(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシム、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物を、薬学的に許容される補助剤、希釈剤、または担体と共に含む医薬製剤。
【請求項３】
治療に使用するための、請求項２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
（ａ）ステロイド関連ＣＮＳ疾患、
（ｂ）３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドに対して曝露した後の耐性発現に起因する病態または症状、
（ｃ）３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドに対する曝露の離脱／禁断によって影響される病態、
（ｄ）抗炎症ステロイドの１つ以上の副作用、
（ｅ）閉経後療法の１つ以上の副作用、及び／または
（ｆ）経口避妊薬の１つ以上の副作用、
の治療のための医薬を製造するための、請求項１に記載の化合物の使用。
【請求項５】
ステロイド関連ＣＮＳ疾患の治療に使用するための医薬製剤であって、前記ステロイド関連ＣＮＳ疾患が、てんかん、月経周期依存的てんかん、うつ病、ストレス関連うつ病、片頭痛、倦怠感、ストレス関連倦怠感、月経前症候群、月経前不快気分障害、月経周期連鎖気分変動、軽度認知機能障害、認知機能障害、月経周期連鎖記憶変化、ストレス関連記憶変化、ストレス関連学習障害、肝性脳症、ダウン症候群、アルツハイマー病、月経周期連鎖集中力欠如障害、月経周期連鎖睡眠障害及び倦怠感、食欲増大、過食及び肥満、アルコール及び薬物乱用の再発、平衡障害、モーメント障害、及び協調運動障害からなる群から選択される、請求項３に記載の使用のための医薬製剤。
【請求項６】
前記ステロイド関連ＣＮＳ疾患が、てんかん、月経周期依存的てんかん、うつ病、ストレス関連うつ病、片頭痛、倦怠感、ストレス関連倦怠感、月経前症候群、月経前不快気分障害、月経周期連鎖気分変動、軽度認知機能障害、認知機能障害、月経周期連鎖記憶変化、ストレス関連記憶変化、ストレス関連学習障害、肝性脳症、ダウン症候群、アルツハイマー病、月経周期連鎖集中力欠如障害、月経周期連鎖睡眠障害及び倦怠感、食欲増大、過食及び肥満、アルコール及び薬物乱用の再発、平衡障害、モーメント障害、及び協調運動障害からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
前記疾患がダウン症候群またはアルツハイマー病である、請求項５に記載の使用のための医薬製剤。
【請求項８】
前記疾患がダウン症候群またはアルツハイマー病である、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
（Ａ）請求項１に記載の化合物、及び
（Ｂ）ステロイド関連ＣＮＳ疾患の治療において有用な少なくとも１つの他の治療薬を含み、
成分（Ａ）及び（Ｂ）の各々が、薬学的に許容される補助剤、希釈剤、または担体と共に製剤化される、配合剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のステロイド化合物、及び一般的には、肝性脳症、ダウン症候群、アルツハイマー病、及び認知機能障害の処置などの治療におけるその使用、ならびに、当該化合物を含む医薬組成物に関する。本発明は、肝性脳症、ダウン症候群、及びアルツハイマー病の治療における公知のステロイド化合物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において一見して公知であることが明らかな文献の目録または考察は、必ずしも、当該文献が当該技術分野の現状の一部であること、あるいは公知の一般常識であることの承認として捉えるべきではない。
【０００３】
プレグナノロン（プレグネノロン、プロゲステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾン、及びコルチゾールを含む）、テストステロン、アンドロステンジオン、及びデヒドロエピアンドロステロンなどの内因性ステロイドホルモンの代謝産物は、様々な研究に供されている。
【０００４】
３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドの多くの例が、γ−アミノ酪酸受容体−塩化物イオノフォア（ＧＡＢＡＡ−Ｒ）複合体に作用することが知られており、したがってＧＡＢＡＡ受容体調節ステロイド（ＧＡＭＳ）と称されている。ＧＡＢＡＡ−Ｒ複合体の構造の複雑さのため、受容体部位における直接のメカニズムは、まだ十分に解明されていない。しかしながら、ＧＡＢＡ受容体ファミリーは、幾つかのサブユニット構成を含み、そのうちの幾つかがＣＮＳの特定の機能及び疾患と関連することが知られている。
【０００５】
３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドは、数日／週にわたって大量に産生され、及びＣＮＳ機能の阻害を直接的に招くことができる。３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドの直接的作用によって引き起こされる疾患及び症状の例としては、月経前不快気分障害、月経前症候群、認知症、アルツハイマー病、ダウン症候群、鎮静状態、倦怠感、慢性疲労症候群、記憶障害、学習障害、運動機能障害、骨折、不器用、食欲増大及び大食症、肥満、アルコール及び薬物乱用の再発、緊張による抑うつ気分、過敏症、うつ病、聴覚及び視覚の低下、小発作性てんかんの悪化、及び燃え尽き症候群が挙げられる。
【０００６】
３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドへの連続的及び／または長期の曝露は、ＧＡＢＡＡ受容体系において耐性を引き起こす。この耐性は、最終的にストレス感受性、集中困難、及び衝動制御の喪失、及びうつ病に至り得る過程の初期段階である。さらに、３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドの作用は、薬物依存性を強化する要素であることが見出されている。
【０００７】
他方で、連続的ではあるがより短期の曝露は、曝露を終了した場合に、離脱効果をもたらす。この現象は、例えば、卵巣の黄体による３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドの産生が中断される月経時に生じる。この離脱現象は、胎盤によるそれらの産生が中断される出産後、あるいはストレス期間が終了した場合にも生じる（ストレスに曝されている間、副腎は、３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドを産生している）。
【０００８】
このような離脱及び／または禁断による影響を受ける症状の例は、部分てんかん、「月経時てんかん」、気分変動、及び「週末」頭痛を含む。
【０００９】
ＧＡＢＡＡ受容体は、塩素チャンネルであり、このチャンネルを介した塩素の流入を加減することによってその作用を示す。ＧＡＢＡＡ受容体が開放しており、細胞内に大量の塩素イオンが流入する場合に、脳内のニューロンの活動が抑制されることは、当該技術分野で既知のことである。流入する塩素の量と、ＧＡＢＡＡ受容体作用性薬物の臨床効果との間に関係があることも既知である。
【００１０】
ベンゾジアゼピン系薬、バルビツレート系薬、及びアルコールもある程度、このメカニズムを介してそれらの作用を示す。しかしながら、このことはこれらの薬物の副作用の原因でもある。
【００１１】
ＧＡＢＡＡ受容体に関する問題点は、脳の大半の部分においてその作用を示すことにある。この点に鑑みて、ＧＡＢＡ作用の完全な遮断薬は危険であり、また、精神病の症状や痙攣などを招きかねない。したがって、３−α−ヒドロキシ−５−α／β−プレグナン−ステロイドの作用が拮抗されるべき場合に、３−α−ヒドロキシ−５−α／β−プレグナン−ステロイド効果を特異的に拮抗する一方で、ＧＡＢＡ自体の効果は拮抗しない化合物を使用することが望ましい。
【００１２】
したがって、本発明は、ＧＡＢＡ受容体をブロックすることができる特異的な物質の提供という問題点を解消することを意図しており、したがって、そのような化合物は、ＧＡＢＡ受容体、またはＧＡＢＡ受容体に関連した他の神経伝達物質の興奮における異常の治療において有用である。
【００１３】
国際特許出願第ＷＯ２００８／０６３１２８号は、３−α−ヒドロキシステロイド及び３−β−ヒドロキシステロイドを開示している。国際特許出願第ＷＯ９９／４５９３１号は、ステロイド３−β−ＯＨ−５α−プレグナン−２０−オンの拮抗作用を開示している。国際特許出願第ＷＯ０３／０５９３５７号は、３−β−ヒドロキシステロイドと、ＧＡＢＡＡ受容体に関するそれらの拮抗作用を開示している。
【００１４】
米国特許第ＵＳ５，２３２，９１７号、同第ＵＳ５，９２５，６３０号、同第ＵＳ５，９３９，５４５号、同第ＵＳ６，１４３，７３６号、及び同第ＵＳ６，２７７，８３８号は、３−α−ヒドロキシステロイド及びそれらのベンゾジアゼピン様効果に重点を置いたＧＡＢＡＡ受容体の作動性調節因子としての、３−α−ヒドロキシステロイド及び３−β−ヒドロキシステロイドを開示している。米国特許出願第ＵＳ２００４／０２４２５４９号では、多数のステロイドが開示されている。
【００１５】
３−β−ＯＨ−５−α−プレグナン−２０−オン及び他の３−β−ＯＨ−５−α／β−プレグナン−ステロイドの拮抗作用が、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，１６９，３３４（２０００）及びＪ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２２，３３６６（２００２））で考察されている。
【００１６】
上記の化合物を含む従来技術の化合物は、特定のＧＡＢＡＡ−Ｒサブタイプに対して特異的ではない。したがって、受容体サブタイプに対してより選択的な化合物が必要とされている。
【００１７】
加えて、従来のステロイド及び自然に得られるステロイドは、代謝に供され、経口投与に適さないことがよくあり、また一般的には透過性が良くない。このことが、このような化合物の投与を非常に難しくしている。したがって、体内で代謝／分解されにくく、かつ／または改善された透過性／生体利用性を有する化合物に対する必要性も存在する。
【発明の概要】
【００１８】
我々は、化合物３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムが、ＧＡＢＡＡ受容体の拮抗薬として作用すること、及びこの化合物が、例えばＧＡＢＡ受容体サブユニットα５の拮抗薬としてＧＡＭＳシグナル効果を調節するなどして、ＧＡＢＡＡ−Ｒ複合体のステロイドエンハンスメントを調節することでそのように作用し得ることを発見した。
【００１９】
本発明では、化合物３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシム、またはその薬学的に許容される塩が提供され、当該化合物及び塩は、本明細書において、以後はまとめて「本発明の化合物」と称する。
【００２０】
【化１】
0006712599.tif 000002
【００２１】
薬学的に許容される塩類は、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。
【００２２】
そのような酸付加塩及び塩基付加塩は、従来の手段、例えば式Ｉの化合物の遊離酸または遊離塩基形態と、１つ以上の等価の適切な酸または塩基との反応を、任意に溶媒中で、または当該塩が溶解できない培地内で行い、続いて標準的な技術を用いて（例えば、真空で、凍結乾燥によって、または濾過によって）当該溶媒または当該培地を除去することによって形成することができる。塩は、塩の形態の本発明の化合物の対イオンを、例えば、適切なイオン交換樹脂を用いて、別の対イオンと交換することによって調製することもできる。
【００２３】
言及できる酸付加塩の例としては、カルボン酸塩（例えば、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、プロピオン酸塩、イソ酪酸塩、ヘプタン酸塩、デカン酸塩、カプリン酸塩、カプリル酸塩、ステアリン酸塩、アクリル酸塩、カプロン酸塩、プロピオール酸塩、アスコルビン酸塩、クエン酸塩、グルクロン酸塩、グルタミン酸塩、グリコール酸塩、α−ヒドロキシ酪酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、フェニル酢酸塩、マンデル酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ｏ−アセトキシ安息香酸塩、サリチル酸塩、ニコチン酸塩、イソニコチン酸塩、ケイ皮酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、馬尿酸塩、フタル酸塩、またはテレフタル酸塩）、ハロゲン化物塩（例えば、塩化物塩、臭化物塩、またはヨウ化物塩）、ハロゲン化水素酸塩（例えば、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、またはヨウ化水素酸塩）、スルホン酸塩（例えば、ベンゼンスルホン酸塩、メチル−、ブロモ−、またはクロロ−ベンゼンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ヒドロキシエタンスルホン酸塩、１−または２−ナフタレン−スルホン酸塩、または１，５−ナフタレンジスルホン酸塩）、または硫酸塩、ピロ硫酸塩、硫酸水素塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、または硝酸塩などが挙げられる。
【００２４】
言及できる塩基付加塩の例として、塩酸などの酸、アルカリ金属（ナトリウム（Ｎａ）塩及びカリウム（Ｋ）塩など）、アルカリ土類金属（マグネシウム（Ｍｇ）塩及びカルシウム（Ｃａ）塩など）、有機塩基（エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、及びリジンなど）、及び無機塩基（アンモニア、及び水酸化アルミニウムなど）を用いて形成された塩がある。さらに具体的には、言及できる塩基付加塩として、マグネシウム（Ｍｇ）塩、カルシウム（Ｃａ）塩、及び特に、カリウム（Ｋ）塩、及びとりわけ、ナトリウム（Ｎａ）塩がある。
【００２５】
本発明のある態様では、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシム塩酸塩が提供される。本発明のさらなる態様では、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムナトリウム塩が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の化合物は、例えば、以下に示したようにして調製することができる。
【００２７】
医学的及び薬学的用途
本発明の化合物は、医薬として示されている。それ故に、本発明のさらなる態様では、医薬としての用途、及び／または医薬におけるのと同様に治療における用途のための本明細書において先に定義した化合物が提供される。
【００２８】
後述する通り、本発明の化合物は、サブユニット組成物α１、β２、γ２を含むＧＡＢＡＡ受容体でのＧＡＢＡの効果を増強し得る一方で、α１、β２、γ２を含むＧＡＢＡＡ受容体に関して単体で適用した場合には、それ自身は、塩素流入に対して直接的な効果を示さない、という驚くべき知見が得られたのである。
【００２９】
とりわけ、本発明の化合物が、α１、β２、γ２受容体に関するＧＡＢＡの効果を増強し、その一方で同時に、α５、β３、γ２受容体に対しては拮抗薬の働きをし得ることが確認された。驚くべきことに、３−α−ヒドロキシ−プレグナン−ステロイドによって誘発されたＨＥＫ細胞（ヒト胎児腎臓、ＨＥＫ）において組換え発現された場合に、３−α−ヒドロキシ−プレグナン−ステロイドと本発明の化合物とを同時に用いて処理することで、α５タイプのヒトＧＡＢＡＡ受容体を介した塩素流入を阻害するが、ＧＡＢＡ単体によって誘発された塩素流入に関しては効果が小さい。
【００３０】
さらに、この作用が、薬理学的及び生理学的に適切な濃度にて達成できることも確認された。
【００３１】
したがって、本発明の化合物は、ヒトＧＡＢＡＡ受容体に関して３−α−ヒドロキシ−プレグナン−ステロイドの作用をブロックすることができるので、一般的には、ヒトでのステロイド関連ＣＮＳ疾患の治療において潜在的に有用である。
【００３２】
「ステロイド関連ＣＮＳ疾患」として、てんかん、月経周期依存的てんかん、うつ病、ストレス関連うつ病、片頭痛、倦怠感、及び特に、ストレス関連倦怠感、月経前症候群、月経前不快気分障害、月経周期連鎖気分変動、認知機能障害（軽度認知機能障害を含む）、月経周期連鎖記憶変化、ストレス関連記憶変化、ストレス関連学習障害、肝性脳症、ダウン症候群、アルツハイマー病、月経周期連鎖集中力欠如障害、月経周期連鎖睡眠障害、及び倦怠感を含む。肥満及び食欲増大、ならびに、アルコール及び／または薬物乱用の再発、幾つかの形態の平衡感覚障害／疾患、モーメント障害、及び協調運動障害も、ステロイド関連またはステロイド誘発のものであることが強く示唆されており、したがって、「ステロイド関連ＣＮＳ疾患」も、食欲増大、過食及び肥満、アルコール及び薬物乱用の再発を誘発する。したがって、本発明は、これらの病態を治療、緩和または予防するための化合物と方法を提供する。
【００３３】
具体的に言及できる疾患としては、ダウン症候群及びアルツハイマー病、ならびに特に肝性脳症が挙げられる。
【００３４】
肝性脳症疾患は、睡眠覚醒循環、認知能力、記憶能力、学習能力、運動協調性、及び／または意識、ならびに、低下した活動レベル、人格変化、認知機能障害、見当識障害、及び／または昏睡の１つ以上の機能障害を含む症状を示し、及び／または特徴としており、及びＡ型肝性脳症、Ｂ型肝性脳症、Ｃ型肝性脳症、ミニマル肝性脳症、及び顕性肝性脳症を含む。
【００３５】
「Ａ型肝性脳症」とは、一般的には、急性肝不全が関係しており、一般的には、脳浮腫が関係している肝性脳症のことを指す。
【００３６】
「Ｂ型肝性脳症」とは、一般的には、本質的肝臓疾患に関係なく、門脈体循環短絡に起因する肝性脳症（バイパス形成）のことを指す。
【００３７】
「Ｃ型肝性脳症」とは、一般的には、肝硬変の患者で発生する肝性脳症のことを指す。このタイプは、しばしば、「偶発性」、「持続性」及び「ミニマル」肝性脳症へと再分類される。
【００３８】
「ミニマル肝性脳症」とは、一般的には、臨床的には顕性認知機能障害には至っていないが、神経心理学の研究では実証することができる肝性脳症のことを指す。
【００３９】
「顕性肝性脳症」とは、一般的には、広範囲の精神及び運動疾患に及ぶ神経精神病症候群として表れる臨床的に明らかな肝性脳症のことを指す。顕性肝性脳症は、それまでは安定していた患者、または持続的に神経精神病的な異常性を示す患者において、数時間または数日にわたって、偶発的に出現する。
【００４０】
上記に加えて、大抵の肝臓移植手術では、他の点では健康である死亡した提供者から得た肝臓を使用するが、生存している提供者からも肝臓（健常者の肝臓の一部）を得ることができる。例えば、肝硬変を患った患者は、通常は、肝性脳症及び術前肝性脳症を経験しており、これは、術後の神経学的合併症の重大な予兆である。肝臓移植をまさに受けようとしている患者の肝性脳症の治療は、本発明の範囲に含まれる。
【００４１】
用語「高アンモニア血症」は、一般的には、血中アンモニアの状態を特徴とした代謝障害のことを指す。
【００４２】
用語「慢性肝不全の急性増悪」とは、一般的には、肝硬変の急性代償不全、少なくとも１つの臓器不全のことを指し、または短期間の内に高い死亡率を示すサブグループに属する。
【００４３】
用語「非代償性肝硬変」とは、一般的には、黄疸、腹水、浮腫、肝性脳症、消化管出血、門脈圧亢進症、細菌感染、またはこれらのあらゆる組み合わせなどの様々な臨床的証拠を有する進行した肝硬変を含むことを意味している。この用語は、臨床的証拠が認められない肝硬変ではあるが、漸近性の食道または胃の静脈瘤、及び倦怠感と活力の喪失、食欲の減退と体重減少、吐き気または腹痛などの初期症状を含むことを一般的には指している「代償性肝硬変」と対比される。
【００４４】
用語「門脈圧亢進症」とは、一般的には、経頸静脈性肝内門脈大循環短絡術（ＴＩＰＳ）の関連の有無にかかわらず、肝硬変へと続く肝静脈圧力勾配のことを指す。
【００４５】
本発明の化合物は、上記の病態すべての治療的処置及び／または予防的処置の双方に適応される。
【００４６】
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載したステロイド関連ＣＮＳ疾患の治療の方法が提供されており、この方法は、そのような治療を必要とする患者に対して、治療有効量の本発明の化合物を投与することを含む。
【００４７】
上記のような、ステロイドが関連した、またはステロイドが誘発した記憶能力及び学習能力疾患、認知機能障害、認知症及び／または気分疾患を、治療を必要とする患者に対して本発明の化合物を投与することによって、治療及び／または予防するための方法がさらに提供される。
【００４８】
本発明の化合物は、耐性発現及び／またはＧＡＢＡＡ受容体のダウンレギュレーションを予防することができる点で有利であるかもしれない。本発明の化合物は、ステロイドを一旦止めても、離脱効果を妨げることができる点で有利であるかもしれない。このようにして、本発明の化合物は、ＧＡＢＡＡ系の感度を維持して、及び例えば、月経周期の黄体期の間における片頭痛及び／またはてんかん発作などの症状を予防するために、感度の落ちた状態を招かないようにする点で有利であるかもしれない。
【００４９】
したがって、本発明の別の実施形態は、本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与することによる、ステロイド耐性発現の病態または症状、及び／またはステロイド離脱の病態または症状の治療または予防のための方法である。
【００５０】
名前を挙げることのできるかような症状及び／または病態の例として、鎮静状態、倦怠感、記憶障害、学習障害、運動機能障害、不器用、例えば、肝性脳症における症状、食欲増大及び大食症、アルコール及び薬物乱用の再発、緊張による抑うつ気分、月経前症候群における主要な症状である過敏症とうつ病、及び小発作性てんかんの悪化を含む。
【００５１】
３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドに対して長期（例えば、数日間）の時間枠で曝露した後の耐性発現に起因した病態及び症状として、例えば、ストレス感受性、集中力欠如障害、ストレスまたは月経周期連鎖集中力欠如障害、睡眠障害、倦怠感、衝動制御の喪失とうつ病、記憶能力、及び学習障害がある。３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドも、薬物依存症を強めてしまう。本発明によると、それを必要とする患者に対して本発明の化合物を投与することによって、これらの病態または症状を、予防、緩和、または治療することができる。
【００５２】
３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドに対する連続的ではあるがより短期の曝露は、曝露を終了した場合に、離脱効果をもたらす。この現象は、卵巣の黄体による３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドの産生が中断される月経時に生じる。この禁断現象は、胎盤による３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドの産生が中断される分娩後（産後）にも生じる。ストレス期間が終了し、かつ、ストレスに曝されている間、副腎による３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドの産生が中断されている場合にも、同じ現象が認められる。この離脱／禁断現象による影響を受ける病態の例は、部分てんかんを含み、その患者は、大脳皮質にてんかん病巣を有しており、その箇所は、月経期間中の離脱の際に悪化する。この現象は、「月経時てんかん」と呼ばれている。他の例は、月経関連片頭痛及びストレス関連片頭痛ならびに産後気分変動である。離脱現象は、早期に発達した耐性のサインである。
【００５３】
本発明の一実施形態は、非常に多くの女性を苦しめている問題に取り組むものであって、ヒトの患者における抗炎症ステロイド及び閉経後療法の副作用を治療及び／または予防するための方法である。本発明によれば、本発明の化合物を、それを必要とする患者に投与することによって、これらの病態または症状は、予防、緩和、または治療することができる。
【００５４】
本発明の別の実施形態は、ヒト患者における経口避妊薬の副作用の治療及び／または予防である。本発明によると、それを必要とする患者に対して本発明の化合物を投与することによって、これらの病態または症状を、予防、緩和、または治療することができる。このことに関連して、本発明の化合物は、患者の方ですでに摂取されているかもしれないが、経口避妊薬と共に投与することができる。経鼻及び経皮投与も、適切な投与の経路である。
【００５５】
換言すれば、本発明の化合物は、予想される３つのメカニズム、すなわち、
（ａ）直接的作用、
（ｂ）耐性誘導、及び／または
（ｃ）離脱効果、
の内の１つ以上のメカニズムによって引き起こされた、ストレスが関連した、及び／またはストレスが誘発した病態を治療する作用を奏し、それにより、ステロイドが、中枢神経系に対して作用する。
【００５６】
さらに、上記実施形態の範囲内において、本発明の化合物の投与量は、ストレスまたは月経の期間内の内因性ステロイドのレベルにまで調整することができる。
【００５７】
「患者」は、哺乳動物（及び特に、ヒトの）患者を含む。
【００５８】
用語「有効量」とは、処置を施した患者に関して治療効果を与える化合物の量のことを指す。この効果は、客観的なもの（すなわち、テストまたはマーカーで測定可能なもの）でも、あるいは、主観的なもの（すなわち、対象が、効果を認めたり、あるいは、効果を感じたりすること）でもよい。
【００５９】
本発明の化合物は、通常は、口腔、静脈内、皮下、頬、直腸、皮膚（例えば、経皮的に）、鼻腔、気管、気管支、舌下から、他の非経口経路によって、または吸入を介して、薬学的に許容される剤形で投与することができる。
【００６０】
本発明の化合物は、錠剤、経口投与のためのカプセルまたはエリキシル剤、直腸投与のための座薬、静脈内または筋肉内投与を含む非経口投与のための滅菌溶液または懸濁液などの形態で投与することができる。
【００６１】
本発明の化合物を含む組成物の製剤は、通常の薬理学的手順にしたがって、選択した経路に対して適切な化学形態で、従来から使用されており、かつ、当業者に周知の適切な補助剤、担体、希釈剤、及び賦形剤と共に、適合または調整することができる。つまり、そのような製剤は、標準的及び／または認められた薬務にしたがって調製することができる。
【００６２】
つまり、本発明のさらなる態様によると、本明細書において先に定義した通り、本発明の化合物を、薬学的に許容される補助剤、希釈剤、または担体と共に含む医薬製剤が提供される。
【００６３】
本発明の化合物の、例えば、有効性及び物理的特性（すなわち、活性成分）に応じて、挙げることができる医薬製剤には、少なくとも１重量％（または少なくとも１０重量％、少なくとも３０重量％、または少なくとも５０重量％）の活性成分が存在している医薬製剤が含まれる。つまりは、当該医薬組成物の他方の成分（すなわち、補助剤、希釈剤、及び担体の添加）に対する活性成分の比率は、少なくとも１：９９（または少なくとも１０：９０、少なくとも３０：７０、または少なくとも５０：５０）の重量比である。
【００６４】
さらに、本発明は、本明細書において先に定義した通り、医薬製剤の調製のためのプロセスを提供するものであって、当該プロセスは、本明細書において先に定義した通り、本発明の化合物と、薬学的に許容される補助剤、希釈剤、または担体とを会合せしめることを含む。
【００６５】
本発明の化合物は、
（ａ）ステロイド関連ＣＮＳ疾患の治療、
（ｂ）３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドに対して曝露した後の耐性発現に起因する病態または症状の治療、
（ｃ）３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドに対する曝露の離脱／禁断によって影響を受ける病態の治療、
（ｄ）抗炎症ステロイドの１つ以上の副作用の治療、
（ｅ）閉経後療法の１つ以上の副作用の治療、及び／または
（ｆ）経口避妊薬の１つ以上の副作用の治療、
の１つ以上において有用な他の治療薬、または経口避妊薬それ自体と組み合わせることができる。このような治療薬または経口避妊薬は、共に、以後は、他の、または別の「本明細書において先に定義した治療薬」と呼ぶこととなる。
【００６６】
例えば、本発明の化合物を、経口避妊薬と共に、製剤または治療計画に取り込んで、
（ｉ）経口避妊薬の副作用、及び／または
（ｉｉ）内因性ステロイドの周期的変動による望ましくない効果、
を緩和及び／または除去することができる。
【００６７】
本発明のさらなる態様は、本明細書において先に定義した治療上適切な投与量の他の治療薬を、治療上適切な投与量の本発明の化合物と組み合わせて含む、医薬組成物及びパーツのキットを提供する。
【００６８】
本発明のさらなる態様では、
（Ａ）本明細書において先に定義した本発明の化合物、及び
（Ｂ）本明細書において先に定義した少なくとも１つの他の治療薬、
を含む配合剤が提供され、成分（Ａ）及び（Ｂ）の各々は、薬学的に許容される補助剤、希釈剤または担体と共に製剤化される。
【００６９】
このような配合剤は、他方の治療薬と併せて本発明の化合物を投与することを可能にし、つまりは、個別の製剤として提供してもよく（それら製剤の少なくとも１つが本発明の化合物を含み、少なくとも１つが他方の治療薬を含む）、あるいは混合製剤（すなわち、本発明の化合物及び他方の治療薬を含む単一製剤）として提供してもよい（すなわち、製剤化してもよい）。
【００７０】
つまりは、
（１）本明細書において先に定義した本発明の化合物、本明細書において先に定義した少なくとも１つの他の治療薬、及び薬学的に許容される補助剤、希釈剤または担体を含む医薬製剤、及び
（２）（ａ）本明細書において先に定義した本発明の化合物を、薬学的に許容される補助剤、希釈剤、または担体と共に含む医薬製剤、及び
（ｂ）本明細書において先に定義した少なくとも１つの他の治療薬を、薬学的に許容される補助剤、希釈剤、または担体と共に含む医薬製剤、の成分を含むパーツのキットを含み、
成分（ａ）及び（ｂ）の各々が、他方と併せた投与に適している形態で提供されるパーツのキットが、さらに提供される。
【００７１】
本発明は、本明細書において先に定義した配合剤の調製のためのプロセスをさらに提供するものであって、そのプロセスは、本明細書において先に定義した少なくとも１つの他の治療薬と、少なくとも１つの薬学的に許容される補助剤、希釈剤、または担体とを会合せしめることを含む。
【００７２】
「会合せしめる」ことによって、我々は、２つの成分が、互いと併せた投与に適したものになることを意味している。本発明の化合物は、本明細書において先に定義した少なくとも１つの他の治療薬が関係している治療において、「追加療法」の一部として採用することができる。
【００７３】
このように、本明細書において先に定義した通り、パーツのキットの調製のためのプロセスに関連して、当該２つの要素を互いに「会合せしめる」ことによって、我々は、当該パーツのキットの当該２つの要素が、
（ｉ）個別の（すなわち、互いに独立した）製剤として提供されてもよいこと（これら個別の製剤は、後程、併用療法における互いと併せた使用のために一緒にされる）、または
（ｉｉ）併用療法における互いと併せた使用のために、「コンビネーションパック」の個別の成分として一緒に梱包及び提供されてもよいこと、を包含する。
【００７４】
本発明の化合物は、様々な投与量で投与することができる。例えば、非経口（例えば、静脈内）の投与量として適切な範囲は、約２０〜１００ｍｇ／体重（ｋｇ）などの約０．２〜２００ｍｇ／体重（ｋｇ）である。その投与量で、続けて与えることができ、あるいは、分割した投与量を、１日に１回、２回、３回または４回、あるいは、それ以上の回数で与えることもできる。
【００７５】
いずれにしても、担当医師または当業者であれば、投与の経路、治療する病態のタイプ及び重篤度、ならびに、治療を受ける特定の患者の人種、年齢、体重、性別、腎機能、肝機能、及び反応に応じて変化する、個々の患者に対して最も適切な実際の投与量を決定することができであろう。上記の投与量は平均的事例の例示でしかなく、当然のことながら、個々の事例では、それよりも高用量または低用量の場合に効果が得られることもあり、そのような事例も本発明の範囲内にある。
【００７６】
本発明の化合物は、ヒトＧＡＢＡＡ受容体に関する３−α−ヒドロキシ−プレグナン−ステロイドの作用を遮断することができる、という利点を有している。
【００７７】
用語「ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）」は、本発明の化合物によって、３−α−ヒドロキシ−５−α／β−ステロイドのＧＡＢＡ−Ｒ受容体に対する作用が妨げられる効果を定義する状況において用いられている。つまり、「ブロッキング」とは、通常は、薬理作用が依然として認められるものの、その程度は小さく、あるいは、より遅い速度であることを示唆する「調節」または「抑制」または同様の用語が意味しているものとは異なる用語である。このように、「拮抗薬」は、その効果を引き出すために、別の物質、例えば、作動薬を妨げる物質のことを意味している。本明細書にあっては、用語「拮抗薬」と用語「ブロッカー」は、置き換えて使用することができる。
【００７８】
先述した通り、また、本発明の化合物は、同時投与によって、ＧＡＢＡＡ受容体に関する３−α−ヒドロキシ−５α／β−プレグナン−ステロイドの作用を選択的にブロックし、そして、ＧＡＢＡ効果については非常に限定的な（最大限でも、部分的な拮抗薬の）効果しかないので有利である。
【００７９】
先述した利点に加えて、本発明の化合物は、上記の用途またはそれ以外の用途での使用に関係なく、従来技術において公知の化合物よりも、ずっと有効であり、ずっと毒性が小さく、ずっと長く作用し、ずっと強力であり、副作用もほとんど示さず、ずっと容易に吸収することができ、及び／またはずっと良好な薬物動態プロファイル（例えば、高い生体利用性、例えば、水性溶媒での改善された溶解性に起因する生体利用性、及び／または低い浄化率）を有し、及び／または他の有用な薬理学的、物理学的、または化学的特性をさらに有している点で有利である。
【００８０】
例えば、量（例えば、活性成分の投与量）または期間について、用語「約」を本明細書で使用する場合はいつでも、それらの変数はおおよそのものであり、そして、本明細書で特定した数値の±１０％、例えば、±５％、及び好ましくは±２％（例えば、±１％）で変化することができることを理解されたい。
【実施例】
【００８１】
本発明を、以下の例をもってして説明するが、それらによって、限定的に解釈すべきではない。
【００８２】
例１
３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムの合成
エチニルグリニャール試薬と３，２０／１７ジケトンステロイドとの反応が、ほとんどの場合、第３位に対して選択的であり、その他のケトン官能基のための保護／脱保護は必要でないことが突き止められた。α及びβ異性体の双方が形成され、それらは、クロマトグラフィー法によって分離され、そして、再結晶化することができる。
【００８３】
３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムを合成するための出発物質は、３−ヒドロキシル置換基と第２０位にケト基とを有する対応するステロイドである。それらは、ＩＢＸ試薬で酸化することによって、各々のジオン類へと変換することができる。その反応は、円滑に進行し、そして、変換を完了する。必要に応じて、他の適切なステロイドを、出発物質として使用することができる。それらの反応は、メタノール、エタノール、水、ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、または当業者が適切であると認識することができる他の溶媒、などの適切な溶媒において実施された。微量でも毒性を呈し、あるいは、検査過程で完全に除去することが困難な重金属類などの反応物の使用を避けるために、可能であれば、反応物は選択される。
【００８４】
空気または湿度に敏感な試薬または生成物が関係する反応は、乾燥溶媒の存在下にある窒素ガスまたはアルゴンガスのような不活性雰囲気下で行われた。ジエチルエーテルとテトラヒドロフランは、ベンゾフェノンの存在下で、ナトリウム（Ｎａ）で乾燥された。試薬と乾燥溶媒を移すために、不活性ガスを充填したシリンジが使用された。反応の至適時間と温度は、生成物の形成と出発物質の損失とを、ＴＬＣまたはＧＣ／ＭＳなどの適切なクロマトグラフィー技術を用いてモニタリングすることによって、決定された。
【００８５】
フラッシュシリカクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー技術を用いることによって、あるいは、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）をＨＰＬＣ機器で使用することによって、精製が行われた。代わりの精製方法が利用できること、また、規模相応の調製のために、クロマトグラフィーカラムを用いることによって、実験室のクロマトグラフィー技術を工業規模に応用できることは、当業者であれば認識することができる。１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、質量分析法、ＩＲ分光法、Ｘ線分光法、及び３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムの構造同定及び純度決定に関して適切であると当業者が認識することができる他のアッセイなどの適切な分析技術を用いることによって、生成物の同定は実施される。基質に応じて、同様の試薬、溶媒、条件、及びパラメーターを使用することができることは、当業者であれば認識することができるであろう。ＮＭＲデータは、Ｂｒｕｋｅｒ  ４００Ｍｈｚ分光計を用いて記録される。
３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オン
【００８６】
３，２０−５α−プレグナン、ジオン（１．５８０ｇ，５．０ｍｍｏｌ）は、室温（ｒｔ）で、窒素の下で、５０ｍｌ乾燥ＴＨＦに溶解された。臭化エチニルマグネシウム（１．１当量）が、室温で、撹拌下で、滴下して加えられ、次いで、当該溶液は、室温で、窒素フローの下で、一晩、撹拌しながら、放置された。
【００８７】
次いで、その帯黄色の溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ（ａｑ）で冷却し、及び水相をジクロロメタン（３×３０ｍｌ）で抽出した。回収した有機相は減圧下で蒸発され、得られた黄色の油を、ジクロロメタンに溶解し、塩水で洗浄し、及びＭｇＳＯ４で乾燥させた。その溶液は真空下で減量され、及び残渣はシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１：４ジエチルエーテル：ジクロロメタン）で精製された。一般的な収率は、７２％であった。最後に生ずる微量の副産物は、ジエチルエーテルからさらに再結晶化することで解消することができる。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００Ｍｈｚ，ＣＤＣｌ３−ｄ６）：δ２．５１（ｔ，１Ｈ）；２．４７（ｓ，３Ｈ）；２．１４（ｍ，１Ｈ）；２．１１（ｓ，３Ｈ）；０．８１（ｓ，１Ｈ）；０．６０（ｓ，３Ｈ）。
３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オン
【００８８】
この化合物は、上記の反応の副産物として得られたものであり、そして、シリカフラッシュカラムクロマトグラフィーによって分離された。一般的な収率は、１３％であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００Ｍｈｚ，ＣＤＣｌ３−ｄ６）：δ２．５２（ｔ，１Ｈ）；２．４３（ｓ，１Ｈ）；２．１１（ｓ，３Ｈ）；０．８０（ｓ，３Ｈ），０．６０（ｓ，３Ｈ）。
【００８９】
３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシム
３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オン（１０ｍｍｏｌ）は、２５０ｍｌ丸底フラスコ内のジクロロメタン５ｍｌとエタノール５０ｍｌに、室温で、空気雰囲気下で、溶解された。４当量の水酸化アンモニウム（ＮＨ２ＯＨ）クロロハイドレート及び４当量の酢酸ナトリウムを５ｍｌ  Ｈ２Ｏに溶解し、次いで、ステロイド溶液に添加した。２０ｍｌのエタノールを添加し、及び混合物を、一晩、還流させた。次いで、その混合物は冷却され、及び減圧下で、溶媒は除去された。次いで、白色の残渣は、５０ｍｌ  Ｈ２Ｏ及び５０ｍｌジクロロメタンで処理をされ、水相が、３×３０ｍｌジクロロメタンで抽出された。次いで、回収した有機相は、ＭｇＳＯ４で乾燥され、濾過され、及び減圧下で溶媒が除去された。最終残渣は、ジクロロメタン：ジエチルエーテルが４：１のシリカフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製され、一般的な収率は、９５〜１００％であった。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００Ｍｈｚ，ＣＤＣｌ３−ｄ６）：δ２．４７（ｓ，１Ｈ）；２．２２（ｔ，１Ｈ）；２．０５（ｍ，１Ｈ）；１．８８（ｓ，３Ｈ）；１．８６（ｍ，１Ｈ）；０．８１（ｓ，３Ｈ），０．６２（ｓ，３Ｈ）。
【００９０】
例２
ＧＡＢＡＡ受容体サブタイプα５及びα１に関する３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムの効果
機能性α１β２γ２Ｌ及びα５β３γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体を発現するヒトα１β２γ２ＧＡＢＡＡ及びα５β３γ２ＧＡＢＡＡ受容体で永続的に形質転換したＨＥＫ−２９３が使用された。機能性ヒトＧＡＢＡＡ受容体を永続的に発現するこの細胞株は、以下のステップで作出された。開始コドンの直前に導入されたコザック配列を含むＧＡＢＡＡ受容体サブユニットα１（３０８−１７２７  ＮＭ＿０００８０６）、β２（２１４−１６７９  ＮＭ＿０００８１３）、及びγ２Ｌ（２９０−１７８５  ＮＭ＿１９８９０４）は、ジェネティシン、ハイグロマイシンＢ、及びゼオシン耐性、それぞれ、を含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングされた。３つのＧＡＢＡＡ受容体サブユニットを安定して発現するＨＥＫ−２９３細胞株は、サブユニットを１つずつトランスフェクションして作出された。そのトランスフェクションの後に、適切な抗生物質を用いた選抜、サブユニット特異的抗体（β２及びγ２）を使用した細胞の分離、及び単一細胞コロニーの製造を行った。製造された細胞株は、３つのＧＡＢＡＡ受容体サブユニットについての免疫細胞化学を用いて分析され、その後、ＧＡＢＡ及びＧＡＭＳテトラヒドロデオキシコルチコステロン（ＴＨＤＯＣ）に関するパッチクランプ分析（下記を参照されたい）において、ＧＡＢＡＡ受容体に対して、通常及び良好な反応性を示す適切な細胞株の選択を行った。
３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムのＧＡＢＡＡ受容体効果を試験するための方法
【００９１】
ＧＡＢＡＡ受容体機能に関する３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムの効果を調べるために、ＨＥＫ−２９３細胞に関するＤｙｎａｆｌｏｗ（商標）システムによって、ＧＡＭＳテトラヒドロデオキシコルチコステロン（ＴＨＤＯＣ）の不在下及び存在下で、実験が行われた。３回の試験において、プロトコルは、シナプス間隙での生理学的条件に近似するように最適化が行われた。
【００９２】
細胞培養：ヒトα１β２γ２ＧＡＢＡＡ及びα５β３γ２ＧＡＢＡＡ受容体サブタイプで永続的にトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞が、セルバインド培養フラスコに、３×１０４／２５ｃｍ２の密度で播種された。播種して３日後に、トランスフェクトした細胞が、パッチクランプ実験のために使用された。これらの細胞をパッチクランプ実験のために使用した場合に、酸素（Ｏ２）気泡が発生したＥＣ溶液で、２回、洗浄が行われた（下記を参照されたい）。次いで、約５ｍｌのＥＣが追加され、そして、細胞は、インキュベーター内で、約１５分間、保たれた。１５分後に、細胞がフラスコの底面から剥がれはじめ、そして、パスツールピペットで、２〜３回、慎重に吸い上げることによって分離された。
【００９３】
Ｄｙｎａｆｌｏｗ（商標）システム：リゾルブチップを備えたＤｙｎａｆｌｏｗ（商標）システムが、すべてのパッチクランプ実験で使用された。リゾルブチップは、非粘着性の素材から作られている。チャンネル幅は１５０μｍで、高さは５０μｍである。ウェルの容積は、２８０μｌである。２６μｌ／分の流速での実行時間は、１８０分である。ポンプ設定は、以下の通りである。内径が９．６５ｍｍのオムニフィックス２ｍｌ注射器が使用された。チップの注射器ポンプ流速は、２６μｌ／分であった。
【００９４】
ステロイド及びＧＡＢＡ：ＧＡＢＡは、超音波によって、約４０分間、１０ｍＭの濃度になるまで、室温で、ＥＣ溶液に溶解された。すべてのステロイドは、６ｍＭの濃度になるまで、エタノールに溶解された。洗浄溶液（ＥＣ）とＧＡＢＡだけを含有する溶液とを含めたすべての最終溶液でのエタノール濃度は、０．１％であった。最終溶液とは、チップのウェルに入れられる溶液のことである。
【００９５】
電気生理学：パッチ電極が、フィラメントを備えていない、外径（Ｏ．Ｄ．）が１．５ｍｍで、内径（Ｉ．Ｄ．）が０．８６ｍｍのホウケイ酸塩ガラス毛管から引き出された。一般的な電極では、細胞内液で満たした場合に、２〜５ＭΩの抵抗を有していた。この細胞内液は、（ｍＭで）１４０  グルコン酸セシウム、３．０  ＮａＣｌ、１．２  ＭｇＣｌ２、１．０  ＥＧＴＡ、１０  ＨＥＰＥＳから構成されていた。ｐＨは、ＣｓＯＨで７．２に調整された。記録をしている間に使用した細胞外（ＥＣ）液は、（ｍＭで）１３７  ＮａＣｌ、５．０  ＫＣｌ、１．０  ＣａＣｌ２、１．２  ＭｇＣｌ２、１０  ＨＥＰＥＳ、１０  グルコースを含有していた。ｐＨは、ＮａＯＨで７．４に調整された。液間電位差を補償した後に、−１７ｍＶの安定保持電位が、すべての実験において使用された。生理学的条件下で、ＨＥＫ−２９３は、−４０ｍＶの静止電位と、細胞内に低濃度の塩化物イオンとを有している。−１７ｍＶの保持電位と低塩化物イオン濃度の細胞内液とを使用することによって、受容体が活性化された場合に、塩化物イオンが細胞内に流れ込む。すべての実験は、室温（２１〜２３℃）で行われた。すべての実験について、標準的なプロトコルが使用された。
【００９６】
プロトコル
ＧＡＢＡ適用：Ｄｙｎａｆｌｏｗ機器を使用することによって、ほとんどの生理学的条件下でのトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３を研究することが可能である。このＤｙｎａｆｌｏｗシステムは、可能な限り短くて４０ミリ秒〜分単位の時間で、溶液の適用を許容する。生理学的に、シナプス間隙において、ＧＡＢＡは、ｍＭの範囲で、約２ミリ秒間、放出されるが、このことは、α１受容体にとっては効果的である。特別なシナプス部位では、ＧＡＢＡレベルは低くなるが、そこに留まる時間は長くなり、このことは、α５受容体にとっては効果的である。α１β２γ２Ｌを用いた実験において、我々は、ＧＡＢＡ±ステロイドを、４０ミリ秒間、適用した。α５β３γ２Ｌを用いた実験では、ＧＡＢＡ±ステロイドは、６秒間、適用された。ほとんどすべての細胞において、第１のＧＡＢＡ適用では、第２のＧＡＢＡ適用よりも小さな反応しか得られないことが確認された。反応について、第２のＧＡＢＡ適用と第３のＧＡＢＡ適用との間には差異は認められなかった。それ故に、第１のＧＡＢＡ適用は、常に、２回の反復を行い、そして、第２の反応が分析に使用される。
【００９７】
洗浄：ＧＡＢＡは、極めて容易に水に溶解することができ、また、受容体から容易に洗い流すことができる。ＧＡＢＡだけを適用した後の１分間が、洗浄時間として設定された。一方で、ステロイドは、水への溶解が困難であり、また、受容体から洗い流すことも難しい。我々の実験では、我々は、ＧＡＢＡ作動薬としてＴＨＤＯＣを使用した。２分間の洗浄時間で、累積効果も感度抑圧効果も示されないままに、２００ｎＭ  ＴＨＤＯＣは完全に洗い流された。
【００９８】
インキュベーション：ステロイドの効果を観察し、及び安定な結果を実現するためには、ＧＡＢＡの適用前に、ステロイドを受容体とインキュベートする必要があることを我々は見出した。この知見は、ＴＨＤＯＣのための結合部位が、受容体の細胞内にある、との示唆によって支持されている（Ｈｏｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）。安定した結果を獲得するための至適時間を見出して、かつ、洗浄時間を最短にするために、異なったインキュベーション時間が研究された。２分間の洗浄時間については、２０秒間のインキュベーション時間が至適時間であると認められた。
【００９９】
最適化の結論：最適化プロトコルは、以下の通りである。２０秒間のステロイドのインキュベーション。４０ミリ秒または６秒間のＧＡＢＡ±ステロイド適用、２分間の洗浄。最初のＧＡＢＡ適用は、２回、反復されるものとし、第１の適用と第２の適用との間で、１分間の洗浄を行う。
ＧＡＢＡＡ受容体α１β２γ２Ｌ及びα５β３γ２に関する３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムの試験結果
【０１００】
２つの異なるＧＡＢＡＡ受容体サブタイプα１β２γ２Ｌ及びα５β３γ２Ｌにおいての３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムのパッチクランプ試験の結果は、予期せぬ結果であり、かつ、驚くべき結果であった。表２に示したように、α１β２γ２Ｌ受容体において、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは、これらの実験で用いたＧＡＭＳであるＴＨＤＯＣの増強効果に対して拮抗作用を示さなかった。３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシム単体は、塩素流入に関して、増強効果または拮抗効果を有していなかった。３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは、α１β２γ２Ｌ  ＧＡＢＡＡ受容体のＧＡＢＡの開放に関して、僅かにアゴニスト作用を示した。このアゴニスト作用は、非常に小さいので、賦形剤の範囲内では、関連性が認められない。
【０１０１】
驚くべきことに、α５β３γ２Ｌ受容体サブタイプに関して、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは、ＧＡＭＳとＧＡＢＡとを用いたすべての試験区における拮抗薬である（表２）。つまり、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは、受容体サブタイプに対して特異的に依存している。それ故に、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは、その作用において選択性を示しており、及びそれ故に、医薬として適切である。３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは特異的であり、及びα１β２γ２Ｌ受容体に対して活性を示さないので、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは、より一般的なα１受容体であるが故に、副作用は小さい。拮抗薬としての阻害の効果は、作動薬としての同様の好ましい変化よりも大きな効果を奏する。
【０１０２】
表２．α１及びα５サブユニットを発現するＧＡＢＡＡ受容体を介した塩素イオン流入を媒介した電流応答に関する研究。Ｄｙｎａｆｌｏｗ（商標）適用システムを組み合わせたパッチクランプ技術は、物質を迅速に適用及び除去するものであって、この研究において使用された。「化合物」とは、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムである。「ＧＡＭＳ」とは、「ＧＡＢＡＡ受容体調節ステロイド」のことを指しており、この例では、テトラヒドロデオキシコルチコステロン（ＴＨＤＯＣ）である。
【０１０３】
【表１】
0006712599.tif 000003
【０１０４】
α１β２γ２−ＧＡＢＡＡ受容体
１μＭ  ３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは、α１β２γ２Ｌ−ＧＡＢＡＡ受容体に関する、ＧＡＢＡが媒介した電流応答を、約１０％増大した（表２）。１μＭ  ３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは、ＧＡＢＡ不在下では、ＧＡＢＡＡ受容体を直接に活性化しなかった。この研究の結果は、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムが、α１β２γ２−ＧＡＢＡＡ受容体にて、ＧＡＢＡが誘発した電流を真逆に調節しないことを示している。さらに、α１−サブユニットタイプで認められたＧＡＢＡが誘発した電流の１０％の増大は、些細な効果であると考えなくてはならない。つまりは、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは、α１β２γ２Ｌ−ＧＡＢＡＡ受容体でＧＡＢＡが誘発した電流に関して、大きな効果は持ち合わせていないのである。
【０１０５】
α５β３γ２−ＧＡＢＡＡ受容体
明確な濃度依存的拮抗効果が、２００ｎＭ  ＧＡＭＳ（ＴＨＤＯＣ）及び０．３μＭ  ＧＡＢＡ誘発電流において、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムについて検出された（表３）。また、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムは、２００ｎＭ  ＴＨＤＯＣ誘発電流に関しても拮抗効果を有しており、すなわち、ＧＡＭＳによってＧＡＢＡＡ受容体を直接的に活性化する。この拮抗作用は、２００ｎＭ  ＴＨＤＯＣ及び０．３μＭ  ＧＡＢＡ誘発電流のいずれかと同じエネルギー規模を有していた。
【０１０６】
表３．２００ｎＭ  ＴＨＤＯＣ＋０．３μＭ  ＧＡＢＡの存在下での０．１〜３μＭ  ３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシム  （「化合物」）。２００ｎＭ  ＴＨＤＯＣ＋０．３μＭ  ＧＡＢＡを制御するための相対的効果は、０に設定した。
【０１０７】
【表２】
0006712599.tif 000004
【０１０８】
例３
ＧＡＢＡＡ受容体サブタイプα５に関する３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムとそのエピマーとの比較効果
上記の例２に記載の手順にしたがって、ＧＡＢＡＡ受容体サブタイプα５に関して、３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムと、そのエピマーである３β−エチニル，３α−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシムの試験を行った。
【０１０９】
例２と比較し、ここで利用した手順における唯一の方法論的相違点は、ステロイドが、エタノールに溶解されて、すべての溶液における０．１％の最終エタノール濃度で、２ｍＭの濃度のストック溶液としたことにある。これらの結果は、以下の表４にまとめられている。
【０１１０】
表４．試験をしたＵＣステロイドの３α−エチニル，３β−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシム（「化合物」）及び３β−エチニル，３α−ヒドロキシ，５α−プレグナン−２０−オキシム（「比較物」）の効果であって、１μＭの濃度で、ＧＡＢＡ−ステロイドＴＨＤＯＣに対して試験を行い、α５β３γ２ＬＧＡＢＡＡ受容体を介した塩素流入の変化として測定をした。
【０１１１】
【表３】
0006712599.tif 000005
【０１１２】
これらの結果は、本発明の化合物が、ＧＡＢＡ受容体サブユニットα５の拮抗薬として作用しているのに対して、当該エピマーは、作動薬として作用していることを示している。