(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）テストインターフェロンと組換え超複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）を提供すること；と
（２）同じ特定の条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏに対して、それぞれ、インビトロで、ＨＴ−２９細胞におけるＬＲＰ６及びＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーションを測定することにより、
前記テストインターフェロンによる統計学的に有意であるＨＴ−２９細胞におけるＬＲＰ６及びＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーションの存在は、前記テストインターフェロンがｒＳＩＦＮ−ｃｏと同じ効力を有すること、あるいは前記テストインターフェロンがｒＳＩＦＮ−ｃｏと効果が同等であることを示すこと；とを含む、
テストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏに対する相対効力を確定又は比較する、あるいはテストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏとの間の同等性を構築する方法。
【請求項２】
ステップ（２）において、それぞれ以下の（ａ）〜（ｉ）：
（ａ）いずれか１つの又はより多くの担癌マウスモデル体内の癌細胞生長に対する抑制；
（ｂ）癌細胞生存力に対する降下；
（ｃ）癌細胞転移に対する抑制；
（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制；
（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の発現に対する抑制；
（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する抑制；
（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する抑制；及び
（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現に対するアップレギュレーション
から選ばれるいずれか一種又は多種の活性をさらに測定すること、ただし、（ｂ）〜（ｉ）の活性は、インビトロ条件で測定される、により、
前記テストインターフェロンによるＨＴ−２９細胞におけるＬＲＰ６及びＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーションと、以下との組合せ：
統計学的に有意である（ｇ）の活性；及び／又は
統計学的に有意である（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のうちいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種の活性；及び／又は
前記テストインターフェロンにおける（ｈ）及び（ｉ）のうちいずれか一種又は多種の活性
の存在は、前記テストインターフェロンがｒＳＩＦＮ−ｃｏと同じ効力を有すること、あるいは前記テストインターフェロンがｒＳＩＦＮ−ｃｏと効果が同等であることをさらに示す、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の一種又は多種の活性を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、子宮頚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞と前立腺癌細胞のいずれか一種又は多種を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記の一種又は多種の活性を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、ヒーラ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＳＷ６２０細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞とＨＴ−２９細胞のいずれか一種又は多種を含む請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
統計学的に有意であるとは、コントロールに比べて、ｐ値≦０．０５である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記コントロールは、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理されず、又は生理食塩水あるいはＰＢＳで処理され、又はＩＦＮα−２ｂで処理されているものであるか、又は前記コントロールは未処理のコントロール（Ｍｏｃｋ）である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記テストインターフェロンのアミノ酸配列とｒＳＩＦＮ−ｃｏのアミノ酸配列（配列番号１）は少なくとも９０％の同一性を有する請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏは同じアミノ酸配列（配列番号１）を有し、且つ同じヌクレオチド配列（配列番号２）にコードされている請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏは同じ比活性を有する請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏに比較する効力を確定する新たな方法、テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏとの間の実質的同等性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）を構築する方法、癌細胞転移、偽足（ｐｓｅｕｄｏｐｏｄ）形成、β−カテニン／ＴＣＦ−媒介転写活性とβ−カテニンの蛋白レベルを抑制する方法、Ｗｎｔ関連受容体又は共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の発現をダウンレギュレーションする方法、Ｗｎｔシグナル伝達経路の標的遺伝子の発現を抑制する方法、腫瘍抑制遺伝子をアップレギュレーションする方法、及びあらゆる前記方法を行うための測定キットに関する。本発明はさらに前記活性を有するインターフェロン又はインターフェロン代用物に関する。
【背景技術】
【０００２】
スーパーインターフェロン（以下、「ｒＳＩＦＮ−ｃｏ」又は「ＳＩＦＮ−Ｉ」と呼ばれ、固形腫瘍に対して治療作用を有するインターフェロンである）は既に特許文献１（組換え超複合インターフェロン）と特許文献２（組換えインターフェロンをコードする核酸）に記載されている。ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｌｆａｃｏｎ−１）（特許文献３に開示された複合インターフェロンα）と同じアミノ酸配列をコードする操作された遺伝子構築物より発現される。しかし、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）をコードする核酸配列と異なる新しい核酸配列にコードされている。ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ蛋白は新しい三次構造と改善された生物学特性を有する。
【０００３】
特許文献４、特許文献５と特許文献６に記載されているように、ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、固形腫瘍に対する直接抑制作用及び抗ウイルス活性を含むより広域スペクトルの生物活性も有する。
【０００４】
他の市販のインターフェロンに比較するｒＳＩＦＮ−ｃｏの独特な生物学活性、及びｒＳＩＦＮ−ｃｏの人類への応用可能性の観点から、ｒＳＩＦＮ−ｃｏと他のテストインターフェロンの生物学活性及び／又は効力を評価する方法を提供することが望まれ、例えば、製造過程中或いは他の面における品質制御を目的として、最終製品が所望の活性を保有又は有し、且つ市販のインターフェロンと異なっていることを保証する。さらに、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの他の用途及び所望の活性を有するインターフェロン又はインターフェロン代用物を提供することが望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，３６４，７２４号
【特許文献２】米国特許第７，５８５，６４７号
【特許文献３】米国特許第４，６９５，６２３号
【特許文献４】米国特許第８，１１４，３９５号
【特許文献５】米国特許第８，２８７，８５２号
【特許文献６】米国特許第８，４２５，８９６号
【発明の概要】
【０００６】
一つの形態では、本発明は、（１）テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供することと、（２）同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、それぞれ以下の（ａ）〜（ｉ）のいずれか一種又は多種の活性を測定することとを含むテストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する相対効力を確定又は比較する方法を提供する。（ａ）いずれか１つの又はより多くの担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する抑制；（ｂ）癌細胞生存力に対する降下；（ｃ）癌細胞転移に対する抑制；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の発現に対する抑制；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する抑制；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する抑制；（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現に対するアップレギュレーション。テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）のうち所定のいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は６種の活性が存在し、及び／又はテストインターフェロンは、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）のうち所定のいずれか一種又は多種の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有することを示し、即ち、それらは実質的に同じ有効性を有するか実質的に同じ結果を生じる。ここで、「実質的に同じ」とは、少なくとも約７０％が同じである；好ましくは、少なくとも約８０％が同じである；さらに好ましくは、少なくとも約９０％が同じである；また好ましくは、少なくとも約９５％が同じである。
【０００７】
他の形態では、本発明は、（１）テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供することと、（２）同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物をそれぞれ下記の（ａ）〜（ｉ）のいずれか一種又は多種の活性を測定することとを含むテストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との間の実質的同等性を構築する方法を提供する。（ａ）いずれか１つの又はより多くの担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する抑制；（ｂ）癌細胞生存力に対する降下；（ｃ）癌細胞転移に対する抑制；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及びＩＤ２のうちいずれか一種又は多種の発現に対する抑制；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する抑制；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する抑制；（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現に対するアップレギュレーション。テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）のうち所定のいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は６種の活性が存在し、及び／又はテストインターフェロンは、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）のうち所定のいずれか一種又は多種の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物とは実質的に効果が同等であることを示す。
【０００８】
幾つかの実施形態では、上記の一種又は多種の活性を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、子宮頚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞と前立腺癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、上記の一種又は多種の活性を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、ヒーラ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＳＷ６２０細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞とＨＴ−２９細胞のいずれか一種又は多種を含む。
【０００９】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）である体内癌細胞生長に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は、肝臓癌細胞、子宮頚癌細胞、結腸癌細胞と肺癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ａ）を測定するために用いられる癌細胞は、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、ヒーラ細胞、ＨＴ−２９細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞とＡ５４９細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、ＨＴ−２９細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞とＡ５４９細胞のいずれか一種又は多種を含む；さらに好ましくは、Ａ５４９細胞を含む。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の抑制作用の測定において、生理食塩水又はＰＢＳはコントラストとして用いられる。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇで；好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇの量で投与する。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は一日おきに投与する。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約２週間〜約６週間；好ましくは、約３週間〜約４週間投与する。
【００１０】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）である癌細胞生存力に対する降下の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲で、それぞれ癌細胞生存力を約５０％降下させる。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、少なくとも約２５ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、少なくとも約５０ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは、少なくとも約７５ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは、少なくとも約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度で、それぞれ癌細胞生存力を実質的に検測できない程度まで降下させる。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の濃度は約０．２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、癌細胞を少なくとも約１日；好ましくは、少なくとも約２日処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、子宮頚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞と前立腺癌細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、肺癌細胞、結腸癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞と前立腺癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、ヒーラ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞とＰＡＮＣ−１細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞とＰＡＮＣ−１細胞のいずれか一種又は多種を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は約１日〜約１０日；好ましくは、約１日〜約６日処理される。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞はＡ５４９細胞とＳＷ６２０細胞のいずれか一種又は多種を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、活性（ｃ）である癌細胞転移に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞はＡ５４９細胞とＳＷ６２０細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法を利用して活性（ｃ）である癌細胞転移に対する抑制を測定する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間；好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。
【００１３】
幾つかの実施形態では、活性（ｄ）である癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞、ＨＴ−２９細胞とＳＷ６２０細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞とＳＷ６２０細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を用いて、測定活性（ｄ）に用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間処理する；好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を使用し、測定活性（ｄ）に用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、β−カテニン／ＴＣＦの転写活性はレポーターシステム（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）により測定される。幾つかの実施形態では、前記レポーターシステムはＴＯＰＦｌａｓｈ又はｐＳＶ４０−ＲＬプラスミドを含む。
【００１４】
幾つかの実施形態では、測定活性（ｅ）の癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーションに使用される癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、測定活性（ｅ）に用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＳＷ６２０細胞とＨＴ−２９細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２０細胞とＨＴ−２９細胞のいずれか一種又は多種を含む；さらに好ましくは、ＨＴ−２９細胞を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、測定活性（ｅ）に用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間処理する；好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を使用し、測定活性（ｅ）に用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、測定活性（ｅ）においてＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６のｍＲＮＡレベルを測定することにより、ＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現を確定する。
【００１５】
幾つかの実施形態では、活性（ｆ）であるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の発現に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、測定活性（ｆ）に用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間処理する；好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、測定活性（ｆ）に用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｆ）の測定において、Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及び／又はＩＤ２のｍＲＮＡレベルを測定することにより、それに対応する発現を確定する。幾つかの実施形態では、活性（ｆ）の測定において、コントラストに比べると、テストインターフェロンは癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種を少なくとも約３０％；好ましくは、少なくとも約４０％；さらに好ましくは、少なくとも約５０％；またさらに好ましく、少なくとも約６０％の発現を降下し、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力有する又は実質的に効果が同等であるとみなされる。
【００１６】
幾つかの実施形態では、活性（ｇ）である癌細胞における偽足形成に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は肺癌細胞を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約４日；好ましくは、少なくとも約８日処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。
【００１７】
幾つかの実施形態では、活性（ｈ）である癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞とＳＷ４８０細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｈ）の測定において、ウエスタンブロット法を利用してβ−カテニン発現に対する抑制を測定する。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約４８時間；好ましくは、少なくとも約７２時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。
【００１８】
幾つかの実施形態では、活性（ｉ）である癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現に対するアップレギュレーションを測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＳＷ６２０細胞とＨＴ−２９細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞とＳＷ６２０細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間処理する；好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｉ）の測定において、ＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及び／又はＢＡＴＦ２のｍＲＮＡレベルを測定することによりそれに対応する発現を確定する。
【００１９】
幾つかの実施形態では、統計学的に有意であるとは、コントラストに比べて、ｐ値≦０．０５、又は≦０．０１、又は≦０．００５、又は≦０．００１、又は≦０．０００５、又は≦０．０００１である。
【００２０】
幾つかの実施形態では、前記コントラストは、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で処理されず、又は生理食塩水あるいはＰＢＳで処理され、又はＩＦＮα−２ｂで処理され、又は前記コントラストは未処理のコントラスト（Ｍｏｃｋ）である。
【００２１】
他の形態では、本発明は、（ａ）複数濃度のテストインターフェロンを提供すること；と（ｂ）該複数濃度のテストインターフェロンを用いて、特定な条件で、第一組の癌細胞生存力に対するテストインターフェロンの第一投与量反応を確定すること；と（ｃ）複数濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供すること；と（ｄ）該複数濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を用いて、同じ特定な条件で、第二組の癌細胞生存力に対するｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の第二投与量反応を確定すること；と（ｅ）第一投与量反応と第二投与量反応を比較すること；とを含む化合物（例えば、テストインターフェロン）の効力を確定又は比較する方法を提供する。このように、化合物、例えばテストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する相対効力を確定する。
【００２２】
幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは特定な比活性を含み、且つ比活性が約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約１×１０９ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、比活性が約４．４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約９×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、比活性が約５×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約８×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、比活性が約６×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約７．５×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。好ましくは、比活性が約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約５×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。
【００２３】
幾つかの実施形態では、化合物の効力を確定又は比較する方法において、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏの濃度が約０．２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にある。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏの濃度は、０．２ｍｃｇ／ｍｌ、０．３９ｍｃｇ／ｍｌ、０．７８ｍｃｇ／ｍｌ、１．５６ｍｃｇ／ｍｌ、３．１３ｍｃｇ／ｍｌ、６．２５ｍｃｇ／ｍｌ、１２．５ｍｃｇ／ｍｌ、２５ｍｃｇ／ｍｌ、５０ｍｃｇ／ｍｌと１００ｍｃｇ／ｍｌの少なくとも２種以上の濃度を含む。
【００２４】
幾つかの実施形態では、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで癌細胞を少なくとも約２０時間、好ましくは少なくとも約２４時間、また好ましくは少なくとも約４８時間、さらに好ましくは少なくとも約７２時間処理する。
【００２５】
幾つかの実施形態では、本発明は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲で（癌細胞のタイプに依存する）癌細胞生存力を５０％の効力降下させることができる本文に記載したような方法を提供する。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ至１２．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内で、癌細胞生存力を５０％降下させることができる。他の実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、約１２．５ｍｃｇ／ｍｌ至２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内で、癌細胞生存力を５０％降下させることができる。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏのＩＣ５０は約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にあり、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１５ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にある。
【００２６】
他の形態では、本発明は、（ａ）複数の癌細胞を提供すること；と（ｂ）特定な条件で、ある量のテストインターフェロンで第一組の癌細胞を検測し、第一組の生存力データを生成すること；と（ｃ）同じ特定な条件で、有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で第二組の癌細胞を処理し、第二組の生存力データを生成すること；と（ｄ）第一組の生存力データと第二組の生存力データとを比較し、テストインターフェロンの効力を確定すること；とを含む化合物（例えば、テストインターフェロン）のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する癌細胞生存力への相対効力を確定又は比較する方法を提供する。
【００２７】
幾つかの実施形態では、約１日〜約６日の範囲内で癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約５０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは約７ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは約８ｍｃｇ／ｍｌ〜約１２．５ｍｃｇ／ｍｌ；またさらに好ましくは約１０ｍｃｇ／ｍｌの範囲内の濃度でｒＳＩＦＮ−ｃｏを使用する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌの範囲内の濃度でｒＳＩＦＮ−ｃｏを使用する。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは特定な比活性を含む。
【００２８】
幾つかの実施形態では、本文に用いられる癌細胞は人腫瘍細胞と動物腫瘍細胞から選ばれる。幾つかの実施形態では、腫瘍細胞は肺腫瘍細胞、又は子宮頚腫瘍細胞、又は肝臓腫瘍細胞、又は結腸直腸腫瘍細胞、又は乳腺腫瘍細胞、又は肺腺腫瘍細胞、又は前立腺腫瘍細胞、又はウイルス誘発した腫瘍細胞又はウイルス転化した細胞である。幾つかの実施形態では、癌細胞はＡ５４９細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈ４６０細胞、Ｈ１２９９細胞、ヒーラ細胞、ＨＴ２９細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、ＳＷ４８０細胞とＳＷ６２０細胞の少なくとも一種から選ばれる。
【００２９】
幾つかの実施形態では、テストインターフェロンもインターフェロンであり、ｒＳＩＦＮ−ｃｏと異なる製造ロットから得られるインターフェロンを含む。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンのアミノ酸配列とｒＳＩＦＮ−ｃｏのアミノ酸配列（配列番号１）は少なくとも９０％の同一性を有し、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンをコードするヌクレオチド配列とｒＳＩＦＮ−ｃｏをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）は少なくとも９０％の同一性を有し、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の同一性を有する。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏは同じアミノ酸配列（配列番号１）を有し、且つ同じヌクレオチド配列（配列番号２）にコードされている。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏは実質的に同じ比活性を有する。幾つかの実施形態では、前記比活性は約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約１×１０９ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンは、配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入することを含む方法により得られる。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンは大腸菌宿主の中でポリヌクレオチド（配列番号２）を発現することにより作られ、好ましくは、大腸菌宿主の中でＰＢＡＤプロモーターの制御で発現される。
【００３０】
他の形態では、本発明は、（例えば、腫瘍転移中に発生する）細胞転移を抑制する方法を提供し、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露し、細胞転移を抑制することを含む。
【００３１】
幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの有効量は、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは約８ｍｃｇ／ｍｌ〜約５０ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは約１２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌを含む。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの有効量は、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌを含む。
【００３２】
他の形態では、本発明は、癌細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露することにより、偽足形成を抑制することを含む癌細胞における偽足形成を抑制する方法を提供する。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの有効量は、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ、好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌを含む。
【００３３】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露することを含む細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦ−媒介転写活性を抑制する方法を提供する。幾つかの実施形態では、レポーターシステムにより、好ましくは、ルシフェラーゼレポーターシステムにより、β−カテニン／ＴＣＦ−媒介転写活性を確定する。幾つかの実施形態では、レポーターシステムはＴＯＰＦｌａｓｈレポーターシステムである。幾つかの実施形態では、プラスミドｐＳＶ４０−ＲＬを使用する。
【００３４】
他の形態では、本発明はさらに、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露することを含む細胞におけるβ−カテニンの蛋白レベルを降下する方法を提供する。幾つかの実施形態では、β−カテニンの特異性抗体を使用し、ウエスタンブロットを介してβ−カテニンの蛋白レベルを検測する。幾つかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコントラストとして用いる。
【００３５】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露することにより、Ｗｎｔ関連受容体又は共受容体をダウンレギュレーションすることを含む細胞におけるＷｎｔ関連受容体又は共受容体の発現をダウンレギュレーションする方法を提供する。幾つかの実施形態では、Ｗｎｔ関連受容体又は共受容体はＬＲＰ蛋白、例えばＬＲＰ６を含む。幾つかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の受容体又は共受容体はＦＺＤ蛋白、例えばＦＺＤ６を含む。幾つかの実施形態では、Ｗｎｔ関連受容体又は共受容体の発現の確定は、これらの受容体又は共受容体のｍＲＮＡレベルの確定を含む。幾つかの実施形態では、これらのｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを調製することにより、これらのｍＲＮＡレベルを確定する。
【００３６】
他の形態では、本発明は、細胞におけるある遺伝子（Ｗｎｔシグナル伝達経路の少なくとも一個の標的遺伝子を含む）の発現を抑制する方法、例えば標的遺伝子過度活発（ｏｖｅｒ−ａｃｔｉｖｅ）の疾病又は症状を治療する方法を提供する。これらのダウンレギュレーション遺伝子はＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、及び／又はＩＤ２を含む。該方法は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露することにより、標的遺伝子の発現を抑制することを含む。
【００３７】
本発明の幾つかの実施形態では、細胞がｒＳＩＦＮ−ｃｏに暴露される特定な時間が少なくとも約１２時間；好ましくは、少なくとも約２０時間；さらに好ましくは、少なくとも約２４時間；さらに好ましくは、少なくとも約３６時間；さらに好ましくは、少なくとも約４８時間；さらに好ましくは、少なくとも約７２時間である。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理した細胞が癌細胞である。
【００３８】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露することにより、少なくとも一種の腫瘍抑制遺伝子の発現に対するアップレギュレーションを実現することを含む、細胞におけるある遺伝子（少なくとも一種の腫瘍抑制遺伝子を含む）の発現をアップレギュレーションする方法を提供する。幾つかの実施形態では、アップレギュレーションされた遺伝子は、ＤＫＫ３、ＫＬＦ４とＢＡＴＦ２の少なくとも一種を含む。幾つかの実施形態では、これらのｍＲＮＡレベルを測定することでアップレギュレーションされた遺伝子の発現を確定する。幾つかの実施形態では、ｃＤＮＡはこれらのｍＲＮＡにより合成され、これらの測定目的に合わせて好ましくは増幅される。
【００３９】
他の形態では、本発明は、少なくとも１種、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８又は９種の下記の（ａ）〜（ｉ）の活性において、テスト化合物とｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との間の実質的同等性を構築する方法を提供する。前記方法はそれらの活性を比較して実質的に同じ反応を示すことを含む。（ａ）いずれか１つの又はより多くの担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する抑制；（ｂ）癌細胞生存力に対する降下；（ｃ）癌細胞転移に対する抑制；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の発現に対する抑制；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する抑制；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する抑制；及び（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現に対するアップレギュレーション。幾つかの実施形態では、本発明は、少なくとも２種類の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供する；好ましくは、本発明は、少なくとも３種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供する；好ましくは、少なくとも４種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供する；さらに好ましくは、少なくとも５種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供する；さらに好ましくは、少なくとも６種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供する；さらに好ましくは、少なくとも７種又は８種又は９種の上記の活性において実質的同等性を構築することを提供する。
【００４０】
他の形態では、本発明は、テストインターフェロン効力を確定する、少なくとも一種のＷｎｔ−関連標的遺伝子の発現を抑制する、腫瘍抑制遺伝子をアップレギュレーションする、及び／又はＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６発現をダウンレギュレーションするための、（ａ）ｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物、及び（ｂ）本文に述べた一つ以上の方法を行うための取り扱い説明書とこれらの方法を行うための試薬の少なくとも一種を含む測定キットを提供する。これらの試薬はリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）又は緩衝剤を含んでもよい。幾つかの実施形態では、測定キットにおけるｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は特定な比活性を含む。
【００４１】
他の形態では、本発明は、いずれか１つの又はより多くの担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する抑制；癌細胞生存力に対する降下；癌細胞転移に対する抑制；癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制；癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の発現に対する抑制；癌細胞における偽足形成に対する抑制；癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する抑制；及び癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現に対するアップレギュレーションから選ばれる一種又は多種の活性、好ましくはそれらから選ばれる２、３、４、５、６、７、８又は９種の活性を含む、インターフェロン又はインターフェロン代用物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】図１は、実施例１に記載の処理を開始してから２１日間の間、人肝臓癌腫瘍ＳＭＭＣ−７７２１のヌードマウスにおける生長曲線を示し、平均相対腫瘍体積（ＲＴＶ）で表し、各組をＭＭＣ（５ｍｇ／ｋｇ）若しくは０．１５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくは０．１０ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくは０．０５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理し、又は賦形剤、生理食塩水（ＮＳ）（０．１５ｍｌ／マウス）で注射する。
【図２】図２は、実施例２に記載の２８日間処理期間での人子宮頚腫瘍のヌードマウスにおける生長曲線を示し、ＲＴＶで表し、各組をＭＭＣ（５ｍｇ／ｋｇ）若しくは０．１５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくは０．１０ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくは０．０５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理し、又は賦形剤、生理食塩水（０．１５ｍｌ／マウス）で注射する。
【図３】図３は、実施例３に記載の２８日間処理期間での人結腸腫瘍ＨＴ−２９のヌードマウスにおける生長曲線を示し、ＲＴＶで表し、各組をＭＭＣ（５ｍｇ／ｋｇ）若しくは０．１５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくは０．１０ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくは０．０５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．１５ｍｇ／マウスのＩＦＮα−２ｂで処理し、又は用賦形剤、生理食塩水（０．１５ｍｌ／マウス）で注射する。
【図４】図４は、実施例４に記載の２１日間処理期間での人肺腫瘍ＳＰＣ−Ａ４のヌードマウスにおける生長曲線を示し、ＲＴＶで表し、各組をＭＭＣ（５ｍｇ／ｋｇ）若しくは０．１５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくは０．１０ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ若しくは０．０５ｍｇ／マウスのｒＳＩＦＮ−ｃｏ、若しくは０．１５ｍｇ／マウスのＩＦＮα−２ｂで処理し、又は賦形剤、生理食塩水（０．１５ｍｌ／マウス）で注射する。
【図５Ａ】図５Ａは、０、０．２、０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５０、２５、５０と１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）の濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで４８時間処理した後、異なる腫瘍細胞の生存力に関する投与量反応曲線を示す。テスト細胞は、Ａ５４９肺腫瘍細胞（図５Ａ）である。結果はコントラスト細胞に対する細胞生存力の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。
【図５Ｂ】図５Ｂは、０、０．２、０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５０、２５、５０と１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）の濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで４８時間処理した後、異なる腫瘍細胞の生存力に関する投与量反応曲線を示す。テスト細胞は、ヒーラ子宮頚腫瘍細胞（図５Ｂ）である。結果はコントラスト細胞に対する細胞生存力の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。
【図５Ｃ】図５Ｃは、０、０．２、０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５０、２５、５０と１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）の濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで４８時間処理した後、異なる腫瘍細胞の生存力に関する投与量反応曲線を示す。テスト細胞は、ＣＬ−１肝臓腫瘍細胞（図５Ｃ）である。結果はコントラスト細胞に対する細胞生存力の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。
【図５Ｄ】図５Ｄは、０、０．２、０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５０、２５、５０と１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）の濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで４８時間処理した後、異なる腫瘍細胞の生存力に関する投与量反応曲線を示す。テスト細胞は、Ｈｕｈ−７肝臓腫瘍細胞（図５Ｄ）である。結果はコントラスト細胞に対する細胞生存力の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。
【図５Ｅ】図５Ｅは、０、０．２、０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５０、２５、５０と１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）の濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで４８時間処理した後、異なる腫瘍細胞の生存力に関する投与量反応曲線を示す。テスト細胞は、ＳＷ４８０結腸腫瘍細胞（図５Ｅ）である。結果はコントラスト細胞に対する細胞生存力の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。
【図５Ｆ】図５Ｆは、０、０．２、０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５０、２５、５０と１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）の濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで４８時間処理した後、異なる腫瘍細胞の生存力に関する投与量反応曲線を示す。テスト細胞は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺腫瘍細胞（図５Ｆ）である。結果はコントラスト細胞に対する細胞生存力の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。
【図５Ｇ】図５Ｇは、０、０．２、０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５０、２５、５０と１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）の濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで４８時間処理した後、異なる腫瘍細胞の生存力に関する投与量反応曲線を示す。テスト細胞は、Ｃａｌｕ−１肺腫瘍細胞（図５Ｇ）である。結果はコントラスト細胞に対する細胞生存力の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。
【図５Ｈ】図５Ｈは、０、０．２、０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５０、２５、５０と１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）の濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで４８時間処理した後、異なる腫瘍細胞の生存力に関する投与量反応曲線を示す。テスト細胞は、ＳＭＭＣ−７７２１肝臓腫瘍細胞（図５Ｈ）である。結果はコントラスト細胞に対する細胞生存力の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。
【図５Ｉ】図５Ｉは、０、０．２、０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５０、２５、５０と１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）の濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで４８時間処理した後、異なる腫瘍細胞の生存力に関する投与量反応曲線を示す。テスト細胞は、ＰＡＮＣ−１前立腺腫瘍細胞（図５Ｉ）である。結果はコントラスト細胞に対する細胞生存力の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。
【図６】図６は、１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ処理とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理をそれぞれ１、２、３、４、５と６日の所定日数で処理した後、Ａ５４９細胞（図６Ａ）とＳＷ６２０細胞（図６Ｂ）生存力に対する作用を示す生存力曲線である。細胞生存力はＭＴＴ法により評価される。結果はコントラスト細胞に対する細胞生存力の百分率として表され、少なくとも２つの独立した実験の平均値として表される。（＊＊ｐ＜０．０１）
【図７】図７は、Ｍｏｃｋコントラスト（図７、Ａ列）に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理（図７、Ｃ列）とＩＦＮα−２ｂ処理（図７、Ｂ列）がそれぞれ肺癌細胞Ａ５４９の３Ｄ培養中での４日後のコロニー形成（１行目）（１００×拡大）、及び８日後の偽足形成（２行目と３行目）（４００×拡大）に対する作用を示すミクロ写真である。Ａ列とＢ列における黒い矢印が癌細胞から突出する偽足を指す。Ｃ列における星印付きの矢印が偽足なしの細胞を指す。
【図８】図８は、ｍｏｃｋコントラストに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理とＩＦＮα−２ｂ処理が異なる肺癌細胞Ａ５４９（図８Ａ）、Ｈ１２９９（図８Ｂ）とＨ４６０（図８Ｃ）；及び異なる結腸癌細胞ＨＴ−２９（図８Ｄ）とＳＷ６２０（図８Ｅ）のβ−カテニン／ＴＣＦ−媒介転写活性に対する作用を示す棒グラフである。数値は３回の試験の平均値である。（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）
【図９】図９は、ｍｏｃｋコントラストに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理とＩＦＮα−２ｂ処理が異なる癌細胞Ａ５４９、Ｈ４６０、ＳＷ６２０とＨＴ−２９におけるＷｎｔ関連受容体又は共受容体ＬＲＰ６（図９Ａ）とＦＺＤ６（図９ｂ）の発現に対する作用を示す棒グラフ（ＧＡＰＤＨ発現に対するｍＲＮＡレベルにより測定される）である。３組で並行して実験を行い、結果をｍｏｃｋコントラスト組で正規化する。
【図１０】図１０は、ウエスタンブロットであり、それぞれ２４、４８と７２時間処理した後、ｍｏｃｋコントラストに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理とＩＦＮα−２ｂ処理が癌細胞Ａ５４９（図１０Ａ）とＳＷ４８０（図１０Ｂ）におけるβ−カテニンの蛋白レベルに対する作用を示す。ＧＡＰＤＨ発現はコントラストとして用いられる。３組で並行して実験を行う。
【図１１】図１１は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂでＡ５４９肺癌細胞を２４時間処理した後、ｍｏｃｋコントラストに比べて、Ｗｎｔシグナル伝達経路の下流である４種類の遺伝子の相対ｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフ：Ａｘｉｎ２（図１１Ａ）；ＣＤ２４（図１１Ｂ）；サバイビン（図１１Ｃ）；とＩＤ２（図１１Ｄ）である。３組で並行して実験を行い、ｍｏｃｋコントラスト組で正規化する。
【図１２】図１２は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで処理した後、ｍｏｃｋコントラストに比べて、異なる腫瘍細胞Ａ５４９、Ｈ４６０、ＳＷ６２０とＨＴ−２９における３種類の腫瘍抑制遺伝子ＤＫＫ−３（図１２Ａ）、ＢＡＴＦ２（図１２Ｂ）とＫＬＦ４（図１２Ｃ）の相対ｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。３組で並行して実験を行い、ｍｏｃｋコントラスト組で正規化する。
【図１３】図１３は、ｍｏｃｋコントラストに比べて、ＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理した後、Ａ５４９細胞（図１３Ａ）とＳＷ６２０細胞（図１３Ｂ）の腫瘍細胞転移を示す棒グラフである。結果はこの処理後の単位領域中の転移細胞平均数±ＳＤとして表される。（＊＊ｐ＜０．０１）
【図１４】図１４は、Ｍｏｃｋコントラストと５ＦＵ処理した細胞に比べて、Ａ５４９細胞（図１４Ａ）とＳＷ６２０細胞（図１４Ｂ）をＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで２４時間又は４８時間処理した後、それぞれ針でプロカスパーゼ−３、切断したカスパーゼ−３（ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３）、プロカスパーゼ−８（ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−８）、切断したカスパーゼ−８（ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−８）、ＰＡＲＰとβ−チューブリン（β−ｔｕｂｕｌｉｎ）の特異性抗体を染色して得られるウエスタンブロットを示す。
【図１５】図１５は、Ａ５４９細胞を１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ（図１５Ａ）、又は１０ｍｃｇ／ｍｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏ（図１５Ｂ）で処理した後、又はヒーラ細胞を１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ（図１５Ｃ）、又は１０ｍｃｇ／ｍｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏ（図１５Ｄ）で処理した後、針でＰ−ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ１、Ｐ−ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ２、Ｐ−ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３とＧＡＰＤＨの特異性抗体を染色して得られるウエスタンブロットをである。
【図１６】図１６は、ＰＢＳ処理したコントラストに比べて、処理を開始してからの２７日間で、ＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理した後、腫瘍生長に対する抑制を示す腫瘍生長曲線である。データは平均腫瘍体積（ｍｍ３）±ＳＤ（ｎ＝８）として表される。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
定義
特に断りのない限り、本文に用いられる科学と技術用語は、当業者がそれらに与える意味又は当業者が通常に理解する意味を有する。
【００４４】
また、特に断りのない限り、単数形は複数を含み、複数形は単数を含む。
【００４５】
また、特に断りのない限り、本文に用いられる用語「又は（ｏｒ）」は「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。
【００４６】
本文に用いられる用語「化合物」とは、あらゆる蛋白（あらゆる抗体、あらゆる活性抗体断片、とあらゆる二量体蛋白又は多量体蛋白を含む）、ポリペプチド、小分子、及び一種又は多種の生物学活性を有する他の分子を指す。
【００４７】
本文に用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ  ｏｒ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は広義的に解読されて制限されず、「である（ｉｓ  ｏｒ  ａｒｅ）」という意味を含む。
【００４８】
本文に用いられる用語「症状」と「疾病」は互換して使用しても併用しても良く、被験者の疾病、感染、炎症、癌症、治療による副作用、又は悪い健康状況の他の成因を示す。
【００４９】
本文に用いられる用語「有効量」は、所望の効果を奏する、例えば細胞生存力を降下させる、蛋白の発現又は活性をダウンレギュレーション又はアップレギュレーションする、又は疾病或いは病症を治療する量を意味する。
【００５０】
本文に用いられる用語「実質的同等性を構築する」とは、ある又は幾つかの測定を行うことで実質的に同じレベルの反応、活性、有効性又は結果を示し、実験誤差の制限内（例えば、±標準差（ＳＤ））にある。
【００５１】
本文に用いられる用語「実質的に同じ」とは、少なくとも約７０％が同じ；好ましくは、少なくとも約８０％が同じ；さらに好ましくは、少なくとも約９０％が同じ；さらに好ましくは、少なくとも約９５％が同じであることを意味する。
【００５２】
本文に用いられる用語「約・・・の範囲」又は「約・・・の間の範囲」は、該範囲内の数、及びこの特定な範囲内のすべての一位と小数点を意味する。例えば、「約４×１０８ＩＵ／ｍｇと約５×１０８ＩＵ／ｍｇとの間の範囲」は４×１０８ＩＵ／ｍｇ、４．１×１０８ＩＵ／ｍｇ、４．２×１０８ＩＵ／ｍｇ、４．３×１０８ＩＵ／ｍｇ、４．４×１０８ＩＵ／ｍｇ等を含み、且つ「８ｍｃｇ／ｍｌ〜２０ｍｃｇ／ｍｌ」は９ｍｃｇ／ｍｌ、１０ｍｃｇ／ｍｌ等を含む。
【００５３】
本文に用いられる用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ  ｏｒ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は非限定的に理解すべきであり、且つ所定の元素及び非所定の元素も含む。
【００５４】
本文に用いられる用語「インターフェロン」又は「ＩＦＮ」はあらゆる自然的にある又は人為的に発生させるインターフェロンを意味し、題名が「複合人白血球インターフェロン」のアメリカ特許４，６９５，６２３に記載の複合インターフェロンα、及びｒＳＩＦＮ−ｃｏを含む。
【００５５】
本文に用いられる用語「インターフェロン活性」は、自然的にあるインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏの特徴としての一種又は多種の生物学活性、例えば抗腫瘍活性及び／又は抗ウイルス活性を意味する。
【００５６】
本文に用いられる用語「ｒＳＩＦＮ−ｃｏ」はコンテキストに応じて、アメリカ特許７，３６４，７２４とアメリカ特許７，５８５，６４７に記載したようなポリヌクレオチド配列とアミノ酸配列、又はその活性断片を有する蛋白又は核酸分子を意味する。前記アメリカ特許７，３６４，７２４とアメリカ特許７，５８５，６４７に記載のポリヌクレオチド配列とアミノ酸配列は以下の通りである。
【００５７】
【化１】
0006768507.tif 000002
【００５８】
本文に用いられる用語「ｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物」とは、ｒＳＩＦＮ−ｃｏに対して効力を測定した又は測定しようとする、テスト化合物の効力又は活性の確定で比較する目的でｒＳＩＦＮ−ｃｏの代わりに使用できる任意の化合物を意味する。ｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物はインターフェロン又はインターフェロン特性を有する化合物であっても良い。
【００５９】
本文に用いられる比活性は生物学活性と蛋白質含有量との比である。該生物学活性は、任意の本分野で慣用する相関生物学活性、例えば、中華人民共和国薬典２０１０版三部付録Ｘ  Ｃに公布している細胞病変抑制法により測定した生物学活性であっても良い。蛋白質含有量は本分野で慣用する任意の方法、例えば、中華人民共和国薬典２０１０版三部付録ＶＩ  Ｂに公布しているＬｏｗｒｙ法により測定できる。
【００６０】
本文に用いられる用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾病を完全又は一部治癒する、疾病の不進展を引き起こす又は誘発する、疾病又は病症の厳重さを改善又は降下させる、疾病再発を防止する、疾病再発の頻度を降下させる、疾病の副作用を減少する、疾病を緩和させる、健康状況を改善する全体感覚等を含む。
【００６１】
用語「Ｗｎｔ関連受容体又は共受容体」は、単独又は共同的にＷｎｔファミリー蛋白に結合し、細胞中の古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路又は非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路におけるシグナル伝達を誘発する一種又は多種分子を含む。該用語は、例えば、Ｗｎｔ共受容体であって、ＤＫＫ１と相互作用する低密度リポ蛋白受容体相関蛋白６であるＬＲＰ６；及びＷｎｔ−４配体の受容体とされる、Ｗｎｔシグナル伝達の受容体であるＦＺＤ６を含む。
【００６２】
本文に用いられる用語「Ｗｎｔシグナル伝達活性」とは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）ファミリーの受容体及びＬＲＰ５／ＬＲＰ６共受容体に結合することにより伝達するＷｎｔシグナル伝達カスケードであり、β−カテニンの放出及びその細胞核への転移を引き起こし、細胞活性化する。
【００６３】
本発明の発明者は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの投与又は治療による生物学作用を見出し、特に、製造過程で効力の一致性を必要とする場合、或いは薬物開発過程で効力を改善しようとする場合、これらの生物学作用はｒＳＩＦＮ−ｃｏ及び他の類似する特性を有するような化合物の効力の評価に用いられることを見出した。本発明の発明者はさらに、今まで未知の、ｒＳＩＦＮ−ｃｏを用いて治療する生物学作用を見出し、且つこれらの生物学作用は、特定な遺伝子をアップレギュレーション又はダウンレギュレーションする必要がある他の症状又は疾病の治療を含むｒＳＩＦＮ−ｃｏの他の用途に用いられる。
【００６４】
一つの形態では、本発明は、（１）前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供すること；と（２）同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、それぞれ以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれるいずれか一種又は多種の活性を測定することにより、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）のうち所定のいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は６種の活性が存在し、及び／又はテストインターフェロンは、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）のうち所定のいずれか一種又は多種の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有することを示すこと；とを含むテストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する相対効力を確定又は比較する方法を提供する。（ａ）いずれか１つの又はより多くの担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する抑制；（ｂ）癌細胞生存力に対する降下；（ｃ）癌細胞転移に対する抑制；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の発現に対する抑制；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する抑制；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する抑制；及び（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現に対するアップレギュレーション。
【００６５】
他の形態では、本発明は、（１）前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を提供すること；と（２）同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、それぞれ以下の（ａ）〜（ｉ）から選ばれるいずれか一種又は多種の活性を測定することにより、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）のうち所定のいずれか１種、又は２種、又は３種、又は４種、又は５種、又は６種の活性が存在し、及び／又はテストインターフェロンは（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）のうち所定のいずれか一種又は多種の活性が存在し、前記テストインターフェロンはｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物と実質的に効果が同等であることを示すこと；と含む、テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との間の実質的同等性を構築する方法を提供する。（ａ）いずれか１つの又はより多くの担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する抑制；（ｂ）癌細胞生存力に対する降下；（ｃ）癌細胞転移に対する抑制；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の発現に対する抑制；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する抑制；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する抑制；及び（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現に対するアップレギュレーション。好ましくは、テストインターフェロンで処理又は投与する場合、例えばＡ５４９細胞及び／又はＳＷ６２０細胞におけるインビトロ癌細胞生存力に対する降下の存在、及び例えばＡ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞とＨＴ−２９細胞のいずれか一種又は多種におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制の存在は、統計学的に有意であるように、そして好ましくは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達の付加的存在は、テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏとの間は実質的に効果が同等であることを示す。また好ましくは、例えば、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロンで適当な細胞を約１日〜約６日処理する場合、細胞生存力の測定を行うことができる。好ましくは、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞又はＨＴ−２９細胞のいずれか一種又は多種癌細胞において、β−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制を測定し、例えば、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロンでこれらの細胞を約２４時間処理する。好ましくは、ＳＴＡＴ蛋白、例えばＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２及び／又はＳＴＡＴ３のリン酸化の存在を測定することで、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を測定し、例えば約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロンでＡ５４９細胞又はヒーラ細胞を異なる時間、例えば約５、１５、３０、６０、１２０及び／又は２４０分間処理する。
【００６６】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも２種類の上記の活性、例えば、（ａ）と（ｂ）；（ａ）と（ｃ）；（ａ）と（ｄ）；（ａ）と（ｅ）；（ａ）と（ｆ）；（ａ）と（ｇ）；（ａ）と（ｈ）；（ａ）と（ｉ）；（ｂ）と（ｃ）；（ｂ）と（ｄ）；（ｂ）と（ｅ）；（ｂ）と（ｆ）；（ｂ）と（ｇ）；（ｂ）と（ｈ）；（ｂ）と（ｉ）；（ｃ）と（ｄ）；（ｃ）と（ｅ）；（ｃ）と（ｆ）；（ｃ）と（ｇ）；（ｃ）と（ｈ）；（ｃ）と（ｉ）；（ｄ）と（ｅ）；（ｄ）と（ｆ）；（ｄ）と（ｇ）；（ｄ）と（ｈ）；（ｄ）と（ｉ）；（ｅ）と（ｆ）；（ｅ）と（ｇ）；（ｅ）と（ｈ）；（ｅ）と（ｉ）；（ｆ）と（ｇ）；（ｆ）と（ｈ）；（ｆ）と（ｉ）；（ｇ）と（ｈ）；（ｇ）と（ｉ）；（ｈ）と（ｉ）を測定する。
【００６７】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも３種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）と（ｃ）；（ａ）、（ｂ）と（ｄ）；（ａ）、（ｂ）と（ｅ）；（ａ）、（ｂ）と（ｆ）；（ａ）、（ｂ）と（ｇ）；（ａ）、（ｂ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）と（ｄ）；（ａ）、（ｃ）と（ｅ）；（ａ）、（ｃ）と（ｆ）；（ａ）、（ｃ）と（ｇ）；（ａ）、（ｃ）と（ｈ）；（ａ）、（ｃ）と（ｉ）；（ａ）、（ｄ）と（ｅ）；（ａ）、（ｄ）と（ｆ）；（ａ）、（ｄ）と（ｇ）；（ａ）、（ｄ）と（ｈ）；（ａ）、（ｄ）と（ｉ）；（ａ）、（ｅ）と（ｆ）；（ａ）、（ｅ）と（ｇ）；（ａ）、（ｅ）と（ｈ）；（ａ）、（ｅ）と（ｉ）；（ａ）、（ｆ）と（ｇ）；（ａ）、（ｆ）と（ｈ）；（ａ）、（ｆ）と（ｉ）；（ａ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｇ）と（ｉ）；（ａ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）と（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）と（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）と（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｃ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｄ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｅ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｅ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｅ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）を測定する。
【００６８】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも４種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ａ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｈ）、（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）を測定する。
【００６９】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも５種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）を測定する。
【００７０】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも６種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）を測定する。
【００７１】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも７種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）を測定する。
【００７２】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、少なくとも８種の上記の活性、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）を測定する。
【００７３】
幾つかの実施形態では、上記の方法のステップ（２）において、同じ特定な条件で、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対して、すべての９種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）を測定する。
【００７４】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において、コントラストに比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．０５、好ましくは、ｐ＜０．０１、さらに好ましくは、ｐ＜０．００５、さらに好ましくは、ｐ＜０．００１、また好ましくは、ｐ＜０．０００５、またさらに好ましくは、ｐ＜０．０００１）、（ａ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。
【００７５】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定で使用される担癌動物モデルは、マウス、好ましくは、ヌードマウス、さらに好ましくは、ＢＡＬＢ／ｃ  Ａｎｕ／ｎｕマウスを含む。幾つかの実施形態では、前記マウス、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ  Ａｎｕ／ｎｕマウスは、約３〜約７週齢、好ましくは、約４〜約６週齢のマウスを含む。幾つかの実施形態では、前記マウス、例えば、ＢＡＬＢ／ｃＡ  ｎｕ／ｎｕマウスは、体重が約１５±２ｇ〜約３０±２ｇであり、好ましくは、約１９±２ｇ〜約２３±２ｇの範囲内にある。
【００７６】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）である体内癌細胞生長に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は、肝臓癌細胞、子宮頚癌細胞、結腸癌細胞と肺癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ａ）を測定するために用いられる癌細胞は、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、ヒーラ細胞、ＨＴ−２９細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞とＡ５４９細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、ＨＴ−２９細胞、ＳＰＣ−Ａ４細胞とＡ５４９細胞のいずれか一種又は多種を含む；さらに好ましくは、Ａ５４９細胞を含む。
【００７７】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の抑制作用の測定において、生理食塩水又はＰＢＳ、好ましくは、生理食塩水はコントラストとして用いられる。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇで；好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、さらに好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で投与する。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は一日おきに投与する。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は、約２週間〜約６週間；好ましくは、約３週間〜約４週間投与する。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるコントラストが、約０．０５ｍｌ〜約０．３０ｍｌ；好ましくは、約０．１０ｍｌ〜約０．２０ｍｌの量で投与する。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるコントラストは一日おきに投与する。幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定において担癌動物モデルに投与されるコントラストは約２週間〜約６週間；好ましくは、約３週間〜約４週間投与する。幾つかの実施形態では、腫瘍内にテストインターフェロン及び／又はコントラストを投与する。
【００７８】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定でＳＭＭＣ−７７２１細胞を使用する場合、コントラスト（例えば、生理食塩水）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えば約０．０５ｍｇと約０．１０ｍｇに対して、ｐ＜０．０５，好ましくは、約０．１５ｍｇに対して、ｐ＜０．０１）、（ａ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇで；好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、さらに好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で一日おきに投与され、約３週間続ける。
【００７９】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定でヒーラ細胞を使用する場合、コントラスト（例えば、生理食塩水）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えば、約０．１５ｍｇ、ｐ＜０．０５に対して、好ましくは、約０．０５ｍｇと約０．１０ｍｇに対して、ｐ＜０．０１）、（ａ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇで；好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、さらに好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で一日おきに投与され、約４週間続ける。
【００８０】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定でＨＴ−２９細胞を使用する場合、コントラスト（例えば、生理食塩水）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように、（例えば約０．１０ｍｇと約０．１５ｍｇに対して、ｐ＜０．０１，好ましくは、約０．０５ｍｇに対して、ｐ＜０．００１）、（ａ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇで；好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、さらに好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で一日おきに投与され、約４週間続ける。
【００８１】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定でＳＰＣ−Ａ４細胞を使用する場合、コントラスト（例えば、生理食塩水）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えば約０．０５ｍｇ、約０．１０ｍｇと約０．１５ｍｇに対して、ｐ＜０．０１）、（ａ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇで；好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、さらに好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で一日おきに投与され、約３週間続ける。
【００８２】
幾つかの実施形態では、活性（ａ）の測定でＡ５４９細胞を使用する場合、コントラスト（例えば、ＰＢＳ）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．０００１）、（ａ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は約０．０２ｍｇ〜約０．３０ｍｇで；好ましくは、約０．０５ｍｇ〜約０．１５ｍｇ、さらに好ましくは、約０．０７５ｍｇ〜約０．１０ｍｇの量で一日おきに投与され、約３週間続ける。
【００８３】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）である癌細胞生存力に対する降下の測定において、テストインターフェロンが約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲にある場合、癌細胞生存力を約５０％降下させ、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロンが少なくとも約２５ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、少なくとも約５０ｍｃｇ／ｍｌ，さらに好ましくは、少なくとも約７５ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは、少なくとも約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度にある場合、癌細胞生存力を実質的に検測できない程度まで降下させ、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。
【００８４】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の濃度は約０．２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の濃度は、０．２ｍｃｇ／ｍｌ、０．３９ｍｃｇ／ｍｌ、０．７８ｍｃｇ／ｍｌ、１．５６ｍｃｇ／ｍｌ、３．１３ｍｃｇ／ｍｌ、６．２５ｍｃｇ／ｍｌ、１２．５ｍｃｇ／ｍｌ、２５ｍｃｇ／ｍｌ、５０ｍｃｇ／ｍｌと１００ｍｃｇ／ｍｌの少なくとも２種以上の濃度を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、癌細胞を少なくとも約１日；好ましくは、少なくとも約２日処理する。
【００８５】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞、結腸癌細胞、子宮頚癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞と前立腺癌細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、肺癌細胞、結腸癌細胞、肝臓癌細胞、乳癌細胞と前立腺癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、ヒーラ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞とＰＡＮＣ−１細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞とＰＡＮＣ−１細胞のいずれか一種又は多種を含む。
【００８６】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、前記テストインターフェロンが約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約１２．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲で処理した後、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＰＡＮＣ−１細胞のいずれか一種又は多種の生存力を約５０％降下させ、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。
【００８７】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、前記テストインターフェロンが約１２．５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲で処理した後、Ａ５４９細胞、ヒーラ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、Ｃａｌｕ−１細胞とＳＭＭＣ−７７２１細胞のいずれか一種又は多種の生存力を約５０％降下させ、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。
【００８８】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、Ａ５４９細胞及び／又はＳＷ６２０細胞を使用する場合、コントラスト（例えば、ＩＦＮα−２ｂ）に比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．０１）、（ｂ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｂ）を測定するために用いられる癌細胞は約１日〜約１０日；好ましくは、約１日〜約６日処理される。
【００８９】
幾つかの実施形態では、活性（ｂ）の測定において、Ａｍ−Ｂｌｕｅ法又はＭＴＴ法により癌細胞生存力を測定する。
【００９０】
幾つかの実施形態では、活性（ｃ）の測定において、コントラストに比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．０１）、（ｃ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、前記コントラストは未処理のコントラスト（Ｍｏｃｋ）である。
【００９１】
幾つかの実施形態では、活性（ｃ）である癌細胞転移に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞はＡ５４９細胞とＳＷ６２０細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ法を利用して活性（ｃ）である癌細胞転移に対する抑制を測定する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｃ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間；好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。
【００９２】
幾つかの実施形態では、活性（ｄ）の測定において、コントラストに比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．０５，好ましくは、ｐ＜０．０１）、（ｄ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、前記コントラストは未処理のコントラスト（Ｍｏｃｋ）である。
【００９３】
幾つかの実施形態では、活性（ｄ）である癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞、ＨＴ−２９細胞とＳＷ６２０細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞とＳＷ６２０細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間；好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｄ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、β−カテニン／ＴＣＦの転写活性はレポーターシステムを用いて測定される。幾つかの実施形態では、前記レポーターシステムはＴＯＰＦｌａｓｈ又はｐＳＶ４０−ＲＬプラスミドを含む。
【００９４】
幾つかの実施形態では、活性（ｅ）の測定において、コントラストに比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えばｐ＜０．００５、好ましくは、ｐ＜０．００１、さらに好ましくは、ｐ＜０．０００５）、（ｅ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、前記コントラストは未処理のコントラスト（Ｍｏｃｋ）である。
【００９５】
幾つかの実施形態では、活性（ｅ）である癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーションを測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＳＷ６２０細胞とＨＴ−２９細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞、ＳＷ６２０細胞とＨＴ−２９細胞のいずれか一種又は多種を含む；さらに好ましくは、ＨＴ−２９細胞を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間；好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｅ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｅ）の測定において、ＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６のｍＲＮＡレベルを測定することによりＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現を確定する。幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡレベルを測定する時、ＧＡＰＤＨをコントラストとして用いる。
【００９６】
幾つかの実施形態では、活性（ｆ）の測定において、コントラストに比べて、テストインターフェロンは、統計学的に有意であるように（例えば、ｐ＜０．０００５、好ましくは、ｐ＜０．０００１）、（ｆ）のうち所定の活性が存在し、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。幾つかの実施形態では、前記コントラストは未処理のコントラスト（Ｍｏｃｋ）である。
【００９７】
幾つかの実施形態では、活性（ｆ）であるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の発現に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は肺癌細胞を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｆ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間；好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｆ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｆ）の測定において、Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及び／又はＩＤ２のｍＲＮＡレベルを測定することによりそれに対応する発現を確定する。幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡレベルを測定する時、ＧＡＰＤＨをコントラストとして用いる。
【００９８】
幾つかの実施形態では、活性（ｆ）の測定において、コントラストに比べて、テストインターフェロンが癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の少なくとも約３０％；好ましくは、少なくとも約４０％；さらに好ましくは、少なくとも約５０％；またさらに好ましく、少なくとも約６０％の発現を降下する場合、前記テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力有する又は実質的に効果が同等であるとみなされる。
【００９９】
幾つかの実施形態では、活性（ｇ）の測定において、前記テストインターフェロンが実質的に癌細胞における偽足形成を抑制する場合、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。ここで、「実質的に抑制」とは、少なくとも約６０％抑制する；好ましくは、少なくとも約７０％抑制する；さらに好ましくは、少なくとも約８０％抑制する；さらに好ましくは、少なくとも約９０％抑制する；またさらに好ましくは、少なくとも約９５％抑制する。
【０１００】
幾つかの実施形態では、活性（ｇ）である癌細胞における偽足形成に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は肺癌細胞を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約４日；好ましくは、少なくとも約８日処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、Ｍａｔｒｉｇｅｌで活性（ｇ）を測定するために用いられる癌細胞を培養する。
【０１０１】
幾つかの実施形態では、活性（ｈ）の測定において、前記テストインターフェロンが癌細胞におけるβ−カテニンレベルを顕著に降下させる場合、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。ここで、例えばウエスタンブロットにおいて処理前に比べて蛋白質を示すバンドが薄くなる又はなくなれば、処理した後に癌細胞におけるβ−カテニンレベルが顕著に降下する。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、活性（ｈ）である癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する抑制を測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞とＳＷ４８０細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｈ）の測定において、ウエスタンブロット法を利用してβ−カテニン発現に対する抑制を測定する。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約４８時間；好ましくは、少なくとも約７２時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｈ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、活性（ｉ）の測定において、ＩＦＮα−２ｂに比べて、前記テストインターフェロンが癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現をより効果的にアップレギュレーションできる場合、前記テストインターフェロンとｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は実質的に同じ効力を有する及び／又は実質的に効果が同等であることを示す。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、活性（ｉ）である癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現に対するアップレギュレーションを測定するために用いられる癌細胞は、肺癌細胞と結腸癌細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞は、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞、ＳＷ６２０細胞とＨＴ−２９細胞のいずれか一種又は多種を含む；好ましくは、Ａ５４９細胞とＳＷ６２０細胞のいずれか一種又は多種を含む。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞を少なくとも約２０時間処理する；好ましくは、少なくとも約２４時間処理する。幾つかの実施形態では、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で、活性（ｉ）を測定するために用いられる癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、活性（ｉ）の測定において、ＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４及び／又はＢＡＴＦ２のｍＲＮＡレベルを測定することによりそれに対応する発現を確定する。幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡレベルを測定する時、ＧＡＰＤＨをコントラストとして用いる。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、統計学的に有意であるとは、コントラストに比べて、ｐ値≦０．０５、又は≦０．０１、又は≦０．００５、又は≦０．００１、又は≦０．０００５、又は≦０．０００１である。
【０１０６】
幾つかの実施形態では、前記コントラストは、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で処理されず、又は生理食塩水あるいはＰＢＳで処理され、又はＩＦＮα−２ｂで処理され、又は前記コントラストが未処理コントラスト（Ｍｏｃｋ）である。
【０１０７】
一つの形態では、本発明は、（ａ）複数濃度のテストインターフェロンを提供すること；と（ｂ）該複数濃度のテストインターフェロンを用いて、特定な条件で、第一組の癌細胞生存力に対するテストインターフェロンの第一投与量反応を確定すること；と（ｃ）複数濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏの代用物（以下、「ｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物」と呼ばれる）を提供すること；と（ｄ）該複数濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物を用いて、同じ特定な条件で、第二組の癌細胞生存力に対するｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物の第二投与量反応を確定すること；と（ｅ）第一投与量反応と第二投与量反応を比較すること；とを含む、化合物（例えば、テストインターフェロン）の効力を確定又は比較する方法を提供する。このように、化合物、例えばテストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に対する相対効力を確定する。
【０１０８】
本発明の幾つかの実施形態では、大腸菌宿主において、好ましくは大腸菌宿主におけるプロモーターＰＢＡＤの制御で新しいポリヌクレオチド（配列番号２）を発現して、アメリカ特許７，３６４，７２４（組換え高効複合インターフェロン）に記載したようなｒＳＩＦＮ−ｃｏ（配列番号１）を調製する。本発明の幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列を大腸菌に導入することを含む方法により得られる。本発明の幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが配列番号１のアミノ酸配列を有し、配列番号２のヌクレオチド配列でコードされ、配列番号２のヌクレオチド配列にコードされないインターフェロン、例えばインターフェロンａｌｆａｃｏｎ−１（ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標））に比べて、前記インターフェロンはＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨｂｓＡｇ）とＢ型肝炎ウイルスｅ抗原（ＨｂｅＡｇ）の発現に対して増加した抑制活性を有する。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、本文方法に用いられるｒＳＩＦＮ−ｃｏは特定な比活性を有する。該比活性は、例えば、約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約１×１０９ＩＵ／ｍｇの範囲内であってもよい。幾つかの実施形態では、比活性が約４．４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約９×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、比活性が約５×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約８×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。幾つかの実施形態では、比活性が約６×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約７．５×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。好ましくは、比活性が約４×１０８ＩＵ／ｍｇ〜約５×１０８ＩＵ／ｍｇの範囲内にある。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、化合物の効力を確定又は比較する方法において、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏの濃度が約０．２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にある。幾つかの実施形態では、テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏの濃度は、０．２ｍｃｇ／ｍｌ、０．３９ｍｃｇ／ｍｌ、０．７８ｍｃｇ／ｍｌ、１．５６ｍｃｇ／ｍｌ、３．１３ｍｃｇ／ｍｌ、６．２５ｍｃｇ／ｍｌ、１２．５ｍｃｇ／ｍｌ、２５ｍｃｇ／ｍｌ、５０ｍｃｇ／ｍｌと１００ｍｃｇ／ｍｌの少なくとも２種以上の濃度を含む。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、本文に用いるｒＳＩＦＮ−ｃｏ効果を確定する方法における細胞は癌細胞であり、人細胞か動物細胞である。テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで細胞を少なくとも約２４時間、好ましくは少なくとも約４８時間、且つさらに好ましくは、少なくとも約７２時間処理し、特に断りのない限り、標準培養条件で、完全培地において、３７℃で、５％ＣＯ２雰囲気中で処理する。培地は、腫瘍細胞の培養に適するあらゆる標準完全培地であってもよく、例えば、１０％胎児牛血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、４ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンと５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されているＳｈａｎｇｈａｉ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（中国上海）の培地から入手できる。ＩＦＮα−２ｂは上海華新生物高技術株式会社（中国上海）から入手でき、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは四川輝陽生命工程株式会社（中国成都）から入手できる。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、本発明は、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内で（癌細胞のタイプに依存）、癌細胞生存力を５０％降下させる能力を有するｒＳＩＦＮ−ｃｏを提供する。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ至１２．５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内で細胞の生存力を５０％降下できる。他の実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは約１２．５ｍｃｇ／ｍｌ至２５ｍｃｇ／ｍｌの濃度範囲内で細胞生存力を５０％降下できる。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏのＩＣ５０が約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にある。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、テストインターフェロンもインターフェロンであるが、比較で使用するｒＳＩＦＮ−ｃｏと異なる製造ロットより得られる。
【０１１４】
したがって、例えば、テストインターフェロンなどの化合物の効力を確定する時、テストインターフェロンが数種の濃度に希釈され、使用される容器に適する一定数の調製細胞（例えば、１００μＬ完全培地における５×１０３細胞）、及びこれらの数種の濃度のテストインターフェロンを共に一定時間、例えば４８時間インキュベートする。インキュベートした後、細胞の生存力を確定し、同様にテストインターフェロンではなく、ｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理した細胞生存力と比較する。結果より、それぞれのテストインターフェロンで処理した細胞及びｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理した細胞の投与量反応曲線が作られ比較できる。このように、５０％有効投与量又はＩＣ５０の面で、テストインターフェロンのｒＳＩＦＮ−ｃｏに対する相対効力を確定できる。
【０１１５】
他の形態では、本発明は、（ａ）複数の癌細胞を提供すること；と（ｂ）特定な条件で、一定量のテストインターフェロンで第一組の癌細胞を測定し、第一組の生存力データを生成すること；と（ｃ）同じ特定な条件で、有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物で第二組の癌細胞を処理し、第二組の生存力データを生成すること；と（ｄ）第一組の生存力データと第二組の生存力データとを比較することにより、テストインターフェロンの効力を確定すること；とを含む、化合物（例えば、テストインターフェロン）のｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物に比較する癌細胞生存力に対する効力を確定又は比較する方法を提供する。
【０１１６】
幾つかの実施形態では、約１日〜約６日の範囲内で癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、約６．２５ｍｃｇ／ｍｌ〜約５０ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは約７ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ；また好ましくは約８ｍｃｇ／ｍｌ〜約１２．５ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは約１０ｍｃｇ／ｍｌの範囲内の濃度でｒＳＩＦＮ−ｃｏを使用する。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは特定な比活性を含む。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、本文に用いられる癌細胞は人腫瘍細胞と動物腫瘍細胞から選ばれる。幾つかの実施形態では、腫瘍細胞は肺腫瘍細胞、又は子宮頚腫瘍細胞、又は肝臓腫瘍細胞、又は結腸腫瘍細胞、又は乳腺腫瘍細胞、又は肺腺腫瘍細胞、又は前立腺腫瘍細胞、又はウイルス誘発した腫瘍細胞又はウイルス転化した細胞である。幾つかの実施形態では、癌細胞はＡ５４９細胞、Ｃａｌｕ−１細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈ４６０細胞、Ｈ１２９９細胞、ヒーラ細胞、ＨＴ２９細胞、Ｈｕｈ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＲＡＷ２６４．７細胞、ＳＭＭＣ−７７２１細胞、ＳＷ４８０細胞とＳＷ６２０細胞の少なくとも一種から選ばれる。
【０１１８】
したがって、例えば、テスト容器に適する適当な体積における一定数の癌細胞、例えば、１００μＬ完全培地における２×１０３細胞を、９６ウェルプレートに置き、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理し、又は処理せずにコントラストとし、処理する場合１、２、３、４、５又は６日持続し、未処理コントラスト組の生存力に対する処理した細胞の生存力を毎日確定する。実験終了時、未処理コントラスト組の生存力に対する処理細胞の生存力は、インターフェロン処理の日数に対してプロットできる。このように、テスト化合物が癌細胞生存力を降下させる能力を比較でき、ｒＳＩＦＮ−ｃｏに対する相対効力を確定できる。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露し、細胞転移を抑制することを含む、（例えば腫瘍転移中で発生した）細胞転移を抑制する方法を提供する。
【０１２０】
幾つかの実施形態では、本文に言及した腫瘍細胞のような細胞をｒＳＩＦＮ−ｃｏに暴露することは、インビトロ又はインビボで、有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏが存在したままで細胞を３７℃で一定時間（例えば２４時間）インキュベートすることにより、又は動物或いは被験者に有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏを投与することで一定濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏを所望の効果を得るために十分な時間保持することにより、実施できる。上述した所望の効果は、例えば転移中の腫瘍細胞転移に対する抑制、又は偽足生成に対する抑制、β−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制、β−カテニンの発現に対する抑制、Ｗｎｔ関連受容体及び／又は共受容体に対するダウンレギュレーション、Ｗｎｔシグナル伝達下流標的遺伝子に対するダウンレギュレーション、腫瘍抑制遺伝子に対するアップレギュレーション、及び本文に記載している他の状況である。
【０１２１】
任意の適当な市販のキットを用いて細胞転移検測を行ってもよい。例えば、ここで、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）の２４ウェルプレートにセットされている微孔膜を含む８μｍインサート（ｉｎｓｅｒｔ）を使用できる。この測定について、３７℃のＦＢＳを含有しない温熱炭酸水素塩類培地をインサートの内部及びウェルの底部に添加し、加湿された組織培養インキュベーターにおいて３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気で約２時間復水した。復水した後、注意深く培地を除去し、約０．５×１０４細胞／インサートの密度で、約５００μＬのＦＢＳを含有しない培地に混合懸濁し調製される細胞（例えば３７℃でｒＳＩＦＮ−ｃｏで２４時間予め処理した細胞）をインサートフィルターの上側に接種する。その後、２４ウェルプレートの下室に５００μＬの１０％ＦＢＳを含有する完全培地を添加しても良い。そして、３７℃で細胞／インサート／プレートを約２４時間インキュベートし、例えば綿棒で室膜の上側にある非転移細胞を除去できる。転移細胞を含有する培養インサートの下表面は例えば４％のパラホルムアルデヒドで固定し、２％クリスタルバイオレットで染色することができる。室膜と反対側にある転移細胞の数量をカウントし、単位領域の平均転移細胞数を確定できる。このように、テストインターフェロンの腫瘍細胞転移を抑制する能力を示すことができる。
【０１２２】
幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの有効量は、約５ｍｃｇ／ｍｌ〜約１００ｍｃｇ／ｍｌ；好ましくは約８ｍｃｇ／ｍｌ〜約５０ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜約２５ｍｃｇ／ｍｌ；さらに好ましくは約１２ｍｃｇ／ｍｌ〜約１８ｍｃｇ／ｍｌを含む。
【０１２３】
他の形態では、本発明は、癌細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露することにより、偽足形成を抑制することを含む癌細胞における偽足形成を抑制する方法を提供する。
【０１２４】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに特定な時間暴露することを含む細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦ−媒介転写活性を抑制する方法を提供する。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、ルシフェラーゼレポーターシステムを用いてβ−カテニン／ＴＣＦ−媒介転写活性を確定できる。幾つかの実施形態では、レポーターシステムはＴＯＰＦｌａｓｈレポーターシステムである。幾つかの実施形態では、プラスミドｐＳＶ４０−ＲＬを使用する。したがって、例えば、テストしようとする細胞を９６ウェルプレート上に敷き、例えばウェル毎に約１×１０４細胞、３７℃で約１２時間インキュベートし、そして、約１００ｎｇのＴＯＰＦｌａｓｈ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で瞬時トランスフェクションする。トランスフェクションの効率を標準化するために、さらに１ｎｇのＳＶ４０プロモーターにより駆動される内部コントロールレポーターウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａｒ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ（ｐＲＬ−ＳＶ４０，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で細胞をコトランスフェクションする。６時間トランスフェクションした後、インビトロ分析に用いる細胞をｒＳＩＦＮ−ｃｏで約２４時間処理しても良い。インビトロ分析のためのｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理の後又はインビボ分析のためのトランスフェクションの後、デュアルルシフェラーゼエッセイシステムキット（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔ）をメーカーのマニュアル（Ｃａｔ＃：Ｅ１９６０，Ｐｒｏｍｅｇａ）に従ってルシフェラーゼ検測を行うことができる。相対ルシフェラーゼ活性はホタルルシフェラーゼ／ウミシイタケルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙ／ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性の比率として確定できる。
【０１２６】
他の形態では、本発明はさらに、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに特定な時間暴露することを含む細胞におけるβ−カテニンの蛋白レベルを降下させる方法を提供する。幾つかの実施形態では、その特異性抗体を用いてウエスタンブロットによりβ−カテニンの蛋白レベルを測定する。幾つかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコントラストとして用いる。
【０１２７】
細胞（細胞はインビトロ培養又はインビボ腫瘍サンプルに由来する）におけるβ−カテニンレベルを確定するウエスタンブロット分析について、標準ステップが用いられる。例えば、全細胞蛋白は抽出試薬（Ｃａｔ＃：Ｐ００１３）を利用してメーカーのマニュアル（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｃｈｉｎａ）に従って抽出できる。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌｏｗｒｙ蛋白検測システムにより蛋白濃度を確定できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより１０％〜１２％ゲルで全蛋白を分離し、そして０．４５μｍの硝酸セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）上に転移することができる。該膜はブロッキング緩衝液（５％牛血清白蛋白、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて４℃で徹夜ブロックでき、そして一次抗体（１：１０００に希釈）とともにインキュベートし、そしてＨＲＰ結合の二抗とインキュベートする。抗体はどの販売会社から購入してもよく、例えば以下の抗体を用いることができる：マウスモノクローナルβ−カテニン抗体（１：１０００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、マウスモノクローナルＧＡＰＤＨ抗体（１：２０００，Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ）と抗マウスＨＲＰ結合の二抗（１：２０００，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等。冷光／蛍光イメージングＬＡＳ４０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）及びｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ化学発光基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いてブロットを可視化することができる。
【０１２８】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露することにより、Ｗｎｔ関連受容体又は共受容体をダウンレギュレーションすることを含む、細胞におけるＷｎｔ関連受容体又は共受容体の発現をダウンレギュレーションする方法を提供する。幾つかの実施形態では、Ｗｎｔ関連受容体又は共受容体はＬＲＰ蛋白、例えばＬＲＰ６を含む。幾つかの実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達受容体又は共受容体はＦＺＤ蛋白、例えばＦＺＤ６を含む。上述した通り、細胞をｒＳＩＦＮ−ｃｏに暴露する方法はインビトロ方法又はインビボ方法であっても良い。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、Ｗｎｔ関連受容体又は共受容体の発現を確定することはこれらの受容体又は共受容体のｍＲＮＡレベルを確定することを含む。任意の標準方法によりこれらのｍＲＮＡレベルを確定できる。幾つかの実施形態では、これらのｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを調製してこれらのｍＲＮＡレベルを確定する。例えば、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、メーカーの取り扱い説明書によって全ｍＲＮＡを分離することができる。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＲＴ−ＰＣＴキット（Ｃａｔ＃：ＦＳＱ−１０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いてメーカーの取り扱い説明書によって合成され、そしてＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｃａｔ＃：ＱＰＫ−２０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて定量的なＰＣＲ（ｑＰＣＲ）にさらされる。適当なプライマーを使用でき、例えば、ＬＲＰ６に用いられるプライマーは、センスプライマー：５’−ＴＧＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号４）；アンチセンスプライマー：５’−ＣＡＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号５）であってもよく、且つＦＺＤ６に用いられるプライマーは、センスプライマー：５’−ＧＣＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＴＴＡＧＴＣ−３’（配列番号６）；アンチセンスプライマー：５’−ＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＣ−３’（配列番号７）であっても良い。増幅プロトコールは、９５℃で１分間インキュベートし、４０サイクル（９５℃で、１５秒；６０℃で、１５秒；及び７２℃で、３０秒）であっても良い。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染料をＰＣＲ産物に結合することはＢｉｏ−Ｒａｄ検測システムでリアルタイムでモニターされ、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  ｍａｎａｇｅｒ  ２．１ソフトウェアで分析する。各条件についてサンプルを揃え、並行して行う。２−△△Ｃｔ法により、インターフェロン処理したサンプルとＭｏｃｋ未処理のサンプルとを比較し、倍率変化に対してプロットすることができる。ＧＡＰＤＨを標準化コントラストとして用いられる。該２−△△Ｃｔ法は、通常、リアルタイムの定量的なＰＣＲ実験からの遺伝子発現の相対変化を分析することに利用される。
【０１３０】
他の形態では、本発明は、細胞におけるある遺伝子（Ｗｎｔシグナル伝達経路の少なくとも一つの標的遺伝子を含む）の発現をダウンレギュレーションする方法、例えば標的遺伝子突然変異又は過度活発の疾病又は症状を治療する方法提供する。これらのダウンレギュレーション遺伝子は例えばＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビン及び／又はＩＤ２を含む。該方法は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露することにより、標的遺伝子の発現を抑制することを含む。ダウンレギュレーションの度合は標準技術、例えば前述したｑＰＣＲにより確定できる。例えば、これらのｑＰＣＲに対して、Ａｘｉｎ２に対して、センスプライマー：５’−ＣＧＴＧＧＡＴＡＣＣＴＴＡＧＡＣＴＴ−３’（配列番号８）とアンチセンスプライマー：５’−ＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＴＧＴＡ−３’（配列番号９）を用いることができる；ＣＤ２４に対して、センスプライマー５’−ＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１０）とアンチセンスプライマー５’−ＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡ−３’（配列番号１１）を用いることができる；サバイビンに対して、センスプライマー：５’−ＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＴＴＣＡＡＧ−３’（配列番号１２）とアンチセンスプライマー５’−ＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号１３）を用いることができる；及びＩＤ２に対して、センスプライマー５’−ＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１４）とアンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号１５）を用いることができる。
【０１３１】
本発明の幾つかの実施形態では、細胞がｒＳＩＦＮ−ｃｏに暴露する一定時間は少なくとも約１２時間；好ましくは、少なくとも約２０時間；また好ましくは、少なくとも約２４時間；さらに好ましくは、少なくとも約３６時間；さらに好ましくは、少なくとも約４８時間；さらに好ましくは、少なくとも約７２時間である。幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理した細胞は癌細胞である。
【０１３２】
他の形態では、本発明は、細胞を有効量のｒＳＩＦＮ−ｃｏに一定時間暴露することにより、少なくとも一種の腫瘍抑制遺伝子の発現に対するアップレギュレーションを実現することを含む、細胞におけるある遺伝子（少なくとも一種の腫瘍抑制遺伝子を含む）の発現をアップレギュレーションする方法を提供する。幾つかの実施形態では、アップレギュレーションする遺伝子はＤＫＫ３、ＫＬＦ４とＢＡＴＦ２の少なくとも一種を含む。標準技術により、これらの遺伝子のアップレギュレーション程度を確定できる。幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡレベルを測定することにより、アップレギュレーション遺伝子の発現を確定できる。幾つかの実施形態では、これらのｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成して好ましくは増幅させてこの測定目的に用いる。一つの実例として、増幅目的で、以下のプライマーを使用できる：ＢＡＴＦ２に対して、センスプライマー５’−ＣＡＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１６）とアンチセンスプライマー５’−ＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１７）；ＤＫＫ３に対して、センスプライマー５’−ＧＧＡＧＣＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１８）とアンチセンスプライマー５’−ＡＣＧＣＣＴＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１９）；ＫＬＦ４に対して、センスプライマー５’−ＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号２０）とアンチセンスプライマー５’−ＧＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＧ−３’（配列番号２１）。
【０１３３】
他の形態では、本発明は、少なくとも１種、好ましくは少なくとも２、３、４、５、６、７、８又は９種の下記の（ａ）〜（ｉ）の活性において、テスト化合物とｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との間の実質的同等性を構築する方法を提供する。前記方法は、それらの活性を比較して実質的に同じ反応を示すことを含む。（ａ）いずれか１つの又はより多くの担癌動物モデル体内の癌細胞生長に対する抑制；（ｂ）癌細胞生存力に対する降下；（ｃ）癌細胞転移に対する抑制；（ｄ）癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制；（ｅ）癌細胞におけるＬＲＰ６及び／又はＦＺＤ６の発現に対するダウンレギュレーション；（ｆ）癌細胞におけるＡｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の発現に対する抑制；（ｇ）癌細胞における偽足形成に対する抑制；（ｈ）癌細胞におけるβ−カテニン発現に対する抑制；及び（ｉ）癌細胞におけるＤＫＫ−３、ＫＬＦ−４とＢＡＴＦ２のいずれか一種又は多種の発現に対するアップレギュレーション。幾つかの実施形態では、本発明は、少なくとも２種類の上記の活性、例えば（ａ）と（ｂ）；（ａ）と（ｃ）；（ａ）と（ｄ）；（ａ）と（ｅ）；（ａ）と（ｆ）；（ａ）と（ｇ）；（ａ）と（ｈ）；（ａ）と（ｉ）；（ｂ）と（ｃ）；（ｂ）と（ｄ）；（ｂ）と（ｅ）；（ｂ）と（ｆ）；（ｂ）と（ｇ）；（ｂ）と（ｈ）；（ｂ）と（ｉ）；（ｃ）と（ｄ）；（ｃ）と（ｅ）；（ｃ）と（ｆ）；（ｃ）と（ｇ）；（ｃ）と（ｈ）；（ｃ）と（ｉ）；（ｄ）と（ｅ）；（ｄ）と（ｆ）；（ｄ）と（ｇ）；（ｄ）と（ｈ）；（ｄ）と（ｉ）；（ｅ）と（ｆ）；（ｅ）と（ｇ）；（ｅ）と（ｈ）；（ｅ）と（ｉ）；（ｆ）と（ｇ）；（ｆ）と（ｈ）；（ｆ）と（ｉ）；（ｇ）と（ｈ）；（ｇ）と（ｉ）；（ｈ）と（ｉ）において実質的同等性を構築すること提供する；好ましくは、本発明は、少なくとも３種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）と（ｃ）；（ａ）、（ｂ）と（ｄ）；（ａ）、（ｂ）と（ｅ）；（ａ）、（ｂ）と（ｆ）；（ａ）、（ｂ）と（ｇ）；（ａ）、（ｂ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）と（ｄ）；（ａ）、（ｃ）と（ｅ）；（ａ）、（ｃ）と（ｆ）；（ａ）、（ｃ）と（ｇ）；（ａ）、（ｃ）と（ｈ）；（ａ）、（ｃ）と（ｉ）；（ａ）、（ｄ）と（ｅ）；（ａ）、（ｄ）と（ｆ）；（ａ）、（ｄ）と（ｇ）；（ａ）、（ｄ）と（ｈ）；（ａ）、（ｄ）と（ｉ）；（ａ）、（ｅ）と（ｆ）；（ａ）、（ｅ）と（ｇ）；（ａ）、（ｅ）と（ｈ）；（ａ）、（ｅ）と（ｉ）；（ａ）、（ｆ）と（ｇ）；（ａ）、（ｆ）と（ｈ）；（ａ）、（ｆ）と（ｉ）；（ａ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｇ）と（ｉ）；（ａ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｄ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）と（ｅ）；（ｂ）、（ｄ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｂ）��（ｆ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）と（ｅ）；（ｃ）、（ｄ）と（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｃ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｄ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｅ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｅ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｅ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）において実質的同等性を構築することを含む；好ましくは、少なくとも４種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｄ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｅ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ａ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｅ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｈ）、（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｄ）、（��）、（ｆ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）において実質的同等性を構築することを含む；さらに好ましくは、少なくとも５種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｅ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ａ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）において実質的同等性を構築することを含む；さらに好ましくは、少なくとも６種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｆ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ａ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ��、（ｈ）と（ｉ）において実質的同等性を構築することを含む；さらに好ましくは、少なくとも７種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｇ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）において実質的同等性を構築することを含む；さらに好ましくは、少なくとも８種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｈ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）；（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）と（ｉ）；（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）と（ｉ）において実質的同等性を構築することを含む；又は好ましくは、すべての９種の上記の活性、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）と（ｉ）において実質的同等性を構築することを含む。
【０１３４】
他の形態では、本発明は、（ａ）ｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物、及び（ｂ）本文に述べた一つ以上の方法を行うための取り扱い説明書とこれらの方法を行うための試薬の少なくとも一種を含む測定キットを提供する。これらの試薬はリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）又は緩衝剤を含んでもよい。幾つかの実施形態では、測定キットにおけるｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物は特定な比活性を含む。
【０１３５】
幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロンはまた癌細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路によりシグナルを伝達する及び／又はｒＳＩＦＮ−ｃｏと共通ＩＦＮＡＲ１／２受容体をシェアすることにより、ｒＳＩＦＮ−ｃｏと実質的に等価である又はｒＳＩＦＮ−ｃｏと実質的に同じ効力を有する。幾つかの実施形態では、ＳＴＡＴファミリー、例えばＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２及び／又はＳＴＡＴ３に由来するリン酸化蛋白の存在を検測することで、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を介するシグナル伝達を検測する。幾つかの実施形態では、ウエスタンブロットによりこのような検測を行う。幾つかの実施形態では、癌細胞Ａ５４９及び／又はヒーラ細胞はこのような検測を行うために用いられる。幾つかの実施形態では、約１０ｍｃｇ／ｍｌのテストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで前記癌細胞を処理する。幾つかの実施形態では、前記テストインターフェロン又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで癌細胞を約５、１５、３０、６０、１２０及び／又は２４０分間処理する。幾つかの実施形態では、インターフェロンで処理した後、細胞蛋白を収集してウエスタンブロット分析に用いる。幾つかの実施形態では、ＧＡＰＤＨをコントラストとして用いる。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏ代用物との効果同等性又は相対効力を構築するために行われるテスト又は活動は、任意の慣例的な方法を用いてもよく、ここで挙げた方法に制限されることはない。
【実施例】
【０１３７】
ここで、以下の実施例により本発明をさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。本発明は、具体的に言及されていないが当業者にとって有用な任意の元素や限制が存在する又は存在しないままで行うことができる。さらに、ここで、本発明の説明は制限の意図がなく、特に断りのない限り、当業者に理解できる範囲で、記載された特徴、元素、又は限制の同等や変更、又はその一部の等同物又は変更を含むことは言うまでもない。本文に記載した概要を鑑みて、種々の他の実施形態を実施することができることは当然である。図面を組み合わせて、上述した内容より、具体的な説明と実施例及び添付の請求項に基づいて、本発明の他の目的、特徴、及び利点は、当業者にとって明白となる。
【０１３８】
すべてのデータは平均値±標準差（ＳＤ）を表す。ｔテスト（及びノンパラメトリックテスト）を用いて、異なる変化量の間の関係を分析する。ｐ＜０．０５である時、統計学的に有意である。
【０１３９】
実施例１．ｒＳＩＦＮ−ｃｏの人肝臓癌に対する活性
モデルとして人肝臓癌ＳＭＭＣ−７７２１を用いて本研究を行い、インビボシステムで人肝臓癌に対するｒＳＩＦＮ−ｃｏの活性と効力を示す。テスト物であるｒＳＩＦＮ−ｃｏの活性を、マイトマイシンＣ（「ＭＭＣ」）の活性と比較する。ｒＳＩＦＮ−ｃｏは无色液体であり、濃度が１ｍｇ／ｍｌであり、四川輝陽生命工程株式会社（中国成都）より提供される。テスト物を希釈せずに用いた。解凍して注射するまで４℃で貯蔵する。マイトマイシンＣ（「ＭＭＣ」）、ロット５０５  ＡＧＢ、濃度２ｍｇ／バイアル、Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（日本）より提供される。ＭＭＣを注射する時に生理食塩水で希釈される。
【０１４０】
アメリカ国立衛生研究院（ＮＩＨ）実験動物の管理と使用ガイドにより、動物実験を行った。
【０１４１】
用いられた動物は４〜６週齢の雄性ＢＡＬＢ／ｃＡ  ｎｕ／ｎｕマウスであり、重さが約２３±２ｇであり、上海薬物研究所（中国上海）より得られる。研究方案は上海薬物研究所の動物使用と管理委員会に審査され、基準制度を満たしており、研究を開始する前に委員会に批准された。研究に用いられるプロセスは、動物の不快感、痛苦や痛みを極力避ける又は最小化するように設計した。規定によれば、厳重な又は慢性的で緩和できない痛み又は苦痛を経験する動物を無痛で安楽死させる。６匹の動物を一つの籠に入れる。これらの動物の耳に穴を開ける識別法で耳標を付ける。室温２５℃±１℃で保持する。光照射は、１２時間オンで、１２時間がオフである。食物は不断給餌される。水ボトルで動物に、５μｍのフィルターでろ過した都市水道水を自由に飲めるように供給した。研究者と輝陽生命工程株式会社はいずれも何らの本発明の意向や目的を干渉又は影響する食品汚染又は水汚染がない。
【０１４２】
テスト物（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）と賦形剤コントラストをそれぞれ腫瘍内（ｉ．ｔ．）に投与する。動物のグループによって、処理毎にマウス一匹毎に０．０５ｍｌ〜０．１５ｍｌの体積でテスト物を投与する。ＭＭＣを１０μＬ（μｌ）／ｇで静脈（ｉ．ｖ．）投与する。マウス一匹毎に０．１５ｍｌの体積で生理食塩水を注射し、賦形剤コントラストとする。
【０１４３】
動物をランダムに処理組に分配する。最初に、すべての動物は一つの大きな動物籠に入れた。グループ分けて研究するために、それらは後に分けられ、各処理組を各籠に６匹の動物を入れる。各組の投与量や投与方案を表１に記載する。組１と組２はコントラスト組であり、第一回の処理後に一日おきに各動物に賦形剤を使用する。組３の動物は処理開始後の１日目と６日目に５ｍｇ／ｋｇの投与量でＭＭＣを投与する。組４、組５と組６の動物は第一回処理後にそれぞれ０．１５ｍｇ／マウス（組４）、又は０．１０ｍｇ／マウス（組５）又は０．０５ｍｇ／マウス（組６）に一日おきにｒＳＩＦＮ−ｃｏを投与する。研究の過程において、週に２回各腫瘍の長さと幅を測定することで、腫瘍生長をモニターする。研究の過程において、各動物を週に２回秤量した。
【０１４４】
各マウスに５×１０６個の細胞を皮膚下（ｓ．ｃ．）接種することにより、各動物に腫瘍である人肝臓癌ＳＭＭＣ−７７２１異種移植物を移入する。研究を開始する前に、異種移植物をヌードマウス中で２回継代する。無菌条件で、生長良好な腫瘍を１．５ｍｍ３の断片に切断し、トロカール針で一つのこのような断片を各匹の研究動物の右側腹部に注射する。腫瘍が１００ｍｍ３〜２００ｍｍ３の体積に達する時、マウスをランダムにコントラスト組又は処理組に分け、各組を表１に記載した投与量と日程に従って、賦形剤（組１と組２）、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ（組４、組５と組６）又はＭＭＣ（組３）を受けさせ、３週間続ける。マイクロキャリパーで各腫瘍のサイズ（長さと幅）を週に２回測る。公式Ｖ＝（長さ×幅２）／２により腫瘍体積（Ｖ）を計算する。各相対腫瘍体積（ＲＴＶ）は公式ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０により計算され、Ｖｔは測定当日の腫瘍体積であり、Ｖ０は一回目の処理当日の腫瘍体積である。テスト物又はコントラスト対象の治療効果をＴ／Ｃ（％）と抑制％で示し、Ｔ／Ｃ（％）は、公式：Ｔ／Ｃ（％）＝（処理組の平均ＲＴＶ／コントラスト組の平均ＲＴＶ）×１００％を用いる；抑制％は、公式：抑制％＝１００％−Ｔ／Ｃ％を用いる。
【０１４５】
【表１】
0006768507.tif 000003
【０１４６】
結果を表２と図１に示す。表２は、各処理組の０日目の初期腫瘍サイズ、２１日目の最終腫瘍サイズ及び計算された平均ＲＴＶ、Ｔ／Ｃ％と抑制％を示す。
【０１４７】
【表２】
0006768507.tif 000004
【０１４８】
表２は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏがすべての３つの測定薬量で活性を有し且つ効果的に人肝臓癌細胞の生長を抑制することを示す。２１日目（Ｄ２１）の平均ＲＴＶに対して、賦形剤コントラスト組が９．３６±３．９であり、ＭＭＣ処理組が５．０５±２．１であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４．１３±１．９であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４．５７±２．３であり、且つ０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４．９７±１．７である。２１日目（Ｄ２１）の抑制％：ＭＭＣ処理組が４７．１８％であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が５６．８０％であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が５２．２０％であり、且つ０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４８．１０である。各処理組と賦形剤コントラスト組との間のＲＴＶ差異は統計学的に有意であると確定される。
【０１４９】
図１は、各処理組が２１日の研究期間で、人肝臓癌ＳＭＭＣ−７７２１がヌードマウスでの生長進展（ＲＴＶより表される）を示し、処理を開始してから３、７、１０、１４、１７と２１日目の腫瘍測定結果を示す。結果は、７日目の前に各ＭＭＣ処理組とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組の腫瘍生長の遅延を示し、２１日目まで保持した。結果はさらに、より高いｒＳＩＦＮ−ｃｏ投与量でより大きな抑制傾向を示す。
【０１５０】
テスト物で処理した動物はいずれもテスト薬量に良く耐えられ、毒性又は体重軽減する徴がなかった。賦形剤組、ＭＭＣ処理組、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組と０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組の動物の平均体重（グラムで）は０日目（と２１日目）でそれぞれ、２２．７（２４．８）；２３．９（２５．４）；２３．７（２５．３）；２４．３（２６．２）；と２２．６（２４．４）である。
【０１５１】
実施例２．ｒＳＩＦＮ−ｃｏの人子宮頚癌に対する活性
この研究は、ヒーラ細胞をモデルとして、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの人子宮頚腫瘍治療に対する活性と効力を実証する。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが活性を有し、人子宮頚癌細胞の生長を効果的に抑制したことを示す。特に説明したこと以外、実施例１のように該研究を行った。まず、実施例１と類似する方法で、ヌードマウスに５×１０６個のヒーラ細胞を皮膚下接種して、生長良好な異種移植物をヌードマウス中で２回継代し、人子宮頚癌異種移植物を移入や調製する。その後、１．５ｍｍ３の断片を作って、ｓ．ｃ．方式で動物に移植する。動物の体重は投与初期の時、平均が１９±２ｇである。実施例１に比べて、用いられる動物がいずれも雌性である。各処理組の投与量や投与方案は実施例１と類似し、相違点は０日目から処理後の１と１３日目にＭＭＣを注射し、且つ研究を処理開始後に２８日続ける。
【０１５２】
結果は表３と図２に示される。表３は、計算された０日目と２８日目の平均ＴＶ、及び計算された平均ＲＴＶ、Ｔ／Ｃ（％）と抑制％を示す。２８日目（Ｄ２８）のＲＴＶに対して、賦形剤コントラスト組が１２．４５±４．４６であり、ＭＭＣ処理組が４．９７±１．８５であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が７．４２±１．９１であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が６．６４±２．０４であり、０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が６．６４±１．６０である。２８日目の抑制％に対して、ＭＭＣ処理組が６０．０８％であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４０．４０％であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４６．６７％であり、０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４６．６７％である。ＭＭＣ処理組、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組と０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組に対応するＴ／Ｃ（％）はそれぞれ３９．９２％、５９．６０％、５３．３３％と５３．３３％である。各処理組と賦形剤コントラスト組との間のＲＴＶ差異は統計学的に有意であると確定される。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはテスト動物における人子宮頚癌の生長を効果的に抑制したことを示す。
【０１５３】
【表３】
0006768507.tif 000005
【０１５４】
図２は、２８日の研究期間の各処理組のＲＴＶ進展を示し、処理を開始してから４、７、１１、１４、１８、２１、２５と２８日目に行われた腫瘍測定を反映する。結果より、７日目の前に各ＭＭＣ処理組とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組の人子宮頚腫瘍生長の遅延を示し、２８日目まで保持している。
【０１５５】
研究中のすべての動物はいずれもｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理に耐えられ、毒性現象がない。２８日の処理期間で極小の平均体重変化が観察された。
【０１５６】
実施例３．ｒＳＩＦＮ−ｃｏ対人結腸癌的活性
モデルとしてＨＴ−２９を用いてこの研究を行い、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの人結腸癌治療に対する活性と効力を実証した。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが活性を有し、人結腸癌細胞の生長を効果的に抑制したことを示す。特に説明したこと以外、実施例１のように該研究を行った。まず、実施例１と類似する方法で、ヌードマウスに５×１０６個のＨＴ−２９細胞を皮膚下接種して、生長良好な異種移植物をヌードマウス中で２回継代し、人子宮頚癌異種移植物を移入や調製する。その後、１．５ｍｍ３の断片を作って、ｓ．ｃ．方式で動物に移植する。動物の体重は投与初期の時、平均が２０±２ｇである。実施例１に比べて、この研究に用いられる動物がいずれも雌性である。各処理組の投与量や投与方案は実施例１に記載した通りであり、相違点は１日目と１０日目に組３に対してＭＭＣを投与し、且つ別途に組７を増加し、これらの組の各マウスを体積が０．１５ｍｌで投与量が０．１５ｍｇ／マウスのＩＦＮα−２ｂで処理し、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組と同様に１日おきに行い、処理を計４週間実施する。濃度が１．４１ｍｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂは輝陽生命工程株式会社に提供される。結果を表４と図３中に示す。
【０１５７】
【表４】
0006768507.tif 000006
【０１５８】
表４は、計算された０日目の初期平均ＴＶと２８日目の最終平均ＴＶ、及び計算された平均ＲＴＶ、Ｔ／Ｃ（％）と抑制％を示す。２８日目（Ｄ２８）のＲＴＶに対して、賦形剤コントラスト組が８．４１±２．８２であり、ＭＭＣ処理組が３．１２±１．１９であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４．５１±１．２５であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４．２２±０．８７であり、０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が３．２８±１．２５であり、ＩＦＮα−２ｂ処理組が６．２６±１．４３である。２８日目の抑制％に対して、ＭＭＣ処理組が６２．９％であり、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４６．３７％であり、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が４９．８２％であり、０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組が６１％であり、ＩＦＮα−２ｂ処理組が２５．５６％である。ＭＭＣ処理組、０．１５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組、０．１０ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組、０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組及びＩＦＮα−２ｂ処理組に対応するＴ／Ｃ（％）はそれぞれ３７．１０％、５３．６３％、５０．１８％、３９．００％と７４．４４％である。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏがＩＦＮα−２ｂよりも効果的に人結腸癌細胞の生長を抑制したことを示す。各処理組と賦形剤コントラスト組との間のＲＴＶ差異は統計学的に有意であると確定される。
【０１５９】
図３は２８日の研究期間で各処理組のＲＴＶで表される人結腸腫瘍生長に対する抑制を示し、処理を開始してからの３、７、１０、１４、１７、２１、２４と２８日目に作った腫瘍テストを反映する。結果より、７日目の前に各ＭＭＣ処理組とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組の人結腸腫瘍生長の遅延を示し、２８日目まで保持している。３種の投与量のｒＳＩＦＮ−ｃｏはいずれもＩＦＮα−２ｂより強い腫瘍生長抑制を生じる。
【０１６０】
実施例１と２と同様に、すべてのｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理した動物はいずれもテストの投与量に耐えられ、薬物毒性現象がなく、最小化の体重変化を示す。
【０１６１】
実施例４．ｒＳＩＦＮ−ｃｏの人肺癌に対する活性
ＳＰＣ−Ａ４をモデルとして用い、該研究を行ってｒＳＩＦＮ−ｃｏの人肺癌治療に対する活性と効力を実証する。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが人肺腫瘍生長に対して顕著な抑制を示し、且つｒＳＩＦＮ−ｃｏがＩＦＮα−２ｂよりも遥かに効果的である。特に説明したこと以外、実施例３のように該研究を行った。まず、実施例１と類似する方法で、テスト動物に注射する人異種移植物を移入や調製し、相違点はヌードマウスに２．５×１０６個のＳＰＣ−Ａ４細胞を皮膚下（ｓ．ｃ．）接種して、生長良好な腫瘍をヌードマウス中で２回継代することである。その後、１．５ｍｍ３の断片を作って、ｓ．ｃ．方式で動物に移植する。動物の体重は投与初期の時、平均が２２±２ｇである。実施例３に比べて、該研究に用いられる動物がいずれも雌性であり、且つ該研究は２１日間の処理を行う。各処理組の投与量や投与方案は実施例３に記載した通りであり、相違点は１と６日目に組３に対してＭＭＣを投与する。結果を表５と図４に示す。
【０１６２】
【表５】
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【０１６３】
図４は、２１日の研究期間で各処理組のＲＴＶで表される人肺腫瘍のヌードマウスにおける生長抑制を示し、処理を開始してから４、７、１１、１４、１８、と２１日目に行った腫瘍テストを反映する。結果は、７日目の前に各ＭＭＣ処理組とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組の腫瘍生長の遅延を示し、研究終了の２１日目まで保持している。１１日目からＩＦＮα−２ｂ処理組中で腫瘍抑制が観察された。ＩＦＮα−２ｂによる腫瘍生長抑制はいずれのｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組における腫瘍生長抑制よりも低く且つ統計学的に有意ではない（ｐ＞０．０５）。したがって、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＩＦＮα−２ｂよりも効果的に人肺癌細胞の生長を抑制する。
【０１６４】
０．０５ｍｇ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組における一匹のマウスが１７日目に原因不明で死亡した以外、実施例１〜３と同様に、すべての動物はいずれもテスト物のテスト薬量に耐えられ、毒性又は体重軽減の現象が観察されなかった。
【０１６５】
実施例５．ｒＳＩＦＮ−ｃｏは数種の人実体癌細胞生存力を降下した
細胞培養と試薬。人肺癌細胞系（Ａ５４９、Ｈ１２９９、Ｈ４６０、Ｃａｌｕ−１）、人肝臓癌細胞系（ＳＭＭＣ−７７２１、Ｈｕｈ−７、ＣＬ−１）、人子宮頚癌細胞系（Ｈｅｌａ）、人乳癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、人前立腺癌細胞系（ＰＡＮＣ−１）と人結腸癌細胞系（ＳＷ６２０、ＨＴ２９、ＳＷ４８０）はＳｈａｎｇｈａｉ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（中国上海）から購入される。以上の細胞系はいずれもＳｈａｎｇｈａｉ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎが配合した対応する完全生長培地で５％ＣＯ２と３７℃において培養され、該完全生長培地は１０％熱失活胎児牛血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有し、４ｍＭグルタミン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンと５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されている。完全生長培地は、Ａ５４９に対してＦ−１２Ｋ（ロットＧＮＭ２１１２７；杭州吉諾生物医薬技術株式会社）；ＳＷ６２０とＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対してＬ−１５（ロット４１３００−０３９，ＧＩＢＣＯ）；ＳＭＭＣ−７７２１、Ｈｅｌａ、Ｈｕｈ−７、ＣＬ−１とＰＡＮＣ−１に対してＤＭＥＭ（ロットＣ１１９９５，ＧＩＢＣＯ）；Ｈ４６０、Ｈ１２９９とＳＷ４８０に対してＲＭＰＩ−１６４０（ロットＣ１１８７５，ＧＩＢＣＯ）；ＨＴ−２９に対してＭａｃｒｏ５ａ（ロットＭ４８９２，Ｓｉｇｍａ）；Ｃａｌｕ−１に対してＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳである。
【０１６６】
９６ウェルプレートに１００μｌの完全培地中の約５×１０３個の細胞をウェル毎に入れ、徹夜インキュベートし、そしてそれぞれＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏを１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、３．１３μｇ／ｍｌ、１．５６μｇ／ｍｌ、０．７８μｇ／ｍｌ、０．３９μｇ／ｍｌと０．２０μｇ／ｍｌの濃度で約４８時間処理し、そして細胞を収集して分析する。ＳｕｎＢｉｏ  Ａｍ−Ｂｌｕｅ測定キット（Ｃａｔ＃：ＳＢＡＢ８０２５，Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＢＯ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ，中国上海）により細胞サバイビン率を評価する。そのマニュアルに準拠して、各ウェルに１０μｌのＡｍ−Ｂｌｕｅを添加する。その後、細胞を５％ＣＯ２と３７℃で４時間インキュベートする。９６ウェルプレートを３０秒振盪した後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏｎ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）により５７０ｎｍと５９５ｎｍ各ウェルの吸光率を読み取る。以下のように相対細胞生存力を計算する：細胞生存力＝（処理組（ＯＤ５７０−ＯＤ５９５）−空白（ＯＤ５７０−ＯＤ５９５））／（コントラスト組（ＯＤ５７０−ＯＤ５９５）−空白（ＯＤ５７０−ＯＤ５９５））×１００％、但し、コントラスト組が未処理細胞に対応する。結果を図５に示し、腫瘍細胞の生存力は未処理のコントラスト細胞に対する百分率として表される。各データ点は少なくとも２個の独立実験の平均値を表す。
【０１６７】
図５は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂ処理して癌細胞生存力を降下させる各癌細胞系（Ａ）−（Ｉ）の投与量反応曲線を示す。（Ａ）Ａ５４９細胞；（Ｂ）ヒーラ細胞；（Ｃ）ＣＬ−１細胞；（Ｄ）Ｈｕｈ−７細胞；（Ｅ）ＳＷ４８０細胞；（Ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞；（Ｇ）Ｃａｌｕ−１細胞；（Ｈ）ＳＭＭＣ−７７２１細胞；（Ｉ）ＰＡＮＣ−１細胞。
【０１６８】
結果より、最高のテスト濃度（１００μｇ／ｍｌ）でも、ＩＦＮα−２ｂがＡ５４９細胞、ヒーラ細胞、ＣＬ−１細胞、ＳＷ４８０細胞とＳＭＭＣ−７７２１細胞の生存力降下に対して効果が無いかほとんど効果がないことを示す。１００ｍｃｇ／ｍｌ（μｇ／ｍｌ）のＩＦＮα−２ｂでＨｕｈ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｃａｌｕ−１細胞とＰＡＮＣ−１細胞を処理する時、５０％未満の生存力降下が観察された。それに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは遥かに低い投与量で、投与量に依存する形で腫瘍細胞生存力を降下でき、ＳＷ４８０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とＰＡＮＣ−１細胞に対して、６．２５μｇ／ｍｌ〜１２．５μｇ／ｍｌの濃度で、及びＡ５４９細胞、ヒーラ細胞、ＣＬ−１細胞、Ｈｕｈ−７細胞、Ｃａｌｕ−１細胞とＳＭＭＣ−７７２１細胞に対して、１２．５μｇ／ｍｌ至２５μｇ／ｍｌの濃度で、５０％に近い細胞生存力降下に達成できる。通常、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが細胞生存力を降下するＩＣ５０は、異なる癌細胞に対して約１０ｍｃｇ／ｍｌ〜１８ｍｃｇ／ｍｌの範囲内にある。１００ｍｃｇ／ｍｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏで、いずれの癌細胞系に対しても細胞生存力が検測されない。したがって、各テスト濃度で、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはいずれもＩＦＮα−２ｂよりも効果的に腫瘍細胞生存力を降下する。
【０１６９】
実施例６Ａ．ｒＳＩＦＮ−ｃｏがＩＦＮα−２ｂよりも効果的に細胞生存力を降下させる。
ｒＳＩＦＮ−ｃｏが細胞生存力を降下させる能力を実証するために、Ａ５４９とＳＷ６２０腫瘍細胞（それぞれウェル毎に２×１０３個の細胞が１００μｌ完全培地中）を９６ウェルプレートに入れ、それぞれ１０μｇ／ｍｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで１〜６日間処理する。標準ＭＴＴ法（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド検測，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）により、細胞サバイビン率を評価する。該検測について、各ウェルに約２０μｌのＭＴＴ（４ｍｇ／ｍｌ）を加える。細胞を３７℃で４時間インキュベートする。その後、丁寧に各ウェルの上澄み液を除去してから、各ウェルに同体積（１５０μＬ）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えてクレードル上で徹底的に１５分間混合する。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｌｏｗｅｌｌ，ＭＡ）を用いて５９５ｎｍにおいて９６ウェルプレートの吸光度を読み取る。相対細胞生存力は以下のように計算される：細胞生存力＝（処理組（ＯＤ５９５）−空白（ＯＤ５９５））／（コントラスト組（ＯＤ５９５）−空白（ＯＤ５９５））×１００％。
【０１７０】
結果は未処理のコントラスト細胞に対する百分率として表す。各データ点は少なくとも２個の独立実験の平均値を表す。図６に示されるように、ＩＦＮα−２ｂに比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは時間に依存する形でＳＷ６２０細胞の細胞生存力を激しく降下させるが、ＩＦＮα−２ｂは有するとしても極弱い時間依存効果を有する。ｒＳＩＦＮ−ｃｏの時間依存性効果はＡ５４９細胞に対して、処理の約最初の３日間で顕著である。各細胞系に対して、各時間点で、ｒＳＩＦＮ−ｃｏとＩＦＮα−２ｂとの間の効果差異が統計学的に有意である（ｐ＜０．０１）。これらのデータはｒＳＩＦＮ−ｃｏの時間依存性の強い抗腫瘍効果を示す。
【０１７１】
実施例６Ｂ．ｒＳＩＦＮ−ｃｏがインビボで腫瘍生長を抑制する
ＮＩＨ実験動物の管理と使用ガイドにより該実験を行う。４〜５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスは上海実験動物センター（中国上海）より得られる。約５×１０６個のＡ５４９細胞を各マウスに皮膚下注射して異種移植腫瘍を移入する。動物をランダムに３組（各組８匹のマウス）に分け、ＰＢＳ（１ＸＰＢＳ，ｐＨ７．２−７．４）、各マウス１００μｇ／１００μｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏ又は各マウス１００μｇ／１００μｌのＩＦＮα−２ｂで一日おきに腫瘍内処理を計１２回行う。３日間毎に一回腫瘍を測定し、腫瘍体積は以下のように計算される：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（長さ×幅２）／２。結果を図１６に示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝８）として表す。結果より、ＰＢＳ処理組に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはほとんど完全に移入した腫瘍の生長（ｐ＜０．０００１）を抑制できることを実証した。しかし、ＩＦＮα−２ｂは顕著な腫瘍生長に対する抑制を示さない。結果より、インビボで腫瘍生長を抑制する面では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＩＦＮα−２ｂよりも有効であることを実証した。
【０１７２】
実施例６Ｃ．ｒＳＩＦＮ−ｃｏは三次元培養体系における腫瘍細胞のコロニー形成と偽足形成を抑制する
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｔ＃：３５６２３４）を４℃冷蔵庫で氷の上で徹夜解凍し、２４ウェルプレートを−２０℃で徹夜冷凍する。その後、１５０μｌの１．０ｍｇ／ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌで冷凍した２４ウェルプレートの各ウェルを塗布する。その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌが塗布された２４ウェルプレートを３７℃で２０−３０分間インキュベートする。肺癌細胞Ａ５４９をトリプシン化してカウントする。Ｍａｔｒｉｇｅｌが塗布されたウェルに、２％Ｍａｔｒｉｇｅｌ及び１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏを含有する又はコントラストとしてのインターフェロンを含有しないならし培地における約５×１０３個の細胞を接種する。これらの細胞を３７℃で少なくとも約８日間インキュベートする。３日間毎に一回約２００μｌの上記のならし培地を添加し、培地が乾かすのを防止する。４日目又は８日目に、写真を撮ってコロニーのサイズと偽足形成を観察する。実験は３組並行して行う。
【０１７３】
結果を図７に示す。４日間後、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組（図７Ｃ）は未処理組（図７Ａ）よりも小さいコロニーを有することを発見した。８日後、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組は３組のうち最小のコロニーを有するだけではなく、細胞の周囲にはほとんど突出する偽足がないことも発見し（図７Ｃ、第２と３行）、未処理組（図７Ａ、第２と３行）とＩＦＮα−２ｂ処理組（図７Ｂ、第２と３行）の細胞において、偽足形成が顕著である。該実験は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが癌細胞コロニーの生長を抑制できるだけではなく、癌細胞における偽足形成（転移に必須な特徴）も抑制できることを証明した。
【０１７４】
実施例７．ｒＳＩＦＮ−ｃｏのβ−カテニン／ＴＣＦの転写活性に対する抑制
β−カテニン／ＴＣＦ転写レポーターシステムテスト。ｒＳＩＦＮ−ｃｏのＷｎｔ／β−カテニンシグナル伝達に対するインビトロ作用を測定する。癌細胞を９６ウェルプレートに入れ（ウェル毎に１×１０４個の細胞）、１２個時間インキュベートし、そして１００ｎｇＴＯＰＦｌａｓｈ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）で瞬時トランスフェクションを行う。トランスフェクション効率を標準化するために、細胞を１ｎｇのＳＶ４０プロモーターに駆動される内部コントロールレポーターウミシイタケルシフェラーゼｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）でコトランスフェクションし、そして１０ｍｃｇ／ｍｌインターフェロンｒＳＩＦＮ−ｃｏ又はＩＦＮα−２ｂで６時間処理する又はトランスフェクションした後に処理せずにコントラスト（Ｍｏｃｋ）とする。インターフェロンで２４時間処理した後、メーカーのマニュアル（Ｃａｔ＃：Ｅ１９６０，Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って、デュアルルシフェラーゼエッセイシステムキットでルシフェラーゼ検測を行う。相対ルシフェラーゼ活性はホタルルシフェラーゼ活性／ウミシイタケルシフェラーゼ活性の比率として表される。実験は３組並行して行う。
【０１７５】
図８に示されるように、結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは人実体癌細胞におけるβ−カテニン／ＴＣＦに媒介される転写活性を降下することを示す。２４時間処理した後、３種の肺癌細胞（Ａ５４９、Ｈ１２９９、Ｈ４６０）と２種類の結腸癌細胞（ＨＴ−２９、ＳＷ６２０）において、β−カテニン／ＴＣＦに媒介される転写活性は著しくｒＳＩＦＮ−ｃｏに抑制されている（＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１）。しかし、Ａ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４６０細胞とＨＴ−２９細胞に対して、ＩＦＮα−２ｂは抑制作用が存在せず、反って増強作用をもたらす。
【０１７６】
簡単に言えば、コントラスト組、ＩＦＮα−２ｂ処理組とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組のホタルルシフェラーゼ活性／ウミシイタケルシフェラーゼ活性の比率はそれぞれ：（Ａ）Ａ５４９細胞に対して約３１０、約３５０と約１００である；（Ｂ）Ｈ１２９９細胞に対して約８００、約１０００と約５００である；（Ｃ）Ｈ４６０細胞に対して約４５０、約５００と約２８０である；（Ｄ）ＨＴ−２９細胞に対して約３００、約６００と約２００である；（Ｅ）ＳＷ６２０細胞に対して約１５００、約１２００と約１００未満である。該研究より、Ｗｎｔ／ＴＣＦシグナル伝達を抑制する面では、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＩＦＮα−２ｂより優れているため、その抗腫瘍効果もより優れている。
【０１７７】
実施例８．ｒＳＩＦＮ−ｃｏが癌細胞におけるβ−カテニンの蛋白レベルを降下させる
癌細胞Ａ５４９とＳｗ４８０を約８５％の集密度まで培養して６ウェルプレートに入れる。細胞をそれぞれ１０ｍｃｇ／ｍｌ  ＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで２４時間、４８時間又は７２時間処理し、又は処理せずにコントラスト（Ｍｏｃｋ）とする。処理後、細胞を収集してウエスタンブロットし、その特異性抗体でβ−カテニンの蛋白レベルを検測し、ＧＡＰＤＨを内因性ローディングコントラストとする。実験は３組並行して繰り返す。
【０１７８】
ウエスタンブロット分析。多種の蛋白の発現を確定するために、６ウェルプレートから細胞を収集し、メーカーのマニュアル（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ，Ｃｈｉｎａ）に従って抽出試薬（Ｃａｔ＃：Ｐ００１３）で細胞全蛋白を抽出する。Ｌｏｗｒｙ蛋白測定キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＵＳＡ）により全蛋白濃度を測定する。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、１０％−１２％のゲル上で全蛋白を分離し、それを０．２２又は０．４５μｍのＰＶＤＦ膜上（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）に転移する。５％脱脂乳、牛血清白蛋白、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で、４℃で膜を徹夜ブロッキングする。その後、ブロッキングされた膜と一次抗体（１：１０００に希釈）とをインキュベートし、そしてＨＲＰ結合の二抗とともにインキュベートする。冷光／蛍光イメージングＬＡＳ４０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）とｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ化学発光基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いてブロットを可視化する。
【０１７９】
本研究では、使用される一次抗体はマウスモノクローナルβ−カテニン抗体（１：１０００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）とマウスモノクローナルＧＡＰＤＨ抗体（１：２０００）（Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ）である。抗マウスＨＲＰ結合二抗（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を１：２０００の濃度で使用する。図１０に示される結果より、Ａ５４９細胞について、２日間（４８時間）処理した後、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはβ−カテニンの蛋白レベルを大幅に降下させた。これらの細胞について、３日間（７２時間）処理した後、さらなる降下が観察された。ＳＷ４８０細胞におけるβ−カテニンの蛋白レベル降下は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏで７２時間処理した後に顕著となる。肺癌Ａ５４９細胞と結腸癌ＳＷ４８０細胞中において、β−カテニンのダウンレギュレーションは明らかに時間依存性である。それに比べて、ＩＦＮα−２ｂは何らの顕著なβ−カテニンレベルの降下も引き起こさず、それがβ−カテニンに対するダウンレギュレーションは作用していないことを示す。
【０１８０】
実施例９．ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＷｎｔ経路に媒介される標的遺伝子の転写ダウンレギュレーションを引き起こす
肺癌Ａ５４９細胞を６ウェルプレートに接種し、それぞれ１０μｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理し、又は処理せずにコントラスト（Ｍｏｃｋ）とする。２４時間処理した後、ＴＲＩＺＯＬ試薬で細胞全ｍＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを合成し、４種のＷｎｔシグナル伝達下流遺伝子Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２の特異性プライマーでさらにｑＰＣＲを行う。実験は３組並行して行い、Ｍｏｃｋ組で標準化する。
【０１８１】
定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析。メーカーの取り扱い説明書によれば、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて全ｍＲＮＡを分離する。メーカーの取り扱い説明書によれば、ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｃａｔ＃：ＦＳＱ−１０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した後、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｃａｔ＃：ＱＰＫ−２０１，ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いてｑＰＣＲを行う。４種のＷｎｔ経路標的遺伝子のプライマーは以下の通りである。Ａｘｉｎ２センスプライマー：５’−ＣＧＴＧＧＡＴＡＣＣＴＴＡＧＡＣＴＴ−３’（配列番号８）とアンチセンスプライマー：５’−ＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＴＧＴＡ−３’（配列番号９）；ＣＤ２４センスプライマー：５’−ＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１０）とアンチセンスプライマー：５’−ＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＣＡＡ−３’（配列番号１１）；サバイビンセンスプライマー：５’−ＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＴＴＣＡＡＧ−３’（配列番号１２）とアンチセンスプライマー：５’−ＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣ−３’（配列番号１３）及びＩＤ２センスプライマー：５’−ＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ−３’（配列番号１４）とアンチセンスプライマー５’−ＣＡＣＡＧＴＣＣＡＡＧＴＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号１５）。
【０１８２】
増幅プロトコールは、９５℃で１分間のインキュベート、４０サイクル（９５℃  １５秒、６０℃１５秒、７２℃  ３０秒）からなる。Ｂｉｏ−Ｒａｄ検測システムを用いて、リアルタイムでＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染料がＰＣＲ産物に結合する状況をモニターし、そしてＢｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  ｍａｎａｇｅｒ  ２．１ソフトウェアで分析する。各条件についてサンプルを集め、２組並行して行う。２−△△Ｃｔ法により処理したサンプルとＭｏｃｋを比較し、倍率変化でプロットした。ＧＡＰＤＨを標準化コントラストとして用いる。
【０１８３】
図１１に示す結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＷｎｔ経路に媒介される標的遺伝子Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のダウンレギュレーションを引き起こす。ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理後に、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルが顕著に降下するが、ＩＦＮα−２ｂ処理後に顕著に降下していない。
【０１８４】
簡単に言えば、Ｍｏｃｋコントラストの相対発現レベルを１とするとき、Ａｘｉｎ２遺伝子は（図１１Ａ）、ＩＦＮα−２ｂ処理によって１よりやや高いレベルが得られるが、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理によって約０．４のレベル（ｐ＜０．０００１、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理と未処理とを比較する）が得られる。Ｍｏｃｋ未処理細胞、ＩＦＮα−２ｂ処理細胞とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理細胞について、ＣＤ２４遺伝子の相応レベル（図１１Ｂ）はそれぞれ１、約０．９と約０．４（ｐ＜０．０００１）である；サバイビン遺伝子の相応レベル（図１１Ｃ）はそれぞれ１、約０．９と約０．４（ｐ＜０．０００５）である；ＩＤ２遺伝子の相応レベル（図１１Ｄ）はそれぞれ１、約１と約０．４（ｐ＜０．０００１）である。
【０１８５】
実施例１０．ｒＳＩＦＮ−ｃｏは異なる細胞におけるＷｎｔ関連受容体又は共受容体ＬＲＰ６／ＦＺＤ６のｍＲＮＡレベルをダウンレギュレーションできる
ｒＳＩＦＮ−ｃｏのＬＲＰ６／ＦＺＤ６に対する調節を研究する。実施例９に行われた通り、ｑＰＣＲにより本実施例を実施する。癌細胞Ａ５４９、Ｈ４６０、ＳＷ６２０とＨＴ−２９を６ウェルプレートに接種し、１０μｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理する又は処理せずにコントラスト（Ｍｏｃｋ）とする。２４時間処理した後、ＴＲＩＺＯＬ試薬で細胞全ｍＲＮＡを分離し、ＬＲＰ６とＦＺＤ６の特異性プライマーを用いてｃＤＮＡに対してｑＰＣＲを行う。使用されるプライマーは、ＬＲＰ６センスプライマー：５’−ＴＧＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＧ−３’（配列番号４）とアンチセンスプライマー：５’−ＣＡＴＡＡＣＣＡＡＧＡＧＧＣＡＣＡＧＡＡＧＣ−３’（配列番号５）、及びＦＺＤ６センスプライマー：５’−ＧＣＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＴＴＡＧＴＣ−３’（配列番号６）とアンチセンスプライマー：５’−ＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＡＣＣ−３’（配列番号７）である。実験は３組並行して行い、ｍｏｃｋコントラスト組で正規化する。結果記録はＬＲＰ６又はＦＺＤ６のＧＡＰＤＨに対する相対ｍＲＮＡレベルである。
【０１８６】
図９に示される結果より、４種の癌細胞系において、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＬＲＰ６とＦＺＤ６を異なる程度でダウンレギュレーションさせたことを示す。図９Ａは、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理後にＡ５４９細胞（ｐ＜０．００５）、ＳＷ６２０細胞（ｐ＜０．００５）とＨＴ−２９細胞（ｐ＜０．００５）におけるＬＲＰ６  ｍＲＮＡの相対発現は顕著に著降下したが、ＩＦＮα−２ｂ処理では顕著な降下が観察されなかったことを示す。図９Ｂは、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理後にすべての４個の細胞系Ａ５４９（ｐ＜０．００１）、Ｈ４６０（ｐ＜０．０００５）、ＳＷ６２０（ｐ＜０．００１）とＨＴ−２９（ｐ＜０．０００５）においてＦＺＤ６  ｍＲＮＡの相対発現が顕著に降下したことを示す。他のインターフェロンＩＦＮα−２ｂは、ＨＴ−２９細胞におけるＦＺＤ６  ｍＲＮＡ発現を増強させる一方、Ａ５４９細胞、Ｈ４６０細胞とＳＷ６２０細胞においてＦＺＤ６  ｍＲＮＡ発現をある程度降下させ、但し、ｒＳＩＦＮ−ｃｏと同じ程度に達成できない。結果より、ｒＳＩＦＮ−ｃｏによるＷｎｔシグナル伝達経路の抑制は、Ｗｎｔ関連の細胞表面受容体ＬＲＰ６とＦＺＤ６の発現が抑制されることにより引き起こした可能性があることを示す。ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、テストされる人癌細胞（例えば人肺癌細胞と人結腸癌細胞）において、β−カテニン／ＴＣＦに媒介される転写活性とβ−カテニン蛋白レベル及びＷｎｔシグナル伝達経路と相関する受容体、共受容体と標的遺伝子に対するダウンレギュレーションを含むＷｎｔ経路を抑制する面では、インターフェロンＩＦＮα−２ｂより優れている。
【０１８７】
実施例１１．ｒＳＩＦＮ−ｃｏが腫瘍抑制遺伝子の発現をアップレギュレーションする
本研究ではｒＳＩＦＮ−ｃｏの腫瘍抑制遺伝子に対するアップレギュレーション作用を示す。癌細胞Ａ５４９、Ｈ４６０、ＳＷ６２０とＨＴ−２９を６ウェルプレートに接種し、１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理する又は処理せずにＭｏｃｋコントラストとする。２４時間処理した後、ＴＲＩＺＯＬ試薬で細胞全ｍＲＮＡを分離し、ｃＤＮＡを合成し、ＤＫＫ３、ＫＬＦ４とＢＡＴＦ２の特異性プライマーを用いてさらにｑＰＣＲを行う。以下のプライマーを使用する：ＢＡＴＦ２に対して、センスプライマー５’−ＣＡＧＡＧＣＡＧＧＧＡＧＣＡＣＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１６）とアンチセンスプライマー５’−ＴＧＡＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧ−３’（配列番号１７）；ＤＫＫ３に対して、センスプライマー５’−ＧＧＡＧＣＣＴＧＡＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号１８）とアンチセンスプライマー５’−ＡＣＧＣＣＴＡＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１９）；ＫＬＦ４に対して、センスプライマー５’−ＣＣＴＴＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣ−３’（配列番号２０）とアンチセンスプライマー５’−ＧＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＴＧ−３’（配列番号２１）。
【０１８８】
実験は３組並行して行い、ｍｏｃｋコントラスト組で正規化する。図１２に示される結果はＧＡＰＤＨと比較する相対ｍＲＮＡ発現レベルとして表される。Ａ５４９細胞に対して、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理はすべての３種の腫瘍抑制遺伝子ＤＫＫ−３（図１２Ａ）、ＢＡＴＦ２（図１２Ｂ）とＫＬＦ４（図１２Ｃ）の発現を大幅に増大させ、ＩＦＮα−２ｂよりも遥かに有効である。ＳＷ６２０細胞において、コントラストとＩＦＮα−２ｂ処理に比べて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理後にＫＬＦ４発現のアップレギュレーションも大幅に増加した。ＩＦＮα−２ｂ処理はＨ４６０細胞におけるＤＫＫ−３の発現を顕著に増加した。
【０１８９】
実施例１２．ｒＳＩＦＮ−ｃｏが癌細胞転移を抑制する
ＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで２４時間処理（未処理のコントラスト（Ｍｏｃｋ）に比べる）した後、肺癌Ａ５４９細胞と結腸癌ＳＷ６２０細胞が微孔膜を通す能力を確定することで、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの腫瘍細胞転移を抑制する能力を実証する。２４ウェルプレートにおいて８μｍ細胞培養インサート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）で細胞転移テストを行う。ＦＢＳを含有しない温熱（３７℃）炭酸水素塩類培地をインサートの内部及びウェルの底部に加え、加湿された組織培養インキュベーターにおいて３７℃、５％  ＣＯ２雰囲気で約２時間復水した。復水した後、注意深く培地を除去する。その後、５００μｌのＦＢＳを含有しない培地に混合懸濁する調製細胞（１０μｇ／ｍｌ  ＩＦＮα−２ｂ又は１０μｇ／ｍｌ  ｒＳＩＦＮ−ｃｏで処理した後、又は完全に処理していない）を０．５×１０４細胞／インサートの密度でインサートフィルターの上部に接種する。２４ウェルプレートの下室に５００μｌの１０％ＦＢＳ含有完全培地に入れる。通常な培養条件で３７℃において２４時間過ぎた後、室膜上部の非転移細胞を綿棒で除去する。培養インサートの下部を４％パラホルムアルデヒドで固定して２％クリスタルバイオレットで染色する。３組の並行ウェルのそれぞれにおいて、細胞が入れている室膜の反対側の転移細胞数をカウントする。各実験を少なくとも２回繰り返し、毎回３組の並行ウェルを使う。
【０１９０】
図１３に示される結果は、Ｍｏｃｋ、ＩＦＮα−２ｂ処理細胞とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理細胞のそれぞれの単位領域における転移細胞の平均数を示す。膜を通して転移したＡ５４９細胞について、未処理のＭｏｃｋ組では約３０個の細胞／領域が観察され、ＩＦＮα−２ｂ組では約１１０個の細胞が観察され、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理組では約１０個の細胞が観察された。ＩＦＮα−２ｂ処理による転移増強とｒＳＩＦＮ−ｃｏ処理による転移抑制が統計学的に有意である（ｐ＜０．０１）。ＳＷ６２０細胞を用いる時にもｒＳＩＦＮ−ｃｏによる顕著な抑制が観察された。これに対して、ＩＦＮα−２ｂ処理はＳＷ６２０細胞における腫瘍細胞転移を増加させた。したがって、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは腫瘍細胞転移を効果的に抑制し、ＩＦＮα−２ｂよりも遥かに有効である。
【０１９１】
実施例１３．ｒＳＩＦＮ−ｃｏは細胞アポトーシス経路により作用を果たしていない
本研究は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは細胞アポトーシス経路以外の経路により腫瘍細胞生存力を降下させる作用を果たすことを示すために行われる。腫瘍細胞Ａ５４９とＳＷ６２０を６ウェルプレートに入れ、徹夜インキュベートしてから１０ｍｃｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又は１０ｍｃｇ／ｍｌのｒＳＩＦＮ−ｃｏ又は５ＦＵで２４時間又は４８時間処理する又は処理しない（Ｍｏｃｋコントラストとする）。その後、ウエスタンブロットにより細胞アポトーシス関連の分子標記物をモニターする。使用される一次抗体は、マウスモノクローナルβ−チューブリン抗体（１：２０００，Ｃａｔ＃：ＣＷ００９８Ａ）とマウスモノクローナルＧＡＰＤＨ抗体（１：２０００，Ｃａｔ＃：ＣＷ０１００Ａ）（Ｋａｎｇｗｅｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ）；マウスモノクローナルＰＡＲＰ抗体（１：１０００，Ｃａｔ＃：ｓｃ−２００７，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；ウサギモノクローナル−プロカスパーゼ−３抗体（１：１０００，Ｃａｔ＃：９６６５）とウサギポリクローナル切断カスパーゼ−３抗体（１：１０００，Ｃａｔ＃：９６６１）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）；ヤギポリクローナルプロカスパーゼ−８抗体（１：１０００，Ｃａｔ＃：ｓｃ−６１３６，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）；ウサギモノクローナル切断カスパーゼ−８抗体（１：１０００，Ｃａｔ＃：９４９６）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＳＡ）である。
【０１９２】
Ａ５４９細胞の結果を図１４Ａに示し、ＳＷ６２０細胞の結果を図１４Ｂに示す。ウエスタンブロットは、５ＦＵ（既知の細胞アポトーシスを導く薬物）で処理した後、細胞のプロカスパーゼ−３、プロカスパーゼ−８とＰＡＲＰレベルは顕著な降下を示すが、切断したカスパーゼ−３と切断したカスパーゼ−８はレベル増加を示す。それに対して、インターフェロンＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏはいずれも、プロカスパーゼ−３、プロカスパーゼ−８又はＰＡＲＰレベルを降下させず、切断したカスパーゼ−３又は切断したカスパーゼ−８レベルを増加させない。したがって、結果より、この２種類のインターフェロン、特にｒＳＩＦＮ−ｃｏは、細胞アポトーシス以外の異なるメカニズムにより腫瘍細胞生存力を降下させる可能性がある。
【０１９３】
実施例１４．ｒＳＩＦＮ−ｃｏがＳＴＡＴリン酸化を引き起こす
該実験は、ｒＳＩＦＮ−ｃｏはＩＦＮα−２ｂと同様にＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を利用することを示すために行われる。本研究において、Ａ５４９細胞とヒーラ細胞とをそれぞれ３．３ｃｍの皿に入れ、３７℃で徹夜インキュベートし、そしてそれぞれ１０μｇ／ｍｌのＩＦＮα−２ｂ又はｒＳＩＦＮ−ｃｏで０、５、１５、３０、６０、１２０と２４０分間処理する。処理後、細胞を収集し、細胞蛋白を抽出してＳＤＳ−ＰＡＧＥアガロースにロッドし、ウエスタンブロット分析を行うことにより、ＳＴＡＴ１（Ｔｙｒ７０１）、ＳＴＡＴ２（Ｔｙｒ６９０）とＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）のリン酸化を観察する。ＧＡＰＤＨをロッディングコントラストとする。
【０１９４】
使用される一次抗体は、ＳＴＡＴ１（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１７５Ｓ）、Ｔｙｒ７０１リン酸化−ＳＴＡＴ１（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１６７Ｓ）、ＳＴＡＴ２（１：５００，Ｃａｔ＃４５９４）、Ｔｙｒ６９０リン酸化−ＳＴＡＴ２（１：１０００，Ｃａｔ＃：４４１Ｓ）、ＳＴＡＴ３（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１３２）、Ｔｙｒ７０５リン酸化−ＳＴＡＴ３（１：１０００，Ｃａｔ＃：９１４５Ｓ）である。抗マウス（Ｃａｔ＃：ｓｃ−２００５）又は抗ウサギ（Ｃａｔ＃：ｓｃ−２００４）又は抗ヤギ（Ｃａｔ＃：ｓｃ−２０２０）ＨＲＰ−結合の二抗（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を１：２０００の濃度で使用する。冷光／蛍光イメージングＬＡＳ４０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）とｓｕｐｅｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｗｅｓｔ  ｐｉｃｏ化学発光基質キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いてブロットを可視化する。
【０１９５】
図１５に示される結果より、この２種類のインターフェロン、即ち、ＩＦＮα−２ｂとｒＳＩＦＮ−ｃｏは、Ａ５４９細胞とヒーラ細胞中でＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２とＳＴＡＴ３リン酸化パターンにおいて似たような挙動を示す。したがって、ｒＳＩＦＮ−ｃｏに媒介されたＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達レベルとＩＦＮα−２ｂに媒介されたＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達レベルとは差異がなく、ｒＳＩＦＮ−ｃｏとＩＦＮα−２ｂは共通なＩＦＮＡＲ１／２受容体をシェアすることを表明した。
【産業上の利用可能性】
【０１９６】
本文に述べた方法と測定キットは、テスト化合物、例えばインターフェロンの効力の確定に用いられ、且つβ−カテニン又はＬＲＰ６、ＦＺＤ６、Ａｘｉｎ２、ＣＤ２４、サバイビンとＩＤ２のいずれか一種又は多種の過度活発又は過度発現、又はＤＫＫ３、ＢＡＴＦ２、あるいはＫＬＦ４のダウンレギュレーションにより、不利な影響を受ける疾病又は病症の治療に用いられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
0006768507.tif 000014
【図５Ｄ】
0006768507.tif 000015
【図５Ｅ】
0006768507.tif 000016
【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
0006768507.tif 000018
【図５Ｈ】
0006768507.tif 000019
【図５Ｉ】
0006768507.tif 000020
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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