(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス構造ポリペプチドおよび少なくとも１つのマラリア抗原を含むウイルス様粒子であって、該ウイルス構造ポリペプチドが、チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)由来の構造ポリペプチドであり、該マラリア抗原が、スポロゾイト周囲タンパク質由来の免疫原性断片であり、該マラリア抗原がウイルス構造ポリペプチドのエンベロープタンパク質に挿入されている、ウイルス様粒子。
【請求項２】
該ウイルス構造ポリペプチドが、カプシドおよびエンベロープタンパク質E1およびE2を含む、請求項１に記載のウイルス様粒子。
【請求項３】
少なくとも１つのマラリア抗原が、エンベロープタンパク質のE2に挿入されている、請求項２に記載のウイルス様粒子。
【請求項４】
該ウイルス構造ポリペプチドが、チクングニアウイルス(CHIKV)由来の構造ポリペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項５】
少なくとも１つのマラリア抗原および該ウイルス構造ポリペプチドが融合タンパク質として発現する、請求項１〜４のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項６】
少なくとも１つのマラリア抗原が、該ウイルス構造ポリペプチドと融合しており、１つまたは2つのリンカーが該抗原および該ウイルス構造ポリペプチドのN末端残基および/または該マラリア抗原および該ウイルス構造ポリペプチドのC末端残基の間に介在する、請求項５に記載のウイルス様粒子。
【請求項７】
少なくとも１つのマラリア抗原が、配列番号1または2の第509番および第510番、第510番および第511番、第511番および第512番、第519番および第520番、第529番および第530番、第530番および531番あるいは第531番および第532番の残基の間、または配列番号3の第515番および第516番、第516番および517番、第517番および第518番、第518番および第519番、第519番および第520番、第536番および第537番、第537番及び538番あるいは第538番および第539番の残基の間に挿入される、請求項５または６に記載のウイルス様粒子。
【請求項８】
少なくとも１つのマラリア抗原が、配列番号1または2の第531番および第532番の残基の間、または配列番号3の第518番および第519番の残基の間に挿入される、請求項７に記載のウイルス様粒子。
【請求項９】
配列番号28、31、34、37、39、41または43で表されるアミノ酸配列をコードする核酸分子を哺乳類細胞に形質導入することによって、該融合タンパク質を含むウイルス様粒子が発現する、請求項５〜８のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項１０】
該融合タンパク質を含む該ウイルス様粒子が、配列番号28、31、34、37、39、41または43で表されるアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子を哺乳類細胞に形質導入することにより発現する、請求項５〜８のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項１１】
少なくとも１つのマラリア抗原が、化学架橋により該ウイルス構造ポリペプチドに結合している、請求項１〜４のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項１２】
少なくとも１つのマラリア抗原が、(NPNA)nを含む抗原であり、式中、nが4〜30である、および/または (EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT)yを含む抗原であり、式中yが1〜6である、請求項１〜１１のいずれかに記載のウイルス様粒子。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のウイルス様粒子を発現するための核酸配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１４】
配列番号26〜27、29〜30、32〜33、35〜36、38、40または42で表されるヌクレオチド配列からなる単離された核酸分子。
【請求項１５】
配列番号26〜27、29〜30、32〜33、35〜36、38、40または42で表されるヌクレオチド配列と90%以上の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる、単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の核酸分子を含むベクターであって、該核酸分子に操作可能に結合している発現制御配列を含んでいてよい、ベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれかに記載のウイルス様粒子、請求項１３〜１５のいずれかに記載の核酸分子および/または請求項１６に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項１８】
(a) 請求項１〜１２のいずれかに記載のウイルス様粒子、請求項１３〜１５のいずれかに記載の核酸分子および/または請求項１６に記載のベクター; および
(b) 薬学的に許容される担体
を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれかに記載のウイルス様粒子を含む、ワクチン組成物。
【請求項２０】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の核酸分子および/または請求項１６に記載のベクターを含む、DNAワクチン組成物。
【請求項２１】
抗体の作製方法であって、請求項１〜１２のいずれかに記載のウイルス様粒子、請求項１３〜１５のいずれかに記載の核酸分子および/または請求項１６記載のベクターを非ヒト哺乳動物に接触させることを含む、方法。
【請求項２２】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物における免疫調節のための、請求項１７〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
哺乳動物におけるマラリアの処置方法のための、請求項１７〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
請求項５〜１２のいずれかに記載のウイルス様粒子の製造方法であって、該ウイルス様粒子の発現用に設計されたベクターを製造すること; 該ウイルス様粒子を発現するように該ベクターで形質導入した細胞を培養すること; および該ウイルス様粒子を回収することを含む、方法。
【請求項２６】
少なくとも１つのマラリア抗原が、スポロゾイト周囲タンパク質由来の免疫原性断片を含む、請求項１７〜２０および２３〜２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
マラリアの予防または処置のための請求項１９または２０に記載のワクチン組成物であって、少なくとも１つの第一マラリア抗原または少なくとも１つの第一マラリア抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、刺激組成物; および、少なくとも１つの第二マラリア抗原を含む少なくとも１つのポリペプチドまたは少なくとも１つの第二マラリア抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、追加免疫組成物を別の成分として含む、ワクチン。
【請求項２８】
マラリアの予防または処置に用いるための、請求項１９に記載のワクチン組成物であって、マラリア由来の抗原を複数含む、ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドと少なくとも１つのマラリア抗原を含む粒子およびそれを含む組成物またはワクチン、その医学における使用、特にマラリアの予防または処置における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは、世界で最も流行している、深刻な感染症の１つであり、毎年約2億5千万件発症し、100万人が死亡している (WHO、2009)。5歳未満の子供および妊娠中の女性では、死亡率が高い。45秒に1人の割合で、アフリカの子供がマラリアで死亡している。該疾患は、感染した蚊によって、ヒトからヒトへ伝染するため、過去には、根絶するための試みとして、大々的な殺虫薬のキャンペーンが行われた。これらは、米国の東南部では成功したが、熱帯の発展途上国の殆どでは失敗に終わった。現在の試みとしては、夜間に蚊に刺されるのを防ぐために、蚊帳、特に殺虫薬を浸透させた蚊帳の配布が行われている。しかし、予防および処置の両方のための、殺虫薬および抗マラリア薬に対する耐性が急速に上昇している。したがって、マラリアワクチンは、数百万人もの人々を疾患から守るために必須である(http://www.globalvaccines.org/content/malaria+vaccine+program/19614)。
【０００３】
熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)によって引き起こされるマラリアは、特にアフリカの子供および妊娠中の女性において、未だに主要な公衆衛生上の脅威のままである。有効なマラリアワクチンは、該疾患の負荷を減らすための有用な手段であり、世界のいくつかの領域におけるマラリアの排除に貢献し得る。現在のマラリアワクチンの候補は、ヒトおよび蚊の寄生生活環ステージに対するものであるが、ワクチン開発の可能性について、これまで研究されているタンパク質は比較的少ない。
【０００４】
最も開発が進んでいるワクチン候補である、RTS,Sは、第II相の臨床試験では、マラリアに対する部分的な保護をもたらし、現在、アフリカでの第III相の試験において評価が行われている (The Journal of Clinical Investigation 120(12) 4168-4178, 2010)。
【０００５】
CSPは、スポロゾイト上の主な表面抗原である。CSPは、ヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合するN末端領域(RI)、4アミノ酸(NPNA)リピートを含む中心領域およびトロンボスポンジン様ドメインを含むGPIアンカーC末端領域(RII)から構成される。RTS,Sワクチンに含まれるCSPの領域は、最後の16 NPNAリピートおよび隣接するC末端全体を含む。HBsAg粒子は、RTS,Sのマトリクス担体として作用し、その25%がCSP領域に融合している(The Journal of Clinical Investigation 120(12) 4168-4178, 2010)。
【０００６】
RTS,Sについての一連の第II相試験において、RTS,Sで免疫化した、マラリア無感作の成人の30%〜50%が、相同の熱帯熱マラリア原虫クローンを感染させた蚊による負荷に対して保護された。ガンビアおよびケニアにおける第II相試験において、RTS,Sは、成人の約35%において、マラリア感染に対する短時間性の保護をもたらしたが、ケニアでの試験の結果は、統計学的な優位性は達成されていなかった。モザンビーク、タンザニアおよびケニアで行った第II相試験では、RTS,Sで免疫化した子供および乳幼児の約30%〜50%が臨床マラリアから保護されたが、保護は一般的には短時間性であった (The Journal of Clinical Investigation 120(12) 4168-4178, 2010)。2012年11月9日に出版され、New England Journal of Medicine (NEJM)にオンラインで掲載されている中心的な大規模の第III相試験の結果より、RTS,Sマラリアワクチン候補は、マラリアに対して、アフリカの幼児を保護し得ることが示されている。対照ワクチンで免疫化した場合と比較して、RTS,Sを用いてワクチン接種した乳幼児 (最初のワクチン接種時に6〜12週齢)は、臨床および重症型のマラリアの両方に対してエピソードが1/3に低下しており、注射に対しては同等の反応を示した。
【０００７】
現在のところ、認可されたマラリアに対するワクチンは存在しない。有効性の高いマラリアワクチンは強く望まれている。
【０００８】
ウイルス様粒子(VLP)は、標準の天然ウイルスの組織および構造を模倣しているが、ウイルスゲノムを欠損しており、より安全で安価なワクチン候補を産生できる可能性のある、多タンパク質構造である。予防用の、VLPベースのワクチンは、現在のところ、世界中でごく少数しか市販されていない: GlaxoSmithKlineによるEngerix（登録商標） (Ｂ型肝炎ウイルス) およびCervarix（登録商標） (ヒトパピローマウイルス)およびMerck and Co., Inc.によるRecombivax HB（登録商標） (Ｂ型肝炎ウイルス) およびGardasil（登録商標） (ヒトパピローマウイルス) はそのいくつかの例である。他のVLPベースのワクチンの候補は、臨床試験が行われているかまたは前臨床評価が行われており、例えば、インフルエンザウイルス、パルボウイルス、ノーウォークウイルスおよび種々のキメラVLPである。前臨床試験が成功しているにも関わらず、未だに小規模の基礎研究に限定されているものが他に多く存在する。大規模のVLP産生の意味は、プロセス制御、モニタリング化および最適化の点で議論されている。主要な上流および下流の技術的課題が特定されており、それに基づいて議論されている。VLPベースのワクチンの、成功した画期的新薬が、臨床試験の最新の結果ならびに治療的または予防的なワクチン接種のいずれかのためのキメラVLPベース技術の近年の発展とともに端的に表されている(Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010)。
【０００９】
チクングニアウイルス (CHIKV)は、2004年にこのアルファウイルスがケニアで再出現して以来、アフリカ、欧州およびアジアにおいて、数百万人の人々に感染している。該疾患の重症度およびこの流行性ウイルスの蔓延は、ワクチンまたは抗ウイルス療法の非存在下で、深刻な公衆衛生上の脅威を示す。流行性チクングニアウイルスに対するVLPワクチンは、感染に対して非ヒト霊長類を保護することが報告されている(Nat Med. 2010 March; 16(3): 334-338)。米国特許出願公開第2012/0003266号明細書には、感染またはその少なくとも１つの症状に対して免疫を誘発するチクングニアウイルスに対する、ワクチンまたは抗原性組成物の製剤に有用な、１以上のチクングニアウイルス構造ポリペプチドを含む、ウイルス様粒子 (VLP) を開示している。国際公開第2012/106356号には、アルファウイルスまたはフラビウイルスの修飾ウイルス様粒子(VLP)およびアルファウイルスおよびフラビウイルス介在疾患の予防または処置に用いるための、修飾VLPの産生の増強方法が開示されている(これらの引用文献は、参照により本明細書中に包含される)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第2012/0003266号明細書
【特許文献２】国際公開第2012/106356号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】The Journal of Clinical Investigation 120(12) 4168-4178, 2010
【非特許文献２】Expert Rev. Vaccines 9(10), 1149-1176, 2010
【非特許文献３】Nat Med. 2010 March; 16(3): 334-338
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第一の局面において、本発明は、自己集合が可能な、ポリペプチドと少なくとも１つのマラリア抗原を含む粒子であって、該ポリペプチドが、少なくとも１つの第一付着部位を含み、かかる少なくとも１つのマラリア抗原は、少なくとも１つの第二付着部位を含み、該ポリペプチドおよび該マラリア抗原が、かかる少なくとも１つの第一付着部位および少なくとも１つの第二付着部位を介して結合している、粒子を提供する。
【００１３】
第二の局面において、本発明は、本発明の第一の局面において提供する粒子を発現させるように設計された核酸分子を提供する。
【００１４】
第三の局面において、本発明は、本発明の第一の局面において提供する粒子および／または本発明の第二の局面において提供する核酸分子を含む組成物またはワクチンを提供する。
【００１５】
第四の局面において、本発明は、抗体の作製方法であって、本発明の第一の局面において提供する粒子および／または本発明の第二の局面において提供する核酸分子を哺乳動物に接触させることを含む、方法を提供する。
【００１６】
第五の局面において、本発明は、本発明の第三の局面において提供する組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫調節の方法、マラリアの処置方法、マラリア抗原に対する免疫応答の誘発および／または増強方法を提供する。
【００１７】
第六の局面において、本発明は、本発明の第四の局面において提供する抗体を哺乳動物に投与することを含む、マラリアを引き起こす病原体に対する受動免疫の方法を提供する。
【００１８】
第七の局面において、本発明は、本発明の第一の局面において提供する粒子および／または本発明の第二の局面において提供する核酸分子を哺乳動物に接触させることを含む、マクロファージ上に抗原を提示させる方法を提供する。
【００１９】
第八の局面において、本発明は、本発明の第一の局面において提供する粒子の製造方法であって、該粒子を発現させるように設計したベクターを製造すること；該粒子を発現させるように該ベクターを形質導入した細胞を培養すること；および該粒子を回収することを含む、製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】pVLP74_15 (VLP_CHI 532 NPNAx6)ベクターを示す。
【図２】pVLP78_15 (VLP_CHI 532 NPNAx25)ベクターを示す。
【図３】pVLP74_25 (VLP_VEEV 519 NPNAx6)ベクターを示す。
【図４】マラリアVLPで免疫化した、2週間目のサル個体由来の血清は、CSPに対する抗体の高い力価を誘導したことを示す。
【図５】図４に示すデータの平均値およびSDを示す。
【図６】CSPに対する抗体の誘発における、CHIKV VLPおよびVEEV VLPによる免疫化の組み合わせの効果を示す。図中、Adjはアジュバントを示す。
【図７】CSPに対する抗体の誘発における、マラリア抗原と全く融合していないVLPの投与による効果を示す。図中、4w、6w、10wおよび14wは、それぞれ、免疫化後4週間目、免疫化後6週間目、免疫化後10週間目および免疫化後14週間目であることを示す。
【図８】CSPに対する抗体の誘発における、マラリア抗原と融合したVLPの投与の効果を示す。図中、4w、6w、10wおよび14wは、それぞれ、免疫化後4週間目、免疫化後6週間目、免疫化後10週間目および免疫化後14週間目であることを示す。
【図９】CSPに対する抗体の誘発における、マラリア抗原と融合したVLPを、アジュバントとともに投与した効果を示す。図中、4w、6w、10wおよび14wは、それぞれ、免疫化後4週間目、免疫化後6週間目、免疫化後10週間目および免疫化後14週間目であることを示す。
【図１０】実験スケジュールを示す。
【図１１】PCRを用いた18S マラリアDNAの検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
(1) ポリペプチドと少なくとも１つのマラリア抗原とを含む粒子
第一の局面において、本発明は、自己集合が可能な粒子であって、ポリペプチドと少なくとも１つのマラリア抗原とを含む粒子であって、該ポリペプチドが少なくとも１つの第一付着部位を含み、かかる少なくとも１つの抗原が、少なくとも１つの第二付着部位を含み、該ポリペプチドと該マラリア抗原が、かかる少なくとも１つの第一付着部位および少なくとも１つの第二付着部位を介して結合している、粒子を提供する。
【００２２】
本明細書中で、「自己集合が可能な粒子」という語は、少なくとも１つの、自発的に集合する構成成分により形成される粒子をさす。該成分は、ポリペプチドであっても非ペプチド化合物であってもよい。態様の一において、「自己集合が可能な粒子」は、少なくとも１つのポリペプチドを含むか、または、それからなる粒子であってよい。かかる少なくとも１つのポリペプチドは、１種類以上のペプチドからなる。態様の一において、該粒子は少なくとも10nmの直径、例えば、少なくとも20nm、好ましくは、少なくとも50nmの直径を有する。態様の一において、該粒子の分子量は、100kDa〜100,000kDaであり、好ましくは400kDa〜30,000kDaである。
【００２３】
本発明で用いるポリペプチドは、自発的に集合するものであってよい。該ポリペプチドは、ウイルス構造のポリペプチドであってよい。したがって、本発明の提供する粒子は、ウイルス様粒子であってよい。
【００２４】
ウイルス構造ポリペプチドは、天然起源のウイルスポリペプチドであっても、その修飾ポリペプチドであってもよい。態様の一において、該修飾ポリペプチドは、カプシドおよびエンベロープタンパク質を含む天然起源のウイルス構造ポリペプチドに、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有する。態様の一において、該修飾ポリペプチドは、該アミノ酸の最大10％が欠損、置換および／またはカプシドおよびエンベロープタンパク質を含む天然起源のウイルス構造ポリペプチドに付加されている、変異体である。
【００２５】
態様の一において、本発明に用いるウイルス構造ポリペプチドは、カプシドおよび/またはエンベロープタンパク質またはその断片を含むか、またはこれらからなる。例えば、本発明で用いるウイルス構造ポリペプチドは、カプシドおよびE2およびE1を含むか、これらからなる。抗原は、E2に挿入してよい。態様の一において、本発明の第一の局面で提供する粒子は、240のカプシド、240のE1タンパク質および240のE2タンパク質を集合させることにより形成でき、ここで、マラリア抗原は各E2タンパク質に挿入される。
【００２６】
本発明に用いるウイルス構造ポリペプチドは、アルファウイルスまたはフラビウイルス由来であってよい。したがって、本発明の提供する該粒子は、アルファウイルスまたはフラビウイルス由来のウイルス様粒子であり得る。
アルファウイルスおよびフラビウイルスの例としては、アウラウイルス、ババンキウイルス（Babanki virus）、バーマフォレストウイルス(Barmah Forest virus) (BFV)、ベバルウイルス、カバソウウイルス（Cabassou virus)、チクングニアウイルス(CHIKV)、東部ウマ脳炎ウイルス(EEEV)、エイラートウイルス(Eilat virus)、エバーグレードウイルス(Everglades virus)、フォートモーガンウイルス(Fort Morgan virus)、ゲタウイルス、ハイランドJウイルス(Highlands J virus)、キジラガチウイルス(Kyzylagach virus)、マヤロウイルス、メトリウイルス（Me Tri virus）、ミデルバーグウイルス(Middelburg virus)、モッソダスペドラスウイルス(Mosso das Pedras virus)、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス(RRV)、サケ膵臓病ウイルス(Salmon pancreas disease virus)、セムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、ミナミゾウアザラシウイルス(Southern elephant seal virus)、トナテウイルス(Tonate virus)、トロカラウイルス(Trocara virus)、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)、西部ウマ脳炎ウイルス(WEEV)、ワタロアウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルスおよび黄熱ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
マラリアは、ヒトまたは他の動物（例えばマウス）が罹患する疾患である。マラリアの例としては、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、プラスモディウム・シャバウディおよびプラスモディウム・ヨエリを含むプラスもディウム種によって引き起こされる疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
本明細書において、「マラリア抗原」という語は、任意の抗原またはその断片を指す。抗原またはその断片という語は、免疫系によって認識され得る、および/または細胞性免疫応答を刺激する、および/または抗体の産生を刺激する、任意のペプチドベースの配列を指す。
【００２９】
Scand. J. Immunol. 56, 327-343, 2002によれば、寄生生活環全体を考えると、マラリアワクチンには基本的に６つの標的が存在する:
(1) スポロゾイト; (2) 肝臓ステージ; (3) メロゾイト; (4) 感染RBC; (5) 寄生体毒素; (6) 有性ステージ。
【００３０】
各ステージについて特定されている主要な抗原候補を表にまとめる。
【表１】
0006734651.tif 000002
【００３１】
本発明によれば、上述の1以上の抗原は、粒子に形成されるものであれば、使用してよい。例えば、スポロゾイト周囲タンパク質およびその断片を抗原として使用し得る。スポロゾイト周囲タンパク質の例としては、以下に記載のアミノ酸配列（配列番号56）からなる熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質が挙げられるが、これに限定されるものではない：
【化１】
0006734651.tif 000003
【００３２】
態様の一において、マラリア抗原は、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質B細胞エピトープである。熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質B細胞エピトープの例は、NPNAのリピート配列、例えば (NPNA)4-30 (すなわち、4x NPNA、5x NPNA、6x NPNA、7x NPNA、8x NPNA、9x NPNA、10x NPNA、11x NPNA、12x NPNA、13xNPNA 14x NPNA、15x NPNA、16x NPNA、17x NPNA、18x NPNA、19xNPNA、20x NPNA、21x NPNA、22x NPNA、23x NPNA、24x NPNA、25x NPNA、26x NPNA、27x NPNA、28x NPNA、29x NPNAまたは30x NPNA)であり得る。
【００３３】
態様の一において、マラリア抗原は、(QGPGAP)3-12を含む、プラスモディウム・ヨエリのスポロゾイト周囲タンパク質B細胞エピトープである。
【００３４】
態様の一において、マラリア抗原は、(ANGAGNQPG) 1-12を含む、三日熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質B細胞エピトープである。
【００３５】
態様の一において、マラリア抗原は、(NAAG)4-30を含む、四日熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質B細胞エピトープである。
【００３６】
態様の一において、マラリア抗原は、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質T細胞エピトープである。熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲タンパク質T細胞エピトープの例は、EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (配列番号44)であり得る。(EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT)1-6も、マラリア抗原として使用し得る。
【００３７】
態様の一において、マラリア抗原は、YNRNIVNRLLGDALNGPEEK (配列番号45)である、プラスモディウム・ヨエリスポロゾイト周囲タンパク質T細胞エピトープである。(YNRNIVNRLLGDALNGPEEK)1-6も、マラリア抗原として使用し得る。
【００３８】
本発明は、抗原、該抗原をコードするベクターおよび該抗原に特異的に結合する抗体（および抗体様分子、例えばアパタマーおよびペプチド）を、（単独または組み合わせでの）マラリア感染症の予防または処置における使用とともに提供することにより、上述の要求の１つ以上に取り組むものである。本明細書中で用いる、「抗体」という語は、エピトープまたは抗原決定基に結合できる分子を指す。該用語は、抗体全体およびその抗原結合断片、例えば一本鎖抗体を含むことを意図する。該抗体は、ヒト抗原結合性抗体断片を含み、Fab、Fab'およびF(ab')2、Fd、一本鎖Fvs (scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fvs (sdFv)およびVLまたはVHドメインのいずれかを含む断片が挙げられるが、これらに限定されない。該抗体は、鳥および哺乳動物を含む任意の動物由来であってよい。好ましくは、抗体は、哺乳類、例えばヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダおよびウマ等、または他の適当な動物、例えばニワトリであってよい。本明細書中で、「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体または１以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックであり、内在性の免疫グロブリンを発現しない動物由来の抗体を含み、例えば、米国特許第5,939,598号明細書に記載されており、その記載は、全体が参照により本明細書中に包含される。
【００３９】
本発明に用いる抗原は、天然起源のタンパク質由来の修飾ポリペプチドであってよい。該修飾ポリペプチドは、天然起源のタンパク質の断片であり得る。態様の一において、該修飾ポリペプチドは、天然起源のタンパク質由来のポリペプチドと、少なくとも、70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有する。態様の一において、得られた修飾ポリペプチドは、天然起源のタンパク質由来のポリペプチドに基づいて、アミノ酸の最大10％が欠損、置換および／または付加されている、変異体である。
【００４０】
本発明の提供する粒子において、ポリペプチドと抗原は、該ポリペプチド中に存在する少なくとも１つの第一付着部位および該抗原中に存在する少なくとも１つの第二付着部位を介して結合していてよい。
【００４１】
本明細書中の、「第一付着部位」および「第二付着部位」という語はそれぞれ、２つ以上の物質が互いに結合している部位をさす。
【００４２】
態様の一において、該ポリペプチドおよび該抗原は直接融合している。あるいは、１つまたは２つのリンカーが該抗原のＮ−末端残基と該ポリペプチドおよび／または該抗原のＣ−末端残基と該ポリペプチドの間に介在していてもよい。
【００４３】
該抗原またはポリペプチドは、切断されており、短いリンカーにより置換されていてよい。いくつかの態様において、該抗原またはポリペプチドは１つ以上のペプチドリンカーを含む。典型的には、リンカーは２〜２５アミノ酸からなる。通常、リンカーは、２〜１５アミノ酸の長さであるが、特定の状況下では、１アミノ酸のみ、例えば単独のグリシン残基であってもよい。
【００４４】
態様の一において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが遺伝学的に抗原をコードするポリペプチドと融合している核酸分子は、ホスト細胞において、第一付着部位および第二付着部位がペプチド結合を介して結合するように発現する。この場合、該ポリペプチドおよび該抗原は、ペプチド結合を介して結合する。この態様に関して、該第一付着部位および／または第二付着部位は、本来のポリペプチドまたは抗体から遺伝的に修飾されていてもよい。例えば、該第一付着部位は、ポリペプチドがSG、GS、SGG、GGSおよびSGSGを含むリンカーペプチドを介して抗原と結合するように、該ポリペプチドから修飾されている。
【００４５】
該ポリペプチドが抗原と化学的に結合している場合、該第一付着部位および第二付着部位は、化合物である化学クロスリンカーを介して結合し得る。
【００４６】
該クロスリンカーの例としては、SMPH、スルホ−MBS、スルホ−EMCS、スルホ−GMBS、スルホ−SIAB、スルホ−SMPB、スルホ−SMCC、SVSB、SIAおよびPierce Chemical Companyより入手可能な他のクロスリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
態様の一において、本発明の提供する粒子は、抗原に結合したポリペプチドを含み、ここで、該抗原のＮ−末端残基とＣ−末端残基の間の空間距離は、該抗原または該抗原を含む天然起源のタンパク質またはそれ由来の修飾タンパク質の結晶において測定した場合に、３０Å以下である。
【００４８】
本発明で用いる抗原は、当業者が設計してよい。例えば、本発明で用いる抗原は、天然起源のタンパク質またはその断片であってよい。あるいは、本発明で用いる抗原は、天然起源のタンパク質から修飾されたタンパク質またはその断片であってよい。当業者は、該抗原のＮ−末端残基とＣ−末端残基の間の空間距離が、抗原または該抗原を含む天然起源のタンパク質またはその修飾タンパク質において測定した場合に、30Å以下であるように、抗原を設計してよい。例えば、本発明の提供する粒子に用いる抗原は、フリーソフトウェア、例えばPyMOL (例えば、PyMOL v0.99: http:/www.pymol.org)を用いて設計してよい。態様の一において、該抗原のＮ−末端残基およびＣ−末端残基の空間距離は、30Å(オングストローム)以下、20Å以下、または10Å以下 (例えば、5Å〜15Å、5Å〜12Å、5Å〜11Å、5Å〜10Å、5Å〜8Å、8Å〜15Å、8Å〜13Å、8Å〜12Å、8Å〜11Å、9Å〜12Å、9Å〜11Å、9Å〜10Åまたは10Å〜11Å)である。
【００４９】
チクングニアウイルス様粒子またはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子
態様の一において、本発明は、チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドと少なくとも１つのマラリア抗原とを含む、チクングニアウイルス様粒子またはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子を提供し、ここで、該チクングニアウイルス構造ポリペプチドまたは該ベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドは、少なくとも１つの第一付着部位を含み、かかる少なくとも１つのマラリア抗原は、少なくとも１つの第二付着部位を含み、ここで、該チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドおよびかかる少なくとも１つの抗原は、かかる少なくとも１つの第一付着部位および少なくとも１つの第二付着部位を介して結合している。
【００５０】
態様の一において、マラリア抗原のＮ−末端残基およびＣ−末端残基の間の空間距離は、該マラリア抗原または該マラリア抗原を含む天然起源のタンパク質またはそれ由来の修飾タンパク質の結晶で測定した場合に、30Å以下; 25Å以下; 20Å以下; 15Å以下; 14Å以下; 13Å以下; 12Å以下; 11Å以下; 10Å以下; 9Å以下; または8Å以下 (例えば、5Å〜15Å、5Å〜12Å、5Å〜11Å、5Å〜10Å、5Å〜8Å、8Å〜15Å、8Å〜13Å、8Å〜12Å、8Å〜11Å、9Å〜12Å、9Å〜11Å、9Å〜11Åまたは10Å〜11Å)であってよい。
【００５１】
態様の一において、該マラリア抗原は、化学架橋によって、または遺伝工学によって製造した融合タンパク質として、チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドに結合している。
【００５２】
本発明で用いるチクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドは、チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルスエンベロープタンパク質および／またはカプシドを含んでいてよい。
【００５３】
チクングニアウイルスの例としては、37997およびLR2006 OPY-1株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの例としては、TC-83が挙げられるが、これに限定されない。
【００５５】
本発明で用いるチクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドは、天然起源のウイルス構造ポリペプチドまたはその修飾ポリペプチドを含んでいてよい。該修飾ポリペプチドは、天然起源のウイルス構造ポリペプチドの断片であってよい。態様の一において、該修飾ポリペプチドは、天然起源のウイルスカプシドおよび／またはエンベロープタンパク質と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有する。態様の一において、修飾ポリペプチドは、アミノ酸の最大10％が天然起源のウイルスカプシドおよび／またはエンベロープタンパク質に基づいて欠損、置換およびまたは付加されている変異体である。例えば、K64AまたはK64N変異を、本発明で用いるベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドのカプシドに導入してよい。
【００５６】
チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルスの構造ポリペプチドは、カプシド、E2、およびE1からなっていても、これらを含んでいてもよい。
【００５７】
チクングニアウイルス構造ポリペプチドの例としては、チクングニアウイルス株37997のカプシド-E2-E1およびチクングニアウイルス株LR2006 OPY-1のカプシド-E2-E1が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
ベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドの例としては、ベネズエラウマ脳炎ウイルス株TC-83のカプシド-E2-E1が挙げられるが、これに限定されない。
【００５９】
チクングニアウイルス構造ポリペプチド配列の例は、Genbank受入番号第ABX40006.1にて提供される、以下の配列である(配列番号1)：
【化２】
0006734651.tif 000004
【００６０】
チクングニアウイルス構造ポリペプチド配列の他の例は、Genbank受入番号第ABX40011.1にて提供される以下の配列である(配列番号2):
【化３】
0006734651.tif 000005
【００６１】
ベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドの例として、以下の配列が挙げられる(配列番号3):
【化４】
0006734651.tif 000006
【００６２】
態様の一において、第一付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基を含む。態様の一において、第二付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含む。
【００６３】
態様の一において、２つを超える物質(例えば、抗原およびチクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチド)の、第一付着部位または第二付着部位を介する結合は、化学クロスリンカーを介して達成される。該クロスリンカーの例としては、SMPH、スルホ-MBS、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMPB、スルホ-SMCC、SVSB、SIAおよびPierce Chemical Companyより入手し得る他のクロスリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明によれば、チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドと抗原とを含む、チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子であって、該チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドおよび該抗原が、融合タンパク質として発現する、粒子を提供し得る。
【００６５】
態様の一において、該抗原は、チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドの任意の部位と融合していてよい。例えば、該抗原は、チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドのＮ−またはＣ−末端に直接または間接的に結合していても、または、該抗原は、チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造タンパク質に挿入されていてもよい。
【００６６】
態様の一において、少なくとも１つの抗原は、チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス構造タンパク質のE2に挿入される。例えば、チクングニアウイルス構造タンパク質について、少なくとも１つの抗原は、配列番号1または2の第519番と第520番の残基の間 (すなわち、配列番号1または2の、第519番のGと第520番のQの間); 配列番号1または2の第530番および第531番の残基の間(すなわち、配列番号1または2の、第530番のGと第531番のSの間); 配列番号1または2の、第531番と第532番の残基の間 (すなわち、配列番号1または2の第531番のSと第532番のNの間); 配列番号1または2の第529番と第530番の残基の間 (すなわち、配列番号1または2の、第529番のGと第530番のGの間); または配列番号1または2の第510番と第511番の残基の間 (すなわち、配列番号1または2の、第510番のSと第511番のGの間);または配列番号1または2の第511番と第512番の残基の間(すなわち、配列番号1または2の第511番のGと第512番のNの間); または配列番号1または2の第509番と第510番の残基の間(すなわち、配列番号1または2の第509番のQと第510番のSの間)に挿入される。
【００６７】
例えば、ベネズエラウマ脳炎ウイルス構造タンパク質について、少なくとも１つの抗原は、配列番号3の第517番と第518番の残基の間(すなわち、配列番号3の第517番のGと第518番のSの間); 配列番号3の第518番と第519番の残基の間(すなわち配列番号3の第518番のSと第519番のSの間); 配列番号3の第519番と第520番の残基の間 (すなわち配列番号3の第519番のSと第520番のVの間); 配列番号3の第515番と第516番の残基の間 (すなわち、配列番号3の第515番のLと第516番のSの間); 配列番号3の第516番と第517番の残基の間 (すなわち配列番号3の第516番のSと第517番のGの間); 配列番号3の第536番と第537番の残基の間(すなわち配列番号3の第536番のCと第537番のGの間); 配列番号3の第537番と第538番の残基の間 (すなわち配列番号3の第537番のGと第538番のGの間); 配列番号3の第538番と第539番の残基の間(すなわち、配列番号3の第538番のGと第539番のTの間)に挿入される。
【００６８】
該融合タンパク質は、当該分野で慣用される技術を用いて発現させてよい。該融合タンパク質の発現に、種々の発現系を用いてよい。例えば、該融合タンパク質は、293細胞、Sf9細胞または大腸菌（E.coli）に発現させてよい。
【００６９】
チクングニアウイルス (CHIKV) またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV) 由来のポリペプチドは、天然起源のウイルスポリペプチドであっても、その修飾ポリペプチドであってもよい。さらに、マラリア抗原由来のポリペプチドは、天然起源のポリペプチドもしくは該天然起源のポリペプチドの修飾ポリペプチドであるか、または天然起源のポリペプチドもしくは修飾ペプチドの断片であってよい。該修飾ポリペプチドは、天然起源のウイルス構造ポリペプチドの断片であってよい。
【００７０】
態様の一において、マラリア抗原由来の修飾ポリペプチドは、天然起源のポリペプチドと、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有する。態様の一において、マラリア抗原由来の該修飾ペプチドはマラリア抗原由来の天然起源のポリペプチドに基づいて、アミノ酸の最大10%が欠損、置換および／または付加されている変異体である。
【００７１】
ウイルス由来のポリペプチドが抗原由来のポリペプチドと結合している場合、SG、GS、SGG、GGS SGSGおよびTRGGSを含むリンカーペプチドを用いてよい。ウイルス由来のポリペプチド（以降「PFV」と呼ぶ）の抗原由来のポリペプチド（以降「PFA」と呼ぶ）との結合の例としては、PFV-SG-PFA-GS-PFV; PFV-SG-PFA-GGS-PFV; PFV-SSG-PFA-GS-PFV; PFV-SGG-PFA-GGS-PFV;PFV-SGSG-PFA-GS-PFV; およびPFA-SGG-PFA-TRGGS-PFVが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
態様の一において、本発明は、チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV) 由来のポリペプチドおよびマラリア抗原由来のポリペプチドを含む融合タンパク質を含むウイルス様粒子を提供し、ここで、該ウイルス様粒子は、配列番号28、31、34、37、39、41または43で表されるアミノ酸配列に相当する核酸分子を含む発現ベクターを哺乳類細胞(例えば293F細胞)に導入することにより製造される。この態様については、修飾融合タンパク質を、本発明が提供するウイルス様粒子に用いてもよく、これは、配列番号28、31、34、37、39、41または43と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列に相当する核酸分子を含む発現ベクターを哺乳類細胞 (例えば293F細胞)に形質導入することによって製造し得る。
【００７３】
態様の一において、本発明は：
チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)の１つ以上のカプシド;
チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)の１つ以上のE1; および
チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)の１つ以上のE2
を含むか、またはこれらかなるウイルス様粒子を提供し、ここで、マラリア抗原は、チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)のE2に挿入されている。例えば、本発明は:
チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)の240のカプシド;
チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)の240のE1; および
チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)の240のE2
を含むか、またはこれらからなるウイルス様粒子を提供し、ここで、
マラリア抗原は、チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)のそれぞれのE2に挿入される。
【００７４】
この態様において、該抗原が挿入されるE2は配列番号50で表されるアミノ酸配列でなっていてよく; 該E1は、配列番号51で表されるアミノ酸配列からなっていてよく;該カプシドは、配列番号52で表されるアミノ酸配列でなっていてよいか、または
該抗原が挿入されるE2は、配列番号53で表されるアミノ酸配列からなっていてよく; 該E1は、配列番号54で表されるアミノ酸配列でなっていてよく; 該カプシドは、配列番号55で表されるアミノ酸配列でなっていてよい。
【００７５】
さらに、この態様に関しては、チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV) 由来の修飾カプシド、チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV) 由来の修飾E1ならびにチクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV) 由来の修飾E2を、該ウイルス様粒子に用いてもよい。例えば、チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV) の該修飾カプシドは、配列番号52または配列番号55で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有していてよく;チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)の修飾E1は、配列番号51または配列番号54で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有していてよく; および/またはチクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)の修飾E2は、配列番号50または配列番号53で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%のアミノ酸配列同一性を有していてよい。
また、該修飾カプシド、E1またはE2は、配列番号52または配列番号55で表されるアミノ酸配列からなるカプシド; 配列番号51または配列番号54で表されるアミノ酸配列からなるE1;および/または配列番号50または配列番号53で表されるアミノ酸配列からなるE2に基づいて、該アミノ酸の最大10%が欠損、置換および/または付加されている、変異体であってもよい。
【００７６】
(2) ヌクレオチド、ベクター、ホスト細胞
第二の局面において本発明は、本発明の第一の局面にて提供する粒子を発現させるように設計された核酸分子を提供する。
【００７７】
態様の一において、本発明は、上述のチクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。
【００７８】
チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子をコードするヌクレオチド配列の例としては、チクングニアウイルス株37997のエンベロープをコードするヌクレオチド配列、チクングニアウイルス株37997のカプシド-エンベロープをコードするヌクレオチド配列、チクングニアウイルス株LR2006 OPY-1のエンベロープをコードするヌクレオチド配列、チクングニアウイルス LR2006 OPY-1のカプシド-エンベロープをコードするヌクレオチド配列、ベネズエラウマ脳炎ウイルス株TC-83のエンベロープをコードするヌクレオチド配列およびベネズエラウマ脳炎ウイルス TC-83のカプシド-エンベロープをコードするヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
チクングニアウイルスについて、エンベロープをコードするヌクレオチド配列の例を以下に示す (配列番号4):
【化５】
0006734651.tif 000007
【００８０】
チクングニアウイルスについて、エンベロープをコードする他のヌクレオチド配列の例を以下に示す (配列番号5):
【化６】
0006734651.tif 000008
【００８１】
チクングニアウイルスについて、カプシド-エンベロープをコードするヌクレオチド配列の例を以下に示す(配列番号6):
【化７−１】
0006734651.tif 000009
【化７−２】
0006734651.tif 000010
【００８２】
チクングニアウイルスについて、カプシド-エンベロープをコードするヌクレオチド配列の他の例を以下に示す(配列番号7):
【化８−１】
0006734651.tif 000011
【化８−２】
0006734651.tif 000012
【００８３】
態様の一において、本発明は、上述の核酸分子を含むベクターを提供し、ここで、該ベクターは、該核酸分子に操作可能に結合した発現調節配列を含んでいてよい。
【００８４】
発現調節配列の例としては、プロモーター、例えばＣＭＶプロモーター、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌のlac、phoAおよびtacプロモーター、SV40初期および後期プロモーターおよびレトロウイルスのLTRのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
この態様において、上述の核酸分子に操作可能に結合している発現調節配列を含むベクターは、本発明の第一の局面で提供する粒子の製造用の発現ベクターとして使用し得る。
【００８６】
該発現ベクターは、国際公開第2012/006180号に基づいて当業者が製造してよく、当該文献の内容はその全体が参照により本明細書に包含される。
【００８７】
チクングニアウイルス (CHIKV)由来のポリペプチドと抗原のポリペプチドの融合タンパク質を含むウイルス様粒子の発現に用い得るベクターの例としては、CHIKV VLPポリヌクレオチド (配列番号13; 配列番号14に表されるアミノ酸配列に相当)を含むVLP_CHI 512ベクター (配列番号8); およびCHIKV VLPポリヌクレオチド (配列番号15; 配列番号16に表されるアミノ酸配列に相当)を含むVLP_CHI 532ベクター (配列番号9) に表されるベクターが挙げられる。
【００８８】
発現ベクターは、当業者が、米国特許出願公開第2012/0003266号に基づいて製造してよく、当該文献の内容はその全体が、参照により本明細書中に包含される。
【００８９】
ベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)由来のポリペプチドおよび抗原のポリペプチドの融合タンパク質を含む、ウイルス様粒子の発現に用い得るベクターの例としては、VEEV VLPポリヌクレオチド(配列番号17;配列番号18に表されるアミノ酸配列に相当)を含むVLP_VEEV VLP 518ベクター (配列番号10); VEEV VLPポリヌクレオチド(配列番号19; 配列番号20に表されるアミノ酸配列に相当)を含むVLP_VEEV VLP 519ベクター(配列番号11); およびVEEV VLPポリヌクレオチド(配列番号21; 配列番号22で表されるアミノ酸配列に相当)を含むVLP_VEEV VLP 538ベクター(配列番号12)が挙げられる。
【００９０】
態様の一において、本発明は、チクングニアウイルス(CHIV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)由来のポリペプチドおよびマラリア抗原由来のポリペプチドの融合タンパク質を含むウイルス様粒子を発現するように設計された核酸分子を提供し、該核酸分子は、配列番号26〜27、29〜30、32〜33、35〜36、38、40または42で表されるヌクレオチド配列からなる。
【００９１】
態様の一において、本発明は、配列番号26〜27、29〜30、32〜33または35〜36、38、40または42のいずれかによって表されるヌクレオチド配列を有する核酸分子から修飾された核酸分子を提供する。該修飾核酸分子は、配列番号26〜27、29〜30、32〜33、35〜36、38、40または42のいずれかによって表されるヌクレオチド配列を有する核酸分子と、ヌクレオチド配列が少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または98%同一であってよい。また、該修飾核酸分子は、配列番号26〜27、29〜30、32〜33、35〜36、38、40または42のいずれかによって表されるヌクレオチド配列を有する核酸分子に基づいて、アミノ酸の最大10%が欠損、置換および／または付加されている変異体であってよい。
【００９２】
(3) 組成物またはワクチン
第三の局面において、本発明は、本発明の第一の局面で提供する粒子および／または本発明の第二の局面で提供する核酸分子を含む組成物またはワクチンを提供する。
【００９３】
態様の一において、本発明は、上述のアルファウイルスまたはフラビウイルス様粒子（例えばチクングニアウイルス様粒子またはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子）、または上述の核酸分子を含む組成物またはワクチンを提供する。アルファウイルスまたはフラビウイルス様粒子の含量および該核酸分子の含量は、0.00001〜1w/w%であってよい。
【００９４】
本発明の第一の局面で提供する粒子の投与量 (例えばCHIKV VLP; またはVEEV VLP)は、1日あたりl〜500μgであってよい。
【００９５】
本発明の第三の局面で提供する組成物またはワクチン１つに、１つ以上のマラリア抗原を用いてもよい。
【００９６】
該組成物またはワクチンは、薬学的に許容される担体および/またはアジュバントをさらに含んでいてよい。アジュバントの例としては、アルミニウム塩、水酸化ナトリウム、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバントおよびRibi溶液 (Sigma Adjuvant system, Sigma-Aldrich) が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の第三の局面で提供する組成物またはワクチンは、緩衝剤、例えばリン酸水素ナトリウム水和物、リン酸二水素ナトリウムおよび塩化ナトリウム; および保存剤、例えチメロサールを含んでいてよい。態様の一において、該組成物またはワクチンは、本発明の第一の局面で提供する粒子(例えばCHIKV VLPまたはVEEV VLP) 0.001〜1w/w%、緩衝剤1〜10w/w%、アジュバント0.01〜1w/w%および保存剤0.00001〜0.001w/w%を含む水性液剤であってよい。
【００９７】
当業者は、慣用的な技術を用いて本発明の組成物およびワクチンを製造し得る。例えば、本発明の第一の局面で提供される粒子は、生理学的なpH（例えばpH 5〜9、pH7）を有する緩衝液と混合して、本発明の第三の局面で提供する組成物およびワクチンが製造される。
【００９８】
本発明の医薬組成物は、本発明の目的に反しない限り、単一の有効成分または２つ以上の有効成分の組み合わせを含んでいてよい。例えば、ケモカインを含むサイトカイン、サイトカインの抗体、例えば抗TNF抗体 (例えばインフリキシマブ、アダリムマブ)、抗VEGF抗体 (例えばベバシズマブおよびラニビズマブ)、サイトカイン受容体拮抗薬、例えば抗HER2抗体 (例えばトラスツズマブ)、抗EGF受容体抗体 (例えばセツキシマブ)、抗VEGFアプタマー(例えばペガプタニブ)および免疫調節剤、例えばシクロスポリン、タクロリムス、ウベニメクスを組み合わせ治療に用いてよい。
【００９９】
複数の有効成分の組み合わせにおいて、それぞれの含量は、その治療効果および安全性によって適宜増減してよい。
【０１００】
本明細書中で、「組み合わせ」という語は、２つ以上の有効成分を単一の実体または用量の形態で同時に患者に投与するか、または両方を別々の実体で同時にまたは時間に特定の制限なく連続的に患者に投与することを指し、ここで、該投与は、体内において、好ましくは同時に、かかる２つの成分の治療上有効なレベルをもたらす。
【０１０１】
態様の一において、該組成物はＤＮＡワクチンを含むワクチン組成物である。態様の一において、本発明の提供する該ＤＮＡワクチンは、CpG含有オリゴヌクレオチドを含む。
【０１０２】
本発明の第三の局面で提供する組成物またはワクチンは、1回以上投与してもよい。本発明の第三の局面で提供する組成物またはワクチンを２回以上投与する場合、各投与に、異なる本発明の第一の局面で提供する粒子 (例えばCHIKV VLPまたはVEEV VLP) を用いてよい。態様の一において、本発明の第一の局面で提供するCHIKV VLPを用いた免疫化および、本発明の第一の局面で提供するVEEV VLPを用いた免疫化の組み合わせを用いる。例えば、本発明の第一の局面で提供するCHIKV VLPを1回目の免疫化に使用し、本発明の第一の局面で提供するVEEV VLPは2回目の免疫化に用いても、または、本発明の第一の局面で提供するVEEV VLPを1回目の免疫化に用い、本発明の第一の局面で提供するCHIKV VLPを2回目の免疫化に用いてよい。
【０１０３】
当業者は、本発明の第三の局面で提供する組成物またはワクチンを用いた免疫化のタイミングを決定し得る。例えば、2回目の免疫化は、1回目の免疫化の1、2、3、4、5、6、7、8、9または10週後に行われる。
【０１０４】
態様の一において、本発明は、
(a)本発明の第一の局面で提供する粒子を含むワクチン組成物；および
(b)本発明の第一の局面で提供する粒子を含む他のワクチン組成物
を含むキットを提供し、ここで、(a)に含まれる粒子は、(b)に含まれる粒子とは異なるウイルス様粒子である。この態様において、(a)に含まれる粒子は、チクングニアウイルス様粒子であってよく、(b) に含まれる粒子がベネズエラウマ脳炎ウイルスウイルス様粒子であってよい。
【０１０５】
態様の一において、本発明は、
(a) 本発明の第一の局面で提供する粒子を含むワクチン組成物; および
(b) 本発明の第一の局面で提供する粒子を含む他のワクチン組成物、
(c) 本発明の第一の局面で提供する粒子をそれぞれが含む、１つ以上のワクチン組成物
を含むキットを提供し、ここで、(a)は免疫化を刺激するのに用いられ、(b)および(c)は免疫化の追加に使用され; (a)に含まれる粒子は、 (b)に含まれる粒子とは異なるウイルス様粒子であり; (c)に含まれる粒子は、(a) および(b)に含まれる粒子とは異なるか、または(a)または(b) に含まれる粒子と同じである。
【０１０６】
上述のキットに含まれるそれぞれのワクチン組成物は、同時、別または連続的に投与してよい。
【０１０７】
本発明の第一の局面で提供する、アルファウイルスまたはフラビウイルスのウイルス様粒子 (例えばチクングニアウイルスまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス)または本発明の第二の局面で提供する核酸分子は、本発明の第三の局面で提供する組成物およびワクチンに使用し得る。
【０１０８】
例えば、
１つ以上 (例えば240)のチクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)のカプシド;
１つ以上 (例えば240)のチクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)のE1; および
１つ以上 (例えば240)のチクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)のE2
を含むか、またはこれらからなるチクングニアウイルスまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子であって、マラリア抗原が、チクングニアウイルス(CHIKV)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)のE2に挿入されているチクングニアウイルスまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子は、本発明の第三の局面で提供する組成物またはワクチンの製造に使用し得る。該抗原が挿入されるE2は、配列番号50で表されるアミノ酸配列からなっていてよく; E1は配列番号51で表されるアミノ酸配列でなっていてよく; 該カプシドは、配列番号52で表されるアミノ酸配列でなっていてよいか; または
該抗原が挿入されるE2は、配列番号53で表されるアミノ酸配列でなっていてよく; 該E1は、配列番号54で表されるアミノ酸配列でなっていてよく;該カプシドは、配列番号55で表されるアミノ酸配列でなっていてよい。
【０１０９】
本発明の第三の局面で提供する組成物またはワクチンは、哺乳動物 (例えばヒト) に、筋肉内 (i.m.)、皮内(i.e.)、皮下(s.c)、真皮内 (i.d.) または腹腔内 (i.p.)に投与し得る。
【０１１０】
本発明の第三の局面で提供する組成物またはワクチンは、マラリアの処置または予防に使用し得る。
【０１１１】
したがって、本発明の第一の局面で提供する、アルファウイルスまたはフラビウイルス(例えばチクングニアウイルスまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス)のウイルス様粒子または本発明の第二の局面で提供する核酸分子の、マラリアの処置または予防用の医薬組成物またはワクチンを製造するための使用もまた、本発明が提供するものである。
【０１１２】
(4) 抗体の産生方法、免疫調節の方法、マラリアの処置方法、哺乳動物におけるマラリア抗原に対する免疫応答の誘発および／または増強方法、受動免疫の方法、抗原のマクロファージ上の提示方法および粒子の製造方法
第四の局面において、本発明は、本発明の第一の局面で提供する粒子および／または本発明の第二の局面で提供する核酸分子を哺乳動物に接触させることを含む、抗体の作製方法を提供する。
【０１１３】
本発明の第四の局面で作製する抗体は、慣用の技術を用いてヒト化してよい。したがって、態様の一において、本発明の第四の局面で提供する方法は、非ヒト哺乳類作製抗体をヒト化する工程をさらに含む。
【０１１４】
本発明の第一の局面で提供する粒子および／または本発明の第二の局面で提供する核酸分子は、患者に直接、罹患臓器にまたは全身に投与しても、または該患者由来の細胞またはヒト細胞株に生体外適用して、次いで該細胞を該患者に投与しても、または該患者由来の免疫細胞、例えばＢ細胞およびＴ細胞のサブポピュレーションを試験管内で選択した後、該患者に再び投与するのに用いてもよい。
【０１１５】
本発明によれば、本ウイルス様粒子は免疫療法に適用してよい。
【０１１６】
第五の局面において、本発明は、本発明の第三の局面で提供する組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における免疫調節の方法、マラリアの処置方法、マラリア抗原に対する免疫応答の誘発および／または増強方法を提供する。
【０１１７】
第六の局面において、本発明は、本発明の第四の局面で提供する抗体を、哺乳動物に投与することを含む、マラリア発症性病原に対する受動免疫の方法を提供する。
【０１１８】
第七の局面において、本発明は、本発明の第一の局面で提供する粒子および／または本発明の第二の局面で提供する核酸分子を哺乳類に接触させることを含む、マラリア抗原のマクロファージ上の提示方法を提供する。
【０１１９】
第八の局面において、本発明は、該粒子を発現するように設計したベクターを作製すること; 該粒子を発現するように該ベクターを用いて形質導入した細胞を培養すること；該粒子を回収することを含む、本発明の第一の局面において提供する粒子の製造方法を提供する。
【０１２０】
哺乳動物の例としては、ヒトが挙げられるが、これに限定されない。
【０１２１】
態様の一において、本発明は、上述のチクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子および／または上述の核酸分子を哺乳動物に接触させることを含む、マラリア抗原に対する抗体の作製方法を提供する。作製された抗体は、該チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子に含まれるマラリア抗原または該核酸分子がコードするマラリア抗原に特異的に結合し得る抗体であってよい。本発明の提供する抗体の作製方法は、マラリア抗原に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の作製に有用であり得る。
【０１２２】
態様の一において、本発明の抗体の作製方法により得られるマラリア抗原に対する抗体は、受動免疫に用いられる。受動免疫の方法は、かかる得られた抗体を哺乳類に投与することを含んでいてよい。
【０１２３】
好ましい態様の一において、本発明の提供する免疫調節は、哺乳類においてマラリア抗原に対する免疫応答を誘発および／または増強する。したがって、態様の一において、本発明は、有効量の上述の該組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるマラリア抗原に対する免疫応答の誘発および／または増強方法を提供する。
【０１２４】
チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎に感染した患者の症状を、チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルスの異常な分子の大きさと合わせて考えると、このVLPは、効果的および効率的に作用して、マクロファージおよびその組成物、例えばサイトカインならびに免疫調節性化合物を標的とし得る。
【０１２５】
局面の一において、本発明は、上述のチクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子および/または上述の核酸分子を哺乳動物に投与することを含む、抗原のマクロファージ上の提示方法を提供する。本発明の提供するチクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子は、マクロファージを標的とする上で優れている。態様の一において、本発明の提供するチクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子は、該チクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子に含まれている少なくとも１つの抗原をマクロファージに送達する送達システムの一種である。
【０１２６】
態様の一において、本発明は、本発明の第一の局面で提供するチクングニアまたはベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子の作製方法であって、該粒子の発現用に設計したベクターを製造すること；該ベクターを用いて該粒子を発現するように形質導入を行った細胞を培養すること；および該粒子を回収することを含む、方法を提供する。この態様において、形質導入は、慣用的な方法を用いて行い得る。形質導入に用いる細胞は、293細胞であってもよい。VLPの回収は、細胞をベクターで形質導入した後の馴化培地を回収することを含んでいてよく、該馴化培地から超遠心分離を用いてVLPを精製することをさらに含んでいてよい。
【０１２７】
本発明は、以下の実施例により詳細に記述されるが、これは本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１２８】
実施例１ ウイルス構造ポリペプチドとマラリア抗原の断片を含むチクングニアウイルス(CHIKV)様粒子の製造
マラリアCSP1タンパク質の以下のポリヌクレオチドを用いる。N末端リンカーはSGGであり、C末端リンカーはGGSである。
VLP74 (NPNAアミノ酸配列の6リピート)
【化９】
0006734651.tif 000013
VLP78 (NPNAアミノ酸配列の25リピート)
【化１０】
0006734651.tif 000014
【０１２９】
それぞれのポリヌクレオチドを配列番号15または16 (配列番号1または2)の第531番のSerをコードするコドンと、第532番のAsnをコードするコドンの間に挿入し、チクングニアウイルス構造ペプチドのE2に修飾VLP74または78由来のペプチドが挿入されたチクングニアウイルス様粒子の発現用のプラスミド (以降、本明細書中ではCHIKV-VLP74または78と称する) を作製した。
【０１３０】
293F細胞 (Lifetechnology) を、PEI (GE Healthcare)またはGeneX (ATCC) を用いて、該プラスミドで形質導入した。該形質導入の4日後に、馴化培地を回収し、3000rpmで15分間遠心分離を行って、細胞から分離した。該上清を0.45μｍフィルターで濾過し、ウイルス様粒子を得た。該ウイルス様粒子を、TFFカラムを用いて濃縮し、QXLカラム(GE Healthcare) を用いて精製し、精製ウイルス様粒子を得た。動物にウイルス様粒子を用いて免疫化を行った場合、該ウイルス様粒子をさらにスピンカラム (分子量カットオフ値: 100 kDa) を用いて濃縮し、免疫化用のウイルス様粒子を作製した。
【０１３１】
チクングニアウイルス構造ポリペプチドと結合したVLP74または78を含むVLPの発現は、CHIKVに対する特異的な抗体(ATCC: VR-1241AF)およびVLP74または78に対する特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングにより確認した。
【０１３２】
実施例2  ウイルス構造ポリペプチドとマラリア抗原の断片とを含むベネズエラウマ脳炎ウイルス(VEEV)様粒子の作製
マラリアCSP1タンパク質の、実施例1で用いたものと同じポリヌクレオチド(VLP74およびVLP78)を用いる。N末端リンカーはSGGであり、C末端リンカーはGGSである。
【０１３３】
それぞれのポリヌクレオチドを、配列番号19または20（配列番号3）の第518番のSerおよび第519番のSerをコードするコドンの間に挿入し、修飾VLP74または78由来のペプチドが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス構造ポリペプチドのE2に挿入された、ベネズエラウマ脳炎ウイルス様粒子発現用のプラスミド(以降、本明細書中で、VEEV-VLP74または78と称する)を作製した。
【０１３４】
293F細胞(Lifetechnology)を、PEI (GE Healthcare) またはGeneX (ATCC) を用いて、該プラスミドで形質導入した。形質導入の4日後に、馴化培地を回収し、3000rpmで15分間遠心分離して細胞から分離した。上清を0.45μmのフィルターで濾過し、ウイルス様粒子を得た。TFFカラムを用いて該ウイルス様粒子を濃縮し、QXL カラム(GE Healthcare)を用いて精製し、精製ウイルス様粒子を得た。ウイルス様粒子を用いて動物を免疫化した場合、該精製ウイルス様粒子を、さらにスピンカラムを用いて濃縮し (分子量カットオフ値:100 kDa) 、免疫化用のウイルス様粒子を作製した。
【０１３５】
ベネズエラウマ脳炎ウイルスの構造ポリペプチドと結合したVLP 74または78を含むVLPの発現は、VEEV特異的な抗体およびVLP74または78に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングにより確認した。
【０１３６】
実施例3: 非ヒト霊長類(サル)における免疫原性
該サルを0週目にX25-CHI (80μg) で、3週目にX6-VEE (80μg)で、筋肉内注射により、アジュバント(Sigma Adjuvant System, Sigma, S6322)を用いて、または用いずに免疫化した。X25-CHI は、CHIKV VLP粒子(VLP78_15)上の25回のマラリアCSPリピートアミノ酸NPNAを指す。X6-VEEは、VEEV VLP粒子(VLP74_25)上の6回のマラリアCSPリピートアミノ酸NPNAを指す。最初の免疫化後、2週目および5週目に採血を行う。
【０１３７】
96ウェルELISAプレートを、1ウェルあたりPBS 100μl中の組換えスポロゾイト周囲タンパク質 (rCSP) (Reagent Proteins, ATG-422) 50ngでコートした。2時間インキュベーションした後の該プレートを、0.05% Tween-20含有TBS緩衝液で3回洗浄し、0.05% Tween-20および5%粉乳を含むTBS緩衝液でブロッキングした。熱失活した希釈サル血清をブロッキング緩衝液に添加し、室温で1時間インキュベーションした。
3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgGまたは抗マウスIgGを、1:4000 の希釈率で添加し、室温で1時間インキュベーションした。3回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質を添加して発色させて10分間インキュベーションし、2N H2SO4を添加して発色を止めた。データは、Gen5 (BioTek)およびGraphPad Prism6 (GraphPad software Inc)を用いて解析した。
【０１３８】
免疫原性は図4〜6に示す。
【０１３９】
CSPに対する抗体の誘発が、マラリアVLPで免疫化した全てのサルの血清で見られた (図4参照)。CSPに対する抗体の力価を示す平均OD値を図5に表す。図5は、免疫化サル由来の血清が、CSPに対する抗体の高い力価を誘発したことを示す。
【０１４０】
図6に示すように、CSPに対する抗体の高い力価は、NPNAを含むCHIKV VLP粒子およびNPNAを含むVEEV VLP粒子を、免疫化の刺激および追加にそれぞれ用いた場合に、免疫化の刺激および追加の両方にNPNAを含むCHIKV VLP粒子のみを用いた場合と比較して、達成された。さらに、図6は、アジュバントの使用が、CSPに対する抗体の力価をさらに促進したことを示す。さらに、図6は、NPNA25リピートの投与が、CSP6リピートの投与と比較して、CSPに対する抗体の高い力価が誘発されることを示す。
【０１４１】
0週目にX25-CHI (80μg)で、さらに3週目にX6-VEE (80μg)で、アジュバントを用いずに免疫化したサル由来の血清中の抗Pf CSP抗体の力価を、Malaria Serology Lab Malaria Vaccine Branch, WRAIRで、ELISAにより測定した。Malaria Serology Lab Malaria Vaccine Branch, WRAIRで行ったELISAにおいて、該プレートをCSPrp ((NPNA) 6ペプチド) [0.2μg/μL] (Supplier: Eurogentec EP070034) でコートし、ヤギαヒトIgG (KPL/074-1002 LOT# 120714)を二次抗体として用いた。最終力価は、OD 1.0 (414nm)を示す希釈倍率によって決定した。
【０１４２】
結果として、サル由来の血清中の抗Pf CSP抗体の力価は、1回目の免疫化と比較して2回目の免疫化後には上昇していた（表2参照）。
RTS,S (GlaxoSmithKline) で免疫化したサル由来の血清中の抗Pf CSP抗体力価と比較して、X25-CHI (80μg)およびX6-VEE (80μg) を用いて、アジュバントの非存在下で免疫化したサル由来の血清中の抗Pf CSPの抗体力価は、RTS,S (GlaxoSmithKline)がアジュバントを含んでいてもさらに高いと考えられる。
【表２】
0006734651.tif 000015
【０１４３】
実施例4: マウスにおける免疫原性
マウスに対して、0週目にVLP78_15 10μg、3週目にVLP74_25 10μg、6週目にVLP78_15 10μgを用いて、アジュバント (Sigma Adjuvant System, Sigma, S6322)を用いて、または用いずに、筋肉内注射により免疫化を行った。
【０１４４】
免疫化マウス由来の血清中の抗Pf CSP抗体の力価は、Malaria Serology Lab Malaria Vaccine Branch, WRAIRにて、ELISAによって測定され、ここで、プレートを、CSPrp ( (NPNA) 6 Peptide) [0.2μg/μL] (Supplier: Eurogentec EP070034)でコートし、ヤギαマウスIgG (KPL/074-1806 LOT# 100737)を、二次抗体として、血清中の該抗体を検出するのに用いた。
【０１４５】
最終力価は、OD 1.0 (414nm)を示す希釈倍率によって決定した。
【０１４６】
免疫原性を表３および４に示す。
【０１４７】
表3および4は、ウイルス様粒子で３回免疫化を行った後では、より高いCSPに対する抗体力価が達成されたことを示す。さらに、表3および4は、アジュバントの使用により、CSPに対する抗体の力価が増強したことを示す。
【表３】
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【表４】
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【０１４８】
実施例5: プラスモディウム・ヨエリのCSPを挿入したVLPのマウスにおける免疫原性
マウスのマラリアCSP (プラスモディウム・ヨエリCSP)に見られるQGPGAPを抗原として用いた。6x QGPGAP をCHIKV VLPに挿入した。該マウスをCHIKV VLPを用いて、アジュバントであるRibiを用いてまたは用いずに、0週目および8週目に、2回(マウス1匹あたりVLP 20μg)、筋肉内注射により免疫化した。
【０１４９】
免疫原性を最初の免疫化後、4、6、10および14週後に確認した。抗プラスモディウム・ヨエリCSP抗体をELISAにより測定した。該ELISAは、プレートをプラスモディウム・ヨエリCSPリピート配列のペプチド（0.1 ng/μl）でコートした以外は、実施例３に記載のELISAと同様の方法で行った。二次抗体は、抗マウスIgG HRP (Cell signal, #7076S) であった。結果を図7〜9に示す。
【０１５０】
図7〜9は、CSPに対する抗体の高い力価が、6X QGPGAPを含むCHIKV VLPの筋肉内投与により達成されたことを示す。さらに、図7〜9は、アジュバントの使用が、CSPに対する抗体の力価を増強させたことを示す。
【０１５１】
実施例6: プラスモディウム・ヨエリCSPエピトープ: 6x QGPGAPを含むCHIKV VLPの筋肉内注射による、マウスのマラリアに対する保護
6x QGPGAPをCHIKV VLPに挿入した。該マウス (n=5)を、アジュバントであるRibiを用いてまたは用いずに、筋肉内注射により、0週目および8週目にCHIKV VLPを用いて2回免疫化した(マウス1匹あたり20μg VLP) (図10参照)。マウスマラリア: プラスモディウム・ヨエリによる負荷(i.v.)を17週目に行った (図10参照)。
【０１５２】
マラリア感染を、PCRにより確認した。ゲノムDNAを負荷後6日目のマウス血液から精製した。18SマラリアDNAを、PCRにより増幅した。図11は、PCRの結果を示し、対照マウス5匹全て(PBS注射)がマラリアに感染しており;対照VLPで免疫化したマウスは5匹全てがマラリアに感染しており; 6x QGPGAPを含むCHIKV VLPで免疫化した5匹のマウスのうち、2匹がマラリアに感染しており、3匹はマラリアに感染しておらず; 6x QGPGAPを含むCHIKV VLPと、アジュバント: Ribiを用いて免疫化した5匹のマウスのうち、1匹のマウスがマラリアに感染しており、4匹のマウスはマラリアには感染していなかったことを示す。
【０１５３】
実施例7: NPNAリピートを含むチクングニアウイルス(CHIKV)様粒子またはNPNAリピートを含むベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV) 様粒子を含む、ワクチン組成物の製造
6xまたは25x NPNAを含むチクングニアウイルス(CHIKV) 様粒子を実施例1にしたがって製造し、6x NPNAを含むベネズエラウマ脳炎ウイルス (VEEV)様粒子を実施例2にしたがって製造した。ワクチン組成物を製造するために、製造した粒子それぞれ80μgをリン酸スクロース溶液（pH 7.2、エンドトキシン不含有） (Teknova, SP buffer) 1mlと混合した。
【図１】
0006734651.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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