(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４から８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼのＮ末端に配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＭｙｃタグ、及び、Ｃ末端に配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＨｉｓタグが付加されたアルカリホスファターゼ誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のアルカリホスファターゼ誘導体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の発現ベクターを有する形質転換細胞。
【請求項５】
大腸菌またはチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求項４に記載の形質転換細胞。
【請求項６】
請求項４または５に記載の形質転換細胞を培養し、得られた培養液からアルカリホスファターゼ誘導体を回収する、アルカリホスファターゼ誘導体の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱安定性に優れた牛小腸由来高活性アルカリホスファターゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
アルカリホスファターゼ（ＥＣ  ３．１．３．１）は、アルカリ性に至適ｐＨを有する、基質選択性の低いホスホモノエステラーゼである。アルカリホスファターゼの多くは活性中心に亜鉛を有しており、大腸菌等の原核生物から哺乳動物等の真核高等生物にいたるまで、自然界に広く存在することが知られている。
【０００３】
アルカリホスファターゼは分子生物学分野や免疫診断分野において汎用されている有用性の高い酵素である。例えば分子生物学分野では、仔牛小腸由来のアルカリホスファターゼ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；以下ＣＩＡＰと表記）や北極小エビ由来のアルカリホスファターゼや大腸菌由来のアルカリホスファターゼ等が、ＤＮＡまたはＲＮＡの５’末端の脱リン酸化に利用されている。またヒト胎盤由来のアルカリホスファターゼ（特に分泌型に改変したもの）は、宿主細胞への外来遺伝子導入の効率を判定するためのレポーターとして利用されている。
【０００４】
アルカリホスファターゼの中でもＣＩＡＰは比活性が高いため免疫診断分野用途での有用性が高く、チャイニーズハムスター卵巣細胞（以下ＣＨＯ細胞と表記）（非特許文献１）やメタノール資化性酵母（特許文献１）を宿主細胞とした、組換えＣＩＡＰの生産が開示されている。
【０００５】
Ｍａｎｅｓらは、牛小腸から調製したｃＤＮＡライブラリーからアルカリホスファターゼ遺伝子をクローニングし、牛小腸由来アルカリホスファターゼ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；以下ｂＩＡＰと表記））がＩからＶＩＩまでのアイソマーからなることを明らかにし、さらにＩからＩＶのアイソマーの生化学的分析を行っている（非特許文献１）。ｂＩＡＰＩからＩＶのアイソマーのアミノ酸配列は、非常に相同性が高く、５６箇所に相違があるのみであり、ｂＩＡＰＩとＩＩの比較では、２４箇所に相違があるのみであった。しかしながらこれら４種類のアイソマーの生化学的性質は大きく異なっており、ｂＩＡＰＩＩ（ＣＩＡＰ）は、ｂＩＡＰＩからＩＶのアイソマーの中で最も高活性であるが、熱安定性は低く（Ｔ５０（１０ｍｉｎ）＝５９℃）、一方、ｂＩＡＰＩは、最も熱安定性は高い（Ｔ５０（１０ｍｉｎ）＝６６℃）が、比活性はｂＩＡＰＩＩの１／３以下であった（特許文献２）。ｂＩＡＰＩとｂＩＡＰＩＩのアミノ酸配列の相違に着目し、ｂＩＡＰＩとｂＩＡＰＩＩの変異体を作製し、比活性と熱安定性に有効な変異を検証した結果、高活性化には３２２位がグリシンであること、熱安定化には３２２位がアスパラギン酸であることが重要であった。ところが、ｂＩＡＰＩの３２２位をグリシンに置換した変異体（（Ｇｌｙ３２２）ｂＩＡＰＩ）は、比活性は、ｂＩＡＰＩＩ並に向上したが、熱安定性は低下し、ｂＩＡＰＩとｂＩＡＰＩＩの間になった。さらにｂＩＡＰＩＩの３２２位をアスパラギン酸に置換した変異体（（Ａｓｐ３２２）ｂＩＡＰＩＩ）は、熱安定性は向上し、ｂＩＡＰＩとｂＩＡＰＩＩの間になったが、比活性はｂＩＡＰＩ並に低下した。ｂＩＡＰＩ並に熱安定性が高く、かつ、ｂＩＡＰＩＩ並に高活性であるアルカリホスファターゼ変異体は得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３６５７８９５号公報
【特許文献２】特許第４２９５３８６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｍａｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３（３６）、２３３５３−２３３６０（１９９８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、熱安定性に優れた高活性アルカリホスファターゼを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ｂＩＡＰＩＩの３２２位がアスパラギン酸、３２３位がリジンもしくはアスパラギン、３８５位がセリンもしくはグリシンもしくはアスパラギン、４３０位がアラニンであるｂＩＡＰＩＩ変異体が、熱安定性に優れ、かつ高比活性であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、以下の態様を包含する。
（１）  配列番号４から８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼ（以下、本発明のアルカリホスファターゼと称する）。
（２）  本発明のアルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチドと称する）。
（３）本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターと称する。）。
（４）本発明の発現ベクターを有する形質転換細胞（（以下、本発明の細胞と称する。）。
（５）本発明の細胞が、大腸菌、もしくはチャイニーズハムスター卵巣細胞である（４）に記載の細胞。
（６）本発明の細胞を培養し、得られた培養液からアルカリホスファターゼを回収する、アルカリホスファターゼの生産方法（以下、本発明のアルカリホスファターゼ生産方法と称する。）。
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１１】
本発明のアルカリホスファターゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列であるｂＩＡＰＩＩの３２２位がアスパラギン酸であり、４３０位がアラニンである配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち以下の（１）および／または（２）に記載のアミノ酸置換が生じたアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼである。
（１）Ｋ３２３Ｎ  （２）Ｓ３８５Ｇ／Ｎ
具体的には、配列番号４から８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むアルカリホスファターゼを例示でき、当該ポリペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側にオリゴペプチドの付加された誘導体も包含している。ｂＩＡＰを含め哺乳動物由来のアルカリホスファターゼの多くは膜結合性のため、アルカリホスファターゼのＣ末端側２０から３０アミノ酸残基にＧＰＩアンカー領域を有しているが、分泌発現させるためにＧＰＩアンカー領域を除去してもよい。
【００１２】
さらに精製や検出を容易にするため、Ｎ末端側および／またはＣ末端側にタグ配列を付加してもよい。タグ配列としては、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグが例示できる。Ｎ末端側および／またはＣ末端側にタグ配列を付加した本発明のアルカリホスファターゼの具体例として、配列番号１１および１２をあげることができる。
【００１３】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアルカリホスファターゼをコードする塩基配列である。アミノ酸をコードする塩基配列は複数あるため、翻訳された結果同一のアミノ酸になるポリヌクレオチドは本発明に含有されるが、宿主細胞での使用頻度の高いコドンを用いたポリヌクレオチドであることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドの具体例として、配列番号１３から１７のいずれかに記載のポリヌクレオチドをあげることができる。
【００１４】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを機能発現させるための環状または直鎖状のポリヌクレオチドである。本発明の発現ベクターの構成要素としては、本発明のポリヌクレオチド、およびその５’末端側にインフレームに連結したシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドに加えて、転写活性化配列（プロモーター／エンハンサー）、転写終結配列、薬剤耐性や栄養要求性などのマーカー遺伝子、宿主細胞内でプラスミドとして増殖するために必要な複製開始点などが含まれる。ここでインフレームに連結とは、（ポリ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド同士が同じ読み取り枠で翻訳されるように配置することを指す。
【００１５】
シグナルペプチドは、トランスフェクションに用いる細胞において本発明のアルカリホスファターゼを分泌発現するものであれば特に限定されるものではなく、具体的には、マウスＭＭＰ−９由来のシグナルペプチド（特開２０１４−１８０２２２号公報）を例示できる。
【００１６】
本発明のアルカリホスファターゼをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドの５’末端側にインフレームで連結されたシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドは、化学合成やｃＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による酵素合成などを組み合わせることで合成できる。
【００１７】
前記ポリヌクレオチドを用いて発現ベクターを作製する際は、その上流に転写活性化配列（プロモーター／エンハンサー）を配置すると好ましい。転写活性化配列はトランスフェクションに用いる細胞で機能するものであれば特に限定されるものではなく、恒常的に活性化されているものであっても、外部条件によって活性を調節可能なものであってもよい。恒常的に活性化されているものとしては、Ｔ７プロモーター、ＬａｃＵＶ５プロモーター、Ｔｉｃプロモーター、Ｔｒｃプロモーター、Ｔａｃプロモーター、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ヒト伸長因子１−αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、β−アクチンプロモーター、ハムスターユビキチン／Ｓ２７ａプロモーターなどが例示でき、調節可能なものとしては、ＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）などが例示できる。
【００１８】
マーカー遺伝子は、トランスフェクションに用いる細胞において発現可能な選択マーカーをコードする遺伝子の中から適宜選択されたものであれば良く、具体的には、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン／カルベニシリン耐性遺伝子）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ネオマイシン抵抗性遺伝子）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ハイグロマイシンＢ抵抗性遺伝子）、ブラスティサイジンＳデアミナーゼ遺伝子（ブラスティサイジン抵抗性遺伝子）といった薬剤耐性遺伝子、グルタミンシンセターゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子といった栄養要求性に関わる遺伝子、緑色蛍光タンパク質遺伝子など光学的な識別を可能にする遺伝子等を例示できる。
【００１９】
本発明の発現ベクターは、大腸菌で働くｃｏｌＥ１複製開始点のような、動物細胞以外で働く複製開始点を含んでもよい。この場合には、β−ラクタマーゼ遺伝子とｃｏｌＥ１複製開始点とを含んだ、本発明の発現ベクターを大腸菌にトランスフェクションし、当該組換え大腸菌をカルベニシリン入りの培地で培養することで、本発明の発現ベクターを大量に調製することができる。例えば、プラスミドｐＯｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ（ライフテクノロジーズ社製）やプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒなどから、本発明の発現ベクターを好適に調製することができる。プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒは、Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１０８巻，６７３−６７６ページ（１９９０年）に記載の方法に従って入手することが出来る。
【００２０】
次に本発明の細胞及び本発明のアルカリホスファターゼ生産方法について説明する。本発明の発現ベクターをトランスフェクションされる宿主細胞は、大腸菌ではＫ−１２株やそれに由来する任意の菌株  （ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、Ｗ３１１０、Ｃ６００など）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現しているもの（例えばＢＬ２１（ＤＥ３））、哺乳動物細胞では、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞）、マウスミエローマ細胞（例えば、ＳＰ２／０細胞、Ｐ３Ｕ１細胞）及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が例示できる。ＣＨＯ細胞の株に特に限定はなく、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−６１）、ＣＨＯ−Ｓ細胞、ｄｈｆｒ遺伝子欠損株であるＤＧ４４細胞やＤＸＢ１１細胞が例示できる。より好ましくは、大腸菌では、ＤＨ５α、ＣＨＯ細胞では、ＤＧ４４細胞をあげることができる。
【００２１】
本発明の発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションするには、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などの当業者が通常用いる方法の中から適宜選択して行なえばよい。トランスフェクションに用いる本発明の発現ベクターは環状のポリヌクレオチドであってもよく、適切な制限酵素で消化することにより得られた直鎖状のポリヌクレオチドであってもよい。例えば、プラスミドｐＯｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ中に１ヶ所存在する制限酵素ＰｖｕＩの認識部位はベクターを直鎖状にする目的で用いることができる。この場合には、ｐＯｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯに挿入するポリヌクレオチド中に制限酵素ＰｖｕＩの認識部位を含まないよう設計するとよい。
【００２２】
本発明の発現ベクターをトランスフェクションして得られた形質転換細胞は、当業者が通常用いる方法で単クローン化し、単クローン化した細胞を培養して得られた培養液中のアルカリホスファターゼ活性を指標にして選抜することで、所望のアルカリホスファターゼ生産性を有した組換え細胞を取得することができる。なお前記選抜した組換え細胞に対して、さらに本発明の発現ベクターを導入し、そこから単クローン化した組換え細胞を培養することで、アルカリホスファターゼ活性が更に上昇した組換え細胞を選抜してもよい。
【００２３】
また本発明の発現ベクターに共発現可能な選択マーカーが含まれている場合、当該選択マーカーに対応した選択培地で培養することにより、当該選択マーカーが発現している組換え細胞群を選択することができ、当該選択した細胞群を単クローン化後、培養液中のアルカリホスファターゼ活性を指標にして選抜することもできる。一例として、共発現可能なｄｈｆｒ遺伝子を含む本発明の発現ベクターをｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、ヒポキサンチンおよびチミジンを含まない選択培地で培養し、ｄｈｆｒ遺伝子が発現している細胞群を増殖させ、当該細胞群から単クローン化した細胞を培養して培養液中のアルカリホスファターゼ活性を指標にして選抜することで所望のアルカリホスファターゼ生産性を有した組換え細胞を取得することができる。なお選択マーカーとしてｄｈｆｒ遺伝子を用いた場合、組換え細胞をメトトレキサート（ＭＴＸ）を含んだ培地で培養し、導入した遺伝子の増幅を誘導することで、アルカリホスファターゼ活性が更に上昇した組換え細胞を選抜することができる。
【００２４】
アルカリホスファターゼ活性は、当業者が通常用いる一般的な方法により測定することが出来る。具体的な測定方法には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質に用いた加水分解反応を挙げることが出来る。その一例として、反応温度２５℃で、ｐＨ９からｐＨ１０の緩衝液（例えば、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６））中で、アルカリホスファターゼ活性による加水分解反応で生じるｐ−ニトロフェノールを波長４０５ｎｍにおける吸光度で定量することにより、酵素活性を算出する方法が挙げられる。なお前記緩衝液に、ウシ血清アルブミンのような酵素活性への影響が少ないタンパク質や、塩化マグネシウムのようなマグネシウム塩や、塩化亜鉛のような亜鉛塩などを適量加えてもよい。アルカリホスファターゼ活性測定の具体的態様の例として、試料溶液５μＬを加えたマイクロウェルプレート（ＮＵＮＣ社製、カタログ番号２６９６２０）に、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（以下ｐＮＰＰと略記する）と、０．１％ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ａ７０３０）と、０．１ｍＭ塩化マグネシウムと、０．０１ｍＭ塩化亜鉛とを含んだ、０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）（ｐＮＰＰ基質溶液）を１００μＬ添加し、２５℃で一定時間保温後、０．５Ｍの水酸化ナトリウム１００μＬを加えることで反応を停止し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００（Ｔｅｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した後、アルカリホスファターゼを含まない試料溶液を用いて同様に得た測定値の吸光度を差し引くことで測定する方法があげられる。試料溶液の濃度や反応の時間は実験的に最適化すればよく、吸光度の値が２以下、好ましくは１．５以下、より好ましくは１以下になるように条件を定めればよい。
【００２５】
アルカリホスファターゼの比活性は、精製品を調製し、タンパク質量とアルカリホスファターゼ活性を測定することで算出できる。また、アルカリホスファターゼに前述のタグ配列を付加し、それらに対する抗体を利用することでも算出することができる。例えば、Ｃ末端側にＨｉｓタグ、Ｎ末端側にＭｙｃタグを付加したアルカリホスファターゼの場合、Ｃ末端側のＨｉｓタグを特異的に認識する市販の抗Ｈｉｓタグ抗体とＮ末端側のＭｙｃタグを特異的に認識する市販の抗Ｍｙｃタグ抗体を利用すればよく、両抗体のうち、いずれかの抗体が、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）で標識されたものを用いることが好ましい。未標識の抗タグ抗体を担体（例えばマイクロウェルプレート）に固定化し、ウシ血清アルブミンを用いてブロッキング後、適度に希釈したＮ末端側にＭｙｃタグ、Ｃ末端側にＨｉｓタグを付加したアルカリホスファターゼを含む試料溶液を添加し一定時間反応後、Ｂ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離を行ない、ｐＮＰＰ基質溶液と反応させ、固定化した抗タグ抗体に結合したアルカリホスファターゼの活性を比色定量し、Ｂ／Ｆ分離後、ＨＲＰ標識された抗タグ抗体と一定時間反応後、Ｂ／Ｆ分離を行ない、ＨＲＰの基質（例えば３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））を作用させてＨＲＰの活性を比色定量し、Ｃ末端側にＨｉｓタグ、Ｎ末端側にＭｙｃタグを付加したｂＩＡＰＩＩのアルカリホスファターゼ活性の比色定量値をＨＲＰ活性の比色定量値で割った値を基準にして、測定対象の比活性を相対値として求めることができる。
【００２６】
本発明の細胞を培養するための培地は、当業者が通常用いる培地中から適宜選択すればよく、大腸菌では、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地、２ｘＹＴ培地、Ｍ９培地、哺乳動物細胞では、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）  １６４０培地、Ｌ−１５培地、ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルの最小必須培地（ＭＥＭ；Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）、ハムのＦ１２培地、にそれぞれ５から１０％容量のウシ胎児血清を加えた培地を例示できる。また分泌生産されたアルカリホスファターゼを効率よく精製するために、ウシ胎児血清を添加しない、いわゆる無血清培地を使用してもよい。なお無血清培地を使用する場合、多くの細胞の生育に必要とされるインシュリンやトランスフェリンを添加すると好ましい。さらに上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦＩおよびＩＧＦＩＩ）等の成長因子や、プロスタグランジンや、セルロプラスミンや、高密度リポタンパク質や、低密度リポタンパク質や、ウシ血清アルブミンや、脂肪酸等を、本発明の細胞の生育や、アルカリホスファターゼの分泌生産や、アルカリホスファターゼの精製に好ましい範囲で培地に添加してもよい。具体例として本発明の細胞がｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞であるＤＧ４４細胞の場合には、ヒポキサンチンとチミジンを含んでいる培地、例えばＣＤ  ＣＨＯ培地（商品名、ライフテクノロジーズ社製）にグルタミンを添加した培地を用いて培養するとよく、ｄｈｆｒ遺伝子を含むＤＧ４４細胞の場合には、ヒポキサンチンとチミジンを含んでいない培地、例えば、ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地（商品名、ライフテクノロジーズ社製）にグルタミンを添加した培地を用いて培養するとよい。なおプルロニックＦ６８（商品名、ライフテクノロジーズ社製）のような非イオン性界面活性剤や、市販のペニシリン−ストレプトマイシン混合溶液を適宜培地に加えてもよい。
【００２７】
本発明の細胞を培養する際の、容器、温度、ＣＯ２濃度、振とう条件（エアレーション）などの外的な培養条件に特に制限はなく、例えば、本発明の細胞が大腸菌の場合、培養液１０ｍＬを入れた１２５ｍＬ容のバッフル付き三角フラスコで、温度３０℃、振とう速度１５０ｒｐｍで培養することで、効率よく本発明の細胞を培養することができる。本発明の細胞がＤＧ４４細胞の場合、培養液３０ｍＬを入れた２００ｍＬ容のフラスコで、温度３７℃、ＣＯ２濃度８％、振とう速度１３５ｒｐｍで培養することで、効率よく本発明の細胞を培養することができる。培養液中の細胞密度の測定は、当業者が通常用いる方法の中から適宜選択して測定すればよい。例えば、細胞が懸濁している培養液を採取し、採取した培養液と同容量の市販のトリパンブルー染色液（例えば、商品名０．４ｗ／ｖ％  Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、和光純薬社製）と混合して、染色されない細胞（生細胞）の数を、顕微鏡下で溶液血球計算盤を用いて計測し算出すればよい。
【００２８】
本発明の細胞の培養液から、アルカリホスファターゼを回収するには、当業者が通常用いる方法の中から適宜選択／組み合わせて行なえばよい。回収方法の一例として、遠心分離、限外ろ過膜を用いた濃縮、硫安塩析、疎水クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または前述した方法を組み合わせた方法があげられる。なおアルカリホスファターゼのＮ末端側および／またはＣ末端側にタグを付加している場合は、前記の方法に加え、タグに対する親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーを組み合わせて精製してもよい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明のアルカリホスファターゼ、本発明のポリヌクレオチド、本発明の発現ベクター、本発明の細胞及び本発明のアルカリホスファターゼ生産方法を用いることにより、熱安定性に優れた高活性アルカリホスファターゼを効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】プラスミドｐＣＩＰｍ２０９２Ｈ２の模式図である。
【図２】プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ２の模式図である。
【図３】プラスミドｐＣＩＰ４００−１００１Ｈ２の模式図である。
【図４】プラスミドｐＣＩＰ４３４−ｍ１００１Ｈ２の模式図である。
【図５】実施例９表５に記載のｂＩＡＰＩＩ変異体の比活性測定結果を示す図である。
【図６】実施例９表４に記載のｂＩＡＰＩＩ変異体の熱安定性試験結果を示す図である。
【図７】実施例９表５に記載のｂＩＡＰＩＩ変異体の熱安定性試験結果を示す図である。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１  プラスミド（発現ベクター）の作製
本検討に用いたプラスミド（発現ベクター）を、それぞれ以下に示す方法で作製した。
【００３３】
（Ａ）プラスミドｐＣＩＰ１０００
（Ａ−１）Ｎ末端側に仔牛小腸由来のアルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）のシグナルペプチド（配列番号１８）を、Ｃ末端側にヒスチジン６個からなるＨｉｓタグを、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるｂＩＡＰＩＩに付加したポリペプチドをコードする配列番号１９に記載のポリヌクレオチドを含むプラスミドである、ｐＣＩＰ−１をＯＰＥＲＯＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社で合成し、これを鋳型とし、配列番号２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃１）と配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃２）をプライマーセットとして、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ライフテクノロジー社製）を用いてＰＣＲを行なった。
（Ａ−２）得られた１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１）を、ＣＭＶプロモーターを用いた発現ベクターであるｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＴＯＰＯ（ライフテクノロジーズ社製）のクローニングサイトに挿入した。
（Ａ−３）（Ａ−２）でＤＮＡ−１を挿入したプラスミドの塩基配列を調べた。結果、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２２）が挿入されたプラスミド（５．９ｋｂｐ）であることを確認し、当該プラスミドをｐＣＩＰ１０００と名付けた。
【００３４】
（Ｂ）プラスミドｐＣＩＰ１０００Ｈ
ｐＣＩＰ−１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化して得た１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２）と、ｐＣＩＰ１０００を制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＩで二重消化して得た４．４ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３）をＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで得たプラスミド（５．９ｋｂｐ）をｐＣＩＰ１０００Ｈと名付けた。
【００３５】
（Ｃ）プラスミドｐＣＩＰｍ２０９２Ｈ
（Ｃ−１）ｐＴｒｃ９９Ａを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ＤＮＡ  ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔ（タカラバイオ社製）で平滑化し、それを制限酵素ＮｃｏＩで消化して４．１ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−４）を得た。
（Ｃ−２）配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃３）、配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃４）、配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃５）、配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃６）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来ｍｇｌＢのシグナルペプチドをコードする０．０８５ｋｂｐのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−５）を得た。
【００３６】
（Ｃ−３）配列番号２８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃７）、配列番号２９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃８）、配列番号３０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃９）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、Ｍｙｃタグと配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるｂＩＡＰＩＩのＮ末端６アミノ酸をコードする０．０６９ｋｂｐのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−６）を得た。
（Ｃ−４）ＤＮＡ−５とＤＮＡ−６を鋳型セットにして、配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃３）と配列番号３０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃９）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるｍｇｌＢシグナルペプチド、Ｍｙｃタグおよび配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるｂＩＡＰＩＩのＮ末端６アミノ酸をコードする０．１３８ｋｂｐのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−７）を得た。
（Ｃ−５）ＤＮＡ−４と、ＮＡ−７を制限酵素ＢｓｐＨＩとＢｂｖＣＩで二重消化して得たオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−８）と、ｐＣＩＰ１０００Ｈを制限酵素ＢｂｖＣＩとＨｐａＩで二重消化して得た１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−９）をライゲーションすることで得たプラスミド（５．７ｋｂｐ）をｐＣＩＰｍ２０９２Ｈ（図１）と名付けた。
【００３７】
（Ｄ）プラスミドｐＣＩＰｍ２０９２Ｈ２
（Ｄ−１）ｐＣＩＰｍ２０９２Ｈを鋳型とし、配列番号３１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃１０）と配列番号３２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃１１）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１０）を得た。
（Ｄ−２）ＤＮＡ−１０を鋳型とし、配列番号３１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃１０）と配列番号３３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃１２）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１１）を得た。
（Ｄ−３）ＤＮＡ−１１を制限酵素ＢｂｖＣＩとＡｇｅＩで二重消化して得た１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１２）とｐＣＩＰｍ２０９２Ｈを制限酵素ＢｂｖＣＩとＡｇｅＩで二重消化して得た４．２ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１３）をライゲーションすることで得たプラスミド（５．７ｋｂｐ）をｐＣＩＰｍ２０９２Ｈ２と名付けた。ｐＣＩＰｍ２０９２Ｈ２は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるｍｇｌＢシグナルペプチド、Ｍｙｃタグおよび配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるｂＩＡＰＩＩ、および配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるヒスタグをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである（図１）。
【００３８】
（Ｅ）プラスミドｐＣＩＰｍ２０９３Ｈ２
（Ｅ−１）配列番号３４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃１３）、配列番号３５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃１４）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．０４５ｋｂｐのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−１４）を得た。
（Ｅ−２）ｐＣＩＰｍ２０９２Ｈ２を鋳型とし、配列番号３６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃１５）と配列番号３７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃１６）、配列番号３２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−＃１１）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．５３５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１５）を得た。
【００３９】
（Ｅ−３）ＤＮＡ−１５とＤＮＡ−１６をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．５５８ｋｂｐのオリゴヌクレオチド（ＤＮＡ−１６）を得た。
（Ｅ−４）ＤＮＡ−１６を制限酵素ＸｍａＩとＳａｃＩＩで二重消化して得た０．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１７）とｐＣＩＰｍ２０９２Ｈ２を制限酵素ＸｍａＩとＳａｃＩＩで二重消化して得た５．２ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−１８）をライゲーションすることで得たプラスミド（５．７ｋｂｐ）をｐＣＩＰｍ２０９３Ｈ２と名付けた。
ｐＣＩＰｍ２０９３Ｈ２は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるｍｇｌＢシグナルペプチド、Ｍｙｃタグ、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるｂＩＡＰＩＩ変異体（配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるｂＩＡＰＩＩの３２２位がアスパラギン酸に置換された変異体）および配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるヒスタグをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである。
【００４０】
（Ｆ）プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ２
（Ｆ−１）プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ（Ｙａｓｕｋａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０８，６７３−６７６（１９９０））を鋳型とし、配列番号３８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１７）および配列番号３９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１８）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．３７ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−１８）を得た。
（Ｆ−２）ＤＮＡ−１８を鋳型とし、配列番号３８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１７）および配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−１９）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．３９ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−１９）を得た。
（Ｆ−３）プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒを鋳型とし、配列番号４１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２０）および配列番号４２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２１）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．６９ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−２０）を得た。
【００４１】
（Ｆ−４）ＤＮＡ−２０を鋳型とし、配列番号４３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２２）および配列番号４２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２１）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．７１ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−２１）を得た。
（Ｆ−５）ＤＮＡ−１９を制限酵素ＭｆｅＩとＸｂａＩで二重消化し得られたポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２２）と、ＤＮＡ−２１を制限酵素ＸｂａＩとＰｃｉＩで二重消化して得られたポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２３）と、プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒを制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｃｉＩで二重消化し得られた２．８ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２４）を、ライゲーションすることで、配列番号４４に記載の塩基配列を含んだプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ２を作製した。なおプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ２は、プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒのＳＶ４０後期（ｌａｔｅ）プロモーターとｄｈｆｒ遺伝子の間にある制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位をなくし、かつ、ＳＶ４０初期（ｅａｒｌｙ）プロモーターからＳＶ４０ポリＡまでの領域を置換したプラスミドである（図２）。
【００４２】
（Ｇ）プラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ３
（Ｇ−１）ｐＥＣＥｄｈｆｒ２を制限酵素ＫａｓＩで消化後、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションすることで、配列番号３７に記載の塩基配列を含んだプラスミドｐＥＣＥｄｈｆｒ３を作製した。
【００４３】
（Ｈ）プラスミドｐＣＩＰ４００−１００１Ｈ２
（Ｈ−１）ｐＴｒｃ９９Ａを鋳型とし、配列番号４５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２３）および配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２４）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．０６３ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−２５）を得た。
（Ｈ−２）配列番号４７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを鋳型とし、配列番号４８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２５）および配列番号４９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２６）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、マウスＭＭＰ−９由来のシグナルペプチド（配列番号５０）をコードする０．０７５ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−２６）を得た。
（Ｈ−３）ｐＴｒｃ９９Ａを鋳型とし、ＤＮＡ−２５とＤＮＡ−２６をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．１５ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−２７）を得た。
【００４４】
（Ｈ−４）ＤＮＡ−２７を制限酵素Ａｏｒ５１ＨＩとＢｇｌＩＩで二重消化して得られた０．１４ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２８）と、ｐＣＩＰｍ２０９２Ｈ２を制限酵素Ａｏｒ５１ＨＩとＭｌｕＩで二重消化して得られた１．５ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−２９）と、ｐＥＣＥｄｈｆｒ３を制限酵素ＢｇｌＩＩとＭｌｕＩで二重消化して得られた３．７ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３０）をライゲーションすることで得たプラスミド（５．３ｋｂｐ）をｐＣＩＰ４００−１００１Ｈ２と名付けた。ｐＣＩＰ４００−１００１Ｈ２は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなるマウスＭＭＰ−９由来のシグナルペプチド、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるｂＩＡＰＩＩおよび配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるヒスタグをコードするポリヌクレオチドを含むプラ
スミドである（図３）。
【００４５】
（Ｉ）プラスミドｐＣＩＰ４３４−ｍ１００１Ｈ２
（Ｉ−１）ｐＣＩＰ４００−１００１Ｈ２を鋳型とし、配列番号５１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２７）および配列番号５２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２８）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．３ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−３１）を得た。
（Ｉ−２）ＤＮＡ−３１と配列番号５３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−２９）をプライマーセットとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いてＰＣＲを行ない、０．３３ｋｂｐの増幅産物（ポリヌクレオチド）（ＤＮＡ−３２）を得た。
（Ｉ−３）ＤＮＡ−３２を制限酵素ＳｆｉＩとＡｏｒ５１ＨＩで二重消化して得られた０．３ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３３）と、ｐＣＩＰ４００−１００１Ｈ２を制限酵素ＳｆｉＩとＡｏｒ５１ＨＩで二重消化して得られた５．１ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３４）をライゲーションすることで得たプラスミド（５．４ｋｂｐ）をｐＣＩＰ４３４−ｍ１００１Ｈ２と名付けた。ｐＣＩＰ４３４−ｍ１００１Ｈ２は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列からなるマウスＭＭＰ−９由来のシグナルペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＭｙｃタグ、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるｂＩＡＰＩＩ、および配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるヒスタグをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドである（図４）。
【００４６】
実施例２  変異導入
エラープローンＰＣＲ法による変異導入
ｐＣＩＰｍ２０９３Ｈ２を鋳型（５０ｎｇ／μｌ）として、配列番号５４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−３０）（０．４μＭ）、配列番号５５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（Ｐｒｉｍｅｒ−３１）（０．４μＭ）、０．０８ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ、１ｍＭ  ｄＣＴＰ、１ｍＭ  ｄＴＴＰ、５ｕｎｉｔ    Ｇｏ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（プロメガ株式会社）を混合し、９５℃で２分加熱後、９５℃（３０秒）、６０℃（３０秒）、７２℃（８８秒）のＰＣＲ反応を３０サイクル繰り返した。１．４ｋｂｐの増幅産物をアガロース電気泳動により回収後、制限酵素ＢｂｖＣＩとＳａｃＩＩで二重消化した。
【００４７】
実施例３  大腸菌での高活性変異体のスクリーニング
実施例２のエラープローンＰＣＲ法による変異導入で調製した制限酵素消化物とｐＣＩＰｍ２０９３Ｈ２を制限酵素ＢｂｖＣＩとＳａｃＩＩで二重消化して得た４．３ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３５）をライゲーションして得たプラスミドを大腸菌ＤＨ５α（ニッポンジーン社製）にトランスフェクションし、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０μｇ／ｍｌ  ＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ）、５０μｇ／ｍｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｎａを含むＬＢ寒天培地にて２８℃で培養した。青く呈色したコロニーを、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｎａを含む１／２濃度のＬＢ培地にて２８℃で培養し、菌濁度（ＯＤ６００）と培養液中のアルカリホスファターゼ活性を測定し、菌濁度あたりのアルカリホスファターゼ活性の高い菌を回収した。
【００４８】
実施例４  大腸菌ペリプラズム画分の調製
実施例３で回収した大腸菌を５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  Ｎａを含む４ｘＹＴ培地（ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ  ３．２％、Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ２％、ＮａＣｌ  ０．５％）にて２８℃で培養後、遠心分離（３，５００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して菌を回収した。
【００４９】
その菌を菌濁度（ＯＤ６００）が１００となるように、２０％ショ糖、０．１５Ｍ  ＫＣｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ  卵白リゾチームを含む０．０３Ｍ  Ｂｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．０）［以下、ＳＫＢ溶液という］に懸濁し、４℃で２４時間以上インキュベートした。菌懸濁液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して上清を回収後、ポアサイズ０．４５μｍのカートリッジフィルターでろ過した。そのろ液をペリプラズム画分とした。
【００５０】
実施例５  大腸菌で生産したｂＩＡＰＩＩ変異体の比活性測定
抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）を０．４μｇ／ｍｌに希釈し１００μｌずつ９６ウェルイムノプレート（ＮＵＮＣ社製  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ４３０３４１）に添加し、抗体固定化プレートを作製した。それに実施例４で調製したペリプラズム画分を添加し、一時間インキュベートした。プレートを洗浄後、ｐＮＰＰ溶液を添加し室温下で波長４０５ｎｍの吸光度をモニタリングし吸光度増加速度（ＯＤ４０５／ｍｉｎ）を求めた。抗ｃ−Ｍｙｃ抗体固定化プレートに実施例４で調製したペリプラズム画分を添加し、一時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識抗ヒスタグ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製）を添加し、一時間インキュベートした。プレートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し室温下で波長６２０ｎｍの吸光度をモニタリングし吸光度増加速度（ＯＤ６２０／ｍｉｎ）を求めた。ｐＮＰＰを基質にした吸光度増加速度（ＯＤ４０５／ｍｉｎ）の値を、ＴＭＢを基質にした吸光度増加速度（ＯＤ６２０／ｍｉｎ）の値で割った値（ＯＤ４０５／ＯＤ６２０）を比活性として表し、対照サンプルと比較した。
【００５１】
実施例６  配列解析
実施例５の比活性測定の結果選択されたｂＩＡＰＩＩ変異体を生産する大腸菌よりプラスミドを抽出し、配列解析を行った。その結果、配列番号２に記載のアミノ酸配列の４３０位のグルタミン酸がアラニンに置換されていた。このプラスミドをｐＣＩＰｍ２１０３Ｈ２と名付けた。
【００５２】
【表１】
0006732368.tif 000002
実施例７  多重変異体の作製（１）
実施例６で得られたｐＣＩＰｍ２１０３Ｈ２を鋳型として用い、実施例２に記載の変異導入、実施例３に記載の大腸菌での高活性変異体のスクリーニング、実施例４に記載の大腸菌ペリプラズム画分の調製、実施例５に記載の比活性測定、実施例６に記載の配列解析を実施した結果、配列番号３に記載のアミノ酸配列の３２３位がアスパラギン（Ｎ）、３８５位のセリンがグリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）に置換された多重変異体が得られた。これらのプラスミドをそれぞれｐＣＩＰｍ２１５７Ｈ２、ｐＣＩＰｍ２１５５Ｈ２、ｐＣＩＰｍ２１５６Ｈ２と名付けた。
【００５３】
【表２】
0006732368.tif 000003
実施例８  多重変異体の作製（２）
実施例７で得られたｂＩＡＰＩＩ多重変異体のアミノ酸置換を掛け合わせた多重変異体を作製した。ｐＣＩＰｍ２１５５Ｈ２、ｐＣＩＰｍ２１５６Ｈ２を制限酵素ＰｓｔＩとＭｌｕＩで二重消化して得た０．４ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３６、ＤＮＡ−３７）とｐＣＩＰｍ２１５７Ｈ２を制限酵素ＰｓｔＩとＭｌｕＩで二重消化して得た５．３ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３８）をライゲーションすることで得たプラスミド（５．７ｋｂｐ）をｐＣＩＰｍ２１５８Ｈ２、ｐＣＩＰｍ２１５９Ｈ２と名付けた。
【００５４】
【表３】
0006732368.tif 000004
実施例９  変異体遺伝子の発現べクターへの載せ変え
実施例３から８の結果、得られたｂＩＡＰＩＩ多重変異体のプラスミドを制限酵素ＢｂｖＣＩとＭｌｕＩで二重消化し、１．４ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−３９）を回収した。実施例１（Ｈ）で作製したｐＣＩＰ４００−１００１Ｈ２を制限酵素ＢｂｖＣＩとＭｌｕＩで二重消化し、３．９ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−４０）を回収した。実施例１（Ｉ）で作製したｐＣＩＰ４３４−ｍ１００１Ｈ２を制限酵素ＢｂｖＣＩとＭｌｕＩで二重消化し、３．９ｋｂｐのポリヌクレオチド（ＤＮＡ−４１）を回収した。ＤＮＡ−３９とＤＮＡ−４０、ＤＮＡ−３９とＤＮＡ−４１をライゲーションすることで、以下に示すプラスミドを作製した。
【００５５】
【表４】
0006732368.tif 000005
【００５６】
【表５】
0006732368.tif 000006
実施例１０  ＣＨＯ細胞へのトランスフェクションおよびｂＩＡＰＩＩ変異体の生産
（１）実施例９で作製したプラスミドを制限酵素ＰｖｕＩで消化することで直鎖化後、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ＭＡＸ試薬（ライフテクノロジーズ社製）を使用したリポフェクション法によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）であるＤＧ４４細胞に導入した。
（２）プラスミドを導入したＤＧ４４細胞を、８ｍＭのグルタミンおよび０．１８％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（ライフテクノロジーズ社製）を含んだＣＤ  ＣＨＯ培地（培地１）で、温度３７℃、ＣＯ２濃度８％、回転振とう速度１３５ｒｐｍで３日間培養した。
（３）培養液を低速（９００ｒｐｍ）で遠心分離することで培養細胞を回収後、８ｍＭ  グルタミンおよび０．１８％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を含んだＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地（培地２）に懸濁して（培地交換１回目）、７日間培養を継続した。
（４）（３）と同様にして、培養細胞を回収後、培地２に懸濁して（培地交換２回目）、７日間培養を継続した。
（５）（３）と同様にして、培養細胞を回収後、培地２に懸濁して（培地交換３回目）、７日間培養を継続した。
（６）（３）と同様にして、培養細胞を回収後、培地２に懸濁して（培地交換４回目）、７日間培養を継続した。
（７）（６）の７日目の培養液を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）して培養上清を回収した。
【００５７】
実施例１１  ＣＨＯ細胞で生産したｂＩＡＰＩＩ変異体の比活性測定
抗ヒスタグ抗体（和光純薬社製）を０．５μｇ／ｍｌに希釈し１００μｌずつ９６ウェルイムノプレート（ＮＵＮＣ社製  ＭＡＸＩＳＯＲＰ  ４３０３４１）に添加し、抗体固定化プレートを作製した。それに実施例１０で調製した、Ｎ末端に配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＭｙｃタグ、Ｃ末端に配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるヒスタグが付加された実施例９表５に記載のｂＩＡＰＩＩ変異体を含んだ培養上清を添加し、一時間インキュベートした。プレートを洗浄後、ｐＮＰＰ溶液を添加し室温下で波長４０５ｎｍの吸光度をモニタリングし吸光度増加速度（ＯＤ４０５／ｍｉｎ）を求めた。抗ヒスタグ抗体固定化プレートに実施例１０で調製した、Ｎ末端に配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＭｙｃタグ、Ｃ末端に配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるヒスタグが付加された実施例９表５に記載のｂＩＡＰＩＩ変異体を含んだ培養上清を添加し、一時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ＨＲＰ標識抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（和光純薬社製）を添加し、一時間インキュベートした。プレートを洗浄後、ＴＭＢ溶液を添加し室温下で波長６２０ｎｍの吸光度をモニタリングし吸光度増加速度（ＯＤ６２０／ｍｉｎ）を求めた。ｐＮＰＰを基質にした吸光度増加速度（ＯＤ４０５／ｍｉｎ）の値を、ＴＭＢを基質にした吸光度増加速度（ＯＤ６２０／ｍｉｎ）の値で割った値（ＯＤ４０５／ＯＤ６２０）を比活性として表し、対照サンプルと比較した。
比活性測定の結果を図５に示す。配列番号４から８に記載のｂＩＡＰＩＩ変異体は、配列番号１に記載のｂＩＡＰＩＩと同等の比活性を示した。
【００５８】
実施例１２  ＣＨＯ細胞で生産したｂＩＡＰＩＩ変異体の熱安定性試験
実施例１０で調製した、ｂＩＡＰＩＩ変異体を含んだ培養上清をアルカリホスファターゼ活性が同等になるように実施例１０に記載の培地２で希釈後、７．５μｌずつＰＣＲ８連チューブ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に分注した。それらをＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で５５℃から７０℃で１０分間加温後、氷冷した。それらにｐＮＰＰ溶液を１５０μＬ添加し、室温で一定時間保温後、それらのうちの１００μＬを０．５Ｍの水酸化ナトリウム１００μＬと混合することで反応を停止し、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。未加温のサンプルの活性を１００％としたときの各温度での加温サンプル中の残存活性を示す。
【００５９】
実施例９表４に記載のｂＩＡＰＩＩ変異体の熱安定性試験結果を図６に示す。配列番号４から８に記載のアミノ酸配列からなるｂＩＡＰＩＩ変異体のＣ末端に配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるヒスタグが付加した本発明のアルカリホスファターゼは、ｂＩＡＰＩＩと同等以上の熱安定性を示した。
【００６０】
実施例９表５に記載のｂＩＡＰＩＩ変異体の熱安定性試験結果を図７に示す。配列番号４から８に記載のアミノ酸配列からなるｂＩＡＰＩＩ変異体のＮ末端に配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＭｙｃタグが付加し、それらのＣ末端に配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるヒスタグが付加した本発明のアルカリホスファターゼは、ｂＩＡＰＩＩと同等以上の熱安定性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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