(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列を決定する方法であって、
支持体に結合した核酸を少なくとも１つ提供するステップと、
（ｉ）少なくとも１つの核酸の同一鎖に異なる位置でハイブリダイズすることが可能な少なくとも２つのプライマーと、（ｉｉ）ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰから選択される少なくとも１つのヌクレオチドをそれぞれ含む４つの標識部分の存在下で、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記核酸を酵素と接触させるステップを含み、前記４つの標識部分はそれぞれ、その他の３つの標識部分の固有の標識とは異なる固有の標識を有する、ステップと、
前記少なくとも２つのプライマーを前記核酸の同一鎖にハイブリダイズするステップと、
前記核酸の同一鎖上で前記少なくとも２つのプライマーそれぞれにおいて、プライマー伸長を行い、複数の伸長リードを提供する、ここで前記伸長リードはそれぞれ前記少なくとも２つのプライマーの一方から伸長し、前記４つの標識部分と同じセットが各伸長に用いられる、ステップと、
前記プライマー伸長のそれぞれで取り込まれた少なくとも１つのヌクレオチド塩基に対応するシグナルデータを得るステップと、
前記シグナルデータから、前記ヌクレオチド塩基の正体を判定し、前記塩基を伸長リードに割り当てるステップとを含み、
前記少なくとも２つのプライマーは、前記複数の伸長リードがリードの一つが他のリードよりも明るくされることで化学的に区別されるように、異なるレベルのブロックプライマーおよび非ブロックプライマーを含む、方法。
【請求項２】
未結合の標識部分を除去するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の伸長リードは同時に起きる伸長リードを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記４つの標識部分はそれぞれ、単一の可逆的に終結させるヌクレオチドアナログ、または、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰから選択される可逆的ターミネータアナログを含む、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
前記酵素にはポリメラーゼまたはリガーゼが含まれる、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
前記支持体はチップまたはビーズを含む、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
前記固有の標識には色素、フルオロフォア、クロモフォア、コンビナトリアル蛍光エネルギー移動タグ、質量タグ、またはエレクトロホアが含まれる、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも２つのプライマーは、重複配列を有する、及び／又は単一塩基の追加により異なる、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
バイオインフォマティクス情報を用いて前記塩基を前記伸長リードに割り当てる、請求項１〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも２つのプライマー伸長のそれぞれに対応するシグナルデータは、同時に得られる、請求項１〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド塩基の正体を判定するステップは、前記複数の伸長リードのそれぞれで検出される前記固有の標識に対応するシグナル強度プロファイルを解析するステップを含む、請求項１〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
前記シグナルデータは１つまたは複数の画像を含み、任意で前記シグナルデータは、前記プライマー伸長において取り込まれた複数のヌクレオチドアナログに対応する色シグナルとして検出され、各色シグナルは、異なるヌクレオチドアナログまたはヌクレオチドアナログの組み合わせに対応する、１〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
１つまたは複数のシグナルデコンボリューション、シグナル改良、およびシグナル選択を含むシグナル処理のステップを含む、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
多数のベースコールが各ハイブリダイゼーションサイクルで作成される、請求項１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
前記塩基を伸長リードに割り当てるステップは、前記ヌクレオチド塩基の位置を決定するステップを含む、及び／又は前記塩基を伸長リードに割り当てるステップは、各伸長リードに対し暫定ベースコールと最終ベースコールを提供するステップを含み、
ここで、任意に、前記最終ベースコールは、前記暫定ベースコールデータと参照ゲノムとの比較により提供される、請求項１〜１４の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シーケンシング速度の上昇とシーケンシングデータ密度の増加を可能にするシーケンシング法に関する。システムは、シーケンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）などの次世代シーケンシング法に基づき得るが、核酸の同一鎖の異なる位置に結合する多数のプライマーを用いる。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ配列を解読することは、生物学的研究の事実上全ての分野において不可欠である。Ｓａｎｇｅｒシーケンシングの出現で、科学者らは、任意の所与の生物系から遺伝情報を明らかにする能力を得た。この技術は世界中の研究室で広く採用されるようになったが、科学者らが必要とする不可欠な情報をしばしば得られなくするスループット、拡張性、スピード、および解像度における固有の制限が、未だ常に該技術の妨げになっていた。これらの障壁を乗り越えるため、多数の革新的な発見のきっかけとなり、ゲノム科学において革命を引き起こした、根本的に異なるシーケンシングへのアプローチである次世代シーケンシング（ＮＧＳ）が開発された。
【０００３】
次世代シーケンシングデータ出力は、開発されて以来、毎年２倍超という、ムーアの法則を上回る速度で最初は増加した。２００７年には、単一シーケンシングランで、最高約１ギガベース（Ｇｂ）のデータを生成することが可能だった。２０１１までにその速度は単一シーケンシングランでほぼテラベース（Ｔｂ）のデータに到達し、４年でほぼ１０００倍に増加した。即時に大量のシーケンシングデータを生成する機能でもって、次世代シーケンシング法は、研究者がほんの数時間または数日間でアイディアから完全なデータセットへ素早く移ることを可能にする。研究者は今や、未だ下がり続けているゲノム当たりの試薬コストで、およそ３日間で１６人のヒトゲノムを単一ランで配列決定し、データを生成することが可能である。
【０００４】
比較すると、最初のヒトゲノムは、ＣＥ技術を用いて配列決定するのにおよそ１０年を必要とし、解析を終わらせるのに追加で３年必要とした。完成したプロジェクトは次世代シーケンシング法が発明されるほんの数年前の２００３年に発行され、３０億米ドルに近い値札が付いた。
【０００５】
最新のハイスループットシーケンシング機器は大規模なデータ出力が可能である一方、次世代シーケンシング技術は拡張性が高い。目標の研究のためのより低い出力量またはより小さいゲノムにも、同一の基礎となる化学反応を用いることが可能である。この拡張性は研究者に、特定の研究のニーズに最も合う研究を設計する柔軟性を与える。細菌／ウイルスの少量のゲノムまたはエクソームのような標的領域をシーケンシングする場合に、研究者はより出力の低い機器を用い、１回のランでより少ないサンプルを処理することを選択するか、または、ハイスループット機器において多重化することにより多くのサンプルを処理することを選択することが可能である。多重化は、単一実験の間に多数のサンプルを同時に配列決定することを可能にする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
次世代シーケンシングは出力を著しく増加させたが、シーケンシングのデータ速度およびデータ密度を増加させることには、例えば多量のゲノムを用いて作業する場合は特に、まだメリットがある。本発明は、特に次世代シーケンシング／シーケンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ）手法に適用した場合に、データ速度およびデータ密度／収率（yield）をさらに改善することを目標とする。
【０００７】
好適には、用語「ベースコール」、ベースコール、またはベースコーリングは、例えばヌクレオチドをクロマトグラムピークに割り当てることにより、塩基（ヌクレオ塩基）をシーケンシング時に得られる情報に割り当てるプロセスを指す。
【０００８】
本明細書で用いる場合、特に明記しない限り、以下の用語はそれぞれ下記の定義を有するものとする。
・Ａ−アデニン
・Ｃ−シトシン
・ＤＮＡ−デオキシリボ核酸
・Ｇ−グアニン
・ＲＮＡ−リボ核酸
・Ｔ−チミン
・Ｕ−ウラシル
【０００９】
「核酸」は任意の核酸分子を意味するものとし、該「核酸」としては、限定されるわけではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその混成物が挙げられる。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ、ならびにそれらの誘導体であり得る。これらの塩基の誘導体は当技術分野で周知であり、「PCR Systems, Reagents and Consumables（Perkin Elmer Catalogue 1996-1997, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, N.J., USA）」に例示されている。
【００１０】
ヌクレオチドの「種」は、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵを指す。
【００１１】
「質量タグ（mass tag）」は、切断可能な結合により別の実体に結合することが可能な、所定のサイズの分子実体を意味するものとする。
【００１２】
「固体基材」は、抗体または薬剤をはり付けることができる固相に存在する、任意の適切な媒体を意味するものとする。
【００１３】
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の介在値（intervening value）はそれぞれ、文脈上明白に定められていない限り下限の単位の１０分の１までが本発明に含まれ、その指定された範囲の任意の他の指定された値または介在値も本発明に含まれることを理解されたい。指定された範囲に特定の除外された限界がない限り、これらのより小さい範囲の上限と下限は独立してそのより小さい範囲に含まれてよく、それもまた本発明に含まれる。指定された範囲が限界の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限界のいずれか一方または両方を除外した範囲も本発明に含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様は核酸配列を決定するための方法を提供し、該方法は、
支持体に結合した核酸を少なくとも１つ提供するステップと、
少なくとも２つのプライマーを核酸の同一鎖にハイブリダイズするステップと、
前記核酸の同一鎖において、前記少なくとも２つのプライマーのそれぞれでプライマー伸長を行うステップと、
前記プライマー伸長のそれぞれで取り込まれた少なくとも１つのヌクレオチド塩基に対応するシグナルデータを得るステップと、
前記シグナルデータから、前記ヌクレオチド塩基の正体を判定し、前記塩基を伸長リードに割り当てるステップとを含む。
【００１５】
好適には、前記方法は、（ｉ）前記核酸の同一鎖の異なる位置にハイブリダイズすることが可能な前記少なくとも２つのプライマーと、（ｉｉ）ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰから選択されるヌクレオチドアナログを少なくとも１つ含む４つの標識部分の存在下で、複数の伸長リードを提供するハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記核酸を酵素と接触させるステップを含み、前記４つの標識部分はそれぞれ、その他の３つの標識部分の固有の標識とは異なる固有の標識を有し、前記伸長リードはそれぞれ前記少なくとも２つのプライマーの一方から伸長する。
【００１６】
前記方法は、未結合の標識部分を除去するステップを含み得る。
【００１７】
好適には、前記複数の伸長リードは、実質的に同時に起きる伸長リードを含む。
【００１８】
ある実施形態では、４つの標識部分はそれぞれ、単一の可逆的に終結させるヌクレオチドアナログ、または、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰから選択される可逆的ターミネータアナログ、または、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰから選択されるヌクレオチドアナログを少なくとも１つ含むオリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００１９】
有利なことに、少なくとも２つのプライマー伸長のそれぞれに対応するシグナルデータを、実質的に同時に得ることができる。
【００２０】
これは、シグナルデータが、同一の核酸鎖からの多数のシグナルに対応するデータを含むという利点を提供する。
【００２１】
オプションとして、シグナルデータには１つまたは複数の画像を含む。
【００２２】
オプションとして、シグナルデータは、プライマー伸長において取り込まれた複数のヌクレオチドアナログに対応する色シグナルとして検出され、ここにおいて各色シグナルは、異なるヌクレオチドアナログまたはヌクレオチドアナログの組み合わせに対応する。
【００２３】
本発明の一態様は、以下のステップの実行を含む、核酸配列を決定する方法を提供する：
（ａ）支持体に結合した核酸を少なくとも１つ提供するステップと、
（ｂ）（ｉ）前記核酸の同一鎖の異なる位置にハイブリダイズすることが可能な少なくとも２つのプライマーと、（ｉｉ）ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰから選択されるヌクレオチドアナログを少なくとも１つ含む４つのプローブの存在下で、伸長リードを複数提供するハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記核酸を酵素と接触させるステップであって、前記４つのプローブはそれぞれ、その他の３つのプローブの固有の標識とは異なる固有の標識を有し、前記伸長リードはそれぞれ前記少なくとも２つのプライマーの一方から伸長する、ステップと、
（ｃ）未結合のプローブを除去するステップと、
（ｄ）前記対応する固有標識の正体を判定することにより、ステップ（ｂ）で取り込まれた前記ヌクレオチドアナログの正体を判定するステップと、
（ｅ）ヌクレオチド塩基を伸長リードに割り当てるステップ。
【００２４】
好適には、複数の伸長リードは同時に起きる伸長リードを含む。
【００２５】
ある実施形態では、前記方法はシーケンシング・バイ・シンセシスを含み、酵素にはポリメラーゼが含まれる。
【００２６】
４つのプローブにはそれぞれ、単一の可逆的に終結させるヌクレオチドアナログ、または、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰから選択される可逆的ターミネータアナログが含まれ得る。
【００２７】
ある実施形態では、前記方法はシーケンシング・バイ・ライゲーションを含み、酵素にはリガーゼが含まれる。
【００２８】
４つのプローブはオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００２９】
オリゴヌクレオチドは、シーケンシング・バイ・ライゲーション技法で用いられる種類であり得る。
【００３０】
前記方法はシーケンシング・バイ・シンセシス、シーケンシング・バイ・ライゲーション、パイロシーケンシング、またはナノポアシーケンシングを含み得る。
【００３１】
ある実施形態では、各固有標識は異なる色として検出可能である。
【００３２】
有利なことに、２つ以上のプライマーを核酸の同一鎖だが異なる位置にハイブリダイズすると、これは、鎖のシーケンシングが２つの別個の点から始まることを可能にして多数の伸長リードを提供し、データの密度およびそれが得られる速度を潜在的に増大させる。システムが固体支持体に結合した核酸を用いる場合、例えば、次世代シーケンシング技法では、これは多数のベースコールが特定の位置それぞれで作成されることを可能にする。各ベースコールは正しい伸長リードに割り当てられ、これは核酸配列の決定を可能にする。
【００３３】
ある実施形態において、前記方法は、同一鎖の異なる位置で核酸の単一鋳型鎖に取り込まれた複数のヌクレオチド塩基を、リアルタイムで同時に特定できるという利点を提供する。
【００３４】
好適には、核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。
【００３５】
好適には、核酸は固体基材に結合する。
【００３６】
最も好適には、固体基材は、シーケンシング・バイ・シンセシス手法またはシーケンシング・バイ・ライゲーション手法で用いられる種類のものである。
【００３７】
好適には、固体基材はチップである。
【００３８】
あるいは、固体基材はビーズである。
【００３９】
オプションとして、固有標識は切断可能なリンカーを介して塩基に結合する。
【００４０】
オプションとして、固有標識は、化学的に切断可能なリンカーまたは光切断可能なリンカーを介して塩基に結合する。
【００４１】
オプションとして、固有標識は色素、フルオロフォア、クロモフォア、コンビナトリアル蛍光エネルギー移動タグ、質量タグ、またはエレクトロホアである。
【００４２】
好適には、（ａ）支持体に結合した核酸を少なくとも１つ提供するステップの後、該核酸を増幅する。
【００４３】
最も好適には、核酸をブリッジ増幅により増幅する。
【００４４】
オプションとして、前記核酸の同一鎖に異なる位置でハイブリダイズすることが可能な少なくとも２つのプライマーは、重複配列を有する。
【００４５】
オプションとして、第２プライマーは、末端に追加塩基を１つ有する第１プライマーと同じである。それぞれに追加の塩基を加えた、追加プライマーを用いることも可能である。
【００４６】
オプションとして、ブロックプライマーおよび非ブロックプライマーを用いて伸長リードを化学的に区別する。これは、正しいベースコールが正しい伸長リードに割り当てられることを確保する。
【００４７】
これは、用いる少なくとも２つのプライマーのそれぞれに対し、異なるレベルのブロックプライマーおよび非ブロックプライマーを用いることにより達成できる。
【００４８】
オプションとして、バイオインフォマティクス情報を用いて、前記塩基を伸長リードに割り当てる。
【００４９】
ある実施形態では、ヌクレオチドアナログの正体を判定するステップは、複数の伸長リードに対応するシグナルデータを検出するステップを含む。
【００５０】
複数の伸長リードのそれぞれに対応するシグナルデータは、同時に検出することができる。
【００５１】
ヌクレオチドアナログの正体を判定するステップは、伸長リードのそれぞれで検出される固有標識に対応するシグナル強度プロファイルを解析するステップを含み得る。
【００５２】
これは、各伸長リードに対応するシグナルデータにおけるシグナル強度を同時に測定するステップを含み得る。
【００５３】
オプションとして、前記方法は、強度データのヒストグラムを生成することにより、シグナルデータにおける強度測定値の分布を求めるステップを含む。
【００５４】
シグナルデータは、ステップ（ｂ）において取り込まれた複数のヌクレオチドアナログに対応する色シグナルとして検出され得、各色シグナルは、異なるヌクレオチドアナログまたはヌクレオチドアナログの組み合わせに対応する。
【００５５】
前記方法は、１つまたは複数のシグナルデコンボリューション（deconvolution）、シグナル改良、およびシグナル選択を含む、シグナル処理のステップを含み得る。
【００５６】
前記方法は、各伸長リードで最も強度の高い色シグナルを選択してベースコールを提供するステップを含み得る。
【００５７】
多数のベースコールが、各ハイブリダイゼーションサイクルで作成され得る。
【００５８】
オプションとして、塩基を伸長リードに割り当てるステップは、ヌクレオチドアナログの位置を決定するステップを含む。
【００５９】
オプションとして、塩基を伸長リードに割り当てるステップは、各伸長リードに、暫定ベースコールと最終ベースコールを提供するステップを含む。
【００６０】
オプションとして、最終ベースコールは、暫定ベースコールデータと参照ゲノムとの比較により提供される。
【００６１】
オプションとして、最終ベースコールは、暫定ベースコールデータと参照ゲノムとの比較により提供される。
【００６２】
ある実施形態では、少なくとも２つのプライマーは重複プライマーであり得る。
【００６３】
ある実施形態では、少なくとも２つのプライマーは、単一塩基の追加により異なり得る。
【００６４】
有利なことに、ある実施形態において、前記方法は、同一の核酸鎖または分子の別個の部位において実質的に同時に起きた複数のプライマー伸長に対応するシグナルデータを含むシグナルを、検出することを提供する。
【００６５】
有利なことに、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰの単一ヌクレオチドモノマーアナログ、または、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰのアナログを含むオリゴヌクレオチドプローブに対応する、わずか４つの固有標識が前記方法で必要とされ得る。
【００６６】
同一の４プローブセットが、各伸長リード向けに前記方法において好適に用いられる。
【００６７】
本明細書に従い、配列決定する核酸のそれぞれの残基に対し以下のステップを実行することを含む、核酸配列を決定する方法を提供する：
（ａ）支持体に結合した核酸を少なくとも１つ提供するステップと、
（ｂ）（ｉ）前記核酸の同一鎖の異なる位置にハイブリダイズすることが可能な少なくとも２つのプライマーと、（ｉｉ）４つの可逆的に終結させるヌクレオチドアナログ、または、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰのアナログから選択される可逆的ターミネータの存在下で、ポリメラーゼが核酸合成に触媒作用を及ぼして複数の伸長リードを提供することを可能にする条件下で、前記核酸を核酸ポリメラーゼと接触させるステップであって、前記４つのアナログはそれぞれ、その他の３つのアナログの固有標識とは異なる固有標識を有し、前記伸長リードはそれぞれプライマーから伸長する、ステップと、
（ｃ）未結合のヌクレオチドアナログを除去するステップと、
（ｄ）前記対応する固有標識の正体を判定することにより、ステップ（ｂ）で取り込まれた前記ヌクレオチドアナログの正体を判定するステップと、
（ｅ）前記塩基を伸長リードに割り当てるステップ。
【００６８】
本発明のさらに別の態様は、少なくとも１つの核酸を固定するための固体支持体を有するシーケンシング装置、ならびに、
（ｉ）前記核酸の同一鎖の異なる位置にハイブリダイズすることが可能な少なくとも２つのプライマーと、（ｉｉ）ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびｄＡＴＰから選択されるヌクレオチドアナログを少なくとも１つ含む４つのプローブの存在下で、複数の伸長リードを提供するハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記核酸を酵素と接触させるステップであって、前記４つのプローブはそれぞれ、その他の３つのプローブの固有標識とは異なる固有標識を有し、前記伸長リードはそれぞれ前記少なくとも２つのプライマーの一方から伸長する、ステップと、
未結合のプローブを除去するステップと、
前記対応する固有標識の正体を判定することにより、取り込まれた前記ヌクレオチドアナログの正体を判定するステップと、
ヌクレオチド塩基を伸長リードに割り当てるステップとにより核酸配列を決定する手段を含む、核酸配列を決定するためのシステムを提供する。
【００６９】
本発明の別の態様は、
支持体にハイブリダイズした核酸を少なくとも１つ提供するステップと、
少なくとも２つのプライマーを核酸の同一鎖にハイブリダイズして２つの伸長リードを提供するステップと、
可逆的ターミネータ塩基を用いて前記プライマーそれぞれの伸長を実行するステップと、
塩基の追加それぞれにつき前記の結合した可逆的ターミネータ塩基の画像を得るステップと、
前記画像から、前記支持体上のある位置に存在する前記複数の塩基を決定するステップと、
前記塩基を伸長リードに割り当てるステップとを含む、シーケンシング法を提供する。
【００７０】
本発明のさらに別の態様は、少なくとも１つの核酸を固定するための固体支持体を有するシーケンシング装置と、
支持体に結合した核酸を少なくとも１つ提供し、
少なくとも２つのプライマーを核酸の同一鎖にハイブリダイズし、
前記核酸の同一鎖上の前記少なくとも２つのプライマーそれぞれにおいて、少なくとも２つのプライマー伸長を実行し、
前記少なくとも２つのプライマー伸長のそれぞれで取り込まれた少なくとも１つのヌクレオチド塩基に対応するシグナルデータを得て、
前記シグナルデータから前記ヌクレオチド塩基の正体を判定し、前記塩基を伸長リードに割り当てるための手段とを含む、核酸配列を決定するためのシステムを提供する。
【００７１】
好適には、システムはシグナルデータを処理するためのシグナルプロセッサを含む。
【００７２】
本発明のさらに別の態様は、シーケンシング試薬と前記方法を実行するための指示書を含む、核酸配列を決定するためのキットを提供する。
【００７３】
本発明を例示するため、ｖ２ ＰｈｉＸクラスタを有するフローセルを用いた。標準的な構造は、図１および以下に示すように、Ｐ５、ＳＢＳ３、その後Ｔ残基、続いてゲノム挿入、ＳＢＳ８’、続いてＡ残基、およびＰ７を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】SBS3/SBS8 std PE構造。太字=P5、下線= SBS3、イタリック体= SBS8、イタリック体および太字 = P7。
【図２】図２は、調べる３チャネル（緑、橙、および赤）での、グレーンスケールの第１サイクルの個別スキャンを示す。
【図３】図３に見られるように、組み合わせシグナルにより得られる強度情報は異なることが強度ヒストグラムにより分かり、これは次に塩基情報に割り当てられて効果的なベースコールを可能にする。
【図４】図４は強度ヒストグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
図１
SBS3/SBS8 std PE構造
太字=P5、下線= SBS3、イタリック体 = SBS8、イタリック体および太字= P7
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACCACGACGCTCTTCCGATCT---挿入---
TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTAGATGTGAGAAAGGGATGGTGCTGCGAGAAGGCTAGA---挿入---
AGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TCTAGCCTTCTCGCCAAGTCGTCCTTACGGCTCTGGCTAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC
【００７６】
ＳＢＳ３、ＳＢＳ３＋Ｔ、およびＳＢＳ８’プライマーを、以下の表１に示すように両者単独でおよび組み合わせてハイブリダイズした。
【００７７】
【表１】
0006789935.tif 000002
【００７８】
シーケンシングの第１サイクルを実行し、フローセルの第１画像を得る。図２は、調べる３チャネル（緑、橙、および赤）での、グレースケールの第１サイクルの個別スキャンを示す。レーン１およびレーン３のシグナルは、３チャネルのうち異なる２つで最も強い一方、レーン４のシグナルは、Ｔ塩基およびＡ塩基の混合物が該レーンのＳＢＳ３およびＳＢＳ８’に取り込まれていることから、３チャネル全てで強い。ＳＢＳ３におけるＴの取込みは、緑チャネルと橙チャネルで強いシグナルとして現れ、赤では非常に弱い、ＳＢＳ８’におけるＡの取込みは、橙チャネルと赤チャネルにおいて強く現れ、緑チャネルでは弱いシグナルと強いシグナルが混在する。ＳＢＳ３／ＳＢＳ８’レーンは、使用した２プライマーへのＴおよびＡの取込みにより、緑チャネル、橙チャネル、および赤チャネルにおいて強いシグナルを示す。
【００７９】
図３に見られるように、組み合わせシグナルにより得られる強度情報は異なることが強度ヒストグラムにより分かり、これは次に塩基情報に割り当てられて効果的なベースコールを可能にする。上段のヒストグラムはＳＢＳ３のみに由来し、Ｔベースコールを示し、下段のヒストグラムはＳＢＳ８’のみに由来し、Ａベースコールを示す一方、中央のヒストグラムは組み合わせたＳＢＳ３／ＳＢＳ８’のヒストグラムを示し、ここでは、伸長リードそれぞれに由来するＡベースコールとＴベースコールの両方が作成されている。
【００８０】
同様に、図４は再び強度ヒストグラムを示すが、この場合は、上段のヒストグラムはＳＢＳ３＋Ｔのみに由来し、ここでベースコールはそれがゲノムＤＮＡに関連することから４塩基の何れかであり得、下段のヒストグラムはＳＢＳ８’のみに由来し、Ａベースコールを示す一方、中央のヒストグラムは組み合わせたＳＢＳ３＋Ｔ／ＳＢＳ８’のヒストグラムを示し、ここでベースコールは、それが１つの伸長リードに由来するゲノムＤＮＡに関連することから４塩基の何れかであり得る上、他の伸長リードに由来するＡのベースコールであり得、Ａ／Ａクラスタに由来する二重の強度ピークを提供する。
【００８１】
いったん強度リーディングおよびイメージングが得られたら、各シーケンシングサイクルの各位置で作成される多数のコールとともに、ベースコールを各位置で作成することが可能である。各位置での各コールを次に正しい伸長リードに割り当てることが必要である。これは化学的に、例えば、ブロックプライマーおよび非ブロックプライマーの混合物を用いることでリードの１つを他より明るくすることにより、行うことが可能である。別のオプションは、バイオインフォマティクス情報を用いて、例えばヒト挿入またはＥ．ｃｏｌｉ挿入などを用いている場合に、どれがより統計学的に「正しい」ベースコールであるかを決定することである。
【００８２】
特定の実施形態において、多数のプライマーは重複プライマーであり得る。例えば、ＳＢＳ３およびＳＢＳ３＋Ｔを各サイクルにおいて２連続塩基を配列決定するために用いて、各塩基を多数回調べることにより、より良い精度を得ることが可能であり、単一塩基の追加により異なる２つのプライマーを用いるこの場合は、各塩基は２度調べられる。
【００８３】
一部の場合では、ブロックプライマーおよび非ブロックプライマーを用いて伸長リードを化学的に区別する。例えば、プライマーの一方が開始時に完全に非ブロック状態である一方、もう一方のプライマーはブロック／非ブロックプライマーの混合であることになる。そのため、例えばプライマー１は１００％非ブロック状態であり、シーケンシングにおいて１００％のシグナルを提供することになる。その場合、「プライマー２」は例えば２５％の非ブロックと７５％のブロックの混合となり、シーケンシングにおいてこのプライマー部位からは２５％のシグナルが得られることを意味する。そのため、結果的に、２リードが２つの異なるレベル（１００％および２５％）のデータを提供することになり、これは、どの塩基がどのリードに属するかを区別することを容易にするはずである。
【００８４】
バイオインフォマティクス情報を用いて前記塩基を伸長リードに割り当てる場合、例えばリードがＡ／Ｇ、Ａ／Ｇ、Ｔ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｃ、Ａ／Ｔであれば、読み取る塩基の混合物から最も可能性のあるリード候補をバイオインフォマティクス的にサーチすることが可能である。
【００８５】
次に、有望なマッチについて、シーケンシングされるゲノムにおいてサーチを実行し、上記の塩基混合物に由来する任意の他の有望なリードとは対照的に、２リードを以下のように識別することが可能である場合がある（例えば、ＡＡＴＣＣＡはいずれのゲノムにも見られない）。
Ｒ１、ヒト、ＡＧＴＣＣＴ
Ｒ２、Ｅ.ｃｏｌｉ、ＧＡＴＧＣＡ
より長いリードは各ゲノムに固有である可能性が高いことになる。
【００８６】
シーケンシング法
本明細書に記載する方法は、種々の核酸シーケンシング技法と共に用いることが可能である。特に適用可能な技法は、核酸がアレイの一定の位置に付着し、その結果、その相対的位置が変わらず、アレイが繰り返しイメージングされるものである。画像が、例えば、あるヌクレオチド塩基種を別のものと識別するのに用いられる種々の標識と一致して、異なる色チャネルで得られる実施形態が、特定に適用可能である。一部の実施形態において、標的核酸のヌクレオチド配列を決定するプロセスは、自動化プロセスであり得る。好適な実施形態には、シーケンシング・バイ・シンセシス（「ＳＢＳ」）技法が含まれる。
【００８７】
ＳＢＳ技法には、概して、鋳型鎖に対するヌクレオチドの反復追加を通して、新生核酸鎖を酵素的に伸長させることが含まれる。ＳＢＳの従来の方法では、単一ヌクレオチドモノマーが、各送達でポリメラーゼが存在する中で、標的ヌクレオチドに提供され得る。しかしながら、本明細書に記載の方法では、２種類以上のヌクレオチドモノマーを、各送達でポリメラーゼが存在する中で標的核酸に提供することが可能である。
【００８８】
ＳＢＳは、ターミネータ部分を有するヌクレオチドモノマーまたは何れのターミネータ部分も欠くものを利用することが可能である。ターミネータを欠くヌクレオチドモノマーを利用する方法としては、例えば、以下でさらに詳細に記載するように、パイロシーケンシングおよびγ‐リン酸標識ヌクレオチドを用いるシーケンシングが挙げられる。ターミネータを欠くヌクレオチドモノマーを用いる方法では、各サイクルで加えられるヌクレオチドの数は概して可変であり、鋳型配列およびヌクレオチドの送達方式に依存する。ターミネータ部分を有するヌクレオチドモノマーを利用するＳＢＳ技法では、ターミネータは、ジデオキシヌクレオチドを利用する従来のサンガーシーケンシングの場合のように、用いるシーケンシング条件下で事実上不可逆的であり得るか、または、ターミネータは、Ｓｏｌｅｘａ（現在のＩｌｌｕｍｉｎａ社）により開発されたシーケンシング法の場合のように可逆的であり得る。
【００８９】
ＳＢＳ技法は、標識部分を有するヌクレオチドモノマーまたは標識部分を欠くものを利用することが可能である。従って、取込み事象は、標識の蛍光といった標識の特性、分子量または電荷といったヌクレオチドモノマーの特性、またはピロリン酸の放出といったヌクレオチド取込みの副産物などに基づいて検出することが可能である。実施形態において、２つ以上の異なるヌクレオチドがシーケンシング試薬に存在する場合、異なるヌクレオチドは互いに識別可能であるか、または、代わりに、２つ以上の異なる標識は用いる検出技法の下で識別不可であり得る。例えば、シーケンシング試薬に存在する異なるヌクレオチドは異なる標識を有し得、それらはＳｏｌｅｘａ（現在のＩｌｌｕｍｉｎａ社）により開発されたシーケンシング法により例示されるように、適切な光学部品を用いて識別することが可能である。
【００９０】
実施形態にはパイロシーケンシング技法が含まれる。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生鎖に取り込まれる際の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. and Nyren, P. (1996) "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release." Analytical Biochemistry 242(1), 84-9、Ronaghi, M. (2001) "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing." Genome Res. 11(1), 3-11、Ronaghi, M., Uhlen, M. and Nyren, P. (1998) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate." Science 281(5375), 363、米国特許第６２１０８９１号明細書、同第６２５８５６８号明細書、および同第６２７４３２０号明細書（これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。パイロシーケンシングでは、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼにより即時にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換されることにより検出され得、生成されるＡＴＰ量はルシフェラーゼにより生成される光子を介して検出される。配列決定する核酸はアレイのフィーチャに付着にすることが可能であり、アレイをイメージングして、アレイのフィーチャにおいてヌクレオチドの取込みにより生成される化学発光シグナルを捕捉することが可能である。画像は、アレイを特定のヌクレオチド種（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）で処置した後、得ることが可能である。各ヌクレオチド種の付加後に得られる画像は、アレイのどのフィーチャを検出するかに関して異なるだろう。これらの画像における違いは、アレイのフィーチャの異なる配列内容を反映する。しかしながら、各フィーチャの相対的位置は画像において不変であろう。画像は、本明細書に記載の方法を用いて格納、処理、および解析することが可能である。例えば、アレイをそれぞれ異なるヌクレオチド種で処置した後で得られる画像は、可逆的ターミネータに基づくシーケンシング法で異なる検出チャネルから得られる画像について本明細書で例示するのと同じ方法で、扱うことが可能である。
【００９１】
別の例示的な種類のＳＢＳでは、サイクルシーケンシングは、例えば、国際公開第０４／０１８４９７号および米国特許第７０５７０２６号明細書（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）などに記載されるように、切断可能または光脱色可能な色素標識を含有する可逆的ターミネータヌクレオチドの段階的な付加により達成される。このアプローチは、Ｓｏｌｅｘａ（現在のＩｌｌｕｍｉｎａ社）により商業化され、また、国際公開第９１／０６６７８号および同第０７／１２３７４４号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。両方の終結が可逆的である蛍光標識ターミネータおよび切断される蛍光標識が利用できることは、効果的な循環可逆的終結（cyclic reversible termination、ＣＲＴ）シーケンシングを容易にする。ポリメラーゼはまた、これらの修飾ヌクレオチドを効果的に取込み、該ヌクレオチドから伸長するように同時操作することが可能である。
【００９２】
好適には、可逆的ターミネータに基づくシーケンシングの実施形態では、標識はＳＢＳ反応の条件下において、実質的に伸長を阻害しない。しかしながら、検出標識は、例えば切断または分解により除去可能である。画像は、標識がアレイ化核酸フィーチャに取り込まれた後に捕捉することが可能である。特定の実施形態では、各サイクルは４つの異なるヌクレオチド種をアレイに同時に送達することを要し、各ヌクレオチド種はスペクトル的に別個の標識を有する。すると４つの画像を、それぞれ、該４つの異なる標識の１つに対し選択的な検出チャネルを用いて得ることが可能である。あるいは、異なるヌクレオチド種を連続的に加え、アレイの画像を各付加ステップの間で得ることが可能である。このような実施形態では、各画像は、取り込まれた特定種のヌクレオチドを有する核酸フィーチャを示すだろう。各フィーチャの異なる配列内容のために、別個のフィーチャが別個の画像に存在することも、存在しないこともあるだろう。しかしながら、フィーチャの相対的位置は画像において不変であろう。このような可逆的ターミネータ−ＳＢＳ法により得られる画像は、本明細書に記載するように、格納、処理、および解析することが可能である。画像捕捉ステップに続き、後続のヌクレオチドの付加および検出サイクルのために、標識を除去し、可逆的ターミネータ部分を除去することが可能である。標識が特定のサイクルで検出された後および後続のサイクルの前で標識を除去することは、バックグランドシグナルとサイクル間のクロストークを減少させるという利点を提供し得る。有用な標識および除去方法の例を以下に記載する。
【００９３】
特定の実施形態において、一部またはすべてのヌクレオチドモノマーは可逆的ターミネータを含み得る。このような実施形態では、可逆的ターミネータ／切断可能ｆｌｕｏｒは、３’エステルリンケージを介してリボース部分に結合したｆｌｕｏｒを含み得る（Metzker, Genome Res. 15:1767-1776 (2005)（これは参照により本明細書に組み込まれる））。他のアプローチは、ターミネータの化学作用を蛍光標識の切断から切り離している（Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102: 5932-7 (2005)（これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。Ruparel et alは、小さい３’アリル基を用いて伸長をブロックするが、パラジウム触媒を用いた手短な処置により容易にデブロックできる、可逆的ターミネータの開発について記載する。フルオロフォアを、長波長のＵＶ光に３０秒当てることにより容易に切断することができる光切断可能リンカーを介して塩基に結合した。したがって、ジスルフィド還元または光切断の何れかを光切断可能なリンカーとして用いることが可能である。可逆的終結に対する別のアプローチは、ｄＮＴＰに多量の色素を配置した後に起きる自然な終結を用いることである。ｄＮＴＰに装填された多量の色素の存在は、立体障害および／または静電気障害をくぐり抜け効果的なターミネータとして作用し得る。色素が除去されなければ、１つの取込み事象の存在がさらなる取込みを妨害する。色素の切断によりｆｌｕｏｒは取り除かれ、終結を効果的に逆転させる。修飾ヌクレオチドの例は、米国特許第７４２７６７３号明細書および同第７０５７０２６号明細書にも記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９４】
本明細書に記載の方法およびシステムと共に利用することが可能な別の例示的なＳＢＳシステムおよび方法は、米国特許出願公開第２００７／０１６６７０５号明細書、同第２００６／０１８８９０１合明細書、米国特許第７０５７０２６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２４０４３９合明細書、同第２００６／０２８１１０９号明細書、国際公開第０５／０６５８１４号、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号明細書、国際公開第０６／０６４１９９号明細書、同第０７／０１０，２５１号、米国特許出願公開第２０１２／０２７０３０５号明細書、および同第２０１３／０２６０３７２号明細書に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９５】
一部の実施形態は、４つより少ない異なる標識を用いた４つの異なるヌクレオチドの検出を利用し得る。例えば、ＳＢＳは、米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２号明細書に組み込まれた資料に記載されている方法およびシステムを利用して実行することが可能である。第１の例として、ヌクレオチド種の対は同じ波長で検出することが可能だが、これは、該対のうち一方の強度をもう一方と比較した差に基づくか、または、明白なシグナルの出現または消失を引き起こす（例えば、化学的修飾、光化学的修飾、または物理的修飾を介した）該対の一方に対する変更と、該対のもう一方で検出されるシグナルとの比較に基づいて識別することが可能である。第２の例としては、４つの異なるヌクレオチド種のうち３つを特定の条件下において検出可能である一方で、４番目のヌクレオチド種は該条件下で検出可能な標識を欠く、または、該条件下で最小限にしか検出されない（例えば、バックグランド蛍光などが原因の、最小限の検出）。最初の３つのヌクレオチド種の核酸への取り込みは、そのそれぞれのシグナルの存在に基づき求めることが可能であり、４番目のヌクレオチド種の核酸への取り込みは、任意のシグナルの欠如または該シグナルの最小限の検出に基づき求めることが可能である。第３の例としては、１つのヌクレオチド種は、２つの異なるチャネルで検出される標識を含み得る一方、他のヌクレオチド種はわずか１つのチャネルでのみ検出される。上記３つの例示的な構成は相互排他的であるとは考えられず、種々の組み合わせで用いることが可能である。３つの例を全て組み合わせる例示的な実施形態は、第１チャネルで検出される第１ヌクレオチド種（例えば、第１励起波長により励起された場合に第１チャネルにおいて検出される標識を有するｄＡＴＰ）、第２チャネルで検出される第２ヌクレオチド種（例えば、第２励起波長により励起された場合に第２チャネルにおいて検出される標識を有するｄＣＴＰ）、第１チャネルおよび第２チャネルの両方で検出される第３ヌクレオチド種（例えば、第１および／または第２励起波長により励起された場合に両チャネルにおいて検出される標識を少なくとも１つ有するｄＴＴＰ）、ならびに、いずれのチャネルでも検出されないか、または最小限にしか検出されない、標識を欠く第４のヌクレオチド種（例えば、標識を持たないｄＧＴＰ）を用いる、蛍光系ＳＢＳ法である。
【００９６】
一部の実施形態は、シーケンシング・バイ・ライゲーション技法を利用することが可能である。このような技法は、ＤＮＡリガーゼを利用してオリゴヌクレオチドを取込み、そのようなオリゴヌクレオチドの取り込みを特定する。オリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列における特定のヌクレオチドの正体と相互に関連する異なる標識を有する。他のＳＢＳ法のように、画像を、核酸フィーチャのアレイを標識化シーケンシング試薬で処置した後に得ることが可能である。各画像は、取り込まれた特定の種類の標識を有する核酸フィーチャを示すだろう。別個のフィーチャが、各フィーチャの異なる配列内容のために、別個の画像に存在することも存在しないこともあるだろうが、フィーチャの相対的位置は、画像において不変だろう。ライゲーションに基づくシーケンシング法により得られる画像は、本明細書に記載するように格納、処理、および解析することが可能である。本明細書に記載の方法およびシステムとともに利用することが可能な例示的なＳＢＳシステムおよび方法は、米国特許第６９６９４８８号明細書、同第６１７２２１８号明細書、および同第６３０６５９７号明細書に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９７】
一部の実施形態は、シーケンシング・バイ・ライゲーション技法を利用することが可能である。このような技法は、ＤＮＡリガーゼを利用してオリゴヌクレオチドを取込み、そのようなオリゴヌクレオチドの取り込みを特定する。オリゴヌクレオチドは、典型的には、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズする配列における特定のヌクレオチドの同一性と相互に関連する異なる標識を有する。他のＳＢＳ法のように、画像を、核酸フィーチャのアレイを標識化シーケンシング試薬で処置した後に得ることが可能である。各画像は、取り込まれた特定の種類の標識を有する核酸フィーチャを示すだろう。別個のフィーチャが、各フィーチャの異なる配列内容のために、別個の画像に存在することも存在しないこともあるだろうが、フィーチャの相対的位置は、画像において不変だろう。ライゲーションに基づくシーケンシング法により得られる画像は、本明細書に記載するように格納、処理、および解析することが可能である。本明細書に記載の方法およびシステムとともに利用することが可能な例示的なＳＢＳシステムおよび方法は、米国特許第６９６９４８８号明細書、同第６１７２２１８号明細書、および同第６３０６５９７号明細書に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
シーケンシング・バイ・ライゲーションは、２塩基プローブを光で繰り返しまたは長期にわたり照射することを必要とするシーケンシングとして周知の方法である。シーケンシング・バイ・シンセシスを用いる例示的なシステムとしては、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州カールスバッド、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるＳＯＬｉＤ（商標）システムが挙げられる。簡単に言えば、シーケンシング・バイ・ライゲーションの方法は、シーケンシングプライマーを鋳型ビーズに固定されたアダプター配列にハイブリダイズするステップを含む。４つの蛍光標識された２塩基プローブの組は、シーケンシングプライマーへのライゲーションを競う。２塩基プローブの特定は、各ライゲーション反応において第１塩基および第２塩基をそれぞれ調べることにより達成される。一連のライゲーションサイクルの後、伸長産物は除去され、鋳型は、ライゲーションサイクルの第２ラウンドで、ｎ−１位置に対し相補的なシーケンシングプライマーを用いてリセットされる。多数のライゲーションサイクル、検出、および切断が、最終的なリード長を決定するサイクル数で行われる。
【００９９】
加えて、本明細書に記載の方法および解決策は、核酸のアレイから配列決定するのに特に有用であり得、この場合、各位置の各ヌクレオチドをその特定可能な標識に基づき特定することが可能であることから、多数の配列を多数のアレイ上の位置から同時に読み取ることが可能である。例示的な方法は、米国特許出願公開第２００９／００８８３２７号明細書、同第２０１０／００２８８８５号明細書、および同第２００９／０３２５１７２号明細書に記載されている。
【０１００】
一部の実施形態は、ナノポアシーケンシング（Deamer, D. W. & Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing." Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000)、Deamer, D. and D. Branton, "Characterization of nucleic acids by nanopore analysis". Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin, and J. A. Golovchenko, "DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater. 2:611-615 (2003)（これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））を利用することが可能である。このような実施形態では、標的核酸はナノポアを通過する。ナノポアは、合成ポアまたはα−ヘモリシンなどの生体膜タンパク質であり得る。標的核酸がナノポアを通過する際、ポアの電気コンダクタンスの変動を測定することにより、各塩基対を特定することが可能である（米国特許第７００１７９２号明細書、Soni, G. V. & Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing using solid-state nanopores." Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)、Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DNA analysis." Nanomed. 2, 459-481 (2007)、Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. & Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution." J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)（これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる））。ナノポアシーケンシングにより得られるデータは、本明細書に記載するように格納、処理、および解析することが可能である。特にデータは、本明細書に記載する光学画像および他の画像の例示的処置に従って、画像として処置することが可能である。ある実施形態では、単一ポアを用いてＤＮＡ鎖を保持することができ、それに対し２つ以上のプライマーをハイブリダイズする。次に、光学系シーケンシング・バイ・シンセシスを実行することができる。
【０１０１】
一部の実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを伴う方法を利用することが可能である。ヌクレオチドの取り込みは、例えば米国特許第７３２９４９２号明細書および同第７２１１４１４号明細書（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ−ホスフェート標識ヌクレオチドの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の相互反応を介して検出することが可能であるか、または、ヌクレオチドの取り込みは、例えば米国特許第７３１５０１９号明細書（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようにｚｅｒｏ−ｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓを用いて、ならびに、例えば米国特許第７４０５２８１号明細書および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号明細書（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、蛍光ヌクレオチドアナログおよび操作されたポリメラーゼを用いて、検出することが可能である。照射は、蛍光標識ヌクレオチドの取り込みを低バックグラウンドで観察することが可能であるように、表面係留ポリメラーゼの周りのゼプトリットルスケールの体積に制限することができる（Levene, M. J. et al. "Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations." Science 299, 682-686 (2003)、Lundquist, P. M. et al. "Parallel confocal detection of single molecules in real time." Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)、Korlach, J. et al. "Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nano structures." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。このような方法で得られた画像は、本明細書に記載のように格納、処理および分析することができる。ある実施形態では、２つのポリメラーゼが各ウェルの底に存在し得、それぞれが、同一の鋳型分子に結合した異なるプライマーから配列データを生成する。
【０１０２】
いくつかのＳＢＳ実施形態は、ヌクレオチドが伸長産物に取り込まれる際に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出されたプロトンの検出に基づくシーケンシングは、電気検出器およびＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ社（コネチカット州ギルフォード、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の子会社）より商業的に入手可能な関連技法、または、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書、同第２００９／０１２７５８９号明細書、同第２０１０／０１３７１４３号明細書、もしくは同第２０１０／０２８２６１７号明細書（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載のシーケンシング法およびシステムを用いることが可能である。具体的には、本明細書に記載の方法を用いて、プロトンを検出するのに用いられるアンプリコンのクローン集団を生成することが可能である。パイロシーケンシング法を用いる実施形態では、核酸の鎖につき２つ以上のプライマーを用いることは、デコンボルブ（deconvolve）する単位時間当たりでより多くのシグナルを意味し得る。パイロシーケンシング法では、Ｔがフラッシュされた際の通常の２倍のｐＨの低下は、プライマーの１つがＴＴ取り込みを有すること、または、各プライマーが単一のＴ取り込みを有することを意味し得る。
【０１０３】
上記方法は、多数の異なる標的核酸を同時に操作するように、多重形式で有利に実行することが可能である。特定の実施形態では、異なる標的核酸を共通の反応器または特定の基材の表面において処置することが可能である。これは、シーケンシング試薬の好都合な送達、未反応試薬の除去、および取り込み事象の検出を、多重方式で可能にする。表面結合した標的核酸を用いる実施形態では、標的核酸はアレイ形式であり得る。アレイ形式では、標的核酸は典型的には、空間的に識別可能なやり方で表面に結合することが可能である。標的核酸は、直接共有結合、ビーズもしくは他の粒子への結合、または、表面に付着するポリメラーゼもしくは他の分子へ結合することにより、結合し得る。アレイは、標的核酸の単一コピーを各部位（フィーチャともいう）で含むことが可能であるか、または、同一配列を有する多数のコピーが各部位またはフィーチャに存在することが可能である。以下にさらに詳細に記載するように、ブリッジ増幅またはエマルジョンＰＣＲなどの増幅法により多数のコピーを生成することが可能である。
【０１０４】
本明細書に記載の方法は、例えば、少なくともおおよそ、１０フィーチャ／ｃｍ２、１００フィーチャ／ｃｍ２、５００フィーチャ／ｃｍ２、１０００フィーチャ／ｃｍ２、５０００フィーチャ／ｃｍ２、１００００フィーチャ／ｃｍ２、５００００フィーチャ／ｃｍ２、１０００００フィーチャ／ｃｍ２、１００００００フィーチャ／ｃｍ２、５００００００フィーチャ／ｃｍ２以上といった種々の密度の何れかでフィーチャを有するアレイを用いることが可能である。
【０１０５】
本明細書に記載の方法の利点は、複数の標的核酸の迅速かつ効果的な並列検出を提供することである。したがって、本開示は、上記で例示したものなどの当技術分野で既知の技法を用いて核酸を調製および検出することができる、統合システムを提供する。したがって、本開示の統合システムは、増幅試薬および／またはシーケンシング試薬を１つまたは複数の固定ＤＮＡ断片に送達することが可能な流体コンポーネントを含み得、該システムは、ポンプ、バルブ、リザーバ、および流体ラインなどのコンポーネントを含む。フローセルは、標的核酸の検出用の統合システムにおいて構成される、および／または、用いることが可能である。例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８号明細書および米国特許出願番号第１３／２７３６６６号明細書に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に記載されている。フローセルで例示されるように、統合システムの１つまたは複数の流体コンポーネントを増幅法および検出法に用いることが可能である。核酸シーケンシングの実施形態を例にとると、統合システムの１つまたは複数の流体コンポーネントは、本明細書に記載の増幅法、および、上記で例示するようなシーケンシング法におけるシーケンシング試薬の送達に用いることが可能である。あるいは、統合システムは、増幅法を実行するためおよび検出法を実行するための、別個の流体システムを含むことが可能である。増幅核酸を作成し、核酸配列を決定することも可能な統合シーケンシングシステムの例としては、限定されるわけではないが、ＭｉＳｅｑ（商標）プラットフォーム（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、および米国特許出願番号１３／２７３，６６６号（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている装置が挙げられる。
【０１０６】
核酸増幅
一部の実施形態では、固定ＤＮＡ断片を、米国特許第７９８５５６５号明細書および同第７１１５４００号明細書（これらの各内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の開示により例示されるように、クラスタ増幅技法を用いて増幅する。米国特許第７９８５５６５号明細書および同第７１１５４００号明細書に組み込まれた材料は、固定核酸分子のクラスタまたは「コロニー」からなるアレイを形成するために増幅産物を固体支持体に固定することを可能にする、固相核酸増幅法を記載する。このようなアレイ上の各クラスタまたはコロニーは、複数の同一の固定ポリヌクレオチド鎖および複数の同一の固定ポリヌクレオチド相補鎖から形成される。このように形成されたアレイは、概して、本明細書では「クラスタ化アレイ」という。米国特許第７９８５５６５号明細書および同第７１１５４００号明細書に記載されるような固相増幅反応産物は、固定ポリヌクレオチド鎖と固定相補鎖の対をアニールすることにより形成される、いわゆる「ブリッジ状」構造であり、両鎖は５’末端で好適には共有結合を介して固体支持体に固定される。クラスタ増幅技法は、固定核酸鋳型を用いて固定アンプリコンを生成する方法の例である。他の適切な手法を用いて、本明細書で提供する方法に従い生成された固定ＤＮＡ断片から固定アンプリコンを生成することも可能である。例えば、１つまたは複数のクラスタもしくはコロニーは、各増幅プライマー対の一方のプライマーが固定されていても、両方のプライマーが固定されていても、固相ＰＣＲを介して形成され得る。
【０１０７】
他の実施形態では、固定ＤＮＡ断片は溶液中で増幅される。例えば、一部の実施形態では、固定ＤＮＡ断片は固体支持体から切断されるか、さもなければ解放され、増幅プライマーが次に解放された分子に溶液中でハイブリダイズする。他の実施形態では、増幅プライマーは、１つまたは複数の初期の増幅ステップで固定ＤＮＡ断片にハイブリダイズし、その後、溶液中で後続の増幅ステップが続く。したがって、一部の実施形態では、固定核酸鋳型を用いて液相アンプリコンを生成することが可能である。
【０１０８】
本明細書に記載のまたは当技術分野で一般的に知られている増幅手法の何れも、固定ＤＮＡ断片を増幅するためにユニバーサルなまたは標的特異的なプライマーと共に利用することが可能であることが理解されよう。適切な増幅法としては、限定されるわけではないが、米国特許第８００３３５４号明細書（これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ＴＭＡ（transcription mediated amplification）、およびＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）が挙げられる。上記の増幅法を用いて、対象の１つまたは複数の核酸を増幅することが可能である。例えば、マルチプレックスＰＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡ、およびＮＡＳＢＡなどを含むＰＣＲを利用して、固定ＤＮＡ断片を増幅することが可能である。一部の実施形態では、対象の核酸に特異的に向けられるプライマーが増幅反応に含まれる。
【０１０９】
他の適切な核酸増幅法としては、オリゴヌクレオチドの伸長およびライゲーション、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)（これは参照により本明細書に組み込まれる））、ならびにオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（概して、米国特許第７５８２４２０号明細書、同第５１８５２４３号明細書、同第５６７９５２４号明細書、同第５５７３９０７号明細書、欧州特許第０ ３２０ ３０８号明細書、同第０ ３３６ ７３１号明細書、同第０ ４３９ １８２号明細書、国際公開第９０／０１０６９号、同第８９／１２６９６号、および同第８９／０９８３５号を参照されたい（これらは全て、参照により組み込まれる））技法を挙げることが可能である。これらの増幅手法を、固定ＤＮＡ断片を増幅するために設計することが可能であることが理解されよう。例えば、一部の実施形態では、増幅法として、ライゲーションプローブ増幅、および、対象の核酸に特異的に向けられるプライマーを含有するオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）反応を挙げることが可能である。一部の実施形態では、増幅法として、対象の核酸に特異的に向けられるプライマーを含有するプライマー伸長ライゲーション反応を挙げることが可能である。プライマー伸長および対象の核酸を増幅するために特異的に設計され得るライゲーションプライマーの非限定的例として、増幅は、米国特許第７５８２４２０号明細書および同第７６１１８６９号明細書（これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に例示されるように、ＧｏｌｄｅｎＧａｔｅ ａｓｓａｙ（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）に用いられるプライマーを含み得る。
【０１１０】
本開示の方法で用いることが可能な例示的な等温増幅法としては、限定されるわけではないが、例えば、Dean et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)により例示される多置換増幅（ＭＤＡ）、または、例えば米国特許第６２１４５８７号明細書により例示される等温鎖置換核酸増幅が挙げられ、該引用文献はそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示で用いることが可能な他のＰＣＲに基づかない方法としては、例えば、Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995、米国特許第５４５５１６６号明細書、同第５１３０２３８号明細書、およびWalker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)などに記載されている鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または、Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003)などに記載されている多分岐鎖置換増幅が挙げられ、該引用文献はそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。等温増幅法は、ゲノムＤＮＡのランダムなプライマー増幅のために、鎖置換Ｐｈｉ２９ポリメラーゼまたはＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの大断片、５’->３’ｅｘｏ−と一緒に用いることが可能である。これらのポリメラーゼの使用は、その高い処理能力および鎖置換活性を活用する。高い処理能力は、ポリメラーゼが長さ１０〜２０ｋｂの断片を生成することを可能にする。上記に記載するように、より小さい断片は、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼといった処理能力および鎖置換活性の低いポリメラーゼを用いる等温条件下で生成することが可能である。増幅反応、条件、およびコンポーネントについての追加の記載は、米国特許第７６７０８１０号明細書の開示に詳細に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
本開示で有用な別の核酸増幅法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるGrothues et al. Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993)に記載される、ランダム３’領域に続き定常５’領域を有する２ドメインプライマーの集団を用いるタグ付きＰＣＲである。増幅の第一ラウンドを実行して、ランダムに合成された３’領域からの個別のハイブリダイゼーションに基づく熱変性したＤＮＡにおいて、多数の開始を可能にする。３’領域の性質のため、開始部位はゲノム全体にわたってランダムであると考えられる。その後、未結合のプライマーを除去することができ、さらに、複製を定常５’領域に相補的なプライマーを用いて行うことが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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