(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ５糖およびＣ６糖からなる群から選択されるｎ種の糖の混合物からｎ＋ａ種の酸化生成物および還元生成物を得るための方法であって、
ｎは少なくとも２であり、ａは少なくとも１であり、
混合物中の糖の少なくとも２種が互いに非等モル比で存在しており、
第１の段階で、互いに非等モル比で存在する糖の少なくとも１種は酵素的に酸化され、同時に、互いに非等モル比で存在する他の糖の少なくとも１種は酵素的に還元され、
第１の段階で、互いに非等モル比で存在する糖の少なくとも１種の一部は変換されない、方法において、
少なくとも第２の段階で、第１の段階で変換されなかった糖の少なくとも一部の半分は酵素的に酸化され、残りの半分は酵素的に還元されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
糖酸および糖酸ラクトンがそれぞれ酸化生成物として得られ、糖アルコールが還元生成物として得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖の混合物がキシロースおよびアラビノースを含有し、キシロースが過剰に存在していることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の段階でアラビノースがアラボン酸またはアラボン酸ラクトンに酸化され、キシロースの一部がキシリトールに還元され、第２の段階で、未反応のキシロースの半分がキシロン酸またはキシロノラクトンに完全にまたは部分的に酸化され、残りの半分がキシリトールに還元されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
形成したアラボン酸および／または形成したキシロン酸がα−ケトグルタル酸にさらに加工されることを特徴とする、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
混合物がグルコースをさらに含有することを特徴とする、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
混合物が他の存在する糖に対して過剰のグルコースを含有し、グルコースから少なくとも部分的にソルビトールが得られることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
２つの段階の少なくとも１つにおいて、好ましくは少なくとも第２の段階で、特に好ましくは第１の段階と第２の段階の両方で、少なくとも１種のレドックス補因子および前記レドックス補因子に依存する少なくとも１種の酵素が反応混合物中に存在することを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
好ましくは第１の段階と第２の段階の両方で、並行して進行する酵素的反応によってレドックス補因子が再生されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第１の段階および第２の段階がワンポット反応で行われることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
２つの段階が少なくとも部分的に同時に進行することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
混合物から蓄積する糖酸を除去することを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
糖を含有する混合物がヘミセルロース含有材料から得られたものであることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ヘミセルロース含有材料がリグノセルロース材料をパルプ化することによって得られたものであることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
リグノセルロース材料が、藁、特に麦藁、バガス、エネルギーグラス、特にネピアグラス、スイッチグラス、および／または殻、特に外穎からなる群から選択される材料であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リグノセルロース材料がアルコール、特にＣ1〜4アルコール、水およびアルカリでパルプ化することによって得られたものであることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ５糖およびＣ６糖からなる群から選択されるｎ種の糖の混合物からｎ＋ａ種の酸化生成物および還元生成物を得るための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖混合物の分画のための多数の方法が文献に公開されている。それらの多くがクロマトグラフィーに基づくものである。
【０００３】
ＵＳ２００４／０１７３５３３Ａ１において、糖類、好ましくはキシロースおよびグルコースからなる混合物のクロマトグラフィー分離法が記載されている。この分離によって、一方はキシロースに富み、他方はグルコースに富んだ個別のストリームが得られる。糖混合物は好ましくはバイオマスの加水分解によって製造されたものである。
【０００４】
糖、糖アルコール、炭水化物およびこれらの混合物の分離はＥＰ１４９０５２１Ｂ１に記載されており、ここで、少なくとも１つのステップで、弱塩基性のアニオン交換樹脂（架橋ポリアクリル酸ポリマーまたはエピクロロヒドリン−トリエチレンテトラミン樹脂）がクロマトグラフィー分離に使用される。
【０００５】
ＣＡ２３５９３３７から、キシロース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、グルコース、キシリトール、アラビトール、ソルビトール、ガラクチトールまたはマンニトール（または他の単糖）の他の糖または糖アルコールからの分離が、比較的低いヒドロキシル含有量を有するアニオン交換体から製造されたイオン交換体によるクロマトグラフィーによって実施される、糖の分離法が公知である。
【０００６】
クロマトグラフィーによる糖の分画の主な欠点は、成分の分離が不完全なことである。結果として、低い収率と主要な糖の画分における他の糖の高い占有率が挙げられる。
【０００７】
糖の分画の別の手法は、異なる物理的または化学的特性（極性、溶解度等）の結果として互いに容易に分離することができる成分への（任意選択で）選択的な糖変換である。
【０００８】
そのような分画の一例がＵＳ７４９８４３０に記載されており、ここで、糖混合物からキシロースおよびアラビノースの分画が実施される。この分画は、糖をキシロースモノアセタールとアラビノースジアセタールとの混合物に変換することによって起こる。続いて、液液抽出によって、キシロースモノアセタールがアラビノースジアセタールから分離される。
【０００９】
ＷＯ２０１１／１３３５３６Ａ１において、糖加水分解物中のＣ５および／またはＣ６アルドース糖を触媒と接触させて、糖をケトース異性体に変換する方法が記載されている。さらに、異性化Ｃ５および／またはＣ６ケトースを錯化剤（ＣＡ）と接触させることによって、ケトースはＣＡに結合し、ケトース−ＣＡコンジュゲートが出現する。ケトース−ＣＡコンジュゲートは糖混合物から選択的に分離することができた。
【００１０】
本発明において、糖の分画の第１のステップとして、糖混合物中の糖の一部が糖酸に選択的に変換される。糖酸の製造のためのいくつかの方法が文献に記載されている。
【００１１】
グルコン酸の製造方法はＵＳ２６５１５９２から公知である。カタラーゼおよびグルコースオキシダーゼ活性を示す酵素系にグルコース溶液を加え、全グルコースを酸化するために過酸化水素を化学量論量で加える。
【００１２】
ＵＳ３６１９３９６において、グルコン酸をグルコース含有材料からグルコースオキシダーゼによって酵素的に製造する方法が記載されている。公知の方法に対する改善点は、グルコン酸を反応媒体から分離し、グルコースオキシダーゼを回収するために、反応媒体を電気透析に供することにある。
【００１３】
ＵＳ３９３５０７１において、グルコースをグルコン酸に変換するが、ここで、グルコースは水溶液中で酸素により酸化される。グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼを含み、適切な担体に堅く結合した触媒にグルコース溶液を通過させる。一例において、フルクトースの存在下におけるグルコースの選択的酸化が記載されており、新生のグルコン酸はその後、イオン交換体によって分離される。
【００１４】
グルコン酸およびその塩の製造方法がＣＡ２１９４８５９から公知であり、１５％以上の濃度を有するグルコースを、１０℃以上の温度で、グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼの存在下でグルコン酸に変換する。この変換は、オキシダーゼ活性に対して過剰なカタラーゼ活性を用いるように行われる。
【００１５】
ＵＳ７９２３２２６Ｂ２において、１，２，４−ブタントリオールの製造方法が記載されており、ここで、キシロースもキシロノラクトン／キシロン酸に酸化される。しかしながら、この特許は反応において還元されるレドックス補因子の再循環システムは開示していない。
【００１６】
また糖酸の製造のために、発酵法がすでに使用されている（例えば、Ｂｕｃｈｅｒｔら、１９８８；Ｔｏｉｖａｒｉら、２０１２ｂ）。
【００１７】
ＵＳ２３５１５００において、発酵によってグルコースがグルコン酸に変換する方法が記載されている。グルコン酸塩の沈殿を防ぐために、新生のグルコン酸に対して０．２５〜１．５の量でホウ酸を加える。
【００１８】
文献には、キシロン酸とキシリトールの両方がキシロースから形成される発酵法のいくつかの例もある。Ｎｙｇａｒｄら（２０１１）では、キシロースをキシロン酸およびキシリトールに変換するためにクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）株を使用する。しかしながら、この方法では大量のバイオマスが生成される（生成物キシロン酸およびキシリトールの合計に対して約５０％）。さらなる先行技術の方法では、キシロースからキシロン酸およびキシリトールを製造するために、Ｓ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株（Ｔｏｉｖａｒｉら、２０１２ｂ）または改変大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｃａｏら、２０１３）が使用される。その場合にも、非常に大量のバイオマスが生成され、それによってキシロースに加えて培地に添加された物質、例えばグルコースなども消費される。
【００１９】
先行技術によるキシロネートの製造のための記載した方法およびさらなる発酵法では、次の問題：バイオマス、アセテートまたは他の糖酸の生成の結果としての損失、比較的低い基質濃度および／または比較的長い反応時間が明らかとなる。
【００２０】
単離された酵素を使用して糖アルコールキシリトールを製造するいくつかの酵素的方法が公知である（例えば、Ｚｈａｎｇら（２０１１））。こうした方法では、使用されたレドックス補因子はさらなる酵素的レドックス反応によって再生される。しかしながら、このためには、各々の場合にさらなる基質を少なくとも化学量論量で添加しなければならない。Ｎｉｄｅｔｚｋｙら（１９９６）は、キシロースからキシリトールを製造し、グルコースまたはキシロースのいずれかの同時酸化によって還元等価体がもたらされる方法を記載している。
【００２１】
糖アルコールキシリトールを製造するさらなる周知の可能性は発酵である。Ｋｏら（２００６）では、例えば、キシロースからキシリトールを得るための発酵法が記載されている。そのために、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）の遺伝子組換え株が使用される。キシロースレダクターゼの補因子の再生は詳述されておらず、細胞の全体的な代謝に引き継がれる。明らかとなる不利益は、グルコースが培養物にさらに添加されることである。使用された糖の大部分はバイオマスに変換され、生成物の形成に役立たない。特筆すべきは、使用されたキシロースに対して化学量論的に可能な量のキシリトールが得られない。
【００２２】
Ｌ−アラボネートをＬ−２−ケト−３−デオキシアラボネートおよびアルファ−ケトグルタレートセミアルデヒドを介してアルファ−ケトグルタレートに変換することを可能にする酵素が文献に記載されている（Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６）。さらに、Ｄ−キシロン酸をＤ−２−ケト−３−デオキシキシロネートおよびアルファ−ケトグルタレートセミアルデヒドを介してアルファ−ケトグルタレートに変換することを可能にする酵素が記載されている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、２００６；Ｊｏｈｎｓｅｎら、２００９）。
【００２３】
ＷＯ２０１４／０７６０１２Ａ１において、とりわけ、アラビノースとキシロースとの混合物（約１０対９０のモル比）から、アラビノースがアラビノラクトンまたはアラボン酸に主として酵素的に酸化され、キシロースが本質的に等モル比でキシリトールに酵素的に還元される方法が記載されている。
【００２４】
アラビノースとキシロースとの間の記載したモル比は、リグノセルロース含有バイオマスをパルプ化した後、パルプ化によって得られたヘミセルロース含有材料を酵素的に分解することによって得られ得る糖混合物の典型的なものである。
【００２５】
さらなる先行技術がＷＯ２０１０／１０６２３０Ａ１から公知である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】ＵＳ２００４／０１７３５３３Ａ１
【特許文献２】ＥＰ１４９０５２１Ｂ１
【特許文献３】ＣＡ２３５９３３７
【特許文献４】ＵＳ７４９８４３０
【特許文献５】ＷＯ２０１１／１３３５３６Ａ１
【特許文献６】ＵＳ２６５１５９２
【特許文献７】ＵＳ３６１９３９６
【特許文献８】ＵＳ３９３５０７１
【特許文献９】ＣＡ２１９４８５９
【特許文献１０】ＵＳ７９２３２２６Ｂ２
【特許文献１１】ＵＳ２３５１５００
【特許文献１２】ＷＯ２０１４／０７６０１２Ａ１
【特許文献１３】ＷＯ２０１０／１０６２３０Ａ１
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｂｕｃｈｅｒｔら、１９８８  Applied and Environmental Microbiology 28, 367-372.
【非特許文献２】Ｔｏｉｖａｒｉら、２０１２ｂ  Metabolic Engineering 14.
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇら（２０１１）  Bioresource Technology 102, 1837-1843.
【非特許文献４】Ｎｉｄｅｔｚｋｙら（１９９６）  Biotechnology and Bioengineering 52, 387-396.
【非特許文献５】Ｋｏら（２００６）  Applied and Environmental Microbiology 72, 4207-4213.
【非特許文献６】Ｗａｔａｎａｂｅら、２００６  Journal of Biological Chemistry 281, 33521-33536.
【非特許文献７】Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、２００６  Journal of Bacteriology 189, 2181-2185.
【非特許文献８】Ｊｏｈｎｓｅｎら、２００９  Journal of Biological Chemistry 284, 27290-27303.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明の目的は、バイオマスからよく発生する非常に複雑な糖混合物を高純度および高収率で、糖の数および構造に関係なく分画することである。さらに、本発明の目的は、分画された糖／糖酸、特にキシロース、キシロン酸、アラビノース、アラボン酸のさらなる生成物、特にキシリトールおよびα−ケトグルタレートへのさらなる変換の可能性を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明の目的は、請求項１に記載の方法によって達成される。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の好ましい実施形態は従属請求項に示されている。
【００３１】
最初に、本発明は、Ｃ５糖およびＣ６糖からなる群から選択されるｎ種の糖の混合物からｎ＋ａ種の酸化生成物および還元生成物を得るための方法であって、
ｎは少なくとも２であり、ａは少なくとも１であり、
混合物中の糖の少なくとも２種が互いに非等モル比で存在しており、
第１の段階で、互いに非等モル比で存在する糖の少なくとも１種は酵素的に酸化され、同時に、互いに非等モル比で存在する他の糖の少なくとも１種は酵素的に還元され、
第１の段階で、互いに非等モル比で存在する糖の少なくとも１種の一部は変換されない、方法において、
少なくとも第２の段階で、第１の段階で変換されなかった糖の少なくとも一部の半分は酵素的に酸化され、残りの半分は酵素的に還元されることを特徴とする、方法を提供する。
【００３２】
好ましくは、第２の段階で、第１の段階で変換されなかった糖の本質的に全量の半分は酵素的に酸化され、残りの半分は酵素的に還元される。
【００３３】
さらに、第１の段階でそれぞれ酸化および還元された２種の糖は、好ましくは本質的に等モル量で変換される。
【００３４】
本発明による方法は、糖混合物から互いから分離可能な糖酸化生成物（例えば、糖酸など）および糖還元生成物（例えば、糖アルコールなど）が得られるような糖に関する酵素的酸化および還元反応のカップリングに基づいたものである。
【００３５】
特にバイオマスから得られる多くの糖混合物において、その中に含まれる糖は等モル比で存在しない。例えば、ＷＯ２０１４／０７６０１２Ａ１に記載のように、第１の段階で一方の糖の酵素的酸化および他方の糖の酵素的還元が本質的に等モル比で起これば、最初の混合物中により多量に存在する糖の一部は、未反応の形態で混合物中に残存することになる。
【００３６】
本発明によれば、前記糖のこの未反応の部分もまた酵素的酸化および酵素的還元に供されることになる。結果として、互いから分離することができる前記糖の酸化生成物（例えば、糖酸など）および還元生成物（例えば、糖アルコールなど）が本質的に等モル比で再度出現することになる。
【００３７】
第１の段階で変換されなかった前記糖の全部が酸化および還元されれば、こうした酸化および還元生成物のみからなる混合物が得られ、生成物の完全な分離がこうして可能となる。
【００３８】
したがって、例えば、２種の糖（ｎ＝２）の混合物では、３種（ａ＝１）の生成物、すなわち、第１の段階で酸化された糖の酸化生成物ならびに他方の糖の酸化および還元生成物が前記方法によって出現することになる。
【００３９】
特に、２種を超える糖の混合物が存在する場合、第１の段階はいくつかのサブステップを含み得る。
【００４０】
例えば、３種の糖Ａ、ＢおよびＣの混合物（糖Ｃがモル過剰で存在する）では、第１の段階の第１のサブステップで糖Ａが完全に酸化または還元され得、それに応じて、糖Ｃが等モル比で部分的に還元または酸化され得る。第２のサブステップでは、例えば、糖Ｂが完全に酸化または還元され得、ここでも、糖Ｃの一部がそれに応じて還元または酸化され得る。次いで、第２の段階では、糖Ｃの未反応部分全部が好ましくは各々の場合に半分ずつ還元および酸化され得る。
【００４１】
第１の段階のサブステップは、同時に進行してもよく、連続的に進行してもよい。
【００４２】
本発明によれば、糖酸および糖酸ラクトンが好ましくは酸化生成物として得られ、糖アルコールが還元生成物として得られる。
【００４３】
本発明による方法では、好ましくはキシロースならびにＣ５糖、例えば、アラビノース、リキソース、リボースなど、およびＣ６糖、例えば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、イドース、ガラクトースおよびタロースなどからなる群から好ましくは選択される少なくとも１種のさらなる糖を含有する物質の混合物が変換される。
【００４４】
特に好ましい一実施形態では、糖の混合物はキシロースおよびアラビノースを含有し、キシロースが過剰に存在している。
【００４５】
そのような混合物は、リグノセルロース材料をパルプ化することによって得られたヘミセルロース含有材料の分解中に特に蓄積し、特にリグノセルロース材料が藁、特に麦藁、バガス、エネルギーグラス、特にネピアグラス、スイッチグラス、および／または殻、特に外穎からなる群から選択される材料である場合に蓄積する。
【００４６】
典型的には、この方法で得られた混合物中のキシロースとアラビノースとのモル比は約９：１となり得る。
【００４７】
過剰量のキシロースと、アラビノースとを含む糖混合物が存在する実施形態では、第１の段階で、アラビノースはアラボン酸またはアラボン酸ラクトンに好ましくはそれぞれ酸化され、キシロースの一部はキシリトールに還元され、第２の段階で、未反応のキシロースの半分はキシロン酸またはキシロノラクトンに完全にまたは部分的に酸化され、残りの半分はキシリトールに還元される。
【００４８】
本発明の前記態様では、例えばアラボン酸の同時酸化的生成によって必要な酸化当量がもたらされるので、キシリトールを生成するために混合物に加えるべきさらなる糖はない。
【００４９】
混合物中９：１のキシロースとアラビノースとの例示的な比から開始して、例えば以下が順次続いて起こる。
【００５０】
そのような混合物において、第１の段階で、アラビノースの本質的に全量がアラボン酸に酸化され、キシロースの本質的に等モル量がキシリトールに還元された場合、１部のアラボン酸、１部のキシリトールおよび８部の未反応のキシロースの混合物が得られる。
【００５１】
第２の段階で、好ましくは全部の未反応のキシロースが、半分はキシロン酸に、半分はキシリトールに酵素的に還元された場合、１部のアラボン酸、４部のキシロン酸および５部のキシリトールの混合物が得られることになる（アラボン酸が事前にすでに分離されていない場合）。
【００５２】
したがって、最初の糖混合物から、容易に分離可能な酸化および還元生成物の混合物が簡潔に生じ、この生成物はすでにそれ自体有益な物質（例えば、キシリトールなど）であるか、有益な生成物にさらに加工することができる。
【００５３】
したがって、本発明のこの実施形態では、形成したアラボン酸および／または形成したキシロン酸はα−ケトグルタル酸に好ましくはさらに加工される。
【００５４】
またこのさらなる加工は好ましくは酵素的に起こり得る。
【００５５】
糖酸アラボン酸およびキシロン酸のアルファ−ケトグルタレートへの酵素的変換について、アラボン酸の場合、前記酸はまずアラボン酸デヒドラターゼによってＬ−２−ケト−３−デオキシアラボネートに変換され、次いでＬ−２−ケト−３−デオキシアラボネートデヒドラターゼによってアルファ−ケトグルタル酸セミアルデヒド（アルファ−ＫＧＳＡ）に変換され、さらにアルファ−ＫＧＳＡデヒドロゲナーゼによってアルファ−ケトグルタレートに変換され得る。キシロン酸の場合、前記酸はまずキシロン酸デヒドラターゼによってＤ−２−ケト−３−デオキシキシロネートに変換され、次いでＤ−２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼによってアルファ−ケトグルタル酸セミアルデヒド（アルファ−ＫＧＳＡ）に変換され、さらにアルファ−ＫＧＳＡデヒドロゲナーゼによってアルファ−ケトグルタレートに変換され得る。
【００５６】
酵素クラスＬ−アラボン酸デヒドラターゼおよびＬ−２−ケト−３−デオキシアラボネートデヒドラターゼの適切な代表例は、例えば、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅから入手可能である。酵素クラスキシロン酸デヒドラターゼおよびＤ−２−ケト−３−デオキシキシロネートデヒドラターゼの適切な代表例は、例えば、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓから入手可能である。適切なアルファ−ケトグルタル酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、例えば、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅまたはＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓから入手可能である。
【００５７】
本発明による方法のさらに好ましい実施形態は、キシロースおよびアラビノースを含有する混合物がグルコースをさらに含有することを特徴とする。
【００５８】
特に、方法の前記実施形態では、混合物中に含有されるグルコースはグルコン酸に酸化される。
【００５９】
方法の前記実施形態では、好ましくはグルコン酸の分離後に、アラビノースはアラボン酸に好ましくは酵素的に酸化される。
【００６０】
キシロース／アラビノース／グルコースの９：１：０．４の比の例示的な混合物（この範囲の混合物は、例えば、藁のパルプ化およびその後の酵素的分解中に得ることができる）から開始して、例えば以下が順次続く。
【００６１】
そのような混合物では、第１の段階で、グルコースの本質的に全量がグルコン酸に酸化され、キシロースの本質的に等モル量がキシリトールに還元された場合、１部のアラビノース、０．４部のグルコン酸、０．４部のキシリトールおよび８．６部の未反応のキシロースの混合物が得られる。
【００６２】
第１の段階のさらなる反応で、アラビノースの本質的に全量がアラボン酸に酸化され、ここでもキシロースの本質的に等モル量がキシリトールに還元された場合、１部のアラボン酸、０．４部のグルコン酸、１．４部のキシリトールおよび７．６部の未反応のキシロースの混合物が得られる。
【００６３】
第２の段階で、好ましくは全部の未反応のキシロースが、半分はキシロン酸に酵素的に酸化され、半分はキシリトールに還元された場合、１部のアラボン酸、０．４部のグルコン酸、３．８部のキシロン酸および５．２部のキシリトールの混合物が得られることになる（アラボン酸および／またはグルコン酸がすでに事前に分離されていない場合）。
【００６４】
得られたアラボン酸および／またはキシロン酸のアルファ−ケトグルタレートへのさらなる加工は上記のように実行可能である。
【００６５】
さらに好ましい実施形態では、糖混合物は他の存在する糖（複数可）に対して過剰なグルコースを含有し、グルコースから少なくとも部分的にソルビトールが得られる。
【００６６】
出発点は、グルコース／マンノース／ガラクトース／キシロース／アラビノースの７：１．４：０．７：０．７：０．４の比の例示的な混合物であるべきである。この範囲の混合物は、例えば、木材のパルプ化およびその後の酵素的分解中に得ることができる（Ｂｅｒｒｏｃａｌら、２００４）。高含有量のグルコースを有する糖混合物は、他のリグノセルロース含有バイオマス、例えば、藁、トウモロコシ藁、稲藁、バガス、エネルギーグラスなどから糖ポリマーの完全加水分解中にも得ることができる。例えば、以下が順次続く。
【００６７】
そのような混合物において、第１の段階で、マンノースの本質的に全量がマンノン酸に酸化され、グルコースの本質的に等モル量がソルビトールに還元された場合、１．４部のマンノン酸、０．７部のガラクトース、０．７部のキシロース、０．４部のアラビノース、１．４部のソルビトールならびに５．６部の未反応のグルコースの混合物が得られる。
【００６８】
第１の段階のさらなる反応で、ガラクトースの本質的に全量がガラクトン酸に酸化され、ここでもグルコースの本質的に等モル量がソルビトールに還元された場合、１．４部のマンノン酸、０．７部のガラクトン酸、０．７部のキシロース、０．４部のアラビノース、２．１部のソルビトールならびに４．９部の未反応のグルコースの混合物が得られる。
【００６９】
第１の段階のさらなる反応で、キシロースの本質的に全量がキシロン酸に酸化され、ここでもグルコースの本質的に等モル量がソルビトールに還元された場合、１．４部のマンノン酸、０．７部のガラクトン酸、０．７部のキシロン酸、０．４部のアラビノース、２．８部のソルビトールならびに４．２部の未反応のグルコースの混合物が得られる。
【００７０】
第１の段階のさらなる反応で、アラビノースの本質的に全量がアラボン酸に酸化され、ここでもグルコースの本質的に等モル量がソルビトールに還元された場合、１．４部のマンノン酸、０．７部のガラクトン酸、０．７部のキシロン酸、０．４部のアラボン酸、３．２部のソルビトールならびに３．８部の未反応のグルコースの混合物が得られる。
【００７１】
第１の段階のステップは連続的にまたは（部分的に）同時に進行し得る。さらに、糖酸の分離を個々のステップの後に行ってもよい。
【００７２】
第２の段階で、好ましくは全部の未反応のグルコースが、半分はグルコン酸に酵素的に酸化され、半分はソルビトールに還元された場合、１．４部のマンノン酸、０．７部のガラクトン酸、０．７部のキシロン酸、０．４部のアラボン酸、１．９部のグルコン酸および５．１部のソルビトールの混合物が得られることになる（糖酸がすでに事前に分離されていない場合）。
【００７３】
糖酸の分離は第２の段階の後に（も）行ってもよい。得られたアラボン酸および／またはキシロン酸のアルファ−ケトグルタレートへのさらなる加工は上記のように実行可能である。
【００７４】
可能な任意選択のさらなる段階で、得られたＤ−ソルビトールは、酵素的または非酵素的に、好ましくは酵素的に、例えば、Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼまたはＤ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によって、Ｄ−フルクトースに酸化され得る。酵素によっておそらくは還元されたレドックス補因子ＮＡＤ（Ｐ）は、少なくとも１種のさらなるレドックス酵素によって再生することができる。結果として、レドックス補因子は化学量論未満の量で使用することができる。
【００７５】
前記の特定の実施形態では、例えば、グルコース含有量を有するバイオマス加水分解物から高純度のＤ−フルクトースを得るために、本発明による方法を使用することができる。混合物からの他の糖のより容易な分離は、糖酸への変換によって可能となる。さらに、糖酸への酸化は、ソルビトールへのグルコースの還元のためのレドックス当量をもたらす。上記の例示的な混合物では、レドックス補因子再循環に外部の物質を添加することなく、混合物中のグルコースの比較的高い割合がソルビトールに変換され得る。それによって得られたソルビトールは有益な生成物フルクトースの調製に利用可能である。
【００７６】
本発明による方法において行われる糖の酵素的酸化は、多様な酵素クラスによって実施することができる。例えば、オキシダーゼ（酸素を用いる）またはデヒドロゲナーゼ（酸化されたレドックス補因子ＮＡＤ（Ｐ）+を用いる）がこのために適切である。好ましくは、レドックス補因子に依存する酵素が使用される。特に好ましくは、レドックス補因子のみに依存する酵素が使用される。したがって、各々の場合に等モル比で進行する影響を受ける糖の酸化および還元を洗練された様式で達成することができる。したがって、本発明による方法のさらに好ましい実施形態は、２つの段階の少なくとも１つで、好ましくは少なくとも第２の段階で、特に好ましくは第１の段階と第２の段階の両方で、少なくとも１種のレドックス補因子および前記レドックス補因子に依存する少なくとも１種の酵素が反応混合物中に存在することを特徴とする。
【００７７】
本発明による方法では、特に第１の段階で、好ましくはアラビノースはアラボン酸に酸化される。例えば、Ｌ−アラビノースデヒドロゲナーゼをＬ−アラビノースの酸化に使用することができる。適切なＬ−アラビノースデヒドロゲナーゼは、例えば、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｅまたはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｖｉｅｔｎａｍｉｅｎｓｉｓから入手可能である。
【００７８】
本発明による方法では、好ましくはキシロース、特に第１の段階後に溶液中に残っているキシロースの一部がキシロン酸に酸化される。Ｄ−キシロースの酸化は、例えば、Ｄ−キシロースデヒドロゲナーゼによって実施することができる。適切なキシロースデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓから入手可能である。あるいは、より広い基質スペクトルを有し、アラビノースデヒドロゲナーゼと注釈される酵素を使用することもできる。
【００７９】
本発明による方法では、特に第１の段階で、好ましくはグルコースはグルコン酸に酸化される。例えば、Ｄ−グルコース−１−デヒドロゲナーゼをグルコースの酸化に使用することができる。適切なＤ−グルコース−１−デヒドロゲナーゼは、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓから入手可能である。
【００８０】
さらに、グルコースオキシダーゼをグルコースの酸化に使用することができる。適切なＤ−グルコースオキシダーゼは、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒから入手可能である。
【００８１】
本発明による方法では、好ましくはキシロース、特に第１の段階後に溶液中に残っているキシロースの一部がキシリトールに還元される。
【００８２】
例えば、Ｄ−キシロースの還元はＤ−キシロースレダクターゼによって触媒することができる。適切なキシロースレダクターゼは、例えば、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）またはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から入手可能である。
【００８３】
本発明による方法では、補因子ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤ+および／またはＮＡＤＰ+を特定の実施形態で使用することができる。それによって、ＮＡＤ+はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化型形態を示し、ＮＡＤＨは還元型形態を示し、一方ＮＡＤＰ+はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の酸化型形態を示し、ＮＡＤＰＨは還元型形態を示す。補因子は個別に反応に加えてもよいか、反応の他の成分、例えば、使用される酵素の一部であるか、こうした２つの源の組合せが使用される。レドックス補因子が使用される場合、レドックス補因子は本発明による方法における基質に対して化学量論未満の量で存在する。還元または酸化反応で酸化または還元されたレドックス補因子は、適切な酵素反応によってそれらの元のレドックス状態に戻すことができる（レドックス補因子再循環）ので、数回の反応サイクルを通過することができる。
【００８４】
酵素的補因子再生系は、アルコールデヒドロゲナーゼ、糖デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ヒドロゲナーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼからなる群から特に選択され、それによって補助基質、特にケトン、アルデヒド、糖、ピルビン酸およびその塩および／または酸素が消費され、水素が生成される。
【００８５】
キシロースからのキシロン酸（ラクトン）の生成において、レドックス補因子再循環は、さらなるレドックス酵素、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼまたは糖レダクターゼ、例えばキシロースレダクターゼなどによって実施することができる。好ましくは、糖レダクターゼが使用される。
【００８６】
キシリトールの生成において、レドックス補因子再循環は、さらなるレドックス酵素、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼまたは糖デヒドロゲナーゼ、例えばグルコースデヒドロゲナーゼもしくはアラビノースデヒドロゲナーゼなどによって同様に実施することができる。好ましくは、糖デヒドロゲナーゼが使用される。
【００８７】
適切なＮＡＤＨオキシダーゼは、例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃｕｍまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓから入手可能である。
【００８８】
適切なアルコールデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒまたはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉから入手可能である。
【００８９】
本発明による方法の特定の実施形態では、グルコースはグルコースデヒドロゲナーゼによってグルコン酸（ラクトン）に変換され、レドックス補因子再循環はキシロースレダクターゼによって実施される。本発明による方法のさらに特定の実施形態では、新生のグルコン酸は物質の混合物から分離される。
【００９０】
本発明による方法のさらなる特定の実施形態では、アラビノースはアラビノースデヒドロゲナーゼによってアラボン酸（ラクトン）に変換され、レドックス補因子再循環はキシロースレダクターゼによって実施される。本発明による方法のさらなる特定の実施形態では、得られたアラボン酸は物質の混合物から分離される。本発明による方法の別の好ましい実施形態では、アラボン酸（ラクトン）は物質の混合物から分離されず、そこで残りのキシロースはキシロン酸（ラクトン）に酸化される。
【００９１】
本発明の一態様では、第１の段階後に残っているキシロースは、形成している糖酸の存在下においても、任意選択で、糖酸の分離後にも、すなわち酵素、好ましくはキシロースレダクターゼ、より好ましくはＮＡＤ（Ｐ）依存型キシロースレダクターゼによって、キシリトールに還元される。別の態様では、残っているキシロースはＮＡＤ（Ｐ）依存型キシロースレダクターゼによってキシリトールに還元され、レドックス補因子再循環はキシロースデヒドロゲナーゼによって実施され、その結果残っているキシロースはキシロン酸に同時に酸化される。
【００９２】
したがって、本発明による方法では、第１の段階と第２の段階の両方において、少なくとも１種のレドックス補因子および前記レドックス補因子に依存する少なくとも１種の酵素が反応混合物中に好ましくは存在する。通常、２つの段階で各々２種の酵素が存在し、例えば、一方はレダクターゼで他方はデヒドロゲナーゼである。しかしながら、単一の酵素による還元および酸化の両方の触媒作用も考えられる。
【００９３】
すでに上述した通り、特に好ましくは使用される全ての酵素が、混合物中に同様に存在するレドックス補因子に依存している。
【００９４】
レドックス補因子は酵素調製物中に十分な量ですでに含まれているか、レドックス補因子は反応にさらに添加されるかのいずれかである。
【００９５】
さらに、第１の段階および／または第２の段階で使用されるレドックス補因子は、本発明による方法で各々の場合に並行して進行する還元および酸化反応によって好ましくは再生される。
【００９６】
本方法で使用される酵素は組換え発現によって得ることができる。これに関連して、多様な系、例えば、大腸菌、サッカロマイセス・セレビシエまたはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が当業者に公知である。好ましくは、大腸菌が使用され、この目的のために、当業者は一般的なプロトコールを熟知している。酵素は、無傷細胞で、透過性細胞でまたは細胞溶解物の形態で使用することができる。細胞溶解物の場合、酵素は直接使用してもよく、例えばタンパク質精製のためのクロマトグラフィー法によるさらなる精製を行ってもよく、これは文献に見出すことができるかつ／または当業者に公知である。細胞溶解物が使用される場合、さらなる精製を好ましくは行わないか、簡単な精製ステップ（例えば、遠心分離またはろ過）のみが好ましくは行われる。
【００９７】
前出の説明からすでに明らかとなったように、本発明による方法における第１の段階および第２の段階はワンポット反応で行うことができる。
【００９８】
したがって、糖混合物の完全な分離を１つの反応容器のみでおそらくは達成し得る。
【００９９】
本発明による方法のさらなる好ましい実施形態では、２つの段階は少なくとも部分的に同時に進行し得る。記載のような酵素反応に基づいて、両段階の同時反応制御が可能である。
【０１００】
本発明による方法のさらなる実施形態は、混合物から蓄積する糖酸を除去することを含む。その際、蓄積する糖酸（例えば、アラボン酸、グルコン酸またはキシロン酸）の除去は、本発明による方法の第１の段階と第２の段階の間に行ってもよく、第２の段階の後のみに行ってもよい。
【０１０１】
上述のように、２種超の糖の混合物の場合、本発明による方法の第１の段階で、すなわち並行してまたは連続的に進行する第１の段階のサブステップで、数種の糖を酸化することが可能である。サブステップが連続的に行われる場合、本発明による方法の特定の実施形態では、各サブステップ後にそれぞれの糖酸を分離することが可能である。任意選択で、糖酸は第１の段階後に一緒に分離されてもよく、あるいは、糖酸は溶液中に残されてもよい。
【０１０２】
有機酸の分離のためのいくつかの方法が先行技術から当業者に公知である。前記方法には、これらの限定されるものではないが、イオン交換クロマトグラフィー、電気透析、結晶化／沈殿および抽出が含まれる。
【０１０３】
すでに上述した通り、糖を含有する混合物はヘミセルロース含有材料から得ることができる。
【０１０４】
好ましくは、ヘミセルロース含有材料はリグノセルロース材料をパルプ化することによって得られたものである。これに関連して、多様な化学的、物理的、機械的および／または酵素的方法が当業者に公知である。リグノセルロース含有材料のパルプ化方法はＢｒｏｄｅｕｒら（２０１１）に見出すこともできる。さらに、リグノセルロース含有材料のパルプ化または脱リグニンのための方法は、例えば、ＷＯ２０１０／１２４３１２Ａ２（Ｅｒｔｌら、２０１０）に見出すことができる。
【０１０５】
本発明による方法では、「リグノセルロース含有材料」には、特にリグノセルロース含有バイオマス、例えば、一年生もしくは多年生植物または一年生もしくは多年生植物の部分、例えば、木材、例えば、軟材もしくは硬材、または（乾燥）イネ科植物、もしくはイネ科植物の部分、好ましくはイネ科植物、藁、例えば、麦藁、ライ麦藁もしくはトウモロコシ藁、エネルギーグラス、例えば、スイッチグラス（Ｒｕｔｅｎｈｉｒｓｅ）、ススキ、マニラ麻、サイザル麻、バガス、または非定型的なリグノセルロース基質、例えば、トウモロコシの穂軸、殻、例えば、外穎、例えば、麦殻、稲殻、特に好ましくは藁、特に麦藁、バガス、エネルギーグラス、特にネピアグラス、スイッチグラス、および／または殻、特に外穎が含まれる。
【０１０６】
好ましくは、リグノセルロース材料は、アルコールで、特にＣ1〜4アルコール、水およびアルカリでパルプ化することによって得ることができる。適切な方法は例えばＷＯ２０１０／１２４３１２Ａ２（Ｅｒｔｌら、２０１０）から公知である。
【０１０７】
本発明による方法では、酸が示される場合、そうした酸の対応する塩も含まれ、逆もまた同様である。さらに、酵素的に生成した糖酸が示される場合特に、対応する糖酸ラクトンも含まれ、逆もまた同様である。糖の糖酸／糖酸ラクトンへの酵素的酸化では、こうした２種の生成物の比は、使用される糖および例えば反応時間やとりわけｐＨ値などの反応条件に強く依存する。
【実施例】
【０１０８】
実施例１：バイオマスから糖混合物を得るためのキシラナーゼ処理。
藁から生成した脱リグニンパルプを使用した。パルプの調製の説明はＷＯ２０１０／１２４３１２Ａ２（実施例１）に見出すことができる。１０ｇ（乾燥重量）のパルプを蒸留水で再懸濁させて１０％の粘稠度にし、４．９のｐＨ値をＨ2ＳＯ4で調整した。１０００μｌのＸｙｌａｎａｓｅ  Ｅｃｏｐｕｌｐ  ＴＸ８００Ａ（Ｅｃｏｐｕｌｐ  Ｆｉｎｌａｎｄ  Ｏｙ）を添加し、インキュベーションを５０℃で１６ｈの間行った。主にグルコース、キシロースおよびアラビノースを約２：１０：１の比で含有する１．５％糖溶液（ｗ／ｖ）が得られる。
【０１０９】
以下の実施例２から５は、糖混合物からの糖の選択的な酵素的酸化または還元の可能性を例示するのに役立つ。
【０１１０】
実施例２：グルコースデヒドロゲナーゼ（補因子再循環のためのＮＡＤＨ−オキシダーゼ）を用いたグルコース酸化。
グルコース、キシロースおよびアラビノース（糖濃度：約１％）を含有する糖混合物（約５００μｌ）に１８．５ｍｇのＮａＨＣＯ3を添加した。その後すぐに、３０μｌのグルコースデヒドロゲナーゼ（約３００Ｕ／ｍｌの活性）、１０μｌのＮＡＤＨ−オキシダーゼ（約１１４０Ｕ／ｍｌの活性）および２．５μｌのＮＡＤＨ（濃度：１００ｍＭ）を添加した。混合物を２５℃で約１７時間インキュベートした。グルコースの８６％が反応してグルコン酸になった。得られた溶液は強イオン交換体（Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  Ａ−２６（ＯＨ）、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を通過させた。それによって、得られたグルコン酸を混合物から完全に分離した。
【０１１１】
実施例３：アラビノースデヒドロゲナーゼ（補因子再循環のためのＮＡＤＨ−オキシダーゼ）を用いたアラビノース酸化。
グルコース、キシロースおよびアラビノース（糖濃度：約１％）を含有する糖混合物（約５００μｌ）に６．２ｍｇのＮａＨＣＯ3を添加した。その後すぐに、３０μｌのアラビノースデヒドロゲナーゼ（約３００Ｕ／ｍｌの活性）、２０μｌのＮＡＤＨ−オキシダーゼ（約１１４０Ｕ／ｍｌの活性）および２．５μｌのＮＡＤＨ（濃度：１００ｍＭ）を添加した。混合物を２５℃で約１７時間インキュベートした。アラビノースの１００％が反応してアラボン酸になった。得られた溶液は強イオン交換体（Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  Ａ−２６（ＯＨ）、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を通過させた。それによって、得られたアラボン酸を糖混合物から完全に分離した。
【０１１２】
実施例４：アラビノースデヒドロゲナーゼ（補因子再循環のためのキシロースレダクターゼ）を用いたアラビノース酸化。
キシロースおよびアラビノース（キシロース：約１０％、アラビノース：約１％）を含有する糖混合物（約５００μｌ）に１６．９ｍｇのＮａＨＣＯ3を添加した。その後すぐに、３０μｌのアラビノースデヒドロゲナーゼ（約３００Ｕ／ｍｌの活性）、３０μｌのキシロースレダクターゼ（約１０３Ｕ／ｍｌの活性）および２．５μｌのＮＡＤＨ（濃度：１００ｍＭ）を添加した。混合物を３０℃で約２０分間インキュベートした。アラビノースの１００％が反応してアラボン酸になった。それによって、混合物中に含有されるキシロースの１０％がキシリトールに変換された。得られた溶液は強イオン交換体（Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  Ａ−２６（ＯＨ）、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を通過させた。それによって、得られたアラボン酸を糖混合物から完全に分離した。
【０１１３】
実施例５：アラビノースデヒドロゲナーゼ（補因子再循環のためのキシロースレダクターゼ）を用いたアラビノース酸化、キシロースレダクターゼ（補因子再循環のためのアルコールデヒドロゲナーゼ）を用いたキシロース還元。
バイオマス（＝キシラン加水分解物）から得られた糖溶液を蒸発によって約６３ｇ／ｌのＤ−キシロースおよび７ｇ／ｌのＬ−アラビノースの糖濃度に濃縮し、ｐＨ＝８．０をＮａＯＨで調整した。２．５ｍｌの５００ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ＝８．０、２００Ｕのキシロースレダクターゼおよび１６０Ｕのアラビノースデヒドロゲナーゼを８０ｍｌの前記溶液に添加した。２００ｍｌ丸底フラスコで、溶液を３５℃（水浴）で２０分間マグネチックスターラ（２００ｒｐｍ）で撹拌した。アラビノースは完全に変換されており、溶液は約５６ｇ／ｌのＤ−キシロース、約７ｇ／ｌのキシリトールおよび約７ｇ／ｌのＬ−アラビノ−１，４−ラクトン／Ｌ−アラボン酸を含有していた。
【０１１４】
前記実施例では、使用された補因子は使用された酵素溶解物中にすでに十分な程度まで存在しており、個別に添加する必要はなかった。
【０１１５】
実施例６：キシロースおよびアラビノースの混合物の変換（本発明による）
キシロースおよびアラビノース（キシロース：約１０％、アラビノース：約１％）を含有する糖混合物（約５００μｌ）に１６．９ｍｇのＮａＨＣＯ3を添加した。その後すぐに、３０μｌのアラビノースデヒドロゲナーゼ（アラビノースに対する約３００Ｕ／ｍｌの活性；この酵素はキシロースデヒドロゲナーゼとしての一定の活性も示す）、３０μｌのキシロースレダクターゼ（約１０３Ｕ／ｍｌの活性）および２．５μｌのＮＡＤＨ（濃度：１００ｍＭ）を添加した。混合物を３０℃で約７２時間インキュベートした。アラビノースの１００％が反応してアラボン酸になり、キシロースの４５％が反応してキシロン酸になり、キシロースの５５％が反応してキシリトールになった。得られた溶液は強イオン交換体（Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  Ａ−２６（ＯＨ）、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）を通過させた。それによって、得られたアラボン酸およびキシロン酸を混合物から完全に分離した。
【０１１６】
この実施例は、本発明による方法の第１の段階および第２の段階の少なくとも部分的な同時の経過を実証している。第１の段階は、アラビノースの酸化および等モル部のキシロースの還元である。それと少なくとも部分的に同時に進行する第２の段階は、アラビノースデヒドロゲナーゼの活性による未反応のキシロースの半分の酸化およびもう半分の残りのキシロースの還元を含む。
【０１１７】
実施例７：キシロースおよびグルコースの混合物の変換（本発明による）：
反応バッチは、以下の成分：３６４μｌのｄＨ2Ｏ、２．５μｌのＮＡＤＰＨ溶液（１００ｍＭ）、１０μｌのＤ−グルコース溶液（５０％ｗ／ｖ）、１００μｌのＤ−キシロース溶液（５０％ｗ／ｖ）、５μｌのグルコースデヒドロゲナーゼ（３００Ｕ／ｍｌ、グルコースで測定）、１９μｌのキシロースレダクターゼ（１６０Ｕ／ｍｌ）、および５．６ｍｇのＣａＣＯ3を含んでいた。使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは一定のキシロースデヒドロゲナーゼ活性も示す。反応を３５℃で穏やかに揺動し、異なる時点で試料を採取した。ＧＣ／ＭＳによって、糖の含有量ならびに反応生成物の含有量を決定した。１ｈ後、グルコースは大部分がグルコン酸に変換されていた。同様に、使用されたキシロースの小部分（約１０％）がこの時点までにキシロン酸に酸化されていた。形成された糖酸に化学量論的に、キシロースは１ｈ後にキシリトールに還元されていた。反応１ｈ後のおよその組成：１０ｍｇ／ｍｌグルコン酸、１０ｍｇ／ｍｌキシロン酸、２０ｍｇ／ｍｌキシリトール、７０ｍｇ／ｍｌキシロース。
【０１１８】
６ｈ後、キシロースは約９０％変換されていた。１ｈ後の時点と比較して、生成物キシロン酸およびキシリトールは化学量論的に形成された。反応６ｈ後のおよその組成：１０ｍｇ／ｍｌグルコン酸、４０ｍｇ／ｍｌキシロン酸、５０ｍｇ／ｍｌキシリトール、１０ｍｇ／ｍｌキシロース。
【０１１９】
実施例８：ＧＣ／ＭＳによる反応の分析
ＧＣ／ＭＳで酸化反応を分析するために、基質および生成物を誘導体化した。このために、４μｌの試料をガラスバイアルに移し、Ｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させた。誘導体化のために、１５０μｌのピリジンおよびＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドとトリメチルクロロシランの９９：１混合物５０μｌを次いで添加した。誘導体化は６０℃で１６ｈ間行った。その後に、試料をＧＣ−ＭＳによって分析した。その際、試料をガスクロマトグラフで分離カラムＨＰ−５ｍｓ（５％フェニル）メチルポリシロキサンによって分離し、Ｓｈｉｍａｄｚｕの質量分析計ＧＣＭＳ  ＱＰ２０１０  Ｐｌｕｓで分析した。
【０１２０】
非特許文献
0006732017.tif 000002
0006732017.tif 000003