(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル(14)中に含まれる粒子(1, 2,…9, 101…104)を同定する方法において、
伝播軸(Z)に沿って前記サンプル(14)に向かって伝播する入射光波(12)を生み出す光源(11)を用いて前記サンプルに光を照射する工程a)と、
マトリクスアレイ光検出器(16)を用いて、前記マトリクスアレイ光検出器が前記入射光波(12)と個々の前記粒子によって生み出された回折波との間の干渉を含む光波(22)を受けるように前記光源と前記マトリクスアレイ光検出器との間に置かれた前記サンプルの画像を取得する工程b)とを含み、
さらに、
前記マトリクスアレイ光検出器(16)が存在する面(P)に対して平行な面(x, y)における前記粒子の位置を特定する工程c)と、
前記取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、前記マトリクスアレイ光検出器(16)から複数の再構成距離(|z|)で前記マトリクスアレイ光検出器(16)が受ける前記光波(22)の少なくとも１つの特徴量
【数１】
0006727229.tif 000066
を評価する工程d)と、
前記特徴量の変化
【数２】
0006727229.tif 000067
を前記伝播軸(Z)に対して平行な軸に沿って前記位置(x, y)を通る前記再構成距離の関数として表すプロファイルを特定する工程e)と、
前記プロファイルに応じて前記粒子を同定する工程f)とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記特徴量は、個々の前記再構成距離において、前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波(22)の複素式(U(x, y, z))を評価することによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記特徴量は、前記複素式(U(x, y, z))の係数または独立変数から特定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記同定は、前記特徴量の変化を学習段階で特定された基準プロファイルと比較することによって行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記マトリクスアレイ光検出器の面に対して平行な面における個々の前記粒子の位置は、前記マトリクスアレイ光検出器によって取得された画像または前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波(22)の複素式(U(x, y, z))を用いて特定される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記マトリクスアレイ光検出器(16)によって取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、再構成面または検出面における基準複素画像(Uref)を特定する工程と、
前記基準複素画像から、前記マトリクスアレイ光検出器(16)から複数の前記再構成距離(|z|)における前記マトリクスアレイ光検出器(16)が受ける前記光波(22)の少なくとも１つの前記特徴量
【数３】
0006727229.tif 000068
を評価する工程とを含む、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記基準複素画像(Uref)に対して伝播演算子(h)を適用して、前記再構成面または前記マトリクスアレイ光検出器が存在する面から複数の前記再構成距離における第２の複素画像(Uref,z)を計算する工程と、
個々の前記第２の複素画像(Uref,z)から複数の前記再構成距離のそれぞれにおける前記特徴量を特定する工程とを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記光源は空間的コヒーレンス光源である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記光源は発光ダイオードまたはレーザダイオードである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプルと前記マトリクスアレイ光検出器との間に拡大光学部品が配置されない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルが血球を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記粒子は、白血球、赤血球、または血小板の細胞系の中で同定される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
サンプル(14)中に含まれる粒子を同定する装置において、
前記サンプル(14)の方向に伝播軸(Z)に沿って入射光波(12)を生み出すように配置された光源(11)と、
前記光源(11)とマトリクスアレイ光検出器(16)との間で前記サンプル(14)を保持するホルダと、
前記入射光波(12)と前記粒子によって形成された回折波との間の干渉から生じる光波(22)を受け、前記サンプルの画像を取得するように配置された前記マトリクスアレイ光検出器(16)とを有し、
さらに、
前記マトリクスアレイ光検出器(16)が存在する面（P)に対して平行な面(x, y)における前記粒子の位置を特定する工程と、
前記取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、前記マトリクスアレイ光検出器(16)から複数の再構成距離(|z|)における前記マトリクスアレイ光検出器(16)が受ける前記光波(22)の少なくとも１つの特徴量
【数４】
0006727229.tif 000069
を評価する工程と、    
前記特徴量の変化
【数５】
0006727229.tif 000070
を前記伝播軸(Z)に対して平行な軸に沿って前記位置(x, y)を通る前記再構成距離の関数として表すプロファイルを特定する工程と、
前記プロファイルに応じて前記粒子を同定する工程とを、
実行するように構成されたプロセッサ(20)を有することを特徴とする装置。
【請求項１４】
前記マトリクスアレイ光検出器と分析される前記サンプルとの間に拡大光学部品を有さない、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記プロセッサは、
個々の前記再構成距離における前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の複素式(U(x, y, z))を特定し、
個々の前記再構成距離における前記複素式(U(x, y, z))の係数または独立変数を特定することによって、前記特徴量を評価するように構成された、請求項１３または１４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体、特に体液、例えば血液中に存在する粒子を数え同定する分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
体液、特に血液は、粒子、例えば細胞を含むことができ、その種類および数を知ることは有用である。
【０００３】
例えば、全血球数または全血球検査は、医学研究室で一般的に行われる血液の検査である。この種の検査では、血液の主成分（特に、赤血球、白血球、または血小板）とそれらの数を同定することが可能である。これらの検査は一般的に高性能な自動装置を用いて行われるが、より低コストで同等レベルの性能が得られるよりシンプルな方法が研究されている。
【０００４】
この目的のための研究における１つの手段は、レンズレス撮像等のシンプルな光学方法の利用である。レンズレス撮像による生物学的粒子の観察は、２０００年末以来、ある程度の進展が見られている。この技術では、光源とマトリクスアレイ光検出器または画像センサとの間にサンプルを配置する。光検出器でとらえられる画像は、光源から生み出された入射光波とサンプルを構成する粒子によって回折された光波との間の干渉によって形成される。この画像は一般的に「ホログラム」と呼ばれる。したがって、個々の粒子に対して、センサにそれ特有の回折パターンを記録することが可能である。この技術の生物学的サンプルへの適用は、国際公開第２００８／０９０３３０号（特許文献１）に記載されている。そして、生成された回折パターンと事前に公知の粒子に対応させて確立された回折パターンとを比較することによって、個々の粒子のシンプルな分析を行うことが可能である。しかしながら、この方法は、粒子濃度が増加すると、限界に到達する可能性がある。
【０００５】
特に、画像センサによって検出される回折パターンに基づいて粒子単独を数え同定することは、サンプル中の粒子濃度が増加すると、限界に到達する。特に、Seo Sungjyu, “High-throughput lensfree bloodanalysis on a chip”, Anal Chem, 2010, June 1（非特許文献１）に報告されているように、サンプルが血液であり、粒子が、100000粒子/μl超の濃度の赤血球であるとき、数のカウントはもはや信頼性がない。サンプル中に存在する個々の粒子のいわゆる複素画像を作成するために、デジタルホログラフィック再構成技術と呼ばれる数学的技術を適用することができる。この種の技術では、粒子が配置され、撮像素子から既知の距離に位置する対象面に対して光波を後方伝播する。上記文献は、ホログラフィック再構成等が、サンプル中に高濃度で存在する赤血球の数を数えることを可能とすることを実証している。この文献は、再構成された個々の粒子の複素画像において、白血球は赤血球とは異なる識別特性を持つ標識が事前に付与されていることを報告している。
【０００６】
また、米国特許出願公開第２０１４／０３２７９４４号明細書（特許文献２）には、画像センサによって取得されたホログラムを模擬実験により得られたホログラムと比較することによって、ホログラムに基づいて、粒子、例えば血液粒子を分類する方法について、記載されている。しかしながら、この方法は、粒子密度が高いときには実行が困難となるという共通の限界を有する。
【０００７】
また、米国特許出願公開第２０１２／０１４８１４１号明細書（特許文献３）および国際公開第２０１４／０１２０３１号（特許文献４）には、細胞（この場合には精子）の複素画像を再構成することを可能な方法が記載されている。これらの方法では、再構成された複素画像から上記細胞の特性とそれらの軌道を評価することができる。同様に、米国特許出願公開第２００９／０２９０１５６号明細書（特許文献５）には、上記粒子の複素画像に基づく、粒子と粒子の軌道の追跡の分類について、記載されている。サンプルの複素画像は、粒子の同定には不充分である可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００８／０９０３３０号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４／０３２７９４４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１２／０１４８１４１号明細書
【特許文献４】国際公開第２０１４／０１２０３１号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９／０２９０１５６号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Seo Sungjyu, “High-throughput lensfree bloodanalysis on a chip”, Anal Chem, 2010, June 1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
粒子濃度が高いサンプルに適用可能な、粒子、特に血球の同定方法が求められている。この方法はまた、観測できる分野が広く、シンプルに、特に事前に粒子に標識を付与する必要なく、実施できる必要がある。さらに、この方法は、体液に見られる粒子、特に、赤血球、白血球、および血小板を信頼性良く識別する必要がある。
【００１１】
さらに、粒子と光検出器との間の距離を正確に知る必要のない方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために、本発明は以下の方法を提供する。
本発明の方法は、
サンプル、例えば血液等の生物学的液体のサンプルに含まれる粒子を同定する方法において、
伝播軸に沿って前記サンプルに向かって伝播する入射光波を生み出す光源を用いて前記サンプルに光を照射する工程と、
マトリクスアレイ光検出器を用いて、前記マトリクスアレイ光検出器が前記入射光波と個々の前記粒子によって生み出された回折波との間の干渉を含む光波を受けるように前記光源と前記マトリクスアレイ光検出器との間に置かれた前記サンプルの画像を取得する工程とを含み、
さらに、
前記マトリクスアレイ光検出器が存在する面に対して平行な面(x, y)における前記粒子の位置を特定する工程と、
前記取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、前記マトリクスアレイ光検出器から複数の再構成距離で前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の少なくとも１つの特徴量を評価する工程と、
前記特徴量の変化を前記伝播軸に対して平行な軸に沿って前記位置を通る前記再構成距離の関数として表すプロファイルを特定する工程と、
前記プロファイルに応じて前記粒子を同定する工程とを含むことを特徴とする。
【００１３】
デジタル再構成アルゴリズムの適用は、画像に対する伝播演算子の適用、一般的に畳み込み積の形成を意味する。
【００１４】
前記特徴量は、個々の前記再構成距離において、前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の複素式を評価することによって得ることができる。
【００１５】
前記特徴量は、前記複素式の係数から特定することができる。この場合、複素式は、マトリクスアレイ光検出器が受ける光波の振幅を表す。
【００１６】
前記特徴量は、前記複素式の独立変数から特定することができる。この場合、複素式は、マトリクスアレイ光検出器が受ける光波の位相を表す。
【００１７】
一態様において、本発明の方法は、
前記マトリクスアレイ光検出器によって取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、基準複素画像と呼ばれる複素画像を特定する工程と、
前記基準複素画像から、前記マトリクスアレイ光検出器から複数の前記再構成距離における前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の少なくとも１つの前記特徴量を評価する工程とを含むことができる。
【００１８】
本発明の方法はまた、
前記基準複素画像に対して伝播演算子を適用して、前記再構成面または前記マトリクスアレイ光検出器が存在する面から複数の前記再構成距離における第２の複素画像と呼ばれる基準複素画像を計算する工程と、
個々の前記第２の複素画像から複数の前記再構成距離のそれぞれにおける前記特徴量を特定する工程とを含むことができる。
【００１９】
前記基準複素画像は、サンプルの面から離れた再構成面で作成された複素画像であることができる。それはまた、検出面で作成された複素画像であってもよい。
【００２０】
前記同定は、前記特徴量の変化を学習段階で特定された基準プロファイルと比較することによって行うことができる。
【００２１】
前記マトリクスアレイ光検出器の面に対して平行な面における個々の前記粒子の位置は、前記マトリクスアレイ光検出器によって取得された画像または前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の複素式を用いて特定することができる。
【００２２】
前記光源は、好ましくは空間的コヒーレンス光源、例えば発光ダイオードである。この場合、好ましくは、光源とサンプルとの間に空間フィルタが配置される。前記光源は、時間的コヒーレンス光源、例えばレーザダイオードであってもよい。
【００２３】
前記光検出器は、光検出器が受ける光波を捕集することが可能な複数の画素のマトリクスアレイを含む。画素とサンプルとの間の距離は、50μm〜2cm、好ましくは100μm〜5mmの間で変化することができる。好ましくは、サンプルは、光検出器の画素に直接接する位置に配置されない。
【００２４】
好ましくは、前記サンプルと前記マトリクスアレイ光検出器との間に拡大光学部品が配置されない。
【００２５】
前記サンプルは特に、血球を含むことができる。この場合、前記粒子は、白血球、赤血球、または血小板の細胞系の間で同定することができる。
【００２６】
本発明の他の主題である装置は、
サンプル中に含まれる粒子を同定する装置において、
前記サンプルの方向に伝播軸に沿って入射光波を生み出すように配置された光源と、
前記光源とマトリクスアレイ光検出器との間で前記サンプルを保持するホルダと、
前記入射光波と前記粒子によって形成された回折波との間の干渉から生じる光波を受け、前記サンプルの画像を取得するように配置された前記マトリクスアレイ光検出器とを有し、
さらに、
前記マトリクスアレイ光検出器が存在する面に対して平行な面における前記粒子の位置を特定する工程と、
前記取得された画像に対してデジタル再構成アルゴリズムを適用して、前記マトリクスアレイ光検出器から複数の前記再構成距離における前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の少なくとも１つの前記特徴量を評価する工程と、
前記特徴量の変化を前記伝播軸に対して平行な軸に沿って前記位置を通る前記再構成距離の関数として表すプロファイルを特定する工程と、
前記プロファイルに応じて前記粒子を同定する工程とを、
実行するように構成された、マイクロプロセッサまたは電算機等のプロセッサを有することを特徴とする。
【００２７】
好ましくは、本発明の装置は、前記マトリクスアレイ光検出器と分析される前記サンプルとの間に拡大光学部品を有さない。
【００２８】
前記プロセッサは、上記複数の工程を実行させる指令のシークエンスを含むプログラム化可能なメモリを含むまたは当該メモリに接続されることができる。
【００２９】
前記プロセッサは特に、
個々の前記再構成距離における前記マトリクスアレイ光検出器が受ける前記光波の複素式を特定し、
個々の前記再構成距離における前記複素式の係数または独立変数を特定することによって、前記特徴量を評価するように構成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の一態様に係る装置を示す図である。
【００３１】
【図２Ａ】マトリクスアレイ光検出器によって取得された画像を示す図である。
【００３２】
【図２Ｂ】第１の例において、種々の粒子について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量を、光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。
【００３３】
【図３Ａ】第１の例において、種々の白血球について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量を、光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。
【００３４】
【図３Ｂ】第１の例において、種々の赤血球について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量を、光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。
【００３５】
【図４Ａ】第１の例において、血小板凝集体の中央である、光検出器によって取得された画像の対象領域を示す図である。
【００３６】
【図４Ｂ】図４Ａに示す凝集体を構成する種々の血小板について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量のプロファイルを示す図である。
【００３７】
【図５Ａ】第２の例において、種々の粒子について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量を光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。
【００３８】
【図５Ｂ】第２の例において、種々の粒子について、光検出器が受ける光波の位相を光検出器に関する距離zの関数として表すプロファイルを示す図である。
【００３９】
【図６Ａ】第３の例において、種々の粒子について、光検出器が受ける光波の相補的な振幅と呼ばれる特徴量を光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。
【００４０】
【図６Ｂ】第３の例において、種々の粒子について、光検出器が受ける光波の位相を光検出器に関する距離の関数として表すプロファイルを示す図である。
【００４１】
【図７Ａ】第１の例において、光検出器が受ける光波の複合的な特徴量を距離の関数として表すプロファイルを示す図である。
【図７Ｂ】第２の例において、光検出器が受ける光波の複合的な特徴量を距離の関数として表すプロファイルを示す図である。
【図７Ｃ】第３の例において、光検出器が受ける光波の複合特徴量を距離の関数として表すプロファイルを示す図である。
【００４２】
【図８】図８Ａは、再構成面において、サンプルの基準複素画像と呼ばれる複素画像を計算することを可能とする方法を示す図である。図８Ｂは、マトリクスアレイ光検出器によって取得されたホログラムを示す図である。図８Ｃは、図８Ａに示す方法を複数回繰り返した後に再構成された基準複素画像と呼ばれる画像の代表例を示す図である。図８Ｄは、基準複素画像から作成された第２の複素画像に基づいて得られたプロファイルを示す図である。
【００４３】
【図９】図９Ａは、画像センサによって取得された水溶液中に分散された赤血球を含むサンプルのホログラムである。図９Ｂ、図９Ｃはそれぞれ、再構成で作成された、基準画像と呼ばれる複素画像の係数と位相を示す図である。図９Ｄ、図９Ｅはそれぞれ、伝播軸に沿って赤血球を通って画像センサが受ける光波の係数と位相の変化を表すプロファイルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
図1は、本発明の１つの主題である装置の例を示す。光源11は、伝播軸Zに沿ってサンプル14の方向に入射光波と呼ばれる光波を生み出すことができる。サンプル14は、所定の種類の粒子の間で同定したい粒子1, 2, 3, 4, 5, .., 9を含む媒体10、例えば生物学的液体を含む。
【００４５】
粒子は、細胞であることができる。特に、媒体１０が血液または血液を含む溶液であるとき、粒子は、赤血球、白血球、または血小板であることができる。
【００４６】
粒子はまた、有機または無機のマイクロビーズ、例えば、金属のマイクロビーズ、あるいは、ポリマーまたはガラスのマイクロビーズであることができ、この種のマイクロビーズは生物学的実験を行うときに一般的に使用される。粒子はまた、媒体10に浸された小滴、例えば脂肪滴であることができる。それはまた、微生物、例えば、バクテリア、イースト、またはエキソソームであることができる。一般的に、粒子のサイズは、有利には1mm未満、さらには500μｍ未満、好ましくは0.5〜500μｍである。したがって、用語「粒子」は、検査されるサンプルにはじめから存在する内因粒子と、分析前にサンプルに添加される外因粒子の双方を言う。
【００４７】
媒体10は一般的に液体媒体、特に体液であるが、それはまた、寒天、空気、または液体の乾燥残留物であることができる。
【００４８】
本発明の１つの主題である方法は、個々の観察される粒子を同定することを可能とする。同定とは、粒子の所定の種類に粒子を分類することを意味する。それは、所定の特性の間での粒子の特性の特定、または、所定の特性の間での粒子サイズの特定であるかもしれない。
【００４９】
光源とサンプルとの間の距離Δは、好ましくは1cm超である。それは好ましくは2〜30cmである。光源は、サンプルから見て、点状であると見なせることが好ましいかもしれない。このことは、その直径（またはその対角線）は好ましくは、サンプルと光源との間の距離の1/10未満、より好ましくは1/100未満であることを意味する。この場合、光は平面波またはそのように見なせる波の形態でサンプルに到達する。
【００５０】
光源11は、点光源であってもよいし、点状となるように絞りまたは空間フィルタ（図1では示さず）を伴うものであってもよい。絞りの開口径は、一般的に5μｍ〜1mm、好ましくは50〜500μｍである。
【００５１】
絞りは、第１の端が光源と対向配置され、第２の端がサンプルと対向配置された光ファイバに置き換えてもよい。この場合、第２の端は、点光源11のようになり得る。
【００５２】
サンプル14は、基部15とカバー13とを含むチャンバに収容される。チャンバの側壁は、示されていない。考えられる例において、チャンバは、ノイバウアＣ−チップ流体チャンバである。基部15とカバー13との間の距離は、100μｍである。伝播軸Zに沿ったチャンバの厚みは、一般的に数cm未満、例えば1cm未満、さらには1mm未満、例えば50〜500μｍである。
【００５３】
光源11は、時間的コヒーレンスであることができるが、これは必須ではない。
【００５４】
この第１の例において、光源は、波長450nmを出射するレーザダイオードである。それは、サンプルから15cmの距離に配置される。
【００５５】
サンプル14は、光源11とマトリクスアレイ光検出器または画像センサ16との間に配置される。後者は、好ましくはサンプルを収容するチャンバの基部15に対して、平行または実質的に平行に延びる。
【００５６】
用語「実質的に平行」は、２つの要素が厳密に平行ではなく、10°未満、好ましくは数°の角度の誤差が許容されることを意味する。
【００５７】
光源のスペクトル幅は小さいことが好ましく、例えば100nm未満、さらには20nm未満、好ましくは5nm未満である。用語「スペクトル幅」は、光源の発光ピークの半値幅を示す。
【００５８】
光検出器16は、CCDまたはCMOSの画素のマトリスクアレイを含むマトリクスアレイ光検出器であることができる。画素のサイズがより小さく、取得される画像の空間分解能がより良好となることから、CMOS光検出器が好ましい。この例において、光検出器は、12ビットAPTINAセンサ、リファレンス番号MT9P031である。それは、RGB CMOSセンサであり、その画素間ピッチは2.2μｍである。光検出器の有効面積は、５．７×４．３ｍｍ２である。
【００５９】
光検出器は、好ましくは入射光波12の伝播軸Zに対して垂直な検出面Pに置かれる。
【００６０】
好ましくは、光検出器は、アレイの上に透明な保護窓が置かれた画素のマトリスクアレイを含む。画素のマトリクスアレイと保護窓との間の距離は、一般的に数10μｍ〜150または200μｍである。画像の空間分解能を向上するために、光検出器の画素間ピッチは3μｍ未満であることが好ましい。
【００６１】
この例において、粒子1, 2,...9と光検出器16の画素のマトリクスアレイとの間の距離dは、1.5mmである。ただし、使用される流体チャンバの厚みに応じて、変動することができる。.一般的に態様に関係なく、粒子と光検出器の画素との間の距離dは、好ましくは50μｍ〜2cm、より好ましくは100μｍ〜2mmである。
【００６２】
なお、マトリクスアレイ光検出器16とサンプル14との間には拡大光学部品は配置されない。このことは、光検出器16の個々の画素と同じレベルに任意で存在するマイクロレンズをフォーカスすることを妨げない。
【００６３】
この第１の例において、サンプルは、6%のデキストラン（Sigma Aldrich、リファレンス番号D4876）を含むアルセバー液中で赤血球を血沈させた後、血小板と白血球リッチプラズマとを回収する従来のプロトコルによって得られた白血球リッチプラズマである。得られたプラズマは、生理的pHのリン酸緩衝食塩液（PBS）で希釈される。赤血球の除去は完全ではなく、得られるリッチプラズマは残留赤血球を含む。
【００６４】
粒子は、いくつかの粒子の種類、特に赤血球、白血球、または血小板の間で分類することができる。好ましくは、粒子は、事前に標識の付与を受けない。
【００６５】
図2Aは、光検出器16で得られた画像を示す。この画像は、全体的な回折パターンを示し、その素回折パターンには、個々の粒子に関連する素回折パターンを見ることができる。個々の素回折パターンは、中央の円盤状領域を含み、その周囲には暗と明の同心円状の輪が交互に延びている。そのような素パターンは、選択された粒子を同定し、検出面Pにおける粒子の動径座標(x, y)を特定することを可能とする。これらの座標は例えば、粒子に応じた素回折パターンの中央である。
【００６６】
個々の素回折パターンは、サンプルの上流にある光源11から生み出された入射光波12と粒子による入射光波の回折から生じる光波との間の干渉によって形成される。したがって、光検出器16は、サンプル14の上流で光源11から出射された光波12と、個々の粒子またはサンプル14に存在する他の回折要素によって回折された光波との重畳によって形成される光波22を受ける。
【００６７】
プロセッサ20、例えばマイクロプロセッサは、マトリクスアレイ光検出器16の画像を受け取り、伝播軸Zに沿ってマトリクスアレイ光検出器が受ける光波22の特徴量の再構成を行う。マイクロプロセッサ20は、本明細書で述べる計算工程を実行するための指令を記録可能なメモリ23に接続される。それは、スクリーン25に接続することができる。再構成は特に、マトリクスアレイ光検出器と観察されるサンプルとの間で作成される。
【００６８】
プロセッサ20は、同定方法の工程を実行するために、メモリに記録された指令のシークエンスを実行することができる。プロセッサは、マイクロプロセッサ、または、本明細書で述べる1つ以上の工程を実行するために、マトリクスアレイ光検出器から受け取った画像を処理可能な他の電算機であることができる。
【００６９】
図2Aに示されるマトリクスアレイ光検出器によって取得された画像Iは、光波22の強度I(x, y)の空間的な分布を表す。なお、xとyは、光検出器の平面Pにおける座標である。
【００７０】
非特許文献Ryle et al, “Digital in-line holography of biological specimens”, Proc. of SPIE Vol. 6311 (2006)に記載されている公知のデジタルホログラフィック再構成の原理によれば、光検出器によって測定された強度I(x, y)の畳み込み積と伝播演算子h(x, y, z)とを特定することによって、空間座標(x, y, z)、特に光検出器から距離|z|に位置する面の任意の点における、光波22の複素式U(x, y, z)を再構成することが可能である。
【００７１】
伝播演算子h(x, y, z)の関数は、光検出器16と座標(x, y, z)の点との間の光の伝播を表す。そして、再構成距離と呼ばれる距離|z|におけるこの光波の以下に示す振幅u(x, y, z)と位相φ(x, y, z)を特定することが可能である。
u(x, y, z) = abs [U(x, y, z)]
φ(x, y, z) = arg [U(x, y, z)]
演算子abs、argはそれぞれ係数および独立変数を表す。
【００７２】
伝播演算子の適用は特に、光検出器から上流側の距離|z|における複素式を評価することを可能とする。したがって、光波22が光検出器に到達する前に光波22の複素式の値が再構成される。ここで、後方伝播について説明する。検出面Pの座標をz=0とするとき、この後方伝播は、伝播演算子h(x, y, −|z|)を適用することによって実行される。用語「上流」と「下流」は、入射光波12の伝播方向に関することは理解されよう。
【００７３】
I(x,y) = I(x, y, z = 0)が、光検出器によって測定された信号の強度に対応するとき、検出面Pにおける測定された強度I(x,y)と光波の複素式U(x, y)との間の関係は、下記式で表される。
I(x,y) = |U(x, y)|2
【００７４】
座標(x, y, z)における光波(22)の複素式は、下記式で表される。
【数１】
0006727229.tif 000002
ここで、符号*は、畳み込み演算子を表す。
検出面Pを境界としサンプル14を含む半空間ではz<0であり、
検出面Pを境界としサンプル14を含まない半空間ではz>0である。
【００７５】
検出面Pを境界としサンプル14を含む半空間において、光波の複素式は下記式で表すことができる。
【数２】
0006727229.tif 000003
【００７６】
好ましくは、ホログラフィック再構成の前に、あらかじめ、測定された強度I(x,y)に対して、数学的前処理が適用される。このことは、特に伝播演算子が適用されるときに作成されるアーチファクトの数を減少することによって、結果の質を向上することを可能とする。
【００７７】
したがって、正規化強度と呼ばれる強度
【数３】
0006727229.tif 000004
は、以下のように特定される。
【数４】
0006727229.tif 000005
ここで、
I(x,y) = 座標(x, y)において、光検出器によって測定された強度、
Average (I) = 座標(x, y)を含む画像Iの対象領域において測定された強度の平均である。
この対象領域は、光検出器によって作成された全画像に対応する。
【００７８】
この前処理は、入射光波(12)の強度による測定された強度の正規化に相当し、入射光波(12)の強度は演算子Average (I)によって評価される。
【００７９】
次に、上記したように、
正規化強度
【数５】
0006727229.tif 000006
から、光波(22)の複素式が下記式を用いて特定される。
【数６】
0006727229.tif 000007
【００８０】
デジタル再構成は特に、フレネル回折モデルに基づくことができる。この例において、伝播演算子は、以下に示すフレネル−ヘルムホルツ関数である。
【数７】
0006727229.tif 000008
ここで、λは波長である。
したがって、下記式が得られる。
【数８】
0006727229.tif 000009
ここで、
x′とy′は光検出器の面における座標、
xとyは光検出器から距離|z|に位置する再構成面における座標である。
zは、入射光波(12)の伝播軸Zに沿って再構成された画像の座標である。
【００８１】
複素式U(x, y, z)の値から、光源11から出射された入射光波12の粒子(1,2..9)による回折から生じる光波22の特徴量を得ることが可能である。上記したように、振幅u(x, y, z)または位相φ(x, y, z)を評価することが可能であるが、振幅または位相の関数を評価することも可能である。
【００８２】
例えば、以下に示す相補的な振幅
【数９】
0006727229.tif 000010
と呼ばれる特徴量を評価することが可能である。
【数１０】
0006727229.tif 000011
【００８３】
個々の再構成された複素式U(x, y, z)から、
光検出器から距離|z|において、光検出器の面に対して平行な面における、式uz(x, y) = abs [U(x, y, z)]で表される光波22の振幅の画像uz、
光検出器から距離|z|において、光検出器の面に対して平行な面における、式φz(x, y) = arg [U(x, y, z)]で表される光波22の位相の画像φz、
光検出器から距離|z|において、光検出器の面に対して平行な面における、
【数１１】
0006727229.tif 000012
で表される上記したような相補的な振幅の画像
【数１２】
0006727229.tif 000013
を作成することが可能である。
【００８４】
この第１の例において、
伝播軸Zに沿った複数の座標z1…zMにおいて、相補的な振幅の画像
【数１３】
0006727229.tif 000014
が再構成される。ここで、Mは21である。
個々の画像
【数１４】
0006727229.tif 000015
（ここで、1≦m≦M）から、値
【数１５】
0006727229.tif 000016
が得られる。ここで、(xn, yn)は、光検出器16の面に対して平行な面における粒子nの座標を表す。
事前に特定された２つの量
【数１６】
0006727229.tif 000017
と
【数１７】
0006727229.tif 000018
との間の補間によって、種々の
【数１８】
0006727229.tif 000019
の値（ここで、zm < z < zm =+1）が得られる。
【００８５】
取得された画像I(x, y)または再構成距離zで得られた画像
【数１９】
0006727229.tif 000020
を用いて、
個々の検査される粒子nについて、光検出器16の面に対して平行な面における座標(xn, yn)が特定される。
【００８６】
図2Bは、以下の9つの種々の種類の異なる粒子について、上記したような相補的な振幅
【数２０】
0006727229.tif 000021
の変化を、再構成距離|z|の関数として示す。
粒子1〜4：白血球、頭字語WBCで示す。
粒子5〜6：赤血球、頭字語RBCで示す。
粒子7〜9：血小板、頭字語PLTで示す。
【００８７】
再構成距離|z|は、zmin = 1000μｍとzmax = 1500μｍとの間で変化する。これらの演算と平行して、個々の粒子(1,…,9)は顕微鏡を用いて観察された。この顕微鏡観察は確実な同定を得ることを可能とする基準測定として用いられる。
【００８８】
この例で測定されたサンプルでは、以下のことが示唆される。
白血球WBCである粒子1〜4では、相補的な振幅の変化を再構成距離の関数として表す曲線
【数２１】
0006727229.tif 000022
は、振幅の閾値
【数２２】
0006727229.tif 000023
よりも低い最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて増加し、この増加は顕著な変動を含む。
赤血球RBCである粒子5、6では、曲線
【数２３】
0006727229.tif 000024
は、ベースラインBLと振幅の閾値
【数２４】
0006727229.tif 000025
との間の最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて単調に増加する。
血小板PLTである粒子7〜9では、曲線
【数２５】
0006727229.tif 000026
は、ベースラインBLに従い、２つの値BL ± εの間にとどまる。
【００８９】
したがって、光検出器の面に対して平行な面における位置が(xn, yn)である個々の検出される粒子nについて、複数の再構成距離zにおける相補的な振幅の変化を表すプロファイル
【数２６】
0006727229.tif 000027
を確立し、このプロファイルを用いて、粒子が、赤血球、白血球、または血小板のいずれかであることを同定することが可能である。
【００９０】
このプロファイルは特に、既知の粒子を用いて学習段階で作成されたプロファイルのライブラリと比較することができる。換言すれば、伝播軸Z(座標zの軸)に沿った相補的な振幅の変化を表すプロファイル
【数２７】
0006727229.tif 000028
は、観察される粒子の種類の識別特性を形成する。
【００９１】
従来技術とは対照的に、サンプルから所定の距離におけるホログラフィック再構成を行うことによって粒子の複素画像を作成するのではなく、光検出器から複数の距離において、入射光波の伝播方向に沿って、入射光波12の粒子による回折から生じる光波22の特性が再構成される。得られる情報は、より豊富で、種々の種類の粒子間の明確な分類を可能とする。
【００９２】
図3A、3Bはそれぞれ、50個の白血球WBCと240個の赤血球RBCについて得られた、光検出器が受ける光波22の相補的な振幅プロファイル
【数２８】
0006727229.tif 000029
を示す。プロファイルは繰り返し再現性が良く、それに基づいて粒子の堅牢な分類が可能である。これらのプロファイルは、上記例と同様の実験条件で得られた。
【００９３】
図3Aに示す測定を得るために使用されたサンプルは、図2A、2Bを参照して述べたサンプルと同様、リッチプラズマであった。
図3Bに示す測定を得るために使用されたサンプルは、上記したようなリン酸緩衝食塩液（PBS）を用いて、希釈比1/400で希釈した全血液を含む。
【００９４】
図4Bは、上記種類のリッチプラズマのサンプル中の4個の血小板101、102、103、104について得られた、軸Zに沿った相補的な振幅プロファイル
【数２９】
0006727229.tif 000030
を示す。顕微鏡観察は、血小板101、102、103、104が凝集体であることを示した。
【００９５】
図4Aは、光検出器16によって取得された画像Iの対象領域を示す。これは、凝集体をなす個々の血小板の座標(x101,y101), (x102,y102), (x103,y103), (x104,y104)の同定を可能とする。
【００９６】
これらのプロファイルは、第１の例のプロファイルと同様の実験条件で得られたものである。
プロファイル
【数３０】
0006727229.tif 000031
は、血小板が凝集体であるかに関係なく同様であり、BL ± εの間隔内でベースラインBL付近にとどまることが示唆される。したがって、本発明の１つの主題である同定方法を用いることで、凝集体であっても血小板を正確に同定することが可能である。
【００９７】
第２の例において、光源11は、中心波長がλ = 485 nmであり、半値幅が22nmである485-DF-22 オメガ光学フィルタを結合した白色発光ダイオードである。光源と光検出器との間の距離Δは8cmである。サンプルは、上記したようなリッチプラズマである。
【００９８】
この例において、光検出器からの複数の距離zで光波22の複素式U(x, y, z)が再構成され、次いで、粒子の座標(x, y)において、光波の相補的な振幅と位相が特定された。そして、相補的な振幅と位相をzの関数として表すプロファイル
【数３１】
0006727229.tif 000032
およびφ(z)が確立された。
【００９９】
上記例と同様に、観察される粒子の特性は、顕微鏡観察によって確認された。
【０１００】
図5A、5Bはそれぞれ、種々の粒子について、相補的な振幅
【数３２】
0006727229.tif 000033
と位相φ(x, y, z)を距離zの関数として示す。図5Aは、以下のことを示す。
白血球WBCである粒子では、相補的な振幅の変化を再構成距離の関数として表す曲線
【数３３】
0006727229.tif 000034
は、振幅の閾値
【数３４】
0006727229.tif 000035
よりも低い際立った最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて増加し、この増加は顕著な変動を含む。
赤血球RBCである粒子では、曲線
【数３５】
0006727229.tif 000036
は、ベースラインBLと振幅の閾値
【数３６】
0006727229.tif 000037
との間の最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて単調に増加する。
血小板PLTである粒子では、曲線
【数３７】
0006727229.tif 000038
は、ベースラインBLに従い、２つの値BL ± εの間にとどまる。
【０１０１】
したがって、光検出器の面に対して平行な面における位置が(xn, yn)である個々の検出される粒子nについて、複数の再構成距離zにおける光検出器が受ける光波22の上記したような相補的な振幅の変化を表すプロファイル
【数３８】
0006727229.tif 000039
を確立し、
このプロファイルを用いて、粒子が、赤血球RBC、白血球WBC、または血小板PLTのいずれかであることを分類することが可能である。
したがって、分類は、レーザ光源以外の光源を用いても可能である。
【０１０２】
図5Bは、以下のことを示す。
白血球WBCである粒子では、位相φの変化を再構成距離zの関数として表す曲線φ(z)は、第１の位相の閾値φthreshold1よりも高い最大値を有し、次いで、第２の位相の閾値φthreshold2よりも低い最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて増加する。
赤血球RBCである粒子では、曲線φ(z)は、前記第１の位相の閾値φthreshold1よりも高い最大値を有し、次いで、前記第２の位相の閾値φthreshold2よりも高い最小値を有し、そこから曲線はベースラインBLに向けて単調増加する。
血小板PLTである粒子では、位相φの変化を再構成距離の関数として表す曲線φ(z)は、２つの値φthreshold1とφthreshold2の間にとどまる。測定される値は、前記第１、第２の位相の閾値の間にとどまる。
【０１０３】
したがって、光検出器の面に対して平行な面における位置が(n, n)である個々の検出される粒子nについて、複数の再構成距離zにおける光検出器が受ける光波の位相の変化を表すプロファイルφ(xn, yn, z)を確立し、このプロファイルを用いて、粒子が、赤血球、白血球、または血小板のいずれかであることを分類することが可能である。
【０１０４】
第３の例において、光源11は、中心波長がλ = 610 nmであり、半値幅が20nmである610-DF-20 オメガ光学フィルタを結合した白色発光ダイオードである。光源はサンプルからの距離Δが8cmのところに配置される。操作方法とサンプルは、上記例と同様である。
【０１０５】
図6A、6Bはそれぞれ、種々の粒子について、相補的な振幅
【数３９】
0006727229.tif 000040
と位相φ(x, y, z)を距離zの関数として示す。図6Aは、以下のことを示す。
白血球WBCである粒子では、振幅uの変化を再構成距離zの関数として表す曲線
【数４０】
0006727229.tif 000041
は、相補的な振幅の閾値
【数４１】
0006727229.tif 000042
よりも低い際立った最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて増加し、この増加は顕著な変動を含む。
赤血球RBCである粒子では、曲線
【数４２】
0006727229.tif 000043
は、ベースラインBLと振幅の閾値
【数４３】
0006727229.tif 000044
との間の最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて単調に増加する。
血小板PLTである粒子では、曲線
【数４４】
0006727229.tif 000045
は、ベースラインBLに従い、２つの値BL ± εの間にとどまる。
【０１０６】
したがって、光検出器の面に対して平行な面における位置が(xn, yn)である個々の検出される粒子nについて、複数の再構成距離zにおける光検出器が受ける光波22の上記したような相補的な振幅の変化を表すプロファイル
【数４５】
0006727229.tif 000046
を確立し、このプロファイルを用いて、粒子が、赤血球RBC、白血球WBC、または血小板PLTのいずれかであることを分類することが可能である。
【０１０７】
図6Bは、以下のことを示す。
白血球WBCである粒子では、位相φの変化を再構成距離zの関数として表す曲線φ(z)は、第１の位相の閾値φthreshold1よりも高い最大値を有し、次いで、第２の位相の閾値φthreshold2よりも低い最小値を有し、そこからベースラインBLに向けて増加する。
赤血球RBCである粒子では、曲線φ(z)は、前記第１の位相の閾値φthreshold1よりも高い最大値を有し、次いで、前記第２の位相の閾値φthreshold2よりも高い最小値を有し、そこから曲線はベースラインBLに向けて単調増加する。
血小板PLTである粒子では、位相φの変化を再構成距離zの関数として表す曲線φ(z)は、２つの値φthreshold1とφthreshold2の間にとどまる。測定される値は、前記第１、第２の位相の閾値の間にとどまる。
上記２つの例は、相補的な振幅のプロファイル
【数４６】
0006727229.tif 000047
または位相のプロファイルφ(z)によって粒子の特性を明らかにすることが可能であることを示す。
また、相補的な振幅と位相とを組み合わせた複合光学パラメータ、例えば下記式の比で表される符号kを使用することが可能である。
【数４７】
0006727229.tif 000048
図7A、7B、および7Cはそれぞれ、第１の例（405nmレーザ光源）、第２の例（中心波長がλ = 485 nmであるフィルタと組み合わされた白色LED光源）、および第３の例（中心波長がλ = 610 nmであるフィルタと組み合わされた白色LED光源）の構成において、伝播軸Zに沿った前記複合光学パラメータの変化を示す。各構成において、観察されるサンプルは、上記したようなリッチプラズマである。 
【０１０８】
各グラフにおいて、分析された粒子は、３つの白血球（WBC）と１つの赤血球（RBC）である。
【０１０９】
光源によらず、プロファイルk(z)における変動は、赤血球よりも白血球の方が大きくなることが示唆される。
【０１１０】
特に、第１の複合の閾値kthreshold1と第２の複合の閾値kthreshold2から同定することが可能である。プロファイルk(z)が第１の複合の閾値kthreshold1未満と第２の複合の閾値kthreshold2超との間にとどまるとき、分析される粒子は赤血球であると同定される。プロファイルがこれらの閾値の一方を外れるとき、検査される粒子は白血球であると同定される。
【０１１１】
マトリクスアレイ光検出器16によって取得された画像Iまたはホログラムに対するデジタル伝播演算子hの適用は、取得された画像が位相に関する情報を含まないことから、ある限界を有するかもしれない。したがって、プロファイルが確立される前に、光検出器16が受ける光波22の位相に関する情報を得ることが好ましい。
この位相に関する情報は、従来技術に記載の方法を用いて、サンプル14の複素画像Uzを再構成し、マトリクスアレイ光検出器16の面Pまたは光検出器から距離|z|に位置する再構成面Pzにおける光波22の振幅と位相の評価を得ることができる。本発明者らは、基準複素画像の計算に基づく方法を開発した。図8Aを参照して、この方法について述べる。この方法は、以下の工程を含む。
マトリクスアレイ光検出器16を用いてサンプル14の画像Iを取得する。この画像は、ホログラムを形成する（工程100）。
再構成面Pzまたは検出面Pにおけるサンプル14の基準画像Urefと呼ばれる複素画像を計算する。この基準複素画像は、マトリクスアレイ光検出器16が受ける光波22の位相と振幅に関する情報を含む。この工程は、取得された画像Iに対して、上記伝播演算子hを適用することによって実行される。この複素画像は、粒子の特性を明らかにするプロファイルがその画像に基づいて作成されるため、基準画像と呼ばれる（工程110〜170）。
基準複素画像Urefまたは光検出器によって取得された画像を用いて、検出面または検出面に対して平行な面における粒子の動径位置(x,y)を選択する（工程180）。
基準複素画像Urefに対して伝播演算子hを適用することによって、伝播軸Zに沿った第２の画像と呼ばれる複素画像Uref,zを計算する（工程185）。
再構成面Pz（または検出面P）から複数の距離において、あらかじめ選択された粒子の動径座標(x,y)で、個々の第２の複素画像Uref,zから、光波22の特徴量を評価し、伝播軸Zに沿った上記特徴量の変化を表すプロファイルを作成する（工程190）。
上記プロファイルに応じて粒子を特徴付ける。上記したように、この特徴付けは、得られたプロファイルを、標準サンプルを用いて位相を測定して得られた標準プロファイルと比較することによって行うことができる（工程200）。
【０１１２】
図8Aに示すアルゴリズムについて、以下に詳述する。あるいくつかの工程で得られた結果を図8B〜8Dに示す。工程110〜170は、Urefで示す基準複素画像を得る好ましい方法であり、この画像は、再構成面Pzにおける光波22の複素式の空間的な分布を表す。当業者であれば、他のアルゴリズムを用いてもそのような複素画像の再構成を行うことが可能であることは理解されよう。例えば、従来技術を参照して述べたアルゴリズムを用いることを想到できるであろう。
工程100：画像の取得
【０１１３】
この工程において、画像センサ16は、サンプル14の画像I、より正確にはサンプルから送られて画像センサが受ける光波22の画像を取得する。そのような画像またはホログラムを、図8Bに示す。
【０１１４】
この画像は、緩衝食塩液に浸された赤血球を含み、上記装置のように、CMOSセンサから1500μｍの距離dに配置された100μｍ厚の流体チャンバに入れられたサンプル14を用いて得られたものである。
工程110：初期化
【０１１５】
この工程において、画像センサ16によって取得された画像Iからサンプル14の初期画像U0k=0が特定される。この工程は、以下に工程120〜180を参照して述べる反復アルゴリズムの初期化であり、指数kは、個々の繰り返しが何番目であるかを示す。初期画像U0k=0の係数u0k=0は、画像センサによって取得された画像Iに対して平方根演算子を適用することによって得ることができ、この場合、
【数４８】
0006727229.tif 000049
である。
この例において、画像Iは、サンプル14に入射する光波12の強度で代表されるものによって正規化される。サンプル14に入射する光波12の強度は例えば、画像Iの平均
【数４９】
0006727229.tif 000050
の平方根であり、
この場合、取得された画像Iの個々の画素I(x, y)が以下に示すように上記平均で除される。
【数５０】
0006727229.tif 000051
【０１１６】
初期画像U0k=0の位相φ0k=0は、個々の画素(x,y)においてゼロまたは所定の任意の値に決められた所定値とすることができる。特に、初期画像U0k=0は、マトリクスアレイ光検出器16によって取得された画像Iから直接得られる。しかしながら、マトリクスアレイ光検出器16によって取得された画像Iは、サンプル14から送られた光波22の位相に関する情報を含まず、画像センサ16は、この光波の強度に対してのみ反応する。
工程120：伝播
【０１１７】
この工程において、上記したような伝播演算子を適用することによって、サンプルの面で得られた画像U0k-1が再構成面Pzに伝播され、再構成面Pzにおいてサンプル14を表す複素画像Uzkが得られる。伝播は、以下に示す伝播演算子h−zを用いて、画像U0k-1を重畳することによって実行される。
【数５１】
0006727229.tif 000052
ここで、符号＊は、畳み込み演算子を表す。符号「−z」は、伝播軸Zの方向に対して反対方向に伝播が実行されることを表す。後方伝播とも言う。
【０１１８】
１回目の繰り返し(k=1)において、U0k=0は、工程110で特定された初期画像である。それ以降の繰り返しにおいて、U0k-1は、各繰り返しにおいてアップデートされた検出面Pにおける複素画像である。
【０１１９】
再構成面Pzは、検出面から離れた、好ましくは検出面Pに対して平行な面である。好ましくは、再構成面Pzは、サンプル14が存在する面P14である。特に、この面で再構成された画像では、一般的に高い空間分解能を得ることができる。それはまた、検出面からゼロ以外の距離に位置する、好ましくは検出面に対して平行な面、例えば、マトリクスアレイ光検出器16とサンプル14との間に存在する面であってもよい。
工程130：複数の画素におけるインジケータの計算
【０１２０】
この工程において、複素画像Uzkの複数の画素(x,y)、好ましくはこれらの画素のそれぞれについて、個々の画素に関連した量εk(x,y)が計算される。この量は、計算が行われる画素(x,y)の画像Uzkまたはその係数の値Uzk(x,y)に依存する。それはまた、この画素の画像の導関数、例えばこの画像の導関数の係数に依存することができる。
【０１２１】
この例において、個々の画素に関連した量εk(x,y)は、個々の画素の画像Uzkと値1との間の差の係数である。そのような量は、下記式を用いて得ることができる。
【数５２】
0006727229.tif 000053
工程140：画像Uzkに関連したノイズインジケータの確立
【０１２２】
工程130において、複素画像Uzkの複数の画素において、量εk(x,y)が計算された。これらの量は、ベクトルEkから得ることができる、個々の画素(x,y)に関連した量εk(x,y)である。この工程において、ベクトルEkのノルムから、ノイズインジケータと呼ばれるインジケータが計算される。一般的に、オーダーはノルムと関連し、ディメンジョンnの座標(x1, x2,…xn)で表されるベクトルxのオーダーpのノルム
【数５３】
0006727229.tif 000054
は、下記式で表される。
【数５４】
0006727229.tif 000055
ここで、p≦0である。
【０１２３】
この例では、オーダー1、換言すればp=1のノルムが用いられる。以下に述べるように、本発明者らは、オーダー1またはオーダー1以下のノルムが、そのようなサンプルに対して特に適することを見出している。
【０１２４】
この工程において、複素画像Uzkの個々の画素(x,y)について計算された量εk(x,y)が合計され、複素画像Uzkに関連した、下記式で表されるノイズインジケータεkが求められる。
【数５５】
0006727229.tif 000056
【０１２５】
オーダー1またはオーダー1以下のノルムが用いられることで、ノイズインジケータεkの値が減少し、複素画像Uzkはサンプルをより精度良く表すものとなる。特に、１回目の繰り返しにおいて、画像U0kの個々の画素(x,y)における位相φ0k(x, y)の値の評価は良くない。また、従来技術を参照して述べたように、検出面Pから再構成面Pzへのサンプル画像の伝播は、実質的な再構成ノイズを伴う。この再構成ノイズは、再構成された画像における変動の形となって現れる。これらの変動の故に、再構成された画像における再構成ノイズの寄与が増加すると、上記したようなノイズインジケータεkの値が増加する。特に、再構成ノイズに由来する変動は、このインジケータの値が増加させる傾向がある。
【０１２６】
この工程の重要な点は、検出面Pにおいて、サンプルの画像U0kの個々の画素に対する位相値φ0k(x, y)を特定することであり、このことは、次の繰り返しにおいて、インジケータεkより低いインジケータεk＋1の再構成画像Uzk＋1が得られることを可能とする。
【０１２７】
上記したように、１回目の繰り返しにおいて、関連する情報は、光波22の位相ではなく強度のみから得られる。したがって、検出面Pにおける光波22の位相に関連する情報がないことから、再構成面Pzにおいて再構成される最初の画像Uzk=1は、再構成ノイズの実質的な量の影響を受ける。したがって、インジケータεk=1の値は高いものとなる。以降の繰り返しにおいて、アルゴリズムは、検出面Pにおける位相φ0k(x, y)を徐々に調整し、インジケータεkを徐々に最小化する。
【０１２８】
検出面における画像U0kは、強度と位相の両方の観点から、検出面Pにおける光波22を表す。工程120〜160は、画像U0kの個々の画素に対して、繰り返し、画像U0k−1を再構成面Pzに伝播することによって得られる画像Uzkから得られるインジケータεkを最小化する位相φ0k(x, y)の値を確立することを目的としている。
【０１２９】
最小化アルゴリズムは、勾配降下法または共役勾配降下法であることができる。後者について以下に述べる。
工程150：検出面における位相の値の調整
【０１３０】
工程150は、次の繰り返しk+1において、複素画像U0kの再構成面Pzへの伝播から生じるインジケータεk＋1を最小化するように、複素画像U0kの個々の画素の位相φ0k(x, y)の値を特定することを目的としている。これを行うことで、複素画像U0kの画素の位相φ0k(x, y)である位相ベクトルφ0kが確立される。このベクトルのディメンジョンは(Npix, 1)である。ここで、Npixは、画素数である。このベクトルは、個々の繰り返しにおいて、下記のアップデータ式を用いてアップデータされる。
φ0k(x, y)= φ0k−1(x, y) + αkpk(x, y)
ここで、
αkは、距離を表す、「ステップサイズ」と呼ばれる数である。
pkは、ディメンジョン(Npix, 1)の方向ベクトルである。
個々のp(x, y)はインジケータεkの勾配
【数５６】
0006727229.tif 000057
の方向を表す。
この式は、以下のようにベクトル形式で表すことができる。
φ0k=φ0k−1 +αkpk
それは、以下のように表すことができる。
【数５７】
0006727229.tif 000058
ここで、
【数５８】
0006727229.tif 000059
は、ディメンジョン(Npix, 1)の勾配ベクトルであり、インジケータεkの変化を未知の値、例えばベクトルφ0kの自由度の関数として表す。
pk−1は、上記繰り返しにおいて確立された方向ベクトルである。
βkは、方向ベクトルpk−1に適用されるスケールファクタである。
勾配ベクトル
【数５９】
0006727229.tif 000060
の個々の
【数６０】
0006727229.tif 000061
は、下記式で表される。
【数６１】
0006727229.tif 000062
ここで、Imは演算項の虚数部を戻す演算子であり、r′は検出面における座標(x, y)である。
【０１３１】
スケールファクタβkは、下記式で表すことができる。
【数６２】
0006727229.tif 000063
【０１３２】
ステップサイズαkは、繰り返しの回に応じて、例えば、１回目の繰り返しにおける0.03と最後の繰り返しにおける0.0005との間で、変化することができる。
【０１３３】
アップデータ式はベクトルφ0kの調整を可能とし、これによって複素画像U0kの個々の画素における位相φ0k(x, y)の繰り返しアップデータが可能となる。そして、検出面におけるこの複素画像U0kは、個々の画素に関連した位相のこれらの新しい値を用いてアップデータされる。なお、複素画像U0kの係数は変更されず、これは、マトリクスアレイ光検出器16によって取得された画像から特定され、下記式で表される。
u0k(x, y)= u0k=0(x, y)
工程160：アルゴリズムの繰り返しまたは終了
【０１３４】
収束基準に到達しない限り、工程160では、工程150においてアップデータされた複素画像U0kに基づいて、工程120〜160の新しい繰り返しを含むアルゴリズムの繰り返しを行う。収束基準は、所定の繰り返し回数K、インジケータの勾配
【数６３】
0006727229.tif 000064
の最小値、
または２つの連続する位相ベクトルφ0k−1、φ0kの間の無視可能な差であることができる。収束基準に到達したとき、評価は、検出面Pまたは再構成面Pzにおけるサンプルの複素画像の正確な評価であると見なせる。
工程170： 基準複素画像の取得
【０１３５】
この方法では、最後の繰り返しの終わりに、再構成面Pzに対して最後の繰り返しから生じる複素画像U0kが伝播され、基準複素画像Uref＝Uzkを得ることができる。代替的に、基準複素画像Urefは、検出面Pにおける最後の繰り返しから生じる複素画像U0kであってもよい。ただし、粒子の密度が高いときには、この代替は不利である。これは、特に再構成面Pzがサンプル14が存在する面P14に対応するとき、検出面Pにおける空間分解能は再構成面Pzにおけるそれよりも小さいためである。
【０１３６】
図8Cは、8回の繰り返しの後に再構成面Pzで得られた基準複素画像Uzk=8の個々の画素の係数uzk=8を示す。この画像の空間分解能では、個々の粒子の動径座標(x, y)を良好に同定することが可能である。
工程180：粒子の動径座標の選択
【０１３７】
この工程において、粒子の動径座標(x, y)は、基準画像Uref＝Uzk=30から、例えば係数uref＝uzk=30の画像または位相φref=φzk=30の画像から、選択される。上記したように、用語「動径座標」は、検出面または再構成面の座標を示す。また、最後の繰り返しに続いて検出面で得られたホログラムI0または複素画像U0kに基づいて、この選択を実行することを想到することができる。ただし、粒子数が多いときには、特に再構成面PzがサンプルP14の面に対応するときに、より良い空間分解能が得られることから、再構成面で作成された画像の選択を実行することが好ましい。図8Cにおいて、点線で囲まれた粒子の選択が示されている。
工程185：伝播演算子の適用
【０１３８】
この工程185において、上記したような伝播演算子hを用いて、基準複素画像Urefが複数の再構成距離に伝播され、検出面Pまたは再構成面Pzからの種々の距離で再構成された第２の複素画像Uref,zと呼ばれる複数の画像が得られる。このように、この工程は、下記式で表される複数の複素画像Uref,zの特定を含む。
【数６４】
0006727229.tif 000065
ここで、zmin ≦ z ≦ zmax である。
【０１３９】
値zminとzmaxは、基準複素画像が伝播される軸Zに沿った最小と最大の座標である。好ましくは、サンプル14と画像センサ16との間の複数の座標zで複素画像が再構成される。複素画像は、サンプル14の一方の側で作成することができる。
【０１４０】
これらの第２の複素画像は、ホログラフィック再構成演算子hを基準画像Urefに適用することによって確立される。基準画像は、工程120〜160の繰り返しに続いて画像センサが受ける光波22、特にその位相を正確に表す複素画像である。したがって、第２の画像Uref,zは、伝播軸Zに沿った光波22の伝播の良い記述子となる。
工程190：プロファイルの作成
【０１４１】
この工程において、個々の第２の複素画像Uref,zから上記したような光波22の特徴量が特定され、伝播軸Zに沿った特徴量の変化を表すプロファイルが特定される。特徴量は例えば、係数、位相、またはこれらの組合せであることができる。図8Dは、伝播軸Zに沿った光波22の位相φ(z)の変化を示す。
工程200：特徴付け
【０１４２】
そして、上記工程で作成されるプロファイルから粒子の特性を明らかにすることができる。好ましくは、既知の標準サンプルを用いて学習段階で作成された標準プロファイルのデータベースを利用することができる。そして、特徴付けは、標準プロファイルに基づいて、作成されたプロファイルを比較または分類することによって、実行される。
【０１４３】
この態様では、赤血球を含むサンプルについて試験を行った。図9A〜9Eに他の例を示す。これらの例において、サンプルは、リン酸緩衝食塩液（PBS）を含む水溶液を用いて、希釈比1/400で希釈した赤血球を含む。サンプル14は、100μｍ厚の流体チャンバ15内に入れられ、このチャンバは、スペクトルバンドの中心波長が450nmである上記発光ダイオードから8cmの距離に配置された。サンプルは、上記CMOS画像センサから1.5mmの距離に配置された。空間フィルタ18の開口径は、150μｍであった。
【０１４４】
図9Aは、画像センサによって取得された画像Iを示す。図9B、9Cにそれぞれ、サンプルの面P10において再構成された複素画像Uzk=8の係数と位相の画像を示す。これらの画像は、8回の繰り返しで得られたものである。
【０１４５】
画像Uzk=8は基準画像Urefを形成し、それに対して上記したような伝播演算子hが適用され、伝播軸Zに沿った複数の第２の複素画像Aref,zが得られた。さらに、基準画像の係数または位相の画像において、赤血球が同定された。この赤血球は、これらの画像のそれぞれにおいて、点線で囲まれている。この赤血球の動径座標(x, y)が得られた。第２の複素画像Aref,zから係数を表すプロファイルu(z)と画像センサ16に到達する光波22の位相を表すプロファイルφ(z)が作成された。プロファイルの個々の点の値は、上記動径座標において各第２の画像の係数と位相を特定することによって得られる。図9D、9Eはそれぞれ、このようにして選択された赤血球の係数と位相のプロファイルを示す。プロファイルは、座標 zmin = 1000μｍ〜zmax = 2000μｍ、ステップサイズ5μｍの条件で特定された。再構成面は、検出面から1380μｍに位置し、これは図9Dおよび9Eにおける横軸76に対応する。
【０１４６】
上記方法は血液粒子に限定されず、他の体液、例えば、尿、脳脊髄液、骨髄等に適用することができる。さらに、この方法は、特に、水または他の水溶液中の汚染物質または毒素の分析用の非体液にも適用することができる。
【０１４７】
この方法はまた、寒天等の非液体媒体、または、スライド上に広く付着した乾燥血液を得る血液塗抹等の体液の乾燥残留物内の粒子の検出と同定に適用することができる。後者の場合、粒子は、乾燥残留物または空気によって互いに隔てられている。 
【０１４８】
さらに、上記したように、粒子は、内因粒子（例えば血液粒子）であっても外因粒子（マイクロビーズ、小滴）であってもよい。
【０１４９】
上記の例は、特徴量を再構成距離の関数として表すプロファイルにおける変化と所定の閾値を用いた比較に基づく、シンプルな同定のクライテリアを提供する。クライテリアの妥当性は、粒子が置かれる媒体とサンプル準備のプロトコルに関係する。他のクライテリアは、異なる準備のプロトコルを受けた粒子に適用することができる。したがって、同定のクライテリアは、与えられたサンプルの種類に対して、既知の粒子を含む標準サンプルについて実行された学習段階で特定することができる。
【０１５０】
また、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、より複雑でより堅牢な他の分類方法を実行することができる。
【図１】
0006727229.tif 000071
【図２Ａ】
0006727229.tif 000072
【図２Ｂ】
0006727229.tif 000073
【図３Ａ】
0006727229.tif 000074
【図３Ｂ】
0006727229.tif 000075
【図４Ａ】
0006727229.tif 000076
【図４Ｂ】
0006727229.tif 000077
【図５Ａ】
0006727229.tif 000078
【図５Ｂ】
0006727229.tif 000079
【図６Ａ】
0006727229.tif 000080
【図６Ｂ】
0006727229.tif 000081
【図７Ａ】
0006727229.tif 000082
【図７Ｂ】
0006727229.tif 000083
【図７Ｃ】
0006727229.tif 000084
【図８】
0006727229.tif 000085
【図９】
0006727229.tif 000086