(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
（１）配列番号３８のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ１、
（２）配列番号３９のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ２、
（３）配列番号４０のポリペプチド配列を有するＬＣＤＲ３、
（４）配列番号３４のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ１、
（５）配列番号３５のポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ２、ならびに
（６）配列番号３６および７３〜９０からなる群から選ばれるポリペプチド配列を有するＨＣＤＲ３、
を含む、
ＰＣＳＫ９と結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片であって、
ａ．配列番号３３および９１〜１０８からなる群から選ばれるポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号３７のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
を含むモノクローナル抗体または抗原結合断片。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体または抗原結合断片は、キメラのものである、請求項１又は２に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体または抗原結合断片は、ヒトのものである、請求項１又は２に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片。
【請求項５】
ヒト重鎖ＩｇＧ１定常領域およびヒト抗体の軽鎖κ定常領域を含む、請求項４に記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片。  
【請求項６】
単離された請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれかに記載の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物。
【請求項１０】
ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの結合を遮断するか、あるいは対象へのＬＤＬ取り込みを増加するための、請求項９に記載の薬物組成物。
【請求項１１】
脂質疾患、障害または病症、代謝性疾患、障害または病症、炎症性疾患、障害または病症、感染性疾患、障害または病症を治療するための、請求項９の薬物組成物。
【請求項１２】
脂質異常、代謝性疾患または炎症性疾患を治療するための、薬物組成物であって、前記の脂質異常、代謝性疾患または炎症性疾患は高脂血症、原発性高脂血症、脂質代謝異常、混合性脂質代謝異常、ホモ型家族性高コレステロール血症および敗血症からなる群から選ばれる、請求項９の薬物組成物。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を製造する方法であって、所定の条件においてモノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする核酸を含む細胞を培養することによって、モノクローナル抗体または抗原結合断片を生成させる工程と、前記細胞または細胞培養物から抗体または抗原結合断片を回収する工程とを含む方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれかに記載のモノクローナル抗体または抗原結合断片を含む薬物組成物を製造する方法であって、前記モノクローナル抗体または抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせることによって前記薬物組成物を得る工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、2015年10月16日に提出した中国特許出願番号が201510673316.1の優先権を出張し、その全内容を全体として引用して本明細書に取り入れる。  
【０００２】
（電子形式で提出された配列の引用）
本出願は、配列表を含み、EFS-Webによって電子形式で提出され、ASCIIフォーマットの配列表として、ファイル名は「配列表ファイル」で、作成日付は2016年9月19日で、大きさは約76.7 kBである。EFS-Webによって提出された配列表は本明細書の一部で、かつその全内容を全体として引用して本明細書に取り入れる。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、抗PCSK9モノクローナル抗体、前記抗体をコードする核酸と発現ベクター、前記ベクターを含む組み換え細胞、および前記抗体を含む組成物に関する。また、前記抗体を製造する方法、および前記抗体で脂質異常、代謝性疾患、高コレステロール血症、炎症性疾患および感染性疾患を含む疾患を治療する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
2008年に、約1700万人が心血管疾患で死亡し、全世界の死亡人数の約三分の一であった。2030年にこの数字は2360万に増加すると予想される（Mozaffarianら、2015、循環.131(4):e29-322)。様々な研究では、（LDL-C）レベルと心血管疾患の進展の間に強い関連性があり、これは主にLDL-Cがアテローム性動脈硬化において重要な働きをするためであることが示された（RallidisとLekakis、2016、Hellenic J Cardiol.57(2):86-91)。そのため、血漿中LDL-Cレベルを低下させることは心血管疾患を予防する有効な方法であると思われている。スタチン系薬物は長年ずっと高コレステロール血症の主な治療薬で、かつ多くの場合では有効である。しかしながら、かなりの数の危篤な患者において、スタチン系薬物による治療はLDL-Cレベルを低下させることができないため、LDL-Cレベルを低下させる新しい治療方法が必要になる。
【０００５】
多くのLDL-Cは肝臓細胞におけるLDL受容体（LDLR）によって除去される。2003年に、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン9（PCSK9）がLDL-C除去経路における重要な因子であることが見出された。PCSK9は主に肝臓細胞において生成し、分泌型セリンプロテアーゼで、LDLRと結合してLDLRの内在化とリソソームの分解に導く。これによる肝臓細胞表面におけるLDLRタンパク質濃度の低下は、血漿から除去されるLDL-Cの減少につながる。そのため、PCSK9の存在は血漿中LDL-Cの肝臓代謝を抑制することができる。LDLRとApoB以外、PCSK9は三番目の常染色体優性家族性高脂血症に関連する遺伝子である（RallidisとLekakis、2016、Hellenic J Cardiol.57(2):86-91)。
【０００６】
PCSK9の機能欠失型突然変異はLDL-Cレベルと心血管疾患の低下に関連し、高いPCSK9レベルの人たちはLDL-Cレベルが上がり、かつ心血管疾患のリスクが顕著に増加する。PCSK9の機能獲得型突然変異は家族性高コレステロール血症と因果関係がある（Gencerら、2015、Swiss Med Wkly.145:w14094）。体外実験では、PCSK9がHepG2細胞におけるLDLRの発現レベルを低下させることができることが示された。同様のように、マウスにおけるPCSK9レベルの増加が肝臓におけるLDLR発現を低下させるが、PCSK9ノックアウトマウスは上がったLDLR発現を有する。以上のように、データからPCSK9が脂質障害の治療が期待できる治療標的であることが示された。
【０００７】
スタチン系薬物以来、PCSK9に対する抗体は心血管疾患の予防の最大の進歩で、かつたとえば高コレステロール血症、高脂血症、冠動脈性心疾患、代謝症候群や急性冠症候群を治療する治療剤として有用であるとされている。
【０００８】
たとえばアムジェンやサノフィ/リジェネロンからの全ヒトPCSK9モノクローナル抗体（mAb）のI期およびII期臨床試験がすでに完了し、かつ一連の期待できる結果が出ました。たとえば、アリロクマブ（サノフィ/リジェネロン）の研究では、LDL-Cレベルに39.2％から67.9％の低下が見られた（Gencerら等、2015、Swiss Med Wkly.145:w14094)。現在III期臨床試験が実行中で、その目的はPCSK9の抑制の急性冠症候群患者の心血管イベントへの影響に対する評価である。
【０００９】
進展が得られたが、本分野では、有効にPCSK9とLDLRの結合を抑制しながら、生体に起こる好ましくない副作用が最小限にできる抗PCSK9抗体を含む、より有効な治療剤が必要である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、高親和力で特異的にPCSK9と結合し、肝臓細胞のLDL取り込みを誘導して体内におけるLDLRの分解を防止するモノクローナル抗体を提供することによって、この需要に満足させた。具体的に、本発明の全ヒト抗PCSK9抗体はアリロクマブ（リジェネロン）よりも高いPCSK9に対する親和力を有する。
【００１１】
一つの一般的な側面では、本発明は、PCSK9と結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。
一つの具体的な側面では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
（１）  それぞれ配列番号38、39、40、34、35、および36であるポリペプチド配列、
（２）  それぞれ配列番号6、7、8、2、3、および4であるポリペプチド配列、
（３）  それぞれ配列番号14、15、16、10、11、および12であるポリペプチド配列、
（４）  それぞれ配列番号22、23、24、18、19、および20であるポリペプチド配列、
（５）  それぞれ配列番号30、31、32、26、27、および28であるポリペプチド配列、或いは
（６）  それぞれ配列番号46、47、48、42、43、および44であるポリペプチド配列、
を有するLCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、
特異的にPCSK9、好ましくはヒトPCSK9と結合する、抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００１２】
もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
（１）  配列番号38のポリペプチド配列を有するLCDR1、
（２）  配列番号39のポリペプチド配列を有するLCDR2、
（３）  配列番号40のポリペプチド配列を有するLCDR3、
（４）  配列番号34のポリペプチド配列を有するHCDR1、
（５）  配列番号35のポリペプチド配列を有するHCDR2、ならびに
（６）  配列番号36および73〜90のいずれかのポリペプチド配列を有するHCDR3、
を含む、
PCSK9、好ましくは特異的にヒトPCSK9と結合する、抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００１３】
もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号1、9、17、25、33、または91〜108または41のいずれかと少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域を含むか、あるいは配列番号5、13、21、29、37または45のいずれかと少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む、抗体または抗原結合断片に関する。
【００１４】
一つの実施形態によれば、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片はヒト/ラットキメラのものである。
もう一つの実施形態によれば、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片はヒトのものである。
【００１５】
もう一つの実施形態によれば、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、さらに、一つの定常領域、好ましくはヒト重鎖IgG1定常領域、およびヒト抗体の軽鎖κ定常領域を含む。
【００１６】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、単離された本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸に関する。
もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含むベクターに関する。
【００１７】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む宿主細胞に関する。
もう一つの一般的な側面では、本発明は、単離された本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸と薬学的に許容されるベクターとを含む薬物組成物に関する。
【００１８】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、必要な被験者においてPCSK9とLDLRの結合を遮断する方法、あるいはLDL取り込みを増加する方法であって、被験者に本発明の薬物組成物を施用する工程を含む方法に関する。
【００１９】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、必要な被験者の疾患、障害または症状（好ましくは脂質異常、代謝性疾患、炎症性疾患、感染性疾患）を治療する方法であって、被験者に本発明の薬物組成物を施用する工程を含む方法に関する。
【００２０】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を製造する方法であって、所定の条件においてモノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む細胞を培養することによって、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を生成させ、かつ細胞または細胞培養物から抗体またはその抗原結合断片を回収する工程を含む方法に関する。
【００２１】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む薬物組成物を製造する方法であって、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせることによって前記薬物組成物を得る工程を含む方法に関する。
【００２２】
発明の詳述、およびその好適な実施形態ならびに添付された請求の範囲を含む、以下の公開内容から、本発明のほかの側面、特徴および利点は明らかである。
図面を合わせると前記概要および以下の発明の詳述をさらに理解することができる。もちろん、本発明は図面で示された具体的な実施形態に限定されない。  
【００２３】
図面は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図1は、異なるバッチの免疫原A（hPCSK9-His）のHepG2細胞におけるLDL取り込みの抑制に対する影響を示す。
【図２】図2は、ELISAによって測定された本発明の実施形態によるキメラ抗PCSK9抗体の免疫原A（hPCSK9-His）に対する結合活性を示す。
【図３】図3は、ELISAによって測定された本発明の実施形態によるキメラ抗PCSK9抗体の組換えヒトPCSK9D374Yタンパク質に対する結合活性を示す。
【図４】図4は、ELISAによって測定された本発明の実施形態によるキメラ抗PCSK9抗体の組換えカニクイザルPCSK9タンパク質に対する結合活性を示す。
【図５】図5は、ELISAによって測定された本発明の実施形態によるキメラ抗PCSK9抗体の組換えPCSK9タンパク質とLDLR ECDタンパク質の結合に対する抑制を示す。
【図６】図6は、ELISAによって測定された本発明の実施形態によるキメラ抗PCSK9抗体の組換えPCSK9D374Yタンパク質とLDLR ECDタンパク質の結合に対する抑制を示す。
【図７】図7は、FACSによって測定された本発明の実施形態によるキメラ抗PCSK9抗体のPCSK9D374Yによって誘導されたLDLR下方調節に対する抑制を示す。
【図８】図8は、本発明の実施形態によるキメラ抗PCSK9抗体のPCSK9D374Yによって誘導されたHepG2細胞におけるLDL取り込みに対する抑制を示す。
【図９】図9は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の免疫原A（hPCSK9-His）に対する結合活性を示す。
【図１０】図10は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の組換えPCSK9D374Yタンパク質に対する結合活性を示す。
【図１１】図11は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体のカニクイザルPCSK9に対する結合活性を示す。
【図１２】図12は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の組換えPCSK9タンパク質とLDLR ECDタンパク質の結合に対する抑制を示す。
【図１３】図13は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の組換えPCSK9D374Yタンパク質とLDLR ECDタンパク質の結合に対する抑制を示す。
【図１４】図14は、本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体のPCSK9D374Yによって誘導されたHepG2細胞におけるLDL取り込みに対する抑制を示す。
【図１５】図15は、本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体のPCSK9D374Yによって誘導されたHepG2細胞におけるLDL取り込みに対する抑制を示す。
【図１６】図16は、本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体のPCSK9D374Yによって誘導されたHepG2細胞におけるLDL取り込みに対する抑制を示す。
【図１７】図17は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の免疫原Aに対する結合活性を示す。
【図１８】図18は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の組換えPCSK9D374Yタンパク質に対する結合活性を示す。
【図１９】図19は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体のカニクイザルPCSK9に対する結合活性を示す。
【図２０】図20は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の組換えPCSK9タンパク質とLDLR ECDタンパク質の結合に対する抑制を示す。
【図２１】図21は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の組換えPCSK9D374YとLDLR ECDタンパク質の結合に対する抑制を示す。
【図２２】図22は、ELISAによって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体のPCSK9D374Yによって誘導されたHepG2細胞におけるLDL取り込みに対する抑制を示す。
【図２３】図23AおよびBは、本発明の実施形態による抗PCSK9抗体のマウスにおける組換えhPCSK9タンパク質が介するLDLR分解に対する抑制を示す。マウスLDLR（mLDLR）に対する抗体およびマウスβ-アクチン（mβ-アクチン）に対する抗体で、組換えヒトPCSK9タンパク質（hPCSK9）および抗PCSK9抗体、対照IgGまたは溶媒のマウスの肝臓分解物に対してウェスタンブロット解析を行ったが、ここで、ウェスタンブロットにおけるmLDLRバンドの密度とmβ-アクチンバンドの密度の比がプロットされた。  図23A：30mg/kg、3mg/kg、または0.3mg/kgの139G1C8、対照IgGまたは溶媒を施用したマウスにおけるmLDLR/mβ-アクチンの比。   図23B：30mg/kg、3mg/kg、または0.3mg/kgの96F8C6、対照IgGまたは溶媒を施用したマウスにおけるmLDLR/mβ-アクチンの比。
【図２４】図24は、示差走査熱量測定法（DSC）によって測定された本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の熱安定性を示す。
【図２５】図25は、本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の凍結・解凍安定性を示す。
【図２６】図26は、本発明の実施形態による全ヒト抗PCSK9抗体の溶解度を示す。
【図２７Ａ】図27AおよびBは、本発明の実施形態による、本発明の実施形態の向上した親和力を有するいくつかのヒト抗PCSK9抗体のPCSK9D374Yによって誘導されたHepG2細胞におけるLDL取り込みに対する抑制を示す。図27A：抗体クローンAF-mab023_06、AF-mab023_12または96F8C6のPCSK9D374Yによって誘導されたHepG2細胞におけるLDL取り込みに対する抑制。
【図２７Ｂ】図27AおよびBは、本発明の実施形態による、本発明の実施形態の向上した親和力を有するいくつかのヒト抗PCSK9抗体のPCSK9D374Yによって誘導されたHepG2細胞におけるLDL取り込みに対する抑制を示す。図27B：抗体クローンAF-mab023_01、AF-mab023_11、AF-mab023_14またはAF-mab023_18のPCSK9D374Yによって誘導されたHepG2細胞におけるLDL取り込みに対する抑制。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳述
背景および明細書全体において、複数の出版物、文章および特許が引用または記述され、これらの参考文献におけるいずれも全体として引用して本明細書に取り入れられる。本明細書に含まれる書類、法案、材料、装置、文章などの検討は本発明の前後文を提供するためである。本発明で公開されたものまたは保護を要求されたもののいずれに対しても、このような検討はこれらの事項のいずれかまたは全部が既存技術の一部になることを認めるわけではない。
【００２６】
別途に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術と科学用語はいずれも本発明が属する分野の当業者が通常理解する意味と同様である。さらに、本明細書で用いられる具体的な用語は明細書で定義された意味を有する。本明細書で引用されたすべての特許、公開された特許出願および出版物は、ここで完全に記述されるように、引用によって本明細書に取り入れられる。注意すべきのは、前後文で別途に明示されない限り、本明細書および添付された請求の範囲で用いられるように、単一の形態の「一」、「一つ」および「当該」は複数の形態を含む。
【００２７】
別途に説明されない限り、すべての場合、本明細書に記載のいずれの数値（たとえば本明細書に記載の濃度または濃度範囲）も用語「約」で修飾されたものと理解されるべきである。そのため、一つの数値は、通常、記載された値の±10％を含む。たとえば、1mg/mLの濃度は0.9mg/mL〜1.1mg/mLを含む。同様に、1％〜10％（w/v）の濃度範囲は0.9％（w/v）〜11％（w/v）を含む。前後文で別途に明示されない限り、本明細書で用いられるように、使用された数値の範囲は特別にすべての可能な下位範囲、当該範囲内におけるすべての単一の数値を含み、このような範囲内における整数および当該値の分数を含む。
【００２８】
本発明は、通常、単離された抗PCSK9モノクローナル抗体、前記抗体をコードする核酸と発現ベクター、前記ベクターを含む組み換え細胞、および前記抗体を含む組成物に関する。また、前記抗体を製造する方法、および前記抗体で脂質異常、代謝性疾患、高コレステロール血症、炎症性疾患および感染性疾患を含む疾患を治療する方法を提供する。本発明の抗体は一つまたは複数の期待される機能特性を有し、PCSK9と結合する高親和力、PCSK9に対する高特異性、PCSK9とLDLRの結合を遮断する能力、LDL取り込みを刺激する能力、PCSK9によって誘導されたLDLR分解を阻害する能力を含むが、これらに限定されない。
【００２９】
一般的な側面では、本発明は、PCSK9と結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。
本明細書で用いられるように、用語「抗体」は広義で使用され、イムノグロブリンまたは抗体分子を含み、ヒト、ヒト化、複合およびキメラ抗体、ならびにモノクローナルまたはポリクローナル抗体断片が含まれる。通常、抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すタンパク質またはペプチド鎖である。抗体の構造は、周知のものである。重鎖定常ドメインのアミノ酸配列によって、イムノグロブリンは主に5つのクラス（すなわちIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM）に分かれる。IgAおよびIgGはさらに同クラスのIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4に細分される。そのため、本発明の抗体は主な5つのクラスまたは相応するサブクラスのいずれでもよい。好ましくは、本発明の抗体はIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4である。その定常領域のアミノ酸配列によって、脊椎動物の種の抗体の軽鎖を2つの顕著に異なるタイプの一つ、すなわちκおよびλに分類することができる。そのため、本発明の抗体はκまたはλの軽鎖定常ドメインを含んでもよい。具体的な実施形態によって、本発明の抗体はラットまたはヒト抗体由来の重鎖および/または軽鎖の定常領域を含む。重鎖および軽鎖の定常ドメイン以外、抗体は、さらに、軽鎖可変領域と重鎖可変領域からなる抗原結合領域を含み、各領域に3つのドメイン（すなわちCDR1、CDR2およびCDR3）が含まれる。軽鎖可変ドメインは任意にLCDR1、LCDR2およびLCRD3に関し、重鎖可変ドメインは任意にHCDR1、HCRD2およびHCDR3に関する。
【００３０】
本明細書で用いられるように、用語「単離された抗体」とは基本的に異なる抗原特異性を有するほかの抗体を含まない抗体をいう（たとえば、特異的にPCSK9と結合する単離された抗体は基本的にPCSK9と結合しない抗体を含まない）。さらに、単離された抗体は基本的にほかの細胞物質および/または化学物質を含まない。
【００３１】
本明細書で用いられるように、用語「モノクローナル抗体」とは基本的に同質の抗体群から得られる抗体をいい、すなわち、少量に存在しうる天然の突然変異以外、前記抗体群を構成する単一の抗体は同一のものである。本発明のモノクローナル抗体はハイブリドーマ法、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローン技術、または組換えDNA法によって製造することができる。たとえば、ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を生成させることができるが、前記ハイブリドーマは非ヒト遺伝子組換え動物（たとえば遺伝子組換えマウスまたはラット）から得られる、ヒト重鎖組換え遺伝子および軽鎖組換え遺伝子を含むゲノムを有するB細胞を含む。
【００３２】
本明細書で用いられるように、用語「抗原結合断片」とは抗体断片、たとえばダイアボディ、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv断片、ジスルフィド結合安定化Fv断片（dsFv）、(dsFv)2、二重特異性dsFv（dsFv-dsFv'）、ジスルフィド結合安定化ダイアボディ（dsダイアボディ）、一本鎖抗体分子（scFv）、単一ドメイン抗体（sdab）、scFv二量体（2価ダイアボディ）、一つまたは複数のCDRを含む部分抗体からなる多重特異性抗体、ラクダ単一ドメイン抗体、ナノ抗体、ドメイン抗体、2価ドメイン抗体、または抗原と結合するが完全の抗体構造を含まない任意のほかの抗体断片をいう。抗原結合断片は同様の抗原(親抗体または親抗体断片と結合する同様の抗原)と結合することができる。具体的な実施形態によれば、抗原結合断片は軽鎖可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖定常領域のFdセグメントを含む。ほかの具体的な実施形態によれば、抗原結合断片はFabおよびF(ab')を含む。
【００３３】
本明細書で用いられるように、用語「一本鎖抗体」とは約15〜約20のアミノ酸からなる短鎖ペプチドで連結した重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む、本分野の通常の一本鎖抗体をいう。本明細書で用いられるように、用語「単一ドメイン抗体」とは重鎖可変領域および重鎖定常領域を、あるいは重鎖可変領域だけを含む、本分野の通常の単一ドメイン抗体をいう。
【００３４】
本明細書で用いられるように、用語「ヒト抗体」とはヒトから生成する抗体、または本分野で既知の任意の技術によって製造されるアミノ酸配列を有するヒトから生成する抗体に相応するアミノ酸配列を有する抗体をいう。ヒト抗体の定義は、完全または全長の抗体、その断片、ならびに/あるいは少なくとも一つの重鎖および/または軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
【００３５】
本明細書で用いられるように、用語「ヒト化抗体」とは抗体の抗原結合特性が維持され、かつ人体における抗原性が低下するように、修飾によってヒト抗体との配列相同性を増強させた非ヒト抗体をいう。
【００３６】
本明細書で用いられるように、用語「キメラ抗体」とはイムノグロブリン分子のアミノ酸配列が2つまたはそれ以上の種由来の抗体をいう。通常、軽鎖および重鎖の可変領域はいずれも1種類の哺乳動物（たとえばマウス、ラット、ウサギなど）から誘導される、所要の特異性、親和力、および性能を有する抗体の可変領域に相応し、定常領域はもう1種類の哺乳動物（たとえばヒト）から誘導される抗体の配列に相応することで、当該種において免疫応答を引き起こすことを避ける。
【００３７】
本明細書で用いられるように、用語「PCSK9」とはプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン9型タンパク質をいい、分泌タンパク質で、分泌型セリンエンドプロテアーゼの哺乳動物プロタンパク質転換酵素ファミリーの可溶性メンバーである。分泌されるPCSK9は細胞表面のLDLRと結合する。結合したタンパク質が内在化した後、PCSK9はLDLRの飲み込み・再生を防止し、そして2種類のタンパク質のリソソームによる分解につながる（RallidisとLekakis、2016、Hellenic J Cardiol.57(2):86-91)。用語「ヒトPCSK9」とはヒト由来のPCSK9をいう。GenBank登録番号NP_777596.2はヒトPCSK9の例示的なアミノ酸配列を示す。  
【００３８】
本明細書で用いられるように、用語「特異的にPCSK9と結合する」抗体とは、PCSK9、好ましくはヒトPCSK9と結合する抗体をいい、そのKD値は1×10-7M未満、好ましくは1×10-8M未満、より好ましくは5×10-9M未満、1×10-9M未満、5×10-10M未満、1×10-10M未満である。用語「KD」とはKdとKaの比（すなわちKd/Ka）から得られる解離定数をいい、かつモル濃度（M）で表示される。本発明によれば、本分野の方法によって抗体のKD値を確認することができる。たとえば、抗体のKDは表面プラスモン共鳴、たとえばBiacore＜登録商標＞システムのようなバイオセンサーシステム、またはバイオレイヤー干渉の測量技術、たとえばOctet RED96システムによって確認することができる。
【００３９】
抗体のKD値が小さいほど、抗体と標的抗原の結合の親和力が高い。 
一つの具体的な側面では、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
（１）  それぞれ配列番号38、39、40、34、35、および36であるポリペプチド配列、
（２）  それぞれ配列番号6、7、8、2、3、および4であるポリペプチド配列、
（３）  それぞれ配列番号14、15、16、10、11、および12であるポリペプチド配列、
（４）  それぞれ配列番号22、23、24、18、19、および20であるポリペプチド配列、
（５）  それぞれ配列番号30、31、32、26、27、および28であるポリペプチド配列、或いは
（６）  それぞれ配列番号46、47、48、42、43、および44であるポリペプチド配列、 
を有するLCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、
PCSK9、好ましくは特異的にヒトPCSK9と結合する、抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４０】
もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
（１）  配列番号38のポリペプチド配列を有するLCDR1、
（２）  配列番号39のポリペプチド配列を有するLCDR2、
（３）  配列番号40のポリペプチド配列を有するLCDR3、
（４）  配列番号34のポリペプチド配列を有するHCDR1、
（５）  配列番号35のポリペプチド配列を有するHCDR2、ならびに
（６）  配列番号36および73〜90のいずれかのポリペプチド配列を有するHCDR3、
を含む、
PCSK9、好ましくは特異的にヒトPCSK9と結合する、抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４１】
もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号1、9、17、25、33、または91〜108または41のいずれかと少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域を含むか、あるいは配列番号5、13、21、29、37または45のいずれかと少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む、抗体または抗原結合断片に関する。一つの好適な実施形態によれば、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1、9、17、25、33、または41と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域、ならびにそれぞれ配列番号5、13、21、29、37または45と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。もう一つの好適な側面によれば、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号33または91〜108のいずれかと少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域、ならびに配列番号37と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。
【００４２】
もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
ａ．  配列番号1のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号5のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｂ．  配列番号9のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号13のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｃ．  配列番号17のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号21のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｄ．  配列番号25のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号29のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
ｅ．  配列番号33および91〜108からなる群から選ばれるポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号37のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、あるいは
ｆ．  配列番号41のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号45のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、あるいは
を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００４３】
一つの実施形態において、本発明は、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、それぞれ配列番号6、7、8、2、3、および4のポリペプチド配列を有する、抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域、および配列番号5と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号1のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号5のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。  
【００４４】
一つの実施形態において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、それぞれ配列番号14、15、16、10、11、および12のポリペプチド配列を有する、抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号9と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域、および配列番号13と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号9のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号13のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。  
【００４５】
一つの実施形態において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、それぞれ配列番号22、23、24、18、19、および20のポリペプチド配列を有する、抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号17と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域、および配列番号21と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号17のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号21のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。  
【００４６】
一つの実施形態において、本発明は、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、それぞれ配列番号30、31、32、26、27、および28のポリペプチド配列を有する、抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号25と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域、および配列番号29と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号25のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号29のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。  
【００４７】
一つの実施形態において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、それぞれ配列番号38、39、40、34、35、および36のポリペプチド配列を有する、抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号33と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域、および配列番号37と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号33のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号37のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００４８】
一つの実施形態において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号38のポリペプチド配列を有するLCDR1、配列番号39のポリペプチド配列を有するLCDR2、配列番号40のポリペプチド配列を有するLCDR3、配列番号34のポリペプチド配列を有するHCDR1、配列番号35のポリペプチド配列を有するHCDR2、ならびに配列番号36および73〜90からなる群から選ばれるポリペプチド配列を有するHCDR3を含む、抗体またはその抗原結合断片に関する。  
【００４９】
もう一つの実施形態において、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号91〜108のいずれかと少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域、および配列番号37と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号91〜108のいずれかのポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号37のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００５０】
一つの実施形態において、本発明は、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、それぞれ配列番号46、47、48、42、43、および44のポリペプチド配列を有する、抗体またはその抗原結合断片に関する。もう一つの実施形態において、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号41と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域、および配列番号45と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。好ましくは、前記の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号41のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号45のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。  
【００５１】
もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、キメラのものである抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５２】
もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、ヒトのものである抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５３】
もう一つの具体的な側面によれば、本発明は、本発明の単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、一つの定常領域、好ましくはヒト重鎖IgG1定常領域（配列番号67）、およびヒト抗体の軽鎖、好ましくはヒト軽鎖κ定常領域（配列番号69）を含む抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００５４】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、単離された本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸に関する。当業者にとって、タンパク質のコード配列はタンパク質のアミノ酸配列を変えないまま、変えられることがあることがわかる（たとえば、置換、削除、挿入など）。そのため、当業者にとって、タンパク質のアミノ酸配列を変えないまま、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸配列を変えることができることがわかる。
【００５５】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含むベクターに関する。ここの公開に基づき、当業者に既知の任意のベクター、たとえばプラスミド、コスミド、ファージベクターまたはウイルスベクターを使用することができる。一部の実施形態において、前記ベクターは組換え発現ベクター、たとえばプラスミドである。前記ベクターは通常の機能の発現ベクターの構築に使用される任意のエレメント、たとえばプロモーター、リボソーム結合エレメント、ターミネーター、エンハンサー、選別マーカーや複製起点を含んでもよい。プロモーターは構成型、誘導型または抑制型のプロモーターでもよい。本分野において、多くの発現ベクターは核酸を細胞に送達することができ、本発明で細胞における抗体またはその抗原結合断片の生成に有用であることが知られている。本発明の実施形態によれば、通常のクローン技術または人工遺伝子合成によって組換え発現ベクターを生産することができる。  
【００５６】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む宿主細胞に関する。ここに公開された内容に基づき、当業者に既知の任意の宿主細胞を、本発明の抗体またはその抗原結合断片の組換え発現に使用することができる。一部の実施形態において、宿主細胞は大腸菌TG1またはBL21細胞（たとえばscFvまたはFab抗体の発現に使用される）、CHO-DG44またはCHO-K1細胞（たとえば全長IgG抗体の発現に使用される）である。具体的な実施形態によれば、通常の方法、たとえば化学的形質移入、熱ショックまたはエレクトロポレーションによって組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換させ、宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれ、組換え核酸は有効に発現される。
【００５７】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を製造する方法であって、所定の条件においてモノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む細胞を培養することによって、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を生成させ、かつ細胞または細胞培養物から（たとえば上清液から）抗体またはその抗原結合断片を回収することを含む方法に関する。細胞から発現された抗体またはその抗原結合断片を収穫し、かつ本分野で既知の通常の技術および本明細書に記載の通常の技術によって精製することができる。
【００５８】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、単離された本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸と薬学的に許容されるベクターとを含む薬物組成物に関する。
【００５９】
本明細書で用いられるように、用語「ベクター」とは、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定剤、相溶剤、油、脂質、小嚢を含む脂質、マイクロスフェア、リポソームカプセル化（liposomal encapsulation）、または本分野で既知の薬物製剤に使用されるほかの物質をいう。もちろん、ベクター、賦形剤または希釈剤の特性は具体的な応用の投与形態によって決まる。本明細書で用いられるように、用語「薬学的に許容されるベクター」とは、本発明に記載の組成物の有効性または本発明に記載の組成物の生物活性に干渉しない無毒物質をいう。具体的な実施形態によれば、ここの公開に基づき、抗体薬物組成物に適する任意の薬学的に許容されるベクターはいずれも本発明に使用することができる。
【００６０】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、必要な被験者の肝臓においてLDL取り込みを増加する方法、あるいはPCSK9とLDLRの結合を遮断する方法であって、被験者に本発明の薬物組成物を施用する工程を含む方法に関する。
【００６１】
PCSK9と結合する抗体およびその抗原結合断片の機能活性は本分野で既知の方法および本明細書に記載の方法によって特徴付けることができる。PCSK9と結合する抗体およびその抗原結合断片を特徴付ける方法は、Biacore、ELISAおよびOctetRed分析を含む親和力および特異性の試験、PCSK9とLDLRの結合に対する遮断を検出するための受容体配位子結合試験、HepG2細胞におけるPCSK9によって誘導されたLDLR分解に対する抑制を検出する試験、HepG2細胞におけるLDL取り込みの増加を検出する試験、肝臓におけるPCSK9によって誘導されたLDLR分解に対する抑制を検出する実験などを含むが、これらに限定されない。具体的な実施形態によれば、PCSK9と結合する抗体およびその抗原結合断片を特徴付ける方法は以下の実施例2〜15に記載の方法を含む。
【００６２】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、必要な被験者の脂質異常、代謝性疾患、高コレステロール血症、炎症性疾患および感染性疾患を治療する方法であって、被験者に本発明の薬物組成物を施用する工程を含む方法に関する。
【００６３】
本明細書で用いられるように、用語「被験者」とは動物、好ましくは哺乳動物である。具体的な実施形態によれば、被験者は哺乳動物で、非霊長類（たとえば、ラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット、ウサギ、モルモットまたはマウス）または霊長類動物（たとえばサル、チンパンジーまたはヒト）を含む。具体的な実施形態において、前記被験者はヒトである。
【００６４】
本発明の実施形態によれば、前記薬物組成物は治療有効量の抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片を含む。本明細書で用いられるように、用語「治療有効量」とは被験者において所要の生物または薬物反応を引き起こす活性成分または構成要素の量をいう。前記目的によって、経験および通常の手段によって治療有効量を決めることができる。
【００６５】
本明細書で用いられるように、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片では、治療有効量とは必要な被験者においてLDL取り込みを刺激する抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片の量をいう。同様に、本明細書で用いられるように、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片では、治療有効量とは疾患、障害または病症を治療するか、疾患、障害または病症の進展を予防または緩和するか、あるいは代謝性疾患、障害または病症に関連する症状を軽減させるか完全に軽減させる、抗PCSK9抗体またはその抗原結合断片の量をいう。
【００６６】
より具体的な実施形態によれば、治療される疾患、障害または病症は脂質異常、高脂血症、脂質代謝異常または代謝性疾患である。より具体的な実施形態によれば、治療される疾患、障害または病症は脂質異常で、原発性高脂血症、混合性脂質代謝異常、ホモ型家族性高コレステロール血症を含むが、これらに限定されない。ほかの具体的な実施形態によれば、治療される疾患、障害または病症は炎症性疾患、たとえば敗血症、あるいは感染性疾患である。
【００６７】
具体的な実施形態によれば、治療有効量とは1、2、3、4またはこれ以上の以下の効果を実現させるに十分な治療量。（i）治療される疾患、障害または病症あるいはそれに関連する症状の重篤度の軽減または改善、（ii）治療される疾患、障害または病症あるいはそれに関連する症状の持続時間の減少、（iii）治療される疾患、障害または病症あるいはそれに関連する症状の進展の予防、（iv）治療される疾患、障害または病症あるいはそれに関連する症状の退化、（v）治療される疾患、障害または病症あるいはそれに関連する症状の進展または発作の予防、（vi）治療される疾患、障害または病症あるいはそれに関連する症状の再発の予防、（vii）治療される疾患、障害または病症あるいはそれに関連する症状を有する被験者の入院治療の減少、（viii）治療される疾患、障害または病症あるいはそれに関連する症状を有する被験者の入院時間の減少、（ix）治療される疾患、障害または病症あるいはそれに関連する症状を有する被験者の生存率の増加、（xi）被験者において治療される疾患、障害または病症あるいはそれに関連する症状の抑制または軽減、ならびに/あるいは（xii）もう一つの療法の増強または改善といった予防または治療の効果である。
【００６８】
治療有効量または投与量は、たとえば治療される疾患、障害または病症、投与形態、標的部位、被験者の生理状態（たとえば年齢、体重、健康状況を含む）、被験者がヒトか動物か、施用されるほかの薬物、および当該処理が予防か治療かといった様々な要素によって変わる。滴定の治療投与量を最適化することによって、安全性および有効性を最適化する。
【００６９】
具体的な実施形態によれば、被験者に施用する予定の経路に適するように、本明細書に記載の組成物を調製する。たとえば、本明細書に記載の組成物は静脈内、皮下または筋肉内への施用に適する形態に調製することができる。
【００７０】
本明細書で用いられるように、用語「治療」、「治療される」および「療法」とはいずれも下記疾患に関連する測定可能な生理的パラメーターの少なくとも一つの改善または逆転をいい、前記疾患は、脂質疾患、障害または病症、代謝性疾患、障害または病症を含み、被験者において必ずしも識別できるわけではないが、被験者において識別することができる。用語「治療」、「治療される」および「療法」とは、さらに、疾患、障害または病症を消退させるか、その進展を阻害するか、あるいは少なくともその進展を遅延させることをいう。具体的な実施形態において、用語「治療」、「治療される」および「療法」とは、疾患、障害または病症に関連する一つまたは複数の症状の進展または発作を軽減・予防するか、その持続時間を減少させることをいうが、前記の疾患、障害または病症は、たとえば脂質異常、高脂血症、脂質代謝異常、混合性脂質代謝異常、ホモ型家族性高コレステロール血症、代謝性疾患、炎症性疾患、たとえば敗血症、あるいは感染性疾患である。具体的な実施形態において、用語「治療」、「治療される」および「療法」とは、疾患、障害または病症の再発を予防することをいう。具体的な実施形態において、用語「治療」、「治療される」および「療法」とは、疾患、障害または病症を有する被験者の生存率を増加することをいう。具体的な実施形態において、用語「治療」、「治療される」および「療法」とは、被験者の疾患、障害または病症を治癒することをいう。
【００７１】
具体的な実施形態によれば、脂質疾患、障害または病症あるいは代謝性疾患、障害または病症の治療に使用される組成物はもう一つの療法と併用してもよいが、スタチン系薬物またはほかの脂質降下薬を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書で用いられるように、前後文で被験者に2種類またはこれ以上の療法を施用する用語「併用」とは1種類よりも多い療法を使用することをいう。使用される用語「併用」は、被験者に施用する治療の順番を限定しない。たとえば、被験者への第一の療法(たとえば、本明細書に記載の組成物)は第二の療法を施用する前（たとえば、5分間、15分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間または12週間前）、同時、あるいは後（たとえば、5分間、15分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、16時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8周または12周後）でもよい。
【００７３】
もう一つの一般的な側面では、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む薬物組成物を製造する方法であって、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせることによって前記薬物組成物を得ることを含む方法に関する。
【００７４】
実施形態
また、本発明は以下の非限定的な実施形態を提供する。
【００７５】
実施形態1は単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片で、
（１）  それぞれ配列番号6、7、8、2、3、および4であるポリペプチド配列、
（２）  それぞれ配列番号14、15、16、10、11、および12であるポリペプチド配列、
（３）  それぞれ配列番号22、23、24、18、19、および20であるポリペプチド配列、
（４）  それぞれ配列番号30、31、32、26、27、および28であるポリペプチド配列、
（５）  それぞれ配列番号38、39、40、34、35、および36であるポリペプチド配列、或いは
（６）  それぞれ配列番号46、47、48、42、43、および44であるポリペプチド配列、
を有するLCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2およびHCDR3を含み、
ここで、前記抗体またはその抗原結合断片はPCSK9、好ましくは特異的にヒトPCSK9と結合する。
【００７６】
実施形態2は単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片で、
（１）  配列番号38のポリペプチド配列を有するLCDR1、
（２）  配列番号39のポリペプチド配列を有するLCDR2、
（３）  配列番号40のポリペプチド配列を有するLCDR3、
（４）  配列番号34のポリペプチド配列を有するHCDR1、
（５）  配列番号35のポリペプチド配列を有するHCDR2、
（６）  配列番号36および73〜90のいずれかのポリペプチド配列を有するHCDR3、
を含み、
ここで、前記抗体またはその抗原結合断片はPCSK9、好ましくは特異的にヒトPCSK9と結合する。
【００７７】
実施形態3は実施形態1または2の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、配列番号1、9、17、25、33または91〜108、または41のいずれかと少なくとも95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域を含むか、あるいは配列番号5、13、21、29、37または45のいずれかと少なくとも95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。
【００７８】
実施形態4は実施形態3の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、それぞれ配列番号1、9、17、25、33または41と少なくとも95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域を含むか、ならびにそれぞれ配列番号5、13、21、29、37または45と少なくとも95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。
【００７９】
実施形態5は実施形態3の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、それぞれ配列番号91〜108のいずれかと少なくとも95％の相同性を有するポリペプチド配列の重鎖可変領域を含むか、ならびに配列番号37と少なくとも95％の相同性を有するポリペプチド配列の軽鎖可変領域を含む。
【００８０】
実施形態6は実施形態4または5の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、
（ａ）  配列番号1のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号5のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
（ｂ）  配列番号9のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号13のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、 
（ｃ）  配列番号17のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号21のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
（ｄ）  配列番号25のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号29のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
（ｅ）  配列番号33または91〜108のいずれかのポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号37のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、あるいは
（ｆ）  配列番号41のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および配列番号45のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、
を含む。
【００８１】
実施形態7は実施形態1〜6のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、前記の抗体またはその抗原結合断片はキメラのものである。
実施形態8は実施形態1〜7のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、前記の抗体またはその抗原結合断片はヒトのものである。
【００８２】
実施形態9は実施形態8の単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、ヒト重鎖IgG1定常領域およびヒト抗体の軽鎖κ定常領域を含む。
実施形態10は実施形態1〜9のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片で、前記抗体または抗原結合断片はヒトのPCSK9との結合のKD値が5×109M未満、好ましくはKD値が1×109M未満で、ここで、KDは表面プラスモン共鳴分析（たとえばBiacoreシステム）またはバイオレイヤー干渉測定技術（たとえばOctet RED96システム）によって測定される。
【００８３】
実施形態11は単離された実施形態1〜10のいずれかのモノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする核酸である。
実施形態12は実施形態11の単離された核酸を含むベクターである。
【００８４】
実施形態13は実施形態12の核酸を含む宿主細胞である。
実施形態14は実施形態1〜10のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片と薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物である。
【００８５】
実施形態15は必要な被験者においてPCSK9とLDLRの結合を遮断するか、あるいはLDL取り込みを増加する方法で、前記被験者に実施形態14の薬物組成物を施用する工程を含む。
実施形態16は、必要な被験者において脂質疾患、障害または病症、代謝性疾患、障害または病症、炎症性疾患、障害または病症、感染性疾患、障害または病症を治療する方法で、前記被験者に実施形態14の薬物組成物を施用する工程を含む。
【００８６】
実施形態17は実施形態16の方法で、前記方法はさらに必要な被験者の脂質異常、代謝性疾患、炎症性疾患または感染性疾患を治療するために、被験者に別の薬剤を施用する工程を含む。
【００８７】
実施形態18は必要な被験者の脂質異常、代謝性疾患、炎症性疾患または感染性疾患を治療する方法で、被験者に実施形態14の薬物組成物を施用する工程を含む。
実施形態19は実施形態18の方法で、前記の脂質異常または代謝性疾患は高脂血症、原発性高脂血症、脂質代謝異常、混合性脂質代謝異常、ホモ型家族性高コレステロール血症であるか、あるいは前記の炎症性疾患は敗血症である。
【００８８】
実施形態20は実施形態18〜19のいずれかの方法で、前記方法はさらに必要な被験者の脂質異常、代謝性疾患、炎症性疾患または感染性疾患を治療するために、被験者に別の薬剤を施用する工程を含む。
【００８９】
実施形態21は実施形態1〜10のいずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を製造する方法で、所定の条件においてモノクローナル抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸を含む細胞を培養することによって、モノクローナル抗体または抗原結合断片を生成させ、かつ細胞または細胞培養物から抗体または抗原結合断片を回収する工程を含む。
【００９０】
実施形態22は実施形態1〜10のいずれかのモノクローナル抗体または抗原結合断片を含む薬物組成物を製造する方法であって、前記モノクローナル抗体または抗原結合断片を薬学的に許容される担体と組み合わせることによって前記薬物組成物を得る工程を含む。
【００９１】
実施形態23は必要な被験者の脂質異常、代謝性疾患、炎症性疾患、または感染性疾患、たとえば高脂血症、原発性高脂血症、脂質代謝異常、混合性脂質代謝異常、ホモ型家族性高コレステロール血症または敗血症の治療における実施形態1〜10のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片の使用である。
【００９２】
実施形態24は必要な被験者の脂質異常、代謝性疾患、炎症性疾患、または感染性疾患、たとえば高脂血症、原発性高脂血症、脂質代謝異常、混合性脂質代謝異常、ホモ型家族性高コレステロール血症または敗血症の治療における実施形態14の薬物組成物の使用である。
【００９３】
実施形態25は、必要な被験者の脂質異常、代謝性疾患、炎症性疾患、または感染性疾患、たとえば高脂血症、原発性高脂血症、脂質代謝異常、混合性脂質代謝異常、ホモ型家族性高コレステロール血症または敗血症を治療する薬物の製造における実施形態1〜10のいずれかの単離されたモノクローナル抗体または抗原結合断片の使用である。
【００９４】
実施形態26は、必要な被験者の脂質異常、代謝性疾患、炎症性疾患、または感染性疾患、たとえば高脂血症、原発性高脂血症、脂質代謝異常、混合性脂質代謝異常、ホモ型家族性高コレステロール血症または敗血症を治療する薬物の製造における実施形態14の薬物組成物の使用である。
【実施例】
【００９５】
本発明の以下の実施例はさらに本発明を説明するためのものである。もちろん、以下の実施例は本発明を限定せず、かつ本発明の範囲は添付された請求の範囲によって決まる。
実施例1-抗PCSK9抗体の製造
ヒトPCSK9タンパク質を免疫原として抗PCSK9抗体を生成させた。ヒトイムノグロブリン遺伝子組換えマウス技術によって全ヒト抗体の開発と製造を行い、初めてAbgenix（XenonマウスおよびMedarex（HuMab「mouse」）; Lonbergら、1994、ネーチャー 368: 856-859; LonbergおよびHuszar、1995、Internal Rev. Immunol. 13:65-93;  HardingおよびLonberg,、1995、Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546）に記載された。
【００９６】
パイロット試験抗体の生産、精製および検証試験を行うことによって、PCSK9に高親和力（KD＜1×10-9M）を有する抗体が得られた。PCSK9に特異的な抗体はPCSK9とLDLRの結合を遮断することができる。標準の分子生物学的方法によって生成した抗PCSK9抗体の重鎖と軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を測定し、そして表1にまとめた。
【００９７】
【表１】
0006700387.tif 000002
【００９８】
表1に示された抗PCSK9抗体の重鎖と軽鎖の可変領域は表2にまとめられた核酸配列によってコードされる。
【００９９】
【表２】
0006700387.tif 000003
【０１００】
全ヒト型の抗PCSK9抗体を製造した。当該全ヒト抗PCSK9抗体は高親和力（KD＜1×10-9M）でヒトPCSK9に結合し、かつPCSK9とLDLRの結合を遮断した。受容体配位子遮断試験およびLDL取り込み試験によって抗PCSK9抗体の生物学的活性を評価したところ、これらは体内でPCSK9とLDLRの結合を遮断し、HepG2細胞のLDLに対する取り込みを増強させ、そしてPCSK9によって誘導されたLDLR分解を阻止した。抗PCSK9抗体は脂質異常、代謝性疾患、高コレステロール血症、炎症性疾患または感染性疾患の治療に有用である。
【０１０１】
実施例2-抗PCSK9抗体の製造
（工程1）免疫原AであるHis標識PCSK9（PCSK9-His）の製造
標準の分子生物学クローン技術（SambrookおよびRussell、1989、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、第二版）によって、配列番号62の全長タンパク質配列（UniProtKB ID Q8NBP7）に相応するヒトPCSK9のコード配列（hPCSK9、配列番号61）をHisタグとともに、pCpCベクター（Invitrogen、＃V044-50）にクローンした。ポリエチレンイミン（PEI，Polysciences）およびプラスミドによって、HEK293細胞（Invitrogen）に対して一過性形質移入を行い、37℃でFreeStyle 293発現培地（Invitrogen）において増幅を行った。4日間増幅した後、培地を回収して遠心で細胞成分を除去した。培養上清に組み換えられたHisタグされたPCSK9が含有された。組み換えられたHisタグされたPCSK9を含有する培養上清液に最終濃度が10 mMになるようにイミダゾールを入れた。サンプルに0.22ミクロンの無菌フィルターを通させてNi-NTAアフィニティークロマトグラフィーを行った。緩衝液A[20mMイミダゾール含有1×PBS、pH7.2）および緩衝液B [（緩衝液A、0.1％（v/v）Trition X100,0.1％（v/v）Triton X114]でサンプルを平衡化した後、緩衝液C[1×PBS（pH7.2）、250mMイミダゾール]でHis標識PCSK9タンパク質（PCSK9-His）をNi-NTAアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶離させた。Superdex 200カラム（GEヘルスケア）でさらに溶離液を精製して高純度のHis標識組換えヒトPCSK9タンパク質を得た。サンプルを4℃で1×PBS（pH7.2）で一晩透析させた。透析後、精製されたPCSK9-Hisに0.22ミクロンの無菌フィルターを通させ、分けて-80℃で保存した。
【０１０２】
PCSK9-His免疫原を同定するために、サンプルのタンパク質の濃度および純度を測定し、そして免疫原の分子量および生物活性を測定した。
一連の体外同定方法によって、His標識hPCSK9免疫原の生物活性を評価したところ、免疫原がPCSK9の生物活性を示し、かつ投与量に依存してHepG2細胞のLDLに対する取り込みを抑制したことがわかった。生産された2バッチのHis標識hPCSK9免疫原はHepG2のLDL取り込みの抑制において、相当する生物活性を示した（図1を参照する）。この2バッチの生物活性を有するHis標識hPCSK9免疫原はマウス免疫に使用された。
【０１０３】
【表３】
0006700387.tif 000004
【０１０４】
（工程2）免疫原BであるhPCS9発現構築体の製造
ヒトPCSK9のコード配列（hPCSK9、配列番号61）をpcDNA3.1ベクター（Invitrogen）にサブクローンし、得られたプラスミドを1.0um金コロイド弾（Bio-RAD）に包埋した後、Heliosジーンガンの説明書に従い、Heliosジーンガン（Bio-rad No.165-2431）によって免疫を行った。
【０１０５】
（工程3）ハイブリドーマ細胞の融合と抗体の選別 
ヒトIg FcはマウスのFc受容体と相互作用しないため、hFcを含有する免疫原がマウスにおいて引き起こす免疫応答が弱く、モノクローナル抗体の製造の効率が低くなる。マウスのゲノムにヒトイムノグロブリン（Ig）可変領域をコードする遺伝子およびラットIg定常領域の遺伝子を導入することによって、Harbour H2L2遺伝子組換えマウスを作り、マウスにhV-rCを含むキメラIgを含有させ、同時にマウスIgの発現が不活性化された（WO2010/070263A1）。Harbour H2L2遺伝子組換えマウスは野生型マウス（たとえばBalb/c）に相当する免疫応答および抗体力価を示すことができる。
【０１０６】
（3A部分）免疫原Aで6〜8週齢のHarbour H2L2遺伝子組換えマウス（北京維通利華）を免疫させ、かつマウスを特定の病原体のない（SPF）条件で飼育した。初回の免疫において、50ugの免疫原Aを0.25mLの完全フロイントアジュバント（CFA）とともに各マウスの腹腔に注射した。免疫応答を増強するために、初回の免疫の2週間後、50ugの免疫原Aを0.25mLの不完全フロイントアジュバント（IFA）とともに各マウスの腹腔に注射した後、3週間置いて免疫強化を与えた。免疫の1週間後血液サンプルを収集した。ELISAによって血清における抗体力価および特異性を検出し、結果を表4に示す。ブランク対照は1％（w/w）BSAであった。表4で示されたOD450nm値はELISAによって測定された3回目の免疫強化の7日間後の血清抗体価値である。3回目の強化後の血清抗体価は通常少なくとも1:10,000に達した。
【０１０７】
【表４】
0006700387.tif 000005
【０１０８】
（3B部分）免疫原Bで6〜8週齢のHarbour H2L2遺伝子組換えマウス（北京維通利華）を免疫させ、そしてマウスをSPF条件で飼育した。初回の免疫において、50ugの免疫原Aを0.20mLのゲルブアジュバント（Invitrogen）とともに各マウスの尾根部（BOT）に注射した。初回の免疫の2週間後、1回目の免疫強化を与え、さらに3週間おきに免疫強化を与えた。免疫の1週間後血液サンプルを収集した。ELISAによって血清における抗体力価および特異性を検出し、結果を表5に示す。ブランク対照は1％（w/w）BSAであった。表5で示されたOD450nm値はELISAによって測定された3回目の免疫強化の7日間後の血清抗体価値である。3回目の免疫強化後の血清抗体価は通常1:10,000以上に達した。
【０１０９】
【表５】
0006700387.tif 000006
【０１１０】
（3C部分）免疫原Bで6〜8週齢のHarbour H2L2遺伝子組換えマウス（北京維通利華）を免疫させ、そしてマウスをSPF条件で飼育した。初回の免疫において、50ugの免疫原Aを0.25mLの完全フロイントアジュバント（CFA）とともに各マウスの腹腔に注射した。免疫応答を増強するために、初回の免疫の2週間後、50ugの免疫原Aを0.25mLの不完全フロイントアジュバント（IFA）とともに各マウスの腹腔に注射した後、3週間おきに免疫強化を与えた。免疫の1週間後血液サンプルを収集した。ELISAおよびFACS分析によって血清における抗体力価および特異性を検出し、結果を表6に示す。表6では、PCSK9で免疫されたマウスの血清が異なる免疫原Aとの結合のレベルを示すことが説明された。最高血清希釈度は約一百万であった。ブランク対照は1％（w/w）BSAであった。表6で示されたOD450nm値はELISAによって測定された3回目の免疫強化の7日間後の血清抗体価値である。
【０１１１】
【表６】
0006700387.tif 000007
【０１１２】
上記工程3A〜Cが完成する前、hPCSK9に対する特異的免疫応答を有するマウスを選んで融合に使用し、かつ腹膜内に100μgのhPCSK9-Hisを注射することによって、最終ブーストを与えた。3日間後、マウスを殺処分し、その脾臓細胞を収集した。脾臓細胞のサンプルに最後濃度が1％（w/w）になるようにNH4OHを入れることによって、サンプルにおける赤血球を分解させた。1000rpmでサンプルを遠心し、かつDMEM培地で3回洗浄した。脾臓細胞の活力を検出した後、高効率電気融合方法（酵素学方法、Vol.220）によって、生存する脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞SP2/0（ATCC）と5：1の比率で融合させた。
【０１１３】
融合細胞を20％FBSおよび1×ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン（HAT）培地（w/w）を含有するDMEM培地に再懸濁させ、かつ濃度を105個細胞/200μLに調整した。200uLの融合細胞を96ウェルプレートの各ウェルに入れ、37℃、5％CO2でインキュベートした。細胞の融合の14日間後、ハイブリドーマ上清液を収集してELISAによって選別した。37℃、5％(v /v) CO2の条件において、10％（w/w）熱不活性化したFBSを含有するDMEMを含む24ウェルプレートで、ELISAによってOD450nmが0.5超のクローンを増幅させた。3日間培養した後上清液を収集した。抗体のアイソタイプを測定し、かつELISAによってその組換えPCSK9D374Yタンパク質（機能獲得型突然変異体：実施例1の方法で製造された）と結合する能力を測定した（実施例3を参照する）。受容体配位子結合試験によって、ハイブリドーマ上清液のブロッキング活性を測定し（実施例4を参照する）、LDLR分解を測量する試験を行い（実施例5を参照する）、そしてPCSK9が介する細胞のLDL取り込みの遮断試験を行った（実施例6を参照する）。
【０１１４】
24ウェルプレートによる選別の結果に基づき、PCSK9と結合し、PCSK9とLDLRの間の受容体-配位子の相互作用を遮断し、かつPCSK9が介するLDL取り込みの減少を抑制するクローンを選択し、そのサブクローンを行った。37℃および5％（v/v）CO2の条件において、10％（v/v）FBSを含有するDMEM培地で96ウェルプレートにおいて有限希釈によってサブクローンした。10日間培養した後、上清液を収集し、たとえばELISAによって測定し、その組換えヒトPCSK9、PCSK9D374Y、カニクイザルPCSK9（配列番号63：実施例1の方法で製造された）およびマウスPCSK9（UniProtKB ID Q80W65、配列番号65：実施例1の方法で製造された）と結合する能力、あるいはそのPCSK9またはPCSK9D374YとLDLRの結合を遮断する能力を評価し、初期選別を行った。
【０１１５】
選択基準に合ったクローンを10％（w/w）FBS含有DMEM培地で37℃、5％（v/v）CO2の条件において増幅させ、かつハイブリドーマ細胞がその後の抗体の生成と精製に使用できるように液体窒素で冷凍した。 
【０１１６】
（工程4）リード候補抗体の生産と精製
ハイブリドーマ細胞由来の抗体の濃度が約1-10ug/mLと低く、かつ抗体の濃度が幅広く変わる。さらに、FBSおよび培地の成分は分析に干渉する可能性がある。そのため、小規模の抗体の生産と精製を行う必要がある（1〜5 mg）。
【０１１７】
T-75培養瓶において、ハイブリドーマ無血清培地（Invitrogen）で実施例2におけるハイブリドーマ細胞を培養し、かつ3代継代した。ハイブリドーマ細胞が良い状態にある時、細胞を2L培養瓶に移した。各培養瓶に500mLの生産培地を入れ、かつ細胞密度を105個細胞/mLに調整した。培養瓶を37℃の回転インキュベーターに置き、回転数は3回/分であった。ハイブリドーマ細胞を14日間培養した後、上清液を収集して細胞を除去した。その後、0.45ミクロンのフィルターで上清液をろ過した。その後、培養上清液を精製に使用したか-30℃で保存した。
【０１１８】
ハイブリドーマ培養上清液に2 mLタンパク質Gカラム（GEヘルスケア）を通させることによってモノクローナル抗体を精製した。まず、PBS緩衝液（pH7.2）でタンパク質Gカラムを平衡化した後、ハイブリドーマ培養上清液を3mL/分の一定の流速で平衡化されたタンパク質Gカラムに仕込んだ。その後、4倍体積のPBS緩衝液でカラムを洗浄した。その後、溶離緩衝液（0.1M酢酸塩緩衝液、pH2.5）で抗PCSK9抗体を溶離し、UV検出器によって溶離液のUV吸光度（A280紫外吸収ピーク）をモニタリングした。溶離液に10％の1.0M Tris-HCL緩衝液を入れることによってpHを中和し、サンプルを0.22ミクロンのフィルターによって無菌ろ過を行った。無菌ろ過された精製した抗PCSK9抗体を得た。
【０１１９】
UV吸光度（A280/1.4）で精製した抗PCSK9抗体の濃度を検出し、かつ純度および内毒素のレベルを検出した（Lonzaキット）。分析結果は表7に示す。精製した抗PCSK9抗体の内毒素濃度は1.0EU/mg未満であった。
【０１２０】
【表７】
0006700387.tif 000008
【０１２１】
実施例3-リード候補抗体の特徴付け
（A部分）ELISAによる抗PCSK9抗体と組換えPCSK9およびPCSK9D374Yタンパク質の結合の検出
ELISAによって実施例2で得られた精製された抗PCSK9抗体と組換えヒトPCSK9タンパク質（免疫原A）、PCSK9D374YおよびカニクイザルPCSK9タンパク質の結合を分析した。
【０１２２】
PBSでストレプトアビジン（カタログ番号85878、Sigma）を最終濃度が1ug / mLになるように希釈し、100uLずつ96ウェルELISAプレートの各ウェルに入れ、さらにプラスチック膜で当該プレートを密封し、かつ4℃で一晩インキュベートした。2日目に、洗浄緩衝液[0.01％（v/v）ツイン20]でプレートを2回洗浄し、さらにブロッキング緩衝液[0.01％（v/v）0.1％BSA（w/w）ツイン20]で室温で2時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を吸い取り、各ウェルに100uLずつ0.5ug/mLのビオチン化された免疫原A（hPCSK9-His）、ビオチン化されたPCSK9D374Yまたはビオチン化されたカニクイザルPCSK9タンパク質（ビオチン標識キット、Invitrogen）を入れ、そして37℃で1時間インキュベートした。洗浄緩衝液[0.01％（v/v）ツイン20]でプレートを3回洗浄し、結合しなかったPCSK9タンパク質を除去した。200uLの実施例2で得られた精製された抗PCSK9抗体を各ウェルに入れ、37℃で1時間インキュベートした。洗浄緩衝液[0.01％（v/v）ツイン20]でプレートを2回洗浄し、そして各ウェルに200uLのHRPとカップリングされた二次抗体（Sigma）を入れ、37℃で2時間インキュベートした。洗浄緩衝液でプレートを3回洗浄し、各ウェルに100μlのTMB基質を入れ、室温で30分間インキュベートした。各ウェルに100uLの停止液（0.1N HCl）を入れ、反応を停止させた。ELISAプレートリーダー（384plus SpectraMax、Molecular Devices）によって450nmにおける吸光値を測定した。結果は図2〜4および表8〜10に示す。IgG対照はラットIgGであった。
【０１２３】
【表８】
0006700387.tif 000009
【０１２４】
【表９】
0006700387.tif 000010
【０１２５】
【表１０】
0006700387.tif 000011
【０１２６】
実施例4-抗PCSK9抗体のPCSK9およびPCSK9D374YとLDLRの結合を遮断する能力の測定
野生型PCSK9およびその突然変異型PCSK9D374YはいずれもLDLRと結合し、野生型と比べ、突然変異型PCSK9D374YはLDLRに対してより高い結合親和力を有する。受容体配位子結合試験によって、抗PCSK9抗体のPCSK9およびPCSK9D374YとLDLRの結合を遮断する能力を検出した。 
【０１２７】
LDLRの細胞外ドメイン（配列番号64：全長LDLRのAla22-Arg788に相応する）をHis標識とともにクローンした（LDLRECD-His：実施例1の方法で製造された）。PBSで精製されたLDLRECD-Hisを最終濃度が1.0ug/mLになるように希釈し、100uLの希釈されたLDLRECD-Hisを96ウェルプレートの各ウェルに入れた後、プラスチック膜で封じ、4℃で一晩インキュベートした。洗浄緩衝液（PBS + 0.01％（v/v）ツイン20）でプレートを2回洗浄し、そしてブロッキング緩衝液（PBS + 0.01％（v/v）BSA + 1％ツイン20（w/w））で室温で2時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を吸い出し、50uLの実施例2で得られた精製した抗PCSK9抗体を96ウェルプレートの各ウェルに入れた。各ウェルに50μLずつ0.5μg/mLのビオチン化された組換えhPCSK9-Hisまたはビオチン化されたPCSK9D374Yタンパク質（ビオチン化はビオチン標識キットによって行われた、Invitrogen）を入れ、混合し、そして37℃で2時間インキュベートした。洗浄緩衝液（PBS + 0.01％（v/v）ツイン20）でプレートを3回洗浄した。その後、各ウェルに100uLのHRPとカップリングされたストレプトアビジン（Sigma）を入れ、37℃で1時間インキュベートした。その後、洗浄緩衝液でプレートを3回洗浄し、かつ100uLのTMB基質を各ウェルに入れた。室温で15分間インキュベートした後、50uLの停止液（0.1N HCl）を入れて反応を停止させた。ELISAプレートリーダー（384plus SpectraMax、Molecular Devices）によってOD450nmにおける吸光値を検出した。結果は図5〜6および表11〜12に示すように、抗PCSK9抗体がPCSK9およびPCSKD374YとLDLRの結合を遮断することができることが示された。
【０１２８】
【表１１】
0006700387.tif 000012
【０１２９】
【表１２】
0006700387.tif 000013
【０１３０】
実施例5-PCSK9が介するLDLR分解を測定する試験
トリプターゼで対数期のHepG2細胞（ATCC）を消化し、遠心して10％（w/w）牛胎児血清が補充されたMEM培地（Invitrogen、カタログ番号11095-080)に再懸濁させた。細胞密度を3×105個細胞/mLに調整し、そして細胞を24ウェルプレートの各ウェルに入れた。プレートを6時間インキュベートしてHepG2細胞を付着させた後、培地を吸い取り、10％（w/w）LPDS（Kalen生物医薬有限責任公司、880100-2）が補充されたMEM培地を添加して一晩インキュベートした。2日目に、実施例2で得られた0.4ug/mLのPCSK9D374Yと抗PCSK9抗体を混合して24ウェルプレートに入れ、それを37℃で4時間インキュベートした。10％LPDSが添加されたMEM培地を捨て、PBSでプレートを2回洗浄した。ベルセン溶液（Invitrogen）でプレートからHepG2細胞を分離させて収集した。細胞をPBSで2回洗浄し、細胞数を測定し、かつPBSで細胞密度を2×106個細胞/mLに調整した。細胞懸濁液にブロッキング緩衝液[1％（w/w）FBS PBS]を入れ、そして96ウェルFACSプレート（FACS Calibur，BD）の各ウェルに100uLずつ細胞懸濁液を入れ、当該96ウェルFACSプレートを氷上に15分間インキュベートした後、遠心した。ブロッキング緩衝液を吸い取り、各ウェルに100μLずつ1ug /μLのLDLR抗体（Progen、61009）を入れ、氷上で15分間インキュベートした。FACS緩衝液[1％（w/w）BSA HBSS]でプレートを2回洗浄し、各ウェルに100uLずつAlexa-488とカップリングされた抗ウサギ二次抗体（モレキュラープローブス社、A-11034）を入れ、氷上で15分間インキュベートした。FACS緩衝液でプレートを3回洗浄し、かつ最後の洗浄後100uLのFACS緩衝液に再懸濁させた。FACS Calibur（BD）によって平均蛍光強度（MFI）を検出し、結果は図7および表13に示す。IgG対照はラットIgGで、表中の値は細胞群の平均蛍光強度。結果では、抗PCSK9抗体は投与量に依存してPCSK9D374Yで誘導されたHepG2細胞におけるLDLR分解を抑制したことが示された。
【０１３１】
【表１３】
0006700387.tif 000014
【０１３２】
実施例6-PCSK9が介するHepG2細胞におけるLDL取り込みの抑制を測定する試験
トリプターゼで対数期のHepG2細胞（ATCC）を消化し、遠心して10％（w/w）牛胎児血清が補充されたMEM培地（Invitrogen、カタログ番号11095-080)に再懸濁させた。細胞密度を5×105個細胞/mLに調整し、細胞をPDLで被覆された96ウェルプレート（Millipore、A-003-E）に入れた。プレートを6時間インキュベートしてHepG2細胞を付着させた後、培地を吸い取り、10％（w/w）LPDS（Kalen生物医薬有限責任公司、880100-2）が補充されたMEM培地を添加して一晩インキュベートした。10ug/mLのBODIPY＜登録商標＞ FL LDL（Invitrogen，L3483）、0.5ug/mLのPCSK9D374Yおよび実施例2で得られた抗PCSK9抗体を混合して96ウェルプレートに入れ、それを6時間インキュベートした。培地を吸い取り、PBSでプレートを2回洗浄し、M5プレートリーダー（モレキュラーデバイス）によって520nm/485nmにおける蛍光強度を測定した。結果は図8および表14と15に示すように、抗PCSK9抗体が投与量に依存してPCSK9D374Yが介するLDL取り込みに対する抑制を遮断することが示された。
【０１３３】
【表１４】
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【０１３４】
【表１５】
0006700387.tif 000016
【０１３５】
実施例7-抗PCSK9抗体可変領域におけるアミノ酸配列の同定
全RNAの分離：実施例2で得られたハイブリドーマクローンの上清液を同定した（すなわち生物活性の検証と測定、実施例3〜6）後、遠心して5×107個のハイブリドーマ細胞を収集した。1mLのTrizolを細胞の沈殿に入れ、混合して1.5mL遠心管に移し、室温で5分間インキュベートした。サンプルに0.2mLのクロロホルムを入れ、15秒ボルテックスした。2分間置いた後、混合物を4℃、12000gで5分間遠心した。上清液を収集し、新しい1.5mL遠心管に移し、0.5mLのイソプロパノールを入れ、軽く混合し、サンプルを室温で10分間インキュベートした。サンプルを4℃、12000gで15分間遠心した。上清液を吸い出し、沈殿物を1mLの75％（v/v）エタノールで洗浄した。混合物を4℃、12000gで5分間遠心し、上清液を捨て、沈殿物を自然乾燥した。沈殿物にDEPCで処理された水（55℃水浴10分間）を入れて全RNAを得た。
【０１３６】
逆転写とPCR：1ugのRNAおよび逆転写酵素を最終体積が20uLの反応混合物に入れ、そして混合物を42℃で60分間インキュベートした後、70℃で10分間インキュベートすることで反応を停止させた。1uL cDNA、25 pmol各プライマー、1uL DNAポリメラーゼ、250umol dNTPsおよび緩衝系を含む50uLのPCR反応混合物を調製した。PCRプログラムは以下の通りに設定された。95℃で3分間変性させ、35サイクルの変性（95℃30秒）、アニーリング（55℃30秒）および伸長（72℃35秒）の後、72℃で最後に5分間伸長させることによって、PCR産物を得た。使用された市販の逆転写キットはPrimeScript RT Master Mix（Takara，RR036）で、市販のQ5ハイフィデリティーポリメラーゼPCRキットはNEB（M0492）からのものであった。
【０１３７】
クローンと配列決定：アガロースゲル電気泳動によって5uLのPCR産物を検出し、NucleoSpin Gel& PCR精製キット（MACHEREY-NAGEL、740609）によってアガロースゲルからサンプルを回収した。連結反応：50ngのサンプルに50ngのTベクター、0.5uLのリガーゼおよび1uLの緩衝液を入れ、水で最終体積が10uLになるように調整した。T4 DNAリガーゼ（NEB，M0402）で反応混合物を16℃で30分間インキュベートした。氷の上で5分間インキュベートされた100uLの感受性細胞（Ecos 101感受性細胞、Yeastern、FYE607）に5uLの連結産物を入れ、42℃で1分間熱ショックさせ、さらに氷の上で1分間インキュベートした。650uLの抗生物質を含まないSOC培地を入れて細胞を回収し、振とうしてインキュベーターにおいて37℃、200rpmで30分間インキュベートした。200uLの各細菌培養物を抗生物質を含有するLB寒天プレートに塗布し、37℃で一晩置いた。翌日に、TベクターのプライマーであるM13FおよびM13RでPCR反応を行った。ピペットチップで細菌集落を取ってPCR反応混合物に浸漬させ、上下に吸い取った。半分の反応混合物を100nMアンピシリンを含有するLB寒天プレートに移した。PCR反応終了後、5uLのPCR産物を取ってアガロースゲル電気泳動によって検出し、陽性サンプルを配列決定分析に付した（Kabat、1991、「目的注目タンパク質配列」、NIH、Bethesda、MD）。配列決定の結果は表1〜2に示す。
【０１３８】
実施例8-全ヒト抗PCSK9抗体の形質転換、発現および精製 
（工程1）プラスミドの構築と製造：実施例7で得られた抗PCSK9抗体の重鎖と軽鎖可変領域の配列。抗PCSK9抗体の重鎖可変領域の配列をシグナルペプチドおよびヒト重鎖IgG1定常領域を含有する発現ベクターにサブクローンした。抗PCSK9抗体の軽鎖可変領域の配列をシグナルペプチドおよびヒト抗体の軽鎖κ定常領域を含有する発現ベクターにサブクローンした。配列決定によって組換えプラスミドを検証・確認した（配列決定方法は実施例7と同様である）。キット（MACHEREY-NAGEL）によってアルカリ溶解を行うことによって、組換えプラスミドの純度と質量を向上させ、かつ0.22uMフィルター（Millpore）でプラスミドをろ過した。精製されたプラスミドを形質移入に使用した。
【０１３９】
（工程2）形質移入：37℃、130RPM、8％CO2（v/v）の条件において、FreeStyle 293培地（Invitrogen）でHEK293E細胞（Invitrogen）を培養した。HEK293E細胞の細胞密度を1〜1.5×10 6/mLに調整し、形質移入に使用した。10％（v/v）F68（Invitrogen）をFreeStyle 293培地に入れ、最終濃度が0.1％（v/v）で、培地Aとした。5mLの培地Aを200ug/mL PEI（Sigma）と混合することによって、培地Bを生成させた。5mLの培地Aを100ug/mL 工程1で得られた組換えプラスミドと混合することによって、培地Cを生成させた。5分間インキュベートした後、培地Bと培地Cを混合して15分間インキュベートすることによって、混合物Dを生成させた。10mLの混合物Dをゆっくり100mLのHEK293E細胞に入れ、PEIが局部に集中しないように連続に撹拌した。HEK293E細胞を振とうして一晩インキュベートした。翌日に、最終濃度が0.5％（w/v）になるようにペプトンを入れた。約5〜7日目に、抗体の力価を検出した。約6〜7日目に、HEK293E培養物を遠心し（30分間、3500RPM）、上清液を収集して0.22uMフィルターでろ過することによって精製した。  
【０１４０】
（抗体3）抗体の精製：タンパク質Aカラム（GE）を0.1M NaOHで30分間洗浄したか、5倍カラム体積の0.5M NaOHで内毒素を除去した。長時間に使用されていないカラムは1M NaOHで少なくとも1時間浸漬し、内毒素を含まない水で中性pHまで洗浄し、かつ10倍ベッド体積の1％Triton×100で洗浄した。その後、5倍カラム体積のPBS（PBSリン酸塩緩衝液、pH7.2）でカラムを平衡化した。工程2で得られたろ過上清液をカラムにかけ、必要によって流出物を収集した。5倍カラム体積のPBSでカラムを洗浄した後、5倍カラム体積の0.1Mグリシン-HCl pH3.0で溶離させた。0.5倍カラム体積の1M Tris-HCl（NaCl 1.5M）pH8.5で抗PCSK9抗体を含有する溶離液を中和した。内毒素の汚染を避けるように、ヒト抗PCSK9抗体を1×PBSで4時間透析した。透析後、分光光度法またはキットによって抗PCSK9抗体の濃度を測定し、HPLC-SECによって抗体の純度を測定し、内毒素検出キット（Lonza）によって内毒素のレベルを測定した。全ヒト抗PCSK9抗体を同定し、結果は図9〜11と17〜19および表16〜21に示す。 
【０１４１】
【表１６】
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【０１４２】
【表１７】
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【０１４３】
【表１８】
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【０１４４】
【表１９】
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【０１４５】
【表２０】
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【０１４６】
【表２１】
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【０１４７】
受容体配位子結合試験によって、キメラ抗PCSK9抗体から転換された全ヒト抗PCSK9抗体がPCSK9とLDLRの結合を遮断することができることが実証された。結果は図12〜13と20〜21および表22〜25に示すように、全ヒト抗PCSK9抗体がPCSK9およびPCSKD374YとLDLRの結合を遮断することができることが示された。IgG対照はヒトIgGであった。
【０１４８】
【表２２】
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【０１４９】
【表２３】
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【０１５０】
【表２４】
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【０１５１】
【表２５】
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【０１５２】
メラ抗PCSK9抗体から転換された全ヒト抗PCSK9抗体がPCSK9D374Yが介するLDL取り込みの減少を抑制することができた。結果は図14〜16と22および表26〜27に示すように、全ヒト抗PCSK9抗体が投与量に依存してPCSK9D374Yが介するLDL取り込みに対する抑制を遮断することが示された。IgG対照はヒトIgGであった。
【０１５３】
【表２６】
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【０１５４】
【表２７】
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【０１５５】
実施例9-Octed Red 96による結合と解離定数の検出
解離定数はOcted red 96（Fortiebio）によって測定された。詳細な操作および方法はメーカーによって提供される装置説明書に従って行われる。つまり、AHCセンサー（抗ヒトFcセンサー、Fortiebio）によって親和力の測定を行った。抗PCSK9抗体を0.1％（w/w）BSAおよび0.02％（v/v）Tween20を含有するPBS緩衝液（pH7.4）で10ug/mLに希釈し、かつAHCセンサーでインキュベートした。5つの異なる濃度の組換えhPCSK9-His（100nMまたは400nMの開始濃度から2倍の連続希釈されたもの）を抗体が入ったAHCセンサーと30℃で3分間インキュベートした。さらに反応混合物を0.1％（v/w）BSAおよび0.02％（v/v）Tween20を含有するPBS緩衝液（pH7.4）で30℃で5分間インキュベートした。Octet Red 96によってリアルタイムで抗PCSK9と免疫原Aの結合と解離シグナルを記録した。Octet Userソフトによって親和力、結合および解離定数を確認し、結果を表28に示す。
【０１５６】
【表２８】
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【０１５７】
実施例10-Biacoreによる結合と解離定数の検出
抗ヒトFc IgGの流動セル1と2への固定化：HBS-EP+（10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05％P2O、pH 7.4）を流動緩衝液として使用し、かつ固定化ウィザードテンプレート（immobilization wizard template）で抗ヒトFc IgGの固定化を行った。新しく混合された50mmol/L NHSと200mmol/L EDCでSシリーズCM5センサーチップの流動セル1と2を活性化させた。10mM NaAC（pH4.5）に希釈された20μg/mLの抗ヒトFc IgGを活性化された流動セル1と2に注射した。残った活性カップリング部位を1Mエタノールアミンでブロッキングした。
【０１５８】
組換えHisで標識されたhPCSK9タンパク質を50nMに希釈した後、HBS-EP +緩衝液で2倍の連続希釈を4回行った。His-標識のhPCSK9タンパク質の濃度は0nM、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nMおよび50nMであった。HBS-EP+を流動緩衝液として使用してKDの測定を行った。各抗体を10uL/minの流速でCM5センサーの流動セル2に注射することによって、230RU応答をさせた。その後、製造されたHis-標識のhPCSK9タンパク質を30uL/minの流速で流動セル1と2に注射し、180秒持続した。緩衝液の流動を400秒維持して（30uL/min）解離の測定に使用した。表面のテスト抗体を除去するため、pH 1.5の10mMグリシン-HClを20秒（30uL/min）で注射した。流動セル1を参照流動セルとして使用した。連続に希釈された各濃度のHis-標識のhPCSK9タンパク質に対し、上記工程を繰り返した。Biacore T200評価ソフト1.0によって各抗体のKD値を評価し、1：1結合モデルでデータをフィットした。結果は表29に示す。
【０１５９】
【表２９】
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【０１６０】
実施例11-PCSK9抗体のPCSK9が介するLDLR分解に対する影響
SPF条件において9〜10週齢のC57BL/6マウスを飼育した。マウスをランダムに5つの群に4匹ずつ分けた。1日目に、マウスの腹膜内に30mg/kg、3mg/kgまたは0.3mg/kgの被験抗PCSK9抗体（たとえば139G1C8または96F8C6）、対照IgGまたは溶媒を施用した。2日目に、すべてのマウスの静脉内に組換えヒトPCSK9タンパク質を施用した（30ug/マウス）。PCSK9注射の1時間後、マウスを殺処分してその肝臓を得た。マウスLDLR（mLDLR）に対する抗体およびマウスβ-アクチン（mβ-アクチン）に対する抗体で肝臓分解物のウェスタンブロット解析を行った。密度測定法によってタンパク質バンドを定量し、mLDLRとmβ-アクチンの比をプロットした。結果は図23AとBに示すように、抗PCSK9抗体が体内でPCSK9が介するLDLR分解を抑制したことが示された。  
【０１６１】
実施例12-示差走査熱量測定法（DSC）による抗体の熱安定性の検出
サンプル緩衝液で全ヒト抗PCSK9抗体を1mg/mLに調整し、最終体積は約700uLであった。パラメーターは以下の通りに設定した（VP-DSC）。開始温度30℃、最終温度100℃、走査速度50℃/時間で、再走査回数は0で、プレスキャンは恒温で3分間で、ポストスキャンは恒温で0分間で、後サイクルは恒温25℃で、ろ過時間は25秒で、フィードバックモード/ゲインは無しで、細胞充填パラメーターは35℃であった。得られたタンパク質-緩衝液の熱分析図の結果は、相応する緩衝液-緩衝液走査値を引くことによって処理した後、ベースラインをトレースラインにフィットした。OriginTM 7.0ソフトによって熱分析図で観察された各ピークの最大値におけるTmsを記録した。結果を図24に示す。
【０１６２】
実施例13-抗体の凍結・解凍安定性
全ヒト抗PCSK9抗体の凍結・解凍安定性は以下のように同定された。100uLの各抗PCSK9抗体の少量の冷凍原液を室温で解凍した。完全に解凍すると、サンプルを-80℃の冷蔵庫で快速に冷凍し、かつ-80℃で少なくとも2時間維持した後、さらに室温で解凍した。サンプルに対して同様の冷凍/解凍のサイクルを3回行った。目視で沈殿の状況をチェックした。3回の冷凍/解凍のサイクル後、サンプルから20uLの少量試料を取ってサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）分析を行った。HPLC-SECによって特徴付け、冷凍/解凍のサイクルの前と後の全ヒト抗PCSK9抗体の安定性を分析した。図25に示された結果から、3回の冷凍/解凍のサイクル後、単量体のIgGはテストされた各抗PCSK9抗体の95％以上を占めたことが示された。   
【０１６３】
実施例14-抗体の溶解度
4℃において、10mgのIgGを14000gの遠心ろ過器（Amicon Ultra-0.5mL 30K）で＞100mg/mLまで濃縮することによって、全ヒト抗PCSK9抗体の溶解度を同定した。2mLまたはそれ以上のIgGを遠心ろ過器に入れ、4℃で14000gで濃縮させた。遠心の設定時間は2 min、3 min、5 min、8 min、15 minおよび20 min、毎回に20uL分けて収集管に入れ、分光光度計によってA280において濃度を検出した。濃度が100mg/mLに達した時、遠心を止めた。HPLC-SECの同定に関し、6uLの濃縮サンプルをHPLC-SECカラムに注射し、ピーク面積に基づいて単量体および多量体の百分率を確認した。図26に示された結果から、テストされたすべての全ヒト抗PCSK9抗体が100mg/mL超の溶解度を有し、かつテストされたすべての全ヒト抗PCSK9抗体に対して単量体IgGが95％超であったことが示された。
【０１６４】
実施例15-抗PCSK9抗体の親和性成熟過程
（工程1）CDR突然変異誘発ライブラリーの構築と検証
1．ファージ発現ベクターの構築とscFvディスプレイの検証：実施例6の方法によって、抗PCSK9抗体98F8C6の重鎖および軽鎖の可変領域の配列を得た。オーバーラップPCRによって重鎖可変領域、リンカーおよび軽鎖可変領域をコードする核酸をアセンブルし、scFvを生成させた。PCR産物をファージベクターに連結した後、TG1細胞に導入した。アンピシリン選択プレートからの陽性クローンを選択し、そのファージ発現ベクターを回収して配列決定を行った。
【０１６５】
2．CDR突然変異誘発ライブラリーの設計：CDR位置はKabat番号によって定義された。典型的な抗体構造において、HCDR3およびLCDR3のドメインは抗原認識のコアインタフェースを提供し、ほかのCDRに囲まれている。そのため、抗PCSK9抗体のどのCDRが抗原結合に貢献するかというような構造情報が欠けている状況において、HCDR3およびLCDR3はライブラリー構築の最初の標的になる。NNKプライマー（N=任意のヌクレオチド、K=G、T）でCDR3環におけるアミノ酸残基をランダムに突然変異させた。各バリアントにおける突然変異の数を抑えるために各位置の突然変異率を50％に維持し、かつ最大限に元の結合エピトープを残した。長いCDR（＞10個のアミノ酸）を2つまたは3つの重なる断片に分けた。96F8C6クローンのHCDR3の大きさから、CDR-H3-1とCDR-H3-2と2つの重なる断片に分けられ、そして単独のランダムライブラリーにおいて各断片を突然変異させた。CDR突然変異に使用されたプライマーは以下の通りである。
【０１６６】
配列番号70 （CDRH3-1_mut-F）
gtgtattactgtgcgaga(NNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNK)tataactactactactac
配列番号71 （CDRH3-2_mut-F）
attactatggttcggggagt(NNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNK)tggggccaagggaccacg
配列番号72 （CDRL3_mut-F）
attttgcaacttattactgc(NNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNK)tttggccaggggaccaagc
3．ライブラリーの構築：オーバーラップPCRによってランダム突然変異ライブラリーを構築した。PCR産物を制限酵素SfiIで50℃で2時間消化した後、T4リガーゼで16℃で一晩SfiIで消化されたファージに連結した。各ライブラリーをTG1大腸菌に電気的形質転換した。
【０１６７】
4．ライブラリーの検証：各ライブラリーの大きさは108〜109個のクローンの間であった。各ライブラリーは50個のクローンの配列決定を行い、野生型配列の配列アラインメントによって突然変異ライブラリーの品質、たとえば突然変異位置や突然変異率を評価した。
【０１６８】
5．ライブラリーのパッケージングと滴定：細菌ライブラリーを増幅させた後、補助ファージをパッケージングされたファージ粒子に入れて以下のような選別工程に使用した。新しく感染したTG1クローンを計数することによって精製されたファージライブラリーの力価を測定した。
【０１６９】
（工程2）親和性によるライブラリーのパンニング         
平衡条件において、ビオチン化された可溶性hPCSK9を溶液相における抗原とし、CDR突然変異ScFvファージライブラリーに対してパンニングした。まず、2％のMPBS（2％牛乳を含有するPBS溶液）で使用される遠心管およびストレプトアビジン磁気ビーズを室温で2時間ブロッキングした。2％のMPBSにおいて、ビーズでライブラリーを予め消耗した後、ブロッキングされた管の中でビオチン-hPCSK9と混合し、ローテーターで室温で2時間インキュベートした。1回目のパンニングにおいて、使用された抗原濃度は10nMで、そして後の回で毎回10倍で減少した。ScFv-抗原-ビオチン複合体をストレプトアビジン磁気ビーズと混合して15分間インキュベートした。磁石でビーズを収集し、1.5の微量遠心管に移し、それぞれMPBST（2％牛乳、0.5％ツイン20のPBS溶液）、PBST（0.5％ツイン20のPBS溶液）、MPBS（2％牛乳のPBS）およびPBSで5回洗浄した。37℃において、1mLのトリプターゼ（PBS中10ug/mL）でビーズから結合したファージを30分間溶離させた。磁石でビーズを管の一側に吸い、溶離されたファージを含有する溶液を4mLのTG1（A600＝0.6）を含有する管に移し、パンニングライブラリーの滴定に使用した。
【０１７０】
毎回のパンニング後、得られたクローンをシークエンシングして突然変異の濃縮を確認した。3回または4回のパンニング後、得られたクローンを選別した。
（工程3）親和力が増加した結合バリアントのELISA選別 
3回または4回のパンニング後、500個超の単一クローンが選ばれた。IPTGによってScFvバリアントの発現を誘導し、かつ強いELISAシグナルを有するクローンをシークエンシングした。
【０１７１】
（工程4）親和力が向上したバリアントの真核生産と親和力による特徴付け 
濃縮クローンからのVHおよびVL配列をIgG発現ベクターにクローンし、相応するリーダー配列と定常領域の間に挿入した。一過性形質移入によって得られたベクターをHEK293細胞に導入した。実施例8に記載のように、5〜7日後、タンパク質Aカラムで親和性精製によって培養上清液におけるIgGを精製した。親和力が向上したバリアントのVH配列は表30に示した。これらのバリアントの軽鎖配列は98F8C6抗体の軽鎖のもの、たとえば、それぞれ配列番号38〜40のLCDR 1〜3、または配列番号37の軽鎖可変領域、またはそのコード配列の配列番号58と同様である。
【０１７２】
【表３０】
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【０１７３】
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【０１７４】
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【０１７５】
実施例10に記載のように、BiacoreによってヒトPCSK9に対する親和力が向上した抗体の最終解離定数（KD）を測定し、データを表31に示す。親和力が向上した抗体の組換えPCSK9D374Yによって誘導されたLDL取り込みに対する影響を測定したが、結果は図27AとBおよび表32に示す。
【０１７６】
【表３１】
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【０１７７】
【表３２】
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【０１７８】
本発明を詳しく説明する場合、その具体的な実施形態を参照し、本発明の主旨と範囲を逸脱しない限り、様々な変更や修飾を加えることができることは、当業者にとって明らかである。
【０１７９】
参考文献
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【図１】
0006700387.tif 000036
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【配列表】
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