(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんに罹患している対象を処置するための医薬組成物であって、第１の治療用ペプチドまたは第１の治療用ペプチドの複数コピーを含む第１の多価構造化ポリペプチドを含み、第１の治療用ペプチドは、ＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）を含む６〜８個のアミノ酸からなり；
治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、対象における免疫細胞の増殖を増加させることによってがんを処置するのに十分な量であり、がんは、腹腔内臓器のがんである、前記医薬組成物。
【請求項２】
がんが、卵巣がんである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
第１の治療用ペプチドが、ＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
該医薬組成物が第１の多価構造化ポリペプチドを含み、第１の多価構造化ポリペプチドが分岐状である、請求項１から３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
対象が持続性ウイルス感染に罹患している、請求項１から４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
持続性ウイルス感染がＨＩＶ／エイズ感染、ＣＭＶ感染、ＨＢＶ感染、およびＨＣＶ感染からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
対象がＨＢＶ感染に罹患している、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
該医薬組成物が、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される免疫細胞の増殖を刺激し、Ｔ細胞が、ナチュラルキラーＴ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
第２の治療用ペプチドまたは第２の治療用ペプチドの複数コピーを含む第２の多価構造化ポリペプチドをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
第２の治療用ペプチドが、以下からなる群から選択される、５から８個のアミノ酸の配列からなる、請求項９に記載の医薬組成物：
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）；および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、Ｐであり；
Ｘ３は、Ｓであり；
Ｘ４は、ＨおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）。
【請求項１１】
第２の治療用ペプチドがＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）およびＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）からなる群から選択される、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
該医薬組成物が第２の多価構造化ポリペプチドを含み、第２の多価構造化ポリペプチドが分岐状である、請求項９から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
第２の治療用ペプチドが、複合型グリカン上の末端配列５−アセチルノイラミン酸−ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンを機能的に模倣し、末端配列が、α（２，３）結合しているか、α（２，６）結合しているか、または末端糖である、請求項９から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
末端糖が、Ｎ−アセチルガラクトサミンおよびガラクトースからなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
担体をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
抗炎症剤、Ｂ細胞増殖剤、細胞傷害性Ｔ細胞増殖剤およびＮＫ細胞増殖剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
対象において抗体媒介性細胞傷害を増強するのに十分な量で混合される抗体調製物、または対象における受動免疫防御を増強するのに十分な量でそれらと共に混合される免疫グロブリンをさらに含む、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
対象における受動免疫防御を増強するのに十分な量でそれらと共に混合される免疫グロブリンをさらに含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１５年４月２７日に出願された米国特許出願第１４／６９７，２４０号の一部継続出願であり、それに対する優先権を主張するが、その内容はそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
電子ファイル化した資料の参照による援用
本明細書と同時に提出されたコンピュータ判読可能なアミノ酸配列一覧は、その全体が参照により本明細書に援用され、以下のように特定される：２０１５年７月８日に作成した「Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔ」（変更）という名称の１つの２，２５８バイトＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル。
【０００３】
技術分野
本発明は、感染症およびがんを処置するための対象における自然免疫系および適応免疫系をモジュレートする際の治療用ペプチドおよびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ウイルス感染は、有効処置にとって難題である。抗ウイルス処置は初期の急性感染症を処置するように見えるかもしれないが、後になって感染症の身体的症状が持続性感染として再発することが多い。持続性感染の一般的な特徴は、免疫応答を効果的にモジュレートし、特異的および非特異的な免疫防御を回避するウイルスの能力である。本質的には、持続性ウイルス感染は免疫抑制性疾患である。一般に、これらの疾患の経過は、免疫系の強さによって緩和される。持続性ウイルス感染はまた、がんの発症と密接に関連している。
【０００５】
ＨＩＶ−１は、持続性感染を引き起こすウイルスの一例である。ＨＩＶは、おそらく、免疫抑制疾患を引き起こすウイルスの中で最も広く知られているものである。免疫系は、感染症の急性期にこれらのウイルスに対する抗体を効果的に産生するが、抗体は大部分が非中和性であり、感染症を慢性的ステージ、最終的には致命的なステージに進行させる。さらに、免疫系の細胞溶解成分は、細胞が病原体誘導細胞表面抗原を発現するにもかかわらず、感染細胞を破壊することができない［１］。このような感染症に対する一次療法は、細胞への侵入後のウイルス複製とその後の成熟を阻害する抗レトロウイルス薬の組合せを毎日投与することである。最も一般に使用されるのは、ヌクレオシド逆転写酵素阻害薬、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害薬、インテグラーゼ阻害剤、およびウイルス生成物の酵素的プロセスを遮断するプロテアーゼ阻害剤である。これらの薬剤は、感染細胞内部のウイルス複製を効果的に阻害し、血中のウイルス量を検出不可能なレベルまで減少させる［２、３］。
【０００６】
これらのウイルスによる感染で特に混乱に陥る局面とは、取り込まれたプロウイルスステージが長期間潜伏を維持し得る潜在的な病原巣の確立である。その結果、ウイルスは、現在の処置によって、感染した個体から完全には排除することはできない。抗レトロウイルス療法を中止した場合、これらの病原巣は活性化され、ウイルスは数週間以内に処置前のレベルに「逆戻り」する［３、４］。プロウイルスが実際に潜伏しているか、または極めて低レベルでただ単に複製しているかどうかの問題は、完全には解決されていない。免疫系はウイルス複製の抑制を維持することが多いが、免疫系が損なわれた場合には健康を維持することができない。
【０００７】
後天性免疫不全症候群（エイズ）の明確な特徴は、リンパ管および血管に内在する細胞に影響する一種のがんであるカポジ肉腫（ＫＳ）の発症である。ＫＳは、免疫低下状態の対象においてヘルペスウイルスによって引き起こされる。
【０００８】
ＨＩＶと同様、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、免疫系に関連した持続性感染を引き起こす。しかし、ＣＭＶは健全な個体に潜伏しており、免疫系が損なわれた場合に、一般に活性化する。ウイルスＤＮＡポリメラーゼ阻害剤である抗ウイルス薬ガンシクロビルは、急性サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染の処置で一般的に使用されている。またヒトＣＭＶは、オンコモジュレーション（ｏｎｃｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を介してがんの発症に役割を果たすことが確認されており、例えば、がん細胞が免疫認識を逃れるようになる［４４］。
【０００９】
慢性ウイルス性肝炎は、肝臓がんの世界的に最も一般的な危険因子である。ＨＩＶと同様、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）はＲＮＡウイルスであり、慢性感染を引き起こす可能性はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）よりも高い。ＨＣＶの処置における最近の進歩には、ＨＩＶ−１感染の処置で使用されているのと同様の方法で作用するプロテアーゼ阻害剤の開発が関与している［５］。ＨＣＶにおいて、プロテアーゼ阻害剤は、ペグ化インターフェロンアルファおよびリバビリンの現在認可されている医薬品管理体制に加えられる。
【００１０】
世界の人口の約３分の１には、現在または過去においてＢ型肝炎に感染した証拠があり、これはＨＩＶ感染とＨＣＶ感染を合わせたものよりも多い［６］。ほとんどの健全な成人は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に対して効果的な免疫応答を起こすが、免疫防御の有効性はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性に依存する［６］。ＮＫ  Ｔ細胞はＨＢＶ感染の回復に寄与し、ＮＫＧ２Ｄ受容体は重要な役割を果たす［６］。ＨＢＶは慢性感染を確立し、感染細胞はＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を発現するが、免疫系は感染の進行を防ぐことはできない。長期間にわたるウイルス複製の継続は、肝硬変および肝細胞がんの進行をもたらす［６−８］。ＨＢＶによる感染は、肝細胞がんの主要原因である。約６６２，０００人が毎年世界で死亡し、そのうちの約半数が中国においてである［９］。
【００１１】
これらの持続性ウイルス感染および免疫抑制性疾患に対する潜在的に有力な治療的アプローチは、抗ウイルス活性を有する薬剤の組合せ、特に、ＮＫＧ２Ｄに結合するものと、自然免疫系および適応免疫系の活性化細胞の増殖の誘導を促進する強力な抗癌活性を有するものとの組合せである。
【００１２】
治療に対する代替アプローチ
上記のようなウイルス複製サイクルの工程を直接阻害することによる、またはがん処置用の非常に毒性の高い細胞傷害性化学療法剤の使用による疾患の予防または調節を目的とした治療的アプローチとは異なり、患者の免疫系の再活性化は、実用的でコスト効率の良い方法で感染患者に健康および生産性を回復させる見込みのある代替療法である。このアプローチは、病原体特異的な処置ではなく、疾患に対する一般的な防御を提供する。そのため、免疫療法に対する最大の目的は、サイトカインおよびモノクローナル抗体処置の開発により示されているように、免疫系を刺激または阻害することができる生成物に結びついている。
【００１３】
ＨＩＶ感染性の阻害におけるサイトカイン、特にインターロイキン−１６（ＩＬ−１６）、インターロイキン８（ＩＬ−８）およびＲＡＮＴＥＳ（Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  Ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ；ＣＣＬ５としても知られている）の役割は、非常に重要である。オーバーラップ機能および相補機能を有するＩＬ−１６、ＩＬ−８およびＲＡＮＴＥＳなどのサイトカインは、受容体と結合するウイルスと競合することにより、また、侵入に必要な受容体をダウンレギュレートして細胞へのウイルスの侵入に干渉することにより、ウイルス感染を弱化するように作用することができる。インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ）などの他のサイトカインは、細胞内の抗ウイルス酵素を活性化することにより、また抗体媒介性食作用を刺激することにより、ウイルス量を減少させるように作用する。さらにこれらのサイトカインは、ＨＢＶ感染の急性期に効果的であることも示されている［６］。
【００１４】
インターロイキン（ＩＬ）およびインターフェロン（ＩＦＮ）は、傷害または損傷に応答して様々な細胞から放出される有効な細胞刺激剤である。このため、これらのタンパク質は、治療剤とし多くの注目を集めている。ＩＬ−１６はＣＤ４の天然リガンドであり、Ｔ細胞への結合においてウイルスと競合するはずである。ＩＬ−２１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を回避するために必要であり、また免疫を維持し、持続性ウイルス感染を回復するために必須である［１０−１２］。しかし、リポ多糖類（ＬＰＳ）などの一般の刺激剤と同様、ＩＬおよびＩＦＮは、炎症性サイトカインの放出を誘導する。したがって、通常の内因性濃度よりも高い濃度で投与された場合、生命に危険を及ぼす可能性があり、入院治療施設が必要となり得る本質的な有害作用を有することが多い。同じく、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６のレベルは、ヒトにおける死亡の可能性と直接関係している。さらに、組換えＩＬおよびＩＦＮの産生およびそれらの適用は、非常にコストが高い。外来患者用に開発された低用量の免疫賦活剤処置であっても、成功率が低く、例えば、がん治療からの緩解を延長するか、または慢性レベルのＨＩＶなどの疾患を調節するなどのいくつかの状況においては、適切ではない。このような見地から、そのままの大きなサイトカイン分子などの外因性治療剤は、一般的な治療用途にはあまり適していないように思われる。
【００１５】
通常、感染は、（ｉ）病原体の内在化ならびに樹状細胞（ＤＣ）によるＴ細胞およびＢ細胞への抗原提示、（ｉｉ）Ｂ細胞による抗体の産生、（ｉｉｉ）ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による病原体感染細胞の溶解、ならびに／または（ｉｖ）抗体媒介性食作用によるウイルスもしくはがん細胞の破壊、を介した免疫系によって解消される。中和抗体応答が病原体回避の対象となるが、それにもかかわらず病原体に結合する多くの非中和抗体が感染患者内に存在する。生じた抗原−抗体複合体を認識し、抗体（Ｆｃ）−媒介性食作用によって複合体を破壊することができる免疫エフェクター細胞機能、特に食細胞活性の回復を、一般に感染のクリアランスに適用することができる。
【００１６】
食細胞以外のウイルス感染に有意に関与する細胞型は、特に、Ｔ細胞群の２つのサブセット（ＣＤ３＋およびＣＤ８＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６＋）ならびにＣＴＬ（ＣＤ８＋）である。これらの細胞は、感染細胞を直接溶解する能力に加えて抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって、ウイルス感染細胞およびがん細胞を死滅させることができる。ＮＫ細胞は自然免疫系の不可欠な要素であり、主として、ウイルス感染細胞およびがん細胞を死滅させる原因となる。ＮＫ細胞およびＣＴＬは、主として、細胞内顆粒に含有されているパーフォリン、グランザイムおよびグラニュライシン（ｇｒａｎｌｙｓｉｎ）などの細胞傷害性分子を放出することにより、それらの標的を死滅させる。これらの分子は、ウイルス感染細胞またはがん細胞の表面上に抗体が結合する抗原を含有する標的細胞とこれらの細胞とが接触する場合に放出される。また活性化ＮＫ細胞はマクロファージを活性化し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の１型（Ｔｈ１）細胞への分化を促進する、サイトカインおよびケモカイン、例えばＩＦＮ−γを放出する［１１、１２］。
【００１７】
これらの問題の１つまたは複数に対処する試みに関する情報は、以下の文献で確認することができる：米国特許出願公開第２００７／０００３５４２号；米国特許出願公開第２００６／０２６９５１９号；米国特許出願公開第２００４／０２４８１９２号；Ｐ．Ｗ．Ｌａｔｈａｍ、１９９９；Ｆａｔｋｅｎｈｅｕｅｒら、２００５；Ｓｔｏｖｅｒら、２００６；Ｃｏｈｅｎ、２００７；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、２００５ａ、およびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、２００５ｂ。しかし、これらの文献において言及されたこれらのそれぞれの処置では、以下の１つまたは複数の不都合な点が問題となっている：
１．薬剤のサイズまたは組成がコスト効率の良い合成および精製に重大な難題をもたらす；
２．薬剤が特定の病原体および／または細胞型に特異的であり、一般的な治療用途には不適切である；
３．薬剤による処置によって、炎症または肝毒性などの生命に危険を及ぼす可能性のある臨床的に有害な副作用が誘導され、入院処置施設が必要となる；
４．処置を中止した直後に全身性ウイルス量が増加する；
５．薬剤に長期間曝露すると、多くの場合、処置耐性の病原体を引き起こす；
６．外来患者用に開発された低用量の処置は成功率が低く、いくつかの状況においては適切ではない；
７．多くの患者にとって、処置は効果的でなく、非実用的であり、またはコストが非常に高い；
８．治療用抗体の開発には、かなりの医学的インフラが必要である；
９．ワクチンなどの処置は、感染を予防するのには適切であり得るが、既に感染しており、抑制免疫系を有しているものを処置するのには適切でない；
１０．誘導された免疫原性応答と他の内因性免疫調節剤の効果との間に有益な相乗作用はない；
１１．薬剤は、間接処置である、有益なサイトカインの放出を抑制する抑制性サイトカインの放出を阻害する；
１２．薬剤は、食細胞の活性化を促進するのではなく、免疫系応答の平衡を保つようベースラインのサイトカインレベルを回復するように作用する。
【００１８】
また、これらの治療プロトコルの多くは、病原体が変異によって処置から免れるようになるので、時間の経過と共に効果が消失する。さらに、この疾患に伴ういかなる免疫抑制も、自然免疫系および適応免疫系が抗原変化に応答し、感染が制御下に保たれる能力を弱化する。
【００１９】
病原体、例えばＨＩＶ−１またはＨＢＶなどに感染した個体の免疫系は、抗体産生による防御応答を開始する。たとえ、ウイルスが１つの部位または少数部位で変異し、それによって抗体の中和活性を免れたとしても、内生的に産生される非中和抗体は通常ポリクローナルであり、ウイルスに依然として結合し得る。抗ウイルス抗体の存在は、感染についての診断テストとして使用されることが多い。疾患の経過中に、自然免疫応答および適応免疫応答の細胞成分は、その後、非存在となるか、休止状態になる。免疫防御の機序が十分に低レベルに到達した場合、ウイルスの複製は止まらず、急速にその疾患が最終ステージに至る。しかし、この後期ステージでさえも、患者を積極的治療によって死から救済することができる。したがって、免疫系細胞、特に食細胞およびＮＫ細胞を再活性化する薬剤は、疾患の進行に対する免疫防御を回復させる見込みがある。
【００２０】
病原体の抑制機序を解消することが不可欠であるばかりでなく、免疫系を抑制する宿主の自然な機序をモジュレートすることも重要である。そのままの大きなサイトカイン分子などの外因性薬剤に基づく治療は、一般的に治療用途にあまり適してはいないが、サイトカインおよび免疫調節剤を含む免疫系を活性化／再活性化する治療剤は、この点に関して特に有望であることを示す。しかし、ペプチドは、大きなポリペプチドまたはタンパク質よりもはるかに適切な治療剤であることが多い。ペプチドは、例えば、多くの場合、付随的な有害作用を誘導することなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで１つまたは複数の特定の所望する効果を誘導するように設計することができ、通常、コスト的に有効な方法で合成することができる。
【００２１】
この技術の開発は、ウイルス、細菌、真菌、およびがんによって引き起こされる疾患に適用することができる。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、免疫低下状態の対象を処置する方法であって、治療用ペプチドまたは治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドを含む組成物を、免疫低下状態の対象に投与することを含み、治療用ペプチドは、５から８個のアミノ酸からなり、かつ
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、ＰおよびＱからなる群から選択され；
Ｘ３は、ＳおよびＨからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｈ、ＴおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、Ｒ、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）
からなる群から選択され、
治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、対象における免疫細胞の増殖を増加、活性化および／または刺激するのに十分な量である、方法に関する。
【００２３】
本発明はまた、がんおよび／またはウイルス感染に罹患している対象を処置する方法であって、治療用ペプチドまたは治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドをがんおよび／またはウイルス感染に罹患している対象に投与することを含み、治療用ペプチドは５から８個のアミノ酸からなり、かつ
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、ＰおよびＱからなる群から選択され；
Ｘ３は、ＳおよびＨからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｈ、ＴおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、Ｒ、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）
からなる群から選択され、
治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、対象における免疫細胞の増殖を増加させることによって、がんおよび／またはウイルスを処置するのに十分な量である、方法に関する。
【００２４】
前述の方法のある実施形態において、治療用ペプチドは、下記：ＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）、ＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）およびＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）の１つまたは複数からなる群から選択することができる。いくつかの実施において、対象は、ＨＩＶ／エイズ感染、ＣＭＶ感染、ＨＢＶ感染、およびＨＣＶ感染からなる群から選択され得る持続性ウイルス感染に罹患していてもよい。
【００２５】
特定の非限定的な実施形態において、本発明は、がんに罹患している対象を処置する方法であって、治療用ペプチドまたは治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドをがんに罹患している対象に投与することによってなされ、治療用ペプチドはＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）であり、治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは対象におけるがんを処置するのに十分な量である、方法に関する。
【００２６】
一実施形態において、多価構造化ポリペプチドは対象に投与され、分岐状である。本発明のある非限定的な態様において、対象に投与される治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、マクロファージ；樹状細胞；ナチュラルキラー細胞；ナチュラルキラーＴ細胞；ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞；Ｂ細胞；ならびにそれらの組合せからなる群から選択される免疫細胞の増殖を刺激する。
【００２７】
特定の実施形態において、治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、対象において抗体媒介性細胞傷害を誘導するのに十分な量で、好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ｌＬ−１６、ｌＬ−１７、ｌＬ−２１、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−γおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるリンパ球由来の少なくとも１つの内因性サイトカインの発現を増加させる、ならびに／またはＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１３およびＴＮＦ−αからなる群から選択される少なくとも１つの内因性サイトカインを減少させるのに十分な量で投与される。さらに、多価構造化ポリペプチドは、シグナル伝達に関与するリン酸化キナーゼの速やかな改変を誘導し、これらの活性を達成する。
【００２８】
ある実施において、本方法は、（ａ）組成物を投与する前の免疫低下状態の対象における免疫細胞のレベル；および（ｂ）組成物を投与した後の免疫低下状態の対象における免疫細胞のレベル、を決定することをさらに含む。（ａ）および（ｂ）のレベルは、フローサイトメトリーにより決定することができる。（ｂ）と（ａ）の好ましい比の例は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５である。本発明のさらなる別の態様では、（ａ）に対する（ｂ）の比は、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも３．５、少なくとも４、少なくとも４．５、または少なくとも５である。
【００２９】
本発明のいくつかの実施において、治療用ペプチドは、好ましくは、複合型グリカンまたは糖タンパク質上の末端配列５−アセチルノイラミン酸−ガラクトースを機能的に模倣し、末端配列はα（２，３）またはα（２，６）結合している。治療用ペプチドは、好ましくは、細胞表面糖タンパク質上の末端Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはガラクトースを機能的に模倣する。治療用ペプチドは、受容体ＮＫＧ２Ｄおよび／またはシグレックに結合し、Ｂ細胞、ＤＣ、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞および／または食細胞上の受容体に結合することにより免疫系のモジュレーターとして機能するように構成されるのが有利である。さらに、治療用ペプチドは、Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはガラクトースに特異的な受容体、例えば、未熟ＤＣおよびマクロファージ上のＣＬＥＣ１０ａ／ＣＤ３０１、ＤＣ上のランゲリン（ｌａｎｇｅｒｉｎ）、および肝細胞上のアシアロ糖タンパク質（ａｓｉａｌｙｌｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体−１に結合する。いくつかの実施形態において、治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、抑制性シグレック受容体に結合することによって免疫細胞を活性化する。いくつかの実施形態において、治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＬＥＣ１０ａを含む活性化受容体に結合することによって免疫細胞を活性化する。
【００３０】
本発明の方法は、第２の治療用ペプチドまたは第２の治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドを対象に投与することをさらに含み得る。第２の治療用ペプチドは、５から８個のアミノ酸からなり、かつ
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）；および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、Ｐであり；
Ｘ３は、Ｓであり；
Ｘ４は、ＨおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）
からなる群から選択される。
【００３１】
いくつかの実施において、第２の治療用ペプチドは、ＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）およびＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）からなる群から選択される。いくつかの態様において、第２の治療用ペプチドを含む多価構造化ポリペプチドは対象に投与され、多価構造化ポリペプチドは分岐状である。いくつかの実施において、第２の治療用ペプチドは、複合型グリカン上の末端配列５−アセチルノイラミン酸−ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンを機能的に模倣し、末端配列は、α（２，３）もしくはα（２，６）結合しているか、またはＮ−アセチルガラクトサミンもしくはガラクトースなどの末端糖に結合している。
【００３２】
前述の方法の治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、担体を含む組成物中に存在していてもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、抗炎症剤、細胞傷害性Ｔ細胞増殖剤またはＮＫ細胞増殖剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤；および本発明の治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドをさらに含んでいてもよい。このような組成物は、対象における抗体媒介性細胞傷害を増強するのに十分な量で混合される抗体調製物；または対象における受動免疫防御を増強するのに十分な量でそれらと共に混合される免疫グロブリンをさらに含んでいてもよい。
【００３３】
また治療用組成物も本発明において検討されている。本発明の治療用組成物は、担体、治療用ペプチドまたは治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチド（ここで、治療用ペプチドはＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）であり、治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは対象におけるがんを処置するのに十分な量である）、ならびにＢ細胞増殖剤、細胞傷害性Ｔ細胞増殖剤またはＮＫ細胞増殖剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む。本組成物は、抗体媒介性細胞傷害を増強するのに十分な量で混合される抗体調製物をさらに含んでいてもよく、または受動免疫防御を増強するのに十分な量でポリペプチド組成物と混合される免疫グロブリンをさらに含んでいてもよい。
【００３４】
いくつかの実施形態において、治療用組成物は、第２の治療用ペプチドまたは第２の治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドをさらに含む。第２の治療用ペプチドは、５から８個のアミノ酸からなり、かつ
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）；および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、Ｐであり；
Ｘ３は、Ｓであり；
Ｘ４は、ＨおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）
からなる群から選択される。
【００３５】
いくつかの態様において、第２の治療用ペプチドは、ＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）、およびＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）からなる群から選択される。いくつかの実施において、第２の治療用ペプチドを含む多価構造化ポリペプチドは対象に投与され、多価構造化ポリペプチドは分岐状である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】一価の治療用ペプチドのモデルを示す図である。図１は、受容体シグレック−５（受託番号２ＺＧ１）のグリカン結合部位においてドッキングされた一価ＳＶＨ１Ｃ（配列番号３、空間充填構造）のモデルを示し、予測される結合エネルギーはΔＧ’＝−４７ｋＪ／ｍｏｌである。予測される結合エネルギーは、受容体との強い相互作用を示唆し、ＫＤ＝〜１×１０−８Ｍである。
【図２】図２は、受容体ＮＫＧ２Ｄ（受託番号１ＭＰＵ）のリガンド結合部位においてドッキングされた一価ＳＶＨ１Ｃ（配列番号３、空間充填構造）のモデルを示す。ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）に対する予測される結合エネルギーは、ΔＧ’＝−４０ｋＪ／ｍｏｌであった。これはＫＤ＝〜１×１０−７Ｍに相当する。
【図３】図３は、Ｎ−アセチルガラクトサミンに対して高度に特異的なＣＬＥＣ１０ａに相同なタンパク質である受容体アシアロ糖タンパク質受容体−１（ＡＳＧＰＲ−１）（受託番号１ＤＶ８）のリガンド結合部位においてドッキングされた一価ＳＶ６Ｄ（配列番号５、空間充填構造）のモデルを示す。予測される結合エネルギーは、ΔＧ’＝−４０ｋＪ／ｍｏｌであった。これはＫＤ＝〜１×１０−７Ｍに相当する。
【図４】ペプチドの最終設計のモデルを示す図である。４つの同一の活性配列（例えば、アーム１およびアーム２）をリンカー配列（３）によって、トリリシンアミドからなる中心コア（４）から伸長させた。
【図５】ＳＶＨ１Ｃ（［ＮＰＳＨＰＬＳＧＧＧＧＳ］４Ｋ３−ＮＨ２）の多価構造を示す。Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｓ、セリン；Ｈ、ヒスチジン；Ｌ、ロイシン；Ｇ、グリシン；Ｋ、リシン。ペプチドの分子量は４，５９３．９である。リンカー配列（ＧＧＧＳ）は、トリリシンコアから活性配列を伸長する。
【図６】ＳＶ６Ｄ（［ＮＱＨＴＰＲＧＧＧＳ］４Ｋ３−ＮＨ２）の多価構造を示す。Ｎ、アスパラギン；Ｑ、グルタミン；Ｈ、ヒスチジン；Ｔ、スレオニン；Ｐ、プロリン；Ｒ、アルギニン、Ｇ、グリシン；Ｓ、セリン；Ｋ、リシン。分子量は４，３６９．１である。リンカー配列（ＧＧＧＳ）は、トリリシンコアから活性配列を伸長する。
【図７】固相アッセイにおけるレクチン型受容体シグレック（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン受容体）および他のレクチン型受容体へのＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）の結合を示す図である。これらのアッセイにおける緩衝液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳであった。図は、受容体に結合したＳＶＨ１Ｃに結合したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの量を示す。受容体はＦｃ−キメラであり、プロテインＡ／Ｇ−コーティングしたマイクロタイターウェルでアッセイした。シグレック−１およびＣＬＥＣ１０ａはＣ末端Ｈｉｓタグを含有しており、Ｎｉコーティングしたウェルとは別の実験でアッセイした。ＳＥＭは、二連で実施した４つの独立した実験から決定した。フェツインによる阻害は、各受容体群において糖タンパク質を１０μＭで添加（２番目の黒色の棒）、または３０μＭで添加（３番目の薄灰色の棒）した２つのアッセイの平均によって示す。結合は、ペルオキシダーゼの比色アッセイによって測定した。
【図８】固相アッセイにおけるＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）の受容体ＮＫＧ２Ｄへの結合を示す図である。Ａでは、受容体に結合したＳＶＨ１Ｃに結合したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの量を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで十分洗浄した後に測定した。フェツイン（５μＭ、黒色の棒；１０μＭ、薄灰色の棒；３０μＭ、灰色の棒）およびシアリルラクトース（１２μＭ、黒色の棒；２０μＭ、薄灰色の棒；４０μＭ、灰色の棒）が阻害剤として含まれていた。結合は、ペルオキシダーゼの比色アッセイによって測定した。このアッセイは、３回実施した。Ｂでは、フェツイン（丸）またはシアリルラクトース（正方形）によるＳＶＨ１ＣのＮＫＧ２Ｄへの結合の阻害をグラフ表示した。
【図９】５分間、１００ｎＭのＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）でヒトＰＢＭＣを処置した後の細胞表面免疫受容体のリン酸化の変化を示す図である。細胞溶解産物を捕捉抗体のアレイ上に広げ、リン酸化形態をホスホチロシン抗体（Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｒｒａｙ、  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）によって検出した。ＣＤ２２９、ＦｃγＲＩＩＡ、ＬＡＩＲ−１、シグレック−２、−３、−５、−７、−９および−１０のリン酸化形態は減少したが、ＢＬＡＭＥ（Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）は増加した。ＦｃＲＨ４、ＳＨＰ−１およびＮＫｐ４６は有意には変化しなかった。この実験は、本ペプチドがヒト細胞に対して劇的な効果を有することを示した。
【図１０】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）を隔日で皮下注射すると、腹腔内の免疫細胞群に比較的大きな増加が生じたことを示す図である。次第に濃くなる棒は、１日、３日および５日間の処置での、すなわち、０日目、２日目および４日目にそれぞれ注射した２４時間後の特定の細胞型群を示す。腹膜細胞を３匹の動物から採取し、プールし、フローサイトメトリーによって分析した。細胞型を同定するために使用したマーカーは、図の上部に記載している。各細胞型の総数をプロットし、スケールを各細胞型の上部に示した。細胞は、図下部の横方向の通常表示によって識別される。星印は、ＣＤ６９を発現する活性化群を示す。
【図１１】ＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）およびＳＶ６Ｂ（配列番号２）の抗ウイルス活性を、抗ＨＩＶ抗体を含まないＰＢＭＣ培養物においてＨＩＶ−１複製を阻害することにより示す図である。
【図１２】固相アッセイにおけるレクチン型受容体ＣＬＥＣ１０ａ、ランゲリン、ＡＳＧＰＲ−１、デクチン−１および他のレクチン型受容体へのＳＶ６Ｄ（配列番号５）の結合を示す図である。これらのアッセイにおける緩衝液は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳであった。図は、受容体に結合したＳＶ６Ｄに結合したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼの量を示す。受容体はＦｃ−キメラであり、プロテインＡ／Ｇコーティングしたマイクロタイターウェルにおいてアッセイした。このアッセイは、図７で記載したものと同様であった。
【図１３Ａ】５分、１０分または１５分間、１００ｎＭのＳＶ６Ｄで処置した培養物中のヒトＰＢＭＣにおけるシグナル伝達キナーゼのリン酸化の変化を示す図である。細胞溶解産物を捕捉抗体アレイ上に広げ、リン酸化形態はヒトホスホキナーゼアレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）により検出した。
【図１３Ｂ】５分、１０分または１５分間、１００ｎＭのＳＶ６Ｄで処置した培養物中のヒトＰＢＭＣにおけるシグナル伝達キナーゼのリン酸化の変化を示す図である。細胞溶解産物を捕捉抗体アレイ上に広げ、リン酸化形態はヒトホスホキナーゼアレイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）により検出した。
【図１４】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＳＶ６Ｄ（配列番号５）を隔日で皮下注射すると、腹腔内の免疫細胞群に比較的大きな増加が生じたことを示す図である。次第に濃くなる棒は、１日、３日および５日間の処置での、すなわち、０日目、２日目および４日目にそれぞれ注射した２４時間後の特定の細胞型群を示す。腹膜細胞を３匹の動物から採取し、プールし、フローサイトメトリーによって分析した。細胞型を同定するために使用したマーカーは、図の上部に記載している。各細胞型の総数をプロットし、スケールを各細胞型の上部に示した。細胞は、図下部の横方向の通常表示によって識別される。星印は、ＣＤ６９を発現する活性化群を示す。
【図１５】卵巣がん細胞株を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスの処置効果を示す図である。１日おきに皮下注射したＳＶ６Ｄ（配列番号５）の１ｎｍｏｌｅ／ｇ用量または０．１ｎｍｏｌｅ／ｇ用量で処置する間、個々のマウスの体重を測定した。腹水形成は処置の開始時に明らかであり、示した体重は処置後２週間のものである。０．１ｎｍｏｌｅ／ｇ用量の有効性は、現在使用の化学療法薬パクリタキセルの有効性と類似していた。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、マクロファージ、Ｂ細胞、ＤＣ、ＮＫ細胞、Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を活性化および増殖するための組成物および方法に関する。本組成物および方法は、免疫抑制を解消し、抗ウイルス活性および／または抗がん活性を生じさせることができる受容体のグリカンリガンドのペプチド模倣体の使用を含む。
【００３８】
免疫系抑制の解消
抑制機構は、免疫系内のバランスを自然に維持し、過剰に刺激された有害な免疫応答の進行を防ぐ。これらの抑制機構における主要成分は、シグレック（シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン）ファミリーの細胞表面レクチン型受容体である［１３、１４］。大部分のシグレックの細胞質ドメインは、リン酸化された場合にチロシンホスファターゼ、例えばＳＨＰ−１を補給するＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン型阻害モチーフ）を含有している。シグレックは豊富な細胞表面タンパク質であり、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）などの活性化受容体複合体の糖タンパク質サブユニット上のシアル酸残基に結合する。次いで、シグレック関連ＳＨＰ−１は活性化複合体を脱リン酸化し（不活性化し）、これが免疫機能を抑制する［１３−１５］。
【００３９】
免疫系のほとんどの細胞は数種類のシグレックを含有する［１３−１５］。ヒトにおいては、合計１４種のシグレックが発現される。一例としては、幅広く研究されているシグレック−２は、ＩｇＭなどのＢＣＲ関連タンパク質上のシアル酸残基に結合し、抗原認識および抗体産生におけるＢＣＲの活性の抑制をもたらす［１４、１５］。シグレック−２は、その細胞質ドメイン内に６個のチロシン残基を含有し、そのうちの３個は３つのＩＴＩＭ内にあり、これらはリン酸化される可能性がある。シグレック−２に対して高親和性を有するシアロシドは、シグレック−２のシアル酸結合部位に結合し、ＢＣＲ複合体からそれを遊離させる［１４、１６］。その結果、ＢＣＲ複合体の活性化はもはや弱化されなくなり、Ｂ細胞活性化が起こる。シグレックによる他の免疫細胞の類似の抑制も、これらの受容体の抑制活性を阻害する低分子の結合によって解消されることが予測され得る。ほとんどのシグレックは抑制機能を示すが、シグレック−１４、−１５および−１６は細胞質ＩＴＩＭを欠いており、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン型活性化モチーフ）を含有するアダプタータンパク質ＤＡＰ１２と関連して活性化機能を果たす［１３−１５］。複数のシグレックに結合する化合物は、活性化機能も増強しながらシグレックの抑制能力を低下させることによって、複数の免疫細胞活性化を達成する強力な機序を提供するはずである。シアル酸−ガラクトース配列を結合するさらなる受容体は、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞で発現される、有効な活性化受容体ＮＫＧ２Ｄである［１７、１８］。ＮＫＧ２Ｄはまた、ＩＴＡＭを含有する細胞質アダプタータンパク質ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２と共に機能する。本発明に記載のペプチドの１セットはシアル酸−ガラクトース配列の模倣体であり、これらの受容体に高い結合活性で結合する［１９］。
【００４０】
シアル酸を模倣する本発明のペプチド、例えばＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）は、二重機能を有する。第１に、それらは抑制性シグレック受容体に結合する。第２に、それらはまた、活性化受容体のＮＫＧ２Ｄに結合する。免疫系の過剰な活性化を防ぐ抑制性受容体としてのシグレックは、「チェックポイント」である。これらのシグレック受容体に結合し不活性化することにより、本発明のペプチドは「チェックポイント阻害剤」と考えることができる。同時に、同じ細胞上の活性化受容体に結合することによって、本ペプチドはこれらの細胞に対して強い刺激効果を及ぼす。この機能にとって不可欠なのは、本ペプチドのシアル酸結合部位に対する結合活性が、天然の細胞ベースのグリカンよりもはるかに大きいことである。実際、シグレックは、シアル酸含有リガンドにミリモルの低い範囲のＫＤ値で結合するが、本ペプチドは、３桁のより大きな結合活性で、１マイクロモル以下のＫＤ値で結合する。したがって、本ペプチドは、治療上の有用性を提供するのに非常に適している。
【００４１】
このように、本ペプチドとレクチン型抑制性受容体との相互作用は、免疫細胞の活性化をもたらす。これらの活性は、活性化受容体に結合し、免疫細胞を直接活性化する他のペプチドと組み合わせることができる。レクチンは、一般に高特異的な炭水化物結合タンパク質であり、これらの受容体は、糖残基を含有するリガンドと相互作用する。免疫系の細胞は、各種の調節性Ｃ型レクチン細胞表面受容体を発現する［２０、２１］。本発明のペプチドの第２のセットは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）およびガラクトース（Ｇａｌ）の模倣体であり、免疫細胞の活性化をもたらす受容体に結合する。このリガンド特異性を有する受容体は、マクロファージガラクトース型レクチン（ＭＧＬ）、ＣＬＥＣ１０ａまたはＣＤ３０１とも呼ばれるカルシウム依存性（Ｃ型）レクチンである［２２］。この受容体の２つの形態はマウスにおいて発現され、その１つはガラクトースに特異的であり（Ｇａｌ、ＭＧＬ１）、２つ目はＧａｌＮＡｃに特異的である（ＭＧＬ２）。ＣＬＥＣ１０ａは、一次抗原提示細胞（ＡＰＣ）であるマクロファージおよび未熟樹状細胞によって発現される。したがって、免疫細胞上のレクチン型受容体は、免疫系への侵入を提示する。
【００４２】
ＣＬＥＣ１０ａは遍在性ホスファターゼＣＤ４５上のグリカンに結合し、その活性を弱化する。ＣＤ４５のホスファターゼ活性は、リンパ球活性化に必要である［２３］。ＣＤ４５上のグリカンよりもはるかに高い結合活性で結合するペプチドとのＣＬＥＣ１０ａの結合は、細胞活性化をもたらす。したがって、ＣＬＥＣ１０ａは、免疫細胞活性化のための戦略的標的である。広範囲の文献によって、ＣＬＥＣ１０ａの標的化は、ＤＣによる抗原の内在化、ＣＤ４＋Ｔ細胞への抗原の提示、およびＩＦＮγ−産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の分化を促進することが示された［２２、２４］。ＣＬＥＣ１０ａに結合するリガンドもまた、抗原特異的ＩＦＮγ−産生ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強し、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１細胞に傾け、Ｔ細胞の増殖が増加する。さらに、ＤＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化および増殖を媒介する［２５］。広く発現され豊富な細胞表面タンパク質であるＣＤ４５のホスファターゼ活性は、リンパ球活性化および発達に必要である［２３］。Ｔ細胞上のＣＤ４５のＧａｌＮＡｃ残基へのＤＣ上のＣＬＥＣ１０ａのトランス結合は、Ｔ細胞阻害をもたらす［２６］。ＧａｌＮＡｃ含有因子の導入は、ＣＬＥＣ１０ａをＣＤ４５から排除し、抑制性受容体の脱リン酸化およびＴ細胞活性化を可能にする［２４］。ＣＬＥＣ１０ａは、マクロファージ活性化因子の適切な受容体、共有結合したＧａｌＮＡｃを含有する血清型群特異的成分−１（Ｇｃ１）の臨床上有効な抗がん誘導体である。いくつかのがん細胞によって発現される加水分解酵素はＧａｌＮＡｃ残基を除去し、それによりタンパク質を不活性化する［２７］。これらの結果から、免疫細胞の制御およびがんの処置におけるＧａｌＮＡｃ含有リガンドの受容体に関する重要な役割が示唆された。
【００４３】
現在のがんの免疫療法は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４などのＴ細胞上の抑制性受容体に結合し、その活性を阻害するモノクローナル抗体の使用に着目している。またがん細胞によって高度に発現され、ＰＤ−１に対する活性化リガンドとして作用する抗体がタンパク質ＰＤ−Ｌ１に対して開発されている。これらの抗体の組合せは、あるタイプのがんの処置において非常に効果的であることが判明している［２８］。これらの抗体が静脈内注射された場合、重大な毒性の副作用が起こる。本発明のペプチドは、異なる抑制性受容体と相互作用し、結果は全面的に同等であり得るが、異なる機序によって容易に達成され、毒性は著しく低下する。
【００４４】
受容体のグリカンリガンドのペプチド模倣体
ペプチドによる免疫系刺激の重要な要素は、食細胞の活性化の他に、Ｂ細胞、ＤＣ、ＮＫ細胞、Ｔ細胞およびＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）の活性化および増殖である。この目的に向けて、グリカン５−アセチルノイラミン酸−ガラクトース［Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）ＧａｌおよびＮｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ］のペプチド模倣体が設計された。これらのグリカンは、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞上の重要な活性化受容体ＮＫＧ２Ｄに結合し［１８］、また、免疫系のほとんどの細胞に存在し、一般に抑制性受容体であるシグレック（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン）受容体のファミリーに結合する［１３−１５］。同定されたＮＫＧ２Ｄの内因性リガンドが数種類のタンパク質ベースの活性化リガンドであるが［１７、２９］、グリカンの結合もまたこれらの細胞を活性化するはずである。食細胞の活性化は、これらの細胞上のシグレックまたは他の受容体にペプチドが結合することによって生じる。治療用ペプチドは、アームがわずか９から１２個のアミノ酸長の配列からなる（リンカー配列を含む）多価構造からなる。既に開示されている関連ペプチド［参照によって本明細書に援用される、米国特許第７，８１１，９９５号および同第８，４９６，９４２号］の活性配列は、ＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）およびＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）である。好ましくは、ペプチドは、実質的に純粋な形態である。典型的には、ペプチドが少なくとも７０重量％、より好ましくは少なくとも８０重量％、最も好ましくは少なくとも９５重量％純粋であることが望ましい。一実施形態において、Ｎ末端はアセチル化されていてもよい。
【００４５】
さらに、ペプチドＮＱＨＴＰＲ（ＳＶ６Ｄ；配列番号５）は、末端Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはガラクトースを含有するグリカンによって制御される戦略上重要な受容体に結合するように設計された。ＳＶ６Ｄ（配列番号５）は、腹膜腔内の免疫細胞の増殖および活性化を強く刺激し、卵巣がんのモデルにおいて腹水の進行を効果的に抑制した。このペプチドは、他の腹膜臓器のがんの処置においても効果的であることが予想される。関連ペプチドの活性配列は既に開示されている［参照によって本明細書に援用される、米国特許第７，８３８，４９７号および同第８，４６０，６９７号］。
【００４６】
好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、少なくとも２つのアームを有するペプチド構築物を含む。構築物は、典型的には中央骨格を有し、各アームは、リンカーを介して中央骨格に連結されている治療用配列を含む。ペプチド構築物の各治療用配列は、同一であっても、異なっていてもよい。好ましい実施形態において、治療用配列は、ペプチド構築物の各アームと同一である。治療用配列は、好ましくは、上記の治療用ペプチドの群から選択される。本発明はまた、本発明の少なくとも１つのペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む治療用組成物も提供する。好ましい実施形態において、本組成物は、抗体媒介性細胞傷害性または食作用を増強するのに十分な量でそれらと混合される抗原および／または抗体調製物を好ましくはさらに含む、免疫賦活組成物である。あるいは、本組成物は、受動免疫防御を実質的に増強するのに十分な量で、例えば、対照と比べて少なくとも３０％増加する量で治療用ペプチドと混合される免疫グロブリンを含むことができる。
【００４７】
別の実施形態において、本治療用組成物は、担体；Ｂ細胞増殖剤、樹状細胞増殖剤、細胞傷害性Ｔ細胞増殖剤またはＮＫ細胞増殖剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤；および治療用ペプチドまたは上記のような多価構造化ポリペプチドを含む。ある実施形態において、本組成物は、対象における抗体媒介性細胞傷害を増強するのに十分な量で混合される抗体調製物をさらに含む；または受動免疫防御を増強するのに十分な量でポリペプチド組成物と混合される免疫グロブリンをさらに含む。
【００４８】
好ましい細胞傷害性Ｔ細胞増殖剤および／またはＮＫ細胞増殖剤には、ＩＬ−２、ＩＬ−１５およびＩＬ−２１発現を増加させる分子が含まれる。あるいは、ＩＬ−１２およびＩＬ−１８発現を誘導する分子が含まれる。
【００４９】
本発明のペプチドは、疾患、とりわけ、侵入病原体または有害な細胞の内因性抗原に対する抗体の内因性誘導によって処置可能なそれらの疾患に罹患している対象を処置するのに有用である。本発明のペプチドは、ウイルス感染、がん、細菌感染および酵母菌感染、ならびに／または免疫系の刺激による処置を必要とする他の自己免疫疾患のような疾患を処置するために特異的に使用することができる。このような自己免疫疾患としては、慢性関節リウマチ、乾癬；皮膚炎；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患に関連した応答；クローン病；潰瘍性大腸炎；呼吸窮迫症候群；成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；皮膚炎；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；大腸炎；糸球体腎炎；アレルギー性疾患；湿疹；喘息；Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症反応が関与する症状；アテローム性動脈硬化；白血球接着不全；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；真性糖尿病；多発性硬化症；レイノー症候群；自己免疫性甲状腺炎；アレルギー性脳脊髄炎；シェーグレン（Ｓｊｏｒｇｅｎ）症候群；若年性糖尿病；サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症に関連した免疫応答；結核；サルコイドーシス；多発性筋炎；肉芽腫症；血管炎；悪性貧血（アジソン病）；白血球漏出が関与する疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；多臓器傷害症候群；溶血性貧血；重症筋無力症；抗原−抗体複合体媒介性疾患；抗糸球体基底膜疾患；抗リン脂質抗体症候群；アレルギー性神経炎；グレーブス病；ランバート−イートン筋無力症候群；水疱性類天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  ｂｕｌｌｏｕｓ）；天疱瘡；自己免疫性多内分泌症；ライター病；スティッフマン症候群；ベーチェット病；巨細胞性動脈炎；免疫複合体性腎炎；ＩｇＡ腎症；ＩｇＭ多発性神経障害；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）および自己免疫性血小板減少症が挙げられる。
【００５０】
本発明は、疾患細胞を直接的に、または抗体依存性細胞傷害により攻撃する、対象におけるリンパ球のサブセットを、特にＮＫ細胞を実質的に活性化し、Ｆｃ−媒介性食作用の活性化を補い、対象を処置する方法を含む。好ましい実施形態において、ＨＩＶ−１複製は、対照および／または対象におけるペプチド投与前のレベルと比べて、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％対象において阻害される。抗体の存在下においては、阻害は１００％に達し得る。
【００５１】
好ましい実施形態において、作用領域が比較的広い非特異的治療剤を提供するため、ＤＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫおよび細胞傷害性Ｔ細胞を活性化する薬剤は、好ましくは、免疫系の食細胞と協同して働く。本発明のペプチドは、ＮＫ細胞および食細胞を含む免疫細胞を同時に刺激し、特に病原体特異的抗体の存在に応答することによって、この目的を達成することができる。したがって、本発明のペプチドを用いた処置は、好ましくは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫系細胞の活性化を誘導し、病原体に対する持続的な内因性防御を提供する。
【００５２】
以下の説明において、また説明する目的において、多くの具体的な詳細は、本発明の様々な態様の完全な理解を提供するために記載している。しかし、当業者には、本発明を曖昧にしないようにするために、構造、組成物および方法は、時には、一般的に示されるか、または議論されていることが理解されよう。多くの場合、材料および操作の説明は、本発明の様々な形態を実施することを可能にするのに十分である。開示された発明が適用され得る多くの様々な代替技術および処置が存在し、本発明の範囲全体は、下記に記載されている実施例に限定されないことに留意されたい。特段の定義のない限り、本明細書で使用されているすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００５３】
本明細書で使用されている用語の「薬学的に許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の監督官庁によって承認されたか、または米国薬局方、もしくは動物、より詳細にはヒトでの使用に関する他の一般に認識されている薬局方に記載されているものを意味する。用語の「担体」とは、活性成分と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。このような医薬担体は、液体、例えば、水、および鉱油、動物、植物または合成起源のものを含む油、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱物油、胡麻油等であり得る。医薬担体は、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプン糊、タルク、ケラチン、コロイドシリカ、尿素等であり得る。さらに、他の賦形剤を使用することができる。
【００５４】
好ましくは、本明細書に記載の方法によって処置される対象は、哺乳動物、例えば、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタであり、より好ましくは、対象はヒトである。
【００５５】
「有効量」または「治療有効量」とは、対象における自然免疫系および適応免疫系をモジュレートし、ならびに／または疾患を処置もしくは予防し、それによって対象における所望の治療効果を得るのに有効な本発明の治療用ペプチドまたは組成物の量の記載を意味する。
【００５６】
典型的な組成物および剤形は、１つまたは複数の賦形剤を含み得る。適切な賦形剤は薬学の当業者には周知であり、適切な賦形剤の非限定的な例は本明細書で提供されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．（１９９０）を参照されたい。
【００５７】
本発明は、治療用ペプチド、必要としている対象に投与するためのそれらの治療用ペプチドの組成物、およびそれらの治療用ペプチドを含有する組成物の投与によって対象の免疫系を刺激する方法を含む。一般に、本発明の利点は、特定のサイトカインのモジュレートされた放出、ならびに、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞および食細胞を含むがこれらに限定されない免疫細胞の刺激により病原体特異的抗体の存在へ応答することである。サイトカインの非限定的な例としては、免疫系の細胞によって分泌され、免疫応答に影響を及ぼし得るインターロイキンおよびインターフェロンなどの免疫調節タンパク質が挙げられる。免疫細胞の刺激の非限定的な例は、Ｆｃ−媒介性食作用の誘導である。さらなる例は、抗体依存性細胞傷害に対するＮＫ細胞の直接活性化である。さらなる例は、ＮＫ細胞およびＣＴＬを活性化し、直接細胞傷害によって感染細胞またはがん細胞を溶解させることである。
【００５８】
アミノ酸に関する一文字表記が本明細書において主として使用される。当業者には周知のとおり、一文字表記は以下のとおりである：Ａはアラニンである；Ｃはシステインである；Ｄはアスパラギン酸である；Ｅはグルタミン酸である；Ｆはフェニルアラニンである；Ｇはグリシンである；Ｈはヒスチジンである；Ｉはイソロイシンである；Ｋはリシンである；Ｌはロイシンである；Ｍはメチオニンである；Ｎはアスパラギンである；Ｐはプロリンである；Ｑはグルタミンである；Ｒはアルギニンである；Ｓはセリンである；Ｔはスレオニンである；Ｖはバリンである；Ｗはトリプトファンである；Ｙはチロシンである。
【００５９】
本治療用ペプチドは、好ましくは、５から８個のアミノ酸である。好ましい治療用ペプチドは、
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、ＰおよびＱからなる群から選択され；
Ｘ３は、ＳおよびＨからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｈ、ＴおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、Ｒ、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）
からなる群から選択される。
【００６０】
最も好ましい実施形態において、治療用ペプチドは、ＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）、ＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）およびＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）からなる群から選択される。
【００６１】
治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドが好ましい。一実施形態において、多価構造化ポリペプチドは、構築物および少なくとも２つのアームを含み、構築物は中央骨格を有し、各アームは、リンカーを介して中央骨格に連結されている治療用ペプチド配列を含み、各治療用配列は、好ましくは同一である。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「構築物」は、分子全体として定義され、少なくとも２つのアームと連結されている中央骨格を含む。好ましい実施形態において、構築物は、２つ以上のアーム、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のアーム、好ましくは２から８のアームに連結されている中央骨格を含む。さらに好ましい実施形態において、構築物は、４つのアームに連結されている中央骨格を含む。構築物内の各アームは、同一のまたは異なる治療用配列および／またはリンカーからなっていてもよい。好ましい一実施形態において、治療用配列は、アーム間で同一である。
【００６３】
「中央骨格」は、アームを結合するための構造を提供する。中央骨格は、末端官能基を有する分子分岐に結合されている少なくとも２つの官能基を有する、コア分子、例えば、ペプチドアームが付加されているトリリシンをベースとしている。このような分子は、コア分子から分岐されたモノマーの数に応じて、様々な数の分岐を提示するように開発または作製することができる。各分岐上の各末端官能基は、アームへの結合手段を提供する。好ましい中央骨格の非限定的な例としては、エチレンジアミン（１，２−エタンジアミン）、エチレングリコール（１，２−ジヒドロキシエタン）、ポリオール、例えばグリセロール、３，５−ジアミノ安息香酸、１，３，５−トリアミノベンゼン、および中間長のモノカルボン−ジアミノ化合物が挙げられる。好ましくは、モノカルボン−ジアミノ化合物は、２から１０個の範囲の炭素長である。このような化合物の非限定的な例は、２，３−ジアミノプロピオン酸および２，６−ジアミノカプロン酸である。より好ましい実施形態において、モノカルボン−ジアミノ化合物は、６個の炭素長である。光を吸収する芳香族中央骨格を提供する化合物は、同様にペプチド濃度を決定するのに有効であり得る。モノカルボン−ジアミノ化合物のカルボキシル基は、ビオチン誘導体を含むＣ末端タグを付加することができる。好ましい実施形態において、中央骨格は、トリリシンコア（中央分子としてのリシン残基が、２つのリシン残基に、それぞれそのカルボキシル基を介して中央リシン残基のアミノ基のうちの１つに結合している）を含み、４つのアームに対する中央骨格を提供する。
【００６４】
「アーム」は、治療用配列とリンカーを含む。「リンカー」は、中央骨格をコア配列に連結するペプチド鎖または他の分子を含む。好ましい実施形態において、リンカーは、限定するものではないが、特定のリンカーペプチド配列、ポリエチレングリコール、６−アミノカプロン酸（６−アミノヘキサン酸）、８−アミノオクタン酸、およびデキストランを含む。最も好ましい実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７）、ＳＳＳＳ（配列番号８）、ＳＳＳＳＳＳＳＳ（配列番号９）、またはそれらの変異体である。リンカーの長さは調整すること可能であり、例えば、リンカーＧＧＧＳ（配列番号６）を繰り返して変更可能な長さ、例えば、２回繰り返し（ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７））、または３回以上さえ提供することができる。また追加のセリン残基をＳＳＳＳ（配列番号８）に付加し、様々な長さのリンカーを得ることもできる。治療用ペプチドは、好ましくは、複合型グリカン上の末端配列５−アセチルノイラミン酸−ガラクトースを機能的に模倣し、末端配列はα（２，３）またはα（２，６）結合している。いくつかの態様において、治療用ペプチドは、複合型グリカン上の末端配列５−アセチルノイラミン酸−ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンを機能的に模倣し、末端配列はα（２，３）またはα（２，６）結合している。治療用ペプチドは、有利には、受容体ＮＫＧ２Ｄおよび／またはシアル酸結合免疫グロブリン様レクチンに結合し、Ｂ細胞、ＤＣ、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞および／または食細胞上の受容体に結合することによって、免疫系のモジュレーターとして機能するように構成される。
【００６５】
治療用ペプチドは、好ましくは、対象のＮＫ細胞の活性化を誘導するのに十分な量で投与され、対象はヒトである。一実施形態において、治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、対象において抗体媒介性細胞傷害を誘導するのに十分な量で、好ましくは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＴＮＦ−β、ＩＦＮ−γおよびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるリンパ球由来の少なくとも１つの内因性サイトカインの発現を増加させ、ならびに／またはＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−αからなる群から選択される少なくとも１つの内因性サイトカインを減少させるのに十分な量で投与される。
【００６６】
本方法は、有利には、抗体媒介性細胞傷害を増強するのに十分な量で混合される抗体調製物を投与することをさらに含むことができる。
対象の血液中のＢ細胞、ＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞などの免疫細胞のレベルを決定することは、当技術分野で公知の方法、例えば、細胞特異的表面マーカーに対する抗体を使用する末梢血単核細胞のフローサイトメトリー分析を使用して行われる。対象の血液中の単球と比較したＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の比をさらに確立することは有利である。好ましい実施形態において、ＮＫ細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞と単球の比は３：１であり、より好ましくは４：１である。本発明は、単球に対するＮＫ細胞および／またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の比が高いと最も効果的である。
【００６７】
本発明は、免疫応答を刺激し、特定のサイトカインの放出をモジュレートする一連のペプチドを同定する。したがって、第１の態様において、本発明は、９から１２個のアミノ酸長（スペーサー配列を含む）からなる治療用ペプチドを提供する。好ましい実施形態において、治療用ペプチドは、実質的に精製された形態である。本明細書で使用する場合、用語の「実質的に精製された」とは、その合成された状態において確認した場合に、通常それに伴う成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を意味する。材料を合成する場合、材料は、細胞物質、ゲル物質、培地、化学的前駆体、混入ポリペプチド、核酸、エンドトキシン、および他の有機化学物質を実質的にまたは本質的に含まない。好ましくは、ペプチドは、存在するすべての有機分子種の９０％超（ペプチド含量）を示すように精製される。より好ましくは、ペプチドは９５％超（ペプチド含量）に精製され、最も好ましくは、ペプチドは本質的に同質になるまで精製され、他の有機分子種は従来の技術によって検出されない。有利には、治療用ペプチドを無水酢酸と反応させ、治療用ペプチドのＮ末端をアセチル化する。アセチル化はペプチドをＮ末端分解から保護するため、好ましい。
【００６８】
本発明の科学的根拠
ペプチド配列は、植物レクチンの糖結合部位へのドッキングのコンピュータ支援分子モデリングによって同定され、これらは受容体類似体としての機能を果たした。Ｓｕｓａｖｉｏｎのペプチドの設計の基礎となる概念には、いくつかの要素があった。免疫系細胞上の多くの受容体が炭水化物リガンドに結合するという見解から［２０、２１］、本発明者らは、これらのグリカンリガンドのペプチドの模倣体を開発することに着目した。５から８個のアミノ酸長のペプチドは、レクチンおよび受容体のグリカン結合部位を満たし、免疫系の抗原提示プロセスにとっては不可視なほどに十分短い。最終ペプチドの重要な態様は、細胞内のシグナル伝達経路の開始に重要な事象である、受容体の架橋結合が可能な多価構造である［３０、３１］。ペプチドの最も有効なアミノ酸配列を決定するため、細胞表面受容体の類似体として選択された、十分に特性決定された植物レクチンのグリカン結合部位への単一（一価）配列のドッキングの分子モデリングを実施した。レクチンの結晶構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からダウンロードした。モデリングには、ＡｒｇｕｓＬａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｍａｒｋ  Ａ．  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｐｌａｎａｒｉａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＬＬＣ、シアトル、ワシントン州）を使用した。レクチンまたは受容体の結合部位を含むアミノ酸残基は、各タンパク質を開示している文献から選択した。この手法によって、固有のペプチド配列を予測した結合エネルギーにより評価した。これらのコンピュータ内での実験からは、いくつかのペプチドがさらなる特性決定を促進する十分な高親和性で様々なレクチンに結合することが予測された。
【００６９】
ＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）と明示したペプチドとレクチン型受容体シグレック−５（受託番号２ＺＧ１）のグリカン結合部位との相互作用に関するモデルを図１に示す。シグレック受容体のファミリーは、末端シアル酸（５−アセチルノイラミン酸、Ｎｅｕ５Ａｃとも呼ばれる）を含有するリガンドに特異的である。シグレック−５は、末端Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，８）Ｎｅｕ５Ａｃおよび／またはＮｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌ結合を含有するグリカンに高特異的に結合する。−４７ｋＪ／ｍｏｌのΔＧ’という予測値は、一価ペプチドに関する１×１０−８ＭのＫＤに相当する。これらの糖に結合する細胞表面受容体は、シグレックとＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞上の重要な活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄとのファミリーを含む。ＮＫＧ２Ｄはｉｎ  ｖｉｖｏで様々なペプチド／タンパク質リガンドを有するが［１７、２９］、この受容体のＣ型レクチンドメインは、それがグリカンにも結合し得ることを示唆した。ＮＫＧ２ＤがＮｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌに対する特異性を有するグリカンに結合することをＩｍａｉｚｕｍｉら［１８］が実証した際に、この仮説は肯定された。ＮＫＧ２Ｄ（受託番号１ＭＰＵ）のリガンド結合部位は、Ｌｉら［３２］およびＭｃＦａｒｌａｎｄら［３３］によって示されたデータから構築された。モデリングによって、約１×１０−７ＭのＫＤに相当する−４０ｋＪ／ｍｏｌのΔＧ’で、ＮＫＧ２Ｄに対する非常に好ましい結合エネルギーが予測された（図２）。
【００７０】
レクチン型受容体アシアロ糖タンパク質受容体−１（ＡＳＧＰＲ−１）（受託番号１ＤＶ８）のグリカン結合部位を有するＳＶ６Ｄ（配列番号５）と命名したペプチドの相互作用のモデルを図３に示す。ＡＳＧＰＲ−１はＣＬＥＣ１０ａの相同体であり、ガラクトースよりもＮ−アセチルガラクトサミンを結合する強い傾向がある［３４］。−４０ｋＪ／ｍｏｌのΔＧ’という予測値は、一価ペプチドに関する１×１０−７ＭのＫＤに相当する。
【００７１】
次いで、短鎖ペプチド配列を多価構造に組み込んだ（図４）。この設計は、リガンド密度およびエントロピー因子の関数としての結合活性の概念に基づいていた。多価性に関する理論的基礎は、Ｍａｍｍｅｎら［３５］、Ｄｉｍｉｃｋら［３６］およびＣａｉｒｏら［３７］によって提供された。多価性は、分子モデリングによって予測されるものよりもはるかに好ましい結合エネルギーを提供するはずである。一価ペプチドは活性であるはずであるが、リガンドの多価性は高い結合活性相互作用を提供し、多くの場合、細胞応答の活性化に必要とされる受容体の架橋結合を促進する［３０、３１］。図５は、活性配列ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）を有する最終的な四価構造を示す。図６は、活性配列ＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）を有する最終的な四価構造を示す。
【００７２】
ペプチドのレクチンへの直接結合
ＭＡＡおよびＳＮＡ１などのレクチンへのＳＶＨ１Ｃの結合［１９］は、ペプチドが複合型グリカンの末端上のＮｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ配列を模倣することを示唆している。この配列は、ＮＫ細胞およびδγＴ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞上の受容体ＮＫＧ２Ｄに対するリガンドである［１８］。また、１４種のレクチン型受容体のファミリー、シグレック（シアル酸結合Ｉｇ様レクチン）は、Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ−配列に結合する（文献１３において概説されている）。シグレックは、細胞間相互作用を促進し、グリカン認識を介して自然免疫系および適応免疫系における細胞の機能を制御すると考えられる。これらの受容体は、分子モデリングによって予測されるように、ペプチドの可能性のある標的である（図１〜３）。ＮＫＧ２ＤはＮｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ結合に特異的であるが、シグレックファミリーのメンバーは、α（２，３）結合またはα（２，６）結合に対して特異性を示す。したがって、ペプチドは、これらの受容体の全部に結合する適応性を有する。
【００７３】
ＳＶＨ１ＣのＮＫＧ２Ｄおよびシグレックへの結合
Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）Ｇａｌ構造は受容体のＣ型レクチンドメインに結合するが（１８）、ＮＫＧ２Ｄがｉｎ  ｖｉｖｏでグリカン受容体として機能することは知られていない。一方、シグレックは、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２，３）ＧａｌまたはＮｅｕ５Ａｃ（α２，６）Ｇａｌに結合する受容体として特性決定されている［１３−１５］。これらの受容体は、リガンドと結合した場合に、阻害または活性化のいずれかとして機能する。シグレック−１はマクロファージ上で発現され、細胞接着に関与するだけでなくエンドサイトーシスも増強する［１３］。したがって、それはウイルスのエンベロープ上のグリカンに結合することによって、ＨＩＶ−１によるこれらの細胞の感染を増強する［３８−３９］。他のシグレックの発現は、免疫系の他の細胞上に分布している［１３−１５］。
【００７４】
ＳＶＨ１Ｃのシグレックへの直接結合は、プロテインＡ／Ｇでコーティングしたマイクロタイターウェルに組換えキメラシグレックを結合させた固相アッセイによって実証された。キメラシグレックはＮ末端グリカン結合ドメインおよびＣ末端Ｆｃγドメインを含有しており、プロテインＡに強固に結合した。次いで、ビオチン化ペプチドをシグレックと共にインキュベートし、ウェルを慎重に洗浄し、ペルオキシダーゼとコンジュゲートさせたストレプトアビジンの結合によって結合ペプチドを検出した。図７は、いくつかのシグレックおよび追加のレクチン型受容体を使用したこのアッセイの結果を示す。ＳＶＨ１Ｃは、いくつかのシグレックに強固に結合したが、ＣＬＥＣ９ａ、ＣＬＥＣ１０ａまたはＤＣ−ＳＩＧＮには結合しなかった。ＳＶＨ１Ｃの結合はシアリル化タンパク質、フェツインによって阻害され、これにより、ＳＶＨ１Ｃがシグレックのグリカン結合部位で結合する可能性が高いことが示された。他の実験においては、ビオチン化ＳＶＨ１Ｃおよびストレプトアビジン−アガロースを使用しＰＢＭＣから探索したタンパク質のプロテオミクス解析によって、ペプチドに結合したタンパク質複合体のうち、骨髄性細胞上で確認された活性化受容体のシグレック−１５が同定された（４０）。シグレック−１５を発現する骨髄性細胞の中には、マクロファージおよび樹状細胞がある［１３］。
【００７５】
また固相アッセイを使用し、ＳＶＨ１ＣのＮＫＧ２Ｄへの結合を決定した（図８）。Ｆｃ−キメラＮＫＧ２Ｄは、Ｆｃドメインに強固に結合する、プロテインＡ／Ｇでコーティングしたマイクロタイターウェルに結合させた。ビオチン化ｓｖＨ１Ｃの結合は、ストレプトアビジンにコンジュゲートさせたペルオキシダーゼの活性によって測定した。強固な結合が観察され、ＫＤは約１μＭであった。図８に示したように、ペプチドのフェツインおよびトリサッカライドシアリルラクトースへの結合は阻害され、ペプチドが受容体上のグリカン結合部位に結合したことが示された。糖タンパク質フェツインは、受容体のグリカン結合部位におけるペプチドの結合を確認する効果的なプローブである。フェツインの各分子は、３つのＮ結合型グリカンおよび３つのＯ結合型グリカン上で、ほぼ等しくα（２，３）結合およびα（２，６）結合を有し、主にＮｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌとして終止する、合わせて１２から１５個のオリゴサッカライドを含有する［４１、４２］。
【００７６】
シグレック受容体のうち、大部分は抑制性受容体であり、それらの細胞質ドメイン内にＩＴＩＭ（免疫受容体チロシン型抑制性モチーフ）を含有するが、いくつかは、特にシグレック−１４、シグレック−１５およびシグレック−１６は、細胞質活性化アダプタータンパク質ＤＡＰ１２と共に機能する［１３、４０］。またＮＫＧ２Ｄは活性化受容体であり、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシン型活性化モチーフ）を含有する、細胞質のアダプタータンパク質ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２と関連して機能する［１７、２９］。これらの受容体の機能は、制御モチーフ内のチロシン残基のリン酸化によって制御される。図９に示したように、５分間１００ｎＭのＳＶＨ１Ｃでヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を処置すると、いくつかの受容体のリン酸化状態に著しい変化が生じた。リン酸化抑制性受容体は、一般に、他の受容体を不活性化するホスファターゼのＳＨＰ−１を補給することにより機能する［１３−１５］。したがって、これらの受容体の脱リン酸化はそれらの活性を弱化する。
【００７７】
免疫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖
抑制性受容体の活性の低下がｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫細胞の増殖の刺激によって反映されるかどうかを決定するため、ＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）を１日おきに１ナノモル／グラム体重の用量で皮下注射し、腹膜腔中の免疫細胞の群をフローサイトメトリーによって測定した。注射剤を０日目、２日目および４日目に投与し、腹腔洗浄を実施して免疫細胞を得た。各時点での３匹の動物由来の細胞をプールし、フローサイトメトリーによって分析した。図１０に示したように、ほとんどの細胞型は処置期間にわたって増殖した。特に、ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋）、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにＢ細胞（ＣＤ１９＋）群は、活性化マーカーＣＤ６９＋を発現したものを含め、数倍に増加した。特に、ＣＤ７３、ＣＤ８０およびＣＤ２７３を発現するメモリーＢ細胞は、有意に増加した。免疫細胞の数は、ＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）の投与により、処置前の免疫細胞の数と比べ、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、または少なくとも５倍増加した。
【００７８】
ウイルス複製の複製を阻害するＳＶＨ１Ｃ活性の試験において、実験は、ＨＩＶ−１が低力価で添加された培養物にＳＶ６Ｂ（配列番号２）およびＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）を添加したＰＢＭＣを用いて実施した。培養物が高投入量のウイルスで覆われた場合、中和のパーセントは低下することが確認された。したがって、その後の実験においては、ウイルスの投入はＴＣＩＤ５０を約３０に減らした。ペプチドを抗血清非含有の培養物に添加するアッセイを実施した。図１１に示した結果において、ペプチド単独ではウイルス複製を８０％から９０％阻害した。この実験におけるＩＣ５０値は、ＳＶＨ１Ｃについては２ｐＭであり、ＳＶ６Ｂについては約３００ｐＭであった。抗体がこの実験においては存在しなかったことから、抗体媒介性食作用は、中和には有意には寄与しなかった。ＰＢＭＣのフローサイトメトリー分析は、これらの培養物中のＮＫ／単球の比が比較的高いことを示した。
【００７９】
サイトカイン放出の誘導
ペプチドによる細胞の活性化がサイトカイン放出の誘導によって検出することができるかどうかを決定するため、培養した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を本発明の一実施形態のペプチドで処置し、４時間インキュベートした後、培地を回収し、異なる４０のサイトカインの量における変化をアッセイした。コア配列ＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）またはＮＳＰＨＰＬＳＧ（配列番号３）の４つのコピーを含有する治療用ペプチド構築物を、各アッセイにおいて１００ｎＭの濃度で添加した。凍結ヒトＰＢＭＣの約３００万個の細胞を３７℃で解凍し、５０ｍＬコニカルチューブに移し、そこに洗浄培地８ｍＬをゆっくりと添加した。次いで、追加の洗浄培地８ｍＬを添加し、撹拌して混合した。次いで、細胞を１０分間３３０ｇで遠心分離し、上清を除去し、ペレットを１０ｍＬ洗浄培地に再懸濁し、上記のように遠心分離を行った。次いで、洗浄した細胞を、１０％ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ−１６４０培地中で１ｍＬ当たり約６００万個の細胞になるよう再懸濁し、懸濁液１００ｍＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに加え、給湿５％のＣＯ２中、３７℃で一晩インキュベートした。２４時間後、培地を、１０％ＦＢＳ含有の新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地２００μＬと置き換え、２日間給湿５％のＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。次いで、ペプチドアリコートを１００ｎＭの最終濃度で試料に二連で添加し、４時間給湿５％のＣＯ２中、３７℃でインキュベートした。次いで、培地を取り出し、−８０℃で保存した。試料をサイトカインの産生について分析した。１セットの対照細胞は、実験薬剤で処置しなかった。第２セットの対照細胞は、様々な炎症性サイトカインの産生の誘導に一般に使用される薬剤のリポ多糖類で処置した。炎症に関する陽性対照は、制御されていない炎症反応をペプチドが生じていないことを確認するのに不可欠であった。
【００８０】
培地は、サイトカインレベルのアッセイのためにＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、Ｇａ．）によって開発された方法で除去した。この技術において、サイトカインに対する抗体の膜アレイは、培地の試料と共にインキュベートする。洗浄後、アレイは、ビオチンで標識したすべての抗体のカクテルとインキュベートした。次いで、膜を洗浄して未結合の抗体を除去し、ビオチンに結合する蛍光色素で標識したストレプトアビジンとインキュベートした。最終洗浄後、膜アレイを蛍光検出器で読み取った。
【００８１】
ペプチドは、いくつかの重要なサイトカインの放出を刺激した。特に、サイトカインのＩＬ−２１は、ナチュラルキラー細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球の増殖および分化に必要とされるＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生された。本発明のペプチドを用いた処置に応答してＴ細胞の一般的な群によって放出されるさらなるサイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−β、およびＲＡＮＴＥＳであった。重要なことには、炎症性サイトカインＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＴＮＦ−αの放出は誘導されなかった。他の重要なサイトカイン、特にエオタキシン−２、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３の放出は減少した（表１）。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
本明細書に記載のペプチドへの応答におけるＰＢＭＣから放出されるサイトカイン、特にＴ細胞の混合物は、単独で、または他の処置との組合せのいずれかで、免疫系の効果的な調節を提供するはずである。本発明のペプチドを用いる処置は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫系細胞の活性化を誘導し、外因的に投与された場合にこれらのタンパク質が急速に消失するのとは対照的に、有益なサイトカインの持続的な内因的亢進を提供するはずである。これらのサイトカイン応答は、おそらく、疾患との闘いに関与する免疫細胞の直接的活性化に追加される。
【００８４】
本明細書に記載の実施形態および実施例は、本発明およびその実際的な適用について最も良く説明し、それによって当業者が本発明を作製および使用できるようにするために提示された。しかし、当業者には、前述の説明および実施例は、説明および例示のためにのみ提示されたことが理解されよう。記載された説明は、完全であること、または本発明を開示した正確な形態に限定することを意図するものではない。多くの変更および変形が、下記の請求項の趣旨および範囲から逸脱することなく、上記の教示を参照することにより可能である。本明細書の実施例は、本発明のペプチドの治療効力を開示するが、ＨＩＶウイルスの中和複製に関して、例えば、ペプチドは、多種多様な感染または障害を、このような疾患を予防するための予防的処置を含めて処置するのに有用であり、また健全な対象の健康を増進または安定させるために有用であるはずである。
【００８５】
類似の実験を実施したところ、ＳＶ６Ｄ（配列番号５）はレクチン型受容体にも結合するが、ＳＶＨ１Ｃ（配列番号３）に比べて異なるセットに結合することを示した。Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはガラクトースに特異的な受容体へのＳＶ６Ｄの直接結合は、ポリ−ヒスチジンタグを含有する組換え受容体がニッケルコーティングしたマイクロタイターウェルに結合された固相アッセイによって実証された。次いで、ビオチン化ペプチドを受容体とインキュベートし、ウェルを慎重に洗浄し、結合ペプチドを、ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジンの結合によって検出した。図１２は、いくつかのレクチン型受容体を用いたこのアッセイの結果を示す。ＳＶ６Ｄは、ＣＬＥＣ１０ａ、ランゲリン、ＡＳＧＰＲ−１およびデクチン−１には強く結合したが、ＣＬＥＣ９ａ、ＤＣ−ＳＩＧＮまたはシグレック−１には強く結合しなかった。
【００８６】
ＳＶ６Ｄの細胞表面受容体への結合が細胞の細胞質にシグナルを伝達するか否かを決定するため、ＰＢＭＣの培養物を１００ｎＭのＳＶ６Ｄとインキュベートし、試料を５分、１０分または１５分後に取り出し、未処置細胞におけるシグナル伝達キナーゼ中間体のリン酸化状態と比較した。図１３Ａおよび図１３Ｂに示したように、いくつかの中間体のリン酸化形態は、急速かつ劇的に変化した。特に、タンパク質ｐ５３、ＣＲＥＢおよびＰＲＡＳ４０のリン酸化形態は、１０分で顕著に減少したが、１５分で回復した。これらの急速な変化は、ホスホロ−タンパク質の再形成を示し得る。
【００８７】
他の実験において、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫細胞の増殖を刺激するＳＶ６Ｄ（配列番号５）の活性を決定した。ＳＶ６Ｄを１日おきに１ナノモル／グラム体重の用量で皮下注射し、腹膜腔中の免疫細胞の群をフローサイトメトリーによって測定した。注射剤を０日目、２日目および４日目に投与し、腹腔洗浄を実施して免疫細胞を得た。各時点での３匹の動物由来の細胞をプールし、フローサイトメトリーによって分析した。図１４に示したように、ほとんどの細胞型は処置の期間にわたり増殖した。特に、ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋）、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋）、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにＢ細胞（ＣＤ１９＋）群は、活性化マーカーＣＤ６９＋を発現したものを含め、数倍に増加した。
【００８８】
女性におけるがんの処置で特に困難であるのは、卵巣がんである。卵巣がんの後期症状は、腹腔内の腹水蓄積である。卵巣がんのマウスモデルにおいて、がん細胞株を腹腔内に移植した。細胞は腫瘍を形成し、そのうち、さらに、悪性細胞を空洞に放出する。卵巣がんを処置するＳＶ６Ｄの活性を、１グラム当たり１ナノモルおよび０．１ナノモルのＳＶ６Ｄを隔日で注射することによって試験した。腹水の発生は、動物の体重の増加によってモニタリングした。腹水蓄積は処置の開始時には明らかであり、図１５に示した体重は処置後２週間である。０．１ｎｍｏｌｅ／ｇ用量の有効性は、現在使用されている化学療法薬の医薬品パクリタキセルの有効性に類似していた。
【００８９】
これらの実験からは、ＳＶＨ１ＣおよびＳＶ６Ｄがｉｎ  ｖｉｔｒｏで受容体に結合する際に非常に異なる活性を発現するが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腹膜免疫細胞の増殖および活性化の刺激において非常に類似した効果を有することが示された。ＳＶＨ１Ｃは強い抗ウイルス活性を有し（図１１）、ＳＶ６Ｄは腫瘍細胞の増殖を阻害する可能性が高いことを示す（図１５）。したがって、これらのペプチドは、免疫系活性の増強に対して異なる角度からアプローチし、これらのペプチドの組合せは潜在的に有効な治療の実施形態となる。他の実施形態において、ＳＶ６Ｄは、抗ウイルス活性を主体とする他の治療用ペプチドと組み合わせて、例えば、アミノ酸配列ＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）、ＨＰＳＬＧ（配列番号１０）、ＨＰＳＬＬ（配列番号１１）、ＨＰＳＬＡ（配列番号１２）を有するペプチドセットと組み合わせて使用することができる。
【００９０】
ペプチドの毒性
ヒトＰＢＭＣをペプチドと３日インキュベートし、次いで、可溶性テトラゾリウムベースの色素ＭＴＳでアッセイプレートを染色し、細胞の生存率を決定した。代謝的に活性な細胞のミトコンドリアの酵素はＭＴＳを代謝し、有色のホルマザン生成物を形成する。３７℃で４〜６時間インキュベートした後、プレートを分光測光法で読み取った。ペプチドＳＶＨ１Ｃ単独で処置した細胞、または希釈した抗ＨＩＶ抗血清で処置した細胞は、１ｎＭ〜１μＭのペプチド濃度で１００±２％生存可能であった。細胞傷害性を決定する別のアッセイにおいては、細胞をアクリジンオレンジおよびエチジウムブロマイドを用いて二重染色した。このアッセイにおいて、生細胞は緑色蛍光を発するが、死滅細胞は赤色蛍光を発する。ＳＶＨ１Ｃは、１ｎＭの有効生理活性濃度よりも１０６倍高い濃度である１ｍＭ濃度では、細胞傷害性を示さなかった［４３］。
【００９１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのペプチドの毒性は、ペプチドを動物に注射することによって試験した。ラットに対する予備試験において、予想される治療用量よりも１０００倍高い濃度を提供するペプチドの静脈内注射を行ったところ、動物による認容性が十分に認められ、ペプチドの有害作用は観察されなかった。ペプチドは、限定するものではないが、注射（静脈内、皮下、筋肉内もしくは腹腔内）、局所（経粘膜、頬側経由、舌下もしくは経皮）、および／または経口（液体、錠剤もしくはカプセル）を含む、いくつかの経路で投与することができる。
【００９２】
結論
本明細書で示したデータは、ペプチドＳＶＨ１Ｃ（ＮＰＳＨＰＬＳＧ、配列番号３）が、末端Ｎｅｕ５Ａｃ−Ｇａｌ配列を有するグリカンを機能的に模倣することを実証している。ＮＫＧ２Ｄおよびシグレックなどの受容体は、これらのグリカンに結合する。シグレック−１は単球およびマクロファージ上で発現し、細胞接着に関与するだけでなく、ウイルスのエンドサイトーシスを増強する［３８、３９］。したがって、これらのペプチドは、これらの受容体のリガンドとして作用することにより、細胞活性のモジュレーターとして機能するはずである。
【００９３】
同様に、本明細書に示したデータは、ペプチドＳＶ６Ｄ（ＮＱＨＴＰＲ、配列番号５）が末端Ｎ−アセチルガラクトサミン残基またはガラクトース残基を有するグリカンを機能的に模倣することを実証している。ＣＬＥＣ１０ａおよびＡＳＧＰＲ−１などの受容体は、これらのグリカンに結合する。ＣＬＥＣ１０ａは、未熟樹状細胞およびマクロファージ上で発現し、エンドサイトーシスを増強する［２２、２４］。したがって、これらのペプチドは、これらの受容体のリガンドとして作用することにより、細胞活性のモジュレーターとして機能するはずである。
【００９４】
特に断りのない限り、本明細書のすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載したものと類似している、または同等である任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料は本明細書に記載されている。引用したすべての刊行物、特許および特許公報は、あらゆる目的に対し参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００９５】
本明細書で論じた刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書のいかなるものも、本発明が先行発明のためにこのような刊行物に先行する権利を有さないということを容認するものとして解釈されるものではない。
【００９６】
開示した発明は、これらが変更可能であると記載した特定の方法、プロトコルおよび物質に限定されないものと理解されたい。また、本明細書で使用した技術用語は、単に特定の実施形態を記載するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものでないと理解されたい。
【００９７】
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されるものとする。
【００９８】
参考文献
【００９９】
【表２−１】
0006740250.tif 000003
【０１００】
【表２−２】
0006740250.tif 000004
【０１０１】
【表２−３】
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【０１０２】
【表２−４】
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発明の態様
［態様１］免疫低下状態の対象を処置する方法であって、治療用ペプチドまたは治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドを、免疫低下状態の対象に投与することを含み、治療用ペプチドは、５から８個のアミノ酸からなり、かつ
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、ＰおよびＱからなる群から選択され；
Ｘ３は、ＳおよびＨからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｈ、ＴおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、Ｒ、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）
からなる群から選択され、
治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、対象における免疫細胞の増殖を増加させるのに十分な量である、方法。
［態様２］がんおよび／またはウイルス感染に罹患している対象を処置する方法であって、治療用ペプチドまたは治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドをがんおよび／またはウイルス感染に罹患している対象に投与することを含み、治療用ペプチドは５から８個のアミノ酸からなり、かつ
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、ＰおよびＱからなる群から選択され；
Ｘ３は、ＳおよびＨからなる群から選択され；
Ｘ４は、Ｈ、ＴおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、Ｒ、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）
からなる群から選択され、
治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは、対象における免疫細胞の増殖を増加させることによってがんおよび／またはウイルスを処置するのに十分な量である、方法。
［態様３］治療用ペプチドが、ＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）、ＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）およびＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）からなる群から選択される、態様１または２に記載の方法。
［態様４］対象ががんに罹患している、態様２に記載の方法。
［態様５］がんに罹患している対象を処置する方法であって、治療用ペプチドまたは治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドをがんに罹患している対象に投与することを含み、治療用ペプチドはＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）であり、治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは対象におけるがんを処置するのに十分な量である、方法。
［態様６］多価構造化ポリペプチドが対象に投与され、分岐状である、態様１から５のいずれかに記載の方法。
［態様７］対象が持続性ウイルス感染に罹患している、態様１から４または６に記載の方法。
［態様８］持続性ウイルス感染がＨＩＶ／エイズ感染、ＣＭＶ感染、ＨＢＶ感染、およびＨＣＶ感染からなる群から選択される、態様７に記載の方法。
［態様９］対象がＨＢＶ感染に罹患している、態様１から４または６に記載の方法。
［態様１０］治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドが、マクロファージ；樹状細胞；ナチュラルキラー細胞；ナチュラルキラーＴ細胞；ＣＤ３＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞；Ｂ細胞；ならびにそれらの組合せからなる群から選択される免疫細胞の増殖を刺激する、態様１から９のいずれかに記載の方法。
［態様１１］（ａ）組成物を投与する前の対象における免疫細胞のレベル；および（ｂ）組成物を投与した後の対象における免疫細胞のレベル、を決定することをさらに含む、態様１から１０のいずれかに記載の方法。
［態様１２］（ａ）および（ｂ）がフローサイトメトリーにより決定される、態様１１に記載の方法。
［態様１３］（ａ）に対する（ｂ）の比が少なくとも１．５である、態様１１または１２に記載の方法。
［態様１４］治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドが、抑制性シグレック受容体に結合することによって免疫細胞を活性化する、態様１から１３のいずれかに記載の方法。
［態様１５］治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドが、ＮＫＧ２ＤおよびＣＬＥＣ１０ａからなる群から選択される少なくとも１つの活性化受容体に結合することによって免疫細胞を活性化する、態様１から１４のいずれかに記載の方法。
［態様１６］第２の治療用ペプチドまたは第２の治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドを対象に投与することをさらに含む、態様１から１５のいずれかに記載の方法。
［態様１７］第２の治療用ペプチドが５から８個のアミノ酸からなり、かつ
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）；および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、Ｐであり；
Ｘ３は、Ｓであり；
Ｘ４は、ＨおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）
からなる群から選択される、態様１６に記載の方法。
［態様１８］第２の治療用ペプチドがＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）およびＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）からなる群から選択される、態様１６または１７に記載の方法。
［態様１９］第２の治療用ペプチドを含む多価構造化ポリペプチドが対象に投与され、多価構造化ポリペプチドが分岐状である、態様１６から１８のいずれかに記載の方法。
［態様２０］第２の治療用ペプチドが、複合型グリカン上の末端配列５−アセチルノイラミン酸−ガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンを機能的に模倣し、末端配列が、α（２，３）もしくはα（２，６）結合しているか、またはＮ−アセチルガラクトサミンもしくはガラクトースなどの末端糖に結合している、態様１６から１９のいずれかに記載の方法。
［態様２１］治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドが担体を含む組成物中に存在する、態様１から２０のいずれかに記載の方法。
［態様２２］組成物が、抗炎症剤、細胞傷害性Ｔ細胞増殖剤またはＮＫ細胞増殖剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤；および本発明の治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドをさらに含む、態様２１に記載の方法。
［態様２３］組成物が、対象において抗体媒介性細胞傷害を増強するのに十分な量で混合される抗体調製物；または対象における受動免疫防御を増強するのに十分な量でそれらと共に混合される免疫グロブリンをさらに含む、態様２１または２２に記載の方法。
［態様２４］担体、治療用ペプチドまたは治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチド（ここで、治療用ペプチドはＮＱＨＴＰＲ（配列番号５）であり、治療用ペプチドまたは多価構造化ポリペプチドは対象におけるがんを処置するのに十分な量である）、ならびにＢ細胞増殖剤、細胞傷害性Ｔ細胞増殖剤またはＮＫ細胞増殖剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む、治療用組成物。
［態様２５］対象における抗体媒介性細胞傷害を増強するのに十分な量で混合される抗体調製物をさらに含むか、または受動免疫防御を増強するのに十分な量でポリペプチド組成物と混合される免疫グロブリンをさらに含む、態様２４に記載の治療用組成物。
［態様２６］第２の治療用ペプチドまたは第２の治療用ペプチドの複数コピーを含む多価構造化ポリペプチドをさらに含む、態様２４または２５に記載の治療用組成物。
［態様２７］第２の治療用ペプチドが５から８個のアミノ酸からなり、かつ
ＶＧＧＧＳ（配列番号１）；および
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８
（式中、
Ｘ１は、ＨおよびＮからなる群から選択され；
Ｘ２は、Ｐであり；
Ｘ３は、Ｓであり；
Ｘ４は、ＨおよびＬからなる群から選択され；
Ｘ５は、ＰおよびＫからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ６は、ＬおよびＳからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ７は、ＳおよびＬからなる群から選択されるか、または存在せず；
Ｘ８は、Ｇであるか、または存在しない）
からなる群から選択される、態様２６に記載の組成物。
［態様２８］第２の治療用ペプチドがＶＧＧＧＳ（配列番号１）、ＨＰＳＬＫ（配列番号２）、ＮＰＳＨＰＬＳＧ（配列番号３）およびＮＰＳＨＰＳＬＧ（配列番号４）からなる群から選択される、態様２６または２７に記載の組成物。
［態様２９］第２の治療用ペプチドを含む多価構造化ポリペプチドが対象に投与され、多価構造化ポリペプチドが分岐状である、態様２６から２８のいずれかに記載の組成物。
【図１】
0006740250.tif 000007
【図２】
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【図３】
0006740250.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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