(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）に特異的に結合する単離されたイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該抗体はイヌＩｇＧ重鎖およびイヌκ軽鎖を含有し、前記イヌκ軽鎖が３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ軽鎖１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽鎖２（ＣＤＲＬ２）およびＣＤＲ軽鎖３（ＣＤＲＬ３）を含み、ならびに前記イヌＩｇＧ重鎖が３つの重鎖ＣＤＲ：ＣＤＲ重鎖１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重鎖２（ＣＤＲＨ２）およびＣＤＲ重鎖３（ＣＤＲＨ３）を含み、ここで、
ＣＤＲＬ１が、配列番号：２０のアミノ酸配列を含有し、ＣＤＲＬ２が、配列番号：２２のアミノ酸配列を含有し、ＣＤＲＬ３が、配列番号：２４のアミノ酸配列を含有し、ＣＤＲＨ１が、配列番号：１４のアミノ酸配列を含有し、ＣＤＲＨ２が、配列番号：１６のアミノ酸配列を含有し、およびＣＤＲＨ３が、配列番号：１８のアミノ酸配列を含有しており、
前記抗体およびその抗原結合フラグメントが、イヌＰＤ−１に結合し、およびイヌＰＤ−１のイヌプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）への結合をブロックする、単離されたイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
更に、該抗体が、配列番号：２８および配列番号：３４のアミノ酸配列を含有する、単離されたイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント、および、医薬的に許容される担体または希釈剤を含有する医薬組成物。
【請求項３】
免疫細胞の活性を増大させる方法であって、それを必要とする被験体に、請求項２に記載の医薬組成物の治療有効量を投与することを含み、前記被験体がヒトではない、前記方法。
【請求項４】
前記方法が、
ａ．癌の処置；
ｂ．感染もしくは感染性疾患の処置；または
ｃ．ワクチンアジュバントとしてのために使用される、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１３年１２月２０日出願の米国特許仮出願第６１／９１８，８４７号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、特定の配列を有し、およびイヌＰＤ−１に高い結合親和性を有する、ヒトＰＤ−１に対するイヌ化マウス抗体に関する。本発明はまた、イヌの癌の処置における本発明の抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
主として活性化ＴおよびＢ細胞上で発現される免疫阻害性受容体である、プログラム死受容体１（ＰＤ−１）とも称されるプログラム細胞死受容体１は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に関連する免疫グロブリンスーパーファミリーの成員である。ＰＤ−１および同様のファミリー成員は、そのリガンドに結合する細胞外Ｉｇ可変型（Ｖ型）ドメインおよびシグナル伝達分子に結合する細胞質尾部を含有するＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＤ−１の細胞質尾部は２つのチロシンベースのシグナル伝達モチーフ、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ）およびＩＴＳＭ（免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ）を含有する。
【０００４】
ＰＤ−１は、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）とも称されるプログラム細胞死リガンド１および／またはプログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）とも称されるプログラム細胞死リガンド２に結合した場合、Ｔ細胞応答を減弱させる。これらのリガンドのいずれかのＰＤ−１への結合は抗原受容体シグナル伝達を負に調節する。ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合をブロックすることは、免疫系による腫瘍細胞のクリアランスを助けつつ、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を増強する。マウスＰＤ−１の三次元構造ならびにヒトＰＤ−Ｌ１とマウスＰＤ−１の共結晶構造が報告されている［Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：３３７−３４７（２００４）；Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：３０１１−３０１６（２００８）］。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、公知のシグナル伝達モチーフを有さない短い細胞質領域と共に細胞外領域内にＩｇＶ様ドメインおよびＩｇＣ様ドメインの両方を含むＩ型膜貫通リガンドである。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はどちらも、構成的に発現されるかまたは非造血組織ならびに種々の腫瘍型を含む様々な細胞型において誘導され得る。ＰＤ−Ｌ１はＢ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞および樹状細胞（ＤＣ）上で発現されるだけでなく、末梢細胞、例えば微小血管内皮細胞および非リンパ系器官、例えば心臓または肺でも発現される。これに対し、ＰＤ−Ｌ２はマクロファージおよびＤＣ上でのみ認められる。ＰＤ−１リガンドの発現パターンは、ＰＤ−１が末梢性免疫寛容を維持するうえで役割を果たし、さらに末梢における自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞応答を調節するのに役立ち得ることを示唆する。
【０００６】
いずれの場合も、ＰＤ−１が、おそらく免疫回避を媒介することにより、少なくとも特定のヒト癌において非常に重要な役割を果たすことは今や極めて明らかである。したがって、ＰＤ−Ｌ１は多くのマウスおよびヒト腫瘍で発現されることが示されており、ＰＤ−Ｌ１陰性腫瘍細胞株の大部分ではＩＦＮγによって誘導され得る［Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）；Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）］。さらに、リンパ球に浸潤する腫瘍でのＰＤ−１の発現および／または腫瘍細胞でのＰＤ−Ｌ１の発現は、多数の原発性ヒト腫瘍生検において同定されている。そのような腫瘍組織としては、肺、肝臓、卵巣、子宮頸、皮膚、結腸、神経膠腫、膀胱、乳房、腎臓、食道、胃、口腔扁平上皮細胞、尿路上皮細胞および膵臓の癌ならびに頭頸部の腫瘍が含まれる［Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−１２６６（２００３）；Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００（２００２）；Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７４６２−７４６７（２００３）；Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：３３８１−５（２００６）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：１７５７−１７６１（２００７）；Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７．（２００７）］。より顕著には、腫瘍細胞でのＰＤリガンドの発現は複数の腫瘍型にわたってヒト癌患者の予後不良と相関している［Ｏｋａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｈｏｎｊｏ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：８１３−８２４（２００７）において総説されている］。
【０００７】
さらに、Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．［Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７．（２００７）］は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に対する抗体を投与することを介して、侵襲性膵癌のマウスモデルにおいてＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合をブロックすることの治療効果を明らかにした。これらの抗体は、腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍への浸潤を有効に促進し、ＩＦＮγ、グランザイムＢおよびパーフォリンを含む抗腫瘍エフェクターの上方調節を生じさせた。同様に、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の結合をブロックする抗体の使用は、マウス扁平上皮癌のモデルにおいて腫瘍増殖を有意に阻害した［Ｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．４２：２６８−２７４（２００６）］。
【０００８】
他の研究において、ＰＤ−Ｌ１でのマウス肥満細胞腫株のトランスフェクションは、腫瘍特異的ＣＴＬクローンと共培養した場合、腫瘍細胞の溶解の減少をもたらした。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を添加した場合、溶解が回復した［Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）］。インビボでは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用をブロックすることは、マウス腫瘍モデルにおいて養子Ｔ細胞移入療法の効果を増大させることが示された［Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６５０１−６５０５（２００３）］。癌処置におけるＰＤ−１の役割についてのさらなる証拠は、ＰＤ−１ノックアウトマウスで実施された実験によってもたらされ、この実験では、ＰＤ−Ｌ１を発現する骨髄腫細胞は野生型動物においてのみ増殖し（腫瘍増殖および関連する動物死を生じさせる）、ＰＤ−１欠損マウスでは増殖しなかった［Ｉｗａｉ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）］。ごく最近、ＰＤ−１に対する抗体（ヒトＰＤ−１に対するヒト化マウスモノクローナル抗体を含む）が、ヒトでの癌療法において少なくとも初期の成功を示した［例えば米国特許第８，３５４，５０９号、米国特許第８，００８，４４９号および米国特許第７，５９５，０４８号参照］。
【０００９】
抗ＰＤ−１抗体はまた、慢性ウイルス感染においても有用であり得る。急性ウイルス感染後に生成された記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞は高度に機能性であり、防御免疫の重要な成分を構成する。これに対し、慢性感染はしばしばウイルス特異的Ｔ細胞応答の様々な程度の機能障害（疲弊）を特徴とし、この欠陥が、宿主が残存する病原体を除去できないことの主たる理由である。機能性エフェクターＴ細胞は感染の初期段階で最初に生成されるが、慢性感染の過程でそれらは徐々に機能を喪失する。Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：６８２−６８７（２００６）］は、ＬＣＭＶの研究室株に感染させたマウスが、血液および他の組織中で高レベルのウイルスを生じさせる慢性感染を発症することを示した。これらのマウスは、最初は堅固なＴ細胞応答を発現したが、Ｔ細胞の疲弊後最終的には感染に屈した。Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、慢性感染マウスにおけるエフェクターＴ細胞の数および機能の低下を、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用をブロックする抗体を注射することによって逆転させ得ることを見出した。
【００１０】
本明細書中のいかなる参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願の「先行技術」として使用可能であることの承認と解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第８，３５４，５０９号明細書
【特許文献２】米国特許第８，００８，４４９号明細書
【特許文献３】米国特許第７，５９５，０４８号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：３３７−３４７（２００４）
【非特許文献２】Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５：３０１１−３０１６（２００８）
【非特許文献３】Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）
【非特許文献４】Ｓｔｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）
【非特許文献５】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−１２６６（２００３）
【非特許文献６】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００（２００２）
【非特許文献７】Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：７４６２−７４６７（２００３）
【非特許文献８】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：３３８１−５（２００６）
【非特許文献９】Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：１７５７−１７６１（２００７）
【非特許文献１０】Ｎｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７．（２００７）
【非特許文献１１】Ｏｋａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｈｏｎｊｏ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：８１３−８２４（２００７）
【非特許文献１２】Ｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．４２：２６８−２７４（２００６）
【非特許文献１３】Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３９：６８２−６８７（２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、イヌＰＤ−１に高い結合親和性を有し、ならびにイヌＰＤ−１のイヌＰＤ−Ｌ１への結合をブロックする能力を備えるイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体に関する。本発明はまた、癌などの疾患および／または感染に起因する疾患の処置におけるそのような抗体の使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって、本発明は、イヌＩｇＧ重鎖およびイヌκまたはλ軽鎖を含有する、プログラム死受容体１（ＰＤ−１）に特異的に結合する単離されたイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。この種の特定の実施形態では、イヌκまたはλ軽鎖は、３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ軽鎖１（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ軽鎖２（ＣＤＲＬ２）およびＣＤＲ軽鎖３（ＣＤＲＬ３）を含有し、ならびにイヌＩｇＧ重鎖は、哺乳動物ＰＤ−１抗体から得た３つの重鎖ＣＤＲ：ＣＤＲ重鎖１（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ重鎖２（ＣＤＲＨ２）およびＣＤＲ重鎖３（ＣＤＲＨ３）を含有する。本発明のイヌ化抗体およびそのフラグメントの特定の実施形態は、イヌＰＤ−１に結合するおよび／またはイヌＰＤ−１のイヌプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）への結合をブロックする。
【００１５】
ある実施形態では、イヌ軽鎖はκ鎖である。この種の特定の実施形態では、ＣＤＲＬ１は配列番号：２０のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号：２０の保存的に修飾された変異体を含有する。他の実施形態では、ＣＤＲＬ２は、配列番号：２２を含むアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、ＣＤＲＬ２は、配列番号：２２の保存的に修飾された変異体を含有する。さらに他の実施形態では、ＣＤＲＬ３は配列番号：２４のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、ＣＤＲＬ３は、配列番号：２４の保存的に修飾された変異体を含有する。さらに他の実施形態では、ＣＤＲＨ１は配列番号：１４のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、ＣＤＲＨ１は、配列番号：１４の保存的に修飾された変異体を含有する。さらに他の実施形態では、ＣＤＲＨ２は配列番号：１６のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、ＣＤＲＨ２は、配列番号：１６の保存的に修飾された変異体を含有する。さらに他の実施形態では、ＣＤＲＨ３は配列番号：１８のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、ＣＤＲＨ３は、配列番号：１８の保存的に修飾された変異体を含有する。
【００１６】
具体的な実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号：２０のアミノ酸配列または配列番号：２０の保存的に修飾された変異体を含有し、ＣＤＲＬ２は、配列番号：２２を含むアミノ酸配列または配列番号：２２の保存的に修飾された変異体を含有し、およびＣＤＲＬ３は、配列番号：２４のアミノ酸配列または配列番号：２４の保存的に修飾された変異体を含有する。
【００１７】
他の具体的な実施形態では、ＣＤＲＨ１は、配列番号：１４のアミノ酸配列または配列番号：１４の保存的に修飾された変異体を含有し、ＣＤＲＨ２は、配列番号：１６を含むアミノ酸配列または配列番号：１６の保存的に修飾された変異体を含有し、およびＣＤＲＨ３は、配列番号：１８のアミノ酸配列または配列番号：１８の保存的に修飾された変異体を含有する。
【００１８】
より具体的な実施形態では、ＣＤＲＬ１は、配列番号：２０のアミノ酸配列または配列番号：２０の保存的に修飾された変異体を含有し、ＣＤＲＬ２は、配列番号：２２を含むアミノ酸配列または配列番号：２２の保存的に修飾された変異体を含有し、およびＣＤＲＬ３は、配列番号：２４のアミノ酸配列または配列番号：２４の保存的に修飾された変異体を含有し、ならびにＣＤＲＨ１は、配列番号：１４のアミノ酸配列または配列番号：１４の保存的に修飾された変異体を含有し、ＣＤＲＨ２は、配列番号：１６を含むアミノ酸配列または配列番号：１６の保存的に修飾された変異体を含有し、およびＣＤＲＨ３は、配列番号：１８のアミノ酸配列または配列番号：１８の保存的に修飾された変異体を含有する。
【００１９】
さらにより具体的な実施形態では、ＣＤＲＬ１は配列番号：２０のアミノ酸配列を含有し、ＣＤＲＬ２は配列番号：２２を含むアミノ酸配列を含有し、およびＣＤＲＬ３は配列番号：２４のアミノ酸配列を含有し、ＣＤＲＨ１は配列番号：１４のアミノ酸配列を含有し、ＣＤＲＨ２は配列番号：１６を含むアミノ酸配列を含有し、およびＣＤＲＨ３は配列番号：１８のアミノ酸配列を含有する。
【００２０】
本発明の実施形態に関して、ＩｇＧ重鎖は配列番号：２６のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、ＩｇＧ重鎖は、配列番号：２６の保存的に修飾された変異体を含有する。他の実施形態では、ＩｇＧ重鎖は配列番号：２８のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、ＩｇＧ重鎖は、配列番号：２８の保存的に修飾された変異体を含有する。さらに他の実施形態では、ＩｇＧ重鎖は配列番号：３０のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、ＩｇＧ重鎖は、配列番号：３０の保存的に修飾された変異体を含有する。
【００２１】
ある実施形態では、κ軽鎖は配列番号：３２のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、κ軽鎖は、配列番号：３２の保存的に修飾された変異体を含有する。特定の実施形態では、κ軽鎖は配列番号：３４のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、κ軽鎖は、配列番号：３４の保存的に修飾された変異体を含有する。
【００２２】
より特定の実施形態では、単離されたイヌ化抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列および配列番号：３４のアミノ酸配列を含有する。関連実施形態では、単離されたイヌ化抗体は、配列番号：２８の保存的に修飾された変異体および配列番号：３４の保存的に修飾された変異体を含有する。さらに他の関連実施形態では、単離されたイヌ化抗体は、配列番号：２８のアミノ酸配列および配列番号：３４の保存的に修飾された変異体を含有する。さらに他の関連実施形態では、単離されたイヌ化抗体は、配列番号：２８の保存的に修飾された変異体および配列番号：３４のアミノ酸配列を含有する。
【００２３】
本発明はさらに、本発明のイヌ化抗体の軽鎖のいずれか１つをコードする単離された核酸を提供する。同様に、本発明はさらに、本発明のイヌ化抗体の重鎖のいずれか１つをコードする単離された核酸を提供する。本発明はさらに、本発明の単離された核酸の１またはそれ以上を含有する発現ベクターを提供する。本発明はさらに、本発明の１またはそれ以上の発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
【００２４】
特定の実施形態では、抗体は、組換え抗体またはその抗原結合フラグメントである。関連実施形態では、可変重鎖ドメインおよび可変軽鎖ドメインは、柔軟なリンカーによって連結されて一本鎖抗体を形成する。
【００２５】
特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはＦａｂフラグメントである。
【００２６】
他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはＦａｂ’フラグメントである。他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは（Ｆａｂ’）２フラグメントである。さらに他の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはダイアボディである。特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはドメイン抗体である。特定の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントはラクダ化単一ドメイン抗体である。
【００２７】
特定の実施形態では、イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体または抗原結合フラグメントは、処置されるイヌ被験体の免疫応答を増大させる。
【００２８】
本発明はさらに、本明細書で開示されるイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体または抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸を提供する。関連実施形態では、そのような抗体または抗原結合フラグメントは、イヌ被験体における癌を処置する薬剤の調製のために使用することができる。あるいはまたは合わせて、本発明は、診断用途のための本発明の抗体または抗体フラグメントのいずれかの使用を提供する。さらに付加的な実施形態では、本明細書で開示されるイヌ化抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを含有するキットが提供される。
【００２９】
さらに付加的な実施形態では、本発明のイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体または抗原結合フラグメントのいずれかをコードする単離された核酸を含有する発現ベクターが提供される。本発明はまた、本明細書で述べる発現ベクターのいずれかを含有する宿主細胞に関する。特定の実施形態では、本発明のこれらの核酸、発現ベクターまたはポリペプチドは、抗体を作製する方法において有用である。
【００３０】
本発明はさらに、抗体またはその抗原結合フラグメントを医薬的に許容される担体または希釈剤と共に含有する医薬組成物を包含する。加えて、本発明は、免疫細胞の活性を増大させる方法であって、それを必要とする被験体にそのような医薬組成物の治療有効量を投与することを含む方法を提供する。ある実施形態では、この方法は癌の処置のために使用される。他の実施形態では、この方法は感染または感染性疾患の処置において使用される。さらに他の実施形態では、本発明のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントはワクチンアジュバントとして使用される。
【００３１】
本発明のこれらや他の態様は、以下の「図面の簡単な説明」および「発明を実施するための形態」を参照することによってより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、イヌＰＤ−１のＨｉｓタグ細胞外ドメインに対するマウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体０８Ａ［ｍＡｂ  ０８Ａ；ヒトＰＤ−１に関連して米国特許第８，３５４，５０９Ｂ２号において最初に記述された］の反応性を示す。
【図２】図２は、ＣＥＬＩＳＡを使用して、ＣＨＯ細胞上に発現されたイヌＰＤ−１タンパク質に対するマウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体０８Ａ（上記参照）の反応性を示す。マウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体０８Ａおよびそのイヌ化変異体は、イヌＰＤ−１と用量依存的に反応することが認められた。
【図３】図３は、マウスおよびイヌ化モノクローナル抗体によるリガンド遮断を表示する。マウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体０８Ａ（上記参照）およびそのイヌ化変異体は、ＣＨＯ細胞表面に発現されたＰＤ−１へのイヌＰＤ−Ｌ１の結合をブロックした。
【図４】図４は、ＡＤＣＣ機能を欠くイヌＩｇＧＢ定常重鎖（ＣＨ）のアラインメントを提供する。イヌ野生型ＩｇＢ［ｃＩｇＧＢ野生型］、イヌＩｇＧＢ（＋）Ａ−ヒンジ［ｃＩｇＧＢ（＋）Ａ−ヒンジ］、イヌＩｇＧＢ（＋）Ｄ−ヒンジ［ｃＩｇＧＢ（＋）Ｄ−ヒンジ］およびイヌＩｇＧＢ（−）ＡＤＣＣ［ｃＩｇＧＢ（−）ＡＤＣＣ］を表示する。（＋）Ａ−ヒンジは、示されているようにＩｇＧ−Ａヒンジでの置換プラスリシンおよびアスパラギンアミノ酸置換である；（＋）Ｄ−ヒンジは、示されているようにＩｇＧ−Ｄヒンジでの置換プラスリシンおよびアスパラギンアミノ酸置換である。（−）ＡＤＣＣはリシンおよびアスパラギンアミノ酸置換である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
略語
本発明の「発明を実施するための形態」および「実施例」全体を通して以下の略語を使用する：
ＡＤＣＣ          抗体依存性細胞傷害
ＣＤＣ            補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ            Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いて定義された、免疫グロブリン可変領域内の相補性決定領域
ＣＨＯ            チャイニーズハムスター卵巣
ＥＣ５０          ５０％の効果または結合を生じさせる濃度
ＥＬＩＳＡ        酵素結合免疫吸着法
ＦＲ              抗体フレームワーク領域：ＣＤＲ領域を除く免疫グロブリン可変領域
ＨＲＰ            ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ＩＦＮ            インターフェロン
ＩＣ５０          ５０％の阻害を生じさせる濃度
ＩｇＧ            免疫グロブリンＧ
Ｋａｂａｔ        Ｅｌｖｉｎ  Ａ．Ｋａｂａｔ［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）］によって開発された免疫グロブリンアラインメントおよびナンバリングシステム
ｍＡｂ            モノクローナル抗体（ＭａｂまたはＭＡｂとも略す）
ＭＥＳ            ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＭＯＡ            作用機序
ＮＨＳ            正常ヒト血清
ＰＣＲ            ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＫ              薬物動態
ＳＥＢ            ブドウ球菌エンテロトキシンＢ
ＴＴ              破傷風トキソイド
Ｖ領域            異なる抗体の間で配列が可変であるＩｇＧ鎖のセグメント。軽鎖内のＫａｂａｔ残基１０９および重鎖内のＫａｂａｔ残基１１３までに及ぶ。
【００３４】
ＶＨ              免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ              免疫グロブリンκ軽鎖可変領域
定義
本発明をより容易に理解し得るように、特定の技術および学術用語を以下で明確に定義する。本書類の別の箇所で明確に定義されない限り、本明細書で使用される他のすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【００３５】
付属の特許請求の範囲を含む、本明細書で使用される場合、「ａ、ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（その）」などの語の単数形は、文脈上そうでないとする明らかな指示がない限り、それらの対応する複数の言及を包含する。
【００３６】
細胞または受容体に適用される「活性化」は、文脈上または明白に異なる指示がない限り、リガンドによる細胞または受容体の活性化または処置を指す。「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えばサイトカイン、サイトカイン変異体、類似体、ムテインおよび抗体由来の結合化合物を包含する。「リガンド」はまた、低分子、例えばサイトカインのペプチドミメティックおよび抗体のペプチドミメティックも包含する。「活性化」は、内部機構によってならびに外部または環境因子によって調節される細胞活性化を指すことができる。
【００３７】
分子の「活性」は、リガンドまたは受容体への分子の結合、触媒活性、遺伝子発現または細胞のシグナル伝達、分化もしくは成熟を刺激する能力、抗原活性、他の分子の活性の調節等を表し得るもしくは指し得る。分子の「活性」はまた、細胞間相互作用、例えば接着を調節するもしくは維持するうえでの活性、または細胞の構造、例えば細胞膜もしくは細胞骨格を維持するうえでの活性も指し得る。「活性」はまた、比活性、例えば［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］または［免疫学的活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度等も意味することができる。「活性」は、先天性または適応免疫系の成分の調節も指し得る。
【００３８】
「投与」および「処置」は、動物、例えばイヌ実験被験体、細胞、組織、器官または生体液に適用される場合、動物、例えばイヌ被験体、細胞、組織、器官または生体液への外因性医薬、治療薬、診断薬または組成物の接触を指す。細胞の処置は、細胞への試薬の接触ならびに液体が細胞と接触している場合はその液体への試薬の接触を包含する。「投与」および「処置」はまた、試薬、診断薬、結合化合物による、または別の細胞による、例えば細胞の、インビトロおよびエクスビボ処置も意味する。「被験体」という用語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えばイヌ、ネコまたはヒト）、最も好ましくはイヌを包含する。
【００３９】
「処置する」または「処置すること」は、治療薬、例えば本発明の抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを含有する組成物を、１またはそれ以上の疾患症状を有する、または治療薬が治療活性を有する疾患を保有することが疑われるイヌ被験体または患者に、内部にまたは外部から投与することを意味する。典型的には、治療薬は、処置される被験体または集団において、臨床的に測定可能な程度にそのような（１または複数の）症状の後退を誘導するまたは（１または複数の）症状の進行を阻止することによって、１またはそれ以上の疾患症状を軽減するおよび／または改善するのに有効な量で投与される。何らかの特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療薬の量（「治療有効量」とも称される）は、疾患の状態、患者（例えばイヌ）の年齢および体重、ならびに被験体において所望の応答を引き出す医薬組成物の能力などの因子によって異なり得る。疾患症状が軽減または改善されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために獣医（ｖｅｔｅｒａｎａｒｉａｎ）または他の熟達した医療提供者によって典型的に使用される任意の臨床測定によって評価することができる。本発明（例えば処置方法または製造の項）の実施形態は、すべての被験体において（１または複数の）標的疾患症状を軽減するのに有効であるとは限らないかもしれないが、当分野で公知の任意の統計的検定、例えばスチューデントｔ検定、カイ二乗検定、マン−ホイットニーのＵ検定、クラスカル−ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンキー−タプストラ検定およびウィルコクソン検定などによって決定される、統計的に有意の数の被験体において（１または複数の）標的疾患症状を軽減するはずである。
【００４０】
「処置」は、ヒト、獣医学（例えばイヌ）または研究用被験体に適用される場合、治療的処置ならびに研究および診断適用を指す。ヒト、獣医学（例えばイヌ）もしくは研究用被験体または細胞、組織もしくは器官に適用される「処置」は、イヌまたは他の動物被験体、細胞、組織、生理学的区画または生理学的流体への本発明の抗体または抗原結合フラグメントの接触を包含する。
【００４１】
イヌＰＤ−１は、配列番号：２のアミノ酸配列を含有することが認められている。具体的な実施形態では、イヌＰＤ−１は、配列番号：１のヌクレオチド配列を含有する核酸によってコードされる。イヌＰＤ−１配列は、例えば非保存領域内に保存された変異を有することによって異なり得るが、このイヌＰＤ−１は、実質的に配列番号：２のアミノ酸配列を含有するイヌＰＤ−１と同じ生物学的機能を有する。例えば、ＰＤ−１の生物学的機能は、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２に結合した場合にＴ細胞応答を減弱させることである。すなわち、ＰＤ−１は負の調節因子と見なし得る。特に、ＰＤ−１の細胞質尾部は、２つのチロシンベースのシグナル伝達モチーフ、ＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ）およびＩＴＳＭ（免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ）を含有する。加えて、イヌＰＤ−１の生物学的機能は、例えば本開示の抗体によって特異的に結合される細胞外ドメイン内にエピトープを有することであり得る。
【００４２】
イヌＰＤ−Ｌ１は、配列番号：８のアミノ酸配列を含有することが認められている。具体的な実施形態では、イヌＰＤ−Ｌ１は、配列番号：７を含有するヌクレオチド配列によってコードされる。イヌＰＤ−Ｌ１配列は、例えば非保存領域内に保存された変異を有することによって異なり得るが、このイヌＰＤ−Ｌ１は、実質的に配列番号：８のアミノ酸配列を含有するイヌＰＤ−Ｌ１と同じ生物学的機能を有する。例えば、ＰＤ−Ｌ１の１つの生物学的機能は、ＰＤ−１に結合した場合にＴ細胞応答を減弱させることである。
【００４３】
特定のイヌＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列はそれぞれ、一般に、配列番号：２のアミノ酸配列を含有するイヌＰＤ−１または配列番号：８のアミノ酸配列を含有するイヌＰＤ−Ｌ１とそれぞれ少なくとも９０％同一である。ある場合には、イヌＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１はそれぞれ、配列番号：２のアミノ酸配列を含有するイヌＰＤ−１または配列番号：８のアミノ酸配列を含有するイヌＰＤ−Ｌ１とそれぞれ少なくとも９５％、またはさらには少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。ある実施形態では、イヌＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸配列を含有するイヌＰＤ−１または配列番号：８のアミノ酸配列を含有するイヌＰＤ−Ｌ１と、それぞれせいぜい１０個のアミノ酸相違しか示さない。ある実施形態では、イヌＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アミノ酸配列はそれぞれ、配列番号：２のアミノ酸配列を含有するイヌＰＤ−１または配列番号：８のアミノ酸配列を含有するイヌＰＤ−Ｌ１と、それぞれせいぜい５個、またはさらには４、３、２もしくは１個のアミノ酸相違だけを示し得る。同一性パーセントは、本明細書中以下で述べるように決定することができる。
【００４４】
「免疫応答」という用語は、例えば、癌細胞、病原体に感染した細胞もしくは組織または侵入病原体の哺乳動物身体（例えばイヌ身体）への選択的損傷、その破壊または哺乳動物身体（例えばイヌ身体）からの除去をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球および前記細胞または肝臓によって産生される可溶性高分子の作用を指す。
【００４５】
イヌ化抗ヒトＰＤ−１抗体
本発明は、イヌＰＤ−１に結合する単離されたイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントおよびそのような抗体またはフラグメントの使用を提供する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体は、哺乳動物ＰＤ−１に特異的に結合するイヌ化抗体を指す。哺乳動物ＰＤ−１、特にイヌＰＤ−１に特異的に結合する抗体は、他の抗原と比較して哺乳動物ＰＤ−１への選択的結合を示す抗体であるが、この特異性は絶対的な結合特異性を必要としない。イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体は、その結合がイヌから得た生物学的試料中のイヌＰＤ−１の存在を決定する場合、またはイヌ試料中の他のイヌタンパク質の活性を過度に妨げることなく、例えば診断状況における偽陽性もしくは治療状況での副作用などの望ましくない結果を生じさせることなくイヌＰＤ−１の活性を変化させることができる場合、イヌＰＤ−１に「特異的」と見なされる。イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体に必要な特異性の程度は抗体の意図される用途に依存してよく、いずれにせよ意図される目的のための使用への適切性によって定義される。企図される方法の抗体または抗体の抗原結合部位に由来する結合化合物は、他のいずれのイヌ抗原との親和性よりも少なくとも２倍高い、好ましくは少なくとも１０倍高い、より好ましくは少なくとも２０倍高い、最も好ましくは少なくとも１００倍高い親和性でその抗原またはその変異体もしくはムテインに結合する。
【００４７】
本明細書で使用される場合、抗体は、イヌＰＤ−１の配列を含有するポリペプチドに結合するが、イヌＰＤ−１のアミノ酸配列を欠く他のイヌタンパク質には結合しない場合、所与の配列（この場合はイヌＰＤ−１）を含有するポリペプチドに特異的に結合すると言われる。例えば、イヌＰＤ−１を含有するポリペプチドに特異的に結合する抗体は、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ形態のイヌＰＤ−１に結合し得るが、他のＦＬＡＧ（登録商標）タグイヌタンパク質には結合しない。
【００４８】
本明細書で使用される場合、特に指示されない限り、「抗体フラグメント」または「抗原結合フラグメント」は、抗体の抗原結合フラグメント、すなわち完全長抗体によって結合される抗原（例えばイヌＰＤ−１）に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、例えば１またはそれ以上のＣＤＲ領域を保持するフラグメントを指す。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、例えばｓｃ−Ｆｖ、ナノボディおよび抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４９】
典型的には、本発明のイヌ化抗体またはその抗原結合フラグメントは、そのイヌＰＤ−１結合活性がモルベースで表される場合、その活性の少なくとも１０％（対応する親抗体と比較した場合）を保持する。好ましくは、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、親抗体としてのイヌＰＤ−１結合親和性の少なくとも２０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％またはそれ以上を保持する。また、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、その生物学的活性を実質的に変化させない保存的または非保存的アミノ酸置換（抗体の「保存的変異体」または「機能保存的変異体」とも称される）を含有することができることも意図されている。
【００５０】
「単離された抗体」は精製状態を指し、そのような状況で分子が他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物または他の物質、例えば細胞デブリおよび増殖培地などを実質的に含まないことを意味する。一般に、「単離された」という用語は、そのような物質または水、緩衝剤もしくは塩が本明細書で述べる結合化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨げる量で存在しない限り、そのような物質が完全に存在しないことまたは水、緩衝剤もしくは塩が存在しないことを指すことを意図しない。
【００５１】
各々の軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体の抗原結合部位を形成する。したがって、一般に、無傷抗体は２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体における場合を除き、２つの結合部位は、一般に、同じである。
【００５２】
典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる３つの超可変領域を含有する。ＣＤＲは通常フレームワーク領域によって隣接され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖の可変ドメインはどちらも、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含有する。各ドメインへのアミノ酸の割当ては、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ  ｅｄ．；ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ，Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１−７５（１９７８）；Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９−６６１６（１９７７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）またはＣｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９）］の定義に従う。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち軽鎖可変ドメイン内のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３ならびに重鎖可変ドメイン内のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）由来のアミノ酸残基を含有する。［配列によって抗体のＣＤＲ領域を定義する、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）参照；また、構造によって抗体のＣＤＲ領域を定義する、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）も参照のこと］。本明細書で使用される場合、「フレームワーク」または「ＦＲ」残基という用語は、ＣＤＲ残基として本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「イヌ」という用語は、特に指示されない限り、すべての家庭イヌ、イエイヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）またはイヌ科イヌ属（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）を包含する。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「イヌフレーム」という用語は、本明細書でＣＤＲ残基として定義される超可変領域残基以外のイヌ抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を指す。イヌ化抗体に関して、大部分の実施形態では、天然イヌＣＤＲのアミノ酸配列は、両方の鎖において対応する異種ＣＤＲ（例えばマウス抗体由来のもの）で置き換えられている。イヌ抗体の重鎖および／または軽鎖は、例えば、以下で論じるように、イヌ抗体内の異種ＣＤＲの立体配座を保存するためおよび／またはＦｃ機能を改変するために、いくつかの異種非ＣＤＲ残基を含有していてもよい。
【００５６】
イヌＩｇＧの４つの公知のＩｇＧ重鎖サブタイプが存在し、それらはＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄと称される。２つの公知の軽鎖サブタイプはλおよびκと称される。
【００５７】
イヌ免疫細胞の結合および活性に加えて、ＰＤ−１に対するイヌ抗体またはイヌ化抗体は、最適には２つの属性を有する：
１．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の欠如、ならびに
２．プロテインＡクロマトグラフィに基づくもののような業界標準技術を用いて大規模で容易に精製される。
【００５８】
天然に存在するイヌＩｇＧアイソタイプはいずれも、両方の基準は満たさない。例えば、ＩｇＧ−ＢはプロテインＡを使用して精製することができるが、高レベルのＡＤＣＣ活性を有する。他方で、ＩｇＧ−ＡはプロテインＡに弱く結合するが、望ましくないＡＤＣＣ活性を示す。さらに、ＩｇＧ−ＤはＡＤＣＣ活性を示さないが、ＩｇＧ−ＣまたはＩｇＧ−ＤのいずれもがプロテインＡカラムでは精製することができない。（ＩｇＧ−ＣはかなりのＡＤＣＣ活性を有する）。本発明は、ＰＤ−１に特異的な突然変異体イヌＩｇＧ−Ｂ抗体を提供することによってこの困難を克服する；そのような抗体はＡＤＣＣなどのエフェクター機能を欠き、業界標準のプロテインＡクロマトグラフィを用いて容易に精製することができる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「イヌ化抗体」という用語は、マウス抗ヒトＰＤ−１抗体由来の３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲをイヌフレームまたは修飾されたイヌフレームと共に含有する抗体を指す。修飾されたイヌフレームは、イヌ化抗体の有効性をさらに最適化する、例えばイヌＰＤ−１へのその結合を増大させるおよび／またはイヌＰＤ−１のイヌＰＤ−Ｌ１への結合をブロックするその能力を増大させる、本明細書で例示するような１またはそれ以上のアミノ酸変化を含有する。
【００６０】
「相同性」は、最適に整列した場合の２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。２つの比較配列の両方におけるある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合、例えば２つのＤＮＡ分子の各々におけるある位置がアデニンによって占有されている場合、これらの分子はその位置において相同である。相同性のパーセントは、２つの配列によって共有される相同な位置の数を、比較した位置の総数で除して、１００を乗じたものである。例えば、２つの配列を最適に整列した場合に２つの配列中の１０の位置のうち６の位置が一致するかまたは相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一般に、比較は、最大の相同性パーセントを与えるように２つの配列を整列した場合に行われる。
【００６１】
「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドが自然界で見出されるポリヌクレオチドの全部または一部分と結合していない、または自然界では連結されていないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡもしくは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの何らかの組合せを意味する。本開示のために、特定のヌクレオチド配列「を含有する核酸分子」は無傷の染色体を包含しないことが理解されるべきである。指定された核酸配列「を含有する」単離された核酸分子は、指定配列に加えて、１０個までまたはさらには２０個までまたはそれ以上の他のタンパク質またはその部分もしくはフラグメントについてのコード配列を含有してよく、または列挙される核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に連結された調節配列を含有してよく、および／またはベクター配列を含有してもよい。
【００６２】
「制御配列」という語句は、特定の宿主生物における作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適切な制御配列としては、例えばプロモーターが含まれ、オペレーター配列が含まれてもよく、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使用することが公知である。
【００６３】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結されて」いる。例えば、プレ配列または分泌リーダーに関するＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてのＤＮＡに作動可能に連結されている；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されている；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置付けられている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結された」は、連結されているＤＮＡ配列が隣接していること、および分泌リーダーの場合は、隣接しておりかつ読み取り相内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の慣例に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。また、核酸配列が本明細書中で提供される場合、それが終結コドンを含有し得ることも容易に理解されるはずである。しかし、終結コドンは交換可能であるので、配列内の特定の終結コドンの含有はその配列の必要部分と見なされるべきではない。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」という表現は交換可能に使用され、すべてのそのような指定語は子孫を包含する。したがって、「形質転換体」および「形質転換細胞」という語は、一次被験体細胞および継代の数を考慮せずにそれに由来する培養物を包含する。また、意図的なまたは不慮の突然変異に起因して、必ずしもすべての子孫が正確に同じＤＮＡ含量を有さないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫は包含される。異なる指定語が意図される場合は、文脈から明らかになる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「生殖細胞系配列」は、再構成されていない免疫グロブリンＤＮＡ配列の配列を指す。再構成されていない免疫グロブリン配列の任意の適切な供給源を使用し得る。ヒト生殖細胞系配列は、例えばアメリカ国立衛生研究所の関節炎および筋骨格系／皮膚疾患国立研究機構（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）のウエブサイト上のＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ（登録商標）生殖細胞系データベースから入手し得る。マウス生殖細胞系配列は、例えばＧｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３３：Ｄ２５６−Ｄ２６１（２００５）］に記載されているように入手し得る。
【００６６】
例示的なイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体の特性
本発明は、単離されたイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体および疾患の処置、例えばイヌの癌の処置における前記抗体またはその抗原結合フラグメントの使用の方法を提供する。イヌＰＤ−１に結合するイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体の例としては、マウス抗ヒトＰＤ−１  ＣＤＲと共にイヌＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−ＢおよびＩｇＧ−Ｄ重鎖ならびに／またはイヌκ軽鎖を含有する抗体が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明は、イヌＰＤ−１に結合し、およびイヌＰＤ−１のイヌＰＤ−Ｌ１への結合をブロックする単離されたイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００６７】
イヌＰＤ−１に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書で述べるマウス抗ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の１、２、３、４、５または６個を含有することができる。１、２、３、４、５または６個のＣＤＲは、以下の実施例の表２において提供されるＣＤＲ配列から独立して選択され得る。ある実施形態では、１、２もしくは３個のＣＤＲはＶＬ  ＣＤＲ（アミノ酸配列番号：２０、２２および／もしくは２４）から選択され、ならびに／または１、２もしくは３個のＣＤＲはＶＨ  ＣＤＲ（配列番号：１４、１６および／もしくは１８）から選択され、ならびに／またはこれらのＶＬ  ＣＤＲの１、２もしくは３個の保存的に修飾された変異体および／またはこれらのＶＨ  ＣＤＲの１、２もしくは３個の保存的に修飾された変異体から選択される。
【００６８】
さらなる実施形態では、イヌＰＤ−１に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウス軽鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２および／またはＣＤＲ−３を含むイヌ抗体κ軽鎖ならびにマウス重鎖ＣＤＲ−１、ＣＤＲ−２および／またはＣＤＲ−３を含むイヌ抗体重鎖ＩｇＧを含有する。
【００６９】
他の実施形態では、本発明は、まだ所望の結合特性および機能特性を示す一方で、ＰＤ−１に特異的に結合し、ならびに配列番号：２０、２２および／または２４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含むＣＤＲを含有するイヌ抗体κ軽鎖ならびに配列番号：１４、１６および／または１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を含むＣＤＲを有するイヌ抗体重鎖ＩｇＧを含有する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の実施形態では、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、まだ所望の結合特性および機能特性を示す一方で、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個までまたはそれ以上の保存的または非保存的アミノ酸置換を有する、κ軽鎖（シグナル配列を有するおよび有さない配列番号：３２または３４のアミノ酸配列を含有する）とＩｇＧ重鎖配列（シグナル配列を有するおよび有さない配列番号：２６、２８または３０のアミノ酸配列を含有する）の組合せから成るイヌフレームを含有する。この種の特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換の数は、ＩｇＧ重鎖については０から５個およびκ軽鎖については０から５個である。
【００７０】
「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、タンパク質中のアミノ酸の、類似の性質（例えば電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、骨格立体配座および剛性等）を有する他のアミノ酸による置換であって、変化がしばしばタンパク質の生物学的活性を変化させずに行われ得る置換を指す。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域内の１個のアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する。［例えばＷａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ  Ｅｄ．；１９８７）参照］。加えて、構造的または機能的に類似のアミノ酸の置換は生物学的活性を破壊する可能性がより低い。本発明の抗体または抗原結合フラグメントの様々な実施形態は、本明細書で開示される配列、例えば配列番号：２６、２８、３０、３２および／もしくは３４を有するポリペプチド鎖、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０個までまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換を含むポリペプチド鎖を含有する。例示的な保存的アミノ酸置換を表Ｉに示す。
【表１】
0006701079.tif 000002
0006701079.tif 000003
【００７１】
本発明の抗体の機能保存的変異体も本発明によって企図される。「機能保存的変異体」は、本明細書で使用される場合、１またはそれ以上のアミノ酸残基が所望の特性、例えば（ｓｕｃｈ  ａｎ）抗原親和性および／または特異性を改変することなく変化している抗体またはフラグメントを指す。そのような変異体としては、表Ｉの保存的アミノ酸置換のような、あるアミノ酸の、類似特性を有するアミノ酸による置換が含まれるが、これに限定されない。
【００７２】
核酸
本発明はさらに、本明細書で開示されるイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体およびその抗原結合フラグメントの免疫グロブリン鎖をコードする核酸を包含する。例えば、本発明は、以下の表２および３ならびに配列表に列挙される核酸を包含する。
【００７３】
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較を実施した場合、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約８０％同一、より好ましくは少なくとも約９０％同一、最も好ましくは少なくとも約９５％同一（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）であるアミノ酸配列を含有する免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含され、ここで前記アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大のマッチを与えるように選択される。本発明はさらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムで比較を実施した場合、参照アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約７０％類似、好ましくは少なくとも約８０％類似、より好ましくは少なくとも約９０％類似、最も好ましくは少なくとも約９５％類似（例えば９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）するアミノ酸配列を含有する免疫グロブリンポリペプチドをコードする核酸を提供し、ここで前記アルゴリズムのパラメータは、それぞれの参照配列の全長にわたってそれぞれの配列間で最大のマッチを与えるように選択される。
【００７４】
配列同一性は、２つの配列を最適に整列した場合に２つのポリペプチドのアミノ酸が等しい位置において同じである程度を指す。配列類似性は、同一の残基および非同一の生化学的に関連するアミノ酸を包含する。類似の特性を共有し、交換可能であり得る生化学的に関連するアミノ酸は上記で論じられている。
【００７５】
以下の参考文献は、配列解析のためにしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴ  ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７）；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３（１９９３）；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０（１９９４）；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＣＯＲＩＮＧ  ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．」ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３４５−３５２，（１９７８）；Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．」ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．」（１９７８），Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（ｅｄ．），ｐｐ．３５３−３５８（１９７８），Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５（１９９１）；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：６６−７０（１９９１）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００（１９９３）；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７（１９９３）；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９（１９９４）；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．「Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．」ｉｎ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ，ｅｄ．），ｐｐ．１−１４，���ｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）。
【００７６】
本発明はまた、本発明の単離された核酸を含有する発現ベクターも提供し、ここで前記核酸は、宿主細胞をベクターでトランスフェクトした場合に宿主細胞によって認識される制御配列に作動可能に連結されている。また、本発明の発現ベクターを含有する宿主細胞ならびに本明細書で開示される抗体またはその抗原結合フラグメントを作製する方法であって、抗体または抗原結合フラグメントをコードする発現ベクターを保有する宿主細胞を培地で培養することおよび抗原またはその抗原結合フラグメントを宿主細胞または培地から単離することを含む方法も提供される。
【００７７】
エピトープ結合および結合親和性
本発明はさらに、配列番号：２８および／もしくは配列番号：３２のアミノ酸配列を含有するイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体、または配列番号：２８および／もしくは配列番号：３４のアミノ酸配列を含有するイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体と同じイヌＰＤ−１上のエピトープに結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、イヌＰＤ−１のイヌＰＤ−Ｌ１への結合を阻害することができる。
【００７８】
イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体は、以下の実施例で述べるように組換え技術によって作製することができる。本明細書で開示される抗体またはフラグメントの発現のための宿主として使用可能な哺乳動物細胞株は当分野で周知であり、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。これらには、中でも特に、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および多くの他の細胞株が含まれる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞が含まれる。特に好ましい細胞株は、いずれの細胞株が高発現レベルを有するかを測定することを通して選択される。使用し得る他の細胞株は、昆虫細胞、例えばＳｆ９細胞、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合部分もしくはフラグメント、軽鎖および／またはその抗原結合フラグメントをコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現または、より好ましくは宿主細胞が増殖する培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。
【００７９】
抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて培地から回収することができる。さらに、産生細胞株からの本発明の抗体（またはそれに由来する他の成分）の発現は、多くの公知の技術を用いて増強することができる。例えばグルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号および同第０３２３９９７号ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して全体的にまたは部分的に考察される。
【００８０】
一般に、特定の細胞株またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、その細胞株またはトランスジェニック動物で産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する。それゆえ、抗体の特定のグリコシル化パターンは、抗体を作製するのに使用される特定の細胞株またはトランスジェニック動物に依存する。しかし、本明細書で提供される核酸分子によってコードされるまたは本明細書で提供されるアミノ酸配列を含有するすべての抗体は、抗体が有し得るグリコシル化パターンに関わりなく、本発明を構成する。同様に、特定の実施形態では、非フコシル化Ｎ−グリカンだけを含むグリコシル化パターンを有する抗体は、これらの抗体が、典型的にはインビトロおよびインビボの両方でそれらのフコシル化対応物よりも強力な効果を発揮することが示されているため、好都合であり得る［例えばＳｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３４６６−３４７３（２００３）；米国特許第６，９４６，２９２号および同第７，２１４，７７５号参照］。
【００８１】
本発明はさらに、本明細書で開示されるイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体の抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントには、例えばペプシンによるＩｇＧの酵素切断によって生成し得るＦ（ａｂ）２フラグメントが含まれる。Ｆａｂフラグメントは、例えばジチオトレイトールまたはメルカプトエチルアミンでのＦ（ａｂ）２の還元によって生成し得る。Ｆａｂフラグメントは、ジスルフィド架橋によってＶＨ−ＣＨ１鎖に付加されたＶＬ−ＣＬ鎖である。Ｆ（ａｂ）２フラグメントは、今度は２つのジスルフィド架橋によって付加された２つのＦａｂフラグメントである。Ｆ（ａｂ）２分子のＦａｂ部分は、その間にジスルフィド架橋が位置するＦｃ領域の一部分を含む。ＦＶフラグメントはＶＬまたはＶＨ領域である。
【００８２】
１つの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域、例えばイヌ定常領域、例えばＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄイヌ重鎖定常領域またはその変異体を含有する。別の実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、軽鎖定常領域、例えばイヌ軽鎖定常領域、例えばλまたはκイヌ軽鎖領域またはその変異体を含有する。限定ではなく例として、イヌ重鎖定常領域はＩｇＧ−Ｄに由来することができ、イヌ軽鎖定常領域はκに由来し得る。
【００８３】
抗体エンジニアリング
本発明のイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体は、例えば抗体の特性を改善するために、親（すなわちイヌ）モノクローナル抗体の可変ドメイン内のフレームワーク残基への修飾を含有するように操作されている。
【００８４】
実験および診断用途
本発明のイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、イヌＰＤ−１タンパク質の診断アッセイ、例えば特定の腫瘍細胞、組織または血清中でのその発現を検出する診断アッセイにおいても有用であり得る。そのような診断方法は、様々な疾患診断、特にイヌにおける特定の癌の診断において有用であり得る。
【００８５】
例えば、そのような方法は以下の段階を含む：
（ａ）イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントで基質（例えばマイクロタイタープレートのウェル、例えばプラスチックプレートの表面）を被覆する段階；
（ｂ）イヌＰＤ−１の存在に関して試験する試料を基質に適用する段階；
（ｃ）試料中の非結合物質を除去するためにプレートを洗浄する段階；
（ｄ）同じくＰＤ−１抗原に特異的な検出可能に標識した抗体（例えば酵素結合抗体）を適用する段階；
（ｅ）非結合標識抗体を除去するために基質を洗浄する段階；
（ｆ）標識抗体が酵素結合している場合、その酵素によって蛍光シグナルに変換される化学物質を適用する段階；および
（ｇ）標識抗体の存在を検出する段階。
【００８６】
さらなる実施形態では、標識抗体を、検出可能な色変化を生じさせるためにＡＢＴＳ［例えば２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）］または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応するペルオキシダーゼで標識する。あるいは、標識抗体を、シンチラントの存在下でシンチレーションカウンターによって検出できる検出可能な放射性同位体（例えば３Ｈ）で標識する。本発明のイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体は、ウェスタンブロットまたは免疫タンパク質ブロット手順において使用し得る。
【００８７】
そのような手順は本発明の一部を形成し、例えば以下を含む：
（ｉ）結合イヌＰＤ−１またはそのフラグメントの存在に関して試験する膜または固体基質を本発明のイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること。そのような膜は、非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲル中のイヌＰＤ−１の存在に関して試験するタンパク質が転写された（例えばゲル中での電気泳動分離後）ニトロセルロースまたはビニルベースの［例えばポリビニリデンフルオライド（ＰＤＶＦ）］膜の形態を取り得る。イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントと膜の接触前に、膜上の非特異的タンパク質結合部位に結合させるために、例えば脱脂粉乳等で膜をブロックしてもよい。
【００８８】
（ｉｉ）非結合イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントおよび他の非結合物質を除去するために膜を１回またはそれ以上の回数洗浄すること；ならびに
（ｉｉｉ）結合イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを検出すること。
【００８９】
結合抗体または抗原結合フラグメントの検出は、抗体または抗原結合フラグメントを検出可能に標識した二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）と結合させ、その後二次抗体の存在を検出することによるものであってもよい。
【００９０】
本明細書で開示されるイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体およびその抗原結合フラグメントはまた、免疫組織化学のためにも使用し得る。そのような方法は本発明の一部を形成し、例えば（１）イヌＰＤ−１の存在に関して試験する細胞を本発明のイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること；および（２）細胞上または細胞中の抗体またはフラグメントを検出することを含む。
【００９１】
抗体または抗原結合フラグメント自体が検出可能に標識されている場合は、それを直接検出することができる。あるいは、抗体または抗原結合フラグメントを、検出される検出可能標識二次抗体によって結合させてもよい。
【００９２】
本明細書で開示される特定のイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体およびその抗原結合フラグメントはまた、インビボ腫瘍イメージングにも使用し得る。そのような方法は、放射性標識イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを、イヌＰＤ−１発現に関連する腫瘍の存在に関して試験するイヌの体内に注射し、次いで、例えば腫瘍に結合した高濃度の抗体または抗原結合フラグメントを含有する位置で、標識抗体または抗原結合フラグメントの存在を検出するために患者の身体の核イメージングを実施することを含み得る。
【００９３】
イメージング技術には、ＳＰＥＣＴイメージング（単光子放射断層撮影法）またはＰＥＴイメージング（陽電子放射断層撮影法）が含まれる。標識としては、例えばＳＰＥＣＴイメージングと組み合わせて、例えばヨウ素１２３（１２３Ｉ）およびテクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、または例えばＰＥＴイメージングもしくはインジウム１１１と組み合わせて、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏもしくは１８Ｆが含まれる［例えばＧｏｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６７：３８５−４４０（２００５）参照］。
【００９４】
医薬組成物および投与
イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの医薬または滅菌組成物を調製するために、イヌ化マウス抗イヌＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントを医薬的に許容される担体または賦形剤と混合する。［例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）参照］。
【００９５】
治療薬および診断薬の製剤は、例えば凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁液の形態で許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製し得る［例えばＨａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ参照］。１つの実施形態では、本発明の抗ＰＤ−１抗体を酢酸ナトリウム溶液ｐＨ５〜６中で適切な濃度に希釈し、張度のためにＮａＣｌまたはスクロースを添加する。安定性を高めるためにポリソルベート２０またはポリソルベート８０などの付加的な作用物質を添加してもよい。
【００９６】
単独でまたは別の作用物質と併用して投与される、抗体組成物の毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（母集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（母集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物において標準的な薬学手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比が治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。特定の態様では、高い治療指数を示す抗体が望ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、イヌにおける使用のための投与量範囲を設定するのに使用できる。そのような化合物の投与量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性を伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および投与経路に依存してこの範囲内で変化させ得る。
【００９７】
投与の方法は様々であり得る。適切な投与経路には、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、眼内、吸入、通気、局所、皮膚、経皮または動脈内経路が含まれる。
【００９８】
特定の実施形態では、イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、注射などの侵襲的経路によって投与することができる。本発明のさらなる実施形態では、イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腫瘍内経路で、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路（例えば経口的に；例えば丸剤、カプセルまたは錠剤中で）による投与も本発明の範囲内である。
【００９９】
組成物は、当分野で公知の医療装置で投与することができる。例えば本発明の医薬組成物は、例えば薬剤充填済み注射器または自己注射器を含む、皮下注射針での注射によって投与できる。本明細書で開示される医薬組成物はまた、無針皮下注射装置、例えば米国特許第６，６２０，１３５号；同第６，０９６，００２号；同第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号に開示されている装置でも投与し得る。
【０１００】
本明細書で開示される医薬組成物は注入によっても投与し得る。医薬組成物を投与するための（ｆｏｒｍ）周知のインプラントおよびモジュールの例としては：薬剤を制御された速度で投与するための移植可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、薬剤を正確な注入速度で送達するための薬剤注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、持続的な薬剤送達のための可変流量の移植可能な注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、多チャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号が含まれる。多くの他のそのようなインプラント、送達システムおよびモジュールは当業者に周知である。
【０１０１】
あるいは、しばしばデポー製剤または持続放出製剤中で、例えば関節炎の関節または免疫病理学によって特徴付けられる病原体誘発性病変内に抗体を直接注入することによって、イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体を全身的にではなく局所的に投与し得る。さらに、例えば関節炎の関節または免疫病理学によって特徴付けられる病原体誘発性病変を標的とする、標的化薬物送達システム、例えば組織特異的抗体で被覆されたリポソーム中でイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体を投与し得る。リポソームは罹患組織を標的とし、罹患組織によって選択的に取り込まれる。
【０１０２】
投与レジメンは、治療用抗体の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性、および生物学的マトリックス中の標的細胞の接近可能性を含む、いくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、同時に望ましくない副作用を最小限に抑えつつ、標的疾患部位において改善を生じさせるのに十分な治療用抗体を送達する。したがって、送達される生物学的製剤の量は、一部には特定の治療用抗体および処置される状態の重症度に依存する。治療用抗体の適切な用量を選択するうえでの指針が入手可能である［例えばＷａｗｒｚｙｎｃｚａｋ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ（１９９６）；Ｋｒｅｓｉｎａ（ｅｄ．）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１）；Ｂａｃｈ（ｅｄ．）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３）；Ｂａｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１−６０８（２００３）；Ｍｉｌｇｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６−１９７３（１９９９）；Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３−７９２（２００１）；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３−６１９（２０００）；Ｇｈｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４−３２（２００３）；Ｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４−１６０２（２０００）参照］。
【０１０３】
適切な用量の決定は、例えば処置に影響を及ぼすことが当分野で公知であるまたは影響を及ぼすと推測されるパラメータまたは因子を使用して、獣医（ｖｅｔｅｒａｎａｒｉａｎ）によって行われる。一般に、用量は、最適用量よりいくぶん低い量から開始して、その後負の副作用と比較して所望のまたは最適の効果が達成されるまで少しずつ増量する。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度または産生される炎症性サイトカインのレベルが含まれる。
【０１０４】
本明細書で開示される抗体またはその抗原結合フラグメントは、持続注入によって、または例えば１日１回、週に１〜７回、週１回、隔週に１回、月１回、隔月に１回、３か月に１回、半年に１回、年１回等で投与される用量によって提供され得る。用量は、例えば静脈内、皮下、局所、経口、経鼻、直腸、筋肉内、大脳内、髄腔内投与または吸入によって提供され得る。１週間の総用量は、一般に少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である［例えばＹａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７−４３４（２００３）；Ｈｅｒｏｌｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２−１６９８（２００２）；Ｌｉｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１−４５６（１９９９）；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３−１４４（２００３）参照］。用量はまた、被験体の血清中でイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体のあらかじめ定められた標的濃度、例えば０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれ以上を達成するように提供され得る。他の実施形態では、本発明のイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体は週１回、隔週に１回、「４週間に１回」、月１回、隔月に１回または３か月に１回ベースで、１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ／被験体で皮下または静脈内経路によって投与される。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「阻害する」または「処置する」または「処置」は、障害に関連する症状の発現の先送りおよび／またはそのような障害の症状の重症度の軽減を包含する。これらの用語は、既存の制御されないまたは望ましくない症状を改善すること、付加的な症状を予防すること、およびそのような症状の基礎となる原因を改善または予防することをさらに包含する。したがって、これらの用語は、障害、疾患もしくは症状を有する、またはそのような障害、疾患もしくは症状を発現する潜在的可能性を有する脊椎動物被験体に有益な結果が与えられていることを意味する。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」、「治療有効用量」および「有効量」という用語は、単独でまたは付加的な治療薬と併用して細胞、組織または被験体に投与された場合、疾患もしくは状態の１もしくはそれ以上の症状またはそのような疾患もしくは状態の進行の測定可能な改善を生じさせるのに有効な、本発明のイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントの量を指す。治療有効用量はさらに、症状の少なくとも部分的な改善、例えば関連する医学的状態の処置、治癒、予防もしくは改善、またはそのような状態の処置、治癒、予防もしくは改善の速度の増大をもたらすのに十分な結合化合物の量を指す。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、治療有効用量はその成分単独を指す。組合せに適用される場合、治療有効用量は、併用して、連続的にまたは同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の総計量を指す。治療薬の有効量は、診断尺度またはパラメータの少なくとも１０％、通常は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の改善をもたらす。有効量はまた、疾患の重症度を評価するのに主観的尺度を用いる場合は、主観的尺度の改善ももたらすことができる。
【０１０７】
他の併用療法
先に述べたように、イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体もしくはその抗原結合フラグメントは、１またはそれ以上の他の治療薬（例えば化学療法剤）と同時投与し得る。抗体を他の治療薬に連結してもよく（免疫複合体として）または他の治療薬とは別に投与することができる。後者（別々の投与）の場合は、抗体を他の治療薬の前、後もしくは治療薬と同時に投与することができるかまたは他の公知の療法と同時投与することができる。
【０１０８】
キット
さらに、ＰＤ−１に特異的に結合する、本明細書で論じる抗体または抗原結合フラグメント（例えば本発明のイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメント）を含むがこれらに限定されない１またはそれ以上の成分を、本明細書で論じる、医薬的に許容される担体および／または化学療法剤を含むがこれらに限定されない１またはそれ以上の付加的な成分と共に含有するキットが提供される。結合組成物および／または化学療法剤は、純粋な組成物としてまたは医薬的に許容される担体と組み合わせて医薬組成物に製剤することができる。
【０１０９】
１つの実施形態では、キットは、本発明の結合組成物（１つの容器中（例えば滅菌ガラスまたはプラスチックバイアル中）に配列番号：２８および配列番号：３２もしくは３４のアミノ酸配列を含有するイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体またはその医薬組成物ならびに別の容器中（例えば滅菌ガラスまたはプラスチックバイアル中）にその医薬組成物および／または化学療法剤を含有する。
【０１１０】
別の実施形態では、キットは、単一の共通容器中に、一緒に医薬組成物中に製剤されていてもよい１またはそれ以上の治療薬成分と組み合わせてもよい、医薬的に許容される担体と共に、結合組成物成分（例えば配列番号：２８および配列番号：３２または３４のアミノ酸配列を含有するイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体）を含む、本発明の組合せを含有する。
【０１１１】
キットが被験体への非経口投与用の医薬組成物を含む場合、キットは、そのような投与を実施するための装置を含有することができる。例えばキットは、上記で論じた１またはそれ以上の皮下針または他の注射装置を含有し得る。キットはまた、キット中の医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書も含有することができる。一般に、そのような情報は、ペットの飼い主および獣医（ｖｅｔｅｒａｎａｒｉａｎ）が同封されている医薬組成物および剤形を有効かつ安全に使用するのに役立つ。例えば本発明の組合せに関する以下の情報が添付文書中で提供され得る：薬物動態、薬力学、臨床試験、効果パラメータ、適応症および用法、禁忌、警告、使用上の注意、有害反応、過量、適切な用量および投与、供給方法、適切な保存条件、参考文献、製造者／配給者情報ならびに特許情報。
【０１１２】
便宜上、本明細書で開示される抗体または特定の結合物質は、キット中で、すなわち診断または検出アッセイを実施するための指示書と共に所定量の試薬の包装された組合せで提供され得る。抗体が酵素で標識されている場合、キットは、基質および酵素が必要とする補因子（例えば検出可能な発色団または発蛍光団を提供する基質前駆体）を含有する。加えて、他の添加物、例えば安定剤、緩衝液（例えばブロック緩衝液または溶解緩衝液）等が含まれてもよい。様々な試薬の相対的な量は、アッセイの感受性を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度を提供するように広く異なり得る。特に、試薬は、溶解後に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含有する、通常は凍結乾燥された、乾燥粉末として提供され得る。
【０１１３】
［実施例］
［実施例１］
イヌＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１
イヌＰＤ−１の同定とクローニング：
完全長イヌＰＤ−１（ｃＰＤ−１）をコードする核酸を、ＮＣＢＩ遺伝子バンクデータベース（アクセッション番号ＸＭ＿５４３３３８．４、配列番号：１）の検索を通して同定した。翻訳されたアミノ酸配列、配列番号：２（アクセッション番号ＸＰ−５４３３３８．３）は、遺伝子バンク（ＮＣＢＩ）タンパク質データベースを検索し、同定されたアミノ酸配列をマウス、ネコおよびヒトＰＤ−１アミノ酸配列と整列することを通してさらに同定した、推定上のイヌＰＤ−１タンパク質に対応する。ＣＨＯ細胞についてコドン最適化した、完全長イヌＰＤ−１遺伝子に対応するＤＮＡ配列を合成し、ｐ９６７９３と称するプラスミドにクローニングした。予測されるイヌＰＤ−１のＤＮＡおよびタンパク質配列と公知のＰＤ−１  ＤＮＡおよびタンパク質配列との比較は、イヌＰＤ−１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするＤＮＡ配列（配列番号：３）およびイヌＰＤ−１のＥＣＤのアミノ酸配列（配列番号：４）の同定をもたらした。
【０１１４】
ＧＴリンカーおよび８個のヒスチジン残基に加えてイヌＰＤ−１のＥＣＤをコードするＤＮＡ配列を合成し、ＬＰＤ２７２６と称するプラスミドにクローニングした。イヌＰＤ−１  ＥＣＤプラスＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  Ｆｃ遺伝子のＦｃ部分に対応する核酸配列（配列番号：５）を化学的に合成し、ＬＰＤ２７２７と称するプラスミドにクローニングした。イヌＰＤ−１  ＥＣＤおよびヒトＩｇＧ１  ＦｃのＦｃ部分は、配列番号：６のアミノ酸配列を含有する。
【０１１５】
イヌＰＤ−Ｌ１の同定とクローニング：
完全長イヌＰＤ−Ｌ１をコードする核酸を、ＮＣＢＩ遺伝子バンクデータベース（アクセッション番号ＸＭ＿５４１３０２．４；配列番号：７）の検索を通して同定した。推定上のイヌＰＤ−１タンパク質に対応する翻訳されたアミノ酸配列（アクセッション番号ＸＰ−５４１３０２．４；配列番号：８）は、遺伝子バンク（ＮＣＢＩ）タンパク質データベースを検索し、同定された配列と公知のＰＤ−Ｌ１マウスおよびヒト配列とのアラインメントによって同定した。
【０１１６】
イヌＰＤ−Ｌ１をコードするＤＮＡと公知のＰＤ−Ｌ１配列との比較は、イヌＰＤ−Ｌ１のＥＣＤドメインに対応するＤＮＡ配列（配列番号：９；ＣＨＯ細胞についてコドン最適化した）を同定した。イヌＰＤ−Ｌ１のＥＣＤの予測されるアミノ酸配列は配列番号：１０である。ＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤプラスＧＴリンカーおよび８個のヒスチジン残基をコードするＤＮＡを合成し、ＬＰＤ２６９５と称するプラスミドにクローニングした。
【０１１７】
イヌＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤプラスＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１  ＦｃのＦｃ部分のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１１）を化学的に合成し、ＬＰＤ２６９７と称するプラスミドにクローニングした。イヌＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤプラスＧＴリンカーおよびヒトＩｇＧ１のＦｃ部分は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含有する。表１は上記の発現プラスミドの説明を含む。
【表２】
0006701079.tif 000004
【０１１８】
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現：
ＰＤ−１  ＥＣＤ−ＨＩＳ、ＰＤ−１  ＥＣＤ−Ｆｃ、ＰＤＬ−１  ＥＣＤ−ＨＩＳおよびＰＤ−Ｌ１  ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質をコードする発現プラスミドをＨＥＫ  ２９３細胞にトランスフェクトし、Ｆｃ融合タンパク質についてはプロテインＡまたはＨＩＳタグタンパク質についてはニッケル（Ｎｉ２＋）カラムクロマトグラフィを使用してトランスフェクト細胞の上清からタンパク質を精製した。精製したタンパク質を以下で詳述するようにＥＬＩＳＡまたは結合アッセイに使用した。発現したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって分析した。
【０１１９】
［実施例２］
イヌＰＤ−１に結合するマウス抗ヒトモノクローナル抗体の同定
イヌＰＤ−１に対するモノクローナル抗体の反応性の確認
以前にヒトＰＤ−１［その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３５４，５０９  Ｂ２号において同定された、ｈＰＤ−１．０８Ａ］に対して惹起されていたマウスモノクローナル抗体の１つが、イヌＰＤ−１とも強力に反応することが認められた。精製ｈＰＤ−１．０８Ａを、イヌＰＤ−１のＨＩＳタグＥＣＤドメインとの反応性に関してＥＬＩＳＡによって次のように試験した：ＨＩＳタグイヌＰＤ−１  ＥＣＤタンパク質を被覆緩衝液（炭酸塩／重炭酸塩、ｐＨ９．０）中で１０μｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌ／ウェルで９６ウェル平底ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）に分注する。プレートを４℃で一晩インキュベートする。その後プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＴ）で３回洗浄する。次に、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中５％脱脂乳）２００μｌを各ウェルに添加し、プレートを３７℃で６０分間インキュベートする。
【０１２０】
その後プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。次に、ブロッキング緩衝液に希釈した試験モノクローナル抗体（ｍＡｂ）１００μｌを適切なカラムの最初のウェルに添加する。その後試験ｍＡｂを適切なプレート位置に２倍希釈する。プレートを３７℃で６０分間インキュベートした後、ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄する。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ）の１：２，０００希釈物１００μｌ／ウェルをプレートに添加し、その後プレートを３７℃で６０分間インキュベートする。次にプレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＫＰＬより）１００μｌ／ウェルをプレートに添加する。３７℃で５〜２０分間、発色反応を発現させた後、６５０ｎｍで吸光度を測定する。
【０１２１】
イヌＰＤ−１タンパク質を発現するＣＨＯ細胞
完全長イヌＰＤ−１遺伝子をプラスミドｐ９６７９３にクローニングした。このプラスミドにおいてイヌＰＤ−１タンパク質の発現はｈＣＭＶプロモーターによって駆動される。ＣＨＯ  ＤＸＢ１１細胞（ｄｈｆｒ−）を、１０％ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ−α（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。プラスミドｐ９６７９３によるＣＨＯ細胞のトランスフェクションを、約６×１０６細胞を含む７５ｃｍ２フラスコ中でリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したリポソーム媒介性遺伝子送達によって実施した。４８時間後、１０％ＦＢＳおよび４００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを添加した、ヌクレオシドを含有しないＭＥＭ−α培地（選択培地）に細胞を継代した。
【０１２２】
ｄｈｆｒ＋のハイグロマイシン耐性細胞のプールに関して限界希釈クローニングを実施した。クローンを免疫蛍光アッセイによってイヌＰＤ−１の発現に関して評価した。簡単に述べると、細胞単層を８０％アセトンで９６ウェルプレート中に固定した。次に、固定して乾燥した細胞単層をポリクローナルヤギ抗ヒトＰＤ−１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、次にフルオレセイン標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（ＫＰＬ）と共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄した。蛍光を示すクローンを増殖させ、細胞株を樹立した。
【０１２３】
ＣＨＯ細胞上に発現されたイヌＰＤ−１タンパク質に対するマウスｍＡｂの反応性
ＣＨＯ細胞上のイヌＰＤ−１とマウス抗ヒトＰＤ−１  ｍＡｂの反応性を、ＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を使用した細胞ベースのアッセイによって測定した。簡単に述べると、イヌＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞を培地（ＤＭＥＭ／ＨＡＭ  Ｆ１２、１０％ＦＢＳ；「ＣＨＯ培地」）５０μｌ中で８０〜１００％の集密度まで培養した。次に、様々な濃度の精製ｍＡｂを含有する培地５０μｌを３７℃で１時間添加した。ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮで３回洗浄した後、培地中で１：１０００希釈したヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）１００μｌを３７℃で１時間添加した。ＰＢＳ−ＴＷＥＥＮでさらに３回洗浄した後、結合ｍＡｂをペルオキシダーゼ基質（ＴＭＢ）で視覚化した。４５０ｎｍでのペルオキシダーゼ活性による吸光度の増加をマイクロプレートリーダーで測定した。１Ｍリン酸５０μＬ／ウェルを添加することによって発色を停止させた。
【０１２４】
マウスおよびイヌ化抗ＰＤ−１  ｍＡｂによるリガンド遮断
イヌＰＤ−１と反応するマウス抗ヒトＰＤ−１  ｍＡｂに関して、イヌＰＤ−１を発現するＣＨＯ細胞株に基づく細胞ベースのＥＬＩＳＡ（ＣＥＬＩＳＡ）アッセイを使用した。ビオチン化ｃＰＤ−Ｌ１／Ｆｃタンパク質と共にこのアッセイを使用してリガンド遮断を確認した。簡単に述べると、ｃＰＤ−１  ＣＨＯ細胞を４×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、細胞が９５〜１００％集密になるまで３７℃で１８〜２４時間細胞をインキュベートする。細胞培養培地を吸引し、プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回およびＣＨＯ培地で１回洗浄する。３０μｇ／ｍＬから出発して、ＣＨＯ培地中で抗ｃＰＤ−１  ｍＡｂの３倍段階希釈物を作製し、各抗体希釈物５０μＬ／ウェルをプレートに添加する。３７℃、５％ＣＯ２で振とうしながら３０分間インキュベートする。ｃＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−ビオチン（ＣＨＯ培地ストック中２ｕｇ／ｍｌ）５０μＬ／ウェルを添加し、３７℃、５％ＣＯ２で振とうしながら４５分間インキュベートし続ける。プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で６回洗浄する。ＣＨＯ培地中１：２０００のストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ストレプトアビジン−ＨＲＰ）１００ｕｌ／ウェルを添加し、３７℃／５％ＣＯ２で３０〜６０分間インキュベートする。プレートをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄する。ＴＭＢ発色基質１００μｌ／ウェルを添加する。１Ｍリン酸５０μｌ／ウェルを添加することによって発色を停止させる。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用してＡ４５０〜Ａ６２０での光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定する。
【０１２５】
マウスＨｐｄ−．０８Ａ  ｍＡｂに対応するＤＮＡ配列のクローニングと同定
マウスＶＨおよびＶＬ鎖のＤＮＡ配列ならびにそれらのＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を、米国特許第８，３５４，５０９号に記載されているように同定する［米国特許第８，３５４，５０９号の表ＩＶ参照；すぐ下の表２に示されている］。
【表３】
0006701079.tif 000005
【０１２６】
［実施例３］
マウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体のイヌ化
イヌ化の工程を実施するために、イヌＩｇＧの重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を決定した。イヌ重鎖および軽鎖のＤＮＡおよびタンパク質配列は当分野で公知であり、ＮＣＢＩ遺伝子およびタンパク質データベースの検索によって入手することができる。イヌＩｇＧの４つの公知のＩｇＧサブタイプが存在し、それらはＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄと称される。イヌ抗体にはκおよびλと称される２種類の軽鎖が存在する。表３は、表２のマウス抗ヒトＰＤ−１  ＣＤＲを含有する本発明の修飾されたイヌ重（ＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−Ｄ）および軽（κ）抗体鎖のアミノ酸および核酸の両配列を列挙する。
【表４】
0006701079.tif 000006
【０１２７】
イヌ化抗ＰＤ−１抗体の構築
いかなる特定のアプローチにも拘束されるものではないが、イヌおよびマウス配列の様々な内容物を有するイヌ化抗ＰＤ−１  ｍＡｂの変異体を作製する工程は、以下の一般的なスキームを含んだ：
ｉ）マウスｍａｂのＶＨ鎖およびＶＬ鎖のＤＮＡ配列を決定する
ｉｉ）マウスｍａｂのＨ鎖およびＬ鎖ＣＤＲを同定する
ｉｉｉ）イヌＩｇＧの適切なＨ鎖およびＬ鎖を同定する
ｉｖ）イヌＩｇＧ  Ｈ鎖およびＬ鎖のＤＮＡ配列を書き出す
ｖ）内因性イヌＨ鎖およびＬ鎖ＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を、それぞれのマウスＣＤＲをコードするＤＮＡで置き換える。また、一部のイヌフレーム残基を対応するマウスフレーム領域からの選択した残基で置き換えてもよい。
【０１２８】
ｖｉ）段階（ｖ）からのＤＮＡを合成し、それを適切な発現プラスミドにクローニングする
ｖｉｉ）プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする
ｖｉｉｉ）発現された抗体をＨＥＫ２９３上清から精製する
ｉｘ）精製した抗体をイヌＰＤ−１への結合に関して試験する。
【０１２９】
上記で概説した段階は、イヌおよびマウス配列の様々な内容物を有する変異体抗体のセットをもたらした。本発明は、配列番号：２８および配列番号：３２または３４を含有するイヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体を、イヌＰＤ−１と特に強固な結合を有すると同定する。
【０１３０】
完全長イヌＰＤ−１  ＤＮＡ配列：シグナル配列に下線を付し、太字で示す。
【０１３１】
ヌクレオチド配列、配列番号：１はシグナル配列を含まず；および
ヌクレオチド配列、配列番号：３５はシグナル配列を含む。
【０１３２】
atggggagccggcgggggccctggccgctcgtctgggccgtgctgcagctgggctggtggccaggatggctcctagactcccctgacaggccctggagcccgctcaccttctccccggcgcagctcacggtgcaggagggagagaacgccacgttcacctgcagcctggccgacatccccgacagcttcgtgctcaactggtaccgcctgagcccccgcaaccagacggacaagctggccgccttccaggaggaccgcatcgagccgggccgggacaggcgcttccgcgtcatgcggctgcccaacgggcgggacttccacatgagcatcgtcgctgcgcgcctcaacgacagcggcatctacctgtgcggggccatctacctgccccccaacacacagatcaacgagagtccccgcgcagagctctccgtgacggagagaaccctggagccccccacacagagccccagccccccacccagactcagcggccagttgcaggggctggtcatcggcgtcacgagcgtgctggtgggtgtcctgctactgctgctgctgacctgggtcctggccgctgtcttccccagggccacccgaggtgcctgtgtgtgcgggagcgaggacgagcctctgaaggagggccccgatgcagcgcccgtcttcaccctggactacggggagctggacttccagtggcgagagaagacgccggagcccccggcgccctgtgccccggagcagaccgagtatgccaccatcgtcttcccgggcaggccggcgtccccgggccgcagggcctcggccagcagcctgcagggagcccagcctccgagccccgaggacggacccggcctgtggcccctctga
完全長イヌＰＤ−１アミノ酸配列：シグナル配列に下線を付し、太字で示す。
【０１３３】
アミノ酸配列、配列番号：２はシグナル配列を含まず；および
アミノ酸配列、配列番号：３６はシグナル配列を含む。
【０１３４】
MGSRRGPWPLVWAVLQLGWWPGWLLDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLEPPTQSPSPPPRLSGQLQGLVIGVTSVLVGVLLLLLLTWVLAAVFPRATRGACVCGSEDEPLKEGPDAAPVFTLDYGELDFQWREKTPEPPAPCAPEQTEYATIVFPGRPASPGRRASASSLQGAQPPSPEDGPGLWPL
イヌＰＤ−１細胞外ドメイン−ＤＮＡ配列：配列番号：３（ＣＨＯ細胞における発現のためにコドンを最適化した）
ctggattcccccgacagaccctggagccctctcaccttctcccctgcccagctgaccgtccaggaaggcgagaatgccaccttcacctgcagcctcgccgacatccccgacagcttcgtgctgaactggtacagactgagccccaggaaccagaccgacaagctggccgctttccaggaggacaggatcgaacccggcagggacaggaggtttagggtcatgaggctgcccaacggcagggacttccacatgtccatcgtggccgccagactgaacgactccggcatctacctgtgcggcgctatctacctgccccccaacacccagatcaacgagagccccagggccgaactgagcgtgacagagagaaccctggaacctcccacccagagcccttcccctcctcctagactgagcggacagctgcagggcctggtg
イヌＰＤ−１細胞外ドメイン：配列番号：４
LDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLEPPTQSPSPPPRLSGQLQGLV
イヌＰＤ−１細胞外ドメイン−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ＤＮＡ配列：配列番号：５（ＨＥＫ−２９３細胞における発現のためにコドンを最適化した）
ctggattcccccgacagaccctggagccctctcaccttctcccctgcccagctgaccgtccaggaaggcgagaatgccaccttcacctgcagcctcgccgacatccccgacagcttcgtgctgaactggtacagactgagccccaggaaccagaccgacaagctggccgctttccaggaggacaggatcgaacccggcagggacaggaggtttagggtcatgaggctgcccaacggcagggacttccacatgtccatcgtggccgccagactgaacgactccggcatctacctgtgcggcgctatctacctgccccccaacacccagatcaacgagagccccagggccgaactgagcgtgacagagagaaccctggaacctcccacccagagcccttcccctcctcctagactgagcggacagctgcagggcctggtgggtaccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
イヌＰＤ−１細胞外ドメイン−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質：シグナル配列に下線を付し、太字で示す：配列番号：６；配列番号：５３はシグナル配列を含む。
【０１３５】
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQALDSPDRPWSPLTFSPAQLTVQEGENATFTCSLADIPDSFVLNWYRLSPRNQTDKLAAFQEDRIEPGRDRRFRVMRLPNGRDFHMSIVAARLNDSGIYLCGAIYLPPNTQINESPRAELSVTERTLEPPTQSPSPPPRLSGQLQGLVGTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
完全長イヌＰＤ−Ｌ１  ＤＮＡ配列：シグナル配列に下線を付し、太字で示す。
【０１３６】
ヌクレオチド配列、配列番号：７はシグナル配列を含まず；および
ヌクレオチド配列、配列番号：３７はシグナル配列を含む。
【０１３７】
atgagaatgtttagtgtctttacattcatggcctactgccatttgctaaaagcatttacgatcacagtttctaaggacctgtatgtggtagagtatggtggcaatgtgacaatggaatgcaaattcccggtggaaaaacagttaaacttgtttgcactaatcgtctactgggaaatggaggataaaaaaattatacaatttgtgaatggaaaggaagacctgaaagttcagcacagcagctacagccagagggctcagctattgaaggaccagctcttcttggggaaggctgcgcttcagatcacagatgtgagattgcaggatgcaggggtttactgctgcttgatcggctatggcggtgctgactacaagcggattactttgaaagttcatgccccgtaccgcaacatcagccaaagaatttctgtggatcctgtcacctctgaacatgaactaatgtgtcaggctgagggttaccctgaggctgaagtcatctggacaagcagtgaccaccgagtcctgagtggcaaaaccaccatcactaattccaatagggaagagaagcttttcaatgtgaccagcacgctgaacatcaatgcaacagctaatgagattttctactgcacttttcaaagatcaggtcctgaggaaaacaatactgccgagttggtcatcccagaacgactgcccgttccagcaagtgagaggactcatttcatgattctgggacctttcctgttgcttcttggtgtagtcctggcagtcactttctgtctaaaaaaacatgggagaatgatggatgtggaaaaatgttgcacccgagataggaactcaaagaaacgaaatgatatacaatttgaagagacataa
完全長イヌＰＤ−Ｌ１：シグナル配列に下線を付し、太字で示す。
【０１３８】
アミノ酸配列、配列番号：８はシグナル配列を含まず；および
アミノ酸配列、配列番号：３８はシグナル配列を含む。
【０１３９】
MRMFSVFTFMAYCHLLKAFTITVSKDLYVVEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKVQHSSYSQRAQLLKDQLFLGKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTSEHELMCQAEGYPEAEVIWTSSDHRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRSGPEENNTAELVIPERLPVPASERTHFMILGPFLLLLGVVLAVTFCLKKHGRMMDVEKCCTRDRNSKKRNDIQFEET
イヌＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインＤＮＡ配列：配列番号：９（ＣＨＯ細胞における発現のためにコドンを最適化した）
tttaccatcaccgtgtccaaggacctgtacgtggtcgagtacggcggcaatgtgaccatggagtgcaagttccccgtggagaagcagctgaacctgttcgccctcatcgtgtactgggagatggaggacaagaagatcatccagttcgtgaacggcaaggaggacctgaaggtgcagcactccagctactcccagagagcccagctgctgaaggaccagctgttcctgggcaaggccgccctgcagatcaccgacgtgagactgcaggacgccggcgtgtattgctgcctgatcggctacggaggcgccgactacaagaggatcaccctgaaggtgcatgcaccctacaggaacatcagccagaggatcagcgtcgatcccgtgaccagcgagcacgagctgatgtgccaagccgagggctatcccgaggccgaagtgatctggaccagcagcgaccacagggtcctgagcggcaagaccaccatcaccaacagcaacagggaggagaagctgttcaacgtgaccagcaccctcaacatcaacgccaccgccaacgagatcttctactgcaccttccagaggagcggccccgaagagaacaacaccgccgagctggtgatccccgagagactgcctgtgcctgccagcgagaggacccac
イヌＰＤ−Ｌ１細胞外ドメインタンパク質：配列番号：１０
FTITVSKDLYVVEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKVQHSSYSQRAQLLKDQLFLGKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTSEHELMCQAEGYPEAEVIWTSSDHRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRSGPEENNTAELVIPERLPVPASERTH
イヌＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ  ＤＮＡ配列：配列番号：１１（ＨＥＫ−２９３細胞における発現のためにコドンを最適化した）
tttaccatcaccgtgtccaaggacctgtacgtggtcgagtacggcggcaatgtgaccatggagtgcaagttccccgtggagaagcagctgaacctgttcgccctcatcgtgtactgggagatggaggacaagaagatcatccagttcgtgaacggcaaggaggacctgaaggtgcagcactccagctactcccagagagcccagctgctgaaggaccagctgttcctgggcaaggccgccctgcagatcaccgacgtgagactgcaggacgccggcgtgtattgctgcctgatcggctacggaggcgccgactacaagaggatcaccctgaaggtgcatgcaccctacaggaacatcagccagaggatcagcgtcgatcccgtgaccagcgagcacgagctgatgtgccaagccgagggctatcccgaggccgaagtgatctggaccagcagcgaccacagggtcctgagcggcaagaccaccatcaccaacagcaacagggaggagaagctgttcaacgtgaccagcaccctcaacatcaacgccaccgccaacgagatcttctactgcaccttccagaggagcggccccgaagagaacaacaccgccgagctggtgatccccgagagactgcctgtgcctgccagcgagaggacccacggtaccgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
イヌＰＤ−Ｌ１細胞外ドメイン−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質：配列番号：１２
FTITVSKDLYVVEYGGNVTMECKFPVEKQLNLFALIVYWEMEDKKIIQFVNGKEDLKVQHSSYSQRAQLLKDQLFLGKAALQITDVRLQDAGVYCCLIGYGGADYKRITLKVHAPYRNISQRISVDPVTSEHELMCQAEGYPEAEVIWTSSDHRVLSGKTTITNSNREEKLFNVTSTLNINATANEIFYCTFQRSGPEENNTAELVIPERLPVPASERTHGTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
０８Ａ  ＶＨ：ＣＤＲ  Ｈ１  ＤＮＡ：配列番号：１３：
agttattatc tgtac
０８Ａ  ＶＨ：ＣＤＲ  Ｈ１タンパク質：配列番号：１４：
Ser  Tyr  Tyr  Leu  Tyr
０８Ａ  ＶＨ：ＣＤＲ  Ｈ２  ＤＮＡ：配列番号：１５：
ggggttaatc ctagtaatgg tggtactaac ttcagtgaga agttcaag
０８Ａ  ＶＨ：ＣＤＲ  Ｈ２タンパク質：配列番号：１６：
Gly  Val  Asn  Pro  Ser  Asn  Gly  Gly  Thr  Asn  Phe  Ser  Glu  Lys  Phe  Lys
０８Ａ  ＶＨ：ＣＤＲ  Ｈ３  ＤＮＡ：配列番号：１７：
agggattcta actacgacgg gggctttgac tac
０８Ａ  ＶＨ：ＣＤＲ  Ｈ３タンパク質：配列番号：１８：
Arg  Asp  Ser  Asn  Tyr  Asp  Gly  Gly  Phe  Asp  Tyr
０８Ａ  ＶＬ：ＣＤＲ  Ｌ１  ＤＮＡ：配列番号：１９：
agggccagca aaagtgtcag tacatctggc tttagttatt tgcac
０８Ａ  ＶＬ：ＣＤＲ  Ｌ１タンパク質：配列番号：２０：
Arg  Ala  Ser  Lys  Ser  Val  Ser  Thr  Ser  Gly  Phe  Ser  Tyr  Leu His
０８Ａ  ＶＬ：ＣＤＲ  Ｌ２  ＤＮＡ：配列番号：２１：
cttgcatcca acctagagtc t
０８Ａ  ＶＬ：ＣＤＲ  Ｌ２タンパク質：配列番号：２２：
Leu  Ala Ser  Asn  Leu  Glu  Ser
０８Ａ  ＶＬ：ＣＤＲ  Ｌ３  ＤＮＡ：配列番号：２３：
cagcacagtt gggagcttcc gctcacg
０８Ａ  ＶＬ：ＣＤＲ  Ｌ３タンパク質：配列番号：２４：
Gln  His  Ser  Trp  Glu  Leu  Pro  Leu  Thr
イヌ化マウス抗ヒトＰＤ−１抗体０８Ａ
ｃａｎＶＨ−ｃａｎＩｇＧＢ−Ｆｃ（１２Ｇ８シグナル配列に下線を付し、太字で示す）：重鎖
ヌクレオチド配列、配列番号：２７はシグナル配列を含まず；および
ヌクレオチド配列、配列番号：４１はシグナル配列を含む。
【０１４０】
ATGGCCGTGCTGGGGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTGCTAAGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGCGATCTGGTGAAGCCTGGAGGCAGCGTGAGACTGAGCTGCGTGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACCTGTACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCAAAGGACTGCAGTGGATCGGCGGCGTGAATCCTAGCAACGGCGGCACCAACTTCAGCGAGAAGTTCAAGAGCAGGGCCACCCTGAGCGTGGACAAGGCCAAGAACACCGCCTACATGCAGCTGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGAGGGACAGCAACTACGACGGCGGCTTCGACTACTGGGGACAGGGAACCCTGCTGACCGTGTCCAGCGCTTCCACAACCGCGCCATCAGTCTTTCCGTTGGCCCCATCATGCGGGTCGACGAGCGGATCGACTGTGGCCCTGGCGTGCTTGGTGTCGGGATACTTTCCCGAACCCGTCACGGTCAGCTGGAACTCCGGATCGCTTACGAGCGGTGTGCATACGTTCCCCTCGGTCTTGCAATCATCAGGGCTCTACTCGCTGTCGAGCATGGTAACGGTGCCCTCATCGAGGTGGCCCTCCGAAACGTTCACATGTAACGTAGCACATCCAGCCTCCAAAACCAAGGTGGATAAACCCGTGCCGAAAAGAGAGAATGGGCGGGTGCCTCGACCCCCTGATTGCCCCAAGTGTCCGGCTCCGGAAATGCTCGGTGGACCCTCAGTGTTTATCTTCCCTCCGAAGCCCAAGGACACTCTGCTGATCGCGCGCACTCCAGAAGTAACATGTGTAGTGGTGGACCTTGATCCCGAGGACCCCGAAGTCCAGATCTCCTGGTTTGTAGATGGGAAACAGATGCAGACCGCAAAAACTCAACCCAGAGAGGAGCAGTTCAACGGAACATACCGAGTGGTATCCGTCCTTCCGATTGGCCACCAGGACTGGTTGAAAGGGAAGCAGTTTACGTGTAAAGTCAACAATAAGGCGTTGCCTAGCCCTATTGAGCGGACGATTTCGAAAGCTAGGGGACAGGCCCACCAGCCATCGGTCTATGTCCTTCCGCCTTCCCGCGAGGAGCTCTCGAAGAATACAGTGAGCCTTACATGCCTCATTAAGGATTTCTTCCCGCCTGATATCGACGTAGAGTGGCAATCAAACGGTCAACAGGAGCCGGAATCCAAGTATAGAACCACTCCGCCCCAGCTTGACGAGGACGGATCATACTTTTTGTATTCAAAACTGTCGGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGAGAGGTGACACCTTCATCTGTGCGGTGATGCACGAAGCACTCCATAATCACTACACCCAAGAGAGCCTCTCGCATTCCCCCGGAAAGTGA
アミノ酸配列、配列番号：２８はシグナル配列を含まず；および
アミノ酸配列、配列番号：４２はシグナル配列を含む。
【０１４１】
MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGYTFTSYYLYWVRQAPGKGLQWIGGVNPSNGGTNFSEKFKSRATLSVDKAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCTRRDSNYDGGFDYWGQGTLLTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK
ｃａｎＶＨ−ｃａｎＩｇＧＡ−Ｆｃ（１２Ｇ８シグナル配列に下線を付し、太字で示す）：重鎖
ヌクレオチド配列、配列番号：２５はシグナル配列を含まず；および
ヌクレオチド配列、配列番号：３９はシグナル配列を含む。
【０１４２】
ATGGCCGTGCTGGGGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTGCTAAGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGCGATCTGGTGAAGCCTGGAGGCAGCGTGAGACTGAGCTGCGTGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACCTGTACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCAAAGGACTGCAGTGGATCGGCGGCGTGAATCCTAGCAACGGCGGCACCAACTTCAGCGAGAAGTTCAAGAGCAGGGCCACCCTGAGCGTGGACAAGGCCAAGAACACCGCCTACATGCAGCTGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGAGGGACAGCAACTACGACGGCGGCTTCGACTACTGGGGACAGGGAACCCTGCTGACCGTGTCCAGCGCTTCCACAACGGCTCCGTCGGTGTTTCCCCTGGCACCTAGCTGCGGGTCGACCTCGGGTAGCACAGTGGCGCTGGCGTGTTTGGTGTCGGGATACTTTCCCGAGCCGGTAACGGTGTCATGGAACTCAGGGTCACTTACATCAGGAGTCCATACTTTTCCGTCCGTGCTGCAGTCAAGCGGCTTGCATTCACTGTCCTCGATGGTGACGGTGCCTTCGTCGAGGTGGCCCAGCGAAACGTTCACTTGTAACGTAGTACACCCGGCCTCCAACACGAAAGTCGATAAACCGGTATTCAATGAGTGCAGATGTACAGACACCCCTCCCTGTCCGGTACCCGAACCCCTTGGAGGGCCGAGCGTCCTCATCTTCCCTCCCAAGCCAAAAGACATCTTGCGCATTACGAGGACACCAGAAGTCACGTGCGTAGTGCTTGATCTCGGTAGAGAAGATCCCGAGGTCCAGATCTCGTGGTTTGTGGATGGAAAGGAGGTCCACACCGCAAAGACTCAGTCGCGCGAGCAGCAGTTCAATGGCACGTATCGGGTCGTGAGCGTGCTTCCTATCGAGCATCAGGACTGGCTCACCGGGAAGGAGTTCAAATGCCGGGTCAATCATATCGACCTCCCGTCACCAATCGAGCGGACCATCTCGAAGGCTAGAGGAAGGGCGCACAAACCTTCGGTCTATGTGCTTCCCCCATCGCCCAAAGAGCTTTCCTCGTCGGATACGGTGTCCATTACATGCTTGATTAAGGACTTCTATCCTCCTGATATTGATGTGGAATGGCAATCAAACGGACAGCAGGAGCCGGAACGCAAGCACCGAATGACCCCACCGCAATTGGACGAAGATGGTAGCTACTTTCTCTACTCAAAGCTCTCAGTCGACAAATCCCGATGGCAGCAGGGAGATCCCTTCACTTGCGCCGTGATGCACGAGACACTCCAAAATCATTACACGGACCTTTCGTTGAGCCACTCGCCCGGAAAG
アミノ酸配列、配列番号：２６はシグナル配列を含まず；および
アミノ酸配列、配列番号：４０はシグナル配列を含む。
【０１４３】
MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGYTFTSYYLYWVRQAPGKGLQWIGGVNPSNGGTNFSEKFKSRATLSVDKAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCTRRDSNYDGGFDYWGQGTLLTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLHSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVFNECRCTDTPPCPVPEPLGGPSVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNGTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKELSSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK
ｃａｎＶＨ−ｃａｎＩｇＧＤ−Ｆｃ（１２Ｇ８シグナル配列に下線を付し、太字で示す）：重鎖
ヌクレオチド配列、配列番号：２９はシグナル配列を含まず；および
ヌクレオチド配列、配列番号：４３はシグナル配列を含む。
【０１４４】
ATGGCCGTGCTGGGGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTGCTAAGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGGCGATCTGGTGAAGCCTGGAGGCAGCGTGAGACTGAGCTGCGTGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACTACCTGTACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCAAAGGACTGCAGTGGATCGGCGGCGTGAATCCTAGCAACGGCGGCACCAACTTCAGCGAGAAGTTCAAGAGCAGGGCCACCCTGAGCGTGGACAAGGCCAAGAACACCGCCTACATGCAGCTGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCACCAGGAGGGACAGCAACTACGACGGCGGCTTCGACTACTGGGGACAGGGAACCCTGCTGACCGTGTCCAGCGCTTCAACCACAGCGCCGAGCGTGTTCCCTCTGGCGCCGTCGTGCGGTTCCACCTCGGGATCAACAGTGGCCCTCGCCTGTCTCGTGAGCGGATACTTTCCGGAGCCTGTCACGGTGTCGTGGAATAGCGGATCACTCACGTCGGGCGTGCATACTTTTCCATCCGTCTTGCAATCGAGCGGATTGTACTCACTCTCCTCAACCGTCACTGTCCCCTCGTCGCGCTGGCCCTCGGAGACTTTTACGTGCAATGTAGTCCATCCGGCGAGCAACACGAAGGTCGACAAGCCCGTACCCAAGGAATCAACATGCAAGTGCATCTCGCCCTGTCCCGTCCCCGAATCCCTTGGTGGCCCCTCAGTGTTTATCTTCCCTCCGAAGCCTAAAGACATCTTGAGAATCACAAGAACACCGGAAATCACGTGTGTGGTCCTTGACTTGGGACGCGAGGACCCTGAGGTACAAATCTCGTGGTTTGTGGACGGGAAAGAGGTGCACACAGCAAAGACACAACCACGCGAGCAGCAGTTTAACTCAACGTACAGGGTAGTATCCGTACTTCCCATTGAACACCAGGATTGGCTCACCGGTAAAGAATTCAAATGCCGAGTGAATCACATCGGGCTTCCTAGCCCAATTGAGCGGACGATTTCCAAAGCTAGGGGTCAGGCCCACCAGCCGAGCGTATACGTGTTGCCGCCCTCCCCGAAGGAGCTGTCATCGTCAGATACGGTAACGTTGACGTGTCTGATCAAAGATTTCTTTCCTCCCGAAATTGATGTGGAATGGCAAAGCAATGGGCAGCCCGAGCCCGAGTCAAAGTACCATACTACTGCACCACAGCTGGACGAAGATGGATCGTATTTCCTCTACTCGAAACTGTCCGTGGATAAGTCCCGGTGGCAGCAAGGGGACACCTTCACTTGCGCGGTCATGCACGAGGCACTTCAGAACCACTATACGGACTTGAGCCTCTCGCATTCGCCAGGGAAG
アミノ酸配列、配列番号：３０はシグナル配列を含まず；および
アミノ酸配列、配列番号：４４はシグナル配列を含む。
【０１４５】
MAVLGLLFCLVTFPSCVLSEVQLVQSGGDLVKPGGSVRLSCVASGYTFTSYYLYWVRQAPGKGLQWIGGVNPSNGGTNFSEKFKSRATLSVDKAKNTAYMQLNSLRAEDTAVYYCTRRDSNYDGGFDYWGQGTLLTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSTVTVPSSRWPSETFTCNVVHPASNTKVDKPVPKESTCKCISPCPVPESLGGPSVFIFPPKPKDILRITRTPEITCVVLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNSTYRVVSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKELSSSDTVTLTCLIKDFFPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK
ｃａｎＶＬ−ｃａｎκ（１０２２）ｘＨＧＦシグナル配列に下線を付し、太字で示す）：軽鎖
ヌクレオチド配列、配列番号：３３はシグナル配列を含まず；および
ヌクレオチド配列、配列番号：４７はシグナル配列を含む。
【０１４６】
ATGGATATGAGAGTACCTGCACAACTTCTGGGATTGCTGCTTCTTTGGCTGAGAGGGGCCCGCTGCGATATCGTCCTGACCCAGACCCCTCCTAGCCTGTCCGTGAGCCCTGGAGAACCCGCCAGCATCAGCTGCAGGGCCTCCAAGAGCGTGAGCACCAGCGGCTTCAGCTACCTGCACTGGTACAGGCAGAAGCCCGGACAGCCTCCTCAGCTGCTGATCTTCCTGGCCAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCTGACAGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGAGGATCTCCAGGGTGGAAGCCGACGACGCCGGAGTGTACTACTGCCAGCACAGCTGGGAACTGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGAACGACGCTCAGCCAGCCGTGTACCTCTTCCAGCCTTCGCCGGACCAGCTTCATACGGGGTCAGCGTCGGTGGTGTGCCTGTTGAACTCGTTTTACCCCAAGGACATTAACGTGAAGTGGAAGGTAGACGGGGTAATTCAAGACACTGGCATTCAAGAGTCCGTCACGGAACAAGACTCAAAAGACTCAACGTATTCACTGTCGTCAACCTTGACGATGTCAAGCACCGAGTATCTTAGCCATGAGCTGTATTCGTGCGAGATCACCCACAAGTCCCTCCCCTCCACTCTTATCAAATCCTTTCAGCGGTCGGAATGTCAGCGGGTCGAT
アミノ酸配列、配列番号：３４はシグナル配列を含まず；および
アミノ酸配列、配列番号：４８はシグナル配列を含む。
【０１４７】
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIVLTQTPPSLSVSPGEPASISCRASKSVSTSGFSYLHWYRQKPGQPPQLLIFLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQHSWELPLTFGQGTKVEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
ｃａｎＶＬ−ｃａｎκ（１０１１）ｘＨＧＦシグナル配列に下線を付し、太字で示す）：軽鎖
ヌクレオチド配列、配列番号：３１はシグナル配列を含まず；および
ヌクレオチド配列、配列番号：４５はシグナル配列を含む。
【０１４８】
ATGGATATGAGAGTACCTGCACAACTTCTGGGATTGCTGCTTCTTTGGCTGAGAGGGGCCCGCTGCGATATCGTCCTGACCCAGACCCCTCTGAGCCTGTCCGTGAGCCCTGGAGAACCCGCCAGCATCAGCTGCAGGGCCTCCAAGAGCGTGAGCACCAGCGGCTTCAGCTACCTGCACTGGTACAGGCAGAAGCCCGGACAGAGCCCTCAGCTGCTGATCTTCCTGGCCAGCAACCTGGAGAGCGGCGTGCCTGACAGGTTTAGCGGAAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACACTGAGGATCTCCAGGGTGGAAGCCGACGACGCCGGAGTGTACTACTGCCAGCACAGCTGGGAACTGCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGAGGAACGACGCTCAGCCAGCCGTGTACCTCTTCCAGCCTTCGCCGGACCAGCTTCATACGGGGTCAGCGTCGGTGGTGTGCCTGTTGAACTCGTTTTACCCCAAGGACATTAACGTGAAGTGGAAGGTAGACGGGGTAATTCAAGACACTGGCATTCAAGAGTCCGTCACGGAACAAGACTCAAAAGACTCAACGTATTCACTGTCGTCAACCTTGACGATGTCAAGCACCGAGTATCTTAGCCATGAGCTGTATTCGTGCGAGATCACCCACAAGTCCCTCCCCTCCACTCTTATCAAATCCTTTCAGCGGTCGGAATGTCAGCGGGTCGAT
アミノ酸配列、配列番号：３２はシグナル配列を含まず；および
アミノ酸配列、配列番号：４６はシグナル配列を含む。
【０１４９】
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCDIVLTQTPLSLSVSPGEPASISCRASKSVSTSGFSYLHWYRQKPGQSPQLLIFLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDAGVYYCQHSWELPLTFGQGTKVEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
［実施例４］
ＰＤ−１に特異的な突然変異体イヌＩｇＧ−Ｂ抗体
イヌＩｇＧの４つの公知のＩｇＧ重鎖サブタイプが存在し、それらはＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−ＣおよびＩｇＧ−Ｄと称される。２つの公知の軽鎖サブタイプはλおよびκと称される。しかし、イヌ免疫細胞の結合および活性化に加えて、ＰＤ−１に対するイヌまたはイヌ化抗体は２つの属性を有する：
１．抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能の欠如、ならびに
２．プロテインＡクロマトグラフィに基づくもののような業界標準技術を用いて大規模で容易に精製される。
【０１５０】
天然に存在するイヌＩｇＧアイソタイプはいずれも、両方の基準は満たさない。例えば、ＩｇＧ−ＢはプロテインＡを使用して精製できるが、高レベルのＡＤＣＣ活性を有する。ＩｇＧ−ＣもかなりのＡＤＣＣ活性を有する。他方で、ＩｇＧ−ＡはプロテインＡに弱く結合するが、望ましくないＡＤＣＣ活性を示す。さらに、ＩｇＧ−ＤはＡＤＣＣ活性を示さないが、ＩｇＧ−ＣまたはＩｇＧ−ＤのいずれもがプロテインＡカラムでは精製することができない。本発明は、ＰＤ−１に特異的な突然変異体イヌＩｇＧ−Ｂ抗体を提供することによってこの困難を克服する；そのような抗体はＡＤＣＣなどのエフェクター機能を欠き、業界標準のプロテインＡクロマトグラフィを用いて容易に精製することができる。正確な修飾を図４に示す。
【０１５１】
前述した低いエフェクター機能を有するＩｇＧ−Ｂ変異体は、リシン（Ｄ  ２７７）およびアスパラギン（Ｎ  ３２５）残基がそれぞれアラニン残基に変異している最初のＩｇＧ−Ｂ変異体［ｃＩｇＧＢ（−）ＡＤＣＣ］、ＩｇＧ−Ｂのヒンジ領域がＩｇＧ−Ｄのヒンジ領域によって置換されている２番目の変異体［ｃＩｇＧＢ（＋）Ｄ−ヒンジ］、およびＩｇＧ−Ｂのヒンジ領域がＩｇＧ−Ａのヒンジ領域で置換されている３番目の変異体［ｃＩｇＧＢ（＋）Ａ−ヒンジ］を包含する。加えて、２番目および３番目の変異体はまた、最初の変異体の同じリシンおよびアスパラギン残基のアラニン残基による置換も含有する。本発明における変異したリシンおよびアスパラギン残基のナンバリングは、Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．［Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，８０：２５９−２７０（２００１）］においてイヌＩｇＧ重鎖に関して述べられているナンバリングスキームに基づく。
【０１５２】
イヌＩｇＧＢ野生型
SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSE
TFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEV
QISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPP
SREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEA
LHNHYTQESLSHSPGK  配列番号：４９
イヌＩｇＧＢ（＋）Ａ−ヒンジ
SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSE
TFTCNVAHPASKTKVDKPVFNECRCTDTPPCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKATLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWF
VDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREEL
SKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHY
TQESLSHSPGK  配列番号：５０
イヌＩｇＧＢ（＋）Ｄ−ヒンジ
SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSE
TFTCNVAHPASKTKVDKPVPKESTCKCISPCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKATLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWF
VDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREEL
SKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHY
TQESLSHSPGK  配列番号：５１
イヌＩｇＧＢ（−）ＡＤＣＣ
SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSE
TFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKATLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEV
QISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFAGTYRVVSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPP
SREELSKNTVSLTCLIKDFFPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEA
LHNHYTQESLSHSPGK  配列番号：５２
【表５】
0006701079.tif 000007
0006701079.tif 000008
0006701079.tif 000009
0006701079.tif 000010
【０１５３】
本明細書で引用するすべての参考文献は、各々個々の公表文献、データベースエントリ（例えばＧｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願または特許が、参照により本明細書に組み込まれることが具体的におよび個別に指示されているかのごとく同じように参照により本明細書に組み込まれる。参照による組込みのこの声明は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従って、そのような引用が、該当する参照による組込みの声明に直接近接していない場合でも、各々が３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従って明確に特定される、ありとあらゆる個々の公表文献、データベースエントリ（例えばＧｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリ）、特許出願または特許に関連することが出願人によって意図される。参照による組込みの該当する声明が、存在する場合、本明細書内に包含されることは、いかなる意味においても参照による組込みのこの一般的な声明を弱めるものではない。本明細書での参考文献の引用は、その参考文献が関連する先行技術であることの承認とは見なされず、またこれらの公表文献または資料の内容または日付に関するいかなる承認も構成しない。
【０１５４】
本発明は、本明細書で述べる特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書で述べるものに加えて本発明の様々な変更が前記説明および添付の図面から当業者に明らかになる。そのような変更は付属の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０１５５】
前記の書面による明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本明細書で示し、説明したものに加えて本発明の様々な変更が前記説明から当業者に明らかになり、それらは付属の特許請求の範囲内に含まれる。
【図１】
0006701079.tif 000011
【図２】
0006701079.tif 000012
【図３】
0006701079.tif 000013
【図４】
0006701079.tif 000014
【配列表】
0006701079000001.app