(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的液体の処理又は混合のための中空円筒遠心処理チャンバ内での洗浄、インキュベーション、形質導入、分離、密度勾配分離、希釈及び容量調整を含む処理工程、及び／又は上記生物学的液体を試薬及び／又は希釈剤と混合することによる、全血、アフェレーシス血液、骨髄血液、臍帯血、軟膜又は培養細胞のような、不透明な生物学的液体及び透明な生物学的液体の連続的処理方法であって、上記遠心処理チャンバが、処理チャンバ内の分離スペースの容量を変化させるために、その概ね円筒形である壁内にピストンのような軸方向に可動な部材を有し、上記分離スペースに生物学的液体を入力し又は上記分離スペースから生物学的液体を出力し、上記処理チャンバが、上記生物学的液体と試薬及び／又は希釈剤とを含む使い捨てセットの一部であり、上記使い捨てセットは密閉された無菌環境を構成している方法であって、
単一の使い捨てセットの一部としての単一の処理チャンバを使用し、洗浄（分離処理としての予備洗浄及び後洗浄を含む）、インキュベーション、形質導入、分離、密度勾配分離、希釈及び容量調整から選択される少なくとも３つの異なる処理を実行し；上記各処理は、単一の使い捨てセットの処理チャンバ内の所与の処理プロファイルに従って１回行われるか、又は複数回繰り返され；上記各処理は、上記可動部材を軸方向に移動させることによって生ずる処理チャンバ内への取り入れ、上記チャンバ内での操作、及び上記可動部材を軸方向に移動させることによって生じる処理チャンバからの出力を含み；上記少なくとも３つの異なる処理が、処理チャンバ内で連続的に連鎖して、処理チャンバ及びその単一の使い捨てセット内の全体的な連続操作として、異なる処理の連鎖を構成し、全ての生物学的液体、少なくとも３つの異なる処理の全てを実施するために必要な試薬及び／又は希釈剤は、全体的な連続操作のために使用される単一の使い捨てセットの閉鎖された無菌環境に含まれることを特徴とする、方法。
【請求項２】
上記処理チャンバ内の全体的な連続的動作を構成する上記連鎖した処理が、以下の（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の連続的処理のうちの１つを有する、請求項１に記載の方法。
（ｉ）予備洗浄；試薬の添加及びインキュベーション；後洗浄、
（ｉｉ）洗浄；希釈；遠心分離；希釈；生成物の容量調整、並びに
（ｉｉｉ）予備解凍；洗浄；サンプリング及び希釈；容量調整／抽出。
【請求項３】
以下の処理：予備洗浄、試薬の添加及びインキュベーション；後洗浄が連続的に実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
磁性ビーズをヒト血球細胞又は幹細胞と結合させる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
以下の処理：洗浄；希釈；遠心分離；希釈；生成物の容量調整が連続的に実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
リンパ球Ｔ細胞又は他のヒト細胞によるウイルス形質導入のためのものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
以下の処理：予備解凍；洗浄；サンプリング及び希釈；容量調整／抽出が連続的に実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
複数回用量の細胞産物の再調整用である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記可動部材の位置が赤外線センサによって監視される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
１つの全体的な連続操作のための１つの使い捨てセットの処理チャンバ内で処理される液体の量が、処理チャンバの最大処理容量の４〜１６倍である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
上記処理チャンバが、使用者の介入なしで上記使い捨てセットのバッグを切り替えるための２つの生物学的添加物を選択するための、上記使い捨てセットのチューブを制御する２つの外部ピンチバルブを伴っている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、洗浄、インキュベーション、形質導入、分離、密度勾配分離、希釈及び容量調整を含む処理工程による、全血、アフェレーシス血液、骨髄血液、臍帯血、軟膜又は培養細胞のような生物学的液体の処理システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
全体が本明細書に組み入れられる特許文献１（Ｃ．ＦＥＬＬ）は、分離すべき生物学的液体と分離された成分とを受け取るための一連の容器を有し、場合により添加剤溶液のための１以上の追加の容器を有する、体液の処理及び成分への分離のための処理システムを開示している。処理チャンバは処理すべき生物学的液体及び処理された生物学的液体の構成要素用に、軸方向に入口／出口を有している。この入口／出口は、生物学的液体の全ての遠心分離処理が行われる体積可変性の分離空間につながっている。処理チャンバは、処理チャンバの端壁から伸びる概ね円筒形である壁を有し、この概ね円筒形の壁は、回転軸と同軸の、中空開放型の円筒空間を占有する中空の処理チャンバをその中に画定しており、軸方向の入口／出口は、中空処理チャンバ内に開口して、概ね円筒形の壁と同軸に前記端壁内に設けられている。処理チャンバは概ね円筒形の壁の内側に、ピストンのような軸方向に可動な部材を有している。体積可変式の分離空間は、概ね円筒形の壁と、処理チャンバの概ね円筒形の壁の内側に在る軸方向に可動な部材とによって処理チャンバの上部に画定されており、このとき移動可能部材の軸方向の運動が分離空間の体積を変え、移動可能部材は処理チャンバ内を軸方向に移動して、遠心処理前又は処理中に選択された量の処理対象の生物学的液体を入口から分離空間内に取り込み、かつ遠心分離処理中又は処理後に分離空間から処理済みの生物学的液体の構成要素を出口から出す。可動部材の位置をモニタリングし、それによって生物学的液体の取込み量及び分離された構成要素の排出量を制御する手段が提供される。システムは更に処理チャンバと選択された容器との選択的連絡を確立する、又は処理チャンバと容器の連絡を絶つための分配バルブ装置を有している。
【０００３】
特許文献２によれば、このようなシステムは分離及び非分離移送モードで運転するように計画されており、これによって、造血幹細胞の分離及び一般実験室での処理といった従来想定されていない新規の応用を含めたシステム使用の可能性が大きく広げられる。
【０００４】
特許文献１及び特許文献２の装置は生物学的液体の分離操作のために設計されており、密閉された滅菌環境を構成する使い捨てセットの一部である処理チャンバ又は混合チャンバを使用し、多くの分離用途、特にドナー又は患者からの成分のオンライン分離（ｏｎ−ｌｉｎｅ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）に対してかなり多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）であることが証明されている。このシステムは、Ｂｉｏｓａｆｅ  ＳＡにより、商標Ｓｅｐａｘで商品化されている。
【０００５】
Ｓｅｐａｘシステムは、主に骨髄、臍帯血又は末梢血のような血液源に由来する軟膜に懸濁した造血性、間葉性又は脂肪由来の幹細胞のような成体幹細胞を含む血液及び血液派生物製品を処理するために過去に使用された。
【０００６】
これまでの最も典型的な応用は、血液又は血液派生物の容積を減少させる処理であった。このようにすることにより、血漿及びほとんどの赤血球は枯渇し、本質的に白血球及び残りの血漿に懸濁した幹細胞、並びに赤血球を含む軟膜層が、選択可能な容積で収集される。選択された最終量に基づいて、より多くの血漿及び赤血球を使用者の必要に応じて加えることができる。
【０００７】
Ｓｅｐａｘ技術がしばしば使用される第２の用途は洗浄用途である。幹細胞濃縮製品は、典型的には４８時間以内に使用されない場合には、通常は凍結保存される。幹細胞を含む細胞産物が移植に必要とされると、解凍処理が行われ、次いで残留毒性ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）によって生じる移植中の付随的な影響を排除するために洗浄処理が実施されることが推奨される。
【０００８】
第３の用途は、用量を減少することが所望される所望の生成物と密度勾配媒体を混合することからなる。沈降の間、遠心工程の際に、密度勾配媒体は、血漿及び単球及びリンパ球細胞集団の後であるが、顆粒球及び赤血球の前に層を生成する。Ｓｅｐａｘの技術により、赤血球を含まない培地に懸濁した白血球及び幹細胞を抽出することができる。これは、提供者と需要者との間に軽度又は重大な不適合性がある場合の移植に特に適している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】欧州特許第０  ９１２  ２５０号公報
【特許文献２】欧州特許第１  １４４  ０２６号公報
【特許文献３】国際公開第２００９／０７２００３号パンフレット
【特許文献４】国際公開２０１４／１８１１５８号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これまでのＳｅｐａｘ技術で行われたほとんどの用途では、通常は８８０ｍｌよりもはるかに低い限定的な量の、幹細胞を含む血液及び血液製剤の処理に焦点を絞っていた。また、公知のＳｅｐａｘの用途では、本質的には、製品の用量濃縮又は洗浄用途等の単一処理機能を最も頻繁に行うことに限定されていた。Ｓｅｐａｘのもう１つの限界は、処理すべき製品が全て製品中に赤血球を含むことであり、装置は赤血球とピストン内ギャップとの間の移行を決定するための必須要素として光学センサを使用していた。
【００１１】
生物学的液体を処理するための他のシステムとしては、例えば、遠心ボウル及び結合された試料分離ユニットを含む試料処理ユニットを有する、特許文献３のものが公知である。このようなシステムでは、連続的な処理工程を実施することができるが、その設定及び操作はＳｅｐａｘシステムと大きく異なっているため、Ｓｅｐａｘシステムの改善に有用な手引とはならない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、生物学的液体の処理又は混合のための中空円筒遠心処理チャンバ内での洗浄、インキュベーション、形質導入、分離、密度勾配分離、希釈及び容量調整を含む処理工程、及び／又は上記生物学的液体を試薬及び／又は希釈剤と混合することによる、全血、アフェレーシス血液、骨髄血液、臍帯血、軟膜又は培養細胞のような、不透明な生物学的液体及び透明な生物学的液体の連続的処理方法であって、上記遠心処理チャンバが、処理チャンバ内の分離スペースの容量を変化させるための、その概ね円筒形である壁内に、ピストンのような軸方向に可動な部材を有し、上記分離スペースに生物学的液体を入力し又は上記分離スペースから生物学的液体を出力し、上記処理チャンバが、上記生物学的液体と試薬及び／又は希釈剤とを含む使い捨てセットの一部であり、上記使い捨てセットは密閉された無菌環境を構成している方法に関する。
【００１３】
本発明によれば、単一の使い捨てセットの一部としての単一の処理チャンバを使用し、洗浄、インキュベーション、形質導入、分離、密度勾配分離、希釈及び容量調整から選択される少なくとも３つの処理を使用し；上記各手段は、処理チャンバ内の所与の処理プロファイルに従って１回行われるか、又は複数回繰り返される。上記各処理は、上記可動部材を軸方向に移動させることによって生ずる処理チャンバ内への取り入れ、上記処理チャンバ内での操作、及び上記可動部材を軸方向に移動させることによって生じる処理チャンバからの出力を含む。上記少なくとも３つの異なる処理が、処理チャンバ内で連続的に連鎖して、処理チャンバ及びその単一の使い捨てセット内の全体的な連続操作として、異なる処理の連鎖を構成する。全ての生物学的液体、少なくとも３つの異なる処理の全てを実施するために必要な試薬及び／又は希釈剤は、全体的な連続操作のために使用される単一の使い捨てセットの閉鎖された無菌環境に含まれる。
【００１４】
１つの用途では、以下の処理：予備洗浄；試薬の添加及びインキュベーション；後洗浄が連続的に実施される。例えば、この用途は磁性ビーズをヒト血球細胞又は幹細胞と結合させるためのものである。
【００１５】
他の用途では、以下の処理：洗浄；希釈、遠心分離；希釈；生成物の容量調整が連続的に実施される。例えば、この用途はリンパ球Ｔ細胞又は他のヒト細胞によるウイルス形質導入のためのものである。
【００１６】
更に他の用途では、以下の処理：予備解凍；洗浄；サンプリング及び希釈：容量調整／抽出が連続的に実施される。例えば、この用途は複数回用量の細胞産物の再調整用である。
【００１７】
説明として、種々の処理は、通常は、以下の工程を含む。
【００１８】
洗浄処理は、通常は以下の工程：細胞をベースとする生成物で処理チャンバを満たし、処理チャンバの残りの容量を洗浄液で満たし、所与のＧ力で所定の時間ｔの間スピンし、回収バッグ内で洗浄液を抽出し、最後に出力収集バッグ内の細胞を含む所望の最終容量を抽出する工程を含む。
【００１９】
インキュベーション処理は、通常は以下の工程：細胞をベースとする生成物で処理チャンバを満たし、インキュベーションビーズで処理チャンバを満たし、一定の時間間隔で処理チャンバの双方向混合によってインキュベーションを行い、最後にインキュベートした生成物を収集バッグに入れる。
【００２０】
形質導入処理は、通常は以下の工程：細胞をベースとする生成物で処理チャンバを満たし、生物学的ウイルスで処理チャンバを満たし、所与のＧ力で所定の時間ｔの間スピンして形質導入を実施し、出力収集バッグ内に形質導入生成物を抽出する工程を含む。
【００２１】
分離工程は、通常は以下の工程：細胞をベースとする生成物で処理チャンバを満たし、所与のＧ力で所定の時間ｔの間スピンして生成物を分離し、回収バッグ内の所望でない成分と出力収集バッグ内の細胞含有成分層をチャンバから抽出する工程を含む。
【００２２】
密度勾配処理は、通常は以下の工程：密度勾配媒体でスピンされた処理チャンバを満たし、細胞をベースとする生成物でスピンされた処理チャンバをゆっくりと満たし、所与のＧ力で所定の時間ｔの間スピンして溶液を成分に分離し、回収バッグ内の所望でない成分と、出力収集バッグ内の細胞含有成分層及び密度勾配媒体の一部とをチャンバから抽出する工程を含む。
【００２３】
濃縮処理は、通常は以下の工程：細胞をベースとする生成物で処理チャンバを満たし、所与のＧ力で所定の時間ｔの間スピンして細胞を濃縮し、回収バッグ内の所望でない成分を抽出し、出力収集バッグ内の密集細胞を抽出する工程を含む。
【００２４】
希釈処理は、通常は以下の工程：所望の最終細胞濃度が達成される必要がある場合の初期の細胞をベースとする生成物を特徴づけ；細胞をベースとする生成物で処理チャンバを満たし；所望の容量又は細胞濃度希釈比に基づいて予め計算された容量の食塩水溶液を処理チャンバに充填し続けるか、又は培地を栄養溶液に懸濁させ；処理チャンバからの流体の充填及び抽出の際に、希釈又は懸濁した細胞溶液を混合するために一定の時間間隔で処理チャンバを双方向に混合し；出力収集バッグ内の希釈された細胞溶液をチャンバから抽出する工程を含む。
【００２５】
容量調整処理は、通常は以下の工程：細胞をベースとする生成物又は予め希釈された溶液で処理チャンバを満たし、出力容量及び要求される用量数を選択し、異なるバッグに自動的に切り替えることにより、又は各服用後に休止させることによって処理チャンバから複数の服用量を抽出し、使用者に次の用量を抽出すべきバッグを選択させる工程を含む。
【００２６】
通常、処理チャンバは可動ピストンを有し、ピストン（又は他の可動部材）の位置は赤外線センサによって監視されている。
【００２７】
１回の全体的な連続操作のために処理チャンバ内で処理される液体の容量は、処理チャンバの最大処理容量の最大１６倍である。例えば、１回の全体的な連続操作のための容量は、処理チャンバの最大処理容積の４倍、８倍又は１６倍としてもよくすることができ、これは処理チャンバ内の前述の分離空間の最大容積で表すことができる。
【００２８】
有利には、処理チャンバは、使用者の介入なしで使い捨てセットのバッグを切り替えるための２つの生物学的添加物を選択する使い捨てセットの管を制御する２つの外部ピンチバルブと一体化されている。
【００２９】
本発明の方法を実施するためのシステムは、通常は、例えば公知のＳｅｐａｘ技術に従って、使い捨てセットの中空遠心分離チャンバ又は混合処理チャンバを収容するキャビネットを有している。
【００３０】
異なる処理と連鎖する本発明の方法の１つの利点は、これまで可能であったよりも大きな容積、例えば４リットルまでの容量を処理することができることであるが、以前に処理された容積は８８０ｍｌまでであった。
【００３１】
また、すべてのタイプの白血球（血小板、単球、リンパ球、顆粒球）に処理を拡張することが可能になったが、以前の処理は基本的に幹細胞及び赤血球に限定されていた。これは、赤血球に使用されていた以前の光センサに代え、透明流体を処理しながらピストン位置を正確に測定するように設計されたアルゴリズムを備えた赤外線センサを使用することによって可能になった。
【００３２】
Ｓｅｐａｘシステムは、ウイルス等２種の生物学的添加物をソフトウェアで自動的に選択し、チャンバをプライミングし、後に再懸濁するための培地溶液で切り替え、使用者の介入なしにバッグを切り替えるための２つのピンチバルブによって有利に完成される。
【００３３】
本発明の第１の用途は、リンパ球Ｔ細胞、Ｂ細胞又は造血幹細胞のようなヒト血液細胞又は幹細胞と結合させるための磁気ビーズとのインキュベーションからなる。第２の用途は、外来遺伝物質がウイルスによってヒト血球細胞又は幹細胞に挿入される形質導入である。第３の用途は、血球細胞又は幹細胞の再現可能な濃度及び容量を達成するために生物学的液体を再調整することを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
添付図面を参照し、例として本発明を更に説明する。
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の第１の用途のフローダイアグラムである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、第１の用途の完全なダイアグラムである。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の第２の用途のフローダイアグラムである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、第２の用途の完全なダイアグラムである。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の第３の用途のフローダイアグラムである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、第３の用途の完全なダイアグラムである。
【図４】図４は、本発明の方法を実施するための装置の処理チャンバを収容するキャビネットの斜視図である。
【図５】図５は、所定の用途を実施するための本発明の方法において使用可能な使い捨てキット又はセットの図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
用途１：ヒトの血液細胞又は幹細胞と磁気ビーズとの結合
第１の用途は、磁気ビーズとのリンパ球Ｔ細胞、リンパ球Ｂ細胞又は造血幹細胞のようなヒト血液細胞又は幹細胞の磁気ビーズの混合に関する。
【００３６】
本明細書は、以下の処理：洗浄、希釈、インキュベーション及び洗浄の順次実施について説明する。
【００３７】
第一工程は、通常は、ヒト血小板、凝集塊、血餅のような不必要な要素を除去するために、末梢血幹細胞を収集するためのアフェレーシス処理から開始し、まれに骨髄収穫由来の細胞をベースとする生成物を前処理することであり、生物学的栄養素を添加することによって細胞を水和させることもできる。製品が前もって凍結保存されていた場合、ジメチルスルホキシドのような凍結保護溶液もこの段階で除去する必要がある。
【００３８】
次いで、第２工程は、磁気ビーズのような試薬の用量、又は着色媒体、又は予め調整された生物学的生成物に対する容量の染色剤を加えることに関する。
【００３９】
第３工程は、溶液のインキュベーションに関する。この工程の目的は、標的細胞に磁気ビーズを結合させること、又は活性化細胞を着色して光力学的処理に対して高度に敏感にすること、又は標的細胞を用いて種々の機構を介して他の溶液と結合させることである。この段階の間、溶液を絶えず混合しながら、分離チャンバ内で、常温で一定時間、通常は１０分から２時間、典型的には３０分で開始することができる。これは、例えば、特許文献４に開示され、Ｂｉｏｓａｆｅ  ＳＡによって商標Ｓｍａｒｔ−Ｍａｘで商品化されている装置により血液バッグ中の制御された温度、時間、及び一定の混合下で行ってもよい。このような装置は、制御可能な温度で可撓性貯蔵バッグに収容された生物標本を混合するのに役立ち、可撓性保存バッグは、貯蔵に加え、生物標本の収集、凍結保存又は移送のためにも役立つ。
【００４０】
最後に、最後の工程は、標的細胞に不適切な選択又は計数を避けるために標的細胞に結合していない非結合磁気ビーズのような過剰試薬を除去するための他の洗浄工程であり、又は細胞を新しい培地に懸濁させて培地を交換することによる着色プロセスを停止する工程である。
【００４１】
これらの工程は、全て自動化されたシステムによって、例えば前述のＳｅｐａｘ技術を用いて滅菌環境下で実施される。
【００４２】
この第１の用途を図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１Ａに示すように、この処理用途は、予備洗浄工程１０、その後の試薬添加２０及びインキュベーション３０を含む。ループ４０を介し、試薬添加２０及びインキュベーション３０をｎ回繰り返す。次いで、最後にインキュベートされた生成物に洗浄後の工程５０を施す。
【００４３】
図１Ｂに示すように、
・予備洗浄工程１０は、通常は、アフェレーシス工程、血小板除去、及び適用可能であればＤＭＳＯ除去から細胞をベースとする生成物を洗浄することを含む。生成物を所定の容量に再懸濁して、濃縮されすぎていない細胞を得、細胞の脱水を防止する。
・試薬添加工程２０は、特定量の磁気ビーズ及び／又は細胞染色剤又は活性化試薬を加えることを含む。
・インキュベーション工程３０では、細胞を遠心処理し、分離チャンバの内部又は外部、例えばＳｅｐａｘシステムで、特定の時間、添加試薬と混合する。これが外で実施される場合、混合及び温度制御のためにＳｍａｒｔ−Ｍａｘのような装置に細胞バッグを設置する。
・後洗浄工程５０は、試薬（例えば、ビーズ）を除去する。
【００４４】
用途２：リンパ球Ｔ細胞によるウイルス形質導入
第２の用途は、ウイルスの添加による、リンパ球Ｔ細胞又は造血幹細胞のような他のヒト細胞の形質導入に関する。
【００４５】
本明細書は、洗浄、希釈、形質導入、希釈、容量調整の処理を連続的に実施することを示している。
【００４６】
第１工程は、血小板、凝集物、凝塊又は細胞破片等の不要な要素を除去するために洗浄処理を実施することによって、末梢血幹細胞を採取するためのアフェレーシス処理に由来する、細胞をベースとする生成物、又は細胞培養プロセス後の拡張細胞から前処理することである。不要な要素が除去されると、細胞はまた、生物学的栄養素を添加することによって再水和され、所望の固定量で懸濁され得る。細胞が以前に培養されている場合には、中程度の培養物も除去しなければならず、また生成物が前もって凍結保存されている場合にはジメチルスルホキシドも除去しなければならない。
【００４７】
次いで、第２工程は、第１工程で予備条件付けされた生物学的製剤を、後に形質導入に使用されるウイルスを含有する溶液で希釈することからなる。これに関連し、通常、ウイルスを含有する溶液は、細胞を含む遠心分離チャンバの内部に満たされる。
【００４８】
第３工程は、１２００〜１７００ｇの高速回転で懸濁媒質から細胞を分離し、それらをウイルスと密接に接触させて形質導入プロセスを開始させることからなる。高ｇ力で回転させることにより、Ｔリンパ球が培地から分離し、遠心分離チャンバの外面に付着する。同時に、チャンバ内に挿入されたウイルスが分離チャンバ内の流体に拡散し、密接に接触することによって、Ｔリンパ球細胞のウイルスによる形質導入プロセスが開始される。
【００４９】
次いで、高回転工程の終わりに、所望の最終容量に達するように、溶液を培養液又は生理食塩水で希釈する。
【００５０】
最後に、後の使用のために用量を数回使用する必要がある場合、溶液全体を１つ又は複数の溶液バッグに分割してもよい。
【００５１】
第２の用途を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａに示すように、本方法のこの用途は、洗浄工程６０、それに続く希釈７０、高回転操作８０、希釈９０、及び生成物をｎ個のバッグに分割するための任意選択の分割工程１００を含む。
【００５２】
図２Ｂに示すように：
・洗浄工程６０は、通常、アフェレーシス処理又は細胞培養由来の細胞をベースとする生成物を洗浄緩衝液で洗浄する。
・希釈工程７０では、特定量のウイルスがＳｅｐａｘシステムの分離チャンバ内の細胞に添加される。
・次いで、これをＳｅｐａｘ遠心処理チャンバ内で、高いｇ力及び長いスピン持続時間を有する高回転工程８０に供する。
・希釈工程９０では、培地を加えて目標の容量に到達させる。
・分割工程１００では、全容量がｎ個の小さなバッグに分割される。これには、バッグの交換やクランプの開閉を手動で行う必要がある。
【００５３】
用途３：再調整投与（凍結後、患者の注入のための正確な投与を含む）
この用途は、以下の処理：洗浄、分離、希釈、容量調整の順次実行を示す。
【００５４】
通常、標準的な自己移植設定では、前条件付けされた患者においてアフェレーシス処置が実施される。患者の事前調整のために血液細胞及び造血幹細胞が濃縮された末梢血は、患者が化学療法又は放射線療法を受けている間に凍結保存される。患者が治療されると患者の細胞は解凍され、再調整されて移植される。
【００５５】
第３の用途は、凍結保存されたアフェレーシス溶液から出発して同一の血液細胞又は幹細胞濃度を有する複数回分の細胞産物を得るための反復可能な自動化された方法である。
【００５６】
第１工程は、例えば特許文献４に開示された装置を使用し、Ｂｉｏｓａｆｅ  ＳＡによって商標Ｓｍａｒｔ−Ｍａｘで商品化された、制御された温度及び混合環境下での細胞製品の解凍に関する。このような装置は、制御された温度で、保存に加えて、生物標本の収集、凍結保存又は移送のための可撓性保存バッグに収容された生物標本を混合するためのものである。
【００５７】
次いで、第２工程は、凍結保護溶液、凍結保存プロセス中に形成された凝集物又は凝固物を排除する洗浄手順を実行することからなる。
【００５８】
次いで、第３工程は、試料を採取して細胞濃度を測定することからなる。試料は、細胞濃度計算に必要な細胞カウンター又はフローサイトメーターのような漸増技術（ｔｉｅｒｃｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって分析される。細胞の実際の密度が計算されると、希釈比を自動可Ｓｅｐａｘプラットフォーム上で調整して所望の細胞濃度に到達させることが可能である。これらの前の２つの工程は、収集工程又は患者とは独立して、再現可能で均質化した細胞濃度を得ることを可能にする。
【００５９】
目的の細胞濃度が得られれば、Ｓｅｐａｘシステムは、使用者が、各バッグ上で分割されるべき容量、又は全細胞溶液を含むべきバッグの数を選択することを可能にする。このようにすることで、全て同一の細胞濃度を含む一定数のバッグ、又はバッグ当たりの一定容量を達成することができる。
【００６０】
この第３の用途を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａに示すように、この工程の用途適用には、解凍工程１１０、その後の洗浄１２０、サンプリング１３０及び希釈１４０が含まれる。第１の抽出工程１５０は、バッグにｘｍｌを抽出し、これはループ１６０を介してｎ回繰り返され、第２の抽出工程１７０は、ｙｍｌを品質管理バッグに抽出し、この工程はループ１８０を介して通常は１回だけ繰り返される。
【００６１】
図３Ｂに示すように、
・解凍操作１１０は細胞生成物を解凍するのに役立つ。
・洗浄操作１２０において、凍結保護剤が除去される。
・サンプリング操作１３０において、洗浄された細胞はサンプリングのために出力バッグに抽出される。この操作には、試料を採取するための手動工程が必要である。
・希釈工程１４０では、細胞濃度が患者の用量に合わせて調整される。
・第１の抽出ステップ１５０は、正確な患者への投薬のために、所定量の細胞を移送バッグに抽出する。これには、バッグの交換及びクランプの開閉を手動で行う必要がある。
・第２の抽出工程１７０は、品質管理（無菌試験）のための最後のｍ個のバッグを準備する。通常、ｍ＝１である。
【００６２】
図４は、本発明を実施するための装置の処理チャンバを収容するキャビネット２００の斜視図であり、この装置は特許文献１及び特許文献２に開示されたシステムの一部であって、その内容は  参照により本明細書に組み入れられる。図示されているように、キャビネット２００は、システムの概ね円筒形の遠心処理チャンバ（図示せず）の内部に収容される旋回閉鎖部２２０を上部に有する上方に突出した部分円筒形ハウジング２１０を有する前面を有する。その膨脹した前面において、部分円筒形ハウジング２１０は、挿入された円筒状の処理チャンバ及びその内容物を見るための窓２１５を有している。キャビネット２００の後部には、使い捨てセットのバッグをつるすための上向きに延長するポスト（部分的に切り欠いて示している）がある。また、キャビネット２００の後部には、統合ソフトウェアによって処理されるプロトコルのパラメータを表示するための表示画面２４０がある。キャビネット２００の側面２５０は平坦であり、この平坦な側面２５０の少なくとも１つには、キャビネット２００と一体化した使い捨てセットのチューブを収容するためのスロット２７０を有する２つのピンチバルブ２６０が設けられており、このチューブは使い捨てセットの２つのバッグキャビネットの側面２５０に支持されている。ピンチバルブ２６０の上方には、チューブを動かすための突起２６５が設けられている。これら２つのピンチバルブ２６０は、キャビネット２００と一体化されたソフトウェアによって、ウイルス等の２つの生物学的添加物を自動的に選択して、処理チャンバをプライミングし、その後、再懸濁のための培地溶液で交換し、使用者の介入なしにバッグを変更する可能が可能である。
【００６３】
図５は、開示された３種の全ての用途を実施するための、本発明の方法において使用するための使い捨てセット又はキットのレイアウトを概略的に示す。使い捨てセットは、チャンバ３００内の可変用量の処理空間３２０を画定する可動部材又はピストン３１０を含む遠心処理チャンバ３００を備えている。チャンバ３００は、管路３３０を介して５方バルブ３４０に接続されている。バルブ３４０の１つの出口は、食塩水又は他の溶液の入力スパイク３０４と、食塩溶液又は種々の他の製品用のバッグ３９４ａ及び３０４ｂに接続するように分岐する配管３５０によって接続されている。バルブ３４０の他の出口は、チューブライン３６０によって廃棄バッグ３０３に接続されている。バルブ３４０の第３の出口は、配管ライン３７０及びフィルタ３７２を介して、他の生物学的液体の血液バッグ又はバッグの接続用の入力スパイク３０１に接続されている。バルブ３４０の第４の出口は、配管ライン３８０を介して一組の出力スパイク３０２に接続されており、収集バッグ３０５に分岐される。また。配管ライン３８０は、サンプリングポート３８２及びサンプリングピロー３８４に接続されている。
【００６４】
種々の配管ラインは、使い捨てセットが設置されているときに手動で起動させることができるか、又は使用中に自動的に作動させることができるものもある、ピンチバルブ３５２に取り付けられている（例えば、図４の磁気作動式ピンチバルブ２６０を参照されたい）。
【００６５】
上記のキット又は使い捨てセットは、スパイク３０１、３０２及び３０４に接続されたバッグであっても、密閉された無菌環境を形成している。
【００６６】
ビーズの洗浄
ビーズ洗浄の用途のためには、１又は２個のアフェレーシス血液ユニットを、入力スパイク３０１を介してキットに接続してもよい。次いで、血液成分除去ユニットを、入力フィルタ３７２でろ過して、残渣、凝固物及び不要な残留物を除去する。
【００６７】
予備洗浄工程は、細胞を洗浄することからなり、このために、食塩水のような洗浄溶液が、スパイク３０４を使用して接続されるか、又は１つの利用可能なバッグ３０４ａに充填される。予備洗浄工程が終了すると、廃液は廃棄バッグ３０３に転送され、セルはチャンバ３００内に残る。
【００６８】
次いで、第２の工程は、第２の利用可能なバッグ３０４ｂに充填された処理チャンバ３００内に磁気ビーズを含む試薬を添加することからなる。次いで、チャンバ３００内でインキュベーション工程を実施する。
【００６９】
最後に、洗浄後の工程は、前洗浄工程と同様、同じ食塩水を吸い上げることによって実施され、最後に、接続された任意のカスタムバッグ中で、インキュベートされた細胞が収集バッグ３０５又はスパイク３０２によって抽出される。
【００７０】
形質導入
ウイルス形質導入の用途では、最初の工程は、アフェレーシスユニットを入力スパイク３０１と接続し、生理食塩水をスパイク３０４で接続し、ウイルスを含む溶液をバッグ３０４ａに添加し、バッグ３０４ｂ内の細胞栄養素を除去し、最後にスパイク３０２を介して複数の出力バッグを３つ以下のバッグに接続する。
【００７１】
第１の工程は、入力バッグを介してアフェレーシスユニットを１により吸い上げる工程、スパイク３０４によって接続された生理食塩溶液を介して洗浄する工程、チャンバ３００内に細胞を残し、ウイルス溶液（バッグ３０４ａから）をチャンバ３００に添加する工程、高いスピン力で遠心分離し、次いで溶液をバッグ３０４ｂから培養培地中に懸濁させ、最後に溶液をスパイク３０２に接続された３個以下のバッグ中の等量又は異なる容量に分割する工程からなる。
【００７２】
再調整及び投与
この用途では、まず凍結保存された血液ユニットが解凍される。次いで、解凍された血液溶液のバッグが入力スパイク３０１に接続され、溶液がチャンバ３００に圧送される。次いで、前に接続された生理食塩水がスパイク３０４を介して接続され、又は利用可能なバッグ３０４ａがチャンバ３００内でアフェレーシスユニットの洗浄のために使用される。細胞が洗浄されると、チャンバ３００内の一部又は全ての細胞溶液が収集バッグ３０５内で抽出され、次いでサンプリングポート３８２を介して細胞濃度を測定するために採取される試料が採取される。次いで、用量は、再びチャンバ３００の内部にポンプ輸送され、スパイク３０４又は利用可能なバッグ３０４ａに接続されたバッグからの生理食塩水で希釈され、次いで出力スパイク３０２に接続された、いくつかのバッグに分割される。
【００７３】
キットは、試料が層流の外側に取り出される必要がある場合にはサンプリングピロー（ｐｉｌｌｏｗ）３８４を備えた凍結調製ラインと、さらなる凍結のために最終溶液に凍結保護溶液を添加する必要がある場合には配管経路３８６に耐性のＤＭＳＯを含んでいる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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