(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１試薬に、検体中の非抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンの反応抑制剤として、ｐ−トルエンスルホン酸及び非抱合型ビリルビンを含み、
第２試薬に、検体中のビリルビンに対する酸化剤としてバナジン酸イオンを含む抱合型ビリルビン測定用試薬。
【請求項２】
バナジン酸イオンに対してｐ−トルエンスルホン酸をモル比で２．５〜１２．５含む請求項１に記載の抱合型ビリルビン測定用試薬。
【請求項３】
上記第１試薬に、さらに非イオン性界面活性剤を含む請求項１又は２に記載の抱合型ビリルビン測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体液中の抱合型ビリルビンの測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビリルビンは、テトラピロール類に属する黄色色素である。ビリルビンは、ヘムの生理的代謝産物であり、胆汁中に最も多く存在する。血液などの生体液中において、ビリルビンは、抱合型ビリルビン、非抱合型ビリルビン、及びデルタ型ビリルビンの三種類が存在し、これらを区別せずに含むものが総ビリルビンと称される。抱合型ビリルビンは、ビリルビンが肝臓中でグルクロン酸抱合を受けて生成されたものであり、グルクロン酸１分子が結合したモノグルクロナイドビリルビンと、グルクロン酸２分子が結合したジグルクロナイドビリルビンとが存在する。非抱合型ビリルビンは、グルクロン酸抱合を受けていないビリルビンである。また、デルタ型ビリルビンは、血清アルブミンと不可逆的にビリルビンが共有結合した状態で存在するビリルビンである。これら３種類のビリルビンの分別定量は、肝・胆道疾患の診断の指標として重要であると言われている。特に、抱合型ビリルビンの測定は、胆汁分泌障害の良い指標となる。
【０００３】
抱合型ビリルビンの測定方法として、ビリルビンオキシダーゼなどの酸化酵素を用いる方法が知られている。この測定方法においては、酸化酵素によって生体液中のビリルビンを酸化させることにより、ビリルビンが有する４５０ｎｍ付近の吸光度を低下させ、その吸光度の変化からビリルビンを測定する。抱合型ビリルビンに対して特異的に酸化酵素が作用する条件を設定することにより、抱合型ビリルビンを特異的に測定することができる（特許文献１参照）。
【０００４】
一方、生体液中のビリルビンは、ジアゾ法により反応促進剤の添加を必要としない直接型ビリルビンと、反応促進剤の添加を必要とする間接型ビリルビンとにも大別することができる。直接型ビリルビンは、血液中に存在する抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンが主に対応すると考えられている。間接型ビリルビンは、血液中に存在する非抱合型ビリルビンが主に対応すると考えられている。
【０００５】
従来の直接型ビリルビンの測定方法として、ジアゾ試薬を用いる方法や高速液体クロマトグラフィーを用いる方法、バナジン酸イオンなどの酸化剤を用いる方法が知られている。これらの方法のうち、バナジン酸イオンなどの酸化剤を用いる方法が最も一般的である。この測定方法では、酸化剤によって生体液中のビリルビンを酸化させることにより、ビリルビンが有する４５０ｎｍ付近の吸光度を低下させ、その吸光度の変化からビリルビンを定量する。この測定方法において、直接型ビリルビンのみに酸化剤が作用するように条件を設定することによって、直接型ビリルビンを測定することができる（特許文献２照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３７２７３９２号公報
【特許文献２】特許第３０９１０９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の直接型ビリルビン測定方法には、直接型ビリルビンに対する反応が完全ではなく、或いは、直接型ビリルビンのみならず一部の間接型ビリルビンにも反応してしまうという問題を有するものがある。そのため、測定されたビリルビンには、抱合型ビリルビンのみではなく、非抱合型ビリルビンやデルタ型ビリルビンも含まれる。一方、酵素法等の抱合型ビリルビンのみを測定する試薬も知られているが、バナジン酸イオンなどの酸化剤を用いる方法と比較すると高価であるという問題がある。したがって、非抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンが測定値に含まれず、抱合型ビリルビンのみを簡易かつ安価に測定する試薬が望まれる。
【０００８】
本発明は、前述された事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、生体液中の抱合型ビリルビンを精度よく且つ簡易に測定する手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは鋭意研究の結果、バナジン酸イオンを酸化剤として生体液中のビリルビンを測定する測定系において、ｐ−トルエンスルホン酸を含有させることにより、抱合型ビリルビンを精度よく測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
酸化剤として用いるバナジン酸イオンとしては、その種類に特段の制限は無いが、好ましい具体例としては、例えば、ＶＯ３−、ＶＯ４３−などの五価のバナジウムを含むものが挙げられる。試薬中にバナジン酸を添加する場合には、バナジン酸そのものを用いてもよいが、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属類の塩や、アンモニウム塩などとして用いることが溶解性の観点から好ましい。試薬におけるバナジン酸イオンの濃度は、試料となる生体液中に含まれるビリルビンの濃度範囲に応じて適宜設定されるが、通常は、２〜８ｍＭの範囲である。バナジン酸イオンが生体液中のビリルビンと反応することによりビリルビンが酸化され、ビリルビンが有する４５０ｎｍの吸光度が低下する。これにより生体液中のビリルビンが光学的に定量可能となる。
【００１１】
非抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンの反応抑制剤として用いるｐ−トルエンスルホン酸は、その種類に特段の限定は無い。また、ｐ−トルエンスルホン酸に代えて、他の芳香族スルホン酸類が用いられてもよい。他の芳香族スルホン酸類の具体例としては、例えば、ベンゼンスルホン酸、ｐ−エチルベンゼンスルホン酸、ｐ−ｎプロピルベンゼンスルホン酸、ｐ−イソプロピルベンゼンスルホン酸、２，４−ジメチルベンゼンスルホン酸、２，５−ジメチルベンゼンスルホン酸、オクチルベンゼンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸などが挙げられる。試薬におけるｐ−トルエンスルホン酸の濃度は、試料となる生体液中に含まれる非抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンの濃度範囲に応じて適宜設定されるが、通常は、１０〜５０ｍＭの範囲である。また、試薬におけるｐ−トルエンスルホン酸の濃度は、バナジン酸イオンに対して、モル比で２．５〜１２．５の範囲が好ましい。
【００１２】
また、非抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンの反応抑制剤として、さらに、ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、水溶性高分子、及びＨＬＢ値が１０以上の非イオン性界面活性剤などが試薬に含まれてもよい。これらの併用については、抱合型ビリルビンの測定に影響を及ぼさない限り特に制限されない。ヒドラジン類の具体例としては、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、又はこれらの鉱酸塩（塩酸塩、硫酸塩など）が挙げられる。ヒドロキシルアミン類の具体例としては、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドロキシルアミン、又はこれらの鉱酸塩（塩酸塩、硫酸塩など）が挙げられる。オキシム類の具体例としては、アセトキシム、ジアセチルモノオキシム、サリチルアルドキシムなどが挙げられる。脂肪族多価アミン類の具体例としては、テトラエチレンペンタミン、ヘキサメチレンテトラミン、トリエチレンテトラミンなどが挙げられる。フェノール類の具体例としては、フェノール、ｐ−クロルフェノール、ｐ−アセトアミドフェノール、４−クロル−１−ナフトール、β−ナフトールなどが挙げられる。水溶性高分子の具体例としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。ＨＬＢ値が１０以上の非イオン性界面活性剤の具体例としては、エマルゲン−１２３ｐ（ポリオキシエチレンラウリルエーテル、花王株式会社商品名）、エマルゲン−９５０（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、花王株式会社商品名）、トリトンＸ−４０５（ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル、ロームアンドハース社商品名）、Ｂｒｉｊ９７（ポリオキシエチレン１０オレイルエーテル、シグマ社商品名）などが挙げられる。
【００１３】
これら反応抑制剤は、単独でも非抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンの反応抑制作用を有しているが、二種以上組み合わせることにより、反応抑制作用がより高くなる場合もあるので、状況に併せて適宜選択して用いればよい。また、これらの反応抑制剤の使用濃度は、試料となる生体液中に含まれる非抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンの反応を抑制し得る濃度範囲で適宜設定される。
【００１４】
また、分析精度の向上、試薬の安定性、ビリルビンの酸化反応の促進などを目的として、さらに、キレート剤が試薬に含まれてもよい。キレート剤の具体例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣｙＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−ＯＨ）、トリエチレンテトライミン六酢酸（ＴＴＩＩＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸、あるいはこれらのアルカリ金属塩（例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩など）やアンモニウム塩などが挙げられる。試薬におけるキレート剤の濃度は、抱合型ビリルビンの測定を阻害しない範囲で適宜設定される。
【００１５】
また、非抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンの反応抑止を目的として、非抱合型ビリルビンが試薬に含まれてもよい。試薬における非抱合型ビリルビンの濃度は、０．１〜１０ｍｇ／Ｌの範囲が好適である。さらに、非抱合型ビリルビンの安定化の観点から、ヒト血清アルブミン又は牛血清アルブミンなどが適宜選択されて用いられてもよい。
【００１６】
また、試薬には適宜緩衝液や防腐剤を用いることができる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝、酒石酸緩衝液、フタル酸緩衝液などが挙げられる。
【００１７】
抱合型ビリルビン測定用試薬は、前述された成分を適宜選択して常法により混合することにより得ることができる。好ましい具体例としては、例えば、第１試薬は、ｐＨ２．６〜３．０に調整された酒石酸緩衝液１０〜１００ｍＭ、塩化ヒドロキシルアンモニウム１０〜５０ｍＭ、ヒドロキシエタンジホスホン酸５〜２０ｍＭ、ｐ−トルエンスルホン酸１０〜５０ｍＭ、ＤＴＰＡ０．０２〜１ｍＭ、ビリルビン溶液０．１〜１０ｍｇ／ｍＬ、非イオン性界面活性剤０．０１〜０．１重量％、ヒト血清アルブミン又は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）０．００５〜０．０５重量％を含み、第２試薬は、ｐＨ７．０に調整されたリン酸緩衝液１０〜１００ｍＭ、メタバナジン酸ナトリウム２〜８ｍＭ、ヒドロキシエタンジホスホン酸５〜１０ｍＭ、ヒト血清アルブミン又は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）０．００５〜０．０５％を含む。なお、抱合型ビリルビン測定用試薬はこのような第１試薬と第２試薬とを混合する二試薬系のものであっても、全ての成分が予め混合された一試薬系のものであってもよい。
【００１８】
前述された二試薬系の試薬を用いて抱合型ビリルビンを測定する方法の具体例は次のようである。第１試薬に生体液（血漿、血清、尿など）を混合し、この溶液の特定波長、例えば４３０〜４６０ｎｍ付近の吸光度を測定する（吸光度１）。次いで、上記溶液に第２試薬を添加して、２５〜４０℃で、３〜１５分間、ビリルビンの酸化反応を行った後、再度、特定波長の吸光度を測定する（吸光度２）。得られた吸光度１及び吸光度２の値に液量補正値などを乗ずるなどした後、特定波長における吸光度変化量Ａを求める。そして、標準物質に試薬を作用させて同様に得られた吸光度変化量Ｂから作成した検量線に当て嵌めることによって生体液中の抱合型ビリルビンの濃度を測定することができる。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００１９】
以下、実施例が示されて本発明が更に詳細に説明されるが、本発明は以下の実施例に限定されないことは言うまでもない。
【００２０】
［実施例１〜７］
表１にそれぞれ示される組成の試薬を抱合型ビリルビン測定用試薬として調製した。なお、各第１試薬のｐＨは２．９に調整した。
【００２１】
［比較例１〜５］
表１にそれぞれ示される組成の試薬を抱合型ビリルビン測定用試薬として調製した。なお、各第１試薬のｐＨは２．９に調整した。また、バナジン酸を酸化剤として用いた測定法の商品名：直接ビリルビンＥ−ＨＡテストワコー（和光純薬工業株式会社製）、及び酵素（ビリルビンオキシダーゼ）を用いた測定法の商品名：イアトロＬＱ  Ｄ−ＢＩＬ（Ａ）（ニプロ株式会社製）を比較例４，５として用いた。比較例５の酵素を用いた測定方法は、従来のバナジン酸法（比較例１）に比べて、非抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンの影響を受けることなく、抱合型ビリルビンを測定できることが知られている。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
ＱＡＰトロール×１（シスメックス社製）に、非抱合型ビリルビンとして、干渉チェック・Ａプラスのビリルビン−Ｆ（シスメックス社製）を０、０．５、１．０ｍｇ／ｄＬ添加し、それぞれ試料１、２、３を調製した。また、ＱＡＰトロール×１（シスメックス社製）に、自社調製したデルタ型ビリルビンを０、０．２５、５ｍｇ／ｄＬ添加し、それぞれ試料４、５、６を調製した。自動分析装置７１８０（日立ハイテクノロジーズ社製）を用いて、以下に示す測定条件で実施例１〜７及び比較例１〜３を試薬として各試料１〜６を測定した。また、各試薬添付の測定法に準じて、比較例４，５を試薬として各試料１〜６を測定した。その結果を表２に示す。
【００２４】
測定条件：ビリルビン１０ｍｇ／ｄＬ相当のジタウロビリルビンを含む水溶液を標準液として使用し、表３に示す条件で測定を行った。
【００２５】
【表２】
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【００２６】
【表３】
0006699273.tif 000004
【００２７】
表２から明らかなように、実施例１〜７では、試料１と試料３との測定値差、及び試料４と試料６との測定値差が、比較例５と同程度あり、比較例１〜４より低かった。これにより、実施例１〜７の測定試薬は、非抱合型ビリルビン及びデルタ型ビリルビンが測定値に与える影響が、酵素法である比較例５と同程度に低く、また、バナジン酸イオンを酸化剤として含む比較例１〜４より明らかに低いことが確認できた。