(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シグナル経路に向けられる、ＥＲ及び／又はＰＲ陽性且つＨＥＲ２陰性の癌を患う患者に対する療法の適合性を評価するために、前記患者を層別化するための方法であって、
（ｉ）近接ライゲーションアッセイを適用して、前記患者の組織試料内で、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、並びに、ＴＡＦ、ＴＢＰ、ＰＯＬＩＩ、ＴＦＩＩ、ｐ３００、ＣＲＥＢ及びＣＢＰを含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質の存在を検出することによって、ＥＲ及び／又はＰＲシグナル経路の活性化状態を決定するステップであり、前記少なくとも１つのメンバーは、転写因子複合体の一部であり、前記少なくとも１つのタンパク質は、前記ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバーと同じ転写因子複合体の一部である、ステップ、
を含み、
前記層別化は、ステップ（ｉ）において決定された前記活性化状態に基づき、さらに、前記療法の適合性は、前記層別化に基づき評価され、
前記ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバーが、核内で、前記ＴＡＦ、ＴＢＰ、ＰＯＬＩＩ、ＴＦＩＩ、ｐ３００、ＣＲＥＢ及びＣＢＰを含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質のすぐ近くに位置している場合に、ステップ（ｉ）のシグナル経路は活性であると決定される、方法。
【請求項２】
前記ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバーはＥＲ二量体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉｉ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイを適用して、前記患者の同じ又は異なる組織試料において、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、及び、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ（ＡＰ１）、ＳＰ１、ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡ−転写因子、ＮＦｋａｐｐａＢファミリー、ｃ／ＥＢＰタンパク質、ＦＯＸＯ、ＳＭＡＤ転写因子タンパク質を含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質の存在を検出することによって、ステップ（ｉ）において評価される前記シグナル経路とは異なるシグナル経路の活性化状態を決定するステップをさらに含み、
前記層別化が、さらに、ステップ（ｉｉ）において決定される前記活性化状態に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｉｉｉ）前記患者の組織試料内のセリン３０５にてＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバーのリン酸化状態を決定するステップをさらに含み、
前記層別化が、さらに、ステップ（ｉｉｉ）において決定される前記リン酸化状態に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ｉｖ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイを適用することによって、ステップ（ｉ）において評価される前記シグナル経路とは異なり、さらに、ＰＩ３Ｋ経路、Ｗｎｔ経路、ヘッジホッグ（ＨＨ）経路、ＮＦｋａｐｐａＢ、Ｎｏｔｃｈ経路、ＴＧＦｂｅｔａ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＭＴの経路、ＡＲ、ＲＡＲ、ＰＰＡＲ、グルココルチコイド、ＶｉｔＤの経路のような他の核内受容体経路、並びに、インスリンＧＦ及びＥＧＦのような成長因子経路を含む群から選択される１つ又は複数のシグナル経路の活性化状態を決定するステップであり、前記患者の同じ又は異なる組織試料が使用されるステップをさらに含み、
前記層別化が、さらに、ステップ（ｉｖ）において決定される前記活性化状態に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（ｖ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイを適用して、ＰＫＢ／Ａｋｔのリン酸化状態を測定することにより、前記患者の同じ又は異なる組織試料において、活性のＰＫＢ／Ａｋｔタンパク質を検出することによって、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態を決定するステップをさらに含み、
前記層別化が、さらに、ステップ（ｖ）において決定される前記活性化状態に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｖｉ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイを適用して、前記患者の同じ又は異なる組織試料において、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、及び、少なくとも１つの成分の存在を検出するステップであり、前記少なくとも１つの成分は、いかなるＥＲＥ（エストロゲン応答要素）ハーフサイトでも、又は、いかなる非ＥＲＥサイトでも存在することが予想され、さらに／或いは、前記少なくとも１つの成分は、ＡＰ１、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質／ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡ−転写因子、ＮＦｋａｐｐａＢ、ＳＰ１、Ｃ／ＥＢＰ、ＦＯＸＯ、及び、ＳＭＡＤの転写因子タンパク質を含む群から選択されるステップをさらに含み、
前記層別化が、さらに、ステップ（ｖｉ）における前記検出に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
患者の疾患の予後診断のための方法であって、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法を行うステップを含み、前記予後診断は、決定された前記活性化状態に基づく、方法。
【請求項９】
療法に対する患者の療法抵抗性の予測及び／又は検出のための方法であって、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法を行うステップを含み、前記予測及び／又は検出は、決定された前記活性化状態に基づく、方法。
【請求項１０】
−  転写因子、転写因子複合体、又は、転写因子複合体の一部である受容体のエピトープに対して作られた第１の抗体、及び、
−  対応するコアクチベータータンパク質のエピトープに対して作られた第２の抗体であって、該当する場合、前記（コアクチベーター）タンパク質は、前記転写因子複合体と同じ転写因子複合体の一部である、第２の抗体、
を含むキットの、請求項１に記載の方法における使用。
【請求項１１】
−  転写因子、転写因子複合体、又は、転写因子複合体の一部である受容体のエピトープに対して作られた第１の抗体、及び、
−  対応するコアクチベータータンパク質のエピトープに対して作られた第２の抗体であって、該当する場合、前記（コアクチベーター）タンパク質は、前記転写因子複合体と同じ転写因子複合体の一部である、第２の抗体、
を含むキットの、請求項８に記載の方法における使用。
【請求項１２】
−  転写因子、転写因子複合体、又は、転写因子複合体の一部である受容体のエピトープに対して作られた第１の抗体、及び、
−  対応するコアクチベータータンパク質のエピトープに対して作られた第２の抗体であって、該当する場合、前記（コアクチベーター）タンパク質は、前記転写因子複合体と同じ転写因子複合体の一部である、第２の抗体、
を含むキットの、請求項９に記載の方法における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に、患者に対する標的療法等の療法の適合性を評価するために患者、好ましくは癌患者を層別化するための改善された方法に関し、その療法は、好ましくは、エストロゲン受容体（ＥＲ）及び／又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）シグナル経路に向けられている（他の適した経路も本明細書において以下に記載される）。本発明は、さらに、患者、好ましくは癌患者の疾患、好ましくは癌の予後診断のための方法、並びに、療法に対する患者、好ましくは癌患者の療法抵抗性の予測及び／又は検出のための方法に関する。さらに、本発明は、新規のキット及び対応するその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１は、エストロゲン作用を標的にした内分泌／ホルモン療法の失敗に関連している細胞シグナル経路を開示している。非特許文献１に開示された、特定の経路が活性であるかどうかを示す方法は、医療分野における診断及び療法応答予測の改善を目的として改善されるべきである。
【０００３】
非特許文献２は、乳癌増殖及び内分泌療法抵抗性を支配する協調されたＰＲの迅速且つ非古典的な転写効果を調査している。
【０００４】
非特許文献３は、ヒト乳腺腫瘍細胞における内在性ＥＲα／ＰＩ３Ｋ及びＥＲα／Ｓｒｃ相互作用の検出について報告している。
【０００５】
非特許文献４は、原発性の浸潤性乳癌を有する患者にとって最適な治療を決定するための、現存するマーカーに対する補完としてのバイオマーカーの調査に関係している。
非特許文献６は、プロゲスチンが、サイクリンＤ１プロモーターにて、及び、協調された迅速且つ転写の効果を介してＡＰ−１、Ｓｔａｔ３、ＰＲ及びＥｒｂＢ−２間で転写複合体のアセンブリを誘発し、その複合体はエンハンセオソームとして機能しているということを開示している。
非特許文献７は、Ｅｒα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体が、乳癌細胞株の細胞質内に存在するということを実証するＰＬＡアッセイを開示している。
非特許文献８は、原発性浸潤乳癌を有する患者にとって最適な治療を決定するための、現存するマーカーに対する補体としてのバイオマーカーの調査に関係している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”  ｂｙ  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｖｏｌｕｍｅ９，ｐａｇｅｓ６３１ｔｏ６４３（２００９）
【非特許文献２】“Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｌｏｎｇ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３  ａｎｄ  ＥｒｂＢ−２  ｇｏｖｅｒｎｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”  ｂｙ  Ｄｉａｚ  Ｆｌａｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌｕｍｅ１５，  Ｎｕｍｂｅｒ６，  ｐａｇｅ  Ｒ１１８（２０１３）
【非特許文献３】“Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｐｉｄ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ”，  ｂｙ  Ｐｏｕｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｖｏｌｕｍｅ４，  Ｎｕｍｂｅｒ１１，  ｐａｇｅｓ１２００ｔｏ１２１３（２０１２）
【非特許文献４】“Ｔｈｅ  Ａｋｔ／ｍＴＯＲ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓ−ａ  ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”，  Ｌｉｎｋｏｐｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｓ，  Ｎｏ．１３７９（２０１３）
【非特許文献５】Ｗｅｉｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ７（３），  ｐａｇｅｓ  ４０１−４０９  （２０１０）；“Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ：  ａ  ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｔｏｏｌｂｏｘ”
【非特許文献６】Ｆｌａｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｌｏｎｇ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １，  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ３  ａｎｄ  ＥｒｂＢ−２  ｇｏｖｅｒｎｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”，１７  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１３，  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ｖｏｌ．１５，  ｎｏ．６，  ＤＯＩ：１０．１１８６／ＢＣＲ３５８７
【非特許文献７】Ｐｏｕｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｐｉｄ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ”，５  Ｏｃｔｉｂｅｒ  ２０１２，  ＥＭＢＯ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ｖｏｌ．４，  ｎｏ．１１，  ＤＯＩ：１０．１００２／ｅｍｍｍ．２０１２０１６１５
【非特許文献８】Ｂｏｓｔｎｅｒ，  Ｊｏｓｅｆｉｎｅ，“Ｔｈｅ  Ａｋｔ／ｍＴＯＲ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｓ−ａ  ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔａｍｏｘｉｆｅｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”，  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，１２  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在の染色アッセイは、例えば、ＥＲ経路を標的にする薬物が使用された場合のＥＲ経路の活性化及び療法応答に関連していると既知である細胞核内のＥＲ染色のような、細胞内の又は癌細胞における特定の位置の（（活性の）転写因子、若しくはそれぞれ、転写因子複合体ではなく）１つのタンパク質の発現を染色することに基づいている。しかし、そのような単一タンパク質の染色は、活性である経路の証拠を提供しない。例えば、ＥＲの場合、単一タンパク質は、活性なＥＲ転写因子複合体内にない場合にも核内に存在することができる。
【０００８】
乳癌における日常的な病理学の染色は、ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２染色を伴う。ＥＲ及びＰＲは、通常、１％（ＵＳ）又は１０％（ＥＵ）を超える癌細胞がそれぞれ核ＥＲ又はＰＲを発現する場合に陽性であると考慮される。これは、これらの経路がそれぞれの患者において活性であるという指標として使用される。陽性の試験結果に要求される陽性の癌細胞の最小の割合はセンター間で異なる。これらの患者は、ホルモン（抗ＥＲ経路）治療に対する候補者であると考慮される。ＥＲ陽性患者は、（ネオアジュバント、アジュバント又は転移性設定の）ホルモン療法を用いて治療される。しかし、２５〜５０％の患者が、治療に応答しないか又は治療に抵抗性になる。従って、改善された療法応答予測のためのアッセイが要求される。
【０００９】
そのような従来のＥＲ染色は、予後診断目的でも使用される。しかし、ＥＲ陽性グループ内で、多くの患者が、元々予測されたものよりも悪い予後を有するように思われる。これは、改善された予後診断アッセイを要求する。
【００１０】
抗ＥＲ経路療法に応答しないＥＲ陽性グループの患者内で、例えばＨＥＲ２経路、Ｗｎｔ経路、ＨＨ（ヘッジホッグ）経路等、ＥＲ経路ではなく別の腫瘍駆動シグナル経路に関連している一次又は二次の多数の生化学的抵抗性機構が説明されてきた（抵抗性に関する詳細は、本明細書において以下にさらに記載されることになる）。ホルモン療法に抵抗性のＥＲ陽性患者における１つ又は複数の抵抗性経路を示すアッセイが必要とされる。
【００１１】
上記のことを考慮して、患者に対するホルモン療法等の好ましくは、ＥＲ及び／又はＰＲシグナル経路に向けられる療法の適合性を評価するために、患者、好ましくは癌患者、特に乳癌又は前立腺癌患者、特にＥＲ及び／又はＰＲ陽性且つＨＥＲ２陰性の乳癌患者を層別化するための改善された方法を提供することが本発明の主な目的である。本発明と関連させて取り組むことができるさらなるシグナル経路は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）シグナル経路、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）シグナル経路、ＶｉｔＤ経路、及び、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）シグナル経路を含むが、それらに限定されない。本発明のさらなる目的は、患者、好ましくは癌患者の疾患、好ましくは癌の予後診断のための、並びに、特定の療法に対する患者、好ましくは癌患者の療法抵抗性の予測及び／又は検出のための改善された方法の提供に関する。本発明の根底にあるさらなる目的が、以下の本明細書、及び、特に付随の特許請求の範囲を研究した場合に明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の主な目的は、好ましくはエストロゲン受容体（ＥＲ）及び／又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）シグナル経路に向けられる、患者に対する療法、好ましくはホルモン療法の適合性を評価するために、患者、好ましくは癌患者を層別化するための方法によって達成され、当該方法は、
（ｉ）近接ライゲーションアッセイを適用して、患者の組織試料内、好ましくは腫瘍組織試料内、より好ましくは生検試料内で、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、並びに、ＴＡＦ、ＴＢＰ、ＰＯＬＩＩ、ＴＦＩＩ、ｐ３００、ＣＲＥＢ及びＣＢＰを含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質の存在を検出することによって、ＥＲ及び／又はＰＲシグナル経路の活性化状態を決定するステップであって、上記の少なくとも１つのメンバーは、転写因子複合体の一部であり、上記の少なくとも１つのタンパク質は、同じ転写因子複合体の一部である、ステップ、
を含み、
層別化は、ステップ（ｉ）において決定された活性化状態に基づき、さらに、療法の適合性は、層別化に基づき評価される。
【００１３】
そのような方法の好ましい実施形態が、特許請求の範囲及び本明細書において以下に記載される。
【００１４】
ＥＲ（上記を参照）に関して、通常α及びβと呼ばれる２つの異なる形のＥＲがあり、それぞれ、別の遺伝子（それぞれＥＳＲ１及びＥＳＲ２）によってコードされる。ホルモンにより活性化されるエストロゲン受容体は二量体を形成し、さらに、上記の２つの形は、多くの細胞型において共発現されるため、受容体は、ＥＲα（αα）又はＥＲβ（ββ）のホモ二量体又はＥＲαβ（αβ）のヘテロ二量体を形成することができる。従って、ＥＲファミリーの少なくとも１つのファミリーメンバーは、好ましくは、ＥＲα、ＥＲβを含む群から選択されて、ＥＲαα（ホモ二量体）、ＥＲββ（ホモ二量体）及びＥＲαβ（ヘテロ二量体）、或いは、例えばＡＰ１（Ｆｏｓ、Ｊｕｎ）若しくはＮＦｋａｐｐａＢファミリー又はＣＲＥＢのメンバーのような別の転写因子を有するヘテロ二量体を形成し、本発明の目的に対して、少なくとも１つのメンバーは、好ましくはＥＲタンパク質である。
【００１５】
上記のように、本発明の方法と関連させて好ましくは検出されることになる上記のＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバーは、転写因子複合体の一部である。「転写因子複合体」という用語は、少なくとも２つの転写因子又はそれぞれタンパク質を含むか又はそれらから成る複合体を意味する。例えば、そのような転写因子複合体は、１つ又は複数のホモ二量体及び／又はヘテロ二量体、好ましくはＥＲ単量体若しくは二量体、並びに／又は、上記の群から選択される１つ又は複数の、好ましくは２つ以上のタンパク質（例えばｐ３００）を含んでもよい。
【００１６】
ＰＲ経路の活性状態は、上記の方法と同様に決定することができる。２つのプロゲステロン受容体、ＰＲ−Ａ及びＰＲ−Ｂがあり、これらは、リガンドプロゲステロンの結合によって活性化され、これらの受容体を、ＣＲＥＢ／ｐ３００のようなＥＲ結合コアクチベーターに類似であり且つ標的遺伝子のプロモーター領域内の特定の応答要素に結合する活性の転写因子に変え、その特定の応答要素からはｍＲＮＡが作製される。
【００１７】
本発明による（本明細書において記載される）方法は、癌患者の層別化、特に、乳癌又は前立腺癌患者の、特に、ＥＲ及び／又はＰＲ陽性且つＨＥＲ２陰性の乳癌患者の層別化に特に適している。特に、本発明による方法は、患者に対するホルモン療法の適合性を評価するために有利に使用することができる。
【００１８】
癌は、世界中で主な死亡原因であり、２００８年においては７６０万の死（全ての死の約１３％）に相当している。そのうち、４５８０００の死は、乳癌によっておそらく起きた。乳癌は、世界中の女性において最も一般的な癌（女性における全ての癌のうち約１６％）であり、男性にも発症し得るが、それははるかに少ない頻度である（１００の乳癌のうち１つの乳癌のみが男性において診断されている）。いくつか異なる形の乳癌が存在し、従って、異なる治療が必要でもある。乳癌を治療する従来の方法は、多くの場合アジュバント化学療法及び／又は放射線療法と組み合わされた（原発性）腫瘍の外科的除去であった。疾患機構のさらなる理解が、パラダイムシフトを、細胞を非選択的に殺す（重度の副作用を引き起こす）ことはないが疾患の原因である異常を含有する細胞が非常に特異的に攻撃される（個別化療法、個別化医療又はプレシジョン医療としても記載される）いわゆる標的療法に導いた。
【００１９】
そのような標的治療に対する最も顕著な例は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅによる（トラスツズマブとして既知の）ハーセプチンである。ハーセプチンは、（ＨＥＲ２／ｎｅｕ又はｅｒｂｂ２として既知の）ＨＥＲ２受容体に結合する。ＨＥＲ２の過剰発現は、細胞シグナル（最も顕著：ＰＩ３Ｋ経路及びＭＡＰＫ経路）の過剰活性化をもたらし、最終的に、異常な細胞増殖をもたらす。
【００２０】
別の例は、規定の（＞１〜１０％；上記を参照）割合の癌細胞がＥＲ及び／又はＰＲを発現する乳癌の治療であった。これらの受容体は、ＥＲ及びＰＲのシグナル経路をそれぞれ活性化することができる。それらの症例は、ホルモン（又は内分泌）療法を用いて治療される。それらの療法は、エストロゲンの生成を阻止するか、又は、限られたＥＲ結合部位に対してエストロゲンと競合する（例えば、タモキシフェンは、そのようなエストロゲン類似体である）。
【００２１】
最初の（すなわち、癌が存在しているかどうか定める）診断に対して、通常、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色が、疑わしい組織の生検試料又は薄切片に対して行われる。この組織は、新鮮凍結組織、又は、より一般的にはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を含む。
【００２２】
癌が診断された場合、どの種類の標的療法が（仮にあるとすると）患者に利点を提供するかを決定するためにさらなるテストが行われる必要がある。現在のガイドライン（例えば、乳癌を治療するためのＮａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ（ＮＣＣＮ）のガイドライン等）においては、上記の受容体分子（ＨＥＲ２、ＥＲ、ＰＲ）の存在／過剰発現に対する病理組織学的テストが、フォローアップとして記載されている。これらのテストは、通常、診断に対するＨ＆Ｅ染色と同じ組織試料／ブロック由来の組織スライドであるが、その試料の異なる薄切片に対して行われる免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイの形で実行される。例えばＨＥＲ２−ＩＨＣに対する代わりとして（又は、ＩＨＣの結果が不明瞭である場合に）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）が、ＨＥＲ２−遺伝子の増幅を測定するために行われることが頻繁にある。
【００２３】
これらのテストによると、次に患者は、４つの以下の乳癌クラスのうちの１つに属しているとして層別化される。
（１）ＥＲ若しくはＰＲ（又はその両方）に対して陽性であり、且つ、ＨＥＲ２に対して陰性である
→ホルモン受容体陽性乳癌
（２）ＥＲ及びＰＲのどちらに対しても陰性であるが、ＨＥＲ２に対して陽性である
→ＨＥＲ２陽性乳癌
（３）ＥＲ若しくはＰＲ（又はその両方）に対して陽性であり、且つ、ＨＥＲ２に対して陽性である
→ホルモン受容体陽性ＨＥＲ２陽性乳癌
（４）全ての受容体に対して陰性
→いわゆる、トリプルネガティブ乳癌
（付け足しの発言：ＥＲ又はＰＲが陽性である場合、治療に対して（現在）同じ影響を有するため、（ＥＲ又はＰＲのどちらを意味するかに言及することなく）ホルモン受容体陽性と呼ぶことができる）。
【００２４】
乳癌患者に限定されることはないけれども、本発明は、本発明の一態様によると、乳癌患者の層別化、特に、上記の乳癌クラスのクラス（１）に属する乳癌患者（すなわち、ＥＲ／ＰＲ＋且つＨＥＲ２−）に注目している。クラス（１）は、乳癌において最も蔓延しているタイプである。
【００２５】
どのマーカーに対して患者が陽性であるとテストされたかに応じて、すなわち、上述の乳癌クラスのうちどのクラスに患者が属しているかに応じて、異なる治療が、最適な療法である。それらのマーカーとは無関係で、化学療法及び／又は放射線療法が適用されなければならないかどうかが決定される必要がある。上記のマーカー、又はそれぞれ、クラスに基づき、標的療法のうちの１つを適用することができる／適用するべきであるかどうかを決定することができる。
（１）患者が、ＥＲ又はＰＲの発現に対して陽性であるとテストされた場合、内分泌治療が最適な療法である。従って、治療の種類はここでも、患者が閉経前又は閉経後であるかどうかという第１の有益な情報における患者のホルモン状態次第である。
薬物ベースのアプローチが選ばれる場合、以下の可能性が存在する。
（ｉ）乳房組織におけるエストロゲン受容体へのエストロゲン結合を阻止すること（他の組織においてはアゴニスト作用を有しながらのアンタゴニスト作用）によって機能する選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）を使用すること；最もよく知られた例：タモキシフェン；
（ｉｉ）体がアロマターゼ酵素を介してエストロゲンを作るのを防ぐアロマターゼ阻害物質（ＡＩ）を使用すること；例は：アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、フェマーラ（レトロゾール）及びファドロゾールである；
（ｉｉｉ）エストロゲン受容体を下方制御することによって機能するエストロゲン受容体アンタゴニストを使用すること；例：フルベストラント。
（２）ＨＥＲ２に対して陽性の患者はＨＥＲ２特異的治療を受けることができ、ＨＥＲ２特異的治療は、トラスツズマブ及びペルツズマブ等のＨＥＲ２（若しくはＨＥＲ２ファミリー）受容体に特異的な抗体、又は、ラパチニブ等のチロシンキナーゼ阻害物質（ＴＫＩ）、或いは、その組み合わせを含む。
（３）患者が、ＨＥＲ２に対しても、ホルモン受容体のうちの１つに対しても陽性である場合、どちらの状態も標的にされるため、（１）及び（２）において記載された治療の組み合わせが選ばれる。
（４）３つの受容体全てが陰性であるとテストされ；これは、標的とされた療法のうちいずれも適用されず、化学療法のような代わりとなるアプローチが選ばれなければならないということを意味する。
【００２６】
ＩＨＣは証明された臨床値を有するけれども、単なるタンパク質の存在ではそのシグナル活動に関する指標を与えないという事実に関して制限される。通常、タンパク質が活動的にシグナル伝達しているかどうかを伝えることが可能であるためには、そのリン酸化状態を検出するか、又は、他のタンパク質との複合体を形成しているかどうか検出する方法が必要である。
【００２７】
従って、関連性のある相互作用が、特に、多数のタンパク質の凝集によって引き起こされ、タンパク質の相互作用が、特定の経路（転写因子複合体）の活性化を示し得る。それらの近さは、おそらく、腫瘍駆動経路の同定、従って、上記腫瘍の治療に対する関連性のある情報である。例えば古典的なＥＲ経路において、ＥＲは、ＰＬＡを使用して検出することができる二量体として核に入る。核に入った後で、多くの因子を含む転写因子複合体が形成され（図１を参照）、そのうちいずれかの２つが、ＰＬＡアッセイに対する根拠（標的）として役立ち得る。核におけるＥＲ又は例えば一般的な補因子ｐ３００の単なる存在は無意味であり得るが、その近さは、完全に機能的な転写因子複合体の形成を示し、従って、遺伝子のセットの活性な転写を示す。
【００２８】
上記に加えて、近接ライゲーションアッセイが、画像分析及び定量化を、ＩＨＣ／ＩＦと比較してより容易且つより信頼できるものにする等、いくつかのさらなる利点を可能にする。特に、近接ライゲーションアッセイは、別々のシグナル（ドット）を生成し、（ｉｎ  ｓｉｔｕシグナル増幅により）単一分子の相互作用を測定することができ、高い感度が得られ、さらに、バックグラウンドシグナル／自家蛍光による問題はより少ない（シグナルは、ノイズからより容易に分けることができる（ドット対「スミア」））。さらに、改善され且つ単純化された画像分析によって、自動化された画像分析及びより正確な定量化が促進される。
【００２９】
近接ライゲーションアッセイ（（参照により本明細書において含まれる）非特許文献５が比較されたい。方法のアニメーションをここで見つけることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｏｕｔｕｂｅ．ｃｏｍ／ｗａｔｃｈ？ｖ＝ＫｂｐＵＵ７ｊＱＴＦ８＆）は、２つのタンパク質エピトープのコロケーションについて報告する能力を持つ方法である。この方法は、ＤＮＡオリゴでラベルされた２つの抗体を使用する。オリゴはどちらも、抗体がそのエピトープを見つけた後で試料に添加される２つの二次ＤＮＡオリゴから閉環を形成することが必要とされる。閉ループが形成されると、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が使用されて、環状プローブの何百ものコピーを作製する。後に、フルオロフォアでラベルされた相補プローブが、２つのタンパク質が同じ場所に配置された所において非常に明るいスポットをもたらすＲＣＡ産物にアニールされる。
【００３０】
例えば、Ｏｌｉｎｋ  Ｓ．Ａ．，  ＳｗｅｄｅｎからのＤｕｏｌｉｎｋ近接ライゲーションアッセイを、本発明に関連して使用することができる。しかし、他の可能性も除外されない。
【００３１】
上記のように、癌治療における鍵となる問題は、（上記の）クラス（１）に属する乳癌患者のうち多くの割合の患者が、上記の療法（ＥＲアンタゴニスト、ＳＥＲＭ又はＡＩ）に反応しない、又は、しばらくして抵抗性になるということであり、そのような抵抗性は、多くの場合、活性化されている他の経路によって媒介される。例えば、ＥＲ＋乳癌において細胞にとってホルモン依存を免れる１つの方法は、ＰＩ３Ｋ経路の過剰活性化である。言い換えると、それらの細胞においては、もはやＥＲ経路が癌を駆動するのではなく、ＰＩ３Ｋ経路が乗っ取り、代わりに療法によって標的にされるべきである。ＥＲアルファからＥＲアルファ／ＥＲベータのヘテロ二量体又はＥＲベータのホモ二量体への切り替えも、薬物への抵抗性を誘発する方法であり得る。さらなる抵抗性の機構が存在し、さらに、追加の例が、特に、本発明による方法の好ましい実施形態に関連して、以下においてさらに記載されることになる（特に、以下においてさらに記載されるステップ（ｉｉ）から（ｖｉ）を参照）。
【００３２】
さらに、（単なる）ＥＲ受容体の過剰発現の検出では、ＥＲシグナルが疾患進行の原因であるという証拠にはならない。これに関して、従来技術において知られる今日のアプローチの明らかな欠点は、現在のＥＲ診断テストではＥＲ経路が、ＥＲが検出される癌細胞において実際に活性であるかどうかを決定することができないということである。これは、適切な治療に対して所望の特異性を用いて患者を正確に分類する価値を下げる。
【００３３】
上記の問題、又は、それぞれ欠点は、例えば（古典的な）ＥＲ経路の活性の正確な決定、好ましくは、（特に、本発明による方法の好ましい実施形態と関連して以下においてさらに記載される）関連性のある「回避」又はそれぞれ「抵抗性」の経路の活性の正確な決定も可能にする（本明細書において上記の）本発明による方法によって取り組まれる。
【００３４】
本発明者等は、本明細書において記載される本発明の方法を使用することによって、（ＥＲタンパク質の核内の存在のみがＥＲ経路活性化に対する指標として受け取られる標準的に使用される方法とは対照的に）病理組織学診断に対して標準的に使用される組織試料内の細胞におけるタンパク質レベルで、古典的なＥＲ経路のような典型的な経路の実際の活性化状態を測定することが可能であるということを見つけた。
【００３５】
さらに、組織試料から空間情報及び単一細胞情報を得ることが、（本明細書において記載される）本発明の方法を用いて可能である一方、Ｍｕｓｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるアプローチは、試料全体にわたってシグナルを平均する。例えば、単一細胞レベルにて空間情報を得ることは、例えば活性化されたＥＲ経路を有する細胞の割合を計算するために、組織内のどの細胞の中でＥＲ経路が活性化されているかを決定するのに必要である。例えば、本発明の方法を、他の組織バイオマーカー染色と組み合わせることによって、どのバイオマーカーが１つの細胞において共に活性であるかを同定することが可能になり、これは、療法の選択のために重要であり得る。比較して、これは、組織スライドから単離されたＲＮＡ／ＤＮＡから経路活性が推測される場合に可能ではない。そのような他のバイオマーカーは、例えば、ＤＮＡ突然変異、又は、別の経路のシグナルタンパク質若しくは転写因子であり得、同じ細胞内に存在する場合にホルモン療法に抵抗性を与え得る。
【００３６】
上記のように、本明細書において記載されるように層別化される（癌）患者は、好ましくは、乳癌又は前立腺癌患者であり、その結果、（本明細書において記載される）本発明の方法と関連して使用されることになる組織試料は、好ましくは、乳癌又は前立腺癌患者からのものである。さらに好ましいのは、癌患者がＥＲ及び／又はＰＲ陽性且つＨＥＲ２陰性の乳癌患者であり、その結果、組織試料がＥＲ及び／又はＰＲ陽性且つＨＥＲ２陰性の乳癌患者からのものである本発明の方法である。
【００３７】
有利に、本発明の方法は、特に、ＥＲ及び／又はＰＲシグナル経路の活性状態を決定するだけでなく、ホルモン療法に対する抵抗性のあり得る機構を評価するのにも適している。これに関して、本発明の方法は、１つ又は複数の「回避」又は「抵抗性」の経路或いはそれぞれの機構の活性を決定するステップをさらに含むということが好ましい。そのような方法の好ましい実施形態及びステップが以下に記載される。
【００３８】
好ましくは、本発明の方法は、以下の：
（ｉｉ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイ、好ましくは近接ライゲーションアッセイを適用して、（癌）患者の同じ又は異なる組織試料において、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、及び、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ（ＡＰ１）、ＳＰ１、ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡ−転写因子、ＮＦｋａｐｐａＢファミリー、ｃ／ＥＢＰタンパク質、ＦＯＸＯ、ＳＭＡＤ転写因子タンパク質を含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質の存在を検出することによって、ステップ（ｉ）において評価されるシグナル経路とは異なるシグナル経路の活性化状態を決定するステップであって、好ましくは、上記のＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー及び上記の少なくとも１つのタンパク質は、同じ転写因子複合体の一部であり、
層別化が、さらに、ステップ（ｉｉ）において決定される活性化状態に基づく、ステップ、
（ｉｉｉ）（癌）患者の組織試料内のセリン３０５にてＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバーのリン酸化状態を決定するステップであって、
層別化が、さらに、ステップ（ｉｉｉ）において決定されるリン酸化状態に基づく、ステップ、
（ｉｖ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイ、好ましくは近接ライゲーションアッセイを適用することによって、ステップ（ｉ）において評価されるシグナル経路とは異なり、さらに、ＰＩ３Ｋ経路、Ｗｎｔ経路、ＨＨ経路、ＮＦｋａｐｐａＢ、Ｎｏｔｃｈ経路、ＴＧＦｂｅｔａ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＭＴの経路、ＡＲ、ＲＡＲ、ＰＰＡＲ、グルココルチコイド、ＶｉｔＤの経路のような他の核内受容体経路を含む群から選択される１つ又は複数のシグナル経路の活性化状態を決定するステップであって、（癌）患者の同じ又は異なる組織試料が使用され、
層別化が、さらに、ステップ（ｉｖ）において決定される活性化状態に基づく、ステップ、
（ｖ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイ、好ましくは近接ライゲーションアッセイを適用して、ＰＫＢ／Ａｋｔ、好ましくはスレオニン３０８及び／又はセリン４７３のリン酸化状態を測定することにより、（癌）患者の同じ又は異なる組織試料において、活性のＰＫＢ／Ａｋｔタンパク質を検出することによって、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態を決定するステップであって、
層別化が、さらに、ステップ（ｖ）において決定される活性化状態に基づく、ステップ、並びに、
（ｖｉ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイ、好ましくは近接ライゲーションアッセイを適用して、（癌）患者の同じ又は異なる組織試料において、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、及び、少なくとも１つの成分、好ましくは転写因子の存在を検出するステップであって、上記の少なくとも１つの成分、若しくは、それぞれ転写因子が、いかなるＥＲＥ（エストロゲン応答要素）ハーフサイトでも、又は、いかなる非ＥＲＥサイトでも存在することが予想され、さらに／或いは、上記の少なくとも１つの成分、若しくは、それぞれ転写因子が、ＡＰ１（ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ）、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質／ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡ−転写因子、及び、ＮＦｋａｐｐａＢ、ＳＰ１、Ｃ／ＥＢＰ、ＦＯＸＯ、ＳＭＡＤの転写因子タンパク質を含む群から選択され、
層別化が、さらに、ステップ（ｖｉ）における検出に基づく、ステップ、
のうち少なくとも１つ、すなわち、１つ以上又は全てをさらに含む。
【００３９】
本明細書において記載される本発明による方法の意図される目的に応じて、並びに／又は、それぞれ、（癌）患者のタイプ、療法のタイプ、評価されなくてはならない療法のタイプの適合性、及び／若しくは、シグナル経路、決定されなくてはならないシグナル経路の活性化に応じて、（上記の）ステップ（ｉｖ）が、（前置きに記載された）ステップ「（ｉ）」の代わりに、又は、それぞれ（前置きに記載された）ステップ「（ｉ）」として、行われてもよい。
【００４０】
ステップ（ｉｉ）は、エストロゲン−ＥＲ複合体が、遺伝子のプロモーター領域内のエストロゲン応答要素（ＥＲＥ）に直接結合することができるだけでなく、非ＥＲＥサイトにて補因子として作用し、ｃ−Ｊｕｎ又はｃ−Ｆｏｓ等の他のＤＮＡ結合要素と相互作用してもよいという知識に基づく（これに関して、いかなる非ＥＲＥサイトにて、又は、例えばＡＰ１等のいかなるＥＲＥハーフサイトでも存在すると予測される転写因子を一般的に言及するステップ（ｖｉ）も参照）。
【００４１】
上記のステップ（ｉｉｉ）によって取り組まれるホルモン療法に対する（例えばタモキシフェン治療に対する）抵抗性の別のあり得る機構は、ＥＲ内の位置３０５（リガンドとＤＮＡ結合ドメインの間の領域）上のセリンのリン酸化である。ＥＲのリン酸化状態を決定することは、好ましくは、ＰＬＡを使用することによって行われる。これに関して、例えば（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｕｐｓｔａｔｅから入手可能な）ａｎｔｉＥＲαＳ３０５−Ｐ等、使用することができるＥＲ特異的抗体が入手可能である。
【００４２】
本発明の特定の好ましい実施形態によると、本発明の方法は、ＰＩ３Ｋ経路、Ｗｎｔ経路及び／又はＨＨ経路の活性化状態を決定するステップをさらに含む（上記のステップ（ｉｖ）を参照）。それらの経路も、あり得る抵抗性に対する影響を有し得るか、又は、それぞれ、そのような抵抗性を示し得る。それらの経路に対しても、特異的転写因子を決定することができ、さらに、好ましくは、ＰＬＡ方法を介して検出することができる。ＰＩ３Ｋ経路は、特に興味深いものである。この経路は、好ましくは、ＥＲ転写因子複合体を含む経路に加えてテストされる。従って、本発明の方法は、好ましくは、上記のステップ（ｖ）をさらに含む。次に、テストの結果が、ｐＡｋｔ陽性又はｐＡｋｔ陰性として定められる。或いは、例えば、ＦＯＸＯクラスからのＰＩ３Ｋ経路の転写因子も決定することができる。
【００４３】
特に好ましいのは、ＥＲ転写因子複合体を検出することによってＥＲ経路の活性化状態を決定すること、さらに、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態を決定することに注目する本発明による方法である。従って、本発明の方法は、好ましくは、以下の：
（ｉ）近接ライゲーションアッセイを適用して、癌患者の組織試料内で、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、好ましくはＥＲ二量体、並びに、ＴＡＦ、ＴＢＰ、ＰＯＬＩＩ、ＴＦＩＩ、ｐ３００、ＣＲＥＢ及びＣＢＰを含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質、好ましくはｐ３００の存在を検出することによって、ＥＲ及び／又はＰＲシグナル経路の活性化状態を決定するステップであって、上記の少なくとも１つのメンバーは、転写因子複合体の一部であり、上記の少なくとも１つのタンパク質は、同じ転写因子複合体の一部である、ステップ、並びに、
（ｖ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイ、好ましくは近接ライゲーションアッセイを適用して、ＰＫＢ／Ａｋｔのリン酸化状態を測定することにより、癌患者の同じ組織試料において、活性のＰＫＢ／Ａｋｔタンパク質を検出することによって、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態を決定するステップ、
を含み、層別化は、ステップ（ｉ）において決定された活性化状態、及び、ステップ（ｖ）において決定された活性化状態に基づき、
好ましくは、（上記のように）癌患者は、好ましくは、乳癌患者、特に、ＥＲ及び／又はＰＲ陽性且つＨＥＲ２陰性の乳癌患者であり、それぞれ、組織試料は、好ましくは、乳癌患者、特に、ＥＲ及び／又はＰＲ陽性且つＨＥＲ２陰性の乳癌患者からのものである。
【００４４】
「組織試料」という用語は、本明細書において使用される場合、好ましくは、患者の生検試料（例えば、細胞診によって／から得られる生検試料、液体生検、血液細胞、切除された腫瘍細胞又は細針生検等）、より好ましくは、患者、特に癌患者の腫瘍組織試料を意味する。腫瘍組織試料が本発明の方法と関連させて使用される場合、そのような腫瘍組織試料は、好ましくは、新鮮凍結（ＦＦ）腫瘍組織試料、及び、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料を含む群から、並びに／又は、切除された腫瘍の薄切片、生検試料の薄切片、捕獲された循環性腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び穿刺吸引を含む群から選択される。それらの組織試料に対して、本発明による方法を、容易且つ効果的に行うことができる。
【００４５】
本発明のさらなる態様は、患者、好ましくは癌患者の疾患、好ましくは癌の予後診断のための方法に関し、当該方法は、近接ライゲーションアッセイを適用することによってＥＲ及び／又はＰＲシグナル経路の活性化状態を決定するステップを含み、当該方法は、少なくとも上記のステップ（ｉ）を含み、予後診断は、決定された活性化状態に基づく。
【００４６】
本発明の別の態様は、好ましくはＥＲ及び／又はＰＲシグナル経路に向けられているホルモン療法等の療法に対する患者、好ましくは癌患者の療法抵抗性の予測及び／又は検出のための方法に関し、当該方法は、近接ライゲーションアッセイを適用することによってＥＲ及び／又はＰＲシグナル経路の活性化状態を決定するステップを含み、当該方法は、少なくとも上記のステップ（ｉ）を含み、予測及び／又は検出は、決定された活性化状態に基づく。
【００４７】
そのような方法は、上記のさらなるステップ（ｉｉ）から（ｖｉ）のうち１つ以上又は全てのステップも含んでよい。特に好ましくは、そのような方法は、以下の：
（ｉｉ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイ、好ましくは近接ライゲーションアッセイを適用して、（癌）患者の同じ又は異なる組織試料において、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、及び、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ（ＡＰ１）、ＳＰ１、ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡ−転写因子、ＮＦｋａｐｐａＢファミリー、ｃ／ＥＢＰタンパク質、ＦＯＸＯ、ＳＭＡＤ転写因子タンパク質を含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質の存在を検出することによって、ステップ（ｉ）において評価されるシグナル経路とは異なるシグナル経路の活性化状態を決定するステップであって、好ましくは、上記のＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー及び上記の少なくとも１つのタンパク質は、同じ転写因子複合体の一部であり、
予後診断、それぞれ、予測及び／又は検出が、さらに、ステップ（ｉｉ）において決定される活性化状態に基づく、ステップ、
（ｉｉｉ）（癌）患者の組織試料内のセリン３０５にてＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバーのリン酸化状態を決定するステップであって、
予後診断、それぞれ、予測及び／又は検出が、さらに、ステップ（ｉｉｉ）において決定されるリン酸化状態に基づく、ステップ、
（ｉｖ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイ、好ましくは近接ライゲーションアッセイを適用することによって、ステップ（ｉ）において評価されるシグナル経路とは異なり、さらに、ＰＩ３Ｋ経路、Ｗｎｔ経路、ＨＨ経路、ＮＦｋａｐｐａＢ、Ｎｏｔｃｈ経路、ＴＧＦｂｅｔａ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＭＴの経路、ＡＲ、ＲＡＲ、ＰＰＡＲ、グルココルチコイド、ＶｉｔＤの経路のような他の核内受容体経路を含む群から選択される１つ又は複数のシグナル経路の活性化状態を決定するステップであって、（癌）患者の同じ又は異なる組織試料が使用され、
予後診断、それぞれ、予測及び／又は検出が、さらに、ステップ（ｉｖ）において決定される活性化状態に基づく、ステップ、
（ｖ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイ、好ましくは近接ライゲーションアッセイを適用して、ＰＫＢ／Ａｋｔ、好ましくはスレオニン３０８及び／又はセリン４７３のリン酸化状態を測定することにより、（癌）患者の同じ又は異なる組織試料において、活性のＰＫＢ／Ａｋｔタンパク質を検出することによって、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態を決定するステップであって、
予後診断、それぞれ、予測及び／又は検出が、さらに、ステップ（ｖ）において決定される活性化状態に基づく、ステップ、
（ｖｉ）ｉｎ  ｓｉｔｕ染色アッセイ、好ましくは近接ライゲーションアッセイを適用して、（癌）患者の同じ又は異なる組織試料において、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、及び、少なくとも１つの成分、好ましくは転写因子の存在を検出するステップであって、上記の少なくとも１つの成分、若しくは、それぞれ転写因子が、いかなるＥＲＥ（エストロゲン応答要素）ハーフサイトでも、又は、いかなる非ＥＲＥサイトでも存在することが予想され、さらに／或いは、上記の少なくとも１つの成分、若しくは、それぞれ転写因子が、ＡＰ１（ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ）、ｃＡＭＰ応答要素結合タンパク質／ＣＲＥＢ、ＧＡＴＡ−転写因子、及び、ＮＦｋａｐｐａＢ、ＳＰ１、Ｃ／ＥＢＰ、ＦＯＸＯ、ＳＭＡＤの転写因子タンパク質を含む群から選択され、
予後診断、それぞれ、予測及び／又は検出が、さらに、ステップ（ｖｉ）において決定される活性化状態に基づく、ステップ、
のうち１つ又は複数のステップをさらに含む。
【００４８】
一般に、そのような方法の好ましい実施形態が、（癌）患者の層別化のための方法と関連させて上記のステップ及び実施形態を考慮して明らかになる。
【００４９】
本発明の方法、特に、本明細書において記載される好ましい実施形態による方法を適用することによって、（癌）患者が特定の療法に対する抵抗性を発達させる見込みの信頼できる予測を行うこと、又は、そのような抵抗性がすでに存在しているかどうかを決定することが可能である。
【００５０】
本発明のさらなる態様は、以下の成分、すなわち：
−  ＥＲファミリーのメンバーのエピトープに対して作られた第１の抗体であって、上記のメンバーは転写因子複合体の一部である、第１の抗体、並びに、
−  ＴＡＦ、ＴＢＰ、ＰＯＬＩＩ、ＴＦＩＩ、ｐ３００、ＣＲＥＢ及びＣＢＰを含む群から選択されるタンパク質のエピトープに対して作られた第２の抗体であって、上記のタンパク質は、上記のＥＲファミリーのメンバーと同じ転写因子複合体の一部である、第２の抗体、
を含むキットに関する。
【００５１】
好ましくは、そのようなキットは、本明細書において記載される本発明による方法、好ましくは、好ましい方法として本明細書において記載される方法において使用される。本発明は、従って、そのようなキットの、本発明による方法における特定の使用、及び、それぞれ、本発明による方法において使用するためのそのようなキットにも関する。
【００５２】
本発明に関連して、好ましくは本発明による方法において使用するための本発明によるキットの調製における第１及び第２の抗体の使用も、該当する場合には（それぞれ先に記載されたか又は本明細書において以下に記載される）１つ又は複数のさらなる任意の成分の使用も開示される。
【００５３】
好ましくは、特異的なオリゴ配列に結合される２つの二次抗体を介して、又は、一次抗体へのオリゴ配列の直接結合を介して、ＰＬＡアッセイが、プロトコルに従って開発及び実行される。
【００５４】
当然ながら、そのようなキットの意図される使用に応じて、さらなる／他のタンパク質のさらなる／他のエピトープに対して作られたさらなる／他の抗体が利用されてもよい（これに関して、特に、さらなる抗体に対する標的が言及される上記のステップ（ｉｉ）から（ｖｉ）を参照）。
【００５５】
好ましくは、（Ａ）上記のキットの第１及び第２の抗体は、ＤＮＡオリゴでそれぞれラベルされるか、又は、（Ｂ）キットは、それぞれ第１及び第２の抗体に対して作られる第３及び第４の抗体をさらに含み、第３及び第４の抗体は、ＤＮＡオリゴでラベルされる。
【００５６】
本発明によるキットは、サークル形成オリゴヌクレオチド、ライゲーション及びローリングサークル増幅をそれぞれ可能にするリガーゼ及びポリメラーゼ等の酵素等、さらなる成分も含んでよい。さらに、洗浄緩衝液、及び、相補オリゴヌクレオチドの形の明視野又は蛍光プローブが、そのようなキットに加えられてもよい。顕微鏡スライド、カバーガラス及び封入剤も、そのようなキットに加えることができる。そのようなキットにおけるいかなる緩衝液も、ＤＡＰＩ又はいかなる他の核染色を含有して細胞核を可視化することができる。そのようなキットの別の実施形態において、蛍光プローブもオリゴヌクレオチドプローブも含有する（一次）抗体が加えられてもよい。そのような抗体は、そのままで蛍光を発し、同時に、ＰＬＡの適用においてパートナーであり得る。
【００５７】
そのようなキットを用いて、本発明の方法は、安全且つ再現可能な方法で行うことができる。
【００５８】
本発明と関連させて、本発明による方法を行うため、すなわち、（ａ）いかなる要求されるインキュベーション及び洗浄ステップも含む染色アッセイを実行するため、（ｂ）試料の照明による画像の取得、及び、その画像をデジタルファイルにおいて格納するため、又は、（ｃ）染色された試料のデジタル画像の処理及び分析のための自動化された機器が使用されてもよい。
【００５９】
そのような自動化された機器を使用することは、結果の信頼性及び繰り返し性を改善し、コンピュータアルゴリズムによって染色アッセイを自動化された様式で解釈することができるように、試料スライド染色結果のデジタル化を可能にし、より多くの数の試料の処理も迅速化する。
【００６０】
（標的）療法の選択に対して、癌患者の腫瘍組織試料内の多数のシグナル経路が、同じ癌細胞又は異なる細胞においても活性であるかどうかを同定し、多数の癌細胞クローン、或いは例えば、癌細胞内の１つの経路、及び、腫瘍関連線維芽細胞又は腫瘍組織に存在する免疫細胞（例えばマクロファージ）若しくは他の細胞タイプ内の別の経路を表すことが重要である。これも、例えば組織内の独立したＷｎｔ陽性クローンが転移の傾向を示し得る等、予後診断に関連し得る。
【００６１】
合成致死療法を取り巻く最近の動向：癌細胞内の異なるシグナル経路（又は他の関連性のある標的）を標的にする薬物の組み合わせを意味し、これらの療法は、両方の標的が同じ細胞に存在する場合にのみ細胞に対して致死性であり、１つの標的が１つの癌細胞クローンに存在し且つもう１つの標的が別の癌細胞クローン又は組織内の他の細胞タイプに存在する場合には致死性ではない。
【００６２】
本発明の上記の態様及び他の態様が、以下に記載の実施形態、特に付随の特許請求の範囲からより明らかになり、さらに、それらを参考にして説明される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項において記載される。請求項１、８及び９に記載の方法、請求項１０に記載のキット、並びに、請求項１１乃至１３に記載のキットの使用は、従属請求項に記載され且つ本明細書において記載される類似の及び／又は同じ好ましい実施形態、又はそれぞれ、ステップ及び特徴を有するということが理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】潜在的なＥＲ経路の概略図であり、特に、ＥＲ自体が多成分転写因子複合体の一部であり得るということを示しており、この複合体のタンパク質の全てが、本明細書に記載される本発明の方法に対する可能性のある標的である。ＰＩ３Ｋを介して、ＮＦｋａｐｐａＢを含む別の転写因子複合体が形成されてもよいということも明確である。
【図２】本発明による好ましい方法の結果に応じた、適した療法の選択を例示した流れ図である。
【図３】ＥＲ及びｐ３００に対するＩＨＣアッセイの結果を示した図である（これに関しては、以下の実施例３を参照）。
【図４】ＥＲ及びｐ３００に対するＩＨＣアッセイの結果を示した図である（これに関しては、以下の実施例３を参照）。
【図５】ＥＲ及びｐ３００に対するＰＬＡアッセイの結果を示した図である（これに関しては、以下の実施例３を参照）。
【図６】ＥＲ及びｐ３００に対するＰＬＡアッセイの結果を示した図である（これに関しては、以下の実施例３を参照）。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
上記のように、本発明の方法は、タンパク質レベルでの信頼できる特定の経路の活性の決定を可能にする。特に、近接ライゲーションアッセイを使用することによって、組織試料のどの細胞内で経路が活性であるかを決定することができる。この点で、それぞれの経路が活性化された（上記の）組織試料、好ましくは組織スライド内の癌細胞の割合に対する証拠を提供することも可能である。さらに、本明細書において記載される方法は、特定の（ホルモン）療法が効果的であるかどうか、（ホルモン）治療に対する抵抗性が発生すると予想される又はおそらく発展するかどうかを予測するのを可能にするため、釣り合う療法を、どの経路が活性であるとわかったかに応じて選ぶことができる。
【００６５】
（上記の）本発明による方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組織試料に対して、好ましくは組織スライドに対して行われるということが好ましい。
【００６６】
本発明による方法は、有利に、さらなる典型的に使用される層別化技術と組み合わせることができる。そのようなさらなる層別化テストを、癌患者から得られる同じ組織試料に対して、又は、異なる組織試料に対して行うことができる。さらに、そのようなさらなる層別化は、本発明によるテストに先立ち、同時に又は後に行われてもよい。例えば、そのようなさらなるテストを、ＩＨＣ染色を使用することによって行うことができる。
【００６７】
（本明細書において記載される）本発明の方法において使用される１つ又は複数の近接ライゲーションアッセイと関連させて使用されてもよい抗体に関して、２つ以上の経路に対するテストを同じ試料に対して並行して行うことができるように、異なるカラーチャンネルの異なるラベルを担持する異なる抗体が利用されてもよいということに留意されたい。さらに、例えばＩＨＣ及びＰＬＡ染色を同じ抗体を用いて行うことができるように、異なるカラーチャンネルのラベルで、例えば抗ＥＲ抗体等の特定の抗体をラベルすることが適し得る。
【００６８】
上記のように、本発明の一態様による特に好ましい方法は、以下のステップ、すなわち：
（ｉ）近接ライゲーションアッセイを適用して、（癌）患者の組織試料内で、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、並びに、ＴＡＦ、ＴＢＰ、ＰＯＬＩＩ、ＴＦＩＩ、ｐ３００、ＣＲＥＢ及びＣＢＰを含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質の存在を検出することによって、ＥＲ及び／又はＰＲシグナル経路の活性化状態を決定するステップであって、上記の少なくとも１つのメンバーは、転写因子複合体の一部であり、上記の少なくとも１つのタンパク質は、同じ転写因子複合体の一部である、ステップを含む。
【００６９】
本発明による方法のさらなる好ましい実施形態及び特徴は先に記載されている。本発明の一態様による本発明の例証的な特に好ましい方法は、以下のステップ、すなわち：
（ｉ）近接ライゲーションアッセイを適用して、（癌）患者の組織試料内で、ＥＲファミリーの少なくとも１つのメンバー、好ましくはＥＲ二量体、並びに、ＴＡＦ、ＴＢＰ、ＰＯＬＩＩ、ＴＦＩＩ、ｐ３００、ＣＲＥＢ及びＣＢＰを含む群から選択される少なくとも１つのタンパク質、好ましくはｐ３００の存在を検出することによって、ＥＲ及び／又はＰＲシグナル経路の活性化状態を決定するステップであって、上記の少なくとも１つのメンバーは、転写因子複合体の一部であり、上記の少なくとも１つのタンパク質は、同じ転写因子複合体の一部である、ステップ、並びに
（ｖ）近接ライゲーションアッセイを適用して、ＰＫＢ／Ａｋｔのリン酸化状態を測定することにより、（癌）患者の同じ組織試料において、活性のＰＫＢ／Ａｋｔタンパク質を検出することによって、ＰＩ３Ｋ経路の活性化状態を決定するステップ、
を含み、好ましくは、患者は癌患者、より好ましくは乳癌患者、好ましくはＥＲ及び／又はＰＲ陽性且つＨＥＲ２陰性の乳癌患者であり、さらに、それぞれ、組織試料は、乳癌患者、好ましくはＥＲ及び／又はＰＲ陽性且つＨＥＲ２陰性の乳癌患者からの腫瘍組織試料である。
【００７０】
そのような方法を利用することによって、基本的には４つの異なるテスト結果が、アジュバント設定における４つの異なる治療選択肢と共に可能である（いずれの場合も、さらなる化学療法及び放射線療法が別に決定される）。
１．ＥＲ含有転写因子複合体（ステップ（ｉ））：陽性
ｐＡｋｔ（ステップ（ｖ））：陰性
→治療選択：「内分泌治療」
２．ＥＲ含有転写因子複合体（ステップ（ｉ））：陽性
ｐＡｋｔ（ステップ（ｖ））：陽性
→治療選択：「内分泌治療」及び（潜在的な新たな）ＰＩ３Ｋ経路の阻害物質
３．ＥＲ含有転写因子複合体（ステップ（ｉ））：陰性
ｐＡｋｔ（ステップ（ｖ））：陰性
→内分泌治療なし、（おそらく、ＴＯＲＣ１及び／又はＴＯＲＣ２阻害物質等、ｐＡｋｔの下流のＰＩ３Ｋ経路阻害物を除いて）ＰＩ３Ｋ経路薬物なし
４．ＥＲ含有転写因子複合体（ステップ（ｉ））：陰性
ｐＡｋｔ（ステップ（ｖ））：陽性
→（潜在的な新たな）ＰＩ３Ｋ経路の阻害物質。
【００７１】
好ましくは同じ組織試料を使用することによって、本明細書において述べられる経路（これに関しては、特に、上記のステップ（ｉｉ）から（ｖｉ）を参照）のうち２つ、３つ、それ以上又は全ての経路の活性を分析することは本発明の範囲内であるということに留意しなくてはならない。これは、それぞれの（癌）患者に対する適した治療の改善された選択を可能にする。
【００７２】
例えば、本明細書において記載される方法に基づき行われるテストの結果に応じて、（ホルモン）治療に対する適した療法、及び／又は、例えば適したＰＩ３Ｋ経路の阻害物質を、（例えばＦＤＡ、ＣＦＤＡ、ＥＭＡ等による）現在承認されている薬物から、又は、臨床試験における薬物（例えばＰＩ３Ｋ経路に取り組む薬物に対して図２を参照）若しくは公示されていない未来の薬物から選ぶことができる。
【００７３】
上記のように、図１は、潜在的なＥＲ経路を概略的に示している。特に、この図は、ＥＲ自体が多成分転写因子複合体の一部であり得るということを示しており、この複合体のタンパク質の全てが、本明細書において記載される本発明の方法に対する可能性のある標的である。図１において、参照番号は、以下の意味、すなわち：
１  エストロゲン
２  エストロゲン受容体
３  成長因子
４  遺伝子発現
５  抗アポトーシス
６  血管拡張
７  二量体化
８  核
を有する。
【００７４】
上記のように、図２は、本発明による好ましい方法の結果に応じた、適した療法の選択を例示した流れ図を例証的に示している。図２において、参照番号は、以下の意味、すなわち：
１  抗体
３  ＡＴＰ−競合的阻害物質
５  ＡＴＰ−競合的阻害物質
７  ＡＴＰ−競合的阻害物質
９  ＡＴＰ−競合的＆アロステリック阻害物質
１１  ＡＴＰ−競合的＆ＦＫＢＰ１２介在性阻害物質
５１  以下の薬物（Ｐａｎ−Ｐｉ３Ｋ）の作用の介入／モードの１つ又は複数の潜在的な位置：
ＢＫＭ１２０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）
ＸＬ−１４７（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）
ＰＸ−８６６（Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ）
ＧＤＣ−０９４１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）
ＣＨ５１３２７９０９（Ｃｈｕｇａｉ  Ｐｈａｒｍａ）
５３  以下の薬物（Ｐ１１０δ特異的）の作用の介入／モードの１つ又は複数の潜在的な位置：
ＣＡＬ−１０１（Ｃａｌｉｓｔｏｇａ）
５５  以下の薬物（Ｐ１１０α−特異的）の作用の介入／モードの１つ又は複数の潜在的な位置：
ＢＹＬ７１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）
ＧＤＣ−００３２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）
ＩＮＫ−１１１７（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ）
７１  以下の薬物（ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ）の作用の介入／モードの１つ又は複数の潜在的な位置：
ＰＫＩ−５８７（Ｐｆｉｚｅｒ）
ＢＥＺ２３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）
ＢＧＴ２２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）
ＰＦ−４６９１５０２（Ｐｆｉｚｅｒ）
ＧＤＣ−０９８０（Ｐｆｉｚｅｒ）
ＸＬ−７６５（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）
ＳＦ１１２６（Ｓｅｒｎａｆｏｒ）
ＧＳＫ１０５９６１５（ＧＳＫ）
７３  以下の薬物（ＴＯＲＣ１／２）の作用の介入／モードの１つ又は複数の潜在的な位置：
ＩＮＫ−１２８（Ｉｎｔｅｌｌｉｋｉｎｅ）
ＯＳＩ−０２７（Ｗｙｅｔｈ／Ｐｆｉｔｚｅｒ）
ＡＺＤ−８０５５（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）
９１  以下の薬物（Ａｋｔ）の作用の介入／モードの１つ又は複数の潜在的な位置：
ＡＺＤ−５３６３（Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）
ＧＤＣ−００６８（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）
ＧＳＫ６９０６９３（ＧＳＫ）
ＶＱＤ００２（Ｖｌｏｑｕｅｓｔ）
１１１  以下の薬物（ＴＯＲＣ１）の作用の介入／モードの１つ又は複数の潜在的な位置：
Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ／ＲＡＤ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）
Ｔｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ／ＣＣＩ−７７９（Ｗｙｅｔｈ／Ｐｆｉｔｚｅｒ）
Ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ／ＡＰ−２３５７５（Ｍｅｒｃｋ／Ａｒｉａｄ）
を有する。
【００７５】
上記のように、本発明は、本発明による方法を行うため、すなわち、それぞれ先に記載されているように、（ａ）患者に対する療法の適合性を評価するために、患者、好ましくは癌患者を層別化するため、（ｂ）患者、好ましくは癌患者の疾患、好ましくは癌の予後診断のため、又は、（ｃ）（ホルモン）療法に対する患者、好ましくは癌患者の療法抵抗性の予測及び／若しくは検出のための自動化された機器の使用によって行われてもよい。
【００７６】
好ましくは、当該方法は、その結果、読み取りが蛍光であるように行われる。
【００７７】
一般に、本発明の方法と関連させて本明細書において記載されるテストは手動で行うことができるが、例えばＶｅｎｔａｎａ（Ｒｏｃｈｅ）のベンチマーク等、自動化された機器を使用し、その結果、再現性を高めることも可能である。
【実施例１】
【００７８】
基板上で回転させられる癌細胞株試料内のＥＲシグナル経路の活性化状態を決定する間接ＰＬＡアッセイ：
異なる種（例えばマウス及びウサギ等）で産生した２つの抗体、例えば、エストロゲン−ＥＲ二量体複合体上のエピトープに対するマウス抗体（モノクローナルマウス抗ヒトエストロゲン受容体α、クローン１Ｄ５、Ｄａｋｏ／Ｃａｔ＃Ｍ７０４７）、及び、ｐ３００に対するウサギ抗体（抗ｐ３００マウス抗ヒトｍＡｂ、クローンＮＭ−１１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｃａｔ＃ＮＡ４６−１００ＵＧ又は抗ｐ３００ＣＴマウス抗ヒトｍＡＢ、クローンＲＷ１２８、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｃａｔ＃ＮＡ０５−２５７）が使用される。
【００７９】
【表１】
0006700186.tif 000002
【実施例２】
【００８０】
（実施例１のアッセイに加えて行われることになる）Ａｋｔのリン酸化状態（＝活性化状態）を検出する直接ＰＬＡアッセイ：
２つの抗体が使用される（同じ種からであり得る：例えば、Ａｋｔ１に対するマウス抗体（Ｆ−８Ｌ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、及び、ホスホＡｋｔに対する別のマウス抗体（１８Ｆ３．Ｈ１１、Ａｂｃａｍ、ａｂ１０５７３１）等）。
【００８１】
【表２】
0006700186.tif 000003
【実施例３】
【００８２】
３．１  ＥＲ＋（ＭＣＦ７）及びＥＲ−（ＳＫＢＲ３）の細胞株両方におけるＥＲ及びｐ３００に対するＩＨＣアッセイ
ＥＲ及びｐ３００に対するＩＨＣアッセイを、第一に、ＥＲ＋（ＭＣＦ７）細胞株においても、ＥＲ−（ＳＫＢＲ３）細胞株においても行った。
【００８３】
分析によって、ＥＲもｐ３００も、異なる濃度でＭＣＦ７細胞の核内に存在するということが明確に示された。特に、染色ＩＨＣアッセイから得られる本来のカラー画像において、多くの細胞は緑がかって着色され、ＥＲの存在を示し、多くの細胞は赤みがかって着色され、ｐ３００の存在を示し、さらに、多くの細胞は黄色がかって着色され、組み合わされた信号を示した（染色ＩＨＣアッセイから得られる本来のカラー画像に基づくグレースケール画像を示し；細胞を例証的に指摘する参照番号「ＥＲ」、「ｐ３００」及び「ＥＲ＋ｐ３００」は、ＥＲ、ｐ３００又は組み合わせを示す図３を参照）。本来のカラー画像における色の差（図３においては明度の差に単純化される）は、ＥＲ及びｐ３００両方の発現及び／又は存在が細胞間で大きく異なるということを示している。
【００８４】
ＳＫＢＲ３細胞においては、対照的に、ｐ３００のみを見つけることができる。実際、ＳＫＢＲ３細胞は、核を離れるＥＲチャンネルにおいて、抗ｐ３００抗体によって赤みがかって着色されたいかなる信号も示さない（染色ＩＨＣアッセイから得られる本来のカラー画像に基づくグレースケール画像を示し；画像内で可視の細胞は本来のカラー画像内で赤みがかって着色され、ｐ３００の存在のみを示す図４を参照）。
【００８５】
３．２  ＥＲ＋（ＭＣＦ７）及びＥＲ−（ＳＫＢＲ３）の細胞株両方におけるＥＲ及びｐ３００に対するＰＬＡ：
ｐ３００と組み合わせたＥＲに対するＰＬＡを、ＥＲ＋（ＭＣＦ７）細胞株においても、ＥＲ−（ＳＫＢＲ３）細胞株においても行った。
【００８６】
結果は、細胞の核内の、どちらの因子も同じ複合体において存在する位置を明確に示した。特に、染色ＰＬＡから得られる本来のカラー画像において、多くの活性の転写因子複合体が、多くの赤みがかって着色されたドットによってＭＣＦ７細胞に対して示されている（ＭＣＦ７細胞に対する染色ＰＬＡから得られる本来のカラー画像に基づくグレースケール画像を示し；明るいスポットが本来の画像において赤みがかって着色され、活性の転写因子複合体を示す図５を参照）。ＩＨＣアッセイから予想されるように、細胞間でいくらかの変動がある。さらに予想されるように、ＳＫＢＲ３細胞は、いかなる活性の転写因子複合体もほとんど示さない（ＳＫＢＲ３細胞に対する染色ＰＬＡから得られる本来のカラー画像に基づくグレースケール画像を示す図６を参照）。
【００８７】
類似のデータが、ＥＲ及び補因子ＣＲＥＢに対するＰＬＡを行う場合にもたらされる（データは示されていない）。
【００８８】
本発明は、図面及び上記の説明において例示、さらには記述されてきたけれども、そのような例示及び記述は、例示的又は例証的であり、拘束性はないと考慮されることになる。本発明は、開示された実施形態に限定されない。
【００８９】
開示された実施形態に対する他の変化は、請求された発明を実行する際に、図面、明細書、及び付随の特許請求の範囲の調査から当業者により理解する及びもたらすことができる。
【００９０】
特許請求の範囲において、「含む」という用語は、他の要素又はステップを除外せず、不定冠詞はその複数形を除外しない。テスト方法が互いに異なる従属項において記載されているという単なる事実は、これらの方法の組合せを役立つよう使用することができないと示しているわけではない。
【図１】
0006700186.tif 000004
【図２】
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【図３】
0006700186.tif 000006
【図４】
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【図５】
0006700186.tif 000008
【図６】
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