(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクターであって、
（１）ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列と、その下流に存在する第１のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第１の転写終結配列とを含む第１のレポーター遺伝子発現ユニット、
（２）構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第２のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第２の転写終結配列とを含む第２のレポーター遺伝子発現ユニット、および
（３）前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含むレポーターベクター。
【請求項２】
前記第１のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列と、前記第１のレポーター遺伝子と、前記第１の転写終結配列と、前記第２のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記第２のレポーター遺伝子と、前記バイシストロニック発現用配列と、前記複製開始蛋白質遺伝子と、前記第２の転写終結配列とは、この順番で５’から３’に向う方向で配置される、請求項１に記載のレポーターベクター。
【請求項３】
前記第１のレポーター遺伝子は、前記ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列の活性化によって発現し、前記第２のレポーター遺伝子および前記複製開始蛋白質遺伝子は、前記構成的な活性を示すプロモーター配列の活性化によって発現する請求項１又は２に記載のレポーターベクター。
【請求項４】
前記第１のレポーター遺伝子から生ずる信号と、前記第２のレポーター遺伝子から生ずる信号とが、互いに識別可能に異なる請求項１〜３の何れか１項に記載のレポーターベクター。
【請求項５】
前記第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子が、それぞれ青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、赤色蛍光蛋白質遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、一酸化窒素合成酵素遺伝子、キサンチンオキシダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、または重金属結合蛋白質遺伝子の少なくとも一種である請求項４に記載のレポーターベクター。
【請求項６】
前記第１の転写終結配列および前記第２の転写終結配列が、ポリ（Ａ）配列を含む配列である請求項１〜５の何れか１項に記載のレポーターベクター。
【請求項７】
前記第１の転写終結配列および前記第２の転写終結配列が、ポリ（Ａ）付加シグナル配列である請求項６に記載のレポーターベクター。
【請求項８】
前記第１の転写終結配列および前記第２の転写終結配列が、シミアン・ウイルス４０のポリ（Ａ）付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル配列、および人工合成されたポリ（Ａ）付加シグナル配列の少なくとも一種である請求項７に記載のレポーターベクター。
【請求項９】
前記構成的な活性を示すプロモーター配列が、サイトメガロウイルスプロモーター、またはヒト・ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼプロモーターの少なくとも一種である請求項１〜８の何れか１項に記載のレポーターベクター。
【請求項１０】
前記バイシストロニック発現用配列が、ＩＲＥＳ配列である請求項１〜９の何れか１項に記載のレポーターベクター。
【請求項１１】
前記ＩＲＥＳ配列が、脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ配列である請求項１０に記載のレポーターベクター。
【請求項１２】
前記複製開始蛋白質遺伝子が、シミアン・ウイルス４０の野性型ラージＴ抗原遺伝子、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子、またはマウス・ポリオーマ・ウイルスのラージＴ抗原遺伝子の少なくとも一種である請求項１〜１１の何れか１項に記載のレポーターベクター。
【請求項１３】
前記複製開始配列が、シミアン・ウイルス４０、エプスタイン・バー・ウイルス、またはマウス・ポリオーマ・ウイルスの複製開始配列の少なくとも一種である請求項１〜１２の何れか１項に記載のレポーターベクター。
【請求項１４】
前記ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列が配列番号１に記載の塩基配列を含む塩基配列であり、前記第１および第２の転写終結配列が、それぞれポリ（Ａ）付加シグナル配列を含む塩基配列であり、前記バイシストロニック発現用配列が、配列番号７に記載の配列を含む塩基配列であり、前記複製開始蛋白質遺伝子が、配列番号８、９または１０に記載の配列を含む塩基配列であり、前記複製開始配列が、配列番号１１に記載の配列を含む塩基配列である請求項１又は２に記載のレポーターベクター。
【請求項１５】
レポーターベクターおよび前記レポーターベクターを担持するキャリアを含む被検細胞の細胞特性を評価するためのアッセイキットであって、
前記レポーターベクターが、
（１）ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列と、その下流に存在する第１のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第１の転写終結配列とを含む第１のレポーター遺伝子発現ユニット、
（２）構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第２のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第２の転写終結配列とを含む第２のレポーター遺伝子発現ユニット、および
（３）前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含むアッセイキット。
【請求項１６】
前記レポーターベクターの前記第１のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列と、前記第１のレポーター遺伝子と、前記第１の転写終結配列と、前記第２のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記第２のレポーター遺伝子と、前記バイシストロニック発現用配列と、前記複製開始蛋白質遺伝子と、前記第２の転写終結配列とは、この順番で５’から３’に向う方向で配置される、請求項１５に記載
のアッセイキット。
【請求項１７】
被検細胞の細胞特性を評価する方法であって、
（ａ）被検細胞に、レポーターベクターを導入すること、
（ｂ）レポーターベクターを複製ならびに第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子を発現させること、
（ｃ）第１のレポーター遺伝子からの第１の信号および第２のレポーター遺伝子からの第２の信号を検出すること、および
（ｄ）第１の信号および第２信号に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価することを含み、
前記レポーターベクターが、
（１）ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列と、その下流に存在する第１のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第１の転写終結配列とを含む第１のレポーター遺伝子発現ユニット、
（２）構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第２のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第２の転写終結配列とを含む第２のレポーター遺伝子発現ユニット、および
（３）前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含む方法。
【請求項１８】
前記レポーターベクターの前記第１のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーター配列と、前記第１のレポーター遺伝子と、前記第１の転写終結配列と、前記第２のレポーター遺伝子発現ユニットにおける前記第２のレポーター遺伝子と、前記バイシストロニック発現用配列と、前記複製開始蛋白質遺伝子と、前記第２の転写終結配列とは、この順番で５’から３’に向う方向で配置される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記被検細胞が、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、造血組織性腫瘍、胎児性腫瘍またはこれらの何れかの組み合わせである請求項１７又は１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクター、アッセイキット、方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国における死因の１位は癌である。癌は、悪性腫瘍の形成という共通点を持つ疾患群であり、今日までに２００を超える様々な腫瘍が同定されている。悪性腫瘍の共通点は、細胞の無制御な増殖、近隣組織への浸潤能力、および全身組織への転移形成能力である。
【０００３】
癌、例えば、悪性腫瘍の治療においては、腫瘍の性質（即ち、腫瘍細胞の特性）に応じた適切な治療法の選択が重要である。そのために、腫瘍細胞の特性、すなわち腫瘍の良性悪性が評価されることが望ましい。悪性腫瘍の場合には、その攻撃性、例えば、浸潤性や転移性などについても評価できることが望ましい。
【０００４】
例えば、特定遺伝子の発現変化が腫瘍細胞の特性と高い相関を示す場合、その遺伝子は腫瘍マーカーとして利用できる。腫瘍マーカーを検出することにより、遺伝子発現に関連する腫瘍特性を判別することが可能となる。例えば、血液または他の体液、あるいは採取した腫瘍細胞において、特定の腫瘍マーカーが検出されれば、そのマーカーと高い相関をもつ腫瘍細胞の存在が示唆される。公知の腫瘍マーカーには、腫瘍細胞の増殖性を評価するＫｉ−６７遺伝子などがある。
【０００５】
腫瘍マーカーのプロモーター活性を測定する方法として、レポーター遺伝子を用いた方法がある。この方法では、腫瘍マーカーのプロモーターとレポーター遺伝子とを連結したベクターを被検細胞内に導入し、前記レポーター遺伝子からの信号を検出または測定する。それにより被検細胞の細胞特性を評価する。また、このようなプロモーターアッセイの１つとして、プロモーターレポーター遺伝子の下流にベクターの自己複製のための配列を配する評価方法がある。しかしながら、より優れた更なる評価手段の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−２３９６７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、被検細胞の細胞特性を評価するための新規のレポーターベクター、アッセイキット、方法および装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
実施形態に従うレポーターベクターは、第１のレポーター遺伝子発現ユニット、第２のレポーター遺伝子発現ユニット、および複製開始配列を含む。第１のレポーター遺伝子発現ユニットは、細胞特性マーカーのプロモーター配列と、その下流に存在する第１のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第１の転写終結配列とを含む。第２のレポーター遺伝子発現ユニットは、構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第２のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第２の転写終結配列とを含む。複製開始配列は、前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製を開始する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施形態のレポーターベクターの一例を示す図である。
【図２】実施形態のレポーターベクターの一例を示す図である。
【図３】実施形態のレポーターベクターの一例を示す図である。
【図４】実施形態の被検細胞の細胞特性の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【図５】実施形態の細胞特性評価装置の一例を示す図である。
【図６】実施形態の細胞特性評価装置を用いた細胞特性の評価方法の一例を示すフローチャートである。
【図７】実施形態の細胞特性評価装置の例を示す図である。
【図８】例において用いたベクターの構成を示す図である。
【図９】例における結果を示す図である。
【図１０】例における結果を示す図である。
【図１１】例において用いたベクターの構成を示す図である。
【図１２】例における結果を示す図である。
【図１３】例における結果を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、図面を参照しながら実施の形態について説明する。
【００１１】
実施形態は、被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクター、アッセイキット、方法、および装置を提供する。
【００１２】
本実施形態のレポーターベクターは、例えば、少なくとも２つのレポーター遺伝子、即ち細胞特性マーカーのプロモーター配列の活性化によって発現する第１のレポーター遺伝子と、構成的な活性を示すプロモーター配列の活性化によって発現する第２のレポーター遺伝子と、当該ベクターが導入された被検細胞内で当該ベクター自身を複製するための複製開始ユニットとを含む。当該レポーターベクターは、上述の第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子の他に、更なるレポーター遺伝子を含み得る。このように、当該レポーターベクターは、自己複製型マルチレポーターベクターであり得る。自己複製型マルチレポーターベクターは、例えば、２つのレポーター遺伝子を含む場合は、自己複製型デュアルレポーターベクターであり得る。また、３つのレポーター遺伝子を含む場合は、自己複製型トリプルレポーターベクターであり得る。しかしながら、レポーターベクターはこれらに限定されるものではない。
【００１３】
被検細胞の細胞特性の評価により、細胞自体、例えば、細胞内部若しくは細胞外部の「状態」または「性質」、或いは細胞を取り囲む「環境」の条件が、予め決定された特定の条件であるか否かについて判断される。例えば、このような条件は、特定の疾患の兆候を示す指標、特定の疾患が発症している指標、特定の疾患の発症の進行の程度を示す指標および／または特定の疾患の重症度を示す指標などが存在するか否かなどによって判断され得る。このような条件は、例えば、疾患発症、疾患存在または疾患の進展度に関連して含有量が変化する細胞内の物質に関する条件であってもよい。またこのような条件は、具体的な指標であってもよく、例えば、特定の遺伝子の存在、特定の遺伝子の発現、細胞内外のｐＨ値、酸化還元に関する情報、特定のイオンの存在、酵素の存在、酵素基質の存在、特定の物質の存在などについて、それらの存在の有無、それらの存在についての数量的な値の大きさ、それらの存在分布、および／または存在状態の変化などであってもよい。
【００１４】
例えば、癌細胞または腫瘍細胞について細胞特性を評価する場合、被検細胞の細胞特性の評価とは、被検細胞の腫瘍特性、例えば、転移性若しくは浸潤性の有無または程度、その細胞が正常であるのか異常であるのかを評価すること、並びに被検細胞が異常である若しくはその可能性がある場合には、その異常性の程度または悪性度の程度などを評価することを含み得る。腫瘍細胞の細胞特性の評価とは、例えば、腫瘍細胞の転移性若しくは浸潤性の有無、腫瘍細胞の転移性の程度、腫瘍細胞の良性度若しくは悪性度、腫瘍細胞の正常性若しくは異常性の程度を評価することであり得る。
【００１５】
ここにおいて、「癌細胞」および「腫瘍細胞」または「癌」および「腫瘍」の語は、交換可能に使用される。
【００１６】
１．レポーターベクター
実施形態に従うレポーターベクターは、例えば、被検細胞の細胞特性を評価するための自己複製型マルチレポーターベクターであり得る。
【００１７】
図１に、レポーターベクターの一例を簡略化した図を示す。実施形態に従うレポーターベクター１は、少なくとも第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０、第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０および複製開始ユニットを含む。
【００１８】
第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０は、細胞特性マーカーのプロモーター配列１１と、その下流に存在する第１のレポーター遺伝子１２と、その下流に存在する第１の転写終結配列１３とを含む。細胞特性マーカーのプロモーター配列１１、第１のレポーター遺伝子１２、および第１の転写終結配列１３は、機能的に連結されている。それにより第１のレポーター遺伝子１２の発現は、細胞特性マーカーのプロモーター配列１１の活性化によって発現される。各配列の詳しい説明は後述する。
【００１９】
第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０は、構成的な活性を示すプロモーター配列２１と、その下流に存在する第２のレポーター遺伝子２２と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列２３と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子２４と、その下流に存在する第２の転写終結配列２５とを含む。構成的な活性を示すプロモーター配列２１、第２のレポーター遺伝子２２、バイシストロニック発現用配列２３、複製開始蛋白質遺伝子２４および第２の転写終結配列２５は、機能的に連結されている。それにより第２のレポーター遺伝子２２および複製開始蛋白質遺伝子２４は、構成的な活性を示すプロモーター配列２１の活性化によって発現される。各配列の詳しい説明は後述する。
【００２０】
複製開始ユニットは、複製開始配列３０と、第２のレポーター遺伝子発現ユニットに含まれる複製開始蛋白質遺伝子２４とを含む。複製開始配列３０は、複製開始蛋白質遺伝子２４から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記自己複製型デュアルレポーターベクター１の複製を開始させる。複製開始配列３０は、自己複製型デュアルレポーターベクターの配列中、第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０と第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０とが存在する領域を除く、何れかの領域に存在し得る。
【００２１】
ここで、「機能的に連結された」とは、当該レポーターベクターが含む各ヌクレオチド配列が目的とする機能を発揮することが可能な状態で連結している状態をいう。例えば、蛋白質をコードする配列の場合、それぞれの塩基配列がコードするアミノ酸配列が正しく連結されていることをいう。言い換えれば、それは、アミノ酸コドンのフレームにずれがなく、当該塩基配列が導入された細胞において、目的とする活性が機能するペプチドが合成されることをいう。またここで、「機能的に連結」の語は、「作動可能に連結」の語と交換可能に使用される。
【００２２】
第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０、第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０、および複製開始配列３０は、１つのレポーターベクター１上に含まれる。第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０の下流に第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０が存在してもよいし、その逆であってもよい。
【００２３】
第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０および第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０の転写方向は、互いに同じ方向であり得る。しかしながら、第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０および第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０の転写方向は、互いに逆向きの方向であってもよい。そのような自己複製型デュアルレポーターベクターの例を図２に示す。この例では、第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０の転写方向が第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０と逆向きであること以外は、図１に示すベクターと同様の構成を有する。
【００２４】
レポーターベクターにおける第１のレポーター遺伝子発現ユニット、第２のレポーター遺伝子発現ユニットおよび複製開始配列３０は、この順番で時計回りに、即ち、５’から３’に向う方向でベクター上に配置されてもよく、それとは逆方向で配置されてもよいが、５’から３’に向う方向で配置されることが好ましい。或いは、第１のレポーター遺伝子発現ユニット、複製開始配列３０、第２のレポーター遺伝子発現ユニットの順番であってもよい。
【００２５】
レポーターベクターにおける第１のレポーター遺伝子発現ユニットと、第２のレポーター遺伝子発現ユニットとの配置は、この順番で時計回りに、即ち、５’から３’に向う方向でベクター上に配置されてもよく、それとは逆方向で配置されてもよいが、２つの遺伝子発現ユニットの向きが５’から３’に向う方向で配置されることが好ましい。
【００２６】
図１では省略されているが、第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０、第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０、および複製開始配列３０の間には、これらの遺伝子発現ユニットの機能を損なわない限りにおいて、任意の塩基配列が含まれ得る。このような塩基配列は、特定の機能を有する塩基配列であってもよいし、機能をもたない任意の塩基配列であってもよい。特定の機能を有する塩基配列は、例えば、更なるレポーター遺伝子、転写終結配列、薬剤耐性遺伝子、またはレポーターベクターの維持や調整に使用する大腸菌や酵母などの複製開始配列などであり得る。
【００２７】
更なるレポーター遺伝子は、後述する第１のレポーター遺伝子または第２のレポーター遺伝子と同様のレポーター遺伝子を含む公知のレポーター遺伝子であり得る。当該レポーター遺伝子から発現するレポーター蛋白質から得られ得る信号と、第１および第２のレポーター遺伝子から発現するレポーター蛋白質から得られる信号とは、互いに識別可能に異なる信号であることが好ましい。
【００２８】
第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０および第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０の上流に転写終結配列を配置することにより、第１のレポーター遺伝子発現ユニット１０または第２のレポーター遺伝子発現ユニット２０からの遺伝子発現の漏れ込み（即ち、リーク）や、プラスミド上の任意の配列からの予期せぬ遺伝子発現のリークを減少させることができる。これにより、前記リークによるバックグラウンド（ノイズ）を減少させて、信号検出の感度と精度を高めることができる。転写終結配列についての詳細は後述する。
【００２９】
以下に、実施形態のレポーターベクターの構成要素の例について説明する。
【００３０】
１−１．第１のレポーター遺伝子発現ユニット
細胞特性マーカーのプロモーター配列１１は、細胞特性マーカーのプロモーターを含む。細胞特性マーカーのプロモーターは、被検細胞に由来する細胞特性マーカーのプロモーターであり得る。細胞特性マーカーは、特定の疾患に罹患した細胞において発現する、または特定の疾患に罹患した細胞において正常な細胞に比べて多く若しくは少なく発現する遺伝子である。特定の疾患に罹患した細胞において発現する細胞特性マーカーは、例えば、特定の疾患に罹患した細胞のみにおいて発現する遺伝子であってもよい。これらの遺伝子の発現は、そこに含まれるプロモーターの活性化により発現される。したがって、細胞特性マーカーのプロモーターの活性化は、被検細胞の細胞特性、例えば、細胞自体の状態または細胞を取り囲む環境に従った細胞特性マーカーの発現量に対応している。
【００３１】
細胞特性マーカーのプロモーター配列１１は、評価されるべき細胞特性が腫瘍特性である場合、腫瘍マーカーであり得る。腫瘍マーカーは、例えば、それ自身公知の腫瘍マーカーであり得る。そのような細胞特性マーカーのプロモーターは、例えば、ＮＡＭＰＴ、Ｋｉ６７、ｆｏｓまたはｍｙｃなどの遺伝子プロモーターを含み得る。検出されるべき腫瘍の種類は、例えば、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、造血組織性腫瘍、胎児性腫瘍、またはそれらの何れかの組み合わせであり得る。上皮性腫瘍は、例えば、乳腺腫瘍、または肺腫瘍などであり得る。
【００３２】
検出対象が、関節炎や骨粗しょう症などの骨代謝異常に関わる細胞である場合は、例えば、ＮＦＡＴＣ１やＣＩＣＣ４などの遺伝子プロモーターが使用され得る。また、検出対象が、多様な疾患の惹起に関わる酸化ストレスを受けた細胞である場合、例えば、カタラーゼやＳＯＤなどの遺伝子プロモーターが使用され得る。
【００３３】
細胞特性マーカーのプロモーター配列１１は、上記のようなプロモーターを含むポリヌクレオチドであり得る。細胞特性マーカーのプロモーター配列１１は、上記のようなプロモーターの他に、リンカー配列などを含んでいてもよい。
【００３４】
細胞特性マーカーのプロモーター配列１１は、例えば、表１−１および表１−２に示される配列番号１に記載のＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーターの配列であってもよい。
【００３５】
【表１−１】
0006723011.tif 000002
【００３６】
【表１−２】
0006723011.tif 000003
【００３７】
第１のレポーター遺伝子１２は、検出可能な信号を生ずるレポーター蛋白質をコードし、かつ細胞特性マーカーのプロモーター配列１１の活性化によりレポーター蛋白質を発現し得る何れかの遺伝子であり得る。
【００３８】
前記検出可能な信号は、蛍光、発光および呈色などであってもよく、或いは蛋白質などの物質の呈示であってもよい。或いはそれは、例えば、それ自身公知の方法により検出することが可能な信号であればよい。ここで用いる「発光」とは、化学発光、生物発光または生物化学発光を指す。
【００３９】
前記検出可能な信号は、レポーター蛋白質自身から発せられる信号であってもよいし、レポーター蛋白質と何れかの物質との反応、例えば酵素反応の結果、レポーター蛋白質または何れかの物質から発せられるものであってもよいし、あるいはレポーター蛋白質と何れかの物質との結合の結果、レポーター蛋白質または何れかの物質から生じる信号であってもよい。
【００４０】
レポーター蛋白質は、例えば、青色蛍光蛋白質、緑色蛍光蛋白質、赤色蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、一酸化窒素合成酵素、キサンチンオキシダーゼおよび重金属結合蛋白質であり得る。
【００４１】
レポーター蛋白質自身から信号が生じるレポーター遺伝子は、例えば、青色蛍光蛋白質、緑色蛍光蛋白質、赤色蛍光蛋白質などの蛍光蛋白質をコードする遺伝子であり得る。
【００４２】
レポーター蛋白質と何れかの物質との反応から信号が生じるレポーター遺伝子は、例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、またはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子などの発光酵素蛋白質をコードした遺伝子、キサンチンオキシダーゼ遺伝子または一酸化窒素合成酵素遺伝子などの活性酸素生成酵素をコードした遺伝子、あるいはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子またはクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子などの発色酵素蛋白質をコードする遺伝子などであり得る。
【００４３】
レポーター蛋白質と何れかの物質との結合から信号が生じる遺伝子は、重金属結合蛋白質をコードする遺伝子であり得る。重金属結合蛋白質を検出可能な信号として発現する遺伝子の１例は、特開２０１２−２００２４５に開示されている。
【００４４】
第１のレポーター遺伝子１２は、発光酵素蛋白質をコードする遺伝子であることがより好ましく、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子およびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であることが好ましい。
【００４５】
第１の転写終結配列１３は、その上流の遺伝子の転写を終結するための配列である。第１の転写終結配列１３は、例えば、ポリ（Ａ）配列を含む配列であってもよく、例えば、ポリ（Ａ）付加シグナル配列であり得る。
【００４６】
ポリ（Ａ）付加シグナル配列は、例えば、シアミン・ウイルス（ＳＶ）４０のポリ（Ａ）付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル配列、または人工的に合成されたポリ（Ａ）付加シグナルなどであり得る。ＳＶ４０ウイルスのポリ（Ａ）付加シグナル、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル、または人工的に合成されたポリ（Ａ）付加シグナル配列は、例えば、それぞれ表２に示される配列番号２、配列番号３、配列番号４に記載の塩基配列を含み得る。ただし、実施形態において使用可能なポリ（Ａ）付加シグナル配列は、これらに限定されるものではなく、ポリ（Ａ）付加シグナル配列としての機能を損なわない限りにおいては、遺伝子配列を改変したものを用いてもよい。
【００４７】
【表２】
0006723011.tif 000004
【００４８】
１−２．第２のレポーター遺伝子発現ユニット
構成的な活性を示すプロモーター配列２１は、被検細胞内で構成的な活性を示すプロモーターを含む。このようなプロモーターは、被検細胞内で構成的に発現されている遺伝子の転写が開始される際に活性化され得る。
【００４９】
構成的な活性を示すプロモーター配列２１は、プロモーター活性を有する配列の他に、リンカー配列などを含んでいてもよい。
【００５０】
構成的な活性を示すプロモーター配列は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ヒト・ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーター、ユビキチン遺伝子ファミリー由来のプロモーター、またはポリペプチド鎖伸長因子（ＥＦ１α）遺伝子プロモーターであり得る。ＣＭＶプロモーターおよびヒト・ヘルペスウイルスのｔｋプロモーターは、例えば、それぞれ表３に記載の配列番号５および配列番号６に記載の配列を含み得る。
【００５１】
【表３】
0006723011.tif 000005
【００５２】
第２のレポーター遺伝子２２は、構成的な活性を示すプロモーター配列２１の活性化によりレポーター蛋白質を発現し得ること以外は、第１のレポーター遺伝子１２と同様のレポーター遺伝子であり得る。第１のレポーター遺伝子１２から発現するレポーター蛋白質から得られる信号と、第２のレポーター遺伝子２２から発現するレポーター蛋白質から得られる信号とは、互いに識別可能に異なる信号であることが好ましい。
【００５３】
バイシストロニック発現用配列２３は、被検細胞において、ｍＲＮＡの５’末端キャップ構造に依存せずに、ｍＲＮＡの内部にリボソームを結合させて蛋白質の翻訳を開始させることによって、バイシストロニックな発現を可能にする配列を含む塩基配列であり得る。バイシストロニックな発現とは、バイシストロニック発現用配列２３の上流および下流に存在する２つの遺伝子がコードする２種類の蛋白質を１つのｍＲＮＡで翻訳させ、同時に発現させることをいう。
【００５４】
したがって、第２のレポーター遺伝子２２および前記複製開始蛋白質遺伝子２４の間にバイシストロニック発現用配列２３が存在することにより、構成的な活性を示すプロモーター配列２１の活性化によって、第２のレポーター遺伝子２２および複製開始蛋白質遺伝子２４の発現が同時に制御され得る。
【００５５】
バイシストロニック発現用配列２３は、例えば、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位、ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）配列であり得る。ＩＲＥＳ配列は、脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ配列などであり得る。脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ配列は、例えば、表４に記載の配列番号７に記載の塩基配列を含み得る。
【００５６】
【表４】
0006723011.tif 000006
【００５７】
複製開始蛋白質遺伝子２３は、被検細胞で当該レポーターベクター１の自己複製を開始させる蛋白質をコードする遺伝子であり得る。このような複製開始蛋白質遺伝子２３は、例えば、シミアン・ウイルス４０の野性型ラージＴ抗原遺伝子、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子、またはマウス・ポリオーマ・ウイルスのラージＴ抗原遺伝子などであり得る。複製開始蛋白質遺伝子２３は、例えば、表５−１および表５−２に記載の配列番号８、表６−１および表６−２に記載の配列番号９、または表７−１および表７−２に記載の配列番号１０で示される塩基配列であり得る。複製開始蛋白質遺伝子２３は、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０の配列中の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された配列により示された、ＤＮＡ複製開始機能を有する核酸などであってもよい。ここで、ＤＮＡ複製開始機能とは、複製を開始できる蛋白質をコードしていることをいう。
【００５８】
第２の転写終結配列２５は、その上流に存在し得る第２のレポーター遺伝子２２および前記複製開始蛋白質遺伝子２４遺伝子の転写を終結するための配列であり、第１の転写終結配列１３と同様の配列であり得る。
【００５９】
【表５−１】
0006723011.tif 000007
【００６０】
【表５−２】
0006723011.tif 000008
【００６１】
【表６−１】
0006723011.tif 000009
【００６２】
【表６−２】
0006723011.tif 000010
【００６３】
【表７−１】
0006723011.tif 000011
【００６４】
【表７−２】
0006723011.tif 000012
【００６５】
１−３．複製開始配列
複製開始配列３０は、複製開始蛋白質が結合することにより、レポーターベクター１の複製が開始されるような配列を含む塩基配列であり得る。複製開始蛋白質は、複製開始蛋白質遺伝子２３から発現される複製開始蛋白質であってもよいし、被検細胞内に存在する複製開始蛋白質であってもよい。
【００６６】
複製開始配列３０は、複製開始蛋白質遺伝子２３の由来生物、およびそれから発現される複製開始蛋白質遺の種類などによって、適切なものが選択され得る。
【００６７】
例えば、複製開始蛋白質遺伝子２３が、シミアン・ウイルス４０のラージＴ抗原遺伝子である場合、複製開始配列３０として、シミアン・ウイルス４０からの複製開始配列が用いられ得る。その場合、複製開始配列３０は表８に記載の配列番号１１の塩基配列を含み得る。
【００６８】
複製開始蛋白質遺伝子２３が、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子である場合、複製開始配列３０として、エプスタイン・バー・ウイルスからの複製開始配列が用いられ得る。
【００６９】
複製開始蛋白質遺伝子２３が、マウス・ポリオーマ・ウイルスのラージＴ抗原遺伝子である場合、複製開始配列３０として、マウス・ポリオーマ・ウイルスからの複製開始配列が用いられ得る。
【００７０】
【表８】
0006723011.tif 000013
【００７１】
これらのような例は、好ましいが、これらに限定するものではない。
【００７２】
上記のような構成を有することにより、同じ被検細胞から、被検細胞内の細胞特性マーカーの量に応じた、第１のレポーター遺伝子から得られた第１の信号と、構成的な活性を持つ遺伝子の量に応じた、第２のレポーター遺伝子からの第２の信号とが同時に得られる。例えば、第２の信号は、第１の信号の標準化に用いることが可能である。例えば、第１の信号を第２の信号で除算することにより第１の信号の相対値が算出され得る。このことによって、被検細胞によるレポーターベクターの導入量のばらつきが補正され、被検細胞の細胞特性を精度よく評価できる。
【００７３】
構成的な活性を持つプロモーターによって複製開始蛋白質遺伝子が発現されることによって、レポーターベクター自身が累積的に複製される。それによって第１の信号および第２の信号が増幅され得る。これにより、従来技術よりも高い精度で被検細胞の細胞特性を評価することができる。
【００７４】
実施形態のレポーターベクター更なる１例を図３に示す。
【００７５】
レポーターベクター３は、第１のレポーター遺伝子発現ユニット、第２のレポーター遺伝子発現ユニット、および複製開始配列を含む。第１のレポーター遺伝子発現ユニットは、そこに含まれる細胞特性マーカーのプロモーターが配列番号１に示されるＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーターであり、第１のレポーター遺伝子がＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子であり、および第１の転写終結配列が配列番号３に記載の牛成長ホルモン遺伝子ポリ（Ａ）付加シグナル配列であり得る。
【００７６】
第２のレポーター遺伝子発現ユニットは、そこに含まれる構成的な活性を示すプロモーター配列が配列番号５に示されるＣＭＶプロモーターであり、第２のレポーター遺伝子がホタルルシフェラーゼ遺伝子であり、バイシストロニック発現用配列が配列番号７に記載の脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ配列であり、複製開始蛋白質遺伝子遺伝子が配列番号１０に記載のＳＶ４０のラージＴ抗原遺伝子であり、および転写終結配列が配列番号２に記載のＳＶ４０の後期ポリ（Ａ）付加シグナル配列であり得る。
【００７７】
また、複製開始配列は、配列番号１１に記載のＳＶ４０の複製開始配列であり得る。
【００７８】
しかしながら、レポーターベクターは、このようなレポーターベクターに限定されるものではない。
【００７９】
２．被検細胞の細胞特性を評価するためのアッセイキット
更なる実施の形態として、本実施形態にかかるレポーターベクターを含む被検細胞の細胞特性を評価するためのアッセイキットが提供され得る。
【００８０】
当該アッセイキットは、上記１．に記載のレポーターベクターのうち、少なくとも１種類のレポーターベクターを含む。
【００８１】
当該アッセイキットは、更に、レポーターベクターを担持するキャリア、および／または被検細胞の細胞特性を評価するために必要な何れかの試薬を含み得る。
【００８２】
前記キャリアは、例えば、緩衝液、リポソーム、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、塩化カルシウム、またはアパタイト・ナノ粒子などであり得る。
【００８３】
前記試薬は、例えば、賦形剤、安定剤、希釈剤および／または補助剤などであり得る。
【００８４】
当該アッセイキットは、アッセイキットに含まれるレポーターベクターの第１および／または第２のレポーター遺伝子の種類に応じて選択される信号の検出に必要な物質を含み得る。
【００８５】
前記信号の検出に必要な物質は、レポーター蛋白質と反応して信号を生ずる物質（例えば、基質）、前記反応により生成した物質を検出する添加物、またはレポーター蛋白質と結合して信号を生ずる物質などであり得る。
【００８６】
レポーターベクター、キャリアおよび試薬は、個別にまたは何れかの成分が組み合わされて容器に含まれて提供され得る。
【００８７】
３．被検細胞の細胞特性を評価する方法
上述のようなレポーターベクターを用いて、被検細胞の細胞特性を評価する方法は、図４に示される以下の工程を含み得る。
【００８８】
（Ａ）レポーターベクターを用意することと、
（Ｂ）被検細胞に、レポーターベクターを導入することと、
（Ｃ）レポーターベクターを複製ならびに第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子を発現させることと、
（Ｄ）第１のレポーター遺伝子からの第１の信号および第２のレポーター遺伝子からの第２の信号を検出することと、
（Ｅ）第１の信号および第２信号に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価することと。
【００８９】
以下、これらについて更に説明する。
【００９０】
（Ａ）レポーターベクターの用意
レポーターベクターは、上述のような第１のレポーター遺伝子発現ユニットと、第２のレポーター遺伝子発現ユニットと、複製開始配列を同一のベクター上に組み込むことにより作製され用意され得る。
【００９１】
ベクターは、当該技術分野において既知のいずれのベクター、例えば、プラスミド、コスミド、またはファージなどであり得る。しかしながら、プラスミドベクターが好ましい。
【００９２】
ベクターの作製には、当業者に既知の何れかの方法が使用され得る。ベクターは、後述するキャリアに含めた状態で用意され得る。
【００９３】
（Ｂ）被検細胞へのレポーターベクターの導入
上記（Ａ）で得られたレポーターベクターは、被検細胞および／または前記基準となる細胞に導入され得る。
【００９４】
被検細胞は、被検対象から採取され得る。被検対象は、例えば、サルおよびヒト等の霊長類、マウスおよびラット等の齧歯類、ウサギ、イヌおよびネコ等の伴侶動物、ウマおよびウシ等の家畜などの何れかの哺乳動物であり得る。
【００９５】
被検細胞は、細胞特性が評価されるべき細胞であればよい。被検細胞は、細胞群でも、単一細胞でもよく、試料中に含まれていてもよい。試料は、例えば、血液、尿、便、唾液、口腔内粘膜、体腔液、喀痰、またはバイオプシーなどで得られた組織などであり得る。
【００９６】
被検細胞は、評価されるべき細胞特性が細胞の癌化であり、検出対象が癌細胞である場合は、例えば、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、造血組織性腫瘍、胎児性腫瘍、またはそれらの何れかの組み合わせであり得る。上皮性腫瘍は、例えば、乳腺腫瘍、または肺腫瘍などであり得る。
【００９７】
レポーターベクターの導入は、公知の何れかの方法で行われ得る。
【００９８】
（Ｃ）レポーターベクターの複製とレポーター遺伝子の発現
レポーターベクターを被検細胞に導入した後、被検細胞を当該ベクターの自己複製と第１および第２のレポーター遺伝子の発現が可能な条件で維持され得る。当該条件は、被検細胞が分裂して増殖し得るような、当業者に公知の培養条件であり得る。
【００９９】
このような条件において、第１および第２のレポーター遺伝子が発現され得る。さらに、それと同時に、当該レポーターベクターが、前記構成的な活性を示すプロモーター配列の活性化によって発現された複製開始蛋白質が、当該レポーターベクター上の複製開始配列に結合することにより、自己複製し得る。累積的に自己複製された当該レポーターベクター上の第１および第２のレポーター遺伝子が発現することにより、第１の信号および第２の信号が増幅され得る。
【０１００】
（Ｄ）レポーター遺伝子からの信号の検出
第１および第２の信号の検出は、第１および第２のレポーター遺伝子から合成されたレポーター蛋白質から得られる、例えば、光学的信号を検出または定量することにより行われ得る。検出の方法は、レポーター遺伝子がコードするレポーター蛋白質の種類に応じて、適切な方法が選択され得る。以下にその方法について説明する。
【０１０１】
レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である場合、被検細胞からルシフェラーゼ蛋白質を抽出し、基質の一種であるルシフェリンを添加し、発光反応が行われた後に、その溶液の発光強度が、信号として発光測定装置、例えばルミノメーター用いて検出され得る。
【０１０２】
レポーター遺伝子が蛍光蛋白質遺伝子の場合、例えば、被検細胞または被検細胞から抽出した蛍光蛋白質を含む抽出液に特定波長の光を照射し、被検細胞内において蛍光蛋白質から発生される蛍光の強度が、信号として蛍光測定装置により検出され得る。
【０１０３】
レポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の場合、β−ガラクトシダーゼ蛋白質を抽出し、５−ブルモー４−クロロー３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）やｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）などの基質を加えた後に、その溶液の吸光度が、信号として吸光度測定装置を用いて検出され得る。
【０１０４】
レポーター遺伝子が一酸化窒素合成酵素遺伝子またはキサンチンオキシダーゼ遺伝子の場合、一酸化窒素合成酵素またはキサンチンオキシダーゼを抽出し、基質を加えた後に発生する活性酸素の発生の有無または量を信号として、電子スピン共鳴装置（ＥＳＲ装置）などで検出され得る。ＥＳＲ装置を用いた方法では、活性酸素の発生量を直接的に測定してもよいし、特異的なスピントラップ剤を利用して測定してもよい。スピントラップ剤を利用する場合、まず、活性酸素生成酵素をスピントラップ剤でトラップしてから、トラップされた活性酸素生成酵素から発生される活性酸素の発生量が測定され得る。
【０１０５】
レポーター遺伝子が重金属結合蛋白質遺伝子の場合、レポーター蛋白質に由来する重金属に結合した蛋白質の量が、信号として磁気共鳴イメージング装置、核医学診断装置、ＭＲＩ撮像装置、またはＸ線コンピュータ断層撮影装置により検出され得る。重金属結合蛋白質の量は、例えば、以下のように検出され得る。まず、測定可能な重金属を予め被検細胞の培養液に加える。次に、必要に応じて被検細胞を洗浄した後に、被検細胞から重金属結合蛋白質を抽出する。次に、抽出された重金属結合蛋白質を、培養液に加えた重金属に対応した画像診断装置で撮像し、重金属結合蛋白質の量を測定する。なお、重金属結合蛋白質は、被検細胞の内部で発現させてもよいし、被検細胞の外表面で発現させてもよい。
【０１０６】
重金属結合蛋白質遺伝子は、例えば、金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列であり得る。例えば、金属化合物結合蛋白質は、特定の金属化合物に対して特異的に結合するペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドおよび／または蛋白質であればよい。
【０１０７】
例えば、金属化合物を結合するペプチドをコードする配列は、所望の金属化合物と結合することが知られる抗体遺伝子や一本鎖抗体遺伝子の塩基配列を利用してもよく、そのような塩基配列に基づいてデザインすればよい。そのような塩基配列について、例えば、金属化合物との結合を維持する範囲での１つまたは幾つかの塩基の置換、欠失および付加などの修飾および／または改変、適用する対象に応じた修飾および／または改変することによりデザインしてもよい。
【０１０８】
一本鎖抗体ペプチドをコードする遺伝子は、金属化合物を結合する抗体のアミノ酸配列からデザインすることができる。
【０１０９】
例えば、ＭＲＩ撮像では、造影効果が高いためにガドリニウム化合物が好ましく使用される。ガドリニウム化合物は、例えば、ガドリニウム、ガドリニウムイオン、ガドリニウム錯体、それらの塩およびそれらの誘導体、これらの何れかを含む誘導体、またはガドリニウム化合物の類似物などからなる金属化合物であればよい。
【０１１０】
また、重金属結合蛋白質遺伝子は、細胞外に金属化合物結合能を提示するレポーター遺伝子であってもよい。そのようなレポーター遺伝子は、細胞外に提示される金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列であってもよい。そのような塩基配列は、例えば、細胞において転写され、翻訳され、金属化合物結合ペプチドを産生し、産生された金属化合物結合ペプチドは、細胞膜に移動して、細胞外に金属化合物結合能を提示するように構成されていればよい。このようなレポーター遺伝子の例は、例えば、特開２０１２−２００２４５に開示されている。そこにおいて開示されているように、そのようなレポーター遺伝子は、金属化合物結合ペプチドをコードする塩基配列と、前記金属化合物結合ペプチドを細胞膜に輸送するシグナルペプチドをコードする塩基配列と、前記シグナルペプチドによって前記細胞膜に輸送された前記金属化合物結合ペプチドを前記細胞膜に固定化するアンカーペプチドをコードする塩基配列とを含めばよい。
【０１１１】
信号の検出により得られた結果は、信号の有無であっても、信号の大きさであっても、或いはその両方であってもよい。
【０１１２】
第１の信号を検出したあとに当該信号を消滅させたあとに、第２の信号を検出してもよいし、その逆の順番で検出してもよい。あるいは、第１の信号および第２の信号を適切なフィルターで分離して同時に検出してもよい。
【０１１３】
（Ｅ）第１の信号および第２信号に基づいた被検細胞の細胞特性の評価
上記（Ｄ）で得られた第１の信号の値を第２の信号で除算することにより相対値が算出され得る。前記相対値は、被検細胞と基準となる細胞とで比較され得る。
【０１１４】
前記比較は、被検細胞および基準となる細胞において同時に上記（Ａ）〜（Ｅ）の工程を行い、前記相対値を算出して比較してもよいし、予め算出しておいた基準となる細胞の相対値と比較してもよい。
【０１１５】
上述では、（Ａ）の工程としてレポーターベクターを用意することを含む方法を示したが、当該方法は、必ずしもレポーターベクターを用意することを含む必要はなく、予め用意されたレポーターベクターを使用して行われてもよい。
【０１１６】
上記のような被検細胞の細胞特性の評価方法によって細胞特性をより精度よく評価することができる。
【０１１７】
４．被検細胞の評価装置
上述のような被検細胞の細胞特性を評価する方法は、細胞特性評価装置によって行われ得る。細胞特性評価装置について、以下に図５を用いて説明する。図５は、細胞特性評価装置の概略を示すブロック図である。細胞特性評価装置は、被検細胞の細胞特性を検出し、それに基づいて被検細胞の細胞特性を評価する装置の１例である。
【０１１８】
細胞特性評価装置は、以下の構成を備える：
（ｉ）レポーターベクターを被検細胞に導入するための遺伝子導入部、
（ｉｉ）前記ベクター導入部で得られた前記被検細胞を含む試料を受け取り、所望の時間に亘り前記被検細胞を培養するための恒温部、
（ｉｉｉ）前記恒温部から前記試料を受け取り、前記試料に含まれる前記被検細胞の前記第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子から生ずる信号を検出する検出部、および
（ｉｖ）前記検出の結果に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価する評価部。
【０１１９】
遺伝子導入部において、被検細胞の核内へのレポーターベクターの導入を行う。当該レポーターベクターは、上述の何れかのレポーターベクターであり得る。
【０１２０】
恒温部では、被検細胞の核内での自己複製ベクターの自己複製が行われる。
【０１２１】
検出部では、第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子から生ずる信号の検出を行う。例えば、検出部では、被検細胞の、発光測定、蛍光測定、吸光度測定、Ｘ線測定、電子スピン共鳴、核医学診断、および／または磁気共鳴イメージングなどが行われ得る。これらの測定を行う測定機器は、第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子によって選択され得る。検出部で得られた情報は評価部に送られる。
【０１２２】
評価部は、プロセッサ、表示部および入力部などを備え得る。評価部では、プロセッサによって検出部で得られた情報がデータ処理され、必要に応じて表示部に表示され得る。即ち、検出部で得られた結果は、評価部のプロセッサに送られて、予め決められた手順に従って分析、計算および加工されて、表示部に示され得る。
【０１２３】
遺伝子導入部、恒温部および検出部の内部は、連続して処理を行うことが可能であるように連絡窓でその内部が通じていてもよい。１つの部から次の部に被検細胞が渡された後には、遮蔽板によって連絡窓が閉じられ得る。
【０１２４】
細胞特性評価装置には、さらに試料から被検細胞を分離し、当該被検細胞を遺伝子導入部に送るように構成された細胞分離部を含んでもよい（図示せず）。
【０１２５】
細胞特性評価装置によって細胞特性を評価する方法を行う手順について、図６を用いて以下に説明する。
【０１２６】
試験者が、被検細胞とレポーターベクターとを入れた容器を遺伝子導入部に搬入する（Ｓ１）。その後分析を開始するための指示を入力部から入力する。入力部からの指示はプロセッサに送られて、プロセッサの指示により、遺伝子導入部では、レポーターベクターの被検細胞への導入を可能にするための処理が行われる（Ｓ２）。所定の時間が経過した後、導入処理を終了し、容器に収容された被検細胞を恒温部へと送る。恒温部では所定の時間に亘り所定の条件下で被検細胞を維持する。これにより、レポーターベクターの自己複製が行われる（Ｓ３）。所定の時間が経過した後、容器に収容された被検細胞は、恒温部から検出部に送られる。検出部では、被検細胞の第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子から生ずる信号の検出を行う（Ｓ４）。検出された情報は、評価部に送られ、プロセッサによりデータ処理され、処理されたデータに基づいて細胞特性が評価され得る（Ｓ５）。それにより得られた情報は表示部に示される。遺伝子導入部、恒温部および検出部への容器の動きは、ベルトコンベア、可動式アームおよび／または可動式トレイなどの移動手段によって行われ得る。これらの全ての動きは、全てプロセッサの制御の下で、予め設定されたプログラムに従うプロセッサの指示に応じて行われる。遺伝子導入部は、選択された手法による遺伝子導入のために必要な構成を備える。恒温部は、レポーターベクターの自己複製のために必要な条件を満たすために必要な構成を備える。検出部は、検出される信号に応じて検出のために必要な構成を備える。
【０１２７】
このような細胞特性評価装置の実施形態の例を図７に示す。
【０１２８】
図７（Ａ）に示される細胞特性評価装置５０は、細胞分離部である細胞分離ユニット５１と、遺伝子導入部であるＤＮＡ導入ユニット５２と、測定部および評価部である測定ユニット５３と、これらの下方に連続して配置されたステージ５４とを含む。細胞分離ユニット５１、ＤＮＡ導入ユニット５２および測定ユニット５３は、１つのステージ５４を共有し、このステージ５４によって、この順番で連絡している。言い換えれば、ステージ５４の上方に細胞分離ユニット５１と、ＤＮＡ導入ユニット５２と、測定ユニット５３とが上流から下流に向けてこの順番で配置される。
【０１２９】
細胞分離ユニット５１は、対象から得た検体から、試験されるべき細胞、即ち、被検細胞を分離するための分離器５５を含む。分離器５５は、対象から得た検体を受ける受容器５６ａと、受容器５６ａで受け取った検体について消化などを行う処理器５６ｂと、処理器５６ｂで処理された処理済み検体から被検細胞を分離するための分離部５７とを備える。受容器５６ａと処理器５６ｂと分離部５７は、互いに内径の異なる３つの中空の筒状体が上から下へと向けてこの順番で積み重なり、互いに液密に一体化されてなる。受容器５６ａと処理器５６ｂと分離部５７との各境界部は、弁により開閉可能に液絡されている。受容器５６ａは上部が開口したテーパのある筒状体であり、開閉可能な蓋を備える。受容器５６ａと処理器５６ｂとの境界は、弁が液密に閉じる。この弁が閉じたときには、これは受容器５６ａの底となる。処理器５６ｂは、受容器５６ａの下端と連続する筒状体である。受容器５６ａとの境界部の弁が液密に閉じたときには、処理器５６ｂは有蓋となる。分離部５７との境界部の弁が閉じたときには、処理器５６ｂは有底となる。分離部５７は、その内壁が処理器５６ｂの内壁から液密に連続している筒状体であり、その下端には弁が設けられている。この弁が液密に閉じて、分離部５７は有底となる。分離部５７内部には、分離材が固定されている。装置５０の使用時には、分離部５７底の下方のステージ５４上に、容器５８が載置される。容器５８は、分離された被検細胞５９を含む試料を分離部５７から受け取り、収容する容器５８である。ここで、処理器５６ｂは、その内部に含む検体に対して消化および生化学反応などの所望の処理を行う加熱および／または恒温機構を備えてもよい。また、分離材は、処理器５６ｂからの下りてきた検体から、被検細胞を含む試料を分離、採取する部材であってもよく、または処理器５６ｂからの下りてきた検体から、夾雑物を取り除く部材であってもよい。分離材は、分離部５７の中心軸に交差する面に沿って広がり分離部５７の内壁の円周に亘って固定されていてもよい。分離材は、例えば、フィルター、メンブランおよび／または磁石などであってもよい。
【０１３０】
分離器５５で分離された被検細胞５９を含む試料は、ステージ５４上に載置された容器５８に収容される。被検細胞を収容する容器５８は、ＤＮＡ導入ユニット５２に送られる。
【０１３１】
ＤＮＡ導入ユニット５２は、容器５８に収容された被検細胞に対してレポーターベクターを導入する制御部６０と導入プローブ６１とを備える。被検細胞へのレポーターベクターの導入はそれ自身公知の方法により行われてもよい。制御部６０と導入プローブ６１は、選択された導入方法を達成するための何れかの導入機構を利用した装置であればよい。例えば、ＤＮＡ導入ユニット５２はエレクトロポレーションを行う装置であってもよい。その場合、制御部６０はＤＮＡ導入器であり、導入プローブ６１は電極プローブであり、これらによってエレクトロポレーターが構成されていてもよい。更に、ＤＮＡ導入ユニット５２は、レポーターベクターを含む試薬を容器５８に供給するためのノズルを備えてもよい（図示せず）。更にＤＮＡ導入ユニット５２は、ノズルに試薬を送るための送液システム、送液システムに試薬を供給するための試薬収納容器を備えてもよい（図示せず）。
【０１３２】
また、ＤＮＡ導入ユニット５２は、所定の時間に亘り、所定の培養条件下で容器５８内の被検細胞５９を培養する培養器として機能してもよい。ＤＮＡ導入ユニット５２の培養は、制御部６０により制御されればよい。
【０１３３】
ＤＮＡ導入ユニット５２において、レポーターベクターが導入された被検細胞を含む容器５８は、次に測定ユニット５３に送られる。
【０１３４】
測定ユニット５３は、ステージ５４の一部分を上部と下部とから覆う暗箱６２と、暗箱６２内部に配置された光源６３と、光源６３の下方のステージ面に開口する窓と、窓の下方に設置された対物レンズ６７を取り付けられた撮像部６８と、光源６３および撮像部６８に連絡している制御部６５と、制御部６５にそれぞれ連絡した表示部６４および記憶部６６とを備える。例えば、測定ユニット５３の光源６３、対物レンズ６７および撮像部６８は、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラなどを搭載した顕微鏡に含まれて設置されてもよい。また、制御部６５、表示部６４および記憶部６６は、これらを備えたコンピュータであってもよい。
【０１３５】
図７の（Ｂ）は、図７（Ａ）に示した装置５０のうち、ステージについての構成のみが異なる装置の例である。この装置５０では、細胞分離ユニット５１と、ＤＮＡ導入ユニット５２と、測定ユニット５３と、これらのユニットのそれぞれの下方にそれぞれ配置されたステージ５４ａ、５４ｂ、５４ｃとを含む。このように図７の（Ｂ）の装置５０は、ステージがそれぞれのユニットに対して設けられる。ユニット間、即ち、ステージ間の移動は、手動により行ってもよく、それぞれの移動をロボットアームなどによって自動で行ってもよい。
【０１３６】
このような図７の（Ａ）および（Ｂ）に示す装置５０による細胞特性の評価の１例について説明する。まず、細胞分離ユニット５１の分離部５７下方のステージ５４上に容器５８を載置する。次に、上部開口から受容器５６ａ内に、所望により予めミンスやホモジナイズなどの前処理がなされた検体を持ち込む。これと共に、処理器５６ｂでの処理に必要な試薬が添加される。試薬の添加は、処理器５６ｂに開閉可能に設けられた試薬添加口から行われてもよい。受容器５６ａの蓋を閉め、処理器５６ｂとの境界の弁を開く。予め設定された条件に従って処理器５６ｂ内で消化処理が行われる。処理器５６ｂは予め設定された条件を満たす環境を作り出すための温度調節器を備えていてもよい。次に、処理器５６ｂと分離部５７との境界の弁か解放され、処理器５６ｂ内で処理された検体が分離部５７内部に送られる。分離部５７の分離材を通過することにより、検体に含まれる夾雑物が除去される。分離された被検細胞を含む試料は容器５８に送られて収容される。ここで、分離材を通過するのに先駆けて処理器５６ｂ内で進められた反応を止めるための反応停止試薬が検体に対して添加されてもよい。この添加は、予め分離部５７内に反応停止試薬を収容されていてもよく、そのような試薬を添加するための開閉可能な試薬添加口が分離器５５の何れかの位置の壁面に設けられていてもよい。
【０１３７】
被検細胞５９を含む試料を収容したままで、容器５８は、ＤＮＡ導入ユニット５２に送られる。ＤＮＡ導入ユニット５２のノズルからレポーターベクターを含む試薬が容器５８に添加される。導入プローブ６１を容器５８内の試料に接触させ、制御部６０からの制御によりレポーターベクターが被検細胞５９に導入される。制御部６０の制御下で被検細胞５９は、所定の時間に亘り、所定の培養条件下で培養される。
【０１３８】
その後、容器５８は測定ユニット５３に送られる。測定ユニット５３では、容器５８に収容された被検細胞５９における第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子から生ずる信号の量を測定する。測定ユニット５３における全ての手続きは、予め記憶部６６に格納されたプログラムおよび複数の情報が纏められたテーブルに従って制御部６５が制御する。例えば、光源６３からの光照射、照射時間および照射間隔などの照射条件の制御、撮像部６８による撮像および撮像条件の制御、撮像された画像についての画像処理および画像処理などが測定ユニット５３により制御される。また、細胞特性の評価についても、予め記憶部６６に格納されたプログラムに沿って、画像と細胞特性とを対応付けした情報を含むテーブルを参照して、制御部６５が行う。
【０１３９】
ＤＮＡ導入ユニット５２における被検細胞の培養の後、容器５８は測定ユニット５３に送られる。その後、光源６３からの光が容器５８内に照射される。容器５８を通過した光は、対物レンズ６７で集められ、その光から撮像部６８は任意に明視野画像を得る。その後、暗箱６２内において、被検細胞に導入された第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子から生ずる信号（ここでは、１例としての発光）を、対物レンズ６７を通して、撮像部６８によって撮像する。光源６３の光照射を止め、被検細胞からの発光が対物レンズ６７で集められ、その光から撮像部６８が発光画像を得る。撮像部６８により得られた任意の明視野画像および発光画像は、制御部６５により画像処理されて任意に重ね合わされて（マージされて）表示部６４に表示される。制御部６５では、画像の表示部６４への表示と同時または表示と前後して、明視野画像および発光画像と、記憶部６６に格納されたテーブルとに基づいて、被検細胞の細胞特性を評価する。この評価の結果は、マージされた画像と共に表示部６４に示される。
【０１４０】
ここでは、第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子から生ずる信号として発光が生じる例を示したが、発光とは異なる信号についても、撮像部６８を構成する検出装置を交換することにより同様に測定することが可能である。
【０１４１】
またここで、測定ユニット５３は、電算的処理および画像処理などを行う処理部あるいは特性評価を行う解析部を更に備えてもよい。これらの処理部および解析部が、上述では制御部６５が行っている電算的処理および画像処理、並びに特性評価を行ってもよい。
【０１４２】
上記実施形態では、被検細胞の培養をＤＮＡ導入ユニット５２が行う例を示したが、被検細胞の培養は、測定ユニット５３において行ってもよい。その場合、装置５０が更に細胞培養を可能にする部材を備えればよい。或いは、ＤＮＡ導入ユニット５２と測定ユニット５３と両方において、被検細胞が培養されてもよい。
【０１４３】
装置５０の各ユニットの動きを制御するために各ユニットがそれぞれに制御部を備えてもよく、装置５０に含まれる全てのユニットが１つの制御部、例えば、制御部６５により行われてもよい。また、ステージ５４上に載置された容器５８のユニット間の移動は、ステージ５４に搭載された容器移動機構により行ってもよい。そのような機構は、例えば、装置５０に備えられ、装置５０に備えられた制御部により動きを制御されたロボットアームによって行われてもよい。或いは、ステージ５４にベルトコンベアが取り付けられていてもよい。
【０１４４】
また、容器５８へのレポーターベクターの添加は、容器５８がＤＮＡ導入ユニット５２の所定の位置に送られる以前の何れかの時期に行われてもよい。その場合、装置５０は、レポーターベクター添加機構をＤＮＡ導入ユニット５２よりも上流の所望の位置に更に備えればよい。
【０１４５】
このような装置によって、被検細胞の細胞特性が評価される。この装置によれば、より高い精度で被検細胞の細胞特性を評価することが可能である。また、検査をスループットで行うことが可能であるので、簡便に検査を行うことが可能であり、試料の取り違えやコンタミネーションを防ぐことが可能である。
【０１４６】
また、明視野画像に基づいて、被検細胞の形態学的特徴を得て、レポーターベクターからの情報と共に被検細胞の細胞特性が評価されてもよい。形態学的特徴は、例えば、被検細胞の面積、被検細胞の面積に対する核の面積の比率、被検細胞の長径に対する短径の比率、被検細胞における核の数または被検細胞の辺縁部の特徴、例えば、辺縁部のコントラスト比などであってもよい。これらは、非侵襲性光学的撮像方法によって得られる。例えば、ハイパースペクトルイメージング法、位相差顕微法または微分干渉法などによってこれらの情報を得てもよい。
【０１４７】
例えば、明視野で形態学的観察を行う場合、近赤外領域の波長を有する光を照射して行うことが好ましい。例えば、近赤外領域の波長を有する光は、７００ｎｍ〜７５０ｎｍの波長を有する近赤外光または３５０ｎｍ〜１０５０ｎｍのマルチスペクトル光が好ましい。例えば、被検細胞に対して近赤外領域の波長の光を照射し、その光の反射または吸収、例えば、反射率または吸収率を指標に被検細胞の形態学的情報を得ればよい。
【０１４８】
例えば、被検細胞の悪性度が高い場合には、細胞形態が紡錘形などのアスペクト比が高い細胞形態をしている傾向がある。例えば、そのような被検細胞の形態学的情報についても、測定ユニット５３において取得すればよい。その場合についても、測定ユニット５３は、予め記憶部６６に格納されたプログラムおよび複数の情報が纏められたテーブルに従う制御部６５により制御されればよい。テーブルには、レポーターベクターからの検出可能な信号と細胞特性との関係についての情報が含まれる他、更に、被検細胞の形態学的特徴と細胞特性との関係、検出可能な信号と細胞特性と形態学的特徴との関係を示す情報が含まれればよい。また、例えば、光源６３からの光照射、照射時間および照射間隔などの照射条件の制御、撮像部６８による撮像および撮像条件の制御、撮像された画像についての画像処理および画像処理などが測定ユニット５３により制御される。また、細胞特性の評価は、予め記憶部６６に格納されたプログラムに沿って、形態学的特徴とレポーターベクターからの情報と細胞特性とを対応付けした情報を含むテーブルを参照して、制御部６５が行えばよい。このようにプロモーター活性と形態的特徴との複数の側面から被検細胞の細胞特性を評価することにより、より正確な結果を出すことが可能である。
【０１４９】
＜例＞
例１．乳癌細胞株を用いたデュアルレポーターベクターの構造評価
（ａ）デュアルレポーターベクターの作製
ニコチンアミドホスホリボシル転移酵素（ＮＡＭＰＴ）遺伝子のプロモーター領域（−２４２６〜＋２７６ｂｐ、配列番号１）を組込んだレポーターベクターを作製した。Ｎａｍｐｔ遺伝子のプロモーター領域は、ヒトのゲノムを鋳型としたＰＣＲで増幅して調整した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ ＧＸＬＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ ＢＩＯ）を用いて行った。ＰＣＲに用いたプライマー配列を以下に示す。
【０１５０】
Ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＧＧＧＡＣＧＣＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＡ−３’ 
Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ；５’−ＣＧＧＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＴＧＧＣＧＣＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡ−３’ 
このように調整したＮａｍｐｔ遺伝子のプロモーター配列（Ｎａｍｐｔプロモーター）を、トゲオキヒオドシエビ由来ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子の上流に組み込んで、Ｎａｍｐｔプロモーター配列とＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）（登録商標）遺伝子とＳＶ４０転写終結配列とからなるレポーター遺伝子発現ユニット、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターとホタル由来ルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ, Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子とウシ成長モル本遺伝子の転写終結配列とからなるレポーター遺伝子発現ユニット、およびＳＶ４０複製開始配列を同一核酸上に含む自己複製型デュアルレポーターベクターを作製した。自己複製型デュアルレポーターベクターは、２つのレポーター遺伝子発現ユニットの向きが異なる２種類を作製した（ｐＳ−Ｎａｍｐｔ−Ｄ（図８（Ａ））とｐＡ−ＮａｍｐＤ（図８（Ｂ）））。当該自己複製型デュアルレポーターベクターは、上述のように乳癌細胞株のマーカー遺伝子のプロモーターを含む第１のレポーター遺伝子発現ユニット（Ｎａｍｐｔプロモーター配列を含むユニット）と、構成的な活性を示すプロモーターを含む第２のレポーター遺伝子発現ユニット（ＣＭＶプロモーターを含むユニット）からなる設計とした。
【０１５１】
（ｂ）リポフェクション（レポーターベクターの細胞への導入）
１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、０．５μｇのデュアルレポーターベクターを加えた。その後、０．５μｇのエンハンサー試薬（Ｐｌｕｓ ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて室温で５分間インキュベートした。この溶液に、１．５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えてよく縣濁し、室温に２５分間インキュベートした。溶液４０μｌを４８ウェルプレートに移した後、２００μｌのヒト乳がん細胞株の縣濁液（高転移性悪性腫瘍細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を加えて穏やかに混合した。その後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベータ内で細胞を培養した。
【０１５２】
（ｃ）レポータージーンアッセイ
リポフェクションから９６時間後、４８ウェルプレートから培養液を取り除き、細胞をＰＢＳで洗浄した。その後、１５０μｌの細胞溶解液（Ｇｌｏ−Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて−８０℃に３０分以上静置して凍結した。使用時には、細胞溶解液を室温で解凍した後、溶解液を遠心チューブに回収し、遠心により細胞残渣を沈殿させた。上清を新しいサンプルチューブに回収し、上清２５μｌを９６ウェル・プレート（Ｎｕｎｃ）に分注した。ウェルに等量のＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ基質溶液（Ｏｎｅ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、またはＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）基質溶液（Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えた後、ルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）で発光強度を測定した。それにより、腫瘍細胞の悪性度評価用のＮｌｕｃのレポーター活性（Ｎａｍｐｔプロモーターの活性）、および細胞ごとの導入レポーターＤＮＡ量補正用のＦｌｕｃのレポーター活性（ＣＭＶプロモーターの活性）を測定した。腫瘍細胞の悪性度評価に用いる相対レポーター活性（ＲＬＵ）は、Ｎｌｕｃの活性値（発光強度）をＦｌｕｃの活性値（発光強度）で除算した値とした。
【０１５３】
結果を図９に示した。悪性度が高い高転移性乳癌細胞株におけるＲＬＵは、２つの遺伝子発現ユニットを順向きに組込んだｐＳ−Ｎａｍｐｔ−Ｄでは、２つの遺伝子発現ユニットを逆向きに組込んだｐＡ−Ｎａｍｐ−Ｄよりも高い相対レポーター活性を示した。この結果から、２つの遺伝子発現ユニットの向きが順向きであるｐＳ−Ｎａｍｐｔ−Ｄが、腫瘍細胞の悪性度の評価に適したデュアルレポーターベクター構造であることが明らかになった。
【０１５４】
例２．デュアルレポーターベクター：ｐＳ−Ｎａｍｐｔ−Ｄを用いた乳癌細胞株の良悪性評価
ｐＳ−Ｎａｍｐｔ−Ｄを［例１］（２）の方法で、正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）と、３種類の乳癌細胞株（高転移性悪性腫瘍細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、低転移性悪性腫瘍細胞株：Ｔ−４７Ｄ, ＢＴ−４７４）に導入して培養した。７２時間後、［例１］（３）の方法でレポータージーンアッセイをおこない、相対レポーター活性（ＲＬＵ）を算出した。相対レポーター活性（ＲＬＵ）を算出した。
【０１５５】
結果を図１０に示した。ｐＳ−Ｎａｍｐｔ−Ｄを導入した全ての乳癌細胞株で、ＨＭＥＣよりも有意に高いレポーター活性が測定された。最も高いＲＬＵを示したのは、高転移性悪性腫瘍細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−２３１であった。同細胞株のＲＬＵは、ＨＭＥＣの約７．８倍であった。これに対し、低転移性細胞株のＴ−４７ＤとＢＴ−４７４のＲＬＵは、ＨＭＥＣの２．０倍と１．４倍であった。ｐＳ−Ｎａｍｐｔ−Ｄのレポーター活性を指標として、全悪性乳癌細胞株を検出できたこと、悪性度の高い高転移性腫瘍細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１で高いＲＬＵ値が測定されたことから、ｐＳ−Ｎａｍｐｔ−Ｄが、腫瘍細胞の悪性度の評価に適したデュアルレポーターベクター構造であることが明らかになった。
【０１５６】
例３．乳癌細胞株を用いた自己複製型デュアルレポーターベクターの構造評価、および乳癌細胞株の良悪性評価
（ａ）レポーターベクターの構築
ｐＳ−Ｎａｍｐｔ−Ｄにおいて、ＣＭＶプロモーター：：ルシフェラーゼ遺伝子とウシ成長ホルモン遺伝子ポリ（Ａ）付加シグナルの間に、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）の複製開始蛋白質（ＬＴ）遺伝子を挿入した、自己複製型デュアルレポーターベクター（ｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬ−ＣＭＶＬＬＴ）を作製した（図１１（Ａ））。また、ｐＳ−Ｎａｍｐｔ−Ｄにおいて、Ｎａｍｐｔプロモーター：：ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）遺伝子とＳＶ４０ポリ（Ａ）付加シグナルの間に、ＳＶ４０の複製開始蛋白質（ＬＴ）遺伝子を挿入した、自己複製型デュアルレポーターベクター（ｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬＬＴ−ＣＭＶＬ）を作製した（図１１（Ｂ））。
【０１５７】
（ｂ）エレクトロポレーション（レポーターベクターの細胞への導入）
乳腺由来の悪性腫瘍細胞株１０種類（Ｔ−４７Ｄ，ＭＣＦ７，ＢＴ−４７４，ＵＡＣＣ−８１２，ＳＫ−ＢＲ−３，ＨＣＣ７０，ＭＤＡ−ＭＢ−４６８，ＢＴ−５４９，ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＢＴ−２０）、乳腺由来の良性腫瘍細胞株１種類（ＭＣＦ１０Ａ）、および正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）に対して、エレクトロポレーションで（ａ）に記載した２種類の自己複製型デュアルレポーターベクターを導入した。予め培養しておいた細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて培養容器から剥がし、血清入りの培地を加えて細胞を懸濁した。細胞懸濁液を５０ｍＬプラスチック遠心管に回収し、遠心により細胞を沈殿させた後、上清を取り除き、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を加えて細胞を懸濁した。細胞を遠心により沈殿させ上清を取り除いた後、１ｘ１０７ 細胞／ｍＬの密度になるようにＯｐｔｉ−ＭＥＭを加えて細胞懸濁液を調整した。この細胞懸濁液１００ μLを１．５ｍLチューブに分注し、レポーターベクター（ｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬ−ＣＭＶＬＬＴ、またはｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬＬＴ−ＣＭＶＬ）を５．０μｇ加えた後、エレクトロポレーター（ＣＵＹ ＥＤＩＴ ＩＩ、Ｂｅｘ）とキュベット電極（２ ｍｍ幅、Ｂｅｘ）を用いてエレクトロポレーションを行った。培地１ｍＬを加えて穏やかに混合した後、キュベット電極を５％ＣＯ２インキュベータ内に静置した。５分後、インキュベータからキュベット電極を取り出し、あらかじめ培地を加えた２４ウェルプレートに細胞懸濁液を移して、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。
【０１５８】
（ｃ）レポータージーンアッセイ
エレクトロポレーションから７２時間後に、［例１］（３）の方法でレポータージーンアッセイをおこない、相対レポーター活性（ＲＬＵ）を算出した。結果を、図１２に示した。
【０１５９】
ｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬ−ＣＭＶＬＬＴを導入した場合、全ての悪性腫瘍細胞株が、正常乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の２０倍以上のＲＬＵを示した。また、良性腫瘍細胞株ＭＣＦ１０Ａと悪性腫瘍細胞株のＲＬＵと比較しても、全ての悪性乳癌細胞でＭＣＦ１０Ａよりも高いＲＬＵを示した。これに対して、ｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬＬＴ−ＣＭＶＬを導入した場合は、ｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬ−ＣＭＶＬＬＴよりも低いＲＬＵを示した。また、同レポーターベクターでは、２種類の悪性乳癌細胞が、ＨＭＥＣと同程度のＲＬＵを示し、３種類の悪性乳癌でＭＣＦ１０Ａと同程度、もしくは低いＲＬＵを示した。この結果から、ＣＭＶプロモーターを含む構成的な活性を示すレポーター配列を含むレポーター遺伝子発現ユニットにＩＲＥＳ配列::複製開始蛋白質遺伝子を挿入したｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬ−ＣＭＶＬＬＴの方が、信号の値が高く、より精度の良い腫瘍の悪性度評価用のレポーターベクター構造として適していることが明らかとなった。
【０１６０】
例４．ｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬ−ＣＭＶＬＬＴ導入乳癌細胞株の発光顕微鏡検出
Ｔ−４７ＤとＨＭＥＣを１：１、或いは１：３で混合した。このような混合細胞に対して、エレクトロポレーションにより、ｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬ−ＣＭＶＬＬＴを導入した後、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。７２時間後、発光イメージングシステムは、ＬｕｍｉｎｏＶｉｅｗ（ＬＶ２００、オリンパス）を使用して、発光細胞の写真を撮影した。結果を、図１３に示した。この結果、ｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬ−ＣＭＶＬＬＴが導入されたＴ−４７Ｄの９７％で細胞発光が観察された。この結果から、ｐＡｍｐ−ＮａｍＮＬ−ＣＭＶＬＬＴで悪性乳腺腫瘍細胞株の評価が可能であることが示された。
【０１６１】
以上の実験から、実施形態の自己複製型デュアルレポーターベクターは、より精度のよい被検細胞の細胞特性の評価に適していることが明らかとなった。
【０１６２】
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
以下に、本願出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
被検細胞の細胞特性を評価するためのレポーターベクターであって、
（１）細胞特性マーカーのプロモーター配列と、その下流に存在する第１のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第１の転写終結配列とを含む第１のレポーター遺伝子発現ユニット、
（２）構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第２のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第２の転写終結配列とを含む第２のレポーター遺伝子発現ユニット、および
（３）前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含むレポーターベクター。
［２］
前記第１のレポーター遺伝子は、前記細胞特性マーカーのプロモーター配列の活性化によって発現し、前記第２のレポーター遺伝子および前記複製開始蛋白質遺伝子は、前記構成的な活性を示すプロモーター配列の活性化によって発現する［１］に記載のレポーターベクター。
［３］
前記細胞特性マーカーのプロモーター配列が、ＮＡＭＰＴ遺伝子のプロモーターである［１］または［２］に記載のレポーターベクター。
［４］
前記第１のレポーター遺伝子から生ずる信号と、前記第２のレポーター遺伝子から生ずる信号とが、互いに識別可能に異なる［１］〜［３］の何れか１つに記載のレポーターベクター。
［５］
前記第１のレポーター遺伝子および前記第２のレポーター遺伝子が、それぞれ青色蛍光蛋白質遺伝子、緑色蛍光蛋白質遺伝子、赤色蛍光蛋白質遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、一酸化窒素合成酵素遺伝子、キサンチンオキシダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、または重金属結合蛋白質遺伝子の少なくとも一種である［４］に記載のレポーターベクター。
［６］
前記第１の転写終結配列および前記第２の転写終結配列が、ポリ（Ａ）配列を含む配列である［１］〜［５］の何れか１つに記載のレポーターベクター。
［７］
前記第１の転写終結配列および前記第２の転写終結配列が、ポリ（Ａ）付加シグナル配列である［６］に記載のレポーターベクター。
［８］
前記第１の転写終結配列および前記第２の転写終結配列が、シミアン・ウイルス４０のポリ（Ａ）付加シグナル配列、ウシ成長ホルモン遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナル配列、および人工合成されたポリ（Ａ）付加シグナル配列の少なくとも一種である［７］に記載のレポーターベクター。
［９］
前記構成的な活性を示すプロモーター配列が、サイトメガロウイルスプロモーター、またはヒト・ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼプロモーターの少なくとも一種である［１〜８］の何れか１つに記載のレポーターベクター。
［１０］
前記バイシストロニック発現用配列が、ＩＲＥＳ配列である［１］〜［９］の何れか１つに記載のレポーターベクター。
［１１］
前記ＩＲＥＳ配列が、脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ配列である［１０］に記載のレポーターベクター。
［１２］
前記複製開始蛋白質遺伝子が、シミアン・ウイルス４０の野性型ラージＴ抗原遺伝子、エプスタイン・バー・ウイルスのＥＢＮＡ−１遺伝子、またはマウス・ポリオーマ・ウイルスのラージＴ抗原遺伝子の少なくとも一種である［１］〜［１１］の何れか１つに記載のレポーターベクター。
［１３］
前記複製開始配列が、シミアン・ウイルス４０、エプスタイン・バー・ウイルス、またはマウス・ポリオーマ・ウイルスの複製開始配列の少なくとも一種である［１］〜［１２］の何れか１つに記載のレポーターベクター。
［１４］
前記細胞特性マーカーのプロモーター配列が配列番号１に記載の塩基配列を含む塩基配列であり、前記第１および第２の転写終結配列が、それぞれポリ（Ａ）付加シグナル配列を含む塩基配列であり、前記バイシストロニック発現用配列が、配列番号７に記載の配列を含む塩基配列であり、前記複製開始蛋白質遺伝子が、配列番号８、９または１０に記載の配列を含む塩基配列であり、前記複製開始配列が、配列番号１１に記載の配列を含む塩基配列である［１］に記載のレポーターベクター。
［１５］
レポーターベクターおよび前記レポーターベクターを担持するキャリアを含む被検細胞の細胞特性を評価するためのアッセイキットであって、
前記レポーターベクターが、
（１）細胞特性マーカーのプロモーター配列と、その下流に存在する第１のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第１の転写終結配列とを含む第１のレポーター遺伝子発現ユニット、
（２）構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第２のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第２の転写終結配列とを含む第２のレポーター遺伝子発現ユニット、および
（３）前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含むアッセイキット。
［１６］
被検細胞の細胞特性を評価する方法であって、
（ａ）被検細胞に、レポーターベクターを導入すること、
（ｂ）レポーターベクターを複製ならびに第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子を発現させること、
（ｃ）第１のレポーター遺伝子からの第１の信号および第２のレポーター遺伝子からの第２の信号を検出すること、および
（ｄ）第１の信号および第２信号に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価することを含み、
前記レポーターベクターが、
（１）細胞特性マーカーのプロモーター配列と、その下流に存在する第１のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第１の転写終結配列とを含む第１のレポーター遺伝子発現ユニット、
（２）構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する第２のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第２の転写終結配列とを含む第２のレポーター遺伝子発現ユニット、および
（３）前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含む方法。
［１７］
前記被検細胞が、上皮性腫瘍、非上皮性腫瘍、造血組織性腫瘍、胎児性腫瘍またはこれらの何れかの組み合わせである［１６］に記載の方法。
［１８］
被検細胞の細胞特性を評価するための装置であって、
レポーターベクターを被検細胞に導入するための遺伝子導入部、
前記ベクター導入部で得られた前記被検細胞を含む試料を受け取り、所望の時間に亘り前記被検細胞を培養するための恒温部、
前記恒温部から前記試料を受け取り、前記試料に含まれる前記被検細胞の第１のレポーター遺伝子および第２のレポーター遺伝子から生ずる信号を検出する検出部、および
前記検出の結果に基づいて前記被検細胞の細胞特性を評価する評価部
を具備し、
前記レポーターベクターが、
（１）細胞特性マーカーのプロモーター配列と、その下流に存在する前記第１のレポーター遺伝子と、その下流に存在する第１の転写終結配列とを含む第１のレポーター遺伝子発現ユニット、
（２）構成的な活性を示すプロモーター配列と、その下流に存在する前記第２のレポーター遺伝子と、その下流に存在するバイシストロニック発現用配列と、その下流に存在する複製開始蛋白質遺伝子と、その下流に存在する第２の転写終結配列とを含む第２のレポーター遺伝子発現ユニット、および
（３）前記複製開始蛋白質遺伝子から合成される複製開始蛋白質と結合し、それによって前記レポーターベクターの複製が開始される複製開始配列
を含む装置。
【符号の説明】
【０１６３】
１…自己複製型デュアルレポーターベクター
１０…細胞特性マーカーのプロモーター配列    １１…第１のレポーター遺伝子
１２…第１の転写終結配列    １３…第１のレポーター遺伝子発現ユニット
２０…構成的な活性を示すプロモーター配列    ２１…第２のレポーター遺伝子
２２…バイシストロニック発現用配列    ２３…複製開始蛋白質遺伝子
２４…第２の転写終結配列    ３０…複製開始配列  
５０…細胞特性評価装置    ５１…細胞分離ユニット    ５２…ＤＮＡ導入ユニット
５３…測定ユニット    ５４…ステージ    ５５…分離器    ５６…受容器
５７…分離部    ５８…容器    ５９…被検細胞    ６０…制御部
６１…導入プローブ    ６２…暗箱    ６３…光源    ６４…表示部    ６５…制御部
６６…記憶部    ６７…対物レンズ    ６８…撮像部。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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