(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非導電性の表面上に配置された、熱伝導性材料で製造された別個の加熱領域であって、その中にＤＮＡサンプルを含有してそれを分配するように構成された複数の一体型ウェルを含む、別個の加熱領域と、
ｄｃ電圧源に接続されて、該ｄｃ電圧源に接続されると該複数の一体型ウェルを一定の温度に加熱するように構成された少なくとも１つの伝導性トレースであって、少なくとも一部が該別個の加熱領域の周りに波型の形状で該表面上に配置されている、少なくとも１つの伝導性トレースと
を含み、
該複数の一体型ウェルのそれぞれが、該別個の加熱領域の厚さを構成するウェルの壁によって画定される、デジタルＰＣＲデバイス。
【請求項２】
前記複数の一体型ウェルが、前記別個の加熱領域中で規則的なアレイとして提供され、ここで該アレイの同じ列中のウェルは、該ウェルの壁の開口部を介して互いに流体連通する、請求項１に記載のデジタルＰＣＲデバイス。
【請求項３】
前記開口部が、ウェルの各列に沿って同一線上である、請求項２に記載のデジタルＰＣＲデバイス。
【請求項４】
前記表面の上、前記複数の一体型ウェルを含む前記別個の加熱領域の上、および前記少なくとも１つの伝導性トレースの上に設けられたトップ層をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のデジタルＰＣＲデバイス。
【請求項５】
前記表面および前記トップ層が、少なくとも１つのフレキシブルなシート材料から形成されている、請求項１から４のいずれか一項に記載のデジタルＰＣＲデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デジタルＰＣＲデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲは、シーケンシングのためのＤＮＡクローニング、疾患の診断、ＤＮＡサンプルからの個体の同定、および遺伝子の機能分析の実行などの様々な用途のためにＤＮＡ配列の複数のコピーを製造するのに一般的に使用される方法である。ＰＣＲにおいて、ＤＮＡ配列の複製は、複数の熱サイクルで起こり、各サイクルは、典型的には３つの主要な工程：変性、アニーリングおよび伸長を有する。変性工程において、二本鎖ＤＮＡテンプレートは、約９４〜９８℃に２０〜３０秒加熱され、一本鎖ＤＮＡが生じる。アニーリング工程において、温度を２０〜４０秒かけて約５０〜６５℃に低くすることによりプライマーが一本鎖ＤＮＡにアニールされる。伸長工程において、ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＴａｑ）を使用して、一本鎖ＤＮＡにアニールされたプライマーをＤＮＡポリメラーゼの最適な活性温度（Ｔａｑの場合、７５〜８０℃）で伸長することによって、新しい二本鎖ＤＮＡが合成される。上述の３つの主要な工程に加えて、使用されるＤＮＡポリメラーゼが熱活性化されている場合初期化工程が必要な場合があり、残存する一本鎖ＤＮＡフラグメントが確実になくなるように最後のサイクルの最終的な伸長工程がより長い期間（例えば５〜１５分）保持されてもよい。
【０００３】
ＰＣＲを実行するためのいずれのデバイスも、変性、アニーリングおよび伸長工程を起こすために繰り返しの熱サイクルを実行することが可能であることを必要とする。これは、反応物を必要な温度に加熱および冷却すること、ならびに必要な時間の長さにわたり必要な温度を保持することを含む。温度がほぼ１００℃および／または１００℃超まで上昇することを考慮すれば、既存の微小流体工学またはラボオンチップＰＣＲデバイスは、典型的には、必要な熱を供給するための外部のサーマルサイクラーを必要とすることから、それらの使用中における真の携帯可能性とサイズは制限される。
【０００４】
各サイクルが得られたＤＮＡ配列の数を効果的に倍加させるように、１つのサイクルで形成された新しい二本鎖ＤＮＡが次のサイクルで変性、アニーリングおよび伸長を受けるため、ＰＣＲを介したＤＮＡ複製は指数関数的である。したがってＰＣＲ増幅サイクルの数は、反応開始時のＤＮＡのコピー数に依存する。
【０００５】
それに対して、デジタルＰＣＲは、不確実な指数関数データに頼る必要なくＤＮＡの初発量を定量できるように、ＰＣＲのサイクル数に依存することなく最初のサンプル中のＤＮＡの量を決定できるＰＣＲの形態である。デジタルＰＣＲでは、１つのＤＮＡサンプルを複数のウェルに分配して、ＰＣＲを全てのウェルで同時に実行する。複数のウェル内のＤＮＡの濃度は、ポアソン分布に従うと仮定される。ＰＣＲが実行された後、各ウェルは、その中で増幅されたＤＮＡの非存在（陰性）または存在（陽性）のいずれかであることを示すと予想される。この方式で、絶対定量は、陽性の最終結果を示すウェルの数を数えることによって達成することができる。
【０００６】
現在のところ、デジタルＰＣＲシステムも、従来のＰＣＲシステムのように、ＤＮＡが分配されるウェルのそれぞれに必要な熱を供給するための外部のサーマルサイクラーに頼り、そのためそれらのサイズおよび携帯可能性も同様に制限される。これは、特に、人口が広範な地域にわたり分散しており、不十分なインフラストラクチャーや輸送ネットワークにより試験器具の利用が妨げられる場合、世界各地で流行を制御するために重要な感染症の診断を効率的に実行する医療従事者の能力を制限する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年、９ボルトまたはそれ未満の電圧を使用して１００℃またはそれより高温に加熱できるｄｃヒーターが開発されており、ここでｄｃヒーターは、１インチ平方であるかまたはそれより小さい。ｄｃヒーターは、非導電性の表面上に配置された、熱伝導性材料で製造された別個の加熱領域と、ｄｃ電圧源に接続されて、ｄｃ電圧源に接続されると別個の加熱領域を一定の温度に加熱するように構成された少なくとも１つの伝導性トレースとを含む。少なくとも１つの伝導性トレースは、少なくとも一部が別個の加熱領域の周りに波型の形状で表面上に配置されている。このような低い電圧源によって駆動する小さいヒーターは、スペースおよび省力に関して多くの用途に、特に携帯用の使用に、さらには使い捨ての使用にも可能性をもたらす。しかしながら、このような小さいｄｃヒーターで加熱した場合に有意義な反応を行うために、その中にＤＮＡサンプルを入れるための小さい領域内に十分な数の仕切りまたはウェルを提供することにおいてサイズの制約を受けることから、このようなｄｃヒーターのデジタルＰＣＲへの使用はそれでもなお課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様によれば、非導電性の表面上に配置された、熱伝導性材料で製造された別個の加熱領域であって、その中にＤＮＡサンプルを含有してそれを分配するように構成された複数の一体型ウェルを含む、別個の加熱領域と、ｄｃ電圧源に接続されて、ｄｃ電圧源に接続されると複数の一体型ウェルを一定の温度に加熱するように構成された少なくとも１つの伝導性トレースであって、少なくとも一部が別個の加熱領域の周りに波型の形状で表面上に配置されている、少なくとも１つの伝導性トレースとを含む、デジタルＰＣＲデバイスが提供される。
【０００９】
複数の一体型ウェルのそれぞれは、別個の加熱領域の厚さを構成するウェルの壁によって画定されてもよい。
【００１０】
複数の一体型ウェルは、別個の加熱領域中に規則的なアレイとして提供されてもよく、ここでアレイの同じ列中のウェルは、ウェルの壁の開口部を介して互いに流体連通する。
【００１１】
開口部は、ウェルの各列に沿って同一線上であってもよい。
【００１２】
デジタルＰＣＲデバイスは、表面の上、複数の一体型ウェルを含む別個の加熱領域の上、および少なくとも１つの伝導性トレースの上に設けられたトップ層をさらに含んでいてもよい。
【００１３】
表面およびトップ層は、少なくとも１つのフレキシブルなシート材料から形成されていてもよい。
【００１４】
本発明を十分理解して容易に実施できるようにするため、ここで非限定的な実施例によって本発明の例示的な実施形態のみを説明するものとし、説明は、添付の例示的な図面を参照しながらなされる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】デジタルＰＣＲデバイスの第１の例示的な実施形態の概略図である。
【図２】デジタルＰＣＲデバイスの伝導性トレースの波型の形状の様々な実施形態の概略図である。
【図３】デジタルＰＣＲデバイスの複数の一体型ウェルの平面図の写真である。
【図４】３次元のスクリーンキャプチャーおよびデジタルＰＣＲデバイスの多数のウェルのモデルの熱分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
デジタルＰＣＲデバイス１０の例示的な実施形態およびその様々な用途は、図１から４を参照しながら後述され、ここで同じまたは類似の部品を示すのに同じ参照番号が使用される。
【００１７】
図１で示されるようなデジタルＰＣＲデバイス１０の第１の実施形態において、デジタルＰＣＲデバイス１０は、高分子フィルムなどの非導電性の、表面３０上に配置された生物学的に不活性な熱伝導性材料で製造される別個の加熱領域２０を含む。別個の加熱領域２０は、表面３０上に所定の厚さを有する材料の層として配置される。表面３０は、例えば高分子材料で製造されてもよく、比較的硬くてもよいし（例えば、印刷回路基板に使用されるものなどのラミネート）またはフレキシブルでもよい（例えば、フレキシブルなポリプロピレンシート、高分子フィルム、カード用紙など）。
【００１８】
デジタルＰＣＲデバイス１０はまた、ｄｃ電圧源５０（図１では（＋）および（−）として示される）に接続されて、ｄｃ電圧源５０に接続されると別個の加熱領域２０を一定の温度に加熱するように構成された伝導性トレース４０も含む。別個の加熱領域２０は、伝導性トレース４０と導電性接触した状態ではない。伝導性トレース４０および別個の加熱領域２０は、好ましくは同じ材料で製造され、このような材料は、例えば金であり、これは、伝導性でありかつ生物学的に不活性である。
【００１９】
伝導性トレース４０は、少なくとも一部が別個の加熱領域２０の周りに波型の形状６０で表面３０上に配置されている。図１において、波型の形状６０は、図２で示されるようなスカラップ状の形態４１を有し、この形態は、同じ方向で湾曲した、所定角度で交わり、外側に向かって突端が形成され別個の加熱領域２０に向かって弧が凸型になっている一連の円弧を含む。この実施形態において、別個の加熱領域は長方形であり、波型の形状６０は別個の加熱領域２０の２つの逆側にのみ提供される。
【００２０】
代替の実施形態において、波型の形状６０は、図２で示されるように、のこぎり歯型４２、波型４３、方形波型４４、ハトの尾型４５、切手の縁の形態４６、または上述の波型の形状６０それぞれの改変された形態であってもよい。波型の形状６０は、直線部分が間に存在していてもよいしまたは存在していなくてもよい伝導性トレース４０の曲線または屈折部の反復単位を含むとみなすことができる。伝導性トレース４０が曲がったりまたは屈折したりするあらゆるところの外側または凸型のエッジまたは角で、より高い温度点が生じることが発見された。それゆえに、表面３０上に伝導性トレース４０の適切な波型の形状６０を提供することによって、別個の加熱領域２０に近接して位置する複数のより高い温度点がもたらされる。この方式で、例えばラップトップのＵＳＢポートによって提供できるようなわずか５ボルトのｄｃ電圧を使用して、例えばわずか３ｍｍ×１０ｍｍの寸法を有する別個の加熱領域２０を、望ましい高い温度、例えば１００℃またはそれより高い温度に加熱するのに十分な熱を、伝導性トレース４０の波型の形状６０によって生成することができる。
【００２１】
ｄｃ電圧源５０は、デジタルＰＣＲデバイス１０が構成される用途に応じて９ボルトまたはそれ未満の電圧を有するあらゆる好適な電力供給源であり得る。例えば、ｄｃ電圧源５０は、電池の形態であってもよいし、または上述したようにそれ自体の電力供給源を有するラップトップもしくはコンピューターまたは他のホストデバイスのＵＳＢポートの形態であってもよく、５ボルトまたはそれ未満の電圧であり得る。この方式で、デジタルＰＣＲデバイス１０は、デジタルＰＣＲデバイス１０によって使用される低いｄｃ電圧を供給できる電池または他の携帯用デバイスで駆動することができるため、容易に携帯することができる。
【００２２】
別個の加熱領域２０を、伝導性トレース４０のいかなる部分とも電気的な接触を有さないように構成することによって、別個の加熱領域２０の全てが、デジタルＰＣＲデバイス１０が定常加熱状態に到達するときに一定の温度を有することが見出されている。別個の加熱領域２０が、デジタルＰＣＲを実行するためにＤＮＡサンプルが分配されるデジタルＰＣＲデバイス１０の複数の一体型ウェル２９を加熱するように構成されているために、この均一加熱の特徴は特に重要であり、さらに、全てのウェルが均一に加熱され、ＤＮＡサンプルへの損傷を引き起こす可能性がある過剰な温度または温度の急上昇に曝露されるウェルをなくすことが重要である。
【００２３】
とりわけ、デジタルＰＣＲデバイス１０の複数のウェル２９は、図３で示されるように、別個の加熱領域２０と一体化されている。これは、別個の加熱領域２０にウェル２９をエッチングすること、もしくは複数の一体型ウェル２９が包含されるように別個の加熱領域２０を印刷すること、または複数のウェル２９を別個の加熱領域２０と一体的に形成するための他のあらゆる好適な方法により達成することができる。図３で示されるような例示的な実施形態において、複数の一体型ウェル２９のそれぞれは、長さ約４２０μｍ×幅２２０μｍの内部寸法を有する。
【００２４】
各ウェル２９は、図４で示されるように、別個の加熱領域２０の厚さである約６０μｍの壁の高さを有するウェルの壁２７によって画定される。複数の一体型ウェル２９は、図３からわかるように、好ましくは規則的なアレイで提供される。より好ましくは、アレイの同じ列中のウェル２９は、ＤＮＡサンプルを全てのウェル２９に流動できるようにウェルの壁２７中の開口部２８を介して互いに流体連通するように構成されている。図３に示される実施形態において、開口部は、約幅１８０μｍである。開口部２８は、アレイを通るＤＮＡサンプルの流動を容易にするために、好ましくはウェルの各列に沿って同一線上である。この方式で、各ウェル２９は、ウェル２９に流動させるＤＮＡサンプルの一部を保持するための仕切りとして機能するように構成されている。
【００２５】
使用中、各ウェル２９がＤＮＡサンプルの一部を保持できるように、ＤＮＡサンプルを複数の一体型ウェル２９のアレイを通って流動させる。伝導性トレース４０にｄｃ電圧が適切に供給およびサイクリングされることによって、複数の一体型ウェル２９のそれぞれにおいて同数のＰＣＲサイクルが起こるように、供給されたｄｃ電圧のサイクリングに従って別個の加熱領域２０の均一な加熱が起こる。各ウェル２９中に存在する全てのＤＮＡが、全ての複数の一体型ウェル２９において同じ回数増幅される。全てのウェル２９に蛍光性タグまたは他のあらゆる適切なタグを適用することによって、ＰＣＲ開始時に有意な数のＤＮＡが存在するウェルは、陽性の結果を示すと予想される。したがって、陽性の結果を示すウェルを数えることにより、ウェル２９中のＰＣＲの増幅サイクル数に合わせて調整することによってサンプル中のＤＮＡを定量することが可能になる。
【００２６】
デジタルＰＣＲデバイス１０は、好ましくは、環境への曝露による損傷からそれらを保護するために、表面３０の上、別個の加熱領域２０の上、および伝導性トレース４０の上に設けられたトップ層（示されていない）を有する。トップ層はまた、好ましくは、使用者の安全性のために電気絶縁機能も提供する。したがって表面３０およびトップ層が、厚さ３ｍｍ未満のパッケージ中に、伝導性トレース４０および複数の一体型ウェル２９を含む別個の加熱領域２０を封入していてもよい。
【００２７】
トップ層は、複数の一体型ウェル２９にＤＮＡサンプルを設置するために少なくとも１つのサンプル収集開口部を有すると予想され、さらに、複数の一体型ウェル２９に試薬を添加するための１つまたは複数の他の開口部を有してもよい。またトップ層は、複数の一体型ウェル２９を見るための結果表示ウィンドウとして構成された透明な部分を有してもよい。
【００２８】
デジタルＰＣＲデバイス１０がそのｄｃ電圧源をＵＳＢホストデバイスから供給させようとする場合、デジタルＰＣＲデバイス１０は、追加で、伝導性トレース４０がＵＳＢホストデバイスとの接続のためのＵＳＢインターフェースと共に構成されているタブ（示されていない）を備えてもよい。
【００２９】
例示的な実施形態において、デジタルＰＣＲデバイス１０は、４μｌのサンプルにデジタルＰＣＲを実行するために、約３ｍｍ×１０ｍｍの面積を有し、８００個の一体型ウェル２９を含む別個の加熱領域２０を含む。このような少量のサンプルからＤＮＡの定量を可能にするデジタルＰＣＲデバイス１０の能力は、ごく少量のＤＮＡサンプルしか入手できない法医学用途において特に有利である。したがってデジタルＰＣＲデバイス１０は、少量のＤＮＡサンプルと共に使用するための様々なＤＮＡ増幅用途にとって、容易に携帯可能な、さらには使い捨ての解決策を提供する。デジタルＰＣＲデバイス１０に必要なサンプルの体積は、ピコリットル範囲もの少量にすることができるため、等温増幅または一定温度のＰＣＲサイクリングを可能にすることが想定される。これは、ＤＮＡ増幅をより簡単に実行できるようにするため感染症の診断にとって特に有益であり、さらに、低コストという大きな利点のために臨床医は高額の器具に多大な投資をする必要なく診断を実行することができる。
【００３０】
前述の説明で本発明の例示的な実施形態を説明したが、関連する分野の当業者であれば、本発明から逸脱することなく設計、構築および／または操作の細部における多くの改変がなされ得ることを理解しているものと予想される。例えば、別個の加熱領域２０および波型の形状６０の代替の形状が、デジタルＰＣＲデバイスの実際の用途に従い要求に応じて提供されることが想定することができ、これらの機構の可能性のある形およびサイズに限定されない。ウェルの数および寸法、壁の高さ、ならびに別個の加熱領域の寸法は全て、上述した例と異なっていてもよく、本デバイスを用いて実行しようとするＰＣＲの特定の用途およびタイプに応じて望ましい数および寸法に従って構成されてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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