(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
0006768662.tif 000014
［式中：
ｍは、１から３までの整数であり；
ｎは、０または１であり；
ｐは、０であり；
ｑは、２であり；
Ｒ１はそれぞれ、独立してＣ１−Ｃ３アルキル−Ｘ−から選択され；
Ｘはそれぞれ、独立して直接結合およびＯから選択され；
Ｒ２は、独立してＣ１−Ｃ３アルキル−Ｙ−、およびフェニル−（ＣＨ２）ｚ−Ｙ−から選択され；
Ｙは、Ｏであり；
ｚはそれぞれ、独立して０および１から選択される］
またはその医薬的に許容できる塩を含む、
内分泌障害、心血管障害、呼吸器障害、代謝障害、皮膚障害、骨障害、腎疾患、生殖障害、眼および／または水晶体を冒す疾患、ならびに／あるいは内耳を冒す状態、肝疾患、痛み、癌、アレルギー性障害、外傷性障害、敗血症性、出血性およびアナフィラキシー性のショック、胃腸系の疾患または障害、および異常な血管新生から選択される、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ４活性に関連する状態または障害の治療用の医薬組成物。
【請求項２】
Ｒ１はそれぞれ、メチルおよびメトキシから選択される、請求項１の組成物。
【請求項３】
化合物が式（Ｉａ）の化合物
【化２】
0006768662.tif 000015
である、請求項１または２の組成物。
【請求項４】
化合物が式（Ｉｂ）の化合物
【化３】
0006768662.tif 000016
である、請求項１〜３のいずれか１項の組成物。
【請求項５】
ｎが０である、請求項１〜４のいずれか１項の組成物。
【請求項６】
化合物が式（Ｉｅ）の化合物
【化４】
0006768662.tif 000017
である、請求項５の組成物。
【請求項７】
化合物が
【化５】
0006768662.tif 000018
２，４，６−トリメチル−Ｎ−フェネチルベンゼンスルホンアミド；および
【化６】
0006768662.tif 000019
４−メトキシ−Ｎ−フェネチルベンゼンスルホンアミド
から選択される、請求項１の組成物。
【請求項８】
化合物が２，４，６−トリメチル−Ｎ−フェネチルベンゼンスルホンアミドである、請求項７の組成物。
【請求項９】
障害が、糖尿病、脳卒中、線維症、たとえば肺線維症、神経障害性疼痛、および糖尿病合併症、たとえば神経障害から選択される、請求項１〜８の組成物。
【請求項１０】
障害が脳卒中である、請求項９の組成物。
【請求項１１】
障害が線維症である、請求項９の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ（Ｎｏｘ）に関連する状態または障害の処置に使用するためのスルホンアミド誘導体に関する。より具体的には、本発明は、Ｎｏｘ活性の増大により起きるかまたは推進される種々の疾患の処置に使用するためのＮｏｘ阻害剤としてのスルホンアミド誘導体に関する。特に、本発明は、Ｎｏｘ４に関連する障害の処置に使用するための、Ｎｏｘ４に対する選択性をもつスルホンアミド誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化的ストレスの定義は、反応性酸素の形成と排出のインビボ平衡異常である。細胞または組織における正常な酸化還元状態が変化すると、細胞機構のＤＮＡ、タンパク質および脂質を含めた成分に損傷を与える可能性のある有害なラジカルが生成する可能性がある。細胞成分が遺伝子変化を引き起こす化学変化をすると、これは癌その他の重大な疾患の形成を促進すると一般に考えられてきた。
【０００３】
酸素ラジカルの供給源  −  潜在的に酸化的ストレスを引き起こす可能性のある酸素ラジカル（Ｏ２−、Ｈ２Ｏ２およびＯＨ−）のインビボ発生因子が多数同定されている：ミトコンドリア内の複合体ＩおよびＩＩＩ、ならびにＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、シトクロムＰ４５０、金属イオン（コバルト、バナジウム、クロム、銅および鉄）、ならびに酸化還元循環できるある種の有機化合物。
【０００４】
一般的な抗酸化性物質  −  内因性の細胞性抗酸化性物質も多数ある：たとえば、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ペルオキシレドキシン類およびスルフィレドキシン。食物により供給されるビタミン類も生物を有害な酸素ラジカルから保護する重要な部分とみなされ、多くの食物源中に存在する重要な抗酸化性物質の最近の発見により抗酸化性物質の集積が増加した。
【０００５】
療法剤としての抗酸化性物質  −  ある種の抗酸化性物質が疾患を予防しかつ健康を増進するのに有益となりうることはきわめて明瞭である。それよりはるかに明瞭でないのは、どのタイプの抗酸化性物質を使用できるかということである。天然食物中に存在する抗酸化性物質の多くが酸化還元活性をもつ。これらのタイプの酸化還元活性物質を単離して補助医薬として供給すれば、これは有益であるより有害な結果をもたらす可能性の方が大きい。酸素ラジカルを広範に捕捉する、抗酸化性物質の非ターゲティッド適用は、無効であるだけでなく有害な可能性すらあることが臨床試験により示された。これは、健常者および各種疾患を伴う患者を含めた２３２，５５０人の参加者について６７のランダム化試験で行なわれた試験で示された(Bjelakovic G, Nikolova D, Simonetti RG, Gluud C. Cochrane Database Syst Rev. 2008 Jul 16; (3):CD004183. Epub 2008 Jul 16)。
【０００６】
したがって、酸化還元活性をもつ一般的な抗酸化性物質は、有害な酸化還元サイクルを仲介することによって実際には細胞損傷を付加する可能性がある。他の一般的な抗酸化性物質は、身体機能を維持するのに必要である正常な細胞インビボ活性を有害にブロックするであろう。
【０００７】
反応性酸素の供給源および役割  −  次第に明らかになってきたのは、炎症、２型糖尿病、糖尿病合併症、多嚢胞卵巣症候群、発作（脳卒中、卒中：ｓｔｒｏｋｅ）、神経損傷状態および癌など多数の病的状態において反応性酸素の過度の産生および蓄積を引き起こしているのは、ミトコンドリア内の複合体ＩおよびＩＩＩなど一般的に酸素ラジカルを漏出しているものではなく、むしろ強力な酸素ラジカル産生因子（正常な細胞シグナル伝達系の一部）がアップレギュレートされたものであるということである。したがって、酸化的ストレスの定義は、必ずしも酸素ラジカルがＤＮＡ、タンパク質および脂質を不可逆的に変化させることではなく、アップレギュレートされると“正常な”細胞シグナル伝達を次第に妨害するようになって細胞レベルで平衡異常を形成し、それが最終的に他の組織および全身機能を変化させる可能性があることである。これの代表例はメタボリックシンドロームであり、これはインスリン抵抗性を開始因子とする血管疾患、２型糖尿病、発作、腎障害、神経障害、心不全、および発作に関係する(Reaven, “Role of insulin resistance in human disease”, Diabetes 37(12), 1988)。インスリン抵抗性自体は、適切な受容臓器にエネルギーを選択的に貯蔵するのを指令するツールとして、正常な身体機能の一部でもある。しかし、栄養過剰、または他の障害、たとえば過度の成長ホルモン産生を伴う肢端肥大症、またはｏｂ／ｏｂマウスの場合のような異常機能性レプチンなどの代謝変化が起きると、これはメタボリックシンドロームに関係する臓器不全の原因となる可能性のある無制御インスリン抵抗性を伴う有害な状態を誘発するであろう。無制御インスリン抵抗性の共通点は、局所的および全身的な酸素ラジカル過剰産生である(Houstis et al., Nature 440, 2006; Katakam et al., J cereb blood Flow Metab, 2012 Jan 11)。
【０００８】
この過剰産生について最も興味深い候補のひとつは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（Ｎｏｘ）と呼ばれる膜貫通タンパク質（酵素）のファミリーである。同定されたＮｏｘの７つのファミリーメンバーがあり（Ｎｏｘ１〜５およびＤｕｏｘ１〜２）、これらは反応性酸素の主要または鍵となる供給源として認識されることがきわめて多く、また下記を含めた多数の細胞事象において正常な細胞シグナル伝達系の一部として主要な役割も果たす：増殖(Brar et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 282, 2002)、成長(Brar et al., Am J Physiol Cell Physiol, 282, 2002)、線維形成(Grewal et al., Am J Physiol, 276, 1999)、移動(Sundaresan et al., Science, 270, 1995)、アポトーシス(Lundqvist-Gustafsson et al., J Leukoc Biol, 65, 1999)、分化(Steinbeck et al., J Cell Physiol, 176, 1998)、細胞骨格再配列(Wu et al., J Virol, 78, 2004)、および収縮(Rueckschloss et al., Exp Gerontol, 45, 2010)。
【０００９】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼと疾患−ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性低下を伴なう幾つかの遺伝的状態が同定されている−Ｎｏｘ２欠損は、微生物を死滅させてその攻撃を中和するための免疫応答を低下させる（慢性肉芽腫性疾患）−内耳におけるＮｏｘ３欠損は重力知覚を欠損させ、また甲状腺における酵素活性が欠損した二重ＮＡＤ（Ｐ）ＨオキシダーゼＤｕｏｘ２は甲状腺機能低下を生じる。
【００１０】
しかし、Ｎｏｘ活性増大は多数の疾患の一部であるかまたは原因ですらあることの強力な証拠を証言するはるかに大きな刊行物リストがあり、それは指数的に増加しているようにも思われる(Lambeth JD, Review Article “Nox enzymes, ROS, and chronic disease: An example of antagonistic pleiotropy”, Free Radical Biology & Medicine 43, 2007; Takac I et al., “The Nox Family of NADPH Oxidases: Friend or Foe of the Vascular System”, Curr Hypertens Rep. 2011 Nov 10; Montezano AC, “Novel Nox homologues in the vasculature: focusing on Nox4 and Nox5”, Clin Sci London 2011; Bedard K et al., “The Nox family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology” Physiol Rev. 2007; Camici M et al., “Obesity-related glomerulopathy and podocyte injury: a mini review”, Front Biosci 2012; Nabeebaccus A et al., “NADPH oxidases and cardiac remodeling” Heart Fai Rev. 2011; Kuroda J et al., “NADPH oxidase and cardiac failure”J Cardiovasc Transl Res. 2010; Kuroda J et al., “NADPH oxidase 4 is a major source of oxidative stress in the failing heart” Proc Natl Acad Sci USA 2010; Maejima Y et al., “Regulation of myocardial growth and death by NADPH oxidase” J Mol Cell Cardiol. 2011; Barnes JL et al., “Myofibroblst differentiation during fibrosis: role of NAD(P)H oxidases” Kidney international, 2011; Alison Cave “Selective targeting of NADPH oxidase for cardiovascular protection” Current Opinion in Pharmacology 2009; Albert van der Vliet “Nox enzymes in allergic airway inflammation” Biochimica et Biophysica Acta 1810, 2011; Pendyala S et al., “Redox regulation of Nox proteins” Respiratory Physiology & Neurobiology 174, 2010; Nair D et al., “Intermittent Hypoxia-Induced Cognitive Deficits Are Mediated by NADPH oxidase Activity in a Murine Model of Sleep Apnea” PLoS ONE, vol. 6, Issue 5, May 2011; Chia-Hung Hsieh et al., “NADPH oxidase Subunit 4-Mediated Reactive Oxygen species Contribute to Cycling Hypoxia-Promoted Tumor Progression in Glioblastoma Multiforme” PloS ONE, vol 6, issue 9, September 2011; Sedeek M et al., “Molecular mechanisms of hypertension: role of nox family NADPH oxidase” Current Opinion in Nephrology and Hypertension 2009; Augusto C et al., “Novel Nox homologues in the vasculature: focusing on Nox4 and Nox5” Clinical Science 2011; Briones AM et al., “Differential regulation of Nox1, Nox2 and Nox4 in vascular smooth muscle cells from WKY and SHR” Journal of the American Society of Hypertension 5:3, 2011)。
【００１１】
最近、Ｎｏｘ酵素、特にＮｏｘ４およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−オキシダーゼは肺線維症に高度に関与することが示された。線維症における酸化的ストレスの機能は十分に認識されている(Kinnula VL, Fattman CL, Tan RJ, Oury TD (2005) Oxidative stress in pulmonary fibrosis: a possible role for redox modulatory therapy. Am J Respir Crit Care Med 172:417-422)；肺線維症および多臓器系における線維症の病態発生において酸化的ストレスが重要な役割を果たすことを示す実質的かつ増加しつつある一連の証拠があるからである(Kuwano K, Nakashima N, Inoshima I, Hagimoto N, Fujita M, Yoshimi M, Maeyama T, Hamada N, Watanabe K, Hara N (2003) Oxidative stress in lung epithelial cells from patients with idiopathic interstitial pneumonias. Eur Respir J 21:232-240)。したがって、Ｎｏｘ酵素、特にＮｏｘ４は、肺感染症、急性肺傷害、肺動脈性高血圧症、閉塞性肺障害、線維性肺疾患、および肺癌にも関与すると思われる。
【００１２】
ＮＡＤＰＨオキシダーゼのイソ酵素、類似性、相異および機能  −  ＮＡＤＰＨオキシダーゼの７種類すべてのイソ酵素（同定されたもの）は、ＮＡＤＰＨとＦＡＤの結合部位ならびに６つの膜貫通ドメインをもつ様式において、またそれらが２つのヘム複合体を含むという点において、類似する。
【００１３】
すべてのＮＡＤＰＨオキシダーゼ型が同じ基本的機序を使って反応性酸素を発生するが、細胞内局在性および作用様式は著しく異なる。
酵素Ｎｏｘファミリーが産生する反応性酸素種は、スーパーオキシドＯ２−または過酸化水素Ｈ２Ｏ２のいずれかである。
【００１４】
Ｎｏｘ１および２はｐ２２ｐｈｏｘに構成性結合し、この酵素複合体を活性化するために、他の成分、たとえばＲａｃ、ｐ４７ｐｈｏｘ、ｐ６７ｐｈｏｘが、完全なＮｏｘ１活性に必要である。Ｎｏｘ２は、完全活性化のためにＲａｃ、ｐ４０ｐｈｏｘ、ｐ４７ｐｈｏｘおよびｐ６７ｐｈｏｘを必要とする。Ｎｏｘ１および２は、活性化されるとＯ２−を発生する。
【００１５】
Ｎｏｘ３も活性になるためには細胞質ゾルタンパク質をアセンブルする必要がある(Cheng et al., J Biol Chem, 279(33), 2004)。
Ｎｏｘ４もｐ２２ｐｈｏｘと会合し、この形態で構成性活性である。しかし、Ｎｏｘ４活性はアセンブリーまたはリガンド活性化によってではなく発現によって調節され、これによりこのイソ型は他のイソ型と区別される(Serrander et al., Biochem J. 406, 2007)。Ｎｏｘ４は、誘導されると一般にＮｏｘ１および２より高いレベルで発現する(Ago et al., Circulation, 109, 2004)。Ｎｏｘ４は、他のＮｏｘバリアントのようなＯ２−ではなく主にＨ２Ｏ２を発生すると思われる(Takac et al., J. Biol. Chem. 286, 2011)。これがこのイソ型をユニークなものにしている；Ｈ２Ｏ２は、膜を通過する能力、したがってきわめて短い半減期をもつＯ２−より遠く離れた場所で作用する能力をもつからである。
【００１６】
Ｎｏｘ５、Ｄｏｕｘ１およびＤｏｕｘ２は、Ｃａ２＋によって活性化される(De Deken, Wang et al., J.Biol Chem., 275(30), 2000)。
Ｎｏｘ４と疾患  −  他のイソ型と比較したＮｏｘ４の独自性は、療法ターゲットとしての独自性とも関係がある；それは過剰発現すると多種多様な疾患に関与すると思われるからである。
【００１７】
Ｎｏｘ４は、誘発されるまではきわめて低いレベルではあるけれども多くの細胞タイプに広範に発現する。それは主に腎臓、内皮細胞、外膜線維芽細胞、胎盤、平滑筋細胞、破骨細胞にみられ、また腫瘍において発現する主要なＮｏｘである(Chamseddine et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285, 2003; Ellmark et al., Cardiovasc Res. 65, 2005; Van Buul et al., Antioxid Redox Signal. 7, 2005; Kawahara et al., BMC Evol Biol. 7, 2007; Krause et al., Jpn J Infect is. 57(5), 2004; Griendling, Antioxid Redox Signal. 8(9), 2006)。Ｎｏｘ４は大部分の乳癌細胞系および原発性乳腺腫に過剰発現することが見出された。既にトランスフォームした乳腺腫細胞におけるＮｏｘ４の過剰発現は腫瘍形成性の増大を示し、Ｎｏｘ４がこの場合はミトコンドリアにおいて同定された。Ｎｏｘ４が乳癌を処置するためのターゲットとして示唆された(Graham et al., Cancer Biol Ther 10(3), 2010)。
【００１８】
Ｎｏｘ４は、脳血管内皮細胞においてＴＮＦ−αにより引き起こされる酸化的ストレスおよびアポトーシスを仲介する(Basuroy et al., Am J Physiol Cell Physiol vol. 296, 2009)。虚血性発作に伴うそれの有害作用は、動物モデルおよびヒトの組織で十分に立証されている。Ｎｏｘ４のノックダウン実験は、神経損傷の領域を劇的に低減した(Sedwick, PLos Biology, vol.8 issue 9, 2010; Kleinschnitz et al., vol. 8 issue 9, 2010)。
【００１９】
虚血性発作（ischemic stroke）は、世界的に発作（stroke）の全症例の約８０％を占め、２番目の主な死因である。ＫＯマウスにおいて、Ｎｏｘ４は急性発作の効果的な療法ターゲットであることが示された。最近のレポート(Kleinschnitz et al, 前記を参照)に、虚血性発作において起きる有意のＮｏｘ４活性増大が神経細胞死の主因であることを示す確信できるデータが公開された。マウスの脳と同様にヒトにおいても虚血に際してＮｏｘ４活性増大が誘発されることが示された。高特異的なＮｏｘ４阻害剤は安全な薬物である可能性をもつ。Ｎｏｘ４の完全ノックアウトはマウスにおいて明らかな表現型を示さない。しかし、ＫＯは、誘発虚血性発作において神経細胞の生存を劇的に改善する（野生型と比較して７０％超）。発作患者の処置はまた、他のタイプの発作、たとえば出血性発作についてのリスクを伴うことなく実施でき、よって、この処置はＣＡＴスキャンの必要性なしに開始できる。
【００２０】
さらに、微小血管および臍帯静脈の両方の内皮細胞におけるノックダウン試験および過剰発現試験により、Ｎｏｘ４活性の増大は内皮細胞の増殖および移動に際して重要な役割を果たすことが立証された(Datla et al., Arterioscler Throm Vasc Biol. 27(11), 2007)。当初は糖尿病における血管形成欠損にはＮｏｘ２が関与すると考えられたが、焦点はＮｏｘ４の方へよりシフトした(Zhang et al., PNAS, 107, 2010; Garriodo-Urbani et al., Plos One 2011; Takac et al., Curr Hypertens Rep, 14, 2012)。
【００２１】
Ｎｏｘ４は、肺線維症の発症に際して上皮細胞死において鍵となる役割を果たす(Camesecchi et al., Antiox Redox Signal. 1:15(3), 2011)。
ｓｉＲＮＡ仲介によるＮｏｘ４ノックダウンはＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性を有意に低下させることが、メサンギウム細胞および腎皮質から精製したミトコンドリアにおいて立証された。このノックダウンは、グルコース誘導によるミトコンドリアのスーパーオキシド産生をブロックした。Ｎｏｘ４は糖尿病においてミトコンドリア機能異常および細胞傷害をもたらす可能性がある酸化的ストレスに対する中心的なメディエーターとして作用することが示唆された(Block et al., PNAS vol. 106, no. 34, 2009)。
【００２２】
Ｎｏｘ４はラットにおいて食事誘発性肥満症で全身的にアップレギュレートされることも立証された(Jiang, redox rep, 16(6), 2011)。
Ｎｏｘ４は不全性心臓の病理に強く関係づけられてきた(Nabeebaccus A et al. “NADPH oxidases and cardiac remodeling” Heart Fai Rev. 2011; Kuroda J et al., “NADPH oxidase and cardiac failure Cardiovasc Transl Res. 2010; Kuroda J et al., “NADPH oxidase 4 is a major source of oxidative stress in the failing heart” Proc Natl Acad Sci USA 2010)。ミトコンドリアＮｏｘ４活性の増大と“老化性心臓”の機能障害との関係が示唆された(Tetsuro Ago et al., AGING, December 2010, vol.2 No 12)。
【００２３】
細胞外マトリックス蓄積は慢性腎疾患の病理に関与する。増殖因子ＩＧＦ−Ｉ活性がこのプロセスに関与する主な因子であり、Ｎｏｘ４はこのプロセスにおけるメディエーターである(New et al., Am J Physiol Cell Physiol. 302(1), 2012)。慢性的なレニン−アンギオテンシンの活性化と腎損傷システムの進行との関係が、このプロセスにおける協同作用因子としてのＮｏｘ４およびアンギオテンシンＩＩについて十分に確立されている(Chen et al., Mol Cell Biol. 2012)。
【００２４】
したがって、以上のことから、Ｎｏｘ酵素は生体において幾つかの機能をもち、それらは種々の障害にも関与している可能性があると思われる。そのような疾患および障害の例は、心血管障害、呼吸器障害、代謝障害、内分泌障害、皮膚障害、骨障害、神経炎症性障害、腎疾患、生殖障害、眼および／または水晶体を冒す疾患、ならびに／あるいは内耳を冒す状態、炎症性障害、肝疾患、痛み、癌、アレルギー性障害、外傷性障害、敗血症性、出血性およびアナフィラキシー性のショック、胃腸系の疾患または障害、血管新生、血管新生依存性状態である。特にＮｏｘ４がそのような障害に関与することが見出されたとも思われる。その結果、Ｎｏｘを阻害しうる化合物、特にＮｏｘ４を選択的に阻害しうる化合物は、Ｎｏｘ酵素、特にＮｏｘ４が関与する疾患および障害の処置に使用するためにきわめて重要であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Bjelakovic G, Nikolova D, Simonetti RG, Gluud C. Cochrane Database Syst Rev. 2008 Jul 16; (3):CD004183. Epub 2008 Jul 16
【非特許文献２】Reaven, “Role of insulin resistance in human disease”, Diabetes 37(12), 1988
【非特許文献３】Houstis et al., Nature 440, 2006
【非特許文献４】Katakam et al., J cereb blood Flow Metab, 2012 Jan 11
【非特許文献５】Brar et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 282, 2002
【非特許文献６】Brar et al., Am J Physiol Cell Physiol, 282, 2002
【非特許文献７】Grewal et al., Am J Physiol, 276, 1999
【非特許文献８】Sundaresan et al., Science, 270, 1995
【非特許文献９】Lundqvist-Gustafsson et al., J Leukoc Biol, 65, 1999
【非特許文献１０】Steinbeck et al., J Cell Physiol, 176, 1998
【非特許文献１１】Wu et al., J Virol, 78, 2004
【非特許文献１２】Rueckschloss et al., Exp Gerontol, 45, 2010
【非特許文献１３】Lambeth JD, Review Article “Nox enzymes, ROS, and chronic disease: An example of antagonistic pleiotropy”, Free Radical Biology & Medicine 43, 2007
【非特許文献１４】Takac I et al., “The Nox Family of NADPH Oxidases: Friend or Foe of the Vascular System”, Curr Hypertens Rep. 2011 Nov 10
【非特許文献１５】Montezano AC, “Novel Nox homologues in the vasculature: focusing on Nox4 and Nox5”, Clin Sci London 2011
【非特許文献１６】Bedard K et al., “The Nox family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology” Physiol Rev. 2007
【非特許文献１７】Camici M et al., “Obesity-related glomerulopathy and podocyte injury: a mini review”, Front Biosci 2012
【非特許文献１８】Nabeebaccus A et al., “NADPH oxidases and cardiac remodeling” Heart Fai Rev. 2011
【非特許文献１９】Kuroda J et al., “NADPH oxidase and cardiac failure”J Cardiovasc Transl Res. 2010
【非特許文献２０】Kuroda J et al., “NADPH oxidase 4 is a major source of oxidative stress in the failing heart” Proc Natl Acad Sci USA 2010
【非特許文献２１】Maejima Y et al., “Regulation of myocardial growth and death by NADPH oxidase” J Mol Cell Cardiol. 2011
【非特許文献２２】Barnes JL et al., “Myofibroblst differentiation during fibrosis: role of NAD(P)H oxidases” Kidney international, 2011
【非特許文献２３】Alison Cave “Selective targeting of NADPH oxidase for cardiovascular protection” Current Opinion in Pharmacology 2009
【非特許文献２４】Albert van der Vliet “Nox enzymes in allergic airway inflammation” Biochimica et Biophysica Acta 1810, 2011
【非特許文献２５】Pendyala S et al., “Redox regulation of Nox proteins” Respiratory Physiology & Neurobiology 174, 2010
【非特許文献２６】Nair D et al., “Intermittent Hypoxia-Induced Cognitive Deficits Are Mediated by NADPH oxidase Activity in a Murine Model of Sleep Apnea” PLoS ONE, vol. 6, Issue 5, May 2011
【非特許文献２７】Chia-Hung Hsieh et al., “NADPH oxidase Subunit 4-Mediated Reactive Oxygen species Contribute to Cycling Hypoxia-Promoted Tumor Progression in Glioblastoma Multiforme” PloS ONE, vol 6, issue 9, September 2011
【非特許文献２８】Sedeek M et al., “Molecular mechanisms of hypertension: role of nox family NADPH oxidase” Current Opinion in Nephrology and Hypertension 2009
【非特許文献２９】Augusto C et al., “Novel Nox homologues in the vasculature: focusing on Nox4 and Nox5” Clinical Science 2011
【非特許文献３０】Briones AM et al., “Differential regulation of Nox1, Nox2 and Nox4 in vascular smooth muscle cells from WKY and SHR” Journal of the American Society of Hypertension 5:3, 2011
【非特許文献３１】Kinnula VL, Fattman CL, Tan RJ, Oury TD (2005) Oxidative stress in pulmonary fibrosis: a possible role for redox modulatory therapy. Am J Respir Crit Care Med 172:417-422
【非特許文献３２】Kuwano K, Nakashima N, Inoshima I, Hagimoto N, Fujita M, Yoshimi M, Maeyama T, Hamada N, Watanabe K, Hara N (2003) Oxidative stress in lung epithelial cells from patients with idiopathic interstitial pneumonias. Eur Respir J 21:232-240
【非特許文献３３】Cheng et al., J Biol Chem, 279(33), 2004
【非特許文献３４】Serrander et al., Biochem J. 406, 2007
【非特許文献３５】Ago et al., Circulation, 109, 2004
【非特許文献３６】Takac et al., J. Biol. Chem. 286, 2011
【非特許文献３７】De Deken, Wang et al., J.Biol Chem., 275(30), 2000
【非特許文献３８】Chamseddine et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285, 2003
【非特許文献３９】Ellmark et al., Cardiovasc Res. 65, 2005
【非特許文献４０】Van Buul et al., Antioxid Redox Signal. 7, 2005
【非特許文献４１】Kawahara et al., BMC Evol Biol. 7, 2007
【非特許文献４２】Krause et al., Jpn J Infect is. 57(5), 2004
【非特許文献４３】Griendling, Antioxid Redox Signal. 8(9), 2006
【非特許文献４４】Graham et al., Cancer Biol Ther 10(3), 2010
【非特許文献４５】Basuroy et al., Am J Physiol Cell Physiol vol. 296, 2009
【非特許文献４６】Sedwick, PLos Biology, vol.8 issue 9, 2010
【非特許文献４７】Kleinschnitz et al., vol. 8 issue 9, 2010
【非特許文献４８】Datla et al., Arterioscler Throm Vasc Biol. 27(11), 2007
【非特許文献４９】Zhang et al., PNAS, 107, 2010
【非特許文献５０】Garriodo-Urbani et al., Plos One 2011
【非特許文献５１】Takac et al., Curr Hypertens Rep, 14, 2012
【非特許文献５２】Camesecchi et al., Antiox Redox Signal. 1:15(3), 2011
【非特許文献５３】Block et al., PNAS vol. 106, no. 34, 2009
【非特許文献５４】Jiang, redox rep, 16(6), 2011
【非特許文献５５】Tetsuro Ago et al., AGING, December 2010, vol.2 No 12
【非特許文献５６】New et al., Am J Physiol Cell Physiol. 302(1), 2012
【非特許文献５７】Chen et al., Mol Cell Biol. 2012
【発明の概要】
【００２６】
１観点によれば、Ｎｏｘ活性の増大、より具体的にはＮｏｘ４活性の増大に関連する（たとえば、それに起因するかまたはそれにより推進される）疾患の処置に使用するための、Ｎｏｘ阻害剤である化合物が提供される。
【００２７】
さらなる観点によれば、Ｎｏｘ活性の増大、より具体的にはＮｏｘ４活性の増大に関連する障害の処置に使用するための、Ｎｏｘ阻害剤、より具体的にはＮｏｘ４阻害剤である化合物が提供される。
【００２８】
したがって、第１観点によれば、式（Ｉ）の化合物
【００２９】
【化１】
0006768662.tif 000002
【００３０】
［式中：
ｐは、０から２までの整数であり；
ｑは、０から２までの整数であり；
ｍは、１から３までの整数であり；
ｎは、０から３までの整数であり；
Ｒ１はそれぞれ、独立してＣ１−Ｃ３アルキル−Ｘ−から選択され；
Ｘはそれぞれ、独立して直接結合、Ｏ、およびＳから選択され；
Ｒ２はそれぞれ、独立してＣ１−Ｃ３アルキル−Ｙ−、およびフェニル−（ＣＨ２）ｚ−Ｙ−から選択され；
Ｙはそれぞれ、独立してＯおよびＳから選択され；
ｚはそれぞれ、独立して０および１から選択される］
またはその医薬的に許容できる塩であって、
内分泌障害、心血管障害、呼吸器障害、代謝障害、皮膚障害、骨障害、神経炎症性障害、腎疾患、生殖障害、眼および／または水晶体を冒す疾患、ならびに／あるいは内耳を冒す状態、炎症性障害、肝疾患、痛み、癌、アレルギー性障害、外傷性障害、敗血症性、出血性およびアナフィラキシー性のショック、胃腸系の疾患または障害、異常な血管新生および血管新生依存性状態から選択される、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ活性に関連する状態または障害の処置に使用するための化合物が提供される。
【００３１】
さらなる観点によれば、前記のいずれかの状態の処置に使用するための、本明細書中で前記に定めた式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容できる塩、および所望により医薬的に許容できる賦形剤を含む、医薬組成物が提供される。
【００３２】
そのような状態および障害の例は、たとえばＮｏｘ、特にＮｏｘ４に関連するかまたはそれにより仲介されるものとして本明細書中で前記に述べたもの、たとえば心血管障害、内分泌障害、呼吸器障害、代謝障害、皮膚障害、骨障害、神経炎症性障害、腎疾患、生殖障害、内分泌障害、眼および／または水晶体を冒す疾患、ならびに／あるいは内耳を冒す状態、炎症性障害、肝疾患、痛み、癌、アレルギー性障害、外傷性障害、敗血症性、出血性およびアナフィラキシー性のショック、胃腸系の疾患または障害、血管新生および血管新生依存性状態、ならびに肺感染症、急性肺傷害、肺動脈性高血圧症、閉塞性肺障害、線維症、たとえば線維性肺疾患、脳血管偶発症候ならびに肺癌である。
【００３３】
１観点によれば、哺乳動物においてニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ（Ｎｏｘ）、特にＮｏｘ４を阻害するために、Ｎｏｘ、特にＮｏｘ４の発現と関連する障害の処置に使用するための、本明細書中で前記に定めた式（Ｉ）の化合物が提供される。
【００３４】
１観点によれば、その必要がある哺乳動物において、その哺乳動物に本明細書中で前記に定めた式（Ｉ）の化合物を投与することにより、Ｎｏｘ、特にＮｏｘ４の活性を阻害する方法が提供される。本方法は、本明細書中で前記に定めたＮｏｘ活性、特にＮｏｘ４活性と関連する障害の処置に有用である。
【００３５】
さらなる観点によれば、本明細書中で前記に定めたＮｏｘ活性、特にＮｏｘ４活性と関連する障害の処置に用いる医薬を製造するための、本明細書中で前記に定めた化合物の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、４種類の異なる本発明化合物について、被験化合物の２００μＭ溶液の１：３系列希釈により得られた１１種類の濃度での、Ｎｏｘ４トランスフェクションしたＴＲｅｘ−２９３細胞における用量応答曲線を示す：Ａ）２，４，６−トリメチル−Ｎ−フェネチルベンゼンスルホンアミド、Ｂ）４−メトキシ−Ｎ−フェネチルベンゼンスルホンアミド、Ｃ）Ｎ−（４−エトキシフェニル）−３，４−ジメトキシベンゼン−スルホンアミド、およびＤ）Ｎ−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−３，４−ジメトキシベンゼンスルホンアミド。
【図２】図２は、指定濃度の２，４，６−トリメチル−Ｎ−フェネチルベンゼンスルホンアミドの存在下での、それぞれＡ）ＰＬＢ９８５細胞およびＢ）ＰＢＭＣ細胞からのＲＯＳ産生の尺度としてのイソルミノール依存性化学発光を、ＰＭＡ（３０ｎｇ／ｍｌ）対照（＝１００％）と比較した％で示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
一般に、本明細書中で用いる用語はいずれも、本発明が属する技術分野で受け入れられているそれの普通の意味をもつはずである。しかし、明瞭にするために、以下に若干の定義を示し、そうではないことが明記されない限り、または状況から明らかでない限り、それらを本明細書および特許請求の範囲の全体に適用する。
【００３８】
用語“内分泌障害”は、内分泌系の障害を表わし、内分泌腺の分泌減退および分泌過多、または内分泌腺の腫瘍であってもよい。糖尿病および多嚢胞卵巣症候群は内分泌障害の例である。
【００３９】
用語“心血管障害または疾患”は、アテローム性硬化症、特に内皮機能障害に関連する疾患または障害を含み、これには下記のものが含まれるが、それらに限定されない：高血圧症、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病の心血管合併症、内膜過形成、冠動脈性心疾患、脳、冠動脈または動脈の血管攣縮、内皮機能障害、うっ血性心不全を含む心不全、末梢動脈疾患、再狭窄、ステントにより起きた外傷、発作（stroke：卒中、脳卒中）、虚血性発作（ischemic attack）、臓器移植後などの血管合併症、心筋梗塞、高血圧症、アテローム硬化班の形成、血小板凝集、狭心症、動脈瘤、大動脈剥離、虚血性心疾患、心肥大、肺塞栓症、深部静脈血栓症を含む血栓性事象、下記に際して虚血後に血流または酸素送達の復旧により起きた傷害：臓器移植、開心術、血管形成術、出血性ショック、心臓、脳、肝臓、腎臓、網膜および腸を含めた虚血臓器の血管形成術。
【００４０】
用語“呼吸器障害または疾患”は、気管支喘息、気管支炎、アレルギー性鼻炎、成人呼吸器症候群、嚢胞性線維症、肺ウイルス感染症（インフルエンザ）、肺高血圧症、特発性肺線維症、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む。
【００４１】
用語“アレルギー性障害”は、枯草熱および喘息を含む。
用語“外傷性障害(traumatism)”は、多発性外傷性障害(polytraumatism)を含む。
用語“代謝に影響を及ぼす疾患または障害”は、肥満症、メタボリックシンドロームおよびＩＩ型糖尿病を含む。
【００４２】
用語“皮膚疾患または障害”は、乾癬、湿疹、皮膚炎、創傷癒合および瘢痕形成を含む。
用語“骨障害”は、骨粗鬆症、オステオポラシス(osteoporasis)、骨硬化症、歯周炎、および副甲状腺機能亢進症を含む。
【００４３】
用語“脱髄性”は、軸索周囲のミエリンの破壊を含むＣＮＳの状態または疾患を表わす。本発明に関して、脱髄性疾患という用語は、細胞を脱髄するプロセスを含む状態、たとえば多発性硬化症、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脊髄障害、ＣＮＳ内の自己反応性白血球が関与するいずれかの神経炎症状態、先天性代謝障害、異常な髄鞘形成を伴なう神経障害、薬物誘発性脱髄、放射線照射誘発性脱髄、遺伝性脱髄状態、プリオン誘発性脱髄状態、脳炎誘発性脱髄、または脊髄傷害を含むものとする。好ましくは、この状態は多発性硬化症である。
【００４４】
用語“腎疾患または障害”は、糖尿病性腎障害、腎不全、糸球体腎炎、アミノグリコシドおよび白金化合物の腎毒性、ならびに過活動膀胱を含む。特定の態様において、本発明によるこの用語は、慢性腎疾患または障害を含む。
【００４５】
用語“生殖障害または疾患”は、勃起機能障害、受精能障害、前立腺肥大、および良性前立腺肥大を含む。
用語“眼および／または水晶体を冒す疾患または障害”は、糖尿病性白内障を含めた白内障、白内障手術後の水晶体の再混濁化、糖尿病性その他の形態の網膜障害を含む。
【００４６】
用語“内耳を冒す状態”は、老人性難聴、耳鳴り、メニエール病その他の平衡障害、卵形嚢結石症(utriculolithiasis)、前庭性片頭痛、ならびに騒音誘発性難聴および薬物誘発性難聴（聴器毒性）を含む。
【００４７】
用語“炎症性障害または疾患”は、下記のものを意味する：炎症性腸疾患、敗血症、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群、膵臓炎、外傷により誘発されたショック、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、関節リウマチ、慢性関節リウマチ、動脈硬化症、脳内出血、脳梗塞、心不全、心筋梗塞、乾癬、嚢胞性線維症、発作、急性気管支炎、慢性気管支炎、急性細気管支炎、慢性細気管支炎、骨関節炎、痛風、脊髄炎、強直性脊椎炎、ロイター(Reuter)症候群、乾癬性関節炎、脊椎関節炎、若年性関節炎または若年性強直性脊椎炎、反応性関節炎、感染性関節炎または感染後関節炎、淋菌性関節炎、梅毒性関節炎、ライム病、“血管炎症候群”により誘発された関節炎、多発性結節性動脈炎、アナフィラキシー性血管炎、リューゲネク(Luegenec)肉芽腫症、リウマチ様多発筋痛症、関節細胞リウマチ、カルシウム結晶沈着性関節炎、偽性痛風、非関節性リウマチ、滑液嚢炎、腱滑膜炎、外上顆炎（テニス肘）、手根管圧迫症候群、反復使用（タイピング）による障害、混合型関節炎、神経障害性関節障害、出血性関節炎、血管紫斑病、肥厚性骨関節症、多中心性細網内皮系組織球症、特定の疾患により誘発された関節炎、血液色素沈着、鎌状赤血球病その他のヘモグロビン異常、高リポ蛋白血症、異ガンマグロブリン血症、副甲状腺機能亢進症、肢端肥大症、家族性地中海熱、ベーチェット病、全身性自己免疫疾患、紅斑性狼瘡、多発性硬化症およびクローン病、または再発性多発性軟骨炎などの疾患、慢性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、あるいはＮＡＤＰＨオキシダーゼを阻害するのに十分な用量で療法有効量の式（Ｉ）により表わされる化合物を哺乳動物に投与する必要がある関連疾患。
【００４８】
用語“肝疾患または障害”は、肝臓の線維症、アルコール誘発性線維症、脂肪症および非アルコール性脂肪肝炎を含む。
用語“関節炎”は、下記のものを意味する：急性関節リウマチ、慢性関節リウマチ、クラミジア関節炎、慢性吸収性関節炎(chronic absorptive arthritis)、乳糜（び）関節炎(anchylous arthritis)、腸疾患に起因する関節炎、フィラリア性関節炎、淋菌性関節炎、痛風性関節炎、血友病性関節炎、肥厚性関節炎、若年性慢性関節炎、ライム関節炎、新生子ウマ関節炎(neonatal foal arthritis)、結節性関節炎、アルカプトン尿性関節炎、乾癬性関節炎または化膿性関節炎、あるいはＮＡＤＰＨオキシダーゼを阻害するのに十分な用量で療法有効量の式（Ｉ）により表わされる化合物を哺乳動物に投与する必要がある関連疾患。
【００４９】
用語“痛み”は、炎症性疼痛に関連する痛覚過敏症を含む。
用語“癌”は、下記のものを意味する：癌腫（たとえば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、腎癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、肺腺癌、膀胱癌、または上皮癌）、またはＮＡＤＰＨオキシダーゼを阻害するのに十分な用量で療法有効量の式（Ｉ）により表わされる化合物を哺乳動物に投与する必要がある関連疾患。
【００５０】
用語“胃腸系の疾患または障害”は、胃粘膜障害、虚血性腸疾患の管理、腸炎／大腸炎、癌化学療法、または好中球減少症を含む。
用語“血管新生(angiogenesis)”は、発芽血管新生(sprouting angiogenesis)、嵌入血管新生(intussusceptive angiogenesis)、血管形成(vasculogenesis)、動脈形成、およびリンパ管形成を含む。血管新生は、既存の毛細管または後毛細管細静脈からの新たな血管の形成であり、癌、関節炎および炎症などの病的状態で起きる。血管新生刺激に際して血管が侵入できる皮膚、筋肉、腸、結合組織、関節、骨などの組織を含めた多種多様な組織または組織化された組織からなる臓器が、疾患状態における血管新生を支持することができる。本明細書中で用いる用語“血管新生依存性状態”は、血管新生または血管形成のプロセスが病的状態を持続または補足する状態を意味するものとする。血管形成は、内皮細胞前駆体である血管芽細胞から生じる新たな血管の形成の結果である。両プロセスとも結果的に新たな血管を形成し、血管新生依存性状態という用語の意味に含まれる。同様に、本明細書中で用いる用語“血管新生”は、デノボ血管形成、たとえば血管形成から生じるもの、ならびに既存の血管、毛細管および細静脈の分枝および発芽から生じるものを含むものとする。
【００５１】
用語“血管新生阻害性”は、それが新生血管形成(neovascularization)の程度、量または速度を低下させるのに有効であることを意味する。組織における内皮細胞の増殖または移動の程度、量または速度の低下を生じさせることは、血管新生阻害の具体例である。血管新生阻害活性はいずれの癌の処置にも特に有用である；それは腫瘍増殖プロセスをターゲットとし、腫瘍組織の新生血管形成がなければその腫瘍組織は必要な栄養素が得られず、増殖速度が低下し、それ以上の増殖が停止し、退縮し、最終的に壊死状態になり、結果的に腫瘍が死滅するからである。さらに、血管新生阻害活性は転移形成に対して特に有効であるので、いずれの癌の処置にも特に有用である；転移形成も転移癌細胞が原発性腫瘍から進出できるように原発性腫瘍の血管形成を必要とし、かつ続発部位でのそれらの樹立には転移の増殖を支持するための新生血管形成が必要だからである。
【００５２】
本明細書中で用いる“処置(treatmentおよびtreating)”などは、一般に、希望する薬理学的および生理学的効果を得ることを意味する。この効果は、疾患、その症状または状態を阻止または部分的に防止するという点で予防的であってもよく、ならびに／あるいは疾患、その疾患に起因する状態、症状、または有害作用を部分的または完全に治癒させるという点で治療的であってもよい。本明細書中で用いる用語“処置”は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患のいかなる処置をも含み、それには下記のものが含まれる：（ａ）疾患に対する素因をもつ可能性があるけれどもまだそれを伴なうと診断されていない対象において、その疾患が発症するのを防止する；（ｂ）疾患を阻害する、すなわちそれの進展を阻止する；あるいは疾患を軽減する、すなわち疾患および／またはそれの症状または状態を退行させる。
【００５３】
本明細書中で用いる用語“対象”は、哺乳動物を表わす。たとえば、本発明により考慮される哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜、たとえばウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなどが含まれる。
【００５４】
“有効量”または“療法有効量”は、処置された対象に療法効果を与える化合物量を表わす。療法効果は客観的（すなわち、ある検査またはマーカーにより測定可能）または主観的（すなわち、対象が効果を指摘するか、または感じる）であってよい。
【００５５】
本発明に関して用いる用語“阻害剤”は、Ｎｏｘ、特にＮｏｘ４の活性を完全もしくは部分的に阻害し、および／または反応性酸素種（ＲＯＳ）の発生を阻害もしくは低減する分子と定義される。
【００５６】
“医薬的に許容できる”は、一般に安全、無毒性であって生物学的にも他の形でも不都合でない医薬組成物の調製に有用であることを意味し、動物用およびヒトの医薬用として有用であることを含む。
【００５７】
用語Ｃｎ（ｎは整数である）は、ある基または部分がｎ個の炭素原子を含むことを明記する。
用語Ｃｎ−Ｃｍ（ｍおよびｎは両方とも整数であり、ｍ＞ｎである）は、少なくともｎ個、最大でｍ個の炭素原子を含む基または部分を表わす。したがって、用語Ｃ１−Ｃ６アルキルは、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を含むことができるアルキル基を表わす。
【００５８】
本発明によるＣ１−Ｃ３アルキルは、より特別にはＣ１−Ｃ２アルキル、たとえばメチルである。
式（Ｉ）の化合物において、ｍは１、２または３である。ある態様において、ｍは１である。ある他の態様において、ｍは２である。さらに他の態様において、ｍは３である。ある他の態様において、ｍは１または３である。さらに他の態様において、ｍは２または３である。
【００５９】
式（Ｉ）において、部分Ｒ１はそれぞれ、独立してＣ１−Ｃ３アルキル−Ｘ−から、またはＣ１−Ｃ２アルキル−Ｘ−から選択される；たとえばＣＨ３−Ｘ−。
Ｘはそれぞれ、独立して直接結合、ＯおよびＳから選択される。ある態様において、Ｘはそれぞれ直接結合およびＯから選択される。ある態様において、Ｘはそれぞれ直接結合である。ある態様において、ＸはそれぞれＯまたはＳであり、たとえばＸはそれぞれＯである。
【００６０】
ある特定の態様において、Ｒ１はそれぞれ、Ｃ１−Ｃ３アルキルおよびＣ１−Ｃ３アルコキシ、たとえばメチルおよびメトキシから選択される。ある態様において、Ｒ１はそれぞれＣ１−Ｃ３アルキルから選択される；たとえばメチル。ある他の態様において、Ｒ１はそれぞれＣ１−Ｃ３アルコキシから選択される；たとえばメトキシ。
【００６１】
式（Ｉ）の化合物において、ｎは０から３までの整数であり、たとえばｎは０から２までの整数である。ある態様において、ｎは０または１である。ある特定の態様において、ｎは０である。ある他の態様において、ｎは１から３までの整数であり、たとえばｎは１または２であり、特にｎは１である。
【００６２】
部分Ｒ２はそれぞれ、独立してＣ１−Ｃ３アルキル−Ｙ−、およびフェニル−（ＣＨ２）ｚ−Ｙ−から選択される。ある態様において、Ｒ２はそれぞれＣ１−Ｃ３アルキル−Ｙ−である。ある態様において、Ｒ２はそれぞれフェニル−（ＣＨ２）ｚ−Ｙ−である。
【００６３】
Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｙ−はいずれも、より特別にはＣ１−Ｃ２アルキル−Ｙ−から選択できる；たとえば、Ｃ１−Ｃ３アルキル−Ｙ−はいずれもＣ２Ｈ５−Ｙ−であってもよい。
【００６４】
部分Ｙは、独立してＯおよびＳから選択され、たとえばＹはそれぞれＯである。
部分フェニル−（ＣＨ２）ｚ−Ｙ−において、ｚは０および１から選択される整数である。ある態様において、ｚは０である。ある他の態様において、ｚは１である。
【００６５】
ある態様において、ｎは０であり、またはｎは１であり、Ｒ２はエトキシまたはベンジルオキシである。
ある態様において、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉａ）
【００６６】
【化２】
0006768662.tif 000003
【００６７】
により表わすことができ、式中のｍ、ｎ、ｐ、ｑ、Ｒ１およびＲ２は本明細書中で前記に定めたものである。たとえば、式（Ｉａ）の化合物のある態様において、ｐは０である。式（Ｉａ）の化合物のあるさらなる態様において、ｐは０であり、ｑは１または２であり、特にｑは２である。
【００６８】
ある態様において、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉｂ）
【００６９】
【化３】
0006768662.tif 000004
【００７０】
により表わすことができ、式中のｎ、ｐ、ｑ、Ｒ１およびＲ２は本明細書中で前記に定めたものである。たとえば、式（Ｉｂ）の化合物のある態様において、ｐは０である。式（Ｉｂ）の化合物のある態様において、ｑは１または２であり、特にｑは２である。式（Ｉｂ）の化合物のある特別な態様において、ｐは０であり、ｑは１または２であり、特にｑは２である。
【００７１】
ある態様において、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉｃ）
【００７２】
【化４】
0006768662.tif 000005
【００７３】
により表わすことができ、式中のｐ、ｑおよびＲ１は本明細書中で前記に定めたものである。式（Ｉｃ）の化合物のある態様において、ｑは１または２であり、特にｑは２である。
【００７４】
ある態様において、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉｄ）
【００７５】
【化５】
0006768662.tif 000006
【００７６】
により表わすことができ、式中のｑおよびＲ１は本明細書中で前記に定めたものである。たとえば、式（Ｉｄ）の化合物のある態様において、ｑは１または２である。
ある特定の態様において、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉｅ）
【００７７】
【化６】
0006768662.tif 000007
【００７８】
により表わすことができ、式中のＲ１はそれぞれ本明細書中で前記に定めたものである。
ある態様において、式（Ｉ）の化合物は下記のものから選択される：
【００７９】
【化７】
0006768662.tif 000008
【００８０】
２，４，６−トリメチル−Ｎ−フェネチルベンゼンスルホンアミド；
【００８１】
【化８】
0006768662.tif 000009
【００８２】
４−メトキシ−Ｎ−フェネチルベンゼンスルホンアミド；
【００８３】
【化９】
0006768662.tif 000010
【００８４】
Ｎ−（４−エトキシフェニル）−３，４−ジメトキシベンゼンスルホンアミド；および
【００８５】
【化１０】
0006768662.tif 000011
【００８６】
Ｎ−（４−（ベンジルオキシ）フェニル）−３，４−ジメトキシベンゼンスルホンアミド。
式（Ｉ）の化合物は市販されているか、あるいは当技術分野で周知の方法により、容易に入手できる出発物質から一般的な方法および手順を用いて製造できる。
【００８７】
たとえば、式（Ｉ）の化合物は、下記の反応スキームに示すように、スルホニルクロリド１とアミン２を適切な溶媒中で反応させることにより製造できる。
【００８８】
【化１１】
0006768662.tif 000012
【００８９】
本発明化合物はＮｏｘ阻害剤である。より具体的には、本発明化合物はＮｏｘ４阻害剤である。Ｎｏｘイソ型は、Ｎｏｘ４のように疾患に関与するだけでなく、生体における種々の重要な生物学的機能も備えているという事実からみて、主に１種類の特定のＮｏｘイソ型、すなわちＮｏｘ４を阻害する能力は、本発明化合物の重要な利点であると考えられる。
【００９０】
プロセス条件に応じて、式（Ｉ）の目的生成物は中性または塩の形で得られる。これらの目的生成物の遊離塩基および遊離酸ならびに塩類が共に本発明の範囲に含まれる。本発明化合物の酸付加塩は、それ自体既知の方法で、塩基性作用剤、たとえばアルカリを用いて、またはイオン交換により、遊離塩基に変換できる。得られた遊離塩基は、有機酸または無機酸との塩類を形成することもできる。本発明化合物のアルカリ付加塩は、それ自体既知の方法で、酸性作用剤、たとえば酸を用いて、またはイオン交換により、遊離酸に変換できる。得られた遊離酸は、有機塩基または無機塩基との塩類を形成することもできる。
【００９１】
酸付加塩または塩基付加塩の調製に際して、好ましくは医療用として許容できる塩類を適切に形成する酸または塩基を用いる。そのような酸の例は、ハロゲン化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、脂肪族、脂環式、芳香族または複素環式のカルボン酸またはスルホン酸、たとえばギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、ピルビン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、エンボン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ハロゲンベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、またはナフタレンスルホン酸である。塩基付加塩には、無機塩基、たとえばアンモニウムまたはアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩などから、ならびに有機塩基、たとえばアルコキシド、アルキルアミド、アルキルアミンおよびアリールアミンなどから誘導されるものが含まれる。本発明の塩類を調製するのに有用な塩基の例には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウムなどが含まれる。
【００９２】
鏡像異性体およびジアステレオマーを含めて、本発明化合物の幾つかの立体異性体が存在する可能性がある。鏡像異性体はそれらの純粋な形で、または２種類の鏡像異性体のラセミ（等量）混合物もしくは非等量混合物として存在することができる。ジアステレオマーはそれらの純粋な形で、またはジアステレオマーの混合物として存在することができる。ジアステレオマーには幾何異性体も含まれ、それらはそれらの純粋なシスもしくはトランス形で、またはそれらの混合物として存在することができる。
【００９３】
さらなる観点によれば、本発明は、療法有効量の本明細書中で前記に定めた式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容できる塩および所望により医薬的に許容できる賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００９４】
医薬配合物は、通常は、有効物質、すなわち本発明化合物またはその医薬的に許容できる塩を、一般的な医薬用賦形剤と混合することにより調製される。配合物はさらに、既知の方法、たとえば造粒、圧縮、マイクロカプセル化、スプレーコーティングなどにより調製できる。配合物は、常法により、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁液剤、坐剤または注射剤の剤形で調製できる。液体配合物は、有効物質を水その他の適切なビヒクルに溶解または懸濁することにより調製できる。錠剤および顆粒剤を常法によりコーティングしてもよい。
【００９５】
臨床用には、本発明化合物を経口、直腸、非経口または他の投与様式のための医薬配合物中に配合する。これらの医薬製剤は、本発明のさらなる目的である。
通常は、有効化合物の有効量は製剤の０．１〜９５重量％、好ましくは非経口用製剤中には０．２〜２０重量％、好ましくは経口投与用製剤中には１〜５０重量％である。
【００９６】
個々の化合物の投与レベルおよび投与頻度は、使用する個々の化合物の力価、その化合物の代謝安定性および作用期間、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与の様式および時間、排出速度、薬物の組み合わせ、処置すべき状態の重症度、ならびに療法を受けている患者を含めた、多様な要因に応じて異なるであろう。一日量は、たとえば体重キロ当たり約０．００１ｍｇから約１００ｍｇまでの範囲であってもよく、単回投与されるか、あるいはたとえばそれぞれ約０．０１ｍｇから約２５ｍｇまでの量で多数回投与される。普通はそのような投与量を経口により投与するが、非経口投与も選択できる。
【００９７】
本発明化合物を含有する医薬配合物を経口投与のための単位剤形で調製する際、選択した化合物を、固体、粉末状の成分、たとえば乳糖、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体、ゼラチン、または他の適切な成分、ならびに崩壊剤および滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウムおよびポリエチケングリコールワックスと混合することができる。この混合物を次いで顆粒剤に加工し、あるいは圧縮して錠剤にする。
【００９８】
ソフトゼラチンカプセル剤は、本発明の有効化合物（単数または複数）、植物油、脂肪、または他の適切なソフトゼラチンカプセル剤用ビヒクルの混合物を収容したカプセルを用いて調製できる。ハードゼラチンカプセル剤は、有効化合物の顆粒を収容することができる。ハードゼラチンカプセル剤は、有効化合物を、固体、粉末状の成分、たとえば乳糖、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン、アミロペクチン、セルロース誘導体またはゼラチンと組み合わせて収容することもできる。
【００９９】
直腸投与用の単位剤形は、（ｉ）有効物質を中性脂肪基剤と混合したものを含む坐剤の形態；（ｉｉ）有効物質を、植物油、パラフィン油、もしくはゼラチン直腸カプセル剤用の他の適切なビヒクルとの混合物中に含有するゼラチン直腸カプセルの形態；（ｉｉｉ）調合済みマイクロ浣腸剤の形態；または（ｉｖ）投与直前に適切な溶剤中に再構成される乾燥マイクロ浣腸剤配合物の形態で調製できる。
【０１００】
経口投与用の液体製剤は、シロップ剤または懸濁液剤の形態、たとえば０．２重量％から２０重量％までの有効成分を含有し、残部が糖または糖アルコール、ならびにエタノール、水、グリセロール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールの混合物からなる、液剤または懸濁液剤の形態で調製できる。所望により、そのような液体製剤は着色剤、矯味矯臭剤、サッカリン、およびカルボキシメチルセルロースまたは他の増粘剤を含有してもよい。経口投与用の液体製剤は、使用前に適切な溶剤で再構成される乾燥粉末の形態で調製することもできる。
【０１０１】
非経口、たとえば静脈内投与用の液剤は、医薬的に許容できる溶剤中の本発明化合物の溶液として、好ましくは０．１重量％から１０重量％までの濃度で調製できる。これらの液剤は、安定化成分および／または緩衝化成分を含有することもでき、アンプル剤またはバイアル剤の形態の単位量に分配される。非経口投与用の液剤は、使用前に必要に応じて適切な溶剤で再構成される乾燥製剤として調製することもできる。
【０１０２】
本発明化合物は１種類以上の追加の療法有効薬剤と組み合わせて使用または投与することもできる。それらの成分は、同時または逐次に投与するために、同じ配合物中または別個の配合物中にあってよい。
【０１０３】
したがって、本発明のさらなる観点において、下記のものを含む組み合わせ製剤が提供される：
（Ａ）本明細書中で定める本発明化合物；および
（Ｂ）他の療法剤；
その際、（Ａ）および（Ｂ）を医薬的に許容できる賦形剤との混合物中に配合する。
【０１０４】
そのような組み合わせ製剤は、本発明化合物を他の療法剤と併せた投与を提供し、したがって別個の配合物として供給でき、その際、それらの配合物のうち少なくとも１つは本発明化合物を含み、少なくとも１つは他の療法剤を含む；あるいは、複合製剤として供給（すなわち、配合）できる（すなわち、本発明化合物と他の療法剤を含有する単一配合物として提供される）。
【０１０５】
したがって、さらに下記のものが提供される：
（１）本発明に従って使用するための前記に定めた化合物、他の療法剤、および医薬的に許容できる賦形剤、たとえば佐剤、希釈剤またはキャリヤーを含有する、医薬配合物；ならびに
（２）構成要素として下記のものを含むパーツのキット：
（ａ）本発明に従って使用するための本明細書中で定めた化合物を、医薬的に許容できる賦形剤、たとえば佐剤、希釈剤またはキャリヤーと混合したものを含有する、医薬配合物；および
（ｂ）他の療法剤を、医薬的に許容できる賦形剤、たとえば佐剤、希釈剤またはキャリヤーと混合したものを含有する、医薬配合物；
それらの構成要素（ａ）および（ｂ）はそれぞれ、他方と組み合わせて投与するのに適した形態で提供される。
【０１０６】
本発明化合物は、他の処置様式、たとえば癌の処置のための放射線照射と組み合わせて使用または投与することもできる。
１観点によれば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸オキシダーゼ（Ｎｏｘ）、特にＮｏｘ４を阻害するために、Ｎｏｘ、特にＮｏｘ４の発現と関連する障害の処置に使用するための、本明細書中で前記に定めた式（Ｉ）の化合物が提供される。障害は、たとえば内分泌障害、心血管障害、呼吸器障害、代謝障害、皮膚障害、骨障害、神経炎症性障害、腎疾患、生殖障害、眼および／または水晶体を冒す疾患、ならびに／あるいは内耳を冒す状態、炎症性障害、肝疾患、痛み、癌、アレルギー性障害、外傷性障害、敗血症性、出血性およびアナフィラキシー性のショック、胃腸系の疾患または障害、異常な血管新生および血管新生依存性状態から選択できる。ある態様において、障害は糖尿病、発作、線維症、たとえば肺線維症、神経障害性疼痛、および糖尿病合併症、たとえば神経障害から選択される；たとえば障害は糖尿病であり、あるいは障害は発作である。
【０１０７】
ある態様において、障害は内分泌障害である。ある態様において、障害は心血管障害である。ある態様において、障害は呼吸器障害である。ある態様において、障害は代謝障害である。ある態様において、障害は皮膚障害である。ある態様において、障害は骨障害である。ある態様において、障害は神経炎症性障害である。ある態様において、障害は腎疾患である。ある態様において、障害は生殖障害である。ある態様において、障害は眼および／または水晶体を冒す疾患、ならびに／あるいは内耳を冒す状態である。ある態様において、障害は炎症性障害である。ある態様において、障害は外傷性障害である。ある態様において、障害は敗血症性、出血性およびアナフィラキシー性のショックである。ある態様において、障害は胃腸系の疾患または障害である。ある態様において、障害は異常な血管新生であるか、またはそれを伴う。ある態様において、障害は血管新生依存性状態である。
【０１０８】
１観点によれば、患者に療法有効量の本明細書中で定める式（Ｉ）の化合物を投与することにより、その必要がある患者において、Ｎｏｘ、特にＮｏｘ４の活性を阻害する方法が提供される。患者はいかなる哺乳動物であってもよいが、好ましくはヒトである。
【０１０９】
処置すべき患者は、Ｎｏｘ、特にＮｏｘ４の活性増大に関連する状態もしくは障害に罹患している患者、またはそのような状態もしくは障害を発症するリスクをもつ患者であってよい。
【実施例】
【０１１０】
実施例１
細胞ベースのアッセイおよび分析化学
１  細胞生存性
１．１  Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
このアッセイは、生存性の尺度として細胞がレサズリン(resazurin)を還元してレゾルフィン(resorufin)にする能力に基づく。ＴＲＥｘ（商標）−２９３  Ｎｏｘ４細胞をＴ−２２５フラスコ内で培養し、トリプシン処理により採集し、細胞培地に再懸濁した。９０μｌ中２０，０００個の細胞を９６ウェルの細胞培養プレート（透明な底を備えた黒色のもの）に播種した。９０μｌの細胞培地のみを含むバックグラウンドプレートも１つ用意した。
【０１１１】
２４時間後、３７℃の細胞培地中に最終濃度の１０倍に希釈した化合物１０μｌを、細胞プレートおよびバックグラウンドプレートに添加した。化合物を１０μＭの最終濃度で二重に試験した。最終濃度１００μＭのクロルプロマジンを陽性対照として添加した。２４時間の処理後、２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬を添加し、プレートを３７℃で１２０分間インキュベートした。レゾルフィン蛍光をＶｉｃｔｏｒ２Ｖプレートリーダーで読み取った。すべての実験値をバックグラウンドに対して補正した後、細胞生存性の分析を行なった。
【０１１２】
１．２  ＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）
このアッセイは、膜の統合性の尺度としての周囲の細胞培地における乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性に基づく。膜の統合性はアポトーシス、ネクローシスまたは化学物質による影響を受ける可能性がある。ＴＲＥｘ（商標）−２９３  Ｎｏｘ４細胞をＴ−２２５フラスコ内で培養し、トリプシン処理により採集し、ＨＢＳＳに再懸濁して細胞１００，０００個／ｍｌにした。９０μｌの細胞懸濁液をＶ底ポリプロピレン製９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＨＢＳＳのみを含むバックグラウンドプレートを１つ用意した。化合物をＨＢＳＳ中に最終濃度の１０倍に希釈し、ウェル当たり１０μｌを添加した。化合物を１０μＭの最終濃度で二重に試験した。
【０１１３】
プレートを３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション時間が終了する４５分前に、１０μｌの細胞溶解用溶液（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を全部の対照ウェルに添加して、細胞の総ＬＤＨ含量を推定した。自然なＬＤＨ漏出量を非処理細胞について決定した。
【０１１４】
細胞プレートを２５０×ｇで５分間遠心し、５０μｌの上清を９６ウェルＳｐｅｃｔｒａｐｌａｔｅへ移した。５０μｌの再構成した基質ミックスを添加し、プレートを室温で３０分間インキュベートした。５０μｌの停止溶液を添加し、プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）で４９０ｎｍの波長において読み取った。化合物特異的バックグラウンドを差し引き、細胞毒性％を下記に従って計算した：
[(実験量-自然量)/(総量-自然量)]＊100%
上記２種類の細胞生存性アッセイで試験した場合、本発明化合物はいずれも有意の細胞毒性を示さなかった。
【０１１５】
２  用量応答曲線
Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄベースのアッセイによる用量応答測定を下記に従って実施した：化合物の系列希釈を、リキッドハンドラーＪａｎｕｓ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）およびスケジューリングソフトウェアＯｖｅｒｌｏｒｄ（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）に基づくシステムを用いて実施した。
【０１１６】
ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ化合物原液１５μｌを含む化合物プレートから出発して、１０μｌのＤＭＳＯを化合物プレートの各段に添加した（Ｆｌｅｘｄｒｏｐ）。５μｌの化合物溶液を１０μｌのＤＭＳＯに添加することにより系列希釈を行なって（１：３）、１１種類の濃度にした。化合物プレートの各ウェルに９０μｌのアッセイ用緩衝液を添加した。混合した後、１０μｌを化合物プレートの各ウェルからアッセイプレートのウェルへ移し、続いて２０μｌの検出ミックスおよび２０μｌのＴＲＥｘ（商標）−２９３  Ｎｏｘ４細胞懸濁液を添加した。次いでアッセイプレートを室温で４０〜６０分間インキュベートした。
【０１１７】
特注の計算テンプレートを用いてＡｃｔｉｖｉｔｙｂａｓｅ  ＸＥ（ＩＤＢＳ）でデータを解析した。組込み方程式を用いて生の蛍光データを阻害率％に換算した：
【０１１８】
【数１】
0006768662.tif 000013
【０１１９】
用量応答曲線に非線形回帰を用いて４パラメーター算定式を当てはめた。図１に、本発明化合物についての用量応答曲線を示す。
３  同一性、純度および安定性(IDENTITY, PURITY AND STABILITY)（ＩＰＳ）分析
ＤＭＳＯ溶液を希釈して、ＰＢＳ，ｐＨ７．４中、１００μＭの最終濃度にした。２つの試料を調製した：１つは即時分析のためのもの、２つ目は３７℃で２４時間保存するためのもの。
【０１２０】
ＵＶおよびＥＳＩ−ＭＳ検出を備えた逆相ＨＰＬＣシススムで分析を実施した。純度を、２２０ｎｍにおける試料ピークの相対面積として定義した。同一性を、試料のＭＳクロマトグラムにおける分子イオンの存在により決定した。安定性は、０時間目のクロマトグラムの試料ピークに対する２４時間後の試料ピークの相対面積比であった。純度および安定性の数値は、切り捨てて１０％増分でレポートした（すなわち、９６％を９０％としてレポートする）。
【０１２１】
ＩＰＳ分析において、被験化合物はプラスの同一性をもち、９０％以上の純度であり、８０％以上の安定性を備えていた。
実施例２
Ｎｏｘ２に対する本発明化合物の活性
本発明化合物のＮｏｘ４特異性を評価するために、多数の本発明化合物を、Ｎｏｘ２からの反応性酸素種（ＲＯＳ）産生に対するそれらの潜在的な阻害効果について試験した。
【０１２２】
１  試験計画
ＰＬＢ９８５細胞（ヒト急性骨髄性白血病細胞系）およびヒト末梢血単核細胞(peripheral blood mononuclear cell)（ＰＢＭＣ）について、ホルボール  １２−ミリステート  １３−アセテート(phorbol 12-myristate 13-acetate)（ＰＭＡ）（３０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した後のＮｏｘ２からのＲＯＳ産生の阻害を、イソルミノール増強化学発光を用いて評価した。本発明化合物およびジフェニレンヨードニウムクロリド(diphenyleneiodonium chloride)（ＤＰＩ）を、２００μＭから０，０１μＭまでの範囲の３倍希釈系列で用量設定した。
【０１２３】
すべての試料を二重試験として分析した。
２  分析アッセイ
２．１  イソルミノールアッセイ
イソルミノール依存性化学発光(Dahlgren et al. 1999)を用いてＲＯＳのレベルを測定した。イソルミノールは生体膜を通過できない疎水性色素である。よって、この方法を用いて細胞外ＲＯＳを測定する。イソルミノールはＲＯＳにより励起され、励起された分子が基底状態に戻る際に発生する光を、放出されたＲＯＳの量に対比して測定する。この反応はペルオキシダーゼにより触媒および増幅される。天然のペルオキシダーゼがこれを達成できるが、それの分泌は限られており、よって追加のペルオキシダーゼ、この場合には西洋わさびペルオキシダーゼフラクションＩＩを添加する必要がある。
【０１２４】
２．２  データ収集および解析
ＦｌｕｏＳｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）および白色９６ウェルプレートを用いて発光を検出した。３７℃で振とうしながら６７秒間、２３サイクルの測定を実施した。これら２３サイクルから曲線下面積（ＡＵＣ）値を計算した。阻害剤を添加しなかったＰＭＡ刺激細胞と比較した変化率パーセントとして結果を評価した。非線形回帰およびＩＣ５０計算を、Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘ用のＰｒｉｓｍ  ５を用いて実施した。
【０１２５】
３  材料および方法
３．１  ヒトＰＢＭＣ
人血（１日齢のバフィーコート中）をＫｏｍｐｏｎｅｎｔｌａｂ，Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｈｏｓｐｉｔａｌ，スウェーデン、ヨーテボリ(Goeteborg)から購入した。
【０１２６】
３．１．１  ＰＢＭＣ単離
赤血球を全血からデキストラン沈降により除去した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（０．７５ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌを補足）を用い、製造業者の指示に従って、無赤血球画分を密度勾配遠心分離により分離した。ＰＢＭＣを、血漿とＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ試薬の境界から単離した。混入血小板が除去されるまで、ＰＢＭＣをＨＢＳＳ中で洗浄した。細胞の数および生存率をトリパンブルー排除により判定した。
【０１２７】
３．１．２  ＰＢＭＣの凍結保存
細胞をKreher et al. 2003に従って凍結保存した。簡単に述べると、単離した細胞を２０×１０６個／ｍｌで室温の凍結媒体Ａ（６０％のウシ胎仔血清，４０％のＲＰＭＩ  １６４０）に再懸濁した。等体積の室温の凍結媒体Ｂ（２０％のＤＭＳＯ，８０％のウシ胎仔血清）を滴加した。１５×１０６個の細胞を凍結チューブに分注し、予冷した（４℃）低温用速度制御凍結容器(Cryogenic Controlled-Rate Freezing Container)に入れて−８０℃に置いた。２４時間後、試料を不定期間保存のために−１５０℃のフリーザーへ移した。
【０１２８】
３．１．３  ＰＢＭＣの融解
細胞を３７℃の水浴内で急速融解し、室温のＨＢＳＳ中へピペッティングし、遠心分離した（２５０×ｇ，２０℃，５分）。ＨＢＳＳ中で洗浄した（２×）後、細胞をＨＢＳＳに２×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞の数および生存率をトリパンブルー排除により判定した。
【０１２９】
分析直前にアッセイプレート当たり１つのバイアルを使用、融解および調製した。
３．１．４  細胞数：ヒトＰＢＭＣ
総細胞数（バイアル当たり）：  ９〜９．７５×１０６個
生存率：  ９２〜９５％
アッセイ生存細胞濃度：  ２×１０６個／ｍｌ
３．２  ＰＬＢ９８５
ＰＬＢ９８５細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシン１００Ｕ／ｍｌを補足したＲＰＭＩ  １６４０（＝完全増殖培地）中、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。細胞をほぼ週２回、継代した。好中球と分別するために、細胞を遠心沈殿させ（２５０ｇ，５分，室温）、１．２５％のＤＭＳＯを補足した完全増殖培地に再懸濁して５日間おいた(Zhen et al.1993, Tucker et al.1987)。分析当日に、分別した細胞をペレット化し（２５０ｇ，５分，室温）、ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、ＨＢＳＳに細胞２×１０６個／ｍｌで再懸濁した。細胞の数および生存率をトリパンブルー排除により判定した。細胞を使用時まで室温に保存した。
【０１３０】
３．２．１  細胞数：ＰＬＢ９８５
総細胞数：  ９４×１０６個
生存率：  ９２％
アッセイ生存細胞濃度：  ２×１０６個／ｍｌ
３．３  試薬
アッセイプレート，白色９６ウェル（Ｎｕｎｃ  ２３６１０８）
デキストランＴ５００（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｍｏｓ  ５５１０  ０５００  ４００６）
ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ：Ｄ５８７９）
ＤＰＩ
ウシ胎仔血清（ＶＷＲ：ＬＯＮＺ１４−８０１Ｆ）
Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ７１−７１６７−００）
ｆＭＬＦ（Ｓｉｇｍａ：Ｆ３５０６）
ＨＢＳＳ（自社調製：５．４ｍＭ  ＫＣｌ，０．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ，０．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，４．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３，１．３ｍＭ  ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ，０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ，０．６ｍＭ  ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ，１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，５．６ｍＭ  Ｄ−グルコース）
ＨＲＰフラクションＩＩ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８２５０）
イソルミノール（４−アミノフタルヒドラジド）（Ｓｉｇｍａ  Ａ８２６４）
ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ８１３９）
ＲＰＭＩ  １６４０（ＶＷＲ：ＬＯＮＺ１２−７０２Ｆ／１２）。
【０１３１】
３．４  被験化合物
本発明化合物の１００ｍＭ  ＤＭＳＯ原液を試験に用いた。
３．５  イソルミノール緩衝液
イソルミノール緩衝液はイソルミノール（０，０１７５ｍｇ／ｍｌ）およびＨＲＰフラクションＩＩ（１，７５Ｕ／ｍｌ）を含有する。これらの成分を４×作業濃度でＨＢＳＳ中に希釈することにより緩衝液を調製した。
【０１３２】
４  操作
４．１  物質調製
被験化合物をＤＭＳＯ中に１００×作業濃度で希釈し、最終濃度として２００μＭから０．０１μＭまで３倍希釈系列で用量設定した。
【０１３３】
ＤＰＩを１００×作業濃度で希釈し、被験化合物と同じ希釈系列で用量設定した。ＤＰＩを最終濃度１μＭですべてのプレートにおける対照としても用いた。その際、ＤＭＳＯ中に１００×作業濃度で希釈を行なった。
【０１３４】
ＰＭＡをイソルミノール緩衝液中に４×作業濃度で希釈した。
４．２  イソルミノールアッセイ
イソルミノール緩衝液中に４×作業濃度に希釈した２５μｌのＰＭＡを各ウェルに添加した。非刺激対照ウェルにはイソルミノール緩衝液のみを添加した。その後、２４μｌのＨＢＳＳおよび１μｌの化合物試験溶液またはＤＰＩ溶液のいずれかを試験プレートの各ウェルに添加した（最終ＤＭＳＯ濃度＝１．２５％）。最後に、５０μｌの細胞懸濁液（２ｘ１０６個／ｍｌ）を各ウェルに添加し、続いて直ちに発光測定を開始した。
【０１３５】
５  結果
化合物２，４，６−トリメチル−Ｎ−フェネチルベンゼンスルホンアミドについての結果を、ＰＭＡの存在下での発光と比較した指定濃度の被験化合物の存在下で得られた発光％として表わす；図２を参照。
【図１】
0006768662.tif 000020
【図２】
0006768662.tif 000021