(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、
ａ）酵母と、
ｂ）前記酵母によって発現された少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原と
を含み、
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１０または配列番号１３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２】
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１０または配列番号１０の位置２〜４１０を含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項３】
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１３または配列番号１３の位置２〜４１０を含むアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項４】
酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、
ａ）酵母と、
ｂ）前記酵母によって発現された少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原と
を含み、
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１２または配列番号１５に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する融合タンパク質である、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項５】
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１２または配列番号１５のアミノ酸配列を有する融合タンパク質である、請求項４に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項６】
前記酵母がサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項７】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項８】
前記酵母が酵母菌体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項９】
前記酵母菌体が死滅されている、請求項８に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項１０】
前記酵母菌体が熱不活性化されている、請求項８に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項１１】
対象への投与に好適な薬学的に許容可能な賦形剤中に製剤化されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項１２】
酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、
ａ）不活性化酵母菌体と、
ｂ）配列番号１０の位置２〜４１５のアミノ酸配列を含むブラキュリー融合タンパク質とを含み、
前記ブラキュリー融合タンパク質が前記酵母によって発現されたものであり、
前記組成物がブラキュリー特異的Ｔ細胞反応を誘発する、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項１３】
前記融合タンパク質が配列番号１２のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項１４】
酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、
ａ）不活性化酵母菌体と、
ｂ）配列番号１３の位置２〜４１５のアミノ酸配列を含むブラキュリー融合タンパク質とを含み、
前記ブラキュリー融合タンパク質が前記酵母によって発現されたものであり、
前記組成物がブラキュリー特異的Ｔ細胞反応を誘発する、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項１５】
前記融合タンパク質が配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項１６】
前記ブラキュリー融合タンパク質の発現がプロモータＣＵＰ１の制御下にある、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項１７】
前記酵母がサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項１８】
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項１９】
対象への投与に好適な薬学的に許容可能な賦形剤中に製剤化されている、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２０】
ブラキュリーを発現する癌の治療に使用するための酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、ブラキュリーを発現する癌を有する対象に投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２１】
癌を有する対象における癌の転移進行の低減、停止、逆転、遅延、または予防に使用するための酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、転移進行を起こしているか、転移進行を起こすリスクを有するか、または転移進行を起こし始めると予測される癌を有する対象に投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２２】
ブラキュリー発現癌の発症の予防または遅延に使用するための酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、対象に投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２３】
脊索腫の治療に使用するための酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、脊索腫を有する対象に投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２４】
前記対象が他の癌療法で治療されているかまたは治療されたことがある、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２５】
前記療法が、放射線療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、標的癌療法、養子Ｔ細胞移入、または１種以上の追加の免疫療法組成物の投与から選択される、請求項２４に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２６】
癌を有する対象における腫瘍細胞の化学療法耐性または放射線耐性の低減または予防に使用するための酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、癌を有しかつ化学療法および放射線療法の少なくとも一方を受けている前記対象に投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２７】
前記対象における腫瘍負荷の低減、前記対象の生存率の増加、および前記対象における腫瘍成長の阻害の少なくとも一つを行うための、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２８】
前記癌が、乳癌、骨癌、脊索腫、小腸癌、胃癌、膵癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、およびそれらの転移癌からなる群から選択される、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項２９】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染に関連する疾患または病態の治療または予防に使用するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
【請求項３０】
ブラキュリーを発現する癌を治療するための医薬の調製における、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の免疫療法組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、保健福祉省の一機関である国立衛生研究所との共同研究開発契約の履行時に作成された。米国政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
【０００２】
共同研究契約に関する言明
本発明は、２００８年５月８日に締結された共同研究開発契約の当事者によってまたは当事者を代表してなされた。共同研究開発契約の当事者は、グローブイミューン・インコーポレイテッド（ＧｌｏｂｅＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）および国立衛生研究所の研究所、センター、または部門である国立癌研究所によって代表される米国保健福祉省である。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、ＥＦＳ−ウェブ（ＥＦＳ−Ｗｅｂ）によりテキストファイルとして電子的に提出された配列表を含む。テキストファイルは、「７７９７−３−ＰＣＴ＿ＳＴ２５」という名称であり、バイト単位で５０ＫＢのサイズを有し、２０１６年７月２６日に登録された。テキストファイルに含まれる情報は、連邦行政命令集第３７編１．５２（ｅ）（５）の規定により、その全体が参照により本出願に組み込まれる。
【０００４】
本発明は、概して、ブラキュリーの発現または過剰発現によって特徴付けられる癌を予防および／または治療するための改善された酵母−ブラキュリー免疫療法組成物および方法、ならびに酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の製造および使用を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
「Ｔ」としても知られるブラキュリーは、中胚葉転写因子であると共に遺伝子のＴボックス複合体のメンバーである。ブラキュリーをコードする遺伝子（ヒトではＴ遺伝子またはブラキュリー遺伝子と呼ばれる）は、ナディン・ドブロボルスカヤ−ザバドスカヤ（Ｎａｄｉｎｅ  Ｄｏｂｒｏｖｏｌｓｋａｉａ−Ｚａｖａｄｓｋａｉａ）により、ヘテロ接合動物の尾長および仙椎に影響を及ぼす突然変異を介してマウスにおいて１９２７年に初めて同定された。ブラキュリー遺伝子は、１９９０年にハーマン（Ｈｅｒｍａｎｎ）ら（非特許文献１）によりマウスにおいて、および１９９６年にエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら（非特許文献２）によりヒトにおいてクローニングされた。エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）らはまた、ヒトブラキュリーの推定アミノ酸配列も記載した。
【０００６】
転写因子のＴボックスファミリーのメンバーとして、ブラキュリーは、パリンドロームコンセンサス配列に結合する高度に保存されたＤＮＡ結合ドメインモチーフ（「Ｔボックス」またはＴドメインと呼ばれる）を含有する。ブラキュリーは、他のＴボックスタンパク質と同様に、初期発生に役割を果たすことが示されており、脊椎動物において背側中胚葉の形成および分化ならびに体軸発生にきわめて重要である（たとえば、（非特許文献３）、（非特許文献４）、（非特許文献５）、（非特許文献６）、（非特許文献７）を参照されたい）。より最近では、パレナ（Ｐａｌｅｎａ）らは、ブラキュリーが様々なヒト腫瘍組織および癌細胞系で発現されることを実証すると共に、正常ドナーおよび癌患者においてブラキュリーのペプチドを用いてブラキュリー特異的Ｔ細胞系を発生させ得ることを示した（非特許文献８）。フェルナンド（Ｆｅｒｎａｎｄｏ）らによる研究では、ブラキュリーは、ヒト腫瘍細胞で上皮間葉転換（ＥＭＴ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を促進して腫瘍細胞に間葉表現型ならびに遊走能および浸潤能を付与すると共に、腫瘍細胞周期進行を減衰させることが示された（非特許文献９）。したがって、ブラキュリーは癌の転移進行に関与する。
【０００７】
癌は、世界中で主要な死亡原因であり、癌の有効な治療法の開発は、依然として研究および臨床開発の最も活発な分野の１つである。癌を治療および予防するための様々な革新的手法が提案されてきたが、多くの癌は、依然として高い死亡率を有し、治療が困難であるかまたは従来の治療法に対して比較的不応性であり得る。ブラキュリー発現に関連する癌は、乳房、小腸、胃、腎臓、膀胱、子宮、卵巣、精巣、肺、結腸、骨（脊索腫を含む）、および前立腺を含めて、様々な組織に見出されることがあり、転移癌および後期癌を含む。加えて、ブラキュリーは、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ：ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、エプスタイン・バーウイルス形質転換Ｂ細胞、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫などのＢ細胞由来の腫瘍で発現される。したがって、ブラキュリーは多数のヒト癌の一因となると思われる。ブラキュリーは癌免疫療法の標的とすることが提案されてきたが（たとえば、前掲の（非特許文献８）、前掲の（非特許文献９）、および（特許文献１）を参照されたい）、これは比較的新しい癌標的であるため、ブラキュリーの発現または過剰発現に関連する癌を効果的に治療および／または予防する新しい免疫療法製剤の必要性が当技術分野に依然として存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００８／１０６５５１号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ハーマン（Ｈｅｒｒｍａｎｎ）ら著、１９９０年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４３巻、ｐ．６１７〜６２２
【非特許文献２】エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら著、１９９６年、ゲノム・リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．）、第６巻、ｐ．２２６〜２２３
【非特許文献３】ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）ら著、１９９０年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３４３巻、第６２５９号、ｐ．６５７〜６５９
【非特許文献４】ベディントン（Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ）ら著、１９９２年、ディベロップメント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（補遺）、ｐ．１５７〜１６５
【非特許文献５】シュルテ−メルカー（Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｍｅｒｋｅｒ）ら著、１９９４年、ディベロップメント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、第１２０巻、ｐ．１００９〜１０１５
【非特許文献６】キスパート（Ｋｉｓｐｅｒｔ）およびハーマン（Ｈｅｒｒｍａｎｎ）著、１９９４年、ディベロップメンタル・バイオロジー（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．）、第１６１巻、ｐ．１７９〜１９３
【非特許文献７】ショウェル（Ｓｈｏｗｅｌｌ）ら著、２００４年、ディベロップメンタル・ダイナミクス（Ｄｅｖ  Ｄｙｎ）、第２２９巻、ｐ．２０１−２１８
【非特許文献８】パレナ（Ｐａｌｅｎａ）ら著、２００７年、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）、第１３巻、第８号、ｐ．２４７１〜２４７８
【非特許文献９】フェルナンド（Ｆｅｒｎａｎｄｏ）ら著、２０１０年、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）、第１２０巻、第２号、ｐ．５３３〜５４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ブラキュリーの発現または過剰発現に関連する癌を効果的に治療および／または予防する新しい免疫療法製剤の必要性が当技術分野に依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一実施形態は、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、ａ）酵母と、ｂ）酵母によって発現された少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原とを含み、改変ブラキュリー抗原が、野生型ブラキュリーの位置４２〜２２９のいずれか１つ以上のアミノ酸の欠失または置換から選択される少なくとも１つの改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有し、ブラキュリー抗原が、野生型ブラキュリーと比較して破壊されたＤＮＡ結合部位を有する、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物に関する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、野生型ブラキュリーと比較して破壊されたＤＮＡ結合活性を有する。さらに他の態様では、酵母は、野生型ブラキュリーを発現する酵母と比較して低減されたフロキュレーション表現型を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、野生型ブラキュリーの位置６６〜２１７のいずれか１つ以上のアミノ酸の欠失または置換から選択される少なくとも１つの改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、野生型ブラキュリーの位置１９８〜２２２のいずれか１つ以上のアミノ酸の欠失または置換から選択される少なくとも１つの改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、Ｌｙｓ６６、Ａｒｇ６９、Ａｒｇ７０、Ａｒｇ１０１、Ｌｙｓ１０３、Ｌｙｓ１４７、Ａｓｎ１５０、Ｌｙｓ１５１、Ｓｅｒ１６２、Ｔｈｒ１９６、Ａｌａ１９７、Ｔｙｒ１９８、Ｉｌｅ２０８、Ａｓｎ２１１、Ｐｒｏ２１２、Ｐｈｅ２１３、Ａｌａ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｌａ２１６、および／またはＰｈｅ２１７から選択される、野生型ブラキュリーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸残基の欠失または置換から選択される少なくとも１つの改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、Ｍｅｔ８７、Ｐｒｏ１２７、Ａｓｐ１２８、Ｓｅｒ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ａｓｎ１３１、Ｐｈｅ１３２、および／またはＶａｌ１７５から選択される、野生型ブラキュリーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８個のアミノ酸残基の欠失または置換から選択される少なくとも１つの改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。さらに他の態様では、改変は欠失である。さらに他の態様では、改変ブラキュリー抗原は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なる。さらに他の態様では、改変ブラキュリー抗原は、野生型ブラキュリーの位置６６と位置２１７との間の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の隣接アミノ酸の欠失により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、野生型ブラキュリーの位置１９８と位置２２２との間の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の隣接アミノ酸の欠失により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、野生型ブラキュリーの位置１９８〜２２２の欠失により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。
【００１２】
以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態または態様のいずれかの一態様では、改変ブラキュリー抗原は、少なくとも１つのアゴニストＴ細胞エピトープをさらに含むアミノ酸配列を有する。一態様では、アゴニストエピトープは配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【００１３】
以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態または態様のいずれかの一態様では、改変ブラキュリー抗原は、配列番号１０または配列番号１３に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、配列番号１０または配列番号１３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、配列番号１０または配列番号１３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。さらに他の態様では、改変ブラキュリー抗原は、配列番号１０または配列番号１０の位置２〜４１０を含むアミノ酸配列を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、配列番号１３または配列番号１３の位置２〜４１０を含むアミノ酸配列を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、配列番号１２または配列番号１５に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する融合タンパク質である。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、配列番号１２または配列番号１５のアミノ酸配列を有する融合タンパク質である。
【００１４】
以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態のいずれかの以上の態様のいずれかでは、酵母はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。一態様では、酵母はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する。一態様では、酵母は酵母菌体である。一態様では、酵母菌体は死滅されている。一態様では、酵母菌体は熱不活性化されている。
【００１５】
以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態のいずれかの一態様では、組成物は、対象への投与に好適な薬学的に許容可能な賦形剤中に製剤化されている。
本発明のさらに他の実施形態は、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、ａ）不活性化酵母菌体と、ｂ）配列番号１０の位置２〜４１５のアミノ酸配列を含むブラキュリー融合タンパク質とを含み、ブラキュリー融合タンパク質が酵母によって発現されたものであり、組成物がブラキュリー特異的Ｔ細胞反応を誘発する、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物に関する。一態様では、融合タンパク質は配列番号１２のアミノ酸配列を有する。本発明のさらに他の実施形態は、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、ａ）不活性化酵母菌体と、配列番号１３の位置２〜４１５のアミノ酸配列を含むブラキュリー融合タンパク質とを含み、ブラキュリー融合タンパク質が酵母によって発現されたものであり、組成物がブラキュリー特異的Ｔ細胞反応を誘発する、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物に関する。一態様では、融合タンパク質は配列番号１５のアミノ酸配列を有する。
【００１６】
以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態または態様のいずれかでは、ブラキュリー融合タンパク質の発現はプロモータＣＵＰ１の制御下にある。一態様では、酵母はサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する。一態様では、酵母はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する。一態様では、組成物は、対象への投与に好適な薬学的に許容可能な賦形剤中に製剤化されている。
【００１７】
本発明のさらに他の実施形態は、ブラキュリーを発現する癌を治療する方法に関する。一態様では、本方法は、ブラキュリーを発現する癌を有する対象に、以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を投与することを含む。
【００１８】
本発明のさらに他の実施形態は、癌を有する個体において癌の転移進行を低減、停止、逆転、遅延、または予防する方法であって、転移進行を起こしているか、転移進行を起こすリスクを有するか、または転移進行を起こし始めると予測される癌を有する個体に、以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の免疫療法組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００１９】
本発明のさらに他の実施形態は、ブラキュリー発現癌の発症を予防または遅延する方法であって、以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の免疫療法組成物を個体に投与することを含む、方法に関する。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、脊索腫を治療する方法であって、脊索腫を有する対象に、以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の免疫療法組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００２１】
以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態または態様のいずれかの一態様では、個体は他の癌療法で治療されているかまたは治療されたことがある。一態様では、療法は、放射線療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、標的癌療法、養子Ｔ細胞移入、または１種以上の追加の免疫療法組成物の投与から選択される。
【００２２】
本発明の他の実施形態は、癌を有する患者において腫瘍細胞の化学療法耐性または放射線耐性を低減または予防する方法であって、癌を有しかつ化学療法および／または放射線療法を受けている個体に、以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の免疫療法組成物を投与することを含む、方法に関する。
【００２３】
以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の本発明の実施形態または態様のいずれかの一態様では、本方法は、個体において腫瘍負荷を低減し、個体の生存率を増加させ、および／または個体において腫瘍成長を阻害する。一態様では、癌は、乳癌、骨癌、脊索腫、小腸癌、胃癌、膵癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、およびそれらの転移癌である。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）感染に関連する疾患または病態を治療または予防する方法であって、以上にまたは本明細書の他の箇所に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を個体に投与することを含む、方法に関する。
【００２５】
本発明のさらに他の実施形態は、ブラキュリーを発現する癌を治療するための、癌を有する個体において癌の転移進行を低減、停止、逆転、もしくは予防するための、ブラキュリー発現癌の発症を予防もしくは遅延するための、または癌を有する患者において腫瘍細胞の化学療法耐性もしくは放射線耐性を低減もしくは予防するための、本明細書に記載の免疫療法組成物のいずれかの使用に関する。
【００２６】
本発明のさらに他の実施形態は、ブラキュリーを発現する癌を治療するための医薬の調製における、本明細書に記載の免疫療法組成物のいずれかの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＧＩ−６３０１（または６３０１）およびＧＩ−６３０５（または６３０５）と記された酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の抗原発現と比較して、ＧＩ−６３０６（または６３０６）として知られる酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の抗原発現を示すウェスタンブロットのディジタル画像の図。（「ｕｇ」はマイクログラムである）。「ＹＶＥＣ」は空ベクター酵母である。
【図２】ＧＩ−６３０６として知られる酵母−ブラキュリー免疫療法組成物が酵母−ブラキュリー免疫療法組成物ＧＩ−６３０１およびＧＩ−６３０５と比較して低減されたフロキュレーション表現型を呈することを示すディジタル画像の図。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、概して、改善された酵母−ブラキュリー免疫療法組成物、かかる組成物の製造方法、およびかかる組成物を用いてブラキュリーを発現または過剰発現する癌を予防および／または治療する方法に関する。本発明は、免疫療法に使用するために低減または破壊されたＤＮＡ結合活性を有する新規なブラキュリー抗原を生成するブラキュリー抗原の特異的改変を含む。本発明者らは、ブラキュリー抗原のかかる改変がまた、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の製造および使用の両方を改善するという驚くべき予想外の発見をした。本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、ＤＮＡに結合する能力と、したがって天然ブラキュリーと同じように転写因子として作用する能力とが欠如しているだけでなく、驚くべきことにかつ予想外なことに、製造がより容易であり、投与がより容易であり、かつ他の改変（たとえば、アゴニスト突然変異）を導入したときでさえも高レベルでブラキュリー抗原を発現する。
【００２９】
より具体的には、本発明は、改善された酵母ベースの免疫療法組成物（本明細書では、「酵母ベースの免疫療法」、「酵母−ブラキュリー免疫療法」、「酵母−ブラキュリー免疫療法組成物」、「酵母ベースの免疫療法製剤」、「酵母ベースのワクチン」、またはこれらの語句の派生語としても参照される）を含み、組成物は、酵母媒体と少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原（ブラキュリーアゴニスト抗原を含む）とを含み、ブラキュリー抗原のＤＮＡ結合活性は、（たとえば、野生型ブラキュリータンパク質と比較して）突然変異により（たとえば、ブラキュリータンパク質の天然ＤＮＡ結合活性を低減または消失するのに十分なブラキュリーＤＮＡ結合領域内の欠失、置換、挿入、または他の改変により）低減または消失されている。本発明は、癌を治療または予防するためのこうした改善された酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の使用、ならびにこうした改善された酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の製造方法をさらに含む。本発明者らは、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋ＣＴＬを含めて正常者および癌患者のブラキュリー特異的Ｔ細胞を拡大するように設計されたこうした新規な酵母−ブラキュリー免疫療法製剤の構築および製造を本明細書に記載する。本発明の新規な組成物を用いた酵母−ブラキュリー免疫療法は、ブラキュリー特異的細胞免疫反応（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）を誘発するのに有用であり、また、ブラキュリー発現腫瘍を有する対象に投与して、限定されるものではないが、脊索腫、転移癌、および関連病態を含めて、ブラキュリーを発現する癌を予防および／または治療するための新規な療法を提供するのに有用である。
【００３０】
ブラキュリーは、ほとんどの正常（非腫瘍）組織では発現されず、典型的に腫瘍細胞で過剰発現されるため、正常組織に関連するいずれの「オフターゲット」効果も関心事にならず、ＤＮＡ結合配列を保持するブラキュリー抗原がインビボでいずれの場所で使用されているかは、本発明の時点では観測されていない。しかしながら、本発明の改善された酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、天然ブラキュリーのＤＮＡ結合機能を抑止する改変を含み、それにより、転写因子として機能するブラキュリー抗原の能力と、したがって下流でのかかる活性のいかなる影響とを排除する。本発明では、ブラキュリーは免疫原としての作用のみを必要とするため、ｍＲＮＡ転写におけるその天然での役割の不活性化は問題にならない。
【００３１】
本発明者らは、ＤＮＡ結合活性が抑止されたブラキュリーを酵母で発現させた場合、この酵母がこの改変を含まないブラキュリーを発現する酵母と比較して異なる構造特性を有するという予想外かつ予測不能な発見をした。より具体的には、本発明に記載された改変を含まない酵母−ブラキュリー組成物は、製造プロセス時にロバストな「フロキュレーション」表現型を呈する。すなわち、酵母細胞が成長してブラキュリー抗原を発現するにつれて、細胞は凝集して成長培地中またはＰＢＳ中の非凝集細胞よりも緻密な大きい多細胞構造になる（より具体的に以下に記載する）。これとは対照的に、本発明の改変ブラキュリー抗原を発現する酵母は、フロキュレーション表現型を呈しないかまたは実質的に低減されたフロキュレーション表現型を呈する。したがって、ブラキュリーのＤＮＡ結合機能を抑止することにより、抗原の免疫原性を維持しつつ天然ブラキュリーの生物学的活性が欠如した酵母ベースの免疫療法製剤が提供されるだけでなく、新しい抗原の驚くべき予想外の特性として、改変抗原を発現する酵母でフロキュレーション表現型が消失する。フロキュレーション表現型の消失により、酵母−ブラキュリーでこの特性に適応するように利用される製造プロセスで工程数を削減でき、かつ／または工程を修正できる。
【００３２】
加えて、新規な改変以外は配列が同一であるブラキュリー抗原の発現レベルと比較して、本発明の改変を含む例示的なブラキュリー抗原（実施例を参照されたい）は、酵母で実質的により高いレベルで発現された。本発明に係るブラキュリー抗原の改変により酵母でブラキュリー抗原の発現を促進可能であることも、この結果から示唆された。ロバストな抗原発現は、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物のきわめて好ましい特性である。
【００３３】
本発明に有用な酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、運動性の獲得および他の組織への浸潤の開始前または開始時に腫瘍細胞を標的とすることにより、転移癌の発症および／または癌、とりわけ転移癌の進行を予防、阻害、停止、逆転、または遅延する。加えて、本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、初期癌を有するまたは前癌（前悪性）病変もしくは腫瘍を有する個体、癌を発生するリスクが高い個体、特に高い転移率を有する個体、および本明細書に記載されるように癌の他の予防免疫療法と組み合わせて使用し得る癌の予防のための予防剤として正常個体において、転移癌または癌進行を予防または遅延するために使用可能である。
【００３４】
本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物はまた、化学療法および放射線療法を含めて、他の癌療法を受けている個体に利益を提供する。転移癌は、場合により、原発癌よりも化学療法および／または放射線療法に対して耐性であることが知られている。したがって、本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、癌においてブラキュリー発現腫瘍を阻害することにより（それによって抗増殖作用を阻害することにより）、転移癌で起こり得る化学療法耐性または放射線耐性を阻害または低減または排除するために使用可能であり、本発明の組成物は、個体において化学療法または放射線療法の性能を向上させ得る。
【００３５】
近年、ブラキュリーは、脊索腫として知られる稀な骨癌の識別バイオマーカになってきた。サイトケラチン染色と組み合わせた場合、ブラキュリーを用いた脊索腫の検出の感度および特異度は、それぞれ９８％および１００％である（オークレ（Ｏａｋｌｅｙ）ら著、２００８年、モダン・パソロジー（Ｍｏｄ  Ｐａｔｈ）、第２１巻、ｐ．１４６１〜１４６９）。したがって、本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、脊索腫を予防および／または治療するのに有用である。
【００３６】
本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物はまた、本質的に非腫瘍であり得るまたは悪性形質転換に先行し得るブラキュリー発現に関連する病態または疾患を治療するために使用可能である。たとえば、ブラキュリーは、感染因子、たとえば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）などのウイルスが感染した細胞でアップレギュレートされ得る。したがって、本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法は、限定されるものではないが、感染性疾患をはじめとするブラキュリー発現に関連するいずれかの疾患または病態、たとえば、限定されるものではないが、ＥＢＶ関連病態（たとえば、単核球症）をはじめとするウイルス感染症を治療または予防するために使用可能である。
【００３７】
本明細書に記載の酵母−ブラキュリー組成物のすべては、毒性問題を有するものが多い外因性アジュバント、サイトカイン、または他の免疫刺激性分子を用いることなく、ＣＤ４依存性ＴＨ１７およびＴＨ１  Ｔ細胞反応および抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）反応を含む）を含めて、標的抗原（ブラキュリー）に対する先天性免疫反応および適応免疫反応を誘導する。加えて、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数および／または機能を阻害することにより、たとえば、通常、腫瘍の存在により抑制されると思われるエフェクターＴ細胞反応を促進する。さらに、抗体反応を引き起こすことにより免疫化する免疫療法組成物と比較して、酵母−ブラキュリー免疫療法により誘発される抗原特異的な広範にわたるかつ強力な細胞免疫反応は、腫瘍細胞を標的とするのに特に有効であると考えられる。実際に、多くの研究から、免疫療法は、ＭＨＣクラスＩ分子との関連で腫瘍ペプチドを認識するＣＤ８＋ＣＴＬを介して腫瘍細胞を標的とする場合に促進されることが示されてきた。
【００３８】
酵母−ブラキュリー免疫療法は、抗原提示細胞の活性化にきわめて有効であり、かつ免疫反応をクロスプライミングする特異能力を有し、その結果、たとえ他に抑制的な環境があったとしてもそれに対抗して、典型的に腫瘍に対して有効なＣＤ８＋ＣＴＬ反応を引き起こす。このタイプの免疫療法は、関連免疫原を提示する抗原提示細胞の自然能力を利用するため、本発明に係る効果的免疫療法剤を生成するためにブラキュリーのＣＴＬエピトープまたはＭＨＣクラスＩＩエピトープがどのようなものであるかを正確に知る必要はない。実際に、単一の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物で複数のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを標的とし得るため、本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法剤は、短いペプチドの使用に限定されるものではなく、実際に、こうした組成物でより長いポリペプチドおよび融合タンパク質の使用が有効である。したがって、酵母−ブラキュリー免疫療法を使用することにより、推定Ｔ細胞エピトープを同定するアルゴリズムおよび複雑な式の使用は回避される。
【００３９】
酵母−ブラキュリーは、外因性アジュバント、免疫刺激剤もしくは分子、共刺激分子、またはサイトカインを用いることなく、免疫化プロトコル（予防用または治療用）で効果的に利用可能であるが、必要に応じてかかる作用剤を含めてもよい。さらに、酵母−ブラキュリー免疫療法は、他のタイプの免疫療法で問題になり得る有効性の喪失を伴うことなく、繰返し投与が可能である。
【００４０】
本発明の組成物
本発明の一実施形態は、ブラキュリーの発現または過剰発現によって特徴付けられる癌または他の疾患（初期には検出可能なブラキュリーを発現する細胞を含有し得ないが、癌の発生の後期にはブラキュリーを発現する細胞を含有し得るまたは含有するであろう癌を含む）の予防および／または治療に使用可能な酵母ベースの免疫療法組成物に関する。組成物は、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）１つ以上のブラキュリー抗原を含む癌抗原とを含む酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であり、ブラキュリー抗原は、改変ブラキュリー抗原（たとえば、野生型ブラキュリータンパク質と比較される）である。具体的には、改変ブラチュリー抗原は、最低限でも、ブラキュリータンパク質のＤＮＡ結合活性が突然変異により（たとえば、ブラキュリータンパク質の天然ＤＮＡ結合活性を低減または消失するのに十分なブラキュリーＤＮＡ結合領域の欠失、置換、挿入、または他の改変により）低減または消失された改変を含む。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、野生型ブラキュリータンパク質を発現する酵母と比較して、最低限でも、低減されたフロキュレーション表現型を有する改変ブラキュリー抗原を発現する酵母（酵母は低減された大きい多細胞構造への凝集を呈する）をもたらす改変を含む。改変ブラキュリー抗原は、追加の改変（すなわち、野生型ブラキュリータンパク質との差異）、たとえば、ブラキュリー抗原中に１つ以上のアゴニストエピトープを生成するタンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基の置換を含み得る（より詳細に以下に記載される）。最後に、改変ブラキュリー抗原は、改変されているとはいえ、免疫反応を誘発する能力、好ましくは、腫瘍細胞により発現されるブラキュリータンパク質などの天然ブラキュリータンパク質に対する細胞媒介免疫反応（Ｔ細胞反応）を保持する。改変ブラキュリー抗原は、最も典型的には、酵母媒体により（たとえば、任意選択的に酵母細胞質体、酵母ゴースト、もしくは酵母膜抽出物、またはそれらの一部にさらに処理可能なインタクト酵母または酵母スフェロプラストにより）組換えタンパク質として発現されるが、本明細書に記載されるように、１つ以上の改変ブラキュリー抗原を酵母媒体中に充填して、さもなければ酵母媒体と複合体化して、それと結合させて、それと混合して、もしくはそれと共に投与して本発明の組成物を形成することは、本発明の実施形態である。
【００４１】
本発明によれば、「酵母−ブラキュリー免疫療法組成物」は、酵母媒体と少なくとも１種のブラキュリー抗原またはその免疫原性ドメインとを含有し、かつ本発明で以上におよび本明細書の他の箇所に記載の少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原を含有する、特定のタイプの「酵母ベースの免疫療法組成物」である。「免疫療法組成物」は、対象において少なくとも１つの治療効果を達成するのに十分な免疫反応を誘発する組成物である。本明細書で用いられる場合、酵母ベースの免疫療法組成物とは、酵母媒体成分を含み、かつ対象において少なくとも１つの治療効果を達成するのに十分な免疫反応を誘発する組成物を意味する。より具体的には、酵母ベースの免疫療法組成物は、酵母媒体成分と典型的に抗原成分とを含み、かつ限定されるものではないが、Ｔ細胞媒介細胞免疫反応をはじめとする細胞免疫反応などの免疫反応を誘発または誘導することが可能である組成物である。一態様では、本発明に有用な酵母ベースの免疫療法組成物は、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞媒介免疫反応、一態様では、特に標的抗原（たとえば、癌抗原）に対するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞媒介免疫反応を誘導可能である。ＣＤ４＋免疫反応は、ＴＨ１免疫反応、ＴＨ２免疫反応、ＴＨ１７免疫反応、または以上の任意の組合せを含み得る。酵母ベースの免疫療法剤は、具体的には、ＴＨ１およびＴＨ１７反応を引き起こすことが可能である。ＣＤ８＋免疫反応は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を含むことが可能であり、酵母ベースの免疫療法剤は、かかる反応を引き起こすことが可能である。一態様では、酵母ベースの免疫療法組成物は、対象において調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の数および／または機能を変調する。酵母ベースの免疫療法はまた、たとえば、サイトカイン、抗体の添加により、および／または酵母の作製プロセスの調整により、一方のタイプの反応を他方のタイプの反応よりも促進するように変更を加えることが可能である。任意選択的に、酵母ベースの免疫療法組成物は、体液性免疫反応を誘発可能である。
【００４２】
本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、「予防用」または「治療用」のいずれかであり得る。予防用に提供される場合、本発明の組成物は、個体におけるブラキュリー発現腫瘍の発生の予防、阻害、もしくは遅延ならびに／または腫瘍遊走および／もしくは他の組織の腫瘍浸潤（転移）の予防、阻害、もしくは遅延ならびに／または一般には癌の進行の予防もしくは阻害を目標として、ブラキュリーを発現する癌の発生前または発生の検出前に提供される。本明細書で考察されるように、ブラキュリーは、後期癌を含めていくつかの癌で発現され、転移癌の場合のように腫瘍の浸潤および遊走に関連するプロセスであるＥＭＴプロセスに関与することが示されている。したがって、予防用組成物は、癌でないと思われる個体（健常または正常な個体）、前癌状態（前悪性病変）の個体、および癌を有しているがブラキュリーが依然として検出されていない個体（すなわち、癌中での腫瘍細胞によるブラキュリー発現前）に投与することが可能である。癌、特にブラキュリー発現および／または転移が典型的に関連する癌を発生する高いリスクがある個体は、本発明に係る組成物を用いて予防的に治療し得る。治療用に提供される場合、免疫療法組成物は、たとえば、個体における腫瘍負荷の低減により、個体における腫瘍増殖の阻害により、個体の生存率の増大により、腫瘍遊走および／または他の組織の腫瘍浸潤（転移癌）の発生の予防、阻害、逆転、もしくは遅延により、および／または個体における癌の進行の予防、阻害、逆転、もしくは遅延により、癌を改善することを目標として、ブラキュリー発現癌を有する個体に提供される。一態様では、酵母−ブラキュリー免疫療法は、癌においてブラキュリー発現を阻害することにより、転移癌で起こり得る化学療法耐性または放射線耐性を阻害、低減、または排除するために治療用に使用され、本発明の組成物は、個体において化学療法または放射線療法の性能を向上させ得る。
【００４３】
典型的に、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、酵母媒体と、本発明の改変ブラキュリー抗原を含む少なくとも１種の癌抗原とを含み、この癌抗原は、酵母媒体によって発現されるか、それと結合されるか、その中に充填されるか、またはそれと混合される。いくつかの実施形態では、癌抗原は融合タンパク質として提供される。本発明の組成物および方法に使用するのに好適ないくつか改変ブラキュリータンパク質および融合タンパク質は、以下に記載される。いくつかの実施形態では、癌抗原および改変ブラキュリー抗原は同一のエレメントである。いくつかの実施形態では、癌抗原は、改変ブラキュリー抗原に加えて他の癌抗原をはじめとする他の抗原を含む。本発明の一態様では、癌抗原として有用な融合タンパク質は、２つ以上の抗原、たとえば、改変ブラキュリー抗原とブラキュリー抗原でない他の癌抗原、または２つの異なるブラキュリー抗原（たとえば、異なるアゴニストエピトープを有する２つの改変ブラキュリー抗原）を含み得る。一態様では、融合タンパク質は、１つ以上の抗原の２つ以上の免疫原性ドメイン、たとえば、改変ブラキュリー抗原の２つ以上の免疫原性ドメインを含み得る（ただし、免疫原性ドメインは本発明の改変を含む）。
【００４４】
本発明によれば、「抗原」という用語の本明細書での一般的使用は、タンパク質（このタンパク質は、天然に存在するか、もしくは合成的に誘導されるか、もしくは設計される）の任意の部分（たとえば、ペプチド、部分タンパク質、全長タンパク質）、細胞組成物（全細胞、細胞溶解物、もしくは破壊細胞）、生物（全生物体、溶解物、もしくは破壊細胞）、あるいは炭水化物もしくは他の分子またはそれらの一部を意味する。抗原は、免疫系の要素（たとえば、Ｔ細胞、抗体）が遭遇する同一または類似の抗原に対する抗原特異的免疫反応（たとえば、体液性および／または細胞媒介性の免疫反応）を誘発し得る。抗原は、単一のエピトープ程度の小さいもの、単一の免疫原性ドメイン以上のものであり得ると共に、複数のエピトープまたは免疫原性ドメインを含み得る。このため、抗原のサイズは、約８〜１１アミノ酸程度の小さいもの（すなわち、ペプチド）、および全長タンパク質、多量体、融合タンパク質、キメラタンパク質、全細胞、全微生物体、またはそれらの任意の一部（たとえば、タンパク質断片（ポリペプチド）、全細胞のライセート、または微生物の抽出物）程度の大きいものであり得る。加えて、抗原は、酵母媒体中または本発明の組成物中に充填可能な炭水化物を含み得る。
【００４５】
本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法剤に有用な抗原は、ポリペプチド、全長タンパク質、多量体、融合タンパク質、およびキメラタンパク質であり、これらの態様のいずれでも、抗原は、本明細書に記載の少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原を含む。酵母で発現させるために、改変ブラキュリー抗原などのタンパク質である抗原は、酵母で組換え発現可能な最小限のサイズであり、典型的に２５アミノ酸長以上、または２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、もしくは５０以上のアミノ酸長、または２５〜５０アミノ酸長以上、３０〜５０アミノ酸長以上、もしくは３５〜５０アミノ酸長以上、もしくは４０〜５０アミノ酸長以上、もしくは４５〜５０アミノ酸長以上であるが、より小さいタンパク質を発現し得ると共に、かなり大きいタンパク質（たとえば、数百アミノ酸長、さらには数千アミノ酸長）を発現し得る。一態様では、全長タンパク質またはＮ末端および／もしくはＣ末端から１〜２０アミノ酸が欠如しているタンパク質を発現し得る。融合タンパク質およびキメラタンパク質も本発明で発現し得る抗原である。「標的抗原」とは、本発明の免疫療法組成物が特異的に標的とする抗原（すなわち、免疫反応の誘発が望まれる抗原、たとえば、本発明ではブラキュリー）である。「癌抗原」とは、抗原を標的とすることが癌を標的とすることでもあるように癌に関連する少なくとも１種の抗原、たとえば、腫瘍細胞により発現される抗原を含む抗原である。癌抗原は、１つ以上の腫瘍関連タンパク質を含む１つ以上のタンパク質に由来する１種以上の抗原を含み得る。「ブラキュリー抗原」とは、ブラキュリータンパク質から誘導、設計、または生成される抗原である。本発明に係る「改変ブラキュリー抗原」は、野生型ブラキュリータンパク質と比較してブラキュリータンパク質の天然ＤＮＡ結合活性を低減もしくは消失し、および／または改変ブラキュリー抗原を発現する酵母のフロキュレーション表現型を低減または排除するのに十分な少なくとも１つの改変（たとえば、欠失、置換、挿入、または他の改変）により、対応する野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含むブラキュリー抗原である（たとえば、改変抗原を発現する酵母は、野生型タンパク質を発現する酵母と比較して低減された大きい多細胞構造への凝集傾向を有する）。改変ブラキュリー抗原は、アゴニストエピトープを生成する１つ以上アミノ酸置換などの追加の改変を含み得る。
【００４６】
免疫反応の刺激について言及する場合、「免疫原」という用語は、「抗原」という用語の一部であるため、いくつかの場合、「抗原」という用語と同義的に用い得る。免疫原は、本明細書で用いられる場合、個体への免疫原の投与により、個体の免疫系が遭遇する同一または類似の抗原に対して抗原特異的免疫反応が開始されるように、体液性および／または細胞媒介性の免疫反応を誘発する抗原を記述する（すなわち、免疫原性である）。一実施形態では、免疫原は、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応（たとえば、ＴＨ１、ＴＨ２、および／またはＴＨ１７）および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞反応（たとえば、ＣＴＬ反応）をはじめとする細胞媒介性免疫反応を誘発する。
【００４７】
所与の抗原の「免疫原性ドメイン」は、動物に投与したときに免疫原として作用可能な少なくとも１つのエピトープを含有する抗原の任意の部分、断片、またはエピトープ（たとえば、ペプチド断片またはサブユニットまたは抗体エピトープまたは他のコンフォメーショナルエピトープ）であり得る。したがって、免疫原性ドメインは、単一のアミノ酸よりも大きく、かつ少なくとも、免疫原として作用可能な少なくとも１つのエピトープを含有するのに十分なサイズである。たとえば、単一のタンパク質は、複数の異なる免疫原性ドメインを含有可能である。免疫原性ドメインは、コンフォメーショナルメインが想定される体液性免疫反応の場合などでは、タンパク質内が線状配列である必要はない。
【００４８】
エピトープとは、本明細書では、免疫系の適切な共刺激性シグナルおよび／または活性化細胞との関連で免疫系に提供されたときに免疫反応を誘発するのに十分な所与の抗原内の単一免疫原性部位として定義される。換言すれば、エピトープは、免疫系の成分により認識される抗原の一部であり、抗原決定基として参照され得る。Ｔ細胞エピトープが、Ｂ細胞エピトープまたは抗体エピトープとサイズおよび組成が異なること、およびクラスＩ  ＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープが、クラスＩＩ  ＭＨＣ経路を介して提示されるエピトープとサイズおよび構造属性が異なることは、当業者であれば分かるであろう。たとえば、クラスＩ  ＭＨＣ分子により提示されるＴ細胞エピトープは、典型的に８〜１１アミノ酸長であるが、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子により提示されるエピトープは、長さにそれほど制限がなく、最大で２５アミノ酸以上であり得る。加えて、Ｔ細胞エピトープは、エピトープにより結合される特定のＭＨＣ分子に依存する予測構造特性を有する。エピトープは、線状配列エピトープまたはコンフォメーショナルエピトープ（保存結合領域）であり得る。ほとんどの抗体は、コンフォメーショナルエピトープを認識する。
【００４９】
ブラキュリー（「Ｔ」としても参照し得る）は、複数の異なる動物種間で高度に保存されたタンパク質であり、まとめてＴボックスファミリーのタンパク質と呼ばれるいくつかの異なるタンパク質間で共有されたＤＮＡ結合ドメインモチーフである「Ｔボックス」ドメインまたは「Ｔドメイン」を含有する転写因子である。ヒトブラキュリーは、１９９６年に初めてクローニングされた（エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら著、前掲）。例示的な野生型ヒトブラキュリーをコードするヌクレオチド配列の１つは、配列番号１により本明細書に表される。これはジーンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＭ＿００３１８１（ＧＩ：１９７４３８１１）から得られたｍＲＮＡ配列である。配列番号１は、４３５アミノ酸の野生型ヒトブラキュリータンパク質をコードする。このアミノ酸配列は、配列番号２として本明細書に表される（ジーンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＰ＿００３１７２；ＧＩ：４５０７３３９にも見出される）。配列番号２内で、位置４２〜２２３は、Ｔボックス領域（Ｔボックスドメイン）として表され、ＤＮＡ結合に特異的に関連する位置は、配列番号２の次の位置：６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、１０１、１６２、１９６、１９７、１９８、２０４、２０８、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、および２１９として表される。
【００５０】
他の例示的な野生型ヒトブラキュリータンパク質は、配列番号２のヒトブラキュリータンパク質の変異体であり、配列番号４のアミノ酸配列を有する。配列番号４（これも４３５アミノ酸のタンパク質である）は、配列番号３により本明細書に表されるヌクレオチド配列によりコードされる。配列番号４は、タンパク質の全長にわたり配列番号２に対して約９９％同一である。配列番号４は、位置１７７（それぞれＡｓｐ対Ｇｌｙ）、位置３６８（それぞれＴｈｒ対Ｓｅｒ）、および位置４０９（それぞれＡｓｎ対Ａｓｐ）が配列番号２と異なる。Ｔボックス領域（Ｔボックスドメイン）は、位置４２〜２２３に位置し、ＤＮＡ結合に特異的に関連する位置は、配列番号４の次の位置：６３、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７２、１０１、１６２、１９６、１９７、１９８、２０４、２０８、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、および２１９として表される。
【００５１】
Ｔボックスドメイン（またはＴボックス領域）は、配列特異的ＤＮＡ結合に必要かつ十分なＴボックスタンパク質内の最小限の領域としてすべての「Ｔボックスタンパク質」内で一般に定義される。Ｔボックスファミリーのメンバー（このドメインを有するタンパク質）は、ＤＮＡコンセンサス配列ＴＣＡＣＡＣＣＴに結合する（ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）およびコンロン（Ｃｏｎｌｏｎ）著、ゲノム・バイオロジー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２００２年、第３巻、第６号、レビュー、ｐ．３００８）。ブラキュリーでは、Ｔボックスファミリーの影響力の大きいメンバーであるネズミタンパク質の位置１〜２２９（たとえば、位置１〜２２９）は、全ＴボックスＤＮＡ結合ドメインを含むものして最初に記載され（キスパート（Ｋｉｓｐｅｒｔ）ら著、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、１９９３年、第１２巻、第８号、ｐ．３２１１〜３２２０、キスパート（Ｋｉｓｐｅｒｔ）ら著、ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、１９９６年、第１４巻、第１９号、ｐ．４７６３〜４７７２）、ネズミタンパク質のＮ末端の１７アミノ酸程度の小さい欠失は、タンパク質のＤＮＡ結合能力を顕著に減衰させた（キスパート（Ｋｉｓｐｅｒｔ）ら著、１９９３年、前掲）。様々なＴボックスタンパク質間の残基の保存に基づいて、後続の刊行物および公共データベースは、約１８０アミノ酸ドメインに対応する位置４１または４２の近傍から位置２２３の近傍まで一般に延在するものとしてＤＮＡ結合ドメインをより具体的に記載したが（たとえば、ジーンバンク（ＧＥＮＢＡＮＫ）（登録商標）受託番号ＮＰ＿００３１７２を参照されたい）、位置１〜２２９内に追加のまたはより少ないアミノ酸を有するドメインも科学文献に見出し得る。ＤＮＡ結合に直接関与するものとして結晶構造を介して同定されたブラキュリーのアミノ酸残基としては、（配列番号２または配列番号４に対して与えられた位置）Ｌｙｓ６６、Ａｒｇ６９、Ａｒｇ７０、Ａｒｇ１０１、Ｌｙｓ１０３、Ｌｙｓ１４７、Ａｓｎ１５０、Ｌｙｓ１５１、Ｓｅｒ１６２、Ｔｈｒ１９６、Ａｌａ１９７、Ｔｙｒ１９８、Ｉｌｅ２０８、Ａｓｎ２１１、Ｐｒｏ２１２、Ｐｈｅ２１３、Ａｌａ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｌａ２１６、およびＰｈｅ２１７が挙げられる（たとえば、ミュラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）およびハーマン（Ｈｅｒｒｍａｎｎ）著、１９９７年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３８９巻、ｐ．８８４−８８８、図１を参照されたい）。ブラキュリータンパク質の二量化に直接関与するものとして結晶構造を介して同定されたブラキュリーのアミノ酸残基（タンパク質がＤＮＡに結合する形であるため、これらの残基はまたＤＮＡ結合に影響を及ぼし得る）としては、（配列番号２または配列番号４に対して与えられた位置）Ｍｅｔ８７、Ｐｒｏ１２７、Ａｓｐ１２８、Ｓｅｒ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ａｓｎ１３１、Ｐｈｅ１３２、およびＶａｌ１７５が挙げられる（たとえば、ミュラー（Ｍｕｅｌｌｅｒ）およびハーマン（Ｈｅｒｒｍａｎｎ）著、１９９７年、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３８９巻、ｐ．８８４−８８８、図１を参照されたい）。
【００５２】
Ｔボックスドメインおよび特定のＤＮＡ結合残基、タンパク質二量化残基、または他の種のブラキュリー配列を含めて他のブラキュリー配列の活性に重要な他の残基は、これらの配列との比較により容易に同定可能である。本明細書で用いられる場合、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知のかつ本発明で利用されるいずれかのブラキュリータンパク質の「Ｔボックスドメイン」または「ＤＮＡ結合ドメイン」への参照は、一般にヒトブラキュリータンパク質の少なくとも位置４１〜２２３（配列番号２または配列番号４のこれらの位置により例示される）を意味し、ヒトブラキュリータンパク質の位置１〜２２９またはドメインのＮ末端上のブラキュリー配列の追加の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０連続アミノ酸、または定義されたＴボックスドメインのＣ末端上のブラキュリー配列の追加の１、２、３、４、５、または６連続アミノ酸（たとえば、配列番号２または４の位置４１〜２２３のいずれかの側）を含み得る。ＤＮＡ結合に特に関連する残基としては、ヒトブラキュリー配列に関して（配列番号２または配列番号４により例示される）、位置６６、６９、７０、１０１、１０３、１４７、１５０、１５１、１６２、１９６、１９７、１９８、２０８、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、および２１７が挙げられる。タンパク質の二量化に特に関連し、およびブラキュリーのＤＮＡ結合活性に影響を及ぼし得る残基としては、ヒトブラキュリー配列に関して（配列番号２または配列番号４により例示される）、位置８７、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、および１７５が挙げられる。
【００５３】
本発明によれば、「低減または破壊されたＤＮＡ結合活性」を有する改変ブラキュリー抗原とは、野生型（天然に存在する非改変型）ブラキュリータンパク質と比較して、ＤＮＡへの改変ブラキュリータンパク質の結合能力またはブラキュリーＴボックス領域が標準的実験室条件下または生理学的条件下で結合することが知られている配列への改変ブラキュリータンパク質の結合能力が（任意の好適な検出手段により）観測可能もしくは検出可能に、好ましくは有意に、より好ましくは統計的に有意に低減された改変ブラキュリータンパク質を一般に意味する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、その天然ＤＮＡ標的への検出可能な結合能力を有していない。ＤＮＡ結合活性は、当技術分野で公知の様々なアッセイにより、たとえば、インビトロもしくはエクスビボで改変ブラキュリータンパク質とＤＮＡとを接触させることにより、またはＤＮＡ結合から生じる転写因子活性を検出することにより検出可能である。たとえば、天然ブラキュリーが結合するオリゴヌクレオチドと共に改変ブラキュリーを好適な条件下でインキュベートすることが可能であり、および結合された複合体を免疫沈降させて評価することが可能である。他の例として、改変ブラキュリーをコードするヌクレオチド構築物を用いておよびレポータプラスミドを用いて細胞を共トランスフェクトし、ＤＮＡへのブラキュリーの結合能力またはＤＮＡへのブラキュリーの結合能力を必要とする転写因子としての作用能力のリードアウトとしてレポータ活性（たとえば、酵素活性）を測定することが可能である。たとえば、こうしたタイプのアッセイに関して、たとえば、キスパート（Ｋｉｓｐｅｒｔ）ら著、１９９３年、前掲、またはキスパート（Ｋｉｓｐｅｒｔ）ら著、１９９６年、前掲を参照されたい。タンパク質−ＤＮＡ結合を測定する他のアッセイも当技術分野で公知である。
【００５４】
本発明によれば、「低減された酵母フロキュレーション表現型」に関連する改変ブラキュリー抗原とは、低減されたフロキュレーション表現型を有する改変ブラキュリー抗原を発現する酵母で得られる改変を有するブラキュリータンパク質を意味する。すなわち、抗原を発現する酵母は、大きい多細胞構造への凝集傾向または集塊一体化傾向が低減される。以上で考察したように、野生型（非改変型）ブラキュリー抗原を発現する酵母は、培養時にロバストなフロキュレーション表現型を有する。酵母「フロキュレーション」は、当技術分野で記載されており、酵母を成長させた培地から酵母細胞を分離させる酵母細胞の無性凝集として一般に定義される。フロキュレーション表現型を有する酵母は、酵母が含まれる成長培地中または成長緩衝液中でこの表現型を有していない酵母よりも緻密であり、容易には懸濁液中に残留し得ない。フロキュレーションに関与する生物学的機序に関していくつかの理論が存在し、たとえば、ドミンゲス（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｓ）ら著、バイオテクノロジー・アンド・バイオプロセス・エンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇ．）、２０００年、第５巻、ｐ．２８８〜３０５）にレビューされている。酵母フロキュレーションが起こる機序にかかわらず、本発明は、酵母においてこの性質をもたらす抗原にし得る改変を記載することにより、ブラキュリー抗原を発現する酵母のフロキュレーション表現型を低減する。酵母におけるフロキュレーション表現型は、限定されるものではないが、結合強度測定、フロックサイズ測定、酵母沈降速度決定、沈降試験、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ：ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、ヘルムアッセイ、および修正ヘルムアッセイを含めて、任意の好適な検出方法を用いて測定可能である（たとえば、ファン・ハマーズベルド（ｖａｎ  Ｈａｍｅｒｓｖｅｌｄ）ら著、ジャーナル・オブ・ザ・インスティテュート・オブ・ブリューイング（Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．）、１９９６年、第１０２巻、ｐ．３３３〜３４２、ソアレス（Ｓｏａｒｅｓ）ら著、ジャーナル・オブ・ザ・インスティテュート・オブ・ブリューイング（Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．）、１９９７年、第１０３巻、ｐ．９３〜９８、ドートコート（Ｄ’Ｈａｕｔｃｏｕｒｔ）およびスマート（Ｓｍａｒｔ）著、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ソサエティー・オブ・ブリューイング・ケミスツ（Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｂｒｅｗ  Ｃｈｅｍ．）、１９９９年、第５７巻、ｐ．１２３〜１２８、ビドグレン（Ｖｉｄｇｒｅｎ）およびロンデスボロー（Ｌｏｎｄｅｓｂｏｒｏｕｇｈ）著、ジャーナル・オブ・ザ・インスティテュート・オブ・ブリューイング（Ｊ  Ｉｎｓｔ  Ｂｒｅｗ．）、２０１１年、第１１７巻、ｐ．４７５〜４８７を参照されたい）。
【００５５】
本発明の一実施形態では、改変ブラキュリー抗原（すなわち、野生型タンパク質と比較してＤＮＡ結合活性が低減もしくは破壊されたブラキュリー抗原および／または抗原を発現する酵母が低減されたフロキュレーション表現型を有するブラキュリー抗原）は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個、またはそれを超えるアミノ酸改変（すなわち、ブラキュリーのＤＮＡ結合活性を低減もしくは破壊し、および／または改変ブラキュリータンパク質を発現する酵母のフロキュレーション表現型を低減するのに十分なアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、または他の改変）により野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。好ましくは、ブラキュリー配列に対する改変の数は、低減もしくは破壊されたＤＮＡ結合および／または低減された酵母のフロキュレーション表現型の目標を達成するのに必要な最小限の数に抑えられ、一方、ブラキュリー抗原内のＴ細胞エピトープの保持は最大化される（すなわち、Ｔ細胞エピトープを含有するブラキュリーアミノ酸配列を維持することが好ましい）。本発明の一態様では、かかる改変は、ブラチュリーの位置１〜２２９（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）内で行われる。本発明の一態様では、かかる改変は、ブラチュリーの位置１８〜２２９（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）内で行われる。本発明の一態様では、かかる改変は、ブラキュリーの位置６６〜２１７（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）内で行われる。一態様では、かかる改変は、ブラキュリーの位置１９８〜２２２（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）内で行われる。一態様では、かかる改変は、Ｌｙｓ６６、Ａｒｇ６９、Ａｒｇ７０、Ａｒｇ１０１、Ｌｙｓ１０３、Ｌｙｓ１４７、Ａｓｎ１５０、Ｌｙｓ１５１、Ｓｅｒ１６２、Ｔｈｒ１９６、Ａｌａ１９７、Ｔｙｒ１９８、Ｉｌｅ２０８、Ａｓｎ２１１、Ｐｒｏ２１２、Ｐｈｅ２１３、Ａｌａ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｌａ２１６、Ｐｈｅ２１７（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸残基の欠失または置換をもたらす。一態様では、かかる改変は、代替的または追加的に、Ｍｅｔ８７、Ｐｒｏ１２７、Ａｓｐ１２８、Ｓｅｒ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ａｓｎ１３１、Ｐｈｅ１３２、および／またはＶａｌ１７５（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）から選択される少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８個のアミノ酸残基の欠失または置換をもたらす。一態様では、かかる改変は、ブラキュリーの位置６６と位置２１７との間または一態様ではブラキュリーの位置１９８と位置２２２との間（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個、またはそれを超える隣接アミノ酸の置換または欠失である。いずれにせよ、改変は、抗原を発現する酵母の低減もしくは破壊されたＤＮＡ結合および／または低減されたフロキュレーション表現型の目標を達成する。
【００５６】
以上で考察したように、本発明に有用なブラキュリー抗原は、以上に記載の改変に加えて、抗原内にアゴニストエピトープの形成をもたらす１つ以上のさらなる改変を含み得る。本明細書で一般に用いられる場合、「アゴニスト」とは、受容体またはリガンドに結合して反応を生成または開始する任意の化合物または作用剤であり、限定されるものではないが、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸結合剤などが含まれ、受容体またはリガンドに結合する天然に存在する物質の作用を模倣または増強する作用剤が含まれ得る。改変ブラキュリー抗原を含めて、本発明のブラキュリー抗原に関連して用いられる場合、「アゴニスト」抗原またはタンパク質とは、「ミモトープ」としても参照し得る少なくとも１つのＴ細胞アゴニストエピトープを含む抗原またはタンパク質を意味する。ミモトープペプチドは、野生型エピトープの構造を模倣するペプチドであり、アゴニストとして、ミモトープは、天然エピトープの作用（生物学的機能）を模倣または増強する。
【００５７】
たとえば、配列番号５のアミノ酸配列（ＷＬＬＰＧＴＳＴＬ）は、野生型ブラキュリータンパク質のＴ細胞エピトープである。配列番号５は、配列番号２または配列番号４の位置２４６〜２５４に位置する。配列番号６のアミノ酸配列（ＷＬＬＰＧＴＳＴＶ）は、配列番号５のＴ細胞エピトープのミモトープまたはアゴニストである。したがって、本発明の一態様では、改変ブラキュリー抗原は、ＷＬＬＰＧＴＳＴＶ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む。一態様では、配列番号６の位置４のアミノ酸（プロリンまたはＰ）は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、イソロイシン（Ｉ）、またはバリン（Ｖ）で置換される。
【００５８】
一態様では、改変ブラキュリー抗原は、ＳＱＹＰＳＬＷＳＶのアミノ酸配列（配列番号７）を含む。一態様では、配列番号７の位置２のアミノ酸（この配列ではグルタミンまたはＱ）は、ロイシン（Ｌ）で置換される。一態様では、配列番号７の位置４のアミノ酸（この配列ではプロリンまたはＰ）は、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、またはバリン（Ｖ）で置換される。一態様では、配列番号７の位置７のアミノ酸（この配列ではトリプトファンまたはＷ）は、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）、またはトレオニン（Ｔ）で置換される。一態様では、配列番号７の位置９のアミノ酸（この配列ではバリンまたはＶ）は、ロイシン（Ｌ）で置換される。配列番号７にこれらの置換の１つ以上の任意の組合せを有する配列を含む抗原は、本発明により企図される。
【００５９】
一態様では、改変ブラキュリー抗原は、ＲＬＩＡＳＷＴＰＶのアミノ酸配列（配列番号８）を含む。一態様では、配列番号８の位置１のアミノ酸（この配列ではアルギニンまたはＲ）は、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）で置換される。一態様では、配列番号８の位置６のアミノ酸（この配列ではトリプトファンまたはＷ）は、バリン（Ｖ）、リシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）、またはトレオニン（Ｔ）で置換される。配列番号８のこれら置換の一方または両方の任意の組合せを有する配列を含む抗原は、本発明により企図される。
【００６０】
一態様では、改変ブラキュリー抗原は、ＡＭＹＳＦＬＬＤＦＶのアミノ酸配列（配列番号９）を含む。一態様では、配列番号９の位置２のアミノ酸（この配列ではメチオニンまたはＭ）は、ロイシン（Ｌ）で置換される。
【００６１】
本発明の一実施形態では、改変ブラキュリー抗原は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質である。配列番号１０のタンパク質は、アミノ酸配列が位置１９８〜２２２の欠失により配列番号４で表されるヒトブラキュリータンパク質のアミノ酸配列と異なる本発明に係る改変ブラキュリー抗原の一例である（すなわち、配列番号４の位置１９８〜２２２は配列番号１０に存在しない）。換言すれば、配列番号１０は、配列番号４の位置２２３〜４３５に直接融合された位置１〜１９７からなる単一のポリペプチドである。この改変ブラキュリー抗原は、破壊されたＤＮＡ結合能力を有し、この抗原を発現する酵母は、配列番号４のブラキュリータンパク質と比較して低減されたフロキュレーション表現型を有する。配列番号１２は、配列番号１０の改変ブラキュリータンパク質（実際には、配列番号１０のＮ末端メチオニンは以下に記載のＮ末端ペプチドの付加に適応するように除去されるため、配列番号１０の位置２〜４１０）を含む融合タンパク質である。配列番号１２は、Ｎ末端からＣ末端の方向にインフレームで融合された次の配列エレメント：（１）プロテアソーム分解に対する耐性を付与し、かつ酵母において発現を安定化するＮ末端ペプチド（配列番号１６によっても本明細書に表されるＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏのアミノ酸配列を有する配列番号１２の位置１〜６）、（２）配列番号１０の位置２〜４１０（配列番号１２の位置７〜４１５）としても記載可能な配列番号４の位置２〜１９７および２２３〜４３５からなるヒトブラキュリー抗原、および（３）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１２の位置４１６〜４２１）を有する単一ポリペプチドである。配列番号１２のアミノ酸配列および配列番号１０の位置２〜４１０のアミノ酸配列は、配列番号１１のポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【００６２】
本発明の他の実施形態では、改変ブラキュリー抗原は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質である。配列番号１３のタンパク質は、（１）位置１９８〜２２２の欠失（すなわち、配列番号４の位置１９８〜２２２は配列番号１３に存在しない）および（２）配列番号４の位置２５４に位置する（および配列番号１３の位置２２９に位置する）アミノ酸（ロイシン）のバリンによる置換により、アミノ酸配列が配列番号４で表されるヒトブラキュリータンパク質のアミノ酸配列と異なる、本発明に係る改変ブラキュリー抗原の他の例である。換言すれば、配列番号１３は、配列番号４の位置２２３〜４３５に直接融合された位置１〜１９７からなり、かつ配列番号１３へのアゴニストエピトープの導入をもたらすアミノ酸改変を含む単一ポリペプチドである。位置２５４（配列番号４に対する）でのロイシンからバリンへの置換は、配列番号１３の位置２２１〜２２９に配列番号１３のＴ細胞アゴニストエピトープを生成する。理論により拘束されるものではないが、このＴ細胞アゴニストエピトープは、野生型エピトープ（配列番号４の位置２４６〜２５４）と比較して、ブラキュリーに対する増強されたＴ細胞反応を誘発すると考えられる。このアゴニストエピトープはまた、配列番号６によっても本明細書に表される。配列番号１３で表されるこの改変ブラキュリー抗原は、破壊されたＤＮＡ結合能力を有し、この抗原を発現する酵母は、配列番号４のブラキュリータンパク質と比較して低減されたフロキュレーション表現型を有し、加えてアゴニストエピトープを含有し、この構築物を酵母−ブラキュリー免疫療法剤で対象に投与した場合、天然ブラキュリーに対するＴ細胞反応を増強する。配列番号１５は、配列番号１３の改変ブラキュリータンパク質（実際には、配列番号１３のＮ末端メチオニンは以下に記載のＮ末端ペプチドの付加に適応するように除去されるため、配列番号１３の位置２〜４１０）を含む融合タンパク質である。配列番号１５は、Ｎ末端からＣ末端の方向にインフレームで融合された次の配列エレメント：（１）プロテアソーム分解に対する耐性を付与し、かつ酵母において発現を安定化するＮ末端ペプチド（配列番号１５の位置１〜６、このアミノ酸配列は配列番号１６によっても本明細書に表される）、（２）配列番号１３の位置２〜４１０（配列番号１５の位置７〜４１５）としても記載可能である、配列番号４の位置２〜１９７および２２３〜４３５からなり、かつ配列番号４の位置２５４のロイシンに対するバリンの置換をさらに含有するヒトブラキュリー抗原、および（３）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１５の位置４１６〜４２１）を有する単一ポリペプチドである。配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号１３の位置２〜４１０のアミノ酸配列は、配列番号１４のポリヌクレオチド配列によりコードされる。この融合タンパク質を発現する酵母ベースの免疫療法組成物はまた、本明細書ではＧＩ−６３０６としても参照される。
【００６３】
本発明の他の実施形態では、改変ブラキュリー抗原は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４個のアミノ酸の欠失により、野生型ブラキュリータンパク質のアミノ酸配列（たとえば、配列番号２、配列番号４、または異なるヒトブラキュリータンパク質の対応する配列）と異なるアミノ酸配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるタンパク質である。ただし、欠失し得るアミノ酸残基は、（１）Ｌｙｓ６６、Ａｒｇ６９、Ａｒｇ７０、Ａｒｇ１０１、Ｌｙｓ１０３、Ｌｙｓ１４７、Ａｓｎ１５０、Ｌｙｓ１５１、Ｓｅｒ１６２、Ｔｈｒ１９６、Ａｌａ１９７、Ｔｙｒ１９８、Ｉｌｅ２０８、Ａｓｎ２１１、Ｐｒｏ２１２、Ｐｈｅ２１３、Ａｌａ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｌａ２１６、Ｐｈｅ２１７、Ｍｅｔ８７、Ｐｒｏ１２７、Ａｓｐ１２８、Ｓｅｒ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ａｓｎ１３１、Ｐｈｅ１３２、および／またはＶａｌ１７５から選択される１つ以上のアミノ酸（配列番号２または配列番号４に対して与えられた位置）、この場合、位置Ｌｙｓ６６、Ａｒｇ６９、Ａｒｇ７０、Ａｒｇ１０１、Ｌｙｓ１０３、Ｌｙｓ１４７、Ａｓｎ１５０、Ｌｙｓ１５１、Ｓｅｒ１６２、Ｔｈｒ１９６、Ａｌａ１９７、Ｔｙｒ１９８、Ｉｌｅ２０８、Ａｓｎ２１１、Ｐｒｏ２１２、Ｐｈｅ２１３、Ａｌａ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｌａ２１６、Ｐｈｅ２１７の１つ以上の欠失がより好ましい（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）、（２）野生型ブラキュリータンパク質の位置１〜２２９内に位置する１つ以上のアミノ酸（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）、（３）野生型ブラキュリータンパク質の位置６６〜２１７内に位置する１つ以上のアミノ酸（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）、または（４）野生型ブラキュリータンパク質の位置１９８〜２２２内に位置する１つ以上のアミノ酸（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）から選択される。いずれにせよ、改変ブラキュリー抗原は、低減もしくは破壊されたＤＮＡ結合活性を有し、かつ／またはこの抗原を発現する酵母は、低減されたフロキュレーション表現型を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、以下に定義される「ほぼ全長」のブラキュリータンパク質であり得る。すなわち、このタンパク質は、野生型配列と比較してＮ末端および／またはＣ末端から１〜１０個のアミノ酸が欠如し得る。
【００６４】
一態様では、改変ブラキュリー抗原は、少なくとも１つのアゴニストエピトープ（たとえば、配列番号６または任意の他のアゴニストエピトープ、たとえば、以上に記載の配列番号５、７、８、または９の配列のアゴニスト）をさらに含む。
【００６５】
一態様では、改変ブラキュリー抗原は、以上に記載の改変ブラキュリー抗原に加えて、任意選択的に、（１）酵母α因子配列などのＮ末端ペプチドもしくは本明細書に記載の酵母ベースの免疫療法剤との併用に好適な他のＮ末端ペプチドで置換されていてもよい、プロテアソーム分解に対する耐性を付与するようにおよび配列番号１６で表される発現を安定化するように設計された合成Ｎ末端ペプチドであるＮ末端ペプチド、（２）ヘキサヒスチジンタグなど、融合タンパク質の単離もしくは同定に有用なＣ末端ペプチド、（３）融合タンパク質内のセグメントを連結するために使用される１、２、３個、もしくはそれを超えるアミノ酸のリンカーペプチド、および／または（４）他のブラキュリー抗原もしくは異なる（非ブラキュリー）抗原であってもよい好ましくは癌抗原である他の抗原も含み得る融合タンパク質の一部である。
【００６６】
本発明の他の実施形態では、改変ブラキュリー抗原は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、または少なくとも２４個のアミノ酸をその位置に天然に存在するものと異なるアミノ酸残基で置換することにより、野生型ブラキュリータンパク質のアミノ酸配列（たとえば、配列番号２、配列番号４、または異なるヒトブラキュリータンパク質の対応する配列）と異なるアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるタンパク質である。置換し得るアミノ酸残基は、（１）Ｌｙｓ６６、Ａｒｇ６９、Ａｒｇ７０、Ａｒｇ１０１、Ｌｙｓ１０３、Ｌｙｓ１４７、Ａｓｎ１５０、Ｌｙｓ１５１、Ｓｅｒ１６２、Ｔｈｒ１９６、Ａｌａ１９７、Ｔｙｒ１９８、Ｉｌｅ２０８、Ａｓｎ２１１、Ｐｒｏ２１２、Ｐｈｅ２１３、Ａｌａ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｌａ２１６、Ｐｈｅ２１７、Ｍｅｔ８７、Ｐｒｏ１２７、Ａｓｐ１２８、Ｓｅｒ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ａｓｎ１３１、Ｐｈｅ１３２、および／またはＶａｌ１７５から選択される１つ以上のアミノ酸（配列番号２または配列番号４に対して与えられた位置）、この場合、位置Ｌｙｓ６６、Ａｒｇ６９、Ａｒｇ７０、Ａｒｇ１０１、Ｌｙｓ１０３、Ｌｙｓ１４７、Ａｓｎ１５０、Ｌｙｓ１５１、Ｓｅｒ１６２、Ｔｈｒ１９６、Ａｌａ１９７、Ｔｙｒ１９８、Ｉｌｅ２０８、Ａｓｎ２１１、Ｐｒｏ２１２、Ｐｈｅ２１３、Ａｌａ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｌａ２１６、Ｐｈｅ２１７の１つ以上の置換がより好ましい（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）、（２）野生型ブラキュリータンパク質の位置１〜２２９内に位置する１つ以上のアミノ酸（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）、（３）野生型ブラキュリータンパク質の位置６６〜２１７内に位置する１つ以上のアミノ酸（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）、または（４）野生型ブラキュリータンパク質の位置１９８〜２２２内に位置する１つ以上のアミノ酸（配列番号２または配列番号４の位置に対応する位置）から選択される。いずれにせよ、置換の結果として、改変ブラキュリー抗原は、低減もしくは破壊されたＤＮＡ結合活性を有し、かつ／またはこの抗原を発現する酵母は、低減されたフロキュレーション表現型を有する。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、以下に定義される「ほぼ全長」のブラキュリータンパク質であり得る。すなわち、このタンパク質は、野生型配列と比較してＮ末端および／またはＣ末端から１〜１０個のアミノ酸を欠如し得る。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、少なくとも１つのアゴニストエピトープ（たとえば、配列番号６または任意の他のアゴニストエピトープ、たとえば、以上に記載の配列番号５、７、８、または９の配列のアゴニスト）をさらに含む。一態様では、改変ブラキュリー抗原は、以上に記載の改変ブラキュリー抗原に加えて、任意選択的に、（１）酵母α因子配列などのＮ末端ペプチドもしくは本明細書に記載の酵母ベースの免疫療法剤との併用に好適な他のＮ末端ペプチドで置換されていてもよい、プロテアソーム分解に対する耐性を付与し、かつ配列番号１６で表される発現を安定化するように設計された合成Ｎ末端ペプチドであるＮ末端ペプチド、（２）ヘキサヒスチジンタグなど、融合タンパク質の単離もしくは同定に有用なＣ末端ペプチド、（３）融合タンパク質内のセグメントを連結するために使用される１、２、３個、もしくはそれを超えるアミノ酸のリンカーペプチド、および／または（４）他のブラキュリー抗原もしくは異なる（非ブラキュリー）抗原であってもよい好ましくは癌抗原である他の抗原も含み得る融合タンパク質の一部である。
【００６７】
ヒトブラキュリーは、他の動物種のブラキュリーとの非常に高い相同性を有するため、特にこれらの配列が同一である場合、実質的に相同である場合、および標的抗原（たとえば、腫瘍細胞が発現する天然ブラキュリー）に対する有効な免疫反応を誘発する場合、本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の調製時に他の生物のブラキュリーの配列または本明細書に記載の例示的なヒト配列と異なるヒトブラキュリー配列を利用することが可能である。たとえば、ハーマン（Ｈｅｒｍａｎｎ）らにより１９９０年に初めてクローニングされたネズミブラキュリー（ハーマン（Ｈｅｒｍａｎｎ）ら著、前掲）は、ヒトブラキュリーに対してヌクレオチドレベルで約８５％同一であり、アミノ酸レベルで約９１％同一である。他の動物のブラキュリーに関して、アミノ酸レベルでは、ヒトブラキュリーは、パン・トログロディテス（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）のブラキュリーに対して９９．５％同一であり、カニス・ルプス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）のブラキュリーに対して９０．１％同一であり、ボス・タウラス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）のブラキュリーに対して８８．５％同一であり、ラタス・ノルベギカス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）のブラキュリー９２．２％同一であり、およびガルス属（Ｇａｌｌｕｓ）のブラキュリーに対して８０．９％同一である。Ｔボックスドメインを含有するブラキュリーのアミノ酸１〜２２３内で、マウスおよびヒトのブラキュリーは、わずか２つのアミノ酸（位置２６および９６）のみが異なる。
【００６８】
本発明のいずれかの実施形態によれば、「全長」タンパク質（または全長機能ドメインまたは全長免疫ドメイン）への参照は、本明細書に記載の、他に公知の、または公的に利用可能な配列に記載のタンパク質または機能ドメインまたは免疫ドメインの全長アミノ酸配列を含む。タンパク質のホモログタイプでもある「ほぼ全長」のタンパク質またはドメインは、全長のタンパク質またはドメインのＮ末端および／またはＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸を欠失または省略することにより、全長のタンパク質またはドメインと異なる。例として、本明細書に記載の融合タンパク質のいくつかは、抗原の位置１のメチオニンを省略してＮ末端ペプチドを置換するため、「ほぼ全長」のブラキュリー抗原を含む。タンパク質またはドメインまたは抗原への一般的参照は、全長およびほぼ全長の両方のタンパク質ならびにそれらの他のホモログを含み得る。
【００６９】
ブラキュリー抗原または癌抗原に関連するいずれかの実施形態の一態様では、抗原は、酵母による抗原の発現を可能にするのに十分な最小限のサイズである。酵母において発現させるために、タンパク質は、典型的に少なくとも約２５アミノ酸長であるが、より小さいタンパク質を発現させてもよく、かなり大きいタンパク質を酵母により発現させてもよい。たとえば、本発明に有用な癌抗原は、酵母により組換え発現可能であり、かつ少なくとも１つの免疫原性ドメインを含有する癌タンパク質の断片である。一実施形態では、本発明に有用な癌抗原は、少なくとも２５アミノ酸長、または少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、もしくは４１０、４１５、４２０、４２５、もしくは４３０アミノ酸長である。
【００７０】
本発明に有用なブラキュリー抗原（改変ブラキュリー抗原を含む）はまた、本明細書に記載の改変ブラキュリー抗原のいずれかのアミノ酸配列（たとえば、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１５）に対してタンパク質の全長にわたり少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有するタンパク質を含み、このブラキュリー抗原は、本発明の改変ブラキュリー抗原の特性を保持する（すなわち、ＤＮＡ結合活性が低減もしくは破壊され、かつ／または抗原を発現する酵母が低減されたフロキュレーション表現型を有する）。
【００７１】
以上で簡潔に考察したように、Ｎ末端発現配列およびＣ末端タグ、たとえば、本明細書に記載の融合タンパク質に対して以上に記載したものは任意選択であるが、発現、安定性を改良もしくは支援するために、かつ／またはタンパク質の同定および／もしくは精製を可能にするために、本明細書の他の箇所に記載のいくつかの異なる配列から選択し得る。また、酵母で使用するのに好適である多様なプロモータは、当技術分野で公知である。さらに、短い介在リンカー配列（たとえば、１、２、３、４、または５アミノ酸のペプチド）は、様々な理由で、たとえば、クローニングを容易にする制限酵素部位を導入するために、宿主ファゴソームプロテアーゼ用の切断部位として、タンパク質または抗原のプロセシングを加速するために、および構築物の将来的操作のために、ブラキュリー抗原を含む融合タンパク質の一部間に導入可能である。
【００７２】
任意選択的に、本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の成分として使用されるタンパク質は、融合タンパク質を含めて、酵母における異種抗原の発現の改良または安定化を行うのに特に有用な抗原構築物を用いて作製される。一実施形態では、所望の抗原タンパク質またはペプチドは、それらのアミノ末端で、（ａ）酵母媒体中で融合タンパク質の発現を安定化させるか、または発現された融合タンパク質の翻訳後修飾を防止する特異的合成ペプチド（かかるペプチドは、たとえば、２００４年８月１２日公開の米国特許出願公開第２００４／０１５６８５８Ａ１号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている）、（ｂ）限定されるものではないが、酵母α因子リーダー配列を含めて、融合パートナが酵母においてタンパク質の発現の安定性改良を提供し、かつ／または酵母細胞によるタンパク質の翻訳後修飾を防止する、内因性酵母タンパク質の少なくとも一部（かかるタンパク質はまた、たとえば、前掲の米国特許出願公開第２００４／０１５６８５８Ａ１号明細書に詳細に記載されている）、および／または（ｃ）酵母の表面上に融合タンパク質を発現させる、酵母タンパク質の少なくとも一部（たとえば、より詳細に本明細書に記載されるＡｇａタンパク質）に融合される。酵母細胞において抗原の発現の安定性を向上させ、および／または酵母においてタンパク質の翻訳後修飾を防止する例示的な合成配列は、配列Ｍ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｐを含む（本明細書では配列番号１６により表される）。加えて、本発明は、任意選択的に、具体的にはタンパク質の選択および同定に使用するための、抗原コード構築物のＣ末端に融合されたペプチドの使用を包含する。かかるペプチドとしては、任意の合成または天然のペプチド、たとえば、ペプチドタグ（たとえば、６×Ｈｉｓもしくはヘキサペプチド）または任意の他の短いエピトープタグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に係る抗原のＣ末端に結合されるペプチドは、以上で考察されたＮ末端ペプチドの付加を併用してまたは併用せずに使用可能であり、その逆も同様である。
【００７３】
本発明によれば、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物で使用される酵母媒体は、本発明に係る組成物（たとえば、療法用または予防用の組成物）で１つ以上の抗原、その免疫原性ドメイン、またはそのエピトープと組み合わせて使用可能な任意の酵母細胞（たとえば、全細胞もしくはインタクト細胞）またはそれらの派生物（以下を参照されたい）である。したがって、酵母媒体は、限定されるものではないが、生存インタクト（菌体）酵母微生物（すなわち、細胞壁を含むすべてのその成分を有する酵母細胞）、死滅（死亡）もしくは不活性化インタクト酵母微生物、あるいは酵母スフェロプラスト（すなわち、細胞壁が欠如している酵母細胞）、酵母細胞質体（すなわち、細胞壁および核が欠如している酵母細胞）、酵母ゴースト（すなわち、細胞壁、核、および細胞質が欠如している酵母細胞）、細胞レベル下の酵母細胞膜抽出物もしくはその一部（酵母細胞膜粒子としても参照され、以前には細胞レベル下の酵母粒子としても参照された）、任意の他の酵母粒子、または酵母細胞壁調製物をはじめとするインタクト酵母の派生物を含む。
【００７４】
酵母スフェロプラストは、典型的に酵母細胞壁の酵素消化により作製される。かかる方法は、たとえば、フランズソフ（Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ）ら著、１９９１年、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第１９４巻、ｐ．６６２〜６７４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００７５】
酵母細胞質体は、典型的に酵母細胞の除核により作製される。かかる方法は、たとえば、クーン（Ｃｏｏｎ）著、１９７８年、ナショナル・キャンサー・インスティチュト・モノグラフス（Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．Ｍｏｎｏｇｒ．）、第４８巻、ｐ．４５〜５５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００７６】
酵母ゴーストは、典型的に透過化細胞または溶解細胞の再封により作製されるが、その細胞のオルガネラの少なくとも一部を含有し得る（その必要があるわけではい）。かかる方法は、たとえば、フランズソフ（Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ）ら著、１９８３年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５８巻、ｐ．３６０８〜３６１４およびブッセイ（Ｂｕｓｓｅｙ）ら著、１９７９年、バイオシミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、第５５３巻、ｐ．１８５〜１９６（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００７７】
酵母細胞膜粒子（細胞レベル下の酵母細胞膜抽出物またはその一部）は、天然の核または細胞質が欠如している酵母細胞膜を意味する。粒子は、天然酵母細胞膜のサイズから、超音波処理法または当業者に公知の他の膜破壊法およびそれに続く再封により作製されるマイクロ粒子までの範囲内のサイズを含めて、任意のサイズであり得る。細胞レベル下の酵母細胞膜抽出物の作製方法は、たとえば、フランズソフ（Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ）ら著、１９９１年、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、第１９４巻、ｐ．６６２〜６７４に記載されている。また、酵母細胞膜部分を含有する酵母細胞膜粒子の一部と、酵母細胞膜粒子の調製前に抗原または他のタンパク質が酵母により組換え発現された場合には対象の抗原または他のタンパク質とを使用してもよい。対象の抗原または他のタンパク質は、膜内、膜のいずれかの表面上、またはそれらの組合せに担持可能である（すなわち、タンパク質は、膜内および膜外の両方にならびに／または酵母細胞膜粒子の膜をまたいで存在可能である）。一実施形態では、酵母細胞膜粒子は、膜の表面上にまたは少なくとも部分的に膜内に埋め込んで少なくとも１つの所望の対象の抗原または他のタンパク質を含む、インタクトの、破壊された、または破壊かつ再封された酵母細胞膜であり得る組換え酵母細胞膜粒子である。
【００７８】
酵母細胞壁調製物の例は、動物に投与したときに酵母細胞壁調製物が疾患標的に対して所望の免疫反応を刺激するように、その表面上にまたは少なくとも部分的に細胞壁内に埋め込んで抗原を担持する単離された酵母細胞壁の調製物である。
【００７９】
任意の酵母株を用いて本発明の酵母媒体を作製することが可能である。酵母は、３クラス：子嚢菌、担子菌、および不完全菌の１つに属する単細胞微生物である。免疫変調剤として使用するための酵母タイプの選択の一考慮点は、酵母の病原性である。一実施形態では、酵母は、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの非病原性株である。非病原性酵母株の選択により、酵母媒体が投与される個体に及ぼすいかなる悪影響も最小限に抑えられる。しかしながら、当業者に公知の何らかの手段により酵母の病原性を打ち消すことが可能であれば、病原性酵母を使用してもよい（たとえば、突然変異株）。本発明の一態様によれば、非病原性酵母株が使用される。
【００８０】
本発明に使用し得る酵母株の属としては、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（病原性の場合もある）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一態様では、酵母の属は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、またはシゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択され、一態様では、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が使用される。本発明に使用し得る各種の酵母株としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールスバーゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、クリプトコッカス・ラウレンティイ（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ハンゼヌラ・アノマラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ａｎｏｍａｌａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロマイセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアナス変種ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．ｌａｃｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｒｕｂｒａ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの種のいくつかは、以上に挙げた種に含まれるとみなされる様々な亜種、タイプ、サブタイプなどを含むことを認識すべきである。一態様では、本発明で使用される酵母種は、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｈ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびＳ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）を含む。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、操作が比較的簡単であるため、かつ食品添加物として使用するうえで「一般に安全であると認められる」または「ＧＲＡＳ」であるため（ＧＲＡＳ、ＦＤＡ提案規則６２ＦＲ１８９３８、１９９７年４月１７日）、有用である。本��明の一実施形態は、特に高いコピー数にプラスミドを複製可能な酵母株、たとえば、Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｃｉｒ°株である。Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、１つ以上の標的抗原および／または抗原融合タンパク質および／または他のタンパク質の高レベルでの発現を可能にする発現ベクターを支持可能な株の１つである。本発明に有用な他の酵母株は、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３αである。加えて、Ｎ結合グリコシル化を増加させる酵素中の突然変異のように、発現された標的抗原または他のタンパク質の翻訳後修飾の低減を呈する株をはじめとする任意の突然変異酵母株を本発明に使用することができる。
【００８１】
酵母ベースの免疫療法組成物を作製するための、酵母媒体の作製方法および発現方法、酵母媒体と、抗原および／または他のタンパク質および／または対象の作用剤との組合せ方法および／または会合方法は、本発明により企図される。
【００８２】
本発明によれば、「酵母媒体−抗原複合体」または「酵母−抗原複合体」という用語は、酵母媒体と抗原との任意の会合を記述するために総称的に用いられ、かかる組成物が以上に記載したように免疫反応を誘発するために使用される場合、「酵母ベースの免疫療法組成物」と同義的に用いられ得る。かかる会合は、酵母による抗原の発現（組換え酵母）、酵母中への抗原の導入、酵母への抗原の物理結合、および緩衝液中または他の溶液中または製剤中などでの酵母と抗原との混合一体化を含む。これらのタイプの複合体は、以下に詳細に記載される。
【００８３】
一般に、酵母媒体および抗原（および／または他の作用剤）は、本明細書に記載のいずれかの技術により会合可能である。一態様では、酵母媒体は抗原を細胞内で充填した。他の態様では、抗原を酵母媒体に共有結合または非共有結合により結合させた。さらに他の態様では、酵母媒体および抗原を混合により会合させた。好ましい実施形態の他の態様では、酵母媒体により、または酵母媒体が誘導された酵母細胞もしくは酵母スフェロプラストにより、抗原を組換え発現させる。
【００８４】
本発明の一実施形態では、酵母媒体中で抗原または他のタンパク質を組換え発現する代わりに、タンパク質もしくはペプチド、あるいは抗原として機能し、および／または本発明に係る免疫変調剤もしくは生物学的反応修飾剤として有用である炭水化物もしくは他の分子を酵母媒体に細胞内充填する。続いて、この時点で抗原および／または他のタンパク質を細胞内に含有する酵母媒体を個体に投与可能であるか、または樹状細胞などの担体中に充填可能である。ペプチドおよびタンパク質は、当業者に公知の技術により、たとえば、拡散、能動輸送、リポソーム融合、エレクトロポレーション、食作用、凍結−解凍サイクル、および浴超音波処理により、本発明の酵母媒体に直接挿入することが可能である。ペプチド、タンパク質、炭水化物、または他の分子を直接充填可能な酵母媒体としては、インタクトの酵母、ならびに産生後に抗原および他の作用剤を充填可能なスフェロプラスト、ゴースト、または細胞質体が挙げられる。他の選択肢として、インタクトの酵母に抗原および／または作用剤を充填し、次いでスフェロプラスト、ゴースト、細胞質体、または細胞レベル下の粒子をそれから調製することが可能である。
【００８５】
本発明の他の実施形態では、抗原および／または他の作用剤は、酵母媒体に物理結合される。酵母媒体への抗原および／または他の作用剤の物理結合は、当技術分野における好適な任意の方法により、たとえば、限定されるものではないが、酵母媒体の外表面への抗原および／もしくは他の作用剤の化学架橋、または抗体もしくは他の結合パートナを用いるなどによる酵母媒体の外表面への抗原および／または他の作用剤の生物学的結合をはじめとする、共有結合および非共有結合による会合方法により達成可能である。化学的架橋は、たとえば、グルタルアルデヒド結合、光親和性標識、カルボジイミド処理、ジスルフィド結合で連結可能な化学剤による処理、および当技術分野で標準的な他の架橋化学剤による処理を含む方法により達成可能である。他の選択肢として、酵母の外表面が特定の電荷特性を有する抗原および／または他の作用剤に融合または結合しやすくなるように、酵母細胞膜の脂質二重層の電荷または細胞壁の組成を変化させる化学剤を酵母媒体に接触させることが可能である。また、抗原を酵母媒体に結合させるために、抗体、結合性ペプチド、可溶性受容体、他のリガンドなどの標的化剤を融合タンパク質として抗原中に組み込むか、または他に抗原に会合させることが可能である。
【００８６】
抗原または他のタンパク質を酵母の表面上に発現する場合またはその表面に物理結合する場合、スペーサアームは、一態様では、表面上での抗原または他のタンパク質の発現または含有量が最適化されるように慎重に選択され得る。スペーサアームのサイズは、どの程度の量の抗原または他のタンパク質が酵母の表面への結合で露出されるかに影響を及ぼし得る。したがって、いずれの抗原または他のタンパク質を使用するかに依存して、当業者は、酵母表面上の抗原または他のタンパク質の適切なスペーシングを行うスペーサアームを選択するであろう。一実施形態では、スペーサアームは、少なくとも４５０アミノ酸の酵母タンパク質である。
【００８７】
さらに他の実施形態では、酵母媒体および抗原または他のタンパク質は、より受動的であるか、非特異的であるか、または非共有結合的な結合機構により、たとえば、緩衝液中または他の好適な配合物（たとえば、混合物）中で酵母媒体と抗原または他のタンパク質とを温和に混合一体化することにより、互いに会合される。
【００８８】
一実施形態では、酵母媒体の調製に使用される酵母細胞は、タンパク質が酵母細胞により発現されるように、タンパク質（たとえば、抗原）をコードする異種核酸分子でトランスフェクトされる。かかる酵母も本明細書で組換え酵母として参照される。次いで、酵母細胞は、薬学的に許容可能な賦形剤を用いて製剤化するか、患者に直接投与するか、後に投与するために貯蔵するか、またはインタクト細胞として樹状細胞中に充填することが可能である。酵母細胞はまた、死滅させることが可能であり、または酵母のスフェロプラスト、細胞質体、ゴースト、もしくは細胞レベル下の粒子を形成することなどにより、誘導体化することが可能であり、これらはいずれも続いて貯蔵、投与、または樹状細胞中への誘導体の充填に供し得る。また、抗原を発現する組換えスフェロプラストを作製するために、酵母スフェロプラストに組換え核酸分子を直接トランスフェクトすることが可能である（たとえば、スフェロプラストを酵母菌体から作製し、次いでトランスフェクトする）。抗原を組換え発現する酵母細胞または酵母スフェロプラストを用いて、酵母細胞質体、酵母ゴースト、または酵母細胞膜粒子もしくは酵母細胞壁粒子を含む酵母媒体あるいはそれらの一部を作製し得る。
【００８９】
本発明の酵母媒体中での抗原または他のタンパク質の発現は、当業者に公知の技術を用いて達成される。簡潔に述べると、宿主酵母細胞にトランスフォームしたときに核酸分子の構成発現または調節発現のいずれかを引き起こすことができるようにするために、核酸分子が転写制御配列に機能的に結合されるように、少なくとも１つの所望の抗原または他のタンパク質をコードする核酸分子を発現ベクター中に挿入する。１つ以上の抗原および／または他のタンパク質をコードする核酸分子は、１つ以上の発現制御配列に機能的に連結された１つ以上の発現ベクター上に存在可能である。特に重要な発現制御配列は、プロモータおよび上流活性化配列などのように転写開始を制御するものである。任意の好適な酵母プロモータを本発明に使用することが可能であり、様々なかかるプロモータが当業者に公知である。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現用のプロモータとしては、次の酵母タンパク質をコードする遺伝子のプロモータが挙げられるが、これらに限定されるものではない：アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｉ（ＡＤＨ１）またはＩＩ（ＡＤＨ２）、ＣＵＰ１、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、翻訳伸長因子ＥＦ−１α（ＴＥＦ２）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ、トリオースリン酸デヒドロゲナーゼに対してＴＤＨ３としても参照される）、ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、ガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ（ＧＡＬ７）、ＵＤＰ−ガラクトースエピメラーゼ（ＧＡＬ１０）、シトクロムｃ１（ＣＹＣ１）、Ｓｅｃ７タンパク質（ＳＥＣ７）、および酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）（ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨおよびＣＹＣ１／ＧＡＬ１０プロモータなどのハイブリッドプロモータおよび細胞内のグルコース濃度が低い場合（たとえば、約０．１〜約０．２パーセント）に誘導されるＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータを含む）、ならびにＣＵＰ１プロモータおよびＴＥＦ２プロモータ。同様に、エンハンサーとしても参照されるいくつかの上流活性化配列（ＵＡＳ：ｕｐｓｔｒｅａｍ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が公知である。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現用の上流の活性化配列としては、次のタンパク質をコードする遺伝子のＵＡＳが挙げられるが、これらに限定されるものではない：ＰＣＫ１、ＴＰＩ、ＴＤＨ３、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＳＵＣ２、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０、ならびにＧＡＬ４遺伝子産物により活性化される他のＵＡＳ（一態様ではＡＤＨ２  ＵＡＳが使用される）。ＡＤＨ２  ＵＡＳはＡＤＲ１遺伝子産物により活性化されるため、異種遺伝子がＡＤＨ２  ＵＡＳに機能的に連結される場合、ＡＤＲ１遺伝子を過剰発現させることが好ましいこともある。サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中での発現用の転写終止配列としては、α因子、ＧＡＰＤＨ、およびＣＹＣ１遺伝子の終止配列が挙げられる。
【００９０】
メチルトローフ酵母中で遺伝子を発現するための転写制御配列としては、アルコールオキシダーゼおよびギ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写制御領域が挙げられる。
【００９１】
本発明に係る酵母細胞中への核酸分子のトランスフェクションは、核酸分子を細胞内に導入可能な任意の方法により達成可能であり、たとえば、拡散、能動輸送、浴超音波処理、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。トランスフェクト核酸分子は、酵母染色体中に組込み可能であるか、または当業者に公知の技術を用いて染色体外ベクター上に維持可能である。かかる核酸分子を担持する酵母媒体の例は、本明細書に詳細に開示される。以上で考察したように、酵母細胞質体、酵母ゴースト、および酵母細胞膜粒子または細胞壁調製物はまた、所望の核酸分子をインタクト酵母微生物または酵母スフェロプラストにトランスフェクトして、その中で抗原を産生し、次いで当業者に公知の技術を用いて微生物またはスフェロプラストをさらに操作して、所望の抗原または他のタンパク質を含有する細胞質体、ゴースト、もしくは細胞レベル下の酵母細胞膜抽出物、またはそれらの一部を作製することにより、組換え産生可能である。
【００９２】
組換え酵母媒体の作製ならびに酵母媒体による抗原および／または他のタンパク質の発現に有効な条件としては、酵母株を培養可能な効果的培地が挙げられる。効果的培地は、典型的に同化可能な炭水化物源、窒素源、およびリン酸源、ならびに適切な塩、ミネラル、金属、および他の栄養素、たとえば、ビタミンおよび増殖因子を含む水性培地である。培地は、複合栄養素を含んでいてもよく、または規定の最少培地であってもよい。本発明の酵母株は、バイオリアクター、エルレンマイヤーフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリプレートをはじめとする様々な容器中で培養可能であるが、これらに限定されるものではない。培養は、酵母株に適した温度、ｐＨ、および酸素含有率で行われる。かかる培養条件は、十分に当業者の技能の範囲内にある（たとえば、グトリエ（Ｇｕｔｈｒｉｅ）ら編、１９９１年、メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１９４巻、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を参照されたい）。たとえば、一プロトコル下では、スタータプレートから取得される培養物および／または酵母−ブラキュリー免疫療法組成物のスタータ培養物を用いて、好適な培地を含有する液体培養物を接種することが可能であり、および２５０ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で約２０時間増殖させる。次いで、必要に応じて初代培養物をより大量の培養物に増大させることが可能である。酵母にトランスフォームされたベクターからのタンパク質発現（たとえば、ブラキュリー発現）は、利用されるプロモータが構成プロモータであれば構成的であり得、利用されるプロモータが誘導プロモータであれば、プロモータに適した誘導条件（たとえば、ＣＵＰ１プロモータの場合、硫酸銅）を加えることにより誘導され得る。誘導プロモータの場合、タンパク質発現の誘導は、培養物が好適な細胞密度に増殖した後に開始され得る。それは、約０．２Ｙ．Ｕ．／ｍｌ以上の密度であり得る。
【００９３】
本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の培養に好適な培地の一例はＵ２培地であるが、これに限定されるものではない。Ｕ２培地は、次の成分を含む：２０ｇ／Ｌのグルコース、６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母ニトロゲンベース、および各０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、ロイシン、トリプトファン、およびアデニン。本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の培養に好適な培地の他の例としてはＵＬ２培地が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＵＬ２培地は、次の成分を含む：２０ｇ／Ｌのグルコース、６．７ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム含有酵母ニトロゲンベース、および各０．０４ｍｇ／ｍＬのヒスチジン、トリプトファン、およびアデニン。
【００９４】
酵母媒体において本発明に係る改変ブラキュリー抗原を発現するために誘導プロモータ（たとえば、ＣＵＰ１プロモータ）を使用する場合、タンパク質発現の誘導は、かかるプロモータを用いて酵母により発現されるほとんどのタンパク質に好適な細胞密度と比較してより高い細胞密度で開始される。ＣＵＰ１プロモータにより駆動される最適ブラキュリー抗原発現は、ブラキュリー抗原を発現する酵母を少なくとも０．５Ｙ．Ｕ／ｍｌ〜約２．０Ｙ．Ｕ．／ｍｌ、一態様では０．５Ｙ．Ｕ．／ｍｌ〜約１．５Ｙ．Ｕ．／ｍｌ、一態様では少なくとも１．０Ｙ．Ｕ．／ｍｌ〜約２．０Ｙ．Ｕ．／ｍｌ、他の態様では少なくとも約１．０Ｙ．Ｕ．／ｍｌの細胞密度まで成長させたときに行われる。本発明の一実施形態では、ＣＵＰ１プロモータなどの誘導プロモータの制御下に抗原発現を有する酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、抗原発現の誘導前に中間対数期まで成長させる。一態様では、抗原発現の誘導前に約１〜２Ｙ．Ｕ．／ｍｌまで細胞を成長させる。一態様では、抗原発現を誘導して（たとえば、硫酸銅の添加により）、６、６．５、７、７．５、または８時間まで継続する。一態様では、誘導は、約３０℃の温度および２５０ｒｐｍの撹拌速度で行われる。
【００９５】
本発明のいくつかの実施形態では、酵母は中性ｐＨ条件下で増殖される。本明細書で用いられる場合、「中性ｐＨ」という用語の一般的使用は、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ８のｐＨ範囲、一態様では約ｐＨ６〜約８を意味する。ｐＨ計による測定時、わずかな変動（たとえば、１／１０または１／１００）が起こり得ることは当業者であれば分かるであろう。したがって、酵母細胞の増殖に中性ｐＨを使用することは、培養中のほとんどの時間にわたり酵母細胞が中性ｐＨで増殖されることを意味する。一実施形態では、酵母は、少なくとも５．５のｐＨレベルに維持された培地中で増殖される（すなわち、培養培地のｐＨをｐＨ５．５未満に低下させない）。他の態様では、酵母は、約６、６．５、７、７．５、または８に維持されたｐＨレベルで増殖される。酵母の培養に中性ｐＨを使用すると、免疫変調用の媒体として酵母を使用するうえで望ましい特徴であるいくつかの生物学的作用が促進される。たとえば、中性ｐＨで酵母を培養すると、細胞世代時間に悪影響を及ぼすことなく（たとえば、倍加時間の減速）、酵母の良好な増殖が可能になる。酵母は、その細胞壁柔軟性を失うことなく高密度まで増殖を続けることが可能である。中性ｐＨを使用すると、柔軟な細胞壁を有する酵母および／またはあらゆる採取密度で細胞壁消化酵素（たとえば、グルカナーゼ）に対してより感受性のある酵母の生成が可能になる。柔軟な細胞壁を有する酵母は、より酸性の条件下に増殖された酵母と比較して、たとえば、酵母を貪食した抗原提示細胞によるサイトカインの分泌を促進することにより、様々なまたは改良された免疫反応を誘導できるため、この形質は望ましい（たとえば、ＴＨ１型サイトカイン、たとえば、限定されるものではないが、ＩＦＮ−γ、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、およびＩＬ−２、ならびにＩＬ−６などの炎症誘発性サイトカイン）。加えて、かかる培養方法により、細胞壁に位置する抗原へのより大きい到達性が与えられる。他の態様では、いくつかの抗原に対して中性ｐＨを使用すると、かかる抗原発現酵母をより低いｐＨ（たとえば、ｐＨ５）の培地で培養したときには可能でないジチオトレイトール（ＤＴＴ）処理によるジスルフィド結合抗原の放出が可能になる。
【００９６】
本発明の一実施形態では、酵母細胞壁調製物、酵母細胞膜粒子、または酵母断片（すなわち、インタクトでない）が作製されるように、インタクトの酵母（異種抗原または他のタンパク質の発現を行うまたは行わない）を粉砕または処理することが可能であり、酵母断片は、いくつかの実施形態では、免疫反応を促進するために、本発明の改変ブラキュリー抗原（たとえば、タンパク質サブユニットとしてまたは異なる媒体内に含まれる）を含む他の組成物と共に提供し得るか、またはそれと共に投与し得る。たとえば、酵素処理、化学処理、または物理力（たとえば、機械的剪断もしくは超音波処理）を用いて、補助剤として使用される部分に酵母を破壊することが可能である。
【００９７】
本発明の一実施形態では、本発明に有用な酵母媒体は、死滅または不活性化された酵母媒体を含む。酵母の死滅または不活性化は、当技術分野で公知の様々な好適な方法のいずれかにより達成可能である。たとえば、酵母の熱不活性化は、酵母の標準的不活性化方法であり、必要に応じて、当業者であれば、当技術分野で公知の標準的方法により、標的抗原の構造変化をモニターすることが可能である。他の選択肢として、酵母の他の不活性化方法、たとえば、化学法、電気法、放射活性法、またはＵＶ法を使用することが可能である。たとえば、メソッド・オブ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１９４巻、コールド・スプリング・ハーバ・パブリッシング（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、１９９０年などの酵母培養の標準的教科書を参照されたい。不活性化戦略のいずれを用いたとしても、標的抗原の二次構造、三次構造、または四次構造を考慮に入れて、その免疫原性が最適化されるようにかかる構造を維持すべきである。
【００９８】
酵母媒体は、当業者に公知のいくつかの技術を用いて、本発明の酵母ベースの免疫療法組成物または生成物の形態に製剤化可能である。たとえば、酵母媒体は、凍結乾燥により乾燥可能である。酵母媒体を含む製剤はまた、ベーキングまたは醸造の操作で使用される酵母に対して行われるように、ケーキまたはタブレットに酵母を充填することにより調製可能である。加えて、酵母媒体は、宿主または宿主細胞が耐えられる等張性緩衝液などの薬学的に許容可能な賦形剤と混合可能である。かかる賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース液、ハンクス液、および他の水性生理的平衡塩類液が挙げられる。固定油、ゴマ油、エチルオレエート、トリグリセリドなどの非水性媒体を使用することも可能である。他の有用な製剤としては、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、グリセロール、デキストランなどの粘度増強剤を含有する懸濁剤が挙げられる。賦形剤はまた、等張性および化学的安定性を向上させる物質などの添加剤を副次量で含有可能である。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝剤、およびトリス緩衝液が挙げられ、一方、保存剤の例としては、チメロサール、ｍまたはｏ−クレゾール、ホルマリン、およびベンジルアルコールが挙げられる。標準的製剤は、液体注射剤または注射用の懸濁液もしくは溶液として好適な液体中に溶解可能な固形剤のいずれかであり得る。したがって、非液体製剤では、賦形剤は、たとえば、投与前に無菌水または生理食塩水を添加し得るデキストロース、ヒト血清アルブミン、および／または保存剤を含み得る。
【００９９】
本発明の一実施形態では、組成物は、追加の作用剤を含み得る。この作用剤はまた、生物学的反応修飾剤化合物またはかかる作用剤／修飾剤を生成する能力としても参照され得る。たとえば、酵母媒体に少なくとも１つの抗原および少なくとも１つ作用剤／生物学的反応修飾剤化合物をトランスフェクトもしくは充填することが可能であるか、または本発明の組成物を少なくとも１つの作用剤／生物学的反応修飾剤と組み合わせて投与することが可能である。生物学的反応修飾剤としては、免疫変調化合物として参照され得る免疫反応を変調可能なアジュバントおよび他の化合物、ならびに他の化合物または作用剤の生物学的活性を修飾する化合物、たとえば、酵母ベースの免疫療法剤（かかる生物学的活性は、免疫系効果に限定されるものではない）が挙げられる。特定の免疫変調化合物は、防御免疫反応を刺激可能であり、一方、他のものは、有害免疫反応を抑制可能であり、免疫変調が所与の酵母ベースの免疫療法剤との組合せに有用であるかは、疾患状態または治療もしくは予防される病態および／または治療される個体に少なくとも部分的に依存し得る。特定の生物学的反応修飾剤は、細胞媒介性免疫反応を優先的に促進し、一方、他のものは、体液性免疫反応を優先的に促進する（すなわち、体液性免疫と比較して増大されたレベルの細胞媒介性免疫が存在する免疫反応を刺激可能であり、その逆も同様である）。特定の生物学的反応修飾剤は、酵母ベースの免疫療法剤の生物学的性質と共通した１つ以上の性質を有するか、または酵母ベースの免疫療法剤の生物学的性質を増強もしくは補完する。免疫反応の刺激もしくは抑制を測定するための、および細胞媒介性免疫反応と体液性免疫反応とを区別するための、一方のタイプの細胞媒介性反応と他方のタイプのものとを区別するための（たとえば、ＴＨ１７反応に対してＴＨ１反応）、当業者に公知のいくつかの技術が存在する。
【０１００】
本発明に有用な作用剤／生物学的反応修飾剤としては、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、脂質誘導体、ペプチド、タンパク質、ポリサッカリド、小分子薬剤、抗体およびその抗原結合フラグメント（限定されるものではないが、抗サイトカイン抗体、抗サイトカイン受容体抗体、抗ケモカイン抗体を含む）、ビタミン、ポリヌクレオチド、核酸結合部分、アプタマー、および増殖変調剤が挙げられ得るが、これらに限定されるものではない。いくつかの好適な作用剤としては、ＩＬ−１またはＩＬ−１アゴニストまたはＩＬ−１Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−１または他のＩＬ−１アンタゴニスト、ＩＬ−６またはＩＬ−６アゴニストまたはＩＬ−６Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−６または他のＩＬ−６アンタゴニスト、ＩＬ−１２またはＩＬ−１２アゴニストまたはＩＬ−１２Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−１２または他のＩＬ−１２アンタゴニスト、ＩＬ−１７またはＩＬ−１７アゴニストまたはＩＬ−１７Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−１７または他のＩＬ−１７アンタゴニスト、ＩＬ−２１またはＩＬ−２１アゴニストまたはＩＬ−２１Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−２１または他のＩＬ−２１アンタゴニスト、ＩＬ−２２またはＩＬ−２２アゴニストまたはＩＬ−２２Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−２２または他のＩＬ−２２アンタゴニスト、ＩＬ−２３またはＩＬ−２３アゴニストまたはＩＬ−２３Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−２３または他のＩＬ−２３アンタゴニスト、ＩＬ−２５またはＩＬ−２５アゴニストまたはＩＬ−２５Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−２５または他のＩＬ−２５アンタゴニスト、ＩＬ−２７またはＩＬ−２７アゴニストまたはＩＬ−２７Ｒアゴニスト、抗ＩＬ−２７または他のＩＬ−２７アンタゴニスト、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−αを含む）、Ｉ型インターフェロンのアゴニストまたはアンタゴニストまたはそれらの受容体、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−γを含む）、ＩＩ型インターフェロンのアゴニストまたはアンタゴニストまたはそれらの受容体、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）タンパク質および／またはＩＭＰ３２１（可溶形ＬＡＧ３に由来するＴ細胞免疫刺激因子）、抗ＣＴＬＡ−４抗体（たとえば、アネルギーＴ細胞を放出する）、Ｔ細胞共刺激剤（たとえば、抗ＣＤ１３７、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ４０）、アレムツズマブ（たとえば、カムパス（ＣａｍＰａｔｈ）（登録商標））、デニロイキンジフチトクス（たとえば、オンタック（ＯＮＴＡＫ）（登録商標））、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５、免疫チェックポイント阻害剤（たとえば、自己寛容を維持し、かつ生理学的免疫反応の持続時間および大きさを調節する免疫系の阻害経路である「免疫チェックポイント」の阻害剤、かかる免疫チェックポイント阻害剤としては、抗ＣＴＬＡ−４抗体、たとえば、イピリムマブ（ブリストル・マイヤーズ・スクイブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ニュージャージ州プリンストン）またはトレメリムマブ（メディミューン／アストラゼネカ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、デラウェア州ウィルミントン）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死タンパク質１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム細胞死タンパク質２リガンド（ＰＤ−Ｌ２、たとえば、ＡＭＰ−２２４（アンプリミューン（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、メリーランド州ゲイサーズバーグ／グラクソスミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ペンシルバニア州フィラデルフィア）として知られるＰＤ−Ｌ２融合タンパク質）、抗ＰＤ−１抗体（たとえば、ニボルマブ（ブリストル・マイヤーズ・スクイブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ））、ペムブロリズマンブ（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ニュージャージ州ホワイトハウスステーション）、またはピディリズマブ（キュアテック（ＣｕｒｅＴｅｃｈ）、イスラエル国ヤブネ））、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（たとえば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ジェネンテック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）、ＭＥＤＩ４７３６（メディミューン／アストラゼネカ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））、ＢＭＳ−９３６５５９（ブリストル・マイヤーズ・スクイブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ））、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ＥＭＤセローノ（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）、メリーランド州ロックランド））、または抗ＰＤ−Ｌ２抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤（たとえば、ＩＮＣＢ２４３６０）、ＦＯＸＰ３をブロックする作用剤（たとえば、活性／死滅ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ調節細胞を抑止する）、Ｆｌｔ３リガンド、イミキモド（アルダラ（Ａｌｄａｒａ）（商標））、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、サルグラモスチム（ロイキン（Ｌｅｕｋｉｎｅ）（登録商標））、限定されるものではないが、プロラクチンおよび成長ホルモンを含むホルモン、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ：Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）アゴニスト、限定されるものではないが、ＴＬＲ−２アゴニスト、ＴＬＲ−４アゴニスト、ＴＬＲ−７アゴニスト、およびＴＬＲ−９アゴニスト、ＴＬＲアンタゴニスト、限定されるものではないが、ＴＬＲ−２アンタゴニスト、ＴＬＲ−４アンタゴニスト、ＴＬＲ−７アンタゴニスト、およびＴＬＲ−９アンタゴニスト、抗炎症剤および免疫変調剤、限定されるものではないが、ＣＯＸ−２阻害剤（たとえば、セレコキシブ、ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、スタチン、およびサリドマイド、ならびにそれらのアナログ、たとえば、イミド（ＩＭｉＤ）（商標）（サリドマイドの構造アナログおよび機能アナログである（たとえば、レブリミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ）（登録商標）（レナリドマイド）、アクチミド（ＡＣＴＩＭＩＤ）（登録商標）（ポマリドマイド）））、炎症誘発剤、たとえば、菌類成分もしくは細菌成分または任意の炎症誘発性サイトカインもしくはケモカイン、免疫療法ワクチン、たとえば、限定されるものではないが、ウイルスベースのワクチン、細菌ベースのワクチン、または抗体ベースのワクチン、ならびに任意の他の免疫変調剤、免疫増強剤、抗炎症剤、炎症誘発剤、および抗原提示細胞またはＴＨ１７、ＴＨ１、および／もしくはＴｒｅｇ細胞の数を変調し、活性化状態を変調し、および／または生存率を変調する任意の作用剤が挙げられるが、これらに限���されるものではない。かかる作用剤の任意の組合せは、本発明により企図され、酵母ベースの免疫療法剤と組み合わされたまたはそれを用いるプロトコルで（たとえば、併行的に、逐次的に、もしくは他の方式で）投与されたかかる作用剤はいずれも本発明に包含される組成物である。かかる作用剤は当技術分野で周知である。これらの作用剤は、単独でまたは本明細書に記載の他の作用剤と組み合わせて使用し得る。
【０１０１】
本発明に係る組成物は、癌の予防もしくは治療に有用な任意の他の作用剤もしくは組成物もしくはプロトコル、または癌、特にブラキュリーの発現もしくは過剰発現に関連する癌の任意の症状を治療もしくは寛解する任意の化合物をさらに含み得るか、またはそれらと共に投与され得る（併行的に、逐次的に、または断続的に）。加えて、本発明の組成物は、予防用および／または治療用の免疫療法を含めて、他の免疫療法組成物と一緒に使用可能である。実際には、本発明の組成物は、癌においてブラキュリー発現を阻害することにより（それによって抗増殖作用を阻害することにより）、転移癌で起こり得る化学療法耐性または放射線耐性を阻害または低減するために使用可能であるか、または本発明の組成物は、個体において化学療法または放射線療法の性能を向上させ得る。癌の治療に有用な追加の作用剤、組成物、またはプロトコル（たとえば、治療プロトコル）としては、化学療法、腫瘍の外科的切除、放射線療法、同種異系移植もしくは自己由来幹細胞移植、および／または標的癌療法が挙げられるが、これらに限定されるものではない（たとえば、腫瘍の増殖および進行に関与する分子を特異的に標的とする小分子薬剤、生物製剤、またはモノクロナール抗体療法、限定されるものではないが、選択的エストロゲン受容体変調剤（ＳＥＲＭ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、アロマターゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、セリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、レチノイド受容体活性化剤、アポトーシス刺激剤、血管新生阻害剤、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、または免疫刺激剤が含まれる）。これらの追加の療法剤および／または療法プロトコルはいずれも、本発明の免疫療法組成物の前に、それと同時に、それと交互に、もしくはその後に、または様々な時点で投与され得る。たとえば、化学療法または標的化癌療法と組み合わせて個体に投与する場合、免疫療法組成物の有効性を最大化するために、化学療法または標的化癌療法の施行の「休診日」間で酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を投与することが望ましいこともある。腫瘍の外科的切除は、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の投与に先行することが多いと思われるが、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の投与中または投与後に追加のまたは初回の手術を行ってもよい。
【０１０２】
本発明はまた、本明細書に記載の組成物のいずれかまたは本明細書に記載の組成物の各成分のいずれかを含むキットを包含する。キットは、ブラキュリーの発現または過剰発現によって特徴付けられる癌を予防または治療するために、本発明に係る組成物のいずれかを使用するための追加の試薬および書面の説明書または指示書を含み得る。
【０１０３】
本発明の組成物の投与方法または使用方法
本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、ブラキュリーの発現または過剰発現に関連付けられるか、またはそれによって特徴付けられる癌の予防または治療（かかる癌の発生の予防、かかる癌の進行の阻止、またはかかる癌の排除を含む）に使用するように設計される。より具体的には、酵母−ブラキュリー免疫療法用組成物は、ブラキュリー発現腫瘍の発生の予防、阻害、もしくは遅延、および／または腫瘍遊走の予防、阻害、もしくは遅延、および／または他の組織の腫瘍浸潤（転移）、および／または一般に個体における癌の進行の予防もしくは阻害に使用可能である。酵母−ブラキュリー免疫療法用組成物はまた、たとえば、個体における腫瘍負荷の低減により、個体における腫瘍増殖の阻害により、個体の生存率の増大により、腫瘍遊走および／または他の組織の腫瘍浸潤（転移癌）の発生の予防、阻害、逆転、もしくは遅延により、および／または個体における癌の進行の予防、阻害、逆転、もしくは遅延により、癌の少なくとも１つの症状を寛解させるために使用可能である。酵母−ブラキュリー免疫療法はまた、癌においてブラキュリー発現を阻害することにより、転移癌で起こり得る化学療法耐性または放射線耐性を阻害、低減、または排除するために治療用に使用可能であり、本発明の組成物は、個体において化学療法または放射線療法の性能を向上させ得る。
【０１０４】
本発明の組成物および方法に関連する癌は、ブラキュリーを発現するもしくは発現し得る任意の癌、またはブラキュリーを発現するもしくは発現し得る癌に近接する癌であり、限定されるものではないが、乳癌、骨癌（限定されるものではないが、脊索腫を含む）、小腸癌、胃癌、腎臓癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌を含み、さらに転移癌および後期癌を含む。加えて、ブラキュリーは、Ｂ細胞由来の腫瘍、たとえば、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、エプスタイン・バーウイルス形質転換Ｂ細胞、バーキットリンパ腫、およびホジキンリンパ腫、ならびにそれらの転移癌で発現される。
【０１０５】
したがって、本発明の一実施形態は、癌、特にブラキュリー発現癌を治療する方法に関する。本方法は、ブラキュリー発現癌を有する個体に本明細書に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を投与することを含み、この組成物は、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）本発明の少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原を含む癌抗原とを含む組成物を含む。一態様では、本方法は、患者において腫瘍負荷を低減する。一態様では、本方法は、患者の生存率を増加する。一態様では、本方法は、個体において腫瘍増殖を阻害する。一態様では、本方法は、腫瘍の転移進行を予防、停止、または逆転する。
【０１０６】
ブラキュリー発現は、癌が進展するにつれてまたはより高いステージ（たとえば、特定の癌に依存してステージＩからステージＩＩ、ステージＩＩＩ、ステージＩＶまで）に進行するにつれてより多く見られると考えられ、また転移プロセスに関連するため、ブラキュリー発現癌の発症を予防もしくは遅延するか、または前転移段階もしくは前悪性段階で癌を停止させるか、またはかかる癌の進行を予防もしくは遅延する（たとえば、癌を安定化させる）方法を提供することは、本発明の実施形態である。かかる方法は、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）本発明の少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原を含む癌抗原とを含む組成物を含み得る本明細書に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を、ブラキュリー発現癌細胞が検出されない個体に投与することを含む。この実施形態の一態様では、癌は、癌を有する個体の少なくともサブセットにおいて、癌のあるステージでブラキュリーを発現することが知られているかまたは発現する可能性があると考えられる。この実施形態の一態様では、個体は、すでに癌を有しているが、ブラキュリーは、組成物を最初に投与した時点で癌において検出されない。すなわち、個体は、ブラキュリー発現が依然として出現していないまたはブラキュリー発現がいずれにせよ検出可能でないより初期の癌を有し得る（すなわち、ブラキュリーは、低レベルでまたは少数の腫瘍細胞で発現していてもしていなくてもよいが、それでもなお標準的な検出方法では容易に検出できない）。いくつかの場合、癌のタイプは、高い転移進行速度を有することが知られているものであり得る。この態様では、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の投与は、患者の癌におけるブラキュリー発現腫瘍細胞の発生を予防、遅延、または阻害するため、ブラキュリー発現を伴う転移プロセスを予防、停止、遅延、または阻害する。他の態様では、個体は、組成物が投与される時点で癌を有していない。かかる個体は、おそらく家族歴または遺伝子マーカを理由として、あるいは個体が前癌細胞もしくは病変の徴候を示したかまたは前癌（前悪性）細胞もしくは病変を有することを理由として、癌を発生する「素因」を有し得るかまたは発生する可能性が高い。
【０１０７】
本発明の一実施形態は、癌を有する個体において腫瘍遊走を阻害する方法および／または癌の転移進行を低減、中止（停止）、逆転、もしくは予防する方法、または癌における転移イベントの発生を逆転する方法に関する。以上で考察したように、ブラキュリーは、ヒト腫瘍細胞において上皮間葉転換（ＥＭＴ）を促進することにより、腫瘍細胞に間葉表現型ならびに遊走能および浸潤能を付与すると共に腫瘍細胞周期進行を減衰させる。したがって、ブラキュリーは、転移プロセスに関与することから、前転移段階で癌を停止させることを含めて、転移プロセスを予防または阻害するための理想的な標的となる。本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の使用は、化学療法および放射線療法などの従来の療法からの癌の回避（または試行回避）に対抗して、癌の進行を停止することを含めて、転移癌を予防または治療するのに有効であり得る。本方法は、限定されるものではないが、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）本発明の少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原を含む癌抗原とを含む本明細書に記載の本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を、癌を有する個体に投与する工程を含む。
【０１０８】
一態様では、ブラキュリーは、組成物が最初に投与される時点で個体の癌で検出されない。一般に、ブラキュリーが個体の癌で検出されない場合、個体は、ブラキュリー発現が依然として出現していない（たとえば、ステージＩもしくはステージＩＩ）またはブラキュリー発現がいずれにせよ依然として検出可能でないより初期の癌を有し得る（すなわち、ブラキュリーは、低レベルでもしくは少数の腫瘍細胞で発現していてもしていなくてもよいが、それでもなお、標準的検出方法を用いて容易に検出できない）。本発明のこれらの態様では、ブラキュリー発現腫瘍細胞の発生は、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の使用により、予防、遅延、または阻害される。結果として、腫瘍遊走および／もしくは腫瘍の転移進行をもたらす他の転移プロセスは、予防、遅延、もしくは阻害され、かつ／または腫瘍進行の一般的停止が起こる。
【０１０９】
他の態様では、ブラキュリー発現は、組成物が最初に投与される時点で個体の癌で検出されるかまたは検出可能である。個体は、本発明のこの態様では、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶの癌を有し得る。この態様では、酵母−ブラキュリー免疫療法用組成物の使用により、ブラキュリーを発現する腫瘍の増殖が低減、排除、減速、または停止され、その結果、個体における腫瘍負荷が低減可能になり、ブラキュリー発現腫瘍の増殖が阻害可能になり、かつ／または個体の生存率が増大可能になる。個体は、転移プロセスの停止、減速、または逆転を経験し得るため、患者の生存率および健康が改善されると共に、さらに癌を治療する他の治療プロトコルが可能になる。
【０１１０】
実際には、転移癌は、化学療法、放射線療法、標的癌療法などの癌療法に対する耐性（または耐性増加）に関連し得るため、癌は、療法から「回避」するかまたは単に療法の影響を受けにくくなって進行する。したがって、療法の効力を改善または増強し、かつ患者の健康および生存率を向上させるために、かかる療法に対する耐性を低減または排除する必要性が存在する。したがって、本発明の一実施形態は、癌患者において化学療法耐性、標的癌療法耐性、または放射線耐性を低減または予防する方法に関する。本方法は、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）本発明の少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原を含む癌抗原とを含む組成物を含み得る本明細書に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を、癌を有しかつ癌に対する化学療法および／または放射線療法を受けている個体に投与することを含む。本発明のこの方法はまた、限定されるものではないが、標的癌療法を含めて、癌に対する他の治療処置に関連する耐性を治療するためにも使用し得る。
【０１１１】
この実施形態の一態様では、ブラキュリーは、組成物が最初に投与される時点で個体の癌で検出されない。この態様では、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の投与は、癌におけるブラキュリー発現腫瘍細胞の発生を阻害することにより、化学療法または放射線療法に対する耐性の出現を予防または阻害する。他の態様では、ブラキュリー発現は、組成物が最初に投与される時点で個体の癌で検出される。この態様では、個体は、すでに化学療法または放射線療法に対する耐性を経験していてもしていなくてもよい。いずれの場合も、本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の投与は、患者においてブラキュリー発現腫瘍細胞を低減または排除することにより、化学療法もしくは放射線療法に対する耐性を予防もしくは阻害するか、または個体を治療する化学療法もしくは放射線療法の能力を増強する。
【０１１２】
本発明のさらに他の実施形態は、脊索腫を有する個体（対象）に本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を投与することにより脊索腫を治療する方法に関する。脊索腫はブラキュリーの発現によって特徴付けられ、実際に、ブラキュリーはこの癌に対する識別バイオマーカである。すなわち、ブラキュリー発現は、すべての脊索腫に共通し、その特異的バイオマーカである。したがって、本発明のこの方法は、限定されるものではないが、（ａ）酵母媒体と、（ｂ）本発明の少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原を含む癌抗原とを含む本明細書に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を、脊索腫を有する個体または脊索腫を発症するリスクを有しているが現時点ではブラキュリー発現癌細胞が検出されない個体に投与する工程を含む。本発明の免疫療法組成物で治療される対象は、切除不能な病変（すなわち、外科的に完全に除去できない）または切除可能な病変が初めて発生した脊索腫対象、最初の再発であるか否かにかかわらず切除不能な局所再発性病変を有する対象（すなわち、除去された元の病変または一次病変と同一の場所の近傍で（同一の場所にまたはその近くに）再出現する病変は局所再発性である）、以下に記載のオリゴ転移疾患を有する対象、または以下に記載の転移疾患を有する対象であり得る。一態様では、対象は、以前に放射線療法、手術、および／または標的薬剤療法を受けたことがあってもなくてもよい。他の態様では、対象は、以前に照射された癌病変を有する。一態様では、対象は、以前に照射されていない癌病変を有する。一態様では、対象は、酵母−ブラキュリー免疫療法が施され、加えて癌病変は、酵母−ブラキュリー免疫療法が施される前、施される間、および／または施された後に照射される。
【０１１３】
以上に記載の本方法のいずれかの一態様では、個体は、本発明の酵母−ブラキュリー組成物が投与されることに加えて、本発明の酵母ベースの免疫療法組成物の投与前、投与と逐次的、投与時、および／または投与後に投与または実施される癌の治療に有用な少なくとも１つの他の治療化合物または治療プロトコルで追加的に治療される。たとえば、本明細書に記載の本発明の方法に関する実施形態のいずれかでは、個体が癌を有する場合（腫瘍細胞で検出可能なブラキュリー発現の状態にかかわらず）、一態様では、個体は、他の癌療法で治療を受けているかまたは治療を受けたことがある。かかる療法は、限定されるものではないが、化学療法または標的癌療法または薬剤療法（たとえば、チロシンキナーゼ阻害剤、たとえば、限定されるものではないが、イマチニブ、スニチニブセツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ラパチニブ、およびエベロリムスＳＴＡＴ３阻害剤、アントラサイクリン、シスプラチン、アルキル化剤、カンプトテシンアナログ）、放射線療法（たとえば、限定されるものではないが、スタンドアロン放射線療法およびアジュバント放射線療法、とりわけハドロンベースの放射線療法）、腫瘍の外科的切除、幹細胞移入、サイトカイン療法、養子Ｔ細胞移入、および／または第２の免疫療法組成物の投与を含めて、本明細書で以上に記載した治療プロトコルのいずれかまたはいずれかの治療化合物もしくは治療剤の使用を含み得る。第２の免疫療法組成物を投与する場合、かかる組成物は、限定されるものではないが、追加の酵母ベースの免疫療法、組換えウイルスベースの免疫療法（ウイルスベクター）、サイトカイン療法、免疫刺激療法（免疫刺激性を有する化学療法を含む）、ＤＮＡワクチン、および他の免疫療法組成物を含み得る。
【０１１４】
これらの追加の作用剤または療法のいずれかは、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の初回投与前または初回投与後に投与または実施できる。一実施形態では、酵母−ブラキュリー組成物が化学療法または他の療法の１つ以上の逐次的投与間で所定の間隔で投与されるプロトコルのように、１つ以上の療法を酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の投与と交互に投与または施行可能である。一実施形態では、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、追加の療法の開始前の一定期間にわたり一回以上の用量で投与される。換言すれば、酵母−ブラキュリー免疫療法用組成物は、一定期間にわたり単独療法として投与され、次いで追加の療法（たとえば、化学療法）は、酵母−ブラキュリー免疫療法の新しい用量と同時に、または酵母−ブラキュリー免疫療法と交互に追加される。他の選択肢としてまたは追加として、他の療法は、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の投与の開始前の一定期間にわたり施行され得る。また、この考え方は、組み合わせ得る（たとえば、腫瘍の外科的切除、続いて数週間にわたる酵母−ブラキュリー免疫療法を用いた単独療法、続いて数週間または数ヶ月間にわたる化学療法と酵母−ブラキュリー免疫療法との交互用量、任意選択的に続いて酵母−ブラキュリー免疫療法または他の療法を用いた単独療法、または逐次的に、併行的に、もしくは交互に提供される療法の組合せの新しいプロトコル）。酵母−ブラキュリー免疫療法を用いた癌治療のための種々のプロトコルは、本発明の対象であり、これらの例は、種々の可能なプロトコルの例であるとみなされるべきであり、限定すべきものではない。
【０１１５】
一態様では、第２の免疫療法組成物は、ブラキュリー抗原を含まない第２の癌抗原を含む。たとえば、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物との組合せに有用な第２の免疫療法組成物は、他の癌抗原を含む酵母免疫療法組成物である。かかる癌抗原は、限定されるものではないが、癌胎児性抗原（ＣＥＡ：ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、点突然変異Ｒａｓオンコプロテイン、ＭＵＣ−１、ＥＧＦＲ、ＢＣＲ−Ａｂｌ、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ、ＧＰ−１００、ＭＵＣ−２、正常および点突然変異ｐ５３オンコプロテイン、ＰＳＭＡ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１（ｇｐ７５）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−２、ＴＡＧ７２、ＫＳＡ、ＣＡ−１２５、ＰＳＡ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２、ｈＴＥＲＴ、ｐ７３、Ｂ−ＲＡＦ、腺腫性大腸ポリポーシス（ＡＰＣ：ａｄｅｎｏｍａｔｏｕｓ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ  ｃｏｌｉ）、Ｍｙｃ、フォンヒッペル・リンダウタンパク質（ＶＨＬ）、Ｒｂ−１、Ｒｂ−２、アンドロゲン受容体（ＡＲ：ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、Ｓｍａｄ４、ＭＤＲ１、Ｆｌｔ−３、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ｐａｘ３−ｆｋｈｒ、ｅｗｓ−ｆｌｉ−１、ＨＥＲＶ−Ｈ、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＴＷＩＳＴ、メソテリン、ＮＧＥＰ、そのような抗原の改変体、そのような抗原のスプライス変異体、およびそのような抗原のエピトープアゴニスト、ならびにそのような抗原の組合せ、および／またはそれらの免疫原性ドメイン、それらの改変体、それらの変異体、および／またはそれらのエピトープアゴニストを含み得る。
【０１１６】
本明細書で用いられる場合、癌を「治療」するまたはその任意の変形（たとえば、「癌の治療を受けた」など）は、一般に、個体において腫瘍負荷を低減するなどにより、癌の少なくとも１つの症状を改善すること、個体において腫瘍成長または腫瘍成長の速度（腫瘍成長速度論）を阻害、低減、減少、または軽減すること、全生存率および／または無進行生存率を含み得る個体の生存率を増加または延長すること、腫瘍反応速度（すなわち、以下に定義されるＲＥＣＩＳＴおよび／またはチョイ（Ｃｈｏｉ）により測定される）を改善すること、腫瘍の再発を遅延、阻害、停止、または予防すること、腫瘍遊走および／または他の組織の腫瘍浸潤（転移癌）の発生を予防、阻害、逆転、または遅延すること、個体において癌の進行を予防、阻害、逆転、または遅延すること、癌により発現される腫瘍抗原に対する長期記憶免疫反応を改善すること、放射線療法、化学療法、および／または標的薬剤療法に対する病変の感度を増加させること、および／または個体の健康状態を改善することを含む治療の少なくとも１つの治療目的で（この治療の不在下と比較して）、癌が発生した後（たとえば、個体において癌が診断または検出された後）、本発明に係る組成物を投与することを意味する。
【０１１７】
癌を「予防する」またはそれから「保護する」またはそれらの任意の変形（たとえば、「癌の予防」など）は、一般に、癌の発症または発生を予防もしくは遅延すること、または治療後にもかかわらず癌を生じた場合、治療の不在下と比較して個体においてアウトカムを少なくとも改善すること、たとえば、限定されるものではないが、個体において腫瘍負荷を低減すること、個体において腫瘍成長または腫瘍成長の速度を阻害（低減、減少、軽減）すること、全生存率および／または無進行生存率を含み得る個体の生存率を増加（延長）すること、腫瘍反応速度（すなわち、以下に定義されるＲＥＣＩＳＴおよび／またはチョイ（Ｃｈｏｉ）により測定される）を改善すること、腫瘍の再発を遅延、阻害、停止、または予防すること、腫瘍遊走および／または他の組織の腫瘍浸潤（転移癌）の発生を予防、阻害、逆転、または遅延すること、個体において癌の進行を予防、阻害、逆転、または遅延すること、癌により発現される腫瘍抗原に対する長期記憶免疫反応を改善すること、放射線療法、化学療法、および／または標的薬剤療法に対する腫瘍の感度を増加させること、および／または個体の健康状態を改善することを含む治療の少なくとも１つの目的で（この治療の不在下と比較して）、癌が発生する前、または癌の特定の病期もしくは癌の腫瘍抗原発現が発生する前（たとえば、ブラキュリー発現が癌で検出される前）、本発明に係る組成物を投与することを意味する。
【０１１８】
本発明の一実施形態では、本発明の酵母ベースの免疫療法組成物による治療は、対象において奏功率を改善する。すなわち、ＲＥＣＩＳＴまたはチョイ（Ｃｈｏｉ）の基準により測定した場合である。「ＲＥＣＩＳＴ」とは、固形腫瘍の奏功評価基準を意味し、癌患者の腫瘍が改善、安定化、または進行する場合を定義する既刊のガイドラインのセットである。ＲＥＣＩＳＴに定義された奏功は、非侵襲的イメージング評価により決定される標的病変のサイズの変化に依存する。ＲＥＣＩＳＴ基準は、欧州癌研究治療機構（ＥＯＲＴＣ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）、米国国立癌研究所（ＮＣＩ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、およびカナダ国立癌研究所臨床試験グループを含む国際協力により２０００年２月に最初に刊行され（テラッセ（Ｔｈｅｒａｓｓｅ）ら著、ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．）、２０００年、第９２巻、ｐ．２０５〜２１６）、およびアイゼンハウアー（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ）ら著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）、２００９年、第４５巻、ｐ．２２８〜２４７に記載されるように２００９年に改訂された。アイゼンハウアー（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ）ら著、前掲に記載されるように、「完全奏功」またはＣＲは、いずれの病理学的リンパ節（標的または非標的）も短軸が＜１０ｍｍに低減されてすべての標的病変が消失するものとして現時点で定義される。「部分奏功」または「ＰＲ」は、ベースライン直径の和を参照として標的病変の直径の和が少なくとも３０％減少するものとして現時点で定義される。「安定疾患」または「ＳＤ」は、試験時の最小径和を参照としてＰＲと認定するのに十分な縮小がなく、ＰＤと認定するのに十分な増加がないものとして定義される。「進行疾患」または「ＰＤ」は、試験時の最小和を参照として標的病変の直径の和が少なくとも２０％増加するものとして定義される。加えて、和はまた、少なくとも５ｍｍの絶対増加も実証しなければならない。１つ以上の新しい病変の外観も進行であるとみなされる。追加の基準は、アイゼンハウアー（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ）ら著、前掲に記載の非標的病変に適用される。
【０１１９】
「チョイ（Ｃｈｏｉ）」基準とは、チョイ（Ｃｈｏｉ）ら（ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．）、２００７年、第２５巻、第１３号、ｐ．１７５３〜１７５９）により最初に記載されたコンピュータ断層撮影の奏功基準のセットを意味し、ＣＴにより測定される標的病変のサイズおよび密度の変化を評価する。チョイ（Ｃｈｏｉ）基準はまた、ＣＲ、ＰＲ、ＳＤ、およびＰＤのグループを用いて患者を分類する。ＣＲは、新しい病変がなく、すべての病変が消失するものとして定義される。ＰＲは、新しい病変も測定不能な疾患の明らかな進行もなく、ＣＴでサイズ減少＞１０％または腫瘍縮小減少＞１５％であるものとして定義される。ＳＤは、ＣＲ、ＰＲ、ＰＤの基準を満たさず、腫瘍進行に帰属される症状の悪化を示さないものとして定義される。ＰＤは、腫瘍サイズ増加＞１０％であるものとして定義され、ＣＴで腫瘍縮小によるＰＲの基準を満たさず、かつ／または新しい病変を有する。
【０１２０】
対象または個体への本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の送達（投与、免疫化）は、エクスビボまたはインビボで行い得るが、典型的にインビボで行われる。エクスビボ投与とは、患者外で調節工程の一部を行って、たとえば、酵母媒体、改変ブラキュリー抗原、およびいずれかの他の抗原、作用剤、または組成物が細胞内に充填されるような条件下で、本発明の組成物を患者から取り出された細胞集団（樹状細胞）に投与し、その細胞を患者に戻すことを意味する。本発明の療法組成物は、患者に戻すか、または任意の好適な投与形態により患者に投与することが可能である
組成物の投与は、全身、粘膜、および／または標的部位の近接位置（たとえば、腫瘍部位の近傍）であり得る。好適な投与経路は、予防もしくは治療される癌のタイプおよび／または標的細胞集団もしくは組織に依存するが、当業者に明らかであろう。種々の許容可能な投与方法としては、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、節内投与、冠脈内投与、動脈内投与（たとえば、頸動脈内）、皮下投与、経真皮送達、気管内投与、関節内投与、脳室内投与、吸入（たとえば、エアロゾル）、頭蓋内投与、脊髄内投与、眼内投与、経耳投与、鼻腔内投与、経口投与、肺内投与、カテーテルの進入、および組織内への直接注入が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一態様では、投与経路は、静脈内、腹腔内、皮下、真皮内、節内、筋肉内、経真皮、吸入、鼻腔内、経口、眼内、関節内、頭蓋内、および脊髄内を含む。非経口送達は、真皮内、筋肉内、腹腔内、胸腔内、肺内、静脈内、皮下、心房カテーテル、および静脈カテーテルの経路を含み得る。経耳送達は、点耳剤を含み得、鼻腔内送達は、点鼻剤を含み得、または鼻腔内注入および眼内送達は、点眼剤を含み得る。エアロゾル（吸入）送達はまた、当技術分野で標準的な方法を用いて行うことも可能である（たとえば、ストリブリング（Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第１８９巻、ｐ．１１２７７−１１２８１、１９９２年を参照されたい）。一態様では、本発明の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は皮下投与される。一態様では、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、腫瘍環境中に直接投与される。一態様では、本発明の酵母ベースの免疫療法組成物は髄腔内に投与される。
【０１２１】
本発明の一態様では、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、注射に供するために製剤化され、注射、たとえば皮下注射により投与される。一態様では、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、適正な取扱い、用量、および対象への投与についての説明書を添えてバイアル入り懸濁剤として提供される。一態様では、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、適正な取扱い、再懸濁、用量、および対象への投与についての説明書を添えてバイアル入り凍結乾燥製剤として提供される。本発明の改変ブラキュリー抗原の利点の１つは、組成物をバイアル中で適正に懸濁または再懸濁させてシリンジへの充填時および対象への投与時に適正な懸濁状態を維持することを保障するために、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の投与で医師の側にそれほど労力をかけないで済むことであり、結果的に、抗原を発現する酵母のフロキュレーション表現型が低減される。
【０１２２】
一般に、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の好適な単回用量は、好適な期間にわたり１回以上投与したとき、１つ以上の腫瘍抗原またはエピトープ（たとえば、ブラキュリー）に対する抗原特異的免疫反応を誘発するのに有効な量で、患者の身体の所与の細胞型、組織、または領域に酵母媒体および改変ブラキュリー抗原を効果的に提供可能な用量である。たとえば、一実施形態では、本発明の酵母ベースの組成物の単回用量は、組成物が投与される生物の１キログラム体重当たり約１×１０５〜約５×１０７酵母細胞均等物である。一態様では、本発明の酵母媒体の単回用量は、０．１×１０６細胞の増分の任意の中間用量を含めて（すなわち、１．１×１０６、１．２×１０６、１．３×１０６．．．）、１単位用量当たり（すなわち、１単位生物当たり）、約０．１酵母単位（Ｙ．Ｕ．、これは１×１０６酵母細胞または酵母細胞均等物である）〜約１００Ｙ．Ｕ．（１×１０９細胞）である。一実施形態では、用量は、１Ｙ．Ｕ．〜４０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜５０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜６０Ｙ．Ｕ．の用量、１Ｙ．Ｕ．〜７０Ｙ．Ｕ．の用量、または１Ｙ．Ｕ．〜８０Ｙ．Ｕ．の用量を含み、一態様では、１０Ｙ．Ｕ．〜４０Ｙ．Ｕ．、５０Ｙ．Ｕ．、６０Ｙ．Ｕ．、７０Ｙ．Ｕ．、または８０Ｙ．Ｕ．を含む。一実施形態では、用量は、個体上の異なる部位に、ただし同一投与期間中に投与される。たとえば、一投与期間中に個体の４つの異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．用量を注射することにより４０Ｙ．Ｕ．用量を投与し得るか、または同一の投与期間中に個体の４つの異なる部位に５Ｙ．Ｕ．用量を注射することにより、もしくは個体上の２つの異なる部位に１０Ｙ．Ｕ．用量を注射することにより２０Ｙ．Ｕ．用量を投与し得る。本発明は、単回用量を形成するために、一定量の酵母ベースの免疫療法組成物（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０Ｙ．Ｕ．、またはそれを超える）を個体上の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える異なる部位に投与することを含む。１酵母単位（Ｙ．Ｕ．）は、１×１０７酵母細胞または酵母細胞均等物である。
【０１２３】
本発明の免疫療法組成物の「ブースタ」または「ブースト」は、たとえば、抗原に対する免疫反応が弱くなったとき、または免疫反応の提供もしくは特定の１つ以上の抗原に対する記憶反応の誘導が必要な場合に投与される。ブースタは、治療される個体の状態および投与時の療法の目的（たとえば、予防、積極療法、維持）に依存して、初回投与後、約１、２、３、４、５、６、７、もしくは８週間の間隔または毎月１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、毎年１回、および／または数年間隔で投与可能である。一実施形態では、投与スケジュールは、数週間〜数ヶ月間、さらには数年間にわたり、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回またはそれを超えて酵母ベースの免疫療法組成物の用量が投与されるものである。一実施形態では、用量は、脊索腫に対する所望の予防処置または治療処置を達成する必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０用量またはそれを超えて毎週１回または２週間に１回、続いて２週間に１回または毎月１回の用量で投与される。一実施形態では、用量は、所望の予防結果または治療結果が達成されるまで、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０用量またはそれを超えて２週間に１回、続いてさらに毎月１回の用量で投与される。一実施形態では、用量は、癌に対する所望の予防処置または治療処置を達成する必要に応じて１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０用量またはそれを超えて毎月１回、続いてさらに毎月１回または異なる頻度（たとえば、毎年４回）の用量で投与される。その場合、本明細書に記載の投与プロトコルのすべてにおいて、追加のブースタは、必要に応じて維持療法または寛解療法として同様のまたはより長いインターバル（たとえば、数ヵ月または数年）で与え得る。一態様では、ブースタは、長期維持療法のために投与される（すなわち、治療の主なコースが終了した後、疾患の再発の予防または遅延を意図して、または疾患安定化の維持を意図して）。
【０１２４】
本発明の方法では、組成物および療法用組成物は、任意の脊椎動物を含めて動物に、具体的には、限定されるものではないが、霊長動物、齧歯動物、家畜、および家庭愛玩動物をはじめとする哺乳網脊椎動物類の任意のメンバーに投与可能である。家畜は、消費されるまたは有用品を生産する哺乳動物を含む（たとえば、羊毛生産用のヒツジ）。本発明を利用して治療または保護する哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびブタを含む。
【０１２５】
「個体」とは、脊椎動物、たとえば、限定されるものではないが、ヒトをはじめとする哺乳動物である。哺乳動物は、家畜、競技用動物、愛玩動物、霊長動物、マウス、およびラットを含むが、これらに限定されるものではない。「個体」という用語は、「動物」、「対象」、または「患者」という用語と同義的に使用可能である。
【０１２６】
本発明に有用な一般的技術
本発明を実施する際、特に指定がない限り、当業者に周知である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、および免疫学の従来技術が利用されるものとする。かかる技術は、酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｖｍｏｌｏｇｙ）、第１９４巻、グトリエ（Ｇｕｔｈｒｉｅ）ら編、コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９０年、生物学および酵母の活性（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｙｅａｓｔｓ）、スキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ）ら編、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８０年、酵母遺伝学の方法：実験コースマニュアル（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ）、ローズ（Ｒｏｓｅ）ら著、コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９０年、酵母サッカロマイセス属：細胞周期および細胞生物学（Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、プリングル（Ｐｒｉｎｇｌｅ）ら編、コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９７年、酵母サッカロマイセス属：遺伝子発現（Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら編、コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９３年、酵母サッカロマイセス属：ゲノム動力学（Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ）、ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ）ら編、コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９２年、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、１９８９年、および分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第３版、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）、２００１年、（本明細書ではまとめて「サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」として参照される）、分子生物学の現用プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｆ．Ｍ．アウスベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、１９８７年、２００１年までの補遺を含む、ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，  ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら編、１９９４年、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）著、１９８８年、抗体、実験マニュアル���Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ・パブリケーションズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ニューヨーク、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）著、１９９９年、抗体の使用：実験マニュアル（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（本明細書ではまとめて「ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）」として参照される）、ブューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）ら編、核酸化学の現用プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インコーポレイテッド（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、２０００年、カサレットおよびドウルの毒性学  毒の基礎科学（Ｃａｓａｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ｄｏｕｌｌ’ｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｏｉｓｏｎｓ）、Ｃ．クラーセン（Ｃ．Ｋｌａａｓｓｅｎ）ら編、第６版、２００１年、ならびにワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅｓ）、Ｓ．プロトキン（Ｓ．Ｐｌｏｔｋｉｎ）、Ｗ．オレンスタイン（Ｗ．Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎ）、およびＰ．オフィット（Ｐ．Ｏｆｆｉｔ）編、第５版２００８年などの文献に十分に説明されている。
【０１２７】
一般的定義
「タルモゲン（ＴＡＲＭＯＧＥＮ）（登録商標）」（グローブイミューン・インコーポレイテッド（ＧｌｏｂｅＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）、ルーイビル、コロラド州）は、一般に、細胞外（その表面上）、細胞内（内部または細胞質ゾル内）、または細胞外および細胞内の両方で１つ以上の異種抗原を発現する酵母媒体を意味する。タルモゲン（ＴＡＲＭＯＧＥＮ）（登録商標）は、概説されている（たとえば、米国特許第５，８３０，４６３号明細書を参照されたい）。特定の酵母ベースの免疫療法組成物ならびにその製造方法およびその一般的使用方法は、たとえば、米国特許第５，８３０，４６３号明細書、米国特許第７，０８３，７８７号明細書、米国特許第７，７３６，６４２号明細書、スタブス（Ｓｔｕｂｂｓ）ら著、（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、第７巻、ｐ．６２５〜６２９、２００１年、ルゥ（Ｌｕ）ら著、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第６４、ｐ．５０８４−５０８８、２００４年、およびベルンシュタイン（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）ら著、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）、２００８年１月２４日、第２６巻、第４号、ｐ．５０９〜２１（それぞれそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。
【０１２８】
本明細書で用いられる場合、「アナログ」という用語は、他の化合物に構造的に類似しているが組成がわずかに異なる化学化合物を意味する（１原子の、異なる元素の原子によるもしくは特定の官能基の存在での交換、または１官能基の他の官能基による交換）。したがって、アナログは、機能および外観が類似または同程度であるが、参照化合物を基準にして異なる構造または起源を有する化合物である。
【０１２９】
「置換」、「置換誘導体」、および「誘導体」という用語は、化合物を記述するために用いられる場合、非置換化合物に結合された少なくとも１つの水素が異なる原子または化学部分と交換されることを意味する。
【０１３０】
誘導体は、親化合物に類似した物理構造を有するが、誘導体は、親化合物と異なる化学的および／または生物学的性質を有し得る。かかる性質としては、親化合物の活性の増加または減少、親化合物と比較して新しい活性、増強または低減された生物学的利用能、増強または低減された有効性、インビトロおよび／またはインビボで増強または低減された安定性、および／または増強または低減された吸収性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１３１】
一般に、「生物学的活性」という用語は、化合物（タンパク質またはペプチドを含む）が、インビボ（すなわち、天然生理学的環境中）またはインビトロ（すなわち、実験室条件下）で観測または測定したときに、細胞、組織、または生物の代謝過程、生理学的過程、化学的過程、または他の過程に影響を及ぼす少なくとも１つの検出可能な活性を有することを意味する。
【０１３２】
本発明によれば、「変調」という用語は、「調節」と同義的に使用可能であり、一般に、特定の活性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを意味する。本明細書で用いられる場合、「アップレギュレート」という用語は、一般に、特定の活性に関して、誘発、開始、増加、拡張、推進、改善、増強、増幅、促進、または提供のいずれかを記述するために使用可能である。同様に、「ダウンレギュレート」という用語は、一般に、特定の活性に関して、低下、低減、阻害、寛解、減少、軽減、遮断、または防止のいずれかを記述するために使用可能である。
【０１３３】
本発明の一実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸配列はいずれも、指定のアミノ酸配列のＣ末端および／またはＮ末端のそれぞれにフランキングする少なくとも１つ〜約２０の追加の異種アミノ酸を有して生成可能である。得られるタンパク質またはポリペプチドは、指定のアミノ酸配列で「本質的に構成される」として参照可能である。本発明によれば、異種アミノ酸とは、指定のアミノ酸配列にフランキングして天然に見出されない（すなわち、インビボで本質的に見出されない）、または指定のアミノ酸配列の機能に関連しない、または遺伝子中に生じる指定のアミノ酸配列をコードする天然に存在する核酸配列にフランキングするヌクレオチドによりコードされないアミノ酸の配列である。所与のアミノ酸配列が誘導された生物の標準的コドン使用頻度を用いて天然に存在する配列中のかかるヌクレオチドが翻訳されたとしても、同様に、「本質的に構成される」という表現は、本明細書の核酸配列に関連して用いられる場合、少なくとも１つ〜約６０程度の追加の異種ヌクレオチドにより、指定のアミノ酸配列をコードする核酸配列の５’および／または３’末端のそれぞれがフランキングされ得る、指定のアミノ酸配列をコードする核酸配列を意味する。異種ヌクレオチドは、天然の遺伝子中に生じる指定のアミノ酸配列をコードする核酸配列にフランキングして天然に見出されないか（すなわち、インビボで本質的に見出されない）、またはタンパク質に何らかの追加の機能を付与するかもしくは指定のアミノ酸配列を有するタンパク質の機能を変化させるタンパク質をコードしない。
【０１３４】
本発明によれば、「選択的に結合する」という表現は、本発明の抗体、抗原結合フラグメント、または結合パートナが指定のタンパク質に優先的に結合する能力を意味する。より具体的には、「選択的に結合する」という表現は、一方のタンパク質から他方のタンパク質への（たとえば、抗体、そのフラグメント、または結合パートナから抗原への）特異的結合を意味し、結合のレベルは、任意の標準的アッセイ（たとえば、イムノアッセイ）により測定したときにアッセイのバックグラウンド対照よりも統計的に有意に高い。たとえば、イムノアッセイを行う場合、対照は、典型的に抗体または抗原結合フラグメントを単独で含有する反応ウェル／チューブを含み（すなわち、抗原の不在下）、抗原の不在下での抗体またはその抗原結合フラグメントによる反応性の量（たとえば、ウェルへの非特異的結合）は、バックグラウンドであるとみなされる。結合は、酵素イムノアッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロットアッセイなど）をはじめとする当技術分野で標準的である様々な方法を用いて測定可能である。
【０１３５】
本発明に使用されるタンパク質またはポリペプチドへの一般的参照には、全長タンパク質、ほぼ全長タンパク質（以上に定義される）、もしくは任意の断片、ドメイン（構造性、機能性、もしくは免疫原性）、コンフォメーショナルエピトープ、または所与のタンパク質のホモログもしくは変異体が含まれる。融合タンパク質も一般にタンパク質またはポリペプチドとして参照され得る。単離されたタンパク質とは、本発明によれば、その天然環境から取り出された（すなわち、人為的操作を受けた）、かつたとえば精製タンパク質、部分精製タンパク質、組換え産生タンパク質、および合成タンパク質を含み得るタンパク質（ポリペプチドまたはペプチドを含む）である。したがって、「単離」は、タンパク質が精製された程度を反映しない。好ましくは、本発明の単離されたタンパク質は、組換え産生される。本発明によれば、「改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」および「突然変異」という用語は、特に本明細書に記載のタンパク質のアミノ酸配列もしくはその一部（または核酸配列）に対する改変／突然変異に関して同義的に使用可能である。
【０１３６】
本明細書で用いられる場合、「ホモログ」または「変異体」という用語は、参照タンパク質またはペプチドに小変更を加えることにより参照タンパク質またはペプチド（すなわち、「プロトタイプ」または「野生型」タンパク質）と異なるが、天然に存在する基本タンパク質およびの側鎖の構造を維持する、タンパク質またはペプチドを意味するように使用される。かかる変化としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：１つまたは少数のアミノ酸側鎖の変化、欠失（たとえば、タンパク質またはペプチドのトランケートのバージョン）、挿入、および／または置換を含む、１つまたは少数のアミノ酸の変化、１つまたは少数の原子の立体化学の変化、および／またはわずかな誘導体化、限定されるものではないが、たとえば、メチル化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、プレニル化、パルミチン酸化、アミド化、および／またはグリコシルホスファチジルイノシトールの付加。ホモログまたは変異体は、参照のタンパク質またはペプチドと比較して向上した性質、低減された性質、または実質的に類似の性質を有し得る。ホモログまたは変異体は、タンパク質のアゴニストまたはタンパク質のアンタゴニストを含み得る。ホモログまたは変異体は、タンパク質を作製するための当技術分野で公知の技術を用いて、たとえば、限定されるものではないが、単離された参照タンパク質に対する直接改変により、直接タンパク質合成により、またはたとえば、ランダム突然変異誘発もしくは標的突然変異誘発を行ってタンパク質変異体のコードをもたらす従来のまたは組換えによるＤＮＡ技術を用いた、タンパク質をコードする核酸配列の改変によって作製可能である。加えて、参照タンパク質の天然に存在する変異体が存在し得（たとえば、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、または個体差から生じ得る他の天然変異体）、本発明で単離、作製、および／または利用し得る。
【０１３７】
所与のタンパク質のホモログまたは変異体は、参照タンパク質のアミノ酸配列（たとえば、本明細書に指定されたアミノ酸配列または指定のタンパク質のアミノ酸配列）に対して少なくとも約４５％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約５５％、または少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％の同一性、または少なくとも約８７％の同一性、または少なくとも約８８％の同一性、または少なくとも約８９％の同一性、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％の同一性、または少なくとも約９２％の同一性、または少なくとも約９３％の同一性、または少なくとも約９４％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性、または少なくとも約９６％の同一性、または少なくとも約９７％の同一性、または少なくとも約９８％の同一性、または少なくとも約９９％の同一性（または整数増分で４５％〜９９％の任意の同一性パーセント）であるアミノ酸配列を含み得るか、それらで本質的に構成され得るか、またはそれらで構成され得る。一実施形態では、ホモログまたは変異体は、参照タンパク質のアミノ酸配列に対して１００％未満の同一性、約９９％未満の同一性、約９８％未満の同一性、約９７％未満の同一性、約９６％未満の同一性、約９５％未満の同一性、およびそれに続いて１％の増分で約７０％未満までの同一性であるアミノ酸配列を含むか、それらで本質的に構成されるか、またはそれらで構成される。
【０１３８】
本明細書で用いられる場合、特に明記されていない限り、同一性パーセント（％）という用語の意味は、（１）標準的デフォルトパラメータでアミノ酸検索に対してｂｌａｓｔｐを用い、および核酸検索に対してｂｌａｓｔｎを用いる基本的局所アライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ：Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）の基本的相同性検索（クエリー配列は、デフォルトにより低複雑性領域に対してフィルター処理される）（たとえば、アルチュル，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）、マッデン，Ｔ．Ｌ．（Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．）、シェーファ，Ａ．Ａ．（Ｓｃｈａａｆｆｅｒ，Ａ．Ａ．）、チャン，Ｊ．（Ｚｈａｎｇ，Ｊ．）、チャン，Ｚ．（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．）、ミラー，Ｗ．（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．）、およびリップマン，Ｄ．Ｊ．（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．）著、１９９７年、“ギャップ付きＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．）”、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、第２５巻、ｐ．３３８９〜３４０２（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている）、（２）２つの配列のＢＬＡＳＴアライメント（たとえば、以下に記載のパラメータを使用する）、（３）および／または標準的デフォルトパラメータによるＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（位置特異的反復ＢＬＡＳＴ）を用いて行われる相同性の評価を意味する。２つの配列に対して基本的ＢＬＡＳＴとＢＬＡＳＴとの間で標準的パラメータにいくつかの差があるため、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて、２つの特定配列が有意な相同性を有すると認識されることがあり、一方、配列の１つを用いて基本的ＢＬＡＳＴで行った検索では、クエリー配列により最大一致で第２の配列が同定されないことがある点に留意されたい。加えて、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、配列ホモログを探索する感度の高い方法である「プロファイル」検索の自動化された使いやすいバージョンを提供する。このプログラムでは、最初にギャップ付きＢＬＡＳＴデータベース検索を行う。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴプログラムでは、戻された任意の有意なアライメントからの情報を用いて、位置特異的スコアマトリックスを構築し、これでクエリー配列を置き換えて、次のラウンドのデータベース検索を行う。したがって、これらのプログラムのいずれか１つを用いて同一性パーセントを決定可能であることを理解すべきである。
【０１３９】
タツソバ（Ｔａｔｕｓｏｖａ）およびマッデン（Ｍａｄｄｅｎ）著、１９９９年、“Ｂｌａｓｔ  ２配列−タンパク質および核酸の配列を比較するための新しいツール（Ｂｌａｓｔ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）”、ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．）、第１７４巻、ｐ．２４７〜２５０（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＢＬＡＳＴを用いて２つの特定配列を互いにアライメントすることが可能である。かかる配列アライメントは、得られたアライメントへのギャップ（欠失および挿入）の導入を可能にして２つの配列間でギャップ付きＢＬＡＳＴ検索（ＢＬＡＳＴ  ２．０）を行うＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて、ｂｌａｓｔｐまたはｂｌａｓｔｎで行われる。ここで明確にすることを目的として、以下の標準的デフォルトパラメータを用いて、２つの配列に対するＢＬＡＳＴ配列アライメントを行う。
【０１４０】
ｂｌａｓｔｎでは、０ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いる：
マッチに対するリウォード＝１
ミスマッチに対するペナルティー＝−２
オープンギャップ（５）および伸長ギャップ（２）ペナルティー
ギャップ×＿ドロップオフ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（１１）フィルター（オン）
ｂｌａｓｔｐでは、０ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いる：
オープンギャップ（１１）および伸長ギャップ（１）ペナルティー
ギャップ×＿ドロップオフ（５０）期待値（１０）ワードサイズ（３）フィルター（オン）。
【０１４１】
単離された核酸分子は、その天然環境から取り出された（すなわち、人為的操作を受けた）核酸分子であり、その天然環境は、核酸分子が天然に見出されるゲノムまたは染色体である。したがって、「単離」は、必ずしも核酸分子の精製度を反映するわけではなく、分子が、全ゲノムまたは全染色体または核酸分子が天然に見出される２つ以上の遺伝子を含有するゲノムセグメントを含まないことを示している。単離された核酸分子は、完全遺伝子を含み得る。遺伝子を含む単離された核酸分子は、かかる遺伝子を含む染色体の断片ではなく、遺伝子に関連するコード領域および調節領域を含むが、同一染色体上に天然に見出される追加の遺伝子ではない。単離された核酸分子はまた、遺伝子の一部を含み得る。単離された核酸分子はまた、天然に指定の核酸配列を通常フランキングしない追加の核酸（すなわち、異種配列）によりフランキングされた（すなわち、配列の５’および／または３’末端が）指定の核酸配列を含み得る。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（たとえば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの誘導体（たとえば、ｃＤＮＡ）を含み得る。「核酸分子」という表現は、主に物理的核酸分子を意味し、「核酸配列」という表現は、主に核酸分子上のヌクレオチド配列を意味するが、２つの表現は、特にタンパク質またはタンパク質のドメインをコードし得る核酸分子または核酸配列に関して同義的に使用可能である。
【０１４２】
組換え核酸分子は、トランスフェクト細胞内で核酸分子の発現を効果的に調節可能な任意の転写制御配列の少なくともの１つに機能的に連結された、本明細書に記載のいずれか１つ以上のタンパク質をコードするいずれかの核酸配列の少なくとも１つを含み得る分子である。「核酸分子」という表現は、主に物理的核酸分子を意味し、「核酸配列」という表現は、主に核酸分子上のヌクレオチド配列を意味するが、２つの表現は、特にタンパク質をコードし得る核酸分子または核酸配列に関して同義的に使用可能である。加えて、「組換え分子」という表現は、主に転写制御配列に機能的に連結された核酸分子を意味するが、動物に投与される「核酸分子」という表現と同義的に使用可能である。
【０１４３】
組換え核酸分子は、本発明の融合タンパク質をコードする単離された核酸分子に機能的に連結された、任意の核酸配列、典型的に異種配列である組換えベクターを含み、融合タンパク質の組換え産生を可能にすると共に、本発明に従って宿主細胞内への核酸分子の送達を可能にする。かかるベクターは、ベクターに挿入される単離された核酸分子に天然では近接して見出されない核酸配列を含有可能である。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでも、原核または真核のいずれでも可能であり、本発明では、好ましくは、酵母にトランスフェクトするのに有用なプラスミドである。組換えベクターは、核酸分子のクローニング、配列決定、および／または他の操作で使用可能であり、かかる分子（たとえば、ＤＮＡ組成物またはウイルスベクターベースの組成物）の送達に使用可能である。組換えベクターは、好ましくは、核酸分子の発現に使用され、発現ベクターとしても参照可能である。好ましい組換えベクターは、酵母などのトランスフェクト宿主細胞内で発現可能である。
【０１４４】
本発明の組換え分子では、核酸分子は、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、宿主細胞に適合可能であり、かつ本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列などの調節配列を含有する発現ベクターに機能的に連結される。具体的には、本発明の組換え分子は、１つ以上の発現制御配列に機能的に連結された核酸分子を含む。「機能的に連結される」という表現は、宿主細胞内にトランスフェクト（すなわち、トランスフォーム、トランスデュース、またはトランスフェクト）したとき、分子が発現されるように核酸分子を発現制御配列に連結することを意味する。
【０１４５】
本発明によれば、「トランスフェクション」という用語は、外因性核酸分子（すなわち、組換え核酸分子）を細胞内に挿入可能な任意の方法を意味するように使用される。かかる用語が、藻類、細菌、酵母などの微生物細胞内への核酸分子の導入を意味するように使用される場合、「トランスフォーメーション」という用語は、「トランスフェクション」という用語と同義的に使用可能である。微生物系では、「トランスフォーメーション」という用語は、微生物による外因性核酸の獲得に起因して遺伝変化を記述するように使用され、「トランスフェクション」という用語と本質的に同義である。したがって、トランスフェクション技術としては、トランスフォーメーション、細胞化学処理、粒子照射、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、感染、およびプロトプラスト融合が挙げられる。
【０１４６】
以下の実験結果は、例示を目的として提供されたものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
（実施例）
実施例１
以下の実施例では、改善された酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の作製を記載する。
【０１４７】
この実験では、アゴニストエピトープであるＴ細胞エピトープＷＬＬＰＧＴＳＴＶ（配列番号９）を含み、かつＴボックスＤＮＡ結合ドメインの欠失をさらに含むほぼ全長ブラキュリータンパク質であるヒトブラキュリー抗原を発現するように、酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を工学操作した。配列番号４または６に存在する天然ブラキュリーＴ細胞エピトープは、たとえば、ＷＬＬＰＧＴＳＴＬ（配列番号８）である。銅誘導プロモータＣＵＰ１の制御下でヒトブラキュリーアゴニスト抗原を発現させて、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を作製した。より具体的には、本発明に係る改変ブラキュリー抗原でもあるブラキュリーアゴニスト抗原は、配列番号１３で表される単一ポリペプチドとして作製した。配列番号１３のアミノ酸配列は、（１）位置１９８〜２２２の欠失（すなわち、配列番号４の位置１９８〜２２２は配列番号１３に存在しない）、および（２）配列番号４の位置２５４に位置する（および配列番号１３の位置２２９に位置する）アミノ酸（ロイシン）のバリンによる置換により、配列番号４で表されるヒトブラキュリータンパク質（非改変ブラキュリー抗原）のアミノ酸配列と異なる。換言すれば、配列番号１３は、配列番号４の位置２２３〜４３５に直接融合された位置１〜１９７からなり、かつ配列番号１３へのアゴニストエピトープの導入をもたらすアミノ酸改変（配列番号４の位置２５４に対応する配列番号１３の位置２２９）を含む単一ポリペプチドである。位置２５４（配列番号４に対する）でのロイシンからバリンへの置換は、配列番号１３の位置２２１〜２２９に配列番号１３のＴ細胞アゴニストエピトープを生成する。理論により拘束されるものではないが、このＴ細胞アゴニストエピトープは、野生型エピトープ（配列番号４の位置２４６〜２５４）と比較して、ブラキュリーに対する増強されたＴ細胞反応を誘発すると考えられる。このアゴニストエピトープはまた、配列番号６によっても本明細書に表される。配列番号１３で表される改変ブラキュリー抗原は、破壊されたＤＮＡ結合能力を有し、この抗原を発現する酵母は、配列番号４のブラキュリータンパク質と比較して低減されたフロキュレーション表現型を有し、加えてアゴニストエピトープを含有し、この構築物を酵母−ブラキュリー免疫療法剤で対象に投与した場合、天然ブラキュリーに対するＴ細胞反応を増強する。
【０１４８】
配列番号１５は、配列番号１３の改変ブラキュリータンパク質（実際には、配列番号１３のＮ末端メチオニンは以下に記載のＮ末端ペプチドの付加に適応するように除去されるため、配列番号１３の位置２〜４１０）を含む融合タンパク質である。配列番号１５は、Ｎ末端からＣ末端の方向にインフレームで融合された次の配列エレメント：（１）プロテアソーム分解に対する耐性を付与し、かつ酵母において発現を安定化するＮ末端ペプチド（配列番号１５の位置１〜６、このアミノ酸配列は配列番号１６によっても本明細書に表される）、（２）配列番号１３の位置２〜４１０（配列番号１５の位置７〜４１５）としても記載可能である、配列番号４の位置２〜１９７および２２３〜４３５からなり、かつ配列番号４の位置２５４のロイシンに対するバリンの置換をさらに含有するヒトブラキュリー抗原、および（３）ヘキサヒスチジンタグ（配列番号１５の位置４１６〜４２１）を有する単一ポリペプチドである。配列番号１５のアミノ酸配列および配列番号１３の位置２〜４１０のアミノ酸配列は、配列番号１４のポリヌクレオチド配列によりコードされる。この融合タンパク質を発現する酵母ベースの免疫療法組成物はまた、本明細書ではＧＩ−６３０６としても参照される。
【０１４９】
簡潔に述べると、ＧＩ−６３０６酵母免疫療法組成物を作製するために、配列番号１３のアミノ酸配列を有するヒトブラキュリータンパク質をコードするＤＮＡ配列を合成し、ＰＣＲを用いて増幅し、次いで酵母２μｍ発現ベクター中のＣＵＰ１プロモータの後のＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩクローニング部位に挿入した（ベクターｐＧＩ−１００）。配列番号１５で表される完全融合タンパク質をコードするように、Ｎ末端安定化ペプチドＭＡＤＥＡＰ（配列番号１６）およびＣ末端ヘキサヒスチジンペプチドをコードするヌクレオチド配列もプラスミドベクターに追加した。得られたプラスミドを、プラスミドの保存のためにＤＨ５αに、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の作製のためにサッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｗ３０３αにトランスフォームした。
【０１５０】
サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）へのトランスフォーメーションを酢酸リチウム／ポリエチレングリコールトランスフェクションにより行い、ウラシルの欠如した固体寒天最小プレート（ＵＤＡ；ウリジンドロップアウト寒天）上で一次トランスフェクタントを選択した。ウリジンおよびロイシンの両方を欠如している寒天プレート（ＵＬＤＡ）上に個々のコロニーを再ストリーキングすることにより、これらの一次トランスフォーマントコロニーを選択し、続いて３０℃で４日間成長させてクローン純度を確保し、かつ酵母細胞内に高ブラキュリープラスミドコピー数の定常状態を確立した。
【０１５１】
ＵＬＤＡプレートからのコロニーを用いてウリジンおよびロイシンの欠如した液体スタータ培養液（ＵＬ４ａａ）に接種し、２５０ｒｐｍで回転振盪しながら３０℃で２０時間成長させた。次いで、この初代培養液を用いて同一ＵＬ４ａａ処方の最終培養液に接種した。
【０１５２】
ＵＬ４ａａ液体培地の処方（１リットル当たり）：
２５グラム（ｇ）グルコース
硫酸アンモニウムを含有する１０ｇ酵母ニトロゲンベース
０．０８ｇアデニン
０．１６ｇトリプトファン
０．１６ｇヒスチジン。
【０１５３】
ＣＵＰ１駆動銅誘導プロモータの制御下で酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を評価する最初の実験では、酵母−ブラキュリー培養液が約２Ｙ．Ｕ．／ｍｌの密度に達した後、０．３７５ｍＭ硫酸銅を添加することにより最終培養液中で酵母−ブラキュリー発現を開始し、３０℃で誘導を３時間継続した。次いで、各培養液から細胞を採取し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳ中５６℃で１時間熱死滅させた。
【０１５４】
培養液の熱死滅後、細胞をＰＢＳ中で３回洗浄した。ＴＣＡ沈殿／ニトロセルロース結合アッセイにより全タンパク質含有率を測定し、抗ｈｉｓタグモノクローナル抗体および抗ブラキュリー抗体（アブカム（Ａｂｃａｍ）、マサチューセッツ州ケンブリッジ）を用いてブラキュリー抗原発現をウェスタンブロットにより評価した。組換え精製ｈｉｓタグ付き抗原の既知量を含有する標準曲線上へのブラチュリー抗原バンド強度／酵母ライセートシグナルの補間により、ウェスタンブロットの半定量的ディジタルイメージングを用いて、酵母細胞のブラキュリー抗原含有率を定量した。
【０１５５】
初期発現実験の結果は図１に示されており、ＧＩ−６３０６は、改変ブラキュリーアゴニスト抗原（配列番号１３の位置２〜４１０）を含む融合タンパク質（配列番号１５）を高レベル（１６，４３８ｎｇ／ＹＵ）で発現することが実証された。この発現レベルは、ＧＩ−６３０１として知られる酵母免疫療法組成物により発現される非改変ブラキュリー抗原（配列番号４の位置２〜４３５）を含む融合タンパク質の発現（１６，７８７ｎｇ／ＹＵ、図１を参照されたい）に匹敵する。ＧＩ−６３０６による改変ブラキュリーアゴニスト抗原の発現は、配列番号１３と同一のアゴニスト点突然変異を含有するが、配列番号１３中に存在するＤＮＡ結合ドメインの欠失を含有していないブラキュリーアゴニスト抗原の発現よりも顕著に高かった（ＧＩ−６３０５として知られる酵母免疫療法組成物は、配列番号４の位置２〜４３５のアミノ酸配列を発現する。ただし、配列番号４に対する位置２５４のロイシンはバリンで置換されている）（図１参照、１０，８６２ｎｇ／ＹＵ）。したがって、ブラキュリーのＤＮＡ結合活性の抑止（たとえば、ＤＮＡ結合残基の欠失を介して）は、ブラキュリーアゴニスト抗原の発現を有意に増強するにように思われた。
【０１５６】
以上に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法製剤（ＧＩ−６３０１、ＧＩ−６３０５、およびＧＩ−６３０６）の培養液を、沈降の目視検査に基づいてフロキュレーション特性に関しても評価した。図２に示されるように、酵母−ブラキュリー組成物ＧＩ−６３０６は、ＧＩ−６３０１、ＧＩ−６３０５のいずれよりも顕著にフロキュレーションが少ない。
【０１５７】
実施例２
以下の実施例では、ブラキュリー陽性癌の対象において第１相臨床試験を記載する。
オープンラベルで逐次用量漸増、第１相臨床試験は、本明細書に記載のＧＩ−６３０６または他の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物として知られる酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を用いて開始された。臨床試験プロトコル下で、４Ｙ．Ｕ．（１Ｙ．Ｕ．×４部位、すなわち各訪問につき患者の体の４つの異なる部位に１Ｙ．Ｕ．の免疫療法組成物を投与する）、１６Ｙ．Ｕ．（４Ｙ．Ｕ×４部位）、４０Ｙ．Ｕ．（１０Ｙ．Ｕ．×４部位）、または８０Ｙ．Ｕ．（２０Ｙ．Ｕ．×４部位）の用量範囲を皮下投与で利用して、９〜１８名の癌患者（３〜６名の患者／用量・コホート）に逐次コホート用量漸増プロトコルで酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を投与する。２週間のインターバルで合計７回の訪問（約３ヵ月）で免疫療法組成物を投与し、次いで、その後、患者が研究離脱基準を満たすまで毎月１回投与する。最大耐用量（ＭＴＤ：ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）または観測最良用量の患者の拡大コホート（ｎ＝１０）を追加の試験のために選択する。主エンドポイントとして、安全性および耐容性の結果をモニターし、拡大コホートでは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイでのブラキュリー特異的Ｔ細胞の増加およびブラキュリータンパク質が奏功する増殖により測定されるＴ細胞前駆体の有意な変化を検出可能であるかをモニターする（たとえば、治療時のブラキュリー特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の出現または拡大）。副エンドポイントとして、臨床効果、たとえば、無進行生存率、臨床ラジオグラフィー反応、血清中マーカの低減、および／または循環腫瘍細胞の低減を測定し、および一般的免疫活性化のパラメータ、たとえば、末梢血中の免疫細胞サブセット（ＣＤ８＋メモリー／エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋メモリー／エフェクターＴ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞、ＤＣ）の頻度およびサイトカイン（たとえば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＴＧＦ−β、など）の血清中レベルの変化を測定する。
【０１５８】
ＧＩ−６３０６を含む免疫療法組成物は、有意な毒性を伴うことなく安全性および耐容性が良好であると予想される。加えて、免疫療法組成物は、患者の少なくとも一部または大多数において治療により現れるブラキュリー特異的Ｔ細胞反応または既存のブラキュリー特異的ベースラインＴ細胞反応の改善をもたらすと予想される。一部の患者では、疾患の安定化が予想される。
【０１５９】
追加の研究または本研究の拡張では、以上で決定された最大耐容用量または観測最良用量を利用して、本明細書に開示される酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を患者の追加のコホートに投与し、前述の主および副エンドポイントを測定する。
【０１６０】
実施例３
以下の実施例では、本明細書に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を用いた第２相臨床試験を記載する。
【０１６１】
ランダム化第２相臨床試験は、乳癌の患者において実施例１に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を用いて行う。ステージＩ、ＩＩ、またはＩＩＩのブラキュリー陽性乳癌を有する少なくとも１００名以上の対象を登録する。対象の選択基準は、グレード１、２、または３の癌を有する対象を含み得る。対象の選択基準はまた、「三重陰性」乳癌（エストロゲンレセプター（ＥＲ：ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ：ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、およびＨＥＲ２のそれぞれが陰性である癌）を有する対象も含み得る。対象の選択基準はまた、リンパ節陰性癌を有する患者も含み得る。
【０１６２】
試験は、二重盲検試験としてまたはオープンラベルプラセボ対照多施設試験として行う。患者はすべて標準ケア療法を受け、治療集団の患者は、治療時に酵母−ブラキュリー免疫療法組成物の数回の一連の注射を受ける。主エンドポイントは無再発生存率または全生存率である。追加のエンドポイントは、抗原特異的Ｔ細胞反応（たとえば、治療時に出現または拡大するブラキュリー特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞）、リンパ節陰性の維持、転移への進行、および腫瘍細胞のブラキュリー発現を含み得る。
【０１６３】
酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、有意な毒性を伴うことなく安全性および耐容性が良好であると予想される。加えて、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物は、患者の少なくとも一部または大多数において治療により現れるブラキュリー特異的Ｔ細胞反応または既存のブラキュリー特異的ベースラインＴ細胞反応の改善をもたらすと予想される。患者の一部または大多数は、安定化疾患を有し、リンパ節陰性を維持し、かつ／または転移進行が予防、低減、もしくは停止すると予想される。
【０１６４】
本発明の種々の実施形態を詳細に説明してきたが、これらの実施形態の変更形態および適合形態がなされるであろうことは当業者に明らかである。しかしながら、次の例示的な特許請求の範囲に明記されるように、かかる変更形態および適合形態は本発明の範囲内であることが明確に理解されるべきである。
（付記）
好ましい実施形態として、上記実施形態から把握できる技術的思想について、以下記載する。
［項１］
酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、ａ）酵母と、ｂ）前記酵母によって発現された少なくとも１種の改変ブラキュリー抗原とを含み、
前記改変ブラキュリー抗原が、野生型ブラキュリーの位置４２〜２２９のいずれか１つ以上のアミノ酸の欠失または置換から選択される少なくとも１つの改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有し、前記ブラキュリー抗原が、前記野生型ブラキュリーと比較して破壊されたＤＮＡ結合部位を有する、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２］
前記改変ブラキュリー抗原が、前記野生型ブラキュリーと比較して破壊されたＤＮＡ結合活性を有する、項１に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項３］
前記酵母が、野生型ブラキュリーを発現する酵母と比較して低減されたフロキュレーション表現型を有する、項１に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項４］
前記改変ブラキュリー抗原が、前記野生型ブラキュリーの位置６６〜２１７のいずれか１つ以上のアミノ酸の欠失または置換から選択される少なくとも１つの改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、項１〜３のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項５］
前記改変ブラキュリー抗原が、前記野生型ブラキュリーの位置１９８〜２２２のいずれか１つ以上のアミノ酸の欠失または置換から選択される少なくとも１つの改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、項１〜３のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項６］
前記改変ブラキュリー抗原が、Ｌｙｓ６６、Ａｒｇ６９、Ａｒｇ７０、Ａｒｇ１０１、Ｌｙｓ１０３、Ｌｙｓ１４７、Ａｓｎ１５０、Ｌｙｓ１５１、Ｓｅｒ１６２、Ｔｈｒ１９６、Ａｌａ１９７、Ｔｙｒ１９８、Ｉｌｅ２０８、Ａｓｎ２１１、Ｐｒｏ２１２、Ｐｈｅ２１３、Ａｌａ２１４、Ｌｙｓ２１５、Ａｌａ２１６、およびＰｈｅ２１７の少なくとも１つから選択される、前記野生型ブラキュリーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸残基の欠失または置換から選択される少なくとも１つの改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、項１〜３のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項７］
前記改変ブラキュリー抗原が、Ｍｅｔ８７、Ｐｒｏ１２７、Ａｓｐ１２８、Ｓｅｒ１２９、Ｐｒｏ１３０、Ａｓｎ１３１、Ｐｈｅ１３２、およびＶａｌ１７５の少なくとも１つから選択される、前記野生型ブラキュリーの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、または８個のアミノ酸残基の欠失または置換から選択される少なくとも１つの改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、項１〜３のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項８］
前記改変が欠失である、項１〜７のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項９］
前記改変ブラキュリー抗原が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の前記改変により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なる、項１〜７のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項１０］
前記改変ブラキュリー抗原が、前記野生型ブラキュリーの位置６６と位置２１７との間の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の隣接アミノ酸の欠失により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、項１〜７のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項１１］
前記改変ブラキュリー抗原が、前記野生型ブラキュリーの位置１９８と位置２２２との間の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の隣接アミノ酸の欠失により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、項１〜７のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項１２］
前記改変ブラキュリー抗原が、前記野生型ブラキュリーの位置１９８〜２２２の欠失により、野生型ブラキュリーのアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する、項１〜７のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項１３］
前記改変ブラキュリー抗原が、少なくとも１つのアゴニストＴ細胞エピトープをさらに含むアミノ酸配列を有する、項１〜７のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項１４］
前記アゴニストエピトープが配列番号６のアミノ酸配列を有する、項１３に記載の酵母ブラキュリー免疫療法組成物。
［項１５］
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１０または配列番号１３に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する、項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項１６］
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１０または配列番号１３に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項１７］
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１０または配列番号１３に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項１８］
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１０または配列番号１０の位置２〜４１０を含むアミノ酸配列を有する、項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項１９］
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１３または配列番号１３の位置２〜４１０を含むアミノ酸配列を有する、項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２０］
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１２または配列番号１５に対して少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する融合タンパク質である、項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２１］
前記改変ブラキュリー抗原が、配列番号１２または配列番号１５のアミノ酸配列を有する融合タンパク質である、項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２２］
前記酵母がサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する、項１〜２１のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２３］
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する、項１〜２２のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２４］
前記酵母が酵母菌体である、項１〜２３のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２５］
前記酵母菌体が死滅されている、項２４に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２６］
前記酵母菌体が熱不活性化されている、項２４に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２７］
対象への投与に好適な薬学的に許容可能な賦形剤中に製剤化されている、項１〜２６のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２８］
酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、ａ）不活性化酵母菌体と、ｂ）配列番号１０の位置２〜４１５のアミノ酸配列を含むブラキュリー融合タンパク質とを含み、
前記ブラキュリー融合タンパク質が前記酵母によって発現されたものであり、
前記組成物がブラキュリー特異的Ｔ細胞反応を誘発する、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項２９］
前記融合タンパク質が配列番号１２のアミノ酸配列を有する、項２８に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項３０］
酵母−ブラキュリー免疫療法組成物であって、ａ）不活性化酵母菌体と、ｂ）配列番号１３の位置２〜４１５のアミノ酸配列を含むブラキュリー融合タンパク質とを含み、
前記ブラキュリー融合タンパク質が前記酵母によって発現されたものであり、
前記組成物がブラキュリー特異的Ｔ細胞反応を誘発する、酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項３１］
前記融合タンパク質が配列番号１５のアミノ酸配列を有する、項３０に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項３２］
前記ブラキュリー融合タンパク質の発現がプロモータＣＵＰ１の制御下にある、項２８〜３１のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項３３］
前記酵母がサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に由来する、項２８〜３２のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項３４］
前記酵母がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する、項２８〜３３のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項３５］
対象への投与に好適な薬学的に許容可能な賦形剤中に製剤化されている、項２８〜３４のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物。
［項３６］
ブラキュリーを発現する癌を治療する方法であって、ブラキュリーを発現する癌を有する対象に、項１〜３５のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を投与することを含む、方法。
［項３７］
癌を有する個体において癌の転移進行を低減、停止、逆転、遅延、または予防する方法であって、転移進行を起こしているか、転移進行を起こすリスクを有するか、または転移進行を起こし始めると予測される癌を有する個体に、項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物を投与することを含む、方法。
［項３８］
ブラキュリー発現癌の発症を予防または遅延する方法であって、項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物を個体に投与することを含む、方法。
［項３９］
脊索腫を治療する方法であって、脊索腫を有する対象に、項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物を投与することを含む、方法。
［項４０］
個体が他の癌療法で治療されているかまたは治療されたことがある、項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
［項４１］
前記療法が、放射線療法、腫瘍の外科的切除、化学療法、標的癌療法、養子Ｔ細胞移入、または１種以上の追加の免疫療法組成物の投与から選択される、項４０に記載の方法。
［項４２］
癌を有する患者において腫瘍細胞の化学療法耐性または放射線耐性を低減または予防する方法であって、癌を有しかつ化学療法および放射線療法の少なくとも一方を受けている個体に、項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物を投与することを含む、方法。
［項４３］
個体における腫瘍負荷の低減、前記個体の生存率の増加、および前記個体における腫瘍成長の阻害の少なくとも一つを行う、項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
［項４４］
前記癌が、乳癌、骨癌、脊索腫、小腸癌、胃癌、膵癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、およびそれらの転移癌からなる群から選択される、項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
［項４５］
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染に関連する疾患または病態を治療または予防する方法であって、項１〜３５のいずれか一項に記載の酵母−ブラキュリー免疫療法組成物を個体に投与することを含む、方法。
［項４６］
ブラキュリーを発現する癌の治療に使用するための、項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物。
［項４７］
癌を有する個体において癌の転移進行の低減、停止、逆転、または予防に使用するための、項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物。
［項４８］
ブラキュリー発現癌の発症の予防または遅延に使用するための、項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物。
［項４９］
癌を有する患者において腫瘍細胞の化学療法耐性または放射線耐性の低減または予防に使用するための、項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物。
［項５０］
ブラキュリーを発現する癌を治療するための医薬の調製における、項１〜３５のいずれか一項に記載の免疫療法組成物の使用。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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