(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コレステロールの吸収の改変に使用するための、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項２】
高コレステロールまたは心疾患の処置に使用するための、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つを含む、組成物。
【請求項３】
ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１株またはその変異株をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される２つまたはそれを超える株を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記１つまたは複数の株が、１０５ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量で存在する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
被包されている、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記１つまたは複数の株が、プレバイオティクス組成物と混合される、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記プレバイオティクスが、前記１つまたは複数の株の増殖に特異的なプレバイオティクスを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
食料品、または栄養補助食品の形態である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
有効量のラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つを含有する、高コレステロール血清レベルを有する個体を処置するための、医薬組成物。
【請求項１１】
一回投与量が、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１株またはその変異株をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
一回投与量が、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される２つまたはそれを超える株を含む、請求項１０から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の株が、１０５ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量で含まれる、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記組成物が被包されている、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の株が、プレバイオティクス組成物と混合されており、前記プレバイオティクスが、前記１つまたは複数の株の増殖に特異的なプレバイオティクスを含んでもよい、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
食料品、または栄養補助食品の形態である、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロールレベルの管理に有用な、プロバイオティクス組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクスは、宿主に健康上の利益を付与する細菌である。典型的に、腸内に天然に存在する細菌集団を補給するために、プロバイオティクス細菌株の培養物が個体によって消費され、または個体に投与される。数例を挙げると、がん、下痢症および過敏性腸症候群の発生の低減を含むいくつかの健康上の利益が、プロバイオティクスに関連するとされている。プロバイオティクスは、いくつかの生理的状態を管理する一助になる潜在可能性があり、摂取された脂質などのある特定の物質の吸収を低減するように作用する。また予備研究では、プロバイオティクスが、コレステロールの血清レベルおよび血圧の低下に有用であり、糖尿病をモジュレートし、体重を低減する一助になり得ることが示されている。
【０００３】
本発明の一目的は、腸内のコレステロール吸収を既に低減している可能性があるプロバイオティクス組成物を提供することである。またプロバイオティクス組成物が、心疾患、糖尿病または肥満などの他の生理的状態を処置するために使用できることは、やはり有益となるはずである。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は以下の［１］から［１８］を含む。
［１］コレステロールの吸収の改変に使用するための、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つを含む、組成物。
［２］高コレステロール、心疾患、糖尿病または肥満の処置に使用するための、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つを含む、組成物。
［２］ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１株またはその変異株をさらに含む、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［３］ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される２つまたはそれを超える株を含む、上記［１］または［２］に記載の組成物。
［４］上記１つまたは複数の株が、１０５ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量で存在する、上記［１］から［３］のいずれかに記載の組成物。
［５］被包されている、上記［１］から［４］のいずれかに記載の組成物。
［６］上記１つまたは複数の株が、プレバイオティクス組成物と混合される、上記［１］から［５］のいずれかに記載の組成物。
［７］上記プレバイオティクスが、上記１つまたは複数の株の増殖に特異的なプレバイオティクスを含む、上記［６］に記載の組成物。
［８］食料品の形態である、上記［１］から［７］のいずれかに記載の組成物。
［９］栄養補助食品の形態である、上記［１］から［８］のいずれか一項に記載の組成物。
［１０］有効量のラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つを有する組成物を投与することによって、高コレステロール血清レベルを有する個体を処置する、方法。
［１１］ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１株またはその変異株を追加で投与するステップをさらに含む、上記［１０］に記載の方法。
［１２］ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される２つまたはそれを超える株を投与するステップを含む、上記［１０］から［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］上記１つまたは複数の株が、１０５ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量で投与される、上記［１０］から［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］上記組成物が被包されている、上記［１０］から［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］上記１つまたは複数の株が、プレバイオティクス組成物と混合される、上記［１０］から［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］上記プレバイオティクスが、上記１つまたは複数の株の増殖に特異的なプレバイオティクスを含む、上記［１５］に記載の方法。
［１７］食料品の形態である、上記［１０］から［１６］のいずれかに記載の方法。
［１８］栄養補助食品の形態である、上記［１０］から［１６］のいずれか一項に記載の方法。
本発明の一態様では、コレステロールの吸収の改変に使用するための、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つを含む組成物が提供される。
【０００５】
本発明の第２の態様では、高コレステロール、心疾患、糖尿病または肥満の処置に使用するための、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つを含む組成物が提供される。
【０００６】
本発明のさらなる一態様では、高コレステロール、心疾患、糖尿病または肥満を処置するための薬品の製造における、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つを含む組成物の使用が提供される。
【０００７】
本願の文脈における用語「変異株」は、開示されている株から直接導出されているが、１つまたは複数の遺伝子変異の導入によって（遺伝子操作または選択によって）、表現型的に異なっている任意の株を意味することを企図する。
【０００８】
本発明の組成物は、主に、ヒト個体におけるコレステロールの吸収の改変またはある特定の関連疾患の処置を目的としている。しかし、該組成物は、動物を処置するために等しく使用することができる。
【０００９】
両方の態様に共通して、該組成物は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１株またはその変異株をさらに含むことができる。
【００１０】
さらに該組成物は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される２つまたはそれを超える株を含むことができる。
【００１１】
１つまたは複数の株は、オリゴ糖などのプレバイオティクス組成物と混合することができる。しかし、選択された正確なプレバイオティクスは、該組成物中の１つまたは複数の株によって決定され、好ましくは１つまたは複数の株の増殖に特異的である。
【００１２】
プロバイオティクス組成物は、好ましくは、小腸内のコレステロールの吸収プロファイルの変化を誘発するために、組成物中に有効量で存在する。好ましくは、培養物は、個体に１０５ｃｆｕ／ｇ〜１０１２ｃｆｕ／ｇの範囲の量で投与される。より好ましくは、プロバイオティクス細菌株は、１０８ｃｆｕ／ｇ〜１０９ｃｆｕ／ｇの範囲の量で存在する。ただし、個体の状態に応じて異なる投与量が投与され得ることを理解されよう。
【００１３】
株は、被包されていてもよい。多くの被包技術が、当業者には明らかであり、用いられる被包技術は、消化通過中にプロバイオティクス培養物に必要な安定性に合わせて調整される。被包は、プロバイオティクスに合わせて具体的に調整されたプレバイオティクスを含むことができる。
【００１４】
プロバイオティクス組成物は、コレステロール吸収を低下するのに最も適した時間に放出されるようにするための賦形剤または担体化合物をさらに含むことができる。典型的に、培養物は、小腸の腸管腸細胞に到達するまでに、相対的に無傷で生存していなければならない。
【００１５】
組成物は、いくつかの食料品型式、例えば飲むことのできる液体、スプレッド、および／または固体もしくは液体食料品と混合できる粉末であってもよい。該組成物は、栄養補助食品として提供することもできる。
【００１６】
組成物は、１つまたは複数の活性成分、例えばビタミン、ミネラル、植物性化学物質、抗酸化剤、およびそれらの組合せと組み合わせることができる。
【００１７】
ビタミンには、脂溶性ビタミン、例えばビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミン、ならびにそれらの組合せが含まれ得る。一部の実施形態では、ビタミンには、水溶性ビタミン、例えばビタミンＣ（アスコルビン酸）、ビタミンＢ（チアミンまたはＢ１、リボフラビン（riboflavoin）またはＢ２５ナイアシンまたはＢ３、ピリドキシンまたはＢ６、葉酸またはＢ９、シアノコバラミン（cyanocobalimin）またはＢ１２、パントテン酸、ビオチン）、およびそれらの組合せが含まれ得る。
【００１８】
ミネラルには、ナトリウム、マグネシウム、クロム、ヨウ素、鉄、マンガン、カルシウム、銅、フッ化物、カリウム、亜リン酸、モリブデン、セレン、亜鉛、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００１９】
抗酸化剤には、アスコルビン酸、クエン酸、ローズマリー油、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＥリン酸塩、トコフェロール、ジ−アルファ−トコフェリルリン酸塩、トコトリエノール、アルファリポ酸、ジヒドロリポ酸、キサントフィル、ベータクリプトキサンチン、リコペン、ルテイン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、ベータ−カロテン、カロテン、混合カロテノイド、ポリフェノール、フラボノイド（fiavonoid）、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００２０】
植物性化学物質には、カロテノイド（cartotenoid）、葉緑素、クロロフィリン、繊維、フラバノイド、アントシアニン（anthocyamn）、シアニジン（cyaniding）、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン、フラバノール、カテキン、エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン（epigailocatechingallate）、テアフラビン、テラルビシン（thearubigin）、プロアントシアニジン（proanthocyanin）、フラボノール、ケルセチン、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチン、フラバノンスヘスペレチン、ナリンゲニン、エリオジクチオール、タンゲレチン、フラボン、アピゲニン、ルテオリン、リグナン、フィトエストロゲン、レスベラトロール、イソフラボン、ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、ダイズイソフラボン、およびそれらの組合せが含まれ得るが、それらに限定されない。
【００２１】
組成物は、医薬品または薬品の代わりに（またはそれに加えて）、栄養補助食品、健康補助食品または機能性食品として使用することができる。さらに組成物は、既存の食料品、例えばヨーグルト、食品スプレッドに組み込むことができ、または食料品と容易にブレンドすることができ、もしくは液体飲料に製造することができる粉末として組み込むことができる。
【００２２】
本発明のさらに第３の態様によれば、有効量のラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）、またはそれらの変異株から選択される株の少なくとも１つを有する組成物を投与することによって、高コレステロール血清レベルを有する個体を処置する方法が提供される。
【００２３】
該方法は、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１株またはその変異株を追加で投与するステップをさらに含むことができる。
【００２４】
この方法は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）およびラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）ＡＴＣＣ４３１２１またはそれらの変異株から選択される２つまたはそれを超える株を投与するステップを含むことができる。
【００２５】
本発明の第１および第２の態様に関して列挙されている組成物のいくつかの特徴は、本発明の方法で投与される組成物と交換可能であることも、当業者は理解されよう。
【００２６】
本発明の詳細な説明
ここで、本発明の実施形態を、以下の図面の詳細な説明を単なる例として用いて説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】９６ウェルプレートで、ＭＲＳＡ中、好気条件下で増殖させた乳酸桿菌株の写真である。
【図２】９６ウェルプレートで、ＭＲＳＡだけ（対照）、ＭＲＳＡ＋０．５％ＧＤＣＡ、ＭＲＳＡ＋０．５％ＴＤＣＡ、ＭＲＳＡ＋０．５％Ｏｘｇａｌ、およびＭＲＳＡ＋２％Ｏｘｇａｌ中、嫌気条件下で増殖させた乳酸桿菌株の写真である。
【図３】９６ウェルプレートで、ＭＲＳＡだけ（対照）、ＭＲＳＡ＋０．５％ＧＤＣＡ、ＭＲＳＡ＋０．５％ＴＤＣＡ、ＭＲＳＡ＋０．５％Ｏｘｇａｌ、およびＭＲＳＡ＋２％Ｏｘｇａｌ中、好気条件下で増殖させた乳酸桿菌株の写真である。
【図４】ハイスループットスクリーニングに付した多様な乳酸桿菌株を示す円グラフである。
【図５】コレステロール低下能のさらなる分析のために識別された２４種類の株の結果を示す棒グラフである。
【図６】光学密度に対してコレステロール同化を正規化した後の、図５に示されている２４種類の株の結果を示す棒グラフである。
【図７】フリーズドライ実験中のいくつかの株の粉末計数を示す棒グラフである。
【図８】フリーズドライ実験中のいくつかの株のフリーズドライでの生存率を示す棒グラフである。
【図９】フリーズドライ状態にされたいくつかの株の胃内でのインビトロ生存率を示す棒グラフである。
【図１０】株Ｂ４３２１、Ｂ２８２８およびＢ２８３０に関する２００μＭのＧＤＣにおける胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示す棒グラフである。
【図１１】株Ｂ４３２１、Ｂ２８２８およびＢ２８３０に関する胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性（Ｏｘｇａｌ）を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２８】
乳酸桿菌の７１８の株の初期ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）試験を実施して、異なるタイプの胆汁酸塩に対する耐性を評価した。次に、胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を確立するために、さらなる実験を実施して、２８６の耐性株における胆汁の沈殿を調査した。
【００２９】
試験した株は、乳酸桿菌アシドフィルス（acidophilus）、乳酸桿菌ヘルベティカス（helveticus）、乳酸桿菌アリメンタリス（alimentarius）、乳酸桿菌ブレビス（brevis）、乳酸桿菌ブチネリ（buchneri）、乳酸桿菌カゼイ（casei）（亜種：ラムノサス（rhamnosus）、カゼイ（casei）、トレランス（tolerans）、シュードプランタルム（pseudoplantarum）、パラカゼイ（paracasei）、アラクトスス（alactotsus）およびラムノサス（rhamnosus）を含む）、乳酸桿菌クリスパタス（crispatus）、乳酸桿菌クルバトゥス（curvatus）（亜種：クルバトゥス（curvatus）を含む）、乳酸桿菌デルブリュッキ（delbrueckii）（亜種：ブルガリクス（bulgaricus）およびラクチス（lactis）を含む）、乳酸桿菌ファーメンタム（fermentum）、乳酸桿菌パニス（panis）、乳酸桿菌パラカゼイ（paracasei）（亜種：パラカゼイ（paracasei）を含む）、乳酸桿菌ペントスス（pentosus）、乳酸桿菌プランタルム（planatarum）、乳酸桿菌プランタルム（plantarum）、乳酸桿菌ラムノサス（rhamnosus）、乳酸桿菌サケイ（sakei）、乳酸桿菌サリバリウス（salivarius）（亜種：サリバリウス（salivarius）を含む）であった。
【００３０】
株を、ＭＲＳ中３７℃で終夜増殖させた。これらの培養物の中からグリセロール原液を生成し、−８０℃で保存した。マイクロタイタープレートに接種し、すべての株を、マスタプレートに四連で入れた。
【００３１】
これらの実験で使用した胆汁酸塩は、Ｓｉｇｍａ（登録商標）から購入し、以下の通りであった。グリコデオキシコール酸ナトリウム（ＧＤＣＡ）（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｇ３２５８、ＣＡＳ：１６４０９−３４−０）、タウロデオキシコール酸ナトリウム水和物（ＴＤＣＡ）（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｔ０８７５、ＣＡＳ：２０７７３７−９７−１）およびウシ胆汁（Ｏｘｇａｌ）（Ｓｉｇｍａ製品番号Ｂ３８８３、ＣＡＳ：８００８−６３−７）。実験で使用した胆汁酸塩の濃度は、以下の通りであった。０．５％ＧＤＣＡ、０．５％ＴＤＣＡ、０．５％ｏｘｇａｌ、および２．０％ｏｘｇａｌ。グリコデオキシコール酸を使用するインビトロデータは、ヒトのインビボ環境をより厳密に模倣するので、生成物の有効性の可能性を反映する可能性がより高いと思われる。
【００３２】
培養物を、９６ウェルプレートで、ＭＲＳＡ中３７℃で終夜増殖させた。次に、９６ウェルプレート中ＭＲＳＡ寒天１５０μｌを含有し、添加した胆汁酸塩を含むウェルに、培養物５μｌをスポッティングし、好気／嫌気条件下で４８時間インキュベートした。株の適切な増殖を確実にするために、ｐＨ条件をモニタした。
【００３３】
結果は、ある特定の株が、嫌気条件下および好気条件下の両方で、ＭＲＳＡプレート上で実際に増殖したことを示した。以下の表１は、初期ＨＴＳから得られた陽性結果のすべてを示しており、特定の株は、嫌気条件下で、様々な胆汁酸塩上で増殖することができる（ＯＤ６００の測定によって評価した）。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
図１は、多くの株が、ＭＲＳＡ中、好気条件下で十分に増殖したことを示している。図３に示されている通り、ＧＤＣＡは、好気条件下であらゆる場合において株の増殖を阻害するが、図２に示されている通り、嫌気条件下では、いくつかの株がＧＤＣＡ中で実際に増殖する。２．０％Ｏｘｇａｌは、好気条件および嫌気条件の両方においていくつかの株の増殖を阻害することが見出された。
【００３６】
以下の表２は、増殖の結果の簡単な概要を示す。
【００３７】
【表２】
0006666256.tif 000003
【００３８】
合計４１の株は、３種類すべての胆汁酸塩が０．５％で存在する状態で増殖することが見出された。
【００３９】
次に、耐性株における胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を、５μｌを「ＰＣＲチューブプレート」（薄肉微量遠心管中寒天１５０μｌ）にスポッティングすることによって評価した。これらのチューブプレートを、９６ウェルプレートと同じ条件下で増殖させた（ＭＲＳ＋０．５％ＴＤＣＡ、ＭＲＳ＋０．５％ＧＤＣＡ、ＭＲＳ＋０．５％ｏｘｇａｌ、ＭＲＳ＋２．０％ｏｘｇａｌ、胆汁なしのＭＲＳ（対照））。
【００４０】
プレートを、３７℃で嫌気的にインキュベートし、胆汁の沈殿（胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性に関する）を、以下の採点系を使用して、２４時間および４８時間後に評価した。ＢＳＨ活性については、＋または−として増殖を記録する。次に、０．５％ｏｘｇａｌを含有するＭＲＳプレート上へのその後の画線培養のために、陽性を選択した。
【００４１】
７２時間後、数個の陽性を識別した。陽性培養物だけが、ＧＤＣＡおよびＴＤＣＡにおける沈殿を示した。
【００４２】
図４は、初期ハイスループットスクリーニングアッセイに使用した株の範囲を示す。
【００４３】
初期（earler）ＢＳＨ活性に基づいて株数を２４まで絞った後、０．４％を補充したＭＲＳ培地におけるコレステロール同化のさらなるスクリーニングを実施した。
【００４４】
以下の表３は、選択された株およびそれらのコレステロール低下の平均（％）の結果を示す。
【００４５】
【表３】
0006666256.tif 000004
【００４６】
図５は、表の結果を棒グラフで示しており、最初の８つの株の間には、株の残りと比較して大きな差異があることを示している。
【００４７】
以下の表４および図６は、光学密度に対して正規化されたコレステロール同化を示している。
【００４８】
【表４】
0006666256.tif 000005
【００４９】
次に、コレステロール低下（％）（以下の表５）および腸内の株の潜在的な増殖有効性の文脈においてＯＤに正規化したコレステロール低下（以下の表６）に基づいて、株の結果を比較して評価を行った。
【００５０】
【表５】
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【００５１】
【表６】
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【００５２】
株２８２８（ＥＣＧＣ１３１１０４０３）、２８３０（ＥＣＧＣ１３１１０４０２）、２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）およびＡＴＣＣ４３１２１は、先の表５および６の両方の分析において、高コレステロールの低下および良好なＢＳＨ活性を示している。実施したインビトロ試験は、これらの株が、互いに組み合わせられようと、または個々であろうと、個体のコレステロール吸収の改変、または心疾患、糖尿病もしくは肥満の処置に使用するのに適し得ることを強力に示唆している。これらの株を、増殖に特異的なプレバイオティクスと併用すると、増殖を促進し、支持することができる。
【００５３】
次に、いくつかの株が、フリーズドライに上手く対処する方法、および選択された３種類の株の特定の胆汁酸塩に対するその後のＢＳＨ活性を調査するための実験を実施した。
【００５４】
第１のステップは、いくつかの株を発酵させることであった。株は、選択されたすべての担体および抗凍結剤を酸性にすることが見出された。配合物は、生成中に冷間加工されるべきであると評価された。担体の選択およびそれらの最終濃度は、以下の通りであった。８２％ＭＤ＋１４％ソルビトール（ＭＤ＝マルトデキストリン）（残りの培地、および細菌）および８２％ＭＤ＋１４％スクロース。すべての株は、酵母エキスおよび大豆ペプトンのミックスを用いて、選択された窒素供給源上で十分に増殖した。動物成分は、この検証については提案されなかったが、大豆ペプトンは、不溶性沈殿物を生じる場合があり、これは将来的に下流処理を妨害するおそれがあると評価された。生成に使用される培地は、１００％ＹＥに基づくものと評価され、他の窒素供給源を含まないことが理想的であった。以下の表７は、選択された３種類の株（Ｂ４３２１、Ｂ２８２８およびＢ２８３０）に関する、培地中の発酵の結果および生存率の概要を示す。以下のデータでは、Ｂ４３２１は、過去に言及したＢ２６９１と同じ株に関する。
【００５５】
【表７】
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【００５６】
図７は、いくつかの株の粉末計数を示し、図８は、同じ株のフリーズドライでの生存率を示す。
【００５７】
図９は、胃内の株の生存率を示す。株Ｂ４３２１（Ｂ２６９１）は、明らかに試験条件下でより良好に生存している。約１０９ＣＦＵ／ｍＬの定常細胞を、ペプシンおよびリパーゼを含むＮａ／Ｋ／ＨＣｌ溶液中、ｐＨ２．４５で６０分間インキュベートした。
【００５８】
図１０および１１は、選択された株に対する胆汁酸塩ヒドロラーゼ活性を示している。Ｂ２８２８およびＢ２８３０は、３時間でほぼ１００％の基質に変換された。したがって、これらの株を区別することは不可能であると思われた。
【００５９】
前述の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護範囲を制限するものではなく、本発明を実施することができる方法を例示する。
【００６０】
生物学的材料の寄託
生物学的材料の寄託は、英国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＮＣＴＣ）の英国特許出願の目的で行われた。ＮＣＴＣは、ブダペスト条約の下で認知されている国際寄託当局（ＩＤＡ）である。
【００６１】
英国のＮＣＴＣに寄託された株のそれぞれには、接頭辞ＥＣＧＣを有する番号が割り当てられている。ＥＣＧＣは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを表す。
【００６２】
Ｂ２６９１（ＥＣＧＣ１３１１０４０１）は、元々、ＮＣＴＣに寄託されたとき、Ｌ．ロイテリ（reteri）として表現型的に分類されていたことに留意されたい。その後、Ｂ２６９１は、遺伝子分析に基づいてＬ．プランタルム（plantarum）であることが見出され、この株は、本願ではＢ２６９１と呼ばれており、後の実験ではＢ４３２１と改名された。
【００６３】
【表８】
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【００６４】
【表９】
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【００６５】
【表１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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