(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を酵素で処理し溶解する工程を有し、該工程の後に、酵素を失活させる工程を有する、エンドトキシン測定のための前処理方法であって、
酵素で処理した後の溶液が均一に溶解している、エンドトキシン測定のための前処理方法。
【請求項２】
酵素を失活させる工程において溶液の温度を上昇させて酵素を失活させる請求項１記載のエンドトキシン測定のための前処理方法。
【請求項３】
酵素がタンパク質分解酵素である請求項１又は２記載のエンドトキシン測定のための前処理方法。
【請求項４】
エンドトキシン量を測定しようとする生体適合性材料をタンパク質分解酵素で処理し、該生体適合性材料が溶媒に溶解した溶液を得る工程を有し、該工程の後に、該溶液を加熱し該酵素を失活させる工程を有する、エンドトキシン測定のための前処理方法。
【請求項５】
酵素で処理した後の溶液が均一に溶解している請求項４記載のエンドトキシン測定のための前処理方法。
【請求項６】
試料が生体適合性材料である請求項１〜３の何れか１項に記載のエンドトキシン測定のための前処理方法。
【請求項７】
生体適合性材料が脱細胞化組織である請求項４〜６に記載のエンドトキシン測定のための前処理方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載のエンドトキシン測定のための前処理方法を行ったエンドトキシン測定用試料。
【請求項９】
エンドトキシンが安定化している請求項８記載のエンドトキシン測定用試料。
【請求項１０】
請求項１〜７の何れか１項に記載のエンドトキシン測定のための前処理方法により前処理を行った後に、エンドトキシン測定を行う、エンドトキシンの測定方法。
【請求項１１】
エンドトキシン測定がリムルステストによって行われる請求項１０記載のエンドトキシンの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンを測定するための前処理方法及び該前処理方法を行ったエンドトキシン測定用試料、さらにはエンドトキシンの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、内毒素ともいわれている。グラム陰性菌は動物の腸内や皮膚表面、植物表面等に定常的に存在するに留まらず、埃等に付着して空気中を浮遊しており、同菌の死滅や菌体の分裂により、エンドトキシンは放出されることになる。
【０００３】
このエンドトキシンは免疫反応の誘導、サイトカイン生産の誘導等、種々の生物活性を有しており、人の血液中に侵入したときには、発熱、炎症、さらにはショック死等を引き起こすという問題がある。そのため、医薬品や血液に直接接触する医療器具等がエンドトキシンで汚染された場合、ごく微量でも重篤な結果を招くことがあり、これらのエンドトキシン汚染量は厳密に管理されなければならない。
【０００４】
エンドトキシンを測定する方法としては、ウサギ発熱性試験、鶏胚致死試験、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ等がある。それらに比べて鋭敏で操作が簡易かつ迅速な測定方法としてカブトガニ血球由来成分であるリムルス試薬（Limulus Amebocyte Lysate）を利用したリムルステストが広く行われている（特許文献１、２）。
【０００５】
リムルステストとはリムルス試薬（LAL試薬）にエンドトキシンを含む水溶液を加えると同溶液が凝固する性質を応用した試験法で、１９８８年には日本薬局方にエンドトキシン試験法として収載されている。また２０１１年には日米欧の３薬局方の国際調和合意に基づいた改正がなされている。このリムルステストとしては、ゲル化法（ゲル化転倒法）、比濁法（比濁時間分析法、非特許文献２）、合成基質法（比色法、非特許文献３）等が実施されており、特に、そのための分析試薬や分析装置が市販されている比濁時間分析法が広く実施されている。
【０００６】
これらのリムルステストにおいては、エンドトキシン量を測定しようとする試料に含まれるエンドトキシンの全量を水溶液とする必要がある。例えば医薬品であれば水に溶解し水溶液とし、水に溶解しないガラスや金属性の医療器具に付着するエンドトキシン量を測定する場合は、これらの器具を水に浸し、含まれるエンドトキシンを均一に水中に移さなければ、正確なエンドトキシン量を測定したことにならない。そのため、水に溶解しにくい医薬品や、器具の表面や内部に付着するエンドトキシンを均一に水に溶解させるために、超音波を使用する超音波抽出法や、Vortex処理法等が行われている。
【０００７】
一方、近年、生体適合性材料を使用した医療材料が利用されるようになっている。特に、他人又は他種の動物の組織を移植する場合の拒絶反応を低減するために、生体由来組織から細胞を除去する脱細胞化処理を施した、脱細胞化組織を利用した脱細胞化材料が開発されている。例えば脱細胞化の方法としては、界面活性剤を使用する方法（特許文献３、４）、酵素を使用する方法（特許文献５）、酸化剤を使用する方法（特許文献６）、高静水圧処理による方法（特許文献７〜９）、凍結融解処理による方法（特許文献１０、１１）、高張電解質溶液で処理する方法（特許文献１２）等が知られており、脱細胞化組織は、皮膚（特許文献１０、１１）、角膜（特許文献８）、血管（特許文献１３、１４）等への応用が提案されている。
【０００８】
これら脱細胞化材料等の生体由来材料は、コラーゲン等の、水に難溶性又は不溶性の成分を主成分とするため、これらに含まれるエンドトキシン量を測定しようとする場合、測定水溶液に、試料表面に存在するエンドトキシンしか溶出せず、試料内部にエンドトキシンが残り、試料中に存在するエンドトキシンの全量を溶出させることができず、そのため、試料中に存在するエンドトキシンの全量を正確に測定できないという問題があった。
【０００９】
またエンドトキシンの測定において、エンドトキシンが測定試料中で不安定化した場合は、測定時に行う添加回収試験が適切に実施できないという問題があり、測定試料中のエンドトキシンは安定化している必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開昭５９−４２４５１号公報
【特許文献２】特開平８−２１１０６３号公報
【特許文献３】特開昭６０−５０１５４０号公報
【特許文献４】特表２００３−５１８９８１号公報
【特許文献５】特表２００２−５０７９０７号公報
【特許文献６】特表２００３−５２５０６２号公報
【特許文献７】特開２００４−０９７５５２号公報
【特許文献８】国際公開第２００８／１１１５３０号パンフレット
【特許文献９】特表２０１３−５０２２７５号公報
【特許文献１０】特開２００５−１８５５０７号公報
【特許文献１１】特開２００５−２１１４８０号公報
【特許文献１２】特開２０１０−２２１０１２号公報
【特許文献１３】特開２０１３−５０３６９６号公報
【特許文献１４】国際公開第２０１４／１０９１８５号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，７８：１３８−１４８（１９７１）
【非特許文献２】薬学雑誌，１０５：３００−３０３（１９８５）
【非特許文献３】Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４８：５５０−５５５（１９８４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って本発明の目的は、エンドトキシン量を正確に測定するための前処理方法を提供することにある。また本発明の目的は、特に生体適合性材料中のエンドトキシン量を正確に測定するための前処理方法を提供することにある。また本発明の目的は、該前処理方法を行った、正確なエンドトキシン量を測定できるエンドトキシン測定用試料を提供することにある。また本発明の目的は、該前処理方法後に測定を行う、正確なエンドトキシン量を測定できるエンドトキシンの測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、試料を酵素で処理し溶解する工程を有し、該工程の後に、酵素を失活させる工程を有する、エンドトキシン測定のための前処理方法を提供するものである。
また本発明は、酵素を失活させる工程において溶液の温度を上昇させて酵素を失活させる、前記のエンドトキシン測定のための前処理方法を提供するものである。
また本発明は、酵素がタンパク質分解酵素である前記のエンドトキシン測定のための前処理方法を提供するものである。
また本発明は、酵素で処理した後の溶液が均一に溶解している前記のエンドトキシン測定のための前処理方法を提供するものである。
また本発明は、試料が生体適合性材料である前記のエンドトキシン測定のための前処理方法を提供するものである。
また本発明は、生体適合性材料が脱細胞化組織である前記のエンドトキシン測定のための前処理方法を提供するものである。
【００１４】
また本発明は、前記のエンドトキシン測定のための前処理方法を行ったエンドトキシン測定用試料を提供するものである。
また本発明は、エンドトキシンが安定化している前記のエンドトキシン測定用試料を提供するものである。
また本発明は、前記のエンドトキシン測定のための前処理方法により前処理を行った後に、エンドトキシン測定を行う、エンドトキシンの測定方法を提供するものである。
また本発明は、エンドトキシン測定がリムルステストによって行われる前記のエンドトキシンの測定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、試料中、特に生体適合性材料中のエンドトキシン量を正確に測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
まず本発明のエンドトキシン測定のための前処理方法（以下、単に本発明の前処理方法ともいう）が行われる試料について説明する。
本発明の前処理方法は、エンドトキシン量を測定しようとする試料に対して行われる。試料は、エンドトキシン量を測定しようとする試料であれば特に限定されないが、エンドトキシン量を正確に測定できることから、生体適合性材料が好ましい。生体適合性材料の他には、ペプチド医薬品、タンパク質医薬品等の医薬品、食品、飲料等も試料として用いることができる。
【００１７】
生体適合性材料とは、移植や治療等の医療行為で生体に使用した場合に、著しく有害な影響を及ぼさない材料のことをいい、ポリエチレングリコールやポリウレタン、Ｌ−ラクチド／ε―カプロラクトン共重合体等の合成高分子や、生物由来材料が挙げられる。生物由来材料の「生物由来」とは「動物由来」を指し、好ましくは、「脊椎動物由来」を指す。生物由来材料は、生物の生体由来の組織（「生体由来組織」又は「生体組織」とも称する）が好ましく、ヒトに対する医療用途に使用されることより、正確なエンドトキシン量の測定が必要な「哺乳類の生体組織」又は「鳥類由来の生体組織」が特に好ましい。また入手の容易さから医療用途に使用されやすい、哺乳類の家畜、鳥類の家畜又はヒト由来の生体組織が好ましい。哺乳類の家畜としては、ウシ、ウマ、ラクダ、リャマ、ロバ、ヤク、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、アルパカ、イヌ、タヌキ、イタチ、キツネ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス、リス、アライグマ等が挙げられる。また、鳥類の家畜としては、インコ、オウム、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ガチョウ、ホロホロ鳥、キジ、ダチョウ、ウズラ等が挙げられる。これらの中でも、生体適合性材料としては、ウシ、ブタ、ウマ又はヒト由来の生体組織が好ましく、入手し易く、安全性の観点から、ブタ由来の生体組織がより好ましい。
【００１８】
生体組織の部位としては、水に難溶性又は不溶性なことよりエンドトキシン量の測定時に水溶液とすることが困難である、タンパク質や糖タンパク質（例えばコラーゲンやプロテオグリカン等）等で構成されている部位が好ましく、このような部位としては、例えば、肝臓、腎臓、尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃、食道、胃、小腸、大腸、腸管、肛門、膵臓、心臓、血管、脾臓、肺、脳、骨、脊髄、軟骨、精巣、子宮、卵管、卵巣、胎盤、角膜、骨格筋、腱、神経、皮膚、筋膜、心膜、硬膜、臍帯、心臓弁膜、角膜、羊膜、硬膜、腹膜（大網膜、小網膜）、横隔膜、粘膜下層、小腸粘膜下組織、その他コラーゲン含有組織が挙げられる。
【００１９】
生体適合性材料は、タンパク質を主成分として構成されているものが好ましく、コラーゲンを主成分として構成されているものがより好ましい。
また、人工コラーゲンや人工タンパク質等、人工的に製造したものも、生体適合性材料として挙げられる。
【００２０】
これらの生体適合性材料の中でも、脱細胞化処理した生体組織（「脱細胞化組織」とも称する）が特に好ましい。脱細胞化処理とは、細胞及び核酸成分等の抗原性の高い成分を除去する処理であり、この処理を行うことにより生体への移植組織として使用した場合に起こる拒絶反応を抑制することができる。そのため脱細胞化組織は、移植材料に好適に使用され、移植材料等の医療材料に使用される際に、材料にエンドトキシンが含まれていた場合、発熱、炎症、さらにはショック死等を引き起こすという問題があり、材料中のエンドトキシン量は正確に測定されなければならない。そのため、本発明の前処理方法及び測定方法を用いる対象として脱細胞化組織は好適である。
【００２１】
脱細胞化処理の方法は特に限定されず、従来公知の方法が挙げられる。脱細胞化処理の例を挙げると、物理的撹拌、超音波処理、凍結融解法、高静水圧法、高張液低張液法、アニオン性界面活性剤やノニオン性界面活性剤等による界面活性剤による処理、蛋白分解酵素や核酸分解酵素等による酵素処理、アルコール溶剤による処理等が挙げられ、これらの２種以上を組み合わせる場合もある。
【００２２】
次に、本発明の前処理方法の手順について説明する。本発明の前処理方法は、エンドトキシン量を測定しようとする試料、特に生体適合性材料に対して行われる。以下、生体適合性材料に対して行う場合を例に説明する。
【００２３】
本発明の前処理方法は、生体適合性材料の試料を、酵素で処理し溶解する工程、好ましくは水に溶解する工程を有することを特徴とする。生体適合性材料を溶解する水は、蒸留水又は純水が好ましい。
【００２４】
酵素は、生体適合性材料の溶解のし易さから、タンパク質分解酵素が好ましく、タンパク質分解酵素の例としては、プロテイナーゼＫ、キモトリプシン、トリプシン、スブチリシン等のセリンプロテアーゼ、ペプシン、カテペプシン等のアスパラギン酸プロテアーゼ（酸性プロテアーゼ）、サーモリシン等の金属プロテアーゼ、パパイン、カスパーゼ、ブロメライン等のシステインプロテアーゼが挙げられる。なかでも、生体適合性材料の溶解のし易さから、プロテイナーゼＫが好ましい。なお、タンパク質分解酵素以外では、例えば生体適合性材料がエステル結合を有する合成高分子の場合、エステラーゼ等を酵素として用いることもできる。酵素は、そのままの状態で使用する場合があり、水等の溶媒に溶解している溶液製剤の状態のものを使用する場合もある。溶液製剤には酵素を安定化するための安定剤やキレート剤等が含まれている場合もある。酵素は市販されているものを使用することができる。
【００２５】
本発明の前処理方法においては、生体適合性材料及び酵素を水等の溶媒中に加えることにより、生体適合性材料を酵素で処理することができる。例えば、酵素を水等の溶媒に溶解して酵素溶液を調製し、該酵素溶液に生体適合性材料を浸漬させることにより、生体適合性材料を酵素で処理することができる。酵素処理の際、使用する酵素の量は、生体適合性材料の０．１０ｇあたり、酵素溶液の状態で、０．０１ｍｌから１０ｍｌが好ましく、０．１ｍｌから５．０ｍｌがより好ましく、酵素溶液中の酵素の濃度は、３．０Ｕ／ｍｌから３００Ｕ／ｍｌが好ましく、６．０Ｕ／ｍｌから１８０Ｕ／ｍｌがより好ましい。
【００２６】
酵素処理する温度は、酵素の至適温度に依存するが、１０℃から６５℃が好ましく、３５℃から６５℃がより好ましく、４０℃から６０℃がより一層好ましい。酵素処理する時間は、生体適合性材料が溶解するまでの時間とすることができ、特に制限はないが、０．２時間から４８時間が好ましく、０．５時間から３６時間がより好ましく、１時間から２４時間がより一層好ましい。また、酵素処理中に、容器を密閉し振盪操作を行うことも好ましい。
【００２７】
酵素処理は、生体適合性材料中に含まれる正確なエンドトキシン量の測定のため、生体適合性材料が溶解するまで行い、好ましくは均一に溶解するまで行う。定法に従って温度、時間等の酵素処理条件を適宜選択することにより、生体適合性材料を溶解する（好ましくは均一に溶解する）ことができる。溶解状態は目視により判断することができる。
【００２８】
本発明の前処理方法においては、このようにして生体適合性材料を酵素で処理し溶解する工程を行うことにより、生体適合性材料が溶解した溶液を得ることができる。本発明の前処理方法は、かかる工程の後に、酵素を失活させる工程を有する。酵素処理した後の上記溶液を加熱し温度上昇させることで酵素を失活させる工程を有することが、より正確なエンドトキシン量が測定できるため好ましい。酵素を失活させる温度は、７５℃から１００℃が好ましく、７５℃から９０℃がより好ましく、７５℃から８５℃がより一層好ましい。失活処理時間は１分から６０分が好ましく、２分から３０分がより好ましく、５分から１５分がより一層好ましい。酵素の失活を、エタノール等の溶媒を加える失活方法、酸又はアルカリを加えてｐHを変化させる失活方法等で行った場合、リムルステストにおいて、リムルス試薬を滴下後にゲル化してしまい、添加回収試験が実施できないため、これらの失活方法は適さない。
【００２９】
本発明の前処理方法で処理された試料（前処理した溶液）は、エンドトキシン測定用試料として好適である。前処理した溶液は、そのまま又は水（蒸留水若しくは純水）で希釈して、エンドトキシンの測定に用いることができる。本発明の前処理方法で処理された試料中のエンドトキシンは安定化しているため好ましい。
【００３０】
エンドトキシンの測定方法としては、カブトガニ血球由来成分であるリムルス試薬を利用したリムルステストが好ましい。リムルステストには、ゲル化法（ゲル化転倒法）、比濁法（比濁時間分析法）、合成基質法（比色法）等が挙げられ、特に、比濁時間分析法が好ましい。
リムルステストに使用するリムルス試薬は市販のものが使用でき、また市販されているエンドトキシン測定用のキットや測定機器も使用できる。例えば、和光純薬工業株式会社製のエンドトキシン測定システムであるトキシノメーター等が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下の実施例及び比較例に用いられる蒸留水は、すべてエンドトキシンフリーであるものを使用した。また、使用した器具は、あらかじめオートクレーブ処理等を行って、エンドトキシンフリーとしたものである。
【００３２】
（使用試薬）
・ＥＴ溶液（エンドトキシン溶液）
コントロールスタンダードエンドトキシン（Ｌｉｍｕｌｕｓ ＥＳ−II Ｓｉｎｇｌｅ Ｔｅｓｔ ｗａｋｏ、和光純薬工業株式会社製、以下ＣＳＥと略記する）を蒸留水で希釈し、これを適宜希釈したものを使用した。
・Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液（プロテイナーゼＫ溶液）
６００Ｕ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＰＣＲＧｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ）を蒸留水で希釈し、これを適宜希釈したものを使用した。今回試験に使用したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液のエンドトキシン濃度の測定を行ったところ、検出限界値未満（０．００１４ＥＵ/ｍｌ未満）であった。この結果より、使用したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液に含まれるエンドトキシンは、本測定には影響しないことが分かった。尚、ＥＵとは、エンドトキシンユニットを指す。
【００３３】
〔実施例１〕
（生体適合性材料の測定試料の準備）
屠畜場からブタ大動脈を購入し、冷蔵で搬送した。このブタ大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（以下、内膜シート）と生理食塩水をポリエチンレン製バッグに入れてシールし、研究開発用高圧処理装置（（株）神戸製鋼所製：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）で１００〜１０００ＭＰａにて高静水圧処理を行った。処理したシートを核酸分解酵素含有洗浄液及びアルコール含有洗浄液により洗浄し、脱細胞化組織である脱細胞化ブタ大動脈シートを得た。
得られた脱細胞化ブタ大動脈シートから１ｃｍ×１ｃｍの試験片を２枚採取し、それぞれ重量を測定し、それぞれ２．０ｍｌマイクロチューブに入れた。マイクロチューブの１本は添加回収試験用サンプルとし、１本はエンドトキシン測定用サンプルとした。
【００３４】
（添加回収試験用サンプル溶液の調製）
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液をＥＴ溶液で希釈し、１２０Ｕ／ｍｌの０．１５ＥＵ／ｍｌ含有Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を１．０ｍｌ調製した。
添加回収試験用サンプルに、１２０Ｕ／ｍｌの０．１５ＥＵ／ｍｌ含有Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液１．０ｍｌを添加し、５０℃で３時間酵素処理し、脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させた。処理後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを、８０℃８分で失活させ、溶液を室温に戻した後、蒸留水を用いて１０倍希釈した。
【００３５】
（エンドトキシン測定用サンプル溶液の調製）
エンドトキシン測定用サンプルに、１２０Ｕ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を１．０ｍｌ添加し、５０℃で３時間酵素処理し、脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させた。処理後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを、８０℃８分で失活させ、溶液を室温に戻した後、蒸留水を用いて１０倍希釈した。
【００３６】
この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として用いて、下記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、下記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００３７】
＜エンドトキシン濃度の測定方法＞
和光純薬工業株式会社製トキシノメーター（ＥＴ−６０００／Ｊ）を用いて、比濁時間分析法の常法に従って、以下のようにエンドトキシン濃度の測定を行った。
すなわち、添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として、それぞれの２００μｌを、和光純薬工業株式会社製のＬｉｍｕｌｕｓ ＥＳ−２ Ｓｉｎｇｌｅ Ｔｅｓｔ ｗａｋｏ（ゲル化感度：０．０１５ＥＵ／ｍｌ)のリムルス試薬（凍結乾燥品。カブトガニ血球抽出物(ＡＬ)を含有する。）に添加し、数秒間攪拌し、混合液を得た後、３７℃保温下に、トキシノメーター（ＥＴ−６０００／Ｊ）を用いて、上記混合液の透過光量が、測定開始から５％減少するまでの時間（以下、Ｔｇと略記する。）を測定した。別に、蒸留水と濃度既知のエンドトキシン溶液を用いて同様の測定を行い、エンドトキシン濃度とＴｇとの関係を表す検量線を作成した。この検量線に基づいて、試料中のエンドトキシンの濃度を算出した。
【００３８】
＜添加回収率の算出方法＞
（添加回収試験用サンプル溶液のエンドトキシン量測定値（ＥＵ/ｍｌ）−エンドトキシン測定用サンプル溶液のエンドトキシン量測定値（ＥＵ/ｍｌ））／エンドトキシン測定用サンプル溶液のエンドトキシン含有量（０．０１５ＥＵ／ｍｌ）×１００＝添加回収率（％）
【００３９】
〔実施例２〕
０．１５ＥＵ／ｍｌ含有Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液による脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させるための酵素処理の時間を３時間から２２時間に変えた以外は、実施例１と同様の手順で添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を調製した。この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として用いて、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００４０】
〔実施例３〕
酵素処理し脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させるのに用いた０．１５ＥＵ／ｍｌ含有Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液の濃度が６０U／ｍｌであること以外は、実施例１と同様の手順で添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を調製した。この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として用いて、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００４１】
〔実施例４〕
０．１５ＥＵ／ｍｌ含有Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液による脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させるための酵素処理の時間を３時間から２２時間に変えた以外は、実施例３と同様の手順で添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として調製した。この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を用いて、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００４２】
〔実施例５〕
酵素処理し脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させるのに用いた０．１５ＥＵ／ｍｌ含有Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液及びＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液の濃度が１５Ｕ／ｍｌであること以外は、実施例１と同様の手順で添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を調製した。この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として用いて、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００４３】
〔実施例６〕
屠畜場からブタ大動脈を購入し、冷蔵で搬送した。このブタ大動脈を切り開いてシート状にした。以下実施例１と同様にして、脱細胞化した後、添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を調製した。この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として用いて、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００４４】
〔実施例７〕
屠畜場からブタ皮膚を購入し、冷蔵で搬送した。このブタ皮膚から、真皮層を含む組織を採取した。以下実施例１と同様にして、脱細胞化した後、添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を調製した。この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として用いて、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００４５】
〔実施例８〕
屠畜場からブタ心膜を購入し、冷蔵で搬送した。このブタ心膜から、脂肪組織を除去した。以下実施例１と同様にして、脱細胞化した後、添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を調製した。この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として用いて、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００４６】
〔実施例９〕
屠畜場からウシ心膜を購入し、冷蔵で搬送した。このウシ心膜から、脂肪組織を除去した。以下実施例１と同様にして、脱細胞化した後、添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を調製した。この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として用いて、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。
【００４７】
〔実施例１０〕
（使用試薬）
・ＥＴ溶液（エンドトキシン溶液）
ＣＳＥを蒸留水で希釈し、これを適宜希釈したものを使用した。
・Ｐａｐａｉｎ溶液（パパイン溶液）
Ｐａｐａｉｎ（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ、Ｒｏｃｈｅ）を蒸留水で希釈し、これを適宜希釈したものを使用した。
【００４８】
（生体適合性材料の測定試料の準備）
実施例１と同様の手順で作製した。
【００４９】
（添加回収試験用サンプル溶液の調製）
Ｐａｐａｉｎ溶液をＥＴ溶液で希釈し、３０Ｕ／ｍｌの０．１５ＥＵ／ｍｌ含有Ｐａｐａｉｎ溶液を１．０ｍｌ調製した。
添加回収試験用サンプルに、３０Ｕ／ｍｌの０．１５ＥＵ／ｍｌ含有Ｐａｐａｉｎ溶液１．０ｍｌを添加し、５０℃で１．５時間酵素処理し、脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させた。処理後、Ｐａｐａｉｎを、８０℃８分で失活させ、溶液を室温に戻した後、蒸留水を用いて１０倍希釈した。
【００５０】
（エンドトキシン測定用サンプル溶液の調製）
エンドトキシン測定用サンプルに、３０Ｕ／ｍｌのＰａｐａｉｎ溶液を１．０ｍｌ添加し、５０℃で１．５時間酵素処理し、脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させた。処理後、Ｐａｐａｉｎを、８０℃８分で失活させ、溶液を室温に戻した後、蒸留水を用いて１０倍希釈した。
【００５１】
この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として用いて、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。
釈した。
【００５２】
〔比較例１〕
（生体適合性材料の測定試料の準備）
実施例１と同様の手順で作製した。
【００５３】
（添加回収試験用サンプル溶液の調製）
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液をＥＴ溶液で希釈し、６０Ｕ／ｍｌの０．１５ＥＵ／ｍｌ含有Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を２．０ｍｌ調製した。
添加回収試験用サンプルに、６０Ｕ／ｍｌの０．１５ＥＵ／ｍｌ含有Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液１．０ｍｌを添加し、５０℃で３時間酵素処理し、脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させた。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋの失活処理をせず、溶液を室温に戻した後、蒸留水を用いて１０倍希釈した。
【００５４】
（エンドトキシン測定用サンプル溶液の調製）
エンドトキシン測定用サンプルに、６０Ｕ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液を１．０ｍｌ添加し、５０℃で３時間酵素処理し、脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させた。その後、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋの失活処理をせず、溶液を室温に戻した後、蒸留水を用いて１０倍希釈した。
この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を試料として用いて、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。この結果より、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋの失活処理をしない場合、添加回収率は２００％を大きく超えてしまった。添加回収率は５０〜２００％の間でなければならないため（日本薬局方）、酵素の失活処理をしない方法は、分析方法として適さないことがわかる。
添加回収率が２００％を大きく超えてしまった理由は定かではないが、その理由のひとつとして、残存したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋがリムルス試薬のゲル化カスケードを開始させてしまったため、疑陽性を示したと考えられる。
【００５５】
〔比較例２〕
（使用試薬）
・ＥＴ溶液
ＣＳＥを蒸留水で希釈し、これを適宜希釈したものを使用した。
・ＮａＯＨ溶液
蒸留水に水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を溶解し、４０ｍｇ／ｍｌ（１．０規定）のＮａＯＨ溶液を調製した。これを適宜希釈したものを使用した。
・ＨＣｌ溶液
蒸留水で塩酸を希釈し、１８ｍｇ／ｍｌ（０．５規定）のＨＣｌ溶液を調製した。
【００５６】
（生体適合性材料の測定試料の準備）
屠畜場からブタ大動脈を購入し、冷蔵で搬送した。このブタ大動脈を切り開いて採取したシート状の内膜（以下、内膜シート）と生理食塩水をポリエチンレン製バッグに入れてシールし、研究開発用高圧処理装置（（株）神戸製鋼所製：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）で１００〜１０００ＭＰａにて高静水圧処理を行った。処理したシートを核酸分解酵素含有洗浄液及びアルコール含有洗浄液により洗浄し、脱細胞化組織である脱細胞化ブタ大動脈シートを得た。
脱細胞化ブタ大動脈シートから１ｃｍ×１ｃｍの試験片を２枚採取し、それぞれ重量を測定し、それぞれ２．０ｍｌマイクロチューブに入れた。１本は添加回収試験用サンプルとし、１本はエンドトキシン測定用サンプルとした。
【００５７】
（添加回収試験用サンプル溶液の調製）
ＮａＯＨ溶液をＥＴ溶液で希釈し、０．５規定の０．３０ＥＵ／ｍｌ含有ＮａＯＨ溶液を２．０ｍｌ調製した。
添加回収試験用サンプルに、０．５規定の０．３０ＥＵ／ｍｌ含有ＮａＯＨ溶液１．０ｍｌを添加し、４５℃で２２時間処理して、脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させた。
【００５８】
（エンドトキシン測定用サンプル溶液の調製）
エンドトキシン測定用サンプルに、０．５規定のＮａＯＨ溶液を１．０ｍｌ添加し、４５℃で２２時間処理して、脱細胞化組織の試験片を均一に溶解させた。
【００５９】
この添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を、それぞれＨＣｌ溶液で中和し、前記＜エンドトキシン濃度の測定方法＞によりエンドトキシン濃度の測定を行い、前記＜添加回収率の算出方法＞で添加回収率を算出した。結果を表１に示す。この結果より、ＮａＯＨ溶液で生体適合性材料である脱細胞化組織を溶解した場合、添加回収率が０％未満となることが分かった。添加回収率は５０〜２００％の間でなければならないため（日本薬局方）、水酸化ナトリウム等のアルカリを使用して生体適合性材料である脱細胞化組織を溶解させる方法は、分析方法として適さないことがわかる。添加回収率が０％未満となる理由は定かではないが、その理由のひとつとしては、水酸化ナトリウム溶液中のエンドトキシンは非常に不安定であり、２２時間処理することで、添加したエンドトキシン全量が不活化されたため、疑陰性を示したと考えられる。
【００６０】
〔比較例３〕
０．３０ＥＵ／ｍｌ含有ＮａＯＨ溶液による脱細胞化組織への処理時間を１分間に変更し、比較例２と同様の手順で添加回収試験用サンプル溶液とエンドトキシン測定用サンプル溶液を調製した。
添加回収試験用サンプル溶液、エンドトキシン測定用サンプル溶液とも、脱細胞化組織の試験片は均一に溶解せず溶け残りがあったため、脱細胞化組織溶解時のエンドトキシン濃度を測定することができなかった。
【００６１】
【表１】
0006712160.tif 000002