(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
包埋された脈管構造を有する組織構成物をプリントする方法であって、
（ｉ）それぞれ複数の生細胞を含む１つまたは複数の細胞含有フィラメントを、基材上に１つまたは複数の組織パターンを形成するように堆積させるステップであって、組織パターンのそれぞれが１つまたは複数の予め定められた細胞型を含むステップ；
（ｉｉ）１つまたは複数の犠牲フィラメントを、基材上に、１つまたは複数の組織パターンに相互貫入する脈管チャネルパターンを形成するように堆積させるステップであって、犠牲フィラメントのそれぞれがファジティブインクを含み、ファジティブインクが追加的生細胞を含むステップ；
これに続く、
（ｉｉｉ）細胞外マトリクス組成物で、１つまたは複数の組織パターンおよび脈管チャネルパターンを少なくとも部分的に囲むステップと、
（ｉｖ）ファジティブインクを除去して、細胞外マトリクス組成物中の１つまたは複数の組織パターンに相互貫入する、灌流可能な相互接続された脈管チャネルのネットワークを作成するステップであって、追加的生細胞の少なくとも一部がファジティブインクの除去後に相互接続された脈管チャネルのネットワークに残るステップと、を含む、
方法。
【請求項２】
１つまたは複数の細胞含有フィラメントのそれぞれが、細胞外マトリクス材料をさらに含み、
細胞外マトリクス材料が、ゼラチン、フィブリンおよびゼラチンメタクリレートの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つまたは複数の細胞含有フィラメントの少なくとも１つが：
（ｉ）薬物、小分子、毒素、タンパク質およびホルモンからなる群から選択される、１つまたは複数の機能性化学的物質を更に含むか；又は
（ｉｉ）細胞１個／ｍｌから細胞約１０9個／ｍｌの細胞濃度を有し、細胞濃度が１つまたは複数の細胞含有フィラメントのそれぞれを通じて均一である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
１つまたは複数の細胞含有フィラメント、および１つまたは複数の犠牲フィラメントが、±１００μｍの位置精度で堆積されるか、または
位置精度が±１０μｍである、
請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
１つまたは複数の細胞含有フィラメントのそれぞれ、および、１つまたは複数の犠牲フィラメントのそれぞれが、基材上に堆積される前に室温でノズルから押し出され、Ｎ個のノズルが押し出しのために使用され、２≦Ｎ≦１０２４である、
請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ファジティブインクを除去するステップが、１つまたは複数の犠牲フィラメントを冷却するステップを含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
追加的生細胞が、内皮細胞、平滑筋細胞、又は結合組織細胞を含む、
請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
以下のステップの少なくとも１つを更に含み、
（ｉ）ファジティブインクを除去するステップの後に、内皮細胞の懸濁物を相互接続された脈管チャネルのネットワークに注入するステップ；
（ｉｉ）細胞外マトリクス組成物で１つまたは複数の組織パターンおよび脈管チャネルパターンを少なくとも部分的に囲む前に、基材上に、１つまたは複数の構造フィラメントを層ごとに堆積させて型を形成するステップであって、型が、ファジティブインクの除去後にその灌流のために脈管チャネルのネットワークと流体連通する流路を含むステップ；  （ｉｉｉ）第２の脈管チャネルパターンを形成するように、１つまたは複数の追加的犠牲フィラメントを基材上に堆積させるステップであって、追加的犠牲フィラメントのそれぞれが、第２のファジティブインクを含むステップ；
（ｉｖ）細胞外マトリクス組成物で、第２の脈管チャネルパターンを少なくとも部分的に囲むステップ；
（ｖ）細胞外マトリクス組成物中に第２の相互接続された脈管チャネルネットワークを作るように第２のファジティブインクを除去するステップであって、第２のファジティブインクが、追加的生細胞を有し、第２のファジティブインクの除去後に追加的生細胞の少なくとも一部が第２の相互接続された脈管チャネルネットワーク中に残るステップ、又は、
（ｖｉ）第２のファジティブインクを除去するステップの後に、追加的生細胞の懸濁物を、第２の相互接続されたチャネルネットワークに注入するステップであって、追加的生細胞が、上皮細胞、平滑筋細胞、又は結合組織細胞を含むステップ；
１つまたは複数の組織パターンおよび脈管チャネルパターンを少なくとも部分的に細胞外マトリクス組成物で囲むステップが、１つまたは複数の細胞含有フィラメントおよび１つまたは複数の犠牲フィラメントの堆積の間に生じ、それにより１つまたは複数の組織チャネルパターンおよび脈管チャネルパターンが細胞外マトリクス組成物中に、同時に形成かつ包埋され、
細胞外マトリクス組成物がミクロゲルおよび細胞外マトリクス材料を含み；かつ、
ミクロゲルがポリアクリル酸を含み、細胞外マトリクス材料がゼラチンメタクリレートを含む、
請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）１つまたは複数の組織パターンであって、それぞれが複数の生細胞を含む１つまたは複数の細胞含有フィラメントを基材上に堆積させることにより作成されたものであり、各組織パターンが、１つまたは複数の予め定められた細胞型を含む、１つまたは複数の組織パターン；
（ｉｉ）１つまたは複数の組織パターンに相互貫入する、相互接続された脈管チャネルのネットワークであって、最大のチャネルが灌流のための単一の入口及び出口を提供し、一方で、最小のチャネルが隣接導管間の特徴的な拡散距離を低減する、ネットワーク；および
（ｉｉｉ）１つまたは複数の組織パターンおよび脈管チャネルの相互接続されたネットワークを少なくとも部分的に囲んでいる細胞外マトリクス組成物、
を含む、包埋された脈管構造を有する３次元的にプリントされた組織構成物。
【請求項１０】
生細胞が：生殖細胞、体細胞および幹細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である、請求項９に記載の３次元的にプリントされた組織構成物。
【請求項１１】
細胞外マトリクス組成物が
（ｉ）合成または天然由来生体材料；
（ｉｉ）ハイドロゲル；
（ｉｉｉ）ゼラチン、フィブリンおよびゼラチンメタクリレートの１つまたは複数；又は
（ｉｖ）ミクロゲル
を含む、請求項９から１０のいずれか１項に記載の３次元的にプリントされた組織構成物。
【請求項１２】
細胞外マトリクス組成物が、相互接続された脈管チャネルのネットワークを完全に囲んでいる、請求項９から１１のいずれか１項に記載の３次元的にプリントされた組織構成物。
【請求項１３】
１つまたは複数の組織パターンのそれぞれが、生細胞を含む１つまたは複数の細胞含有フィラメントの配置によって規定され、
１つまたは複数の細胞含有フィラメントが、さらに、
（ｉ）細胞外マトリクス材料であって、ゼラチン、フィブリン、ミクロゲル、およびゼラチンメタクリレートの１つまたは複数を含む、細胞外マトリクス材料、
を含み、
（ｉｉ）薬物、小分子、毒素、タンパク質およびホルモンからなる群から選択される１つまたは複数の機能性化学的物質を含んでいてもよい、
請求項９から１２のいずれか１項に記載の３次元的にプリントされた組織構成物。
【請求項１４】
１つまたは複数の脈管チャネルがその上に内皮層を含み、内皮層が少なくとも約７０％、又は１００％の培養密度を有し、
１つまたは複数の脈管チャネルが、内皮層上に間質細胞層または平滑筋細胞層をさらに含んでいてもよい、請求項９から１３のいずれか１項に記載の３次元的にプリントされた組織構成物。
【請求項１５】
細胞外マトリクス組成物中に１つまたは複数の機能性チャネルをさらに含み、
１つまたは複数の機能性チャネルが、その上の上皮層、又は、上皮層上の間質細胞層を含む、
請求項９から１４のいずれか１項に記載の３次元的にプリントされた組織構成物。
【請求項１６】
細胞外マトリクス組成物を少なくとも部分的に囲む界面構造をさらに含み、相互接続された脈管チャネルのネットワークと流体連通する流路を含む、請求項９から１５のいずれか１項に記載の３次元的にプリントされた組織構成物。
【請求項１７】
（ｉ）１つまたは複数の犠牲フィラメントを基材上に機能性チャネルパターンを形成するように堆積させるステップであって、犠牲フィラメントのそれぞれがファジティブインクおよび複数の上皮細胞を含むステップ；
（ｉｉ）細胞外マトリクス組成物で機能性チャネルパターンを少なくとも部分的に囲むステップ、
（ｉｉｉ）細胞外マトリクス組成物中に灌流可能な相互接続された機能性脈管チャネルのネットワークを作るためにファジティブインクを除去し、ファジティブインクの除去後に機能性脈管チャネルのネットワーク中に上皮細胞の少なくとも一部が残り、それにより上皮組織構成物を形成するステップ
を含む、上皮組織構成物を３次元的にプリントする方法。
【請求項１８】
細胞外マトリクス組成物で機能性チャネルパターンを少なくとも部分的に囲むステップが１つまたは複数の犠牲フィラメントの堆積の間に生じ、それにより１つまたは複数の機能性チャネルパターンが細胞外マトリクス組成物中に形成され、同時に包埋される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｉ）それぞれが複数の生細胞を含む１つまたは複数の細胞含有フィラメントを、基材上に、１つまたは複数の組織パターンを形成するように堆積させるステップであって、組織パターンのそれぞれが１つまたは複数の予め定められた細胞型を含むステップ；又は
（ｉｉ）ファジティブインクを除去するステップの後に、上皮細胞および／または間質細胞の懸濁物を機能性チャネルのネットワークに注入するステップであって、生細胞および１つまたは複数の予め定められた細胞型が上皮細胞を含むステップ、
を更に含む、
請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
上皮組織構成物が、ネフロン、腸、乳管、尿道又はリンパである、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
（ｉ）その上に上皮層を含む１つまたは複数の機能性チャネル；および
（ｉｉ）１つまたは複数の機能性チャネルを少なくとも部分的に囲んでいる細胞外マトリクス組成物
を含む、３次元的にプリントされた上皮組織構成物。
【請求項２２】
（ｉ）１つまたは複数の機能性チャネルが上皮層上に間質細胞層をさらに含む；又は、  （ｉｉ）生細胞および１つまたは複数の予め定められた細胞型が上皮細胞を含む、
請求項２１に記載の３次元的にプリントされた上皮組織構成物。
【請求項２３】
（ｉ）１つまたは複数の組織パターンであって、各組織パターンが１つまたは複数の予め定められた細胞型の複数の生細胞を含み、細胞外マトリクス組成物が１つまたは複数の組織パターンを少なくとも部分的に囲んでいる、１つまたは複数の組織パターン；又は、  （ｉｉ）細胞外マトリクス組成物中の脈管チャネルのネットワークであって、最大のチャネルが灌流のための単一の入口及び出口を提供し、一方で、最小のチャネルが隣接導管間の特徴的な拡散距離を低減する、ネットワーク
をさらに含む、請求項２１から２２のいずれか１項に記載の３次元的にプリントされた上皮組織構成物。
【請求項２４】
ネフロン、腸、乳管、尿道、膵管およびリンパからなる群から選択される、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の３次元的にプリントされた上皮組織構成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１３年１１月５日に出願された米国仮特許出願第６１／９００，０２９号に米国特許法１１９条による優先権を主張する。
次の特許および特許出願公開も参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４４７９４号、表題“Ｍｕｌｔｉｎｏｚｚｌｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｗｒｉｔｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、２０１２年６月２９日出願；米国特許出願公開第２０１３／００８４４４９号、表題“Ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃ  Ｉｎｋ  ｆｏｒ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｗｒｉｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ”、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／２９４２９として２０１１年３月２２日に出願；および米国特許第８，１０１，１３９号、表題“Ｍｉｃｒｏｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ”、２００８年６月５日出願。
連邦支援の研究または開発
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって認められた契約番号ＤＭＲ  ０８２０４８４の下で政府の支援で行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本開示は、一般に組織工学に、より具体的には包埋された脈管構造を含む組織構成物を製作することに関する。
【背景技術】
【０００２】
必要に応じて三次元（３Ｄ）脈管化（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ）組織を作る能力は、組織工学、薬物スクリーニング、毒物学、３Ｄ組織培養および臓器修復における科学的および技術的進歩を可能とした。天然組織および最終的には臓器を模倣する３Ｄ操作された組織構成物を産生するためには、いくつかの鍵となる構成成分、細胞、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）および脈管構造が複合体配置に構築される必要がある場合がある。これらの構成成分のそれぞれは、極めて重要な役割を演じる：細胞はすべての生体システムの基本単位であり、ＥＣＭは構造的支持を提供し、脈管ネットワークは、効率的な栄養素および廃棄物輸送、温度制御、因子の送達およびロングレンジのシグナル伝達経路を提供する。各細胞の数百μｍ内に灌流可能な脈管構造が無ければ、三次元組織はすぐに壊死性領域を生じる可能性がある。組織構成物中に脈管ネットワークを包埋できないことから、数十年間にわたり３Ｄ組織工学での進歩が妨げられてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
プリントされた組織構成物は、１つまたは複数の組織パターンを含み、各組織パターンは１つまたは複数の予め定められた細胞型の複数の生細胞を含む。脈管チャネルのネットワークは、１つまたは複数の組織パターンを貫通する。細胞外マトリクス組成物は、１つまたは複数の組織パターンおよび脈管チャネルのネットワークを少なくとも部分的に囲む。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
包埋された脈管構造を有する組織構成物をプリントする方法は、それぞれが複数の生細胞を含む１つまたは複数の細胞含有線維（ｃｅｌｌ−ｌａｄｅｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）を基質上に１つまたは複数の組織パターンを形成するように沈着させるステップを含む。１つまたは複数の組織パターンのそれぞれは、１つまたは複数の予め定められた細胞型を含む。それぞれファジティブインク（ｆｕｇｉｔｉｖｅ  ｉｎｋ）を含む１つまたは複数の犠牲線維（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）は、基質上に１つまたは複数の組織パターンを貫通する脈管パターンを形成するように沈着される。脈管パターンおよび１つまたは複数の組織パターンは、細胞外マトリクス組成物で少なくとも部分的に囲まれる。次いでファジティブインクは、細胞外マトリクス組成物中に脈管チャネルを作るように除去され、それにより組織構成物中に貫通している脈管ネットワークを形成する。
【０００５】
上皮組織構成物をプリントする方法は、１つまたは複数の犠牲線維を基質上に機能性チャネルパターンを形成するように沈着させることを必要とする。犠牲線維のそれぞれはファジティブインクおよび複数の上皮細胞を含む。機能性チャネルパターンは、細胞外マトリクス組成物で少なくとも部分的に囲まれている。次いでファジティブインクは、細胞外マトリクス組成物中に１つまたは複数の機能性チャネルを作るように除去される。上皮細胞の少なくとも一部は、ファジティブインクの除去後に１つまたは複数の機能性チャネルに残り、それにより上皮組織構成物を形成する。
【０００６】
プリントされた上皮組織構成物は、上皮層を含む１つまたは複数の機能性チャネルを含む。細胞外マトリクス組成物は、１つまたは複数の機能性チャネルを少なくとも部分的に囲む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】脈管構造、細胞外マトリクスおよび細胞が組合せでプリントされ得るバイオプリンティング概念の例示を示す図である。
【図１Ｂ】三次元に正確に位置付けられた脈管構造および複数の細胞型を含む、３Ｄプリントされた不均一組織構成物の模式図である。
【図２Ａ】２つの組織パターンおよび貫通している脈管ネットワークを含む２Ｄ組織構成物を示す断面模式図である。
【図２Ｂ】組織パターンおよび貫通している脈管ネットワークを含む３Ｄ組織構成物の例を示す図である。
【図２Ｃ】２つの組織パターンおよび貫通している脈管ネットワークを含む３Ｄ組織構成物の例を示す図である。
【図３Ａ−３Ｂ】２つの組織パターンおよび貫通している脈管ネットワークを含む３Ｄ組織構成物の例を示す図である。
【図４】各ｚ軸が独立に制御されるカスタム３Ｄプリンターに取り付けられた４個のプリントヘッド（ノズル）を示す図である。
【図５Ａ−５Ｃ】図５Ａは４個のプリントヘッド（ノズル）を示す図であり、図５Ｂは複雑なインクパターンが異なる組成物を有する４層微細構造を形成するように４個のノズルから逐次的に沈着される４層微細構造を示す図である。図５Ｃは、各挿入図が各層の外形を例示する沈着工程の各層の逐次的製作画像を示す図である
【図６Ａ−６Ｆ】図６ＡはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７のゾルゲル転移の模式図である。図６Ｂは、４０質量％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７インクのせん断係数（Ｇ’およびＧ’’）の温度依存性を示すグラフである。図６Ｃは、ＧｅｌＭＡに特徴的であるヘリックスからコイルへの転移の模式図である。図６Ｄは、ＧｅｌＭＡせん断係数の熱依存性を示すグラフである。図６Ｅは、細胞を含有するＧｅｌＭＡを示す図である。図６Ｆは、１０Ｔ１／２線維芽細胞を含むＧｅｌＭＡ含有について温度の関数としてのせん断係数を示すグラフである。
【図７Ａ−７Ｋ】図７Ａ及び７Ｂは、ＧｅｌＭＡ中に形成された、直径範囲が１１５μｍから５００μｍである１Ｄチャネルを示す図である。図７Ｃは、可視化のために可溶性蛍光色素で灌流されたチャネルを示す図である。図７Ｄ〜７Ｅは、単一の３０μｍガラスキャピラリーを使用してプリントされた曲線線維を有する２Ｄ階層分枝ネットワークを示す図である。図７Ｆは、可視化のために赤色蛍光色素で灌流された構造を示す図である。図７Ｇ〜７Ｉは、ファジティブインクの排除後に灌流できる３Ｄ脈管パターンを作るために犠牲線維からプリントされた高度に周期性の３Ｄ格子を示す図である。図７Ｊは、ＨＵＶＥＣ懸濁物で灌流した２Ｄ脈管ネットワーク内の代表的マイクロチャネルの光学的画像である。図７Ｋは、マイクロチャネル壁を覆う生きているＨＵＶＥＣ細胞を有する図７Ｊに示されるマイクロチャネルの共焦点画像である。
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａは、犠牲線維を沈着させることおよびファジティブインクを除去することによって作られた種々のチャネル直径の代表的な断面を示す図である。図８Ｂは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を含む種々のプリントされた犠牲線維の膨潤比（Ｄfinal／Ｄinitial）を示すプロットを示すグラフである。各データ点は、６個の試料の平均であり、それぞれは一定の速度、圧力およびノズル高（ｚ軸）で沈着された。直径は、プリント直後および排除後に再度トップダウン（ｔｏｐ−ｄｏｗｎ）光学顕微鏡を介して測定される。
【図９Ａ−９Ｄ】図９Ａ〜９Ｂは、内皮化脈管チャネルが、示すとおり、フィブリンゲル中に作られ得ることを示す図である。図９Ｃおよび９Ｄは、製作された二分枝化脈管ネットワークでの動物血浸潤前後の写真である。
【図１０Ａ−１０Ｇ】図１０Ａは、４個の別々のインクでプリントされた最終的な３Ｄプリントされた不均一組織構成物構造のトップダウン図である。図１０Ｂは、図１０Ａに示す組織構成物を作るために使用された複合ツールパス（ｔｏｏｌ−ｐａｔｈ）の角度を付けた図であり、緑色線維はＧＦＰ  ＨＮＤＦ含有ＧｅｌＭＡを含み、青色線維は１０Ｔ１／２線維芽細胞含有ＧｅｌＭＡを含み、赤色線維はＲＦＰ  ＨＵＶＥＣで内皮化され得るＰｌｕｒｏｎｉｃインクを含む。灰色の影を付けた領域は、３Ｄプリントされた構成物を封入する純粋なＧｅｌＭＡマトリクスに対応する。図１０Ｃは、プリント直後の図１０Ａの構造の緑色蛍光チャネルを重ねた明視野顕微鏡画像である。図１０Ｄは、プリントされた構造の広がり（ｓｐａｎｎｉｎｇ）および面外の性質を例示する写真である。図１０Ｅは、ファジティブインク排除工程の実証を示す図である。図１０Ｆは、図１０Ａの構造からの３種の蛍光チャネル：１０Ｔ１／２線維芽細胞（青）、ＨＮＤＦ（緑）、ＨＵＶＥＣ（赤）の合成画像である。図１０Ｇは、プリントされていない対照と比較した、プリントされた１０Ｔ１／２線維芽細胞の細胞生存率アッセイ結果を示すグラフである。
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａは、複数の細胞含有線維および、ファジティブインクを含む犠牲線維を含有する３層構造の模式図である。図１１Ｂは、内皮化前に排除された微細構造の写真である。図１１Ｃは、培養２日後のＧＦＰ  ＨＮＤＦ（緑）およびＲＦＰ  ＨＵＶＥＣ（赤）の落射蛍光画像である。
【図１２Ａ−１２Ｆ】図１２Ａ〜１２Ｃは、フィブリンゼラチンを含むＧＦ含有細胞外マトリクス材料の直接プリントによる増殖因子（ＧＦ）勾配の形状を例示する模式図および画像である。図１２Ｄは、１つのチャネル中だけに蛍光標識ＢＳＡを含む平行プリントされた脈管チャネルの灌流のための例示的型を示す図である。図１２Ｅおよび１２Ｆは、２４時間で図１２Ｄの２つのチャネルの間にほとんど直線勾配が生成されることを示す図である。
【図１３Ａ−１３Ｊ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ポリマーネットワークを貫通するフィブリンゼラチンの合成を例示する図である。最初にゲル前駆体をトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）と一緒に混合する。次いで、酵素トロンビンを介するフィブリノーゲンの重合によって、フィブリンネットワークが形成される。次に第２相がフィブリンゲルの周囲に形成され、２つの相はＴＧを介して一緒にゆっくり架橋される。図１３Ｅ〜１３Ｆは、フィブリンゼラチンマトリクス材料の機械的特性を示す図である。図１３Ｇ〜１３Ｊは、線維芽細胞（結合組織）、平滑筋細胞、内皮細胞および腎近位尿細管（上皮）細胞、それぞれに対するフィブリンゼラチンマトリクス接着性（ａｄｈｅｓｉｖｉｔｙ）の多様性を示す図である。
【図１４】ポリマーネットワークを貫通するフィブリンゼラチンの光学的特性へのＴＧインキュベーション時間の影響を例示する図である。透明度は、ローダミンタグ化フィブリノーゲンおよび共焦点顕微鏡を使用して可視化されるフィブリンゲルの最終的なポア構造（ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ）によって決定される。
【図１５Ａ】組織構成物の受動的ロッキング（ｒｏｃｋｉｎｇ）灌流のための例示的型を示す図である。
【図１５Ｂ−１５Ｇ】図１５Ｂ〜１５Ｄは、組織構成物の受動的ロッキング（ｒｏｃｋｉｎｇ）灌流のための例示的型を示す図である。図１５Ｅ〜１５Ｇは、組織構成物の能動的なポンプに基づく灌流のための例示的型を示す図である。
【図１６Ａ−１６Ｇ】図１６Ａ〜１６Ｃは、ファジティブインクから形成された犠牲線維内の内皮細胞の沈着、細胞外マトリクス組成物での犠牲線維の封入およびチャネル壁を覆っている内皮細胞を有するチャネルを形成するためのファジティブインクの排除を模式的に示す図である。図１６Ｄは、ＨＵＶＥＣの分散物を含むプリントされたままのファジティブインク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７）を示す図である。図１６Ｅは、流し込み（ｃａｓｔｉｎｇ）および液化後のファジティブインクを示す図である。図１６Ｆは、ＨＵＶＥＣの１日インキュベーション後の脈管ネットワークを示す図である。図１６Ｇは、２４時間の能動的灌流後の脈管ネットワークを示す図である。
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７Ａは、組織構成物（具体的にこの例では上皮組織構成物）中に機能性チャネルネットワークを形成するための細胞外マトリクス組成物中の１つまたは複数の機能性チャネルの作製を例示する図である。ステップは、機能性チャネルパターンを形成するためのファジティブインク（細胞含有ファジティブインクであってよい）を含む１つまたは複数の犠牲線維の沈着、細胞外マトリクス組成物でのチャネルパターンの少なくとも部分的な封入、機能性チャネルを形成するためのファジティブインクの除去、および機能性チャネルを上皮細胞で覆うための任意選択での播種アプローチを含む。図１７Ｂは、チャネルが上皮細胞で覆われている細胞外マトリクス組成物中の２つの機能性チャネルを示す図である。
【図１７Ｃ−１７Ｆ】図１７Ｃは、チャネルが上皮細胞で覆われている細胞外マトリクス組成物中の２つの機能性チャネルを示す図である。図１７Ｄ〜１７Ｆは、ＰＴＥＣで覆われたチャネルの種々の共焦点顕微鏡画像およびＮａ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅを含む種々の細胞特異的タンパク質が発現されている免疫蛍光画像である。
【図１８Ａ−１８Ｅ】図１８Ａ〜１８Ｃは、播種３日後でのＨＵＶＥＣ（赤）およびＨＮＤＦ（緑）の初期の均一な分散を強調する図である。図１８Ｄ〜１８Ｅは、８日後の同じチャネルを示す図であり、その時点でチャネルは、明確な外側間質性（ＨＮＤＦ）層およびコンフルエントな内皮（ＨＵＶＥＣ）層を含む。
【図１９Ａ−１９Ｆ】細胞含有マトリクスに直接ファジティブインクをプリントした後に、さらなる細胞含有マトリクスで封入すること、脈管チャネルを形成するためにファジティブインクを排除すること、ならびにＨＵＶＥＣを脈管チャネルに播種すること、内皮細胞がコンフルエント層を形成し、経時的に毛細管構造を構築することを示す図である。
【図２０Ａ−２０Ｃ】２つの細胞型（ゼラチンフィブリン細胞外マトリクス材料内に分散したＨＮＤＦおよびＨＵＶＥＣ）を含むプリントされた細胞含有線維での自発的新規脈管構造形成を示す共焦点顕微鏡画像である。
【図２１Ａ−２１Ｆ】図２１Ａは、包埋されたプリント工程を模式的に示す図である。図２１Ｂは、包埋されたプリントのために好適な半貫通しているポリマーネットワーク（ＩＰＮ）（例えば、ＰＡＡ−ＧｅｌＭＡ）を含む細胞外マトリクス組成物の模式図である。図２１Ｃは、包埋されたプリントによって構成され得る無作為な３Ｄ形状を有する複合体不均一構造を例示する図である。図２１Ｄは、包埋されたプリントのために好適なインクおよびマトリクスレオロジーの代表的なレオロジー的測定値を提供する図である。図２１Ｅは、包埋されたプリントによって形成された脈管ネットワークを含む脈管立方体（ｃｕｂｅ）の写真である。図２１Ｆは半ＩＰＮ細胞外マトリクス組成物内のプリントされた細胞含有線維を示す図である。
【図２２】半ＩＰＮ細胞外マトリクス組成物の透明度が置換（ＤＳ）の程度によって調整され得ることを実証する図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
貫通している脈管構造を含むプリントされた組織構成物およびそのような組織構成物をプリントする方法が本明細書に記載されている。図１Ａは、バイオプリンティングの概念の例示を提供する。プリント方法は、３Ｄ組織培養から臓器移植のための薬物スクリーニングにわたる適用のために予め定められた位置に細胞、脈管構造、上皮管および細胞外マトリクスを含む不均一な２Ｄおよび３Ｄ組織構成物の製作を可能にできる。
【０００９】
図１Ｂおよび図２Ａ〜２Ｃは、三次元に正確に位置付けられた脈管構造および複数の細胞型を含む例示的なプリントされた組織構成物を示す模式図を提供する。図２Ａまたは２Ｃを参照して、例示的なプリントされた組織構成物１００は、第１の組織パターン１１５ａおよび第２の組織パターン１１５ｂを含み、第１および第２のそれぞれの組織パターン１１５ａ、１１５ｂが１つまたは複数の予め定められた細胞型の複数の生細胞を含む。例えば第１の組織パターン１１５ａは細胞型ＡおよびＢを含んでよく、第２の組織パターン１１５ｂは細胞型Ｃを含んでよい。生細胞を含み、予め定められた細胞型を有する１つまたは複数の細胞含有線維１０５の配置は、各組織パターン１１５ａ、１１５ｂを規定できる。この例において、第１の組織パターン１１５ａを規定する細胞含有線維１０５は細胞型ＡおよびＢを含み、第２の組織パターン１１５ｂを規定する細胞含有線維は細胞型Ｃを含む。脈管チャネルのネットワーク１３５は、組織パターン１１５ａ、１１５ｂを貫通する。細胞外マトリクス組成物１３０は、１つまたは複数の組織パターン１１５ａ、１１５ｂおよび脈管チャネルのネットワーク１３５を少なくとも部分的に囲む。
【００１０】
プリントされた組織構成物中で別のパターンまたはネットワークを「貫通する」パターンまたはネットワークは、他のパターンまたはネットワークの１つまたは複数の線維、チャネルまたは部分に、層化されている、部分的にもしくは完全に上に重なっている、部分的にもしくは完全に下に重なっている（ｕｎｄｅｒｌａｐｐｉｎｇ）、囲んでいる、中に包埋されているおよび／または織り交ぜられている、１つまたは複数の線維、チャネルまたは部分を含むと理解され得る。「基質上に沈着された」線維は基質上に直接または予め基質上に沈着されたまたは形成された別の線維、チャネルまたは部分に直接沈着されると理解されてよい。
【００１１】
ここで図２Ｂを参照して、包埋された脈管構造を含む組織構成物は、１つまたは複数の細胞含有線維１０５を沈着させることによってプリントでき、ここで各細胞含有線維１０５は複数の生細胞を基質１１０上に１つまたは複数の組織パターン１１５（この例では１つの組織パターン）を形成するように含む。組織パターン１１５は、１つまたは複数の予め定められた細胞型の細胞を含む。１つまたは複数の犠牲線維１２０も、それぞれファジティブインクを含み、基質１１０上に、１つまたは複数の組織パターン１１５を貫通する脈管パターン１２５を形成するように沈着される。１つまたは複数の組織パターン１１５および脈管パターン１２５は、細胞外マトリクス組成物１３０によって部分的にまたは完全に囲まれる。次いでファジティブインクは、細胞外マトリクス組成物１３０中に脈管チャネルのネットワーク１３５を作るように除去される。それにより貫通している脈管ネットワークが組織構成物１００に形成される。
組織構成物は、ｎ個までの異なる予め定められた細胞型を含み得る。例えばｎは、１≦ｎ≦３００、２≦ｎ≦２００または２≦ｎ≦１００を満たす場合がある。さらに典型的にはｎは、５０以下、３０以下または２０以下である。例えば、２個以上、４個以上、８個以上、１６個以上または２０個以上の予め定められた細胞型が組織構成物中にあってよい。
【００１２】
図２Ａ〜２Ｃの例によって例示されるとおり各組織パターンは、１つまたは複数の細胞含有線維の二または三次元配置を含むまたは、それによって規定され、各組織パターン（およびそれにより細胞含有線維の各配置）は、予め定められた細胞型の異なるサブセットを含む場合がある。例えば５個の異なる予め定められた細胞型（例えば細胞型Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）ならびに３個の異なる組織パターン（例えば組織パターン１、２および３）を含む組織構成物において、１つまたは複数の細胞含有線維の第１の配置によって規定される組織パターン１は、細胞型Ａを含む場合があり；１つまたは複数の細胞含有線維の第２の配置によって規定される組織パターン２は、細胞型ＢおよびＣを含む場合があり；ならびに１つまたは複数の細胞含有線維の第３の配置によって規定される組織パターン３は、細胞型ＡおよびＥを含む場合がある。
【００１３】
生細胞に加えて１つまたは複数の細胞含有線維は、細胞外マトリクス材料と称される場合がある合成または天然由来生体適合性材料を含んでよい。１つまたは複数の細胞含有線維のそれぞれは、下に記載の１つまたは複数の機能性化学的物質（例えば薬物、毒素、タンパク質および／もしくはホルモン）を同様にまたは代替的に含む場合がある。各組織パターンは、細胞含有線維の１つの層または複数の層を含む場合があり、それはいくつかの実施形態ではそれらの間の接触領域で少なくとも部分的に融合している場合がある。例えば１つまたは複数の細胞含有線維から形成された隣接層は、線維組成物および沈着（または沈着後）条件に応じて部分的にまたは完全に融合している場合がある。
組織構成物中の細胞含有線維の配置は、連続的または非連続的であってよい。連続的配置では例示的組織パターンの（および１つまたは複数の予め定められた細胞型を含む）細胞含有線維は、組織構成物中で単一の相互接続された組織ネットワークを形成できる。例えば予め定められた細胞型の生細胞を含む単一の細胞含有線維は、連続的配置を形成するように単一の層または複数の層に沈着される場合がある。代替的に、予め定められた細胞型の生細胞を含む複数の細胞含有線維は、細胞含有線維のそれぞれが、同じ予め定められた細胞型を含む別の細胞含有線維と物理的に接触している、場合により（possibly）少なくとも部分的に融合している、連続的配置を形成するように単一の層または複数の層に沈着される場合がある。
【００１４】
１つまたは複数の予め定められた細胞型を含む細胞含有線維の非連続的配置では、予め定められた細胞型の単一の相互接続された組織ネットワークは、組織構成物内に形成されない。代わりに、予め定められた細胞型を含む細胞含有線維は、組織構成物全体に均一にまたは不均一に分散されてよい。結果として予め定められた細胞型に対応する細胞も組織構成物全体に均一にまたは不均一（例えば塊状に）に分散されてよい。この実施形態では、所与の組織パターンおよび細胞型のいくつかまたはすべての細胞含有線維は、同じ細胞型の細胞を含む別の細胞含有線維と物理的に接触している場合がある、または接触している細胞含有線維はない。
【００１５】
１つまたは複数の細胞含有線維のそれぞれは、少なくとも１つの生細胞を含み、多数の生細胞を含む場合がある。例えば各細胞含有線維は、少なくとも細胞約１００個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０００個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０4個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０5個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０6個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０7個／ｍｌまたは少なくとも細胞約１０8個／ｍｌの細胞濃度を有する場合がある。典型的には細胞濃度は、細胞約１０9個／ｍｌ以下または細胞約１０8個／ｍｌ以下である。これと一致して組織構成物の１つまたは複数の組織パターンは、少なくとも細胞約１００個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０００個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０4個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０5個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０6個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０7個／ｍｌまたは少なくとも細胞約１０8個／ｍｌの細胞濃度を有する場合がある。典型的には組織パターン中の細胞濃度は、細胞約１０9個／ｍｌ以下または細胞約１０8個／ｍｌ以下である。
【００１６】
細胞濃度は、細胞含有線維のそれぞれ全体で実質的に均一（例えば±１０％以内、±５％以内または±１％以内）であってよく、細胞濃度は組織パターンのそれぞれ全体で実質的に均一であってよい。代替的に、細胞約１０個／クラスターから細胞約１０００個／クラスターまたは細胞約１０個／クラスターから細胞約１００個／クラスターのサイズの範囲であり得る細胞の凝集物またはクラスターを含む細胞含有線維を沈着させることは可能である。そのようなクラスターは、細胞含有線維内に均一にまたは不均一に（したがって１つまたは複数の組織パターン全体に均一にまたは不均一に）分散され得る。全体として細胞濃度は組織構成物全体に実質的に均一であってよく、あるいは細胞濃度は１つもしくは複数の組織パターンの位置および形態によって、ならびに／または１つもしくは複数の組織パターン内の細胞分散によって規定され得る予め定められた不均質性を組織構成物内に含んでよい。
【００１７】
１つまたは複数の組織パターンを貫通する脈管ネットワークは、脈管チャネルの二または三次元的に相互接続された配置である。ネットワークは、親脈管チャネルから複数の分枝脈管チャネルへの１つまたは複数の分枝（例えば、二分枝、三分枝など）を含む場合がある。ネットワークは、大きな直径のチャネルが小さな直径のチャネルに枝分かれする、階層分枝構造を有する場合がある。脈管チャネルのいくつかまたはすべては、湾曲した経路に沿っていてよく、それにより曲線とみなされる場合がある。ネットワーク中のすべての脈管チャネルは同じ直径を有してよく、または少なくとも１つの、いくつかの、またはすべての脈管チャネルは、異なる直径を有してよい。いくつかの場合では、１つまたは複数の脈管チャネルは、その長さに沿って不均一な直径を有する場合がある。
【００１８】
脈管チャネルの貫通しているネットワークに十分近いことは、生存し続けるために組織構成物の細胞に関して有益である。組織および臓器様構造を作るための以前の試みでの１つの主な問題は壊死性領域が、利用できる灌流可能な脈管構造を有さない領域に生じる場合があることである。本研究では、各細胞含有線維およびしたがって各細胞は、脈管ネットワークに近い位置に、または脈管ネットワークが形成され得る場所近くに位置付けられてよい。例えば、各組織パターンを形成する１つまたは複数の細胞含有線維の少なくとも一部は、およびしたがって生細胞のいくつかまたはすべては、脈管チャネルから約１ｍｍ以下で離れて、約５００μｍ以下で離れて、約３００μｍ以下で離れて、約２００μｍ以下で離れて、約１００μｍ以下で離れて、約５０μｍ以下で離れて、および／または約１０μｍ以下で離れていてよい。細胞含有線維の１つまたは複数および、したがって生細胞の少なくともいくつかは、脈管チャネルと直接接触するように沈着されてよい。脈管ネットワークのいくつかの部分、例えば最小の毛細管が犠牲線維の沈着およびファジティブインクの除去後に血管新生および／または管形成によって形成され得ることは、想定される。例えば、内皮細胞を含む細胞含有線維は、新たな毛細管を生成するために管形成および／または血管新生を促すようにファジティブネットワークに隣接して沈着され得る。
【００１９】
細胞含有（および他の）線維の沈着について下に記載のプリント工程が高い位置精度を可能にすることから、組織構成物内の生細胞および／または細胞外マトリクス材料の設置は、±２００μｍ以内、±１００μｍ以内、±５０μｍ以内、±１０μｍ以内または±１μｍ以内に制御され得る。
上に考察したとおり、さまざまな種類の細胞が１種を超える細胞型の細胞を含む細胞含有線維を沈着させることによって互いに非常に近接に位置付けられてよい。貫通している脈管構造に加えて、１つまたは複数の組織パターンが１つまたは複数の他の組織パターンを貫通してよく、それにより特定の種類の細胞が別のものに非常に近接に位置付けられてよいことも企図される。例えば、第１の種類の細胞（例えば上皮または内皮細胞）を含む１つまたは複数の細胞含有線維は、第２の種類の細胞（例えば、平滑筋細胞）を含む１つまたは複数の細胞含有線維に、層化されている、部分的にもしくは完全に上に重なっている、部分的にもしくは完全に下に重なっている、囲んでいる、中に包埋されているおよび／または織り交ぜられていてよい。いくつかの実施形態ではすべての組織パターンは、少なくとも１つの他の組織パターンを貫通していてよく、すべての組織パターンが他のすべての組織パターンを貫通していてよいことも企図される。
【００２０】
細胞外マトリクス組成物は、部分的にまたは完全に１つまたは複数の組織パターンを囲んでいる場合があり、ここで完全に囲まれている組織パターンは曝露されていない細胞含有線維を含む。細胞外マトリクス組成物も部分的にまたは完全に脈管チャネルのネットワークを囲んでいる場合があり、ここで完全に囲まれている脈管ネットワークは曝露されていない脈管チャネルを含む。例えば脈管チャネルのネットワークは細胞外マトリクス組成物によって完全に囲まれている場合があり、一方組織パターンは細胞外マトリクス組成物によって部分的に囲まれている（例えば、それに隣接している）だけである場合がある。そのような例では細胞含有線維は、脈管パターンが封入された後に沈着されてよい。いくつかの実施形態では細胞外マトリクス組成物は、下に記載のとおり細胞外マトリクス組成物と共に沈着される場合がある追加的生細胞および／または１つまたは複数の機能性化学的物質を含む場合がある。そのような細胞外マトリクス組成物は、細胞含有マトリクスと称される場合がある。下に記載のとおり細胞外マトリクス組成物は、当業者に周知の別の方法によってプリントされ、流し込まれまたは形成され得る。
【００２１】
組織構成物は、任意の所望の２Ｄまたは３Ｄ形状を有してよい。例えば組織構成物は、細胞含有線維および貫通している脈管ネットワークの単一の層または複数の層から構成された平面外形を有してよい。そのような構造は、任意の所望の高さ（厚さ）を有してよい。典型的には組織構成物は、組織培養および薬物スクリーニングから皮膚構成物および角膜置換の範囲の適用を有し、約１００ｃｍ以下、約１０ｃｍ以下、約１ｃｍ以下、約１ｍｍ以下、約５００μｍ以下または約１００μｍ以下、典型的には少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１００μｍ、少なくとも約２００μｍまたは少なくとも約１ｍｍの高さを有する。
【００２２】
代替的に、脈管ネットワークが包埋される組織構成物は、無作為なまたは適用に応じた３Ｄサイズおよび形状を有してよい。組織構成物は、固形構造、多孔性構造および／または中空構造（例えば、管状または非管状）を有してよく、具体的な臓器の形態および機能を模倣するように製作されてよい。例えば組織構成物は、腎臓、心臓、膵臓、肝臓、膀胱、膣、尿道、気管、食道、皮膚または他の身体的臓器のサイズおよび形状を有してよい。３Ｄサイズおよび形状は、下に記載のとおりいくつかの場合では型によって決められてよい。
一般に、貫通している脈管パターンを有する細胞含有線維の三次元配置では、犠牲線維は、細胞含有線維の一部を覆うまたは下にある部分を有する場合があり、犠牲および細胞含有線維は、鉛直方向に（重力によって定義される）に垂直なＸＹ平面に限定される場合もされない場合もある。犠牲線維は、いくつかのまたはすべての細胞含有線維と物理的に接触していてよく、いくつかの実施形態では線維は、接触領域で部分的にまたは完全に融合していてよい。犠牲および細胞含有線維の両方は、接触の点の間に未支持で伸びて広がっている部分を有してよい。
【００２３】
図２Ａ〜２Ｃは、それぞれ脈管パターン１２５または脈管チャネルのネットワーク１３５によって貫通されている１つまたは複数の組織パターン１１５を含む例示的組織構成物１００を示している。図２Ａでは、それぞれ２つの細胞含有線維１０５を含む２つの組織パターン１１５ａ、１１５ｂは、基質１１０上に単一層で沈着されている。細胞含有線維１０５に隣接しているおよび／または物理的に接触しているのは、脈管パターン１２５の犠牲線維１２０である、ここで各犠牲線維１２０はファジティブインクを含む。細胞外マトリクス組成物１３０での封入後、ファジティブインクは、脈管チャネルのネットワーク１３５を形成するように除去されてよい。
【００２４】
図２Ｂは、細胞含有線維１０５の３Ｄ格子構造１１５を、貫通している脈管パターン１２５の犠牲線維１２０と交互に含む組織構成物１００の模式図を示す。犠牲線維１２０を作っているファジティブインクは、図２Ｂにも描かれている脈管チャネルのネットワーク１３５を作るために最終的には除去される。
図２Ｃの組織構成物１００は、２つの組織パターン１１５ａ、１１５ｂを含み、それぞれは、脈管チャネルのネットワーク１３５によって（またはファジティブインクがまだ除去されていない場合、犠牲線維１２０を含む脈管パターン１２５によって）貫通されている曲線細胞含有線維１０５によって規定される。脈管ネットワーク１３５は、種々の長さおよび直径の曲線チャネルを含む階層分枝構造を有する。固形基質１１０は組織構成物１００の下層に示されているが、この図および他の例示的図において下層の固形基質１１０は存在しなくてもよい。
【００２５】
図３Ａは、脈管パターン１２５の犠牲線維１２０を伴う半織り（ｓｅｍｉ−ｗｏｖｅｎ）立体配置での細胞含有線維１０５を含む２つの例示的組織パターン１１５ａ、１１５ｂの上面図を示す。図３Ｂは、細胞外マトリクス組成物１３０によって囲まれた同じ組織パターン１１５ａ、１１５ｂおよび脈管パターン１２５（または、ファジティブインクが除去されている場合、脈管チャネルのネットワーク１３５）の複数の層を示す。
【００２６】
組織構成物中の生細胞および予め定められた細胞型は、生殖細胞、体細胞および幹細胞を含む哺乳動物の身体を構成する細胞から選択される任意の哺乳動物細胞型を含んでよい。細胞型に応じて哺乳動物の身体を構成する細胞は、最初期胚（ｖｅｒｙ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏ）：内胚葉、外胚葉または中胚葉における３種の主な生殖細胞層の１つに由来してよい。用語「生殖細胞」は、配偶子（卵子および精子）を生じる任意の細胞系を指す。用語「体細胞」は、多細胞生物の身体を形成する任意の生物学的細胞；配偶子、生殖細胞、生殖母細胞または未分化幹細胞以外の任意の細胞を指す。例えば哺乳動物では、体細胞は、すべての内臓、皮膚、骨、血液および結合組織を形成する。そのように細胞は、臓器、皮膚、骨、血液および結合組織（すなわち間質細胞）を含む哺乳動物組織から単離された任意の体細胞を含んでよい。体細胞の例は、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、腱細胞、マスト細胞、遊走細胞、免疫細胞、ペリサイト、炎症性細胞、内皮細胞、筋細胞（心臓性、骨格および平滑筋細胞）、脂肪細胞（すなわち脂質細胞または脂肪細胞）、実質細胞（ニューロンおよびグリア細胞、ネフロン細胞、肝細胞、膵臓細胞、肺実質細胞）ならびに非実質細胞（例えば、類洞肝内皮細胞、クッパー細胞および肝星細胞）を含む。用語「幹細胞」は、無期限に分裂し、特定化した細胞を含む哺乳動物の身体の実質的にすべての組織を生じる能力を有する細胞を指す。幹細胞は、さらなる特化を受けて機能性または体細胞を生じることができる多分化能前駆細胞になる多能性細胞を含む。幹細胞および前駆細胞の例は、赤血球、白血球および血小板を生じる骨髄由来造血幹細胞（成体幹細胞；すなわち、血球芽細胞）；間質細胞、脂肪細胞および骨細胞型を生じる骨髄由来間葉系幹細胞（成体幹細胞）；皮膚細胞の種々の種類を生じる上皮幹細胞（前駆細胞）；ニューロンおよびグリア細胞を生じる神経幹細胞および神経前駆細胞；ならびに分化した筋肉組織に寄与する筋サテライト細胞（前駆細胞）を含む。
【００２７】
組織構成物は、薬物、毒素、タンパク質ならびに／または、これだけに限らないが：増殖因子、増殖阻害剤、サイトカイン、ステロイドおよび／もしくはモルフォゲンを含むホルモンから選択される１つまたは複数の機能性化学的物質も含む場合がある。いくつかの細胞特異的例は、：これだけに限らないがＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ベータを含む骨形態形成タンパク質、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子を含む。１つまたは複数の機能性化学的物質は、細胞含有線維および／または犠牲線維と共に沈着されてよく、囲んでいる細胞外マトリクス組成物に拡散する場合がある。
【００２８】
そのようなアプローチは、細胞外マトリクス組成物内のキュー（ｃｕｅ）の勾配を生成するために使用され得る。細胞は、固定されたおよび拡散性の化学的キューの勾配に細胞遊走、増殖および分化を方向付けられる発達、創傷治癒および炎症性応答の間に応答する。キューの勾配を導入する１つの方法は、図１２Ａ〜１２Ｃに例示のとおり、目的のキューを予めロードした細胞含有線維を直接プリントすることであり、細胞外マトリクス組成物内での封入において濃度勾配を生成するように拡散できる。そのような勾配は、トランスグルタミナーゼの作用によって足場に固着される場合があるまたはない。代替的に固定の、長期勾配を生成するために、ファジティブインクを除去することによって形成されたチャネルは、囲んでいる細胞外マトリクス組成物に拡散できる因子を導入するために使用され得る。例えば蛍光標識ＢＳＡの直線勾配の形成は、一対の平行チャネルを作り、蛍光ＢＳＡを１つのチャネルだけに通して流すことによって、図１２Ｄ〜１２Ｆにおいて実証される。２４時間で、２つのチャネル間に直線に近い勾配が明確である（図１２Ｅ〜１２Ｆ）。
【００２９】
細胞含有線維の細胞外マトリクス材料および、組織および脈管パターンを少なくとも部分的に囲む細胞外マトリクス組成物は、合成または天然由来生体適合性材料を含んでよい。細胞外マトリクス材料および細胞外マトリクス組成物は、同じまたは異なる生体適合性材料を含んでよい。下に記載のとおり、細胞含有線維および、いくつかの実施形態では細胞外マトリクス組成物がマイクロノズルを通じた押し出しを必要とする３Ｄプリント工程において沈着され得ることから：（１）せん断減粘（ｓｈｅａｒ  ｔｈｉｎｎｉｎｇ）挙動を示す；（２）規定の降伏応力τyを示す；および／または（３）せん断弾性係数Ｇ’およびせん断粘性（ｓｈｅａｒ  ｖｉｓｃｏｕｓ）係数Ｇ’’、係数が室温でＧ’＞Ｇ’’を有することは、細胞外マトリクス材料および細胞外マトリクス組成物の１つまたは両方に関して有益であり得る。
【００３０】
一例では細胞外マトリクス材料および／または細胞外マトリクス組成物は、ゲルを含み得る。バイオプリンティング適用のために理想的なゲルは、せん断弾性係数における初期増加によって観察され得る、低粘性溶液から固形様ゲルへの急速な転移を示し得る。急速で、制御可能なゲル化は、遅いゲル化工程に典型的な膨化および解離を最少化するまたは防ぐことによって、プリントされた構造の忠実度を増強できる。用語「ゲル」は、粘性または堅さを提供するためにゲル化薬剤を含み得る半固形物質を指す場合がある。ゲルは、増粘剤、架橋剤または重合剤などのゲル化剤の使用で形成でき、架橋構造または非架橋構造を含み得る。ゲルは、疎水性または親水性であってよい。好適なゲルのいくつかの例は、ハイドロゲル、熱可逆性ゲル、光感受性ゲル、ｐＨ感受性ゲル、ペプチドゲルまたは細胞型特異的ゲルを含む。ゲルの追加的例は、シリカゲル、シリコーンゲル、アロエベラゲル、アガロースゲル、ナフィオン、ポリウレタン、エラストマー（熱可塑性、熱可塑性ミネラルオイルなど）、イオン交換ビーズ、オルガノゲル（ｏｒｇａｎｏｇｅｌ）、キセロゲルおよびハイドロコロイドを含む。ハイドロゲルは、コラーゲン、ヒアルロネート、フィブリン、アルギネート、アガロース、キトサン、ゼラチン、マトリゲル、グルコサミノグリカンおよびこれらの組合せ由来のものを含む。一例ではゲルは、光重合可能なメタクリレート（ＭＡ）基で修飾されている変性コラーゲンであるゼラチンメタクリレート（ＧｅｌＭＡ）を含んでよい。好適なハイドロゲルは、合成ポリマーを含んでよい。特定の実施形態ではハイドロゲルは、ポリ（アクリレート）およびその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）およびその共重合体、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼンならびにこれらの組合せ由来のものを含んでよい。細胞外マトリクス材料および／または細胞外マトリクス組成物は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロネート、エラスチンおよび／またはプロテオグリカンを含む１つまたは複数の細胞外マトリクスなどの天然由来生体適合性材料を含んでよい。細胞外マトリクス材料および／または細胞外マトリクス組成物のための他の好適な生体適合性材料は、セルロース、マトリゲル、アクリレート、アクリルアミド、ポリ乳酸ｃｏ−グリコール酸、エポキシ、アルデヒド、尿素、アルコール、ポリエステル、シルク、タンパク質、グルコサミノグリカン、炭水化物、ミネラル、塩、クレイ（ｃｌａｙｓ）、ヒドロキシアパタイトおよび／またはリン酸カルシウムの変種を含んでよい。
【００３１】
好ましい実施形態では細胞外マトリクス材料および／または細胞外マトリクス組成物は、ゼラチンおよびフィブリンを含み得る。ゼラチンおよびフィブリンは、天然細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を模倣する貫通ポリマーネットワークを形成でき、細胞付着、バイオプリンティング、透明度および生体適合性のために最適化され得る。ポリマーネットワークを貫通しているフィブリンゼラチンは、図１３Ａ〜１３Ｄに例示のとおり、フィブリノーゲンおよびゼラチンの溶液を遅効性Ｃａ2+依存性酵素であるトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）と、その後にフィブリンゲル骨格を作るためにウシトロンビンと混合され得るゲル前駆体溶液を作るために混合することによって作ることができる。フィブリンは、ウシトロンビンおよび塩化カルシウムによって活性化された濃縮フィブリノーゲン溶液から作られてよい。フィブリンは、プリントされた構造の急速で制御可能なゲル化を可能にする急速な凝固相である。有利には、フィブリンおよびゼラチンは、移動表面鎖エンタングルメント（ｅｎｔａｎｇｌｅｍｅｎｔ）を介して一緒にまとめられ得る一方で強固な界面を形成する。この性質の一体化したゲルを作ることは、トランスグルタミナーゼ（ＴＧ）の遅い架橋動態のために可能である。トロンビンは、急速にフィブリンゲル形成を誘導するが、ＩＰＮに存在するゼラチンは、既に流し込まれた層に犠牲インク（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ  ｉｎｋ）をプリントできるようにし、最終的には液体ゼラチンフィブリンで封入する。２つの相は、一緒にまとめられてよく、一体化ゲルを作る。実施例において下でさらに考察されるこの材料系は、ゲル化動態、界面接着、機械的特性、光学的特性および細胞材料相互作用を修正するために容易に適合され得る。
【００３２】
上に記載のとおりファジティブインクを含む１つまたは複数の犠牲線維は、１つまたは複数の組織パターンを貫通する脈管パターンを形成するように基質上に沈着され得る。脈管パターンは、１つまたは複数の犠牲線維の二または三次元的に相互接続された配置またはネットワークを含む。細胞外マトリクス組成物での部分的なまたは完全な封入後のファジティブインクの除去は、組織構成物中に灌流可能な脈管チャネルのネットワークを作る。細胞含有線維と同様に犠牲線維がマイクロノズルを通じた押し出しを含む３Ｄプリント工程において沈着され得ることから：（１）せん断減粘挙動を示す；（２）規定の降伏応力τyを示す；ならびに／または（３）せん断弾性係数Ｇ’およびせん断粘性係数Ｇ’’、係数は室温でＧ’＞Ｇ’’、を有することは、ファジティブインクに有利であり得る。
【００３３】
沈着のための基質は、ガラスまたは他のセラミクス、ＰＤＭＳ、アクリル、ポリウレタン、ポリスチレンまたは他のポリマーなどの材料を典型的には含む。いくつかの実施形態では基質は、生体組織もしくは脱水組織、または上に記載の細胞外マトリクス組成物の１つを含み得る。基質は、プリントの前に浄化および表面処置されてよい。例えばガラス基質は、ガラス基質への細胞含有線維の結合を促進するためにシラン処置を受けてよい。いくつかの実施形態では、例えば参照により本明細書に組み込まれるW. Wu et al., Adv. Mater. 23 (2011) H178-H183に記載のとおり基質は固相材料でなくてもよく、代わりに液体またはゲル相であってよく、慎重に制御されたレオロジー特性を有する場合があることが推測される。Ｗｕらの研究において、ファジティブインクはネットワーク構造を作るために合成ハイドロゲルに直接プリントされた。しかしこれらの合成材料は、細胞接着および増殖を支持せず、それらの使用を非生物学的応用に限定している。本開示では、細胞接着、遊走、増殖および組織特異的機能を促進する一方でプリントのために好適なレオロジーを維持している細胞外マトリクス組成物が記載される。細胞含有および犠牲線維は、プリントの間に細胞外マトリクス組成物に包埋され、それにより組織および脈管パターンを細胞外マトリクス組成物で少なくとも部分的に囲むことが、模式的に図２１Ａに示すとおり、細胞含有および犠牲線維それぞれの沈着の間に生じる。これは、例えば図２１Ｃに示すとおりプリントの間に支持材料を必要とする場合がある複合体３Ｄ構造を自由裁量で含む。組織および脈管パターンの形成および包埋が同時に生じる場合、上に記載のとおり、沈着が生じる基質は、細胞外マトリクス組成物を保持する容器または細胞外マトリクス組成物それ自体であるとみなされる。
【００３４】
細胞外マトリクス組成物を形成するためにミクロゲル（例えばポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）ミクロゲル）は、レオロジー的修飾因子として使用でき、既に記載のとおりゼラチンメタクリレートなどの１つまたは複数の細胞外マトリクス材料と混ぜ合わせられる。半貫通しているポリマーネットワーク（半ＩＰＮ）は、図２１Ｂに模式的に示すとおり形成され得る。ミクロゲルは化学的に架橋された三次元ポリマーネットワークからなるコロイドゲル粒子を含むと理解されてよい。ミクロゲルは、シェルだけを含みコアを含まない、立体的に安定化されたコロイドとして作用できる。それらは、組成が変動し、ＰＡＡ、ポリスチレン、ＰＥＧおよび／または他の生体材料を含んでよい。天然細胞外マトリクスまたは生体材料が理想的なレオロジーを与えるミクロゲル形態に転換され得ることは企図される。好適な生体材料の例は、ヒアルロン、コラーゲン、アルギネート、フィブリン、アルブミン、フィブロネクチン、エラスチンまたはマトリゲルを含む。代替的にＰＥＧ、アクリレート、ウレタンまたはシリコーンなどの合成材料は、同様の様式で修飾され得る。
【００３５】
包埋されたプリントのために好適なインクおよびマトリクスレオロジーの代表的なレオロジー的測定値を図２１Ｄに示す。一例では高分子量（＞１．２５ＭＤａ）ＰＡＡミクロゲルがレオロジー的修飾因子として使用され、既に記載のとおり内皮化され得る複合体３Ｄ脈管ネットワークの作製を支持する細胞外マトリクス組成物を作るためにゼラチンメタクリレート（ＧｅｌＭａ）と混ぜ合わせられる。細胞外マトリクス組成物の透明度は、図２２に示すとおり、置換の程度およびメッシュサイズを変えることによって変更され得る。図２１Ｅは、３Ｄ脈管ネットワークの包埋されたプリントの制御を実証している脈管立方体を示し、図２１ＦはＰＡＡ−ＧｅｌＭＡ細胞外マトリクス組成物内のプリントされた細胞含有線維を示す。
【００３６】
方法は、組織および脈管パターンを細胞外マトリクス組成物で囲むまたは封入する前に、１つまたは複数の構造線維（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔ）を型を形成するように、予め定められたパターンで基質上に層ごとに沈着することをさらに含み得る。構造線維は、上に提供された例示的細胞外マトリクス組成物または細胞外マトリクス材料から選択される１つまたは複数の構造材料を含んでよい。型は、封入の間に細胞外マトリクス組成物を保持でき、組織構成物の一部として残る、または処理後に除去され得る。構造線維は、基質上の組織構成物の周囲長およびＸＹ平面を超える組織構成物の三次元形状のすべてまたは少なくとも一部を規定できる。
【００３７】
型は、組織構成物の形状を規定するほかに他の機能も有する。例えば型は、プリントされた組織構成物においてチャネルの灌流のための界面としても役立ち得る。図１５Ａ〜１５Ｄおよび１５Ｅ〜１５Ｇは、プリントされた型の例示的設計または界面構造を示す。図１５Ａ〜１５Ｄに示す例示的型は、受動的ロッキング灌流のために設計されている。界面構造とも称される場合がある型は、ＰＤＭＳを含む場合がある型の基礎部分とガラスを含む場合がある覆うカバーとの間に組織構成物を固定化することによってロッキングの間に脈管化組織を位置に保持できる。
図１５Ｅ〜１５Ｇの型の設計は、組織構成物の能動的なポンプに基づく灌流を可能にし、組織構成物の脈管チャネルと流体連絡にある（例えば近接する）流路を含む。図１５Ｆ〜１５Ｇに示すとおり流路として役立つ導管は、型自体に部分的にまたは全体が包埋されていてよく、中空ピン（例えば金属ピン）は脈管チャネルと結びつけるために使用され得る。図１５Ｅに示す例示的型は、流路を含有する複数の支持物（ｂｕｔｔｒｅｓｓ）を有する壁を有し、組織構成物が製作される型の内側に伸びる中空ピンを含む。組織構成物の脈管チャネルは、流路に連結されたチューブから脈管チャネルに流れが導入され得るように中空ピンの開口部と近接していてよく、液は１つまたは複数の他の開口部を通じて脈管チャネルから除去され得る。
【００３８】
一例では型は、粘弾性、無毒性、生体適合性および可逆性の圧力でフィットさせる封を形成できることが周知である構造材料、エラストマーシリコーンで形成されていてよい。構造材料は、シリコーン、エポキシ、アクリル酸のエステルまたは上に提供の細胞外マトリクス組成物の１つの１つまたは複数を含む１つまたは複数の未硬化構造線維を形成するために３Ｄプリントされてよい。プリント完了後、構造線維は、（例えば加熱または光重合によって）好適な期間（例えば約１時間以上）硬化されてよく、その後型は所望の材料特性を示し得る。
【００３９】
組織および脈管パターンの封入は、液化マトリクス前駆体の型への流し込みおよび細胞外マトリクス組成物を形成するためのマトリクス前駆体のゲル化を含んでよい。マトリクス前駆体の流し込みは、約２５℃から約４０℃の温度で行われ得る。例えばゼラチンメタクリレートまたはＧｅｌＭＡは、温度約３７℃で流し込まれてよい。流し込み後、マトリクス前駆体は、硬い物理ゲルを形成するために冷却されてよい（例えばＧｅｌＭＡの場合は約１５℃に）。代替的に封入は、上に示すとおり包埋されたまたは全方向の３Ｄプリント工程での組織および脈管パターンの沈着の間に生じ得る。細胞外マトリクス組成物が、線維沈着によって、細胞含有および犠牲線維と同様に沈着され得ることも企図される。例えば、細胞外マトリクス組成物を含む１つまたは複数のＥＣＭ線維は、下に記載のとおりノズルから押し出され、所望の３Ｄ外形を作り上げるように基質上に層ごとに沈着され得る。そのような場合、細胞外マトリクス組成物を含有するように型を使用することは、必ずしも必要ではない。
【００４０】
細胞外マトリクス組成物は、持続的な化学的架橋構造を形成するためのファジティブインクの除去の前または後に硬化されてよい。細胞外マトリクス組成物に応じて硬化は加熱、ＵＶ照射または化学的添加物（例えば酵素的硬化）を必要とする場合がある。
１つもしくは複数の組織パターンを定める細胞含有線維、貫通している脈管パターンもしくは機能性チャネルパターンを定める１つもしくは複数の犠牲線維、型を規定できる１つもしくは複数の構造線維および／または細胞外マトリクス組成物をもたらし得る１つもしくは複数のＥＣＭ線維を含む、基質上に沈着される任意のまたはすべての線維は、基質上に沈着される前にノズルから押し出され得る。それに続く押し出し工程の考察において、犠牲線維、細胞含有線維、構造線維および／またはＥＣＭ線維は、処理ステップが任意のまたはすべての線維組成物に適用可能であることから、集合的に「線維」と称される場合がある。
【００４１】
図４は、線維を押し出し、基質上にそれらを沈着させるために使用できる４個の例示的ノズルまたはプリントヘッドを示す。示されるノズルは、４個の独立したｚ軸を備えた大きなプラットフォーム（ｌａｒｇｅ  ｂｕｉｌｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）（７５０ｍｍｘ６５０ｍｍ）を含む特注の３Ｄプリンターの一部である。図５Ａ〜５Ｃは、４個のノズルのそれぞれからの異なる組成物の線維の逐次的沈着による４層、複数材料構成物の３Ｄプリントの実証を提供する。図５Ｃの挿入図は、各層についての３Ｄ構造の反復単位を示している。
図４および５Ａの例示的プリンターに４個のノズルがあるが、３Ｄプリントによって組織構成物を形成するために使用されるノズルの数はより少なくてもより多くてもよい。一般に１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上Ｎ個までのノズルが線維を押し出すために使用でき、ここで１≦Ｎ≦１０２４、より典型的にはＮは５１２以下である、Ｎは２５６以下である、Ｎは１２８以下であるまたはＮは６４以下である。線維は、Ｎ個のノズルから連続的な沈着工程で逐次的にまたは平行する沈着工程で同時に押し出されてよく、ここで各ノズルは異なる前駆体インク（例えば、１つまたは複数の予め定められた細胞型を含む細胞含有インク、ファジティブインク、構造インクまたはＥＣＭインク）を含有していてよい。沈着が平行および連続的な沈着ステップの両方を含み得ることも企図される。逐次的または連続的プリントを促進するためにノズルは、図４に示すとおりｚ方向に独立に制御されてよい。
【００４２】
各ノズルは、サイズで直径約１μｍから約１ｍｍ、より典型的には約５０μｍから約５００μｍの内径を有してよい。ノズルのサイズは、所望の線維直径に応じて選択されてよい。注入圧およびノズル移動速度に依存して、沈着線維は約１μｍから約１０ｍｍ、より典型的には約１００μｍ（０．１ｍｍ）から約１ｍｍの直径範囲を有する。ノズルに供給されるインクは、Ｌｕｅｒ−Ｌｏｋ（商標）または他のコネクターの方法によってプリントのためのノズルに個々に繋がれ得る別々のシリンジ外筒に保管されてよい。各線維の押し出しは、約１ｐｓｉから約２００ｐｓｉ、約１０ｐｓｉから約８０ｐｓｉまたは約２０ｐｓｉから約６０ｐｓｉの適用圧力下で行われ得る。押し出しの間の圧力は、一定でよいまたは変更されてよい。代替的圧力供給源を使用することによって、１００ｐｓｉもしくは２００ｐｓｉを超えるおよび／または１ｐｓｉ未満の圧力がプリントの間に適用され得る。種々の圧力は、線維の長さに沿って変化する直径を有する線維をもたらし得る。そのようなアプローチは、例えば、種々の長さおよび直径の犠牲線維から形成される、図２Ｃにおいておよび図７Ｅ〜７Ｆにおいて示す分枝、階層脈管ネットワークを形成するために使用できる。押し出しは周囲温度または室温条件（例えば約１８℃から約２５℃）で実行され得る。
【００４３】
各線維の押し出しおよび沈着の間にノズルは、±１００μｍ以内、±５０μｍ以内、±１０μｍ以内または±１μｍ以内の位置精度で予め定められた進路（例えば（ｘ1、ｙ1、ｚ1）から（ｘ2、ｙ2、ｚ2））に沿って移動できる。したがって線維は、±２００μｍ以内、±１００μｍ以内、±５０μｍ以内、±１０μｍ以内または±１μｍ以内の位置精度で沈着され得る。ノズルは移動でき、線維は約３ｍ／秒（例えば約１ｃｍ／秒から約３ｍ／秒）の高い速度で、より典型的には約１ｍｍ／秒から約５００ｍｍ／秒、約１ｍｍ／秒から約１００ｍｍ／秒または約１ｍｍ／秒から約１０ｍｍ／秒の範囲で沈着され得る。
【００４４】
ノズルの予め定められた進路は、プリンターの大きなプラットフォーム（ｂｕｉｌｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）のサイズによって決定される少なくとも約２４００ｃｍ2、少なくとも約２７００ｃｍ2および約１ｍ2までのＸＹ境界領域を有する場合がある。例えば、大きなプラットフォームは、約６０ｃｍから約１００ｃｍの長さおよび約４０ｃｍから約１００ｃｍの幅を有する場合がある。各プリントヘッドは、ｚ方向に約１０ｃｍから約５０ｃｍまたは約１５から約３０ｃｍの距離を移動できる。
【００４５】
沈着線維は好適な組成およびレオロジー特性を有する前駆体インク（例えば、１つまたは複数の予め定められた細胞型を含む細胞含有インク、ファジティブインク、構造インクまたはＥＣＭインク）から形成される。前駆体インクは、粘弾性であってよく、非直線状せん断依存（ｓｈｅａｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）を有する粘性を含む。前駆体インクの粘性は、約０．００１Ｐａ−秒から約１０，０００Ｐａ−秒の範囲内であってよい。前駆体インクは、レオロジー特性の制御を補助するために増粘剤（ｖｉｓｃｏｓｉｆｉｅｒ）を任意選択で含んでよい。各細胞含有インクならびに任意選択でファジティブおよび／またはＥＣＭインクは、液体またはゲルであってよい担体中に１つまたは複数の予め定められた細胞型の１つまたは複数の細胞を含んでよい。担体は、上に記載の細胞外マトリクス材料に加えて、上に記載の１つまたは複数の機能性化学的物質を含んでよい。担体は、同様にまたは代替的に細胞の増殖を支持するように設計された細胞培養培地を含んでよい。一例では、ハイドロゲルと混合された生細胞を含む細胞含有インクを形成するために、予め定められた量のハイドロゲル前駆体粉末を好適な組成の溶液を形成するために細胞培養培地と混合する。目的の細胞を次いで所望の細胞濃度（例えば、細胞含有線維について上に記載の任意の細胞濃度）で溶液中に分散させ、完全に混合する。例示的細胞含有ＧｅｌＭＡインク、細胞含有ゼラチンフィブリンインク、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７ファジティブインクおよびＰＤＭＳ構造インクを調製するステップは、下の例に記載される。
【００４６】
組織および脈管パターンの封入後、ファジティブインクは細胞外マトリクス組成物中の脈管チャネルのネットワークを形成するように除去されてよい。ファジティブインクは、生体適合性材料を含むことができ、室温沈着の間に細胞含有製剤および細胞外マトリクス組成物との適合性について設計されてよい。好適なファジティブインクは、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２３、アガロース、糖、ワックス、脂肪油（例えば、Ｃｒｉｓｃｏなどの動物脂肪由来油）を含んでよい。ハイドロゲルが細胞外マトリクス組成物（および／または細胞外マトリクス材料）のために使用される場合およびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７などのハイドロゲルがファジティブインクとして使用される場合、同様の水分含有量（例えば±３０％以内）を有することはプリント後のファジティブインクのゆがみを回避するためにファジティブインクおよびマトリクスハイドロゲルについて有利であり得る。ファジティブインクおよび細胞外マトリクス組成物は、下でさらに考察するとおり、相補性熱転移を有するように選択されてもよい。
【００４７】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７は、製作工程を完了するために必要な短期間において複数の細胞型に対して生物学的に不活性であるＦＤＡ承認材料である。材料は、疎水性ポリ（ポリエチレンオキシド）（ＰＰＯ）セグメントおよび２つの親水性ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）セグメントをＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ立体配置に配置されて含む。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７は、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ；約２１質量％）およびゲル化温度より上で熱可逆性ゲル化を受ける。ゲル化温度は、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ濃度が増加する場合におよそ１０℃から４℃に低下する。これらの決定的なパラメーターの両方が超えている場合、ミセルは水に良く溶媒和される冠状に自己構築する親水性ＰＥＯセグメントを形成する一方で、疎水性ＰＰＯセグメントはミセルコア内に密に会合する。しかしゲル化温度未満では、疎水性ＰＰＯ単位は水和され、その濃度がＣＭＣを超える系について個々のＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ分子種が水に可溶性になり、ゲルから液体への転移を生じる。それによりゲル点未満への冷却で材料は液化する。
【００４８】
パターン化細胞および囲んでいる細胞外マトリクス組成物が、犠牲線維の沈着またはファジティブインクの除去の間に傷害を受けないことは重要である、したがって厳しい（ｈａｒｓｈ）溶媒および／または上昇した温度が除去工程の間は利用されないことは好ましい。ファジティブインクおよび細胞外マトリクス組成物／材料の適切な選択を伴って、ファジティブインクは組織構成物を損なうことなく除去され得る。例えばファジティブインクが上に記載のゲルから液体への転移を受ける場合、封入後の脈管パターンの冷却がファジティブインクの除去のために有効である場合がある。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を除去するために脈管パターンは、濃度に応じて約１℃以下の温度に冷却されてよい。除去のためにファジティブインクが好適な水性溶液中に溶解される可能性も企図される。ファジティブインクが液体化または溶解されると、インクを抽出するために脈管パターンの曝露末端に真空が適用され得る。
【００４９】
有利なことに組織構成物は、内皮細胞の付着および増殖を支持するように設計でき、脈管チャネルを覆って液体拡散への障壁を提供する一方、同時に恒常性維持機能を促進し、種々の組織に特異的な脈管微小環境を確立することを補助する。内皮化を促進するためにいくつかの実施形態ではファジティブインクを含む犠牲線維は、複数の内皮細胞または他の生細胞をさらに含む場合がある。図１６Ａ〜１６Ｃに例示のとおり細胞は、犠牲線維に沿って沈着されてよく、ファジティブインクの除去後に脈管チャネルに残ってよい。チャネルの直接的な細胞形成（cellularization）は、ファジティブインクの液化の後に細胞がチャネル壁に吸着する場合に達成され得る。このアプローチは、高度に入り組んだネットワークまたは、流れ抵抗の増大のために直接注入を使用して満たすことが困難な場合がある小さなチャネルに生細胞を組み込むことを可能にできる。内皮細胞およびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７を含むファジティブインクの排除によって形成されたチャネルを含む例示的なプリントされた組織構成物は図１６Ｄ〜１６Ｇに示され、実施例においてさらに記載される。別の例では上皮細胞は、ファジティブインク中で送達され、乳腺、腎臓または肝臓に存在する管状上皮組織を作るために使用される。
【００５０】
ファジティブインクで内皮および／または他の生細胞を沈着させることに加えて、または代替的に内皮化は、ファジティブインクの除去後の生細胞（例えば内皮細胞）の懸濁物の脈管チャネルへの注入によって影響され得る。これらのアプローチの１つまたは両方を使用して、１００％までの培養密度を有する内皮層は、１つまたは複数の脈管チャネルの壁を覆って形成され得る。ここで培養密度１００％は、内皮細胞によって壁が完全に覆われていることを意味する。脈管チャネルのネットワーク中に形成された各内皮層は、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または１００％の培養密度を有する場合があり、それにより脈管チャネルは実際の血管として機能できる。下の実施例に記載のとおり、代表的な階層二分枝化ネットワークにヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）懸濁物を注入でき、穏やかなロッキングが続くことが示された（図７Ｊを参照されたい）。４８時間後、代表的な二分枝マイクロチャネル内の共焦点画像化と合わせた生／死染色によって決定されたとおり、これらの細胞は９５％を超える生存率を保持し、ほとんどコンフルエントな層を構築した。
【００５１】
複数の種類の細胞が脈管チャネルに注入されてよい。ｉｎ  ｖｉｖｏで、毛細管より大きな直径を有するすべての血管は、外側の線維組織層、平滑筋層および内皮細胞の内層を含有する。線維芽細胞などの１つまたは複数の他の種類の細胞は、ファジティブインクを除去した後に内皮細胞と共に脈管チャネルに注入されてよい。下の実施例に記載のとおり脈管チャネルは、それぞれ間質性および内皮層に自己構築でき、天然の血管の解剖学的形態を模倣する２つの細胞型、線維芽細胞およびＨＵＶＥＣで同時播種されてよい。
【００５２】
同じまたは異なるファジティブインクが犠牲線維として沈着され、組織構成物内の脈管チャネルに加えてまたはその代わりにチャネル、管および／またはコンパートメントを形成するように上に記載のとおり除去されてよいことも企図される。言い換えると、１つまたは複数の追加的犠牲線維は、脈管パターンに加えてまたはその代わりに基質上に機能性チャネルパターンを形成するために沈着されてよい。これは、図１７Ａに模式的に示される。
【００５３】
各追加的犠牲線維は、脈管パターン（脈管パターンが存在する場合）を規定するために使用されるファジティブインクと同じまたは異なっている第２のファジティブインクを含んでよい。沈着後、機能性チャネルパターンは、脈管パターンを参照して上に記載のとおり、細胞外マトリクス組成物（例えば図１７ＡのステップＩＩＩに示すハイドロゲル溶液）で少なくとも部分的に囲まれていてよい。機能性チャネルパターンを少なくとも部分的に細胞外マトリクス組成物で囲むことが、１つまたは複数の機能性チャネルパターンが同時に形成され、細胞外マトリクス組成物中に包埋されるように、１つまたは複数の犠牲線維の沈着の間に生じる場合があることも企図される。機能性チャネルパターンの形成および包埋が同時に生じる場合、沈着が生じる基質は細胞外マトリクス組成物を保持する容器または細胞外マトリクス組成物それ自体であると考えられ得る。次いで第２のファジティブインクは、図１７ＡのステップＶに例示し、脈管チャネルを参照して上に記載のとおり、細胞外マトリクス組成物中に１つまたは複数の機能性チャネルを作るために除去され得る。したがって図１７Ａ（中央）および１７Ｂに示すとおり機能性チャネルネットワークは、組織構成物中に形成されてよく、この例ではそれは上皮組織構成物である。１つまたは複数の種類の生細胞（例えば上皮細胞）は、追加的犠牲線維で沈着されてよく、生細胞の少なくとも一部は、第２のファジティブインクの除去後に１つまたは複数の機能性チャネル中に残っていてよい。同様にまたは代替的に、第２のファジティブインクを除去した後に、生細胞（例えば上皮細胞）の懸濁物は、図１７ＡのステップＶＩに示すとおり、機能性チャネルに注入されてよい。
【００５４】
機能性チャネルは、管状組織または組織構成成分を規定できる。３Ｄプリントおよび上皮化を介して形成できる管状構造の例は、これだけに限らないが、ネフロン（腎臓の）、腸、乳管、尿道およびリンパを含む。そのようなプリントされた上皮組織構成物は、上皮層を含む１つまたは複数の機能性チャネルを含むことができ、細胞外マトリクス組成物は、図１７Ａ（中央）および１７Ｂに例示のとおり、１つまたは複数の機能性チャネルを少なくとも部分的に囲むことができる。間質細胞層も上皮層上に存在できる。プリントされた上皮組織構成物は、１つまたは複数の組織パターンをさらに含むことができ、上記のとおり、細胞外マトリクス組成物中にそれぞれ１つまたは複数の予め定められた細胞型の複数の生細胞を含む。生細胞および１つまたは複数の予め定められた細胞型は、上皮細胞および／または既に記載の別の細胞型を含んでよい。プリントされた上皮組織構成物は、同様に上に記載のとおり、細胞外マトリクス組成物中に脈管チャネルのネットワークをさらに含み得る。
【００５５】
例えばリンパ系の管（チャネル）のネットワークは、ファジティブインクを含む犠牲線維を使用して作られてよい。別の例では任意の所望の外形のコンパートメントは、犠牲線維を予め定められた配置の沈着によって組織構成物内に包埋され得る。そのような包埋されたコンパートメントは、増殖因子、追加的細胞ならびに／または、いくつかの実施形態では細胞挙動、分化、機能、移動および／もしくは増殖を方向付けるために犠牲線維と共に沈着される場合がある追加的足場材料を含有するために使用され得る。
【００５６】
次に上皮細胞（上皮化）で播種される、機能性チャネルを含むプリントされた上皮組織構成物は、図１７Ａ〜１７Ｆに示される。図１７Ａ〜１７Ｂを参照して、プリントされた組織構成物は、近位尿細管、ネフロンの一部である。それは、単純なまたは複雑な形状でプリントされてよく、図１７Ｃ〜１７Ｆに示すとおり成長し、機能性チャネルを囲む上皮細胞で播種され得る。使用される細胞は、ヒト腎近位尿細管細胞（ＰＴＥＣ）である；しかし、このアプローチは、上皮組織の任意の多数の種類に適用され得る。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、組織特異的疾患および毒性研究のために製作され得る。この種類の機能性ヒト組織模倣物は、より大きな臓器の増殖のため、またはハイスループットな薬物毒性およびスクリーニングのための基盤として使用され得る。
【実施例】
【００５７】
ファジティブインク
図６Ａを参照して、せん断降伏応力（ｓｈｅａｒ  ｙｉｅｌｄ  ｓｔｒｅｓｓ）（τy）を超えるせん断応力を適用される場合（例えばプリントの間）、および適用されるせん断応力がτy未満である（例えばプリント後）ときに定常せん断弾性係数（Ｇ’）がせん断粘性係数（Ｇ’’）を超える場合、強いせん断減粘応答を示す高度に濃縮された（４０質量％）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７Ａは、例示的系のためのファジティブインクとして選択される。ファジティブインク弾性は、図６Ｂに示すとおり、２２℃で約２ｘ１０4Ｐａであることが見出されている。ＣＭＴ（約４℃）未満では、インク液化およびその弾性は、桁違いに減少し、それにより組織構成物からのその除去を促進する。
上に記載のとおり、ファジティブインクから形成される犠牲線維は、１つまたは複数の追加的細胞、増殖因子、薬物などを含む場合がある。例えば、内皮、上皮および／または他の細胞は、ファジティブインク内に分散されてよく、犠牲線維で沈着されてよい。ファジティブインクが脈管（または他の）チャネルを形成するように除去される場合、細胞は残存でき、チャネルの壁を覆う。
【００５８】
このアプローチは、高度に濃縮された内皮細胞含有ファジティブ（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）インク（細胞１ｘ１０7個／ｍｌ）で実証された。ファジティブインクは、細胞外マトリクス組成物に沈着され、封入される。図１６Ａ〜１６Ｃに模式的におよび図１６Ｄ〜１６Ｇに実験的に示されるとおり、脈管チャネルを形成するためのファジティブインクの除去において、内皮細胞はチャネルの壁に付いたままである。図１６Ｇは、このアプローチを使用して作られ、２４時間にわたって灌流されている単純なチャネルを示す。内皮細胞は、チャネルを覆っていると考えられ、従来の播種アプローチを使用して作られたものに定性的に類似していると見られる。この技術は、既存の脈管チャネルを内皮細胞で播種する代替法を提供し、特に細胞が詰まって流れを妨害している可能性がある、高度に分枝状した脈管ネットワークの場合に、非均一播種を導く。
【００５９】
細胞外マトリクス組成物および材料
上に記載のとおり、ゼラチンおよびフィブリンに基づく貫通しているポリマーネットワークは開発されており、天然ＥＣＭを模倣し、組織構成物の細胞外マトリクス組成物および／または細胞外マトリクス材料のために使用され得る。
図１３Ａ〜１３Ｄは、ゼラチンフィブリンの貫通しているポリマーネットワークをまたはゼラチンフィブリンマトリクスの製作を示す。第１にゲル前駆体を最初に一緒に混合する。酵素トロンビンを介するフィブリノーゲンの重合がフィブリンゲルまたはネットワークを形成する。この相は、せん断弾性係数における増加によって示されるとおり、初期の機械的強度および剛性を提供する。次いで第２相（ゼラチン）がフィブリンゲルの周囲に形成され、２つの相はトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）を介して一緒にゆっくり架橋される。図１３Ｅおよび１３Ｆは、ゼラチンフィブリンの貫通しているポリマーネットワークについてのせん断係数対時間（Ｇ’およびＧ”）ならびに応力ひずみ曲線を示す。
【００６０】
ＴＧは、多数の生物学的機能を有する天然に存在する酵素タンパク質架橋剤であり；例えばｉｎ  ｖｉｖｏで創傷治癒の間に上方制御される場合がある。ＴＧインキュベーション時間を変更することによって、フィブリンゲルの光学的特性（例えば透明度）は、調整され得る。透明度は、フィブリンゲルの最終的なポア構造によって決定され、ローダミンタグ化フィブリノーゲンおよび共焦点顕微鏡を使用して可視化される。ＴＧおよびゼラチンが天然フィブリン重合を妨害するかどうかを決定することも興味深い。図１４に例示のとおり、フィブリンの線維性の性質が保存され、インキュベーション時間などのさまざまな処理条件を変更することによって正確に調整できることを共焦点顕微鏡画像は明らかにした。より長いフィブリンＴＧインキュベーション時間は、より高密度の線維性ネットワーク、次いでより高い光学的透明度をもたらす。
【００６１】
製作の検討の外に細胞材料相互作用は、材料選択に重要な役割を演じる。ゼラチンフィブリンマトリクスは、線維芽細胞（結合組織）、平滑筋細胞、内皮細胞および腎近位尿細管細胞（上皮）を含む多数の異なる細胞型と適合性であることが示されている。ゼラチンフィブリンマトリクスの接着力は、種々の基質上の細胞の突出した領域を比較することによって定量された。ゼラチンフィブリンマトリクスは、天然フィブリン、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）およびゼラチンメタクリレート（ＧｅｌＭａ）を含む他のすべての材料よりも性能が優れていた。図１３Ｇ〜１３Ｉは、例示的ゼラチンフィブリンマトリクス表面上に血管をつくるために不可欠な種々の細胞、線維芽細胞、内皮細胞および平滑筋細胞を示している。接着性の多様性を強調するために、図１３Ｊに例示のとおり組織特異的上皮細胞を表面上に増殖させた。
【００６２】
第２の例では、生体適合性であり、容易に処理され、安価であるゼラチンメタクリレート（ＧｅｌＭＡ）が、細胞含有製剤のための細胞外マトリクス材料としておよび封入ステップのための細胞外マトリクス組成物としての両方の使用のために選択される。ＧｅｌＭＡは、光重合可能なメタクリレート（ＭＡ）基で修飾され、マトリクスがプリント後にＵＶ光によって共有結合的に架橋されるようにする変性コラーゲンである。図６Ｃに例示のとおり、物理ゲル化は、コラーゲンに類似の構造を有する分子間三重らせんのアセンブリから生じる。濃度を変更することによって、メタクリル化の程度および温度、せん断降伏応力および水性ＧｅｌＭＡ系の弾性係数は、系統的に調整され得る。
【００６３】
細胞外マトリクス組成物は、細胞培養培地に１５質量％ＧｅｌＭＡを溶解することによって産生される。およそ２５℃以上で、組成物は１０-1Ｐａ未満のＧ’値を有する低粘性液体である。２５℃未満への冷却で、組成物はゲル化を受け、透明、粘弾性細胞外マトリクス材料を生じる。細胞外マトリクス組成物の弾性は、プリントおよびファジティブインク除去のそれぞれの典型的条件に対応する、２２℃および２℃で約１０3Ｐａおよび２ｘ１０4ＰａのＧ’値が観察されて（図６Ｄ）温度低下と共に増加する。
同じ水性ＧｅｌＭＡ組成物をプリントのための生細胞を含有する細胞含有インクを作るために使用する。先行する研究は、インテグリン結合モチーフおよびマトリクス金属プロテアーゼ感受性群の存在により、細胞がＧｅｌＭＡに接着、リモデルおよび遊走することを示した。中程度の濃度、例えば１０Ｔ１／２線維芽細胞の細胞２ｘ１０6個／ｍＬの１５質量％ＧｅｌＭＡインクへの組込み（図６Ｅおよび６Ｆ）がゲル化を確実にする温度、または目的の温度範囲、例えば２℃から４０℃での組成物の弾性を顕著に変化させないことを見出している。それにより純粋および細胞含有ＧｅｌＭＡインクの両方は、必要に応じて同じやり方でプリントでき、さらに処理され得る。
【００６４】
ファジティブＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７、純粋なＧｅｌＭＡおよび細胞含有ＧｅｌＭＡインクについて観察された熱可逆的なゲル化における差異は、３つの別々の処理ウインドウを生じる。およそ４℃から２５℃の間で各インクは、堅く、固形様応答を示し、Ｇ’＞Ｇ’’である。Ｔ≧２５℃ではＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７ファジティブインクは堅く、固形様（Ｇ’＞Ｇ’’）である一方で、純粋および細胞含有ＧｅｌＭＡインクは容易に流れる液体である。約４℃未満ではＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７ファジティブインクは容易に流れる液体である一方で純粋および細胞含有ＧｅｌＭＡインクは堅く、固形様である（Ｇ’＞Ｇ’’）。
【００６５】
脈管パターンのプリント
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７−ＧｅｌＭＡ系について上に記載の補足的な熱挙動は、次に無細胞性細胞外マトリクス組成物（純粋なＧｅｌＭＡ）中に封入される複数の犠牲線維を含む代表的な脈管パターンをプリントするために利用される。図７Ａ〜７Ｋは、１Ｄ、２Ｄおよび３Ｄ脈管ネットワークの形成ならびにチャネルの内皮化を各脈管ネットワーク設計の模式図および対応する光学画像と共に例示する。ファジティブインクを除去後、各脈管ネットワークを可視化の補助のために蛍光赤色色素で灌流する（図７Ｃ、７Ｆおよび７Ｉ）。各組織構成物内で、犠牲線維の直径は、プリント圧力、速度および／またはノズル高を修正することによって所望により変更できる。例えば４５μｍから５００μｍに増加する直径を有する１Ｄマイクロチャネルアレイは、単一の３０μｍノズルを使用して、単にプリント圧力およびノズル高を各プリント品（ｆｅａｔｕｒｅ）間で段階的様式で増加させることによってプリントされる（図７Ａ〜７Ｂ）。
ＧｅｌＭＡマトリクスを光重合後、プリント構成物を４℃未満に冷却することによってファジティブインクを除去し、オープン１Ｄマイクロチャネルを得る。図８Ａに示すこれらの１Ｄチャネルの代表的な断面画像は、それらの最終直径が約１００μｍから約１ｍｍの範囲であることを明らかにする。ＧｅｌＭＡインクがファジティブインクより高い含水量を有することからプリント脈管品は、囲んでいるマトリクスからファジティブインク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７）に水が拡散すると膨潤する場合がある。実際に、この材料系について初期マイクロチャネル直径に無関係の膨潤比を有して直径はサイズで２倍近くになる（図８Ｂ）。
【００６６】
２Ｄ脈管ネットワーク設計は、生物学系において見出される階層、二分枝化モチーフを模倣し、効率的な血流、栄養輸送および老廃物除去を最大化する一方で代謝コストを最小化するより小さなチャネルを形成するために大きなチャネルを二分枝化する。これらの２Ｄ階層的脈管ネットワークを３０μｍの単一のノズルを使用してプリントする（例えば図７Ｅおよび７Ｆ）。プリントされたままの大きなチャネル（直径６５０μｍ）は、灌流のための単一の入口および出口を提供するが、一方小さなチャネル直径（４５μｍ））は、隣接導管間の特徴的な拡散距離を低減する。図７Ｇ、７Ｈおよび７Ｉに示す、均一のマイクロチャネルの３Ｄ周期配置を含む３Ｄ毛細管ネットワーク設計を最終的にプリントする。包埋されたマイクロチャネルがすべて三次元的に相互接続されていることから、ファジティブインクは囲んでいるＧｅｌＭＡマトリクスから迅速におよび高い忠実度で除去できる。
【００６７】
脈管チャネルの播種
複数種類の液体を包埋された脈管ネットワークを通じて流すことができ、灌流可能な性質を実証する。例えば２Ｄ階層二分枝化ネットワークにヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）懸濁物を注入し、続いて穏やかにロッキングした。４８時間後、細胞は９５％を超える生存率を保持し、代表的な、二分枝マイクロチャネル内の共焦点画像化と合わせた生／死染色によって決定されるほとんどコンフルエントな層を構築することが見出される。
脈管チャネルは、ＨＵＶＥＣに加えて線維芽細胞または平滑筋細胞などの複数の細胞型で播種されてよい。ここで線維芽細胞は、ＨＵＶＥＣと同時播種される。約１週間の灌流培養後、均一に同時播種された内皮細胞および線維芽細胞は、外側を覆っている間質（ヒト皮膚線維芽細胞；ＨＮＤＦ）およびコンフルエントな内側の内皮（ＨＵＶＥＣ）の２つの別々の層に自己構築することが見出されている。図１８Ａ〜１８Ｃは、播種３日後のＨＵＶＥＣ（赤）およびＨＮＤＦ（緑）の初期の均一な分散を強調している。図１８Ｄ〜１８Ｅは、８日後の同じチャネルを示し、その時点でチャネルは、別々の外側間質性（ＨＮＤＦ）層およびコンフルエントな内皮（ＨＵＶＥＣ）層を含んでいる。コンフルエントな内皮は、細胞がコンフルエントなネットワーク（マゼンタで示す）を形成する場合に発現される内皮特異的接合部タンパク質である血管内皮カドヘリン（ＶＥ−Ｃａｄ）を染色するための免疫組織化学を使用して可視化される。
【００６８】
製作されたチャネル壁に沿って、内皮細胞の接着および増殖をさらに促進するために、壁の内側は、図９Ａ〜９Ｄに示すとおりＨＵＶＥＣ懸濁物を導入する前にフィブロネクチン溶液をチャネルを通して灌流することによってコートされてよい。同様に動物血が２Ｄ脈管ネットワークの入口に直接注入される場合、それはネットワーク全体を通って急速に出口へ流れる。これらの初期の実証は、ほとんど任意の無作為な設計の灌流可能な脈管構造を作る可能性を例示する。
【００６９】
１種を超える細胞型を含む細胞含有線維のプリント
単一のインク線維内で２つ以上細胞型の送達を可能にする細胞同時培養インクのプリントを実証する。この例ではゼラチンフィブリンマトリクス材料中のＨＮＤＦおよびＨＵＶＥＣの分散物を含む細胞含有インクは、図２０Ａ〜２０Ｃに証明されるとおりプリント線維中での自発的新規脈管構造形成を導く。これは、ＨＵＶＥＣの単一培養に基づいたプリント線維では観察されない。このアプローチは、組織特異的細胞型（例えば肝細胞、膵島（ｉｓｌｅｔ）、有足細胞、ニューロンなど）または幹細胞（例えばｉＰＳＣ、ＭＳＣなど）を含む１種を超える細胞型を含む細胞含有線維が、所望の不均一性を達成するためおよび機能を増強するためにも使用できることを示唆している。
【００７０】
細胞含有マトリクスへのファジティブインクのプリント
前述の例と同様に、細胞含有マトリクスを形成するためにＨＮＤＦおよびＨＵＶＥＣを細胞外マトリクス組成物（具体的にはゼラチンフィブリンマトリクス材料）内に分散させる。ファジティブインクは、細胞含有マトリクス上に直接プリントされ、次いでゼラチンフィブリンマトリクス材料によって封入する。ファジティブインクを脈管チャネルを形成するために排除し、脈管チャネルをＨＵＶＥＣで播種する。経時的にＨＵＶＥＣは、プリントされた細胞含有線維内でキャピラリー構造に会合することが見出される。図１９Ａ〜１９Ｄは、内皮細胞が脈管チャネルに接着するようになり、コンフルエント層を形成することを示し、図１９Ｅ〜１９Ｆはコンフルエントな血管からの小さなキャピラリーの血管新生の伸長（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）の証拠を示し、そのプロセスが細胞リモデリングおよび高レベルの生物学的プロセスの助けになることを示している。
【００７１】
この観察された挙動に寄与する２つの効果が仮定される。第１に、線維芽細胞は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）などの特異的化学的キューを通じてｉｎ  ｖｉｔｒｏで血管新生促進支持細胞であることが多数回示されており、新血管新生プロセスをしばしば導く。追加的に、マトリクス内の増殖性細胞の濃縮された集団は、拡散だけでは対処されないと考えられる広範な代謝性要求を有する。血管の数１００μｍ以内にない細胞は酸素ストレスを加えられ、最終的には壊死性になることは広く認められている。ｉｎ  ｖｉｖｏで、壊死を予防するための無脈管性構造への宿主脈管構造の必要性が観察されている。
【００７２】
貫通している脈管構造を含む組織構成物のプリント
血管が豊富な組織構成物の製作を実証するために、複数の種類の細胞および細胞外マトリクス組成物、さまざまな設計の３Ｄ不均一構造をプリントする。
第１の構造は、平面の中および外にプリントされた半織品からなる（図１０Ａ〜１０Ｇ）。この４層組織構成物は、それぞれ異なる細胞型および、ファジティブインクを含む犠牲線維から形成された脈管パターンを含む２つの組織パターンを含む。組織構成物は、４種のインク：ＰＤＭＳ、ファジティブＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７および２つの異なる細胞含有ＧｅｌＭＡインクをプリントし、層ごとに構築された配列で産生され、プリント品を完全に封入するために３７℃で純粋なＧｅｌＭＡインクを沈着することおよび、最後にＧｅｌＭＡマトリクスに架橋するための光重合化が続いた。この３Ｄ構造は、理解され、プリント可能性を実証するために製作され、全４層プリント構成物を通じて共焦点画像を作製した。
【００７３】
既に示したとおり、ＰＤＭＳインクを各組織構成物を囲み、封入ステップのために使用される純粋なＧｅｌＭＡインクのための型として役立つ高アスペクト比境界の形態で最初にプリントする。ファジティブインクおよび、緑色蛍光タンパク質を発現しているヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＨＮＤＦ）または、非蛍光１０Ｔ１／２ｓの確立されたマウス線維芽細胞系いずれかを含有している細胞含有ＧｅｌＭＡインクの両方を、細胞２ｘ１０6個／ｍＬの濃度で２００μｍノズルを通して予め規定した逐次的工程で同時プリントする。図１０Ｃは、プリント直後の３Ｄ構造の画像を示す。緑色蛍光チャネルだけを明視野画像上に重ね、それによりプリントされた細胞チャネルは容易に可視化できる。製作後ファジティブインクを液化し、３Ｄ構成物から除去する。排除手順は、空のシリンジチップを入口および出口マイクロチャネルに置くこと、および次いで中程度の真空下で脈管ネットワーク全体を吸引排除することを含む。除去工程は、急速であり、高い忠実度で、上に記載のとおり次いで内皮化される貫通している脈管構造をもたらす。
組織構成物の特性決定
顕微鏡を使用して、独立して染色される（緑−ＧＦＰ  ＨＮＤＦ、青−１０Ｔ１／２および赤−ＨＵＶＥＣ）３つの細胞型の位置を特定する。この操作された組織構成物の半織性質は、図１０Ｂ〜１０Ｄに示す模式図および画像において明らかに見られる。共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して、この３Ｄ組織構成物を完全に調べ、各細胞の正確な位置を決定することが可能である。培養２日後にＸＹ、ＸＺおよびＹＺで３Ｄプリントされた構造の共焦点顕微鏡画像を図１０Ｇに示す。このアプローチの多用途性を実証するために、他の３Ｄ組織構成物も設計し、プリントした。高密度のため共焦点画像を得ることは困難であるが、細胞含有線維の貫通する性質、ＧｅｌＭＡ中の緑色蛍光タンパク質発現ＨＮＤＦおよび３Ｄ脈管構造ネットワークを覆う赤−ＨＵＶＥＣの両方は可視である。
【００７４】
細胞生存率の調査
最終ステップとして、プリントされた１０Ｔ１／２線維芽細胞の生存率を１週間の経過にわたって調査した。０日目に細胞生存率は６１％であった；しかし７日後に８２％に増加した。対照（０日目に７８％）と比較して低い初期細胞生存率がある一方で、プリントされた細胞は増殖し、経時的に伝播し、培養で１週間後に同様のレベルの生存率を導く。初期生存率の減少は、プリント工程の間に細胞が経験するせん断または伸展ストレスから生じる可能性がある。適用した圧力、ノズル直径、細胞型および環境条件は、プリント後の細胞生存率に影響を与える場合がある。別の決定的なパラメーターは、所望の操作された組織構成物をプリントするために必要な構築時間である。細胞含有インクを損なわずにインクリザーバーに保管できる最大時間がある場合がある。しかし既に報告されている高スループット、複数材料プリントのための複数ノズルプリントヘッドの導入（Ｊ．Ａ．Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、“Ｍｕｌｔｉｎｏｚｚｌｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｗｒｉｔｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４４７９４号、２０１２年６月２９日出願、参照により本明細書に組み込まれる）は、単一のノズルプリントと比較して特徴的な構築時間を２桁低減できる。例えば、典型的な成体ヒト肝臓に匹敵する操作された組織構成物用量１０００ｃｍ3をプリントすることは、単一の２００μｍノズルを使用して典型的なプリント速度でおよそ７２時間必要である。しかし６４複数ノズルアレイの導入は、それぞれ構築時間を約１時間に低減できる。
【００７５】
新規アプローチが、必要に応じて３Ｄバイオプリンティングを介して脈管化、不均一組織構成物を作るために、開発され、本開示に記載されている。この高度に拡張性があるプラットフォームは、脈管構造、複数の細胞型および任意選択で、薬物、毒素、タンパク質および／またはホルモンなどの他の機能性化学的物質が、細胞外マトリクス内の所望の位置にプログラム可能に位置付けられている操作された組織構成物の製作を可能にする。この技術は、移植のために必要な機能性３Ｄ組織および臓器の迅速な産生を導き得る。
【００７６】
本発明は、その特定の実施形態を参照して特に詳細に記載されているが、他の実施形態は、本発明から逸脱することなく可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の精神および範囲は、本明細書に含まれる好ましい実施形態の記載に限定されるべきではない。文理上または同等性によってのいずれかで特許請求の範囲の意味内に入るすべての実施形態は、本明細書に含まれる。
【００７７】
さらに、上に記載の利点は必ずしも本発明の唯一の利点ではなく、記載された利点のすべてが本発明のすべての実施形態で達成されることは必ずしも予測されない。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕それぞれ複数の生細胞を含む１つまたは複数の細胞含有線維を基質上に１つまたは複数の組織パターンを形成するように沈着させるステップであって、組織パターンのそれぞれが１つまたは複数の予め定められた細胞型を含むステップ；
１つまたは複数の犠牲線維を基質上に１つまたは複数の組織パターンを貫通する脈管パターンを形成するように沈着させるステップであって、犠牲線維のそれぞれがファジティブインクを含むステップ；
細胞外マトリクス組成物で１つまたは複数の組織パターンおよび脈管パターンを少なくとも部分的に囲むステップ、
細胞外マトリクス組成物中に脈管チャネルを作るようにファジティブインクを除去し、それにより貫通している脈管ネットワークを組織構成物中に形成するステップ
を含む、包埋された脈管構造を有する組織構成物をプリントする方法。
〔２〕１つまたは複数の細胞含有線維のそれぞれが細胞外マトリクス材料をさらに含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕細胞外マトリクス材料がゼラチン、フィブリンおよびゼラチンメタクリレートの１つまたは複数を含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔４〕１つまたは複数の細胞含有線維の少なくとも１つが：薬物、小分子、毒素、タンパク質およびホルモンからなる群から選択される１つまたは複数の機能性化学的物質をさらに含む、前記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５〕１つまたは複数の細胞含有線維のそれぞれが細胞１個／ｍｌから細胞約１０9個／ｍｌの細胞濃度を有する、前記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６〕細胞濃度が１つまたは複数の細胞含有線維のそれぞれ全体を通じて均一である、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕組織微細構造がｎ個までの予め定められた細胞型を含み、ｎが２≦ｎ≦３００を満たす正の整数である、前記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法。
〔８〕１つまたは複数の細胞含有線維および１つまたは複数の犠牲線維が±１００μｍの位置精度で沈着される、前記〔１〕から〔７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕位置精度が±１０μｍである、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕１つまたは複数の細胞含有線維のそれぞれおよび１つまたは複数の犠牲線維のそれぞれが基質上に沈着される前に室温でノズルから押し出される、前記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１１〕Ｎ個のノズルが押し出しのために使用され、２≦Ｎ≦１０２４である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕ファジティブインクを除去するステップが１つまたは複数の犠牲線維を冷却するステップを含む、前記〔１〕から〔１１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１３〕追加的生細胞が１つまたは複数の犠牲線維と共に沈着され、追加的生細胞の少なくとも一部がファジティブインクの除去後に脈管チャネルに残る、前記〔１〕から〔１２〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１４〕追加的生細胞が内皮細胞を含む、前記〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕ファジティブインクを除去するステップの後に、内皮細胞の懸濁物を脈管チャネルに注入するステップをさらに含む、前記〔１〕から〔１４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１６〕細胞外マトリクス組成物で１つまたは複数の組織パターンおよび脈管パターンを少なくとも部分的に囲む前に、型を形成するように基質上に１つまたは複数の構造線維を層ごとに沈着させるステップをさらに含む、前記〔１〕から〔１５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１７〕型がファジティブインクの除去後のその灌流のために脈管チャネルとの流体連絡中に流路を含む、前記〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕機能性チャネルパターンを形成するように１つまたは複数の追加的犠牲線維を基質上に沈着させるステップであって、追加的犠牲線維のそれぞれが第２のファジティブインクを含むステップ；
細胞外マトリクス組成物で機能性チャネルパターンを少なくとも部分的に囲むステップ、および
細胞外マトリクス組成物中に１つまたは複数の機能性チャネルを作るように第２のファジティブインクを除去し、それにより組織構成物中に機能性チャネルネットワークを形成するステップ
をさらに含む、前記〔１〕から〔１７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔１９〕追加的生細胞が１つまたは複数の追加的犠牲線維と共に沈着され、第２のファジティブインクの除去後に追加的生細胞の少なくとも一部が１つまたは複数の機能性チャネル中に残る、前記〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕第２のファジティブインクを除去するステップの後に、追加的生細胞の懸濁物を１つまたは複数の機能性チャネルに注入するステップをさらに含む、前記〔１８〕または〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕追加的生細胞が上皮細胞を含む、前記〔１９〕または〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕１つまたは複数の組織パターンおよび脈管パターンを少なくとも部分的に細胞外マトリクス組成物で囲むステップが１つまたは複数の細胞含有線維および１つまたは複数の犠牲線維の沈着の間に生じ、それにより１つまたは複数の組織パターンおよび脈管パターンが細胞外マトリクス組成物中に形成され、同時に包埋される、前記〔１〕から〔２１〕のいずれか１項に記載の方法。
〔２３〕細胞外マトリクス組成物がミクロゲルおよび細胞外マトリクス材料を含む、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕ミクロゲルがポリアクリル酸を含み、細胞外マトリクス材料がゼラチンメタクリレートを含む、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２５〕１つまたは複数の予め定められた細胞型の複数の生細胞を各組織パターンが含んでいる１つまたは複数の組織パターン；
１つまたは複数の組織パターンを貫通する脈管チャネルのネットワーク；および
１つまたは複数の組織パターンおよび脈管チャネルのネットワークを少なくとも部分的に囲んでいる細胞外マトリクス組成物
を含む、包埋された脈管構造を有するプリントされた組織構成物。
〔２６〕ｎ個までの予め定められた細胞型を含み、ｎが２≦ｎ≦３００を満たす正の整数である、前記〔２５〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔２７〕生細胞が：生殖細胞、体細胞および幹細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞である、前記〔２５〕または〔２６〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔２８〕細胞外マトリクス組成物が合成または天然由来生体材料を含む、前記〔２５〕から〔２７〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔２９〕細胞外マトリクス組成物がハイドロゲルを含む、前記〔２８〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔３０〕細胞外マトリクス組成物がゼラチン、フィブリンおよびゼラチンメタクリレートの１つまたは複数を含む、前記〔２８〕または〔２９〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔３１〕細胞外マトリクス組成物がミクロゲルをさらに含む、前記〔３０〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔３２〕細胞外マトリクス組成物が脈管チャネルのネットワークを完全に囲んでいる、前記〔２５〕から〔３１〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔３３〕生細胞が１つまたは複数の組織パターンのそれぞれ全体を通じて均一に分散されている、前記〔２５〕から〔３２〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔３４〕１つまたは複数の組織パターンのそれぞれの生細胞の少なくともいくつかが１つまたは複数の脈管チャネルから約１ｍｍ以下の距離で沈着される、前記〔２５〕から〔３３〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔３５〕距離が約３００μｍ以下である、前記〔３４〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔３６〕１つまたは複数の組織パターンのそれぞれが生細胞を含む１つまたは複数の細胞含有線維の配置によって規定される、前記〔２５〕から〔３５〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔３７〕１つまたは複数の細胞含有線維が細胞外マトリクス材料をさらに含む、前記〔３６〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔３８〕細胞外マトリクス材料がゼラチン、フィブリンおよびゼラチンメタクリレートの１つまたは複数を含む、前記〔３７〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔３９〕１つまたは複数の細胞含有線維の少なくとも１つが：薬物、小分子、毒素、タンパク質およびホルモンからなる群から選択される１つまたは複数の機能性化学的物質をさらに含む、前記〔２５〕から〔３８〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔４０〕細胞外マトリクス組成物が１つまたは複数の添加物を含み、前記１つまたは複数の添加物が１つまたは複数の細胞含有線維から拡散される、前記〔３９〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔４１〕脈管チャネルのネットワークが分枝構造を有し、前記ネットワークが１つまたは複数の二分枝を含んでいる、前記〔２５〕から〔４０〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔４２〕１つまたは複数の脈管チャネルが曲線である、前記〔２５〕から〔４１〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔４３〕１つまたは複数の脈管チャネルがその長さに沿って不均一な直径を有する、前記〔２５〕から〔４２〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔４４〕１つまたは複数の脈管チャネルが内皮層を含み、前記内皮層が少なくとも約７０％の培養密度を有する、前記〔２５〕から〔４３〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔４５〕内皮層が１００％の培養密度を有する、前記〔４４〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔４６〕１つまたは複数の脈管チャネルが内皮層上に間質細胞層または平滑筋細胞層をさらに含む、前記〔４４〕または〔４５〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔４７〕細胞外マトリクス組成物中に１つまたは複数の機能性チャネルをさらに含む、前記〔２５〕から〔４６〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔４８〕１つまたは複数の機能性チャネルが上皮層を含む、前記〔４７〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔４９〕１つまたは複数の機能性チャネルが上皮層上に間質細胞層をさらに含む、前記〔４８〕に記載のプリントされた組織構成物。
〔５０〕細胞外マトリクス組成物を少なくとも部分的に囲む界面構造をさらに含み、脈管チャネルのネットワークとの流体連絡中に流路を含む、前記〔２５〕から〔４９〕のいずれか１項に記載のプリントされた組織構成物。
〔５１〕１つまたは複数の犠牲線維を基質上に機能性チャネルパターンを形成するように沈着させるステップであって、犠牲線維のそれぞれがファジティブインクおよび複数の上皮細胞を含むステップ；
細胞外マトリクス組成物で機能性チャネルパターンを少なくとも部分的に囲むステップ、
細胞外マトリクス組成物中に１つまたは複数の機能性チャネルを作るためにファジティブインクを除去し、ファジティブインクの除去後に１つまたは複数の機能性チャネル中に上皮細胞の少なくとも一部が残り、それにより上皮組織構成物を形成するステップ
を含む、上皮組織構成物をプリントする方法。
〔５２〕細胞外マトリクス組成物で機能性チャネルパターンを少なくとも部分的に囲むステップが１つまたは複数の犠牲線維の沈着の間に生じ、それにより１つまたは複数の機能性チャネルパターンが細胞外マトリクス組成物中に形成され、同時に包埋される、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕それぞれ複数の生細胞を含む１つまたは複数の細胞含有線維を基質上に１つまたは複数の組織パターンを形成するように沈着させるステップであって、組織パターンのそれぞれが１つまたは複数の予め定められた細胞型を含むステップ、をさらに含む前記〔５１〕または〔５２〕に記載の方法。
〔５４〕生細胞および１つまたは複数の予め定められた細胞型が上皮細胞を含む、前記〔５３〕に記載の方法。
〔５５〕ファジティブインクを除去するステップの後に、上皮細胞および／または間質細胞の懸濁物を１つまたは複数の機能性チャネルに注入するステップをさらに含む、前記〔５１〕から〔５４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５６〕上皮組織構成物が：ネフロン、腸、乳管、尿道およびリンパからなる群から選択される、前記〔５１〕から〔５５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５７〕上皮層を含む１つまたは複数の機能性チャネル；および
１つまたは複数の機能性チャネルを少なくとも部分的に囲んでいる細胞外マトリクス組成物
を含む、プリントされた上皮組織構成物。
〔５８〕１つまたは複数の機能性チャネルが上皮層上に間質細胞層をさらに含む、前記〔５７〕に記載のプリントされた上皮組織構成物。
〔５９〕１つまたは複数の組織パターンをさらに含み、各組織パターンが１つまたは複数の予め定められた細胞型の複数の生細胞を含み、細胞外マトリクス組成物が１つまたは複数の組織パターンを少なくとも部分的に囲んでいる、前記〔５７〕または〔５８〕に記載のプリントされた上皮組織構成物。
〔６０〕生細胞および１つまたは複数の予め定められた細胞型が上皮細胞を含む、前記〔５９〕に記載のプリントされた上皮組織構成物。
〔６１〕細胞外マトリクス組成物中に脈管チャネルのネットワークをさらに含む、前記〔５７〕から〔６０〕のいずれか１項に記載のプリントされた上皮組織構成物。
〔６２〕ネフロン、腸、乳管、尿道、膵管およびリンパからなる群から選択される、前記〔５７〕から〔６１〕のいずれか１項に記載のプリントされた上皮組織構成物。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６Ａ−６Ｆ】
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【図７Ａ−７Ｋ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図９Ａ−９Ｄ】
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【図１０Ａ−１０Ｇ】
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【図１１Ａ−１１Ｃ】
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【図１２Ａ−１２Ｆ】
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【図１３Ａ−１３Ｊ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ−１５Ｇ】
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【図１６Ａ−１６Ｇ】
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【図１７Ａ−１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ−１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
0006712220.tif 000036
【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ−２１Ｆ】
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【図２２】
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