(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）のいずれかで示される、分子量１６００以上４００００以下の化合物。
【化１】
0006700750.tif 000021
（Ｉ）
【化２】
0006700750.tif 000022
（ＩＩ）
【化３】
0006700750.tif 000023
（ＩＩＩ）
上記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）において、ｎ、ｍは各々独立に１以上の整数であり、Ｒ１０１乃至Ｒ１１２は水素原子であり、
Ｒ１１乃至Ｒ１４はメチル基であり、
Ｌ１１乃至Ｌ１７は無置換のメチン基であり、Ａ１１及びＡ１２が炭素数１〜３のアルキレン基であり、Ａ１３及びＡ１４が炭素数２〜５のアルキレン基であり、
Ｑ１１及びＱ１２は−ＣＯＮＨ−であり、
Ｂ１１及びＢ１２は−ＯＣＨ３である。
【請求項２】
前記化合物の分子量が２０００以上２５０００以下である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物の分子量が２５００以上１１０００以下である請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物の分子量が２５００以上４５００以下である請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
腫瘍集積量／血中滞留量の比が１．５以上である請求項１乃至４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の化合物と、分散媒とを有する光音響イメージング用造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物、および、前記化合物を有する光学イメージング用造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
非侵襲的に生体内部の情報を可視化する方法として、光学イメージング法が知られている。光学イメージング法では、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する音響波や蛍光などの信号を測定して画像化する。また、Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  ｇｒｅｅｎ（以下ＩＣＧと略すことがある）などの近赤外波長領域の光を吸収する色素を生体に投与することで、生体内でその色素が発する蛍光または音響波を測定することも可能である。したがって、ＩＣＧのような色素は、光学イメージング用造影剤として利用できる。
【０００３】
ここで、色素を腫瘍の造影剤として用いるために、色素にポリマーを結合させることが好ましい。色素は一般的に低分子であるため、腫瘍に集積する前に血中から速やかに排出される。しかし、ポリマーを結合しておくことで排出されにくくなる。そのため、血中を循環するうちに腫瘍に集積し、結果的に腫瘍集積量を高めることができるからである。
一方、腫瘍部位から発生する信号強度に対して腫瘍部位以外からの信号強度が低いと、高いコントラストで腫瘍部を可視化できる。そのため、腫瘍部以外の組織、中でも体内全体に広がる血管に色素が長時間残存しないことが望まれる。すなわち、造影剤の血中滞留量に対する腫瘍集積量の比（Ｔｕｍｏｒ／Ｂｌｏｏｄ比、以下Ｔ／Ｂと略すことがある）が高いことが望ましい。
【０００４】
特許文献１には、光学イメージング剤として、モノアミノ−ＰＥＧ２０ｋとＣｙ５（登録商標）−ビスＮＨＳエステルとを反応させてなる化合物の記載がある。なお、本明細書においてｋは１０００を表し、例えば２０ｋは２００００であり、ここでいうＰＥＧ２０ｋとは、ＰＥＧの平均分子量が２００００であるという意味である。また、本明細書においてＰＥＧとは、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）の略である。すなわち、色素（Ｃｙ５（登録商標））に、２０ｋという高分子量のポリマー（ＰＥＧ）を２つ結合させることで、腫瘍集積性を高めた化合物の開示がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１２−５２０８５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らが検討したところ、Ｃｙ５（登録商標）−ビスＮＨＳエステルの有する２つのエステル基の各々に２０ｋのモノアミノ−ＰＥＧが反応してなる化合物は、上記Ｔ／Ｂが低いことがわかった。
【０００７】
そこで本発明では、Ｔ／Ｂが高く、腫瘍部を高コントラストに造影可能な造影剤として用いることができる化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る化合物は、下記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）のいずれかで示される、分子量１６００以上４００００以下の化合物である。
【０００９】
【化１】
0006700750.tif 000002
（Ｉ）
【００１０】
【化２】
0006700750.tif 000003
（ＩＩ）
【００１１】
【化３】
0006700750.tif 000004
（ＩＩＩ）
【００１２】
上記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）において、ｎ、ｍは各々独立に１以上の整数であり、Ｒ１０１乃至Ｒ１１２は各々独立に、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、炭素数１〜１８のアルキル基、炭素数１〜１８のアルキルエステル基、及び炭素数１〜１８のアルキルアミド基のいずれかであり、
Ｒ１１乃至Ｒ１４は各々独立に、炭素数１〜１８のアルキル基または炭素数１〜１８のフッ化アルキル基であり、
Ｌ１１乃至Ｌ１７は各々独立に置換又は無置換のメチン基であり、メチン基の置換基は炭素数１〜４のアルキル基またはハロゲン原子であり、Ｌ１１とＬ１３、Ｌ１２とＬ１４、Ｌ１３とＬ１５、Ｌ１４とＬ１６、が五員環又は六員環を形成していてもよく、Ａ１１乃至Ａ１４は各々独立に、炭素数１〜９のアルキレン基、または炭素数１〜９のフッ化アルキレン基であり、
Ｑ１１及びＱ１２は各々独立に、−ＣＯＮＴ−、−ＮＴＣＯ−、−ＮＴ（Ｃ＝Ｏ）ＮＴ−、−ＮＴ（Ｃ＝Ｓ）ＮＴ−、−ＮＴ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＴ−、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＴ＝Ｎ−、−ＣＴ＝Ｎ−ＮＨ−、−ＣＴ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＴ＝Ｎ−ＮＨ−Ｏ−及び下記式（ｉ）、（ｉｉ）のいずれかであり、Ｔは水素原子、または炭素数１〜５のアルキル基のいずれかであり、
Ｂ１１及びＢ１２は各々独立に、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２、及び−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）２のいずれかである。
【００１３】
【化４】
0006700750.tif 000005
（ｉ）
【００１４】
【化５】
0006700750.tif 000006
（ｉｉ）
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る化合物によれば、従来に比べて分子量の小さいＰＥＧと、従来に比べて疎水性が高い色素とが結合した構造を有するためＴ／Ｂが高く、腫瘍を高コントラストに造影可能な造影剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施例１で行った合成プロセスを示す図である。
【図２】本発明の実施例１で合成して得られたＣＹＰ−２ＰＥＧ−１ｋ×２のＭａｌｄｉ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限られない。
【００１８】
本実施形態に係る化合物は、下記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）に示すように、シアニン系の色素の２つのインドール環に存在する各々の窒素原子にリンカーを介して、例えば１５ｋ以下の比較的低分子量のＰＥＧが結合してなる化合物である。このような比較的低分子量のＰＥＧに低分子色素が結合してなる化合物は、特許文献１に開示の従来の化合物に比べてＰＥＧの分子量が小さいため、血中滞留性（Ｂ）が低いが、そのために、腫瘍集積性（Ｔ）も低い。一方、本実施形態に係る化合物は、ナフチル環を有するため、Ｃｙ５（登録商標）やＣｙ７（登録商標）といった、ベンゼン環を有する構造に比べて環が１つ多く、疎水性が高い。そのため、化合物同士が疎水性相互作用により複数集まって会合体を形成し、見かけの分子量が高くなるため、血中滞留性が高い。しかも、会合体である状態は、単独の化合物である状態と動的な平衡状態、すなわち可逆関係にあると考えられる。そのため、会合体を形成して血中に滞留する中で腫瘍に集積していく一方で、一定割合で存在する単独の化合物は排出されていく。
【００１９】
このように、本実施形態に係る化合物は、腫瘍集積性が高く、かつ、血中滞留性が低いため、Ｔ／Ｂが大きい。
【００２０】
本実施形態に係る化合物は具体的には、下記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）のいずれかで示される、分子量１６００以上４００００以下の化合物である。
【００２１】
【化６】
0006700750.tif 000007
（Ｉ）
【００２２】
【化７】
0006700750.tif 000008
（ＩＩ）
【００２３】
【化８】
0006700750.tif 000009
（ＩＩＩ）
【００２４】
本実施形態に係る化合物の分子量は、Ｔ／Ｂが高いという観点から、２０００以上２５０００以下であることが好ましく、２５００以上１１０００以下であることが好ましく、２５００以上４５００以下であることが特に好ましい。上記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）において、ｎ、ｍは各々独立に１以上の整数である。なお、ｎ、ｍは各々独立に１２以上２３７以下の整数であることが好ましく、２５以上３８以下の整数であることがさらに好ましい。
【００２５】
上記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）において、Ｒ１０１乃至Ｒ１１２は各々独立に、水素原子、ハロゲン原子、アセトキシ基、炭素数１〜１８のアルキル基、炭素数１〜１８のアルキルエステル基、及び炭素数１〜１８のアルキルアミド基のいずれかである。なお、Ｒ１０１乃至Ｒ１１２が水素原子であることが好ましい。
【００２６】
上記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）において、Ｒ１１乃至Ｒ１４は各々独立に、炭素数１〜１８のアルキル基または炭素数１〜１８のフッ化アルキル基である。上記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）において、Ｒ１１乃至Ｒ１４がメチル基であることが好ましい。  上記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）において、Ｌ１１乃至Ｌ１７は各々独立に置換又は無置換のメチン基であり、メチン基の置換基は炭素数１〜４のアルキル基またはハロゲン原子である。また、Ｌ１１とＬ１３、Ｌ１２とＬ１４、Ｌ１３とＬ１５、Ｌ１４とＬ１６、が五員環又は六員環を形成していてもよい。なおＬ１１乃至Ｌ１７は無置換のメチン基であることが好ましい。本明細書において、近赤外波長帯域とは、６００ｎｍ以上１３００ｎｍ以下を指す。
【００２７】
上記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）において、Ａ１１乃至Ａ１４は各々独立に、炭素数１〜９のアルキレン基、または炭素数１〜９のフッ化アルキレン基である。なお、Ａ１３及びＡ１４が炭素数１〜９のアルキレン基であることが好ましく、炭素数２〜５のアルキレン基であることが好ましく、炭素数５のアルキレン基であることが特に好ましい。Ａ１１及びＡ１２が炭素数１〜３のアルキレン基であることが好ましい。
【００２８】
上記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）において、Ｑ１１及びＱ１２は各々独立に、−ＣＯＮＴ−、−ＮＴＣＯ−、−ＮＴ（Ｃ＝Ｏ）ＮＴ−、−ＮＴ（Ｃ＝Ｓ）ＮＴ−、−ＮＴ（Ｃ＝Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＴ−、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＴ＝Ｎ−、−ＣＴ＝Ｎ−ＮＨ−、−ＣＴ＝Ｎ−Ｏ−、−ＣＴ＝Ｎ−ＮＨ−Ｏ−、及び下記式（ｉ）、（ｉｉ）のいずれかである。Ｑ１１及びＱ１２においてＴは水素原子、または炭素数１〜５のアルキル基のいずれかである。なお、Ｑ１１及びＱ１２が、−ＣＯＮＨ−であることが好ましい。
【００２９】
【化９】
0006700750.tif 000010
（ｉ）
【００３０】
【化１０】
0006700750.tif 000011
（ｉｉ）
上記式（Ｉ）乃至（ＩＩＩ）において、Ｂ１１及びＢ１２は各々独立に、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２、及び−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）２のいずれかである。なお、Ｂ１１及びＢ１２が−ＯＣＨ３であることが好ましい。
【００３１】
また、本実施形態に係る化合物において、上記式（Ｉ）が、下記の式（Ｉ−１）乃至（Ｉ−２）で表されることが好ましく、下記の式（Ｉ−１）で表されることが特に好ましい。
【００３２】
【化１１】
0006700750.tif 000012
（Ｉ−１）
【００３３】
【化１２】
0006700750.tif 000013
（Ｉ−２）
上記式（Ｉ−１）乃至（Ｉ−２）においてｎは１以上の整数である。
【００３４】
（本実施形態に係る化合物の製造方法）
上記本実施形態に係る化合物の製造方法について説明する。
【００３５】
（化合物の合成）
本実施形態における化合物は、ＰＥＧと特定のシアニン系の化合物とを、それぞれがもつ官能基を介してカップリング反応によって結合させることで調製する。例えば、特定のシアニン系の化合物のインドール環に存在する窒素原子の置換基を介して、ＰＥＧを結合させる。なお、アミノ基を有するＰＥＧのアミノ基と、特定のシアニン系の化合物が有するカルボキシル基を介してアミド結合させることが好ましい。
【００３６】
シアニン系の化合物とＰＥＧとの連結基として、アミド結合、ウレア結合、チオウレア結合、ウレタン結合、エーテル結合、チオエーテル結合、スルホンアミド結合、リン酸エステル結合、ジスルフィド結合、イミン結合、ヒドラゾン結合、マレイミド基へのチオール付加によるチオエーテル結合、トリアゾール結合を介してＰＥＧと特定のシアニン系の化合物を結合させても良い。
【００３７】
ここで、アミド結合、ウレア結合、チオウレア結合、ウレタン結合、エーテル結合、チオエーテル結合、スルホンアミド結合、トリアゾール結合は生体内で比較的安定な結合であるからである。マレイミド基へのチオール付加によるチオエーテル結合、イミン結合、ヒドラゾン結合は、縮合剤などを用いることなく形成することが可能であるため、精製工程における縮合剤の除去の負担が少なくすることが可能である。
【００３８】
ＰＥＧと結合した特定のシアニン系の色素は、限外濾過法、サイズ排除カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー法等の公知の精製法により精製することができる。ＰＥＧと特定のシアニン系の化合物との結合は、上述のＰＥＧの有するアミノ基などの官能基と特定のシアニン系の化合物の置換基を介して直接結合されていても良いし、種々の架橋材（クロスリンカー）を介して結合させても良い。
【００３９】
特定のシアニン系の色素とＰＥＧとを反応させる方法としては、カルボキシル基とアミノ基の反応として縮合剤を用いる方法、塩を形成し脱水反応により縮合を行う方法、脱水剤を用いる方法、カルボキシル基を酸クロライドやスクシンイミドエステルに変換し、アミノ基と反応させる方法のいずれも利用が可能である。
【００４０】
上記縮合剤としては、カルボジイミド系縮合剤、イミダゾール系縮合剤、トリアジン系縮合剤、ウロニウム系縮合剤、リン酸系縮合剤などが利用可能である。
【００４１】
上記カルボジイミド系縮合剤の例としては、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）を挙げることが出来る。また、反応促進剤として、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシアザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）を併用することが好ましい。なぜなら上記縮合剤と反応促進剤との併用によって、反応時間を短くすることができ、また本実施形態における化合物をより多く産生することができるからである。
【００４２】
上記縮合剤の使用量は、特定のシアニン化合物に対して、２．０倍モル以上の範囲であることが好ましい。なぜならば、一つの特定のシアニン系化合物に二つのＰＥＧを結合させてなる本実施形態における化合物をより多く産生することができるからである。また、縮合剤そのものを反応溶媒として用いることも可能である。
【００４３】
本実施形態に係る化合物を合成する際に用いられるＰＥＧの使用量は、特定のシアニン化合物に対して、２．０倍モル以上であることが好ましい。なぜなら、ＰＥＧの使用量が多いほど、一つの特定のシアニン化合物に一つのＰＥＧのみが結合した化合物の残存量を少なくすることができ、精製工程における未反応化合物の除去の負担が少ないためである。
【００４４】
本実施形態における反応工程において使用する有機溶媒は特定のシアニン化合物と、ＰＥＧとを結合させることができれば特に限定されない。反応工程において用いる有機溶媒の例として、ヘキサン、シクロへキサン、ヘプタン等の炭化水素類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トリクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦと略すことがある）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの非プロトン性極性溶媒類、ピリジン誘導体が挙げられる。また、これらの有機溶媒を２種類以上混合して使用することも可能である。
【００４５】
好ましくは、ＤＭＦ、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性極性溶媒類、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類が挙げられる。なぜなら、特定のシアニン化合物と、ＰＥＧはこれらの有機溶媒に対する溶解性が高く、該化合物が十分に分散した状態で反応を行うことが出来るためである。なお、化合物を製造する際に用いられる有機溶媒の使用量は、反応条件等に応じて、適宜定め得る。本実施形態に係る化合物を得るための合成を行う際の反応温度は、特に限定されないが、通常は０℃以上、かつ溶媒の沸点以下の範囲の温度である。ただし、用いる縮合剤に合わせた最適な温度で反応を行うことが望ましい。反応時間は、例えば、１時間乃至１２０時間の範囲である。
【００４６】
（化合物の精製）
本実施形態における化合物の精製は、特定のシアニン系の色素とＰＥＧを有する化合物との結合体を精製し、未反応化合物を除去できれば手法は特に限定されない。
【００４７】
本実施形態に係る化合物を単離精製する方法としては、水やアセトニトリル、メタノールなどの極性の高い溶媒を用いた逆相クロマトグラフィー、有機溶媒を用いた、順相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、透析、再沈殿、再結晶が挙げられる。精製の際に用いられる有機溶媒としては、ヘキサン、シクロへキサン、ヘプタン等の炭化水素類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、トリクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性極性溶媒類、ピリジン誘導体、メタノール、エタノール等のアルコール類が挙げられる。また、これらの溶媒を２種類以上混合して使用することも可能である。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、メタノール、エタノール等のアルコール類が挙げられる。なぜなら、これらの溶媒を用いた場合、シアニン系の色素と上記結合体の溶解性が良くなる。その結果、特定のシアニン系の色素と本実施形態に係る化合物とが十分に分散した状態で精製を行うことが出来る。本実施形態に係る化合物乾燥工程は特に限定されないが、乾燥方法としての例としては、定法のエバポレーター、真空乾燥器、凍結乾燥器等を用いた方法が挙げられる。
【００４８】
（ＰＥＧ）
ＰＥＧは、水溶性の高分子であり、タンパク質の血清半減期の増加や免疫原性の低下などの効果を奏する。
【００４９】
本実施形態に係る化合物を調製するために用いるＰＥＧの分子量は、１５０００以下であることが好ましく、５０００以下であることが好ましく、２０００以下であることが特に好ましい。
【００５０】
分子量２００００未満の比較的低分子量のＰＥＧでは血中滞留性が低くなる。
【００５１】
また、ＰＥＧの分子量が小さくなればなるほど、分子サイズが立体的に小さくなることから立体反発が生じず凝集効果は向上する。
【００５２】
ＰＥＧの分子量が数百になると、１分子全体の疎水性が高くなり、会合体の巨大化または腫瘍細胞および正常細胞への非特異的な吸着が生じ、腫瘍への集積量は低下すると考えられる。
【００５３】
そのため、分子量１０００から２０００のＰＥＧを用いることが最も好ましい。
【００５４】
本明細書中で述べるＰＥＧまたは本実施形態に係る化合物の「分子量」は、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析法から得られる分子量分布の重量平均分子量（Ｍｗ）である。
【００５５】
本実施形態におけるＰＥＧは、特定のシアニン系の化合物と共有結合できる反応性の官能基をＰＥＧ１分子に少なくとも１つ以上有するもの、厳密にはＰＥＧ誘導体である。ここで反応性の官能基とは、結合させる色素の有する官能基によって適宜選択することができる。反応性官能基とは、例えば、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボニル基、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル基、スルホスクシンイミジルオキシカルボニル基、およびＮ−マレイミドアルキレン基等であることが好ましい。
【００５６】
本実施形態に係る化合物のＰＥＧ末端の官能基の例としては、−Ｈ、−ＯＣＨ３、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＨ、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２、及び−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）２が挙げられる。これらの官能基は親水性であるため、本実施形態に係る化合物の疎水部の凝集性を増加することができる。本実施形態においてＰＥＧ誘導体として下記式（ｐ１）で示される化合物を用いることが好ましい。
【００５７】
【化１３】
0006700750.tif 000014
（ｐ１）
上記式（Ｉ−１）においてｎは１以上の整数である。
【００５８】
なお、上記式（ｐ１）のＭｗが１０００のものがＰＧ１−ＡＭ−１ｋ（Ｎａｎｏｃｓ社製）、Ｍｗが５５０のものがＰＧ１−ＡＭ−５５０（Ｎａｎｏｃｓ社製）、Ｍｗが２０００のものがＰＧ１−ＡＭ−２ｋ（Ｎａｎｏｃｓ社製）、Ｍｗが５０００のものがＰＧ１−ＡＭ−５ｋ（Ｎａｎｏｃｓ社製）、Ｍｗが１００００のものがＰＧ１−ＡＭ−１０ｋ（Ｎａｎｏｃｓ社製）、Ｍｗが２００００のものがＰＧ１−ＡＭ−２０ｋ（Ｎａｎｏｃｓ社製）である。
【００５９】
また、本実施形態においてＰＥＧ誘導体として、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＡＳｅｒｉｅｓ（日油製）＜ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｈ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−５０Ｈ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−１２Ｔ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−２０Ｔ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−３０Ｔ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥＰＡ−４０Ｔ＞、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＥＡ  Ｓｅｒｉｅｓ（日油製）（上記式（ｐ１）で表される化合物）＜ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−０５０ＥＡ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−１００ＥＡ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＥＡ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−３００ＥＡ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−４００ＥＡ＞、ｍＰＥＧ−Ａｍｉｎｅ（ＭＷ  ５５０、１０００、２０００、３４００、５０００、１００００、２００００）（Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ社製）などを用いることが出来る。
【００６０】
（特定のシアニン系の化合物）
本実施形態において、シアニン系の化合物の構造は、該シアニン系の色素のインドール環およびポリメチン鎖に疎水基を有していてもよい。ハロゲン原子、アセトキシ基、アルキル基、アルキルエステル基、アルキルアミド基の導入は、無置換のシアニン化合物に比べて色素の疎水性を増加することができ凝集性を増加することができるからである。これらのアルキル鎖の炭素数が多ければ多いほど、疎水性および凝集性が増加する。また、本実施形態において、シアニン系の化合物の芳香環部位が上記式（Ｉ）で示されるようなベンゾ［ｅ］インドール、上記式（ＩＩ）で示されるようなベンゾ［ｆ］インドール、上記式（ＩＩＩ）で示されるようなベンゾ［ｇ］インドールであってもよい。これらの異性体の疎水性および凝集性はほぼ同等であるからである。
【００６１】
シアニン系の化合物のポリメチン鎖が無置換、またはアルキレン鎖、シクロペンチル環、シクロヘキシル環で置換されていてもよい。それらの置換基の導入は、シアニン化合物の共役構造を変えることなく、色素部位の疎水性を増加することができ凝集性を増加することができるからである。
【００６２】
本実施形態に係る特定のシアニン系の色素としては、下記式（ｄ１）で示されるＣ５ｃｙｐａｔｅ（以下、ＣＹＰと略すことがある）、下記式（ｄ２）で示されるｃｙｐａｔｅ（以下、Ｃ２ＣＹＰと略すことがある）を用いることが好ましく、Ｃ５ｃｙｐａｔｅを用いることがさらに好ましい。
【００６３】
【化１４】
0006700750.tif 000015
（式ｄ１）
【００６４】
【化１５】
0006700750.tif 000016
（式ｄ２）
【００６５】
（リンカー部分）
また、シアニン系の化合物とＰＥＧの結合体のリンカー部は、アルキレン鎖またはフッ化アルキレン鎖であることが好ましい。アルキレン鎖は、炭素数１以上９以下のアルキレン鎖であることが好ましく、炭素数２以上５以下であることがさらに好ましい。炭素数が増加するにつれて疎水性が高く、凝集効果を高めることができる。
なお、炭素数が６以下のフッ化アルキレン鎖は安定かつ安全性が高く、また疎水性が高いため、本実施形態に係る化合物の凝集効果を高めることができる。
【００６６】
（本実施形態に係る化合物の用途）
（光学イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、本実施形態に係る化合物と、分散媒とを有する。ここで分散媒は、本実施形態に係る化合物を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖水溶液などが挙げられる。本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、上記本実施形態に係る化合物をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る化合物と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に化合物を分散媒に分散させて使用してもよい。本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、上記化合物や分散媒の他にさらに賦形剤などの薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、安定剤、溶解補助剤などを有していてもよい。また、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、凍結乾燥時に使用する添加剤を含んでいてもよい。添加剤の一例としてグルコース、ラクトース、マンニトール、ポリエチレングリコール、グリシン、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウムが挙げられる。添加剤は１種類のみを用いても、複数種類を併用してもよい。
【００６７】
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、生体内に投与するときに造影剤の溶液のｐＨが５．０以上８．０以下に調整されていることが好ましく、７．０以上７．４以下であることがより好ましい。また、造影剤が生理食塩液を含む場合、造影剤の溶液の生理食塩液に対する浸透圧比は０．０１から２．０であることが好ましく、１．０であることがより好ましい。
【００６８】
本実施形態において光学イメージングとは、光を照射することで、イメージング（画像化）することを意味する。本実施形態に係る造影剤に光を照射することで、発せられた音響波を検出することで光音響イメージングをすることができ、発せられた蛍光を検出することで蛍光イメージングをすることができる。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。本実施形態に係る光学イメージング用造影剤が蛍光イメージングに用いられる場合、蛍光イメージング用造影剤、光音響イメージングに用いられる場合、光音響イメージング用造影剤と呼ぶ。
【００６９】
（腫瘍造影）
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、生体内に投与したときに、腫瘍部位に集積し、かつ血液中の造影剤残存量が低い。その結果、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波や蛍光を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波や蛍光を正常部位から発せられる音響波や蛍光よりも大きくすることができる。
【００７０】
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤の腫瘍集積量／血中滞留量（Ｔ／Ｂ）は、１．２より大きいことが好ましく、１．５以上であることがさらに好ましい。また、Ｔ／Ｂ比が高くなるにつれて、腫瘍部位をより高いコントラストでイメージングをすることができる。
【００７１】
（リンパ節造影）
また、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は腫瘍造影以外にもリンパ節の造影に用いることもできる。さらに、センチネルリンパ節の造影剤に用いることが特に好ましい。これは、本実施形態に係る化合物は、色素単独と比べてサイズが大きいため、センチネルリンパ節により留まりやすく集積性が向上されることが期待されるからである。
【００７２】
（光線力学療法）
本実施形態に係る化合物は、光照射によって活性酸素種を発生させられ、光線力学的療法（ｐｈｏｔｏｄｙａｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）による腫瘍の治療にも用いることができる。本実施形態に係る化合物は、血管内の残量が少ないため、光を照射することによって本実施形態に係る化合物から発生する活性酸素種が腫瘍周辺の血管を損傷することなく、腫瘍細胞のみを損傷させることができるからである。
【００７３】
（捕捉分子）
本実施形態に係る化合物にさらに、捕捉分子が結合していてもよい。本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された本実施形態に係る化合物を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
【００７４】
（本実施形態に係る造影剤を用いたイメージング方法）
（光学イメージング方法）
生体内に投与された本実施形態に係る化合物を、光音響イメージング装置または蛍光イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る化合物を検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本実施形態に係る光音響イメージング方法または蛍光イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。（ａ）本実施形態に係る化合物が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｂ）前記検体内に存在する前記化合物から発生する音響波および蛍光を検出する工程
また、本実施形態に係る化合物は、前記（ｂ）で得られた音響波や蛍光の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布または蛍光信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号や蛍光の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号や蛍光の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度や蛍光強度が表現されるようなもの構わないし、２次元平面上に光音響信号強度や蛍光強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響信号や蛍光の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
【００７５】
上記（ａ）の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係る化合物を投与された検体を用いることができる。
【００７６】
また、上記（ｂ）の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係る化合物から発せられる光音響信号や蛍光を検出する装置は特に限定されない。
【００７７】
上記（ｂ）の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製））、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４  ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
【００７８】
音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８、Ｅｎｄｒａ  Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。
【００７９】
蛍光を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の蛍光イメージング装置（ＩＶＩＳ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。
【００８０】
本実施形態に係る化合物を用いたイメージング方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍、リンパ節あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等は、同様な機能、効果を有する造影剤が得られる範囲で自由に変えることが出来る。なお以下でＭｗは分子量を表す。
【００８２】
本実施例において調製した各サンプル、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．３５ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．５５ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−２ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−５ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１０ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−２０ｋ×２の構造はいずれも上記式（Ｉ−１）で表される。ただし、上記列挙したサンプル名は各々分子量が異なり、「ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．３５ｋ×２」であれば、上記式（Ｉ−１）の有する２つのＰＥＧ部分（（ＯＣＨ２ＣＨ２）のうち、１つのＰＥＧ部分に対する分子量が０．３５ｋであるという意味である。また、他も同様である。
【００８３】
また、Ｃ２ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１ｋ×２の代表的な構造は上記式（Ｉ−２）で表され、Ｃ１０ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．３５ｋ×２の代表的な構造は下記式（Ｃ１）で表される。ただし、上記列挙したサンプル名は各々分子量が異なり、「Ｃ２ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１ｋ×２」であれば、上記式（Ｉ−２）の有する２つのＰＥＧ部分（（ＯＣＨ２ＣＨ２）のうち、１つのＰＥＧ部分に対する分子量が１ｋであるという意味である。また、他も同様である。
【００８４】
【化１６】
0006700750.tif 000017
（Ｃ１）
【００８５】
また、ｃｙ７−２ＰＥＧ−２０ｋ×２、ｃｙ７−２ＰＥＧ−１ｋ×２の代表的な構造は下記式（Ｃ２）で表され、ｃｙ５−２ＰＥＧ−２０ｋ×２、ｃｙ５−２ＰＥＧ−１ｋ×２の代表的な構造は下記式（Ｃ３）で表される。ただし、上記列挙したサンプル名は各々分子量が異なり、「ｃｙ７−２ＰＥＧ−２０ｋ×２」であれば、下記式（Ｃ２）の有する２つのＰＥＧ部分（（ＯＣＨ２ＣＨ２）のうち、１つのＰＥＧ部分に対する分子量が２０ｋであるという意味である。また、他も同様である。
【００８６】
【化１７】
0006700750.tif 000018
（Ｃ２）
【００８７】
【化１８】
0006700750.tif 000019
（Ｃ３）
（分析方法）
以下の各実施例で得られた各化合物の構造決定は、１Ｈ−ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ製、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ５００、共鳴周波数：５００ＭＨｚ）測定装置を用いて行った。
【００８８】
以下の各実施例において行った吸収スペクトル測定は、紫外可視光吸収スペクトル測定装置（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ製、Ｌａｍｂｄａ  Ｂｉｏ  ４０）を用いた。
下記各実施例において行った質量分析（ＭＳ）は、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ−ＭＳ（ブルカー・ダルトニクス製、Ａｕｔｏｆｌｅｘ）を用いた。
【００８９】
以下の比較例２において行った質量分析は、ゲル浸透クロマトグラフ分析装置（昭和電工社製、Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ−１０１、分析カラム：Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＦ−３１０ＨＱ、Ａｓａｈｉｐａｋ  ＧＦ−５１０  ＨＱ、溶離液：２０ｍｍｏｌ／Ｌ  臭化リチウム入りジメチルホルムアミド、流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ）を用い、ＥａｓｉＶｉａｌ（登録商標）ＰＥＧ／ＰＥＯ（アジレントテクノロジー社製）を用いて得られた校正曲線より算出を行った。
【００９０】
［実施例１］
（ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１ｋ×２の合成）
Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５，１６，ｐｐ５１−６１を参照して合成した化合物（Ｃ５ｃｙｐａｔｅ、以下ＣＹＰと略す）９．８ｍｇに、ＰＧ１−ＡＭ−１ｋ（上記式（ｐ１）参照）（Ｎａｎｏｃｓ社製、Ｍｗ１０００）５８ｍｇ、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ＷＳＣ・ＨＣｌ）３８ｍｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（同仁化学社製、ＨＯＢｔ）１６ｍｇ、無水ジメチルホルムアミド（和光純薬工業社製、ｄｒｙ  ＤＭＦ）１ｍＬおよびクロロホルム（キシダ化学社製、ＣＨＣｌ３）５ｍＬを加えて室温かつ遮光下で２．５日間撹拌した。反応溶液を減圧留去して濃縮した後、クロロホルム５０ｍＬで再度溶解した。前記溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液５０ｍＬ続いて飽和食塩水５０ｍＬで分液操作を行った。回収したクロロホルム溶液に無水硫酸ナトリウム（キシダ化学社製）を加えた後、溶液を濾過した。濾液を減圧留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（充填剤：キシダ化学社製シリカゲル、６０〜２２０μｍ、７０〜２３０ｍｅｓｈ、移動相：メタノール（キシダ化学社製）／クロロホルム／トリエチルアミン（キシダ化学社製）＝１／５／０．０６）により分離精製を行い、緑色固体１１ｍｇを得た。図１に本実施例の反応プロセスを示す。
【００９１】
得られた化合物のＤＭＳＯ（和光純薬工業社製）中での吸収極大は７９４ｎｍであり、質量スペクトルはほぼ分子量３０００を中心とした分布を有していた。
【００９２】
上記合成してできた化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの測定結果を以下に示す。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ／ＣＤＣｌ３＝１／１）（ｐｐｍ）：８．１４（ｄ），７．９７−７．９２（ｍ），７．６２（ｍ）、７．５３−７．４４（ｍ）、６．５６（ｔ），６．２０（ｄ）、４．１３（ｔ）、３．７６−３．４７（ｂｒ、）、３．３４（ｓ）、２．２３（ｔ）、１．９８（ｓ）、１．８８（ｍ）、１．７２（ｍ）、１．５２（ｍ）．
以下の実施例では、上記と同じ製造元の反応試薬、塩や溶媒を用いた。
【００９３】
［実施例２］
（ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．５５ｋ×２の合成）
実施例１と同様にして、ＰＧ１−ＡＭ−５５０（上記式（ｐ１）参照）を用いて式（Ｉ−１）のＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．５５ｋ×２を合成した。室温かつ遮光下で３日間反応した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：メタノール／クロロホルム＝１／２０から１／５のグラジエント勾配）およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー（担体：ＧＥヘルスケア社製  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）  ＬＨ−２０、移動相：クロロホルム）により分離精製を行い、緑色固体を得た。ＤＭＳＯ中での吸収極大は７９４ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量１９００を中心とした分布を有していた。
【００９４】
［実施例３］
（ＣＹＰ−２ＰＥＧ−２ｋ×２の合成）
実施例１と同様にして、ＰＧ１−ＡＭ−２ｋ（上記式（ｐ１）参照）を用いて式（Ｉ−１）のＣＹＰ−２ＰＥＧ−２ｋ×２を合成した。室温かつ遮光下で５日間反応した後、限外濾過（分画分子量：５０００、溶媒：１５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）により分離精製を行い、緑色固体を得た。ＤＭＳＯ中での吸収極大は７９４ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量４２００を中心とした分布を有していた。
【００９５】
［実施例４］
（ＣＹＰ−２ＰＥＧ−５ｋ×２の合成）
実施例１と同様にして、ＰＧ１−ＡＭ−５ｋ（上記式（ｐ１）参照）を用いて式（Ｉ−１）のＣＹＰ−２ＰＥＧ−５ｋ×２を合成した。室温かつ遮光下で１日間および４５℃４時間反応した後、分取用薄層クロマトグラフィー（移動相：メタノール／クロロホルム／ジイソプロピルエチルアミン＝１／２０／０．０２）により分離精製を行い、緑色固体を得た。ＤＭＳＯ中での吸収極大は７９４ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量１０６００を中心とした分布を有していた。
【００９６】
［実施例５］
（ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１０ｋ×２の合成）
実施例１と同様にして、ＰＧ１−ＡＭ−１０ｋ（上記式（ｐ１）参照）を用いて式（Ｉ−１）のＣＹＰ−２ＰＥＧ−１０ｋ×２を合成した。室温かつ遮光下で５日間および反応した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：メタノール／クロロホルム／ジイソプロピルエチルアミン（キシダ化学社製）＝１／２５／０．２から１／１５／０．２のグラジエント勾配）および限外濾過（分画分子量：１０，０００、溶媒：１５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）により分離精製を行い、緑色固体を得た。ＤＭＳＯ中での吸収極大は７９４ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量２１７００を中心とした分布を有していた。
【００９７】
［実施例６］
（Ｃ２ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１ｋ×２の合成）
実施例１と同様にして、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５，１６，ｐｐ５１−６１を参照して合成した化合物（ｃｙｐａｔｅ、以下Ｃ２ＣＹＰと略す）とＰＧ１−ＡＭ−１ｋ（上記式（ｐ１）参照）を用いて式（Ｉ−２）のＣ２ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１ｋ×２を合成した。室温かつ遮光下で５日間および反応した後、再沈殿法（メタノール／クロロホルム／ジエチルエーテル）により精製を行い、緑色固体を得た。ＤＭＳＯ中での吸収極大は７９４ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量２７００を中心とした分布を有していた。
【００９８】
［比較例１］
（ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．３５ｋ×２の合成）
実施例１と同様にして、ＰＧ１−ＡＭ−３５０（上記式（ｐ１）参照）を用いて上記式（Ｉ−１）のＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．３５ｋ×２を合成した。室温かつ遮光下で３日間反応した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：メタノール／クロロホルム＝１／１５から１／５のグラジエント勾配）により分離精製を行い、緑色固体を得た。ＤＭＳＯ中での吸収極大は７９４ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量１５００を中心とした分布を有していた。
【００９９】
［比較例２］
（ＣＹＰ−２ＰＥＧ−２０ｋ×２の合成）
実施例１と同様にして、ＰＧ１−ＡＭ−２０ｋ（上記式（ｐ１）参照）を用いて、上記式（Ｉ−１）で示される化合物（ＣＹＰ−２ＰＥＧ−２０ｋ×２）を合成した。室温かつ遮光下で５日間および反応した後、限外濾過（分画分子量：３００００、溶媒：１５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）により分離精製を行い、緑色固体を得た。ＤＭＳＯ中での吸収極大は７９４ｎｍであり、ゲル浸透クロマトグラフ分析により予想通り平均分子量４５０００を示すピークが見られた。
【０１００】
［比較例３］
（ｃｙ７−２ＰＥＧ−１ｋ×２の合成）
実施例１と同様にして、Ｃｙａｎｉｎｅ  ７  ｂｉｓａｃｉｄ（ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ製）とＰＧ１−ＡＭ−１ｋ（上記式（ｐ１））を用いて上記式（Ｃ２）のｃｙ７−２ＰＥＧ−１ｋ×２を合成した。室温かつ遮光下で１日間および反応した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：メタノール／クロロホルム＝１／５から３／４のグラジエント勾配）および透析法  （分画分子量：１，０００、溶媒：メタノール）により精製を行い、緑色固体を得た。リン酸緩衝生理食塩水中での吸収極大は７５０ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量３０００を中心とした分布を有していた。
【０１０１】
［比較例４］
（ｃｙ７−２ＰＥＧ−２０ｋ×２の合成）
比較例３と同様にして、ＰＧ１−ＡＭ−２０ｋ（上記式（ｐ１）参照）を用いて上記式（Ｃ２）のｃｙ７−２ＰＥＧ−２０ｋ×２を合成した。室温かつ遮光下で３日間および反応した後、ゲル浸透クロマトグラフィー（移動相：メタノール／クロロホルム＝１／１）により分離精製を行い、緑色固体を得た。リン酸緩衝生理食塩水中での吸収極大は７５０ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量４３０００を中心とした分布を有していた。
【０１０２】
［比較例５］
（ｃｙ５−２ＰＥＧ−１ｋ×２の合成）
Ｃｙａｎｉｎｅ  ５  ｂｉｓｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ  （ＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ製）２．２ｍｇに、ＰＧ１−ＡＭ−１ｋ（上記式（ｐ１）参照）１３ｍｇ、１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ・ＨＣｌ）７  ｍｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）５ｍｇ、無水ジメチルスルホキシド（ｄｒｙ  ＤＭＳＯ）０．４ｍＬおよびクロロホルム（ＣＨＣｌ３）１ｍＬを加えて室温かつ遮光下で１日間撹拌した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（移動相：メタノール／クロロホルム＝１／５から３／４のグラジエント勾配）および透析法  （分画分子量：１０００、溶媒：メタノール）により精製を行い、青色固体を得た。リン酸緩衝生理食塩水中での吸収極大は６５０ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量２９００を中心とした分布を有していた。
【０１０３】
［比較例６］
（ｃｙ５−２ＰＥＧ−２０ｋ×２の合成）
比較例５と同様にして、ＰＧ１−ＡＭ−２０ｋ（上記式（ｐ１）参照）を用いて上記式（Ｃ３）に示すｃｙ５−２ＰＥＧ−２０ｋ×２を合成した。室温かつ遮光下で４日間および反応した後、ゲル浸透クロマトグラフィー（移動相：メタノール／クロロホルム＝１／１）により分離精製を行い、青色固体を得た。リン酸緩衝生理食塩水中での吸収極大は６５０ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量４３０００を中心とした分布を有していた。
【０１０４】
［比較例７］
（Ｃ１０ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．３５ｋ×２の合成）
実施例１と同様にして、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００５，１６，ｐｐ５１−６１を参照して合成した化合物（Ｃ１０ｃｙｐａｔｅ、以下Ｃ１０ＣＹＰと略す）とＰＧ１−ＡＭ−０．３５ｋ（上記式（ｐ１）参照）を用いて上記式（Ｃ１）のＣ１０ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．３５ｋ×２を合成した。室温かつ遮光下で５日間および反応した後、再沈殿法（メタノール／クロロホルム／ジエチルエーテル）により精製を行い、緑色固体を得た。ＤＭＳＯ中での吸収極大は７９４ｎｍであり、質量スペクトルは予想通りほぼ分子量１５８０を中心とした分布を有していた。
【０１０５】
（腫瘍集積性の評価）
上記実施例および比較例で調製した化合物の腫瘍集積性を確認するために、ｃｏｌｏｎ−２６細胞株を移植した腫瘍移植マウスに対して、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−２０ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１ｋ×２、ｃｙ７−２ＰＥＧ−２０ｋ×２、ｃｙ７−２ＰＥＧ−１ｋ×２、ｃｙ５−２ＰＥＧ−２０ｋ×２、ｃｙ５−２ＰＥＧ−１ｋ×２を尾静脈に投与した。投与量は色素量として１３ｎｍｏｌとした。投与２４時間後に、マウスの尾より採血を行い、マウスを炭酸ガスで安楽死させた後、ｃｏｌｏｎ−２６腫瘍組織を摘出した。腫瘍組織をプラスチックチューブに移し、腫瘍組織の重量に対し１．２５倍量の１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートした。次いで、ホモジネート溶液を遠心操作（１６０００×Ｇ、５分間、４℃）により上澄み液を回収し、上澄み液（２μＬ）にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１８μＬ）を加えた。血液に関しては、採血した血液（４μＬ）に１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液（１１μＬ）とＤＭＳＯ（９μＬ）を加えた。ＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）ＣＬｘ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ社製）を用い、４８ウェルプレート上でのホモジネート溶液及び血液の蛍光強度を測定することで腫瘍組織中と血液中の本実施例、比較例に係る化合物量を定量した。腫瘍組織の単位重量あたりの、投与量（色素量１３ｎｍｏｌ）に対する腫瘍組織への色素移行率（％  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ：％ＩＤと略す）を、化合物の腫瘍集積量（％ＩＤ／ｇ）として、表１に示した。本明細書では、このようにして求められた化合物の腫瘍組織中の集積量をＴ（％ＩＤ／ｇ）、化合物の血中の色素の滞留量をＢ（％ＩＤ／ｇ）とし、Ｔの値をＢで割った値をＴ／Ｂ（腫瘍集積量／血中滞留量）という指標として定義する。表１に上記実施例および比較例に係る化合物のＴ／Ｂを示した。同様に、ｃｏｌｏｎ−２６細胞株を移植した腫瘍移植マウスに対して、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１０ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−５ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−２ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．５５ｋ×２、ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．３５ｋ×２、Ｃ２ＣＹＰ−２ＰＥＧ−１ｋ×２、Ｃ１０ＣＹＰ−２ＰＥＧ−０．３５ｋ×２を尾静脈に投与した。投与２４時間後におけるＴ／Ｂを測定し、その結果を表１に示す。
【０１０６】
【表１】
0006700750.tif 000020
【０１０７】
（まとめ）
表１で示す結果から、疎水性の高い色素であるＣＹＰを用いたＣＹＰ−２ＰＥＧ−１ｋ×２では高いＴ／Ｂ比を示すことがわかる。これは、色素を介した分子間の疎水性会合により、みかけの分子量が大きくなっていること、色素単独に比べて腎排泄が抑制されているがＣＹＰ−２ＰＥＧ−２０ｋ×２よりも腎排泄が早いことなどからだと考えられる。また、ＣＹＰとＰＥＧの組み合わせでのみ、ＰＥＧの分子量を小さくすることによってＴ／Ｂ比が増加することが示された。１つのＰＥＧの分子量が０．５５ｋから１０ｋの範囲において、分子量２０ｋのＰＥＧを２つ結合したＣＹＰ−２ＰＥＧ−２０ｋ×２のＴ／Ｂ比に比べて、高いＴ／Ｂ比であった。１つのＰＥＧの分子量が０．５５ｋから１０ｋの範囲において２以上のＴ／Ｂ比であった。
上記の結果と同様に、ＣＹＰ−２ＰＥＧのＰＥＧの分子量を適切な範囲とすることによってＴ／Ｂ比が大きくなることが示された。
【図１】
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【図２】
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