(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部と、
前記細胞培養部の上部に配置された培地供給手段と、
前記細胞培養部の下部に配置された培地回収手段と、
を備え、
ここで、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記細胞培養部が、１以上の培地排出口を有する底部と、前記底部に略垂直に配置された側部とを備えた、
細胞培養装置であって、
ここで前記培地供給手段が液滴化培地供給手段である、又はここで前記培地供給手段が、培地貯留部と、前記培地貯留部の底部に設けられた２以上の培地滴下ノズルとを有するものであり、
ここで前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、
細胞培養装置。
【請求項２】
２以上の前記細胞培養部が積層された、請求項１に記載の細胞培養装置。
【請求項３】
前記側部が、さらに、１以上の培地供給口を有する、請求項１又は２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記培地回収手段と一端部で連通した培地排出ラインと、
前記培地排出ラインの他端部と連通した培地貯槽と、
前記培地貯槽と一端部で連通した培地供給ラインと、
をさらに備え、
ここで、前記培地供給ラインの他端部が、前記培地供給手段と連通されており、培地が循環することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項５】
さらに、前記培地貯槽内の培地を前記培地供給手段へ汲み上げるポンプを備えた、請求項４に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記培地回収手段が、漏斗状である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記細胞培養部を収容する外筒をさらに備え、
ここで、前記培地供給手段が、前記外筒内であって、かつ、前記細胞培養部の上部に配置され、
ここで、前記培地回収手段が、前記外筒内であって、かつ、前記細胞培養部の下部に配置されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれて、
ｉｉ）ロール状に巻き込まれて、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結されて、
ｉｖ）縄状に結まれて、及び／又は
ｖ）２以上が積層されて、
前記細胞培養部に収容されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものであって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、前記細胞培養部に収容されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１０】
前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。
【請求項１７】
ポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部と、
前記細胞培養部の上部に配置された培地供給手段と、
前記細胞培養部の下部に配置された培地回収手段と、
を備え、
ここで、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記培地回収手段が、前記細胞培養部を収容する外筒の一部である、
細胞培養装置であって、
ここで前記培地供給手段が、液滴化培地供給手段であり、
ここで前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、細胞培養装置。
【請求項１８】
前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものであって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、前記細胞培養部に載置されている、請求項１７に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置に関する。また、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を使用した細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、治療やワクチンに用いられる酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ウイルス（ウイルスタンパク質）等のタンパク質が培養細胞を用いて工業的に産生されている。しかし、こうしたタンパク質の生産技術はコストが高く、それが医療費を引き上げていた。そのため、大幅なコスト削減を目指して、高密度に細胞を培養する技術や、タンパク質の産生量を増大させるような革新的な技術が求められていた。【０００３】
タンパク質を産生させる細胞として、培養基材に接着する足場依存性の接着細胞が用いられることがある。こうした細胞は、足場依存的に増殖するため、シャーレ、プレート又はチャンバーの表面に接着させて培養する必要がある。従来、こうした接着細胞を大量に培養するためには、接着するための表面積を大きくする必要があった。ところが、培養面積を大きくするには、空間を必然的に増大させる必要があり、それがコストを増大させる要因となっていた。【０００４】
培養空間を小さくしつつ、接着細胞を大量に培養する方法として、微小多孔を有する担体、特に、マイクロキャリアを用いた培養法が開発されている（例えば、特許文献１）。マイクロキャリアを用いた細胞培養系は、マイクロキャリアが互いに凝集しないようにするために十分に攪拌・拡散される必要がある。そのため、マイクロキャリアを分散させた培地を十分に攪拌・拡散することができるだけの容積が必要となるため、培養できる細胞の密度には上限がある。また、マイクロキャリアと培地とを分離するためには、細かな粒子を分別できるフィルターで分離させる必要があり、それがコストを増大させる原因ともなっていた。こうした状況から、高密度の細胞を培養する革新的な細胞培養の方法論が希求されていた。【０００５】
＜ポリイミド多孔質膜＞
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献２〜４は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。【０００６】
細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０５４１７４号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０３８８７３号
【特許文献３】特開２０１１−２１９５８５号公報
【特許文献４】特開２０１１−２１９５８６号公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／０１２４１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を提供することを目的とする。また、本発明は、ポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置を使用した細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、所定の構造を有するポリマー多孔質膜が、細胞を大量に培養可能な最適な空間を提供するのみならず、乾燥に強い湿潤環境を提供することを見出し、細胞を気相暴露して培養する装置及びそれを使用する培養方法を完成させた。すなわち、限定されるわけではないが、本発明は好ましくは以下の態様を含む。【００１０】
［１］  ポリマー多孔質膜と、前記ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部と、前記細胞培養部の上部に配置された培地供給手段と、前記細胞培養部の下部に配置された培地回収手段と、を備え、
ここで、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記細胞培養部が、１以上の培地排出口を有する底部と、前記底部に略垂直に配置された側部とを有する、細胞培養装置。
［２］  ２以上の前記細胞培養部が積層された、［１］に記載の細胞培養装置。
［３］  前記側部が、さらに、１以上の培地供給口を有する、［１］又は［２］に記載の細胞培養装置。
［４］  前記培地回収手段と培地排出ラインで連通した培地排出ラインと、前記培地排出ラインの他端部と連通した培地貯槽と、前記培地貯槽と一端部で連通した培地供給ラインと、をさらに備え、
ここで、前記培地供給ラインの他端部が、前記培地供給手段と連通されており、培地が循環することを特徴とする、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［５］  さらに、前記培地貯槽内の培地を前記培地供給手段へ汲み上げるポンプを備えた、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［６］  前記培地回収手段が、漏斗状である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［７］  前記培地供給手段が、培地貯留部と、前記培地貯留部の底部に設けられた２以上の培地滴下ノズルとを有する、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［８］  前記培地供給手段が、液滴化培地供給手段である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［９］  前記細胞培養部を収容する外筒をさらに備え、
ここで、前記培地供給手段が、前記外筒内であって、かつ、前記細胞培養部の上部に配置され、
ここで、前記培地回収手段が、前記外筒内であって、かつ、前記細胞培養部の下部に配置されている、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１０］  前記ポリマー多孔質膜が、
ｉ）折り畳まれて、
ｉｉ）ロール状に巻き込まれて、
ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結されて、
ｉｖ）縄状に結まれて、及び／又は
ｖ）２以上が積層されて、
前記細胞培養部に収容されている、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１１］  前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものであって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、前記細胞培養部に収容されている、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１２］  前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１３］  前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１４］  前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１５］  前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１６］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、［１］〜［１５］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
［１７］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１６］に記載の細胞培養装置。
［１８］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１６］又は［１７］に記載の細胞培養装置。
［１９］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、［１］〜［１５］のいずれか１項に記載の細胞培養装置。【００１１】
［２０］  ［１］〜［１９］のいずれか１項に記載の細胞培養装置を使用する、細胞の培養方法。【００１２】
［２１］  ポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部と、
前記細胞培養部の上部に配置された培地供給手段と、
前記細胞培養部の下部に配置された培地回収手段と、
を備え、
ここで、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記培地回収手段が、前記細胞培養部を収容する外筒の一部である、
細胞培養装置。
［２２］  前記培地供給手段が、液滴化培地供給手段である、［２１］に記載の細胞培養装置。
［２３］  前記ポリマー多孔質膜が、ケーシングを備えたモジュール化ポリマー多孔質膜であって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ケーシング内に収容されたものであって、
ここで、前記モジュール化ポリマー多孔質膜が、前記細胞培養部に載置されている、［２１］又は［２２］に記載の細胞培養装置。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、細胞培養担体としてポリマー多孔質膜を用いることにより、培養スペースを削減可能である。また、本発明の細胞培養装置を採用することにより、培地の量が少ない条件下でも、簡便かつ効率的な細胞培養を可能とする。さらに、本発明で使用されるポリマー多孔質膜は微親水性の多孔質特性を有し、ポリマー多孔質膜内に安定的に液を保持することができるため、乾燥に強い湿潤環境を提供する。そのため、従来の細胞培養装置と比較しても極めて少量の培地でも、細胞の生存及び増殖を達成することができる。さらにまた、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても培養が可能であり、細胞に対して効率的に酸素を供給することが可能であり、大量の細胞の培養に適している。【００１４】
本発明の細胞培養装置を採用すれば、用いる培地の量を極めて少なくすることができる。また、本発明の細胞培養装置に使用されるポリマー多孔質膜は、気相中に露出させながら培養可能であるため、ポリマー多孔質膜に担持された細胞への酸素供給は拡散によって十分に行われる。したがって、本発明の細胞培養装置は、別途酸素供給手段を必要としない。さらにまた、本発明の細胞培養装置は、任意の方向から液滴化した培地をポリマー多孔質膜へ供給するための供給手段を有しているため、ポリマー多孔膜や細胞培養モジュールの任意の部位に存在する細胞に対し均質な培地を供給する事ができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施形態における細胞培養部を示す図である。上は平面図、下は側面図を示す。
【図２】図２は、実施形態における細胞培養装置の構成例を示す断面図である。
【図３】図３は、実施形態における培地供給手段を示す図である。（Ａ）平面図、（Ｂ）断面図、（Ｃ）斜視図。
【図４】図４は、実施形態における細胞培養装置の構成例を示す斜視図である。
【図５】図５は、実施形態における細胞培養装置の構成例を示す断面図である。
【図６】図６は、ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を示す。
【図７】図７は、一実施形態における細胞培養装置の構成例を示す図である。
【図８】図８は、一実施形態の細胞培養装置における、液滴化培地供給手段から滴下される培地の様式を示す概念図である。（Ａ）ドロップ型、（Ｂ）メッシュ型、（Ｃ）シャワー型を示す。（Ｄ）ドロップ型及びメッシュ型の液滴を供給するために使用される、外筒蓋体の構成を示す図である。外筒蓋体の培地供給口には、ステンレス鋼製のメッシュを巻いて形成したメッシュ束が挿入される。
【図９】図９は、一実施形態における細胞培養装置の構成例を示す図である。（Ａ）細胞培養装置の概要図、（Ｂ）実際の細胞培養装置の外観を示す写真である。
【図１０】図１０は、一実施形態における細胞培養装置に適用されるモジュール化ポリマー多孔質膜を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例６において示される、一実施態様の本発明の細胞培養装置を使用した場合の、ヒト皮膚線維芽細胞から産生されるフィブロネクチンの量を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について、必要に応じて図面を参照しながら説明する。実施形態の構成は例示であり、本発明の構成は、実施形態の具体的構成に限定されない。
【００１７】
１．ポリマー多孔質膜
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１〜１５０μｍ、０．０１〜１００μｍ、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜１５μｍである。
【００１８】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、２０μｍ〜１００μｍである。
【００１９】
ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
【数１】
0006777149.tif 000002
（式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）
【００２０】
表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。
【００２１】
ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
【００２２】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。
【００２３】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
【００２４】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
【００２５】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
【数２】
0006777149.tif 000003
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
【００２６】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
【００２７】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
【００２８】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である。
【００２９】
１−１．ポリイミド多孔質膜
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
【００３０】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
【００３１】
一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００３２】
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
【００３３】
ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
【００３４】
ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
【００３５】
本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
【００３６】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
【００３７】
着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
【００３８】
炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。
【００３９】
また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００４０】
着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
【００４１】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００４２】
これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
【００４３】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
【００４４】
これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
【００４５】
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
【００４６】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
【００４７】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
【００４８】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
【００４９】
例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１−２１９５８５号公報、又は特開２０１１−２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
【００５０】
１−２．ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
【００５１】
アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
【００５２】
二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
【００５３】
ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
【００５４】
ポリエーテルスルホンの対数粘度は、多孔質ポリエーテルスルホン膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
【００５５】
また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
【００５６】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
【００５７】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
【００５８】
本発明の細胞培養装置に用いられる、細胞培養担体としての上述のポリマー多孔質膜は、微親水性の多孔質特性を有するため、ポリマー多孔質膜内に安定した液保持がなされ、乾燥にも強い湿潤環境が保たれる。そのため、従来の細胞培養担体を用いる細胞培養装置と比較して、極めて少量の培地でも細胞の生存及び増殖を達成することができる。また、ポリマー多孔質膜の一部又はすべてが空気に露出した状態であっても培養が可能であるため、細胞に対して効率的な酸素供給を行うことができ、大量の細胞を培養することができる。
【００５９】
本発明によれば、用いる培地の量が極めて少なく、また、培養担体であるポリマー多孔質膜を気相に露出することができるため、細胞への酸素供給は拡散によって十分に行われる。したがって、本発明では特に酸素供給装置を必要としない。
【００６０】
２．細胞培養装置
【００６１】
本発明の一態様は、
ポリマー多孔質膜と、前記ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部と、前記細胞培養部の上部に配置された培地供給手段と、前記細胞培養部の下部に配置された培地回収手段と、を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
ここで、前記細胞培養部が、１以上の培地排出口を有する底部と、前記底部に略垂直に配置された側部とを有する、細胞培養装置に関する。該細胞培養装置を、以下で、「本発明の細胞培養装置」とも呼ぶ。以下に本発明の細胞培養装置の実施態様について、図を示しながら説明する。
【００６２】
図１は、本発明の細胞培養装置を構成する細胞培養部２を示す図である。細胞培養部２は、上述のポリマー多孔質膜を載置するための底部２２と、底部２２に略垂直に配置された側部２１とを有している。底部２２には、後述する培地供給手段３から滴下された培地を排出するための培地排出口２３を１以上備えている。培地排出口２３の形状や数は、ポリマー多孔質膜が脱落せず、かつ、培地を下段の細胞培養部２又は培地回収手段４（後述）へ排出する機能を有していれば特に限定されない。本実施例においては、スリット状に培地排出口２３を設けている。細胞培養部２の側面方向から培地が供給されるように、側部２１はさらに培地供給口２６を１以上備えていてもよい。培地供給口２６の位置、大きさは、目的に応じて適宜設計を変更してもよい。本実施形態においては、細胞培養部２の外観は円筒形であったが、これに限定されず、例えば、三角柱形、角柱形など、任意の形態であってもよい。ただし、後述するように、細胞培養部２は積層して使用することがあるため、細胞培養部２の上面と下面（底部２２）の形状が同一かつ平行であることが好ましい。
【００６３】
本明細書において、「培地」とは、細胞、特に動物細胞を培養するための細胞培養培地のことを指す。培地は、細胞培養液と同義の意味として用いられる。そのため、本発明において用いられる培地とは、液体培地のことを指す。培地の種類は、通常使用される培地を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定される。
【００６４】
図２は、本発明の細胞培養装置の構成例を示す図である。細胞培養部２が５段積層されており、最上段の細胞培養部２には、蓋部２７が載置される。蓋部２７には、底部２２に設けられた培地排出口２３と同様、複数の培地排出口２７１（図４参照）がスリット状に設けられている。培地排出口２７１の形状や数は、培地を下段の細胞培養部２へ排出する機能を有していれば特に限定されない。
【００６５】
各段の細胞培養部２には、上述のポリマー多孔質膜が収容される。積層された細胞培養部２の最下段は、外筒５の内部に設けられたストッパー５１上に載せられる。本実施態様において、外筒５は、積層した細胞培養部２を収容する円筒形部分と、細胞培養部２の各段を滴下してきた培地を回収するための漏斗形状の培地回収手段４とから形成されている。本実施態様では、外筒５の一部に培地回収手段４が含まれている。培地回収手段４は、上部から滴下した培地を回収可能な形状であれば限定されないが、効率的に培地を集約する観点から、漏斗状であることが好ましい。外筒５の形状は、上述の細胞培養部２の形状に応じて適宜変更することが可能である。最上段の細胞培養部２の上部には、培地供給手段３が配置される。細胞培養部２に設けられた固定具挿入口２４と、培地供給手段３に設けられた固定具挿入口３４の位置が垂直になるように合わせ、固定具挿入口３４側から固定具６１を挿入することで、培地供給手段３及び細胞培養部２が適切な位置に配置される。
【００６６】
図３は、培地供給手段３を示す図である。図３に示す培地供給手段３は、側部３１と底部３２とから形成された細胞の培地貯留部３０を備えている。底部３２には複数の培地滴下孔３５を備えており、培地滴下孔３５は、中心に向かってテーパ状になっている。また、底部３２において、培地貯留部３０の反対側（外側）には、培地滴下孔３５と連通した培地滴下ノズル３３を形成する。培地滴下ノズル３３の中心には、該培地滴下孔３５と連通したノズル孔３３０を有している。培地貯留部３０に貯留された培地は、培地滴下孔３５を通り、培地滴下ノズル３３のノズル孔３３０を通って、所定量が滴下される。培地滴下孔３５の径及びテーパ形状の角度、培地滴下ノズル３３の先端の形状、ノズル孔３３０の径等を適宜調整することで、ノズル孔３３０から滴下される培地の量、滴下速度を調節可能である。底部３２において、培地滴下孔３５は、円の中心から同心円状に等間隔に配置されている。これにより、培地が、培地滴下ノズル３３から同等に滴下される。
【００６７】
培地供給手段３の側部３１の任意の位置にオーバーフロー管３６が設けられている。オーバーフロー管３６によって、培地貯留部３０から培地があふれ出し、側部３１を伝って培地が流れ出ることを防止する。オーバーフロー管３６の位置により、培地貯留部３０に収容する培地の量が決定される。脚部３７は、底部３２の培地滴下ノズル３３と同じ側に設けられ、その長さは、培地滴下ノズル３３より長い。脚部３７の長さを調節することにより、細胞培養部２に供給される培地の位置を決定することが可能である。同一の長さの脚部３７が少なくとも３つ設けられ、それによって、細胞培養部２の上部に培地供給手段３を設置することができる。脚部３７は設けられなくてもよく、例えば、脚部３７が設けられていない場合は、外筒５の上部に、例えば、嵌合されて設置されてもよい。
【００６８】
図４は、本発明の細胞培養装置１の構成例を示す斜視図であり、図２の構成例から、細胞培養部２及び培地供給手段３を垂直方向にそれぞれ独立させた状態を示している。本実施態様では、細胞培養部２ａの底部２２ａに平行に設けられたスリット状の培地排出口２３ａに対し、一段下の細胞培養部２ｂの底部２２ｂに平行に設けられたスリット状の培地排出口２３ｂが、反時計回りに３０度回転した位置に設けられている。培地排出口２３ｃ〜２３ｅも同様に上段と下段で３０度ずつ回転した位置に培地排出口２３が設けられている。これにより、培地が、複数積層した細胞培養部の上段から下段へ効率的に滴下される。
【００６９】
図５は、本発明の細胞培養装置１のさらなる構成例を示す図である。外筒５の一部である培地回収手段４は漏斗状であり、滴下した培地が培地排出部４１へ集約される。培地排出部４１には培地排出ライン７２の一端部と連通し、培地排出ライン７２の他端部は、培地貯槽７と連通している。培地貯槽７は、さらに、培地供給ライン７３の一端部と連通しており、培地供給ライン７３の他端部は培地供給手段３と連通している。これにより、培地貯槽７は、細胞培養装置１から排出された培地が貯留され、貯留された培地が再び細胞培養装置１内に供給され、培地が循環させる。培地を循環させることで、ポリマー多孔質膜に担持された細胞によって産生されるタンパク質の濃度が高くなり、タンパク質回収効率を上げることが可能となる。培地貯槽７内に排出される培地７１を定期的に交換することで、新鮮な培地を供給することも可能である。ここでは図示しないが、別途新鮮な培地を供給する培地貯槽が設けられてもよい。この場合、培地貯槽７は使用済みの培地のみを貯留し、培地貯槽から培地供給ライン７３を介して細胞供給手段３へ新鮮な培地が供給される。培地供給ライン７３の途中には、培地を汲み上げるためのポンプ８を備える。ポンプ８の種類は、特に限定されないが、例えばペリスタポンプ等が使用可能である。
【００７０】
本発明の別の実施形態において、培地供給手段３は、培地を液滴化培地として供給する液滴化培地供給手段であってもよい（例えば、図７の液滴化培地供給手段３’）。本明細書において、「液滴化培地」とは、ミスト状化又は水滴化された培地をいい、本発明に用いられるポリマー多孔質膜に噴射又は噴霧可能な状態の培地をいう（例えば、図８（Ｃ））。液滴化培地の径は限定されないが、例えば、重力によって自由落下せず、空気中に浮遊可能な程度に小さいミスト状の液滴化培地であってもよい。ミスト状の液滴化培地の径は、例えば、１μｍ〜１００μｍ程度であってもよく、さらに小さい径であってもよい。また、液滴化培地は、例えば、重力によって自由落下する水滴状の培地であってもよく、例えば、１００μｍ以上であってもよい。培地を液滴化する方法については、公知の手段により液滴化する方法を用いればよく、例えば、ミスト状ノズルやシャワーノズル等を用いて液滴化させればよい。ただし、液滴化方法は、培地の成分を変化させない方法によって液滴化されなければならず、例えば、液滴化させる方法からは、蒸発させる方法は除かれる。
【００７１】
本発明の実施態様において、液滴化培地は、細胞を担持したポリマー多孔質膜に供給される。液滴化した培地は、ポリマー多孔質膜へ到達するまでの間に気相を通過し、培地中に酸素が溶け込むことになる。これにより、十分な量の酸素を有する培地が、継続的に供給されることとなり、細胞が虚血に陥ることなく、培養することが可能となる。また、ポリマー多孔質膜が常に気相に暴露されているため、ポリマー多孔質膜に付着している培地も常に酸素を取り込むことが可能となり、酸素を効率的に供給できる培養が可能となる。
【００７２】
液滴化培地供給手段は、細胞培養部２の上部に配置されてもよく、細胞培養部２の側面側に配置されてもよく、細胞培養部２の下部に配置されてもよく、複数設けられても良い。本発明の実施形態において、液滴化培地供給手段は、密閉された外筒５内に設けられてもよい。これにより、外筒５の内部で、ミスト状の培地が充満し、細胞が担持されたポリマー多孔質膜に一様に培地が供給されることとなる。
【００７３】
本発明の他の実施態様は、
ポリマー多孔質膜と、
前記ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部と、
前記細胞培養部の上部に配置された培地供給手段と、
前記細胞培養部の下部に配置された培地回収手段と、
を備え、
ここで、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記培地回収手段が、前記細胞培養部を収容する外筒の一部である、
細胞培養装置に関する。
【００７４】
図７（Ａ）に示すように、一実施態様の細胞培養装置１’において、培地回収手段４’は外筒５’の一部であり、滴下した培地が培地排出部４１’へ集約される。また、外筒５’の内部には、ポリマー多孔質膜９を載置し、外筒５’の内部に収容するための細胞培養部２’が設けられている。細胞培養部２’は、液滴化培地供給手段３’から滴下された培地を排出するための培地排出口を１以上備えている。培地排出口の形状や数は、ポリマー多孔質膜が脱落せず、培地回収手段４’へ排出する機能を有していれば特に限定されず、例えば、スリット状、メッシュ状、小孔の培地排出口が設けている。
【００７５】
図７（Ｂ）に示すように、他の実施形態の細胞培養装置１’ａにおいて、培地回収手段４’は、細胞培養部２’の機能を兼ねた、細胞培養部兼培地回収手段４’ａであってもよい。この場合、ポリマー多孔質膜９は、直接、細胞培養部兼培地回収手段４’ａの上に載置することができる。細胞培養部兼培地回収手段４’ａの上には、後述のモジュール化ポリマー多孔質膜９０を載置することが好ましい。モジュール化ポリマー多孔質膜を用いることにより、細胞培養部兼培地回収手段４’ａ上に、容易に任意の数のモジュール化ポリマー多孔質膜を収容することができる。
【００７６】
液滴化培地供給手段３’からは、例えば、図８（Ａ）のようにドロップ型、及び図８（Ｃ）のようにシャワー型の液滴３３１が供給される。液滴３３１の形状は、液滴化培地供給手段３’として公知のノズルを適宜選択することによって変更することができる。また、図８（Ｂ）のように、液滴化培地供給手段３’ａから放出された液滴３３１を、さらに液滴メッシュ３０’に適用することにより、液滴をポリマー多孔質膜全体に均質に供給することができる。液滴メッシュ３０’は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製のメッシュを用いることができるが、これに限定されない。他の実施態様において、液滴メッシュ３０’は、例えば、図９（Ａ）のように、液滴化培地供給手段３’の下部に設けることができる。また、他の実施形態においては、図９（Ｂ）のように、ポリマー多孔質膜及び／又はモジュール化ポリマー多孔質膜の間にも液滴メッシュ３０’を用いることにより、多段化してもよい。液滴メッシュ３０’のメッシュ構造は、液滴の培地が適用された場合に、培地の表面張力によって液滴メッシュ３０’全体に拡散して、液滴メッシュ３０’の下面側に培地を供給できる程度の目開きを有していればよい。液滴化培地供給手段３’の一実施態様としては、例えば、ステンレス鋼製のメッシュを巻いて形成したメッシュ束３１’を用いてもよい。図８（Ｄ）に示すように、メッシュ束３１’は、外筒蓋部５２の内面側に設けられた蓋部培地供給口５２ａに挿入されている。これにより、培地が外筒の内壁を伝うことなく、直接ポリマー多孔質膜へ培地を滴下させることができる。また、外筒と外筒蓋部との嵌合部分からのコンタミネーションも防止することができる。本実施態様では、ステンレス鋼製のメッシュ束３１’を用いているが、培地が外筒の内壁を伝うことなく、直接ポリマー多孔質膜へ培地を滴下させる機能を発揮する構成であれば、これに限定されない。また、メッシュ束３１’は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製のメッシュを用いることができるが、これに限定されない。
【００７７】
本発明の実施形態で使用されるポリマー多孔質膜は、例えば、ｉ）折り畳んで、ｉｉ）ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ）シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、及び／又は、ｉｖ）縄状に結んで、細胞培養部２の底部２２上に適用されてもよい。また、本発明の実施形態で使用されるポリマー多孔質膜は、ｖ）２以上が積層されて、細胞培養部２の底部２２上に適用されてもよい。ｉ）〜ｖ）のように形状を加工することにより、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリマー多孔質膜を入れることができる。
【００７８】
本発明の実施態様で使用されるポリマー多孔質膜は、モジュール化されたポリマー多孔質膜（以下、「モジュール化ポリマー多孔質膜」という。）が使用されてもよい。本明細書において「モジュール化ポリマー多孔質膜」とは、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜をいう。本明細書において、「モジュール化ポリマー多孔質膜」との記載は、単に「モジュール」と記載することができ、相互に変更しても同一のことを意味する。
【００７９】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜が備えるケーシングは、２以上の細胞培地流出入口を有し、該細胞培地流出入口によって培地がケーシングの内外へ流出入する。該ケーシングの細胞培地流出入口の径は、ケーシングの内部へ細胞が流入可能であるように、前記細胞の径よりも大きいことが好ましい。また、細胞培地流出入口の径が、該細胞培地流出入口よりポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さいことが好ましい。ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい径は、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜の形状、大きさによって適宜選択可能である。例えば、ポリマー多孔質膜がひも状である場合、該ポリマー多孔質膜の短辺の幅より小さく、該ポリマー多孔質膜が流出しない適度の径であれば特に限定されない。該細胞培地流出入口の数は、細胞培地がケーシング内外へ供給及び／又は排出されやすいように、出来るだけ多く設けられていることが好ましい。好ましくは、５以上、好ましくは１０以上、好ましくは２０以上、好ましくは５０以上、好ましくは１００以上である。細胞培地流出入口は、ケーシングの一部又は全部が、メッシュ状の構造を有していてもよい。また、該ケーシング自体がメッシュ状であってもよい。本発明において、メッシュ形状の構造とは、例えば、縦、横、及び／又は斜めの格子状の構造を有するものであって、各目開きが、流体が通過出来る程度に細胞培地流出入口を形成するものであるが、これに限定されない。例えば、図１０のような構造を有する。
【００８０】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜のケーシングは、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼などの金属などが挙げられるが、細胞の培養に影響を与えない素材であれば特に限定されない。
【００８１】
本発明の実施態様で使用されるモジュール化ポリマー多孔質膜は、
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
該ケーシング内に収容されたものであって、該モジュール化ポリマー多孔質膜を細胞培養部２へ適用することが可能である。
【００８２】
本明細書において、「ケーシング内に２以上の独立した該ポリマー多孔質膜が集約されて収容されている」とは、互いに独立した２以上のポリマー多孔性膜が、ケーシングで囲まれた一定空間内に集約されて収容されている状態を指す。本発明において、２以上の独立した該ポリマー多孔質膜は、該ポリマー多孔質膜の少なくとも１カ所と該ケーシング内の少なくとも１カ所とを任意の方法によって固定され、該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態に固定されたものであってもよい。また、２以上の独立したポリマー多孔質膜は、小片であってもよい。小片の形状は、例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形をとりうるが、好ましくは、ひも状、又は四角が好ましい。本発明において、小片の大きさは、任意の大きさをとりうるが、ひも状である場合、長さは任意の長さでよいが、幅は、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは３０ｍｍ以下がよく、より好ましくは１０ｍｍ以下がよい。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止される。本発明において、ポリマー多孔性膜の小片が四角である場合、略正方形であることがより好ましく、その一辺の長さは、ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態となるように、ケーシングの内壁に沿って、又は内壁の一辺の長さより短く（例えば、０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度短い）形成されたものであればよい。また、本発明において、ポリマー多孔性膜の小片が略正方形である場合、長さは任意の長さでよいが、例えば、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは５０ｍｍ以下がよく、より好ましくは３０ｍｍ以下がよく、さらにより好ましくは２０ｍｍ以下がよく、１０ｍｍ以下であってもよい。
【００８３】
本明細書において、「折り畳まれたポリマー多孔質膜」とは、該ケーシング内にて折り畳まれていることで、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔質膜である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、ポリマー多孔膜に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。
【００８４】
本明細書において、「ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜」とは、ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔性膜をいう。また、本発明おいて、縄状に編み込まれたポリマー多孔質膜とは、例えば短冊状の複数のポリマー多孔質膜を、任意の方法によって縄状に編み込み、ポリマー多孔質膜同士の摩擦力によって互いに動かない状態のポリマー多孔質膜をいう。（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が集約されたポリマー多孔質膜、（ｉｉ）折り畳まれたポリマー多孔質膜、（ｉｉｉ）ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜、及び（ｉｖ）縄状に結ばれたポリマー多孔質膜、が、組み合わせられてケーシング内に収容されていてもよい。
【００８５】
本明細書において、「該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態」とは、該モジュール化ポリマー多孔質膜を細胞培養培地中で培養する場合に、該ポリマー多孔質膜が継続的に形態変化しない状態になるようにケーシング内に収容されている状態をいう。換言すれば、該ポリマー多孔質膜自体が、流体によって、継続的に波打つ動きを行わないように抑制された状態である。ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態を保つため、ポリマー多孔質膜内で生育されている細胞にストレスが加えられることが防止され、細胞が死滅されることなく安定的に細胞が培養可能となる。
【００８６】
３．細胞培養装置を使用した細胞培養方法
【００８７】
＜細胞をポリマー多孔質膜へ適用する工程＞
本発明で使用される細胞のポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
【００８８】
（Ａ）細胞を前記ポリマー多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
（Ｂ）前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
（Ｃ）前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に細胞縣濁液を装填し、そして、
細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
【００８９】
（Ａ）の態様は、ポリマー多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリマー多孔質膜を細胞縣濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。
【００９０】
ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞はポリマー多孔質膜に接着する。ポリマー多孔質膜の表面に播種された細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。
【００９１】
（Ｂ）の態様において、ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に細胞縣濁液を載せる。ポリマー多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、細胞縣濁液を前記膜に吸い込ませることにより、細胞縣濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリマー多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の細胞縣濁液が装填された箇所に細胞が吸い込まれて播種される。
【００９２】
あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリマー多孔質膜に細胞縣濁液を装填してもよい。この場合、細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。
【００９３】
例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリマー多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリマー多孔質膜の全体において、細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。
【００９４】
（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、細胞縣濁液中の細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより細胞縣濁液中の細胞の濃度を濃縮する、細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。
【００９５】
（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。
【００９６】
限定されるわけではないが、好ましくは、ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。
【００９７】
態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。
【００９８】
【表１】
0006777149.tif 000004
【００９９】
さらに、本発明の方法において、細胞のポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある接着性細胞をポリマー多孔質膜と縣濁的に共存させることにより細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の方法において、細胞をポリマー多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、細胞及び１又はそれ以上の前記ポリマー多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリマー多孔質膜の性質から、細胞はポリマー多孔質膜に接着しうる。よって、生来浮遊培養に適さない細胞であっても、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、細胞は、ポリマー多孔質膜に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、細胞がポリマー多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。
【０１００】
上述した細胞のポリマー多孔質膜への適用は、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）〜（Ｃ）のうち、２つ以上の方法を組み合わせてポリマー多孔質膜に細胞を適用してもよい。細胞を担持させたポリマー多孔質膜を、上述の細胞培養装置１における、細胞培養部２へ適用して、培養することが可能である。
【０１０１】
その他、予め、ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部２に、懸濁された細胞が含まれる培地を、細胞供給手段３より滴下して播種してもよい。
【０１０２】
本明細書において、「懸濁された細胞」とは、例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素によって、接着細胞を強制的に浮遊させて培地中に懸濁して得られた細胞や、公知の馴化工程によって、培地中に浮遊培養可能となった接着細胞などを含んでいる。
【０１０３】
本発明に利用し得る細胞の種類は、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
【０１０４】
本発明に利用しうる動物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。
【０１０５】
本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第２００９／１２３３４９号（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
【０１０６】
「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。
【０１０７】
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
【０１０８】
「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。
【０１０９】
細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ−６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）、ＢＨＫ細胞（新生児ハムスター腎臓細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。
【０１１０】
本明細書において、「接着細胞」とは、一般に、増殖のために適切な表面に自身を接着させる必要がある細胞であって、付着細胞又は足場依存性細胞ともいわれる。本発明のいくつかの実施形態では、使用する細胞は接着細胞である。本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、より好ましくは、培地中に懸濁した状態でも培養可能な細胞である。懸濁培養可能な接着細胞とは、公知の方法によって、接着細胞を懸濁培養に適した状態へ馴化させることによって得ることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などや、これらの細胞から派生して得られた細胞株が挙げられる。
【０１１１】
ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図１に示す。図１は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の細胞の培養方法では、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の細胞の培養方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。例えば、ポリマー多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。
【０１１２】
本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。そして、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。
【０１１３】
本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
【０１１４】
つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。
【０１１５】
本発明の細胞の培養方法において、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、５．０×１０8個以上、１．０×１０9個以上、２．０×１０9個以上、または５．０×１０9個以上となるまで培養することをいう。
【０１１６】
なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数を、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、ＣＣＫ８を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ  Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１〜３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。
【０１１７】
また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０5個以上、２．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、または５．０×１０8個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。
【実施例】
【０１１８】
以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１１９】
以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は６μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４６μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７３％であった。【０１２０】
（実施例１）
筒型気相培養装置によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法【０１２１】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、９．９×１０６になるまで培養を継続した。振盪培養向け酸素透過バッグにモジュール１０個を入れ、ＣＯ２インキュベータ内で終夜振盪培養を行った。【０１２２】
翌日、モジュールを取り出し、図５に示す筒型気相培養装置の細胞培養部（各細胞培養部の培地排出口は平行の位置関係である）にモジュール１０個を設置し、液溜め（図５の培地貯槽７に相当）には、３５０ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分２０ｍｌの速度で循環させた。４日後に培養を終了した所、細胞密度２．５×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数５．０×１０７個の細胞が観察された。酸素供給装置を使用せず、コンパクトかつ簡便な設備で、大量の抗体産生細胞を培養出来る事実が示された。【０１２３】
（実施例２）
筒型気相培養装置によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法【０１２４】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、２．４×１０６になるまで培養を継続した。ナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套（ケーシング）を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール３０個を酸素透過型培養バッグに滅菌的に封入し、上記培養液３０ｍｌを注加した。ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置した後、翌日、モジュールを取り出し、図５に示す筒型気相培養装置の細胞培養部（各細胞培養部の培地排出口は、反時計回りに３０度ずれた位置関係である、図４参照）にモジュール３０個を設置し、液溜め（図５の培地貯槽７に相当）には、３００ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し、同培地をチューブポンプ経由で毎分２０ｍｌの速度で循環させた。【０１２５】
４日後に培養を終了した所、細胞密度７．１×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数５．８×１０７個の細胞が観察された。酸素供給装置を使用せず、コンパクトかつ簡便な設備で、大量の抗体産生細胞を培養出来る事実が示された。【０１２６】
（実施例３）
液滴化培地供給手段を備えた細胞培養装置（以下、「ミスト及びシャワー型リアクター」という）によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法【０１２７】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、３．９×１０６になるまで培養を継続した。１０ｃｍ径シャーレ１枚に上記浮遊培養液を夫々１２ｍｌ注加した後、ナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套（ケーシング）を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール１２個を同シャーレに加えた。モジュールを細胞懸濁液で湿潤した後、ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置した。【０１２８】
翌日、モジュールを取り出し、ミスト及びシャワー型リアクターの内部にモジュール１２個を設置し（図９（Ａ）参照）、培地貯槽には、２００ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留し、同培地をチューブポンプ経由で毎分６０ｍｌの速度で循環させた。２日後に培養を終了した所、細胞密度３．４×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数８．２×１０６個の細胞が観察された。【０１２９】
（実施例４）
ミスト及びシャワー型リアクターによるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法【０１３０】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、９．９×１０６になるまで培養を継続した。振盪培養向け酸素透過バッグにモジュール１０個を入れ、ＣＯ２インキュベータ内で終夜振盪培養を行った。【０１３１】
翌日、振盪バッグよりモジュールを取り出し、実施例４と同様の条件で、ミスト及びシャワー型リアクターによる細胞培養を行った。培地貯槽には、２００ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分６０ｍｌの速度で循環させた。４日後に培養を終了した所、細胞密度８．８×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数１．８×１０７個の細胞が観察された。【０１３２】
（実施例５）
ステンレス綱製ケーシングを有するモジュール化ポリマー多孔質膜（以下、「メタルモジュール」という）による筒型気相培養装置（以下、「気筒型バイオリアクター」という）の準備及びそれを使用した細胞培養【０１３３】
ポリイミド多孔質膜の有する耐熱性を最大限に活用し、簡単な全体乾熱滅菌で滅菌作業を完了すべく、ステンレス鋼メッシュ製のケーシング、中敷、及びポリイミド多孔質膜で構成されるメタルモジュールを作製した（図１０を参照）。具体的には、１ｃｍ×１ｃｍのポリイミド多孔質膜及びポリイミド多孔質膜と同面積のステンレス鋼メッシュ（「中敷」という。図示しない）を積層したもの（ポリイミド多孔質３枚、中敷１枚、ポリイミド多孔質４枚、中敷１枚、ポリイミド多孔質３枚、の順番で積層）を、ステンレスメッシュ製のケーシングで封止して、メタルモジュールを作製した（図１０）。作業は、開放空間下で非滅菌的に実施した。【０１３４】
このメタルモジュールを運用するためのガラス製耐熱気筒型リアクターは、ガラスチャンバ内にメタルモジュールが据付けられ、液滴下により、培地を気筒内に供給可能である。メタルモジュールを備えた気筒型バイオリアクターは、耐熱素材のみで作製されている為、滅菌は簡便な乾熱滅菌のみで実行可能となる。メタルモジュール３０個を耐熱気筒内に設置後、非滅菌的に組み立てられた装置をアルミホイルで包み、摂氏１９０度にて８０分間乾熱滅菌し、放冷した事で滅菌作業を完結した。【０１３５】
作製した気筒型バイオリアクターを用いて、ヒト皮膚線維芽細胞の培養実験に着手した。【０１３６】
上述に示す通り、気筒型リアクター全体を滅菌的に組み立て、ＣＯ２インキュベータ内に装置全体を設置した。シャーレで培養していたヒト皮膚線維芽細胞をトリプシン処理にて剥離させ、図８に示す各反応形式に対し、７０ｍｌずつの細胞懸濁液を準備した。その時の細胞密度は、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．４×１０５であった。吸着後の細胞増殖挙動に関して、表２にて説明する。
【表２】
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【０１３７】
※１：液中残留細胞密度とは、ポリイミド多孔質膜に細胞を吸着させた後の、細胞懸濁液中に残存した細胞数（密度）を示している。
※２：細胞吸着率とは、播種に使用した細胞懸濁液中の細胞がどれだけポリイミド多孔質膜に吸着したかを示している。
※３：初期予想成熟度とは、ポリイミド多孔質膜での細胞の最大生息数を１００％とした場合の、実際の細胞の吸着細胞数を％として表したものである。
※４：※３と同じものを示している（培養５日目を測定して算出した）。上部；最上部のモジュール、下部；最上部のモジュール、の値をそれぞれ示している。【０１３８】
なお、ドロップ型の液滴は、図８（Ｄ）に示すように、巻き取ったステンレス鋼メッシュ（久宝金属製作所製、品番Ｅ９１０３，２０＃）（図８（Ｄ）のメッシュ束に相当）を蓋体に設けられた培地供給口に挿入することにより実現させた。メッシュ型の液滴は、ドロップ型の方法に加え、メッシュ束の直下に、平面状のステンレス鋼メッシュ（久宝金属製作所製、品番Ｅ９１０３，２０＃）を設けて、モジュールをカバーすることにより実現させた。シャワー型の液滴は、いけうち社製、品番１／８ＭＶＶＰ６５０３ＰＰ−ＩＮ番のノズルを用いることにより実現させた。【０１３９】
その後、ポンプを用いて連続的に培地（コージンバイオ株式会社製＿ＫＢＭ  Ｆｉｂｒｏ  Ａｓｓｉｓｔを使用）を供給する事で培地循環が開始され、連続培養を進めた。３日に一回培地交換を実施しながら、培養を継続した。細胞数の評価に関しては、３０個あるモジュールの内、１〜２個を取り出し、それらのモジュールに生育するヒト皮膚線維芽細胞を、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ  Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）の呈色反応を用いて細胞数を測定した。この実験結果から明らかな様に、本実験に於いては、培地液の注加方法がその後の各システムに於けるモジュール内細胞数を決定付ける事となる事実が判明した。また、興味深い事に、メッシュによる液浸透平準化の効果は非常に大きく、しっかりと細胞が増殖する結果が観察された。一方で、ドロップの添加方式では培地がリアクター内部全体に広がらず、偏流が生じる事で細胞生育領域が限定されて細胞数の減少を招いたと思われる。シャワー式に培地を注加する方法もある程度の液平準化効果に寄与すると思われる。【０１４０】
引き続き、本培養方法のバイオリアクターとしての効率を検証すべく、物質産生能の評価を進めた。タカラバイオ製ヒトフィブロネクチン測定用Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔを用いて、産生されたフィブロネクチン量を測定した。図１１に測定結果を示す。【０１４１】
図１１からも自明な様に、この物質産生評価に於いても、メッシュ培養法が圧倒的に優位を示しており、フィブロネクチン産生力を着実に伸ばしつつある。１ヶ月の安定運転を実現する事が出来た。一方で、シャワー型及びドロップ型においても、安定的な物質は達成されたが、産生力の向上を見出す事は出来なかった。非常に簡便な装置で、気相暴露型培養にてヒト初代細胞を安定的に培養し、高効率で有用物質の産生を実現し得る事を実証する事が出来た。
【符号の説明】
【０１４２】
１、１’、１’ａ    細胞培養装置
２、２ａ〜２ｅ、２’    細胞培養部
２１、２１ａ〜２１ｅ    側部
２２、２２ａ〜２２ｅ    底部
２３、２３ａ〜２３ｅ    培地排出口
２４    固定具挿入口
２５    上部
２６    培地供給口
２７    蓋部
２７１    培地排出口
３    培地供給手段
３０    培地貯留部
３１    側部
３２    底部
３３    培地滴下ノズル
３３０    ノズル孔
３３１    液滴
３４    固定具挿入口
３５    培地滴下孔
３６    オーバーフロー管
３７    脚部
３’、３’ａ、３’ｂ    液滴化培地供給手段
３０'    液滴メッシュ
３１’    メッシュ束
４、４’    培地回収手段
４’ａ    細胞培養部兼培地回収手段
４１、４１’、４１’ａ    培地排出部
５、５'、５’ａ    外筒
５１    ストッパー
５２    外筒蓋部
５２ａ    蓋部培地供給口
６１    固定具
７    培地貯槽
７１    培地
７２    培地排出ライン
７３    培地供給ライン
８    ポンプ
９    ポリマー多孔質膜
９０    モジュール化ポリマー多孔質膜
９００    ケーシング
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006777149.tif 000014
【図１０】
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【図１１】
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