(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１３のアミノ酸配列内２１５番目のアスパラギン（asparagine）がアルギニン（arginine）に置換、２３３番目のグリシン（glycin）がヒスチジン（histidine）に置換、及び ２３５番目のトレオニン（threonine）がグルタミン（glutamine）に置換されることを含む、ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体。
【請求項２】
前記ＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体が、配列番号１のアミノ酸配列からなるものである、請求項１に記載のＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体。
【請求項３】
請求項１に記載のＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１に記載のＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体を含むか、請求項４に記載のベクターで形質転換された、ヒスチジン（Histidine）を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項５に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
請求項５に記載のヒスチジンを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；前記培養された微生物または培地からヒスチジンを回収する段階を含み、
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、
ヒスチジン生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体及びそれを用いたヒスチジンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−ヒスチジンは２０個の標準アミノ酸のうちの１つのアミノ酸であり、栄養学的な観点から見ると、成人には多くの量が必要とされていないが、成長期の子供たちには該当する必須アミノ酸として分類される。また、Ｌ−ヒスチジンは、抗酸化と免疫調節などの重要な生理的過程に関与して胃腸潰瘍治療剤、循環器系治療剤の原料及びアミノ酸輸液製剤などの医学産業で用いられる。
【０００３】
ヒスチジンは、特にヘモグロビンに多く含まれていて、主に血分を原料とするタンパク質加水分解抽出法を用いて主に生産される。しかし、これは低い効率と環境汚染などの欠点を有している。一方、微生物発酵法を介してＬ−ヒスチジンを生産することは可能であるが、大規模な工業化はまだ行われていなかった。これはＬ−ヒスチジンの生合成がヌクレオチド合成前駆体であるＰＲＰＰと競争関係を有し、高エネルギーを必要とする複雑な生合成過程及び調整メカニズムを持っているからである。
【０００４】
発酵法に用いられる微生物のＬ−ヒスチジン生産能は、従来には、突然変異誘発及び突然変異体の選抜方法、遺伝子改良を介した菌株の新陳代謝を調節する方法で改善させた。最近微生物を用いたヒスチジンの生産はＰＲＰＰからいくつかの段階を経て生合成されると知られているが、ヒスチジン生合成に関与する酵素のうちの最初の酵素であるＡＴＰホスホリボシル転移酵素は、最終産物であるＬ−ヒスチジンまたはその誘導体によるフィードバック阻害が発生して工業的にＬ−ヒスチジンを大量生産するのに問題がある（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開特許第ＷＯ２０１４−０２９３７６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory  Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New  York, 1989
【非特許文献２】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley  & Sons, Inc., New York
【非特許文献３】Sambrook et  al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献４】Pearson et al（1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献５】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276−277
【非特許文献６】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献７】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math（1981）2:482
【非特許文献８】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353−358（1979）
【非特許文献９】Gribskov et al（1986）Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献１０】Biochimie. 2012 Mar;94（3）:829-38
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本出願者らは、Ｌ−ヒスチジンによって阻害を受けるＡＴＰホスホリボシル転移酵素を改良するために鋭意努力した結果、新たに開発したＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体を導入した微生物がＬ−ヒスチジンを高収率で製造しうることを確認し、本出願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願の一つの目的は、配列番号１３のアミノ酸配列内２１５番目のアスパラギン（asparagine）がアルギニン（arginine）に置換、２３３番目のグリシン（glycin）がヒスチジン（histidine）に置換、及び２３５番目のトレオニン（threonine）がグルタミン（glutamine）に置換されることを含む、ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体を提供することにある。
【０００９】
本出願の他の目的は、前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１０】
本出願の別の目的は、前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。
【００１１】
本出願の別の目的は、前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体及び前記タンパク質を含むように形質転換された微生物を提供することにある。
【００１２】
本出願の別の目的は、前記微生物を培地で培養する段階；前記培養された微生物または培養培地からヒスチジンを回収する段階を含むヒスチジン生産方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１３】
本出願は、ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素（ＨｉｓＧ）タンパク質を用いてヒスチジンを効率的に生産しうる方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されうる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見えない。
【００１５】
前記目的を達成するための本出願の一つの様態は、配列番号１３のアミノ酸配列内２１５番目のアスパラギン（asparagine）がアルギニン（arginine）に置換、２３３番目のグリシン（glycin）がヒスチジン（histidine）に置換、及び２３５番目のトレオニン（threonine）がグルタミン（glutamine）に置換されたことを含む、ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体を提供する。
【００１６】
本出願において、用語、「ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素（ATP Phosphoribosyltransferase、ＨｉｓＧ）」は、化学反応を触媒するグリコシルトランスフェラーゼ（glycosyltransferases）系列の酵素であって、特にペントシルトランスフェラーゼ（pentosyltransferases）に属する。この酵素の一般的な名称は、１−（５−ホスホ−Ｄ−リボシル）−ＡＴＰ：二リン酸ホスホ−α−Ｄ−リボストランスフェラーゼ（1-（5-phospho-D-ribosyl）-ATP：diphosphate phospho-alpha-D-ribosyl transferase）である。前記酵素は次のような反応を触媒する。１−（５−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｄ−ｒｉｂｏｓｙｌ）−ＡＴＰ＋ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＜−＞  ＡＴＰ＋５−ｐｈｏｓｐｈｏ−ａｌｐｈａ−Ｄ−ｒｉｂｏｓｅ １−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ。前記酵素は、ヒスチジンの生合成で最初の段階を触媒する。
【００１７】
本出願でＡＴＰホスホリボシル基転移酵素は、「ＨｉｓＧ」または「ＨｉｓＧタンパク質」と混用されうる。前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素は、公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。その例として、コリネバクテリウム属由来のＡＴＰホスホリボシル基転移酵素であってもよいが、これに制限されない。その例として、配列番号１３のアミノ酸配列であってもよいが、これに制限されるものではない。その例として、前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素は、配列番号１３のアミノ酸配列またはこれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素は、配列番号１３及び前記配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。また、このような相同性または同一性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する補助タンパク質も、本出願のＡＴＰホスホリボシル基転移酵素として用いられることは自明である。
【００１８】
本出願のＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体は、具体的には、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）由来の配列番号１３に記載されたアミノ酸配列を有するＡＴＰホスホリボシル基転移酵素でＮ末端から２３３番目のグリシン（glycin）アミノ酸残基、２３５番目のトレオニン（threonine）アミノ酸残基、または２１５番目のアスパラギン（asparagine）アミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。その例として、前記２３３番目のグリシン（glycin）アミノ酸残基はヒスチジン（histidine）、２３５番目のトレオニン（threonine）アミノ酸残基はグルタミン（glutamine）、または２１５番目のアスパラギン（asparagine）アミノ酸残基はアルギニン（arginine）に置換されたものであってもよい。
【００１９】
具体的には、前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体は、配列番号１のアミノ酸配列からなるものであってもよい。本出願でのＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと８０％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、本出願の前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体は、配列番号１及び前記配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相同性または同一性を有するポリペプチドを含んでもよい。また、このような相同性または同一性を有し、前記タンパク質に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたアミノ酸配列を有する補助タンパク質も、本出願の範囲内に含まれるのは自明である。
【００２０】
また、コドン縮退性（codon degeneracy）によって、前記配列番号１のアミノ酸配列からなる群からなるタンパク質またはそれと相同性または同一性を有するタンパク質に翻訳されうるポリヌクレオチドも含まれるのは自明である。また、公知の遺伝子配列から調製されうるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化し、配列番号１のアミノ酸配列になるタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であれば制限なく含まれてもよい。前記「厳しい条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、非特許文献１及び２）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子同士、８０％以上、具体的には、８５％以上、より具体的には、９０％以上、さらに具体的には、９５％以上、より一層具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士でハイブリッド化する。そして、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を挙げられる。
【００２１】
すなわち、本出願で「特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド」と記載されていても、その配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、本出願で用いられるのは自明である。例えば、前記変異型ポリペプチドと同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、前記アミノ酸配列の前後にタンパク質の機能を変更していない配列の追加、自然に発生しうる突然変異、そのサイレント突然変異（silent mutation）または保存的置換を除外することなく、これらの配列の追加、あるいは突然変異を有する場合でも、本願の範囲内に属するのが自明である。
【００２２】
前記「保存的置換（conservative substitution）」は、１つのアミノ酸を類似の構造的及び／または化学的性質を有する別のアミノ酸に置換させることを意味する。これらのアミノ酸置換は、一般的に残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性（amphipathic nature）での類似性に基づいて発生しうる。例えば、陽に荷電された（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み；陰に荷電された（酸性）アミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸を含み；芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含み；疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンを含む。
【００２３】
従って、本出願において、「変異型（variant）」は、「特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチド」にさらに１つ以上のアミノ酸の保存的置換（conservative substitution）及び／または変形（modification）を含んでもよい。例えば、一部の変異体は、Ｎ末端リーダー配列または膜転移ドメイン（transmembrane domain）などの１つ以上の部分が除去された変異型を含んでもよい。他の変異型は、成熟タンパク質（mature protein）のＮ末端及び／またはＣ末端から一部が除去された変異型を含んでもよい。また、変異型はポリペプチドの特性と２次構造に最小限の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含む他の変形を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは翻訳と同時に（co-translationally）または翻訳後に（post-translationally）タンパク質の転移（transfer）に関与するタンパク質Ｎ末端のシグナル（またはリーダー）配列とコンジュゲートしてもよい。また、前記ポリペプチドはポリペプチドを確認、精製、または合成できるように、他の配列またはリンカーとコンジュゲートされてもよい。前記用語、「変異型」は、変異体、変形、変異されたタンパク質、変異型ポリペプチド、変異などの用語（英語表現では、modification、modified protein、modified polypeptide、mutant、mutein、divergentなど）が用いられてもよく、変異された意味で用いられる用語であれば、これに制限されない。
【００２４】
混成化は、たとえ混成化の厳密度によって塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いに混成化が可能であるヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含みうる。
【００２５】
具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されてもよい。
【００２６】
ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている（非特許文献３参照）。
【００２７】
相同性（homology）または同一性（identity）は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と関連された程度を意味し、パーセンテージで示されてもよい。用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
【００２８】
保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は標準配列アルゴリズムによって決定されるし、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）または同一な（identical）配列は、一般的に配列全体または全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上に沿って中間または高い厳しい条件（stringent conditions）でハイブリッドしてもよい。ハイブリッドするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮されうる。
【００２９】
任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献４と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献５）（バージョン５.０.０またはそれ以降のバージョン）で実行されるような、ニードルマン−ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献６）を用いて決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al, Nucleic AcidsＲesearch 12: 387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403（1990）；Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.]（1988）SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定してもよい。
【００３０】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、非特許文献７に公知されたように、例えば、非特許文献６のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定してもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからのシンボルの全体数で同様の配列されたシンボル（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）一進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献８に開示されたように、非特許文献９の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本願で用いられたものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、配列間の関連性（relevance）を示す。
【００３１】
本出願の他の一つの様態は、前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体をコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む。
【００３２】
本出願において、用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合によって長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）で一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であり、より具体的には、前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【００３３】
本出願でＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体のアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ｈｉｓＧ遺伝子であり、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来であってもよい。遺伝暗号の縮退性（genetic code degeneracy）に起因して、 同じアミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体も、本出願に含まれるし、具体的には、配列番号２で示してもよいが、これに制限されない。
【００３４】
また、変異型ポリヌクレオチドも遺伝暗号の縮退性（genetic code degeneracy）に起因し、同じアミノ酸配列をコードする塩基配列及びその変異体も、本出願に含まれる。
【００３５】
本出願のもう一つの様態として、本出願は、前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、及び前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された微生物を提供する。具体的には、前記導入は形質転換によって行われてもよいが、これに制限されない。
【００３６】
具体的には、本出願のＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体を含む微生物は、野生型ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素を含む微生物に比べて宿主細胞の成長を阻害することなくヒスチジンの生産能が向上されるので、これらの微生物からヒスチジンを高収率で得ることができる。
【００３７】
本出願で用いられた用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的タンパク質を発現できるように、適合の調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合のｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
【００３８】
本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。
【００３９】
一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドに交替してもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行われてもよいが、これに限定されない。
【００４０】
本出願において、用語、「形質転換」は、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されない。
【００４１】
また、前記において、用語、「作動可能に連結された」というのは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と、前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００４２】
本出願で使用される用語、「ヒスチジンを生産する微生物」または「ヒスチジン生産能を有する微生物」とは、自然にヒスチジン生産能を有している微生物またはヒスチジンの生産能のない親菌株にヒスチジンの生産能が付与された微生物をを意味する。
【００４３】
前記ヒスチジンを生産する微生物は、変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むか、または変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換されて変異型ポリペプチドを発現しうる細胞または微生物であって、本出願の目的上、前記宿主細胞または微生物は、前記ＡＴＰホスホリボシル基転移酵素変異体を含むＬ−ヒスチジンを生産しうる微生物であればいずれも可能である。具体例としては、エシェリキア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、エルウィニア（Erwinia）属、エンテロバクテリア（Enterobacteria）属、サルモネラ（Salmonella）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属などの微生物菌株が含まれてもよく、具体的には、コリネバクテリウム属微生物であってもよく、より具体的な例としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよいが、これに限定されない。
【００４４】
本出願において、用語、「ヒスチジンを生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然型または変異を介してヒスチジン生産能を有しているコリネバクテリウム属微生物を意味する。コリネバクテリウム属微生物の培養物がヒスチジンを有しているのはすでに知られていた。ただし、ヒスチジンの生産能が著しく低く、生産メカニズムに作用する遺伝子やメカニズムの原理が明らかにされていない状態である。したがって、本出願でヒスチジン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、天然型微生物自体または外部ヒスチジン生産メカニズムと関連する遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性を強化させたり不活性させて、向上されたヒスチジン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。
【００４５】
本出願で「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）などであるが、必ずこれに限定されるものではない。より具体的には、本出願でコリネバクテリウム属微生物は、高濃度のヒスチジンに露出されても、細胞生長と生存に影響を少なく受けるコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよい。
【００４６】
本出願のもう一つの様態として、本出願は記述された微生物を培養する段階及び培養された微生物または培養培地からヒスチジンを回収する段階を含む、ヒスチジンを生産する方法を提供する。
【００４７】
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的には、ｐＨ６〜８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０〜４５℃、具体的には、２５〜４０℃を維持してもよく、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産されたヒスチジンは、培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。
【００４８】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。  
【００４９】
本出願の前記培養段階で生産されたヒスチジンを回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて培地または微生物から目的とするヒスチジンを回収してもよい。
【００５０】
以下、本出願の実施例により、より詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
【００５１】
実施例１．ＡＴＰホスホリボシル転移酵素（ATP phosphoribosyltransferase、ＨｉｓＧ）変異体の設計
コリネバクテリウム属微生物のＡＴＰホスホリボシル転移酵素（ATP phosphoribosyltransferase、ＨｉｓＧ）は、ヒスチジン濃度やプリン系列ヌクレオチドなどの濃度が高くなるとＡＴＰホスホリボシル転移酵素の調節部位（regulatory domain）に基質であるＡＴＰと競争、あるいは非競争的結合になって活性が弱化される。これを参考にして、ヒスチジンがＡＴＰホスホリボシル転移酵素に結合することを妨げると同時に構造的に活性が強化される変異が設計された。
【００５２】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムのＡＴＰホスホリボシル基転移酵素のＮ末端から２３３番目のグリシン（glycin）アミノ酸残基がヒスチジン（histidine）に、 ２３５番目のトレオニン（threonine）アミノ酸残基がグルタミン（glutamine）に、２１５番目のアスパラギン（asparagine）アミノ酸残基がアルギニン（arginine）に置換されたＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体（Ｎ２１５Ｒ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）が設計された（配列番号１）。前記配列番号１のＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体をコードする塩基配列は、配列番号２である。
【００５３】
実施例２．ｈｉｓＧ遺伝子クローニング及びＭａｒｋｅｒｌｅｓｓ菌株製作のための染色体挿入用ベクターの製作
実施例２−１．Ｎ２１５Ｒ変異とＧ２３３Ｈ及びＴ２３５Ｑ変異が導入されたＨｉｓＧ遺伝子クローニング及び染色体挿入用ベクターの製作
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体遺伝子を分離し、配列番号３と配列番号４のプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応を介してｈｉｓＧ遺伝子断片を得た（表１）。この時、ＰＣＲ反応は９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５２℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分３０秒重合を２５回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、約８５０ｂｐのポリヌクレオチドを取得できた。前記得られたｈｉｓＧ遺伝子の断片をＴＯＰＯベクターに接合し、製造されたベクターをpＴＯＰＯ−ｈｉｓＧと命名した。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
前記で作製したpＴＯＰＯ−ｈｉｓＧベクターを鋳型とし、前記表１と下記表２に開示されたプライマーを用いて次のようにＰＣＲを行った。１次には、ｈｉｓＧ遺伝子内に変異を導入するために、変異を起こしたい部位を中心に５’末端と３’末端に対してそれぞれＰＣＲを行った後、２次には、２つのＰＣＲ断片を結合するＰＣＲを行った。
【００５６】
具体的には、前記鋳型の５’末端は、Ｘｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｆ（配列番号３）とＣｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ−Ｒ（配列番号８）プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。前記鋳型の３’末端は、Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ−Ｆ（配列番号７）とＸｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｒ（配列番号４）プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲで得られた前記２つのＰＣＲ断片を２次ＰＣＲの鋳型とし、Ｘｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｆ（配列番号３）とＸｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｒ（配列番号４）プライマーを用いて２次ＰＣＲを行った。前記２次ＰＣＲで得られたｈｉｓＧ_Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩ（New England Biolabs、Beverly、MA）で切断した。Ｔ４リガーゼ（New England Biolabs、Beverly、MA）を用いて、染色体挿入用ベクターｐＤＣをＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のベクターに前記切断された遺伝子断片を接合して組換えベクターを製造した。製造されたベクターをｐＤＣ−ｈｉｓＧ_Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑと命名した。
【００５７】
Ｎ２１５Ｒ変異を追加で導入するために、再び２次ＰＣＲを行った。具体的には、ｐＤＣ−ｈｉｓＧ_Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑを鋳型とし、５’末端はＣｇｌ１３０３２ ｈｉｓＧ Ｎ２１５Ｒ−Ｆ（配列番号５）とＣｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ−Ｒ（配列番号８）プライマーを用いてＰＣＲで増幅し、 ３’末端はＣｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ−Ｆ（配列番号７）とＣｇｌ１３０３２ ｈｉｓＧ Ｎ２１５Ｒ−Ｒ（配列番号６）プライマーを用いてＰＣＲで増幅した。増幅された２つのＰＣＲ断片を２次ＰＣＲの鋳型とし、Ｘｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｆ（配列番号３）とＸｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｒ（配列番号４）プライマーを用いて２次ＰＣＲを行った。前記２次ＰＣＲで得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断し、Ｔ４リガーゼを用いて、染色体挿入用ベクターｐＤＣをＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のベクターに前記切断された遺伝子断片を接合してｐＤＣベクターに挿入した。ここで製造されたベクターをｐＤＣ−ｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｒ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑと命名した。前記で製作されたベクター内ｈｉｓＧ変異が導入されたかどうかは配列分析で確認した。
【００５８】
実施例２−２．既公知のＨｉｓＧ変異が導入された遺伝子のクローニング及び染色体挿入用ベクターの製作
公知のＨｉｓＧ変異遺伝子（Ｎ２１５Ｋ／Ｌ２３１Ｆ／Ｔ２３５Ａ）が導入された微生物のヒスチジン生産能と本出願の変異が導入された微生物のヒスチジン生産能を比較確認するために、公知の変異遺伝子のベクターを作製した（非特許文献１０）。
【００５９】
ＨｉｓＧ変異遺伝子（Ｎ２１５Ｋ／Ｌ２３１Ｆ／Ｔ２３５Ａ）が導入されたベクターを製作するために、前記実施例２−１と同様の方法でpＴＯＰＯ−ｈｉｓＧ ｔｅｍｐｌａｔｅベクターを鋳型とし、配列番号９と１２、配列番号１０と１１をそれぞれプライマーとして用いてＰＣＲ増幅した（表２）。増幅された２つのＰＣＲ断片を２次ＰＣＲの鋳型とし、Ｘｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｆ（配列番号３）とＸｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｒ（配列番号４）プライマーを用いて２次ＰＣＲを行った。前記２次ＰＣＲで得られた遺伝子の断片を制限酵素ＸｂａＩで切断し、Ｔ４リガーゼを用いて、染色体挿入用ベクターｐＤＣをＸｂａＩ制限酵素で切断した線状のベクターに前記切断された遺伝子断片を接合してＰＤＣベクターに挿入した。ここで製造されたベクターをｐＤＣ−ｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｋ／Ｌ２３１Ｆ／Ｔ２３５Ａと命名した。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
実施例３．ＨｉｓＧ変異遺伝子が挿入された菌株の選別
実施例３−１．ＨｉｓＧ変異遺伝子が挿入された野生型菌株の選別
実施例２で製造された、前記ＨｉｓＧ変異遺伝子を含むベクターｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｒ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑをコリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ  １３０３２（Corynebacterium glutamicum ＡＴＣＣ  １３０３２）にエレクトロポレーション法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で耐性を示す菌株を選別した。染色体上に変異遺伝子が挿入された菌株を選別するために２次組換え過程（cross-over）を行った。Ｘｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｆ（配列番号３）とＸｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｒ（配列番号４）プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の配列分析によりゲノム上に挿入されたＤＮＡ断片であるｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｒ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５ＱによってｈｉｓＧ変異遺伝子が挿入された菌株を確認し、ＡＴＣＣ１３０３２−１６１と命名した。
【００６２】
実施例３−２．ＨｉｓＧ変異遺伝子を含むベクターが挿入されたＬ−ヒスチジン生産能を有する菌株の選別
コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ  １３０３２（Corynebacterium glutamicum ATCC  13032）はヒスチジンを生産できないため、酵素の活性を測定してＬ−ヒスチジンの生産能を確認するために、Ｌ−ヒスチジン生産能を有する菌株であるＨＣＪ−８６（ＫＣＣＭ１１７９５Ｐ）を宿主細胞として用いた。
【００６３】
前記ＨＣＪ−８６は以下のように収得した。野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２活性化培地で１６時間培養して活性化させた後、活性化された菌株を１２１℃で１５分間滅菌した種培地に接種し、１４時間培養し、培養液５ｍｌを回収した。前記回収した培養液を１００ｍＭクエン酸緩衝溶液（citric buffer）で洗浄した後、最終濃度２００ｍｇ／ＬとなるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（N-Methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidine、ＮＴＧ）を添加して２０分間処理し、１００ｍＭリン酸緩衝溶液（phosphate buffer）で洗浄した。ＮＴＧで処理された菌株を最小培地に塗抹して死滅率を計算した結果、死滅率は８５％であった。
【００６４】
Ｌ−ヒスチジンの誘導体である１，２，４−トリアゾール−３−アラニン（1,2,4-triazole-3-alanine）に対する耐性を有し、Ｌ−ヒスチジン生産能を有する１種の変異株を選別した。前記変異株をＨＣＪ−８６と命名し、２０１５年１２月２２日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託して受託番号ＫＣＣＭ１１７９５Ｐを与えられた。ＨＣＪ−８６のｈｉｓＧ遺伝子の配列解析の結果、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ  １３０３２と配列が同一であり、ｈｉｓＧ遺伝子に変異はないことが確認された。
【００６５】
実施例２で製造されたＨｉｓＧ変異遺伝子を含むベクターを（ｐＤＣ−ｈｉｓＧ_Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ、ｐＤＣ−ｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｒ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ、ｐＤＣ−ｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｋ／Ｌ２３１Ｆ／Ｔ２３５Ａ）コリネバクテリウム・グルタミカムＨＣＪ−８６に電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で耐性を示す菌株を選別した。染色体上に変異遺伝子が挿入された菌株を選別するために、２次組換え過程（cross-over）を行った。Ｘｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｆ（配列番号３）とＸｂａ１−Ｃｇｌ−ｈｉｓＧ−Ｒ（配列番号４）プライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の配列分析によりゲノム上に挿入されたＤＮＡ断片ｈｉｓＧ_Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ、ｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｒ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ、ｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｋ／Ｌ２３１Ｆ／Ｔ２３５Ａによって、ｈｉｓＧ遺伝子が変異された菌株の取得を確認し、これらはそれぞれＨＣＪ−９６、ＨＣＪ−１６１、ＨＣＪ−１６２と命名された。
【００６６】
このうちＨＣＪ−１６１は２０１７年２月２７日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１９８２Ｐを与えられた。
【００６７】
また、前記２次組換え過程を経た菌株の配列を分析してｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｒ ＤＮＡ断片のみを有する菌株を選別し、これはＨＣＪ−１６３と命名された。
【００６８】
ｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｒ／Ｌ２３１Ｆ／Ｔ２３５Ａ変異を有する菌株を製造するために、ＨＣＪ−１６１菌株にベクターｐＤＣ−ｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｋ／Ｌ２３１Ｆ／Ｔ２３５Ａを電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で耐性を示す菌株を１次選別した。２次組換え過程（cross-over）を経た菌株の配列を分析して、ｈｉｓＧ遺伝子に組換えが起こった菌株の中でｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｒ／Ｌ２３１Ｆ／Ｔ２３５Ａ変異を含む菌株を２次選別した。このように選別された菌株はＨＣＪ−１６４と命名された。
【００６９】
ｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｋ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ変異を有する菌株を製造するために、ＨＣＪ−１６２菌株にベクターｐＤＣ−ｈｉｓＧ_Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑを電気穿孔法で形質転換した後、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した選別培地で耐性を示す菌株を１次選別した。２次組換え過程（cross-over）を経た菌株の配列を分析して、ｈｉｓＧ遺伝子に組換えが起こった菌株の中でｈｉｓＧ_Ｎ２１５Ｋ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ変異を含む菌株を２次選別した。このように選別された菌株は、ＨＣＪ−１６５と命名された。各菌株とＡＴＰホスホリボシル転移酵素（ATP phosphoribosyltransferase、ＨｉｓＧ）の変異形質は表３の通りである。
【００７０】
【表３】
0006789436.tif 000004
【００７１】
実施例４．ＡＴＰホスホリボシル転移酵素の活性測定
実施例４−１．ＡＴＰホスホリボシル転移酵素の収得
種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２及び実施例３で選別した菌株（ＨＣＪ−９６、ＨＣＪ−１６１、ＨＣＪ−１６２、ＨＣＪ−１６３、ＨＣＪ−１６４、ＨＣＪ−１６５）をそれぞれ接種した後、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振とう培養して種培養液を得た。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナー バッフルフラスコに、１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で４５時間２００ｒｐｍで培養した。培養後、得られた細胞を超音波破砕した後に遠心分離し、これから得られた上澄み液をＡＴＰホスホリボシル転移酵素の活性を評価するために用いた。一方、実施例４−１で用いた培地の組成は下記の表４の通りである。
【００７２】
【表４】
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【００７３】
実施例４−２．ＡＴＰホスホリボシル転移酵素の活性測定
前記実施例４−１で得られたＡＴＰホスホリボシル転移酵素野生型とＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体の活性を測定した。前記酵素の活性を把握するための評価条件は、既存の文献報告を参考にして行った（非特許文献１０）。
【００７４】
前記酵素の活性の評価のために、上澄み液はタンパク質定量をして濃度を同一に合わせた。前記酵素を試料酵素とし、反応条件は定量されたタンパク質０．０５ｍｇに計５００μｌになるように反応組成物を混合した後、３０℃で２９０ｎｍのＵＶ波長で１分３０秒の間測定した。活性が低いＡＴＰホスホリボシル転移酵素野生型は、活性測定のために上澄み液のタンパク質０．３ｍｇが使用され、２９０ｎｍのＵＶ波長で３０分間測定した。前記酵素の活性を測定するための反応液の組成は以下の通りである。
【００７５】
【表５】
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【００７６】
測定した結果、前記ＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体は、野生型酵素よりも酵素活性が増加したことを確認できた。特にＮ２１５Ｒ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ変異を有するＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体は、野生型酵素よりも約１６０倍の高い活性を示した（表６）。
【００７７】
【表６】
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【００７８】
実施例４−３．ＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体のヒスチジンによる活性阻害程度の測定
ＡＴＰホスホリボシル転移酵素野生型及び前記実施例４−１で得られたＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体のＬ−ヒスチジンによる活性抑制の程度を測定した。具体的には、それぞれ０ｍＭ、５０ｍＭ、または１００ｍＭのＬ−ヒスチジンを含む前記実施例４−２の反応組成液で、前記実施例４−２に記載された方法と同様の方法で前記酵素の活性を測定した。測定した結果、前記野生型酵素は、５０ｍＭ及び１００ｍＭのＬ−ヒスチジン濃度で活性が完全に阻害されることが確認できた。しかし、前記ＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体は、Ｌ−ヒスチジンにより活性阻害を少なく受けており、特に、Ｎ２１５Ｒ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ変異を有するＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体１００ｍＭのＬ−ヒスチジンがある組成液でも最も高い活性を示した（表７）。
【００７９】
【表７】
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【００８０】
実施例５．ＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体が導入されたＬ−ヒスチジン生産菌株の生産能の測定
前記実施例３で選別された菌株のＬ−ヒスチジン生産能を測定し、活性が増加したＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体が実際にＬ−ヒスチジンの生産に及ぼす影響を確認した。
【００８１】
種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに、親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ  １３０３２（Corynebacterium glutamicum ＡＴＣＣ  １３０３２）、及び変異株（ＡＴＣＣ１３０３２−１６１、ＨＣＪ−９６、ＨＣＪ−１６１、ＨＣＪ−１６２、ＨＣＪ−１６３、ＨＣＪ−１６４、ＨＣＪ−１６５）をそれぞれ接種した後、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振とう培養して種培養液を得た。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃で４５時間２００ｒｐｍで培養してＬ−ヒスチジンを生産するようにした。培養終了後、液体高速クロマトグラフィーを利用してＬ−ヒスチジンの生産量を測定した。詳細な分析方法及び濃度は下記表８の通りである。
【００８２】
【表８】
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【００８３】
【表９】
0006789436.tif 000010
【００８４】
その結果、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２はＬ−ヒスチジンを全く生成できなかったが、本願のＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体で形質転換されたＡＴＣＣ１３０３２−１６１は０．５ｇ／Ｌ生産することを確認した。また、ＨＣＪ−１６１は、２．３ｇ／Ｌであって、親菌株であるＨＣＪ−８６に比べて４３．７５％増加した（表９）。ＨＣＪ−８６、ＨＣＪ−９６、ＨＣＪ−１６２、ＨＣＪ−１６３、ＨＣＪ−１６４はすべて１．６〜１．９ｇ／Ｌ水準のヒスチジンが生成され、ＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体（Ｎ２１５Ｒ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）を有する菌株であるＨＣＪ−１６１が最も高い酵素活性及びＬ−ヒスチジン生産能を示すことを確認した。したがって、結果的に本願のＡＴＰホスホリボシル転移酵素変異体（Ｎ２１５Ｒ／Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）を用いて、Ｌ−ヒスチジンを高効率及び高水率で生産しうることが確認できた。
【００８５】
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００８６】
【表１０】
0006789436.tif 000011
【配列表】
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