(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ニトロアルコール化合物を作製するための方法であって、ニトロアルカン化合物およびクピン−ニトロアルドラーゼの存在下でアルデヒド化合物またはケトン化合物を対応するβ−ニトロアルコール化合物に変換し、
前記クピン−ニトロアルドラーゼが、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｆ（Ｘ５）ＰＧＡＲ（Ｘ６）（Ｘ７）ＷＨ（Ｘ８）ＨＰ（Ｘ９）Ｇ
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＫまたはＲ残基であり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり；
Ｘ３はＶ、Ａ、Ｉ、Ｃ、Ｍ、Ｈ、またはＴ残基であり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり；
Ｘ５は任意のアミノ酸であり；
Ｘ６はＴ、ＳまたはＮ残基であり；
Ｘ７は任意のアミノ酸であり；
Ｘ８はＴ、Ｓ、またはＩ残基であり；
Ｘ９は任意のアミノ酸であり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換され、
前記クピン−ニトロアルドラーゼが、配列番号１または３のアミノ酸の番号付けに従った以下の変異：Ａ４０Ｈ、Ａ４０Ｒ、Ｖ４２ＴおよびＱ１１０Ｈのうちの１つ以上を有し、マンガン、鉄、ニッケル、コバルト、銅または亜鉛を含む、方法。
【請求項２】
クピン−ニトロアルドラーゼの存在下で式Ｉの化合物を式ＩＩの化合物と反応させて式ＩＩＩのβ−ニトロアルコール化合物を得る、請求項１に記載の方法であって、
【化１】
0006669362.tif 000012
式中、
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ４〜２０シクロアルキルアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜２０アリールアルキル、３〜１４員のヘテロシクロアルキル、４〜２０員のヘテロシクロアルキルアルキル、５〜２０員のヘテロアリールまたは６〜２０員のヘテロアリールアルキルであり、これらは任意選択で１つ以上のＲａにより置換されており、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、Ｈまたは、任意選択で１つ以上のＲａにより置換されたＣ１〜２０アルキルであり、
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＯＲｂ、−ＮＲｂＲｂ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲｂ、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＲｂＲｂ、Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ２〜２０アルケニル、またはＣ２〜２０アルキニルであり、
Ｒｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは、任意選択で置換されたＣ１〜２０アルキル、Ｃ２〜２０アルケニルもしくはＣ２〜２０アルキニルであり、
ｎは、０、１、２または３である、
方法。
【請求項３】
単相系もしくは二相系またはエマルジョンにおいて反応が実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記β−ニトロアルコール化合物が少なくとも５５％のエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）で得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記β−ニトロアルコール化合物が少なくとも１０％の変換率で得られる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｆ（Ｘ５）ＰＧＡＲ（Ｘ６）（Ｘ７）ＷＨ（Ｘ８）ＨＰ（Ｘ９）Ｇ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とするクピン−ニトロアルドラーゼ変異体であって、式中、
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、Ｋ、またはＲ残基であり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり；
Ｘ３はＶ、Ａ、Ｉ、Ｃ、Ｍ、Ｈ、またはＴ残基であり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり；
Ｘ５は任意のアミノ酸であり；
Ｘ６はＴ、ＳまたはＮ残基であり；
Ｘ７は任意のアミノ酸であり；
Ｘ８はＴ、Ｓ、またはＩ残基であり；
Ｘ９は任意のアミノ酸であり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換され、
配列番号１または３のアミノ酸の番号付けに従った以下の変異：Ａ４０Ｈ、Ａ４０Ｒ、Ｖ４２ＴおよびＱ１１０Ｈのうちの１つ以上を有し、
マンガン、鉄、ニッケル、コバルト、銅または亜鉛を含む、クピン−ニトロアルドラーゼ変異体。
【請求項７】
請求項６に記載のクピン−ニトロアルドラーゼ変異体をコードする、単離されたポリ核酸分子。
【請求項８】
請求項７の単離されたポリ核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
請求項８のベクターを導入することにより得られる組換え非ヒト細胞。
【請求項１０】
請求項９の組換え非ヒト細胞を培養することにより得られる培養物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キラルβ−ニトロアルコール化合物を作製するための方法であって、ニトロアルカン化合物およびクピン−ニトロアルドラーゼの存在下でアルデヒド化合物またはケトン化合物を対応するβ−ニトロアルコール化合物に変換する方法に関する。本発明は、特に、ヘンリー反応をエナンチオ選択的に触媒する（Ｒ）−選択的クピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体触媒プロセスは化学産業にとって非常に重要になってきている。生体触媒の特性が、キラル化合物またはプロキラル化合物を伴う化学反応において２つのエナンチオマーのうちのいずれかを優先的に反応させるか形成することを可能にする場合、酵素の使用は特に重要である。
【０００３】
酵素のこのような好ましい特性を利用するための必須要件は、工業プロセスで必要とされるような十分な量のそれらの酵素を低コストで利用できること、十分に高い反応性、選択性、および工業プロセスの現実的な条件下での高い安定性である。
【０００４】
β−ニトロアルコールは、医薬成分として使用されるエフェドリン、ベスタチンおよびスフィンゴシンなどの生物活性化合物の合成に重要なキラル構築ブロックであるβ−アミノアルコールの前駆体である。ニトロアルドール反応またはヘンリー反応は、Ｃ−Ｃ結合の形成のための有機合成における古典的な人名反応の１つである。最大で２つの新たなキラル中心を生じさせる可能性があるため、エナンチオ選択的且つ立体選択的にニトロアルドール付加を実施できることは、合成用途には根本的に重要である。この反応は１世紀超にわたって知られているが（Ｈｅｎｒｙ，  １８９５）、非酵素的な有機分子触媒またはキラル金属触媒を利用する立体特異的プロトコルは、最近になって発展してきたに過ぎない。これらの方法の発展は印象的ではあるが、それらは未だにいくつかの欠点を共有し、これらの欠点には、金属触媒の場合には長い反応時間および、時には、極端な反応条件、または有機分子触媒の場合には不十分な選択性、が含まれる。
【０００５】
過去１０年の間に、最初の不斉性の生体触媒によるニトロアルドール反応が、熱帯性のゴムノキであるパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）に由来するヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨｂＨＮＬ）で見出された（Ｐｕｒｋａｒｔｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．  ２００６  ４５（２１），  ３４５４−６；Ｇｒｕｂｅｒ−Ｋｈａｄｊａｗｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００７，  ３４９，  １４４５−１４５０；Ｙｕｒｙｅｖ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃａｔａｌ．Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ．，（２０１０）  ２８，  ３４８；Ｙｕｒｙｅｖ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｅｍｃａｔｃｈｅｍ，（２０１０）  ２，  ９８１）。
【０００６】
また、ＨｂＨＮＬと同様にα／β−ヒドロラーゼスーパーファミリーに属する、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）由来の（Ｓ）−選択的ＭｅＨＮＬも、活性および選択性はより低いものの、（Ｓ）−選択的ニトロアルドール反応を触媒することが可能である。
【０００７】
（Ｒ）−選択的にＨＮＬにより触媒されるヘンリー反応を触媒する最初の（Ｒ）−選択的ＨＮＬは、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｂｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡｔＨＮＬであり（Ｆｕｈｓｈｕｋｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，  １５３，  １５３−１５９）、これは、（Ｓ）−選択的ニトロアルドラーゼと同様にα／β−ヒドロラーゼスーパーファミリーにも属する。
【０００８】
対照的に、異なるタンパク質フォールドに属する、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ  ａｍｙｇｄａｌｕｓ）由来の（Ｒ）−選択的ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＰａＨＮＬ）については、これまでニトロアルドール反応における活性は示されていない。
【０００９】
しかし、残念なことに、報告された反応条件にて反応時間を（２時間から４時間に）延長してもその間にＡｔＨＮＬの反応産物のエナンチオマー過剰率は、収率の増加を伴うことなく著しく低下する（Ｆｕｈｓｈｕｋｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１）。
【００１０】
Ａｓａｎｏおよび共同研究者は、ベンズアルデヒド１ｍｍｏｌあたり４０ｍｇのＡｔＨＮＬを適用して、５０％のｎ−ブチルアセテートを伴うｐＨ７の二相系においてベンズアルデヒドおよびＭｅＮＯ２で最も高いエナンチオ選択性を達成した（収率３０％およびｅｅ９１％）。収率およびエナンチオマー過剰率はさらに、より多量の酵素（基質１ｍｍｏｌあたり１００ｍｇ）を適用することによって僅かに向上した。基質１ｍｍｏｌあたり４０ｍｇのＡｔＨＮＬおよび２時間という反応時間を適用すると、基質および反応系に依存して最大６０％の収率または最大９６％のエナンチオマー過剰率を得ることができた。しかし、これらは同一の反応条件下では共存しない。
【００１１】
しかし、報告された反応条件にて反応時間を（２時間から４時間に）延長してもその間にＡｔＨＮＬの反応産物のエナンチオマー過剰率は、収率の増加を伴うことなく著しく低下する。ニトロエタンは使用されなかった。
【００１２】
Ｇｏｔｏｒおよび共同研究者は、水中での運搬体タンパク質ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によるニトロアルドール反応のタンパク質媒介性触媒作用を報告した。この触媒作用は、これらの科学者等の観察から非特異的なタンパク質触媒作用という結論が導かれたため、有機分子触媒作用として分類され得る（Ｂｕｓｔｏ，Ｅ．；Ｇｏｔｏｒ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｖ．；Ｇｏｔｏｒ，Ｖ．，  Ｏｒｇ．ＰｒｏｃｅｓｓＲｅｓ．Ｄｅｖ．，（２０１１）  １５，  ２３６）。生体触媒によるニトロアルドール反応は、トランスグルタミナーゼ（Ｔａｎｇ，  Ｒ．  Ｃ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌ．  Ｂ：  Ｅｎｚｙｍ．，  （２０１０）  ６３，  ６２）、ヒドロラーゼ（Ｗａｎｇ，  Ｊ．  Ｌ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  （２０１０）  １４５，  ２４０）、プロテアーゼ（Ｌｏｐｅｚ−Ｉｇｌｅｓｉａｓ，  Ｍ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．，  （２０１１）  ３５３，  ２３４５）、リパーゼ（Ｌｅ，  Ｚ．−Ｇ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  Ｒｅｖ．，  （２０１３）  ６，  ２７７；  Ｘｉａ，  Ｗ．−Ｊ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  （２０１３）  １８，  １３９１０）、アシラーゼ（Ｘｉａ，  Ｗ．−Ｊ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  （２０１３）  １８，  １３９１０）およびグルコアミラーゼ（Ｇａｏ，  Ｎ．；  ｅｔ  ａｌ．，  ＲＳＣ  Ａｄｖ．，  （２０１３）  ３，  １６８５０）などの酵素でも報告されているが（概要についてはＭｉｌｎｅｒ，  Ｓ．  Ｅ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ，  （２０１２），  ３０５９を参照のこと）、全ての場合において、反応がエナンチオ選択的ではないか、またはエナンチオ選択性についてのデータが提示されていない。
【００１３】
従って、これまでは、α／β−ヒドロラーゼのフォールドを有する植物のＨＮＬのみが、エナンチオ選択的ニトロアルドール反応を触媒することが可能であった。
【００１４】
別のアプローチは、化学合成された立体異性体の混合物を酵素による速度論的光学分割によって（例えばヒドロラーゼを使用して）分離する化学−酵素的アプローチである。しかし、一般的な速度論的光学分割の主な欠点は、最大で５０％という収率の制限である。
【００１５】
従って、ヘンリー反応をエナンチオ選択的に触媒できる新たなニトロアルドラーゼが依然として必要とされている。
【００１６】
最近になって、クピンのフォールドを有する新たな細菌性ＨＮＬの発見が報告された（Ｈａｊｎａｌ，  Ｉ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｅｂｓ  Ｊ．，  （２０１３）  ２８０，  ５８１５；  Ｈｕｓｓａｉｎ，  Ｚ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  （２０１２）  ７８，  ２０５３）。しかし、これらは非常に低い比活性しか示さない。新たな酵素の一つであるＧｔＨＮＬは詳細に特徴付けられており、その構造が解明された（Ｈａｊｎａｌ，  Ｉ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｅｂｓ  Ｊ．，  （２０１３）  ２８０，  ５８１５；  Ｌｙｓｋｏｗｓｋｉ，  Ａ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｆ，  （２０１２）  ６８，  ４５１）。ＧｔＨＮＬは、約１５ｋＤａの分子量を有する小さな金属依存性モノ−クピンであり、四量体を形成する。
【発明の概要】
【００１７】
β−ニトロアルコール化合物を作製するための改良された方法を提供することが本発明の目的である。方法は、アルデヒド化合物またはケトン化合物を提供する工程と、その化合物をニトロアルカン化合物およびクピン−ニトロアルドラーゼの存在下で対応するβ−ニトロアルコール化合物に変換する工程と、を含む。本発明は、特に、ヘンリー反応をエナンチオ選択的に触媒できる（Ｒ）−選択的クピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】ＧｔＨＮＬ（ＰＤＢ−コード：４ＢＩＦ）の構造の１つのクピン単量体の模式図。
【図１Ｂ】配列番号１、３および５〜１０の多重配列アライメント。
【図２】５０％のＴＢＭＥを伴う二相系におけるＡｃＨＮＬおよびＧｔＨＮＬならびにＧｔＨＮＬの三重変異体（ＧｔＨＮＬ−Ａ４０Ｈ／Ｖ４２Ｔ／Ｑ１１０Ｈ、省略名：ＧｔＨＮＬｍｕｔ）およびＡｃＨＮＬの三重変異体（ＡｃＨＮＬ−Ａ４０Ｈ／Ｖ４２Ｔ／Ｑ１１０Ｈ、省略名：ＡｃＨＮＬｍｕｔ）とベンズアルデヒド（２０μｍｏｌ）およびニトロメタン（１ｍｍｏｌ）とのニトロアルドール反応。清澄化したライセート（酵素／ｍｍｏｌ  ＢＡの量は、総ライセートタンパク質の約５０％がＨＮＬであると仮定した場合の酵素自体の量を指す）または精製酵素を使用した。変換率およびｅｅの値は、６時間の反応時間の後に測定した。
【図３】５０％のＴＢＭＥを伴う二相系および種々のタンパク質対基質比における三重変異体ＧｔＨＮＬ−Ａ４０Ｈ／Ｖ４２Ｔ／Ｑ１１０Ｈ（省略名：ＧｔＨＮＬｍｕｔ）とベンズアルデヒド（２０μｍｏｌ）およびニトロメタン（１ｍｍｏｌ）とのニトロアルドール反応。参照用にＡｔＨＮＬを使用した。変換率およびｅｅの値は、２時間および２４時間の反応時間の後に測定した。
【図４】５０％のＴＢＭＥを伴う二相系におけるいくつかのクピン−ニトロアルドラーゼとベンズアルデヒド（２０μｍｏｌ）およびニトロエタン（１ｍｍｏｌ）とのニトロアルドール反応。変換率およびｅｅの値は、２時間、４時間および２４時間の反応時間の後に測定した。
【図５−１】クピン−ニトロアルドラーゼのタンパク質配列。  配列番号１：ＧｔＨＮＬ（Ｇｒａｎｕｌｉｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒｉｃｏｌａ  ＭＰ５ＡＣＴＸ９，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｅ８ＷＹＮ５）。  配列番号２：ＧｔＨＮＬ三重変異体（Ａ４０Ｈ，Ｖ４２Ｔ，Ｑ１１０Ｈ）のタンパク質配列。  配列番号３：ＡｃＨＮＬのタンパク質配列（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ５１１９６；  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃ１Ｆ９５１）。  配列番号４：ＡｃＨＮＬ三重変異体（Ａ４０Ｈ，Ｖ４２Ｔ，Ｑ１１０Ｈ）のタンパク質配列。  配列番号５：クピン２保存バレルドメインタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｂ８ＥＮＩ４）。  配列番号６：クピン２保存バレルドメインタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ５Ｇ１６２）。  配列番号７：クピン２保存バレルドメインタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃ６Ｄ４９９）。  配列番号８：性質不明のタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃ１Ｄ３Ｅ９）。  配列番号９：クピン２保存バレルドメインタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ６Ｕ７Ｖ５）。  配列番号１０：クピン２保存バレルドメインタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｆ８ＩＦ０３）。
【図５−２】クピン−ニトロアルドラーゼのタンパク質配列。  配列番号１：ＧｔＨＮＬ（Ｇｒａｎｕｌｉｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒｉｃｏｌａ  ＭＰ５ＡＣＴＸ９，  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｅ８ＷＹＮ５）。  配列番号２：ＧｔＨＮＬ三重変異体（Ａ４０Ｈ，Ｖ４２Ｔ，Ｑ１１０Ｈ）のタンパク質配列。  配列番号３：ＡｃＨＮＬのタンパク質配列（Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ５１１９６；  Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃ１Ｆ９５１）。  配列番号４：ＡｃＨＮＬ三重変異体（Ａ４０Ｈ，Ｖ４２Ｔ，Ｑ１１０Ｈ）のタンパク質配列。  配列番号５：クピン２保存バレルドメインタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｂ８ＥＮＩ４）。  配列番号６：クピン２保存バレルドメインタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ５Ｇ１６２）。  配列番号７：クピン２保存バレルドメインタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃ６Ｄ４９９）。  配列番号８：性質不明のタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃ１Ｄ３Ｅ９）。  配列番号９：クピン２保存バレルドメインタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ａ６Ｕ７Ｖ５）。  配列番号１０：クピン２保存バレルドメインタンパク質のタンパク質配列（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｆ８ＩＦ０３）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
第一の態様では、本発明は、β−ニトロアルコール化合物を作製するための方法であって、ニトロアルカン化合物およびクピン−ニトロアルドラーゼの存在下でアルデヒド化合物またはケトン化合物を対応するβ−ニトロアルコール化合物に変換する方法に関する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、上記のような方法であって、クピン−ニトロアルドラーゼが図１Ａの保存されたバレルドメインを含む、方法に関する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、上記のような方法であって、クピン−ニトロアルドラーゼが、ＰＦＡＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＣＬ００２９を有するクピンスーパーファミリーの保存されたバレルドメインを含む、方法に関する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、上記のような方法であって、クピン−ニトロアルドラーゼが、ＰＦＡＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＰＦ０７８８３を有するクピン２ファミリーの保存されたバレルドメインを含む、方法に関する。
【００２３】
別の態様では、本発明は、上記のような方法であって、クピン−ニトロアルドラーゼが、ＳＣＯＰ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ５１１８２を有するＲｍｌＣ様（ＲｍｌＣ−ｌｉｋｅ）クピンスーパーファミリーに属する、方法に関する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、上記のような方法であって、クピン−ニトロアルドラーゼがＩｎｔｅｒＰｒｏタンパク質ファミリーデータベース（ｔｈｅ  ＩｎｔｅｒＰｒｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ）のＲｍｌＣ様ゼリーロールフォールド（ＩＰＲ０１４７１０）を含む、方法に関する。
【００２５】
別の態様では、本発明は、上記のような方法であって、クピン−ニトロアルドラーゼがＩｎｔｅｒＰｒｏタンパク質ファミリーデータベースのＲｍｌＣ様クピンドメイン（ＩＰＲ０１１０５１）を含む、方法に関する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、上記のような方法であって、クピン−ニトロアルドラーゼがＩｎｔｅｒＰｒｏタンパク質ファミリーデータベースのクピン２保存バレルドメイン（ＩＰＲ０１３０９６）を含む、方法に関する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、上記のような方法であって、クピン−ニトロアルドラーゼの存在下で式Ｉの化合物を式ＩＩの化合物と反応させて式ＩＩＩのβ−ニトロアルコールを得る方法に関し、
【化１】
0006669362.tif 000002
式中、
Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ２〜２０アルケニル、またはＣ２〜２０アルキニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ４〜２０シクロアルキルアルキル、Ｃ６〜１４アリール、Ｃ７〜２０アリールアルキル、３〜１４員のヘテロシクロアルキル、４〜２０員のヘテロシクロアルキルアルキル、５〜２０員のヘテロアリールまたは６〜２０員のヘテロアリールアルキルであり、これらは任意選択で１つ以上のＲａにより置換されており、
Ｒ３およびＲ４は、互いに独立して、Ｈまたは、任意選択で１つ以上のＲａにより置換されたＣ１〜２０アルキルであり、
Ｒａは、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＯＲｂ、−ＮＲｂＲｂ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲｂ、−（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）Ｒｂ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＮＲｂＲｂ、Ｃ１〜２０アルキル、Ｃ２〜２０アルケニル、またはＣ２〜２０アルキニルであり、
Ｒｂは、それぞれ独立して、Ｈまたは、任意選択で置換されたＣ１〜２０アルキル、Ｃ２〜２０アルケニルもしくはＣ２〜２０アルキニルであり、
ｎは、０、１、２または３である。
【００２８】
アルキル基は、別段の記載がない限り、任意選択で置換された直鎖状または分枝状のＣ１〜２０アルキル、好ましくは１〜２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖、を意味する。アルキル基は１つ以上のＲａにより置換されていてよい。
【００２９】
アルケニル基は、別段の記載がない限り、任意選択で置換された部分的に不飽和の直鎖状または分枝状のＣ２〜２０アルケニル、好ましくは少なくとも１つの二重結合を含む２〜２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖、を意味する。アルケニル基は１つ以上のＲａにより置換されていてよい。
【００３０】
アルキニル基は、別段の記載がない限り、任意選択で置換された部分的に不飽和の直鎖状または分枝状のＣ２〜２０アルキニル、好ましくは少なくとも１つの三重結合を含む２〜２０個の炭素原子の直鎖または分枝鎖、を意味する。アルキニル基は１つ以上のＲａにより置換されていてよい。
【００３１】
シクロアルキル基は、任意選択で置換された、３〜１０個の炭素原子（好ましくは４〜６個の炭素原子）を含む単環式非芳香族炭化水素環または７〜１０個の炭素原子（好ましくは７個の炭素原子）を含む二環式非芳香族炭化水素環系を意味し、ここでシクロアルキル基は任意選択で１つ以上の二重結合または三重結合を含む。シクロアルキル基は１つ以上のＲａにより置換されていてよい。
【００３２】
ヘテロシクロアルキル基は、任意選択で置換された、３〜１４個の炭素原子（好ましくは４〜８個の炭素原子）を含む単環式非芳香族炭化水素環または７〜１４個の炭素原子（好ましくは８〜１０個の炭素原子）を含む二環式非芳香族炭化水素環系を意味し、ここで、ヘテロシクロアルキル基において炭化水素環または炭化水素環系の炭素原子のうちの１つ以上が、−Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓｉ−および−Ｐ−を含む群より選択される基に置き換わっており、ヘテロシクロアルキル基は任意選択で１つ以上の二重結合を含む。ヘテロシクロアルキル基は１つ以上のＲａにより置換されていてよい。
【００３３】
アリール基は、好ましくは、任意選択で置換された、単環式、二環式、三環式または四環式の芳香族炭化水素基、好ましくは６〜１４個の炭素原子を有する単環式芳香族炭化水素基を意味し、アリール基は、好ましくは、任意選択で置換されたフェニルである。アリール基は１つ以上のＲａにより置換されていてよい。
【００３４】
ヘテロアリール基は、炭素原子のうちの少なくとも１つがＯ、Ｎ、および／またはＳのようなヘテロ原子に置き換わっている任意選択で置換された芳香族の５員または６員の単環式炭化水素基を意味し、ここで、芳香族単環式の５員または６員の環状炭化水素基は任意選択でさらなる単環式の５員〜７員（好ましくは５員〜６員）の芳香族または非芳香族の炭化水素環に融合しており、さらなる単環式の芳香族または非芳香族の炭化水素環において１つ以上（好ましくは１つまたは２つ）の炭素原子がＯ、Ｎ、および／またはＳのようなヘテロ原子に置き換わっていてよい。ヘテロアリール基は１つ以上のＲａにより置換されていてよい。
【００３５】
ハロゲン基は、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素である。
【００３６】
本明細書において使用される場合、「任意選択で置換された」は、ハロゲン、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−ＣＮ、カルボニルおよびカルボキシルからなる群より選択される置換基、
置換および非置換Ｃ６〜１４アリールまたはＣ５〜１４ヘテロアリール残基に隣接するＣ１〜２０アルキル、Ｃ２〜２０アルケニルおよびＣ２〜２０アルキニルに適用される。
【００３７】
方法は、単相系もしくは二相系またはエマルジョンにおいて実施できる。
【００３８】
単相反応溶液は水性溶媒または有機溶媒を含む。
【００３９】
適切な水溶液は、例えば水、クピン−ニトロアルドラーゼ含有溶液、または緩衝液である。緩衝液の例は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液、またはそれらの混合物である。これらの溶液のｐＨはｐＨ２〜９、好ましくは４〜７であってよい。
【００４０】
適切な有機溶液は、僅かに水混和性の、または水不混和性の脂肪族または芳香族の炭化水素（任意選択でハロゲン化されている）、アルコール、エーテルもしくはエステルまたはそれらの混合物または基質自体であってよい。例えば、限定されるものではないが、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、四塩化炭素、ベンゼン、トルエン、シクロヘキサン、ヘキサデカン、ヘキサン、ヘプタン、クロロホルム、キシレン、ペンタノール、ヘキサノール、オクタノールおよびドデカノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトニトリル、ニトロメタン、ニトロエタン、またはそれらの混合物が好適である。イオン性液体および超臨界流体を指す新型溶媒（ｎｅｏｔｅｒｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔｓ）も適用可能である。
【００４１】
水−有機溶媒二液相系において生物変換を行うことの利点は当技術分野において周知である。二相系は、互いに混和しない２つの相（例えば水相および有機相）からなる。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、上記のような方法であって、反応が単相系もしくは二相系またはエマルジョンにおいて実施される方法に関する。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は、上記のような方法であって、二相系が本明細書に記載されるような水溶液および有機溶液を含む方法に関する。
【００４４】
本発明のクピン−ニトロアルドラーゼは、この系にて、精製酵素または全細胞懸濁液のいずれかとして存在してよいか、または無細胞ライセート中に含まれていてよいか、または（例えばＣｅｌｉｔｅ（登録商標）、Ａｖｉｃｅｌ等などの支持体上に、または架橋酵素集合体（ＣＬＥＡ）として）固定化された形態であってよい。
【００４５】
さらに、変換は−１０℃〜＋５０℃という温度にて、好ましくは０℃〜３５℃にて、起こる。
【００４６】
適用可能な求電子剤の選択肢の範囲は、芳香族アルデヒドからヘテロ芳香族アルデヒドおよび脂肪族アルデヒドにまで及ぶ。基質および反応系に依存して、最大９７．３％の収率または９９％超のエナンチオマー過剰率が本発明の方法によって得られる可能性がある。
【００４７】
さらなる態様では、本発明は、上記のような方法であって、β−ニトロアルコール化合物が少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％のエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）で得られる方法に関する。
【００４８】
さらなる態様では、本発明は、上記のような方法であって、β−ニトロアルコール化合物が少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％の変換率で得られる方法に関する。
【００４９】
クピンスーパーファミリーのタンパク質（ＰＦＡＭ：ＣＬ００２９）は、１０〜１２個の逆平行βストランドから構成される保存されたβバレルドメインを含む（図１Ａ）。Ｃｕｐａはバレルのラテン語である。タンパク質構造分類データベース（ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄａｔａｂａｓｅ）（ＳＣＯＰ）では、クピンスーパーファミリーのタンパク質は、二本鎖βヘリックスフォールド内のＲｍｌｃ様クピンスーパーファミリー［５１１８２］として分類される。クピンのフォールドは幅広い様々な酵素に見出されるが、非酵素タンパク質にも見出される。クピンドメインは、単独で、あるいは他のドメインと組み合わさって、タンパク質構造中に１つ、２つまたは３つ以上見出され得る。クピンスーパーファミリーのタンパク質は、全体としての配列類似性は非常に低いが、それらは全て、長さおよびアミノ酸配列の両方が様々である保存度の低いモチーフ間の領域によって隔てられた２つの短いが部分的に保存されたクピン配列モチーフを含む（図１）。クピンスーパーファミリーのタンパク質は、古細菌、細菌および真核生物において広範な生物学的機能を有する。
【００５０】
クピンは構造的に保存されており、通常、Ｇ−（Ｘ）５−Ｈ−Ｘ−Ｈ−（Ｘ）３，４−Ｅ−（Ｘ）６−Ｇ（モチーフ１）およびＧ−（Ｘ）５−Ｐ−Ｘ−Ｇ−（Ｘ）２−Ｈ−（Ｘ）３−Ｎ（モチーフ２）という２つの保存されたモチーフを含み、このスーパーファミリーのメンバーの間では、全体としての配列同一性が低い。また、上記の２つのモチーフは、金属との結合のための残基も含む。大部分のクピンは、鉄、亜鉛、マンガン、銅、ニッケルまたはカドミウムなどの二価の陽イオンに結合する金属結合タンパク質である。金属は通常、反応機構において直接的に、または少なくとも基質との相互作用を介して、酵素反応に関与する。
【００５１】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１０％の、好ましくは少なくとも２０％の、より好ましくは少なくとも５０％の変換率で不斉性のβ−ニトロアルコール反応を触媒することが可能なクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００５２】
さらなる態様では、本発明は、クピン−ニトロアルドラーゼであって、図１Ａの保存されたバレルドメインを含むクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００５３】
さらなる態様では、本発明は、クピン−ニトロアルドラーゼであって、ＰＦＡＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＣＬ００２９を有するクピンスーパーファミリーの保存されたバレルドメインを含むクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００５４】
さらなる態様では、本発明は、クピン−ニトロアルドラーゼであって、ＰＦＡＭ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＰＦ０７８８３を有するクピン２ファミリーの保存されたバレルドメインを含むクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００５５】
さらなる態様では、本発明は、クピン−ニトロアルドラーゼであって、ＳＣＯＰ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ５１１８２を有するＲｍｌＣ様クピンスーパーファミリーに属するクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００５６】
別の態様では、本発明は、クピン−ニトロアルドラーゼであって、ＩｎｔｅｒＰｒｏタンパク質ファミリーデータベースのＲｍｌＣ様ゼリーロールフォールド（ＩＰＲ０１４７１０）を含むクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００５７】
別の態様では、本発明は、クピン−ニトロアルドラーゼであって、ＩｎｔｅｒＰｒｏタンパク質ファミリーデータベースのＲｍｌＣ様クピンドメイン（ＩＰＲ０１１０５１）を含むクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００５８】
別の態様では、本発明は、クピン−ニトロアルドラーゼであって、ＩｎｔｅｒＰｒｏタンパク質ファミリーデータベースのクピン２保存バレルドメイン（ＩＰＲ０１３０９６）を含むクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００５９】
本発明のさらなる態様は、組換えクピン−ニトロアルドラーゼである、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼである。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つ、具体的には少なくとも２つ、具体的には少なくとも３つ、具体的には少なくとも４つ、具体的には少なくとも５つまたは６つ以上のアミノ酸の改変を含む、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼである。
【００６１】
本発明によれば、「改変」なる用語は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失または置換または挿入を意味する。具体的には、改変は１アミノ酸の置換である。
【００６２】
本発明の特定の実施形態において、クピン−ニトロアルドラーゼは、１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を含む。
【００６３】
本発明の実施形態によれば、野生型配列のアミノ酸を置換するために任意のアミノ酸を選択できる。
【００６４】
置換アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジンおよびスレオニンから選択される。具体的には、上記の置換アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジンまたはスレオニンである。
【００６５】
さらなる態様では、本発明は、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼであって、そのアミノ酸配列がそれぞれの野生型酵素と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、または少なくとも９８％同一であるクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００６６】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１、配列番号３の番号付けに従った位置４０、４２および／または１１０（図１Ｂ）のうちのいずれか１箇所で改変されている、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００６７】
さらなる態様では、本発明は、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０の番号付けに従った位置４０、４２および／または１１０（図１Ｂ）のうちのいずれか１箇所で改変されている、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００６８】
本発明の実施形態によれば、位置４０、４２および／または１１０のうちのいずれかの箇所の改変はアミノ酸置換である。
【００６９】
さらなる実施形態によれば、本発明のクピン−ニトロアルドラーゼ変異体は、保存されたバレルドメインの位置４０、４２および１１０のうちのいずれかの箇所に１つ、２つまたは３つの置換を含む。
【００７０】
さらなる態様では、本発明は、配列番号２（ＧｔＨＮＬｍｕｔ）または配列番号４（ＡｃＨＮＬｍｕｔ）を有する、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００７１】
さらなる実施形態によれば、クピン−ニトロアルドラーゼ変異体は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５〜１０の番号付けに従ったＡ４０ＨまたはＡ４０Ｒである。
【００７２】
さらなる実施形態によれば、クピン−ニトロアルドラーゼ変異体は、配列番号１または配列番号３または配列番号５〜１０の番号付けに従ったＶ４２ＴまたはＱ１１０Ｈである。
【００７３】
さらなる実施形態によれば、クピン−ニトロアルドラーゼ変異体は、配列番号１または配列番号３または配列番号５〜１０の番号付けに従ったＡ４０Ｈ  Ｖ４２Ｔである。
【００７４】
特定の実施形態によれば、クピン−ニトロアルドラーゼ変異体は、配列番号１または配列番号３または配列番号５〜１０の番号付けに従ったＡ４０Ｈ  Ｖ４２Ｔ  Ｑ１１０Ｈである。
【００７５】
さらなる態様では、本発明は、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｆ（Ｘ５）ＰＧＡＲ（Ｘ６）（Ｘ７）ＷＨ（Ｘ８）ＨＰ（Ｘ９）Ｇ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関し、式中、
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｎ、ＫまたはＲ残基であり、好ましくはＡまたはＮであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳ、Ｈ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ３はＶ、Ａ、Ｉ、Ｃ、Ｍ、Ｈ、またはＴ残基であり、好ましくはＶであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＴまたはＲであり；
Ｘ５は任意のアミノ酸であり、好ましくはＥであり；
Ｘ６はＴ、ＳまたはＮ残基であり、好ましくはＴであり；
Ｘ７は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡであり；
Ｘ８はＴ、Ｓ、またはＩ残基であり、好ましくはＴであり；
Ｘ９は任意のアミノ酸であり、好ましくはＬであり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換されている。
【００７６】
さらなる態様では、本発明は、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｆ（Ｘ５）ＰＧＡＲ（Ｘ６）（Ｘ７）ＷＨ（Ｘ８）ＨＰ（Ｘ９）Ｇ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関し、式中、
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｈ、Ｇ、Ｎ、ＫまたはＲ残基であり、好ましくはＡまたはＮであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳ、Ｈ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ３はＶ、Ａ、Ｉ、Ｃ、Ｍ、またはＴ残基であり、好ましくはＶであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＴまたはＲであり；
Ｘ５は任意のアミノ酸であり、好ましくはＥであり；
Ｘ６はＴ、ＳまたはＮ残基であり、好ましくはＴであり；
Ｘ７は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡであり；
Ｘ８はＴ、Ｓ、またはＩ残基であり、好ましくはＴであり；
Ｘ９は任意のアミノ酸であり、好ましくはＬであり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換されている。
【００７７】
さらなる態様では、本発明は、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｆ（Ｘ５）ＰＧＡＲ（Ｘ６）（Ｘ７）ＷＨ（Ｘ８）ＨＰ（Ｘ９）Ｇ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関し、式中、
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｎ、ＫまたはＲ残基であり、好ましくはＡまたはＮであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳ、Ｈ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ３はＶ、Ａ、Ｉ、Ｃ、Ｍ、またはＨ残基であり、好ましくはＶであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＴまたはＲであり；
Ｘ５は任意のアミノ酸であり、好ましくはＥであり；
Ｘ６はＴ、ＳまたはＮ残基であり、好ましくはＴであり；
Ｘ７は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡであり；
Ｘ８はＴ、Ｓ、またはＩ残基であり、好ましくはＴであり；
Ｘ９は任意のアミノ酸であり、好ましくはＬであり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換されている。
【００７８】
さらなる態様では、本発明は、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）Ｆ（Ｘ５）ＰＧＡＲ（Ｘ６）（Ｘ７）ＷＨ（Ｘ８）ＨＰ（Ｘ９）Ｇ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関し、式中、
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｇ、Ｎ、ＫまたはＲ残基であり、好ましくはＡまたはＮであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳ、Ｈ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ３はＶ、Ａ、Ｉ、Ｃ、またはＭ残基であり、好ましくはＶであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＴまたはＲであり；
Ｘ５は任意のアミノ酸であり、好ましくはＥであり；
Ｘ６はＴ、ＳまたはＮ残基であり、好ましくはＴであり；
Ｘ７は任意のアミノ酸であり、好ましくはＡであり；
Ｘ８はＴ、Ｓ、またはＩ残基であり、好ましくはＴであり；
Ｘ９は任意のアミノ酸であり、好ましくはＬであり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換されている。
【００７９】
さらなる態様では、本発明は、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）ＦＥＰＧＡＲＴＡＷＨＴＨＰＬＧ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関し、式中、
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ＮまたはＲ残基であり、好ましくはＡまたはＮであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳ、Ｈ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ３はＶ、Ａ、Ｉ、Ｃ、Ｍ、Ｈ、またはＴ残基であり、好ましくはＶであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＴまたはＲであり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換されている。
【００８０】
さらなる態様では、本発明は、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）ＦＥＰＧＡＲＴＡＷＨＴＨＰＬＧ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関し、式中、
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、またはＮ残基であり、好ましくはＡまたはＮであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳ、Ｈ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ３はＶ、Ａ、Ｉ、Ｃ、Ｍ、Ｈ、またはＴ残基であり、好ましくはＶであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＴまたはＲであり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換されている。
【００８１】
さらなる態様では、本発明は、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）ＦＥＰＧＡＲＴＡＷＨＴＨＰＬＧ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関し、式中、
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、ＮまたはＲ残基であり、好ましくはＡまたはＮであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳ、Ｈ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ３はＶであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＴまたはＲであり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換されている。
【００８２】
さらなる態様では、本発明は、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）ＦＥＰＧＡＲＴＡＷＨＴＨＰＬＧ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関し、式中、
Ｘ１はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｆ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｇ、Ｎ、ＫまたはＲ残基であり、好ましくはＡまたはＮであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳ、Ｈ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ３はＶ、Ａ、Ｉ、Ｃ、またはＭ残基であり、好ましくはＶであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＴまたはＲであり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換されている。
【００８３】
さらなる態様では、本発明は、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）ＦＥＰＧＡＲＴＡＷＨＴＨＰＬＧ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関し、式中、
Ｘ１はＡまたはＮ残基であり、好ましくはＡであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳ、Ｈ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ３はＶ、Ａ、Ｉ、Ｃ、またはＭ残基であり、好ましくはＶであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＴまたはＲであり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換されている。
【００８４】
さらなる態様では、本発明は、一般式：
（Ｘ１）（Ｘ２）（Ｘ３）（Ｘ４）ＦＥＰＧＡＲＴＡＷＨＴＨＰＬＧ
のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼに関し、式中、
Ｘ１はＡまたはＮ残基であり、好ましくはＡであり；
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、好ましくはＳ、Ｈ、Ａ、またはＴであり；
Ｘ３はＶであり；
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、好ましくはＴまたはＲであり；
位置Ｘ１またはＸ３のうちの少なくとも一方はＨ、Ｋ、ＲまたはＴ残基により置換されている。
【００８５】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１もしくは３または配列番号５〜１０の番号付けに従った以下の変異Ａ４０Ｈ、Ａ４０Ｒ、Ｖ４２Ｔおよび／またはＱ１１０Ｈのうちの１つ以上を有するクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００８６】
さらなる態様では、本発明は、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼをコードする単離されたポリ核酸分子に関する。
【００８７】
本発明のさらなる態様では、上記のようなクピン−ニトロアルドラーゼをコードする単離されたポリ核酸分子が提供される。ポリ核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。従って、上記のような本発明のクピン−ニトロアルドラーゼをコードすることになる改変は、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで行われる。この単離されたポリ核酸分子は、上記のような本発明のクピン−ニトロアルドラーゼの大規模生産に好適である。
【００８８】
さらなる態様では、本発明は、上記のような単離されたＤＮＡ分子を含むベクターに関する。
【００８９】
ベクターは、効率的なトランスフェクションならびに効率的なタンパク質発現に必要な調節要素を全て含む。このようなベクターは当技術分野において周知であり、この目的のために任意の好適なベクターを選択できる。
【００９０】
本発明のさらなる態様は、上記のような本発明のベクターでトランスフェクトされている組換え非ヒト細胞に関する。細胞のトランスフェクションおよび組換え細胞の培養は、当技術分野において周知のように実施できる。このような組換え細胞ならびにそれらに由来する任意の子孫細胞は上記ベクターを含む。従って、ベクターに依存して連続的または活性化時に本発明のクピン−ニトロアルドラーゼタンパク質を発現する細胞株が提供される。
【００９１】
さらなる態様では、本発明は、上記のような組換え細胞を培養することによって得られる培養物に関する。
【００９２】
組換え細胞は、金属イオンの存在下で、好ましくは鉄またはマンガンの存在下で、培養されてよい。
【００９３】
さらなる態様では、本発明は、上記のような培養物から回収されたクピン−ニトロアルドラーゼに関する。具体的には、タンパク質は、細胞を破砕して上清からタンパク質を回収することによって単離され得る。
【００９４】
さらなる態様では、本発明は、クピン−ニトロアルドラーゼを生産するための方法であって、上記のような培養物からクピン−ニトロアルドラーゼを回収することを含む方法に関する。細胞培養物からの上記単離または精製は、当技術分野において公知の方法によって実施できる。具体的には、アフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して上記タンパク質を単離できる。
【００９５】
さらなる態様では、本発明は、当技術分野で公知の方法によって緩衝液中の金属塩（例えばＦｅＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＮｉＣｌ２、ＣｕＣｌ２またはＺｎＣｌ２）の溶液と共にインキュベートされている、上記のように生産されたクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００９６】
さらなる態様では、本発明は、当技術分野で公知の方法によって金属がインビトロでマンガン、鉄、ニッケル、コバルト、銅または亜鉛に交換されている、上記のように生産されたクピン−ニトロアルドラーゼに関する。
【００９７】
実施例
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために記載されているが、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また、限定するものと解釈されるべきでない。実施例には、従来の方法（例えばクローニング、トランスフェクション、および微生物宿主細胞におけるタンパク質の過剰発現のための方法の基本的態様）の詳細な説明は含まれない。このような方法は当業者に周知である。
【００９８】
実施例１：タンパク質生産
Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ５１１９６由来の仮想タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｃ１Ｆ９５１，  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  （２００９）  ７５，  ２０４６）をコードする遺伝子（ｇｅｎｅ  ＩＤ：ＮＣ＿０１２４８３）は、Ｅ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化して注文した（ＧｅｎｅＡｒｔ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）（以下ではＡｃＨＮＬと呼称）。コード領域はＮｄｅＩ制限部位とＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に挟まれており、これらの制限部位は、発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，  Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，  Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）に上記遺伝子をクローニングするために使用された。
【００９９】
Ｅ．ｃｏｌｉ用にコドン最適化されている、Ｇｒａｎｕｌｉｃｅｌｌａ  ｔｕｎｄｒｉｃｕｌａ由来のＧｔＨＮＬに相当するＡｃｉＸ９＿０５６２（ｇｅｎｅ  ＩＤ：３２２４３４２０１）をコードする配列は、以前に発現ベクターｐＥＴ２６ｂ（＋）にクローニングされていた（Ｈａｊｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２０１３  ２８０（２２）：５８１５−２８）。ＧｔＨＮＬは、半合理的なタンパク質設計（より詳細には部位飽和変異導入（ｓｉｔｅ−ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ））のためのテンプレートとして使用された。変異Ａ４０Ｈ、Ｖ４２ＴおよびＱ１１０Ｈは、改善した変異体をもたらした。部位特異的変異導入によって位置Ａ４０、Ｖ４２およびＱ１１０における最良のアミノ酸交換を組み合わせた。その後、位置Ａ４０、Ｖ４２およびＱ１１０における同一のアミノ酸交換を部位特異的変異導入によってＡｃＨＮＬの配列にも導入した。
【０１００】
発現宿主としてＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）を使用した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）。硫酸カナマイシン（終濃度４０ｍｇ／Ｌ）を添加したＬＢ（溶原ブロス、Ｌｅｎｎｏｘ）培地（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ，  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，ドイツ）中で細胞を増殖させた。ＯＤ６００が約０．８の培養物に０．５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を添加することにより組換えタンパク質の発現を開始させ、２５℃にて２０時間、培養を続けた。全ての酵素は、マンガンが発現培地中に存在する状態で産生させた。必ず、１００μＭのＭｎＣｌ２を誘導と同時に添加した。細胞を回収して、冷緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．０）中に再懸濁し、氷上で冷却しながら３分間を２回の超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｓ−２５０、８０％負荷サイクルおよび出力制御７に設定）により破砕した。細胞ライセートを５０，０００ｇで１時間遠心分離して、破砕されていない細胞および不溶性物質を除去した。無細胞ライセートを０．４５μｍのシリンジフィルターでろ過し、必要であれば、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ（分子量カットオフ１０，０００Ｄａ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して所望の濃度まで濃縮した。ライセートを等分し、さらなる使用まで凍結した。タンパク質の発現は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥによって観察した。ＡｃＨＮＬおよびＧｔＨＮＬ、ならびにアミノ酸置換Ａ４０Ｈ、Ａ４０Ｒ、Ｖ４２ＴおよびＱ１１０Ｈを含むＧｔＨＮＬおよびＡｃＨＮＬの変異体は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）において可溶性タンパク質として高産生量で発現し、総可溶性タンパク質の５０％超という産生量に達した。
【０１０１】
精製手順については、ＧｔＨＮＬに関して公開されたプロトコルを、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを適用して改変した（Ｈａｊｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。要するに、緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ６．８または６．９、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で細胞を超音波処理で溶解させ、清澄化したライセートをＱＳｅｐｈａｒｏｓｅ陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐＴＭ  Ｑ  ＦＦ  ５  ｍＬ，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）にロードした。１０％の緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ６．６、１Ｍ  ＮａＣｌ）でタンパク質を溶出させた。５０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌで予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＨｉＬｏａｄ  １６／６００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）上でサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。目的のタンパク質を含む画分をプールし、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン）上で緩衝液を５０ｍＭ  ＫＰｉ、ｐＨ６．０に交換した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて無細胞ライセートのタンパク質濃度を通常通りに決定した。Ｐｒｏｔｐａｒａｍを用いてアミノ酸配列に基づいて算出した吸光係数を適用し、２８０ｎｍにてＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（モデル２０００ｃ，  Ｐｅｑｌａｂ，  Ｅｒｌａｎｇｅｎ，ドイツ）を用いて精製タンパク質の濃度を決定した。タンパク質は、さらなる使用まで−８０℃または−２０℃で保存した。取り込みの成功は、誘導結合プラズマ／発光分光法（ＩＣＰ／ＯＥＳ）によって確認した。
【０１０２】
実施例２：二相系におけるニトロアルドール反応
有機相としてのＭＴＢＥに溶解させたベンズアルデヒドおよびニトロメタンならびにｐＨ６のリン酸緩衝液中の無細胞ライセートまたは精製酵素を含む水相からなる二相系を用いて、これらの酵素がβ−ニトロアルコールの合成を触媒する能力を調べた。
【０１０３】
内部標準（０．２％  １，３，５−トリイソプロピルベンゼン、ＩＳ）、ベンズアルデヒド（２０μｍｏｌ、ＢＡ）およびニトロメタン（１ｍｍｏｌ、ＮＭ）を含む有機溶媒（５００μｌ  ＭＴＢＥ）を、無細胞ライセート（約５０％でクピン−ニトロアルドラーゼを含む約０．５〜３ｍｇの総タンパク質）または精製酵素（約０．３〜１．５ｍｇ）のいずれかを含むｐＨ６の５０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液５００μｌと混合した。陰性対照として、酵素を含まない無細胞ライセート、ＭｎＣｌ２非存在下で発現させたＡｃＨＮＬ、またはＭｎＣｌ２を含む、および含まない緩衝液のみ、のいずれかを使用した。合成遺伝子として注文してｐＥＴ２８ａ（＋）ベクターにクローニングしたＡｔＨＮＬであってＡｓａｎｏのグループ（Ｆｕｈｓｈｕｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）により説明されるように発現および精製したＡｔＨＮＬ（２〜３ｍｇ）を陽性対照として使用した。低ｐＨにおけるＡｔＨＮＬの安定性の問題を理由にＡｔＨＮＬをｐＨ６．５で適用したことに留意されたい。エッペンドルフサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ）装置において３０℃で１２００ｒｐｍにて２〜２４時間、混合物をインキュベートした。１３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって反応を停止させた。４５０μｌのＨＰＬＣ溶媒混合物で有機相５０μＬを希釈し、キラルＨＰＬＣによって分析した。
【０１０４】
ベンズアルデヒドおよびニトロメタンを用いた最初のクピン−ニトロアルドラーゼにより触媒されるヘンリー反応の結果を図２および表１に示す。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
ＡｃＨＮＬは、６時間のインキュベーションの後に１９％という変換率および８８％というｅｅを示した。ＧｔＨＮＬ−Ａ４０Ｈ／Ｖ４２Ｔ／Ｑ１１０Ｈは、ほぼ７０％という変換率および９７％というｅｅを達成した。清澄化したライセートまたは精製酵素を適用した場合に差異は観察されなかった。従って、精製酵素は、適用された反応条件下で安定であるが、他方では、良好〜優秀なｅｅの値を得るために精製される必要はない。全ての陰性対照（ＭｎＣｌ２非存在下で発現させたＡｃＨＮＬならびに緩衝液中に適用されたＭｎＣｌ２または酵素を含まないＥ．ｃｏｌｉのライセート中に適用されたＭｎＣｌ２）は不活性であった。従って、クピンタンパク質およびマンガンの両方がニトロアルドール活性のために組み合わせで必要である。
【０１０７】
より少ない量の酵素でも良好な変換率を達成できるかどうか、より短い反応時間を適用してｅｅをさらに改善できるかどうか、および、より長いインキュベーション時間の間にｅｅが安定であるかどうかをさらに調べるために、ＧｔＨＮＬ−Ａ４０Ｈ／Ｖ４２Ｔ／Ｑ１１０Ｈを用いた反応を繰り返した（図３および表２）。
【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
ＡｔＨＮＬについての文献（Ｆｕｈｓｈｕｋｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）で報告された値および我々によっても決定された値と比較すると、新たに見出された上記のＧｔＨＮＬ三重変異体は、ＡｔＨＮＬよりも活性が高く、より高いエナンチオ選択性を示す。
【０１１０】
重要なことに、ＡｔＨＮＬとは対照的に、ＧｔＨＮＬ−Ａ４０Ｈ／Ｖ４２Ｔ／Ｑ１１０Ｈを用いれば、より長いインキュベーション時間によってエナンチオ選択性をほとんど失わずにより高い収率を達成できる。
【０１１１】
ＡｃＨＮＬおよびＧｔＨＮＬの単一変異体を、それらがニトロアルドール反応を触媒する能力について試験した。
【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
実施例３：ベンズアルデヒドへのニトロエタンの付加
精製したＡｃＨＮＬ、ＡｃＨＮＬ−Ａ４０Ｈ、ＡｃＨＮＬ−Ａ４０Ｒ、ＡｃＨＮＬ−Ａ４０Ｈ／Ｖ４２Ｔ／Ｑ１１０Ｈ、ＧｔＨＮＬ−Ａ４０ＲおよびＧｔＨＮＬ−Ａ４０Ｈ／Ｖ４２Ｔ／Ｑ１１０Ｈを、それらがニトロアルドール反応においてニトロメタンの代わりにニトロエタンを利用する能力について試験した。ニトロメタンの代わりに１ｍｍｏｌのニトロエタンを使用したことを除き、実施例２に記載されるように反応を実施した。
【０１１４】
ベンズアルデヒドおよびニトロエタンと共に精製酵素を用いた最初のクピン−ニトロアルドラーゼにより触媒されるヘンリー反応の結果を図４および表４に示す。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
ベンズアルデヒドへのニトロエタンの付加は同時に２つの新たな立体中心をもたらし、２−ニトロ−１−フェニルプロパノールのジアステレオマー混合物が得られた。２時間の反応時間の後、ＡｃＨＮＬのアンチ／シン比率は２：１であり、アンチ異性体のエナンチオマー過剰率は８５％であった。従って、生成物の混合物は、予想される主要生成物である（１Ｒ，２Ｓ）−２−ニトロ−１−フェニルプロパノールを約６０％含む。単一変異体ＡｃＨＮＬ−Ａ４０Ｈでは、（１Ｒ，２Ｓ）−２−ニトロ−１−フェニルプロパノールの割合が７０％までさらに増加した。
【０１１７】
実施例４：様々なアルデヒドへのニトロメタンの付加
２−Ｃｌ−ベンズアルデヒド、ヘキサナールまたはシクロヘキサンカルボキシアルデヒドのいずれかをベンズアルデヒドの代わりに使用するように改変して、実施例２に記載されるように反応を実施した。
【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
反応条件：ＴＢＭＥおよび５０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ６．０、１：１）からなる二相系中のアルデヒド（２０ｍＭ）およびニトロメタン（１Ｍ）、反応容積１ｍＬ、３０℃、１２００ｒｐｍ、２４時間。精製酵素（２．５ｍｇ）を使用した。
【０１２０】
実施例５：ニトロアルドール反応の金属依存性
ＧｔＨＮＬ−Ａ４０Ｈ／Ｖ４２Ｔ／Ｑ１１０Ｈから金属イオンを除去するために、（実施例１に記載されるような）精製タンパク質を、１００ｍＭの酢酸ナトリウムおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ５．５）中の２０ｍＭ  ２，４−ピリジンジカルボン酸一水和物（ＰＤＣＡ）に対して５０時間透析し、その後に、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５）に対して２０時間透析した。得られたアポタンパク質を１０倍モル過剰のＦｅＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｏＣｌ２、ＮｉＣｌ２またはＺｎＣｌ２のいずれか共に室温で２．５時間インキュベートした。ＰＤ−１０カラムを使用して、結合していない金属を除去し、および緩衝液を５０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ６．０）に交換した。金属分析をＩＣＰ−ＯＥＳにより実施した。
【０１２１】
実施例２に記載されるように反応を実施した。
【０１２２】
【表６】
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【０１２３】
実施例６：ニトロアルドール活性を有する他のクピン−ＨＮＬ
配列番号１および３に対して５８〜８４％の配列同一性を有する、いくつかの他のクピン（Ｗｉｅｄｎｅｒ，  Ｒ．；  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊ．，  （２０１４），  １０，  ５８）を、それらがニトロアルドール反応を触媒する能力について試験した。タンパク質の発現および無細胞ライセートの調製は、実施例１に記載されるように実施した。
【０１２４】
【表７】
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【０１２５】
実施例２に記載されるように反応を実施した。
【０１２６】
【表８】
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【０１２７】
実施例７：水溶液系におけるニトロアルドール反応
ｐＨ６の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液５００μｌ中のベンズアルデヒド５μｍｏｌ、ニトロメタン０．３ｍｍｏｌ、および総ライセートタンパク質（約５０％でクピン−ニトロアルドラーゼを含む）０．３７５ｍｇまたは精製タンパク質０．５ｍｇからなる単相の水溶液系を用いて、クピン−ニトロアルドラーゼがβ−ニトロアルコールの合成を触媒する能力を調べた。３０℃で１２００ｒｐｍにて１時間のインキュベーションの後、０．２％の内部標準（１，３，５−トリイソプロピルベンゼン、ＩＳ）を含む５００μＬのＭＴＢＥで抽出することにより反応を停止させた。４５０μＬのＨＰＬＣ溶媒混合物で有機相５０μＬを希釈し、キラルＨＰＬＣによって分析した。
【０１２８】
ベンズアルデヒドおよびニトロメタンを用いた水溶液系における最初のクピン−ニトロアルドラーゼにより触媒されるヘンリー反応の結果を表９に示す。
【０１２９】
【表９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【配列表】
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