(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料のラマンスペクトルを測定するラマン顕微装置であって、
試料および明視野用の対物レンズを結ぶ光軸の周りに配置されて当該光軸に沿ってＵＶ光を発する複数のＵＶ発光素子と、
試料に対して前記明視野用の対物レンズと同じ側に配置されて複数の前記ＵＶ発光素子からの前記ＵＶ光を試料上の測定部位に暗視野で照射するためのリング状のレンズと、
前記明視野用の対物レンズを中心に試料側とは反対側の前記光軸上に配置されて前記ＵＶ光の波長よりも長波長の光を透過させるロングパスフィルターと、
を備えることを特徴とするラマン顕微装置。
【請求項２】
請求項１記載のラマン顕微装置において、
前記複数のＵＶ発光素子は、枠体の窓部の周囲に配置され、
前記ロングパスフィルターは、前記枠体の窓部を塞ぐように当該枠体に支持されることを特徴とするラマン顕微装置。
【請求項３】
請求項２記載のラマン顕微装置において、
前記窓部の周囲には、前記ＵＶ発光素子に加えて、ＲＧＢ発光素子またはフルカラー発光素子が配置されていることを特徴とするラマン顕微装置。
【請求項４】
請求項２または３記載のラマン顕微装置において、
前記窓部の周囲には、前記ＵＶ発光素子に加えて、ラマン顕微装置の波数校正用の基準光源としての水銀ランプまたはネオンランプが配置されていることを特徴とするラマン顕微装置。
【請求項５】
請求項２から４のいずれかに記載のラマン顕微装置において、
前記ロングパスフィルターは、位置に応じて透過する波長域が変化するグラデーションフィルターであって、前記窓部において波長域の変化方向に沿ってシフト可能に支持されていることを特徴とするラマン顕微装置。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のラマン顕微装置において、さらに、
前記明視野用の対物レンズおよび前記ロングパスフィルターを順に介して試料からの蛍光を撮像する蛍光撮像手段と、
前記蛍光撮像手段によって撮像された蛍光観察画像に基づいてラマンスペクトル測定用の励起波長を選択する励起波長選択手段と、
を備えることを特徴とするラマン顕微装置。
【請求項７】
樹脂の硬化過程の観察用の請求項１から６のいずれかに記載のラマン顕微装置。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載のラマン顕微装置において、
前記光軸の周りには、前記ＵＶ発光素子に加えて、試料に複数色の光を照射するためのＲＧＢ発光素子またはフルカラー発光素子が配置されていて、
前記明視野用の対物レンズおよび前記ロングパスフィルターを順に介して、試料からの色ごとの反射光を撮像する反射光撮像手段と、
前記反射光撮像手段によって撮像された色ごとの観察画像に基づいて、前記反射光撮像手段の視野内に分布する試料を認識する試料認識手段と、
を備えることを特徴とするラマン顕微装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラマン顕微装置に蛍光観察機能を付与するためのフィルターユニット、および、それを備えたラマン顕微装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラマンスペクトル測定（ラマン観察）では、試料からのラマン散乱光の分光スペクトルを観察する。試料に或る励起波長のレーザー光を照射すると、その光は、試料の分子振動によって異なる波長の光となって散乱する。これがラマン散乱光である。
【０００３】
一方、試料は、紫外光や可視光に対する大小様々な蛍光特性を有しているので、試料からはレーザー光に応じた蛍光を発することになる。一般的に、ラマン観察では、試料の自家蛍光（ｓｅｌｆ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）が強いと、ラマン散乱光と蛍光との波長が重なってしまい、ラマンスペクトルの非常に微弱なラマンピークが、蛍光スペクトルに埋もれてしまう。
【０００４】
そこで、ラマン顕微装置には、試料に応じた最適な励起波長のレーザー光を選択できるように構成され、複数種類の励起用レーザーが切り替え可能に装着されているものがある。このことについては、非特許文献１にも、「また、試料自身が蛍光を発する場合はレーザー励起波長を変更することが最も効果的です。ラマン散乱光の波長は励起波長に依存して変わりますが、蛍光の波長は励起波長に依存しません。このため、励起波長を変更すればラマン散乱光と蛍光の重なりを回避、軽減することができます。なお、ラマンスペクトルは励起波長からのシフト値で表されるので、励起波長を変えても同一位置のラマンピークが得られ、純粋に蛍光の影響が軽減されたスペクトルが得られます。（略）このように、標準の５３２ｎｍレーザーや従来から用いられている長波長側の７８５ｎｍレーザーに加えて、短波長側の４５７ｎｍレーザーの３波長を試料によって使い分ける」のように説明されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】“457nmレーザーを利用した蛍光回避測定事例”，［online］，日本分光株式会社，［平成３１年７月２４日検索］，インターネット＜URL：https://www.jasco.co.jp/jpn/technique/applicationdata/PDF/Raman/260-AN-0012.pdf＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、発明者らは、測定対象の試料が決まったら、その試料に対する予備測定として蛍光観察を実行し、その結果に基づいて、最適な励起波長のレーザー光を選択し、本測定であるラマン観察を実行するという手法について検討してきた。蛍光観察によって、その試料がどの励起波長のレーザーに対してどんな波長の蛍光を発するのかを予測できれば、蛍光の波長とラマン散乱光の波長とが重ならないような励起レーザーを選択することができる。
【０００７】
しかしながら、単純に、試料の蛍光観察に必要な光学素子を追加するとなれば、ラマン顕微装置が複雑化・大型化してしまう。レーザーラマン顕微装置内に蛍光観察機能を入れる場合、装置内に光源（水銀ランプや重水素ランプなど）を入れて、ダイクロイックミラー等を使って特定の光を試料に照射し、試料からの蛍光成分を取り出すために吸収フィルターを通して観測を行う必要がある。また、レーザーと蛍光観察用光源の光学切替や、観察カメラまでの光路内に吸収フィルターを入れるための切替機構が必要になる。
【０００８】
本発明の目的は、複雑化・大型化することなく、ラマン顕微装置に蛍光観察機能を付与させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、ラマン顕微装置に容易に装着可能な暗視野ＵＶ照射タイプのユニットで、かつ、ロングパスフィルターを備えたフィルターユニットを開発した。
【００１０】
すなわち、本発明に係るラマン顕微装置は、試料のラマンスペクトルを測定する装置であって、
試料および明視野用の対物レンズを結ぶ光軸の周りに配置されて当該光軸に沿ってＵＶ光を発する複数のＵＶ発光素子と、
試料に対して前記明視野用の対物レンズと同じ側に配置されて複数の前記ＵＶ発光素子からの前記ＵＶ光を試料上の測定部位に暗視野で照射するためのリング状のレンズと、
前記明視野用の対物レンズを中心に試料側とは反対側の前記光軸上に配置されて前記ＵＶ光の波長よりも長波長の光を透過させるロングパスフィルターと、
を備えることを特徴とする。
ここで、前記複数のＵＶ発光素子は、枠体の窓部の周囲に配置され、
前記ロングパスフィルターは、前記枠体の窓部を塞ぐように当該枠体に支持されることが好ましい。
【００１１】
ここで、前記窓部の周囲には、前記ＵＶ発光素子に加えて、ＲＧＢ発光素子またはフルカラー発光素子が配置されていることが好ましい。また、前記窓部の周囲には、前記ＵＶ発光素子に加えて、校正用基準光源としての水銀ランプまたはネオンランプが配置されていることが好ましい。
【００１２】
また、前記ロングパスフィルターは、位置に応じて透過する波長域が変化するグラデーションフィルターであって、前記窓部において波長域の変化方向に沿ってシフト可能に支持されていることが好ましい。
【００１３】
このような構成のフィルターユニットの特徴は、暗視野ＵＶ照射機能とロングパスフィルター機能の両方を備えていることである。そして、本発明に係る暗視野対物レンズを装着したラマン顕微装置は、上記のフィルターユニットを備えていることを特徴とする。
【００１４】
このようなラマン顕微構成によれば、暗視野対物レンズ（少なくとも明視野用のレンズとリング状のレンズを含む）の光軸上であって、この暗視野対物レンズを中心に試料側とは反対側の光軸上に、フィルターユニットが配置されている。そして、フィルターユニットのＵＶ発光素子から暗視野対物レンズのリング状のレンズに向かってＵＶ光（暗視野ＵＶ光とも呼ぶ。）が発せられる。リング状のレンズによってＵＶ光が試料上の測定点に集光されるので、測定点の蛍光特性に応じた蛍光が発生する。この試料からの蛍光は、暗視野対物レンズの光軸上に位置する明視野用のレンズによって集光されて、フィルターユニットのロングパスフィルターに向かって進行する。ロングパスフィルターによって、試料からの跳ね返りＵＶ光が除去されて、試料からの蛍光がラマン顕微装置の可視観察光学系へと進行する。なお、ラマン顕微装置は、例えば、レーザー照射光学系、ラマン観察光学系および可視観察光学系を備えており、ロングパスフィルターを通過した蛍光は、可視観察光学系で観察されることになる。通常のラマン観察は、レーザー照射光学系からのレーザー光を試料に照射して、試料からのラマン散乱光をラマン観察光学系で観察することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の構成によれば、暗視野対物レンズユニットを装着したラマン顕微装置に、フィルターユニットを装着させるだけで、暗視野ＵＶ光による試料の暗視野蛍光観察が可能となる。従って、複雑化・大型化することなく、ラマン顕微装置に蛍光観察機能を付与させることができる。
【００１６】
また、このように構成されたラマン顕微装置は、フィルターユニットを用いて暗視野蛍光観察を実行することによって、ラマンスペクトルの測定に適切な励起レーザーを容易に選択することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】一実施形態に係るフィルターユニットと暗視野対物レンズユニットとの位置関係を示す図である。
【図２】前記フィルターユニットを垂直面で切った断面を示す図である。
【図３】前記フィルターユニットのリング状の発光素子の配列を示す図である。
【図４】前記フィルターユニットのネオンランプを用いた波数校正の説明図である。
【図５】図１のフィルターユニットを備えたラマン顕微装置の全体構成図である。
【図６】（Ａ）は、前記ラマン顕微装置を使った明視野可視観察モードによる測定例を示す図であり、（Ｂ）は、暗視野蛍光観察モードによる測定例を示す図である。
【図７】前記ラマン顕微装置を使って励起波長を選択する手順を示す図である。
【図８】（Ａ）〜（Ｃ）はＵＶ硬化樹脂の硬化プロセスのラマン観察結果のグラフ。
【図９】ＲＧＢ発光素子を用いて３色同時照明した場合と単色毎の照明をした場合における試料の観察画像を比較するための図である。
【図１０】（Ａ）はフィルターユニットの変形例を示す斜視図であり、（Ｂ）はフィルターユニットの別の変形例を示す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
フィルターユニット
初めに、図１〜図３に基づいて、本実施形態に係るフィルターユニット１の構成を説明する。図１は、ラマン顕微装置における暗視野用対物レンズユニット２と、フィルターユニット１との位置関係を示す。図２は、フィルターユニット１の概略構造を示す断面図である。
【００１９】
フィルターユニット１は、暗視野ＵＶ照射付きのフィルターユニットであって、枠体１２と、枠体１２の窓部１４を塞ぐように当該枠体に支持されたロングパスフィルター１６と、窓部１４の周囲に配置された複数のＵＶ−ＬＥＤ素子１８と、を備える。
【００２０】
図１には、枠体１２が、表裏の面を貫通する窓部１４を有した板状の部材として示されているが、枠体１２の形状や大きさ、および、枠体１２全体に対する窓部１４の位置や大きさについては、任意に定めることができる。通常は、レボルバーなど、ラマン顕微装置における対物レンズの支持部材へ装着可能な範囲で、枠体１２の形状や大きさ、窓部１４の大きさや位置が定められる。
【００２１】
ロングパスフィルター１６は、少なくともＵＶ−ＬＥＤ素子１８が発するＵＶ光よりも長波長側の光を通過させるフィルターであり、当該ＵＶ光が、試料Ｓを跳ね返ってラマン顕微装置の各種観測光学系に侵入することを防止する。いわゆるＵＶカット用フィルターである。
【００２２】
ＵＶ−ＬＥＤ素子１８は、少なくとも２個が窓部１４の周りに配置されている。２個〜数十個のＬＥＤ素子１８が窓部の周りに配置されていてもよい。通常は、これらのＬＥＤ素子１８が等間隔で配置されるが、それに限定されない。
【００２３】
ＬＥＤ素子１８は、その照射方向がフィルター面を含む枠体１２の一方の面に対して略直角になるように、枠体１２に固定されている。ＬＥＤ素子１８からのＵＶ光の波長域は、可視光よりも短波長であることが好ましい。また、ラマン顕微装置にＵＶ域の励起レーザーが搭載される場合は、ＬＥＤ素子１８からのＵＶ光の波長域を、その励起波長よりも短波長にしてもよい。
【００２４】
フィルターユニット１は、図１に示すように、貫通孔（窓部１４）に支持されたフィルター１６の中心軸が、暗視野用対物レンズユニット２の軸心と一致するように、顕微装置のレボルバー等に装着される。この際、ＵＶ−ＬＥＤ素子１８の照射方向が暗視野用対物レンズユニット２側を向く。
【００２５】
顕微装置のレボルバーに装着されている暗視野用対物レンズユニット２は、図１に示すように、筒状のケース２２と、その中心軸上に配置された明視野用のレンズ２４と、この明視野用のレンズ２４を囲むようなリング状のレンズ２６と、を有する。
【００２６】
図２の断面図に、フィルターユニット１の概略構造を示す。フィルターユニット１の枠体１２は、図２に示すように、全体がスティック状であって、長手方向の中心よりも一方の端部に偏った位置に貫通孔（窓部１４）がある。この窓部１４にロングパスフィルター１６が支持されている。ロングパスフィルター１６の縁部が窓部１４の内壁に形成された段差部に載置された状態になっていてもよく、また、ロングパスフィルター１６が窓部１４から落ちないように、載置されたロングパスフィルター１６に対向するように窓部１４に落下防止部材を取り付けてもよい。いずれにしても、ロングパスフィルター１６に有害な応力が付与されないようになっている。
【００２７】
ユーザーが、スティック状の枠体１２の他方の端部付近を持って、レボルバーに形成された孔にフィルターユニット１を挿入することで、フィルターユニット１のフィルター１６が顕微装置の光軸上に配置されるようになっている。また、他のフィルターに交換する場合は、フィルターユニット１ごと、レボルバーから抜き取って、異なる特性のロングパスフィルターや、異なる特性の発光素子・ランプなどを有する他のフィルターユニットを装着すればよいので、フィルターの交換も容易である。
【００２８】
また、窓部１４の周りには、ＵＶ−ＬＥＤ素子１８を含む、各種のＬＥＤ素子および小型ランプを収納する空間１５が複数形成されている。図３に、フィルター１６の周りにリング状に配置された各種のＬＥＤ素子および小型ランプの位置関係を示す。円形のフィルター１６は、窓部１４に対して着脱可能になっており、交換することができる。フィルター１６の周囲に、ＵＶ−ＬＥＤ素子１８の他、赤色ＬＥＤ（１８Ｒ）、緑色ＬＥＤ（１８Ｇ）、青色ＬＥＤ（１８Ｂ）が配置されている。
【００２９】
図３には示されていないが、これらの３色のＬＥＤ素子（１８Ｒ，１８Ｇ，１８Ｂ）は、赤色、緑色、青色の３チップＬＥＤを内蔵したフルカラーＬＥＤ素子（３ｉｎ１型フルカラーＬＥＤとも呼ばれる。）に置き換えて、配置スペースのコンパクト化を図ってもよい。本書においてフルカラーＬＥＤは、１つのソケット内に３色のチップＬＥＤが搭載されている素子を指し、光拡散カバーによって混色されることによって、白色を含む様々な色への調光が可能になっている。３色のＬＥＤ素子（１８Ｒ，１８Ｇ，１８Ｂ）を配置する場合は各色の照射方向が固定されてしまうが、フルカラーＬＥＤを採用すれば、色によって照射方向が固定されないですむ。
【００３０】
また、図３には示されていないが、小型水銀ランプまたは小型ネオンランプをこれらの配置に混ぜてもよい。これによって、小型水銀ランプを、ラマン顕微装置の短波長（高波数）側の波長校正用の基準光源として使うことができる。また、小型ネオンランプを長波長（低波数）側の波長校正用の基準光源として使うことができる。
【００３１】
例えば、これらの小型水銀ランプまたは小型ネオンランプを点灯させながら、試料のラマンスペクトルを測定することができる。ネオンランプのスペクトルとラマンスペクトル信号を同時測定することで、波数校正しながら、ラマンピークのシフトを観察するのである。図４は、ネオンランプを用いた波数校正を説明するためのラマンスペクトル図である。例えば、シリコン（Ｓｉ）などの試料に応力が掛かっていると、ラマンピークのシフトが生じる。僅かなシフトであるが、そのままラマンスペクトル測定を続けると、温度変化などに伴った応力の経時変化が生じてしまい、ラマンスペクトルによる解析が困難になる。そこで、図４のように、ネオンランプのスペクトルピークを基準波数に定めて、試料のラマンピークの位置を校正することで、応力等によるシフトの影響を受けずにラマンスペクトルの解析を実行することができる。一方、この原理を利用して、半導体材料等のシリコン（Ｓｉ）の応力解析を実行することもできる。
【００３２】
各種のＬＥＤ素子の照射によって観測される蛍光イメージから、適切なラマン観察用の励起レーザーが選択され、蛍光の影響が最小限に抑えられたラマン観察の実行が可能になる。
【００３３】
次に、図１を使ってフィルターユニット１の作用、つまり、試料Ｓへのリング状ＵＶ照射、および、試料Ｓから発する蛍光の導光について説明する。
【００３４】
図１に示すように、フィルターユニット１は、ラマン顕微装置に装着された状態で、顕微装置側から照射用の電源が供給される。フィルターユニット１に設けられた受電端子（図示しない）が電源を受け取る。従って、フィルターユニット１が顕微装置に装着されると、照射用電源がフィルターユニット１に供給され、内蔵された照射制御回路等によって、所定のＬＥＤ素子又は小型ランプが発光し、ＵＶ照射やＲＧＢ照明などが実行される。
【００３５】
ＵＶ照射の場合について説明すると、フィルターユニット１は、ＵＶ−ＬＥＤ素子１８の発光によってリング状のＵＶ光を形成し、そのＵＶ光が暗視野用対物レンズユニット２に入射する。暗視野用対物レンズユニット２では、フィルターユニット１からのリング状のＵＶ光が、暗視野用対物レンズユニット２内を中心軸に平行に進んで、リング状のレンズ２６によって試料Ｓの測定部位に集められる。このような作用によって、試料Ｓを暗視野でＵＶ照射することができる。
【００３６】
ＲＧＢ照明や、その他の水銀ランプ・ネオンランプによる照明の場合も、ＵＶ照射と同様に実行される。
【００３７】
ＵＶ照射やＲＧＢ照明などによって、試料Ｓから蛍光が発せられると、その蛍光は、明視野用のレンズ２４によって集光されて平行光となって暗視野用対物レンズユニット２から出る。その蛍光は、フィルターユニット１のロングパスフィルター１６に入射する。このロングパスフィルター１６は、試料側からのＵＶ光をラマン顕微装置のラマン観察光学系および可視観察光学系へ入れたくないために設けられたフィルターであり、ＵＶ光よりも長波長側の光を通過させる。つまり、試料Ｓからの跳ね返りＵＶ光をカットする。
【００３８】
なお、図１に示すように、ロングパスフィルター１６を通過した蛍光は、撮像手段（カメラ）Ｃ１まで導光される。撮像手段Ｃ１で撮像された蛍光観察画像は、画像処理手段５に送られて、その蛍光観察画像に基づく蛍光の波長域が読み取られる。励起波長選択手段６は、読み取られた蛍光の波長域とは異なる波長の励起波長を、ラマン観察用の励起波長として選択する。そして、レーザー自動切替機ＳＷ１が選択された励起波長に応じた励起レーザーに切り替えるように構成されている。
【００３９】
ラマン顕微装置
次に、図５〜図７に基づいて、フィルターユニット１を備えたラマン顕微装置１０について説明する。ラマン顕微装置１０は、励起レーザー光を照射したときに生じる試料Ｓからのラマン散乱光を分光検出し、スペクトルデータを取得するための装置である。ラマン顕微装置１０を、図５のように便宜的に、レーザー照射光学系、共焦点顕微光学系、ラマン観察光学系および可視観察光学系に分けて説明する。
【００４０】
レーザー照射光学系は、励起レーザーＬＳ１と、自動レーザーアライメント機ＡＬにセットされた一対の自動アライメントミラーＭ１，Ｍ２と、減光器ＡＴと、ビームスプリッタＢＳ／ＤＭ１とを備える。ここで、励起レーザーＬＳ１を、励起波長の異なる励起レーザーＬＳ２，ＬＳ３とともに、レーザー自動切替機ＳＷ１にセットされた状態で設けることができる。
【００４１】
選択された励起レーザーＬＳ１〜ＬＳ３からの励起光は、自動レーザーアライメント機ＡＬによる光軸調整、減光機ＡＴによる光量調整を受けて、ビームスプリッタＢＳ／ＤＭ１に入射する。ビームスプリッタＢＳ／ＤＭ１は、励起光をフィルターユニット１および暗視野用対物レンズユニット２に向けて反射する。試料Ｓには、円形断面の励起光によるビームスポットが形成される。また、ビームスプリッタＢＳ／ＤＭ１は、暗視野用対物レンズユニット２が集光した試料Ｓからのラマン散乱光を透過する。
【００４２】
共焦点顕微光学系は、自動ＸＹＺステージＳＴと、暗視野用対物レンズユニット２と、フィルターユニット１と、ラマン散乱光の光路を変更するための一対のミラーＭ３，Ｍ４と、リジェクションフィルター自動切替機ＳＷ４と、結像レンズＩＬと、分光器前の共焦点アパーチャーＡＰ１と、を備える。
【００４３】
暗視野用対物レンズユニット２によって集光された試料Ｓからのラマン散乱光は、フィルターユニット１とビームスプリッタＢＳ／ＤＭ１を透過して、一対のミラーＭ３，Ｍ４によって平行光束のままリジェクションフィルター自動切替機ＳＷ４に導かれる。リジェクションフィルター自動切替機ＳＷ４にセットされた複数のリジェクションフィルター（帯域阻止フィルター）ＲＦ１，ＲＦ２のうち、選択されたフィルターを通過した光だけが、結像レンズＩＬに導かれる。共焦点アパーチャーＡＰ１は、開孔を有する板状の部材であり、開孔の大きさ、形状または位置が異なっている複数のアパーチャーの中から試料に応じて選択された１つであり、結像レンズＩＬの結像面に位置決めされている。複数のアパーチャーを切替可能に構成されたアパーチャー切替手段ＳＷ５は、ラマン観察における共焦点性を上げて、空間分解能を向上させる手段として用いられる。試料の測定場所を変更することなく、空間分解能を向上させることができる。空間分解能が上がると蛍光成分が減衰する。例えば、蛍光観察画像から蛍光の強い部位を検知した場合、アパーチャー切替手段ＳＷ５のアパーチャーを切り替えて、空間分解能を向上させる、という対応をとることもできる。アパーチャーを切り替えても蛍光が強い場合は、レーザー切替手段で励起レーザーを変更してもよい。これらによって、適切なラマンスペクトルを取得することができる。
【００４４】
ラマン観察光学系は、分光器３およびＣＣＤ検出器４を備える。分光器３は、回折格子の切替手段ＳＷ６を有し、励起レーザーに応じた適切な回折格子に切替可能に構成されている。また、ＣＣＤ検出器４は、検出器の切替手段ＳＷ７によって、励起レーザーに応じた適切な検出器に切替可能に構成されている。ラマン散乱強度は、励起波長の４乗に反比例するほど微弱であるため、励起波長に応じてＣＣＤ検出器４を切り替えることにより、ラマン散乱光の波数に対する感度が良好な検出器を選択することができる。
【００４５】
可視観察光学系は、ミラーＭ３をオフラインにする観察切替機ＳＷ３と、ビームスプリッタＢＳ／ＤＭ２と、レンズＬ１と、観察用カメラ（撮像手段）Ｃ１、ミラーＭ５と、レンズＬ２と、照明用光源Ｓ４と、を備える。
【００４６】
本実施形態のラマン顕微装置１０は、暗視野用対物レンズユニット２とビームスプリッタＢＳ／ＤＭ１の間の光軸上のフィルターユニット１を備えているので、試料Ｓへの暗視野によるＵＶ照射が可能となる。そして、試料Ｓから発する蛍光は、フィルターユニット１のロングパスフィルター１６を透過して可視観察光学系によって観察される。このように、ラマン顕微装置１０に暗視野の蛍光観察機能を付与することができる。
【００４７】
また、蛍光観察からラマン観察に移行した場合は、レーザー励起された試料からのラマン散乱光がロングパスフィルター１６を透過してラマン観察光学系によって観察されるので、そのフィルターユニット１を装着したまま、観察を続けることがでる。
【００４８】
図６（Ａ），（Ｂ）に、本実施形態のラマン顕微装置１０の明視野可視観察モードおよび暗視野蛍光観察モードにおける光の導線を示す。
【００４９】
明視野可視観察モードでは、ラマン顕微装置１０の可視観察光学系を用いた試料の可視光による観察が実行される。この場合、試料には、可視観察光学系の照明Ｓ４からの照明光が照射され、試料からの反射光をカメラＣ１が捉える。画像６Ａは、スライドガラス上に分散する蛍光粒子（暗い部分）の可視観察画像である。
【００５０】
一方、暗視野蛍光観察モードでは、ラマン顕微装置１０のフィルターユニット１および可視観察光学系を用いた試料の蛍光観察が実行される。試料には、フィルターユニット１に設けられた例えば３７５ｎｍ励起のＵＶ−ＬＥＤ素子１８からのＵＶ光が暗視野にて照射され、試料からの蛍光をカメラＣ１が捉える。画像６Ｂは、画像６Ａと同じスライドガラス上に分散する蛍光粒子（明るい部分）の暗視野による蛍光観察画像である。
【００５１】
図７を用いて、励起レーザーの選択方法について説明する。
【００５２】
まず、明視野可視観察モードにて、画像７Ａのような試料の明視野可視観察画像に基づいて、観察したい測定部位を視野に入れる。ここでは、蛍光性顔料を試料とした。画像７Ａの下半分の領域に試料が映っており、蛍光性顔料（暗い部分）が粒状に分布しているのが分かる。
【００５３】
次に、暗視野蛍光観察画像モードに切り替える。試料への照射光として、フィルターユニット１に装備されている各種光源（ＵＶ光、ＲＧＢ光、小型水銀ランプ光、ネオンランプ光など）の中から１つ又は２以上の組合せを選択する。ここでは、ＵＶ−ＬＥＤ（３７５ｎｍ励起）を選択した場合について説明する。
【００５４】
試料をＵＶ−ＬＥＤ光で励起して、暗視野蛍光観察画像を取得する。画像７Ｂは、蛍光観察画像であり、明るい部分が蛍光性顔料を示す。これによって、試料の自家蛍光の強度が分かる。蛍光について、どの色が強く浮き出ているかをより明確にするため、カメラＣ１に、ＲＧＢカラーフィルター付きＣＣＤカメラを採用して、３原色の色ごとの蛍光イメージを取得してもよい。３色に分解された蛍光イメージ（画像７ＣのＲｅｄ，Ｇｒｅｅｎ，Ｂｌｕｅの各画像）は、その色の成分が強い程、明るく表示されるように画像処理されている。ここで例示された蛍光イメージの場合、「赤」色および「青」色の蛍光成分はほとんど検出されていないのに対し、「緑」色の蛍光成分が強く検出されていることが分かる。
【００５５】
本実施形態では、ラマン顕微装置１０が、既存の技術を用いて蛍光観察画像から蛍光の波長域を検知する画像処理手段５と、検知された蛍光の波長域に入らないように、励起レーザーの励起波長を選択する励起波長選択手段６とを備えている。検知された蛍光の波長域よりも長波長側の励起レーザーを選択してもよい。
【００５６】
上記の例のように、画像処理手段５によって、３色に分離された蛍光が、各色の蛍光イメージに予め設定された明るさの閾値と比較され、どの色の波長域で強い蛍光を発しているかが判定される。そして、判定された蛍光の波長域から外れる（例えば、蛍光の波長域よりも長波長側になる）ように、励起レーザーが選択されるようにラマン顕微装置１０を構成してもよい。
【００５７】
図７の蛍光性顔料に対しては、最も蛍光の強かった「緑」色の波長域に近い５３２ｎｍの励起レーザーの使用が回避される。例えば、励起レーザーとして、標準的な５３２ｎｍ可視レーザーの他に、４８８ｎｍ励起、６３３ｎｍ励起、７８５ｎｍ励起などの可視レーザー、１０６４ｎｍ赤外レーザー、および３２５ｎｍＵＶレーザーなどが選択可能である場合、蛍光性顔料に対する適切な励起レーザーとして、７８５ｎｍ可視レーザーや１０６４ｎｍ赤外レーザーを選択してもよい。画像ＳＰ７１は、７８５ｎｍ可視レーザーを選択した場合のラマンスペクトルを示す。この画像に示されるように、蛍光を回避した良好なスペクトルデータを取得できることが分かる。比較として、５３２ｎｍ可視レーザーを選択した場合のラマンスペクトルを画像ＳＰ７２として示す。５３２ｎｍ可視レーザーでは、蛍光の影響が強く、ラマンスペクトルが蛍光に埋もれて、Ｓ／Ｎ比が悪化している。
【００５８】
＜本実施形態の効果＞
このように、フィルターユニット１を用いた暗視野蛍光観察画像に基づいて、ラマン顕微装置１０の励起光学系に設置されている励起レーザーＬＳ１〜ＬＳ３の中から適切な励起波長の励起レーザーを選択することができる。図５のレーザー自動切替機ＳＷ１を用いれば、選択した励起レーザーへの自動切替も可能になる。本実施形態のラマン顕微装置１０では、適切な励起レーザーを用いることで、蛍光の影響を回避したラマンスペクトルを測定することができる。
【００５９】
また、ラマン顕微装置１０には、暗視野対物レンズユニット２の光軸上であって、この暗視野対物レンズユニット２を中心に試料側とは反対側に、フィルターユニット１が装着されている。例えば、フィルターユニット１を暗視野用対物レンズユニット２用のレボルバーに着脱自在にセットできるように構成することもできる。レボルバーにフィルターユニット１をセットするだけで、ラマン顕微装置１０に暗視野での蛍光観察機能を容易に付与することができる。
【００６０】
本実施形態のフィルターユニット１は、暗視野ＵＶ照射付きのロングパスフィルターユニットであり、そのロングパスフィルター１６は、ラマン顕微装置側の励起レーザーによる照射へは何ら影響を及ぼさない。よって、フィルターユニット１による蛍光観察の後、フィルターユニット１を付けたまま、ラマン観察を実行することができる。蛍光観察からラマン観察への移行において、フィルターユニット１の着脱作業が不要となり、ラマン顕微装置の使い勝手が向上する。
【００６１】
フィルターユニット１のＵＶ−ＬＥＤ素子１８から暗視野用対物レンズユニット２のリング状のレンズ２６に向かってリング状のＵＶ光が発せられ、リング状のレンズ２６によって試料を暗視野で照射する。ＵＶ光に代えて、単色ＬＥＤ素子１８Ｒ，１８Ｇ，１８Ｂからの単色光を試料に暗視野で照射することもできる。ＵＶ光、単色ＬＥＤ光、またはこれらを組み合わせた光を選択的に試料へ照射することによって、試料の反射率や自家蛍光の特性を多様な励起条件下で観察画像として取得することができて、より適切な励起波長を選択することができる。
【００６２】
また、試料から発生した蛍光は、暗視野用対物レンズユニット２の光軸上に位置する明視野用のレンズ２４によって集光されて、フィルターユニット１のロングパスフィルター１６に向かって進行する。ロングパスフィルター１６によって、試料からの跳ね返りＵＶ光が除去されて、試料からの蛍光がラマン顕微装置１０の可視観察光学系へと進行する。
【００６３】
ラマン顕微装置１０は、レーザー照射光学系、共焦点顕微光学系、ラマン観察光学系および可視観察光学系を備え、フィルターユニット１からのＵＶ光の照射によって生じた蛍光は、ロングパスフィルター１６を通過して、可視観察光学系で観察される。このような構成のラマン顕微装置１０であれば、フィルターユニット１を暗視野用対物レンズユニット２のレボルバーに装着するだけでよいので、ラマン顕微装置１０の内部に蛍光観察用の光源や光学系切替機構を設置する必要がなくなる。
【００６４】
以下、本実施形態のラマン顕微装置１０による特徴的なラマン観察方法を説明する。
【００６５】
ＵＶ硬化樹脂の硬化プロセスの観察
ここでは、ラマンスペクトルの特定の波長ピークが落ちていく（減衰していく）様子から、ＵＶ照射による試料の硬化プロセスを観察するという方法を説明する。
【００６６】
従来のＵＶ硬化樹脂の硬化プロセスの観察では、試料へのＵＶ照射を透過光学系として構成するか、または、ＵＶ照射を測定光軸に直交または斜め方向から試料に照射するか、のいずれかが必要だった。前者の透過光学系を採用するには、試料自体が透過する材料であるという条件が加わる。また、後者の場合、例えばＵＶ照射用のバンドルファイバの出射口を対物レンズと試料との隙間に挿入するためのスペースを確保しなければならず、作動距離の長い低倍率の対物レンズの選択が必要になる。
【００６７】
本実施形態のフィルターユニット１を備えたラマン顕微装置１０を使って、ＵＶ硬化樹脂の硬化プロセスを観察すれば、暗視野用対物レンズユニット２と試料との隙間を狭くすることができて、高倍率の対物レンズを使うことができ、ＵＶ硬化樹脂のより細かな変化まで観察することができる。
【００６８】
図８（Ａ）〜（Ｃ）に、硬化プロセスの観察結果の一例を示す。アクリルモノマーを主成分とする紫外線硬化樹脂（小谷野製作所製）にフィルターユニット１のＵＶ−ＬＥＤ１８からのＵＶ光を照射しつつ、硬化プロセスのラマンスペクトルを露光時間２秒にて、６０秒ごとのインターバル測定を行った。図８（Ａ）は、そのラマンスペクトルであり、縦軸が散乱強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を示し、横軸がラマンシフト（ｃｍ−１）を示す。図８（Ａ）における波数１０００ｃｍ−１〜２０００ｃｍ−１の領域の測定データを図８（Ｂ）に拡大して示す。微弱なラマンピークまできめ細かく検出されていることが分かる。ＵＶ硬化樹脂へのＵＶ光の照射が繰り返されるにつれて、１６４０ｃｍ−１付近のＣ＝Ｃ伸縮振動と思われるピークが減衰していく様子をはっきりと観察することができる。図８（Ｃ）は、１６３６ｃｍ−１のラマン信号強度の時間変化をグラフにしたものであり、本実施形態のラマン顕微装置１０を用いれば、特定のラマンピークが減衰していく過程をかなりの高精度でモニターすることができる。
【００６９】
このように、ラマンスペクトルの中から、樹脂の硬化プロセスに関連性が高い特定のラマンピークに注目して、ＵＶ光の照射時間に伴って、そのラマンピークがどのように増減するかを観察することで、樹脂の硬化状態を評価することができる。
【００７０】
サンプルサーチへの利用
ＲＧＢ発光素子１８Ｒ，１８Ｇ，１８Ｂを使った暗視野可視観察によって、３原色のどの色を照射した場合に一番、色が浮き出るかを調べることもできる。つまり、フィルターユニット１に設けられたＲＧＢ発光素子１８Ｒ，１８Ｇ，１８Ｂを色ごとに発光させて試料へ照射する。図１の撮像手段Ｃ１によって照射した色ごとに試料からの反射光が撮像される。画像処理手段５が、撮像された観察画像に基づいて、ＲＧＢ発光素子１８Ｒ，１８Ｇ，１８Ｂの各色の光の反射率を測定する。そして、試料認識手段７が、測定された反射率に基づいて、試料中の微小異物の分布状態を捉えることができる。これは、観察視野に分散している小さな測定対象物を、画像のコントラストを利用して認識する機能（サンプルサーチ機能）として有効な手段になる。
【００７１】
図９は、ＲＧＢ発光素子１８Ｒ，１８Ｇ，１８Ｂを用いて３色同時照明した場合と単色照明をした場合におけるそれぞれの試料の観察画像（９Ａ，９Ｒ，９Ｇ，９Ｂ）を撮像したものである。試料として、プリンター用の３色のトナー（シアンＣ、マゼンタＭ、イエローＹ）を混合したものを用いた。単色照明によって得られた観察画像から、色ごとに測定対象物の分布が異なっていることが分かる。このことを利用して、すべての発光素子を同時照射した場合には見落とされがちになるような、微小な測定対象物の分布状態まで認識可能な試料認識機能を実現することができる。
【００７２】
図１０（Ａ）は、窓枠の四隅にＵＶ−ＬＥＤ素子１８を配置したフィルターユニット１Ａの例である。また、図１０（Ｂ）の例では、フィルターユニット１Ｂに、フィルター上の位置に応じて透過波長域が異なるグラデーション型のロングパスフィルター１６Ａを用いる。ロングパスフィルター１６Ａが窓枠１４Ａの開口範囲をスライド自在に支持されている。ロングパスフィルター１６Ａは、フィルターユニット１Ｂがレボルバー等に装着された状態のままでも、手動または電動によりスライド可能に構成されている。そのスライド位置を変えることによって、ロングパスフィルター１６Ａを透過させる波長域を測定条件に応じて調整することが容易にできる。
【符号の説明】
【００７３】
１，１Ａ，１Ｂ  フィルターユニット
２          暗視野対物レンズユニット（暗視野対物レンズ）
３          分光器
４          ＣＣＤ検出器
５          画像処理手段
６          励起波長選択手段
７          試料認識手段
１０        ラマン顕微装置
１２        枠体
１４，１４Ａ  窓部
１６        ロングパスフィルター
１６Ａ      グラデーションフィルター
１８        ＵＶ−ＬＥＤ素子（ＵＶ発光素子）
１８Ｒ，１８Ｇ，１８Ｂ  ＲＧＢ発光素子の各素子
２４        明視野用のレンズ（明視野用の対物レンズ）
２６        リング状のレンズ
Ｃ１        カメラ（蛍光撮像手段、反射光撮像手段）
ＬＳ１〜ＬＳ３  励起レーザー
ＳＷ１      レーザー自動切替機
【要約】
【課題】複雑化・大型化することなく、ラマン顕微装置に蛍光観察機能を付与させることである。
【解決手段】枠体１２と、枠体１２の窓部１４の周囲に配置されてＵＶ光を発する複数のＵＶ−ＬＥＤ素子１８と、枠体１２の窓部１４を塞ぐように当該枠体１２に支持されてＵＶ光の波長よりも長い波長を透過させるロングパスフィルター１６とを備えるフィルターユニット１を用いて、暗視野対物レンズ２を装着したラマン顕微装置に蛍光観察機能を付与させる。
【選択図】      図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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