(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスと、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａの配列を有する２種類のトリペプチドを有効成分として含有するコラーゲン産生促進用組成物であって、
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部あたりＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａの配列を有する２種類のトリペプチドをあわせて１〜２００質量部含有するコラーゲン産生促進用組成物。
【請求項２】
バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体のコラーゲン産生を促進するための新規な組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは線維芽細胞から細胞外に分泌されるタンパク質である。コラーゲンは、生体における種々の結合組織に、力学的な強度を与えるのに役立っており、腱の主成分はコラーゲン繊維がきちんとすきまなく配列したもので、非常に強い力に耐える。また、皮膚においては、真皮の乾燥重量のうち約７０％をコラーゲンが占めているといわれ、皮膚の弾力性や柔軟性を維持するのに重要な役割を果たしている。また、コラーゲンがそれに接する細胞に対して、増殖、分化シグナルを与えるための情報伝達の働きも担っていることがわかってきている。コラーゲンには種々のタイプが存在することが知られており、３０種以上のタイプが報告されている。中でもコラーゲンの線維性を構成する基本のタイプがＩ型コラーゲンであり、生体の主要構成成分である。脊椎動物では８５％〜９０％と最も大量に存在するコラーゲンであり、骨に大量に含まれ、骨に弾力性を持たせる働きをしている。また皮膚の真皮にも非常に多く、Ｉ型コラーゲンの太い線維によって皮膚の強さを生み出す働きがある。
近年、皮膚の弾力性や、シワの改善を目的としてコラーゲンやコラーゲンの加水分解物を経口摂取することが行われており、「美容ドリンク」や「美肌飲料」などの名称でコラーゲンやコラーゲンの加水分解物を含む飲料が市販されている。これらの飲料は、１回あたりコラーゲン換算で９００〜１００００ｍｇを摂取することが効果的であるといわれている。
経口摂取したコラーゲンやコラーゲンペプチドがどのような作用機序で皮膚の弾力性やシワの改善に働くのか、詳細な機構は明らかになっていないが、一部のコラーゲンペプチドが、コラーゲンを経口摂取すると血液中に出現することが知られている。そしてそのコラーゲンペプチドが線維芽細胞のＩ型コラーゲンの産生を促進することも知られている。
【０００３】
特許文献１には、コラーゲンをコラゲナーゼで酵素分解した際に得られるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐの構造を有するトリペプチド（コラーゲントリペプチド）が生体コラーゲン合成促進作用を有し、これを含むコラーゲン加水分解物をコラーゲン合成促進剤として利用する技術が記載されている。
特許文献２には、前記のコラーゲントリペプチドとフラボノイドの一種であるシリマリンとリンゴ抽出物が、コラーゲンと線維芽細胞を含むコラーゲンゲルを収縮させ、シワ改善に用いることができることが記載されている。
特許文献３には、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ、またはＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの構造を有するコラーゲン由来のペプチドがシリビンと相乗的にＩ型コラーゲンの産生を促進することが記載されている。
特許文献４では、コラーゲンを経口摂取した直後に血液中に出現する複数のトリペプチド又はジペプチドを合成して、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐのジペプチドまたはトリペプチドが培養マウス線維芽細胞に対してコラーゲン合成を促進することを確認して、その結果に基づき、皮膚コラーゲン産生促進剤として利用することを提案している。
特許文献５にはＧｌｙ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｈｙｐのいずれかの配列を有するジペプチドを有効成分とするコラーゲン産生促進剤が記載されている。
このように、これまでの研究開発から、コラーゲンタンパク質の加水分解物やコラーゲンペプチド、アミノ酸など多くの物質がコラーゲン産生促進作用を有することが明らかとなっており、引き続き有用な物質の探索が行われている。
【０００４】
一方、バラ科バラ属の植物の花弁又はつぼみのエキスに様々な作用が見いだされている。そして、これを化粧品や健康食品に配合できることも知られている。特許文献６には、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる少なくとも１種のバラ科バラ属の植物のつぼみ又は花弁を水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られた抽出物を有効成分とする抗菌作用組成物や飲食品が記載されている。
特許文献７には、特許文献６と同様の抽出物であって、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる少なくとも１種のバラ科植物のつぼみ又は花弁を水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られた抽出物が記載されている。そして、この抽出物に抗インフルエンザウィルス作用を見いだし、これを有効成分とする抗インフルエンザウィルス剤及びこれを配合した飲食品の発明が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３８０２７２１号公報
【特許文献２】特許第５５７２４０６号公報
【特許文献３】特許第４０３３８７７号公報
【特許文献４】特許第４９９５１５５号公報
【特許文献５】特開２０１６−１６９１９９号公報
【特許文献６】特許第４６３３２２６号公報
【特許文献７】特開２００２−１４５７９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、コラーゲンペプチドのコラーゲン産生促進機能の増強に注目している。そしてコラーゲンペプチドにバラツボミエキスを併用するとコラーゲンペプチドのコラーゲン産生能が向上することをすでに確認している。
本発明は、コラーゲンペプチドに含有されているトリペプチドであるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（以下「ＧＰＯ」）及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（以下「ＧＰＡ」）とバラ科バラ属の植物の花弁及び／またはつぼみのエキスを併用すると、極めて強いコラーゲン産生促進作用を発揮することを見出したことからなされたものである。
すなわち、本発明は、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチドであるＧＰＯ及びＧＰＡを含有する新規な組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１) バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスと、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａの配列を有する２種類のトリペプチドを有効成分として含有するコラーゲン産生促進用組成物。
（２）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部あたりＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａの配列を有する２種類のトリペプチドをあわせて１〜２００質量部含有する（１）に記載の組成物。
（３）バラ科バラ属の植物が、ガリカローズ、ドッグローズ、アポテカリーズローズ、スイートブライヤー、ダマスクバラ、セイヨウバラ及びハマナシから選ばれる１種以上である（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスが水、親水性有機溶媒又はこれらの混合液により抽出処理して得られたエキスである（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の組成物は、生体コラーゲン産生を促進する作用を有している。そして本発明の組成物は、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスの示すコラーゲン産生促進作用及び、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａの配列を有する２種類のトリペプチドの示すコラーゲン産生促進作用が相乗的に作用し、両者の示すコラーゲン産生促進作用をはるかに超えた高いコラーゲン産生促進作用を発揮する。
またバラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスの有する抗菌性や抗ウイルス作用をあわせ持つため、感染症の防御や、感染予後体力回復のための飲食品としても使用可能である。さらにまた、本発明の組成物は、原料とする成分の食経験が長く、安全性が確認されているため、飲食品として経口で摂取することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】バラつぼみエキスとＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（ＧＰＯ）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（ＧＰＡ）１：１混合物によるＩ型コラーゲン産生促進試験の結果を示すグラフである。
【図２】バラつぼみエキスＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（ＧＰＯ）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（ＧＰＡ）２：１混合物によるＩ型コラーゲン産生促進試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチドを含有するコラーゲン産生促進用組成物に関する。
本発明の組成物について説明する。
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみは、どのような品種から採取したものでもかまわないが、園芸種として大量に栽培されているものが産業上好ましい。このようなものとして特にガリカローズ（Ｒｏｓａ  ｇａｌｌｉｃａ）、ドッグローズ（Ｒｏｓａ  ｃａｎｉｎａ）、アポテカリーズローズ（Ｒｏｓａ  ｇａｌｌｉｃａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、スイートブライヤー（Ｒｏｓａ  ｒｕｂｉｇｉｎｏｓａ）、ダマスクバラ（Ｒｏｓａ  ｄａｍａｓｃｅｎａ  ｔｒｉｇｉｎｔｉｐｅｔａｌａ）、セイヨウバラ（Ｒｏｓａ  ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ）及びハマナシ（Ｒｏｓａ  ｒｕｇｏｓａｒｕｂｒａ）が好ましい。
【００１１】
例えば、バラ科バラ属の植物の花弁又はつぼみを生のまま又は乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。抽出に用いる溶媒としては、水又は親水性有機溶媒及びこれらの混合液を室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。具体的には、メタノール、エタノール等の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等の炭素数２〜４の多価アルコール、及びこれら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。なお、水と親水性有機溶媒との混合系溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜４０質量部、多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１０〜９０質量部添加することが好ましい。
【００１２】
この場合、抽出処理は、室温乃至還流加熱下で、任意の装置を用いて行うことができる。例えば、抽出溶媒を満たした処理槽にバラ科バラ属の植物のつぼみ（又は花弁）を投入し、必要に応じて時々攪拌しながら、３０分〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、濾過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を溜去し、乾燥することにより赤褐色のバラエキスが得られる。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９０℃で３０分〜２時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜２時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであればそのまま配合して本発明の有効成分として用いることができる。特許文献６には具体的な製造方法が開示されており、これにしたがって本発明に適したエキスを得ることができる。
【００１３】
このようにして得られるバラ科バラ属の植物のエキスは、原料に由来する好ましい風味を有しており、そのまま本発明に利用可能であるが、必要に応じて、脱色等を目的とする精製を施し、配合用途に応じて、アルコールその他の有機溶剤の溶液又は水溶液の形として利用することができる。
【００１４】
本発明に用いるバラ科バラ属の植物のエキスは、必要によりデキストリンやシクロデキストリンを添加して、噴霧乾燥などの乾燥手段で粉末化することもできる。
本発明に用いるバラ科バラ属の植物のエキスは、市販されているものを使用することができる。本発明に適した、バラのつぼみのエキスの噴霧乾燥品である丸善製薬株式会社製の「ローズバッツエキスパウダーＭＦ」を例示できる。
本発明に用いるバラ科バラ属の植物エキスは、ポリフェノールとして５質量％以上含有し、好ましくは１０〜８０質量％、特に好ましくは１０〜２０質量％含有するものである。
なお、本発明に用いるバラ科バラ属の植物のエキス量は、植物抽出物由来の固形分相当量を指す。
【００１５】
本発明に用いるトリペプチドは、コラーゲンの酵素加水分解によって得られるコラーゲンペプチド中に含有されているトリペプチドが好ましく、豚、ウシなどの動物由来、魚由来のいずれも使用可能である。また、合成品であっても良い。
本発明のトリペプチドのアミノ酸配列は、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａの両成分を含有する。
また、ＧＰＯ：ＧＰＡの比率が１：１〜３：１であるものが好ましいがこの限りではない。
【００１６】
本発明にあっては、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとトリペプチドの相乗作用によってコラーゲン産生を促進する。このような相乗効果を得るためには、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとコラーゲントリペプチド（ＧＰＯ及びＧＰＡの合計）の配合比は、バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキス１質量部に対し１〜３００質量部、好ましくは１〜２００質量部、特に好ましくは５〜１５０質量部を含有する組成物とする。
【００１７】
この組成物を飲食品に添加する場合、 添加量は、０．０１質量％以上、好ましくは０．５〜９５質量％、特に好ましくは５〜９０質量％である。医薬品とする場合、症状及び対象とする年齢や、体重、投与する剤形によって異なるため一義的に配合量を決定できない。
【００１８】
食品としては、通常の食品の他、栄養補助食品、機能性食品、健康食品、特定保健用食品等として、例えば、錠剤、カプセル、パウダー等のような形態が好ましい。その他、ジュースのような飲料、ゼリーに配合することもできる。  
【００１９】
医薬品用途において、投与に関しては、有効成分を経口投与、非経口摂取の場合、直腸内投与、注射等の投与方法に適した固体又は液体の医薬用無毒性担体と混合して、慣用の医薬製剤の形態で投与することができる。形態としては、例えば、粉末、散剤、顆粒、錠剤、カプセル等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。これらの製剤は常套手段により調製することが可能である。上記の医薬品用担体としては、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチレンデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤等の添加剤を適宜添加することも可能である。  
【実施例】
【００２０】
以下に本発明の組成物を用いたコラーゲン産生促進試験例及び比較試験例を示し、 本発明を具体的に説明する。
＜１．トリペプチドＧＰＯ及びＧＰＡの１：１混合物とバラつぼみエキスの併用効果確認試験＞
（１）試験試料（サンプル）
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとして、丸善製薬株式会社が販売
しているローズバッツエキスパウダーＭＦを用いた。またトリペプチドとして、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（ＧＰＯ）配列表配列番号１及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ（ＧＰＡ）配列表配列番号２を用いた。ＧＰＯ、ＧＰＡは化学合成品の試薬純度のものを用いた。
【００２１】
（２）試験方法
１）使用細胞
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ：ロンザジャパン株式会社)
【００２２】
２）細胞培養
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気の条件下で培養を行った。培地は非働化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース含有、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。以降、この培地を「基礎培地」と表記する。通常培養には１０ｃｍまたは１５ｃｍディッシュを用い、継代時の細胞剥離には０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。
【００２３】
（３）試験試料調製
試験試料は培地で溶解した。ＵＶＡ照射前は基礎培地を用い、ＵＶＡ照射後はＦＢＳ不含基礎培地を用いた。
試験試料の最終濃度
下記表１の濃度で試験を実施した。
【００２４】
（４）細胞の形態観察
添加による影響を確認するため形態観察を行った。形態観察には倒立型システム顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ７０）を用いて行った。
【００２５】
（５）コラーゲン産生量の確認試験
２４ｗｅｌｌプレートに細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／５００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。１日前培養した後、評価試料を含む基礎培地５００μＬと交換して１日培養した。その後、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、カルシウム・マグネシウム含有、フェノールレッド不含）５００μＬに置換し、蓋を取ったディッシュをＵＶＡ照射ランプの下に一列に置いて１２Ｊ／ｃｍ２照射した（約１３２分）。照射後、ＨＢＳＳを取り除き、サンプル入りのＦＢＳ不含基礎培地５００μＬと交換して２日間培養した。培地を回収し、−８０℃中に保存した。培地回収後、ディッシュを５００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液２００μＬで懸濁し、細胞を回収した。
回収した培地は４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心し、その上清中のＩ型コラーゲン量をＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ，  Ｈｕｍａｎ，  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（株式会社エーセル）を用いて測定した。細胞懸濁液は４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心し、その上清中のタンパク量をＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて測定した。培地中のＩ型コラーゲン量は細胞タンパク量で補正した。また測定結果はコントロール（無添加）細胞のコラーゲン産生量に対する増加量を求め、増加率％を得た。なお結果は、３回試験した結果のコラーゲン産生増加率の平均値で示す。
【００２６】
（６）試験結果
試験結果を表１及び図１に示す。
【００２７】
【表１】
0006777794.tif 000002
【００２８】
表１及び図１から、バラつぼみエキスとＧＰＯとＧＰＡ１：１混合トリペプチドの併用は顕著にコラーゲン産生を促進することが明らかとなった。
【００２９】
またＧＰＯとＧＰＡ１：１混合トリペプチドとバラつぼみエキス併用によるＩ型コラーゲン産生相乗効果の評価は、以下の基準で判定した。
相乗効果有りの評価：相加効果の理論値＜実測値の場合を相乗効果「有」として判定した。
相加効果の理論値＝（Ａ／Ｄ−１）×１００＋（Ｂ／Ｄ−１）×１００
実測値＝（Ｃ／Ｄ−１）×１００
Ａ：バラつぼみエキス単独添加によるＩ型コラーゲン産生量
Ｂ：トリペプチド混合物添加によるＩ型コラーゲン産生量
Ｃ：バラつぼみエキスとトリペプチド混合物の併用によるＩ型コラーゲン産生量
Ｄ：コントロール群（無添加サンプル）のＩ型コラーゲン産生量
併用効果の判定表を、下記の表２に示す。
【００３０】
【表２】
0006777794.tif 000003
【００３１】
バラつぼみエキスとトリペプチドＧＰＯ、ＧＰＡ混合物の併用により、Ｉ型コラーゲンの産生量が相乗的に上昇したことが確認できた。
【００３２】
＜２．トリペプチドＧＰＯ及びＧＰＡの２：１混合物とバラつぼみエキスの併用効果確認試験＞
（１）試験試料（サンプル）
バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスとして、丸善製薬株式会社が販売
しているローズバッツエキスパウダーＭＦを用いた。またトリペプチドとして、試験１と同様にＧＰＯとＧＰＡを用いた。
【００３３】
（２）試験方法
１）使用細胞
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ：ロンザジャパン株式会社)
【００３４】
２）細胞培養
細胞は３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気の条件下で培養を行った。培地は非働化したウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０％、ｐｅｎｉｃｉｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１％を添加したダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース含有、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。通常培養には１０ｃｍまたは１５ｃｍディッシュを用い、継代時の細胞剥離には０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。
【００３５】
（３）試験試料調製
試験試料は培地で溶解した。ＵＶＡ照射前は基礎培地を用い、ＵＶＡ照射後はＦＢＳ
不含基礎培地を用いた。
試験試料の最終濃度
下記表３の濃度で試験を実施した。
【００３６】
（４）細胞の形態観察
添加による影響を確認するため形態観察を行った。形態観察には倒立型システム顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ  ＩＸ７０）を用いて行った。
【００３７】
（５）コラーゲン産生量の確認試験
２４ｗｅｌｌプレートに細胞を１×１０５ｃｅｌｌｓ／５００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。１日前培養した後、サンプル入り基礎培地５００μＬと交換して１日培養した。その後、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、カルシウム・マグネシウム含有、フェノールレッド不含）５００μＬに置換し、蓋を取ったディッシュをＵＶＡ照射ランプの下に一列に置いて１２Ｊ／ｃｍ２照射した（約１３２分）。照射後、ＨＢＳＳを取り除き、サンプル入りのＦＢＳ不含基礎培地５００μＬと交換して２日間培養した。培地を回収し、−８０℃中に保存した。培地回収後、ディッシュを５００μＬのリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、０．１Ｎの水酸化ナトリウム溶液２００μＬで懸濁し、細胞を回収した。
【００３８】
回収した培地は４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心し、その上清中のＩ型コラーゲン量をＣｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ，  Ｈｕｍａｎ，  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（株式会社エーセル）を用いて測定した。細胞懸濁液は４℃、１０，０００×ｇで１０分間遠心し、その上清中のタンパク量をＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて測定した。培地中のＩ型コラーゲン量は細胞タンパク量で補正した。また測定結果はコントロール（無添加）細胞のコラーゲン産生量に対する増加量を求め、増加率％を得た。なお結果は、３回試験した結果のコラーゲン産生増加率の平均値で示す。
【００３９】
（６）試験結果
試験結果を表３及び図２に示す。
【００４０】
【表３】
0006777794.tif 000004
【００４１】
表３及び図２から、バラつぼみエキスとＧＰＯとＧＰＡ２：１混合トリペプチドの併用は、コラーゲン産生を促進することが明らかとなった。
【００４２】
またＧＰＯとＧＰＡ２：１混合トリペプチドとバラつぼみエキス併用によるＩ型コラーゲン産生相乗効果の評価は、以下の基準で判定した。
相乗効果有りの評価：相加効果の理論値＜実測値の場合を相乗効果「有」として判定した。
相加効果の理論値＝（Ａ／Ｄ−１）×１００＋（Ｂ／Ｄ−１）×１００
実測値＝（Ｃ／Ｄ−１）×１００
Ａ：バラつぼみエキス単独添加によるＩ型コラーゲン産生量
Ｂ：トリペプチド混合物添加によるＩ型コラーゲン産生量
Ｃ：バラつぼみエキスとトリペプチド混合物の併用によるＩ型コラーゲン産生量
Ｄ：コントロール群（無添加サンプル）のＩ型コラーゲン産生量
併用効果の判定表を、下記の表４に示す。
【００４３】
【表４】
0006777794.tif 000005
【００４４】
バラつぼみエキスとトリペプチドＧＰＯ、ＧＰＡ混合物の併用により、Ｉ型コラーゲンの産生量が相乗的に上昇したことが確認できた。
【００４５】
＜３．試験結果まとめ＞
以上の試験１及び２から次の点が明らかとなった。
（１）バラつぼみエキスとＧＰＯ、ＧＰＡの混合物を併用すると生体のコラーゲン産生が相乗的に促進される。
（２）トリペプチドＧＰＯとＧＰＡの配合比率は、ＧＰＯ：ＧＰＡの比率が１：１又は２：１の比率になるように混合して試験したが、いずれの場合もバラつぼみエキスと併用することでコラーゲン産生が相乗的に増加した。
【００４６】
参考製造例１
バラ科バラ属の植物のつぼみのエキスの製造例
アポテカリーズローズのつぼみ（Ｒｏｓａ  ｇａｌｌｉｃａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）３００ｇに５０質量％エタノールを２０００ｍＬ加え、還流冷却器を付けて、８０℃にて１時間抽出した後、濾紙で濾過して抽出液１を得た。また、抽出残渣に５０重量％エタノール１５００ｍＬを加え、同様に還流冷却器を付けて、８０℃にて１時間抽出した後、濾紙で濾過して抽出液２を得た。得られた抽出液１、２を合せて減圧下で濃縮、乾燥させて粉末エキス１００ｇを得た（収率３３．３％）。
【００４７】
参考製造例２
バラ科バラ属の植物のつぼみのエキスの製造例
セイヨウバラのつぼみ（Ｒｏｓａ  ｃｅｎｔｉｆｏｌｉａ）３００ｇに水２０００ｍＬを加え、９０℃にて１時間抽出を行った後、濾紙にて濾過し、抽出液を得た。得られた抽出液を減圧下で濃縮、乾燥させて、製造例２の粉末エキス１００ｇを得た（収率３３．３％）。 
【要約】
【課題】コラーゲン産生促進用組成物を提供すること。
【解決手段】バラ科バラ属の植物の花弁及び／又はつぼみのエキスと、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａの配列を有する２種類のトリペプチドを有効成分として含有するコラーゲン産生促進用組成物。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【配列表】
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