて光受容体変性を抑制するために用いられることに成功している（ＬａＶａｉｌ等、１９９８年）。しかし、カプセル化細胞眼内インプラントによって送達されるＣＮＴＦを用いた臨床試験は、網膜色素変性の患者について視覚における有益性を示せていない（Ｂｉｒｃｈ等、２０１３年）。
【０００５】
移植によって受容体消失を置き換えることが想定されているが、網膜内層においてグラフト化光受容体を双極細胞に再結合する問題が、長きにわたってそのような方法の臨床的発展の妨げとなっている（Ｌｉｔｃｈｆｉｅｌｄ等、１９９７年）。この問題は、ｒｄ１マウスについては光受容体前駆体をその分化のきわめて特定の段階で移植することで解決している（ＭａｃＬａｒｅｎ等、２００６年）。残念ながら、ヒトにおけるこの光受容体分化期間のため、臨床への移行が実質的に限定されている（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄ等、２００７年）。
【０００６】
また、視力において錐体は重要な役割を果たすので、網膜色素変性における２次的な錐体消失の防止に取り組みが集中している。桿体由来の錐体生存因子（rod-derived cone viability factor、ＲｄＣＶＦ）の同定により、網膜色素変性に罹患する患者の錐体変性及び視力消失を防止するこの新規の栄養因子の投与に基づく治療的発展がもたらされている（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄ等、２００４年、Ｂｙｒｎｅ等、２０１５年）。この方法は、桿体と錐体との生理的相互作用に基づくものである。ＲｄＣＶＦをコードする遺伝子、ヌクレオレドキシン様１（ＮＸＮＬ１）は、桿体依存的に発現され、結果的に、疾患の第１フェイズにおける桿体消失に続いてスイッチオフされる（Ｒｅｉｃｈｍａｎ等、２０１０年）。網膜色素変性を引き起こす遺伝子の多くの割合のものが、錐体ではなく、ロドプシン遺伝子ＲＨＯなどの桿体によって特に発現されるので、ＲｄＣＶＦは、おそらく原因遺伝子とはほぼ関係なく適用され得る処置である（Ｂｙｒｎｅ等、２０１５年、Ｙａｎｇ等、２００９年）。
【０００７】
しかしながら、ＲｄＣＶＦは、網膜色素上皮（retinal pigmentedepithelium、ＲＰＥ）の遺伝子欠損からもたらされる網膜色素変性の処置において効果的であり得るとは考えにくい。前述のように、この構成において、健康なＲＰＥ細胞の移植は良い方法である（Ｇｏｕｒａｓ等、１９８９年）。そうした手法は理にかなっているが、今日まで、動物モデルで観察される光受容体生存と厳密に比較して、視覚機能に関して限定的に成功しているのみである（Ｄａ  Ｃｒｕｚ等、２００７年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ゆえに、網膜色素上皮の変性又は機能障害からもたらされる網膜疾患を処置するための改善された方法が大いに必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、本明細書において、ＲＰＥ細胞におけるＯＴＸ２タンパク質の細胞内レベルの増大が、光受容体生存におけるこれら細胞の移植の有益性を拡大することを示した。
【００１０】
従って、第１の態様において、本発明は、網膜変性の処置に用いるための、ＯＴＸ２タンパク質の細胞内レベルを増加させるように改変された網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に関する。
【００１１】
ＯＴＸ２タンパク質は、天然の哺乳動物ＯＴＸ２タンパク質、又はその変異体若しくは機能性フラグメントであるとよい。特に、このタンパク質は、配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はその任意の変異体若しくはフラグメントを含むか、或いは配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又はその任意の変異体若しくはフラグメントからなるとよい。好ましくは、ＯＴＸ２タンパク質は、配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むか、又は配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるものである。
【００１２】
改変されるＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞への幹細胞の分化から、好ましくは誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の分化から取得されるとよい。
【００１３】
好ましい実施形態において、ＲＰＥ細胞は、ＯＴＸ２タンパク質を過剰発現するように遺伝子的に改変される。これらの細胞は、１以上の制御配列に操作可能に連結されたＯＴＸ２タンパク質をコードする組み換え核酸配列を導入することによって、遺伝子的に改変されるとよい。特に、これらの細胞は、１以上の制御配列に操作可能に連結されたＯＴＸ２タンパク質をコードする核酸配列を含む組み換えウイルスベクター、好ましくはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はレンチウイルスベクターを導入することによって、遺伝子的に改変されるとよい。
【００１４】
好ましくは、改変ＲＰＥ細胞におけるＯＴＸ２タンパク質のレベルは、正規化後に、非改変ＰＲＥ細胞のＯＴＸ２タンパク質のレベルより少なくとも１．５倍高い。
【００１５】
好ましくは、ＲＰＥ細胞は、眼内注入によって、好ましくは目の網膜下腔に注入することによって、これを必要とする対象に投与される。
【００１６】
他の態様において、本発明はさらに、ＯＴＸ２タンパク質レベルを増加させるように改変されたＲＰＥ細胞、好ましくはＯＴＸ２タンパク質を過剰発現するように遺伝子的に改変されたＲＰＥ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。好ましくは、この医薬組成物は眼内注入用に製剤化される。
【００１７】
これらの態様において、網膜変性は、望ましくはＲＰＥ機能障害に関する。特に、網膜変性は、網膜色素変性、加齢性黄斑変性、網膜剥離、レーベル先天黒内障、糖尿病網膜症、ベスト病、スタルガルト病、及びコロイデレミアからなる群から選択される疾患によるものであり得る。好ましくは、網膜変性は網膜色素変性によるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、培養網膜色素上皮細胞には上皮間葉転換が起こることを示す。（Ａ）は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定された、培養ＲＰＥ細胞におけるα平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２）及びビメンチン（ＶＩＭ）の２つの間葉系マーカーの発現量を示す。（Ｂ）は、培養及び天然ＲＰＥ細胞間における、３７の選択遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定された発現差異を示す。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して、及び天然ＲＰＥ細胞におけるそれら自体の発現レベルに対してデータを正規化した。平均と標準偏差（ＳＤ）。(ｎ＝３、分散分析検定）。（Ｃ）は、天然及び培養ＲＰＥ細胞におけるＯＴＸ２発現のウェスタンブロッティング解析を示す。（Ｄ）は、網膜剥離（retinal detachment、ＲＤ）後の患者及び死後の正常標本におけるＯＴＸ２、ＫＣＮＪ１３及びＶＩＭの発現を示す。各データポイントは平均と平均の標準誤差（ＳＥＭ）、分散分析として処理された（ｎ＝１９、ｔ検定、ウェルチ補正）。（Ｅ）は、ｒ＝０．４６、Ｐ＜０．００３のピアソン相関、及びＰ＜０．０００１の直線回帰を示す。（Ｆ）は、ＲＤ及びコントロール標本においてロバストマルチアレイ平均（robustmulti-array average、ＲＭＡ）を用いて正規化したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータを用いた発現速度を示す。早期ＲＤは１週間未満、中期ＲＤは１週間〜３ヵ月、後期ＲＤは３ヵ月より長い（ダネット分散分析検定）。
【図２】図２は、網膜色素上皮における新規のＯＴＸ２標的遺伝子の特定を示す。（Ａ）は、記載されるように組み換えＡＡＶベクターに感染させたＲＰＥ細胞における、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＯＴＸ２遺伝子発現解析を示す。（Ｂ）は、ＧＦＰ及びＯＴＸ２に感染させたＲＰＥ細胞におけるＶＩＭの発現を示す。ｎ＝４。（Ｃ）は、ＧＦＰ及びＯＴＸ２形質導入培養ＲＰＥ細胞におけるＶＩＭのウェスタンブロット解析を示す（ｎ＝３）。（Ｄ）は、ＯＴＸ２及びＯＴＸ２Ｌ形質導入ＲＰＥ細胞における相対定量的ＲＴ−ＰＣＲを示す。データは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して及び天然ＲＰＥ細胞におけるそれら自体の発現レベルに対して正規化した。平均と標準偏差（ＳＤ）（ｎ＝３、分散分析検定）。（Ｅ）は、解析したプロモーターにおける予測ＯＴＸ２結合要素の位置を示す。（Ｆ）は、未感染ＲＰＥ細胞におけるクロマチン免疫沈降を示す。-ＩｇＧは免疫グロブリンなし、＋ＩｇＧは非免疫免疫グロブリンを示す。
【図３】図３は、ＯＴＸ２がヒトＲＰＥ細胞においてＫＣＮＪ１３、ＲＤＨ１０及びＳＬＣ１６Ａ８の発現を誘導することを示す。（Ａ）は、記載されるように組み換えＡＡＶベクターに感染させたｉＰＳ−ＲＰＥ細胞における、定量的ＲＴ−ＰＣＲによるＯＴＸ２発現量を示す。データは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して及び天然ＲＰＥ細胞におけるそれら自体の発現レベルに対して正規化された。平均と標準偏差（ＳＤ）（ｎ＝３、分散分析検定）。（Ｂ）は、記載されるように組み換えＡＡＶベクターに感染させたｉＰＳ−ＲＰＥ細胞における、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる候補遺伝子発現量を示す。データは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して及び天然ＲＰＥ細胞におけるそれら自体の発現レベルに対して正規化した。平均と標準偏差（ＳＤ）（ｎ＝３、分散分析検定）。
【図４】図４は、ＲＣＳラットにおけるＯＴＸ２を過剰発現する遺伝子的改変ＲＰＥ細胞のグラフティングは、光受容体機能を向上することを示す。（Ａ）は、非処置の目とＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２グラフトで移植した目との暗順応網膜電図（electroretinogram、ＥＲＧ）比較を示す。（Ｂ）は、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２をグラフト化目におけるｂ波反応に対する潜時の比較を示す。各ポイントは平均とＳＥＭとして示される（ｎ＝７、ボンフェローニ分散分析）。（Ｃ）は、未処置の目（白色棒）並びにＲＰＥ−ＧＦＰ（薄い灰色）及びＲＰＥ−ＯＴＸ２（濃い灰色）グラフト化目の明順応ＥＲＧを示す。（Ｄ）は、未処置の目（白色棒）並びにＲＰＥ−ＧＦＰ（薄い灰色）及びＲＰＥ−ＯＴＸ２（濃い灰色）グラフト化目のフリッカーＥＲＧを示す。グラフト化・未注入目（ｎ＝７、ウィルコクソンの符号付順位和検定）、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２（ｎ＝７、対応のないコルモゴロフ‐スミルノフ検定）の統計的検定において、ポイントは平均とＳＥＭとを示す。
【図５】図５は、移植後のＲＣＳラットの視覚挙動の向上を示す。（Ａ）は、視動性チャンバを示す。（Ｂ）は、Ｏｐｔｏｍｏｔｒｙのセットアップを示す。ＣＷ（時計回り回転、左目が反応する）、ＣＣＷ（反時計回り回転、右目が反応する）。（Ｃ）は視力を表す。（Ｄ）は、コントラスト感度を表す。ポイントは平均とＳＥＭとして示される（ｎ＝７、ウィルコクソンの符号付順位和ｔ検定）。
【図６】図６は、光干渉断層撮影（optical coherence tomography、ＯＣＴ）を用いて、ジストロフィー性ラットのＲＰＥ−ＯＴＸ２処置の目における外顆粒層（outer nuclear layer、ＯＮＬ）の保護を示す。（Ａ）は、野生型（ｒｄｙ＋／＋）目、ジストロフィー性未処置目、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２グラフト化目のＯＣＴ切片を示す。（Ｂ）は、ジストロフィー性未注入目、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２グラフト化目の平均外顆粒層（ＯＮＬ）厚の３Ｄ表示である。（Ｃ）は、未注入目と、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２グラフト化目とのＯＮＬ厚の比較を示す。平均と最小及び最大（マン・ホイットニー検定）。（Ｄ）は、未注入目、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２グラフト化目におけるＯＮＬ厚み頻度分布を示す。（Ｅ）は、目の中央部分における側頭−鼻側及び背側−腹側ＯＮＬ厚のＯＮＬ厚割合（野生型に対する％）の比較を示す。測定値は各群の目の平均とＳＥＭとして示される（ウィルコクソンの符号付順位和ｔ検定）。Ｔは側頭側、Ｎは鼻側、Ｄは背側、Ｖは腹側を示す。
【図７】図７において、ヘマトキシリン及びエオジン切片は、ＲＰＥ−ＯＴＸ２を移植した目におけるＯＮＬ厚が大きくなるという改善を示す。
【図８】図８は、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２細胞の生存性活性を示す。（Ａ）は、ＧＦＰ及びＯＴＸ２形質導入ブタ初代ＲＰＥ細胞の上清の生存活性を示す。コントロールは、非細胞インキュベート馴化培地を示す。結果は４つの独立的実験の合計を示す。＃：コントロールに対してのみ有意である。ポイントは平均とＳＥＭとして示される（ｎ＝６、ホルム・シダック多重比較分散分析）。（Ｂ）は、記載されるように組み換えＡＡＶベクターに感染させたＲＰＥ細胞におけるＣＮＴＦ及びＢＤＮＦの発現を示す。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた。コントロールＡＡＶ−ＧＦＰ形質導入細胞における発現レベルによってデータを正規化した。平均とＳＤ（ｎ＝３、分散分析検定）。
【図９】図９は、非分化ｉＰｓ、分化ヒトｉＰｓ由来ＲＰＥ細胞及びヒト成人ＲＰＥ細胞におけるＲＰＥ特異的遺伝子マーカーの相対発現量を示す。データは平均とＳＤとして示される。
【図１０】図１０は、非注入及び移植ｒｄｙ−／−ラットにおけるＥＲＧ振幅比較を示す。（Ａ）は、野生型（ｒｄｙ＋／＋）ＲＣＳラットの特徴的ＥＲＧトレースを示す。（Ｂ）は、非注入ジストロフィー性ラット、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２グラフト化動物において、注入後４２日に記録された特徴的ＥＲＧ振幅を示す。（Ｃ）は、野生型、ジストロフィー性非注入、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２グラフト化動物のＥＲＧ記録の比較を示す。
【図１１】図１１は、外科的処置を示す。
【図１２】図１２は、天然ＲＰＥ細胞に対する培養ＲＰＥ細胞の相対発現量を示す。天然ＲＰＥ細胞における発現によって培養ＲＰＥ細胞における相対発現（２−ΔΔＣｔ）を正規化した。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた。統計的分析（グラフパッドプリズム、多重ｔテスト、ホルム・シダック法、α=１．０００％、ｎ＝生物学的３連）。
【図１３】図１３は、コントロール形質導入ＲＰＥ細胞に対する、ＡＡＶ−Ｏｔｘ２、Ｏｔｘ２Ｌ形質導入ＲＰＥ細胞における相対発現量を示す。ＡＡＶ−Ｏｔｘ２及びＡＡＶ−Ｏｔｘ２Ｌで形質導入した培養ＲＰＥ細胞における遺伝子の相対発現量（２−ΔΔＣｔ）をコントロール細胞（ＡＡＶ−ＧＦＰ形質導入ＲＰＥ）における発現によって正規化した。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを用いた。統計的分析（グラフパッドプリズム、２要因の分散分析、ダネット検定、α=１．０００％、ｎ＝生物学的３連）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、ＲＰＥ細胞によるＯＴＸ２の過剰発現が、光受容体生存におけるこれらの細胞移植の有用性を向上させることを本明細書において示した。実際に、発明者等は網膜色素変性のインビボモデルを用いて、ＯＴＸ２をコードする組み換えアデノ随伴ウイルスベクターに感染させたＲＰＥ細胞のグラフティングが、非過剰発現ＯＴＸ２ＲＰＥ細胞のグラフティングと比較して、外顆粒層（ＯＮＬ）厚を顕著に増加させ、このモデルにおける光受容体の反応性及び生存性を向上するということを示した。これらの結果に基づいて、ＯＴＸ２過剰発現ＲＰＥ細胞のグラフティングは、網膜変性症の、特に例えば加齢性黄斑変性、レーベル先天黒内障、又は網膜色素変性などのＲＰＥ層機能不全によって実質的に引き起こされる疾患の、有用性が高い治療になり得ると考えられる。
【００２０】
ゆえに第１の態様において、本発明は、網膜変性の処置に用いるための、ＯＴＸ２タンパク質の細胞内レベルを増加させるように改変された網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に関する。
【００２１】
オルソデンティクルホメオボックス２タンパク質又はホメオボックスタンパク質ＯＴＸ２としても知られるＯＴＸ２タンパク質は、転写因子である。このタンパク質は、脳、頭蓋顔面、及び感覚器官の発達において役割を果たしている。網膜発達時において、ＯＴＸ２はＲＰＥ特異化、並びに光受容体及び双極細胞の分化及び成熟を調節する。ＯＴＸ２発現は、生涯をとおしてこれらの３つの細胞型において維持される（Ｆｏｓｓａｔ等、２００７年）。
【００２２】
多くの異なる哺乳動物ＯＴＸ２タンパク質のアミノ酸配列が既知であり、ヒト、ブタ、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ウサギ、又はラットが挙げられるがこれらに限定されない。また該アミノ酸配列は配列データベースにおいて容易に見い出される。
【００２３】
本明細書において、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換的に用いられ、アミノ酸鎖を形成するアミノ酸数に関わらず、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸鎖に関する。
【００２４】
本発明によるＲＰＥ細胞において増大細胞内レベルを有するＯＴＸ２タンパク質は、天然の哺乳動物ＯＴＸ２タンパク質、又はその変異体若しくは機能性フラグメントであってよい。
【００２５】
本明細書に用いられるように、「天然の哺乳動物ＯＴＸ２タンパク質」という用語は、哺乳動物ＯＴＸ２タンパク質の、特にヒト、ブタ、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、マウス、ウサギ、又はラットのＯＴＸ２タンパク質の、任意の天然に発生した選択的スプライスアイソフォーム、又は任意の天然に発生した対立形態を含む。
【００２６】
本明細書に用いられるように、「ＯＴＸ２タンパク質変異体」という用語は、天然ＯＴＸ２タンパク質由来であり、且つ１以上（例えば複数）の位置における改変、つまり置換、挿入、及び／又は削除を含むがＯＴＸ２活性を残存させる、ポリペプチド配列に関する。変異体は、当該技術において既知の種々の技法により取得されるとよい。特に、天然タンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変するための技法の例として、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、及び合成オリゴヌクレオチド構成を含むがこれらに限定されない。
【００２７】
好ましくは、本明細書に用いられるように、「変異体」という用語は、天然配列に少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。本明細書に用いられるように、「配列同一性」又は「同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列のアライメントからの配置の一致数（％）（同一のアミノ酸残基）に関する。配列同一性は、配列ギャップを最小化しながらオーバーラップ及び同一性を最大化するようにアライメントした時に配列を比較することで決定される。特に、配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、多くの数学的なグローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムのいずれかを用いて、決定されるとよい。同様の長さの配列は、最も有利には長さ全体にわたり配列をアライメントするグローバルアライメントアルゴリズム（例として、ニードルマン・ウンシュアルゴリズム、ニードルマン及びウンシュ、１９７０年）を用いて好ましくはアライメントされ、一方で、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例として、スミス・ウォーターマンアルゴリズム（スミス及びウォーターマン、１９８１年）又はアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）アルゴリズム（アルトシュル他、１９９７年、アルトシュル他、２００５年）を用いて好ましくはアライメントされる。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアライメントは、当該技術の範囲内である種々の方法でおこなわれ得、例えば、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/、又はhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/などのインターネット上のウェブサイトにおいて公衆に利用可能なコンピュータソフトウエアが用いられる。当業者は、比較される配列全長にわたって最大のアライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的のため、アミノ酸配列同一性率値はペアワイズシーケンスアライメントプログラムであるＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅを用いて生成された値に関し、該ペアワイズシーケンスアライメントプログラムは、全ての検索パラメータがデフォルト値に設定される、即ち、スコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープン＝１０、ギャップエクステンド＝０．５、エンドギャップペナルティ＝偽、エンドギャップオープン＝１０、及びエンドギャップエクステンド＝０．５に設定される、ニードルマン・ウンシュアルゴリズムを用いて、２つの配列の最適なグローバルアライメントを求める。
【００２８】
さらに好ましくは、「変異体」という用語は、３０、２５、２０、１５、１０、又は５未満の置換、挿入、及び／又は削除によって天然配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。好ましい実施形態において、変異体は、１つ以上の保存的置換、好ましくは１５、１０又は５未満の保存的置換によって天然配列とは異なる。保存的置換の例は、塩基性アミノ酸群（アルギニン、リジン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸群（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疏水性アミノ酸群（メチオニン、ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸群（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに小型アミノ酸群（グリシン、アラニン、セリン及びトレオニン）内のものである。
【００２９】
本明細書において用いられるように、「機能性フラグメント」という用語は、天然ＯＴＸ２タンパク質又は上述で規定したような変異体における少なくとも１００、１５０、２００、又は２５０の連続するアミノ酸を含み、ＯＴＸ２活性を示す、該タンパク質又は変異体のフラグメントに関する。好ましくは、フラグメントは、ＯＴＸ２タンパク質のＮ末端における少なくとも１００の連続するアミノ酸、即ち転写調節活性に関与するＤＮＡ結合ドメインを含む。
【００３０】
変異体又はフラグメントのＯＴＸ２活性は、当業者には既知の任意の方法によって評価されるとよい。例として、ＯＴＸ２活性は、以下に実験の項において詳細に記載され、Ｒｅｉｃｈｍａｎ等、２０１０年、Ｄｏｒｖａｌ等、２００６年、及びＰａｔｔｅｎｄｅｎ等、２００２年に先述されるように、クロマチン免疫沈降法（chromatin immunoprecipitation、ＣｈＩＰ）を用いて評価されるとよい。またＴＹＲＰ１プロモーターは、ＯＴＸ２タンパク質を結合しその結果その転写因子活性を促進するＯＴＸ２調節エレメントを含むことが報告されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒａｌｅｓ等、２００３年）。このように、ＴＹＲＰ１プロモーターＤＮＡと変異体又はフラグメントとの免疫共沈降法は、ＯＴＸ２調節エレメントに結合して転写を促進する能力をこの変異体又はフラグメントが保持することを示す。ＯＴＸ２活性は、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒａｌｅｓ等（２００３年）の文献に記載されるような遺伝子レポーターアッセイを用いて評価されてもよい。
【００３１】
所定の実施形態では、本発明によるＲＰＥ細胞において細胞内レベルの増大を示すＯＴＸ２タンパク質は、ヒトＯＴＸ２タンパク質又はその変異体若しくはフラグメントである。
【００３２】
ヒトＯＴＸ２タンパク質は、遺伝子ＯＴＸ２（遺伝子ＩＤ：５０１５）によってコードされ、ＣＰＨＤ６又はＭＣＯＰＳ５としても知られる。選択的スプライシングにより、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１２５７４５２．１（アイソフォームｂ、２８９アミノ酸長、配列番号１５）及びＮＰ＿００１２５７４５４．１（アイソフォームａ、２９７アミノ酸長、配列番号１６）によって特定されるような、ＯＴＸ２タンパク質の２つの別のアイソフォームをコードする、複数の転写変異体がもたらされる。
【００３３】
ＯＴＸ２タンパク質は、配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は任意のその変異体若しくはフラグメントを含む、或いは配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列、又は任意のその変異体若しくはフラグメントからなる。好ましくは、ＯＴＸ２タンパク質は、配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号１５若しくは配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる。
【００３４】
網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、下層の脈絡膜（即ち網膜の後ろの血管層）と上層の網膜視細胞（即ち光受容体）との間において神経感覚網膜外部にある色素性細胞層である。
【００３５】
ＲＰＥ細胞は、黒色色素性細胞の玉石状細胞形態によって特徴づけられる。ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ６５、転写因子ＭＩＴＦ、密着結合タンパク質ＺＯ−１（ＴＪＰ１）、ベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ、ＢＥＳＴ１）、ＭＥＲＴＫ、ＲＤＨ１０、及び色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を含む複数のＲＰＥマーカーを発現する。
【００３６】
好ましくは、本発明に用いられるＲＰＥ細胞は、哺乳動物ＲＰＥ細胞であり、より好ましくはヒトＲＰＥ細胞である。
【００３７】
実施形態において、ＲＰＥ細胞はドナー（例えば屍体の目のドナー）から、又は処置される対象から取得される。好ましくは、ＲＰＥ細胞は処置される対象から取得される。この場合、ＲＰＥ細胞は対象から採取され、その後、ＯＸＴ２タンパク質の細胞内レベルを増大させるように改変されて同じ対象に再注入される（自家移植）。
【００３８】
他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は、幹細胞、好ましくはヒト幹細胞のＲＰＥ細胞への分化から取得される。ＲＰＥ細胞への分化に適した幹細胞の例は、胚性幹細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、成体幹細胞、造血細胞、胎児幹細胞、間葉系幹細胞、分娩後幹細胞、複能性幹細胞、又は胚性生殖細胞を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
好ましくは、幹細胞は、多能性幹細胞、即ち胚体外組織を含まないヒト又は動物の身体の全ての細胞型に分化する可能性を有する幹細胞である。これらの幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の両方を含む。
【００４０】
ヒト胚性幹細胞からＲＰＥ細胞を作製することには倫理的問題があり得る。一実施形態において、胚性幹細胞は非ヒト胚性幹細胞である。他の実施形態において、ヒト胚性幹細胞は、方法自体又は任意の関連する行為がヒト胚の破壊を包含しないという条件で用いられるとよい。
【００４１】
誘導多能性幹細胞は、特定遺伝子の強制的発現を誘導することで（例えばヒト細胞におけるＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８）、非多能性細胞、通常は成体体細胞から人工的に派生させた幹細胞である。ｉＰＳ細胞使用の一有利性は、全体で胚性細胞の関与を回避し、ゆえにそのいずれの倫理的問題も回避されることである。
【００４２】
従って、好ましい実施形態において、ＲＰＥ細胞はｉＰＳ細胞由来ＲＰＥ細胞である。ｉＰＳ細胞は、処置される対象又は他の対象から取得されるとよい。好ましくは、ｉＰＳ細胞は処置される対象の細胞由来、特にその対象の線維芽細胞由来である。
【００４３】
ＲＰＥ細胞は、当業者には既知の任意の分化方法を用いてｉＰＳ細胞から取得されるとよい。特にそうしたＲＰＥ細胞は、Ｒｅｉｃｈｍａｎ等（２０１４年）の文献に記載のプロトコルを用いて、ヒトｉＰＳ細胞から取得されるとよい。簡潔に記載すると、線維芽細胞がＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ及びＫＬＦ４遺伝子を発現するエピソームベクターで遺伝子導入され、ＲＰＥ細胞がコンフルエントのｉＰＳ細胞の分化によって取得される。
【００４４】
ＲＰＥ細胞は、用いられる幹細胞型に応じて、当業者には既知の任意の方法、例えばＲｅｉｃｈｍａｎ等（２０１４年）の文献又は国際出願公開第２０１１／０６３００５号に記載の方法などを用いて幹細胞から作製されるとよい。
【００４５】
本発明において使用されるＲＰＥ細胞は、ＯＴＸ２タンパク質の細胞内レベルを増大させるように改変される。ＯＴＸ２タンパク質の細胞内レベルは、非改変ＲＰＥ細胞のレベルと比較して増加する。これらのＲＰＥ細胞は、それを必要とする対象に投与される前にインビトロ又はエクスビボで改変される。
【００４６】
本明細書に用いられるように、「改変されたＲＰＥ細胞」という用語は、ＯＴＸ２タンパク質の細胞内レベルを増大させるように遺伝子的又は化学的に改変されたＲＰＥ細胞に関する。
【００４７】
実施形態において、ＯＴＸ２タンパク質の細胞内レベルは、このタンパク質を細胞に直接的導入することで増加される。細胞に導入されるタンパク質は、上述のような任意のＯＴＸ２タンパク質であり得、特に天然の哺乳動物の、好ましくはヒトのＯＴＸ２タンパク質、又はその変異体若しくは機能性フラグメントであり得る。
【００４８】
好ましくは、改変ＲＰＥ細胞におけるＯＴＸ２タンパク質の細胞内レベルは、非改変ＲＰＥ細胞のレベルよりも少なくとも１．５倍高い、又は２、３、４、５倍高い。
【００４９】
ＯＴＸ２は、数多くのホメオタンパク質のように、細胞に自然に形質導入を行うことが可能である。しかしながら、任意的に、細胞膜を超えて細胞内へのＯＴＸ２タンパク質の進入を容易にするために、上述のタンパク質は細胞透過性ペプチドに融合されるとよい。数多くの細胞透過性ペプチドが当該技術において既知であり（例えば、Ｄｅｓｈａｙｅｓ等、Cell. Mol. Life Set、2005、62: 1839-1849; Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ等、Curr. Pharm.Design、2005、11: 3597-3611; Ｍａｅ及びＬａｎｇｅｌ、Curr. Opin. Pharmacol、2006、6: 509-514参照）、本発明に用いられ得る。
【００５０】
代替的に、ＯＴＸ２タンパク質はまた、天然進入タンパク質（例えばプロタミン、ヒストン、抗体）、ウイルス構造（例えばヘルペスＶＰ２２）、タンパク質遺伝子導入試薬（例えばＣｈａｒｉｏｔ、Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ、ＴｒａｎｓＰａｓｓ  Ｐ、ＰｒｏｔｅｏＪｕｉｃｅ、ＰＵＬＳｉｎ）、カチオン性脂質、ナノ粒子（例えば乳酸グリコール酸共重合体）、デンドリマー、ポリカチオン、又は小分子担体（例えば、Ｏｋｕｙａｍａ等、Nat Methods. 2007 Feb;4(2): 153-9）などの内在化担体と組み合わせてＲＰＥ細胞に導入されるとよい。ＯＴＸ２タンパク質は細胞への注入にも関する。
【００５１】
好ましい実施形態において、本発明に従って用いられるＲＰＥ細胞は、ＯＴＸ２タンパク質を過剰発現するように遺伝子的に改変される。
【００５２】
上述のようなＯＴＸ２タンパク質の発現レベルは、当業者には既知の任意の方法を用いて、ＲＰＥ細胞において産生されるＯＴＸ２タンパク質量を測定することで決定されるとよい。通常は、これらの方法は、細胞試料、好ましくは細胞溶解物を、試料に存在するＯＴＸ２タンパク質と選択的に相互作用可能な結合パートナーに接触させることを含む。結合パートナーは、通常、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体である抗ＯＴＸ２は市販で入手可能である（例えば、抗ＯＴＸ２抗体ａｂ９５６６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。タンパク質量は、例えば、準定量的ウエスタンブロットや、ＥＬＩＳＡなどの酵素標識及び媒介性免疫測定法、ビオチン・アビジン型アッセイ、放射性免疫測定法、免疫電気泳動法、若しくは免疫沈降法によって、又はタンパク質アレイ若しくは抗体アレイによって測定されるとよい。反応は、蛍光、化学発光、放射性、酵素性の標識若しくは染色分子などの明らかにする標識、又は、抗原及びそれらと反応する抗体における複合体形成を検出する他の方法を含む。
【００５３】
ＯＴＸ２の発現レベルは、ＯＴＸ２ｍＲＮＡ量を測定することで決定されてもよい。ｍＲＮＡ量を測定する方法は当該技術において既知である。例として、試料に含有される核酸は、例えば溶菌酵素若しくは化学溶液を用いて標準的方法によってまず抽出される、又は製造者の指示に従って核酸結合樹脂によってまず抽出される。そして、抽出されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（例えばノーザンブロット解析）、及び／又は増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出される。定量的又は準定量的ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。ヒトＯＴＸ２ｍＲＮＡの定量化に用いられ得るプライマーペアの例は、フォワードプライマー5’-CTTCCTACTTTGGGGGCATGGACTGTG-3’（配列番号１７）及びリバースプライマー5’-GCATTGGTACCCATGGGACTGAGTGTG-3’（配列番号１８）で構成されるものである。その他の適切なプライマーは当業者により容易に設計され得る。
【００５４】
本明細書に用いられるように、「過剰発現する」又は「過剰発現」という用語は、正規化後に、非遺伝子的改変ＲＰＥ細胞の発現レベルより少なくとも１．５倍高い、又は２、３、４、５倍高い発現レベルに関する。発現レベルは、ＲＰＬＰＯ（酸性リボソームリン酸タンパク質ＰＯ（acidicribosomal phosphoprotein PO）、ＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、又はβアクチンなどの安定的な発現を行うことで知られるタンパク質の発現レベルを用いて正規化されるとよい。
【００５５】
ＲＰＥ細胞におけるＯＴＸ２タンパク質過剰発現は、ＯＴＸ２をコードする内在性遺伝子の転写を増大させること、ＯＴＸ２タンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセット若しくはベクターを導入すること、ＯＴＸ２をコードするｍＲＮＡの翻訳を増大させること、及び／又はＯＴＸ２をコードするｍＲＮＡの分解を減少させることなどによって、当業者に既知の任意の方法によって取得されるとよい。
【００５６】
一実施形態において、ＲＰＥ細胞は、ＯＴＸ２をコードする内在性遺伝子の転写を増大させるように遺伝子的に改変される。特に、ＯＴＸ２をコードする遺伝子の転写は、そのプロモーターを改変又は置換することで増大され得る。例として、遺伝子のプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、又はホスホグリセレート（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）キナーゼプロモーターなどの強力な構成的プロモーターによって置換されるとよい。
【００５７】
他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は、ＯＴＸ２をコードする核酸配列を含む発現カセット又は発現ベクターを、該細胞に導入することによって遺伝子的に改変される。
【００５８】
核酸配列は、上述のようなＯＴＸ２タンパク質、特に天然の哺乳動物の、好ましくはヒトのＯＴＸ２タンパク質、又はその変異体若しくは機能性フラグメントをコードする任意の核酸配列であってよい。
【００５９】
多くの異なる哺乳類ＯＴＸ２タンパク質のコード配列は既知であり、ヒト、ブタ、チンパンジー、イヌ、ウシ、マウス、ウサギ、又はラットが挙げられるがこれらに限定されず、配列データベースにおいて容易に見出され得るものである。代替的に、コード配列は、ポリペプチド配列に基づいて当業者によって容易に決定され得る。
【００６０】
好ましくは、核酸配列は、ＲＰＥ細胞における該核酸の発現をもたらす１つ以上の制御配列に操作可能に連結される。
【００６１】
制御配列は、ＲＰＥ細胞に認識されるプロモーターを含むとよい。プロモーターは、ＯＴＸ２タンパク質発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、ＲＰＥ細胞における転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであり、変異、トランケート、及びハイブリッドプロモータを含むとよい。プロモーターは、構成的プロモーター又は誘導的プロモーターであり、好ましくは構成的プロモーターであり、より好ましくは強力な構成的プロモーターであるとよい。プロモーターはまた、組織特異的であってよく、特にＲＰＥ細胞に特異的であってもよい。適切なプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、又はホスホグリセレート（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒｏｌ）キナーゼプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、組織メタロプロテイナーゼ阻害物質３（Ｔｉｍｐ３）プロモーター、及びチロシナーゼプロモーターを含むが、これらに限定されない。好ましくは、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【００６２】
制御配列は、適切な転写開始、転写終了、及び転写エンハンサ配列；スプライシングやポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡ処理シグナル；細胞質ｍＲＮＡ安定化配列；転写効率向上配列（つまり、コザックコンセンサス配列）、及び／又はタンパク質安定性向上配列も含むとよい。例えば自然性、構成的、誘導的及び／又は組織特異的であるものなどの多数の発現制御配列が当該技術において既知であり、ＯＴＸ２をコードする核酸配列の発現を促進するために使用されるとよい
通常、発現カセットは、転写プロモーター及び転写ターミネーターに操作可能に連結されたＯＴＸ２をコードする核酸配列を含むか、又は該核酸配列からなる。
【００６３】
核酸配列又は発現カセットは発現ベクターに含まれるとよい。ベクターは、自己複製ベクター、つまり、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体である、染色体外成分として存在してその複製が染色体複製とは別であるベクターであるとよい。ベクターは自己複製を確実にする任意の手段を含むとよい。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、ベクターが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってよい。
【００６４】
適切なベクターの例は、組み換えの組み込み又は非組み込みウイルスベクター、並びに組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ由来のベクターを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ベクターは組み換えの組み込み又は非組み込みウイルスベクターである。組み換えウイルスベクターの例は、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（Adeno-associated virus）、又はウシパピローマウイルス由来のベクターを含むが、これらに限定されない。
【００６５】
好ましくは、ＲＰＥ細胞は、組み換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はレンチウイルスベクターを用いて、つまり、１つ以上の制御配列に操作可能に連結されたＯＴＸ２タンパク質をコードする核酸配列を含む組み換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、又はレンチウイルスベクターを該細胞に導入することで、遺伝子的に改変される。好ましい実施形態において、ベクターは、組み換えアデノ随伴ウイルスベクターであり、より好ましくはアデノ随伴ウイルス２由来ベクターである。非天然の改変変異体及びキメラＡＡＶが用いられてもよい。特に、キャプシドタンパク質は、形質導入効果を向上する１つ以上のアミノ酸置換を含む変異体であってよい。ＡＡＶ粒子は、同じセロタイプ又は混合セロタイプ（つまりシュードタイプ化ＡＡＶ）のウイルスタンパク質及びウイルス核酸を含むとよい。例として、組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ１キャプシドタンパク質を含む、ＡＡＶセロタイプ２/１ハイブリッド組み換え遺伝子導入系であるとよい。当業者にとって、そうしたベクター、並びにその構築及び使用方法は既知であり、国際出願公開第０１／８３６９２号が参照される。
【００６６】
核酸構築物、発現カセット又はベクターは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン遺伝子導入法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法、リポフェクション法、又はウイルス感染法を含むがこれらに限定されない任意の既知の技術を用いて、ＲＰＥ細胞に移行されるとよい。
【００６７】
上述の核酸構築物、発現カセット又はベクターは、異所性形態において改変ＲＰＥ細胞内で保持されるか、又はゲノムに組み込まれるとよい。
【００６８】
上述のような改変ＲＰＥ細胞は、網膜変性の処置に用いられる。
【００６９】
好ましい実施形態において、網膜変性はＲＰＥ機能障害に関連する。
【００７０】
ＲＰＥ細胞は血液網膜関門の主要要素をなし、ＲＰＥにおける密着結合及び接着結合の健常性欠失により光受容体ホメオスタシスが破壊され得る。ＲＰＥ細胞はまた、通常は光受容体によって脱落される外節先端を貪食し、ライト及びヒートシンクとして機能するためにメラノソームを生成し、栄養因子を提供し、視物質を再生する。
【００７１】
本明細書に用いられるように、「ＲＰＥ機能障害」という用語は、任意のこれらの機能が障害されることに関し、メラノソームの光退色、リポフスチン顆粒の蓄積、外節貪食の障害、ドルーゼンの形成、及び／又は血液網膜関門の崩壊を引き起こし得るものである。ＲＰＥ機能障害は、網膜色素変性、加齢性黄斑変性、網膜剥離、レーベル先天黒内障、糖尿病網膜症、ベスト病、スタルガルト病又はコロイデレミアなどの種々の変性網膜疾患の根底にある原因として知られる。ＲＰＥ機能障害は、ＲＰＥ６５、ＭＥＲＫＴ、ＢＥＳＴ１、ＣＲＢ１、ＫＣＮＪ１３、ＬＲＡＴ、ＭＡＫ、ＲＰ１Ｌ１、ＲＧＲ、ＲＤＨ１２若しくはＯＴＸ２などのＲＰＥ細胞特異的遺伝子における変異によるもの、又はＲＰＥ細胞アポトーシスの増加によるものであり得る。これらの変異又はアポトーシス度は、当業者に既知の任意の方法で評価されるとよい。
【００７２】
一実施形態において、網膜変性は、網膜色素変性、加齢性黄斑変性、網膜剥離、レーベル先天黒内障、糖尿病網膜症、ベスト病、スタルガルト病及びコロイデレミアからなる群から選択される疾患によるものである。望ましくは、網膜変性は網膜色素変性によるものである。
【００７３】
さらなる態様において、本発明はまた、上述のような改変ＲＰＥ細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００７４】
医薬組成物は、投与経路に従って薬学的に許容される担体において製剤化される。
【００７５】
好ましくは、組成物は、特に目の網膜下腔に、眼内注入によって投与されるように製剤化される。そうした投与に適する医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、溶質、又は懸濁若しくは増粘剤を含み得る、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張水溶液若しくは滅菌等張非水溶液（例えば平衡塩溶液（balanced salt solution、ＢＳＳ））、分散剤、懸濁剤、又は乳剤、又は使用直前に注入可能な滅菌溶液若しくは分散剤へと再構成され得る滅菌散剤と組み合わせた、ＲＰＥ細胞を含むとよい。
【００７６】
任意的に、改変ＲＰＥ細胞を含む組成物は、細胞保管に適切な任意の温度で保管用に凍結されるとよい。例えば、細胞は、約−２０℃、−８０℃、又は任意の他の適切な温度で凍結されるとよい。極低温で凍結された細胞は、適切な容器において保管され、細胞損傷リスクを低減するため及び解凍において細胞が生存する可能性を最大化するために保管用に調製されるとよい。代替的に、細胞は、冷蔵室温で、例えば約４℃で保持されてもよい。
【００７７】
投与される改変ＲＰＥ細胞量は、当業者には既知の標準的方法によって定められるとよい。患者の生理的データ（例えば年齢、寸法及び体重）、及び処置される疾患のタイプ及び重症度は、適切な用法を決定するために考慮される必要がある。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、単一の用量又は複数の用量で投与されるとよい。各単位用量は、例えばμｌ当たり１０，０００〜５０，０００の改変ＲＰＥ細胞を含有するとよい。
【００７９】
医薬組成物は、副腎皮質ステロイド、抗生剤、鎮痛剤、免疫抑制剤、栄養因子、又はそれらの任意の組合せなどの１又は複数の添加活性化合物をさらに含むとよい。
【００８０】
本発明において用いられるＲＰＥ細胞のすべての実施形態は、この態様においても考慮される。
【００８１】
他の態様において、本発明はまた、処置を必要とする対象の網膜変性を処置する方法にも関し、該方法は、治療有効量の、ＯＴＸ２の細胞内レベルを増大させるように改変されたＲＰＥ細胞、好ましくはＯＴＸ２を過剰発現するように遺伝子的に改変されたＲＰＥ細胞を投与すること、又は本発明の医薬組成物を投与することを含む。
【００８２】
本明細書に使用されるように、「対象」という用語は動物に関し、好ましくはヒト、ブタ、チンパンジー、イヌ、ネコ、ウシ、マウス、ウサギ、又はラットを含む哺乳動物に関する。より好ましくは、対象は、成人、子供、及び出生前段階のヒトを含むヒトである。
【００８３】
本明細書に使用されるように、「処置」、「処置する」又は「処置すること」という用語は、疾患の治療、防止、予防及び遅延などの、患者の健康状態を改善することを意図した任意の行為に関する。所定の実施形態において、そうした用語は、疾患又は疾患に関連した症状の改善又は根絶に関する。他の実施形態において、この用語は、そうした疾患を有する対象に１つ以上の治療剤を投与することからもたらされる疾患の広がり又は疾患悪化を最小化することに関する。
【００８４】
特に、「網膜変性の処置」という用語は、特に網膜電図記録における桿体細胞反応の増大を伴う、光受容体の光検出能力の保存又は改善に関し得る。この用語は、外顆粒層厚の増大にも関し得る。
【００８５】
「治療有効量」とは、網膜変性の上述のような処置を構成するために十分である、対象に投与される改変ＲＰＥ細胞量を意図する。
【００８６】
本発明の網膜変性を処置する方法において、医薬組成物又はＲＰＥ細胞は、好ましくは眼内に投与され、より好ましくは目の網膜下腔に注入することで投与される。
【００８７】
本発明の方法は、少なくとも１つの添加治療剤を対象に投与することをさらに含んでもよい。特に該治療剤は、副腎皮質ステロイド、抗生剤、鎮痛剤、免疫抑制剤、若しくは栄養因子、又はそれらの任意の組み合せからなる群から選択されるとよい。
【００８８】
本発明のＲＰＥ細胞及び医薬組成物のすべての実施形態は、この態様においても考慮される。
【００８９】
他の態様において、本発明はまた、移植を必要とする患者への移植に用いるための上述のような改変ＲＰＥ細胞を調製する方法にも関し、該方法は、ＲＰＥ細胞を準備すること、及びＯＴＸ２タンパク質レベルを増大させるように該細胞を改変することを含む。
【００９０】
好ましくは、ＲＰＥ細胞は幹細胞の分化から取得され、より好ましくは、処置される対象の体細胞、例えば線維芽細胞から取得した誘導多能性幹細胞の分化から取得される。
【００９１】
好ましくは、ＲＰＥ細胞はＯＴＸ２タンパク質を過剰発現するように遺伝子的に改変される。
【００９２】
本発明の網膜変性を処置するためのＲＰＥ細胞、医薬組成物、及び方法のすべての実施形態は、この方法においても考慮される。
【００９３】
本発明者らは、本発明のＲＰＥ細胞が光受容体の生存性を向上可能であることを示した。このようにさらなる態様において、本発明は、インビトロ又はエクスビボの網膜細胞生存性を向上させるために上述のような改変ＲＰＥ細胞の使用することにも関する。本発明はまた、網膜細胞をインビトロ又はエクスビボ培養する方法にも関し、該方法は、上述のような改変ＲＰＥ細胞の存在下で網膜細胞を培養することを含む。本発明はまた、網膜細胞と上述のような改変ＲＰＥ細胞とを含む共培養にも関する。
【００９４】
改変ＲＰＥ細胞について開示されるすべての実施形態は、この態様においても考慮される。
【００９５】
本明細書に使用されるように、「網膜細胞」という用語は、光受容体、アマクリン細胞、双極細胞、水平細胞及び神経節細胞に関する。好ましい実施形態において、この用語は光受容体細胞に関する。
【００９６】
網膜細胞のインビトロ又はエクスビボ培養は、例えばＬｅｖｅｉｌｌａｒｄ等（２００４年）の文献に記載されるような、当業者には既知の任意の方法を用いておこなわれるとよい。
【００９７】
本発明の共培養体は、任意の適用に用いられ得る。そうした適用の例は、薬剤スクリーニング、毒性分析、又は細胞治療のための細胞作製を含むが、これらに限定されない。
【００９８】
本明細書に記載又は引用されるすべての特許、特許出願、仮特許出願、及び出版物は、この明細書の明らかな教示と矛盾しない程度に、全ての図面及び表を含む、その全体が言及によって組み込まれる。
【００９９】
以下の実施例は例示を目的として記載され、限定するものではない。
【実施例】
【０１００】
［材料及び方法］
＜動物＞
色素ジストロフィー性ＲＣＳ（ｒｄｙ−／−、ｐ＋）ラットをパリ市視覚研究所（Institute de la Vision）の動物施設にて飼育した。成体（雄と雌）の受容動物は、移植時に生後１８日齢であった。すべての実験は、眼科及び視力研究における動物の使用についての動物実験倫理委員会（チャールズダーウィン）によって改訂及び認可された、神経科学研究における動物及びヒトの使用の方針に従って行われている。標準的な１２時間毎の明暗周期で動物を飼育し、視力機能のすべての評価は、明期の最初の８時間で行われた。すべての動物に、移植の２日前からサクリファイスされる日まで、経口の２１０ｍｇ／ｌのシクロスポリンＡ（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ２３９８３５）投与を飲料水で行った。
【０１０１】
＜ＲＮＡ精製＞
網膜剥離有り又は無しの死後のヒト網膜試料、コントロール試料、及び、ブタの天然又は培養初代網膜色素上皮細胞をグアニジン塩酸塩溶液に配置し、塩化セシウム（ＣｓＣｌ２）法を用いて全ＲＮＡを精製した（Ｄｅｌｙｆｅｒ等、２０１３年）。短時間で、組織・細胞試料をポリトロン（Ｋｉｍｅｍａｔｉｃａ  ＰＴ２１００）を用いて６ＭグアニジンＨＣｌ内でホモジナイズした。ホモジナイズ後に、試料をｐＨ５．０の２Ｍ酢酸カリウムとともに１０分室温（ＲＴ）でインキュベートし、その後２０℃で５，０００ｒｐｍの遠心分離を１０分行った。上清をｐＨ８で５．３ｍｌの１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１％Ｎ−ラウロイルザルコシン、３．２ｇのＣｓＣｌ２に混合し、ポリアロマー超遠心分離チューブ（Ｒｏｔｏｒ  ＳＷ  ４１  ＴＩ、Ｂｅｃｋｍａｎ）の１．８ｍｌのＣｓＣｌ／ＥＤＴＡ上部に移して、ＣｓＣｌ勾配を作製した。試料をＯｐｔｉｍａ  ＬＥ８０ｋ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて、２０℃で２４時間、３５，０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットをｐＨ７．５で１５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳと、ｐＨ７．５で１５０μｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡとに再懸濁した。全ＲＮＡをフェノール・クロロホルム抽出を用いて精製し、ジエチルピロカルボネート（diethylpyrocarbonate、ＤＥＰＣ）水に再懸濁した。変性ゲル電気泳動法によりＲＮＡ完全性を評価した。
【０１０２】
＜逆転写とリアルタイムＰＣＲ＞
製造者の指示に従ってランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＳｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１μｇの全ＲＮＡから一本鎖状ｃＤＮＡを合成した。短時間で、ＤＮＡｓｅＩ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１８０６８−０１５）処理及び６５℃で５分間の不活化後の１μｇの全ＲＮＡを、５ユニット（Ｕ）のＲＮａｓｉｎＰｌｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１００ｎｇランダムプライマー（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ＭのＤＴＴ、及び４Ｕの逆転写酵素と混合した。試料を４２℃で５０分間インキュベートし、７２℃で１５分間のインキュベーションによって酵素反応を不活化した。ヒト試料、ヒト誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来ＲＰＥ細胞、及びブタの初代ＲＰＥ細胞における遺伝子内在発現を遺伝子特異的プライマーを使用してリアルタイムＰＣＲによって定量化した。解析前にプライマー効率を測定し、９０％〜１１０％及びＲ２≒１である効率を持つプライマーのみを定量化解析に用いた。１０ｎｇのｃＤＮＡを０．１ｍＭのフォワード・リバースプライマー混合物及び１×ｐｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４３６７６５９）に混合した。増幅及び振幅の解析（サイクル閾値（ｃｙｃｌｅ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ、Ｃｔ）を７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、短期間で、９５℃で１サイクルを含む第１のセクション、９５℃で１５秒の次に６０℃で２０秒の４０サイクルの第２のセクション、９５℃で１分、５５℃で３０秒、９５℃で３０秒の１サイクルの第３のセクションを行った。各遺伝子発現は、製造者の指示に従ってΔＣｔ式法を用いてハウスキーピング遺伝子発現によって正規化された。ヒト網膜剥離における解析とｈｉＰＳ−ＲＰＥ及びブタ初代ＲＰＥ細胞における遺伝子スクリーニングとのために、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase、ＧＡＰＤＨ）をハウスキーピング遺伝子として用いた。ヒトｉＰＳ−ＲＰＥの特性評価のために、１８ＳｒＲＮＡをハウスキーピング遺伝子として用いた。比較解析のため、製造者の指示に従ってΔΔＣｔ式法を用いて結果を算出し、表された倍数を２−ΔＣｔ及び／又は２−ΔΔＣｔとして示した。
【０１０３】
＜プラスミド構築＞
ベクタープラスミドｐＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｅＧＦＰは、アデノ随伴ウイルス２（ＡＡＶ２）ゲノム、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下でｅＧＦＰをコードする導入遺伝子カセットを有する。ｐＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｅＧＦＰプラスミドのｅＧＦＰをＮｏｔＩ（５’）及びＢａｍＨＩ（３’）制限酵素部位においてＯｔｘ２スプライシング変異体のＣＤＳで置換することで、プラスミドｐＡＡＶ２−ＣＭＶ−Ｏｔｘ２ｖ（スプライシング変異体）を構築した。フォワードプライマー5’GTGTCCAGGCGGCCGCAAAAATGATGTCTTATCTAAA(配列番号１)及びリバースプライマー5’AATCGGATCCCGATATCTCACAAAACCTGGAATTTCCA(配列番号２)を用いた高性能ＰＣＲによって、ラットＯｔｘ２及びＯｔｘ２ＬフラグメントをそれぞれプラスミドＬＡ０ＡＣＡ１４４ＹＫ１３ＣＭ１及びＬＡ０ＡＣＡ６ＹＬ１７．ＣＯＮＴＩＧから(http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/)増幅した。ヘルパープラスミド（ｐＨｅｌｐｅｒ）は、３つのアデノウイルスヘルパー遺伝子ＶＡ、Ｅ４及びＥ２Ａや、ＡＡＶ１カプシドのタンパク質をコードするプラスミドｐＬＴ−ＲＣ０２を提供する（Ａｃｌａｎｄ等、２００５年）。
【０１０４】
＜ＡＡＶ２．１ウイルスの作製＞
ＣＭＶプロモーターの制御下において、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はＯｔｘ２、及びＯｔｘ２Ｌスプライシング変異体をコードする導入遺伝子カセットを有するＡＡＶ２ベクターをＡＡＶ１カプシドにパッケージングした。短時間で、１５×１０６ＨＥＫ２９３細胞に、１２μｇのｐＨｅｌｐｅｒプラスミド、１０μｇのｐＬＴ−ＲＣ０２、及び６μｇのｐＡＡＶ２−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ、ｐＡＡＶ２−ＣＭＶ−Ｏｔｘ２、又はｐＡＡＶ２−ＣＭＶ−Ｏｔｘ２Ｌプラスミドのいずれかを、トリプル遺伝子導入した。これらの構築物を、１２０μｌの１μｇ／μｌポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及び５００μｌのＤＭＥＭと混合した。遺伝子導入後４８時間で細胞を採取した。上清を、１×ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液（８％ＰＥＧ、５ＭのＮａＣｌ）で４℃において２時間インキュベートした。細胞を凍結・解凍の３サイクルで溶解し、溶解緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．５）に再懸濁した。細胞溶解物をＰＥＧペレットと合わせ、Ｄａｌｋａｒａ等（２００９年）による記載のようにウイルス粒子をイオジキサノール勾配（１５％、２５％、４０％及び６０％）によって採取し遠心分離した。ＡＡＶウイルスを含有する４０％画分を採取し、１×ＰＢＳ、０．００１％プルロニックによって精製した。ウイルス粒子をＰＢＳ、０．００１％プルロニック内で保管した。ＩＴＲ配列を標的とする5’GGAACCCCTAGTGATGGAGTT（配列番号３）及び3’CGGCCTCAGTGAGCGA（配列番号４）であるプライマーを用いてリアルタイムＰＣＲによる絶対定量化で力価を測定し、これはμｌ毎のウイルスゲノム（ｖｇ／μｌ）として表された。
【０１０５】
＜ヒト誘導多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞＞
遺伝子挿入のないヒトｉＰＳ細胞株であるｈｉＰＳＣ−２を、８歳の少年の成人ヒト皮膚線維芽細胞から作製した。線維芽細胞はＲｅｉｃｈｍａｎ等により十分に特性評価されたものであり（Ｒｅｉｃｈｍａｎ等、２０１４年）、これに、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、及びＫＬＦ４を発現するエピソームベクターで遺伝子導入した。ＨｉＰＳＣ−２を、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組み換え塩基性線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）を伴うＲｅｐｒｏＳｔｅｍ培地（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）内でマイトマイシンＣ不活化マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層（Ｚｅｎｉｔｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）にて保持した。細胞を標準的な５％ＣＯ２／９５％空気中において３７℃でインキュベートし、機械的な方法で週に１度の継代を行った。Ｒｅｉｃｈｍａｎ等（２０１４年）の記載のようにコンフルエントｈｉＰＳＣ−２を分化することで、ＲＰＥ細胞を取得した。色素細胞のパッチを機械的な方法で切り離し、コンフルエントに達するために、ゼラチン被膜培養ディッシュに広げ、継代０と表示した。ＲＰＥ細胞は、形態、色素発現と、ＲＰＥ特異的タンパク質発現を検出する免疫細胞化学（ＭＩＴＦ及びＺＯ−１）とによって特性評価された。ＲＰＥ遺伝子マーカーの発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ及び特定のプライマーを用いて測定された。ヒトｉＰＳ細胞由来ＲＰＥ細胞は４継代まで増殖可能であり、そのＲＰＥ形態を保持する（Ｓｉｎｇｈ等、２０１３年）。遺伝子発現の検討は、継代１の細胞において行われた。
【０１０６】
＜ブタ網膜色素上皮初代培養＞
ブタの目は、ピエトレン、ラージホワイト、及びランドレースの３つの育種から採取され、認可と殺場から取得された（Ａｂａｔｔｏｉｒ  Ｇｕｙ  Ｈａｒａｎｇ、ウーダン、仏国）。目を９５％エタノールにおいて３分間除菌し、ＣＯ２非依存性培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。鋸状縁の位置（角膜の３ｍｍ）でニードルを用いて小さく切開を行い、角膜のまわりで目を切断し、角膜を後に取り去った。眼球から水晶体や硝子体、神経網膜を取り除いた。ＲＰＥ・脈絡膜、眼杯をＰＢＳで２度洗浄し、眼杯の２／３までトリプシン−ＥＤＴＡ０．２５％を満たし、３７℃で１時間４０分インキュベートした。やさしく上下にピペッティングすることでＲＰＥ細胞を採取し、２０％ＦＢＳ及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ培地に移した。１１個の目からのＲＰＥ細胞を共にプールし、同じ培地の５つの１０ｃｍ２ディッシュに播種した。１日目と４日目に培地を取り換えた。５〜６日目までに、培養はコンフルエントになり、ＲＰＥ細胞に典型的な玉石様外観を示した。
【０１０７】
＜ニワトリ錐体光受容体集積培養＞
ステージ２９のニワトリの胚から目を切り離して、１×ＰＢＳ内で洗浄し、ＣＯ２非依存性培地に目を移した。解剖器具を用いて神経網膜を分離して、角膜、硝子体、水晶体、及び他の残渣組織から慎重に取り除いた。神経網膜を新しいＣＯ２非依存性培地に移し、解剖器具を用いて小片に解離した。小片を新しいチューブに移した。３７℃で２０分間、トリプシン−ＥＤＴＡ０．２５％で解離を行い、続いて遠心分離を行った。１０％ＦＢＳを含有するＭ１９９培地を添加してトリプシン反応を停止し、続いて遠心分離を行った。５μｇ／ｍｌインスリン；５μｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム；１６．１μｇ／ｍｌプトレシン；０．６３μｇ／ｍｌプロゲステロン；１００μｇ／ｍプロスタグランジン；３７５μｇ／ｍｌタウリン；２．５６μｇ／ｍｌシチジン−５’−ジホスホコリン；１．２８μｇ／ｍｌシチジン−５’−ジホスフェートエタノールアミン；０．２μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン；０．０２μｇ／ｍｌトリヨードチロシン；１１０μｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウム；１００μｇ／ｍｌリノール酸で補完した、ＣＤＭ培地（５０％Ｍ１９９（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃ．１１１５０−０５９）、５０％ＤＭＥＭで、光受容体前駆体をインキュベートした。
【０１０８】
＜インビトロの形質導入＞
インビトロの形質導入のために、初代ＲＰＥ細胞及び／又はｉＰＳ由来ＲＰＥ細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ内において１２×１０６細胞／ウェルで、１２ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を１×ＰＢＳで洗浄して、６×１０１０ウイルス粒子（ＡＡＶ２．１−ＧＦＰ又はＡＡＶ２．１−Ｏｔｘ２ｖスプライス変異体）を含有する３００μｌのＤＭＥＭで、５時間インキュベートした。５時間のインキュベーション後、培地を１０％ＦＢＳ及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンに調節した。細胞を１０日間３７℃で、５％ＣＯ２においてインキュベートした。５日目に培地を１度変えた。移植検討のために、形質導入に用いたウイルスと共に初代ＲＰＥ細胞を７日間インキュベートした。
【０１０９】
＜ウェスタンブロッティング及び免疫細胞化学＞
ウェスタンブロッティングプロトコルをＬｅｖｅｉｌｌａｒｄ等（２００４年）の記載のように行った。短時間で、形質導入したブタ初代ＲＰＥ細胞を、溶解緩衝液［５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ−ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、５０ｍｇ／ｍｌのＴＬＣＫ（Ｓｉｇｍａ）、１×プロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）、１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００］内で可溶化し、次に音波処理を行った。用いた抗体は、抗ＯＴＸ２（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ１９７９、１／１，５００）、抗ＡＣＴＢ（１／５００）である。４５日のインキュベーション後のｈｉＰＳ−ＲＰＥ単層の免疫標識を、ＺＯ−１及びＭＩＴＦについて行った。短時間で、細胞を１０分間４％ホルムアルデヒドにおいて固定し、次に１×ＰＢＳ内で３回の洗浄を行った。室温で１時間、ＰＢＳ、０．２％ゼラチン、及び０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００でブロッキングを行い、１次抗体と共に４℃で１晩インキュベーションした。用いた抗体は抗ＺＯ−１（６１−７３００、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １／２５０）及び抗ＭＩＴＦ（ｃｌｏｎｅ  Ｄ５、Ｍ３６２１、ＤＡＣＯ  １／２００）である。スライドを０．１％ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、Ａｌｅｘ−ａＦｌｕｏｒ４８８又は５９４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１／６００）とコンジュゲートした適切な２次抗体及びＤＡＰＩ（１／１０００）と共に、１時間室温でインキュベートした。ＣＣＤ  ＣｏｏｌＳＮＡＰ−ＨＱカメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＤＭ６０００顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）又は４０５−、４８８−、及び５４３−ｎｍレーザーを備えたオリンパスＦＶ１０００共焦点顕微鏡を用いて、蛍光染色シグナルを捉えた。共焦点画像は１．５５−又は０．４６−μｍステップサイズを用いて取得され、４〜８オプティカルセクションの画像に相当するものであった。
【０１１０】
＜クロマチン免疫沈降法＞
クロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）を先行の記載のように行った（Ｒｅｉｃｈｍａｎ等、２０１０年；Ｄｏｒｖａｌ等、２００６年；Ｐａｔｔｅｎｄｅｎ等、２００２年）。新しいＲＰＥ細胞を６つのブタの目から素早く分離し、共にプールした。ＲＰＥをＰＢＳ内の氷温の４％ホルムアルデヒドで３０分間架橋し、ＰＢＳ内でリンスし、溶解緩衝液［１％ＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０］及びプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）内で８００ｂｐの平均ＤＮＡサイズへと音波処理（Ｖｉｂｒａ  Ｃｅｌｌ）した。音波処理した試料を１５，０００ｒｐｍで１０分間４℃において遠心分離し、上清をＧセファロースビーズ（ＰＩ−２０３９９、Ｆｉｃｈｅｒ）で１時間室温（ＲＴ）において前精製した。１００μｌの分割量を希釈緩衝液（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で１．５ｍｌに希釈し、１）抗体なし、２）２．５μｇの抗ウサギ抗体（１１１‐０３５‐０４５、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂ）、３）抗ＯＴＸ２抗体（ａｂ９５６６、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に１時間室温でインキュベートした３つの反応物に分けた。試料を１５，０００ｒｐｍで１０分間２０℃において遠心分離し、上清を１５μｌのタンパク質Ｇセファロースビーズ、１５０μｇの超高純度サケ精子ＤＮＡ（１５６３２−０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１５０μｇの酵母ｔＲＮＡ（１５４０１−０１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合して、１時間３０分間室温でインキュベートした。沈殿物を、ＴＳＥＩ（０．１％のＳＤＳ；１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２ｍＭのＥＤＴＡ；２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１５０ｍＭのＮａＣｌ）、ＴＳＥＩＩで４回（０．１％ＳＤＳ；１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；２ｍＭのＥＤＴＡ；２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；５００ｍＭのＮａＣｌ）、緩衝液ＩＩＩで１回（０．２５ＭのＬｉＣｌ、ｐＨ８．０；１％ノニデットＰ−４０；１％デオキシコレート；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、及び最後にＴＥ緩衝液で３回（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）、室温において１０分間連続的に洗浄した。試料を溶出し、１００μｌの溶出緩衝液（１％ＳＤＳ；０．１ＭのＮａＨＣＯ３）内において６５℃で１晩インキュベートすることで架橋を除去した。ＤＮＡフラグメントをフェノール・クロロホルム抽出によって精製し、７０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。２μｌの免疫沈降物質を増幅するために、準定量的ＰＣＲを用いた。２５μｌにおいて９４℃で３分間、４０サイクル（９４℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で３０秒）、７２℃で３分のＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーは、フラグメントをプロモーター遺伝子に増幅するために設計されたものであり、ＫＣＮＪ１３、フォワード5’-GCAGGCCTTCCATGATTTTA（配列番号５）及びリバース5’-TGAGCTGTCAGATGGCTTTG（配列番号６）；ＳＬＣ１６Ａ１２、フォワード5’-TGCCTGTCCCACTAGGAAGT（配列番号７）及びリバース5’-GCATCATTTGCCATGTGACT（配列番号８）；ＲＤＨ１０、フォワード5’-GGCAACAAGTCCCACCTAAA（配列番号９）及びリバース5’-GTTTACTTGGTGGGGGAGGT��配列番号１０）；ＴＹＲＰ１、フォワード5’-CCAATTTGCAGGGAACAAAT（配列番号１１）及びリバース5’-TGCCTTAAATTGCCTTCTCAA（配列番号１２）；ＨＧＢ、フォワード5’-GAACGTCAGGATTCCCTTGA（配列番号１３）及びリバース5’-CCATTGGGAGCTTCCTTGTA（配列番号１４）である。
【０１１１】
＜網膜色素細胞の調製及び移植＞
ＡＡＶ２．１−ＧＦＰ又はＡＡＶ２．１−ＯＴＸ２を有する形質導入初代ブタＲＰＥ細胞を、移植前に前述のように１週間インキュベートした。細胞をＨＢＳＳ（ハンク平衡塩溶液、カルシウム、マグネシウム含有、フェノールレッド非含有）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄し、Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ０．０５％で解離した。やさしくピペッティングしてＲＰＥ細胞を採取し、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＨＢＳＳに移した。得られた細胞ペレットを、ＨＢＳＳに２５，０００細胞／μｌで再懸濁した。手術用顕微鏡を介して直接検眼法で外科的処置を行った（図１１）。外科医は各ラットに注入される細胞識別（ＲＰＥ−ＧＦＰ又はＲＰＥ−ＯＴＸ２）について知らされないという、盲検法を用いた。受容ラットは、外科的処置の最低１０分前に、ケタミン（１０００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）混合物を単回の腹腔内注入することで麻酔された。ハミルトンシリンジ（１０μｌ、モデル１７０１  ＲＮ  ＳＹＲ、ＮＤＬ販売）に装着した３０ゲージの鈍端ハミルトンニードルを、強膜及びＲＰＥを介して網膜下腔へ、接線方向に挿入した。細胞懸濁液を、目毎に５０，０００細胞で、徐々に注入した。全ての処置中に、塩化ナトリウム液滴を定期的に点眼することで目の脱水状態を防止した。外科的処置後に、角膜の脱水及び破損を理由に、処置及び非処置の両目を閉じた状態にした。ラットは、麻酔から回復するまで３５℃のチャンバ内に置かれた。
【０１１２】
＜視運動反応＞
Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  Ｉｎｃ（加国）のｏｐｔｏｍｏｔｒｙ、及びＯｐｔｏＭｏｔｒｙ、１．７７システムを用いて、回転する正弦格子に対するラットの視運動反応を観察することによって、処置及び非処置の目のコントラスト感度及び視力を測定した（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等、２００７年；Ｐｒｕｓｋｙ等、２００４年；Ｐｅａｒｓｏｎ等、２０１２年）。ラットは、すぐに、格子回転方向に頭部を動かすことで回転する垂直格子に反射的に反応する。用いたプロトコルは、パターン回転に対して２つの目が不均等な感度を有することに基づいて、左右の視力の独立的な測定を行うものである。これについて、右目及び左目は、反時計回り回転及び時計回り回転にそれぞれ最も感度が高い。観察者には、パターン回転の方向と、どちらの目が処置を受けたか及びどちらの目にＲＰＥ−ＧＦＰ又はＲＰＥ−ＯＴＸ２細胞が投与されたかとが「マスク化」される、二重盲検法を用いた。生後５０日の各ラットを、４つの内向きのＬＣＤコンピュータモニター画面の中央に位置する台座に素早く配置し、赤外線光源を有する上部の赤外線ビデオカメラで観察した。ラットが台座に慣れると、ＯｐｔｏＭｏｔｒｙソフトウエアで無作為に決定された、時計回り又は反時計回りに回転する正弦縞パターンをラットに提示して、７秒の試験を開始した。左目（時計回り回転）及び右目（反時計回り回転）によってそれぞれ不随意反射頭部追跡反応が行われる。コントラスト感度は、０．０４２周期／角度の空間周波数及び０．５Ｈｚの回転速度で測定された。視力を評価するために、格子は１００％の一定コントラストを有し、初期刺激は０．０４２周期／角度であった。プログラムは、ステアケースパラダイムを使用して、７０％以上の正確な観察者反応を得た空間周波数又はコントラスト％として規定した両目の視力又はコントラスト感度の測定を集約する。視力は、閾値反応をもたらす最高空間周波数として規定された。同様に、コントラスト感度は、閾値反応をもたらす最低パーセントコントラストによって１００を除算したものとして規定された。このプロトコルにより右目感度と左目感度との分離が可能になる一方で、対側の目が刺激に対して「盲目」であるわけではない。
【０１１３】
＜網膜電図（Electroretinogram、ＥＲＧ）＞
ラット生後６０日又は移植後４２日に、ＳＥＩＭバイオメディカルシステムを用いてＥＲＧを記録した。移植実験のため、試験される目に５０，０００の形質導入ＲＰＥ細胞の上側網膜下注入を行った。ＥＲＧを行う者が、どちらの目に移植を受けたか、どちらの目が未処置であるか、及びどちらの目にＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２が投与されたかを認識しないように、２重マスク化プロトコルを用いた。一晩暗所に適応させた後、動物を暗赤色光下で記録するために準備した。動物を、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注入で麻酔し、３７℃のサーモスタット制御の加温性プラットフォームで保温した。０．５％マイドリアティカム（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ）を用いて瞳孔を拡張させ、オキシブプロカインのクロロハイドレート１．６ｍｇ／０．４ｍｌを適用して角膜を局所麻酔した。目を開けて突出を維持するために、上下まぶたを後退させた。角膜が金電極に接触した後に保湿を維持するように、ビスコティアーズ（Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓ）液体ジェルを各角膜に与えた。ステンレス鋼の参照電極をラットの頭部において皮下に挿入した。ラットの背中に皮下に挿入された第２のニードル電極は信号を接地するために用いられた。記録前にさらに５分間、動物を完全な暗闇に置いた。両目から共にＧａｎｚｆｅｌｄ型ＥＲＧを取得して内部制御を得た。暗順応記録のため、５ｋＨｚのサンプリング周波数、４ｍｓのフラッシュ持続時間、及び０．５Ｈｚの周波数刺激を用いて、３μｃｄｓ／ｍ２、３０ｍｃｄｓ／ｍ２、０．３、３、及び１０ｃｄｓ／ｍ２の光強度で単回のフラッシュ記録を取得した。刺激開始前５０ｍｓから刺激後４５０ｍｓまでデータを記録した。５分の光適応後に、桿体抑制バックグラウンドにおいて、明順応錐体ＥＲＧを行い、１０ｃｄｓ／ｍ２の光強度で記録を取得した。バンドパスフィルターを０〜１ｋＨｚに設定した。各暗順応反応は１０回の反応の平均を表し、各明順応ＥＲＧ反応は５回の刺激フラッシュ一式からの５回の反応の平均を表す。各群（ｎ＝７）についてｂ波ピークまでの平均時間を各記録において定めた。１０Ｈｚのフラッシュライト及び０．３ｃｄｓ／ｍ２の強度で、フリッカー錐体ＥＲＧ反応を行った。
【０１１４】
＜光干渉断層撮影（Optical coherence tomography、ＯＣＴ）法＞
生後６０日の処置ラットに麻酔を行い、上述のように瞳孔を拡張させた。塩化ナトリウム液滴を定期的に点眼することで目の脱水状態を防いだ。ＯＣＴ画像を両目についてスペクトラルドメイン眼科イメージングシステム（スペクトラルドメイン光干渉断層撮影、ＯＣＴ、Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ、８４０ｎｍ、ＨＨＰ；Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ；米国ノースカロライナ州)を用いて記録した。発明者等は、１００の総Ｂスキャンを伴い、Ｂスキャン毎に１０００Ａスキャンで、２ｍｍ×２ｍｍの周囲からなる矩形スキャンを行った。スキャンはまず視神経中心に取得され、その後神経を側頭・鼻側又は上側・下側に移動させて取得した。ＯＣＴスキャンをＡＶＩファイルとしてＩｎＶｉｖｏＶｕｅからエクスポートした。これらのファイルをＩｍａｇｅＪ（バージョン１．４７；アメリカ国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ）にロードし、Ｓｔａｃｋｒｅｇプラグインを用いて登録した。ピクセル数を３．１１ピクセル／μｍの距離に変換して、画像調整を行った。外顆粒層（ＯＮＬ）厚を、中心（視神経から）から開始して腹側・背側及び側頭・鼻側に１００μｍ毎に測定し、ＩｍａｇｅＪ用自家製プラグインを用いて、ＯＣＴスキャンで取得された目の全ての領域をカバーした。未処置の目（ｎ＝６）、ＲＰＥ−ＧＦＰを移植した目（ｎ＝６）、及びＲＰＥ−ＯＴＸ２を移植した目（ｎ＝７）の群について、各ポイントの厚み平均を算出した。ＯＮＬ厚を３Ｄ密度マップとして表示した。
【０１１５】
＜インビボの走査レーザー検眼鏡（scanning laser ophthalmoscope、ＳＬＯ）法＞
高解像度赤外線反射イメージング及び蛍光眼底造影を、先行の記載のように改変型走査レーザー検眼鏡（ＳＬＯ；Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｒｅｔｉｎａ  Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、独国）を用いて行った（Ｗｅｉｓｍａｎｎ等、１８９３年）。
【０１１６】
＜ライブデッドアッセイ＞
先行の記載のようにライブデッドアッセイを行った（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄ等、２００４年）。簡潔に、ＧＦＰ、ＯＴＸ２（配列番号１５）及びＯＴＸ２Ｌ（配列番号１６）を有する形質導入ＲＰＥ細胞をＣＤＭ培地で１週間インキュベートした。ＲＰＥ形質導入細胞の馴化培地を採取し、９６ウェル黒色組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において上述及びＡｄｌｅｒ等（１９８９年）による記載のように調製されたニワトリの胚（ステージ２９）の初代網膜培養物に添加し、５％ＣＯ２において３７℃で７日間インキュベートした。１４の負のコントロール用ウェル（馴化培地）も含まれる。発明者等は、ライブデッドアッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて細胞生存性をモニターした。ライブデッド分析を行う者がどちらの上清がＲＰＥ−ＧＦＰ又はＲＰＥ−ＯＴＸ２形質導入細胞からのものかを認識しないように、マスク化プロトコルが用いられた。取得及び細胞計数のため、発明者等は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をもとにしたアルゴリズムを開発した。２つの励起フィルター（４８５及び５２０ｎｍ）、２つの蛍光フィルター（５２０及び６３５ｎｍ）、１０×対物レンズ、コンピュータ駆動モーター式走査ステージ（Ｍａｅｒｚｈａｅｕｓｅｒ）及びＣＣＤカメラを有する、水銀落射蛍光ランプを備えた反転蛍光顕微鏡下（ＴＥ２００、Ｎｉｋｏｎ）で、発明者等はプレートを計数した。発明者等は、スクリーニングのために、生存細胞数を負のコントロールの平均生存細胞数と比較した。各アッセイを、各条件について４つの複製物で個別に３回繰り返して行った。
【０１１７】
＜ヘマトキシリン及びエオジン包埋＞
上述のようにケタミン及びキシラジンで動物を麻酔し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）内の２．５％グルタルアルデヒド及び２％ホルムアルデヒドで直ちに灌流した。目を摘出して、固定液（２％ホルムアルデヒド）内で一晩インキュベートした。レンズを除去して、眼杯を５％ショ糖内で５回洗浄した。眼杯を２％四酸化オスミウム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、２０１０３０）内で１時間固定した。このステップの後、段階的エタノール（５０％、７０％、９５％）での脱水と、プロピレンオキサイド内での１０分のインキュベーションとを行った。その後、１対１の（アラルダイトエポキシ樹脂／プロピレンオキサイド）混合物で、目を室温で一晩インキュベートした。６５℃に温めたアラルダイトエポキシ樹脂混合物で一晩包埋を行った。１μｍ厚のプラスチック切片をライカＥＭ、ＵＣ６ウルトラミクロトームを用いて矢状軸に沿って作製し、トルイジンブルー（１％ホウ砂、１％トルイジンブルー）で染色した。
【０１１８】
＜統計＞
すべてのデータは、他に言及されない限り、平均値±標準誤差として表される。ｎは、検討されるしかるべき動物、目、又は細胞の数である。統計的有意性を、グラフパッドプリズム６ソフトウエアを用いて、対応のないノンパラメトリックｔ検定、多重比較のためにボンフェローニ又はダネット補正を伴う分散分析、ウェルチ補正、コルモゴロフ‐スミルノフ、ウィルコクソンの符号付順位和検定、（両側）を適宜適用して評価する。
【０１１９】
［結果］
＜培養網膜色素上皮細胞には上皮間葉転換が起こる＞
発明者等は、初代ブタＲＰＥ細胞の一週間の培養がα平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２）及びビメンチン（ＶＩＭ）の２つの間葉系マーカーの発現を誘導することを発見した（図１Ａ）。
【０１２０】
この転換のもととなる機構を解明するために、ＰＲＥ細胞によって特異的に発現されるため選択された、ＲＰＥ機能又は光受容体生存に関与すると推定される３７遺伝子のサブセットの発現が測定された。これらの遺伝子の２７（３７％）が培養初代ＲＰＥ細胞において下方調節される一方で、３つの遺伝子であるＳＬＣ１６Ａ３、ＳＬＣ１６Ａ１２及びＴＹＲＰ１が上方調節されることが分かった（図１Ｂ及び１２）。
【０１２１】
下方調節された遺伝子の中で、発明者等は、２つの転写因子ＣＲＸ及びＯＴＸ２の存在を見出した。ＣＲＸ発現は著しく大きく減少する一方で、ＯＴＸ２の発現は半分になる。ＯＴＸ２はＣＲＸの発現を調節すること及び故にＣＲＸはＯＴＸ２の下流にあることが報告されているので、ＯＴＸ２発現はウェスタンブロッティングによって検討された。こうして、ＯＴＸ２タンパク質発現は培養において一週間後に減少することが確認された（図１Ｃ）。ＯＴＸ２のスプライス変異体ＯＴＸ２Ｌに対応する信号は、この処理時に誘導された。ＯＴＸ２Ｌは、ホメオドメインより５アミノ酸上流である付加オクタペプチドＧＰＷＡＳＣＰＡをコードするが、付加的機能はこの変異体には起因しない。
【０１２２】
上皮から間葉への転換はまた、網膜剥離の後、インビボにおいても起こり、その合併症である増殖性硝子体網膜症に関わる。定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、神経網膜の１９の死後標本と比較した網膜剥離の１９のヒト摘出標本におけるＶＩＭ発現を検討した。ＶＩＭ発現の２．３７倍の上昇は網膜剥離に相関した（図１Ｄ）。同じ標本において、ＯＴＸ２発現は０．４６倍減少した。興味深いことに、ＫＣＮＪ１３遺伝子によってコードされるその有力な標的の１つ、内向き整流性カリウムチャネルＫＩＲ７．１も下方調節された。ＫＣＮＪ１３の突然変異は、他の欠損の中でも網膜剥離をもたらす常染色体優性網膜疾患、雪結晶型硝子体網膜変性を引き起こす。ＯＴＸ２とＫＣＮＪ１３発現との直接的な関連は、これらの標本内におけるそれらの発現の相関によって推定された（ピアソンｒ相関、ｒ＝０．４６、Ｐ＜０．００３及びＰ＜０．０００１の直線回帰）（図１Ｅ）。網膜剥離の発生と外科的処置との間の遅延によって分類すると、ＫＣＮＪ１３発現が１週〜３ヵ月の間に減少することが分かった（図１Ｆ）。
【０１２３】
＜網膜色素上皮における新規のＯｔｘ２標的遺伝子の特定＞
ＯＴＸ２が、下方調節された２７の遺伝子の発現を調節するかをテストするために、発明者等はラットのＯＴＸ２を過剰発現し、また個別にブタ初代ＲＰＥ細胞においてＯＴＸ２Ｌを過剰発現した。ＯＴＸ２及びＯＴＸ２ＬｃＤＮＡを、アデノ随伴ウイルスベクターにクローニングし、ＲＰＥ細胞をＡＡＶ２．１−ＧＦＰ、ＡＡＶ２．１−ＯＴＸ２、又はＡＡＶ２．１−ＯＴＸ２Ｌに感染させた。形質導入の７日後、ブタとラットとのＯＴＸ２ｍＲＮＡを区別しないプライマーを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲによってＯＴＸ２発現を検証した（図２Ａ）。
【０１２４】
ＯＴＸ２の異所性発現はＶＩＭの発現を１/４に減少させることが確認された（図２Ｂ）。用いた抗体は異所性ラットを内在性ブタＯＴＸ２と区別しないので、ウェスタンブロッティング解析により、発明者等はこのシステムにおけるＯＴＸ２過剰発現レベルを評価できた（図２Ｃ）。この解析により、ＶＩＭタンパク質発現が異所性ＯＴＸ２によって減少することが示された。３７の選択遺伝子の中で、ＣＲＸ発現がＯＴＸ２及びＯＴＸ２Ｌの両方によってほぼ２０倍誘導されることがわかり、ＯＴＸ２はＲＰＥ細胞におけるＣＲＸの発現を制御することを確認した（図２Ｄ）。同様に、チロシナーゼ遺伝子ＴＹＲが１５倍誘導された。チロシナーゼ関連タンパク質遺伝子ＤＣＴ及びＫＣＮＪ１３はＯＴＸ２（約９倍）及びＯＴＸ２Ｌ（５〜６倍）によって誘導された。最後に、ケラチン遺伝子ＫＲＴ１８、レチノールデヒドロゲナーゼ遺伝子ＲＤＨ１０、ＴＹＰＲ１、及びモノカルボン酸トランスポーター遺伝子ＳＬＣ１６Ａ８及びＳＬＣ１６Ａ１２が２〜５倍誘導された（図１３）。興味深いことに、ＳＬＣ１６Ａ８遺伝子内のリスクアレルは、ＲＰＥ機能障害に関わる疾患である加齢性黄斑変性の素因となるものである（Ｆｒｉｔｓｃｈｅ等、２０１３年）。
【０１２５】
転写レベルでのこれらの遺伝子発現の調節におけるＯＴＸ２の役割をさらに確認するために、未感染初代ブタＲＰＥ細胞に染色体免疫沈降を行った。ＴＹＲＰ１は、このプロモーター内のＯＴＸ２調節エレメントとＯＴＸ２が結合することが報告されているため、正のコントロールとして用いられた（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍｏｒａｌｅｓ等、２００３年）。候補ＯＴＸ２調節エレメントは、ＫＣＮＪ１３、ＲＤＨ１０、及びＳＬＣ１６Ａ１２プロモーターにおいて見出された（図２Ｅ）。抗ＯＴＸ２はＴＹＲＰ１プロモーターＤＮＡを共免疫沈降したが、免疫グロブリンを除去する（−ＩｇＧ）、又は非免疫物を用いる（＋ＩｇＧ）と信号は観察されなかった（図２Ｆ）。発現がＯＴＸ２によって誘導されるＫＣＮＪ１３及びＲＤＨ１０の２つの遺伝子で、同様の結果を得た。第３のＳＬＣ１６Ａ１２も、いくらかの共免疫沈降を示した。βグロビン（ＨＧＢ）プロモーターを負のコントロールとして用いた。
【０１２６】
＜ＯＴＸ２はヒトＲＰＥ細胞においてＫＣＮＪ１３、ＲＤＨ１０、及びＳＬＣ１６Ａ８発現を誘導する＞
これらの遺伝子がヒトＰＲＥ細胞においてＯＴＸ２の標的となるかを検証するために、ＯＴＸ２をヒト誘導多能性幹由来ＰＲＥ（ｉＰＳ−ＲＰＥ）において過剰発現した（Ｒｅｉｃｈｍａｎ等、２０１４年）。これらのｉＰＳ−ＲＰＥ細胞は、メラニンを発現し、典型的な玉石状形態を有し、密着結合タンパク質ＺＯ−１及び転写因子ＭＩＴＦを発現する（データは示されず）。ヒトｉＰＳ−ＲＰＥ細胞は、未分化ｉＰＳ細胞と反対に、正常ヒト死後標本のＲＰＥ細胞と同様のレベルに、ＲＤＨ１０に加えてＲＰＥ６５、ＭＩＴＦ、ＢＥＳＴ１及びＭＥＲＴＫのようないくつかのＲＰＥマーカーを発現する（図９）。これは、ｉＰＳ細胞がＲＰＥ細胞に分化したことを示す。
【０１２７】
ＡＡＶ感染では、ＲＴ−ＰＣＲによって示されるように、７日後に内在性ＯＴＸ２に対し、Ｏｔｘ２及びＯｔｘ２Ｌの発現がそれぞれ８及び５倍増加した（図３Ｃ）。チロシナーゼ遺伝子ＴＹＲの発現は、ブタＲＰＥ培養において観察されたものと同様に、ＯＴＸ２及びＯＴＸ２Ｌによってそれぞれ３０倍及び２０倍誘導された（図３Ｄ）。ＣＲＸ発現は１８倍増加した。４つのさらなる候補のＯＴＸ２調節遺伝子は、ＯＴＸ２及びＯＴＸ２Ｌの異所性発現によって誘導され、ＫＣＮＪ１３（１２．４倍）、ＳＬＣ１６Ａ１２（３．３倍）、ＲＤＨ１０（２．０倍）及びＳＬＣ１６Ａ８（１．８倍）であった。
【０１２８】
＜ＲＣＳにおけるＯＴＸ２を過剰発現する遺伝子的改変ＲＰＥ細胞のグラフティングは光受容体機能を改善する＞
ＲＰＥ移植の効果を、ＭＥＲＴＫタンパク質をコードするｒｄｙ遺伝子の劣性突然変異を保持する網膜色素変性劣性モデルであるＲＣＳラットにおいて検討した。ＭＥＲＴＫは、光受容体の外節貪食に必須である、ＲＰＥによって発現される受容体型チロシンキナーゼである。ゆえに、ＭＥＲＴＫ突然変異は網膜色素変性を引き起こし、ＲＣＳの桿体光受容体は出生後（ｐｏｓｔ−ｎａｔａｌ、ＰＮ）２３〜６０日に変性する。桿体変性についで錐体変性が続く（Ｄ’Ｃｒｕｚ等、２０００年；Ｐｉｎｉｌｌａ等、２００４年；Ｇｉｒｍａｎ等、２００５年）。生後６０日までに、桿体及び錐体機能は記録できないものになり、組織学的検査は、光受容体細胞層である外顆粒層（ＯＮＬ）がほぼ完全に失われることを示した（図７Ａ）。
【０１２９】
発明者等は、二重盲検法を用いて、変性が始まる前に生後１７日のＲＣＳラットの目の網膜下腔に５０，０００ＲＰＥ細胞を注入した（ｎ＝７）。この研究のために十分なヒトｉＰＳ−ＲＰＥ細胞を準備することができなかったので、ブタＲＰＥ細胞を用いた。注入を右目の網膜背部に行ったが、左目は未処置で残した。移植の１週前に、ＧＦＰ又はＯＸＴ２をコードする組み換えＡＡＶ２．１ベクターに、ＲＰＥ細胞を感染させた。ＡＡＶ２．１‐ＧＦＰ形質導入ＲＰＥ（ＲＰＥ−ＧＦＰ）細胞を負のコントロールとして用いた。移植細胞の存在は、２つの目を切開後、リポーターとしてＧＦＰの蛍光性を用いて、生後６０日に検証された（データは示されず）。
【０１３０】
移植の４３日後、生後６０日に網膜電図（ＥＲＧ）を記録した。ＲＰＥ−ＧＦＰ又はＲＰＥ−ＯＴＸ２細胞で処置された目の暗順応ＥＲＧにおけるｂ波振幅（桿体反応）は、３×１０−６〜１０ｃｄｓ／ｃｍ２において、対側の非注入の目のものよりも有意に大きいことが分かった（図４Ａ及び図１０）。ＲＰＥ−ＯＴＸ２を移植した目の桿体反応は、ＲＰＥ−ＧＦＰのものよりも大きかった。反応中央値は、ＧＦＰの中央値よりもほぼ２倍高く、野生型ｒｄｙ＋／＋ラットの中央値の２９．４％に相当する。刺激とｂ波反応との間の時間を意味する潜時を考慮すると、ＲＰＥ−ＯＴＸ２グラフト化目は、高光強度において、ＲＰＥ−ＧＦＰの目よりも速く反応した（図４Ｂ）。明順応ＥＲＧのｂ波振幅（錐体反応）は、ＯＴＸ２とＧＦＰとで、ＲＰＥ−ＯＴＸ２の反応が大きく両反応が未処置の目のものより大きくても、有意差はなかった（図４Ｃ及び図１０）。そうした条件では、信号は、錐体光受容体及び双極細胞の両方の反応から起こった。純粋な錐体反応はフリッカーＥＲＧによって記録された。これらの条件では、反応の振幅は処置された目において大きく、ＲＰＥ−ＧＦＰよりもＲＰＥ−ＯＴＸ２について有意に大きいことが分かった（図４Ｄ及び図１０）。
【０１３１】
＜ＲＣＳラットの移植後の視覚挙動＞
処置ラットの視覚挙動は、回転格子に対する視運動頭部追跡反応を測定することによって、生後５０日に二重盲検法を用いて評価した（図５Ａ）。視力及びコントラスト感度は、パターン回転に対する２つの目の不均等な感度に基づいて右目及び左目の視力の独立的測定をもたらす。つまり、右目及び左目はそれぞれ反時計回りの回転及び時計回りの回転により感度が高い。視力について、固定コントラストの白黒縞の太さが各動物の視覚能力に対して調節され、視力を測定する。コントラスト感度について、これは、コントラスト感度測定のために調節された同じ太さの暗・明の灰色縞のコントラストである（図５Ｂ）。
【０１３２】
ＲＰＥ−ＧＦＰ又はＲＰＥ−ＯＴＸ２のグラフト化目は高い頭部追跡反応をもたらし、対側の非注入目の角度につき０．３３５周期と比較して、それぞれ角度につき０．４９２周期及び０．４７４周期の平均視力反応を得た（図５Ｃ）。グラフト化目では、コントラスト感度も向上し（図５Ｄ）、非処置の目の５５．７５％と比較して、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２について７６％及び６６．８８％であった。
【０１３３】
＜ＲＰＥ−ＯＴＸ２細胞のグラフティングはＲＣＳラットの桿体光受容体を保護する＞
移植による桿体保護を検証するために、大部分のげっ歯動物において９５〜９７％桿体からなる外顆粒層（ＯＮＬ）厚を生後６０日に測定した。測定は、１００μｍの間隔をあけた光学的切片で網膜全体（９．５ｍｍ２）に行った。測定は、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって各切片において１００μｍ毎に行われた（網膜ごとに平均１，００５の測定）。光学的切片において、ＯＮＬは、この層が存在しない未注入ＲＣＳラットの網膜と野生型網膜を比較することで明確に特定される（図６Ａ）。網膜表面全体にわたる各位置における平均ＯＮＬ厚を用いて、網膜の３次元マップを再構成した。ＯＮＬは、画像面にわたる白色優勢によって見て取れるように、移植した目において全体的により厚い（図６Ｂ）。細胞が注入された背側・側頭側の１／４の部分に向かってＯＮＬ厚が徐々に増大することをマップは示す。網膜全体のＯＮＬは、ＲＰＥ−ＧＦＰの目と比較してＲＰＥ−ＯＴＸ２の目においてより厚みがある（図６Ｃ）。ＯＮＬは、網膜面の９５％において、未注入の目について平均６．６９μｍ厚であったが、ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２についてそれぞれ１７．５９μｍ及び２５．３９μｍであった。ＯＮＬ厚は、ＲＰＥ−ＧＦＰの目について６〜３２μｍに分布し、ＲＰＥ−ＯＴＸ２の目については１３〜４２μｍに移った（図６Ｄ）。両曲線の２峰性の態様は、注入部位における桿体の保護からもたらされており、測定における移植細胞自体の存在によるものではない。データは、側頭から鼻側（ＴＮ）及び背側から腹側（ＤＶ）の２つの中心的セクションに対して、野生型（ｒｄｙ＋／＋）目のＯＮＬ厚で正規化された（図６Ｅ）。網膜の背側・側頭側四分円である注入部位において、ＯＮＬがＲＰＥ−ＧＦＰグラフト化目よりもＲＰＥ−ＯＴＸ２グラフト化目において２倍厚いということを発明者等は発見した。これは、野生型目のＯＮＬ厚の約４０％に相当し、ＧＦＰについては約２０％、及び未処置ＲＣＳ目については約１０％に相当する。移植したＲＣＳの目のＯＮＬ厚はまた、網膜の反対部分、鼻側・腹側四分円でもより厚みがある。
【０１３４】
生後７５日目に動物をサクリファイスし、目を切開した。ヘマトキシリン及びエオジン染色は、未処置のＲＣＳの目において、ＯＮＬの薄化に加えて、網膜内層の非組織化を示した（図７Ａ）。興味深いことに、ＯＴＸ２で遺伝子的に改変されたＲＰＥ細胞の移植は、この２次的イベントをＲＰＥ−ＧＦＰ細胞よりも大きく防止した（図７Ｂ及び図７Ｃ）。網膜内層の組織体は、野生型（ｒｄｙ＋／＋）の目のものと類似した（図７Ｄ）。
【０１３５】
＜ＲＰＥ−ＯＴＸ２改変細胞は、錐体光受容体を保護する神経栄養因子を分泌する＞
ＲＰＥ−ＧＦＰ及びＲＰＥ−ＯＴＸ２の注入部位から離れた位置の光受容体の救済は、グラフティングされたＲＰＥ細胞由来のパラクリン効果を示した。発明者等は、ニワトリ胚からの錐体豊富化初代培養物を用いて、形質導入ＲＰＥ細胞の馴化培地における神経栄養因子の存在を検証した（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄ等、２００４年）。ＡＡＶベクターに感染させたブタの初代ＲＰＥ細胞から採取した馴化培地を、ニワトリの網膜培養物に添加した。培養の７日後に、細胞の生存性をライブデッドアッセイを用いて記録した（Ｌｅｖｅｉｌｌａｒｄ等、２００４年）。ＲＰＥ細胞は、保護分子を自然に分泌した。しかし、ＲＰＥ−ＧＦＰと比較して、ＲＰＥ−ＯＴＸ２は大きく細胞生存を導いた（図８Ａ）。ＯＴＸ２形質導入ブタＲＰＥ細胞からの馴化培地は、負のコントロール（培地のみ）より３倍、ＧＦＰ形質導入ＲＰＥ細胞からの培地と比較すると２倍、細胞生存の増加を促進した。ＯＴＸ２で形質導入されたＲＰＥ細胞から単離されたＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の発現がＯＴＸ２によって誘導される一方で、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＴＦ）の発現は変化がなかったことを示した（図８Ｂ）。
【０１３６】
［参考文献］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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