(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスの大腿骨髄腔に対して略垂直に穿刺針を穿刺し、前記穿刺針を介して、細胞と、細胞及び薬剤とのいずれかを前記大腿骨髄腔に注入することを特徴とする大腿骨髄腔への注入方法。
【請求項２】
前記穿刺針の穿刺部位が、大腿骨体、内側顆部、及び外側顆部から選択される少なくとも１種である請求項１に記載の大腿骨髄腔への注入方法。
【請求項３】
前記マウスが、免疫不全マウスである請求項１から２のいずれかに記載の大腿骨髄腔への注入方法。
【請求項４】
前記細胞としてヒト造血幹細胞と、ヒト造血幹細胞及び薬剤とのいずれかを大腿骨髄腔に注入する請求項１から３のいずれかに記載の大腿骨髄腔への注入方法。
【請求項５】
前記細胞の注入濃度が、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下である請求項１から４のいずれかに記載の大腿骨髄腔への注入方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の大腿骨髄腔への注入方法に用いられる穿刺器具の穿刺針の基端に取り付ける穿刺補助器具であって、
大腿骨への前記穿刺針の穿刺深さを調節することを特徴とする穿刺補助器具。
【請求項７】
前記穿刺深さが、２ｍｍ以上５ｍｍ以下である請求項６に記載の穿刺補助器具。
【請求項８】
非ヒト免疫不全動物における大腿骨髄腔に対して略垂直に穿刺針を穿刺し、前記穿刺針を介して、ヒト造血幹細胞を、前記大腿骨髄腔に注入して移植させ、血液再構築モデル動物を作製することを特徴とする血液再構築モデル動物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腿骨髄腔への注入方法、血液再構築モデル動物の作製方法、及びこれらに用いる穿刺補助器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療・創薬・毒性評価等、多岐に亘る分野の研究において、免疫不全マウスにヒト造血幹細胞を移植し、血液再構築マウスを作製することが行われている。
【０００３】
前記ヒト造血幹細胞の移植する部位としては、静脈や骨髄等が有効であることが知られている。また、前記移植においては、静脈に移植するよりも骨髄に移植する方が、血液再構築マウス作製効率が１５倍以上高いことが知られている（例えば、非特許文献１参照）。そのため、静脈に移植するよりも高い効率において血液の再構築ができる骨髄への移植が望まれている。
しかし、ヒト造血前駆細胞の骨髄への移植は、手技に熟練を要することから、成功率高く移植操作を実施することは難しいとされている。また、それによる、高価な細胞と高価な免疫不全マウスとの浪費も問題とされている。そのため、ヒト造血幹細胞を移植する部位として、静脈が多く選択されている。
【０００４】
ここで、骨髄における移植部位としては、脛骨、大腿骨などが知られている。しかし、前記大腿骨は、分厚い筋肉に覆われているため移植が困難であるという問題がある。
そこで、前記脛骨は、外観から骨の角度（方向）を認識しやすく、固定が容易であることから、関節部から脛骨の近位端に、シリンジ針を穿刺して、造血幹細胞を脛骨に移植することが提案されている（例えば、特許文献１及び非特許文献２参照）。
しかし、前記脛骨は、髄腔が非常に狭いことから、シリンジ針の先を挿入できる空間が狭く、移植時のシリンジ針の角度や力加減の調節が非常に困難であるという問題がある。
そのため、静脈移植より血液再構築マウス作製効率が高い骨髄移植において、より簡便で、かつ高確率に骨髄腔に注入する方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１４０３３６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙａｈａｔａ，  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，１０１（８），２９０５−２９１３（２００３）
【非特許文献２】Ｐｆｅｉｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，４９（２），１２１−１３１（２０１５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、より簡便で、かつ高確率に大腿骨髄腔に注入することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するための手段としては、以下のとおりである。即ち、本発明の大腿骨髄腔への注入方法は、非ヒト動物の大腿骨髄腔に対して略垂直に穿刺針を穿刺し、前記穿刺針を介して、液体を前記大腿骨髄腔に注入する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、より簡便で、かつ高確率に大腿骨髄腔に注入することができる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の穿刺補助器具の一例を示す概略断面図である。
【図２】図２は、実施例１における大腿骨髄腔からの液体の漏出の有無を確認した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（大腿骨髄腔への注入方法）
本発明の大腿骨髄腔への注入方法は、非ヒト動物の大腿骨髄腔に対して略垂直に穿刺針を穿刺し、前記穿刺針を介して、液体を前記大腿骨髄腔に注入する注入工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、非ヒト動物における大腿骨への細胞等の液体の注入について、以下のことを知見した。
前記大腿骨は、脛骨と比較して、髄腔が広く、穿刺して、細胞等の液体を注入しやすいという点から有利である。
従来の大腿骨への細胞等の液体の注入方法としては、細胞の脛骨への移植と同様に、膝関節を９０°に折り曲げて固定し、膝蓋靭帯より少し上から、大腿骨に対して平行方向から、膝蓋面に穿刺針を挿入して、大腿骨髄腔に細胞を注入している。この場合、大腿骨を覆う分厚い筋肉、靭帯等により、前記膝蓋面への穿刺角度の把握が困難であるため、目的とする位置に穿刺することができないという問題がある。
そこで、穿刺部位を、大腿骨髄腔に対して略垂直に穿刺針を穿刺することにより、大腿骨を安定に固定することができ、また、大腿骨髄腔に対して略垂直に穿刺針を穿刺する部位は、膝蓋面と比較して穿刺できる面積が広く、穿刺しやすいという利点があることを知見した。
【００１３】
＜穿刺＞
前記穿刺は、大腿骨髄腔に対して略垂直に行う。
前記大腿骨髄腔に対して略垂直とは、大腿骨の長手方向に対して略垂直であることを意味する。
前記略垂直とは、前記大腿骨への入射角が０°以上３０°以下であることを意味する。
【００１４】
前記穿刺部位としては、大腿骨髄腔に対して、略垂直に穿刺針を穿刺することができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、穿刺できる面積が大きく、及び固定がしやすい点から、例えば、大腿骨体、内側顆部、外側顆部などが挙げられる。これらの中でも、大腿骨体、内側顆部が好ましい。
【００１５】
前記穿刺を行う器具としては、先端の尖った中空の器具であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、注射筒と穿刺針とを有する穿刺器具などが挙げられる。
前記穿刺針の内径としては、大腿骨に孔を開け、かつ液体を注入できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．１０ｍｍ以上１.０ｍｍ以下が好ましく、０．１２ｍｍ以上０.３ｍｍ以下がより好ましい。
前記注射筒、及び穿刺針としては、市販品を用いることができ、前記市販品としては、例えば、テルモ株式会社製、株式会社夏目製作所製、ニプロ株式会社製、ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー社製などが挙げられる。
前記注射筒の市販品としては、例えば、商品名：テルモシリンジ（テルモ株式会社製）、商品名：ニプロシリンジ（ニプロ株式会社製）などが挙げられる。
前記穿刺針の市販品としては、例えば、商品名：テルモ注射針（テルモ株式会社製）、商品名：フローマックス（ニプロ株式会社製）などが挙げられる。
これらの中でも、ＢＤ  プラスチパックＴＭ２９Ｇ  インスリン皮下投与用針付注射筒（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー社製、注射針、注射筒一体型）が好ましい。
【００１６】
＜注入＞
前記注入としては、液体を大腿骨髄腔に入れることができれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記注入としては、液体を充填した注射筒と、前記注射筒に穿刺針を取り付けた穿刺器具を用いることができる。
前記液体の注入としては、大腿骨を固定して、前記穿刺器具における穿刺針を、大腿骨表面に接触させ、前記穿刺針を押圧しながら、ゆっくりと左右に回転させることにより、大腿骨に穿刺針径の孔を形成し、形成した孔から穿刺針を大腿骨髄腔に挿入する。ここで、穿刺針が、大腿骨髄腔に挿入できていることは、注射筒から手を離した時に、穿刺器具が転倒せず、直立するか否かで確認することができ、穿刺器具が直立する場合は、穿刺針が大腿骨髄腔に挿入できていると判断できる。次に、穿刺針が大腿骨髄腔に挿入された状態において、前記液体を大腿骨髄腔に注入することができる。
【００１７】
＜＜液体＞＞
前記液体としては、大腿骨髄腔に注入できるものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞、薬剤、その他の溶液などが挙げられる。
【００１８】
−細胞−
前記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト造血幹細胞などが挙げられる。
【００１９】
−−ヒト造血幹細胞−−
前記ヒト造血幹細胞は、血球系細胞に分化可能な幹細胞である。
前記血球系細胞としては、例えば、リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球、赤血球、血小板などが挙げられる。
【００２０】
浮遊状態における前記細胞の体積平均粒径としては、１００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以下がより好ましい。
【００２１】
なお、前記細胞の体積平均粒径は、下記の測定方法で測定することができる。
培地中に浮遊した浮遊細胞を回収した後、遠心分離、上清除去、分散により細胞懸濁液を得る。得られた細胞懸濁液から１０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、０．４質量％トリパンブルー染色液１０μＬを加えてピペッティングを行って細胞を染色する。染色した細胞懸濁液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。なお、細胞数、細胞生存率も同様の測定方法により求めることができる。前記細胞は、浮遊状態であると、略球状の形状をとるため、体積平均粒径を測定することができる。
【００２２】
前記ヒト造血幹細胞は、緩衝液等の液体により懸濁された懸濁液として注入することが好ましい。
【００２３】
前記懸濁液中の細胞数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。
また、非ヒト動物がマウスである場合、注入する細胞数としては、１×１０４個／個体以上１×１０６個／個体以下が好ましく、３×１０４個／個体以上６×１０４個／個体以下が一般的である。
前記細胞数としては、前記体積平均粒径の測定方法と同様にして自動セルカウンター（商品名：Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）；血球計算盤などを用いて測定することができる。
【００２４】
前記ヒト造血幹細胞の懸濁液の注入量としては、特に制限はなく、各非ヒト動物の大腿骨髄腔の大きさから適宜選択することができ、マウスにおいては、１０μＬ以上１００μＬ以下が好ましく、２０μＬ以上５０μＬ以下がより好ましく、ラットにおいては、１０μＬ以上１００μＬ以下が好ましく、２０μＬ以上６０μＬ以下がより好ましい。
【００２５】
前記ヒト造血幹細胞としては、市販品を用いることができ、前記市販品としては、例えば、商品名：ＣＤ１３３＋／Ｐｒｏｍｉｎｉｎ−１造血幹細胞（１×１０５個、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、商品名：ＣＤ３４＋造血幹細胞（１×１０５個、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２６】
［細胞懸濁液の調製］
前記細胞懸濁液は、前記細胞を培地中に懸濁することにより得ることができる。前記細胞懸濁液における細胞濃度は、例えば、自動セルカウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、血球計算盤などを用いて測定することができる。
前記培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＭＥＭ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）培地（２質量％ＢＳＡ含有）などが挙げられる。
【００２７】
−−薬剤−−
前記薬剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、治療薬マニュアル２００７（株式会社医学書院、２００７年２月発行）など当業者に一般的なハンドブック等に記載の薬剤乃至製剤などが挙げられる。
前記薬剤としては、例えば、解熱・鎮痛・抗炎症薬、片頭痛治療薬、抗リウマチ薬、痛風・高尿酸血症治療薬、精神科用薬、神経科用薬、循環器用薬、アレルギー治療薬、呼吸器用薬、消化器用薬、糖尿病薬、ホルモン製剤、骨粗鬆症薬、骨代謝改善薬、ビタミン製剤、造血と血液凝固関係製剤、輸液・栄養製剤、電解質製剤、灌流用剤、中毒治療薬、抗菌剤、化学療法剤、抗真菌剤、化学療法剤、抗ウイルス薬、寄生虫・原虫用薬、抗癌剤、免疫抑制剤、インターフェロン・インターロイキン製剤、眼科用薬、耳鼻咽喉科用薬、口腔用薬、泌尿・生殖器用薬、痔治療薬、皮膚用薬、酵素製剤、生物学的製剤、ワクチン・トキソイド、生活改善薬、診断用薬、漢方薬などが挙げられる。
【００２８】
前記精神科用薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、睡眠・鎮静薬、抗不安薬、抗神経病薬、抗うつ薬・気分安定薬・精神刺激薬などが挙げられる。
前記神経科用薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗てんかん薬、パーキンソン病／症候群治療薬、脳循環代謝改善薬、筋弛緩薬、自律神経系作用薬、抗めまい薬などが挙げられる。
前記循環器用薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、強心薬、抗狭心症薬、β遮断薬、Ｃａ拮抗薬、抗不整脈薬、利尿薬、降圧薬、末梢循環障害治療薬、高脂血症用薬、昇圧薬などが挙げられる。
前記呼吸器用薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、呼吸促進薬、気管支拡張薬・喘息治療薬、鎮咳薬、去痰薬などが挙げられる。
前記消化器用薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、消化性潰瘍治療薬、健胃・消化薬、下剤、止痢・整腸薬などが挙げられる。
前記ホルモン製剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下垂体ホルモン製剤、副腎皮質ホルモン製剤、性ホルモン製剤などが挙げられる。
これらの中でも、バクロフェン（痙性麻痺の治療薬；髄腔内バクロフェン療法）、抗がん剤（例えば、白血病の治療薬等）を好適に用いることができる。
【００２９】
−−その他の溶液−−
前記その他の溶液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、染色液などが挙げられる。前記染色液を大腿骨髄腔に注入することにより、大腿骨への注入が成功している場合は、非ヒト動物の体表が染色されるため、目視により注入の成功の有無を迅速に確認することができる。
前記染色液としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エバンスブルー溶液、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）溶液などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３０】
＜非ヒト動物＞
前記非ヒト動物としては、ヒト以外であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、非ヒト哺乳類、鳥類などが挙げられる。これらの中でも、非ヒト哺乳類が好ましい。
前記非ヒト哺乳類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、サルなどが挙げられる。これらの中でも、マウス、ラット、ハムスター、モルモットが好ましく、マウス、ラットがより好ましく、マウスが特に好ましい。
また、非ヒト免疫不全動物を好適に用いることができる。
【００３１】
＜＜非ヒト免疫不全動物＞＞
前記非ヒト免疫不全動物は、免疫不全であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記免疫不全とは、免疫系が正常に機能しないことを意味する。
【００３２】
前記非ヒト免疫不全動物としては、例えば、免疫不全マウスとして、ヌードマウス、Ｓｅｖｅｆｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウス、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ（ＮＯＤ）マウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ−ｓｃｉｄ−ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウス（ＮＯＧマウス）、Ｒａｇ２ｎｕｌｌ／ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウス、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス；免疫不全ラットとして、ＦＳＧラット、ＳＣＩＤラットなどが挙げられる。
ＮＯＧマウス及びＮＳＧマウスは、ＮＯＤ／ＳｈｉＪｉｃ−ｓｃｉｄマウス、又はＮＯＤ／ＳｈｉＬｔＪ−ｓｃｉｄマウスにＩＬ−２ＲγＫＯ遺伝子を導入したマウスであり、Ｔ、Ｂ、ＮＫ細胞の欠失、補体活性の欠失、マクロファージ、樹状細胞の機前記能不全という多様な不全形質を持ち、異種細胞の生着性に極めて優れている。
【００３３】
前記非ヒト免疫不全動物の週齢としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、２週齢以上４６週齢以下が好ましく、２週齢以上１０週齢以下がより好ましく、４週齢以上８週齢以下が特に好ましい。
【００３４】
（血液再構築モデル動物の作製方法）
本発明の血液再構築モデル動物の作製方法は、非ヒト免疫不全動物における大腿骨髄腔に対して略垂直に穿刺針を穿刺し、前記穿刺針を介して、ヒト造血幹細胞を、大腿骨髄腔に注入して移植させ、血液再構築モデル動物を作製する工程を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
【００３５】
前記穿刺、前記穿刺する穿刺部位、前記穿刺針、前記非ヒト免疫不全動物、及び前記ヒト造血幹細胞としては、本発明の大腿骨髄腔への注入方法における穿刺、穿刺する穿刺部位、穿刺針、非ヒト免疫不全動物、及びヒト造血幹細胞と同様のものを用いることができる。
【００３６】
［血液再構築モデル動物の作製方法］
非ヒト免疫不全動物（例えば、ＮＯＧマウス等）を２週間の検疫、馴化期間を経た後、マウスを専用ホルダ内に半固定した状態において、Ｘ線を全身に照射（例えば、２．５Ｇｙ）する。前記照射には、例えば、Ｘ線照射装置（装置名：ＭＢＲ−３２０Ｒ、日立メディコ株式会社製）を用いて、管電圧：３００ｋＶ、管電流：１０ｍＡ、１．０ｍｍ  Ａｌ＋０．５ｍｍ  Ｃｕフィルターの条件下にて行う。Ｘ線管と照射台との間隔は、例えば、５５０ｍｍとする。
前記Ｘ線照射後、５時間以内に、大腿骨髄腔に細胞の移植を行うことが好ましい。
その後、シリンジを用いてヒト造血幹細胞を含む細胞懸濁液を、Ｘ線照射ＮＯＧマウスの大腿骨髄腔内に注入して移植することにより血液再構築モデル動物の作製することができる。
【００３７】
＜血液再構築モデル動物＞
前記血液再構築モデル動物は、非ヒト免疫不全動物にヒト造血幹細胞を移植することにより、前記非ヒト免疫不全動物の体内において、ヒト血液環境を構築したモデル動物である。前記血液再構築モデル動物を作製することにより、ヒト以外の動物において、ヒトに近い血液環境において各種試験等を行うことができる。
【００３８】
［用途］
本発明の大腿骨髄腔への注入方法は、本発明の血液再構築モデル動物の作製方法に好適に使用することができる。
本発明の血液再構築モデル動物の作製方法により作製された血液再構築モデル動物は、ＨＩＶ感染症、結核症、非結核性抗酸菌症、サイトメガロウイルス感染症、単純ヘルペス、帯状疱疹、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、進行性多巣白質脳症、悪性リンパ腫、血管炎等の疾患の研究に有効である。
【００３９】
（穿刺補助器具）
前記穿刺補助器具は、本発明の大腿骨髄腔への注入方法、本発明の血液再構築モデル動物の作製方法に用いられる穿刺器具の穿刺針の基端に取り付ける穿刺補助器具であって、大腿骨への前記穿刺針の穿刺深さを調節し、更に必要に応じてその他の手段を有してなる。
前記穿刺補助器具の装着位置としては、例えば、穿刺針の基端などが挙げられる。
【００４０】
前記穿刺補助器具としては、その形状、大きさ、構造、材質等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４１】
前記形状としては、例えば、三角柱、四角注、五角柱等の多角柱；円柱状、テーパー状、逆テーパー状などが挙げられる。これらの中でも、円柱状が好ましい。
前記大きさとしては、前記穿刺補助器具の外径が、穿刺針が骨に対し過度に深く刺さり過ぎない（貫通防止）ことを防止する点から、穿刺の際、皮膚に引っかかるための十分な厚みがあることが好ましく、穿刺部位の視認性を向上する点から、厚すぎないことが好ましい。
前記穿刺補助器具の外径としては、テーパー状として先端部の外径が５ｍｍ以上９ｍｍ以下、かつ基端部の外径：６ｍｍ以上１０ｍｍ以下が好ましく、円柱状として外径：２ｍｍ以上１５ｍｍ以下が好ましく、４ｍｍ以上７ｍｍ以下がより好ましい。
前記穿刺補助器具の長手方向の長さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜、穿刺針と穿刺深さとの関係から選択することができる。
【００４２】
前記材質としては、例えば、有機材料、無機材料などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記有機材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）、ポリイミド（ＰＩ）、ナイロン（Ｎｙ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、中密度ポリエチレン（ＭＤＰＥ）、塩化ビニル、塩化ビニリデン、ポリフェニレンサルファイド、ポリエーテルサルフォン、ポリエチレンナフタレート、ポリプロピレン、ウレタンアクリレート等のアクリル系材料、ゴムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記無機材料としては、例えば、ガラス、セラミックなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００４３】
前記穿刺補助器具としては、穿刺針を挿通できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記穿刺補助器具が針基により係止されるタイプの場合は、その内径が穿刺針の外径と同等であることが好ましく、前記穿刺補助器具が針基又は注射筒と係合されるタイプの場合は、その内径が穿刺針の外径と同等又は大きいことが好ましい。
【００４４】
前記穿刺針の穿刺深さとしては、大腿骨髄腔に穿刺針を挿入できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、２ｍｍ以上５ｍｍ以下が好ましく、３ｍｍ以上４ｍｍ以下がより好ましい。前記穿刺深さが、２ｍｍ以上であると、大腿骨髄腔に穿刺針を挿入することができ、５ｍｍ以下であると、穿刺針が大腿骨を貫通することを防止できる。なお、前記穿刺針の穿刺深さは、非ヒト動物の種類によって適宜調節することが好ましい。
また、非ヒト動物がマウスである場合の前記穿刺針の穿刺深さとしては、２ｍｍ以上３ｍｍ以下が好ましい。
【００４５】
＜その他の手段＞
前記その他の手段としては、例えば、脱離を防止するために穿刺針の基端部と係合する手段、穿刺深さを調節するための伸縮手段などが挙げられる。
【００４６】
図１は、本発明の穿刺補助器具の一例を示す概略断面図である。図１において、本発明の穿刺補助器具１は、穿刺針２を挿通して、穿刺針２の基端に挿着され、針基３により係止される。穿刺補助器具１は、針基３、又は針基３が取り付けられている注射筒４と係合させてもよい。穿刺補助器具１を挿着することにより、穿刺針２の穿刺深さＡを目的に応じて適宜調節することができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００４８】
（大腿骨略垂直穿刺）
＜実施例１＞
４週齢のＩＣＲマウス（日本チャールズ・リバー株式会社より購入、以下、「マウス」とも称することがある）を用いた。
【００４９】
ＩＣＲマウスは、入荷から１週間の検疫、及び馴化期間を経た後、実験に供試した。検疫、及び馴化期間では、外傷や脱毛の有無、運動性等の外見上の一般状態を観察した。ＩＣＲマウスは、ＨＥＰＡ（Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）フィルターで清浄化された空気を供給した飼育室（温度：２３℃±２℃、湿度：５０％±１５％）にて、ポリカーボネート製の飼育ケージ（３２ｃｍ×２１ｃｍ×１７ｃｍ、トキワ科学器械株式会社製）内に３匹／飼育ケージにて飼育した。飼料は、マウス用固形飼料（ＣＥ−２、３０ｋＧｙ照射滅菌、日本クレア株式会社製）を自由摂取させた。飲料水は、純水をオートクレーブ滅菌後、塩素及び塩酸の滴下によりｐＨ３に調整したものを用いた。床敷は、実験動物用床敷（クリーンチップ、日本クレア株式会社製）を用いた。飼育期間中は、飼育ケージ、飲料水、及び床敷を週２回交換した。飼料は週１回交換した。また、飼育照明は、タイマー付飼育照明を利用して、明期：７時〜１９時、暗期：１９時〜７時の明暗サイクルとした。
【００５０】
マウス１０匹を使用して、実験小動物用簡易吸入麻酔装置（装置名：ＴＫ−７、株式会社バイオマシナリー製、流量：２Ｌ／分間）を用いたイソフルラン（マイラン製薬株式会社製、導入麻酔濃度：２．５質量％、維持麻酔濃度：２質量％）にて吸入麻酔した。吸入麻酔下のマウスに対して、以下のようにして大腿骨髄腔への液体の注入操作を行った。
−大腿骨髄腔への液体の注入操作−
ＢＤ  プラスチパックＴＭ２９Ｇ  インスリン皮下投与用針付注射筒（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー社製、注射針、注射筒一体型）を用いて、大腿骨体又は内側顆部に対して略垂直に穿刺針を穿刺後、注射筒内に充填した２質量％エバンスブルー溶液（和光純薬工業株式会社製）５０μＬを髄腔内に注入した。
【００５１】
エバンスブルー溶液が髄腔より体内に注入された場合、即時にマウス体表が青色に染色されることを利用し、注入操作の成否を判定した。注入操作に失敗した場合は、他方の大腿骨への注入操作を実施し、マウス１匹に対し、最大２回の注入操作を実施した。術者は、マウス５匹を用いて手技を習練した後、マウスへの注入操作を実施した。その結果、注入操作１５回中９回注入に成功した（成功率：６０％）。
注入操作を完了したマウスについて、麻酔から覚めたマウスの行動を確認したところ、液体注入前と比較して顕著な行動異常は認められなかった。
その後、前記マウスを頸椎脱臼による安楽死処置後、直剪刀（株式会社夏目製作所製）及び有鈎ピンセット（株式会社夏目製作所製）を用いて注入部位を切開し、注入溶液の漏れの有無について確認した。その結果、成功した９回中８回は穿刺部からの漏出なく溶液が注入されていることが確認できた（非漏出率：８９％）。結果を下記表１及び図２に示す。図２に示すように、マウスの右足１０において、液体の漏れが認められ、左足２０において、液体の大腿骨髄腔への注入ができていることが分かる。なお、液体の注入が成功しなかった多くの場合において、液体が大腿骨髄腔外に入ることにより皮下の膨張が確認できた。
【００５２】
（脛骨平行穿刺）
＜比較例１＞
実施例１において、大腿骨髄腔への液体の注入操作を以下に示す脛骨髄腔への液体の注入操作に変更した以外は、実施例１と同様にして、液体の注入の確認、注入溶液の漏れの有無の確認を行った。
−脛骨髄腔への液体の注入操作−
前記マウスの膝関節を９０度に折り曲げた状態で固定した後、ＢＤ  プラスチパックＴＭ２９Ｇ  インスリン皮下投与用針付注射筒（ベクトンディッキンソン・アンド・カンパニー社製、注射針、注射筒一体型）を用いて、脛骨体に平行に膝関節上方より近位端に対して穿刺針を穿刺後、注射筒内に充填した２質量％エバンスブルー溶液（和光純薬工業株式会社製）５０μＬを髄腔内に注入した。
【００５３】
液体の注入の確認をしたところ、注入操作１７回中８回注入に成功した（成功率：４７％）。
注入操作を完了したマウスについて、麻酔から覚めたマウスの行動を確認したところ、液体注入前と比較して足を引きずるように歩くことが認められた。
注入溶液の漏れの有無について確認したところ、成功した８回中２回は穿刺部からの漏出なく溶液が注入されていることが確認できた（非漏出率：２５％）。結果を下記表１に示す。
また、注入溶液の漏出のほとんどは、注射針の針先が脛骨を貫通し、穿刺部の真反対側に突き出たことによりできたピンホールから起こっていることが確認された。
【００５４】
【表１】
0006734078.tif 000002
【００５５】
前記表１から、実施例１は、比較例１と比較して、高い成功率にて液体を髄腔内に注入することができることが分かる。成功率が高いことは、本発明の大腿骨髄腔への注入方法が、穿刺対象部の固定が容易であることに加え、標的部の面積が広いことから、容易に液体を注入することができるためであると考えられる。
特に、非漏出率については、実施例１は、比較例１と比較して顕著に高いことが分かる。これは、従来の方法においては、穿刺の角度と力加減を誤ることにより漏出の原因となるピンホールが空くためであると推測され、本発明においては、穿刺の角度と力加減を容易に調節することができ、ピンホールの発生を抑制できることが示唆された。
【００５６】
実施例１及び比較例１においては、エバンスブルー溶液を用いることにより注入の成否、及び溶液の漏出の有無を容易に判別できた。しかし、細胞や薬剤等を注入する実験においては、注入の成否を判定することは可能な場合もあるものの、髄腔からの漏出の有無を判別することは不可能であり、また、その後の実験結果からも注入操作時の漏出を結論付けることは難しい。
そのため、非漏出率の高い本発明の大腿骨への注入方法は、簡便で、かつ信頼性が高く、さらに、短期での習熟も可能な有用な方法である。
また、膝蓋皿や膝蓋腱等を傷つける従来の注入方法と比較して、これらを傷つけることなく液体の注入が可能な本発明の大腿骨髄腔への注入方法は、動物愛護上も優れた手法である。
【００５７】
（実施例２）
実施例１において、以下の条件に変更した以外は、実施例１と同様にして、液体の注入の確認、注入溶液の漏れの有無の確認を行った。
−条件−
匹数：５匹
術者：動物実験に精通している者：１名
：動物実験の経験が浅い者：１名
なお、動物実験に精通している者とは、動物実験に従事して１０年以上の者を意味し、動物実験の経験が浅い者とは、動物実験に従事して１年未満の者を意味する。
なお、前記術者は、実施例１における術者とは異なる者である。
【００５８】
マウス５匹を用いて、大腿骨髄腔に対して略垂直に穿刺針を穿刺し、液体の注入を確認した。動物実験に精通している者においては、注入操作８回中３回注入に成功した（成功率：３８％）。注入溶液の漏れの有無について確認したところ、成功した３回中２回は穿刺部からの漏出なく溶液が注入されていることが確認できた（非漏出率：６７％）。一方、動物実験の経験が浅い者においては、注入操作１０回中２回注入に成功した（成功率：２０％）。注入溶液の漏れの有無について確認したところ、成功した２回中１回は穿刺部からの漏出なく溶液が注入されていることが確認できた（非漏出率：５０％）。
【００５９】
（実施例３）
実施例２において、以下の穿刺補助器具を使用した以外は、実施例２と同様にして、液体の注入の確認、注入溶液の漏れの有無の確認を行った。
−穿刺補助器具−
・形状：テーパー状
先端部の内径：４．１３ｍｍ、外径：５．９４ｍｍ
基端部の内径：４．９６ｍｍ、外径：６．４９ｍｍ
・材質：ポリプロピレン（ＰＰ）
・穿刺深さ：２．８ｍｍ±０．１ｍｍ
【００６０】
液体の注入の確認をしたところ、動物実験に精通している者においては、注入操作８回中５回注入に成功した（成功率：６３％）。注入溶液の漏れの有無について確認したところ、成功した５回中５回は穿刺部からの漏出なく溶液が注入されていることが確認できた（非漏出率：１００％）。一方、動物実験の経験が浅い者においては、注入操作７回中５回注入に成功した（成功率：７１％）。注入溶液の漏れの有無について確認したところ、成功した５回中４回は穿刺部からの漏出なく溶液が注入されていることが確認された（非漏出率：８０％）。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
２名の術者とも、穿刺補助器具なしでの大腿骨髄腔内への溶液注入は高い確率において実施できなかったが、穿刺補助器具を使用することにより成功率は顕著に向上し、非漏出率も高かった。穿刺補助器具を使用することにより注射針の穿刺深さが調整され、これにより注射針の大腿骨の貫通が抑止されたと考えられる。穿刺の際の力加減を習得前の術者にも高い成功率での髄腔内溶液注入を可能にする穿刺補助器具は、非常に有用である。
【００６３】
本発明の態様としては、例えば、以下の通りである。
＜１＞  非ヒト動物の大腿骨髄腔に対して略垂直に穿刺針を穿刺し、前記穿刺針を介して、液体を前記大腿骨髄腔に注入することを特徴とする大腿骨髄腔への注入方法である。
＜２＞  穿刺針の穿刺部位が、大腿骨体、内側顆部、及び外側顆部から選択される少なくとも１種である前記＜１＞に記載の大腿骨髄腔への注入方法である。
＜３＞  前記非ヒト動物が、非ヒト免疫不全動物である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の大腿骨髄腔への注入方法である。
＜４＞  前記液体が、細胞及び薬剤の少なくともいずれかである前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の大腿骨髄腔への注入方法である。
＜５＞  前記細胞の注入濃度が、５×１０５個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下である前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の大腿骨髄腔への注入方法である。
＜６＞  前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の大腿骨髄腔への注入方法に用いられる穿刺器具の穿刺針の基端に取り付ける穿刺補助器具であって、
大腿骨への前記穿刺針の穿刺深さを調節することを特徴とする穿刺補助器具である。
＜７＞  前記穿刺深さが、２ｍｍ以上５ｍｍ以下である前記＜６＞に記載の穿刺補助器具である。
＜８＞  非ヒト免疫不全動物における大腿骨髄腔に対して略垂直に穿刺針を穿刺し、前記穿刺針を介して、ヒト造血幹細胞を、大腿骨髄腔に注入して移植させ、血液再構築モデル動物を作製することを特徴とする血液再構築モデル動物の作製方法である。
【符号の説明】
【００６４】
１  穿刺補助器具
２  穿刺針
３  針基
４  注射筒
Ａ  穿刺深さ
１０  右足
２０  左足
【図１】
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【図２】
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