(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養物を接種され、培養された、プレート培地における微生物増殖を特定する自動化された方法であって、
前記プレート培地の培養の開始時（ｔ０）に、前記培地の第１のデジタル画像を得ることであって、該第１のデジタル画像は複数のピクセルを有することと、
前記第１のデジタル画像の１つ以上のピクセルに座標を割り当てることと、
前記培地のための培養期間後（ｔｘ）に、前記培地の第２のデジタル画像を得ることであって、該第２のデジタル画像は複数のピクセルを有することと、
前記第２のデジタル画像を前記第１のデジタル画像と位置合わせすることであって、該位置合わせは、前記第１の画像の前記ピクセルに割り当てられた座標と、該座標を割り当てられた前記第１の画像の前記ピクセルに対応する前記第２の画像の１つ以上のピクセルとに基づくことと、
前記第２のデジタル画像の局所的に隣接するピクセル間の変化を示す空間コントラストデータを生成することと、
前記第１のデジタル画像及び前記第２のデジタル画像の対応するピクセル間の変化を示す時間コントラストデータを生成することと、
前記第２のデジタル画像の複数のピクセルの各々について、該ピクセルの前記空間コントラストデータ及び前記時間コントラストデータの組み合わせに基づいて、前記ピクセルにコントラスト値を割り当てることと、
所定の閾値を超え、互いの所定の誤差範囲内にあるコントラスト値を有する隣接するピクセルを関係付けることであって、該関係付けられたピクセルは、識別された物体を構成することと、
各識別された物体を、メモリ内に候補コロニーとして記憶することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記空間コントラストデータ及び前記時間コントラストデータを組み合わせることは、該空間コントラストデータ及び該時間コントラストデータの平均をとることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記空間コントラストデータ及び前記時間コントラストデータは、加重平均に従って組み合わされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
空間コントラストデータを生成することは、
時点ｔｘにおいて複数の画像を得ることであって、該複数の画像の各々は、異なる照明条件下で得られることと、
前記複数のｔ０画像の各々において空間データを処理することと、
前記処理された空間データを組み合わせることと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
空間データを処理することは、照明条件ごとに空間データ結果を別個に処理するとともに、該別個に処理された空間データ結果から最大の結果を選択することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
時間コントラストデータを生成することは、
時点ｔ０において複数の画像を得ることであって、該複数の画像の各々は、異なる照明条件下で得られることと、
時点ｔｘにおいて複数の画像を得ることであって、時点ｔｘにおける各画像の前記照明条件は、時点ｔ０において得られた画像の前記照明条件に対応することと、
前記対応するｔ０画像及びｔｘ画像の各々における時間データを処理することと、
前記処理された時間データを組み合わせることと、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
時間データを処理することは、照明条件ごとに時間データ結果を別個に処理するとともに、該別個に処理された時間データ結果から最大の結果を選択することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
所与の識別された物体について、
前記物体に関連付けられた前記ピクセル情報から複数の物体特徴を得ることであって、該物体特徴は、少なくとも１つの形態学的特徴を含み、該形態学的特徴は、物体形状、物体エリア、物体外周又は物体エッジのうちの少なくとも１つであることと、
分類アルゴリズムを用いて前記物体特徴を組み合わせることと、
前記組み合わされた物体特徴を、メモリ内に記憶された複数の微生物のための物体特徴情報と比較することと、
前記比較に基づいて、前記識別された物体を、微生物のタイプとして分類することと、
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記物体特徴は、少なくとも１つのスペクトル特徴を更に含み、該スペクトル特徴は、物体の色、物体の明るさ、物体の色相又は物体の彩度のうちの少なくとも１つである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記物体特徴は、少なくとも１つの時間特徴を更に含み、該時間特徴は、物体の増殖率、物体の色の変化、又は前記物体が最初に視覚的に観察可能であった予測時間のうちの少なくとも１つである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記物体特徴のうちの少なくとも１つが、前記識別された物体の各ピクセルについて得られ、次に、１つ以上の統計的ヒストグラム特徴を用いて組み合わされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記分類アルゴリズムは、教師あり機械学習アルゴリズムであり、前記組み合わされた物体特徴は、メモリに記憶された４つ以下の微生物について物体特徴情報と比較される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
所与の識別された物体について、
前記識別された物体のピクセルごとに、該ピクセルの前記時間コントラストデータに基づいて、該ピクセルに時間コントラスト値を割り当てることと、
前記割り当てられた時間コントラスト値から１つ以上の最大値を特定することと、
２つ以上の最大値が特定される場合、前記最大値が共通コロニー形成ユニットに関連付けられるか、又は異なるコロニー形成ユニットに関連付けられるかを判断することと、
異なるコロニー形成ユニットに関連付けられると判断された任意の２つの最大値について、前記識別された物体を、前記２つの最大値のそれぞれのロケーションに少なくとも部分的に基づいて、２つの物体に分割することと、
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
２つの最大値が共通のコロニー形成ユニットに関連付けられるか又は異なるコロニー形成ユニットに関連付けられるかを判断することは、
最大値ごとに、該最大値から前記識別された物体のエッジへの距離を求めることと、
各求められた距離と、前記２つの最大値間の前記距離とに基づいて、包含係数値を計算することと、
前記包含係数値を所定の範囲と比較することであって、前記最大値は、前記包含係数値が前記所定の範囲未満である場合、共通コロニー形成ユニットと関連付けられ、前記包含係数値が前記所定の範囲よりも大きい場合、異なるコロニー形成ユニットと関連付けられることと、
を更に含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記包含係数値が前記所定の範囲内にある場合、前記方法は、
最大値ごとに、該最大値を取り囲む領域を画定することと、
前記最大値を取り囲む前記それぞれの領域の凸性を計算することであって、前記凸性が閾値よりも高い場合、前記最大値は、異なるコロニー形成ユニットに関連付けられることと、
を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記空間コントラストデータに基づいて、第１の時点におけるデジタル画像内の１つ以上の物体を識別することと、
第２の時点におけるデジタル画像内の所与の識別された物体について、第２の時点におけるデジタル画像内の前記物体のための前記組み合わされた空間コントラストデータ及び時間コントラストデータが、前記第１の時点におけるデジタル画像内で識別された物体のための前記空間コントラストデータに一致する場合、前記第２のデジタル画像内の前記物体をアーチファクトとして分類することと、
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
プロセッサに、プレート培地における微生物増殖を評価する方法を実行させるように構成されたプログラム命令が符号化されたコンピュータ可読メモリストレージ媒体であって、前記方法は、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法を含む、コンピュータ可読メモリストレージ媒体。
【請求項１８】
生体試料を接種され、光学的に透明な容器内に配置された培養培地における増殖を特定するシステムであって、
前記培養培地のデジタル画像を捕捉するための画像取得デバイスと、
前記捕捉されたデジタル画像において識別された候補コロニー物体に関する情報を記憶するメモリと、
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法に従う方法を行うよう命令を実行するように動作可能な１つ以上のプロセッサと、
を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年４月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／１５１，６８１号及び２０１６年４月５日に出願された米国仮特許出願第６２／３１８，４８３号の出願日の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の開示は、引用することにより本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００２】
微生物増殖の検出のための培養プレートのデジタル画像がますます注目されている。微生物増殖を検出するためにプレートを撮像する技法が、国際公開第２０１５／１１４１２１号に記載されており、その全体が引用することにより本明細書の一部をなす。そのような技法を用いると、研究室のスタッフは、もはや直接検査することによりプレートを読み出す必要はなく、プレート検査のために高品質デジタル画像を用いることができる。研究室ワークフロー及び意思決定を培養プレートのデジタル画像の調査にシフトすることにより、効率を改善することもできる。画像は、運用者又は適切な技能を有する別の人物によって更にまとめるために、運用者によってマーク付けすることができる。更なる画像を取得し、二次プロセスを誘導するのに用いることもできる。
【０００３】
コロニーの検出、コロニーの計数、コロニーの個体群分化及びコロニーの同定は、近代の微生物学撮像システムのための目的を定義する。これらの目的を可能な限り早期に実現することにより、患者に結果を送達する目標が迅速に達成され、そのような結果及び解析が経済的にもたらされる。研究室のワークフロー及び意思決定を自動化することにより、目標を達成することができる速度及びコストを改善することができる。
【０００４】
微生物増殖の証拠を検出するための撮像技法に関して大きな進歩がなされたが、自動化されたワークフローをサポートするそのような撮像技法を拡張することが依然として求められている。微生物増殖を示すための培養プレートを調査するための装置及び方法は、プレート調査の高度に視覚的な特性に部分的に起因して、自動化するのが困難である。これに関して、自動化された解釈に基づいて、培養プレート画像を自動的に解釈し、行われる次のステップ（例えば、コロニーの同定、感受性試験等）を決定することができる技法を開発することが望ましい。
【０００５】
例えば、特にコロニーが異なるサイズ及び形状であり、互いに接触しているときに、プレート培養物におけるコロニーを同定及び区別することは困難である可能性がある。これらの問題は、成長が既にプレートのいくつかの領域において重なり合っているときに悪化する。これらの理由により、可能な場合、コロニーを同定し、プロセスにおいて増殖を早期に判断することが好ましい。一方、コロニーの少なくともいくらかの増殖を可能にするために、培養時間が依然として必要とされている。このため、一方では、コロニーが増殖することを可能にされる時間が長いほど、コロニーはより多く、背景と及び互いにコントラストをなし始め、それらのコロニーを同定するのがより容易になる。しかし、他方で、コロニーがあまりに長く増殖を許され、プレートを満たし始める及び／又は互いに接触し始める場合、これらのコロニーを背景と及び互いに対比することがより困難になる。相対的に乏しいコントラストであっても、コロニーを互いから分離するのに十分なだけコロニーが依然として小さい培養時間においてコロニーを検出することが可能である場合、この問題を最小限にするか、又は更には解決することができる。
【発明の概要】
【０００６】
本開示の一態様は、プレート培地（plated media）における微生物増殖を評価するための自動化された方法であって、実質的に光学的に透明な容器内に配置された、生体試料を接種された培養培地を準備することと、インキュベーターにおいて、接種された培養培地を培養することと、接種された培養培地を保有する透明な容器をデジタル撮像装置内に設置することと、第１の時点（ｔ０）において接種された培養培地の第１のデジタル画像を得ることであって、第１のデジタル画像は複数のピクセルを有することと、接種された培養培地を保有する容器に対する第１のデジタル画像におけるピクセルの座標を求めることと、接種された培養培地を保有する容器をデジタル撮像装置から取り出すとともに、接種された培養培地を、更なる培養のためにインキュベーター内に設置することと、更なる培養の後、接種された培養培地を保有する容器をデジタル撮像装置内に設置することと、第２の時点（ｔｘ）において、接種された培養培地の第２のデジタル画像を得ることであって、第２のデジタル画像は複数のピクセルを有することと、第１のデジタル画像を第２のデジタル画像と位置合わせすることであって、それによって、第２のデジタル画像内のピクセルの座標が、第１のデジタル画像内の対応するピクセルの座標に対応することと、第２のデジタル画像のピクセルを、第１のデジタル画像の対応するピクセルと比較することと、第１のデジタル画像と第２のデジタル画像との間で変化したピクセルを特定することであって、第１のデジタル画像と第２のデジタル画像との間で変化していないピクセルは背景を示すことと、第２のデジタル画像における特定されたピクセルのいずれが背景を示すピクセルとの所定のレベルの閾値コントラストを有するかを判断することと、第２のデジタル画像における１つ以上の物体を識別することであって、各物体は上記閾値コントラストのレベルに一致し、背景ピクセルによって互いに分離しないピクセルからなることと、識別された物体のうちの少なくとも１つについて、物体のピクセルから物体の形態を求めることと、物体の形態から、物体がコロニー候補であるか否かを判断することと、物体に関連付けられたピクセルの座標をメモリに提供することとを含む、方法を対象とする。
【０００７】
いくつかの例では、本方法は、所定の一連の照明条件に従って最初に複数の第１のデジタル画像を得ることを更に含むことができ、第１のデジタル画像の各々は、異なる照明条件下で得られ、各照明条件は、照明源に対する、接種された培養培地を保有する光学的に透明な容器の指定された向きと、デジタル撮像装置内で光学的に透明な容器が上に設置される指定された背景色とを含む。指定された向きは、接種された培養培地を保有する光学的に透明な容器の上面に向かって下方に方向付けられた照明源と、接種された培養培地を保有する光学的に透明な容器の底面に向かって上方に方向付けられた照明源と、接種された培養培地を保有する光学的に透明な容器の側面に向かって方向付けられた照明源とを備えることができる。指定された上面及び側面の向きについて、指定された背景色は黒色とすることができる。指定された底面の向きについて、指定された背景色は白色とすることができる。照明条件は、指定された照明スペクトルを更に含むことができ、指定された照明スペクトルは、赤色波長を放射する照明源と、緑色波長を放射する照明源と、青色波長を放射する照明源とを備える。
【０００８】
いくつかの例では、本方法は、物体に関連付けられたピクセル情報から物体特徴を得ることを更に含むことができ、物体特徴は、物体形状、物体サイズ、物体エッジ及び物体の色のうちの少なくとも１つを含み、物体の形態は、物体特徴に基づいて求められる。物体の色は、物体に関連付けられたピクセルのスペクトル特徴から求めることができる。スペクトル特徴は、ピクセルの色、色相、ルミナンス及びクロミナンスからなる群から選択することができる。また、背景特徴情報を得ることができる。背景特徴情報は、培地タイプ及び培地の色を含むことができ、物体の形態は、背景特徴情報に更に基づいて求めることができる。物体特徴及び背景特徴情報を、メモリ内に記憶された他の物体特徴及び他の背景特徴情報と比較することができ、物体特徴及び背景特徴情報に基づいて、微生物のタイプを判断することができる。
【０００９】
いくつかの例では、第１のデジタル画像を、第２のデジタル画像と位置合わせすることは、第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像の各々のピクセルに極座標を割り当て、それによって、第２のデジタル画像内のピクセルの極座標が、第１のデジタル画像内の対応するピクセルの極座標と同じであるようにすることを含むことができる。また、いくつかの例では、複数の培養培地が準備され、生体試料を接種され、１つ以上の光学的に透明な容器内に配置され、インキュベーターにおいて培養され、細菌増殖の同じ時間フレームにおいてデジタル撮像装置内に設置されることができ、それによって、培養培地ごとに第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像が得られる。また、いくつかの例では、本方法は、第１のデジタル画像内で、光学的に透明な容器又はプレート培地における結露の証拠であるピクセル情報を特定することと、画像から、結露に起因するピクセル情報を減算することとを更に含むことができる。照明源が光学的に透明な容器の底面に向かって上方に方向付けられたデジタル画像内で、結露の証拠であるピクセル情報を特定することができ、画像から、所定の閾値未満の光学密度を有するピクセルのためのピクセル情報が減算される。
【００１０】
いくつかの例では、本方法は、第１のデジタル画像内又は第２のデジタル画像内で、塵の証拠であるピクセル情報を特定することと、画像から、塵に起因するピクセル情報を減算することとを更に含むことができる。デジタル画像内で、塵の証拠であるピクセル情報を特定することができ、デジタル画像について、光学的に透明な容器は、白色の培養培地を含み、照明源は、光学的に透明な容器の上面に向かって下方に方向付けられ、背景色は黒色であり、光学的に透明な容器は、色付きの又は暗い培養培地を含み、照明源は、光学的に透明な容器の上面に向かって下方に方向付けられ、背景色は白色であり、又は、照明源は、光学的に透明な容器の底面に向かって上方に方向付けられる。塵は、培養培地、光学的に透明な容器、又はデジタル撮像装置の光学コンポーネントのうちの任意のものの上にある塵とすることができる。
【００１１】
いくつかの例では、本方法は、接種された培地の第３のデジタル画像を得ることであって、第３のデジタル画像は、第１のデジタル画像が取得される時点と、第２のデジタル画像が取得される時点との間の時点で得られ、接種された培養培地は、デジタル撮像装置から取り出され、第１のデジタル画像の取得と第２のデジタル画像の取得との間、及び第２のデジタル画像の取得と第３のデジタル画像の取得との間でインキュベーター内に設置されることと、第３のデジタル画像を第１のデジタル画像と位置合わせすることであって、第３のデジタル画像内のピクセルの座標が、第１のデジタル画像内の対応するピクセルの座標と同じであるようにすることと、第３のデジタル画像及び第２のデジタル画像のピクセルを互いに比較することと、第３のデジタル画像及び第２のデジタル画像間で変化したピクセルを特定することとを更に含むことができる。第１のデジタル画像と第３のデジタル画像との間の培養時間は、第３のデジタル画像と第２のデジタル画像との間の培養時間に等しいものとすることができる。識別された物体のうちの少なくとも１つは、第３のデジタル画像と第２のデジタル画像との間で変化した識別されたピクセルに関連付けることができる。
【００１２】
いくつかの例では、本方法は、接種された培地の第３のデジタル画像を得ることであって、第３のデジタル画像は、第２のデジタル画像が得られる時点の後に得られ、接種された培養培地は、第２のデジタル画像が得られる時点と第３のデジタル画像が得られる時点との間に、デジタル撮像装置から取り出され、インキュベーター内に設置されることと、第３のデジタル画像を、第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像と位置合わせすることであって、第３のデジタル画像内のピクセルの座標が、第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像内の対応するピクセルの座標と同じであるようにすることと、第３のデジタル画像及び第２のデジタル画像のピクセルを互いに比較することと、第２のデジタル画像と第３のデジタル画像との間で変化したピクセルを特定することと、変化したことが特定された、第２のデジタル画像及び第３のデジタル画像の比較されたピクセルに基づいて、第２のデジタル画像内で識別された物体が、第３のデジタル画像内で変化したと判断することとを更に含むことができる。第３のデジタル画像内で変化したと判断された第２のデジタル画像内で識別された物体は、シードオブジェクトであると判断することができ、シードオブジェクトからの判断された変化の程度が評価される。そのような場合、本方法は、第２のデジタル画像と第３のデジタル画像との間で変化したことが特定されたピクセルに基づいて、メモリ内の物体に関連付けられたピクセルの座標を更新することを更に含むことができる。
【００１３】
本開示の別の態様は、培養物を接種され、培養された、プレート培地における微生物増殖を特定する方法であって、培地の培養の開始時（ｔ０）に、培地の第１のデジタル画像を得ることであって、第１のデジタル画像は複数のピクセルを有することと、第１のデジタル画像の１つ以上のピクセルに座標を割り当てることと、培地のための培養期間後（ｔｘ）に、培地の第２のデジタル画像を得ることであって、第２のデジタル画像は複数のピクセルを有することと、第２のデジタル画像を第１のデジタル画像と位置合わせすることであって、この位置合わせは、第１の画像のピクセルに割り当てられた座標と、座標を割り当てられた第１の画像のピクセルに対応する第２の画像の１つ以上のピクセルとに基づくことと、第２のデジタル画像の局所的に隣接するピクセル間の変化を示す空間コントラストデータを生成することと、第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像の対応するピクセル間の変化を示す時間コントラストデータを生成することと、第２のデジタル画像の複数のピクセルの各々について、ピクセルの空間コントラストデータ及び時間コントラストデータの組み合わせに基づいて、ピクセルにコントラスト値を割り当てることと、所定の閾値を超え、互いの所定の誤差範囲内にあるコントラスト値を有する隣接するピクセルを関係付けることであって、関係付けられたピクセルは、識別された物体を構成することと、各識別された物体を、メモリ内に候補コロニーとして記憶することとを含む、方法を対象とする。
【００１４】
いくつかの例では、空間コントラストデータ及び時間コントラストデータを組み合わせることは、空間コントラストデータ及び時間コントラストデータの平均をとることを含む。空間コントラストデータ及び時間コントラストデータは、加重平均に従って組み合わせることができる。
【００１５】
空間コントラストデータを生成することは、時点ｔｘにおいて複数の画像を得ることであって、複数の画像の各々は、異なる照明条件下で得られることと、複数のｔ０画像の各々において空間データを処理することと、処理された空間データを組み合わせることとを含むことができる。空間データを処理することは、照明条件ごとに空間データ結果を別個に処理するとともに、別個に処理された空間データ結果から最大の結果を選択することを含むことができる。
【００１６】
時間コントラストデータを生成することは、時点ｔ０において複数の画像を得ることであって、複数の画像の各々は、異なる照明条件下で得られることと、時点ｔｘにおいて複数の画像を得ることであって、時点ｔｘにおける各画像の照明条件は、時点ｔ０において得られた画像の照明条件に対応することと、対応するｔ０画像及びｔｘ画像の各々における時間データを処理することと、処理された時間データを組み合わせることとを含むことができる。時間データを処理することは、照明条件ごとに時間データ結果を別個に処理するとともに、別個に処理された時間データ結果から最大の結果を選択することを含むことができる。
【００１７】
いくつかの例では、本方法は、所与の識別された物体について、物体に関連付けられたピクセル情報から複数の物体特徴を得ることであって、物体特徴は、少なくとも１つの形態学的特徴を含み、形態学的特徴は、物体形状、物体エリア、物体外周又は物体エッジのうちの少なくとも１つであることと、分類アルゴリズムを用いて物体特徴を組み合わせることと、組み合わされた物体特徴を、メモリ内に記憶された複数の微生物のための物体特徴情報と比較することと、比較に基づいて、識別された物体を、微生物のタイプとして分類することとを更に含むことができる。物体特徴は、少なくとも１つのスペクトル特徴を更に含むことができ、スペクトル特徴は、物体の色、物体の明るさ、物体の色相、物体の彩度のうちの少なくとも１つ、又は少なくとも１つの時間特徴である（時間特徴は、物体の増殖率、物体の色の変化、又は物体が最初に視覚的に観察可能であった予測時間のうちの少なくとも１つである）。物体特徴のうちの少なくとも１つを、識別された物体の各ピクセルについて得て、次に、１つ以上の統計的ヒストグラム特徴を用いて組み合わせることができる。分類アルゴリズムは、教師あり機械学習アルゴリズムとすることができ、組み合わされた物体特徴は、メモリに記憶された４つ以下の微生物について物体特徴情報と比較することができる。
【００１８】
いくつかの例では、本方法は、所与の識別された物体について、識別された物体のピクセルごとに、ピクセルの時間コントラストデータに基づいて、ピクセルに時間コントラスト値を割り当てることと、割り当てられた時間コントラスト値から１つ以上の最大値を特定することと、２つ以上の最大値が特定される場合、最大値が共通コロニー形成ユニットに関連付けられるか、又は異なるコロニー形成ユニットに関連付けられるかを判断することと、異なるコロニー形成ユニットに関連付けられると判断された任意の２つの最大値について、識別された物体を、上記２つの最大値のそれぞれのロケーションに少なくとも部分的に基づいて、２つの物体に分割することとを更に含むことができる。２つの最大値が共通のコロニー形成ユニットに関連付けられるか又は異なるコロニー形成ユニットに関連付けられるかを判断することは、最大値ごとに、最大値から識別された物体のエッジへの距離を求めることと、各求められた距離と、２つの最大値間の距離とに基づいて、包含係数値を計算することと、包含係数値を所定の範囲と比較することであって、最大値は、包含係数値が所定の範囲未満である場合、共通コロニー形成ユニットと関連付けられ、包含係数値が所定の範囲よりも大きい場合、異なるコロニー形成ユニットと関連付けられることとを更に含むことができる。包含係数値が所定の範囲内にある場合、また、本方法は、最大値ごとに、最大値を取り囲む領域を画定することと、最大値を取り囲むそれぞれの領域の凸性を計算することであって、凸性が閾値よりも高い場合、最大値は、異なるコロニー形成ユニットに関連付けられることとを更に含むことができる。
【００１９】
いくつかの例では、本方法は、空間コントラストデータに基づいて、第１の時点におけるデジタル画像内の１つ以上の物体を識別することと、第２の時点におけるデジタル画像内の所与の識別された物体について、第２の時点におけるデジタル画像内の物体のための組み合わされた空間コントラストデータ及び時間コントラストデータが、第１の時点におけるデジタル画像内で識別された物体のための空間コントラストデータに一致する場合、第２のデジタル画像内の物体をアーチファクトとして分類することとを更に含むことができる。
【００２０】
本開示の更に別の態様は、培養物を接種され、培養されたプレート培地における微生物増殖を評価する方法であって、プレート培地の第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像を得ることであって、各デジタル画像は、接種された培地のための培養期間後に、異なる時点に得られることと、第２のデジタル画像を第１のデジタル画像と位置合わせすることであって、この位置合わせは、第１の画像のピクセル、及び座標に割り当てられた第１の画像のピクセルに対応する第２の画像の１つ以上のピクセルに割り当てられた座標に基づくことと、第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像の対応するピクセル間の変化を示す時間コントラストデータを生成することと、時間コントラストデータから、第２のデジタル画像内の物体を識別することと、時間コントラストデータから、識別された物体の１つ以上の動的物体特徴を得ることと、１つ以上の動的物体特徴に基づいて、識別された物体を、有機体のタイプとして分類することと、識別された物体及びその分類をメモリ内に記憶することとを含む、方法を対象とする。いくつかの例では、１つ以上の動的物体特徴は、識別された物体の増殖速度、識別された物体のクロマティック特徴に対する変化、又はプレート培地に対し概ね垂直な軸に沿った増殖の変化を含むことができる。
【００２１】
いくつかの例では、本方法は、プレート培地の第３のデジタル画像を、接種された培地のための培養期間後に、第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像と異なる時点に得ることと、第３のデジタル画像を、第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像と位置合わせすることと、第２のデジタル画像及び第３のデジタル画像の対応するピクセル間の変化を示す時間コントラストデータを生成することとを更に含むことができ、物体は、上記時間コントラストデータに更に基づいて特定され、識別された物体のうちの１つ以上の動的物体特徴は、時間コントラストデータの二次導関数を含む。１つ以上の動的物体特徴は、物体増殖加速度を含むことができる。
【００２２】
本開示の更なる態様は、プロセッサに方法を実行させるように構成されたプログラム命令が符号化されたコンピュータ可読メモリストレージ媒体を対象とする。本方法は、プレート培地における微生物増殖を評価するか、培養物を接種され、培養されたプレート培地における微生物増殖を特定するか、又は培養物を接種され、培養されたプレート培地における微生物増殖を評価するための上記の方法のうちの任意のものとすることができる。
【００２３】
本開示のまた更なる態様は、生体試料を接種された培養培地における増殖を評価するためのシステムを対象とする。本システムは、培養培地のデジタル画像を捕捉するための画像取得デバイスと、メモリと、方法を行うよう命令を実行するように動作可能な１つ以上のプロセッサとを備える。いくつかの例では、メモリは、捕捉されたデジタル画像に関する情報を記憶することができ、実行された命令によって行われる方法は、プレート培地における微生物増殖を評価するための上記の方法のうちの任意のものとすることができる。他の例では、メモリは、捕捉されたデジタル画像において識別された候補コロニー物体に関する情報を記憶することができ、実行された命令によって行われる方法は、培養物を接種され、培養されたプレート培地における微生物増殖を特定する上記で説明した方法のうちの任意のものとすることができる。また更なる例では、メモリは、捕捉されたデジタル画像において識別された１つ以上の物体に関する情報、及び識別された物体の１つ以上の分類を記憶することができ、実行された命令によって行われる方法は、培養物を接種され、培養されたプレート培地における微生物増殖を評価するための上記で説明した方法のうちの任意のものとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本開示の態様による、培養物を撮像解析及び試験するためのシステムの概略図である。
【図２】本開示の態様による、培養物を撮像解析及び試験するための自動化された研究室ワークフロールーチンを示すフローチャートである。
【図３Ａ】本開示の態様による、コロニー形態が経時的に変化するときのコロニー形態の視覚表現による時間コントラストを示す画像である。
【図３Ｂ】本開示の態様による、コロニー形態が経時的に変化するときのコロニー形態の視覚表現による時間コントラストを示す画像である。
【図３Ｃ】本開示の態様による、コロニー形態が経時的に変化するときのコロニー形態の視覚表現による時間コントラストを示す画像である。
【図３Ｄ】異なる照明条件下の空間コントラストを示す画像である。
【図３Ｅ】異なる照明条件下の空間コントラストを示す画像である。
【図４】本開示の態様による、画像情報を得て解析するための例示的なルーチンのフローチャートである。
【図５】本開示の態様による、空間コントラストを得るための例示的なルーチンのフローチャートである。
【図６】本開示の態様による、時間コントラストを得るための例示的なルーチンのフローチャートである。
【図７】本開示の態様による、画像からアーチファクトをフィルタリングするための例示的なルーチンのフローチャートである。
【図８】本開示の態様による、画像のピクセルをラベル付けするための例示的なルーチンのフローチャートである。
【図９】本開示の態様による、コロニーを別個の物体に分割するための例示的なルーチンのフローチャートである。
【図１０】本開示の態様による、例示的な物体分割ルーチンのフローチャートである。
【図１１】図１０の分割ルーチンの一部としてのコンフルエントコロニーの測定値を示す図である。
【図１２】本開示の態様によるボロノイ図である。
【図１３Ａ】本開示の態様による分離係数（isolation factor）測定を示す図である。
【図１３Ｂ】本開示の態様による分離係数測定を示す図である。
【図１３Ｃ】本開示の態様による分離係数測定を示す図である。
【図１４】本開示の態様による、影響のボロノイ領域を示す図である。
【図１５Ａ】本開示の態様による、コロニー増殖の特徴化を示す画像である。
【図１５Ｂ】本開示の態様による、コロニー増殖の特徴化を示す画像である。
【図１５Ｃ】本開示の態様による、コロニー増殖の特徴化を示す画像である。
【図１６Ａ】画像の試料コロニーの、ズームされ向きを変えられた画像を有する、撮像プレートのセクションを示す図である。
【図１６Ｂ】画像の試料コロニーの、ズームされ向きを変えられた画像を有する、撮像プレートのセクションを示す図である。
【図１６Ｃ】図１６Ｂのそれぞれの画像のベクトル図である。
【図１７】本開示の態様による、標本のＳＨＱＩ、空間コントラスト及び時間コントラスト画像を示す図である。
【図１８】図２のルーチンのタイムラインを、比較可能なマニュアル実行されるルーチンのタイムラインと比較するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示は、プレート培地の１つ以上のデジタル画像において検出されるコントラストに少なくとも部分的に基づいて、プレート培地における微生物増殖を特定及び解析する装置、システム及び方法を提供する。本明細書において説明される方法の多くは、完全に又は部分的に自動化することができ、例えば、完全に又は部分的に自動化される研究室ワークフローの一部として統合される。
【００２６】
本明細書に記載のシステムは、微生物の同定及びそのような微生物の微生物増殖検出のために微生物学試料を撮像する光学系において実施することが可能である。本明細書に詳細に記載されていない多くのそのような市販のシステムが存在する。１つの例は、ＢＤ  Ｋｉｅｓｔｒａ（商標）ＲｅａｄＡコンパクトインテリジェント培養及び撮像システムである。他の例示的なシステムは、国際公開第２０１５／１１４１２１号及び米国特許出願公開第２０１５／０２９９６３９号に記載されているものを含み、それらの全体が、引用することにより本明細書の一部をなす。そのような光学的撮像プラットフォームは、当業者には既知であり、本明細書に詳細に説明されない。
【００２７】
図１は、プレート培地の高品質撮像を提供するための処理モジュール１１０及び画像取得デバイス１２０（例えば、カメラ）を有するシステム１００の概略図である。処理モジュール及び画像取得デバイスは、プレート培地上で培養される培養物の増殖を可能にするために、プレート培地を培養するための培養モジュール（図示せず）等の他のシステムコンポーネントに更に接続され、それによって、これらと更にインタラクトすることができる。そのような接続は、培養のための標本を受け取り、これらをインキュベーターに、次にインキュベーターと画像取得デバイスとの間に移送する追跡システムを用いて、完全に又は部分的に自動化することができる。
【００２８】
処理モジュール１１０は、システム１００の他のコンポーネントに、様々なタイプの情報の処理に基づいてタスクを実行するように命令することができる。プロセッサ１１０は、１つ以上の動作を実行するハードウェアとすることができる。プロセッサ１１０は、中央処理装置（ＣＰＵ）等の任意の標準的なプロセッサとすることもできるし、又は特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）若しくはフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）等の専用プロセッサとすることもできる。１つのプロセッサブロックが示されているが、システム１００は、並列に動作する場合もしない場合もある複数のプロセッサ、又はインキュベーター及び／又は画像取得デバイス１２０内の試料容器に関する情報を記憶及び追跡するための他の専用ロジック及びメモリを含むこともできる。これに関して、処理ユニットは、限定ではないが、システム内の標本のロケーション（インキュベーター又は画像取得デバイス、内部のロケーション及び／又は向き等）、培養時間、捕捉画像のピクセル情報、試料のタイプ、培養培地のタイプ、予防処置情報（例えば、有害な標本）等を含む、システム１００内の標本に関するいくつかのタイプの情報を追跡及び／又は記憶することができる。これに関して、プロセッサは、本明細書に記載の様々なルーチンを完全に又は部分的に自動化することが可能であり得る。１つの実施形態において、本明細書に記載のルーチンを実行するための命令は、非一時的コンピュータ可読媒体（例えば、ソフトウェアプログラム）上に記憶することができる。
【００２９】
図２は、培養物を撮像、解析、及び任意選択で試験するための例示的な自動化された研究室ルーチン２００を示すフローチャートである。ルーチン２００は、ＢＤ  Ｋｉｅｓｔｒａ（商標）Ｔｏｔａｌ  Ｌａｂ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ又はＢＤ  Ｋｉｅｓｔｒａ（商標）Ｗｏｒｋ  Ｃｅｌｌ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ等の自動化された微生物学研究室システムによって実施することができる。例示的なシステムは、相互接続されたモジュールを含み、各モジュールは、ルーチン２００の１つ以上のステップを実行するように構成される。
【００３０】
２０２において、培養培地が準備され、生体試料を接種される。培養培地は、光学的に透明な容器とすることができ、それによって、生体試料は、様々な角度から照明されている間、容器内で観測することができる。接種は所定のパターンを辿ることができる。試料をプレート上にストリークするためのストリーキングパターン及び自動化された方法は、当業者には既知であり、本明細書において詳細に論じない。１つの自動化された方法は、磁気制御されたビーズを用いてプレート上に試料をストリークする。２０４において、培地は、生体試料の増殖を可能にするために培養される。
【００３１】
２０６において、培地及び生体試料の１つ以上のデジタル画像が捕捉される。以下でより詳細に説明されるように、培地のデジタル撮像は、培養プロセス中に複数回（例えば、培養の開始時、培養の最中の時点、培養の終了時に）行うことができ、それによって、培地の変化を観測及び解析することができる。培地の撮像は、インキュベーターから培地を取り出すことを含むことができる。複数の画像が異なる時点において培地から取得されるが、培地は、撮像セッション間に更なる培養のためにインキュベーターに返される場合がある。
【００３２】
２０８において、生体試料は、捕捉されたデジタル画像からの情報に基づいて解析される。デジタル画像の解析は、画像内に含まれるピクセル情報の解析を含むことができる。いくつかの例において、ピクセル情報は、ピクセル単位で解析することができる。他の例において、ピクセル情報は、ブロック単位で解析することができる。また更なる例では、ピクセルは、ピクセルの全体領域に基づいて解析することができ、それによって、領域内の個々のピクセルのピクセル情報を、個々のピクセルの情報を組み合わせるか、試料ピクセルを選択するか、又は以下でより詳細に説明される統計的ヒストグラム動作等の他の統計的動作を用いることによって導出することができる。本開示において、「ピクセル」に適用されるものとして記載されている動作は、ブロック又は他のピクセルのグループに同様に適用可能であり、「ピクセル」という語は、本明細書ではそのような適用を含むように意図される。
【００３３】
解析は、増殖が培地において検出されるか否かを判断することを含むことができる。画像解析の観点から、（物体とその隣接する環境との間の差に基づいて）撮像される物体を識別することによって、次に経時的に物体の変化を特定することによって、画像内で増殖を検出することができる。本明細書においてより詳細に説明するように、これらの差及び変化は共に「コントラスト」の形態をとる。増殖を検出することに加えて、１０８における画像解析は、検出される増殖の量を量子化し、別個のコロニーを識別し、姉妹コロニーを識別すること等を更に含むことができる。
【００３４】
２１０において、生体試料（特に、識別された姉妹コロニー）が量的に大きな増殖を呈するか否かが判断される。増殖が見つからない場合、又は僅かな量の増殖しか見つからない場合、ルーチン２００は２２０に進むことができ、２２０において、最終報告が出力される。２１０から２２０に進む場合、最終報告は、大量の増殖がないことを示すか、又は正常細菌叢の増殖を報告する可能性が高い。
【００３５】
生体試料が、量的に大きな増殖を呈すると判断される場合、２１２において、以前の解析に基づいて、１つ以上のコロニーを画像から選び出すことができる。コロニーを選び出すことは、完全に自動化されたプロセスとすることができ、このプロセスにおいて、選び出されたコロニーの各々がサンプリングされ、試験される。代替的に、コロニーを選び出すことは、部分的に自動化されたプロセスとすることができ、このプロセスにおいて、複数の候補コロニーが自動的に同定され、デジタル画像において視覚的に運用者に提示され、それによって、運用者は、サンプリング及び更なる試験のための１つ以上の候補の選択を入力することができる。選択された又は選び出されたコロニーのサンプリングは、それ自体をシステムによって自動化することができる。
【００３６】
２１４において、有機体懸濁液における試料をプレート培養すること等によって、サンプリングされたコロニーが、更なる試験のために用意される。２１６において、試料が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）撮像を用いて試験され、元の培地からサンプリングされた標本のタイプが同定される。２１８において、試料は、更に又は代替的に抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）にかけられ、同定された標本のための可能な処置が特定される。
【００３７】
２２０において、最終報告において試験結果が出力される。報告は、ＭＡＬＤＩ及びＡＳＴの結果を含むことができる。上述したように、報告は、標本増殖の量子化を示すこともできる。このため、自動化システムは、接種された培養培地で開始し、培養物において見つかった標本に関する最終報告を、追加の入力をほとんど又は全く行うことなく生成することが可能である。
【００３８】
図２の例示的なルーチン等のルーチンにおいて、検出及び同定されたコロニーは、多くの場合に、コロニー形成単位（ＣＦＵ）と呼ばれる。ＣＦＵは、１つ又はいくつかの細菌として開始する微小物体である。経時的に、バクテリアは、増殖してコロニーを形成する。細菌がプレート内に配置されたときからの時間において早期であるほど、検出される細菌が少なく、結果として、コロニーが小さくなり、背景に対するコントラストが低くなる。言い換えると、コロニーサイズが小さいほど、より小さな信号をもたらし、一定の背景における信号が小さいほど、結果としてコントラストが小さくなる。これは、以下の式によって反映される。
【数１】
0006777726.tif 000002
【００３９】
コントラストは、画像内のＣＦＵ等の物体又は他のアーチファクトを識別する際の重要な役割を果たすことができる。物体は、明るさ、色及び／又はテクスチャが背景と大きく異なっている場合、画像内で検出することができる。物体が検出されると、解析は、検出された物体のタイプを識別することも含むことができる。そのような識別は、識別された物体のエッジの平滑性等のコントラスト測定値、又は物体の色及び／又は明るさの均一性（又は均一性の欠如）にも依拠することができる。このコントラストは、画像センサによって検出されるためには、画像のノイズ（背景信号）に勝るように十分大きくなくてはならない。
【００４０】
人間のコントラストの知覚（ウェバーの法則によって支配される）は限られている。最適な条件下で、人間の目は、１％の光レベル差を検出することができる。画像測定値（例えば、明るさ、色、コントラスト）の品質及び信頼性は、測定の信号対雑音比（ＳＮＲ）によって特徴付けることができ、ここで、１００のＳＮＲ値（又は４０ｄｂ）が、ピクセル輝度と無関係に、人間の検出能力に合致する。高ＳＮＲ撮像情報及び既知のピクセル毎ＳＮＲ（SNR per pixel）情報を利用したデジタル撮像技法は、これらのコロニーがまだ人間の目に見えない場合であっても、コロニーの検出を可能にすることができる。
【００４１】
本開示において、コントラストは少なくとも２つの方法で、空間的に及び時間的に収集することができる。空間コントラスト又はローカルコントラストは、単一の画像における所与の領域（例えば、ピクセル、又は隣接するピクセルのグループ）と、その周囲との間の色又は明るさの差を量子化する。時間コントラスト（temporal contrast）又はタイムコントラスト（time contrast）は、１つの画像の所与の領域と、異なる時点において取得された別の画像内のその同じ領域との間の色又は明るさの差を量子化する。時間コントラストを支配する定式は、空間コントラストのものと類似している。
【数２】
0006777726.tif 000003
【００４２】
ここで、ｔ１はｔ０に続く時点である。所与の画像の空間コントラスト及び時間コントラストの双方を用いて物体を識別することができる。識別された物体は、それらの重要性（例えば、それらがＣＦＵであるか、正常細菌叢であるか、塵であるか等）を判断するように更に試験することができる。
【００４３】
図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃは、時間コントラストが撮像された試料に対し有することができる効果の視覚的実証を提供する。図３Ａに示す画像は、異なる時点に捕捉され（左から右、上の行から下の行）、試料における全体的な増殖を示す。図３Ａにおいて増殖が顕著であるが、図３Ｂの対応するコントラスト時間画像から、増殖が更により顕著であり、シーケンスの更に早期において気づくことができる。明確にするために、図３Ｃは、図３Ｂのズームされたセクションを示す。図３Ｃに見て取ることができるように、コロニーの一部分が長く撮像されているほど、コントラスト画像においてより明るいスポットが作成される。このようにして、各コロニーの質量中心を、コロニーの明るい中心又はピークによって示すことができる。このため、経時的に得られる画像データは、コロニー形態における変化における重大な情報を明らかにすることができる。
【００４４】
背景に対する物体の空間コントラスト又は時間コントラストを最大限にするために、システムは、異なる背景における異なる入射光を用いて画像を捕捉することができる。例えば、上面照明法、底面照明法、側面照明法のうちの任意のものを、黒い背景又は白い背景で用いることができる。
【００４５】
図３Ｄ及び図３Ｅは、撮像された試料に対し照明法条件が有し得る効果の視覚的実証を与える。図３Ｄにおける画像は、上面照明法を用いて捕捉されたのに対し、図３Ｅにおける画像は、底面法照明を用いて、概ね同じ時点（例えば、顕著でも大量でもない増殖が生じた時点に十分近い）に捕捉された。見て取ることができるように、図３Ｄ及び図３Ｅの試料における画像の各々は、いくつかのコロニーを含むが、コロニーに関する追加の情報（この場合、溶血）は、図３Ｄの画像における背面照明法又は底面照明法により見ることができるのに対し、同じ情報は、図３Ｅの画像において把握するのが困難である。
【００４６】
所定の時点において、複数の照明条件下で複数の画像を捕捉することができる。画像は、照明光レベル、照明角、及び／又は物体とセンサとの間で展開されるフィルター（例えば、赤色、緑色及び青色フィルター）に起因してスペクトルが異なる、異なる光源を用いて捕捉することができる。この方式において、画像取得条件は、光源位置（例えば、上面、側面、底面）、背景（例えば、黒、白、任意の色、任意の輝度）、及び光スペクトル（例えば、赤色チャネル、緑色チャネル、青色チャネル）の観点で変動することができる。例えば、第１の画像は、上面照明及び黒色背景を用いて捕捉することができ、第２の画像は、側面照明及び黒色背景を用いて捕捉することができ、第３の画像は、底面照明及び背景なし（すなわち、白色背景）を用いて捕捉することができる。さらに、特定のアルゴリズムを用いて、使用する空間コントラストを最大限にするために、１組の変動する画像取得条件を生成することができる。これらの又は他のアルゴリズムは、所与のシーケンスに従って及び／又は或る期間にわたって画像取得条件を変動させることによって、時間コントラストを最大限にするのにも有用とすることができる。いくつかのそのようなアルゴリズムは、国際公開第２０１５／１１４１２１号に記載されている。
【００４７】
図４は、コントラストに少なくとも部分的に基づいて、撮像プレートを解析するための例示的なルーチンを示すフローチャートである。図４のルーチンは、図２のルーチン２００の例示的なサブルーチンとみなすことができ、図２の２０６及び２０８が、少なくとも部分的に図４のルーチンを用いて実行されるようになっている。
【００４８】
４０２において、第１のデジタル画像は、時点ｔ０において捕捉される。時点ｔ０は、培養プロセスが開始してすぐの時点とすることができ、撮像プレート内の細菌はまだ視認可能なコロニーを形成し始めていない。
【００４９】
４０４において、座標が第１のデジタル画像の１つ以上のピクセルに割り当てられる。いくつかの場合、座標は、撮像プレートの中心点から延在する径座標と、中心点の周りの角座標とを有する極座標とすることができる。座標は、後のステップにおいて、第１のデジタル画像を、異なる角度から及び／又は異なる時点に取得されたプレートの他のデジタル画像と位置合わせするのに役立つように用いることができる。いくつかの場合、撮像プレートは、特定のランドマーク（例えば、中心を外れたドット又はライン）を有することができ、第１の画像内のランドマークを覆うピクセル（複数の場合もある）の座標を、他の画像内の同じランドマークを覆うピクセル（複数の場合もある）に割り当てることができるようになっている。他の場合、画像自体を、未来の位置合わせのための特徴とみなすことができる。
【００５０】
４０６において、第２のデジタル画像は、時点ｔｘにおいて捕捉される。時点ｔｘは、撮像プレート内の細菌が視認可能なコロニーを形成する機会を有した、ｔ０後の時点である。
【００５１】
４０８において、第２のデジタル画像は、以前に割り当てられた座標に基づいて、第１のデジタル画像と位置合わせされる。画像を位置合わせすることは、例えば、国際公開第２０１５／１１４１２１号に記載の方法及びシステムを用いた画像の正規化及び標準化を更に含むことができる。
【００５２】
４１０において、第２のデジタル画像のコントラスト情報が求められる。コントラスト情報は、ピクセル単位で収集することができる。例えば、第２のデジタル画像のピクセルを、第１のデジタル画像の（同じ座標における）対応するピクセルと比較して、時間コントラストの存在を判断することができる。さらに、第２のデジタル画像の隣接するピクセルを、互いに比較するか、又は背景ピクセルに既知の他のピクセルと比較して、空間コントラストの存在を判断することができる。ピクセルの色及び／又は明るさにおける変化はコントラストを示し、１つの画像から次の画像、又は１つのピクセル（又はピクセルの領域）から次のピクセル（又はピクセルの領域）へのそのような変化の大きさを、測定、計算、推定又は他の形で求めることができる。時間コントラスト及び空間コントラストの双方が所与の画像について求められる場合、画像の所与のピクセルの全体コントラストを、その所与のピクセルの空間コントラスト及び時間コントラストの組み合わせ（例えば、平均、加重平均）に基づいて求めることができる。
【００５３】
４１２において、第２のデジタル画像内の物体は、４１０において計算されるコントラスト情報に基づいて識別される。類似のコントラスト情報を有する第２のデジタル画像の隣接するピクセルは、同じ物体に属するとみなすことができる。例えば、隣接するピクセルとそれらの背景との間、又はピクセルと第１のデジタル画像におけるそれらの明るさとの間の差が概ね同じである（例えば、所定の閾値量内にある）場合、ピクセルは、同じ物体に属するとみなすことができる。例として、システムは、大きなコントラスト（例えば、閾値量を超える）を有する任意のピクセルに「１」を割り当てることができ、次に、全て「１」を割り当てられた隣接するピクセルのグループを、物体として識別することができる。物体には、同じラベルを有するピクセルが一定の特性を共有するように、特定のラベル又はマスクを与えることができる。このラベルは、サブルーチン４００の後のプロセスの間に、他の物体及び／又は背景から物体を区別するのに役立つことができる。デジタル画像における物体を識別することは、デジタル画像を複数の領域（例えば、前景及び背景）に分割又は区分することを含むことができる。分割の目標は、コンポーネントを解析することが容易になるように、画像を複数のコンポーネントの表現に変更することである。画像分割は、画像内の対象物体を位置特定することに用いられる。
【００５４】
４１４において、（４１２によって識別される）所与の物体の特徴を特徴付けることができる。物体の特徴の特徴付けは、物体の記述的統計（例えば、エリア、反射率、サイズ、光学密度、色、プレートロケーション等）を導出することを含むことができる。記述的統計は、（例えば、ＳＨＱＩ画像から、コントラスト画像から）物体に関して収集された情報の集合の或る特定の特徴を最終的に量的に記述することができる。そのような情報は、種、濃度、混合物、時間及び培地の関数として評価することができる。一方、少なくともいくつかの場合、物体を特徴付けることは、物体の特徴に関する質的情報の集合から始まることができ、ここで、質的情報は、その後、量的に表される。以下の表１は、質的に評価することができ、その後、量的表現に変換することができる例示的な特徴のリストを与える。
【００５５】
【表１】
0006777726.tif 000004
【００５６】
形状、又は視覚的に観察されるまでの時間等の物体のいくつかの特徴は、全体として物体について一回測定することができる。他の特徴は、数回（例えば、ピクセルごと、共通ｙ座標を有するピクセルの行ごと、共通ｘ座標を有するピクセルの列ごと、共通の角座標を有するピクセルの射線（ray）ごと、共通径座標を有するピクセルの円について）測定することができ、次に、例えばヒストグラムを用いて、単一の測定値に組み合わせることができる。例えば、ピクセルごとの色、増殖速度、又はピクセルの行、列、射線若しくは円ごとのサイズ等を測定することができる。
【００５７】
４１６において、特徴付けられた特徴に基づいて物体がコロニーの候補であるか否かが判断される。コロニー候補判断は、量的特徴（例えば、上記の表１に示すスコア）、又はそのサブセットを分類器に入力することを含むことができる。分類器は、物体を評価するために、教師あり機械学習アルゴリズムを実施するための混同行列、又は教師なし機械学習アルゴリズムを実施するためのマッチング行列を含むことができる。教師あり学習は、物体が、可能性のある有機体の制限された組（例えば、２つ又は３つ）と区別される場合に好ましい場合がある（この場合、アルゴリズムは、トレーニングデータの比較的限られた組に対しトレーニングすることができる）。対照的に、教師なし学習は、物体が、可能性のある有機体のデータベース全体から区別される場合に好ましい場合がある。この場合、包括的な、又は更には十分なトレーニングデータを提供することが困難である。混同行列又はマッチング行列の場合、差別化は、範囲において数値的に測定することができる。例えば、所与の物体の対について、「０」は２つの物体が互いに区別されるべきであることを意味し得るのに対し、「１」は、物体を互いに差別化することが困難であることを意味し得る。
【００５８】
コロニー候補は、更なる使用（例えば、試験、以下で説明する分割ルーチン等）のために、自動化システムのメモリに記憶することができる。
【００５９】
複数の培地の使用
上記の例において、単一の培地について培養物の評価が説明されている。一方、これらの例は、培養物が複数の培地において評価される場合に同様に適用可能である。
【００６０】
細菌の特性（例えば、色、増殖率等）は、用いられる培養培地（「培地」）のタイプに依拠して変動する場合があるので、分類中に、培地ごとに異なる混同行列を適用することができる（例えば、サブルーチン４００の４１６）。このため、１つの培地のための分類器が２つの物体について「０」を出力するのに対し、異なる培地のための分類器が同じ２つの物体について「１」を出力することは、完全に理にかなっている。次に、分類器の集合結果を共に（マニュアルで、又は更なるマシン駆動の関係に基づいて）評価して、物体のための全体的な又は最終的な差別化又は区別に到達することができる。
【００６１】
複数の培地の評価は、単一の容器を用いて実施することができる。単一の容器は、複数の培地を同時に撮像することができるように、複数の培地（例えば、二重プレート、三重プレート、四重プレート等）を保持するように構成することができる。代替的に、いくつかの容器において培養物試料をストリークすることによって複数の培地を評価することができる。各容器は１つ以上の培地を保持する。複数の容器の各々は、次に、上記で説明した撮像ルーチンにかけることができる。様々な培地において発見された増殖の、より十分な情報による識別を行うために、培地（例えば、特徴付けられた特徴）の各々から導出された情報を、分類器に集合的に入力することができる。
【００６２】
コントラスト情報
図５は、図４の４１０の一部として空間コントラストを得るための例示的なサブルーチン５００を示す流れ図である。サブルーチン５００は、入力として、１つ以上の背景条件及び照明法条件５５１の組並びにフィルター５５４を受信する。５０２において、入力組５５１から、指定された照明法条件及び背景条件の下でデジタル画像が得られる。５０４において、次に画像が複製される。５０６において、複製された画像のうちの１つが、フィルター５５４を用いてフィルタリングされる。図５の例において、ローパスカーネルがフィルターとして用いられるが、当業者は、用いることができる他のフィルターを認識する。５０８において、フィルタリングされていない画像から減算されたフィルタリングされた画像と、フィルタリングされていない画像に加えられたフィルタリングされた画像との比が計算される。５１０において、空間コントラスト画像が、５０８の計算された比に基づいて得られる。このルーチン５００は、背景条件及び照明法条件５５１の各々について繰り返すことができる。ルーチン５００の各反復の結果として、別の空間コントラスト画像が得られ、これを用いて、５１０において以前に記憶された空間コントラスト画像を反復的に更新することができる。このため、包括的なコントラスト画像（照明条件の各々からのコントラストを含む）を反復的に構築することができる。１つの実施形態では、各反復において、（反復的に構築されたコントラスト画像と比較して）コントラスト設定が依然としてゼロに設定されているクリアされたコントラスト画像を、各照明設定のための入力として提供することができる。５１２において、最後の画像が処理されたと判断される場合、ルーチン５００が終了する。
【００６３】
図６は、同様に図４の４１０の一部として時間コントラストを得るための例示的なサブルーチン６００を示す流れ図である。サブルーチン６００は、入力として、１つ以上の背景及び照明法条件の組６５１と、フィルター６５５とを受信する。６０２において、特定の照明法条件及び背景条件下で取得された第１のデジタル画像及び第２のデジタル画像の各々が得られる。６０４において、ｔ０画像がフィルタリングされる。図６の例において、ローパスカーネルがフィルターとして用いられるが、当業者であれば、用いることができる他のフィルターを認識している。６０６において、フィルタリングされていないｔｘ画像からフィルタリングされたｔ０画像を減算したものと、フィルタリングされていないｔｘ画像にフィルタリングされたｔ０画像を加算したものとの比が計算される。６０８において、６０６の計算された比に基づいて時間コントラスト画像が得られる。このルーチン６００は、異なる照明条件及び／又は異なる背景条件の下で繰り返すことができる。ルーチン６００の各繰り返しの結果として、別の時間コントラスト画像が得られ、これを用いて、６０８において以前に記憶された時間コントラスト画像を反復的に更新することができる。空間コントラスト画像の構築に関して、時間コントラスト画像を反復的に構築することができ、クリアされたコントラスト画像が各照明条件の入力として与えられる。６１０において、最後の画像が処理されたと判断される場合、ルーチン６００が終了する。
【００６４】
コントラストに関する包括的又は全体的な判断を行うために、空間及び時間コントラスト結果を更に組み合わせることができる。空間コントラスト及び時間コントラストの組み合わせは、本明細書において、「混合コントラスト」（ＭＣ）と呼ばれる。１つの実施形態では、混合コントラストは、以下の式に従って、時点ｔ０における空間コントラスト（ＳＣ）画像、時点ｔｘにおける空間コントラスト画像、並びにｔ０画像及びｔｘ画像の比較から導出される時間コントラスト（ＴＣ）画像から導出することができる。
【数３】
0006777726.tif 000005
【００６５】
フィルタリング
画像解析を向上させるために、図４のサブルーチン４００に追加のプロセスを含めることができる。例えば、第１のデジタル画像を、時点ｔ０における画像内に現れる物体のために解析することができる。ｔ０において、細菌がまだ大幅に増殖し始めていないことがわかっているため、時点ｔ０において発見された任意の物体が、単に、コロニー候補を構成しない塵、気泡、アーチファクト、結露等であると仮定することができる。
【００６６】
１つのフィルタリングプロセスを捕捉画像に対し用いて、撮像プレート又はレンズ上に載る塵及び他のアーチファクトを減算することができる。トランスペアレントな培地を検討するとき（例えば、ＭａｃＣｏｎｋｅｙの寒天培養基、ＣＬＥＤ寒天培養基、ＣＨＲＯＭ寒天培養基等）を検討するとき、捕捉画像において或るレベルの塵が存在することが予期される。所与の画像における塵の影響は、画像が取得される特定の照明法条件及び背景条件に少なくとも部分的に基づいて指示することができる。例えば、白色の培地を用いるとき、反射性アーチファクト及び塵は、培地が底面に黒色の背景を用いて上方から照明されるときに最も観測可能である。別の更なる例として、色付きの又は暗い培地を用いるとき、アーチファクト及び塵は、培地が底面に白色の背景を用いて上方から照明されるとき、最も観測可能となる。更なる例として、ほとんど任意の培地において、光を吸収するアーチファクト及び塵は、背景と無関係に、培地が底面から照明されるときに観測可能となる。いずれの場合も、塵及びアーチファクトの管理は、微生物増殖の検出に大きく影響を与え得る複雑な画像処理の課題である。
【００６７】
塵及びアーチファクトは、２つのタイプ、すなわち、（Ａ）位置を変更することが可能なタイプ、及び（Ｂ）位置を変更することが可能でないタイプ、に分けることができる。塵及びアーチファクトは、経時的に蓄積することができ、タイプＡ及びＢの双方の数が経時的に変動する場合があることを意味する。それにもかかわらず、観測結果は、タイプＡが、タイプＢよりも、経時的な量の変化を起こしやすいことを示している。当然ながら、タイプＡは、プレートが撮像チャンバーの内外に動かされることに起因した変化も、より起こしやすい。
【００６８】
通常、タイプＢは、インクドット（プレートの底面にプリントされたブランド、ロット番号及び情報）等、プレート自体に関連するアーチファクト、プラスチック射出成形ポイントに関連する欠陥、又は霜が付いた領域によって生じる。タイプＢは、培地の上に詰まるか、培地内にトラップされるか、又はプレートの下側に静電的に詰まった塵又は気泡によっても生じる可能性がある。
【００６９】
撮像の観点から、タイプＡの塵及びアーチファクトであっても、それら自体はほとんど位置が変化しない。一方、フィルター及びレンズとして動作するプレート及び培地のプラスチックに起因して、タイプＡアーチファクトの観測される特徴及び位置は、培地の色、培地レベル、及びプラスチックに依拠して僅かに変化する場合がある。タイプＢの塵及びアーチファクトも位置が変化しない。一方、タイプＢの塵及びアーチファクトが培地に連結し、培地が経時的に僅かな動き及びシフトを受けている限り（ほとんどが、インキュベーターにおける経時的な僅かな乾燥に起因する）、タイプＢの塵及びアーチファクトは、培地に対して動く可能性がある。したがって、タイプＢの塵及びアーチファクトの位置も、少なくとも幾分、微細な変化を起こしやすい。
【００７０】
コントラストの観点で、タイプＡの塵の小片は、位置「ｐ０」においてｔ０空間コントラスト画像内に、及び位置「ｐｘ」においてｔｘ空間コントラスト画像内に存在すると述べることができる。ｐ０及びｐｘが異なるロケーションであると仮定すると、塵又はアーチファクトは、双方のロケーションにおける時間コントラスト画像にも存在する（例えば、ｐｘロケーションにおいて正のコントラストを示し、ｐ０ロケーションにおいて負のコントラストを示す）。比較により、タイプＢの塵の小片は、時点ｔ０及びｔｘにおいて双方の空間コントラスト画像の共通ロケーションに存在しているが、時間コントラスト画像にはない。
【００７１】
上記で説明したように、混合コントラスト結果を導出するために、空間コントラスト画像及び時間コントラスト画像を組み合わせることができる。タイプＡ及びタイプＢの双方の塵及びアーチファクトの影響は、混合コントラスト結果から更に除去することができる。１つの実施形態において、物体（例えば、ＣＦＵ候補）が混合コントラスト結果において識別される場合、この物体を、時点ｔ０における空間コントラスト結果における物体の近傍Ｎ（ｘ，ｙ）により検出された塵及びアーチファクトと比較することができる。このため、時点ｔ０における空間コントラスト結果において同様の物体が見つかる場合、混合コントラスト結果において識別された物体は、Ａタイプ又はＢタイプの偽陽性としてフラグを付けられる。物体が、最初にＡタイプ又はＢタイプの偽陽性としてフラグを付けられない場合であっても、経時的に、物体がサイズを大幅に変更していないことがわかる場合、依然として、後に、物体がＢタイプの偽陽性であると判断することができる。偽陽性を記憶し、後に、以下で更に説明されるフィルタリングマスク（例えば、バイナリマスク）等を通じて、後続の画像に適用することができる。
【００７２】
別のフィルタリングプロセスを用いて、（例えば、培養セッションの開始時に冷蔵庫からインキュベーターに移送する間に）プレート上に形成された結露を減算することができる。１つの例示的な結露フィルターにおいて、プレートは底面照明法を用いて照らされ、それによって、結露のロケーションを通り抜ける光は、結露のないロケーションよりも少ない。次に、画像の光学密度を評価することができ、低い光学密度のエリアを画像から減算することができる。
【００７３】
さらに又は代替的に、物体を、ｔ０画像及び／又は後続のデジタル画像の任意の解析の考慮から外すように、画像マスクを構築することができる。図７は、ｔ０画像の空間コントラストを用いて画像マスクを生成するための例示的なルーチン７００を示す流れ図である。ルーチン７００の例において、提供される唯一の入力は、時点ｔ０において取得されるＳＨＱＩ画像７５１である。７０２において、ｔ０画像の空間コントラストが決定される。７０４において、空間コントラスト情報を用いて、（例えば、明るさの）平均及び標準偏差等の、ｔ０画像の対象領域内のピクセルに関する統計的情報を収集する。７０６において、コントラスト閾値が、適切な数のピクセルがこの閾値を超えることを確実にするように調整される。例えば、所与のパーセンテージよりも多くのピクセルが画像の背景とみなされない場合、閾値を増大させることができる。７０８において、閾値は、この閾値の下のこれらのピクセルに関する統計情報に基づいて更に調整される。最終的に、７１０において、バイナリマスクが生成される。バイナリマスクは、有効なピクセルでない様々なアーチファクトと、有効であるとみなされる他のピクセルとの間を差別化する。次に、バイナリマスクを、潜在的なコロニーが存在する後続の時点において用いて、有効でないピクセルを占有する物体を検出し、これらの物体が候補コロニーとならないようにすることができる。
【００７４】
上記のフィルタリングプロセスは、塵、結露又は他のアーチファクトを物体として誤って含めることを回避し、４１４において、特性特徴化が有効なピクセルについてのみ実行されればよいため、そのような特徴化を加速することによって、サブルーチン４００を改善することができる。
【００７５】
物体及びラベルの定義
図４のサブルーチン４００に追加することができる別のプロセスは、４１２において識別された物体にラベルを割り当てることである。物体に特定のラベルを与えることができ、それによって、同じラベルを有するピクセルは、或る特定の特性を共有する。ラベルは、サブルーチン４００の後のプロセスの間に、他の物体及び／又は背景から物体を差別化するのに役立つことができる。図８は、時点ｔｘにおいて取得された画像（すなわち、「ｔｘ画像」）のピクセルをラベル付けするための例示的なルーチン８００を示す流れ図である。図８の例において、バイナリマスク８５１（例えば、ルーチン７００の出力）、ｔｘ画像のための初期化されていない候補マスク８５２、及び時間コントラスト画像８５３（例えば、サブルーチン６００の出力）が入力として受信される。８０２において、候補マスク８５２が初期化される。初期化は、撮像プレート上の対象領域を特定することと、バイナリマスク８５１を用いて、時点ｔｘにおいて取得された画像内の「有効ピクセル」を特定することを含むことができる。有効なピクセルは、候補コロニーとして考慮から外されておらず、ラベル付けのために検討される画像のピクセルである。８０４において、時間コントラスト画像８５３が、（例えば、明るさの）平均及び標準偏差等の、ｔｘ画像の対象領域内の有効なピクセルに関する統計的情報を収集するために用いられる。次に、８０６において、時間コントラスト画像８５３及びバイナリマスク８５１の各々の統計情報（好ましくは、同様の照明法条件及び背景条件下で生成される）が組み合わされ、閾値コントラスト画像が形成される。閾値コントラスト画像によって定義される閾値を用いて、ｔｘ画像の「コネクスコンポーネント（connex component）」が８０８においてラベル付けされる。コネクスコンポーネントは、効果的には、隣接するピクセル間の接続（又は隣接するピクセル間のグループ分け）を示すラベルであり、そしてこれは、ピクセルが同じ物体の一部であることを示す。
【００７６】
コネクスコンポーネントがｔｘ画像について定義されると、各コネクスコンポーネントを（８１０において）個々に解析して、そのステータスを単一の物体として検証することができる。図８の例において、ラベルに関連付けられたピクセルの統計的計算が８１２において行われる。計算は、ピクセルの明るさ又は色の平均及び／又は標準偏差を求めるためにヒストグラムを利用することができる。８１４において、ピクセルが閾値エリアに一致するか否かが判断される。閾値エリアに一致しない場合、動作が８３０に進み、８３０においてラベルが更新される。ラベルを更新することは、解析されたコンポーネントを１つのラベルとして保持すること、又はコンポーネントを２つのラベルに分割することを含むことができる。閾値エリアが一致しない場合、コンポーネントは単一のラベルとして保持される。閾値エリアが一致する場合、８１６において、ヒストグラムが平滑化され、８１８において、分散してラベル付けされたピクセルのピークが特定される。ピークは、最小エリアを有することによって更に定義することができる。なぜなら、最小エリアよりも小さいピークは無視することができるためである。８２０において、識別されたピークの数をカウントすることができる。１つのピークのみが存在する場合、動作が８３０に進み、ラベルが更新され、それによってコンポーネントが１つの物体として保持される。２つ以上のピークが存在する場合、８２４において、閾値コントラスト画像を用いて、ピーク間のコントラストが大きいか否かが更に評価される。次に、動作が８３０に進み、複数の識別されたピークに基づいてラベルが更新され、それによって、大きなコントラストの結果として、コンポーネントが２つに分割され、そうでない場合、１つとして保持される。
【００７７】
分割
サブルーチン４００の一部として含むことができる別のプロセスは、時点ｔｘにおけるコンフルエントコロニーを別個の物体に分離するための分割プロセスである。時点ｔｘにおいて、コロニーが互いに重なるか又は接触するところまで増殖している場合、領域内の別個のコロニーを評価するために、コンフルエント領域を通るように境界を引くことが必要とされる場合がある。
【００７８】
いくつかの例において、２つの隣接するコロニーが異なる特徴（例えば、異なる色、異なるテクスチャ）を有する場合、分割は、単に、コンフルエント領域の特徴解析を含むことができる。一方、空間コントラスト及び時間コントラスト単独では、コロニー間の境界を特定するのに常に十分とは限らない。図９は、そのようなコロニーを（例えば、別個のラベルを有する）別個の物体に分離するための、又は言い換えれば、コロニーを分割するための例示的なルーチン９００を示す流れ図である。図９の例示的なルーチン９００は、時点ｔ０において取得される第１のデジタル画像９５１と、時点ｔｘにおいて取得される第２のデジタル画像と、ｔ０画像バイナリマスク９５３（例えば、ルーチン７００によって生成されたマスク）とを入力として用いる。９０２において、ｔ０画像９５１及びｔｘ画像９５２に基づいて時間コントラスト画像が生成される。９０４において、時間コントラスト画像は、バイナリマスク９５３を用いて分割される。９０６において、ラベルが画像のセグメントに適用される。９０８において、ラベルごとにピーク又は最大値が特定される。所与のセグメントの最大値は、通常、セグメントの質量の中心点又は中心である。９１０において、ラベルごとに、（例えば、解析中のラベルの、近傍のラベルの）最大値を用いて、所与のラベルが近傍に対し一意であるか、又は１つ以上の近傍ラベルと組み合わせられるべきであるかに関して更なる判断を行う。ラベルが一意のコンポーネントまで削減されると、ラベルごとの特徴の特徴化（例えば、ルーチン４００のステップ４１４及び４１６）を、９１２において実行することができ、候補コロニーの大域リストを９１４において生成することができる。
【００７９】
包含係数（inclusion factor）等の様々な係数を適用して、所与のラベルの局所最大値が、１つのコロニーに属するか又は異なるコロニーに属するかを判断することができる。包含係数は、近傍ピクセルが隣接する物体に関連付けられているか否かを示す係数である。そのような係数を分割戦略において用いて、所与のラベルにおける２つの局所最大値を２つの別個の物体に分けるか、又はそれらを単一の物体に統合するかを判断することができる。
【００８０】
図１０は、そのような例示的な分割戦略を示す流れ図である。ルーチン１０００は、図９におけるステップ９１０のサブルーチンとして用いることができる。図１０に示すように、２つの局所最大値１０５１及び１０５２が特定される。１００２において、周囲領域がこの最大値ごとに特定される。図１０の例において、領域「Ａ」は最大値１０５１を取り囲み、領域「Ｂ」は最大値１０５２を取り囲む。以下の例示的な式の目的で、領域Ａのサイズが領域Ｂ以上であることが仮定される。いくつかの例において、各領域は、領域の水平軸に沿った水平距離（ｘＡ，ｘＢ）と、領域の垂直軸に沿った垂直距離（ｙＡ，ｙＢ）とを有する長円形状を与えることができる。図１１は、図１０のルーチンを明確にするために、領域Ａ及びＢ並びにそれぞれの最大値の例示的な図を提供する。
【００８１】
１００４において、最大値から物体のエッジへの距離が各局所最大値１０５１及び１０５２について求められる。いくつかの例では、求められる距離は、１００２において割り当てられる領域の平均距離又は中央値距離であり、以後、距離マップと呼ばれる。領域Ａの距離マップは、以後ｒＡと呼ばれ、領域Ｂの距離マップは、ｒＢと呼ばれる。
【００８２】
１００６において、包含係数は、２つの局所最大値間の距離「ｄ」と、１００４において求められた距離とに基づいて計算される。１つの実施形態において、包含係数は、以下の式を用いて計算される。
【数４】
0006777726.tif 000006
【００８３】
１００８において、包含係数が、所定の範囲（例えば、０．５〜１）未満であるか、所定の範囲よりも大きいか、又は所定の範囲内にあるかが判断される。包含係数が所定の範囲未満である場合、最大値は、同じ物体に関連付けられていると判断される。所定の範囲よりも大きい場合、最大値は、別個の物体に関連付けられていると判断される。
【００８４】
包含係数が範囲内に入る場合、最大値が同じ物体に属するか又は異なる物体に属するかは、すぐに明らかとならず、更なる処理が必要とされる。次に、ルーチン１０００は１０１０に続き、１０１０において、２つの最大値のそれぞれの周囲の領域の凸性が、２つの最大値間の位置における第３の領域「Ｃ」の座標を用いて計算される。いくつかの例において、領域は、２つの領域の重み付けされた中心とすることができ、領域Ｃの中心点は、より大きな領域Ａよりも、より小さな領域Ｂに近くなるようになっている。水平距離ｘＣ及び垂直距離ｙＣ、並びに距離マップＨも、領域Ｃについて計算することができる。例えば、凸性は、上記の値及びｄ（Ａ，Ｃ）を用いて計算することができ、これは、以下の式に従う、領域Ｃの中心点と最大値Ａとの間の距離である。
【数５】
0006777726.tif 000007
【００８５】
１０１２において、凸性値が所与の閾値よりも大きいか（より凸であるか）否かが判断される。例えば、ΔΗを０の閾値と比較することができる。凸値が閾値よりも大きい場合、最大値は、別個の物体に関連付けられていると判断される。そうでない場合、１０１４において、領域Ｃの１つ以上のパラメーターが、領域Ｃのサイズが増大するように更新される。例えば、ｄｉｓｔＯｆｆｓｅｔは、ΔＨに基づいて更新することができ、例えば、ΔＨは、０と１との間の値で上限を設けられ（ΔＨが１よりも大きい場合、ΔＨは１に丸められる）、次に、ｄｉｓｔＯｆｆｓｅｔに加えられる。
【００８６】
１０１６において、領域Ｃのサイズが、閾値以上であるか否かが判断される。この閾値以上である場合、最大値は、同じ物体に関連付けられていると判断される。換言すれば、領域Ａと領域Ｂとの差が非常に不明確であるため、領域Ｃが領域Ａ及びＢに影を落とし始めるほど増大する場合、これは、最大値１０５１及び１０５２が同じ物体に属することを良好に示す。上記の例において、これは、最大値間の距離ｄ以上のｄｉｓｔＯｆｆｓｅｔによって示すことができる。そうでない場合、動作は１０１０に戻り、領域Ａ及びＢの凸性が、領域Ｃの更新パラメーター（複数の場合もある）に基づいて再計算される。
【００８７】
全ての最大値について関連付けが求められると、求められた関連付けを、例えば行列（関連付け行列とも呼ばれる）に記憶することができる。記憶された情報を用いて、最大値のリスト全体を、候補物体の最終リストに変換することができる。例えば、関連付け行列の場合、マスターリストは、最大値の完全なリストから作成することができ、次に、各最大値を、反復して見直し、関連付けられた最大値が依然としてリスト上に残っている場合、この最大値をマスターリストから除去することができる。
【００８８】
図９及び図１０の例において、第２の画像が取得される時点ｔｘ（このため、ルーチン９００を実行することができる最も早い時点）は、培養プロセスが始まって僅か数時間後とすることができる。そのような時点は、通常、完全に形成されたコロニーを同定するには早すぎるとみなされるが、分割画像を作成するには十分である場合がある。分割画像は、任意選択で、後続の時点において取得される未来の画像に適用されてもよい。例えば、コロニーの予想される増殖を予測するために、コロニー間の境界を引くことができる。次に、コロニー間がコンフルエントになった場合、境界を利用して、コンフルエントコロニーを分離することができる。
【００８９】
時点ｔ０後の２つ以上の画像による解析
上記で説明したプロセス及びルーチンは、時点ｔ０の後に取得された１つの画像（例えば、時点ｔ０における第１のデジタル画像及び時点ｔｘにおける第２のデジタル画像）のみを必要とするが、他のプロセスは、少なくとも、時点ｔ０の後に取得された第２の画像を必要とする。例えば、時点ｔｘにおける画像がコンフルエントコロニーを含むことが発見される場合、時点ｔｎ（ここで、０＜ｎ＜ｘ）において取得された別の画像を用いて、個々のコロニーを同定し、分解することができる。
【００９０】
例えば、ｔ０＝培養が始まって０時間後（この時点において増殖は生じていない）、及びｔｘ＝培養が始まって２４時間後（この時点において、多くの増殖が生じたため、コロニーはコンフルエントになっている）の場合、時点ｔｎ＝１２時間（この時点において、コロニーは増殖を開始しているが、まだコンフルエントではない）は、個々のコロニーの存在を明らかにする。次に、時点ｔｎにおける画像に基づいてコロニー増殖を予想し、時点ｔｘにおけるコンフルエントコロニー間の境界を推定することができる。これに関して、時点ｔｎにおける画像は、高速に増殖しているコロニーを、低速に増殖しているコロニーと区別するのに役立つことができる。当業者であれば、時点ｔ０と時点ｔｘとの間で取得された画像数が増大するにつれ、コロニーの増殖速度をより正確に予想することができることを認識するべきである。
【００９１】
上記の概念の１つの用途において、時点ｔｎにおいて取得された画像（又は、より包括的には、時点ｔ０とｔｘとの間で取得された画像）を用いて、経時的に増殖するコロニーであることが疑われる物体であるコロニーシードを識別し、これらのシードを、対応するマスク及びラベルと関連付けることができる。各シードは、一意のラベルを受信し、ラベルは、異なる特徴（例えば、ＳＨＱＩ画像から生成された画像に基づく位置、形態及びヒストグラム、赤色チャネル、緑色チャネル、青色チャネル、ルミナンス、クロミナンス、色相又は合成画像）、及び特性（例えば、分離状態／非分離状態、時系列の繁殖を予想するための他の情報）と共に記憶される。いくつかの記憶された特徴（例えば、ヒストグラム）は、プレートグローバルインジケーターを抽出するために、特定のシードに寄与するのではなく、プレートレベルにおいて計算することもできる。次に、シードにより記憶された特徴を用いて、時点ｔｘにおけるコロニー抽出を行うことができ、これらの特徴はまた、トレーニング及び／又は試験のための分類器に入力として提供される。
【００９２】
ｔ０の後に取得された複数の画像を用いた増殖レート追跡を用いて、ワークフロールーチンの最中にプレート上又は撮像レンズ内に現れる塵、アーチファクト又は他の異物を検出することもできる。例えば、塵の小片が、ｔ０の後であるがｔｎの前に撮像レンズ上に落ちる場合、この小片によって生成されるスポットは、時点ｔ０において可視でなかったため、最初は増殖中のコロニーであると解釈される可能性がある。一方、後続の撮像により、スポットに対するサイズ変化がないことが明らかになると、スポットが増殖しておらず、したがってコロニーでないと判断することができる。
【００９３】
増殖速度及び分割の追跡とは別に、コロニーの他の態様は、ｔ０とｔｘとの間の追加の画像の助けにより追跡することができる。コロニー内で経時的に低速に進展する僅かな形態変化の場合、これらの僅かな変化は、より多くの画像を捕捉することによって、より迅速に特定することができる。いくつかの場合、増殖は、通常のｘ軸及びｙ軸に加えて、又はその代わりに、ｚ軸に沿って測定することができる。例えば、肺炎連鎖球菌は、血液寒天培地内で増殖するとき、沈んだ中心を低速に形成することが知られているが、沈んだ中心は、通常、解析２日目まで可視でない。細菌増殖の時間進行を調べることにより、初期の沈んだ中心を検出することができ、中心が完全に沈むのを待たなければならない場合よりも、細菌をはるかに早期に同定することができる。
【００９４】
他の場合、コロニーは、経時的に色を変えることが知られている場合がある。したがって、コロニーの撮像は、ｔ０より後の時点において第１の色（例えば、赤色）を有し、次に、後続の時点において第２の色（例えば、緑色）を有し、これを用いて、コロニー内で増殖するバクテリアの正体を特定することができる。色変化は、色空間（例えば、ＲＧＢ、ＣＭＹＫ等）を通るベクトル又は経路として測定することができる。コロニーの他の色彩特徴に対する変化も同様に測定することができる。
【００９５】
物体特徴
図４に関連して上記で論じたように、撮像プレート上の物体の特徴は、撮像プレート上で行われる画像解析の一部として特徴付けることができる。特徴付けられた特徴は、静的特徴（単一の画像に関する）及び動的画像（複数の画像に関する）の双方を含むことができる。
【００９６】
静的特徴は、所与の時点における物体属性及び／又は周囲の背景を反映することを目的とする。静的特徴は以下を含む。
（ｉ）重心：これは、座標空間（例えば、ｘ−ｙ、極）における撮像された物体の重心を与える静的特徴である。物体の重心は、物体の極座標のように、所与の照明法条件及び背景条件下で特徴組の不変性を与える。重心は、まず、画像内の全てのコロニーのための重み付けされた質量中心を求めることによって取得することができる（Ｍは、全ての検出されたコロニーのためのバイナリマスクである）。重み付けされた質量中心は、画像の各ピクセルが等しい値であるという仮定に基づいて求めることができる。次に、所与のコロニーのための重心を、以下の式によってｘ−ｙ座標において記述することができる（ここで、Ｅ＝｛ｐ｜ｐ∈Ｍ｝であり（Ｅは現在のコロニーのバイナリマスクである）、ｘ座標の範囲は、［０，画像幅］であり、ｙ座標の範囲は、［０，画像高さ］であり、各ピクセルは１単位である）。
【数６】
0006777726.tif 000008
（ｉｉ）極座標：これも静的特徴であり、重心等の撮像プレート上のロケーションを更に特徴付けるために用いることができる。通常、極座標は、径方向軸（ｄ）及び角度軸（Θ）に沿って測定され、プレート中心の座標は［０，０］である。ｉｇｖ（ｘ，ｙ）の座標ｄ及びΘは、（ｄについて、ミリメートル単位で、Θについて、度単位で）以下の式によって与えられる（ここで、ｋは、ピクセルをミリメートルに対応させるピクセル密度であり、「バーコード」は、プレートと以前の及び／又は未来の画像との位置合わせを確実にするための、撮像プレートのランドマーク特徴である）。
【数７】
0006777726.tif 000009
（ｉｉｉ）画像ベクトル：次に、二次元極座標は、１次元画像ベクトルに変換することができる。画像ベクトルは、径方向軸の関数として（通常、コロニーの中心が最も高い輝度を有する）、及び／又は角度軸の関数として画像のピクセルの輝度を特徴付けることができる。多くの場合に、画像ベクトルは、撮像された物体間の類似性／差異をより正確に分類することができる。
（ｉｖ）所与の物体の形状及びサイズを記述する形態学的特徴
（ａ）エリア：これは形態学的特徴であり、撮像された物体（「ブロブ」とも呼ばれる）におけるピクセルの数に基づいて求めることができる。ただし、物体の孔はカウントしない。ピクセル密度が利用可能であるとき、エリアは、物理的サイズ（例えば、ｍｍ２）において測定することができる。そうではなく、ピクセル密度が利用可能でないとき、ピクセルの総数はサイズを示すことができ、ピクセル密度（ｋ）は１に等しくなるようにセットされる。１つの実施形態において、エリアは、以下の式を用いて計算される。
【数８】
0006777726.tif 000010
（ｂ）外周：物体の外周も形態学的特徴であり、物体のエッジを測定し、エッジの総長を合算することによって求めることができる（例えば、１平方ユニットのエリアを有する単一のピクセルは、４ユニットの外周を有する）。このエリアに関して、長さは、ピクセルユニット（例えば、ｋが利用可能でないとき）又は物理的長さ（例えば、ｋが利用可能であるとき）の観点で測定することができる。いくつかの状況において、外周は、物体における任意の孔の外周も含むことができる。さらに、内側の角を２ではなく
【数９】
0006777726.tif 000011
としてカウントすることによって、ラダー効果（ladder effect）（斜めのエッジがラダー状のボックスにデジタル化されるときに結果として生じる）を補償することができる。１つの実施形態では、外周は、以下の式を用いることによって求めることができる。
【数１０】
0006777726.tif 000012
（ｃ）循環性：物体の循環性も形態学的特徴であり、エリア及び外周の組み合わせに基づいて求めることができる。１つの実施形態では、循環性は、以下の式を用いて計算される。
【数１１】
0006777726.tif 000013
（ｄ）半径変動係数（ＲＣＶ：radius coefficient of variation）：これも形態学的特徴であり、Ｎ個全ての方向における物体の平均半径
【数１２】
0006777726.tif 000014
又は重心から延在する角度θと、半径σＲの標準偏差との比をとることによって、物体の半径の変動を示すのに用いられる。１つの実施形態では、この値は、以下の式を用いて計算することができる。
【数１３】
0006777726.tif 000015
（ｖ）他の検出された物体及びプレート壁エッジに対する精密な調査の下での物体の近傍の地形学的関係を記述する、コンテクスト特徴。例えば、撮像されたコロニーの場合、コロニーの１つのコンテクスト特徴は、コロニーが自由であるか、制限された自由空間を有するか、又はリソースへのアクセスを求めて他の周囲のコロニーと競合しているかであり得る。そのような特徴は、同じ知覚環境で増殖するコロニーを分類し、及び／又は異なる環境内で増殖するコロニーを区別するのに役立つ傾向にある。
（ａ）影響領域：これは、物体と、その近傍物体との間の空間を検討するコンテクスト特徴であり、解析下の物体が拡張して（他の異なる物体が拡張して、その同じ領域を最初に占有することなく）占有する場合がある領域を予測する。影響の領域は、図１２に示す図等のボロノイ図の形態で表すことができる。これは、コロニー１２０１と、その近傍のコロニー、例えば１２０５との間の距離ｄに基づく影響領域（影付き）を示す。１つの実施形態において、物体のエッジから影響領域のエッジへの距離（ＤＮＣ）は、以下の式を用いて特徴付けることができる。
【数１４】
0006777726.tif 000016
（ｂ）プレート壁への距離：これは、最近傍のプレート壁からの物体のエッジの距離（ＤＰＷ）を計算するコンテクスト特徴である。１つの実施形態において、この距離は、以下の式を用いて特徴付けることができる。
【数１５】
0006777726.tif 000017
（ｃ）分離係数：これは、物体のサイズ、及び（例えば、別の物体、プレート壁の）最近傍のエッジへの距離に基づいて、所与の物体の相対的分離を特徴付けるコンテクスト特徴である。図１３Ａ〜図１３Ｃは、分離係数の態様を示す。図１３Ａは、最近傍のエッジがプレート壁に対しコロニーから距離ｄにある例を示す。図１３Ｂ及び図１３Ｃは、最近傍のエッジが別のコロニーに属する例を示す。そのような場合、解析下のコロニーを中心として周りに円が描かれ、次に、円が近傍のコロニーに接触するまで拡張される（図１３Ｂにおけるように、最初は小さく、その後、図１３Ｃにおけるように大きくなる）。図１３Ａ〜図１３Ｃの実施形態において、分離係数（ＩＦ）は、以下の式を用いて特徴付けることができる。
【数１６】
0006777726.tif 000018
（ｄ）近傍占有比：これは、所与の物体についての所与の距離ｄ内のプレートの境界を画されたボロノイ影響領域（Ｖ）のエリア断片を特徴付けるコンテクスト特徴である。１つの実施形態では、近傍占有比（ＯＲ）は、以下の式を用いて特徴付けることができる（この式の場合、Ｅ＝｛ｐ｜ｐ∈Ｖ，ｄｉｓｔ（ｐ，ｉｇｖ（ｘ，ｙ））＜ｄ｝である）。
【数１７】
0006777726.tif 000019
（ｅ）相対近傍占有比：いくつかの例では、所与の距離ｄは、所定の係数
【数１８】
0006777726.tif 000020
を乗算された物体の平均半径を用いて導出することができる。結果は、相対近傍占有比（ＲＮＯＲ）であり、以下の式を用いて所与の係数ｘについて導出することができる。
【数１９】
0006777726.tif 000021
（ｖｉ）所与の物体の光特性を記述するスペクトル特徴。色（赤色光、緑色光及び青色光チャネル、色相、ルミナンス及びクロミナンス、又は任意の他の色空間変換）、テクスチャ及びコントラスト（経時的及び／又は空間にわたる）が、そのような特徴の例である。スペクトル特徴は、コロニーマスクを用いた培養中に様々な時点において及び／又は様々な照明条件下で捕捉された画像から導出することができ、所与のコロニーのためのボロノイ影響領域に更に関連付けることができる。
（ａ）チャネル画像：これは、特定のカラーチャネル（例えば、赤色（Ｒ）、緑色（Ｇ）、青色（Ｂ））を用いて画像をスペクトル分解するのに用いられるスペクトル特徴である。
（ｂ）ルマ：これもまた、ＲＧＢチャネルを入力として用いて画像の明るさを特徴付けるのに用いられるスペクトル特徴である。
（ｃ）色相：これは、画像のエリアが、知覚した色（例えば、赤色、黄色、緑色、青色）又はそれらの組み合わせに類似して見えるように特徴付けられているスペクトル特徴である。色相（Ｈ２）は、通常、以下の式を用いて特徴付けられる。
【数２０】
0006777726.tif 000022
（ｄ）クロマ：これは、エリアが同様に白で照明される場合に、その明るさに対し画像のエリアの彩度を特徴付けるスペクトル特徴である。クロマ（Ｃ２）は、通常、以下の式を用いて特徴付けられる。
【数２１】
0006777726.tif 000023
（ｅ）放射分散：色相及びクロマコントラストの放射分散を解析することにより、アルファ溶血、ベータ溶血及びガンマ溶血の区別が可能になる。
（ｆ）最大コントラスト：この特徴は、画像の中心点（例えば、撮像されたコロニーの中心）から所与の半径ｒにおけるピクセルについて、測定された平均コントラストの最大値を計算することによって、画像の分解能を特徴付ける。この特徴を用いて、解析される物体によって生じる増殖に基づいて、時点ｔ０に取得された画像と、時点ｔｘにおいて取得された画像との間の知覚される差を記述することができる。最大コントラストは、以下のように特徴付けることができる。
【数２２】
0006777726.tif 000024
（ｖｉｉ）解析される物体の近傍における培地の変化を記述する背景特徴。例えば、撮像されたコロニーの場合、変化は、コロニーの周りの微生物増殖（例えば、溶血の兆候、ＰＨの変化、又は特定の酵素反応）によって生じ得る。
【００９７】
動的特徴は、物体属性及び／又は周囲の背景の変化を経時的に反映することを目的とする。時系列処理により、静的特徴を経時的に関係付けることが可能になる。これらの特徴の別個の一次導関数及び二次導関数は、経時的に特徴付けられるそのような特徴における変化の瞬間「速度」及び「加速度」（又は横ばい若しくは減速度）を与える。動的特徴の例は以下を含む。
（ｉ）経時的に上記の静的特徴を追跡するための時系列処理。所与の培養時点に測定された各特徴を、その相対的培養時間に従って参照し、特徴が、後の培養時点において測定される特徴に関係付けられることを可能にすることができる。画像の時系列を用いて、上記で説明したように、経時的に現れ、増殖するＣＦＵ等の物体を検出することができる。物体の以前に捕捉された画像の進行中の解析に基づいて、自動化されたプロセスによって、撮像のための時点をプリセット又は定義することができる。各時点において、画像は、単一の取得構成の全シリーズのための、又は、複数の取得構成から捕捉された画像のシリーズ全体としての、所与の取得構成とすることができる。
（ｉｉ）経時的な上記の特徴（例えば、上記で論じたような増殖速度の追跡）に対する変化の瞬間速度及び加速度（又は横ばい若しくは減速度）を与えるための、そのような特徴の別個の一次導関数及び二次導関数。
（ａ）速度：経時的な特徴の一次導関数。特徴ｘの速度（Ｖ）は、（ｘ単位）／時間の観点で特徴付けることができ、Δｔは、以下の式に基づく、時間単位で表される期間である。
【数２３】
0006777726.tif 000025
（ｂ）加速度：速度の一次導関数でもある、経時的な特徴の二次導関数。加速度（Ａ）は、以下の式に基づいて特徴付けることができる。
【数２４】
0006777726.tif 000026
【００９８】
上記の画像特徴は、物体又は物体のコンテクストから測定され、様々な培地及び培地条件において増殖する有機体の特異性を捕捉することを目的とする。列挙された特徴は、包括的であることを意図するものではなく、任意の当業者が、当該技術分野において既知の多岐にわたる既知の画像処理ベースの特徴に従って、この特徴組を変更、拡大又は制限することができる。
【００９９】
画像特徴は、画像内のピクセルごと、ピクセルグループごと、物体ごと、又は物体のグループごとに収集することができる。画像の領域を、更には画像全体をより包括的に特徴付けるために、収集された特徴の分布をヒストグラムに構成することができる。ヒストグラム自体は、到来する画像特徴データを解析するか又は他の形で処理するために、いくつかの統計的特徴に頼ることができる。
【０１００】
統計的ヒストグラム特徴は、以下を含むことができる。
（ｉ）最小値：ヒストグラム内で捕捉される分布の最も小さな値。これは、以下の関係によって特徴付けることができる。
【数２５】
0006777726.tif 000027
（ｉｉ）最大値：ヒストグラム内で捕捉される分布の最も大きな値。これは、以下の関係によって特徴付けることができる。
【数２６】
0006777726.tif 000028
（ｉｉｉ）和：ヒストグラム内で捕捉される全ての個々の値の和。和は、以下の関係によって定義することができる。
【数２７】
0006777726.tif 000029
（ｉｖ）平均（mean）：算術平均（arithmetic mean）又は平均（average）。これは、以下の関係に従って、全てのスコアの和をスコア数（Ｎ）で除算したものである。
【数２８】
0006777726.tif 000030
（ｖ）四分位１（Ｑ１）：分布の第一四分位数におけるスコア。スコアの２５％がＱ１未満であり、７５％がＱ１を超える。これは、以下の関係によって記述される。
【数２９】
0006777726.tif 000031
（ｖｉ）中央値（Ｑ２）：分布の第二四分位数におけるスコア。スコアの５０％が中央値未満であり、５０％が中央値を超える。中央値は、平均よりも極端なスコアに対し敏感でなく、これにより、通常、高度に歪んだ分布の場合に、中央値は平均よりも良好な尺度となる。これは以下の関係によって記述される。
【数３０】
0006777726.tif 000032
（ｖｉｉ）四分位３（Ｑ３）：分布の第三四分位数におけるスコア。スコアの７５％がＱ３未満であり、２５％がＱ３を超える。これは、以下の関係によって記述される。
【数３１】
0006777726.tif 000033
（ｖｉｉｉ）最頻値：分布において最も頻繁に生じるスコア。これは代表値（measure of central tendency：中心傾向の尺度）として用いられる。代表値としての最頻値の利点は、その意味が明らかであることである。さらに、最頻値は、公称データと共に用いることができる唯一の代表値である。最頻値は、標本変動の影響を大きく受け、したがって、通常、唯一の代表値としては用いられない。また、多くの分布は、２つ以上の最頻値を有する。これらの分布は、「多峰性」と呼ばれる。最頻値は以下の関係によって記述される。
【数３２】
0006777726.tif 000034
（ｉｘ）三項平均（trimean）：第一四分位＋第二四分位（中央値）の二倍＋第三四分位を合算し、４で除算することにより計算されるスコア。三項平均は、極端なスコアに対し、中央値とほぼ同じくらい耐久性があり、歪んだ分布において、算術平均ほどサンプリング変動の影響を受けない。一方、正規分布の場合、三項平均は通常、平均よりも効果的でない。三項平均は、以下の関係に従って記述される。
【数３３】
0006777726.tif 000035
（ｘ）トリム平均：或る特定のパーセンテージの最低スコア及び最高スコアを除外し、次に残りのスコアの平均を算出することによって計算されるスコア。例えば、５０％トリムされた平均は、スコアの下位２５％及び上位２５％を除外し、残りのスコアの平均をとることにより計算される。更なる例として、中央値は、１００％トリムされた平均であり、算術平均は、０％トリムされた平均である。トリム平均は、通常、算術平均よりも、極端なスコアの影響を受けにくい。したがって、歪んだ分布の場合、トリム平均は、平均よりもサンプリング変動の影響を受けにくい。正規分布の場合、トリム平均は通常、平均よりも効果的でない。例として、５０％トリムされた平均は、以下の関係によって記述される。
【数３４】
0006777726.tif 000036
（ｘｉ）範囲：最大値と最小値との間の差。範囲は、広がりの有用な尺度とすることができる。一方、範囲は、２つの値のみに基づくため、極端なスコアに対し敏感である。この敏感さに起因して、範囲は通常、広がりの唯一の尺度として用いられないが、それにもかかわらず、標準偏差又は半四分位範囲等の広がりの他の尺度を補足するものとして用いる場合、有益である。
（ｘｉｉ）半四分位範囲：第三四分位（Ｑ３）と第一四分位（Ｑ１）との間の差異の２分の１として計算される広がりの尺度。分布におけるスコアの半分がＱ３とＱ１との間にあるため、半四分位範囲は、上記スコアの半分を覆うのに必要な距離の半分である。対称分布において、中央値の１半四分位範囲下から、中央値の１半四分位範囲上まで及ぶ間隔は、スコアの半分を含むことになる。一方これは、歪んだ分布の場合には当てはまらない。範囲と異なり、半四分位範囲は、通常、極端なスコアによる影響を実質的に受けない。一方、半四分位範囲は、標準偏差よりも、正規分布におけるサンプリング変動の影響をより大きく受け、したがって、概ね正規分布しているデータの場合には頻繁に用いられない。半四分位範囲は、以下の関係に従って定義される。
【数３５】
0006777726.tif 000037
（ｘｉｉｉ）分散：分布の広がりの尺度。分散は、以下の関係に従って、平均から各数の平均二乗偏差を得ることによって計算される。
【数３６】
0006777726.tif 000038
（ｘｉｖ）標準偏差：分布の値がどの程度広く平均から散らばっているかを測定する分散の関数。標準偏差は、分散の二乗根である。標準偏差は、通常、範囲よりも、極端なスコアに対し敏感でないが、通常、半四分位範囲よりも敏感である。このため、極端なスコアの可能性が存在するとき、標準偏差を補うために半四分位範囲を用いることができる。
（ｘｖ）歪み：平均を中心とした分散の非対称性の尺度。分布は、その尾部のうちの一方が他方よりも長い場合、歪んでいる。正の歪みは、非対称の尾部がより正の値（平均よりも大きい）に向かって延びている分布を示す。負の歪みは、非対称の尾部がより負の値（平均未満）に向かって延びている分布を示す。歪みは、以下の関係に従って計算することができる。
【数３７】
0006777726.tif 000039
（ｘｖｉ）尖度：正規分布と比較した、分布の鋭さ又は平坦さ（又は相対的ピーク幅）の尺度である。正の尖度は、比較的尖った分布を示す。負の尖度は、比較的平坦な分布を示す。尖度は、分布の尾部のサイズに基づき、以下の関係によって求められる。
【数３８】
0006777726.tif 000040
【０１０１】
上記の統計的方法は、画像内の各点におけるローカル特徴を計算し、ローカル特徴の分布から統計の組を導出することによって、濃淡値の空間分布を解析するのに有用である。これらの統計的方法を用いて、解析された領域のためのテクスチャを記述し、統計的に定義することができる。
【０１０２】
テクスチャは、テクスチャ記述子を用いて特徴付けることができる。テクスチャ記述子は、画像の所与の領域にわたって計算することができる（以下で更に詳細に論じられる）。１つの一般的に適用されるテクスチャ方法は、引用することにより本明細書の一部をなす、Haralick, R.他「Texture features for image classification」IEEE Transactions of System, Man and Cybernetics, Vol. 3, pp. 610-621 (1973)によって紹介された共起法（co-occurrence method）である。この方法において、方向θにおける距離ｄによって分離されたピクセルの濃淡度対の相対周波数が組み合わされ、相対変位ベクトル（ｄ，θ）が形成される。相対変位ベクトルは、計算され、濃淡度共起行列（ＧＬＣＭ）と呼ばれる行列に記憶される。この行列は、二次統計テクスチャ特徴を抽出するのに用いられる。Haralickは、２次元確率密度関数ｐｉｊを記述するために１４個の異なる特徴を提案し、それらの特徴のうちの４つが、他のものよりも一般的に用いられる。
【０１０３】
テクスチャは、テクスチャ記述子を用いて特徴付けることができる。テクスチャ記述子は、画像の所与の領域にわたって計算することができる（以下で更に詳細に論じられる）。１つの一般的に適用されるテクスチャ方法は、引用することにより本明細書の一部をなす、Haralick, R.他「Texture features for image classification」IEEE Transactions of System, Man and Cybernetics, Vol. 3, pp. 610-621 (1973)によって紹介された共起法である。この方法において、方向θにおける距離ｄによって分離されたピクセルの濃淡度対の相対周波数が組み合わされ、相対変位ベクトル（ｄ，θ）が形成される。相対変位ベクトルは、計算され、濃淡度共起行列（ＧＬＣＭ）と呼ばれる行列に記憶される。この行列は、二次統計テクスチャ特徴を抽出するのに用いられる。Haralickは、２次元確率密度関数ｐｉｊを記述するために１４個の異なる特徴を提案し、それらの特徴のうちの４つが、他のものよりも一般的に用いられる。
（ｉ）角度方向の第２のモーメント（ＡＳＭ）は、以下によって計算される。
【数３９】
0006777726.tif 000041
（ｉｉ）コントラスト（Ｃｏｎ）は、以下によって計算される。
【数４０】
0006777726.tif 000042
（ｉｉｉ）相関（Ｃｏｒ）は、以下によって計算される（ここで、σｘ及びσｙは、対応する分布の標準偏差である）。
【数４１】
0006777726.tif 000043
（ｉｖ）エントロピー（Ｅｎｔ）は、以下によって計算される。
【数４２】
0006777726.tif 000044
【０１０４】
これらの４つの特徴は、同様に引用することにより本明細書の一部をなす、Strand, J.他「Local frequency features for the texture classification」Pattern Recognition, Vol. 27, No. 10, pp 1397-1406 (1994) [Strand94]にも挙げられている。
【０１０５】
所与の画像について、上記の特徴が評価される画像の領域を、マスク（例えば、コロニーマスク）によって、又はマスクを超えて延在するボロノイ影響領域によって定義することができる。
【０１０６】
図１４は、いくつかの可能な領域を示す。領域１４１０は、コロニー自体と同じだけ遠くに延在するコロニーマスクである。領域１４２０は、コロニーのボロノイ影響領域である（画像又はプレートのエッジにより境界を画される）。更なる説明のために、ピクセル１４３０は、領域１４２０内であるが領域１４１０外のピクセルである。換言すれば、領域１４１０によって表されるコロニーは、ピクセル１６３０に拡張されることが予期されるが、まだ拡張されていない。ピクセル１４４０は、領域１４１０及び１４２０の双方の外側にあるピクセルである。換言すれば、コロニーが画像の時点でピクセル１４１０を占有しないのみでなく、ピクセル１４１０が未来のいずれの時点においてもコロニーによって占有されることも予測されない（この場合、このピクセルは異なるコロニーによって既に占有されている）。
【０１０７】
培養プロセスに沿って異なる時点でコロニーマスクを用い、上述したような、それらに関連付けられたボロノイ影響領域を用いると、コロニーの異なる態様、及び周囲の局所的な増殖中の培地に対するそれらの影響を示す複数のヒストグラムを生成することが可能である。コロニーマスク及びボロノイ影響領域自体は、経時的に、例えばコロニーが成長する際に調整することができる。例えば、図１５Ａ〜図１５Ｃは、コロニーの増殖をどのように用いて、経時的にコロニーのマスクを調整することができるかを示す。図１５Ａは、寒天培地における２４時間の増殖後の血液培養物の一部である。図１５Ｂは、ｔ０において以前に捕捉された画像と比較した、同じ培養物のコントラスト画像である。図１５Ｃは、９時間（最も明るい）、１２時間（中間）及び２４時間（最も暗い）の増殖を示すグレースケール画像である。図１５Ｃにおける各影は、コロニーのための異なるマスクを設計するのに用いることができる。代替的に又は付加的に、増殖が生じるとき、マスクは、それぞれのボロノイ影響領域に従って分離することができる。
【０１０８】
上記の特徴リストにおける特徴のうちの任意の１つ又は組み合わせを、様々な培養条件下の撮像プレートの様々な培地において増殖する有機物の特異性を捕捉するための特徴組として用いることができる。このリストは、包括的であることを意図しておらず、任意の当業者が、撮像されることが意図される物体、及び当該技術分野において既知の多岐にわたる画像処理ベースの特徴に従って、この特徴組を変更、拡大又は制限することができる。このため、上記の例示的な特徴は、例示として与えられ、限定するものではない。
【０１０９】
当業者は、物体の形状及び特徴を求めるための他の測定及び手法を認識しており、上記の例は、例示として与えられ、限定するものではない。
【０１１０】
コントラスト構築
画像シリーズ内のいずれの画像が、増殖の検出、カウント又は同定のための値をもたらすかを初期に予測するのは多くの場合に困難である。これは、一部には、画像コントラストが、異なるコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）について、及び異なる培地にわたって変動することに起因する。いくつかのコロニーの所与の画像において、増殖検出のために、１つのコロニーは、背景に対し、非常に望ましいコントラストを有する場合があるのに対し、別のコロニーは、背景に対し、適切なコントラストを有しない場合がある。これによって、単一の手法を用いて培地におけるコロニーを同定することも困難になる。
【０１１１】
したがって、空間（空間差）及び時間（共通撮像条件下での時間差）を通じて、そして様々な撮像条件（例えば、赤色チャネル、緑色チャネル及び青色チャネル、明るい背景及び暗い背景、スペクトル画像又は任意の他の色空間変換）を用いることによって入手可能な全てのマテリアルからコントラストを構築することが望ましい。また、複数の入手可能なソースからコントラストを収集して、コロニーを検出するためのアルゴリズムへの入力として、標準化された画像を提供することも望ましい。
【０１１２】
画像データは、任意の数の要因に基づいて区切ることができる。例えば、画像データは、特定の時点及び／又は要求される特定の情報（例えば、空間画像情報は、時間画像情報が必要とするほど多くの時点を必要としない場合がある）に限定することができる。照明構成及び色空間を選択して、特定のコントラスト目標を達成することもできる。所望のサイズ（又は目標範囲内のサイズ）を有する物体（例えば、コロニー）を検出するために、空間周波数を変動させることもできる。
【０１１３】
離散した物体を検出するために、コントラストは［０，１］の絶対値に、又は符号付きの［−１，−１］に設定することができる。コントラスト出力のスケール及びオフセットを指定することもできる（例えば、符号付きコントラストを有する８ビット画像の場合、オフセットは１２７．５とすることができ、スケールは１２７．５とすることができる）。コントラストが極値に設定される例では、絶対オフセットをゼロに設定し、スケールを２５６に設定することができる。
【０１１４】
空間コントラストを用いて、均一な背景における別個の物体を検出することができる。定式を利用して、距離ｒ内のロケーション（ｘ，ｙ）において画像Ｉ上の空間コントラスト
【数４３】
0006777726.tif 000045
の自動評価を提供することができる。距離ｒが
【数４４】
0006777726.tif 000046
以上の距離に制限され、コントラスト演算子Ｋを用いてコントラスト設定が制御される１つの実施形態において、以下の式が適用される。
【数４５】
0006777726.tif 000047
【０１１５】
時間コントラストを用いて、（撮像プレート上に現れ、及び／又は拡張するＣＦＵ等の）動いている物体又は経時的に変化する物体を検出することができる。定式を利用して、時点ｔ０及びｔｘ間のロケーション（ｘ，ｙ）における画像Ｉ上の時間コントラスト
【数４６】
0006777726.tif 000048
の自動評価を提供することができる。１つの実施形態において、以下の式が適用される。
【数４７】
0006777726.tif 000049
【０１１６】
空間コントラスト収集は、事前にプログラムされたシーケンスに従ってプレートの複数のＳＨＱＩ画像を生成することによって、自動化された形式で実施することができる。所与の培養時間において複数の画像を生成してコロニー検出調査を進めることができる。１つの実施形態では、画像データ（特に、コントラスト収集演算子にコントラスト入力を提供するのに用いられるベクトル「ｖｅｃｔ」）が、以下の式に従って所与の時点において検出されたコロニーからのいくつかの異なる半径（Ｒｍｉｎ〜Ｒｍａｘ）において、いくつかの構成（ＣＦＧ１〜ＣＦＧＮ）にわたって収集される。
【数４８】
0006777726.tif 000050
【０１１７】
所与の画像Ｉ（ｘ，ｙ）（例えば、ＳＨＱＩ撮像がソースであるとき）についてＳＮＲが知られている場合、ＳＮＲ重み付きコントラストが最大にされる構成は、
【数４９】
0006777726.tif 000051
が
【数５０】
0006777726.tif 000052
にわたって最大であるとき、最良の構成（最良のＣＦＧ）として特定することができる。
【０１１８】
コントラスト演算子Ｋは、この既知のＳＮＲ情報から更に利益を得て、上記の式は以下となる。
【数５１】
0006777726.tif 000053
【０１１９】
時間コントラスト収集は、事前にプログラムされたシーケンスに従って、プレートの複数のＳＨＱＩ画像を生成することによって、自動化された形式で実施することもできる。複数の培養時点にわたって複数の画像を生成してコロニー検出調査を進める。複数の培養時点のうちの少なくとも１つはｔ０である。１つの実施形態において、画像データは、以下に従って、時点ｔ０、及び時点ｔｘまでの１つ以上の後続の培養時点におけるいくつかの構成にわたって収集される［式は、これまで、ベクトル及び構成の双方に「Ｎ」を用いていたが、混乱を招くと思われる．．．以下の改定された式は受け入れ可能であるか、又はＴＮを式に戻す必要があるか？］
【数５２】
0006777726.tif 000054
【０１２０】
上記の例では、ベクトルは、２つの時点（例えば、ｔ０及びｔｘ）における画像の差に基づいた、これらの２つの時点間のベクトルとすることができる。一方、ｔ０とｔｘとの間の更なる時点が含まれる他の用途では、ベクトルは、画像が取得される時点と同じだけ多くの点にわたってマッピングすることができる。数学的に言えば、ベクトルに含めることができる点の数に制限はない。
【０１２１】
空間コントラストに関して、所与の画像Ｉ（ｘ、ｙ）についてＳＮＲが知られている場合、ＳＮＲ重み付きコントラストが最大にされる構成は、
【数５３】
0006777726.tif 000055
が
【数５４】
0006777726.tif 000056
にわたって最大であるとき、最良の構成（最良のＣＦＧ）として特定することができる。
【０１２２】
コントラスト演算子Ｋは、この既知のＳＮＲ情報から更に利益を得て、上記の式は以下となる。
【数５５】
0006777726.tif 000057
【０１２３】
上記の例において、Ｍａｘ演算子は、パーセンタイル（例えば、Ｑ１、中央値、Ｑ３、又は任意の他のパーセンタイル）、又は加重和等の任意の他の統計演算子と交換することができる。加重値は、トレーニングデータベースから抽出された事前作業から生じ、それによって、ニューラルネットワークに対し、教師ありのコントラスト抽出の分野を開拓することができる。さらに、複数のアルゴリズムを用いることができ、複数のアルゴリズムの結果は、Ｍａｘ演算子等の別の演算子を用いて更に組み合わされる。
【０１２４】
画像位置合わせ
経時的に複数の画像が取得されるとき、それらの画像から有効な時間推定を得るために、画像の非常に正確な位置合わせが必要となる。そのような位置合わせは、機械位置合わせデバイス及び／又はアルゴリズム（例えば、画像追跡、画像マッチング）によって達成することができる。当業者であれば、この目標を達成するためのこれらの解決策及び技法を認識している。
【０１２５】
例えば、プレート上の物体の複数の画像が収集される場合、物体のロケーションの座標を決定することができる。後続の時点に収集される物体の画像データは、次に、座標に基づいて以前の画像データと関連付けることができ、次に、これらを用いて、経時的な物体の変化を求めることができる。
【０１２６】
（例えば、分類器への入力として用いられるときの）画像の高速で有益な使用のために、画像の不変性を最大限にするように、これらの画像を空間的基準において記憶することが重要である。コロニーのための基本形状記述子は通常円形であるので、極座標系を用いてコロニー画像を記憶することができる。コロニー質量中心は、コロニーが最初に検出されるとき、コロニーのロケーションの中心として特定することができる。中心点は、後に、コロニーの各後続の画像の極変換のための原点中心（origin center）としての役割を果たすことができる。図１６Ａは、中心点「Ｏ」を有する撮像プレートのズームされた部分を示す。点「Ｏ」から延びる２つの射線「Ａ」及び「Ｂ」が（明確にするために）画像の上に重ね合わされて示される。各射線はそれぞれのコロニー（円で囲まれている）と交差する。図１６Ａの円で囲まれたコロニーが、図１６Ｂの画像１６１１及び１６１２において更に詳細に示される。図１６Ｂにおいて、画像１６１１（射線「Ａ」に交差するコロニー）は、画像１６１３の径方向の軸が画像１６１２の径方向の軸と位置合わせされるように、向きを変えられて画像１６１３（「Ａ’」）にされ、それによって、向きを変えられた画像の最も左の部分が、図１６Ａの点「Ｏ」に最も近くなり、向きを変えられた画像の最も右の部分が、点「Ｏ」から最も遠くなる。この極の向き変更により、（照明等の要素に関して）撮像プレートの異なる方向に向けられたコロニーのより容易な解析が可能になる。
【０１２７】
図１６Ｃにおいて、極変換は、図１６Ｂの画像１６１１、１６１２及び１６１３の各々について完成する。極変換画像１６２１、１６２２及び１６２３において、それぞれの向きを変更された画像１６１１、１６１２及び１６１３の径方向軸（各それぞれの撮像されたコロニーの中心から延在する）が、図１６Ｃの画像における左から右にプロットされ、（それぞれのコロニーの）角度軸が上から下にプロットされる。
【０１２８】
極画像ごとに、径方向軸及び／又は角度軸に沿って、例えば、形状特徴及び／又はヒストグラム特徴（例えば、物体の色又は輝度の平均及び／又は標準偏差）を用いて、要約した１次元ベクトルの組を生成することができる。回転を検討するときに、形状及びヒストグラム特徴がほとんど不変である場合であっても、いくつかのテクスチャ特徴が、回転時に大きな変動を示す可能性があり、このため、不変性は保証されない。したがって、照明ごとに同じ観点又は角度からコロニー画像の各々を提示することに大きな利点がある。なぜなら、次に、物体のテクスチャの差を用いて互いを区別することができるためである。照明条件は、ほとんどの場合、プレート撮像中心の周りの角度位置にリンクされた変動を示すので、コロニー及びプレート中心を通る射線（図１６Ｂの画像１６１１、１６１２及び１６１３の各々において線として示される）は、各画像極変換のための原点（Θ）としての役割を果たすことができる。
【０１２９】
更なる位置合わせの課題は、プレート培地が完全に凍って固い状態でなく、したがって、取得された１つのものから次のものへと僅かにシフトする場合があることにより生じる。したがって、或る時点において取得された画像の或る特定の座標にあるプレートの領域が、後の時点において取得された同じ座標におけるプレートの領域と必ず完全に合致することを確実に想定することはできない。換言すれば、培地の僅かな歪みは、所与のピクセルと、培養プロセス中の異なる時点において捕捉された対応するピクセルとの厳密なマッチングに関して、僅かな不確実性をもたらす場合がある。
【０１３０】
この不確実性を考慮するために、時点ｔａにおける所与のピクセル輝度値
【数５６】
0006777726.tif 000058
を、異なる時点ｔｂにおけるこのピクセルの局所近傍Ｎ（ｘ，ｙ）における最も近い輝度値
【数５７】
0006777726.tif 000059
と比較することができる。局所近傍の選択は、１つの時点から次の時点への撮像プレートの再位置決めにおける１つ以上の誤差又は不正確性（例えば、撮像された培地の不完全な再位置決めに起因した位置正確度誤差、１つの時点から次の時点への撮像された培地の未知の高さに起因する視差の誤差）を求めることを含むことができる。１つの例において、約３ピクセル〜約７ピクセルの範囲内）の設定「ｘ」及び「ｙ」は、ピクセルあたり約５０ミクロンの分解能を有する画像に適していることが観測された。
【０１３１】
当業者であれば、ｔｂソース画像から２つのｔｂ画像、すなわち、ｔｂの濃淡度拡張（
【数５８】
0006777726.tif 000060
と呼ばれる）に対応する第１の画像と、ｔｂの濃淡度の衰え（grey level erosion）（
【数５９】
0006777726.tif 000061
と呼ばれる）に対応する第２の画像とを生成することが効果的な解決策であると認識するであろう。これらは共に、再位置決めの距離の不確実性ｄに合致するカーネルサイズを有する。
【０１３２】
【数６０】
0006777726.tif 000062
の場合、コントラストは０であり、そうでない場合、コントラストは、以下の式を用いて、
【数６１】
0006777726.tif 000063
と
【数６２】
0006777726.tif 000064
との間の
【数６３】
0006777726.tif 000065
に最も近い値から推定される。
【数６４】
0006777726.tif 000066
【０１３３】
ＳＮＲの改善
通常の照明条件下で、光子ショット雑音（センサに到来する光子の到着率における統計的変動）が、検出システムのＳＮＲを制限する。最近のセンサは、有効平方ミクロンあたり約１７００個〜約１９００個の電子であるフルウェルキャパシティを有する。このため、プレート上の物体を撮像する際、主な関心事は、物体を撮像するために用いられるピクセルの数ではなく、センサ空間内で物体によって覆われるエリアである。センサのエリアを増大させることにより、撮像される物体のためのＳＮＲが改善する。
【０１３４】
画像品質は、センサを飽和させることなく（フレームごとのピクセルごとに記録することができる光子の最大数）、光子雑音がＳＮＲを支配する照明条件（光子雑音＝
【数６５】
0006777726.tif 000067
）を用いて画像を捕捉することによって改善することができる。ＳＮＲを最大化するために、画像平均化技法が共通して用いられる。暗い領域のＳＮＲは、明るい領域のＳＮＲよりもはるかに低いので、以下の式によって示すように、これらの技法を用いて大きな明るさ（又は色）の差を有する画像に対処する。
【数６６】
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【０１３５】
ここで、Ｉは、センサにおける電子ストリームによって生成される平均電流である。物質の吸収／反射における差及び電磁スペクトルにわたる光に起因して色が知覚されるとき、捕捉された色に対する信頼性は、高ＳＮＲを有する輝度を記録するシステムの能力に依拠する。画像センサ（例えば、ＣＣＤセンサ、ＣＭＯＳセンサ等）は、当業者によく知られており、本明細書において詳細に説明されない。
【０１３６】
従来のＳＮＲ撮像制限を克服するために、撮像システムは、画像取得中に撮像プレートの解析を行い、解析に基づいて、照明条件及び露出時間をリアルタイムで調整することができる。このプロセスは、引用することにより本明細書の一部をなす、国際公開第２０１５／１１４１２１号に記載されており、包括的に、管理された高品質撮像（ＳＨＱＩ：Supervised High Quality Imaging）として参照される。システムは、異なるカラーチャネル内のプレートの様々な明るさの領域のための撮像条件をカスタマイズすることもできる。
【０１３７】
画像の所与のピクセルｘ、ｙについて、現在のフレームＮ中に取得されたピクセルのＳＮＲ情報を、以前の又は後続の取得されたフレーム（例えば、Ｎ−１、Ｎ＋１）中に取得された同じピクセルのＳＮＲ情報と組み合わせることができる。例として、組み合わされたＳＮＲは、以下の式によって指示される。
【数６７】
0006777726.tif 000069
【０１３８】
新たな取得により画像データを更新した後、取得システムは、環境制約（例えば、対象領域内のピクセルあたり必要とされる最小ＳＮＲ）に従って、ＳＮＲを最大にする最良の次の取得時点を予測することができる。例えば、明るい条件及び暗い条件の最適照明において捕捉された２つの画像の情報をマージすることにより、２つのみの取得において暗い領域のＳＮＲが
【数６８】
0006777726.tif 000070
だけ上がるとき、非飽和状態で捕捉される５つの画像の平均をとることにより、暗い領域（最大輝度の１０％）のＳＮＲが
【数６９】
0006777726.tif 000071
だけ上がる。
【０１３９】
画像のモデリング
いくつかの状況において、１つ以上の画像のピクセル間の空間コントラスト又は時間コントラストを計算するとき、所与の画像のためのピクセル情報が利用可能でない場合があるか、又は劣化している場合がある。利用不可能性は、例えば、プレートの画像が、細胞増殖の前の時間内に捕捉されなかった（例えば、プレートが時点ｔ０において、又はその直後に撮像されなかった）場合に生じ得る。信号情報の劣化は、例えば、画像が時点ｔ０において捕捉されるが、捕捉画像のピクセルが、細菌の増殖前に撮像プレートを正確に反映していないときに生じる場合がある。そのような不正確性は、プレートの後続の時系列画像内に再登場しない一時的なアーチファクト（例えば、プレートが最初にインキュベーターに入れられるときに、熱衝撃に起因してプレートの下で一時的に形成される結露）によって生じ得る。
【０１４０】
そのような状況において、利用不可能な又は劣化した画像（又は画像の或る特定のピクセル）は、プレートのモデル画像と置き換えるか、又はこのモデル画像を用いて向上させることができる。モデル画像は、プレートが、利用不可能な又は劣化した画像の特定の時点をどのように調べることが予期されるかを反映するピクセル情報を提供することができる。時点ｔ０におけるモデル画像の場合、モデルは、プレートの平面画像又は標準画像とすることができ、３次元撮像／モデル化技法を用いて算術的に構築することができる。モデルは、可能な限りリアルなモデルを生成するために、物理的設計パラメーター（例えば、直径、高さ、複数の培地を収容するための仕切り、プラスチック材料等）、培地パラメーター（例えば、培地のタイプ、培地の組成、培地の高さ又は厚み等）、照明パラメーター（例えば、光源の角度、光源の色又は波長（複数の場合もある）、背景の色等）及び位置決めパラメーター（例えば、撮像チャンバーにおけるプレートの位置）の各々を含むことができる。
【０１４１】
劣化した画像の場合、劣化した画像の向上は、（例えば、下にある結露が、一部の光を、プレートを通らないようにブロックし、それによって結露を有するプレートのセクションが僅かにより透明でなくなることに起因して）ピクセル情報が残りの画像ほど鮮明でないとき、信号回復を用いて画像の劣化したピクセル特徴を鮮明にすることにより達成することができる。信号の回復は、残りの画像について輝度情報を求めることと、輝度情報の中央値輝度を特定することと、次に、画像のよりシャープでない領域のための輝度情報を、残りの画像の中央値輝度と置き換えることとを含むことができる。
【０１４２】
応用形態
本開示は、主に、通常の尿の報告量（ＣＦＵ／ｍｌバケットグループ）をシミュレートするために、様々な希釈の生理食塩水において行われる試験に基づく。分離株ごとの懸濁液が、０．５マクファーランド濁度標準液に対し調節され、ＢＤ  Ｕｒｉｎｅ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（型番３６４９５１）において、推定される１×１０６、１×１０５、５×１０４、１×１０４、１×１０３及び１×１０２ＣＦＵ／ｍｌの懸濁液において希釈物を準備するのに用いられた。標本チューブは、標準的な尿のストリーキングパターン、すなわち、＃４Ｚｉｇｚａｇ（プレートあたり０．０１ｍｌの分注）を用いた、Ｋｉｅｓｔｒａ  ＩｎｏｑｕｌＡ（ＷＣＡ１）を使用して処理された。
【０１４３】
プレートは、ＲｅａｄＡ  Ｃｏｍｐａｃｔ（３５ｏＣ、非ＣＯ２）を用いて処理され、最初の２４時間にわたって２時間ごとに、次の２４時間にわたって６時間ごとに撮像され、計４８時間培養された。培養時間は、１時間の第１の読み値として入力され、許容されるマージンが±１５分としてセットされた。２時間〜２４時間の次の読み値は、±３０分の許容されるマージンを有して２時間ごとにセットされた。読み値２４〜４８は、±３０分の許容されるマージンを有して６時間ごとにセットされた。単純な実現可能性の調査の後、これは、許容可能なマージンを削除するように変更された。これは、所望の１８時間〜２４時間の範囲で画像取得を改善するように行われた。
【０１４４】
他の場合、画像は、４８時間の期間にわたって、最初の２４時間については２時間間隔で、次の２４時間については６時間間隔で得ることができる。そのような場合、４８時間の期間にわたって、時点ｔ０（０時間）から取得される画像を含む、合計１７個の画像が得られる。
【０１４５】
全ての取得される画像は、既知の物体ピクセルサイズ、正規化された照明条件、及びピクセルごとの帯域ごとの高い信号対雑音比を用いて、スペクトルの平衡をとられたレンズの幾何収差及び色収差について補正された。本明細書に記載される方法及びシステムにおいて用いるのに適したカメラは、当業者によく知られており、本明細書において詳細に説明されない。例として、４メガピクセルカメラを用いて９０ｍｍプレート画像を捕捉することにより、コロニーが適切なコントラストを有する直径において１００μｍの範囲内にあるとき、最大で３０コロニー／ｍｍ２のローカル密度（＞１０５ＣＦＵ／プレート）の計数が可能になるはずである。
【０１４６】
以下の培地を用いて、培地上で増殖したコロニーのコントラストが評価された。
【０１４７】
ＴＳＡＩＩ５％羊血液（ＢＡＰ）：尿培養のために広く用いられる非選択培地。
【０１４８】
ＢＡＶ：コロニー形態及び溶血に基づくコロニー計数及び推定ＩＤのために用いられる。
【０１４９】
ＭａｃＣｏｎｋｅｙＩＩ寒天培地（ＭＡＣ）：最も一般的なグラム陰性ＵＴＩ病原体のための選択的培地。ＭＡＣは、コロニーを生成する乳糖の分化のために用いられる。ＭＡＣは、プロテウスの遊走も阻害する。ＢＡＰ及びＭＡＣは、尿培養のために一般的に広く用いられる。いくつかの培地は、いくつかのグラム陰性の部分阻害に起因して、コロニーのカウントに用いることを推奨されない。
【０１５０】
コリスチンナリジクス酸寒天培地（ＣＮＡ）：最も一般的なグラム陽性ＵＴＩ病原体のための選択的培地。ＣＮＡは、尿培養のためにＭＡＣほど一般的に用いられないが、グラム陰性コロニーの過度な増殖が生じた場合に、コロニーの同定に役立つ。
【０１５１】
ＣＨＲＯＭＡｇａｒオリエンタシオン（ＣＨＲＯＭＡ）：尿培養のために広く用いられる非選択培地。ＣＨＲＯＭＡは、コロニーの色及び形態に基づくコロニーの計数及びＩＤのために用いられる。大腸菌及びエンテロコッカス属は、培地によって同定され、確認試験を必要としない。ＣＨＲＯＭＡは、コストに起因して、ＢＡＰほど用いられない。混合試料の場合、ＣＬＥＤ培地も用いられた。
【０１５２】
システイン・乳糖電解質欠損（ＣＬＥＤ）寒天培地：乳糖発酵に基づく尿中病原体のコロニー計数及び推定ＩＤのために用いられる。
【０１５３】
標本処理ＢＤ  Ｋｉｅｓｔｒａ（商標）ＩｎｏｑｕｌＡ（商標）を用いて、細菌学標本の処理を自動化し、標準化を可能にし、一貫した高品質のストリーキングを確保した。ＢＤ  Ｋｉｅｓｔｒａ（商標）ＩｎｏｑｕｌＡ（商標）標本プロセッサは、磁性ローリング粒子（magnetic rolling bead）技術を使用して、カスタマイズ可能なパターンを用いて培地プレートをストリークする。磁性ローリング粒子は、直径５ｍｍである。
【０１５４】
図１７は、ＣＨＲＯＭａｇａｒ（上面図）及び血液寒天培地（底面図）培地の双方においてモルガン菌増殖を取り出す際のコントラスト収集アルゴリズム性能の１つの例を示す。ＣＨＲＯＭａｇａｒ及びＢＡＰは共に、微生物学研究において一般的に用いられている非選択増殖培地である。図１７の中央の画像の各々は、プレートの上で光により照明された撮像プレートを表す（上面図）。左側の画像は、中央の画像の対応する空間コントラストを表す。空間コントラストは、１ミリメートルの中央値カーネルに基づく。最後に、右側の画像は、中央の画像の時間コントラストを表す。時間コントラストは、各画像捕捉時点における様々な照明法条件（異なるカラーチャネル、照明設定等）を用いて、培養の０時間（ｔ０）と１２時間（ｔｘ）との間に捕捉された画像から編集される。
【０１５５】
図１７に示すように、局所コントラストは、特にエッジ遷移が小さい場合に、半透明のコロニーを扱うときに制限を有する。なぜなら、空間コントラストアルゴリズムを単独で用いると、最もコントラストが高いコンフルエント領域しか画像から選び出すことができない可能性があるためである。空間コントラストは物体を捉えるのに失敗する可能性がある。図１７から、分離したコロニーにおける時間コントラストの効果も明らかである。
【０１５６】
図１７（特に、底面の血液寒天培地画像）も、空間コントラストを単独で用いて透明な培地における増殖を検出する問題を強調する。透明ケースにプリントされるインクは、非常に強力なエッジを有し、このため、強力な空間コントラストを有する。この結果、任意の他の空間コントラストを見るのが非常に困難になる。なぜなら、コロニーは、あまり強力に定義されたエッジを有していないためである。このため、空間コントラストと併せた時間コントラストの使用が、本開示における大きな利点となっている。
【０１５７】
最終的に、上記で説明したコントラスト判断の結果は、撮像された培地におけるコロニーの高速検出及び同定のための方法を自動化することができるというものである。自動化された方法は、比較可能なマニュアル方法を上回る大きな利点をもたらす。
【０１５８】
図１８は、自動化された試験プロセス１８００（例えば、図２のルーチン２００）のタイムラインを、比較可能なマニュアル実行される試験プロセス１８０５のタイムラインと比較するフローチャートの対を示す。各プロセスは、試験のための標本が研究室において受け取られる（１８１０、１８１５）ことから開始する。次に、各プロセスは、培養１８２０、１８２５に進み、培養中、標本は数回撮像することができる。自動化されたプロセスにおいて、自動化された評価１８３０は、概ね１２時間の培養の後に行われ、その時間後、標本内に増殖（又は通常の増殖）がないか否かを明確に判断する（１８４０）ことができる。図１７における結果から示されるように、自動化プロセスにおける時間コントラストの使用により、１２時間のみの後であっても、コロニーを検出する能力が大幅に改善される。対照的に、マニュアルプロセスにおいて、マニュアル評価１８３５は、培養プロセスが始まってほぼ２４時間が経過するまで行うことができない。２４時間経過して初めて、標本内に増殖（又は通常の増殖）がないか否かを明確に判断する（１８４５）ことができる。
【０１５９】
自動化プロセスの使用は、より高速のＡＳＴ及びＭＡＬＤＩの試験も可能にする。自動化プロセスにおけるそのような試験１８５０は、初期評価１８３０の直後に開始することができ、結果は、２４時間マークまでに取得（１８６０）及び報告（１８７５）することができる。対照的に、マニュアルプロセスにおけるそのような試験１８５５は、多くの場合、３６時間マークに近づくまで開始することができず、データを見直し（１８６５）、報告する（１８７５）ことができるようになるには、更に８時間〜１２時間を要する。
【０１６０】
まとめると、マニュアル試験プロセス１８０５は、最大で４８時間かかることが示され、１８時間〜２４時間の培養期間を必要とし、その後初めてプレートが増殖について評価され、試料がどの程度長く培養されていたか更に追跡する方法はない。対照的に、自動試験プロセス１８００は、（背景と、及び互いと比較して、）コロニー間の比較的乏しいコントラストであっても検出することができ、微生物学者がタイミングを追跡する必要なく撮像及び培養を行うことができるため、標本を特定し、更なる試験（例えば、ＡＳＴ、ＭＡＬＤＩ）のために準備することができるようになる前に、１２時間〜１８時間の培養しか必要とせず、プロセス全体は、約２４時間以内に完了することができる。このため、本開示の自動化プロセスは、本明細書に記載のコントラスト処理の支援により、試験結果の品質又は正確度に悪影響を及ぼすことなく、より高速な試料の試験をもたらす。
【０１６１】
本発明は特定の実施形態を参照しながら本明細書において説明されてきたが、これらの実施形態は本発明の原理及び応用形態を例示するにすぎないことは理解されたい。それゆえ、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、例示的な実施形態に数多くの変更を加えることができること、及び他の構成を考案することができることは理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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