(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、
前記基材に固定された、モノマー単位の一つが少なくともスルホン酸基を有する共重合体と、
を備えるカチオン交換クロマトグラフィー担体であって、
前記共重合体が実質的に架橋構造を形成しておらず、かつ前記共重合体がアクリルアミド及びアクリルアミド誘導体をモノマー単位として含まない、又は、実質的に影響を与えない範囲で含み、
前記基材の質量に対する前記共重合体の質量の割合が５％以上２００％以下であり、
カチオン交換クロマトグラフィー担体体積当たりのグラフト鎖の質量が、０．０３ｇ／ｍＬ以上０．２５ｇ／ｍＬ以下であり、
前記スルホン酸基の密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高く２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、
フロースルー精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項２】
前記共重合体における前記スルホン酸基を有するモノマー単位のモル比率が、電荷を有しない中性モノマー単位のモル比率よりも小さい、請求項１に記載のフロースルー精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項３】
前記共重合体における前記スルホン酸基を有するモノマー単位の質量割合が、電荷を有しない中性モノマー単位の質量割合よりも小さい、請求項１に記載のフロースルー精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項４】
前記スルホン酸基を有するモノマー単位が、グリシジルメタクリレート誘導体である、請求項１から３のいずれかに１項に記載のフロースルー精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項５】
前記中性モノマー単位が、少なくとも親水性モノマー単位を含み、前記共重合体中の前記中性モノマー単位における前記親水性モノマー単位のモル比率が５０％以上である、請求項２又は３に記載のフロースルー精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項６】
前記中性モノマー単位が、少なくとも親水性モノマー単位を含み、前記共重合体中の前記中性モノマー単位の総質量における前記親水性モノマー単位の質量の割合が５０％以上である、請求項２又は３に記載のフロースルー精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項７】
カルボキシル基を含まない、又はカルボキシル基の密度が前記スルホン酸基の密度よりも低い、請求項１から６のいずれか１項に記載のフロースルー精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項８】
前記基材が膜状である、請求項１から７のいずれか１項に記載のフロースルー精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載のフロースルー精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体を備える、生体分子精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１０】
抗体タンパク質精製用である、請求項９に記載の生体分子精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体。
【請求項１１】
不純物及び生理活性物質を含む混合溶液から、前記生理活性物質をフロースルー精製する精製方法であって、
請求項９又は１０に記載の生体分子精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体に対し、前記混合溶液を接触させることを含む、
精製方法。
【請求項１２】
フロースルー方式で前記担体に対し、前記混合溶液を接触させる、請求項１１に記載の精製方法。
【請求項１３】
前記混合溶液のｐＨが４．０以上１０．０以下である、請求項１２に記載の精製方法。
【請求項１４】
前記生理活性物質が抗体タンパク質の単量体である、請求項１１から１３のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１５】
前記不純物が、抗体タンパク質の２量体以上の凝集体を含む、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１６】
前記生理活性物質の回収率が８０％以上である、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１７】
前記生体分子精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体１ｍＬあたり、単量体と凝集体を含む抗体タンパク質１００ｍｇ以上を精製する、請求項１１から１６のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１８】
単量体と凝集体を含む抗体タンパク質溶液を精製した時に、凝集体割合を５０％以上低減させる、請求項１１から１７のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１９】
前記カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の前又は後に、アニオン交換クロマトグラフィー担体を用いた精製を行うことを更に含む、請求項１１から１８のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２０】
前記アニオン交換クロマトグラフィー担体が膜状である、請求項１９に記載の精製方法。
【請求項２１】
前記アニオン交換クロマトグラフィー担体を用いた精製がフロースルー方式である、請求項１９又は２０に記載の精製方法。
【請求項２２】
前記カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程及び前記アニオン交換クロマトグラフィー担体を用いた精製工程の前に、アフィニティ−クロマトグラフィー工程を更に含む、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２３】
一連の精製工程で、バッファー交換を行わない請求項１９から２２のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２４】
前記アフィニティ−クロマトグラフィー工程が、バインドアンドエリュート方式で実施され、溶出工程において、１価酸からなるバッファーにより前記生理活性物質を溶出する、請求項２２に記載の精製方法。
【請求項２５】
前記１価酸からなるバッファーの電気伝導度が１０．０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項２４に記載の精製方法。
【請求項２６】
前記アフィニティ−クロマトグラフィー工程の後に、前記混合溶液のｐＨを４．０以下とする工程を更に含む、請求項２２、２４及び２５のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２７】
一連の精製工程において、前記生理活性物質を含む混合溶液の電気伝導度が１０ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項１９から２６のいずれか１項に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、強カチオン交換基を有するイオン交換クロマトグラフィー担体、及びそれを用いた生体分子の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン（抗体）は、免疫反応を司る生理活性物質である。近年、医薬品、診断薬あるいは対応する抗原タンパク質の分離精製材料等の用途において、その利用価値が高まっている。抗体は免疫した動物の血液あるいは抗体産生能を保有する細胞の細胞培養液又は動物の腹水培養液から取得される。但し、それらの抗体を含有する血液や培養液は、抗体以外のタンパク質、又は細胞培養に用いた原料液に由来する複雑な夾雑成分を包含し、それらの不純物成分から抗体を分離精製するには、煩雑で長時間を要する操作が通常必要である。【０００３】
液体クロマトグラフィーは、抗体の分離精製に重要である。抗体を分離するためのクロマトグラフィー手法として、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、及び逆相クロマトグラフィー等があり、これらの手法を組み合わせることで抗体が分離精製される。【０００４】
イオン交換クロマトグラフィーは、吸着剤表面のイオン交換基を固定相として移動相中に存在する対イオンを可逆的に吸着することにより分離を行う方法である。吸着剤の形状としては、ビーズや、平膜、及び中空糸等の膜などが採用されており、これらの基材にカチオン交換基又はアニオン交換基を結合したものが吸着剤として市販されている。【０００５】
カチオン交換基を有する吸着剤では、低塩濃度の抗体溶液を吸着材に接触させることにより、抗体を吸着させ、移動相の塩濃度を高めることにより、吸着させた抗体を溶出させる精製が一般的に行われている。更に、より良好な方法として、以下に説明するフロースルー様式による目的物質の精製も提案されている。【０００６】
フロースルー様式とは、目的物質よりも不純物を選択的に吸着剤に吸着させる精製方法の様式である。そのため、従来の吸着、溶出を利用した方法に比べ、緩衝液の節約や工程の簡略化につながる。また、高流速で抗体溶液を処理することができれば、更にフロースルー精製の利点が活きると考えられる。【０００７】
また、カチオン交換工程においては、抗体単量体と、抗体２量体等の凝集体と、を分離することがしばしば目的とされている。しかし、抗体単量体と抗体凝集体の等電点はほぼ等しいため、フロースルー精製において、抗体単量体と抗体２量体の分離は特に難しく、カチオン交換体の緻密な設計が必要となる。【０００８】
特許文献１では、強カチオン交換基を有するモノマーと非荷電モノマーを担体にグラフト重合した、フロースルー精製に適したクロマトグラフィー担体が開示されている。【０００９】
特許文献２では、温度応答性モノマーと、強カチオン交換基を有するグラフト鎖が担体に固定された、フロースルー精製に適したクロマトグラフィー担体が開示されている。【００１０】
特許文献３では、弱カチオン交換基を有するフロースルー精製に適したクロマトグラフィー担体が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１３−１８９４２７号公報
【特許文献２】国際公開第２０１４／１７１４３７号
【特許文献３】国際公開第２０１６／０１３６０９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
特許文献１に開示されているカチオン交換体は、固体担体上の低密度（１ないし３０ｍｍｏｌ／Ｌ）のカチオン交換基の使用を特徴としており、それ以上のカチオン交換基の密度では、フロースルー精製において、効率的に凝集体が除去できないため、カチオン交換基の密度に制限がある。そのため、精製できる抗体量が必ずしも多くはない。【００１３】
特許文献２に開示されているカチオン交換体は、温度応答性モノマーのアクリルアミド誘導体、具体的にはイソプロピルアクリルアミドをモノマー単位としてグラフト鎖に含むため、精製性能が温度の影響を受ける傾向にある。また、処理温度が低いと、イソプロピルアクリルアミドをモノマー単位として含む高分子鎖が親水性となり、凝集体除去性能が低下する。そのため、疎水性モノマーを共重合することにより、イソプロピルアクリルアミドの共重合体の下限臨界温度を下げ、高分子の疎水的な性質を強めることにより、室温付近での凝集体除去性能を向上させている。しかし、特許文献２に開示されているカチオン交換体の性能を安定させるためには、精密な温度コントロールが必要である。一方で、タンパク医薬品の製造は製造現場によって温度が異なるため、温度の影響を極力受けないことが望ましい。【００１４】
更に、特許文献２に開示されているカチオン交換基の密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上のカチオン交換膜については、抗体凝集体の除去効率に改善の余地がある。【００１５】
特許文献３は、３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上のカチオン交換基密度の、フロースルー精製に適したカチオン交換膜が開示されている。当該カチオン交換膜は、カチオン交換基密度が高くても、凝集体を効率的に除去できており、多量の抗体を精製できている。一方、開示されているカチオン交換膜は、弱カチオン交換基が主であり、低いｐＨではカチオン交換基が荷電しないため、広範囲のｐＨ領域における効率的な抗体凝集体の除去という観点からは、改善の余地がある。【００１６】
このように、抗体等の生理活性物質のフロースルー精製において、広範囲のｐＨ領域において多量の生理活性物質を効率的に、かつ温度の影響を受けずにフロースルー精製できるカチオン交換膜は開示されていない。そこで、本発明は、フロースルー精製において、温度による影響を受けにくく、低ｐＨでも効率よく多量の生理活性物質を精製可能なカチオン交換膜を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者は上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、フロースルー精製において、温度による影響を受けにくく、広いｐＨ範囲で効率よく多量の生理活性物質を精製可能なグラフト鎖の組成を見出し、本発明を完成するに至った。【００１８】
本発明の形態によれば、基材と、基材に固定された、モノマー単位の一つが少なくともスルホン酸基を有する共重合体と、を備えるカチオン交換クロマトグラフィー担体であって、共重合体が実質的に架橋構造を形成しておらず、かつ共重合体がアクリルアミド及びアクリルアミド誘導体をモノマー単位として含まない、又は、実質的に影響を与えない範囲で含み、基材の質量に対する共重合体の質量の割合が５％以上２００％以下であり、スルホン酸基の密度が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高く２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、カチオン交換クロマトグラフィー担体が提供される。【００１９】
上記のカチオン交換クロマトグラフィー担体において、共重合体におけるスルホン酸基を有するモノマー単位のモル比率が、電荷を有しない中性モノマー単位のモル比率よりも小さくともよい。【００２０】
上記のカチオン交換クロマトグラフィー担体において、共重合体におけるスルホン酸基を有するモノマー単位の質量割合が、電荷を有しない中性モノマー単位の質量割合よりも小さくともよい。【００２１】
上記のカチオン交換クロマトグラフィー担体において、スルホン酸基を有するモノマー単位が、グリシジルメタクリレート誘導体であってもよい。【００２２】
上記のカチオン交換クロマトグラフィー担体において、中性モノマー単位が、少なくとも親水性モノマー単位を含み、共重合体中の中性モノマー単位における親水性モノマー単位のモル比率が５０％以上であってもよい。【００２３】
上記のカチオン交換クロマトグラフィー担体において、中性モノマー単位が、少なくとも親水性モノマー単位を含み、共重合体中の中性モノマー単位の総質量における親水性モノマー単位の質量の割合が５０％以上であってもよい。【００２４】
上記のカチオン交換クロマトグラフィー担体が、カルボキシル基を含まなくともよく、あるいは、カルボキシル基の密度がスルホン酸基の密度よりも低くともよい。【００２５】
上記のカチオン交換クロマトグラフィー担体において、基材が膜状であってもよい。【００２６】
また、本発明の態様によれば、上記のカチオン交換クロマトグラフィー担体を備える、生体分子精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体が提供される。【００２７】
上記の生体分子精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体が、抗体タンパク質精製用であってもよい。【００２８】
また、本発明の態様によれば、不純物及び生理活性物質を含む混合溶液から、生理活性物質を精製する精製方法であって、上記の生体分子精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体に対し、混合溶液を接触させることを含む、精製方法が提供される。【００２９】
上記の精製方法において、フロースルー方式で担体に対し、混合溶液を接触させてもよい。【００３０】
上記の精製方法において、混合溶液のｐＨが４．０以上１０．０以下であってもよい。【００３１】
上記の精製方法において、生理活性物質が抗体タンパク質の単量体であってもよい。【００３２】
上記の精製方法において、不純物が、抗体タンパク質の２量体以上の凝集体を含んでいてもよい。【００３３】
上記の精製方法において、生理活性物質の回収率が８０％以上であってもよい。【００３４】
上記の精製方法において、生体分子精製用カチオン交換クロマトグラフィー担体１ｍＬあたり、単量体と凝集体を含む抗体タンパク質１００ｍｇ以上を精製してもよい。【００３５】
上記の精製方法において、単量体と凝集体を含む抗体タンパク質溶液を精製した時に、凝集体割合を５０％以上低減させてもよい。【００３６】
上記の精製方法において、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の前又は後に、アニオン交換クロマトグラフィー担体を用いた精製を行うことを更に含んでいてもよい。【００３７】
上記の精製方法において、アニオン交換クロマトグラフィー担体が膜状であってもよい。【００３８】
上記の精製方法において、アニオン交換クロマトグラフィー担体を用いた精製がフロースルー方式であってもよい。【００３９】
上記の精製方法において、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程及びアニオン交換クロマトグラフィー担体を用いた精製工程の前に、アフィニティ−クロマトグラフィー工程を更に含んでいてもよい。【００４０】
上記の精製方法において、一連の精製工程で、バッファー交換を行わなくともよい。【００４１】
上記の精製方法において、アフィニティ−クロマトグラフィー工程が、バインドアンドエリュート方式で実施され、溶出工程において、１価酸からなるバッファーにより生理活性物質を溶出してもよい。【００４２】
上記の精製方法において、１価酸からなるバッファーの電気伝導度が１０．０ｍＳ／ｃｍ以下であってもよい。【００４３】
上記の精製方法において、アフィニティ−クロマトグラフィー工程の後に、混合溶液のｐＨを４．０以下とする工程を更に含んでいてもよい。【００４４】
上記の精製方法の一連の精製工程において、生理活性物質を含む混合溶液の電気伝導度が１０ｍＳ／ｃｍ以下であってもよい。
【発明の効果】
【００４５】
本発明に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体を用いれば、温度による影響を受けにくく、広いｐＨ範囲で効率よく多量の生理活性物質をフロースルー精製することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】抗体溶液をサイズ排除クロマトグラフィーで測定した際の吸光度のクロマトチャートである。
【図２】図１のクロマトチャートの拡大図である。
【図３】実施例１から１７及び比較例１から４の結果を示す表である。
【図４】実施例１８におけるカチオン交換膜の材料を示す表である。
【図５】実施例１９の結果を示す表である。
【図６】実施例２０及び２１の結果を示す表である。
【図７】実施例２２の結果を示す表である。
【図８】実施例２３から２５の結果を示す表である。
【図９】実施例２６の結果を示す表である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
以下、本発明の好適な実施の形態（以下において、「実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【００４８】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、基材と、基材に固定された共重合体と、を備える。共重合体のモノマー単位の一つは、少なくともスルホン酸基を有する。共重合体は、実質的に架橋構造を形成しておらず、かつ共重合体は、アクリルアミド及びアクリルアミド誘導体をモノマー単位として含まない、又は実質的に影響を与えない範囲で含む。また、基材の質量に対する共重合体の質量の割合であるグラフト率は５％以上２００％以下であり、スルホン酸基の密度は３０ｍｍｏｌ／Ｌより高く２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００４９】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、例えば、不純物を含む生理活性物質の精製に用いられる。生理活性物質とは、例えば、抗体タンパク質の単量体である。不純物とは、例えば抗体タンパク質の２量体以上の凝集体である。
【００５０】
生理活性物質の一例である抗体タンパク質は、生化学における一般的な定義のとおり、脊椎動物の感染防禦機構としてＢリンパ球が産生する糖タンパク質分子（ガンマグロブリン又は免疫グロブリンともいう）である。例えば、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体で精製される抗体タンパク質は、ヒトの医薬品として使用され、投与対象であるヒトの体内にある抗体タンパク質と実質的に同一の構造を有する。
【００５１】
抗体タンパク質は、ヒト抗体タンパク質であってもよく、ヒト以外のウシ及びマウス等の哺乳動物由来抗体タンパク質であってもよい。あるいは、抗体タンパク質は、ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質、及びヒト化抗体タンパク質であってもよい。ヒトＩｇＧとのキメラ抗体タンパク質とは、可変領域がマウスなどのヒト以外の生物由来であるが、その他の定常領域がヒト由来の免疫グロブリンに置換された抗体タンパク質である。また、ヒト化抗体タンパク質とは、可変領域のうち、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＣＤＲ）がヒト以外の生物由来であるが、その他のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ：  ＦＲ）がヒト由来である抗体タンパク質である。ヒト化抗体タンパク質は、キメラ抗体タンパク質よりも免疫原性がさらに低減される。
【００５２】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体の精製対象の一例である抗体タンパク質のクラス（アイソタイプ）及びサブクラスは特に限定されない。例えば、抗体タンパク質は、定常領域の構造の違いにより、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，及びＩｇＥの５種類のクラスに分類される。しかし、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質は、５種類のクラスのいずれであってもよい。また、ヒト抗体タンパク質においては、ＩｇＧにはＩｇＧ１〜ＩｇＧ４の４つのサブクラスがあり、ＩｇＡにはＩｇＡ１とＩｇＡ２の２つのサブクラスがある。しかし、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質のサブクラスは、いずれであってもよい。なお、Ｆｃ領域にタンパク質を結合したＦｃ融合タンパク質等の抗体関連タンパク質も、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質に含まれ得る。
【００５３】
さらに、抗体タンパク質は、由来によっても分類することができる。しかし、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質は、天然のヒト抗体タンパク質、遺伝子組換え技術により製造された組換えヒト抗体タンパク質、モノクローナル抗体タンパク質、及びポリクローナル抗体タンパク質のいずれであってもよい。これらの抗体タンパク質の中でも、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体が精製対象とする抗体タンパク質としては、抗体医薬としての需要や重要性の観点から、ヒトＩｇＧが好適であるが、これに限定されない。
【００５４】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、フロースルー精製に適している。フロースルーとは、目的の生理活性物質を担体に捕捉させず、透過させることを意図する精製方法をいう。例えば、抗体タンパク質の単量体が目的物で、抗体タンパク質の凝集体が不純物である場合、抗体タンパク質単量体は担体に吸着することなく透過し、抗体タンパク質の凝集体が担体に吸着する。この時、抗体タンパク質の単量体は担体に吸着されてもよいが、抗体タンパク質の凝集体がより選択的に担体に吸着されることにより、抗体タンパク質の単量体が精製される。
【００５５】
実施の形態に係るカチオン交換担体が備える基材の形状は、特に限定されないが、膜状であれば一般的に高流速での処理が可能となる。膜の形状としては、中空糸状、平膜状、不織布状、モノリス、キャピラリー、焼結体、円板、及び円筒状等が挙げられる。また、材料も特に限定を受けないが、ポリオレフィン系重合体や、ポリアミド（ナイロン）、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、あるいはセルロース等から構成されていることが好ましい。
【００５６】
ポリオレフィン系重合体としては、例えば、エチレン、プロピレン、ブチレン及びフッ化ビニリデンなどのオレフィン単独重合体、該オレフィンの２種以上の共重合体、又は１種もしくは２種以上のオレフィンと、パーハロゲン化オレフィンと、の共重合体などが挙げられる。パーハロゲン化オレフィンとしては、テトラフルオロエチレン及び／又はクロロトリフルオロエチレンなどが挙げられる。これらの中でも、機械的強度に優れ、かつタンパク質などの夾雑物の高い吸着容量が得られる点で、ポリエチレン又はポリフッ化ビニリデンが好ましい。また、ポリアミドとしては特に限定を受けないが、ナイロン６（ε−カプロラクタムの重縮合体）、ナイロン１１（ウンデカンラクタムの重縮合体）、ナイロン１２（ラウリルラクタムの重縮合体）、ナイロン６６（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６１０（ヘキサメチレンジアミンとアジピン酸の共縮重合体）、ナイロン６Ｔ（ヘキサメチレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン９Ｔ（ノナンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロンＭ５Ｔ（メチルペンタンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体）、ナイロン６２１（カプロラクタムとラウリルラクタムの共縮重合体）、ｐ−フェニレンジアミンとテレフタル酸の共縮重合体、並びにｍ−フェニレンジアミンとイソフタル酸の共縮重合体等が挙げられる。ポリエステルとしては、特に限定を受けないが、ポリエチレンテレフタレート、ポリトリメチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、及びポリブチレンナフタレート等が挙げられる。
【００５７】
基材は、例えば複数の細孔を有する。細孔径は、特に限定されないが、基材が中空糸状の場合は、例えば５ｎｍ以上１０００ｎｍ以下であり、好ましくは１０ｎｍ以上、より好ましくは５０ｎｍ以上、さらに好ましくは１００ｎｍ以上、特に好ましくは１５０ｎｍ以上、あるいは４００ｎｍ以上である。また、基材膜表面積の観点から、細孔径は、好ましくは９００ｎｍ以下、より好ましくは８００ｎｍ以下、さらに好ましくは７００ｎｍ以下、特に好ましくは６５０ｎｍ以下である。細孔径が５ｎｍ以上であると、分離できる抗体タンパク質の分子量が大きくなる傾向にある。また細孔径が１０００ｎｍ以下であると、当該膜状基材の表面積が大きくなり、不純物の結合容量も大きくなる傾向にある。
【００５８】
なお、基材が平膜状や不織布状の場合は、当該カチオン交換クロマトグラフィー担体を使用する際に、支持体を用いることが可能であることや、積層しての使用が可能であるため、細孔径の好適範囲が広くなる。そのため、基材が平膜状や不織布状の場合は、細孔径の好ましい範囲は、１０ｎｍ以上１ｍｍ以下であり、好ましくは１００ｎｍ以上、より好ましくは２００ｎｍ以上、更に好ましくは３００ｎｍ以上である。また表面積の観点から、細孔径は、好ましくは５００ｕｍ以下、より好ましくは３００ｕｍ以下、更に好ましくは１００ｕｍ以下である。
【００５９】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、グラフト重合法により基材に共有結合で固定された共重合体を備える。グラフト重合法としては、放射線グラフト重合法や、表面リビングラジカル重合法が挙げられる。
【００６０】
放射線グラフト重合法で基材表面に共重合体を固定する場合、基材にラジカルを生成させるためにはいかなる手段も採用しうるが、基材に電離性放射線を照射すると、基材全体に均一なラジカルが生成するため、好適である。電離性放射線の種類としては、γ線、電子線、β線、及び中性子線等が利用できるが、工業規模での実施には電子線又はγ線が好ましい。電離性放射線は、コバルト６０、ストロンチウム９０、及びセシウム１３７などの放射性同位体から、又はＸ線撮影装置、電子線加速器及び紫外線照射装置等により得られる。
【００６１】
電離性放射線の照射線量は、１ｋＧｙ以上１０００ｋＧｙ以下が好ましく、より好ましくは２ｋＧｙ以上５００ｋＧｙ以下、さらに好ましくは５ｋＧｙ以上２００ｋＧｙ以下である。照射線量が１ｋＧｙ以上の場合、ラジカルが均一に生成しやすい傾向にある。また、膜状基材の物理的強度の観点から、照射線量が１０００ｋＧｙ以下であるとよい。
【００６２】
電離性放射線の照射によるグラフト重合法には、一般に基材にラジカルを生成した後、次いでラジカルを反応性化合物と接触させる前照射法と、基材を反応性化合物と接触させた状態で基材にラジカルを生成させる同時照射法と、に大別される。実施の形態においては、いかなる方法も適用しうるが、オリゴマーの生成が少ない前照射法が好ましい。ここでいうオリゴマーとは、遊離オリゴマーのことを指す。遊離オリゴマーはグラフト鎖中には取り込まれないため、生成されないことが好ましい。
【００６３】
実施の形態において共重合体の重合時に使用する溶媒は、反応性化合物を均一溶解できるものであれば特に限定されない。このような溶媒として、例えば、メタノールやエタノール、イソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等のアルコール類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトンや２−ブタノン等のケトン類、水、又はそれらの混合物等が挙げられる。
【００６４】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体の基材に固定された共重合体は、モノマー単位の一つが少なくともスルホン酸基を有する。
【００６５】
カチオン交換基を有する共重合体が基材にグラフト重合法により固定されていることにより、グラフト鎖に存在するカチオン交換基が立体的に配置される。そのため、基材表面上にのみカチオン交換基が分布している場合に比べ、吸着対象分子を立体的に吸着することが可能となる。よって、抗体を精製する際、抗体単量体に比べて分子量の大きい抗体凝集体は、グラフト鎖上のカチオン交換基と多点結合することにより選択的に基材に吸着され、抗体単量体を高い純度で得ることが可能となる。
【００６６】
抗体精製プロセスでは、抗体凝集体だけでなく、広範囲のｐＩ分布を有する宿主細胞由来のタンパク質（ＨＣＰ）等の除去も重要であるため、カチオン交換担体でのフロースルー精製では、低いｐＨでも精製できることが好ましい。そのため、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、カルボン酸基等の弱カチオン交換基と比較して、低いｐＨでも荷電し不純物を吸着することができる、強カチオン交換基であるスルホン酸基を備える。
【００６７】
また、抗体単量体に比べて抗体凝集体をより強固に吸着させる選択性の観点から、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体においては、共重合体は実質的に架橋構造ではない。共重合体が実質的に架橋構造ではない場合には、基材上の共重合体の分子鎖が通液に伴って立ち上がるため、抗体凝集体が基材に立体的に吸着することができる。
【００６８】
ここで、実質的に架橋構造ではないとは、架橋構造を有していても実質的に抗体凝集体の吸着性能に影響を与えない程度に架橋度の低いことを含む。架橋構造は、共重合体が、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位を含むことにより、共重合体内に、あるいは隣接する共重合体同士の間に形成される。共重合体が実質的に架橋構造ではない場合、重合性官能基を２つ以上含むモノマー単位の、共重合体における質量割合は、例えば、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、又は０．１％以下であり、低いほど好ましい。
【００６９】
さらに、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、アクリルアミド及びアクリルアミド誘導体をモノマー単位として含まないか、実質的に影響を与えない範囲でアクリルアミド及びアクリルアミド誘導体をモノマー単位として含む。
【００７０】
共重合体がアクリルアミド及びアクリルアミド誘導体をモノマー単位として含む場合、共重合体は温度応答性を有する。そのため、共重合体がアクリルアミド及びアクリルアミド誘導体の少なくともいずれかを含むと、精製時の温度により、不純物除去の性能が変化する傾向にある。これに対し、精製工程の再現性、安定性のため、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、アクリルアミド及びアクリルアミド誘導体を含まないか、含んだとしても影響を与えない範囲で含む。影響を与えない範囲で含むとは、例えば、共重合体の全モノマー単位の中において、アクリルアミド及び／又はアクリルアミド誘導体を、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、３％以下、２％以下、あるいは１％以下の質量割合で含むことをいう。
【００７１】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体のグラフト鎖の結合率（グラフト率）は、基材の密度により、最適値が異なりうる。基材がポリエチレンの場合は、吸着容量及び立体的な吸着の観点から１０％以上が好ましく、より好ましくは２５％以上、更に好ましくは３０％以上、特に好ましくは４０％以上、５０％以上、６０％以上、又は７０％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは２００％以下、より好ましくは１５０％以下、更に好ましくは１２０％以下である。グラフト率は下記式（１）によって表される。
ｄｇ（％）＝（ｗ１−ｗ０）／ｗ０×１００      （１）
ここで、ｗ０はグラフト鎖が導入される前の基材（例えば、多孔質中空糸）の質量、ｗ１はグラフト鎖が導入された後の基材の質量である。本開示において、グラフト率は、グラフト重合後の官能基変換による質量変化は考慮せず、グラフト重合前後の質量変化により定義している。
【００７２】
基材がポリフッ化ビニリデンの場合は、ポリフッ化ビニリデンはポリエチレンに比べ、密度が高いため、適したグラフト率がポリエチレンの場合と異なる。基材がポリフッ化ビニリデンの場合は、吸着容量の観点から５％以上が好ましく、より好ましくは１０％以上である。また、力学的に安定な強度を確保するという観点から、好ましくは１００％以下、より好ましくは８０％以下、更に好ましくは７０％以下である。
【００７３】
また、グラフト鎖の割合は、カチオン交換クロマトグラフィー担体体積当たりのグラフト鎖の質量（グラフト鎖密度）として表すことも出来る。その場合、吸着容量等の観点から、グラフト鎖密度は、０．０３ｇ／ｍＬ以上が好ましく、より好ましくは０．０４ｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは０．０５ｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは０．０６ｇ／ｍＬ以上、０．０７ｇ／ｍＬ以上、０．０８ｇ／ｍＬ以上、０．０９ｇ／ｍＬ以上、０．１ｇ／ｍＬ以上、０．１１ｇ／ｍＬ以上、又は０．１２ｇ／ｍＬ以上である。力学的に安定な強度の観点からは、好ましくは０．２５ｇ／ｍＬ以下、より好ましくは０．２０ｇ／ｍＬ以下、更に好ましくは０．１８ｇ／ｍＬ以下である。本開示において、上記の値は、製造の過程でなく、最終産物として得られたカチオン交換担体のグラフト鎖の量から算出している。グラフト鎖密度は下記式（２）によって表される。
ｓｇ（ｇ／ｍＬ）＝（ｗ２−ｗ０）／ｖ１×１００      （２）
ここで、ｗ２は最終産物として得られたカチオン交換クロマトグラフィー担体の質量であり、ｖ１は最終産物として得られたカチオン交換クロマトグラフィー担体の体積である。なお、上述したように、式（１）においては、ｗ１は、グラフト重合直後で、その後の官能基変換を行う前の基材の質量である。
【００７４】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体におけるスルホン酸基の密度の範囲は、３０ｍｍｏｌ／Ｌより高く、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。「密度」とは、カチオン交換クロマトグラフィー担体１リットル当たりのカチオン交換基のモル数の濃度として一般的に表される。カチオン交換基の密度は吸着容量の観点から、３０ｍｍｏｌ／Ｌより高く、好ましくは３５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは４０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、更に好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、６０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、７０ｍｍｏｌ／Ｌ以上である。また、カチオン交換基密度が高すぎると、抗体の単量体と凝集体の選択性が悪くなる傾向にあることから、２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは１７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
【００７５】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、スルホン酸基に加え、カルボキシル基等の弱カチオン交換基を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。しかし、カルボキシル基等の弱カチオン交換基を含むと、抗体溶液のｐＨにより、カチオン交換体の状態が大きく変化する傾向にあるため、実質的にカルボキシル基等の弱カチオン交換基を含まないことが好ましい。実質的に弱カチオン交換基を含まないとは、強カチオン交換基と弱カチオン交換基の量比にもよるが、カルボン酸基密度が１５ｍｍｏｌ／Ｌ未満、または１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満、または５ｍｍｏｌ／Ｌ未満であることをいう。カルボキシル基を含む場合には、カルボキシル基の密度よりもスルホン酸基の密度の方が高いことが好ましく、カルボン酸基の密度は、例えば、スルホン酸基の１／２以下、より好ましくは１／３以下、更に好ましくは１／４以下、また更に好ましくは１／５以下、特に好ましくは１／６以下である。このような範囲であると、抗体溶液のｐＨの微細な変化に影響を受けず、精製結果の再現性を得やすい傾向にある。
【００７６】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体においては、抗体単量体と抗体凝集体の選択的吸着性の観点から、共重合体において、スルホン酸基を有するモノマー単位のモル比率が、電荷を有しない中性モノマー単位のモル比率よりも小さいことが好ましく、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／３以下、更に好ましくは１／４以下、特に好ましくは１／５以下である。同様に、共重合体における、中性モノマー単位の質量に対するスルホン酸基を有するモノマー単位の質量の割合は、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／３以下、更に好ましくは１／４以下、特に好ましくは１／５以下である。
【００７７】
同じく凝集体の選択的吸着性の観点から、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体の合成における反応溶液の仕込み組成としては、スルホン酸基を有するモノマー又はスルホン酸基導入前駆体を有するモノマーのモル比率が、中性モノマーのモル比率よりも小さいことが好ましく、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／３以下、更に好ましくは１／４以下、特に好ましくは１／５以下である。同様に、中性モノマーの質量に対する、スルホン酸基を有するモノマー又はスルホン酸基導入前駆体を有するモノマーの質量の割合は、好ましくは１／２以下、より好ましくは１／３以下、更に好ましくは１／４以下、特に好ましくは１／５以下である。
【００７８】
実施の形態に係るカチオン交換基を導入する方法としては特に限定を受けないが、グラフト重合の際に、スルホン酸基を有するモノマーを含める方法や、「スルホン酸基導入前駆体」を有するモノマーを含めて共重合した後、スルホン酸基導入前駆体をスルホン酸基に変換する方法等が挙げられる。
【００７９】
ここでいう、「スルホン酸基導入前駆体」とは、スルホン酸基を付与しうる官能基のことをいい、例えばエポキシ基等が挙げられるが、これに限定されるものではない。「スルホン酸基導入前駆体」を有するモノマーとは、スルホン酸基を付与しうる官能基を有するモノマーのことをいう。また、「スルホン酸基導入前駆体」は「スルホン酸基の前駆体」を含みうる。「スルホン酸基の前駆体」とは、例えばスルホン酸基に保護基が付いたものである。「スルホン酸基の前駆体」を有するモノマーとしては、フェニルビニルスルホネート等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
スルホン酸基を有するモノマー単位の例として、スルホン酸を有するポリマーの構成単位である（メタ）アクリルアミドアルキルスルホン酸、ビニルスルホン酸、アクリルアミドｔ−ブチルスルホン酸、及びスチレンスルホン酸等が挙げられる。
【００８１】
スルホン酸基導入前駆体を有するモノマーとして、スチレン及びグリシジルメタクリレート等が挙げられる。グリシジルメタクリレート等の少なくとも一部がメタクリル酸誘導体又はアクリル酸誘導体である強カチオン交換基導入前駆体モノマーを用いることで、強カチオン交換基を有するモノマーを表面リビングラジカル重合法により重合する場合であっても、十分な重合速度を得ることができる。
【００８２】
スルホン酸基導入前駆体を有するモノマーがグリシジルメタクリレートの場合、グリシジルメタクリレートを重合した後、亜硫酸ナトリウムと反応させることにより、グリシジルメタクリレートのエポキシ基の一部又は全部をスルホン酸基に変換することもできる。エポキシ基をスルホン酸基へ変換することにより、カチオン交換基密度を高めることができる。
【００８３】
実施の形態に係る共重合体中の中性モノマー単位は、アクリルアミド誘導体をモノマー単位として含まない、又は、実質的に影響を与えない範囲で含むことの他には特に限定を受けない。中性モノマー単位には、親水性モノマー単位と、疎水性モノマー単位があるが、どちらを含んでいてもよい。
【００８４】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体は、グラフト鎖により抗体凝集体等の不純物の立体的な吸着を行うため、共重合体中の中性モノマー単位の総質量における、親水性モノマー単位の質量の割合が５０％以上であることが好ましい。より好ましくは６０％以上であり、更に好ましくは７０％以上、より更に好ましくは８０％以上、あるいは１００％でもよい。親水性モノマーの割合が多ければ、水溶液中でグラフト鎖が立ち上がり、立体的に吸着しやすい傾向にある。共重合体の中性モノマー単位における親水性モノマー単位のモル比率は、５０％以上が好ましく、より好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上、より更に好ましくは８０％以上、あるいは１００％でもよい。
【００８５】
同じく、立体的な吸着の観点から、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体の合成における反応溶液の仕込み組成としては、中性モノマーの総質量における、親水性モノマーの質量の割合が、５０％以上であることが好ましい。より好ましくは６０％以上であり、更に好ましくは７０％以上であり、より更に好ましくは８０％以上、あるいは１００％でもよい。仕込み組成の中性モノマーにおける親水性モノマー及びのモル比率は５０％以上であることが好ましく、より好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上、より更に好ましくは８０％以上、あるいは１００％でもよい。
【００８６】
そのような親水性モノマーとして、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、３−ヒドロキシプロピルアクリレート、３−ヒドロキシプロピルメタクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、４−ヒドロキシブチルメタクリレート、２−（ジメチルアミノ）エチルアクリレート、及び２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート等の（メタ）アクリレート化合物、並びにそれらの混合物等が挙げられ、２−ヒドロキシエチルメタクリレート及び２−ヒドロキシプロピルメタクリレートが好ましい。
【００８７】
また、上述のようにグリシジルメタクリレートのエポキシ基をスルホン酸基に変換した後の未反応のエポキシ基を酸で処理することにより、ジオールに変換することができる。この場合、エポキシ基から変換されたジオールを含むモノマー単位は、親水性である。通常、未反応のエポキシ基は、０．５ｍｏｌ／Ｌの硫酸を用いて８０℃で２時間程度反応させると、全てジオールに変換される。
【００８８】
共重合体中の中性モノマー単位は、疎水性モノマー単位を含んでいてもよいし、含まなくてもよい。疎水性モノマー単位を含むことにより、抗体との疎水性相互作用を強くし、より不純物除去効率が向上する場合もある。
【００８９】
そのような疎水性モノマー単位として、スチレン類、アルキルアクリルアミド類、アルキルメタクリルアミド類、アルキルアクリレート類、及びアルキルメタクリレート類等があるが、力学的強度の観点から、アルキルアクリルアミド類、アルキルメタクリルアミド類、アルキルアクリレート類、及びアルキルメタクリレート類が好ましい。アルキル基に関しては、炭素数４以上の直鎖又は分岐状のアルキル基であれば、抗体に対し、実質的に疎水性相互作用を発現しうる。
【００９０】
実施の形態に係る純度の向上した生理活性物質を得る精製方法は、不純物と生理活性物質を含む混合溶液から、生理活性物質を精製する精製方法であって、上述したカチオン交換クロマトグラフィー担体に対し、混合溶液を接触させることを含む。実施の形態に係る精製方法による生理活性物質の回収率は、例えば８０％以上である。回収率は、下記式（３）に基づいて算出される。
回収率
＝（抗体回収量×処理後単量体成分純度）／（抗体処理量×処理前単量体成分純度）
（３）
【００９１】
実施の形態に係るフロースルー精製のクロマトグラフィーの移動相としては、強酸、強アルカリ以外の緩衝液（バッファー）を利用すればよく、有機溶媒を必要としない。ここで、緩衝液とは、具体的には、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、及び酢酸緩衝液等が挙げられるが、通常利用される緩衝液であれば特に限定されるものではない。バッファー（緩衝液）濃度は、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは２ｍｍｏｌ／Ｌ以上１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ以上７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、特に好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。ここで、バッファー濃度とは、バッファーの有効成分の濃度のことをいう。例えば通常酢酸と酢酸ナトリウムから調整される酢酸バッファーであれば、酢酸と酢酸ナトリウムの合計の濃度である。また、トリスバッファーでは、トリスヒドロキシメチルアミノエタンの濃度のことをいう。なお、酢酸−トリスバッファー等のように表記されているバッファーについては、前者の濃度のことであり、酢酸−トリスでは酢酸、トリス−酢酸であればトリスの濃度のことをいう。
【００９２】
実施の形態に係る緩衝液は、塩化ナトリウム等の無機塩類を含んでいても、含んでいなくてもよい。その無機塩類の濃度は０ｍｍｏｌ／Ｌ以上１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ以上９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ以上８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ以上７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ以上６０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ以上５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ以上４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。ただし、緩衝液の無機塩類の好適な濃度は、処理するタンパク質の等電点や大きさ、緩衝液のｐＨの組み合わせによって変わりうる。
【００９３】
実施の形態に係る緩衝液を電気伝導度という尺度で表すと、０．５ｍＳ／ｃｍ以上２０ｍＳ／ｃｍ以下であり、好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ以上１５ｍＳ／ｃｍ以下、より好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ以上１０ｍＳ／ｃｍ以下、更に好ましくは０．８ｍＳ／ｃｍ以上８ｍｓ／ｃｍ以下、更に好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ以上５ｍＳ／ｃｍ以下、更に好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ以上４ｍＳ／以下、更に好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ以上３ｍＳ／ｃｍ以下である。ただし、緩衝液の好適な電気伝導度は、処理するタンパク質の等電点や大きさ、緩衝液のｐＨとの組み合わせによって変わりうる。
【００９４】
緩衝液のｐＨは、好ましくは４．０以上１０．０以下、より好ましくは４．５以上９．５以下、特に好ましくは５．０以上９．０以下である。ただし、緩衝液の好適なｐＨは、処理するタンパク質の等電点や大きさ、緩衝液の無機塩類の濃度の組み合わせによって変わりうる。
【００９５】
実施の形態に関わるカチオン交換クロマトグラフィーを用いたフロースルー精製における、抗体溶液をロードする際の流速は、精製効率の観点から、１分間あたり、膜体積の１倍以上が好ましく、より好ましくは２倍以上、更に好ましくは３倍以上、または４倍以上、特に好ましくは５倍以上である。また、不純物との接触時間との観点から、３０倍以下が好ましく、より好ましくは２０倍以下、更に好ましくは１５倍以下、特に好ましくは１０倍以下である。
【００９６】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィーを用いたフロースルー精製における単量体及び凝集体を含む抗体タンパク質のロード量は、特に限定を受けないが、担体１ｍＬあたり１００ｍｇ以上であり、効率的な精製という観点から、担体１ｍＬあたり５００ｍｇ以上が好ましく、より好ましくは７００ｍｇ以上、更に好ましくは８００ｍｇ以上、また更に好ましくは９００ｍｇ以上、特に好ましくは１ｇ以上である。
【００９７】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィーを用いたフロースルー精製における単量体及び凝集体を含む抗体タンパク質溶液の濃度は、例えば２．０ｍｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは３．０ｍｇ／ｍＬ以上、より好ましくは４．０ｍｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは４．５ｍｇ／ｍＬ以上、より更に好ましくは５．０ｍｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは５．５ｍｇ／ｍＬ以上であり、また、６．０ｍｇ／ｍＬ以上、７．０ｍｇ／ｍＬ以上等も好ましい。抗体タンパク質溶液の濃度が高いほど、精製効率が高くなる傾向にある。
【００９８】
実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィーを用いたフロースルー精製によれば、抗体タンパク質中における凝集体の割合が５０％以上低減され、より好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上低減され、特に好ましくは８０％以上低減される。なお、抗体タンパク質の凝集体の割合の低減率とは、図１に示すクロマトチャートの一部を拡大した図２における処理前の凝集体成分（１）、（２）の含有率から処理後の凝集体成分（１）、（２）の含有率の差をとり、当該差を、処理前の凝集体成分（１）、（２）の含有率で割った値の百分率表示である。凝集体成分（１）、（２）のそれぞれの含有率は、図２に例示するように、クロマトチャートのピークの面積から算出される。
【００９９】
また、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィーによる精製工程に加え、アニオン交換クロマトグラフィーによる精製工程と組み合わせることにより、精製物の純度をさらに向上しうる。具体的には、実施の形態に係るフロースルー精製において、目的物質よりも低いｐＩを有する不純物を除去する場合には、アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製を組み合わせてもよい。実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、を組み合わせることにより、目的物質のｐＩよりも高いｐＩを有する不純物の除去性を保持したまま、効率のよい精製を達成できる。
【０１００】
目的物質よりも低いｐＩを有する不純物とは、特に限定を受けないが、例えば、宿主細胞由来のタンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、及びアフィニティークロマトグラフィー工程由来の不純物であるプロテインＡ等がある。
【０１０１】
アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程は、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の前であってもよいし、後であってもよい。
【０１０２】
アニオン交換クロマトグラフィー担体は、特に限定を受けないが、膜状であれば、高流速での処理が可能であり、より効率のよい精製工程の構築が可能である。また、アニオン交換クロマトグラフィー担体は、基材上にグラフト重合鎖を有する構造であってもよい。基材上にグラフト重合体を有する構造であれば、不純物に立体的に吸着することができるため、より高い不純物除去性が得られうる。
【０１０３】
アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製方法については、特に限定を受けないが、フロースルー精製であればより効率的に精製することが可能である。
【０１０４】
アニオン交換クロマトグラフィー工程における単量体及び凝集体を含む抗体タンパク質のロード量は、不純物を除去できれば特に限定を受けないが、効率的な精製という観点から、担体１ｍＬあたり０．２ｇ以上が好ましく、より好ましくは０．５ｇ以上、更に好ましくは１．０ｇ以上、また更に好ましくは２．０ｇ以上、特に好ましくは４．０ｇ以上である。
【０１０５】
カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程と、アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間に、バッファー交換をしてもよいし、しなくてもよい。バッファー交換をしない場合、より効率的な精製ができる。
【０１０６】
カチオン交換クロマトグラフィー担体における精製工程と、アニオン交換クロマトグラフィー担体における精製工程と、は、連続で行ってもよいし、先の工程終了後、一旦タンクに貯蔵し、次の工程を行ってもよい。
【０１０７】
カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程とアニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間に、溶液のｐＨの調整を行ってもよい。ｐＨを調整することにより、より前者の処理ｐＨ付近のｐＩを有する不純物の除去性が高くなる。具体的には、先にカチオン交換クロマトグラフィー担体による精製を行う場合には、アニオン交換クロマトグラフィー担体による精製の前に、溶液に塩基を加えて溶液のｐＨを上げることにより、不純物がマイナスに帯電するため、アニオン交換クロマトグラフィーでより不純物を除去できるようになる。また、先にアニオン交換クロマトグラフフィー担体による精製を行う場合には、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製の前に、溶液に酸を加えて溶液のｐＨを低くすることにより、不純物がプラスに帯電するため、カチオン交換クロマトグラフィーで除去できる不純物のｐＩの範囲が広くなり、より不純物を除去できるようになる。変化させるｐＨの値は不純物除去性が向上すれば特に限定を受けないが、標的となる不純物に応じて任意に変化させることができる。ｐＨの変化量の値としては、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、及び３．０等があげられ、これらの値でもよいし、それぞれの間の値でもよい。不純物を除去できれば特に限定は受けないが、好ましくは、ｐＨを０．１以上変化させれば不純物除去性が特に向上する。
【０１０８】
また、ｐＨと同様に、カチオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程とアニオン交換クロマトグラフィー担体による精製工程の間に、溶液の電気伝導度の調整を行ってもよい。変化させる電気伝導度の値は不純物除去性が向上すれば特に限定を受けないが、標的となる不純物に応じて任意に変化させることができる。電気伝導度の変化量の値として、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、及び５．０ｍＳ／ｃｍ等が挙げられ、これらの値でもよいし、それぞれの間の値でもよい。
【０１０９】
また、一般に、抗体精製において、アフィニティークロマトグラフィーによる精製がなされた後に、イオン交換クロマトグラフィー工程による精製が行われるが、実施の形態に係るカチオン交換クロマトグラフィーによる精製工程及びアニオン交換クロマトグラフィー工程の前に、アフィニティークロマトグラフィー工程を行ってもよい。アフィニティークロマトグラフィー工程後に、上記カチオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製及びアニオン交換クロマトグラフィー工程を行うことにより、より純度の高い目的物を得ることが可能となる。アフィニティークロマトグラフィー担体とは、例えばプロテインＡやプロテインＧを担持された担体のことをいう。アフィニティ−クロマトグラフィー工程は、例えば、バインドアンドエリュート方式で実施される。
【０１１０】
アフィニティークロマトグラフィー工程後の抗体を含む溶出液のバッファー交換を行わずに、カチオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製及びアニオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製を行うことで、効率的な精製が可能である。そのような溶出液として、１価酸を主成分として含むバッファーがあり、例えば酢酸バッファーが挙げられる。
【０１１１】
一般的にアニオン交換クロマトグラフィー工程では、多価酸を主成分とする溶出バッファーを用いると、吸着量が低下し、不純物除去性能が低下する傾向にあるため、アフィニティークロマトグラフィー工程で多価酸を主成分とする溶出バッファーを用いた場合、アニオン交換クロマトグラフィーまでにバッファーを交換しておくことが好ましい。したがって、１価酸を主成分とする溶出バッファーを用いてアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出を行うことにより、バッファー交換の必要なく、より簡便にカチオン交換クロマトグラフィー工程及びアニオン交換クロマトグラフィー工程による精製が可能となる。
【０１１２】
１価酸を主成分とする溶出バッファーについては、アフィニティークロマトグラフィー工程において溶出が可能であり、その後のイオン交換クロマトグラフィー工程において、不純物が除去できれば特に限定を受けないが、酢酸が好ましい。溶出バッファーが酢酸であれば、バッファー交換等をしなくても、その後の工程で求められるｐＨに容易に調整が可能である。
【０１１３】
また、アフィニティークロマトグラフィー工程の溶出に使用する溶出バッファーは、以下に限定されないが、その後のカチオン交換クロマトグラフィーによるフロースルー精製の不純物除去性の観点から、電気伝導度が１０．０ｍＳ／ｃｍ以下であることが好ましく、より好ましくは７．０ｍＳ／ｃｍ以下、更に好ましくは５．０ｍＳ／ｃｍ以下、更に好ましくは３．０ｍＳ／ｃｍ以下、特に好ましくは２．５ｍＳ／ｃｍ以下である。バッファー濃度の観点からいえば、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、より好ましくは５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に好ましくは４０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、更に更に好ましくは３０ｍｍｏｌ／Ｌ以下、特に好ましくは２５ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
【０１１４】
また、生理活性物質を溶出させる溶出プールの電気伝導度を低く保つために、アフィニティークロマトグラフィー工程の溶出の直前に、電気伝導度の低い緩衝液で担体を洗浄することが好ましい。緩衝液としては、生理活性物質を溶出させることがないようｐＨが十分に高く、電気伝導度が十分低ければよい。溶出プールの電気伝導度を低く保つことにより、その後の工程で、求められる電気伝導度に容易に調整が可能である。また、生理活性物質の変性や凝集体の生成を防ぐことができる。
【０１１５】
そのようなｐＨとして、５．０以上が好ましく、より好ましくは６．０以上、更に好ましくは７．０以上であり、電気伝導度としては、１０．０ｍＳ／ｃｍ以下であることが好ましく、より好ましくは７．０ｍＳ／ｃｍ以下、更に好ましくは５．０ｍＳ／ｃｍ以下、特に好ましくは３．０ｍＳ／ｃｍ以下である。
【０１１６】
また、アフィニティークロマトグラフィー工程での溶出後に、溶出液に含まれうるウイルスを酸性（低ｐＨ）条件に一定時間曝すことにより、ウイルスの不活化を行ってもよい。ウイルスを不活化するためには、ｐＨは４．０以下が好ましく、より好ましくは３．８以下、更に好ましくは３．６以下、また更に好ましくは３．５以下、特に好ましくは３．４以下である。
【０１１７】
溶出液を低ｐＨに調整する酸としては特に限定を受けず、強酸であっても、弱酸であってもよい。ただし、添加する量が少なくてよいことや、その後の中和操作の簡便さの観点から、酸は強酸であることが望ましい。そのような強酸として、例えば塩酸が挙げられる。
【０１１８】
実施の形態に係る生理活性物質を含む混合溶液の電気伝導度は、アフィニティークロマトグラフィー工程、低ｐＨ処理によるウイルス不活化、カチオン交換クロマトグラフィー工程、及びアニオン交換クロマトグラフィー工程を含む一連の工程で、常に１０ｍＳ／ｃｍ以下であってもよい。電気伝導度が常に１０ｍｓ／ｃｍ以下であると、不純物が取り除きやすい傾向にある。電気伝導度は、９．０以下でもよく、好ましくは８．０以下、より好ましくは７．０以下、更に好ましくは６．０以下、更に好ましくは５．０以下、更に好ましくは４．０以下、特に好ましくは３．０以下である。
【実施例】
【０１１９】
以下に、実施の形態を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは実施の形態を何ら限定するものではない。【０１２０】
（実施例１）
実施例１では、放射線グラフト重合法によって中空糸状のカチオン交換膜を作製した。
１）カチオン交換膜の作製
２−ヒドロキシエチルメタクリレート７．０７ｇ、グリシジルメタクリレート０．７９ｇをメタノール１１３ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．０３ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、５５ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、６．１３ｇ、グラフト率１０３％の中空糸膜を得た。【０１２１】
放射線グラフト重合法によりグラフト鎖を導入した中空糸を、亜硫酸ナトリウムと、イソプロピルアルコールの混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／イソプロピルアルコール／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）１６０ｇに投入し、８０℃で２０時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、純水で洗浄した。その後、この中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。水及びメタノールで洗浄した後真空乾燥させ、６．２９ｇの、カチオン交換膜１を得た。【０１２２】
この中空糸１本（０．４１９ｇ）をエタノールにより湿潤させ、水に置換した後、水を入れたメスシリンダーに投入して体積の増加分により体積を測定したところ、１．４ｍＬであった。基材膜の質量が０．２０２ｇであることから、グラフト鎖の質量は０．２１７ｇ、密度は０．１５６ｇ／ｍＬであった。水を除去した後、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加えた。１時間放置した後、水酸化ナトリウム水溶液を取り出し、純水１０ｍＬを加えた。更に１時間放置した後、純水を回収することにより、膜内に残った水酸化ナトリウムを回収した。回収した水酸化ナトリウム溶液を統合し、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸により滴定をおこなったところ、８．８８ｍＬを要した。ブランク（イオン交換基を有しない中空糸）の滴定では１０．０５ｍＬであったことから、水酸化ナトリウムと反応した、カチオン交換膜が有するスルホン酸基の量は１４０ｕｍｏｌ（０．０００１４０ｍｏｌ）であった。これを測定した体積で除して算出されたスルホン酸基の密度は１００ｍｍｏｌ／Ｌであった。得られたカチオン交換膜１をモジュール化（膜体積０．３０ｍＬ）し、実施例１に係るカチオン交換膜１とした。【０１２３】
スルホン酸基を有するモノマー単位の質量は、スルホン酸基の量から求めることができる。スルホン酸基に変換後のグリシジルメタクリレートの分子量は２２４．２３であることから、スルホン酸基を有するモノマー単位の質量は、０．０３１４ｇであった。また、中空糸１本あたりのグラフト鎖の質量は、反応前後の多孔質中空糸の質量から、０．２１７ｇであった。したがって、中性モノマー単位の質量は、中空糸１本あたりのグラフト鎖の質量と、スルホン酸基を有するモノマー単位の質量と、から、０．１８５６ｇであった。ここから計算すると、スルホン酸基を有するモノマー単位の質量は、中性モノマー単位の質量の１／５．９１であった。【０１２４】
２）細胞培養液の調製
抗体タンパク質として、ＣＨＯ細胞ＣＲＬ１２４４５から発現させたヒトモノクローナル抗体（以下、「ＣＲＬ１２４４５抗体」という。）を０．１５１ｇ／Ｌ含む培養液上澄みを用意した。ＣＲＬ１２４４５抗体生産細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名  ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標）  ＭＦ−ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と抗体を含む抗体溶液（培養上澄）を取得した。【０１２５】
３）アフィニティーカラムによる抗体タンパク質の精製
リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））で平衡化したプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅを充填したカラム）に、抗体溶液を添加し、プロテインＡに抗体タンパク質を吸着させた。次に、カラムにリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））を通液して洗浄した後、カラムに溶出緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．６））を通液して、プロテインＡカラムから抗体タンパク質を溶出させて、不純物がある程度低減された抗体溶液を回収した。【０１２６】
４）凝集体の調製
得られた抗体溶液の一部に塩酸を加え、ｐＨ２．５に調整し、一時間放置した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和し、多量の抗体凝集体を含む抗体溶液を調製した。【０１２７】
５）凝集体を含む抗体溶液の調製
プロテインＡカラムから得られた抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にバッファー交換した溶液と、多量の凝集体を含む抗体溶液を１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にバッファー交換した溶液を任意の割合で混合し、凝集体を含む抗体溶液を調製した。【０１２８】
６）凝集体量の測定
得られた抗体溶液を下記の条件により、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）装置を用いて測定した。
カラム；ＡＣＱＵＩＴＹ  ＹＰＬＣ  ＢＥＨ２００  ＳＥＣ１．７ｕｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
カラム温度：３０℃
システム：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  Ｈ  ＣＬＡＳＳ（ｗａｔｅｒｓ社製）
移動相：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム＋０．２ｍｏｌ／Ｌ Ｌ（＋）−アルギニン水溶液（塩酸でｐＨ６．７に調整）
その結果、図１に例示するクロマトチャートが得られ、それを拡大したものが図２である。図２の（１）及び（２）のピークで現れるものは抗体の凝集体であり、（３）で現れるピークは単量体である。クロマトチャートのピークの面積から算出される凝集体（１）の割合は２．３５％であり、凝集体（２）の割合は１．９２％、単量体の割合は９５．７３％であった。以下の実施例及び比較例においても、最初に現れる凝集体のピークを凝集体（１）、２番目に現れる凝集体のピークを凝集体（２）という。【０１２９】
７）凝集体の除去
カチオン交換膜１に、抗体タンパク質の凝集体成分（不純物）と単量体成分（目的の生理活性物質）を含む抗体溶液を接触させた。加えた量は５０ｍＬ（５．３６ｍｇ／ｍＬの濃度、抗体タンパク質の総量２６８ｍｇ）であり、流速は１．５ｍＬ／分であった。抗体溶液を流した後、流速１．５ｍＬ／分で、１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）１０ｍＬを用いてカチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分析したところ、凝集体成分の含有量は減少していた。結果を図３に示す。【０１３０】
（実施例２）
実施例２では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（３０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ５．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）を用いた以外は、実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は５０ｍＬ、その濃度は５．５６ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１３１】
（実施例３）
実施例３では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ５．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）を用いた以外は、実施例２と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は４０ｍＬ、その濃度は５．５６ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１３２】
（実施例４）
実施例４では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（ｐＨ６．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は６０ｍＬ、その濃度は５．７０ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１３３】
（実施例５）
実施例５では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ６．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は６０ｍＬ、その濃度は５．７１ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１３４】
（実施例６）
実施例６では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（３０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ６．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は６０ｍＬ、その濃度は５．９６ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１３５】
（実施例７）
実施例７では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ６．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は６０ｍＬ、その濃度は５．９１ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１３６】
（実施例８）
実施例８では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（ｐＨ７．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は６０ｍＬ、その濃度は５．６９ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１３７】
（実施例９）
実施例９では、凝集体を含む抗体を、膜体積１ｍＬあたり２ｇ以上処理した例を示す。処理した抗体溶液の量が１２０ｍＬ、抗体溶液の濃度が５．８９であった以外は、実施例８と同様の操作を行った。結果を図３に示す。【０１３８】
（実施例１０）
実施例１０では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は６０ｍＬ、その濃度は５．５７ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１３９】
（実施例１１）
実施例１１では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（３０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ７．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液の量は６０ｍＬ、抗体溶液の濃度は５．６７ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１４０】
（実施例１２）
実施例１２では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（ｐＨ８．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は５０ｍＬ、その濃度は５．５３ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１４１】
（実施例１３）
実施例１３では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（ｐＨ９．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液）を用いた以外は実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は５０ｍＬ、その濃度は５．４４ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１４２】
（実施例１４）
実施例１４では、抗体タンパク質として、ＡＥ６Ｆ４抗体（ヒトモノクローナル抗体）を０．１７２ｇ／Ｌ含む培養液上澄みを用意した。ＡＥ６Ｆ４産生細胞は、九州大学大学院農学研究院、片倉喜範准教授よりご提供頂いた。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞の培養は、文献（日本生物工学会講演要旨集、１９９４年、６５巻、６５ページ）を参考に培養した。ＡＥ６Ｆ４抗体産生細胞を含む培養液を、ろ過膜（旭化成メディカル社製、商品名  ＢｉｏＯｐｔｉｍａｌ（登録商標）  ＭＦ−ＳＬ）を用いてろ過し、不純物と抗体を含む抗体溶液（培養上澄）を取得した。【０１４３】
それ以外は実施例１と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は３０ｍＬ、その濃度は５．９２ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１４４】
（実施例１５）
実施例１５では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（３０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ５．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液）を用いた以外は、実施例１４と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は４０ｍＬ、その濃度は５．６６ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１４５】
（実施例１６）
実施例１６では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（ｐＨ６．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）を用いた以外は実施例１４と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は３０ｍＬ、その濃度は５．５０ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１４６】
（実施例１７）
実施例１７では、抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（ｐＨ７．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液）を用いた以外は実施例１４と同様の操作を行った。処理した抗体溶液量は４０ｍＬ、その濃度は５．６７ｍｇ／ｍＬであった。結果を図３に示す。【０１４７】
（比較例１）
比較例１では以下に説明するカチオン交換膜２を用いた。カチオン交換膜２は次のように作製した。２−ヒドロキシエチルメタクリレート３．０８ｇ、ブチルメタクリレート１．５４ｇ、メタクリル酸０．５７ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．３１ｇ、グラフト率７７％のカチオン交換膜を得た。実施例１と同様に測定して、弱カチオン交換基であるカルボン酸の密度は１７５ｍｍｏｌ／Ｌであった。これをモジュール化（膜体積０．２５ｍＬ）し、比較例１に係るカチオン交換膜２とした。【０１４８】
比較例１では、カチオン交換膜２を用いた以外は実施例１と同様に実施した。結果を図３に示す。【０１４９】
（比較例２）
比較例２では抗体溶液及び洗浄工程に異なる緩衝液（ｐＨ６．０の１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液）を用いた以外は比較例１と同様の操作を行った。結果を図３に示す。【０１５０】
（比較例３）
比較例３では、以下に説明するカチオン交換膜３を用いた。２−ヒドロキシエチルメタクリレート７．７２ｇ、グリシジルメタクリレート０．１３ｇをメタノール１１３ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．０３ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、５５ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、６．０９ｇ、グラフト率１０１％の中空糸膜を得た。後は実施例１と同様にスルホン酸基を導入し、カチオン交換膜８を得た。スルホン酸基密度は２２ｍｍｏｌ／Ｌであった。【０１５１】
カチオン交換膜３を用い、後は実施例１と同様に凝集体除去の評価を行った。結果を図３に示す。【０１５２】
（比較例４）
比較例４では、以下に示す、強カチオン交換基と弱カチオン交換基の合計が３０ｍｍｏｌ／Ｌより高い密度であるが、主成分が弱カチオン交換基主体である、カチオン交換膜４を用いた。カチオン交換膜４は次のように合成した。Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３．０９ｇ、ブチルメタクリレート１．２９ｇ、グリシジルメタクリレート０．５１ｇ、ｔ−ブチルメタクリレート０．２６ｇを５０容量％ｔ−ブチルアルコール水溶液２４０ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．００ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２００ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を、１４０ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、５．１２ｇ、グラフト率７１％のカチオン交換膜前駆体を得た。【０１５３】
放射線グラフト重合法によりグラフト鎖を導入した中空糸を、亜硫酸ナトリウムと、ＩＰＡと、の混合水溶液（亜硫酸ナトリウム／ＩＰＡ／純水＝１０／１５／７５ｗｔ％）２００ｇに投入し、８０℃で２４時間反応を行い、グラフト鎖中のエポキシ基をスルホン酸基に変換した。反応後、この中空糸を純水で洗浄した。その後、この中空糸を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸中に投入し、８０℃で２時間反応を行うことで、グラフト鎖中に残存していたエポキシ基をジオール基に変換した。更に、１４０ｍＬのクロロホルム中で、４ｍＬのメタンスルホン酸と反応させ、ｔ−ブチル基を脱保護し、カルボンキシル基に変換した。実施例１と同様の方法で、全カチオン交換基量および膜体積を測定したところ、それぞれ４９ｕｍｏｌおよび１．０ｍＬであった。これより、全カチオン交換基密度は、４９ｍｍｏｌ／Ｌであった。【０１５４】
スルホン酸基密度は以下の方法により求めた。１ｍｏｌ／Ｌの塩酸に１時間浸漬し、スルホン酸を全て水素化した。純水で洗浄し、塩酸を除去した後、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加え、塩化水素を溶出させた。１時間放置した後、塩化水素を含む塩化ナトリウム水溶液を回収した。更に１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム水溶液を１０ｍＬ加え、１時間放置し、回収することにより、膜内に残った塩化水素を回収した。回収物を統合し、０．０１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を用いて滴定したところ、中和に２．０９ｍＬ要した。ブランクが０．２９ｍＬであったことから、膜が有するスルホン酸基は１８ｍｍｏｌ／Ｌであることが分かった。カルボキシル基は全カチオン交換基密度からスルホン酸基密度を差し引くことで求めることが出来、３１ｍｍｏｌ／Ｌであった。【０１５５】
カチオン交換膜４を用い、後は実施例１と同様に凝集体除去の評価を行った。結果を図３に示す。【０１５６】
（実施例１８）
実施例１８では、図４に示すモノマーの仕込み組成を用いた以外は実施例１と同様の条件を用いて、それぞれスルホン酸基密度が異なるカチオン交換膜５から１３を作製した。図４には、合成後のグラフト率、スルホン酸基密度、スルホン酸基を有するモノマー単位質量／電荷を持たないモノマー単位質量、及びグラフト鎖密度も示した。グラフト率の増加に伴って膜体積も膨張により増大するため、グラフト率が高いからといって、必ずしもグラフト鎖密度が高いわけではない。【０１５７】
（実施例１９）
実施例１９では、実施例１８で作製したカチオン交換膜５から１３を用いた。カチオン交換膜５から８に対しては、ｐＨ５．０の抗体溶液を用い、実施例１と同様の操作を行い、カチオン交換膜９から１３に対しては、ｐＨ６．０の抗体溶液を用い、実施例４と同様の操作を行った。結果を図５に示す。【０１５８】
（実施例２０）
実施例２０では、以下に示すカチオン交換膜１４を合成し、カチオン交換膜１４を用いた以外は実施例１７と同様に、ＡＥ６Ｆ４抗体を用い、凝集体除去の評価を行った。カチオン交換膜１４を作製する際には、２−ヒドロキプロピルメタクリレート１０．９ｇ、グリシジルメタクリレート０．８７ｇをメタノール１０９ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．０２ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を５５ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、６．１０ｇ、グラフト率１０２％の中空糸膜を得た。その後は、実施例１と同様にスルホン酸基を導入し、カチオン交換膜１４を得た。スルホン酸基密度は７８ｍｍｏｌ／Ｌであった。また、スルホン酸基を有するモノマー単位質量／中性モノマー単位質量は１／９．１８、グラフト鎖密度は０．１６０ｇ／ｍＬであった。【０１５９】
カチオン交換膜１４を用いた以外は実施例１７と同様に凝集体除去の評価を行った。結果を図６に示す。【０１６０】
（実施例２１）
実施例２１では、以下に示すカチオン交換膜１５を合成し、カチオン交換膜１５を用いた以外は、実施例１７と同様に、ＡＥ６Ｆ４抗体を用い、凝集体除去の評価を行った。カチオン交換膜１５を作製する際には、グリシジルメタクリレート０．９８ｇをメタノール１１９ｍＬに溶解させ、３０分間窒素バブリングしたものを反応液として用いた。外径３．０ｍｍ、内径２．０ｍｍ、平均孔径０．２５ｕｍのポリエチレン多孔質中空糸３．０２ｇ（１５ｃｍ、１５本）を密閉容器に入れて、容器内の空気を窒素で置換した。その後、容器の外側からドライアイスで冷却しながら、γ線２５ｋＧｙを照射し、ラジカルを発生させた。得られたラジカルを有するポリエチレン多孔質中空糸をガラス容器に移し、２００Ｐａ以下に減圧することにより、反応管内の酸素を除いた。これに４０℃に調整した上記反応液を５５ｍＬ導入し、１６時間静置した。その後、中空糸をメタノールで洗浄し、真空乾燥機中で真空乾燥させ、３．４７ｇ、グラフト率１５％の中空糸膜を得た。その後は、実施例１と同様にスルホン酸基を導入し、カチオン交換膜１５を得た。スルホン酸基密度は５３ｍｍｏｌ／Ｌであった。また、スルホン酸基を有するモノマー単位質量／中性モノマー単位質量の比率は１／１．５０、グラフト鎖密度は０．０３８ｇ／ｍＬであった。また、スルホン酸基を有するモノマー単位と、中性モノマー単位のモル比率は１／３．２であった。【０１６１】
カチオン交換膜１５を用いた以外は実施例１７と同様に凝集体除去の評価を行った。結果を図６に示す。【０１６２】
（実施例２２）
実施例２２では、カチオン交換膜１を用い、凝集体に加え、ＨＣＰとＰｒｏｔｅｉｎ  Ａの除去性を、１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１５ｍｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ７．０）の抗体溶液を用い、ＣＲＬ１２４４５抗体についてそれぞれ評価した。【０１６３】
ＨＣＰはＣＹＧＮＵＳ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社のＣＨＩＮＥＳＥ  ＨＡＭＳＴＥＲ  ＯＶＡＲＹ  Ｈｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−３ｒｄ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用い、プロテインＡはＴＨＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社のＰＲＯＴＥＩＮ  Ａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用い、ＵＶ測定により定量し、抗体の質量に対する質量としてｐｐｍで表した。【０１６４】
結果を図７に示す。【０１６５】
（実施例２３）
実施例２３では、ＣＲＬ１２４４５抗体を用い、アフィニティークロマトグラフィー工程、カチオン交換クロマトグラフィー工程、及びアニオン交換クロマトグラフィー工程の一連の工程をバッファー交換を行わずに実施した。【０１６６】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例２３に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速２０ｍＬ／分間で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ５８ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））１５０ｍＬで平衡化し、ＣＲＬ１２４４５抗体を含む培養上澄みを添加し、抗体を１．２２ｇ吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））１８０ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）３００ｍＬを通役してカラムから抗体を溶出させ、抗体が溶出している画分のみを採取した。溶出液に１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを６．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は１．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有していた。得られた抗体溶液と同じ溶液組成であり、凝集体を多く含む抗体溶液と混合することにより、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液を調整した。抗体溶液の凝集体（１）の割合は１．３５％であり、凝集体（２）の割合は０．７７％、単量体の割合は９７．８７％であった。また、ＨＣＰの含有量は２３０ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。結果を図８に示す。【０１６７】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例２３に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１（体積：０．３ｍＬ）を用いた。カチオン交換膜１に加えた抗体溶液の量は５０ｍＬ（６．５ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．８ｍＬ／分であった。カチオン交換膜１に抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ６．０）を流速１．８ｍＬ／分で１２ｍＬ通液し、カチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で６０ｍＬの溶液を回収した。同じ操作を後２回繰り返し、回収した溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図８に示す。【０１６８】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例２３に係るアニオン交換クロマトグラフィー工程では、体積０．２５ｍＬのアニオン交換膜（ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ、旭化成メディカル）を用いた。カチオン交換クロマトグラフィー工程で回収した抗体溶液に１ｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液を加えてｐＨ７．８にしたところ電気伝導度は１．７ｍＳ／ｃｍであった。その後、抗体溶液をＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに接触させた。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに加えた抗体溶液の量は１６５ｍＬ（４．５ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分であった。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ７．８）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計１７５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図８に示す。【０１６９】
（実施例２４）
実施例２４では、ＣＲＬ１２４４５抗体を用い、アフィニティークロマトグラフィー工程、低ｐＨによるウイルス不活化工程、カチオン交換クロマトグラフィー工程、及びアニオン交換クロマトグラフィー工程の一連の工程をバッファー交換を行わずに実施した。【０１７０】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例２４に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速２０ｍＬ／分間で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ５８ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））１５０ｍＬで平衡化し、ＣＲＬ１２４４５抗体を含む培養上澄みを添加し、抗体を１．２２ｇ吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））１８０ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）３００ｍＬを通役してカラムから抗体を溶出させ、抗体が溶出している画分のみを採取した。得られた抗体溶液に１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加え、ｐＨを２．７にし、２時間静置し、ウイルス不活化処理を実施した。その後、１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを６．０に調整し、抗体溶液を得た。得られた抗体溶液は２．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有しており、後述するカチオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液とした。抗体溶液の凝集体（１）の割合は１．７０％であり、凝集体（２）の割合は１．８９％、単量体の割合は９６．４１％であった。また、ＨＣＰの含有量は３０７ｐｐｍ、プロテインＡの含有量は３ｐｐｍであった。結果を図８に示す。【０１７１】
（カチオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例２４に係るカチオン交換クロマトグラフィー工程では、カチオン交換膜１（体積：０．７２ｍＬ）を用いた。カチオン交換膜１に加えた抗体溶液の量は１２５ｍＬ（７．２ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は４．４ｍＬ／分であった。カチオン交換膜１に抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ６．０）を流速４．４ｍＬ／分で１５ｍＬ通液し、カチオン交換膜１を洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で１３５ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図８に示す。【０１７２】
（アニオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例２４に係るアニオン交換クロマトグラフィー工程では、体積０．２５ｍＬのアニオン交換膜（ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ、旭化成メディカル）を用いた。カチオン交換クロマトグラフィー工程で回収した抗体溶液に１ｍｏｌ／Ｌのトリス緩衝液を加えてｐＨ８．０にしたところ電気伝導度は２．７ｍＳ／ｃｍであった。その後、抗体溶液をＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに接触させた。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに加えた抗体溶液の量は１３２ｍＬ（５．６ｍｇ／ｍＬの濃度）であり、流速は１．５ｍＬ／分であった。ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄに抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー（ｐＨ８．０）を流速１．５ｍＬ／分で１０ｍＬ通液し、ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄを洗浄した。フロースルー工程と洗浄工程で、合計１４２ｍＬの溶液を回収した。回収した溶液をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）及びＥＬＩＳＡにより分析したところ、凝集体成分、ＨＣＰ及びプロテインＡの含有量は減少していた。結果を図８に示す。【０１７３】
（実施例２５）
実施例２５では、アニオン交換クロマトグラフィー工程で体積０．１８ｍＬのＭｕｓｔａｎｇ  Ｑ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、流速０．９ｍＬ／分で処理した以外は、実施例２４と同様の操作を行った。結果を図８に示す。【０１７４】
（実施例２６）
実施例２６では、ＣＲＬ１２４４５抗体を用い、アフィニティークロマトグラフィー工程及び低ｐＨによるウイルス不活化工程後、カチオン交換クロマトグラフィー担体とアニオン交換クロマトグラフィー担体を直通させ、カチオン交換クロマトグラフィー工程とアニオン交換クロマトグラフィー工程の間にｐＨ調整を行わずに実施した。【０１７５】
（アフィニティークロマトグラフィー工程）
実施例２６に係るアフィニティークロマトグラフィー工程では、流速２０ｍＬ／分間で操作を行った。まず、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ５８ｍＬを充填したカラムをリン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））１５０ｍＬで平衡化し、ＣＲＬ１２４４５抗体を含む培養上澄みを添加し、抗体を１．３５ｇ吸着させた。次に、リン酸緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム＋１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．０））３００ｍＬを通液し、更にトリス／酢酸緩衝液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ８．０））１８０ｍＬを通液して洗浄した後、溶出液として２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ３．４）３００ｍＬを通役してカラムから抗体を溶出させ、抗体が溶出している画分のみを採取した。得られた抗体溶液に１ｍｏｌ／Ｌの塩酸を加え、ｐＨを２．７にし、２時間静置し、ウイルス不活化処理を実施した。その後、１ｍｏｌ／Ｌトリス緩衝液を加え、ｐＨを５．０に調整した。その抗体溶液の組成を図９に示す。更に、ｐＨ５．０に加え、６．０、７．０、および８．０に調整した抗体溶液を得た。得られた抗体溶液はそれぞれ７．１ｍｇ／ｍＬ、７．１ｍｇ／ｍＬ、７．１ｍｇ／ｍＬ、７．０ｍｇ／ｍＬの濃度であり、２．６、２．７，２．７，２．７ｍＳ／ｃｍの電気伝導度を有しており、後述するイオン交換クロマトグラフィー工程に用いる抗体溶液とした。【０１７６】
（イオン交換クロマトグラフィー工程）
実施例２６に係るイオン交換クロマトグラフィー工程では、体積０．３０ｍＬのカチオン交換膜１と、体積０．２５ｍＬのアニオン交換膜（ＱｙｕＳｐｅｅｄ  Ｄ、旭化成メディカル）を直列に繋いで用いた。流速１．５ｍＬ／分でアフィニティークロマトグラフィー工程後の各ｐＨの抗体溶液を流した後、抗体溶液と同じ組成のバッファー１５ｍＬを用い流速１．５ｍＬ／分で洗浄した。精製結果を図９に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0006740357.tif 000008
【図８】
0006740357.tif 000009
【図９】
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