(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト・サイログロブリン（ＴＧ）に対する抗原特異性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を含むα鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１と、配列番号４のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ２と、配列番号５のアミノ酸配列を含むα鎖ＣＤＲ３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ２と、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むβ鎖ＣＤＲ３とを含む、単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【請求項２】
前記ＴＣＲが配列番号２のＴＧ４７０−４７８アミノ酸配列に対する抗原特異性を有する、請求項１に記載の単離又は精製されたＴＣＲ。
【請求項３】
配列番号９のアミノ酸配列を含むα鎖可変領域、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むβ鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載の単離又は精製されたＴＣＲ。
【請求項４】
配列番号１３のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離又は精製されたＴＣＲ。
【請求項５】
配列番号１１のアミノ酸配列を含むα鎖、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含むβ鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離又は精製されたＴＣＲ。
【請求項６】
自己切断型ウイルスリンカーペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離又は精製されたＴＣＲ。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲの機能的部分を含む単離又は精製されたポリペプチドであって、前記機能的部分が、配列番号３〜８のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲの機能的部分を含む単離又は精製されたポリペプチドであって、前記機能的部分が、配列番号９及び１０のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲの機能的部分を含む単離又は精製されたポリペプチドであって、前記機能的部分が、配列番号１１及び１２のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項１０】
自己切断型ウイルスリンカーペプチドを含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の単離又は精製されたポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号３〜５のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド鎖、及び配列番号６〜８のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド鎖を含む、単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１２】
配列番号９のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド鎖、及び配列番号１０のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１１に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１３】
配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド鎖、及び配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド鎖を含む、請求項１１又は１２に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質が融合タンパク質である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１５】
前記タンパク質が組換え抗体である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１６】
自己切断型ウイルスリンカーペプチドを含む、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の単離又は精製されたタンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離又は精製された核酸。
【請求項１８】
配列番号２２〜２７のヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
配列番号１５及び１６のヌクレオチド配列を含む、請求項１７又は１８に記載の核酸。
【請求項２０】
配列番号１９及び２０のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２１】
配列番号１７及び１８のヌクレオチド配列を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２２】
請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の核酸を含む、組換え発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の組換え発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２２又は２３に記載の組換え発現ベクターを含む、単離された宿主細胞。
【請求項２５】
前記細胞がヒトである、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２４又は２５に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む、細胞集団。
【請求項２７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲの機能的部分に特異的に結合する抗体又はその抗原結合部分であって、前記機能的部分が、配列番号３〜８のアミノ酸配列を含む、抗体又はその抗原結合部分。
【請求項２８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７〜２１に記載の核酸、請求項２２若しくは２３に記載の組換え発現ベクター、請求項２４若しくは２５に記載の宿主細胞、請求項２６に記載の細胞集団、又は請求項２７に記載の抗体若しくはその抗原結合部分と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴＣＲ、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１７〜２１に記載の核酸、請求項２２若しくは２３に記載の組換え発現ベクター、請求項２４若しくは２５に記載の宿主細胞、請求項２６に記載の細胞集団、又は請求項２７に記載の抗体若しくはその抗原結合部分を含む、哺乳動物におけるがんを検出、治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項３０】
前記がんが甲状腺癌又は神経芽細胞腫である、請求項２９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロス・リファレンス
本願は、２０１４年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第62/079,713号について優先権を主張し、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
電子的に提出された物件の参照による援用
本明細書と同時に提出され、コンピューターで読み取り可能な以下のヌクレオチド／アミノ酸配列リストは、その全体が本明細書に援用される：２０１５年１１月１日付けの「722275_ST25.txt」という名前の68,835バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件
【背景技術】
【０００３】
米国における甲状腺癌の発生率は、過去４０年間にわたって増加している（Davies et al., JAMA Otolaryngol Head Neck Surg., 140(4):317-322(2014)）。甲状腺摘除術やアジュバント放射性ヨウ素（ＲＡＩ）療法などの治療法の進歩にもかかわらず、甲状腺癌、特に進行性又は転移性の甲状腺癌の予後は不良である場合がある。したがって、がん、特に甲状腺癌のためのさらなる治療について満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一実施形態は、ヒト・サイログロブリン（ＴＧ）に対して抗原特異性を有し、配列番号３のアミノ酸配列を含むアルファ（α）鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）１と、配列番号４のアミノ酸配列を含むα鎖のＣＤＲ２と、配列番号５のアミノ酸配列を含むα鎖のＣＤＲ３と、配列番号６のアミノ酸配列を含むベータ（β）鎖のＣＤＲ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むβ鎖のＣＤＲ２と、及び配列番号８のアミノ酸配列を含むβ鎖のＣＤＲ３とを含む、単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
【０００５】
本発明の一実施形態は、ヒトＴＧに対して抗原特異性を有し、そして配列番号４４のアミノ酸配列を含むα鎖のＣＤＲ１と、配列番号４５のアミノ酸配列を含むα鎖のＣＤＲ２と、配列番号４６のアミノ酸配列を含むα鎖のＣＤＲ３と、配列番号４７のアミノ酸配列を含むβ鎖のＣＤＲ１と、配列番号４８のアミノ酸配列を含むβ鎖のＣＤＲ２と、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含むβ鎖のＣＤＲ３とを含む、単離又は精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
【０００６】
本発明はさらに、関連するポリペプチド及びタンパク質、並びに関連する核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞及び細胞集団を提供する。本発明によりさらに提供されるのは、抗体又はその抗原結合部分及びＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）に関連する医薬組成物である。
【０００７】
本発明によって、哺乳動物におけるがんの存在を検出する方法及び哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法が、さらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１Ａは、２個の正常甲状腺試料（正常甲状腺１及び２）、１個の原発性甲状腺癌試料及び３個のリンパ節転移試料（リンパ節転移１、２及び３）における、ＴＧ（黒棒）、フォークヘッドボックスＥ１（ＦＯＸＥ１）（横縞棒）、ヨードチロシン脱ヨウ素酵素（ＩＹＤ）（斜線のバー）、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）（箱入り棒）、及びペアード・ボックス８（ＰＡＸ８）（縦縞棒）のＲＮＡコピー数を、１×１０５（１０＾５）コピーのβアクチンＲＮＡに対する相対値で示すグラフである。
【図２】図１Ｂは、様々な正常組織試料で測定した、１×１０４コピーのβアクチンＲＮＡに対する、ＴＧの相対的なＲＮＡコピー数を示すグラフである。
【図３】図２は、ＴＧをコードするアデノウイルスでワクチン処理したマウスに由来する脾細胞から分泌されたマウス・インターフェロン（ＩＦＮ）−γ（ｐｇ／ｍｌ）の量を示すグラフであり、ペプチド２（NLFGGKFLV（配列番号２））又はペプチド５（ILQRRFLAV（配列番号３２）で、インビトロで２回刺激すると共に、以下と共培養したときのものである（左から順番に）：ＭＡＲＴ−１対照ペプチドでパルスした標的Ｔ２細胞（Ｔ２／ＭＡＲＴ）（陰影のない棒）、ＴＧ類縁ペプチド（ペプチド２又は５）でパルスした標的Ｔ２細胞（灰色棒）、対照緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するようにトランスフェクトしたＣｏｓ７−ＨＬＡ−Ａ＊０２０１細胞（ＣｏｓＡ２／ＧＦＰ）（後向斜線棒）、ＴＧを発現するようにトランスフェクトしたＣｏｓ７−ＨＬＡ−Ａ＊０２０１細胞（ＣｏｓＡ２／ＴＧ）（前向斜線棒）、悪性上皮性腫瘍細胞株ＸＴＣ（縦縞棒）又はＨＬＡ−Ａ０２０１を発現するように形質導入したＸＴＣ細胞（ＸＴＣ／Ａ２）（横縞棒）。
【図４】図３Ａは、種々の濃度（ｎＭ）のＭＡＲＴ−１ペプチド（黒丸）又はＴＧペプチドNLFGGKFLV（配列番号２）（白三角）でパルスした標的Ｔ２細胞とエフェクター非形質導入（ＵＮ）ＰＢＬとの共培養、種々の濃度（ｎＭ）のＭＡＲＴ−１ペプチド（白四角）又はＴＧペプチドNLFGGKFLV（配列番号２）（菱形）でパルスした標的Ｔ２細胞と抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲを誘導したエフェクターＰＢＬとの共培養、種々の濃度（ｎＭ）のＭＡＲＴ−１ペプチド（黒三角）又はＴＧペプチドNLFGGKFLV（配列番号２）（白丸）でパルスした標的Ｔ２細胞とネズミ（murine）抗ＴＧ−ＴＣＲ（ｍＴＧ−ＴＣＲ）（配列番号１１及び１２）を形質導入したエフェクターＰＢＬとの共培養において測定したＩＦＮ−γ量（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【図５】図３Ｂは、ＣｏｓＡ２／ＧＦＰ細胞（小チェック棒）、ＣｏｓＡ２／ＭＡＲＴ細胞（大チェック棒）、ＣｏｓＡ２／ＴＧ細胞（横縞棒）、６２４Ｍｅｌ細胞（縦縞棒）、９３８Ｍｅｌ細胞（ＭＡＲＴ−１を発現していない悪性黒色腫由来細胞株）（前向斜線棒）、ＸＴＣ細胞（後向斜線棒）又はＸＴＣ／Ａ２細胞（箱入棒）の対象細胞を、誘導されていないＰＢＬ（ＵＴ）又は抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲ（ＭＡＲＴ）若しくはネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲ（ｍＴＧ−ＴＣＲ）（配列番号１１及び１２）で形質導入したＰＢＬのエフェクター細胞と共培養したときに測定されたＩＦＮ−γの量（ｐｇ／ｍｌ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、ヒトＴＧに対する抗原特異性を有する、単離又は精製されたＴＣＲを提供する。本発明のＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、任意のヒトＴＧタンパク質、ポリペプチド又はペプチドに対して抗原特異性を有してもよい。本発明の一実施形態では、該ＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は配列番号１のアミノ酸配列を含む又はそれからなるヒトＴＧタンパク質に対して抗原特異性を有する。本発明の一実施形態において、該ＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、NLFGGKFLV（配列番号２）のアミノ酸配列を含む若しくはそれからなるヒトＴＧ４７０−４７８ペプチド、又はLVLEIFTLL（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む若しくはそれからなるヒトＴＧ３−１１ペプチドに対して、抗原特異性を有する。本発明の好ましい実施形態では、該ＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、NLFGGKFLV（配列番号２）のアミノ酸配列を含む又はそれからなるヒトＴＧ４７０−４７８ペプチドに対する抗原特異性を有する。
【００１０】
本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ依存性様式で、ヒトＴＧを認識することができる。本明細書で使用される「ＭＨＣクラスＩ依存性様式」は、該ＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）がＭＨＣクラスＩ分子との関係の中で、ＴＧへの結合の際に免疫応答を引き起こすことを意味する。該ＭＨＣクラスＩ分子は、当該分野で公知の任意のＭＨＣクラスＩ分子、例えば、ＨＬＡ−Ａ分子であり得る。本発明の好ましい実施形態では、該ＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ−Ａ２分子である。
【００１１】
本発明のＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、養子細胞移植のために使用される細胞によって発現される場合を含む、多くの利点を提供する。ＴＧは、分化した甲状腺癌、正常な甲状腺及び甲状腺癌患者で既に除去されたかも知れない重要でない組織においてのみ高いレベルの発現を示す。ＴＧは神経芽細胞腫でも発現している。特定の理論又は機構に縛られることなく、本発明のＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、正常な非がん性の非甲状腺細胞の破壊を最小化又は排除し、それによって毒性を低減、例えば、最小化又は排除しつつ、有利にがん細胞を破壊すると考えられる。さらに、本発明のＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、例えば、化学療法、外科手術又は放射線治療などの他のタイプの治療に応答しないＴＧ陽性がんを有利に、成功裏に、治療又は予防してもよい。加えて、本発明のＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、ＴＧへの高度に貪欲な認識を提供し、これは有利には、未操作の腫瘍細胞（例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−γで処置されていない、ＴＧ及びＨＬＡ−Ａ２の一方又は両方をコードするベクターでトランスフェクトされていない、ＴＧ４７０−４７８ペプチドでパルスされていない、又はそれらの組み合わせで処理されていない腫瘍細胞）を認識する能力を提供してもよい。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「抗原特異性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」という文言は、該ＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）が、高い結合性をもってＴＧに特異的に結合すること及び免疫学的に認識し得ることを意味する。例えば、ＴＣＲ（又はその機能的部分若しくはその機能的変異体を含む）を発現しているＴ細胞を、（ａ）低濃度のＴＧペプチド（例えば、約０．０５ｎｇ／ｍＬから約５ｎｇ／ｍＬで、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、又は上記の任意の２つの値により規定される範囲）でパルスした抗原陰性ＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞、又は（ｂ）標的細胞がＴＧを発現するようにＴＧをコードするヌクレオチド配列を導入したＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞と共培養したときに、該Ｔ細胞が、少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬ以上（例えば、２００ｐｇ／ｍＬ以上、３００ｐｇ／ｍＬ以上、４００ｐｇ／ｍＬ以上、５００ｐｇ／ｍＬ以上、６００ｐｇ／ｍＬ以上、７００ｐｇ／ｍＬ以上、１，０００ｐｇ／ｍＬ以上、５，０００ｐｇ／ｍＬ以上、７，０００ｐｇ／ｍＬ以上、１０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、２０，０００ｐｇ／ｍＬ以上、又は上記の任意の２つの値により規定される範囲）のＩＦＮ−γを分泌している場合、ＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、ＴＧに対する「抗原特異性」を有すると考えられる。本発明のＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）を発現している細胞はまた、より高濃度のＴＧペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞との共培養の際にＩＦＮ−γを分泌してもよい。
【００１３】
代替的に又は追加的に、ＴＣＲ（又はその機能的部分若しくはその機能的変異体を含む）を発現しているＴ細胞を、（ａ）低濃度のＴＧペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞、又は（ｂ）標的細胞がＴＧを発現するようにＴＧをコードするヌクレオチド配列を導入したＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞と共培養したときに、陰性対照で発現するＩＦＮ−γの量と比較して、該Ｔ細胞が少なくとも２倍のＩＦＮ−γを分泌する場合、ＴＣＲ（機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、ＴＧに対して「抗原特異性」を有すると考えられる。その陰性対照は、例えば、（ｉ）ＴＣＲ（又はその機能的部分若しくはその機能的変異体）を発現しているＴ細胞であって、（ａ）同じ濃度の無関係のペプチド（例えば、ＴＧペプチドとは異なる配列を有するいくつかの他のペプチド）でパルスした抗原陰性ＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞若しくは（ｂ）標的細胞が無関係のペプチドを発現するように、無関係のペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入したＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞と共培養したもの、又は（ｉｉ）非形質導入Ｔ細胞（例えば、ＴＣＲ、又は機能的部分若しくはその機能的変異体を発現しないＰＢＭＣに由来する）を、（ａ）同じ濃度のＴＧペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞若しくは（ｂ）標的細胞がＴＧを発現するように、ＴＧをコードするヌクレオチド配列を導入したＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞と共培養したものであってもよい。ＩＦＮ−γ分泌は、当該分野で公知の方法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法によって測定されてもよい。
【００１４】
代替的に又は追加的に、（ａ）低濃度のＴＧペプチドでパルスした抗原陰性ＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞、又は（ｂ）標的細胞がＴＧを発現するように、ＴＧをコードするヌクレオチド配列を導入したＨＬＡ−Ａ２＋標的細胞と共培養することにより、ＩＦＮ−γを分泌する陰性対照Ｔ細胞の数と比較して、ＩＦＮ−γを分泌するＴＣＲ（又はその機能的部分若しくはその機能的変異体）を発現しているＴ細胞の数が少なくとも２倍であるとき、ＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）は、ＴＧに対して「抗原特異性」を有すると考えられる。ペプチドの濃度及び陰性対照は、本発明の他の態様に関しても、本明細書で記載される通りであってもよい。ＩＦＮ−γを分泌する細胞の数は、当該分野で公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ法によって測定されてもよい。
【００１５】
本発明は、２つのポリペプチド（すなわち、ポリペプチド鎖）、例えば、ＴＣＲのアルファ（α）鎖、ＴＣＲのベータ（β）鎖、ＴＣＲのガンマ（γ）鎖、ＴＣＲのデルタ（δ）鎖、又はそれらの組み合わせを含むＴＣＲを提供する。本発明のＴＣＲのポリペプチドは、ＴＣＲがＴＧに対して抗原特異性を有する限り、任意のアミノ酸配列を含むことができる。
【００１６】
本発明の一実施形態では、該ＴＣＲは２つのポリペプチド鎖を含み、その各々はＴＣＲの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む可変領域を含む。本発明の一実施形態では、該ＴＣＲは、配列番号３又は４４（α鎖のＣＤＲ１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号４又は４５（α鎖のＣＤＲ２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号５又は４６（α鎖のＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号６又は４７（β鎖のＣＤＲ１）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１と、配列番号７又は４８（β鎖のＣＤＲ２）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２と、配列番号８又は４９（β鎖のＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３とを含む第２のポリペプチド鎖を含む。これに関して、本発明のＴＣＲは、配列番号３〜８又は配列番号４４〜４９からなる群から選択される任意の１以上のアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、該ＴＣＲは配列番号３〜５、配列番号６〜８、配列番号４４〜４６又は配列番号４７〜４９のアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態では、該ＴＣＲは配列番号３〜８の全て又は配列番号４４〜４９の全てのアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本発明の一実施形態では、該ＴＣＲは、上記のＣＤＲセットを含むＴＣＲの可変領域のアミノ酸配列を含む。これに関して、該ＴＣＲは、配列番号９若しくは５０（α鎖の可変領域）；配列番号１０若しくは５１（β鎖の可変領域）；配列番号９及び１０の両方；又は配列番号５０及び５１の両方のアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、本発明のＴＣＲは配列番号９及び１０の両方、又は配列番号５０及び５１の両方のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
本発明の一実施形態では、該ＴＣＲはＴＣＲの定常領域のアミノ酸配列をさらに含む。これに関して、該ＴＣＲは、配列番号１３若しくは５２（α鎖の定常領域）、配列番号１４若しくは５３（β鎖の定常領域）、配列番号１３及び１４の両方、又は配列番号５２及び５３の両方のアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、本発明のＴＣＲは配列番号１３及び１４の両方、又は配列番号５２及び５３の両方のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲは可変領域と定常領域との組み合わせを含んでもよい。これに関して、該ＴＣＲは、配列番号９（α鎖の可変領域）及び配列番号１３（α鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むα鎖；配列番号１０（β鎖の可変領域）及び配列番号１４（β鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むβ鎖；配列番号５０（α鎖の可変領域）及び配列番号５２（α鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むα鎖；配列番号５１（β鎖の可変領域）及び配列番号５３（β鎖の定常領域）の両方のアミノ酸配列を含むβ鎖；配列番号９、１０、１３及び１４の全てのアミノ酸配列；又は配列番号５０〜５３の全てのアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、本発明のＴＣＲは配列番号９、１０、１３及び１４の全て、又は配列番号５０〜５３の全てのアミノ酸配列を含む。
【００２０】
本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲは本明細書中に記載される任意のＣＤＲ領域と定常領域との組み合わせを含んでもよい。これに関して、該ＴＣＲは、配列番号３〜５及び１３の全てのアミノ酸配列を含むα鎖；配列番号６〜８及び１４の全てのアミノ酸配列を含むβ鎖；又は配列番号３〜８及び１３〜１４の全てのアミノ酸配列を含むことができる。本発明の一実施形態では、該ＴＣＲは、配列番号４４〜４６及び５２の全てのアミノ酸配列を含むα鎖；配列番号４７〜４９及び５３の全てのアミノ酸配列を含むβ鎖；又は配列番号４４〜４９及び５２〜５３の全てのアミノ酸配列を含むことができる。
【００２１】
本発明の一実施形態では、本発明のＴＣＲはＴＣＲのα鎖及びＴＣＲのβ鎖を含むことができる。本発明のＴＣＲのα鎖及びβ鎖の各々は独立して任意のアミノ酸配列を含むことができる。これに関して、本発明のＴＣＲのα鎖は配列番号１１又は５４のアミノ酸配列を含むことができる。この型のα鎖は、ＴＣＲの任意のβ鎖と対になることができる。これに関して、本発明のＴＣＲのβ鎖は配列番号１２又は５５のアミノ酸配列を含むことができる。従って、本発明のＴＣＲは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号１１及び１２の両方、又は配列番号５４及び５５の両方のアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、本発明のＴＣＲは配列番号１１及び１２の両方、又は配列番号５４及び５５の両方のアミノ酸配列を含む。
【００２２】
本発明の一実施形態では、該ＴＣＲは、ネズミＴＣＲ又はヒトＴＣＲである。本明細書中で使用される場合、「ネズミ（ｍｕｒｉｎｅ）」又は「ヒト（ｈｕｍａｎ）」という用語は、本明細書中に記載されるＴＣＲ又はＴＣＲの任意の構成要素（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変領域、定常領域、α鎖及び／又はβ鎖）に言及する場合、それぞれ、マウス又はヒト由来のＴＣＲ（又はその構成要素）（すなわち、それぞれ、マウスＴ細胞、又はヒトＴ細胞に由来するか、又はかつてそれらによって発現されたＴＣＲ（又はその構成要素））を意味する。本発明の一実施形態では、（ｉ）配列番号３〜８の全て；（ｉｉ）配列番号９及び１０；（ｉｉｉ）配列番号１１及び１２；（ｉｖ）配列番号３〜８及び１３〜１４の全て；又は（ｖ）配列番号９、１０、１３及び１４の全てを含むＴＣＲは、ネズミＴＣＲである。本発明の一実施形態では、（ｉ）配列番号４４〜４９の全て；（ｉｉ）配列番号５０及び５１；（ｉｉｉ）配列番号５４及び５５；（ｉｖ）配列番号４４〜４９及び５２〜５３の全て；又は（ｖ）配列番号５０〜５３の全てを含むＴＣＲは、ヒトＴＣＲである。本発明の一実施形態では、該ネズミＴＣＲ（その機能的部分及びその機能的変異体を含む）はNLFGGKFLV（配列番号２）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるヒトＴＧ４７０−４７８ペプチドに対する抗原特異性を有し、該ヒトＴＣＲは、LVLEIFTLL（配列番号５８）のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるヒトＴＧ３−１１ペプチドに対する抗原特異性を有する。
【００２３】
本明細書に記載の本発明のＴＣＲの機能的変異体は、本発明の範囲に含まれる。本明細書中で使用する場合、「機能的変異体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、親（parent）ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質と実質的又は有意な配列同一性又は類似性を有する、ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質を指し、そしてその機能的変異体は、変異体のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質の生物学的活性を保持している。機能的変異体は、例えば、親ＴＣＲが抗原特異性を有するか、親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質と同様に、親ポリペプチド又はタンパク質が特異的に結合するＴＧに対して、類似する程度に、同じ程度に、又はより高い程度において、特異的に結合する能力を保持する、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質（親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質）の変異体を含む。親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質に準拠して、機能的変異体は、例えば、アミノ酸配列において少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上、親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列と一致している。
【００２４】
該機能的変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的（conservative）アミノ酸置換を有する、親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含むことができる。保存的アミノ酸置換は当該技術分野で公知であり、そして特定の物理的及び／又は化学的性質を有する１つのアミノ酸が、同じ化学的又は物理的性質を有する別のアミノ酸と交換されるアミノ酸置換を含む。例えば、該保存的アミノ酸置換は、酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ又はＧｌｕ）に置換し、非極性側鎖を有するアミノ酸が別の非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌなど）に置換し、塩基性アミノ酸が他の塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇなど）に置換し、極性側鎖を有するアミノ酸が別の極性側鎖を有するアミノ酸が（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒなど）に置換したものであり得る。
【００２５】
代替的に又は追加的に、該機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を有する親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列を含むことができる。この場合、該非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性を妨害又は阻害しないことが好ましい。好ましくは、該非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性が親ＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質と比較して上昇するように、機能的変異体の生物学的活性を増強するものである。
【００２６】
該ＴＣＲ（又はその機能的変異体）、ポリペプチド又はタンパク質は、該ＴＣＲ（又はその機能的変異体）、ポリペプチド又はタンパク質の他の構成要素、例えば、他のアミノ酸が、該ＴＣＲ（又はその機能的変異体）、ポリペプチド又はタンパク質の生物学的活性を実質的に変化させないように、本質的に特定のアミノ酸配列、又は本明細書に記載の配列からなることができる。これに関して、本発明のＴＣＲ（又はその機能的変異体）、ポリペプチド又はタンパク質は、例えば、本質的には、配列番号１１、配列番号１２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号１１及び１２の両方、又は配列番号５４及び５５の両方のアミノ酸配列からなる。また、例えば、本発明のＴＣＲ（その機能的変異体を含む）、ポリペプチド又はタンパク質は、本質的に、配列番号９、配列番号１０、配列番号５０、配列番号５１、配列番号９及び１０の両方、又は配列番号５０及び５１の両方のアミノ酸配列（複数可）からなる。さらに、本発明のＴＣＲ（その機能的変異体を含む）、ポリペプチド又はタンパク質は、本質的には、配列番号３若しくは４４（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号４若しくは４５（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号５若しくは４６（α鎖のＣＤＲ３）、配列番号６若しくは４７（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号７若しくは４８（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号８若しくは４９（β鎖のＣＤＲ３）、又はそれらの任意の組み合わせ、例えば、配列番号３〜５；６〜８；３〜８；４４〜４６；４７〜４９；４４〜４９のアミノ酸配列からなることができる。
【００２７】
また、本発明によって、本明細書に記載の任意のＴＣＲ（又はその機能的変異体）の機能的部分を含むポリペプチドが提供される。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、オリゴペプチドを含み、１以上のペプチド結合によって連結されたアミノ酸の一本鎖を指す。
【００２８】
本発明のポリペプチドに関して、該機能的部分がＴＧに特異的に結合する場合、該機能的部分は、該ＴＣＲ（又はその機能的変異体）の連続するアミノ酸を含む任意の部分であり得る。用語「機能的部分（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ）」は、ＴＣＲ（又はその機能的変異体）に関して使用される場合、本発明のＴＣＲ（又はその機能的変異体）の任意の部分又は断片を指し、そしてその部分又は断片は、その一部（その親ＴＣＲ又はその親機能的変異体）である該ＴＣＲ（又はその機能的変異体）の生物学的活性を保持している。機能的部分は、例えば、ＴＧに特異的に結合する能力（例えば、ＨＬＡ−Ａ２依存的な様式で）又はがんを検出、治療若しくは予防する能力を、該親ＴＣＲ（又はその機能的変異体）と、類似する程度、同じ程度、又はより高い程度に、維持しているＴＣＲ（又はその機能的変異体）の機能的部分を含む。該親ＴＣＲ（又はその機能的変異体）に準拠して、該機能的部分は、例えば、該親ＴＣＲ（又はその機能的変異体）の、約１０％、２５％、３０％、５０％、６８％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上を含むことができる。
【００２９】
該機能的部分は、該親ＴＣＲ又はその機能的変異体のアミノ酸配列に見られない追加のアミノ酸を、該部分のアミノ末端若しくはカルボキシ末端に、又はその両方の末端に含むことができる。望ましくは、該追加のアミノ酸が、該機能的部分の生物学的機能、例えば、ＴＧに特異的に結合する能力；及び／又はがんを検出し、がんを治療し若しくは予防する能力などを妨害しない。より望ましくは、該追加のアミノ酸は、該親ＴＣＲ又はその機能的変異体の生物学的活性と比較して、その生物学的活性を増強する。
【００３０】
該ポリペプチドは、本発明のＴＣＲ又はその機能的変異体のα鎖及びβ鎖のいずれか、又は両方の機能的部分を含むことができる。例えば、本発明のＴＣＲ又はその機能的変異体のα鎖及び／又はβ鎖の可変領域（複数可）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の１以上（one of more）を含む機能的部分である。本発明の一実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号３若しくは４４（α鎖のＣＤＲ１）、４若しくは４５（α鎖のＣＤＲ２）、５若しくは４６（α鎖のＣＤＲ３）、６若しくは４７（β鎖のＣＤＲ１）、７若しくは４８（β鎖のＣＤＲ２）、８若しくは４９（β鎖のＣＤＲ３）、又はそれらの組み合わせのアミノ酸配列を含む、機能的部分を含むことができる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号３〜５；６〜８；４４〜４６；４７〜４９；配列番号３〜８の全て；又は配列番号４４〜４９の全てのアミノ酸配列を含む、機能的部分を含む。より好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号３〜８の全て、又は配列番号４４〜４９の全てのアミノ酸配列を含む機能的部分を含む。
【００３１】
本発明の一実施形態では、本発明のポリペプチドは、例えば、上記のＣＤＲ領域の組み合わせを含む、本発明のＴＣＲ、又はその機能的変異体の可変領域を含むことができる。これに関して、該ポリペプチドは、配列番号９若しくは５０（α鎖の可変領域）、配列番号１０若しくは５１（β鎖の可変領域）、配列番号９及び配列番号１０の両方、又は配列番号５０及び５１の両方のアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号９及び１０の両方、又は配列番号５０及び５１の両方のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
本発明の一実施形態では、本発明のポリペプチドは、上記の本発明のＴＣＲ又はその機能的変異体の定常領域を、さらに含むことができる。これに関して、該ポリペプチドは、配列番号１３若しくは５２（α鎖の定常領域）、配列番号１４若しくは５３（β鎖の定常領域）、配列番号１３及び配列番号１４の両方、又は配列番号５２及び５３の両方のアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号１３及び１４の両方、又は配列番号５２及び５３の両方のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本発明の一実施形態では、本発明のポリペプチドは、本発明のＴＣＲ又はその機能的変異体の可変領域及び定常領域の組み合わせを含んでもよい。これに関して、該ポリペプチドは、配列番号９（α鎖の可変領域）及び配列番号１３（α鎖の定常領域）の両方、配列番号１０（β鎖の可変領域）及び配列番号１４（β鎖の定常領域）の両方、又は配列番号９、１０、１３及び１４の全てのアミノ酸配列を含むことができる。一実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号５０（α鎖の可変領域）及び配列番号５２（α鎖の定常領域）の両方、配列番号５１（β鎖の可変領域）及び配列番号５３（β鎖の定常領域）の両方、又は配列番号５０〜５３の全てのアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号９、１０、１３及び１４の全て、又は配列番号５０〜５３の全てのアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明の一実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の任意のＣＤＲ領域と、本発明のＴＣＲ又はその機能的変異体の定常領域との組み合わせを含んでいてもよい。これに関して、該ポリペプチドは、配列番号３〜５及び１３の全て、配列番号６〜８及び１４の全て、又は配列番号３〜８及び１３〜１４の全てのアミノ酸配列を含むことができる。本発明の一実施形態では、該ポリペプチドは、配列番号４４〜４６及び５２の全て、配列番号４７〜４９及び５３の全て、又は配列番号４４〜４９及び５２〜５３の全てのアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号３〜８及び１３〜１４の全て、又は配列番号４４〜４９及び５２〜５３の全てのアミノ酸配列を含む。
【００３５】
本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載のＴＣＲ又はその機能的変異体のα鎖又はβ鎖の全長を含むことができる。これに関して、本発明のポリペプチドは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号１１及び１２の両方、又は配列番号５４及び５５の両方のアミノ酸配列を含むことができる。好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号１１及び１２の両方、又は配列番号５４及び５５の両方のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
本発明はさらに、本明細書に記載のポリペプチドの少なくとも１つを含むタンパク質を提供する。「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、１以上のポリペプチド鎖を含む分子を意味する。
【００３７】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号３〜５又は配列番号４４〜４６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号６〜８又は配列番号４７〜４９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖とを含むことができる。代替的又は追加的に、本発明のタンパク質は、配列番号９又は５０のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１０又は５１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含むことができる。該タンパク質は、例えば、（ｉ）配列番号９及び１３の両方若しくは配列番号３〜５及び１３の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号１０及び１４の両方若しくは配列番号６〜８及び１４の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含むことができ、又は（ｉｉ）配列番号５０及び５２の両方若しくは配列番号４４〜４６及び配列番号５２の全てのアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、配列番号５１及び５３の両方若しくは配列番号４７〜４９及び５３の全てのアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含むことができる。代替的又は追加的に、本発明のタンパク質は、配列番号１１又は５４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１２又は５５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含むことができる。この例においては、本発明のタンパク質は、ＴＣＲであり得る。代替的に、例えば、該タンパク質が、配列番号１１及び１２の両方、配列番号５４及び５５の両方のアミノ酸配列を含む単一のポリペプチド鎖を含む場合、又は該タンパク質の第１及び／又は第２のポリペプチド鎖（複数可）が更に他のアミノ酸配列、例えば、免疫グロブリン又はその一部をコードするアミノ酸配列を含む場合、本発明のタンパク質は、融合タンパク質であり得る。これに関して、本発明はまた、少なくとも１つの他のポリペプチドとともに、本明細書に記載された本発明のポリペプチドの少なくとも１つを含む融合タンパク質を提供する。該他のポリペプチドは、融合タンパク質の別個のポリペプチドとして存在することができるか、又は本明細書に記載される本発明のポリペプチドの１つとフレーム（タンデム）で発現されるポリペプチドとして存在することができる。該他のポリペプチドは、免疫グロブリン、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＭＨＣ分子、ＣＤ１分子、例えば、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄなどを含む、任意のペプチド分子若しくはタンパク質性の分子又はその部分をコードすることができるが、これらの例に限定されない。
【００３８】
該融合タンパク質は、本発明のポリペプチドの１以上のコピー及び／又は該他のポリペプチドの１以上のコピーを含むことができる。例えば、該融合タンパク質は、１、２、３、４、５又はそれ以上の本発明のポリペプチド及び／又は他のポリペプチドのコピーを含むことができる。融合タンパク質を作製する適切な方法は、当該分野で公知であり、例えば、組換えによる方法が挙げられる。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のＴＣＲ（及びその機能的部分及び機能的変異体）、ポリペプチド及びタンパク質は、α鎖及びβ鎖を連結するリンカーペプチドを含む単一のタンパク質として発現されてもよい。これに関して、配列番号１１及び１２の両方、配列番号５４及び５５の両方、配列番号９及び配列番号１０の両方、配列番号５０及び５１の両方、配列番号３〜８の全て、配列番号４４〜４９の全て、配列番号９、１０、１３及び１４の全て、配列番号５０〜５３の全て、配列番号３〜８及び１３〜１４の全て、又は配列番号４４〜４９及び５２〜５３の全てを含む本発明のＴＣＲ（及びその機能的部分及び機能的変異体）、ポリペプチド及びタンパク質は、リンカーペプチドをさらに含んでもよい。該リンカーペプチドは、宿主細胞中の組換えＴＣＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）、ポリペプチド及び／又はタンパク質の発現を有利に促進してもよい。該リンカーペプチドは、任意の適切なアミノ酸配列を含んでもよい。本発明の一実施形態では、該ＴＣＲ（若しくはその機能的部分又はその変異体）、ポリペプチド又はタンパク質は、自己切断性の、ウイルスリンカーペプチドを含む。例えば、該リンカーペプチドは、配列番号２８を含んでもよい。該リンカーペプチドを含むコンストラクトを宿主細胞で発現させた場合、、該リンカーペプチドが切断され、分離したα鎖及びβ鎖となってもよい。
【００４０】
本発明のタンパク質は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドの少なくとも１つを含む組換え抗体であり得る。本明細書中で使用される場合、「組換え抗体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、本発明のポリペプチドの少なくとも１つと、抗体のポリペプチド鎖又はその一部を含む組換え（例えば、遺伝子操作された）タンパク質を指す。抗体又はその一部のポリペプチドは、重鎖、軽鎖、重鎖若しくは軽鎖の可変領域若しくは定常領域、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は抗体のＦｃ、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ）２'断片などであり得る。抗体のポリペプチド鎖又はその一部は、該組換え抗体とは異なるポリペプチドとして存在することができる。代替的に、抗体のポリペプチド鎖又はその一部は、本発明のポリペプチドとフレーム（タンデム）で発現するポリペプチドとして存在することができる。抗体のポリペプチド又はその一部は、本明細書に記載の任意の抗体及び抗体断片を含む、任意の抗体又は任意の抗体断片のポリペプチドであり得る。
【００４１】
本発明（それらの機能的変異体を含む）のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質は、該ＴＣＲ、ポリペプチド若しくはタンパク質（又はそれらの機能的変異体）が、それらの生物学的活性、例えば、ＴＧに特異的に結合し；哺乳動物のがんを検出し；又は哺乳動物におけるがんを処置若しくは予防するなどの能力を保持する限り、任意の長さ、すなわち、任意の数のアミノ酸を含むことができる。例えば、該ポリペプチドは、約５０〜約５０００アミノ酸長の範囲で、例えば、５０、７０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上のアミノ酸の長さであり得る。これに関して、本発明のポリペプチドはオリゴペプチドも含む。
【００４２】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質（その機能的変異体を含む）は、天然に存在する１以上のアミノ酸の代わりに合成アミノ酸を含むことができる。そのような合成アミノ酸は、当該技術分野において公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノ−ｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチル−システイン、トランス−３−及びトランス−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ'−ベンジル−Ｎ'−メチル−リジン、Ｎ'，Ｎ'−ジベンジルリジン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）−カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、α−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンが挙げられる。
【００４３】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及びタンパク質（その機能的変異体を含む）は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、環化、例えば、ジスルフィド架橋を介したもの、又は酸付加塩への変換及び／又は適切な二量体化若しくは重合化又はコンジュゲート化することができる。
【００４４】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド及び／又はタンパク質（その機能的変異体を含む）は、例えば、デノボ合成のような当該技術分野で公知の方法によって得ることができる。また、ポリペプチド及びタンパク質は、標準的な組換え法により本明細書に記載の核酸を用いて、組換えにより作製することができる。例えば、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4thed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(2012)を参照されたい。代替的には、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド及び／又はタンパク質（その機能的変異体を含む）は、Synpep (Dublin, CA)、Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD)及びMultiple Peptide Systems (Sandiego, CA)のような企業によって商業的に合成することができる。これに関して、本発明のＴＣＲ（その機能的変異体を含む）、ポリペプチド及びタンパク質は、合成、組換え、単離及び／又は精製することができる。
【００４５】
コンジュゲート、例えば、本発明の任意のＴＣＲ、ポリペプチド若しくはタンパク質（それらの任意の機能的変異体を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、宿主細胞集団、又は抗体若しくはその抗原結合部分を含むバイオ・コンジュゲートは本発明の範囲に含まれる。コンジュゲートを合成する一般的な方法と同じく、コンジュゲートは、当技術分野で公知である。
【００４６】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載されている、任意のＴＣＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）、ポリペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本明細書で使用する「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」、「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」及び「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」を含み、一般にＤＮＡ又はＲＮＡのポリマーを意味し、一本鎖又は二本鎖であり、天然の材料から合成又は取得する（例えば、単離及び／又は精製する）ことができる。それらは、天然、非天然又はは改変されたヌクレオチドを含むことができ、そして天然、非天然又はは改変されたヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、修飾されていないオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間にみられるホスホジエステルの代わりの、ホスホロアミデート結合又はホスホロチオエート結合のようなものである。一実施形態では、該核酸は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。該核酸が、任意の挿入、欠失、逆位及び／又は置換を含まないことが一般には好ましい。しかし、本明細書で考察されるように、核酸が１以上の挿入、欠失、逆位、及び／又は置換を含んでいても、いくつかの例においては適切である。
【００４７】
好ましくは、本発明の核酸は組換え体である。本明細書で使用される場合、用語「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」は、（ｉ）天然又は合成の核酸セグメントを、生細胞内で複製することができる核酸分子に加えることによって、生細胞の外に構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されたものの複製で得られる分子を指す。本明細書の目的のためには、該複製はインビトロ複製、又はインビボ複製であり得る。
【００４８】
該核酸は、当技術分野で公知の手順を用いて、化学合成及び／又は酵素的ライゲーション反応に基づいて構築することができる。例えば、上記のGreen and Sambrookらを参照されたい。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を増加させるため、若しくはハイブリダイゼーション時に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるため（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）に設計された、様々な修飾ヌクレオチドを用いて化学的に合成することができる。該核酸を合成するために使用することができる修飾されたヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−置換アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５'−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル及び２，６−ジアミノプリンであるが、これらに限定されない。代替的には、本発明の核酸の１以上は、Macromolecular Resources (Fort Collins, CO)及びSynthegen (Houston, TX)のような企業から購入することができる。
【００４９】
該核酸は、本明細書に記載の、任意のＴＣＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）、ポリペプチド又はタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列を含むことができる。本発明の一実施形態では、該核酸は、配列番号２２（α鎖のＣＤＲ１）；配列番号２３（α鎖のＣＤＲ２）；配列番号２４（α鎖のＣＤＲ３）；配列番号２５（β鎖のＣＤＲ１）；配列番号２６（β鎖のＣＤＲ２）；又は配列番号２７（β鎖のＣＤＲ３）のヌクレオチド配列を含んでもよい。好ましくは、該核酸は、配列番号２２〜２４の全て；配列番号２５〜２７の全て；又は配列番号２２〜２７の全てのアミノ酸配列を含む。特に好ましい実施形態では、該核酸は、配列番号２２〜２７の全てのヌクレオチド配列を含む。本発明の一実施形態では、該核酸は、配列番号１５（α鎖可変領域）；配列番号１６（β鎖可変領域）；又は配列番号１５及び１６の両方のヌクレオチド配列を含んでもよい。好ましくは、該核酸は、配列番号１５及び１６の両方のヌクレオチド配列を含む。本発明の別の実施形態では、該核酸は、配列番号１７若しくは５６（α鎖全長）；配列番号１８若しくは５７（β鎖全長）；配列番号１７及び１８の両方、又は配列番号５６及び５７の両方のヌクレオチド配列を含んでもよい。好ましくは、該核酸は、配列番号１７及び１８の両方、又は配列番号５６及び５７の両方のヌクレオチド配列を含む。
【００５０】
本発明の一実施形態では、該核酸は、ＴＣＲα又はβ鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。これに関して、本明細書中に記載される任意の核酸は、配列番号１９（α鎖の定常領域）；配列番号２０（β鎖の定常領域）；又は配列番号１９及び２０の両方のヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。好ましくは、該核酸は、配列番号１５及び１９の両方；配列番号１６及び２０の両方；配列番号１５〜１６及び１９〜２０の全て；配列番号２２〜２４及び１９の全て；配列番号２５〜２７及び２０の全て；又は配列番号２２〜２７及び１９〜２０の全てを含む。特に好ましい実施形態では、該核酸は、配列番号１５〜１６及び１９〜２０の全て、又は配列番号２２〜２７及び１９〜２０の全てのヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
本発明の一実施形態では、配列番号５６及び５７のヌクレオチド配列を含む核酸はヒトＴＣＲをコードする。本発明の一実施形態では、配列番号２２〜２４の全て；配列番号２５〜２７の全て；配列番号２２〜２７の全て；配列番号１５及び１６の両方；配列番号１７及び１８の両方；配列番号１５及び１９の両方；配列番号１６及び２０の両方；配列番号１５〜１６及び１９〜２０の全て；配列番号２２〜２４及び１９の全て；配列番号２５〜２７及び２０の全て；又は配列番号２２〜２７及び１９〜２０の全てのヌクレオチド配列を含む核酸はネズミＴＣＲをコードする。
【００５２】
本発明はまた、本明細書に記載の任意の核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、又は本明細書に記載の任意の核酸のヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００５３】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする該ヌクレオチド配列は、好ましくは高度にストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする。「高度にストリンジェンシーな条件（ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、該ヌクレオチド配列が、非特異的なハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に強く、標的配列（本明細書に記載の任意の核酸のヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高度にストリンジェンシーな条件には、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド又はヌクレオチド配列と一致するいくつかの小さな領域（例えば、３〜１０塩基）を偶然有するランダム配列からわずかに異なった（scattered）ミスマッチを含むポリヌクレオチドを区別しうる条件が含まれる。そのような相補性の小領域は、１４〜１７塩基又はそれ以上の完全長の相補鎖よりも容易に融解し、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションによりそれらを容易に区別することができる。比較的高度にストリンジェンシーな条件には、例えば、約５０〜７０℃の温度で、約０．０２〜０．１ＭのＮａＣｌ又はそれと同等な条件によって提供されるような、低塩及び／又は高温条件が含まれる。そのような高度にストリンジェンシーな条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的鎖との間のミスマッチがあれば、ほとんど許容せず、任意の本発明のＴＣＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）の発現を検出するのに特に適している。ホルムアミド添加量を増加することにより、条件をより厳しくすることができることは一般的に理解されている。
【００５４】
本発明はまた、本明細書に記載の任意の核酸に対して、少なくとも約７０％又はそれ以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。これに関して、該核酸は、本質的に、本明細書に記載の任意のヌクレオチド配列からなってもよい。
【００５５】
本発明の核酸は、組換え発現ベクターに組み込むことができる。これに関して、本発明は、本発明の任意の核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。本発明の一実施形態では、該組換え発現ベクターは、α鎖、β鎖及びリンカーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、一実施形態では、該組換え発現ベクターは、配列番号２１（配列番号１１及び１２のα及びβ鎖、及びそれらの間に位置するリンカーをコードする）のヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
本明細書の目的のために、用語「組換え発現ベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、コンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合、宿主細胞によってｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドが発現されるような遺伝子改変オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド・コンストラクトを意味し、該ベクターは、細胞内で発現されるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドを有するのに十分な条件下で細胞と接触する。本発明のベクターは、全体として自然発生的ではない。しかしながら、ベクターの部分は天然に存在し得る。本発明の組換え発現ベクターは、一本鎖又は二本鎖であり、天然の材料から部分的に合成又は取得することができ、そして天然、非天然又は改変されたヌクレオチドを含むことができる、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む任意の型のヌクレオチドを含むことができるが、それらに限定されない。該組換え発現ベクターは、天然に存在するヌクレオチド間結合、天然に存在しないヌクレオチド間結合、又はその両方の型の結合を含むことができる。好ましくは、非天然で生じた若しくは改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写又は複製を妨害しない。
【００５７】
本発明の組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであることができ、任意の適切な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために用いることができる。適切なベクターには、例えば、プラスミド及びウイルスのように増殖及び拡大（expansion）のため、若しくは発現又はその両方のために設計されたものが挙げられる。該ベクターは、pUCシリーズ（Fermentas Life Sciences）、pBluescriptシリーズ（Stratagene, LaJolla, CA）、pETシリーズ（Novagen, Madison, WI）、pGEXシリーズ（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）及びpEXシリーズ（Clonetech, Palo Alto, CA）からなる群の中から選択することができる。バクテリオファージベクター、例えば、λGT10、λGT11、λZapII（Stratagene）、λEMBL4及びλNM1149もまた使用することができる。植物発現ベクターの例としては、pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121及びpBIN19（Clonetech）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、pEUK-C1、pMAM及びpMAMneo（Clonetech）が挙げられる。好ましくは、該組換え発現ベクターはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターである。特に好ましい実施形態では、該組換え発現ベクターはMSGV1ベクターである。
【００５８】
本発明の組換え発現ベクターは、例えば、上記のGreen and Sambrookらに記載されている、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。環状又は線状である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核宿主細胞において機能的である複製システムを含むように調製することができる。複製システムは、例えば、ＣｏｌＥ１、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来するものであり得る。
【００５９】
望ましくは、該組換え発現ベクターは、ベクターがＤＮＡベースであるのか、又はＲＮＡベースであるのかを考慮して適切な形で、ベクターが導入される宿主細胞（例えば、細菌、真菌、植物又は動物）の型に特異的な転写及び翻訳の開始及び終止コドンなどの、調節配列を含む。
【００６０】
該組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞の選択を可能にする１以上のマーカー遺伝子を含むことができる。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主細胞における相補性などを含む。本発明の発現ベクターのための適切なマーカー遺伝子は、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子である。
【００６１】
該組換え発現ベクターは、ＴＣＲ、ポリペプチド、若しくはタンパク質（その機能的変異体を含む）をコードするヌクレオチド配列、又はＴＣＲ、ポリペプチド若しくはタンパク質（その機能的変異体を含む）をコードするヌクレオチド配列に相補的であるか若しくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結した天然又は非天然プロモーターを含むことができる。プロモーターの選択、例えば、強、弱、誘導性、組織特異性及び発生段階特異性は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターの組み合わせも当業者の技術の範囲内である。該プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びネズミ幹細胞ウイルスの長い末端反復に見出されるプロモーターであり得る。
【００６２】
本発明の組換え発現ベクターは、一過性の発現若しくは安定した発現のいずれかのために、又はその両方のために、設計することができる。また、組換え発現ベクターは、構成的発現又は誘導発現のために作製することができる。さらに、該組換え発現ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製することができる。
【００６３】
本明細書において、「自殺遺伝子（ｓｕｉｃｉｄｅ ｇｅｎｅ）」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞を死滅させる遺伝子を指す。該自殺遺伝子は、遺伝子が発現される細胞における作用因子、例えば、薬剤に対する感受性を付与し、細胞がその作用因子と接触、又はそれに対して曝露した場合に細胞を死滅させる遺伝子であり得る。自殺遺伝子は、当該技術分野で公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンダミナーゼ（cytosine daminase）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及びニトロレダクターゼが挙げられる。
【００６４】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の任意の組換え発現ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」は、本発明の組換え発現ベクターを含み得る任意のタイプの細胞をいう。該宿主細胞は、真核細胞、例えば、植物、動物、菌類若しくは藻類又は原核細胞、例えば、バクテリア又は原生動物であり得る。該宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞、すなわち生物、例えば、ヒトから直接単離した細胞であり得る。該宿主細胞は、付着細胞又は懸濁細胞、すなわち懸濁液中で増殖する細胞であり得る。適切な宿主細胞は当該技術分野で公知であり、例えば、ＤＨ５α大腸菌細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。組換え発現ベクターを増幅又は複製する目的のために、該宿主細胞は好ましくは原核細胞、例えば、ＤＨ５α細胞である。組換えＴＣＲ、ポリペプチド又はタンパク質を産生する目的のために、該宿主細胞は好ましくは哺乳動物細胞である。最も好ましくは、該宿主細胞は、ヒト細胞である。宿主細胞は、任意の細胞型であり、任意のタイプの組織に由来し、任意の発生段階であり得るが、好ましくは末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。より好ましくは、該宿主細胞はＴ細胞である。
【００６５】
本明細書の目的のために、該Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞のような任意のＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、又は培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など由来のＴ細胞、又は哺乳動物から得られたＴ細胞であり得る。哺乳動物から得られたものである場合、該Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺又は他の組織若しくは体液を含む多数の供給源から得ることができるが、これらに限定されない。Ｔ細胞は濃縮又は精製されていてもよい。好ましくは、該Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。該Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、記憶Ｔ細胞（例えば、中央記憶Ｔ細胞及びエフェクター記憶Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞などを含む、任意のタイプのＴ細胞及び任意の発生段階のＴ細胞であり得るが、これらに限定されない。
【００６６】
また、本発明は、本明細書で記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞集団を提供する。該細胞集団は、記載された任意の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含む、遺伝的に不均一な集団であり得る。加えて、少なくとも１つの他の細胞、例えば、任意の組換え発現ベクターを含まない宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、又はＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞などが挙げられる。代替的に、該細胞集団は、集団が、組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、本質的にそれからなる）、実質的に均質な集団であり得る。該集団は細胞のクローン集団であってもよく、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含むような、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであってもよい。本発明の一実施形態では、該細胞集団は、本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
【００６７】
本発明の一実施形態においては、集団の細胞数は急速に増加してもよい。Ｔ細胞数の増殖は、例えば、米国特許第8,034,334号；米国特許第8,383,099号；米国特許出願公開第2012/0244133号；Dudleyら, J. Imm nother., 26:332-42 (2003)；及びRiddellら, J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990)に記載されているように、当該技術分野において公知である方法の任意の１つによって達成することができる。一実施形態において、Ｔ細胞数の増殖は、Ｔ細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ−２及びフィーダーＰＢＭＣ（例えば、放射線照射した同種異形のＰＢＭＣ）と共に培養することで実施される。
【００６８】
本発明は、さらに、本明細書に記載の任意のＴＣＲ（又はその機能変異体）の機能的部分に特異的に結合する抗体、又はその抗原結合部位を提供する。好ましくは、該機能的部位が、特異的にがん抗原、例えば、配列番号３若しくは４４（α鎖のＣＤＲ１）、配列番号４若しくは４５（α鎖のＣＤＲ２）、配列番号５若しくは４６（α鎖のＣＤＲ３）、配列番号６若しくは４７（β鎖のＣＤＲ１）、配列番号７若しくは４８（β鎖のＣＤＲ２）、配列番号８若しくは４９（β鎖のＣＤＲ３）、配列番号９若しくは５０（α鎖の可変領域）、配列番号１０若しくは５１（β鎖の可変領域）、又はそれらの組み合わせ、例えば、配列番号３〜５；４４〜４６；６〜８；４７〜４９；３〜８；４４〜４９；９；１０；５０；５１；９〜１０若しくは５０〜５１のアミノ酸配列を含む機能的部位に結合する。さらに好ましくは、該機能的部分が、配列番号３〜８、４４〜４９、９及び１０、又は５０及び５１のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態においては、該抗体又はその抗原結合部位が、６つのＣＤＲ全て（α鎖のＣＤＲ１〜３及びβ鎖のＣＤＲ１〜３）によって形成されるエピトープに結合する。該抗体は、当該分野において公知の任意の型の免疫グロブリンであり得る。例えば、該抗体は、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどであり得る。該抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであり得る。該抗体は、自然界に存在する抗体、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどから単離及び／又は精製した抗体であり得る。代替的には、該抗体は、遺伝子工学的に作製した抗体、例えば、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。該抗体は、単量体又は多量体であり得る。また、該抗体は、本発明のＴＣＲ（又はその機能的変異体）の機能的部分に対して、任意のアフィニティーレベル又はアビディティーレベルを有することができる。望ましくは、他のペプチド又はタンパク質との交差反応が最小限であるように、抗体は、本発明のＴＣＲ（又はその機能的変異体）の機能的部分に対して特異的である。
【００６９】
本発明のＴＣＲの任意の機能的部分又は機能的変異体に対する抗体の結合能力を試験する方法は、当該技術分野において公知であり、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降及び競合的阻害アッセイのような任意の抗体−抗原結合アッセイを含む。
【００７０】
抗体を作製するために適した方法は、当該技術分野において公知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、C.A. Janewayら. (eds.), Immunobiology, 8th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2011)に記載されている。代替的には、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法、非ヒト動物において抗体を産生する方法、バクテリオファージベクター発現システム、のような他の方法が、当該技術分野において公知である。
【００７１】
ファージディスプレイは、本発明の抗体を作製するためにも用いることができる。これに関連して、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージ・ライブラリーは、標準的な分子生物学及び組換えＤＮＡ技術（例えば、Green and Sambrookら. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4thEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012)を参照）を用いて作製することができる。望ましい抗原に対して特異的に結合するように、望ましい特異性を有する可変領域をコードするファージは選択され、完全抗体又は部分抗体は、選択した可変ドメインを含むように再構築される。再構築した該抗体をコードする核酸配列は、ハイブリドーマ作製に用いられるミエローマ細胞のような、好適な細胞株に導入され、モノクローナル抗体の性質を有する抗体が、該細胞によって分泌される（上記のJanewayらを参照）。
【００７２】
ヒト化抗体の作製方法は、当該技術分野において公知である。抗体は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の遺伝子に特異的な遺伝子組換えがなされたトランスジェニックマウスによっても産生することができる。そのような方法は当該技術分野において公知であり、例えば、上記Janewayらに記載されている。
【００７３】
本発明は、本明細書に記載の任意の抗体の抗原結合部位も提供する。該抗原結合部位は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｓＦｖ、ダイアボディ（diabodies）、トリアボディ（triabodies）のような、少なくとも一つの抗原結合部位を有する任意の部位であり得る。
【００７４】
１本鎖可変領域断片（ｓＦｖ）抗体断片は、合成ペプチドによって抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインと抗体軽鎖のＶドメインとが結合されているものを含む、短くしたＦａｂ断片からなり、所定の組換えＤＮＡ技術を用いることで作製することができる（例えば、上記のJanewayらを参照）。同様にして、ジスルフィド結合で安定化した可変領域断片（ｄｓＦｖ）は組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。しかしながら、本発明の抗体断片は、これらの典型的な抗体断片の型に限定されない。
【００７５】
また、該抗体又はその抗原結合部分は、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリフォスファターゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）及び元素粒子（例えば、金粒子）のような検出可能なラベルを含むように改変することができる。
【００７６】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質（その機能的変異体を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び抗体（その抗原結合部分を含む）は、単離及び／又は精製することができる。本明細書で用いられる用語「単離する」とは、自然環境から取り出すことを意味する。本明細書で用いられる場合、用語「精製する（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、純度が増すことを意味し、「純度（ｐｕｒｉｔｙ）」とは相対的な用語であって、絶対的な純度として解釈される必要はない。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％を超えていても良く又は１００％であり得る。
【００７７】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質（その機能的変異体を含む）、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び抗体（それらの抗原結合部分を含む）、これらは本明細書において、以降は「発明のＴＣＲ材料（ｉｎｖｅｎｔｉｖｅ ＴＣＲ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）」と称され、医薬組成物などの組成物に製剤化することができる。これに関して、本発明は、本明細書に記載された任意のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、機能性部分、機能的変異体、核酸、発現ベクター、宿主細胞（その集団を含む）及び抗体（その抗原結合部分を含む）を含む医薬組成物、及び医薬的に許容される担体を提供する。任意の本発明のＴＣＲ材料を含有する本発明の医薬組成物は、１を超える発明のＴＣＲ材料、例えば、ポリペプチド及び核酸、又は２以上の異なるＴＣＲ（その機能的部分及び機能的変異体を含む）を含むことができる。代替的に、医薬組成物は、アスパラギナーゼ（asparaginase）、ブスルファン（busulfan）、カルボプラチン（carboplatin）、シスプラチン（cisplatin）、ダウノルビシン（daunorubicin）、ドキソルビシン（doxorubicin）、フルオロウラシル（fluorouracil）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシ尿素（hydroxyurea）、メトトレキセート（methotrexate）、パクリタキセル（paclitaxel）、リツキシマブ（rituximab）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビンクリスチン（vincristine）などの化学療法剤のように、他の医薬的な活性がある薬剤（複数可）又は薬物（複数可）と組み合わせた本発明のＴＣＲ材料を含むことができる。
【００７８】
好ましくは、該担体は医薬的に許容される担体である。医薬組成物に関して、該担体は、特定の本発明のＴＣＲ材料のために慣用的に使用が考慮される任意の物であり得る。そのような医薬的に許容される担体は、当業者に周知であり、一般に容易に入手可能である。医薬的に許容される担体は、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。
【００７９】
担体の選択は、本発明のＴＣＲ材料を投与するために使用される特定の方法と同様に、特定の本発明のＴＣＲ材料によって部分的に決定される。従って、本発明の医薬組成物の種々の適切な製剤が存在する。適切な製剤は、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内又は腹腔内投与のための任意の製剤を含んでもよい。本発明のＴＣＲ材料を投与するために１超の経路を使用することができ、ある場合には、特定の経路は、別の経路よりも迅速かつ効果的な応答を提供することができる。
【００８０】
好ましくは、本発明のＴＣＲ材料は、注射、例えば、静脈内に投与される。本発明のＴＣＲ材料が、本発明のＴＣＲ（又はその機能的変異体）を発現する宿主細胞である場合、該注射用細胞のための医薬的に許容される担体は、例えば、通常の生理食塩水（水に溶解した、約０．９０％ｗ／ｖのＮａＣｌ、約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水約１Ｌ当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、NORMOSOL R電解質溶液（Abbott, Chicago, IL）、PLASMA-LYTE A（Baxter, Deerfield, IL）、水に溶解した５％のデキストロース又はリンゲル乳酸塩などの任意の等張な担体を含んでもよい。一実施形態では、医薬的に許容される該担体に、ヒト血清アルブミンが補充される。
【００８１】
本発明の目的のために、投与される本発明のＴＣＲ材料の量又は投与量（例えば、本発明のＴＣＲ材料が１以上の細胞である場合は細胞数）は、十分な効果、例えば、妥当な時間枠で、対象又は被験動物において、治療又は予防応答、を達成するのに十分であるべきである。例えば、本発明のＴＣＲ材料の投与量は、がん抗原（例えば、ヒトＴＧ）に結合するのに十分でなければならず、又は投与から約２時間以上、例えば、１２〜２４時間若しくはそれ以上の期間にがんを検出し、治療し若しくは予防するのに十分でなければならない。特定の実施形態では、該期間はさらに長くなる可能性がある。該投与量は、治療される動物（例えば、ヒト）の体重と同様に、特定の本発明のＴＣＲ材料の有効性及び動物（例えば、ヒト）の状態によって決定される。
【００８２】
投与量を決定するための多くのアッセイは、当技術分野で公知である。本発明の目的のために、標的細胞が溶解される程度、又はＴ細胞の異なる投与量がそれぞれ与えられた哺乳動物のセット中で、そのようなＴ細胞を哺乳動物に所与の投与量で投与した際に、本発明のＴＣＲ（又はその機能的変異体若しくは機能的部分）、ポリペプチド又はタンパク質を発現するＴ細胞によって分泌されるＩＦＮ−γの程度を比較することを含むアッセイ法を、哺乳動物への初期投与量を決定するために用いることができる。ある用量の投与の際に標的細胞が溶解される又はＩＦＮ−γが分泌される程度は、当該技術分野で公知の方法によってアッセイすることができる。
【００８３】
本発明のＴＣＲ材料の投与量はまた、特定の本発明のＴＣＲ材料の投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質及び程度によって決定される。典型的には、主治医は、年齢、体重、一般的健康状態、食事、性別、投与される本発明のＴＣＲ材料、投与経路及び治療されるがんの重篤度などの様々な要因を考慮に入れて、個々の患者を治療する本発明のＴＣＲ材料の投与量を決定する。本発明のＴＣＲ材料が細胞集団である実施形態では、１回の注入当たりに投与される細胞数は、例えば、約１×１０６〜約１×１０１２細胞、又はそれ以上で変化してもよい。ある実施形態では、１×１０６未満の細胞を投与してもよい。
【００８４】
当業者であれば、改良によって本発明のＴＣＲ材料の治療効果又は予防効果が増大するように、本発明のＴＣＲ材料を任意の数の方法で改良することができることを容易に理解するであろう。例えば、本発明のＴＣＲ材料は、直接的又は間接的な架橋のいずれかを介して標的部分に結合させることができる。標的部分に化合物、例えば、本発明のＴＣＲ材料を結合させることは当該技術分野で公知である。本明細書中で使用される場合、用語「標的部分（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）」は、標的部分が、本発明のＴＣＲ材料を表面に受容体が発現している細胞集団に向かわせることを指揮するように、細胞表面受容体を特異的に認識して結合する任意の分子又は作用物質をいう。標的部分としては、抗体又はその断片、ペプチド、ホルモン、成長因子、サイトカイン及び細胞表面受容体（例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、ＣＤ２８、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦ）、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）など）に結合する任意の他の天然又は非天然リガンドが挙げられるが、それらに限定されない。本明細書で使用される用語「架橋」という用語は、本発明のＴＣＲ材料を標的部分に連結する任意の作用物質又は分子を指す。当業者は、本発明のＴＣＲ材料の機能のために必要でない本発明のＴＣＲ材料上の部位は、架橋及び／又は標的部分を結合させるための理想的な部位であることを認識している。但し、一旦本発明のＴＣＲ材料に結合したその架橋及び／又は標的部分は、本発明のＴＣＲ材料の機能、すなわちＴＧに結合する能力又はがんを検出、治療若しくは予防する能力を妨害しないことが条件である。
【００８５】
本発明の医薬組成物、ＴＣＲ（その機能的変異体を含む）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞又は細胞集団は、がんを治療又は予防する方法において使用することができると期待される。特定の理論に拘束されるものではないが、本発明のＴＣＲ（及びその機能的変異体）は、ＴＣＲ（又は関連する本発明のポリペプチド若しくはタンパク質及びその機能的変異体）が、細胞によって発現されるとき、ＴＧを発現する標的細胞に対する免疫応答を媒介することができるように、ＴＧに特異的に結合すると考えられる。これに関して、本発明は、哺乳動物のがんを治療又は予防する方法を提供するものであって、哺乳動物のがんを治療又は予防するための有効量で、本明細書に記載の任意の医薬組成物、ＴＣＲ（及びその機能的変異体）、ポリペプチド若しくはタンパク質、又は明細書に記載の任意のＴＣＲ（及びその機能的変異体）、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む任意の核酸若しくは組換え発現ベクター、又は本明細書に記載の任意のＴＣＲ（及びその機能的変異体）、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードする組換えベクターを含む任意の宿主細胞若しくは細胞集団を哺乳類に投与すること含んでいる。
【００８６】
本発明の一実施形態は、本明細書に記載の任意の医薬組成物、ＴＣＲ（及びその機能的変異体）、ポリペプチド若しくはタンパク質、又は本明細書に記載の任意のＴＣＲ（及びその機能的変異体）、ポリペプチド、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸若しくは組換え発現ベクター、又は本明細書に記載の任意のＴＣＲ（及びその機能的変異体）、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードする組換えベクターを含む任意の宿主細胞若しくは細胞集団を提供するものであり、哺乳動物におけるがんの治療又は予防に使用される。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「治療（ｔｒｅａｔ）」及び「予防（ｐｒｅｖｅｎｔ）」ならびにそれに由来する用語は、１００％又は完全な治療又は予防を意味する必要はない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、哺乳類におけるがんの治療又は予防の任意のレベルを提供することができる。さらに、本発明の方法によって提供される治療又は予防は、治療又は予防されるがんの１以上の状態若しくは症状の治療又は予防を含むことができる。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退行を促進することを含むことができる。また、本明細書の目的のためには、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、がんの兆候又はその症状若しくは状態を遅延させることを包含することができる。
【００８８】
また、哺乳動物のがんの存在を検出する方法も提供される。該方法は、（ｉ）本明細書に記載された任意の本発明のＴＣＲ（及びその機能的変異体）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体若しくはその抗原結合部位又は医薬組成物と、哺乳動物由来の１以上の細胞を含む試料を接触させることを含んでいる。それによって複合体を形成し、該複合体を検出し、該複合体の検出が哺乳動物におけるがんの存在を示す指標となる。
【００８９】
哺乳動物におけるがんを検出する本発明の方法に関して、細胞の試料は、全細胞、その溶解物又は全細胞溶解物の一部、例えば、核若しくは細胞質画分、全タンパク質画分又は核酸画分を含むことができる。
【００９０】
本発明の検出方法の目的のために、該接触を哺乳動物に関して、インビトロ又はインビボで行うことができる。好ましくは、該接触はインビトロで行う。
【００９１】
また、該複合体の検出は、当技術分野で公知の任意の数の方法によって行うことができる。例えば、本明細書に記載の本発明のＴＣＲ（及びその機能的変異体）、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団又は抗体若しくはその抗原結合部分は、検出可能な標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォア（例えば、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ）及び元素粒子（例えば、金粒子）で標識することができる。
【００９２】
本発明の方法の目的のために、宿主細胞又は細胞集団が投与されるが、該細胞は、哺乳動物に対して同種又は自己由来であり得る。好ましくは、該細胞は哺乳動物に対して自己由来である。
【００９３】
本発明の方法に関して、該がんは以下を含む任意のがんであり得る。任意の急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、骨癌、脳癌、乳癌、肛門・肛門管若しくは肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部・胆嚢若しくは胸膜の癌、鼻・鼻腔若しくは中耳の癌、口腔の癌、膣の癌、外陰部の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、消化管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下喉頭癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、中咽頭癌、卵巣癌、陰茎癌、膵臓癌、腹膜癌、大網癌、腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌、皮膚癌、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、尿管癌及び膀胱癌である。好ましいがんは、甲状腺癌又は神経芽細胞腫である。
【００９４】
本発明の方法で言及する哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。本明細書で使用される場合、用語「哺乳動物（ｍａｍｍａｌ）」は、マウス及びハムスターのようなげっ歯類の哺乳動物及びウサギのようなウサギ目の哺乳動物を含む、任意の哺乳動物を意味するが、これらに限定されない。好ましくは、哺乳動物はネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ科）を含む食肉目である。より好ましくは、哺乳動物はウシ属（ウシ）及びイノシシ属（ブタ）を含むウシ目、又はウマ科（ウマ）を含むウマ目である。最も好ましくは、哺乳動物は霊長目、セボイド目若しくはシモイド目（サル）又は類人猿（ヒト及び類人猿）である。特に好ましい哺乳動物はヒトである。
【００９５】
以下の実施例において、本発明をさらに説明するが、言うまでもなく、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９６】
以下の材料及び方法を実施例１〜７に用いた。
【００９７】
細胞株、組織、ペプチド、及び抗体
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Sigma, St. Louis, MO）、１０ＩＵ／Ｌ甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ；Sigma-Aldrich）、インスリン−トランスフェリン−セレン（Life Technologies）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Life Technologies, Carlsbad, CA）中で、ヒュルトレがん細胞株ＸＴＣ（内分泌外科部門、ＮＣＩ）を維持した。ＨＬＡ−Ａ２を発現するＸＴＣ株（ＸＴＣ／Ａ２）を、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１を有するレトロウイルスでＸＴＣを形質導入することにより樹立した（手術部門、ＮＣＩ）。使用した細胞株はTopalian et al., J.Immunol., 142(10): 3714-25(1989)に記載のように、手術部門において切除腫瘍から作製したメラノーマ株６２４及び９３８を含んでいた。Ｃｏｓ７、Ｔ２及び２９３ＧＰ細胞株を、ＮＣＩの手術部門から入手した。線維芽細胞（手術部門、ＮＣＩ）及び小気道上皮細胞（Lonza, Walkersville, MD）を含む正常なヒト初代培養株を実験の対照として使用し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Life Technologies）で維持した。対照として用いたがん細胞株は以下の通り：ＭＤＡ２３１（乳腺癌；ＨＬＡ−Ａ２＋）、ＭＤＡ４６８（乳腺癌；ＨＬＡ−Ａ２−）、Ｈ２０８７（肺癌；ＨＬＡ−Ａ２＋）、ＢＥ−３（食道下部のバレット食道関連腺癌；ＨＬＡ−Ａ２＋）、ＳＫ−ＢＲ３（乳腺癌；ＨＬＡ−Ａ２−）、ＳＫ−ＯＶ３（卵巣腺癌；ＨＬＡ−Ａ２−）、ＢＩＣ（ヒト食道腺癌、ＨＬＡ−Ａ２＋）及び４つの腎細胞癌腫株（ＨＬＡ−Ａ２＋；外科部門、ＮＣＩ）。
【００９８】
全てのペプチド（Pi Prometrics, Huntsville, AL）をＨＬＡ−Ａ＊０２０１結合アルゴリズムに基づいて合成した。インビトロ刺激のために、２０個の最良なＨＬＡ−Ａ２結合性９マー（-mers）及び１０個の最良な１０マー（-mers）を選択した。ペプチド１〜８は、以下のＴＧエピトープを表す：1-TLLASICWV（配列番号２９）、2-NLFGGKFLV（配列番号２）、3-ELPEFLLFL（配列番号３０）、4-ALVLEIFTL（配列番号３１）、5-ILQRRFLAV（配列番号３２）、6-ALLRSGPYM（配列番号３３）、7-LVEIFTLL（配列番号３４）、8-VQQVQCWCV（配列番号３５）。
【００９９】
TAQMANリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
ＲＮＡを、外科的に切除した組織から採取するか、又は商業的に購入した（Clonetech, Mountain View, CA）。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット、又はSUPERSCRIPT III First-Strand cDNA合成システム（Life Technologies）によって合成した。抗原の比較のために、以下のRT-PCR Taqmanプローブを使用した：３'ＴＧ（00968047_ml）、ＴＰＯ（Hs00374163_A1）、ＩＹＤ（Hs00416923_A1）、ＦＯＸＥ１（Hs00915085_S1）、ＰＡＸ８（Hs00247586_m1）、及びＡＣＴＢ（Hs03023880_g1）（Life Technologies）。ＴＧについては、正常組織パネルにおけるＴＧの低発現を評価するために、カスタムデザインのTaqmanプライマー／プローブを用いた。絶対コピー数を、7500FASTリアルタイムＰＣＲシステム（Life Technologies）を用いて、各ｃＤＮＡをコードするプラスミドを対照として作成した標準曲線に基づいて算出した。
【０１００】
アデノウイルスの調製
正常な甲状腺に由来する全ＲＮＡを、RNeasy miniキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて手術標本から精製し、ランダムヘキサマーをプライマーとしたｃＤＮＡを、SUPERSCRIPT III First-Strand cDNA合成システム（Life Technologies）により合成した。ＴＧ４２−８３４８の５'側に由来する２つの短いｃＤＮＡ断片（ＴＧ４２−２１８６及びＴＧ２１７２−４２９２）をＰＣＲ増幅し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Clonetech）を用いてpShuttle2ベクターにクローニングした。配列確認後、ｐＳｈｕｔｔｌｅ２／ＴＧ４２−４２９２プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、ウエスタンブロッティング（抗体：sc-7836, Santa Cruz Biotechnology）を行うことにより、ＴＧタンパク質の産生を調べた。ｐＳｈｕｔｔｌｅ２／ＴＧ４２−４２９２プラスミドから、制限酵素消化によりサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター−ＴＧ４２−４２９２断片を得て、pAdeno-Xプラスミドにクローニングした。このプラスミドを、製造者の指示（ADENO-X発現システム１、Clonetech）に従って、組換えアデノウイルスを増幅するために使用した。増幅したウイルスをADENO-X maxi精製キット（Clonetech, Mountain View, CA）で精製し、PD10ゲルろ過カラム（GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA）を用いて緩衝液をＰＢＳと交換した。感染性ウイルスの力価を、ADENO-X rapidタイターキット（Clonetech）を用いて測定した。
【０１０１】
Ｙｅｔｉ／Ａ２マウスの免疫
Ｙｅｔｉ／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（Ｙｅｔｉ／Ａ２）を作製するために、Ｙｅｔｉマウス（Stetson et al., J.Exp.Med., 198(7): 1069-76(2003)）を、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウスと交配させた。マウスはまた、ＩＦＮ−γレポーター遺伝子である黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）のトランスジェニックであった。Ｙｅｔｉシステムでは、ＹＦＰの発現はＩＦＮ−γプロモーターによって駆動される。これらのマウスの細胞がＩＦＮ−γを産生する場合、細胞がＹＦＰも発現するのを蛍光顕微鏡で視覚化することができ、又は蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）によって検出することができる。１億コロニー形成単位（ＣＦＵ）の組換えアデノウイルス／ＴＧ４２−４２９２を用いて、２週間の間隔でＹｅｔｉ／Ａ２を免疫した（半分には尾基部の静脈注射、他方の半分には尾基部への皮下注射を行った）。２回目のアデノウイルスを用いた免疫の２週間後、脾臓細胞を採取し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Life Technologies）、５５μＭ２−メルカプトエタノール（Life Technologies）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Life Technologies）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（Life Technologies）、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（Life Technologies）、１０Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Life Technologies）及び２５０ｎｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ（Life Technologies）を含むＲＰＭＩ（Life Technologies）に組換えヒト・インターロイキン（ＩＬ）−２（３０ＩＵ／ｍｌ）を添加した中で、細胞濃度が１００万細胞／ウェルとなるように２４ウェルプレート上に播種した。個々のペプチドを、最終濃度で１μＭとなるように添加した。１週間での再刺激を、以下に記載するように行った。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１陽性のエプスタイン−バーウイルスで形質転換したＢリンパ芽球様Ｔ２細胞を１００Ｇｙで照射し、１μＭの濃度で各ペプチドを室温で２時間パルスした。培地で３回洗浄した後、Ｔ２細胞をＹｅｔｉ脾細胞におよそ１：１の細胞数比となるよう加えた。２回目のインビトロ刺激の２日後、蛍光顕微鏡（AX10, Zeiss）及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ; FACSCanto II, BD Biosciences）を用いて黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）発現を分析した。ＹＦＰを発現した培養細胞を、ＴＧ発現標的細胞（ＴＧを発現するようにトランスフェクトしたＸＴＣ／Ａ２及びＣｏｓＡ２）との共培養のために選択し、ＩＦＮ−γ分泌によって反応性を調べた。Ｔ細胞受容体遺伝子をクローニングする目的で、RNeasyキットを用いてＴＧ反応性を有する培養細胞からＲＮＡを精製した。
【０１０２】
レトロウイルス上清の作製
Robbins et al., J. Clin. Oncol, 29(7): 917-24 (2011)に記載されているように、リポフェクタミン２０００（Life Technologies）を用いて、抗ＴＧ−ＴＣＲ及びエンベロープタンパク質（ＲＤ１１４）をコードするレトロウイルスベクターで、２９３ＧＰ細胞を共トランスフェクションすることにより、レトロウイルス上清を作製した。リポフェクションの翌日、培地を新しい培地と交換した。上清を４８時間後に回収し、抗ＣＤ３で刺激した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を形質導入するために使用した。
【０１０３】
抗ＣＤ３で刺激したＰＢＬのレトロウイルス導入
全てのＰＢＬは、施設内治験審査委員会が承認した試験に登録された患者からの白血球除去輸血によって収集した。Cohen et al., Cancer Res., 66(17): 8878-86 (2006)に記載のように、５％ヒト血清（Valley Biomedical Inc., Winchester, VA）、及びＰＢＬにとって３００ＩＵ／ｍｌとなる濃度のＩＬ−２（Prometheus, San Diego, CA）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地（Life Technologies）を用いて、リンパ球を培養した。同種異系ドナーに由来するＰＢＬを、形質導入が行われる前の２日間、可溶性の抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍＬ）で刺激した。刺激後、レトロネクチン（１０μｇ／ｍＬの濃度で４００μＬのＰＢＳに溶解されている；宝酒造、日本）で最初にコートした２４ウェルプレートに、細胞を加え、続いてウイルス含有培養上清を添加し、遠心分離（２０００×ｇ、３２℃、２時間）した。ウイルスを添加した後、刺激したＰＢＬを１ウェル当たり５×１０５細胞の濃度で添加し、プレートを１０００×ｇで１０分間遠心分離した。プレートを５％ＣＯ２インキュベーター内において、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、新しいレトロネクチンでコーティングし、ウイルスを添加した２４ウェルプレートに細胞を移すことで、２回目の形質導入を行った。細胞を０．５〜１×１０６細胞／ｍＬの間の細胞密度に維持した。形質導入効率を、形質導入したＰＢＬにおけるマウスＴＣＲ−β発現のＦＡＣＳ分析で確認した。
【０１０４】
サイトカイン放出アッセイ
既に、Wang et al., J. Immunol Methods, 366(1-2): 43-51 (2011)に記載のように、形質導入したＰＢＬによるインターフェロン（ＩＦＮ）−γの放出を決定した。簡潔には、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中で３７℃、５％ＣＯ２条件下で、レトロウイルス形質導入細胞（１×１０５）を１８〜２２時間、５×１０４標的細胞（ＸＴＣ、ＸＴＣ／Ａ２、ＣｏｓＡ２又はＴＧでトランスフェクトしたＣｏｓＡ２）又は対照腫瘍細胞株と共に培養した。後日、ＩＦＮ−γ分泌を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定した。
【０１０５】
実施例１
この実施例は、ＴＧが正常組織、原発性甲状腺癌及びリンパ節転移癌において発現していることを実証する。
【０１０６】
甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペアード・ボックス８（ＰＡＸ８）、フォークヘッドボックスＥ１（ＦＯＸＥ１）、ヨードチロシン脱ヨウ素酵素（ＩＹＤ）及びサイログロブリン（ＴＧ）（van Staveren et al., Cancer Res., 67(17): 81 13-20 (2007)）を含む甲状腺特異的抗原の発現を、ＴＡＱＭＡＮ定量的ＲＴ−ＰＣＲによって調べた。これらの全ての甲状腺特異的抗原のうち、ＴＧは正常な甲状腺、原発性甲状腺癌、及び甲状腺癌のリンパ節転移癌、において最高の発現を維持した（図１Ａ）。非甲状腺、正常ヒト組織で、ＴＧの低発現を観察した。甲状腺組織におけるＴＧ発現は、他の正常な組織における発現よりも高かった（図１Ｂ）。これらのデータに基づいて、養子細胞治療のための甲状腺特異的標的抗原の候補としてＴＧを同定した。
【０１０７】
実施例２
この実施例はＴＧ４７０−４７８によるＹｅｔｉ／Ａ２脾細胞の刺激を実証する。
【０１０８】
ＨＬＡ−Ａ０２０１制限ネズミＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ０２０１及びＩＦＮ−γレポーター遺伝子（黄色蛍光タンパク質）をトランスジェニックしたＹｅｔｉマウスを、ＴＧ遺伝子の５'半分（ＴＧ４２−４２９２）をコードするアデノウィルスでワクチンすることによって作製した。該マウスは、ＴＧ含有アデノウイルスでワクチン接種した日を０日目とし、１４日目に同じアデノウイルスで２回目のワクチン接種を行った。２８日目に脾臓細胞を採取し、採取して直ぐインビトロでＴＧペプチドによって刺激し、３５日目に２回目のインビトロでのＴＧペプチド刺激を行った。
【０１０９】
２回目のインビトロ刺激の２日後、Ｙｅｔｉ／Ａ２脾細胞によるＩＦＮ−γレポーター遺伝子ＹＦＰの発現を、フローサイトメトリーによって測定した。ＴＧ類縁ペプチドでパルスしたＴ２細胞との共培養後、刺激した脾細胞におけるＹＦＰ発現を、また紫外線顕微鏡法で評価した。
【０１１０】
ＴＧ４７０−４７８エピトープ（NLFGGKFLV；配列番号２）を表すペプチド２で刺激した細胞は、フローサイトメトリー及び顕微鏡検査によって決定したように、ＹＦＰシグナルを産生した。このバルク培養細胞を、無関係（Ｔ２／ＭＡＲＴ）又はＴＧ４７０−４７８ペプチド（Ｔ２／ＴＧ）でパルスしたＴ２細胞、ＧＦＰ又はＴＧｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣＯＳＡ２細胞（ＣｏｓＡ２／ＧＦＰ及びＣｏｓＡ２／ＴＧ）、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクションした若しくはしなかったＴＧ＋甲状腺癌細胞株であるＸＴＣ細胞に対する反応性について試験した（図２）。ペプチド２で刺激した脾細胞は、ＸＴＣ／Ａ２細胞、ＣｏｓＡ２／ＴＧ細胞及び類縁ペプチドでパルスしたＴ２細胞に対して強い反応性を示した。
【０１１１】
実施例３
この実施例は実施例２のＴＧ４７０−４７８で刺激した脾細胞からのネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲの単離を実証する。
【０１１２】
全ＲＮＡを、ＲＮＡ単離キット（RNeasy, Qiagen）によりバルク培養細胞から単離した。ＴＣＲα及びβ鎖のｃＤＮＡの５'末端の増幅を、SMARTer 5'RACEキット（Clonetech）によって、以下のプライマーを用いて行った：ユニバーサルプライマーＡミックス（Clonetech）、α特異的プライマー5'-GGCTACTTTCAGCAGGAGGA-3'（配列番号３６）、β特異的プライマー5'-AGGCCTCTGCACTGATGTTC-3'（配列番号３７）。ＴＣＲα及びβのｃＤＮＡ分子をＴＡクローニングによりＴＯＰＯベクターに挿入した。α鎖及びβ鎖の４８の個々のコロニーからのプラスミドを精製し、配列決定した。この配列分析によってオリゴクローン性を明らかにした。α鎖がTRAV3D-3*02/J22*01であるのは２７／４８コロニー、α鎖がTRAV15N-1*01であるのは２１／４８コロニー及びβ鎖がTRBV26*01/D2*01/J2-5*01であるのは４５／４７コロニーであった。TRAV15N-1*01は非生産的組換えであったため無視した。シーケンスデータに基づいて、以下のプライマーを合成した（Life Technologies）：α鎖についてはＴＣＲαフォワード（配列番号３８）及びＴＣＲαリバース（配列番号３９）及びβ鎖についてはＴＣＲβフォワード（配列番号４３）及びＴＣＲβリバース（配列番号４０）。ＲＴ−ＰＣＲによりα鎖及びβ鎖の全長ｃＤＮＡを単離した。α鎖及びβ鎖ｃＤＮＡは、それぞれ配列番号１１及び１２をコードした。
【０１１３】
実施例４
この実施例は実施例３のネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲをコードするレトロウイルス組換え発現ベクターの作製を実証する。
【０１１４】
実施例３に記載の全長のα鎖及びβ鎖を単離した後、配列番号４１、４２及び４３を７：２：１のモル比で混合したものをフォワードプライマー、配列番号４０をリバースプライマーとして用いて、自己切断２Ａペプチド配列をβ鎖の５'に導入した。
【０１１５】
増幅後、α鎖及び２Ａ−β鎖を、ネズミ幹細胞ウイルス・ベースのレトロウイルスベクターｐＭＳＧＶ（Zhao et al., J. Immunol., 174(7): 4415-23 (2005)）の変異物であるレトロウイルスベクターＭＳＧＶ１（配列番号２１）に、ＩｎＦｕｓｉｏｎ反応（Clonetech）によりクローニングした。マウス抗ＴＧ−ＴＣＲをコードするプラスミドは、自己切断ｐ２Ａ領域（配列番号２８）によって隔てられたα鎖及びβ鎖（それぞれ、配列番号１１及び１２）をコードする７３９４塩基対の配列であった。サンガーシーケンシングによりプラスミドの配列を確認した。
【０１１６】
実施例５
この実施例は、ネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターによるドナーＰＢＬの形質導入を実証する。
【０１１７】
抗ＣＤ３で刺激したヒト・ドナーＰＢＬを、実施例４のベクターにより、レトロウイルスで形質導入した。形質導入の３日後、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８及びマウス抗ＴＣＲβ鎖又は抗ＭＡＲＴ−１／ＨＬＡ−Ａ２四量体に対する抗体で標識することによりＦＡＣＳ分析を実施した。３人のドナー患者に由来するＰＢＬの形質導入効率は高く（８０〜９０％）、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との間に有意差はなかった。実験を５回以上実施し、それぞれで同様の結果であった。
【０１１８】
実施例６
この実施例はＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋／ＴＧ＋標的に対するネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲの反応性を実証する。
【０１１９】
抗ＣＤ３で刺激したＰＢＬを、実施例４のネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲ又は抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。非形質導入細胞を、対照として使用した。形質導入の３日後に、１×１０５の形質導入細胞又は対照細胞を、ＴＧ（NLFGGKFLV（配列番号２））（Ｔ２／ＴＧ）又はＭＡＲＴ−１（Ｔ２／ＭＡＲＴ−１）ペプチドのいずれかでパルスした５×１０４のＴ２細胞と共培養した。ネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）を発現するＰＢＬは、非常に低い濃度（＜０．１ｎＭ）でペプチドを認識し、抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲ対照を認識しなかった（図３Ａ）。
【０１２０】
マウス抗ＴＧ−ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）をコードするベクターで形質導入したＰＢＬについて、腫瘍細胞株又はＴＧを発現するようにトランスフェクトした細胞株との共培養後に、ヒトＩＦＮ−γの放出を決定することによって反応性を分析した。ＸＴＣ／Ａ２及びＣｏｓＡ２／ＴＧを含む、ＨＬＡ−Ａ２＋ＴＧ＋細胞株に応答するネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）をコードするベクターで形質導入したＰＢＬは、高レベルのＩＦＮ−γを放出した（図３Ｂ）。
【０１２１】
実施例７
この実施例はＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋／ＴＧ＋標的に対するネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲの特異性を実証する。
【０１２２】
ＸＴＣ、ＸＴＣ／Ａ２、並びにＨ２０８７、ＢＩＣ、ＢＥ−３、ＳＫ−ＯＶ３、ＳＫ−ＢＲ３、ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ４６８、４つの腎細胞癌株、正常ヒト線維芽細胞及び小気道上皮細胞を含む、ＴＧ及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１のいずれか又は両方を発現しない細胞株パネル及び正常組織に対する反応性を分析することによって、ネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）の特異性を試験した（表１）。表１に示すように、全ての細胞株はＸＴＣ／Ａ２を除き、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−及びＴＧ−のいずれか又は両方であった。ネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲ（配列番号１１及び１２）をコードするベクターで形質導入したＰＢＬは、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＴＧ＋ＸＴＣ／Ａ２細胞株に対してのみ反応性を示し、ＴＧ陰性又はＨＬＡ−Ａ＊０２０１陰性の任意の細胞株に対して反応性を示さなかった。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−患者及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋患者由来の、ＴＧを発現している、新しい切除組織、正常な組織、原発性甲状腺組織に対するネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲの更なる試験により、ネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲ形質導入ＰＢＬは、ＩＦＮ−γを分泌し、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋／ＴＧ＋に対する反応性を示したが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−／ＴＧ＋組織に対する反応性を示さなかった。
【０１２３】
【表１】
0006666342.tif 000002
【０１２４】
実施例８
この実施例はヒト抗ＴＧ−ＴＣＲの単離及びＰＢＬへのヒト抗ＴＧ−ＴＣＲの形質導入効率を実証する。
【０１２５】
ＴＧ４２−４２９２由来の３０個のコンピューターアルゴリズムで予測したＨＬＡ−Ａ２高結合ペプチドで、ヒトのＰＢＬを個別に４回刺激した。４回のインビトロ刺激後、ＴＧ３−１１ペプチド（LVLEIFTLL、配列番号５８）で刺激した培養細胞はＸＴＣ／Ａ２に対して反応性を示した。この培養細胞について限界希釈クローニングを行い、分析した２８クローンのうち、１つのクローン１４がＴＧ特異的反応性を有していた。細胞の増殖後、５'ＲＡＣＥ、続いてＲＴ−ＰＣＲによってＴＣＲα及びβ遺伝子をクローニングした（それぞれ配列番号５４及び５５をコードする）。ＰＢＬを、ヒト抗ＴＧ−ＴＣＲをコードするレトロウイルス発現ベクターで形質導入した。
【０１２６】
形質導入したＰＢＬにおけるヒト抗ＴＧ−ＴＣＲ発現の形質導入効率を、ＦＡＣＳ分析で確認した。２人のドナー患者由来のＰＢＬの形質導入効率は高く（７５〜８０％）、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との間に有意差はなかった。
【０１２７】
実施例９
この実施例においては実施例８のヒト抗ＴＧ−ＴＣＲの反応性を示す。
【０１２８】
実施例８のヒト抗ＴＧ−ＴＣＲを形質導入したＰＢＬを種々の濃度のＭＡＲＴ−１又はＴＧ３−１１でパルスしたＴ２細胞と共培養し、ＩＦＮ−γを測定した（ｐｇ／ｍｌ）。結果を表２Ａに示す。
【０１２９】
【表２】
0006666342.tif 000003
【０１３０】
実施例３のネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲで形質導入したＰＢＬを、種々の濃度のＭＡＲＴ−１又はＴＧ４７０−４７８でパルスしたＴ２細胞と共培養した。結果を表２Ｂに示す。
【０１３１】
【表３】
0006666342.tif 000004
【０１３２】
表２Ａ及び２Ｂに示すように、ネズミ抗ＴＧ−ＴＣＲの反応性は、ヒト抗ＴＧ−ＴＣＲの反応性よりも優れていたが、ヒト抗ＴＧ−ＴＣＲで形質導入したＰＢＬは、ＴＧ３−１１でパルスした細胞に対して反応性であった。
【０１３３】
実施例８のヒト抗ＴＧ−ＴＣＲ又は実施例３のマウス抗ＴＧ−ＴＣＲで形質導入したＰＢＬを、ＣＯＳＡ２／ＧＦＰ細胞、ＣＯＳＡ２／ＴＧ細胞、６２４Ｍｅｌ細胞、ＸＴＣ細胞又はＸＴＣ／Ａ２細胞と共培養し、ＩＦＮ−γを測定した（ｐｇ／ｍｌ）。結果を表３に示す。
【０１３４】
【表４】
0006666342.tif 000005
【０１３５】
表３に示すように、マウス抗ＴＧ−ＴＣＲの反応性はヒト抗ＴＧ−ＴＣＲの反応性よりも優れていたが、ヒト抗ＴＧ−ＴＣＲで形質導入したＰＢＬは、ＨＬＡ−Ａ２＋／ＴＧ＋細胞株に対して反応性であった。
【０１３６】
別の実験において、形質導入していない（ＵＴ）、又は実施例８のヒト抗ＴＧ−ＴＣＲ、実施例３のマウス抗ＴＧ−ＴＣＲ若しくは抗ＭＡＲＴ−１  ＴＣＲで形質導入した２人の患者由来のＰＢＬを、ＣＯＳＡ２／ＧＦＰ細胞、ＣＯＳＡ２／ＭＡＲＴ−１細胞、ＴＧを発現するよう形質導入したＣｏｓ７−ＨＬＡ−Ａ＊０１細胞（ＣＯＳＡ１／ＴＧ細胞）、ＣＯＳＡ２／ＴＧ細胞、６２４Ｍｅｌ細胞（ＭＡＲＴ−１＋）、９３８Ｍｅｌ細胞、ＸＴＣ細胞又はＸＴＣ／Ａ２細胞と共培養し、ＩＦＮ−γを測定した（ｐｇ／ｍｌ）。結果を表４Ａ（患者１）及び表４Ｂ（患者２）に示す。
【０１３７】
【表５】
0006666342.tif 000006
【０１３８】
【表６】
0006666342.tif 000007
【０１３９】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−患者及びＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋患者に由来する、ＴＧを発現し、新しく切除した、正常な、原発性甲状腺組織に対するヒト抗ＴＧ−ＴＣＲのさらなる試験によって以下を実証した。ＩＦＮ−γ分泌を測定した場合、ヒト抗ＴＧ−ＴＣＲを形質導入したＰＢＬはＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋／ＴＧ＋に対して反応性であったが、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−／ＴＧ＋組織に対しては反応性ではなかった。
【０１４０】
本明細書中に引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が個別にかつ具体的に援用され、その全体が本明細書に記載されているのと同程度に本明細書に援用される。
【０１４１】
本発明を記載する文脈（特に添付の特許請求の範囲の文脈）における用語「a」、「an」、「the」及び「少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、単数及び複数形を含むものとして解釈されるべきである。「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」という用語に続く１以上の項目のリスト（例えば、「Ａ及びＢの少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ）」）の使用は、別段の記載がない限り、又は文脈によって明確に矛盾しない限り、リストした項目（Ａ若しくはＢ）から選択した１つの項目又は２以上の任意の組み合わせ、を意味するものと解釈されるべきである。「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含有する(containing)」という用語は、別段の記載がない限り、制限のない用語（すなわち、「含むが、これに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個別に指す簡略方法として役立つことを意図しており、本明細書において個々の値はそれぞれ個別に列挙されているかのように、個々の値が明細書に取り込まれる。本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供される任意の及び全ての例又は例示的な言語（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）の使用は、単に本発明をよりよく示すことを意図しており、特に断らない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠であるとして、任意の主張されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０１４２】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するために本発明者らに知られている最良の形態を含むものとして、本明細書に記載する。これらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の明細書を読むことによって当業者にとって明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこのような変形を適切に使用することを期待しており、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は適用法によって許容されるように、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載された主題の全ての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、又は文脈によって明らかに否定されない限り、それらの全ての可能な変形例における上記要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【図１】
0006666342.tif 000008
【図２】
0006666342.tif 000009
【図３】
0006666342.tif 000010
【図４】
0006666342.tif 000011
【図５】
0006666342.tif 000012
【配列表】
0006666342000001.app