(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性物質（９１０）を通じて移動した音響波（９２２）を検出する音響モニタリングデバイスと、
前記音響モニタリングデバイス（１０２）に通信可能に結合されたコンピューティングデバイス（１０１）と
を備えたシステム（１００）であって、前記コンピューティングデバイスは、実行時に、
前記検出された音響波の測定された音響データから実験によって得たＴＯＦのセットを算出することであって、各実験によって得たＴＯＦは複数の時点のうちのそれぞれの時点で前記多孔性物質の候補拡散点を通じて移動した音響波のＴＯＦを示す、実験によって得たＴＯＦのセットを算出することと、
前記多孔性物質についての候補拡散定数の範囲を設定することと、
試薬の予期される濃度が時間、空間、及び前記候補拡散定数の関数であり、前記候補拡散定数ごとに、前記複数の時点について及び前記候補拡散点について前記多孔性物質内の試薬の前記予期される濃度の空間依存性濃度モデルをシミュレートすることと、
前記空間依存性濃度モデルを使用して前記多孔性物質についての空間依存性ＴＯＦモデルを算出することであって、前記ＴＯＦモデルは、前記複数の時点ごとに及び前記候補拡散定数ごとに、前記候補拡散点へ、それぞれモデル化されたＴＯＦを割り当てる、空間依存性ＴＯＦモデルを算出することと、
前記候補拡散点について誤差関数を決定することであって、誤差は、対応する実験によって得たＴＯＦから前記候補拡散点へ割り当てられた各前記モデル化されたＴＯＦの間の距離を示し、前記実験によって得たＴＯＦは、対応するモデル化されたＴＯＦをモデル化するのに使用されるのと同じ時点で前記音響モニタリングデバイスによって測定される、誤差関数を決定することと、
前記対応する実験によって得たＴＯＦまで最小距離を有する１つ又は複数のモデル化されたＴＯＦを特定するために前記誤差関数を使用することと、
前記１つ又は複数の特定されたモデル化されたＴＯＦの前記候補拡散定数から前記多孔性物質について計算された拡散定数を出力することと
を含む動作を前記コンピューティングデバイスに実行させる命令を含むシステム（１００）。
【請求項２】
多孔性物質（９１０）の拡散定数を決定する方法であって、
音響波（９２２）の測定された音響データから実験によって得たＴＯＦのセットを算出するステップであって、前記音響波は音響モニタリングデバイス（１０２）によって検出され前記多孔性物質（９１０）を通じて移動したものであり、各実験によって得たＴＯＦは複数の時点のうちのそれぞれの時点で前記多孔性物質の候補拡散点を通じて移動した音響波の前記ＴＯＦを示す、実験によって得たＴＯＦのセットを算出するステップと、
前記多孔性物質についての候補拡散定数の範囲を設定するステップと、
試薬の予期される濃度が時間、空間、及び前記候補拡散定数の関数であり、前記候補拡散定数ごとに、前記複数の時点について及び前記候補拡散点について前記多孔性物質内の試薬の前記予期される濃度の空間依存性濃度モデルをシミュレートするステップと、
前記空間依存性濃度モデルを使用して前記多孔性物質についての空間依存性ＴＯＦモデルを算出するステップであって、前記ＴＯＦモデルは、前記複数の時点ごとに及び前記候補拡散定数ごとに、前記候補拡散点へ、それぞれモデル化されたＴＯＦを割り当てる前記空間依存性濃度モデルを使用するステップと、
前記候補拡散点について誤差関数を決定するステップであって、誤差は、対応する実験によって得たＴＯＦから前記候補拡散点へ割り当てられた各前記モデル化されたＴＯＦの間の距離を示し、前記実験によって得たＴＯＦは、対応するモデル化されたＴＯＦをモデル化するのに使用されるのと同じ時点で前記音響モニタリングデバイスによって測定される、誤差関数を決
定するステップと、
前記対応する実験によって得たＴＯＦまで最小距離を有する１つ又は複数のモデル化されたＴＯＦを特定するために前記誤差関数を使用するステップと、
前記１つ又は複数の特定されたモデル化されたＴＯＦの前記候補拡散定数から前記多孔性物質について計算された拡散定数を出力するステップと
を含む方法。
【請求項３】
前記空間依存性ＴＯＦモデルを算出するステップは、前記多孔性物質について熱方程式を解くことによって各前記モデル化されたＴＯＦを決定するステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記実験によって得たＴＯＦのセットを算出するステップは、前記多孔性物質の２つ以上の候補拡散点について実行され、前記空間依存性濃度モデルは、前記複数の時点について及び前記２つ以上の候補拡散点の各々について前記多孔性物質内の試薬の予期される濃度を示し、前記空間依存性ＴＯＦモデルは、前記複数の時点ごとに及び前記候補拡散定数ごとに、前記２つ以上の候補拡散点の各々へ、それぞれモデル化されたＴＯＦを割り当てる、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記音響データは、
前記試薬が拡散する前の前記多孔性物質中の音響波の速度、及び／又は
前記多孔性物質の中への前記試薬の拡散中の前記複数の時点における前記多孔性物質を通じての前記音響波の前記実験によって得たＴＯＦ、及び／又は実験によって得た位相シフトデータであって、前記実験によって得た位相シフトデータから前記実験によって得たＴＯＦを算出するための実験によって得た位相シフトデータ、
前記多孔性物質がない前記試薬中の音響波の速度、及び／又は
前記多孔性物質の厚さ
を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記空間依存性ＴＯＦモデルの前記算出は、
前記候補拡散定数のうちの最初のものを選択するステップと、
前記選択された候補拡散定数に依存して前記複数の時点ごとに前記多孔性物質中の前記複数の候補拡散点の各々で予期された試薬濃度（ｃｒｅａｇｅｎｔ）を計算するステップと、
前記多孔性物質の半径にわたって前記時点及び前記候補拡散定数について計算された前記予期された試薬濃度（ｃｒｅａｇｅｎｔ）を積分することによって、前記複数の時点ごとに及び前記候補拡散定数ごとに、統合された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｃｔｅｄ）を計算するステップと、
前記試薬が拡散する前の前記多孔性物質中の音響波の速度と前記多孔性物質がない前記試薬中の音響波の速度との線形結合を算出することによって、前記統合された試薬濃度を前記空間依存性ＴＯＦモデルのそれぞれのモデル化されたＴＯＦへ変換するステップと、
前記候補拡散定数のうちの次のものを選択するステップと、終了基準に到達するまで前記次の選択された候補拡散定数のためにこのステップ及び前記３つの前のステップを繰り返すステップと
を含む、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試薬中の前記音響波の速度は、流体を通じて超音波送信機と超音波受信機の間で超音波を送信し、前記送信機と前記受信機の間で前記ＴＯＦを計算し、以下の式、すなわち、
【数１】
0006632624.tif 000024
に従って前記試薬の前記音響波の前記速度を計算することによって計算され、ただし、ｒｆｌｕｉｄは前記試薬中の前記音響波の速度であり、ｄは前記送信機と前記受信機の間の距離であり、ｔは前記送信機と前記受信機の間の前記ＴＯＦである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
非拡散多孔性物質中の音響波の速度（ｒｏｒｉｇ）は、以下の式、すなわち、
【数２】
0006632624.tif 000025
に従って決定され、ただし、Δｔは前記試薬及び前記多孔性物質を通過する波と前記試薬だけを通過する波との間のＴＯＦの差であり、ｄｍａｔは前記多孔性物質の厚さである、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記空間依存性濃度モデルは、熱方程式を用いることによって前記候補拡散点における前記試薬の前記予期される濃度を計算するように構成されており、前記熱方程式は、経時的に前記多孔性物質と同じ三次元形状を有する対象の所与の領域内の熱の分布を説明する、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記多孔性物質は円筒形であり、前記熱方程式は以下の式、すなわち、
【数３】
0006632624.tif 000026
によって特定され、ただし、ｃｆｌｕｉｄは前記試薬の前記予期される濃度であり、ｔは選択された時点における拡散時間であり、Ｄは前記候補拡散定数であり、ｘは前記多孔性物質の深さ方向の前記候補拡散点の空間座標であり、Ｒ０は前記多孔性物質の半径であり、Ｊ０は第１種及び０次のベッセル関数であり、Ｊ１は第１種及び一次のベッセル関数であり、αｎは０次ベッセル関数のｎ次ルートの位置であり、ｃｍａｘは前記試薬の最大濃度である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記空間依存性濃度モデルを使用して前記空間依存性ＴＯＦモデルを算出するステップは、
前記多孔性物質と同じ三次元形状を有する対象の熱方程式を用いて、時点、候補拡散定数、及び候補拡散点の一意の組み合わせごとに、それぞれの予期された試薬濃度（ｃｆｌｕｉｄ）を算出するステップと、
特定の時点について算出された全ての予期された試薬濃度（ｃｆｌｕｉｄ）から、前記多孔性物質の半径に空間的にわたって前記時点の前記予期された試薬濃度（ｃｆｌｕｉｄ）を積分することによって、積分された予期された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）を算出するステップと、
前記積分された予期された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）の各々を前記空間依存性ＴＯＦモデルの前記モデル化されたＴＯＦのうちのそれぞれ１つへ変換するステップと、
を含む、請求項２から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記積分された予期された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）を算出する前記算出ステ
ップは、以下の式、すなわち、
【数４】
0006632624.tif 000027
に従って実行され、ただし、ｃｆｌｕｉｄは前記試薬の前記予期される濃度であり、ｔは選択された時点における拡散時間であり、ｃｄｅｔｅｃｔｅｄは前記積分された予期された試薬濃度であり、×は前記多孔性物質の深さ方向の前記候補拡散点の空間座標であり、Ｒ０は、前記多孔性物質の半径である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記積分された予期された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）の各々を前記空間依存性ＴＯＦモデルの前記モデル化されたＴＯＦのうちのそれぞれ１つへ前記変換するステップは、以下の式、すなわち、
【数５】
0006632624.tif 000028
に従って算出され、ＴＯＦは、前記変換から生じる前記空間依存性ＴＯＦモデルの前記モデル化されたＴＯＦ値のうちの１つであり、ｒｏｒｉｇは前記試薬がない前記多孔性物質中の前記音響波の前記速度であり、ｒｆｌｕｉｄは前記多孔性物質がない前記試薬中の前記音響波の前記速度であり、ｃｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄは前記積分された予期された試薬濃度であり、Ｄは前記候補拡散定数であり、ｔは選択された時点における拡散時間であり、ρは前記多孔性物質の気孔率であり、ｄｍａｔは前記多孔性物質の厚さである、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記誤差関数は、前記以下の式、すなわち、
【数６】
0006632624.tif 000029
に従って計算される、請求項２から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
特定の候補拡散点及び特定の候補拡散定数に関連し異なる時点についてモデル化された前記空間依存性ＴＯＦモデルの複数の前記モデル化されたＴＯＦを解析するステップであって、時間範囲を示す予期された減衰定数（τｓｉｍｕｌａｔｅｄ）を特定するために実行され、その後に前記モデル化されたＴＯＦは予め定められたパーセンテージだけ減衰してしまう複数の前記モデル化されたＴＯＦを解析するステップと、
前記特定の候補拡散点及び前記特定の候補拡散定数に関連し前記異なる時点で測定された前記空間依存性ＴＯＦモデルの複数の測定されたＴＯＦを解析するステップであって、時間範囲示す実験によって得た減衰定数（τｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）を特定するために実行され、その後に前記実験によって得たＴＯＦが予め定められたパーセンテージだけ減衰してしまう複数の前記測定されたＴＯＦを解析するステップと
をさらに含み、
前記誤差関数は、以下の式、すなわち、
誤差（Ｄ）＝（τｓｉｍｕｌａｔｅｄ（Ｄ）−τｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）２
に従って計算され、ここで、Ｄは前記候補拡散定数である、請求項２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記音響モニタリングデバイスに通信可能に結合されたコンピュータシステムのプロセッサによって実行される、請求項２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試薬に関して前記多孔性物質の十分な拡散の時間を示す基準時間を取得するステップと、
前記出力された拡散定数から十分な拡散時間を計算するステップと、
少なくとも前記計算された十分な拡散時間の間固定剤中に組織試料を浸漬されたままにするステップと
を含む、請求項２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬は液体であり、前記複数の時点は、前記多孔性物質が前記液体の体積中へ浸漬されて以来経過した前記時間をそれぞれ示す、請求項２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬は固定液であり、及び／又は前記多孔性物質は組織試料である、請求項２から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記多孔性物質を前記試薬中に浸漬するステップと、
前記音響波が検出される間に０℃から１５℃の温度で前記浸漬された多孔性物質を維持するステップと、
前記複数の時点ごとに、前記実験によって得たＴＯＦを基準ＴＯＦと比較するステップであって、前記基準ＴＯＦは、組織試料が前記試薬で十分に拡散されることを示す、比較するステップと、
前記実験によって得たＴＯＦが閾値に到達した場合、前記組織試料及び前記試薬の温度が周囲温度まで上昇することを可能にし、又は前記組織試料及び前記試薬の前記温度を２０℃よりも大きい温度へ加熱をトリガするステップと
をさらに含む、請求項２から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
固定組織試料を得るために前記組織試料を固定するステップと、
前記固定組織試料を不安定生物指標化合物に結合することができる特定の結合実体と接触させるステップと、
前記特定の結合実体の結合を検出するステップと
をさらに含む、請求項１７又は１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２から１６のいずれか一項に記載の方法を実施するために、プロセッサによって実行されるコンピュータ可読コードを記憶する有形の非一時的なコンピュータ可読媒体。
【請求項２３】
試薬内に浸漬される試料を通じて移動した音響波を検出する音響モニタリングデバイスと、
前記音響モニタリングデバイスと通信可能に結合された、飛行時間に基づいて前記音響波の速度を評価するための手段と、
を備えるシステムにおける方法であって、
前記試薬内に浸漬される試料についての真の拡散定数を決定する方法であって、
モデル飛行時間を生成するために、複数の時点にわたって及び複数の候補拡散定数ごとに、前記試料の中へ拡散の空間依存性をシミュレートするステップと、
誤差関数を得るために、前記モデル飛行時間を実験によって得た飛行時間と比較するステップとを含み、
前記誤差関数の最小値は、真の拡散定数をもたらす、方法。
【請求項２４】
前記複数の候補拡散定数は、外部源によって与えられる候補拡散定数の範囲を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料についての絶対的な音響波の速度を決定するステップをさらに含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記音響波の速度を決定するステップは、試薬中の音響波の速度を計算するステップと、前記試料の厚さを決定するステップとを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記空間依存性をシミュレーションするステップは、前記複数の時点にわたって前記試料を通じての試薬のモデル濃度を決定するステップをさらに含む、請求項２３から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記空間依存性をシミュレーションするステップは、前記試料についての熱方程式の解を用いて時間及び空間の関数として前記試薬の濃度を決定するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料についての前記熱方程式の前記解は、前記試料の幾何学的形状に基づいている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記空間依存性をシミュレーションするステップは、前記モデル濃度を飛行時間へ変換するステップをさらに含む、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記モデル飛行時間は、前記複数の候補拡散定数ごとに飛行時間を決定することによって得られる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記誤差関数は、前記モデル飛行時間と前記実験によって得た飛行時間の間の差一つ一つに基づいている、請求項２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記誤差関数は、前記モデル飛行時間と前記実験によって得た飛行時間の間の拡散の速度に基づいている、請求項２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
候補拡散定数ごとに、実験によって得た飛行時間とシミュレートされた飛行時間の間の誤差を決定するステップをさらに含む、請求項２３から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記誤差関数は、誤差に基づいている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
組織試料を通じて移動した音響波を検出する音響モニタリングデバイスと、
前記音響モニタリングデバイスに通信可能に結合され、飛行時間に基づいて前記音響波の速度を評価するように構成されているコンピューティングデバイスであって、実行時に、
前記組織試料についての候補拡散定数の範囲を設定することと、
複数の時点について及び候補拡散点の範囲のうち第１のものについて、前記組織試料内の試薬の空間依存性をシミュレートすることと、
前記空間依存性に基づいてモデル化された飛行時間を決定することと、
複数の拡散定数ごとに、前記空間依存性のシミュレーションを繰り返すことと、
前記複数の拡散定数についての前記モデル化された飛行時間と前記組織試料についての実験によって得た飛行時間との間の誤差を決定することと
を含む動作を処理システムに実行させる命令を含むコンピューティングデバイスと
を備えたシステムであって、
前記誤差に基づく誤差関数の最小値は、前記組織試料についての真の拡散定数をもたらすシステム。
【請求項３７】
前記動作は、前記組織試料についての熱方程式を解いて前記モデル化された飛行時間を決定するステップをさらに含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記誤差は、候補拡散定数ごとに決定される、請求項３６又は３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記誤差関数は、前記拡散定数の関数として拡散定数ごとに前記誤差から決定される、請求項３７に記載のシステム。
【請求項４０】
試料物質についてのシミュレートされた飛行時間を前記試料物質についての実験によって得た飛行時間と比較することと、
前記シミュレートされた飛行時間と音響飛行時間の間の誤差関数の最小値に基づいて前記試料物質についての拡散定数を得ることと
を含む動作を実施するようにプロセッサによって実行されるコンピュータ可読コードを記憶する有形の非一時的なコンピュータ可読媒体であって、
前記動作が、システム内の動作であって、当該システムが、
前記試料物質を通じて移動した音響波を検出する音響モニタリングデバイスと、
前記音響モニタリングデバイスと通信可能に結合された、飛行時間に基づいて前記音響波の速度を評価するための手段と、
を備えるシステムである、
有形の非一時的なコンピュータ可読媒体。
【請求項４１】
多孔性物質の中に拡散する流体の拡散定数を決定する方法であって、
（ａ）前記流体の体積の中に前記多孔性物質の試料を浸漬するステップと、
（ｂ）音響モニタリングシステムを用いて前記流体の前記体積中に浸漬された前記多孔性物質の前記試料についての音響データのセットを収集し、前記音響データのセットを信号解析器へ送信するステップであって、前記音響データのセットは、
（ｂ１）流体が拡散する前の前記多孔性物質中の超音波の絶対的な音響波の速度、
（ｂ２）前記多孔性物質の中への流体の拡散中の少なくとも一時点における前記多孔性物質を通じての超音波のＴＯＦ（ＴＯＦｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）、
（ｂ３）前記流体中の超音波の絶対的な音響波の速度、及び
（ｂ４）前記多孔性物質の厚さ
を有する送信するステップと、
（ｃ）信号解析器上で前記多孔性物質の中への前記流体の拡散についての拡散定数を計算するステップであって、
（ｃ１）複数の候補拡散定数ごとに、時間経過に伴うＴＯＦの変化をモデル化するサブステップであって、
（ｃ１ａ）第１の候補拡散定数を選択し、
（ｃ１ｂ）ステップ（ｂ２）における前記少なくとも一時点に対応する複数の拡散時間を選択し、
（ｃ１ｃ）時間及び空間の関数として前記多孔性物質の厚さ（ｂ４）を通じた複数の深さごとに前記流体の濃度を計算し、
（ｃ１ｄ）各時点（ｃｄｅｔｅｃｔｅｄ）で拡散された試薬の総量を計算し、
（ｃ１ｅ）ステップ（ｂ１）及び（ｂ３）における絶対的な音響波の速度の加算として（ｃ１ｄ）で決定された前記濃度から生じる予期されたＴＯＦ差を計算し、
（ｃ１ｆ）複数の候補拡散定数について（ｃ１ａ）〜（ｃ１ｅ）を繰り返す
ことによるＴＯＦ傾向をモデル化するサブステップと、
（ｃ２）ステップ（ｂ２）における超音波の前記ＴＯＦと（ｃ１）から計算された各前記ＴＯＦ差と間の誤差関数を拡散定数の関数として計算するサブステップであって、真の拡散定数は前記誤差関数の最小値である拡散定数を計算するステップと
を含む方法。
【請求項４２】
前記流体中の音響波の速度は、前記流体を通じて超音波送信機と超音波受信機の間で超音波を送信し、前記送信機と前記受信機の間の前記飛行時間を計算し、以下の式、すなわち、
【数７】
0006632624.tif 000030
に従って前記音響波の速度を計算することによって計算され、ただし、ｒｆｌｕｉｄは前記流体中の前記音響波の速度であり、ｄは前記送信機と前記受信機の間の前記距離であり、ｔは前記送信機と前記受信機の間の前記飛行時間（ＴＯＦ）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
非拡散多孔性物質中の音響波の速度（ｒｏｒｉｇ）は、以下の式、すなわち、
【数８】
0006632624.tif 000031
に従って決定され、ただし、Δｔは前記流体及び前記多孔性物質を通過する波と前記流体だけを通過する波との間のＴＯＦの差であり、ｄｍａｔは前記多孔性物質の厚さである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記多孔性物質の前記厚さは、パルスエコー超音波を用いて決定される、請求項４１から４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記多孔性物質は円筒形であり、前記多孔性物質の厚さ（ｂ４）を通じての前記複数の深さごとの前記流体の濃度は、以下の式、すなわち、
【数９】
0006632624.tif 000032
に従って計算され、ただし、ｃｆｌｕｉｄは前記濃度であり、ｔは選択された時点における前記拡散時間であり、Ｄは前記候補拡散定数であり、ｘは前記多孔性物質の深さ方向の空間座標であり、Ｒ０は前記多孔性物質の半径であり、Ｊ０は第１及び０次のベッセル関数であり、Ｊ１は第１種及び１次のベッセル関数であり、αｎは０次ベッセル関数のｎルートの位置であり、ｃｍａｘは前記試薬の最大濃度である、請求項４１から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
拡散された試薬の総量（ｃｄｅｔｅｃｔｅｄ）は、以下の式、すなわち、
【数１０】
0006632624.tif 000033
に従って計算された、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記予期されたＴＯＦ差は、以下の式、すなわち、
【数１１】
0006632624.tif 000034
に従って計算され、ただし、ｄｍａｔは前記多孔性物質の厚さであり、ρは前記多孔性物質の多孔率である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記誤差関数は、以下の式、すなわち、
【数１２】
0006632624.tif 000035
に従って計算される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記多孔性物質は組織試料であり、前記流体は固定剤溶液である、請求項４１から４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
組織試料を固定する方法であって、請求項４９に記載の方法によって固定剤溶液中に浸漬された組織試料の拡散定数を計算するステップと、前記計算された拡散定数に基づいて十分な拡散時間を計算するステップと、少なくとも前記計算された十分な拡散時間の間前記固定剤中に前記組織試料を浸漬されたままにするステップとを含む方法。
【請求項５１】
組織試料を固定する方法であって、
（ａ）架橋結合固定剤溶液で十分に拡散される組織試料を得るステップであって、
（ａ１）前記架橋結合固定剤は０℃から１５℃の温度にあり、対象から前記架橋結合固定剤溶液の体積の中に新たに得られる固定されていない組織試料を浸漬し、
（ａ２）請求項２８に記載の方法によって拡散定数を計算し、
（ａ３）前記計算された拡散定数に基づいて十分な拡散時間を決定する
ことによって組織試料を得るステップと、
（ｂ）前記組織試料が前記十分な拡散時間の間前記架橋結合固定剤溶液中に浸漬された後に、前記組織試料の温度を室温から５０℃の範囲内の温度へ上昇させ、前記組織試料の固定を可能にするのに十分な期間この温度の範囲内で前記組織試料を保持するステップとを含む方法。
【請求項５２】
組織試料中の不安定生物指標化合物を検出する方法であって、
（ａ）固定された組織試料を得るために請求項５１に記載の前記方法に従って前記組織試料を固定するステップと、
（ｂ）前記不安定生物指標化合物に結合することができる特定の結合実体を用いて前記固定された組織試料に接触させるステップと、
（ｃ）前記特定の結合実体の結合を検出するステップと
を含む方法。
【請求項５３】
前記不安定生物指標化合物は、リン酸化たんぱく質、ｍＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[001]２０１４年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０９３，１５１号の利益は、それによって権利主張されており、その内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[002]本開示は、組織試料などの物質の解析に関する。より詳細には、本開示は、物質の真の拡散定数の計算に関する。
【背景技術】
【０００３】
[003]拡散定数（すなわち、拡散係数）の測定は、拡散定数が流体及び固体の基本性質を表すため、基礎科学と応用科学の複数の分野にとって重要であり、したがっていくつかの商業分野に直接利用されている。例えば、拡散係数の診断値は、正常な組織と異常な組織を区別するのに役立つことが分かっている。免疫組織化学（ＩＨＣ：ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）イメージングでは、人間被験者からの組織切片などの生体標本は、液体又は固定剤の中にしばしば置かれ、これは細胞の代謝活動を中断させる。組織試料を通じての固定剤の拡散をモニタすることは、固定剤が組織試料全体に浸出したか判断するのに役立ち、それによって固定不十分な組織（ｕｎｄｅｒ−ｆｉｘｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ）又は固定過剰な組織（ｏｖｅｒ−ｆｉｘｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ）を最小にし又は限度以内にする。
【０００４】
[004]拡散定数を計算するためのいくつかの方法は、従来技術に示されており、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）拡散強調イメージング、流体の電解質モニタリング、光学検出及び定量化、及びＸ線ベースの方法が含まれる。これらの技法のうち、ＭＲＩベースの方法は、断然最も一般的に臨床上用いられる方法である。しかしながら、これらの方法の各々は、検出、感度、コスト、複雑性、試料適合性、及び必要な収集時間の観点でそれ自体の限界を有する。電解質モニタリングベースの方法は、電気的に異なる物質の活性拡散を必要とし、電気的に中性な物質はこの方法を用いてモニタすることができないことを意味する。光学的技法の主な欠点は、光学的技法は、典型的には知られている標準的なものに戻って関連している拡散係数の相対表現を主に作り出す。これは拡散定数の絶対的な定量化を難しくさせ得る。前に述べたように、拡散係数を検出し定量化するために、ＭＲＩを用いて多くの研究がなされてきた。しかしながら、これは、体内で移動可能な水プロトンの核磁化の検出から得られる。これは、ＭＲＩを水の拡散を検出しモニタするのによく適したものにするが、このモダリティは、他の代わりの流体の拡散をモニタすることにおける有用性を現在制限している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
[005]本開示は、試料の拡散係数を再構築するために拡散モデルと相関する音響飛行時間（ＴＯＦ）ベースの情報を用いて試料の拡散定数を計算するシステム及びコンピュータによって実行される方法を提示することにより上記特定の課題を解決する。組織試料の幾何学的形状に基づく受動的な流体交換（すなわち、拡散）を通じて累積された位相差を音響的に決定し、ＴＯＦへの拡散の影響をモニタし、後処理アルゴリズムを使用して結果を相関させ、それによって拡散定数を決定するような本明細書中に開示された動作は、いくつかの組織試料の中にホルマリンなどの固定剤が浸透することによって引き起こされる音の速さの変化をモニタすることによって可能にされる。組織標本システム（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）は、組織試料の拡散をモニタし最適処理ワークフローを決定するようになされ得る。また、開示された動作は、水の拡散を定量化するだけに限定されず、上記の従来技術の方法とは異なり、全ての組織及び他の物質の中への全ての流体の拡散をモニタするために使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
[006]例示的な一実施形態では、本開示は、試薬内に浸漬される試料についての真の拡散定数を決定する方法であって、この方法は、モデル飛行時間を生成するために、複数の時点にわたって及び複数の候補拡散定数（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｖｉｔｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）ごとに、試料の中への拡散の空間依存性をシミュレートするステップと、誤差関数を得るために、モデル飛行時間を経験的な飛行時間と比較するステップとを含み、誤差関数の最小値が真の拡散定数をもたらす方法を提供する。
【０００７】
[007]別の例示的な実施形態では、本開示は、組織試料を通じて移動した音響波を検出する音響モニタリングデバイスと、音響モニタリングデバイスに通信可能に結合され、飛行時間に基づいて音響波の速さを評価するように構成されているコンピューティングデバイスであって、実行時に、組織試料についての候補拡散定数の範囲を設定することと、複数の時点について及び候補拡散点（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｖｉｔｙ  ｐｏｉｎｔ）の範囲のうち第１のものについて、組織試料内の試薬の空間依存性をシミュレートすることと、空間依存性に基づいてモデル化された飛行時間を決定することと、複数の拡散定数ごとに、空間依存性のシミュレーションを繰り返すことと、複数の拡散定数についてのモデル化された飛行時間と組織試料についての経験的な飛行時間との間の誤差を決定することとを含む動作を処理システムに実行させる命令を含むコンピューティングデバイスとを備えたシステムであって、誤差に基づく誤差関数の最小値が組織試料についての真の拡散定数をもたらすシステムを提供する。
【０００８】
[008]さらに別の例示的な実施形態では、本開示は、試料物質についてのシミュレートされた飛行時間を試料物質についての経験的な飛行時間と比較することと、シミュレートされた飛行時間と音響飛行時間の間の誤差関数の最小値に基づいて試料物質についての拡散定数を得ることとを含む動作を実施するようにプロセッサによって実行されるコンピュータ可読コードを記憶する有形の非一時的なコンピュータ可読媒体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】[009]本開示の例示的な実施形態による最適化された組織固定のための組織処理システム１００を示す図である。
【図２Ａ】[0010]本開示の例示的な実施形態によるバイオプシーカプセルからの超音波スキャンパターン及び標準サイズのカセットからの超音波スキャンパターンをそれぞれ表す図である。
【図２Ｂ】本開示の例示的な実施形態によるバイオプシーカプセルからの超音波スキャンパターン及び標準サイズのカセットからの超音波スキャンパターンをそれぞれ表す図である。
【図２Ｃ】[0011]本開示の例示的な実施形態についてのタイミング図である。
【図３】[0012]本開示の例示的な実施形態による組織試料についての拡散係数を得る方法を示す流れ図である。
【図４】[0013]本開示の例示的な実施形態による組織試料についての拡散係数を得る代替の方法を示す流れ図である。
【図５】[0014]図５Ａは、本開示の例示的な実施形態による実験している間の第１の時点についてのシミュレートされた濃度の傾きを示すグラフである。図５Ｂは、本開示の例示的な実施形態による実験している間のいくつかの時点についてのシミュレートされた濃度の傾きを示すグラフである。
【図６】[0015]図６Ａは、本開示の例示的な各実施形態による実験している間の超音波によって検出されるＮＢＦ濃度のシミュレートされた量を示すグラフである。図６Ｂは、本開示の例示的な各実施形態による実験している間の第１の候補拡散定数についてシミュレートされたＴＯＦ信号を示すグラフである。
【図７】[0016]本開示の例示的な実施形態による全ての潜在的な拡散定数について計算された時間変化するＴＯＦ信号を示すグラフである。
【図８】[0017]図８Ａは、本開示の例示的な実施形態による６ｍｍ片の人間の扁桃試料から収集された経験的に計算されたＴＯＦの傾向を示すグラフである。図８Ｂは、本開示の例示的な実施形態による６ｍｍ片の人間の扁桃試料から収集された空間的に平均化されたＴＯＦ信号の傾向を示すグラフである。
【図９】[0018]図９Ａは、候補拡散定数の関数としてのシミュレートされたＴＯＦ信号と経験的に測定されたＴＯＦ信号との間の計算された誤差関数のグラフである。図９Ｂは、この誤差関数の拡大図である。
【図１０】[0019]本開示の例示的な実施形態による経験的なＴＯＦと比べてグラフで描かれたモデル化された拡散定数を用いて計算されたＴＯＦ傾向を示すグラフである。
【図１１】[0020]図１１Ａは、複数の組織試料について再構築された拡散定数を示すグラフである。図１１Ｂは、複数の組織試料について再構築された拡散定数を示すグラフである。
【図１２】[0021]図１２Ａは、位相シフトによってＴＯＦを測定する送信機と受信機のペアを備えたシステムを示す図である。図１２Ｂは、位相シフトによってＴＯＦを測定する送信機と受信機のペアを備えたシステムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
Ｉ．技術的実施（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）
[0022]本開示は、試料の拡散係数を再構築するために、拡散モデルと相関する音響飛行時間（ＴＯＦ）ベースの情報を用いて試料の（「拡散係数」としても知られている）拡散定数を計算するシステム及びコンピュータによって実行される方法を提示することにより上記特定の課題を解決する。本明細書中に開示された組織標本システム及び方法は、組織試料の中への固定剤流体の拡散をモニタするようになされ得る。例えば、ホルマリンが組織を貫いて入るとき、それは細胞組織間にある流体にとって代わる。細胞組織間にある流体及びホルマリンが離散的な音速を有するので、この流体交換は、組織体積の組成をわずかに変化させる。したがって、出力超音波パルスは、より流体交換が生じるときに増加する小さい通過時間微分を累積する。これは、組織試料の幾何学的形状に基づく拡散により累積された位相差を決定し、ＴＯＦへの拡散の影響をモニタし、後処理アルゴリズムを使用して結果を相関させ、それによって拡散定数を決定することなどの動作を可能にする。また、開示されたＴＯＦ計器の感度は、拡散定数に関して潜在的により正確な特性を可能にする１０パーツ・パー・ミリオン未満の変化を検出することができる。ナノ秒ＴＯＦスケールに関して、全ての流体及び組織は、離散的な音速を有し、したがって開示された動作は、水の拡散を定量化するだけに限定されず、全ての組織の中への全ての流体の拡散をモニタするために使用することができる。
【００１１】
[0023]拡散速度は、ホルマリンに濡れた組織試料の異なる音響特性に基づいて音響プローブのシステムによってモニタすることができる。拡散モニタリング及び経験的なＴＯＦ測定のためのそのようなシステムは、同一出願人による同時継続の米国特許出願公開第２０１３／０２２４７９１号において、２０１４年１２月に出願されたＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＦＩＸＡＴＩＯＮ（最適化された組織固定のための物質及び方法）という名称の米国特許出願において、２０１５年２月９日に出願されたＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＳＴＡＮＤＡＲＤＩＺＩＮＧ  ＤＩＦＦＵＳＩＯＮ  ＯＦ  Ａ  ＦＬＵＩＤ  ＩＮＴＯ  ＴＩＳＳＵＥＳ（組織の中への流体の拡散を標準化する物質及び方法）という名称の米国特許出願において、及び２０１４年１２月２９日に出願された最適化されたＤＩＦＦＵＳＩＯＮ  ＭＯＮＩＴＯＲＩＮＧ  ＰＲＯＴＯＣＯＬ  ＦＯＲ  ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＦＩＸＡＴＩＯＮ（組織固定のための拡散モニタリングプロトコル）という名称の米国特許出願においてさらに詳細に記載されており、その各々の内容は、全体として本明細書中に参照により本明細書によって組み込まれる。拡散モニタリング及び経験的なＴＯＦ測定に適したシステムは、２０１５年１２月１７日に出願されたＡＣＣＵＲＡＴＥＬＹ  ＣＡＬＣＵＬＡＴＩＮＧ  ＡＣＯＵＳＴＩＣ  ＴＩＭＥ−ＯＦ−ＦＬＩＧＨＴ（音響飛行時間の正確な計算）という名称の国際特許出願にやはり記載されており、その各々の内容は、全体として本明細書中に参照により本明細書によって組み込まれる。参照された出願は、組織試料を通じて移動する液体固定剤と接触させられ、組織試料の厚さほぼ全体にわたって拡散させられ、処理全体を通じて組織試料の状態及び条件を評価するために連続的又は定期的にモニタされる音響特性に基づいて解析される固体組織試料を説明する。例えば、細胞組織間にある流体より大きいバルクモジュールを有するホルマリンなどの固定剤は、それが細胞組織間にある流体を置き換えるので、ＴｏＦをかなり変え得る。得られた情報に基づいて、固定プロトコルは、処理の一貫性を高め、処理時間を減少させ、処理品質を改善するなどのように調整することができる。音響測定は、組織試料を非侵襲的に解析するために使用することができる。組織試料の音響特性は、液体試薬（例えば、液体固定剤）が試料を通じて移動するときに変化し得る。試料の音響特性は、例えば、予浸プロセス（例えば、低温固定剤の拡散）、固定プロセス、色付けプロセスなどの間に変化し得る。固定プロセス（例えば、架橋結合プロセス）では、組織試料はより重く架橋結合されるので、音響エネルギーの伝達の速さは変化し得る。リアルタイムモニタリングは、試料を通じての固定剤の移動を正確に追跡するために使用することができる。例えば、生体試料の拡散又は固定のステータスは、音響波の飛行時間（ＴＯＦ）に基づいてモニタすることができる。測定の他の例には、音響信号振幅、減衰、散乱、吸収、音響波の位相シフト、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００１２】
[0024]実施形態によれは、組織試料通じての固定剤の移動は、リアルタイムでモニタすることができる。
ＩＩ．システム及び方法
[0025]本明細書中に使用される「飛行時間」又は「ＴＯＦ」は、例えば、物体、粒子、又は音響波、電磁波、もしくは他の波が媒体を通じてある距離移動するのにかかる時間である。このＴＯＦは、例えば、送信機によって発せられた音響信号（「送信された信号」）の位相と受信機によって受信された音響信号（「受信された信号」）の位相との間の位相差を決定することによって経験的に測定することができる。
【００１３】
[0026]本明細書中に使用される「試料」は、例えば、複数の細胞を含む生体標本である。例には、組織生検試料、外科標本試料、羊水穿刺試料、及び検死物質が含まれるが、これらに限定されない。試料は、例えば組織試料スライド上に封じ込まれ得る。
【００１４】
[0027]「多孔率」は、物質中の空隙（すなわち、「空の」）空間の測度であり、０から１の間の対象の全体積についてのもしくは０から１００％の間のパーセンテージとしての空隙の体積の割合である。本明細書中に使用される「多孔性物質」は、例えば、０よりも大きい多孔率を有する三次元物体である。
【００１５】
[0028]本明細書中に使用される「拡散係数」又は「拡散定数」は、例えば、分子拡散によるモル流束と拡散が観察される対象の濃度の傾き（又は拡散のための駆動力）との間の比例定数である。拡散率は、例えば、フィックの法則の中、及び物理化学の数多くの他の式の中で出会う。（ある物質の別の物質に対する）拡散率が高くなるほど、物質は互いにより速く拡散する。典型的には、化合物の拡散定数は、空気中で水中と同じくらいの約１０，０００×である。空気中の二酸化炭素は、１６ｍｍ２／ｓの拡散定数を有し、水中ではその拡散定数は０．００１６ｍｍ２／ｓである。
【００１６】
[0029]本明細書中に使用される「位相差」は、例えば、同じ周波数を有し同じ時点で参照される２つの波の間の度又は時間の単位で表される差である。
[0030]本明細書中に使用される「バイオプシーカプセル」は、例えば、生検組織試料のための容器である。典型的には、バイオプシーカプセルは、試料を保持し液体試薬、例えば緩衝液、固定液、又は染色液組織試料を囲みその中に拡散させるためのメッシュを備える。本明細書中に使用される「カセット」は、例えば、バイオプシーカプセルのための容器である。好適には、カセットは、カセットが超音波送信機／受信機ペアのビーム経路に対して自動的に選択され移動させられ、例えば持ち上げできるように設計及び成形されている。例えば、この移動は、カセットが装着されるデバイスのロボットアーム又は別の自動化された可動構成部品によって実行することができる。
【００１７】
[0031]一実施形態では、拡散定数を計算するシステムが提供される。以下さらに詳細に説明されるように、このシステムは、プロセッサとこのプロセッサに結合されたメモリとを含む信号解析器を備え、このメモリは、プロセッサによって実行されるときに、音響データのセットから拡散定数を計算することを含む動作をプロセッサに実行させるコンピュータ実行可能命令を記憶するためのものである。
【００１８】
[0032]信号解析器に入力されるデータは、音響モニタリングシステムによって生成される音響データセットであり、音響データセットは、音響信号が関心の物質に遭遇するように音響信号を送信し、次いで音響信号が関心の物質に遭遇した後に音響信号を検出することによって生成される。したがって、さらなる実施形態では、本明細書中に開示されたような信号解析器と以下にさらに詳細に述べられる音響モニタリングシステムとを備えたシステムが提供される。それに加えて、又は代替として、本明細書中に開示されたような信号解析器と、本明細書中に開示されたような音響モニタリングシステムから得られる音響データセットを含む非一時的なコンピュータ可読媒体とを備えたシステムが提供されてもよい。１つの実施形態では、音響モニタリングシステムによって送受信される音響データは、周波数掃引によって生成される。本明細書中に使用されるとき、用語「周波数掃引」は、最初のセットの音響波が第１の一定の持続期間の間に一定の周波数で媒体を通じて発せられ、後続のセットの音響波が後続の（好ましくは等しい）持続期間の間に一定の周波数間隔で発せされるように、媒体を通じて一定の周波数の間隔で送信される一連の音響波を指すものとする。
【００１９】
[0033]いくつかの実施形態では、システムは、多孔性物質の中への流体の拡散をモニタするようになされている。そのような実施形態では、（ａ）本明細書中に述べられたような信号解析器、（ｂ）本明細書中に述べられたような音響モニタリングシステム及び／又は音響モニタリングシステムによって生成される音響データセットを含む非一時的なコンピュータ可読媒体、並びに（ｃ）流体の体積中に浸漬された多孔性物質を保持するための機器を備えるシステムが提供され得る。１つの実施形態では、システムは、組織試料の中への固定剤の拡散をモニタするためのものである。
【００２０】
[0034]各実施形態によれば、拡散定数は、例えば、製薬、セラミックス、冶金、物質、製造、地球科学、土木工学、製造、及び／又は工学の分野で対象を特徴付けする又は説明するために決定される。例えば、この方法は、例えば知られている物質又は知られている組成を有する物質の知られている基準拡散定数値と拡散定数を比較することによって、対象、例えば布地、プラスチック、セラミックス、組織、又は他のものの色付けプロセスをモニタするために、固定プロセスをモニタするために、特定のタイプの物質を特定するために使用することができる。
【００２１】
[0035]いくつかのさらなる実施形態によれば、特定された拡散定数は、生体試料、例えば組織試料を分類するために使用される。この分類の結果は、例えば、試料が得られる組織タイプを特定するために、組織試料が腫瘍から得られたのか又は健康な組織から得られたのか判定するために、あるいは組織試料を様々な腫瘍のサブタイプに分類するために使用することができる。例えば、多くの腫瘍から、腫瘍細胞は互いのすぐ近くでクラスタ化されることが知られている。したがって、一部の腫瘍タイプから得られた試料は、対応する健康な組織の試料とは異なる拡散定数を有する。例えば、前処理ステップにおいて、異なる組織タイプ及び／又は腫瘍タイプから得た試料の拡散定数を決定し、決定された拡散定数を基準値として記憶し、記憶された基準拡散定数を本発明の各実施形態によって得られる拡散値と比較することによって、本発明の各実施形態は、組織試料を分類するために使用することができる。
【００２２】
[0036]１つの実施形態では、音響データセットを収集するための音響モニタリングシステムが提供され、音響モニタリングシステムは送信機及び受信機を備えており、送信機及び受信機は、送信機によって生成される音響信号が受信機によって受信されコンピュータ可読信号に変換されるように配置される。１つの実施形態では、システムは、超音波送信機及び超音波受信機を備える。本明細書中に使用されるとき、「送信機」は、電気信号を音響エネルギーに変換することができるデバイスであり、「超音波送信機」は、電気信号を超音波音響エネルギーに変換することができるデバイスである。本明細書中に使用されるとき、「受信機」は、音響波を電気信号に変換することができるデバイスであり、「超音波受信機」は、超音波音響エネルギーを電気信号」に変換することができるデバイスである。
【００２３】
[0037]電気信号から音響エネルギーを生成するのに役立つある種の物質は、音響エネルギーから電気信号を生成するのにも役立つ。したがって、送信機及び受信機は、必ずしも別個の構成部品とする必要はないが、送信機及び受信機は、別個の構成部品とすることができる。送信機及び受信機は、送信された波が関心の物質に遭遇した後に受信機が送信機によって生成された音響波を検出するように配置される。いくつかの実施形態では、受信機は、関心の物質によって反射された音響波を検出するように配置される。他の実施形態では、受信機は、関心の物質を通じて送信された音響波を検出するように配置される。
【００２４】
[0038]１つの実施形態では、送信機は、変換器に動作可能にリンクされた少なくとも波形発生器を備え、波形発生器は、変換器と通信する電気信号を生成するように構成され、変換器は、電気信号を音響信号に変換するように構成される。いくつかの実施形態では、波形発生器はプログラム可能であり、例えば、開始周波数及び／又は終了周波数、周波数掃引の周波数の間のステップサイズ、周波数ステップの個数、及び／又は各周波数を送信する持続期間を含む周波数掃引のいくつかのパラメータを修正することができるようになっている。他の実施形態では、波形発生器は、１つ又は複数の予め決定された周波数掃引パターンを生成するように事前プログラムされる。他の実施形態では、波形発生器は、事前プログラムされた周波数掃引とカスタマイズされた周波数掃引の両方を送信するようになされ得る。送信機は、集束要素を含むこともでき、この集束要素は、変換器によって生成される音響エネルギーが特定のエリアへ予測可能に集束及び方向付けされることを可能にする。
【００２５】
[0039]動作時、送信機は媒体を通じて周波数掃引を送信し、次いでこの周波数掃引は受信機によって検出され、非一時的なコンピュータ可読記憶媒体に記憶される及び／又は解析のために信号解析器へ送信される音響データセットに変換される。音響データセットが送信された音響波と受信された音響波の間の位相差を表すデータを含む場合、音響モニタリングシステムは位相比較器を含むこともでき、この位相比較器は、送信された音響波と受信された音響波の間の位相差に対応する電気信号を生成する。したがって、いくつかの実施形態では、音響モニタリングシステムは、送信機及び受信機に通信可能にリンクされた位相比較器を備える。位相比較器の出力がアナログ信号である場合、音響モニタリングシステムは、位相比較器のアナログ出力をデジタル信号へ変換するアナログ／デジタル変換器を備えることもできる。次いで、デジタル信号は、例えば、非一時的なコンピュータ可読媒体に記憶することができ、又は解析のために信号解析器へ直接通信することができる。
【００２６】
[0040]プロセッサとこのプロセッサに結合されたメモリとを含む信号解析器が提供され、上述したように、このメモリは、プロセッサによって実行されるときに、音響モニタリングシステムによって生成された音響データセットに少なくとも一部基づいて拡散定数をプロセッサに計算させるコンピュータ実行可能命令を記憶するためのものである。
【００２７】
[0041]用語「プロセッサ」は、例として、プログラム可能なマイクロプロセッサ、コンピュータ、システムオンチップ、又は複数のもの、あるいは前述のものの組み合わせを含むデータを処理する全ての種類の機器、デバイス、及び機械を包含する。機器は、専用論路回路、例えば、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）又はＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）を備えることができる。機器は、ハードウェアに加えて、問題のコンピュータプログラムのための実行環境を生成するコード、例えば、プロセッサファームウェア、プロトコルスタック、データベース管理システム、オペレーティングシステム、クロスプラットフォームルーチン環境、仮想マシン、又はそれらのうちの１つ又は複数の組み合わせを構成するコードを含むこともできる。機器及び実行環境は、ウェブサービスインフラストラクチャ、分散コンピューティングインフラストラクチャ、グリッドコンピューティングインフラストラクチャなどの様々な異なるコンピューティングモデルインフラストラクチャを実現することができる。
【００２８】
[0042]（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、スクリプト、又はコードとしても知られる）コンピュータプログラムは、コンパイルされた又は解釈された言語、宣言型言語又は手続き型言語を含む任意の形態のプログラミング言語で記述することができ、それは、スタンドアローンプログラムとして、又はモジュール、コンポーネント、サブルーチン、オブジェクト、又はコンピューティング環境における使用に適した他のユニットとしてなどの任意の形態で展開することができる。コンピュータプログラムは、必要ではないが、ファイルシステム中のファイルに対応することができる。プログラムは、他のプログラム又はデータ（例えば、マークアップ言語ドキュメントに記憶される１つ又は複数のスクリプト）を保持するファイルの一部に、問題のプログラムに専用の単一ファイルに、又は複数の座標ファイル（例えば、１つ又は複数のモジュール、サブプログラム、又はコード部分を記憶するファイル）に記憶することができる。コンピュータプログラムは、１つのコンピュータ上、又は１つにサイトに位置するもしくは複数のサイトにわたって分散し通信ネットワークによって相互接続された複数のコンピュータ上で実行されるように展開することができる。
【００２９】
[0043]本明細書中に記載されたプロセス及び論理の流れは、入力データを演算し出力を生成することによってアクションを実行するように１つ又は複数のコンピュータプログラムを実行する１つ又は複数のプログラム可能なプロセッサによって実行することができる。プロセス及び論理の流れは、専用論路回路、例えば、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）又はＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）によって実行することもでき、機器は、専用論路回路、例えば、ＦＰＧＡ（フィールドプログラマブルゲートアレイ）又はＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）として実装することもできる。
【００３０】
[0044]コンピュータプログラムの実行に適したプロセッサは、例として、汎用マイクロプロセッサと専用マイクロプロセッサの両方、及び任意の種類のデジタルコンピュータの任意の１つ又は複数のプロセッサを含む。一般に、プロセッサは、読出し専用メモリもしくはランダムアクセスメモリ又は両方から命令及びデータを受信する。コンピュータの必須の要素は、命令に従ってアクションを実行するプロセッサ、並びに命令及びデータを記憶する１つ又は複数のメモリデバイスである。一般に、コンピュータは、例えば磁気ディスク、光磁気ディスク、又は光ディスクなどのデータを記憶するための１つ又は複数の大容量記憶デバイスも備え、あるいはそれらからデータを受信しもしくはそれらにデータを送信し又は両方を行うように動作可能に結合される。しかしながら、コンピュータは、そのようなデバイスを有することを必要としない。また、コンピュータは、別のデバイス、例えば、いくつか例を挙げると、携帯電話、携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯オーディオ又は動画プレイヤ、ゲーム機、全地球測位システム（ＧＰＳ）受信機、又はポータブル記憶デバイス（例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）フラッシュドライブ）に組み込むことができる。コンピュータプログラム命令及びデータを記憶するのに適したデバイスは、全ての形態の不揮発性メモリ、媒体、及びメモリデバイスを含み、例として半導体メモリデバイス、例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、及びフラッシュメモリデバイス、磁気ディスク、例えば、内蔵ハードディスク又はリムーバブルディスク、光磁気ディスク、並びにＣＤ−ＲＯＭディスク及びＤＶＤ−ＲＯＭディスクが含まれる。プロセッサ及びメモリは、専用論路回路に補足されてもよく、又は専用論路回路に組み込まれてもよい。
【００３１】
[0045]ユーザとのやり取りを行うために、本明細書中に記載された本主題の各実施形態は、表示デバイス、例えば、ユーザに情報を表示するためのＬＣＤ（液晶ディスプレイ）、ＬＥＤ（発光ダイオード）ディスプレイ、又はＯＬＥＤ（有機発光ダイオード）ディスプレイ、並びにキーボード、及びポインティングデバイス、例えば、マウス又はトラックボール（これによってユーザはコンピュータに入力を行うことができる）を有するコンピュータ上で実施することができる。いくつかの実施では、タッチスクリーンが、情報を表示するとともにユーザから入力を受け取るために使用され得る。他の種類のデバイスが、同様にユーザとのやり取りを行うために使用されてもよく、例えば、ユーザに送られるフィードバックは、感覚フィードバック、例えば、視覚フィードバック、聴覚フィードバック、又は触覚フィードバックの任意の形態とすることができ、ユーザからの入力は、音響入力、音声入力、又は触覚入力を含む任意の形態で受け取ることができる。加えて、コンピュータは、ユーザによって使用されるデバイスへドキュメントを送信し、ユーザによって使用されるデバイスからドキュメントを受信することによって、例えば、ウェブブラウザから受信した要求に応じてウェブページをユーザのクライアントデバイス上のウェブブラウザへ送信することによって、ユーザとやり取りすることができる。
【００３２】
[0046]本明細書中に記載された本主題の各実施形態は、例えばデータサーバとしてバックエンドコンポーネントを含む、又はミドルウェアコンポーネント、例えばアプリケーションサーバを含む、又はフロントエンドコンポーネント、例えば、ユーザが本明細書中に記載された本主題の実施とのやり取りすることができるグラフィカルユーザインターフェースもしくはウェブブラウザを有するクライアントコンピュータを含む、あるいは１つ又は複数のそうしたバックエンドコンポーネント、ミドルウェアコンポーネント、又はフロントエンドコンポーネントの任意の組み合わせを含むコンピューティングシステムにおいて実施することができる。システムのコンポーネントは、デジタルデータ通信、例えば、通信ネットワークに関する任意の形態又は媒体によって相互接続することができる。通信ネットワークの例には、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）及び広帯域ネットワーク（「ＷＡＮ」）、相互接続ネットワーク（例えば、インターネット）、並びにピアツーピアネットワーク（例えば、アドホックピアツーピアネットワーク）が含まれる。
【００３３】
[0047]コンピューティングシステムは、任意の個数のクライアント及びサーバを含むことができる。一般に、クライアント及びサーバは、互いから遠く離れており、典型的には通信ネットワークを介して総合接続する。クライアントとサーバの関係は、それぞれのコンピュータ上で実行するとともに互いにクライアントサーバ関係を有するコンピュータプログラムによって生じる。いくつかの実施形態では、サーバは、（例えば、クライアントデバイスへデータを表示するために、及びクライアントデバイスとやり取りするユーザからのユーザ入力を受信するために）データ（例えば、ＨＴＭＬページ）をクライアントデバイスへ送信する。クライアントデバイスで生成されたデータ（例えば、ユーザのやり取りの結果）は、サーバでクライアントデバイスから受信することができる。
【００３４】
[0048]動作時、信号解析器は、試験物質から記録された音響データセットを入力として受け入れる。音響データセットは、周波数掃引が関心の物質に遭遇した後に検出される周波数掃引の少なくも一部を表す。いくつかの実施形態では、検出される周波数掃引の一部は、関心の物質によって反射される音響波を構成する。他の実施形態では、検出される周波数掃引の一部は、関心の物質を通過した音響波を構成する。
【００３５】
[0049]図１は、本開示の例示的な実施形態による最適化された組織固定のための組織処理に役立つシステム１００の一実施形態を示す。システム１００は、コンピュータ１０１に結合されたプロセッサ１０５によって実行される複数の処理モジュール又は論理命令を記憶するためのメモリ１１０に通信可能に結合された音響モニタリングデバイス１０２を備える。音響モニタリングデバイス１０２は、１つ又は複数の送信機及び１つ又は複数の受信機を含む前述の音響プローブを備えることができる。組織試料は、送信機及び受信機が音響波の飛行時間（ＴｏＦ）を検出するために通信している間に、液体固定剤の中に浸漬することができる。メモリ１１０内の処理モジュールは、プロセッサ１０５が動作を実行することを可能にするための非一時的な論理的コンピュータ可読命令を含むことができ、ユーザ入力又は電子入力によって組織ブロックについての情報を受信し組織の音響速度などの組織特徴を決定する組織解析モジュール１１１と、組織の実際のＴＯＦ信号を決定し、空間的な平均を算出し、組織特徴（例えば細胞タイプ、細胞密度、細胞サイズ並びに試料調製及び／又は試料染色の効果）並びに音響モニタリングデバイス１０２からの入力に基づいて経験的な減衰定数を生成するためにＴＯＦ測定モジュール１１３のそばで、時間変化する（「予期された」又は「モデル化された」）ＴＯＦ信号を生成し様々な時間及びモデルの拡散定数についての固定剤又は試薬濃度の空間依存性をシミュレートしモデル減衰定数を出力するＴＯＦモデリングモジュール１１２と、経験的なＴＯＦデータとモデル化されたＴＯＦデータを相関させる（例えば比較させる）とともに相関性の誤差関数の最小値に基づいて組織試料についての真の拡散定数を決定するための相関モジュール１１４とを備える。これらのモジュールによって実行されるこれら及び他の動作によって、量的な結果又はグラフィカルな結果はユーザオペレーションコンピュータ１０１へ出力されることができる。したがって、図１に示されていないが、コンピュータ１０１は、キーボード、マウス、スタイラス、及びディスプレイ／タッチスクリーンなどのユーザ入出力デバイスも備えることができる。
【００３６】
[0050]上述したように、モジュールは、プロセッサ１０５によって実行される論理を備える。「論理」は、本明細書中に使用されるとき及びこれらの開示全体を通じて、プロセッサの演算に影響を与えるように適用され得る命令信号及び／又はデータの形態を有する任意の情報を指す。ソフトウェアは、そのような論理の一例である。プロセッサの例は、コンピュータプロセッサ（処理ユニット）、マイクロプロセッサ、デジタル信号プロセッサ、コントローラ、及びマイクロコントローラなどである。論理は、１つの例示的な実施形態では、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読出し専用メモリ（ＲＯＭ）、消去可能／電気的消去可能プログラマブル読出し専用メモリ（ＥＰＲＯＭＳ／ＥＥＰＲＯＭＳ）、フラッシュメモリなどであり得るメモリ１１０などのコンピュータ可読媒体に記憶される信号から形成することができる。論理は、デジタルハードウェア回路及び／又はアナログハードウェア回路を備えることもでき、例えば、ハードウェア回路は、論理ＡＮＤ、ＯＲ、ＸＯＲ、ＮＡＮＤ、ＮＯＲ、及び他の論理演算を備える。論理は、ソフトウェアとハードウェアの組み合わせから形成されてもよい。ネットワーク上で、論理は、１つのサーバ上又は複数のサーバの複合体上にプログラムされてもよい。特定の論理ユニットは、ネットワーク上の単一の論理位置に限定されない。また、モジュールは、いずれかの特定の順序で実行される必要はない。各モジュールは、実行される必要があるときには、別のモジュールを呼び出すことができる。
【００３７】
[0051]音響モニタリングデバイス１０２は、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＲＴＭ）によるＬｙｎｘ  ＩＩなどの市販のディップアンドダンク（ｄｉｐ−ａｎｄ−ｄｕｎｋ）組織プロセッサ上へ後付けすることができる。Ｓｏｌｉｄｗｏｒｋｓ（登録商標）ソフトウェアを用いて設計された機械的ヘッドは、標準的な試薬キャニスタにぴったり合いそれを封止することができる。封止されると、外部真空システムは、バルク試薬とともに組織を含むカセットの内容についてガス抜きを開始することができる。より小さい組織試料のためにＣｅｌｌＰａｔｈ（ＲＴＭ）によるＣｅｌｌＳａｆｅ  ５などの標準的なサイズの組織学的カセット、又はＣｅｌｌＰａｔｈ（ＲＴＭ）によるＣｅｌｌＳａｆｅ  Ｂｉｏｐｓｙ  Ｃａｐｓｕｌｅｓなどのバイオプシーカプセルのいずれかとともに使用されるように設計されたカセットホルダが、利用されてもよい。各ホルダは、実験中に試料が滑るのを防ぐために組織をしっかりと保持する。カセットホルダは、一方向にカセットホルダを滑らせる垂直並進運動アームに取り付けることができる。機械的ヘッドは、２つの金属ブラケットを組織カセットの両側に備えて設計することができ、一方のブラケットは５つの送信変換器を収容し、他方のブラケットは５つの受信変換器を収容し、これらはそれらのそれぞれの送信変換器に空間的に並べられている。受けブラケットは、他方の変換器の伝搬軸に直交するように向けられた変換器のペアを収容することもできる。各取得後、直交センサは、音速に重大な影響がある流体内の空間と時間のばらつきを検出するために基準ＴＯＦ値を計算することができる。さらに、各２次元取得の終わりに、カセットは持ち上げることができ、第２の基準の取得が得られる。これらの基準ＴＯＦ値は、環境的に誘起されるホルマリンのばらつきを補償するために使用することができる。環境的に誘起されるホルマリン又は任意の他の固定剤のばらつきは、例えば、多孔性物質を含む容器内の温度の変動、ばらつきなどであり得る。
【００３８】
[0052]図２Ａ及び図２Ｂは、本開示の例示的な実施形態によるバイオプシーカプセルからの超音波スキャンパターン及び標準サイズのカセットからの超音波スキャンパターンの図をそれぞれ示す。一組織例について以下に説明される測定手順及びモデリング手順は、多孔性物質の他の形態に適用することも可能であり、したがって組織試料は、多孔性物質についての非限定の例にすぎない。
【００３９】
[0053]本明細書中に記載されるように、音響モニタリングデバイスにおける音響センサからの測定値は、組織試料を通じての音響信号のＴＯＦの変化及び変化の速度を追跡するために使用することができる。これは、経時的に拡散を決定する又は拡散の速度を決定するために、経時的に異なる位置で組織試料をモニタすることを含む。
【００４０】
[0054]例えば、「異なる位置」は、「候補拡散位置（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｖｉｔｙ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とも呼ばれ、組織試料の表面内又は表面上の位置であり得る。いくつかの実施形態によれば、試料は、バイオプシーカプセル及び音響ビーム経路の相対移動によって異なる「試料位置」に配置することができる。相対移動は、段階的に又は連続的なやり方で試料上を「スキャニング」するために、受信機及び／又は変換器を移動させることを含み得る。代替として、カセットは、移動可能なカセットホルダによって位置を移し変えることができる。
【００４１】
[0055]図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、例えば、カセット内の全ての組織を撮像するために、カセットホルダは、垂直方向に≒１ｍｍだけ連続的に持ち上げることができ、ＴＯＦ値は、新しい位置ごとに必要とされる。このプロセスは、カセットの開放穴全体を覆うまで繰り返され得る。図２Ａを参照すると、バイオプシーカプセル２２０内の組織を撮像するとき、信号は、５つの変換器ペア全てから計算され、図２Ａに示されたスキャンパターンになる。代替として、図２Ｂに示された標準的なサイズのカセット２２１内の組織を撮像するとき、第２及び第４の変換器ペアはオフにすることができ、ＴＯＦ値は、標準的なサイズのカセット２２１の３つの中央区画のそれぞれ中心に位置する第１、第３、及び第５の変換器ペアの間で取得される。次いで、２つの組織コアは、列ごとに配置することができ、一方は上部にあり、一方は底部にあり、６つの試料（２行×３列）からのＴＯＦトレースが同時に得られることを可能にし、ラン・ツー・ランのばらつきをかなり減少させ、スループットを増加させる。この例示的な実施形態では、超音波ビームの半値全幅は２．２ｍｍである。
【００４２】
[0056]音響モニタリングデバイスにおける音響センサは、空間的に並べられているＣＮＩＲＨｕｒｒｉｃａｎｅ  Ｔｅｃｈ（Ｓｈｅｎｚｈｅｎ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（ＲＴＭ）によるＴＡ００４０１０４−１０などの４ＮＨｚの集束変換器のペアを備えることができ、組織試料はそれらの共通の焦点に配置される。１つの変換器、指定された変換器は、結合流体（すなわち、ホルマリン）及び組織を横断するとともに受信変換器によって検出される音響パルスを送出することができる。
【００４３】
[0057]図２Ｃは、本開示の１つの例示的な実施形態についてのタイミング図を示す。初めに、送信変換器は、数百マイクロ秒間に正弦波を送信するために、Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＲＴＭ）によるＡＤ５９３０などの波形発生器を用いてプログラムされ得る。次いで、そのパルス列は、流体及び組織を横断した後に受信変換器によって検出することができる。受信された超音波の正弦波及び送信された正弦波は、Ａｎａｌｏｇ  ＤｅｖｉｃｅｓによるＡＦ８３０２などの例えばデジタル位相比較器を用いて比較される。位相比較器の出力は、送信されたパルスと受信されたパルスの間に時間的重なりの領域中に有効な読取値をもたらす。位相比較器の出力は、Ａｔｍｅｌ（ＲＴＭ）によるＡＴｍｅｇａ２５６０などのマイクロコントローラ上の統合型アナログ／デジタル変換器で出力が照会される前に、安定することができる。次いで、プロセスは、周波数範囲にわたって入力正弦波と出力正弦波の間の位相関係を構築するために、変換器の帯域幅にわたって複数の音響周波数で繰り返され得る。この音響位相周波数掃引は、音響干渉計に類似しサブナノの第２の精度で通過時間を検出することができる後処理アルゴリズムを用いてＴＯＦを計算するのに直接使用される。
【００４４】
[0058]したがって、本発明の各実施形態によれば、特定の時点及び特定の候補拡散点について得られた「測定されたＴＯＦ」、すなわち、「測定されたＴＯＦ値」は、送信された超音波信号と対応する受信された超音波信号との間で測定された位相シフトから算出され、それによって超音波信号のビーム経路は特定の候補拡散点を横切り、それによって位相シフトは特定の時点で測定された。
【００４５】
[0059]図３は、本開示の例示的な実施形態による組織試料についての拡散係数を得る方法を示す。本実施形態に関連して開示された動作は、図１のシステムに含まれる任意の電子又はコンピュータベースのシステムによって実行することができる。これら動作は、メモリなどのコンピュータ可読媒体上に符号化することができ、プロセッサによって実行され、人間の操作者に提示できる又は続く動作に使用できる出力になる。また、これらの動作は、本開示の新規な精神が維持される限り、当業者の理解を用いて、本明細書中に開示された順序に加えて任意の順序で実行することがでる。
【００４６】
[0060]この方法は、組織試料についての音響速度の計算を含むことができる（Ｓ３３０）。この動作は、組織試料が内部に浸漬される試薬内の音の速さを計算することを含む。例えば、超音波変換器間の距離ｄｓｅｎｓｏｒ、すなわち、送信変換器と受信変換器の間の距離は、正確に測定することができ、純粋な試薬中の超音波送信機と超音波受信機の間の通過時間ｔｒｅａｇｅｎｔが測定され、ここで、試薬中の音の速さｒｒｅａｇｅｎｔは、
【００４７】
【数１】
0006632624.tif 000002
【００４８】
を用いて計算される。
[0061]組織の厚さは、測定又はユーザ入力によって得ることもできる。超音波方法、機械的方法、及び光学的方法を含む様々な適切な技法が、組織の厚さを得るために利用できる。最後に、音響速度が、
【００４９】
【数２】
0006632624.tif 000003
【００５０】
を用いてバルク試薬（例えば固定液）に対して非拡散組織（すなわち、固定液がまだ適用されていない組織試料）から位相遅れを得ることによって決定される（Ｓ３３０）。
[0062]特定の式は、組織試料の知られている幾何学的形状に基づいて得られ、一般に、この式は、時間ｔ＝０における非拡散組織試料（すなわち、試薬を欠いている、例えば固定液を欠いている組織試料）中の音の速さを表す。実験的な実施形態では、例えば、組織試料の音響速度は、較正されたカリパスを用いるようにして正確に測定される（本明細書中では「センサ」とも呼ばれる）２つの超音波変換器間の距離（ｄｓｅｎｓｏｒ）に基づいてまず試薬中の音の速さを計算することによって計算することができる。この例では、センサの隔離距離は、カリパスを用いて測定され、センサの隔離距離ｄｓｅｎｓｏｒ＝２２．４ｍｍだった。次に、センサ間の（組織を欠いている）試薬を横断する音響パルスに必要とされる通過時間（ｔｒｅａｇｅｎｔ）は、適用可能なプログラムで正確に記録することができる。実験的な例では、１０％ＮＢＦ（中性緩衝ホルマリン）のバルク試薬についてｔｒｅａｇｅｎｔ＝１６．７１μｓである。次いで、試薬（ｒｒｅａｇｅｎｔ）中の音速は、
【００５１】
【数３】
0006632624.tif 000004
【００５２】
のように計算することができる。
[0063]この実験では、扁桃の試料片は、正確で標準化された試料厚さ（ｄｔｉｓｓｕｅ＝６ｍｍ）を確実にするように６ｍｍの組織学的生検コアパンチのコアをなし、ＴＯＦ差（Δｔ）は、音響センサ間で、組織が存在する状態（ｔｔｉｓｓｕｅ＋ｒｅａｇｅｎｔ）及び組織が存在しない状態（ｔｒｅａｇｅｎｔ）、すなわち、
Δｔ＝ｔｔｉｓｓｕｅ＋ｒｅａｇｅｎｔ−ｔｒｅａｇｅｎｔ
Δｔ＝１６９２１．３−１６７０９．７＝２１１．６ｎｓ
で計算された。
【００５３】
[0064]時間ｔｒｅａｇｅｎｔは、送信変換器から受信変換器までの距離を横断するために超音波信号が必要とする時間であり、それによって信号は、試薬体積を通るが組織試料を通らない。この横断時間は、例えば、組織と同じ直径、例えば６ｍｍを有するバイオプシーカプセルを２つのセンサ間に置き、組織ではなく試薬だけを通る信号についてＴＯＦ測定を実行することによって測定することができる。
【００５４】
[0065]時間ｔｔｉｓｓｕｅは、送信変換器から受信変換器までの距離を横断するために超音波信号が必要とする時間であり、それによって信号は、試薬を含まないかつ試薬によって囲まれていない組織試料を通る。上記横断時間は、例えば、試薬をカプセルに加える前に２つのセンサ間にバイオプシーカプセルを置き、組織だけを通る信号についてＴＯＦ測定を実行することによって測定することができる。
【００５５】
[0066]
[0067]組織の厚さ及び試薬中の音の速さに加えて組織によって引き起こされる時間差（又は「ＴＯＦ差」）Δｔは、試料の知られている幾何学的形状（例えば円筒形形状、立方体形状、箱形状など）から得られる以下の式、すなわち、
【００５６】
【数４】
0006632624.tif 000005
【００５７】
を用いて非拡散組織（ｔｔｉｓｓｕｅ（ｔ＝０））の音速を計算するために使用することができる。
[0068]その後、モデリングプロセスが、様々な候補拡散定数に関してＴＯＦをモデル化するために実行される。候補拡散定数は、文献から得られた組織特性の知られている又は従来の知識から選択される定数の範囲を含む（Ｓ３３１）。候補拡散定数は、正確でないが、どんな範囲が観察下の特定の組織又は物質についてあり得るのかの大まかな見積りに単に基づいている。これらの評価された候補拡散定数は、モデリングプロセスへ送られ（ステップＳ３３２〜Ｓ３３５）、組織の真の拡散定数を得るために誤差関数の最小が決定される（Ｓ３３７）。言い換えると、方法は、拡散定数を変えることで経験的に測定されたＴＯＦ拡散曲線と一連のモデル化された拡散曲線の間の差を追跡する。
【００５８】
[0069]例えば、複数の候補拡散定数のうち１つを選択すると、組織試料中の試薬濃度の空間依存性は、円筒形の対象についての熱方程式
【００５９】
【数５】
0006632624.tif 000006
【００６０】
の解を用いて時間及び空間の関数として試薬濃度Ｃｒｅａｇｅｎｔの計算に基づいてシミュレートされる（Ｓ３３２）。
[0070]ただし、ｘは組織の深さ方向の空間座標であり、Ｒ０は試料の半径であり、Ｄは候補拡散定数であり、ｔは時間であり、Ｊ０は第１種及び０次のベッセル関数であり、Ｊ１は第１種及び１次のベッセル関数であり、αｎは０次ベッセル関数のｎ次ルートの位置であり、ｃｍａｘは試薬の最大濃度である。言い換えると、これらのベッセル関数（高次微分方程式）の各々の係数の合計は、空間、時間、及び測度の関数としての定数、すなわち拡散定数を与える。この式はこれらの実験的な実施形態に開示された円筒形組織試料に特有であるが、式は形状又は境界条件に応じて変化し、任意の形状についての熱方程式の解はその形状についての拡散定数を与えることができる。
【００６１】
[0071]このステップは、複数の時点について繰り返されて（Ｓ３３３〜Ｓ３３４）、（特定の時点における予期された試薬濃度の積分は音の速さの微分を算出するために使用することができるので、予期された試薬濃度に対応する）時間変化するＴＯＦを得る（Ｓ３３５）。例えば、拡散時間が完了したか否かについての判定がなされる。この拡散時間は、使用されるハードウェア又はシステムのタイプに基づくことができる。時間間隔Ｔごとに、ステップＳ３３３、Ｓ３３４、及びＳ３３２は、モデル化された試料濃度が時間変化するＴＯＦ信号へ変換されてモデリング時間が完了するまで繰り返される（Ｓ３３５）。
【００６２】
[0072]実験的な実施形態では、使用される各候補拡散定数Ｄｃａｎｄｉｄａｔｅは、以下の値、すなわち
０．０１≦Ｄｃａｎｄｉｄａｔｅ≦２μｍ２／ｍｓ
の範囲内に含まれる。
【００６３】
[0073]組織試料は、円筒形生検コアパンチのコアをなし、したがって円筒形によってよく近似され得る。次いで、上記熱方程式の解を使用して組織試料中の試薬の予期された濃度（ｃｒｅａｇｅｎｔ）を計算し、実験の第１の時点について、すなわち、（開示された実験を実行するシステムに使用されるＴＯＦ取得間の時間間隔に基づいて）拡散の１０４秒後、組織の深さ方向の試薬の濃度を表す解は、図５Ａに示されている。例えば、特定のシステムは、ここでは「ピクセル」とも呼ばれるいくつかの異なる空間位置ごとに新しいＴＯＦ値を規則的に測定することができる。したがって、各「ピクセル」は、例えば１０４秒ごとに新しいＴＯＦ値を割り当てる更新レートを有することができる。
【００６４】
[0074]図５Ａは、実験的な実施形態における熱方程式から計算される受動的拡散の１０４秒後の組織の６ｍｍの試料の中への１０％ＮＢＦのシミュレートされた濃度の傾きを示す。また、これらのステップは、実験している間（実験的な実施形態においては８．５時間の長さ）の１０４秒ごとに繰り返される組織全体を通じての試薬の濃度を決定することが繰り返され、その結果は図５Ｂに示されている。
【００６５】
[0075]図５Ｂは、組織中（水平方向軸）の全ての位置並びに全ての時間における（「予期された」、「モデル化された」、又は「熱方程式ベースの」）試薬の濃度を表示するｃｒｅａｇｅｎｔ（ｔ，ｒ）のグラフを示す（上向きに移動する曲線）。
【００６６】
[0076]図３に戻って参照すると、試薬モデリングステップ（Ｓ３３２〜Ｓ３３４）の結果を使用して、超音波検出機構が組織の深さに関して位相遅れを線形的に構築することに基づいて超音波信号への寄与を予測する。
【００６７】
[0077]超音波は、深さ方向に、すなわちＵＳビームの伝搬軸に沿って全ての組織からの積分信号を検出し、したがって深さ方向に流体交換の積算量に影響されやすいので、「積分され予期された」試薬濃度ｃｄｅｔｅｃｔｅｄは、「検出された試薬濃度」とも呼ばれ、計算され得る。したがって、「検出された試薬濃度」は、経験的に検出された値ではない。むしろ、それは、特定の時点ｔ及び特定の候補拡散定数について算出された全ての予期された試薬濃度を空間的に積分することによって生成される微分値である。空間的積分は、例えば、組織試料の半径を覆うことができる。
【００６８】
[0078]例えば、検出された試薬濃度ｃｄｅｔｅｃｔｅｄは、
【００６９】
【数６】
0006632624.tif 000007
【００７０】
を用いて計算することができる。
[0079]いくつかの実施形態によれば、統合された試薬濃度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）ｃｄｅｔｅｃｔｅｄは、特定の時点における試薬の総量を計算するために使用される。例えば、試料のさらなる体積及び／又は重量の情報は、絶対的な試薬の量を計算するのに使用することができる。代替として、試薬の量は、例えば、試薬によってすでに拡散させられている試料の体積分率［％］を示す、例えば百分率値として、相対的単位で算出される。
【００７１】
[0080]シミュレーション（すなわち、熱方程式モデルに基づく算出）の後、所与の候補拡散定数及び所与の時点についての試薬の検出された濃度は、次いで、
【００７２】
【数７】
0006632624.tif 000008
【００７３】
を用いて非拡散組織と試薬の線形結合としてＴＯＦ信号に変換することができる（Ｓ３３５）。
[0081]ただし、ｒｔｉｓｓｕｅ（ｔ＝０）は、非拡散組織の音の速さであり、ρは、バルク試薬と流体交換できる組織試料の体積分率を表す組織の気孔率（ｖｏｌｕｍｅ  ｐｏｒｏｓｉｔｙ）である。したがって、この式は、２つの別個の音速（組織及び試薬）の線形結合として拡散からのＴＯＦ信号の変化をモデル化する。一方で純粋な組織及び他方で純粋な試薬のそれぞれの音速のＴＯＦは、（例えば、それぞれの位相シフトベースのＴＯＦ測定によって）経験的に容易に決定することができるので、特定の時点で試料の中にすでに拡散させられた試薬の量は、容易に決定することができる。
【００７４】
[0082]各実施形態によれば、（試料緩衝液又は組織流体などのバルク流体のＴＯＦ寄与がない）純粋な組織試料のＴＯＦ寄与は、バルク流体だけで満たされている対応する変換器間距離を横切った超音波信号について測定されたＴＯＦ寄与からバルク流体を含む及び／又はバルク流体によって囲まれる組織試料について測定されたＴＯＦ寄与を差し引くことによって得ることができる。
【００７５】
[0083]図６Ａ及び図６Ｂは、それぞれ、実験している間の超音波によるシミュレートされた、「検出された」、又は「統合された」ＮＢＦの濃度のグラフ（図６Ａ）と、第１の候補拡散定数についてシミュレートされた（又は「予期された」）ＴＯＦ信号のグラフ（図６Ｂ、ただしＤ＝０．０１μｍ２／ｍｓ）とを示す。図６ＢのＴＯＦ信号は、試薬のそれぞれの積分濃度の微分として算出される。
【００７６】
[0084]この点で、この方法は、概して、モデル化された（又は「シミュレートされた」もしくは「予期された」）ＴＯＦを、組織試料内の「候補拡散点」とも呼ばれる異なる空間的な関心領域（ＲＯＩ：ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ）を測定し真の拡散定数を得るために誤差関数の最小値を決定することによって決定された経験的なＴＯＦと相関させる（Ｓ３３６）。この例では、（Ｓ３２２）によって特定された範囲内で選択された特定の拡散定数について各モデル化されたＴＯＦは、経験的なＴＯＦと相関（Ｓ３３６）し、誤差が最小化されるか否かについての決定がされる（Ｓ３３７）。誤差が最小化されない場合、次の拡散定数が選択され（Ｓ３３８）、モデリングプロセスが新しい拡散定数について繰り返される（Ｓ３３２〜Ｓ３３５）。誤差が最小化される（Ｓ３３７）ことが相関性（Ｓ３３６）に基づいて決定される場合、真の拡散定数が決定され（Ｓ３３９）、この方法は終わる。
【００７７】
[0085]図４は、代替の方法を示しており、それによって全ての候補拡散定数は、まず、ステップＳ４４６〜Ｓ４４７に基づいてモデリングを実行するために使用され、全ての拡散定数が処理された後、相関性が実行される（Ｓ４４８）。全ての潜在的な拡散定数について計算された時間変化するＴＯＦ信号の図が図７に示されている。例えば、図７は、６ｍｍの組織試料について８．５時間の実験に関してシミュレートされたＴＯＦトレースを示しており、拡散定数は０．０１から２．０μｍ２／ｍｓの範囲であった。図４の実施形態では、誤差最小化は、真の拡散定数決定ステップＳ４３９内で実行される。
【００７８】
[0086]いずれにしても、経験的なＴＯＦは、相関性が生じることについて決定されなければならない。経験的なＴＯＦは、組織内の異なる空間的な関心領域（ＲＯＩ）を測定することによって決定することができる。各信号は、組織の中への活性拡散から寄与を分離するために減じられたバックグラウンド試薬からの寄与を有する。個々のＴＯＦ傾向は、フィルタリングによって時間的に滑らかにされる。次いで、これらの空間的に別個のＴＯＦ傾向は、組織の中への１０％ＮＢＦの拡散の平均速度を決定するために空間的に平均化される。
【００７９】
[0087]図８Ａ及び図８Ｂは、６ｍｍ片の人間の扁桃試料から収集された経験的に計算されたＴＯＦの傾向（図８Ａ）、及び組織の中への１０％ＮＢＦの流体交換の平均速度及び量を表す空間的に平均化されたＴＯＦ信号（図８Ｂ）をそれぞれ示す。
【００８０】
[0088]組織の中への拡散の平均速度は、（図８Ｂに破線によって示された）単一の指数信号に非常に相関しており、
【００８１】
【数８】
0006632624.tif 000009
【００８２】
によって得られる。
[0089]ただし、Ａはナノ秒単位のＴＯＦの振幅（すなわち、拡散されていない組織試料と完全に拡散された組織試料の間のＴＯＦ差）であり、τｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌは、ＴＯＦがその振幅の３７％まで減衰するのに必要な時間、すなわち６３％減衰されるのに必要な時間を表す試料の減衰定数であり、オフセットは上記の所与の減衰関数の垂直オフセットである。
【００８３】
[0090]この６３％は、以下の計算、すなわち、
時間ｔ＝τにおいて、ＴＯＦ（τ）＝Ａｅ（−ｔａｕ／ｔａｕ）＝Ａｅ−１＝Ａ／ｅ＝Ａ／２．７２＝０．３７＊Ａ
によって得ることができる。
【００８４】
[0091]試料中の試薬濃度が増加するにつれてＴＯＦが減少するとここで仮定されるが、この方法は同様に試薬に適用可能であり、これによって試料の中に拡散すると測定されたＴＯＦを増大させる。実験的な実施形態の６ｍｍ片の人間の扁桃では、τｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝２．８３時間である。したがって、複数の連続した時点について経験的に決定された複数のＴＯＦから、組織試料の減衰定数は、例えば、経時的にＴＯＦ信号の振幅をグラフで描き、オフセットを特定するグラフを解析し、減衰定数についての上記解を解くことによって算出することができる。
【００８５】
[0092]誤差相関性（図３のＳ３３６、図４のＳ４４８）は、モデル化された（「予期された」）ＴＯＦ対経験的なＴＯＦの誤差を決定するために実行される。計算されたＴＯＦ信号、シミュレートされたＴＯＦ信号、及び経験的なＴＯＦ信号を有すると、２つの信号の間の差は、候補拡散定数が２つの信号の間の差を最小化するか否か見るために計算することができる（Ｓ３３７）。
【００８６】
[0093]誤差関数は、例えば、以下のもの、すなわち、
【００８７】
【数９】
0006632624.tif 000010
【００８８】
誤差（Ｄ）＝（τｓｉｍｕｌａｔｅｄ（Ｄ）−τｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）２
を用いて一組の異なるやり方で算出することができる。
[0094]第１の誤差関数は、シミュレートされた（「モデル化された」、「予期された」）ＴＯＦ信号と経験的に測定されたＴＯＦ信号との間の差を一つ一つ計算する。
【００８９】
[0095]第２の誤差関数は、それぞれの減衰定数の間の差の二乗の和を計算することによってシミュレートされたＴＯＦ信号とモデル化されたＴＯＦ信号との間の拡散の速度を排他的に比較する。経験的な減衰定数τｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌは、上述したように、経験的に得ることができる。「モデル化された」、「予期された」、又は「シミュレートされた」減衰定数τｓｉｍｕｌａｔｅｄは、減衰関数にやはり従う連続した時点のモデル化された（「予期された」）ＴＯＦ信号から類似的に得ることができる。
【００９０】
[0096]誤差関数の出力に基づいて、真の拡散定数を決定することができる（Ｓ３３９）。真の拡散定数は、例えば、
Ｄｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ＝ａｒｇ  ｍｉｎ（誤差（Ｄ））
のように誤差関数の最小値として計算される。
【００９１】
[0097]この式は、経験的データにできる限り近いＴＯＦ信号を生成する候補拡散係数の決定を可能にする。
[0098]例えば、図３に示された方法に関して、誤差関数は、誤差が最小化される（Ｓ３３７）まで候補拡散定数ごとに決定することができる。代替として、図４の方法では、経験的なＴＯＦとの相関性は、全ての候補拡散定数が処理された後に実行することができ、これに関し、真の拡散定数の決定（Ｓ４３９）は、誤差関数の最小値を決定することを含む。誤差関数の最小値は、理想的にゼロ又は可能な限りゼロの近くである。当業界で知られている何らかの誤差関数を、当業者によって使用することができ、その目標は本明細書中に開示されたモデル化された係数と経験的な係数の間の誤差を最小化することである。
【００９２】
[0099]図９Ａおよぶ図９Ｂは、それぞれ、候補拡散定数の関数として（図９Ａ、ΔＤ≒１０ｅ〜５μｍ２／ｍｓ）、及び誤差関数の拡大図（図９Ｂ）としてシミュレートされたＴＯＦ信号と経験的に測定されたＴＯＦ信号との間の計算された誤差関数のグラフを示す。実験的な実施形態では、誤差関数の最小値は、Ｄ＝０．１６１８μｍ２／ｍｓにおけるものであるように計算された。再構築された定数の有効性は、試験され、ＴＯＦ傾向をバックシミュレートする（ｂａｃｋ−ｓｉｍｕｌａｔｅ）ために使用される。図１０は、この拡散定数を用いて計算されるとともに６ｍｍ片の人間の扁桃で測定された経験的なＴＯＦに沿ってグラフで描かれたＴＯＦ傾向を示す。図１０では、グラフは、１０％ＮＢＦの６ｍｍ片の人間の扁桃から経験的に計算されたＴＯＦ傾向（破線）と、Ｄｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ＝０．１６８μｍ２／ｍｓについてのモデル化されたＴＯＦ傾向（実線）とを示す。この実施形態では、τｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝２．８３０時間及びτｓｉｍｕｌａｔｅｄ＝２．８２９時間である。
【００９３】
[00100]さらに、この同じ手順は、図１１Ａ及び図１１Ｂに示されるように、全ての試料についてうまく再構築された拡散定数を有する６ｍｍの人間の扁桃試料のいくつかの標本について繰り返された。図１１Ａは、６ｍｍの人間の扁桃の２３個の試料について再構築された拡散定数を示す。線１１５１は平均を表す。図１１Ｂは、再構築された拡散定数の分布を示す箱及び箱ひげ図を示す。線１１５２は中央値を表し、箱１１５３は２５〜７５百分位数から延び、箱ひげ１１５４は５〜９５百分位数から延びる。全体的に、アルゴリズムで予測された６ｍｍの扁桃試料は、０．１８４９μｍ２／ｍｓの平均拡散定数を有し、比較的きつく分布しており、標準偏差０．０５４５μｍ２／ｍｓをもたらす。
【００９４】
[00101]図１２Ａは、本発明の実施形態による超音波信号の飛行時間をモニタするためのシステムを示す。超音波ベースの飛行時間（ＴＯＦ）モニタリングシステムは、超音波信号の位相シフトに基づいて飛行時間の測定を実行するための一対又は複数対の変換器（例えば、ＴＡ００４０１０４−１０、ＣＮＩＲＨｕｒｒｉｃａｎｅ  Ｔｅｃｈ）を備えることができる。図１２Ａに示される実施形態では、システムは、超音波（「ＵＳ」）送信機９０２と超音波受信機９０４とからなる少なくとも１対の変換器を備え、超音波（「ＵＳ」）送信機９０２及び超音波受信機９０４は、送信機から受信機までのビーム経路９１４内に配置される組織試料９１０が２つの変換器９０２、９０４の共通焦点の近くに位置するように、互いに対して空間的に配列される。組織試料９１０は、例えば、固定液で満たされている試料容器９１２（例えば、ＣｅｌｌＰａｔｈの「セルセーフ（ＣｅｌｌＳａｆｅ）５」のような標準的な組織カセット、又はＣｅｌｌＰａｔｈの「セルセーフ・バイオプシー・カプセル（ＣｅｌｌＳａｆｅ  Ｂｉｏｐｓｙ  Ｃａｐｓｕｌｅｓ）」のようなバイオプシーカプセル）内に収容することができる。位相シフトベースのＴＯＦ測定は、バイオプシーカプセル９１２が固定液で満たされる前後に、この液が試料の中にゆっくりと拡散する間に実行される。送信機として働く一方の変換器は、組織を横断する音響パルスを送出し、受信機として働く他方の変換器によって検出される。送信機受信機変換器ペアを構成する２つの変換器の間の総距離は「Ｌ」と呼ばれる。超音波信号が送信機９０２と受信機９０４の間の距離を横断するのに必要とする合計時間は、信号の飛行時間と呼ぶことができる。送信機９０２は、例えば、４ＭＨｚに集中され、３．７〜４．３ＭＨｚの周波数掃引範囲をサポートすることができる。
【００９５】
[00102]各実施形態によれば、距離Ｌは、ここでは少なくとも概算で知られていると仮定される。例えば、変換器の距離は、（例えば、光学的測定技法、超音波ベースの測定技法、又は他の測定技法によって）正確に測定することができ、又は音響モニタリングシステムの製造業者によって開示することができる。
【００９６】
[00103]送信変換器９０２は、定められた時間間隔、例えば数百マイクロ秒の間に、定められた周波数について正弦波（又は「正弦波信号」）を送信するように波形発生器（例えば、Ａｎａｌｏｇ  ＤｅｖｉｃｅｓからのＡＤ５９３０）を用いてプログラム可能である。この信号は、流体及び／又は組織を横断した後に受信変換器９０４によって検出される。受信された超音波信号９２２及び発せられた（「送信された」とも呼ばれる）正弦波信号９２０は、デジタル位相比較器（例えば、ＡＤ８３０２、Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて電子的に比較される。
【００９７】
[00104]本明細書中に使用される「受信された」「信号」（又は波）は、変換器、例えば信号を受信する受信機９０４によって特定され提供される特性（位相、振幅、及び／又は周波数など）を有する信号である。したがって、信号特性は、信号が試料又は任意の他の種類の物質を通った後に特定される。
【００９８】
[00105]本明細書中に使用される「送信された」又は「発せられた」「信号」（又は波）は、変換器、例えば信号を発する送信機９０２によって特性される特性（位相、振幅、及び／又は周波数など）を有する信号である。したがって、信号特性は、信号が試料又は任意の他の種類の物質を通ってしまう前に特定される。
【００９９】
[00106]例えば、送信された信号は、送信変換器によって特定される信号特性によって特徴付けすることができ、受信された信号は、受信変換器によって測定された信号特性よって特徴付けすることができ、そしてそれによって送信変換器及び受信変換器は、音響モニタリングシステムの位相比較器に動作可能に結合される。
【０１００】
[00107]図１２Ｂは、試料のない純粋な試薬を横切るビーム経路についての音波の速さを推論することができる純粋な試薬についてのＴＯＦの決定を示す。本実施形態では、１つ又は複数の変換器ペア９０２、９０４及び試料容器９１２は、互いに対して移動することができる。好適には、システムは、ＵＳビームが固定液だけを含むが組織を含まない容器の領域９１４を横断するように容器９１２の位置を移し変えることができる容器ホルダを備える。
【０１０１】
[00108]時間Ａにおいて、組織が固定液中にまだ浸漬されていないとき、変換器間の距離を横断する音信号についてのＴＯＦは、図１２Ａに説明されたように、測定された位相シフトφｅｘｐによって得られる。この場合には、ビーム経路は、試薬がない試料を横切る。Ｌが知られているので、測定されたＴＯＦは、非拡散試料の存在中の距離を横断する音信号の速さを算出するために使用することができる。
【０１０２】
[00109]時間Ｂにおいて、組織が固定液中に浸漬されるとき、変換器間の距離を横断する音信号についてのＴＯＦは、測定された位相シフトφｅｘｐによって得られる。この場合には、ビーム経路は、試薬だけを含み試料を含まない試料容器を横切る（又は、試料がない位置で試料容器を横切る）。Ｌが知られているので、測定されたＴＯＦは、ビーム経路中に試薬（及び試料容器）だけが存在する距離、すなわち、試料が存在しない距離を横切るための音信号の速さを算出するために使用することができる。時間Ａ及び時間Ｂは、さらなる変換器ペアが並列で２つの測定を実行するように構成されている場合に、同一の時点を表すことができる。
【０１０３】
[00110]さらなる態様では、本発明は、多孔性物質９１０を通じて移動した音響波９２２を検出する音響モニタリングデバイスと、音響モニタリングデバイス１０２に通信可能に結合されたコンピューティングデバイス１０１とを備えたシステム１００に関する。このコンピューティングデバイスは、実行時に、
○  検出された音響波の測定された音響データから経験的なＴＯＦのセットを算出することであって、各経験的なＴＯＦは複数の時点のうちのそれぞれの時点で多孔性物質の候補拡散点を通じて移動した音響波のＴＯＦを示し、候補拡散点は多孔性物質の表面内又は表面に位置する、経験的なＴＯＦのセットを算出することと、
○  多孔性物質についての候補拡散定数の範囲を設定することと、
○  試薬の予期される濃度が時間、空間、及び候補拡散定数の関数であり、候補拡散定数ごとに、複数の時点について及び候補拡散点について多孔性物質内の試薬の予期される濃度の空間依存性濃度モデルをシミュレートすることと、
○  空間依存性濃度モデルを使用して多孔性物質についての空間依存性ＴＯＦモデルを算出することであって、ＴＯＦモデルは、複数の時点ごとに及び候補拡散定数ごとに、候補拡散点へ、それぞれモデル化されたＴＯＦを割り当てるものであり、表現「モデル化された」、「シミュレートされた」、及び「予期された」は、互いに交換可能に本明細書中に使用され、例えば、「使用」は、空間依存性濃度モデルを空間依存性ＴＯＦモデルへ変換することからなり得る、空間依存性濃度モデルを使用することと、
○  候補拡散点について誤差関数を決定することであって、誤差は、対応する経験的なＴＯＦから候補拡散点へ割り当てられた各モデル化されたＴＯＦの間の（「誤差」ともみなされ得、「誤差」とも呼ばれ得る）距離を示し、経験的なＴＯＦは、その対応するモデル化されたＴＯＦをモデル化するのに使用されるのと同じ時点で音響モニタリングデバイスによって測定される、誤差関数を決定することと、
○  対応する経験的なＴＯＦまで最小距離を有する１つ又は複数のモデル化されたＴＯＦを特定するために誤差関数を使用することと、
○  １つ又は複数の特定されたモデル化されたＴＯＦの候補拡散定数から多孔性物質について計算された拡散定数を出力することと
を含む動作をコンピューティングデバイスに実行させる命令を含む。
【０１０４】
[00111]さらなる態様では、本発明は、対応する方法に関する。
[00112]各実施形態によれば、空間依存性ＴＯＦモデルを算出するステップは、多孔性物質について熱方程式を解くことによって各モデル化されたＴＯＦを決定するステップを含む。
【０１０５】
[00113]各実施形態によれば、経験的なＴＯＦのセットを算出するステップは、多孔性物質の２つ以上の候補拡散点について実行される。空間依存性濃度モデルは、複数の時点について及び２つ以上の候補拡散点の各々について多孔性物質内の試薬の予期される濃度を示すコンピュータモデル、例えば１つ又は複数のモデリング関数のセットである。空間依存性ＴＯＦモデルは、複数の時点ごとに及び候補拡散定数ごとに、２つ以上の候補拡散点の各々へ、それぞれモデル化された（又は「予期された」）ＴＯＦを割り当てる。
【０１０６】
[00114]各実施形態によれば、音響データは、試薬が拡散する前の多孔性物質中の音波の速度と、及び／又は多孔性物質の中への試薬の拡散中の複数の時点における多孔性物質を通じての音響波の経験的なＴＯＦ、及び／又は経験的な位相シフトデータであって、経験的な位相シフトデータから経験的なＴＯＦを算出するための経験的な位相シフトデータ、及び／又は多孔性物質がない試薬中の音波の速度、及び／又は多孔性物質の厚さを含む。例えば、厚さは、各実施形態によれば、パルスエコー超音波を用いて決定される。
【０１０７】
[00115]各実施形態によれば、空間依存性ＴＯＦモデルの算出は、
○  候補拡散定数のうちの最初のものを選択するステップと、
○  選択された候補拡散定数に依存して複数の時点ごとに多孔性物質中の複数の候補拡散点の各々で予期された試薬濃度（ｃｒｅａｇｅｎｔ）を計算するステップと、
○  多孔性物質の半径にわたって時点及び候補拡散定数について計算された予期された試薬濃度（ｃｒｅａｇｅｎｔ）を積分することによって、複数の時点ごとに及び候補拡散定数ごとに、統合された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｃｔｅｄ）を計算するステップと、
○  試薬が拡散する前の多孔性物質中の音波の速さと多孔性物質がない試薬中の音波の速さとの線形結合を算出することによって、統合された試薬濃度を空間依存性ＴＯＦモデルのそれぞれのモデル化されたＴＯＦへ変換するステップと、
○  候補拡散定数のうちの次のものを選択するステップと、終了基準に到達するまで次の選択された候補拡散定数のためにこのステップ及び３つの前のステップを繰り返すステップとを含む。
【０１０８】
[00116]要するに、任意の試料物質についての拡散定数の決定は、所与の温度、圧力などで試薬中の音の速さを計算し、標準的なパルスエコー超音波を用いて試料の厚さを決定し、超音波の位相遅れによって非拡散試料中の絶対的な音速を決定し、続いて候補拡散定数からモデル化されたＴＯＦ傾向を生成し、試料の中への試薬拡散の空間依存性をまずシミュレートし、超音波ビームによって検出された試薬濃度全体を合計し、検出された試薬濃度をＴＯＦ差へ変換し、複数の拡散時間の間これらのステップを繰り返すことによって行うことができる。次いで、モデル化されたＴＯＦ傾向は、（知られている文献によって示されるように）複数の候補拡散定数についての空間依存性シミュレーションを繰り返し、全ての時間で及び全ての拡散定数について経験的なＴＯＦ差とシミュレートされたＴＯＦ差の間の誤差を計算し、経験的なＴＯＦとモデル化されたＴＯＦの間の誤差関数を拡散定数として結果として得ることによって決定される。誤差関数の最小値として真の拡散定数を計算することによって出力を得る。
【０１０９】
[00117]また、本開示は、生物学的内容と非生物学的内容の両方に当てはまり、音響ＴＯＦ曲線に基づいて任意の物質の拡散定数を再構築する能力を与える。開示された方法は、従来技術の方法に比べてより敏感かつ正確である。開示された演算は、ＴＯＦ曲線をベッセル関数の和を含む単一の指数関数へフィットすることを行うが、内容に応じて、二重指数関数又は二次関数がより適切である場合もある。したがって、式自体は、変更されてもよく、一方、本明細書中に開示された新規な特徴は、当業者によって読まれたときにそれらの発明の精神及び範囲を維持することができる。
ＩＩＩ．本システム及び方法の例示的な応用
[00118]拡散定数計算は、組成解析を含む多くの応用に役立つことが知られている。本システム及び方法は、拡散定数測定を利用する任意のシステムに使用されることが考えられる。１つの特定の実施形態では、本システム及び方法は、流体が多孔性物質の中へ拡散するのをモニタリングする分野に適用される。
【０１１０】
[00119]１つの特定の実施形態では、多孔性物質は組織試料である。多くの一般的な組織解析法では、組織試料は、流体溶液で拡散される。例えば、Ｈｉｎｅ（Ｓｔａｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９８１  Ｍａｒ；５６（２）：１１９−２３）は、固定後又は埋め込み及び切断前に、ヘマトキシリン溶液及びエオシン溶液の中に組織試料を浸漬することによって組織ブロック全体を色付けする方法を開示する。さらに、固定は、固定されていない組織試料を固定剤溶液の体積の中に浸漬することによってしばしば実行され、固定剤溶液は、組織試料の中に拡散することが許可される。Ｃｈａｆｉｎら（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（１）：ｅ５４１３８．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．  ００５４１３８（２０１３年））によって示されるように、固定剤が組織の中に十分に拡散したことを確実にすることができないことは、組織試料の完全性を損ない得る。したがって、一実施形態では、本システム及び方法は、組織試料の中への固定剤の十分な拡散時間を決定するために適用される。そのような方法では、ユーザは、組織試料内の特定の点（組織試料の厚さの中心など）で実現される最小固定剤濃度を選択する。少なくとも組織の厚さ、組織の幾何学的形状、及び計算された真の拡散定数を知っていれば、当業者は、組織試料の中心での最小固定剤濃度に到達するための最小時間を決定するために、よく知られている「拡散」又は「拡散率」アルゴリズムを適用することができる。したがって、固定剤は、少なくとも最小時間の間に組織試料の中に拡散させることが可能にされる。
【０１１１】
[00120]１つの実施形態では、本システム及び方法は、組織試料に対して２つの温度浸漬固定法を実施するために使用される。本明細書中に使用されるとき、「２温度固定法」は、第１の期間の間に低温固定剤溶液中に組織がまず浸漬され、続いて第２の期間の間に組織を加熱する固定法である。低温ステップは、架橋結合を実質的に引き起こすことなく、固定剤溶液が組織全体を通じて拡散することを可能にする。次いで、組織が組織全体にわたって十分に拡散されると、加熱ステップは、固定剤によって架橋結合をもたらす。低温拡散、それに続く加熱ステップの組み合わせは、標準的な方法を用いるよりもより完全に固定される組織試料をもたらす。したがって、１つの実施形態では、組織試料は、（１）低温固定剤溶液中に固定されていない組織試料を浸漬するとともに、本明細書中に開示されたようなシステム及び方法を用いて組織試料におけるＴＯＦをモニタすることによって組織試料の中への固定剤の拡散をモニタする（拡散ステップ）、及び（２）閾値ＴＯＦが測定された後に、組織試料の温度が上昇することを可能にする（固定ステップ）ことによって固定される。例示的な各実施形態では、拡散ステップは、２０℃未満、１５℃未満、１２℃未満、１０℃未満、０℃から１０℃の範囲内、０℃から１２℃の範囲内、０℃から１５℃の範囲内、２℃から１０℃の範囲内、２℃から１２℃の範囲内、２℃から１５℃の範囲内、５℃から１０℃の範囲内、５℃から１２℃の範囲内、５℃から１５℃の範囲内である固定剤溶液中で実行される。例示的な各実施形態では、組織試料を囲む環境は、固定ステップ中に２０℃から５５℃の範囲内で上昇することが許容される。いくつかの実施形態では、固定剤は、グルタルアルデヒド及び／又はホルマリン基の溶液などのアルデヒド基の架橋結合固定剤である。浸漬固定にしばしば使用されるアルデヒドの例は、以下に挙げるものである。
【０１１２】
・  フォームアルデヒド（ほとんどの組織について、標準作用濃度５〜１０％ホルマリンであるが、いくつかの組織には２０％ホルマリンと同程度高さの濃度が使用されている）
・  グリオキサール（標準作用濃度１７から８６ｍＭ）
・  グルタルアルデヒド（標準作用濃度２００ｍＭ）
[00121]アルデヒドは、しばしば互いに組み合わされて使用される。標準的なアルデヒドの組み合わせは、１０％ホルマリン＋１％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒドを含む。典型的なアルデヒドがある特殊化された固定応用に使用されており、フマルアルデヒド、１２．５％ヒドロキシアジポアルデヒド（ｐＨ７．５）、１０％クロトンアルデヒド（ｐＨ７．４）、５％ピルビンアルデヒド（ｐＨ５．５）、１０％アセトアルデヒド（ｐＨ７．５）、１０％アクロレイン（ｐＨ７．６）、及び５％メタアクロレイン（ｐＨ７．６）を含む。免疫組織化学に使用されるアルデヒド基固定剤溶液の他の特定の例は、表１に記載されている。
【０１１３】
【表１】
0006632624.tif 000011
【０１１４】
[00122]いくつかの実施形態では、固定剤溶液は、表１から選択される。いくつかの実施形態では、使用されるアルデヒド濃度は、上述した標準的な濃度よりも高い。例えば、ほぼ同様の組成を有する免疫組織化学のために選択された組織を固定するために使用される標準的な濃度より少なくとも１．２５倍も高いアルデヒド濃度を有する高濃度アルデヒド基固定剤溶液が使用される。いくつかの例では、高濃度アルデヒド基の固定剤溶液は、２０％より多いホルマリン、約２５％以上のホルマリン、約２７．５％以上のホルマリン、約３０％以上のホルマリン、約２５％から約５０％ホルマリン、約２７．５％から約５０％ホルマリン、３０％から約５０％ホルマリン、約２５％から約４０％ホルマリン、約２７．５％から約４０％ホルマリン、及び約３０％から約４０％ホルマリンから選択される。この文脈で使用されるとき、用語「約」は、Ｂａｕｅｒら、Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｓｕｂｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｕｌｔｒａ−ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ（生物指標化合物保存の超精密拡散モニタリング及び最適化のための動的サブナノ秒飛行時間検出）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ＳＰＩＥ，Ｖｏｌ．９０４０，９０４００Ｂ−１（２０１４年３月２０日）によって測定されるように、４℃における拡散において統計的にかなり大きい差とならない濃度を包含するものとする。
【０１１５】
[00123]２温度固定プロセスは、例えばリン酸化たんぱく質、ＤＮＡ、及び（ｍｉＲＮＡ及びｍＲＮＡなどの）ＲＮＡ分子が含まれる組織試料中のある種の不安定生物指標化合物を検出する方法に特に役立つ。ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５２８００（参照により本明細書中に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態では、これらの方法を用いて得られる固定された組織試料は、そのような不安定標識の存在について分析を受けることができる。したがって、１つの実施形態では、試料中の不安定標識を検出する方法が提供され、方法は、本明細書中に開示されたように２温度固定に従って組織を固定し、固定した組織試料を不安定標識に特に結合することができる分析物結合実体に接触させることを含む。分析物結合実体の例は、標的抗原に結合する抗体及び抗体フラグメント（一本鎖抗体を含む）、ＭＨＣ：抗原複合体に結合するＴ細胞受容体（単一鎖受容体を含む）、（特定のＴ細胞受容体に結合する）ＭＨＣ：ペプチドマルチマー、特定の核酸又はペプチドターゲットに結合するアプタマー、特定の核酸、ペプチド、及び他の分子に結合するジンクフィンガー、受容体リガンドに結合する（単一の鎖受容体及びキメラ受容体を含む）受容体複合体、受容体複合体に結合する受容体リガンド、及び特定の核酸に混成させる核酸プローブを含む。例えば、組織試料中のリン酸化たんぱく質を検出する免疫組織化学的方法が提供され、この方法は、前述の２温度固定法に従って得られた固定された組織をリン酸化たんぱく質に特有の抗体と接触させ、リン酸化たんぱく質への抗体の結合を検出することを含む。他の実施形態では、核酸分子を検出するｉｎ  ｓｉｔｕ混成法が提供され、方法は、前述の２温度固定法に従って得られた固定された組織を関心の核酸に特有の核酸プローブと接触させ、関心の核酸へのプローブの結合を検出することを含む。
【０１１６】
[00124]本開示の例示的な各実施形態の前述の開示は、例示及び記述のために示された。網羅的であること又は開示された精密な形態に本開示を限定することは意図されていない。本明細書中に記載された実施形態の多くの変形形態及び修正形態は、上記の開示の観点で当業者に明らかであろう。本開示の範囲は、本明細書に添付された特許請求の範囲によって及びその均等物によってのみ定められるものである。
【０１１７】
[00125]さらに、本開示の説明している代表的な実施形態では、本明細書は、本開示の方法及び／又はプロセスを特定の一連のステップとして示すことができる。しかしながら、方法又はプロセスが本明細書中に記載されたステップの特定の順序に頼らない限りにおいては、方法又はプロセスに記載されたステップの特定の順番に限定されるべきではない。当業者は、他の順番のステップも可能であり得ることを理解されよう。したがって、本明細書中に記載されたステップの特定の順序は、特許請求の範囲の限定とみなされるべきではない。加えて、本開示の方法及び／又はプロセスに向けられた特許請求の範囲は、記載された順序のステップの実施に限定されるべきではなく、当業者は、順番は変更されて
もよく、本開示の精神及び範囲内のままであり得ることを容易に理解できよう。
本願発明の実施例には、以下の発明を含むが、これに限定されない：
［発明１］
多孔性物質（９１０）を通じて移動した音響波（９２２）を検出する音響モニタリングデバイスと、
前記音響モニタリングデバイス（１０２）に通信可能に結合されたコンピューティングデバイス（１０１）と
を備えたシステム（１００）であって、前記コンピューティングデバイスは、実行時に、
前記検出された音響波の測定された音響データから経験的なＴＯＦのセットを算出することであって、各経験的なＴＯＦは複数の時点のうちのそれぞれの時点で前記多孔性物質の候補拡散点を通じて移動した音響波のＴＯＦを示す、経験的なＴＯＦのセットを算出することと、
前記多孔性物質についての候補拡散定数の範囲を設定することと、
試薬の予期される濃度が時間、空間、及び前記候補拡散定数の関数であり、前記候補拡散定数ごとに、前記複数の時点について及び前記候補拡散点について前記多孔性物質内の試薬の前記予期される濃度の空間依存性濃度モデルをシミュレートすることと、
前記空間依存性濃度モデルを使用して前記多孔性物質についての空間依存性ＴＯＦモデルを算出することであって、前記ＴＯＦモデルは、前記複数の時点ごとに及び前記候補拡散定数ごとに、前記候補拡散点へ、それぞれモデル化されたＴＯＦを割り当てる、空間依存性ＴＯＦモデルを算出することと、
前記候補拡散点について誤差関数を決定することであって、誤差は、対応する経験的なＴＯＦから前記候補拡散点へ割り当てられた各前記モデル化されたＴＯＦの間の距離を示し、前記経験的なＴＯＦは、対応するモデル化されたＴＯＦをモデル化するのに使用されるのと同じ時点で前記音響モニタリングデバイスによって測定される、誤差関数を決定することと、
前記対応する経験的なＴＯＦまで最小距離を有する１つ又は複数のモデル化されたＴＯＦを特定するために前記誤差関数を使用することと、
前記１つ又は複数の特定されたモデル化されたＴＯＦの前記候補拡散定数から前記多孔性物質について計算された拡散定数を出力することと
を含む動作を前記コンピューティングデバイスに実行させる命令を含むシステム（１００）。
［発明２］
多孔性物質（９１０）の拡散定数を決定する方法であって、
音響波（９２２）の測定された音響データから経験的なＴＯＦのセットを算出するステップであって、前記音響波は音響モニタリングデバイス（１０２）によって検出され前記多孔性物質（９１０）を通じて移動したものであり、各経験的なＴＯＦは複数の時点のうちのそれぞれの時点で前記多孔性物質の候補拡散点を通じて移動した音響波の前記ＴＯＦを示す、経験的なＴＯＦのセットを算出するステップと、
前記多孔性物質についての候補拡散定数の範囲を設定するステップと、
試薬の予期される濃度が時間、空間、及び前記候補拡散定数の関数であり、前記候補拡散定数ごとに、前記複数の時点について及び前記候補拡散点について前記多孔性物質内の試薬の前記予期される濃度の空間依存性濃度モデルをシミュレートするステップと、
前記空間依存性濃度モデルを使用して前記多孔性物質についての空間依存性ＴＯＦモデルを算出するステップであって、前記ＴＯＦモデルは、前記複数の時点ごとに及び前記候補拡散定数ごとに、前記候補拡散点へ、それぞれモデル化されたＴＯＦを割り当てる前記空間依存性濃度モデルを使用するステップと、
前記候補拡散点について誤差関数を決定するステップであって、誤差は、対応する経験的なＴＯＦから前記候補拡散点へ割り当てられた各前記モデル化されたＴＯＦの間の距離を示し、前記経験的なＴＯＦは、対応するモデル化されたＴＯＦをモデル化するのに使用されるのと同じ時点で前記音響モニタリングデバイスによって測定される、誤差関数を決
定するステップと、
前記対応する経験的なＴＯＦまで最小距離を有する１つ又は複数のモデル化されたＴＯＦを特定するために前記誤差関数を使用するステップと、
前記１つ又は複数の特定されたモデル化されたＴＯＦの前記候補拡散定数から前記多孔性物質について計算された拡散定数を出力するステップと
を含む方法。
［発明３］
前記空間依存性ＴＯＦモデルを算出するステップは、前記多孔性物質について熱方程式を解くことによって各前記モデル化されたＴＯＦを決定するステップを含む、発明２に記載の方法。
［発明４］
前記経験的なＴＯＦのセットを算出するステップは、前記多孔性物質の２つ以上の候補拡散点について実行され、前記空間依存性濃度モデルは、前記複数の時点について及び前記２つ以上の候補拡散点の各々について前記多孔性物質内の試薬の予期される濃度を示し、前記空間依存性ＴＯＦモデルは、前記複数の時点ごとに及び前記候補拡散定数ごとに、前記２つ以上の候補拡散点の各々へ、それぞれモデル化されたＴＯＦを割り当てる、発明２又は３に記載の方法。
［発明５］
前記音響データは、
前記試薬が拡散する前の前記多孔性物質中の音波の速度、及び／又は
前記多孔性物質の中への前記試薬の拡散中の前記複数の時点における前記多孔性物質を通じての前記音響波の前記経験的なＴＯＦ、及び／又は経験的な位相シフトデータであって、前記経験的な位相シフトデータから前記経験的なＴＯＦを算出するための経験的な位相シフトデータ、
前記多孔性物質がない前記試薬中の音波の速度、及び／又は
前記多孔性物質の厚さ
を含む、発明２から４のいずれか一項に記載の方法。
［発明６］
前記空間依存性ＴＯＦモデルの前記算出は、
前記候補拡散定数のうちの最初のものを選択するステップと、
前記選択された候補拡散定数に依存して前記複数の時点ごとに前記多孔性物質中の前記複数の候補拡散点の各々で予期された試薬濃度（ｃｒｅａｇｅｎｔ）を計算するステップと、
前記多孔性物質の半径にわたって前記時点及び前記候補拡散定数について計算された前記予期された試薬濃度（ｃｒｅａｇｅｎｔ）を積分することによって、前記複数の時点ごとに及び前記候補拡散定数ごとに、統合された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｃｔｅｄ）を計算するステップと、
前記試薬が拡散する前の前記多孔性物質中の音波の速さと前記多孔性物質がない前記試薬中の音波の速さとの線形結合を算出することによって、前記統合された試薬濃度を前記空間依存性ＴＯＦモデルのそれぞれのモデル化されたＴＯＦへ変換するステップと、
前記候補拡散定数のうちの次のものを選択するステップと、終了基準に到達するまで前記次の選択された候補拡散定数のためにこのステップ及び前記３つの前のステップを繰り返すステップと
を含む、発明２から５のいずれか一項に記載の方法。
［発明７］
前記試薬中の前記音波の速さは、流体を通じて超音波送信機と超音波受信機の間で超音波を送信し、前記送信機と前記受信機の間で前記ＴＯＦを計算し、以下の式、すなわち、
【数１０】
0006632624.tif 000012

に従って前記試薬の前記音波の前記速さを計算することによって計算され、ただし、ｒｆｌｕｉｄは前記試薬中の前記音の速さであり、ｄは前記送信機と前記受信機の間の距離であり、ｔは前記送信機と前記受信機の間の前記ＴＯＦである、発明６に記載の方法。
［発明８］
非拡散多孔性物質中の音波の速さ（ｒｏｒｉｇ）は、以下の式、すなわち、
【数１１】
0006632624.tif 000013

に従って決定され、ただし、Δｔは前記試薬及び前記多孔性物質を通過する波と前記試薬だけを通過する波との間のＴＯＦの差であり、ｄｍａｔは前記多孔性物質の厚さである、発明６又は７に記載の方法。
［発明９］
前記空間依存性濃度モデルは、熱方程式を用いることによって前記候補拡散点における前記試薬の前記予期される濃度を計算するように構成されており、前記熱方程式は、経時的に前記多孔性物質と同じ三次元形状を有する対象の所与の領域内の熱の分布を説明する、発明２から８のいずれか一項に記載の方法。
［発明１０］
前記多孔性物質は円筒形であり、前記熱方程式は以下の式、すなわち、
【数１２】
0006632624.tif 000014

によって特定され、ただし、ｃｆｌｕｉｄは前記試薬の前記予期される濃度であり、ｔは選択された時点における拡散時間であり、Ｄは前記候補拡散定数であり、ｘは前記多孔性物質の深さ方向の前記候補拡散点の空間座標であり、Ｒ０は前記多孔性物質の半径であり、Ｊ０は第１種及び０次のベッセル関数であり、Ｊ１は第１種及び一次のベッセル関数であり、αｎは０次ベッセル関数のｎ次ルートの位置であり、ｃｍａｘは前記試薬の最大濃度である、発明９に記載の方法。
［発明１１］
前記空間依存性濃度モデルを使用して前記空間依存性ＴＯＦモデルを算出するステップは、
前記多孔性物質と同じ三次元形状を有する対象の熱方程式を用いて、時点、候補拡散定数、及び候補拡散点の一意の組み合わせごとに、それぞれの予期された試薬濃度（ｃｆｌｕｉｄ）を算出するステップと、
特定の時点について算出された全ての予期された試薬濃度（ｃｆｌｕｉｄ）から、前記多孔性物質の半径に空間的にわたって前記時点の前記予期された試薬濃度（ｃｆｌｕｉｄ）を積分することによって、積分された予期された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）を算出するステップと、
前記積分された予期された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）の各々を前記空間依存性ＴＯＦモデルの前記モデル化されたＴＯＦのうちのそれぞれ１つへ変換するステップと、
を含む、発明２から１０のいずれか一項に記載の方法。
［発明１２］
前記積分された予期された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）を算出する前記算出ステ
ップは、以下の式、すなわち、
【数１３】
0006632624.tif 000015

に従って実行され、ただし、ｃｆｌｕｉｄは前記試薬の前記予期される濃度であり、ｔは選択された時点における拡散時間であり、ｃｄｅｔｅｃｔｅｄは前記積分された予期された試薬濃度であり、×は前記多孔性物質の深さ方向の前記候補拡散点の空間座標であり、Ｒ０は、前記多孔性物質の半径である、発明１１に記載の方法。
［発明１３］
前記積分された予期された試薬濃度（ｃｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）の各々を前記空間依存性ＴＯＦモデルの前記モデル化されたＴＯＦのうちのそれぞれ１つへ前記変換するステップは、以下の式、すなわち、
【数１４】
0006632624.tif 000016

に従って算出され、ＴＯＦは、前記変換から生じる前記空間依存性ＴＯＦモデルの前記モデル化されたＴＯＦ値のうちの１つであり、ｒｏｒｉｇは前記試薬がない前記多孔性物質中の前記音波の前記速さであり、ｒｆｌｕｉｄは前記多孔性物質がない前記試薬中の前記音波の前記速さであり、ｃｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄは前記積分された予期された試薬濃度であり、Ｄは前記候補拡散定数であり、ｔは選択された時点における拡散時間であり、ρは前記多孔性物質の気孔率であり、ｄｍａｔは前記多孔性物質の厚さである、発明１１又は１２に記載の方法。
［発明１４］
前記誤差関数は、前記以下の式、すなわち、
【数１５】
0006632624.tif 000017

に従って計算される、発明２から１３のいずれか一項に記載の方法。
［発明１５］
特定の候補拡散点及び特定の候補拡散定数に関連し異なる時点についてモデル化された前記空間依存性ＴＯＦモデルの複数の前記モデル化されたＴＯＦを解析するステップであって、時間範囲を示す予期された減衰定数（τｓｉｍｕｌａｔｅｄ）を特定するために実行され、その後に前記モデル化されたＴＯＦは予め定められたパーセンテージだけ減衰してしまう複数の前記モデル化されたＴＯＦを解析するステップと、
前記特定の候補拡散点及び前記特定の候補拡散定数に関連し前記異なる時点で測定された前記空間依存性ＴＯＦモデルの複数の測定されたＴＯＦを解析するステップであって、時間範囲示す経験的な減衰定数（τｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）を特定するために実行され、その後に前記経験的なＴＯＦが予め定められたパーセンテージだけ減衰してしまう複数の前記測定されたＴＯＦを解析するステップと
をさらに含み、
前記誤差関数は、以下の式、すなわち、
誤差（Ｄ）＝（τｓｉｍｕｌａｔｅｄ（Ｄ）−τｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）２
に従って計算され、ここで、Ｄは前記候補拡散定数である、発明２から１４のいずれか一項に記載の方法。
［発明１６］
前記音響モニタリングデバイスに通信可能に結合されたコンピュータシステムのプロセッサによって実行される、発明２から１５のいずれか一項に記載の方法。
［発明１７］
前記試薬に関して前記多孔性物質の十分な拡散の時間を示す基準時間を取得するステップと、
前記出力された拡散定数から十分な拡散時間を計算するステップと、
少なくとも前記計算された十分な拡散時間の間固定剤中に組織試料を浸漬されたままにするステップと
を含む、発明２から１６のいずれか一項に記載の方法。
［発明１８］
前記試薬は液体であり、前記複数の時点は、前記多孔性物質が前記液体の体積中へ浸漬されて以来経過した前記時間をそれぞれ示す、発明２から１７のいずれか一項に記載の方法。
［発明１９］
前記試薬は固定液であり、及び／又は前記多孔性物質は組織試料である、発明２から１８のいずれか一項に記載の方法。
［発明２０］
前記多孔性物質を前記試薬中に浸漬するステップと、
前記音響波が検出される間に０℃から１５℃の温度で前記浸漬された多孔性物質を維持するステップと、
前記複数の時点ごとに、前記経験的なＴＯＦを基準ＴＯＦと比較するステップであって、前記基準ＴＯＦは、組織試料が前記試薬で十分に拡散されることを示す、比較するステップと、
前記経験的なＴＯＦが閾値に到達した場合、前記組織試料及び前記試薬の温度が周囲温度まで上昇することを可能にし、又は前記組織試料及び前記試薬の前記温度を２０℃よりも大きい温度へ加熱をトリガするステップと
をさらに含む、発明２から１９のいずれか一項に記載の方法。
［発明２１］
固定組織試料を得るために前記組織試料を固定するステップと、
前記固定組織試料を不安定生物指標化合物に結合することができる特定の結合実体と接触させるステップと、
前記特定の結合実体の結合を検出するステップと
をさらに含む、発明２から１９のいずれか一項に記載の方法。
［発明２２］
発明２から１６のいずれか一項に記載の方法を実施するために、プロセッサによって実行されるコンピュータ可読コードを記憶する有形の非一時的なコンピュータ可読媒体。
［発明２３］
試薬内に浸漬される試料についての真の拡散定数を決定する方法であって、
モデル飛行時間を生成するために、複数の時点にわたって及び複数の候補拡散定数ごとに、前記試料の中へ拡散の空間依存性をシミュレートするステップと、
誤差関数を得るために、前記モデル飛行時間を経験的な飛行時間と比較するステップとを含み、
前記誤差関数の最小値は、真の拡散定数をもたらす、方法。
［発明２４］
前記複数の候補拡散定数は、外部源によって与えられる候補拡散定数の範囲を含む、発明２３に記載の方法。
［発明２５］
前記試料についての絶対的な音響速度を決定するステップをさらに含む、発明２３又は２４に記載の方法。
［発明２６］
前記音響速度を決定するステップは、試薬中の音の速さを計算するステップと、前記試料の厚さを決定するステップとを含む、発明２５に記載の方法。
［発明２７］
前記空間依存性をシミュレーションするステップは、前記複数の時点にわたって前記試料を通じての試薬のモデル濃度を決定するステップをさらに含む、発明２３から２６のいずれか一項に記載の方法。
［発明２８］
前記空間依存性をシミュレーションするステップは、前記試料についての熱方程式の解を用いて時間及び空間の関数として前記試薬の濃度を決定するステップをさらに含む、発明２７に記載の方法。
［発明２９］
前記試料についての前記熱方程式の前記解は、前記試料の幾何学的形状に基づいている、発明２８に記載の方法。
［発明３０］
前記空間依存性をシミュレーションするステップは、前記モデル濃度を飛行時間へ変換するステップをさらに含む、発明２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
［発明３１］
前記モデル飛行時間は、前記複数の候補拡散定数ごとに飛行時間を決定することによって得られる、発明３０に記載の方法。
［発明３２］
前記誤差関数は、前記モデル飛行時間と前記経験的な飛行時間の間の差一つ一つに基づいている、発明２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
［発明３３］
前記誤差関数は、前記モデル飛行時間と前記経験的な飛行時間の間の拡散の速度に基づいている、発明２３から３２のいずれか一項に記載の方法。
［発明３４］
候補拡散定数ごとに、経験的な飛行時間とシミュレートされた飛行時間の間の誤差を決定するステップをさらに含む、発明２３から３３のいずれか一項に記載の方法。
［発明３５］
前記誤差関数は、誤差に基づいている、発明３４に記載の方法。
［発明３６］
組織試料を通じて移動した音響波を検出する音響モニタリングデバイスと、
前記音響モニタリングデバイスに通信可能に結合され、飛行時間に基づいて前記音響波の速さを評価するように構成されているコンピューティングデバイスであって、実行時に、
前記組織試料についての候補拡散定数の範囲を設定することと、
複数の時点について及び候補拡散点の範囲のうち第１のものについて、前記組織試料内の試薬の空間依存性をシミュレートすることと、
前記空間依存性に基づいてモデル化された飛行時間を決定することと、
複数の拡散定数ごとに、前記空間依存性のシミュレーションを繰り返すことと、
前記複数の拡散定数についての前記モデル化された飛行時間と前記組織試料についての経験的な飛行時間との間の誤差を決定することと
を含む動作を処理システムに実行させる命令を含むコンピューティングデバイスと
を備えたシステムであって、
前記誤差に基づく誤差関数の最小値は、前記組織試料についての真の拡散定数をもたらすシステム。
［発明３７］
前記動作は、前記組織試料についての熱方程式を解いて前記モデル化された飛行時間を決定するステップをさらに含む、発明３６に記載のシステム。
［発明３８］
前記誤差は、候補拡散定数ごとに決定される、発明３６又は３７に記載のシステム。
［発明３９］
前記誤差関数は、前記拡散定数の関数として拡散定数ごとに前記誤差から決定される、発明３７に記載のシステム。
［発明４０］
試料物質についてのシミュレートされた飛行時間を前記試料物質についての経験的な飛行時間と比較することと、
前記シミュレートされた飛行時間と音響飛行時間の間の誤差関数の最小値に基づいて前記試料物質についての拡散定数を得ることと
を含む動作を実施するようにプロセッサによって実行されるコンピュータ可読コードを記憶する有形の非一時的なコンピュータ可読媒体。
［発明４１］
多孔性物質の中に拡散する流体の拡散定数を決定する方法であって、
（ａ）前記流体の体積の中に前記多孔性物質の試料を浸漬するステップと、
（ｂ）音響モニタリングシステムを用いて前記流体の前記体積中に浸漬された前記多孔性物質の前記試料についての音響データのセットを収集し、前記音響データのセットを信号解析器へ送信するステップであって、前記音響データのセットは、
（ｂ１）流体で拡散する前の前記多孔性物質中の超音波の絶対的な音速、
（ｂ２）前記多孔性物質の中への流体の拡散中の少なくとも一時点における前記多孔性物質を通じての超音波のＴＯＦ（ＴＯＦｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ）、
（ｂ３）前記流体中の超音波の絶対的な音速、及び
（ｂ４）前記多孔性物質の厚さ
を有する送信するステップと、
（ｃ）信号解析器上で前記多孔性物質の中への前記流体の拡散についての拡散定数を計算するステップであって、
（ｃ１）複数の候補拡散定数ごとにＴＯＦ傾向をモデル化するサブステップであって、
（ｃ１ａ）第１の候補拡散定数を選択し、
（ｃ１ｂ）（ｂ２）の前記時点に対応する複数の拡散時間を選択し、
（ｃ１ｃ）時間及び空間の関数として前記多孔性試料の厚さ（ｂ４）を通じた複数の深さごとに前記流体の濃度を計算し、
（ｃ１ｄ）各時点（ｃｄｅｔｅｃｔｅｄ）で拡散された試薬の総量を計算し、
（ｃ１ｅ）（ｂ１）及び（ｂ３）の線形結合として（ｃ１ｄ）で決定された前記濃度から生じる予期されたＴＯＦ差を計算し、
（ｃ１ｆ）複数の候補拡散定数について（ｃ１ａ）〜（ｃ１ｅ）を繰り返す
ことによるＴＯＦ傾向をモデル化するサブステップと、
（ｃ２）（ｂ２）の前記ＴＯＦと（ｃ１）から計算された各前記ＴＯＦ差と間の誤差関数を拡散定数の関数として計算するサブステップであって、前記真の拡散定数は前記誤差関数の最小値である拡散定数を計算するステップと
を含む方法。
［発明４２］
前記流体中の音の速さは、前記流体を通じて超音波送信機と超音波受信機の間で超音波を送信し、前記送信機と前記受信機の間の前記飛行時間を計算し、以下の式、すなわち、
【数１６】
0006632624.tif 000018

に従って前記音の速さを計算することによって計算され、ただし、ｒｆｌｕｉｄは前記流体中の前記音の速さであり、ｄは前記送信機と前記受信機の間の前記距離であり、ｔは前記送信機と前記受信機の間の前記飛行時間（ＴＯＦ）である、発明４１に記載の方法。
［発明４３］
非拡散多孔性物質中の音の速さ（ｒｏｒｉｇ）は、以下の式、すなわち、
【数１７】
0006632624.tif 000019

に従って決定され、ただし、Δｔは前記流体及び前記多孔性物質を通過する波と前記流体だけを通過する波との間のＴＯＦの差であり、ｄｍａｔは前記多孔性物質の厚さである、発明４２に記載の方法。
［発明４４］
前記多孔性物質の前記厚さは、パルスエコー超音波を用いて決定される、発明４１から４３のいずれかに記載の方法。
［発明４５］
前記多孔性物質は円筒形であり、前記多孔性試料の厚さ（ｂ４）を通じての前記複数の深さごとの前記流体の濃度は、以下の式、すなわち、
【数１８】
0006632624.tif 000020

に従って計算され、ただし、ｃｆｌｕｉｄは前記濃度であり、ｔは選択された時点における前記拡散時間であり、Ｄは前記候補拡散定数であり、ｘは前記組織の深さ方向の空間座標であり、Ｒ０は前記試料の半径であり、Ｊ０は第１及び０次のベッセル関数であり、Ｊ１は第１種及び１次のベッセル関数であり、αｎは０次ベッセル関数のｎルートの位置であり、ｃｍａｘは前記試薬の最大濃度である、発明４１から４４のいずれかに記載の方法。
［発明４６］
拡散された試薬の総量（ｃｄｅｔｅｃｔｅｄ）は、以下の式、すなわち、
【数１９】
0006632624.tif 000021

に従って計算された、発明４５に記載の方法。
［発明４７］
前記予期されたＴＯＦ差は、以下の式、すなわち、
【数２０】
0006632624.tif 000022

に従って計算され、ただし、ｄｍａｔは前記物質の厚さであり、ρは前記物質の多孔率である、発明４６に記載の方法。
［発明４８］
前記誤差関数は、以下の式、すなわち、
【数２１】
0006632624.tif 000023

に従って計算される、発明４７に記載の方法。
［発明４９］
前記多孔性物質は組織試料であり、前記流体は固定剤溶液である、発明４１から４８のいずれかに記載の方法。
［発明５０］
組織試料を固定する方法であって、発明４９に記載の方法によって固定剤溶液中に浸漬された組織試料の拡散定数を計算するステップと、前記計算された拡散定数に基づいて十分な拡散時間を計算するステップと、少なくとも前記計算された十分な拡散時間の間前記固定剤中に前記組織試料を浸漬されたままにするステップとを含む方法。
［発明５１］
組織試料を固定する方法であって、
（ａ）架橋結合固定剤溶液で十分に拡散される組織試料を得るステップであって、
（ａ１）前記架橋結合固定剤は０℃から１５℃の温度にあり、対象から前記架橋結合固定剤溶液の体積の中に新たに得られる固定されていない組織試料を浸漬し、
（ａ２）発明２８に記載の方法によって拡散定数を計算し、
（ａ３）前記計算された拡散定数に基づいて十分な拡散時間を決定する
ことによって組織試料を得るステップと、
（ｂ）前記組織試料が前記十分な拡散時間の間前記架橋結合固定剤溶液中に浸漬された後に、前記組織試料の温度を室温から５０℃の範囲内の温度へ上昇させ、前記組織試料の固定を可能にするのに十分な期間この温度の範囲内で前記組織試料を保持するステップとを含む方法。
［発明５２］
組織試料中の不安定生物指標化合物を検出する方法であって、
（ａ）固定された組織試料を得るために発明３０に記載の前記方法に従って前記組織試料を固定するステップと、
（ｂ）前記不安定生物指標化合物に結合することができる特定の結合実体を用いて前記固定された組織試料に接触させるステップと、
（ｃ）前記特定の結合実体の結合を検出するステップと
を含む方法。
［発明５３］
前記不安定生物指標化合物は、リン酸化たんぱく質、ｍＲＮＡ、及びｍｉＲＮＡからなる群から選択される、発明５２に記載の方法。
【図１】
0006632624.tif 000036
【図２Ａ】
0006632624.tif 000037
【図２Ｂ】
0006632624.tif 000038
【図２Ｃ】
0006632624.tif 000039
【図３】
0006632624.tif 000040
【図４】
0006632624.tif 000041
【図５】
0006632624.tif 000042
【図６】
0006632624.tif 000043
【図７】
0006632624.tif 000044
【図８】
0006632624.tif 000045
【図９】
0006632624.tif 000046
【図１０】
0006632624.tif 000047
【図１１】
0006632624.tif 000048
【図１２】
0006632624.tif 000049