(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム細胞死タンパク質１（programmed cell death protein 1：ＰＤ−１）への結合能を有する核酸アプタマーであって、前記アプタマーが、モチーフCCATCTCCC（配列番号１）を有すると共に、
（i） CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC（配列番号８）；又は
（ii）TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT（配列番号９）
に対して少なくとも８５％同一の核酸配列を含む、核酸アプタマー。
【請求項２】
前記アプタマーが、
（i） CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC（配列番号８）；又は
（ii）TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT（配列番号９）
に対して少なくとも９０％同一の核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項３】
前記アプタマーが、
（i） CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC（配列番号８）；又は
（ii）GATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT（配列番号９）
に対して少なくとも９５％同一の核酸配列を含む、請求項２に記載の核酸アプタマー。
【請求項４】
前記アプタマーが、
（i） CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC（配列番号８）；又は
（ii）TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT（配列番号９）
の核酸配列を含む、請求項３に記載の核酸アプタマー。
【請求項５】
前記アプタマーが、
（i） TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC（配列番号１０）；又は
（ii）TCCCTACGGCGCTAACTGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCTGCCACCGTGCTACAAC（配列番号１１）
の核酸配列からなる、請求項１に記載の核酸アプタマー。
【請求項６】
前記アプタマーが、ＰＤ−１に対して２０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する、請求項１〜５の何れか一項に記載の核酸アプタマー。
【請求項７】
前記核酸アプタマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされてなる、請求項１〜５の何れか一項に記載の核酸アプタマー。
【請求項８】
前記ＰＥＧが、前記核酸アプタマーの３’末端にコンジュゲートされてなる、請求項７に記載の核酸アプタマー。
【請求項９】
前記ＰＥＧの分子量が、１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲である、請求項７に記載の核酸アプタマー。
【請求項１０】
第１の抗ＰＤ−１アプタマー、第２の抗ＰＤ−１アプタマー、及び、前記第１の抗ＰＤ−１アプタマーと前記第２の抗ＰＤ−１アプタマーとを連結するポリマー部分を含む、抗ＰＤ−１アプタマーダイマー。
【請求項１１】
前記第１の抗ＰＤ−１アプタマー及び前記第２のアプタマーのうち少なくとも一方が、請求項１〜６の何れか一項に記載の核酸アプタマーである、請求項１０に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマー。
【請求項１２】
前記第１の抗ＰＤ−１アプタマーが、前記第２の抗ＰＤ−１アプタマーと同一である、又は、前記第１の抗ＰＤ−１アプタマーが、前記第２の抗ＰＤ−１アプタマーと異なる、請求項１１に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマー。
【請求項１３】
前記第１のアプタマー及び前記第２のアプタマーの双方が、配列番号１の核酸配列を含む、請求項１１に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマー。
【請求項１４】
前記ポリマー部分がＰＥＧである、請求項１０に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマー。
【請求項１５】
前記ＰＥＧの分子量が１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲である、請求項１４に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマー。
【請求項１６】
前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、又はその双方が、リンカーを介して前記ポリマー部分と連結されている、請求項１０に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマー。
【請求項１７】
前記リンカーがポリＴ断片を含む、請求項１６に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマー。
【請求項１８】
前記ポリＴ断片が５〜２０のＴ残基を含む、請求項１７に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマー。
【請求項１９】
（i）請求項１に記載の核酸アプタマー、又は、請求項１０に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマーと、（ii）医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２０】
対象の免疫を増強するのに用いられる医薬組成物であって、（i）請求項１に記載の核酸アプタマー、又は、請求項１０に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマーと、（ii）医薬的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２１】
前記対象が、癌を有する、癌を有すると疑われる、又は癌のリスクを有するヒト患者である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記癌が、メラノーマ、非小細胞肺癌、大腸癌、又は腎細胞癌である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記対象が、ＨＩＶ感染を有する、又はＨＩＶ感染を有すると疑われるヒト患者である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願番号第62/031,427号（2014年7月31日出願）に基づき、米国特許法（35 U.S.C.）第119条(e)に規定される優先権を主張する。なお、当該出願の内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞は宿主免疫系を抑制して免疫監視機構を回避する。腫瘍微小環境内の免疫系を再活性化してＴ細胞の癌細胞除去能を回復するべく、幾つかのアプローチが開発されてきた。斯かるアプローチの一つが、免疫応答を抑制する受容体、例えば細胞毒性Ｔ−リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）やプログラム死１（ＰＤ１）等の阻害に基づく、免疫チェックポイント標的化である。ＣＴＬＡ−４に対するアンタゴニスト抗体（ｍＡｂ）であるイピリムマブ（ipilimumab）が、進行性メラノーマの治療剤として２０１１年にＦＤＡにより承認された。近年、ＰＤ−１に対する阻害性抗体が、メラノーマ及び非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer：ＮＳＣＬＣ）の治療に有効であることが、臨床試験により示された。
【０００３】
ＰＤ−１は、死滅細胞で高発現しており、プログラム細胞死の過程に関与していることが知られている。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞外ドメインと、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif：ＩＴＩＭ）を含む細胞内ドメインとを含む、Ｉ型膜貫通タンパク質である。ＣＴＬＡ−４受容体と同様に、ＰＤ−１もＴ細胞活性化を阻害する強力な阻害性受容体である。しかし、シグナル伝達経路の分析によれば、ＰＤ−１とＣＴＬＡ−４とはＴ細胞活性化を個別の機構によって抑制しており、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１のアンタゴニスト抗体による二重処置によって相乗効果が得られることが明らかとなった。更に、Ｔ細胞のみで発現するＣＴＬＡ−４と比べ、ＰＤ−１は活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びマクロファージで広く発現する。斯かるＰＤ−１受容体の広範な分布は、ＰＤ−１受容体が免疫調節に対してより広い役割を担っていることを示唆している。これらの知見を総合すれば、ＰＤ−１経路を阻害しうる分子があれば、抗癌免疫療法において大きな可能性を有するだろうと考えられる。
【０００４】
アプタマーは、二次構造や、更に複雑な三次元構造を取ることが可能な、短小なＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。アプタマー技術は、１９９０年代初頭の発見以来、膨大な進歩を遂げてきた。アプタマーは治療用途に適した幾つかの利点を有する。例えば、分子量が低く、抗体よりも容易に組織内に侵入できること、化学合成のコストが低いこと、修飾方法が確立されていること、安定性に優れていること等である。従って、標的タンパク質に高い親和性を有する適切なアプタマーの開発は、非常に重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、首尾よくインビトロでＴ細胞増殖を増加させ、インビボで腫瘍成長を抑制した、種々の抗ＰＤ−１核酸アプタマーの開発例に基づく。
【０００６】
即ち、本発明の一側面は、ＰＤ−１に結合してその阻害活性を抑制する核酸アプタマー（抗ＰＤ−１アプタマー）を特徴とする。当該抗ＰＤ−１アプタマーは、例えば核酸配列CCATCTCCC（配列番号１）、TATATTGTWC（配列番号２）、GTACAGTTX（配列番号３）、GCACTACA（配列番号４）、GTACATCAY（配列番号５）、YGCTACTGTZ（配列番号６）、又はCCATCTCCCGTCC（配列番号７）を有していてもよい。これらの配列の各々において、適切な場合、ＷはＣ又はＧであり、ＸはＣ若しくはＡであるか、又は存在せず、ＹはＡ若しくはＴであるか、又は存在せず、及び／又は、ＺはＴ若しくはＣであるか、又は存在しない。ある態様によれば、本明細書に開示の抗ＰＤ−１アプタマーは、ＰＤ−１に対して２０ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する。
【０００７】
ある態様によれば、前記核酸アプタマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートされる。ある例によれば、ＰＥＧは、核酸アプタマーの３’末端にコンジュゲートされる。これに代えて、或いはこれに加えて、ＰＥＧ部分の分子量は、１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲である。例えば、ＰＥＧ部分の分子量は２０ｋＤａである。
【０００８】
別の側面によれば、本発明は、第１の抗ＰＤ−１アプタマーと、第２の抗ＰＤ−１アプタマーと、前記第１の抗ＰＤ−１アプタマー及び前記第２の抗ＰＤ−１アプタマーを連結するポリマー部分とを含む抗ＰＤ−１アプタマーダイマーを提供する。前記の第１及び第２の抗ＰＤ−１アプタマーは、本明細書にて供される何れのアプタマーであってもよい。ある例によれば、前記の第１及び第２の抗ＰＤ−１アプタマーは、同一であってもよい。別の例によれば、これらは異なっていてもよい。一例として、前記の第１及び第２の抗ＰＤ−１アプタマーは、何れも配列番号１の核酸配列を有する。
【０００９】
本明細書に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマーの何れにおいても、前記の第１及び第２の抗ＰＤ−１アプタマーを連結するポリマー部分は、ＰＥＧであってもよい。斯かるＰＥＧの分子量は、１０ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲、例えば２０ｋＤａであってもよい。ある例によれば、前記第１のアプタマー、前記第２のアプタマー、又はその両方が、ポリマー部分（例えばＰＥＧ）にリンカーを介して結合されていてもよい。ある例によれば、リンカーはポリＴ断片であり、これは５〜２０のチミン（Ｔ）残基を含んでいてもよい。
【００１０】
ある態様によれば、抗ＰＤ−１アプタマーは、
（i）CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC（配列番号８）又は
（ii）TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT（配列番号９）に対して少なくとも８５％（例えば、９０％又は９５％）同一の核酸配列を含む。一例によれば、前記アプタマーは、
（i）CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC（配列番号８）又は
（ii）TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT（配列番号９）の核酸配列を含む。別の例によれば、アプタマーは、
（i）TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC（配列番号１０）；
（ii）TCCCTACGGCGCTAACTGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCTGCCACCGTGCTACAAC（配列番号１１）；又は
TCCCTACGGCGCTAACCCTCCCCTAGTATATATTGTCCTCGTCTATGCCACCGTGCTACAAC（配列番号１２）である。
【００１１】
本発明の別の観点は、本明細書に記載の抗ＰＤ−１アプタマーの何れか、又は、本明細書に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマーの何れかと、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を特徴とする。
【００１２】
更に別の観点によれば、本発明は、癌（例えばメラノーマ、非小細胞肺癌、大腸癌、又は腎細胞癌）を治療する方法を提供する。斯かる方法は、本明細書に記載の少なくとも１つの抗ＰＤ−１核酸アプタマーを含む、本明細書に記載の医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。ある態様によれば、対象は、癌を有する、癌を有する虞のある、又は癌のリスクのあるヒト患者である。
【００１３】
更に、本発明は、対象の免疫活性を強化する方法であって、本明細書に記載の抗ＰＤ−１アプタマー含有医薬組成物の有効量（例えばＴ細胞活性化を増加させるのに有効な量）を、それを必要とする対象に投与することを含む方法も提供する。対象は、癌（例えば、メラノーマ、非小細胞肺癌、大腸癌、又は腎細胞癌）を有する、癌を有する虞のある、又は癌のリスクのあるヒト患者であってもよい。或いは、対象は、ＨＩＶ感染を有する、或いはＨＩＶ感染の虞のあるヒト患者であってもよい。
【００１４】
更に、本発明の範囲内には、（a）癌（例えば肺癌、メラノーマ、大腸癌、若しくは腎細胞癌）、又は、ＨＩＶ感染等の感染性疾患の治療に使用するための医薬組成物であって、本明細書に記載の抗ＰＤ−１核酸アプタマー、抗ＰＤ−１アプタマーダイマー、又はそのＰＥＧコンジュゲート、例えばCCATCTCCC（配列番号１）の核酸配列、又は本明細書に記載の他の核酸配列を含む核酸と、医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物；並びに、（b）斯かる抗ＰＤ−１アプタマー、抗ＰＤ−１アプタマーダイマー、及び／又は、そのＰＥＧコンジュゲートの、癌（例えば肺癌、メラノーマ、大腸癌、若しくは腎細胞癌）又はＨＩＶ感染等の感染性疾患の治療用の薬剤の製造における使用も含まれる。
【００１５】
本発明の一又は二以上の態様の詳細を以下に記載する。本発明の他の特徴又は利点は、以下の複数の態様の詳細な説明と、添付の図面及び特許請求の範囲から、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＰＤ−１に結合する核酸アプタマーを、ＳＥＬＥＸを通じて選択するプロセスを模式的に示す図である。図中「Ｓ」はＰＤ１特異的アプタマーを示し、「ＮＳ」は非特異的アプタマーを示す。
【００１７】
【図２】図２は、示されるＳＥＬＥＸスクリーニングの異なるラウンドで得られるアプタマープールの親和性分析を示すチャートである。
【００１８】
【図３Ａ】図３は、ＳＥＬＥＸスクリーニングから単離されるＰＤ−１結合核酸アプタマーの配列分析を示す図である。パネルＡは、単離されたＰＤ−１結合アプタマーの相関を示すツリー表示である。パネルＢは、クラスタ化ＰＤ−１アプタマーの配列の詳細を示す。各ＰＤ−１アプタマー内における保存ヌクレオチドCCATCTCCC（配列番号１）を囲み強調表示する。図３に示す前記アプタマーのヌクレオチド配列のうち、パネルＢは以下のとおりである。ＰＤ１−１（配列番号１６）；ＰＤ１−２（配列番号２４）；ＰＤ１−３（配列番号２５）；ＰＤ１−４（配列番号２４）；ＰＤ１−５（配列番号２６）；ＰＤ１−６（配列番号１６）；ＰＤ１−７（配列番号１０）；ＰＤ１−８（配列番号２４）；ＰＤ１−９（配列番号１８）；ＰＤ１−１１（配列番号２７）；ＰＤ１−１２（配列番号２８）；ＰＤ１−１３（配列番号１５）；ＰＤ１−１４（配列番号１０）；ＰＤ１−１５（配列番号２９）；ＰＤ１−１６（配列番号１１）；ＰＤ１−１７（配列番号３０）；ＰＤ１−１８（配列番号１５）；ＰＤ１−１９（配列番号１１）；ＰＤ１−２０（配列番号１１）；ＰＤ１−２１（配列番号１８）；ＰＤ１−２２（配列番号１１）；ＰＤ１−２３（配列番号１１）；ＰＤ１−２４（配列番号１９）；ＰＤ１−２５（配列番号１１）；ＰＤ１−２６（配列番号３１）；ＰＤ１−２８（配列番号１１）；ＰＤ１−２９（配列番号１０）；ＰＤ１−３１（配列番号１１）；ＰＤ１−３２（配列番号３２）；ＰＤ１−３３（配列番号３３）；ＰＤ１−３４（配列番号３４）；ＰＤ１−３６（配列番号３５）；ＰＤ１−３７（配列番号１１）；ＰＤ１−３９（配列番号１１）；ＰＤ１−４０（配列番号１１）；ＰＤ１−４１（配列番号３６）；ＰＤ１−４２（配列番号３７）；ＰＤ１−４４（配列番号３８）；ＰＤ１−４５（配列番号１１）；ＰＤ１−４６（配列番号３９）；ＰＤ１−４７（配列番号４０）；ＰＤ１−４８（配列番号４１）。
【図３Ｂ】同上。
【００１９】
【図４Ａ−Ｂ】図４は、２つの抗ＰＤ−１アプタマーの例、ＰＤ１６及びＰＤ７の、結合活性及び予測される構造を示す。パネルＡは、ＰＤ１６のＰＤ−１結合親和性を示すチャートであり、パネルＢは、ＰＤ７のＰＤ−１結合親和性を示すチャートである。ＰＤ７及びＰＤ１６の解離定数（Ｋｄ）は、それぞれ９.７ｎＭ及び２.１ｎＭである。パネルＣは、ＰＤ−１アプタマーＰＤ１６（配列番号１１）及びＰＤ７（配列番号１０）の、Mfoldにより決定された予測される二次構造を示す。保存されるCCATCTCCC（配列番号１）を点線囲みで強調表示する。ＰＤ７及びＰＤ１６の予測される構造のΔＧは、それぞれ−１．７及び−０．８である。
【図４Ｃ】同上。
【００２０】
【図５】図５は、抗ＰＤ−１アプタマーの例であるＰＤ７が、Ｔ細胞増殖を促進するのを示すチャートである。ＰＤ７アプタマー処置によってＴ細胞増殖が促進され、その効果はＰＤ−１アンタゴニスト抗体による処置と比べてより顕著であった。パネルＡは、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の不在下で実施された実験の結果を示すチャートである。パネルＢは、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の存在下で実施された実験の結果を示すチャートである。
【００２１】
【図６】図６は、前記アプタマーのコアヌクレオチド配列、コア１、コア１（最適化）、コア２、コア３、コア４、コア５、及びコア６を用いたＰＤＬ１競合アッセイの結果を示すグラフである。
【００２２】
【図７】図７は、ＰＤＬ１競合アッセイでコア１を用いた場合における、ＰＤＬ１とＰＤ１との相互作用の用量依存性阻害を示すグラフである。コア１のＩＣ５０は３１．１８ｎＭであり、これはＰＤＬ１／ＰＤ１相互作用の５０％を阻害するのに必要とされるコア１核酸の量を表す。
【００２３】
【図８】図８は、ＰＤＬ１競合アッセイを模式的に表す図である。パネルＡは、ニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）被覆プレートに固定化したヒスチジンタグ化ＰＤ１タンパク質（His tag−ＰＤ１タンパク質）である。ヒスチジンタグ化ＰＤ１タンパク質は、ＰＤ１アンタゴニストアプタマーの不在下で、ビオチンタグ化ＰＤＬ１（ビオチン−ＰＤＬ１）に結合する。これは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされたストレプトアビチンによって検出可能である。パネルＢは、アンタゴニストＰＤ１アプタマーの存在によって、ＰＤ１とＰＤＬ１との相互作用が阻害され、ＨＲＰが結合することができず、シグナル（例えばＥＣＬ添加による化学発光シグナル）を発しなくなることを示す。
【００２４】
【図９】図９は、ＰＤ１アプタマー結合アッセイを模式的に示す図である。ヒスチジンタグ化ＰＤ１タンパク質（His tag−ＰＤ１タンパク質）は、ニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）被覆プレートに固定化される。ビオチン（ビオチン−ＢＤ１アプタマー）にコンジュゲートされたアンタゴニストＰＤ１アプタマーの固定化ＰＤ１への結合は、ストレプトアビチンにコンジュゲートされたホースラディッシュペルオキシダーゼ（ストレプトアビチン／ＨＲＰ）を用いて検出することができる。結合したＨＲＰの検出は、ＨＲＰと接触すると蛍光を発する基質（例えばＥＣＬ）を加えることによって行うことができる。
【００２５】
【図１０】図１０は、（i）ＰＤ−１アンタゴニスト抗体、（ii）ランダム対照配列、（iii）ＰＤ７アプタマー（配列番号１０）、（iv）配列番号１に示すコア核酸配列を含むコア配列（配列番号１３）、及び（v）図１１に示すＰＥＧ化ＰＤ７ダイマー（コア配列）の存在下でのリンパ球増殖活性を示すグラフである。
【００２６】
【図１１】図１１は、ダイマーアプタマー分子の非限定的な例を模式的に示す図である。本図では、直鎖２０ｋＤａ ＰＥＧ分子の各末端に、コア配列番号１の核酸配列とポリＴリンカーとを含む２つの個別のアプタマー配列、CCATCTCCCATTTTTTTTTTT（配列番号１４）がコンジュゲートされてなる。
【００２７】
【図１２】図１２は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ−細胞増殖アッセイの例を模式的に示す図である。
【００２８】
【図１３Ａ−Ｂ】図１３は、アプタマーの例であるＰＤ７及びコア１配列のＣＤ４＋（パネルＤ）及びＣＤ８＋（パネルＣ）Ｔ−細胞増殖に対する活性と、アンタゴニストＰＤ−１抗体及びランダム配列陰性対照のＣＤ４＋（パネルＢ）及びＣＤ８＋（パネルＡ）Ｔ−細胞増殖に対する活性とを示すグラフを含む。
【図１３Ｃ−Ｄ】同上。
【００２９】
【図１４】図１４は、アプタマーの例（ＰＤ７）の同系肺癌マウスモデルにおける腫瘍成長阻害活性を示すグラフである。
【００３０】
【図１５】図１５は、アプタマーの例（ＰＤ７）によるヒト化肺癌マウスモデルの処置スケジュールを模式的に示す図である。
【００３１】
【図１６Ａ】図１６は、ヒト化肺癌マウスモデルを用いて示された、ＰＤ−１アンタゴニストアプタマーＰＤ７による、インビボにおける肺癌成長の阻害活性の結果である。パネルＡは、対照マウス２３９、２２６、及び２３３における、経時的な腫瘍成長を示すグラフである。２５、３２、及び３８日目におけるそれらの写真を、それぞれパネルＢ〜Ｄに示す。パネルＥは、ＰＤ７処置マウス２４０、２３４、及び２３５における、経時的な腫瘍成長を示すグラフである。２５、３２、及び３８日目におけるそれらの写真を、それぞれパネルＦ〜Ｈに示す。
【図１６Ｂ−Ｄ】同上。
【図１６Ｅ】同上。
【図１６Ｆ−Ｈ】同上。
【００３２】
【図１７】図１７は、ＰＤ−１アンタゴニストアプタマーＰＤ７による肺癌成長平均阻害活性を、対照マウスとの比較により示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、種々の抗ＰＤ−１核酸アプタマーを開発し、それらの抗ＰＤ−１核酸アプタマーの例を用いて、首尾よくインビトロでＴ細胞増殖を強化した知見に基づく。その結果によれば、驚くべきことに、アプタマー（例えばＰＤ７）での処置によって、（i）ＰＤ−１アンタゴニスト抗体よりも強いＴ細胞増殖（例えばＣＤ＋Ｔ細胞増殖）作用、及び、（ii）腫瘍成長の顕著な低下が、同系及びヒト化のマウス腫瘍モデルの双方で得られた。更に、その結果によれば、アプタマー処置によって、ＰＤ−１とＰＤＬ−１との間の結合が阻害された。即ち、本明細書に記載されるような抗ＰＤ−１アプタマーは、免疫活性を増強して腫瘍成長を阻害するのに有効であり、これにより癌や感染性疾患（例えばＨＩＶ感染）の治療に有効である。
【００３４】
したがって、本明細書では、抗ＰＤ−１アプタマー、そのようなアプタマーを含む医薬組成物、および免疫活性を高め、かつ／または本明細書で開示される抗ＰＤ−１アプタマーで病気（例えば、癌およびＨＩＶ感染）を治療する方法が記載される。
【００３５】
抗ＰＤ−１アプタマー
本明細書では、ＰＤ−１に結合してその活性を阻害し、それによって免疫活性（例えば、Ｔ細胞活性）を高める核酸アプタマー（抗ＰＤ−１アプタマー）について記載される。
【００３６】
本明細書で用いる「核酸アプタマー」は、特定の標的分子（例えばＰＤ−１）に対する結合活性を有する核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を意味する。前記アプタマーは、特定の標的分子に結合することにより、その活性を抑制することができる。本開示の抗ＰＤ−１アプタマーは、線状又は円形であるが、ＲＮＡ、ＤＮＡ（例えば、一本鎖ＤＮＡ）、修飾核酸、又はこれらの混合物であってもよい。前記抗ＰＤ−１アプタマーは、（例えば、天然の遺伝子には存在しないヌクレオチド配列を含む、又は天然には存在しない修飾ヌクレオチドを含む）非天然出現の分子であってもよい。これに代えて、又はこれに加えて、前記抗ＰＤ−１アプタマーは、機能ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでいなくてもよい。
【００３７】
ＰＤ−１、即ちプログラム細胞死タンパク質１（別名ＣＤ２７９）は、Ｔ細胞及び前Ｂ細胞で発現する細胞表面タンパク質であり、Ｔ細胞及びＢ細胞の細胞死及び分化に関与する。ヒトにおいて、ＰＤ−１はＰＤＣＤ１遺伝子によりコードされる。ヒトＰＤ−１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００５００９で提供されている。
【００３８】
本明細書に開示の抗ＰＤ−１核酸アプタマーは、CCATCTCCC（配列番号１）；TATATTGTWC（配列番号２）（ここでＷはＣ又はＧである）；GTACAGTTX（配列番号３）（ここでＸはＣ又はＡであるか、或いは存在しない）；GCACTACA（配列番号４）；GTACATCAY（配列番号５）（ここでＹはＡ又はＴであるか、或いは存在しない）；YGCTACTGTZ（配列番号６）（ここでＹはＡ又はＴであるか、或いは存在せず、ＺはＴ又はＣであるか、或いは存在しない）；又はCCATCTCCCGTCC（配列番号７）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。抗ＰＤ−１アプタマーの他の例を図３のパネルＢに示す。
【００３９】
ある態様によれば、本明細書に開示の抗ＰＤ−１核酸アプタマーは、5’-CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC-3’（配列番号８）又は5’-TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCC CT-3’（配列番号９）に対して、少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、又は９８％）同一のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００４０】
２つの核酸の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990（Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993で修正）のアルゴリズムを用いて決定される。そのようなアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のNBLAST及びXBLASTプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。NBLASTプログラム（スコア=１００、ワード長−１２）を用いてBLASTヌクレオチド検索を行って、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されたようにGapped BLASTを用いることができる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを用いた場合、各プログラム（例えば、XBLAST及びNBLAST）の規定値パラメーターを用いることができる。
【００４１】
他の態様によれば、本明細書に記載の抗ＰＤ−１アプタマーは、5’-CTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATAC-3’（配列番号８）又は5’-TGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCT-3’（配列番号９）のヌクレオチド配列と比較して、最大８個（例えば６個、５個、４個、３個、２個、又は１個以下）のヌクレオチド多様性を含んでいてもよい。そのような多様性を導入することができる位置は、例えば、基準ヌクレオチド配列を含むＰＤ１６（配列番号１１）及びＰＤ７（配列番号１０）の二次構造（図４Ｂを参照のこと）に基づいて決定することができる。
【００４２】
ある例によれば、抗ＰＤ−１アプタマーは、５’末端、３’末端、又はその両方に、（１又は複数の）プライマー部位を含んでいてもよい。一例によれば、斯かる抗ＰＤ−１アプタマーは、
5’-TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC-3’（配列番号１０）、
5’-TCCCTACGGCGCTAACTGATCACAAGAATAACTATCCCATCTCCCTGCCACCGTGCTACAAC-3’（配列番号１１）、又は
5’-TCCCTACGGCGCTAACCCTCCCCTAGTATATATTGTCCTCGTCTATGCCACCGTGCTACAAC-3’（配列番号１２）のヌクレオチド配列を有する。ここで下線／イタリックのフランキング配列は、５’及び３’末端のプライマー部位を示す。
【００４３】
本明細書で開示される抗ＰＤ−１アプタマーの何れかは、ヌクレオチドを２００個以下、例えば、１５０個、１００個、８０個、７０個、６０個、５０個、４０個、又は３０個含んでいてもよい。実施例によっては、前記抗ＰＤ−１アプタマーは、３０〜１５０個、３０〜１００個、３０〜８０個、３０〜７０個、３０〜６０個、３０〜５０個、又は３０〜４０個の範囲のヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００４４】
態様によっては、本明細書で記載される抗ＰＤ−１アプタマーは、２０ｎＭ未満（例えば、１５ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ以下）の解離定数（Ｋｄ）でＰＤ−１（例えば、ヒトＰＤ−１）に結合してもよい。前記抗ＰＤ−１アプタマーは、ヒトＰＤ−１に特異的に結合してもよい。あるいは、前記アプタマーは、異なる種（例えば、ヒト及びマウス）に由来するＰＤ−１分子と結合してもよい。Ｔ細胞表面に発現したＰＤ−１分子に結合する場合、そのようなアプタマーは、ＰＤ−１の活性を少なくとも２０％（例えば、４０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、１００倍、又は１，０００倍）まで阻害し（よって、Ｔ細胞活性を高め）てもよい。ＰＤ−１に対する抗ＰＤ−１アプタマーの阻害活性（よって、Ｔ細胞活性を高める活性化）は、例えば以下の実施例に記載するように決定してもよい。
【００４５】
態様によっては、本明細書で記載される抗ＰＤ−１アプタマーは、非天然出現の核酸塩基、糖、又はヌクレオシド間共有結合（主鎖）を含んでいてもよい。そのような修飾オリゴヌクレオチドは、細胞の取り込みの向上、標的核酸との親和性の向上、及び生体内での安定性の向上など、望ましい特性を提供する。
【００４６】
一例では、本明細書で記載されるアプタマーは、修飾された主鎖を有する。そのような主鎖は、リン原子を保持したもの（例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、４，４６９，８６３号、５，３２１，１３１号、５，３９９，６７６号、及び５，６２５，０５０号を参照のこと）、及びリン原子を有しないもの（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、５，１６６，３１５号、及び５，７９２，６０８号を参照のこと）を含む。リンを含有する修飾主鎖としては、例えば、ホスホロチオアート、対掌性ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、メチル及びその他のアルキルホスホン酸塩（３’−アルキレンホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩、及び対掌性ホスホン酸塩を含む）、ホスフィナート、ホスホルアミダート（３’−アミノホスホルアミダート及びアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、チオノホスホルアミダート、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノリン酸塩、及び３’−５’結合又は２’−５’結合を有するボラノリン酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。また、そのような主鎖としては、反転極性、すなわち、３’−３’結合、５’−５’、又は２’−２’結合を有するものが挙げられる。リン原子を含まない修飾主鎖は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子とアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子又は複素環ヌクレオシド間結合により形成される。そのような主鎖として、モルホリノ結合（一部、ヌクレオシドの糖部分から形成される）を有する主鎖；シロキサン主鎖；スルフィド主鎖、スルホキシド主鎖、及びスルホン主鎖；ホルムアセチル主鎖及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル主鎖及びチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファマート主鎖；メチレンイミノ主鎖及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホナート主鎖及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；及びＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２成分部分を有するその他の主鎖などが挙げられる。
【００４７】
他の例では、本明細書で記載されるアプタマーは、１つ以上の置換された糖部位を含む。そのような置換された糖部位は、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル、及びＯ−アルキル−Ｏ−アルキルの１つを２’位に含んでいてもよい。これらの基では、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は無置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。前記置換された糖部位はまた、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させる基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学特性を向上させる基を２’位に含んでいてもよい。好ましい置換された糖部位としては、２’−メトキシエトキシ、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシを有するものが挙げられる。Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504を参照のこと。
【００４８】
これに代えて、又はこれに加えて、本明細書で記載されるアプタマーは、１種以上の修飾された天然核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、及びウラシル）を含んでいてもよい。修飾された核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering（ポリマー科学と工学の小辞典）, pp. 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, and Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications（アンチセンスの研究と応用）, pp. 289-302, CRC Press, 1993などが挙げられる。これら核酸塩基の特定のものは、標的部位に対するアプタマー分子の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらは、５−置換されたピリミジン、６−アザピリミジン、及びＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換されたプリン（例えば、２−アミノプロピル−アデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシン）を含む。Sanghvi, et al., eds., Antisense Research and Applications（アンチセンスの研究と応用）, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278を参照のこと。
【００４９】
本明細書で記載されるアプタマーの何れかは、従来の方法（例えば、化学合成又は生体外転写）で作製してもよい。本明細書で記載されるアプタマーの意図した生物活性は、例えば以下の実施例で記載する方法で確認することができる。また、前記抗ＰＤ−１アプタマーの何れかを発現させるためのベクターも本開示の範囲内である。
【００５０】
本明細書で記載されるアプタマーの何れかは、共有結合、非共有結合、又はその両方で１つ以上のポリエーテル部位（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部位）にコンジュゲートされていてもよい。したがって、態様によっては、本明細書で記載されるアプタマーはペグ化されている。本開示は、特定の分子量のＰＥＧ部位に関して限定されることを意味しない。態様によっては、前記ポリエチレングリコール部位の分子量は５ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜８０ｋＤａ、２０ｋＤａ〜７０ｋＤａ、２０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、２０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜４０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜３０ｋＤａ、又は１５ｋＤａ〜２５ｋＤａの範囲である。実施例によっては、前記ＰＥＧ部位の分子量は４０ｋＤａである。本明細書で記載される抗ＰＤ−１アプタマーにコンジュゲートされたＰＥＧ部位は、線状又は分岐状であってもよい。このＰＥＧ部位は、前記核酸アプタマーの５’末端、３’末端、又はその両方にコンジュゲートされてもよい。必要に応じて、前記ＰＥＧ部位は、核酸アプタマーの３’末端に共有結合でコンジュゲートされてもよい。ある態様によれば、核酸アプタマーは、ヌクレオチド配列CCATCTCCCA（配列番号１３）又はCCATCTCCCATTTTTTTTTTT（配列番号１４ ）を含む。配列番号１４のポリＴ断片はスペーサであり、当業者には周知のように当該断片の長さは変更可能である。
【００５１】
ＰＥＧ部位を核酸にコンジュゲートする方法は、当該分野で周知であり、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０７３８２０Ａ２（その関連する教示を参照により本明細書に組み込む）に詳しく記載されている。自明であるが、核酸アプタマーにコンジュゲートされたＰＥＧ、及び本明細書で記載される核酸アプタマーにＰＥＧをコンジュゲートする方法は、例示的であり、限定を意味するものではない。
【００５２】
本発明は、本明細書に記載の何れかの抗ＰＤ−１核酸アプタマーのダイマーも提供する。ある態様によれば、抗ＰＤ−１アプタマーダイマーは、適切なポリマー部分によって連結された２つの抗ＰＤ−１アプタマーを含む。斯かるポリマー部分は本明細書に記載のＰＥＧ部分であってもよい。ダイマーが有する２つのアプタマーの何れか一方又は両方が、配列番号１〜１４の何れか一つのヌクレオチド配列を含んでいてもよい。２つの抗ＰＤ−１アプタマーは同一でも、異なっていてもよい。例えば、抗ＰＤ−１アプタマーの一方又は両方が、（配列番号１３）又は（配列番号１４）を含んでいてもよい。別の例によれば、本明細書に記載の抗ＰＤ−１アプタマーダイマーは、（配列番号１）を含む一のアプタマーと、（配列番号２）を含む別のアプタマーとを有していてもよい。
【００５３】
態様によっては、本明細書で提供される抗ＰＤ−１アプタマー２量体の何れかの重合体部位はＰＥＧである。ＰＥＧは、本明細書で記載される分子量を有していてもよい。
【００５４】
態様によっては、本明細書で提供される抗ＰＤ−１アプタマー２量体は、リンカーを介して前記重合体部位に結合したアプタマーを含む。一例では、第１のアプタマーは、リンカーを介して前記重合体部位に結合される。他の例では、第２のアプタマーは、リンカーを介して前記重合体部位に結合される。他の例では、第１のアプタマー及び第２のアプタマーは、リンカーを介して前記重合体部位に結合される。本明細書で用いられる「リンカー」は、２個の分子又は部位を結合する化学部位を意味する。実施例によっては、前記リンカーは、１個以上のヌクレオチドを含む。これらのヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであってもよい。実施例によっては、前記核酸リンカーは、長さが１〜５０個のヌクレオチドである。このようなリンカーは、長さが、１〜５個、１〜１０個、１〜１５個、１〜２０個、１〜３０個、１〜４０個、１０〜１５個、１０〜２０個、１０〜３０個、１０〜４０個、１０〜５０個、２０〜３０個、２０〜４０個、２０〜５０個、３０〜４０個、３０〜５０個、又は４０〜５０個のヌクレオチドであってもよい。実施例によっては、前記リンカーは、長さが１１個のヌクレオチドである。前記リンカーは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及び／又はグアニン（Ｇ）を含んでいてもよい。実施例によっては、前記リンカーは、ポリＴ断片を含む。「ポリＴ断片」は、２個以上の連続したチミン（Ｔ）ヌクレオチド残基の伸長部を意味する。例えば、前記ポリＴリンカーは、２〜５０個のＴ残基を含んでいてもよい。実施例によっては、前記ポリＴリンカーは、長さが、２〜４０個、２〜３５個、２〜３０個、２〜２５個、２〜２０個、５〜１５個、又は１０〜１５個のヌクレオチドである。態様によっては、前記ポリＴリンカーは、１１個の連続したチミン（Ｔ）ヌクレオチドを含む。
【００５５】
医薬組成物
本明細書で記載される抗ＰＤ−１アプタマー、アプタマーダイマー、又はそれらのＰＥＧコンジュゲートのうち１又は２以上を、医薬的に許容可能な担体（賦形剤）と混合して、例えば、標的の病気の治療に用いられる医薬組成物を形成することができる。「許容可能」とは、前記担体が前記組成物の薬効成分と相溶でなければならず（及び前記薬効成分を安定化させることができることが好ましい）、治療対象に有害ではないことを意味する。医薬的に容認可能な賦形剤（担体）としては、当該分野で周知の緩衝液が挙げられる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed（レミントン：薬学の科学と実践、第２０版）. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照のこと。
【００５６】
本開示の方法で用いられる医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤を凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で含んでいてもよい。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed（レミントン：薬学の科学と実践、第２０版）. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照のこと。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度で投与対象に対して毒性がない。これら許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸）；酸化防止剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存料（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、又はベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチル又はプロピルパラベン）；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；親水性重合体（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミ、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン）；単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストランを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖類（例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでいてもよい。
【００５７】
実施例によっては、本明細書で記載される医薬組成物は、前記ＰＤ−１結合アプタマーを含有するリポソーム（又は前記アプタマーを製造するためのベクター）を含む。前記リポソーム（又はベクター）は、Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)、米国特許第４，４８５，０４５号、及び４，５４４，５４５号に記載の方法等の公知の方法により作製してもよい。循環時間が向上したリポソームは、米国第５，０１３，５５６で開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法により生成することができる。リポソームを所定の孔寸法のフィルターから押し出して、所望の直径のリポソームを得る。
【００５８】
また、前記抗ＰＤ−１アプタマーは、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション（微細乳濁液）、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルション中で、例えば、液滴形成（コアセルベーション）技術又は界面重合により作製したマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、及びポリ（メチルメタクリル酸）マイクロカプセル）に取り込まれていてもよい。このような技術は当該分野で周知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed（レミントン：薬学の科学と実践、第２０版）. Mack Publishing (2000)を参照のこと。
【００５９】
他の実施例では、本明細書で記載される医薬組成物は、徐放性形態で製剤されてもよい。徐放性製剤の好適な例としては、前記ＰＤ−１結合アプタマーを含有する固体疎水性重合体の半透過性母体が挙げられる。これらの母体は、例えば、フィルム又はマイクロカプセルなどの成形品の形態である。徐放性母体の例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−グルタミン酸７−エチルの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸共重合体（例えば、LUPRON DEPOT（登録商標）乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球体）、酢酸イソブチル酸スクロース、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【００６０】
生体内投与に用いられる医薬組成物は殺菌されていなければならない。これは、例えば、殺菌濾過膜で濾過することにより容易に達成される。治療用抗ＰＤ−１アプタマー組成物を殺菌された取り出し口を有する容器（例えば、皮下注射針で突き刺すことができる栓を有する静脈内投与液袋又はバイアル）に入れてもよい。
【００６１】
本明細書で記載される医薬組成物は、経口投与、非経口投与、直腸投与、あるいは吸入又は送気による投与のための単位投与形態（例えば、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、又は尿道坐薬）であってもよい。
【００６２】
錠剤などの固体組成物を調製するために、主要薬効成分を医薬品担体、例えば、従来の錠剤成分（例えば、とうもろこし澱粉、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸水素カルシウム、又はガム、及びその他の医薬希釈剤（例えば、水））と混合して、本発明の化合物又は非毒性の医薬的に許容可能であるその塩の均質な混合物を含む固体の予備処方組成物を形成してもよい。これらの予備処方組成物を均質という場合、前記組成物を錠剤、丸薬、及びカプセルなどの等しい有効単位投与形態に容易に分割できるように薬効成分が前記組成物全体に均一に分散されていることを意味する。次いで、本発明の薬効成分を０．１〜約５００ｍｇ含む上述の種類の単位投与形態にこの固体の予備処方組成物を分割する。この新規な組成物の錠剤又は丸薬を被覆、あるいは配合して、持続作用の利点を得られるような投与量を提供することができる。例えば、前記錠剤又は丸薬は、内部投与成分及び外部投与成分（内部投与成分の包装材の形態で）を含んでいてもよい。これら２つの成分を腸溶性層で分離してもよい。この腸溶性層は、胃の中で崩壊に耐える働きをして、前記内部成分を無傷で十二指腸に送る、あるいは放出を遅らせることができる。このような腸溶性層、すなわちコーティングには様々な材料を用いることができる。そのような材料としては、様々な重合体の酸、及び重合体の酸とシェラック、セチルアルコール、及び酢酸セルロースの混合物が挙げられる。
【００６３】
好適な界面活性剤としては、特に非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、４０、６０、８０、又は８５）、及び他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、４０、６０、８０、又は８５）が挙げられる。界面活性剤を含む組成物は、０．０５〜５％の界面活性剤を含むのが好都合で、０．１〜２．５％であってもよい。自明であるが、必要に応じて、他の成分（例えば、マンニトール又は他の医薬的に許容可能な媒体）を添加してもよい。
【００６４】
市販の脂質乳液（例えば、Intralipid（登録商標）、Liposyn（登録商標）、Infonutrol（登録商標）、Lipofundin（登録商標）、及びLipiphysan（登録商標））を用いて好適な乳液を調製してもよい。前記薬効成分を、予め混合した乳液組成物に溶解してもよく、あるいは油（例えば、大豆油、紅花油、綿実油、ごま油、とうもろこし油、又はアーモンド油）、及びリン脂質（例えば、卵リン脂質、大豆リン脂質、又は大豆レシチン）と水と混合して形成された乳液に溶解してもよい。自明であるが、例えば、グリセリン又はグルコースなどの他の成分を添加して、前記乳液の張性を調整してもよい。好適な乳液は、典型的には２０％以下、例えば、５〜２０％の油を含む。脂質乳液は、０．１〜１．０．ｉｍ、特に０．１〜０．５．ｉｍの脂質滴を含んでいてもよく、ｐＨは５．５〜８．０の範囲であってもよい。
【００６５】
前記乳液組成物は、抗ＰＤ−１アプタマーをIntralipid（登録商標）又はその成分（大豆油、卵リン脂質、グリセリン、及び水）と混合して調製したものであってもよい。
【００６６】
吸入又は送気用の医薬組成物は、医薬的に許容可能な水性溶媒又は有機溶媒の溶液及び懸濁液、又はそれらの混合物、及び粉末を含む。前記液体又は固体組成物は、上述の好適な医薬的に許容可能な賦形剤を含んでいてもよい。態様によっては、前記組成物は、局所性効果又は全身性効果のために経口又は経鼻呼吸経路で投与される。
【００６７】
好ましい殺菌された医薬的に許容可能な溶媒中の組成物を、気体を用いて噴霧してもよい。噴霧液を直接噴霧装置から吸い込んでもよく、噴霧装置をマスク、テント、又は間欠式陽圧呼吸器に取り付けてもよい。溶液、懸濁液、又は粉末組成物を、好ましくは適切に製剤を送達する装置から経口投与又は経鼻投与してもよい。
【００６８】
治療法
本明細書で記載される抗ＰＤ−１アプタマー、ダイマー、又はそのＰＥＧコンジュゲートの何れかを用いて、免疫活性の亢進、特にＴ細胞増殖の促進を図ってもよく、これによって癌又は伝染病（例えば、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）感染又は細菌感染）の治療に有効になる。
【００６９】
本明細書で開示される方法を実践するために、治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に少なくとも１種の抗ＰＤ−１アプタマーを含む本明細書で記載される医薬組成物の有効量を好適な経路で投与してもよい。好適な経路としては、例えば、静脈内投与（例えば、急速静注、又は所定の期間に渡る持続注入）、筋肉内投与、腹腔内投与、脳脊髄内投与、皮下投与、関節内投与、滑液嚢内投与、髄腔内投与、経口投与、吸入又は局所投与経路が挙げられる。ジェット噴霧器及び超音波噴霧器を含む商業的に入手可能な液体製剤用噴霧器は、投与に有用である。液体製剤を直接噴霧してもよく、凍結乾燥した粉末を再構成後に噴霧してもよい。あるいは、本明細書で記載される抗ＰＤ−１アプタマーを含有する組成物をフルオロ炭素製剤及び定量吸入器を用いて、エアロゾル化してもよく、あるいは凍結乾燥して粉砕した粉末として吸入してもよい。
【００７０】
本明細書で用いられる「有効量」は、単独又は２種以上を１種以上の他の活性薬剤と組み合わせで対象に及ぼす治療効果をもたらすのに必要な各活性薬剤の量を意味する。態様によっては、前記治療効果は、腫瘍量の低減、癌細胞の減少、又は免疫活性の向上である。前記ＰＤ−１結合アプタマーの量が前記治療効果を達成したかどうかを決定することは当業者には自明である。当業者には自明であるが、治療される特定の疾患、前記疾患の重症度、個々の患者のパラメーター（年齢、体調、体格、性別、及び体重を含む）、治療期間、（もしあれば）併用療法の性質、特定の投与経路、及び医療関係者の知識及び経験の範囲内の同様の因子により有効量は変動する。これらの因子は、当業者には周知であり、通常の実験で対処することができる。一般に、個々の成分又はそれらの組み合わせの最大投与量、すなわち、妥当な医学的判断により最も安全性が高い投与量を用いることが好ましい。
【００７１】
半減期などの実験的考察は、一般に投与量の決定に寄与する。投与の頻度を決定して、治療の過程に渡って調整してもよい。また、一般に、実験的考察は、標的の病気／障害の治療及び／又は抑制及び／又は改善及び／又は遅延に基づくものであるが、必ずしもそうではない。あるいは、ＰＤ−１結合アプタマーの連続徐放性製剤が適切な場合がある。徐放性を達成するための様々な製剤及び装置は当該分野で周知である。
【００７２】
一例では、本明細書で記載される抗ＰＤ−１アプタマーの投与量は、前記ＰＤ−１結合アプタマーを１回以上投与された個体で実験的に決定してもよい。前記拮抗薬の投与量を徐々に増加させて個体に投与する。前記拮抗薬の有効性を評価するため、病気／障害の標識を追跡してもよい。
【００７３】
一般に、本明細書で開示される抗ＰＤ−１アプタマーの何れかの投与で、初期の候補投与量は約２ｍｇ／ｋｇであってもよい。本開示の目的のために、典型的な１日の投与量は、上記の因子によって０．１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲の何れかであってもよい。数日以上繰り返して投与する場合、疾患によって症状の所望の抑制が生じるまで、あるいは十分な治療レベルに達して標的の病気又は障害、あるいはその症状が軽減されるまで治療を持続する。例示的な投与計画は、約２ｍｇ／ｋｇの初期投与量を投与し、その後、１週間に維持投与量約１ｍｇ／ｋｇ、あるいは隔週で維持投与量約１ｍｇ／ｋｇでＰＤ−１結合アプタマーを投与することを含む。しかしながら、医師が達成したいと望む薬物動態的減衰のパターンにより、他の投薬計画が有用である場合がある。例えば、週に１回から４回の投与が想起される。態様によっては、約３μｇ／ｍｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲（例えば、約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、及び約２ｍｇ／ｋｇ）の投与を用いてもよい。態様によっては、投与頻度は、週に１回、２週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、又は３ヶ月以上に１回である。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイで容易に監視される。投与計画（前記ＰＤ−１結合アプタマーを用いることを含む）は、経時的に変動してもよい。
【００７４】
態様によっては、標準重量の成人患者の場合、約０．３〜５．００ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で投与してもよい。特定の投薬計画、すなわち、投与量、タイミング、及び反復は、特定の個体、個体の病歴、個々の薬剤の特性（例えば、薬剤の半減期、及び当該分野で周知のその他の検討事項）に依存する。
【００７５】
本開示の目的のために、本明細書で記載されるＰＤ−１結合アプタマーの適切な投与量は、特定のＰＤ−１結合アプタマー、病気／障害の種類及び重症度、前記ＰＤ−１結合アプタマーが予防目的又は治療目的で投与されるか否か、それまでの治療、患者の臨床歴及び拮抗薬に対する応答、ならびに主治医の裁量に依存する。臨床医は、所望の結果を達成する投与量に達するまでＰＤ−１結合アプタマーを投与してもよい。態様によっては、前記所望の結果は、腫瘍量の低減、癌細胞の減少、又は免疫活性の向上である。ある投与量が所望の結果をもたしたかどうかを決定する方法は、当業者には自明である。例えば、投与対象の生理的状態、投与の目的が治療的又は予防的であるか否か、及び高度な技能を持つ医師には周知の他の因子によって、１種以上のＰＤ−１結合アプタマーの投与は連続的又は断続的であってもよい。ＰＤ−１結合アプタマーの投与は本質的には予め選択した期間の間連続的であってもよく、例えば、標的の病気又は障害の発達の前、途中、又は後など、一連の間隔を空けた投与であってもよい。
【００７６】
本明細書で用いられる用語「治療」は、標的の障害、標的の病気の症状、又は標的の病気又は障害に対する素因を治す、癒す、軽減する、緩和する、変化させる、是正する、向上させる、改良する、又は影響を及ぼす目的で前記病気又は障害、前記病気／障害の症状、又は前記病気／障害に対する素因を有する対象への１種以上の活性薬剤を含む組成物の適用すなわち投与を意味する。
【００７７】
標的の病気／障害の軽減は、前記病気の発症又は進行を遅らせること、あるいは病気の重症度を低減することを含む。前記病気の軽減は、必ずしも治癒的な結果を必要としない。本明細書で用いられる用語「（標的の病気又は障害の）遅延」は、前記病気の進行を遅らせる、妨げる、減速する、妨害する、安定化させる、かつ／又は先送りすることを意味する。この遅延は、その病気の病歴及び／又は治療されている個体によって時間の長さを変動させることであってもよい。病気の発達を「遅延する」又は軽減する、あるいは病気の発症を遅延する方法は、この方法を用いない場合に比べて、所定の期間内で前記病気の１つ以上の症状が発達する確率を低下させる、かつ／又は所定の期間内で前記症状の程度を低下させる方法である。そのような比較は、典型的には統計的に有意な結果を得るのに十分な数の対象者を用いた臨床研究に基づくものである。
【００７８】
病気の「発達」又は「進行」は、前記病気の初期の出現及び／又はそれに続く進行を意味する。前記病気の発達は、標準的な臨床技術及び当該分野で周知の臨床技術を用いて検出可能であり、評価することができる。しかしながら、発達はまた、検出不可能である可能性がある進行を意味する。本開示の目的のために、発達又は進行は、前記症状の生物的過程を意味する。「発達」は、発生、再発、及び発症を含む。本明細書で用いられる標的の病気又は障害の「発症」又は「発生」は、最初の発症及び／又は再発を含む。
【００７９】
態様によっては、生体内で少なくとも５％（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上）腫瘍量、癌細胞の成長、又はＨＩＶ増殖を低減するのに十分な量で前記治療を必要とする対象に本明細書で記載されるＰＤ−１結合アプタマーを投与する。他の態様では、少なくとも５％（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上）ＰＤ−１の活性量を低減するのに有効な量で前記ＰＤ−１結合アプタマーを投与する。他の態様では、少なくとも５％（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上）免疫活性を高めるのに有効な量で前記ＰＤ−１結合アプタマーを投与する。
【００８０】
医薬品当業者に周知の従来の方法を用いて、治療する病気の種類又はその病気の部位に応じて前記対象に前記医薬組成物を投与してもよい。また、この組成物を従来の他の経路、例えば、経口投与、非経口投与、吸入スプレー、局所投与、直腸投与、経鼻投与、口腔投与、膣投与、又は埋め込み容器から投与してもよい。本明細書で用いられる用語「非経口投与」は、皮下投与、皮膚内投与、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、動脈内投与、滑液嚢内投与、胸骨内投与、髄腔内投与、病巣内投与、及び頭蓋内注射又は点滴技術を含む。また、例えば、１ヶ月、３ヶ月、又は６ヶ月のデポ注射可能な材料又は生分解性材料及び方法を用いて注射可能なデポ投与経路から前記対象に投与してもよい。実施例によっては、前記医薬組成物を眼球内又は硝子体内に投与する。
【００８１】
注射可能な組成物は、様々な担体、例えば、植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、カルボン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、及びポリオール（グリセリン、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）を含んでいてもよい。静脈内注射の場合、点滴法で水溶性ＰＤ−１結合アプタマーを投与してもよい。これにより、前記ＰＤ−１結合アプタマー及び生理的に容認可能な賦形剤を含む医薬製剤を注入する。生理的に容認可能な賦形剤は、例えば、５％ブドウ糖、０．９％生理食塩水、リンガー液、又はその他の好適な賦形剤を含んでいてもよい。筋肉内投与用製剤、例えば、前記ＰＤ−１結合アプタマーの好適な可溶塩の形態である殺菌製剤を医薬賦形剤（例えば、注射用水、０．９％生理食塩水、又は５％グルコース溶液）に溶解して、投与してもよい。
【００８２】
一態様では、ＰＤ−１結合アプタマーは、部位特異的な送達技術又は標的局所送達技術により投与される。部位特異的な送達技術又は標的局所送達技術としては、例えば、前記ＰＤ−１結合アプタマーの埋め込み可能な各種デポ源、又は局所送達カテーテル（例えば、注入カテーテル、内在型カテーテル、又は針カテーテル）、人工血管、外膜ラップ、シャント及びステント、又は他の埋め込み可能な装置、部位特異的な担体、直接注射、又は直接塗布が挙げられる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／５３２１１及び米国特許第５，９８１，５６８号を参照のこと。
【００８３】
また、アンチセンスポリヌクレオチド、発現ベクター、又は下位ゲノムポリヌクレオチドを含む治療組成物の標的送達を用いてもよい。受容体媒介のＤＮＡ送達技術が、例えば、Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer （遺伝子治療：直接遺伝子移入の方法と応用）(J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338に記載されている。
【００８４】
遺伝子治療試験プロトコールの局所投与の場合、ポリヌクレオチド（例えば、本明細書で記載されるＰＤ−１結合アプタマー又はそのようなアプタマーを産生するためのベクター）を含む治療組成物を、ＤＮＡが約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲で投与する。態様によっては、遺伝子治療試験プロトコールを通じて用いられるＤＮＡ濃度が約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、及び約２０μｇ〜約１００μｇ、又はそれ以上の範囲であってもよい。
【００８５】
本明細書で記載される方法で治療される対象は哺乳類、例えば、家畜動物、競技用動物、愛玩動物、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、及びラットであってもよい。一例では、前記対象はヒトである。前記抗ＰＤ−１アプタマーを含有する組成物は、前記治療を必要とする対象の免疫活性（例えば、Ｔ細胞活性）を高めるために用いられてもよい。実施例によっては、癌（例えば、肺癌、メラノーマ、結腸直腸癌、又は腎細胞癌）を有する、癌を有すると疑われる、又は癌のリスクがある前記対象はヒト患者であってもよい。他の実施例では、前記対象はＨＩＶ感染を有する、又はＨＩＶ感染を有すると疑われるヒト患者であってもよい。そのような患者もまた、通常の医療行為によって識別することができる。
【００８６】
標的の病気又は障害（例えば、癌、ＨＩＶ感染などのウイルス感染、又は細菌感染）を有する対象は、通常の医学検査（例えば、ラボ試験、臓器機能試験、ＣＴスキャン、又は超音波）により識別することができる。そのような標的の病気／障害の何れかを有すると疑われる対象は、その病気／障害の１つ以上の症状を示す場合がある。前記病気／障害のリスクがある対象は、その病気／障害に関連づけられた危険因子の１つ以上を有する対象であってもよい。そのような対象もまた、通常の医療行為によって識別することができる。
【００８７】
特定の投薬計画、すなわち、本明細書で記載される方法で用いられる投与量、タイミング、及び反復は、特定の対象（例えば、ヒト患者）及びその対象の病歴に依存する。
【００８８】
態様によっては、前記抗ＰＤ−１アプタマーを好適な他の治療薬（例えば、抗癌剤又は抗ＨＩＶ剤）と共に用いてもよい。これに代えて、又はこれに加えて、前記抗ＰＤ−１アプタマーも、前記薬剤の有効性を向上及び／又は補完する働きをする他の薬剤と共に用いてもよい。
【００８９】
標的の病気／障害の治療有効性は、例えば、以下の実施例で記載する方法により評価することができる。
【００９０】
標的の病気の軽減に用いるキット
本開示はまた、免疫活性（例えば、Ｔ細胞活性）を高め、癌（例えば、肺癌、メラノーマ、結腸直腸癌、又は腎細胞癌）を軽減し、かつ／又はＨＩＶ感染のリスクを低減するキットを提供する。そのようなキットは、ＣＴＬＡ４に結合するアプタマー（例えば、本明細書で記載されるアプタマーの何れか）を含む１つ以上の容器を含んでいてもよい。
【００９１】
態様によっては、前記キットは、本明細書で記載される方法の何れかに従って使用するための指示を含んでいてもよい。含まれているこれらの指示は、本明細書で記載される、標的の病気を治療する、その発症を遅延する、又は病気を軽減するためのアプタマーの投与についての説明を含んでいてもよい。前記キットはさらに、ある個体が前記標的の病気を有するかどうかの識別に基づいて治療に好適な個体を選択することについての説明を含んでいてもよい。さらに他の態様では、前記指示は、前記標的の病気のリスクがある個体に前記アプタマーを投与することについての説明を含む。
【００９２】
ＣＴＬＡ４結合アプタマーの使用に関する指示は、一般に、投与量、投与日程、及び意図された治療のための投与経路に関する情報を含む。前記容器は、単位投与量、バルク包装（例えば、複数回投与量を包装したもの）、又は下位単位投与量であってもよい。本発明のキットと一緒に提供される指示は、典型的にはラベル又は包装袋の挿入物（例えば、キットに含まれる紙シート）に書かれた指示であるが、機械で読み取り可能な指示（例えば、磁性又は光学式記録ディスク）上に担持された指示もまた容認可能である。
【００９３】
前記ラベル又は包装袋の挿入物は、本明細書で記載される、癌に関連づけられた病気又は障害の治療、その発症の遅延、及び／又はその病気の軽減に前記組成物が用いられることを示す。指示は、本明細書で記載される方法の何れかを実践するために提供されてもよい。
【００９４】
本発明のキットは、好適に包装されている。好適な包装としては、バイアル、瓶、ジャー、柔軟性のある包装（例えば、密封されたマイラー又はプラスチック袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。また、特定の装置、例えば、吸入器、経鼻投与装置（例えば、噴霧機）、又は注入装置（例えば、ミニポンプ）と組み合わせて包装を用いることも想定される。キットは、殺菌された取り出し口を有していてもよい（例えば、前記容器は皮下注射針で突き刺すことができる栓を有する静脈内投与液袋又はバイアルであってもよい）。また、前記容器は殺菌された取り出し口を有していてもよい（例えば、前記容器は皮下注射針で突き刺すことができる栓を有する静脈内投与液袋又はバイアルであってもよい）。前記組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、本明細書で記載されるＣＴＬＡ４結合アプタマーである。
【００９５】
必要に応じて、キットは、緩衝液などの追加の成分、及び解釈のための情報を提供してもよい。通常、前記キットは、容器、及び前記容器の上又はそれに関連づけられたラベル又は包装袋の挿入物を含む。態様によっては、本発明は、上記のキットの内容物を含む製造品を提供する。
【００９６】
一般技術
本発明を実施するに当たっては、別途記載しない限り、従来の分子生物学（組換技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術が含まれる。これらは技術常識の範囲内である。Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987); ＰＣＲ: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).
【００９７】
更なる検討を要することなく、当業者であれば上記の記載に基づいて、本発明を最大限に利用することができる。従って、以下の具体的な態様は、あくまでも単なる例示と解すべきであり、本明細書の他の部分を如何なる意味でも限定することはない。本明細書で引用される公報は、本明細書で参照される目的又は主題に関して、引用により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９８】
例１：ＳＥＬＥＸによる抗ＰＤ−１アプタマーの同定
非特異的アプタマー数を低減するべくＰＤ１細胞外ドメインを選択に用いた。発明者等が用いたＳＥＬＥＸストラテジーは、図１に示すような膜ＳＥＬＥＸである。要約すると、ＰＤ１タンパク質をアプタマーライブラリーと共にインキュベートし、真空吸引によりニトロセルロース膜を通過させた。数回の洗浄を行うと、ＰＤ１を結合したアプタマーが膜にトラップされ、更にＰＣＲ反応で増幅される。単鎖アプタマーからなる新たなアプタマープールがＰＣＲ産物から単離され、これをＰＤ１タンパク質の新たなバッチとインキュベートして、ＳＥＬＥＸの新規ラウンドを開始する。アプタマープールが首尾良く進化したことを示すために、ＰＤ１選択のラウンド４、８、１２、及び１６からのアプタマープールを選択し、分析した。ＲＴ−ｑＰＣＲを連結した総結合アッセイによって、結合親和性及び特異性を測定した（図２）。これらのデータによれば、ＳＥＬＥＸラウンド数の増加に伴って、親和性が増大していた。例えば、親和性は１２０．７ｎＭ（ラウンド４）〜６．６ｎＭ（ラウンド１６）に増加した（図２）。これらのデータは、本発明者等のＳＥＬＥＸ手順が、高親和性且つ特異的なアプタマーを選択する上で効率的に機能したことを示している。１６回の選択ラウンドの後、前記アプタマープールの配列を決定した。
【００９９】
例２：異なるＳＥＬＥＸラウンドからのアプタマープール親和性分析
ラウンド４、８、１２、及び１６におけるアプタマープールをＰＤ−１に対して増幅し、続いて５００ｎＭから開始して２倍ずつ連続希釈を行った。選択されたプールの各々について、１０の用量点でＰＤ−１タンパク質とインキュベートすることにより分析した。結合されたアプタマーをセルロース膜結合によって単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲで定量した。結果をＸＹプロットで示した。黒丸はラウンド４、緑四角はラウンド８、青三角はラウンド１２、赤逆三角はラウンド１６の結果を示す。点線は各プールの適合曲線を示す。ラウンド４、８、１２、及び１６の解離定数は、それぞれ４９３．７ｎＭ、２４５．７ｎＭ、１８．５ｎＭ、及び６．８ｎＭであった。
【０１００】
例３：ＰＤ１アプタマーの配列分析
図３のパネルＡは、ＰＤ−１アプタマーの結果のツリー表示を示す。図３のパネルＢは、ＰＤ−１に結合した、クラスタ化ＰＤ−１アプタマーの配列詳細を示す。囲み領域は、ＰＤ−１アプタマー内の保存領域を示す。ラウンド１６のアプタマープールはＴＡクローニングであり、５０クローンを選択して配列決定に供した。配列はクラスタ化ソフトウェアで分析した。ツリー表示の結果は、プール１６で進化した優勢な群を示す（図３、パネルＡ）。図３のパネルＢは、９ヌクレオチド塩基の保存領域を含む、ＰＤ１アプタマーの詳細な配列情報を示す。これら９ヌクレオチド塩基はCCATCTCCC（配列番号１）である。このコア配列を含む核酸はＰＤ−１に結合すると予想される。配列番号２４〜４２の核酸配列を以下に示す。
【０１０１】
【表Ａ１】
0006680760.tif 000002
【表Ａ２】
0006680760.tif 000003
【０１０２】
例４：抗ＰＤ−１アプタマーＰＤ７及びＰＤ１６の親和性及び構造分析
ＰＤ−１アプタマープール内の２つの主要な配列群として、ＰＤ７及びＰＤ１６を選択した。総結合アッセイの示すところによれば、ＰＤ７（図４、パネルＢ）及びＰＤ１６（図４、パネルＡ）の結合親和性は、それぞれ９.７ｎＭ及び２.１ｎＭであった。Mfoldソフトウェアを用いてＰＤ７及びＰＤ１６アプタマーの二次構造を予測したところ、結果が示すところでは、ＰＤ７とＰＤ１６との間で二次構造に有意な類似性は観られなかった（図、パネルＣ）。更に、ＰＤ７及びＰＤ１６内の保存された領域は、異なる部位に存在し、幹／ループ構造に関与していた（図４、パネルＣ）。この結果は、これらのアプタマーの二次構造が、ＰＤ−１タンパク質への結合に関与する主要因子ではないことを示している。
【０１０３】
例５：ＰＤ−１アンタゴニストアプタマーの同定
７つの主要な配列群として、７つのＰＤ−１アプタマーを選択し、Ｔ細胞増殖アッセイに供した。本試験で検討したＰＤ−１アプタマーは、ＰＤ１６、ＰＤ１３、ＰＤ６、ＰＤ７、ＰＤ８、ＰＤ９、及びＰＤ２４である。これらのヌクレオチド配列を以下に示す。これらのアプタマーは何れも、対照群と比較してＴ細胞増殖を増加させた。前記アプタマーの一つであるＰＤ７は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の不在下（図５、パネルＡ）又は存在下（図５、パネルＢ）の何れでも、Ｔ細胞増殖の誘導に関して最も強い効果を示し、ＰＤ−１アンタゴニスト抗体よりも強いＴ細胞活性因子であった。これらの結果が示すところでは、ＰＤ７により、ＰＤ−１アンタゴニスト抗体と比較して、シグナルが３０％超も増大した（図５、パネルＡ）。
【０１０４】
【表Ｂ】
0006680760.tif 000004
【０１０５】
例６：抗ＰＤ−１アプタマー配列のアンタゴニスト活性
例１に記載のＳＥＬＥＸで単離された抗ＰＤ−１アプタマーの更なるアプタマーヌクレオチド配列を、次世代配列決定（NGS）データを用いた統計分析で同定した。
コア１ − CCATCTCCC（配列番号１）；
最適化コア１ − CCATCTCCCGTCC（配列番号７）
コア２ − ＴＡＴＡTTGTCC（配列番号２０）；
コア３ − GＴＡCAGTT（配列番号２１）；
コア４ − GCACTACA（配列番号４）；
コア５ − GＴＡCATCA（配列番号２２）；及び
コア６ − GCＴＡCTGT（配列番号２３）。
【０１０６】
上記アプタマーヌクレオチド配列の各々のＰＤ−１アンタゴニスト活性を、インビトロ競合アッセイで検討した。要約すると、２００ｎｇのヒスチジンタグ標識ＰＤ−１受容体（His tag−ＰＤ１タンパク質）でニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）被覆プレートを被覆し、Ｆｃ標識ＰＤＬ−１タンパク質／アプタマー混合物で処理した。タンパク質Ｇ−ＨＲＰ及びＥＣＬ基質を用いて結合シグナルを決定した。陽性対照としてＰＤ−１アンタゴニスト抗体Ｊ１１６を用い、陰性対照はアプタマー又は抗体の不在下で実施した。斯かる競合アッセイの模式図を図８、パネルＡ及びＢに示す。前記アプタマー配列（コア１〜６及びコア１（最適化））の各々を、２００ｎＭの濃度でインビトロ競合アッセイに供した。競合アッセイでは、アプタマーヌクレオチド配列は何れも、図６に示すように、ＰＤ−１とＰＤＬ−１との相互作用を阻害した。更に、コア１、CCATCTCCC（配列番号１）について、ＰＤ−１／ＰＤＬ−１結合との拮抗のＩＣ５０を、インビトロ競合アッセイで決定したところ、３１．１８ｎＭであった（図７）。これらのデータは、アプタマーヌクレオチド配列が、ＰＤ−１のＰＤＬ−１への結合に拮抗しうることを示す。
【０１０７】
例７： 抗ＰＤ−１アプタマーが異なる種のＰＤ−１に交差反応する
アプタマーを用いて、他の生物種とのＰＤ−１結合の交差反応性を、インビトロＰＤ−１アプタマー結合アッセイにより検証した。要約すると、２００ｎｇのヒスチジンタグ標識ＰＤ−１受容体（His tag −ＰＤ１タンパク質）によって、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）被覆プレートを被覆し、５’末端にビオチンをコンジュゲートしたアプタマー（ビオチン−ＰＤ−１アプタマー）で処理した。前記アプタマーのＰＤ−１への結合は、ストレプトアビチン−ＨＲＰ及びＥＣＬ基質を用いて検出した。インビトロＰＤ−１結合アッセイの模式図を図９に示す。試験したアプタマーは以下のとおりである。
ＰＤ７ − TCCCTACGGCGCTAACCTTCCATCTCCCATGCTTAGTCAAACATACGCCACCGTGCTACAAC（配列番号１０；コア配列を下線で示す）；
ＰＤ１００ − TCCCTACGGCGCTAACCCTCCCCTAGTATATATTGTCCTCGTCTATG CCACCGTGCTACAAC（配列番号１２；コア配列を下線で示す）。
コア１ − CCATCTCCC（配列番号１）；及び
コア２ − TATATTGTCC（配列番号２０）。
【０１０８】
上記のアプタマーの、ヒト、マウス、ラット、アカゲザル、及び／又は、イヌのＰＤ−１への結合を、図９に示すインビトロＰＤ−１結合アッセイにより評価した。前記アプタマーの（各生物種の）ＰＤ−１への結合の解離定数を決定した。その結果を表１に示す。これらのデータは、これらのアプタマーが、ヒト、マウス、ラット、サル、及びイヌを含む、多種多様な生物種のＰＤ−１に結合することを示している。
【０１０９】
【表１】
0006680760.tif 000005
【０１１０】
例８：抗ＰＤ−１アプタマーがリンパ球増殖及びＣＤ８＋ Ｔ−細胞増殖を誘発した。
リンパ球増殖アッセイを用いて、遊離アプタマー及びＰＥＧコンジュゲート化アプタマー（ＰＥＧコンジュゲート）の双方を含む抗ＰＤ−１アプタマーによる、リンパ球増殖の促進能を検証した。要約すると、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をFicoll−paqueで単離し、完全ＲＰＭＩ培地で一晩培養して、細胞を安定化させた。安定化されたＰＢＭＣを、種々の異なる濃度のＰＤ−１アプタマー、ＰＥＧ化アプタマー、アンタゴニストＰＤ−１抗体、又はランダム対照配列で、４８時間処理した。Promega社CellTiter（登録商標）増殖キットを用いて総細胞数を評価した。試験したアプタマーは、ＰＤ７（配列番号１０）、CCATCTCCCA（配列番号１３；コア配列）、及びＰＥＧ化ＰＤ７ダイマー（図１１に示す）である。
【０１１１】
上記アプタマーは何れも、リンパ球増殖の増加能が、ＰＤ−１アンタゴニスト抗体よりも強かった（図１０）。これらのデータは、前記アプタマー及びＰＥＧ−コア配列ダイマーが、免疫活性の増強に使用できることを示している。
【０１１２】
更に、フローサイトメトリーを用いて、抗ＰＤ−１アプタマーによるＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ−細胞増殖の促進能を、ＰＤ７及びコア１を例に用いて検証した。要約すると、マウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ−細胞を、電磁ビーズを用いてマウス脾臓から単離した。これらの細胞を、蛍光指示染料であるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で染色した。ＣＦＳＥ染色細胞を、抗原提示細胞（APC；マウスＰＢＭＣから単離された単離された単球及びマクロファージ）と共培養し、４０ｎＭのＰＤ７又は４０ｎＭのアプタマーヌクレオチド配列CCATCTCCC（配列番号１）で７２時間処理した。陽性対照はアンタゴニストＰＤ−１抗体で処理し、陰性対照はランダムＤＮＡ配列で処理した。フローサイトメトリーを用いて細胞群の蛍光強度を監視した。蛍光シグナルが弱いほど増殖が増加していることを示す。アッセイの模式図を図１２に示す。結果によれば、アンタゴニストＰＤ−１抗体及びＰＤ７アプタマーはＣＤ８＋ Ｔ−細胞増殖を増加させたが、ＣＤ４＋ Ｔ−細胞増殖は増加させなかった（図１３、パネルＡ〜Ｄ）。一方、陰性対照は何れの細胞種でも、細胞増殖に何らの影響も及ぼさなかった（図１３、パネルＡ及びＢ）。これらのデータによれば、本明細書に示すコア配列を含むアプタマーを用いて、ＣＤ８＋ Ｔ−細胞増殖を促進することにより、免疫活性を増強しうることが示された。
【０１１３】
例９： 抗ＰＤ−１アプタマーがインビボ同系マウスモデルで腫瘍成長を阻害した
同系肺癌マウスモデルを用いて、本明細書に記載の抗ＰＤ−１アプタマーによる、インビボでの肺癌成長の阻害活性を、ＰＤ−１アンタゴニストアプタマーＰＤ７（配列番号１０）を例に用いて検証した。要約すると、０日目において、マウスLewis肺癌細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６４２）を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに皮下移植した（１マウス当たりLewis肺細胞２×１０５個）。腫瘍が１００ｍｍ３に達した後、マウスを対照群、ＰＢＳ処理群（ｎ＝７）、又はＰＤ−１アプタマー処理群（ｎ＝７）に分けた。ＰＤ−１アプタマー処理マウスには、ＰＢＳ中４０ｎｍｏｌのＰＤ７を、対照マウスにはＰＢＳを、腹腔内注射により投与した。図１４に示すように、Lewis肺細胞同系マウスに、０日目及び５日目にＰＤ−１アプタマーを投与した（図１４；投与時を矢印で示す）。腫瘍サイズは０、３、５、７、９、及び１１日目に測定した。腫瘍細胞注入後１１日目の時点で、ＰＤ７処理マウスの腫瘍サイズは、対照ＰＢＳ処理マウスの腫瘍サイズと比較して、約５０％も減少した（図１４）。これらのデータは、ＰＤ７アプタマーが肺癌の治療に使用できることを示している。
【０１１４】
例１０：抗ＰＤ−１アプタマーがインビボヒト化マウスモデルで腫瘍成長を阻害した
ヒト化肺癌マウスモデルを用いて、本明細書に記載の抗ＰＤ−１アプタマーによる、インビボでの肺癌成長の阻害活性を、ＰＤ−１アンタゴニストアプタマー ＰＤ７（配列番号１０）を例として検証した。要約すると、０日目において、ヒトＡ５４９肺癌細胞を、ＮＯＤマウスに皮下移植した（１マウス当たりＡ５４９細胞１．５×１０６）。Ａ５４９細胞のマウスへの移植から１週間後に、ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）をマウスに注射した。マウスを対照群、スクランブル化ＤＮＡ処置群（n＝３；マウス２２６、２３３、及び２３９）、又はＰＤ−１アプタマー処理群（n＝３；マウス ２３４、２３５、及び２４０）に分けた。マウスに１５０μｌの８μＭ ＰＤ−１アプタマー又はスクランブル化ＤＮＡ対照を、腹腔内注射した。Ａ５４９肺細胞ヒト化マウスに、ＰＤ−１アプタマー又はスクランブル化ＤＮＡ対照を週一回、三週間に亘って投与した。処置スケジュールを模式的に図１５に示す。腫瘍サイズの測定は２５、３２、及び３８日目に、ＩＶＩＳスペクトル系を用いて行った。腫瘍細胞注入後３８日目の時点で、ＰＤ７処理マウスの腫瘍サイズ（図１６、パネルＡ〜Ｄ）は、スクランブル化ＤＮＡ対照で処理したマウスの腫瘍サイズ（図１６、パネルＥ〜Ｈ）と比較して、顕著に縮小していた。これらのデータの平均によれば、ＰＤ７で処理したマウスは、スクランブル化ＤＮＡ対照で処理したマウスと比較して、３８日目の腫瘍サイズは８０％庁も減少していた（図１７）。これらのデータは、ＰＤ７アプタマーがヒト肺癌の治療に使用できることを示している。
【０１１５】
他の態様
本明細書に記載の任意の特徴を、任意の組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書に記載の特徴は各々、同一・同等・又は同様の目的を果たす代替的な特徴で置換してもよい。即ち、別途明記しない限り、開示される各特徴は、包括的な同等又は同様の特徴の群の一例に過ぎない。
【０１１６】
上記の記載から、当業者であれば容易に、本発明の本質的な特徴を特定することが可能であり、且つ、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない限りにおいて、本発明に種々の改変や修正を加え、種々の用途や条件に適合させることが可能である。即ち、他の態様も特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ−Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ−Ｈ】
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【図１７】
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【配列表】
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