(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法：
（ａ）前記サンプルを第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）を検出するための第１シグナル−発生手段及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を検出するための第２シグナル−発生手段と共にインキュベーションし、単一類型の検出器を使用して、第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）でシグナルを検出する段階であって；前記第１シグナル−発生手段は、前記第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド及び標識を含み、かつ前記第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）の存在時にシグナルを発生し、前記第２シグナル−発生手段は、前記第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド及び標識を含み、かつ前記第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）の存在時にシグナルを発生し、前記シグナルの発生はリアルタイムＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）により行われ；前記第１シグナル−発生手段及び前記第２シグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルは、前記単一類型の検出器によって、前記２つのターゲット核酸配列に対して区別されず；前記第１検出温度及び前記第２検出温度は、前記第１シグナル−発生手段及び前記第２シグナル−発生手段によってシグナルが発生する温度範囲を考慮して選択され；
（ｂ）前記２つのターゲット核酸配列に対して、前記第１検出温度及び前記第２検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記の２つの方程式を提供する段階；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１  （Ｉ）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２  （ＩＩ）
前記式において、（ＳＤ１）は、前記第１検出温度から検出されるシグナルであり、（ＳＤ２）は、前記第２検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）は、前記第１検出温度で前記第１シグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ１）は、前記第１検出温度で前記第２シグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ１Ｄ２）は、前記第２検出温度で前記第１シグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ２）は、前記第２検出温度で前記第２シグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、４つであり；
（ｃ）以下の式からなる群から選択される２つの追加方程式を提供する段階；
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）  （ＩＩＩ）、
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）  （ＩＶ）、及び
ＳＴ１Ｄ２＝０  （Ｖ）
前記式において、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、前記第１検出温度及び前記第２検出温度で前記第１シグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化の関係を示す前記第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）の基準値（ＲＶ）であり、ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、前記第１検出温度及び前記第２検出温度で前記第２シグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化の関係を示す前記第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）の基準値（ＲＶ）であり；ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）は、ＳＴ１Ｄ１及びＳＴ１Ｄ２の関数を示し；ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）は、ＳＴ２Ｄ１及びＳＴ２Ｄ２の関数を示し；
方程式（Ｖ）において、ＳＴ１Ｄ２＝０は、前記第１シグナル−発生手段が前記第１ターゲット核酸配列の存在時にも、前記第２検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合に選択され、
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２  （ＶＩ）またはＳＴ１Ｄ２／ＳＴ１Ｄ１＝ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１  （ＶＩＩ）を含み；ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２  （ＶＩＩＩ）またはＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１  （ＩＸ）を含み；
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２は、（ｉ−１）第１ターゲット核酸配列を第１ターゲット核酸配列の検出のための第１シグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉ−２）第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出し、（ｉ−３）次いで、前記第１検出温度から検出されたシグナル対前記第２検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１は、前記（ｉ−１）及び（ｉ−２）を実施した後、前記第２検出温度から検出されたシグナル対前記第１検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２は、（ｉｉ−１）第２ターゲット核酸配列を第２ターゲット核酸配列の検出のための第２シグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉｉ−２）第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出し、（ｉｉ−３）次いで、前記第１検出温度から検出されたシグナル対前記第２検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１は、（ｉｉ−１）及び（ｉｉ−２）を実施した後、前記第２検出温度から検出されたシグナル対前記第１検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；
（ｄ）前記２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる前記関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び段階（ｃ）から提供された４つの方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解を得る段階。
【請求項２】
前記方法は、前記２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに前記関心シグナルのうち少なくとも１つを割り当てることによって、サンプル内の前記２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つを検出するように実施される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方程式（ＩＩＩ）は、前記方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）での２つの変数（ＳＴ１Ｄ１）及び（ＳＴ１Ｄ２）を前記２つの変数から選択される１つの変数への変換に使われ、前記方程式（ＩＶ）は、前記方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）での２つの変数（ＳＴ２Ｄ１）及び（ＳＴ２Ｄ２）を前記２つの変数から選択される１つの変数への変換に使われる請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）、（ＳＴ２Ｄ１）及び（ＳＴ２Ｄ２）を得るための前記２つの追加方程式は、下記の方程式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）のうち１つ及び下記の方程式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）のうち１つを含む請求項１から３のいずれかに記載の方法：
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２ （ＶＩ）
ＳＴ１Ｄ２／ＳＴ１Ｄ１＝ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１ （ＶＩＩ）
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２ （ＶＩＩＩ）
ＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１ （ＩＸ）。
【請求項５】
（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）、（ＳＴ２Ｄ１）及び（ＳＴ２Ｄ２）を得るための前記２つの追加方程式は、下記の方程式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）のうち１つ及び下記の方程式（Ｖ）を含む請求項１から３のいずれかに記載の方法：
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２ （ＶＩＩＩ）
ＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１ （ＩＸ）
ＳＴ１Ｄ２＝０ （Ｖ）。
【請求項６】
下記の段階を含む、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法：
（ａ）前記サンプルをＮ個のターゲット核酸配列を検出するためのＮ個のシグナル−発生手段と共にインキュベーションし、単一類型の検出器を使用して、Ｎ個の検出温度でシグナルを検出する段階であって；前記それぞれのターゲット核酸配列は、相応するシグナル−発生手段によって検出され；前記Ｎ個のシグナル−発生手段のそれぞれは、前記相応するターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド及び標識を含み、かつ前記相応するターゲット核酸配列の存在時にシグナルを発生し、前記シグナルの発生はリアルタイムＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）により行われ、前記Ｎ個のシグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルは、前記単一類型の検出器によって、それぞれのターゲット核酸配列に対して区別されず；Ｎは、２以上の整数であり；前記Ｎ個の検出温度は、前記Ｎ個のシグナル−発生手段によってシグナルが発生する温度範囲を考慮して選択され；
（ｂ）前記ターゲット核酸配列に対して、それぞれの検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記のＮ個の方程式を提供する段階；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋・・・・・＋ＳＴＮＤ１＝ＳＤ１ （１）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋・・・・・＋ＳＴＮＤ２＝ＳＤ２ （２）
・ ・
・ ・
・ ・
ＳＴ１ＤＮ＋ＳＴ２ＤＮ＋・・・・・＋ＳＴＮＤＮ＝ＳＤＮ （Ｎ）
前記式において、（ＳＤ１）ないし（ＳＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度でそれぞれのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、Ｎ２個であり；
（ｃ）以下の式からなる群から選択される（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式を提供する段階；
ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）＝ＲＶＴｊ（ＤαＤβ） （Ｘ）、及び
ＳＴｊＤＫ＝０ （ＸＩ）
前記式において、Ｔｊでのｊは、１からＮ番目の整数までのあらゆる整数を示し；それぞれのｊ番目のターゲット核酸配列に対して、α及びβは、共に１〜Ｎから選択される２つの整数の組合せを示し；前記組合せの数は、ＮＣ２に表示され；それぞれのｊ番目のターゲット核酸に対して、Ｋは、１〜Ｎから選択される整数のうち少なくとも１つであり；ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でｊ番目のシグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化を反映する関係を示すｊ番目のターゲット核酸配列（Ｔｊ）の基準値（ＲＶ）であり；ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）は、ＳＴｊＤα及びＳＴｊＤβの関数を示し；
方程式（ＸＩ）において、ＳＴｊＤＫ＝０は、ｊ番目のシグナル−発生手段がｊ番目のターゲット核酸配列の存在時にも、Ｋ番目の検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合に選択され；
ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）＝ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、ＳＴｊＤα／ＳＴｊＤβ＝ＲＶＴｊＤα／Ｄβ （ＸＩＩ）またはＳＴｊＤβ／ＳＴｊＤα＝ＲＶＴｊＤβ／Ｄα （ＸＩＩＩ）を含み；
ＲＶＴｊＤα／Ｄβは、（ｉ−１）ｊ番目のターゲット核酸配列をｊ番目のターゲット核酸配列の検出のためのｊ番目のシグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉ−２）α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でシグナルを検出し、（ｉ−３）次いで、前記α番目の検出温度から検出されたシグナル対前記β番目の検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴｊＤβ／Ｄαは、前記（ｉ−１）及び（ｉ−２）を実施した後、前記β番目の検出温度から検出されたシグナル対前記α番目の検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；
（ｄ）前記Ｎ個のターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び段階（ｃ）から提供されたＮ２個の方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解を得る段階。
【請求項７】
前記方法は、前記ターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに前記関心シグナルのうち少なくとも１つを割り当てることによって、サンプル内の前記ターゲット核酸配列のうち少なくとも１つを検出するように実施される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｊ番目のターゲット核酸配列（Ｔｊ）の基準値（ＲＶ）を含む方程式（Ｘ）は、前記方程式（１）ないし（Ｎ）での変数（ＳＴｊＤ１）ないし（ＳＴｊＤＮ）を前記変数（ＳＴｊＤ１）ないし（ＳＴｊＤＮ）から選択される１つの変数への変換に使われる請求項６から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式は、下記の方程式群から選択される請求項６から８のいずれかに記載の方法：
ＳＴｊＤα／ＳＴｊＤβ＝ＲＶＴｊＤα／Ｄβ （ＸＩＩ）
ＳＴｊＤβ／ＳＴｊＤα＝ＲＶＴｊＤβ／Ｄα （ＸＩＩＩ）
前記式において、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でそれぞれのｊ番目のターゲット核酸に対する方程式は、前記方程式（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）から選択される。
【請求項１０】
前記（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式は、下記の方程式群から選択される請求項６から８のいずれかに記載の方法：
ＳＴｊＤα／ＳＴｊＤβ＝ＲＶＴｊＤα／Ｄβ （ＸＩＩ）
ＳＴｊＤβ／ＳＴｊＤα＝ＲＶＴｊＤβ／Ｄα  （ＸＩＩＩ）
ＳＴｊＤＫ＝０ （ＸＩ）
前記式において、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でそれぞれのｊ番目のターゲット核酸に対する方程式は、前記方程式（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）から選択され；
前記方程式（ＸＩ）が、追加方程式として選択される場合、他の追加方程式は、ｊ番目のターゲット核酸配列に対するαまたはβがｊ番目のターゲット核酸配列に対するＫと異なる方程式（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）から選択される方法。
【請求項１１】
前記段階（ａ）は、核酸増幅が伴われるシグナル増幅過程で実施される請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体であって、前記方法は、下記の段階を含む：
（ａ）単一類型の検出器を使用して、第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）から検出されるシグナルを受信する段階であって；前記サンプル内の前記第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）は、第１シグナル−発生手段によって検出され、前記第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）は、第２シグナル−発生手段によって検出され；前記第１シグナル−発生手段は、前記第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド及び標識を含み、かつ前記第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）の存在時にシグナルを発生し、前記第２シグナル−発生手段は、前記第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド及び標識を含み、かつ前記第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）の存在時にシグナルを発生し、前記シグナルの発生はリアルタイムＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）により行われ、前記第１シグナル−発生手段及び前記第２シグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず；前記第１検出温度及び前記第２検出温度は、前記第１シグナル−発生手段及び前記第２シグナル−発生手段によってシグナルが発生する温度範囲を考慮して選択され；
（ｂ）前記２つのターゲット核酸配列に対して、前記第１検出温度及び前記第２検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記の２つの方程式を提供する段階；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１ （Ｉ）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２ （ＩＩ）
前記式において、（ＳＤ１）は、前記第１検出温度から検出されるシグナルであり、（ＳＤ２）は、前記第２検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）は、前記第１検出温度で前記第１シグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ１）は、前記第１検出温度で前記第２シグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ１Ｄ２）は、前記第２検出温度で前記第１シグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ２）は、前記第２検出温度で前記第２シグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、４つであり；
（ｃ）以下の式からなる群から選択される２つの追加方程式を提供する段階；
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２） （ＩＩＩ）、
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２） （ＩＶ）、及び
ＳＴ１Ｄ２＝０（Ｖ）
前記式において、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、前記第１検出温度及び前記第２検出温度で前記第１シグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化の関係を示す前記第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）の基準値（ＲＶ）であり、ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、前記第１検出温度及び前記第２検出温度で前記第２シグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化の関係を示す前記第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）の基準値（ＲＶ）であり；ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）は、ＳＴ１Ｄ１及びＳＴ１Ｄ２の関数を示し；ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）は、ＳＴ２Ｄ１及びＳＴ２Ｄ２の関数を示し；
方程式（Ｖ）において、ＳＴ１Ｄ２＝０は、前記第１シグナル−発生手段が前記第１ターゲット核酸配列の存在時にも、前記第２検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合に選択され、
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２ （ＶＩ）またはＳＴ１Ｄ２／ＳＴ１Ｄ１＝ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１ （ＶＩＩ）を含み；ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２ （ＶＩＩＩ）またはＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１ （ＩＸ）を含み；
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２は、（ｉ−１）第１ターゲット核酸配列を第１ターゲット核酸配列の検出のための第１シグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉ−２）第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出し、（ｉ−３）次いで、前記第１検出温度から検出されたシグナル対前記第２検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１は、前記（ｉ−１）及び（ｉ−２）を実施した後、前記第２検出温度から検出されたシグナル対前記第１検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２は、（ｉｉ−１）第２ターゲット核酸配列を第２ターゲット核酸配列の検出のための第２シグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉｉ−２）第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出し、（ｉｉ−３）次いで、前記第１検出温度から検出されたシグナル対前記第２検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１は、（ｉｉ−１）及び（ｉｉ−２）を実施した後、前記第２検出温度から検出されたシグナル対前記第１検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；
（ｄ）前記２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び段階（ｃ）から提供された４つの方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解を得る段階。
【請求項１３】
サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体であって、前記方法は、下記の段階を含む：
（ａ）単一類型の検出器を使用して、Ｎ個の検出温度から検出されるシグナルを受信する段階であって；前記それぞれのターゲット核酸配列は、相応するシグナル−発生手段によって検出され；前記Ｎ個のシグナル−発生手段のそれぞれは、前記相応するターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド及び標識を含み、かつ前記相応するターゲット核酸配列の存在時にシグナルを発生し、前記シグナルの発生はリアルタイムＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）により行われ、前記Ｎ個のシグナル−発生手段によって発生する前記関心シグナルは、前記単一類型の検出器によって、それぞれのターゲット核酸配列に対して区別されず；Ｎは、２以上の整数であり；前記Ｎ個の検出温度は、前記Ｎ個のシグナル−発生手段によってシグナルが発生する温度範囲を考慮して選択され；
（ｂ）前記ターゲット核酸配列に対して、それぞれの検出温度で発生する前記関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記のＮ個の方程式を提供する段階；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋・・・・・＋ＳＴＮＤ１＝ＳＤ１ （１）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋・・・・・＋ＳＴＮＤ２＝ＳＤ２ （２）
・ ・
・ ・
・ ・
ＳＴ１ＤＮ＋ＳＴ２ＤＮ＋・・・・・＋ＳＴＮＤＮ＝ＳＤＮ （Ｎ）
前記式において、（ＳＤ１）ないし（ＳＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度でそれぞれのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、Ｎ２個であり；
（ｃ）以下の式からなる群から選択される（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式を提供する段階；
ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）＝ＲＶＴｊ（ＤαＤβ） （Ｘ）、及び
ＳＴｊＤＫ＝０ （ＸＩ）
前記式において、Ｔｊでのｊは、１からＮ番目の整数までのあらゆる整数を示し；それぞれのｊ番目のターゲット核酸配列に対して、α及びβは、共に１〜Ｎから選択される２つの整数の組合せを示し；前記組合せの数は、ＮＣ２に表示され；それぞれのｊ番目のターゲット核酸に対して、Ｋは、１〜Ｎから選択される整数のうち少なくとも１つであり；ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でｊ番目のシグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化を反映する関係を示すｊ番目のターゲット核酸配列（Ｔｊ）の基準値（ＲＶ）であり；ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）は、ＳＴｊＤα及びＳＴｊＤβの関数を示し；
方程式（ＸＩ）において、ＳＴｊＤＫ＝０は、ｊ番目のシグナル−発生手段がｊ番目のターゲット核酸配列の存在時にも、Ｋ番目の検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合に選択され；
ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）＝ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、ＳＴｊＤα／ＳＴｊＤβ＝ＲＶＴｊＤα／Ｄβ （ＸＩＩ）
またはＳＴｊＤβ／ＳＴｊＤα＝ＲＶＴｊＤβ／Ｄα （ＸＩＩＩ）を含み；
ＲＶＴｊＤα／Ｄβは、（ｉ−１）ｊ番目のターゲット核酸配列をｊ番目のターゲット核酸配列の検出のためのｊ番目のシグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉ−２）α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でシグナルを検出し、（ｉ−３）次いで、前記α番目の検出温度から検出されたシグナル対前記β番目の検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴｊＤβ／Ｄαは、前記（ｉ−１）及び（ｉ−２）を実施した後、前記β番目の検出温度から検出されたシグナル対前記α番目の検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；
（ｄ）前記Ｎ個のターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び段階（ｃ）から提供されたＮ２個の方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解を得る段階。
【請求項１４】
（ａ）コンピュータプロセッサ、及び（ｂ）前記コンピュータプロセッサにカップリングされた請求項１２のコンピュータ読取り可能な記録媒体を含む、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別するための装置。
【請求項１５】
（ａ）コンピュータプロセッサ、及び（ｂ）前記コンピュータプロセッサにカップリングされた請求項１３のコンピュータ読取り可能な記録媒体を含む、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲット核酸配列に対する関心シグナルの区別に関する。
【背景技術】
【０００２】
ターゲット核酸配列の検出のために、リアルタイム検出方法がリアルタイム方式でターゲット増幅をモニタリングしながら、ターゲット核酸配列の検出に広く使われる。リアルタイム検出方法は、一般的にターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされる標識されたプローブまたはプライマーを使用する。標識されたプローブとターゲット核酸配列との間のハイブリダイゼーションを使用する例示的な方法は、ヘアピン構造を有する二重標識されたプローブを使用する分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）方法（非特許文献１）、ハイビーコン（ＨｙＢｅａｃｏｎ）方法（非特許文献２）、供与体及び受容体でそれぞれ標識された２つのプローブを使用するハイブリダイゼーションプローブ方法（非特許文献３）、及び単一標識されたオリゴヌクレオチドを使用するルクス（Ｌｕｘ）方法（特許文献１）を含む。二重標識されたプローブ及びＤＮＡ重合酵素の５’−ヌクレアーゼ活性による前記プローブの切断を使用したＴａｑＭａｎ方法（特許文献２〜３）が、また当該技術分野で広く用いられている。
【０００３】
標識されたプライマーを使用する例示された方法は、サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ）プライマー方法（非特許文献４、特許文献４）、スコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プライマー方法（非特許文献５、特許文献５）、及びＴＳＧプライマー方法（特許文献６）を含む。
【０００４】
代案的な接近法として、ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成される二量体（デュープレックス）を使用するリアルタイム検出方法が提案された：インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）分析（特許文献７〜９）、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）方法（特許文献１０）、ＰＣＥ−ＳＨ（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（特許文献１１）、ＰＣＥ−ＮＨ（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（特許文献１２）。
【０００５】
前記記述された従来のリアルタイム検出技術は、ターゲット増幅と関連するか、関係のないシグナル増幅過程で１つの選択された検出温度で蛍光標識から発生したシグナルを検出する。従来のリアルタイム検出技術によって単一反応チューブで単一類型の標識を使用して、複数のターゲット核酸配列を検出する場合、ターゲット核酸配列に対して発生したシグナルは、互いに区別されない。したがって、従来のリアルタイム検出技術は、複数のターゲット核酸配列を検出するために、一般的に異なる類型の標識を用いる。Ｔｍ差を使用するメルティング分析は、単一類型の標識を使用する場合にも、複数のターゲット核酸配列を検出することができる。しかし、メルティング分析は、リアルタイム技術よりも実施時間がさらに長く、ターゲット核酸配列が増加するほど異なるＴｍ値を有するプローブの設計がさらに難しくなるという深刻な短所がある。
【０００６】
したがって、メルティング分析に依存せず、１つの反応容器及び単一類型の検出器で単一類型の標識を使用して、複数のターゲット核酸配列を検出するための新規方法または接近法が開発される場合、非常に向上した便宜性、コスト効果及び効率性によって複数のターゲット核酸配列を検出することができる。また、前記新規の方法を他の検出方法（例えば、メルティング分析）と組み合わせれば、非常に向上した効率で１つの反応容器において単一類型の標識を使用して、複数のターゲット核酸配列を検出することができる。
【０００７】
本明細書の全般に亘って、多数の特許及び文献が参照され、その引用がカッコで囲まれている。このような特許及び文献の開示内容は、本発明及び本発明が属する技術分野のレベルをより明確に説明するために、その全体として本明細書に参照として含まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第７，５３７，８８６号
【特許文献２】米国特許第５，２１０，０１５号
【特許文献３】米国特許第５，５３８，８４８号
【特許文献４】米国特許第６，１１７，６３５号
【特許文献５】米国特許第６，３２６，１４５号
【特許文献６】ＷＯ第２０１１／０７８４４１号
【特許文献７】米国特許第５，６９１，１４２号
【特許文献８】米国特許第６，３５８，６９１号
【特許文献９】米国特許第６，１９４，１４９号
【特許文献１０】ＷＯ第２０１２／０９６５２３号
【特許文献１１】ＷＯ第２０１３／１１５４４２号
【特許文献１２】ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖ．１４  ＭＡＲＣＨ  １９９６
【非特許文献２】Ｆｒｅｎｃｈ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ，１５（６）：３６３−３７４（２００１）
【非特許文献３】Ｂｅｒｎａｄ  ｅｔ  ａｌ，１４７−１４８  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０００；４６
【非特許文献４】Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ，２５１６−２５２１  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，ｖ．２５  ｎｏ．１２
【非特許文献５】Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ，８０４−８０７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖ．１７  ＡＵＧＵＳＴ  １９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ターゲット核酸配列、特に、複数のターゲット核酸配列をより正確かつ簡便な方式で定性的または定量的に検出する新規方法を開発するために鋭意努力した。その結果、本発明者らは、検出温度でターゲット核酸配列に対するシグナルを収得した後、検出結果を適した方程式を使用して処理することによって、非常に向上した便宜性、コスト効果及び効率性によって１つの反応容器において単一類型の標識及び単一類型の検出器を使用して、複数のターゲット核酸配列を検出することができるということを確認した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法及びキットを提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法及びキットを提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別するための装置を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別するための装置を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法を実行するためのプロセッサを具現するコンピュータ読取り可能な記録媒体に保存されるためのコンピュータプログラムを提供することである。
【００１８】
本発明のさらに他の目的は、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法を実行するためのプロセッサを具現するコンピュータ読取り可能な記録媒体に保存されるためのコンピュータプログラムを提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的及び利点は、添付した特許請求の範囲及び図面と共に、下記の詳細な説明から明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明の最大の特徴は、１つのシグナル反応容器において単一類型の標識及び単一類型の検出器を使用して、複数のターゲット核酸配列を検出することである。異なる検出温度及び変数を解くための数学方程式を用いる本発明は、１つの反応容器において単一類型の標識を用いて複数のターゲット核酸配列を検出することができる。本発明の構成要素は、本発明の特徴に合わせて選択され、ターゲット核酸配列を検出する驚くべきプロセスになる。
【００２１】
従来のリアルタイムＰＣＲ方法は、１つの反応容器で２つのターゲット核酸配列を検出するために、２種の類型の蛍光標識またはメルティング分析が必要である。
【００２２】
本発明は、１つの反応容器において単一類型の蛍光標識を使用して２つのターゲット核酸配列を検出するリアルタイムＰＣＲプロトコルを可能にする。
【発明の効果】
【００２３】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）異なる検出温度を用いる本発明は、１つの反応容器において単一類型の標識のみでも従来のリアルタイム方式で複数のターゲット核酸配列を検出することができる。従来の技術は、ターゲット増幅後、メルティング分析によって複数のターゲット核酸配列を検出する。これとは異なって、本発明は、ターゲット増幅後、メルティング分析が不要であるので、分析時間が画期的に短縮される。
（ｂ）本発明は、数学方程式を使用して検出温度から検出された総信号に含まれた個別的なシグナル値（すなわち、変数）が得られる。方程式解析法に基づいた本発明は、体系的方式で個別的なシグナル値を収得し、これにより、より正確かつ便利な方式で分析結果を提供することができる。
（ｃ）本発明は、ターゲット核酸配列の検出のために、シグナル−発生手段を選択するに当たって、非常に自由である。特に、本発明は、（ｉ）それぞれのターゲット核酸配列に対してあらゆる検出温度でシグナルを発生させるシグナル−発生手段、（ｉｉ）ターゲット核酸配列の一部に対してあらゆる検出温度でシグナルを発生させるシグナル−発生手段及びターゲット核酸配列の一部に対して検出温度の一部でシグナルを発生させるシグナル−発生手段、及び（ｉｉｉ）異なるターゲット核酸配列に対して異なるシグナル−発生温度範囲を有するシグナル−発生手段を使用することができる。
（ｄ）本発明は、２つの検出温度間にシグナル−発生手段によって発生するシグナル変化の特定の関係（パターン、または規則）があるという発見を具現する。特に、本発明は、ターゲット核酸配列を検出するために、“シグナル変化の前記関係（パターン、または規則）を示す基準値”という新たな概念を導入する。本発明は、基準値を含む方程式を使用する。前記基準値の利用は、より論理的な方式で個別シグナルを提供し、より便利な方式で追加方程式を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】第１検出温度（６０℃）及び第２検出温度（７２℃）で第１ターゲット核酸配列（ナイセリア・ゴノレアのゲノムＤＮＡ、ＮＧ）、第２ターゲット核酸配列（クラミジア・トラコマチスのゲノムＤＮＡ、ＣＴ）、及びこれらの組合せの検出結果を示す。ＮＧ及びＣＴに対するシグナルは、ＴａｑＭａｎプローブ方法によって発生した。ＮＴＣは、鋳型のない対照群を示す。
【図１Ｂ】図１Ａの検出結果に基づいて基準値を収得することを示す。第１検出温度でのシグナル対第２検出温度でのシグナルの比率は、基準値の一例である。
【図１Ｃ】連立方程式１を解いて得たＳＴ１Ｄ１及びＳＴ２Ｄ１に対するプロッティング結果を示す。実験的に得た基準値を使用した。点線は、収得された増幅曲線の有意性を確認するために、図１ＡでのＮＧ単独サンプル及びＣＴ単独サンプルの結果を参照して決定された閾値を示す。
【図１Ｄ】連立方程式２を解いて得たＳＴ１Ｄ２及びＳＴ２Ｄ２に対するプロッティング結果を示す。実験的に得た基準値を使用した。点線は、閾値を示す。
【図２Ａ】第１検出温度（６０℃）及び第２検出温度（７２℃）で第１ターゲット核酸配列（ナイセリア・ゴノレアのゲノムＤＮＡ、ＮＧ）、第２ターゲット核酸配列（クラミジア・トラコマチスのゲノムＤＮＡ、ＣＴ）、及びこれらの組合せの検出結果を示す。ＮＧ及びＣＴに対するシグナルは、ＰＴＯＣＥ方法によって発生した。ＮＴＣは、鋳型のない対照群を示す。ＣＴに対するシグナル発生手段は、６０℃及び７２℃で関心シグナルを提供するように設計され、ＮＧに対するシグナル発生手段は、６０℃で関心シグナルを提供するように設計された。
【図２Ｂ】図２Ａの検出結果に基づいて基準値を収得することを示す。第１検出温度でのシグナル対第２検出温度でのシグナルの比率は、基準値の一例である。
【図２Ｃ】方程式セット２（ＳＴ１Ｄ２＝０）を解いて得たＳＴ１Ｄ１及びＳＴ２Ｄ１に対するプロッティング結果を示す。点線は、収得された増幅曲線の有意性を確認するために、図２ＡでのＮＧ単独サンプル及びＣＴ単独サンプルの結果を参照して決定された閾値を示す。
【図２Ｄ】方程式セット２（ＳＴ１Ｄ２＝０）を解いて得たＳＴ１Ｄ２及びＳＴ２Ｄ２に対するプロッティング結果を示す。点線は、閾値を示す。
【図２Ｅ】実験的に得た基準値が使われた方程式セット３を解いて得たＳＴ１Ｄ１及びＳＴ２Ｄ１に対するプロッティング結果を示す。点線は、閾値を示す。
【図２Ｆ】実験的に得た基準値が使われた方程式セット３を解いて得たＳＴ１Ｄ２及びＳＴ２Ｄ２に対するプロッティング結果を示す。点線は、閾値を示す。
【図２Ｇ】任意選択整数値（ａｒｂｉｔｒａｒｙ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｖａｌｕｅ）がＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２として使われた方程式セット４を解いて得たＳＴ１Ｄ１及びＳＴ２Ｄ１に対するプロッティング結果を示す。点線は、閾値を示す。
【図２Ｈ】任意選択整数値がＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２として使われた方程式セット４を解いて得たＳＴ１Ｄ２及びＳＴ２Ｄ２に対するプロッティング結果を示す。点線は、閾値を示す。
【図３Ａ】３つの検出温度（６０℃、７２℃及び９５℃）で３つのターゲット核酸配列［ナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）のゲノムＤＮＡ、及びマイコプラズマ・ジェニタリウム（ＭＧ）のゲノムＤＮＡ］、及びこれらの組合せの検出結果を示す。ＮＧ及びＣＴに対するシグナルは、ＴＯＣＥ方法によって発生し、ＭＧに対するシグナルは、ＴａｑＭａｎプローブ方法によって発生した。
【図３Ｂ】３つの検出温度（６０℃、７２℃及び９５℃）で３つのターゲット核酸配列［ナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）のゲノムＤＮＡ、及びマイコプラズマ・ジェニタリウム（ＭＧ）のゲノムＤＮＡ］、及びこれらの組合せの検出結果を示す。ＮＧ及びＣＴに対するシグナルは、ＴＯＣＥ方法によって発生し、ＭＧに対するシグナルは、ＴａｑＭａｎプローブ方法によって発生した。
【図３Ｃ】図３Ａの検出結果に基づいて基準値を収得することを示す。検出温度間のシグナルの比率は、基準値の一例である。
【図３Ｄ】連立方程式５を解いて得たＳＴ１Ｄ１、ＳＴ２Ｄ１及びＳＴ３Ｄ１に対するプロッティング結果を示す。実験的に得た基準値を使用した。点線は、収得された増幅曲線の有意性を確認するために、図３ＡでのＮＧ単独サンプル、ＣＴ単独サンプル及びＭＧ単独サンプルの結果を参照して決定された閾値を示す。
【図３Ｅ】連立方程式５を解いて得たＳＴ１Ｄ１、ＳＴ２Ｄ１及びＳＴ３Ｄ１に対するプロッティング結果を示す。実験的に得た基準値を使用した。点線は、収得された増幅曲線の有意性を確認するために、図３ＡでのＮＧ単独サンプル、ＣＴ単独サンプル及びＭＧ単独サンプルの結果を参照して決定された閾値を示す。
【図３Ｆ】連立方程式６を解いて得たＳＴ１Ｄ２、ＳＴ２Ｄ２及びＳＴ３Ｄ２に対するプロッティング結果を示す。実験的に得た基準値を使用した。点線は、閾値を示す。
【図３Ｇ】連立方程式６を解いて得たＳＴ１Ｄ２、ＳＴ２Ｄ２及びＳＴ３Ｄ２に対するプロッティング結果を示す。実験的に得た基準値を使用した。点線は、閾値を示す。
【図３Ｈ】連立方程式７を解いて得たＳＴ１Ｄ３、ＳＴ２Ｄ３及びＳＴ３Ｄ３に対するプロッティング結果を示す。実験的に得た基準値を使用した。点線は、閾値を示す。
【図３Ｉ】連立方程式７を解いて得たＳＴ１Ｄ３、ＳＴ２Ｄ３及びＳＴ３Ｄ３に対するプロッティング結果を示す。実験的に得た基準値を使用した。点線は、閾値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ｉ．２つのターゲット核酸配列に対する関心シグナルの区別
本発明の一態様において、下記の段階を含む、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法が提供される：
（ａ）前記サンプルを第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）を検出するための第１シグナル−発生手段及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を検出するための第２シグナル−発生手段と共にインキュベーションし、第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）でシグナルを検出する段階であって；前記２つのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルは、単一類型の検出器（ｓｉｎｇｌｅ  ｔｙｐｅ  ｏｆｄｅｔｅｃｔｏｒ）によって、各ターゲット核酸配列に対して区別されず；
（ｂ）前記２つのターゲット核酸配列に対して、各検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記の２つの方程式を提供する段階；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１  （Ｉ）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２  （ＩＩ）
前記式において、（ＳＤ１）は、第１検出温度から検出されるシグナルであり、（ＳＤ２）は、第２検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）は、第１検出温度で第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ１）は、第１検出温度で第２シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ１Ｄ２）は、第２検出温度で第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ２）は、第２検出温度で第２シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、４つであり；
（ｃ）前記４つの変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）及び（ＳＴ２Ｄ２）からなる群から選択される少なくとも１つの変数をそれぞれ含む２つの追加方程式を提供する段階；及び
（ｄ）前記２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び段階（ｃ）から提供された４つの方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得る段階。
【００２６】
増幅曲線を使用する従来のリアルタイムＰＣＲ方法によれば、区別されない同じシグナルを提供するシグナル−発生手段を使用して複数のターゲット核酸配列を区別して検出することができないということが、当業者の一般的な常識である。
【００２７】
本発明は、当該技術分野の一般的な常識と関連した限界を克服し、非常に改善された方式でターゲット核酸配列を検出する予期せぬ結果をもたらす。
【００２８】
本発明の方法は、サンプル内の２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルを区別する方法であって、本願で表現され、選択的にサンプル内の２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つを検出する方法または２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに関心シグナルのうち少なくとも１つを割り当てることによって、サンプル内の２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つの存在を決定する方法として表現される。
【００２９】
本願に使われた用語“関心シグナル”は、本発明によって区別されるシグナルを意味する。最終的に検出されるシグナルは、複数のシグナルの和であり得る。例えば、検出温度で最終的に検出されるシグナルは、（ｉ）第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）に対する第１シグナル−発生手段からのシグナル、及び（ｉｉ）第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）に対する第２シグナル−発生手段からのシグナルを含みうる。（ｉ）シグナル、及び（ｉｉ）シグナルのそれぞれは、本発明によって区別される関心シグナルである。例えば、本発明は、検出されたシグナルから（ｉ）シグナル及び／または（ｉｉ）シグナルを区別することを目標とする。関心シグナルのこのような区別は、関心シグナルを２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てるようにする。その結果、関心シグナルの区別は、ターゲット核酸配列がサンプル内に存在または不存在するか否かを決定可能にする。
【００３０】
従来技術によれば、２つのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルは、各ターゲット核酸配列に対して区別されない。興味深くも、本発明は、２つのシグナル−発生手段によって発生する関心信号を区別して単一類型の検出器を使用する場合にも、関心シグナルが、前記２つのターゲット核酸配列に割り当てられるようにする。
【００３１】
また、本発明は、より体系的であり、信頼性があり、簡便な方式で数学方程式を使用して関心シグナルを区別可能にする。
【００３２】
本発明は、次のように詳しく説明される：
【００３３】
段階（ａ）：サンプルのシグナル−発生手段とのインキュベーション及びシグナル検出
分析しようとするサンプルを第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）の検出のための第１シグナル−発生手段及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）の検出のための第２シグナル−発生手段と共にインキュベーションした後、前記２つのシグナル−発生手段からのシグナルを第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）から検出し；前記２つのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルは、単一類型の検出器によって、各ターゲット核酸配列に対して区別されない。
【００３４】
本発明は、ターゲット核酸配列に対するシグナルを提供するために、シグナル−発生手段を用いる。ターゲット核酸配列のそれぞれは、相応するシグナル−発生手段によって検出される。
【００３５】
本願に使われた用語“シグナル−発生手段”は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルの発生に使われる任意の物質を意味し、これは、例えば、オリゴヌクレオチド、標識及び酵素を含む。選択的に、本願に使われた用語“シグナル−発生手段”は、シグナル発生のための物質を使用する任意の方法を意味する。
【００３６】
本発明の一具現例によれば、インキュベーションは、シグナル−発生手段によるシグナルが発生する条件下に実施される。このような条件は、温度、塩の濃度、及び溶液のｐＨを含む。
【００３７】
シグナル−発生手段として使われるオリゴヌクレオチドの例は、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド（例えば、プローブ及びプライマー）を含み；ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたプローブまたはプライマーが切断されて断片を放出する場合、シグナル−発生手段として使われるオリゴヌクレオチドは、前記断片に特異的にハイブリダイズされるキャプチャーオリゴヌクレオチドを含み；前記キャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた断片が延びて、延長鎖を形成する場合、シグナル−発生手段として使われるオリゴヌクレオチドは、前記延長鎖に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドを含み；シグナル−発生手段として使われるオリゴヌクレオチドは、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドを含み；及びシグナル−発生手段として使われるオリゴヌクレオチドは、その組合せを含む。
【００３８】
シグナル発生原理は、同一であるとしても、使われた異なる配列のオリゴヌクレオチドを含むシグナル発生手段は、互いに異なると見なされる。
【００３９】
標識は、オリゴヌクレオチドに連結されるか、自由な形態であり得る。標識は、延長反応の間に延長産物に挿入されうる。
【００４０】
シグナル発生でオリゴヌクレオチドの切断が使われる場合、酵素の例は、５’−ヌクレアーゼ及び３’−ヌクレアーゼ、特に、５’−ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素、３’−ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素、またはＦＥＮヌクレアーゼを含む。
【００４１】
本発明で、シグナルは、多様な物質を使用して多様な方式で発生しうる。
【００４２】
一具現例によれば、２つのシグナル−発生手段のうち少なくとも１つは、二量体の形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル−発生手段である。
【００４３】
一具現例によれば、それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段は、二量体の形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル−発生手段である。
【００４４】
一具現例によれば、前記二量体は、二本鎖のターゲット核酸配列を含む。
【００４５】
シグナル−発生手段と関連して、本願に使われた用語“二量体の形成に依存的な方式でシグナルを発生させる”とは、検出されるシグナルが２つの核酸分子の結合または解離に依存的に提供されることを意味する。前記表現は、ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成された二量体（例えば、標識を有する検出オリゴヌクレオチド及び核酸配列）によってシグナルが提供されることを含む。また、前記表現は、二量体（例えば、標識を有する検出オリゴヌクレオチド及び核酸配列）のハイブリダイゼーションの抑制によってシグナルが提供されることを含み、前記抑制は、他の二量体の形成によって起こる。
【００４６】
特に、シグナルは、ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた検出オリゴヌクレオチド間の二量体の形成によって発生する。
【００４７】
本願に使われた用語“検出オリゴヌクレオチド”は、検出されるシグナルの発生に関与するオリゴヌクレオチドである。本発明の一具現例によれば、検出オリゴヌクレオチドは、実際のシグナル発生に関与するオリゴヌクレオチドを含む。例えば、他のオリゴヌクレオチド（例えば、ターゲット核酸配列、または検出オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド）と検出オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションまたは非ハイブリダイゼーションがシグナル発生を決定する。
【００４８】
本発明の一具現例によれば、検出オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識を含む。
【００４９】
ターゲット核酸配列及び検出オリゴヌクレオチド間の二量体の形成によるシグナルは、スコーピオン方法（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８０４−８０７（１９９９））、サンライズ（または、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）方法（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５（１２）：２５１６−２５２１（１９９７）、及び米国特許第６，１１７，６３５号）、ルクス方法（米国特許第７，５３７，８８６号）、プレクサー（Ｐｌｅｘｏｒ）方法（Ｓｈｅｒｒｉｌｌ  Ｃ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２６：４５５０−４５５６９（２００４））、分子ビーコン方法（Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｖ．１４  ＭＡＲＣＨ  １９９６）、ハイビーコン方法（Ｆｒｅｎｃｈ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ，１５（６）：３６３−３７４（２００１））、隣接したハイブリダイゼーションプローブ方法（Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７３：２２１（１９９９））、及びＬＮＡ方法（米国特許第６，９７７，２９５）を含む多様な方法によって発生しうる。
【００５０】
特に、シグナルは、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成された二量体によって発生する。
【００５１】
本願に使われた用語“媒介オリゴヌクレオチド”は、ターゲット核酸配列を含まない二量体の生産を媒介するオリゴヌクレオチドである。
【００５２】
本発明の一具現例によれば、媒介オリゴヌクレオチドの切断自体は、シグナルを発生させず、媒介オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び切断後に、前記切断によって形成された断片が、シグナル発生のための連続した反応に関与する。
【００５３】
一具現例によれば、媒介オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションまたは切断自体は、シグナルを発生させない。
【００５４】
本発明の一具現例によれば、媒介オリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、切断されて断片を放出することによって、二量体の生産を媒介するオリゴヌクレオチドを含む。特に、前記断片は、キャプチャーオリゴヌクレオチド上で前記断片の延長によって二量体の生産を媒介する。
【００５５】
本発明の一具現例によれば、媒介オリゴヌクレオチドは、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲティング部位、及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含む。
【００５６】
本発明の一具現例によれば、媒介オリゴヌクレオチドの切断は、断片を放出し、前記断片は、キャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズされ、キャプチャーオリゴヌクレオチド上で延びる。
【００５７】
本発明の一具現例によれば、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドは、切断されて断片を放出し、前記断片は、キャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズされ、前記断片は、延びて延長鎖を形成し、これは、前記延長鎖及びキャプチャーオリゴヌクレオチド間の延長二量体の形成を引き起こして、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する。
【００５８】
本発明の一具現例によれば、前記延長鎖に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む第３オリゴヌクレオチドが使われる場合、前記第３オリゴヌクレオチド及び延長鎖のハイブリダイゼーションは、他の類型の二量体を形成して、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する。
【００５９】
本発明の一具現例によれば、キャプチャーオリゴヌクレオチドに相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む第３オリゴヌクレオチドが使われる場合、第３オリゴヌクレオチド及び前記キャプチャーオリゴヌクレオチド間の二量体の形成は、前記延長鎖及び前記キャプチャーオリゴヌクレオチド間の二量体の形成によって抑制されて、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する。
【００６０】
本発明の一具現例によれば、前記断片、延長鎖、キャプチャーオリゴヌクレオチド、第３オリゴヌクレオチド、またはこれらの組合せが検出オリゴヌクレオチドとして作用する。
【００６１】
媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成された二量体によるシグナルは、ＰＴＯＣＥ方法（ＷＯ２０１２／０９６５２３）、ＰＣＥ−ＳＨ方法（ＷＯ２０１３／１１５４４２）、及びＰＣＥ−ＮＨ方法（ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２）を含む多様な方法によって発生しうる。
【００６２】
前記文献に開示された用語と関連して、オリゴヌクレオチドの相応する例は、下記の通りである：媒介オリゴヌクレオチドは、ＰＴＯ（プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド）に相応し、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、ＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド）に相応し、第３オリゴヌクレオチドは、それぞれＳＯ（シグナリングオリゴヌクレオチド）、またはＨＯ（ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド）に相応する。ＳＯ、ＨＯ、ＣＴＯ、延長鎖、またはこれらの組合せは、検出オリゴヌクレオチドとして役割を果たせる。
【００６３】
媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成された二量体によるシグナルは、媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成された二量体によって、他の二量体の形成が抑制されることによって、提供されたシグナル（例えば、ＰＣＥ−ＮＨ）を含む。
【００６４】
例えば、媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成された二量体によるシグナルが、ＰＴＯＣＥ方法によって発生する場合、シグナル−発生手段は、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含むアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド）、ＣＴＯ（キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド）、適した標識、及び５’−ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素を含む。ＰＴＯは、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲティング部位、及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列に非常補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含む。ＣＴＯは、３’から５’方向に、（ｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲティング部位に非常補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含む。
【００６５】
ＰＴＯＣＥ方法によるシグナル発生の特定の例は、下記の段階を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとハイブリダイズさせる段階；（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で５’−ヌクレアーゼ活性を有する酵素に段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって；前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’−ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導し、前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；（ｃ）前記ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯとをハイブリダイズさせる段階であって；前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を使用して延長反応を実施する段階であって；前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた断片は、延びて延長二量体が形成され；前記延長二量体は、（ｉ）前記断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの配列及び／または長さ、または（ｉｉｉ）前記断片の配列及び／または長さ及び前記ＣＴＯの配列及び／または長さによって調節可能なＴｍ値を有し；前記延長二量体は、（ｉ）前記断片及び／または前記ＣＴＯに連結された少なくとも１つの標識、（ｉｉ）延長反応の間に延長二量体内に挿入された標識、（ｉｉｉ）延長反応の間に延長二量体内に挿入された標識及び断片及び／またはＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識によってターゲットシグナルを提供し；及び（ｅ）前記延長二量体が、その二本鎖の形態を保持する既定の温度でターゲットシグナルを測定することによって、前記延長二量体を検出する段階であって、前記延長二量体の存在は、ターゲット核酸配列の存在を示す。このような場合、前記方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階（ａ）〜（ｅ）の全部または一部を繰り返すことをさらに含む。
【００６６】
文言“反復サイクルの間に変性”で、用語“変性”は、二本鎖核酸分子を一本鎖核酸分子に分離することを意味する。
【００６７】
ＰＴＯＣＥ方法の段階（ａ）で、アップストリームオリゴヌクレオチドの代わりに、ターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセットが使われる。このような場合、前記方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階（ａ）〜（ｅ）の全部または一部を繰り返すことをさらに含む。
【００６８】
ＰＴＯＣＥ方法は、ＣＴＯにハイブリダイズされたＰＴＯ断片が延びて、延長鎖を形成した後、前記延長が検出される過程として分類される。ＰＴＯＣＥ方法は、延長鎖及びＣＴＯの間の二量体を使用して延長鎖の形成を検出することを特徴とする。
【００６９】
延長鎖の形成を検出する他の接近法がある。例えば、延長鎖の形成は、前記延長鎖に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドを使用して検出されうる（例えば、ＰＣＥ−ＳＨ方法）。この方法で、シグナルは、（ｉ）延長鎖に特異的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドに連結された標識、（ｉｉ）延長鎖に特異的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドに連結された標識及びＰＴＯ断片に連結された標識、（ｉｉｉ）延長鎖に特異的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドに連結された標識及び延長反応の間に延長鎖に挿入された標識、または（ｉｖ）延長鎖に特異的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドに連結された標識及びインターカレーティング染料から提供されうる。選択的に、シグナルは、（ｉ）延長鎖に連結された標識、または（ｉｉ）インターカレーティング染料から提供されうる。
【００７０】
選択的に、延長鎖の形成の検出は、ＣＴＯ及び前記ＣＴＯに特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの抑制を検出する他の方法（例えば、ＰＣＥ−ＮＨ方法）によって実施される。このような抑制は、ターゲット核酸配列の存在を示すものと見なされる。シグナルは、（ｉ）ＣＴＯにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドに連結された標識、（ｉｉ）ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）ＣＴＯにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドに連結された標識及びＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識から提供されうる。
【００７１】
一具現例によれば、ＣＴＯに特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドは、ＰＴＯ断片と重なる配列を有する。
【００７２】
一具現例によれば、検出オリゴヌクレオチドは、延長鎖に特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＥ−ＳＨ方法）及びＣＴＯに特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＥ−ＮＨ方法）を含む。一具現例によれば、検出オリゴヌクレオチドは、反応の間に生成された延長鎖またはＣＴＯを含む。
【００７３】
ＰＴＯＣＥ−基盤の方法は、一般的にターゲット核酸配列の存在に依存的な延長鎖の形成を伴う。用語“ＰＴＯＣＥ−基盤の方法”は、ＰＴＯの切断及び延長を通じる延長鎖の形成を含む、シグナルを提供する多様な方法を包括するために本願で使われる。
【００７４】
ＰＴＯＣＥ−基盤の方法によるシグナル発生の例は、下記の段階を含む：（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとハイブリダイズさせる段階；（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で５’−ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって；前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’−ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導し、前記切断は、ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し；（ｃ）前記ＰＴＯから放出された断片をＣＴＯとハイブリダイズさせる段階であって；前記ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ；（ｄ）段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を使用して延長反応を実施する段階であって；前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた断片は、延びて延長鎖を形成し；及び（ｅ）延長鎖の存在に依存的に発生するシグナルを検出して、前記延長鎖の形成を検出する段階。段階（ａ）で、アップストリームオリゴヌクレオチドの代わりに、ターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセットが使われる。この場合、前記方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階（ａ）〜（ｅ）の全部または一部を繰り返すことをさらに含む。
【００７５】
一具現例によれば、二量体の形成によって発生したシグナルは、二量体のハイブリダイゼーション（例えば、二量体自体のハイブリダイゼーションまたは第３オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション）によって誘導されたシグナルまたは二量体の形成による第３オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの抑制によって誘導されたシグナルを含む。
【００７６】
一具現例によれば、ターゲット核酸配列のうち少なくとも１つのターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段は、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で二量体が形成されることによるシグナル−発生手段である。
【００７７】
一具現例によれば、各ターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段は、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で二量体が形成されることによるシグナル−発生手段である。
【００７８】
一具現例によれば、２つのシグナル−発生手段のうち少なくとも１つのシグナル−発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル−発生手段である。
【００７９】
一具現例によれば、ターゲット核酸配列のそれぞれに対するシグナル−発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル−発生手段である。
【００８０】
特に、シグナルは、検出オリゴヌクレオチドとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション以後、検出オリゴヌクレオチドの切断によって発生する。
【００８１】
検出オリゴヌクレオチドとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション以後、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナルは、ＴａｑＭａｎプローブ方法（米国特許第５，２１０，０１５号、及び第５，５３８，８４８号）を含む多様な方法によって発生しうる。
【００８２】
シグナルが、ＴａｑＭａｎプローブ方法によって発生する場合、シグナル−発生手段は、ターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセット、適した標識（例えば、相互作用的二重標識）を有するＴａｑＭａｎプローブ及び５’−ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素を含む。ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＴａｑＭａｎプローブは、ターゲット増幅の間に切断されて、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを発生させる。
【００８３】
ＴａｑＭａｎプローブ方法によってシグナルを発生させる特定の例は、（ａ）プライマーセット及び適した標識（例えば、相互作用的二重標識）を有するＴａｑＭａｎプローブをターゲット核酸配列とハイブリダイズさせる段階；（ｂ）前記段階（ａ）の結果物及び５’−ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素を使用してターゲット核酸配列を増幅させる段階であって、前記ＴａｑＭａｎプローブは、切断されて標識を放出し；及び（ｃ）前記放出された標識からシグナル発生を検出する段階を含む。
【００８４】
特に、シグナルは、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で検出オリゴヌクレオチドの切断によって発生する。
【００８５】
一具現例によれば、ターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに対するシグナル−発生手段は、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で検出オリゴヌクレオチドの切断によってシグナルを発生させるシグナル−発生手段である。
【００８６】
一具現例によれば、ターゲット核酸配列のそれぞれに対するシグナル−発生手段は、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で検出オリゴヌクレオチドの切断によってシグナルを発生させるシグナル−発生手段である。
【００８７】
本発明の一具現例によれば、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドが切断されて断片を放出する場合、前記断片は、検出オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズされ、前記断片は、検出オリゴヌクレオチドの切断を誘導する。
【００８８】
本発明の一具現例によれば、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドが切断されて断片を放出する場合、前記断片は、延びてキャプチャーオリゴヌクレオチドに相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む検出オリゴヌクレオチドを切断する。
【００８９】
媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式の検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナルは、インベーダー分析（米国特許第５，６９１，１４２号）、ＰＣＥＣ（ＰＴＯ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｌｅａｖａｇｅ）方法（ＷＯ第２０１２／１３４１９５号）、及び米国特許第７，３０９，５７３号に記載の方法を含む多様な方法によって発生しうる。特に、米国特許第７，３０９，５７３号に記載の方法は、切断によるシグナル発生を使用するＰＴＯＣＥ−基盤の方法のうち１つと見なされ、前記方法で、延長鎖の形成によってＣＴＯに特異的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの切断を検出することによって、前記延長鎖の形成が検出されうる。インベーダー分析は、媒介オリゴヌクレオチドの切断によって断片を形成し、断片の延長なしに連続した切断反応を誘導する。
【００９０】
本発明の一具現例によれば、シグナルが、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で発生する場合、検出オリゴヌクレオチドの切断は、シグナル変化を誘導するか、検出される標識された断片を放出させる。
【００９１】
シグナル−発生手段が検出オリゴヌクレオチドの切断によってのみではなく、二量体の形成によってシグナルを発生させる場合、前記シグナル−発生手段は、切断によってシグナルの発生に使われる限り、切断によってシグナルを提供するシグナル発生手段として見なされる。
【００９２】
シグナルが、検出オリゴヌクレオチドの切断によって発生する場合、前記切断による放出された標識は、任意の温度から検出されうる。
【００９３】
本発明の具現例によれば、ターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル−発生手段、及び二量体の形成によるシグナル−発生手段の組合せである。
【００９４】
一具現例によれば、検出オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識を含む。
【００９５】
本発明の一具現例によれば、検出オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含みうる。本発明の一具現例によれば、検出オリゴヌクレオチドが、複数のオリゴヌクレオチドを含む場合、これは、多様な方式で標識を有しうる。例えば、複数のオリゴヌクレオチドのうち、１つのオリゴヌクレオチドが少なくとも１つの標識を有するか、複数のオリゴヌクレオチドいずれもが少なくとも１つの標識を有するか、またはオリゴヌクレオチドの１つの部位が少なくとも１つの標識を有し、他の部位は、標識を有さない。
【００９６】
２つのシグナル−発生手段によって発生したシグナルは、単一類型の検出器によって区別されない。用語“単一類型の検出器によって区別されないシグナル”は、これらの同一であるか、実質的に同一なシグナル特性（例えば、光学的特性、放出波長及び電気的シグナル）によってシグナルが単一類型の検出器によって互いに区別されないことを意味する。例えば、２つのターゲット核酸配列に対して同じ標識（例えば、ＦＡＭ）が使われ、ＦＡＭからの放出波長を検出するために単一類型の検出器が使われる場合、シグナルは、区別されるように検出されない。
【００９７】
本願に使われた用語“単一類型のシグナル”は、同一であるか、実質的に同一なシグナル特性（例えば、光学的特性、放出波長及び電気的シグナル）を提供するシグナルを意味する。例えば、ＦＡＭ及びＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０は、異なる類型のシグナルを提供する。
【００９８】
本願に使われた用語“単一類型の検出器”は、単一類型のシグナルのための検出手段を意味する。幾つかの異なる類型のシグナルのための幾つかのチャネル（例えば、光ダイオード）を含む検出器で、各チャネル（例えば、光ダイオード）が“単一類型の検出器”に該当する。
【００９９】
本発明の一具現例によれば、２つのシグナル−発生手段は、同じ標識を含み、前記標識からのシグナルは、単一類型の検出器によって区別されない。
【０１００】
本発明で有用な標識は、当該技術分野で知られた多様な標識を含む。例えば、本発明で有用な標識は、単一標識、相互作用二重標識、インターカレーティング染料、及び挿入（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ）標識を含む。
【０１０１】
単一標識は、例えば、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学標識、及び金属標識を含む。一具現例によれば、単一標識は、二本鎖に存在するか、または一本鎖に存在するかによって異なるシグナル（例えば、異なるシグナル強度）を提供する。一具現例によれば、単一標識は、蛍光標識である。本発明で使われる単一蛍光標識の望ましい類型及び結合サイトは、米国特許第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号に開示されており、その教示内容は、その全体が参考として本願に含まれている。例えば、単一蛍光標識は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、及びフルオレセイン−ベース標識を含む。単一標識は、多様な方法によってオリゴヌクレオチドに連結されうる。例えば、標識は、炭素原子を含有するスぺーサ（例えば、３−カーボンスぺーサ、６−カーボンスぺーサ、または１２−カーボンスぺーサ）を通じてプローブに連結される。
【０１０２】
代表的な相互作用的標識システムであって、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチャー分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴで、エネルギー供与体は、蛍光性であるか、エネルギー受容体は、蛍光性または非蛍光性であり得る。相互作用的標識システムの他の形態で、エネルギー供与体は、非蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのさらに他の形態で、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光性、化学発光性、電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムは、“接触−媒介クエンチング（ｏｎ  ｃｏｎｔａｃｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）”に基づいた二重標識を含む（Ｓａｌｖａｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２（３０）ｎｏ．２１  ｅ１２２、及びＪｏｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ  ２００２（１２４）ｐｐ  ６９５０−６９５６）。相互作用的標識システムは、少なくとも２つの分子（例えば、染料）間の相互作用によってシグナル変化を誘導する任意の標識システムを含む。
【０１０３】
本発明に有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は、当該技術分野に知られた任意の分子を含みうる。これらの例は、下記の通りである：Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １１０（５２０）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ  ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ  ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ  ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ  Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ  ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ  ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ  ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｇｏｌｄ  ５４０（５４４）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０（５５９）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ５９０（５９１）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０（６１０）、ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ  ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ  ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ  ６７０（７０５）、及びＱｕａｓａｒ  ７０５（６１０）。カッコ内の数字は、ｎｍ単位の最大放出波長である。望ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、及びフルオレセイン−ベース標識を含む。
【０１０４】
適した蛍光分子及び適したレポーター−クエンチャー対は、下記のように多様な文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｒ  ＡＮＤ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９６）；米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。
【０１０５】
幅広い波長または特定波長の蛍光をクエンチングすることができる非蛍光クエンチャー分子（例えば、ブラッククエンチャーまたはダーククエンチャー）が、本発明で使われうるということに留意する。
【０１０６】
レポーター及びクエンチャー分子を含むシグナリングシステムで、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴの他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン染料がレポーターとして使われ、ローダミン染料が、クエンチャーとして使われる。
【０１０７】
相互作用的二重標識は、二量体のうち、１本の鎖に連結されうる。相互作用的二重標識を含有する鎖が一本鎖の状態を保持する場合、前記鎖は、ヘアピンまたはランダムコイル構造を形成して、相互作用的二重標識間のクエンチングを誘導する。前記鎖が二量体を形成する場合、クエンチングは減る。選択的に、相互作用的二重標識が鎖上に近接して位置したヌクレオチドに連結される場合、相互作用的二重標識の間にクエンチングが起こる。前記鎖が二量体を形成した後、切断される場合、クエンチングは減る。
【０１０８】
相互作用的二重標識のそれぞれは、二量体の２本の鎖のそれぞれに連結されうる。二量体の形成は、クエンチングを誘導し、二量体の変性は、アンクエンチングを誘導する。選択的に、２本の鎖のうち、１つが切断される場合、アンクエンチングが誘導されうる。
【０１０９】
本発明で有用な例示されたインターカレーティング染料は、ＳＹＢＲＴＭ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＰＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＢＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＳＹＴＯＴＭ４３、ＳＹＴＯＴＭ４４、ＳＹＴＯＴＭ４５、ＳＹＴＯＸＴＭＢｌｕｅ、ＰＯＰＯＴＭ−１、ＰＯＰＯＴＭ−３、ＢＯＢＯＴＭ−１、ＢＯＢＯＴＭ−３、ＬＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＪＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ１、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ１、ＳＹＴＯＴＭ１１、ＳＹＴＯＴＭ１３、ＳＹＴＯＴＭ１５、ＳＹＴＯＴＭ１６、ＳＹＴＯＴＭ２０、ＳＹＴＯＴＭ２３、ＴＯＴＯＴＭ−３、ＹＯＹＯＴＭ３、ＧｅｌＳｔａｒＴＭ、及びチアゾールオレンジを含む。インターカレーティング染料は、二本鎖核酸分子に特異的に挿入されてシグナルを発生させる。
【０１１０】
挿入標識がプライマー延長の間に標識を挿入してシグナルを発生させる過程に使われる（例えば、Ｐｌｅｘｏｒ方法、Ｓｈｅｒｒｉｌｌ  Ｃ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２６：４５５０−４５５６９（２００４））。また、挿入標識は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成された二量体によるシグナル発生で使われる。
【０１１１】
挿入標識は、一般的にヌクレオチドに連結されうる。また、非自然塩基を有するヌクレオチドが使われる。
【０１１２】
本願に使われた用語“非自然塩基”は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（ｃ）、及びウラシル（Ｕ）のような自然塩基の誘導体を意味し、これらは、水素−結合塩基対を形成しうる。本願に使われた用語“非自然塩基”は、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、第５，９６５，３６４号、第６，００１，９８３号、及び第６，０３７，１２０号に記載のように、親化合物として自然塩基から異なる塩基対の形成パターンを有する塩基を含む。非自然塩基間の塩基対の形成は、自然塩基のように２つまたは３つの水素結合を含む。また、非自然塩基間の塩基対の形成は、特定の方式で形成される。非自然塩基の特定の例は、塩基対の組合せで下記の塩基を含む：ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ、ｉｓｏ−ｄＣ／ｉｓｏ−ｄＧ、Ｋ／Ｘ、Ｈ／Ｊ、及びＭ／Ｎ（米国特許第７，４２２，８５０号参照）。
【０１１３】
ＰＴＯＣＥ方法によってシグナルが発生する場合、延長反応の間に挿入されたヌクレオチドは、第１非自然塩基を有し、ＣＴＯは、前記第１非自然塩基に特異的結合親和性がある第２非自然塩基を有するヌクレオチドを有しうる。
【０１１４】
本願に使われた用語“ターゲット核酸”、“ターゲット核酸配列”または“ターゲット配列”は、検出または定量のための関心のある核酸配列を称する。ターゲット核酸配列は、一本鎖だけではなく、二本鎖の配列を含む。ターゲット核酸配列は、核酸サンプル内に初期に存在する配列だけではなく、反応で新たに生成された配列を含む。
【０１１５】
ターゲット核酸配列は、任意のＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子、これらのハイブリッド（キメラ核酸）を含みうる。前記配列は、二本鎖または一本鎖の形態であり得る。出発物質として核酸が二本鎖である場合、前記２本の鎖を一本鎖または部分的に一本鎖の形態で作ることが望ましい。鎖を分離する公知の方法は、加熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア、及びグリコール酸処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ作用）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、鎖分離は、８０℃〜１０５℃の範囲の温度で加熱することで達成されうる。このような処理を果たすための一般的な方法は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）］によって提供される。
【０１１６】
ｍＲＮＡを出発物質として用いる場合、アニーリング段階を実施する前に逆転写段階が必要であり、その詳細な内容は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８））］から確認される。逆転写のために、ｍＲＮＡのポリＡ末端にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドｄＴプライマー、ランダムプライマーまたはターゲット−特異的プライマーが使われる。
【０１１７】
ターゲット核酸配列は、任意の自然原核細胞核酸、眞核細胞核酸（例えば、原生動物及び寄生虫、真菌類、酵母、高等植物、下等及び哺乳動物及びヒトを含む高等動物）、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタインバーウイルス、肝塩ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウィロイド核酸を含む。また、核酸分子は、組替えによって生産または生産されうるか、または化学的に合成または合成されうる任意の核酸分子であり得る。したがって、核酸分子は、自然で発見または発見されないこともある。ターゲット核酸配列は、公知または公知されていない配列を含みうる。
【０１１８】
本願に使われた用語“サンプル”は、本発明によって有利に評価される生物学的サンプルまたは任意の他の媒体からの任意の細胞、組織、または流体を意味し、これは、ウイルス、細菌、組織、細胞、血液、血清、血しょう、リンパ、牛乳、小便、糞便、眼球液、唾液、精液、脳抽出物、脊髄液（ＳＣＦ）、虫垂、脾臓及び扁桃組織抽出物、羊水、腹水及び非生物学的サンプル（例えば、食品、水及び土壌）を含む。また、サンプルは、生物学的供給源から単離された自然核酸分子及び合成核酸分子を含む。
【０１１９】
シグナルは、シグナル検出からの多様なシグナル特徴、例えば、シグナル強度［例えば、ＲＦＵ（相対的蛍光単位）値、または増幅を実施する場合、特定サイクル、選択されたサイクルまたはエンドポイントでのＲＦＵ値］、シグナル変化形状（または、パターン）またはＣｔ値、または前記特徴を数学的に処理することで収得された値を含む。
【０１２０】
一具現例によれば、基準値またはサンプル分析と関連した用語“シグナル”は、検出温度から収得されたシグナル自体だけではなく、前記シグナルを数学的に処理することによって、提供された変形されたシグナルを含む。
【０１２１】
本発明の一具現例によれば、リアルタイムＰＣＲによって増幅曲線が収得される場合、増幅曲線からの多様なシグナル値（または、特徴）が、各検出温度でシグナル値（または、特徴）の区別及びターゲット核酸配列の検出のために、選択されて使われる（強度、Ｃｔ値、または増幅曲線データ）。
【０１２２】
本発明の一具現例によれば、段階（ａ）は、核酸増幅が伴われるシグナル増幅過程で実施される。本発明の一具現例によれば、段階（ａ）は、核酸増幅なしにシグナル増幅過程で実施される。
【０１２３】
本発明で、シグナル−発生手段によって発生するシグナルは、ターゲット増幅と同時に増幅されうる。選択的に、シグナルは、ターゲット増幅なしに増幅されうる。
【０１２４】
本発明の一具現例によれば、シグナル発生は、ターゲット増幅と共にシグナル増幅を含む過程で実施される。
【０１２５】
本発明の一具現例によれば、ターゲット増幅は、ＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）によって実施される。ＰＣＲは、ターゲット増幅のために当業者に広く用いられ、これは、ターゲット配列の変性、ターゲット配列とプライマーとの間のアニーリング（ハイブリダイゼーション）及びプライマー延長のサイクルを含む（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号；Ｓａｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３５０−１３５４）。シグナルは、前述したシグナル発生方法（例えば、ＴａｑＭａｎ方法及びＰＴＯＣＥ−基盤の方法）をＰＣＲ過程に適用することで増幅されうる。一具現例によれば、本発明は、リアルタイムＰＣＲ方法によってシグナルを提供する。一具現例によれば、ターゲット核酸配列の増幅は、ＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応、Ｗｉｅｄｍａｎｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ）−ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １９９４  Ｆｅｂ；３（４）：Ｓ５１−６４参照）、ＧＬＣＲ（ギャップフィリングＬＣＲ、ＷＯ第９０／０１０６９号、ＥＰ第４３９１８２号、及びＷＯ第９３／００４４７号参照）、Ｑ−ｂｅｔａ（Ｑ−βレプリカーゼ増幅、Ｃａｈｉｌｌ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．，３７（９）：１４８２−５（１９９１）、米国特許第５５５６７５１号参照）、ＳＤＡ（鎖置換増幅、Ｇ  Ｔ  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１６９１−１６９６（１９９２）、ＥＰ第４９７２７２号参照）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列−ベース増幅、Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５０（６３１３）：９１２（１９９１））、ＴＭＡ（転写−媒介増幅、Ｈｏｆｍａｎｎ  ＷＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ．３２（４）：２８９−９３（２００５）；米国特許第５８８８７７９号参照）、またはＲＣＡ（ローリングサークル増幅、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２：１７３３２−１７３３６（２００５）参照）によって行われる。
【０１２６】
前記増幅方法は、温度を変化または変化させない一連の反応の繰り返しを通じてターゲット配列を増幅させることができる。一連の反応の繰り返しを含む増幅の単位は、“サイクル”と表現される。サイクルの単位は、増幅方法によって繰り返し回数または時間として表現される。
【０１２７】
例えば、シグナルの検出は、増幅の各サイクル、選択された幾つかのサイクルまたは反応のエンドポイントで実施される。一具現例によれば、少なくとも２つのサイクルでシグナルが検出される場合、それぞれのサイクルでのシグナルの検出は、あらゆる検出温度または一部選択された検出温度で実施される。本発明の一具現例によれば、検出は、奇数サイクルでは相対的高温検出温度で実施され、偶数サイクルでは相対的高温検出温度で実施される。
【０１２８】
本発明の一具現例によれば、インキュベーションは、シグナル−発生手段によるシグナル発生だけではなく、ターゲット増幅が可能な条件で行われる。
【０１２９】
ターゲット核酸配列の増幅は、増幅のためのプライマーセット及び核酸重合酵素を含むターゲット増幅手段によって達成される。
【０１３０】
本発明の一具現例によれば、ヌクレアーゼ活性（例えば、５’−ヌクレアーゼ活性または３’−ヌクレアーゼ活性）を有する核酸重合酵素が使われる。本発明の一具現例によれば、ヌクレアーゼ活性のない核酸重合酵素が使われる。
【０１３１】
本発明で有用な核酸重合酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｐｓ  １７、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ  ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、及びＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｅｕｓを含む、多様なバクテリア種から収得された熱安定性ＤＮＡ重合酵素である。特に、熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。
【０１３２】
本発明の一具現例によれば、ターゲット核酸配列の増幅は、非対称ＰＣＲによって達成される。プライマーの比率は、ダウンストリームオリゴヌクレオチドの切断またはハイブリダイゼーションを考慮して選択されうる。
【０１３３】
本発明の一具現例によれば、段階（ａ）及び／または段階（ｂ）は、核酸増幅のないシグナル増幅工程で実施される。
【０１３４】
シグナルが、オリゴヌクレオチドの切断を含む方法によって発生する場合、シグナルは、ターゲット増幅なしに増幅されうる。例えば、段階（ａ）は、ＣＰＴ方法（Ｄｕｃｋ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，９：１４２−１４８（１９９０））、インベーダー分析（米国特許第６，３５８，６９１号、及び第６，１９４，１４９号）、ＰＴＯＣＥ−基盤の方法（例えば、ＰＣＥ−ＳＨ方法、ＰＣＥ−ＮＨ方法、及びＰＣＥＣ方法）またはＣＥＲ方法（ＷＯ第２０１１／０３７３０６号）によってターゲット配列の増幅ないシグナル増幅で実施される。
【０１３５】
前述したシグナル増幅方法は、温度を変化または変化させない一連の反応の繰り返しを通じてシグナルを増幅させることができる。一連の反応の繰り返しを含むシグナル増幅の単位は、“サイクル”として表現される。サイクルの単位は、増幅方法によって繰り返し回数または時間として表現される。
【０１３６】
例えば、シグナルの発生及び検出は、増幅の各サイクル、選択された幾つかのサイクルまたは反応のエンドポイントで実施される。
【０１３７】
サンプルを、シグナルを提供する２つのシグナル−発生手段と共にインキュベーション（反応）する間に、または後に、シグナルは、単一類型の検出器のような検出器を使用して検出されうる。
【０１３８】
本発明は、複数のターゲット核酸配列の検出のための検出温度を考慮した任意の類型のシグナル−発生手段を使用して実施される。シグナル−発生手段は、ターゲット核酸配列の存在時に、２つの検出温度いずれもでまたは２つの検出温度のうち、１つの検出温度のみでシグナルを提供するように設計される。シグナル−発生手段が、２つの検出温度のうち、１つのみでシグナルを提供するように設計される場合、シグナル−発生手段が、さらに低い温度のみでシグナルを提供することが有利である。
【０１３９】
一具現例によれば、２つのターゲット核酸配列のそれぞれは、あらゆる検出温度でシグナルを発生させるシグナル−発生手段によって検出される。
【０１４０】
一具現例によれば、２つのターゲット核酸配列のうち、第１ターゲット核酸配列は、１つの検出温度でシグナルを発生させるシグナル−発生手段によって検出され、２つのターゲット核酸配列のうち、第２ターゲット核酸配列は、２つの検出温度でシグナルを発生させるシグナル−発生手段によって検出される。
【０１４１】
一具現例によれば、検出温度は、シグナル−発生手段によってシグナルが発生する温度範囲を考慮してあらかじめ決定される。
【０１４２】
本発明は、シグナル−発生手段に依存的な方式でシグナルが発生する特定温度範囲が存在するということを用いる。
【０１４３】
例えば、シグナル−発生手段が２つの核酸分子間のハイブリダイゼーション（または、結合）時には、シグナルを発生させ、これら間の非ハイブリダイゼーション（または、解離）時には、シグナルを発生しない場合、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションを可能にする温度では、シグナルが発生するが、２つの核酸分子間にハイブリダイズされない温度では、シグナルが発生しない。このように、シグナル発生（すなわち、シグナル検出）が可能な特定温度範囲とシグナル発生が不可能な他の温度範囲とが存在する。前記温度範囲は、シグナル−発生手段で使われる２つの核酸分子のハイブリッドのＴｍ値によって影響を受ける。
【０１４４】
切断後、標識を有する切断された断片を使用するシグナル発生方法が用いられる場合、シグナルは、理論的に任意の温度（例えば、３０℃〜９９℃）から検出されうる。
【０１４５】
検出温度は、シグナル発生手段によってシグナル発生が可能な温度範囲から選択される。
【０１４６】
一具現例によれば、ターゲット核酸配列を検出するためのシグナル−発生手段は、２つの検出温度で互いに異なるシグナル（例えば、シグナル強度）または異なるシグナル変化パターン（例えば、シグナル強度の変化程度）を提供するシグナル−発生手段であり得る。
【０１４７】
一具現例によれば、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル−発生手段（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ方法）が用いられる場合、シグナル−発生手段からのシグナルは、検出オリゴヌクレオチドとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションによるシグナル発生及び／または染料からのシグナル発生が温度に影響を受けるという点で、検出温度によって異なる。例えば、蛍光レポーター分子及び／またはクエンチャー分子で標識されたプローブは、検出温度によって異なるシグナルを発生させ、プローブは、相対的高温検出温度よりも相対的低温検出温度でさらに高いシグナルを発生させることができる。
【０１４８】
一具現例によれば、２つのターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段が先に製作された後、２つのターゲット核酸配列に対する検出温度が割り当てられ、以後、段階（ａ）を行う。
【０１４９】
本発明の一具現例によれば、シグナル−発生手段が、二量体の形成に依存的な方式でシグナルを発生させる場合、検出温度は、二量体のＴｍ値に基づいて選択される。
【０１５０】
本発明の一具現例によれば、シグナル−発生手段が、二量体の形成に依存的な方式でシグナルを発生させる場合、検出温度は、二量体のＴｍ値を調節することで制御される。
【０１５１】
例えば、シグナルが、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされる検出オリゴヌクレオチド（例えば、ルクスプローブ、分子ビーコンプローブ、ハイビーコンプローブ、及び隣接したハイブリダイゼーションプローブ）によって発生する場合、シグナルの検出は、オリゴヌクレオチドのＴｍ値を調節することによって、既定の温度で成功的になされる。スコーピオンプライマーが使われる場合、シグナルの検出は、延長鎖とハイブリダイズされる部位のＴｍ値を調節することによって、既定の温度で成功的になされる。
【０１５２】
シグナルが、ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成される二量体によって発生する場合、シグナルの検出は、二量体のＴｍ値を調節することによって、既定の温度で成功的になされる。例えば、シグナルが、ＰＴＯＣＥ方法によって発生する場合、シグナルの検出は、ＣＴＯ上でＰＴＯ断片の延長によって形成された延長二量体のＴｍ値を調節することによって、既定の温度で成功的になされる。
【０１５３】
ＰＴＯＣＥ−基盤の方法は、二量体及び前記二量体によってハイブリダイゼーションが影響を受ける第３ハイブリッドのＴｍ値を容易に調節する利点がある。
【０１５４】
本発明の一具現例によれば、シグナル−発生手段が、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させる場合、検出温度は、任意に選択される。すなわち、検出オリゴヌクレオチドの切断によって発生したシグナルが検出される限り、任意の温度が選択されうる。前述したように、シグナルが、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で発生する場合、前記切断によって放出された標識は、多様な温度から検出されうる。
【０１５５】
２つのターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段いずれもは、２つの検出温度いずれもでシグナルを提供するように設計される。一具現例によれば、ＴａｑＭａｎプローブ方法、ＰＴＯＣＥ−基盤の方法、またはこれらの組合せは、２つの検出温度いずれもでシグナルを提供するシグナル−発生手段として選択されうる。
【０１５６】
選択的に、２つのターゲット核酸配列のうち、１つに対するシグナル−発生手段は、２つの検出温度いずれもでシグナルを提供するように設計され、他のターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段は、１つの検出温度で（特に、相対的にさらに低い検出温度で）シグナルを提供するように設計される。一具現例によれば、ＴａｑＭａｎプローブ方法またはＰＴＯＣＥ−基盤の方法は、２つの検出温度いずれもでシグナルを提供するように選択され、ＰＴＯＣＥ−基盤の方法は、１つの検出温度でシグナルを提供するように選択されうる。
【０１５７】
本発明で使われた検出器は、シグナルを検出することができる任意の手段を含む。例えば、蛍光シグナルが使われる場合、蛍光シグナルの検出に適した光ダイオードが検出器として用いられうる。単一類型の検出器を使用した検出は、単一類型のシグナルを検出することができる検出器を使用して、または幾つかのチャネル（すなわち、光ダイオード）を有する検出器のそれぞれのチャネル（すなわち、光ダイオード）を使用して検出が実施されることを意味する。
【０１５８】
一具現例によれば、シグナルの発生は、標識からの“シグナル発生または消滅”及び“シグナル増加または減少”を含む。
【０１５９】
段階（ｂ）：関心シグナルを示す変数を含む方程式の樹立
２つのターゲット核酸配列に対して、各検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記の２つの方程式を提供する：
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１  （Ｉ）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２  （ＩＩ）
前記式において、（ＳＤ１）は、第１検出温度から検出されるシグナルであり、（ＳＤ２）は、第２検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）は、第１検出温度で第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ１）は、第１検出温度で第２シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ１Ｄ２）は、第２検出温度で第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ２）は、第２検出温度で第２シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、４つである。
【０１６０】
第１検出温度（Ｄ１）から検出されるシグナルである（ＳＤ１）は、第１検出温度（Ｄ１）で第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルである（ＳＴ１Ｄ１）及び第１検出温度（Ｄ１）で第２シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルである（ＳＴ２Ｄ１）からなる。第２検出温度（Ｄ２）から検出されるシグナルである（ＳＤ２）は、第２検出温度（Ｄ２）で第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルである（ＳＴ１Ｄ２）及び第２検出温度（Ｄ２）で第２シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルである（ＳＴ２Ｄ２）からなる。
【０１６１】
（ＳＤ１）及び（ＳＤ２）は、検出器によって測定されたシグナル、すなわち、整数値であり得る。（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）及び（ＳＴ２Ｄ２）は、収得される未知の変数である。本発明は、測定されたシグナル（ＳＤ１）及び（ＳＤ２）を使用して変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）及び（ＳＴ２Ｄ２）のうち少なくとも１つに対する解を得る方法に関するものである。
【０１６２】
段階（ｃ）：追加方程式の樹立
以後、前記４つの変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）及び（ＳＴ２Ｄ２）からなる群から選択される少なくとも１つの変数をそれぞれ含む２つの追加方程式を提供する。
【０１６３】
２つの方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）を立てた後、２つの追加方程式が樹立され、これにより、数学的処理によって方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）での変数のうち少なくとも１つ（特に、変数のうち少なくとも２つ、より特に、変数いずれも）に対する解を得るために、総４つの方程式が提供される。
【０１６４】
例えば、前記２つの追加方程式が、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）が同じ変数セットを有させる場合（すなわち、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）が連立方程式に変換される）、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）での変数のうち少なくとも１つに対する解は、前記連立方程式（特に、２つの変数を有する線形連立方程式）を解いて得られる。選択的に、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）での変数のうち少なくとも１つに対する解は、前記連立方程式解析方法と異なる方式で得られる。
【０１６５】
一具現例によれば、前記２つの追加方程式は、下記の方程式からなる群から選択される：
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）  （ＩＩＩ）、
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）  （ＩＶ）、及び
ＳＴ１Ｄ２＝任意選択値  （Ｖ）
前記式において、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、第１検出温度及び第２検出温度で第１シグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化の関係（ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｅ）を示す第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）の基準値（ＲＶ）であり、ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、第１検出温度及び第２検出温度で第２シグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化の関係を示す第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）の基準値（ＲＶ）であり；ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）は、ＳＴ１Ｄ１及びＳＴ１Ｄ２の関数を示し；ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）は、ＳＴ２Ｄ１及びＳＴ２Ｄ２の関数を示し；
方程式（Ｖ）において、ＳＴ１Ｄ２＝任意選択値は、第１シグナル−発生手段が第１ターゲット核酸配列の存在時にも、第２検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合に選択されうる。
【０１６６】
本発明の一具現例によれば、方程式（Ｖ）が選択される場合、方程式（ＩＩＩ）は、追加方程式として選択されない。
【０１６７】
前述した具現例は、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）での変数のうち少なくとも１つに対する解を得るための２つの接近法を説明する。
【０１６８】
第１接近法は、２つの追加方程式として方程式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）を使用することである。
【０１６９】
興味深くも、本発明者らは、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが既定の２つの検出温度で１つの反応容器から検出される場合、特定関係（パターン、または規則）でシグナル変化が存在するということを確認した。例えば、ターゲット核酸配列に対して相対的高温検出温度から検出されたシグナル及び相対的低温検出温度から検出されたシグナル間のシグナル変化は、特定関係（パターン、または規則）を示す。例えば、前記シグナルの強度は、互いに同一であるか、実質的に同一でありうるか、または前記シグナルの強度は、互いに異なるが、２つの検出温度で特定の範囲であり得る。
【０１７０】
本発明は、前記発見を基準値を収得し、ターゲット核酸配列に対する関心シグナルの区別に適用することである。ターゲット核酸配列に対するシグナルは、検出温度のみを異ならせて検出されるために（例えば、ターゲットの量の変化またはバッファ条件の変化なし）、２つの検出温度間のシグナル変化には、特定関係（パターン、または規則）がある。一具現例によれば、本発明の方法は、２つの検出温度間のターゲット核酸配列に対するシグナル変化の特定関係（パターン、または規則）を許容する条件下で実施される。
【０１７１】
ターゲット核酸配列の“基準値（ＲＶ）”は、２つの検出温度でターゲット核酸配列の検出のためのシグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化の関係を示す。
【０１７２】
一具現例によれば、ＲＶ値が使われる場合、１つの検出温度でのシグナルは、他の検出温度でのシグナルの側面で表現される。
【０１７３】
方程式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）において、基準値としてＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）及びＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、既定の値である。一具現例によれば、基準値は、ターゲット核酸配列に相応する標準物質を使用して収得されうる。例えば、ターゲット核酸配列に相応する標準物質を相応するシグナル−発生手段と共にインキュベーションした後、第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出した後、第１検出温度及び第２検出温度でのシグナル変化の関係を収得する。シグナル変化の関係は、第１検出温度及び第２検出温度から検出されたシグナル間の差として表現される。
【０１７４】
基準値は、第１検出温度及び第２検出温度でシグナル−発生手段によって提供されたシグナルの数学的処理を通じて収得される。このような数学的処理は、シグナルの関数である。基準値を収得するために使われる関数は、前記関数が第１検出温度及び第２検出温度でシグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化の関係を提供する限り、如何なる関数も含む。例えば、関数は、シグナルの加算、乗算、減算及び除算のような数学的処理として提示されうる。
【０１７５】
第１検出温度及び第２検出温度から提供されるシグナルの特徴自体が、第１検出温度及び第２検出温度でのシグナル変化の関係の収得に使われる。選択的に、第１検出温度及び第２検出温度でのシグナルは、前記シグナルの特徴を数学的に処理することで変形され、第１検出温度及び第２検出温度でのシグナル変化の関係の収得に使われる。
【０１７６】
選択的に、初期に収得された基準値は、変形され、基準値として使われる。
【０１７７】
一具現例によれば、基準値と関連して、用語“シグナル”は、検出温度から収得されたシグナル自体だけではなく、シグナルを数学的に処理することによって、提供された変形されたシグナルを含む。
【０１７８】
前述したように、基準値としてＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）及びＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、既定の値であるために、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）及びＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、（ｉ）方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）での２つの変数（ＳＴ１Ｄ１）及び（ＳＴ１Ｄ２）を前記２つの変数から選択された１つの変数に変換するための変換子、及び（ｉｉ）方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）での２つの変数（ＳＴ２Ｄ１）及び（ＳＴ２Ｄ２）を前記２つの変数から選択された１つの変数に変換するための変換子としての役割を果たせる。
【０１７９】
一具現例によれば、方程式（ＩＩＩ）は、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）での２つの変数（ＳＴ１Ｄ１）及び（ＳＴ１Ｄ２）を前記２つの変数から選択された１つの変数への変換に使われ、方程式（ＩＶ）は、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）での２つの変数（ＳＴ２Ｄ１）及び（ＳＴ２Ｄ２）を前記２つの変数から選択された１つの変数への変換に使われる。
【０１８０】
一具現例によれば、前記２つの追加方程式のうち１つは、方程式（ＩＩＩ）から選択され、他の１つは、方程式（ＩＶ）から選択される。
【０１８１】
本発明で使われる基準値は、多様な方式で収得されうる。例えば、基準値は、予想値として与えられうる。ターゲット配列、シグナル−発生手段及び検出温度を考慮して、第１検出温度及び第２検出温度でのシグナル変化の関係を示す基準値を予想することができる。選択的に、基準値は、基準値を得るための実験を実施することによって、実験的な値または実際的な値として与えられうる。
【０１８２】
一具現例によれば、（ｉ）ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、（ｉ−１）第１ターゲット核酸配列を第１ターゲット核酸配列の検出のための第１シグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉ−２）第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出し、（ｉ−３）次いで、前記第１検出温度から検出されたシグナル及び前記第２検出温度から検出されたシグナル間の差を得ることで収得され、（ｉｉ）ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、（ｉｉ−１）第２ターゲット核酸配列を第２ターゲット核酸配列の検出のための第２シグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉｉ−２）第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出し、（ｉｉ−３）次いで、前記第１検出温度から検出されたシグナル及び前記第２検出温度から検出されたシグナル間の差を得ることで収得され；前記ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）と異なる。
【０１８３】
基準値の収得で、用語“第１検出温度及び第２検出温度から検出されたシグナル間の差”は、第１検出温度及び第２検出温度でシグナル変化の関係の一具現例である。
【０１８４】
一具現例によれば、第１検出温度及び第２検出温度から検出されたシグナル間の差は、第１検出温度から検出されたシグナル及び第２検出温度から検出されたシグナルを数学的に処理することで収得される差を含む。
【０１８５】
一具現例によれば、数学的処理が行われる場合、シグナルの特徴は、数学的処理が容易ではなければならない。特定の具現例で、数学的処理は、シグナルを使用した計算（例えば、加算、乗算、減算及び除算）またはシグナルから由来の他の値を収得することを含む。
【０１８６】
第１検出温度及び第２検出温度でのシグナル間の差は、多様な側面で表現される。例えば、前記差は、数値、シグナルの存在／不在またはシグナル特徴を有するプロットとして表現される。
【０１８７】
差を収得するためのシグナルの数学的処理は、多様な計算方法及びこれらの変形によって実施される。
【０１８８】
特に、差を収得するためのシグナルの数学的処理は、第１検出温度及び第２検出温度でのシグナル間の比率を計算することで実施される。
【０１８９】
例えば、第２検出温度から検出されたシグナルのエンドポイント（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）強度対第１検出温度から検出されたシグナルのエンドポイント強度の比率が、基準値として使われる。
【０１９０】
本発明の一具現例によれば、シグナル間の差を収得するためのシグナルの数学的処理は、相対的低温検出温度から検出されたシグナル対相対的高温検出温度から検出されたシグナルの比率の計算である。本発明の一具現例によれば、シグナル間の差を収得するためのシグナルの数学的処理は、相対的高温検出温度から検出されたシグナル対相対的低温検出温度から検出されたシグナルの比率の計算である。
【０１９１】
一具現例によれば、基準値は、相対的高温検出温度から検出されたシグナル及び相対的低温検出温度から検出されたシグナル間の減算を計算することで収得されうる。
【０１９２】
差を収得するための数学的処理は、多様な方式で実施される。数学的処理は、機械を使用して実施される。例えば、シグナルは、検出器またはリアルタイムＰＣＲ装置内のプロセッサによって数学的に処理されうる。選択的に、シグナルは、特に、既定のアルゴリズムによって手作業で数学的に処理されうる。
【０１９３】
本発明の一具現例によれば、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）と異なる。本発明の一具現例によれば、第１シグナル−発生手段及び第２シグナル−発生手段は、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）がＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）と異なるように設計される。
【０１９４】
ＲＶ値が互いに異なる場合、差の程度を記述する定量的表現は、ＲＶ値を計算する接近法によって変わりうる。
【０１９５】
一具現例によれば、基準値を収得するためのシグナルは、共通の計算方法によって処理されて、比較のための基準値を提供し、以後、前記比較のための基準値を使用して２つの基準値間の差の程度を収得することができる。一具現例によれば、共通の計算方法は、２つのシグナルの除算である。
【０１９６】
例えば、本方法の方法によってシグナルの分析に使われる基準値を収得するために、２つのシグナルを減算によって処理する場合、前記２つのシグナルは、比較のための基準値を収得するために、除算によって処理されうる。
【０１９７】
一具現例によれば、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）よりも少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．５倍、１．７倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、または１０倍さらに大きい。選択的に、ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）よりも少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．５倍、１．７倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、または１０倍さらに大きい。
【０１９８】
一具現例によれば、第１基準値が、第２基準値と異なるか否かを決定するために比較する場合、前記基準値は、シグナルの除算によって計算される。一具現例によれば、第１基準値が第２基準値と異なるか否かを決定するための基準値計算方法は、ターゲット核酸配列を検出するための基準値計算方法と同一または異なる。
【０１９９】
本発明の一具現例によれば、基準値のためのシグナル−発生手段は、ターゲット核酸配列の検出のためのシグナル−発生手段と同一であり得る。
【０２００】
一具現例によれば、基準値を収得するためのインキュベーション条件は、サンプルの分析のためのインキュベーション条件と同一である。
【０２０１】
ターゲット核酸配列に対して、基準値は、成分（例えば、ターゲット核酸配列、シグナル−発生手段、酵素、またはｄＮＴＰ）の量、バッファｐＨまたは反応時間を含む多様な反応条件で収得されうる。本発明の一具現例によれば、基準値は、反応完了時に飽和シグナルの提供には十分な反応条件下で収得されうる。本発明の一具現例によれば、基準値収得時に得られたシグナル間の差は、特定の範囲を有し、基準値は、前記特定の範囲内で、または前記特定の範囲を参照して選択される。本発明の一具現例によれば、基準値は、前記特定の範囲の最大値または最小値で選択されうるか、または前記特定の範囲の最大値または最小値を参照して選択されうる。特に、基準値は、多様な条件から収得された基準値の標準偏差、許容誤差範囲、特異度、または敏感度を考慮して変形されうる。
【０２０２】
“ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）またはｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）”でｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）またはｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）は、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）またはＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）を計算するための数学的表現によって提示されうる。
【０２０３】
一具現例によれば、ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２  （ＶＩ）またはＳＴ１Ｄ２／ＳＴ１Ｄ１＝ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１  （ＶＩＩ）を含み；ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２  （ＶＩＩＩ）またはＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１  （ＩＸ）を含む。
【０２０４】
ＲＶが、第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）でのシグナル間の比率を使用して収得される場合、ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）またはｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）は、シグナル間の比率を計算するための数学的表現によって提示されうる。用語“ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）”で、Ｔ１（Ｄ１Ｄ２）は、計算されたＲＶが第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）でのシグナル間の差を計算することによって、収得された第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）に係わる基準値に相応するということを示す。ＲＶ計算方法の決定時に、用語“Ｔ１（Ｄ１Ｄ２）”は、前記計算方法を考慮して具体的に表現される。
【０２０５】
例えば、用語“ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２”は、第１検出温度（Ｄ１）から検出されたシグナル対第２検出温度（Ｄ２）から検出されたシグナルの比率を計算することによって、収得された第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）に係わる基準値を意味する。選択的に、用語“ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１”は、第２検出温度（Ｄ２）から検出されたシグナル対第１検出温度（Ｄ１）から検出されたシグナルの比率を計算することによって、収得された第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）に係わる基準値を意味する。
【０２０６】
一具現例によれば、ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２は、（ｉ−１）第１ターゲット核酸配列を第１ターゲット核酸配列の検出のための第１シグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉ−２）第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出し、（ｉ−３）次いで、前記第１検出温度から検出されたシグナル対前記第２検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１は、段階（ｉ−１）及び（ｉ−２）を実施した後、前記第２検出温度から検出されたシグナル対前記第１検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２は、（ｉｉ−１）第２ターゲット核酸配列を第２ターゲット核酸配列の検出のための第２シグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉｉ−２）第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出し、（ｉｉ−３）次いで、前記第１検出温度から検出されたシグナル対前記第２検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１は、段階（ｉｉ−１）及び（ｉｉ−２）を実施した後、前記第２検出温度から検出されたシグナル対前記第１検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得される。
【０２０７】
一具現例によれば、（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）、ＳＴ２Ｄ１）及び（ＳＴ２Ｄ２）を得るための２つの追加方程式は、下記の方程式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）のうち１つ及び下記の方程式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）のうち１つを含む：
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２  （ＶＩ）
ＳＴ１Ｄ２／ＳＴ１Ｄ１＝ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１  （ＶＩＩ）
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２  （ＶＩＩＩ）
ＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１  （ＩＸ）。
【０２０８】
一具現例によれば、選択された２つの検出温度で特定のターゲット核酸配列に対するＲＶを計算するための複数の方程式が提供されうる（例えば、第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）で第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）に対する方程式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ））。一具現例によれば、このような場合、複数の方程式のうちから１つの方程式のみ追加方程式のうち１つとして選択される。
【０２０９】
式（Ｉ）及び（ＩＩ）と共に方程式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）は、変数のうち少なくとも１つに対する解を得るのに使われる。実施例１及び図１Ａ〜図１Ｄで例示されたように、ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）が、ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２であり、ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）が、ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２である場合、変数に対する解を得るための方程式セットは、下記を含む：
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２及びＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２は、実験的に既定の値であるために、変数、（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）及び（ＳＴ２Ｄ２）に対する解は、前記４つの方程式によって得られ得る。
【０２１０】
選択的に、基準値は、第１検出温度から検出されたシグナル及び第２検出温度から検出されたシグナル間の減算を計算することで収得されうる。
【０２１１】
方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）内の変数のうち少なくとも１つに対する解を得るための第２接近法は、２つの追加方程式として方程式［（ＩＩＩ）及び（Ｖ）］または［（ＩＶ）及び（Ｖ）］を使用することである。方程式（Ｖ）において、ＳＴ１Ｄ２＝任意選択値は、第１シグナル−発生手段が第１ターゲット核酸配列の存在時にも、第２検出温度で実質的にシグナルを発生させないように製造される場合に選択されうる。
【０２１２】
方程式（Ｖ）が適用される場合、任意選択値が、ＳＴ１Ｄ２として使われる。一具現例によれば、ゼロ（０）がＳＴ１Ｄ２として使われること（ＳＴ１Ｄ２＝０）が、本発明の実施側面で便利である。選択的に、負の整数または正の整数が、ＳＴ１Ｄ２として使われる（ＳＴ１Ｄ２＝負の整数またはＳＴ１Ｄ２＝正の整数）。
【０２１３】
（ＳＴ１Ｄ２）を除いた変数に対する解の数値は、方程式（Ｖ）に使われた整数の値によって変わりうる。しかし、変数に対する解の数値が、ＳＴ１Ｄ２として選択された整数の数値を使用して計算される値を有するという点は注目すべきことである。選択的に、変数を解くためのこのような接近法は、（ＳＴ１Ｄ２）を除いた変数に対する解の数値がシグナル抽出のために使われたＳＴ１Ｄ２の値として選択された整数を使用して収得される結果であると表現される。
【０２１４】
したがって、各ターゲット核酸配列に対するシグナル区別は、任意の整数が方程式（Ｖ）に適用される場合にも、各検出温度で可能になる一方、計算された変数は、前記整数によって変わる。
【０２１５】
特に、データセットを得るために複数のサイクルでシグナルを検出し、各サイクルでシグナル区別を実施した後、シグナル区別の結果をあらゆるサイクルに対してプロッティングする場合、方程式（Ｖ）での整数によって絶対シグナル値が変わりうる。しかし、あらゆるサイクルでシグナル変化（例えば、シグナル変化パターン）の発生または非発生は変わらず、これにより、ターゲット検出のためのシグナル区別は、成功的に達成されうる。
【０２１６】
一具現例によれば、方程式（Ｖ）を使用して計算された変数に対する解は、定義された方式で数学的に変形されうる。そのような変形で、変数に対する解は、他の整数（例えば、ＳＴ１Ｄ２＝０）を使用して計算された値を有するように変形されうる。
【０２１７】
変数に対する解を得るために使われた方程式（Ｖ）での整数の数値は、関心ターゲット核酸配列の存在または不在が決定される時に考慮されない。
【０２１８】
関心ターゲット核酸配列の存在または不在が追加方程式として方程式（Ｖ）を使用して計算された変数に対する解を使用することで決定される場合、（ｉ）計算された変数に対する解自体、または（ｉｉ）定義された方式で数学的に変形された解が使われる。また、計算された解またはこれらの数学的変形の有意性を決定するための閾値は、方程式（Ｖ）で整数の数値を考慮して樹立され、これにより、関心ターゲット核酸配列の存在または不在を最終的に決定することができる。
【０２１９】
一具現例によれば、方程式（Ｖ）が選択される場合、方程式（ＩＩＩ）は選択されず、方程式（ＩＶ）が選択される。
【０２２０】
当業者は、明細書及び特許請求の範囲で第２接近法についての説明が、ＳＴ１Ｄ１＝任意選択値、ＳＴ２Ｄ１＝任意選択値、またはＳＴ２Ｄ２＝任意選択値が選択される具現例を含むということを理解できるであろう。例えば、ＳＴ２Ｄ２＝任意選択値は、第２シグナル−発生手段が第２ターゲット核酸配列の存在時にも、第２検出温度で実質的にシグナルを発生させないように製造される場合に選択されうる。方程式ＳＴ２Ｄ２＝任意選択値が選択される場合、方程式（ＩＶ）は選択されず、方程式（ＩＩＩ）が選択される。そのような多様な具現例が請求され、不要な重複による明細書の複雑性を避けながら、一具現例（ＳＴ１Ｄ２＝任意選択値）の説明に含まれうる。
【０２２１】
用語“シグナルを発生させない”は、“シグナルの非発生”だけではなく、バックグラウンドシグナルのように“有意性のないシグナル発生”を含む。
【０２２２】
特に、データセットを得るために複数のサイクルでシグナルが検出される場合、用語“シグナルを発生させない”は、サイクル間にシグナル変化または有意なシグナル変化がないということを意味する。
【０２２３】
データセットを得るために複数のサイクルでシグナルが検出される場合は、非制限的に、リアルタイムＰＣＲのような増幅反応によってシグナル増幅曲線を収得することを含みうる。
【０２２４】
一具現例によれば、（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）、（ＳＴ２Ｄ１）及び（ＳＴ２Ｄ２）を得るための２つの追加方程式は、下記の方程式（ＶＩＩＩ）及び（ＩＸ）のうち１つ及び（ＩＸ）及び下記の方程式（Ｖ）を含む：
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２  （ＶＩＩＩ）
ＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１  （ＩＸ）
ＳＴ１Ｄ２＝任意選択値  （Ｖ）。
【０２２５】
実施例２及び図２Ｃ〜図２Ｄに例示されたように、第１シグナル−発生手段が第１ターゲット核酸配列の存在時にも、第２検出温度で実質的にシグナルを発生させないように製造される場合、方程式（Ｖ）において、ＳＴ１Ｄ２＝０及び追加方程式としてｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）  （ＩＶ）が変数のうち少なくとも１つに対する解を得るために選択されうる。ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）が、ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２である場合、変数に対する解を得るための方程式セットは、下記を含む：
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ２＝０
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２は、既定の整数値であるために、変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）及び（ＳＴ１Ｄ２）に対する解は、前記４つの方程式によって得られ得る。
【０２２６】
２つの追加方程式として方程式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）を使用する第１接近法の特定の具現例として、第１シグナル−発生手段が第１ターゲット核酸配列の存在時にも、第２検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、任意選択値として選択されうる。
【０２２７】
一具現例によれば、第１シグナル−発生手段が第１ターゲット核酸配列の存在時にも、第２検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、任意選択値である。
【０２２８】
前述したように、第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）が、第２検出温度（Ｄ２）でシグナルを発生させない場合、任意選択値が、ＳＴ１Ｄ２として使われ、これにより、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）が、任意選択値になりうる。
【０２２９】
特に、ＳＴ１Ｄ２の解（値）が方程式で或る値または前記値の周囲（例えば、“０”または“０”周囲）になるように、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）として任意選択値が選択されうる。
【０２３０】
“或る値または前記値の周囲”と関連して、用語“前記値の周囲”は、或る値で考慮される有意レベル内の任意の数を意味する。
【０２３１】
特に、ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）が、第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）でのシグナル間の比率を計算するための数学的表現によって提示される場合、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、任意選択値として選択されうる。
【０２３２】
実際に、第１シグナル−発生手段が第１ターゲット核酸配列の存在時にも、第２検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合にも、非常に弱い強度を有するシグナル（例えば、バックグラウンドシグナル）を発生させることが一般的である。特に、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）として任意選択値は、実際に得られたシグナル値を用いて計算されたＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）と同一であるか、これよりも少ないか、これよりも大きい。
【０２３３】
明細書及び特許請求の範囲で第１接近法についての説明が、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）またはＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）が任意選択値である具現例を含むということを、当業者なら理解できるであろう。例えば、第２シグナル−発生手段が第２ターゲット核酸配列の存在時にも、第２検出温度で実質的にシグナルを発生させないように製造される場合、ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、任意選択値であり得る。そのような多様な具現例が請求され、不要な重複による明細書の過度な複雑性を避けながら、前記具現例（任意選択値としてＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２））の説明に含まれうる。
【０２３４】
方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）と共に方程式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）が変数のうち少なくとも１つに対する解を得るために使われる。実施例２及び図２Ｇ〜図２Ｈに例示されたように、第１シグナル−発生手段が第１ターゲット核酸配列の存在時にも、第２検出温度で実質的にシグナルを発生させないように製造される場合、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、任意選択値であり得る。ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）が、ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２であり、ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）が、ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２である場合、変数に対する解を得るための方程式セットは、下記を含む：
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２は、任意選択値であるために、変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）及び（ＳＴ２Ｄ２）に対する解は、前記４つの方程式によって得られ得る。
【０２３５】
本発明の方法が、それぞれのシグナル−発生手段によって発生したシグナル量（例えば、シグナル強度）を定量可能にするという点は非常に面白いことである。前述したように、変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）及び（ＳＴ２Ｄ２）に対する解は、それぞれのシグナル−発生手段によって発生したシグナル量（例えば、シグナル強度）を定量可能にし、これは、ターゲット核酸配列の定量に適用可能である。
【０２３６】
段階（ｄ）：変数に対する解の収得
最後に、２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び（ｃ）から提供された前記４つの方程式を使用して変数のうち少なくとも１つに対する解を収得する。
【０２３７】
前述したように、段階（ｂ）及び（ｃ）から提供される方程式は、２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、変数のうち少なくとも１つに対する解を得るのに使われ、これにより、２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つの存在が決定されうる。
【０２３８】
特に、変数のうち少なくとも２つ（より特に、少なくとも３つ、最も特に、４つ）に対する解は、２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つ（最も特に、全部）に割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも２つ（より特に、少なくとも３つ、最も特に、４つ）を区別するために、段階（ｂ）及び（ｃ）から提供された４つの方程式を使用して収得される。
【０２３９】
一具現例によれば、本発明の方法は、前記２つの変数に対する解（値）を得るために使われ、前記２つの変数のうち１つは、第１ターゲット核酸配列に対する変数から選択され、他の変数は、第２ターゲット核酸配列に対する変数から選択される。
【０２４０】
一具現例によれば、シグナルを発生させる接近法によって、変数に対して得られた解（値）が有意であるか否かを分析するために閾値が用いられうる。
【０２４１】
陰性対照群、敏感度または使われた標識が閾値の決定に考慮されうる。本発明の一具現例によれば、閾値は、ユーザによって、または自動的に決定されうる。
【０２４２】
一具現例によれば、閾値は、第１ターゲット核酸配列のみを使用して、または第２ターゲット核酸配列のみを使用して検出されたシグナルを参照して決定される。
【０２４３】
一具現例によれば、シグナルが、ＰＣＲによるターゲット増幅と関連したリアルタイム方式で発生する場合、各増幅サイクルまたは一部選択されたサイクルでのシグナルは、基準値を用いて数学的に処理され、前記計算結果が、サイクルに対してプロッティングされ、関心シグナルの区別に（例えば、ターゲット核酸配列の存在の決定）使われる。
【０２４４】
本発明の一具現例によれば、２つのターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含み、前記２つのターゲット核酸配列のうち１つは、一種の類型のヌクレオチド変異を含み、他のターゲット核酸配列は、他の類型のヌクレオチド変異を含む。
【０２４５】
本願に使われた用語“ヌクレオチド変異”は、配列が類似した連続したＤＮＡセグメントのうち、特定位置のＤＮＡ配列での任意の単一または複数のヌクレオチド置換、欠失または挿入を意味する。このような連続したＤＮＡセグメントは、１つの遺伝子または１つの染色体の任意の他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異または多型対立遺伝子変異であり得る。例えば、本発明から検出されたヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）、突然変異、欠失、挿入、置換、及び転座を含む。例示されたヌクレオチド変異は、ヒトゲノム内の多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子での変異）、病原体の薬剤耐性と関連した変異及び腫瘍形成誘発変異を含む。本願に使われた用語“ヌクレオチド変異”は、核酸配列の特定位置での任意の変異を含む。すなわち、用語“ヌクレオチド変異”は、核酸配列の特定位置での野生型及びその任意の突然変異型を含む。
【０２４６】
本発明の一具現例によれば、本発明から検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）である。
【０２４７】
本発明の一具現例によれば、第１ＳＮＰ対立遺伝子で構成された同型接合体は、第１ターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段を使用して検出され、第２ＳＮＰ対立遺伝子で構成された同型接合体は、第２ターゲット核酸配列に対する第２シグナル−発生手段を使用して検出され、第１ＳＮＰ対立遺伝子及び第２ＳＮＰ対立遺伝子で構成された異型接合体は、前記２つのシグナル−発生手段を使用して検出される。
【０２４８】
ＩＩ．少なくとも３つのターゲット核酸配列に対する関心シグナルの区別
本発明の他の態様において、下記の段階を含む、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法が提供される：
（ａ）前記サンプルをＮ個のターゲット核酸配列を検出するためのＮ個のシグナル−発生手段と共にインキュベーションし、Ｎ個の検出温度でシグナルを検出する段階であって；前記それぞれのターゲット核酸配列は、相応するシグナル−発生手段によって検出され；前記Ｎ個のシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルは、単一類型の検出器によって、それぞれのターゲット核酸配列に対して区別されず；Ｎは、２以上の整数であり；
（ｂ）ターゲット核酸配列に対して、それぞれの検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記のＮ個の方程式を提供する段階；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋・・・・・＋ＳＴＮＤ１＝ＳＤ１  （１）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋・・・・・＋ＳＴＮＤ２＝ＳＤ２  （２）
・                                      ・
・                                      ・
・                                      ・
ＳＴ１ＤＮ＋ＳＴ２ＤＮ＋・・・・・＋ＳＴＮＤＮ＝ＳＤＮ  （Ｎ）
前記式において、（ＳＤ１）ないし（ＳＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度でそれぞれのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、Ｎ２個であり；
（ｃ）変数（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）からなる群から選択される少なくとも１つの変数をそれぞれ含む（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式を提供する段階；及び
（ｄ）前記Ｎ個のターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び段階（ｃ）から提供されたＮ２個の方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解を得る段階。
【０２４９】
本発明の方法は、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルを区別する方法であって、本願で表現され、選択的には、サンプル内の少なくとも１つのターゲット核酸配列を検出する方法または少なくとも１つのターゲット核酸配列に少なくとも１つの関心シグナルを割り当てて、サンプル内の少なくとも１つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法として表現される。
【０２５０】
前記第２態様は、原則的に前述した本発明の第１態様の技術的原理及び特徴に従うので、両者間の共通説明は、本明細書の複雑性をもたらす過度な重複を避けるために省略する。第２態様を説明するために、第１態様についての説明を言及する場合、第２態様は、第１態様と一部異なるという点に留意しなければならない。したがって、当業者は、第１態様についての一部説明が、第２態様についての説明に直接に適用可能であり、他の説明が、若干の変形によって第２態様についての説明に適用可能であるということを理解できるであろう。
【０２５１】
本発明は、下記のようにより詳細に説明される：
【０２５２】
段階（ａ）：サンプルとシグナル−発生手段とのインキュベーション及びシグナル検出
まず、分析するサンプルをＮ個のターゲット核酸配列を検出するためのＮ個のシグナル−発生手段と共にインキュベーションした後、シグナル−発生手段からのシグナルをＮ個の検出温度で検出し；それぞれのターゲット核酸配列は、相応するシグナル−発生手段によって検出され；Ｎ個のシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルは、単一類型の検出器によって、各ターゲット核酸配列に対して区別されず；Ｎは、２以上の整数である。
【０２５３】
本発明から検出されるターゲット核酸配列の数は、制限されず、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０つ以上のターゲット核酸配列を含む。
【０２５４】
例えば、ターゲット核酸配列の数が、３つである場合、Ｎは、３であり、ターゲット核酸配列は、それぞれＴ１、Ｔ２及びＴ３として表現される。
【０２５５】
一具現例によれば、ターゲット核酸配列の数が、Ｎ個である場合、シグナル−発生手段が、Ｎ個使われる。
【０２５６】
ターゲット核酸配列の数が、Ｎ個である場合、検出温度が、Ｎ個使われる。例えば、ターゲット核酸配列の数が、３つである場合、Ｎは、３であり、検出温度が、３つ使われる。検出温度は、それぞれＤ１、Ｄ２及びＤ３として表現される。
【０２５７】
本発明は、ターゲット核酸配列に対するシグナルを提供するために、シグナル−発生手段を用いる。それぞれのターゲット核酸配列は、相応するシグナル−発生手段によって検出される。例えば、Ｎ個のターゲット核酸配列のうち、ｇ番目のターゲット核酸配列は、ｇ番目のシグナル−発生手段によって検出され、前記用語“ｇ”は、１〜Ｎから選択される整数である。
【０２５８】
本発明の一具現例によれば、前記インキュベーションは、シグナル−発生手段によってシグナルを発生させる条件下で実施される。
【０２５９】
本発明の一具現例によれば、前記インキュベーションは、Ｎ個のシグナル−発生手段を含む単一反応容器で実施される。
【０２６０】
本発明の第２態様のためのシグナル−発生手段は、本発明の第１態様のためのシグナル−発生手段を参照することができる。
【０２６１】
本発明で、シグナルは、多様な物質を使用して多様な方式で発生しうる。
【０２６２】
一具現例によれば、Ｎ個のシグナル−発生手段のうち少なくとも１つは、二量体の形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル−発生手段である。
【０２６３】
一具現例によれば、それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段は、二量体の形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル−発生手段である。
【０２６４】
特に、シグナルは、ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズする検出オリゴヌクレオチド間の二量体の形成によって発生する。
【０２６５】
特に、シグナルは、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズする媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成される二量体によって発生する。
【０２６６】
媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成された二量体によるシグナルは、ＰＴＯＣＥ方法（ＷＯ第２０１２／０９６５２３号）、ＰＣＥ−ＳＨ方法（ＷＯ第２０１３／１１５４４２号）、及びＰＣＥ−ＮＨ方法（第ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２号）を含む多様な方法によって発生しうる。
【０２６７】
一具現例によれば、Ｎ個のシグナル−発生手段のうち少なくとも１つは、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル−発生手段である。
【０２６８】
一具現例によれば、それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル−発生手段である。
【０２６９】
特に、シグナルは、検出オリゴヌクレオチドとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション以後、検出オリゴヌクレオチドの切断によって発生する。検出オリゴヌクレオチドとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション以後、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナルは、ＴａｑＭａｎプローブ方法（米国特許第５，２１０，０１５号、及び第５，５３８，８４８号）を含む多様な方法によって発生しうる。
【０２７０】
特に、シグナルは、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で検出オリゴヌクレオチドの切断によって発生する。本発明の一具現例によれば、媒介オリゴヌクレオチドの切断は、断片を放出し、前記断片は、二量体の形成またはキャプチャーオリゴヌクレオチド上で前記断片の延長による検出オリゴヌクレオチドの切断を媒介する。
【０２７１】
本発明の一具現例によれば、Ｎ個のターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに対するシグナル−発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル−発生手段であり、他のターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段は、二量体の形成によるシグナル−発生手段である。
【０２７２】
一具現例によれば、それぞれのターゲット核酸配列は、あらゆる検出温度でシグナルを発生させるシグナル−発生手段によって検出される。
【０２７３】
一具現例によれば、Ｎ個のターゲット核酸配列のうち、ｇ番目のターゲット核酸配列は、少なくとも“ｇ”個の検出温度でシグナルを発生させるシグナル−発生手段によって検出される。例えば、ターゲット核酸配列のうち、３番目のターゲット核酸配列は、３つ以上の検出温度でシグナルを発生させるシグナル−発生手段によって検出される。
【０２７４】
本発明の一具現例によれば、Ｎ個のシグナル−発生手段は、同じ標識を含み、前記標識からのシグナルは、単一類型の検出器によって区別されない。
【０２７５】
本発明の一具現例によれば、段階（ａ）は、核酸増幅が伴われるシグナル増幅過程で実施される。
【０２７６】
本発明で、シグナル−発生手段によって発生するシグナルは、ターゲット増幅と同時に増幅されうる。選択的に、シグナルは、ターゲット増幅なしに増幅されうる。
【０２７７】
本発明の一具現例によれば、シグナル発生は、ターゲット増幅と共にシグナル増幅を含む過程で実施される。
【０２７８】
本発明の一具現例によれば、ターゲット増幅は、ＰＣＲ（重合酵素連鎖反応）によって実施される。
【０２７９】
本発明の一具現例によれば、インキュベーションは、シグナル−発生手段によるシグナル発生だけではなく、ターゲット増幅が可能な条件で実施される。
【０２８０】
本発明の一具現例によれば、段階（ａ）は、核酸増幅のないシグナル増幅過程で実施される。
【０２８１】
シグナルが、オリゴヌクレオチドの切断を含む方法によって発生する場合、前記シグナルは、ターゲット増幅なしに増幅されうる。
【０２８２】
サンプルを、シグナルを提供するためのシグナル−発生手段と共にインキュベーション（反応）する間に、または後に、前記シグナルは、検出器、例えば、単一類型検出器を使用して検出される。本発明によれば、２つのターゲット核酸配列の存在または不在は、単一類型検出器を使用する場合にも決定されうる。
【０２８３】
本発明は、検出温度の観点で任意の類型のシグナル−発生手段を使用して実施される。
【０２８４】
シグナル−発生手段は、Ｎ個の検出温度のうち、全部または一部でシグナルを提供するように設計される。
【０２８５】
特に、シグナル−発生手段は、検出温度の変更時に異なるシグナルを提供するように設計される。
【０２８６】
一具現例によれば、検出温度は、シグナル−発生手段によってシグナル発生が可能な温度範囲を考慮してあらかじめ決定される。
【０２８７】
検出温度は、シグナル発生手段によってシグナル発生が可能な温度範囲から選択される。
【０２８８】
一具現例によれば、Ｎ個の検出温度は、互いに異なる。
【０２８９】
一具現例によれば、ターゲット核酸配列を検出するためのシグナル−発生手段は、Ｎ個の検出温度のそれぞれで互いに異なるシグナル（例えば、シグナル強度）を提供するシグナル−発生手段であり得る。
【０２９０】
一具現例によれば、２つのターゲット核酸配列に対するシグナル−発生手段が先に製作された後、２つのターゲット核酸配列に対する検出温度が割り当てられ、以後、段階（ａ）を実施する。
【０２９１】
本発明の一具現例によれば、シグナル−発生手段が、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させる場合、検出温度は、任意的に選択される。すなわち、検出オリゴヌクレオチドの切断によって発生するシグナルが検出されうる限り、如何なる温度も選択されうる。前述したように、シグナルが、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で発生する場合、切断によって放出された標識は、多様な温度から検出されうる。
【０２９２】
本発明に使われる検出器は、シグナルを検出することができる任意の手段を含む。例えば、蛍光シグナルが使われる場合、蛍光シグナルの検出に適した光ダイオードが検出器として用いられうる。単一類型の検出器を使用した検出は、単一類型のシグナルを検出することができる検出器を使用して、または幾つかのチャネル（すなわち、光ダイオード）を有する検出器のそれぞれのチャネル（すなわち、光ダイオード）を使用して検出を実施することを意味する。
【０２９３】
段階（ｂ）：関心シグナルを示す変数を含む方程式の樹立
ターゲット核酸配列に対して、それぞれの検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む、下記のＮ個の方程式が提供される；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋・・・・・＋ＳＴＮＤ１＝ＳＤ１  （１）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋・・・・・＋ＳＴＮＤ２＝ＳＤ２  （２）
・                                      ・
・                                      ・
・                                      ・
ＳＴ１ＤＮ＋ＳＴ２ＤＮ＋・・・・・＋ＳＴＮＤＮ＝ＳＤＮ  （Ｎ）
前記式において、（ＳＤ１）ないし（ＳＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度でそれぞれのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、Ｎ２個である。
【０２９４】
前記数学方程式において、水平の点線“・・・・・”は、変数を示し、その個数は、Ｎの数に依存的である。例えば、Ｎが、３である場合、前記水平の点線によって表示される追加変数はない。Ｎが、４である場合、前記水平の点線によって表示される（Ｎ−３）個の追加変数が存在する。また、垂直の点線“・・・・・”は、方程式を示し、その個数は、Ｎの数に依存的である。例えば、Ｎが、３である場合、前記垂直の点線によって表示される追加方程式はない。Ｎが、４である場合、前記垂直の点線によって表示される（Ｎ−３）個の追加方程式が存在する。
【０２９５】
Ｎが、２である場合、方程式セットは、下記のように提示される：
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１  （１）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２  （２）
【０２９６】
第１検出温度（Ｄ１）から検出されたシグナルである（ＳＤ１）は、第１検出温度（Ｄ１）でＮ個のターゲット核酸配列に対するＮ個のシグナル−発生手段によって発生するＮ個の関心シグナルからなる。すなわち、第１検出温度から検出されたシグナルである（ＳＤ１）は、第１検出温度で第１ターゲット核酸配列に対する第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルである（ＳＴ１Ｄ１）ないし第１検出温度でＮ番目のターゲット核酸配列に対するＮ番目のシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルである（ＳＴＮＤ１）からなる。
【０２９７】
他の検出温度に対する方程式は、第１検出温度に対して、前記のように解釈されうる。
【０２９８】
例えば、Ｎ番目の検出温度（ＤＮ）から検出されたシグナルである（ＳＤＮ）は、Ｎ番目の検出温度（ＤＮ）でＮ個のターゲット核酸配列に対するＮ個のシグナル−発生手段によって発生するＮ個の関心シグナルからなる。Ｎ番目の検出温度から検出されたシグナルである（ＳＤＮ）は、Ｎ番目の検出温度で第１ターゲット核酸配列に対する第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルである（ＳＴ１ＤＮ）ないしＮ番目の検出温度でＮ番目のターゲット核酸配列に対するＮ番目のシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルである（ＳＴＮＤＮ）からなる。
【０２９９】
（ＳＤ１）ないし（ＳＤＮ）は、検出器によって測定されたシグナル、すなわち、整数値であり得る。（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）は、収得される未知の変数である。本発明は、測定されたシグナル（ＳＤ１）ないし（ＳＤＮ）を使用して変数（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）のうち少なくとも１つに対する解を得る方法に関するものである。
【０３００】
具体例で、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列が、Ｔ１、Ｔ２及びＴ３を含み、Ｎ個の検出温度が、６０℃、７２℃及び９５℃を含む場合、ターゲット核酸配列に対して、それぞれの検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記のＮ個の方程式が提供されうる：
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋ＳＴ３Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋ＳＴ３Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ３＋ＳＴ２Ｄ３＋ＳＴ３Ｄ３＝ＳＤ３
【０３０１】
段階（ｃ）：追加方程式の樹立
次いで、変数（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）からなる群から選択される少なくとも１つの変数をそれぞれ含む、（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式が提供される。
【０３０２】
方程式（１）ないし（Ｎ）を立てた後、（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式を樹立し、前記追加方程式は、数学的処理によって方程式（１）ないし（Ｎ）で変数のうち少なくとも１つ（特に、変数のうち少なくとも２つ、より特に、変数のうち少なくとも３つ、さらに特に、変数のうち少なくとも４つ、さらに特に、変数のうち少なくとも５つ）に対する解を得るために提供される。
【０３０３】
数学的に、段階（ｂ）及び（ｃ）から提供されたＮ２個の方程式は、変数のうち少なくとも１つに対する解を提供することができる。
【０３０４】
例えば、追加方程式が、方程式（１）ないし（Ｎ）が同じ変数セットを有させる場合（すなわち、方程式（１）ないし（Ｎ）が連立方程式に変換される場合）、前記連立方程式（特に、Ｎ個の変数を有する線形連立方程式）を解くことによって、方程式（１）ないし（Ｎ）で変数のうち少なくとも１つに対する解が得られる。選択的に、前記連立方程式−解析法と異なる方式で方程式（１）ないし（Ｎ）で変数のうち少なくとも１つに対する解が得られる。
【０３０５】
一具現例によれば、（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式は、下記の方程式からなる群から選択される：
ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）＝ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）  （Ｘ）、及び
ＳＴｊＤＫ＝任意選択値  （ＸＩ）
Ｔｊでのｊは、１からＮ番目の整数までのあらゆる整数を示し；それぞれのｊ番目のターゲット核酸配列に対して、α及びβは、共に１〜Ｎから選択される２つの整数の組合せを示し；前記組合せの数は、ＮＣ２に表示され；それぞれのｊ番目のターゲット核酸に対して、Ｋは、１〜Ｎから選択される整数のうち少なくとも１つであり；ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でｊ番目のシグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化を反映する関係を示すｊ番目のターゲット核酸配列（Ｔｊ）の基準値（ＲＶ）であり；ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）は、ＳＴｊＤα及びＳＴｊＤβの関数を示し；
方程式（ＸＩ）において、ＳＴｊＤＫ＝任意選択値は、ｊ番目のシグナル−発生手段がｊ番目のターゲット核酸配列の存在時にも、Ｋ番目の検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合に選択され；
方程式（ＸＩ）が、追加方程式として選択される場合、他の追加方程式は、ｊ番目のシグナル−発生手段に対するαまたはβがｊ番目のシグナル−発生手段に対するＫと異なる方程式（Ｘ）から選択される。
【０３０６】
一具現例によれば、ゼロ（０）が、ＳＴｊＤＫとして使われる（ＳＴｊＤＫ＝０）ということが、本発明の実施側面で便利である。選択的に、負の整数または正の整数が、ＳＴｊＤＫとして使われる（ＳＴｊＤＫ＝負の整数またはＳＴｊＤＫ＝正の整数）。
【０３０７】
ｊ番目のターゲット核酸配列（Ｔｊ）が存在する場合、ＳＴｊＤα及びＳＴｊＤβは、α番目の検出温度（Ｄα）及びβ番目の検出温度（Ｄβ）でｊ番目のシグナル−発生手段によって提供されるシグナルをそれぞれ示す。
【０３０８】
方程式（Ｘ）は、複数の方程式を単一一般方程式として記述するために提供される。
【０３０９】
数学方程式（Ｘ）において、Ｔｊでのｊは、１からＮ番目の整数までのあらゆる整数を示し、α及びβは、共に１〜Ｎから選択される２つの整数の組合せを示す。α及びβと関連して、用語“組合せ”は、１つの集団（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から項目を選択する方式を意味する数学的組合せであり、選択順序は重要ではない。α及びβの組合せは、Ｎ個の検出温度のうちの２つの組合せを意味する。α及びβの組合せ数は、ＮＣ２に表示される。
【０３１０】
一具現例によれば、ターゲット核酸配列が、Ｎ個である場合、方程式（Ｘ）は、“Ｎｘ［ＮＣ２］”個の方程式を記述することができる。
【０３１１】
例えば、Ｎが、３である場合、ｊは、１、２及び３を含み、α及びβの組合せは、（１、２）、（１、３）及び（２、３）を含む。この場合、方程式（Ｘ）は、９つの方程式を記述する。
【０３１２】
例えば、“ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）＝ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）”は、下記を含みうる：
（ｉ）ｊ＝１である場合；
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）、
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ３）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ３）、
ｆ（ＳＴ１Ｄ２、ＳＴ１Ｄ３）＝ＲＶＴ１（Ｄ２Ｄ３）、
（ｉｉ）ｊ＝２である場合；
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）、
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ３）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ３）、
ｆ（ＳＴ２Ｄ２、ＳＴ２Ｄ３）＝ＲＶＴ２（Ｄ２Ｄ３）、
（ｉｉ）ｊ＝３である場合
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ２）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ２）、
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ３）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ３）、及び
ｆ（ＳＴ３Ｄ２、ＳＴ３Ｄ３）＝ＲＶＴ３（Ｄ２Ｄ３）。
【０３１３】
一具現例によれば、（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式が、方程式（Ｘ）から選択される場合、これらは、（Ｎ−１）個の方程式がそれぞれのｊに対する方程式群から選択されるように選択されうる。
【０３１４】
より特に、このような（Ｎ−１）個の方程式の選択は、それぞれのｊに対して選択された（Ｎ−１）個の方程式が方程式（１）ないし（Ｎ）によって変数のうち少なくとも１つに対する解を得るために、Ｎ個の変数を有する連立方程式を提供するように実施される。
【０３１５】
Ｎが、３であり、検出温度Ｄ１でのシグナルが分析される特定の例で、それぞれのｊに対して２つの方程式（すなわち、Ｎ−１＝３−１＝２）が、３つの提示可能な方程式のうちから選択される。前記９つの方程式から選択された６つの追加方程式は、下記の通りである：
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ３）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ３）
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ３）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ３）
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ２）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ２）
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ３）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ３）
【０３１６】
特に、（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式は、方程式（Ｘ）に表示された方程式群から選択された方程式を含む。
【０３１７】
一具現例によれば、（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式のうち一部は、下記の方程式群から選択されうる：
ＳＴｊＤＫ＝任意選択値（ＸＩ）
【０３１８】
ｊ番目のシグナル−提供手段がｊ番目のターゲット核酸配列の存在時にも、Ｋ番目の検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合、ＳＴｊＤＫが、任意選択値を有させる方程式が提供される。
【０３１９】
一具現例によれば、シグナルは、ｊ番目のシグナル−発生手段の特徴を調節することによって、複数の検出温度で発生しないこともある。
【０３２０】
方程式（ＸＩ）は、複数の方程式を単一一般方程式で記述するために提供される。
【０３２１】
検出温度が、Ｎ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対するシグナルを発生させないように選択される場合、前記検出温度でターゲット核酸配列に対するシグナルが任意選択値を有させる方程式が提供される。前記方程式は、方程式（ＸＩ）に表示される。
【０３２２】
例えば、ターゲット核酸配列が、Ｎ個（すなわち、Ｎ＝３）であり、第１ターゲット核酸配列に対する第１シグナル−発生手段が第２検出温度及び第３検出温度でシグナルを発生させないように設計され、第２ターゲット核酸配列に対する第２シグナル−発生手段が第３検出温度でシグナルを発生させないように設計される場合、方程式（ＸＩ）“ＳＴｊＤＫ＝任意選択値”は、ＳＴ１Ｄ２＝任意選択値、ＳＴ１Ｄ３＝任意選択値、及びＳＴ２Ｄ３＝任意選択値を含む。前記３つの方程式のうち、全部または一部が選択されうる。
【０３２３】
一具現例によれば、追加方程式は、方程式（ＸＩ）に表示される方程式群から選択される方程式だけではなく、方程式（Ｘ）に表示される方程式群から選択される方程式を含む。
【０３２４】
前述した具現例は、方程式（１）ないし（Ｎ）での変数のうち少なくとも１つに対する解を得るための２つの接近法を説明する。
【０３２５】
第１接近法は、（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式として方程式（Ｘ）を使用することである。
【０３２６】
方程式（Ｘ）において、基準値としてＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、既定の値である。
【０３２７】
前記基準値は、２つの検出温度でシグナル−発生手段によって提供されるシグナルの数学的処理を通じて得られる。このような数学的処理は、シグナルの関数である。基準値を得るのに使われる関数は、前記関数が２つの検出温度でシグナル−発生手段によって提供されるシグナル変化の関係を提供する限り、任意の関数を含む。例えば、前記関数は、シグナルの加算、乗算、減算及び除算のような数学的処理として提供されうる。
【０３２８】
前述したように、基準値としてＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、既定の値であるために、ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、方程式（１）ないし（Ｎ）で変数（ＳＴｊＤ１）ないし（ＳＴｊＤＮ）を変数（ＳＴｊＤ１）ないし（ＳＴｊＤＮ）から選択される１つの変数に変換するための変換子の役割を果たせる。
【０３２９】
一具現例によれば、ｊ番目のターゲット核酸配列（Ｔｊ）の基準値（ＲＶ）を含む方程式（Ｘ）は、方程式（１）ないし（Ｎ）で変数（ＳＴｊＤ１）ないし（ＳＴｊＤＮ）を変数（ＳＴｊＤ１）ないし（ＳＴｊＤＮ）から選択される１つの変数への変換に使われる。
【０３３０】
本発明で使われる基準値ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、多様な方式で得られる。例えば、基準値は、予想値として与えられうる。ターゲット配列、シグナル−発生手段及び検出温度を考慮して、検出温度でのシグナル変化の関係を示す基準値を予想することができる。選択的に、基準値は、基準値を得る実験を実施することによって、実験的な値または実際的な値として与えられうる。
【０３３１】
一具現例によれば、ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、（ｉ−１）ｊ番目のターゲット核酸配列をｊ番目のターゲット核酸配列の検出のためのｊ番目のシグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉ−２）α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でシグナルを検出し、（ｉ−３）次いで、前記α番目の検出温度から検出されたシグナル及び前記β番目の検出温度から検出されたシグナル間の差を得ることで収得される。
【０３３２】
用語“α番目の検出温度及びβ番目の検出温度から検出されたシグナル間の差”は、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でのシグナル変化の関係の一具現例である。
【０３３３】
一具現例によれば、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度から検出されたシグナル間の差は、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度から検出されたシグナルを数学的に処理することで得られる差を含む。
【０３３４】
一具現例によれば、数学的処理が行われる場合、シグナルの特徴は、数学的処理が容易ではなければならない。特定の具現例で、数学的処理は、シグナルを使用した計算（例えば、加算、乗算、減算及び除算）またはシグナルから由来の他の値を収得することを含む。
【０３３５】
α番目の検出温度及びβ番目の検出温度から検出されたシグナル間の差は、数値、またはシグナル特徴を有するプロットとして表現される。
【０３３６】
差を収得するためのシグナルの数学的処理は、多様な計算方法及びこれらの変形によって実施される。
【０３３７】
特に、差を収得するためのシグナルの数学的処理は、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でのシグナル間の比率を計算することで実施される。
【０３３８】
例えば、β番目の検出温度から検出されたシグナルのエンドポイント強度（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）対α番目の検出温度から検出されたシグナルのエンドポイント強度の比率が基準値として使われる。
【０３３９】
差を収得するための数学的処理は、多様な方式で行われる。数学的処理は、機械を使用して実施される。例えば、シグナルは、検出器またはリアルタイムＰＣＲ装置内のプロセッサによって数学的に処理されうる。選択的に、シグナルは、特に、既定のアルゴリズムによって手作業で数学的に処理されうる。
【０３４０】
本発明の一具現例によれば、Ｎ個の検出温度でＮ個のターゲット核酸配列に対するＲＶは、互いに異なる。
【０３４１】
特に、同じ２つの検出温度間のシグナルを使用して計算された異なるターゲット核酸配列に係わる基準値は、異なる。例えば、３つのターゲット核酸配列が存在する場合、ＲＶＴ１（ＤαＤβ）、ＲＶＴ２（ＤαＤβ）及びＲＶＴ３（ＤαＤβ）は、互いに異なる。一具現例によれば、シグナル発生手段は、異なるターゲット核酸配列に対して異なる基準値を提供するように使われる。
【０３４２】
ＲＶ値が互いに異なる場合、差の程度を記述する定量的表現は、ＲＶ値を計算する接近法によって変わりうる。
【０３４３】
一具現例によれば、基準値を収得するためのシグナルは、共通の計算方法によって処理されて、比較のための基準値を提供し、以後、前記比較のための基準値を使用して２つの基準値間の差の程度を収得することができる。一具現例によれば、共通の計算方法は、２つのシグナルの除算である。
【０３４４】
例えば、本方法の方法によってシグナルの分析に使われる基準値を収得するために、２つのシグナルが減算によって処理される場合、前記２つのシグナルは、比較のための基準値を収得するために、除算によって処理されうる。
【０３４５】
一具現例によれば、１つの基準値は、他の基準値よりも少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．５倍、１．７倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、または１０倍さらに大きい。
【０３４６】
一具現例によれば、本発明で使われる基準値のうち一部は、互いに同一であり得る。
【０３４７】
本発明の一具現例によれば、基準値のためのシグナル−発生手段は、ターゲット核酸配列の検出のためのシグナル−発生手段と同一であり得る。
【０３４８】
一具現例によれば、基準値を収得するためのインキュベーション条件は、サンプルの分析のためのインキュベーション条件と同一である。
【０３４９】
ターゲット核酸配列に対して、基準値は、成分（例えば、ターゲット核酸配列、シグナル−発生手段、酵素、またはｄＮＴＰ）の量、バッファｐＨまたは反応時間を含む多様な反応条件で収得されうる。本発明の一具現例によれば、基準値は、反応完了時に飽和シグナルの提供には十分な反応条件下で収得されうる。本発明の一具現例によれば、基準値収得時に得られたシグナル間の差は、特定の範囲を有し、基準値は、前記特定の範囲内で、または前記特定の範囲を参照して選択される。本発明の一具現例によれば、基準値は、前記特定の範囲の最大値または最小値で選択されうるか、または前記特定の範囲の最大値または最小値を参照して選択されうる。特に、基準値は、多様な条件から収得された基準値の標準偏差、許容誤差範囲、特異度、または敏感度を考慮して変形されうる。
【０３５０】
“ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）＝ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）”でｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）は、ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）を計算するための数学的表現として提供されうる。
【０３５１】
一具現例によれば、ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）＝ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、ＳＴｊＤα／ＳＴｊＤβ＝ＲＶＴｊＤα／Ｄβ  （ＸＩＩ）またはＳＴｊＤβ／ＳＴｊＤα＝ＲＶＴｊＤβ／Ｄα  （ＸＩＩＩ）を含む。
【０３５２】
ＲＶが、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でのシグナル間の比率を使用して収得される場合、“ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）＝ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）”でｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）は、ＳＴｊＤα及びＳＴｊＤβ間の比率を計算するための数学的表現として提供されうる。用語“ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）”で、Ｔｊ（ＤαＤβ）は、計算されたＲＶがα番目の検出温度（Ｄα）及びβ番目の検出温度（Ｄβ）でのシグナル間の差を計算することによって、収得されたｊ番目のターゲット核酸配列に係わる基準値に相応するということを示す。
【０３５３】
ＲＶ計算方法の決定時に、用語“Ｔｊ（ＤαＤβ）”は、前記計算方法を考慮して具体的に表現される。例えば、用語“ＲＶＴｊＤα／Ｄβ”は、α番目の検出温度から検出されたシグナル対β番目の検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することによって、収得されたｊ番目のターゲット核酸配列に係わる基準値を意味する。
【０３５４】
一具現例によれば、ＲＶＴｊＤα／Ｄβは、（ｉ−１）ｊ番目のターゲット核酸配列をｊ番目のターゲット核酸配列の検出のためのｊ番目のシグナル−発生手段と共にインキュベーションし、（ｉ−２）α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でシグナルを検出し、（ｉ−３）次いで、前記α番目の検出温度から検出されたシグナル対前記β番目の検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得され；ＲＶＴｊＤβ／Ｄαは、前記（ｉ−１）及び（ｉ−２）を実施した後、前記β番目の検出温度から検出されたシグナル対前記α番目の検出温度から検出されたシグナルの比率を計算することで収得される。
【０３５５】
一具現例によれば、Ｎ２−Ｎ個の追加方程式は、下記の方程式群から選択される：
ＳＴｊＤα／ＳＴｊＤβ＝ＲＶＴｊＤα／Ｄβ  （ＸＩＩ）
ＳＴｊＤβ／ＳＴｊＤα＝ＲＶＴｊＤβ／Ｄα  （ＸＩＩＩ）
【０３５６】
前記式において、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でそれぞれのｊ番目のターゲット核酸に対する方程式は、前記方程式（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）から選択される。特に、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でそれぞれのｊ番目のターゲット核酸に対する方程式は、方程式（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）のうち１つから選択される。
【０３５７】
方程式（１）ないし（Ｎ）と共に方程式（Ｘ）に表示される方程式群から選択される追加方程式（ら）は、変数のうち少なくとも１つに対する解を得るために使われる。
【０３５８】
具体例（Ｎ＝３）で、方程式（ＸＩＩ）または（ＸＩＩＩ）は、下記のように提供される：
（ｉ）ｊ＝１である場合；
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）は、下記を含み：
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２またはＳＴ１Ｄ２／ＳＴ１Ｄ１＝ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ３）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ３）は、下記を含み：
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ３＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３またはＳＴ１Ｄ３／ＳＴ１Ｄ１＝ＲＶＴ１Ｄ３／Ｄ１
ｆ（ＳＴ１Ｄ２、ＳＴ１Ｄ３）＝ＲＶＴ１（Ｄ２Ｄ３）は、下記を含み：
ＳＴ１Ｄ２／ＳＴ１Ｄ３＝ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ３またはＳＴ１Ｄ３／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ３／Ｄ２
（ｉｉ）ｊ＝２である場合；
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、下記を含み：
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２またはＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ３）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ３）は、下記を含み：
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ１Ｄ３＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３またはＳＴ２Ｄ３／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ３／Ｄ１
ｆ（ＳＴ２Ｄ２、ＳＴ２Ｄ３）＝ＲＶＴ２（Ｄ２Ｄ３）は、下記を含み：
ＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ３＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ３またはＳＴ２Ｄ３／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ３／Ｄ２
（ｉｉ）ｊ＝３である場合
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ２）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ２）は、下記を含み：
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ２＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２またはＳＴ３Ｄ２／ＳＴ３Ｄ１＝ＲＶＴ３Ｄ２／Ｄ１
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ３）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ３）は、下記を含み：
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ３＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３またはＳＴ３Ｄ３／ＳＴ３Ｄ１＝ＲＶＴ３Ｄ３／Ｄ１
ｆ（ＳＴ３Ｄ２、ＳＴ３Ｄ３）＝ＲＶＴ３（Ｄ２Ｄ３）は、下記を含みうる：
ＳＴ３Ｄ２／ＳＴ３Ｄ３＝ＲＶＴ３Ｄ２／Ｄ３またはＳＴ３Ｄ３／ＳＴ３Ｄ２＝ＲＶＴ３Ｄ３／Ｄ２
【０３５９】
一具現例によれば、選択された２つの検出温度で特定のターゲット核酸配列に対するＲＶ計算のために、複数の方程式が提供されうる。一具現例によれば、そのような場合、複数の方程式のうちから単一方程式が選択される。例えば、ｊ＝１（すなわち、Ｔ１）であり、２つの検出温度が、６０℃（Ｄ１）及び７２℃（Ｄ２）である場合、“ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）”は、ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２及びＳＴ１Ｄ２／ＳＴ１Ｄ１＝ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１を含みうる。前記２つの特定の方程式のうち、単一方程式がターゲット核酸配列（Ｔ１）に対するＲＶ計算に使われる。
【０３６０】
検出温度Ｄ１でのシグナルが分析される場合、前述した方程式から選択された６つの追加方程式は、下記のように選択されうる：
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２（または、ＳＴ１Ｄ２／ＳＴ１Ｄ１＝ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ１）
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ３＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３（または、ＳＴ１Ｄ３／ＳＴ１Ｄ１＝ＲＶＴ１Ｄ３／Ｄ１）
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２（または、ＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ１）
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ３＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３（または、ＳＴ２Ｄ３／ＳＴ２Ｄ１＝ＲＶＴ２Ｄ３／Ｄ１）
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ２＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２（または、ＳＴ３Ｄ２／ＳＴ３Ｄ１＝ＲＶＴ３Ｄ２／Ｄ１）
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ３＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３（または、ＳＴ３Ｄ３／ＳＴ３Ｄ１＝ＲＶＴ３Ｄ３／Ｄ１）
【０３６１】
最終的に、変数に対する解を得るための方程式セットは、下記を含みうる：
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋ＳＴ３Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋ＳＴ３Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ３＋ＳＴ２Ｄ３＋ＳＴ３Ｄ３＝ＳＤ３
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ３＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ３＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ２＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ３＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３
【０３６２】
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２、ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３、ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２、ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３、ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２、及びＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３は、実験的に既定の値であるために、変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ３Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）、（ＳＴ２Ｄ２）、（ＳＴ３Ｄ２）、（ＳＴ１Ｄ３）、（ＳＴ２Ｄ３）、及び（ＳＴ３Ｄ３）に対する解は、前記９つの方程式によって収得されうる。
【０３６３】
方程式（１）ないし（Ｎ）での変数のうち少なくとも１つに対する解を得るための第２接近法は、（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式として方程式（Ｘ）及び（ＸＩ）を使用することである。方程式（ＸＩ）において、ＳＴｊＤＫ＝任意選択値は、ｊ番目のシグナル−発生手段がｊ番目のターゲット核酸配列の存在時にも、Ｋ番目の検出温度で実質的にシグナルを発生させないように製造される場合に選択されうる。
【０３６４】
一具現例によれば、方程式（ＸＩ）が、追加方程式として選択される場合、他の追加方程式は、ｊ番目のターゲット核酸配列に対するαまたはβがｊ番目のターゲット核酸配列に対するＫと異なる方程式（Ｘ）から選択される。
【０３６５】
すなわち、追加方程式として、少なくとも１つの方程式が方程式（ＸＩ）に表示される方程式群から選択される場合、ｊ番目のターゲット核酸配列に対するαまたはβがｊ番目のターゲット核酸配列に対するＫと同じ方程式（Ｘ）に表示される方程式群の一部が他の追加方程式から排除され、他の追加方程式は、前記排除されたものを除き、方程式（Ｘ）から選択される。
【０３６６】
したがって、本願に使われた文言“方程式（ＸＩ）が、追加方程式として選択される場合、他の追加方程式は、ｊ番目のターゲット核酸配列に対するαまたはβがｊ番目のターゲット核酸配列に対するＫと異なる方程式（Ｘ）から選択される”は、“方程式（ＸＩ）が追加方程式として選択される場合、他の追加方程式は、ｊ番目のターゲット核酸配列に対するαまたはβがｊ番目のターゲット核酸配列に対するＫと同じ方程式を除いた方程式（Ｘ）から選択される”にも記述されうる。
【０３６７】
３つのターゲット核酸配列が分析され（すなわち、Ｎ＝３及びｊは、１、２及び３を含む）、ターゲット核酸配列（Ｔ１）に対するシグナル発生手段がＴ１の存在時にも、７２℃（Ｄ２）及び９５℃（Ｄ３）の検出温度で実質的にシグナルを発生させないように製造され、ターゲット核酸配列（Ｔ２）に対するシグナル発生手段がＴ２の存在時にも、９５℃の検出温度（Ｄ３）で実質的にシグナルを発生させないように製造される特定の例（図３Ａ参照）で、方程式（ＸＩ）は、下記の方程式を含みうる：
ＳＴ１Ｄ２＝０（ｊ＝１及びＫ＝２）、
ＳＴ１Ｄ３＝０（ｊ＝１及びＫ＝３）、及び
ＳＴ２Ｄ３＝０（ｊ＝２及びＫ＝３）。
【０３６８】
一方、方程式（Ｘ）“ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）＝ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）”は、下記を含みうる：
（ｉ）ｊ＝１である場合；
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）、
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ３）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ３）、
ｆ（ＳＴ１Ｄ２、ＳＴ１Ｄ３）＝ＲＶＴ１（Ｄ２Ｄ３）、
（ｉｉ）ｊ＝２である場合；
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）、
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ３）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ３）、
ｆ（ＳＴ２Ｄ２、ＳＴ２Ｄ３）＝ＲＶＴ２（Ｄ２Ｄ３）、
（ｉｉ）ｊ＝３である場合
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ２）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ２）、
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ３）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ３）、及び
ｆ（ＳＴ３Ｄ２、ＳＴ３Ｄ３）＝ＲＶＴ３（Ｄ２Ｄ３）。
【０３６９】
“ＳＴ２Ｄ３＝０（ｊ＝２及びＫ＝３）”が、追加方程式のうち１つとして使われる場合、他の追加方程式は、方程式（Ｘ）（ｊ＝１）のうち、２つの方程式、すなわち、方程式（Ｘ）（ｊ＝３）のうち、２つの方程式、及び方程式（Ｘ）（ｊ＝２）のうち、１つの方程式を含みうる。特定の具現例で、このような方程式の選択に対して、ターゲット核酸配列（ｊ＝２、すなわち、Ｔ２）に対するαまたはβがターゲット核酸配列（ｊ＝２、すなわち、Ｔ２）に対するＫと同じ方程式は排除される。すなわち、“ｆ（ＳＴ２Ｄα、ＳＴ２Ｄβ）＝ＲＶＴ２（ＤαＤβ）”のうち、Ｄ３検出温度を含む方程式は排除される。
【０３７０】
検出温度６０℃（Ｄ１）でのシグナルが分析される場合、Ｄ１を含む変数を含む方程式は、下記のように選択されうる：
ＳＴ２Ｄ３＝０
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）
ｆ（ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ１Ｄ３）＝ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ３）
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ２）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ２）
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ３）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ３）
【０３７１】
“ＳＴ２Ｄ３＝０（ｊ＝２及びＫ＝３）“を使用する代わりに、ＳＴ１Ｄ２＝０（ｊ＝１及びＫ＝２）及びＳＴ１Ｄ３＝０（ｊ＝１及びＫ＝３）が、２つの追加方程式として使われる。他の追加方程式は、方程式（Ｘ）（ｊ＝２）のうち、２つの方程式、及び方程式（Ｘ）（ｊ＝３）のうち、２つの方程式を含みうる。特定の具現例で、このような方程式の選択に対して、ターゲット核酸配列（ｊ＝１、すなわち、Ｔ１）に対するαまたはβがターゲット核酸配列（ｊ＝１、すなわち、Ｔ１）に対するＫ（すなわち、２または３）と同じ方程式は排除される。すなわち、“ｆ（ＳＴ１Ｄα、ＳＴ１Ｄβ）＝ＲＶＴ１（ＤαＤβ）”のうち、検出温度としてＤ２またはＤ３を含む方程式は排除される。検出温度６０℃（Ｄ１）でのシグナルを分析する場合、Ｄ１を含む変数を含む方程式は、下記のように選択されうる：
ＳＴ１Ｄ２＝０
ＳＴ１Ｄ３＝０
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）
ｆ（ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ３）＝ＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ３）
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ２）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ２）
ｆ（ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ３）＝ＲＶＴ３（Ｄ１Ｄ３）
【０３７２】
一具現例によれば、Ｎ２−Ｎ個の追加方程式は、下記の方程式群から選択される：
ＳＴｊＤα／ＳＴｊＤβ＝ＲＶＴｊＤα／Ｄβ（ＸＩＩ）
ＳＴｊＤβ／ＳＴｊＤα＝ＲＶＴｊＤβ／Ｄα（ＸＩＩＩ）
ＳＴｊＤＫ＝任意選択値（ＸＩ）
前記式において、α番目の検出温度及びβ番目の検出温度でそれぞれのｊ番目のターゲット核酸に対する方程式は、前記方程式（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）から選択され；
前記方程式（ＸＩ）が、追加方程式として選択される場合、他の追加方程式は、ｊ番目のターゲット核酸配列に対するαまたはβがｊ番目のターゲット核酸配列に対するＫと異なる方程式（ＸＩＩ）及び（ＸＩＩＩ）から選択される。
【０３７３】
具体例として、３つのターゲット核酸配列が分析され（すなわち、Ｎ＝３であり、ｊは、１、２及び３を含む）、ターゲット核酸配列（Ｔ１）に対するシグナル発生手段がＴ１の存在時にも、７２℃（Ｄ２）及び９５℃（Ｄ３）の検出温度で実質的にシグナルを発生させないように製造され、ターゲット核酸配列（Ｔ２）に対するシグナル発生手段がＴ２の存在時にも、９５℃の検出温度（Ｄ３）で実質的にシグナルを発生させないように製造される特定の例（図３Ａ参照）で、変数に対する解を得るのに利用可能な多様な方程式セットがある。
【０３７４】
“ＳＴ２Ｄ３＝０（ｊ＝２及びＫ＝３）”が、１つの追加方程式として使われる場合、変数に対する解を得るための方程式セットのうち１つは、下記を含みうる：
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋ＳＴ３Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋ＳＴ３Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ３＋ＳＴ２Ｄ３＋ＳＴ３Ｄ３＝ＳＤ３
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ３＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ２Ｄ３＝０
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ２＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ３＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３
【０３７５】
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２、ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３、ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２、ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２、及びＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３は、実験的に、または任意的に決定される整数であるために、変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ３Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）、（ＳＴ２Ｄ２）、（ＳＴ３Ｄ２）、（ＳＴ１Ｄ３）、及び（ＳＴ３Ｄ３）に対する解は、前記９つの方程式によって収得されうる。
【０３７６】
“ＳＴ２Ｄ３＝０（ｊ＝２及びＫ＝３）”を使用する代わりに、ＳＴ１Ｄ２＝０（ｊ＝１及びＫ＝２）及びＳＴ１Ｄ３＝０（ｊ＝１及びＫ＝３）が、２つの追加方程式として使われる。変数に対する解を収得するための方程式セットのうち１つは、下記を含みうる：
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋ＳＴ３Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋ＳＴ３Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ３＋ＳＴ２Ｄ３＋ＳＴ３Ｄ３＝ＳＤ３
ＳＴ１Ｄ２＝０
ＳＴ１Ｄ３＝０
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ３＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ２＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ３＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３
【０３７７】
ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２、ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３、ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２、及びＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３は、実験的に、または任意的に決定される整数であるために、変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ３Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ２）、（ＳＴ３Ｄ２）、（ＳＴ２Ｄ３）、及び（ＳＴ３Ｄ３）に対する解は、前記９つの方程式によって収得されうる。
【０３７８】
一具現例によれば、ｊ番目のシグナル−発生手段がｊ番目のターゲット核酸配列の存在時にも、Ｋ番目の検出温度でシグナルを発生させないように製造されても、方程式“ＳＴｊＤＫ＝任意選択値”が、追加方程式として使われないこともある。このような場合、αまたはβがＫと同じＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、実験的に収得された値であり得る。
【０３７９】
一具現例によれば、ｊ番目のシグナル−発生手段がｊ番目のターゲット核酸配列の存在時にも、Ｋ番目の検出温度でシグナルを発生させないように製造される場合、αまたはβがＫと同じＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、任意選択値である。
【０３８０】
特に、方程式（Ｘ）において、ｆ（ＳＴｊＤα、ＳＴｊＤβ）が、α番目の検出温度（Ｄα）及びβ番目の検出温度（Ｄβ）でのシグナル間の比率を計算するための数学的表現によって提供される場合、ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、任意選択値として選択されうる。
【０３８１】
特に、ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）として任意選択値は、ＳＴｊＤＫの解が方程式セットの解析過程で或る値またはその値の周囲の値（例えば、“０”または“０”周囲）になるように選択されうる。
【０３８２】
一具現例によれば、ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）として任意選択値は、実際的に収得されたシグナル値を用いて計算されたＲＶＴｊ（ＤαＤβ）と同一であるか、大きいまたは小さい。
【０３８３】
実際的に、ｊ番目のシグナル−発生手段がｊ番目のターゲット核酸配列の存在時にも、Ｋ番目の検出温度でシグナルを発生させないように製造されても、非常に弱い強度を有するシグナル（例えば、バックグラウンドシグナル）を発生させることが一般的である。したがって、αまたはβがＫと同じＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、実験的に収得されうる。
【０３８４】
本発明の方法が、シグナル−発生手段のそれぞれによって発生するシグナル量（例えば、シグナル強度）の定量を可能にするということは非常に面白いことである。前述したように、変数（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）に対する解は、シグナル−発生手段のそれぞれによって発生するシグナルの量（例えば、シグナル強度）の定量を可能にし、これは、ターゲット核酸配列の定量に適用可能である。
【０３８５】
段階（ｄ）：変数に対する解の収得
最終的に、Ｎ個のターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び（ｃ）から提供されたＮ２個の方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解を得る。
【０３８６】
前述したように、段階（ｂ）及び（ｃ）から提供されたＮ２個の方程式は、Ｎ個のターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために使われ、これにより、Ｎ個のターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに対する存在を決定することができる。
【０３８７】
特に、変数のうち少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも９つ、少なくとも１６つ、少なくとも２５つ、または少なくともＮ２個）に対する解は、ターゲット核酸配列のうち少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ及び少なくとも１０つ、または少なくともＮ個）に割り当てられた関心シグナルのうち少なくとも１つ（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも９つ、少なくとも１６つ、少なくとも２５つ、または少なくともＮ２個）を区別するために、段階（ｂ）及び（ｃ）から提供されたＮ２個の方程式を使用して得られる。
【０３８８】
一具現例によれば、本方法は、各ターゲット核酸配列に対する変数群からそれぞれ選択されるＮ個の変数に対する解（値）を得るために使われる。
【０３８９】
一具現例によれば、シグナルを発生させる方式によって、変数に対して得た解が有意であるか否かを分析するために、閾値が用いられうる。陰性対照群、敏感度及び使われた標識が、閾値の決定に考慮されうる。本発明の一具現例によれば、閾値は、ユーザによって、または自動で決定されうる。
【０３９０】
一具現例によれば、閾値は、検出温度でターゲット核酸配列のうち、１つのみを使用して検出されたシグナルを参照して決定される。
【０３９１】
一具現例によれば、閾値は、それぞれのターゲット核酸配列またはそれぞれの検出温度に対して特定的に使われる。
【０３９２】
一具現例によれば、シグナルが、ＰＣＲによるターゲット増幅と関連したリアルタイム方式で発生する場合、それぞれの増幅サイクルまたは一部選択されたサイクルでのシグナルは、基準値を用いて数学的に処理され、計算結果がサイクルに対してプロッティングされ、関心シグナルの区別（例えば、ターゲット核酸配列の存在決定）に使われる。
【０３９３】
一具現例によれば、閾値は、関心シグナルの有意性を決定するために、プロッティング結果に適用される。
【０３９４】
本発明の一具現例によれば、ターゲット核酸配列は、変異を含む。
【０３９５】
本願に使われた用語“ヌクレオチド変異”は、配列が類似した連続したＤＮＡセグメントのうち、特定位置のＤＮＡ配列での任意の単一または複数のヌクレオチド置換、欠失または挿入を意味する。このような連続したＤＮＡセグメントは、１つの遺伝子または１つの染色体の任意の他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異または多型対立遺伝子変異であり得る。例えば、本発明から検出されたヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）、突然変異、欠失、挿入、置換、及び転座を含む。例示されたヌクレオチド変異は、ヒトゲノム内の多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素）遺伝子での変異）、病原体の薬剤耐性と関連した変異及び腫瘍形成誘発変異を含む。本願に使われた用語“ヌクレオチド変異”は、核酸配列の特定位置での任意の変異を含む。すなわち、用語“ヌクレオチド変異”は、核酸配列の特定位置での野生型及びその任意の突然変異型を含む。
【０３９６】
本発明の一具現例によれば、本発明から検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）である。
【０３９７】
ＩＩＩ．ターゲット核酸配列に対する関心シグナルを区別するためのキット
本発明のさらに他の態様において、下記を含む、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別するためのキットが提供される：
（ａ）前記第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）の検出のための第１シグナル−発生手段及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）の検出のための第２シグナル−発生手段の前記２つのターゲット核酸配列の検出のための２つのシグナル発生手段；及び
（ｂ）２つのターゲット核酸配列に対する関心シグナルの区別という題目の態様Ｉの本発明の方法を記載した説明書。
【０３９８】
本発明のさらなる態様において、下記を含む、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別するためのキットが提供される：
（ａ）前記Ｎ個のターゲット核酸配列を検出するためのＮ個のシグナル−発生手段；及び
（ｂ）少なくとも３つのターゲット核酸配列に対する関心シグナルの区別という題目の態様ＩＩの本方法を記載した説明書。
【０３９９】
本発明のキットは、本発明の方法を実施するために製造されるので、両者間の共通説明は、本発明の複雑性をもたらす過度な重複を避けるために省略する。
【０４００】
前述した本発明のあらゆるキットは、バッファ、ＤＮＡ重合酵素補助因子、及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅反応（例えば、ＰＣＲ反応）の実施に必要な試薬を選択的に含みうる。選択的に、キットは、また多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファ及び試薬、及びＤＮＡ重合酵素活性を抑制する抗体を含みうる。また、キットは、陽性対照群及び陰性対照群の実施に必要な試薬を含みうる。特定反応で使われる試薬の最適量は、本開示事項の利点が分かっている当業者によって容易に決定されうる。キットの構成成分は、個別容器内に存在するか、複数の構成要素が、１つの容器内に存在することができる。
【０４０１】
本発明の方法を記載または実施するための説明書は、適した記録媒体に記録されうる。例えば、説明書は、紙及びプラスチックのような、基板上に印刷されうる。他の具現例で、説明書は、ＣＤ−ＲＯＭ及びディスケットのような適したコンピュータ読取り可能な記録媒体上に存在する電子保存データファイルとして存在することができる。さらに他の具現例で、キット内に実質的な説明書が含まれないこともあるが、遠隔ソースから、例えば、インターネットを通じて、説明書を得る手段が提供される。前記具現例の１種の例は、説明書を見られるか／あるいは説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。
【０４０２】
ＩＶ．ターゲット核酸配列に対する関心シグナルを区別するための記録媒体及び装置
下記の記載の本発明の記録媒体、装置及びコンピュータプログラムは、コンピュータで本発明の方法を実施するためのものなので、両者間の共通説明は、本明細書の複雑性をもたらす過度な重複を避けるために省略する。
【０４０３】
本発明のさらに他の態様において、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別するための方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体が提供され、前記方法は、下記の段階を含む：
（ａ）第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）から検出されるシグナルを受信する段階であって；前記サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）は、第１シグナル−発生手段によって検出され、第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）は、第２シグナル−発生手段によって検出され；前記２つのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルは、単一類型の検出器によって区別されず；
（ｂ）前記２つのターゲット核酸配列に対して、各検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記の２つの方程式を提供する段階；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１  （Ｉ）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２  （ＩＩ）
前記式において、（ＳＤ１）は、第１検出温度から検出されるシグナルであり、（ＳＤ２）は、第２検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）は、第１検出温度で第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ１）は、第１検出温度で第２シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ１Ｄ２）は、第２検出温度で第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ２）は、第２検出温度で第２シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、４つであり；
（ｃ）前記４つの変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）及び（ＳＴ２Ｄ２）からなる群から選択される少なくとも１つの変数をそれぞれ含む２つの追加方程式を提供する段階；及び
（ｄ）前記２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び段階（ｃ）から提供された４つの方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解を得る段階。
【０４０４】
本発明の一具現例によれば、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）だけではなく、追加方程式は、コンピュータ読取り可能な記録媒体に保存される。本発明の一具現例によれば、第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）の基準値（ＲＶ）としてＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）、及び／または第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）の基準値（ＲＶ）としてＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）は、コンピュータ読取り可能な記録媒体に保存される。
【０４０５】
本発明の一具現例によれば、コンピュータ読取り可能な記録媒体は、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）だけではなく、追加方程式を提供する指示を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータ読取り可能な記録媒体は、前記方法の実施するに当たって、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）及び／またはＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）を入力する指示を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータ読取り可能な記録媒体は、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）及び／またはＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）を収得するための方法を実行するプロセッサを具現する指示をさらに含む。
【０４０６】
本発明のさらに他の態様において、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別するための方法を実行するためのプロセッサを具現するコンピュータ読取り可能な記録媒体に保存されるためのコンピュータプログラムが提供され、前記方法は、下記の段階を含む：
（ａ）第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）から検出されるシグナルを受信する段階であって；前記サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）は、第１シグナル−発生手段によって検出され、第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）は、第２シグナル−発生手段によって検出され；前記２つのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルは、単一類型の検出器によって区別されず；
（ｂ）前記２つのターゲット核酸配列に対して、各検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記の２つの方程式を提供する段階；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１  （Ｉ）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２  （ＩＩ）
前記式において、（ＳＤ１）は、第１検出温度から検出されるシグナルであり、（ＳＤ２）は、第２検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）は、第１検出温度で第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ１）は、第１検出温度で第２シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ１Ｄ２）は、第２検出温度で第１シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり、（ＳＴ２Ｄ２）は、第２検出温度で第２シグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、４つであり；
（ｃ）前記４つの変数（ＳＴ１Ｄ１）、（ＳＴ２Ｄ１）、（ＳＴ１Ｄ２）及び（ＳＴ２Ｄ２）からなる群から選択される少なくとも１つの変数をそれぞれ含む２つの追加方程式を提供する段階；及び
（ｄ）前記２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び段階（ｃ）から提供された４つの方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解を得る段階。
【０４０７】
本発明の一具現例によれば、コンピュータプログラムは、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）だけではなく、追加方程式を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータプログラムＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）及び／またはＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータプログラムは、方程式（Ｉ）及び（ＩＩ）だけではなく、追加方程式を提供する指示を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータプログラムは、本方法の実行時にＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）及び／またはＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）を入力する指示を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータプログラムは、ＲＶＴ１（Ｄ１Ｄ２）及び／またはＲＶＴ２（Ｄ１Ｄ２）を収得する方法を実行するためのプロセッサを具現する指示をさらに含む。
【０４０８】
前記プロセッサによって実行される場合、前記プログラム指示が作動して、プロセッサが、前述した本発明の方法を実行させる。プログラム指示は、第１検出温度（Ｄ１）及び第２検出温度（Ｄ２）から検出されたシグナルを受信する指示を含み、２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられた関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び（ｃ）から提供された４つの方程式を使用して変数のうち少なくとも１つに対する解を得る指示を含みうる。
【０４０９】
前述した本発明の方法は、プロセッサ、例えば、独立型コンピュータ（ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、ネットワークに連結されたコンピュータ（ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｔｔａｃｈｅｄ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ）またはリアルタイムＰＣＲ機器のようなデータ収集装置（ｄａｔａ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ）にあるプロセッサで具現される。
【０４１０】
コンピュータ読取り可能な記録媒体の類型は、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードドライブ、携帯用ＨＤＤ、ＵＳＢ、マグネチックテープ、ＭＩＮＩＤＩＳＣ、不揮発性メモリカード、ＥＥＰＲＯＭ、光学ディスク、光学記録媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、システムメモリ、及びウェブサーバのような多様な記録媒体を含む。
【０４１１】
シグナルと関連したデータ（例えば、強度、増幅サイクル数、及び検出温度）は、幾つかの機器を通じて受信されうる。例えば、データは、ＰＣＲデータ収集装置にあるプロセッサによって収集されうる。データは、データが収集されている間にリアルタイムで提供されうるか、またはメモリユニットやバッファに保存され、実験完了後、プロセッサに提供されうる。同様に、前記データセットは、前記収集装置とのネットワーク連結（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット、及びイントラネット）または直接連結（例えば、ＵＳＢまたは他の直接有線連結、または無線連結）によってデスクトップコンピュータシステムのような別途のシステムに提供され、または、ＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、携帯用ＨＤＤのような携帯用媒体上で独立型コンピュータシステムに提供されうる。同様に、前記データセットは、ノート型パソコンまたはデスクトップコンピュータシステムのようなクライアントにネットワーク連結（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット、イントラネット、及び無線通信ネットワーク）を通じてサーバシステムに提供されうる。データが受信されるか、収集された後、前記データ分析過程が進行して、２つのターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び（ｃ）から提供された４つの方程式を使用して変数のうち少なくとも１つに対する解を得る。例えば、プロセッサは、受信されたデータを処理して、第１検出温度及び第２検出温度から検出されたシグナル間の差を収得する。本発明を実行するプロセッサを具現する指示は、ロジックシステムに含まれうる。前記指示は、たとえ携帯用ＨＤＤ、ＵＳＢ、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ及びＤＶＤのような如何なるソフトウェア記録媒体上に提供されうるが、ダウンロードされてメモリモジュール（例えば、ハードドライブ、またはローカルまたは付着ＲＡＭやＲＯＭのような他のメモリ）に保存することができる。本発明を実行するためのコンピュータコードは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、ＶＢＳｃｒｉｐｔ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、及びＸＭＬのような多様なコーディング言語で実行可能である。また、多様な言語及びプロトコルは、本発明によるデータと命令の外部及び内部保存と伝送とに用いられうる。
【０４１２】
本発明のさらに他の態様において、（ａ）コンピュータプロセッサ、及び（ｂ）前記コンピュータプロセッサにカップリングされた前述したコンピュータ読取り可能な記録媒体を含む、サンプル内の第１ターゲット核酸配列（Ｔ１）及び第２ターゲット核酸配列（Ｔ２）を含む２つのターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別するための装置が提供される。
【０４１３】
一具現例によれば、前記装置は、サンプル及びシグナル−発生手段を収容することができる反応容器、前記反応容器の温度を調節する温度調節手段及び／または第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出する単一類型の検出器をさらに含む。
【０４１４】
一具現例によれば、コンピュータプロセッサは、単一類型の検出器が第１検出温度及び第２検出温度でシグナルを検出可能にするだけではなく、変数のうち少なくとも１つに対する解が得られる。前記プロセッサは、１つのプロセッサが２種の行為を行う方式で製作することができる：２つの検出温度での検出及び解の計算に関する命令。選択的に、プロセッサユニットは、２つのプロセッサが２種の行為をそれぞれ行う方式で製作することができる。
【０４１５】
前記装置の第１の必須的な特徴は、前記装置が、２つの検出温度でシグナルを検出可能にするプロセッサを有しているということである。一具現例によれば、シグナルが、ターゲット核酸配列の増幅と共に発生する場合、前記装置は、毎増幅サイクルごとに前記２つの検出温度でシグナルを検出可能にするプロセッサを含む。
【０４１６】
前記装置の第２の必須的な特徴は、前記２つの検出温度でのシグナルを処理して、変数に対する解を得るプロセッサを有しているということである。一具現例によれば、変数に対する解は、数学的処理によって数値として表現される。
【０４１７】
一具現例によれば、前記プロセッサは、ターゲット核酸配列の検出のための従来の装置（例えば、リアルタイムＰＣＲ装置）にソフトウェアが設けられて具現可能である。一具現例によれば、前記装置は、２つの検出温度でシグナルを検出可能にし、２つの検出結果を数学的に処理可能にするプロセッサを含む。
【０４１８】
本発明のさらに他の態様において、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法を実行するためのプロセッサを具現する指示を含むコンピュータ読取り可能な記録媒体が提供され、前記方法は、下記の段階を含む：
（ａ）Ｎ個の検出温度から検出されるシグナルを受信する段階であって；前記それぞれのターゲット核酸配列は、相応するシグナル−発生手段によって検出され；前記Ｎ個のシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルは、単一類型の検出器によって、各ターゲット核酸配列に対して区別されず；Ｎは、２以上の整数であり；
（ｂ）ターゲット核酸配列に対して、それぞれの検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記のＮ個の方程式を提供する段階；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋・・・・・＋ＳＴＮＤ１＝ＳＤ１  （１）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋・・・・・＋ＳＴＮＤ２＝ＳＤ２  （２）
・                                      ・
・                                      ・
・                                      ・
ＳＴ１ＤＮ＋ＳＴ２ＤＮ＋・・・・・＋ＳＴＮＤＮ＝ＳＤＮ  （Ｎ）
前記式において、（ＳＤ１）ないし（ＳＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度でそれぞれのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、Ｎ２個であり；
（ｃ）変数（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）からなる群から選択される少なくとも１つの変数をそれぞれ含む（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式を提供する段階；及び
（ｄ）前記Ｎ個のターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び段階（ｃ）から提供されたＮ２個の方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解を得る段階。
【０４１９】
本発明の一具現例によれば、方程式（１）ないし（Ｎ）だけではなく、追加方程式は、コンピュータ読取り可能な記録媒体に保存される。本発明の一具現例によれば、基準値としてＲＶＴｊ（ＤαＤβ）は、コンピュータ読取り可能な記録媒体に保存される。
【０４２０】
本発明の一具現例によれば、コンピュータ読取り可能な記録媒体は、方程式（１）ないし（Ｎ）だけではなく、追加方程式を提供する指示を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータ読取り可能な記録媒体は、本方法を実行時にＲＶＴｊ（ＤαＤβ）を入力する指示を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータ読取り可能な記録媒体は、ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）を収得するための方法を実行するためのプロセッサを具現する指示をさらに含む。
【０４２１】
本発明のさらに他の態様において、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別する方法を実行するためのプロセッサを具現するコンピュータ読取り可能な記録媒体に保存されるためのコンピュータプログラムが提供され、前記方法は、下記の段階を含む：
（ａ）Ｎ個の検出温度から検出されるシグナルを受信する段階であって；前記それぞれのターゲット核酸配列は、相応するシグナル−発生手段によって検出され；前記Ｎ個のシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルは、単一類型の検出器によって、各ターゲット核酸配列に対して区別されず；Ｎは、２以上の整数であり；
（ｂ）ターゲット核酸配列に対して、それぞれの検出温度で発生する関心シグナルを示す変数をそれぞれ含む下記のＮ個の方程式を提供する段階；
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋・・・・・＋ＳＴＮＤ１＝ＳＤ１  （１）
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋・・・・・＋ＳＴＮＤ２＝ＳＤ２  （２）
・                                      ・
・                                      ・
・                                      ・
ＳＴ１ＤＮ＋ＳＴ２ＤＮ＋・・・・・＋ＳＴＮＤＮ＝ＳＤＮ  （Ｎ）
前記式において、（ＳＤ１）ないし（ＳＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度から検出されるシグナルであり；（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）のそれぞれは、それぞれの検出温度でそれぞれのシグナル−発生手段によって発生する関心シグナルを示す変数であり；変数の総数は、Ｎ２個であり；
（ｃ）変数（ＳＴ１Ｄ１）ないし（ＳＴＮＤＮ）からなる群から選択される少なくとも１つの変数をそれぞれ含む（Ｎ２−Ｎ）個の追加方程式を提供する段階；及び
（ｄ）前記Ｎ個のターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、段階（ｂ）及び段階（ｃ）から提供されたＮ２個の方程式によって、前記変数のうち少なくとも１つに対する解を得る段階。
【０４２２】
本発明の一具現例によれば、コンピュータプログラムは、方程式（１）ないし（Ｎ）だけではなく、追加方程式を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータプログラムは、ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータプログラムは、方程式（１）ないし（Ｎ）だけではなく、追加方程式を提供する指示を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータプログラムは、本方法を実行するに当たって、ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）を入力する指示を含む。本発明の一具現例によれば、コンピュータプログラムは、ＲＶＴｊ（ＤαＤβ）を収得するための方法を実行するためのプロセッサを具現する指示をさらに含む。
【０４２３】
前記プロセッサによって実行される場合、前記プログラム指示が作動して、プロセッサが、前述した本発明の方法を実行させる。プログラム指示は、Ｎ個の検出温度から検出されたシグナルを受信する指示、及びＮ個のターゲット核酸配列のうち少なくとも１つに割り当てられる関心シグナルのうち少なくとも１つを区別するために、変数のうち少なくとも１つに対する解を収得する指示を含みうる。
【０４２４】
本発明のさらに他の態様において、（ａ）コンピュータプロセッサ、及び（ｂ）前記コンピュータプロセッサにカップリングされた前述したコンピュータ読取り可能な記録媒体を含む、サンプル内のＮ個のターゲット核酸配列のそれぞれに対する関心シグナルとして、単一類型の検出器によって区別されないシグナルを区別するための装置が提供される。
【０４２５】
一具現例によれば、前記装置は、サンプル及びシグナル−発生手段を収容することができる反応容器、前記反応容器の温度を調節する温度調節手段及び／またはＮ個の検出温度でシグナルを検出するための単一類型の検出器をさらに含む。
【０４２６】
一具現例によれば、コンピュータプロセッサは、単一類型の検出器がＮ個の検出温度でシグナルを検出可能にするだけではなく、変数のうち少なくとも１つに対する解を収得可能にする。前記プロセッサは、１つのプロセッサが２種の行為を行う方式で製作することができる：Ｎ個の検出温度での検出及び解の計算の命令。選択的に、プロセッサユニットは、２つのプロセッサが２種の行為をそれぞれ行う方式で製作することができる。
【０４２７】
前記装置の第１の必須的な特徴は、前記装置が、Ｎ個の検出温度でシグナルを検出可能にするプロセッサを有しているということである。一具現例によれば、シグナルが、ターゲット核酸配列の増幅と共に発生する場合、前記装置は、毎増幅サイクルごとにＮ個の検出温度でシグナルを検出可能にするプロセッサを含む。
【０４２８】
前記装置の第２の必須的な特徴は、Ｎ個の検出温度でのシグナルを処理して、変数に対する解を得るプロセッサを有しているということである。一具現例によれば、変数に対する解は、数学的処理によって数値として表現される。
【０４２９】
一具現例によれば、前記プロセッサは、ターゲット核酸配列の検出のための従来の装置（例えば、リアルタイムＰＣＲ装置）にソフトウェアが設けられて具現可能である。一具現例によれば、前記装置は、Ｎ個の検出温度でシグナルを検出させ、検出結果を数学的に処理可能にするプロセッサを含む。
【０４３０】
本発明は、実施例によってより詳しく説明される。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、添付の特許請求の範囲に提示された本発明の範囲が、これら実施例によって制限されるものではないということは、当業者に自明である。
【実施例】
【０４３１】
実施例１：異なる温度でのシグナル検出を含むＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲの実施及び方程式解析による２つのターゲット検出
本発明者らは、異なる温度でのシグナル検出を含むＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ及び単一検出チャネルを使用して、２つのターゲット核酸配列を１つの反応容器で検出できるか否かを調査した。２つの検出温度から検出される関心シグナルを示す変数を有する方程式を立て、それを解いて関心シグナルを区別し、ターゲット核酸配列の存在または不在を決定した。
【０４３２】
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーとの延長、ＴａｑＭａｎプローブの切断のために、５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用した。ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ：ＮＧ）のゲノムＤＮＡ及びクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：ＣＴ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸配列として使用した。４種のタイプのサンプル（ＮＧ、ＣＴ、ＮＧ＋ＣＴ、及び鋳型のない対照群）を準備して分析した。
【０４３３】
ＮＧ及びＣＴを検出するために、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを使用した。ターゲット核酸配列が存在すれば、ＴａｑＭａｎプローブは切断されて、標識された断片が放出される。増幅曲線は、前記標識された断片からのシグナルを測定して得られる。
【０４３４】
ＮＧのためのＴａｑＭａｎプローブは、その５’末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ  ６７０）及びその３’末端にクエンチャー分子で標識され（配列番号：３）、ＣＴのためのＴａｑＭａｎプローブは、その５’末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ  ６７０）及びその内部にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）で標識される（配列番号：６）。
【０４３５】
“６０℃”及び“７２℃”をシグナル検出温度として選択した。
【０４３６】
６０℃及び７２℃の検出温度でＮＧ及びＣＴによって提供される関心シグナルを示す変数、ＮＧ及びＣＴの基準値（ＲＶ）、及び２つの検出温度から検出されるシグナルを使用して、下記の方程式を立てた。
【０４３７】
＜方程式セット１＞
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ１Ｄ１は、６０℃の検出温度でＮＧによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ１は、ＮＧを示し、Ｄ１は、６０℃の検出温度を示し；
ＳＴ２Ｄ１は、６０℃の検出温度でＣＴによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ２は、ＣＴを示し、Ｄ１は、６０℃の検出温度を示し；
ＳＴ１Ｄ２は、７２℃の検出温度でＮＧによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ１は、ＮＧを示し、Ｄ２は、７２℃の検出温度を示し；
ＳＴ２Ｄ２は、７２℃の検出温度でＣＴによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ２は、ＣＴを示し、Ｄ２は、７２℃の検出温度を示し；
ＳＤ１は、整数であり、６０℃でシグナルを測定することによって、実験的に得られ；
ＳＤ２は、整数であり、７２℃でシグナルを測定することによって、実験的に得られ；
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２は、整数であり、エンドポイントで６０℃でのＲＦＵ÷７２℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＮＧ単独含有サンプルに対して測定されたものである。Ｔ１は、ＮＧを示し、Ｄ１及びＤ２は、６０℃及び７２℃の検出温度をそれぞれ示し；及び
ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２は、整数であり、エンドポイントで６０℃でのＲＦＵ÷７２℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＣＴ単独含有サンプルに対して測定されたものである。Ｔ２は、ＣＴを示し、Ｄ１及びＤ２は、６０℃及び７２℃の検出温度をそれぞれ示す。
【０４３８】
前記方程式セットを解くための１種の接近法は、次の通りである：それぞれのターゲット核酸配列に対して選択される２つの変数を有する線形連立方程式を新たに樹立した後、前記２つの変数に対する解を得る。例えば、下記の４つの線形連立方程式を立てることができる：
連立方程式１
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１
１／ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ１Ｄ１＋１／ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ２
連立方程式２
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ１Ｄ２＋ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２
連立方程式３
ＳＴ１Ｄ１＋ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ１
１／ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２
連立方程式４
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋１／ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ２
【０４３９】
以後、前記４つの線形連立方程式のうち、１つを選択する。各サイクルで相応する変数に対する解を得た後、それをプロッティングする。プロッティング結果は、相応する変数によって表示されるターゲット配列の増幅曲線として見なされる。最後に、ターゲット配列の存在または不在を決定する。
【０４４０】
本実施例で、線形連立方程式１及び２を使用する。
【０４４１】
本実施例で使用したアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、及びプローブの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｆ  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：１）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：２）
ＮＧ−Ｐ  ５’−［Ｑｕａｓａｒ  ６７０］ＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［ＢＨＱ−２］−３’（配列番号：３）
ＣＴ−Ｆ１  ５’−ＴＣＣＧＡＡＴＧＧＡＴＡＡＡＧＣＧＴＧＡＣＩＩＩＩＩＡＴＧＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：４）
ＣＴ−Ｒ１  ５’−ＡＡＣＡＡＴＧＡＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＧＩＩＩＩＩＣＧＴＴＡＧＡＧＴＣ−３’（配列番号：５）
ＣＴ−Ｐ  ５’−［Ｑｕａｓａｒ  ６７０］ＣＡＴＴＧＴＡＡＡＧＡ［Ｔ（ＢＨＱ−２）］ＡＴＧＧＴＣＴＧＣＴＴＣＧＡＣＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：６）
（Ｉ：デオキシイノシン）
【０４４２】
ターゲット核酸配列（ＮＧゲノムＤＮＡ  １ｐｇ、ＣＴゲノムＤＮＡ  １０ｐｇ、またはＮＧゲノムＤＮＡ  １ｐｇ及びＣＴゲノムＤＮＡ  １０ｐｇの混合物）、ＮＧターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号：１）５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：３）１．５ｐｍｏｌｅ、ＣＴターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号：４）５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号：５）１０ｐｍｏｌｅ、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：６）３ｐｍｏｌｅ、及び４Ｘマスターミックス（最終的に、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び２Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素）５μｌを含有した２０μｌの最終体積でリアルタイムＰＣＲを実施した。前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて、５０℃で５分間反応させた後、９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を５０サイクル繰り返した。シグナルの検出は、毎サイクルごとに６０℃及び７２℃で実施した。
【０４４３】
図１Ａに示されたように、ＮＧ、ＣＴ、またはＮＧ＋ＣＴが存在する場合、６０℃及び７２℃でいずれもシグナルが検出された。ターゲット核酸配列が存在しない場合、シグナルが検出されなかった。各ターゲットの基準値は、ＮＧ単独サンプルまたはＣＴ単独サンプルのシグナルを使用して計算し、図１Ｂに示した。図１Ｂに示されたように、ＮＧ及びＣＴに係わる基準値は、それぞれ１．８及び５．８であった。
【０４４４】
図１Ｃは、連立方程式１を解いて得たプロッティング結果を示す。ＳＴ１Ｄ１に対するプロッティング結果は、６０℃でＮＧの増幅曲線として見なされ、ＳＴ２Ｄ１に対するプロッティング結果は、６０℃でＣＴの増幅曲線として見なされる。収得された増幅曲線の有意性を確認するために、ＮＧサンプル及びＣＴサンプルの結果を参照して適した閾値を選択した。図１Ｃに示されたように、６０℃でＮＧまたはＣＴの増幅曲線は、各サンプル内のターゲット核酸配列の存在または不在を示すことができる。
【０４４５】
図１Ｄは、７２℃でＮＧまたはＣＴの増幅曲線を連立方程式２を解いて得られ、これにより、各サンプル内のターゲット核酸配列の存在または不在を決定することができるということを示す。
【０４４６】
前記結果は、変数、基準値及び各検出温度から測定されたシグナルを含む方程式を立て、それを解く方式が、各検出温度から検出されたシグナルから各ターゲット配列に対する関心シグナルを抽出または区別可能にするということを立証する。
【０４４７】
したがって、異なる温度でのシグナル検出を含むＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ及び単一検出チャネルを使用して、２つのターゲット核酸配列を１つの反応容器で検出し、これは、本発明の方程式解析方式がより便利であり、より信頼性のある方式でターゲット配列の存在を決定可能にするということを示す。
【０４４８】
実施例２：異なる温度でのシグナル検出を含むＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ実施及び方程式解析による２つのターゲット検出
本発明者らは、異なる温度でのシグナル検出を含むＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ及び単一検出チャネルを使用して、２つのターゲット核酸配列を１つの反応容器で検出できるか否かを調査した。２つの検出温度から検出される関心シグナルを示す変数を有する方程式を立て、それを解いて関心シグナルを区別し、ターゲット核酸配列の存在または不在を決定した。
【０４４９】
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーとの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用した。ナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ及びクラミジア・トラコマチス（ＣＴ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸配列として使用した。４種の類型のサンプル（ＮＧ、ＣＴ、ＮＧ＋ＣＴ、及び鋳型のない対照群）を準備して分析した。
【０４５０】
ＣＴ及びＮＧを検出するために、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを使用した。もし、ターゲットが存在する場合、ＰＴＯは切断され、ＰＴＯ断片が生成される。前記ＰＴＯ断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にアニーリングされ、ＣＴＯのテンプレーティング部位上で延びて、ＣＴＯと延長二量体（二量体ＣＴＯ）を形成する。前記延長二量体の形成は、シグナルを提供し、延長二量体−形成温度でシグナルを測定することによって、増幅曲線が得られる。
【０４５１】
“６０℃”及び“７２℃”をシグナル検出温度として選択した。
【０４５２】
本実施例で、ＣＴに対する前記延長二量体の配列及び長さは、６０℃及び７２℃で前記二量体を形成して、シグナルを提供するように設計した。一方、ＮＧに対する前記延長二量体の配列及び長さは、６０℃では二量体を形成して、シグナルを提供するが、７２℃では、二量体を形成せず、解離されてシグナルを提供しないように設計した。７２℃の検出温度では、前記ＣＴに対するシグナルが発生して検出される。６０℃の検出温度では、前記ＣＴに対するシグナルだけではなく、前記ＮＧに対するシグナルが発生して検出される。
【０４５３】
前記ＰＴＯ及びＣＴＯは、その延長が防止されるように、その３’末端がカーボンスぺーサでブロッキングされている。前記ＣＴＯは、その５’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及びそのテンプレーティング部位に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）で標識されている（配列番号：８及び１２）。
【０４５４】
＜方程式セット２＞
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ２＝０
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２、ＳＴ２Ｄ２、ＳＤ１、ＳＤ２、及びＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２は、方程式セット１でのように定義される。
【０４５５】
方程式セット２で、方程式ＳＴ１Ｄ２＝０が、ＮＧの基準値ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２の代わりに使われる。ＮＧに対するシグナル−発生手段は、ＮＧの存在時にも、７２℃の検出温度（Ｄ２）で実質的にシグナルを発生させないように製造されたために、本実施例で、方程式ＳＴ１Ｄ２＝０を採択することができる。
【０４５６】
それぞれのサイクルで相応する変数に対する解を得た後、それをプロッティングする。
【０４５７】
＜方程式セット３＞
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２、ＳＴ２Ｄ２、ＳＤ１、ＳＤ２、ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２、及びＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２は、方程式セット１でのように定義される。
【０４５８】
本実施例で、ＮＧに対するシグナル−発生手段は、ＮＧの存在時にも、７２℃の検出温度（Ｄ２）で実質的にシグナルを発生させないように製造された。しかし、実際の実験で通常検出される７２℃の検出温度（Ｄ２）での非常に弱いシグナル（例えば、背景シグナル）も、ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２の実際の提供に使われる。
【０４５９】
連立方程式セット１を解くように、同じ方式で連立方程式１及び２を使用して解が得られる。それぞれのサイクルで相応する変数に対する解を収得した後、それをプロッティングする。
【０４６０】
＜方程式セット４＞
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２、ＳＴ２Ｄ２、ＳＤ１、ＳＤ２、及びＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２は、方程式セット１でのように定義される。
【０４６１】
方程式セット４で、ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２は、任意選択整数値である。本実施例で、ＮＧに対するシグナル−発生手段は、ＮＧの存在時にも、７２℃の検出温度（Ｄ２）で実質的にシグナルを発生させないように製造されたために、実験的に収得された値の代わりに、ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２に対して任意選択値を使用することができる。この場合、ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２に対する任意選択値は、１０８であり、これは、方程式セット３で実験的に収得された値よりも遥かに大きい。
【０４６２】
連立方程式セット１を解くように、同じ方式で連立方程式１及び２を使用して解が得られる。それぞれのサイクルで相応する変数に対する解を収得した後、それをプロッティングする。
【０４６３】
本実施例で使用したアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、及びＣＴＯの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｆ  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：１）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：２）
ＮＧ−ＰＴＯ  ５’−ＧＴＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：７）
ＮＧ−ＣＴＯ  ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ［Ｔ（ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）］ＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＣＧＴＡＣ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：８）
ＣＴ−Ｆ２  ５’−ＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＴＩＩＩＩＩＴＴＴＧＴＡＴＡＡＣ−３’（配列番号：９）
ＣＴ−Ｒ２  ５’−ＣＣＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＴＧＩＩＩＩＩＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡ−３’（配列番号：１０）
ＣＴ−ＰＴＯ  ５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：１１）
ＣＴ−ＣＴＯ  ５’−［ＢＨＱ−２］ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡ［Ｔ（ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）］ＡＴＧＴＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＡＡＴＣ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：１２）
（Ｉ：デオキシイノシン）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）
【０４６４】
ターゲット核酸配列（ＮＧゲノムＤＮＡ  １０ｐｇ、ＣＴゲノムＤＮＡ  １０ｐｇ、またはＮＧゲノムＤＮＡ  １０ｐｇ及びＣＴゲノムＤＮＡ  １０ｐｇの混合物）、ＮＧターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号：１）５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号：２）５ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号：７）３ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号：８）１ｐｍｏｌｅ、ＣＴターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号：９）５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号：１０）５ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号：１１）３ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号：１２）１ｐｍｏｌｅ、及び２Ｘマスターミックス（最終的に、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び２Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素）１０μｌを含有した２０μｌの最終体積でリアルタイムＰＣＲを実施した。前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて、５０℃で５分間反応させた後、９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を５０サイクル繰り返した。シグナルの検出は、毎サイクルごとに６０℃及び７２℃で実施した。
【０４６５】
図２Ａに示されたように、ＮＧ、ＣＴ、またはＮＧ＋ＣＴが存在する場合、６０℃でシグナルが検出された。ＣＴが単独で存在する場合、６０℃及び７２℃でいずれもシグナルが検出された。ＮＧが単独で存在する場合、６０℃ではシグナルが検出されたが、７２℃では検出されなかった。ターゲット核酸配列が存在しない場合、シグナルが検出されなかった。各ターゲットの基準値は、ＮＧサンプルまたはＣＴサンプルのシグナルを使用して計算し、図２Ｂに示した。図２Ｂに示されたように、ＮＧ及びＣＴに係わる基準値は、それぞれ３６．７及び１．２であった。
【０４６６】
図２Ｃ〜図２Ｈは、方程式セット２、３及び４を解いて得たプロッティング結果を示す。ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ１Ｄ２及びＳＴ２Ｄ２に対するプロッティング結果は、６０℃でＮＧの増幅曲線、６０℃でＣＴの増幅曲線、７２℃でＮＧの増幅曲線、及び７２℃でＣＴの増幅曲線としてそれぞれ見なされる。収得された増幅曲線の有意性を確認するために、ＮＧサンプル及びＣＴサンプルの結果を参照して適した閾値を選択した。
【０４６７】
図２Ｃ、図２Ｅ及び図２Ｇに示されたように、６０℃でＮＧまたはＣＴの増幅曲線は、各サンプル内のターゲット核酸配列の存在または不在を確認可能にする。
【０４６８】
前記結果は、変数、基準値及び各検出温度から測定されたシグナルを含む方程式を立て、それを解く方式が、各検出温度から検出されるシグナルから各ターゲット配列に対する関心シグナルを抽出または区別可能にするということを立証する。
【０４６９】
したがって、異なる温度でシグナルの検出を含むＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ及び単一検出チャネルを使用して、２つのターゲット核酸配列を１つの反応容器で検出し、これは、本方程式解析方式がより便利であり、より信頼性のある方式でターゲット配列の存在を決定可能にするということを示す。
【０４７０】
実施例３：異なる温度でのシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ実施及び方程式解析による３つのターゲット検出
本発明者らは、異なる温度でのシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ及び単一検出チャネルを使用して、３つのターゲット核酸配列を１つの反応容器で検出できるか否かを調査した。３つの検出温度から検出される関心シグナルを示す変数を有する方程式を立て、それを解いて関心シグナルを区別し、ターゲット核酸配列の存在または不在を決定した。
【０４７１】
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーとの延長、ＴａｑＭａｎプローブの切断、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用した。ナイセリア・ゴノレア（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ、クラミジア・トラコマチス（ＣＴ）のゲノムＤＮＡ、及びマイコプラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ：ＭＧ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸配列として使用した。ＮＧ、ＣＴ、ＭＧ、ＮＧ及びＣＴの混合物、ＮＧ及びＭＧの混合物、ＣＴ及びＭＧの混合物、ＮＧ、ＣＴ及びＭＧの混合物、及び鋳型のない対照群をそれぞれ含む８つの反応チューブを準備した。
【０４７２】
ＭＧを検出するために、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを使用した。ＣＴ及びＮＧを検出するために、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを使用した。
【０４７３】
“６０℃”、“７２℃”及び“９５℃”をシグナル検出温度として選択した。
【０４７４】
本実施例で、ＣＴに対する前記延長二量体の配列及び長さは、６０℃及び７２℃ではシグナルを提供し、９５℃では提供しないように設計した。一方、ＮＧに対する前記延長二量体の配列及び長さは、６０℃ではシグナルを提供し、７２℃及び９５℃では提供しないように設計した。９５℃の検出温度では、前記ＭＧに対するシグナルが発生して検出される。７２℃の検出温度では、前記ＭＧに対するシグナルだけではなく、前記ＣＴに対するシグナルが発生して検出される。また、６０℃の検出温度では、前記ＭＧ及びＣＴに対するシグナルだけではなく、前記ＮＧに対するシグナルが発生して検出される。
【０４７５】
ＴａｑＭａｎプローブは、その５’末端に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）及びその３’末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）で標識される（配列番号：１５）。前記ＰＴＯ及びＣＴＯは、その延長が防止されるように、その３’末端がカーボンスぺーサでブロッキングされている。前記ＣＴＯは、クエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及びそのテンプレーティング部位に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）で標識されている（配列番号：８及び１２）。
【０４７６】
本実施例で、各ターゲットの基準値及び３つの検出温度（９５℃、７２℃及び６０℃）からのシグナルを用いるプロッティング方法は、各ターゲット核酸配列の存在を示す増幅曲線を提供する。連立方程式をプロッティング方法として使用し、各検出温度から各ターゲットシグナルの抽出に適用した。各ターゲット核酸配列に対する増幅曲線を得るための基準値計算及び連立方程式は、次の通りである：
＜方程式セット５＞
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋ＳＴ３Ｄ１＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋ＳＴ３Ｄ２＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ３＋ＳＴ２Ｄ３＋ＳＴ３Ｄ３＝ＳＤ３
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ２＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ１Ｄ１／ＳＴ１Ｄ３＝ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３
ＳＴ１Ｄ２／ＳＴ１Ｄ３＝ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ３
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ２＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ２Ｄ１／ＳＴ２Ｄ３＝ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３
ＳＴ２Ｄ２／ＳＴ２Ｄ３＝ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ３
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ２＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２
ＳＴ３Ｄ１／ＳＴ３Ｄ３＝ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３
ＳＴ３Ｄ２／ＳＴ３Ｄ３＝ＲＶＴ３Ｄ２／Ｄ３
ＳＴ１Ｄ１は、６０℃の検出温度でＮＧによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ１は、ＮＧを示し、Ｄ１は、６０℃の検出温度を示し；
ＳＴ２Ｄ１は、６０℃の検出温度でＣＴによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ２は、ＣＴを示し、Ｄ１は、６０℃の検出温度を示し；
ＳＴ３Ｄ１は、６０℃の検出温度でＭＧによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ３は、ＭＧを示し、Ｄ１は、６０℃の検出温度を示し；
ＳＴ１Ｄ２は、７２℃の検出温度でＮＧによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ１は、ＮＧを示し、Ｄ２は、７２℃の検出温度を示し；
ＳＴ２Ｄ２は、７２℃の検出温度でＣＴによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ２は、ＣＴを示し、Ｄ２は、７２℃の検出温度を示し；
ＳＴ３Ｄ２は、７２℃の検出温度でＭＧによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ３は、ＭＧを示し、Ｄ２は、７２℃の検出温度を示し；
ＳＴ１Ｄ３は、９５℃の検出温度でＮＧによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ１は、ＮＧを示し、Ｄ３は、９５℃の検出温度を示し；
ＳＴ２Ｄ３は、９５℃の検出温度でＣＴによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ２は、ＣＴを示し、Ｄ３は、９５℃の検出温度を示し；
ＳＴ３Ｄ３は、９５℃の検出温度でＭＧによって提供される関心シグナルを示す変数であり、Ｔ３は、ＭＧを示し、Ｄ３は、９５℃の検出温度を示し；
ＳＤ１は、整数であり、６０℃でシグナルを測定することによって、実験的に得られ；
ＳＤ２は、整数であり、７２℃でシグナルを測定することによって、実験的に得られ；
ＳＤ３は、整数であり、９５℃でシグナルを測定することによって、実験的に得られ；
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２は、整数であり、エンドポイントで６０℃でのＲＦＵ÷７２℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＮＧ単独含有サンプルで測定される。Ｔ１は、ＮＧを示し、Ｄ１及びＤ２は、６０℃及び７２℃の検出温度をそれぞれ示し；
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３は、整数であり、エンドポイントで６０℃でのＲＦＵ÷９５℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＮＧ単独含有サンプルで測定される。Ｔ１は、ＮＧを示し、Ｄ１及びＤ３は、６０℃及び９５℃の検出温度をそれぞれ示し；
ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ３は、整数であり、エンドポイントで７２℃でのＲＦＵ÷９５℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＮＧ単独含有サンプルで測定される。Ｔ１は、ＮＧを示し、Ｄ２及びＤ３は、７２℃及び９５℃の検出温度をそれぞれ示し；
ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２は、整数であり、エンドポイントで６０℃でのＲＦＵ÷７２℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＣＴ単独含有サンプルで測定される。Ｔ２は、ＣＴを示し、Ｄ１及びＤ２は、６０℃及び７２℃の検出温度をそれぞれ示し；．
ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３は、整数であり、エンドポイントで６０℃でのＲＦＵ÷９５℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＣＴ単独含有サンプルで測定される。Ｔ２は、ＣＴを示し、Ｄ１及びＤ３は、６０℃及び９５℃の検出温度をそれぞれ示し；
ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ３は、整数であり、エンドポイントで７２℃でのＲＦＵ÷９５℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＣＴ単独含有サンプルで測定される。Ｔ２は、ＣＴを示し、Ｄ２及びＤ３は、７２℃及び９５℃の検出温度をそれぞれ示し；
ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２は、整数であり、エンドポイントで６０℃でのＲＦＵ÷７２℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＭＧ単独含有サンプルで測定される。Ｔ３は、ＭＧを示し、Ｄ１及びＤ２は、６０℃及び７２℃の検出温度をそれぞれ示し；
ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３は、整数であり、エンドポイントで６０℃でのＲＦＵ÷９５℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＭＧ単独含有サンプルで測定される。Ｔ３は、ＭＧを示し、Ｄ１及びＤ３は、６０℃及び９５℃の検出温度をそれぞれ示し；及び
ＲＶＴ３Ｄ２／Ｄ３は、整数であり、エンドポイントで７２℃でのＲＦＵ÷９５℃でのＲＦＵを計算することによって、実験的に得られ、ＲＦＵは、ＭＧ単独含有サンプルで測定される。Ｔ３は、ＭＧを示し、Ｄ２及びＤ３は、７２℃及び９５℃の検出温度をそれぞれ示す。
【０４７７】
前記方程式セットを解くための１つの方法は、次の通りである：それぞれのターゲット核酸配列に対して選択される３つの変数を有する線形連立方程式を新たに樹立した後、前記３つの変数に対する解を得る。例えば、方程式セット５で９つのＲＶ方程式のうち、適した６つの方程式を使用して、下記の３つの線形連立方程式を立てることができる：
連立方程式５
ＳＴ１Ｄ１＋ＳＴ２Ｄ１＋ＳＴ３Ｄ１＝ＳＤ１
１／ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ１Ｄ１＋１／ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ２Ｄ１＋１／ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ３Ｄ１＝ＳＤ２
１／ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３×ＳＴ１Ｄ１＋１／ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３×ＳＴ２Ｄ１＋１／ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３×ＳＴ３Ｄ１＝ＳＤ３
連立方程式６
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ１Ｄ２＋ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ２Ｄ２＋ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ２×ＳＴ３Ｄ２＝ＳＤ１
ＳＴ１Ｄ２＋ＳＴ２Ｄ２＋ＳＴ３Ｄ２＝ＳＤ２
１／ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ３×ＳＴ１Ｄ２＋１／ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ３×ＳＴ２Ｄ２＋１／ＲＶＴ３Ｄ２／Ｄ３×ＳＴ３Ｄ２＝ＳＤ３
連立方程式７
ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３×ＳＴ１Ｄ３＋ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３×ＳＴ２Ｄ３＋ＲＶＴ３Ｄ１／Ｄ３×ＳＴ３Ｄ３＝ＳＤ１
ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ３×ＳＴ１Ｄ３＋ＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ３×ＳＴ２Ｄ３＋ＲＶＴ３Ｄ２／Ｄ３×ＳＴ３Ｄ３＝ＳＤ２
ＳＴ１Ｄ３＋ＳＴ２Ｄ３＋ＳＴ３Ｄ３＝ＳＤ３
【０４７８】
以後、それぞれのサイクルで相応する変数に対する解を得た後、それをプロッティングする。前記プロッティング結果は、相応する変数が示すターゲット配列の増幅曲線として見なされる。最後に、ターゲット配列の存在または不在を決定する。
【０４７９】
本実施例で、ＮＧに対するシグナル−発生手段は、ＮＧの存在時にも、７２℃及び９５℃の検出温度で実質的にシグナルを発生させないように製造され、ＣＴに対するシグナル−発生手段は、ＣＴの存在時にも、９５℃の検出温度で実質的にシグナルを発生させないように製造された。したがって、方程式セット５の代わりに、他の方程式セットを使用することができる。
【０４８０】
方程式セット５の第１の変形例として、方程式ＳＴ１Ｄ２＝０及びＳＴ１Ｄ３＝０をＮＧに係わる基準値のうち、ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２、ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３、またはＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ３を含む方程式の代わりに使用し、方程式ＳＴ２Ｄ３＝０をＣＴに係わる基準値のうち、ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３またはＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ３を含む方程式の代わりに使用する。
【０４８１】
第２の変形例として、実験的に収得された値の代わりに、ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ２、ＲＶＴ１Ｄ１／Ｄ３、ＲＶＴ１Ｄ２／Ｄ３、ＲＶＴ２Ｄ１／Ｄ３及びＲＶＴ２Ｄ２／Ｄ３に対して任意選択値を使用することができる。
【０４８２】
第１及び第２の変形の組合せも、本方法で使われる。
【０４８３】
本実施例で使用したアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ、及びＴａｑＭａｎプローブの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｆ  ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：１）
ＮＧ−Ｒ  ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号：２）
ＮＧ−ＰＴＯ  ５’−ＧＴＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：７）
ＮＧ−ＣＴＯ  ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ［Ｔ（ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）］ＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＣＧＴＡＣ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：８）
ＣＴ−Ｆ２  ５’−ＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＴＩＩＩＩＩＴＴＴＧＴＡＴＡＡＣ−３’（配列番号：９）
ＣＴ−Ｒ２  ５’−ＣＣＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＴＧＩＩＩＩＩＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡ−３’（配列番号：１０）
ＣＴ−ＰＴＯ  ５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＧ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：１１）
ＣＴ−ＣＴＯ  ５’−［ＢＨＱ−２］ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡ［Ｔ（ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０）］ＡＴＧＴＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＡＡＴＣ［Ｃ３  ｓｐａｃｅｒ］−３’（配列番号：１２）
ＭＧ−Ｆ  ５’−ＡＡＡＡＣＣＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＩＩＩＩＩＡＴＴＧＧＴＴＣＴＡＣ−３’（配列番号：１３）
ＭＧ−Ｒ  ５’−ＣＴＣＧＴＴＡＡＴＴＴＡＣＣＴＡＴＴＣＣＡＴＴＴＴＧＩＩＩＩＩＣＴＧＡＴＡＡＡＡＧ−３’（配列番号：１４）
ＭＧ−Ｐ  ５’−［ＣＡＬ  Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅｄ  ６１０］ＧＡＧＴＴＣＴＴＴＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＧＴ［ＢＨＱ−２］−３’（配列番号：１５）
（Ｉ：デオキシイノシン）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）
【０４８４】
ターゲット核酸配列（ＮＧゲノムＤＮＡ  １０ｐｇ、ＣＴゲノムＤＮＡ  １０ｐｇ、ＭＧゲノムＤＮＡ  １０ｐｇ、ＮＧゲノムＤＮＡ  １０ｐｇ及びＣＴゲノムＤＮＡ  １０ｐｇの混合物、ＮＧゲノムＤＮＡ  １０ｐｇ及びＭＧゲノムＤＮＡ  １０ｐｇの混合物、ＣＴゲノムＤＮＡ  １０ｐｇ及びＭＧゲノムＤＮＡ  １０ｐｇの混合物；またはＮＧ、ＣＴ及びＭＧゲノムＤＮＡの各１０ｐｇの混合物）、ＮＧターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号：１）５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号：２）５ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号：７）３ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号：８）１ｐｍｏｌｅ、ＣＴターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号：９）５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号：１０）５ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号：１１）３ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号：１２）１ｐｍｏｌｅ、ＭＧターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号：１３）５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号：１４）５ｐｍｏｌｅ、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：１５）１ｐｍｏｌｅ、及び２Ｘマスターミックス［最終的に、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び２Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素］１０μｌを含有した２０μｌの最終体積でリアルタイムＰＣＲを実施した。前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて、５０℃で５分間反応させた後、９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を５０サイクル繰り返した。シグナルの検出は、毎サイクルごとに６０℃、７２℃及び９５℃で実施した。
【０４８５】
図３Ａ及び３Ｂに示されたように、ＮＧ、ＣＴ、ＭＧ及び混合ターゲットが存在する場合、６０℃でシグナルが検出された。ＣＴが単独で存在する場合、６０℃及び７２℃でシグナルが検出されたが、９５℃では検出されなかった。ＮＧが単独で存在する場合、６０℃ではシグナルが検出されたが、９５℃及び７２℃では検出されなかった。ターゲット核酸配列が存在しない場合、シグナルが検出されなかった。各ターゲットの基準値は、ＮＧ単独サンプル、ＣＴ単独サンプルまたはＭＧ単独サンプルのシグナルを使用して計算し、図３Ｃに示した。
【０４８６】
ＳＴ１Ｄ１、ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ２Ｄ１、ＳＴ２Ｄ２、ＳＴ２Ｄ３、ＳＴ３Ｄ１、ＳＴ３Ｄ２及びＳＴ３Ｄ３に対するプロッティング結果は、６０℃でＮＧの増幅曲線、６０℃でＣＴの増幅曲線、６０℃でＭＧの増幅曲線、７２℃でＮＧの増幅曲線、７２℃でＣＴの増幅曲線、７２℃でＭＧの増幅曲線、９５℃でＮＧの増幅曲線、９５℃でＣＴの増幅曲線及び９５℃でＭＧの増幅曲線としてそれぞれ見なされる。収得された増幅曲線の有意性を確認するために、ＮＧ単独サンプル、ＣＴ単独サンプル及びＭＧ単独サンプルの結果を参照して適した閾値を選択した。
【０４８７】
図３Ｄ及び３Ｅに示されたように、６０℃でＮＧ、ＣＴまたはＭＧの増幅曲線は、各サンプルでターゲット核酸配列の存在または不存在を確認させてくれる。
【０４８８】
前記結果は、変数、基準値及び各検出温度から測定されたシグナルを含む方程式を立て、それを解く方式が、各検出温度から検出されるシグナルから各ターゲット配列に対する関心シグナルを抽出または区別可能にするということを立証する。
【０４８９】
したがって、異なる温度でのシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ及び単一検出チャネルを使用して、３つのターゲット核酸配列を１つの反応容器で検出し、これは、本方程式解析方式がより便利であり、より信頼性のある方式で少なくとも３つのターゲット配列の存在を決定可能にするということを示す。
【０４９０】
本発明の望ましい具現例を詳しく記述したところ、本発明の原理による変形及び修正がが可能であるということは、当業者に明白であり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲とその均等物とによって定義される。
【図１Ａ】
0006734851.tif 000002
【図１Ｂ】
0006734851.tif 000003
【図１Ｃ】
0006734851.tif 000004
【図１Ｄ】
0006734851.tif 000005
【図２Ａ】
0006734851.tif 000006
【図２Ｂ】
0006734851.tif 000007
【図２Ｃ】
0006734851.tif 000008
【図２Ｄ】
0006734851.tif 000009
【図２Ｅ】
0006734851.tif 000010
【図２Ｆ】
0006734851.tif 000011
【図２Ｇ】
0006734851.tif 000012
【図２Ｈ】
0006734851.tif 000013
【図３Ａ】
0006734851.tif 000014
【図３Ｂ】
0006734851.tif 000015
【図３Ｃ】
0006734851.tif 000016
【図３Ｄ】
0006734851.tif 000017
【図３Ｅ】
0006734851.tif 000018
【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
0006734851.tif 000020
【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【配列表】
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