(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＨＳＤ７Ａ（トロンボスポンジン、Ｉ型、ドメイン含有７Ａ）タンパク質を認識する１または複数の自己抗体を、患者における膜性腎症の指標とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、該患者から取得された生物学的試料中の、該１または複数の自己抗体を検出するステップを含む、方法。
【請求項２】
（ｉ）前記患者から取得された生物学的試料を、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片と接触させるステップ、および
（ｉｉ）形成された任意の抗原−抗体複合体を検出するステップ
を含み、抗原−抗体複合体の存在は膜性腎症を示す、請求項１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項３】
前記膜性腎症が特発性膜性腎症である、請求項１または２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項４】
前記生物学的試料が血液試料である、請求項１から３のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項５】
前記患者がＰＬＡ２Ｒ１陰性患者である、請求項１から４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項６】
２つの時点の自己抗体のレベルを、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症に対する処置の有効性の指標とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）第１の時点において、該第１の時点において該患者から取得された試料中の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルを決定するステップ、
（ｉｉ）第２の時点において、該第２の時点において該患者から取得された試料中の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルを決定するステップ、および
（ｉｉｉ）該２つの時点の自己抗体のレベルを比較するステップ
を含み、
・該第１の時点と比較した該第２の時点における抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルにおける減少は、該処置が有効であることを示し、および／または
・該第１の時点と比較した該第２の時点における抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルにおける増加は、該処置が有効でないことを示す、
方法。
【請求項７】
前記ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片でコーティングされたデバイスの使用を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
患者における膜性腎症を診断および／または予後判定するためのキットであって、
・ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片、および
・ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片と、生物学的試料中に存在するＴＨＳＤ７Ａに対する自己抗体との間で形成された抗原−抗体複合体の検出のための試薬を含む、キット。
【請求項９】
ＰＬＡ２Ｒ１ポリペプチドまたはその抗体結合性断片をさらに含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片でコーティングされた、膜性腎症を診断および／または予後判定するためのデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜性腎症、特に特発性膜性腎症を有する患者の生物学的試料中に存在する自己抗体によって特異的に認識されるバイオマーカー自己抗原に関する。
【０００２】
本発明は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断、予後判定、モニタリングおよび処置するための方法およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
膜性腎症は、ネフローゼ症候群の一般的な原因である。膜性腎症症例の約１５％は、薬物、感染症、腫瘍、免疫疾患．．．によって引き起こされる二次性膜性腎症である。膜性腎症症例の残り８５％は、特発性であり、自己免疫性原発性膜性腎症とも呼ばれる。その起源は未知のままである。処置を受けなかった特発性膜性腎症を有する患者の約半分は、透析または腎移植を必要とする末期の腎疾患を発症する。腎臓移植片のうち、それらの約４０％は再燃する。
【０００４】
ＰＬＡ２Ｒ１は、特発性膜性腎症における主要な自己抗原として記載されており、腎臓グラフトの前および後の両方で、特発性膜性腎症の診断およびその処置のモニタリングに使用され得る。この自己抗原に基づく可能な治療戦略もまた、報告されている。
【０００５】
しかし、特発性膜性腎症に罹患している患者のうち約７０％のみが抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体を有し、これは、他の自己抗原および対応する自己抗体が、残り３０％の症例に関与する可能性があることを示唆している。したがって、ＰＬＡ２Ｒ１自己抗原に基づいて追跡することができない患者の３０％についての診断、予後判定およびセラグノシス（theragnosis）の対応する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、膜性腎症における新規自己抗原としてのトロンボスポンジンＩ型ドメイン含有７Ａ（ＴＨＳＤ７Ａ）の同定、ならびに患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断および／または予後判定するための対応するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、この方法は、患者から取得された生物学的試料中の、ＴＨＳＤ７Ａタンパク質を認識する１または複数の自己抗体を検出するステップを含む。
【０００７】
一実施形態では、このｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、
（ｉ）患者から取得された生物学的試料を、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片と接触させるステップ、および
（ｉｉ）形成された任意の抗原−抗体複合体を検出するステップ
を含み、抗原−抗体複合体の存在は膜性腎症を示す。
【０００８】
好ましくは、この生物学的試料は血液試料である。
【０００９】
本発明は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症に対する処置の有効性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、この方法は、
（ｉ）第１の時点において、この第１の時点において患者から取得された試料中の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルを決定するステップ、
（ｉｉ）第２の時点において、この第２の時点において患者から取得された試料中の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルを決定するステップ、および
（ｉｉｉ）これら２つの時点の自己抗体のレベルを比較するステップ
を含み、
・第１の時点と比較した第２の時点における抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルにおける減少は、その処置が有効であることを示し、かつ／または
・第１の時点と比較した第２の時点における抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルにおける増加は、その処置が有効でないことを示す。
【００１０】
本発明は、患者における膜性腎症を診断および／または予後判定するためのキットをさらに提供し、このキットは、
・ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片、および
・生物学的試料中に存在する自己抗原と自己抗体との間で形成された抗原−抗体複合体の検出のための試薬
を含む。
【００１１】
本発明はまた、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断および／または予後判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、この方法は、患者から取得された生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａレベルを決定するステップを含む。
【００１２】
一実施形態では、この方法は、
（ｉ）患者から取得された生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａタンパク質のレベルを測定するステップ、
（ｉｉ）このレベルを参照レベルと比較するステップ
を含み、参照レベルと比較したＴＨＳＤ７Ａタンパク質の増加したレベルは、膜性腎症を示す。
【００１３】
好ましくは、この生物学的試料は、腎臓生検または血液試料である。
【００１４】
最後に、本発明は、膜性腎症を処置するための、治療方法、医薬組成物および使用に関する。
【００１５】
実際、本発明は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を処置するための方法に関し、この方法は、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体を患者における試料からｅｘ  ｖｉｖｏで除去するステップを含む。
【００１６】
本発明はまた、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を処置するための方法に関し、この方法は、治療有効量の、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片を発現するベクター、またはこのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片を発現する宿主細胞を投与するステップを含む。
【００１７】
さらに、本発明は、膜性腎症の処置における使用のための、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片（このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片を発現するベクター、またはこのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片を発現する宿主細胞）、および特に、膜性腎症、より特には特発性膜性腎症の処置のための、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片（このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片を発現するベクター、またはこのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片を発現する宿主細胞）を含む医薬組成物に関する。
【００１８】
好ましくは、本発明の治療方法、医薬組成物および使用について、この患者はＴＨＳＤ７Ａ陽性患者である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
患者における膜性腎症を診断および／または予後判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、該患者から取得された生物学的試料中の、ＴＨＳＤ７Ａ（トロンボスポンジン、Ｉ型、ドメイン含有７Ａ）タンパク質を認識する１または複数の自己抗体を検出するステップを含む、方法。
（項目２）
（ｉ）前記患者から取得された生物学的試料を、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片と接触させるステップ、および
（ｉｉ）形成された任意の抗原−抗体複合体を検出するステップ
を含み、抗原−抗体複合体の存在は膜性腎症を示す、項目１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目３）
前記膜性腎症が特発性膜性腎症である、項目１または２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目４）
前記生物学的試料が血液試料である、項目１から３のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目５）
前記患者がＰＬＡ２Ｒ１陰性患者である、項目１から４のいずれか一項に記載のｉｎ
ｖｉｔｒｏ方法。
（項目６）
患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症に対する処置の有効性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）第１の時点において、該第１の時点において該患者から取得された試料中の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルを決定するステップ、
（ｉｉ）第２の時点において、該第２の時点において該患者から取得された試料中の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルを決定するステップ、および
（ｉｉｉ）該２つの時点の自己抗体のレベルを比較するステップ
を含み、
・該第１の時点と比較した該第２の時点における抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルにおける減少は、該処置が有効であることを示し、および／または
・該第１の時点と比較した該第２の時点における抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルにおける増加は、該処置が有効でないことを示す、
方法。
（項目７）
前記ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片でコーティングされたデバイスの使用を含む、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
患者における膜性腎症を診断および／または予後判定するためのキットであって、
・ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片、および
・ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片と、生物学的試料中に存在するＴＨＳＤ７Ａに対する自己抗体との間で形成された抗原−抗体複合体の検出のための試薬を含む、キット。
（項目９）
ＰＬＡ２Ｒ１ポリペプチドまたはその抗体結合性断片をさらに含む、項目８に記載のキット。
（項目１０）
患者における膜性腎症を診断および／または予後判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、該患者から取得された生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａレベルを決定するステップを含む、方法。
（項目１１）
（ｉ）前記患者から取得された生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａタンパク質のレベルを測定するステップ、
（ｉｉ）該レベルを参照レベルと比較するステップ
を含み、該参照レベルと比較したＴＨＳＤ７Ａタンパク質の増加したレベルは、膜性腎症を示す、項目１０に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目１２）
前記膜性腎症が特発性膜性腎症である、項目１０または１１に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目１３）
前記生物学的試料が腎臓生検である、項目１０から１２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目１４）
膜性腎症を処置するための使用のための、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片。
（項目１５）
前記膜性腎症が特発性膜性腎症である、項目１４に記載の使用のためのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片。
（項目１６）
患者がＴＨＳＤ７Ａ陽性患者である、項目１４または１５に記載の使用のためのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片。
（項目１７）
ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片でコーティングされたデバイス。
（項目１８）
ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片および薬学的に許容されるキャリアを含む、医薬組成物。
（項目１９）
膜性腎症を処置するための使用のための、項目１８に記載の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、膜性腎症を有する患者における未知の抗原に対する自己抗体の検出を示す図である。Ａ．膜性腎症（ＭＮ）を有する患者由来の血清および対照患者由来の血清でプローブした、ヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）に対するウエスタンブロッティングの結果。これらの試験した患者の大部分（８８％）は、Ｈａｍｂｕｒｇの既存の血清バンクから得、残りの血清は、Ｎｉｃｅの患者のコホートからのものであった。このパネルは、異なる反応性パターンの代表的画像を示している：示されたＭＮ血清のうち３つ（ＭＮ２〜ＭＮ４）は、サイズがおよそ２５０ｋＤａの糸球体タンパク質と反応したが、組換えホスホリパーゼＡ２受容体（ｒＰＬＡ２Ｒ１）とは反応しなかった。１つのＭＮ血清（ＭＮ３６）が、ほぼ１８０ｋＤａの糸球体タンパク質ならびに組換えＰＬＡ２Ｒ１を認識した。１つのＭＮ血清（ＭＮ６）、１つは微小変化群（ＭＣＤ）を有し１つは巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）を有する、タンパク尿対照由来の２つの血清、および１つの健康なドナーについては、反応性は見られない。Ｂ．抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体について陰性であった膜性腎症（ＭＮ）を有する６９人の患者のうち、６人が２５０ｋＤａ抗原と反応した。これら６人のうち５人は、特発性ＭＮを有し、１人は陽性抗核抗体（ＡＮＡ）を伴う二次性ＭＮを有した。抗ＰＬＡ２Ｒ１陽性患者（ｎ＝６０）、他の糸球体疾患を有する患者（ｎ＝７６）または健康な対照（ｎ＝４４）では、反応性は見られなかった。
【図２】図２は、標的抗原の同定を示す図である。Ａ．反応性血清および非反応性血清を用いた、ヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）、およびトロンボスポンジン１型ドメイン含有７Ａ（ｒＴＨＳＤ７Ａ）を過剰発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のウエスタンブロッティングの結果。このパネルは、その血清がＨＧＥおよびｒＴＨＳＤ７Ａの両方と反応した、膜性腎症（ＭＮ）を有する３人の患者（ＭＮ１〜ＭＮ３）、１人の非反応性ＭＮ患者（ＭＮ３６）、微小変化群（ＭＣＤ）を有する１人の非反応性患者、ならびに１人の非反応性の健康な対照患者の代表的画像を示している。ｒＴＨＳＤ７Ａは、翻訳後修飾における差異に起因する可能性が最も高く、糸球体溶解物中に含まれるネイティブタンパク質よりもわずかに低い位置に移動した。Ｂ．ヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）の溶解物からのＴＨＳＤ７Ａの免疫沈降の結果。ＨＧＥを、ＭＮを有する患者および対照由来の反応性および非反応性血清試料と共にインキュベートし、その後、ヒトＩｇＧ４親和性マトリックスを添加した。試料を遠心分離し、免疫沈降物を、還元条件下で電気泳動し、ＰＶＤＦメンブレン上にブロットし、ポリクローナルウサギ抗ＴＨＳＤ７Ａ抗体を用いて検出した。ＭＮを有する患者由来の５つ全ての反応性血清は、ＨＧＥから標的抗原を免疫沈降させ（ＭＮ１〜ＭＮ５）、１つの非反応性ＭＮ血清（ＭＮ９）ならびに健康な対照患者由来の１つの血清は、免疫沈降させなかった。この実験において血清を水で置き換えた場合には、免疫沈降は生じなかった。
【図３】図３は、抗ＴＨＳＤ７Ａ抗体とＭＮ患者の臨床過程との間の関係性を示す図である。膜性腎症を有する１人の患者由来の連続血清試料を用いた、等体積のヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）のウエスタンブロッティングの結果。タンパク尿における初期の減少後、この患者は、２０１２年９月に重症の浮腫および重いタンパク尿を発症した。シクロスポリンＡおよびステロイドによる免疫抑制処置を開始したところ、この患者が２０１４年１月に部分的寛解に達するまで、タンパク尿は減少した。疾患活性のこの発達は、免疫抑制処置の開始後のウエスタンブロットシグナルの減少によって反映される。
【図４】図４は、大きいＴＨＳＤ７Ａタンパク質（１６５７アミノ酸）の分子構造を示す図である。ＴＳＨＤ７Ａタンパク質は、シグナルペプチド、少なくとも１０個のトロンボスポンジン１型リピート（そのうちいくつかは、トリプトファンリッチ配列を含む）および１つのＲＧＤモチーフを含む大きい細胞外部分、アミノ酸残基１６０８において始まる膜貫通ドメイン、ならびに短い細胞内尾部からなる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明者らは、新たな自己抗原、トロンボスポンジンＩ型ドメイン含有７Ａ（ＴＨＳＤ７Ａ）タンパク質に対して反応性の、特発性膜性腎症に罹患している患者における自己抗体の存在を強調した。
【００２１】
これらの自己抗体は、抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体を提示しない特発性膜性腎症に罹患している患者の約１５％の血清中に存在する。これは、膜性腎症に罹患している患者の総集団の約５〜１０％を示す。
【００２２】
本発明者らは、患者において見出される抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の大部分が、ＩｇＧ４サブクラスのものであることを示した；サブクラスＩｇＧ３、ＩｇＧ２およびＩｇＧ１もまた見出される。
【００２３】
定義
用語「膜性腎症」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、成人ネフローゼ症候群のよくある原因である腎疾患を指す。これは、全身性エリテマトーデス、Ｂ型肝炎または梅毒（．．．）などの二次的要因によって引き起こされる二次性膜性腎症、および「特発性膜性腎症」とも呼ばれる原発性自己免疫性膜性腎症を包含する。「特発性膜性腎症」は、糸球体を標的化する自己免疫疾患であるとみなされ、主要な公知の標的抗原は自己抗原ＰＬＡ２Ｒ１である。
【００２４】
本明細書に開示される全ての疾患、障害および症状は、本願の出願時における教科書によって証明されるような、当技術分野で受容された一般的意味を有する。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「膜性腎症を示す」とは、プロセスまたは事象に適用される場合、そのプロセスまたは事象が、健康な被験体および／または膜性腎症以外の疾患に罹患している患者においてよりも、膜性腎症に罹った患者において有意により頻繁に見出されるような、膜性腎症の診断であるプロセスまたは事象を指す。
【００２６】
用語「バイオマーカー」および「マーカー」は、本明細書で相互交換可能に使用される。これらは、生物学的プロセス、生物学的事象および／または病的状態の特徴的指標である物質を指す。本発明によれば、ＴＨＳＤ７Ａタンパク質（またはＴＨＳＤ７Ａポリペプチド）およびその任意の抗体結合性断片ならびに抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体は、膜性腎症、特に特発性膜性腎症のバイオマーカーである。
【００２７】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書で相互交換可能に使用され、それらの中性（非荷電）形態でのまたは塩として、および、未改変の、またはグリコシル化、側鎖酸化、リン酸化、シトルリン化もしくはトランスグルタミネーション（transglutamination）によって改変された、種々の長さのアミノ酸配列を指す。ある特定の実施形態では、このアミノ酸配列は、全長ネイティブタンパク質である。他の実施形態では、このアミノ酸配列は、全長タンパク質のより小さい断片である。なお他の実施形態では、このアミノ酸配列は、アミノ酸側鎖に結合されたさらなる置換基、例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端に付加されたタンパク質タグ、グルコシル単位、脂質、またはホスフェートなどの無機イオン、ならびにスルフヒドリル基の酸化などの鎖の化学的変換に関連する改変によって、改変される。したがって、用語「タンパク質」（またはその等価な用語）は、その特定の特性を有意には変化させない改変にさらされる、全長ネイティブタンパク質またはその断片のアミノ酸配列を含むことを意図する。特に、用語「タンパク質」は、タンパク質アイソフォーム、即ち、同じ遺伝子によってコードされるが、そのｐＩもしくはＭＷまたは両方が異なるバリアントを包含する。かかるアイソフォームは、そのアミノ酸配列が（例えば、選択的スプライシングまたは限定的なタンパク質分解の結果として）異なり得、または代替法では、差次的翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、アシル化、リン酸化）から生じ得る。
【００２８】
用語ＴＨＳＤ７Ａ（トロンボスポンジンＩ型ドメイン含有７Ａ）は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、有足細胞上で高度に発現され、ＦＡＫ依存的機構を介した血管新生の間の内皮細胞遊走および糸状仮足形成に関与する、１６５７アミノ酸のタンパク質を指す。この用語は、天然に存在するＴＨＳＤ７Ａならびにそのバリアントおよび改変形態を含み得る。ＴＨＳＤ７Ａは、任意の供給源由来であり得るが、典型的には、哺乳動物（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類または他の哺乳動物種）ＴＨＳＤ７Ａ、特にヒトＴＨＳＤ７Ａである。例示的なヒトネイティブＴＨＳＤ７Ａアミノ酸配列は、Ｑ９ＵＰＺ６（ＵｎｉＰｒｏｔデータベース）およびＮＰ＿０５６０１９（ＧｅｎＰｅｐｔデータベース、前駆体配列）に提供され、例示的なヒトネイティブＴＨＳＤ７Ａ  ｍＲＮＡ配列は、ＮＭ＿０１５２０４（ＧｅｎＢａｎｋデータベース、前駆体配列）に提供される。ＴＨＳＤ７Ａタンパク質の構造は、図４に示される。
【００２９】
本明細書で使用する場合、表現「ＴＨＳＤ７Ａの断片」とは、ＴＨＳＤ７Ａの連続的エレメントを指す。典型的には、この断片は、生物学的に活性な断片である、即ち、ＴＨＳＤ７Ａの１または複数の機能的特性を含む。
【００３０】
本発明の文脈では、ＴＨＳＤ７Ａの「断片」は、ＴＨＳＤ７Ａのアミノ酸配列全体の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を含む、好ましくは、ＴＨＳＤ７Ａのアミノ酸配列全体の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％からなる。
【００３１】
好ましくは、この断片は、ＴＨＳＤ７Ａのアミノ酸配列全体の少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、少なくとも１１２０、少なくとも１２５０、少なくとも１３００、少なくとも１４００、少なくとも１５００、少なくとも１６００、少なくとも１６２０、少なくとも１６４０アミノ酸を含む。
【００３２】
好ましくは、この断片は、ＴＨＳＤ７Ａに対する自己抗体によって認識される。これらの自己抗体と相互作用する断片の能力を決定することは、上記方法または直接的結合を決定するための当技術分野で公知の方法のうちの１つによって、達成され得る。
【００３３】
用語ＰＬＡ２Ｒ１（分泌型ホスホリパーゼＡ２受容体、ＰＬＡ２Ｒ１としても公知）は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、本明細書で、特に特発性膜性腎症における主要抗原として公知の、ＰＬＡ２Ｒ１遺伝子によってヒトにおいてコードされる受容体、Ｍ型ホスホリパーゼＡ２受容体を指す。例示的なヒトネイティブＰＬＡ２Ｒ１アミノ酸配列は、ＮＰ＿００１００７２６８（ＧｅｎＰｅｐｔデータベース）に提供され、例示的なヒトネイティブＴＨＳＤ７Ａ  ｍＲＮＡ配列は、ＮＭ＿００１００７２６７（ＧｅｎＢａｎｋデータベース）に提供される。データベースに対する全ての言及、例えば、本明細書に開示されるコードまたはアクセッション番号は、２０１４年７月２４日にオンラインで入手可能なバージョンを指すことに留意すべきである。
【００３４】
用語「ＰＬＡ２Ｒ１陰性患者」または「ＴＨＳＤ７Ａ陰性患者」とは、その血清が、それぞれＰＬＡ２Ｒ１またはＴＨＳＤ７Ａに対する自己抗体を含まない（または検出可能な自己抗体を少なくとも含まない）、患者を指す。逆に、「ＰＬＡ２Ｒ１陽性患者」または「ＴＨＳＤ７Ａ陽性患者」とは、その血清が、それぞれＰＬＡ２Ｒ１またはＴＨＳＤ７Ａに対する自己抗体を含む、患者を指す。
【００３５】
用語「自己抗体」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、被験体（または患者）の免疫系によって産生される、被験体（または患者）自身のタンパク質（例えば、ＴＨＳＤ７Ａ）に対する抗体を指す。自己抗体は、身体の自身の細胞、組織および／または臓器を攻撃して、炎症および細胞傷害を引き起こし得る。用語「ＴＨＳＤ７Ａを認識する自己抗体」は、「抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体」と相互交換可能に使用され得る。
【００３６】
用語「抗体結合性断片」とは、抗原（例えば、ＴＨＳＤ７Ａ）に関して本明細書で使用する場合、抗原が抗体に結合して抗体−抗原複合体を形成する能力を保持する、抗原の断片を指す。特に、本発明の抗原の抗体結合性断片は、膜性腎症に特異的な自己抗体を結合する能力を保持する。抗原の適切な抗体結合性断片は、膜性腎症の特異的自己抗体を結合するそれらの能力を確認するための単純な試験によって、当業者によって同定され得る。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「患者」とは、膜性腎症、特に特発性膜性腎症に罹り得る、ヒト被験体または別の哺乳動物被験体（例えば、霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ブタ、マウス、ラット、ウサギなど）を指す。好ましくは、この患者はヒト患者である。より好ましくは、この患者は、膜性腎症、特に特発性膜性腎症に罹る疑いがある。
【００３８】
用語「生物学的試料」は、その最も広い意味において本明細書で使用される。生物学的試料は、一般に、被験体について取得される。この被験体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。典型的には、生物学的試料は、一般に、患者から取得される。典型的には、この試料は、自己抗体の代表的セットを含む。
【００３９】
試料は、本発明のバイオマーカー（複数可）がアッセイされ得る、任意の生物学的組織または流体のものであり得る。かかる試料には、細胞を含んでいてもいなくてもよい体液、例えば、血液（例えば、全血、血清または血漿）が含まれるがこれらに限定されない。かかる試料には、生検（例えば、腎臓生検）もまた含まれる。用語生物学的試料は、生物学的試料を処理することによって誘導される任意の材料もまた包含する。誘導された材料には、試料から単離された細胞（またはそれらの子孫）または試料から抽出されたタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。生物学的試料の処理は、以下のうち１または複数を含み得る：濾過、蒸留、抽出、濃縮、妨害性構成成分の不活性化、試薬の添加など。
【００４０】
本発明の文脈では、用語「対照」とは、被験体を特徴付けるために使用する場合、健康な被験体、または腎疾患以外の特定の疾患を有すると診断された患者を指す。用語「対照試料」とは、健康な被験体から、または腎障害以外の疾患を有すると診断された患者から取得された１つの試料、または１よりも多い試料を指す。
【００４１】
用語「正常な」および「健康な」は、本明細書で相互交換可能に使用される。これらは、腎障害と関連する任意の症状を示しておらず、膜性腎症または他の腎症を有すると診断されていない、被験体を指す。好ましくは、正常な被験体は、腎系に影響を与える薬物療法を受けているわけではなく、任意の他の疾患を有すると診断されていない。ある特定の実施形態では、正常な被験体は、試験すべき生物学的試料が取得された被験体と比較して、類似の性別、年齢および／または肥満度指数を有する。用語「正常な」はまた、健康な被験体から取得された試料を適格とするために、本明細書で使用される。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「参照レベル」とは、対照から取得された生物学的試料において測定されたレベル、または好ましくは、いくつかの対照から取得された生物学的試料において測定された、いくつかのレベルの平均を指す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「診断」、「診断する」または「診断的」は、その最も広い意味で使用され、膜性腎症における診断、予後判定、セラグノシスおよびモニタリングを包含する。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「処置する」または「処置」とは、膜性腎症、特に特発性膜性腎症と関連する医学的状態と関連する少なくとも１つの有害作用または症状を低減または軽減させることを指す。これらには、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の量を低減させること、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の産生を低減、阻害もしくは停止させること、免疫系の抑制、ならびにそれらが腎臓糸球体と結合した場合の自己抗体の活性と関連する炎症および分解／損傷を低減させること、が含まれる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「セラグノシス」とは、特定の治療から利益を得うる患者の、例えば診断方法による同定を指す。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」とは、可溶性抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の量を低減させることができる、活性作用物質（active  agent）の量を指す。量の低減は、処置の開始前に血清中に存在する自己抗体の量と比較して、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、より特には少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の、自己抗体における低減である。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」とは、医薬品産業において一般に使用される化学物質および化合物の薬学的に許容されるキャリアと組み合わせた、本発明の活性作用物質（例えば、以下に記載するような、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片を発現するベクター、またはこのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片を発現する宿主細胞）を指す。
【００４８】
抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の検出に基づく、診断および予後判定方法ならびにキット
診断方法
したがって、本発明の第１の目的は、患者における膜性腎症、より特には特発性膜性腎症を診断および／または予後判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、この方法は、患者から取得された生物学的試料中の、ＴＨＳＤ７Ａタンパク質を認識する１または複数の自己抗体を検出するステップを含む。
【００４９】
好ましい一実施形態では、この生物学的試料は、血液試料（全血、血清または血漿を含む）である。好ましくは、この生物学的試料は、血清または血漿である。
【００５０】
一実施形態では、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断および／または予後判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、
（ｉ）患者から取得された生物学的試料を、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片と接触させるステップ、および
（ｉｉ）形成された任意の抗原−抗体複合体を検出するステップ
を含み、抗原−抗体複合体の存在は膜性腎症を示す。
【００５１】
本発明の一実施形態では、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片は、異なる哺乳動物種、特に、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウサギまたはマウス由来であり得る。
【００５２】
一実施形態では、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドは、完全ＴＨＳＤ７Ａタンパク質であり得る。
【００５３】
本発明の一実施形態では、抗体結合性断片は、ＴＨＳＤ７Ａのその別個のトロンボスポンジンＩ型ドメインのうちの１つもしくはいくつかおよび／またはリンカーストーク（linker  stalk）によって構成された、ＴＨＳＤ７Ａの完全細胞外ドメインまたはその断片を含み得る、またはそれからなり得る。
【００５４】
本発明のＴＨＳＤ７Ａポリペプチドおよびより一般には全てのバイオマーカーは、組換え方法を含む任意の適切な方法によって調製され得る。例えば「The  Proteins」（第ＩＩ巻、第３版、H.  Neurathら（編）、１９７６年、Academic  Press:  New  York、NY、１０５〜２３７頁）に記載されるようなかかる方法もまた、本発明のバイオマーカーを合成するために使用され得る。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本発明のポリペプチド／タンパク質バイオマーカー（例えば、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチド）は、固体キャリアまたは支持体（例えば、ビーズまたはアレイ）上に固定される。したがって、この実施形態では、本発明の方法は、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片でコーティングされたデバイスの使用を含む。典型的には、このデバイスは、医学的デバイスまたは診断的デバイス、好ましくは診断的デバイスである。
【００５６】
典型的には、本発明の文脈では、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片は、このデバイス上に固定される。
【００５７】
本発明の診断方法は、本発明のバイオマーカー（例えば、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチド）と試験した生物学的試料中に存在する自己抗体との間で形成された抗原−抗体複合体の検出を含む。この検出は、この試料中の自己抗体（即ち、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体）の存在を示す。
【００５８】
本発明の実施では、かかる複合体の検出は、任意の適切な方法によって実施され得る（例えば、E.  HarlowおよびA.  Lane、「Antibodies:  A  Laboratories  Manual」、１９８８年、Cold  Spring  Harbor  Laboratory:  Cold  Spring  Harbor、NYを参照のこと）。
【００５９】
例えば、抗原−抗体複合体の検出は、イムノアッセイを使用して実施され得る。ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光  免疫沈降およびラインブロットを含む広範なイムノアッセイ技術が、利用可能である。イムノアッセイは、当技術分野で周知であり、当業者の一般的知識の範囲内である。かかるアッセイを実施するための方法ならびに実務上の適用および手順は、教科書中にまとめられている。かかる教科書の例には、P.  Tijssen、Practice  and  theory  of  enzyme  immunoassays、R.H.  Burdonおよびv.  P.H.  Knippenberg編、Elsevier、Amsterdam（１９９０年）、２２１〜２７８頁、ならびに免疫学的検出方法を扱う、Methods  in  Enzymology、S.P.  Colowickら編、Academic  Pressの種々の巻、特に７０、７３、７４、８４、９２および１２１巻が含まれる。イムノアッセイは、競合的または非競合的であり得る。例えば、サンドイッチアッセイ技術のいくつかのバリエーションのいずれかが、イムノアッセイを実施するために使用され得る。簡潔に述べると、本発明に従う抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の検出に適用される典型的なサンドイッチアッセイでは、未標識のＴＨＳＤ７Ａポリペプチド（バイオマーカー）が、（上記のように）固体表面上に固定され、試験される生物学的試料は、抗原−抗体複合体の形成を可能にする時間にわたって、かつそのような条件下で、結合したバイオマーカーと接触させられる。好ましくは、抗原−抗体複合体の形成は、非還元条件下で実施される。
【００６０】
インキュベーション後、検出可能な部分で標識された、試験される種由来の抗体を特異的に認識する抗体（例えば、ヒト被験体については抗ヒトＩｇＧ）が添加され、任意のバイオマーカー結合した自己抗体と標識された抗体との間での三元複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートされる。任意の未結合の材料は洗浄して除かれ、試料中の任意の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の存在は、検出可能な部分によって直接的または間接的に生成されるシグナルの観察／検出によって決定される。このアッセイに対するバリエーションには、生物学的試料および標識された抗体の両方が、固定されたＴＨＳＤ７Ａ−タンパク質／ポリペプチドバイオマーカーに同時に添加される、アッセイが含まれる。
【００６１】
第２の抗体（即ち、上記サンドイッチアッセイにおいて添加される抗体）は、任意の検出可能な部分、即ち、その化学的性質によって、三元複合体の検出、および結果として、バイオマーカー−抗体複合体の検出を可能にする、分析的に同定可能なシグナルを提供する任意の実体で、標識され得る。
【００６２】
検出は、定性的または定量的のいずれかであり得る。抗体などの生物学的分子を標識するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、「Affinity  Techniques.  Enzyme  Purification:  Part  B」、Methods  in  Enzymol、１９７４年、第３４巻、W.B.  JakobyおよびM.  Wilneck（編）、Academic  Press:  New  York、NY；ならびにM.  WilchekおよびE.A.  Bayer、Anal.  Biochem.、１９８８年、１７１巻：１〜３２頁を参照のこと）。イムノアッセイにおいて最も一般的に使用される検出可能な部分は、酵素およびフルオロフォアである。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）の場合、酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（perodixase）、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどは、一般にはグルタルアルデヒドまたはペリオデート（periodate）によって、第２の抗体にコンジュゲートされる。特定の酵素と共に使用される基質は、対応する酵素の加水分解の際の検出可能な色変化の生成のために、一般に選択される。免疫蛍光の場合、この第２の抗体は、その結合能の変更なしに蛍光部分に化学的にカップリングされる。バイオマーカー−抗体複合体への蛍光標識された抗体の結合、および任意の未結合の材料の除去後に、蛍光部分によって生成された蛍光シグナルが検出され、任意選択で定量される。あるいは、この第２の抗体は、放射性同位体、化学発光部分または生物発光部分で標識され得る。
【００６３】
典型的には、本発明の文脈では、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドは、単離されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドである。
【００６４】
上述のように、本発明のバイオマーカーは、膜性腎症、より具体的には特発性膜性腎症に罹った患者の集団の血清によって、特に、抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体を有さない、膜性腎症に罹った患者の血清によって、特異的に認識される。
【００６５】
したがって、本発明の特定の一実施形態では、この患者はＰＬＡ２Ｒ陰性患者である。
【００６６】
この患者はまた、膜性腎症の全ての通常の原因、例えば、全身性エリテマトーデス、Ｂ型肝炎および梅毒について、陰性と試験されている。
【００６７】
現在、ＰＬＡ２Ｒ１陰性患者について、膜性腎症、特に特発性膜性腎症の診断のために利用可能な非侵襲性の方法は存在しない。したがって、これらの患者は、腎臓生検を受ける必要がある。
【００６８】
逆に、本発明の方法は、ＴＨＳＤ７Ａ陰性患者において、ならびにＴＨＳＤ７Ａ陽性患者において、侵襲性の技術を実施する必要性から免れさせることができるので、高度に有望である。
【００６９】
特定の一実施形態では、この患者は、腎臓生検を受けなかった、および／または腎臓生検を受けないことになる。
【００７０】
この方法はまた、抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体（特許出願ＷＯ２０１０／００９４５７に記載されている）の検出に基づく膜性腎症の診断方法と並行して適用され得、膜性腎症のさらなるバイオマーカー、例えば、二次性膜性腎症のバイオマーカーが評価され得る。かかるバイオマーカーの例には、抗核抗体（ＡＮＡ）、抗Ｂ型肝炎抗原および迅速血漿レアギン（rapid  plasma  reagin）（ＲＰＲ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００７１】
この診断方法を使用して得られた結果は、臨床データ、膜性腎症の診断のために実施された他の試験、アッセイまたは手順からの結果と比較され得、および／またはそれらと組み合わされ得る。かかる比較および／または組合せは、より洗練された診断を提供することを助け得る。
【００７２】
膜性腎症の予後判定方法およびその処置のモニタリング
本発明者らは、抗ＴＨＳ７Ａ自己抗体の存在およびレベルと、膜性腎症、より具体的には特発性膜性腎症を有する患者の処置の有効性、寛解または再燃との間の相関もまた示した。
【００７３】
膜性腎症、特に特発性膜性腎症に対して使用されている現在の処置は、免疫抑制治療、例えば、シクロスポリン、タクロリムス、アザチオプリン、インフリキシマブ、オマリズマブ、ダクリズマブ、アダリムマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ナタリズマブ、オマリズマブおよびラパマイシンである。これには、シクロホスファミド、クロラムブシルおよびリツキシマブもまた含まれる。
【００７４】
したがって、本発明のさらなる目的は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症に対する処置の有効性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、この方法は、
（ｉ）第１の時点において、この第１の時点において患者から取得された試料中の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルを決定するステップ、
（ｉｉ）第２の時点において、この第２の時点において患者から取得された試料中の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルを決定するステップ、および
（ｉｉｉ）これら２つの時点の自己抗体のレベルを比較するステップ
を含み、
・第１の時点と比較した第２の時点における抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルにおける減少は、その処置が有効であることを示し、および／または
・第１の時点と比較した第２の時点における抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルにおける増加は、その処置が有効でないことを示す。
【００７５】
本発明の方法は、好ましくは、膜性腎症、特に特発性膜性腎症と診断された、ＴＨＳＤ７Ａ陽性患者である患者に対して、実施される。
【００７６】
本発明の実施では、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルの決定は、例えば、上記のような、任意の適切な定量方法によって実施され得る（例えば、E.  HarlowおよびA.  Lane、「Antibodies:  A  Laboratories  Manual」、１９８８年、Cold  Spring  Harbor  Laboratory:  Cold  Spring  Harbor、NYを参照のこと）。特に、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルは、抗原−抗体複合体が形成されるイムノアッセイによって検出され得る。
【００７７】
上で説明したように、この患者は、典型的には、膜性腎症を有すると最初に診断されており、検出可能な量の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体を有する。例えば免疫抑制治療による処置の際に、経時的に、検出可能な抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の量における減少が、有効な処置の場合に観察される。
【００７８】
抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のレベルの、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、より特には少なくとも３０％、なおより特には少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、なおさらにより好ましくは少なくとも８０％の減少が観察される場合、この処置は、有効であるとみなされる。これは一般に、予後良好を示す。
【００７９】
理想的な場合には、自己抗体の量は、本明細書に記載される検出方法の検出可能なレベルを下回るはずであり、患者は、この障害について寛解期にあるとみなされる。
【００８０】
逆に、第１の時点と第２の時点との間のレベルが、安定している、または抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の初期レベルの少なくとも５％、特に少なくとも１０％、より特には少なくとも２０％、なおより特には少なくとも３０％、さらになおより特には少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、なおさらにより好ましくは少なくとも８０％もしくはそれ超増加する場合、この処置は、無効であるとみなされる。
【００８１】
いくつかの状況が観察され得る。
【００８２】
一実施形態では、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体は、第２の時点においては検出されない。これは、この患者が寛解期にあるとみなされることを示す。
【００８３】
別の一実施形態では、安定なレベルの抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体が観察される：第１の時点および第２の時点において取得されたレベルは、同等に類似しており、約１〜５％偏差の間、好ましくは１〜３％偏差の間の偏差で、統計分析分散内にある。これは、安定な疾患を示し、ここで、この処置は、不十分な持続時間のものであった（したがって、臨床的に必要な場合、これは継続されるべきである）または非有効である。
【００８４】
別の一実施形態では、第１の時点と比較して抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の増加したレベルが、第２の時点において観察され、第１の時点は、検出可能な抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体を有した。これは、疾患の悪化および／または有効な処置の欠如を示す。少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、さらにより好ましくは少なくとも２００％の増加は、状況の悪化および予後不良を示すとみなされる。
【００８５】
別の一実施形態では、第１の時点と比較して抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の増加したレベルが、第２の時点において観察され、第１の時点は、検出可能な抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体を有さなかった。これは、患者が再燃したこと、および膜性腎症が再発したことを示す。
【００８６】
本発明によれば、この第２の時点は、第１の時点よりも後になるように選択される。第１の時点および第２の時点は、例えば、治療戦略に関して、および膜性腎症、特に特発性膜性腎症を発症するリスクがある患者、または膜性腎症、特に特発性膜性腎症に既に罹患しており、再燃のリスクがある患者の追跡のために、戦略的に選択され得る。
【００８７】
例えば、この第１の時点は、患者に対する任意の処置の投与の前であり得、第２の時点は、処置が効果を示すはずの時点で、または処置の終了のときに置かれ得、アッセイは後に反復され得る。
【００８８】
したがって、このアッセイは、数回再現され得る；抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体レベルは、２つよりも多い時点において評価され得る。ステップ（ｉｉｉ）の比較は、第１の時点で、または以前の時点で、行われる必要がある。患者の健康状態の改善および処置の有効性は、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体レベルの全体的な減少が時間中に観察される場合に示される。逆に、患者の健康状態の低下および処置の無効性は、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体レベルの減少が時間中に観察されない場合、特に、全体的な増加が観察される場合に、示される。検出不能な抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の期間の後の、検出可能な抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の再出現は、再燃を示す。
【００８９】
使用されるアッセイは、異なる時点において患者から収集した全ての試料について同一である。
【００９０】
無効な処置の場合、治療戦略を適応させる必要がある。
【００９１】
上記を考慮して、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症に対する処置の有効性を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を予後判定するための方法もまた構成する。
【００９２】
キット
別の一態様では、本発明は、本発明に従う方法を実施するために有用な材料を含むキットを提供する。本明細書で提供される診断手順は、診断検査室、実験研究室または従事者によって実施され得る。本発明は、これらの異なる設定において使用され得るキットを提供する。
【００９３】
本発明に従う、生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａ自己抗体を検出するためおよび／または患者における膜性腎症を診断するための材料および試薬が、キットにおいて一緒にアセンブルされ得る。本発明の各キットは、好ましくは生物学的試料中の自己抗体の検出に適切な量で、本発明の少なくとも１つのタンパク質／ポリペプチドバイオマーカーを含む。
【００９４】
したがって、本発明のさらなる目的は、患者から取得された生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａを認識する自己抗体を検出するためのキットに関し、このキットは、
・ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片、および
・自己抗原、好ましくはＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片と、生物学的試料中に存在する自己抗体、好ましくはＴＨＳＤ７Ａに対する自己抗体との間で形成された抗原−抗体複合体の検出のための試薬
を含む。
【００９５】
本発明によれば、この試薬は、生物学的試料中に存在する自己抗体を検出することを可能にし、この自己抗体は、膜性腎症を示す抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体である。
【００９６】
本発明の文脈では、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドは、特に、その別個のトロンボスポンジンＩ型ドメインのうちの１つもしくはいくつかおよび／またはリンカーストークによって構成された、ＴＨＳＤ７Ａの細胞外ドメインまたはその断片を含む、またはそれからなる、哺乳動物ＴＨＳＤ７Ａポリペプチド／タンパク質またはその抗体結合性断片、好ましくはヒトＴＨＳＤ７Ａポリペプチド／タンパク質またはその抗体結合性断片である。
【００９７】
本発明の一実施形態では、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片は、異なる哺乳動物種由来、特に、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウサギまたはマウス由来であり得る。
【００９８】
一実施形態では、本発明は、患者における膜性腎症を診断するための、上記本発明のキットに関する。
【００９９】
一実施形態では、このキットは、ＰＬＡ２Ｒ１ポリペプチドまたはその抗体結合性断片をさらに含む。
【０１００】
本発明の文脈では、このＰＬＡ２Ｒ１ポリペプチドは、哺乳動物ＰＬＡ２Ｒ１ポリペプチド／タンパク質およびその抗体結合性断片、好ましくはヒトＰＬＡ２Ｒ１ポリペプチド／タンパク質およびその抗体結合性断片である。
【０１０１】
本発明の一実施形態では、このＰＬＡ２Ｒ１ポリペプチドまたはその抗体結合性断片は、異なる哺乳動物種由来、特に、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウサギまたはマウス由来であり得る。
【０１０２】
自己抗原マーカーと生物学的試料中に存在する自己抗体との間で形成された抗原−抗体複合体の検出のための試薬は、（抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体に加えて）膜性腎症を示す抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体を検出することもまた可能にする。
【０１０３】
別の一実施形態では、このキットは、膜性腎症の少なくとも１つのさらなるバイオマーカー、例えば、二次性膜性腎症のバイオマーカー（例えば、ＡＮＡ、抗Ｂ型肝炎抗原、迅速血漿レアギン．．．）をさらに含み得る。
【０１０４】
本発明のキット中に含まれるポリペプチドバイオマーカー（複数可）は、基材表面（例えば、ビーズ、アレイなど）上に固定されていても固定されていなくてもよい。
【０１０５】
したがって、一態様では、本発明は、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片でコーティングされたデバイスにさらに関する。典型的には、このデバイスは、医学的デバイスまたは診断的デバイス、好ましくは診断的デバイスである。
【０１０６】
好ましくは、このデバイスは、膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断および／または予後判定するための方法において使用される。典型的には、本発明の文脈では、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片は、このデバイス上に固定される。
【０１０７】
ポリペプチド分子を固体表面上に固定させるための方法は、当技術分野で公知である。ポリペプチド／タンパク質は、固体キャリアまたは支持体の表面に、共有結合的にまたは受動的に、のいずれかで結合されることによって、固定され得る。適切なキャリアまたは支持体材料の例には、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、デキストラン、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、カルボキシメチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、濾紙、マグネタイト、イオン交換樹脂、ガラス、ポリアミン−メチル−ビニル−エーテル−マレイン酸コポリマー、アミノ酸コポリマー、エチレン−マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などが含まれるがこれらに限定されない。固体キャリアまたは支持体の表面上でのポリペプチド／タンパク質バイオマーカーの固定は、当技術分野で周知の方法を使用した、架橋、共有結合的結合または物理的吸着を含み得る。この固体キャリアまたは支持体は、ビーズ、粒子、マイクロプレートウェル、アレイ、キュベット、チューブ、メンブレンの形態、または本発明に従う診断方法（例えば、イムノアッセイを使用する）を実施するのに適切な任意の他の形状であり得る。
【０１０８】
したがって、好ましい実施形態では、本発明のキットは、本明細書で提供される、膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断するためのアレイを含む。あるいは、基材表面が、本発明のバイオマーカーの固定のために、本発明のキット中に含まれ得る。
【０１０９】
本発明のキットは、キット中に含まれるペプチドバイオマーカー（例えば、ＴＨＳＤ７Ａおよび／またはＰＬＡ２Ｒ）と、生物学的試料中に存在する自己抗体との間で形成されたバイオマーカー−抗体複合体の検出のための少なくとも１つの試薬もまた含む。かかる試薬は、例えば、上記のような、試験される種由来の抗体を特異的に認識する標識された抗体（例えば、ヒト被験体について、抗ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ４、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２およびＩｇＧ１、好ましくはＩｇＧ４）であり得る。
【０１１０】
一実施形態では、この標識された抗体は、ヒトＩｇＧの全ての形態を認識する。
【０１１１】
別の一実施形態では、この標識された抗体は、特に、ヒトＩｇＧ４サブクラスを認識する。
【０１１２】
手順に依存して、このキットは、以下のうちの１または複数をさらに含み得る：抽出緩衝液および／または試薬、ブロッキング緩衝液および／または試薬、免疫検出緩衝液および／または試薬、標識化緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段。手順の異なるステップを実施するためのこれらの緩衝液および試薬を使用するためのプロトコールが、キット中に含まれ得る。本発明のキット中に含まれる異なる試薬は、固体（例えば、凍結乾燥された）形態または液体形態で供給され得る。本発明のキットは、各個々の緩衝液および／または試薬のための、異なる容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコまたは瓶）を任意選択で含み得る。各構成成分は、一般に、そのそれぞれの容器中にアリコート化されるとき、または濃縮形態で提供されるときに、適切である。開示された方法の特定のステップを実施するのに適切な他の容器もまた、提供され得る。キットの個々の容器は、好ましくは、商業的販売のために密閉して維持される。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、キットは、本発明の方法に従って、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症の診断のためにその構成成分を使用するための指示を含む。本発明の方法に従ってキットを使用するための指示は、患者から取得された生物学的試料を処理するためおよび／もしくは試験を実施するための指示、ならびに／または結果を解釈するための指示を含み得る。キットは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態での通知もまた含み得る。
【０１１４】
特定の一実施形態では、本発明は、その表面に固定された、本発明の少なくともＴＨＳＤ７Ａポリペプチドバイオマーカーを含む、膜性腎症、特に特発性膜性腎症の診断のためのアレイまたはタンパク質アレイを提供する。好ましくは、このアレイは、１よりも多い本発明のポリペプチド／タンパク質バイオマーカーを含み、したがって、ＰＬＡ２Ｒ陽性患者の検出のために適切なＰＬＡ２Ｒ１ポリペプチドバイオマーカーもまた含む。このアレイは、膜性腎症の少なくとも１つのさらなるバイオマーカー、例えば、二次性膜性腎症のバイオマーカー（例えば、ＡＮＡ、抗Ｂ型肝炎抗原、迅速血漿レアギン．．．）をさらに含み得る。
【０１１５】
別の特定の一実施形態では、本発明は、膜性腎症、特に特発性膜性腎症の診断のための、タンパク質ビーズ懸濁物アレイ（protein  bead  suspension  array）もまた提供する。このビーズ懸濁物アレイは、１または複数の同定可能な別個の粒子またはビーズの懸濁物を含み、ここで、各ビーズは、そのサイズ、色または蛍光シグネチャーに関するコード化特徴を含み、各ビーズは、本発明のポリペプチド／タンパク質バイオマーカーでコーティングされる。
【０１１６】
本発明のなおさらなる目的は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断するための、本発明のキット、アレイまたはビーズの使用に関する。
【０１１７】
一実施形態では、本発明のキット、アレイまたはビーズは、
・ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその抗体結合性断片、および
・自己抗原マーカーと、生物学的試料中に存在する自己抗体との間で形成された抗原−抗体複合体の検出のための試薬
を含み、本発明の方法に従って使用され得る。
【０１１８】
本発明のキット、アレイまたはビーズは、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症に対する処置の有効性を評価するため、および患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を予後判定するためにも、使用され得る。
【０１１９】
特定の一実施形態では、この患者は、ＰＬＡ２Ｒ１を認識する自己抗体の存在について以前に評価されており、この自己抗体について陰性である。この患者はまた、膜性腎症の全ての通常の原因、例えば、全身性エリテマトーデス、Ｂ型肝炎および梅毒について、陰性と試験されている。
【０１２０】
その場合、この患者における膜性腎症を診断するために使用される本発明のキットまたはアレイは、ＰＬＡ２Ｒ１ポリペプチドまたはその抗体結合性断片も、膜性腎症の任意の他のバイオマーカーも含まない。
【０１２１】
ＴＨＳＤ７Ａ自己抗原の検出に基づく診断方法およびキット
本発明者らは、自己抗原ＴＨＳＤ７Ａが、膜性腎症に罹った患者、特に、特発性膜性腎症に罹った患者の腎臓において（特に、ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体を有する患者において）、過剰発現されることを示した。
【０１２２】
したがって、本発明のさらなる目的は、膜性腎症、特に特発性膜性腎症のバイオマーカーとしての、ＴＨＳＤ７Ａの使用に関する。
【０１２３】
したがって、本発明は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断および／または予後判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、この方法は、患者から取得された生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａレベルを決定するステップを含む。
【０１２４】
本発明によれば、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断および／または予後判定するためのこのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症のモニタリングもまた包含する。
【０１２５】
本発明によれば、このＴＨＳＤ７Ａレベルは、ＴＨＳＤ７Ａタンパク質レベルおよびｍＲＮＡタンパク質レベルを包含する。
【０１２６】
特定の一実施形態では、この患者はＰＬＡ２Ｒ陰性患者である。
【０１２７】
一実施形態では、この方法はまた、抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体および膜性腎症のさらなるバイオマーカーの検出に基づく膜性腎症の診断方法と並行して適用され得る。
【０１２８】
別の一実施形態では、この生物学的試料は、好ましくは、血液試料または腎臓生検である。
【０１２９】
ＴＨＳＤ７Ａタンパク質レベルの検出に基づく診断方法
一実施形態では、本発明は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断および／または予後判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、この方法は、患者から取得された生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａタンパク質のレベルを決定するステップを含む。
【０１３０】
特定の一実施形態では、この方法は、
（ｉ）患者から取得された生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａタンパク質のレベルを測定するステップ、
（ｉｉ）このレベルを参照レベルと比較するステップ
を含み、参照レベルと比較したＴＨＳＤ７Ａタンパク質の増加したレベルは、膜性腎症、特に特発性膜性腎症を示す。
【０１３１】
好ましくは、この生物学的試料は、血液試料または腎臓生検である。
【０１３２】
典型的には、ＴＨＳＤ７Ａタンパク質の増加したレベルは、対照試料において測定されたタンパク質レベルの、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％の増加に対応する。
【０１３３】
ＴＨＳＤ７Ａレベルは、当技術分野で周知の異なる方法によって測定され得る。
【０１３４】
特定の一実施形態では、本発明の方法は、この生物学的試料を、生物学的試料中に存在するバイオマーカー（例えば、ＴＨＳＤ７Ａ）と選択的に相互作用することが可能な結合パートナーと接触させるステップを含む。
【０１３５】
この結合パートナーは、ポリクローナルまたはモノクローナル、好ましくはモノクローナルであり得る抗体であり得る。別の一実施形態では、この結合パートナーは、アプタマーであり得る。
【０１３６】
本発明のポリクローナル抗体またはその断片は、適切な抗原またはエピトープを、例えば、とりわけ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジおよびマウスから選択される宿主動物に投与することによる、公知の方法に従って惹起され得る。当技術分野で公知の種々のアジュバントが、抗体産生を増強するために使用され得る。本発明を実施する際に有用な抗体は、ポリクローナルであり得るが、モノクローナル抗体が好ましい。
【０１３７】
本発明のモノクローナル抗体またはその断片は、培養物中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を使用することによって、調製および単離され得る。産生および単離のための技術には、KohlerおよびMilstein（１９７５年）によって元々記載されたハイブリドーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Coteら、１９８３年）；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Coleら  １９８５年）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３８】
あるいは、単鎖抗体の産生について記載された技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）は、本発明のバイオマーカーに対する単鎖抗体を産生するために、適応され得る。本発明を実施する際に有用な抗体には、インタクトな抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２断片、およびＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィドブリッジを還元することによって生成され得るＦａｂ断片が含まれるがこれらに限定されない、抗バイオマーカー断片もまた含まれる。あるいは、Ｆａｂおよび／またはｓｃＦｖ発現ライブラリーが、本発明のバイオマーカーに対する所望の特異性を有する断片の迅速な同定を可能にするように、構築され得る。例えば、抗体のファージディスプレイが使用され得る。かかる方法では、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片は、適切なバクテリオファージ、例えば、Ｍ１３の表面上で発現される。簡潔に述べると、タンパク質で免疫された適切な宿主、例えばマウスの脾臓細胞が、取り出される。ＶＬ鎖およびＶＨ鎖のコード領域が、そのタンパク質に対する所望の抗体を産生している細胞から取得される。次いで、これらのコード領域は、ファージ配列の末端に融合される。ファージが適切なキャリア、例えば細菌中に挿入されると、このファージは、抗体断片をディスプレイする。抗体のファージディスプレイは、当業者に公知のコンビナトリアル方法によっても提供され得る。次いで、ファージによってディスプレイされた抗体断片が、イムノアッセイの一部として使用され得る。ＶＨＨもまた使用され得る。
【０１３９】
ＴＨＳＤ７Ａを認識する市販のモノクローナル抗体の例には、Ａｂｃａｍ（ａｂ１２１１２２）、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＮＢＰ１−９３６１２）、Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＰＡＢ２００２１）、Ａｔｌａｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ＨＰＡ０００９２３）およびＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ｓｃ−１６３４５３、ｓｃ−１６３４５５）から取得されるものが含まれる。
【０１４０】
別の一実施形態では、結合パートナーは、アプタマーであり得る。アプタマーは、分子認識に関して抗体に対する代替法を提示する分子のクラスである。アプタマーは、高い親和性および特異性で事実上任意のクラスの標的分子を認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列またはオリゴペプチド配列である。かかるリガンドは、Tuerk  C.  １９９７年に記載されるような、ランダム配列ライブラリーのＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）を介して単離され得る。このランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって取得可能である。このライブラリーでは、各メンバーは、独自の配列の、最終的に化学的に改変された線状オリゴマーである。このクラスの分子の可能な改変、使用および利点は、Jayasena  S.D.、１９９９年に概説されている。ペプチドアプタマーは、ツーハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーから選択されるプラットフォームタンパク質、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉチオレドキシンＡによってディスプレイされた、コンフォメーション的に制限された抗体可変領域からなる（Colasら、１９９６年）。
【０１４１】
本発明の結合パートナー、例えば、抗体またはアプタマーは、検出可能な分子または物質、例えば、蛍光分子、放射性分子または当技術分野で公知の任意の他の標識で、標識され得る。一般にシグナルを（直接的または間接的のいずれかで）提供する標識は、当技術分野で公知である。
【０１４２】
本明細書で使用する場合、用語「標識された」は、抗体に関して、検出可能な物質、例えば、放射性作用物質またはフルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））を抗体またはアプタマーにカップリングさせる（即ち、物理的に連結する（slinking））ことによる、抗体またはアプタマーの直接的標識化、ならびに検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識化を包含する意図である。本発明の抗体またはアプタマーは、当技術分野で公知の任意の方法によって、放射性分子で標識され得る。例えば、放射性分子には、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、Ｉ１２３、Ｉ１２４、ＩｎＩ１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４３】
上述のアッセイは、固体支持体への結合パートナー（即ち、抗体またはアプタマー）の結合を含み得る。本発明の実施において使用され得る固体支持体には、基材、例えば、ニトロセルロース（例えば、メンブレンまたはマイクロタイターウェル形態で）；ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）；フッ化ポリビニリデン（polyvinylidine  fluoride）；ジアゾ化紙；ナイロンメンブレン；活性化されたビーズ、磁気的に応答性のビーズなどが含まれる。
【０１４４】
本発明のバイオマーカーは、競合、直接的反応またはサンドイッチ型アッセイなどのイムノアッセイを含む、標準的な免疫診断的技術を使用することによって検出され得る。かかるアッセイには、凝集試験；酵素標識されたおよび酵素媒介性のイムノアッセイ、例えばＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジン型アッセイ；ラジオイムノアッセイ；免疫電気泳動；免疫沈降が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４５】
より特には、ＥＬＩＳＡ法が使用され得、このとき、マイクロタイタープレートのウェルは、本発明のバイオマーカーに対する抗体のセットでコーティングされる。次いで、このバイオマーカー（複数可）を含むまたは含むと疑われる生物学的試料が、コーティングされたウェルに添加される。抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分なインキュベーションの期間の後、このプレート（複数可）は、未結合の部分を除去するために洗浄され得、検出可能に標識された二次結合分子が添加され得る。この二次結合分子は、任意の捕捉された試料マーカータンパク質と反応させられ、プレートが洗浄され、二次結合分子の存在が、当技術分野で周知の方法を使用して検出される。
【０１４６】
あるいは、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）法が使用され得る。ＩＨＣは、具体的には、試料または組織標本中の標的をｉｎ  ｓｉｔｕで検出する方法を提供する。試料の全体的な細胞の完全性は、ＩＨＣにおいて維持され、したがって、目的の標的の存在および位置の両方の検出を可能にする。典型的には、試料は、ホルマリンで固定され、パラフィン中に包埋され、染色、および光学顕微鏡法による引き続く検査のために、切片へとカットされる。ＩＨＣの現在の方法は、直接的標識化または二次抗体ベースのもしくはハプテンベースの標識化のいずれかを使用する。公知のＩＨＣシステムの例には、例えば、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、Ｐｏｗｅｒｖｉｓｉｏｎ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｄａｌｅ、ＡＺ）、ＮＢＡ（商標）キット（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）、ＨｉｓｔｏＦｉｎｅ（登録商標）（Ｎｉｃｈｉｒｅｉ  Ｃｏｒｐ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）が含まれる。
【０１４７】
特定の一実施形態では、組織切片（即ち、腎臓生検試料）は、本発明のバイオマーカーを認識する抗体（例えば、抗ＴＨＳＤ７Ａ抗体）とのインキュベーション後に、スライドまたは他の支持体上にマウントされ得る。次いで、適切な固体支持体上にマウントされた試料における顕微鏡検査が、実施され得る。顕微鏡写真の作成のために、試料を含む切片は、本発明のバイオマーカー（例えば、ＴＨＳＤ７Ａタンパク質）の存在を選択的染色によって強調するために、ガラススライドまたは他の平面支持体上にマウントされ得る。
【０１４８】
したがって、ＩＨＣ試料には、例えば以下が含まれ得る：（ａ）新鮮な組織またはこの組織から単離された細胞を含む調製物、（ｂ）固定および包埋された組織または細胞試料、ならびに（ｃ）組織または細胞試料中の本発明の検出バイオマーカー（例えば、ＴＨＳＤ７Ａタンパク質）。一部の実施形態では、ＩＨＣ染色手順は、例えば以下のステップを含み得る：組織をカットおよびトリミングするステップ、固定、脱水、パラフィン浸透、薄い切片にカットするステップ、ガラススライド上にマウントするステップ、ベーキングするステップ、脱パラフィン処理、再水和、抗原回復、ブロッキングステップ、本発明のバイオマーカーを認識する一次抗体を適用するステップ、洗浄するステップ、二次抗体（任意選択で、適切な検出可能な標識にカップリングされている）を適用するステップ、洗浄するステップ、対比染色、および顕微鏡試験。
【０１４９】
バイオマーカー（複数可）を（イムノアッセイベースの方法を用いてまたは用いずに）検出することには、化合物の分離：化合物の分子量に基づく遠心分離；質量および電荷に基づく電気泳動；疎水性に基づくＨＰＬＣ；サイズに基づくサイズ排除クロマトグラフィー；および使用される特定の固相に対する化合物の親和性に基づく固相親和性もまた、含まれ得る。一旦分離されると、本発明のバイオマーカーは、既知の「分離プロファイル」、例えば、その化合物についての、標準的な技術を使用して測定される保持時間に基づいて、同定され得る。
【０１５０】
あるいは、分離された化合物は、例えば、特に、バイオマーカー（複数可）の断片またはペプチドが測定される場合、質量分析計によって、検出および測定され得る。
【０１５１】
別の一態様では、上記のように、本発明は、本発明に従う方法を実施するために有用な材料を含むキットを提供する。本明細書に提供される診断手順は、診断検査室、実験研究室または従事者によって実施され得る。本発明は、これらの異なる設定において使用され得るキットを提供する。
【０１５２】
本発明に従う、生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａレベルを（ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルで）検出するためおよび／または患者における膜性腎症を診断するための材料および試薬が、キットにおいて一緒にアセンブルされ得る。
【０１５３】
一実施形態では、本発明のキットは、少なくとも、ＴＨＳＤ７Ａを認識する抗体またはＴＨＳＤ７Ａの他の結合パートナーを含む。
【０１５４】
特定の一実施形態では、このキットは、少なくとも、ＰＬＡ２Ｒ１を認識する抗体またはＰＬＡ２Ｒ１の他の結合パートナーをさらに含み得る。
【０１５５】
別の特定の一実施形態では、このキットは、膜性腎症の別のバイオマーカー、例えば、二次性膜性腎症のバイオマーカー（例えば、ＡＮＡ、抗Ｂ型肝炎抗原、迅速血漿レアギン．．．）を認識する少なくとも１つの別の抗体（または別の結合パートナー）もまた含み得る。
【０１５６】
この結合パートナーは、より容易な検出のためにタグ化され得る。これは、基材表面（例えば、ビーズ、アレイなど）上に固定されていても固定されていなくてもよい。例えば、本発明のキットは、本明細書で提供されるような、膜性腎症を診断するためのアレイを含み得る。あるいは、基材表面（例えば、メンブレン）が、結合パートナーの固定（例えば、電気泳動およびメンブレンへの移行を介した）のために、本発明のキット中に含まれ得る。
【０１５７】
さらに、本発明のキットは、一般に、キット中に含まれる結合パートナーと、本発明のバイオマーカーとの間の複合体の検出のための、少なくとも１つの試薬もまた含む。
【０１５８】
手順に依存して、このキットは、以下のうちの１または複数をさらに含み得る：抽出緩衝液および／または試薬、ウエスタンブロッティング緩衝液および／または試薬、ならびに検出手段。手順の異なるステップを実施するためのこれらの緩衝液および試薬を使用するためのプロトコールが、キット中に含まれ得る。
【０１５９】
本発明のキット中に含まれる異なる試薬は、固体（例えば、凍結乾燥された）形態または液体形態で供給され得る。本発明のキットは、各個々の緩衝液および／または試薬のための、異なる容器（例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコまたは瓶）を任意選択で含み得る。各構成成分は、一般に、そのそれぞれの容器中にアリコート化されるとき、または濃縮形態で提供されるときに、適切である。開示された方法の特定のステップを実施するのに適切な他の容器もまた、提供され得る。キットの個々の容器は、好ましくは、商業的販売のために密閉して維持される。ある特定の実施形態では、キットは、本発明の方法に従って、患者における膜性腎症の診断、予後判定またはモニタリングのためにその構成成分を使用するための指示を含む。本発明の方法に従ってキットを使用するための指示は、被験体から取得された生物学的試料を処理するためおよび／もしくは試験を実施するための指示、または結果を解釈するための指示を含み得る。キットは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態での通知もまた含み得る。
【０１６０】
ＴＨＳＤ７Ａ  ｍＲＮＡレベルの検出に基づく診断方法
別の一実施形態では、本発明は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を診断および／または予後判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関し、この方法は、患者から取得された生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａ発現のレベルを決定するステップを含む。
【０１６１】
特定の一実施形態では、この方法は、
（ｉ）患者から取得された生物学的試料中のＴＨＳＤ７Ａ  ｍＲＮＡのレベルを測定するステップ、
（ｉｉ）このレベルを参照レベルと比較するステップ
を含み、参照レベルと比較したＴＨＳＤ７Ａ  ｍＲＮＡの増加したレベルは、膜性腎症、特に特発性膜性腎症を示す。
【０１６２】
好ましくは、この生物学的試料は、血液試料または腎臓生検である。
【０１６３】
典型的には、ＴＨＳＤ７Ａ  ｍＲＮＡの増加したレベルは、対照試料において測定されたｍＲＮＡレベルの、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％の増加に対応する。
【０１６４】
ｍＲＮＡの量を決定するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、試料（例えば、患者から調製された細胞または組織）中に含まれる核酸は、最初に、標準的な方法に従って、例えば、溶解酵素もしくは化学的溶液を使用して抽出され、または製造業者の指示に従って核酸結合性樹脂によって抽出される。次いで、抽出されたｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット分析）および／または増幅（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出される。好ましい一実施形態では、ＴＨＳＤ７ＡのｍＲＮＡレベルは、ＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、さらにより好ましくはリアルタイム定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定される。
【０１６５】
増幅の他の方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。
【０１６６】
少なくとも１０ヌクレオチドを有し、本明細書の目的のｍＲＮＡに対して配列相補性または相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブまたは増幅プライマーとしての用途を見出す。かかる核酸は、同一である必要はないが、典型的には、比較できるサイズの相同な領域に対して、少なくとも約８０％同一、より好ましくは８５％同一、さらにより好ましくは９０〜９５％同一であることが理解される。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションを検出するために、検出可能な標識などの適切な手段と組み合わせて核酸を使用することが、有利である。蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンドまたは他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）を含む、広範な種々の適切な指標が、当技術分野で公知である。
【０１６７】
プローブは、典型的には、１０〜１０００ヌクレオチド長の間、例えば、１０と８００との間、より好ましくは１５と７００との間、典型的には２０と５００との間の、一本鎖核酸を含む。プライマーは、典型的には、増幅される目的の核酸と完全にまたはほぼ完全に一致するように設計された、１０〜２５ヌクレオチド長の間の、より短い一本鎖核酸である。これらのプローブおよびプライマーは、それらがハイブリダイズする核酸に対して「特異的」である、即ち、これらは、好ましくは、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（最も高い融解温度Ｔｍ、例えば、５０％ホルムアミド、５×または６×ＳＣＣに対応する。ＳＣＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａである）下でハイブリダイズする。
【０１６８】
上記増幅および検出方法において使用される核酸プライマーまたはプローブは、キットとしてアセンブルされ得る。かかるキットは、コンセンサスプライマーおよび分子プローブを含む。好ましいキットは、増幅が生じたかどうかを決定するために必要な構成成分もまた含む。このキットは、例えば、ＰＣＲ緩衝液および酵素；陽性対照配列、反応対照プライマー；ならびに特異的配列を増幅および検出するための指示もまた含み得る。
【０１６９】
本発明の治療方法
本発明者らは、有足細胞上で発現されるＴＨＳＤ７Ａタンパク質が、膜性腎症の特定の症例における自己抗原であることを強調し、このことが、この自己抗原を標的化することに基づく新規治療アプローチを想起することを可能にする。
【０１７０】
実際、先行技術に記載されるように、特にＰＬＡ２Ｒ１について、有足細胞の足上の標的抗原への自己抗体結合から生じる免疫沈着物は、有足細胞傷害をもたらす補体系を活性化し得る。
【０１７１】
したがって、本発明のさらなる目的は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を処置するための方法に関し、この方法は、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体を患者における試料からｅｘ  ｖｉｖｏで除去するステップを含む。
【０１７２】
一実施形態では、この膜性腎症は特発性膜性腎症である。
【０１７３】
別の一実施形態では、この患者はＴＨＳＤ７Ａ陽性患者である。
【０１７４】
好ましくは、この患者はヒト患者である。
【０１７５】
この抗体は、抗原としてＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片を用いた免疫吸収によって、血液から除去され得る。この試料は、抗体の除去後、患者に戻される。
【０１７６】
ＴＨＳＤ７Ａに対する自己抗体の免疫吸収は、循環する自己抗体、特に循環するＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の量を低減させることを助け、それによって、腎臓に対する潜在的損傷を低減させる。この処置は、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の存在の免疫学的確認後および任意の免疫抑制治療の開始前に、最初に適用され得る。これは、免疫抑制治療が患者において免疫系および自己抗体の産生に対して効果を有することができるより前のこの早期の期間の間に、特に有用である。この処置は、この患者の処置の間およびこの患者が陽性−ＴＨＳＤ７Ａ患者と診断された後のいつでも、適用され得る。
【０１７７】
一実施形態では、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の免疫吸収は、固定されたＴＨＳＤ７Ａポリペプチド上に血液、血清または血漿を通過させることによって、生じ得る。組換えＴＨＳＤ７Ａ、好ましくは組換えヒトＴＨＳＤ７Ａ、または断片は、当技術分野で公知の不活性および無菌マトリックス、例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ上に固定され得る。これらの抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体は、固定されたＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたは断片に結合し、マトリックスに間接的に結合したままになる。次いで、血液、血清または血漿が収集される。この得られた血液、血清または血漿は、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体が低減されているはず、または検出可能な抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体を有さないはずである。この免疫吸収手順は、無菌条件下で実施すべきである。次いで、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体が枯渇した収集された血液、血清または血漿は、患者中に輸注して戻され得る。
【０１７８】
本発明の治療方法において使用する場合、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドの断片は、典型的には、抗体結合性断片である。
【０１７９】
本発明の別のさらなる目的は、患者における膜性腎症、特に特発性膜性腎症を処置するための方法に関し、この方法は、治療有効量の、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片を発現するベクター、またはこのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片を発現する宿主細胞を投与するステップを含む。
【０１８０】
一実施形態では、この膜性腎症は特発性膜性腎症である。
【０１８１】
別の一実施形態では、この患者はＴＨＳＤ７Ａ陽性患者である。
【０１８２】
好ましくは、この患者はヒト患者である。
【０１８３】
本発明によれば、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片は、可溶性形態で投与される。
【０１８４】
可溶性ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片を提供することによって、この可溶性ポリペプチドは、デコイ抗原として機能し得、腎糸球体においてＴＨＳＤ７Ａから自己抗体を隔離し得、それによって、腎臓に対する潜在的損傷を低減することができる。このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドは、好ましくは、ヒト起源のＴＨＳＤ７Ａポリペプチドである。
【０１８５】
一実施形態では、血清からのＴＨＳＤ７Ａに対する自己抗体の処理または吸着に適切な断片は、その別個のトロンボスポンジンＩ型ドメインのうちの１つもしくはいくつかおよび／またはリンカーストークによって構成された、ＴＨＳＤ７Ａの細胞外ドメインまたはその断片を含む、またはそれからなる断片である。
【０１８６】
上記のように、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドおよび断片は、例えば、細菌細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞または植物細胞における組換えタンパク質合成などの、当技術分野で周知の任意の方法によって合成され得る。
【０１８７】
従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術は、ＰＣＲクローニングのための鋳型としてＴＨＳＤ７ＡのｍＲＮＡを使用して、ＴＨＳＤ７Ａをコードする核酸をクローニングするために使用され得る。上記のように、例示的なヒトネイティブＴＨＳＤ７Ａ  ｍＲＮＡ配列は、ＮＭ＿０１５２０４（ＧｅｎｅＢａｎｋ）に提供される。
【０１８８】
理想的には、制限酵素消化認識部位が、増幅された核酸の、クローニングベクターまたは他のベクター中へのライゲーションを促進するために、ＰＣＲプライマーのセンス鎖およびアンチセンス鎖の末端にデザインされるべきである。あるいは、３’−Ａオーバーハングが、当技術分野で周知のＴＡ−クローニングの目的のために含まれ得る。３’Ａオーバーハングを有するかかるコード核酸は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎトポイソメラーゼ補助ＴＡベクター（topoisomerase-assisted  TA  vector）、例えば、ｐＣＲ（登録商標）−ＴＯＰＯ、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）およびｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）中に容易にライゲーションされ得る。このコード核酸は、一般的目的のクローニングベクター、例えば、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ  Ｉｎｃ．）またはＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＩＮＣ．のｐＣＲ  ＴＯＰＯ（登録商標）中にクローニングされ得る。次いで、ＴＨＳＤ７Ａをコードする核酸を保有する、得られた組換えベクターは、哺乳動物細胞株、昆虫細胞株、酵母細胞、細菌細胞および植物細胞からなる群から選択される宿主細胞を使用する種々のタンパク質発現系におけるＴＨＳＤ７Ａ融合タンパク質の合成のために、タンパク質発現ベクターまたはウイルスベクター中にサブクローニングされ得る。プロテアーゼ切断部位もまたデザインされ得、より大きい融合タンパク質、例えば、Ｈｉｓ−ＴＨＳＤ７Ａまたはチオレドキシン−ＴＨＳＤ７ＡからのＴＨＳＤ７Ａの遊離を促進するために、核酸内に含まれ得る。プロテアーゼ切断部位の例には、エンテロキナーゼ、キモトリプシンおよびトロンビンの切断部位が含まれるがこれらに限定されない。
【０１８９】
ＰＣＲ増幅されたコード核酸は、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮトポイソメラーゼ補助ＴＡベクター、例えば、ｐＣＲ（登録商標）−ＴＯＰＯ、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）およびｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）において、ＴＯＰＯ（登録商標）クローニング方法を使用してベクター中にクローニングされ得る。ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）およびｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）は共に、５’→３’配向でのＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）発現ベクター中へのＤＮＡ配列のクローニングを可能にする定方向ＴＯＰＯエントリーベクターである。５’→３’配向での定方向クローニングは、プロモーターが、核酸の５’ＡＴＧ開始コドンの上流にあり、したがって、プロモーター駆動性のタンパク質発現を可能にするような、タンパク質発現ベクター中へのＤＮＡ配列の一方向挿入を促進する。ＴＨＳＤ７Ａコード核酸を保有する組換えベクターは、一般的なクローニングＥ．ｃｏｌｉ細胞、例えば、ＸＬＩＢｌｕｅ細胞、ＳＵＲＥ細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）およびＴＯＰ−１０細胞（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）中にトランスフェクトされ得、その中で増殖され得る。
【０１９０】
異なる発現ベクターが発現のために利用可能であり、異種タンパク質発現系から産生された組換えタンパク質の精製が行われ得る。例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞または植物細胞から選択される宿主細胞を使用する異種タンパク質発現系は、当業者に周知である。この発現ベクターは、そのそれぞれの宿主細胞における効率的な遺伝子転写および翻訳のために、必要な５’上流および３’下流の調節エレメント、例えば、プロモーター配列、リボソーム認識および結合ＴＡＴＡボックス、ならびに３’ＵＴＲ  ＡＡＵＡＡＡ転写終結配列を有するべきである。この発現ベクターは、発現された組換えタンパク質中に取り込まれるさらなる配列、例えば、６Ｘ−ヒスチジン、Ｖ５、チオレドキシン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ｃ−Ｍｙｃ、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶ、ＦＬＡＧ、マルトース結合性ペプチド、金属結合性ペプチド、ＨＡおよび「分泌」シグナル（ミツバチメリチン、［アルファ］−因子、ＰＨＯ、Ｂｉｐ）を有し得る。さらに、それらが必要なくなった後のさらなる配列の酵素的除去を促進するために、これらの配列の後ろに取り込まれた酵素消化部位が存在し得る。これらのさらなる配列は、組換えタンパク質発現の検出のため、親和性クロマトグラフィーによるタンパク質精製のため、宿主原形質における組換えタンパク質の増強された溶解度のため、特に小さいタンパク質断片について、より良いタンパク質発現のため、および／または培養培地中へと、原核生物細菌のペリプラズム中へと、もしくは酵母細胞のスフェロプラストへと、発現された組換えタンパク質を分泌するために、有用である。組換えタンパク質の発現は、宿主細胞において構成的であり得るか、または例えば、硫酸銅、ガラクトースなどの糖、メタノール、メチルアミン、チアミン、テトラサイクリン、バキュロウイルスによる感染、およびラクトースの安定な合成アナログ、（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）ＩＰＴＧで、誘導され得る。
【０１９１】
一部の実施形態では、組換えＴＨＳＤ７Ａは、種々の発現宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌の細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞および植物細胞、例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓにおいて、またはさらには無細胞発現系から、発現され得る。クローニングベクターから、核酸は、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、細菌細胞もしくは植物細胞、またはウサギ網状赤血球発現系などの無細胞発現系におけるタンパク質の発現に適切な組換え発現ベクター中にサブクローニングされ得る。サブクローニングは、ＰＣＲクローニング、制限消化とその後のライゲーション、または組換え反応、例えば、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ＬＲおよびＢＰ  ＣＬＯＮＡＳＥ（商標）酵素混合物を使用したラムダファージベースの部位特異的組換えの反応によって、達成され得る。サブクローニングは、核酸の５’ＡＴＧ開始コドンが発現ベクター中のプロモーターの下流になるように、一方向性であるべきである。あるいは、コード核酸が、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）、ｐＥＮＴＲ／ＳＤ／Ｄ−ＴＯＰＯ（登録商標）（定方向エントリーベクター）、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｐＥＮＴＲ（エントリー）ベクターのいずれか中にクローニングされる場合、コード核酸は、１回の単一の組換え反応で、それぞれ、哺乳動物細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫および酵母におけるタンパク質発現のために、種々のＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）発現ベクター（デスティネーション）中に移入され得る。一部のＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）デスティネーションベクターは、そのそれぞれの宿主細胞に感染するとその宿主細胞における組換えタンパク質の異種発現を可能にする、バキュロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルスおよびレンチウイルスの構築のためにデザインされている。デスティネーションベクター中に遺伝子を移入させることは、製造業者の指示に従って、たった２つのステップで達成される。Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、哺乳動物細胞および酵母におけるタンパク質発現のためのＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）発現ベクターが存在する。Ｅ．ｃｏｌｉにおける形質転換および選択の後に、発現ベクターは、適切な宿主における発現のために即座に使用される。
【０１９２】
他の発現ベクターおよび宿主細胞の例は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞、例えば、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ならびにＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（ＮＯＶＡＧＥＮ）におけるタンパク質発現のためのｐＥＴベクター（ＮＯＶＡＧＥＮ）、ｐＧＥＸベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびｐＭＡＬベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）；哺乳動物細胞株、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ−２９３、ＪｕｒｋａｔおよびＭＣＦ−７における発現のための強力なＣＭＶプロモーターベースのｐｃＤＮＡ３．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）およびｐＣＩｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；哺乳動物細胞におけるアデノウイルス媒介性の遺伝子移入および発現のための複製不全（replication  incompetent）アデノウイルスベクター、ベクターのｐＡＤＥＮＯ  Ｘ、ｐＡｄ５Ｆ３５、ｐＬＰ−ＡＤＥＮＯ−Ｘ−ＣＭＶ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴ、ｐＡｄ−ＤＥＳＴベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）；哺乳動物細胞におけるレトロウイルス媒介性の遺伝子移入および発現のための、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＲＥＴＲＯ−Ｘ（商標）系との使用のための、ｐＬＮＣＸ２、ｐＬＸＳＮおよびｐＬＡＰＳＮレトロウイルスベクター；哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性の遺伝子移入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）；哺乳動物細胞におけるアデノ随伴ウイルス媒介性の遺伝子移入および発現のためのアデノウイルス随伴ウイルス発現ベクター、例えば、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ、ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰおよびｐＡＡＶ−ＲＣベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）；Ｓｐｏｄｏｐｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ９（Ｓｆ９）およびＳｆ１ｌ昆虫細胞株における発現のためのＢＡＣｐａｋ６バキュロウイルス（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）およびｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）ＨＴ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞における発現のためのｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉｓ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現のためのＰｉｃｈｉａ発現ベクターｐＰＩＣＺα、ｐＰＩＣＺ、ｐＦＬＤαおよびｐＦＬＤ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）ならびにＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおける発現のためのベクターｐＭＥＴαおよびｐＭＥＴ；酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのｐＹＥＳ２／ＧＳおよびｐＹＤｌ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）ベクターである。Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉにおける異種タンパク質の大規模発現における最近の進歩は、Griesbeck  C.ら  ２００６年  MoI.  Biotechnol.  ３４巻：２１３〜３３頁およびFuhrmann  M.  ２００４年、Methods  MoI  Med.  ９４巻：１９１〜５頁によって記載されている。外来異種コード配列は、相同組換えによって、核、葉緑体およびミトコンドリアのゲノム中に挿入される。スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与する多用途葉緑体選択可能マーカー、アミノグリコシドアデニルト���ンスフェラーゼ（ａａｄＡ）を保有する葉緑体発現ベクターｐ６４は、葉緑体において外来タンパク質を発現させるために使用され得る。微粒子遺伝子銃（biolistic  gene  gun）法は、藻類においてベクターを導入するために使用され得る。葉緑体中へのそのエントリーの際に、外来ＤＮＡは、遺伝子銃粒子から放出され、相同組換えを介して葉緑体ゲノム中に組み込まれる。
【０１９３】
異なる宿主細胞における組換えタンパク質発現は、構成的であり得る、または硫酸銅、ガラクトースなどの糖、メタノール、メチルアミン、チアミン、テトラサイクリンもしくはＩＰＴＧなどの誘導因子によって誘導可能であり得る。タンパク質を宿主細胞において発現させた後、宿主細胞を溶解して、発現したタンパク質を精製のために遊離させる。種々の宿主細胞を溶解させる方法は、「Sample  Preparation-Tools  for  Protein  Research」EMD  BioscienceおよびCurrent  Protocols  in  Protein  Sciences（CPPS）中で特集されている。好ましい精製方法は、親和性クロマトグラフィー、例えば、ヒスチジンタグ化組換えタンパク質に対するニッケル、コバルトまたは亜鉛親和性樹脂を使用する、イオン−金属親和性クロマトグラフである。ヒスチジンタグ化組換えタンパク質を精製する方法は、彼らのＴＡＬＯＮ（登録商標）コバルト樹脂を使用してＣＬＯＮＴＥＣＨによって、彼らのｐＥＴ系マニュアル、第１０版においてＮＯＶＡＧＥＮによって、記載されている。別の好ましい精製戦略は、免疫親和性クロマトグラフィーによるものであり、例えば、抗ｍｙｃ抗体をコンジュゲートした樹脂が、ｍｙｃタグ化組換えペプチドを親和性精製するために使用され得る。セリンプロテアーゼ、例えば、トロンビンおよびエンテロキナーゼによる酵素消化は、ヒスチジンまたはｍｙｃタグから組換えタンパク質を切断して放出させ、ヒスチジンタグおよびｍｙｃタグを親和性樹脂に結合させたままにしつつ、組換えタンパク質を親和性樹脂から放出させる。
【０１９４】
無細胞発現系もまた企図される。無細胞発現系は、タンパク質折り畳みに好都合な反応条件の容易な改変、生成物毒性に対する感受性の減少、ならびに反応体積およびプロセス時間の低減に起因した迅速な発現スクリーニングまたは大量タンパク質産生などのハイスループット戦略に対する適性を含む、伝統的な細胞ベースの発現方法を超えるいくつかの利点を提供する。この無細胞発現系は、プラスミドまたは線状ＤＮＡを使用し得る。さらに、翻訳効率における改善が、反応ミックス１ミリリットル当たり１ミリグラムのタンパク質を上回る収量を生じている。高収量でタンパク質を産生することが可能な無細胞翻訳系の一例は、Spirin  AS.ら、Science  ２４２巻：１１６２頁（１９８８年）によって記載されている。この方法は、反応混合物全体にわたる、アミノ酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を含む栄養補給緩衝液（feeding  buffer）の連続的フローデザイン、ならびに翻訳されたポリペプチド生成物の連続的除去を使用する。この系は、無細胞の連続的栄養補給緩衝液を提供するために、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物を使用する。この連続的フロー系は、原核生物および真核生物の両方の発現ベクターと適合性である。一例として、内在性膜タンパク質ＥｍｒＥ多剤トランスポーターの大規模無細胞産生は、Chang  G.ら、Science  ３１０巻：１９５０〜３頁（２００５年）によって記載されている。
【０１９５】
他の市販の無細胞発現系には、チューブ反応形式で最大でミリグラム量の活性な組換えタンパク質を産生するための効率的な、共役した転写および翻訳反応のためにＥ．ｃｏｌｉベースのｉｎ−ｖｉｔｒｏ系を利用するＥＸＰＲＥＳＳＷＡＹ（商標）Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；これもまたＥ．ｃｏｌｉベースのｉｎ−ｖｉｔｒｏ系を使用するＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）；およびウサギ網状赤血球ベースのｉｎ−ｖｉｔｒｏ系を使用するＴＮＴ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。
【０１９６】
一実施形態では、いくつかのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドのカクテルが、処置のために使用される。想定されるペプチドは、より長い血清半減期のための他のタンパク質、タンデムに連結されたペプチドまたは環状ペプチドと融合され得る。
【０１９７】
本明細書に記載される方法には、哺乳動物、例えば、ブタまたはウサギから精製される哺乳動物ＴＨＳＤ７Ａが包含される。一実施形態では、ネイティブ（非組換え）哺乳動物ＴＨＳＤ７Ａが、腎臓からｅｘ  ｖｉｖｏで精製される。ネイティブタンパク質の精製の方法は、当業者に周知である。
【０１９８】
本発明のなおさらなる目的は、膜性腎症、特に特発性膜性腎症の処置における使用のための、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片に関する。
【０１９９】
一実施形態では、この膜性腎症は特発性膜性腎症である。
【０２００】
別の一実施形態では、この患者はＴＨＳＤ７Ａ陽性患者である。
【０２０１】
好ましくは、この患者はヒト患者である。
【０２０２】
好ましい一実施形態では、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドの断片は、抗体結合性断片である（これは、本発明によれば、特発性膜性腎症に罹った患者の自己抗体が、この断片を認識することを意味する）。
【０２０３】
好ましくは、ＴＨＳＤ７Ａの断片は、その別個のトロンボスポンジンＩ型ドメインのうちの１つもしくはいくつかおよび／またはリンカーストークによって構成された、ＴＨＳＤ７Ａの細胞外ドメインまたはその断片を含む、またはそれからなる。
【０２０４】
本発明によれば、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片は、治療有効量で使用される。
【０２０５】
特定の一実施形態では、本発明は、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片を発現するベクター、またはこのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片を発現する宿主細胞もまた提供する。
【０２０６】
本発明のさらなる目的は、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物に関する。さらなる一態様では、本発明は、膜性腎症を処置するための使用のための、この医薬組成物に関する。
【０２０７】
一実施形態では、この膜性腎症は特発性膜性腎症である。
【０２０８】
別の一実施形態では、この患者はＴＨＳＤ７Ａ陽性患者である。
【０２０９】
好ましくは、この患者はヒト患者である。
【０２１０】
特定の一実施形態では、この医薬組成物は、このＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片を発現するベクター、またはこのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドもしくはその断片を発現する宿主細胞を含み得る。
【０２１１】
この医薬組成物は、全長ＴＨＳＤ７Ａおよび種々のサイズの断片、特に抗体結合性断片と、薬学的に許容されるビヒクルとの組合せであり得る。かかる断片の例には、その別個のトロンボスポンジンＩ型ドメインのうちの１つもしくはいくつかおよび／またはリンカーストークによって構成された、ＴＨＳＤ７Ａの細胞外ドメインまたはその断片を含む、またはそれからなる断片が包含されるがこれらに限定されない。
【０２１２】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、いくつかのＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片のカクテルを含み得る。想定されるペプチドは、より長い血清半減期のための他のタンパク質、タンデムに連結されたペプチドまたは環状ペプチドと融合され得る。
【０２１３】
一実施形態では、用語「薬学的に許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の規制機関によって承認されたこと、または米国薬局方、もしくは動物、より特にはヒトにおける使用のための一般に認識された他の薬局方に列挙されたことを意味している。用語「キャリア」とは、治療剤と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。かかる薬学的キャリアは、無菌液体、例えば、水、および石油からのもの、動物、植物または合成起源のものを含む油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合に好ましいキャリアである。生理食塩水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体キャリアとして、特に注射可能な溶液のために、使用され得る。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。この組成物は、所望に応じて、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤もまた含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、徐放性製剤などの形態を取り得る。この組成物は、伝統的なバインダーおよびキャリア、例えば、トリグリセリドを用いて、坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、標準的なキャリア、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１８版、Gennaro編（Mack  Publishing  Co.、１９９０年）に記載されている。一実施形態では、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニン；セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；ならびに糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトールを含む他の成分が、医薬製剤に添加され得る。
【０２１４】
一実施形態では、この組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適応された医薬組成物として、慣用的手段に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、この組成物は、可溶化剤および注射の部位における疼痛を緩和するための局所麻酔薬、例えばリグノカイン（lignocamne）もまた含み得る。一般に、これらの成分は、別々に、または単位剤形中に一緒に混合されてのいずれかで、例えば、活性作用物質の量を示す密封容器、例えば、アンプルまたはサシェ中の、乾燥した凍結乾燥粉末または水なし濃縮物として、供給される。組成物が注入によって投与される場合、これは、無菌医薬品グレードの水または食塩水を含む注入瓶で分配され得る。組成物が注射によって投与される場合、これらの成分が投与前に混合され得るように、無菌の注射用水、または食塩水のアンプルが提供され得る。
【０２１５】
本発明の組成物は、中性または塩形態として製剤化され得る。
【０２１６】
薬学的に許容される塩には、いくつか挙げると、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるものなどのアニオンと形成される塩、および水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるものなどのカチオンと形成される塩が含まれる。
【０２１７】
種々の送達系、例えば、リポソーム、微粒子およびマイクロカプセルにおけるカプセル封入が、当技術分野で公知であり、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片を投与するために使用され得る（例えば、WuおよびWu、J.  Biol.  Chem.、２６２巻：４４２９〜４４３２頁（１９８７年）を参照のこと）。この組成物は、小胞、特にリポソーム中で送達され得る（Langer、Science、２４９巻：１５２７〜１５３３頁（１９９０年）；Treatら、Liposomes  in  the  Therapy  of  Infectious  Disease  and  Cancer、Lopez-BeresteinおよびFidler編（Liss、New  York  １９８９年）、３５３〜３６５頁；Lopez-Berestein、同書、３１７〜３２７頁を参照のこと；一般に同書を参照のこと）。導入の方法には、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外および経口経路が含まれるがこれらに限定されない。これらの組成物は、任意の簡便な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜裏打ち層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与され得、他の生物学的に活性な作用物質と一緒に投与され得る。投与は、全身または局所であり得る。さらに、本発明の医薬組成物を、脳室内および髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって中枢神経系中に導入することが望まれ得る；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｃａｎａレザバなどのレザバに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進され得る。例えば、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアロゾル化剤を用いた製剤による肺投与も、使用され得る。
【０２１８】
一実施形態では、治療的投与に使用される医薬製剤は、無菌でなければならない。無菌性は、無菌濾過メンブレン（例えば、０．２ミクロンメンブレン）を介した濾過によって容易に達成される。医薬製剤のｐＨは、典型的には、約６〜８であるべきである。
【０２１９】
一実施形態では、この組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプが使用され得る（Langer、上記；Sefton、CRC  Crit.  Ref.  Biomed.  Eng.、１４巻：２０１頁（１９８７年）；Buchwaldら、Surgery、８８巻：５０７頁（１９８０年）；Saudekら、N.  Engl.  J.  Med.、３２１巻：５７４頁（１９８９年）を参照のこと）。別の一実施形態では、ポリマー性材料が使用され得る（Medical  Applications  of  Controlled  Release、LangerおよびWise編（CRC  Press、Boca  Raton、FIa.  １９７４年）；Controlled  Drug  Bioavailability、Drug  Product  Design  and  Performance、SmolenおよびBall編（Wiley、New  York  １９８４年）；RangerおよびPeppas、Macromol.  Sci.  Rev.  Macromol.  Chem.、２３巻：６１頁（１９８３年）を参照のこと；Levyら、Science、２２８巻：１９０頁（１９８５年）；Duringら、Ann.  Neurol.、２５巻：３５１頁（１９８９年）；Howardら、J.  Neurosurg.、７１巻：１０５頁（１９８９年）もまた参照のこと）。他の制御放出系は、Langerによる総説（Science、２４９巻：１５２７〜１５３３頁（１９９０年））において議論されている。徐放性組成物の例については、米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１Ａ、米国特許第３，８８７，６９９号、ＥＰ１５８，２７７Ａ、カナダ特許第１１７６５６５号、U.  Sidmanら、Biopolymers  ２２巻：５４７頁（１９８３年）およびR.  Langerら、Chem.  Tech.  １２巻：９８頁（１９８２年）を参照のこと。
【０２２０】
製剤において使用される正確な用量は、投与の経路、ならびに膜性腎症の重症度および血清中の抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の力価にも依存し、従事者の判断および各患者の情況に従って決定すべきである。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から外挿され得る。
【０２２１】
患者に投与される投薬量は、典型的には、患者の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇと２０ｍｇとの間、より好ましくは、患者の体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜１０ｍｇである。遺伝子治療のために、ウイルスベクターは、１適用につき患者１人当たり１×１０６〜１０１４のウイルスベクター粒子の範囲であるべきである。
【０２２２】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが、最適な投薬量範囲を同定することを助けるために、任意選択で使用され得る。使用される正確な用量は、投与の経路、および処置されている状態の重篤度にも依存し、例えば、公開された臨床研究を考慮して、従事者の判断および各被験体の情況に従って決定すべきである。しかし、適切な有効投薬量の量は、約４時間毎に約１０マイクログラムから約５グラムの範囲であるが、これらは、典型的には、４時間毎に約５００ｍｇまたはそれ未満である。一実施形態では、この有効投薬量は、４時間毎に、約１０μｇ、約２０μｇ、約５０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇ、約８００μｇ、約９００μｇ、約１ｍｇ、約１．２ｍｇ、約１．４ｍｇ、約１．６ｍｇ、約１．８ｍｇ、約２．０ｍｇ、約２．２ｍｇ、約２．４ｍｇ、約２．６ｍｇ、約２．８ｍｇ、約３．０ｍｇ、約３．２ｍｇ、約３．４ｍｇ、約３．６ｍｇ、約３．８ｍｇ、約４．０ｍｇ、約４．２ｍｇ、約４．４ｍｇ、約４．６ｍｇ、約４．８ｍｇ、または約５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２０．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇである。等価な投薬量が、約２時間毎、約６時間毎、約８時間毎、約１２時間毎、約２４時間毎、約３６時間毎、約４８時間毎、約７２時間毎、約１週間毎、約２週間毎、約３週間毎、約１ヶ月毎および約２ヶ月毎が含まれるがこれらに限定されない種々の期間にわたって、投与され得る。本明細書に記載される有効投薬量の量とは、投与される総量を指す。ＴＨＳＤ７Ａポリペプチド、その断片、またはそれを含む発現ベクターおよび／もしくは宿主細胞を含む組成物は、一度に、または一連の処置にわたって、患者に適切に投与される。
【０２２３】
一実施形態では、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片を含む組成物は、アザチオプリン、インフリキシマブ、オマリズマブ、ダクリズマブ、アダリムマブ、エクリズマブ、エファリズマブ、ナタリズマブ  オマリズマブ、シクロホスファミド、クロラムブシルおよび／またはリツキシマブが含まれるがこれらに限定されない免疫抑制治療と組み合わせて投与される。
【０２２４】
特に、ＴＨＳＤ７Ａポリペプチドまたはその断片を含む組成物は、膜性腎症、特に特発性膜性腎症を処置するために有用な、患者にとって有効であり得る任意の処置と組み合わせて投与される。
【０２２５】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。しかし、これらの実施例は、本発明の範囲を限定すると決して解釈すべきではない。
【実施例】
【０２２６】
材料および方法
患者。膜性腎症（ＭＮ）の診断を、腎生検によって行った。血清を、膜性腎症を有する患者、他の腎臓疾患を有する患者および健康な対照から採取した。全ての患者は、最初の血清を採取した時点では、先行する免疫抑制治療を有さなかった。血清を、ＥＬＩＳＡによって、抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体について調査した。
【０２２７】
ヒト腎組織。腎摘除術を受けた患者由来の腎臓の健康な部分を、ヒト糸球体の抽出物の調製のために使用した。糸球体を、段階篩別（graded  sieving）によって獲得し、ダウンスホモジナイズした。可溶性画分および膜画分を、超遠心分離および可溶化によって分離した。存在する免疫グロブリンＧを除去するために、試料を、プロテインＧマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共にインキュベートし、結合した免疫グロブリンを、磁性分離カラムによって抽出した（同上）。酵素的脱グリコシル化のために、本発明者らは、製造業者の指示（共にＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、Ｎ−グリコペプチダーゼＦおよびノイラミニダーゼを使用した。
【０２２８】
ウエスタンブロット分析。タンパク質試料を、非還元条件もしくは還元条件下で、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、半乾燥条件下でＰＶＤＦメンブレンに移した（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）。メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＵＳＡ）を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ０．０５％中５％の粉乳で一晩ブロッキングし、引き続いて、一次抗体および二次抗体と共に室温で２時間インキュベートした。一次抗体としての使用のために、血清を、０．５％粉乳中１：１００作業希釈に希釈した。ＴＨＳＤ７Ａ（トロンボスポンジン１型ドメイン含有７Ａ）の特異的検出のために、本発明者らは、１：１，０００の作業希釈での市販のウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を使用した。二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたマウス抗ヒトまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ（全てＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＵＳＡ）であった。ＩｇＧサブクラス検出が望まれる場合には、マウス抗ヒトＩｇＧ１〜ＩｇＧ４を適用した（同上）。
【０２２９】
免疫沈降。ヒト糸球体溶解物を、膜性腎症または他の糸球体疾患を有する患者および健康な対照由来の血清と共にインキュベートした。ＩｇＧ４親和性マトリックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を添加し、試料を４℃で一晩インキュベートした。免疫沈降物を、上記のように、低速遠心分離によって収集し、試料を電気泳動し、ブロットし、抗ＴＨＳＤ７Ａ抗体を用いて検出した。
【０２３０】
質量分析。ウエスタンブロット分析における目に見えるバンドに対応するゲル領域を切り出し、トリプシンゲル内消化に供した。消化したペプチドを、ギ酸およびアセトニトリルを使用して単離し、ナノ高速液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＨＰＬＣ）によって分離し、ＡＢＩ  ４７００質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＵＳＡ）を使用するマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）タンデム質量分析によって同定した。生データを、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＵＳＡ）によって分析し、Ｐａｒａｇｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍを使用してさらに処理した。
【０２３１】
候補タンパク質の組換え発現。ＴＨＳＤ７Ａ、ならびにＰＬＡ２Ｒ１の３つのパラログ、即ち、マクロファージマンノース受容体（ＭＲＣ１）、エンドサイトーシス受容体１８０（ＭＲＣ２）および樹状細胞受容体２０５（ＬＹ７５）をコードするヒトｃＤＮＡを、標準的な方法を使用してＰＣＲによってクローニングしたか、または会社（Ｇｅｎｅ  ＣｏｐｐｏｅｉａおよびＯｒｉＧｅｎｅ）から購入した。全てのｃＤＮＡ配列を、哺乳動物発現ベクター中へのサブクローニングおよび特異的ＨＡまたはＤＤＫタグ（ｐＬＰＣＸまたはｐＣＭＶ６エントリー）の付加後に、配列決定によって確認した。プラスミドを、リン酸カルシウムトランスフェクションによってＨＥＫ２９３細胞中に一過的にトランスフェクトした。７２時間後に、培地を収集し、細胞を掻き取り、溶解させた。目的の発現されたタンパク質の可溶性画分を、超遠心分離によって取得した。この膜画分を、溶解緩衝液中に再懸濁し、激しい手動ダウンシング（douncing）によってホモジナイズし、可溶化された画分を、高速遠心分離後に取得した。候補タンパク質の発現を、特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析によって確認し、モックトランスフェクションと比較した。
【０２３２】
組織学的分析。免疫蛍光分析のために、ヒト腫瘍腎摘除術標本の健康な極の２μＭパラフィン切片を、脱パラフィン処理し、水中で再水和した。抗原回復を、クエン酸塩緩衝液ｐＨ６．１中で煮沸（一定の９８℃で３０分間）することによって得た。非特異的結合を、ＰＢＳ中０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）を有する５％ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＵＳＡ）で室温３０分間ブロッキングし、その後、ブロッキング緩衝液中の一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。染色を、蛍光色素をコンジュゲートした二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ；１：４００、５％ウマ血清中で室温３０分間）で視覚化した。核を、ＤＲＡＱ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＵＳＡ）を使用して視覚化した。陰性対照を、一次抗体を省いて実施した。染色した切片を、Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ５１０および適切なソフトウェアを使用する共焦点顕微鏡法によって評価した（全てＺＥＩＳＳ、ＯＢＥＲＫＯＣＨＥＮ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０２３３】
免疫組織化学検査のために、ＭＮを有する患者由来の腎生検の１μＭパラフィン切片を、脱パラフィン処理し、再水和した。抗原回復を、ＤＡＫＯ抗原回復緩衝液、ｐＨ９中で煮沸（９８℃で１５分間）し、引き続いて室温で１５分間冷却することによって得た。非特異的結合を、ＰＢＳ中０．０５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＳＩＧＭＡ）を有する５％ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ）を用い室温で３０分間ブロッキングし、その後、ブロッキング緩衝液中のウサギ抗ＴＨＳＤ７Ａ（１：４００、Ａｔｌａｓ）と共に４℃で一晩インキュベートした。染色を、製造業者の指示に従って、ＺｙｔｏｃｈｅｍＰｌｕｓ  ＡＰ  Ｐｏｌｙｍｅｒキット（ＺＹＴＯＭＥＤ  ＳＹＳＴＥＭＳ）を用いて視覚化した。核を、ヘマラウン（hemalaun）で対比染色し、切片を、アラビアゴム（ＳＩＧＭＡ）を用いてマウントした。陰性対照を、一次抗体を省いて実施した。染色を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを使用してＡｘｉｏｓｋｏｐを用いて評価した（全てＺＥＩＳＳ）。
【０２３４】
組織学的分析に使用した一次抗体は、以下であった：ウサギ抗ＴＨＳＤ７Ａおよび抗ＰＬＡ２Ｒ１（ＡＴＬＡＳ、１：２００）、モルモット抗ネフリン（ＡＣＲＩＳ、１：１００）、ヤギ抗コラーゲンＩＶ型（ＳＯＵＴＨＥＲＮＢＩＯＴＥＣＨ、１：４００）およびヒツジ抗フィブロネクチン（ＤＡＫＯ、１：５００）。全ての二次抗体は、蛍光色素をコンジュゲートした、親和性精製したロバ抗体（ＪＡＣＫＳＯＮ  ＩＭＭＵＮＯＲＥＳＥＡＲＣＨ、Ｄｉａｎｏｖａ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ、１：４００）であった。
【０２３５】
結果
ＰＬＡ２Ｒ１のパラログおよびヒト糸球体由来のタンパク質溶解物による特発性膜性腎症血清のスクリーニング。本発明者らは、２つの並行するアプローチによって、特発性膜性腎症（ｉＭＮ）血清および適切な対照血清をスクリーニングした。第１のアプローチは、候補抗原として、ＰＬＡ２Ｒ１のパラログに焦点を当てた。第２のアプローチは、ヒト糸球体抽出物（ＨＧＥ）由来の総タンパク質に対する、より一般的な血清のスクリーニングであった。
【０２３６】
ＰＬＡ２Ｒ１の３つのパラログタンパク質、即ち、マクロファージマンノース受容体（ＭＲＣ１）、エンドサイトーシス受容体１８０（ＭＲＣ２）および樹状細胞受容体２０５（ＬＹ７５）を、組換えタンパク質としてＨＥＫ２９３細胞において一過的に発現させた。これらのパラログならびにＨＧＥに対する血清反応性を、膜性腎症を有する６５人の患者（そのうち３０人は、抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体について陰性であった）、他のタンパク尿腎臓疾患を有する５７人の患者および４４人の健康な対照由来の血清を用いて、非還元条件下でのウエスタンブロット分析によって調査した。ＥＬＩＳＡによって以前に試験した、抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体について陽性であることが既知の全ての血清は、ウエスタンブロット分析で組換えＰＬＡ２Ｒ１と反応したが、これらの血清も他のカテゴリー由来の血清も、ＰＬＡ２Ｒ１のパラログタンパク質とは反応しなかった。抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体について全て陰性であった、ｉＭＮを有する４人の患者由来の血清は、サイズが約２５０ｋＤａの同じ糸球体タンパク質を認識した（図１Ａ）。他の腎臓疾患を有する患者または健康な対照由来の血清は、このエリアではいずれの反応性も示さなかった。次いで、このスクリーニングを、膜性腎症を有する１２９人の患者（ｉＭＮを有する９５人および二次性ＭＮを有する３４人）に拡張させた。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析において抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体について全て陰性の合計６つの血清が、２５０ｋＤａの同じタンパク質と反応することが見出された（図１Ｂ）。これらの患者のうち、５人はｉＭＮを有し、１人は、この患者を二次性ＭＮの症例として分類する、抗核抗体（ＡＮＡ）についての陽性力価を伴うＭＮを有した（図１Ｂ）。
【０２３７】
こうして、上記スクリーニングは、同じＨＧＥ調製物中の約１８０ｋＤａのサイズを有するＰＬＡ２Ｒ１とはおそらく別個の、ＨＧＥ中に存在する２５０ｋＤａの新規自己抗原を同定した。２つの抗原間をよりよく識別するために、本発明者らは、低アクリルアミド百分率を有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでＨＧＥタンパク質を泳動して、目的の２つのタンパク質を分離し、次いで、ウエスタンブロットを作製し、続いて、ＰＬＡ２Ｒ１または新たな抗原に対して反応性の血清と共に、メンブレンをインキュベートした。予測通り、約６０ｋＤａのサイズ差を有する２つの別個のバンドが明らかになり、これは、２つの異なる抗原の存在を示している。ＰＬＡ２Ｒ１と比較して新規抗原をさらに特徴付けるために、本発明者らは、２つの抗原を含むＨＧＥを酵素的に脱グリコシル化した。Ｎ−グリコペプチダーゼＦは、新規抗原のサイズをおよそ２２５ｋＤａまで減少させ、シアル酸を除去する酵素であるノイラミニダーゼの添加は、２００ｋＤａへのさらなるシフトを引き起こした。他方、ＰＬＡ２Ｒ１は、以前に記載されたように、Ｎ−グリコペプチダーゼＦの添加後におよそ１４５ｋＤａへと移動したが、ノイラミニダーゼの添加後にはシフトはもはや見られなかった。完全にグリコシル化された２５０ｋＤａタンパク質と反応する全ての血清は、同じ分子質量の脱グリコシル化形態もまた認識し、これは、全ての血清が同じタンパク質を認識することを示唆している。さらに、新規抗原およびＰＬＡ２Ｒ１の両方が、ＨＧＥの膜画分中に存在したが、可溶性画分中にはＰＬＡ２Ｒ１だけが存在する。
【０２３８】
ＴＨＳＤ７Ａとしての新規ＨＧＥ抗原の同定。本発明者らは、ネイティブ糸球体タンパク質、ならびにＮ−グリコペプチダーゼＦならびにＮ−グリコペプチダーゼＦおよびノイラミニダーゼで処理した糸球体タンパク質のゲル電気泳動を実施した。各処理由来のタンパク質の大部分を、クマシーブルー色素で染色し、他の部分を、ＰＶＤＦに移し、新規抗原に対する抗体について陽性の患者の血清でプローブした。次いで、本発明者らは、標的タンパク質が３つ全ての条件において特異的に存在すると仮定して、上記のように、２５０ｋＤａ、２２５ｋＤａおよび２００ｋＤａのウエスタンブロットシグナルに対応するクマシー染色されたゲルエリアを切り出した。質量分析による分析を、全てのゲルスライスにおいて実施し、一次候補リストを得た。候補タンパク質を、新たな抗原の予測された生化学的特徴に従って、即ち、それらの分子質量、Ｎ−グリコシル化、膜性局在、およびヒト腎臓または糸球体における発現を参照して、ランク付けした。興味深いことに、ＰＬＡ２Ｒ１の全ての以前に試験したパラログが、質量分析による分析において顕著な位置に現れ、これは、初期のアプローチを遡及的に正当化する。本発明者らは、市販の抗体および一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用して、候補抗原について特異的に試験し、トロンボスポンジン１型ドメイン含有７Ａ（ＴＨＳＤ７Ａ）を目的のタンパク質として最終的に同定した。
【０２３９】
実際、ＨＧＥ中の２５０ｋＤａタンパク質と以前に反応した６つ全ての血清は、ＨＥＫ２９３細胞において発現された組換えＴＨＳＤ７Ａもまた認識したが、抗ＰＬＡ２Ｒ１陽性血清または対照のどれも、それを認識しなかった（図２Ａ）。注目すべきことに、ＨＧＥ中に存在するネイティブＴＨＳＤ７Ａタンパク質およびＨＥＫ２９３細胞において発現された組換えタンパク質は、同じパターンのグリコシル化を示したが、組換えタンパク質はわずかにより低い位置に移動し、これは、翻訳後修飾における軽微な差異を示唆している（図２Ａ）。反応性血清によって認識された糸球体自己抗原が実際にＴＨＳＤ７Ａであることの最終的な証拠として、本発明者らは、免疫沈降実験を実施した。全ての反応性血清は、沈降物の、ＴＨＳＤ７Ａに対する特異的ポリクローナル抗体との反応性によって実証されるように、ＨＧＥからＴＨＳＤ７Ａを免疫沈降させたが、対照は免疫沈降させなかった（図２Ｂ）。
【０２４０】
抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体の特徴付け。抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体のＩｇＧサブタイプ（複数可）を決定するために、本発明者らは、異なるＩｇＧ（１〜４）に対する二次抗体を使用した。抗ＴＨＳＤ７Ａ  ＩｇＧ４は、６つ全ての反応性血清について優勢な抗体であることが見出された。しかし、他のＩｇＧサブタイプもまた、ほとんどの血清中に存在した。この知見は、全ての利用可能な生検における、ＩｇＧ４についての増強された染色に一致した。さらに、全ての陽性血清が、ゲルを還元条件下で泳動した場合、ＨＧＥ中の２５０ｋＤａタンパク質および組換えＴＨＳＤ７Ａの両方に対するそれらの反応性を喪失した。したがって、抗ＰＬＡ２Ｒ１自己抗体と同様、抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体は、ほとんどＩｇＧ４であり、ネイティブおよび組換えの両方のＴＨＳＤ７Ａタンパク質中に存在するＴＨＳＤ７Ａ中の１または複数のコンフォメーション依存的エピトープ（複数可）を認識する。
【０２４１】
抗ＴＨＳＤ７Ａ自己抗体および疾患活性。ｉＭＮを有し、抗ＴＨＳＤ７Ａ抗体について陽性の２人の患者由来の連続血清試料が、半定量的ウエスタンブロット分析による抗ＴＨＳＤ７Ａ抗体レベルの分析のために利用可能であった。１人の患者では、免疫抑制治療は、抗ＴＨＳＤ７Ａ抗体レベルの実質的な減少を誘導し、タンパク尿における低減がそれに続いた（図３）。他方、軽微な臨床的愁訴に起因して免疫抑制治療を受けなかった１人の患者では、抗体レベルは、持続性のネフローゼ範囲のタンパク尿を伴って、着実に高いままであった。合わせると、これらの結果は、抗体レベルと臨床的疾患活性（clinical  disease  activity）との間の関連を示唆している。
【０２４２】
健康な対照およびＭＮ患者におけるＴＨＳＤ７Ａの糸球体発現。ＴＨＳＤ７Ａの糸球体発現を調査するために、本発明者らは、健康な被験体およびｉＭＮを有する患者由来の生検試料において、免疫蛍光および免疫組織化学的分析を実施した。本発明者らは、２つの異なる抗ＴＨＳＤ７Ａ特異的抗体でプローブした場合、健康な腎臓由来の生検標本においてＴＨＳＤ７Ａの顕著な線状の糸球体発現を見出した。一次抗体を省いた陰性対照は、染色を全く示さなかった。有足細胞の足突起の細胞間スリットダイアフラグム（slit-diaphragm）の領域において発現される膜貫通タンパク質、ネフリンについて染色した場合、ＴＨＳＤ７Ａについてと非常に類似した染色パターンが見られた。さらに、両方の分子は強い共局在を示し、これは、ＴＨＳＤ７Ａが、有足細胞の足突起中にまたはそれにごく近接して位置することを示唆している。他方、ＴＨＳＤ７Ａは、糸球体基底膜のマーカー、例えば、コラーゲンＩＶ型およびフィブロネクチンとは共局在しなかった。正確には、ＴＨＳＤ７Ａは、コラーゲンＩＶ型およびフィブロネクチンと比較して上皮下に位置し、これは、ＴＨＳＤ７Ａが、糸球体基底膜ではなく有足細胞の足突起上で発現されることを示唆している。
【０２４３】
以前の研究から、ＰＬＡ２Ｒ１が、ＭＮおよびＰＬＡ２Ｒ１に対する検出可能な抗体を有する患者由来の生検の上皮下（subepthelial）沈着物においてＩｇＧ４と共局在することが公知である。抗ＴＨＳＤ７Ａ陽性ＭＮ患者におけるこの現象を調査するために、本発明者らは、特異的抗ＴＨＳＤ７Ａならびに抗ＩｇＧ４抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡法を実施した。本発明者らは、抗ＴＨＳＤ７Ａ陽性ＭＮを有する患者（ｎ＝５）由来の全ての利用可能な生検において、ＩｇＧ４およびＴＨＳＤ７Ａについての強い染色を見出した。それによって、ＴＨＳＤ７Ａは、ＭＮについて典型的である顆粒状パターンでＩｇＧ４と共局在した。
【０２４４】
ＴＨＳＤ７Ａの免疫組織化学的染色は、健康な対照由来の生検試料において、有足細胞形質膜に沿った線状の陽性を明らかにした。対照的に、ＰＬＡ２Ｒ１は、わずかに少なく発現される。抗ＴＨＳＤ７Ａ陽性ＭＮを有する患者由来の５つ全ての利用可能な生検において、免疫組織化学検査は、正常対照と比較した場合に、ＴＨＳＤ７Ａについての顕著に増強された染色を明らかにした。他方、ＰＬＡ２Ｒ１染色は、これらの患者において正常であった。対照的に、抗ＰＬＡ２Ｒ１抗体を有する全ての調査した患者は、ＴＨＳＤ７Ａについては正常染色を有したが、以前に記載されたように、ＰＬＡ２Ｒ１の増強された顆粒状染色を有した。二次性ＭＮを有する患者由来の全ての調査した生検は、ＴＨＳＤ７ＡおよびＰＬＡ２Ｒ１の両方について正常染色を有した。
【０２４５】
生検組織からの抗ＴＨＳＤ７Ａ  ＩｇＧの溶出。ＩｇＧを、その血清がＴＨＳＤ７Ａと反応性であった１人の患者、ＰＬＡ２Ｒ１関連ｉＭＮの２人の症例、およびクラスＶループス腎炎の１人の症例由来の凍結残存生検コア（frozen  remnant  biopsy  core）から、酸溶出させた。抗ＴＨＳＤ７Ａ血清陽性症例由来のＩｇＧは、ウエスタンブロットで組換えＴＨＳＤ７Ａを特異的に認識したが、ＰＬＡ２Ｒ１関連ＭＮ症例から溶出されたＩｇＧは、ＴＨＳＤ７Ａを認識せず、ＰＬＡ２Ｒ１を特異的に認識した。クラスＶループス腎炎生検から溶出されたＩｇＧは、いずれの抗原も認識しなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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