(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液、血清、血漿、尿、唾液、涙、脳脊髄液（ＣＳＦ）、食塩水、水、環境上サンプルから選ばれる液体サンプル中に低濃度で存在するターゲットを検出するためのターゲット検出方法であって、
（ａ）前記液体サンプル及び検出システムを構成する直径が５〜５０μｍのサイズの複数のマイクロ液滴を生成し、
（ｂ）前記検出システムの前記ターゲットとの結合が検出可能なシグナルを生成する検出システムで前記ターゲットを検出し、
（ｃ）液滴デジタル検出（ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）粒子ディテクター又は液滴デジタル検出粒子カウンテイングシステムで前記複数のマイクロ液滴のための検出可能なシグナルを定量することを含んでなり、
ステップ（ｃ）における検出可能なシグナルは、μＬからｍＬの範囲の容量を有する円筒状キュベットであるキュベット内で定量され、
前記マイクロ液滴は、前記液体サンプル中のターゲットに結合した状態で、４６９ｎｍ、４８８ｎｍ或いは５６１ｎｍの励起光を放射するダイオードレーザーにより蛍光シグナルを発することができるセンサーを含み、
前記キュベットは、キュベットを保持する台に接続される２つのモータによって、１０から１１００ｒｐｍの回転数の回転運動と１から１５ｍｍ／秒の範囲の垂直速度で垂直上下運動が付与されており、
前記液滴デジタル検出粒子ディテクター又は液滴デジタル検出粒子カウンテイングシステムは、前記キュベットを保持する機械的部品を持つポータブル顕微鏡を有し、
前記マイクロ液滴を生成する液滴システムと前記液滴デジタル検出粒子ディテクター又は液滴デジタル検出粒子カウンテイングシステムとを統合した統合総合液滴デジタル検出システム（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＩＣ  ３Ｄ）ｓｙｓｔｅｍ）は、前記液滴デジタル検出粒子ディテクター又は液滴デジタル検出粒子カウンテイングシステムのデータを解析するデータ解析のソフトウェアを含み、
３つの前記ダイオードレーザーの励起光により３つの異なるセンサーの蛍光シグナルを同時に検出できることを特徴とするターゲット検出方法。
【請求項２】
前記検出システムは、ＲＴ−ＰＣＲ；ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）；ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）；であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）；鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）；指数関数的等温増幅及びハイブリッド形成；分子指標；アプタマー；ＤＮＡザイム；アプタマー阻止剤−ＤＮＡ−酵素（ＩＤＥ）或いはアプタマー−ＩＤＥシステム；或いはリアルタイム蛍光センサーによるニッキングを含む酵素ベースアッセイを含んでなることを特徴とする請求項１に記載のターゲット検出方法。
【請求項３】
前記ターゲットを増幅するために前記マイクロ液滴中でＰＣＲを行うことをさらに含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のターゲット検出方法。
【請求項４】
前記検出可能なシグナルは蛍光シグナルであるか、或いは前記検出可能なシグナルはＤＮＡザイムセンサーによって生成されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のターゲット検出方法。
【請求項５】
前記液体サンプルは、血液或いは血漿サンプルを含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のターゲット検出方法。
【請求項６】
前記液体サンプルは、処理なし或いは処理の全血サンプルからなり、希釈された血液サンプル、或いは如何なる濃縮又は精製なしの全血サンプルであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のターゲット検出方法。
【請求項７】
前記ターゲットは、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、或いはＳＮＰである核酸であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のターゲット検出方法。
【請求項８】
前記ターゲットは、バクテリア、多薬剤耐性生物（ＭＤＲＯ）、ツベルクローシス（ＴＢ：ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、寄生生物、真菌類、或いはウイルスである病原体；癌細胞、幹／始原細胞、或いは免疫細胞である細胞；エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、マイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）或いはアポトーシス小体である細胞由来ベシクルを含んでなることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載のターゲット検出方法。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載されたターゲット検出方法を実行するためのターゲット検出システムであって、
（ａ）エマルションベースマイクロ流体システム、或いは液滴システムであるエマルションシステムと、
（ｂ）粒子ディテクター又は粒子カウンテイングシステムとを含んでなることを特徴とするターゲット検出システム。
【請求項１０】
複数タイプのターゲットの多重且つ迅速な検出ができるように形成された使い捨てのカートリッジをさらに含むことを特徴とする請求項９に記載のターゲット検出システム。
【請求項１１】
ポータブル装置、又はスマートフォンであるポイント−オブ−ケアー適用のための電子装置に連結されることを特徴とする請求項９に記載のターゲット検出システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にバイオアナリシス、及び検出及びスクリーニング方法に関するものである。特に、別の実施形態で本発明は、液滴マイクロ流体システム、或いはエマルション化剤を、センサー或いはセンシングシステム、アプタマー、或いはＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）と統合して用いる生物学的、生理学的或いは病理学的マーカー、或いは単一分子、或いは単一細胞を検出する高処理能力、多重システム或いは方法を提供する。別の実施形態で、このセンサー或いはセンシングシステムは、核酸ベース、抗体ベース、酵素ベース、或いは化学薬剤ベースのセンサー或いはセンシングシステムである。別の実施形態で、本発明は、迅速かつ高感度蛍光検出システム、特に液滴（ｄｒｏｐｌｅｔ（小滴））或いはエマルションシステムを、３Ｄ粒子ディテクター（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｓｅｄ）を含むディテクターシステムと統合して用いる生物学的、生理学的或いは病理学的マーカー、或いは単一分子、或いは単一細胞を検出する方法を提供する。別の実施形態で、本発明は、オリゴ核酸及びペプチドアプタマー（ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｐｔａｍｅｒｓ）のようなアプタマー、及び関連した、例えばアプタマーベースの小分子及び生体分子を高処理能でスクリーニングする方法、センサー及び治療を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノミクス、プロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）、セロミクス（ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）及びメタボロミクス（ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ）における最近の進歩は、種々の生物学的プロセスを調整する生物学及び化学化合物の大きなライブラリを、我々に与えている。その開発は、生物学的ターゲットに対し活性な化合物を見つけるのに、何百万もの生化学的、遺伝学的或いは薬学的なアッセイが平行して行われ、分析されていて、高処理能分析／スクリーニングの必要性があった。さらに、これらのマーカーを分析、検出、識別及び定量することは、生物学と病理学を研究し、かつ新しい診断学及び治療学を開発する強力な新しい手段となっている。
【０００３】
例えば、分子、癌細胞のような細胞など多くの生物学的及び疾病マーカーは、生体サンプル中に低い濃度で存在していて、生物学及び病理学のプロセスでは重要な役割を果たしている。この低濃度のマーカーを、迅速かつ選択的に検出できることは、新しい生物学を解明するに、或いは疾病や異常をモニターし検出するに、そして新しい治療法を開発するに、極めて重要である。
【０００４】
癌、アルツハイマー病（ＡＤ）及び他の疾病及び体の調子を、何らかの徴候が出る前にスクリーニング及びモニターする早期の識別は、これらの疾病を有効に抑え、処理し、そして根絶する上で強力かつしばしば必要なステップであることが分った。従来の画像ツール（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）はスキャン及び磁気共鳴画像（ＭＲＩ））及び生検分析は、残念なことに、日常の疾病スクリーニングには、複雑かつ高価及び／又は侵襲的である。最も重要なことは、これらは、特に、疾病を初期段階で識別する感度と特異性に欠けている。それ故に、最近の努力は、生体サンプル〔例えば、疾病を正常サンプルから区別する血液、尿、唾液、涙、及び脳脊髄液（ＣＳＦ）〕に存在する特定の分子バイオマーカー（例えば、核酸及び蛋白質）及び細胞マーカー（例えば、癌細胞）をターゲットとするアッセイの開発に向けられている。
【０００５】
残念にも、疾病バイオマーカーを見出し、それらを臨床のアッセイに翻訳するのは、大きな挑戦であることが分った。先ず、高度で金のかかるゲノムとプロテオミクス技術（例えば、配列決定、質量分析（ＭＳ）、生命情報科学）の進歩にも拘わらず、信頼できる疾病バイオマーカーは見出されていない。これらの技術は、誤りである割合が高いこと、及び正常サンプルと疾病サンプルとの間の違いが僅かで、疾病サンプル中にバイオマーカーの不均一性があることによって使用上限界がある。単一バイオマーカーは、有用な診断に必要な感度と特異性に欠けていることは広く認められている。さらに、バイオマーカーで識別されるとしても、さらに、次の過程である臨床でのアッセイ開発は、時間を要し、高価でかつしばしば実行不可能である。例えば、前立腺癌のバイオマーカーとして前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を検出するＥＬＩＳアッセイの開発をしたいとしとも、ＰＳＡ抗体が、既に十分な特異性と選択性をもって存在しなければならない。これは、多数のバイオマーカーアッセイが要求されるとき、特に問題となる。
【０００６】
バイオマーカーによる敏感、迅速かつ高い処理能力での識別と検出が必要となる別の重要な領域は、病原体（例えば、結核（ＴＢ）、ウィルス（例えば、ＨＩＶ）、及びマラリアのような寄生生物バクテリア）による感染症である。例えば、細菌感染症は、主要健康問題であると共に、死亡率が３０〜４０％で、毎年世界的に１８００万人、米国で７０万人以上が感染する敗血症の主な原因でもある。敗血症及びその他攻撃的な細菌感染症は、お金のかかる集中治療室で管理され、ヘルスケア負担、経済的負担、さらに社会的負担が大きくなっている。例えば、米国内で１人の敗血症患者は、入院中に凡そ２５，０００ＵＳドルを要し、これは、年に１７０億ドルに相当している。特に、抗菌剤耐性は、米国内と世界的にみても、大きな問題となりつつある。疾病管理予防センター（ＣＤＣ）によれば、毎年２００万人以上の人が、抗菌剤耐性によって感染し、死者が２３，０００人を越えている。抗菌剤耐性に関連した攻撃的な細菌感染症は、しばしば、集中治療室（ＩＣＵ）内で管理され、関連コストが高くなり、大きな健康管理上の負担、経済的負担、さらに社会的負担となっている。抗生物質の慎重な使用のための同盟（ＡＰＵＡ）は、抗菌剤耐性による感染は、米国のヘルスケアシステムに毎年２００億ドル以上のコストを要すると推定している。
【０００７】
血液感染が高死亡率であるのは、バクテリアの診断とその治療のプロセスが、非効率的で時間のかかるプロセスであることと関係している。患者が感染しているバクテリアを効果的に検出しかつ日常的にモニタリングして、初期段階で疾病を診断することが、その生存率に深く影響しているのは広く認識されている。不運にも、血液培養、血液中のバクテリアを識別する黄金律は、結果を得るに数日を要している。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような新しい分子診断方法は、アッセイ時間を数時間にすることができるが、血液中の低濃度バクテリア（１〜１００コロニー−形成ユニット（ＣＦＵ）／ｍＬ）を検出するに充分な感度がない。重要なのは、ＰＣＲベースの方法は、増幅反応があるために、核酸の溶解や分離のようなサンプル処理が必要なことである。さらに、これらの技術は全て、複雑、高価であり、それ故に、患者体内のバクテリアを通常にモニタリングするに適していない。そこで、血液中のバクテリアを、迅速かつ敏感に識別し、これにより血液感染に関連した死亡率を下げ、医療コストを著しく少なくするシンプルな方法が必要とされている。
【０００８】
マイクロ流体システム（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）は、最近、生物学的及び化学的な適用に、広い範囲の実験が行われる有望なプラットフォームとして現れた。マイクロ流体ベースの方法は、従来の高処理能スクリーニング方法に比べて、いくつかの利点がある。これらの利点としては、試薬の消失が無視できる程度である、高価な生物学試薬の消費が少ない、構築コストが低い、分析時間が短い、及び単一チップ上に種々の機能的成分を統合する能力がある、などがある。
【０００９】
特に、液滴ベースのマイクロ流体システムの開発は、特に高い処理能力の生物学的分析には有望な機会を与えている。これらのシステムで、ナノ−からピコ−容量のマイクロ液滴は、キロヘルツ振動数で生成でき、それぞれの液滴は、「試験管」として機能している。それぞれの液滴が小容積であるので、蛋白質−蛋白質の相互作用或いはＤＮＡ交雑、及び細胞−薬剤或いは細胞−細胞の相互作用のような生体分子間の反応は、９６マイクロウエル・プレートベースの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）のような従来の方法に比べて１０９倍の少量を用いて行うことができる。さらに、ターゲットの液滴閉じこみ、例えば、細胞とその周囲環境を小容量に閉じ込めることは、分泌されたマーカーを分析し、単一細胞を検出及び選別する“マーカー”として使用することができるようになる。対照的に、既存の技術、例えばＥＬＩＳＡは、典型的に分泌された蛋白質をバルクで測定し、したがって単一細胞レベルでの重要なダイナミックな情報を逃している。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、細胞選別に、分泌されたマーカーでなく、細胞表面及び細胞内マーカーに依っている。さらに、液滴ベースのマイクロ流体システムは、連続的なマイクロ流体システムに比べて、チャンネル壁で試薬の相互作用を小さくし、サンプルの分散を抑えるといったさらなる利点が加わる。さらに、それは、液滴の生成、結合、選別、インキュベーション及び分析といった各液滴の独立したコントロールが、短時間でできるようになる。
【発明の概要】
【００１０】
別の実施形態で、本発明は、ターゲット；ターゲット分子；ウィルス；生物学的マーカー、生理学的マーカー、或いは病理学的マーカー；単一分子；或いは単一細胞或いは細胞由来粒子、例えば、単一病原体、寄生生物（（寄生虫）ｐａｒａｓｉｔｅ）、バクテリア細胞、ウィルス或いは真菌類を、液滴或いはエマルションベースマイクロ流体システム、３Ｄ粒子ディテクター及び／又は３Ｄ粒子カウンテイングシステム、或いは乳化剤に、小分子、生体分子、アプタマー、ＤＮＡザイム、核酸、蛋白質、ペプチド、酵素、抗体、或いは化学薬剤或いは小分子を使用するアッセイ、センサー或いはセンシングシステムを統合使用して検出、識別及び／又は定量する高処理能、多重システム或いは装置、或いは方法を提供する。
【００１１】
（ａ）ターゲット、ターゲット分子或いは細胞、核酸、蛋白質、ペプチド、ウィルス〔例えば、ＨＩＶのようなレンチウィルス、エボラウィルス疾病（ＥＶＤ）〕、細胞由来の粒子或いは細胞に特異的に結合できる、或いはこれらを直接或いは間接に検出でき、細胞が、任意にバクテリア細胞（任意に、マイコバクテリウム・ツベルクローシスのような）、寄生生物細胞或いは真菌類細胞、或いは、細胞が、任意に哺乳類動物細胞或いはヒト細胞であるアッセイ、センサー、ディテクター、或いはセンシングシステムを用意する。
【００１２】
ここで、アッセイ、センサー、ディテクター、或いはセンシングシステムは、任意に、アプタマー、ＤＮＡザイム（デオキシリボザイム、ＤＮＡ酵素或いは触媒的ＤＮＡとも呼ばれる）、核酸、蛋白質、ペプチド、酵素、抗体、或いは化学薬剤或いは小分子であり、単一核酸分子増幅は、任意に、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、或いはアプタマー阻止剤−ＤＮＡ−酵素（ＩＤＥ）、或いはアプタマー−ＩＤＥシステムである。
【００１３】
ターゲットは、増幅されたターゲットで、任意に、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）或いはＥＸＰＡＲを用いて増幅された核酸ターゲットである。
【００１４】
ここで、ターゲット分子、ウィルス、細胞由来の粒子或いは細胞に特異的に結合、或いはアッセイ、センサー、検出或いはセンシングシステムによるこれらの直接或いは間接の検出は、任意に、蛍光体シグナル或いは蛍光からなる検出可能シグナルを発生させ、或いは生成させる。
【００１５】
任意に、核酸、アプタマー、アプタマー−ＩＤＥシステム、或いはＤＮＡザイムは、単一リボヌクレオチド結合でＤＮＡ−ＲＮＡキメラ基質を開裂するＲＮＡ−開裂ＤＮＡモチーフである。
リボヌクレオチド開裂サイトは、蛍光体とクェンチャーに隣接している。ターゲット分子、ウィルス、細胞由来の粒子或いは細胞に対する核酸、アプタマー、或いはＤＮＡザイムの特異的な結合は、リボヌクレオチド開裂サイトの開裂を起し、蛍光体或いは蛍光アクチベーターからクェンチャーを放出させる。ここで、蛍光アクチベーターは、任意に、活性形にあるとき、蛍光シグナルのような検出可能なシグナルを発生する酵素である。
【００１６】
センサー或いはセンシングシステムは、任意に、アプタマー、ＤＮＡザイム、図４７に記載した構造であるアプタマー阻止剤−ＤＮＡ−酵素（ＩＤＥ）分子複合体（アプタマー−ＩＤＥシステムとも呼ばれる）であり、ＩＤＥ分子複合体の酵素は、活性なとき（例えば、阻止剤の影響下にない）、阻止されていないときに蛍光シグナルのような検出可能なシグナルを生成することができる。ＩＤＥ分子複合体の酵素は、ＩＤＥ分子複合体の阻止剤によって阻止され、ＩＤＥ分子複合体がターゲットに結合しない、そして、ＤＥ分子複合体のアプタマーがそのターゲットと結合すると、ＩＤＥ分子複合体の阻止剤が、酵素から離れて除かれ、或いは不活性化されて、酵素が活性化されて検出できるシグナル、例えば蛍光を生成する。
【００１７】
アッセイ、センサー、検出或いはセンシングシステムは、任意に、核酸ベース、抗体ベース、蛋白質ベース、ペプチドベース、酵素ベース、或いは化学薬剤ベース、或いは小分子ベース、のアッセイ、センサー、検出或いはセンシングシステム、或いはこれらの組合せである。
【００１８】
ここで、アッセイ、センサー、検出或いはセンシングシステムの、ターゲットに対する特異的な結合は、増幅ベース、或いは非増幅ベースの蛍光シグナルを発生させる。
【００１９】
ターゲット分子（任意に、精製された或いは複合体のターゲット）は、核酸、ペプチド、或いは化学薬剤ライブラリからスクリーニングされ、選択され及び／分離されることができる。
【００２０】
ターゲット分子は、任意に、核酸或いはポリペプチドであり、ポリペプチドは、任意に、疾病或いは体調の診断、すなわち細胞表面マーカーであり、或いは酵素であり、酵素は、任意に、特定疾病を検出するためのマーカー、或いは一種のマーカーである。酵素は、任意に、カルバペネマーゼ（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅ）のようなベータ−ラクタマーゼ（ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ）で、任意に、拡張スペクトル・ベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）が作るエンテロバクテリアシエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）及びカルバペネマーゼ耐性エンテロバクテリアシエ、ＴＢ及び他の菌剤耐性病原体の検出用のものである。
【００２１】
任意に、ターゲット分子、ウィルス、細胞由来の粒子或いは細胞或いはバクテリア、寄生生物或いは真菌類は、生物学的マーカー、生理学的マーカー、或いは病理学的マーカーの１つ或いは複数であり、或いは、単一或いは複数の分子、単一細胞或いは複数の細胞、ウィルス、細胞由来の粒子或いは分子の１つ或いは複数である。
【００２２】
（ｂ）複数の液滴或いはマイクロ液滴、エマルションを用意する。ここで、液滴或いはマイクロ液滴、エマルションは、任意に、液滴マイクロ流体システム或いはマイクロ液滴操作アッセイ或いは装置、或いは乳化剤、或いは等価な装置或いはシステムによって生成される。
【００２３】
液滴サイズは、任意に、直径が凡そ５〜５０μｍで、１〜３００μｍ、或いは凡そ１０〜１００μｍの範囲であることができ、任意に、ラベルを付け、或いは染色される、
【００２４】
ここで、ターゲット或いは増幅されたターゲットは、任意に、色素、ナノ粒子、ビーズ、或いは等価物、或いはこれらの組合せでラベル付け、或いは染色される。
【００２５】
そして、粒子或いはナノ粒子内部にターゲットがある複数の液滴或いはナノ液滴を用意する。
【００２６】
（ｃ）任意に、生体サンプル或いは周囲環境サンプルであるサンプルを用意する。
【００２７】
また、サンプルは、任意に、ターゲットであり、或いは検出されるターゲットを含んで懸濁されている。
【００２８】
そして、ターゲットは、任意に、ターゲット分子、核酸、蛋白質、ペプチド、ウィルス、細胞由来の粒子或いは細胞であり、細胞は、任意に、バクテリア細胞、寄生生物細胞或いは真菌類細胞であり、或いは、細胞は、任意に、哺乳類動物細胞或いはヒト細胞である。
【００２９】
（ｄ）サンプル（ターゲットを含む、或いはターゲットからなる）を、任意に、アッセイ、センサー、検出或いはセンシングシステムと共にカプセル化或いはマイクロカプセル化する。
【００３０】
そして、ターゲット或いはサンプルを、任意に、複数の粒子或いはナノ粒子と共に、或いはそれらの中に、カプセル化或いはマイクロカプセル化する。
【００３１】
カプセル化或いはマイクロカプセル化は、任意に、複数の液滴或いはマイクロ液滴、或いはエマルションの中にカプセル化或いはマイクロカプセル化する。
【００３２】
そして、ターゲット検出或いはセンシングシステムは、任意に、アプタマー−ＩＤＥシステムであり、アプタマー−ＩＤＥシステムが、任意に、酵素、或いは酵素の組合せであるとき、相互作用或いは処理により蛍光シグナルのような検出できるシグナルを生成することができる。検出或いはセンシングシステムのカプセル化或いはマイクロカプセル化は、基質をカプセル化或いはマイクロカプセル化し、検出できるシグナルが、酵素によって活性化される。
【００３３】
カプセル化或いはマイクロカプセル化されるサンプル或いはターゲットの処理或いは作成、或いはカプセル化或いはマイクロカプセル化されるサンプルを含むカプセル化或いはマイクロカプセル化される液滴或いはマイクロ液滴の処理或いは作成は、任意に、液滴マイクロ流体システム或いはマイクロ液滴操作装置の使用、或いは高処理能の液滴ジェネレーターの使用、或いは２５６チャンネル・カートリッジシステムの使用、或いは乳化剤の使用である。
【００３４】
ターゲット或いは増幅されたターゲットのラベル付け或いは染色は、任意に、色素、ナノ粒子、ビーズ、或いはそれの等価物、或いはこれらの組合せを用いる。
【００３５】
（ｅ）任意に、蛍光シグナル或いは蛍光、或いは色素、ナノ粒子、ビーズ、或いは等価物、或いはそれの組合せでなる検出できるシグナルの存在を検出する。
【００３６】
検出できるシグナルの存在を検出、認識／定量は、エマルション化された、カプセル化或いはマイクロカプセル化されたサンプル中で、或いは液滴或いはマイクロ液滴中で、或いは粒子或いはナノ粒子中で行う。
【００３７】
検出できるシグナルの検出は、ターゲット分子、ウィルス、細胞由来の粒子或いは細胞を検出、認識及び／又は定量することである。ここで、細胞は、任意に、哺乳類動物細胞、ヒト細胞、バクテリア細胞、寄生生物細胞、真菌類細胞である。
【００３８】
蛍光シグナル或いは蛍光の検出は、任意に、カプセル化或いはマイクロカプセル化されたサンプル、或いは液滴或いはマイクロ液滴、或いはエマルション、或いは粒子或いはナノ粒子中で行われ、サンプル中にターゲット分子、ウィルス、細胞由来の粒子、細胞、寄生生物、真菌類、或いは哺乳類動物細胞或いはヒト細胞の存在を示している。
【００３９】
ターゲット分子、ウィルス、細胞由来の粒子或いは細胞の検出及び／又は定量は、任意に、３Ｄ粒子ディテクター或いは３Ｄ粒子カウンテイングシステムの使用である。
【００４０】
別の実施形態で、検出されたターゲットは、液滴或いはマイクロ液滴の中、或いはエマルションの中で、カプセル化（或いは、マイクロカプセル化）され、或いは粒子或いはナノ粒子と関係し、或いは、その内部にある。また、別に、ターゲット（液滴或いはマイクロ液滴に加え、例えば、ビーズ、ナノ粒子、増幅された核酸、阻止剤−ＤＮＡ−酵素（ＩＤＥ）分子複合体、及び等価物）は、例えば、図８に説明したような３Ｄ粒子ディテクター、３Ｄ粒子カウンティングシステム、或いは等価なシステムで直接に検出及び／又はカウントされる。
【００４１】
別の実施形態で、細胞が、哺乳類動物細胞、ヒト細胞、循環腫瘍細胞、循環メラノーマ細胞、或いはバクテリア細胞である。
【００４２】
別の実施形態で、液滴エマルションマイクロ流体システムが、（ａ）直径が凡そ１〜３００μｍ、或いは１０〜１００μｍの間であるピコリットル液滴、及び／又は（ｂ）混ざらないキャリアーオイル中での単分散で、ピコリットルサイズ流体液滴である。
【００４３】
別の実施形態で、生物学的サンプルが、患者からの生体組織、血液、血清、唾液、涙、尿或いはＣＳＦ、或いは食品、水、土、或いは空気源から得られたサンプルである。
【００４４】
別の実施形態で、ターゲット分子は、核酸、核酸点変異体、或いは単一ヌクレオチドの多型（ＳＮＰ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）或いは小阻止性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり、或いはターゲット分子は、蛋白質、脂質、炭水化物、ポリサッカライド、小分子或いは金属錯体である。
【００４５】
別の実施形態で、ターゲット分子は、ポリペプチド或いは核酸、ポリペプチド或いは核酸点変異体、或いは単一ヌクレオチドの多型（ＳＮＰ）、細胞表面マーカー（特定の細胞タイプ、癌タイプ、表現型を検出スルマーカー）、或いは核酸疾病（例えば、糖尿病、アルツハイマー病、及び同種のもの）或いは癌マーカー、任意に乳癌バイオマーカーがある。ターゲット分子の検出は、任意に、疾病（例えば、糖尿病、アルツハイマー病、及びその他同種のもの）或いは癌（例えば、前立腺癌、メラノーマ、乳癌であり、任意に、ターゲットは、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）である）の診断であり、或いは日常の疾病或いは癌のスクリーニングに、初期段階疾病或いは癌の診断及び／又は経過の見通しに、疾病或いは癌の進行及び／又は再発のモニタリングに、及び／又は薬剤有効性及び安全性のモニターに使用される、
【００４６】
別の実施形態で、蛍光体はフルオレセイン−ｄＴであり、クェンチャーはダブシル−ｄＴ（商品名）（Ｄａｂｃｙｌ−ｄＴ）；及び／又は蛍光共鳴エネルギートランスファー（ＦＲＥＴ）色素ペア；及び／又はターゲット−結合色素である。
【００４７】
別の実施形態で、蛍光は、ＡＰＤ（フォトン・アバランシェ・ダイオード）、ＰＭＴ（光増倍管）、ＥＭＣＣＤ（電子増倍電荷結合素子）、或いはＭＣＰ（マイクロチャンネルプレート）、或いは他の等価物により、任意に、高処理能マナーで検出される。
【００４８】
別の実施形態で、アプタマーは、オリゴヌクレオチド、核酸、或いはペプチドアプタマー；特に、アプタマーは、細胞分化を特定の細胞系譜に特異的に調節する、或いはダウンストリームのシグナル通路に直接連結する。
【００４９】
別の実施形態で、アプタマーは、アゴニスト或いはアンタゴニストとしてターゲットに結合する、或いはセンサーとしての蛍光シグナル出す。
【００５０】
別の実施形態で、センサーは、リー（Ｌｉ）らの文献〔Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，１３５，２４４３−２４４６〕に記載されたようなＤＮＡ鎖置換方策、或いは等価物；或いは近接ライゲーションアッセイ、或いはリー（Ｌｉ）らの文献〔Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．５１，９３１７；或いは、Ｚｈａｎｇ（２０１２），Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８４：８７７．〕に記載されたような結合誘導ＤＮＡアセンブリアッセイである。
【００５１】
別の実施形態で、センサーは、発蛍光（蛍光発生）基質或いはプローブ、或いはターゲットに結合して蛍光を出す等価物である。
【００５２】
別の実施形態で、本発明の高処理能、多重システム或いは装置、或いは方法は、さらに、ターゲット、例えば、１つ或いは複数の生物学的マーカー、生理学的マーカー、或いは病理学的マーカー、或いは単一分子或いは単一細胞を、３Ｄ粒子ディテクター、或いは３Ｄ粒子カウンテイングシステム、或いは等価のシステムの使用を含んだ統合して、検出及び／又は定量する。別の実施形態で、検出されるターゲットは、液滴或いはマイクロ液滴中にカプセル化或いはマイクロカプセル化される、或いは別に、ターゲットは、３Ｄ粒子ディテクター、或いは３Ｄ粒子カウンテイングシステム、或いは等価のシステムにより、直接検出及び／又は計数される。別の実施形態で、本発明の高処理能、多重システム或いは装置、或いは方法は、ＤＮＡ−ビーズ或いはＤＮＡ−ビーズ液滴ライブラリ、或いは、例えば、疾病或いは癌細胞、或いは疾病、或いは細胞マーカー、例えば核酸或いはポリペプチド、例えばメンブレン、マーカーの対象のターゲットに結合する分子のＦＡＣＳベース・スクリーニングの使用を含んでいる。
【００５３】
別の実施形態で、高処理能、多重システムは、望ましい携行性（例えば、バックパックとしてパッケージされている）、自動化液体ハンドリング（例えば、液滴発生と自動サンプリング）、ダイオードレーザー（光源）、ＡＰＤ（ディテクター）、操作〔ヴィンチ（ｖｉｎｃｉ）、ＩＳＳ  Ｉｎｃ．）〕及び／又はデータ解析のソフトウェア（ＳｉｍＦＣＳ）、ディスプレーのである電子部品を３Ｄ粒子カウンテイングシステムと統合、の１つ或いはいずれかであり、例えば、図３２と３３及び４０に説明したように、本発明の典型的なポータブルシステムのデザインは、マイクロカプセル化装置と３Ｄ粒子カウンテイングシステムとの統合である、
【００５４】
別の実施形態で、本発明の高処理能、多重システム或いは装置、或いは方法は、さらに、多数のタイプのターゲットを、多重に、かつ迅速に同時に検出できる廃棄可能なマイクロ流体“カートリッジ”を有し、任意に、前記高処理能、多重システム或いは装置は、完全自動化され、或いはオール−イン−ワンシステムに構築され、或いはモジュラー部品を備え、或いは電子装置、例えば、図３２、３３及び４０に説明したようなポイント−オブ−ケア適用のポータブル装置、例えばスマートフォン及び／又はブルートゥース（登録商標）に連結される。
【００５５】
別の実施形態で、本発明の高処理能、多重システム或いは装置、或いは方法は、アッセイ、センサー、或いはセンサーシステムが、核酸ベースアッセイ；抗体ベースアッセイ；酵素ベースアッセイ；化学薬剤ベースアッセイ；核酸ベースアッセイ；交雑；分子指標；アプタマー；ＤＮＡザイム；リアルタイム蛍光センサー；抗体ベースアッセイ；ＥＬＩＳＡ；サンドイッチベースアッセイ；免疫染色アッセイ；抗体捕捉アッセイ；第２抗体増幅アッセイ；近接ライゲーションベースアッセイ；酵素ベースアッセイ；ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡ、ループ媒介等温増幅（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）、ニッキング、鎖置換及び／又は指数関数的等温増幅；或いはそれらの任意の組合せである。
【００５６】
この高処理能、多重システム或いは装置、或いは方法は、液滴を使用せずに低濃度のターゲットを検出する。
【００５７】
核酸ターゲットは、任意に、色素プローブ或いはナノ粒子により染色され、任意に、３Ｄ粒子カウンターによって測定されるシグナル増幅プロセス、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を用いて検出される。
【００５８】
別の実施形態で、本発明の高処理能、多重システム或いは装置、或いは方法は、カプセル化或いはマイクロカプセル化されたエマルション或いは液滴は、乳化剤の使用により、或いは液滴ベースのマイクロ流体により作られる；或いは、エマルション或いは液滴は、ウォーター−イン−オイル−イン−ウォーター（Ｗ／Ｏ／Ｗ）のダブルエマルション仕様、或いはエマルション或いは液滴が、液体の液滴、任意に、アガロース或いはＰＥＧからなる液体の液滴であり、或いは、任意に、液滴は、ゲル化或いは固化させて液滴粒子を形成する。
【００５９】
そして、液滴は、凡そ１０ｎｍ〜１００μｍのサイズ範囲であり、任意に、液滴は、単分散或いは多分散しており、また、任意に、液滴は、加熱或いは冷却され（例えば、ＰＣＲのために）、併合され、分割され、選別され、及び／又は長期の貯蔵に備える。
【００６０】
エマルション或いは液滴、任意に、蛍光のエマルション或いは液滴は、ターゲットを含んでいて、光学ピンセット、光学トラップ、光学格子、勾配遠心分離、或いは任意の組合せ、或いはこれらの等価物を任意に使用して、３Ｄ粒子カウンテイングシステムに選別される。これにより、選別されたターゲットが、さらに処理、分析することができる。
【００６１】
液滴は、従来のＩＤオンチップ、すなわち２Ｄ解析によって、或いは３Ｄ粒子カウンターによって解析される、
【００６２】
別の実施形態で、本発明の高処理能、多重システム或いは装置、或いは方法は、細胞由来の粒子は、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、マイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）、アポトーシス小体、或いはそれらの任意の組合せであり、或いは、ターゲット分子が、核酸、蛋白質、ペプチド、炭水化物、脂質、小分子、或いは金属イオンである。
【００６３】
別の実施形態で、本発明は、特定ターゲットを高処理能に検出する酵素ベースターゲット検出システムを識別及び分離する方法を提供する。この酵素ベースターゲット検出システムの識別及び分離方法は、以下でなっている。
【００６４】
（ａ）１つの特定ターゲット或いは複数の特定ターゲットを結合して、検出するようにデザインされた酵素ベースターゲット検出システム分子のライブラリを提供する。ターゲットは、酵素ベースターゲット検出システムが検出するようにデザインされ、基質は、検出できる（）部分を有している。酵素ベースターゲット検出システムがこのターゲットに結合していないときには、酵素は不活性である。酵素ベースターゲット検出システムがこの特定ターゲットに結合しているときには、酵素は基質上で活性化され、検出可能なシグナルを生成する。生成した検出可能なシグナルは、任意に、蛍光シグナルである。酵素ベースターゲット検出システムは、任意に、図４７或いは図５１Ａに描いたようなアプタマー阻止剤−ＤＮＡ酵素（ＩＤＥ）システム分子である。酵素ベースターゲット検出システムは、任意に、図５０に描いたような核酸イニシエーター誘起のシグナル増幅カスケードである、
【００６５】
（ｂ）混ざらない（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ）キャリアーオイル液体中で、サンプル、酵素ベースターゲット検出システム及び基質をカプセル化し、複数の液滴を形成させる、個々の液滴は、複数のサンプル、酵素ベースのターゲット検出システム及び基質を含んでおり、カプセル化は、サンプル、酵素ベースのターゲット検出システム及び基質を、オイル流にポンプで送ることであり、そして、複数の液滴は、任意に、ピコリットル−サイズの液滴である。
【００６６】
（ｃ）（ｂ）で生成した複数の液滴を、ソーターを通し、検出できるシグナルを持っている液滴を別のチャンネルに向わせ、そこで選別された液滴が溶解或いは破壊され、希釈され、追加で加えられたターゲット及び基質と共に再カプセル化される。このとき、１つの液滴の中に１つ以上の基質とターゲットあるようにして、液滴当たり約１つの酵素ベースターゲット検出システム分子がある濃度とする。ここで、選別された液滴は、任意に、光学ピンセット、光学トラップ、光学格子、勾配遠心分離、或いは任意の組合せ、或いはそれらの等価物を用いて、溶解される或いは破壊される。生成された検出できるシグナルは、任意に、蛍光シグナルをであり、前記ソーターは、ＦＡＣＳである。また、生成された検出できるシグナルは、任意に、蛍光シグナルをであり、前記ソーターは、マイクロ流体装置である。
【００６７】
（ｄ）検出できるシグナルを持つ液滴を、離れたチャンネルに選別し、これにより、酵素ベースのターゲット検出システム或いは分子を識別及び分離して、特定ターゲットを高処理検出する。ここで、酵素ベースのターゲット検出システム或いは分子は、任意に、アプタマー阻止剤−ＤＮＡ−酵素（ＩＤＥ）システム分子であり、分離されたＩＤＥ分子は、配列化される。
【００６８】
別の実施形態で、本発明は、１つのタイプの分子／１つのビーズ或いは１つのタイプの分子／１つの液滴方策に基づいて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド及び／又はペプチドが液滴ライブラリで合成される薬剤或いはアプタマースクリーニング及びインビトロ選択プラットフォームを提供し、本発明の高処理能、多重システム或いは装置、或いは方法、或いはターゲットを生成するマイクロビーズ上ＤＮＡ、或いはターゲットへの結合を実現する。ここで、マイクロビーズ上のＤＮＡ、すなわちＤＮＡ小片ライブラリは、例えば、分子をターゲットする、或いは分子或いは細胞の機能を調整する機能をもつ薬剤或いはアプタマーのスクリーニングに使用される。ここで、マイクロビーズ上のＤＮＡは、任意に、液滴或いはマイクロ液滴、任意に、ピコリットル液滴、任意に、直径が約２０μｍの液滴の中でカプセル化される。ＰＣＲによってオン−ビーズＤＮＡを増幅し、ＤＮＡライブラリを液滴内で転写及び／又は翻訳して、増幅されたＤＮＡを、ＲＮＡ及び／又はポリペプチド或いはペプチドライブラリを形成させる。転写されたＲＮＡの識別／シーケンス、及び／又は翻訳されたポリペプチド或いはペプチドは、任意に、核酸シーケンスを使用して、同じ液滴中でバーコード付けし、引き続くスクリーニング及びバイオマーカーの見出しに備える。ＲＮＡ及び／又はポリペプチド或いはペプチドは、任意に、本発明の高処理能、多重システム或いは装置、或いは方法によって、ターゲットとして検出及び／又は定量される。
【００６９】
別の実施形態で、本発明は、図１７、３２及び３３に記載したシステムからなる統合総合液滴デジタル検出（ＩＣ３Ｄ））を提供する。
【００７０】
別の実施形態で、本発明は、図１、２、１４、１５、１７、３２、及び３３に記載したような３Ｄ粒子ディテクターと統合されたマイクロカプセル化液滴システムからなる多重システムを提供する。
【００７１】
別の実施形態で、本発明は、本発明の方法を使用して、ターゲットを検出或いは識別するマイクロカプセル化装置と３Ｄ粒子カウンテイングシステムを統合してなる多重ポータブルシステム、任意に、図１７に記載したような多重ポータブルシステムを提供する。
【００７２】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付した図面及び以下の記載にある。その他本発明の特徴、目的、利点は、詳細な説明、図面、請求項から明らかとなろう。
【００７３】
ここに引用した文献、特許出願は全て、全目的のために参考として挙げたものである。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
特に断りのない限り、種々の図面において同じ参照シンボルは、同じ要素を示している。
【図１】ターゲット液滴カプセル化とセンシングメカニズム（例えば、核酸ベース、抗体セル、酵素セル、或いは化学薬剤ベース）の統合、次いで低濃度ターゲット、例えば、細胞、生体分子、ウィルス、イオンなどの生体マーカーの検出及びバイオアナリシスのための３Ｄ粒子ディテクター〔例えば、本発明の統合総合液滴デジタル検出（ＩＣ３Ｄ）〕による液滴分析、及びデータ解析でなる本発明の典型的な方法を説明している。
【図２】本発明の典型的な方法を説明している。図２（ａ）は、通常のバクテリア検出とスクリーニングをするポータブル装置の概要図面である。液滴サンプル、例えば、患者血液或いは尿の一滴を分析し、そのサンプル中のターゲットバクテリアの数を数分以内でディスプレイパネルに表示する。図２（ｂ）は、典型的な方法の概要図面である。サンプルとＤＮＡザイムセンサー或いはセンサーを混合し、液滴、例えばミクロンサイズ液滴が数百万個ある液滴にカプセル化する。ＤＮＡザイムセンサーが、バクテリアを含む液滴中で瞬時にシグナルを出し、バクテリアの数をカウントして解析する。図２（ｃ）は、ｍＬ容量の単一蛍光液滴の正確な検出が数分以内でできる典型的な高い処理能３Ｄ粒子カウンターシステムの概要図面である。３Ｄ粒子カウンターの詳細については、図１７の記載を参照。
【図３】単一細胞及び単一細胞マーカーを検出及び分析する本発明の方法に使用される典型的な液滴を説明している。液滴は、内部に、細胞表面、細胞内及び／又は分泌マーカーをカプセル化し、これらは、典型的な統合液滴カプセル化と本発明の３Ｄ粒子ディテクターシステムにより検出される。
【図４】細胞由来の粒子（例えば、エキソソーム、微小胞、アポトーシス体）の検出と分析をする本発明の方法に使用される典型的な液滴を説明している。液滴は、液滴中にカプセル化され、マーカーは、典型的な統合液滴カプセル化と本発明の３Ｄ粒子ディテクターシステムにより検出される。
【図５】細胞なしマーカーの検出と分析をする本発明の方法に使用される典型的な液滴を説明している。細胞なしマーカーは、限定するものではないが、核酸、蛋白質、ペプチド、炭水化物、脂質、小分子、金属イオンなど（これらは、液滴内にカプセル化されている）であり、典型的な統合液滴カプセル化と本発明の３Ｄ粒子ディテクターシステムにより検出される。
【図６】液滴中でのニッキング酵素反応と組み合わせて、南京錠型プローブ（ｐａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅ）を用いる核酸変異物を検出する本発明の典型的な方法を説明している。図６Ａは、プローブと酵素と共に細胞を導入してマイクロ液滴に組み入れ、その後、蛍光の励起と検出をする物理的プロセスを概略的に説明している。図６Ｂは、１つの、所謂“南京錠型プローブ”を使用する分子メカニズムを概略的に説明している。ライゲーションでローリングサークル増幅（ＲＣＡ）し、次いで、開裂サイトのニッキングをする。
【図７】液滴中のターゲット検出及び分析のためのＲＣＡのシグナル増幅の典型的な方法を説明している。図７ＡはＤＮＡザイムの使用、図７ＢはＤＮＡシーケンスの置換、図７Ｃはニッキング酵素である。
【図８】液滴を使用せずに、低濃度ターゲットを検出することができる本発明のシステム及び方法を概略的に説明している。この方法は、ＲＣＡのようなシグナルの増幅プロセスを使用し、色素によりプローブ或いはナノ粒子を染色し、３Ｄ粒子カウンターで測定する。
【図９】３Ｄ粒子ディテクター解析ステップの前に、ローリングサークル増幅（ＲＣＥ）を使用して細胞マーカーと分子マーカーを検出する本発明の典型的な方法を概略的に説明している。図９Ａは、例えばターゲット捕捉、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を用いる環状ＤＮＡ形成、ＲＣＡを経るＤＮＡ増幅、例えば色素或いはナノ粒子を含むプローブを用いる染色或いは検出プロセスなどの成分でなるローリングサークル増幅（ＲＣＥ）プロセスを使用する細胞或いは細胞表面マーカー検出の例を説明している。図９Ｂは、例えばターゲット捕捉、ライゲーションを用いる環状ＤＮＡ形成、ＲＣＡを経るＤＮＡ増幅、例えば、色素或いはナノ粒子を含むプローブを用いる染色或いは検出プロセスなどの成分でなるローリングサークル増幅（ＲＣＥ）プロセスを使用した分子ターゲット（例えば、蛋白質）検出の例を説明している。
【図１０】ターゲットを選択的かつ迅速に検出する本発明の方法におけるリアルタイムＤＮＡザイムセンサーを用いる典型的な方法を説明している。ターゲットは、核酸、蛋白質、例えばここに説明しているようなバクテリア細胞及び哺乳類動物細胞を含む細胞、ターゲットであるバルクのイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）がある。図１０（ａ）は、如何にしてＤＮＡザイムセンサーが、ターゲットとの相互作用で蛍光シグナルを出すかの典型的メカニズムを説明している。バクテリアによって生成されたターゲットは不活性なＤＮＡザイムシーケンス（赤）と結合し、コンフォメーション変化を受けてＤＮＡザイムを活性化する。活性化されたＤＮＡザイムは、リボヌクレオチド結合（Ｒ）での発蛍光（蛍光発生）基質の開裂に触媒作用を及ぼし、蛍光体（Ｆ）とクェンチャー（Ｑ）を分離させ、強い蛍光シグナルを出す。図１０（ｂ）は、ターゲットであるイー・コリＫ１２溶解物の存在下、ＤＮＡザイムセンサーからのリアルタイム蛍光シグナルを出しているデータをグラフで説明している。変異シーケンスは不活性である。１０，０００のバクテリアと５０ｎＭのＤＮＡザイムからの溶解物を、ＨＥＰＥＳバッファー中、最終容量５０μＬにして混合し、シグナルを、蛍光プレートリーダーで記録した。結果を中間値±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）で示す。図１０（ｃ）は、特にイー・コリ株を検出し、非ターゲットバクテリア或いは哺乳類動物細胞、ヒトＴ細胞リンパ球ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、及びヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を検出しないＤＮＡザイムセンサーからのデータをグラフで説明している。１０，０００のバクテリアと５０ｎＭのＤＮＡザイムからの溶解物を、ＨＥＰＥＳバッファー中、最終容量５０μＬにして混合し、３０分間インキュベートした。ＤＮＡザイム反応生成物をＰＡＧＥで解析した。各反応の開裂パーセントを求め、ＤＮＡザイム単独のコントロールに対して標準化し、“相対蛍光強度”として示す。図１０（ｄ）は、臨床イー・コリ分離物を選択的に検出するＤＮＡザイムセンサーからのデータをグラフで説明している。異なる１１人の患者サンプルから分離したバクテリア（１０００ＣＦＵ）を、１０％血液中、１００ｎＭのＤＮＡザイム及び１ｍｇ／ｍＬのリゾチームと３０分間インキュベートした。蛍光強度は、蛍光プレートリーダーを用い、通常ＤＮＡザイムだけのコントロール（ｃｏｎ）に対する“相対的蛍光強度”として表し、データは、単盲検試験で得た。図１０（ｃ）と図１０（ｄ）では、全ての実験を３回行い、データを中間値±ｓ．ｄとして表わした。ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、両側スチューデントｔ−検定。
【図１１】ＤＮＡザイムセンサーが、希釈された血液中で機能的かつ安定であることを示す典型的な方法からのデータをグラフで説明している。図１１（ａ）は、ＤＮＡザイムセンサーが、センサー溶液で容積比９：１、１：１、１：９に希釈して濃度がそれぞれ９０％、５０％及び１０％となる血液中で、バルクアッセイ中のターゲットイー・コリＫ１２を検出したデータをグラフで説明している。最終溶液は、１０００のバクテリア、１００μＭのＤＮＡザイムセンサー、及び１ｍｇ／ｍＬのリゾチームである。アッセイ時間が３０分で、蛍光プレートリーダーで反応をモニターした。（ＮａＯＨ／熱により）開裂したＤＮＡザイムセンサー（第１カラムセット）と開裂しいていないＤＮＡザイムセンサー（第２カラムセット）を、ポジティブコントロールとネガティブコントロールとして入れた。ＤＮＡザイムセンサーは、テストした全ての血液濃度において、イー・コリの存在で測定可能な蛍光シグナルを発していた。データは、中間値±ｓ．ｄとして表した。ｎ＝３。この図は、ＤＮＡザイムセンサーが、それぞれ異なる濃度に希釈された血液中で、機能的かつ安定であることを示している。図１１（ｂ）は、バクテリア溶解物を加える前に、３０％血液中、種々の時間でインキュベートしたイー・コリ−ＤＮＡザイムセンサーの活性を示すデータをグラフで説明している。データを、中間値±ｓ．ｄとして表す。ｎ＝３。この図は、ＤＮＡザイムセンサーが、それぞれ異なる濃度に希釈された血液中で、機能的かつ安定であることを示している。
【図１２】液滴中で、ＤＮＡザイムセンサーが、ターゲットバクテリであるアイー・コリを検出する典型的な方法を説明している。図１２（ａ）は、液滴中、インキュベーション時間９００秒の後に、単一のサイト１７（Ｓｙｔｏ１７）染色バクテリアとＤＮＡザイムセンサーシグナルの共局在を示す代表的な蛍光写真を説明している。図１２（ｂ）は、ＤＮＡザイムセンサーと単一バクテリアを含む単一液滴のリアルタイム蛍光モニタリングを説明している。図１２（ｃ）は、（ｂ）の蛍光写真のシグナル定量化を説明している。図１２（ｄ）は、液滴の蛍光強度が、液滴のバクテリア数と直接相関していることを示すデータをグラフで説明している。液滴がバクテリアを含んでいない、或いは変異ＤＮＡザイムを使用したとき、蛍光シグナルが小さくなるのが観察される。この図には、１０μｍの液滴を使用した。
【図１３】患者血液中のターゲットバクテリアを選択的に検出するイー・コリ−ＤＮＡザイムセンサーを示す蛍光顕微鏡写真を説明している。液滴中でバクテリアがさらに培養されて増殖し、シグナルを増幅していることが示された。左列、中央列及び右列は、それぞれ、併合、明視野、蛍光の写真である。図１３（ａ）は、それぞれの液滴が、１つの液滴中に１，０００〜１０，０００のバクテリアを含む培養患者血液である。図１３（ｂ）は、液滴中でバクテリアがさらに培養され、増殖して、シグナルを増幅していることを示している。この例では、液滴は５時間培養した。図１３（ｃ）は、変異ＤＮＡザイムを使用したネガティブコントロール実験で、液滴中で蛍光を生成していない。図１３（ｄ）は、バクテリアのない健康なドナーからの血液でのネガティブコントロール実験で、液滴中で蛍光を生成していない。
【図１４】マイクロカプセル化の使用を含む本発明を実施するための典型的な装置を説明している。図１４（ａ）は、典型的な液滴ベースのマイクロ流体装置を説明している。この典型的な装置は、３つの入口、すなわち、オイル用に２つ、サンプル（例えば、血液サンプル）とＤＮＡザイム／バクテリア溶解バッファー用に１つがある。図１４（ｂ）と図１４（ｃ）は、流れの集束で生成させた１０％血液とセンサー溶液からなる均一な３０μｍ液滴を示す代表的顕微鏡写真を説明している。図１４（ｃ）のスケールバーは２００μｍで、液滴中に血液成分、特に赤血球がはっきりと見れる。図１４（ｄ）は、３Ｄ粒子カウンター実験に用いたキュベットに集められた液滴を説明している。図１４（ｅ）は、代表的な蛍光顕微鏡写真を説明している。ＤＮＡザイムセンサー（２５０ｎＭ）が、３時間の反応の後に、１０％血液中に単一イー・コリＫ１２を含む液滴を発光させている。図１４（ｅ）右パネルは、蛍光と明視野の重なりであり、左パネルは、蛍光である。スケールバーは２００μｍ。
【図１５】図１５（ａ）は、本発明を実施するに使用した典型的な高処理能血液マイクロカプセル化装置の概要ダイアグラムを説明している。２層マイクロ流体装置は、１つの装置内に８つの液滴ジェネレーターを統合するように設計した。マイクロ流体装置は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用い、ソフトリソグラフィー法によって構築された。センサーと血液サンプルを上層から導入し、オイル油を下層から注入した。センサーと血液は、上層の中央で合流させ、連結穴を下へ通り抜けて下層に落ち、混合、すなわち“併合”されたサンプルが形成された。下層（混合或いは併合されたサンプル）にある流れの集束構造からの液滴を集め、粒子をカウントした。図１５（ｂ）は、図１５（ａ）に記載した典型的装置のイメージを説明している。描かれたクォーター（ｑｕａｒｔｅｒ）を、装置のサイズを示すために置いた。
【図１６】本発明の典型的な方法で得たデータをグラフで説明している。データは、単一バクテリアが、ＤＮＡザイムセンサーと蛍光液滴を使用して液滴中に検出され、ＩＤオンチップでカウントできることを示している。サイト１７（ＳＹＴＯ  １７）（赤色）染色したコントロールのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）図１６（ａ）、或いはターゲットのイー・コリＫ１２（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２）図１６（ｂ）を、血液中、１０７細胞／ｍＬの濃度でスパイクし、ＤＮＡザイムセンサーと共に、単一細胞マナーで液滴にカプセル化した（このデータにおいて、最終血液濃度は１０％）。３時間の反応の後、液滴を、典型的な共焦点検出システムを使用して、オンチップでカウントした。２００フォトン数以上の（赤）スパイクは、サイト１７を含んでいる液滴を表しており、これは、コントロールの図１６（ａ）の細胞とターゲットの図１６（ｂ）細胞の両方に観察される。しかしながら、ターゲットのイー・コリＫ１２（ｂ）だけが、バックグランド（つまり、細胞を含んでいない液滴）上に（緑色）ＤＮＡザイムシグナルを出していた。初期細胞濃度が高いとき（１０７細胞／ｍＬ）、１つの液滴中に２つのバクテリア（つまり、２つの（赤）スパイク）が時々観察される。これらの場合では、ＤＮＡザイムシグナルが、液滴中のバクテリア数に直接相関している。図１６（ａ）と図１６（ｂ）は、３回行い、合計で凡そ７０，０００の液滴をカウントした。図１６（ｃ）は、イー・コリを０或いは１つ含む代表的な液滴の最大フォトン数をグラフで説明している。黒ドットは、各液滴からのフォトン数を表わしている。実データのオーバーレイがあるボックスプロットを示す。中間値を赤ドットとして示す。Ｎ＝２００、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、両側スチューデントｔ−検定。カウントは、スレッショルド（破線）より高ければ“ポジティブ・ヒット”と考えられ、空の液滴の最大フォトン数としてセットされる。図１６（ａ）、図１６（ｂ）及び図１６（ｃ）：この実験は、本発明の典型的なカプセル化ＤＮＡザイムセンサーシステムは、偽ポジティブ割合がゼロで、ネガティブ割合が最小（−０．５％）であることを示している。
【図１７】本発明の典型的な３Ｄ粒子カウンテイングシステムを概念的に説明している。説明したように、レーザー源（レーザーｌとレーザー２）からの励起光は、ダイクロイックミラー（ＤｌとＤ２）を通って一緒になり、対物レンズ（ＬＩ）を通ったサンプル（Ｓ）上に集光する。同じ対物レンズから集められ、ダイクロイックフィルター（ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ｆｉｌｔｅｒ）を通って集められた放射光は、レンズ（Ｌ２）を通って、共焦点ピンホール（ＰＨ）に集光する。この光線は、別のレンズ（Ｌ３）によって検出ユニットの方に視準を合わせる。ダイクロイックフィルター（Ｄ３）が放射光線を分割し、２つの光増倍管（ＰＭＴ１とＰＭＴ２）の前に置かれた放射フィルタ（Ｆｅｒｎ）に達する。ＰＭＴ（光増倍管）からのアナログシグナルは、データ解析コンピューター上のカードを通って変換されて得られる。本発明の３Ｄ粒子カウンテイングシステムは、以下に、さらに詳細に記載する。
【図１８】本発明の典型的な方法からのデータを説明している。データは、３Ｄ粒子カウンターを最適化する較正ＰＭＴ（光増倍管）を使用している。３０μｍ液滴が、バクテリアをスパイクした液滴から生成し、ＰＭＴの較正に使用した。図１８（ａ）は、種々のＰＭＴ値（２００〜６００）での蛍光強度の生データを、グラフで説明している。図１８（ｂ）の上のグラフは、表に記載したように、種々のＰＭＴ値での液滴カウントのヒストグラムを示している。
【図１９】３Ｄ粒子カウンターを最適化する較正ＲＰＭ（１分当たりの再生）でなる典型的な方法を説明している。ここでは、バクテリアをスパイクした液滴から３０μｍ液滴を生成し、３Ｄ粒子スキャナで光る液滴をカウントした。図１９（ａ）は、表に示した種々のＲＰＭでの液滴カウント数のヒストグラムをグラフで説明している。図１９（ｂ）は、ＲＰＭと粒子カウント数との関係をシミュレートする概要ダイアグラムである。
【図２０】単一バクテリア検出の液滴サイズを最適化する本発明の典型的な方法からのデータをグラフで説明している。データは、液滴が小さな程、単一バクテリア検出の解像度が高いことを示している。バクテリアを健康な血液（５００バクテリア／ｍＬ）中にスパイクし、その血液サンプルをＤＮＡザイムでマイクロカプセル化した。血液にスパイクされたバクテリアは、１０μｍ、２５μｍ、或いは５０μｍ液滴にそれぞれカプセル化した。
【図２１】液滴サイズ（この図では、６０ミクロン対４０ミクロン）が、液滴検出シグナルに如何に影響しているかを示す本発明の典型的な方法からの写真を説明している。液滴サイズが小さい程、液滴中のターゲット有効濃度が増すので、蛍光シグナルはより高く、またより速く生成する。ここで、ターゲットは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から抽出したゲノムＤＮＡ、プローブは、ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ用のタクマン〔ＴＡＱＭＡＮ（商品名）〕プローブで、ＰＣＲ反応を合計４０サイクル行った。
【図２２】３Ｄ粒子カウンター測定におけるスパイクされた粒子（表に示したように）の既知数を使用して、実際の粒子カウント数を標準化した本発明の典型的な方法からのデータをグラフで説明している。
【図２３】３Ｄ粒子カウントシステム（ＩＣ３Ｄシステム）を、標準化方法と共に用いた単一バクテリアの検出でなる本発明の典型的な方法からのデータをグラフで説明している。すなわち、ＤＮＡザイムセンサー（２５０ｎＭ）と、バクテリアをスパイクした１０％血液を含んで生成した液滴（直径で２５μｍ）を、キュベットに集め（２ｍＬ）、３Ｄ粒子カウンターによって解析した。図２３（ａ）は、ドナー血液単独（バクテリアなし）をＤＮＡザイムセンサーと混合しての強度を、グラフで説明している。シグナルはない。図２３（ｂ）は、単一イー・コリＫ１２を含む液滴から得られた蛍光強度の上昇を経過時間で追及した代表的なバクテリアサンプル測定をグラフで説明している。時間的プロフィールを、サンプル中液滴の濃度及び／又は明るさの測定を抽出するパターン認識アルゴリズム（挿入したボックス）で解析した。この実験では、バクテリアをスパイクした血液を、液滴中にＤＮＡザイムと３時間インキュベートした。バクテリア濃度は、液滴溶液に対し１０００ＣＦＵ／ｍＬであった。図２３（ｃ）は、典型的な３Ｄ粒子カウンターによって測定した血液液滴中のバクテリアを定量的に検出するＤＮＡザイム反応動力学をグラフで説明している。合計１０００のバクテリアが、このサンプル中にスパイクされた。蛍光液滴を、３Ｄ粒子カウンターを用いて、１５分毎に定量し、検出されたバクテリア数を、ＤＮＡザイム反応時間を関数としてｙ軸にプロットした。データを中間値±ｓ．ｄとして表わす。ｎ＝３。図２３（ｄ）は、統合総合液滴デジタル検出（ＩＣ３Ｄ）を用いて実際に測定した細胞数（ｙ軸）と、広範囲のスパイクされたバクテリア濃度（“バクテリアの理論数”）（ｘ軸：集めた液滴溶液の１ｍＬ当たりのバクテリア数）の関係をグラフで説明している。Ｙ＝０．９５Ｘ、Ｒ２＝０．９９９。標準カーブは、バクテリアとの反応の後、ＦＩＴＣを含む液滴或いは蛍光ＤＮＡザイムセンサーを含む液滴を用いて作成した。バクテリアの非常に低い濃度（１〜５０細胞／ｍＬ）を正確に作るため、カプセル化に先立って、バクテリアを集め、マイクロインジェクターシステムを使用して血液中にスパイクした。この実験では、バクテリアをスパイクした血液を、液滴中のＤＮＡザイムと３時間インキュベートした。データを、中間値±ｓ．ｄ、ｎ＝３として表わす。１００、１，０００及び１０，０００細胞／ｍＬの濃度でのエラーバーが小さいことに注意。
【図２４】本発明の典型的な統合総合液滴デジタル検出（ＩＣ３Ｄ）システムを用いての臨床イー・コリ分離物（イー・コリ−特異的プローブを使用して）の選択的検出を、グラフで説明している。代表的な３Ｄ粒子カウンターのデータは、異なる１１のバクテリア分離物の中で（図に示したように）、ターゲットのイー・コリだけが、一重盲検実験で典型的な蛍光強度の急激上昇があることを示している。各サンプル中の測定細胞の総数は、左上のボックスに示している。イー・コリＫ１２をスパイクした血液を、ポジティブコントロールとして使用した。
【図２５】本発明の典型的なＩＣ３Ｄシステムと方法の主要パフォーマンスを、ＦＤＡ承認のバクテリア検出ＰＣＲテスト〔例えば、フィルマレイ（ＦＩＬＭＡＲＲＡＹ）（商品名）、バイオ・ファイアー・ダイアノスティクス（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）．ソルトレイクシティー、ユタ州〕と比較して表にまとめている。本発明の典型的なＩＣ３Ｄは、血液中、１〜１０，０００バクテリア／ｍＬの広範囲濃度ターゲットバクテリアを、単一細胞感度、検出感度（ＬＯＤ）１桁台で、凡そ１．５〜４時間以内〔液滴生成（＜４０ｍｉｎ）＋ＤＮＡザイムセンサー反応（“イエス或いはノー”に凡そ４５分、そして絶対的定量に凡そ３．５時間）＋３Ｄ粒子計数（３〜１０分）＋データ処理（５分）〕に絶対的定量化ができる。
【図２６】市販で入手可能な発蛍光（蛍光発生）基質を用いての、ベータ−ラクタマーゼ生成バクテリアの検出を説明している。図２６（ａ）は、細胞溶解物を用いたバルクでのテストのデータをグラフで説明している。バクテリア溶解物を、ＰＢＳバッファー中、最終容量５０μＬにして２μΜの発蛍光基質と混合し、２０分間インキュベートした。反応混合を、蛍光プレートリーダーで解析した。図２６（ｂ）は、液滴中の単一ベータ−ラクタマーゼ−生成バクテリアが、蛍光顕微鏡と本発明の統合総合液滴デジタル検出（ＩＣ３Ｄ）システムを使用して検出できることを示すデータをグラフで説明している。２．５μΜの発蛍光基質と単一バクテリア（図２６（ａ）に示した分離物１或いは７）を含む生成液滴（直径が２０μｍ）を、キュベットに集め、インキュベートした。室温で一夜インキュベートした後、液滴を、粒子カウンター（図２６（ｂ）の上パネル）及び顕微鏡（図２６（ｂ）の下パネル）で解析した。パターン認識アルゴリズムで、時間的プロフィールを解析した（上のパネル）。
【図２７】液滴デジタルＰＣＲを用いて、ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ変異を検出した写真を説明している。ゲノムＤＮＡを、図２７（ａ）のＨＣＴ１１６（ワイルド−タイプＢＲＡＦ，ネガティブコントロール、変異がない）と図２７（ｂ）のＣＯＬＯ２０５細胞（ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ変異がある）から分離した。分離したゲノムＤＮＡを、２０μｍ液滴にカプセル化し、リアルタイム定量的ＰＣＲを行い、ＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ変異を識別した。
【図２８】本発明のプロセスを用い、血液成分を含む液滴中にある核酸の有効ＰＣＲ増幅を示している。ＰＣＲプライマー増幅ターゲットは、５６ヌクレオチド（ｎｔ）長さの合成ＤＮＡテンプレートである。ネガティブコントロールはターゲットがない。この図は、２０％血液中の合成ターゲットＤＮＡの検出を示す代表的なゲル写真を説明している。ＰＣＲを３０或いは４０サイクル行った。ネガティブコントロールは、ターゲットＤＮＡなしで同じ反応を行った。
【図２９】３Ｄ粒子カウンターを用いて血液中の細胞を検知する本発明の典型的なシステム／方法からのデータをグラフで説明している。図２９（ａ）は、本発明の３Ｄ粒子スキャナシステムを用いて、血液中のスパイクされた癌細胞の検出を説明している。図２９（ｂ）は、コントロールとして用いた流動細胞分析（フローサイトメトリー  ：  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を説明している。図２９は、ＷＢＣを分離するのに、リンパ細胞分離遠心分離法を用い、癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を全血にスパイクした。細胞を、細胞トラッカーグリーンで染色、或いはＲＦＰでラベル化した。
【図３０】本発明の典型的なＩＣ３Ｄを用い、血漿中のＬｅｔ−７ａを定量する本発明の典型的な方法からのデータをグラフで説明している。図３０（ａ）は、ブランク（左パネル）、Ｌｅｔ−７ａ（中央パネル）、及びＬｅｔ−７ｂ（右パネル）から得られた液滴の蛍光強度プロフィールを、経時間的に追うグラフで説明している。Ｌｅｔ−７ａだけが、蛍光強度が急激に上昇していて、本発明のＩＣ３Ｄアッセイの特異性を示している。ｍｉＲＮＡ濃度は、カプセル化前のエキソソーム−枯渇血漿中ｌＯｆＭである。図３０（ｂ）は、本発明の典型的なＩＣ３Ｄを使用したＬｅｔ−７ａの実カウント数（ｙ軸）と、スパイクしたＬｅｔ−７ａ濃度（ｘ軸）の関係をグラフで説明している。エラーバーは、３回行った実験に基いている。平均値±Ｓ．Ｄ。図３０（ｃ）は、血漿中のＬｅｔ−７ａを検出するＲＴ−ｑＰＣＲからのデータをグラフで説明している（ｍｉＲＮＡ精製及び逆転写の後）。エラーバーは、３回行った実験に基いている。平均値±Ｓ．Ｄ。図３０（ｄ）は、ＲＴ−ｑＰＣＲ及び本発明の典型的な統合総合液滴デジタルディテクター（ＩＣ３Ｄ）によって検出された、健康なドナーのサンプル３つ、及び結腸癌患者の血漿サンプル３つの中のＬｅｔ−７ａ濃度を定量したデータをグラフで説明している。エラーバーは、３回行った実験に基いている。平均値±Ｓ．Ｄ。Ｐ値＜０．０５（スチューデントＴテスト）。
【図３１】本発明の典型的なシステムを使用する液滴マイクロ液滴ベースのシングル細胞加工の写真を説明している。ここでは、単一ＭＣＦ７細胞を、マイクロ流体装置を用いてＧＦＰ発現ベクターを含むトランスフェクション試薬とカプセル化した。図３１（ａ）は、液滴安定性を、カプセル化後６時間にみた写真である。図３１（ｂ）は、液滴内にトランスフェクション後、ＧＦＰ蛋白質が細胞内で発現していることを示す写真である。（右側のパネルを参照）。
【図３２】本発明の典型的なポータブルシステムを概略的に説明している。このポータブルシステムは、本発明のマイクロカプセル化装置と３Ｄ粒子カウンターの統合したものである。図１７には、３Ｄ粒子カウンターを詳細に描いている。本発明の統合総合液滴デジタルディテクター（ＩＣ３Ｄ）システムは、例えば、スマートフォンやブルートゥース（登録商標）を経由したｉＰａｄ（登録商標）の遠隔装置と接続することができる。遠隔装置は、例えばスマートフォンであり、それ故、インターフェースは、システムの操作、データの集積と解析、及びそのデータを医者、患者及びヘルスケアプロバイダーなどへの送信或いは配達に使用される。
【図３３】統合総合液滴デジタルディテクター（ＩＣ３Ｄ）で自動化及び統合された本発明の装置及びシステムを概略的に説明している。別の実施形態では、本発明の装置はポータブルにし、システムは高処理能の液滴形成システムであることができる。図３３（ａ）は、本発明を実施するに使用することができるドロマイト（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ）から市販の７０−チャンネルテロスシステム（Ｔｅｌｏｓ  ｓｙｓｔｅｍ）を説明している。図３３（ｂ）は、本発明を実施するに使用することができる２５６チャンネルカートリッジシステムを説明している。このシステムは、３ｍＬサンプルを、１５分以内に直径３０μｍの液滴にカプセル化できる。図３３（ｃ）は、自動化され、ポータブルでかつ多重のシステムであるＩＳＳ−ＱＵＡＮＴＡ−３Ｄ粒子ディテクターを説明している。図３３（ｄ）は、本発明のこの典型的なＩＣ３Ｄシステムを使用しての“サンプルを結果へ（Ｓａｍｐｌｅ  ｔｏ  ｒｅｓｕｌｔ）”測定を概略的に説明している。
【図３４】ＤＮＡザイムセンサーのインビトロ進化を用いて、簡単に癌診断できる本発明の典型的な方法を説明している。図３４（ａ）は、混合−及び−読み取り，ＤＮＡザイムセンサー癌診断、通常の癌スクリーニング、初期段階癌診断及び経過見通し、疾病の進行と再発のモニタリング、及び薬剤の効果と安全性のモニタリングに使用する本発明の典型的なシステムを説明している。図３４（ｂ）は、本発明を実施するに使用できるＤＮＡザイムセンサーの典型的なメカニズムを概略的に説明している。ターゲットとの相互作用で蛍光シグナルを生成している（Ｆはフルオレスセイン−ｄＴ、Ｒはリボヌクレオチド、そしてＱはダブシル−ｄＴ）。図３４（ｃ）は、本発明を実施するに使用できるインビトロ選択プロセスを概略的に説明している。最初に、ランダムＤＮＡライブラリを基質にライゲートし、正常血清とインキュベートしてライブラリプールから非特異性シーケンスを除く。開裂していないシーケンスを精製し、癌血清を用いたポジティブ選択に適用する。癌血清により開裂したシーケンスは、精製され、ＰＣＲによって精製、増幅される。次いで、精製の後、培養の集合群を基質にライゲートし、次の選択ラウンドに用いる。
【図３５】典型的なライブラリ（所謂、“ＤｚＬ”）と癌診断に用いるＤＮＡザイムセンサーを生成するシーケンスを記載している。ＤｚＬはライブラリで、ここで、Ｎはランダムヌクレオチドであり、ＦＳＳ、ＤｚＬ−ＦＳＳ−ＬＴ、ＤｚＬ−ＦＰ、ＤｚＬ−ＲＰｌ及びＤｚＬ−ＲＰ２は、それぞれ基質、ライゲーションテンプレート、フォーワードプライマー、リバースプライマー１及びリバースプライマー２である。
【図３６】本発明の実施における変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｄＰＡＧＥ）を使用するＤＮＡザイム進化と選択をモニターする典型的な方法を説明している。図３６（ａ）は、ＤＮＡザイム進化のラウンド１のネガティブ選択のｄＰＡＧＥ写真である。図３６（ｂ）は、ＤＮＡザイム進化のラウンド１のポジティブ選択のｄＰＡＧＥ写真であり、囲みの部分を切り取り、ＤＮＡを溶出してＰＣＲ増幅した；Ｍ＝マーカー（ライゲートしたライブラリを、０．２５ＭのＮａＯＨと、９０℃に加熱して作った）、ＲＭ＝反応混合物。
【図３７】本発明の実施における変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｄＰＡＧＥ）を使用するＤＮＡザイム進化と選択をモニターする典型的な方法を説明している。図３７（ａ）はラウンド７のｄＰＡＧＥ写真、図３７（ｂ）はラウンド１１のポジティブ選択のｄＰＡＧＥ写真である。囲みの部分を切り取り、ＤＮＡを溶出してＰＣＲ増幅した。Ｍ＝マーカー（ライゲートしたライブラリを、０．２５ＭのＮａＯＨと、９０℃に加熱して作った）、ＳＢ＝選択バッファー、ＭＮＳ＝混合した正常血清、ＭＣＳ＝混合した癌血清。囲みの部分を切り取り、ＤＮＡを溶出してＰＣＲ増幅した。
【図３８】インビトロ進化で得られた癌診断の選択されたＤＮＡザイムシーケンス（ＬＣＳ１９−１、１９−２、１９−３及び１９−４、下記参照）の使用を説明している。ＤＮＡザイムシーケンスをＰＡＧＥを用いてテストした。開裂は、開裂されたボトムバンド強度に基づいて確かめた。ＤＮＡザイムのターゲット或いはアクチベーターは、蛋白質、核酸、小分子或いは金属イオン、或いはこれらの組合せなどであることができる。  ＬＣＳ１９−１：ＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＴＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＡＴＡＧＣＣＴＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＣＧＴＡＣＣＡＡＣＧＡＧＧＡＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＣＡＣＴＣ（配列番号７）  ＬＣＳ１９−２：ＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＴＡＡＧＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＣＡＣＴＡＧＡＴＡＡＧＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＧＴＣＴＧＴＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＣＡＣＴＣ（配列番号８）  ＬＣＳ１９−３：ＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＴＡＡＧＣＧＧＧＧＡＧＣＧＡＧＴＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＴＣＧＣＧＧＧＧＡＡＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＡＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＣＡＣＴＣ（配列番号９）  ＬＣＳ１９−４：ＧＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＧＴＡＡＧＣＡＡＴＴＧＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＣＡＧＡＣＧＡＡＴＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＡＴＴＴＡＧＧＡＴＣＴＧＴＣＧＴＣＴＣＡＣＴＣ（配列番号１０）
【図３９】図３９（ａ）は、マイクロ液滴上で、組み合わせＤＮＡ合成を用いて１タイプのＤＮＡ／１ビーズを形成する方法の例を説明している。図３９Ｂは、１タイプＤＮＡ／１ビーズ方法を用いるＤＮＡ−ビーズライブラリの構築方法の例を説明している。その後のＰＣＲ、配列化、転写及び翻訳、そしてビーズから鎖の放出の目的に備えて、プライマー連結サイトと制限サイトをもつ機能サイトを組込むことができる。ここに描いた“ターゲットシーケンス”は、配列番号１１である。
【図４０】液滴ライブラリ生成、装置デザイン、操作及び適用の本発明の典型的な方法を説明している。典型的な液滴操作は、例えば液滴併合、分割、インキュベーション、再注入、画像化、解析及び選別がある。典型的な液滴アッセイは、例えばＰＣＲ、転写、翻訳、種々の生物学及び化学反応及び相互作用がある。典型的な液滴ライブラリ−ベースのスクリーニングは、例えば生物学的相互作用の研究、診断と治療の開発に使用する。
【図４１】ＤＮＡ−ビーズ−液滴ライブラリを用いてスクリーニングする本発明の典型的な方法を説明している。各液滴は単一ビーズを有していて、この単一ビーズは、同じシーケンスの複合ＤＮＡで固定化されている。ＰＣＲは、ＤＮＡを増幅し、かつ液滴中にＤＮＡなしのライブラリを作ることができる。ビーズは除かれ及び／又はターゲットの結合と選別に使用される。液滴は、精製、ターゲット連結、反応、スクリーニング、配列化、チップへの変換などさらなるプロセスのために、マイクロウエルチップに分散され、核酸或いは蛋白質アレイを構築する。
【図４２】患者血液、癌細胞などからのバイオマーカーをスクリーニングするＤＮＡ液滴ライブラリを使用した本発明の典型的な方法を説明している。液滴中にカプセル化した分子は、バーコードを付け、この後に解析及び識別（又は同定：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ができる。液滴アッセイは、チップ−ベース或いはアレイ−ベースのアレイと連結して、高処理能解析及びバイオマーカー識別ができる。
【図４３】本発明の典型的なシステムを使用して、液滴中の単一ビーズカプセル化を示す写真を説明している。この例の中に使用されたビーズは、バングラボラトリーズ社（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）〔フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒｓ）、インディアナ州〕から入手した６μｍの蛍光磁性酸化鉄結晶である。
【図４４】液滴或いはビーズライブラリを操作或いは処理する本発明の典型的な方法及び装置を説明している。磁性ビーズを、磁石を使用して、液滴の中で再配置することができる。液滴を、マイクロ−ブレード（ｍｉｃｒｏ−ｂｌａｄｅ）を使用して２つに分け、液滴中にビーズが有る或いは無しのＤＮＡ液滴ライブラリとする。それぞれは、この後に引き続くスクリーニング或いはバイオマーカーの発見に使用できる。
【図４５】ＤＮＡ−ビーズ液滴ＤＮＡ−ライブラリ、或いは、例えば、癌細胞或いは細胞膜マーカーに結合する分子をＦＡＣＳベースのスクリーニングを使用して、本発明を実施する典型的な方法を説明している。本発明の典型的なプロトコール或いはシステムの概要図面である。  ＤＮＡ−ビーズライブラリを、先ず、ターゲットサンプル、例えば、蛋白質のような精製されたターゲット、或いは血液、細胞、或いは組織のような複雑なサンプルと混合する。結合したターゲット／ビーズ複合物は、磁気選別により、及び／又は色素で染色の後に、抗体或いは他のプローブにより、ＦＡＣＳにより、選別できる。結合したターゲット／ビーズ複合物は、例えば、高ｐＨ或いは低ｐＨバッファー、尿素、ＥＤＴＡなどを用いて分離することができる。分離したターゲットは、処理及び分析されて識別及び特性を確認される。スクリーニングは、単一ラウンド或いは複数ラウンドで行われる。非ターゲット或いはコントロールサンプルを使用するネガティブ選択は、選択プロセスで一緒にしてバインダーの結合特性を改善する。
【図４６】液滴ライブラリを使用して、例えば、蛋白質−蛋白質相互作用或いは酵素反応を調整することができる分子をスクリーニングするに使用する本発明の典型的な方法を説明している、
【図４７】アプタマー阻止剤−ＤＮＡ−酵素（ＩＤＥ）、或いはアプタマー−ＩＤＥ、システムを使用する本発明の典型的なシステムを概略的に説明している。先ず、酵素は、不活性な状態にある。その阻止剤（例えば、小分子阻止剤であることができる）が酵素に結合していることにより酵素活性が阻止されている、或いは活性部位及び／又はアロステリックなサイトに結合或いはそのサイトを占めることによりアロステリックに改変されている。阻止剤は、アプタマー含有核酸（例えば、ＤＮＡ、或いは人工或いは合成核酸）シーケンスによって酵素に拘束されている。ターゲット分子が加えられと、アプタマーは、ターゲット分子の周囲に３次構造を作り、これにより、阻止剤を酵素の活性サイト或いはアロステリックサイトから部位から移動させる（例えば、アプタマー−ＩＤＥがターゲットに結合すると、そのコンフォメーションが変り、酵素から阻止剤を離し、酵素が“阻止を解放”、すなわち活性になる。酵素が活性化され、すなわち自由になると、酵素は、酵素的に検出できるシグナルを生成することができ、例えば、酵素的に検出できるシグナル、すなわち発蛍光（蛍光発生）基質の多数のコピーを出す。
【図４８】アプタマー含有（例えば、アプタマー−ＩＤＥ含有）液滴を生成する本発明の典型的なシステム及び方法を説明している。この方法は、下記に詳細を記載するように、“レポーター増幅によるアプタマーのカプセル化スクリーニング（ＥＮＳＮＡＲＡ）”と名前が付けられている。
【図４９】液滴中の単一酵素検出を示す典型的な蛍光顕微鏡写真を説明している。図４９ａは、発蛍光（蛍光発生）基質と３０μｍ液滴中ベータガラクトシダーゼであり、図４９ｂは、酵素なしでカプセル化した基質のみのネガティブコントロールである。
【図５０】本発明のＥＳＮＡＲＡシステムに使用できる指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）を用いて、液滴中で単一核酸分子増幅する本発明の典型的なシステムを説明している。図５０ａは、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）の典型的なメカニズムを説明している。ＤＮＡテンプレートは、ニッキングサイト（例えば、ニッキング・エンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｓｆＮＢＩ）により、３’−及び５’−の両末端に分かれて２つの繰り返しシーケンスをもつようにデザインされている。各サイドにある両方の繰り返しユニットは、ターゲット核酸鎖（つまり、“イニシエーター”鎖）と相補的である。それ故、ターゲット鎖は、テンプレートと交雑することができ、ＤＮＡポリメラーゼ〔例えば、ベント（ｅｘｏ−）〕によりテンプレートに沿って延び、二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を形成する。ニッキング酵素は、ｄｓＤＮＡ上にニッキングサイトを認識し、新たに合成された鎖を開裂する。開裂の後、上流のシーケンスがプライマーをＤＮＡポリメラーゼによって拡張するように作用し、下流のシーケンスを置き換える。置き換えられた下流のシーケンスは、ターゲット核酸と同じＤＮＡシーケンスであるので、フリープライマーとして作用し、フリーテンプレートと新しい反応を始める。反応混合物中に混合されたエバグリーン（ＥｖａＧｒｅｅｎ）などのｄｓＤＮＡ−結合色素は、増幅されたシーケンスに結合し、リアルタイム方式でモニターすることができる蛍光シグナルを生成する。図５０ｂは、典型的に、液滴中の単一合成核酸検出にＥＸＰＡＲを使用する例を示す蛍光顕微鏡写真を説明している。蛍光顕微鏡写真は、液滴からの蛍光シグナルを経時的にモニターしている（下列）。カプセル化前のスパイクされた合成核酸ターゲットのバルク濃度は１０ｆＭであり、カプセル化後の１液滴当たり０（ゼロ）或いは１分子に翻訳した。ターゲット核酸を含まないコントロール液滴は、研究した時間枠では蛍光を生成していない。時間ポイント＜４０分での写真は、蛍光液滴が殆どないので、示されていない。スケールバーは２００μｍである。
【図５１】本発明の典型的な“アロステリック（ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ）”ＩＤＥシステムを概略的に説明している。このシステムは、マルチドメインＤＮＡシーケンスに結合したリポーター酵素で、図の左パネルは、阻止剤との接触によって阻止された所謂“ＩＤＥ”複合体酵素であり、右パネルは、２６量体の相補的シーケンス（Ｄ１）がアルファ−ループに接合して阻止剤を放出し、これにより酵素を活性化している。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
本発明は、液体サンプル（例えば、ヒトの血液、血清、食塩水或いは水、或いは任意の環境上サンプル）をモニターして、生物学的マーカー、生理学的マーカー及び病理学的マーカーを極めて高感度（例えば、単一分子或いは単一細胞）に検出することができる強力な高処理能力の分析プラットフォーム、及びその製作及び使用方法を提供する。別の実施形態で、システムは、新規なセンサー、例えばバイオセンサー技術と、高処理能の粒子或いは液滴マイクロ流体プラットフォームを統合している。別の実施形態で、バイオセンサーは、ターゲットと特異的に反応して蛍光シグナルを迅速に出すようにしたオリゴヌクレオチド、抗体、ペプチド或いはその他のセンシングエレメントである。別の実施形態で、シグナルは、ＰＣＲ、ローリングサークル増幅、近接ライゲーションアッセイ、及び指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）などの従来からの標準的検出方法で増幅できる。
【００７６】
別の実施形態で、本発明の典型的なプラットフォーム或いはシステムは、小分子、生物学的マーカー、生理学的マーカー或いは病理学的マーカー、或いは単一分子、或いは単一細胞を、３Ｄ粒子ディテクター（“統合総合液滴デジタルディテクター（ＩＣ３Ｄ）”と名付けられている）と統合したマイクロカプセル化液滴システムを用いて、迅速かつ高感度に検出できる。ここで、マイクロカプセル化と３Ｄ粒子ディテクターとの統合の中心概念は、低濃度の生物学的マーカーの検出とバイオ分析、或いは、感染症、癌、糖尿病、アルツハイマー病及びその他同種の疾病などの複雑な疾病の検出、診断であり、図１、２、３、４、５、６、７、８及び９に概略を説明している。
【００７７】
別の実施形態で、本発明は、小分子、生物学的マーカー、生理学的マーカー、或いは病理学的マーカー、或いは単一分子、或いは単一細胞を、センサー、例えばＤＮＡザイムのなどの核酸の使用と統合された粒子ベース或いは液滴ベースマイクロ流体システムを用いて検出する高処理能力の多重システム或いはその方法を提供する。別の実施形態で、本発明の実施に使用されるセンサー、例えばＤＮＡザイムは、ターゲット分子或いは特定の細胞に特異的に結合することができる。別の実施形態で、ターゲット分子或いは細胞は、生物学的マーカー、生理学的マーカー、或いは病理学的マーカー、或いは単一分子、或いは単一細胞である。
【００７８】
我々は、センサー、例えばＤＮＡザイムと統合した液滴マイクロ流体システムからなる本発明の典型的なシステムの有効性を示した。ＤＮＡザイムは、デオキシリボザイム或いはＤＮＡエンザイム、或いは触媒的ＤＮＡとも呼ばれ、化学反応或いは反応に触媒作用を及ぼす能力を持つＤＮＡ分子である。本発明のこれら典型的なシステムと方法を実施するに、センサー、すなわちＤＮＡザイムセンサー（図１０のａとｂ）は、単一細胞マナーで、数時間以内に全血からバクテリアを検出できる。また、単一バクテリアの検出も、バッファー中で１５分以内である（図１０のｃとｄ；図１１）。別の実施形態で、液滴（直径で約１〜３００μｍ、或いは１０〜１００μｍの間にある）中のヒト血液を小室化することで、アッセイ感度を著しく高め、バックグランドを小さくし、ターゲット種の有効濃度を著しく高め、そして液滴の小さなスペースからターゲット及びセンサーの分散を防いでアッセイ時間を短縮した（例えば、例えば、図１２、１３、１４，１５及び１６に示すように）。別の実施形態で、３Ｄ粒子カウンター（“統合総合液滴デジタルディテクター（ＩＣ３Ｄ）”と名付けられている）の統合は、ミリリットルの全血から直接にバクテリアを、培養及び増幅なしのワンステッププロセスで、単一細胞の感度で１．５〜４時間で選択的検出可能にしている（例えば、図１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２５を参照）。別の実施形態で、本発明のマイクロカプセル化システムは、拡張スペクトル・ベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）生成のエンテロバクテリア科細菌、及びカルバペン（ｃａｒｂａｐｅｎｅ）耐性のエンテロバクテリア細菌（ＣＲＥ）、ＴＢ及びその他抗菌剤耐性病原体を検出するベータ−ラクタマーゼ（例えば、カルバペネマーゼ）を含む、酵素マーカー用蛍光発生基質を使用している（例えば、図２６参照）。
【００７９】
別の実施形態で、本発明のシステムは、血液中に循環する希薄な癌細胞を検出するに使用することができる。別の実施形態で、本発明のシステムは、液滴−ＰＣＲ、液滴ＲＴ−ＰＣＲ或いは液滴−指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）を使用する遺伝子表現、ポイント変異体、ｍｉＲＮＡｓ及びＳＮＰを特異的に評価することができる（例えば、図２７、２８、２９及び３０を参照）。別の実施形態で、本発明のシステムは、例えば、リアルタイム蛍光センサーを用いる分泌性で細胞内のプロテインマーカーを特異的に評価することができる。別の実施形態で、本発明の典型的なプラットフォーム或いはシステムは、細胞隔離及び選別に、さらに、腫瘍の不均一性、単一細胞−細胞相互作用（幹細胞−癌−免疫細胞）、癌幹細胞、進化、細胞−薬剤相互作用及び薬剤耐性に関する研究に使用することができる。別の実施形態で、本発明は、例えば幹細胞及び癌幹細胞を含む単一移植細胞の研究、モニター及び追跡を提供する。別の実施形態で、本発明の典型的なプラットフォーム或いはシステムは、血液中に循環するメラノーマ細胞を、例えばなんらのセンサーを用いることなしに、これらの細胞からの固有シグナルを受けて検出するために使用できる。
【００８０】
別の実施形態で、本発明は、統合総合液滴デジタルディテクター（ＩＣ３Ｄ）（例えば、図３２及び３３に示したような）からなるシステムを提供する。
【００８１】
別の実施形態で、本発明の典型的なプラットフォーム或いはシステムは、例えば、疾病及び／又は正常のサンプルを、それぞれポジティブとネガティブの選択ターゲットとして用いた複数ラウンド濃縮の使用を含んでいる（例えば、図３４参照）。この実施形態は、疾病サンプルを正常サンプルと識別する重要な（或いは、ユニークなパネルの）分子サイン、例えば、ＳＮＰ，消失、移動、プロティンなどを特異的に認識するセンサー、例えばＤＮＡセンサーを識別するに使用できる。別の実施形態で、選択でのターゲットサンプルは、血液、血清、或いは組織サンプルを含む複合システムである。
【００８２】
我々は、肺癌を対象にして本発明の典型的なＤＮＡザイムスクリーニングプロセスを完成させ、（例えば、図３５、３６、３７及び３８に説明するように）いくつかのＤＮＡザイムセンサーを得た。別の実施形態で、これらＤＮＡザイムは、癌検出のための液滴マイクロ流体を統合している。別の実施形態で、本発明の典型的なプラットフォーム或いはシステムは、下流のシグナル通路に直接結合するインビトロ選択を用いての、分子と細胞のシグナルアプタマーを得る方策を用いている。別の実施形態で、典型的なＤＮＡザイムスクリーニングプロセスは、幹細胞が特別の系統に分化するのを特異的に調整するアプタマーを識別する。
【００８３】
別の実施形態で、本発明の典型的なプラットフォーム或いはシステムは、インビトロで強力な選択をして、信頼できる核酸バインダー、アゴニスト或いはアンタゴニスト、或いはＤＮＡセンサー、及び癌、糖尿病、アルツハイマー病及び同種のものを含む複雑な疾病の診断をできるようにしている（例えば、図３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５及び４６に示すように）。
【００８４】
別の実施形態で、本発明の液滴マイクロ流体システムは、診断と経過見通しのバイオマーカーをモニターするのに、従来のものと比較して、明らかにより効果的、より感度がよく、製作に容易であり、より調整し易い。別の実施形態で、本発明の方法及びシステムによって生成した液滴ライブラリは、少量のサンプル量で薬剤候補と新しいバイオマーカーを見付け出す機会を著しく増加させることができ、スクリーニングの時間を短縮することができる。
【００８５】
別の実施形態で、本発明の典型的なプラットフォーム或いはシステムは、図４７と４８に示すように、そして下記の実施例８に詳細記述するように、液滴中のリポーター酵素或いは酵素システムをアロステリック制御することにより、アプタマーを識別する、“レポーター増幅によるアプタマーのカプセル化スクリーニング（ＥＮＳＮＡＲＡ）”と呼ばれる方法を包括する。別の実施形態で、本発明の典型的なＥＮＳＮＡＲＡ法は、先ず、アプタマー阻止剤−ＤＮＡ−酵素（ＩＤＥ）ライブラリ、或いは多くのアプタマー−ＩＤＥ（図４８に示すように、１０１２以上の分子である）、蛍光発生基質（例えば、酵素の直接基質）及びターゲット分子（それは、例えば、アプタマー−ＩＤＥによって特異的に結合されている）を含む初期水性混合物を用意し、これらをオイル流にポンプで送る。この不溶解性流体が接触すると、水性成分は、何百万ものピコリットルサイズの液滴に小室化する。
【００８６】
この典型的なＥＮＳＮＡＲＡプロトコールで、第１ステージでは１滴あたり１０６のＩＤＥがある。ソーター（例えば、図に示したようなＦＡＣＳ）は、蛍光液滴をそれぞれ分けられたチャンネルに向かわせ、ここで蛍光液滴が溶解され、希釈され、１滴当たり１つのアプタマー阻止剤−ＤＮＡ−酵素（ＩＤＥ）の濃度で、さらに基質とターゲット分子が加えられて再度カプセル化される（基質及びターゲット分子は、加えられ、すなわち内部に組込まれ，マイクロ液滴当たり１つのＩＤＥに再カプセル化される）。次いで、蛍光シグナルを生成する液滴を含むアプタマーを集め、任意に、アプタマーを配列化する。
【００８７】
〔マイクロ流体システム及びマイクロ液滴の使用及び移送〕
別の実施形態で、本発明のシステム及び方法は、この発明を実施するマイクロ液滴を製造する、使用する及び／又は移送する如何なる形式或いは変形のマイクロ液滴システムをも使用できる。
【００８８】
例えば、マイクロ液滴を空間３次元に移送するマイクロ流体移送システムは、米国特許出願公開第２０１３／０２１３８１２号に記載されているようにして使用できる。別の実施形態で、本発明のシステム及び方法は、マイクロ液滴中のＰＣＲ反応を記載した米国特許出願公開第２０１３／０１４９７１０号にあるような移動及び配置装置に結合されたマイクロ液滴操作装置が使用できる。米国特許出願公開第２０１３／０１３９４７７号は、内容物を制御して加工する“マイクロリアクター”のようなマイクロ液滴の使用を記載している。ここでは、非常に少量の物質を、定量的にマイクロ液滴にカプセル化している。米国特許出願公開第２０１３／０１３０９１９号は、大きなポリヌクレオチドテンプレートのマイクロ液滴ベース配列化方法を記載している。マイクロ液滴は、米国特許出願公開第２０１３／０１２９５８１号に記載された装置で製造できる。
【００８９】
別の実施形態で、本発明のシステム及び方法は、以下の文献に記載されたようなマイクロ液滴操作装置を使用できる。例えば米国特許第８，５２９，０２６号には、マイクロ液滴装置内の流れ部分を外から周期的に乱して、高速で規則的な液滴形成をする装置を記載している。また、米国特許第８，５２８，５８９号には、マイクロ流体チャンネル内のマイクロ流体液滴の１つ以上の予め定めた特性或いは性状を評価し、そのチャンネル内の１つ以上の液体流速を制御して、フィードバック制御を使用して予め定めたマイクロ液滴の特性或いは性状を選択的に変える方法を記載している。また、米国特許第８，４９２，１６８号は、例えば、液滴マイクロアクチュエータで親和性ベースアッセイ試薬とサンプル／被分析物とを合わせ、被分析物の有無及び／又は定量を指示するシグナルを発生して、サンプル中のターゲット被分析物を検出する液滴ベース親和性アッセイを記載している。また、米国特許第８，４７０，６０６号は、液滴アクチュエータ中で、液滴内にある磁気的に応答するビーズを循環させる方法、及び液滴を分割する方法を記載している。また、米国特許第８，５２４，４５７号は、例えばマイクロ−或いはナノ−液体を用いて作られた、例えばマイクロ液滴を用いる均質な非競争的アッセイを用いて、ターゲット分子に対して特異的に親和性のある分子をスクリーニングする方法を記載している。
【００９０】
別の実施形態中で、本発明の方法及びシステムを実施するにあたり、マイクロカプセル化したエマルション或いは液滴は、従来の方法を使用して、或いは乳化剤を使用して製造できる（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．＆  Ｔａｗｆｉｋ，Ｄ．Ｓ．Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｉｎ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ｄｒｏｐｌｅｔｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４，３９５−４０２（２００６）を参照）。別の実施形態では、本発明の方法及びシステムは、高処理能液滴ジェネレーターを含む液滴ベースのマイクロ流体の使用、或いはドロマイト・マイクロ流体（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）〔ロイストン（Ｒｏｙｓｔｏｎ），  ハーツ（Ｈｅｒｔｓ），英国〕から市販されているテロス・システム（ＴＥＬＯＳ  ＳＹＳＴＥＭ）（商品名）のようなマルチ−チャンネル装置を含む液滴ベースマイクロ流体の使用がある。別の実施形態で、例えば、アガロース或いはＰＥＧを含む流体液滴は、ゲル化或いは固化させて、液滴粒子を形成することができる（例えば、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２０１２  Ｊａｎ  ３；８４（ｌ）：３５０−３５５）を参照）。別の実施形態で、本発明の方法及びシステムを実施するにあたり、アガロース液滴ポリメラーゼ連鎖反応に基づく高度並列単一分子増幅アプローチは、効率的でコスト効率の良いアプタマー選択に使用することができる。
【００９１】
〔液滴ベーススクリーニング〕
別の実施形態で、本発明は、１つの液滴に１つのタイプの分子という方策に基づいての薬剤スクリーニング及びインビトロ選択プラットフォームを提供する（例えば、図３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５及び４６参照）。我々は、凡そ２×１０１１の異なる多様のシーケンスをもつ液滴ライブラリ中で、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチドを合成した。我々は、ピコリットル液滴（直径で２０μｍ）中に、合成したマイクロビーズ上ＤＮＡをカプセル化した。すなわち、オン−ビーズＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅され、液滴ＤＮＡライブラリを生成した。次いで、これらＤＮＡを、液滴内に転写、翻訳して、ＲＮＡとペプチドライブラリを形成することができる。特に、翻訳された蛋白質／ペプチドの識別／シーケンスは、同じ液滴中で核酸シーケンスを用いてバーコード化でき、これは、その後のスクリーニングにとって強力なツールとなる。本発明の方法及びシステムによって生成された簡単で安価な典型的なＲＮＡとペプチドライブラリは、治療上或いは診断上のような、活性生体体をスクリーニング及び／又は得るに有用であり、またバイオマーカーを見付け出すにも有用である。
【００９２】
〔ＤＮＡザイムセンサー〕
別の実施形態中で、ＤＮＡザイムは、“ＤＮＡ酵素”或いは“デオキシリボザイム”とも呼ばれ、本発明の方法及びシステムを実施するに使用される。これらは、触媒作用をもつ合成一本−鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである１１，１２。別の実施形態で、本発明を実施するに使用される触媒ＤＮＡ分子は、選択される分子の性状が仕様され、予め定義することができるインビトロ進化或いは選択と呼ばれる組み合わせアプローチを用いて、広いランダムライブラリからインビトロで生成することができる１３，１４。
【００９３】
別の実施形態で、本発明の方法及びシステムを実施するに使用されるＤＮＡザイムは、ＤＮＡ／ＲＮＡ開裂、リン酸化、及びＲＮＡライゲーションを含む種々の触媒作用を有している１２。本発明を実施するに使用されるＤＮＡザイムは、例えば、米国特許第８，３２９，３９４号、８，４５０，１０３に記載されているような既知の技術を使って得られる。
【００９４】
別の実施形態では、本発明の方法及びシステムを実施するに使用されるＤＮＡザイムは、単一リボヌクレオチド結合でＤＮＡ−ＲＮＡキメラ基質を開裂することができるＲＮＡ開裂ＤＮＡモチーフである（例えば、Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ＤＮＡｚｙｍｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｓ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ．Ａｌｉ  ＭＭ，Ａｇｕｉｒｒｅ  ＳＤ，Ｌａｚｉｍ  Ｈ，Ｌｉ  Ｙ．Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２０１１  Ａｐｒ１１；５０（１６）：３７５１−４参照）１０，１５。別の実施形態で、このユニークな特性が、ＤＮＡザイムを、リアルタイム蛍光センサーのプラットフォームとして使用できるようにしている（カナダ特許公開第２８２９２７５号，国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０００２０５号、“Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅｓ  ａｓ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ”を参照）。
【００９５】
〔３Ｄ粒子ディテクターと統合されたマイクロカプセル化液滴システム〕
別の実施形態で、本発明の方法及びシステムを実施するに使用される３Ｄ粒子ディテクター或いはカウンターは、例えば、Ｇｒａｔｔｏｎらの米国特許第７，９７３，２９４号（２０１１）、米国特許出願公開第７，５２８，８３４号（２００９）、Ｊ．Ｐ．Ｓｋｉｎｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ  ２０１３，８４；Ｉ．Ａｌｔａｍｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅａｓ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，２４．の記載を参照されたい。別の実施形態で、本発明は、例えば、図１、２、１４、１５、１７、３２及び３３に示すような３Ｄ粒子ディテクターと統合されたマイクロカプセル化液滴システムを提供する。
【００９６】
本発明を実施するに使用される３Ｄ粒子カウンターは、ｍＬ容量から蛍光粒子を数分以内に単一粒子感度で、検出することができる。簡単に言えば、図１７に示すように、典型的な装置は、水平構造で、直径が１ｃｍの円筒状キュベットを保持する機械的部品を持つ小さいポータブル顕微鏡を有している。２つのモータが、キュベットに回転（１０〜１１００ｒｐｍの間）と垂直上下運動（１〜１５ｍｍ／ｓの間）を与えている。ダイオードレーザー（例えば、４６９ｎｍ或いは５３２ｎｍ）によって生成された励起光は、典型的にキュベットの比較的内壁近くに位置する観察点に集束する。サンプルからの放射は、同じ対物レンズで集められ、ダイクロイックフィルターセットを通って、レンズによってピンホールに集束し、別のレンズによって光電子増倍管（ＰＭＴ）にコリメートされる（（視準される）ｃｏｌｌｉｍａｔｅｄ）。光ディテクターは、観察点での蛍光粒子からの蛍光シグナルを測定し、蛍光の時間的プロファイルを生成する。パターン認識フィルターは、他の全てのノイズの多いシグナルから、非常に高いシグナル／ノイズ比の除去で正確な波形を持つスパイクを抽出する。これで、極めて信頼性のある正確な検出ができるようなる。この装置の単純で革新的なデザインは、約０．０１ミリセカンドで比較的大容量（１００ｐＬ）の高速走査を可能にしている。光電子増倍管の約１００秒間のスパイラル状回転により、約１ｍＬの増倍管を有効に調べる。さらに、測定容量が大きいと、速いシグナルだけを検出するので、粒子の拡散に起因する変動は無視できる。我々は、この光学装置を用いて、サンプル中に１５０μｍしか浸透していないことを強調しておく。それ故に、２５０μｍパスで５００ｎｍでの透過が約１０％である全血（センサー溶液による希釈前でも）のような拡散が大きいサンプルでも、容易に扱える。
【００９７】
このシステムは、蛍光マイクロビーズ或いはソイトックス・オレンジ染色イー・コリ（Ｓｙｔｏｘ  ｏｒａｎｇｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いて数粒子／ｍＬを確実に検出できる（例えば、Ｓｋｉｎｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ，２０１３，８４；Ｉ．Ａｌｔａｍｏｒｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｍｅａｓ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３，２４を参照）。
【００９８】
別の実施形態で、本発明は、例えば、図１〜３３に示すように、３Ｄ粒子ディテクターと統合されたマイクロカプセル化液滴システムを含む方法及びシステムを提供する。
【００９９】
別の実施形態で、本発明の方法及びシステムは、従来の検出アッセイによって容易に達成できない以下のユニークな特徴を有している。
１）少量のマーカー（例えば、１〜１００万／ｍＬ）；
２）大容量サンプル（μＬ〜ｍＬ）と高処理能力の調査が可能；
３）迅速（数分〜数時間）；
４）広い検出範囲；
５）多重化可能；
６）サンプル準備が必要ない或いは最小、血液或いは他の生体サンプルは、濃縮或いは精製ステップなしに直接カプセル化できる。別の実施形態で、このアッセイは、１つのステップ、均質化方式で行われ、これで、全てのターゲットを分析することができる。
【０１００】
別の実施形態で、本発明の方法及びシステムは、生検分析サンプル、すなわち個人或いは患者からの血液、血清、唾液、涙、便、尿或いはＣＳＦサンプルを含む生体サンプルを分析できる。別の実施形態で、本発明の方法及びシステムは、食品、水、土、或いは空気源から得られた如何なるサンプルも分析することができる。
【０１０１】
別の実施形態で、本発明の方法及びシステムを実施するに、サンプルは、処理なし或いは最小の処理（例えば、希釈）で直接アッセイすることができる。標準の確立された生体サンプルの準備プロセスには、希釈、精製、濃縮、抽出、遠心分離、磁気ビーズアッセイ、及び洗浄ステップがあり、必要はないが、本発明のアッセイ、方法及びシステムに統合できる。
【０１０２】
別の実施形態で、本発明のアッセイ、方法及びシステムは、限定するものではないが、例えば、細胞（例えば、癌細胞、幹／始原細胞、免疫細胞）、病原体（例えば、バクテリア、多薬剤耐性生物（ＭＤＲＯ）、結核（ＴＢ））、寄生生物、真菌類、ウィルス（例えばＨＩＶ）、細胞由来の小嚢（例えば、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、微小胞、アポトーシス小体）、核酸（例えば、ＳＮＰ、変異体、発現物）、蛋白質（例えば、ＰＳＡ）、酵素（例えば、ＭＭＰ）、ペプチド、脂質、炭水化物、多糖、小分子或いは金属イオン、を含む如何なるターゲットでも検出及び分析できる。
【０１０３】
別の実施形態で、本発明のアッセイ、方法及びシステムによって検出されるターゲット種の形は、例えば、細胞表面（例えば、ＥｐＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４、ＣＤ２４）、細胞内、分泌マーカー（細胞セクレトーム：ｃｅｌｌ  ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）、細胞フリー循環マーカー（例えば、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質マーカー）、代謝マーカー、機械的マーカー（例えば、細胞変形能、硬度、細胞骨格、など）がある。
【０１０４】
別の実施形態で、本発明の方法及びシステムは、例えば、ＤＮＡ交雑、蛋白質受容体−リガンド相互作用、酵素−基質相互作用、細胞表面受容体二量化（ホモ−及びヘテロ−集団）、共局在、或いは可溶性リガンドと薬剤と他の細胞との相互作用などの生物学的事象を検出或いはモニターするために使用することができる。
【０１０５】
別の実施形態で、本発明の方法及びシステムは、液滴中のターゲットを分析或いは測定するための種々の検出アッセイの使用を含むものである。例えば、本発明の方法及びシステムは、例えば、典型的な３Ｄ粒子カウンター解析の実施形態に、例えば、液滴内のターゲットを選択的に検出する広く多種の確立した蛍光バイオアッセイの使用を含むものである。そのようなアッセイは、限定するものではないが、核酸ベースアッセイ、抗体ベースアッセイ、酵素ベースアッセイ、或いは化学薬剤ベースアッセイ、或いはこれらを組み合わせて使うアッセイがある。核酸ベースアッセイは、例えば、交雑、分子標識、アプタマー、ＤＮＡザイム、或いはその他リアルタイム蛍光センサーがあり、抗体ベースアッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチベース、免疫染色、抗体捕獲、第２の抗体増幅、或いは近接ライゲーションベースなどがあり、酵素ベースアッセイは、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡ、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ニッキング〔例えば、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）〕、鎖置換、及び指数関数的等温増幅（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１２，１２，２４６９−２４８６を参照）がある（例を、図６、７及び９に示す）。ある場合には、ＰＳＡ、ＭＭＰ、ベータ−ラクタマーゼ、及びカルバペネマーゼのようなターゲット自体が、酵素として機能することができ、検出プロセスを引き出している（例として、図２６を参照）。
【０１０６】
別の実施形態中で、本発明の方法及びシステムを実施するに、マイクロカプセル化したエマルション或いは液滴は、従来の方法で、或いは乳化剤を用いて、或いは液滴ベースマイクロ流体によって製造できる。別の実施形態で、本発明の方法及びシステムは、高処理能液滴ジェネレーター或いはマルチ−チャンネル装置を含む液滴ベースマイクロ流体の使用を含むものである（例として図１５を参照）。液滴は、オイル−イン−ウォーター配合であることができ、或いは液滴は、ウォーター−イン−オイル−イン−ウォーター（Ｗ／Ｏ／Ｗ）の二重エマルション配合であることもできる。別の実施形態で、例えば、アガロース或いはＰＥＧを含む流体の液滴は、ゲル化或いは固化させて液滴粒子を形成することができる。
【０１０７】
別の実施形態で、液滴は、１０ｎｍから数百ミクロンに及ぶ異なるサイズに作られる。液滴は、加熱／冷却（ＰＣＲでは）、併合、分割、選別及び長期貯蔵を含む種々の方法で扱われる。液滴は、従来のＩＤオンチップ、或いは２Ｄ解析、或いはこの発明における３Ｄ粒子カウンターで解析することができる。
【０１０８】
別の実施形態で、本発明の方法及びシステムを実施するために、どの３Ｄ粒子カウンターも使用することができ、例えば、図１７に示すような装置システム（“３Ｄ粒子カウントシステム”とラベルした）、或いはポイント・オブ・ケア用のポータブルシステム（例えば、図３２及び３３を参照）がある。
【０１０９】
別の実施形態で、本発明は、統合システム、例えば、好ましい持ち運び性（例えば、バックパックとしてパッケージにされた）と、自動化液体ハンドリング（つまり、液滴生成及び自動サンプリング）と、及びダイオードレーザー（光源）、ＡＰＤ（ディテクター）、操作（ｖｉｎｃｉ，ＩＳＳ  Ｉｎｃ．）及び／又はデータ解析ソフトウェア（ＳｉｍＦＣＳ）、ディスプレイ、コンピューター・インターフェース、スマートフォンを含む統合電子機器の１つ或いはいずれかを、３Ｄ粒子カウントシステムと組み合わせたシステムを提供する。図３２及び３３には、マイクロカプセル化装置と３Ｄ粒子カウントシステムを統合して使用している本発明の典型的な持ち運びできるデザインを説明している。
【０１１０】
別の実施形態で、この典型的な装置は、多数の廃棄可能なマイクロ流体“カートリッジ”と統合して、多数のタイプのターゲットを、同時に多重かつ迅速に検出できるようにしている。この装置は、完全自動化することができ、オール・イン・ワン・システムとして、或いはモジュールコンポーネントと一緒に作り上げることができる。さらに、図３２に説明しているように、ポイント・オブ・ケア用にスマートフォンとブルートゥース（登録商標）などとリンクできる。
【０１１１】
別の実施形態で、我々の装置は、異なる波長で読むことができる複数レーザー源とディテクターで構成して、複数ターゲットを多重かつ並行に検出できるようにしている。多重システムは、異なるターゲットをコード化した多数のセンサー（異なる色にラベルされる）を同時に読むことができる。別の実施形態で、我々の装置には回転台が統合され、並列したテストが行えるように多数のサンプル瓶を収容できる。
【０１１２】
〔３Ｄ粒子ディテクターに統合されたマイクロカプセル化液滴システム、すなわち本発明の統合総合液滴デジタル検出（ＩＣ３Ｄ）システムの適用〕
別の実施形態で、本発明の典型的なシステムは、液滴システムと３Ｄ粒子カウンターを統合してなり、所謂“本発明の統合総合液滴デジタル検出（ＩＣ３Ｄ）システム”（例えば、図１及び３３を参照）を包含していて、ｍＬ容量の生体サンプルを数分以内に選択的に検出できる。別の実施形態で、本発明の典型的なシステムは、低濃度の生体粒子とマーカーを如何にして検出、分析するかを革新するものである。別の実施形態で、本発明の典型的なシステムは、制限するものではないが、以下の分野に適用する生体分析と診断での種々の検出に利用される。
−皮膚感染、傷感染、糖尿病潰瘍感染、ＨＩＶ、バクテリア、ＴＢ、ＭＤＲＯ（例えば、ＭＲＳＡ）を含む感染症病原体（例えば、バクテリア、ウィルス、真菌類など）；
−癌；
−糖尿病；
−アルツハイマー病（例えば、ベータアミロイド、タウ蛋白質）；
−脳傷及び障害（例えば、Ｓ１００Ｂ、グリアル−特異蛋白質、ここで、Ｓ１００Ｂレベルの上昇は、明らかに外傷性脳損傷或いは神経変性疾患を含む神経病理学的状態があることを反映している）；
−炎症及び自己免疫疾患（例えば、ＣＤ４  Ｔ細胞、免疫細胞数）；
−幹細胞及び再生医学（例えば、間葉系間質細胞、内皮前駆細胞、造血幹細胞、細胞は内因性と外因性両方の移植細胞を含む。）；
−心臓血管疾患（例えば、Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）、Ｂ−タイプナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、トロポニン、シスチン  Ｃ、ＩＬ−６）；
−薬剤及び乱用（例えば、テトラヒドロカンナビノール、ＴＨＣ）；
−新生児検診（例えば、フェニルアラニン）；
別の実施形態で、本発明の典型的なシステムは、新しい生物学、細胞−薬剤相互作用及び薬剤感受性を研究し、新しい薬剤と診断を開発し、疾病の進行と治療効果をモニターし、或いはコンパニオン診断として使用され、そして引き続いて個人的診断及び医薬品に使用される。医学分野の適用に加え、本発明の典型的なシステムは、食品産業、農業、水システム道、空気システム、及び防衛（ｄｅｆｅｎｓｅ）への適用を含む他の分野に使用することができる。
【０１１３】
〔血液感染、例えばＢＳＩを早める耐バクテリア及び耐抗菌剤の迅速かつ敏感な検出方法、診断及び治療〕
本発明は、血液中のバクテリアを迅速かつ敏感に識別して、血液感染に関連した死亡率と医療ケアコストを大幅に低減するシステム及び方法を提供する。
【０１１４】
別の実施形態で、本発明は、血液感染診断及び治療を早めるために、血液流中の感染を検出する迅速かつ敏感な方法を提供する。
【０１１５】
別の実施形態で、本発明は、拡張型ベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）とカルバペネム耐性エンテロバクテリアーセ（ＣＲＥ）を検出する迅速かつ敏感な方法を提供する。
【０１１６】
〔癌の検出とモニタリング〕
別の実施形態で、本発明は、例えば、癌細胞を検出する迅速かつ敏感な方法を提供するものであり、癌細胞の１次腫瘍から他の臓器への転移、すなわち播種を検出、１次腫瘍の形成と成長を検出、１次腫瘍から循環に移る循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）として知られる癌細胞の検出をする。別の実施形態で、本発明は、初期段階診断での分析と定量化、経過見通し（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）及び疾病経過のモニタリングを行う方法を提供する。別の実施形態で、本発明は、蛋白質（例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ））、細胞フリー核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、細胞由来の粒子（例えば、エキソソーム、微小胞、アポトーシス小体）などの癌マーカーを検出する方法を提供する。別の実施形態で、本発明は、例えば１０７の白血球につき１つのＣＴＣが在る非常に稀れなマーカーを検出する方法を提供する。本発明の方法は、例えば、不均一系の従来からの流動細胞分析、ＤＮＡ及びＲＮＡ配列化、及び免疫学的アプローチ〔例えば、セルサーチ（ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨＴＭ）（商品名）プラットフォーム〕と共に、或いはそれに代って、臨床現場でのＣＴＣ或いはＰＳＡのような癌マーカーを信頼性高く検出するに使用できる。
【０１１７】
別の実施形態で、本発明は、癌細胞の異質性を詳しく調べる方法である単一細胞検出方法を提供する。別の実施形態で、本発明は、個人的な診断及び治療のために、核酸、蛋白質及び代謝物の検出を行うなど単一細胞レベルで稀な細胞を検出及び分析することができるようにする。
【０１１８】
〔脳、神経系及びＣＮＳ疾病と障害の検出とモニター〕
別の実施形態で、本発明は、神経系と中枢神経システム（ＣＮＳ）疾病、及び脳腫瘍、外傷及び損傷のための既に確立されたバイオマーカーを検出する方法を提供する。別の実施形態で、本発明は、β−アミロイド（Αβ）ペプチド（つまり，Αβ４２）とタウ蛋白質の蓄積を検出する方法を提供する。これらは、アルツハイマー病（ＡＤ）の脳を特徴づける２つのキーとなる神経病理学特徴であって、ＡＤ病因を特徴付けるＣＳＦに検出される重要なバイオマーカーとなり得る。別の実施形態中で、本発明は、これらのバイオマーカーを検出及び定量する方法を提供する。この方法は、バイオマーカーとしてΑβとタウ蛋白質を使って、１）ＡＤをスクリーニング及びモニターする、２）この疾病の分子生物学及び病理学をより深く理解する、及び３）治療の関与を評価することを目的とした研究に極めて貴重となる。別の実施形態で、本発明の方法は、例えば、Αβとタウ蛋白質を検出するために、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を含む既存のアッセイの代わり、或いはそれと共に使用することができる。別の実施形態で、本発明は、非常に低濃度で、しばしば血液脳関門（ＢＢＢ）のために既存のアッセイでは検出できないＳ１００Ｂ（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｂ）のようなマーカーを含めた血液中及び尿中マーカーのスクリーニング及び検出を提供する。
【０１１９】
〔残留ＨＩＶの検出〕
別の実施形態で、本発明は、例えば、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、ＨＩＶ／抗体複合体、及びＨＩＶを含む希少残留細胞などのレトロウィルスを検出する方法を提供する。最近では、ＨＩＶ患者が骨髄移植を含む新しい治療法によって快癒したとみられるいくつかの事例がある。しかしながら、ＨＩＶは、数か月後に再発した。主な挑戦は、治療中に、ウィルスの粒子濃度がしばしば既存の技術の検出限界以下になることがあるということであり、実際には快癒していないのに、“快癒した”ようにみえることである。したがって、この発明の方法は、非常に少ない数のウィルス粒子を検出することができ、この治療及び病気の経過をみる助けになる。
【０１２０】
〔液滴マイクロカプセル化システム：
別の実施形態で、本発明は、バイオアッセイ、医薬及び食品産業を含む種々の目的で、サンプルと処理剤を小室に入れる既存の方法である液滴エマルションカプセル化（例えば、ウォーター−イン−オイル）を使用する方法及びシステムを提供する。別の実施形態で、本発明は、超高感度でかつ高処理能のスクリーニング及び実験を行うプラットフォームとしてマイクロ流体システムの多層フローを使用する方法を提供する。
【０１２１】
別の実施形態で、本発明方法は、“液滴マイクロ流体”を使用して、単分散、例えばピコリットルサイズのマイクロ液滴、不溶解性キャリアー油流体中の流体液滴（例えば、ウォーター−イン−オイル・エマルション）の生成及び取扱いを可能にする。（例えば、“Ｄｒｏｐｌｅｔ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｄｏｎｇ−Ｋｕ  Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０，２０１４を参照）。別の実施形態で、本発明の方法は、ピコリットル液滴（例えば、直径が１〜３００μｍ）中での小室化を使用して、ターゲット種の有効濃度を高めてアッセイ感度を上げ、アッセイ時間を短縮する。
【０１２２】
別の実施形態で、液滴マイクロ流体は、単一細胞のような低濃度ターゲットの高処理能かつ多重の検出と分析、及び遺伝子発現、細胞生存能力及び増殖、単一細胞レベルでの細胞−細胞及び細胞−薬剤相互作用の検出に使用される。別の実施形態で、液滴は、加熱／冷却（ＰＣＲに対し）、併合、分割、選別及び長期貯蔵を含む多くの方法で取り扱われる。
【０１２３】
別の実施形態で、本発明の方法は、１ｍＬのサンプルを数分以内に液滴に変えることができる複数の（例えば、２５６まで）液滴生成チャンネルでなっている。
【０１２４】
別の実施形態で、本発明の方法は、洗浄ステップと反応ステップの繰り返し、流動細胞分析（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を含む種々の目的のために、ハイドロゲル液滴を容易に生成できるアガロースのようなゲル化可能な材料のカプセル化を含むものであり、液滴は、オンチップで検出でき、１０００液滴／秒以上の高い処理能力で効率的に選別することができる。
【０１２５】
〔３Ｄ粒子ディテクター〕
別の実施形態で、本発明の方法は、レア・イベント・ディテクター（Ｒａｒｅ  Ｅｖｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）とも呼ばれる３Ｄ粒子ディテクター、３Ｄ粒子スキャナ、或いは蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を使用するものであり、これらは、米国特許第７５２８３８４号、米国特許出願公開第２００９／０２３０３２４号，米国特許第７５２８３８４号に記載されている。別の実施形態で、この３Ｄ粒子ディテクターは、臨床的に適切な処理能力を達成することができる。別の実施形態で、本発明の方法は、単一粒子感度でミリリッター（ｍＬ）容量から粒子（例えば、蛍光ビーズ或いは染色された細胞）を数分以内に検出することができる３Ｄ粒子数計測技術の使用を含むものである。
【０１２６】
別の実施形態で、本発明の方法は、液体の入った管を、共焦点顕微鏡の対物レンズの前で螺旋運動させることにより、１ｍＬの液体を迅速にスキャンできる３Ｄ粒子数カウント技術の使用を含むものである。この顕微鏡の光学は、凡そ０．０１ミリセカンドで比較的大容量（１００ｐＬ）の測定ができるようにデザインすることができる。約１００秒間の管の螺旋状運動回転で、約１ｍＬの管を効率よく調査する。蛍光粒子が励起容量中を迅速に通ることで、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が１００以上の非常に強いシグナルを作り出す。速いシグナルだけが検出されるので、回転管の機械的構築における欠陥による遅い蛍光シグナル変調は、Ｓ／Ｎ比に何の効果を及ぼさず、このシステムは、Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．，８４（７），０７４３０１；Ａｌｔａｍｏｒｅ，（２０１３）ＦＣＳ．Ｍｅａｓ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ，２４（６），６５７０２に記載されているように、蛍光マイクロビーズやソイトックス・オレンジ染色イー・コリを用いた低粒子／ｍＬを確実に検出することができる。
【０１２７】
本発明は、以下の実施例を参照してさらに記載するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではないと理解される。
【実施例】
【０１２８】
［実施例１：マイクロカプセル化センサーを用いる生体サンプル中のバクテリア検出］
〔リアルタイム蛍光ＤＮＡザイムセンサー〕
１つの実施形態で、凡そ１０１４のランダムシーケンス（例えば、化学的に合成された）を含むＤＮＡライブラリを、ＤＮＡザイムセンサーの選択及び／又は分離に使用する。このライブラリは、例えば、蛍光発生、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ基質にライゲートされた約４０のヌクレオチドの可変シーケンスからなることができる（図１０ａを参照）７。この基質は、開裂サイトとして、それぞれの側面に蛍光体とクェンチャーが隣接する単一リボヌクレオチド（リボアデノシン）を有している。このライブラリに在る特定ＤＮＡシーケンス（つまり、ＤＮＡザイム）が、ターゲットバクテリア溶解物がある状態でのみ、リボヌクレオチド結合で開裂して蛍光シグナルを発するのを理論的根拠としている。
【０１２９】
インビトロ選択は、ＨＥＰＥＳバッファー中で、スタートライブラリをターゲットバクテリア溶解物と共に、約１０分間インキュベートする。開裂した分子は、ゲル分離され、プライマー−特異的ＰＣＲによって増幅され、基質にライゲートされ、次のラウンドの選択に使用される。非ターゲットバクテリアからのバクテリア溶解物は、ネガティブ選択として培養され、非特異的ＤＮＡザイムを除き、アッセイ特異性を確保する。我々の実験では、選択の完結に８〜１５ラウンドの選択（およそ１〜３か月）が必要であった７。ＤＮＡプールの最終ラウンドは配列化できる。この選択アプローチを使用して、イー・コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含む種々のバクテリアを迅速に検出するリアルタイムＤＮＡザイムセンサーを分離した。そのような高い選択性は、選別プロセスにおいて適正なネガティブ選択ターゲットを含ませることによって、特定のバクテリア、ＭＤＲＯ或いは他の病原体を特異的に検出するＤＮＡザイムセンサーを作り出すのが容易であることを示している。別の実施形態で、本発明の方法及びシステムは、細胞のような蛍光発生ＤＮＡザイムプローブ、例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２０１１，Ａｐｒ  １１；５０（１６）：３７５１−４、或いはＬｉ  ｅｔ  ａｌ，国際特許公開第ＷＯ／２０１２／１１９２３１号に記載されているようなバクテリアインジケーターを用いるいずれの既知の方法も包含している。
【０１３０】
我々は、システムにおける１つの例として迅速な発蛍光ＤＮＡザイムセンサーを使用した。図１０ａ及び図１０ｂに示すように、このセンサーは、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ基質とライゲートしているＤＮＡザイムドメインを有し、リボヌクレオチド開裂サイトが、蛍光体とクェンチャーに隣接している。この“不活性”状態は、蛍光体とクェンチャーが近接しているので蛍光シグナルが小さい。ターゲットバクテリアとしてここではモデルシステムとしてイー・コリを使用したが、このターゲットバクテリアが存在すると、ＤＮＡザイムは、バクテリアによって生成したターゲット分子と結合し、基質を開裂する。開裂により蛍光体がクェンチャーから離れ、それにより、強い蛍光シグナルを生成する。さらに、ＤＮＡザイムセンサーは、ターゲットのイー・コリを、コントロールバクテリア或いは哺乳類細胞と高選択性で区別できる（図１０ｃ）。我々は、さらに、イー・コリのストック分離物を用いて予め分離したＤＮＡザイムセンサーは、血液中にスパイクされ溶解した臨床イー・コリ分離物を確実にかつ選択的に検出できることを示した（図ｌ０ｄ）。ＤＮＡザイムセンサーは、全ての臨床イー・コリサンプルを検出することができるが、サンプル間で蛍光強度が変わっており、これが、異なるイー・コリ株間にある潜在的な分子不均一性を反映しているに違いないとするのは興味あることである。これは、さらに、インビトロ進化プロセスに適切なポジティブ及びネガティブ選択ターゲットを入れることにより、同じバクテリア種の異なる株を区別することができるＤＮＡザイムセンサーを作り出す可能性があることを示唆している。
【０１３１】
我々のゴールは、全血をサンプル処理なし或いは最小の処理で使用する“混合及び読み取り”アッセイを開発することであるので、我々は、さらに、全血をセンサー溶液で種々の容積比に希釈した中でセンサー性能テストし（図１１ａ）、我々のフルオレセイン／ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）改変ＤＮＡザイムセンサーが、血液中にスパイクしたイー・コリに応じて極めて強い蛍光シグナルを生成することを見出し、最終血液濃度１０％とするのが最善と決め、この後の液滴実験（下記）に使用した。特に、血液の自動蛍光による妨害が少ない近赤外線色素を用いての色素ペアを最適化することで、さらに血液中でのセンサー性能（例えば、シグナル／ノイズ比）を改善することができる。我々は、さらに、このＤＮＡザイムセンサーは、今後の臨床使用（図１１ｂ）を目標とする時間枠（＜１．５〜４時間）内で、血液中で充分な安定性を示すことを示した。別の実施形態で、ＤＮＡザイムの末端或いは骨格（つまり、反転Ｔとホスホロチオエート）は、さらに化学的に改質することができ、或いは、リボヌクレアーゼ阻止剤（リボロック、フェルメンタス）をアッセイバッファー中に含有させて、血液安定性を高めることができる。
【０１３２】
血液循環感染症（ＢＳＩｓ）、敗血症及び抗菌剤耐性がいくつかの異なるタイプの病原体により引き起こされるが、このセンサーセットは、上記したインビトロＤＮＡザイムセンサー選択で拡大し、他の病原体種も検出することができる。特に、特定のターゲット分子について予備知識なしに複合ターゲットとしてバクテリアを使用する偏見のないスクリーニングは、非常に複雑な混合物からターゲット分子を精製及び識別する面倒なプロセスを通ることなく、予期しないで発生する新しいバクテリア株のセンサーを迅速に開発できるようにする。これは、予め識別されたターゲット遺伝子、或いはバクテリアと関連した迅速で複雑な発生メカニズムが与えられた他のバイオマーカーの検出に依存するＰＣＲを含めた既存技術が直面した主な挑戦となる。ＤＮＡザイムに連結して基質開裂を引き起こす特定のバクテリアバイオマーカーの識別は、我々のアッセイを取り扱うに必ずしも必要でないが、それらは、質量分析装置と結合した親和性精製を使用することにより識別することができる。
【０１３３】
別の実施形態で、本発明は、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．アウレウス）〔Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）〕、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅ．フェカーリス）〔Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）〕、コアグラーゼネガティブ・スタフィロコッチ（ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、クレブシエラ・ニューモニア（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクター・バウマニィ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、腸外病原エシェリシア・コリ（ｅｘｔｒａ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びＥＳＢＬ，ＣＲＥ，メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、及び真菌類病原体を含むターゲットとして、例えば主要血液感染バクテリア或いは薬剤耐性生物を用いるインビトロ選択を経て作られるリアルタイム、蛍光発生ＤＮＡザイムセンサーのパネルを使用する。
【０１３４】
〔液滴マイクロ流体〕
別の実施形態で、本発明のシステム及び方法は、超高感度かつ高処理能のスクリーニングと診断のためのプラットフォームとして、マイクロ流体システムで多相流を取り扱う。
これらのシステムは、“液滴マイクロ流体”と呼ばれ、不溶解性キャリアーオイル流に単分散でピコ−リットルサイズの液滴（つまり、ウォーター−イン−オイル・エマルション）の生成と取扱いができるようにしている１１、１４。種々の分析物組成をもつ液滴を高速度でコントロールして生成する能力により、液滴マイクロ流体を、酵素アッセイ、蛋白質結晶、ナノ材料合成、及び細胞ベースのアッセイを含む一連の化学的及び生物学的な適用に向けての強力なツールにしている１１、１４。ピコリットル液滴（別の実施形態では、直径が約１〜３００μｍ、或いは１０〜１００μｍの間であることができる）での小室化は、ターゲット種の有効濃度を上げることにより、アッセイ感度を上げ、アッセイ時間を短縮する１１。したがって、別の実施形態では、液滴マイクロ流体は、単一細胞のような低濃度ターゲットの高処理能かつ多重の検出と分析に特に適している。確かに、遺伝子発現、細胞生存及び増殖、単一細胞レベルでの細胞−細胞及び細胞−薬剤相互作用は、液滴マイクロ流体を用いて示された１２。別の実施形態で、液滴は、加熱／冷却（ＰＣＲで）、併合、分割、選別及び長期保存といった種々の方法で取り扱われる。別の実施形態で、液滴は、高処理能（＞１０００の液滴／ｓ）でオンチップ検出され、効率良く選別される１１。
【０１３５】
別の実施形態で、本発明のシステム及び方法は、図１２、１３、１４及び１６に示すように、患者の血液中にあるバクテリアを、単一細胞の感度で、数分以内に見出すことができる。別の実施形態で、本発明のシステム及び方法は、液滴マイクロ流体を用いてインビトロ選択により得られるバクテリア検出のＤＮＡザイムセンサーを統合している（図１４）。別の実施形態で、バクテリアの液滴中への閉じ込みにより、迅速なリアルタイム方式のＤＮＡザイムセンサーによって検出できる放出ターゲット分子濃度を著しく増加させている。
【０１３６】
図２ａは、通常のバクテリア検出及びスクリーンを行う本発明の典型的な自動化装置を示している。数分から数時間以内に、患者の血液サンプルを分析し、サンプル中のターゲットバクテリア数をディスプレイパネルに表示する。液滴マイクロ流体は、ＤＮＡザイムセンサーシステムと統合され、血液中のバクテリアを検出する。蛍光液滴を含むバクテリアは、オンチップでカウントされ（図２ｂ）、或いはキュベットに集められた後に３Ｄ粒子カウンターによってカウントされる（図２ｃ）（下記の実施例２）。
【０１３７】
別の実施形態で、血液サンプルとＤＮＡザイムセンサーは混合され、次いで、何百万から何十億個のマイクロンサイズ液滴にカプセル化される。ＤＮＡザイムセンサーは、バクテリアを含む液滴中で瞬間的にシグナルを生成し、これはカウントされ解析される。別の実施形態で、患者の血液は、マイクロ流体チャンネル内で、バクテリア溶解バッファーを含むＤＮＡザイムセンサー溶液と混合され、何百万個のピコリットル液滴にカプセル化される（図２ｂ）。バクテリアは血液中に少ない数で存在する（典型的に、１〜１００ＣＦＵ／ｍＬ）ので、それぞれの液滴は、バクテリアを１つ含む或いは含んでいないかもしれない。ＤＮＡザイムセンサーは、バクテリアを含んでいる液滴中で瞬間的に蛍光を発することができる。液滴は、組み込まれたＡＰＤ（フォトン・アバランシェ・ダイオード）で、高処理能様式（凡そ、３０００液滴数／ｓ）に検出できる。このシステムは、多数の主要バクテリアターゲットを同時にスクリーニングできる多数の液滴マイクロ流体“カートリッジ”と統合することができる。
【０１３８】
別の実施形態で、インビトロ選択技術は、様々の主要病原バクテリアのマルチプルＤＮＡザイムセンサーを形成して、多重バクテリア検出を可能にすることができる。液滴中の単一バクテリアの小室化は、ターゲット分子の濃度を極めて高め、迅速な検出と単一細胞感度を可能にしている。アッセイ時間が著しく短縮されると（つまり、従来技術における数時間から数日に対して数分）、血液感染を素早く有効に治療できるようにする。
【０１３９】
別の実施形態で、本発明の典型的なプラットフォームは、薬剤感受性スクリーニングアッセイとの統合が容易で、患者に特異的な治療のために最善な抗生物質投与を決めることができる。そのような迅速な検出及び初期における介在は、血液感染の治療機会を著しく良くし、死亡率を減少することができる。このように、本発明は、血液感染のある患者の生存率を著しく増加させ、患者ケアに関連した金銭的コストを下げることができる。
【０１４０】
別の実施形態で、本発明の迅速な単一細胞検出方法及びシステムは、循環腫瘍細胞のように血液中でゆっくり成長する種〔例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）〕及びその他の稀な細胞の検出及びスクリーニングのプラットフォームとして使用できる。
【０１４１】
〔液滴マイクロ流体の構築とセットアップ〕
〔装置の構築〕：液滴マイクロ流体は、上記したように、既知の確立された方法によって構築及び操作できる２６。例えば、１つの実施形態で、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）チップに、標準のソフトリソグラフィーを用いて深さが２０μｍ、幅が１５μｍのチャンネルを構築し、これを顕微鏡用スライドガラスに装着する。図１４ａに示すように、ＰＤＭＳ装置は、オイル入口を１つと水入口を２つ（１つはバクテリアをスパイクしたバッファー或いは血液用、もう一方はＤＮＡザイムセンサー及び細胞溶解試薬用）持っている。標準圧力注入／取出しシリンジポンプを用いて、試薬とオイルを、流速０．５〜２μＬ／分で送る。２％（ｗ／ｗ）のＥＡ界面活性剤を含むフッ素オイルＨＦＥ−７５００と合わせ、この流れを集束させることにより、均一なピコリットル−サイズ液滴が、５０Ｈｚの割合で生成されてくる。３つの異なるサイズ（直径で１０、２０及び５０μｍ）の液滴を生成させた。異なるサイズの液滴は、別の実施形態で、マイクロ流体チャンネルサイズと流速を調整することにより、が作られる。図１４ｃには、３０μｍの液滴を生成した画像を示している。液滴生成に引き続いて、短い“揺動（ｗｉｇｇｌｅ）”モジュールを入れて、液滴を無秩序な流れにして迅速に混合する（図１４ａ）。その後、液滴を“インキュベーションチャンネル”（７０ｃｍ）を通して流し、検出ゾーンで検出した。
【０１４２】
図１４は、（ａ）液滴マイクロ流体チップの典型的なレイアウト、（ｂ）形成されている均一なマイクロ液滴の典型的／代表的な顕微鏡イメージ画像、ｃ）液滴中に血液成分、特に赤血球がはっきりと見える、ｄ）キュベットに集められた液滴、ｅ）ＤＮＡザイムセンサー（２５０ｎＭ）が、３時間の反応後に１０％血液中にある単一イー・コリＫ１２を含む液滴をライトアップしていることを示す代表的な蛍光顕微鏡写真、を示している。
【０１４３】
別の実施形態で、我々のシステムの液滴は、多数の液滴形成の挑戦とその構造を実現した高処理能液滴ジェネレーターによって作ることができる。別の実施形態で、高処理能液滴ジェネレーターは、ミリリッター・サンプルを、数分以内に液滴にすることができる。図１５は、高処理能血液マイクロカプセル化装置の例を説明している。二層マイクロ流体装置は、単一装置内に８つの液滴ジェネレーターを統合するようにして設計され、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いてソフトリソグラフィー法によって作成されている。センサーと血液サンプルを上層から導入し、オイルを下層から導入する。センサーと血液は、上層の中間で併合され、貫通孔を通って下層に落ちる。この混合サンプルは、下層に流れるオイルの流れ集束構造から液滴を形成し、生成した血液液滴を集め、液滴数をカウントする。
【０１４４】
別の実施形態では、比較的大きな液滴と比較的小さな血液希釈ファクターを用いることで、液滴生成時間がさらに大幅短縮できる。
【０１４５】
別の実施形態で、液滴は、洗浄と反応ステップの繰り返し、流動細胞分析など異なる目的のために、ヒドロゲル粒子を形成するに容易なアガロースのようなゲル化材料であることができる。
【０１４６】
〔液滴の検出及び定量化〕
液滴の蛍光測定は、注文製作の共焦点顕微鏡〔オブザーヴァーＺｌ（Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚｌ）（商品名）、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）〕を使用して行うことができる。この共焦点セットアップは、蛍光検出のために、励起源としての４８８ｎｍと５６１ｎｍダイオードレーザーと、蛍光測定のための電子増幅電荷結合装置〔クヮントＥＭ：５１２ＳＣ（ＱｕａｎｔＥＭ：５１２ＳＣ）、フォトメトリィス（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｅｓ）〕でなっている。走査速度を最大限にするために、ＣＳＵ−ＸＩスピニングディスク（ＣＳＵ−ＸＩ、横河、日本）を、共焦点顕微鏡に統合した。典型的には、液滴を毎秒数百から数千の割合で測定し、イメージＪ（ＩｍａｇｅＪ）を使用してデータ解析する。共焦点顕微鏡に加えて、標準の流動細胞分析法を用いて、蛍光粒子を高処理能マナーで分析、定量、選別できる３５。
【０１４７】
〔高処理能液滴検出〕
高処理能検出を達成するため、別の実施形態で、デュアルバンド・エミッション・フィルター〔ｚ４８８／６３５，クロマ・テクノロジー・コーポレーション（Ｃｈｒｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），米国〕とダイクロイック・ミラー〔６３０ｄｃｘｒ，クロマ・テクノロジー・コーポレーション，米国〕を取付けた高感度ＡＰＤディテクターを組み入れた光学システムを用いた。これは、３０００の液滴／秒の高処理能で液滴をカウントできる（図１６を参照）。別の実施形態で、光学システムは、検出に先立って、光源及びサンプルからの蛍光放射を反射して送る鏡を有していてもよい。蛍光は、ディテクターに達する前に、デュアルバンド・エミッション・フィルターを通って、残余する励起光が除かれ、ダイクロイック・ミラーで２つの経路に分割され、ＡＰＤディテクターにより同時に検出される３８。この光学システムは、高処理能液滴分析のために、共焦点顕微鏡システムに組み入れられる。
【０１４８】
〔バッファー中のバクテリア検出の最適化〕
〔ＤＮＡザイムセンサーを使用する液滴中バクテリアの検出〕；
ＤＮＡザイムセンサーと統合された液滴マイクロ流体システムを最適化する。例えば、５０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、ｐＨ：７．５、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、１５ｍＭ・ＭｇＣｌ２、及び０．０１％・トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）を用いる反応バッファー中で、バクテリアを検出することができる。２つの重要な特性、すなわち感度及び検出時間をターゲットとするのがよい。患者血液に存在するバクテリア数は少ないので（典型的には、１〜１００ＣＦＵ／ｍＬ）、ピコリットル液滴にカプセル化された時には、各液滴には、バクテリアが１つ含むかどうかの程度になる。それ故、本発明のシステムは、単一細胞の感度でバクテリアを検出することができる。別の実施形態で、イー・コリのようなターゲットバクテリアを、それぞれのＤＮＡザイムセンサー（例えば、１００ｎＭ、フルオレスセインとダブシルで改変）と共に液滴中にカプセル化する。変異ＤＮＡザイム／ターゲットバクテリア及びＤＮＡザイムセンサー／非ターゲットバクテリアを含むコントロール実験を行い、液滴アッセイの特異性をアッセイする。バクテリア溶解剤であるリゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）（１ｍｇ／ｍＬ）を、ＤＮＡザイムセンサー溶液に予め混合しておくことができる。溶解剤の使用により、ターゲット分子のバクテリアからの解放を速やめることができ、アッセイ時間のさらなる短縮ができる。バクテリア溶解条件は、例えば、トライトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、イゲパール（ＩＧＥＰＡＬ）、ＳＤＳ及びリゾチーム単独で或いはこれらの組合せなど種々の薬剤を用いて体系的に最適化することができる。リゾチームは、液滴の形成や、ＤＮＡザイムセンサー機能を妨害せずに、最も効率的にバクテリアを溶解する。
【０１４９】
バクテリアを、液滴中、ある濃度範囲で統計的に希釈し、小室化（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ）できる。例えば、５０μｍの液滴を１つの液滴当たり１、１０、及び１００バクテリアとするために、初期細胞濃度を３、３０、及び３００×１０６／ｍＬバクテリアとする。初期バクテリア溶液の希釈度を大きくしたとき（＜３×１０６／ｍＬ）、形成される液滴には、１つの液滴にバクテリアを１つ含むか或いは含まないようになる。バクテリアは、サイト９（Ｓｙｔｏ９）（緑）或いはサイト１７（Ｓｙｔｏｌ７）（赤）で染色され、これにより、液滴内のバクテリアが、より良くビジュアル化され、共焦点顕微鏡を使用して液滴当たりの細胞数が定量できるようになる。異なる色素で染色されたバクテリアは、検出アッセイ中の同じ液滴中でＤＮＡザイムセンサーシグナルとの共局在を可能にしている。
【０１５０】
バクテリア含有の液滴は、ＤＮＡザイムセンサーによって生成した強い蛍光シグナルにより容易に検出することができる。我々は、本発明の典型的なイー・コリセンサーが、液滴当たりの細胞数と直接相関するシグナルで、液滴中のバクテリアを検出できることを示した（図１２ｄ）。我々は、バッファー中で、ＤＮＡザイムセンサーシステムが、液滴（直径で５μｍ）中に溶解した単一ターゲットであるイー・コリＫ１２を、〜４の充分高いシグナル／バックグラウンド比で８分以内に検出できることを最初に示した（図１２ａ〜ｃ）。我々は、バルクアッセイの場合と比較して、この液滴中の細胞感度と検出時間の短縮は、単一細胞閉じ込めによるターゲット濃度の上昇に依ってなし得たものと考えた。単一細胞の検出を最適化して、どんなターゲットバクテリアも、共焦点顕微鏡と高処理能流動細胞分析法技術の両方でセンサーとして使用できるようになる。
【０１５１】
〔最適化〕
特定のアッセイ或いはターゲットに使用する液滴の最適な検出時間及びシグナル／バックグランド比は、液滴容量（或いはサイズ）とＤＮＡザイムセンサー濃度の２つのパラメーターの最適化により達成される。液滴のサイズが小さい程、単一細胞からターゲット濃度が高くなり、シグナル／バックグランド比を上げ、かつ検出時間を短縮する。液滴サイズは、例えば１０、２０及び５０μｍの３つの異なる場合の性能を比較する。液滴アッセイでは、１００ｎＭのＤＮＡザイムセンサー濃度が、バルクアッセイで最適であると示された出発点である。ＤＮＡザイムセンサー濃度は、検出時間とシグナル／バックグランド比が最適バランスとなるように、例えば、１０、５０、１００、２００及び５００ｎＭで最適化する。
【０１５２】
〔スパイクされた血液中でのバクテリア検出の調査及び最適化〕
別の実施形態で、本発明の典型的なシステムは、処理されていない（或いは希釈された）血液中のバクテリア検出に使用される。ＤＮＡザイムセンサーは、血液検出に支障がない色素−クェンチャー・ペアで改変することができる。滴定と最適化のために、バクテリアを全血中に種々の濃度でスパイクし、上記したように、ＤＮＡザイムセンサー溶液と共に液滴にカプセル化する。注入中に血液サンプルが凝固したり析出するのを防ぐために、頂部にポータブル磁気撹拌器を備えたシリンジ内に、２ｍｍの磁気棒を配置することができる。
【０１５３】
図１４ｃ及びｄに示すように、バクテリアを含む全血は、液滴に直接カプセル化でき、これは室温で数日から数か月間安定に貯蔵できる。所定のアッセイを行うのに、血液と液滴システムのセンサー溶液との容積比を最適化する。これには、血液とＤＮＡザイムセンサー溶液の流速を調整することにより、処理能（つまり、１時間に処理される全血量）を落さずに最適シグナル／バックグランド比とすることで容易に達成できる。血液中のバクテリアの検出のために、我々は、液滴サイズを最適なものにした。しかし、液滴サイズが小さい程、単一細胞からのターゲット濃度が高くなる（これは、シグナル／バックグランド比を上げて、検出時間を短縮させる）が、小さすぎるサイズの液滴に赤血球と白血球を含む血液成分をカプセル化するのは技術的な努力が必要である。我々は、直径が２５μｍの液滴が、この目的には最適であり、それ故に、以後の血液液滴実験に使用することを決定した。
【０１５４】
別の実施形態で、本発明は、例えば、バッファー及び／又はスパイクされた血液中での単一バクテリアを選択的に検出するために、液滴マイクロ流体をＤＮＡザイムセンサーシステムと共に使用する構成と方法を提供する。蛍光顕微鏡（図１４ｅ）或いはＩＤオンチップ液滴カウントシステム（図１６）を使用して、我々のシステムは、液滴中の１０％の血液にある単一ターゲットであるイー・コリＫ１２を選択的に検出することができる。更に、サイト７（Ｓｙｔｏ１７）シグナルと共局在することによって、我々は、ポジティブターゲットとしてイー・コリＫ１２及びネガティブコントロールとしてセンサー単独或いはコントロールバクテリアを使用した３回の実験での〜７０，０００の液滴カウントから、我々のカプセル化したＤＮＡザイムセンサーシステムは、偽ポジティブ割合がゼロで、偽ネガティブ割合が最小（−０．５％）であることを観察した（図１６）。最後に、測定可能な蛍光シグナルは、血液中の単一バクテリアに応じて３時間未満で応答していることを観察できた（図１４ｅ）。
【０１５５】
単一エマルション液滴（ウォーター−イン−オイル）が、流動細胞分析システムに支障ある場合には、ウォーター−イン−オイル−イン−ウォーターのダブルエマルション液滴を、流動細胞分析測定のセットに使用する（構築する）。ウォーター−イン−オイル−イン−ウォーターのダブルエマルション液滴は、流体−焦点結合装置を２つ使用して容易に作ることができ、流動細胞分析や選別に広く使用されてきた。我々は、液滴中でカプセル化する前に、チャンネル内での血液詰まりは観測されなかった。必要ならば、チャンネルの部品を、さらに、汚れの付き難いポリエチレングリコール（ＰＥＧ）或いはヘパリンでコーティングして血液成分による好ましくない詰まりを最小にすることができる３６、３７。
【０１５６】
〔臨床サンプルからのバクテリア検出〕
別の実施形態で、本発明は、臨床への適用可能性がある構成及び方法を提供する。
【０１５７】
〔患者サンプルの使用〕
別の実施形態で、本発明は、非常に高感度で特異的にバクテリアの存在を検出することができる装置を含む構成及び方法を提供する。バクテリアのタイプ及び／又は存在を決定することにより、適切な抗生剤処理を決定し、そして一連の治療でモニターすることができる。血液培養からの一部を、無菌の１５ｍＬ円錐チューブに移す。特別のタイプのバクテリアを含んでいるかもしれない、或いは含んでいる患者の血液（例えば、約１ｍＬ）を、それぞれのＤＮＡザイムセンサーと共に、例えば、上に議論したように適切なプロトコールに従って、液滴にカプセル化することができる。高処理能ＡＰＤディテクターにより、蛍光液滴をカウントできる。我々は、それぞれのバクテリアターゲットに対し、合計１０患者のサンプルを分析した。特別のシステムが患者の血液サンプル中のバクテリアを信頼性高く検出することができるかどうか、例えば、偽ポジティブとネガティブの割合を、決められるように一連の実験を行った。
【０１５８】
そこで、別の実施形態で、本発明の方法、システム及び装置は、患者サンプルからバクテリアを、高感度で選択性をもって信頼性高く検出することができる（偽ポジティブとネガティブの割合が＜１０％）ことを示した。
【０１５９】
〔ポータブルシステム〕
別の実施形態で、装置は、ポータブルで、液体ハンドリング（つまり、液滴生成）を自動化し、光源（薄膜ＬＥＤ）、ダイオードディテクター、及びディテクターディスプレイを含む電子部品を統合している（図２ａ）３８，３９。この典型的な装置は、多数の廃棄可能なマイクロ流体“カートリッジ”と統合して、血液感染した多くのタイプのバクテリアを、多重で迅速な検出を同時にできる。
【０１６０】
別の実施形態で、本発明の方法、システム及び装置は、多剤耐性菌（ＭＤＲＯ）或いは抗菌剤耐性菌による感染を検出することができる。これらの感染は、大きなグローバル健康問題で、格闘負傷及び外傷の人のケアに対する特別な挑戦でもある１−２。別の実施形態中で、本発明の方法、システム、及び装置は、ＭＤＲＯの初期段階での検出をできるようにして、疾病の拡がりを抑え、適切な抗生剤治療を見出して患者のケアを改善するに重要である３。別の実施形態中で、本発明の方法、システム、及び装置は、バクテリア培養（結果を得るに数日要する）及び／又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；アッセイ時間を数時間に短縮するが、低濃度、例えば感染血液中の１〜１００コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）／ｍＬ）のバクテリア検出には充分ではない）のような増幅ベース分子診断方法に代って、或いはこれを補足するために使用することができる４，５。別の実施形態中で、本発明の方法、システム及び装置は、ＭＤＲＯのスクリーニングに、或いは第三世界国家、緊急時、災害状況或いは戦場でのように資材に制限がある環境でのスクリーニングに使用できる。
【０１６１】
［実施例２：３Ｄ粒子カウンターシステム（つまり、ＩＣ３Ｄ）を使用するバクテリア感染の検出］
以下に、血液流感染（ＢＳＩ）を検出する本発明の典型的な方法を記載する。感染初期段階での、バクテリアの迅速検出、識別及び治療を記載する。
【０１６２】
我々は、本発明の統合液滴システムと３Ｄ粒子カウンターシステムは、処理されていない、或いは最少に処理されたバッファーと血液サンプル中のバクテリアを、単一細胞感度で数分から数時間以内に選択的に検出できることを示した。この実施例において、我々のシステムは、ＤＮＡザイムセンサー技術、液滴マイクロ流体、及び高処理能３Ｄ粒子カウントシステム〔つまり、統合総合液滴デジタル検出（ＩＣ３Ｄ）〕（図１と２ｃ）を統合している。この典型的な組合せにより、ｍＬ容量の血液中にある単一細胞を、数分以内に選択的に検出できる。
【０１６３】
別の実施形態で、患者の全血或いは尿のようなその他の生体サンプルは、マイクロ流体チャンネル内で、バクテリア溶解バッファーを含むＤＮＡザイムセンサー溶液と混合され、これにより、図２ｂに例示するように、数百万から数十億個の個々のピコリットル液滴を数百にカプセル化する。
【０１６４】
ＤＮＡザイムセンサーは、インビトロ選択によって識別してターゲットバクテリアの溶解物と特異的に反応し、迅速にリアルタイム蛍光シグナルを出す短い触媒作用のあるオリゴヌクレオチドである。別の実施形態で、この例で使用されるイー・コリ特異ＤＮＡザイムセンサーは、イー・コリを選択的に検出する（図１０）。別の実施形態で、典型的なインビトロの選択技術は、種々の病原バクテリアの多重ＤＮＡザイムセンサーを生成し、多重バクテリア検出を可能することができる。特に、患者血液を、バクテリア溶解バッファーを含むＤＮＡザイムセンサー溶液と、マイクロ流体チャンネル内で混合して、数百万から数十億のピコリットル液滴にカプセル化する。ＤＮＡザイムセンサーは、バクテリアを含む液滴中で瞬間的に蛍光を出し、ｍＬ容量からの単一粒子を数分以内に確実に正確に検出することができる高処理能３Ｄ粒子カウントシステムによって、この蛍光を検出し、及びカウントする（図２ｂ及びｃ）。この蛍光液滴は、特に高い信頼性と臨床的に適切な処理能力で検出される。
【０１６５】
別の実施形態で、液滴中の単一バクテリアの小室化により、ターゲット分子の濃度を著しく上げ、ＰＣＲのようなシグナル増幅プロセスなしで迅速な検出と単一細胞感度を可能にする。別の実施形態で、そのような小室化されたターゲット特異的反応は、３Ｄ粒子カウントシステムで検出できるように、ターゲットバクテリアを含む液滴の“ライトアップ”ステップが是非とも必要になる。別の実施形態で、本発明の典型的な３Ｄ粒子カウントシステムは、ｍＬ容量の単一液滴を数分以内で分析する例外的な信頼度と正確さを有しており、これは、流動細胞分析法が直面する現今の粒子カウント技術、特に、感度と高い偽ポジティブ割合に限界があるといった問題点をなくしている。
【０１６６】
別の実施形態で、ターゲットを含む蛍光性液滴は、例えば、光学ピンセット、光学トラップ、光学格子を用いた３Ｄ粒子カウントシステムで選別することができる。選別されたターゲットは、さらに処理、分析できる。
【０１６７】
既存のＩＤオンチップ液滴カウントシステム（これは、液滴デジタルＰＣＲシステムに使用されている）及び流動細胞分析法を含むその他粒子カウントシステムは、典型的に１秒間に数千粒子で操作し、合計で数十万から数百万の液滴（すなわち、合計サンプル容量がマイクロリットルの数十倍）を分析できるだけの低処理能であるという問題がある３１、３４。それ故に、既存の液滴検出システムは、必然的に液滴カプセル化前に、ターゲットを精製し濃縮してサンプル容量を減らすというサンプル準備が必須になる。しかしながら、我々は、我々のシステムでは処理していない生体サンプル（例えば、血液）を、数十億の液滴まで翻訳する典型的に数ミリリッターの臨床サンプル容量で、迅速に分析することを望んでいる。我々が発明した統合総合液滴デジタル検出（ＩＣ３Ｄ）システムにおいて、多くの液滴を短時間に効果的に分析し、数百万の空の液滴の中にある単一蛍光バクテリア含有液滴を検出するために、我々は、既に説明したように、ミリリットル容量から蛍光粒子を、数分で単一粒子感度で検出できる３Ｄ粒子カウンター２１を統合した。
【０１６８】
図１７は、本発明の典型的な３Ｄ粒子カウントシステムの典型的な概要ダイヤグラムを説明している。別の実施形態で、粒子の総数を迅速に定量するために、２−チャンネルセットアップを用いて赤と緑の蛍光検出を同時に行うことができるようにした。
【０１６９】
別の実施形態で、この装置は、水平形状で、直径が１ｃｍの円筒状キュベットをもつ機械的スリーブを持つ小さな顕微鏡を有している。２つのモータが、キュベットの回転と垂直運動を与えている。ソフトウェアは、回転速度を１０〜１１００ｒｐｍの範囲で変え、垂直速度を１〜１５ｍｍ／秒としている。垂直及び回転運動は、それぞれ線形アクチュエータとＶＥＸＴＡステッピングモーター・モデルＰＫ２３３ＰＢによって生み出されている。これらのモータは、サンプルを入れた透明なキュベットを保持する台に接続される。レーザーによって発生した励起光は、観察容量で集束される（写真を参照）。励起光の焦点は、キュベットの内部、キュベットの壁から約１ｍｍ離れた比較的壁に近くにに位置する。この距離は、高度に分散したメディア内でも粒子の検出と分析が行えるように調節することができる。励起源は、４６９ｎｍ或いは５３２ｎｍで放射する２つのダイオードレーザーである。このようにして、粒子は観察部位中に蛍光を発する。共焦点顕微鏡を対物レンズ前にあるサンプル容器の単純な機械的運動と組み合わせる使用は、粒子を含むサンプルを観測域を通って動かし、分析する手段となり、光学源、鏡或いは光ディテクターを移動させる可動光学部材でなる複雑な光学システムを必要としなくなる。２つのレーザーからの励起光は、ダイクロイックフィルターＺＴ５３２ｎｂｄｃとＺ４７０ｒｄｃを通って合わさり１つのパスになり、２０×０．４ＮＡ空気対物レンズを通って同じ励起部位に向う。サンプルから放射された蛍光は、同じ対物レンズによって集められ、ダイクロイックフィルターのセットを通って送られ、レンズによって大きなピンホール（直径＝２ｍｍ）に集束され、次いで別のレンズによってディテクターへコリメートされる。ダイクロイックビームスプリッターＴ５５０１ｐｘｒ−２５ｍｍＮＲは、放射ビームを２つの光路に分け、２つの光電子増倍管（ＰＭＴ）によって検出する。２つの放射フィルター（ＦＦ０１−ＨＱ５００／２４−２５とＬＰ５６００）を、それぞれのＰＭＴの前に置く。ＰＭＴからのシグナルは、アナログからデジタルへのコンバーター（ＡＤＣ）及び取得カードに送られる。サンプリング頻度を、１０μｓの時間分解能に対応して、１００，０００Ｈｚにセットする。
【０１７０】
別の実施形態で、顕微鏡の光学を、約０．０１ｍｓで比較的大容量（１００ｐＬ）を測定するようにデザインする。約１００秒の螺旋運動しているチューブ回転を、チューブの約１ｍＬが効果的に調査できるようにする。この典型的な光学セットアップを使用するとき、装置は、サンプルに１５０μｍだけ浸入する。それ故、５００ｎｍにおける透過度が２５０μｍパスで約１０％である全血（希釈前でも）のような強く分散するサンプルでも、容易に扱うことができる。
【０１７１】
別の実施形態で、本発明は、多重解析と並列解析ができる自動ポータブル装置を含む本発明の典型的なＩＣ３Ｄシステムの別のデザイン（図３２及び３３）を提供する。別の実施形態で、この装置は、異なる波長で読むことができる多重レーザー源とディテクターで構成される。この多重システムは、異なる病原体にコード化した多重センサー（異なる色にラベルする）を、同時に読み取りできる。我々の並列テストを行なうための多重サンプル容器を収容できる装置に、回転台を加えることができる。
【０１７２】
我々は、既に記載したような液滴に、バクテリアをスパイクした血液とＤＮＡザイムセンサーをカプセル化した（実施例１を参照）。ターゲット特異反応の小室化は、３Ｄ粒子カウントシステムによって検出することができるようにターゲットバクテリアを含む液滴“リアクター”を“ライトアップ”する重要なステップである。液滴を、キュベット（図１４ｄ）に集め、次いで、３Ｄ粒子カウントシステムによって解析した。我々は、このシステムを使用して、典型的に２ｍＬサンプルから単一ターゲットイー・コリＫ１２とＤＮＡザイムセンサーを含む蛍光液滴を、３分以内の測定時間で、単一液滴感度で検出することができることを示した（図２３ａ、ｂ）。我々の現在のシステムは、典型的に、液滴が〜１００，０００／秒、或いは観察の有効容量が〜０．１ｍＬ／分の処理能で操作する。そのような高処理能で、我々の実験で血液希釈によって起きたサンプル容量の増加は、問題にならない。図２３ｂには、バクテリアを含む液滴から得られた蛍光強度上昇を、時間経過との関連で示している。
【０１７３】
別の実施形態で、本発明は、ＩＣ３Ｄアッセイに、パターン認識アルゴリズム（図２３ｂのインセットボックス）及びシグナル補正（図２２と２３ｄ）をしている。
我々のＩＣ３Ｄ解析では、“ヒット”の検出は、閾値強度〔これは、従来のＩＤ粒子カウントシステム（例えば、ＢｉｏＲａｄ・ｄｄＰＣＲシステム）に広く使用され、その強度がレーザーとディテクターを含む多くの要因に依存するので、典型的に偽ポジティブ／ネガティブ割合が高い〕より、むしろパターン認識アルゴリズム（図２３ｂのインセットボックス）で定義される。簡潔にいえば、蛍光粒子（我々の記載では液滴）は、イルミネーション容量中の粒子通過により作り出される“形”、我々の装置でガウスにより検出される。ソフトウェアＳｉｍＦＣＳ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；ｗｗｗ．ｌｆｄ．ｕｃｉ．ｅｄｕ／ｇｌｏｂａｌｓ／で利用可能）で行ったパターン認識は、粒子の通過時間、そして検出されたパターンの振幅を検出している。既にバクテリア（“標準”）と反応したＤＮＡザイムセンサーを含む蛍光液滴を使用して、我々のパターン認識アルゴリズムが、ノイズを自動的にフィルターし、正しく蛍光液滴を含むバクテリアのみを報告していることを予め確認した。このようなパターン認識は、大容量サンプル中の低濃度蛍光液滴を、偽ポジティブ割合をゼロ（つまり、“ヒット”は、空の液滴が数億あるうちに真のポジティブが１つある）にして、極めて信頼性高く正確な検出ができる。これは、バクテリアがない健康なドナー血液サンプル（ｎ＝５）、或いは非ターゲットの臨床バクテリアでスパイクした分離物（ｎ＝８）を含むコントロールサンプルでは、総カウント数が０であったことで支持される。別の実施形態で、本発明は、既にバクテリア或いはＦＩＴＣと反応させたＤＮＡザイムセンサーを含む蛍光液滴を使用して、３Ｄ粒子カウントシステムの補正曲線を作る方法を提供する。
【０１７４】
処理していない血液中のバクテリアを検出する我々のＩＣ３Ｄシステムに要求される最小ＤＮＡザイムの反応時間を決定するために、我々の３Ｄ粒子カウンターを使用して、液滴溶液２ｍＬからのシグナルを経時的にモニターした（図２３ｃ）。我々は、サンプル中の細胞数に関する絶対な定量的データを出すには、典型的に３．５時間が必要ではあるが、ＤＮＡザイム反応を４５分程行うことで、ＩＣ３Ｄテストが“イエス或いはノー”結果を出すことができることを観察した。
【０１７５】
次に、我々のシステムが、１から１０，０００バクテリア／ｍＬの極めて低濃度の広い範囲で、単一細胞感度と１桁台の検出限界（ＬＯＤ）でターゲットバクテリアを絶対的定量化できることを示した（図２３ｄ）。液滴の検出数と、血液サンプル中にスパイクされたターゲットバクテリアの実濃度との間に、線形の相関関係がある。１０〜１０，０００細胞／ｍＬ濃度でのポジティブサンプルにある偽ネガティブ割合と分析エラーに関して、我々は、分析エラーに拘わらずターゲットのイー・コリを常に検出し、つまり、“イエス或いはノー”テストで、本質的に偽ネガティブ割合ゼロで“ポジティブ”として報告することができる。１細胞／ｍＬのサンプルでは、我々のアッセイは、典型的にはその時間のバクテリアを〜７７％検出する。測定時間を延ばすと、エラーが減ることに注意されたい２０，２１。それ故、ＬＯＤは、１桁台にある。
【０１７６】
潜在的な臨床適用可能性を示すために、我々は、ポジティブ血液培養から得た臨床バクテリア分離物を使用して我々のシステムをテストした。我々は、我々のＩＣ３Ｄシステムが、ポジティブコントロールであるイー・コリＫ１２に観察したと同じパフォーマンスで、臨床イー・コリ分離物を選択的にかつ確実に検出することができることを見出した（図２４）。
【０１７７】
別の実施形態で、単一細胞からなる本発明の典型的な方法及びシステムは、成長が緩い菌体〔例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）〕の検出とスクリーニングを行うプラットフォームとして使用できる。
【０１７８】
別の実施形態で、本発明の典型的な方法及びシステムは、他のタイプのセンサーが、細胞（例えば、バクテリア、循環腫瘍細胞及び幹細胞）、ウィルス、及びその他少量の分子ターゲットを含む血液中にある如何なるタイプの希少種も殆ど、選択的かつ感度よく検出するに使用できるプラットフォーム技術として使用できる。
【０１７９】
別の実施形態で、ＤＮＡザイムセンサーに加えて、既知のターゲット遺伝子や分子に用いられるその他センシングシステム（例えば、デジタルＰＣＲ）を、単一バクテリアを迅速に検出できる我々の液滴マイクロ流体と３Ｄ粒子カウントシステムに統合することができる。
【０１８０】
別の実施形態で、ターゲットバクテリアは、測定前に、液滴中で培養、増殖してシグナルを増幅することができる（図１３）。
【０１８１】
別の実施形態で、液滴サイズ、反応時間、センサー濃度、蛍光体／クェンチャーのペア、血液希釈ファクターのスキャニング時間（１〜ｌ０分）、ＲＰＭ（２００〜１０００）及びＰＭＴ（光電子増幅管）（２００〜８００）からの１つ以上のパラメーターは、例えば、図１８、１９及び２０に示したように、最適なパフォーマンスとなるように最適化（つまり、シグナル／バックグランド比、感度、ＬＯＤ及びアッセイ時間）できる。多重−色センサーシステムの使用は，さらに偽ポジティブ／ネガティブ割合を小さくすることができる。液滴サイズが小さくなると、単一細胞からのターゲット濃度を高くし、シグナル／バックグランド比を上げ、検出時間を短縮するので、我々は、１０、２０及び５０μｍの３つの異なる液滴サイズのパフォーマンスを比較した。液滴アッセイについて、種々のＤＮＡザイムセンサー濃度（例えば、１０、５０、１００、２００及び５００ｎＭ）を使用して、検出時間とシグナル／バックグランド比の最善バランスに達することができた。希釈後の生体サンプル（例えば、血液）濃度は、５％〜５０％の範囲とした。
【０１８２】
別の実施形態で、本発明は、１）バクテリア検出のＤＮＡザイムセンサー、２）高処理能かつ高効率（ＨＴ−ＨＥ）のカプセル化システム（図３３ａ及びｂ）、３）少数のバクテリア含有蛍光液滴を大容量から迅速に測定する３Ｄ粒子カウンター（図３３ｃ、ｄ）の３つの主要成分（図３２及び３３）からなり、ベンチトップ、シングルステップ、サンプルから結果の診断である完全統合ＩＣ３Ｄシステムを提供する。例えば、２５６チャンネル迄設けることができるコスト効率のよいモジュラーマイクロ流体システムは、３ｍＬサンプルのカプセル化が１５分未満でできる。別の実施形態中で、本発明は、（ａ）ポータブルにするためのハードウェアのデザイン（それは、フットプリントを小さくし、コンピューターでこの装置と統合している）、（ｂ）ターゲットバクテリアをカプセル化する液滴形成に必要なマイクロ流体成分の統合、及び（ｃ）全体として、この装置をヘルスケア供給者と技術者が使用できるようにするエルゴノミクスにおける改良、を含んでいる。この分野は、装置のハードウェアデザインとソフトウェアの解析が必要となる。このシステムの操作は、無菌の全血サンプルを、ＤＮＡザイムセンサーとバクテリアライセート（リゾチーム）溶液と混合して、圧力チャンバに入れる；ＰＣベースコントロールシステムにより、チャンバを加圧し、サンプル及び連続相のオイルを液滴形成チップにフィードする；生じた液滴を、キュベットに集め、３Ｄ粒子カウンターを使用してカウントする；データ（つまり、サンプル中のバクテリア数）を、注文製作のソフトウェアによって処理し、コンピュータースクリーンに表示する；のステップで行う。上述のシステムは、将来の適用が多い。粒子カウンターの３つのレーザーは、３つの異なるセンサー（及び、分子ターゲット）を同時に読める。例えば、ＣＲＥとＥＳＢＬセンサーを混合物中で一緒に用いると、サンプル中の個々のバクテリアが１つ、他方或いは両方の耐性メカニズムをもっているかどうかを決定することができ、その定量的な特徴は、それぞれの組合せの絶対濃度を記録していることを意味している。第３のセンサー或いは色素を、それらの成分と共に、内部定性的或いは定量的参照として装置の試薬に既知量加えて使用できる。このアッセイは、血液をミリリッター迄扱うことができるが、このＩＣ３Ｄ感度により、従来のテストで採取されていた典型的に１アッセイに対して５〜１０ｍＬより少なくすることが可能となった。これは、血液採取でより多くの特定アッセイを行おうとする道筋を開くものである。他方で、必要であれば、キュベットサイズを大きくして、多容量の血液を扱うこともできよう。
【０１８３】
［実施例３：蛍光発生基質を用いるＩＣ３Ｄによる抗菌剤耐性の検出］
プラットフォーム技術として、このＩＣ３Ｄシステムは、他のセンシング方法（例えば、酵素アッセイ、ＰＣＲ及び等温シグナル増幅）に、液滴マイクロ流体を統合することができる。３Ｄ粒子カウンターは、細胞（例えば、バクテリア、循環腫瘍細胞及び幹細胞）、ウィルス（例えば、ＨＩＶ）、及び分子マーカー（例えば、核酸及び蛋白質）を含む生体サンプル中の如何なるタイプの少量マーカーを、迅速な検出及び分析のプラットフォームとして使用できる（図１）。
【０１８４】
別の実施形態で、本発明は、ベータ−ラクタマーゼ（ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅｓ）とカルバペネマーゼ（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅｓ）に対する蛍光発生基質３６を使用して、抗菌剤耐性のＩＣ３Ｄテストを提供する。例えば図２６を参照。これらのテストは、最も広く見られる抗菌剤耐性病原体群の内にある拡張型ベータ−ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）を生成するエンテロバクター及びカルバペネム−耐性エンテロバクター（ＣＲＥ）を迅速に検出することが可能になったことを示している。
【０１８５】
［実施例４：癌、例えばＣＴＣ、エキソソーム、核酸、蛋白質、ペプチド、炭水化物、脂質、小分子、金属イオンのマイクロカプセル化検出］
別の実施形態で、本発明は、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、他のマーカー及び癌、核酸、蛋白質、ペプチド、炭水化物、脂質、小分子、金属イオン（図３、４及び５）の通常の検出及びモニタリングに使用され、既存の技術より効率的で確実なＩＣ３Ｄテストを提供する。
【０１８６】
多くの癌腫、例えば乳癌について、死亡の９０％以上が離れた器官への転移に依っている。転移は、播種した癌細胞が、全身循環系を経て移動して生き続けるマルチステッププロセスであるので、初期の診断、経過見通しのＣＴＣ分析と定量化、及び疾病進展のモニタリングコースに注目が向けられている。ＣＴＣは、非常に低濃度（白血球１０７当たり１つのＣＴＣ）であるので、不均質な従来の流動細胞分析法や免疫学的アプローチ〔例えば、セルサーチ（ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ）（商品名）プラットフォーム〕は、複雑で、高価で、かつ時間を要するものであり、重要なことには、臨床セッティングでＣＴＣを信頼性高く検出する感度と特異性に欠けたものである。別の実施形態で、本発明は、患者の血液サンプルを処理せず、或いは最少の処理でＣＴＣを選択的に検出するプラットフォーム技術を提供する。別の実施形態で、本発明は、新規な蛍光センサー技術、液滴マイクロカプセル化及び３Ｄ粒子カウンター（つまり、ＩＣ３Ｄ）を統合するシステムを提供する。例えば、ＤＮＡセンサーでなるこれらのセンサーは、そのままのターゲットＣＴＣ溶解物と特異的に反応するように加工され、迅速なリアルタイム蛍光シグナルを発生させている。患者のサンプル（例えば、血液）は、マイクロ流体チャンネル内で細胞溶解バッファーを含むセンサー溶液と混合され、数百万個あるピコリットルそれぞれの液滴中にカプセル化される。本発明は、作用のメカニズムによって制限するものではないが、ＣＴＣを液滴中に閉じ込めることで、ターゲット分子（例えば、Ｈｅｒ２及びＥｐＣＡＭ）の濃度が著しく高められ、センサーによって迅速かつリアルタイム様式で検出できる。それ故、本発明の方法及びシステムは、潜在的に癌診断と経過見通し、及び疾病進行及び治療中の薬剤効能のモニタリングの強力なツールになるＣＴＣ検出の新しい典型を提供する。
【０１８７】
別の実施形態で、本発明は、臨床セッティングでまれな癌ＣＴＣを検出するためのマイクロカプセル化センサーシステムを提供する。別の実施形態で、液滴マイクロ流体は、単一細胞感度で迅速な癌ＣＴＣ検出をするセンサーと統合される。別の実施形態で、癌バイオマーカー（例えば、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１９、及びＭＵＣ１）を特異的に検出する蛍光発生ＤＮＡセンサーを、液滴マイクロ流体システムと統合する。ここで、単一ＣＴＣを液滴中に閉じ込めることで、感度を著しく高め、検出時間を短縮することができる。バッファーとスパイクした全血の両方からのＣＴＣ単一細胞の検出を、最適化することができる。
【０１８８】
典型的な装置の臨床サンプルからのＣＴＣ検出能を確証するために、患者血液試料検体を、患者の診断と関連付けて用い、アッセイ選択性と特異性を決定する。流動細胞分析とセルサーチ（ＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨＴＭ）（商品名）プラットフォームを用いて、ＣＴＣ検出の選択性、特異性及びアッセイ時間に関して付き合わせ比較を行う。
【０１８９】
この発明は、迅速かつ確実なＣＴＣ検出と、通常ベースの癌、例えば乳癌のスクリーニングに適しているプラットフォーム技術を提供する。
【０１９０】
別の実施形態で、本発明の構成、システム及び方法は、配列化、個人別診断及び医術、例えばＣＴＣの検出に使用される。別の実施形態で、本発明の構成、システム及び方法は、例えば、単一細胞遺伝子或いは残留変異を検出、或いはｍＲＡ発現の検出といった遺伝子解析に使用される。別の実施形態で、本発明の構成、システム及び方法は、例えば、遺伝子、或いは残留変異、或いはｍＲＮＡ発現レベルに基づく単一細胞不均一を研究、検出するのに使用される。
【０１９１】
別の実施形態で、細胞は、溶解せずにそのまま残し、免疫染色やタンパク質プロフィールのような他のテスト或いはアッセイに使用することができる。ここで、細胞を“そのまま”としたとき、試薬（例えばセンサー、酵素）は、ウイルス或いは非ウイルスルート（例えば、トランスフェクション試薬、ナノ粒子）を経て細胞に送られる。別の実施形態で、本発明は、液滴中の単一細胞レベルで高処理能細胞エンジニアリングを行う方法である。例えば、我々は、ＭＣＦ７細胞が、ＧＦＰ発現ベクターを含み、ＧＦＰを発現するように加工されたトランスフェクション試薬でカプセル化できることを示した（図３１）。細胞をそのままに保持する場合には、細胞内、細胞表面及び分泌されたマーカーを含む多数のタイプのマーカーを同時に検出、分析し、発現及び機能と関連させることが可能になる。
【０１９２】
別の実施形態で、多数の酵素反応を使用し、強くて高い特異シグナルを発することができる。別の実施形態中で、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む等温反応を血清中で行うことができ、血液中での直接ＣＴＣ検出が容易になる（例えば、図８及び９参照）。別の実施形態で、本発明は、表面マーカーを単に使用する代わりに、単一細胞レベルでの遺伝子変異及びｍＲＮＡ発現を検出するシステムと方法を提供する（図５）。別の実施形態で、ＰＮＡオープナー及びその他同種のものは、単一細胞の遺伝子検出を支援するに使用でき、そして、本発明の配列化アッセイ、システム及び方法は、個人的な診断と治療に強力な新しいツールを提供する。
【０１９３】
別の実施形態で、癌細胞、例えばＣＴＣは、それらの細胞表面、細胞内及び分泌マーカー（例えば、図３参照）により、或いは機械的性質によって特徴づけられ、或いは検出される。図３は、本発明の典型的な統合液滴カプセル化及び３Ｄ粒子ディテクターシステムにより、細胞表面、細胞内及び分泌マーカーを含む単一細胞及び単一細胞マーカーを検出する本発明の典型的な方法を概略的に説明している。
【０１９４】
別の実施形態で、癌細胞、例えばＣＴＣは、例えば、癌蛋白質〔例えば、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＫ１９及びＭＵＣ１〕、細胞フリー核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びＳＮＰ）、細胞由来の粒子（例えば、エキソソーム、微小胞、アポトーシス体）、脂質、炭水化物、ペプチド、酵素、小分子、及びイオンなどの癌マーカーを検出することにより特徴づけられ、或いは検出できる（図４及び５）。
【０１９５】
図４は、本発明の典型的な液滴カプセル化と３Ｄ粒子ディテクターシステムの統合によって、細胞由来の粒子（例えば、エキソソーム、微小胞、アポトーシス体）及びそれらのマーカーを検出することからなる本発明の典型的な方法を示している。
【０１９６】
図５は、本発明の典型的な液滴カプセル化と３Ｄ粒子ディテクターシステムの統合によって、限定するものではないが、核酸、蛋白質、ペプチド、炭水化物、脂質、小分子、金属イオンなどの細胞フリーのマーカーを検出する本発明の典型的な方法を示している。
【０１９７】
別の実施形態で、本発明の方法は、さらに、核酸ベース、抗体ベース、酵素ベース、或いは化学薬剤ベース、及び同種のものを含む既知のアッセイによって、癌細胞及びマーカーを検出する使用（組合せて使用することができる）である。生体サンプルは、液滴カプセル化とその後の分析を行うに先立って、先ず、例えば、勾配遠心分離、洗浄、濃縮、細胞溶解、磁気ビーズ捕捉及び分離、抽出によって、容量を減らし、純度を良くする処理を行う。
【０１９８】
別の実施形態で、本発明の方法は、例えば、幹細胞、癌幹細胞など単一細胞移植細胞の検出、追跡、モニターである。別の実施形態で、移植された細胞は、ＩＣ３Ｄによって検出することができる血液或いは尿に分泌するプローブ（例えば酵素、蛋白質）で加工される。別の実施形態で、移植された細胞は、生体シグナル化の下流側でプローブにより加工され、プローブが活性化されると、生体シグナルを生成するようにする。
【０１９９】
別の実施形態で、本発明の方法は、さらに、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡ、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、ニッキング（例えば、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ））、鎖置換、指数関数的等温増幅及び交雑、分子指標、アプタマー、ＤＮＡザイム、或いはその他リアルタイム蛍光センサーによって検出できるｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＳＮＰ、及び同種のものを含む核酸マーカー（細胞内と、細胞なしの循環する形体の両方）の検出からなっている。別の実施形態で、分子指標と結合したＲＣＡ及びニッキング酵素反応は、核酸マーカー及びそれらの変異物を検出するに使用することができる。例えば、図６及び７参照。
【０２００】
図６は、南京錠型プローブを液滴中でのニッキング酵素反応と組み合わせて使用して核酸変異物検出を含む本発明の典型的な方法を概略的に示している。別の実施形態で、本発明の方法は、さらにアンプリガーゼ（ＡＭＰＬＩＧＡＳＥＴＭ）（商品名）〔エピセンター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、マディソン、ウィスコンシン州〕ライゲーションのテスト及び最適化し、次いで、ＤＮＡ変異検出のための酵素反応をニッキングする本発明の典型的な方法を含んでいる。
【０２０１】
別の実施形態で、本発明の方法は、さらにアンプリガーゼ（ＡＭＰＬＩＧＡＳＥＴＭ）（商品名）〔エピセンター（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）、マディソン、ウィスコンシン州〕ライゲーションのテスト及び最適化し、次いで、ＤＮＡ変異検出のための酵素反応をニッキングする本発明の典型的な方法を含んでいる。
【０２０２】
別の実施形態で、本発明の方法は、さらに、Ｔ４リガーゼ・ライゲーションのテスト及び最適化し、次いで、酵素反応をニッキングする本発明の典型的な方法を含んでいる。
【０２０３】
別の実施形態で、本発明の方法は、さらに、イー・コリ・リガーゼ・ライゲーションのテスト及び最適化し、次いで、酵素反応をニッキングする本発明の典型的な方法を含んでいる。
【０２０４】
別の実施形態で、本発明の方法は、さらに、例としてｍＲＮＡ・ＢＲＡＦ・Ｖ６００Ｅ変異物の検出を含むものである。そのようなアッセイで、ＲＣＡ反応に続いて、ＤＮＡザイムベース、鎖置換、或いは酵素のニッキングを含む種々の方法により、シグナルを増幅し生成することができる。
【０２０５】
核酸マーカー及び変異物も、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲにより検出することができる。例えば、我々は、ＢＲＡＦ・Ｖ６００Ｅ変異物及びＢＲＡＦ・Ｇ４６４Ｖを検出するのに、ＰＣＲを使用する反応を示した。例えば、図２７を参照。
【０２０６】
我々は、血漿と血液サンプルでＰＣＲを行うことができることを示した。例えば、図２８参照。
【０２０７】
我々は、ポリメラーゼの鎖延長と単一鎖ニッキング反応を組み合わせて、指数関数的増幅反応（ＥＸＰｏｎｅｎｔｉａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＥＸＰＡＲ）を用いるＬｅｔ−７ａ・ｍｉＲＮＡを示した。例えば、図３０参照。簡単に言うと、ｍｉＲＮＡの循環は、癌と中枢神経疾病を含む種々の疾病のバイオマーカーを発現している。血液中ｍｉＲＮＡｓの分析及び定量は、潜在的に、初期の検出、監視モニタリング、及び薬剤応答評価に使用することができる。ターゲットとしてＬｅｔ−７ａを使用して、我々は、ＩＣ３Ｄが、血漿から直接に、ターゲットｍｉＲＮＡを１０〜１０，０００コピー／ｍＬの低濃度で、２時間未満に正確に定量できることを示した。この新しいツールを使用して、我々は、さらに、結腸癌患者サンプル中のターゲットｍｉＲＮＡ濃度が、健康なドナーサンプル中のそれより著しく高いことを示した。我々のアッセイは、同じ分類内のマイクロＲＮＡ間における単一ヌクレオチドの違いを、特異性を高く識別することができる。特に、ｍｉＲＮＡ検出の液滴中指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）を調査した。液滴マイクロ流体装置は、標準のソフトリソグラフィーを使用して構築し、既に記載したように操作した。１０％血漿サンプルと、センシング試薬〔ＤＮＡテンプレート、ＤＮＡポリメラーゼ（ベント（ｅｘｏ−）（Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−））、ニッキング・エンドヌクレアーゼ（Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ）、エバグリーン（ＥｖａＧｒｅｅｎ）及びデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）〕を、マイクロ流体チャンネル内で混合し、次いで、流れ集束メカニズムを用いて均一サイズ（ここでは、直径が３０μｍ）の液滴を形成した。ＥＸＰＡＲ反応は、十分な時間が与えられれば非特異的バックグランド増幅をするので、我々は、単一ｍｉＲＮＡ検出の液滴中ＥＸＰＡＲ動力学を研究し、最小のバックグランド増幅で最大のターゲット特異的蛍光シグナルを発生する最適検出時間を決定した。我々は、いくつかの液滴が、Ｌｅｔ−７ａサンプル中凡そ４０分の反応で、ライトアップし始めることを見出した。Ｌｅｔ−７ａサンプル中の蛍光液滴が、５０分で予想した数（１０ｆＭ容積濃度で、１１３液滴当たりｌ０）に上昇したが、一方、Ｌｅｔ−７ｂとブランクサンプルは、蛍光液滴を殆ど持っていなかった。しかしながら、６０分の反応では、いくつかの非特異性シグナルが発生し始めた。この一連のデータから、我々は、１）液滴中の単一ｍｉＲＮＡ検出の実施可能性を示し、２）ターゲットシグナルを非特異性のものと最も良く区別するこの後の液滴測定に使用される最適のＥＸＰＡＲ反応時間として、５０分とするとした。図３０ａは、Ｌｅｔ−７ａ−含有の液滴或いはコントロールから得られた蛍光強度の上昇を、経時的に示している。サンプル中の液滴の濃度及び／又は明るさの測定を抽出するために、光ディテクターにより生成した一時的プロフィールを、ソフトウェアＳｉｍＦＣＳに実装されたパターン認識アルゴリズム（図１５，３０ａ、中間パネル、インサートボックス）で解析した。認識アルゴリズムは、一時的プロフィールの振幅と形状特徴を、観察容量を通り抜ける液滴の時間依存の蛍光強度の特性である予め定義したパターンと一致させる。そのようなパターン認識は、大容量サンプル中の低濃度蛍光液滴を、信頼性高く正確に検出できるようにしている。次に、我々は、ＩＣ３Ｄが、〜１０から１０，０００のコピー／ｍＬの低濃度での広い範囲で、ターゲットＬｅｔ−７ａを、単一分子感度と凡そ１０コピー／ｍＬでの検出限界（ＬＯＤ）で絶対定量化できることを示した（図３０ｂ）。液滴の検出数と血漿サンプルにスパイクされたターゲットｍｉＲＮＡの実際の濃度との間に直線関係がある。ＩＣ３ＤアッセイのＬＯＤは、〜１０５コピー／ｍＬ（つまり、ｆＭ範囲内）である目下の究極判断基準ＲＴ−ｑＰＣＲより少し低い桁である（図３０ｃ）。ＲＴ−ｑＰＣＲは、血漿サンプルを使用して直接扱うことができず、ｍｉＲＮＡの抽出と精製を必要としていることに注意してほしい。ＩＣ３Ｄシステムの潜在的な臨床適用可能性を示すために、結腸癌患者と３０人の健康なドナーからの血漿サンプルを用いた。血漿サンプルは、最初にＥＸＰＡＲを用いるバルクでテストし、健康なドナーと結腸癌患者のサンプル間での蛍光増幅カーブは良く区別できないが、ＥＸＰＡＲが１０％血漿中で直接Ｌｅｔ−７ａ検出には使用できることを示した。ＩＣ３Ｄを、３つの代表的結腸癌患者サンプル（或いは、健康なドナーコントロール）中のＬｅｔ−７ａ濃度を測定するに使用し、ＩＣ３Ｄが、同じサンプルに対してＲＴ−ｑＰＣＲによって確証されたように、血漿から直接にターゲットｍｉＲＮＡ濃度を確実に定量することができることを示した（図３０ｄ）。リボヌクレアーゼ処理血漿を、蛍光液滴がターゲットＬｅｔ−７ａによることを確認するためのネガティブコントロールとして入れた。興味あることに、我々は、結腸癌サンプル中のＬｅｔ−７ａ濃度が、ＩＣ３Ｄ（バルクＥＸＰＡＲによって区別できない）によってデジタル的に定量されたように、健康なドナーサンプル中のものより統計的に遥かに高いことを見出した。癌サンプル中のＬｅｔ−７ａ（腫瘍抑制因子として知られているが）［１７］のレベルが高いのは、腫瘍から血液流に出たエキソソームやｍｉＲＮＡｓの濃度が高くなることに依るものであろう［１８］。
【０２０８】
別の実施形態で、本発明の方法は、蛋白質マーカー（細胞表面上、或いは分泌された）を検出するに使用され、例えば、抗体ベースＥＬＩＳＡ、サンドイッチベース、免疫染色、抗体捕捉、２次的抗体増幅、近接ライゲーションベース、アプタマー、ＤＮＡザイム、或いはその他リアルタイム蛍光センサーによって検出することができる。
【０２０９】
別の実施形態で、本発明の方法は、例えば、その後にシグナル増幅が続く標準の近接ライゲーションベースアセイによって、細胞表面或いは遊離蛋白質マーカーの検出、例えばＥｐＣＡＭ及びＨｅｒ２の検出に使用される。別の実施形態で、ＰＳＡは、リアルタイムＤＮＡセンサーによって検出する、或いは蛍光発生基質を用いて検出することができる。
【０２１０】
［実施例５：液滴なしで３Ｄ粒子カウンターを使用する細胞或いは生体のマーカーの検出及び分析］
別の実施形態で、本発明は、生物学的、生理学的、或いは病理学的マーカー、或いは単一分子、或いは単一細胞を、シグナル増幅の有無に関係なく、３Ｄ粒子ディテクター（図８）と直接に統合されたターゲット検出プロセスを用いて迅速かつ高感度で検出するシステム或いは方法を提供する。
【０２１１】
〔特徴〕
我々のシステムは、従来の検出アッセイでは容易に達することができなかった次のユニークな特徴を有している：
１）マーカー量が少ない（例えば、１〜１００万／ｍＬ）；
２）大容量サンプル（μＬからｍＬ）を高処理能で調べることが可能；
３）迅速（数分から数時間）；
４）広い検出範囲；
５）多重化可能；
６）サンプル準備の必要性なし、或いは最小；
【０２１２】
〔サンプル〕
１）生体サンプルは、患者からの血液、血清、唾液、涙、便、尿、或いはＣＳＦサンプルである。
２）サンプルは、食物、水、及び空気から得る。
【０２１３】
〔サンプル準備〕
サンプルは、処理なし或いは最小の処理（例えば、希釈）で直接アッセイできる。
希釈、精製、濃縮、抽出、遠心分離、細胞溶解、磁気ビーズアッセイ、及び洗浄ステップを含む標準の確立された生体サンプルの準備プロセスは、必ずしも必要はないが、本発明のアッセイに統合できる。
【０２１４】
〔ターゲット〕
本発明のシステムによって検出、分析することができるターゲット種は、限定するものではないが、細胞（例えば、癌細胞、幹／前駆細胞、免疫細胞）、病原体（例えば、バクテリア、多剤耐性菌（ＭＤＲＯ）、結核菌（ＴＢ））、ウィルス（例えば、ＨＩＶ）、細胞由来の小胞（例えば、エキソソーム、微小胞、アポトーシス小体）、核酸（例えば、ＳＮＰ、変異、発現）、蛋白質（例えば、ＰＳＡ）、酵素（例えば、ＭＭＰ））、ペプチド、脂質、炭水化物、多糖類、小分子、或いは金属イオンがある（図８）。
【０２１５】
ターゲット種の形体は、細胞表面（例えば、ＥｐＣＡＭ、Ｎ−カドヘリン、ＣＤ４４、ＣＤ２４）、細胞内、及び分泌したマーカー（細胞セクレトーム）、細胞フリー循環マーカー（例えば、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白質マーカー）、代謝マーカー、機械的マーカー（例えば、細胞変形能、硬度、細胞骨格など）がある。
【０２１６】
本発明のシステムは、発現に加え、例えば、ＤＮＡ交雑（ハイブリダイゼーション）、蛋白質レセプター−リガンド相互作用、酵素−基質相互作用、及び細胞表面レセプター二量化（ホモ−及びヘテロ−クラスタリング）、可溶性リガンドと薬剤の共局在或いは相互作用、及び他の細胞などの生物学的事項を検出或いはモニターするために使用できる。
【０２１７】
〔ターゲット検出アッセイ〕
３Ｄ粒子カウンター解析のターゲットを選択的に検出するために、我々のシステムに用いることができる種々の確立した蛍光生体アッセイがある。そのようなアッセイとしては、限定するものではないが、（図８）、核酸ベース、抗体ベース、酵素ベース、化学薬剤ベース、ナノ粒子ベース、ビーズベース或いは組合せての使用などがある。
【０２１８】
さらにいくつかの例を以下に挙げる。
交雑（ハイブリダイゼーション）、分子指標、アプタマー、ＤＮＡザイム、或いはその他リアルタイム蛍光センサーを含む核酸ベースアッセイがある。
【０２１９】
ＥＬＩＳＡ、サンドイッチベース、免疫染色、抗体捕捉、２次的抗体増幅、或いは近接ライゲーションを含む抗体ベースアッセイがある。
【０２２０】
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＣＡ、ループ媒介等温増幅（Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，  ２０１２，  １２，  ２４６９−２４８６）を含む酵素ベースアッセイがる。ある場合には、ＰＳＡ或いはＭＭＰのようなターゲットがそれ自体が、酵素として機能し、検出プロセスを進めることができる。
【０２２１】
ＲＣＡベースの検出では、ターゲット認識バインダーが、アプタマー或いは抗体を含む生物学的部分或いは化学的部分である。ＲＣＡは、線状であっても、或いは分岐した（つまり、指数関数的な増幅）ものであってもよい。ＲＣＡ生成物が、ロードされ、色素、ナノ粒子或いは量子ドットにより染色されて解析される。
【０２２２】
〔３Ｄ粒子カウンター〕
３Ｄ粒子カウンターは、図１７に示すような装置システム、或いはポイント・オブ・ケア使用のためのポータブルシステムであることができる。
【０２２３】
〔本発明の典型的な統合システム〕
我々のシステムは、好ましい持ち運び性、流体ハンドリングの自動化を実現し、ダイオードレーザー（光源）、ＡＰＤ（ディテクター）、オペレーティング〔ビンチ（ｖｉｎｃｉ）、ＩＳＳ  Ｉｎｃ．）〕＆データ解析ソフトウェア（ＳｉｍＦＣＳ）、ディスプレイなどの電子機器を３Ｄ粒子計数システムと統合している。この構想の装置は、多数の廃棄可能なマイクロ流体“カートリッジ”と統合して、多重タイプターゲットを同時に多重及び迅速に検出することができる。この装置は、完全自動化することができ、オール・イン・ワン・システムとして、或いはモジューラーコンポーネントとして作り上げることができる。さらに、ポイント・オブ・ケア使用のためのスマートフォンやブルートゥース（登録商標）などに連結できる（図３２及び３３）。
【０２２４】
〔適用〕
ターゲット検出プロセス（シグナル増幅あり、或いはなし）と３Ｄ粒子カウンターシステムの本発明の新しいアプローチは、斬新で強力である。それは、現在では不可能であるｍＬ容量の生体サンプル中のターゲット種を数分以内に選択的に検出するのが可能になる。それ故に、我々は、我々の技術が、低濃度の生体粒子及びマーカーを如何にして検出、分析するか、及び多種類の生体分析と診断に如何に使用できるようにするかを革新できる可能性を持っていると信じている。生体分析と診断は、限定するものではないが、次のものがある。
−感染症病原体（バクテリア、ウィルス、真菌類など）。皮膚感染、傷、糖尿病潰瘍、ＨＩＶ、バクテリア、ＴＢ、ＭＤＲＯ（例えば、ＭＲＳＡ）
−癌
−糖尿病
−アルツハイマー病（例えば、ベータアミロイド、及びタウ蛋白質）
−炎症性、自己免疫疾患（例えば、ＣＤ４Ｔ細胞、免疫細胞のカウント）
−幹細胞及び再生の医学（例えば、間葉系間質細胞、内皮前駆細胞、造血幹細胞、或いは細胞は内因性或いは外因性移植細胞であることができる）
−心臓血管疾患（例えば、Ｃ−反応性蛋白（ＣＲＰ）、Ｂ−タイプナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、トロポニン、システィンＣ、ＩＬ−６）
−薬剤及び乱用（例えば、テトラヒドロカンナビノール、ＴＨＣ）
−新生児スクリーニング
【０２２５】
このシステムは、新しい生物学、細胞−薬剤相互作用及び薬剤感受性を研究し、新しい薬剤、治療を開発する、疾病の進行と治療効果をモニターする、或いはコンパニオン診断として使用する、及び個人的な診断と治療薬を反復していくのに使用できる。
【０２２６】
医学適用に加えて、我々のシステムは、食品産業、農業、水道、空気システム及び防御適用を含む他のエリアのために使用することができる。
【０２２７】
〔３Ｄ粒子カウンターと結合したローリングサークル増幅の検出〕
別の実施形態で、本発明は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）と３Ｄ粒子カウンターを統合した新規な検出システムを含むものである（図９）。ＲＣＡは、ユニークなＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９，Ｂｓｔ，ａｎｄ  Ｖｅｎｔ  ｅｘｏ−  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ＤＮＡ，ａｎｄ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｏｒ  ＲＮＡ）を用い、長い単一鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）とＲＮＡを生成する単純で効率的な等温酵素プロセスである（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｌｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ，ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ３ＣＳ６０４３９Ｊ．）。ＲＣＡは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡメチル化、ＳＮＰ、小分子、蛋白質、及び細胞を含む種々のターゲットを検出するに使用することができる。ＲＣＡ生成物を、異なる長さ、サイズ、シーケンス及び構造を持つように調整することができる。ＲＣＡ生成物は、ロードされ、染色され、色素、プローブ、ナノ粒子或いは量子ドットにより解析される。生体マーカー（例えば細胞、小胞及び分子）は、検出され、ＲＣＡ（例えば、図９に示すような近接ライゲーションベースの方法による）により増幅され、次いで、３Ｄ粒子カウンターによって解析、検出される。
【０２２８】
〔３Ｄ粒子カウンターを用いる癌細胞検出〕
生体サンプル中の細胞、例えば癌細胞は、染色され、加工され、検出感度と検出限界に関して流動細胞分析法を含む従来からのアッセイより遥かに効率的である３Ｄ粒子カウンター（図２９ａ）によって検出される。
【０２２９】
［実施例６：癌−特異的ＤＮＡザイムセンサーを生成するインビトロ進化］
以下に、癌に特異的なＤＮＡザイムセンサーを生成するためのインビトロ進化を含む本発明の典型的な方法を記載する。
【０２３０】
本発明は、図３４に示すように、信頼性が高いＤＮＡザイムセンサーベースの癌診断を生む強力なインビトロ進化を開発する技術を提供する。別の実施形態で、それぞれポジティブとネガティブ選択ターゲットとして、癌と正常の血液サンプルを用いる多ラウンド濃縮は、癌を正常サンプル或いは関連した兆候をもつ他の疾病から区別する重大な（或いはユニークなパネルの）分子サインを認識するＤＮＡザイムセンサーを識別することができる。
【０２３１】
図３４は、例えば癌診断用のＤＮＡザイムセンサーのインビトロ進化を説明している。ａ）は、想定の混合−読み取り、ＤＮＡザイムセンサー癌診断及びそれらの適用、ｂ）は、ＤＮＡザイムセンサーのメカニズム：ターゲット（Ｆはフルオレセイン−ｄＴ、Ｒはリボヌクレオチド、ＱはダブシルｄＴを示す）との相互作用で蛍光シグナルを出す。ｃ）は、インビトロ選別プロセスの概要説明である。最初に、ランダムなＤＮＡライブラリを基質に連結させ、正常な血清でインキュベートし、ＤＮＡライブラリの集りから非特異性なシーケンスを除く。分裂していないシーケンスを精製し、癌血清を用いるポジティブ選択に適用する。癌血清による分裂した分子は、ＰＣＲによって精製、増幅される。精製の後に、集団を基質に連結させて、次のラウンドの選択に適用する。
【０２３２】
別の実施形態で、本発明の方法及びシステムは、ほとんど如何なる種類の癌も検出するために診療所で使用することができる（図３４ａ）。そのような単純で安価な血液検査は、現在は利用可能でないが、明らかな症状が出る前に癌の活動をスクリーンする通常の健康診断に容易に組み入れることがでる。そのような初期での介在は、癌を治療する機会を著しく多くし、かつ死亡率死を少なくするであろう。治療中の癌進行を報告し、薬剤の効能と安全性をモニターできる本発明の典型的なアッセイは、治療ガイダンスと薬剤発見に対するツールとなり得るものである。したがって、本発明の方法及びシステムの実行は、患者の生存率を上げ、生活の質を向上し、患者のケアに関連した金銭コストを下げることができる。
【０２３３】
別の実施形態で、本発明の、例えば、癌センサースクリーニングの方法及びシステムは、現在の技術（例えば、プロテオミックなバイオマーカー技術）に比べて多くの革新的な特徴を有している。全体として、強力なインビトロ選択技術と複雑な癌血清をターゲットとすることの組合せは、特定の疾病バイオマーカーを識別する必要なしに、包括的な信頼性のある診断を開発することを可能にしている。そのＤＮＡザイムの活性剤は、蛋白質、核酸、小分子、或いは金属イオンなどである。これは、検出方法を開発するために、極めて複雑な混合物からターゲット分子を精製する煩わしいプロセスを回避することができるので、特に有利である。つまり、ＤＮＡザイムセンサーは、分離したら直ちに癌検出に使用することができる。ＤＮＡザイムセンサーの識別に必要な多ラウンドの濃縮と増幅は、バイオマーカーを見出す従来の方法（例えば、ＭＳと結び付いた２Ｄゲル電気泳動）１−３に固有な偽ポジティブと偽ネガティブ結果の高い割合を小さくするのみならず、癌と正常な組織との間にある僅かな相違を見出すことを可能にしている。我々は、患者間の非特異的な不均質を避けるために、ターゲットとして多数の患者の血清サンプルを混合し、癌と正常サンプルを識別する分子の違いを識別した。さらに、我々のシステムは、他の単一バイオマーカーベースのアッセイより著しく高感度かつ特異的に癌を検出する分子サインパネルに応答し、同じ濃縮したライブラリプールにある多数のＤＮＡザイムセンサーを同時に生成できる可能性を持っている。最後に、我々のこの結果のアッセイは、多くの魅力的な特徴を持っており。その１つが、本質的に迅速、リアルタイムで、混合及び読み取り性があり、日常ベースでの癌のスクリーニングやモニタリングを行うに理想的である
【０２３４】
別の実施形態で、ＤＮＡザイムセンサーは、例えば、全血を扱うにあたり、最適なパフォーマンス、例えば、シグナル／バックグランド比及び安定性に向けて最適化することができる。別の実施形態で、本発明は、健康なコントロールから既に確定した癌のケースを、感度と特異性をもって識別する血液ベースの診断を提供する。標準の臨床の診断と血液検査（例えば、文献にある潜在的な蛋白質バイオマーカー用のＥＬＩＳＡ）を関連させてアッセイパフォーマンスを確立し、テストすべく、過去を顧みつつの長い研究が行われてきた。ＤＮＡザイムセンサーの感度と特異性を、反復する再選択プロセスで最適化することができる。
【０２３５】
〔インビトロ進化〕
〔ライブラリのデザイン〕
凡そ１０１４のランダムシーケンスをもつＤＮＡライブラリは、ＤＮＡザイムセンサーの分離に使用される。図３４ｃで説明するように、ライブラリは、蛍光発生の、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ基質１０に連結した４０のヌクレオチドの可変域（青色）からなっている。この基質は、それぞれの側面が蛍光体（フルオレスセイン−ｄＴ）とクェンチャー（ダブシルｄＴ）と隣接した位置に、開裂サイトとして単一リボヌクレオチド（リボアデノシン）を有している。このライブラリ（つまり、ＤＮＡザイム）中の特定ＤＮＡシーケンスが存在し、リボヌクレオチド結合が開裂する、それ故に、ターゲットの患者血液の存在でのみ蛍光シグナルを出すというのは、合理的である。ランダム領域及び基質は、我々の以前のプロトコールに従うＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてライゲートされる。ライブラリの５’末端及び３’末端にある固定シーケンス領域は、それぞれフォーワードとリバースＰＣＲプライマー結合サイトとして組み込まれたことに注意されたい１０。ライブラリと全ての他のオリゴヌクレオチドは、使用前にゲル電気泳動によって精製した。
【０２３６】
〔ポジティブとネガティブターゲット〕
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を、その高い死亡率と初期段階診断での緊急要請があって、モデルシステムとして使用した１−３。年齢と性別がマッチした、非喫煙の健康なドナーサンプルを得た。我々は、患者と分析前変動性の間の非特異性変動を小さくし、かつそれ故に普遍的（同じ段階／タイプの癌）、かつ特定（癌患者と健康ドナーとの間で）のＤＮＡザイムセンサーを選択するために、多数の患者サンプルを混合することを選んだ。血液型抗原の非互換性を避けるため、血清サンプルは、選別プロセスで使用した。血清サンプルの混合は、バイオマーカーを見出すに一般に使用されており、なんら悪影響（つまり、免疫原性応答が観察されない）３８を生じない。特に、１０のＮＳＣＬＣ患者血清サンプル（それぞれ０．５ｍＬ）（或いは、健康なコントロール血清サンプル）を、よく混合し、分割し、−８０°Ｃで貯蔵して全選別プロセスに使用した。
【０２３７】
〔選択〕
図３４ｃに説明するように、インビトロ選択は、健康ドナーの血清（２００μＬ）（ネガティブ選択）を用いたスタートライブラリ（図３５）（１ｎｍｏｌ）をインキュベートしてスタートし、ターゲット分子がない状態で自己開裂、或いは全ての個人に普遍的な血液中の非特異性分子（例えば、金属イオン、ＡＴＰ、アルブミン）がある状態で開裂する非特異性ＤＮＡザイムを除いた。ネガティブ選択は、選択バッファー〔５０ｍＭ−ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１５ｍＭ−ＭｇＣｌ２、０．０１％−トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、ｐＨ：７．５〕中で、全ての非特異性ＤＮＡザイム除くに充分な時間である３時間で行った。エタノール析出を行って、ライブラリを回収し、開裂していないシーケンスを、ゲル電気泳動によって精製した（例として、図３６と３７を参照）。開裂した分子と開裂していない分子（これら２つは、色素でラベルされる）は、それらのサイズが異なるので、ゲルで容易に識別することができることに注意されたい。精製されて開裂していない分子を、癌の血清混合物（ポジティブ選択）で１０分だけインキュベートした。ポジティブ選択でのこの短いインキュベーション時間は、単にターゲットに迅速に応答するＤＮＡザイムシーケンスを識別することができるようにしていて、それ故に、癌検出のアッセイ時間を短くしている。実際に、インビトロ選択に自由度があるので、望ましい性状の分子を生成させる厳格な選択基準を目的に合わせることができる１３、１４。ポジティブ選択後、開裂した分子を、エタノールで析出し、ゲル分離した。これら分離されたシーケンスを、プライマー特異性ＰＣＲで増幅し、ゲル電気泳動によって精製し、基質にライゲートし、次いで、第２ラウンドの選択に使用した。我々の経験では、開裂したＤＮＡバンドは、５〜８ラウンドで検出可能となり、８〜１５ラウンドを行う選択は、典型的に選択の完結（つまり、開裂したＤＮＡバンドのシグナルにこれ以上著しい増加がない）に必要である１０。最後に、ＤＮＡプールの最終ラウンドは、ＴＡクローニングキット〔フェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）〕を使用して、バクテリアにクローンされ、少なくとも２００クローンが配列化に送られる〔ファンクショナル・バイオサイエンス（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ウィスコンシン州〕１０。
【０２３８】
このアプローチを使用して、我々は、ＮＳＣＬＣサンプルに健康なドナー血清中でよりも一貫して高活性である１９クラスのＤＮＡザイムセンサーを得た（分析に選んだ１セットのシーケンスについて、図３８を参照）。
【０２３９】
〔血液中での最適なパフォーマンスに向けたＤＮＡザイムシーケンスの性状確認と加工〕
識別されたＤＮＡザイムシーケンスが、正常な血清では開裂しないが、ターゲット癌がある基質では開裂することができることを確かめた。さらに、選択ではターゲットとして血清が使用されるが、臨床アッセイは、なんらの処理（つまり、混合−及び−読み取り）しない全血を使用して行うことができる。それ故、我々は、識別されたＤＮＡザイムセンサーを、臨床的に癌として確定する前に、全血中でのシグナル／バックグランド比及び安定性に関して最適なパフォーマンスが出るように性状確認、及び修正をした。
【０２４０】
〔シーケンスのパフォーマンス解析〕
我々の実験で、インビトロ選択により、典型的に５〜２０の異なるクラス（クローン）のシーケンスとなった１０。我々は、ＩＤＴから、それぞれのクラスを代表するシーケンスを合成した。それぞれのシーケンスについて、混合した癌患者の血清及び健康な血清中での開裂パフォーマンスをテストした。特異性（癌及び正常な血清の間の蛍光シグナル比）と動力学（時間を追って開裂％）の２つのパラメーターについて研究した。特に、開裂反応は、１００μＬ血清サンプルを１００ｎＭのＤＮＡザイムセンサーを含む選択バッファー中で混合して、９６−ウエルプレートで行い、開裂活性は、プレートリーダーを用い、リアルタイムで、蛍光シグナル上昇に基づいてモニターした。さらに、このシグナルが、確かに開裂サイトでの開裂によるものであることを証明するため、反応混合をポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。インビトロ選択が、癌バイオマーカーのユニークなパネルを定義する多数のＤＮＡザイムシーケンスを識別するかもしれないと仮定したので、我々は、次の基準を満たす全てのシーケンスを行った：１）癌の血清と正常な血清の間の蛍光シグナル比が＞３、２）１時間で開裂した分子が＞５０％。上記の基準を満たす分子は、一緒に合わせ、均一センシング溶液として下記のタスクに使用した。
【０２４１】
〔血液中のＤＮＡザイムセンサーのシグナル／バックグランド比〕
我々のＤＮＡザイムセンサーは（つまり、蛍光体とクェンチャーは隣接して置き、ターゲットを加える前と後に分けた）、ターゲットがない状態では非常に低いバックグランドであるが、ターゲットがあるときには高いシグナルであった１０。我々は、典型的に、バッファー中でシグナル／バックグランド比が６〜１０であるＤＮＡザイムセンサーを得た１０。しかしながら、血液中で用いたとき、血液の自動蛍光と複雑な環境による色素の妨害（例えば、クェンチング）により、シグナル／バックグランド比を不確実にしているかもしれない。フルオレスセインとダブシルは、最初は、それぞれ、単純であることと低価格であること、そして、選択時に開裂がゲルによってモニターされることから、選択プロセスにおける蛍光発生とクェンチャーとしてそれぞれ選んだ。しかしながら、フルオレスセイン／ダブシルは、上述の理由により血液中で使用するには理想的でないかもしれない。この一連の実験で、Ｃｙ３／ＢＨＱ２，アレキサ（Ａｌｅｘａ）６４７／ＱＳＹ２１，タムラ（ＴＡＭＲＡ）／ＢＨＱ２，テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）／ＢＨＱ２、及びアレキサ５４６／ＱＳＹ９〔グレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）〕を含む蛍光体とクェンチャーペアが、血液中で蛍光検出ができ（つまり、血液の自動蛍光により妨害されない）、最高のシグナル／バックグランド比（つまり、＞５）が再現性よく実現することを確認して最適であった。
【０２４２】
〔血液中ＤＮＡザイムセンサーの安定性〕
ＤＮＡザイムは、血清中で直接進化するので、我々は、それらが、少なくとも選択に使用する時間（つまり、１０分）、ヌクレアーゼ耐性であり、安定していると期待した。我々は、ＤＮＡザイムの末端或いは主鎖（つまり、逆方向Ｔ及びホスホロチオエート）を化学的に改質して、核酸の半減期を、その機能を損なうことなしに数時間或いは数日に延ばすことができた１５。ＤＮＡザイムセンサー中のＲＮＡ結合の崩れを保護するために、アッセイバッファー中にさらにＲＮａｓｅ阻止剤〔リボロック（ｒｉｂｏｌｏｃｋ）、フェルメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）〕を含むことができる。
【０２４３】
〔ＮＳＣＬＣの全段階を通してＤＮＡザイムセンサーの特異性と選択性の検証〕
分離され最適化されたＤＮＡザイムセンサーは、ＮＳＣＬＣをもつ人と健康なコントロールとの間で相違があるかをテストした。異なる段階にあるＮＳＣＬＣ患者からの血液サンプルを得て、各サンプルを、ＤＮＡザイムを追加した前後におけるサンプルの蛍光数値を、蛍光プレートリーダーで３回解析した。サンプルは、バックグランドに標準化し、１）特異性、２）選択性、及び３）ＮＳＣＬＣの異なる段階での応答を解析して決定した。ＤＮＡザイムは、ＮＳＣＬＣを初期に検出する初期（段階：１）ＮＳＣＬＣを検出した。全てのサンプルについて、臨床的に完全ではないがＮＳＣＬＣに対して比較的感度よく特異性ありとされてきた２つのバイオマーカー、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）とサイトケラチン１９断片（ＣＹＦＲＡ  ２１−１）を、ＥＬＩＳＡを用いて一対一比較した。実験結果の有意性を、Ｔ−テストで決定した。
【０２４４】
別の実施形態で、本発明を実施する際に、ＤＮＡザイムセンサー開発の再選択成分を、統合して、ＤＮＡザイムセンサーの特性を最適化した（つまり、感度と特異性の両方とも９０％）。再選択は、識別されたＤＮＡシーケンスが部分的にランダムにして、より厳格な選択基準となる新しい選別プロセスとするスタートライブラリを提供するプロセスである。再選択は、望ましい分子を生成する１次選択よりラウンド数が少なく、より効率的に操作できる。確かに、再選択は、ＤＮＡザイムの感度と特異性を改善するために使用されてきた１５。
【０２４５】
我々のＤＮＡザイムアッセイの感度と特異性が、臨床試験での９０％基準を満たさないならば、再選別プロセスを行い、これにより、識別されたＤＮＡザイムシーケンスが、部分的にランダムとされ（各ベース位置で３０％の変異；例えば、オリジナルベースがＡであるとき、Ａを７０％、Ｃ、Ｔ及びＧをそれぞれ１０％に保つ）、ＩＤＴによって化学的に合成される。より厳格で選択的なポジティブとネガティブ選択ターゲットが用いられるとき以外は、上述のように、インビトロ選択手続きを繰り返す。例えば、初期のＤＮＡザイムセンサーによって検出されなかったサンプルグループは、隔離され、選択のターゲットとして使用する。異なる段階での癌患者間をより効率よく区別するために、健康なドナーを使用する代わりに、１つの段階を他の段階のためのネガティブ選択ターゲットとして使用する。再選択を用いる最適化は、普遍的（癌の同じ段階／タイプ）で、かつ特異的〔癌と健康なドナー或いは同じ徴候（例えば、肺燃焼）をもつ他の障害との間で、及び異なる段階の癌の間で〕であるＤＮＡザイムセンサーを選択するようにする。
【０２４６】
このように、本発明は、感度と選択性（両方とも＞９０％）を最適化したＤＮＡザイムセンサーを作る方法を提供する。本発明のＤＮＡザイムセンサーは、従来の技術より早い段階で癌のリスクが高い患者を識別するツールをスクリーニングするに使用できる。
癌を明確に確認し、段階付けするために、従来からの他の診断ツール、特に、ＣＴ、ＭＲＩを含む画像化技術は、我々のスクリーニングアッセイの後に使用することができる。
【０２４７】
［実施例７：液滴ベース薬剤或いはアプタマーのスクリーニング］
別の実施形態で、我々は、１つのタイプの分子に１つの液滴方策（例えば、図３９〜４６）に基づいた薬剤のスクリーニング、及びインビトロ選択プラットフォームを開発した。ピコリットルマイクロ液滴の中での反応を制限し、及びスクリーニングすることで、効率よく、高処理能で、容易、安価、そして迅速なスクリーニングができる。マイクロ液滴は、種々の分子のライブラリシステムに使用できる。液滴は、ＤＮＡ増幅、転写、及び翻訳それぞれの後に、ＤＮＡ、ＲＮＡ或いはペプチドを含んでいる。例として、我々は、１ビーズ１化合物アプローチを用い、凡そ２×１０１１の多様なシーケンスをもつ液滴ライブラリ中で、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチドを合成した（図３９）。
【０２４８】
我々は、ピコリットル液滴（直径で２０μｍ）に、マイクロビーズ上に合成したＤＮＡをカプセル化した（図４３）。このビーズ上ＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅し、液滴ＤＮＡライブラリを生成した。これらＤＮＡを液滴内に転写し、翻訳して、ＲＮＡとペプチドライブラリを形成した（図３９、４０及び４１）。別の実施形態で、１タイプ分子１液滴を、液滴中単一分子ＰＣＲによって得た。特に、翻訳された蛋白質／ペプチドの同一性／シーケンスは、核酸シーケンスを用いて、同じ液滴中でバーコードを付けることができ、これは、引き続くスクリーニングに強力なツールとなる。別の実施形態で、液滴を、例えば、液滴の併合、分割、培養、再注入、画像化、解析、及び選別などの操作や加工することができる（例として図４０及び４４）。これらＤＮＡ、ＲＮＡ或いはペプチドライブラリは、様々なアッセイ中でのスクリーニング、例えば蛋白質−蛋白質相互作用、酵素−基質板相互作用、レセプター−リガンド相互作用、抗体−抗原相互作用、リガンド−細胞結合、アプタマー−ターゲット結合、ＤＮＡザイム反応（例として図４１、４５及び４６を参照）などに使用することができる。これらＤＮＡ、ＲＮＡ或いはペプチドライブラリは、例えば、新しい酵素を生成する進化実験に、或いは新しいバイオマーカーをスクリーニング及び開発するのに使用することができる（図４２）。別の実施形態で、液滴を直接選別して、ターゲットを含む液滴を識別することができる。別の実施形態で、液滴を破壊し、ターゲット結合粒子を選別し、分析することができる。別の実施形態で、図４１の中で示すように、液滴をマイクロウエルアレイに分け、ここで、そのまま保存或いは砕いて、さらなる分析、選別、新しい基質へのプリントに備える。（Ｂｉｙａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｉｎｔａｇｌｉｏ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｎａｂｌｅｓ  Ｒａｐｉｄ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  Ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ，２０１３  Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓ，６，０８７００１：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｓｓａｙ  ｃｈｉｐ，米国特許第８，５９２，３４８号）。本発明の方法及びシステムによって生成されたこれらライブラリは、容易、安価であり、治療上及び診断上など活性な生体種をスクリーニングする及び／又はこれを得るに、及びバイオマーカーを見出すといった目的に有用である。
【０２４９】
［実施例８：“レポーター増幅によるアプタマーのカプセル化スクリーニング（ＥＮＳＮＡＲＡ）”］
別の実施形態で、本発明は、アプタマーをスクリーニングする“レポーター増幅によるアプタマーのカプセル化スクリーニング（ＥＮＳＮＡＲＡ）”と名付けられた典型的な方法を提案する。図４７と４８に示すように、１つの実施形態で、液滴中のレポーター酵素をアロステリックコントロールするＥＮＳＮＡＲＡを使用して、構造−スィッチングアプタマーを識別することができる。ＥＮＳＮＡＲＡは、リアルタイムセンサーとして直ぐに使用できる多くのターゲットのためのアプタマーを迅速に生成することができる。
【０２５０】
別の実施形態で、典型的なアロステリック酵素センシングシステムは、過去に記載のある構造と同様の共有結合的に連結された阻止剤−ＤＮＡ−酵素（ＩＤＥ）複合体でなっている〔Ｓａｇｈａｔｅｌｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．“ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ”，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，３４４−５（２００３）；Ｇｉａｎｎｅｓｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．“Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｌｏｇｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＤＮＡ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ”，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６，３９５５−８（２００７）、など〕。
【０２５１】
図４７に示すように、この典型的な共有結合的に連結された阻止剤−ＤＮＡ−酵素（ＩＤＥ）複合体の実施形態で、初期の不活性酵素状態では、酵素の触媒サイト（セレウス中立プロテアーゼ（ＣＮＰ））が、ＤＮＡアプタマー分子に共有結合に繋がれた阻止剤（フォスフォロアミダイト・ジペプチド：  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ）によってブロックされている。ターゲット分子がある状態では、アプタマーは、ターゲット分子と３次元構造を作ることによってコンフォメーション変化を受けている。この構造変更は、酵素の触媒サイトから阻止剤を離し、蛍光発生基質と持続的な酵素反応ができるようにしている。単一分子認識は、連続的な基質の反応回数によって数千倍にも増幅することができる。ＤＮＡ分子のランダムシーケンスプールをＩＤＥに統合することによって、単一ＤＮＡシーケンスの結合特性を、酵素の活動に結びつけることができる。
【０２５２】
本発明のアプタマーＩＤＥシステムの別の実施形態では、ＤＮＡは、合成のＤＮＡ或いは他の核酸であり、この例として、合成の非天然に生じるヌクレオチド、或いは核酸類似物がある。核酸類似物の例としては、非イオン主鎖をもつペプチド核酸（ＰＮＡ）、フォスフォロチオエート結合をもつオリゴヌクレオチド、或いはフォスフォロ−ジチオエート、メチルフォスフォネート、フォスフォルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、アルキルフォスフォトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメート、及びモルフォリノ・カルバメート核酸など合成ＤＮＡ主鎖類似物をもつオリゴヌクレオチドがある。
【０２５３】
本発明のアプタマーＩＤＥシステムの別の実施形態で、複合物は、“スイッチング”（或いはオン／オフ）能力を最大にするようにデザインされ、そしてライブラリは、例えば、γ−セグメント二重解離がアプタマー結合親和性と形成されたアプタマー／ターゲット３次構造によりコントロールされる構造など、所望性状のアプタマーをスクリーンするようにデザインされている。それ故、異なる長さのγ−セグメントをスクリーニングに組込むことにより、際立った親和性とスイッチング効率をもつアプタマーが得られる。酵素の触媒サイトからの阻止剤の解離は、二重ＤＮＡ領域を壊すことに関与するかもしれないし、関与しないかもしれない。
【０２５４】
例えば、本発明の実施するための典型的なＩＤＥの構築にあたり、それぞれの典型的なＩＤＥ構築の活性度は、ターゲットＡＴＰ或いはトロンビン（１ｐＭ−１００μΜ）の存在下での蛍光検出によってリアルタイムに測定することができる。１つのループに相補的な２５−量体ＤＮＡを加えることで、ポジティブコントロールとすることができる。同様に、ループとＧＴＰ（ＡＴＰ用）或いはアルブミン（トロンビン用）中の入り交ざったシーケンスは、ネガティブコントロールとして使用することができる。それぞれのアプタマーＩＤＥのパフォーマンスを定量化するに使われた出力パラメーターは、シグナル対バックグランド比、応答時間、感度（親和性、Ｋｄ）、特異性及びダイナミックレンジであることができる。動力学的パラメーター（Ｋｃａｔとｋｍ）は、１ｎＭから５００μＭの異なる濃度範囲でのＩＤＥ構築と蛍光発生基質との間の反応動力学を測定し、速度−基質カーブを構築することにより決定することができる。
【０２５５】
１つの実施形態で、深さが１５−５０μｍ、幅が３０μｍのチャンネルをもつポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）チップを、標準のソフトリソグラフィーを用いて作り、ガラス顕微鏡スライドに装着した。ＰＤＭＳ装置は、オイル入口を１つ、水性液体入口を２つ（１つはＩＤＥライブラリ溶液に、他方はターゲットと基質に）を持っている。標準の圧力注入／引抜きシリンジポンプを用い、流量を０．５〜２μＬ／分で試薬とオイルを送る。２％（ｗ／ｗ）のＥＡ界面活性剤を含むＨＦＥ−７５００フッ素化オイルの流れを集束させて、均一なピコリットルサイズの液滴を、凡そ１，０００Ｈｚの割合で形成することができる。液滴は、異なるサイズ（直径で、５、１０、２０及び３０μｍ）に形成したが、これは、マイクロ流体チャンネルのサイズ及び流量を調節することで容易に達成できる。ＦＡＣＳ選別には、形成されたウォーター−イン−オイル（Ｗ／Ｏ）単一エマルション液滴を、親水性チャンネルをもつ第２のマイクロ流体装置に導入し、ウォーター−イン−オイル−イン−ウォーター（Ｗ／Ｏ／Ｗ）の二重エマルション液滴を形成させる。酵素アッセイでの液滴生成時間の影響を小さくするために、多数の並行した液滴形成構造をもち、数分で凡そ１０７の液滴を形成することできる多層マイクロ流体装置を使用できる。蛍光液滴は、４８８／５６１／６３３ｎｍアルゴンレーザーとＰＭＴディテクターからなる共焦点顕微鏡を用いて画像化し、検出できる。液滴は、典型的に処理量を＞１０７液滴／時間で操作するＢＤ・ＦＡＣＳＡｒｉａ・ＩＩＴＭ（商品名）細胞ソーターを用いるＦＡＣＳで選別できる。
【０２５６】
特別のアッセイ或いはプロトコールに使用する特定のＩＤＥを識別するために、１つの実施形態では、ＩＤＥライブラリを、液滴マイクロ流体を用いた液滴（サイズは最適化できる）にカプセル化した。例えば、凡そ１０１２分子の初期ライブラリを、ターゲット分子（ＡＴＰ或いはグルタメート）と発蛍光（蛍光発生）酵素基質〔凡そ１０７滴（つまり、１０５ＩＤＥ／液滴）中にＤＡＢＣＹＬ−ＰＡｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＰＡｌａ−ＥＤＡＮＳ〕と共にコ−カプセル化する。インキュベーション後、アプタマーを含む蛍光液滴は、ＦＡＣＳで選別できる。液滴の蛍光とアプタマー親和性の間の相関性、及びスイッチング性状から、単にＦＡＣＳのゲーティングパラメータを調節することで特定性状をもつアプタマーを識別、選別できるようにした。選別した液滴を、氷上に保持したエッペンドルフチューブに集め、次いで、等容量のｌＨ，ｌＨ，２Ｈ，２Ｈ−パーフルオロ−ｌ−オクタノール〔アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて破壊した。新しい基質を含んでいるバッファーを加えて溶液を希釈し、オイル相からの分離効率を高めることができる。水相は、集めて、再カプセル化できる。この分割手続きの後では、所定の液滴内に単一分子ＩＤＥだけがあると期待できる。アプタマー含有液滴を、蛍光灯シグナルによって識別し、ＦＡＣＳによって、例えば３８４ウエルプレートに個々に分ける。液滴はウエル内で溶解され、単一アプタマー分子は、ＩＤＥから直接にＰＣＲ増幅され、配列化される。ＩＤＥライブラリが、コントロール分子（ＡＴＰには、ＧＴＰ、ＴＴＰ及びＣＴＰの混合物；グルタメートには、グルタミンとアスパラギンの混合物）と共に最初にインキュベートする際のネガティブ成分は、初期段階で完全に阻止されていないＩＤＥ分子や、或いは交差反応性或いは非特異性結合によって蛍光シグナルを出すことができるＤＮＡシーケンスを除くのに使用できる。このネガティブスクリーニングステップは、ターゲットに対して高度に特異的なアプタマーの発生を可能にできる。
【０２５７】
識別されたアプタマーシーケンスは、性能評価することができ、例えば、識別されたアプタマーシーケンスは、１）特異的に結合し、コントロールでなくターゲットの存在でスイッチングできることが確実である、２）最適な性状（つまり、親和性、特異性、応答時間及びスイッチング効率）を生むシーケンスを識別する、ということで個々に確証できる。それぞれのセンサーの蛍光シグナルは、ターゲット（例えば、ＡＴＰ或いはグルタメート）或いはそれぞれのコントロールの存在下、プレートリーダーを用いて、一定の濃度範囲（例えば、１ｐＭ〜１００μΜ）でリアルタイムにモニターできる。これで、親和性（Ｋｄ）、感度、選択性、シグナル／バックグランド比、応答時間、及びダイナミックレンジを含む識別されたアプタマー／センサーのキーとなる特性を識別する。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）〔バイアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）３０００〕は、識別されたアプタマーの結合動力学（ｋｏｎとＫ０ｆｆ）と可逆性を評価するに使用できる。例えば、このテストのセットは、神経伝達物質を画像化するセンサー構築を識別することができ、例えば、シナプス伝達の瞬間的な（ｍｓオーダーの）神経伝達パルスを解析できる迅速なリガンドの会合と解離センサーを識別することができる。
【０２５８】
図４８に説明するように、典型的なＥＮＳＮＡＲＡプロトコールでは、ライブラリ（例えば、この例のアプタマー）中の特定ＤＮＡシーケンスが存在し、ターゲット分子に結合すると、コンフォメーション変化で阻止剤を酵素の触媒サイトから分離し、蛍光シグナルを出す、というのが論理的根拠である。別の実施形態で、初期ライブラリは、１０１２を越えるＩＤＥが、およそ１０７の滴（例えば、凡そ１０５ＩＤＥ／液滴）にカプセル化されている。このライブラリのアプタマー含有の液滴は、蛍光シグナルを出し、選別される。続いて、この液滴は、破壊され、希釈され、そして別の１０７の液滴中で、液滴当たり単一ＩＤＥ分子のみ残る迄、ターゲットと蛍光基質と共に再カプセル化される。最後に、アプタマーＩＤＥを含む蛍光液滴は選別され、選択されたアプタマーは、配列化される。
【０２５９】
別の実施形態で、ＥＮＳＮＡＲＡは、異なる構造、構成、組成をもつＩＤＥを利用することができる。別の実施形態で、ＥＮＳＮＡＲＡは、例えば、指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）など他のシグナル増幅プロセスを使用することができる。別の実施形態で、ＥＮＳＮＡＲＡは、液滴サイズ、反応時間、及び液滴中での分子濃度を含む多くのパラメーターを最適化することができる。別に、液滴サイズは、直径が約５〜５０μｍの間であることができる。
【０２６０】
本発明は、作用の特別のメカニズムで限定されるものではないが、別のＥＮＳＮＡＲＡ実施形態では、
（ｉ）ＩＤＥに接合したアプタマーは、酵素触媒サイトから阻止剤を分離し、ターゲット分子の結合に応じて蛍光シグナルを出すことができる。これは、（ａ）ガーディリ（Ｇｈａｄｉｒｉ）とその共同研究者により開発されたＩＤＥシステムは、同じスイッチングメカニズムを使用して、ターゲット相補的ＤＮＡを検出することができる（Ｓａｇｈａｔｅｌｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，３４４−５（２００３）；Ｇｉａｎｎｅｓｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｌｏｇｉｃ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＤＮＡ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６，３９５５−８（２００７））。（ｂ）構造−スイッチングアプタマーは、ターゲット結合して、コンフォメーションをＤＮＡ二重構造からアプタマー／ターゲット複合物に変える（例えば、Ｎｕｔｉｕ，Ｒ．＆  Ｌｉ，Ｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｐｔａｍｅｒｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，４７７１−８（２００３）；Ｔａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｔａｍｅｒ  ｓｗｉｔｃｈ  ｐｒｏｂｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３０，１１２６８−９（２００８）、参照）、によって支持される。
ｉｉ）単一アプタマースイッチにより誘発された蛍光シグナルは、酵素リポーターシグナル増幅により液滴中に検出される。これは、デジタルＰＣＲを含めた広範囲な従来の研究、及びピコリットル液滴中でのターゲット酵素の小室化により、ターゲットの有効濃度とシグナル対バックグランド比の上昇によって単一分子の検出ができるようになるという、本発明に示されたデータにより支持される。
【０２６１】
別の実施形態で、本発明の典型的なＥＳＮＡＲＡシステム及び方法は、定義された性状を備えたアプタマーの迅速なスクリーニングに対し、無比の感度と処理能力を提供する。特に、ピコリットル（ｐＬ）サイズ液滴を検出する能力、及び本発明の液滴の“破壊−希釈−再カプセル化”区画化手順により、単一ラウンドで１０１２ものの多様性を備えたライブラリの直接スクリーニングが可能になる。別の実施形態で、典型的なＥＮＳＮＡＲＡは、従来のＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）によって必要とされた長い増幅ステップをなくしている。
【０２６２】
別の実施形態中で、アプタマーが識別されると、それらは、直接、追加の改変や最適化を必要とせずに、構造スイッチングセンサーとして使用することができる。さらに、ＩＤＥシステムはそれ自身は、強力なアプタマー・スクリーニング・プラットフォームばかりでなく、単独機能な、超高感度、そして可逆的センサーとして使用できる。
【０２６３】
別の実施形態で、本発明のＥＮＳＮＡＲＡシステム或いはプロトコールは、例えば、マイクロ流体装置において自動化される。例えば、マイクロ流体装置中のこのシステムを自動化することによって、多数のターゲットを、同時に選択することができる。
【０２６４】
別の実施形態で、本発明のＥＮＳＮＡＲＡシステム或いはプロトコールは、単一ラウンドスクリーニング・アプローチであり、これは、ＰＣＲ増幅にとって必要でなくなる。これにより、初期のライブラリが、高品質アプタマーにとっての多様性及びスクリーニング効率をさらに高め得る改質ヌクレオチドからなることができる。
【０２６５】
別の実施形態で、本発明のＥＳＮＡＲＡシステム或いはプロトコールは、インビボ及びインビトロで分子及び細胞を研究し、したがって生物学を解明し、新しい治療を開発するためのリアルタイムセンサーのツールボックスを作ることができる新しいアプタマースクリーニング技術である。別の実施形態中で、本発明のＥＮＳＮＡＲＡシステム或いはプロトコールは、高い時空間解像度をもつ神経伝達物質の連続的及びリアルタイムなモニタリングを可能にする迅速で可逆的なアプタマーセンサーシステムとなるものである。別の実施形態で、ＥＮＳＮＡＲＡシステム或いは本発明のプロトコールは、複雑な生物学を研究するプローブとして、診断と治療として使用できる多くのアプタマーをデザインするプラットフォームとなるものである。
【０２６６】
本発明の多くの実施形態を記載した。しかしながら、様々な改変が、本発明の精神及び請求の範囲から逸脱することなくなされるかもしれないことは理解されるであろう。従って、その他の実施形態も、以下の請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【配列表】
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