(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのポリマーによって形成されるポリマー構造体（１）であって、
前記構造体（１）は体積（２）、表面（３）及び細胞（１００）を含み、
前記ポリマーは共有結合の架橋により連結された多数のポリマー鎖を含み、
結合密度を特徴とし、該結合密度はポリマー構造体（１）の表面（３）から体積（２）へと増大し、かつ前記ポリマー構造体（１）は、前記増大する結合密度に沿って前記表面（３）上に播種された細胞による浸透が可能である、前記ポリマー構造体（１）。
【請求項２】
結合密度が表面（３）において極小値であり、かつ、体積（２）において極大値に達し、結合密度が１μｍ及び１０００μｍの間の範囲にある表面（３）からある距離において前記極大値に達することを特徴とする、請求項１に記載のポリマー構造体。
【請求項３】
ポリマーは天然ポリマーであり；又は合成ポリマーであり；又はドーパミン、アミン含有基、カテコール類、リン酸塩含有基、チオール含有基、アルコール含有基、活性化エステル及び前記基のいずれかひとつを含むデンドリマーのモノマーの組み合わせを含むポリマーであることを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載のポリマー構造体。
【請求項４】
ポリマー構造体（１）は、複数の異なるポリマーを含む複合ポリマー構造体であり、それぞれのポリマーは結合密度勾配を含み、該結合密度勾配は異なる方向及び／又は異なる距離にわたることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリマー構造体。
【請求項５】
ポリマー構造体（１）又は体積（２）が以下の形：球体の、半球状の、円筒状の、楕円体の、ピラミッド型の、立方体の、直方体状の、及びプリズム型の形の１つを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリマー構造体。
【請求項６】
前記ポリマー鎖がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリマー構造体。
【請求項７】
前記ポリマー構造体（１）がヒドロゲルであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリマー構造体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリマー構造体（１）を含むインプラント。
【請求項９】
細胞（１００）透過性の膜（１０）であり、細胞不透過性材料により実現され、該膜（１０）は請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリマー構造体（１）を含む、前記膜（１０）。
【請求項１０】
細胞（１００）をポリマー構造体（１）の中に埋め込む方法であって、
−  ポリマー構造体（１）を供給する工程であって、
前記ポリマー構造体（１）は少なくとも１つのポリマーによって形成されるポリマー構造体（１）であり、
前記ポリマー構造体（１）は体積（２）及び表面（３）を含み、
前記ポリマーは共有結合の架橋により連結された多数のポリマー鎖を含み、
結合密度を特徴とし、該結合密度はポリマー構造体（１）の表面（３）から体積（２）へと増大し、かつ前記ポリマー構造体（１）は、前記増大する結合密度に沿って前記表面（３）上に播種された細胞による浸透が可能である、前記ポリマー構造体（１）を供給する工程と、
−  細胞（１００）が前記ポリマー構造体（１）の体積（２）の中に浸透する（貫通する）ように、前記ポリマー構造体（１）の前記表面（３）上に細胞（１００）を蒔く工程とを備える、前記方法。
【請求項１１】
体積（２）、表面（３）及び結合密度勾配を含む、ポリマー構造体（１）の生成方法であって、
前記ポリマー構造体（１）は、
少なくとも１つのポリマーによって形成されるポリマー構造体（１）であり、
前記ポリマーは共有結合の架橋により連結された多数のポリマー鎖を含み、
結合密度を特徴とし、該結合密度はポリマー構造体（１）の表面（３）から体積（２）へと増大し、かつ前記増大する結合密度に沿って前記表面（３）上に播種された細胞による浸透が可能である、前記ポリマー構造体（１）であり、
−  それぞれポリマー鎖が部分を含み、多数のポリマー鎖を含むポリマーを供給する工程と、
−  前記ポリマー鎖の部分の間の結合反応により、ポリマー鎖を連結し、その結果、結合密度勾配が形成される工程であり、前記結合密度が、ポリマー構造体（１）の表面（３）から体積（２）へと増大する工程と
を備え、
前記ポリマーは溶液中に供給され、前記結合反応は前記溶液のｐＨにより制御され、前記ｐＨを制御するために、電気分解誘発電流が少なくとも部分的に、ポリマー構造体（１）の前記表面（３）を被覆する第１電極（２１）を用いて前記溶液に適用されることを特徴とする、
前記方法。
【請求項１２】
前記ポリマー鎖は、モノマーの重合により供給され、前記モノマーのそれぞれが前記部分の１つを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合反応は酵素により行われ、前記酵素の酵素活性は、溶液の前記ｐＨを局部的に変えることにより制御され、前記酵素は前記部分の間の共有結合を形成することによって前記ポリマー鎖の前記部分を変換することを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマー鎖がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むことを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
−  ポリマー構造体（１）のためのコンテナ（４０）及び、
−  前記コンテナ（４０）に含まれるポリマー構造体（１）であって、
前記ポリマー構造体（１）は少なくとも１つのポリマーによって形成されるポリマー構造体（１）であり、
前記ポリマー構造体（１）は体積（２）及び表面（３）を含み、
前記ポリマーは共有結合の架橋により連結された多数のポリマー鎖を含み、
結合密度を特徴とし、該結合密度はポリマー構造体（１）の表面（３）から体積（２）へと増大し、かつ前記ポリマー構造体（１）は、前記増大する結合密度に沿って前記表面（３）上に播種された細胞による浸透が可能であり、
結合密度勾配を含むポリマー構造体（１）を含む装置であって、
さらに、前記ポリマー構造体（１）中にチャネル（３０）を含み、かつ、ポリマー構造体（１）及び前記チャネルの内腔（３１）の間の内表面（３）での結合密度勾配を含むことを特徴とする、前記装置。
【請求項１６】
−  ポリマー構造体（１）のためのコンテナ（４０）及び、
−  前記コンテナ（４０）に含まれるポリマー構造体（１）であって、
前記ポリマー構造体（１）は少なくとも１つのポリマーによって形成されるポリマー構造体（１）であり、
前記ポリマー構造体（１）は体積（２）及び表面（３）を含み、
前記ポリマーは共有結合の架橋により連結された多数のポリマー鎖を含み、
結合密度を特徴とし、該結合密度はポリマー構造体（１）の表面（３）から体積（２）へと増大し、かつ前記ポリマー構造体（１）は、前記増大する結合密度に沿って前記表面（３）上に播種された細胞による浸透が可能であり、結合密度勾配を含むポリマー構造体（１）を含む装置であって、
前記結合密度勾配がコンテナ（４０）と接触していない前記ポリマー構造体（１）の表面（３）での結合密度勾配であり、
さらに、前記ポリマー構造体（１）中にチャネル（３０）を含み、かつ、ポリマー構造体（１）及び前記チャネルの内腔（３１）の間の内表面（３）での結合密度勾配を含むことを特徴とする、前記装置。
【請求項１７】
前記ポリマー構造体（１）が少なくとも１つの凹所（３０）を含む表面（３）及び前記少なくとも１つの凹所（３０）の場所での前記表面（３）での結合密度勾配を含むことを特徴とする、請求項１５又は請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
細胞（１００）がポリマー構造体（１）のそれらの侵入を促進するための少なくとも１つの凹所（３０）内に置かれることを特徴とする、請求項１７に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー構造体、該構造体を生成する方法、装置、具体的には該構造体を受け取るための装置、及びその他の態様に関連する。
【背景技術】
【０００２】
天然及び合成ヒドロゲルは、ここ数十年もの間、天然細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の模倣のために大いに発展してきている［１］。ヒドロゲルの物理的及び化学的特性を個々にコントロールする能力は、これらの細胞培養液プラットフォームを、広い範囲の細胞型及び組織の成長及び分化を支持することができるようにする［２］。生理活性分子の取り込みを空間的に制御することにより、ヒト組織の複合的かつ異質なアーキテクチャに向かうことができ、このようにしてより良い組織の擬態を作ることが可能となる［３］、［４］、［４ｃ］。長時間の試薬のインキュベーション及び大規模な洗浄工程のために、このようなパターン化されたゲルの生産は数日にまで及び得る［３−４］。この時間の間、望まれていない相互作用は、溶解性の生理活性分子（パターンの生産に用いられる）及びヒドロゲル中に培養された細胞の間に起こり、制御できない態様でそれらに影響を与える可能性がある。
【０００３】
これらの手順の間でのコントロール不能及び望まれない細胞の改変を克服する戦略は、足場の製作とパターン化の後で細胞を播くことにある。しかしながら、ヒドロゲルの表面の上に播かれた細胞は、マトリックスに侵入しない、又はほとんど侵入しない［３、５］。この現象は、埋め込まれた細胞を許容するように最適化されたヒドロゲルに対しても生じ、界面がバルクの細胞侵入に対する障壁であることを示す。現在の細胞透過を増大する戦略は、主として、様々な技法によりマクロ細孔に取り込むことによりヒドロゲルのバルク特性を変化することにある［５−６］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記に基づいて、本発明に係る課題は、改善されたポリマー構造体、具体的にはヒドロゲル、具体的には細胞透過をバルク特性の影響無しに強化するヒドロゲルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この課題は、請求項１の特徴を有するポリマー構造体により解決される。本発明の実施態様はその他の請求項で言及され、及び／又は以下に記載される。
【０００６】
請求項１によれば、ポリマー構造体は少なくとも１つのポリマーを含むことが開示される。前記構造は、前記体積を区切る、例えば、少なくとも体積の一方の側に、体積及び表面を含み、前記ポリマーは、結合密度により特徴づけられた結合により連結された複数のポリマー鎖を含み、前記結合密度（すなわち、前記結合密度は体積当たりの結合の数である）は、具体的には均一に増加し、より具体的には厳格に均一に増加し、かつ具体的には表面からポリマー構造体の（バルクの）体積へと／に向かって連続して増加する。これにより結合密度勾配は形成される／存在する（該勾配の傾き方向は前記表面に対して垂直（ｎｏｍａｌ）になり得る）。したがって、結合密度は具体的には段階的に形成されておらず、表面からの距離に渡って、極小値から極大値へと次第に増加する。その距離は、少なくとも１μｍであり、具体的には少なくとも１００μｍであり、具体的には少なくとも１５０μｍであり、具体的には少なくとも２００μｍであり、具体的には少なくとも２５０μｍである。一態様によると、結合密度の増大の機能形式／過程は、急激な、Ｓ字型又は線型の何れかになり得る。他の形式もまた可能である。表面で結合密度がゼロになり、バルク（体積）に向かって増加するという事実のため、ポリマー構造体は、バルクに向かって増加する硬さ及び柔らかい表面を含む。
【０００７】
具体的には、結合又は結合反応は化学的結合と呼ぶ。具体的には２つの化学化合物の間の共有結合の形成により、具体的には（第１の化合物に属している）第１の部分及び（第２の化合物に属している）第２の部分を含む、第１の化合物及び第２の化合物（例えば、ポリマー鎖）であり、それらの間で結合及び具体的には共有結合が形成される。
【０００８】
具体的には、前記表面は外表面（例えば外見上面する表面）即ち自由な表面（即ち、ポリマー構造体が配置され得るコンテナの壁面に接触していない。下記参照）である。
【０００９】
有利なことに、このようなポリマー（具体的にはヒドロゲル）表面での（例えば電気化学的に）改変された勾配は細胞が自発的にポリマー／ヒドロゲルを透過することを可能にする。ところが、従来の重合されたゲルの上に蒔かれた細胞は二次元の細胞シートを形成する。とりわけ、積層造形の分野では、組み合わされた因子間の物理的障壁の形成を避けるためのゲル境界を制御することは重要である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実験装置の説明を概略的に示す：ヒドロゲル前駆体が注がれる対電極（第２電極）を格納し、及び、平坦な機能している電極（第１電極）が重合の間に置かれた、本発明に係る装置の約５０μＬのＰＤＭＳチャンバー。
【図２】図２は、ヒドロゲル境界面の生産の概略的な説明を示す：制御は、従来的に重合化するようになされ（エアヒドロゲル）、無電流、低い（０．１μＡ／ｍｍ２）又は高い（１μＡ／ｍｍ２）電流密度が重合の間に印加された陽極で被覆されるようになされる。
【図３】図３は、空気中に用意された、又は電流が無いか、若しくは電流密度が０．１から１μＡ／ｍｍ２の間で変わる電極に覆われたＦＩＴＣ標識化ヒドロゲル境界の蛍光強度プロファイルを示す。
【図４】図４は、ＦＩＴＣ標識化ヒドロゲル境界の、対応する代表の共焦点蛍光イメージを示す。
【図５】図５は、ヒドロゲル境界の機械的な特徴付けを示す。力−変位測定は、空気−、無電流−、０．１μＡ／ｍｍ２−、１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲル表面のコロイド力分光法により得た。
【図６】図６は、改変表面の先端に細胞を播いた１日後（ａ、ｄ、ｇ、及びｊ）及び３日後（ｂ、ｅ、ｈ及びｋ）の改変ヒドロゲル表面１における細胞浸潤を示す。ヒドロゲル表面は電極（ａ及びｂ）なしで、又はアノードで覆って、電流を印加することなく（ｄ及びｅ）、又は０．１μＡ／ｍｍ２（ｇ及びｈ）及び１μＡ／ｍｍ２（ｊ及びｋ）を適用して生成された。
【図７】図７は、播種１日後及び３日後に、ヒドロゲルにおける異なる深さで細胞の分画を解析することにより定量化した細胞浸潤を示す（ｃ、ｆ、ｉ及びｌ）。平均値及び標準偏差（ｎ＝３）が示されている。
【図８】図８は、ヒドロゲル−ヒドロゲル境界面の改変を示す。積層造形をエミュレートするために、細胞を含むゲルは、改変表面を有するヒドロゲルの上部に注がれた：空気（左）及び１μＡ／ｍｍ２（右）。
【図９】図９は、ヒドロゲル底部の異なる深さにおける細胞の分画を解析することによる、第３日に定量されたヒドロゲル底部における上部ゲルからの細胞浸潤を示す。
【図１０】図１０は、改変表面を有するヒドロゲル下部（１０２）（緑）、細胞（１００）（白）を含む第２ゲル（１０１）（赤）を構築物のＬＳＣＭにより獲得されたスタック（１００×５μｍスタック）の３Ｄ再構築を示す；ｃ）において、ヒドロゲル下部の表面は改変されていなかったが、ｄ）において、１μＡ／ｍｍ２が重合反応の間に適用された。
【図１１】図１１は、電流が適用されない場合に、金属電極が取り除かれるときのヒドロゲルの崩壊を示す。実験的現象の概略的な描写及び写真：電極は重合中にチャンバーの先端におかれ、及び、ゲル崩壊の評価は、電極は取り除かれる：電流が適用されなかった場合に崩壊したヒドロゲルが電極上に留まった（ａ）、アノード電流が電極に適用された場合にヒドロゲルは残らなかった（ｂ）。電極はＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧでコーティングされた場合、表面へのゲルの接着は妨げられ得た（ｃ）。テフロン（登録商標）表面を使用したときはこの限りではなかった（ｄ）。
【図１２】図１２は、１μＡ／ｍｍ２ヒドロゲル表面上のマイクロビーズを示す。直径３μｍ及び２０μｍの蛍光ビーズ（Ｆｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ  Ｐｌａｉｎ  ＹＧ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）はヒドロゲル表面上に注がれ、堆積するために１時間放置され、及びその分布は、ヒドロゲル表面の厚さ１５０μｍのＺ−スタックを獲得することにより、ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察された。
【図１３】図１３は、ヒドロゲル横断面図の機械的特徴付けを示し、具体的には実験的装置の概略図を示す：以前に記載したとおりに調製されたヒドロゲルは、表面に向かって垂直に切断され、反転された（上方向を示して切断された）。５０μｍのビーズ（２００）は断面に注がれ、異なる位置でのヒドロゲルの機械的特性を調べるのに用いられた。
【図１４】図１４は、バルクヒドロゲル（表面から少なくとも５００μｍ）上で得られた代表的な力−変位曲線がエア−ヒドロゲル及び０．１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲルが類似のバルク機械的特性を有することを確認することを示す（ｂ）。バルク及び表面の力−変位曲線を比較することによって、無電流−ヒドロゲルは均質な機械特性を有することが確認された（ｃ）。一方で、エア−ヒドロゲルはバルクに比べて硬い表面を有し（ｄ）、及び０．１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲルはバルクに比べて柔らかい表面を有する（ｅ）。
【図１５】図１５は、図１４と同様の図である。
【図１６】図１６は、ヒドロゲル中での細胞移動を示す。ＭＳＣｓはＴＧ−ＰＥＧヒドロゲル（最終濃度：０．５×１０６ｍｌ−１）中に埋め込まれた。移動アッセイについて、３つの無作為の場所が、電動フォーカス及びステージが取り付けられた倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ６０００Ｂ）を用いて選択し、画像は２４時間の間、毎２０分ごとに得られた。細胞移動は、イメージＪ（ＩｍａｇｅＪ）の手動の追跡プラグインを用いて２４時間追跡された。３０個の追跡された細胞は、２４時間中、平均して２２６±４４μｍの移動を有していた。
【図１７】図１７は、より柔らかいヒドロゲル上に播かれた細胞を示す。ヒト由来の骨髄ＭＳＣｓは、（重合中に電極がなく）従来どおりに調製されたＰＥＧ密度が低いＰＥＧゲル上に播かれた（それぞれ０．８％、１．１％、１．４％及び１．７％）。ａ）、ｃ）、ｅ）、及びｇ）は播種３日後に、ＬＳＣＭにより得られた厚さ２５０μｍのスタックの３Ｄ再構築物であり（毎２μｍごとに得られる１２５個のイメージからなる１．７％条件でない限り、毎５μｍごとに得られた５０個のイメージからなる）：細胞は、硬さにかかわらず、ゲル上に２Ｄシートを形成した。先の研究に示されているように［２０］、細胞形態（一番上、右のカラム）は、細胞がより硬いゲル上でより広がることにより、ゲルの硬さに応答することを示す。
【図１８】図１８は、本発明にかかるポリマー構造体／ヒドロゲルを受けるための複数のチャンバーを含む本発明にかかる装置を示す。
【図１９】図１９は、例えば、凹所、チャネル（例えばマイクロチャネル等）を有する本発明に係るポリマー構造体の実施態様（幾何学的可能性）を示し、並びに例えば球体などの形状を有するポリマー構造体の実施態様を示す。
【図２０】図２０は、図１９と同様の図である。
【図２１】図２１は、図１９と同様の図である。
【図２２】図２２は、図１９と同様の図である。
【図２３】図２３は、図１９と同様の図である。
【図２４】図２４は、図１９と同様の図である。
【図２５】図２５は、図１９と同様の図である。
【図２６】図２６は、図１９と同様の図である。
【図２７】図２７は、本発明に係るポリマー構造体／ヒドロゲル中にチャネルを生成することを可能にする、本発明に係る装置の別の実施態様を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に記載のポリマー構造体の一実施態様によると、表面での結合密度は０％（即ち、表面での結合がない）であり、かつ体積（バルクとしても表される）中の最大結合密度（バルクの結合密度に対応し、かつそれ故にバルク密度と呼ばれる）に到達し、具体的には結合密度は１μｍ及び１０００μｍの間に入る表面からの距離での前記最大距離に到達する。一実施態様によると、前記距離は、好ましくは５０μｍ及び１５０μｍの間にある。
【００１２】
さらに、本発明によるポリマー構造体の一態様によれば、ポリマーは天然に存在するポリマー、特に次のポリマーの１つである：フィブリン、アルギン酸塩、キトサン；又は合成ポリマー（即ち、非天然存在ポリマーで、天然に存在するポリマーを改造したものを含む。）、特に次のポリマーの１つである：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ＳＵ−８。さらに、ポリマーは、モノマーの結合体、例えば活性エステル、アルコール含有基、チオール含有基、リン酸塩含有基、リジンのようなアミン含有基、カテコール類、ドーパミン、及び前記基の何れかを含むポリマー又はデンドリマー含有物（例えばハイブレーン、ボルトーン。）などのモノマーの組み合わせからなる、又は、含み得る。
【００１３】
さらに、本発明に係るポリマー構造体の一実施態様によると、ポリマー構造体は、多くの異なるポリマーを含むポリマー構造体の混合物（ブレンド）であり、それぞれのポリマーは結合密度勾配を含み、結合密度勾配は異なる方向及び／又は異なる距離／長さに及ぶ。
【００１４】
さらに、本発明によるポリマー構造体の一態様によると、体積は以下の１つを含む；球状の、円筒状の、立方体の、平行六面体。
【００１５】
さらに、本発明に係るポリマー構造体の一実施態様によると、前記ポリマー鎖は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、具体的には４０００Ｄａから１０００００Ｄａの範囲の分子量を有するＰＥＧ、具体的には４００００Ｄａの分子量を有するＰＥＧを含み、又はとして形成され、ただし、具体的には前記ＰＥＧは非分岐又は分岐ＰＥＧであり、具体的には分岐ＰＥＧは具体的には２、３、４又は８枝を含む。
【００１６】
さらに、本発明によるポリマー構造体の一態様によると、前記構造は細胞（例えば、微生物の基礎構造、機能的及び／又は有機体の生物学的単位）を含み、特に前記ポリマー構造体に埋め込まれる。具体的には、これらの細胞は前記ポリマー構造体の形成の間に該ポリマー構造に埋め込まれる。
【００１７】
さらに、本発明に係るポリマー構造体の一実施態様によると、前記ポリマー構造体はヒドロゲルである。
【００１８】
本発明のさらなる側面によると、インプラントが請求項９において開示され、該インプラントは本発明によるポリマー構造体を含む。特に、インプラントは動物への用途のために設計されており、該インプラントは動物の体からインプラントのポリマー構造体内へと細胞透過を増加させるように設計されている。
【００１９】
本発明のさらなる側面によると、膜は請求項１０により開示され、該膜は、特に細胞不透過性材質において使われる、細胞に対して透過性である膜は、本発明によるポリマー構造体を含む。不透過性材質又は透過性材質の表面上に置かれた細胞は、透過可能領域のみを通って、材質を通って移動するであろう。該膜の一側面における勾配の存在は、材質を通っての細胞の直接の透過を可能にする（図１９から図２６も参照）。
【００２０】
具体的には、膜は２つの区画に分かれてもよく、表面及びバルク／体積（例えば上記で述べたような）を持つ少なくとも１つの透過性の領域を含んでも良い。表面は、細胞が１つの区画から他の区画へ前記表面を通って移動するように結合密度勾配（例えば上記で述べたような）を含んでも良い。膜は、これらの透過領域のいくつかを含んでも良い。膜は、それぞれが本発明による勾配を有する表面を持つ少なくとも２つの透過領域も含むことができる。そして、１つの表面は、区画の１つに面し、他の表面は他の区画に面する。
【００２１】
本発明のさらなる側面によると、方法は、請求項１１に示され、すなわち、細胞をマトリックス（例えば、ポリマー構造体）内へ埋め込むための方法であり、該方法は以下のステップを含む：
−  本発明に係るポリマー構造体を供給する工程、
−  前記ポリマー構造体の前記表面上の表面上に細胞を蒔き、その結果特に細胞がポリマー構造体の体積内に透過する、特に前記結合密度勾配により透過する工程。
【００２２】
本発明のさらなる実施態様によると、ポリマー構造体を生成する方法は、請求項１２により開示される。
【００２３】
それによれば、体積、表面及び結合密度勾配を含む、ポリマー構造体を生成するための方法、具体的には本発明に係る方法は、以下の工程を含む：
−  複数ポリマー鎖の含むポリマーを提供し、各ポリマー鎖はある部分（具体的には、２つのポリマー鎖の部分が互いに等しい又は異なりうる）を含む。
−  前記ポリマー鎖の部分の間の結合反応により、ポリマー鎖を連結することにより、ポリマー構造体を生成する工程（具体的には、結合反応は部分の間で直接的に生じうる、又は、架橋の間で非直接的に起こりうる）。その結果、結合密度勾配が形成され、結合密度は（すなわち、前記結合の密度は）ポリマー構造体の表面から体積へ結合密度勾配が形成され／存在するように増大し、特に均一的に増大し、特にさらに厳格に均一に増大し、及び特に連続的に増大する。
【００２４】
ポリマー構造体を生成する発明による方法の一態様によると、前記結合反応は、１つの電流、放射線を適用することにより、又は、前記部分を結合する能力のある物質、特に前記部分を結合する架橋剤、を加えることにより、制御される。
【００２５】
さらに、ポリマー構造体を生成するための本発明の方法の一実施態様によると、前記ポリマー鎖はモノマーの重合によって提供され（具体的には本発明の文脈で、重合は、ポリマー鎖又は三次元ネットワークを形成する化学反応において、モノマー分子が一緒に反応する過程である）、ただし前記モノマーのそれぞれは、前記部分の１つを含む。
【００２６】
さらに、ポリマー構造体を生成する発明による方法の一態様によると、前記ポリマーは溶液中に供給され、前記結合反応は前記溶液のｐＨにより制御される。具体的には、前記ｐＨ電解誘導電流が少なくとも部分的に又は全体にポリマー構造体の前記表面を覆う第１電極を用いて前記溶液に適用される。好ましくは、１０ｎＡ／ｍｍ２から１μＡ／ｍｍ２の範囲にある電流密度が用いられる。これは特に、次のことを意味する。流れる電流は調節され、機能している電極（例えば、第１電極又は第２電極）の表面で測定される、望まれた電流密度を得る。本発明の一態様によると、好ましい電流密度は０．０５μＡ／ｍｍ２から０．１５μＡ／ｍｍ２までの範囲内で、特に０．０７５μＡ／ｍｍ２から０．０１２５μＡ／ｍｍ２までであり、及び、特に、実質的に０．１μＡ／ｍｍ２の量である。
【００２７】
第１電極は、陽極分極又は陰極分極を担うことができ、陽極又は陰極に変わりうる。第２電極は、第１電極とは反対の極を担う。
【００２８】
さらに、ポリマー構造体を生成する本発明による方法の一態様によると、前記結合反応は、酵素、具体的にはトランスグルタミナーゼ、より具体的にはファクターＸＩＩＩａ（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｒ：Ｐ００４８８により述べられる）又は、その前駆体により果たされ、又は触媒作用を受ける。ユニプロット番号は、ユニプロットナレッジベースの登録を参照する。
【００２９】
特に、２つのポリマー鎖の反応部分は、アシル（第１の部分）、具体的にはアミド、及びアミン（第２の部分）である。
【００３０】
特に、前記第１の又は前記第２の部分は、前記アシル／アミド又は前記アミンを含むペプチドである。
【００３１】
特に、酵素は前記ポリマー構造体中にあり、特に構造及び／又は溶液に酵素を加えることによって、前記ポリマー構造体中にある。
【００３２】
特に、前記酵素の酵素活性は前記溶液の前記ｐＨを局部的に変更することにより制御され、特に、阻害される。特に前記酵素は、前記ポリマー鎖の前記部分を、前記部分間の共有結合の形成によって変換する。
【００３３】
特に、前記ｐＨを制御するために、電解誘導電流は少なくとも部分的に又は全体に、ポリマー構造体の前記表面を覆う第１電極を用いて前記溶液に適用される（上記を参照）。
【００３４】
さらに、ポリマー構造体を生成する本発明による方法の一態様によると、前記ポリマー鎖はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、特に４０００Ｄａから１０００００Ｄａの間の範囲の分子量を有するＰＥＧ、特に４０００Ｄａとして含む又は形成する。特に、前記ＰＥＧは非分岐又は分岐ＰＥＧであり、特に分岐ＰＥＧは、特に２、３、４又は８枝を含む。
【００３５】
本発明のさらなる側面によれば、請求項１８に記載のポリマー構造体が開示される。すなわち、ポリマー構造体は少なくとも第１のポリマーにより形成される。前記構造体は体積及び表面を含む（例えば、前記体積を区切る、例えば、少なくとも１つの側面で前記体積を区切る、上記参照のこと）。前記ポリマーは、結合密度により特徴付けられる結合により連結される複数のポリマー鎖を含む。前記結合密度（即ち、前記結合の密度、上記参照）は、結合密度勾配が形成され／存在するようにポリマー構造体の表面から体積へ増大し、特に均一に増大し、特に厳密に均一に増大し、及び特に連続的に増大する。ポリマー構造体は、ポリマー構造体を生成する本発明に係る方法を用いて生成される。
【００３６】
本発明のさらなる側面によると、装置は請求項１９により開示される。装置は以下を含む。
−  ポリマー構造体に対するコンテナ、及び、
−  特に本発明に係るポリマー構造体それ自体が、特にポリマー構造体が前記コンテナに含まれる。前記ポリマー構造体は架橋密度勾配を含む。
【００３７】
発明に係る装置の一実施態様によると、装置は、電解誘導電流を前記溶液に適用することにより、前記溶液の前記ｐＨを制御するための第１及び第２電極を含む。特に、第１及び／又は第２電極は、ＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧで覆われる。
【００３８】
特に、コンテナはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作られる。さらに、特に、コンテナは壁及び底面がポリマー構造体を受け取るためのチャンバーを区切り、溶液がポリマー構造体又はヒドロゲルの前駆体を含むようにコンテナの底から伸びる周方向壁を含む。
【００３９】
特に、チャンバー中のポリマー構造体又はポリマー構造体若しくはヒドロゲル前駆体を含む溶液は、（例えば、上に面する）表面を含むように、コンテナが開いた側を含む。
【００４０】
特に、第１電極は前記表面に接触するように設計される。ポリマー構造体／溶液（表面から離れて）の体積はコンテナ（即ち、壁及びコンテナの壁及び底面により）により範囲が定められる。特に、第１電極は、少なくとも部分的に、特に完全に、第一の表面を覆うように設計されている。
【００４１】
特に、第２電極（例えば対電極）は、コンテナの壁面の凹所を通ってチャンバー内に突出する。特に、第２電極はコンテナの底に沿って伸び、及び第１電極に面する。第１電極がポリマー構造体又はヒドロゲル又はポリマー構造体の前駆体を含む溶液に接触するための、２次元の平坦な表面を含み、第２電極は縦の形状（例えば、細長い導体／ワイヤー）を有しうる。
【００４２】
電極によって、溶液のｐＨの局部的な変化が前記電極を経由して、溶液の電解が誘導されるように、溶液への電流の適用により達成される。このような電圧誘導型電解によって、陽極電極溶液の境界面での局所的なｐＨの減少となり、及び陰極緩衝液の境界面での局所的なｐＨの増加をもたらす。
【００４３】
前駆体の結合、架橋／重合が阻害され、制限され又は促進されうる各電極周辺の領域の広がりは、電極の近傍にある前駆体溶液の緩衝能力、ｐＨ及び適用された電流密度に依存する。
【００４４】
さらに、本発明による装置の一態様によると、コンテナは、２つの円周の部分を有する壁面を含んでも良い。第１の部分はポリマー構造体／溶液を受け取るためのチャンバーを取り囲み、壁面の第２の部分は、液体、特に生理食塩水、緩衝溶液、化学吸引性溶液、成長因子溶液、細胞懸濁液又はそれらの混合物、及び細胞応答機能を有する他の溶液を受け取るためのさらなるチャンバーを取り囲む。特に、第２電極（又は第１電極）は互いの表面を引っ込める前記壁面の第１又は第２凹所において（摺動自在に）配置される。それにより第２電極がチャンバーに交差して伸び、及び前記凹所を閉じ、特にコンテナから突出する。第２凹所はさらなるチャンバーと流れて連結する。それにより、−第２電極が前記第２凹所から取り除かれたとき−さらなるチャンバーにおいてに蓄えられた液体が前記第２凹所を通じて第１のチャンバー、すなわち第２電極の助けを得て形成されるポリマー構造体／ヒドロゲルのチャネルに流れ得る。特に、壁の第２部分は、第２凹所（及び第１の凹所）に並べられた第３の凹所を含む。それにより第２の凹所は第３の凹所を介して第２凹所の中に閉鎖手段（例えば、棒）を挿入することにより閉じられ得る。この態様により第１のチャンバーの底面は、対電極（第１電極又は第２電極）を含み、又は対電極として形成され得る。
【００４５】
さらに、本発明に係る装置の一実施態様によると、コンテナは、ポリマー構造体／溶液を受け取るための複数のチャンバーを含みうる。それにより、ハイスループットの実験が装置を用いて達成され得る。
【００４６】
本発明による装置の一態様によると、ポリマー構造体はコンテナと接触しないポリマー構造体の表面において結合密度勾配を含む。
【００４７】
さらに、本発明に係る装置の一態様によると、ポリマー構造体は、ポリマー構造体における（例えば上記に述べたような）チャンネルを含み、特に、交差する構造及び、ポリマー構造体とチャンネルの内腔の間の境界面（すなわち、構造体の内部表面）において結合密度勾配を含む。前記勾配は、前記内腔及びバルクの間の境界面全体において、又は前記境界面の部分又は領域において存在しうる。前記勾配は、境界面（表面）に垂直（ｎｏｒｍａｌ）であり得る。それにより特に、結合密度が境界面において最小又はゼロであり、及びバルクに向かって増大する（例えば、上記の通りに）。従って、境界面は柔らかく、構造の硬さはチャンネルの内腔を囲むバルクに向かって増大する。
【００４８】
さらに、本発明による装置の一態様によると、ポリマーは少なくとも１つの凹所（例えばピット、ウェル、陥入、及び他の複雑形状のようなもの）を含む表面を含み、かつ少なくとも１つの凹所の位置で前記表面の結合密度勾配を含む。
【００４９】
さらに、本発明に係る装置の一実施態様によると、細胞、特に球状の、微細組織、及び細胞凝集体の他の形が高分子構造の侵入を促進するための少なくとも１つの凹所の中に置かれる。
【００５０】
請求項としても明確に述べられ得る本発明のさらなる側面は、下記のアイテム（ｉｔｅｍ）として述べられる。
【００５１】
アイテム１に係る本発明の一側面は、１〜１０００μｍの範囲にある距離において、密度が０％である表面から、１００％の最大架橋密度に達するバルクへと広がるポリマーの密度勾配に関する。
【００５２】
アイテム２：アイテム１に記載の密度勾配であって、勾配は架橋剤の散布を用いて、光化学を用いて、又は電気化学的に形成される。
【００５３】
アイテム３：ポリマーのバルク内への細胞透過を増大するために使われる、特にポリマーの表面上に蒔かれた細胞に使われる、アイテム１又は２に記載の（界面）密度勾配。
【００５４】
アイテム４：アイテム１からアイテム３のうちのいずれか１つの密度勾配であって、ただしポリマーは天然物（フィブリン、アルギン酸塩、キトサン等）又は合成物（ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ＳＵ−８及びその他）である。
【００５５】
アイテム５：異なる方向及び異なる長さにわたる、異なる成分の密度勾配に特徴がある、特にアイテム１から４のいずれか１つに記載のポリマー構造体の混合物（ブレンド）。
【００５６】
アイテム６：（何れかの形状からなる、又はプラスチック若しくは金属からなる）ポリマー構造体のためのコンテナ及びポリマー構造体に特徴付けられる装置であって、該ポリマーは、ポリマーの片側がコンテナと接触していないポリマーの側面において、界面密度勾配、特にアイテム１からアイテム４のうちのいずれか１つのものに特徴があるコンテナにおいて含まれる。
【００５７】
アイテム７：（いかなる形状からなる、又はいかなるプラスチック又は金属からなる）ポリマー構造体のためのコンテナ、及び前記ポリマー構造体に交差するチャンネルを特徴とし、かつポリマー構造体及びチャンネルの内腔の一部又は内腔の全部の間の境界面における密度勾配を特徴とするコンテナに含まれる、ポリマー構造体を特徴とする装置。
【００５８】
アイテム８：（任意の形状からなり、又は任意のプラスチック又は金属からなる）ポリマー構造体のためのコンテナ、及びピット、ウェル、陥入、及び他の複雑形状を示す表面を特徴とし、かつこのような複雑形状の表面の一部の又は全てにおける密度勾配を特徴とするコンテナに含まれるポリマー構造体を特徴とする装置。
【００５９】
アイテム９：請求項８に記載の装置であって、細胞（例えば、内皮細胞、間葉系幹細胞及び／又は他の細胞）、これらの細胞型の１つの又はそれ以上からなる球状体、微細組織及び細胞凝集体の他の形態が、前記ピット、ウェル又は陥入に置かれ、高分子構造の侵入を促進する、前記装置。
【００６０】
アイテム１０：前記構造体の側面の１若しくはそれ以上又は前記構造体の表面部分の、１又はそれ以上の密度勾配を特徴とする、球体、半球体、円筒状の、楕円体の、ピラミッド型の、立方体の、直方体状の、及び準柱体の形状の、ポリマー構造体。
【００６１】
アイテム１１：動物の体に埋め込まれ、前記動物の体からポリマー構造体へ細胞透過を増大するための、アイテム１０に記載のポリマー構造体。
【００６２】
アイテム１２：細胞不透過性の物質において用いられる細胞のための透過性膜として用いられる、アイテム１０に記載のポリマー構造体。
【００６３】
アイテム１３：細胞が前記ポリマー構造体の形成の間に埋め込まれる、上記のいずれかのポリマー構造体。
【実施例】
【００６４】
次のさらなる事項に、本発明の実施態様及び例が図面を参照して述べられる。
【００６５】
本発明は、バルク（体積）２に向かって増加する密度勾配を形成するＰＥＧヒドロゲル表面３を電気化学的に調整する方法を記載する。これまでに、水の電気分解によって生成される陽極液相接触面での酸勾配を利用することによる電極の近くでのＰＥＧヒドロゲルの酵素学的架橋反応を局地的に阻害する可能性が示されている［７］。
【００６６】
重合体中にＰＥＧ前駆体溶液の表面３における陽極処理した電極２１を置くことにより、表面密度勾配を有するヒドロゲル１を生産し得る。第１に、共焦点レーザー走査顕微鏡は、密度勾配を定性的に観察するために用いられる。そして、ヒドロゲル表面の機械特性は、コロイドプローブフォース（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｐｒｏｖｅ  ｆｏｒｃｅ）分光学により特徴付けられている。最後に、電気化学的に整えられたヒドロゲル表面からバルクへのヒト由来の骨髄間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）の強化された透過性は、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて示された。
【００６７】
ここで記載されている全ての実験を達成するために、プラチナ対電極（第２電極）２２に収容する特別なポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）型（コンテナ）４０を含み、かつ、ＰＥＧ前駆体溶液が流し込まれた装置５０が設計された（図１を参照）。コンテナ４０は底４２によって区切られるチャンバー４３を囲む円周壁４１を含む。
【００６８】
ここで使われるＰＥＧモノマーは、トランスグルタミネーション（ＴＧ−ＰＥＧと言われる）を介したＰＥＧの架橋反応を可能とする、以前に記載したペプチド性物質を含んだ［８］。コンテナ４０のチャンバー４３は重合の間（図１を参照）、平坦な金の電極２１（第１電極）で覆われ、該電極はＴＧ−ＰＥＧの酵素学的な重合を局所的に阻害するために異なる電流密度で陽極処理された（サンプルは０．１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲル及び１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲルと呼ばれる）。第１のコントロールとして、ゲル１が従来なされているとおりに電極２１の不存在下で用意された（以後、エア−ヒドロゲルと称する）。ゲルの表面における水の蒸発の可能性を説明するために、ゲル前駆体は重合の間電流をかけることなく金表面で覆われた（以後、無電流−ヒドロゲルと称する。図２を参照）。ＰＥＧヒドロゲルの金及びテフロン（登録商標）への強い接着のために、重合後のこれらの表面のいずれかの除去は、ゲルの崩壊という結果を生じた（図１１ａ及びｄを参照）。金表面（例えば第１電極２１の表面）はＰＬＬ−ｇ−ＰＥＧの層で覆われ、ＰＥＧヒドロゲル１への接着が大幅に減少した（図１１ｃを参照）。接着は阻害された、なぜなら、金表面から広がったＰＥＧ鎖はペプチド性架橋物質を含まず、そしてそれ故に不活性フィルムとして機能した。陽極表面の被覆は必要としなかった、なぜなら、その近接における重合の阻害は、前に示した通り、接着問題を除外するのに十分である（図１１ｂ及び［７］）。
【００６９】
電気化学的に改変されたヒドロゲル表面３を特徴付けるために、ＦＩＴＣタグ化されたＬｙｓ基質（Ｌｙｓ−ＦＩＴＣ）はＴＧ−ＰＥＧヒドロゲル前駆体に混合された。蛍光色素は、同様の架橋反応により、ＴＧ−ＰＥＧマトリックス内に共有結合的に包含されるので、蛍光シグナルは架橋密度を示す［９］。ヒドロゲル表面３に対して垂直に切断された断片が、共焦点蛍光顕微鏡によって観察された。陽極電流の存在下で生じた表面境界は強度の勾配を示した。特に、蛍光強度が平坦域に到達した表面からの距離は、２５０μｍ（０．１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲル）から５００μｍ（１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲル）に増加した（図３及び図４を参照）。これらの観察は、ゲル重合が、陽極電流の増加に伴って生じたより長い酸性勾配によって、電流依存形式で陽極−溶液界面で阻害される、という以前の研究と相関する［７］。無電流−ヒドロゲルはゲルの厚さを通して均質のシグナル強度により特徴付けられた一方、エア−ヒドロゲルは表面近くの最初の５０μｍにおいて蛍光ピークを有した。架橋密度の界面の増加は、恐らく重合の間の水の蒸発のため、及び結果としてのモノマー濃度の局所的な増加のためであった。
【００７０】
なぜならば、蛍光測定のみが、１つのサンプル中での架橋の変化という、良い実態をもたらすので、コロイドプローブフォース分光学は異なるヒドロゲル表面の硬さを比較するのに用いられた（図５を参照）。これらの測定を達成するために、５０μｍの長さのビーズ２００はヒドロゲル１の表面上に蒔かれ、ビーズが表面上に残り、ゲルの中に沈まなかったということが制御された（図１２を参照）。フルーイドＦＭ（ＦｌｕｉｄＦＭ、登録商標）チップレス（ｔｉｐｌｅｓｓ）カンチレバーを用い、該カンチレバーは予め作られた微少溶液チャネルを特徴とするＡＦＭカンチレバーであり、所望のビーズが近づけられ、その後、カンチレバーの先端にビーズを固定するために陰圧を適用した後、ゲル１内へと押圧された。この方法は、新鮮なコロイドについて各力−距離曲線を獲得することを可能にし、したがってプローブからもたらされる履歴効果を回避する［１０］。図５は、ビーズをゲル内に押圧することによるヒドロゲルの上部表面をプローブすることにより獲得される力−距離曲線を示す。エア−ヒドロゲルは最も硬い表面を提示した：測定可能な力の最大値（０．８μＮ）はおよそ３．５μｍのみの浸透に達せられた。無電流−ヒドロゲルはエア−ヒドロゲルに比べてより柔らかい表面を示し、０．８μＮは１５μｍ及び１７μｍの間の浸透に達した。この観察は、蛍光顕微鏡測定に従っており、エア−ヒドロゲル中でのより高度の架橋密度の骨組みの存在を明らかにしている。電気化学的に提供されたヒドロゲルの表面は、かなり柔らかかった。特に、０．１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲルの力−距離曲線は、極大の圧変位量（５０μｍ）において、０．０５及び０．１３μｍの間に達し、１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲルに対しての力は、５０μｍにおいて、常に０．０５μＮを下回る力が常時測定された。ゲル表面の柔らかさは電流が増加するにつれて増加するように見えた。
【００７１】
表面（３）の硬さがバルク（２）にどのように関係するのかについての実体を得るために、我々は表面３に対してゲル１を垂直に分割し、出来るだけ表面に近く、かつそれ（バルク）から少なくとも５００μｍ離れた断面をプローブした（図１３を参照）。分断面上で測定された硬さは、大概図５において観察された硬さより系統立って低かった、なぜならば、プローブされた表面は、切刃（ｂｌａｄｅ）に直接接触しており、亀裂やその他の人為的なものを誘導した。それにもかかわらず、分断面の等しい調製物は２、３の重要な知見を確認することを可能にした。０．１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲル及びエア−ヒドロゲルのバルクに対する比較可能な力−距離曲線が測定され、電気化学的表面修飾はマトリックスのバルク特性に影響を与えないということを示した（図１４ｂ）。さらに、この実験は次のことを確認した：無電流−ヒドロゲルが硬さにおいて均質であり（図１５ｃ）、エア−ヒドロゲルはバルクよりもより硬い表面を示し（図１４ｄ）、及び、０．１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲルはバルクよりもより柔らかな表面を有した（図１５ｅ）。
【００７２】
ヒドロゲル表面の特徴付けの後、ヒドロゲルバルク２内に浸透するためにそれらの上に蒔かれた細胞１００の能力が評価された。特に、ヒト由来の骨髄ＭＳＣｓは改変されたゲル表面の上部に蒔かれ、ヒドロゲルの最初の１５０μｍ内での細胞分布が共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して１及び３日間の培養の後に評価された（図６及び図７を参照）。この研究に対して選ばれたゲル組成は以前に示されており、埋め込まれた細胞の移動を裏付けた［１１］。これは、ここで用いられた培養条件について確認された（図１６を参照）。エア−ヒドロゲル及び無電流−ヒドロゲルの両方に蒔かれた細胞は２次元で生育し、単層を形成し、及び、従って、１及び３日間後の最初の５０μｍに、ほぼ排他的に局在化した（図６ａ、ｂ、ｄ、ｅ及び図７ｃ、ｆを参照）。電気化学的改変ヒドロゲル表面上に置かれたとき、細胞はゲルに浸透することができた。さらにその上、浸透の深さは電流密度の増加につれて増加した。特に、細胞は、１日後既に、最も高い電流密度で調製したゲル内に１５０μｍより多く浸透し得た（図６ｊ及び図７ｌ）。３日後の細胞分布は、ゲル表面から最初の１５０μｍ内で完全に均一であった（図６ｋ及び図７ｌを参照）。
【００７３】
これらの結果はヒドロゲル１の表面３からバルク２へ増大する架橋密度勾配が、表面上に蒔かれた細胞の細胞透過を強めたということを示す。ゲルの硬さを均質的に減少することは、細胞透過を増大するためには十分ではなかった。実際、生成されたより柔らかいゲル（０．８％ＰＥＧ）でさえ、３日後のヒドロゲルの表面からバルクへの細胞透過を認めなかった（図１７）。細胞は、走硬性と呼ばれる現象により［１２］、さらに３次元ヒドロゲル内に［１３］、柔らかい領域から硬い領域へと密度勾配に沿って動くことが知られている。アンセス及び同僚たちは、尖った界面を有する柔らかい及び硬い領域を有するＰＥＧ−ヒドロゲルを製造した。興味深いことに、細胞はヒドロゲルの硬さに関わらず運動性であった一方、細胞は柔らかい領域から硬い領域へと移動することが出来ず、代わりに後方に移動し又は界面に沿って並んだ［１４］。硬さの勾配があり−かつシャープでない−増加は、走硬性を裏付けるということを示す。
【００７４】
細胞又は組織へのヒドロゲル透過性は組織工学に対する機能的足場の開発について重要な挑戦であり、他の戦略が探求されている。例えば、ワイリーら（Ｗｙｌｉｅ）は、類似したＲＧＤ−官能基化合成ヒドロゲル神経前駆体細胞透過は非常に限られており、１４日後において２０μｍを超えるという知見を得た。その著者らは、光パターニングを用いてヒドロゲルの表面からバルク内へと渡るＳＨＨ（ソニック・ヘッジホッグ）の勾配を作り出すことにより、２週間後に８５μｍにまで細胞透過を増大した。このアプローチは非常に簡潔であり、しかしながら、より長い製造期間を必要とする［３］。異なる細胞、培養条件及びマトリックスの使用が、その結果の直接的な比較を認めない。多数の研究者が透過問題を克服するための他の方法を追求し、及び、ヒドロゲル内でのマクロ細孔を作ることにより細胞又は組織の透過を改良するための足場の製造戦略を発展させた（［１５］を参照）。マクロ細孔含有物は様々な天然ヒドロゲル、即ち、コラーゲン［６ａ］、ゼラチン［６ｂ］、及び合成ヒドロゲル、即ちポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）［５、６ｃ］の両方において、細胞又は組織透過を組織的に改良するように示されている。これらの全ての技術は、それにもかかわらず、構築物のバルク特性を変更し、製造されたマイクロ微小構造のほとんど又は全く空間的制御を供給しない［１６］。
【００７５】
処理後に細胞を蒔くことは、ヒドロゲル境界が障害を提示しうる間の唯一の発生ではない。積層造形により生産された構造物は、個々に加えられた要素間の界面を特徴とする。細胞及びマトリックス成分が精密に置かれ、生体組織に似た異質的に組織され、かつ可視化された構造物を形成することが繰り返し示された［１７］。一方、組み合わされた要素間の境界はほとんど見落とされ、細胞がこの境界にどのように感知及び反応するかという質問は理解しにくいままである。ボードロウらはこの問題に取り組んだ少数の者であり；著者らは、その後に互いの先端における様々な密度のコラーゲンゲルを含む細胞を重合化し、そして細胞が柔らかいゲルから硬いゲルへと移動せず、かつ、非常に低い頻度で硬いゲルから柔らかいゲルへのみ移動し得るということを示した［１８］。この知見は、積層造形に対してもまた、ゲル境界が細胞侵入への障壁であることを示し、潜在的に個々に加えられた要素の区分化を導くということを示す。この研究で記載されたアプローチは、さらにこのような応用についても有益になり得る。
【００７６】
２つのゲルの間の界面を研究するために、エア−ヒドロゲル及び１μＡ／ｍｍ２−ヒドロゲルは製造された。その先端にＭＳＣｓを含む第２のアレクサ（Ａｌｅｘａ）５６１標識化ゲルが重合化された（図８を参照）。培養３日後に、細胞がエア−ヒドロゲルの界面を横切ることが出来なかった。一方、細胞は、電気化学的改変ゲルに侵入したた（図９及び１０ｃを参照）。研究者は、積層造形が非常に有望であること、及び、加えられた要素間の境界がいかに重大であるかを示した。この点で、戦略は、細胞区分化を減少するこのような界面を改変するために提案される。
【００７７】
結論として、ヒドロゲル表面密度勾配の酵素学的な架橋を電気化学的に制御することにより、ヒドロゲルバルク内における細胞透過能力を増大することが生み出されうる。電気化学的に生成された表面勾配は、積層造形された隣接したヒドロゲルの界面を経由通って処理されたヒドロゲル上での局所的な細胞播種及び、細胞移動を可能にするための大きな見込みがある。
【００７８】
さらなる例
ＰＤＭＳフレーム（発明による装置のコンテナ）の調製。ポリジメチルシリオキサン（ＰＤＭＳ）フレームは以下のように作られた：シリコンエラストマー（ｓｉｌｉｃｏｎ  ｅｌａｓｔｏｍｅｒ）及び硬化剤（シルガード（Ｓｙｌｇａｒｄ）１８４、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）（質量  １０：１）は２０００ｒｐｍで３分間、ＡＲＥ−２５０ミキサー（シンキー、日本）の中で混合された。その混合物は、その後次いで、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）の鋳型の中に注がれた。そこでは、将来の対電極のための穴を作り出すために、直径５００μｍのステンレススチールワイヤが配置された。この混合物は、続いて３０分間真空チャンバーの中で脱気され、６０℃で４時間の間焼かれた。ステンレススチールワイヤ及びＰＤＭＳ形成物は、ＰＭＭＡ型から除去され、イソプロパノール（ＩＰＡ）及びＭｉｌｌｉＱ水で洗浄された。
【００７９】
ＴＧ−ＰＥＧヒドロゲルの調製：メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）感受性ＴＧ−ＰＥＧヒドロゲルは以前記載された通りに調製された［１９］。要するに、ペンディングした活性化第ＸＩＩＩ因子基質ペプチドグルタミン受容体（ｎ−ＰＥＧ−Ｇｌｎ）又は付加的なＭＭＰ感受性リンカーを有するリジンドナー（ｎ−ＰＥＧ−ＭＭＰｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−Ｌｙｓ）を含む８枝のＰＥＧ前駆体が５０ｍＭの塩化カルシウムを含むＴｒｉｓバッファ（ＴＢＳ、５０ｍＭ、ｐＨ７．６）中で化学量論的に混合された（最終乾燥質量含有率１．７％）。Ｌｙｓ−ＦＩＴＣ、Ｇｌｎ−Ａｌｅｘａ５６１、Ｇｌｎ−ＲＧＤ又は組み合わせは、１０Ｕ／ｍＬトロンビンで活性化された活性化第ＸＩＩＩ因子による架橋及び激しい混合の前に、前駆体溶液へと加えられた。
【００８０】
ＴＧ−ＰＥＧ重合の電気化学的制御。前駆体混合物は直ぐに予備の電極として使用される白金ワイヤ（直径０．５ｍｍ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＵＳＡ）を格納するＰＤＭＳ骨組み中に注がれた。１０ｎｍのクロム及び２００ｎｍの金で蒸着したコバルト−クロムディスク（直径１５ｍｍ及び厚さ０．８ｍｍ）が機能電極として使用され、ＰＤＭＳチャンバーの上に置かれた。ＴＧ−ＰＥＧの重合化は、定電流モードが適用されたＤＣ電流の存在下で８分間進行させた。電流密度は１００ｎＡ／ｍｍ２又は１μＡ／ｍｍ２であった。
【００８１】
細胞培養：ヒト骨髄ＭＳＣｓは、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．１０５００）、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．１５１４０−１２２）、５ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．１００−１８Ｂ）及び５０ｎＭ  ＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔ．ｎｏ．１００−１４Ｂ）で補われた必要最小培地アルファ（ＭＥＭａｌｐｈａ、Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ｃａｔ．ｎｏ．２２５７１−０２０）で培養された。
【００８２】
ゲル透過：ＭＳＣｓはヒドロゲル上に蒔かれ、及び１日又は３日間培養され続けた。各時点において、細胞はサンプルに固定され、４％パラホルムアルデヒドで固定され３回洗浄され、染色まで、ＰＢＳ内に置かれた。
【００８３】
ゲル−ゲル界面を交差した透過：細胞懸濁液は各培地で希釈され、（Ｇｌｎ−Ａｌｅｘａ  ５６１を含む）完全なＴＧ−ＰＥＧ溶液に加えられた。細胞含有ゲルが、改変された表面を有する製造されたヒドロゲルの先端に注がれ、組み合わされた構造物は１又は３日間の間培養され続けた。各時点において細胞はサンプルで固定され、４％パラホルムアルデヒドに固定され、３回洗浄され、及び染色までＰＢＳに置かれた。
【００８４】
ヒドロゲル中の細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡検査：透過処理は０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ＰＢＳを用いて室温で３０分間達成され、その後、ＰＢＳを用いた２回の洗浄工程が達成された。ｆ−アクチン染色に対して、サンプル試料は、Ａｌｅｘａ  ６３３−ラベル  ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｃａｔ．ｎｏ．Ａ２２２８４）を用いて４℃で一晩インキュベートされた。その後、共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた解析の前にサンプルはＰＢＳで３回洗浄された。ＴＧ−ＰＥＧヒドロゲル及び細胞は、ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてイメージ化された。各条件にあたり、少なくとも３サンプルが解析され、サンプル毎に３領域が獲得された。
【００８５】
浸透の定量化：ＬＳＣＭから獲得されたスタック（１２５×２μｍ）が３Ｄで再構築され、及び側面投写が行われた。ＦＩＴＣチャンネルはゲル表面を測定するために使用され、ａｌｅｘａ−６３３チャンネルが、ゲルの横断面中の細胞の位置を測定するために使用された。閾値はａｌｅｘａ−６３３のチャンネルイメージに適用され、イメージはその後（ノイズを除去して）きれいにし、及びゲルの表面を起点として２５μｍの厚さの領域でセグメント化した。ポジティブなピクセルの量は、細胞数を代替するものとして各領域で定量された。各セクションでの細胞の比率は、サンプルにおける細胞の全体量のパーセンテージとして計算された。値は、時間当たりの少なくとも３つの足場の平均値＋／−標準偏差を表す。少なくとも３領域が分析された。
【００８６】
製造されるべきポリマー構造体／ヒドロゲルを受け取るために使用された本発明に係る装置は、様々な外観及び形状を取ることができる。
【００８７】
図１８によれば、このような装置のコンテナ４０は、複数のチャンバー４３を含みうる、例えば大規模な並列化実験のための同一の形状を取り得る。チャンバー４３はウェル４４によって分離されうる。ここで、上記に記載されているとおりの個々のチャンバー４３で生成されたポリマー構造体１の開口（上部）表面３は、結合密度勾配を示しうる。それにより、柔らかい表面３が生成され、構造体１の硬さ（及び結合密度勾配）が構造体１のバルク／容積２に向かって増大する。
【００８８】
図１９から２６によれば、コンテナに含まれるポリマー構造体は１又は複数の凹所（ピット、ウェル等）を示し得る。
【００８９】
図１９は、１表面３（３ａ）から別の表面３ａ（３）への細胞１００（１０３）の方向性のある移動に対して透過可能な及び／又は透過不可能な区画Ａ、Ｂを特徴とする（ポリマー−）ヒドロゲル膜１０（膜１０は前記区画Ａ、Ｂを分離する）の形態にあるポリマー構造体の配置を示す。厚さｈは１００μｍから数ｃｍの範囲にあり得る。長さＬ及び幅は１００μｍから数ｃｍの間の範囲にあり得る。透過不可能領域ｓ及び透過可能領域ｄの長さ及び幅は、同一又は異なりうる、及び１μｍから数ｃｍの範囲にあり得る。
【００９０】
図２０は、（結合密度）勾配を特徴とする内腔３１と接触しているポリマー構造体１の内表面３の一部を有するヒドロゲル１を介して作り出されるチャンネル（例えば、マイクロチャンネル）３０の形態にある凹所３０を示す（即ち、前記表面３は内腔３１及びポリマー構造体１の間の界面を形成する）。前記チャンネル３０に染み込ませられた細胞１００は、この領域のみからヒドロゲルバルク２に侵入する。マイクロチャネル３０の直径は１０μｍから数ｃｍの範囲になり得る。最も興味深い範囲は１０μｍから１０００μｍである。チャネル３０の長さＬは１００μｍから数ｃｍの範囲になり得る。
【００９１】
図２１は、細胞１００又は細胞凝集体１００を分散するのに用いられるヒドロゲル１におけるウェル（例えば、矩形ウェル）、特にマイクロウェル、クリプト又は陥入の形態にある、凹所３０を示す。細胞１００は、（例えば、個々のウェル３０の底を形成する）表面３における密度勾配を特徴とする、クリプト又はウェル３０からのみヒドロゲル１からバルク２に侵入しうる。結合密度が表面３において最小又はゼロであり、かつ、バルク／体積２に向かって最大になるように増大する。ウェル３０は任意の形状であり得（立方体状、直方体状の、ピラミッド形の、円筒状の、半球状の、楕円体の、及びプリズム形の）、ここで示されているものは直方体状である（即ち、長方形の切断面である）。ウェル３０の深さｄ、幅ｗ及び長さは１０μｍから数ｍｍの範囲にあり得る。ウェル３０の間の分離ｓは、１０μｍから数ｍｍの範囲にあり得る。ヒドロゲル（ポリマー構造体）の厚さＨ、長さＬ及び幅は１００μｍから数ｃｍの範囲にあり得る。
【００９２】
図２２は、細胞１００又は細胞凝集体１００を分散するのに使われるヒドロゲル１におけるウェル（例えば、マイクロウェル）、クリプト、又は陥入の形態にある凹所３０を含むポリマー構造体（例えば、ヒドロゲル）１を示す。細胞１００は各凹所（ウェル）３０境界を定める表面３における密度勾配を特徴とするクリプト又はウェル３０からのみヒドロゲル１のバルク２に侵入し得る。改めて、ウェル３０は任意の形状を取り得る（立方体状、直方体状の、ピラミッド形の、円筒状の、半球状の、楕円体の、及びプリズム形）。ここで示されるものはピラミッド形である。ウェル３０の深さｄ、幅ｗ及び長さは１０μｍから数ｍｍの範囲になり得る。ウェル３０の間の分離ｓは１０μｍから数ｍｍの範囲になり得る。ヒドロゲル１の厚さＨ、長さＬ及び幅は１００μｍから数ｃｍの範囲になり得る。ピラミッド形ウェルの角度αは１０°から１８０°の間で変わり得る。
【００９３】
図２３は、細胞１００又は細胞凝集体１００を分散するために用いられるヒドロゲル１における陥入、クリプト又は凹所（例えば、マイクロウェル）３０を示す。細胞１００はウェル３０の境界を定める表面３における（結合密度）勾配を特徴とする、クリプト又はウェル３０からのみヒドロゲル１のバルク２に侵入しうる。改めて、ウェル３０は任意の形状を取り得る（立方体状、直方体状の、ピラミッド形の、円筒状の、半球状の、楕円体の、及びプリズム形の）。ここで示されているのは半球状の、又は楕円体の形である。ウェル３０の深さｄ及び半径ｒは１０μｍから数ｍｍの範囲にあり得る。ウェル３０間の分離ｓは１０μｍから数ｍｍの範囲にあり得る。ヒドロゲル（ポリマー構造体）１の厚さＨ、長さＬ及び幅は１００μｍから数ｃｍの範囲にあり得る。
【００９４】
図２４は、コーティングにおける細胞１００の３Ｄ細胞浸透を促進し、及び／又は表面３における２Ｄでの細胞展開を避ける、表面３における密度勾配を特徴とするボディ（例えば任意の形状及びサイズのインプラント又は装置）ヒドロゲルコーティング（厚さｄは１０μｍから数ｍｍに変わり得る）の形態にあるポリマー構造体１を示す。ボディ５の表面３上での２Ｄ細胞展開は、外来ボディ応答の第１のステップであり、及び従って、このコーティングは外来のボディの応答を妨げ得る。
【００９５】
図２５は、２つの液体区画Ｌ１、Ｌ２を分離し、かつ、１又は両方のＬ１、Ｌ２区画から膜１０にある細胞１００の指向性のある細胞侵入を可能にするヒドロゲル膜（厚さｄは１０μｍから数ｍｍの範囲へと変わりうる）の形態にある別のポリマー構造体１０を示す。
【００９６】
図２６は、任意の形状（球状の、半球状の、円筒状の、楕円体の、ピラミッド状の、立方体の、直方体状の、及びプリズム形）のポリマー構造体１（ヒドロゲルボディ）を示す。ここで示されるものは、各ボディ１の中央に向けて増大する密度勾配を特徴とし、かつ個々のボディ１の１以上の面（表面）上に存在するように勾配を有する、球状の、立方体の、ピラミッド状の、及び円筒状のものである。これらのボディ１は、例えば、動物におけるインプラントとして埋め込まれ、及びインプラントのバルクの内部での細胞透過を促進し得る。
【００９７】
特に、図２０から２３に示されている実施態様において、個々の結合密度勾配を生成するための機能している電極（例えば、第１又は第２電極）は、個々の凹所３０の形状の金属ヘッドに包含される。対電極（例えば、第２又は第１電極）は上記にも記載されているとおり、ポリマー構造体（即ち、チャンバー）内に配列され得る。
【００９８】
さらに図２７において示されるように、コンテナ４０は、２つの円周上部分４１ａ、及び４１ｂを有するウォール４１を含み得る。第１の部分４１ａはポリマー構造体／溶液を受け取るためのチャンバー４３を囲み、ウォール４１の第２の部分４１ｂは、液体Ｆ、具体的には生理食塩水、緩衝溶液、ケモアトラクタント溶液、成長因子溶液、細胞懸濁液、又はそれらの混合液、及び細胞機能の応答を誘導する他の溶液を受け取るためのさらなるチャンバー４５を囲む。
【００９９】
ここで、第１電極２１（又は第２電極）は凹所４０１、４０２が互いに面する前記ウォール４１において第１及び第２凹所４０１、４０２内に摺動自在に配置される。それにより、第１電極２１はチャンバー４３を横切り、かつ、前記凹所４０１及び４０２に密接して延長する。特に、第１電極２１はコンテナ４０から突出する（例えば、それを手動で動かすために）。さらに、第２凹所４０２はさらなるチャンバー４５に流れて連結しており、それにより−第１電極２１が前記第２凹所４０２から取り除かれる場合−さらなるチャンバー４５に格納される液体Ｆ（例えば、ケモアトラクタント溶液、成長因子溶液、細胞懸濁液又はそれの混合液及び細胞機能の応答を誘導する他の溶液）が（第１）チャンバー４３、すなわち、電極２１、２２の助けを借りて形成されるポリマー構造体１／ヒドロゲルのチャンネル３０内に、前記第２凹所４０２の間を流れうる。ウォール４１ｂの第２の部分は、第２凹所４０２（及び例えば、さらに第１凹所４０１）と一緒に並べられる第３凹所４０３を含む。それにより、第２凹所４０２は第３凹所４０３を介して第２の凹所４０２の中に閉鎖手段（例えばロッド又はピン）６０を挿入することにより閉じられ得る。さらに、２つのチャンバー４３、４５は、ウォール４１の部分４１ａ、４１ｂが伸びる底４２によってより低い側面上でそれぞれ境界が定められる。第１のチャンバーの底４２は、対電極（第２電極又は第１電極）２２を含み得る又は対電極２２として形成され得る。図２７に記載のコンテナ４０によってポリマー構造体１は形成され、特に該構造体１を交差するチャンネル３０、及びポリマー構造体１と前記チャンネル３０の内腔３１との間の界面３における結合密度勾配を含み得る。このようなチャネル３０は液体Ｆ、例えば上記で述べたようなもので満たされ得る。
【０１００】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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