(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌(Lung Cancer)の診断および／または予後診断のための、および／または肺癌(Lung Cancer)の発達および／または進行をモニタリングするためのインビトロまたはエクスビボの方法において、
対象から単離されたサンプルにおけるヒトカスパーゼ−４−タンパク質の活性型（配列番号１）を検出するおよび／または定量するステップを含む、方法。
【請求項２】
ａ）対象から単離されたサンプルにおけるヒトカスパーゼ−４−タンパク質の活性型（配列番号１）を検出するおよび／または定量するステップと、
ｂ）それを所定の対照と比較するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの追加腫瘍マーカーの検出および／または定量、および適切な対照サンプルとの比較をさらに含み、
前記追加腫瘍マーカーは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８またはＨＭＧＢ１である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
対象から単離された前記サンプルは、生体液、細胞サンプルおよび／または組織サンプルである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記肺癌(Lung Cancer)が、肺癌（Lung Carcinoma）である、請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
肺癌(Lung Cancer)の診断および／または予後診断のための、および／または肺癌(Lung Cancer)の発達および／または進行のモニタリングのためのキットにおいて、
ヒトカスパーゼ−４−タンパク質の活性型（配列番号１）の量を検出するおよび／または測定するための試薬と、
対照試料と
を含む、キット。
【請求項７】
肺癌(Lung Cancer)の予防および／または治療における使用のための、ヒトカスパーゼ−４−タンパク質の活性型（配列番号１）に対する特異的阻害剤であって、抗ヒトカスパーゼ−４抗体、合成ペプチド、アミノ酸および／またはヌクレオチド配列、ワクチン、ｓｉＲＮＡ、または低分子量薬物である、阻害剤。
【請求項８】
ヒトカスパーゼ−４−タンパク質の活性型（配列番号１）の肺癌(Lung Cancer)の診断のためのインビトロバイオマーカーとしての使用。
【請求項９】
前記肺癌(Lung Cancer)が、肺癌（Lung Carcinoma）である、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍、特に肺癌の診断および／または予後診断の、および／またはその進行のモニタリングの方法において、ヒトカスパーゼタンパク質、好ましくは、ヒトカスパーゼ−４またはカスパーゼ−１の活性型のバイオマーカー、またはヒトカスパーゼタンパク質のオルソログ遺伝子によって、好ましくは、ヒトカスパーゼ−４のオルソログ遺伝子によってコードされるタンパク質、例えば、マウスカスパーゼ−１１タンパク質の活性型のバイオマーカーとしての使用に関連する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
肺癌は、予後診断の不良と低い生存率によって特徴付けられる、工業国における死亡の主要な原因の１つである（Ｊｅｔｔら、１９８３年; Ｐｉｎｔｏら、２０１１年）。新生物増殖の基礎となる細胞および分子メカニズムは、まだ十分に定義されていないが、肺癌の危険因子の１つは、発癌物質への暴露（吸入）である（Ｖａｌａｖａｎｉｄｉｓら、２００８年）。
【０００３】
腫瘍性疾患の発症／発達と免疫系の間の厳格な相関（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、２０１３年; Ｐｉｎｔｏら、２０１１年; Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、２０１２年）は、最近の科学的な関心である。慢性炎症は、肺癌を含む多くの呼吸器疾患の共通事項である。新生物の発達／進行は、抗腫瘍免疫の制御を超えて、腫瘍細胞の増殖を促進する免疫抑制環境に関連することが周知である（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、２０１３年）。伝統的な化学療法にもかかわらず、最近、新生物の治療において、ますます重要な役割を果たすと思われる概念は、腫瘍微小環境における免疫系の関与、特に「薬理学的操作」である。
【０００４】
現在までに、最も広く現在使用される免疫療法は、抗腫瘍免疫応答を得るための白血球の活性化からなる（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、２０１３年）。それでもなお、新生物増殖の基礎となる慢性炎症に関与する特定の分子および細胞メカニズムの認知は、新生物の増殖を調節することができる薬理学的標的の同定の点で非常に大きな科学的インパクトであろう。
【０００５】
肺上皮細胞、マクロファージ（ＭΦ）および組織樹状細胞（ＤＣ）は、外部攻撃からの防御の最前線であり、それらは、続いて起こる適応免疫応答に関与する（Ｐｉｎｔｏら、２０１１年）。これらの細胞への連続的な損傷は、ＩＬα、ＩＬ−１Ｂ、高移動度群タンパク質のボックス１（ＨＭＧＢ１）を含む、アラルミン（ａｌａｒｍｉｎ）と呼ばれる分子の放出によって特徴付けられる慢性炎症反応を促進および支持する（Ｐａｕｌ−Ｃｌａｒｋら、２０１２年）。そのようなアラルミンの合成／放出は、カスパーゼ−１依存標準経路（Ｌａｔｚら、２０１３年）、およびカスパーゼ−１１依存非標準経路（Ｋａｙａｇａｋｉら、２０１３年）によってインフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）と呼ばれる多タンパク質システムによって精密に規制される。カスパーゼ−１活性化は、プロIL-１βおよびプロＩＬ−１８をそれらの活性型に変換する（ＬａｍｋａｎｆｉおよびＤｉｘｉｔ、２０１２年）。逆に、カスパーゼ−１１は、ＩＬ−１αおよびＨＭＧＢ１の放出を促進する（ＮｇおよびＭｏｎａｃｋ、２０１３年）。カスパーゼ−１とカスパーゼ−１１の両方は、それが、腫瘍文脈において、新生物の増殖に有利に働く免疫抑制状態を容易にすることができる炎症性反応を誘導する場合（ＬａｍｋａｎｆｉおよびＤｉｘｉｔ、２０１２年）、アポトーシスと異なる細胞死であるピロトーシスを誘導することができる。
【０００６】
インフラマソーム複合体は、Ｎｏｄ様受容体（ＮＬＲ）と呼ばれる細胞質性タンパク質、より一般的には、カスパーゼ−１依存性経路の上流に作用する外因性（病原体関連分子パターン：ＰＡＭＰ）および内因性（危険関連分子パターン：ＤＡＭＰ）リガンドを認識することができる病原体認識受容体（ＰＲＲ）の活性によって調整される（ＣａｆｆｒｅｙおよびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ、２０１２年）。現在までに、２２個のＮＬＲが同定されている。細胞質内ＮＬＲＰ３受容体は、確かにこれまで最も研究されているが、癌におけるその役割は、依然として議論になっているように思われる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、２０１２年）。実際、ＮＬＲＰ３は、その遺伝的不在が、大腸上皮でのより高い慢性炎症に関連する腫瘍増殖を促進するので、結腸癌における保護的役割を果たす（Ａｌｌｅｎら、２０１０年）。また、ＮＬＲＰ３は、ドキソルビシンおよび５−フルオロウラシルなどの特定の伝統的な化学療法剤の活性に必須なようである（Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉら、２００９年）。対照的に、肺転移および線維肉腫のマウスモデルにおいて、ＮＬＲＰ３活性化は、腫瘍増殖を促進し（Ｃｈｏｗら、２０１２ａ）、細胞毒性Ｔリンパ球活性（細胞障害性Ｔリンパ球：ＣＴＬ）だけではなく、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を阻害する骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）のような、免疫抑制活性を有する細胞の漸増を促進する。また、新生物増殖のために必須ではないが（Ｃｈｏｗら、２０１２ｂ）、ＮＬＲＰ３は、中皮腫のプロモーターであるアスベストおよびシリカによって誘導される肺の炎症に関与するようである（Ｄｏｓｔｅｒｔら、２００８年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
カスパーゼ−１１、ヒトカスパーゼ−４のマウス類似体は、非標準的インフラマソーム経路の活性化のために重要な酵素である（ＮｇおよびＭｏｎａｃｋ、２０１３年）。炎症性状態、特に病原性感染による細胞壊死の結果として、この酵素は、ＩＬ−１αの成熟形態のタンパク質分解、および細胞外マトリックス中のＨＭＧＢ１の放出を誘導することができる（ＮｇおよびＭｏｎａｃｋ、２０１３年）。今日まで、細菌感染の間に、カスパーゼ−１１は、ＴＬＲ４およびＴＬＲ３のような、いくつかのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性化の根底にある、ＴＩＲドメイン含有アダプター誘導インターフェロン−β（ＴＲＩＦ）変換経路を介して、タイプＩインターフェロン依存方法で活性化されることが、文献に記載されている（ＢｏｒｔｏｌｕｃｉおよびＭｅｄｚｈｉｔｏｖ、２０１０年）。癌において、特に肺癌において、マウスカスパーゼ−１１および類似体ヒトカスパーゼ−４の役割は両方とも、まだ完全にはわかっていない。したがって、次第に新たに発生する文献を考慮すると、インフラマソーム生物学のいくつかの側面は、慢性炎症が新生物増殖のプロモーターであるように思われる、特に肺腫瘍学の分野で、まだ未開拓である（Ｃｏｕｓｓｅｎｓら、２０１３年）。
【０００８】
特許出願ＷＯ２００８/００９０２８は、そのうちのいくつかはマウスカスパーゼ１１またはヒトカスパーゼ４とは相関がない、いくつかのサイトカインの発現の定量化を含む、肺腺癌を有する対象の予後診断を決定する方法に関する。
【０００９】
また、Ｍ．Ｙａｍａｕｃｈｉら（２０１０年）は、ヒト原発性肺腫瘍上皮細胞において、遺伝子発現プロファイルの分析によって、カスパーゼ４遺伝子をも含む、１３９個のゲフィチニブ感受性遺伝子の同定を記載する。
【００１０】
特許出願ＷＯ２０１０／０６４７０２には、カスパーゼ−１およびカスパーゼ−４の遺伝子を含む、２２７個の遺伝子の遺伝子発現の変化の解析による、肺癌の診断方法が、記載されている。しかしながら、肺癌に関与するバイオマーカーとしてヒトカスパーゼタンパク質の活性型の使用は、以前に記載も示唆もされなかった。また、ＩＬ−１αのような、マウスカスパーゼ−１１またはヒトカスパーゼ−４の炎症性サイトカインエフェクターと肺癌との間の関連性は、既知でもなく、示唆もされていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の記載
著者らは、驚くべきことに、カスパーゼ、特にマウスカスパーゼ−１１［ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＡ７３５３１．１］（配列番号４）およびヒト類似体カスパーゼ−４［ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１２１６．１］（配列番号１）、並びにマウスカスパーゼ−１［ＮＣＢＩ受託番号マウス：ＮＰ＿０３３９３７．２ (ＮＭ＿００９８０７．２)］（配列番号３）およびヒトカスパーゼ−１［ＣＡＡ４６１５３．１］（配列番号２）が、肺における新生物増殖に関与していることを発見した。
【００１２】
また、これらの酵素の活性化剤である分子リガンドは、まだ知られていないが、本著者らは、肺腫瘍増殖に関与する新規の「活性化シグナル経路」を同定し、それは、新規治療および診断標的を同定するために有用である。発癌物質への暴露によって誘導される酸化ストレスの間、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）が産生され、これは、次に、インフラマソーム複合体の一構成成分である、細胞質内受容体ＡＩＭ２［ＮＣＢＩ受託番号：マウス：ＮＰ＿００１０１３８０１．２］（配列番号５）、ヒト［ＮＰ＿００４８２４．１］（配列番号６）によって認識される。
【００１３】
ＡＩＭ２は、マウスではカスパーゼ−１１に結合し、ヒトではカスパーゼ−４に結合し、その活性型は、ＩＬ−１α［ＮＣＢＩ １０受託番号：マウス：ＮＰ＿０３４６８４［ＧＩ： ４７０５９０７５］］（配列暗号７）：およびヒト［ＮＰ＿０００５６６［ＧＩ： ２７８９４３３０］］（配列番号８）、およびＩＬ−１β［ＮＣＢＩ受託番号マウス：ＮＰ＿０３２３８７．１］［ＧＩ： ６６８０４１５］］（配列番号９）およびヒト：ＮＰ＿０００５６７．１［ＧＩ： １０８３５１４５］（配列番号１０）、およびＨＭＧＢ１［ＮＣＢＩ受託番号：マウスＡＡＩ１０６６８［ＧＩ ８４０４０２６２］］（配列番号１１）：ヒト：ＣＡＧ ３３１４４．１［ＧＩ ４８１４５８４３］（配列番号１２）などのアラルミンの放出を誘導し、肺腫瘍形成を促進する。また、ヒト肺癌組織において、カスパーゼ−４へのＡＩＭ２の結合は、非常に顕著である。我々が述べることは、機能的カスパーゼ−１１（１２９Ｓｖマウス）のないマウスまたはカスパーゼ−１／１１ノックアウトマウスにおいて、またはカスパーゼ−１１またはカスパーゼ−１１のエフェクターであるＩＬ−１αに対する特異的モノクロナールによるカスパーゼ−１１の中和の後に、無傷および活性カスパーゼ−１１を有するマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６マウス）と比較して、肺腫瘍増殖の発達の有意な減少が観察されるということによってさらに確認される。
【００１４】
カスパーゼ−１（ｐ２０ ｋＤａ）の活性化と肺癌との間の関連性もまた、本著者らにより確認された。
したがって、著者らは、肺癌発生に関与する新規「経路」を同定しただけではなく、肺癌などの高死亡率を有する疾患の将来の治療戦略の開発のための新しい薬理学的標的を同定した。さらに、腫瘍組織で非常に高いレベルであることがすでに知られている、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βなどの炎症性サイトカインの存在に関連する、ヒトにおけるカスパーゼ−４の活性化は、肺癌のための新しい診断の、および可能な予後診断のツールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
したがって、本発明の態様は、腫瘍の診断および／または予後診断のための、および／または腫瘍の進行のモニタリングのための方法で使用するための、少なくとも：
ａ）ヒトカスパーゼタンパク質の活性型；
ｂ）その変異体、同属体、誘導体または機能的断片；
ｃ）前記ヒトカスパーゼタンパク質遺伝子のオルソログ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性型
からなる群に属するバイオマーカーである。
【００１６】
前記ヒトカスパーゼタンパク質は、好ましくは、ヒトカスパーゼ−４タンパク質（配列番号１）またはヒトカスパーゼ−１タンパク質（配列番号２）である。ヒトカスパーゼ−４遺伝子のオルソログ遺伝子は、例えば、マウスカスパーゼ−１１遺伝子である。
前記腫瘍は、好ましくは、肺腫瘍、より好ましくは、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）である。
【００１７】
本発明のさらなる態様は：
ａ）対象から単離されたサンプルにおける上記で定義されるようなバイオマーカーの検出および／または定量、および
ｂ）適切な対照との比較
のステップを含む、腫瘍の診断および／または予後診断のための、および／または腫瘍の進行のモニタリングのためのインビトロ方法である。
【００１８】
バイオマーカーの定量は、バイオマーカーの量の測定、またはその量の変化の測定、より具体的には、バイオマーカーの量の増加または減少の測定に相当しうる。増加は、腫瘍の悪化に関連しうる。減少は、腫瘍の改善、または対象の回復に関連しうる。
【００１９】
前記バイオマーカーの適切な対照とステップａ）で測定される量の変化を比較して、試験されるサンプル中の前記バイマーカーの量の変化が、増加に相当する場合、ステップａ）の対象は、腫瘍の悪化を経験し得る。
【００２０】
前記バイオマーカーの適切な対照とステップａ）で測定される量の変化を比較して、試験されるサンプル中の前記バイオマーカーの量の変化が、減少に相当する場合、ステップａ）の対象は、腫瘍の改善、または回復を経験し得る。
【００２１】
好ましい態様において、本発明の方法は、少なくとも１つの追加腫瘍バイオマーカーの検出および／または定量、および適切な対照サンプルとの比較をさらに含む。好ましくは、前記追加マーカーは、上記で定義されるようなバイオマーカーの炎症性サイトカインエフェクターであり、より好ましくは、前記炎症性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８またはＨＭＧＢ１である。
【００２２】
ＩＬ−１αは、好ましくは、配列番号８または７により特徴付けられる。
ＩＬ−１βは、好ましくは、配列番号１０または９により特徴付けられる。
ＩＬ−１８は、好ましくは、配列番号１４または１３により特徴付けられる。
ＨＭＧＢ１は、好ましくは、配列番号１２または１１により特徴付けられる。
【００２３】
前記サイトカインの変異体、同属体、誘導体または機能的断片および前記サイトカイン遺伝子のオルソログ遺伝子によりコードされるタンパク質は、上記のサイトカインの定義に含まれる。
本発明による方法において、腫瘍は、好ましくは肺癌、より好ましくは、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）である。
対象から単離されるサンプルは、好ましくは、生体液、細胞サンプルおよび／または組織サンプルである。
【００２４】
本発明のさらなる態様は：
−上記で定義されるような、少なくとも１つのバイオマーカーの量を検出するおよび／または測定するための、および／またはそのバイオマーカーの量の変化を測定するための手段、および任意に、
−対照手段
を含む、腫瘍の診断および／または予後診断のための、および／または腫瘍の進行のモニタリングのためのキットである。
【００２５】
対照手段は、適切な対照の値をバイオマーカーの量の増加と比較するために使用され得る。対照値は、例えば、既知の標準を参照して、正常対象から、または正常集団から得ることができる。
【００２６】
上記で定義されるような少なくとも１つのバイオマーカーの量を検出するおよび／または測定する、および／またはその量の変化を測定するための手段は、好ましくは、少なくとも１つの抗体、類似体またはそれらの機能的誘導体である。前記抗体、類似体またはそれらの機能的誘導体は、前記バイオマーカーに特異的であり得る。
【００２７】
本発明に係るキットは、緩衝液、担体、染料等の通常の補助成分および／または使用説明書をさらに含みうる。
本発明に係るキットにおいて、腫瘍は、好ましくは、肺癌、より好ましくは、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）である。
【００２８】
本発明の別の態様は、腫瘍の予防および／または治療での使用のための、上記で定義されるようなバイオマーカーの特異的阻害剤であり、この阻害剤は、好ましくは、抗体、ワクチン、ｓｉＲＮＡ、または低分子量薬物である。
前記腫瘍は、好ましくは、肺癌、より好ましくは、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）である。
本発明のさらなる態様は：
ａ）ヒトカスパーゼタンパク質の活性型；
ｂ）生物学的サンプルにおける、その変異体、機能的誘導体、または機能的断片；
から選択されるバイオマーカーの存在の決定を特徴とする、腫瘍の診断および／または予後診断のための、および／または腫瘍の発達のモニタリングのためのインビトロまたはエクスビボの方法である。
【００２９】
本発明の方法における好ましい態様によると、ヒトカスパーゼタンパク質は、ヒトカスパーゼ−４（配列番号１）タンパク質、またはヒトカスパーゼ−１（配列番号２）タンパク質である。
【００３０】
さらなる好ましい態様において、本発明の方法は：
ａ）対象から単離されたサンプルにおいて、バイオマーカーを検出するおよび／または定量する、および
ｂ）それを所定の対照と比較する
ステップを含む。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの追加腫瘍マーカーの検出および／または定量、および適切な対照サンプルとの比較である。
【００３２】
本発明の好ましい態様において、追加腫瘍マーカーは、上記のバイオマーカーの炎症性サイトカインであるサイトカインエフェクターであり、好ましくは、該炎症性サイトカインは、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１８またはＨＭＧＢ１である。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、腫瘍の予後診断および／または腫瘍の発達および／または進行のモニタリングの間、生物学的サンプルにおける前記バイオマーカーの存在の増加および／または減少を検出することを特徴とする方法である。
本発明によると、対象から単離されたサンプルは、生体液、細胞サンプルおよび／または組織サンプルである。
【００３４】
本発明のさらなる態様は：
−少なくとも１つのバイオマーカーの量を決定するおよび／または測定するための、および／またはその量の変化を測定するための手段、および任意に、
−対照手段
を含む、腫瘍の診断および／または予後診断のための、および／または腫瘍の発達および／または進行のモニタリングのためのキットである。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、腫瘍の予防および／または治療における使用のためのバイオマーカーの特異的阻害剤であり、この阻害剤は、好ましくは、抗体、合成ペプチド、アミノ酸および／またはヌクレオチド配列、ワクチン、ｓｉＲＮＡ、または低分子量薬物である。
【００３６】
好ましい態様によれば、前記阻害剤は、抗カスパーゼ−１抗体、抗カスパーゼ−４抗体、抗ＩＬ−１α抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−１８抗体、または抗ＨＭＧＢ１抗体から選択される抗体、またはそれらの断片である。
好ましい態様により、前記阻害剤は、Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＨＯ（ｙ−ＶＡＤ−ＣＨＯ）およびＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＭＫ（Ａｃ−Ｙ−ＶＡＤ−ｃｍｋ）から選択されるヒトカスパーゼ−１の合成ペプチド阻害剤である。
【００３７】
好ましい態様によれば、前記阻害剤は、次のペプチド配列を有するカスパーゼ−４の活性部位に干渉することができるアミノ酸配列である：ＧＩＬＥＧＩＣＧＴＶ  ＨＤＥＫＫＰＤＶＬＬ  ＹＤＴＩＦＱＩＦＮＮ ＲＮＣＬＳＬＫＤＫＰ  ＫＶＩＩＶＱＡＣＲＧ（配列番号１５）；
好ましい態様によれば、前記阻害剤は、以下のペプチド抗原を使用する実験動物の免疫後に得られるワクチンおよび／または抗体である：
１. ＳＰＮＫＫＡＨＰＮＭＥＡＧＰＣ (配列番号１６)；
２. ＫＫＫＹＹＤＡＫＴＥＤＫＶＲＣ (配列番号１７)；
３. ＣＡＳＳＱＳＳＥＮＬＥＥＤＡＶ (配列番号１８)；
４. ＭＡＥＧＮＨＲＫＫＰＬＫＶＬＣ (配列番号１９)；
５. ＣＱＳＦＥＴＰＲＡＫＡＱＭＰＴ (配列番号２０)；
６. ＰＥＳＧＥＳＴＤＡＬＫＬＣＰＣ (配列番号２１)；
７. ＣＴＥＦＤＨＬＰＰＲＮＧＡＤＦ (配列番号２２)；
８. ＣＧＬＤＹＳＶＤＶＥＥＮＬＴＡ (配列番号２３)；
９. ＣＧＴＶＨＤＥＫＫＰＤＶＬＬ (配列番号２４)；
１０. ＣＧＡＮＲＧＥＬＷＶＲＤＳＰＡ (配列番号２５)； 
１１. ＣＳＡＬＲＡＦＡＴＲＰＥＨＫＳ (配列番号２６)；
１２. ＣＩＹＰＩＫＥＲＮＮＲＴＲＬＡ (配列番号２７)；
１３. ＣＩＦＮＮＲＮＣＬＳＬＫＤＫＰ (配列番号２８)。
【００３８】
好ましい態様によると、前記阻害剤は、カスパーゼ−４配列番号２９のｍＲＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１２２５．３）に干渉することができるヌクレオチド配列から選択されるｓｉＲＮＡである。
【００３９】
本発明において、「適切な対照」または「適切な対照サンプル」は、健康な対象から、または別の腫瘍に罹患している患者から単離されたサンプルにおいて、定量され、測定され、または評価される量であり得る。
【００４０】
腫瘍の進行をモニタリングする方法の場合、適切な対照の量、または適切な対照サンプルの量は、治療開始前の様々な時点で、治療中の様々な時点等で、同じ対象から単離されたサンプルにおいて、定量、測定、または評価される量であることができる。
本発明によるインビトロまたはエクスビボの方法において、フェーズａ）は、好ましくは、免疫組織化学、細胞学、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または蛍光分光分析によって実施される。
【００４１】
本発明において、用語「検出」は、サンプル中のタンパク質の存在、またはサンプル中の前記標的タンパク質の絶対的または相対的な量を示す信号の観察、検出、または定量のいずれかの方法のいずれかの使用を指す。その方法は、例えば、免疫組織化学的染色、ＥＬＩＳＡ，細胞懸濁液、細胞学、蛍光、放射能、比色分析、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁性、酵素活性、および類似の方法を介して、信号を提供するためのタンパク質または核酸染色方法と組み合わされることができる。
【００４２】
本発明において、用語「定量」は、それぞれのタンパク質の量または濃度またはレベルの測定として理解され、好ましくは、半定量的または定量的である。バイオマーカーの測定は、直接的または間接的であってもよい。明細書中で使用される場合、用語「量」は、限定されないが、タンパク質の絶対的または相対的な量、およびこれに関連する任意の他の値またはパラメータ、またはこれらから生じうるものを指す。前記値またはパラメータは、タンパク質の物理的および化学的性質の両方によって得られる、直接測定によって得られる信号の強度値、例えば、イムノアッセイ、質量分析、または核磁器共鳴における強度値を含む。また、これらの値またはパラメータは、間接測定によって得られるものを含む。
【００４３】
用語「変異体」は、上記で定義されるようなバイオマーカータンパク質に実質的に相同な(homologous)タンパク質を指す。一般的に、変異体は、アミノ酸の付加、欠失または置換を含む。用語「変異体」は、さらにタンパク質の様々なアイソフォーム、例えば、グリコシル化、リン酸化、またはメチル化などの翻訳後修飾から生じるタンパク質を含む。
【００４４】
用語「誘導体または機能的断片」は、上記のようなバイオマーカーと同じ機能によって特徴づけられるタンパク質またはタンパク質断片を指し、例えば、ＡＩＭ２を結合する、および／またはＩＬ−１αおよびＨＭＧＢ１などのアラルミンの放出を誘導する能力を有する。
抗体に言及する場合、用語「断片」は、ｓｃＦｖ（二重特異性抗体、三重特異性抗体および四重特異性抗体）断片、Ｆａｂ断片、およびＦ(ａｂ’)２断片を含む。
【００４５】
本発明はさらに、上記で定義されるようなバイオマーカーの同定または検出を含む、癌の予防のための方法に関する。このバイオマーカーの存在が確認されると、患者は、治療を受けることができる。
本発明で記載されるバイオマーカーは、癌を予防するために使用されることができる。本発明を以下の図面を参照に、非限定的な実施例で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】マウスの肺癌誘導の実験プロトコール。
【００４７】
【図２】ヘマトキシリン・エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）（図２Ａ）、Ｋｉ−６７（図２Ｂ）、およびＫ−Ｒａｓ（図２Ｃ）を介する肺の低温切開片の分析。これらの肺切片は、発癌物質ＮＭＵで処理された肺癌を有するマウスから得られた（図２Ｄ）。ＮＭＵで処理されたマウスの肺における腫瘍増殖の定量（腫瘍面積／全面積として表される）。データは、平均±ＳＥＭとして表される。
【００４８】
【図３】カスパーゼ−１１の活性型（ｐ２０ ｋＤａ）は、不活性型（ｐ４６ ｋＤａ）のみを示すナイーブ（未処理）マウスと比較して、癌を有するマウスの肺において、様々な時点で存在する。
【００４９】
【図４】Ａ．Ｃ５７Ｂｌ／６マウス対１２９Ｓｖマウスにおける腫瘍増殖（Ａ）；Ｂ．対照マウス（ＣＴＲ）と比較して、ＩＬ−１αの活性を中和する抗体（Ａｂ）で処理されたＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける肺癌増殖。
【００５０】
【図５】ナイーブ（図５Ａ）および１２９Ｓｖ（図５Ｃ）マウスでは見られず、Ｃ５７Ｂｌ／６肺腫瘍を有するマウス（図５Ｂ）で見られるカスパーゼ−１（ｐ２０ ｋＤａ）の活性化。
【００５１】
【図６】Ｃ５７Ｂｌ／６動物と比較した、カスパーゼ−１およびカスパーゼ−１１を遺伝的欠損する（カスパーゼ−１／１１ｋｏ）マウスにおける低減された腫瘍性病変（＊＊＊ｐ＜０．０００５, ＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）（図６Ａ）。１２９Ｓｖ動物で得られたものに匹敵するデータである（図６Ｂ）。カスパーゼ−１の既知の特異的阻害剤（Ａｃ−Ｙ−ＶＡＤ−ｃｍｋ, Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＳＭＬ−０４２９、Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−クロロメチルケトン；またはｙ−ＶＡＤ−ＣＨＯ, Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ＣＨＯ, Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, 米国、カタログ番号ｓｃ−３０６９）での薬理学的阻害は、ＮＭＵに暴露されたＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて腫瘍病変を低減した(＊ｐ＜０．０５, ＊＊ｐ＜０．０１)（図６Ｃ）。ただし、この損傷は、カスパーゼ−１／１１ｋｏおよび１２９Ｓｖマウスで観察されものと同等ではなかった（図６Ｄ）。
【００５２】
【図７】カスパーゼ−１１の活性を阻害することができる抗体の投与は、対照動物または対照アイソタイプ（ウサギＩｇＧ）で処理された動物と比較して腫瘍の質量を有意に減少した（＊ｐ＜０．０５）。
【００５３】
【図８】免疫沈降実験。図８Ａ）カスパーゼ−１１はＡＩＭ２インフラマソーム複合体を結合する；図８Ｂ）ＡＩＭ２は、８−ＯＨ−ｄＧに結合する。
【００５４】
【図９】図９Ａ  肺癌患者から得られた肺ホモジネートにおけるカスパーゼ４の前駆体（ｐ４８−ｋＤａ）およびカスパーゼ４の活性型（ｐ２０ ｋＤａ）の存在（Ａ）。同じ患者の肺の「健康」部分は、Ｈで識別され、一方、新生物のものは、ＬＣで識別される。図９Ｂ  肺癌を有する患者の肺ホモジネートにおけるカスパーゼ−１の前駆体（ｐ４６ ｋＤａ）およびカスパーゼ−１の活性型（２０ ｋＤａ）の存在。
【００５５】
【図１０】図１０Ａ  健常者（Ｈ）と比較して、がん患者（ＬＣ）におけるＩＬ−１αの活性部分の存在；図１０Ｂ  分析された肺組織のｐｇ／ｍｇとして表されるＩＬ−１αのＥＬＩＳＡによる定量、Ｃ．健常なヒト肺、および肺癌のヒト肺のホモジネートにおけるＩＬ−１βのレベル。
【００５６】
【図１１】健常（Ｈ）および腫瘍性病変（ＬＣ）の肺ホモジネートに対する免疫沈降実験。カスパーゼ−４は、ＡＩＭ２インフラマソーム複合体を結合する。
【００５７】
【図１２】今回、本著者らによって発見されたもの（Ｂ）と比較して、文献で報告されるもの（Ａ）を表すフローチャート。Ａ．病原体による感染の結果として、標準のインフラマソーム依存カスパーゼ−１経路が活性化されることが知られている。ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８［ＮＣＢＩ受託番号：マウス：ＮＰ＿０３２３８６．１］（配列番号１３）；ヒト：［ＡＡＨ０７４６１．１（配列番号１４）］などの炎症性サイトカインの放出は、炎症性応答を増幅する事象のカスケードを提供し、その結果、宿主が病原体クリアランスを促進することができる。逆に、腫瘍文脈で、（Ｂ）マウスにおけるカスパーゼ−１１およびヒトにおけるカスパーゼ−４は、ＡＩＭ２依存インフラマソーム複合体のプライミングの結果として、炎症応答の誘導に関与する。このメカニズムは、酸化ストレスのマーカーであるヒドロキシル化ヌクレオシド（８―ＯＨ―ｄＧ）のＡＩＭ２認識に応答して活性化される。
【実施例】
【００５８】
原料と方法
肺癌（Ｌｕｎｇ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）のマウスモデル
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イタリア）および１２９Ｓｖマウス、およびカスパーゼ−１および１１ノックアウトマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イタリア）（６〜８週間のメス）を、アルキル化および変異原性活性を有する、発癌物質、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＮＭＵ）の気管内（ｉ.ｔ.）注入に供した（Ｄａｍｉａｎｉら、２００８年）。ＮＭＵは、次の投与スケジュールおよび投与量に応じて、７日ごとに３回投与された：０日目、０．５０μｇ／マウス：８日目、１０μｇ／マウスおよび１５日目、１０μｇ／マウス（図１）。いくつかの実験において、抗ＩＬ−１α抗体（Ａｂ）（２μｇ／ラット腹腔；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）、またはカスパーゼ−１阻害剤（Ａｃ−Ｙ−ＶＡＤ−ｃｍｋ：１０μｇ／マウス、腹腔内、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、または抗カスパーゼ−１１抗体（１０μｇ／マウス腹腔、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、米国）をＮＭＵで処理されたＣ５７Ｂｌ／６マウスに投与した。動物は、図１に示されるスキームにしたがって、異なる時点（最初のＮＭＵ投与から３−７−３０日）で屠殺した。腫瘍病変は、腫瘍病変面積／総肺面積比として表された。
【００５９】
肺癌（Ｌｕｎｇ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）のヒトサンプル
ヒトサンプルは、非小細胞肺癌タイプの上皮起源腺癌のステージＩＩＩ癌の患者において、胸部手術および肺切除の後に得られた。Ｈで示された健康部分は、癌領域から巨視的に非常に遠い肺部分から得られた。ヒト組織は、イタリア、サレルノ（Ｓａｌｅｒｎｏ）、ｔｈｅ Ａｚｉｅｎｄａ Ｏｓｐｅｄａｌｉｅｒａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉａ Ｓａｎ Ｇｉｏｖａｎｎｉ ｄｉ Ｄｉｏ ｅ Ｒｕｇｇｉ ｄ’Ａｒａｇｏｎａの胸部外科によって、提供された。
【００６０】
ウエスタンブロット分析
マウス肺およびヒトサンプルをコラゲナーゼ（１Ｕ／ｍｌ）およびＤＮＡｓｅ Ｉ（２０μｇ／ｍｌ）からなる消化溶液で消化した。タンパク質決定に従って、サンプルを１２％ポリアクリルアミドゲル上に装填し（５０μｇ／サンプル）、次に、ニトロセルロース膜上に移した。抗カスパーゼ−４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、米国）、抗カスパーゼ−１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、米国）、抗カスパーゼ−１１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、米国）、抗ＩＬ−１α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、イギリス）抗体を使用した。装填コントロールをＧＡＰＤＨ認識により行った。
【００６１】
別の実験セットにおいて、ヒトまたはマウスホモジネートは、一次抗体（カスパーゼ−１１、またはカスパーゼ−４、またはＡＩＭ２）および特異抗原を結合することができる磁性マイクロビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を使用することによって、免疫沈降された。第二段階では、一次抗原によって認識される標的のＡＩＭ２または８−ＯＨ−ｄＧとの共局在が、ＡＩＭ２または８−ＯＨ−ｄＧの存在または不存在を検出するために、適切な抗体を使用することによって評価された。
【００６２】
ＥＬＩＳＡ
ヒトおよびマウス肺ホモジネートを、キット製造業者によって提供される指示に従って、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βの存在について試験した（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）（インフォームドコンセントを得た）。
【００６３】
免疫組織化学分析
ＮＭＵで処置したマウスの左葉をＯＣＴ培地（ＴｅｄＰｅｌｌａ Ｉｎｃ、ミラノ、イタリア）で固定し、次に７〜１２μｍの低温切開片に切り、ヘマトキシン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して組織の形態学的特徴を強調し、肺癌病変において、Ｋ−Ｒａｓの存在を確認するための免疫蛍光染色（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ、イギリス）に供される低温切開片、および／または二次ＨＲＰ抗体と腫瘍マーカーであるＫｉ−６７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、イタリア）からなる免疫複合体を検出するために、ジアミノベンジジン法（ＤＡＢ）による免疫組織化学分析に供される低温切開片と、関連づけた。Ｋｉ−６７の対照アイソタイプ（抗ラットＩｇＧ）を陰性対照として使用した。
【００６４】
統計分析
結果は、平均±ＳＥＭとして表される。種々の群間の差は、適切な一元配置分散分析および／またはスチューデントのｔ検定を使用して統計的に分析された。０．０５より低いｐ値は、統計的に有意であるとみなされた。
【００６５】
結果
１．カスパーゼ−１１は、マウスの肺癌増殖に関与する。
Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて、ＮＭＵでの処置は、Ｋｉ−６７（図２Ｂ）、およびＫ−Ｒａｓ（図２Ｃ）などの腫瘍増殖マーカーについて陽性であった肺の低温切開片（図２Ａ）によって示されるように、腫瘍病変を生じた。ＮＭＵで処理されたマウスにおいて、腫瘍面積と総面積の間の比として計算される腫瘍質量増殖は、指数関数型である（図２Ｄ）。
【００６６】
本発明の対象である非常に興味深い知見は、カスパーゼ−１１は、この酵素の活性型（ｐ２０ ｋＤａ）を示さず、不活性型（ｐ４８ ｋＤａ）のみを示したナイーブマウス（未処理）と比較して、ＮＭＵ投与後３日後から４週間まで活性であったことの観察であった（図３）。
【００６７】
肺腫瘍増殖でのカスパーゼ−１１の役割を強調するために、カスパーゼ−１１欠損の１２９Ｓｖマウス（Ｋａｙａｇａｋｉら、２０１１年）が、使用された。ＮＭＵで処理された１２９Ｓｖマウスは、同じ処理を受けているＣ５７Ｂ１／６マウス（７日：０．１０１±０．０１３；３０日：±０．１２３  ０．０１６）と比較して、非常に小さい腫瘍質量を生じた（７日：０．０４３±０．０１３；３０日：０．０５５±０．０１２）（図４Ａ：＊＊ｐ＜０．０１； ＊＊＊ｐ＜０．００５）。さらに、ＩＬ−１α（ＮｇおよびＭｏｎａｃｋ, ２０１３年）のようなアラルミンの放出に関与するカスパーゼ−１１が存在しても、ＮＭＵおよび抗ＩＬ−１α抗体で同時に処理されたＣ５７Ｂｌ／６動物は、腫瘍病変の有意な減少を示し（７日：０．０５６±０．０１３、ｐ＜０．０５；０．０４７±０．０１６、３０日：ｐ＜０．００５）（図４Ｂ）、カスパーゼ−１１欠損１２９Ｓｖマウスで観察される腫瘍の発達（７日：０．０４３±０．０１３；３０日：０．０５５±０．０１２）に十分に匹敵する。この発見は、マウスにおける肺腫瘍増殖におけるカスパーゼ−１１の役割を強く裏付ける。
【００６８】
カスパーゼ−１１は、カスパーゼ−１活性化を介して非標準的なインフラマソームの活性化を誘導することができることが報告されているので（Ｃａｓｅら、２０１３年）、我々は、我々の実験モデルでも、図５Ｂ対５Ａで示されるように、ナイーブマウスと比較して、カスパーゼ−１は、異なる時点（３−７−３０日）で、活性化されたことを観察した。また、驚くべきことに、カスパーゼ−１は、ＮＭＵで処理された１２９Ｓｖマウスで活性化されなかったことが観察され（図５Ｃ）、これは肺腫瘍増殖において、カスパーゼ１活性と機能的カスパーゼ−１１の存在との間の密接な相間関係を暗示する。
【００６９】
これをサポートするものとして、カスパーゼ−１およびカスパーゼ−１１の遺伝的欠損マウス（カスパーゼ−１／１１ｋｏ）は、Ｃ５７Ｂｌ／６動物と比較して、より小さな腫瘍病変を示した（＊＊＊ｐ＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）（図６Ａ）。また、これらのデータは、ＮＭＵに暴露された１２９Ｓｖ動物で得られたものと同等であり（図５Ｃ）、したがって、カスパーゼ−１１は、肺癌発症のための極めて重要な役割を果たすことを意味する（図６Ｂ）。また、上記の記述を裏付けるために、ＮＭＵに暴露されたＣ５７Ｂｌ／６動物は、既知の特異的カスパーゼ−１阻害剤（Ａｃ−Ｙ−ＶＡＤ−ｃｍｋ： ｙ−ＶＡＤ）で処理された。図６Ｃに示すように、腫瘍病変は、ｙ−ＶＡＤで処理された動物で低減された（＊ｐ＜０．０５, ＊＊ｐ＜０．０１）が、この損傷は、カスパーゼ−１／１１ｋｏおよび１２９Ｓｖマウスで観察されたものに匹敵しなかった（図６Ｄ）。これらのデータは、肺癌発症の間、カスパーゼ−１活性化を「調整する」、カスパーゼ−１１の主な活性を裏付ける。また、カスパーゼ−１１活性を阻害することができる抗体でのマウスの処理は、対照または対照アイソタイプ（ウサギＩｇＧ）で処理された動物と比較して、腫瘍質量を有意に減少した（＊ｐ＜０．０５）（図７）。
【００７０】
文献において、カスパーゼ−１１は、インフラマソーム成分の１つであるＮＬＲＰ３を介してカスパーゼ−１の活性化を誘導することができることは、周知である（Ｃａｓｅら、２０１３年）。我々の実験モデルにおいて、Ｃ５７Ｂｌ／６におけるカスパーゼ−１１の活性化（図３）は、活性カスパーゼ−１に関連し（図５）、一方、カスパーゼ−１１の欠損している１２９Ｓｖマウスにおいて、カスパーゼ１は活性ではなく（図５Ｃ）、免疫沈降分析が、Ｃ５７Ｂｌ／６、ナイーブおよびＮＭＵで処理されたマウスから肺ホモジネートのサンプルについて実施された。この実験は、ＮＬＲＰ３およびＡＩＭ２などのインフラマソーム成分に結合するカスパーゼ−１１を検出するために実施された。ウエスタンブロット分析は、カスパーゼ−１１がＡＩＭ２に結合することができるが、ＮＬＲＰ３には結合できないことを示す（この免疫沈降分析においては、明らかになっていない：データは示さず）（図８Ａ）。また、カスパーゼ−１（ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＴｓｃｈｏｐｐ, ２０１０年）およびカスパーゼ−１１（本明細書中で実証されるように）に結合するＡＩＭ２の活性化は、ヒドロキシル化グアノシン誘導体（８−ＯＨ−ｄＧ）によって誘導されたことが観察された（図８）。具体的には、ナイーブまたはＮＭＵ処理されたＣ５７Ｂ１／６マウスから得られた肺ホモジネートのＡＩＭ２免疫沈降に対するウエスタンブロットによる８−ＯＨ−ｄＧ検出は、８−ＯＨ−ｄＧが、ナイーブマウスと比較して、肺腫瘍を有するマウスにおいてＡＩＭ２に結合したことを示した（図８Ｂ）。この発見は、文献で報告されておらず、マウスでの肺癌発生中に非標準的なインフラマソーム経路でカスパーゼ−１１の関与のための作用の新しい機序を提供する。
【００７１】
２．カスパーゼ−４は、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）のヒト腫瘍組織において活性である。
本研究を橋渡しするために、カスパーゼ−１１のヒトアナログ、すなわち、カスパーゼ−４の役割が分析された。カスパーゼ−４は、健康組織と比較して、７人の患者から分析された全ての腫瘍細胞で活性であった（ｐ２０ ｋＤａ）（図９Ａ）。また、同じ組織において、カスパーゼ−１は、健康部分より腫瘍部分においてより活性化される（ｐ２０ ｋＤａ）ことがわかった（図９Ｂ）。したがって、ヒトでのこれらの酵素の活性の存在は、マウスで観察されたものと同様である。また、ＩＬ−１α（図１０ＡおよびＢ、＊＊ｐ＜０．００５）およびＩＬ−１β（図１０Ｂ、＊ｐ＜０．０５）の存在は、正常組織よりも腫瘍組織において高かった。マウスで観察されたものと同様に、カスパーゼ４は、ヒト健康肺および腫瘍病変を有する肺のホモジネート組織で実施された免疫沈降実験、その後のウエスタンブロット分析によって証明されるように、ＡＩＭ２に関連した（図１１）。
【００７２】
これらのデータは、カスパーゼタンパク質、特にカスパーゼ−４（ヒトにおいて）およびカスパーゼ−１の活性型、および各ヒトカスパーゼ遺伝子のオルソログ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性型、特にヒトカスパーゼ−４遺伝子のオルソログ遺伝子、好ましくは、カスパーゼ−１１（マウスにおいて）によってコードされるタンパク質の活性型は、肺腫瘍発生に関与することを初めて示す。
【００７３】
マウスにおいて文献で報告されるものと比較して（図１２のパネルＡ）、本著者らは、腫瘍増殖におけるカスパーゼ−１１／４の役割に加えて、後者は、インフラマソーム活性化の基礎となる酸化ストレスの結果であり、次に、発癌物質により誘導される新生物増殖を促進しうる、グアノシンヒドロキシル化誘導体である８−ＯＨ−ｄＧに結合するＡＩＭ２によって今度は活性化されることを示した（図１２のパネルＢ）。
【００７４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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