(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、少なくとも、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｌ１５、Ｓ１１、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｓ１１、Ｓ９、Ｌ３１、およびＳ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ９、Ｌ３１、およびＳ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ１５、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｓ１１、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物にリステリア・モノサイトゲネスが含まれるか否かを識別する、微生物の識別方法。
【請求項２】
前記識別ステップは、前記微生物にリステリア・モノサイトゲネスが含まれると識別したとき、さらに、リボソームタンパク質Ｓ９に由来するピークの質量電荷比m/zと、リボソームタンパク質Ｌ２４およびＬ６の少なくとも一方に由来するピークの質量電荷比m/zとに基づいて、該リステリア・モノサイトゲネスのラインエージを識別する、請求項１に記載の微生物の識別方法。
【請求項３】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、少なくとも、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ１６に由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１５およびＬ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物にリステリア・イノキュアが含まれるか否かを識別する、微生物の識別方法。
【請求項４】
前記識別ステップは、前記微生物にリステリア・イノキュアが含まれると識別したとき、さらに、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１８に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、該リステリア・イノキュアの菌株を特定する、請求項３に記載の微生物の識別方法。
【請求項５】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、少なくとも、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物に、リボソームタンパク質の質量電荷比のパターンが、リステリア・イノキュアのタイプストレインと類似するグループである菌株が含まれるか否かを識別する、微生物の識別方法。
【請求項６】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、少なくとも、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物に含まれる菌株を、リボソームタンパク質の質量電荷比のパターンが、リステリア・イノキュアのタイプストレインと類似するグループ又は非類似のグループに分類する、微生物の識別方法。
【請求項７】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、少なくとも、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ９およびＬ３１に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物にリステリア・イバノビイが含まれるか否かを識別する、微生物の識別方法。
【請求項８】
前記識別ステップは、前記微生物にリステリア・イバノビイが含まれることを識別したとき、さらに、リボソームタンパク質Ｌ１８に由来するピークの質量電荷比m/zおよびリボソームタンパク質Ｌ１５に由来するピークの質量電荷比m/zの少なくとも一方に基づいて、該リステリア・イバノビイの亜種を識別する、請求項７に記載の微生物の識別方法。
【請求項９】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、少なくとも、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｌ１５に由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物にリステリア・イバノビイの亜種であるイバノビイ  イバノビイ（Listeria ivanovii ivanovii）が含まれるか否かを識別する、微生物の識別方法。
【請求項１０】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、少なくとも、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ９、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１５、Ｓ１１、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１５、Ｓ９、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１１、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物にリステリア・イバノビイの亜種であるイバノビイ  ロンジネンシス（Listeria ivanovii londiniensis）が含まれるか否かを識別する、微生物の識別方法。
【請求項１１】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１１のうちの少なくとも一つに由来するピークの質量電荷比m/zとに基づいて、前記微生物にリステリア・シーリゲリが含まれるか否かを識別する、微生物の識別方法。
【請求項１２】
前記識別ステップは、前記微生物にリステリア・シーリゲリが含まれると識別したとき、さらに、少なくとも、リボソームタンパク質Ｓ９に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、該リステリア・シーリゲリの菌株を特定する、請求項１１に記載の微生物の識別方法。
【請求項１３】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、少なくとも、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ９、Ｌ１８のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｓ９、Ｓ１１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物に含まれる菌株を、リボソームタンパク質の質量電荷比のパターンが、リステリア・シーリゲリのタイプストレインと類似するグループ又は非類似のグループに分類する、微生物の識別方法。
【請求項１４】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、少なくとも、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｓ１１に由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物にリステリア・ウェルシメリが含まれるか否かを識別する、微生物の識別方法。
【請求項１５】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｌ６、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９、Ｌ３１、Ｓ１６のうちの少なくとも１つに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物に含まれるリステリア菌の菌種がリステリア・グレイであるかリステリア・ロコルチアであるかを識別する、微生物の識別方法。
【請求項１６】
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記識別ステップは、少なくとも、前記マーカータンパク質としてリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ１８、Ｓ９、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zとリボソームタンパク質Ｌ６、Ｌ１５、Ｓ１１のいずれかに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ１８、Ｓ９、Ｓ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zとリボソームタンパク質Ｌ６、Ｌ１５、Ｓ１１のいずれかに由来するピークの質量電荷比m/zを指標とするクラスター解析を用いて、前記試料に含まれる微生物が、リステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する、微生物の識別方法。
【請求項１７】
前記識別ステップは、８種類のリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９、Ｌ３１、およびＳ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zを指標とするクラスター解析を用いて、前記試料に含まれる微生物が、リステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する、請求項１６に記載の微生物の識別方法。
【請求項１８】
前記クラスター解析による識別結果を表すデンドログラムを作成するステップを、さらに有する、請求項１６又は１７に記載の微生物の識別方法。
【請求項１９】
コンピュータに請求項１〜１８のいずれか一つの請求項に記載の全てのステップを実行させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を利用した微生物の識別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微生物の種類を識別する手法の１つとしてＤＮＡ塩基配列に基づく相同性解析が知られており、微生物の分類・同定等に広く用いられている（例えば、特許文献１を参照）。この手法では、まず、被検微生物からＤＮＡを抽出してｒＲＮＡ遺伝子等の全生物に高い保存性で存在している領域のＤＮＡ塩基配列を決定する。次に、このＤＮＡ塩基配列を用いて、既知微生物のＤＮＡ塩基配列データを多数収録したデータベースを検索し、前記被検微生物のＤＮＡ塩基配列と高い類似性を示す塩基配列を選出する。そして、該塩基配列が由来する生物種を、前記被検微生物と同一種又は近縁種であると判定する。【０００３】
しかしながら、こうしたＤＮＡ塩基配列を利用した手法では、被検微生物からのＤＮＡ抽出やＤＮＡ塩基配列の決定などに比較的長い時間を要するため、迅速な微生物同定を行うのが困難であるという問題があった。【０００４】
そこで、近年では被検微生物を質量分析して得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物同定を行う手法が用いられるようになりつつある。質量分析によれば、ごく微量の微生物試料を用いて短時間で分析結果を得ることができ、且つ多検体の連続分析も容易であるため、簡便且つ迅速な微生物同定が可能となる。この手法では、まず、被検微生物から抽出したタンパク質を含む溶液や被検微生物の懸濁液等をＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析）等のソフトなイオン化法を用いた質量分析装置によって分析する。なお「ソフトな」イオン化法とは、高分子量化合物の分解を生じにくいイオン化法をいう。そして、得られたマススペクトルパターンを、予めデータベースに多数収録された既知微生物のマススペクトルパターンと照合することにより、被検微生物の同定を行う。こうした手法はマススペクトルパターンを各微生物に特異的な情報（すなわち指紋）として利用するため、フィンガープリント法と呼ばれている。【０００５】
しかし、上述の質量分析を用いたフィンガープリント法による微生物同定では、属レベルや比較的遠縁の種レベルでの同定は可能であっても、近縁種間の識別や種より下位の分類レベルである亜種、病原型、又は株等のレベルでの識別は一般に困難とされている。更に、フィンガープリント法では、マススペクトル上に現れる各ピークの一つ一つが何のタンパク質に由来するかが特定されておらず、同定の理論的根拠や信頼性の点に課題を有していた。そこで、この課題を解消するため、微生物菌体を質量分析して得られるピークの約半分がリボソームタンパク質由来であることを利用し、質量分析で得られるピークの質量電荷比を、リボソームタンパク質遺伝子の塩基配列情報を翻訳したアミノ酸配列から推測される計算質量と関連づけることで該ピークの由来となるタンパク質の種類を帰属する手法が開発されている（特許文献２、３参照）。この手法によれば、質量分析を用いて理論的根拠に基づいた信頼性の高い微生物同定を行うことが可能となる。【０００６】
但し、微生物の分類レベル（科、属、種、亜種、病原型、血清型、株など）によって質量に違いが出るピークは異なるため、例えば、病原型や株レベルでの識別を再現性よく行うためには、同定対象とする病原型や株レベルでの識別に利用可能なマーカーピークを選択することが必要となる。例えばPseudomonas putidaおよびその類縁細胞を同定・識別する場合のマーカータンパク質としては、２３種類のリボソームサブユニットタンパク質（Ｌ５、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２８、Ｌ３０、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ１０、Ｓ１３、Ｓ１４、Ｓ１７、Ｓ１９、Ｓ２０、およびＳ２１）が利用可能であることが報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2006-191922号公報
【特許文献２】特開2007-316063号公報
【特許文献３】特開2013-085517号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】List of prokaryotic names with standing in nomenclature,[平成27年9月18日検索],インターネット<URL:http://www.bacterio.net/>
【非特許文献２】BMC Genomics 2010, 11, 688
【非特許文献３】JMM Case Reports, 2014, DOI 10.1099/jmmcr.0.003103
【非特許文献４】Microbes Infect 2007, 9, 1236-1243
【非特許文献５】Int J med Microbiol, 2011, 301, 79-96
【非特許文献６】Appl Environ Micribiol, 2008, 74, 7629-7642
【非特許文献７】Int J Food Microbiol 2001, 65:55?62
【非特許文献８】J Clin Microbiol 2003, 41:757?762
【非特許文献９】PLoS Pathog 2008, 4:e1000146
【非特許文献１０】Vet Microbiol, 2003, 92, 351?362.
【非特許文献１１】Appl Environ Micribiol, 2008, 74, 5402-5407
【非特許文献１２】J Clin Microbiol. 2012, 50, 2702-2707
【非特許文献１３】Int J Food Microbiol. 2015, 202, 1-9
【非特許文献１４】J Clin Microbiol. 2014, 52, 2371-2379
【非特許文献１５】J Clin Microbiol. 2004, 42, 3819-3822
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ところで、食中毒の原因菌の一つにリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes、以下、「Listeria」は「L.」と略す。）が知られている。リステリア・モノサイトゲネスは、グラム陽性細菌のリステリア属に属する細菌であり、低温（４℃）での増殖能、および耐塩性を有するといった特徴がある。【００１０】
リステリア属は、これまでに１８の菌種が発見されており（非特許文献１）、なかでも１９６０年代から１９８０年代に発見された８種（リステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes）、リステリア・イノキュア（L. innocua）、リステリア・ウェルシメリ（L. welshimeri）、リステリア・シーリゲリ（L. seeligeri）、リステリア・イバノビイ（L. ivanovii）、リステリア・グレイ（L. grayi）、リステリア・マルシイ（L. marthii）、およびリステリア・ロコルチア（L. rocourtiae））は従来種として多数の知見が報告されている（非特許文献２、３）。それによると、 リステリア・モノサイトゲネスおよびリステリア・イバノビイは動物に病原性を有し、特に、リステリア・モノサイトゲネスは、しばしば食肉や乳製品、野菜などの身近な非加熱喫食調理済み食品（Ready-to-eat 食品）を介してヒトに感染し、食中毒の集団発生（アウトブレイク）を引き起こすことが報告されている。しかも、妊婦、新生児、高齢者、およびエイズ、がん、臓器移植患者等の免疫不全者がリステリア・モノサイトゲネスに感染すると、敗血症や髄膜炎等、重篤な症状のリステリア症を引き起こし、死に至る場合もある。さらに、近年では、リステリア・イノキュアの感染患者がリステリア症を発症した例も報告されている（非特許文献３）。【００１１】
リステリア・モノサイトゲネスは１３の血清型（1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、7）が知られており、集団発生事例では血清型4bが最も多く、血清型1/2bおよび血清型1/2aが含まれることも報告されている（非特許文献４）。また、リステリア・モノサイトゲネスは遺伝的に４つの進化系統（ラインエージI、II、IIIおよびIV）に分類することができる（非特許文献５）。ラインエージIおよびIIには、それぞれ感染したヒトから単離されることが多い血清型が属しており、具体的にはラインエージIには血清型1/2b、3b、4b、4d、4eが、ラインエージIIには血清型1/2a、1/2c、3a、3cが属している。一方、ラインエージIIIには血清型4a、4c が属している。ラインエージIVは近年提唱された分類であり、血清型4a、4b、4cがIVに属する場合があることが報告されている（非特許文献６）。ラインエージIIIおよびIVはヒトからの単離例が少なく、主に反芻動物から検出される。【００１２】
このため、リステリア菌の中でもリステリア・モノサイトゲネスはヒトに危害を与える食中毒細菌として食品分野ならびに医療分野で管理する必要があり、その迅速な検出方法ならびに同定識別技術の開発が望まれている。【００１３】
これまでに、リステリア属ならびにリステリア・モノサイトゲネスの血清型を識別する方法として、パルスフィールドゲル電気泳動法（非特許文献７）、マルチローカスシーケンスタイピング法（非特許文献８、９）、マイクロアレイ法（非特許文献１０）等が報告されている。しかしながら、これらの手法はいずれも煩雑な操作が必要であり、時間がかかるという問題がある。【００１４】
一方、臨床分野および食品分野において、近年、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いた微生物同定技術が急速に広がりつつある。これは、ごく微量の微生物試料を用いて得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物同定を行う手法であり、短時間で分析結果を得ることができる。しかも、多検体の連続分析も容易なため、簡便且つ迅速な微生物同定が可能である。【００１５】
そのため、これまでも複数の研究グループによりＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いたリステリア菌の識別が試みられてきた（非特許文献１１〜１４）。例えば非特許文献１０では、検出されたすべての質量ピークを既存データベースとパターンマッチングし、そのスコアを算出することにより、リステリア・モノサイトゲネス、リステリア・イノキュア、リステリア・ウェルシメリ、リステリア・イバノビイ、およびリステリア・シーリゲリを識別したとの報告がなされている。また、特定の質量ピーク（質量電荷比[m/z] 5590および11179）が検出されることを指標（バイオマーカー）として、リステリア・モノサイトゲネスの血清型4aと血清型4cを区別している。【００１６】
一方で、非特許文献１２によれば、リステリア属の６種類の菌種は属レベルでの識別が限界であり、リステリア・グレイのみ種の同定が可能である。また、非特許文献１４では、５つの検出質量のピーク（m/z 5594.85, 6184.39, 11871.31, 5601.21, 11199.33）をバイオマーカーとして、リステリア・モノサイトゲネスを血清型1/2aと血清型1/2bおよび4bのグループに識別したことが報告されている。【００１７】
このように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによるリステリア菌の菌種ならびリステリア・モノサイトゲネスの血清型の識別に関して複数の報告があるものの、マススペクトル上に現れる各ピークやバイオマーカーピークの一つ一つが何のタンパク質に由来するかが特定されておらず、同定識別の理論的根拠や信頼性に乏しい。また、研究グループによって同定識別の結果が異なっており、一定の見解が得られていない。つまり、リステリア菌の菌種ならび血清型識別に好適に利用可能な信頼性の高いマーカータンパク質は未だ確立されていないのが現状である。【００１８】
本発明は上記の点に鑑みて成されたものであり、その目的とするところは、リステリア属の菌種を再現性よく、また迅速に識別することのできるマーカータンパク質を選定し、これを用いた微生物の識別方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、質量分析によって試料に含まれるリステリア菌を識別するためのマーカータンパク質として１７種類のリボソームタンパク質Ｌ３、Ｌ４、Ｌ２３、Ｌ２、Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｓ５、Ｌ１５、Ｓ１３、Ｓ１１、Ｌ１０、Ｌ２１、Ｌ１３、Ｓ９、Ｌ３１、およびＳ１６の少なくとも一つを用いることによりリステリア菌の識別が可能であること、これらの中でも特に８種類のリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９、Ｌ３１およびＳ１６の少なくとも一つを用いることにより再現性よく、且つ迅速にリステリア菌の識別が可能であることを発見し、本発明に至った。【００２０】
すなわち、上記課題を解決するために成された本発明に係る微生物の識別方法は、
a)微生物を含む試料を質量分析してマススペクトルを得るステップと、
b)前記マススペクトルから、マーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを読み取る読取ステップと、
c)前記質量電荷比m/zに基づいて前記試料に含まれる微生物がリステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別する識別ステップと
を有し、
前記マーカータンパク質として１７種類のリボソームタンパク質Ｌ３、Ｌ４、Ｌ２３、Ｌ２、Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｓ５、Ｌ１５、Ｓ１３、Ｓ１１、Ｌ１０、Ｌ２１、Ｌ１３、Ｓ９、Ｌ３１、およびＳ１６のうち少なくとも一つを用いることを特徴とする。【００２１】
特に上記微生物の識別方法においては、前記１７種類のリボソームタンパク質のうち８種類のリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ９、Ｌ３１、およびＳ１６の少なくとも一つを用いることが好ましい。【００２２】
上記微生物の識別方法は、微生物に含まれるリステリア菌の菌種が、リステリア・モノサイトゲネス（L.monocytogenes）、リステリア・イノキュア（L.innocua）、リステリア・ウェルシメリ（L.welshimeri）、リステリア・シーリゲリ（L.seeligeri）、リステリア・イバノビイ（L.ivanovii）、リステリア・グレイ（L.grayi）、およびリステリア・ロコルチア（L.rocourtiae）のいずれかであることを識別する方法として好適である。【００２３】
具体的には、前記識別ステップは、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１５、Ｓ１１、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｓ１１、Ｓ９、Ｌ３１、およびＳ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ９、Ｌ３１、およびＳ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ１５、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｓ１１、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物にリステリア・モノサイトゲネスが含まれるか否かを識別する。【００２４】
前記識別ステップは、前記微生物にリステリア・モノサイトゲネスが含まれると識別したとき、さらに、リボソームタンパク質Ｓ９に由来するピークの質量電荷比m/zと、リボソームタンパク質Ｌ２４およびＬ６の少なくとも一方に由来するピークの質量電荷比m/zとに基づいて、該リステリア・モノサイトゲネスのラインエージを識別する。【００２５】
また、前記識別ステップは、少なくとも、リボソームタンパク質Ｓ１６に由来するピークの質量電荷比、又はリボソームタンパク質Ｌ１５およびＬ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比に基づいて、前記微生物にリステリア・イノキュアが含まれるか否かを識別する。そして、前記微生物にリステリア・イノキュアが含まれると識別したとき、前記識別ステップは、さらに、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１８に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、該リステリア・イノキュアの菌株を特定する。【００２６】
また、前記識別ステップは、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物に、リボソームタンパク質の質量電荷比のパターンが、リステリア・イノキュアのタイプストレイン（基準株）と類似するグループである菌株が含まれるか否かを識別する。【００２７】
さらに、前記識別ステップは、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物に含まれる菌株を、リボソームタンパク質の質量電荷比のパターンが、リステリア・イノキュアのタイプストレインと類似するグループ又は非類似のグループに分類する。【００２８】
また、前記識別ステップは、少なくとも、リボソームタンパク質Ｓ９およびＬ３１に由来するピークの質量電荷比に基づいて、前記微生物にリステリア・イバノビイが含まれるか否かを識別する。【００２９】
さらに、前記識別ステップは、前記微生物にリステリア・イバノビイが含まれることを識別したとき、さらに、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１８に由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１５に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、該リステリア・イバノビイの亜種を識別する。【００３０】
そして、前記識別ステップは、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１５に由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物にリステリア・イバノビイの亜種であるイバノビイ  イバノビイ（L.ivanovii ivanovii）が含まれるか否かを識別し、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ９、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１５、Ｓ１１、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１５、Ｓ９、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１１、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物にリステリア・イバノビイの亜種であるイバノビイ  ロンジネンシス（L.ivanovii londiniensis）が含まれるか否かを識別する。【００３１】
また、前記識別ステップは、リボソームタンパク質Ｓ９に由来するピークの質量電荷比m/zと、Ｌ１８、Ｓ１１のうちの少なくとも一つに由来するピークの質量電荷比m/zとに基づいて、前記微生物にリステリア・シーリゲリが含まれるか否かを識別する。【００３２】
前記識別ステップは、前記微生物にリステリア・シーリゲリが含まれると識別したとき、さらに、少なくとも、リボソームタンパク質Ｓ９に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、該リステリア・シーリゲリの菌株を特定する。【００３３】
前記識別ステップは、少なくとも、リボソームタンパク質Ｓ９に由来するピークの質量電荷比m/z、および、リボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｌ３１のうちの少なくとも一つに由来するピークの質量電荷比m/zと、に基づいて、前記微生物に、リボソームタンパク質の質量電荷比のパターンが、リステリア・シーリゲリの、タイプストレインと類似するグループである菌株が含まれるか否かを識別する。【００３４】
前記識別ステップは、少なくとも、リボソームタンパク質Ｓ９、Ｌ１８のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｓ９、Ｓ１１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物に含まれる菌株を、リボソームタンパク質の質量電荷比のパターンが、リステリア・シーリゲリのタイプストレインと類似するグループ又は非類似のグループに分類する。【００３５】
さらに、前記識別ステップは、少なくとも、リボソームタンパク質Ｓ１１に由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物にリステリア・ウェルシメリが含まれるか否かを識別する。【００３６】
また、前記識別ステップは、リボソームタンパク質Ｌ６、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９、Ｌ３１、Ｓ１６のうちの少なくとも１つに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物に含まれるリステリア菌の菌種がリステリア・グレイであるかリステリア・ロコルチアであるかを識別する。【００３７】
また、上記の本発明に係る微生物の識別方法では、
前記識別ステップは、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ１８、Ｓ９、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zとマーカータンパク質Ｌ６、Ｌ１５、Ｓ１１のいずれかに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ１８、Ｓ９、Ｓ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zとマーカータンパク質Ｌ６、Ｌ１５、Ｓ１１のいずれかに由来するピークの質量電荷比m/zを指標とするクラスター解析を用いて、前記試料に含まれる微生物が、リステリア菌のいずれの菌種を含むかを識別するようにすると良く、とくに８種類のマーカータンパク質（Ｌ２４、Ｌ１８、Ｓ９、Ｌ３１、Ｓ１６、Ｌ６、Ｌ１５、Ｓ１１）に由来するピークの質量電荷比m/zの全てを指標とするクラスター解析を用いると、前記試料に含まれる微生物が、リステリア菌のいずれの菌種であるかを精度良く識別することができる。【００３８】
この場合、前記クラスター解析による識別結果を表すデンドログラムを作成するステップを、さらに有することが好ましい。
【発明の効果】
【００３９】
上記本発明に係る微生物の識別方法では、リステリア属の菌種に特有な変異を示すリボソームタンパク質をマーカータンパク質として用いたため、リステリア属の菌種を再現性よく、且つ迅速に識別することができる。
また、リステリア属の菌種に特有な変異を示すリボソームタンパク質をマーカータンパク質として用い、マススペクトル上におけるマーカータンパク質由来のピークの質量電荷比m/zを指標としてクラスター解析を行うことにより、複数の試料に含まれるリステリア属の細菌の識別を一括で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明に係る微生物の識別方法に用いられる微生物識別システムの要部を示す構成図。
【図２】本発明に係る微生物の識別方法の手順の一例を示すフローチャート。
【図３】実施例で使用したリステリア属の菌種名および菌株名の一覧を示す図。
【図４】実施例で使用したプライマーの一覧を示す図。
【図５】各アミノ酸の質量を示す図。
【図６】実施例で使用したリステリア・モノサイトゲネスの菌株における各タンパク質の理論質量値の一覧を示す図。
【図７Ａ】実施例で使用した菌株における各リボソームタンパク質の実測値の帰属の一覧を示す図。
【図７Ｂ】図７Ａにおける帰属番号と各リボソームタンパク質の理論質量値との関係を示す図。
【図８】実施例で使用したリステリア属の種における各タンパク質の理論質量値の一覧を示す図。
【図９Ａ】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定により得られたチャート（その１）。
【図９Ｂ】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定により得られたチャート（その２）。
【図１０】ＳＡＲＡＭＩＳに基づく解析結果。
【図１１Ａ】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定により得られたピークチャート（その１）。
【図１１Ｂ】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定により得られたピークチャート（その２）。
【図１２Ａ】８種類のリボソームタンパク質の実測値による帰属結果。
【図１２Ｂ】図１２Ａに示す帰属番号と理論質量値の関係を示す表。
【図１３Ａ】８種類のリボソームタンパク質を使って作成したデンドログラム。
【図１３Ｂ】５種類のリボソームタンパク質を使って作成したデンドログラム。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、本発明に係る微生物の識別方法の具体的な実施形態について説明する。
図１は本発明に係る微生物の識別方法に用いられる微生物識別システムの全体図である。この微生物識別システムは、大別して質量分析部１０と微生物判別部２０とから成る。質量分析部１０は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）によって試料中の分子や原子をイオン化するイオン化部１１と、イオン化部１１から出射された各種イオンを質量電荷比に応じて分離する飛行時間型質量分離器（ＴＯＦ）１２を備える。
【００４２】
ＴＯＦ１２は、イオン化部１１からイオンを引き出してＴＯＦ１２内のイオン飛行空間に導くための引き出し電極１３と、イオン飛行空間で質量分離されたイオンを検出する検出器１４とを備える。
【００４３】
微生物判別部２０の実体は、ワークステーションやパーソナルコンピュータ等のコンピュータであり、中央演算処理装置であるＣＰＵ（Central Processing Unit）２１にメモリ２２、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等から成る表示部２３、キーボードやマウス等から成る入力部２４、ハードディスクやＳＳＤ（Solid State Drive）等の大容量記憶装置から成る記憶部３０が互いに接続されている。記憶部３０には、ＯＳ（Operating System）３１、スペクトル作成プログラム３２、属・種決定プログラム３３、および下位分類決定プログラム３５（本発明に係るプログラム）が記憶されると共に、第１データベース３４および第２データベース３６が格納されている。微生物判別部２０は、更に、外部装置との直接的な接続や、外部装置等とのＬＡＮ（Local Area Network）などのネットワークを介した接続を司るためのインターフェース（Ｉ／Ｆ）２５を備えており、該インターフェース２５よりネットワークケーブルＮＷ（又は無線ＬＡＮ）を介して質量分析部１０に接続されている。
【００４４】
図１においては、下位分類決定プログラム３５に係るように、スペクトル取得部３７、m/z読み取り部３８、下位分類判定部３９、クラスター解析部４０、およびデンドログラム（系統図）作成部４１が示されている。これらはいずれも基本的にはＣＰＵ２１が下位分類決定プログラム３５を実行することによりソフトウェア的に実現される機能手段である。なお、下位分類決定プログラム３５は必ずしも単体のプログラムである必要はなく、例えば属・種決定プログラム３３や、質量分析部１０を制御するためのプログラムの一部に組み込まれた機能であってもよく、その形態は特に問わない。なお、属・種決定プログラム３３としては、例えば、従来のフィンガープリント法による微生物同定を行うプログラム等を利用することができる。
【００４５】
また、図１では、ユーザが操作する端末にスペクトル作成プログラム３２、属・種決定プログラム３３、および下位分類決定プログラム３５、第１データベース３４、および第２データベース３６を搭載する構成としたが、これらの少なくとも一部又は全部を前記端末とコンピュータネットワークで接続された別の装置内に設け、前記端末からの指示に従って前記別の装置内に設けられたプログラムによる処理および／又はデータベースへのアクセスが実行される構成としてもよい。
【００４６】
記憶部３０の第１データベース３４には、既知微生物に関する質量リストが多数登録されている。この質量リストは、ある微生物細胞を質量分析した際に検出されるイオンの質量電荷比を列挙したものであり、該質量電荷比の情報に加えて、少なくとも、前記微生物細胞が属する分類群（科、属、種など）の情報（分類情報）を含んでいる。こうした質量リストは、予め各種の微生物細胞を前記質量分析部１０によるものと同様のイオン化法および質量分離法によって実際に質量分析して得られたデータ（実測データ）に基づいて作成することが望ましい。
【００４７】
前記実測データから質量リストを作成する際には、まず、前記実測データとして取得されたマススペクトルから所定の質量電荷比範囲に現れるピークを抽出する。このとき、前記質量電荷比範囲を2,000〜35,000程度とすることにより、主にタンパク質由来のピークを抽出することができる。また、ピークの高さ（相対強度）が所定の閾値以上のものだけを抽出することにより、不所望のピーク（ノイズ）を除外することができる。なお、リボソームタンパク質群は細胞内で大量に発現しているため、前記閾値を適切に設定することにより、質量リストに記載される質量電荷比の大部分をリボソームタンパク質由来のものとすることができる。そして、以上により抽出されたピークの質量電荷比（m/z）を細胞毎にリスト化し、前記分類情報等を付加した上で第１データベース３４に登録する。なお、培養条件による遺伝子発現のばらつきを抑えるため、実測データの採取に用いる各微生物細胞は、予め培養条件を規格化しておくことが望ましい。
【００４８】
記憶部３０の第２データベース３６には、属・種決定プログラム３３により識別可能な分類レベルよりも下位のレベルで既知微生物を識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されている。すなわち、属・種決定プログラム３３によって既知微生物の属が識別可能な場合は属よりも下位の分類（種、亜種、病原型、血清型、株など）で、既知微生物の種が識別可能な場合は種よりも下位の分類（亜種、病原型、血清型、株など）で識別するためのマーカータンパク質に関する情報が登録されている。該マーカータンパク質に関する情報としては、少なくとも既知微生物における該マーカータンパク質の質量電荷比（m/z）の情報が含まれる。本実施形態における第２データベース３６には、被検微生物がリステリア属の７種（リステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes）、リステリア・イノキュア（L. innocua）、リステリア・イバノビイ（L. ivanovii）、リステリア・シーリゲリ（L. seeligeri）、リステリア・ウェルシメリ（L. welshimeri）、リステリア・ロコルチア（L. rocourtiae）、およびリステリア・グレイ（L. grayi））のいずれであるかを識別するためのマーカータンパク質に関する情報として、少なくとも８種類のリボソームタンパク質Ｌ２４の質量電荷比の値（m/z 11180.22、11194.25、11254.35、11558.65）、Ｌ６の質量電荷比の値（m/z 19270.04、19256.01、19097.81、19371.01）、Ｌ１８の質量電荷比の値（m/z 13096.86、13110.89、13082.84、13066.84）、Ｌ１５の質量電荷比の値（m/z 15782.02、15797.08、15811.1、15743.01、15601.77）、Ｓ１１の質量電荷比の値（m/z 13655.65、13674.66、13683.67、13591.66、13591.67）、Ｓ９＋Ａｃの質量電荷比の値（m/z 14283.40、14359.50、14302.45、14372.55、14330.55）、Ｌ３１ type Bの質量電荷比の値（m/z 9259.36、9290.34、9271.3、9327.44）、Ｓ１６の質量電荷比の値（m/z 10234.94、10252.97、10003.54、10230.88）が記憶されている。下位分類決定プログラム３５は、これら８種類のリボソームタンパク質の少なくとも一つを用いて被検微生物がリステリア属の７種の菌種のいずれであるかを識別する。
【００４９】
具体的には、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１５、Ｓ１１、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｓ１１、Ｓ９、Ｌ３１、およびＳ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ９、Ｌ３１、およびＳ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ１５、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｓ１１、およびＳ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、被検微生物にリステリア・モノサイトゲネスが含まれるか否かを識別する。
【００５０】
また、少なくとも、リボソームタンパク質Ｓ１６に由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１５およびＬ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、被検微生物にリステリア・イノキュアが含まれるか否かを識別する。
【００５１】
さらに、リボソームタンパク質Ｓ９およびＬ３１に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、被検微生物にリステリア・イバノビイが含まれるか否かを識別する。
【００５２】
さらにまた、リボソームタンパク質Ｓ９に由来するピークの質量電荷比m/zと、リボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１１のうちの少なくとも一つに由来するピークの質量電荷比m/zとに基づいて、被検微生物にリステリア・シーリゲリが含まれるか否かを識別する。
【００５３】
また、少なくとも、リボソームタンパク質Ｓ１１に由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ９のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、被検微生物にリステリア・ウェルシメリが含まれるか否かを識別する。
【００５４】
このように、上述した８種類のリボソームタンパク質は単独で、又は複数を組み合わせることによりリステリア属の菌種を識別するためのマーカータンパク質として利用することができるため、質量電荷比の値が菌種の情報と共に第２データベース３６に記憶される。
【００５５】
なお、被検微生物にリステリア・モノサイトゲネスが含まれると識別されたとき、リボソームタンパク質Ｓ９に由来するピークの質量電荷比m/zと、リボソームタンパク質Ｌ２４およびＬ６の少なくとも一方に由来するピークの質量電荷比m/zとに基づいて、該リステリア・モノサイトゲネスのラインエージを識別することできる。このように、リボソームタンパク質Ｓ９、Ｌ２４、Ｌ６は、リステリア・モノサイトゲネスの系統（Lineage）を識別するためのマーカータンパク質としても利用することができ、リボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９、Ｌ３１はリステリア・モノサイトゲネスの血清型を識別するためのマーカータンパク質としても利用することができる。従って、これらのリボソームタンパク質の質量電荷比の値は、リステリア・モノサイトゲネスの系統および血清型を識別するためのマーカータンパクに関する情報としても、第２データベース３６に記憶される。
【００５６】
また、被検微生物にリステリア・イノキュアが含まれると識別されたとき、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１８に由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、該イノキュアの菌株を特定することができる。
さらに、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物に、リボソームタンパク質の質量電荷比のパターンが、リステリア・イノキュアのタイプストレイン（基準株）と類似するグループである菌株（例えばリステリア・イノキュアATCC33090T（L.innocuaATCC33090T））が含まれるか否かを識別することができる。
さらにまた、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１６のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、前記微生物に含まれる菌株を、リボソームタンパク質の質量電荷比のパターンが、リステリア・イノキュアのタイプストレインと類似するグループ又は非類似のグループに分類することができる。
従って、リボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１６、Ｌ３１の質量電荷比の値は、リステリア・イノキュアの菌株を識別するためのマーカータンパク質に関する情報としても、第２データベース３６に記憶される。
【００５７】
また、被検微生物にリステリア・イバノビイが含まれると識別されたとき、リボソームタンパク質Ｌ１８に由来するピークの質量電荷比m/zおよびリボソームタンパク質Ｌ１５に由来するピークの質量電荷比m/zの少なくとも一方に基づいて、該リステリア・イバノビイの亜種を識別することができる。
さらに、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１５に由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、被検微生物にリステリア・イバノビイの亜種であるイバノビイ  イバノビイ（L.ivanovii ivanovii）が含まれるか否かを識別することができる。
さらにまた、少なくとも、リボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ９、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１５、Ｓ１１、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１５、Ｓ９、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/z、又はリボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ１１、Ｌ３１のそれぞれに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、被検微生物にリステリア・イバノビイの亜種であるイバノビイ  ロンジネンシス（L.ivanovii londiniensis）が含まれるか否かを識別することができる。
従って、リボソームタンパク質Ｌ１８、Ｓ９、Ｌ３１、Ｌ１５、Ｓ１１の質量電荷比の値は、リステリア・イバノビイの亜種を識別するためのマーカータンパク質に関する情報としても、第２データベース３６に記憶される。
【００５８】
また、リボソームタンパク質Ｌ６、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９、Ｌ３１、Ｓ１６のうちの少なくとも１つに由来するピークの質量電荷比m/zに基づいて、被検微生物に含まれるリステリア菌の菌種がリステリア・グレイであるかリステリア・ロコルチアであるかを識別することができる。
従って、リボソームタンパク質Ｌ６、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９、Ｌ３１、Ｓ１６の質量電荷比の値は、リステリア・グレイであるかリステリア・ロコルチアであるかを識別するためのマーカータンパク質に関する情報として、第２データベース３６に記憶される。
【００５９】
上述した８種類のリボソームタンパク質が、リステリア属の菌種の識別、リステリア・モノサイトゲネスのラインエージや血清型の識別、リステリア・イノキュアの菌株の特定や菌株のグループ分け、リステリア・イバノビイの亜種の識別等に利用可能であることは、リステリア属の菌種毎、あるいは菌株毎に、８種類のリボソームタンパク質の質量電荷比を求め、各菌株、各菌種の８種類のリボソームタンパク質の質量電荷比を帰属させた結果から導き出したものである。例えば、リステリア・イノキュアについては、タイプストレインであるリステリア・イノキュアATCC33090T（L.innocuaATCC33090T）の８種類のリボソームタンパク質の質量電荷比とタイプストレインではないリステリア・イノキュアGTC02960（L.innocuaGTC02960）の８種類のリボソームタンパク質の質量電荷比を比較することにより、菌株のグループ分けに有用なリボソームタンパク質を選択した（詳しくは、後述する実施例、及び８種類のリボソームタンパク質の理論質量値を示す図８、８種類のリボソームタンパク質の実測値に基づく帰属結果を示す図１２Ａ等を参照のこと）。
【００６０】
第２データベース３６に記憶するマーカータンパク質の質量電荷比の値としては、各マーカータンパク質の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することにより求められた計算質量と、実測により検出される質量電荷比を比較して選別することが望ましい。なお、マーカータンパク質の塩基配列は、シークエンスによって決定するほか、公共のデータベース、例えばＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター：National Center for Biotechnology Information）のデータベース等から取得したものを用いることもできる。前記アミノ酸配列から計算質量を求める際には、翻訳後修飾としてＮ−末端メチオニン残基の切断を考慮することが望ましい。具体的には、最後から２番目のアミノ酸残基がGly, Ala, Ser, Pro, Val, Thr, 又はCysである場合に、Ｎ−末端メチオニンが切断されるものとして前記理論値を算出する。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで実際に観測されるのはプロトンが付加した分子であるため、そのプロトンの分も加味して前記計算質量（すなわち各タンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳで分析した場合に得られるイオンの質量電荷比の理論値）を求めることが望ましい。
【００６１】
なお、第２データベース３６に記憶するマーカータンパク質に関する情報の一部又は全部は第１データベース３４に記憶しておいても良い。
【００６２】
本実施形態に係る微生物識別システムを用いたリステリア属の菌種の識別手順について、図２に示すフローチャートを参照しつつ説明を行う。
【００６３】
まず、ユーザは被検微生物の構成成分を含む試料を調製し、質量分析部１０にセットして質量分析を実行させる。このとき、前記試料としては、細胞抽出物、又は細胞抽出物からリボソームタンパク質等の細胞構成成分を精製したものの他、菌体や細胞懸濁液をそのまま使用することもできる。
【００６４】
スペクトル作成プログラム３２は、質量分析部１０の検出器１４から得られる検出信号をインターフェース２５を介して取得し、該検出信号に基づいて被検微生物のマススペクトルを作成する（ステップＳ１０１）。
【００６５】
次に、属・種決定プログラム３３が、前記被検微生物のマススペクトルを第１データベース３４に収録されている既知微生物の質量リストと照合し、被検微生物のマススペクトルに類似した質量電荷比パターンを有する既知微生物の質量リスト、例えば被検微生物のマススペクトル中の各ピークと所定の誤差範囲で一致するピークが多く含まれている質量リストを抽出する（ステップＳ１０２）。属・種決定プログラム３３は、続いてステップＳ１０２で抽出した質量リストと対応付けて第１データベース３４に記憶された分類情報を参照することで、該質量リストに対応した既知微生物の分類（属又は種）を特定する（ステップＳ１０３）。そして、被検微生物がリステリア属の細菌でなかった場合、あるいは被検微生物がリステリア属の細菌であって、且つその菌種が特定された場合（ステップＳ１０４でNoの場合）は、該分類を被検微生物の分類として表示部２３に出力し（ステップＳ１１２）、識別処理を終了する。一方、前記生物種がリステリア属に属する細菌であり、且つ、その菌種が不明な場合（ステップＳ１０４でYesの場合）は、続いて下位分類決定プログラム３５による識別処理に進む。なお、あらかじめ他の方法で、試料中にリステリア菌を含むことが判定されている場合は、マススペクトルを用いた属・種決定プログラムを利用せずに、下位分類決定プログラム３５に進めばよい。
【００６６】
下位分類決定プログラム３５では、まず下位分類判定部３９がマーカータンパク質である８種のリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９＋Ａｃ、Ｌ３１ type B、Ｓ１６の質量電荷比の値をそれぞれ第２データベース３６から読み出す（ステップＳ１０５）。続いてスペクトル取得部３７が、ステップＳ１０１で作成された被検微生物のマススペクトルを取得する。そして、m/z読み取り部３８が、該マススペクトル上において、前記の各マーカータンパク質に関連付けて第２データベース３６に記憶された質量電荷比範囲に現れるピークを各マーカータンパク質に対応するピークとして選出し、その質量電荷比を読み取る（ステップＳ１０６）。そして、読み取った質量電荷比を指標とするクラスター解析を実行する。具体的には、下位分類判定部３９が、この質量電荷比と前記第２データベース３６から読み出した各マーカータンパク質の質量電荷比の値を比較し、該読み取った質量電荷比についてタンパク質の帰属を決定する（ステップＳ１０７）。そして、決定した帰属に基づきクラスター解析を実行して被検微生物の種を判定し（ステップＳ１０８）、その旨を被検微生物の識別結果として表示部２３に出力する（ステップＳ１０９）。
【００６７】
以上、本発明を実施するための形態について図面を参照しつつ説明を行ったが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容される。
【００６８】
例えば、上記実施形態では説明の都合上、被検微生物がリステリア属のいずれの種であるかの判定を行った後に、リステリア・モノサイトゲネスの血清型や系統を識別することとしたが、同時に行うようにしてもよい。また、リステリア・モノサイトゲネスの菌種の血清型や系統の識別は省略しても良い。
【実施例】
【００６９】
以下、本発明におけるマーカータンパク質の選定手順および本発明の効果を実証するために行った実験について説明を行う。【００７０】
（１）使用菌株および培養用培地
タンパク質質量データベースを構築するために、リステリア・モノサイトゲネスを１４株、リステリア・イノキュアを２株、リステリア・イバノビイを２株、リステリア・シーリゲリ３株、リステリア・ウェルシメリ、リステリア・グレイ、およびリステリア・ロコルチアをそれぞれ１株、合わせて２４菌株を使用した（図３）。これらの株は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（ＮＢＲＰ, 病原菌部門, 岐阜大学, 岐阜市, 日本）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection, ＡＴＣＣ, ロックビル, メリーランド州, 米国）、ジャパン・コレクション・オブ・マイクロオルガニズムズ（Japan Collection of Microorganisms, ＪＣＭ, 独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター, つくば市, 日本）、および独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源センター（ＮＢＲＣ, 木更津市, 日本）から入手した。培養には、ブレインハートインフュージョン液体培地（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社，東京，日本）、又は寒天培地を使用した。また、図３に示したリステリア・モノサイトゲネスの血清型（serotype）は、リステリア型別用免疫血清「生研」（デンカ生研株式会社，東京，日本）を用いたマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex Polymerase Chain Reaction）法（非特許文献１５参照）により決定した。【００７１】
（２）ＤＮＡの解析
ゲノム解読株の対象領域の上流および下流のコンセンサス配列に基づいて設計したプライマーにより、S10-spc-alphaオペロンにコードされるリボソームタンパク質、およびバイオマーカー候補のリボソームタンパク質遺伝子のＤＮＡ塩基配列をＤＮＡシークエンシングにより決定した。具体的には、図３に示すリステリア属の各種の菌株から常法によりゲノムを抽出し、それらを鋳型として、リボソームタンパク質遺伝子の領域（〜5kbp）およびバイオマーカータンパク質の領域を、高正確性（high fidelity）ＤＮＡポリメラーゼであるKOD plus（東洋紡，大阪, 日本）を用いたＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）によって増幅した。得られたＰＣＲ産物を精製し、それをＤＮＡシークエンシングの鋳型とした。ＤＮＡシークエンシングは、Big Dye ver. 3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライド・バイオシステムズ, Foster City, カリフォルニア州）を用いて行った。なお、ＰＣＲおよびＤＮＡシークエンシングに使用したプライマーを図４に示す。
また、以上により決定したリボソームタンパク質遺伝子のＤＮＡ塩基配列を翻訳することにより得られたアミノ酸配列と図５に示す各アミノ酸の質量から、リボソームタンパク質の質量電荷比を算出し、これを理論質量値とした。【００７２】
（３）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定
ブレインハートインフュージョン液体培地、又は寒天培地から菌体を回収し、約３コロニー分の菌体を７０％エタノール0.5mLに懸濁した。これを10000rpmにて２分間遠心分離して得られた菌体ペレットを減圧乾燥器にて５分間乾燥しエタノールを蒸発させた。乾燥したペレットに10μLの３５％ギ酸を加えて撹拌し、これを分析サンプルとした。この分析サンプル1.5μLを、10μLのシナピン酸マトリックス剤（50 v/v％アセトニトリル、1 v/v％トリフルオロ酢酸溶液中に20 mg/mLのシナピン酸（和光純薬工業株式会社，大阪，日本）を含んで成る溶液）に加えて十分に混合した。そして、この混合液1.5 μLをサンプルプレートに滴下し、自然乾燥させた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定にはAXIMA微生物同定システム（株式会社島津製作所, 京都市, 日本）を使用し、ポジティブリニアモード、スペクトルレンジ2000m/z〜35000m/zにて試料の測定を行った。上述の方法で算出した理論質量値を、測定された質量電荷比と許容誤差500 ppmでマッチングし、適宜修正を施した。なお、上記AXIMA微生物同定システムのキャリブレーションには大腸菌ＤＨ５α株を用いた。【００７３】
（４）リステリア・モノサイトゲネスの識別のためのタンパク質量データベースの構築
上述したリステリア・モノサイトゲネスの１４株について、上述したリボソームタンパク質の理論質量値と、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定により得られたピークチャートを照合し、実際に検出することができたリボソームタンパク質に関して、理論質量値と実測値に相違がないことを確認した。次に、S10-spc-alphaオペロンにコードされるリボソームタンパク質、およびその他バイオマーカー候補のリボソームタンパク質について、リステリア・モノサイトゲネスの菌株、或いは血清型と質量電荷比の関係を調べた。その結果を図６に示す。なお、リボソームタンパク質Ｓ９にはアセチル基（COCH3）が修飾されていることがわかったため、遺伝子のＤＮＡ配列から算出された質量値にアセチル基が付加したもの（Ｓ９＋Ａｃ）の質量値を理論質量値とした。【００７４】
図６には、リステリア・モノサイトゲネスの１４株について、S10-spc-alphaオペロンにコードされるリボソームタンパク質、およびその他バイオマーカー候補のリボソームタンパク質の理論質量値（質量電荷比（m/z））を示している。なお、血清型1/2b、3b、4b、4d、および4eはLineage Iに、血清型1/2a、1/2c、3a、および3cはLineage IIに、血清型4aはlineage IIIにそれぞれ分類される。また、図６に示す〇、×、△は、それぞれAXIMA微生物同定システムのデフォルトの処理条件（Threshold offset ; 0.015mV, Threshold response ; 1.200）でピーク処理を行った結果を示している。すなわち、〇は理論質量値と許容誤差500 ppm内でピークが検出されたことを、×はピークが検出されない場合があったことを示している。また、△は、ピークは検出されたものの、他の菌株、あるいは他の血清型の理論質量値との差が小さかったり、他のリボソームタンパク質のピークとの差が500 ppm以内であったりしたことを示している。【００７５】
図６から分かるように、S10-spc-alphaオペロンにコードされるリボソームタンパク質Ｌ３、Ｌ４、Ｌ２３、Ｌ２、Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｓ５、Ｌ１５、Ｓ１３、およびＳ１１、並びに当該オペロン外のリボソームタンパク質Ｌ１０、Ｌ２１、Ｌ１３、およびＳ９＋Ａｃの計１５種類は、測定に用いたリステリア・モノサイトゲネスの一部の菌株において他の菌株と異なる理論質量値であった。このことから、これら１５種類のリボソームタンパク質は、リステリア・モノサイトゲネスの菌株あるいは血清型の識別に使用可能なマーカータンパク質であることが示唆された。これら１５種類のリボソームタンパク質の各菌株におけるＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号１〜２４０に示す。各配列番号に対応する配列の概要は以下の通りである。【００７６】
リステリア・モノサイトゲネスの１４個の菌株（ATCC15313T、JCM 2873、JCM 7671、JCM 7672、JCM 7673、JCM 7674、JCM 7675、JCM 7676、JCM 7677、JCM 7678、JCM 7680、JCM 7683、ATCC51772、ATCC19115）およびリステリア・シーリゲリの２個の菌株（JCM 7679、JCM7682）におけるＤＮＡ塩基配列について、以下の通り示す。
配列番号１〜１６：上述の１６個の菌株におけるＬ３のＤＮＡ塩基配列。
配列番号１７〜３２：上述の１６個の菌株におけるＬ４のＤＮＡ塩基配列。
配列番号３３〜４８：上述の１６個の菌株におけるＬ２３のＤＮＡ塩基配列。
配列番号４９〜６４：上述の１６個の菌株におけるＬ２のＤＮＡ塩基配列。
配列番号６５〜８０：上述の１６個の菌株におけるＬ２４のＤＮＡ塩基配列。
配列番号８１〜９６：上述の１６個の菌株におけるＬ６のＤＮＡ塩基配列。
配列番号９７〜１１２：上述の１６個の菌株におけるＬ１８のＤＮＡ塩基配列。
配列番号１１３〜１２８：上述の１６個の菌株におけるＳ５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号１２９〜１４４：上述の１６個の菌株におけるＬ１５のＤＮＡ塩基配列。
配列番号１４５〜１６０：上述の１６個の菌株におけるＳ１３のＤＮＡ塩基配列。
配列番号１６１〜１７６：上述の１６個の菌株におけるＳ１１のＤＮＡ塩基配列。
配列番号１７７〜１９２：上述の１６個の菌株におけるＬ１０のＤＮＡ塩基配列。
配列番号１９３〜２０８：上述の１６個の菌株におけるＬ２１のＤＮＡ塩基配列。
配列番号２０９〜２２４：上述の１６個の菌株におけるＬ１３のＤＮＡ塩基配列。
配列番号２２５〜２４０：上述の１６個の菌株におけるＳ９のＤＮＡ塩基配列。【００７７】
ただし、上記１５種類のリボソームタンパク質のうちＬ３、Ｌ４、Ｌ２３、Ｌ２、Ｌ１０、およびＬ２１は、他の菌株との理論質量値の差が500 ppm以上である菌株が１又は複数存在し、該菌株の識別に用いるバイオマーカーの候補として考えられるものの、ピーク形状が不明瞭であったりピーク強度が不十分であったりしたためにピークを検出することができなかったため、安定的なバイオマーカーとしては不適当であると思われた。
また、リボソームタンパク質Ｓ５およびＬ１３は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定においてピークを検出することができたものの、他の菌株との理論質量値の差が500 ppm以下であったため、バイオマーカーとして不適当であった。さらに、Ｓ１３（m/z 13578.69または13552.65）は、別のリボソームタンパク質Ｌ２０ (m/z 13552.08）のピークと重なっていて、両ピークを区別することができないため、やはり、バイオマーカーとして不適当であると思われた。【００７８】
一方、Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、およびＳ９＋Ａｃの計６種類のリボソームタンパク質は、菌株によらず安定的に検出され、しかも他の菌株との理論質量値の差が500 ppm以上であることから、バイオマーカーとして有用であると考えられた。そこで、本実施例では、これら６種類のリボソームタンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定におけるリステリア・モノサイトゲネスの血清型又は菌株（あるいはLineage）の識別のためのバイオマーカーとして用いることとした。【００７９】
（５）リステリア属の種の識別のための質量データベースの構築
リステリア・モノサイトゲネスの血清型又は菌株の識別に有用であることが示された６種類のバイオマーカーＬ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、およびＳ９＋Ａｃは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定において、リステリア・モノサイトゲネスの全ての菌株において安定して検出されたことから、これらのタンパク質のピークはリステリア属の異種検体についても同様に安定して検出される可能性が高いことが予想された。【００８０】
そこで、リステリア属のうち公的な分譲機関から入手可能であったリステリア・グレイ、リステリア・イノキュア、リステリア・イバノビイ、リステリア・ロコルチア、リステリア・シーリゲリ、リステリア・ウェルシメリの６種１０菌株について、上記６種類のマーカータンパク質の理論質量値を上述した方法により算出した。これら１０菌株についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定を行ったところ、予想通り、上記６種類のタンパク質ピークが安定して検出された。加えて、上記６種類のバイオマーカー以外に明確な質量ピークとして検出されたリボソームタンパク質Ｌ３１ type BおよびＳ１６は、リステリア属の種によって特有のピーク質量を示すことがわかった。従って、これら２種類のリボソームタンパク質もリステリア属の種の識別に利用可能なバイオマーカーであると考え、上記６種類のリボソームタンパク質（Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、およびＳ９）に加え、新たにＬ３１ type B（m/z 9259.36, 9290.34, 9327.44または 9271.3）、およびＳ１６ (m/z 10234.94, 10252.97, 10230.88または10003.54）を含めた８種類のリボソームタンパク質について、リステリア属の種の識別のための理論質量値の表を作成した（図８）。なお、これら８種類のリボソームタンパク質は、リステリア属の種の識別だけでなく、リステリア・モノサイトゲネスの血清型の識別に利用可能なバイオマーカーであることはもちろんである。【００８１】
なお、リステリア・グレイのリボソームタンパク質Ｓ１１は５６番目のアミノ酸が特異的にリジンに変化しており、さらに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定の結果においてメチル基（CH3）の質量が付加した位置に質量ピークが観察された。以上より、リステリア・グレイのＳ１１はメチル化されているものとして理論質量値を算出した。また、リステリア・ロコルチアのＳ１１は理論質量値よりもm/zで約１７大きい位置にピークが観測されたため、理論質量値に１７を加算した数値とした。さらに、Ｓ１６に関してはゲノム解読株のシーケンス情報から理論値を算出し、今回実測した菌株の測定値と相違ないことを確認した。また、リステリア・モノサイトゲネスのＳ１６には２パターンのＤＮＡ配列が登録されていたがアミノ酸配列は一致していた。【００８２】
以上により求めた上記８種類のリボソームタンパク質の６種８菌株におけるＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号２４１〜３０４に示す。各配列番号に対応する配列の概要は以下の通りである。
配列番号２４１〜２４８：リステリア・イノキュアの菌株ATCC 33090TにおけるＬ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９＋Ａｃ、Ｌ３１  type B、Ｓ１６のＤＮＡ塩基配列。菌株ATCC 33090Tはリステリア・イノキュアのタイプストレイン（基準株）である。
配列番号２４９〜２５６：リステリア・イノキュアの菌株GTC02960におけるＬ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９＋Ａｃ、Ｌ３１  type B、Ｓ１６のＤＮＡ塩基配列。
配列番号２５７〜２６４：リステリア・イバノビイ  イバノビイの菌株JCM7681におけるＬ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９＋Ａｃ、Ｌ３１  type B、Ｓ１６のＤＮＡ塩基配列。
配列番号２６５〜２７２：リステリア・イバノビイ  ロンジネンシスの菌株ATCC44954におけるＬ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９＋Ａｃ、Ｌ３１  type B、Ｓ１６のＤＮＡ塩基配列。
配列番号２７３〜２８０：リステリア・シーリゲリの菌株ATCC35967TにおけるＬ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９＋Ａｃ、Ｌ３１  type B、Ｓ１６のＤＮＡ塩基配列。
配列番号２８１〜２８８：リステリア・ウェルシメリの菌株GTC02963におけるＬ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９＋Ａｃ、Ｌ３１  type B、Ｓ１６のＤＮＡ塩基配列。
配列番号２８９〜２９６：リステリア・ロコルチアの菌株GTC16429TにおけるＬ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９＋Ａｃ、Ｌ３１  type B、Ｓ１６のＤＮＡ塩基配列。
配列番号２９７〜３０４：リステリア・グレイの菌株ATCC19120TにおけるＬ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、Ｓ９＋Ａｃ、Ｌ３１  type B、Ｓ１６のＤＮＡ塩基配列。【００８３】
（６）リステリア属の菌種の同定
タンパク質の質量パターンを、ＳＡＲＡＭＩＳ（商標、Spectral Archive and Microbial Identification System）を用いてフィンガープリント法による解析を行い、全ての菌株がリステリア属の細菌であることを確認した。続いて、各菌株のマススペクトル上のピークの質量電荷比が、変異のないバイオマーカータンパク質の質量電荷比と一致したものを「１」、一致しなかったものを「２」〜「５」（２〜５は互いに異なる質量電荷比であることを示す。）、バイオマーカータンパク質に相当するピークが存在しなかったものを「０」としてプロファイルデータを作成した。このデータをPASTソフトウェア（自然史博物館, オスロ大学, ノルウェー）にインポートし、キムラアルゴリズムを用いて近接結合法によってクラスター解析を行った。更に、FigTree ver. 1.4.0ソフトウェアを用いて系統樹（図１３Ａ）を作成した。その結果、図１３Ａから明らかなように、リステリア属の７つの菌種は正しく分類され、さらに、リステリア・モノサイトゲネスは系統（Lineage）毎に正しく分類された。【００８４】
（７）リステリア・モノサイトゲネスの菌株又は血清型・系統（Lineage）の同定
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定で得られるピークの質量電荷比を、上述の６種類のリボソームタンパク質の理論質量値と関連づけることで該ピークの由来となるタンパク質の種類の帰属を解析し、リステリア・モノサイトゲネスの菌株の同定を行った。タンパク質の種類の帰属の解析には、Ｓ１０−ＧＥＲＭＳ（S10-spc-alpha operon Gene Encoded Ribosormal protein Mass Spectrum）法（特許文献３参照）に基づき細菌を識別するソフトウェアを開発し、用いた。【００８５】
まず、上記ソフトウェアを起動して、６種類のリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｌ１５、Ｓ１１、およびＳ９＋Ａｃの菌株毎の理論質量値（リボソームタンパク質Ｌ２４の質量電荷比の値（m/z 11180.22、11194.25、11254.35）、Ｌ６ の質量電荷比の値（m/z 19270.08（19270.80）、19256.01）、Ｌ１８の質量電荷比の値（m/z 13096.86、13110.89)、Ｌ１５の質量電荷比の値（m/z 15782.02、15797.08）、Ｓ１１の質量電荷比の値（m/z 13655.65、13674.66）、およびＳ９＋Ａｃの質量電荷比の値（m/z 14283.40、14359.50、14302.45））を登録した。なお、質量差が500 ppm以下であるＬ６の２つの理論質量値m/z 19270.08と19270.04については、両者を区別することができないと考えられたため、m/z 19270.08として登録した。【００８６】
次に、各菌株について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定で得られたマススペクトルデータを解析し、バイオマーカーに対応するピークが、登録されたバイオマーカーの理論質量値に正しく帰属されるか否かを調べた。その結果、図７Ａに示すように、すべての菌株について、すべてのバイオマーカーに対応するピークが、登録したバイオマーカーの理論質量値に帰属された。図７Ｂは、６種類のリボソームタンパク質の各質量電荷比と図７Ａに示す帰属番号１〜３との関係を示す。帰属パターンをグループＡ〜Ｄに分類し、各菌株の血清型と照合したところ、グループＡにはラインエージIIの菌株、グループＢおよびＣにはラインエージIの菌株、グループＤにはラインエージIIIの菌株がそれぞれ属することが分かった。【００８７】
以上より、Ｌ２４（m/z 11180.22、11194.25、11254.35）、Ｌ６（m/z 19270.08、19256.01）、Ｌ１８（m/z 13096.86、13110.89）、Ｌ１５（m/z 15782.02、15797.08、15668.86）、Ｓ１１（m/z 13655.65、13674.66）、およびＳ９＋Ａｃ（m/z 14283.40、14359.50または14302.45）は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定における、リステリア・モノサイトゲネスの血清型やラインエージの識別のための有用なマーカータンパク質であることが立証された。また、これらマーカータンパク質は、遺伝子情報から正確な質量が算出されており実測値とも照合されていることから、信頼性の高い質量データベースを構成できることが分かった。【００８８】
（８）ＳＡＲＡＭＩＳを用いた識別結果とクラスター解析による識別結果の比較
上述した、ＳＡＲＡＭＩＳを用いたリステリア属の種の識別と、図８に示す８種類のリボソームタンパク質の理論質量値を指標としたクラスター解析によるリステリア属の種の識別を行い、その結果を比較した。図９Ａおよび９Ｂは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定により得られたチャートを示している。図９ＡはグループＡ〜Ｅの、図９ＢはグループＦ〜Ｍの菌種又は菌株のチャートである。これらチャートをＳＡＲＡＭＩＳを用いて解析したところ、図１０に示す識別結果が得られた。同図からわかるように、リステリア・イノキュア２株、リステリア・イバノビイ１株、リステリア・シーリゲリATCC35967、リステリア・ウェルシメリは、いずれも「Listeria sp.」と識別され、種までの同定はできなかった。リステリア・イバノビイ JCM7681株、リステリア・シーリゲリJCM7679およびJCM7682株に関しては、リステリア・モノサイトゲネスと誤同定された。なお、リステリア・シーリゲリJCM7679およびJCM7682株については、生化学試験および16S RNAのシーケンス解析を行い、リステリア・シーリゲリであることを同定した。リステリア・ロコルチアは、その質量ピークと一致する理論質量値がＳＡＲＡＭＩＳのデータベースに格納されていなかったためか、種の同定が行われなかった。一方、リステリア・グレイはＳＡＲＡＭＩＳによって種のレベルまで正しく同定された。リステリア・グレイはその他のリステリア属の菌と系統的に遠類であることから、既存のフィンガープリント法にて同定可能であったものと考えられる。【００８９】
次に、図８に示した理論質量値のデータベースをもとに、リステリア属の種の識別を試みた。なお、質量値の差の小さいＬ１５のm/z 15797.08, 15797.03，および15796.09については実測にてそれらを識別できないと考えられたため、いずれも理論質量値 m/z 15797.08とみなして帰属させた。図１１Ａおよび１１Ｂは図９Ａおよび９Ｂのチャートのバイオマーカーピーク部分を拡大して示したものである。図１１Ａ、１１Ｂから分かるように、リステリア属の種によってバイオマーカー質量がシフトしており、ピークを区別することができた。【００９０】
８種類のリボソームタンパク質の実測値を理論値と比較し帰属したところ、図１２Ａに示す結果が得られた。図１２Ｂは図１２Ａにおけるバイオマーカーの帰属番号と理論質量値との対応関係を示す表である。尚、図１１Ａおよび図１１Ｂのチャート上に示す１〜５の数字は各バイオマーカーの帰属番号を表している。
図８および図１２Ａから分かるように、リステリア・ロコルチアおよびリステリア・グレイについては、一部のリボソームタンパク質において理論値と実測値の相違がみられたが、その他のリステリア属の菌種ではリボソームタンパク質の質量値の差を識別することが可能であった。
図１２Ａに示す８種類のリボソームタンパク質を用いた帰属結果を表すデンドログラム（系統図）およびこれら８種類のうち５種類のリボソームタンパク質Ｌ２４、Ｓ９、Ｌ６、Ｌ１８、およびＳ１６を用いた帰属結果を表すデンドログラムを図１３Ａ、１３Ｂに示す。いずれにおいてもリステリア属の種の識別、およびリステリア・モノサイトゲネスのラインエージの識別ができていることがわかる。以上より、本実施例で見出したリボソームタンパク質をマーカータンパク質として用いたリステリア属の識別方法は非常に有効な手法であることが分かった。【００９１】
尚、上記実施形態では、被検微生物がリステリア属の７つの菌種のいずれであるかを識別するためのマーカータンパク質として８種類のリボソームタンパク質の質量電荷比を第２データベース３６に記憶させたが、上述の実施例において、リステリア・モノサイトゲネスを識別するためのタンパク質質量データベースを構築する過程で見出された１５種類のリボソームタンパク質（Ｌ３、Ｌ４、Ｌ２３、Ｌ２、Ｌ２４、Ｌ６、Ｌ１８、Ｓ５、Ｌ１５、Ｓ１３、Ｓ１１、Ｌ１０、Ｌ２１、Ｌ１３、およびＳ９）と、リステリア・モノサイトゲネス以外のものを識別するためのタンパク質質量データベースを構築する過程で見出された２種類のリボソームタンパク質（Ｌ３１（Ｌ３１  type B）、およびＳ１６）の計１７種類の質量電荷比を第２データベース３６に記憶させ、下位分類決定プログラム３５は、これら１７種類のうちの少なくとも一つを用いて、被検微生物がリステリア属のいずれの菌種であるかを識別するようにしても良い。【００９２】
また、上記実施形態ではクラスター解析によりリステリア・モノサイトゲネスのラインエージを識別したが、１又は複数のリボソームタンパク質の実測値を理論質量値と比較することにより識別しても良い。例えば、リボソームタンパク質Ｌ２４、Ｌ６、Ｓ９に対応する質量ピークの実測値から識別しても良い。特に、リボソームタンパク質Ｌ２４およびＬ６はリステリア・モノサイトゲネスのラインエージＩにおいて特有な質量シフトが観測されたことから、ラインエージIとその他のラインエージを区別するためのマーカータンパク質として有用である。【００９３】
さらに、リボソームタンパク質Ｌ１８はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ測定において明確なピークを検出することができ、リステリア・シーリゲリにおいて特有な質量シフトが観測された。従って、リボソームタンパク質Ｌ１８を、リステリア・シーリゲリを識別するためのマーカータンパク質として用いても良い。【００９４】
また、リステリア・イノキュアに特徴的な質量電荷比をもつリボソームタンパク質Ｓ１６、リステリア・シーリゲリの菌株を区別することが可能なリボソームタンパク質Ｓ９は、リステリア属の種の識別用のバイオマーカーとして有用である。さらに、リボソームタンパク質Ｌ１８、およびＬ１５はリステリア・イバノビイの亜種を識別するための有用なマーカータンパク質となり、リボソームタンパク質Ｓ１１はリステリア・ウェルシメリの識別に有用なマーカータンパク質となる。
【符号の説明】
【００９５】
１０…質量分析部
１１…イオン化部
１２…ＴＯＦ
１３…引き出し電極
１４…検出器
２０…微生物判別部
２１…ＣＰＵ
２２…メモリ
２３…表示部
２４…入力部
２５…Ｉ／Ｆ
３０…記憶部
３１…ＯＳ
３２…スペクトル作成プログラム
３３…属・種決定プログラム
３４…第１データベース
３５…下位分類決定プログラム
３６…第２データベース
３７…スペクトル取得部
３８…m/z読み取り部
３９…下位分類判定部
４０…クラスター解析部
４１…デンドログラム作成部
【図１】
0006709434.tif 000002
【図２】
0006709434.tif 000003
【図３】
0006709434.tif 000004
【図４】
0006709434.tif 000005
【図５】
0006709434.tif 000006
【図６】
0006709434.tif 000007
【図７Ａ】
0006709434.tif 000008
【図７Ｂ】
0006709434.tif 000009
【図８】
0006709434.tif 000010
【図９Ａ】
0006709434.tif 000011
【図９Ｂ】
0006709434.tif 000012
【図１０】
0006709434.tif 000013
【図１１Ａ】
0006709434.tif 000014
【図１１Ｂ】
0006709434.tif 000015
【図１２Ａ】
0006709434.tif 000016
【図１２Ｂ】
0006709434.tif 000017
【図１３Ａ】
0006709434.tif 000018
【図１３Ｂ】
0006709434.tif 000019
【配列表】
0006709434000001.app