(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞の２５％または２５％未満が、ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞である、ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞、およびＣＤ３０４＋（ＢＤＣＡ−４＋）形質細胞様樹状細胞である細胞を含む、患者の癌の治療に用いる細胞集団であって、この細胞集団がＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞の２５％より多くがＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞である細胞集団に比べて減少した免疫抑制活性を生じる、前記細胞集団。
【請求項２】
前記細胞の少なくとも５０％に腫瘍抗原または腫瘍ペプチドが負荷されている、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記細胞が、特に癌治療を必要とする患者の血液由来の血液から精製される、請求項１または２に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記癌が、固形癌または血液癌である、請求項１〜３のいずれか一つに記載の細胞集団。
【請求項５】
前記血液癌が慢性骨髄性白血病である、請求項４に記載の細胞集団。
【請求項６】
前記固形癌がメラノーマまたは前立腺癌である、請求項４に記載の細胞集団。
【請求項７】
患者の癌の治療に用いる、前記請求項１〜６のいずれか一つに記載の細胞集団を生成するためのキットであって、そのキットが
−ＣＤ１ｃに結合する抗体（ＢＤＣＡ−１）、
−単球上に発現されたマーカーに結合することができる抗体、
−Ｂリンパ球、特にＣＤ１９またはＣＤ２０上で発現されるマーカーに結合することができる抗体、および、任意に、
−形質細胞様樹状細胞に結合することができる抗体を
含む、上記キット。
【請求項８】
前記単球マーカーが、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、およびＣＣＲ５からなる群より選択される、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記Ｂ細胞マーカーが、ＣＤ１９およびＣＤ２０からなる群から選択される、請求項７または８に記載のキット。
【請求項１０】
腫瘍抗原または腫瘍ペプチドをさらに含む、請求項７〜９のいずれか一つに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に患者の癌を治療する際に使用するための腫瘍抗原または腫瘍ペプチドが負荷された骨髄性樹状細胞ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋を含む細胞集団に関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の中心的な役割を担う。プロフェッショナルな抗原提示細胞として、ＤＣは、組織微小環境をサンプリングし、病原体由来の生成物および腫瘍細胞を含む死滅宿主細胞の両方を食菌する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊ、Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭ、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；  ３９２：２４５−２５２  ）。  ＤＣは、ナイーブ（腫瘍）抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を引き付けて活性化する特異的な能力を有する。  ＤＣベースの免疫療法は、ＤＣのこの特性を利用する：腫瘍抗原を有するＤＣを、Ｔ細胞を刺激し、腫瘍根絶を開始するために癌患者に注射する（Ｆｉｇｄｏｒ  ＣＧ，  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ＩＪＭ，  Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ  ＷＪ，  Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪＭ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：  ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｗａｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００４；  １０：４７５−４８０；  Ｔａｃｋｅｎ  ＰＪ，  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ＩＪＭ，  Ｔｏｒｅｎｓｍａ  Ｒ，  Ｆｉｇｄｏｒ  ＣＧ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：  ｆｒｏｍ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７；  ７：７９０−８０２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  Ｊ、Ｓｔｅｉｎｍａｎ  ＲＭ、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；  ３９２：２４５−２５２
【非特許文献２】Ｆｉｇｄｏｒ  ＣＧ，  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ＩＪＭ，  Ｌｅｓｔｅｒｈｕｉｓ  ＷＪ，  Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪＭ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：  ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｗａｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００４；  １０：４７５−４８０；  Ｔａｃｋｅｎ  ＰＪ，  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ＩＪＭ，  Ｔｏｒｅｎｓｍａ  Ｒ，  Ｆｉｇｄｏｒ  ＣＧ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：  ｆｒｏｍ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７；  ７：７９０−８０２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
免疫療法のためのＤＣは、一般に、単球前駆体からｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製される。広範囲の培養期間（８〜９日）およびそれらをＤＣに分化させるために必要な化合物は、それらの免疫学的能力に悪影響を及ぼすことがある。
【０００５】
したがって、当技術分野では、代替のＤＣベースの免疫療法アプローチが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の簡単な説明
一実施形態例において、本発明は、特に、患者の癌を治療するための、２５％以下のこれらのＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞を含むか、または、それから成る細胞集団であり、２５％以下のこれらのＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞が、ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞である、細胞集団に関する。
【０００７】
前記細胞集団は、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）である細胞をさらに含むかまたはそれからなることができる。
【０００８】
一実施形態例においては、細胞の少なくとも５０％に腫瘍抗原または腫瘍ペプチドが負荷される。
【０００９】
細胞は、血液から、特に癌治療を必要とする患者の血液から精製することができる。癌は、慢性骨髄性白血病、メラノーマまたは前立腺癌のような固形癌であり得る。
【００１０】
他の態様では、本発明は、患者の癌を治療するための細胞集団を作製するためのキット、および患者の癌を治療するための細胞集団を産生するその使用に関する。そのようなキットは、以下の成分を含むか、またはそれらからなる：
−ＣＤ１ｃに結合することができる抗体（ＢＤＣＡ−１）、
−単球に、好ましくは抑制性ＤＣに結合することができる抗体、
−Ｂ細胞、特にＣＤ１９またはＣＤ２０に結合することができる抗体、および場合により
−ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）に結合することができる抗体。
【００１１】
別の態様では、本発明は、癌を治療するための方法であって、
−上述したような細胞集団を癌に罹患している患者に投与すること、を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞の割合は、癌患者において増加する。
【図１Ｂ】卵巣癌腫のＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋の割合が高い。
【図１Ｃ】：異なる細胞サブセットの表現型。
【図２Ａ】ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団は、トランスクリプトーム解析によって示されるように、独特なサブセットである。
【図２Ｂ】マウスにおける骨髄発生に関与することが記載されている転写因子の発現。
【図２Ｃ】マウスにおける骨髄発生に関与することが記載された成長因子受容体の発現。
【図３】ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団は、多重分析によって示されるようにユニークなサブセットである。
【図４Ａ】ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、抗原取り込みにおいて非常に効率的である。
【図４Ｂ】ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、ＴＬＲリガンドによる刺激の際に共刺激分子ＣＤ８０をアップレギュレートする。
【図４Ｃ】ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、固有の炎症性サイトカインプロファイルを有する。
【図５Ａ】ＭＬＲ
【図５Ｂ】ナイーブＴ細胞の刺激能力。
【図６Ａ】ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋ＤＣは、ＴＬＲ刺激に応答してＰＤ−Ｌ１をアップレギュレートする。
【図６Ｂ】ＰＤ−Ｌ１ブロッキングは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋のＴ細胞刺激能力を増強する。
【図７Ａ】骨髄性ＤＣ免疫療法におけるＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞のより高い割合は、患者におけるより低い応答と相関する。
【図７Ｂ１】：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋ＤＣは、ＫＬＨ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制する。
【図７Ｂ２】ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋ＤＣサプレッサーの能力は、オキサリプラチンによって阻害される。
【図７Ｃ】ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋ＤＣはポリクローナルＴ細胞の増殖を抑制しない。
【図８】可能なソート手順。
【図９】本発明の組成物は、「ＢＤＣＡ−１富化」細胞集団である。本発明によれば、癌に罹患した患者に投与するための細胞集団を得るために、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋の画分を全細胞の２５％未満に減少させる必要がある。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
ヒト末梢血において、自然循環するＤＣの二つの主な集団が区別され得る；ＣＤ１ｃの発現およびＣＤ１９（ＣＤ１ｃ＋（ＢＤＣＡ−１）ＣＤ１９−）の発現の欠如を特徴とする骨髄性ＤＣ（ｍＤＣ）、並びにＣＤ３０４（ＣＤ３０４＋（ＢＤＣＡ−４））の発現を特徴とする形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣｓ）である。これらのサブタイプは、機能、局在、および表現型が異なる。ｍＤＣは主にリンパ節の周辺ゾーンに移動するか、またはそこに存在し、細菌抗原および真菌抗原を認識し応答すると考えられている。一方、ｐＤＣは、主にリンパ節のＴ細胞領域に存在し、ウイルス抗原認識に特化しているようである（Ｌｉｕ  ＹＪ．  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ａｎｄ  ｌｉｎｅａｇｅｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｃｅｌｌ  ２００１；１０６：２５９−２６２）。ｍＤＣおよびｐＤＣの両方は、遭遇する病原体に応じて、適切なＴ細胞応答を開始する能力を有する。
【００１４】
本発明は、抗腫瘍ＤＣワクチンおよびその製造ならびにその使用方法に関する。本発明者らは、ＤＣマーカーＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）および単球性マーカーＣＤ１４の同時発現のために異なる新規の血液骨髄細胞集団を同定した。このＢＤＣＡ−１＋ＣＤ１４＋集団は、抗原特異的免疫抑制を発揮する。ＢＤＣＡ−１＋ＣＤ１４＋細胞はＴ細胞の弱い誘導因子である。したがって、癌患者におけるこの新規集団の標的化および／またはＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋無細胞ＤＣワクチンの調製は、抗腫瘍ＤＣベースのワクチンの臨床効果を改善する。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤ１４＋」は、先天性免疫系の成分であるＣＤ１４遺伝子を発現する細胞を示す。ＣＤ１４タンパク質は、分子量５５ｋＤのタンパク質であり、グリコシルホスファチジルイノシトールテイルによって細胞膜に固定されている。一般に、ＣＤ１４＋という用語は、標識抗ＣＤ１４抗体またはその断片、すなわちＣＤ１４高（ｈｉｇｈ）細胞およびＣＤ１４低（ｌｏｗ）細胞と接触した場合に染色され得るすべての細胞を含む。
【００１６】
ＣＤ１４高とは、標識された抗ＣＤ１４抗体と接触すると明るく染色される細胞を指す。この発現レベルは、血液単球の主なサブセットを示し、全ての血液細胞の最高レベルでＣＤ１４を発現するヒト末梢血からの古典的なＣＤ１４高ＣＤ１６単球によって発現されるようなレベルに相当する（Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＬＯＯＤ，  ２１  ＯＣＴＯＢＥＲ  ２０１０  ＶＯＬＵＭＥ  １１６，  ＮＵＭＢＥＲ  １６）。ＣＤ１４低は、標識された抗ＣＤ１４抗体と接触した場合あまり明るくない染色細胞を示す。  ＣＤ１４低細胞は、ヒト末梢血からの非古典的ＣＤ１４＋ＣＤ１６高単球によって発現されるようなレベルに対応し、ＣＤ１４高細胞およびＣＤ１４細胞の間の発現レベルを示す（Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＬＯＯＤ，  ２１  ＯＣＴＯＢＥＲ  ２０１０ ＶＯＬＵＭＥ  １１６，  ＮＵＭＢＥＲ  １６）。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、細胞集団は、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−細胞を含むか、それから成り、患者の癌を治療における使用のための細胞集団に関する。用語「〜成る」は、全細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは、集団の全ＣＤ１ｃ＋細胞の９５％、９８％または９９％、または９９．９％がＣＤ１９であればよい。
【００１８】
本発明によれば、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−樹状細胞（ｍＤＣ）はＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞に関して枯渇（減少）（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）したものである。好ましくは、ＣＤ１４＋細胞の少なくとも７５％が枯渇している。
【００１９】
すなわち、一態様において、本発明は、これら２５％からそれより少ない（≦２５％の）ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞がＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞である、ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞を含むか、又は、それから成る細胞集団であり；ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞は２５％またはそれより少ない（≦２５％の）ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞を含むように、ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞についてＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞が枯渇している。
【００２０】
好ましい実施形態において、ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞の細胞集団は、２０％未満の、好ましくは１５％未満の、１０％未満の、５％未満の、または最も好ましくは１％未満のＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞を含む。
【００２１】
またＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞はＦｃeＲ１＋であるので、このマーカーをＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞からそれらの細胞を区別するために使用されることができる。
【００２２】
他の実施形態において、本発明は、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−樹状細胞がＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞、好ましくはＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４高のために枯渇しており、細胞集団がＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−樹状細胞を含むか、またはそれから成る、患者の癌を治療における使用のための細胞集団に関する。他の実施形態において、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞、好ましくはＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４高のためのＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−樹状細胞の枯渇は、２５％かそれ未満のＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−樹状細胞がＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞である細胞集団を導くことになる。
【００２３】
他の実施形態例においては、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）は、ＣＤ１９  ＋休眠Ｂリンパ球のサブ集団上でも発現するｍＤＣとは別個のものである。そのため、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）のｍＤＣの単離のために、例えば、ｍＤＣの濃縮の前にマーカーＣＤ１９および／またはＣＤ２０を使用することにより、Ｂ細胞を枯渇（減少）させる。ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−ｍＤＣのサブセットの単離のために、ｍＤＣの濃縮の前にマーカーＣＤ１４を使用することにより、ＣＤ１４＋細胞を枯渇（減少）させる。Ｂ細胞およびＣＤ１４＋細胞の枯渇の後、（例えば、ＣＤ１ｃに結合することができる抗体を使用して）ｍＤＣは標識されることができ、好ましくは、（ＣＤ１ｃ抗体が直接的に磁気ビーズに結合される場合、またはビオチン結合ＣＤ１ｃ抗体および抗ビオチン抗体を使用して磁気ビーズに間接的に結合される場合において）好ましくは時期的に標識されることができ、そしてＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）の特異的な発現により濃縮される。
【００２４】
ＣＤ１４−であるＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−細胞は、ＣＤ１１ｂおよびＣＣＲ５ｌｏｗ／でもある。対照的に、抗原特異的免疫抑制を示すＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞は、分子マーカーＣＤ１４、ＣＤ１１、またはＣＣＲ５を発現し、「抑制性樹状細胞（ＤＣ）」と示される。
【００２５】
本発明の一実施形態において、細胞集団はＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９樹状細胞を含むか、またはそれから成り、ここでＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９樹状細胞の２５％またはそれ未満（≦２５％）は、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）＋（形質細胞様ＤＣ）である細胞と共にあるＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞である。
【００２６】
ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋ｍＤＣは、以下であることを特徴とする：ＣＤ１１ｂ−、ＣＣＲ５ｌｏｗ／−、ＣＤ１９−、ＣＤ１１ｃ−ｈｉｇｈ、ＣＤ１２３−ｌｏｗ、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ２＋、ＣＤ１６−、ＣＤ１４１（ＢＤＣＡ−３）ｌｏｗ、ＣＤ３０３（ＢＤＣＡ−２）−、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）−。これらは系統マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０）の発現を欠損させ、ＣＤ１３およびＣＤ３３およびＦｃレセプター、例えば、ＣＤ３２、またはＣＤ６４、またはＦｃεＲＩなどの骨髄マーカーを発現する。
【００２７】
本発明の一実施形態において、ｍＤＣは、癌の治療を必要とする患者の血液から精製される。これは重大な副作用を引き起こすことなく患者に投与することができる自系のｍＤＣの細胞集団の生成を可能とする。当該一実施形態において当技術分野で知られているアフェレーシス療法を行うことである。本発明の一実施形態では、ｍＤＣは活性化され、患者への投与前に腫瘍抗原が負荷される。
【００２８】
ｐＤＣをとｍＤＣがお互いの機能を補完し、最適な免疫応答のために相乗的に作用する。生体外において（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で異化単球由来ＤＣでのワクチン接種と比較して、ｍＤＣとｐＤＣの同時投与によって、より強力かつ長期にわたる抗腫瘍免疫応答をしばしば生じさせる。ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９樹状細胞を含むか、またはそれから成る細胞集団と共にｍＤＣとｐＤＣの同時投与による癌患者のワクチン接種であり、ここで当該ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９樹状細胞の２５％またはそれ未満（≦２５％）がＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞であることは、本発明の好ましい実施形態を構成する。
【００２９】
したがって、本発明の細胞組成物は、一実施形態において、癌の治療を必要とする患者の血液から精製された、（ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）＋である）ｐＤＣをさらに含む。したがって、ｐＤＣは投与される患者の自系のものである。
【００３０】
他の実施形態において、本発明の細胞組成物は、癌の治療を必要とする患者の血液から精製された（自系）、（特に培養前に単離された細胞中の）ＣＤ３０３（ＢＤＣＡ−２）＋細胞をさらに含む。
【００３１】
ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４／ニューロピリン１）＋ｐＤＣはＣＤ１１ｃ、ＣＤ１２３ｈｉｇｈ、ＣＤ４＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ３０３（ＢＤＣＡ−２）＋、ＣＤ１４１（ＢＤＣＡ−３）ｄｉｍ、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）-およびＣＤ２-として特徴付けられる。これらは、これらは系統マーカー（ＣＤ３，  ＣＤ１４，  ＣＤ１６，  ＣＤ１９，  ＣＤ２０，  ＣＤ５６）の発現を欠損させ、ＣＤ１３およびＣＤ３３のような骨髄マーカーだけでなくＦｃεＲＩも発現しないが、これらはＴＬＲ７およびＴＬＲ９陽性である。
【００３２】
本発明の細胞集団は、薬学的組成物として調製することができる。この目的のため、本発明の細胞組成物は、例えば、生理的食塩水により懸濁させる。
【００３３】
本発明の一実施形態において、細胞集団の樹状細胞には腫瘍抗原または腫瘍ペプチドが負荷される。他の実施形態において、細胞集団の樹状細胞にはＨＬＡ腫瘍抗原またはペプチドが負荷される。
【００３４】
本発明は特定の種類の腫瘍に限定されない。代わりに、本発明の細胞集団は、いずれかの種類の癌を治療するために使用することができる。本発明の一実施形態において、細胞集団は、患者におけるメラノーマ、卵巣癌または前立腺癌の治療に使用される。
【００３５】
治療する腫瘍としては、例えば、Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒによる全てステージ、特に、ステージＩＩＩとＩＶのメラノーマである。また、治療する腫瘍としては、例えば、Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒによる全てステージ、特に、ステージＩＩＩとＩＶの前立腺癌である。
【００３６】
一つの態様において、本発明は、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−細胞からなる樹状細胞の細胞集団に関し、ここで、当該ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９細胞の細胞集団が２５％未満のＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞を含む。好ましい実施形態例において、細胞集団は、全ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９樹状細胞集団の２０％未満、好ましくは１５％未満、１０％未満、５％未満、または、最も好ましくは、１％未満のＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞を含む。
【００３７】
方法としては、樹状細胞を精製し、腫瘍抗原またはペプチドと共にそれらをインキュベートする工程を含む、患者における癌を治療するための細胞集団の製造方法である。
【００３８】
この方法は、以下のステップを含むことができる：
−癌の処置または治療を必要とする患者（自己）の血液から樹状細胞（ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９／ＣＤ１４細胞）を精製する。これにより、自系のｍＤＣの細胞集団が得らる。この精製は、すなわち、以下の抗体を使用して行われる、すなわち
−ＣＤ１ｃ＋細胞を濃縮するためのＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）に結合することができる少なくとも第一の抗体、
−Ｂリンパ球に結合できる少なくとも第２の抗体、および
−抑制性ＤＣに結合することができる少なくとも第三の抗体。
【００３９】
磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を行う場合、最初のＢ細胞及びＣＤ１４＋細胞を枯渇（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）させ；その後、ｍＤＣはＣＤ１ｃ抗体と濃縮される。フロー分離のために、ステップの順序は無関係である。
【００４０】
Ｂリンパ球に結合することができる少なくとも第２の抗体は、一実施形態例においては、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合することができる抗体からなる群から選択される。
【００４１】
抑制性ＤＣに結合することができる少なくとも第三の抗体は、一実施形態では、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、またはＣＣＲ５に結合することができる抗体からなる群から選択される。マーカーＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、およびＣＣＲ５は、抑制性ＤＣ上に共発現される。従って、３つのマーカーのいずれかを用いて抑制性ＤＣの枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を行うことができる。一実施形態では、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、およびＣＣＲ５からなる群からの３つのマーカーの２つまたはすべてを用いて枯渇が行われる。
【００４２】
この方法において、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−樹状細胞は、好ましくはＣＤ１４＋細胞の少なくとも７５％が枯渇するように、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１＋細胞について枯渇される。特定の実施形態では、ＣＤ１４＋細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％が枯渇する。あるいは、この方法において、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−樹状細胞は、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞について、これらの２５％以下（≦２５％）ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−樹状細胞はＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞である。
【００４３】
例えば、ｍＤＣは、アフェレーシス生成物から直接単離することができる。このために、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋に結合することができる一次抗体を使用することができ；この抗体は、二次抗体によって結合され得るビオチンまたは他の分子とコンジュゲート（結合）することができる。例えば、ビーズ、特に磁気ビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄ）などの固体支持体を、ビオチンに結合することができる二次抗体に結合させるか、または一次ＣＤ１ｃにカップリングさせる分子に結合することができる二次抗体に結合させる。二次抗ビオチン抗体と結合された磁気ビーズの使用は、ビオチン化抗ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）抗体に結合したｍＤＣの磁気分離を可能にする。一実施形態では、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）−抗体は、ビーズ、特に磁気ビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄ）のような固体支持体に直接的に結合することができる。別の実施形態では、完全閉鎖免疫磁気ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ単離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を用いてｍＤＣを単離する。
【００４４】
ここで使用される抗体は、インタクトな免疫グロブリン分子、ならびに例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ＣＤＲ領域、パラトープまたはそれらの部分などのフラグメント、またはそれらの断片、ペプチドおよび誘導体、または、抗原もしくはエピトープに結合することができる抗体の全ての部分およびペプチドを意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、完全ヒト化抗体、組換え抗体、およびトランスジェニック動物によって産生されるモノクローナル抗体、またはそれらの断片、ペプチドおよび誘導体を含む。抗体は、それが分子と特異的に反応して分子が抗体に結合することができる場合、分子に「結合することができる」と示される。多数の抗体がヒトにおける使用のために承認されている。例えば、Ｗａｌｄｅｎ、９  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２６９（２００４）またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／ＦＤＡ−ａｐｐ−Ａｂｓ．ｈｔｍｌを参照のこと。
【００４５】
この方法はさらに、上記の精製工程を行った後に得られた樹状細胞を腫瘍抗原またはペプチドと共にインキュベートする工程をさらに含む。
【００４６】
例えば、ＣＤ１９に結合することができる抗体、例えば、磁気ビーズ結合−抗ＣＤ１９抗体を用いてＢ細胞を最初に枯渇させる。ＣＤ１４＋細胞は、ＣＤ１４マイクロビーズ（すなわち、ＣＤ１４に結合することができる抗体、ここで抗体はマイクロビーズ、特に磁気的に分類可能なマイクロビーズに結合する）を用いて枯渇させる。その後、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋ｍＤＣが積極的に選択される。この目的のために、ＣＤ１ｃ／ＢＤＣＡ−１に結合することができる抗体が使用される（抗ＣＤ１ｃ／ＢＤＣＡ−１抗体）。これは、例えば、ビオチン被覆抗ＣＤ１ｃ一次抗体および磁気ビーズ結合−二次抗ビオチン抗体を用いて行うことができる。
【００４７】
ｍＤＣの単離後、ｍＤＣを培養することができ、例えば、一晩、好ましくは約０．１×１０６細胞／ｍｌ〜２×１０６細胞／ｍｌの濃度で、ｍＤＣの成熟を可能にする条件下でインキュベートする。このようなｍＤＣは、以下の基準で、成熟培養工程前のｍＤＣと比較したＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現が増加していることで特徴付けることができる。
【００４８】
本発明の一実施形態においては、この方法は、ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−ｍＤＣの単離に加えて、例えばＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）を用いた癌治療を必要とする患者の血液から形質細胞様樹状細胞を精製する追加の工程を含む。
【００４９】
該方法は、少なくとも１つの実施形態において、精製された樹状細胞を成熟のために誘導する工程をさらに含む。この誘導は、当該分野で公知の任意の刺激、例えば、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストまたはＤＣの成熟を可能にする他の刺激を使用することによって行うことができる。一実施形態では、ＲＮＡ−プロタミン複合体が刺激として使用される。
【００５０】
１つの実施例によれば、この方法は、以下のステップを使用して行う：
第１に、癌治療を必要とする患者由来のアフェレーシス細胞を、所望の細胞を単離するために磁気的に標識する。特に、標識は、抗ＣＤ１ｃ−ビオチン（すなわち、抗体がビオチンで標識されているＣＤ１ｃに結合する抗体）、ＣＤ１４マイクロビーズ（すなわち、ＣＤ１４に結合することができる抗体、すなわち、磁気ビーズ、特に磁気的に選別可能なマイクロビーズ）、およびＣＤ１９マイクロビーズ（すなわち、ＣＤ１９に結合することができる抗体で、抗体はマイクロビーズ、特に磁気的に分類可能なマイクロビーズに結合する）を含む。マーカーＣＤ１９は、上に説明したように、Ｂ細胞を枯渇させるために使用される。
【００５１】
第２に、ＣＤ１４＋およびＣＤ１９＋細胞は、出発細胞組成物から枯渇させる。この目的のために、ＣＤ１４マイクロビーズおよびＣＤ１９マイクロビーズを患者由来の細胞とインキュベートし、磁気標識されたＢ細胞およびＣＤ１４＋細胞（それぞれＣＤ１４−マイクロビーズおよびＣＤ１９−マイクロビーズが結合している）を除去する。マイクロビーズが磁性である場合、それに結合した細胞の除去は、磁気分離システム（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨによって提供される）を用いて行われる。
【００５２】
第３に、抗ビオチンマイクロビーズ（すなわち、ビオチンに結合することができる抗体、ここで抗体はマイクロビーズ、特に磁気的に分類可能なマイクロビーズに結合する）を残りの磁気陰性細胞に添加する。任意に、ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−ｍＤＣおよびＣＤ３０４＋ｐＤＣを同時に単離するために、抗ビオチンマイクロビーズおよびＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）マイクロビーズ（すなわち、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）に結合することができる抗体マイクロビーズ、特に磁気的に選別可能なマイクロビーズ）が残りの細胞に添加される。
【００５３】
第４のステップでは、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋細胞および場合によりＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋およびＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）＋が濃縮され、すなわち血液細胞の集団から単離される。
【００５４】
本発明の一実施形態では、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−樹状細胞はＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞を枯渇させ、ＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−細胞の細胞集団は最大で２５％のＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞を含むようにする。別の実施形態では、ＣＤ１４＋細胞の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を枯渇させ、ＣＤ１＋／ＣＤ１９＋細胞の細胞集団が最大で２５％のＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞を含有する。
【００５５】
本発明の一実施形態においては、ｐＤＣおよびｍＤＣには、異なる抗原またはペプチドまたはその断片が負荷される。
【００５６】
別の態様では、本発明は、患者の癌を治療するための細胞集団を産生するための、特に上記および本明細書に記載の方法におけるキットの使用に関する。そのようなキットは、以下の成分を含むか、またはそれらからなる：
−ＣＤ１ｃに結合する抗体（ＢＤＣＡ−１）、
−単球に、好ましくは抑制性ＤＣに結合することができる抗体、
−Ｂ細胞に結合することができる抗体、および場合により
−ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）に結合することができる抗体。
【００５７】
抑制性ＤＣに結合することができる抗体は、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂおよびＣＣＲ５からなる群から選択することができる。Ｂ細胞に結合することができる抗体は、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合することができる抗体からなる群から選択することができる。
【００５８】
前記使用の一実施形態では、ＨＬＡ結合腫瘍抗原をさらに含む。腫瘍抗原（例えば、腫瘍ペプチド）は、治療される癌に従って選択されるべきである。
【００５９】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞集団を、そのような治療を必要とするヒト癌患者に投与する工程を含む癌の治療方法に関する。本方法の一実施形態によれば、（例えば、２５％以下のＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞および好ましくはＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４−細胞を有するＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４−細胞またはＣＤ１ｃ＋ＣＤ１９＋細胞、または、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）＋細胞に加えて２５％以下のＣＤ１ｃ＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞を有するＣＤ１ｃ＋ＣＤ１９＋細胞などの）血液樹状細胞集団が癌に罹患している患者に投与される。
【００６０】
投与されるべきＤＣの投与率は、通常、注射当たり１０３〜１０９、好ましくは１０５〜１０７であるが、治療される患者に適合させる必要がある。腫瘍抗原または腫瘍ペプチドが負荷されたＤＣは、好ましくは超音波誘導の下で、リンパ節領域に結節内に投与することができる。
【００６１】
通常、２〜４回の結節内注射を１〜４週間に１回行い、任意にＤＴＨチャレンジ（ＤＴＨ＝遅延型過敏症）を行う。ＤＴＨ応答は、患者を腫瘍細胞または特定の腫瘍抗原に免疫する能力の尺度であり、ここで対照として役立つ。疾患の進行がない場合、患者は、さらなるワクチン接種および場合によってはＤＴＨチャレンジからなる維持サイクルの適格性があり、それぞれ、例えば３〜７ヶ月の間隔で、好ましくは６ヶ月の間隔で行われる。
【００６２】
通常、ｍＤＣおよびｐＤＣの集団の１×１０５〜１×１０７個の細胞が投与される。
【００６３】
ｍＤＣおよびｐＤＣは、患者の血液から単離された場合、通常、未成熟（ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの低発現レベルを示す）である。したがって、本発明の一実施形態において、ｍＤＣは、刺激によって、例えば、ＲＮＡ−プロタミン（ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ発現のアップレギュレーション）を用いて、培養され、成熟される。
【００６４】
一実施形態では、ｍＤＣは、磁気ビーズ結合抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む完全閉鎖免疫磁気ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ分離システムを使用して、アフェレーシス産物から直接単離される。
【実施例】
【００６５】
材料と方法
細胞の単離：
異なるサブセットを単離するために、最初のＰＢＭＣを、フィコール−勾配（Ｌｕｃｒｏｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いて健康なドナーまたはステージＩＩＩまたはステージＩＶメラノーマ患者から分離した。ＢＤＣＡ１＋ＤＣ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＰＢＭＣからＢＤＣＡ１を発現する全集団（ＢＤＣＡ  ＋ＤＣおよびＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団を含む）を単離し、続いて抗ＣＤ１４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）により単球分離を行った。２つのＢＤＣＡ１発現サブセットは、抗ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いることにより、ＣＤ１４発現に基づいて遅れて識別された。
【００６６】
ＢＤＣＡ１＋ＤＣは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞、単球および骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を各々、単離するために、我々は、ＰＢＭＣからＴ、ＢおよびＮＫ細胞の枯渇によって前処理されたＦＡＣＳを使用した。任意の非特異的な抗体の結合を回避するために、最初のＰＢＭＣｓをＦｃＲブロッカー（ミルテニーバイオテク社）により処理し、次いで、ＰＢＭＣｓを抗ＣＤ３−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２０−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ５６−ＦＩＴＣ（これら全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から）および抗で処理しＣＤ１９−ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて処理し、続いて抗ＦＩＴＣマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）および磁気活性化細胞分離で処理した。次いで、枯渇したＰＢＭＣｓを、以下の抗体で標識することにより、フロー活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）のために調製した：系統カクテル−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ−Ｃｙ７（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）および抗ＢＤＣＡ１−ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）。４つのサブセットをＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単離した。図８に、ＦＡＣＳゲーティング手順を示す。
【００６７】
ＭＡＣＳ  ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて最初に全ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を単離することにより、ナイーブ（ｎａｉｖｅ、純粋な）ＣＤ４＋Ｔ細胞集団をＰＢＭＣから単離した。続いて、抗ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）および抗ＰＥビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を適用することによって、ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ４＋Ｔ細胞をメモリーＴ細胞から分離した。フローサイトメトリーの測定によれば、９８％より高い純度レベルが達成された。
【００６８】
表現型：ＢＤＣＡ１＋ＤＣ、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞およびＭＤＳＣの表現型をフローサイトメトリーによって比較した。総ＢＤＣＡ１＋集団および単球集団を、上記のようにＭＡＣＳによって単離した。ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、抗ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で標識することにより、ＢＤＣＡ１＋ＤＣと区別された。以下の抗体を、表現型を決定するために使用した：抗のＣＤ１ａ−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３３−ＡＰＣ、抗ＣＤ２０６−ＰＥ（これら全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、抗ＣＤ１６−ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、および抗ＣＤ２０９−ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
【００６９】
取り込みアッセイ：ＢＤＣＡ１＋ＤＣ、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞および単球の抗原取り込み能力は、Ａｌｅｘａ−４８８標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をどの程度まで吸収できるかを測定することによって測定した。ＢＤＣＡ１の１００ｘ１０３＋細胞（上記のようにＭＡＣＳによって単離された）または単球は、３７°Ｃで５、１５、３０、または６０分間でＢＳＡ−のＡｌｅｘａ−４８８を１ｍｇ／ｍｌの存在下または非存在下でＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ社）で培養した。ＢＳＡの自発的結合に起因するバックグラウンドの測定値を測定するために、同様の培養を４℃で行った。培養期間の後、ＢＤＣＡ１＋細胞を抗ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰで染色して、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞をＢＤＣＡ１＋ＤＣと識別した。様々な細胞サブセットによるＢＳＡ−Ａｌｅｘａ４８８の取り込みをフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。
【００７０】
細胞サブセット活性化：単離後、５％ヒト血清を含むＸ−ＶＩＶＯ  １５培地を用いて、丸底９６ウェルプレート（サイトカイン検出のための５０ｘ１０３細胞およびＴ細胞との共培養のための１０ｘ１０３細胞）で細胞サブセットを培養した、（ＨＳ，  ｂｌｏｏｄｂａｎｋ，Ｒｉｖｉｅｒｅｎｌａｎｄ）。これらの細胞は刺激しないまま放置したか、またはＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳまたはポリＩＣ（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ製）で刺激し、３７℃で一晩インキュベートした。活性化後の共刺激分子の発現は、抗ＣＤ８０−ＡＰＣおよび抗ＣＤ８６−ＡＰＣ（いずれもＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を用いて測定した。これらのサブセットによるサイトカイン産生は、標準サンドイッチＥＩＬＳＡを用いてＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０を測定することによって測定した。
【００７１】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）：Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を誘導するサブセットの能力をＭＬＲで試験を行った。健康なドナーからの１００ｘ１０３の新たに単離された同種異系非接着性末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に１０ｘ１０３の非刺激細胞または刺激細胞（上記）を加えた。これらのＴ細胞によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０産生を、標準サンドイッチＥＬＩＳＡによって４８時間の上清中で測定した。増殖は、［３Ｈ］−チミジン取り込みによって測定した。取り込まれた［３Ｈ］−チミジンは、液体シンチレーション分光法により１６時間後に測定した。
【００７２】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を誘導するサブセットの能力を、１０×１０３の刺激されていない細胞または刺激された細胞（上記のように）を５０×１０３の同種のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養することによって測定した。記載されている場合、抗ＰＤ−Ｌ１（Ｒ＆Ｄシステム）またはアイソタイプ対照抗体を添加した。Ｔ細胞の増殖は、３〜４日間の共培養後の［３Ｈ］−チミジン取り込みによって測定した。
【００７３】
ＫＬＨ特異的サプレッサーアッセイ：ＢＤＣＡ１＋ＤＣ、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞、単球およびＭＤＳＣは、上記のようにメラノーマ患者からのＦＡＣＳによって単離した。各サブセットの２０×１０３個の細胞を、３連で、Ｘ−ＶＩＶＯ５％ＨＳ中、３７℃で一晩培養した。一方、３７℃で一晩かけて余分な単球にＫＬＨをパルスした。さらに、自己由来のＣＤ４＋集団をＭＡＣＳＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって単離し、４℃でＸ−ＶＩＶＯ５％ＨＳ中に保持した。翌日、ＫＬＨ特異的Ｔ細胞を含む単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、４つのサブセットのうちの１つの存在下または非存在下でＫＬＨパルス単球によって刺激した。Ｔ細胞の増殖は、２４時間から４８時間の共培養後の［３Ｈ］−チミジン取り込みによって測定した。
【００７４】
結果
ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ１）およびＣＤ１４の同時発現を特徴とする特異的骨髄性サブセットは、腫瘍と関連している
進行性腫瘍が循環中のＢＤＣＡ１＋ＤＣ数に影響を及ぼすかどうかを決定するために、この集団のパーセンテージをステージＩＩＩ／ＩＶメラノーマ患者および健常ドナーの末梢血で評価した。メラノーマ患者におけるＢＤＣＡ１＋ＤＣのより低い傾向が観察されたが、それは有意ではなかった（図１Ａ）。興味深いことに、単球マーカーＣＤ１４を共発現するＢＤＣＡ１＋ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲｈｉ集団（ゲーティング手順の場合、図８も参照）は、健康なドナー（図１Ａ）と比較してメラノーマ患者において有意に上昇した。このＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団の観察された増加は、ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲＬｏｗ（ゲーティング手順の場合、図８も参照）として特徴付けられる循環骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の割合の有意な増加と同時に生じた。ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団の存在は、卵巣癌患者由来の炎症性腫瘍腹水においてもこの集団が検出されたので、循環に限定されない。事実、腹水材料は、ＢＤＣＡ１＋ＤＣと比較してＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団の有意に高い含量を示した（図１Ｂ）。
【００７５】
ＣＤ１４＋ＤＣサブセットの存在は、皮膚真皮区画に広範に示されているが、そのような集団は、決して血液中で調査されない。このＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団が実際に別の骨髄ＤＣサブセットであるかどうかを決定するために、この集団の表現型をＢＤＣＡ１＋ＤＣおよび単球と比較して分析した。ＣＤ１１ｃおよびＨＬＡ−ＤＲ（示されていない）、典型的なＢＤＣＡ１＋ＤＣ（青い線、左の線）の高発現に加えて、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋（緑色の線、中間の線）集団も単球マーカーＣＤ１１ｂを、ＢＤＣＡ１＋ＤＣよりも高いレベルで、しかし単球（オレンジ色の線、右の線）よりも低いレベルで発現している（図１Ｃ）。さらに、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団は、単球のサブセットおよび骨髄性ＤＣのＣＤ１６＋サブセットに特徴的なＣＤ１６の発現を欠いていた。３つの集団は、骨髄マーカーＣＤ３３の高い発現を示し、ＣＤ１ａ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、およびＣＤ２０６（マンノース受容体）の発現がほとんど存在しなかった（図１Ｃ）。集合的に、これらのデータは、進行性腫瘍に関連し、ＢＤＣＡ１＋ＤＣおよび単球の両方に対する表現型類似性を克服する新規な細胞集団を明確に示している。
【００７６】
ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞のトランスクリプトームおよび抗体マイクロアレイ分析は、ＢＤＣＡ１＋＋ＤＣと密接に関連する異なる集団を明らかにする
ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団は、単球およびＢＤＣＡ１＋ＤＣの両方と特異的マーカーの発現を共有するので、この集団の特異性を決定するためにさらなる解析が必要であり、単なるＤＣまたは単球亜集団ではない。この疑問に対処するために、３人の健康なドナーの血液から単離したＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞、ＢＤＣＡ１＋ＤＣ、単球およびＭＤＳＣのトリスコピートームをＲＮＡシークエンシングによって比較した。５０００個の最高発現遺伝子を用いた異なるサンプルの階層的クラスタリングは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞を特異的集団として明確に示す。この集団は多く範囲で共有していたが、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団は、他の集団（図２Ａ）よりもＢＤＣＡ１＋ＤＣに密接に関連していた。本発明者らは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞の起源および発生をより詳細に知るために、マウスにおける骨髄発生に関与することが記載されている転写因子（図２Ｂ）および成長因子受容体（図２Ｃ）の発現を評価した。マウスにおけるＤＣの発生重要なＩＲＦ４、ＢＡＴＦ３およびＦＬＴ３のＲＮＡ発現は、ＢＤＣＡ１＋ＤＣ（青色のバー、左から１番目）中において最も高かったが、単球（オレンジバー、左から３番目）およびＭＤＳＣ（紫色のバー、左から４番目のバー）と比較した場合、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋（緑色棒グラフ、左から２番目）の細胞は、より高い発現を示した。ＤＣ発生のためのもう１つの重要な因子であるＩＲＦ８のＲＮＡ発現は、４つの集団にわたって均一であった。同様に、マウスおよびヒトにおけるＤＣ系統に特異的な転写因子であるＺＢＴＢ４６およびＺＮＦ３６６（ＤＣ−ＳＣＲＩＰＴ）のＲＮＡ発現は、ＢＤＣＡ１＋ＤＣに続いてＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞が最も高かった。さらに、ＤＣ２４で特異的に発現することが明らかにされた長い非コードＲＮＡＬＯＣ６４５６３８（Ｉｎｃ−ＤＣ）のほとんどがＢＤＣＡ１＋ＤＣによって独占的に発現されていた。対照的に、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞、単球およびＭＤＳＣは、ＭＡＦＢ、ＥＧＲ１およびＥＧＲ２、マウスのマクロファージ分化に関与するすべての転写因子のＲＮＡ発現に関して、ＢＤＣＡ１＋ＤＣよりも同等に高いＲＮＡ発現を有していた。さらに、マウスのマクロファージ分化にも関与するＣＳＦ１ＲのＲＮＡ発現は、最も高いＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞であったが、他の集団は等しい発現レベルであった。結論として、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、独特の遺伝子発現プロファイルを有する別個の集団を形成する。
【００７７】
ＲＮＡ発現分析に加えて、抗体分子マイクロアレイを用いて３つの細胞集団においてＣＤ分子、ＨＬＡ分子、ケモカインおよびサイトカイン（表１）の微分タンパク質発現を調べた（多重分析）。差次的に発現されたタンパク質の階層的クラスタリングは、ＢＤＣＡ１＋ＤＣに近いクラスター化したＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞でＲＮＡ発現データと同様のパターンを示した（図３）。従って、タンパク質分析は、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団の特異性をさらに支持する。
【００７８】
ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、ＤＣ機能的特徴を有する
ＲＮＡおよびタンパク質分析は、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞とＢＤＣＡ１＋ＤＣとの間の密接な関係を喚起するが、２つのサブセット間の機能的類似性は、この密接な関連性のさらなる証拠として測定する必要がある。ＤＣは、Ｔ細胞を活性化することによって適応免疫応答を上昇させることができる専門的な抗原提示細胞である。したがって、本発明者らは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞が周囲環境から抗原を取り込む能力を最初に評価した。その目的のために、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞、ＢＤＣＡ１＋ＤＣまたは単球による蛍光標識ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の取り込みを、３７℃で異なる時間インキュベートした後のフローサイトメトリーによって測定した。ＢＳＡの細胞への自発的結合に起因する蛍光を避けるために、４℃コントロール（対照）を各時点で行い、これらの４℃サンプルで測定した平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を、３７℃サンプルから差し引いた（ΔＭＦＩ）。図４Ａに示すように、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、蛍光標識ＢＳＡとの１５分間のインキュベーション後、より高いΔＭＦＩ値によって反映された著しく高い抗原取り込み能力を示す。興味深いことに、この取り込みアッセイでは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞と単球との間の差は有意ではなかったが、このプロセスにおいて単球が最良であることが明らかとなった（図４Ａ、左パネル）。
【００７９】
ＤＣの主要な特徴は、危険信号を感知し、共刺激分子を発現させ、サイトカインを分泌することによってそのようなシグナルに応答する能力であり、プロセスは成熟とも呼ばれる。ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞がこの性質をどの程度有しているかを測定するために、癌免疫療法に一般的に使用されるＧＭ−ＣＳＦ、ＬＰＳ（ＴＬＲ４リガンド）およびｐＩＣ（ＴＬＲ３リガンド）による刺激を伴って、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞、ＢＤＣＡ１＋ＤＣおよび単球の示差的な共刺激分子発現およびサイトカイン産生を測定した。ＢＤＣＡ１＋ＤＣは、ＬＰＳおよびｐＩＣの両方に応答したが、共刺激分子ＣＤ８６およびＣＤ８０を上方制御することによって、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞はＣＤ８０発現を単独でアップレギュレートすることによってこの刺激に反応した。一方、単球は、ＬＰＳに応答してのみ、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞およびＢＤＣＡ１＋ＤＣよりも効率的にＣＤ８０発現を適度にアップレギュレートした（図４Ｂ）。さらに、３つの集団すべてが、サイトカインのプロファイルを分泌することによって応答した。ＢＤＣＡ１＋ＤＣは、２つの他のサブセットに欠けているＩＬ−１２を分泌することによって特徴付けられたが、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、ＢＤＣＡ１＋ＤＣおよび単球と比較して、より高い量のＴＮＦ−αを有意に産生した（図４Ｃ）。ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞および単球の両方が、ＢＤＣＡ１＋ＤＣよりも多量のＩＬ−６を産生した。ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、より高い量の阻害性サイトカインＩＬ−１０を産生した（図４Ｃ）。
【００８０】
成熟において観察された相違により、活性化Ｔ細胞における機能的変化を推測する。したがって、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞、ＢＤＣＡ１＋ＤＣおよび単球のＴ細胞刺激能力を２つの設定で評価した。第１の設定は混合白血球反応（ＭＬＲ）であり、これらの集団のいずれかが３［Ｈ］標識チミジン取り込みによって決定された同種末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の増殖を誘発するために使用された。上記の成熟データから予想されるように、ＰＢＬ増殖を誘導するＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋（３本棒の中央の緑色の棒）細胞の能力は、単球（オレンジ棒、右）よりも高く、ＢＤＣＡ１＋ＤＣよりも低かった；（青色棒、左、図５Ａ）。この観察は、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞がＴＬＲリガンドによって刺激されているか否かにかかわらず存続する。刺激されたＰＢＬの上清中のサイトカインレベルを評価すると、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞誘導性ＰＢＬは、単球誘導ＰＢＬよりも多く、ＢＤＣＡ１＋ＤＣ誘導性ＰＢＬよりもＩＦＮ−γを産生したが、任意の細胞サブセット（図５Ａ）。異なるサブセットのＴ細胞刺激能力を評価するためのより洗練された選択肢は、同種異系のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖をどの程度まで誘導できるかを決定することによるものである。ＭＬＲ設定と同様に、ＢＤＣＡ＋ＣＤ１４＋細胞は、単球よりも高いＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を誘導し、ＢＤＣＡ１＋ＤＣよりも低かった（図５Ｂ）。
【００８１】
総合的に、従来のＢＤＣＡ１＋ＤＣと比較して低い程度であるが、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、高い抗原摂取能、ＴＬＲ刺激に応答して成熟し、Ｔ細胞増殖を誘導する能力によって証明されるように、ＤＣ機能が付与される。
【００８２】
ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団は、そのＴ細胞刺激能力を低下させるＰＤ−Ｌ１発現の上昇を特徴とする
ＤＣ由来の共刺激シグナルＩＩは、Ｔ細胞活性化に不可欠である。共刺激分子に加えて、シグナルＩＩは、ＤＣによって発現され、弱毒化Ｔ細胞応答をもたらす共阻害分子を介して媒介されてもよい。これらの共阻害分子の中には、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２がある。ＰＤ−Ｌ２は、刺激の有無にかかわらず（データは示さず）、サブセットのいずれかにおいても発現されないが、ＰＤ−Ｌ１は、すべてのサブセットによるＴＬＲライゲーションの後に発現する。しかし、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、ＢＤＣＡ１＋ＤＣと比較して有意により高いレベルのＰＤ−Ｌ１を示す（図６Ａ）。ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞のＴ細胞刺激能力に対するＰＤ−Ｌ１発現の影響を評価するために、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化の間に抗体によってＰＤ−Ｌ１分子をブロックした。実際、ＰＤ−Ｌ１分子を中和することは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞誘導Ｔ細胞増殖を有意に増強した（図６Ｂ）。したがって、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞による高いＰＤ−Ｌ１発現は、この細胞集団の機能を妨害することに関与する。
【００８３】
ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞集団は、黒色腫患者におけるＢＤＣＡ１＋ＤＣベースのワクチンに対する応答が低いことと関連している
臨床試験では、ＢＤＣＡ１＋Ｃワクチンを用いてメラノーマ患者を治療した。これらのワクチンに使用されたＢＤＣＡ１＋ＤＣは、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって患者の末梢血から単離された。この単離方法は、Ｂリンパ球枯渇後のＢＤＣＡ１発現細胞の陽性選択に依存する。したがって、単離されたＢＤＣＡ１＋集団は、ＢＤＣＡ１＋ＤＣおよびＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞の両方を含む。後者のパーセンテージ（割合）は、全ワクチン調製物の６％〜４５％の間で変動した。これに基づき、ＢＤＣＡ１＋ＤＣワクチンを投与された患者は、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞含有量が２５％未満のワクチンを受けたグループと、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞含有量が２５％を超えるワクチンを受けたグループの２つのグループに分けられた。ワクチンに使用されたＢＤＣＡ１＋細胞に、メラノーマ特異的抗原ｇｐ−１００およびチロシナーゼおよびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）を免疫原性対照抗原として負荷した。２群間のＫＬＨに対する免疫応答を比較すると、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞の含有量が低いＢＤＣＡ１＋ワクチンを受けた患者は、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞が２５％を超えるワクチンを受けた患者と比較して、有意に高いＫＬＨ特異的Ｔ細胞応答を示した（図７Ａ）。この弱毒化免疫応答は、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞の弱いＴ細胞刺激能力に起因し得る（図５）。しかしながら、Ｔ細胞免疫応答を減衰させる別の経路は、ＭＤＳＣに類似したこれらの応答を積極的に抑制することによるものである。この仮説を検証するために、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞、ＭＤＳＣ、単球およびＢＤＣＡ１＋ＤＣの抑制特性を比較した。これらのサブセットのいずれも健常ドナーから単離された場合、自己ＣＤ４＋Ｔ細胞のαＣＤ３／αＣＤ２８誘導性増殖を抑制することができなかったが、ＭＤＳＣのみがこれらの細胞をメラノーマ患者から単離したときにＴ細胞の湿潤を示した（図７Ｃ）。驚くべきことに、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＫＬＨ負荷単球で刺激すると、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞のみがＫＬＨ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制することができた（図７Ｂ、上のパネル）。興味深いことに、この負荷された抑制は、白金ベースの化学療法剤であるオキサリプラチンの存在下で止められた（図７Ｂ、下部パネル）。従って、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋は、抗原特異的様式でＴ細胞応答を抑制する能力のみ有し、これは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞の含有量が高いＢＤＣＡ１＋ＤＣワクチンを受けているメラノーマ患者における弱毒化ＫＬＨ応答を説明することできる。
【００８４】
ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞集団は、特定のゲーティング手順によって特徴づけることができる
ヒト末梢血由来の樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ）の高発現レベル、および、例えばＣＤ３（Ｔ細胞の場合）、ＣＤ１４（単球の場合）、ＣＤ１９（Ｂ細胞の場合）およびＣＤ５６（ＮＫ細胞の場合）などのいわゆる系統マーカーの発現の欠損により特徴付けられる。ＨＬＡ−ＤＲ＋Ｌｉｎ−細胞内には、ＣＤ１ｃ＋ＣＤ１４−血液ＤＣのサブセットが含まれる（図８）。Ｌｉｎ＋細胞はＣＤ１４＋細胞を含み、ＣＤ１ｃ発現のレベルに応じてさらに分けることができる。ＣＤ１ｃ＋は、上記のような抑制機能を有するＣＤ１ｃ＋ＣＤ１４＋細胞に相当する。ＣＤ１ｃ−ＣＤ１４＋細胞は、２つのさらなるサブセットを含み、これらはＨＬＡ−ＤＲの発現レベルにしたがって区別することができる。最初に発現する高レベルのＨＬＡ−ＤＲは単球に対応し、ＨＬＡ−ＤＲの低いサブセットはＭＤＳＣに対応する（図８）。この知見と一致して、富化されたＣＤ１ｃ＋細胞は異なるレベルでＣＤ１４を発現する（図９）。ＣＤ１４＋単球（図９、Ｒ４）と同じレベルでＣＤ１ｃ＋ＣＤ１４ｈｉｇｈ細胞（図９、Ｒ３）がＣＤ１４を発現し、これは図８に示すようなゲーティング手順と一致する。ＣＤ１４−フルオロフォア結合体の輝度に応じて、ＣＤ１ｃ＋ＣＤ１４−ＤＣとＣＤ１ｃ＋ＣＤ１４ｈｉｇｈ細胞との間の中間レベルでＣＤ１４を発現するさらなるＣＤ１ｃ＋サブセットを区別することができる。これらの細胞は、ＣＤ１ｃ＋ＣＤ１４ｌｏｗと称することができ、図９の領域Ｒ２に含まれる．ＣＤ１ｃ＋ＣＤ１４ｌｏｗ細胞およびＣＤ１ｃ＋ＣＤ１４ｈｉｇｈ細胞は、共に、上記のようにおよび図８に示されるＣＤ１ｃ＋ＣＤ１４＋サブセットを構成する．ＣＤ１ｃ＋ＣＤ１４−は、Ｒ１に示されている。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
考察
免疫回避は、自然免疫応答および癌に対する免疫療法のアキレス腱である。免疫から回避する際の腫瘍の豊富さは、それらが発症する防御機構の過多によって反映される。腫瘍は、Ｔ細胞誘引の中心的なケモカイン回路を破壊することが示唆されている。さらに、腫瘍が腫瘍反応性Ｔ細胞の表面に血管障壁を形成し、これらの細胞を積極的に抑制するために、腫瘍が血管内皮を操作することが示されている。一旦Ｔ細胞が内皮関門を通過すると、これらのＴ細胞は腫瘍細胞に遭遇する前に敵対する免疫抑制性腫瘍間質を交渉しなければならない。実際、腫瘍は、Ｔｒｅｇ細胞、ＭＤＳＣおよびＭ２マクロファージのような免疫抑制性白血球集団の拡大を促し、促進する。この研究では、発明者らは、免疫抑制性白血球ファミリーに新しいメンバー；ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞を導入した。発明者らは、主に末梢血におけるこの新規集団を特徴づけたが、卵巣癌患者の腹水においてこの集団を追跡することができた。ＭＤＳＣと同様に、この集団は、黒色腫患者の末梢血において有意に上昇し、腫瘍が末梢組織における抑制要素の蓄積を促進するという概念を裏付ける。ＭＤＳＣとＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞との間の共通の特徴は、ＣＤ１４の発現であり、これは共同起源を意味し得る。しかし、これらの２つの抑制的集団は抑制の様式が異なる。ＭＤＳＣはバイスタンダーＴ細胞の増殖を普遍的に抑制するが、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞はＴ細胞のみを抗原特異的に抑制する。この差異は、ＣＤ４＋Ｔ細胞への抗原提示に重要なＨＬＡ−ＤＲの発現レベルと関連している可能性がある。ＭＤＳＣは、定義上ＨＬＡ−ＤＲｌｏｗであるが、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、ＢＤＣＡ１＋ＤＣによる発現と同等の高レベルでＨＬＡ−ＤＲを発現する。これに沿って、Ｎａｇａｒａｊらは、特別な癌マウスモデル（ＭＣ３８）では、ＣＤ４＋Ｔ細胞耐性が観察され、実質的なレベルのＭＨＣ−ＩＩを発現する特殊型のＭＤＳＣに起因することを発見した。これに基づいて、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、ＭＤＳＣのＭＨＣ−ＩＩｈｉサブセットとして分類することができた。しかしながら、これらの２つのサブセット間のＲＮＡ発現プロファイルの大きな違いは、ＭＤＳＣとしてＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞を分類することと相反している。また、トランスクリプトーム解析により、マウスのマクロファージ分化の中心的な遺伝子の発現によって、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞とマクロファージとの間に関係がある可能性があることが明らかにされた。それにもかかわらず、ＣＳＦ１Ｒは、マウスおよびヒトの両方において炎症性ＤＣ（ｉｎｆＤＣ）によって高度に発現されることも報告されている。さらに、マクロファージは定義上は組織常在細胞であり、一方では、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は循環および組織の両方で見出されるという事実は、２つの細胞サブセット間の別の不一致を強調し、それらを同じグループ内で分類することに相反する。しかし、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞とマクロファージとの間の潜在的な類似性は、これら２つの間の関係のさらなる議論を促す。
【００８７】
ＣＤ１４発現は、特定の区画内のＤＣまたは特定の条件下でＣＤ１４を発現するので、単球に限定されない。実際、定常状態のヒト真皮は、真皮ＤＣ（ＤＤＣ）のＣＤ１４＋サブセットを有する。ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団と同様に、ＣＤ１４＋ＤＤＣは、真皮マクロファージとの区別を可能にするＢＤＣＡ１を発現する。これらの２つのサブセット間の表現型の類似性は、重複する機能的性質によってさらに支持される。ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞と同様に、ＣＤ１４＋ＤＤＣは低レベルの共刺激分子を発現することが実証され、ナイーブＴ細胞増殖の誘導因子としては不十分であった。さらに、ＣＤ１４＋ＤＤＣは、Ｔｒｅｇ細胞の発達を促進することによって免疫寛容の誘導に関与している。ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞とＣＤ１４＋ＤＤＣとの間の共通形質は、２つの集団間のリンクを強く示唆している。ＣＤ１４＋ＤＤＣに加えて、ＤＣによる上方制御されたＣＤ１４発現も、ビタミンＤ、デキサメタゾンおよびＩＬ−１０のような免疫調節試薬での処置後に観察される。これらのＣＤ１４＋ＤＣの全ての共通の特徴は、共刺激分子の低発現、Ｔ細胞応答の誘発不良および免疫寛容の促進である。このことは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋血液集団が実際に循環抑制ＤＣサブセットであり、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞とＢＤＣＡ１＋ＤＣとの間の密接なＲＮＡ発現プロファイルによって裏付けられる概念であると強く仮定する。
【００８８】
腫瘍関連免疫抑制機構は、それらの同族受容体を免疫細胞に連結させて機能不全にすることによって、腫瘍特異的免疫応答を緩和する免疫抑制分子によって部分的に機能する。チェックポイントとも呼ばれるこれらの阻害経路のうち、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路に言及する。ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞によって発現され、ＤＣ、マクロファージおよびＴ細胞上で可変発現を有する２つのリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有するＣＤ２８ファミリーのメンバーである。Ｔ細胞受容体シグナル伝達中のそのリガンドの１つによるＰＤ−１の誘発は、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生および細胞溶解活性をブロックし、Ｔ細胞の生存を損なう可能性がある。これらの阻害効果は、ＰＤ−１４５の細胞内ドメイン内の免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）に起因する。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路の阻害効果は、抗腫瘍免疫応答を回避するために腫瘍によって乗っ取りされ得る。ＰＤ−Ｌ１発現は、グリア芽細胞腫およびメラノーマ、ならびに頭部および頸部、肺、卵巣、結腸、胃、腎臓および乳癌を含む多くの腫瘍で確認されている。腫瘍細胞、腫瘍浸潤性リンパ球またはその両方による攻撃的な腫瘍挙動、予後不良および死亡リスクの上昇による高発現ＰＤ−Ｌ１レベルがもたらせる。さらに、本発明者らは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団が、その貧弱なＴ細胞刺激能力を部分的に担うＰＤ−Ｌ１の発現の上昇によって特徴付けられることをここに記載した。したがって、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１チェックポイントは、腫瘍免疫抑制機構を中和する非常に興味深い標的である。実際、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体を遮断することによってこの経路を標的とすることは、許容可能であることが証明されただけでなく、治療された患者の２８％まで耐久性のある抗腫瘍応答を示した。Ｍｅｒｃｋ（ＭＫ−３４７５）によって開発された別の抗ＰＤ−１  ｍＡｂは、治療された進行性メラノーマ患者の５０％までの臨床応答率を達成することが最近報告されている。したがって、チェックポイント阻害剤は、特にＤＣワクチンのような他の形態の免疫療法と組み合わせた場合、癌免疫療法において有望な未来を有する。
【００８９】
要約すると、本発明者らは、腫瘍が免疫抑制の組織状態を維持し、活性な抗腫瘍免疫応答を阻止する新規な細胞サブセットを見出した。このＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団の阻害機能によって、それが癌免疫療法の標的となる。
【００９０】
図
図は以下のとおりである：
図１：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋ＤＣは腫瘍と関連している。
図１Ａ：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞の割合は、癌患者において増加する。
図１Ｂ：卵巣癌腫のＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋の割合が高い。
図１Ｃ：異なる細胞サブセットの表現型。
図２Ａ：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団は、トランスクリプトーム解析によって示されるように、独特なサブセットである。
図２Ｂ：マウスにおける骨髄発生に関与することが記載されている転写因子の発現。
図２Ｃ：マウスにおける骨髄発生に関与することが記載された成長因子受容体の発現。
図３：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋集団は、多重分析によって示されるようにユニークなサブセットである。
図４：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞はＤＣ特性を有する。
図４Ａ：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、抗原取り込みにおいて非常に効率的である。
図４Ｂ：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、ＴＬＲリガンドによる刺激の際に共刺激分子ＣＤ８０をアップレギュレートする。
図４Ｃ：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、固有の炎症性サイトカインプロファイルを有する。
図５Ａ：ＭＬＲ
図５Ｂ：ナイーブＴ細胞の刺激能力。
図６：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞の減少した活性は、ＰＤ−Ｌ１およびＭＥＲＴＫ発現によって引き起こされる。
図６Ａ：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋ＤＣは、ＴＬＲ刺激に応答してＰＤ−Ｌ１をアップレギュレートする。
図６Ｂ：ＰＤ−Ｌ１ブロッキングは、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋のＴ細胞刺激能力を増強する。
図７：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞は、黒色腫患者における癌免疫療法に対する反応が低いことと関連している。
図７Ａ：骨髄性ＤＣ免疫療法におけるＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋細胞のより高い割合は、患者におけるより低い応答と相関する。
図７Ｂ：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋ＤＣは、ＫＬＨ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制する。
図７Ｂ：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋ＤＣサプレッサーの能力は、オキサリプラチンによって阻害される。
図７Ｃ：ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋ＤＣはポリクローナルＴ細胞の増殖を抑制しない。
図８：可能なソート手順。
図９：本発明の組成物は、「ＢＤＣＡ−１富化」細胞集団である。本発明によれば、癌に罹患した患者に投与するための細胞集団を得るために、ＢＤＣＡ１＋ＣＤ１４＋の画分を全細胞の２５％未満に減少させる必要がある。
さらに、本発明は以下の実施の態様を包含する：
（１）
ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−樹状細胞が、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋樹状細胞について枯渇し、ＣＤ１４＋細胞の少なくとも７５％が、患者のＣＤ１４＋ＣＤ１６−血液由来の単球と比較して枯渇（減少）している、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−樹状細胞を含むかまたはそれからなる患者の癌の治療に用いる細胞集団。
（２）
前記細胞集団が、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）である細胞をさらに含むかまたはそれからなる、前記（１）に記載の細胞集団。
（３）
前記細胞の少なくとも５０％に腫瘍抗原または腫瘍ペプチドが負荷されている、前記（１）または（２）に記載の細胞集団。
（４）
前記細胞が、特に癌治療を必要とする患者の血液由来の血液から精製される、前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の細胞集団。
（５）
前記癌が、固形癌または慢性骨髄性白血病などの血液癌である、前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載の細胞集団。
（６）
前記固形癌がメラノーマまたは前立腺癌である、前記（５）に記載の細胞集団。
（７）
−患者の血液から以下を使用して前記（１）〜（３）の樹状細胞を精製すること
−ＣＤ１ｃに結合することができる抗体（ＢＤＣＡ−１）、
−Ｂリンパ球（ＣＤ１９またはＣＤ２０）に結合することができる抗体、および
−ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞に結合することができる抗体；
および
−得られた樹状細胞を腫瘍抗原または腫瘍ペプチドとインキュベートするステップを含む、患者の癌を治療するための細胞集団を作製するための方法。
（８）
−ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ−４）に結合する抗体を用いて樹状細胞を精製する
ステップをさらに含む、前記（７）に記載の方法。
（９）
−精製された樹状細胞の成熟を誘導すること
をさらに含む、前記（７）または（８）に記載の方法。
（１０）
ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ−１）＋／ＣＤ１９−／ＣＤ１４＋細胞が、以下のマーカー：ＣＤ１１ｂまたはＣＣＲ５のいずれかの存在によって特徴付けられる、前記（７）〜（９）のいずれか一つに記載の方法。
（１１）
患者の癌を治療するための細胞集団を生成するための、特に前記（７）〜（１０）の方法における、以下を含むキットの使用
−ＣＤ１ｃに結合する抗体（ＢＤＣＡ−１）、
−単球上に発現されたマーカーに結合することができる抗体、
−Ｂリンパ球、特にＣＤ１９またはＣＤ２０上で発現されるマーカーに結合することができる抗体、および、任意に、
−形質細胞様樹状細胞に結合することができる抗体。
（１２）
前記単球マーカーが、ＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、およびＣＣＲ５からなる群より選択される、前記（１２）に記載の使用。
（１３）
前記Ｂ細胞マーカーが、ＣＤ１９およびＣＤ２０からなる群から選択される、前記（１１）または（１２）に記載の使用。
（１４）
腫瘍抗原または腫瘍ペプチドをさらに含む、前記（１１）〜（１３）のいずれか一つに記載の使用。
（１５）
癌に罹患している患者に前記（１）〜（６）の細胞集団を投与することを含む、
癌を治療する方法。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
0006712262.tif 000015
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006712262.tif 000021
【図７Ａ】
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【図７Ｂ１】
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【図７Ｂ２】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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