(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キトサンを含有する凍結乾燥骨格組成物であって、該骨格が固体であり、所望の形状に成形することができ、該キトサンが８０％ないし９８％の範囲のプロトン化レベルを有する遊離アミン基を含有し、かつ、約5,000Daないし400,000Daの範囲の分子量を有し、それにより該骨格の制御された再水和を生じさせ、該骨格が中性水性溶液、血液、血液由来流体およびこれらの組合せの少なくとも１つと接触したとき、該骨格が微粒子分散を形成すると共に、以下の事項の少なくとも１つを生じさせるものである：
i）組織再構築を刺激する；
ii）同化的創傷修復を刺激する；
iii）クロット、好ましくはフィブリンクロット、血液クロット又はこれらの組合せを安定化させる；
iv）好中球走化性を刺激する；
v）マクロファージ走化性を刺激する；
vi）血管形成を刺激する；
vii）間葉細胞走化性を刺激する；
viii）線維症を抑制する；
ix）破骨細胞形成および骨吸収を刺激する；
x）線維性骨修復を刺激する；並びにこれらの組合せを生じさせる；
ここで、凍結乾燥骨格組成物が更に、キトサンオリゴマー、単量体グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、塩酸、乳酸、酢酸およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの制御再水和剤を更に含有してなることを特徴とする凍結乾燥骨格組成物。
【請求項２】
前記キトサンがカチオンである請求項１に記載の凍結乾燥骨格組成物。
【請求項３】
急性先天性免疫創傷修復応答を刺激する生物学的タンパク質又は他の因子の少なくとも１つを更に含有してなる請求項１に記載の凍結乾燥骨格組成物。
【請求項４】
下記の少なくとも１つを更に含有してなる請求項３に記載の凍結乾燥骨格組成物：
i) カチオン性両親媒性抗菌ペプチド；
ii) 細胞遊走を活性化させる生体模倣ペプチド;
iii) SDF-1/CXCL 12、ケモカイン、CXCL 10/IP-10、IL-1レセプター拮抗薬などのポリペプチド又はサブフラグメント、又は生物活性脂質。
【請求項５】
脱顆粒を誘起させることなく好中球走化性を活性化させる因子を更に含有してなる請求項４に記載の凍結乾燥骨格組成物。
【請求項６】
前記他の因子がLTB4、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、IL-4、IL-14、IL-10およびこれらの組合せからなる群から選択されるものである請求項４に記載の凍結乾燥骨格組成物。
【請求項７】
血管形成を刺激する少なくとも１つの生物学的治療用因子を更に含有するものである請求項１に記載の凍結乾燥骨格組成物。
【請求項８】
血管形成を刺激する少なくとも１つの生物学的治療用因子が、組換え因子VIIa(rhFVIIa)、トロンビン、組織因子(Tissue Factor)、VEGF、トリプターゼ、MMP-13、IL-8、MCP-1およびこれらの組合せからなる群から選択される請求項７に記載の凍結乾燥骨格組成物。
【請求項９】
炭酸カルシウム、燐酸カルシウム、ポリトリホスフェート、ヒドロキシアパタイトおよびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのミネラルを更に含有するものである請求項１に記載の凍結乾燥骨格組成物。
【請求項１０】
キトサン並びに任意として少なくとも１つの制御再水和剤を含有する凍結乾燥骨格組成物の製造方法であって、上記キトサンが８０％ないし９８％の範囲のプロトン化レベルを有する遊離アミン基を含有し、かつ、約5,000Daないし約400,000Daの範囲の分子量を有し、該キトサンが１つのプロトン化レベルを有することにより制御された再水和を生じさせるとともに、中性水性溶液、血液、血液由来流体およびこれらの組合せの少なくとも１つと接触したとき自発的な微粒子分散を形成するものであり、該製造方法が：
a) 上記キトサン並びに上記の任意の少なくとも１つの制御再水和剤を、酸の存在下で水と接触させ水性混合物を形成する工程と、
b) 該水性混合物を滅菌する工程と、
c) 該水性混合物を凍結乾燥させ凍結乾燥骨格組成物を与える工程と、
を具備してなることを特徴とする凍結乾燥骨格組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は出血軟骨下骨欠損での、及び／又は出血半月板穿孔チャンネルでの、及び／又は出血腱挿入部での、及び／又は出血回旋腱板修復（ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｒｏｔａｔｏｒ  ｃｕｆｆ  ｒｅｐａｉｒ）サイトでのインプランティーションの使用に供される凍結乾燥ポリマー組成物に係り、i）凝塊の居留を促進し、ii）骨髄由来関節軟骨修復および半月板修復に対する治療作用を刺激することに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節軟骨層に対する外傷又は反復的損傷は、非石灰化組織の変性および症候性局所軟骨病変の発展につながる。半月板損傷および球状膝（ｇｌｏｂａｌ  ｋｎｅｅ）変性を防止又は遅延させるため、骨軟骨接合部に接近する又はそれを侵すOuterbridge Grade IIIおよびIV変性は、しばしば外科的軟骨修復療法により治療されている。軟骨修復療法は創面切除のステップから始められ、そこで変性した関節軟骨の全てが病変領域からキュレット又はシェーバーを用いて除去され、病変の下にある軟骨下骨を露出させる。細胞アシスト療法においては、創面切除された病変部がついで、その病変部に細胞を保持させるため、生体適合性骨格（スカフォールド）又は組織弁を使用して自己細胞を適用して治療される。他のアプローチとして、微小破壊などの骨髄刺激療法では創面切除した軟骨欠損部のベースに直径〜2mm、深さ2ないし4mmの穴を骨に作り（非特許文献１、２）、小柱骨髄から軟骨病変部に移動する細胞による修復組織形成を刺激することがなされる。しかし、細胞介在又は微小破壊療法により誘発される修復組織は多くの場合、線維組織又は線維軟骨組織であり（非特許文献３、４）、これはヒアリン関節軟骨と比較して弱い生体力学的特性と限られた耐久性を有するものであることが報告されている。２つの別個の無作為化比較臨床試験（１つの治療群当り40人の患者で行ったもの）において、細胞療法の臨床的利点は、手術後5年目の微小破壊のものよりも優れてはいなかった（非特許文献３、４、７、８）。 微小破壊療法（その他"骨髄刺激"療法として知られている）は、焦点軟骨病変の治療において細胞療法に対するより安価な代替案を提供するものであり、同じような可能性の治療的応答が得られる。骨格的に高齢者の膝は、骨髄刺激に対し弱められた軟骨修復応答を有する（非特許文献９）。骨髄誘発修復組織の質および耐久性を改善する補助治療が従って望ましい。これは軟骨下骨硬化症の痕跡を有する慢性病変については特にそうである（非特許文献１０）。
【０００３】
液状キトサン調剤が開発されており、これは動物の微小破壊欠損における、より多くのヒアリン関節軟骨修復を成功裡に刺激するものであり（非特許文献１１）、微小破壊単独のものと比較して、ヒトにおける手術後1年での修復組織充填を増大させるものである（非特許文献１２）。しかし、現在の調剤および方法は幾つかの実施上の配慮の観点から制限されている。
【０００４】
1つの用途として、キトサン溶液は脱アセチル化（DDA）が75％ないし85％の生分解性中粘度キトサンおよびリン酸ニナトリウムグリセロールを用いて作られている。このキトサン溶液はついで、自己全血と1:3（v/v）の割合で混合され、更に、骨髄刺激により治療された軟骨病変部上に流される（非特許文献１１）。インプラントは、血液凝固、フィブリンの重合およびキトサンのpH６での溶解性連鎖からpH７での血液での微粒子化への変遷によりその場（in situ）で固化し、その間において、キトサン連鎖は補体C3などのアニオン性血液プロテインと錯体を形成する（非特許文献１４、１５）。このin situ-固化キトサン‐血液インプラントは、好中球、マクロファージ、あるいは活性化アルギナーゼ‐1＋マクロファージおよび破骨細胞を、軟骨下骨欠損の頂部近傍に一時的に集結させ、これが血管形成、骨再構築、軟骨病変に向けての間葉系間質細胞遊走、関節面近傍での軟骨再生軟骨形成中心の形成を刺激する（非特許文献１６−１８）。ヒト被験者において、上記の液状キトサン/血液混合物が瀉血療法を用いex vivoで作られ、ついで、in situ固化のため、15分待機時間とともにミニ関節切開を介して、微小破壊軟骨病変部上に、これを液体混合物として注射した（WO200200272-A, WO2011060553-A1、非特許文献１９）。in situ固化のための待機時間の間、その軟骨を空気中に露出させた。in situ固化のための瀉血療法、ex vivo操作および関節切開の間の15分の待機時間を必要としないで同じ治療応答を有するインプラントを作ることは非常に有利なことになるであろう。
【０００５】
他の従来技術においては、液状キトサン調剤を自己全血と混合させ、予備固化させ、高度に分散させたキトサン微粒子を含有する弾性筒状血液クロットインプラントを形成することがなされている（非特許文献２０, WO2011060554-A1）。このハイブリッドインプラントは、関節切開工程の前に作ることができ、従って関節切開時間を減少させ、水平に配置しない欠損部の治療を可能にする（WO2011060554-A1）。ラビット骨軟骨修復モデルにおいて、低分子量（10kDa, 40kDa）のキトサン調剤が、骨格的高齢ラビットにおける手術後3週間において治療骨軟骨創傷修復応答を刺激することが示された（非特許文献２１）。上記修復応答には、好中球、間葉系間質細胞および破骨細胞の走化性、急速線維軟骨形成の抑制および骨再構築などが含まれる。しかし、キトサンクリアランス動態は更に修復に影響することができる。なぜならば、高い代謝が急速創傷修復を駆動させるラビットにおいては、150kDaのキトサン調剤は余りにも徐々に解除され、それが過剰なアポトーシス好中球蓄積並びにより大きい骨吸収をもたらし、これは好ましくない作用である。全血に分散された10kDaのキトサンの水溶液から作られた予備固化されたインプラントは、ラビットの骨軟骨欠損部への圧入後70日目でドリルホール単独のものと比較して、より多くの骨再構築およびより大きいヒアリン（硝子）様軟骨修復を刺激した（非特許文献２２）。キトサン溶液と血液とを組み合わせることにより、分散キトサン微粒子を含有する血液クロットをどのように生じさせるかについては知られている。しかし、凍結乾燥キトサン調剤から直接、分散キトサン微粒子を含有する血液クロットをどのように生じさせるかについては現在知られていない。
【０００６】
血塊中に含有させたキトサン微粒子からなるインプラントは、好中球、或いは活性化マクロファージを皮下インプラントを含む他の部位に誘発させることが知られている（非特許文献２３）。従って、血液又は血液由来流体中に微粒子として分散する凍結乾燥キトサン骨格（スカフォールド）から作られるインプラントは、血行再建および半月板を含む他の関節組織の修復を刺激するのに使用することができる（非特許文献２４）。
【０００７】
液状キトサン調剤は、その溶液のpHおよびオスモル濃度に従って、室温で時間とともに、沈降し、ゲル化し、又は自然加水分解する（WO2011060553-A1）。液状キトサンの長期保存により自然に形成される低分子キトサン溶液は依然として、液状キトサン-血液インプラントを製造するのに使用することができるが、その得られた水性混合物のin situ固化のための使い易さには欠けている。なぜならば、液状低粘度ポリマー/血液混合物は軟骨欠損部に保留させることが困難であり、関節の輪郭が湾曲しているからである。加水分解がキトサンの構造および生物物理学的挙動を変更させるとしても、貯蔵の間にキトサンの分子量を維持させる方法が必要である。室温での長期貯蔵の間でポリマーの分子量を維持し、分散されたキトサン微粒子を含有するハイブリッドポリサッカリド-血液インプラントを形成させるのに使用することができ、インプランティーションのための15分待機時間を必要としない既製のキトサン調剤は、制御された機械的特性および特定の形（機械的一体性を有する剛性のもので、フレーク状ではない）を有しており、更にそれは所望に応じて、骨軟骨欠損部に送出し、保持させることができる。インプラントのためのex vivoでの準備について時間のかかる術中待機時間を回避することができ、in situ固化のための15分待機時間を必要とせず、骨髄刺激欠損部に容易に送出することができ、キトサンの分子量に何らの変化をもたらすことなく室温での長期貯蔵を可能とするようなキトサン装置があれば、それは非常に有利なことになるであろう。
【０００８】
脱アセチル化および分子量の明確な度合いの幾つかの凍結乾燥キトサン-酢酸調剤がラビットモデルにおける骨軟骨欠損内にインプラントされ、それによる骨および軟骨修復に対する有害な作用が示された（非特許文献２５）。Abarrategi et al 2010による研究において、体重3.0ないし3.4kgのN=3ラビットの大腿骨内側顆に欠損部を形成させており、これはMasoud et al 1986により公けにされたデータによれば骨格的に未熟のものであった（非特許文献２６）。キトサン-酢酸凍結乾燥骨格（スカフォールド）（80%DDA-500kDa, 90%DDA-500kDa, 90%DDA-9kDa）を用いた骨軟骨欠損のラビットの治療は、未治療の骨軟骨欠損のものと比較して、組織学的軟骨修復組織のスコアを改善させたり、減少させたりすることができなかった。手術後3ヶ月の時点で、未治療の欠損部との比較において、18%(w/w)炭酸カルシウム鉱物含量を伴って又は伴わずにキトサン（10kDa-83%DDA）で治療したN=3の欠損部で全体的組織学的スコアが改善されたという報告がなされている（非特許文献２５）。しかし、10kDa-83%DDAキトサンで治療した欠損部についての高い全体的組織学的スコアは、グリコサミノグリカン-涸渇細胞外マトリックスおよび修復組織の貧弱な構造的一体性を示す添付された組織学的画像と矛盾するものであった（非特許文献２５）。更に、未熟ラビットの骨軟骨欠損の高い自発的修復能力があること（非特許文献２９、３０）、更に、処置された欠損部にこのインプラントが生体内（in vivo）で保持されたとする証拠が乏しいことから、この研究の結果は処置された欠損部にこのインプラントが居留できなかったことにより説明することができる。別の凍結乾燥キトサン骨格が止血活性について特許されている。しかし、この調剤は非多孔性コラーゲン相を含み高い機械的特性を可能にしているが、これは凝塊中の微粒子分散と相容れないものである（非特許文献３１, IN200701721-13）。別の凍結乾燥キトサンスポンジが以前に考えられたが、その骨格は、インプラント後に固体で留まり長期の薬剤放出を可能にすることを意図したものである（非特許文献３２, KR2008016216-A）。
【０００９】
出血骨軟骨欠損部にインプラントするのに使用容易な他のポリマーインプラントが先に開発されているが、軟骨修復効果と不合理なものとなり、しばしば骨修復を抑制するものとなる。合成ポリグリコール酸（PGLA）/トリ-ポリホスフェート（TruFit（登録商標）, Smith & Nephew）の固体ヒドロゲル、スポンジ、架橋ポリマー又はシリンダーは軟骨下骨欠損部内で徐々に分解し、軟骨下骨再生を抑制し、関節軟骨修復と矛盾することが示されている（非特許文献３３−３６））。この骨修復を抑制することが示されているTruFit PGLA骨格は更に毒性分解産物を有する（PGLAは乳酸およびグリコール酸に分解する）。別のアプローチにおいて、ブタコラーゲンタイプIおよびコラーゲンタイプIIIの固体薄膜インプラント（Chondro-Gide（登録商標）, Geislich）が、微小破壊により処置された全層軟骨欠損部上にインプラントされたが、無細胞骨格としての軟骨修復を誘発における効果の証明は欠けていた（非特許文献３７）。肉芽組織形成と並行して速動性を以って生分解するポリマーは従って望ましいものである。なぜならば、そのようなポリマーは、骨の病変部への細胞の移行を物理的に干渉することなく、自然の創傷修復応答を増幅する能力を有するからであり、軟骨下骨板の石灰化骨修復の代わり、又は軟骨下骨スペースにおける大きな組織空隙の代わりに、ソフトな組織修復に導くインプラントと比較して、すぐれた生化学的特性を有する軟骨下骨組織を回復させる創傷修復応答を刺激する能力を有するからである。
【００１０】
拡張された微小破壊修復のためのインプラントの設計において、徐々に分解し軟骨下骨再生をブロックする剛性ポリマーと、低い内在的創傷修復生物活性を有するコラーゲン薄膜との間のバランスをとる必要がある。出血骨に適用される治療用インプラントの重要な特性は、遊走能（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ−ａｃｔｉｖｉｔｙ）、すなわち細胞および適当な細胞型を微小破壊された骨のチャンネルへ引き寄せるインプラントの能力である。最初の血液クロット内に均一に分散されたキトサン微粒子であって白血球による適当なin situ分解速動性を有するものは、軟骨下骨欠損部において血管形成を刺激すること（非特許文献３８）、並びに、軟骨下骨板の過渡吸収および修復を刺激することが示されており（非特許文献２２、３９、４０）、これは関節軟骨病変部のベースでの軟骨誘導および軟骨再生に導かれる（WO2011060554-A1）。
【００１１】
固体ポリサッカリドインプラント調剤であって、出血欠損部へ送出できる形に成形することができ、再現的に再水和し血液中で分散され、上記欠損部に居留される微粒子を形成することができ、マクロファージを誘引し、血管形成、局部骨再構築および骨軟骨修復を誘起させるものが望まれている。
【００１２】
現在の技術状態を考慮して、以下の基準の少なくとも１つに応答するキトサンインプラントが必要とされている：
a.  そのインプラントが剛性の3次元構造を有し、特定の形に成形させるため構造的一体性を維持できるものであること（限定されるものではないが、例えば、生検パンチで除芯（coring）して円筒状にしたり、メスでトリミングし、又は乾燥して円錐形又は円筒形とする）。
b.  凍結乾燥されたキトサン骨格（スカフォールド）であって、徐々に再水和して骨髄刺激骨欠損部に制御的物理的堆積および欠損部でのキトサン粒子の保持を可能にすること。
c.   凍結乾燥されたキトサンであって、その骨格が、全血、血漿、血清又は他の血液分画（すなわち、多血小板血漿、白血球分画、クエン酸添加血漿）で吸収された後に、微粒子として分散し、骨欠損部内において血塊の居留を促進すること。
d.   凍結乾燥キトサンが血液中で再水和したのち、血液中の分子種と生物調和（bio-interfaces）し、液状キトサンが全血又は血漿中に混合されたときに形成されるものと同じように、類似の血液プロテイン-キトサン錯体を形成すること（すなわち、キトサン-コンプリメントC3又はキトサン-コンプリメントC5、ファクターB、又はプロトロンビン）（非特許文献１５、４３）。
e.  血漿が、インプラント骨格と結合したのち、外因性又は内因性凝固カスケードを介して又は直接的トロンビン活性化を介してin situで凝固し、フィブリンクロットの形成をもたらすこと。
f.  そのインプラントが、軟骨下骨欠損部内に導入されたのち、処置されない欠損部よりも、より多くの好中球、マクロファージおよび血管新生の内の少なくとも１つを誘発させ、軟骨下骨板吸収を促進させ、軟骨病変部のベースでの軟骨誘導を刺激させ、硝子様修復軟骨を以って病変部の改善された表面再形成をもたらすこと。
g.  そのインプラントが、半月板裂目又は穿孔チャンネル、又は回旋腱板修復部位内に導入されたのち、処置されない欠損部よりも、より多くのマクロファージ、血管新生および間葉系幹細胞の内の少なくとも１つを誘発させ、それにより、破断された結合組織に対する生体力学的一体性を回復させること。
h.  歯科洞増強、腱挿入部位および骨空隙充填材への適用については、そのインプラントは血管形成および織骨形成を促進し、骨吸収を少なくすること。
i.   そのインプラントが、凍結乾燥の前においては、ペプチド、オリゴサッカリド、コラーゲン、アテロコラーゲン、凝固因子、走化性因子、生物活性脂質、生物活性因子、ミネラルなどを更に組み込むことができること。なお、これらの添加剤に限定されるものではない。
j.  上記項目（i）において、そのペプチドはカチオン性両親媒性ペプチド及び／又は生体模倣ペプチドであってもよく、これは好中球の脱顆粒を活性化させることなく、好中球の走化性を刺激するものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO200200272-A
【特許文献２】WO2011060553-A1
【特許文献３】WO2011060554-A1
【特許文献４】WO2011060554-A1
【特許文献５】WO2011060553-A1
【特許文献６】IN200701721-13
【特許文献７】KR2008016216-A
【特許文献８】WO2011060554-A1
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Steadman JR, Rodkey WG, Singleton SB, Briggs KK: Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical results, Operative Techniques in Orthopaedics 1997, 7:300-304
【非特許文献２】Mithoefer K, Williams RJ, 3rd, Warren RF, Potter HG, Spock CR, Jones EC, Wickiewicz TL, Marx RG: The microfracture technique for the treatment of articular cartilage lesions in the knee. A prospective cohort study, J Bone Joint Surg-Am Vol 2005, 87:1911-1920
【非特許文献３】knutsen G, Engebretsen L, Ludvigsen TC, Drogset JO, Grontvedt T, Solheim E, Strand T, Roberts S, Isaksen V, Johansen C, Autologous chondrocyte implantation compared with microfracture in the knee- A randomized trial, J Bone Joint Surg-Am Vol 2004, 86A:455-464
【非特許文献４】Saris DB, Vanlauwe J, Victor J, Haspl M, Bohnsack M, Fortems Y, Vandekerckhove B, Almqvist, K, et al: Characterized chondrocyte implantation results in better structural repair when treating symptomatic cartilage defects of the knee in a randomized controlled trial versus microfracture., Am J Sports Med 2008, 36:235-246
【非特許文献５】Knutsen G, Drogset JO, Engebretsen L, Grontvedt T, Isaksen V, Ludvigsen TC, Roberts S, Solheim E, Strand T, Johansen O: A Randomized trial compared autologous chondrocyte implantation with microfracture, J Bone Joint Surg-Am Vol 2007, 89A: 2105-2112
【非特許文献６】Vanlauwe J, Saris DBF, Victor J, Almqvist KF, Bellemans J, Luyten FP, for the TA, Group EXTS: Five-Year Outcome of Characterized Chondrocyte Implantation Versus Microfracture for Symptomatic Cartilage Defects of the Knee: Early Treatment Matters, The American Journal of Sports Medicine 2011, 39 2566-2574
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【非特許文献８】Hoemann CD, Gosselin Y, Chen H, Sun J, Hurtig M, Carli A, Stanish WD: Characterization of initial microfracture defects in human condyles, Journal of Knee Surgery 2013; 26(5): 347-55
【非特許文献９】Hoemann CD, Hurtig M, Rossomacha E, Sun J, Chevrier A, Shive MS, Buschmann MD: Chitosan-glycerol phosphate/blood implants improve hyaline cartilage repair in ovine microfracture defects, J Bone Joint Surg-Am Vol 2005, 87A:2671-2686
【非特許文献１０】Stanish WD, McComack R, Forriol CF, Mohtadi N, Pelet S, Desnoyers J, Restrepo A, Shive MS: Novel scaffold-based BST-CarGel（登録商標） treatment results in superior cartilage repair in a randomized controlled trial compared to microfracture.  Better structural repair at 12 months in terms of repair tissue quantity and quality. J.Bone Joint Surg-Am Vol 2013, 95(18):1640-50
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【非特許文献１４】Chen G. Sun J, Lascau-Coman V, Chevrier A, Marchand C, Hoemann CD. Acute osteoclast activity following subchondral drilling is promoted by chitosan and associated with improved cartilage repair tissue integration. Cartilage, 2011: 2:173-185
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【非特許文献１７】Hoemann C, Sun J, Hurtig M, Guzman-Morales J, Hubert-Lafantaisie C: Presolidified composition for use in repairing tissue of a patient, comprises a blood component, a salt and a polymer, the blood component, salt and polymer being mixed and solidified in a recipient before administration to the patient
【非特許文献１８】Lafantaisie-Favreau CH, Guzman-Morales J, Sun J, Chen GP, Harris A, Smith TD, Carli A, Henderson J, Stanish WD, Hoemann CD: Subchondral pre-solidified chitosan/blood implants elicit reproducible early osteochondral wound-repair responses including neutrophil and stromal cell chemotaxis, bone resorption and repair, enhanced repair tissue integration and delayed matrix deposition, BMC Musculoskeletal Disorders 2013, 14:27
【非特許文献１９】Guzman-Morales J, Lafantaisie-Favreau CH, Chen GP, Hoemann CD: Subchondral chitosan/blood implant-guided bone plate resorption and woven bone repair is coupled to hyaline cartilage regeneration from microdrill holes in aged rabbit knee.  Osteoarthritis and Cartilage 2014, 22:323
【非特許文献２０】Hoemann CD, Chen G, Marchand C, Sun J, Tran-Khanh N, Chevrier A, Thibault M, Fernandes MGJ, Poubelle PE, Shive MS, Centola M, El-Gabalawy H: Scaffold-guided subchondral bone repair: implication of neutrophils and alternatively activated arginase-1+macrophages. Am J Sports Med 2010;38:1845-56
【非特許文献２１】Chevrier A, Nelea M, Hurtig MB, Hoemann CD, Buschmann MD: Meniscus Structure in Human, Sheep, and Rabbit for Animal Models of Meniscus Repair, Journal of Orthopaedic Research 2009, 27:1197-1203
【非特許文献２２】Abarrategi A, Lopiz-Morales Y, Ramos V, Civantos A, Lopez-Duran L, Marco F, Lopez-Lacomba JL: Chitosan scaffolds for osteochondral tissue regeneration, Journal of Biomedical Materials Research Part A 2010, 95A: 1132-1141
【非特許文献２３】Masoud I, Shapiro F, Kent R, Moses A: A longitudinal study of the growth of the New Zealand white rabbit: Cumulative and biweekly incremental growth rates for body length, body weight,femoral length, and tibial length, Journal of Orthopaedic Research 1986, 4:221-231
【非特許文献２４】Shapiro F, Koide S, Glimcher MJ: Cell Origin and Differentiation in the Repair of Full-Thickness Defects of Articular Cartilage, J Bone Joint Surg-Am Vol 1993, 75A:532-553
【非特許文献２５】Wei XC, Messner K: Maturation-dependent durability of spontaneous cartilage repair in rabbit knee joint, J Biomed Mater Res 1999, 46:539-548
【非特許文献２６】Mehta RD: Accelerated wound healing system and their production method. Edited by MEHTA R D (MEHT-individual)
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【非特許文献２８】Hoemann CD, Sun J, Legare A, Mckee MD, Buschmann MD: Tissue engineering of cartilage using an injectable and adhesive chitosan-based cell-delivery vehicle, Osteoarthritis Cartilage 2005, 13:318-329
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【非特許文献３７】Chevrier A, Hoemann CD, Sun J, Buschmann MD: Temporal and spatial modulation of chondrogenic foci in subchondral microdrill holes by chitosan-glycerol phosphate/blood implants, Osteoarthritis Cartilage 2011, 19:136-144
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【非特許文献３９】Bell A, Hurtig M, Rivard GE, Hoemann CD. Effect of bone marrow surgical approach and rapidly degrading presolidified subchondral chitosan/blood implant on resurfacing of chondral defects in a sheep model. Transactions OARSI, April 2014, Paris
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本明細書において、「制御再水和剤（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）」の用語は、凍結乾燥した材料の再水和の速度を制御する組成又は調剤を有する物質を指すものである。
【００１６】
１つの形態として、少なくとも1つのポリサッカリドを含有する凍結乾燥骨格（スカフォールド）組成物であって、該骨格が実質的に固体であり、所望の形状に成形することができ、上記の少なくとも1つのポリサッカリドがプロトン化レベルを有し、それにより該骨格の制御された再水和を生じさせ、該骨格が中性水性溶液、血液、血液由来流体およびこれらの組合せの少なくとも１つと接触したとき、該骨格が：
i）微粒子分散を形成すると共に、以下の少なくとも1つを生じさせるもの：
ii）組織再構築を刺激する；
iii）同化的創傷修復を刺激する；
iv）クロット、好ましくはフィブリンクロット、血液クロット又はこれらの組合せを安定化させる；
v）好中球走化性を刺激する；
vi）マクロファージ走化性を刺激する；
vi）血管形成を刺激する；
viii）間葉細胞走化性を刺激する；
ix）線維症を抑制する；
x）破骨細胞形成および骨吸収を刺激する；
xi）線維性骨修復を刺激する；並びに
これらの組合せを生じさせる；
であることを特徴とする凍結乾燥骨格組成物が提供される。
【００１７】
他の形態として、少なくとも1つのポリサッカリド並びに任意として少なくとも1つの制御再水和剤を含有する凍結乾燥骨格組成物の製造方法であって、上記の少なくとも1つのポリサッカリドがプロトン化レベルを有し、それにより制御された再水和を生じさせるとともに、中性水性溶液、血液、血液由来流体およびこれらの組合せの少なくとも１つと接触したとき微粒子分散を生じさせるものであり、該製造方法が：
a)上記の少なくとも1つのポリサッカリドを、酸の存在下で水と接触させ水性混合物を形成する工程と、
b)該水性混合物を滅菌する工程と、
c)該水性混合物を凍結乾燥させ凍結乾燥骨格組成物を与える工程と、
を具備してなる凍結乾燥骨格組成物の製造方法が提供される。
【００１８】
他の形態として、少なくとも１つのポリサッカリドを有してなる凍結乾燥骨格組成物が提供され、ここでこの組成物は制御された様式で再水和するものである。1つの態様において、上記組成物は更に少なくとも１つの制御再水和剤を含有するものである。好ましくは、上記ポリサッカリドはキトサン、デキストランおよびそれらの組合せから選択される。好ましくは、上記キトサンは分子量が約5,000ダルトン（Da）ないし約400,000Da、より好ましくは約8,000ダルトン（Da）ないし約350,000Da、最も好ましくは約10,000ダルトン（Da）ないし約300,000Daの範囲のものである。もし、上記調剤中に存在させるとすると、上記の少なくとも１つの制御再水和剤は好ましくは、低分子キトサン、超低分子キトサン、キトサンオリゴマー、単量体グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択されるものである。好ましい態様において、上記の凍結乾燥ポリサッカリドは骨格(scaffold)の形をなしている。他の好ましい態様において、上記の凍結乾燥ポリサッカリドは多孔質、好ましくは高度の多孔質、より好ましくは非常に高度の多孔質、最も好ましくは超多孔質のものとする。
【００１９】
更なる１つの形態として、哺乳動物における血塊の緩和および創傷修復の促進のための凍結乾燥骨格組成物の使用が提供されており、此処で上記凍結乾燥骨格組成物が少なくとも1つのポリサッカリド並びに任意として少なくとも1つの制御再水和剤を含有し、上記の少なくとも1つのポリサッカリドがプロトン化レベルを有し、それにより制御された再水和を生じさせるとともに、中性水性溶液、血液、血液由来流体およびこれらの組合せの少なくとも１つと接触したとき微粒子分散を生じさせるものであルことを特徴とするものである。
【００２０】
他の１つの態様として、上記の少なくとも1つの制御再水和剤が酸から選択される。この酸は、ポリサッカリドのプロトン化状態の最適レベルを提供するように選択される。より好ましくは、この酸は薬理学的に許容される酸である。最も好ましくは、この酸は塩酸、乳酸、酢酸およびこれらの組合せからなる群から選択されるものである。更なる１つの態様として、キトサンが上記の少なくとも1つのポリサッカリドである場合、上記の少なくとも1つの制御再水和剤は、遊離アミン基のプロトン化が70%ないし100%の範囲、好ましくは80%ないし98%の範囲のプロトン化状態を生じさせる酸からなる。１つの態様として、約10,000Da以下の分子量を有するキトサンについては、上記プロトン化状態は好ましくは80%ないし100%の範囲とする。他の１態様において、10,000Daを超える分子量を有するキトサンについては、上記プロトン化状態は好ましくは90%ないし100%の範囲とする。
【００２１】
他の１態様において、上記凍結乾燥ポリサッカリドは薬理学的に許容される酸性塩の形態である。
【００２２】
他の１態様において、上記凍結乾燥ポリサッカリド組成物は更に、炭酸カルシウム、燐酸カルシウム、ポリトリホスフェート、ヒドロキシアパタイトおよびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのミネラルを含有する。
【００２３】
他の形態として、キトサンと、少なくとも1つの制御再水和剤とを有してなる凍結乾燥キトサン骨格組成物が提供される。好ましくは、このキトサンはその分子量が、約5,000Daないし約400,000Daの範囲のもの、より好ましくは約8,000Daないし約350,000Daの範囲、最も好ましくは約10,00Daないし約300,000Daの範囲のものとする。上記の少なくとも1つの制御再水和剤は、超低分子キトサン、キトサンオリゴマー、単量体グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される。好ましい態様において、上記キトサンは骨格の形態である。他の好ましい態様において、上記キトサンは多孔質、好ましくは高度の多孔質、より好ましくは非常に高度の多孔質、最も好ましくは超多孔質のものとする。
【００２４】
他の態様において、上記の少なくとも1つの制御再水和剤は酸から選択される。この酸はキトサンのプロトン化状態の最適レベルを提供するように選択される。より好ましくは、この酸は薬理学的に許容される酸である。最も好ましくは、この酸は塩酸、乳酸、酢酸およびこれらの組合せからなる群から選択されるものである。上記の少なくとも1つの制御再水和剤は遊離アミン基のプロトン化が70%ないし100%の範囲、好ましくは80%ないし98%の範囲のプロトン化状態を生じさせる酸からなる。１つの態様として、約10,000Da以下の分子量を有するキトサンについては、上記プロトン化状態は好ましくは80%ないし100%の範囲とする。他の１態様において、10,000Daを超える分子量を有するキトサンについては、上記プロトン化状態は好ましくは90%ないし100%の範囲とする。
【００２５】
他の態様において、上記の凍結乾燥キトサン骨格組成物は更に、非限定的に、グルコサミンおよびN-アセチルグルコサミンから選択される少なくとも１つのキトサンアミノ糖を含有する。
【００２６】
他の態様において、上記のキトサンは好ましくは、脱アセチル化度（DDA）が約50%ないし約100%、より好ましくは約70%ないし約90%、最も好ましくは約80%とする。
【００２７】
他の態様において、上記のキトサンは薬理学的に許容される酸性塩の形である。好ましくは、この酸は無機酸であり、より好ましくはハロゲン化水素酸である。最も好ましくは、この酸は、塩酸である。好ましくは、上記無機酸は、キトサンポリマーのアミノ基についてモル比で約70%ないし約110%の範囲、より好ましくは約75%ないし約105%の範囲、最も好ましくは約80%ないし約90%の範囲で存在させる。好ましくは、10,000Da以下のキトサンについては、80%ないし90%のモル比が好ましく、10,000Daを超えるキトサンについては、90%ないし100%のモル比がより好ましい。
【００２８】
他の態様において、上記の凍結乾燥キトサン骨格組成物は更に、少なくとも１つの生物学的治療用プロテイン又は他の因子、すなわち、急性先天性免疫創傷修復応答を刺激するものを含有する。好ましくは、この少なくとも１つの生物学的治療用プロテイン又は他の因子としては、非限定的に、細胞遊走を活性化させるカチオン性両親媒性抗菌ペプチド又は生体模倣ペプチドが含まれ、これには、非限定的に、SDF-1/CXCL 12、ケモカイン、CXCL 10/IP-10、IL-1レセプター拮抗薬、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、IL-4、IL-13、IL-10及びペプチドのポリペプチド又はサブフラグメント、LTB4又はPGE2などの生物活性脂質、又は脱顆粒を誘起させることなく好中球走化性を活性化させる因子が含まれる。
【００２９】
他の態様において、上記の凍結乾燥キトサン骨格組成物は更に、血管形成を刺激する少なくとも１つの生物学的治療用因子を含有するもので、これには、非限定的に、組換え因子Vlla(rhFVlla)、トロンビン、組織因子（Tissue Factor）、VEGF、トリプターゼ、MMP-13、IL-8、MCP-1が含まれる。
【００３０】
他の形態として、ここに記載した凍結乾燥ポリサッカリド骨格組成物の製造方法が提供され、その方法は、少なくとも１つのポリサッカリドおよび少なくとも１つの制御再水和剤を、滅菌条件下で酸の存在下で水と接触させて水性混合物を形成する工程と、この混合物を凍結乾燥させ凍結乾燥ポリサッカリド骨格組成物を生じさせる工程とを具備してなる。好ましくは、上記の少なくとも１つのポリサッカリドは、キトサン、キトサンアミノ糖、デキストランおよびこれらの組合せからなる群から選択されるものである。キトサンは、好ましくは、その分子量が約5,000Daないし約400,000Daの範囲のもの、より好ましくは約8,000Daないし約350,000Daの範囲、最も好ましくは約10,00Daないし約300,000Daの範囲のものとする。上記の少なくとも1つの制御再水和剤は好ましくは、超低分子キトサン、キトサンオリゴマー、単量体グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される。
【００３１】
上記方法の他の態様において、上記の少なくとも1つの制御再水和剤は酸から選択される。この酸はキトサンのプロトン化状態の最適レベルを提供するように選択される。より好ましくは、この酸は薬理学的に許容される酸である。最も好ましくは、この酸は塩酸、乳酸、酢酸およびこれらの組合せからなる群から選択されるものである。一具体例において、上記の少なくとも1つの制御再水和剤は遊離アミン基のプロトン化が70%ないし100%の範囲、好ましくは80%ないし98%の範囲のプロトン化状態を生じさせる酸からなる。１つの態様として、約10,000Da以下の分子量を有するキトサンについては、上記プロトン化状態は好ましくは80%ないし100%の範囲とする。他の１態様において、10,000Daを超える分子量を有するキトサンについては、上記プロトン化状態は好ましくは90%ないし100%の範囲とする。
【００３２】
この方法の他の態様において、上記のキトサンは好ましくは、脱アセチル化度（DDA）が約50%ないし約100%、より好ましくは約70%ないし約90%、最も好ましくは約80%とする。
【００３３】
上記の少なくとも１つのポリサッカリドは好ましくは、上記水性混合物中に、約0.2ないし約7%（w/v）、より好ましくは約0.3ないし約5%（w/v）、最も好ましくは約0.5ないし約3%（w/v）の量で存在させる。好ましい態様において、キトサンモノマー又は短鎖キトサンポリマーを含有する上記の少なくとも1つの制御再水和剤は、上記水性混合物中に、約0.2ないし約10%（w/v）、より好ましくは約0.3ないし約7%（w/v）、最も好ましくは約0.5ないし約5%（w/v）の量で存在させる。
【００３４】
好ましい態様において、上記の少なくとも1つの制御再水和剤が酸を含有する場合は、前記水性混合物のpHを約2ないし約6として、キトサンアミンプロトン化状態が100%ないし約80%のものとし、最も好ましくは、前記水性混合物のpHを約2ないし約5.5として、キトサンアミンプロトン化状態が100%ないし約90%となるようにする。好ましい態様において、上記水性混合物のオスモル濃度は約5ないし約200mOsmの範囲とする。
【００３５】
他の好ましい態様において、上記凍結乾燥工程は、上記水性混合物をほぼ室温から約−40℃に制御しながら冷却して溶液を凍結させ、ついでこの混合物を乾燥させることにより無菌状態で行われる。好ましくは、この冷却速度は毎分約1℃とする。好ましくは、乾燥工程は真空下、好ましくは約100mTorrの真空度で行われる。１つの形態において、第一次乾燥工程は約36時間ないし約54時間、最も好ましくは約48時間継続させる。好ましくは、第二次乾燥工程は6時間ないし24時間、好ましくは12時間に亘り、毎分0.05℃ないし0.2℃の昇温速度でより好ましくは毎分0.1℃の昇温速度で、好ましくは約−40℃から約30℃まで加熱して行われ、それに続いて約30℃の等温を約6時間、維持する工程が続行され、その後、真空が除去される。
【００３６】
他の形態として、凍結乾燥キトサン骨格組成物の製造方法が提供され、その方法は、キトサンおよび少なくとも１つの制御再水和剤を、滅菌条件下で酸の存在下で水と接触させて水性混合物を形成する工程と、この混合物を凍結乾燥させ凍結乾燥キトサン骨格組成物を生じさせる工程とを具備してなる。好ましくは、この組成物は更にキトサンアミノ糖を含有する。このキトサンは、好ましくは、その分子量が約5,000Daないし約400,000Daの範囲のもの、より好ましくは約8,000Daないし約350,000Daの範囲、最も好ましくは約10,00Daないし約300,000Daの範囲のものとする。上記の少なくとも1つの制御再水和剤は好ましくは、超低分子キトサン、キトサンオリゴマー、単量体グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される。
【００３７】
上記方法の他の態様において、上記の少なくとも1つの制御再水和剤は酸から選択される。この酸はキトサンのプロトン化状態の最適レベルを提供するように選択される。より好ましくは、この酸は薬理学的に許容される酸である。最も好ましくは、この酸は塩酸、乳酸、酢酸およびこれらの組合せからなる群から選択されるものである。
【００３８】
上記方法の他の態様において、上記のキトサンは好ましくは、脱アセチル化度（DDA）が約50%ないし約100%、より好ましくは約70%ないし約90%、最も好ましくは約80%とする。
【００３９】
上記方法のキトサンは好ましくは、上記水性混合物中に、約0.2ないし約7%（w/v）、より好ましくは約0.3ないし約5%（w/v）、最も好ましくは約0.5ないし約3%（w/v）の量で存在させる。上記の少なくとも1つの制御再水和剤は好ましくは、上記水性混合物中に、約0.2ないし約10%（w/v）、より好ましくは約0.3ないし約7%（w/v）、最も好ましくは約0.5ないし約5%（w/v）の量で存在させる。
【００４０】
上記方法の好ましい態様において、上記水性混合物のpHを約2ないし約6として、キトサンアミンプロトン化状態が100%ないし約80%のものとし、最も好ましくは、前記水性混合物のpHを約2ないし約5.5として、キトサンアミンプロトン化状態が100%ないし約90%となるようにする。好ましい態様において、上記水性混合物のオスモル濃度は約5ないし約200mOsmの範囲とする。
【００４１】
上記方法の他の好ましい態様において、上記凍結乾燥工程は、上記水性混合物をほぼ室温から約−40℃に冷却させ、ついでこの混合物を乾燥させることにより行われる。好ましくは、この冷却速度は毎分約1℃とする。好ましくは、乾燥工程は真空下、好ましくは約100mTorrの真空度で行われる。第一次乾燥工程は約36時間ないし約54時間、最も好ましくは約48時間継続させる。好ましくは、第二次乾燥工程は6時間ないし24時間、好ましくは12時間に亘り、毎分0.05℃ないし0.2℃の昇温速度、より好ましくは1℃の昇温速度で、好ましくは約−40℃から約30℃まで加熱して行われ、それに続いて約30℃の等温を約6時間、維持する工程が続行され、その後、真空が除去される。
【００４２】
他の1つの形態として、哺乳動物における血液凝固および創傷修復のための凍結乾燥ポリサッカリド骨格組成物の使用が提供される。この組成物は少なくとも1つのポリサッカリドおよび少なくとも1つの制御再水和剤を有する。好ましくは、上記の少なくとも1つのポリサッカリドはキトサンから選択される。好ましくは、このキトサンはその分子量が、約5,000ダルトン（Da）ないし約400,000Daの範囲のもの、より好ましくは約8,000Daないし約350,000Daの範囲、最も好ましくは約10,00Daないし約300,000Daの範囲のものとする。好ましくは、上記の少なくとも1つの制御再水和剤は、超低分子キトサン、キトサンオリゴマー、単量体グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される。他の態様において、上記の少なくとも1つの制御再水和剤は、約2,000Daないし約20,000Daの範囲、最も好ましくは約3,000Daないし約8,000Daの範囲のデキストランからなる群から選択される。好ましい態様において、上記の凍結乾燥組成物は、骨格（スカホールド）の形態である。他の好ましい態様において、上記の凍結乾燥組成物は多孔質、好ましくは高度の多孔質、より好ましくは非常に高度の多孔質、最も好ましくは超多孔質のものとする。
【００４３】
上記の使用の他の態様として、上記の少なくとも1つの制御再水和剤は酸から選択される。この酸は、キトサンのプロトン化状態の最適レベルを提供するように選択される。より好ましくは、この酸は薬理学的に許容される酸である。最も好ましくは、この酸は塩酸、乳酸、酢酸およびこれらの組合せからなる群から選択されるものである。
【００４４】
他の態様において、上記の凍結乾燥ポリサッカリドは薬理学的に許容される酸性塩の形である。好ましくは、この酸は無機酸であり、より好ましくはハロゲン化水素酸である。最も好ましくは、この酸は、塩酸である。上記の少なくとも1つの制御再水和剤が酸からなるとき、それはプロトン化状態が、遊離アミン基の70%ないし約100%の範囲のプロトン化、好ましくは80%ないし約98%の範囲のプロトン化を生じさせるものする。１つの態様において、約10,000Da以下の分子量のキトサンについては、上記プロトン化状態は、80%ないし100%の範囲のプロトン化が好ましい。他の態様において、10,000Daを超える分子量のキトサンについては、上記プロトン化状態は、90%ないし100%の範囲が好ましい。
【００４５】
１つの態様において、創傷修復は、非限定的に、血管形成、細胞走化性、組織再構築、関節修復のための粘弾性細胞外マトリックス沈着、骨折修復、半月板修復、回旋腱板修復、線維化の抑制、血行再建および同化組織再生からなる群から選択されるものである。他の1態様において、上記組成物は創傷部位に対し固体で投与される。
【００４６】
他の１形態として、哺乳動物における創傷修復のためのキットが提供される。このキットは、少なくとも１つのポリサッカリドおよび少なくとも１つの制御再水和剤を含有する凍結乾燥骨格組成物と、カット用ツール、注射ツール、マイクロドリル又はマイクロピック、および整形ツールを具備してなる。
【００４７】
他の１形態において、凍結乾燥ポリサッカリド骨格組成物は、好ましくは生体内（in vivo） 又はin vitroで全血又は血液要素と組み合わせ、ついでその組成物を出血チャンネル、出血創傷部又は出血面に導入するため、全血又は血液要素と組み合わせたのち若しくはフィブリン線維形成の後、in vivoで送出される。好ましくは、上記出血チャンネルは、ドリルビット、穿子、突き錐、穿孔針、K-ワイア、中空チューブ、Jamshidi針およびこれらの組合せからなる群からなる外科用ツールの多様な配列により形成することができる。好ましくは、上記出血創傷部は偶発的外傷によって、あるいは外科的処置によって形成される。好ましくは、上記出血面は、シェーバー、キュレット、外科用メス、スクレーパ、ナイフからなる群から選択されるツールにより生じさせることができる。好ましい態様において、凍結乾燥ポリサッカリド骨格は、軟骨下骨、骨、歯周骨、半月板、腱挿入部位、回旋腱板、皮膚およびこれらの組合せからなる群から選択される出血創傷部、更に、好中球およびマクロファージ走化性、幹細胞走化性、血管形成および組織再構築などのアナボリック創傷修復が望ましい器官の治療に使用することができる。
【００４８】
更なる他の態様については当業者にとって明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、所望の肉眼的外観および物理的特性を有するところの制御された凍結乾燥により作られた凍結乾燥組成物を、無制御の凍結乾燥プロセスによるもので最適以下の肉眼的外観および物理的特性を有するものと対比させて示す図である。制御された凍結乾燥条件Ａ（図１Ａ）は無傷の３−Ｄ円筒状キトサン骨格を作り出し、これに対し、標準Labconco装置での凍結乾燥条件Ｂ（図１Ｂ）では、除芯（cored）又は成形できない機械的一体性の乏しいキトサンフレークが作り出された。
【００５０】
【図２】キトサン組成物を実証する図であり、これは、成形され、ツールで送出され、凝固するヒト血漿内にて自発的微粒分散を行う能力を示している。内因性凝固カスケードを介して凝固を開始させるため硝子ビーズの存在下での再石灰化ヒトクエン酸処理血漿内の自発的微粒分散について複数のキトサン調剤をテストした。このアッセイ（ａｓｓａｙ）において、凍結乾燥キトサンケーキの一貫した量を皮膚生検パンチを用いて除芯し、送出し（図２Ａ−２Ｃ）、170μLのヒトクエン酸処理血漿、10μL、200mMのCaCl2および5又は10μＬの10mg/mLの硝子ビーズ（ddH2O中）を収容した96-ウエル内に入れた（図２Ｄ）。これらサンプルを再水和させ、37℃で1時間凝固させた。選択された一部の調剤のみが均質で網状の微粒子分散を血漿中に形成することができ（図２Ｅ、２Ｇ、２Ｉ）、他の調剤は微粒子として分散することができなかった（図２Ｆ、図２Ｈ）。或る特定の実施例において、低分子骨格（10Daキトサン-HCl溶液をpH 4.5凍結乾燥させたもの、調剤#２）を徐々に再水和させ、微粒子として分散させた（図２Ｅ）。一方、高低分子骨格（85Daキトサン-HCl溶液をpH 4.5凍結乾燥させたもの、調剤#３１）は再水和し始めたが（図２Ｄ）、意外にも分散できなかった（図２Ｆ）。溶液のpHを低くすることにより、高低分子骨格（85Daキトサン-HCl溶液をpH 2.5凍結乾燥させたもの、調剤#３３）は徐々に再水和し（図２Ｄ）、微粒子として分散した（図２Ｇ）。低分子/高低分子キトサンの組合せも微粒子として分散した（図２Ｉ）。
【００５１】
【図３】図３は、クエン酸処理ヒト血漿およびキトサン骨格調剤のトロンボエラストグラフィーアッセイを示しており、ここではサンプルを、カルシウムおよび硝子ビーズを用いて直ちに、又は1ないし60分遅延させたのち、クロット活性化させた。このアッセイは、ヒトの血漿に微粒子として分散するキトサン骨格の再水和動態を実証するものである。再石灰化クエン酸処理ヒト血漿と、時間＝０で添加した硝子ビーズとを用いたこの標準化されたトロンボエラストグラフィー（TEG）アッセイにおいては、クロット化時間（パラメータＲ）は開始後7ないし10分で始まり、ついで一気のクロット動態が続いた（図３Ａ）。キトサン凍結乾燥骨格（調剤#２８：10kDa、90％DDA、凍結乾燥法Ａ、生検パンチで除芯したもの）をクエン酸処理血漿に添加し、TEGアッセイを、CaCl2および硝子ビーズを添加することにより1分後に開始した。その凝固時間およびクロット引張り強度の発現は若干遅延された（パラメータＲおよびＫ、図３Ｂ）。水和された90％DDAキトサンポリマーは抗トロンビン活性を有することが知られている。これらのデータは、この骨格が血漿と接触した時点と、一気のトロンビン活性化の時点との間に、この骨格が部分的に再水和され始めること（図３Ｂ）を実証している。第３のテストにおいて、この凍結乾燥キトサン骨格（調剤#２８：90％DDA、凍結乾燥法Ａ）を、クエン酸処理ヒト血漿と組み合わせた後、60分間、再水和させ、ついでクロット活性化剤（CaCl2および硝子ビーズ）を添加した。上記TEGトレースによれば、1分間で再水和した同じ骨格（図３Ｂ）と比較して、より遅延したクロット時間（Ｒ）および一気の凝固（図３Ｃ）のより大きい抑制が示された。これは、完全なキトサン再水和および負に帯電したGlaドメイン含有凝固因子の、正に帯電した可溶化キトサン微粒子との関連に起因するものである。（図３Ｂ）と（図３Ｃ）との組合せデータは、この抑制作用はキトサンの再水和によるものであり、凍結乾燥骨格のHCl成分に起因するものでないことを示している。第４のテストにおいて、凍結乾燥キトサン骨格（調剤#３３：85kDa、80.6％DDA、pH 2.5）を、60分の時点でクロット活性化剤を添加する前に、クエン酸処理ヒト血漿中で60分間再水和させた（図３Ｄ）。このキトサン骨格による凝固時間およびフィブリンアセンブリーの遅延が観察され、これは85kDaキトサンがトロンビン活性化の前に再水和したことを示した。この実験により、キトサン骨格が十分に再水和され、凝固因子とバイオインターフェースする微粒子を形成したことが確認された。これらのデータは更に、ここに記載した特定のキトサン調剤が制御された再水和を受け、これが血漿との接触の後1ないし60分の間隔の間に生じることを実証するものである。
【００５２】
【図４】図４は外科手法で使用された凍結乾燥キトサン骨格インプラントの比較を示すものであり、良好な取扱い特性を有する種々の調剤の中で僅か選ばれた調剤の、出血骨欠損部内での制御された再水和を実証している。凍結乾燥キトサン骨格インプラントは、凍結乾燥法Ａを用いて形成され（図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃ）、ここで、キトサン（80％DDA、10K キトサン-HCl、pH 4.5-5.5）が、凍結乾燥保護剤（幾つかの異なる種類）および凍結乾燥保護剤単独（異なる種類）を伴い又は伴わずに用いられた。取扱い特性および生検パンチで筒状骨格の除芯能力は手術において、テストされた全ての骨格について文書化された（図４Ｃ）。しかし、選択された骨格のみが所望のゆっくりした再水和動態を以って溶解した。図（４Ｄ）は凍結乾燥保護剤を伴ったキトサン骨格が即座に溶解した1例を示し（図４Ｅ）および図（４Ｆないし４Ｉ）は、ビデオ画像列を示すもので、ここで、凍結乾燥保護剤の代わりにデキストラン‐５を伴った個別のキトサン骨格が組織像スライド（図４Ｅ）又は出血マイクロドリルホール（穴）（図４Ｇ‐４Ｉ）内で全血と接触して徐々に溶解している。（図４Ｊ）は、in situ微粒子分散および血液凝固の前における、出血マイクロドリルホール中での凍結乾燥保護剤を伴わない凍結乾燥キトサンのインプラント（調剤#５）のゆっくりしたin vivo再水和を示している。（図４Ｋ）および（図４Ｌ）は、ビデオ画像列において、キトサンと凍結乾燥保護剤との凍結乾燥調剤（調剤#２６）の即座の再水和を示しており、これはインプラント送出についての制御不良に起因する調剤拒絶につながるものである。
【００５３】
【図５】図５はラビットの出血骨軟骨欠損部に適用した凍結乾燥ポリサッカリド骨格インプラントが術後２１日目で依然として部分的に居留していること（図５Ａ）、選択された調剤が、マクロファージ、さもなくば、活性化アルギナーゼ-1+マクロファージの局所的蓄積および血管新生血管を含む治療反応を引き出したこと（図５Ｃ−５Ｈ）を示している。凍結乾燥キトサン骨格インプラントは、図５Ａおよび５Ｂに示すように、治療したラビットの滑車膝軟骨欠損部内に術後２１日まで保持された。これら図中、白色の色相は四角い全層軟骨欠損部中の居留ローダミン-キトサンの赤色蛍光信号を表わしている；これらインプラントは更に、その他、活性化アルギナーゼ-1+マクロファージ（図５Ｃ）およびマクロファージ（RAM-11+、図５Ｄ）を誘引するとともに、凍結乾燥キトサン骨格で処置したマイクロドリルホール内に形成された肉芽組織内に血管新生血管を引き出している（図５Ｅ−５Ｆ）。本図中、血管形成を引き出した調剤は、80％DDAキトサン、10kDaを希塩酸中に5mg/mL又は10mg/mLで溶解させ、制御された凍結乾燥法により処理したものである（調剤#４および#５）。図５Ｇおよび５Ｈは、ラビットの出血骨軟骨欠損部に適用した凍結乾燥ポリサッカリド骨格インプラントデキストラン-5単独およびデキストラン-5とキトサンとの組合せがそれぞれ術後21日目において治癒しているドリルホール内で血管新生肉芽組織の形成を刺激していることを示している。
【００５４】
【図６】図６は、制御された再水和を伴ったキトサン骨格で治療した、若しくは治療しないラビットのドリルホール（ｄｒｉｌｌｅｄ）軟骨欠損部内における修復応答の肉眼的又は組織学的比較を示している。凍結乾燥ポリサッカリド骨格インプラントは、術後21日目においてラビットの骨軟骨欠損部内で血管形成および抑制された線維軟骨形成を引き出した。他方、ドリルホールのみのものは線維軟骨形成を引き出した。線維軟骨は肉眼的白色組織の存在により示され（図６Ａ）、これはグリコサミノグリカン（図６Ｃ）および関節表面近傍のコラーゲンタイプＩ（線維性組織）を含んでいる（図６Ｄ）。比較のため、術後21日目の反対側の膝においては、凍結乾燥キトサンインプラント（凍結乾燥法Ａ、10kDaキトサン-HCl pH5.5, 5mg/mL又は10mg/mL、それぞれ近位および遠位の穴）で治療したドリルホールに、そこにダークグレーの肉眼的外観で示すように血管形成組織で満たされ（図６Ｂ）、大きく血管が新生した肉芽組織の赤色相（図６Ｅ）およびコラーゲンタイプＩ沈着不良又は線維症（図６Ｅ）が表わされている。ドリルホールのみの欠損部に、術後21日目に、一体化の乏しい線維軟骨修復組織を満たした（図６Ｃ）。10Kのキトサン単独およびデキストラン-5インプラントは局所的血管形成を引き出し、線維軟骨合成を抑制した（図６Ｄ、６Ｆ）。図６Ｅ中の矢線は個々の血管を指している。
【００５５】
【図７】図７は、凍結乾燥キトサン含有インプラントを、デキストラン-5および凍結乾燥保護剤単独との対比で、軟骨修復についてin vivoラビットモデルにおける骨再構築を刺激する能力を比較するものである。このグラフは、術後21日目のマイクロドリルホールの頂部（灰色バー）およびこの頂部から0.5mm下（黒色バー）のドリルホール断面積を示すもので、これは治療大腿骨遠位端の2D較正マイクロコンピュータ断層撮影頭頂画像におけるホール円周から測定したものである。このデータは、凍結乾燥ポリサッカリド骨格インプラントが、キトサン（しかし、デキストラン-5ではなく、スクロース又はトレハロース凍結乾燥保護剤単独によってではない）の添加による骨のホールの端部での再構築を刺激するように設計することができることを示すものである。デキストラン-5（水中、50mg/mL、調剤#７、凍結乾燥方法Ａ）は骨吸収を誘起させることなく血管形成を引き出した（図５Ｇに示すように）。骨再構築はドリルホール平均径をホールの頂部（ライトグレーのバー）およびこの頂部より0.5mm下（黒色バー）で広げることにより実証される。骨再構築を誘起させたこの骨格はホール断面積が2mmを超えたものである（点線より上）。ソルビトールを含有するインプラント（コンディション“So”および“SoC”）はドリルホールを跨る骨の代謝性骨吸収、つまり好ましくない作用を示したことが注目される（図7中のシンボル#、調剤#２３と調剤#１６）。骨再構築を誘起させたこの骨格はシンボル（＊）で強調されている。この実験において、全てのキトサンインプラントは10kDa,80%DDAおよびプロトン化レベル80%、pH 4.5を有し、増量剤を含み又は含まず、方法Ａによる凍結乾燥の前に滅菌されたものである（表１および３を参照）。シンボル：S＝50mg/mLスクロース； CS＝2.4mg/mLキトサン＋50mg/mLスクロース； So＝50mg/mLソルビトール； SoC＝2.4mg/mLキトサン＋50mg/mLソルビトール； T＝50mg/mLトレハロース； TC＝5mg/mLキトサン＋50mg/mLトレハロース； D5＝50mg/mLデキストラン-5； D5C＝5mg/mLキトサン＋50mg/mLデキストラン-5； C5＝5mg/mLキトサン-HCl； C10＝10mg/mLキトサン-HCl。
【００５６】
【図８】図８は、剛性ケーキから除芯したのちヒツジの穿孔骨軟骨のホールにインプラントした凍結乾燥キトサンインプラント（調剤#２９、#３３および#３４）の比較を示すものである。これらのデータは凍結乾燥キトサンインプラント（８Ａ、85kDaキトサン-HCl、pH約2.5、それぞれ5mg/mL、10mg/mLおよび20mg/mL、調剤#２９、#３３および#３４）が、剛性凍結乾燥骨格から除芯（coring）することができ、大腿骨内側顆（８Ｂ、骨格的に高齢のヒツジ）の軟骨欠損部の穿孔ヒツジ骨軟骨ホールにインプラントすることができることを示している。インプラントなしの出血マイクロドリルホールがパネルに示されている（図８Ｃ）。インプラント処置のための手術時間の平均的増加は、7分であり、これは予備固化キトサン/血液インプラントについての15分並びにin situ‐固化キトサン-GP/血液インプラント20ないし30分と比較して可なり短い（図８Ｄ）。術後1日目で、処置したドリルホールがハイブリッド血液クロットで満たされたことをこのデータは更に示しており（図８Ｅ、肉眼的外観）、ローダミン-キトサントレーサのエピフルオレセンス顕微鏡から明らかなように、これらホールにキトサン骨格が収容されている（巨視的な白色シグナル、図８Ｆ）。図８Ｇは、術後1日目において凍結乾燥キトサンインプラントがin situで再水和され、処置されたドリルホール内に粒子を形成したことを示している。これは赤色蛍光80kDa RITC-キトサン微粒子（トレーサとして添加した）を表わす白点状信号を指す白色矢線並びにマイクロドリルホールの周りの緑色自家蛍光骨組織を表わすグレー信号を指す白色矢線により示されている。図８Ｈは、術後１日目でのヒツジのマイクロドリルホール内の血液クロット中のin situ再水和したキトサン粒子の高倍率画像を示している（矢線はグレーの網状キトサン微粒子を指している）。
【００５７】
【図９】図９は、術後３および９ヶ月での、インプラント誘起骨再構築および修復を示す２つのチャートである。これらのデータは、術後１日目、３ヶ月、９ヶ月でのドリルホール部の頂部から異なる深さでの平均残留マイクロドリルホールの断面積のマイクロコンピュータ断層撮影測定値を、ドリルホール欠損部（対照）と、in situ再水和したキトサン骨格（調剤#２９、#３３および#３４）で治療したドリルホール欠損部とを対比させて示している。図９Ａは、術後３ヶ月での深さ依存的ドリルホールの断面積を示し、図９Ｂは、ドリルホールの頂部近傍の残留骨の穴面積のマイクロ-ＣＴ測定値を時間とともに示している。１日目でのマイクロドリルホールは、2.0±0.5mm2の均一な断面積を有していた（図９Ｂ）。このデータは、治療したホール並びに未治療のホールが、このドリルホールの頂部近傍で何らかの骨再構築を有することを示している。なぜならば、３ヶ月での平均ホール径は４mm２である（図９Ａ、レベル１および図９Ｂ、ｐ<0.0001、３ヶ月対１日目参照）。治療したホールは、ドリルホールのみの欠損部と比較して、マイクロドリルホール中で、より大きい断面積をより深く有することを示している（p=0.052、図９Ａ）。これは骨再構築を反映しており、より深い骨髄からマイクロドリルホールへのより多くの細胞遊走を可能にするものである。より完全な骨のホール修復が、ドリルホールのみの欠損部との対比において、治療部で９ヶ月目で見られた（p=0.03、図９Ｂ）。
【００５８】
【図１０】図１０は、高齢のヒツジモデルにおける術後３ヶ月での巨視的、組織学的軟骨修復を示すもので、この場合、各大腿骨内側顆に10x10mmの全層軟骨欠損を生じさせ、11のマイクロドリルホールで処置し、更に、1つの膝について滅菌凍結乾燥キトサン（調剤#２９、#３３および#３４）で治療した。図９Ａ−９Ｃおよび図９Ｄ−９Ｆに示す例示のヒツジの修復において、１つの膝顆欠損部を更なる治療を伴うことなく穿孔し（図９Ａ）、反対側の軟骨欠損部を穿孔し、キトサン骨格で治療した（図９Ｄ）。術後３ヶ月において、ドリルホールのみの軟骨欠損部には、ソフトな修復組織が殆んど含まれていなかった（図９Ｂ、巨視的、および残余の骨のホールを示すマイクロＣＴ走査に相当する図９Ｃ）。in situ水和キトサン骨格で処置したドリルホール内には黒色の修復組織色相が示されており、これは赤色の血管形成肉芽組織（図９Ｅ、10mg/mLおよび5mg/mLインプラントにより治療されたホールを指す矢線）並びに幾つかの軟骨修復組織（図９Ｅ、20mg/mLインプラントにより治療されたホールを指す矢線）およびドリルホールエッジを囲む、より多孔質の骨構造（図９Ｆ、治癒しつつある骨のホールのマイクロＣＴ走査に相当する）を表わすものである。この骨格誘起骨再構築は“骨髄刺激”療法において望ましい修復反応である。図９Ｇおよび９Ｈは、滑液腔近傍の大きく血管形成された肉芽組織との比較において、マイクロドリルホールのみからもたらされる3ヶ月のカルスおよび肉芽組織修復の組織像を示している。これは更に、凍結乾燥キトサンインプラント（5, 10又は20mg/mL, 80kDa, pH2.5）で治療したドリルホール下部の線維性骨（ｗｏｖｅｎ  ｂｏｎｅ）の修復の証拠を示している。
【００５９】
【図１１】図１１は、大きい動物モデルにおける、凍結乾燥キトサン骨格で治療したドリルホール内の術後９ヶ月での、より大きい軟骨表面再形成を、ドリルホールのみのものと比較して示している。ヒツジの治療した欠損部は、軟骨欠損部の良好なソフトな組織表面再形成を示しており、術後９ヶ月でのドリルホールのみの反対側の対照の欠損部よりも骨の露出は小さかった。図１1は、2匹の異なるヒツジからの９ヶ月での修復対照組織および反対側の治療した修復組織の巨視的外観（黒色矢線、図１１Ａ１  ｖｓ  図１１Ａ２、図１１Ｃ１  ｖｓ  図１１Ｃ２）および整合画像を示しており、ここで、黒色トレーシングを露出下骨領域上に置いた（それぞれ、図１１Ｂ１vs図１１Ｂ２、図１１Ｄ１vs図１１Ｄ２）。図１１中のグラフは、欠損部の巨視的再表面形成の定量的組織形態測定によるものであり、キトサン骨格での治療が、ドリルホールのみのものと比較して、穿孔軟骨欠損部全層での、より大きい再表面形成をもたらすことを示している。
【００６０】
【図１２】図１２は、術後９ヶ月で形成された修復組織の例示の巨視的外観および対応する組織像を示しており、組織切片の定量的組織形態に基づき、マイクロドリルホールのみのもとの比較において、マイクロドリルホールと凍結乾燥キトサンインプラントとにより、すぐれた再表面形成が誘起されたことを示している。図１２Ａ１および１２Ｂ１は、同じヒツジにおける術後９ヶ月で形成された修復組織を示しており、ここで、１つの膝軟骨欠損部が穿孔され（図１２Ａ１）、反対側の膝軟骨欠損部が穿孔され、かつ、in situ凍結乾燥インプラント（調剤#２９、#３３および#３４、図１２Ｂ１）で処置した。１、２、３の数字は図１２Ａ１および１２Ｂ１中、点線に沿って集められた組織切片中の分析された別々のドリルホールを指している。図１２Ａ２−１２Ａ３および１２Ｂ２−１２Ｂ３は、対照の欠損部（図１２Ａ２、１２Ａ３）との比較において、治療した欠損部（図１２Ｂ２、１２Ｂ３）では露出した骨が少ないことを示している。図１２Ａ４および１２Ｂ４は、このヒツジにおいて、対照および治療したマイクロドリルホールの双方がヒアリン様（硝子状）軟骨組織により修復されたことを示している。図１２Ｃは、欠損部の再表面形成の定量的組織形態測定を示しており、治療した欠損部が、対照のマイクロドリル欠損部との比較において、よりソフトな一体的軟骨修復組織を含み、露出した骨が少ないことを示している（欠損部当り分析されたN=3断片での N=5欠損部）。
【発明の詳細な説明】
【００６１】
1形態として、凍結乾燥ポリサッカリド骨格組成物、好ましくは凍結乾燥キトサン骨格組成物が提供され、これは血液又は血液由来流体と接触したとき水和した微粒子分散を自発的に生じさせ、同化的創傷修復を刺激し、これには非限定的に、好中球およびマクロファージの遊走、幹細胞の遊走、血管形成、細胞走化性、組織再構築、骨吸収、線維性骨修復、線維症の抑制、関節修復のための粘弾性細胞外マトリックス沈着などが含まれる。
【００６２】
好ましい態様として、固体凍結乾燥超多孔性キトサン骨格が提供されており、これは血液、血漿、多血小板血漿フィブリングルー、又はin situで出血欠損部中にて、徐々に再水和し、凝塊中に在留キトサン微粒子分散を自発的に形成する。そのことにより、好中球およびマクロファージの補充を含む局所的同化プロセスが刺激され、血管形成、骨再構築が促進され、出血軟骨下骨に直接送出されたとき軟骨修復組織の量が高められ、あるいは修復半月板裂目において血管形成が促進される。
【００６３】
この組成物は、フィブリンクロット内の分散したキトサン微粒子の局所的送出のために有用であり、創傷再構築を促進するための止血、血行再建および同化組織再生を促進する。更なる形態として、この組成物は、フィブリノーゲン含有流体内においてex vivoで固形凍結乾燥骨格を再水和させ、これらが後にトロンビン活性および自発的フィブリンクロット形成を介して凝固することによりインプラントを形成する。
【００６４】
この固形キトサン骨格組成物は、液体溶液又は粉体又はフレークと較べて、出血外科的欠損部に対し、より容易に投与させることができる。この組成物は送出後、時間とともに溶解するため、血液との接触の際に即座に又は数秒以内に溶解する調剤と比較して、送出の場所についての制御がより容易となる。この組成物は、アクセス可能な手術部位へキトサン骨格を直接投与することができ、それにより使用容易さが改善され、ex vivo操作を必要とする他の方法と比較して、治療を実行する時間量を減少させることができる。1例において、この組成物は、病変部位から流出することがある流体調剤と比較して、出血手術部位への骨格投与の質量についての制御が可能となる。他の形態として、この組成物は、血液又は血液由来流体全体を通して遅延再水和および微粒子分散を行うことができ、手術部位でのキトサン骨格の効率的保留のため、キトサン骨格が凝塊中に分散されるようにすることができる。この遅延した再水和は、低分子キトサン、超低分子キトサン、キトサンオリゴマー、単量体グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、並びに好ましくは塩酸、乳酸および酢酸からなる群から選択される少なくとも１つの酸、からなる群から選択される少なくとも1つの制御された再水和剤の使用を介して達成することができる。
【００６５】
in vivo生分解性動態についての改善された制御が、この組成物により意外にも達成された。これは、血液又は血液由来流体との接触後に微粒子分散を自発的に形成することができない従来の凝集キトサンポリマーインプラント又は固体キトサン骨格調剤とは対照的なことである。更に、この固体、乾燥キトサン骨格組成物は、加水分解によるキトサンポリマー鎖の変性を生じさせることなく、当業者が理解できるような長時間に亘って室温で保存することができる。
【００６６】
他の形態として、個体ポリサッカリド骨格組成物の製造方法が提供される。この方法は、好ましくはキトサンからなるポリマー性カチオンの水性混合物であって、水が本溶液の最初の質量の≧80％、好ましくは≧90％、最も好ましくは≧95％を占めるポロゲン（porogen）であるものを凍結乾燥させ、高多孔性の凍結乾燥ポリサッカリド骨格を生じさせる工程を含む。好ましい態様において、この水性混合物のpHは約2ないし約6、最も好ましくは約2ないし約5.5とする。この凍結乾燥は好ましくは、少なくとも3つの工程により行われ、これには、少なくとも凍結、第1の乾燥および第2の乾燥工程が含まれる。凍結工程は、上記水性混合物を若干の真空下、すなわち、約600Torrないし約400Torr、より好ましくは500Torrで、好ましくは約室温から約-40℃まで冷却することにより行われる。好ましくは、この冷却は毎分約1℃の冷却速度で行われる。好ましくは、第１の乾燥工程は、真空下で好ましくは約100mTorrで行われる。好ましくは、第1の乾燥工程は、一定の棚温度、好ましくは約-40℃で行われる。この第1の乾燥工程は約36時間ないし約54時間、より好ましくは約48時間継続して行われる。好ましくは、第2の乾燥工程は、約-40℃から毎分0.05℃ないし0.2℃、より好ましくは0.1℃の割合で約30℃まで加温し、これを6時間ないし24時間、好ましくは約12時間継続し、ついで約30℃の等温を約6時間維持して行い、その後、真空を除く。前記硝子ビンは好ましくはアルゴンでパージすることにより室内圧力とし、ついで4℃ないし25℃で貯蔵する。この結果得られた凍結乾燥ポリサッカリド骨格組成物は十分な機械的反発力を有し、剃刀又は生検パンチ又はジャムシディ（Ｊａｍｓｈｉｄｉ）針で成形可能なものである。
【００６７】
他の形態として、血漿中で再水和されたのちに自発的微粒子分散がなされるように適当なプロトン化状態およびオスモル濃度を有するよう製剤化されたカチオン性ポリサッカリド、好ましくはキトサンを含有してなる凍結乾燥組成物が提供される。この組成物は水性混合物から凍結乾燥され、水がポロゲン（porogen）として作用し、非常に高い多孔質構造を有する半剛性の塊りを生じさせる。血液又は血液由来流体中で微粒子となるポリサッカリドの分散および後の血液凝固は、凍結乾燥時のポリサッカリド溶液の分子量およびプロトン化状態で制御される。キトサンのプロトン化は好ましくは、10kDa以下のキトサンについては約80%ないし約100%であり、10kDaを超えるキトサンについては少なくとも約90%ないし約100%である。1態様として、このカチオン性ポリサッカリドは高分子カチオン、好ましくはキトサンであり、好ましくは、上記水性混合物中に、約0.2ないし約7%（w/v）、より好ましくは約0.3ないし約5%（w/v）、最も好ましくは約0.5ないし約3%（w/v）の量で存在させる。
【００６８】
他の態様として、上記組成物は、種々の割合の少なくとも1つの制御再水和剤を更に含有し、好ましくは、上記水性混合物中に、約0.2ないし約10%（w/v）、より好ましくは約0.3ないし約7%（w/v）、最も好ましくは約0.5ないし約5%（w/v）の量で存在させる。ここで、この制御再水和剤は低分子キトサン、超低分子キトサン、キトサンオリゴマー、単量体グルコサミンおよびＮ−アセチルグルコサミンからなる群から選択され、血漿中のポリサッカリドのin situ再水和の遅延動態（速度）を制御する。再水和に際し、このポリサッカリドのポリマー鎖は自発的に再水和し、液状血液又は他の体液のpHおよびイオン強度で分散した微粒子を形成する。この組成物は、内因性凝固カスケードおよびフィブリンクロット形成の伝播と適合するものである。
【００６９】
好ましい態様として、上記ポリサッカリドは、分子量が約5,000ダルトン（Da）ないし約400,000Da、より好ましくは約8,000Daないし約350,000Da、最も好ましくは約10,000Daないし約300,000Daの範囲のキトサンから選択される。好ましい態様として、上記キトサン組成物は更に、キトサンアミノ糖（非限定的に、グルコサミン又はＮ−アセチルグルコサミンを含む）を含有し、血漿又は全血内での凍結乾燥キトサンの更なる遅延再水和を許容させる。好ましい態様として、もしも、デキストランがこの組成物内に存在する場合は、このデキストランは、分子量が約3,000Daないし10,000Da、より好ましくは約5,000Daのものが用いられる。
【００７０】
他の好ましい態様として、上記組成物は更に、薬理学的に許容される酸性塩を含有する。好ましくは、この酸は無機酸であり、より好ましくはハロゲン化水素酸である。最も好ましくは、この酸は、塩酸である。1実施例として、上記無機酸は、モル比で約70%ないし約110%の範囲、より好ましくは約75%ないし約105%の範囲、最も好ましくは約80%ないし約100%の範囲で存在させる。凍結乾燥前のこの組成物の好ましいオスモル濃度は5ないし200mOsmの範囲である。
【００７１】
理論的に拘束されるものではないが、この組成物の使用により、より迅速な止血、並びに通常、血塊へ移動する創傷修復細胞のより多数の誘引が確かなものとなると信じられる。すなわち、術後1ないし2週間以内に自然に分解する自然の血腫に比較して、より長期に亘って好中球およびマクロファージを含む修復細胞が誘引される。この組成物の使用は更に、間接的に以下の事項を促進する。すなわち、（１）創傷部への血管および間葉系幹細胞の補充；（２）軟骨下骨欠損部への破骨細胞および血管の補充；（３）軟骨下骨板の再構築；（４）線維症の抑制；（５）関節軟骨病変部の基部での骨誘導性の軟骨誘導（すなわち、結合組織の再生の重要な特徴）および軟骨製関節軟骨再生である。更に、in vivo分解動態は、貯蔵の間に安定に維持されるキトサン分子により調節可能であり、従って、新規、かつ進歩性の仕方を以って、細胞補充の増加度、並びにインプラント後の血塊増幅の時間枠の制御が可能となる。
【００７２】
以下に、非制限的な実施例を提供する。
【実施例】
【００７３】
実施例１：組成物および生検パンチで除芯し、又は外科用メスで整形することができる機械的剛質の凍結乾燥キトサン調剤の製造方法。
【００７４】
pH2ないし5.5でHClに溶解させたキトサンを用いて複数の滅菌液状キトサン調剤を製造した（10kDa, 85kDa又は150kDa、80%DDA又は10kDa 90%DDA）。ここで、増量剤又は凍結乾燥保護剤（スクロース、トレハロース、デキストロース、ソルビトール、グルコサミン-HCl、Ｎ−アセチルグルコサミン）は併用したり、併用しなかったりした。幾つかの調剤は増量剤のみを含有させた。他の調剤は、10kDaおよび150kDaのキトサンを異なる割合で含有するものとした。幾つかのキトサン調剤は、グルコサミンモノマーの遊離アミン基の80%プロトン化で製造した。他の調剤は凍結乾燥前に遊離アミン基の98%プロトン化で製造した。幾つかのキトサン調剤は、合致する分子量とDDAを有するトレース用ローダミンイソチオシアナート（RITC）キトサンを含有させ、それによりキトサン粒子の血漿中および水中での分散を追跡することを可能にした。これら溶液は、２つの別々の方法を用いて硝子又はプラスチック瓶内で無菌条件下で凍結乾燥させた。
【００７５】
凍結乾燥法（Ａ）：無菌の液状調剤を無菌条件下、ガラス瓶内に約500 Torrで、毎分1℃の割合で25℃から-40℃まで冷却させることにより凍結乾燥させた。ついで、Laboratory Series PLC Freeze-Dryer (Millrock Technologies Inc)の装置内で、-40℃、100m Torrの条件下で48時間、第1の乾燥工程に供し、次に第2の乾燥サイクルに供し、ここで、これら調剤を100m Torrの条件下で-40℃から30℃まで12時間をかけて徐々に加温し、ついで30℃の等温で6時間維持した。次に、これら硝子瓶を部屋の温度および圧力に保った状態でアルゴンガスでパージし、４℃で貯蔵した。
【００７６】
凍結乾燥法（Ｂ）：硝子ビン又はプラスチックチューブ内に室温に保った無菌の液状調剤を、フラッシ凍結し、あるいは-80℃のフリーザ内に配置させ、ついで、標準の実験用フリーズドライヤー（Labconco FreeZone 2.5L フリーズドライシステム）へ移した。この凝縮器の温度は-80℃にセットし、最高真空度（＜0.133mBar）にし、72時間維持した。ついで、真空を除去し、サンプルを室温まで加温した。Labconco機器のような標準の装置においては、サンプルの温度を如何なる工程においても正確に制御することができないことに留意すべきである。なぜならば、サンプルは典型的には、この凝縮器のもの（-80℃）とは異なる温度（0℃ないし-70℃）を有しているからである。
【００７７】
物理的取扱いテスト：凍結乾燥法（Ａ）によって作られた幾つかの骨格は、剛性であり、内径1.5mmの皮膚用生検パンチを用いて除芯することができた。他方、他のものは密なマット状骨格を形成し、強い絡み合いのもの、又はふわふわした結持性のもので生検パンチで除芯することができなかった（図１、表１および２）。一般に、低分子キトサンを使用した良好な取扱い特性を有する骨格は、最小5mg/mLの糖、又は純粋なキトサン、5mg/mL又は10mg/mLのキトサンで増量剤を伴ったもの、又は2.5mg/mLのキトサンと増量剤との混合物でキトサンのプロトン化率が80%ないし98%のものを必要とする。高分子量のキトサン（85ないし150kDa）については、最高の取扱い特性を持たすには、完全な100%のプロトン化率でより高いキトサン濃度（10mg/mL又は20mg/mL）が必要であり、それは皮膚用パンチで除芯できる剛質骨格を形成するのに凍結乾燥保護剤を必要としなかった（表２）。凍結乾燥法（Ｂ）で製造された全ての骨格は容認できないような取扱い特性を有していた。これらは、ふわふわした物質、くず様のもの、フレーク状のもの、又は硬くなく生検パンチで除芯できないような密なマット状のものであった（図１Ｂ、表３）。
【００７８】
表１：  凍結乾燥法（Ａ）および80%のプロトン化率のキトサン（pH 4-5.5）で作られた骨格、およびその結果の特性および生物学的反応。
[表１]
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【００７９】
表２：  凍結乾燥法（Ａ）および80%のプロトン化率のキトサン（pH 4-6.0）又は98%のプロトン化率のキトサン（pH 2.5-3）で作られ、増量剤なしで作られた骨格、およびその結果の特性および生物学的反応。
[表２]
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【００８０】
表３：  凍結乾燥法（Ｂ）で作られた骨格。
[表３]
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【００８１】
実施例２：凝固するヒト血漿中でキトサンの再水和並びに自発的微粒子分散が可能な凍結乾燥調剤を識別するためのテスト。
【００８２】
凝固テストおよびキトサン粒子分散テストを、170μLのヒトのクエン酸処理血漿（凍結アリコートを37℃で5分間解凍したもの）を伴った96-ウエルプレート内で行った。ここで、凍結乾燥骨格（スカフォールド）から除芯又はカットされた1.5mm径の円筒状骨格、10μLの200mMのCaCl2および5μLの硝子マイクロビーズ（10μmのSpherocellホウケイ酸硝子ビーズ、ddH2O中10mg/mL）が用いられた。これらサンプルを37℃で20分ないし1時間培養し、接触経路を介しての凝固およびフィブリン重合反応を行わせた。ハイブリッド血漿クロット内に分散したRITC-キトサン粒子の蛍光画像が倒立蛍光顕微鏡を用いて撮られた。結果は：全てのサンプルが凝固し、フィブリンクロットを形成した（図２Ａ-２Ｉ）。全ての低分子量10kDaキトサン調剤は、増量剤を伴い又は伴わずして微粒子として血漿中に分散し、ハイブリッドキトサン微粒子-フィブリンクロットを生じさせることが発見された（図２Ｅ）。しかし、85kDaキトサンは、キトサン溶液が80%プロトン化率で作られたとき、血漿中に分散できなかった（図２Ｆ、表２）。幾つかの粒子分散が、10mg/mLのＮ−アセチルグルコサミンモノマーを追加含有する5mg/mLでの85kDaキトサンについて得られたが、10mg/mLのグルコサミンモノマーでは得られなかった。ついで、80kDaキトサンのプロトン化レベルを98%（凍結乾燥の前の溶液で、pH 4.5でなくpH 2.5）に増加することにより、ヒト血漿内で徐々に再水和し自発的に微粒子分散を形成する凍結乾燥骨格（図２Ｄ、調剤#３３）が得られることが見出された（図２Ｇ）。上記凍結乾燥骨格へのスクロース凍結乾燥保護剤の追加は、98%プロトン化でも80kDaキトサンの微粒子分散を妨げるものであった（図２Ｈ）。高分子および低分子のキトサン凍結乾燥の混合物もまた、98%プロトン化で分散した（図２Ｉ）。この実験により、微粒子の再水和および分散は、広範囲の分子量のキトサンについて、キトサンのプロトン化レベルおよびキトサン濃度を調整することにより制御できることが明らかになった。更に、分子量が高いほど、最良の調剤が凍結乾燥保護剤なしで得られることが明らかになった。
【００８３】
図３は、凍結乾燥法（Ａ）を用いて作られた凍結乾燥キトサン骨格が、ヒト血漿中で徐々に再水和し、負に帯電の凝固因子酵素を有する静電複合体を介して錯体化した微粒子として生物調和（bio-interfaces）することを示している。その結果、血漿単独のもの（図３Ａ）と比較して、遅延した凝固およびより低いクロット引っ張り強度がもたらされる（図３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄ）。これらのデータは全て、血漿中に再水和し、微粒子として自発的に分散し、血液タンパク質と調和する凍結乾燥キトサン骨格の調剤および製造方法を明らかにするものである。
【００８４】
これら実験１および２の結果は表１および２に示されており、以下に要約されている。
【００８５】
取扱いテスト（剛質ケーキで除芯可能、表１−３）、再水和テスト（表１−３におけるカテゴリー“Ｒ”）および微粒子分散テスト（カテゴリー“Ｄ”、表１−３）をパスした調剤は、凍結乾燥法（Ａ）を必要とし、更に、これには、5ないし10mg/mLキトサン-HClの超低分子キトサン-HCl（10kDa、pH 4.5-5.5）、又は2.4 mg/mLないし5mg/mLのキトサントおよび10ないし50mg/mLの増量剤、10ないし20mg/mLの中分子量キトサン-HCl（85kDa以下、pH 2.5、＜60mOsm）および85kDaのキトサン5mg/mL、pH 4.5で10mg/mLのＮ−アセチルグルコサミン増量剤を伴うサンプル、又は85kDaのキトサンと10 kDaのキトサンとの混合物（１：１v/v、pH 4.5）が含まれていた。
【００８６】
取扱いテストを失敗した調剤には、凍結乾燥法（Ｂ）により凍結乾燥された全てのサンプル並びに、凍結乾燥法（Ａ）により凍結乾燥されたサンプルであるが、5mg/mL未満での10 kDa又は85kDaのキトサン-HCl（pH 2.5-5.5）、2.5ないし10mg/mL 、pH 4.5の85 kDa又は150kDaのキトサン、凍結乾燥保護剤（スクロース又はグルコサミン-HCl、10mg/mL）を伴った5mg/mLの85 kDa又は150kDaのキトサンを用いたものが含まれていた。
【００８７】
実施例３：凍結乾燥キトサン調剤が出血欠損部にインプラントすることができ、アナボリック創傷修復プロセスを刺激することができることを実証するための、ラビットモデルにおける生体内（in  vivo）での概念的実証。
【００８８】
パイロットラビット研究（in situ血管形成および骨再構築を観察するための3週間の終点）において、滅菌凍結乾燥キトサンインプラントを作成し（表４）、生検パンチで除芯し、ラビットの膝滑車内の4ｘ5mm全層軟骨欠損部に形成された直径1.5mm、深さ2mmのドリルホール内に直接、インプラントした。滅菌キトサン骨格ケーキおよび凍結乾燥保護剤単独ケーキを、制御された凍結乾燥法（Ａ）により作成した。円筒状のインプラントは、生検パンチを用い、手術中に形成させ、固体ケーキから1.5mmの直径の円筒を除芯した（図４）。ラビットの膝滑車内に生じさせた近位1.5mmのマイクロドリル欠損部を凍結乾燥保護剤単独インプラントで治療し、他方、遠位1.5mmのマイクロドリル欠損部は凍結乾燥保護剤＋キトサンで治療した。１つのラビットの膝においては、双方のドリルホールは治療無しとし（ドリルのみ）、他のラビットの膝においては、双方のドリルホールを5mg/mLキトサン-HCl（pH 5.5）インプラント又は10mg/mLキトサン-HCl（pH 5.5）インプラント（凍結乾燥保護剤（lyoprotectant）無し）で治療した。
【００８９】
表４：  血管形成および骨再構築を誘発させるため、それらの能力をテストするため、凍結乾燥骨格を出血欠損部に直接、送り込む。
[表４]
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【００９０】
結果：in vivo取扱い特性：
幾つかの調剤は余りにも早く溶解し、他方、他の調剤はin situで所望のゆっくりし制御された速度で溶解した。キトサン＋50mg/mLスクロース、キトサン＋50mg/mLソルビトールおよびキトサン＋50mg/mLトレハロースは、血液との接触時に即座に溶解し、出血ドリルホール内で制御された様式で堆積させることができなかった（図４Ｄ、４Ｋ、４Ｆ参照）。キトサン単独（5mg/mL又は10mg/mL）のものは、出血欠損部に堆積させることができ、１ないし2分の間で溶解した（図４Ｇ）。この遅いin situ溶解は、凍結乾燥保護剤を伴った急速溶解調剤よりも好ましいものであった。なぜならば、この急速溶解調剤はドリルホールに圧入させたり、あるいはキトサンを骨のドリルホールに堆積するように導くことが不可能となるからである。キトサン-デキストラン‐５（5mg／mLのキトサンを含む）およびデキストラン‐５（50mg／mL）も、良好な取扱い特性を示し、長い時間をかけてin situで溶解した（1分間程度、図４Ｆ−４Ｉ）。この遅いin situ再水和の特性は、パス‐失敗の基準の判定に使用された（基準“Ｓ”、上記表１参照）。
【００９１】
生物学的応答：３週間の修復組織内の残留ローダミン‐キトサントレーサーの存在が示す用に、キトサンインプラントは欠損部内に保持された（図５Ａ−５Ｂ）。上記キトサン粒子はマクロファージを肉芽組織へ引き寄せる好ましい作用を有する（図５Ｃ、５Ｄ）。糖又はポリサッカリドを含有する全ての調剤は、術後3週目で線維軟骨形成を抑制することが見出された。これは治療的作用である。なぜならば、急速な線維軟骨形成は、後の時点において軟骨誘導および軟骨再生を妨げることが知られているからである（非特許文献３８、４５））。選択されたキトサン調剤は、術後3週間目で血管形成を引き出した（矢線、図５Ｅ、５Ｆ）。血管形成は、ドリルホールのグレーの外観により表わされる肉芽組織の巨視的赤味の色相により（図６Ｂ）、並びにゴモリ（Gomori）染色組織切片中の赤血球で満たされた血管の組織学的外観（ダークグレーにより表わされたもの、図６Ｅ、６Ｆ）により判断された。又、この血管形成は、パス‐失敗の基準として使用された（表１）。10kDaキトサン‐HCl単独（凍結乾燥保護剤なし）で治療されたホールは、3週間目で最も強い血管形成応答を示した（図５Ｅ、５Ｆ、６Ｂ、６Ｅ、６Ｆ）。修復反応は、in situ固化キトサン‐ＧＰ/血液インプラントにより先に誘起された血管形成応答に大きく類似するものであった（非特許文献４６）。デキストラン‐５のみで治療されたマイクロドリルホールも、血管形成応答を示した（表１）。デキストラン‐５は5kDa重合体オリゴサッカリドである。凍結乾燥保護剤単独で治療した幾つかの欠損部は、異物巨（FBG）細胞形成（トレハロース、ソルビトール：潜在的に結晶のため）の兆しを示した。キトサンのみで治療した骨のドリルホール内には異物巨細胞は観察されなかった。肉芽組織内のFBG細胞形成の結合組織修復に対する影響は未知であり、修復を損なわないと思われる。キトサンインプラントで治療したホールはマクロファージおよびさもなければ活性化されたアルギナーゼ‐１＋マクロファージの蓄積を示した（図５Ｃおよび５Ｄ）。骨の再構築は、破骨細胞媒介骨吸収の結果としての、３Ｄ再構成マイクロコンピュータ断層走査における骨のマイクロドリルホールの径の増加により採点した。キトサンで処置した全てのホールは、ホールのエッジ部での骨再構築の証拠を示した（図７）。ソルビトールのみが、ドリルホールを跨る骨の病的骨吸収を伴う骨再構築を示した（図７、コンデション“So”および“SoC”、#）。この実験は、出血骨軟骨欠損部に直接挿入した10kDa凍結乾燥キトサン単独インプラントがin situで留まり、創傷再構築および修復に対し治療同化作用を有することを明らかにした。
【００９２】
実施例４：骨格的に高齢のヒツジモデルにおける生体内（in vivo）での概念的実証：高分子キトサンを伴う凍結乾燥in situキトサンインプラントが治療的作用を有する。
【００９３】
２つの凍結乾燥キトサン調剤が、ラビットモデルにおいて超低分子量キトサンを用いた治療的血管形成作用について識別された（調剤Ｃ５＊およびＣ１０＊、表５）。しかし、大きい動物における骨軟骨修復は、ラビットとの比較において遅延し（非特許文献３９、４８）、そして、予備固化キトサン‐NaCl/血液インプラントを使用してヒツジの欠損部の軟骨形成を誘起させるためには、より高い分子量のキトサンが要求される（非特許文献３９、４８）。これらのデータは、より遅い骨軟骨修復進行と調和させるため、あるいは、より長い再構築を必要とする密度のより大きい軟骨下骨と調和させるため、より遅い分解速度を有するin vivoキトサンインプラントが大きい動物にとって好ましいこと（小さい動物との比較において）を示唆している。従って、３つの凍結乾燥キトサン調剤について、より大きい分子量のキトサン（85kDa）を用い、３つの異なる濃度および上記凍結乾燥法（Ａ）による凍結乾燥前の98%プロトン化でそれぞれ評価した（表５）。幾つかのインプラントは、in vivoクレアランスを記録するため、合致する分子量のローダミン‐キトサントレーサ(tracer)を用いて凍結乾燥させた。この研究計画では、骨格的に高齢、つまり９歳のヒツジで、Ｎ＝２ヒツジ（1日目）、Ｎ＝５ヒツジ（3ヶ月）およびＮ＝５ヒツジ（9ヶ月）を使用した。小さな関節切開を用い、1つの膝を一つずつ、キュレット（10x10mm）を用いて大腿骨内側顆全層軟骨欠損部を形成し、ついで、4mm以下の深さのマイクロドリルホールの3つの垂直列を形成した（1.5mmのドリルバリ径、全部で11個のホール）。１つの膝内の各ドリルホール垂直列に対し、凍結乾燥インプラントのシリンダーをピンセットと共に各出血ホールに挿入することにより、別々のキトサン濃度の調剤で治療した（図８Ｂ）。同じようにして、反対側の膝にドリルホールを形成し、手術単独対照欠損部として出血したままに放置した（図８Ｃ）。
【００９４】
表５：  小さい動物および大きい動物の軟骨修復モデルにおいて、凍結乾燥キトサン調剤をin vivoでテストした。
[表５]
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＊小関節中の欠陥ドリルホールを治療するための良好な取扱いおよびパーフォーマンス特性；§大きい欠陥ドリルホールを治療するためのベストな取扱いおよびパーフォーマンス特性。ＨＭＷ：高分子量画分。
【００９５】
結果：5mg/mLのキトサン骨格と比較して、10mg/mLおよび20mg/mLの凍結乾燥骨格は取扱い特性がすぐれていることが見出された。なぜらなば、これらの凍結乾燥骨格は生検パンチにより容易に除芯することができ、円筒状の形を維持することができたからである。5mg/mLのキトサン骨格は生検パンチで除芯することが困難であり、出血骨軟骨欠損部内にインプラントすることがより困難であったからである。治療したドリルホールの1日目の蛍光画像は、３つの調剤全てについての1日目でのインプラントの保留状態、主にホールのエッジでの保留状態を示している（図８、８Ｂ）。1日目でこれらホールを満たす血塊も又、蛍光をブロックする赤血球を含んでいることが注目される。術後1日目、最初のドリルホールがマイクロコンピュータ断層撮影により、その寸法が分析され、深さが4±1.2mm、断面積が2±0.5mm2であることが判明した（N=17、測定ドリルホール）。修復3ヶ月後において、全ての欠損部の骨のホールは若干深くなっている。つまり、5.1±1.8mm（対照）および5.7±1.8mm（治療したもの）であった。治療したドリルホールは“創傷ブルーム”の形跡又は初期の骨再構築（即ち、線維状の骨吸収および修復）を示した。即ち、当初のドリルホールと比較して、軟骨下骨の下のより大きいドリル穴の断面積により示されたものであり、それと共に、対照のドリルホールとの比較において、治療した残留骨ホールでのより深く、より大きい線維状の骨修復によっても示されている（図９Ａ、図１０）。幾つかの治療ドリルホールは、術後3ヶ月において、軟骨修復組織を以って表面再浮上されていた（図１０Ｅ、20mg/mLのキトサン治療したホール）。しかし、殆んどの治療ドリルホールは3ヶ月で、血管新生肉芽組織および線維状修復骨を、3つのホールにより深く有していた（図１０Ｈ−Ｉ）。修復の9ヶ月目において、ドリルのみの対照と比較して、マイクロドリルおよびインプラントで治療した軟骨欠損部は全層をより多くの組織で再浮上させており（図１１Ａ−１１Ｅ）、その修復組織は主にヒアリン状軟骨であった（図１２Ａ−１２Ｃ）。
【００９６】
ヒトの関節において、治療活性を標的とする調剤は、ラビットおよびヒツジの軟骨修復モデルにおいて有効であることが本明細書に示されたものを網羅する調剤を使用しても、同様の治療効果を示すものと思われる。それらの調剤としては、pH 2.5、20mg/mLおよび45-68mOsm、又は10mg/mLおよび25mOsm、又は5mg/mLおよび10mOsmで溶液として作られた生分解性キトサン（80%DDA、分子量10-150kDa）が含まれる。この調剤は、半月板修復、回旋腱板修復、骨折修復又は他の結合組織修復にとって最良のin vivoクレアランス速度を可能にするよう調整することができ、それは病変部のサイズ、肉芽組織形成の生理学的速度および後の結合組織形成にも依存するものである。この調剤は更に、腱挿入部位修復および洞骨増強手法と関連する用途のため、僅かな骨の再構築を伴う血管新生を促進するよう調整することもできる。
【００９７】
本願の請求項の範囲は、実施例に記載された好ましい具体例により制限されるべきではなく、発明の詳細な説明全体として整合する最も広範な解釈で理解されるべきである。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
0006680682.tif 000012
【図２Ｅ−Ｆ】
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【図２Ｇ−Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４Ａ−Ｅ】
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【図４Ｆ−Ｉ】
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【図４Ｊ】
0006680682.tif 000020
【図４Ｋ−Ｌ】
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【図５Ａ−Ｂ】
0006680682.tif 000022
【図５Ｃ−Ｄ】
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【図５Ｅ−Ｆ】
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【図５Ｇ−Ｈ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｆ】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図８Ｄ】
0006680682.tif 000030
【図８Ｅ−Ｆ】
0006680682.tif 000031
【図８Ｇ−Ｈ】
0006680682.tif 000032
【図９Ａ】
0006680682.tif 000033
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｆ】
0006680682.tif 000035
【図１０Ｇ−Ｊ】
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【図１１Ａ１−Ａ２】
0006680682.tif 000037
【図１１Ｂ１−Ｂ２】
0006680682.tif 000038
【図１１Ｃ１−Ｃ２】
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【図１１Ｄ１−Ｄ２】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ１−Ｂ１】
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【図１２Ａ２−Ｂ２】
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【図１２Ａ３−Ｂ３】
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【図１２Ａ４−Ｂ４】
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【図１２Ｃ】
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