(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコサミノグリカン誘導体を製造する方法であって：
ａ）グリコサミノグリカンのＮ−硫酸化残基の２５％から１００％をＮ−脱硫酸化する工程；
ｂ）５．５から１０．０のｐＨで過ヨウ素酸塩により、隣接ジオール及び隣接ＯＨ／ＮＨ２をアルデヒドに変換するのに効果的な条件下で、前記グリコサミノグリカンの２−Ｎ−、３−Ｏ−非硫酸化グルコサミン残基の２５％から１００％及び２−Ｏ−非硫酸化ウロン酸残基を酸化する工程；及び
ｃ）水素化ホウ素ナトリウムにより、前記アルデヒドをアルコールに変換するのに効果的な条件下で、前記酸化されたグリコサミノグリカンを還元する工程；を含み、
前記グリコサミノグリカンが、天然又は合成のグリコサミノグリカンであり、
前記天然又は合成のグリコサミノグリカンが、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、又は、それらの画分であり、
前記グリコサミノグリカン誘導体は、ヘパラナーゼを阻害する、
グリコサミノグリカン誘導体を製造する方法。
【請求項２】
ｄ）Ｎ−脱硫酸化の前又は後に、前記グリコサミノグリカンの２−Ｏ−硫酸化残基の５０％以下を２−Ｏ−脱硫酸化する工程；を更に含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｄ）は、前記グリコサミノグリカンの２−Ｏ−硫酸化残基の２５％以下を２−Ｏ−脱硫酸化する、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｅ）Ｎ−脱硫酸化の前又は後に、前記グリコサミノグリカンのＮ−アセチル化された残基を部分的又は完全に脱アセチル化する工程；を更に含む、
請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記天然又は合成のグリコサミノグリカンが、非分画ヘパリン又は分子量３，５００から８，０００Ｄａのヘパリンである、
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法。
に記載の方法。
【請求項６】
前記グリコサミノグリカン誘導体は、３，０００から２０，０００Ｄａの分子量を有する、
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコサミノグリカン誘導体は、３，５００から１２，０００Ｄａの分子量を有する、
請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項の前記グリコサミノグリカン誘導体の酵素的又は化学的部分解重合を行う、
オリゴ糖化合物を製造する方法。
【請求項９】
前記グリコサミノグリカン誘導体、及び、前記オリゴ糖化合物は、薬剤として用いる、
請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤は、抗転移薬又は抗腫瘍薬である、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗腫瘍薬は、抗骨髄腫薬である、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
誘導体が下記の構造のいずれも備えることを特徴とするＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体であって、
前記Ｎ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体の出発物質であるグリコサミノグリカンは、天然又は合成のグリコサミノグリカンから選択され、
前記天然又は合成のグリコサミノグリカンは、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸、又は、それらの画分である、
Ｎ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体。
【化１】
0006753610.tif 000003
Ｒ２は、それぞれＳＯ３-又はＨであり、
Ｒ３は、ＳＯ３-又はＨであり、
Ｒ４は、ＳＯ３-又はＨである。
【請求項１３】
下記の構造のいずれも更に備えることを特徴とする、
請求項１２に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体。
【化２】
0006753610.tif 000004
Ｒ２は、それぞれＳＯ３-又はＨであり、
Ｒ３は、ＳＯ３-又はＨである。
【請求項１４】
前記誘導体は、（ａ）３，０００〜２０，０００Ｄａから選択される分子量、又は、（ｂ）３，５００〜１２，０００Ｄａから選択される分子量を有する、
請求項１２または請求項１３に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体。
【請求項１５】
前記天然又は合成のグリコサミノグリカンは、非分画ヘパリン又は３５００〜８０００Ｄａの分子量を有するヘパリンである、
請求項１２〜請求項１４のいずれか１項に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体。
【請求項１６】
隣接ジオール及びＯＨ／ＮＨ２が対応するアルデヒドに変換され、次いで対応するアルコールに変換されたグリコール分割残基（ＲＯ）の全グリコサミノグリカン残基に対する％（百分率）は、３１％〜５４％である、
請求項１２〜請求項１５のいずれか１項に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体。
【請求項１７】
２−Ｏ−硫酸化Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ２Ｓ）の全グリコサミノグリカン残基に対する％（百分率）は、２９％〜４０％である、
請求項１２〜請求項１６のいずれか１項に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体。
【請求項１８】
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の全グリコサミノグリカン残基に対する％（百分率）は、６％〜３０％である、
請求項１２〜請求項１７のいずれか１項に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体。
【請求項１９】
２−ＮＨ２グルコサミン（ＧｌｃＮＨ２）の全グリコサミノグリカン残基に対する％（百分率）は、４％〜１３％である、
請求項１２〜請求項１８のいずれか１項に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体。
【請求項２０】
ヘパラナーゼの阻害から恩恵を得る適応症の治療において使用する、
請求項１２〜請求項１９のいずれか１項に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体に記載のオリゴ糖化合物。
【請求項２１】
抗転移薬又は抗腫瘍薬として使用する、
請求項１２〜請求項１９のいずれか１項に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体に記載のオリゴ糖化合物。
【請求項２２】
抗骨髄腫薬として使用する、
請求項１２〜請求項１９のいずれか１項に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体に記載のオリゴ糖化合物。
【請求項２３】
請求項１２〜請求項１９のいずれか１項に記載のＮ−脱硫酸化グリコサミノグリカン誘導体に記載のオリゴ糖化合物を含む、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−脱硫酸化（N-desulfation）及び任意ではあるが２−Ｏ−脱硫酸化されたグリコサミノグリカン誘導体（glycosaminoglycan derivatives）に関し、そこでは隣接ジオール及びＯＨ／ＮＨ２の少なくとも一部が対応するアルデヒドに変換されてから、そのアルデヒドが対応するアルコールに還元されている。これらの生成物はヘパラナーゼ阻害活性及び抗腫瘍活性を有する。前記グリコサミノグリカン誘導体は、天然又は合成のグリコサミノグリカンから得られ、好ましくは非分画ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、ヘパラン硫酸、又はそれらの誘導体から得られる。天然のグリコサミノグリカンは任意の動物源から得ることができる（様々な動物種及び動物性器官を用いることができる）。
【０００２】
本発明は更に、このグリコサミノグリカン誘導体を調製する方法に関し、更には、病態に有用な薬剤の活性原材料としてのその利用に関する。特に、前記病態は、多発性骨髄腫及び他のがん（即ち、非上皮性悪性腫瘍、上皮性悪性腫瘍、血液悪性腫瘍）を含み、その転移型も含む。本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、腫瘍学的治療法であるかないかを問わず、他の治療法と組み合わせた場合でも薬剤として使用できる。更には、本発明は、ヘパラナーゼの阻害から恩恵を得る任意の治療指標（即ち、糖尿病性腎症、炎症性腸疾患、大腸炎、関節炎、乾癬、敗血症、アテローム性動脈硬化症）における、好ましくはヘパリン及び低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）から得られる前記Ｎ−脱硫酸化され場合により２−Ｏ−脱硫酸化されたグリコサミノグリカン誘導体の使用に関し、公知の確立された薬物又は治療と組み合わせた使用も含む。
【０００３】
本発明は更に、前記のＮ−脱硫酸化され、任意にＯ−脱硫酸化されたグリコサミノグリカン誘導体の少なくとも１種を活性原材料として含有する医薬組成物に関し、そこでは隣接ジオール及びＯＨ／ＮＨ２の少なくとも一部が、対応するアルデヒドに変換された後に、対応するアルコールに還元されている。任意ではあるが、本発明は、少なくとも１種の他の活性原材料、より好ましくは治療用化合物と組み合わせて前記グリコサミノグリカン誘導体の少なくとも１種を活性原材料として含有する医薬組成物に関する。好ましくは、前記グリコサミノグリカン誘導体は、ヘパリン誘導体又は低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）である。
【背景技術】
【０００４】
多発性骨髄腫は、二番目に多く見られる血液悪性腫瘍であり、米国における血液がん全体の１０％以上を占めている。毎年約２０，０００件の新たな症例が出ており、致死率は５０％を超えている（Ｇｒａｈａｍ−Ｒｏｗｅ  Ｄ．、２０１１、多発性骨髄腫の見通し（Multiple myeloma outlook）、Ｎａｔｕｒｅ  ４８０、ｓ３４〜ｓ３５）。
【０００５】
最近の数年間に、有望な治療法、例えばプロテアソーム阻害剤（ベルケイド）、ビスホスフォネート、サリドマイドなどの投与が開発されている。これらの薬剤の有効性は、少なくとも部分的には、骨髄腫腫瘍微環境に及ぼすその影響によるものである。
【０００６】
骨髄腫に対する有効性は前記薬剤によって示されたものの、骨髄腫及び他の腫瘍の治療のための新規の改良された薬物に対する必要性が存在する。
【０００７】
ヘパラナーゼは、シンデカン−１などのプロテオグリカンのヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖（ＰＧ−ＨＳ）を開裂し、それによりＨＳ結合型増殖因子を放出するエンド−β−グルクロニダーゼである。
【０００８】
人体には、ＨＳを開裂可能な単一の優勢な機能性ヘパラナーゼ酵素が存在するように見受けられる。ヘパラナーゼは、ヒトの腫瘍の多くが発現し、その場合、腫瘍細胞の血管形成能及び転移能を大幅に増大させる。ヘパラナーゼレベルの上昇は、実際に多くの腫瘍型の進行及び転移と相関関係があった。例えば、高レベルのヘパラナーゼは、患者の術後生存期間の短縮と関連している。腫瘍転移におけるヘパラナーゼの直接的な役割は、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ及びＳａｎｄｅｒｓｏｎ教授の研究室で実証され、そこで我々の新規な阻害剤もテストされてきた。
【０００９】
ＨＳ結合型増殖因子の放出及び侵入性細胞による細胞外基質（ＥＣＭ）の分解を含む酵素機能に加え、ヘパラナーゼは、腫瘍挙動及びその微環境に影響を及ぼし得る非酵素機能も有する。Ｓａｎｄｅｒｓｏｎのグループは、骨髄腫におけるヘパラナーゼ及びシンデカン−１を対象とした研究の先駆者であり、ヘパラナーゼが骨髄腫の浸潤性腫瘍表現型の主要調節因子として作用することを立証した。これは、ＶＥＧＦ及びＭＭＰ−９の上方調節を促進することによって起こり、同時に腫瘍増殖、転移性及び溶骨性骨破壊を増進する。実際、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ヘパラナーゼが骨髄腫腫瘍の成長及び骨への自然転移を促進すること、ならびに腫瘍細胞によるヘパラナーゼの発現が、少なくとも部分的にはＲＡＮＫＬ発現の上方調節による、著しい骨溶解を助長することが実証されている。ヘパラナーゼの骨溶解促進効果は、骨が劣化すると骨結合型増殖因子が放出されることから、非常に重要となり得る。加えて、破骨細胞は、ＨＧＦなどの腫瘍増殖促進因子を放出する可能性がある。同時に、これらの因子は、腫瘍細胞のホーミングとその後の増殖を助けるニッシェの骨髄内における形成を助長し得る（Ｆｕｘ，Ｌら、２００９、ヘパラナーゼ：細胞表面で活発（Heparanase : busy at the cell surface）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ３４（１０）：５１１〜５１９；Ｓａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｒ．Ｄ．及びＹａｎｇ  Ｙ．、２００８、シンデカン−１：骨髄腫微環境の動的な調節因子（Syndecan-1 : a dynamic regulator of the myeloma microenvironment）、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ２５：１４９〜５９；Ｉｌａｎ  Ｎ．他、２００６、がん転移及び血管形成におけるヘパラナーゼの制御、機能及び臨床的意義（Regulation, function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３８：２０１８〜２０３９）。従って、ヘパラナーゼの阻害は、骨髄腫治療の実行可能な目標であり、酵素的に活性な単一のヘパラナーゼが存在するという事実、及び通常の組織においてその発現はまれであるという事実によって裏付けられる。更には、ヘパラナーゼノックアウトマウスは生存可能であって観察可能な障害を何ら示さないことが証明されている。このことは、ヘパラナーゼ阻害方策からは副作用がほとんどあるいは全く生じないことを示している（Ｃａｓｕ  Ｂ．他、２００８、非抗凝固性ヘパリン及びがんの阻害（Non-anticoagulant heparins and inhibition of cancer）、Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈａｅｍｏｓｔ  Ｔｈｒｏｍｂ．３６：１９５〜２０３；Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ  Ｉ．ら、２００７、ヘパラナーゼ：構造、生物学的機能、及びヘパラン硫酸のヘパリン由来模倣薬による阻害（Heparanase : structure, biological functions, and inhibition by heparin-derived mimetics of heparan sulfate）、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．１３：２０５７〜２０７３；Ｎａｇｇｉ  Ａ．ら、２００５、選択的脱硫酸化、段階的Ｎ−アセチル化、及びグリコール分割によるヘパリンのヘパラナーゼ阻害活性の調節（Modulation of the Heparanase-inhibiting Activity of Heparin through Selective Desulfation, Graded N- Acetylation, and Glycol Splitting）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：１２１０３〜１２１１３）。
【００１０】
ヘパリンは、グリコサミノグリカンファミリーの線状多分散硫酸化多糖類であり、抗凝固活性及び抗血栓活性を有する。ヘパリンの単糖鎖は、交互に並んだウロン酸とＤ−グルコサミン残基（ｒｅｓｉｄｕｅｓ）からなる。主要な繰り返し単位は、二糖類２−Ｏ−硫酸化Ｌ−イズロン酸（ＩｄｏＡ２Ｓ）α（１→４）とＮ−、６−Ｏ−硫酸化Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮ６Ｓ）である。微量成分は、非硫酸化Ｌ−イズロン酸及びＤ−グルクロン酸であり、更にＮ−アセチルＤ−グルコサミン及びＮ−、３−Ｏ−、６−Ｏ−三硫酸化Ｄ−グルコサミンである（ＣａｓｕＢ．、２００５、ヘパリンの構造及び活性ドメイン（Structure and active domains of heparin）、出典：ヘパリン及びヘパラン硫酸の化学及び生物学（Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate）、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ．１〜２８；Ｃａｓｕ  Ｂ．及びＬｉｎｄａｈｌ  Ｕ、２００１、ヘパリン及びヘパラン硫酸の構造及び生物相互作用（Structure and biological interactions of heparin and heparan sulfate）、Ａｄｖ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍ５７：１５９〜２０６）。ヘパリンは、構造的にＨＳに類似しており、効率的にヘパラナーゼを阻害できるが、ヘパラナーゼ阻害方策における高用量での使用は、その抗凝固活性のために不可能である。
【００１１】
興味深いことに、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、ヘパリンよりも生物学的利用可能性が高くて抗凝固性が低く、おそらくは腫瘍の増殖及び転移に対する直接的作用によりがん患者の生存期間を延長するようにみえる。それは、少なくともある程度は、ヘパラナーゼ酵素活性の阻害によると考えられる（Ｚａｃｈａｒｓｋｉ  Ｌ．Ｒ．、及びＬｅｅ，Ａ．Ｙ．２００８、抗がん治療としてのヘパリン（Heparin as an anticancer therapeutic）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ１７：１０２９〜１０３７）；Ｙａｎｇ  Ｙ．他、２００７、「シンデカン−１  ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、骨髄腫治療のための実行可能な目標である（The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy）」、Ｂｌｏｏｄ、１１０：２０４１〜２０４８）。
【００１２】
ヘパラナーゼの酵素活性の効果的な阻害剤は、先行技術においては非抗凝固性ヘパリンによるヘパラナーゼ阻害を研究することによって選択されてきており、そのほとんどは、２−３結合におけるグルコシド環の開環（グリコール分割）によって改質された非硫酸化ウロン酸残基を含有する。前記阻害剤は、元々存在する非硫酸化ウロン酸残基と段階的２−Ｏ−脱硫酸化によって生成される非硫酸化ウロン酸残基の両方のＯ−硫酸化、Ｎ−アセチル化、及びグリコール分割の程度の点で異なっている（Ｎａｇｇｉ  Ａ．、２００５、「ヘパリン及びヘパリン誘導体による増殖因子の阻害及びヘパラナーゼ阻害を調節するための手段としてのグリコール分割（Glycol-splitting as a device for modulating inhibition of growth factors and heparanase inhibition by heparin and heparin derivative）」出典：ヘパリン及びヘパラン硫酸の化学及び生物学（Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate）、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ４６１〜４８１）。
【００１３】
「グリコール分割（ｇｓ）」という用語は、従来は、それぞれヒドロキシル基を持つ２つの隣接する炭素間の１つの結合の切断（グリコール分割）によって一部の単糖類残基の開環を生じる炭水化物ポリマーを意味している。第一世代のグリコール分割ヘパリン、すなわち、いわゆる「還元オキシヘパリン」（ＲＯヘパリン）は、時にはグリコール分割残基によって遮断される未改質多硫酸化ブロックから主になり、これは、元の鎖に沿って存在する非硫酸化グルクロン酸／イズロン酸残基に対応する（Ｎａｇｇｉ  Ａ．、２００５、「ヘパリン及びヘパリン誘導体による増殖因子の阻害及びヘパラナーゼ阻害を調節するための手段としてのグリコール分割（Glycol-splitting as a device for modulating inhibition of growth factors and heparanase inhibition by heparin and heparin derivative）」出典：ヘパリン及びヘパラン硫酸の化学及び生物学（Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate）、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ４６１〜４８１）。このヘパリンに対する化学的作用がＡＴＩＩＩの結合部位におけるグルクロン酸残基を改質し、ヘパリンの抗凝固活性を低下させ、又は無効にし、ヘパリンの高用量での使用を可能とする。
【００１４】
ＷＯ９２／１７１８８は、ヘパリンの非抗凝固性種の平滑筋細胞に対する抗増殖活性を開示する。前記ヘパリンは、天然のヘパリン鎖の微量成分であるＮ−アセチルグルコサミン単位のヒドラジン含有薬剤によるＮ−脱アセチル化と、その後のジオール又は隣接ＯＨ／ＮＨ２基の対応するアルデヒドへの過ヨウ素酸酸化によって調製される。酸化後は、グリコサミノグリカンの断片化を実質的に起こすことなくアルデヒドのアルコールへの還元が行われる。Ｎ−硫酸化単位は、この酸化還元によって影響を受けない。
【００１５】
Ｎ−脱硫酸化ヘパリン（ケミカルアブストラクト登録番号５３２６０−５２−９）は、メルクインデックス（１４版、２００６）においては「ヘパラミン」としても知られ、抗凝固活性の低下、ＶＥＧＦ発現及び血管形成の阻害によるマウスにおける胃がんの転移に対する幾ばくかの活性（Ｃｈｅｎ−Ｊ−Ｌ他、２００７、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２１、４５７〜４６１）、及び虚血及び再かん流によって誘発される肝／腎障害の防止（Ｃｈｅｎ−Ｊ−Ｌ他、２００２、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ８、８９７〜９００）といった幾つかの効果を有することが知られている。Ｎ−脱硫酸化ヘパリンは、様々なＮ−アシル化ヘパリンの合成のための中間体としても知られている。Ｎ−脱硫酸化度は、ヘパリンに存在するＮ−硫酸化グルコサミン残基の１０％から１００％とすることができる（Ｈｕａｎｇ  Ｌ．及びＫｅｒｎｓ  ＲＪ．２００６、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、１４、２３００〜２３１３）。
【００１６】
ＷＯ０１／５５２２１は２−Ｏ−脱硫酸化度が全ウロン酸単位の６０％以下のグリコサミノグリカンを開示している。前記グリコサミノグリカンは抗凝固活性を持たず、ＦＧＦの阻害に基づく抗血管形成活性を示す。ヘパラナーゼの阻害については、活性は予測されていない。
【００１７】
ＵＳ２００８／００５１５６７は、１００％Ｎ−アセチル化され２５％グリコール分割されたヘパリンに対応する化合物を開示する。この化合物は、骨髄腫のサンダーソンモデルを含む実験動物モデルにおいて、ヘパラナーゼ、腫瘍増殖、血管形成及び炎症を阻害する一方で、抗凝固活性をほとんどあるいは全くもたらさず、細胞外基質からの増殖因子のわずかな放出をもたらすものである。
【発明の概要】
【００１８】
それにも関わらず、ヘパラナーゼ阻害活性がより高く、選択性がより高く、生物学的利用能と、骨髄腫及び他の腫瘍などのヘパラナーゼに関連した病変の治療に対する有効性が向上した改良化合物を提供する必要性が依然として存在する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１：グリコサミノグリカンの過ヨウ素酸酸化及びホウ化水素還元によって生成される優勢な構造である。（１）１つのウロン酸（イズロン酸及び／又はグルクロン酸）と１つのグルコサミン（２−Ｎ−アセチル化、２−Ｎ−非置換の及び／又は２−Ｎ−硫酸化）を含むグリコサミノグリカンポリマーの二糖類単位であり、ヒドロキシル基（Ｒ４）は硫酸基で置換又は非置換とすることができる。Ｎ−脱硫酸化（N-desulfation）後、グリコサミノグリカンポリマーは、２−Ｎ−アセチル化グルコサミン（２）と２−ＮＨ２グルコサミン（天然及び／又はＮ−脱硫酸化）（３）を含む二糖類単位を含むことができる。過ヨウ素酸酸化及びホウ化水素還元は、２−Ｏ−非硫酸化ウロン酸残基（５，６，８）の隣接ジオール及び２−Ｎ−及び３−Ｏ−非硫酸化グルコサミン（７，８）の隣接ＯＨ／ＮＨ２基の対応するアルデヒドへの変換（酸化による）、ならびにその後の対応するアルコールへの変換（還元による）をもたらす。ここで留意すべきは、Ｎ−脱硫酸化グルコサミンと２−Ｏ−非硫酸化ウロン酸を含有する二糖類単位においては、両残基がジアルデヒドに変換され、次いでグリコール分割残基（８）に変換されることである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、化学的に改質された新規なグリコサミノグリカン、特にはヘパリン及びＬＭＷＨに関し、これらはヘパラナーゼとそのヘパラン硫酸分解活性を強力に阻害する。
【００２１】
本発明の新規な化合物は、ヘパラナーゼ阻害活性を有する、Ｎ−脱硫酸化され任意ではあるが２−Ｏ−脱硫酸化されたグリコサミノグリカンの誘導体であり、隣接ジオール及びＯＨ／ＮＨ２の少なくとも一部が、対応するアルデヒドに変換され、そのアルデヒドが、対応するアルコールに還元されている。アルデヒドへの変換は、好ましくは過ヨウ素酸塩を採用し、それぞれアミン及びヒドロキシル置換基を持つ、ウロン酸残基の隣接ジオールの結合とグルコサミンのＣ２−Ｃ３結合の両方を切断するのに適した条件で実施される。出発化合物は、当然ながら２−Ｏ−非硫酸化ウロン酸残基を更に含有することができる。特に、Ｎ−脱硫酸化はＮ−硫酸化グルコサミン残基上で起こり、一方、Ｏ−脱硫酸化は２−Ｏ−硫酸化ウロン酸残基上で起こる。
【００２２】
好ましくは、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、非分画ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、ヘパラン硫酸、又はそれらの画分などの天然又は合成のグリコサミノグリカンに由来し、後者は、化学的又は酵素的に調製され（Ｎａｇｇｉ  Ａ．他、２００１、「大腸菌Ｋ５多糖類の化学的改質と酵素的改質の併用によるバイオテクノロジ的ヘパリンを目指して（Toward a biotechnological heparin through combined chemical and enzymatic modification of the Escherichia coli K5 polysaccharide）」、血栓症と止血のセミナー（Seminars in thrombosis and hemostasis）、２７、５４３７）、より好ましくは、グリコサミノグリカン誘導体は、天然又は合成のヘパリン又はＬＭＷＨに由来する。
【００２３】
Ｎ−硫酸化グルコサミン残基の特異的Ｎ−脱硫酸化は、実質的に前記残基を対応するアルデヒドへの変換（及びそれに続く対応するアルコールへの変換）が起こりやすいものとする。これらの残基が３−Ｏ−非硫酸化となることももたらす。図１には、グリコサミノグリカン鎖に存在することができる全ての二糖類単位とそのＮ−脱硫酸化、酸化及び還元反応後の変化が概略図で示されている。
【００２４】
一例として、ヘパリン鎖は本来約５％から約３５％の２−Ｏ−非硫酸化ウロン酸残基、０％から５０％のＮ−アセチル化グルコサミン残基、及び約０％から６％のＮ−非置換（Ｎ−硫酸化もＮ−アセチル化もされていない）グルコサミン残基を含むことができる。組成の違いは、ヘパリン源（動物種、器官提供者）及び抽出手順の違いによる。
【００２５】
グリコサミノグリカンの非硫酸化残基は、炭素２上のものも炭素３上のものも、全てアルデヒドへの変換を起こしやすい。結果として、本発明の方法に含まれる広範囲にわたるＮ−脱硫酸化は、隣接ＯＨ／ＮＨ２が、対応するアルデヒドに（次いで対応するアルコールに）変換される単位の割合の増加に伴い、天然グリコサミノグリカンにおける変換しやすい単位の割合を超える、更なる前記変換が可能な残基を提供する。ただし、２−Ｏ−硫酸化イズロン酸残基の自然の含有量は維持する。場合により、グリコサミノグリカンの化学的に誘発される２−Ｏ−脱硫酸化は、本発明による酸化及び還元反応を受けやすいグルコサミンとウロン酸の比の調節を可能とする。
【００２６】
本発明は更に、Ｎ−脱硫酸化及び任意ではあるが２−Ｏ−脱硫酸化され、隣接ジオール及びＯＨ／ＮＨ２が開環を伴って、対応するアルデヒドに変換されそのアルデヒドが対応するアルコールに還元されている前記グリコサミノグリカン誘導体に関する。本発明は更に、前記グリコサミノグリカン誘導体を調製する方法に関し、更には、多発性骨髄腫及び他のがんなどであって、その転移型も含む病態を治療するための薬剤の活性原材料としてのその使用に関する。更には、本発明は、ヘパラナーゼの阻害から恩恵を得る任意の治療指標における前記グリコサミノグリカン誘導体の使用に関する。本発明は更に、Ｎ−脱硫酸化及び任意ではあるが２−Ｏ−脱硫酸化され、隣接ジオール及びＯＨ／ＮＨ２が開環を伴って、対応するアルデヒドに変換されそのアルデヒドが対応するアルコールに還元されている前記グリコサミノグリカン誘導体を含有する医薬組成物に関する。
【００２７】
本発明のＮ−脱硫酸化及び任意ではあるが２−Ｏ−脱硫酸化されたグリコサミノグリカン誘導体は、
ａ）グリコサミノグリカンのＮ−硫酸化グルコサミン残基の２５％から１００％、好ましくは３０％から９０％、より好ましくは４５％から８０％をＮ−脱硫酸化する工程；任意ではあるが、この方法はグリコサミノグリカンの２−Ｏ硫酸化残基の５０％以下、好ましくは２５％以下を２−Ｏ−脱硫酸化することを更に含む；得られた生成物は、好ましくは０％から５０％のＮ−アセチル化グルコサミン残基、５０％から１００％のＮ−非硫酸化グルコサミン残基を含む；
ｂ）好ましくは過ヨウ素酸酸化により、２Ｎ−、３−Ｏ−非硫酸化グルコサミン残基の隣接ＯＨ／ＮＨ２及び２−Ｏ−非硫酸化ウロン酸残基（元の鎖に沿って自然に存在する非硫酸化残基だけでなく化学的に脱硫酸化された残基も含む）の隣接ジオールを対応するアルデヒドに変換する工程；２Ｎ−、３−Ｏ−非硫酸化グルコサミン残基は、２５％から１００％として存在できる；
ｃ）好ましくは水素化ホウ素ナトリウムにより、前記アルデヒドを、対応するアルコールに還元する工程；
を含む方法によって得ることができる。
【００２８】
任意ではあるが、この方法は、グリコサミノグリカンのＮ−アセチル化残基を部分的又は完全に脱アセチル化することを更に含む。
【００２９】
好適な実施の形態において、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、天然又は合成（化学的又は酵素的に調製された）のグリコサミノグリカンから、好ましくは、非分画ヘパリン、ＬＭＷＨ、ヘパラン硫酸又はそれらの誘導体から得られる。より好ましくは、本発明のグリコサミノグリカン誘導体は、ヘパリン又はＬＭＷＨから得られる。
【００３０】
好適な実施の形態において、酸化、好ましくは過ヨウ素酸酸化、は、ウロン酸の隣接ジオールと、それぞれアミノ及びヒドロキシル置換基を持つグルコサミンのＣ２とＣ３の間の結合の両方を開裂する条件下で実行される。
【００３１】
好適な実施の形態において、Ｎ−脱硫酸化度が異なる改質グリコサミノグリカン試料、好ましくは改質されたヘパリン又はＬＭＷＨを、公知の方法を変更して実行される過ヨウ素酸酸化及び水性媒体中での水素化ホウ素ナトリウム還元に付す。過ヨウ素酸酸化は、解重合を低減させるために使用するキレート剤金属イオン封鎖剤であるＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）の存在下で実行してもよく、溶液をアルカリ化するためのＮａＨＣＯ３もしくはピリジンの存在下で実行してもよく、又はＮＴＡと共にまたはＮＴＡなしでＭｎＣｌ２の存在下で実行してもよい。好ましくは、過ヨウ素酸酸化は、ＮＴＡの存在下で実行される。好ましくは、酸化は、５．５と１０．０の間のｐＨで、より好ましくは、６．０と９．０の間のｐＨで実行される。
【００３２】
本発明は更に、５．５と１０の間、より好ましくは６．０と９．０の間のｐＨで、好ましくは過ヨウ素酸塩により前記グリコサミノグリカンを酸化することを含む、グリコサミノグリカンのグルコサミン残基のＣ２−Ｃ３結合を切断する方法に関する。
【００３３】
好ましくは、隣接ＯＨ／ＮＨ２が対応するアルデヒドに変換されてから、そのアルデヒドが、対応するアルコールに還元されるグルコサミン残基が、グリコサミノグリカンのグルコサミン残基の２５％から１００％、より好ましくは５０％から１００％、最も好ましくは６０％から９０％である。
【００３４】
上記の方法によって得ることができるグリコサミノグリカン由来化合物は、好ましくは分子量が、方法条件及び出発物質であるグリコサミノグリカンにより、８００から３０，０００Ｄａとなる。出発物質として非分画ヘパリンを採用した場合、上記の方法によって得ることができるグリコサミノグリカン由来化合物は、好ましくは分子量が３，０００から２０，０００Ｄａ、好ましくは４，０００から１２，０００Ｄａである。
【００３５】
本発明の新規なグリコサミノグリカン誘導体は、意外にもｉｎ  ｖｉｔｒｏでは強力なヘパラナーゼ阻害剤であって、動物モデルでは骨髄腫を阻害することが証明されている。
【００３６】
隣接ジオール及びＯＨ／ＮＨ２が対応するアルデヒドに変換され、そのアルデヒドが対応するアルコールに還元されている単位の数がより多い生成物は、天然のグリコサミノグリカン及びそのＲＯ誘導体よりも硫酸化度も低い。従って、その生成物は、改質残基の含有量が少ないそれらの類似体よりも低いタンパク質相互作用と好ましい薬物動態を示すことが期待される。
【００３７】
本発明は更に、薬剤として用いるための、上記の方法によって得ることができる化合物に関する。
【００３８】
特に、本発明は、抗転移剤として、抗腫瘍薬として、好ましくは抗骨髄腫薬として用いるための、上記方法によって得ることができる化合物に関する。
【００３９】
本発明に従って調製されるヘパリン及び低分子量ヘパリン誘導体は、その低硫酸化度にも関わらず、多発性骨髄腫実験用モデルにおいては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方において効果的なヘパラナーゼの阻害活性を示している。
【００４０】
更には、本発明の誘導体は、低分子量（実施例５、６及び８参照）であっても、２−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンから得られる、分子量が同程度のＲＯヘパリンより高いヘパラナーゼ阻害活性を示す。後者を表１に示す。
【表１】
0006753610.tif 000002
【００４１】
データは、ＲＯ型グリコール分割ヘパリンの分子量が低いほどヘパラナーゼ阻害活性が低下するという一般的な傾向を示している。
【実施例】
【００４２】
［化合物の調製］
以下の実施例に開示する非分画ヘパリン（以下、ＵＦＨという）のＮ−脱硫酸化は、公知の方法（Ｉｎｏｕｅ  Ｙ及びＮａｇａｓａｗａ  Ｋ、１９７６、「水又はメタノールを含有するジメチルスルホキシドによるヘパリンの選択的Ｎ−脱硫酸化（Selective N-desulfation of heparin with dimethyl sulfoxide containing water or methanol）」、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ４６（１）、８７〜９５）を修正することによって実行された。Ｎ−脱硫酸化度は、１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｎａｇｇｉ  Ａ．他、２００１、「過硫酸化ヘパリンの制御された脱硫酸化による抗因子Ｘａ活性３−Ｏ−硫酸化グルコサミンに富む配列の生成（Generation of anti-factor Xa active, 3-O-sulfated glucosamine-rich sequences by controlled desulfation of oversulfated heparins）」、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３６、４、２８３〜２９０）によって判定した。
【００４３】
Ｎ−脱硫酸化度が異なる改質ヘパリンの試料を、２つのアルデヒド基を持つ分割単位を生じる過ヨウ素酸酸化と、最終的なヘパリン誘導体を生じる水性媒体中での水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）還元に付した；両反応は、公知の方法を修正することによって実行した。過ヨウ素酸酸化は、好ましくはＮａＨＣＯ３、ピリジン、ＭｎＣｌ２又はＭｎＣｌ２とＮＴＡの存在下で実行した。ＵＦＨの段階的な２−Ｏ−脱硫酸化を、公知の方法（Ｊａｓｅｊａ  Ｍ．他、１９８９「アルカリ性溶液におけるヘパリンの新規な位置及び立体選択的改質−核磁気共鳴分光学的証拠（Novel regio- and stereo-selective modifications of heparin in alkaline solution. Nuclear magnetic resonance spectroscopic evidence）」Ｃａｎａｄ  Ｊ  Ｃｈｅｍ、６７、１４４９〜１４５５；Ｒ．Ｎ．Ｒｅｊ  Ａｒｔｈｕｒ  Ｓ．Ｐｅｒｌｉｎ  １９９０「ヘパリンのα−Ｌ−イズロン酸２−硫酸単位のα−Ｌ−ガラクチュロン酸単位への塩基触媒変換及び関連反応（Base-catalyzed conversion of the a-L-iduronic acid 2-sulfate unit of heparin into a unit of a-L-galacturonic acid, and related reactions）」Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００、２５、４３７〜４４７；Ｃａｓｕ  Ｂ．他、２００４「抗血管形成活性を有する低硫酸化グリコール分割ヘパリン（Undersulfated and Glycol-Split Heparins Endowed with Antiangiogenic Activity）」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、４７、８３８〜８４８）を修正したものに従い実行した。以下、「ＲＯ」は、隣接ジオール及びＯＨ／ＮＨ２が対応するアルデヒドに変換され、次いで対応するアルコールに変換されたグリコール分割残基の全グリコサミノグリカン残基に対する％（百分率）を示す。
【００４４】
［Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験］
Ｂｉｓｉｏ他の以前の研究（Ｂｉｓｉｏ  Ａ．他、２００７「ヘパラナーゼによる開裂に対するヘパリン種の感受性に関する高性能液体クロマトグラフィー／質量分光研究（High-performance liquid chromatographic/mass spectrometric studies on the susceptibility of heparin specie to cleavage by heparanase）」Ｓｅｍ  Ｔｈｒｏｍｂ  ｈｅｍｏｓｔ  ３３  ４８８〜４９５）に基づき、イスラエルハイファ大学のＶｌｏｄａｖｓｋｙ教授のグループによってヘパラナーゼ阻害活性が、Ｈａｍｍｏｎｄ他が記載する方法（Ｈａｍｍｏｎｄ他、２０１０「動態解析及び阻害剤スクリーニングに適するヘパラナーゼ活性に関する比色分析の開発（Development of a colorimetric assay for heparanase activity suitable for kinetic analysis and inhibitor screening）」Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、３９６、１１２〜６）に従いｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定された。端的に言えば、ヘパラナーゼは、ヘパリンの抗トロンビン結合部位に構造的に対応する抗血栓剤である合成五糖類フォンダパリヌクスを開裂することができる。ヘパラナーゼによる加水分解の結果、三糖類と還元性二糖類が得られる。後者は、ヘパラナーゼ活性を評価するために容易に定量化できる。本実施例においては、分析溶液（１００μｌ）は、４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０と、１００ｍＭフォンダパリヌクス（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）とを含み、阻害剤試料は含む場合と含まない場合がある。分析の最初にヘパラナーゼを最終濃度１４０ｐＭまで添加した。容器を粘着テープで封止し、３７℃で２から２４時間培養した。１．６９ｍＭの４−［３−（４−ヨードフェニル）−１Ｈ−５テトラゾリオ］−ｌ，３−ベンゼンジスルホナート（ＷＳＴ−１，Ａｓｐｅｐ、オーストラリア  メルボルン）の０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液１００μｌの添加によって分析を停止した。容器を粘着テープで再度封止し、６０℃で６０分間生育させた。吸光度を５８４ｎｍ（Ｆｌｕｏｓｔａｒ、ＢＭＧ、Ｌａｂｔｅｃｈ）で測定した。各容器において、Ｄ−ガラクトースを還元糖標準として、同じ緩衝液と体積で２〜１００μＭの濃度範囲で構築した標準曲線を用意した。ＩＣ５０値を判定した。上記の比色分析を用いて得られた結果を、放射性硫酸塩で標識した細胞外基質（ＥＣＭ）を基質として採用する別のテストを用いて検証した。端的に言えば、ＥＣＭ基質は、培養した角膜内皮細胞によって堆積されるため、組成、生物学的機能、及びバリア性が内皮化基底膜に酷似している。硫酸塩標識ＥＣＭの調製とヘパラナーゼ分析のためのその使用についての詳細な情報は、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ，Ｉ．、細胞生物学における現在のプロトコル（Current Protocols in Cell Biology）、Ｃｈａｐｔｅｒ１０：Ｕｎｉｔ１０．４、２００１に記載されている。
【００４５】
［Ｉｎ  ｖｉｖｏ試験］
ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗骨髄腫活性を、Ｙａｎｇ  Ｙ他（Ｙａｎｇ  Ｙ．他、２００７、「シンデカン−１ヘパラン硫酸プロテオグリカンは、骨髄腫治療のため実現可能な目標である（The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy）」、Ｂｌｏｏｄ１１０：２０４１〜２０４８）に記載の手順に実質的に従いテストした。端的に言えば、５から６週齢のＣＢ１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスをＡｒｌａｎ（インディアナ州インディアナポリス）又はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国）から得た。マウスをバーミンガムのアラバマ大学の動物施設に収容して監視した。実験手順及びプロトコルは全て、動物実験委員会の承認を得た。１×１０６ヘパラナーゼ発現ＣＡＧ骨髄腫細胞（高発現及び低発現）を各マウスの左脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞の注射１０日後、Ａｌｚｅｔ浸透圧ポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州クパチーノ）をマウスの右脇腹に埋め込んだ。ポンプには、テスト化合物（新しいヘパリン誘導体）の溶液又は対照としてのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）が入れてあった。溶液は、１４日間連続して供給した。１４日後、動物を殺し、皮下腫瘍の湿重量と平均血清Κレベルを分析してログランク検定によって実験群内で比較した（ｐ＜０．０５が統計的に有意であると考えられる）。
【００４６】
一週間のルシフェラーゼ生物発光画像化が原発腫瘍に関する定量的なデータを提供し、軟質組織だけでなく骨内の転移も追跡する。とりわけ、ＳＣＩＤ−ｈｕモデルは、ＳＣＩＤマウスの皮下に移植したヒト胎児骨の小片にヒト腫瘍細胞が直接注射されるため、ヒト骨髄腫を綿密に再現するという点で独特である。
【００４７】
［ＮＭＲ分析の一般的手順］
スペクトルを２５℃にて、５−ｍｍＴＣＩ凍結探針又は１０ｍｍＢＢＯプローブを備えるＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ５００分光計（ドイツ  カールスルーエ）で記録した。スペクトルにおけるピーク面積又は体積の積分は、標準的なＢｒｕｋｅｒ  ＴｏｐＳｐｉｎ２．０ソフトウエアを用いて行った。
【００４８】
［非分画ヘパリンのＮ−脱硫酸化］
【００４９】
［実施例１（Ｇ８２２０）］
ＵＦＨ（４．０１ｇ、ｌｏｔ番号Ｇ３３７８）を水（３２ｍｌ）に溶解し、撹拌下にＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ１２０（Ｈ＋、１４４ｍｌ）で処理した。ろ過した酸溶液をピリジンでｐＨ７とし、次いで減圧下で乾燥するまで濃縮した。得られたピリジニウム塩を、ＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ（体積で９５：５）混合物４０ｍｌに溶解し、次いで２５℃で４８時間撹拌した。４０ｍｌの水で希釈した後、溶液を薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対して透析を行った。減圧下での濃縮と凍結乾燥により、Ｇ８２２０（２．７ｇ）、収率＝６７％ｗ／ｗ、ＭＷ＝１９，１００Ｄａ、１３Ｃ−ＮＭＲによって判定したＮ−脱硫酸化度＝全グルコサミン残基の７４．７％、１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した２−Ｏ硫酸化ウロン酸＝全単糖類の１８％、が得られた。
【００５０】
［実施例２（Ｇ８３４３）］
実施例１に記載の手順に従い、ＵＦＨの試料（０．２５ｇ、ロット番号Ｇ３３７８）を対応するピリジニウム塩に変換し、それをＤＭＳＯ：ＭｅＯＨ（体積で９５：５）の混合物中でＮ−脱硫酸化した。２５℃にて２時間撹拌下に置いた後、反応混合物を実施例１に記載の最終手順に従って処理すると、Ｇ８３４３（０．１７２ｇ）、収率＝６９％ｗ／ｗ、ＭＷ＝１８，０００Ｄａ、１３Ｃ−ＮＭＲによって判定したＮ−脱硫酸化度＝全グルコサミン残基の６３．３％、１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した２−Ｏ硫酸化ウロン酸＝全単糖類の１９％、が得られた。
【００５１】
［実施例３（Ｇ８５１６）］
ＵＦＨの試料（０．２５ｇ、ロット番号Ｇ３３７８）から出発して実施例２に記載の手順を踏んだが、Ｎ−脱硫酸化反応時間を４０分に短縮すると、Ｇ８５１６（０．１７ｇ）、収率＝６８％、１３Ｃ−ＮＭＲによるＮ−脱硫酸化度＝全グルコサミン残基の４９．７％、１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した２−Ｏ硫酸化ウロン酸＝全単糖類の１７％、が得られた。
【００５２】
［実施例４（Ｇ８１４７）］
ＵＦＨ（２．５ｇ、ロット番号Ｇ３３７８）を水（２０ｍｌ）に溶解し、撹拌下にＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ１２０（Ｈ＋，９０ｍｌ）で処理した。ろ過した酸溶液をピリジンでｐＨ７とし、次いで減圧下で乾燥するまで濃縮した。得られたピリジニウム塩を、ＤＭＳＯ：ＭｅＯＨ（体積で９０：１０）の混合物２５ｍｌに溶解し、次いで２５℃で１８時間撹拌した。２５ｍｌの水で希釈した後、溶液を薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対して透析を行った。減圧下での濃縮と凍結乾燥により、Ｇ８１４７（１．９ｇ）、収率＝７６％ｗ／ｗ、ＭＷ＝１８，２００Ｄａ、１３Ｃ−ＮＭＲによるＮ−脱硫酸化度＝全グルコサミン残基の６０％、が得られた。
【００５３】
実施例５（Ｇ９４１６）］
ＵＦＨ（５ｇ、ロット番号Ｇ３３７８）を水（４０ｍｌ）に溶解し、撹拌下にＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ１２０（Ｈ＋，９０ｍｌ）で処理した。ろ過した酸溶液をピリジンでｐＨ７とし、次いで減圧下で乾燥するまで濃縮した。得られたピリジニウム塩を、ＤＭＳＯ：ＭｅＯＨ（体積で９５：５）の混合物１００ｍｌに溶解し、次いで、２５℃で１８時間撹拌した。１００ｍｌの水で希釈した後、溶液を薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対して透析を行った。減圧下での濃縮と凍結乾燥により、Ｇ９４１６（３．６５ｇ）、収率＝７３％ｗ／ｗ、ＭＷ＝１８，８００Ｄａ、１３Ｃ−ＮＭＲによるＮ−脱硫酸化度＝全グルコサミン残基の７７％、が得られた。
【００５４】
［実施例６（Ｇ８０７９）］
ＵＦＨ（１ｇ、ロット番号Ｇ３３７８）を水（８ｍｌ）に溶解し、撹拌下にＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ１２０（Ｈ＋、９０ｍｌ）で３０分間処理した。ろ過した酸溶液をピリジンでｐＨ７とし、次いで減圧下で乾燥するまで濃縮した。得られたピリジニウム塩を、ＤＭＳＯ：ＭｅＯＨ（体積で９５：５）の混合物１０ｍｌに溶解し、次いで２５℃で１６時間撹拌した。１０ｍｌの水で希釈した後、溶液を薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で３日間、蒸留水に対して透析を行った。減圧下での濃縮と凍結乾燥により、“Ｇ８０７９”（１ｇ）、収率＝１００％ｗ／ｗ、１３Ｃ−ＮＭＲによるＮ−脱硫酸化度＝全グルコサミン残基の６０％、が得られた。
【００５５】
［Ｎ−脱硫酸化ヘパリンの過ヨウ素酸酸化及び水素化ホウ素ナトリウム還元］
【００５６】
［実施例７（Ｇ８３４０）］
水（７．３ｍｌ）に溶解し４℃に冷却した実施例１のＧ８２２０の試料（０．２５ｇ、７４．７％のＮ−脱硫酸化ヘパリン残基）を、同じ体積の０．２Ｍ  ＮａＩＯ４に添加した。ｐＨ値を２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（約２．１ｍｌ）で６．８に調節し、暗闇で４℃にて撹拌下に０．０８Ｍニトリロ三酢酸（ＮＴＡ、１０ｍｌ）を溶液に添加した。２Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ値を４．０から６．６にし、反応混合物を４℃で８時間、撹拌下に置いた。エチレングリコール（０．７３ｍｌ）を添加して過剰な過ヨウ素酸塩をクエンチし、１時間後、反応混合物を薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対する透析を行って脱塩した。脱塩した溶液をＮａＢＨ４（０．１６４ｇ、３．４ｍｍｏｌ）で処理し、２５℃で３時間撹拌してから、ＮａＢＨ４の過剰分をクエンチするためにそのｐＨ値を１Ｎ  ＨＣｌで４にし、１０分間の撹拌の後、０．１Ｎ  ＮａＯＨで中和した。薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対して透析を行い、減圧下での濃縮及び凍結乾燥を行った結果、０．２０２ｇのＧ８３４０、収率＝９０％ｗ／ｗ、ＭＷ＝８，４００Ｄａ、が得られた。全単糖類残基に対するＲＯ（５３％）、ＩｄｏＡ２Ｓ（３５％）、ＧｌｃＮＡｃ（９％）及びＧｌｃＮＨ２（１２％）の割合を１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヘパラナーゼ阻害：ＩＣ５０＝２０ｎｇ／ｍｌ。
ｉｎ  ｖｉｖｏの抗骨髄腫活性：６０ｍｇ／Ｋｇ／日、１４日間：７５％腫瘍阻害及び６０％血清Ｋ阻害。
【００５７】
［実施例８（Ｇ８４３８）］
実施例２のＧ８３４３（６３．３％がＮ−脱硫酸化ヘパリン残基を０．１７１ｇ）から出発して実施例７に記載の手順と同じ手順を踏むと、Ｇ８４３８（９１．４ｍｇ）、収率＝８２％、ＭＷ＝６，８００Ｄａ、が得られた。ＲＯ（３８％）、ＩｄｏＡ２Ｓ（３２％）、ＧｌｃＮＡｃ（８％）、ＧｌｃＮＨ２（４％）の割合を１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヘパラナーゼ阻害ＩＣ５０：６０ｎｇ／ｍｌ。
【００５８】
［実施例９（Ｇ８５８８）］
実施例３のＧ８５１６（４４％がＮ−脱硫酸化ヘパリン残基を０．１７１ｇ）から出発して実施例７に記載の手順に従うと、Ｇ８５８８（０．１３６ｇ）、収率＝８０％、ＭＷ＝１１，０００Ｄａが得られた。ＧｌｃＮＡｃ（３０％）、ＧｌｃＮＨ２（１３％）、ＩｄｏＡ２Ｓ（３４％）、ＲＯ（３７％）の割合を１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した。
【００５９】
［実施例１０（Ｇ９５７８）］
実施例５のＧ９４１６から出発して実施例７に記載の手順に従うと、Ｇ９５７８、収率＝８９％、ＭＷ＝６，３００Ｄａ、１３Ｃ−ＮＭＲによるＮ−脱硫酸化度＝全グルコサミン残基の４８％、が得られた。グリコサミノグリカンの全残基に対するＲＯ（４５％）及びＩｄｏＡ２Ｓ（３５％）の割合を、１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した。本発明の生成物に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、以下の結果が得られた：
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヘパラナーゼ阻害：ＩＣ５０＝７５ｎｇ／ｍｌ；
ｉｎ  ｖｉｖｏの抗骨髄腫活性（６０ｍｇ／ｋｇ／日、１４日間）：６３％腫瘍阻害。
【００６０】
［実施例１１（Ｇ８１８８）］
水（７．３ｍｌ）に溶解し４℃に冷却した実施例４のＮ−脱硫酸化ヘパリンＧ８１４７の試料（０．２５ｇ、６０％のＮ−脱硫酸化ヘパリン残基）を、同じ体積の０．２Ｍ  ＮａＩＯ４に添加した。暗闇で４℃にて１６時間、撹拌下にｐＨ値を２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（約２．１ｍｌ）で６．８に調節した。エチレングリコール（０．７３ｍｌ）を添加して過剰な過ヨウ素酸塩をクエンチし、１時間後、反応混合物を薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対する透析を行って脱塩した。脱塩した溶液をＮａＢＨ４（０．１６４ｇ、３．４ｍｍｏｌ）で処理し、３時間２５℃で撹拌し、次いで、ＮａＢＨ４の過剰分をクエンチするためにそのｐＨ値を１Ｎ  ＨＣｌで４にし、１０分間の撹拌の後、０．１Ｎ  ＮａＯＨで中和した。薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対して透析を行い、減圧下での濃縮及び凍結乾燥を行った結果、０．１６８ｇのＧ８１８８、収率＝６７％ｗ／ｗ，ＭＷ＝３，４６０Ｄａ、が得られた。ＲＯ（４３％）、ＩｄｏＡ２Ｓ（４０％）、ＧｌｃＮＡｃ（６％）及びＧｌｃＮＨ２（４％）の割合を１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した。
【００６１】
［実施例１２（Ｇ８１８９）］
水（７．３ｍｌ）に溶解し４℃に冷却したＧ８１４７の試料（０．２５ｇ、６０％のＮ−脱硫酸化ヘパリン残基）を、同じ体積の０．２Ｍ  ＮａＩＯ４に添加した。暗闇で４℃にて１６時間、撹拌下にｐＨ値をピリジン（５％ｖ／ｖ、約７３０μｌ）で６．８に調節した。エチレングリコール（０．７３ｍｌ）を添加して過剰の過ヨウ素酸塩をクエンチし、１時間後、反応混合物を４℃で１６時間、薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで蒸留水に対する透析を行って脱塩した。脱塩した溶液をＮａＢＨ４（０．１６４ｇ、３．４ｍｍｏｌ）で処理し、３時間２５℃で撹拌し、次いで、ＮａＢＨ４の過剰分をクエンチするためにそのｐＨ値を１Ｎ  ＨＣｌで４にし、１０分間の撹拌の後、０．１Ｎ  ＮａＯＨで中和した。薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対して透析を行い、減圧下での濃縮及び凍結乾燥を行った結果、０．１８１ｇのＧ８１８９、収率＝７２％ｗ／ｗ、ＭＷ＝５，１５０Ｄａが得られた。ＲＯ（４９％）、ＩｄｏＡ２Ｓ（３９％）、ＧｌｃＮＡｃ（７％）及びＧｌｃＮＨ２（７％）の割合を１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した。
【００６２】
［実施例１３（Ｇ８２１７）］
水（７．３ｍｌ）に溶解し４℃に冷却したＧ８１４７の試料（０．２５ｇ、６０％のＮ−脱硫酸化ヘパリン残基）を、同じ体積の０．２Ｍ  ＮａＩＯ４に添加した。２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（約２．１ｍｌ）でｐＨ値を６．８に調節し、３０ｍｌのＭｎＣｌ２０．０５Ｍ（溶液の最終濃度は０．００００１Ｍ）を暗闇で４℃にて１６時間、撹拌下に添加した。エチレングリコール（０．７３ｍｌ）を添加して過剰の過ヨウ素酸塩をクエンチした。夜間にｐＨが８になったため、試料は沈殿し、次いで、そのｐＨ値を１Ｎ  ＨＣｌで６にした。１時間後、反応混合物を薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対する透析を行って脱塩した。脱塩した溶液をＮａＢＨ４（０．１６４ｇ、３．４ｍｍｏｌ）で処理し、３時間２５℃で撹拌し、次いで、ＮａＢＨ４の過剰分をクエンチするためにそのｐＨ値を１Ｎ  ＨＣｌで４にし、１０分間の撹拌後、０．１Ｎ  ＮａＯＨで中和した。薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対して透析を行い、減圧下での濃縮及び凍結乾燥を行った結果、０．２３０のＧ８２１７、収率＝９２％ｗ／ｗ、ＭＷ＝７，４５５Ｄａ、が得られた。全グリコサミノグリカン残基に対するＲＯ（３１％）、ＩｄｏＡ２Ｓ（２９％）、ＧｌｃＮＡｃ（８％）及びＧｌｃＮＨ２（６％）の割合を１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した。
【００６３】
［実施例１４（Ｇ８２１９）］
水（７．３ｍｌ）に溶解し４℃に冷却したＧ８１４７の試料（０．２５ｇ、６０％のＮ−脱硫酸化ヘパリン残基）を同じ体積の０．２Ｍ  ＮａＩＯ４に添加した。２Ｍ  ＮａＨＣＯ３（約１．２ｍｌ）でｐＨ値を６．８に調節し、撹拌下に暗闇で、４℃にて０．０８Ｍニトリロ三酢酸（ＮＴＡ，１０ｍｌ）とＭｎＣｌ２０．０５Ｍ３１ｍｌとを溶液に添加した。２Ｍ  ＮａＨＣＯ３を添加してｐＨ値を４．０から６．３にし、反応混合物を４℃で８時間、撹拌下に置いた。エチレングリコール（０．７３ｍｌ）を添加して過剰な過ヨウ素酸塩をクエンチし、１時間後、反応混合物を薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対する透析を行って脱塩した。透析した溶液をＮａＢＨ４（０．１６４ｇ、３．４ｍｍｏｌ）で処理し、３時間２５℃で撹拌し、次いで、ＮａＢＨ４の過剰分をクエンチするためにそのｐＨ値を１Ｎ  ＨＣｌで４にし、１０分間の撹拌後、０．１Ｎ  ＮａＯＨで中和した。薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対して透析を行い、減圧下での濃縮及び凍結乾燥を行った結果、０．２０２ｇのＧ８２１９、収率＝９０％ｗ／ｗ、ＭＷ＝７，３３０Ｄａ、が得られた。ＲＯ（５４％）、ＩｄｏＡ２Ｓ（３６％）、ＧｌｃＮＡｃ（９％）及びＧｌｃＮＨ２（８％）の割合を１３Ｃ−ＮＭＲによって判定した。
【００６４】
［比較例１５（Ｇ８０９２）］
水（２９．２ｍｌ）に溶解し４℃に冷却したＧ８０７９の試料（１ｇ、Ｎ−脱硫酸化ヘパリン）に、同じ体積のＮａＩＯ４（ｐＨ５）を添加し、反応混合物を４℃で８時間撹拌下に置いた。エチレングリコール（２．９ｍｌ）を添加して過剰の過ヨウ素酸塩をクエンチし、１時間後、反応混合物を薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で１６時間、蒸留水に対する透析を行って脱塩した。透析した溶液をＮａＢＨ４（０．６５７ｇ、３．４ｍｍｏｌ）で処理し、３時間２５℃で撹拌し、次いで、ＮａＢＨ４の過剰分をクエンチするためにそのｐＨ値を１Ｎ  ＨＣｌで４にし、１０分間の撹拌後、０．１Ｎ  ＮａＯＨで中和した。薄膜（カットオフ：３，５００Ｄａ）に包んで４℃で７２時間、蒸留水に対して透析を行い、減圧下での濃縮及び凍結乾燥を行った結果、０．６４３ｇのＧ８０９２、収率＝６４％ｗ／ｗ、ＭＷ＝６，０６４Ｄａ、が得られた。１３Ｃ−ＮＭＲ分析では、Ｎ−脱硫酸化グルコサミンの９５ｐｐｍにピークを示す。酸性のｐＨでの酸化反応は起こらない。
［第１の局面］
ヘパラナーゼを阻害するグリコサミノグリカン誘導体を調製する方法であって：
ａ）グリコサミノグリカンのＮ−硫酸化残基の２５％から１００％をＮ−脱硫酸化する工程；
ｂ）５．５から１０．０のｐＨで好ましくは過ヨウ素酸塩により、隣接ジオール及び隣接ＯＨ／ＮＨ２をアルデヒドに変換するのに効果的な条件下で、前記グリコサミノグリカンの２−Ｎ−、３−Ｏ−非硫酸化グルコサミン残基及び２−Ｏ−非硫酸化ウロン酸残基の２５％から１００％を酸化する工程；及び
ｃ）好ましくは水素化ホウ素ナトリウムにより、前記アルデヒドをアルコールに変換するのに効果的な条件下で、前記酸化されたグリコサミノグリカンを還元する工程；を含む、
グリコサミノグリカン誘導体を調製する方法。
［第２の局面］
ｄ）Ｎ−脱硫酸化の前又は後に、前記グリコサミノグリカンの２−Ｏ−硫酸化残基の５０％以下、好ましくは２５％以下を２−Ｏ−脱硫酸化する工程；を更に含む、
第１の局面に記載の方法。
［第３の局面］
ｅ）Ｎ−脱硫酸化の前又は後に、前記グリコサミノグリカンのＮ−アセチル化された残基を部分的又は完全に脱アセチル化する工程；を更に含む、
第１の局面または第２の局面に記載の方法。
［第４の局面］
前記グリコサミノグリカンが、天然又は合成のグリコサミノグリカンであって、
好ましくは、前記天然又は合成のグリコサミノグリカンが、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ヘパラン硫酸又はそれらの画分であり、
より好ましくは、前記天然又は合成のグリコサミノグリカンが、分子量３，５００から８，０００Ｄａの非分画ヘパリン又はヘパリンである、
第１の局面〜第３の局面のいずれかに記載の方法。
［第５の局面］
グリコサミノグリカンの非硫酸化グルコサミン残基のＣ２−Ｃ３結合を開裂する方法であって、
前記グリコサミノグリカンを、好ましくは過ヨウ素酸塩により５．５から１０．０のｐＨで、より好ましくは６．０から９．０のｐＨで、酸化する工程；を含む、
Ｃ２−Ｃ３結合を開裂する方法。
［第６の局面］
第１の局面〜第４の局面のいずれかに記載の方法によって得ることができる、
グリコサミノグリカンの誘導体化合物。
［第７の局面］
分子量が、３，０００から２０，０００Ｄａ、好ましくは３，５００から１２，０００Ｄａである、
第６の局面に記載の誘導体化合物。
［第８の局面］
第６の局面または第７の局面のグリコサミノグリカンの誘導体化合物の酵素的又は化学的部分解重合により得ることができる、
オリゴ糖化合物。
［第９の局面］
薬剤として用いる、
第６の局面〜第８の局面のいずれかに記載の化合物。
［第１０の局面］
抗転移、抗腫瘍薬、好ましくは抗骨髄腫薬として用いる、
第９の局面に記載の化合物。
【図１】
0006753610.tif 000005