(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビルダグリプチンを含む、造血幹細胞移植レシピエントにおいて造血幹細胞の生着を増進するための組成物であって、
（ａ）移植前に、造血幹細胞が、インビトロでトレプロスチニル又はその薬学的に許容可能な塩とフォルスコリンとで前処理されており；そして
（ｂ）該組成物が、造血幹細胞の移植後少なくとも１日間投与される、
上記組成物。
【請求項２】
造血幹細胞移植の少なくとも５時間前、特に少なくとも１０時間前、特に少なくとも１５時間前、特に少なくとも２４時間前に投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
造血幹細胞移植後少なくとも２日間、特に少なくとも３日間、特に少なくとも４日間投与される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
レシピエントが、骨髄疾患を患う個人である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
骨髄疾患が、白血病、血液細胞コンパートメントの欠陥、化学療法又は放射線照射によって誘発された骨髄疾患である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記血液細胞コンパートメントの欠陥が、異常ヘモグロビン症、好中性顆粒球機能の欠陥、又は、Ｔリンパ球及び／又はＢリンパ球の欠陥である、請求項５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞移植レシピエントにおける造血前駆細胞の移動及びホーミングを増進するためのジペプチジルペプチダーゼIV（ＤＰＰ−IV）の少なくとも一つの阻害薬を含む組成物の新規使用を提供する。前記造血前駆細胞は、前記細胞の移植前に、前記前駆細胞の生着を増進するために、インビトロでプロスタサイクリン類似体で処理されている。具体的には、前処理は移植前にプロスタサイクリン類似体とｃＡＭＰエンハンサーを用いて実施される。
【背景技術】
【０００２】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、それらの自己複製能(self-renewal)と子孫分化(progeny differentiation)とのバランスを取りながら、個人の生涯にわたってすべての血液産物を再生できる原始細胞である。ＨＳＣは、発生中に所在の移行を経て、ホーミング及び生着の連続工程において骨髄ニッチと関わるために血流を出入りしながら、哺乳動物の体内を生涯にわたって循環する。ホーミングとはドナー幹細胞が骨髄にたどり着くプロセスであり、幹細胞の生着とは骨髄でのそれらの増殖を意味する。
【０００３】
ＨＳＣは、移植レシピエントにおいて血液細胞及び免疫細胞を回復させる能力を持つことから、治療上の可能性を有している。さらに、ＨＳＣは、脳、筋肉及び肝臓などのその他の組織の細胞を生成する可能性も有している。ヒトの自家及び同種骨髄移植法は、現在、白血病、リンパ腫、及びその他の生命に関わる疾患などの疾患の療法として使用されている。自家骨髄移植は、細胞毒性薬の治療濃度域を広げるために使用される標準的方法であり、それにより高用量強度化学療法が可能になる（Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈ  Ｉ，Ｆｌｉｎｎ  Ｉ（２００２）化学療法及び骨髄予備能：自家幹細胞移植から学んだ教訓( Chemotherapy and bone marrow reserve: lessons learned from autologous stem cell transplantation)，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  １７：３９９−４０３，Ａｗｅｄａｎ  ＡＡ（２００２）多発性骨髄腫の治療として自家造血幹細胞移植を用いた高強度治療計画(High intensity regimens with autologous hematopoeticstem cell transplantation as treatment of multiple myeloma)，Ａｎｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ７：３８−４３）。しかしながら、これらの方法の場合、生着のための十分なＨＳＣを確保するために大量のドナー骨髄を単離せねばならない。
【０００４】
細胞輸送、特にＨＳＣのホーミングは、いくつかの異なる細胞内機序によって調節されている。
まず第一に、骨髄ニッチにＨＳＣを定着させる(populate)ために、インビボでのＧαｓ伝達シグナルの必要性が言われている（Ａｄａｍｓ  ＧＢ  ら，（２００９）骨髄生着のための造血幹細胞のＧαｓ媒介シグナリングへの依存(Haematopoietic stem cells depend on Gas-mediated signaling to engraft bone marrow)，Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：１０３−１０７）。これらの発見は、Ｇαｓの活性化が造血幹細胞の生存及び分化を促進することを示した先のインビトロ実験を裏付けるものである（Ｄｅｘｔｅｒ  ＴＭ  ら，（１９８５）膜結合タンパク質のコレラ毒素誘導アデノシン二リン酸リボシル化の阻害薬による幹細胞分化の遮断 (Inhibitors of cholera toxin-induced adenosine diphosphate ribosylation of membrane-associated proteins block stem cell differentiation)，Ｂｌｏｏｄ  ６５：１５４４−１５４８，Ｌｏｎｇ  ＭＷ  ら，（１９８８）コレラ毒素とホルボールジエステルによるマウス造血前駆細胞増殖の相乗的調節 (Cholera toxin and phorbol diesters synergistically modulate murine hematopoietic progenitor cell proliferation) Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１６：１９５−２００）。Ｇαｓは、膜結合型哺乳動物アデニリルシクラーゼの全９個のアイソフォームを刺激するヘテロ三量体Ｇタンパク質のグアニンヌクレオチド結合α−サブユニットである。Ｇαｓは、細胞をコレラ毒素で処理することにより、エクスビボ／インビボで構成的に活性化されうる。これは、コレラ毒素が、触媒アルギニン残基（Ｒ１８６／１８７／２０１／２０２、アルギニンの正確な数はＧαｓのスプライスバリアントによる）をＡＰＤリボシル化するためである。無傷のアルギニン残基は、ＧＴＰ−加水分解及びその結果のＧαｓの失活のために必要とされる（Ｆｒｅｉｓｓｍｕｔｈ  Ｍ，Ｇｉｌｍａｎ  ＡＧ（１９８９）細菌毒素によりタンパク質の反応性を変化させるために設計されたＧｓαの変異。ＡＲＧ１８７における置換はＧＴＰアーゼ活性の喪失をもたらす(Mutations of Gsα designed to alter the reactivity of the protein with bacterial toxins. Substitutions at ARG187 result in loss of GTPase activity)，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：２１９０７−２１９１４）。実際、生着の増進は、コレラ毒素で造血幹細胞を前処理した後に観察できる。幹細胞調製物がコレラ毒素で処理された場合、骨髄中に約２倍の（Ｌｉｎ−）前駆体細胞が存在した（Ａｄａｍｓ、２００９）。第二に、ＨＳＣは、全４個のプロスタグランジンＥ受容体（ＥＰ１〜４）を発現している。造血幹細胞を（ジメチル化）プロスタグランジンＥ２で前処理すると、それらの生着が増進される（Ｎｏｒｔｈ  ＴＥ，ら，（２００７）プロスタグランジンＥ２による脊椎動物の造血幹細胞の恒常性の調節 (Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoieticstem cell homeostasis)，Ｎａｔｕｒｅ  ４４７：１００７−１０１１，８；Ｈｏｇｇａｔｔ  Ｊ，ら，（２００９）プロスタグランジンＥ２による造血幹細胞のホーミング、生存、及び増殖の増進 (Prostaglandin E2 enhances hematopoietic stem cell homing, survival, and proliferation)（Ｂｌｏｏｄ  １１３：５４４４−５４５５）。この効果は、標準(canonical) Ｇαｓ依存性シグナリングにより媒介される。なぜならば、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）のｃＡＭＰ誘導活性化がＷｎｔ依存性シグナルと相乗作用してβ−カテニンを安定化させるからである（Ｇｏｅｓｓｌｉｎｇ  Ｗ  ら（２��０９）ＰＧＥ２とＷｎｔシグナリングの遺伝的相互作用による幹細胞の発生仕様及び再生の調節 (Genetic interaction of PGE2 and Wntsignaling regulates developmental specification of stem cells and regeneration)，Ｃｅｌｌ  １３６：１１３６−１１４７）。
【０００５】
さらに、ＰＧＥ２は、ＨＳＣのＣＸＣＲ４  ｍＲＮＡ及び表面発現も増大させ、インビトロでそれらのストローマ細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）への移動及びインビボで骨髄へのホーミングを増進し、そしてＨＳＣの細胞周期への進入及び進行を刺激する。
【０００６】
プロスタサイクリン類似体を、任意にフォルスコリンも組み合わせて使用して、ＨＳＣの生着を増進する方法は、ＷＯ２０１２／０９５５１１に記載されている。
ＳＤＦ−１-ＣＸＣＲ４軸も、細胞ホーミングに関与していることが知られている。ＳＤＦ−１は、正常ＨＳＣの輸送の調節ならびにそれらホーミング及び骨髄での保持に極めて重要な役割を果たしている（Ｋｕｃｉａ  ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００５）。
【０００７】
ＷＯ２００９／１５２１８６  Ａ１によれば、ＣＤ２６ペプチダーゼ(ＤＰＰIV、ジペプチジルペプチダーゼIV）活性の阻害は移動活性を増強できるので、ＣＤ２６ペプチダーゼ阻害薬の使用は、細胞のホーミング及び生着を増進させると記載されている。
【０００８】
ＷＯ  ２０１２／０７４６７６には、ＧＬＰ−１アンタゴニスト及びＤＰＰIV阻害薬を含有する肝臓保存用組成物が記載されている。
Ｈｕｓｓａｉｎ  Ｆｉｌｚａらは、トレプロスチニル(Treprostinil)の幹細胞移植への効果を報告している（ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  １１，ｎｏ．Ｓｕｐｐｌ  ２，２０１１，ｐ  Ａ６）
ＵＳ２００８／０８５２６４は、造血幹細胞の移植効率を増大させるための前処理に、ＤＰＰ−IV阻害薬／ＣＤ２６ペプチダーゼ阻害薬の使用を開示している。
【０００９】
Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  Ｈ．らは、造血幹細胞を用いた移植に関する調査を提供しており（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，２０１３，ｖｏｌ．２２，ｓｕｐｐｌ．１，ｐｐ．１０３−１１０）、さらに、シタグリプチンと組み合わせたｄｍＰＧＥ２の使用について検討している（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  Ｈ．及びＰｅｌｕｓ，Ｌ．２０１４，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ５３，３４−３８）。
【００１０】
Ｓｃｈｗａｉｇｅｒ  Ｅ．らは、ＤＰＰ−IV阻害薬の使用を開示し、そしてこれらの阻害薬の存在が、骨髄の生着をしないことを開示している（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１１，ｖｏｌ．４０，ｎｏ．２，ｐｐ．９７−１０６）。
【００１１】
Ｈｏｇｇａｔｔ  Ｊ．らは、造血幹細胞を刺激するためのＰＧＥ２の使用を報告している（ＢＬＯＯＤ，２００９，ｖｏｌ．１１３，ｎｏ．２２，ｐｐ．５４４４−５４５５）。
【００１２】
ＷＯ２０１２／０９５５１１は、トレプロスチニルとフォルスコリンによる造血幹細胞の処理について記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＷＯ  ２０１２／０９５５１１
【特許文献２】ＷＯ  ２００９／１５２１８６  Ａ１
【特許文献３】ＷＯ  ２０１２／０７４６７６
【特許文献４】ＵＳ  ２００８／０８５２６４
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈ  Ｉ，Ｆｌｉｎｎ  Ｉ（２００２），Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  １７：３９９−４０３
【非特許文献２】Ａｗｅｄａｎ  ＡＡ（２００２），Ａｎｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ７：３８−４３
【非特許文献３】Ａｄａｍｓ  ＧＢ  ら，（２００９），Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：１０３−１０７
【非特許文献４】Ｄｅｘｔｅｒ  ＴＭ  ら，（１９８５），Ｂｌｏｏｄ  ６５：１５４４−１５４８
【非特許文献５】Ｌｏｎｇ  ＭＷ  ら，（１９８８）Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．１６：１９５−２００
【非特許文献６】Ｆｒｅｉｓｓｍｕｔｈ  Ｍ，Ｇｉｌｍａｎ  ＡＧ（１９８９），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：２１９０７−２１９１４
【非特許文献７】Ｎｏｒｔｈ  ＴＥ，ら，（２００７），Ｎａｔｕｒｅ  ４４７：１００７−１０１１，８
【非特許文献８】Ｈｏｇｇａｔｔ  Ｊ，ら，（２００９）（Ｂｌｏｏｄ  １１３：５４４４−５４５５）
【非特許文献９】Ｇｏｅｓｓｌｉｎｇ  Ｗ  ら（２００９），Ｃｅｌｌ  １３６：１１３６−１１４７
【非特許文献１０】Ｋｕｃｉａ  ら，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２００５
【非特許文献１１】Ｈｕｓｓａｉｎ  Ｆｉｌｚａら（ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ  １１，ｎｏ．Ｓｕｐｐｌ  ２，２０１１，ｐ  Ａ６）
【非特許文献１２】Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  Ｈ．ら（ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，２０１３，ｖｏｌ．２２，ｓｕｐｐｌ．１，ｐｐ．１０３−１１０）
【非特許文献１３】Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ  Ｈ．及びＰｅｌｕｓ，Ｌ．２０１４，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ５３，３４−３８
【非特許文献１４】Ｓｃｈｗａｉｇｅｒ  Ｅ．ら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１１，ｖｏｌ．４０，ｎｏ．２，ｐｐ．９７−１０６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
移植後の幹細胞の局在は、移植成功のための重要な決定因子である。現在、幹細胞は骨髄に容易に生着せず、成熟血液細胞の減少を招く長期の骨髄形成不全があるため、移植には多数の幹細胞が必要となる。
【００１６】
そこで、ＨＳＣを効率的に刺激して、骨髄移植を受ける対象の骨髄ニッチへの単離ＨＳＣのホーミング、生着及び保持を増進し、そして移植に必要なＨＳＣの数を低減するための方法及び治療計画を提供することが依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
問題は本発明の態様によって解決される。
驚くべきことに、造血幹細胞のホーミング及び生着は、エクスビボで、前記幹細胞及び／又は前駆細胞を、前記細胞の生着特性を刺激するプロスタサイクリン類似体で前処理し、さらにジペプチジルペプチダーゼIV（ＤＰＰ−IV）の阻害薬を、前記造血幹細胞を移植された個人に投与することにより、成功裡に増進できることが示された。
【００１８】
具体的には、発明者らにより、造血幹細胞のホーミング及び生着は、エクスビボで、前記細胞を、少なくとも一つのプロスタサイクリン類似体と少なくとも一つのｃＡＭＰエンハンサーとの組合せで前処理し、さらにジペプチジルペプチダーゼIV（ＤＰＰ−IV）の阻害薬を、前記造血幹細胞を移植された個人に投与することにより、成功裡に増進できることが示された。
【００１９】
具体的には、本発明により、ジペプチジルペプチダーゼIV（ＤＰＰ−IV）の少なくとも一つの阻害薬を含む、造血幹細胞移植レシピエントの治療に使用するための組成物が提供される。前記造血幹細胞は、移植前にインビトロで具体的にはプロスタサイクリン類似体とｃＡＭＰエンハンサーで処理されている。
【００２０】
具体的には、本発明は、ジペプチジルペプチダーゼIV（ＤＰＰ−IV）の少なくとも一つの阻害薬を含む、造血幹細胞移植レシピエントの治療に使用するための組成物を提供し、前記レシピエントは、生着を増進するために、インビトロでプロスタサイクリン類似体と任意にｃＡＭＰエンハンサーで処理された造血幹細胞を移植されている。
【００２１】
本発明は、驚くべきことに、単離された造血幹細胞を移植前にプロスタサイクリン類似体と任意にフォルスコリンなどのｃＡＭＰエンハンサーも共にインキュベートし、そして移植を必要とする患者への前記細胞の移植直前及び移植後にＤＰＰ−IV阻害薬を投与することにより、ＨＳＣのホーミング及び生着効率が非常に高まることを示した。このことは、ＤＰＰ−IVの阻害（グリプチンによる）は、それ自体、マウスモデルにおいては骨髄移植を増進するのに十分でないので、驚くべきことである（Ｓｃｈｗａｉｇｅｒ  Ｅ，ら，Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１２  Ｆｅｂ；４０（２）：９７−１０６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｘｐｈｅｍ．２０１１．１０．０１０）。
【００２２】
好適な態様に従って、造血幹細胞は、プロスタサイクリン類似体と、ｃＡＭＰをさらに上昇できる化合物、具体的にはフォルスコリン又はｃＡＭＰ分解の阻害薬（ホスホジエステラーゼ阻害薬）の組合せとインキュベートされる。
【００２３】
さらに、驚くべきことに、インビボ動物モデルにおいて、前記細胞の移植後、ＤＰＰ−IV阻害薬、具体的にはビルダグリプチンを投与すると、プロスタサイクリン類似体の投与と比べて、前記造血細胞レシピエントの生存率が著しく増大することが発明者らにより示された。
【００２４】
さらに、プロスタサイクリン類似体、具体的にはトレプロスチニルと、ＤＰＰ−IV阻害薬、具体的にはビルダグリプチンを、トレプロスチニル及びフォルスコリンで前処理された造血幹細胞の移植後に併用投与すると、相互に拮抗的であることも発明者らにより示された。
【００２５】
本発明の態様に従って、使用するための前記組成物は、グリプチン類、さらに詳しくは、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アナグリプチン、テネリグリプチン、ゲミグリプチン及びデュトグリプチン又はそれらの機能的類似体からなる群から選択されるＤＰＰ−IV阻害薬を含有する。
【００２６】
本発明の特定の態様に従って、造血幹細胞は、インビトロで、トレプロスチニル、イロプロスト(Iloprost)、シカプロスト(Cicaprost)及びベラプロスト(Beraprost)又はそれらの薬学的に許容可能な塩の群から選択されるプロスタサイクリン類似体とインキュベートされる。特に、前記プロスタサイクリン類似体は、トレプロスチニルの酸誘導体、トレプロスチニルのプロドラッグ、トレプロスチニルの多形体又はトレプロスチニルの異性体及びトレプロスチニルの無水多形体の群から選択されるトレプロスチニルの誘導体である。
【００２７】
態様に従って、造血幹細胞の前処理は、さらに、ｃＡＭＰエンハンサー、具体的にはフォルスコリンの存在下で行われる。
本発明は、選ばれた個人群、すなわち、骨髄疾患又は骨髄関連疾患（具体的には、骨髄疾患は、白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、再生不良性貧血、鎌状赤血球疾患、血液細胞コンパートメントの欠陥、化学療法又は放射線照射によって誘発された骨髄疾患である）を患い、移植前にインビトロでプロスタサイクリン類似体及びｃＡＭＰ阻害薬で前処理された造血幹細胞サンプルを用いて幹細胞移植を受ける個人の治療におけるＤＰＰ−IV阻害薬の使用を取り扱う。
【００２８】
さらに詳しくは、血液細胞コンパートメントの欠陥は、異常ヘモグロビン症又は好中性顆粒球機能の欠陥、Ｔリンパ球及び／又はＢリンパ球の欠陥（例えば重症複合型免疫不全症、ブルトン型無ガンマグロブリン血症）でありうるが、これらに限定されない。
【００２９】
本発明の特定の態様に従って、移植後にプロスタサイクリン類似体を投与される個人は、ＤＰＰ−IV阻害薬で処置される個人の群に含まれない。
本発明の態様に従って、ＤＰＰ−IV阻害薬はビルダグリプチンであり、造血幹細胞は移植前にインビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンで処理されている。
【００３０】
さらなる態様に従って、ＤＰＰ−IV阻害薬は、造血幹細胞移植の少なくとも５時間前、特に少なくとも１０時間前、特に少なくとも１５時間前、特に少なくとも２４時間前に投与される。
【００３１】
ＤＰＰ−IV阻害薬の投与は、骨髄における十分な幹細胞の生着に必要な期間でありうる。
本発明の態様は、ＤＰＰ−IV阻害薬を、骨髄移植後少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、好ましくは少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１４日間投与することも取り扱う。
【００３２】
本発明に従って、組成物は、静脈内又は皮下投与により、又は徐放性形態、錠剤及びカプセルの群から選択される経口用形態で投与できる。
本発明は、造血細胞の生着能力を増強するための方法も提供し、前記方法は、
ａ）造血幹細胞及び／又は前駆細胞のサンプルを用意し、
ｂ）前記細胞に、生着を増進する有効量のプロスタサイクリン類似体を投与し、
ｃ）前記混合物を、前記細胞におけるＧアルファｓ−シグナリングを刺激するのに足る期間インキュベートし、
ｄ）前記細胞を単離し、
ｅ）前記細胞をそれを必要とする個人に移植し、
ｆ）前記個人に有効量のＤＰＰ−IV阻害薬を投与する
連続工程を含む。
【００３３】
本発明は、特に、造血細胞の生着能力を増強するための方法を提供し、前記方法は、
ａ）造血細胞のサンプルを用意し、
ｂ）前記細胞に、生着を増進する有効量のプロスタサイクリン類似体とｃＡＭＰエンハンサーを投与し、
ｃ）前記混合物を、前記細胞におけるＧアルファｓ−シグナリングを刺激するのに足る期間インキュベートし、
ｄ）前記細胞を単離し、
ｅ）前記細胞をそれを必要とする個人に移植し、
ｆ）前記個人に有効量のＤＰＰ−IV阻害薬を投与する
連続工程を含む。
【００３４】
本発明は、前記幹細胞が、臍帯血、ドナー骨髄又は胎盤由来である方法も提供する。
本発明は、移植後骨髄に生着する造血細胞の数を増加させる方法も提供し、前記方法は、造血細胞をインビトロで有効量のプロスタサイクリン類似体、具体的にはトレプロスチニルと、特にｃＡＭＰエンハンサー、具体的にはフォルスコリンも共に接触させ、プレインキュベートされた細胞をそれを必要とする個人に投与し、そしてさらにＤＰＰ−IV阻害薬、具体的にはビルダグリプチンを前記個人に造血細胞の投与の直前及び／又は後に投与する工程を含む。
【００３５】
本発明のさらなる態様に従って、造血幹細胞（ＨＳＣ）の生着を、ＨＳＣのエクスビボ前処理によって増進する方法も提供し、前記方法は、下記工程、すなわち
ａ）造血幹細胞及び／又は前駆細胞を含有するサンプルを用意し、
ｂ）前記サンプルに、幹細胞及び／又は前駆細胞の生着能力を増強するためにプロスタサイクリン類似体を含む組成物、特にプロスタサイクリン類似体とｃＡＭＰエンハンサーを含む組成物を混合して、混合物を得、
ｃ）前記混合物を、前記細胞におけるＧアルファｓ−シグナリングを刺激するのに足る期間インキュベートし、
ｄ）前記刺激細胞を単離し、
ｅ）前記細胞を個人に移植し、
ｆ）ＤＰＰ−IV阻害薬を前記個人に、特に静脈内投与により投与する
工程を含む。
【００３６】
本発明はまた、特に骨髄疾患（具体的には、骨髄疾患は、白血病、血液細胞コンパートメントの欠陥及び化学療法又は放射線照射によって誘発された骨髄疾患である）の治療に使用するための、
ａ）第一の単位剤形中に一定量の少なくとも一つのプロスタサイクリン類似体とフォルスコリン
ｂ）グリプチンから選択される一定量の少なくとも一つのＤＰＰ−IV阻害薬
を、成分ａ）とｂ）の２個、３個、４個又はそれより多い個数の別個の単位の形態で含む部品のキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、トレプロスチニル及びフォルスコリンの存在下でのマウス及びヒト造血幹細胞及び前駆細胞のプレインキュベーションにより、それらのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２への移動が増大することを示す。
【図２】図２は、マウス造血幹細胞及び前駆細胞（トレプロスチニル及びフォルスコリンの存在下で刺激されている）のＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２誘導性の移動が、ＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００によって阻害されることを示す。
【図３】図３は、ビルダグリプチンが、造血幹細胞及び前駆細胞（トレプロスチニル及びフォルスコリンとプレインキュベートされている）のＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２への移動を増進することを示す。
【図４】図４は、ビルダグリプチン及びトレプロスチニルは、造血幹細胞及び前駆細胞（トレプロスチニル及びフォルスコリンとプレインキュベートされている）のホーミングを増進するが、インビボで組み合わさると相互に拮抗的であることを示す。
【図５】図５は、致死的に放射線照射されたＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウス（インビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せで前処理された造血幹細胞及び前駆細胞を注入されている）へのトレプロスチニルとビルダグリプチンの併用投与は、ビルダグリプチン又はトレプロスチニルのいずれかの単独インビボ投与よりも、これらのマウスの生存の増進において効果が低いことを示す。
【図６】図６は、マウス及びヒトの造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）におけるプロスタノイド受容体の発現を示す（Ａ、Ｂ）。ＲＮＡをマウス（Ａ）及びヒトＨＳＰＣ（Ｂ）から単離し、逆転写した。マウス脳細胞（ニューロンとグリア細胞の混合培養物）ならびにヒト細胞株ＰＣ３及びＨＣＴ１１６から調製したＲＮＡを陽性対照とした。表１に掲載されたプライマーを用いてＰＣＲ依存性増幅を実施した。全Ｅプロスタノイド受容体（ＥＰ１〜ＥＰ４）、Ｉプロスタノイド受容体（ＩＰ）及びＤプロスタノイド受容体−１（ＤＰ１）の増幅産物（アンプリコン）をアガロースゲル上に電気泳動分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。Ｈ２Ｏと標識されているレーンは対照を示し、増幅は先行逆転写の不在下で実施された。ＧＡＰＤＨをコードするｍＲＮＡを内部標準として増幅した。
【図７】図７は、ヒトＨＳＰＣにおけるトレプロスチニル誘導性及びｄｍＰＧＥ２誘導性のｃＡＭＰ蓄積の比較を示す。
【図８−１】図８は、トレプロスチニル及びフォルスコリンによるマウス及びヒトＨＳＰＣの前処理が、アポトーシスも誘導しなければ、細胞周期の進行又は分化能も変化させないことを示す。ヒトＨＳＰＣを１０μＭのトレプロスチニル及び３０μＭのフォルスコリンと１時間インキュベートした。その後、（Ａ、Ｂ）アポトーシス誘導及び（Ｃ、Ｄ）細胞周期の進行をフローサイトメトリー分析により評価した。アポトーシスを起こした細胞にも、Ｇ０／１、Ｓ及びＧ２期による細胞の分布にも、非処理細胞と処理細胞との間で差は検出されなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ）。（Ｅ，Ｆ）。データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。
【図８−２】同上。
【図８−３】同上。
【図８−４】同上。
【図９】図９は、トレプロスチニル及びフォルスコリンによるインビトロ前処理がＣＸＣＲ４（Ａ＆Ｂ）及びＣＤ２６／ＤＰＰIV（Ｂ）の発現を増強することを示す。
【図１０−１】図１０は、トレプロスチニル及びフォルスコリンによるインビトロ前処理がＣＸＣＲ４を介したＳＤＦ−１の作用を増強することを示す。
【図１０−２】同上。
【図１１】図１１は、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト（ＡＭＤ３１００）のインビボ投与がレシピエントマウスの生存に対するトレプロスチニルの有益効果を抑制することを示す。マウスＨＰＳＣを図４の説明に概要を示すようにインビトロでトレプロスチニル及びフォルスコリンにより前処理し、致死的に放射線照射されたレシピエントマウスに注入した（２×１０５／マウス）。次に、これらを２群に分けた。グループ１に割り当てられたマウス（ｎ＝１０）はさらにトレプロスチニル（０．１５ｍｇ／ｋｇ／８時間）によるインビボ処置を受けたが、グループ２のマウス（ｎ＝１０）はトレプロスチニル（０．１５ｍｇ／ｋｇ／８時間）とＡＭＤ３１００（３．３ｍｇ／ｋｇ／８時間）の両方を皮下注射により８時間ごとに１０日間受けた。二つの生存曲線の間の差は統計学的に有意であった（Ｐ＝０．００７、ログランク検定）。
【図１２】図１２は、単独のビルダグリプチン及びトレプロスチニルによるレシピエントマウスのインビボ処置は、トレプロスチニル及びフォルスコリンとプレインキュベートされたＨＳＰＣのホーミングを増進するが、ビルダグリプチンとトレプロスチニルとの組合せによるインビボ処置では増進しないことを示す。
【図１３】図１３は、ＤＰＰ−IV阻害薬のビルダグリプチンの単独インビボ投与が、トレプロスチニル及びフォルスコリンによるＨＳＰＣのインビトロ処理の、レシピエントマウスの生存率に及ぼす有益効果を増大することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
骨髄環境へのＨＳＣのホーミング及び生着を増進するための方法及び手段を提供することは強い生物学的及び医学的意味合いを持つ。移植後の幹細胞の局在は臨床的処置にとって非常に重要である。というのも、現在、臨床移植には莫大な数の幹細胞が必要とされるため、大量のドナー細胞が必要になるからである。また、相当数の自家ドナー移植物は不十分な数の幹細胞、又はＨＳＣしか含有していないので、このような方法（が提供されること）は非常に有用である。同様に、患者は組織適合ドナーを見つけられないことが多いので、移植の成功に必要なＨＳＣの数を削減するための方法及び組成物に対する需要は一段と強い。インビトロ又はエクスビボでＨＳＣのホーミング及び生着特性を改良できれば、ドナーから採取される細胞が少なくて済むことから、骨髄／末梢血幹細胞採取に伴う時間及び不快感が削減されるばかりでなく、意思あるＨＳＣドナーのプールも増大できる。
【００３９】
本発明は、造血前駆細胞の移植を受ける患者の治療におけるジペプチジルペプチダーゼIV（ＤＰＰ−IV）の新規使用を提供する。ただし、移植に使用される前記幹細胞は、前記細胞を個人の体内に投与又は戻す前に、細胞の生着を増進させるために少なくとも一つのプロスタサイクリン類似体と、特にｃＡＭＰエンハンサーと共にインキュベートされていることが条件である。
【００４０】
造血幹細胞及び前駆細胞、特にマウス及びヒトの造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、いくつかのプロスタノイド受容体を発現している（すなわち、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、ＥＰ４、ＩＰ及びＤＰ１、図６）。トレプロスチニルは、すべてのＧｓ共役受容体、すなわちＥＰ２、ＥＰ４、ＩＰ及びＤＰ１受容体を特異的に活性化することが知られているが、ｄｍＰＧＥ２はＥＰ３受容体も刺激する。発明者らは、トレプロスチニルが造血前駆細胞におけるｃＡＭＰを刺激することを示した。ヒトの造血幹細胞及び前駆細胞では、トレプロスチニルの濃度反応曲線は、反応の１０〜９０％の間で２桁を超えていた。これは、いくつかの刺激受容体の活性化と一致している。トレプロスチニルが誘導するｃＡＭＰ蓄積は、アデニリルシクラーゼの直接活性化剤であるフォルスコリンと組み合わせると増強できる。
【００４１】
造血幹細胞及び前駆細胞は、トレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せに暴露されても、それらの生存性にも、その後受けるそれらの非対称細胞分裂ならびに赤血球及び顆粒球／単球系への分化能力にも、検出可能な影響はない。従って、移植に必要な細胞の数は、プロスタサイクリン類似体とフォルスコリンによる前処理なしの移植に必要な細胞と比べて著しく少なくて済む。
【００４２】
造血幹細胞及び前駆細胞をトレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せで前処理すると、放射線照射生体における骨髄生着を増進する。
インビボでのトレプロスチニルによるレシピエントの追加処置は、骨髄生着をさらに増進する。
【００４３】
前記ＤＰＰ−IV阻害薬は特にグリプチン類の群から選択される。
本明細書及び特許請求の範囲において使用されている単数形、例えば“ａ”、“ａｎ”及び“ｔｈｅ”は、文脈上明らかに他の意味を示している場合を除き、複数形も含む。
【００４４】
具体的に、プロスタサイクリン類似体は、トレプロスチニル、イロプロスト、ベラプロスト及びシカプロスト又はそれらの薬学的に許容可能な塩の群から選択される。
トレプロスチニルは、プロスタサイクリンの合成類似体で、代謝的に安定である。トレプロスチニルは、ＲｅｍｏｄｕｌｉｎＴＭとして市販されている。トレプロスチニルは、（１Ｒ，２Ｒ，３ａＳ，９ａＳ）−［［２，３，３ａ，４，９，９ａ−ヘキサヒドロ−２−ヒドロキシ−１−［（３Ｓ）−３−ヒドロキシオクチル］−１Ｈ−ベンズ［ｆ］インデン−５−イル］オキシ］酢酸・一ナトリウム塩である。
【００４５】
イロプロストは、“Ｉｌｏｍｅｄｉｎｅ”として市販されており、５−｛（Ｅ）−（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ，７Ｒ）−７−ヒドロキシ−６［（Ｅ）−（３Ｓ，４ＲＳ）−３−ヒドロキシ−４−メチル−１−オクテン−６−イニル］−ビ−シクロ［３．３．０］オクタン−３−イリデン｝ペンタン酸である。
【００４６】
ベラプロストは、２，３，３ａ，８ｂ−テトラヒドロ−２−ヒドロキシ−１−（３−ヒドロキシ−４−メチル−１−オクテン−６−イニル）−１Ｈ−シクロペンタ（ｂ）ベンゾフラン−５−ブタン酸である。
【００４７】
シカプロストは、２−［（２Ｅ）−２−［（３ａＳ，４Ｓ，５Ｒ，６ａＳ）−５−ヒドロキシ−４−［（３Ｓ，４Ｓ）−３−ヒドロキシ−４−メチルノナ−１，６−ジイニル］−３，３ａ，４，５，６，６ａ−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ペンタレン−２−イリデン］エトキシ］酢酸である。
【００４８】
本発明に従って、“プロスタサイクリン類似体”という用語は、前記物質の機能的誘導体及び機能的類似体を含む。
“類似体”又は“誘導体”という用語は、別の化学物質に構造及び機能が類似している化学分子のことで、単一の元素又は基が構造的に異なっていることが多い。これは、親化学物質と同じ機能を保持している場合、二つ以上の基（例えば、２、３、又は４個の基）の変更による相違でありうる。こうした変更は当業者には日常的なことであり、例えば、追加又は置換された化学部分（例えば酸のエステル又はアミド）、保護基（例えばアルコール又はチオールのためのベンジル基、及びアミンのためのｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基）などを含む。また、アルキル側鎖に対する修飾、例えばアルキル置換（例えば、メチル、ジメチル、エチルなど）、側鎖の飽和又は不飽和度に対する変更、ならびに置換フェニル及びフェノキシなどの修飾基の付加も含まれる。誘導体は、例えばビオチン又はアビジン部分、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素、及び放射性標識、生物発光、化学発光、又は蛍光部分との複合体も含みうる。さらに、本明細書中に記載の化学物質に何らかの部分を追加して、それらの薬物動態特性を変更することもできる。例えば、いくつかの望ましい性質の中でも特に、エクスビボにおける半減期を増大する、又はそれらの細胞透過性を増大するといったことなどである。また、薬剤の多数の望ましい品質（例えば、可溶性、バイオアベイラビリティ、製造など）を向上させることが知られているプロドラッグも含まれる。
【００４９】
“誘導体”という用語は、その範囲内に、親分子に対してなされる変更、例えば、機能的に等価の又は機能的に改良された分子を提供する付加、削除、及び／又は置換も含む。
本発明の特定の態様に従って、トレプロスチニル誘導体は、トレプロスチニルの酸誘導体、トレプロスチニルのプロドラッグ、トレプロスチニルの多形体、トレプロスチニルの無水多形体、又はトレプロスチニルの異性体の群から選択される。
【００５０】
同様に、イロプロスト、シカプロスト又はベラプロストは、それらの酸誘導体、プロドラッグ、多形体又は異性体の群から選択される誘導体でもよい。
特定の発明的態様に従って、２種類、特に３種類以上の異なるプロスタサイクリン類似体が発明的方法に使用できる。あるいは、４、５又は６種類、又はさらに多くの異なるプロスタサイクリン類似体が使用されてもよい。
【００５１】
具体的には、プロスタサイクリン類似体に加えて、（ジメチル化）プロスタグランジンＥ２が使用できる。
１６，１６−ジメチルＰＧＥ２は、１５−ヒドロキシＰＧＤＨの競合的阻害薬であるが、酵素の基質ではない。１５−ヒドロキシＰＧＤＨによる代謝に対して抵抗性があるため、インビボで長期の半減期を有する。１６，１６−ジメチルＰＧＥ２は、ほとんどのＥＰ受容体サブタイプに対するアゴニストとして作用する。単離されたＥＰ２受容体を活性化するためのＫｄは約１ｎＭである３。１６，１６−ジメチルＰＧＥ２は、培養下での増殖中に造血幹細胞の自己複製能を保存しながら分化を防止するために使用される４，５。
【００５２】
ＤＰＰ−IVは、ポリペプチド及びタンパク質のアミノ末端からＸａａ−Ｐｒｏジペプチドを除去する非古典的セリン、膜結合型アミノジペプチダーゼである。骨髄内で、ＤＰＰ−IVは、結合組織ストローマの膜上の特殊なミクロドメインに局在している。
【００５３】
グリプチンは、ＤＰＰ−IVを阻害する選択的血糖降下薬のクラスであり、主に糖尿病の治療に使用されている。グリプチンは、食物に応答して腸壁細胞によって合成されるインスリン分泌促進物質であるグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）の分解を阻害することにより、食後の血糖の低下を助ける。
【００５４】
本発明で具現化されているグリプチンは、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アナグリプチン、テネリグリプチン、ゲミグリプチン又はデュトグリプチン及び精製、可溶性又は細胞表面ジペプチジルペプチダーゼの強力な阻害薬であることが示されている任意のその他のグリプチンからなる群から特に選択される。
【００５５】
具体的には、ＤＰＰ−IV阻害薬の個人への投与は、本発明に従って前処理されているＨＳＣの投与の前、最中又は後でありうる。
本発明に従って、“処理”、“前処理”又は“インキュベーション”という用語は互換的に使用できる。当該用語は、プロスタサイクリン類似体及びｃＡＭＰエンハンサーと接触させられる単離された造血幹細胞に関して使用される。
【００５６】
さらに詳しくは、前記用語は、造血幹細胞を含有するサンプルを少なくとも一つのプロスタサイクリン類似体と少なくとも一つのｃＡＭＰエンハンサーと混合して混合物を得、前記混合物を前記細胞中のＧアルファｓ−シグナリングを刺激するのに足る時間インキュベートすることを意味する。
【００５７】
特定の態様に従って、使用するための組成物は、トレプロスチニルと共にイロプロスト、ベラプロスト又はシカプロストの一つと、そしてｃＡＭＰエンハンサー、具体的にはフォルスコリンとを含有しうる。あるいは、トレプロスチニルを、２種類以上、例えば、２、３、４又は５種類のその他のプロスタサイクリン類似体、例えば、これらに制限されないが、イロプロスト、ベラプロストもしくはシカプロスト、又はそれらの生理学的に許容可能な塩と組み合わせて、ｃＡＭＰエンハンサー、具体的にはフォルスコリンも一緒に混合することもできる。
【００５８】
発明的使用に従って、ＤＰＰ−IV阻害薬はビルダグリプチンであり、造血幹細胞は移植前にインビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンで処理されている。
代替の方法に従って、ＤＰＰ−IV阻害薬は、シタグリプチン、アログリプチン、サキサグリプチン及びリナグリプチン、アナグリプチン、テネリグリプチン、ゲミグリプチン及びデュトグリプチンから選択され、造血幹細胞は移植前にインビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンで処理されている。
【００５９】
さらなる代替の方法に従って、ＤＰＰ−IV阻害薬は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン、サキサグリプチン及びリナグリプチン、アナグリプチン、テネリグリプチン、ゲミグリプチン及びデュトグリプチンから選択され、造血幹細胞は移植前にインビトロでイロプロストとフォルスコリンで処理されている。
【００６０】
さらなる代替の方法に従って、ＤＰＰ−IV阻害薬は、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン、サキサグリプチン及びリナグリプチン、アナグリプチン、テネリグリプチン、ゲミグリプチン及びデュトグリプチンから選択され、造血幹細胞は移植前にインビトロでベラプロスト及び／又はシカプロストとフォルスコリンで処理されている。
【００６１】
特定の態様に従って、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）エンハンサー、又は、代替として、プロスタグランジンＥＰ受容体へのリガンドが幹細胞の前処理に使用できる。ｃＡＭＰエンハンサーの例は、当該技術分野で公知のものの中でも特に、ジブチリルｃＡＭＰ（ＤＢｃＡＭＰ）、ホルボールエステル、フォルスコリン、スクラレリン(sclareline)、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、コレラ毒素（ＣＴ）、アミノフィリン、２，４ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ノルエピネフリン、エピネフリン、イソプロテレノール、イソブチルメチル−キサンチン（ＩＢＭＸ）、カフェイン、テオフィリン（ジメチルキサンチン）、ドパミン、ロリプラム、プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、及び血管活性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）などであるが、これらに限定されず、インキュベーションの前に、幹細胞、又は幹細胞／トレプロスチニル、又は幹細胞／トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロスト及び／又はベラプロスト混合物に添加できる。ｃＡＭＰエンハンサーの例には、ｃＡＭＰ及びｃＡＭＰの類似体、中でもｓｐ−５，６−ＤＣｌ−ＢＩＭＰＳ（ＢＩＭＰＳ）も含まれる。
【００６２】
フォルスコリンは、組成物に含まれるのに特に好適である。
プロスタサイクリン類似体の量は、刺激ＨＳＣの調製法に依存する。
非常に具体的には、発明的用途の場合、トレプロスチニルの有効濃度は、０．１μＭ〜１００μＭ、特に１μＭ〜５０μＭ、特に５μＭ〜２５μＭの範囲、特に約１０μＭである。
【００６３】
本発明によれば、“約”という用語は、最大１０％、特に最大５％、さらに特に最大１％の数値の偏差を含む。例を挙げると、“約１０μＭ”という用語は、従って９〜１１μＭ、特に９．５〜１０．５μＭ、特に９．９〜１．１μＭの範囲を画定する。
【００６４】
本発明のさらに特定の態様に従って、プロスタサイクリン類似体の最適濃度範囲は、前記細胞におけるｃＡＭＰ蓄積の刺激に関するそのＥＣ５０の１０〜３０倍に相当する。
本発明の特定の態様に従って、プロスタサイクリン類似体とフォルスコリンの比率は約１：３でありうる。フォルスコリンとプロスタサイクリン類似体で処理されたＨＳＣは、再移植の前に精製できるが、これらのＨＳＣはさらなる精製工程なしに再移植されてもよい。なぜならば、少量のフォルスコリンが存在しても、悪い副作用は何ら生じないと見られるからである。
【００６５】
特定の側面に従って、幹細胞のインキュベーションに使用されるｃＡＭＰエンハンサー、具体的にはフォルスコリンの濃度は、１μＭ〜１００μＭ、特に１０μＭ〜５０μＭ、約３０μＭでありうる。
【００６６】
ＤＰＰ−IV阻害薬は、造血幹細胞移植の少なくとも５時間前、特に少なくとも１０時間前、特に少なくとも１５時間前、特に少なくとも２４時間前に投与される。
あるいは、ＤＰＰ−IV阻害薬は、患者に、術前、すなわち移植を受ける１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０日前、及び／又は術後、すなわち移植の少なくとも５時間、特に少なくとも１０時間、特に少なくとも１５時間、特に少なくとも２４時間後から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日後、又はそれより多い日数まで投与できる。
【００６７】
具体的には、ビルダグリプチンは、５０〜２００ｍｇ／日、特に７５〜１５０ｍｇ／日、特に約１００ｍｇ／日の量で個人に投与できる。
具体的には、シタグリプチンは、５０〜２００ｍｇ／日、特に７５〜１５０ｍｇ／日、特に約１００ｍｇ／日の量で個人に投与できる。
【００６８】
具体的には、サキサグリプチンは、約２．５〜１０ｍｇ／日、特に約５ｍｇ／日の量で個人に投与できる。
具体的には、リナグリプチンは、約２．５〜１０ｍｇ／日、特に約５ｍｇ／日の量で個人に投与できる。
【００６９】
具体的には、アログリプチンは、約１２．５〜５０ｍｇ／日、特に約２５ｍｇ／日の量で個人に投与できる。
発明的方法は、有益なことに、個人にそのまま投与できる刺激幹細胞を提供し、さらに前記細胞のホーミング及び生着を刺激する。
【００７０】
“個人”とは、広くは本発明に従って前処理された幹細胞の移植を受けるあらゆる動物、特に哺乳動物、特にヒトを含むことを意味する。
グリプチン及びプロスタサイクリン類似体で処理されたＨＳＣは、再移植される前に精製されてもよいが、これらのＨＳＣは更なる精製工程なしに再移植することもできる。
【００７１】
前記細胞中のＧアルファｓ−シグナリングを刺激するために必要な時間は、公知の方法に従って、例えばｃＡＭＰの測定を使用することにより測定できる。これには、例えば、ＲＩＡ、ＥＰＡＣ（ｅｐａｃ１）を用いた蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）（Ｐｏｎｓｉｏｕｅｎ  Ｂ．ら，ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ，５，１２，１１７６−１１８０（２００４））、放射化学法など、多数のバリエーションがある。Ｇアルファｓ−シグナリングが起きている刺激細胞は、当該技術分野で公知の方法、例えばＦＲＥＴに基づくｃＡＭＰレポーターなどにより、非刺激細胞から選択又は区別又は単離することができる。
【００７２】
前記細胞においてＣＤ２６ペプチダーゼ活性を阻害するのに必要な、そしてＳＤＦ−１への移動応答を増加させるために有効な時間は、公知法、例えばＡｌａ−Ｐｒｏ−７−アミド−トリフルオロメチルクマリンの切断の蛍光光度測定により測定することができる。あるいは、ＣＸＣＬ１２又はＧＬＰ−１などの天然基質の切断の阻害をＨＰＬＣ又はＥＬＩＳＡによってモニターしてもよい。
【００７３】
本発明の態様に従って、各細胞のインキュベーション時間は、約３０分間〜２４時間、好ましくは約１時間〜１２時間、好ましくは約１時間〜４時間である。
さらなる態様に従って、ＨＳＣをプロスタサイクリン類似体とｃＡＭＰエンハンサーで前処理するためのインビトロインキュベーション時間は、少なくとも１０分間、特に少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間である。
【００７４】
本発明のさらなる側面に従って、少なくとも１×１０５ドナー細胞／ｍｌがプロスタサイクリン類似体及びｃＡＭＰエンハンサーと共に約３７℃でインキュベートされる。
ｃＡＭＰ依存性経路は、造血幹細胞の生着を促進するための必須経路である。発明者らにより、プロスタサイクリン類似体は造血幹細胞中のｃＡＭＰ上昇を誘発できることが示された。プロスタサイクリン類似体は、多数の受容体、すなわちＩＰ受容体及びＥＰ受容体を活性化してＧアルファｓ−シグナリングの増加をもたらすことにより、これを行う。従って、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロスト又はベラプロストなどのプロスタサイクリン類似体は、ｃＡＭＰレベルをより効果的に上昇させる。
【００７５】
“造血幹細胞（ＨＳＣ）”という用語又はより一般的な“幹細胞”という用語は、本発明の記載においては等価の用語として理解され、一般的に、骨髄（例えば、単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、及びリンパ系（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、及び当該技術分野で公知のその他を含む血液細胞タイプを生み出す万能性(pluripotent)又は多能性(multipotent)“幹細胞”のいずれかのことを言う。
【００７６】
“幹細胞”は、通常、多数の細胞タイプを形成するそれらの能力（すなわち多能性であること）及びそれらの自己複製能を特徴とする。しかしながら、少能性(oligopotent)及び単能性(unipotent)前駆細胞も含まれてもよい。
【００７７】
“前駆細胞”という用語は、幹細胞のように特定のタイプの細胞に分化する傾向を有する生体細胞を含むが、幹細胞よりも既により特定的で、その“標的”細胞への分化へと押し進められる。前駆細胞は、分化して一つ又は複数種類の細胞を形成できる幹細胞の早期子孫である。幹細胞と前駆細胞間の最も重要な相違は、幹細胞は無限に複製できるが、前駆細胞は限られた回数しか分裂できない。ほとんどの前駆細胞は少能性と記載され、成体幹細胞と比較できる。前駆細胞は細胞分化の更に進んだ段階にあると言われる。それらは、幹細胞と完全分化細胞との間の“中心”に位置する。それらが持っている能力の種類は、それらの“親”幹細胞のタイプとそれらのニッチにも依存する。前駆細胞は、体内を通り、それらが必要とされる組織に移動できる。成体幹細胞と前駆細胞は多くの性質を共有している。
【００７８】
前駆細胞は成体に見出され、身体の修復系として作用する。それらは、特別な細胞を補給するが、血液、皮膚及び腸組織も維持する。それらは発生中の胚膵臓組織にも見出すことができる。
【００７９】
“造血”とは、一般的に、ＨＳＣから特殊な血液細胞への細胞分化又は形成の過程のことを言う。発生中、造血は、胎児肝臓から骨髄に位置を変え、その後そこが成人期を通して造血の部位であり続ける。骨髄中に確立されると、ＨＳＣは骨空洞全体に無作為に分布することはない。むしろ、ＨＳＣは典型的には骨内膜表面にごく近接して見出される。骨表面からの距離が増大するにつれて、より成熟した幹細胞の数が増加する。
【００８０】
造血組織は、長期及び短期再生能を有する細胞のほか、方向付けられた(committed)多能性、少能性、及び単能性前駆細胞も含有している。
ＨＳＣを含有するサンプルは具体的には骨髄でありうる。
【００８１】
ＨＳＣは、ＨＳＣを含有することが知られているいずれかの供給源、具体的には末梢血、臍帯又は臍帯血、胎盤及び骨髄から公知技術によって得ることができる。あるいは、動物の胎児肝臓、胎児脾臓、及び大動脈・性腺・中腎などの供給源も可能である。本発明の方法及び組成物にはヒト由来のＨＳＣが好適である。
【００８２】
例えば、ＨＳＣは、大腿骨、腰部、肋骨、胸骨、及びその他の骨を含む成人の骨髄中に見出すことができる。ＨＳＣは、多くの場合、骨髄コンパートメントからの細胞の放出を誘導するＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）などのサイトカインで前処理した後、針と注射器を用いて腰部から、又は血液から取り出すことにより、直接得ることができる。
【００８３】
ＨＳＣは、ある種の表現型マーカー又は遺伝子型マーカーに従って識別することができる。例えば、ＨＳＣは、それらのサイズの小ささ、系統（ｌｉｎ）マーカーの欠如、ローダミン１２３（ｒｈｏ１０）又はＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２などの生体染色色素による低染色（サイドポピュレーション(side population)）、及びそれらの表面上の様々な抗原マーカー（その多くは分化シリーズのクラスターに属する（例えば、ＣＤ５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ９０、ＣＤ１３３、ＣＤ１０５、ＣＤ４５、ＧＲ−１（＝Ｌｙ−６Ｇ／Ｃ）、７−４、Ｔｅｒ−１１９及びｃ−ｋｉｔ））の存在によって識別できる。ＨＳＣは主に、典型的には系統方向性（分化系列決定）(lineage commitment)を検出するために使用されるマーカーが陰性であるので、ｌｉｎ（−）細胞と呼ばれることが多い。ほとんどのヒトＨＳＣは、ＣＤ５＋、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）＋、ＣＤ１１＋、ＧＲ−１＋、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙｌ／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／〜、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋、及びｌｉｎ（−）として特徴付けられる。しかしながら、ある種のＨＳＣはＣＤ３４７＋及びＣＤ３８＋であるため、すべての幹細胞がこれらの組合せによってカバーされるわけではない。また、一部の研究によれば、最早期の幹細胞は細胞表面にｃ−ｋｉｔを欠いているかもしれないことが示唆されている。
【００８４】
フローサイトメトリー又はＦＡＣＳによるｌｉｎ（−）ＨＳＣの精製の場合、一連の成熟血液系マーカー抗体がｌｉｎ（＋）細胞又は後期多能性前駆細胞（ＭＰＰ）を枯渇させるために使用できる。例えば、当該技術分野で公知のものの中でも、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＧＲ−１、７−４及びＴｅｒ−１１９、ＣＤ１３、ＣＤ３２及びＣＤ３３、ＣＤ７１、ＣＤ１９、ＣＤ６１、Ｍａｃ−１（ＣＤｌ  ｌｂ／ＣＤ１８）、Ｇｒ−Ｉ、１１７Ｒａ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、及びＣＤ８に対する抗体である。さらなる精製法も当該技術分野では知られている。例えば、細胞表面分子の‘シグナル伝達リンパ球活性化分子’（ＳＬＡＭ）の特別なシグネチャーを使用する方法である。
【００８５】
ＨＳＣは、臍帯血、骨髄、末梢血、又はその他の供給源のいずれの由来であるにせよ、血清を含む又は含まない任意の適切な市販培地又は特注培地中で成長又は増殖できる。ヒト由来のＨＳＣは本発明の好適な態様である。例えば、一定の態様において、無血清培地はアルブミン及び／又はトランスフェリンを利用できる。さらに、中でも、Ｆｌｔ−３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）などのサイトカインが含まれてもよい。ＨＳＣはバイオリアクターなどの容器中でも増殖できる。ＨＳＣのエクスビボ増殖用の適切な培地は、ストローマ細胞（例えばリンパ網内系ストローマ細胞）などのＨＳＣ支持細胞も含みうる。これは、例えば、リンパ組織の脱凝集から誘導でき、ＨＳＣのほか、それらの子孫のインビトロ、エクスビボ、及びインビボにおける維持、増殖、及び分化を支持することが示されている。
【００８６】
“臍帯血(cord blood又はumbilical cord blood)”とは、一般的に、新生児から得られる比較的少量の血液（最大約１８０ｍｌ）のことを言い、新生児循環に戻るものである。臍帯血はＨＳＣに富むので、後の使用のために当該技術分野で公知の技術に従って採取及び貯蔵できる。
【００８７】
“エクスビボ”又は“インビトロ”という用語は、生体の外で行われる活動のことを言う。例えば、生体外の人工的環境において、生きた組織に対して行われる実験又は測定などを指すが、最小の自然条件の変更で行われるのが好ましい。一定の態様において、そのような組織又は細胞は、エクスビボ処理のために、採取及び凍結し、後に解凍することができる。生きている細胞又は組織を用いて数日間以上続く組織培養実験又は手順は、典型的には“インビトロ”と見なされるが、この用語はエクスビボと互換的に使用することもできる。“エクスビボ投与”、“エクスビボ処理”、又は“エクスビボ治療的使用”という記述は、一般的に、一つ又は複数の器官、細胞、又は組織を、生きている又は死亡したばかりの対象から採取し、任意に精製／富化し、幹細胞又は前駆細胞を処理するための処理又は手順に暴露し（例えば、細胞を本発明の組成物とインキュベートしてＨＳＣの生着能力を増強することを含むエクスビボ投与工程）、そしてその任意の処理又は手順の後、同じ又は異なる個人に投与する医学的手順のことを言う。
【００８８】
個人に投与されるＤＰＰ−IV阻害薬の量は、その対象の特徴、例えば、全身の健康状態、年齢、性別、体重、及び薬物に対する耐性のほか、トレプロスチニル及び／又は細胞移植物に対する反応の程度、重症度、及びタイプに依存する。
【００８９】
幹細胞移植を受ける個人は、何らかの骨髄疾患を患っているはずである。すなわち、正常の骨髄構造が、悪性腫瘍、鎌状赤血球疾患、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、再生不良性貧血、又は血液細胞及び血小板の産生の減少を招く感染に置換された疾患である。前記骨髄疾患は、例えば、白血病、血液細胞コンパートメントの欠陥又は化学療法もしくは放射線照射処置後の骨髄移植の必要性などでありうる。
【００９０】
さらに詳しくは、血液細胞コンパートメントの欠陥は、サラセミアのような異常ヘモグロビン症、好中性顆粒球機能の欠陥、好中性顆粒球機能の欠陥、Ｔリンパ球及び／又はＢリンパ球の欠陥、例えば重症複合型免疫不全症、ブルトン型無ガンマグロブリン血症でありうる。
【００９１】
例えば化学療法又は放射線照射に起因する骨髄疾患を患い、ゆえに造血幹細胞移植を受ける個人の治療のために、骨髄移植後、限られた期間、一つ又は複数のＤＰＰ−IV阻害薬を投与することによる使用も、本発明で取り扱う。
【００９２】
単離された幹細胞を前処理するための少なくとも一つのプロスタサイクリン類似体と一つ又は複数のｃＡＭＰエンハンサー、及び、移植された患者への一つ又は複数のＤＰＰ−IV阻害薬の投与は、ＨＳＣを使用する骨髄移植中又は骨髄再構成時のヒトＨＳＣの生着の増進に使用することができる。生着の促進は、対象が、死に至る可能性のある感染、出血及びその他の深刻な合併症にかかりやすい期間を短くする。従って、プロスタサイクリン類似体とグリプチンとの組合せは、骨髄の生着を増進するためにドナー骨髄を前処理するための有用な治療的選択肢になるはずである（すなわち、必要な細胞数の低減と骨髄形成不全の期間の短縮化により）。
【００９３】
骨髄移植後、ＤＰＰ−IV阻害薬で対象を数日間連続処置することは、生着の改良により、改良された臨床転帰をもたらす（すなわち、必要な細胞数の低減と骨髄形成不全の期間の短縮化により）。
【００９４】
そこで、特定の態様に従って、治療は、少なくとも１日間、特に移植後５日間、さらに特に少なくとも１０日間、さらに特に移植後少なくとも１４日間行われる。
ＤＰＰ−IV阻害薬は、適用可能な、そして当該技術分野で知られている任意の様式により、対象に投与できる。さらに詳しくは、腸内、静脈内又は皮下投与が提供される。
【００９５】
静脈内投与が好適な投与様式である。
しかしながら、ＤＰＰ−IV阻害薬は、徐放性形態、錠剤又はカプセルの群から選択される経口用形態でもよい。
【００９６】
本発明はまた、特に骨髄疾患（具体的には、骨髄疾患は、白血病、血液細胞コンパートメントの欠陥及び化学療法又は放射線照射によって誘発された骨髄疾患である）の治療に使用するための、
ａ）第一の単位剤形中に一定量の少なくとも一つのプロスタサイクリン類似体とフォルスコリン
ｂ）グリプチンから選択される一定量の少なくとも一つのＤＰＰ−IV阻害薬
を、成分ａ）とｂ）の２個、３個、４個又はそれより多い個数の別個の単位の形態で含む部品のキットも提供する。
【００９７】
本発明はさらに、本発明によるキットを使用説明書と共に含む包装品も取り扱う。
上記説明は、以下の実施例を参照することにより、より十分に理解されるであろう。しかしながら、そのような実施例は、単に本発明の一つ又は複数の態様を実施する代表的方法に過ぎないので、本発明の範囲を制限するものとして読まれるべきではない。
【実施例】
【００９８】
実施例１：
インビトロ移動アッセイ
マウスの造血前駆細胞を、インビトロで、１０μＭのトレプロスチニル（Ｔｒｅｐ）と３０μＭのフォルスコリン（Ｆｓｋ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、オーストリア・ウィーン）との組合せ又はビヒクルにより、３７℃で１時間、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（英国ロンドン）から購入した増殖因子含有幹細胞培地［（ＳｔｅｍＳｐａｎＴＭ（ＳＦＥＭ）（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）（５０ｎｇ／ｍＬのマウス幹細胞因子（ＳＣＦ）、５０ｎｇ／ｍＬのｆｍｓ様チロシンキナーゼ−３リガンド（Ｆｌｔ３）、５０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン１１（ＩＬ１１）及び１５０ｎｇ／ｍＬのマウスインターロイキン３（ｍＩＬ３）］中で前処理した。その後、細胞を洗浄し、培地中に２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。
【００９９】
細胞懸濁液（０．１ｍＬ、２×１０５細胞含有）をＴｒａｎｓｗｅｌｌＴＭディッシュ（孔径５μｍ）の上部チャンバーに加えた。底部チャンバーには、培地又は１００ｎｇ／ｍｌのマウス・ストローマ細胞由来因子１（ＳＤＦ−１＝ＣＸＣＬ１２）を含有する培地を加えた。細胞を３７℃で４時間移動させた。次に、下部チャンバーから回収された細胞の数を細胞計数器により決定した。移動細胞の数は、上部チャンバーに加えた全細胞のパーセンテージとして表された。
【０１００】
ヒト臍帯血由来ＣＤ３４＋細胞を幹細胞培地［Ｘ−ＶＩＶＯＴＭ１５（Ｌｏｎｚａ社、スイス）、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌｔ３、５０ｎｇ／ｍＬのヒト・トロンボポエチン及び５０ｎｇ／ｍＬのヒト（ＳＣＦ）補給、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社（英国ロンドン）より購入］中に維持した。移動アッセイを、組換えヒトＳＤＦ−１を下部チャンバーに加えた以外はマウス細胞で記載したように実施した。示されたデータは、三重に実施された３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表している。統計学的有意差は、一元配置分散分析(one-way ANOVA)と、それに続くダネットの多重比較により評価した（＊、ｐ＜０．０５）。
【０１０１】
データを図１に示す。
実施例２：
トレプロスチニルとフォルスコリンの存在下で刺激されたマウス造血前駆細胞のＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２誘導移動の、ＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００による阻害
造血幹細胞及び前駆細胞をトレプロスチニル（１０μＭ；Ｔ）及びフォルスコリン（３０μＭ、；Ｆ）と共に３７℃で１時間プレインキュベートし、洗浄して、細胞密度２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させた。細胞懸濁液（０．１ｍＬ中に２×１０５細胞）をＴｒａｎｓｗｅｌｌＴＭディッシュの上部チャンバーに加えた。ここには１０μＭのＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００（１０μＭ）を含む培地と含まない培地が入っていた。下部チャンバーの培地は１００ｎｇ／ｍｌのマウスＳＤＦ−１を含有していた。インキュベーションを３７℃で４時間続けた。その後、下部チャンバーに回収された細胞を図１の説明に概要を示したようにカウントした。示されたデータは、三重に実施された３つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。統計学的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡと、それに続くダネットの多重比較により評価した（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【０１０２】
ＣＸＣＲ４アンタゴニストＡＭＤ３１００は、トレプロスチニルとフォルスコリンの存在下で刺激されたマウス造血前駆細胞のＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２誘導移動を阻害する。
データを図２に示す。
【０１０３】
実施例３：
ビルダグリプチンは、トレプロスチニルとフォルスコリンと共にプレインキュベートされた造血前駆細胞のＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２誘導移動を増強する
マウス造血前駆細胞（ｍＨＰＣ；左側パネル）及び臍帯血由来ヒトＣＤ３４＋細胞（右側パネル）をトレプロスチニル（１０μＭ；Ｔ）及びフォルスコリン（３０μＭ、；Ｆ）の不在下又は存在下で１時間プレインキュベートした。その後、細胞懸濁液（０．１ｍＬ中に２×１０５細胞）をＴｒａｎｓｗｅｌｌＴＭディッシュの上部チャンバーに加えた。ここには３０ｎＭのビルダグリプチン（Ｖｉｌ）を含む培地と含まない培地が入っていた。下部チャンバーの培地は１００ｎｇ／ｍｌのマウス又はヒトＳＤＦ−１を適切に含有していた。インキュベーションを３７℃で４時間続けた。その後、下部チャンバーに回収された細胞を図１の説明に概要を示したようにカウントした。示されたデータは、三重に実施された３つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。統計学的有意差は、一元配置ＡＮＯＶＡと、それに続くダネットの多重比較により評価した（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【０１０４】
データを図３に示す。
実施例４：
インビボ・ホーミングアッセイ
ビルダグリプチンとトレプロスチニルは、トレプロスチニル及びフォルスコリンと共にプレインキュベートされた造血前駆細胞のホーミングを増進するが、インビボで組み合わせると相互に拮抗的である。
【０１０５】
マウスの造血幹細胞及び前駆細胞を、６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃドナーマウス（１５匹）から、骨髄、赤血球、巨核球及びリンパ系の細胞で保持された系統特異的抗体とＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ  Ｂｉｏｔｅｃ社、ドイツ・ベルギッシュグラートバハ）を製造業者の説明書に従って用い、磁気細胞選別(magnetic cell sorting)により単離した。ｓｃａ１＋、ｃ−Ｋｉｔ＋、系統陰性（Ｌｉｎ−）細胞を、トレプロスチニル（１０μＭ）とフォルスコリン（３０μＭ）との組合せの不在下（ビヒクル対照＝非処理細胞）及び存在下（＝処理細胞）で１時間プレインキュベートした。
【０１０６】
その後、（非処理及び処理）造血幹前駆細胞（１×１０６細胞）を、致死的に（９Ｇｙ）放射線照射されたレシピエントのＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈を通じて注入した。レシピエントマウスは何ら追加の処置を受けなかったか（非処理細胞及び処理細胞と標識されているバー）、又はマウスは骨髄移植の２４時間前から、トレプロスチニル（３μｇ／８時間；“インビボｔｒｅｐ”と標識されているバー）、ビルダグリプチン（１０ｍｇ／ｋｇ／２４時間；“インビボｖｉｌ”と標識されているバー）、もしくはトレプロスチニルとビルダグリプチンとの組合せ（“インビボｔｒｅｐ＋ｖｉｌ”と標識されているバー）を注入した。
【０１０７】
細胞の骨髄へのホーミング能力は、２０時間後にコロニー形成アッセイによって評価した。骨髄細胞を採取するために大腿骨及び脛骨をＰＢＳでフラッシュ洗浄した。赤血球を赤血球溶解バッファー（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）により除去した。残った細胞を半固体のメチルセルロースベースの培地（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ，ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国）に再懸濁させた。各条件は三重に評価された。顆粒球・単球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）及び赤血球コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）の両方の形成を支持するために特異的増殖因子を加えた。すなわち、エリスロポエチン  ３Ｕ／ｍＬ、ＩＬ３  １０ｎｇ／ｍＬ、ＩＬ７  １０ｎｇ／ｍＬ、ＧＭ−ＣＳＦ  １０ｎｇ／ｍＬである。培養物は、５％ＣＯ２を含有する湿潤雰囲気中に３７℃で６日間維持した。その後、コロニーの数を顕微鏡下でカウントした。当然のことながら、これらのコロニーは、注入され、骨髄に移動してきた細胞から生じている。なぜならば、レシピエントマウスの内因性骨髄は放射線照射により破壊されているからである。従って、造血前駆細胞を注入されなかった放射線照射マウスの骨髄を平板培養しても、コロニーは得られなかった（陰性対照）。
【０１０８】
下記のことが明白である。
（ｉ）トレプロスチニル及びフォルスコリンとのインビトロ・プレインキュベーションはホーミングを増大した（参照：非処理及び処理と標識されているバー）。
【０１０９】
（ii）トレプロスチニル及び／又はビルダグリプチンによるレシピエントマウスの単独処置はホーミングを促進しなかった（参照：２番目のバー“非処理”と、３〜５番目の標識“＋インビボｔｒｅｐ”、“＋インビボｖｉｌ”、“＋インビボｔｒｅｐ＋ｖｉｌ”）。
【０１１０】
（iii）処理細胞を注入されているレシピエントマウスの、トレプロスチニル又はビルダグリプチンのいずれかによる処置はホーミングを促進した（参照：６番目のバー“非処理”と、７及び８番目の標識“＋インビボｔｒｅｐ”、“＋インビボｖｉｌ”）。しかし
（iv）組合せ（一番右側の標識“＋インビボｔｒｅｐ＋ｖｉｌ”）は、いずれかの化合物の単独投与（７及び８番目の標識“＋インビボｔｒｅｐ”、“＋インビボｖｉｌ”）より効果がなかった。従って、インビボで組み合わせると、トレプロスチニルとビルダグリプチンは相互に拮抗的である。
【０１１１】
ビルダグリプチン及びトレプロスチニルは、トレプロスチニルとフォルスコリンと共にプレインキュベートされた造血前駆細胞のホーミングを増進するが、インビボで組み合わさると相互に拮抗的である。データを図４に示す。
【０１１２】
実施例５：
インビボ生着アッセイ
インビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せで前処理された造血前駆細胞を注入されたＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウス（致死的に放射線照射されている）へのトレプロスチニルとビルダグリプチンの併用投与は、ビルダグリプチン又はトレプロスチニルいずれかの単独インビボ投与よりも、これらのマウスの生存の増進に効果が少ない。
【０１１３】
造血前駆細胞を、図４の説明に概要を示したようにドナーマウス（ＢＡＬＢ／ｃ）の骨髄から単離した。細胞をインビトロで、１０μＭのトレプロスチニル及び３０μＭのフォルスコリン又はビヒクルにより、３７℃で１時間処理した。洗浄後、０．２×１０６個の系統陰性造血前駆細胞を、致死的に放射線照射された（９Ｇｙ）レシピエントのＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）の尾静脈を通じて注入した。インビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せで前処理されなければ、この数の造血前駆細胞は少なすぎてレシピエント動物を救えない。従って、前処理されていない細胞を受けたマウスの群は第１週以内に死亡した（黒線、ＣＴＲＬ）。限られた数の造血幹細胞は、前処理された細胞を受け、その後トレプロスチニルで処置されたマウスの５０％を救うのに足る数であった（３μｇ／８時間、皮下、１０日間；インビトロ前処理細胞＋レシピエントマウスのトレプロスチニルによるインビボ処置と標識された赤色曲線）。最も効果的な治療計画は、前処理された造血前駆細胞の注入と、その後のビルダグリプチンの投与であった（１０ｍｇ／２４時間、皮下）。全マウス（すなわち１０匹中１０匹）が生き残った（インビトロ前処理細胞＋レシピエントマウスのビルダグリプチンによるインビボ処置と標識された曲線）。これに対し、トレプロスチニル（３μｇ／８時間）とビルダグリプチン（１０ｍｇ／２４時間）との組合せを受けたマウスは、前処理細胞を受けた全レシピエントマウスのうち最悪の転帰となった。１０匹のマウス中２匹しか生き残らなかった（インビトロ前処理細胞＋レシピエントマウスのトレプロスチニルとビルダグリプチンとの組合せによるインビボ処置と標識された灰色線）。薬物注入（すなわち、トレプロスチニル及び／又はビルダグリプチンの皮下注射による投与）は、造血前駆細胞移植の直後に開始し、１０日間継続した。すべての曲線は、互いに有意に異なっている（ログランク検定）。
【０１１４】
インビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せで前処理された造血前駆細胞を注入されたＢＡＬＢ／ｃレシピエントマウス（致死的に放射線照射されている）へのトレプロスチニルとビルダグリプチンの併用投与は、ビルダグリプチン又はトレプロスチニルいずれかの単独インビボ投与よりも、これらのマウスの生存の増進に効果が少ない。データを図５に示す。
【０１１５】
実施例６：
我々は、トレプロスチニルとフォルスコリンの作用がさらに増強される条件を探った。これは、トレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せの作用が、少なくとも一部はＣＸＣＲ４受容体（すなわち、ケモカインのストローマ細胞由来因子−１＝ＳＤＦ１＝ＣＸＣＬ１２の受容体）の誘導によって媒介されているとの観察に基づいていた。さらに、我々は、ジメチルＰＧＥ２及びトレプロスチニルがヒトＨＳＰＣによるｃＡＭＰ蓄積に及ぼす効果も比較した。
【０１１６】
材料及び方法
マウス及びヒトの造血幹細胞及び前駆細胞の単離
１０匹のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６又はＢａｌｂ／Ｃ）を頸椎脱臼により犠死させた。後肢の長骨（すなわち大腿骨及び脛骨）を筋肉及び結合組織から外し、注射器と２７  １／２Ｇ針を用いてＲＰＭＩ培地でフラッシュ洗浄した。細胞懸濁液から目に見える結合組織を除き、収集して遠心管に移した。細胞を遠心分離（１，２００ｒｐｍ／〜１００ｇ、５分間）により採取し、３ｍＬの赤血球溶解バッファー（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．４に調整）中に再懸濁させた。細胞懸濁液を２０℃で２分間、次いで氷上で４分間インキュベートした。その後、ＲＰＭＩ（１０ｍＬ）を加え、細胞を遠心分離により採取し、カウントした。細胞の典型的な収量は３＊１０７／マウスであった。
【０１１７】
細胞を、２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含有する氷冷ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中に細胞密度２．５＊１０８細胞／ｍＬで再懸濁させ、これに、ＣＤ５、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ、ＧＲ−１（＝Ｌｙ−６Ｇ／Ｃ）、７−４及びＴｅｒ−１１９に対する系統特異的抗体を含有するビオチン化抗体のカクテル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社の“Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”）を、１０８細胞あたり０．１ｍＬの抗体溶液の比率で加えた。細胞を抗体と共に氷上で２０分間インキュベートし、遠心分離によりペレット化した。再懸濁後（３．３＊１０８細胞／ｍＬ）、第二の抗ビオチン被覆マイクロビーズ（０．２ｍＬ／１０８細胞、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社の“Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｋｉｔ”に提供されている）を細胞懸濁液に加え、混合物を氷上で１５分間インキュベートした。その後、サンプルをＭＡＣＳバッファー（３０ｍＬ）中に希釈し、細胞を遠心分離により回収し、６ｍＬのＭＡＣＳバッファー中に再懸濁させた。この懸濁液を、細胞適合性プラスチック材料で被覆された強磁性ビーズを含有するプレパックＬＳカラム上に装填した。典型的には３本のカラムが使用された（２ｍＬの細胞懸濁液／カラム）。流出液(flow-through)は系統マーカー陰性細胞（Ｌｉｎ−細胞）を含有していたが、系統が方向付けられた細胞はカラム上に保持された。細胞を遠心分離によってペレット化し、２ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。典型的な収量は７＊１０５  ｌｉｎ−細胞／マウスであった。
【０１１８】
ヒト造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）を健常ドナーの臍帯から採取した。臍帯血サンプル（〜５０ｍＬ）を健常満期産の最中に回収した。ＣＤ３４＋細胞を磁気活性化細胞選別器（ＭＡＣＳ）Ｄｉｒｅｃｔ  ＣＤ３４  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて単離し、記載のように増殖させた（３）。手短に述べると、臍帯血を等量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈し；この懸濁液（２５ｍｌ）をＬｙｍｐｈｏＰｒｅｐＴＭ（Ｎｙｃｏｍｅｄ社から得た密度培地(density medium)で、ジアトリゾ酸ナトリウム(sodium triatoate)と多糖類の混合物を含有する）上に層化した。この試験管を水平ローター(swinging bucket rotor)で３０分間、３５５ｇで遠心分離した。単核細胞を含有する層を採取し、ＰＢＳで希釈し（５０ｍＬに）、４００ｇで８分間遠心分離して、残留ＬｙｍｐｈｏＰｒｅｐＴＭを除去した。赤血球を、１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するバッファー（ｐＨはＨＣｌで７．２〜７．４に調整）中で１０分間４℃で溶解して除去した。単核細胞の数を測定し、単離キットに提供されているＭＡＣＳバッファー中２＊１０８細胞／ｍＬに調整した。ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（０．１ｍＬ／ｍＬ細胞懸濁液）を加え、懸濁液を室温で１５分間インキュベートし、ＥａｓｙＳｅｐ（登録商標）Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（５０μＬ／ｍＬ）を加えた。室温での１０分間の追加インキュベーションの後、細胞懸濁液を培地の添加により２．５ｍＬに希釈した。試験管を５分間磁石内に置き、その後細胞を回収した。この工程を５回繰り返した。富化細胞を、ＧｌｕｔａＭＡＸ（２．５ｍＭ；Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；それぞれ１２５Ｕ／ｍＬ）ならびにＦｌｔ３Ｌ、ＳＣＦ及びＴＰＯ（それぞれ５０ｎｇ／ｍＬ）を補給した無血清Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を含有する懸濁培養で、６日間増殖させた（すなわち２回の集団倍加）。典型的な収量は９＊１０５  ＣＤ３４＋細胞／臍帯血標本であった。これを増殖させて３．５＊１０６細胞を得た。すべての手順は、これらの研究に関するウィーン医科大学治験審査委員会(Medical University of Vienna Institutional Review Board)のガイドラインに従って実施された。ヘルシンキ宣言の原則(Declaration of Helsinki Principles)に従ってインフォームド・コンセントが提供された。
【０１１９】
フローサイトメトリー
マウス及びヒト造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）調製物の純度をフローサイトメトリーにより評価した。細胞表面マーカーの染色に使用された抗体は下記の供給源由来であった。すなわち、マウス系統パネル抗体は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社由来であり（ＢＤ  ５５９９７１、抗ＣＤ３ε、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ４５Ｒ、抗Ｌｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６ｃ、抗Ｔｅｒ−１１９をビオチン化して含有）、アフィニティー精製ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（マウスＦｃγＩＩ／ＩＩＩブロック、ＢＤ  ５５３１４２）及び蛍光染料ストレプトアビジン−アロフィコシアニン−Ｃｙ７（ストレプトアビジンＡＰＣ−Ｃｙ７、ＢＤ５５４０６３）もＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社より得た。フィコエリトリン（ＰＥ）−Ｃｙ７−標識抗マウスＬｙ６Ａ／Ｅ（＝幹細胞抗原−１＝Ｓｃａ１）ＰＥ−Ｃｙ７（カタログ番号２５−５９８１−８２）及びＰＥ−Ｃｙ５抗マウスＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）（カタログ番号１５−１１７１−８１）はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社より得た。
【０１２０】
ＭＡＣＳの直後、１＊１０６個の系統陽性（Ｌｉｎ＋）及び陰性（Ｌｉｎ−）細胞をＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）管に移し、５０μＬのＰＢＳ中、氷上で貯蔵した。その間、ＦＡＣＳに適切な下記抗体を希釈し（１：５０）、ＰＢＳ中に混合した。すなわち、精製抗ＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃ受容体を遮断するため）、ビオチン化抗ＣＤ３ε、ビオチン化抗ＣＤ１１ｂ、ビオチン化抗ＣＤ４５Ｒ、ビオチン化抗Ｌｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ、及びビオチン化抗Ｔｅｒ−１１９、ストレプトアビジン標識ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｃｙ７標識抗Ｓｃａ−１、ＰＥ−Ｃｙ５標識抗ｃ−ｋｉｔである。このマスター混合物（５０μＬ）を各サンプルに加え、次いでそれを穏やかな渦流(vortexing)により混合し、４℃、暗所で１５分間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離により回収し、２ｍＬのＰＢＳ中で洗浄し、そしてＰＢＳ中に再懸濁させた。サンプルをＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）で分析した。ゲーティング手順は次の通りであった。生存細胞のゲートを、前方散乱及び側方散乱を記録することにより設定した。生存細胞はさらに、系統マーカー（すなわち、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５Ｒ、Ｌｙ−６Ｇ／Ｌｙ−６Ｃ、Ｔｅｒ−１１９）の発現に基づいて区別された。これにより、Ｌｉｎ−細胞のゲートが定義できた（Ｌｉｎ−細胞はさらに、Ｓｃａ−１及びｃ−ｋｉｔの発現についても分析された）。
【０１２１】
フローサイトメトリーを使用して、ヒトＨＳＰＣによるＣＸＣＲ４及びＣＤ２６／ＤＰＰIV（ジペプチジルペプチダーゼIV）の発現もモニターした。ＣＸＣＲ４及びＣＤ２６／ＤＰＰIVの発現は、１０μＭのトレプロスチニルと３０μＭのフォルスコリンで２時間、４時間及び６時間処理した後に測定した。インキュベーション後、ヒトＣＤ３４＋細胞を洗浄し、製造業者の説明書に従って、ＣＸＣＲ４及びＣＤ２６に対する抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で染色し、ＦＡＣＳ分析により定量した。３つの独立した実験を別個に実施した後、統計分析のためにデータを平均した。データは、平均±ＳＥＭで示され、比較は一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行われた。
【０１２２】
［３Ｈ］ｃＡＭＰ蓄積アッセイ
ヒト造血ＣＤ３４＋幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ、４＊１０５／ｍＬ）をまず、増殖因子を補給したＸ−ＶＩＶＯ１５培地中で、１００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）の不在下存在下で１６時間プレインキュベートし、次いで、増殖因子と１０μｇ／ｍＬのアデノシンデアミナーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）を補給したＸ−ＶＩＶＯ１５培地中の［３Ｈ］アデニン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、１μＣｉ／ｍＬ）中での更なる４時間のインキュベーション期間により、アデニンヌクレオチドプールの代謝標識を行った。その後、細胞を、１又は１０μＭのトレプロスチニル、１又は１０μＭのジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、フォルスコリン（３０μＭ）又はフォルスコリンとプロスタノイドとの組合せに３０分間暴露(challenge)した。次いで、細胞をペレット化し（１００ｇで５分間）、培地を除去して、ペレットを、０．１ｍＭのｃＡＭＰを含有する氷冷２．５％過塩素酸（０．９ｍＬ）中で溶解し、氷上に１時間保持して、４．２Ｍ  ＫＯＨ（０．１ｍＬ）で中和した。ＡＴＰとｃＡＭＰを、Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ５０−Ｘ８及び中性アルミナを含有するカラム上での連続クロマトグラフィーにより分離した（３）。
【０１２３】
細胞生存性、細胞周期分布及びコロニー形成
ヒト又はマウスＨＳＰＣを、ビヒクル又は１０μＭのトレプロスチニルと３０μＭフォルスコリンとの組合せの存在下、３７℃で１時間及び２４時間インキュベートした。４℃のＰＢＳで洗浄後、細胞を、外在化ホスファチジルセリンについては製造業者のプロトコルに従ってＰＥ  Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（登録商標）を用い、又はＤＮＡ含有量についてはＰＩ（ＰＢＳ中５０μｇ／ｍＬ）を用いて、３７℃で４０分間染色した。フローサイトメトリーにより得られたデータをＦａｃｓ  Ｄｉｖａソフトウェア（登録商標）を用いて分析した。マウスＨＳＰＣのコロニー形成は下記のようにして調べた。１０μＭのトレプロスチニルと３０μＭフォルスコリンの存在下での１時間のインキュベーションの後、ＣＦＵ−ＧＭ形成用としてＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３（それぞれ１０ｎｇ／ｍＬ）を含有し、ＣＦＵ−Ｅ用として３Ｕ／ｍＬのＥＰＯ及びＩＬ−３を含有するＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（登録商標）中に再懸濁させ、３７℃及び５％ＣＯ２で７〜１０日間培養した。コロニーの数は光学顕微鏡下でカウントした。
【０１２４】
移動アッセイ
ＢＡＬＢ／ｃドナーマウスの骨髄由来のマウス系統陰性造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）及び臍帯血から単離したヒトＣＤ３４＋  ＨＳＰＣを、マウス幹細胞培地（ＳＦＥＭＴＭ；それぞれ５０ｎｇ／ｍＬの増殖因子；ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＩＬ１１及び１５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ３）又はヒト幹細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯＴＭ１５、それぞれ５０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、ＦＬ３、及びＳＣＦ）のいずれかの中で、１０μＭのトレプロスチニルと３０μＭフォルスコリンとの組合せで刺激した。洗浄後、細胞懸濁液（０．１ｍＬ中２×１０６細胞）をＴｒａｎｓｗｅｌｌＴＭ（直径６．５ｍｍ、孔径３μｍ）の上部チャンバーに入れた。下部チャンバーは、増殖因子と１００ｎｇ／ｍｌのＳＤＦ−１を含有する３００μＬの培地で満たした。必要な場合、上部及び底部チャンバーの両方に３０ｎＭのビルダグリプチンを補給した。３７℃での４時間のインキュベーション後、ＳＤＦ−１への走化性を調べた。底部チャンバーに移動したＨＳＰＣを細胞計数器でカウントした。アッセイは三重に実施された。
【０１２５】
ホーミングアッセイ
ドナーマウスＢ６．ＳＪＬ−ＰｔｒｃＡＰｅｐ３Ｂ／Ｂｏｙｌ（ＣＤ４５．１＋）の全骨髄細胞から、系統陰性ＨＳＰＣをＭＡＣＳマイクロビーズ（上記参照）を用いて単離した。細胞をインビトロで１０μＭのトレプロスチニル及び３０μＭフォルスコリン又はビヒクル対照で１時間３７℃で処理した。洗浄後、０．２×１０６個の系統陰性ＣＤ４５．１＋  細胞を、致死的に放射線照射された（１０Ｇｙ）レシピエントＣ５７Ｂｌ／６（ＣＤ４５．２＋）マウスに注入した。レシピエントマウスは、インビボで、トレプロスチニル（０．１５ｍｇ／ｋｇ／８時間）、ビルダグリプチン（１０ｍｇ／ｋｇ）、又は両薬物の組合せのいずれかによる皮下処置も受けた。対照マウスには同じ量のビヒクルを注入した。移植の１６時間後、レシピエントマウスから全骨髄細胞を単離した。赤血球の溶解後、細胞をＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２マーカーに対し染色した。骨髄中のＣＤ４５．１＋及びＣＤ４５．２＋細胞の割合はフローサイトメトリーにより測定した。
【０１２６】
骨髄移植：
同系のレシピエントマウス（Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃ）に致死的放射線照射を浴びせた。造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）の静脈内投与で救えなければ、これらのマウスは最初の２週間以内に死亡した。Ｌｉｎ−（Ｓｃａ１＋及びｃ−Ｋｉｔ＋）ＨＳＰＣ細胞を上記に概要を示した通りに調製し、エクスビボで、１０μＭのトレプロスチニル＋３０μＭのフォルスコリン（ＦＳＫ）の組合せの不在下及び存在下、３７℃で１時間、前処理した。その後、細胞（１〜５＊１０５／マウス）を尾静脈から注入した。白血球数をＦＡＣＳにより求め、血液サンプルを第９日目（血球数は〜１Ｇ／Ｌであった）から３〜５日ごとに採取した。場合によって、マウス（２５〜３０ｇ）は、１０日間、８時間ごとに皮下投与された（ｉ）トレプロスチニル（０．１５ｍｇ／ｋｇ／８時間）及びビルダグリプチン（１０ｍｇ／ｋｇ／１２時間）又は両者の組合せでも処置された。
【０１２７】
造血幹細胞及び前駆細胞からのＲＮＡの単離とポリメラーゼ連鎖反応：
ＲＮＡを、２ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、マウス及びヒト造血幹細胞及び前駆細胞（３＊１０６細胞）と、マウス大脳皮質から調製された混合（すなわちニューロン及びグリア）培養物と、ヒト前立腺がん細胞株ＰＣ３及びヒト結腸がん細胞株ＨＣＴ１１６（陽性対照として）から単離した。ホモジナイズされたサンプルを室温で５分間インキュベートして、核タンパク複合体を完全解離させた。クロロホルム（０．４ｍＬ）を細胞溶解物（ライセート）に加え、試験管を手で１５秒間激しく振盪した。室温での３分間のインキュベーション後、サンプルを１２，０００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。遠心分離後、混合物は、下部の赤色フェノール−クロロホルム相、中間相、及び無色の上部水性相に分離する。水性相（ＲＮＡ）を新しい試験管に移し、１ｍｌのイソプロピルアルコールと混合することによりＲＮＡを沈殿させた。室温での１０分間のインキュベーション後、サンプルを１２，０００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を除去し、ゲル様ＲＮＡペレットを２ｍｌの７５％エタノールで一度洗浄した。サンプルを渦流混合し、７，５００ｇで５分間、４℃で遠心分離した。ＲＮＡペレットを１０分間風乾し、溶液をピペットの先端に数回通すことにより、８０μＬの（高純度）水中に溶解し、５５℃で１０分間インキュベートした（−２０℃で貯蔵）。
【０１２８】
ＲＮＡ（１μｇ）を、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を用い、１μＬのオリゴ（ｄＴ）１８プライマー、４μｌの５ｘ反応バッファー、１μｌのＲｉｂｏＬｏｃｋＴＭ  ＲＮアーゼ阻害薬（２０ｕ／μｌ）、２μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、１μｌのＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（２００ｕ／μｌ）及び精製水の存在下でｃＤＮＡに逆転写し、４２℃で６０分間、次いで７０℃で５分間のインキュベーションにより、合計体積１２μｌを得た。
【０１２９】
ヒトプロスタグランジン受容体及びＣＸＣＲ４の断片のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅は、１μｌのｃＤＮＡ、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１μｌのフォワードプライマー［１０μＭ］、１μｌのリバースプライマー［１０μＭ］、４μｌのＧｏＴａｑ（登録商標）バッファー［５ｘ］、０．２μｌのＧｏＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ及び精製水を用いて実施され、最終体積２０μｌ（１１．８μｌ）となった。混合物をまず９５℃で５分間インキュベートし、次いで４０サイクル（９５℃で４５秒間の変性、５７℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で４５秒間の伸長反応）を繰り返し、最後に７２℃で５分間伸長反応を行った。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル上で分離させた。
【０１３０】
【表１】
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【０１３１】
結果：
トレプロスチニル及びｄｍＰＧＥ２に誘導されたサイクリックＡＭＰ蓄積ヒト造血幹細胞及び前駆細胞
材料及び方法で概要を示したように、［３Ｈ］アデニンで代謝標識後、ヒトＨＳＰＣを、トレプロスチニル（Ｔｒｅｐ、１０μＭ）、ｄｍＰＧＥ２（１０μＭ）又はフォルスコリン（Ｆｓｋ、３０μＭ）、トレプロスチニル（１０μＭ）又はｄｍＰＧＥ２（１０μＭ）とフォルスコリン（３０μＭ）との組合せで刺激した。必要な場合、ＨＳＰＣは、刺激前に百日咳毒素（ＰＴＸ）で１６時間、前処理された。データは、三重に実施された３つの独立した実験から得たものである。誤差バーは標準偏差(s.e.m.)を示す。３０μＭのフォルスコリンの存在下では、１０μＭのトレプロスチニルは１０μＭのｄｍＰＧＥ２よりも有効であった（Ｐ＝０．０３；ウィルコクソン検定）。この差は百日咳毒素による前処理で消滅した（ｎｓ、有意差なし）。データを図７に示す。
【０１３２】
ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）のアデニンヌクレオチドプールを［３Ｈ］アデニンで代謝標識し、それらのトレプロスチニル及びジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）に対する応答を３０μＭのフォルスコリンの存在下及び不在下で調べた。トレプロスチニルは、細胞がフォルスコリンの不在下又は存在下で刺激されたかどうかに関わらず、ｄｍＰＧＥ２より著しく有効であったことが図７から明らかである。このジテルペンは、アデニリルシクラーゼの触媒Ｃ１及びＣ２ドメインの間の偽基質溝(pseudosubstrate cleft)に結合し、酵素の様々なアイソフォームを、刺激Ｇタンパク質Ｇαｓに対してより反応性にする（５〜７）。ｄｍＰＧＥ２の効果が低いことは、ｄｍＰＧＥ２はＧｉ共役ＥＰ３受容体の完全アゴニストでもあることから（８，９）、ＥＰ２及びＥＰ４受容体を介したアデニリルシクラーゼのＧｓ依存性刺激と、Ｇｉ共役ＥＰ３受容体を介した同時阻害の両方を起こすことを考慮に入れると、合理的に説明できる。百日咳毒素は、Ｇｉ共役受容体とＧｉ（ならびにＧｏ及びＧｔなどの関連Ｇタンパク質）との相互作用を、ＧαｉサブユニットのＣ末端から除去された４個のアミノ酸のシステイン残基をＡＤＰリボシル化することによって消失させる。それ故、ＨＳＰＣを百日咳毒素の存在下で１６時間プレインキュベートした。この前処理は、ｄｍＰＧＥ２に対する応答を増大する結果（参照：図７の６番目及び９番目のバー）、トレプロスチニル＋フォルスコリンによって引き起こされるｃＡＭＰ応答と、ｄｍＰＧＥ２＋フォルスコリンによって引き起こされるそれとの間に有意な差がなくなる（参照：図７の８番目及び９番目のバー）。このことは、ヒトＨＳＰＣに対するｄｍＰＧＥ２及びトレプロスチニルの作用に大きな違いがあることを裏付けている。すなわち、ｄｍＰＧＥ２はＧｉ共役受容体に関与するが、トレプロスチニルは関与しない。
【０１３３】
トレプロスチニル及びフォルスコリンによるＨＳＰＣの前処理は、細胞の生存性、細胞周期の進行又は分化能を変化させない
ｃＡＭＰの継続的な上昇は、幹細胞におけるアポトーシスを誘発しうる（１０）。ｄｍＰＧＥ２処理ＨＳＣの生着向上は、細胞生存、増殖及びホーミングに対する効果によるものであった（１１）。トレプロスチニルとｄｍＰＧＥ２は、Ｇタンパク質を動員するそれらの能力に違いがある。ｄｍＰＧＥ２が誘導するＧｉの動員は特に関係がありうる。なぜならば、Ｇｉを介したシグナリングは、脂質キナーゼのＰＩ３キナーゼと下流のキナーゼＡＫＴの活性化をもたらすことができ、これが細胞の増殖及び生存を刺激するからである（１２，１３）。そこで、我々は、３０μＭフォルスコリンと１０μＭの組合せによるヒトＨＳＰＣのインビトロ処理がどうかについて調べた。
【０１３４】
トレプロスチニル及びフォルスコリンによるマウス及びヒトＨＳＰＣの前処理は、アポトーシスも誘導しなければ、細胞周期の進行も分化能も変化させない。ヒトＨＳＰＣを１０μＭのトレプロスチニル及び３０μＭのフォルスコリンと１時間インキュベートした。その後、（Ａ，Ｂ）アポトーシスの誘導及び（Ｃ，Ｄ）細胞周期の進行をフローサイトメトリー分析により評価した。代表的な原画が描写されており（Ａ，Ｃ、左側パネル）、３つの独立した実験で得られたデータがまとめられている（Ｂ，Ｄ、右側パネル）。アポトーシスを起こした細胞にも、Ｇ０／１、Ｓ及びＧ２期による細胞の分布にも、非処理細胞と処理細胞との間で差は検出されなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ）。（Ｅ，Ｆ）。マウスのＨＳＰＣを骨髄から単離し、前処理して、分化ならびに顆粒球・単球コロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）及び赤血球系統コロニー形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）の増殖を支持するのに必要な増殖因子を含有するメチルセルロース培地中に再懸濁させた。１０日後、コロニーの数を光学顕微鏡下でカウントし、コロニーの形状及び形態を観察した。示されているのは、代表的な顕微鏡写真と３つの独立した実験の定量化である。データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。
【０１３５】
（データを図８に示す）
トレプロスチニルは、細胞に対してよりアポトーシスを発生させやすくし（図８Ａ＆Ｂ）、又は細胞周期へのそれらの進入及び進行を妨げ（図８Ｃ＆Ｄ）、又は特定系統を生み出すマウスＨＳＰＣの能力を変化させた（図８Ｅ＆Ｆ）。原ドット図（図８Ａ）に示され、図８Ｂにまとめられているように、生存細胞、早期アポトーシス細胞及び死細胞の存在は同等であり、アネキシン−Ｖ陽性細胞の数は、３０μＭのフォルスコリン及び１０μＭのトレプロスチニルでインビトロ処理しても増加しなかった。同様に、非同期的に増殖する非処理ヒトＨＳＰＣ及びトレプロスチニルとフォルスコリンの存在下で維持されているＨＳＰＣの細胞周期分布は、ＨＳＰＣが１時間暴露されようが又は２４時間暴露されようが関わりなく同等であった（参照：代表的な原ヒストグラムについては図８Ｃ及び平均化されたデータについては図８Ｄ）。重要なことに、我々は、トレプロスチニルとフォルスコリンが骨髄コロニー及び赤血球コロニーの形成に及ぼす何の影響も検出できなかった。マウスのＨＳＰＣを骨髄から単離し、トレプロスチニル及びフォルスコリンの存在下で１時間インキュベートして、分化ならびにＣＦＵ−ＧＭ及びＢＦＵ−Ｅのコロニー形成単位の増殖を支持するのに必要な増殖因子入りのメチルセルロース含有培地中に再懸濁させた。１０日後、コロニーの形態（図８Ｅ）及びコロニーの数（図８Ｆ）は同等であった。
【０１３６】
トレプロスチニルは、ヒト及びマウスのＨＳＰＣのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ−１２への移動を刺激する
前述のように、ｄｍＰＧＥ２処理ＨＳＣの生着向上は、細胞生存、増殖及びホーミングに対する効果によるものであった（１０）。我々の実験条件下で、トレプロスチニル及びフォルスコリンによるマウス及びヒトＨＳＰＣのインビトロ処理は、骨髄再構成を増進したが（以下及び図１３参照）、インビトロにおける細胞生存性も細胞周期の進行も変化しなかった（参照：図８）。
【０１３７】
ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４軸は、ＨＳＰＣの骨髄ニッチへのホーミングに主要な役割を演じている。そこで、我々は、トレプロスチニルの有益作用は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＲ４が媒介する効果を通じてＨＳＰＣの生着が増進した結果であると推測した。
【０１３８】
以下のデータは図９に示されている。トレプロスチニル及びフォルスコリンによるインビトロ前処理は、ＣＸＣＲ４（Ａ＆Ｂ）及びＣＤ２６／ＤＰＰIV（Ｂ）の発現を増強する。（Ａ）ＲＮＡをヒトＨＳＰＣから単離し、これを１０μＭのトレプロスチニルと３０μＭのフォルスコリンとの組合せ（Ｔｒｅｐ＋Ｆｓｋ）の不在下（非処理）又は存在下で１時間インキュベートした。ヒトＰＣ３細胞株から調製したＲＮＡを陽性対照とした。逆転写後、ＰＣＲ依存性増幅を表１に掲載したプライマーを用いて実施した。ＣＸＣＲ４の増幅産物（アンプリコン）はアガロースゲル上に電気泳動分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。β−アクチンをコードするｍＲＮＡを内部標準(internal control)として増幅した。データは、類似の結果を有する二つの追加実験の代表である。（Ｂ，Ｃ）ヒトＣＤ３４＋細胞（Ｂ）及びｍＨＳＰＣを、１０μＭのトレプロスチニルと３０μＭのフォルスコリン又はビヒクル対照（非処理）のいずれかと、２時間、４時間及び６時間インキュベートした。その後、サンプルを、ＣＸＣＲ４（Ｂ）及びＣＤ２６（ＦｉＣ）の発現について、ＦＡＣＳにより分析した。示されているのは、≧３（３つ以上）の独立した実験における陽性細胞のパーセントである（平均±ＳＥＭ；＊Ｐ＜０．０５ 対 非処理対照、ＡＮＯＶＡ）。
【０１３９】
この推測を次のように調べた。（ｉ）トレプロスチニル及びフォルスコリンによるヒトＨＳＰＣの前刺激は、ＣＸＣＲ４のｍＲＮＡレベルを上昇させた（図９Ａ）。これは、ＣＸＣＲ４タンパク質の発現増強にも変換された（図９Ｂ）。興味深いことに、これはＣＸＣＲ４リガンドのＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２を分解する酵素であるＣＤ２６／ＤＰＰIV（ジペプチジルペプチダーゼIV）のアップレギュレーションも伴っていた（図９ＣにマウスＨＳＰＣについて示されている）。（ii）ＣＸＣＲ４のアップレギュレーションは、それぞれヒト（図１０Ａ）及びマウスＨＳＰＣ（図１０Ｂ）のＳＤＦ−１への移動の増大をもたらしていた。（iii）この有向性の移動は、選択的ＣＸＣＲ４アンタゴニストのプレリキサホル／ＡＭＤ３１００によって遮断されたので、特異的であった。（図１０Ｃ）。同様に、基本的移動（すなわちＳＤＦ−１の不在下でのランダムな移動）は、ＨＳＰＣをトレプロスチニル及びフォルスコリンで前処理しても増大しなかった（参照：図１０Ａ＆Ｂの１番目及び３番目のバー）。
【０１４０】
図１０は以下のデータを示している。トレプロスチニル及びフォルスコリンによるインビトロ前処理は、ＣＸＣＲ４を介してＳＤＦ−１の作用を増強する。単離したばかりのマウス及びヒトＨＰＳＣを、インビトロでビヒクル（開放バー）又は１０μＭのトレプロスチニルと３０μＭのフォルスコリン（Ｔｒｅｐ＋Ｆｓｋ、閉鎖バー）のいずれかと３７℃で１時間前処理した後、洗浄工程に付した。ヒト（Ａ）又はマウスＨＳＰＣ（Ｂ，Ｃ）の懸濁液（増殖因子を含有する０．１ｍＬ培地中に２×１０５細胞）を上部ＴｒａｎｓｗｅｌｌＴＭチャンバーに加え、ＳＤＦ−１（下部チャンバーに１００ｎｇ／ｍＬ）の方に４時間移動させた。５μｍフィルターを通って移動した細胞をカウントした。ＨＳＰＣは、１０μＭのＡＭＤ３１００の不在下及び存在下でもインキュベートした（Ｃ）。データは、三重に実施された３つの独立した実験の平均±ＳＥＭを表す。統計学的な比較は、ＡＮＯＶＡに続いてテューキー(Tukey)多重比較によって実施した（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【０１４１】
ＣＸＣＲ４の遮断は骨髄移植に対するトレプロスチニルの有益効果を鈍化する
ＡＭＤ３１００によるアンタゴニズムをインビボで再現した。致死的に放射線照射されたレシピエントマウスの骨髄をトレプロスチニル及びフォルスコリンで前処理されたマウスＨＳＰＣを用いて再構成し、マウスにはその後最適用量のトレプロスチニルを１０日間皮下投与した。ＡＭＤ３１００の同時投与（３．３ｍｇ／ｋｇ／８時間）はトレプロスチニルの有益作用を鈍化した結果、すべてのレシピエントマウスは最終的に骨髄不全で死亡した（図１１）。従って、総合すれば、観察から、トレプロスチニル処理ＨＳＰＣにおけるトレプロスチニル誘導性のｃＡＭＰ蓄積、ＣＸＣＲ４の発現増大、及びＣＸＣＲ４によるシグナリングの増強の間には機構的な関連性が示されている。さらに、トレプロスチニルの作用はＣＸＣＲ次第、すなわち、ＣＸＣＲ４によるシグナリングが遮断されると骨髄は生着せず、全動物とも死亡したことも文書に記されている。
【０１４２】
ビルダグリプチンによるＣＤ２６／ＤＰＰIVの阻害は、トレプロスチニルとの同時投与ではなく連続投与の場合にのみ、ＨＰＳＣによるホーミング及び骨髄再構成を増進する
いくつかのケモカインはＣＤ２６／ＤＰＰIV（ジペプチジルペプチダーゼIV）によって分解されることが知られている。これは、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２にも該当する。トレプロスチニルの作用は−少なくとも一部は−ＣＸＣＲ４の誘導によって媒介され、ＣＸＣＲ４次第であるという発見を考慮すると。従って、増強されたＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２の作用は有益であることが予測される。その意味で、トレプロスチニル及びフォルスコリンによる処理がＣＤ２６の発現も誘導したことは考慮に値する。ＣＤ２６は、非刺激ＨＳＰＣでは本質的に検出できなかったが、トレプロスチニル及びフォルスコリンで刺激されたＨＳＰＣの１０％を超える細胞で検出された（図９Ｃ）。いくつかのＤＰＰ−IV阻害薬は入手可能であり、それらの人体薬理学も良く理解されている。それらは長年、II型糖尿病の治療において何百万人の患者に投与されてきた。実際、大多数の患者はＤＰＰ−IV阻害薬に対する耐性があり、危険な副作用もない。
【０１４３】
ＤＰＰ−IV阻害薬がトレプロスチニルの適切な組合せパートナーとなりうることを踏まえ、我々はＤＰＰ−IV阻害薬のビルダグリプチンがトレプロスチニルの作用を増強するかどうか調べた。これは、最初に、注入されたＨＳＰＣの骨髄へのホーミング能力を測定する手法で試験した。ＣＤ４５．１＋ドナーマウスの骨髄から採取したＨＳＰＣを同系のＣＤ４５．２レシピエントに注入した。動物を１６時間後に犠死させ、それらの骨髄から回収したＣＤ４５．１＋細胞の量をＦＡＣＳにより定量した。
【０１４４】
これらの実験から、以下のことが示された。
（ｉ）インビトロでのトレプロスチニル＋フォルスコリンの組合せによるＨＳＰＣの単独前処理は、統計学的に有意なホーミングの増進をもたらすのに十分でなかった（参照：図１２の３番目のバー及び１番目のバー）。
【０１４５】
図１２は、単独のビルダグリプチン及びトレプロスチニルによるレシピエントマウスのインビボ処置は、トレプロスチニル及びフォルスコリンとプレインキュベートされたＨＳＰＣのホーミングを増進するが、ビルダグリプチンとトレプロスチニルとの組合せによるインビボ処置では増進しないことを示している。ＣＤ４５．１＋ドナーマウスの骨髄から単離したマウスＨＳＰＣを、ビヒクル（“非処理細胞”）又はトレプロスチニルとフォルスコリン（“処理細胞”）のいずれかで前処理し、致死的に放射線照射されたレシピエントＣ５７Ｂｌ／６（ＣＤ４５．２＋）マウスに尾静脈注射により移植した（２×１０５細胞／マウス）。次に、レシピエントマウスを７つの群に分けた。グループ１と２のマウスは非処理対照細胞のみを受け、グループ２のマウスはそれに加えてビルダグリプチンによるインビボ処置を受けた（Ｖｉｌ、１０ｍｇ／ｋｇ／日）。グループ３に割り当てられたマウスはインビトロ処理細胞のみを受け、グループ４のマウスはそれに加えてインビボでのトレプロスチニル処置を受けた（Ｔｒｅｐ、０．１５ｍｇ／ｋｇ／８時間）。グループ５に割り当てられたマウスは、トレプロスチニル（０．１５ｍｇ／ｋｇ／８時間）及びＡＭＤ３１００（３．３ｍｇ／ｋｇ／８時間）による併用インビボ処置を受けた。グループ５のマウスは、インビボでトレプロスチニル（０．１５ｍｇ／ｋｇ／８時間）及びビルダグリプチン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）の両方を受け、最後にグループ６のマウスはインビボでビルダグリプチンを受けた。ＣＤ４５．１＋細胞の骨髄へのホーミング能力は、１６時間後に、レシピエントの骨髄をＦＡＣＳにより分析することによって評価した。データは平均±ＳＥＭである（ｎ＝３）。統計学的な比較は、ＡＮＯＶＡに続いてテューキー多重比較によって実施した。インビトロ前処理＋インビボのビルダグリプチンの組合せ（最後のバー、“＋インビボ（Ｖｉｌ）”）は、他のすべてから統計学的に有意である（＊＊、ｐ＜０．０１）。４番目のバー（“＋インビボＴｒｅｐ”）は、最初の３つのバー、５番目のバー（“＋インビボ（Ｔｒｅｐ＋ＡＭＤ３１００”）及び６番目のバー（“＋インビボ（Ｔｒｅｐ＋Ｖｉｌ）とは統計学的に有意に異なっている。
【０１４６】
以前の観察で、ｄｍＰＧＥ２によるインビトロ前処理はＨＳＰＣのホーミングを増進することが示されている（１１）。そこで、これらの発見は、ｄｍＰＧＥ２中でのＨＳＰＣのプレインキュベーション（１１）とトレプロスチニル及びフォルスコリンの組合せ中でのＨＳＰＣのプレインキュベーションとの間の差を再び浮き彫りにする。
【０１４７】
（ii）トレプロスチニル＋フォルスコリンの組合せによるインビトロでのＨＳＰＣの前処理は、レシピエントマウスの骨髄へのそれらのホーミングを、これらのレシピエントマウスがインビボでもトレプロスチニルで処置されるならば、増進した（参照：図１２の４番目のバー及び３番目のバー）。
【０１４８】
（iii）インビトロ前処理（トレプロスチニル＋フォルスコリンによる）と、それに連続したトレプロスチニルのインビボ投与により得られたホーミングの増進は、レシピエントマウスがＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００／プレリキサホルを投与されると消失した（図１２の４番目のバー及び５番目のバー）。この観察は、トレプロスチニルの作用はＣＸＣＲ４の誘導次第であることを示した上記ならびに図９、１０及び１１に要約された発見と一致する。
【０１４９】
（iv）非処理ＨＳＰＣを受けたレシピエントマウスへのビルダグリプチンの単独インビボ投与は、ホーミングを増進しなかった（参照：図１２の２番目のバー及び１番目のバー）。
【０１５０】
（ｖ）トレプロスチニル＋フォルスコリンで前処理されたＨＳＰＣを受け、その後インビボでトレプロスチニルを投与されたレシピエントマウスへのビルダグリプチンのインビボ投与は、トレプロスチニルのホーミング効果を抑制した（参照：図１２の４番目のバー及び６番目のバー）。
【０１５１】
（vi）ＨＳＰＣをインビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せで前処理し、レシピエントマウスにビルダグリプチンを投与した場合、最も顕著なホーミングの増進が観察された。この治療計画後のホーミングは、トレプロスチニル＋フォルスコリンで前処理されたＨＳＰＣの注入とその後のインビボでのトレプロスチニル投与（参照：図１２の７番目のバー及び４番目のバー）又はその後のインビボでのトレプロスチニルとビルダグリプチンの投与（参照：図１２の７番目のバー及び６番目のバー）を含むその他すべてを上回っていた。
【０１５２】
ビルダグリプチンによるＣＤ２６／ＤＰＰIVの阻害は、トレプロスチニル＋フォルスコリンＨＰＳＣによる骨髄再構成を連続投与された場合にのみ増進する
致死的に放射線照射されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、２＊１０５個のＬｉｎ−、ｃ−Ｋｉｔ＋、Ｓｃａ１＋  ＨＳＰＣの静脈内注入により救われた。これらの条件下で、ＨＳＰＣの数は、非処理ＨＳＰＣを注入された全動物が死亡するほど限定的である（図１３の実線）。これに対し、ＨＳＰＣがインビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せで前処理され、レシピエント動物がトレプロスチニルを１０日間投与された場合、６０％の動物が生き残った（図１３の三角／点線）。レシピエントマウスの生存は、ＨＳＰＣがインビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せで前処理され、レシピエント動物がビルダグリプチンを１０日間投与された場合、１００％に向上した（図１３の円／点線）。しかしながら、トレプロスチニルとビルダグリプチンの併用投与は、顕著な相互拮抗作用をもたらした。インビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せで前処理されたＨＳＰＣを注入され、その後トレプロスチニルとビルダグリプチンを投与された場合、大多数のレシピエントは死亡した（図１３の四角／点線）。これらの観察は、図１３にまとめられたホーミングアッセイの結果と一致している。言い換えれば、二つの独立した手法で、トレプロスチニルとビルダグリプチンの、インビボで同時投与された場合の相互拮抗作用と、適正な時系列で適用された場合、すなわちトレプロスチニル＋フォルスコリンによるＨＳＰＣのインビトロ前処理と、それに続くビルダグリプチンのレシピエントマウスへのインビボ投与の相乗作用が報告された。
【０１５３】
ＡＭＤ３１００／プレリキサホルによるＣＸＣＲ４の遮断はレシピエントマウスの生存に対するビルダグリプチンの有益効果に拮抗（を鈍化）するが、ＡＭＤ３１００／プレリキサホルもそれ自体は生存を増進する：
このプロジェクトの根底にある作業仮説は、フォルスコリン＋トレプロスチニルの組合せで前処理されたＨＳＰＣを受けたレシピエントマウスへのビルダグリプチンの投与は、ＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２の分解が阻害されるので、アップレギュレートされたＣＸＣＲ４を介するシグナリングが増強されたことを事実と仮定している。もしそうであれば、ビルダグリプチンの作用は、ＡＭＤ３１００／プレリキサホルの同時投与によって鈍化するはずである。実験は７群のレシピエントＢＡＬＢ／ｃマウスで実施された（５匹／群）。これらの群のいくつかは内部標準で、先の発見が再現されることを確認するために含められた。全マウスともＨＳＰＣを受けたが、これらの細胞は尾静脈から注入される前にインビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せで前処理されていた。ＨＳＰＣの数は限られていたので（ＢＡＬＢ／ｃにおいて２＊１０５／マウス）、前処理されたＨＳＰＣを注入するだけではレシピエントを救うのに不十分であった。ビルダグリプチンを注入されたレシピエントマウスが最良であった。彼らの生存は、トレプロスチニルを投与された群よりも良かった（図１１のデータ、下記参照）。さらに、トレプロスチニルとビルダグリプチンとの組合せを投与された動物は思わしくなかった。従って、これらの観察は図１３に示された結果を再現している。ビルダグリプチンとＡＭＤ３１００／プレリキサホルの組合せを受けたレシピエントの生存は、ビルダグリプチン単独で処置された動物よりも低かった。従って、ビルダグリプチンの作用は、少なくとも一部は、ＣＸＣＲ４を介したＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２のシグナリングの増強によると説明できる。すべての条件は並行して試験されたので、比較は合理的であることが強調される。
【０１５４】
結論：
主な発見は次のように要約できる：
（ｉ）トレプロスチニルはｄｍＰＧＥ２とは異なる。なぜならば、トレプロスチニルは（マウス及びヒトの）ＨＳＰＣ中のＧｓ共役プロスタノイド受容体を活性化するが、ｄｍＰＧＥ２は、やはりＨＳＰＣ上に存在するＧｉ共役ＥＰ３受容体も活性化する。従って、トレプロスチニル（フォルスコリンと組み合わせて）による単独のインビトロ処理だけではインビトロにおけるＨＳＰＣの増殖及び生存も（図８）、インビボにおける骨髄へのホーミングも（図１１）増進しない。これは、ｄｍＰＧＥ２に関する公表データ（１１）とは対照的である。ホーミングが増進されるのは、レシピエント動物がインビボでトレプロスチニルにより連続的に処置された場合だけである（図１２）。
【０１５５】
（ii）トレプロスチニルの作用は、少なくとも一部は、ＣＸＣＲ４の誘導と（図９）、その結果としてのＣＸＣＲ４を介するＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２の増強されたシグナリング次第である。このことは、インビトロでは、トレプロスチニル＋フォルスコリン前処理ＨＳＰＣのＳＤＦ−１への増強された移動（走化性）を示すことにより（図１０Ａ、Ｂ）、この効果がＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００／プレリキサホルで遮断されることにより（図１０Ｃ）、そしてインビボでは、トレプロスチニル誘導性のホーミングの増進（図１２）及びレシピエントマウスの骨髄生着／生存（図１１）がＡＭＤ３１００／プレリキサホルによって阻害されることを示すことにより、実証された。
【０１５６】
（iii）ＣＤ２６／ＤＰＰIVの阻害は、それ自体、ＨＳＰＣの骨髄へのホーミングに影響しないが、ＨＳＰＣが最初にインビトロでトレプロスチニルとフォルスコリンに暴露され、次いでインビトロでビルダグリプチンに暴露されると、トレプロスチニルと相乗する（図１２）。二つの化合物がインビボで同時に投与されると、相互拮抗作用がある。この相乗作用と相互拮抗作用は、独立した実験で再現された。その実験では、ＨＳＰＣのホーミングというよりも生着が試験された。すなわち、致死的に放射線照射されたレシピエントマウスにおけるＨＳＰＣの骨髄再構成能力、従って彼らの生存を支持する能力が試験された（図１３）。
【０１５７】
図１３は、ＤＰＰ−IV阻害薬のビルダグリプチンを単独でインビボ投与すると、レシピエントマウスの生存率に及ぼすトレプロスチニルとフォルスコリンによるＨＳＰＣのインビトロ処理の有益効果を増大することを示している。ドナーＢＡＬＢ／ｃマウスから単離されたマウスＨＳＰＣを、インビトロで、１０μＭのトレプロスチニル及び３０μＭのフォルスコリン又はビヒクル（実線）により、３７℃で１時間処理した。洗浄後、２×１０５細胞を致死的に放射線照射された（１０Ｇｙ）レシピエントのＢＡＬＢ／ｃマウスに注入した。ビヒクル処理ＨＳＰＣを受けたマウスの群は、インビボで何の追加処置も受けず、照射の対照としての役割を果たした（実線、ｎ＝１９）。これらはすべて骨髄不全により死亡した。別の群のマウス（点線／三角；ｎ＝２０）は、１０μＭのトレプロスチニル及び３０μＭのフォルスコリンで前処理されたＨＳＰＣを受け、インビボでもトレプロスチニル（０．１５ｍｇ／ｋｇ／８時間）による処置を受けた。次の群のマウス（点線／四角；ｎ＝２０）もインビトロでフォルスコリン＋トレプロスチニルで前処理されたＨＳＰＣを受け、さらにインビボでトレプロスチニル（０．１５ｍｇ／ｋｇ／８時間）とビルダグリプチン（１０ｍｇ／ｋｇ／２４時間）の両方で処置された。最後に、一群のマウス（点線／円；ｎ＝２０）は、インビトロでフォルスコリン＋トレプロスチニルで前処理されたＨＳＰＣを受け、インビボでビルダグリプチン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）で処置された。インビボ処置は皮下注射により行われ、移植直後に開始され、１０日間継続された。生存曲線はログランク検定により比較された。３つの処置条件間の差は統計学的に有意であった（ｐ＜０．０１）。
【０１５８】
この驚くべき発見は理解するのが困難であるが、シグナルの順序の重要性を浮き彫りにしている。すなわち、トレプロスチニルが提供するＧｓ依存性シグナルは、ＣＸＣＲ４を介してＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２により生じるＧｉ／Ｇｑ依存性シグナルより先でなければならない。
【０１５９】
（iv）インビボのＡＭＤ３１００／プレリキサホルは、トレプロスチニルの投与及びビルダグリプチンの投与の両方の有益効果に拮抗する。トレプロスチニルはＣＸＣＲ４を誘導し、ビルダグリプチンはＳＤＦ−１／ＣＸＣＬ１２を分解する酵素を遮断するので、この拮抗作用は予測通りである。従って、両操作によってＣＸＣＲ４を介したシグナリングの増強がもたらされるが、ＡＭＤ３１００／プレリキサホルはこれを遮断する。この観察は、移植されたＨＳＰＣに適正な合図を順番に送ることの重要性を強調している（上記ポイント（iii）参照）。さらに、我々は、以前、インビボにおいてトレプロスチニルの用量反応曲線は釣鐘形であること、すなわち高用量は現実験で使用された標準用量よりも骨髄生着の促進に有益でないことに言及した。これは、骨内膜ニッチの内壁の細胞上にＥＰ４受容体が存在し、その刺激がＨＳＰＣの生着に及ぼすプロスタノイドの作用に拮抗しうることによるものであろう（１５）。同様に、ＳＤＦ１／ＣＸＣＬ１２も、シグナリングの状況(context)に応じて、骨髄再構成に有利に働くことも妨害することもある複合作用を骨内膜ニッチに及ぼすと考えられる。
【０１６０】
これらの発見に基づき、
（ｉ）トレプロスチニルとフォルスコリンとの組合せによるＨＳＰＣのインビトロ前処理は、トレプロスチニル又はビルダグリプチンのインビボ投与のいずれかと組み合わせると、骨髄再構成を増進できる。
【０１６１】
（ii）二つの化合物（すなわちトレプロスチニルとビルダグリプチン）の同時適用の組合せは相互拮抗作用をもたらすのであまり価値がない。しかしながら、ビルダグリプチンとトレプロスチニルを交互方式に投与する連続治療計画は有用でありうると考えられる。
ある態様において、本発明は以下であってもよい。
［態様１］ジペプチジルペプチダーゼIV（ＤＰＰ−IV）の少なくとも一つの阻害薬を含む、造血幹細胞移植レシピエントの治療に使用するための組成物であって、前記造血幹細胞及び／又は前駆細胞は、生着を増進するために、移植前にインビトロでプロスタサイクリン類似体で処理されている、上記組成物。
［態様２］造血幹細胞及び／又は前駆細胞が、移植前にプロスタサイクリン類似体及びｃＡＭＰエンハンサーで処理されている、態様１に記載の使用のための組成物。
［態様３］ＤＰＰ−IV阻害薬がグリプチンから選択される、態様１又は２に記載の使用のための組成物。
［態様４］グリプチンが、シタグリプチン、ビルダグリプチン、アログリプチン、サキサグリプチン及びリナグリプチン、アナグリプチン、テネリグリプチン、ゲミグリプチン及びデュトグリプチンからなる群から選択される、態様１〜３に記載の使用のための組成物。
［態様５］前記プロスタサイクリン類似体が、トレプロスチニル、イロプロスト、シカプロスト及びベラプロスト又はそれらの薬学的に許容可能な塩の群から選択される、態様１〜４のいずれか１に記載の使用のための組成物。
［態様６］前記プロスタサイクリン類似体が、トレプロスチニル、好ましくは、トレプロスチニルの酸誘導体、トレプロスチニルのプロドラッグ、トレプロスチニルの多形体又はトレプロスチニルの異性体の群から選択されるトレプロスチニルの誘導体である、態様１〜５のいずれか１に記載の使用のための組成物。
［態様７］前記ｃＡＭＰエンハンサーがフォルスコリンである、態様１〜６のいずれか１に記載の使用のための組成物。
［態様８］ＤＰＰ−IV阻害薬がビルダグリプチンであり、造血幹細胞がインビトロでトレプロスチニル及びフォルスコリンで処理されている、態様１に記載の使用のための組成物。
［態様９］ＤＰＰ−IV阻害薬が、造血幹細胞移植の少なくとも５時間前、特に少なくとも１０時間前、特に少なくとも１５時間前、特に少なくとも２４時間前に投与される、態様１〜８のいずれか１に記載の使用のための組成物。
［態様１０］ＤＰＰ−IV阻害薬が、造血幹細胞移植後少なくとも１日間、特に少なくとも２日間、特に少なくとも３日間、特に少なくとも４日間投与される、態様１〜９のいずれか１に記載の使用のための組成物。
［態様１１］骨髄疾患を患う個人の治療における、態様１〜１０のいずれか１に記載の使用のための組成物。
［態様１２］骨髄疾患が、白血病、血液細胞コンパートメントの欠陥、化学療法又は放射線照射によって誘発された骨髄疾患である、態様１〜１１のいずれか１に記載の使用のための組成物。
［態様１３］前記血液細胞コンパートメントの欠陥が、異常ヘモグロビン症、好中性顆粒球機能の欠陥、又は、Ｔリンパ球及び／又はＢリンパ球の欠陥である、態様１２に記載の使用のための組成物。
［態様１４］造血細胞の生着能力を増強するための方法であって、
ａ）造血幹細胞又は前駆細胞のサンプルを用意し、
ｂ）前記細胞に有効量のプロスタサイクリン類似体とｃＡＭＰエンハンサーを投与し、
ｃ）前記混合物を、前記細胞におけるＧアルファｓ−シグナリングを刺激するのに足る期間インキュベートし、
ｄ）前記細胞を単離し、
ｅ）前記細胞をそれを必要とする個人に移植し、
ｆ）前記個人に有効量のＤＰＰ−IV阻害薬を投与する
連続工程を含む方法。
［態様１５］前記幹細胞又は前駆細胞が、臍帯血、ドナー骨髄又は胎盤由来である、態様１４に記載の方法。
【０１６２】
参考文献
【０１６３】
【表２】
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【０１６４】
【表３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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