(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定体積から像平面（BE）への顕微鏡観察ビーム経路を画定し、顕微鏡対物レンズ（２）と、照明システム（１１）を結合するための入力をもつビーム組み合わせ器（６）と、像平面（BE）に配置された絞り（１５）とを有する光学システムをもつ共焦点走査蛍光顕微鏡（１）であって、
前記ビーム組み合わせ器は前記顕微鏡対物レンズと前記絞りとの間に配置されており、前記光学システムが、前記ビーム組み合わせ器（６）と前記像平面（BE）との間の前記観察ビーム経路において、光ビームを異なる回折次数に応じたビーム束に分割して、各回折次数の光ビームに、他の回折次数とは異なる球面位相を付与する第一の回折光学系（７）と、分割されたビーム束の色収差の補償のための第二の回折光学系（１３）と、分割されたビーム束を前記像平面（BE）に合焦する収集光学系（８）とを有し、
前記顕微鏡対物レンズの焦点深度を拡大するための光学系（１０）が、前記観察ビーム経路の外に配置されており、前記照明システムからの光は前記ビーム組み合わせ器に入力される前に前記焦点深度を拡大するための光学系を通り、
前記拡大された焦点深度を生成するための光学系（１０）が生成する照明体積の軸方向の広がりが、所定の励起波長、前記顕微鏡対物レンズ（２）の所定の開口数、所定の共焦点絞り開口サイズおよび浸漬媒体の所定の屈折率について、当該顕微鏡の光学的断面少なくとも二つ分の厚さである、
共焦点走査蛍光顕微鏡。
【請求項２】
それぞれの回折次数の光ビームに付与される前記球面位相が所定の球面位相のそれぞれの整数倍である、請求項１記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記回折光学系（７）が、前記顕微鏡対物レンズ（２）からくる波面を二つの異なる空間方向の(2m＋1)2個の回折次数に分割する二次元位相格子であり、m＝1,2,3,…である、請求項１または２記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記絞り（１５）が開口をもち、前記収集光学系（８）はさまざまな回折次数の分割されたビーム束のそれぞれを、この開口に合焦する、請求項１ないし３のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項５】
前記絞り（１５）は、分割された回折次数のそれぞれについて、または少なくとも分割された回折次数の部分集合について、対応する開口をもち、前記収集光学系（８）はさまざまな回折次数の分割されたビーム束のそれぞれを対応する開口に合焦する、請求項１ないし３のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記光学システムが、さらなる像平面（wBE）を生成するための少なくとも一つの光学系を有する、請求項１ないし５のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項７】
前記さらなる像平面（wBE）に検出器（９）が配置される、請求項６記載の顕微鏡。
【請求項８】
少なくとも一つのスペクトル分散性要素（１２）が、前記像平面（BE）と前記さらなる像平面（wBE）との間に配置され、それにより、少なくとも0以外の回折次数の分割されたビーム束について、異なる波長が前記さらなる像平面（wBE）の異なる位置に合焦されるようにされる、請求項６または７記載の顕微鏡。
【請求項９】
前記少なくとも一つのスペクトル分散性要素（１２）は、前記さらなる像平面（wBE）を生成する光学系のコリメートされたビーム経路部分に配置される、請求項８記載の顕微鏡。
【請求項１０】
前記スペクトル分散性要素（１２）は、前記顕微鏡対物レンズ（２）のひとみ面と共役な面（PE）に、または少なくとも近似的に該面内に、配置される、請求項８または９記載の顕微鏡。
【請求項１１】
前記スペクトル分散性要素（１２）が、前記観察ビーム経路から可逆的に取り外しするために移動可能に取り付けられる、請求項８ないし１０のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項１２】
前記拡大された焦点深度を生成するための光学系（１０）が、
三次位相変調マスクまたはベッセル・ビーム生成手段を有する、および／または、
前記顕微鏡対物レンズ（２）のひとみを完全に満たさないよう設計される、
請求項２記載の顕微鏡。
【請求項１３】
前記三次位相変調マスクまたはベッセル・ビーム生成手段が、前記顕微鏡対物レンズのひとみ面と共役な面内に配置される、請求項１２記載の顕微鏡。
【請求項１４】
前記完全に満たさないことは、ビーム整形によって達成される、請求項１２または１３記載の顕微鏡。
【請求項１５】
前記ビーム整形はコリメートされた光のビーム断面積を減らす、請求項１４記載の顕微鏡。
【請求項１６】
前記拡大された焦点深度を生成するための光学系（１０）が生成する照明体積の軸方向の広がりが、その横方向の広がりの少なくとも五倍である請求項１ないし１５のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項１７】
前記拡大された焦点深度を生成するための光学系が生成する照明体積の軸方向の広がりが、その横方向の広がりの少なくとも十倍である、請求項１６記載の顕微鏡。
【請求項１８】
前記拡大された焦点深度を生成するための光学系が生成する照明体積の軸方向の広がりが、その横方向の広がりの少なくとも二十倍である、請求項１７記載の顕微鏡。
【請求項１９】
前記回折光学系（７）は、所定の励起波長、前記顕微鏡対物レンズ（２）の所定の開口数、所定の共焦点絞り開口サイズおよび浸漬媒体の所定の屈折率についての軸方向に隣り合う測定体積の諸中心点が、互いから、当該顕微鏡（１）の三つ以上の光学的断面の厚さ離間されるよう形成される、請求項１ないし１８のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項２０】
前記第一の回折光学系（７）は、前記顕微鏡対物レンズ（２）のひとみに共役な平面（Ge1）に、あるいは少なくとも近似的には該平面に、配置される、請求項１ないし１９のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項２１】
前記光学システムは、前記顕微鏡対物レンズ（２）と前記ビーム組み合わせ器（６）との間に、種々の測定体積を逐次的に走査するための調整可能なビーム偏向ユニット（４）と、前記偏向ユニット（４）を前記顕微鏡対物レンズ（２）のひとみにイメージングするための伝達光学系（３）とを有する、請求項１ないし２０のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項２２】
前記検出器（９）は、回折次数の少なくとも一つにおいて、点拡散関数の空間的な過剰サンプリングをするよう構成されている、請求項１ないし２１のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項２３】
前記検出器（９）は、各回折次数において、点拡散関数の空間的な過剰サンプリングをするよう構成されている、請求項２２のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項２４】
前記焦点深度を拡大する光学系（１０）が、前記像平面（BE）にイメージングされる測定体積すべてが前記拡大された焦点深度の範囲内にあるよう形成される、請求項１ないし２３のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【請求項２５】
前記焦点深度を拡大する光学系（１０）を通った後の光の照明焦点が線形であり、その線の長手方向は前記顕微鏡対物レンズ（２）の光軸と平行である、請求項１ないし２４のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定体積から像平面への顕微鏡観察ビーム経路を画定し、（測定体積から像平面の方向に挙げると）顕微鏡対物レンズと、照明システムを結合するための入力をもつビーム組み合わせ器と、像平面内に配置された絞りとを有する光学システムをもつ走査蛍光顕微鏡に関する。絞りは、以下では共焦点絞りと称される。顕微鏡は便利には、光源、好ましくは少なくとも一つのレーザーをもつ照明システムをも有する。
【背景技術】
【０００２】
たとえば特許文献１の共焦点走査蛍光顕微鏡は、生命科学として知られる学問分野における不可欠なツールとなっている。像は一般に、三次元の点拡散関数（PSF:  point  spread  function）によって定義される、回折限界によって制限された単一の体積（測定体積）が試料を逐次的に走査することによって構築される。焦点外の蛍光は、共焦点絞りにおいて、使用される信号である焦点の蛍光から分離される。これは、光学的断面の属性をもつイメージングにつながり、焦点面からの蛍光のみが測定信号に寄与する。結果として、光学的により厚い、散乱しやすい試料であっても、いわゆるぼけのない（blur-free）イメージングが可能である。ここで、光学的断面の厚さは共焦点絞りの開口のサイズに依存し、下限は回折に関係した解像度によってのみ制限される。
【０００３】
しかしながら、走査式の逐次的な画像構築には欠点もある。たとえば、ピクセル毎に十分な蛍光光子を累積することによって十分な信号対雑音比（SNR）を達成することができるよう、画像の構築は比較的遅い。さらなる問題は、試料の褪色である。励起光は常に、焦点体積に向かって細くなっていく光の円錐内においても透過される。しかしながら、それにより励起される焦点外での蛍光放出は共焦点イメージングには使われず、光学的断面のために、共焦点検出絞りにおいて特に弁別される。したがって、試料のみが焦点外の光入力の負荷を受ける。この場合、褪色プロセスの非線形性のため、試料は、焦点面の近傍において特に褪色する。ピクセル滞留時間を、よって画像の記録全体を短縮するため、励起強度を高めることが通例である。しかしながら、これは、試料の増大した負荷、よって強い褪色および光損傷につながる。
【０００４】
試料負荷を軽減する一つの可能性は、画像記録を並列化することである。これはたとえば、特許文献２または特許文献３のように、焦点面におけるN個の別個の同時に照明され、測定される測定体積（単に測定点と称される）を用いて達成される。これは、試料がN個の点において同時に、照明ビーム毎にはより低い強度をもって、測定されることを許容する。照明強度はこの場合、1/Nに低下し、ピクセル滞留時間はN倍拡大される。よって、画像リフレッシュ・レート（フレーム・レート）は同一であり、SNRは個々の測定体積による走査された記録に匹敵する。試料へのエネルギー入力量は同じだが、空間的に分散しているので、試料を損なう蛍光の飽和というリスクは低減できる。同じ利点をもつ多重並列画像記録が、回転ニプコー円板によってまたは線形走査を用いても達成される。
【０００５】
他方、いくつかの測定点の並列イメージングにより、必要な像記録時間は短縮でき、よってたとえば、反復的な記録の場合、最大可能なフレーム・レートがより高くなる。しかしながら、上記のように、これは増大した励起強度を必要とする。
【０００６】
同じ焦点面からのいくつかの測定点の同時イメージングに対する代替として、焦点面（以下では一次焦点面とも称される）に平行であり、顕微鏡対物レンズから異なる距離にある諸平面（以下では二次焦点面と称される）からの測定点が同時にイメージングされ、それぞれ準共焦点で検出されることも可能である。
【０００７】
従来技術では、そのような軸方向の複数焦点イメージングは、単色共焦点顕微鏡法の特殊な場合について、特許文献４から知られている。そこで使われているのは、光学的に中心から外れた回折光学要素（DOE:  diffractive-optical  element）、たとえば位相格子に、顕微鏡対物レンズの光軸上のいくつかの別個の測定体積の同時イメージングのための収集光学系を組み合わせた形の複数焦点イメージング・システムである。対物レンズから異なる距離にある試料面からの波面（一次および二次焦点面）はDOEにおいて異なる曲率をもつ。波面は、DOEによって、異なる解析次数の間で分配され、有利には（共焦点絞りが配置されている）同じ平面に合焦される。この場合、照明波長以外の波長は絞りにおいて弁別される。その結果、この顕微鏡は、単色イメージングに好適であるだけである。他方、蛍光測定では、ストークスシフトおよび蛍光放出のスペクトル分布のため、大きなスペクトル帯域幅が検出される必要がある。したがって、特許文献４に基づく顕微鏡は蛍光測定のためには使用できず、特に、スペクトル・イメージングのためには使用できず、反射測定のために、たとえば物質顕微鏡観察において使用できるだけである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】DE19702753A1
【特許文献２】US5,239,178
【特許文献３】US6,028,306
【特許文献４】DE10356416A1
【特許文献５】US7,295,726B1
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Abrahamsson  et  al.、"Fast  multicolor  3D  imaging  using  aberration-corrected  multifocus  microscopy"、Nature  Methods,  volume  10,  No.1,  page  60
【非特許文献２】Seitz、"Single-Photon  Imaging"、Springer  Series  in  Optical  Sciences,  volume  160
【非特許文献３】Dowski/Cathey、"Extended  depth  of  field  through  wave-front  coding"  Applied  Optics,  volume  34,  No.  11,  page  1859
【非特許文献４】Y.  Lin、"Experimental  investigation  of  Bessel  beam  characteristics"、Applied  Optics,  volume  31,  page  2708
【非特許文献５】Sheppard、"Super-resolution  in  confocal  imaging"、Optik、volume  80  (1988),  page  53
【非特許文献６】Chen  et  al.、"Focal  Modulation  Microscopy"、Optics  Express,  volume  16,  edition  23,  page  18764
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、冒頭で述べた型の走査蛍光顕微鏡を、異なる焦点面（一次および二次焦点面）からの蛍光がそれぞれ準共焦点的に同時に検出できるよう改善するという目的に基づく。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の目的は、請求項１に記載される特徴をもつ走査蛍光顕微鏡によって達成される。
【００１２】
本発明の有利な構成は従属請求項に記載される。
【００１３】
本発明によれば、光学システムは、ビーム組み合わせ器と像平面との間の観察ビーム経路において、光ビームを異なる回折次数に応じた（再合焦された）ビーム束に分割して、各回折次数の光ビームに、他の回折次数とは異なる球面位相、特に（所定の）球面位相のそれぞれの整数倍を付与する第一の回折光学系と、分割されたビーム束の（第一の回折光学系によって生成される）色収差の補償のための第二の回折光学系と、分割されたビーム束を像平面に合焦して、（物体側で）顕微鏡対物レンズの光軸上にまたは該光軸に平行な軸上に配置された（離接）一連の異なる測定体積が（回折光学系の異なる回折次数に応じて）像平面に同時にイメージングされることができるようにするための収集光学系とを有する。「物体側」はこの場合、「像平面とは反対側を向いている顕微鏡対物レンズの側」と同義である。
【００１４】
第一の回折光学系は、好ましくは、異なる焦点面からの光ビームの波面を、それぞれの平面の波面をもつよう再合焦〔リフォーカス〕し、再合焦された各波面の伝搬方向（波数ベクトル）が回折次数の一つに対応するようにする。回折光学系は、たとえばDOEであってもよい。第一の回折光学系は好ましくは、二次元位相格子である。第二の回折光学系は便利には、第一の回折光学系と収集光学系の間に配置される。それはたとえば、格子として形成されてもよい。第二の回折光学系により、すべての波長が、共焦点絞りの開口（単数または複数）を通過させらことができる。言うまでもなく、光が検出される前に、一つまたは複数の中間像平面が、共焦点絞りの前および／または後の伝達光学系によって生成されてもよい。再合焦された分割されたビーム束の色収差の補正のための第二の回折光学系は、たとえば非特許文献１において記号「CCG」のもとに記述されている。
【００１５】
異なる（一次および二次の）焦点面からの光の距離に依存し、色から独立な分割により、焦点外の蛍光もイメージングされ、準共焦点的に同時に検出されることができる。これは、励起光がよりよく利用されるという点で、試料負荷を軽減する。特に、たとえいくつかの測定点のためであっても、励起される必要があるのは、単一の照明体積、よって単一の上流円錐だけである。
【００１６】
好ましくは、照明システムの結合のためのビーム組み合わせ器入力より前で観察ビーム経路外において、顕微鏡対物レンズの（物体側の）焦点深度（焦点の広がり）を拡大するための光学系がさらに、対物レンズの光軸に沿って追加的に配置される。観察ビーム経路の（光学システムの）外部の位置は、照明体積の広がりのみが影響され、照明体積のさまざまな位置にある測定体積の広がりは影響されないことを意味する。焦点深度を拡大するための光学系は、軸方向の分解能を低減する効果をもつ。よって、照明方向における最大分解能は人為的に悪化させられる。照明体積のこのようにして拡大された焦点深度（EDOF:  extended  depth  of  field［拡大被写界深度］）のため、同一の光パワーで、より多くの測定体積が同時に励起できる。さらに、焦点面、よって測定体積は、軸方向において互いからさらに離間されることができ、そのため互いから光学的によりよく分離できる。
【００１７】
特許文献４では、より多数の軸方向測定体積を同時にイメージングできるよう、一方を他方の後ろに置いた二つの直交位相格子の配置が提供される。しかしながら、回折次数の、よって測定体積のイメージングのこの型の二次元分割は、光が弱いという欠点がある。その結果、これは蛍光顕微鏡法には好適でない。
【００１８】
したがって、（二次元）位相格子が、顕微鏡対物レンズからくる波面を二つの異なる空間方向の(2m＋1)2個の回折次数に分割する実施形態が特に有利である。ここで、m＝1,2,3,…である。このようにして、分割されたビーム束は、検出器平面において、正方形の(2m＋1)×(2m＋1)のマトリクスとして配置され、二次元検出器マトリクスによって、ほとんど負担なしにより多数の平面が同時に記録される（光電子変換される）ことができる。個別の回折光学系による二次元分割は光が強く、よって、複数軸複数焦点式の試料にやさしい蛍光記録が可能になる。
【００１９】
第一の有利な構成上の変形では、（共焦点）絞りが（ちょうど）一つの開口をもち、収集光学系はさまざまな回折次数の分割されたビーム束のそれぞれを、この（共通の）開口に合焦するものとされる。検出器は、たとえば、絞りの後方のある距離のところに配置されてもよく、ビーム束が検出器に到達する時点までには、ビーム束（の光軸）が、少なくとも検出器どうしの間の距離に対応する距離だけ発散させられるようにされる。あるいはまた、検出器は、さらなる像平面内に配置されてもよい。
【００２０】
第二の有利な構成上の変形では、（共焦点）絞りは、分割された回折次数のそれぞれについて、または少なくとも分割された回折次数の部分集合について、対応する開口をもち、収集光学系はさまざまな回折次数の分割されたビーム束のそれぞれを対応する開口に合焦するものとされる。検出器は、たとえば、共焦点絞りの開口の（真）後ろに、あるいはさらなる像平面に、配置されてもよい。
【００２１】
好ましくは、共焦点絞りの後では、各回折次数について少なくとも一つの検出器がそれぞれ配置される。それらの検出器は好ましくは、少なくとも100kHzの高い反復周波数で読むことができ、好ましくは、単一光子検出に好適である。たとえば、すべての検出器がまとまって、たとえば非特許文献２において記載されるようなガイガー・モードで動作させられる単一光子アバランシェ・ダイオード（SPAD:  single-photon  avalanche  diode）のマトリクスであってもよい。その際、それぞれの個々のダイオードまたは単一ダイオードの対応して割り当てられたサブグループが本発明でいうところの検出器（他とは独立に読むことができる）である。その際、検出器の数はたとえば、ビーム束の数より多い。SPADの代わりに、検出器は、マルチアノード光電子増倍管の形に構成された二次元マトリクスであって、検出器の数はビーム束の数(2m＋1)2に対応していてもよい。あるいはまた、検出器の別個のマトリクス、たとえばそれぞれの場合のSPADマトリクスが、共焦点絞りの各開口の後に配置されてもよい。
【００２２】
光学システムが、さらなる像平面を生成するための少なくとも一つの光学系を有していれば有利であることがある。その場合、検出器は、このさらなる像平面に配置されてもよい。
【００２３】
本発明は、少なくとも0以外の回折次数の、任意的にはまた回折次数0の各ビーム束が、検出器に達する前に、当該光学システムによって、空間的・スペクトル的に、それ自身において追加的に分割されることができるという格別な利点をもつ。この目的のために、少なくとも一つのスペクトル分散性の要素が、像平面とさらなる像平面との間で光学システムにおいて配置されることが有利でありうる。それにより、少なくとも0以外の回折次数の分割されたビーム束について、異なる波長が前記さらなる像平面の異なる位置に合焦されるようにされる。この場合、前記少なくとも一つのスペクトル分散性要素は、前記伝達光学系のコリメートされたビーム経路部分に配置されてもよい。
【００２４】
いくつかの検出器の間でのビーム束のそのような空間的・スペクトル的分割により、当該ビーム束が由来する測定体積がスペクトル分解されて検出できる。これは、測定体積についての追加的な情報を提供する。好ましくは、各回折次数についての分散性要素の後にそれぞれの場合において観察ビーム経路において、いくつかの検出器の群が配置される。それらの群は便宜上離接的である。この場合、各検出器群はそれぞれの測定体積に一対一に割り当てられる。この場合の検出器群の各検出器は、関連する測定体積のスペクトル・チャネルに対応する。特に、こうして、いくつかの異なる蛍光染料が、たとえば分離（unmixing）または主成分解析（PCA:  principal  component  analysis）によって、同時に検出され、識別されることができる。結果として、さまざまな型の蛍光マーカーが同時に位置特定できる。
【００２５】
一つまたは複数のプリズム（たとえば、分割されたビーム束／回折次数当たり一つ、任意的には回折次数0でも）または一つまたは複数の回折格子（たとえば、分割されたビーム束／回折次数当たり一つ、任意的には回折次数0でも）が、たとえばスペクトル分散性要素として使用されてもよい。
【００２６】
好ましくは、スペクトル分散性要素は、顕微鏡対物レンズのひとみ面と共役な面内に配置される。合焦された分割された、色補正された諸光ビーム束の交点はひとみ面内にあるので、すべての光ビーム束は、小さなサイズの単一の分散性要素により、空間的・スペクトル的に分割できる。
【００２７】
便宜上、すべての実施形態において、少なくとも一つの、だが好ましくはすべてのスペクトル分散性要素が、たとえば較正目的のために、観察ビーム経路から可逆的に取り外しするために移動可能に取り付けられてもよい。
【００２８】
有利な実施形態では、拡大された焦点深度を生成するための光学系が位相板、特に三次位相変調マスクまたはベッセル・ビーム生成手段を、特に顕微鏡対物レンズのひとみ面と共役な面内にそれぞれ配置されて有する、および／または特にビーム整形によって、特にコリメートされた光のビーム断面積を減らすために、顕微鏡対物レンズのひとみを完全に満たさないよう設計される。拡大された焦点深度を生成するための三次位相変調マスクはたとえば非特許文献３に記載されている。ひとみを完全に満たさないための光学系はたとえば、ひとみのにおけるビーム断面積を減らすビーム整形器であってもよい。ひとみを満たさないことは、照明の開口数の低減につながり、結果として軸方向の分解能ωzが悪くなる。
【００２９】
軸方向に拡大された照明体積を生成するために他のいかなる既知のEDOF様の光学系が使われてもよい。これはたとえば、非特許文献４のようにベッセル・ビームを生成するため、あるいは非特許文献３に対応する仕方で照明光に三次位相プロファイルを付与するために、照明ビーム経路のひとみに位相マスクまたは絞りマスクを導入することによる。光源または光源の下流の光学系であって、たとえば特許文献４において参照符号１１で記載されている、測定体積に対応する一連の点を軸方向に画定するものも有利であることがある。利点は、軸上の各焦点面における、よりよい分解能にある。というのも、ここでは完全な共焦点性がそれぞれ達成できるからである。欠点は、試料のより拡大された照明であり、相応して負荷が大きくなる。
【００３０】
好ましくは、焦点深度を拡大する光学系が生成する照明体積の軸方向の広がりが、その横方向の広がりの少なくとも五倍、特に少なくとも十倍、より特定的には少なくとも二十倍である、および／または、所定の励起波長、顕微鏡対物レンズの所定の開口数、所定の共焦点絞り開口サイズおよび浸漬媒体の所定の屈折率について、顕微鏡の光学的断面少なくとも二つ分の厚さに対応する。これにより、（第一の）回折光学系が、従来技術に比べて光学的分離のために十分な軸方向距離を与えるよう形成できる。
【００３１】
（第一の）回折光学要素は、有利には、所定の励起波長、顕微鏡対物レンズの所定の開口数、所定の共焦点絞り開口サイズおよび浸漬媒体の所定の屈折率についての隣り合う軸方向測定体積の諸中点が、互いから、顕微鏡の三つ以上の光学的断面の厚さ離間されるよう形成される。所与の対物レンズについての（第一の）回折要素の適切な構成は、格子パラメータによって軸方向分割を設定することによって、測定体積の所望される軸方向の分離が達成されることを許容する。
【００３２】
像平面にイメージングされる測定体積すべてが拡大された焦点深度内にあるよう焦点深度を拡大する光学系が形成されれば、よって試料における拡大された焦点深度をもつ照明が検出によってカバーされる領域に適応されれば、有利である。このようにして、励起光を効率的に使用でき、それにより試料が保護される。この目的のため、検出における所与の格子を用いて、測定体積が完全に照明されるよう照明光学系が適応されることができる、あるいは試料における所与の光分布を用いて、照明される領域が完全にイメージング（および検出）されるよう、検出ビーム経路が適応されることができる。
【００３３】
ビーム組み合わせ器は、散乱された励起光を試料光から分離し去るために、便宜上、色分割器であってもよい。結果として、おおむね蛍光のみが検出器に到達する。スペクトル検出の間にスペクトル分解が十分高ければ、色分割器をなくすことも可能である。その場合、励起波長に対応するスペクトル・チャネルが弁別される。
【００３４】
好ましくは、第一の回折光学系は、顕微鏡対物レンズのひとみに共役な平面に、あるいは少なくとも近似的には該平面に、配置される。この目的のために、光学システムは、それぞれの場合において（追加的な）共役ひとみ面を与える一つまたは複数の伝達光学系を有していてもよい。
【００３５】
走査蛍光顕微鏡は、便利には、励起光の放出のための光源をもつ照明システムを有していてもよい。その場合、光源は、便利には、特に光源とビーム組み合わせ器の間のコリメーション光学系を用いて、前記ビーム組み合わせ器の入力により励起光を前記観察ビーム経路中に（顕微鏡対物レンズの方向に）注入するよう配置される。光源はたとえばレーザーであってもよい。この場合、光源によって放出される励起光は、物体側での有利な軸方向の焦点の伸張を受けてもよい。好ましくは、（測定体積と重なる）線形な照明焦点が（焦点を拡大する光学系および対物レンズ、特にまた照明ビーム経路におけるさらなるビーム整形光学系のイメージングによって）得られ、その線の長手方向は顕微鏡光学レンズの光軸に平行である。こうして、試料は保護される。これは、たとえば、レーザーなどのような事実上点の形の光源を用いて達成される。励起光のより効果的な使用のため、結果的には試料をやさしく扱うため、照明線は、いくつかの点において絞られる、それにより実質的に一次および二次検出焦点面内の測定体積のみが照明される（だが測定体積間の中間の空間は照明されない）。
【００３６】
有利には、顕微鏡観察ビーム経路を画定する光学システムは、光学的に顕微鏡対物レンズとビーム組み合わせ器との間に、種々の測定体積を逐次的に走査するための調整可能なビーム偏向ユニット（ビーム走査ユニット）と、該偏向ユニットを顕微鏡対物レンズのひとみにイメージングするための伝達光学系とを有する。こうして、ほとんど負担なしに走査が可能にされる。偏向ユニットは、準静的で共振式のスキャナのみならず、電流スキャナおよびMEMSスキャナをも含みうる。画定された回転点をもつスキャナ、たとえば特許文献５に記載されるようなMEMSベースのスキャナが光学的に有利である。
【００３７】
好ましくは、検出器は、二次元マトリクスとして配置され、顕微鏡は制御ユニットを有する。制御ユニットは、ビーム偏向ユニットを調整し、検出器によって光を記録し検出器によって出力される信号値を検出し、上記の段階を何度か繰り返し、検出された信号値から共焦点画像のスタックを得るよう設計される。
【００３８】
本発明は、有利には、試料の操作と組み合わされてもよい。たとえば、ワイドフィールド照明によってまたは特定的な合焦された照明によって試料の反応が誘起される。ここでの応用はたとえばFRAPまたは物質の解放（解き放つこと（uncaging））である。本発明は、光遺伝学の方法と組み合わされてもよい。
【００３９】
検出器は、有利には、回折次数の少なくとも一つにおいて、好ましくは各回折次数において、たとえば非特許文献５に記載されるように点拡散関数の空間的な過剰サンプリングをするよう構成されていてもよい。このようにして、PSFの形およびPSF内の強度分布を見きわめることができる。このようにして、より高い分解能の画像を得ることができる。過剰サンプリングは、たとえば、観察ビーム経路に配置された各回折次数のための（離接的な）検出器のそれぞれの群によって達成される。光学システムが、スペクトル分解された検出のために設計されていれば、関連する群のいくつかの検出器はそれぞれ同じ波長範囲において構成されていてもよい。ここで、好適な検出器はたとえば、その感度、読み速度およびピクセル構成の観点から、SPADマトリクス・センサーである。
【００４０】
本発明に基づくイメージングは、たとえばSTEDまたはRESOLFTのような、光学分解能を増すための他の方法と組み合わせて使われてもよい。理想的には、この目的のために二つの照明ビーム経路が設けられ、追加的なビーム組み合わせ器によって結合され、それにより両方からの光が試料に達する。上記のように、第一のものは、好ましくはベッセル・ビームにより、蛍光励起（励起ビーム）についての拡大された物体側焦点を生成する。第二の照明ビーム経路は、たとえば付与された渦巻き位相をもつ環状絞りにより、自己再構成する円環ビーム（より高次のベッセル・ビームで、中心の最大がないもの）を生成し、この円環ビームは次いで、中心の外での蛍光の脱励起／抑制のはたらきをする（脱励起ビーム）。脱励起ビームの波長は好ましくは、励起ビームに対して赤方偏移している。この目的のために、第一の照明ビーム経路は、第二の照明ビーム経路の光源より短い波長を放出する光源を有していてもよい。
【００４１】
光学システムは、照明および／または検出PSFのすべてが同時に補正されるような適応光学系を有していてもよい。ここで、N個のチャネル（回折次数）における信号の適応的な最適化のためのフィードバック・モードが可能である。
【００４２】
軸方向の複数焦点イメージングは、（光軸に沿って行なわれる）z方向における走査と組み合わされてもよい。
【００４３】
蛍光励起は、（単一光子励起により）線形にでも（複数光子励起または周波数増倍――二次高調波生成（SHG:  Second  Harmonic  Generation）、CARSなどにより）非線形にでも行なわれうる。しかしながら、この場合、検出は、便利には、「デスキャン式で（descanned）」行なわれる。非線形励起の格別な利点は、強度を二乗する結果、軸方向に拡大されたPSFを生成することがより簡単であるということである。さらに、本方法は、たとえば非特許文献６による、蛍光イメージングの他の方法と組み合わされることもできる。
【００４４】
本発明は、有利には、高速な粒子追跡のために使われてもよい。
【００４５】
本発明は、例示的な実施形態に基づいて下記においてより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】軸方向の複数焦点検出のための顕微鏡を示す図である。
【図２】観察ビーム経路の定義のための当該光学システムの第一の実施形態および第二の実施形態からの一部を示す図である。
【図３】観察ビーム経路の定義のための当該光学システムの第三の実施形態および第四の実施形態からの一部を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
すべての図面において、一致する部分は同じ参照符号を帯びている。
【００４８】
図１は、レーザー走査顕微鏡（LSM）の形の走査蛍光顕微鏡１を概略的に示している。ここで、照明システムとしての光源１１としてのレーザーが、顕微鏡対物レンズ２と一緒に照明ビーム経路Aを画定する。照明ビーム経路Aは、位相マスク１０を含み、ビームスプリッター６、たとえばダイクロイック・ビームスプリッター・キューブによって、観察ビーム経路Bと組み合わされる（光学的に結合される）。位相マスク１０は、観察ビーム経路Bの外部に配置される。光学伝達システム５は、位相マスク１０の平面を偏向ユニット４上にイメージングする。偏向ユニット４は励起光ビームをxおよびy方向に偏向させることができる。さらなる光学伝達システム３が偏向ユニット４を対物レンズ４のひとみ面にイメージングする。対物レンズ２は、レーザー・ビームを試料Pに合焦し、照明体積の横方向位置は偏向ユニット４上で設定されている偏向角に依存する。
【００４９】
たとえばPSFの軸方向の強度プロファイルの全半値幅によって与えられることができる照明体積の軸方向の長さは、位相マスク１０の性質によって確立され、顕微鏡対物レンズ２自身（位相マスク１０なしの場合）のものに対してz方向に有意に伸ばされる。一方、xおよびy方向における照明PSFの横方向のサイズはほぼ同一である。この目的のため、位相マスク１０はたとえば、三次位相変調マスクである。z方向における照明体積の広がりはたとえば、x方向またはy方向におけるものの五倍である。
【００５０】
試料Pにおいて伸ばされた焦点プロファイルに沿って生成される蛍光は対物レンズ２によって実質的にコリメートされ、上記の光学系を通って、観察ビーム経路Bを照明ビーム経路Aからスペクトル的に分けるビームスプリッター６まで戻る。伝達光学系５はそれにより、軸方向に分布した情報がある中間像平面ZBEを、伝達光学系５のひとみ面である第一の格子面GE1に変換する。第一の格子面GE1には、二次元DOE位相格子の形の第一の回折光学系７が配置されている。第一の回折光学系７は(2m＋1)2個の回折次数を生成し（ここで、たとえばm＝1）、よって入射光を対応する数のビーム束に分割する。位相格子７は、各回折次数（各ビーム束）に対して一定の球面位相項を付与し、それによりそれぞれの位相項による中間像平面ZBEの再合焦が、有利には等間隔のきざみで、波面の曲率に依存して、よって対物レンズ２からの蛍光放出の距離に依存して、行なわれる。第一の回折光学系７の下流には、GE1における位相格子７のスペクトル分散を打ち消すために、第二の回折光学系１３、たとえば格子またはDOEがある。諸回折次数に分割され、再合焦されて色補正された光ビーム束は、収集光学系としてのレンズ８によって、像平面BE内の共焦点絞り１５上にイメージングされる。像平面BEの背後には検出器マトリクス９が配置されている。マトリクス９の検出器９ik（たとえばi＝1……128；k＝1……128）はたとえばSPADであるが、CCDまたはCMOSセンサーであってもよい。
【００５１】
制御ユニット１４は、偏向ユニット４および光源１１を、また検出器９ikをも制御する。制御ユニット１４は、測定された値を受け入れ、たとえば計算的に補正するようにも設計される。
【００５２】
図２のＡでは、観察ビーム経路Bの一部の細部が概略的に示されている。L1によって指定されるレンズはこの場合、たとえば、伝達光学系５の一部である。対物レンズ２のひとみ面に共役な第一の格子面GE1内の回折光学系７における再合焦された分割の後、再合焦された情報は、GE1における位相格子７のスペクトル分散を補償するために、第二の回折光学系１３によって色補正され、面L2内の収集光学系８によって、ピクセル化されたセンサー９上に直接イメージングされる。各回折次数は結果として、試料Pの異なる面からのそれぞれの測定体積を、検出器マトリクス９上に鮮鋭にイメージングする。さらに、0次のほかは各回折次数の蛍光はスペクトル的に分散される。検出器マトリクス９上での結果として得られる光分布は、図２の二つの部分図A、Bにおいて、ビーム経路のわきに概略的に示されている。
【００５３】
理想的には、第二の回折光学系１３の回折のすべての関連しない次数はGE2において最大限抑制される。すると、収集光学系L2によるイメージングは、各波長および蛍光源の各平面のサブビームのすべてが一点に合焦されるという効果をもつ。この像平面BE（同時にピンホール面PHEでもある）において、試料光は次いでピンホール絞り１５によって準共焦点的にフィルタリングされ、それぞれの回折次数において考慮される測定体積（焦点面）を起源とする蛍光から焦点外の光が分離される。
【００５４】
面L3内のレンズは、たとえば面L4内のレンズと一緒にさらなる伝達光学系をなすものであるが、PHEにおけるピンホール絞り１５を透過した光ビームをコリメートし、さらなるひとみ面GE3を生成する。面GE3では、すべての回折次数が再び互いから分離する。この面GE3では、任意的に、スペクトル分散性であり次数を分離する要素１２が挿入されてもよい。一方では、レンズL4によってZBEの異なる面を検出器マトリクス９の異なる位置にイメージングし、他方では、検出器９ikの間でスペクトル情報を分散させるためである。要素１２はたとえば、セグメント分割されたプリズムであり、回折次数を互いとの関係で拡散させる。回折次数0のセグメントは面平行な板である。結果として、次数0は検出器マトリクス９上でスペクトル的に分解されない。八つの他の回折次数は、各ビーム束が空間的／スペクトル的分割のため関連する群の検出器９ik（全検出器のそれぞれの部分集合）の間で分散されるので、スペクトル分解されて検出されることができる。
【００５５】
図２のＢでは、スペクトル分散性要素１２、たとえばプリズムまたは回折格子が、0次のビーム経路中に追加的に配置されている。それにより、すべての回折次数がそれぞれの群の検出器９ikの間で空間的・スペクトル的に分割される。こうして、0次によって表わされる試料面についてもスペクトル情報が見きわめられる。スペクトル分散性要素１２は有利には、観察ビーム経路B中で位置決めし直したり、可逆的に再び取り除いたりすることができるよう配置される。
【００５６】
検出器９ikによって測定されたデータはすでに、一次および二次焦点面との関係で準共焦点である。分散の向きだけが、較正によって、計算に含められる必要がある。検出システムの較正は、たとえば、顕微鏡１の照明焦点領域を通じて軸方向に動かされる個別の蛍光ビーズによって、行なわれる。ここで、要素１２は0次のビーム経路から取り除かれる。この場合、検出器９ikは0次のもとで、光学システムの、色が乱されていないPSFを測定する。このPSFに基づいて、他のすべての回折次数のスペクトル分散を見きわめることができる。これら他の次数には、それぞれの（あらかじめ決定された）位相項によって補正されただけの同一のPSFが存在していなければならないからである。こうして知られたPSFを用いて、要素１２の分散も最終的に較正されることができる。
【００５７】
図３のＡでは、観察ビーム経路Bの定義のためのさらなる光学システムからの一部が示されている。図２のＡとの違いとして、たとえば種々のプリズムによってセグメント分割された、次数を分離する要素１６が、GE2の補正格子と収集光学系L2との間で格子面GE3に導入されている。GE2およびGE3における要素のスペクトル分散の和は、GE1における回折光学系７のスペクトル分散と大きさが等しく、逆向きである。次数分離要素１６のため、位相格子７の回折次数のすべては、第二の回折光学系１３によってスペクトル的に補正されたのちに、収集光学系L2によってPHEの別個の横方向位置にイメージングされる。対応して、(2m＋1)2個の開口のマトリクス配置をもつ共焦点絞り１５が共焦点面に配置される。最後に、レンズL3はPHEを、さらなる像平面wBEに配置されている検出器マトリクス９上にイメージングする。図３のＡのこの変形では、検出器９上でのスペクトル分散なしにイメージングが行なわれる。
【００５８】
図３のＢでは、すべての回折次数が通過するスペクトル分散性要素１２が、センサー・マトリクス９の上流のひとみ面（PE）に導入されている。よって、センサー・マトリクス上でのスペクトル光分布の向きは、位相格子の回折次数すべてについて同じである。しかしながら、スペクトル分解能は、異なる入射角のため、変わりうる。理想的には、要素１２は可逆的に配置可能であり、よって図３のＡとＢの構成の間で切り換えることが可能である。これは、スペクトル分解能の較正のために使用されてもよい。
【００５９】
代替的な諸実施形態においては、共焦点絞りは(2m＋1)2個の開口をもたず、たとえば(2m＋1)個の開口しかもたない。
いくつかの態様を記載しておく。
〔態様１〕
測定体積から像平面（BE）への顕微鏡観察ビーム経路（A）を画定し、顕微鏡対物レンズ（２）と、照明システム（１１）を結合するための入力をもつビーム組み合わせ器（６）と、像平面（BE）に配置された絞り（１５）とを有する光学システムをもつ共焦点走査蛍光顕微鏡（１）であって、
前記光学システムが、前記ビーム組み合わせ器（６）と前記像平面（BE）との間の前記観察ビーム経路（A）において、光ビームを異なる回折次数に応じたビーム束に分割して、各回折次数の光ビームに、他の回折次数とは異なる球面位相、特にある球面位相のそれぞれの整数倍を付与する第一の回折光学系（７）と、分割されたビーム束の色収差の補償のための第二の回折光学系（１３）と、分割されたビーム束を前記像平面（BE）に合焦する収集光学系（８）とを有することを特徴とする、
共焦点走査蛍光顕微鏡。
〔態様２〕
前記顕微鏡対物レンズの焦点深度を拡大するための光学系（１０）が、前記照明システムの前記結合のためのビーム組み合わせ器入力より前で前記観察ビーム経路（A）の外において、前記対物レンズの光軸に沿って配置されている、態様１記載の顕微鏡。
〔態様３〕
前記回折光学系（７）が、前記顕微鏡対物レンズ（２）からくる波面を二つの異なる空間方向の(2m＋1)2個の回折次数に分割する二次元位相格子であり、m＝1,2,3,…である、態様１または２記載の顕微鏡。
〔態様４〕
前記絞り（１５）が開口をもち、前記収集光学系（８）はさまざまな回折次数の分割されたビーム束のそれぞれを、この開口に合焦する、態様１ないし３のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様５〕
前記絞り（１５）は、分割された回折次数のそれぞれについて、または少なくとも分割された回折次数の部分集合について、対応する開口をもち、前記収集光学系（８）はさまざまな回折次数の分割されたビーム束のそれぞれを対応する開口に合焦する、態様１ないし３のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様６〕
前記光学システムが、さらなる像平面（wBE）を生成するための少なくとも一つの光学系を有しており、特に、前記さらなる像平面（wBE）に検出器（９）が配置される、態様１ないし５のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様７〕
少なくとも一つのスペクトル分散性要素（１２）が、前記像平面（BE）と前記さらなる像平面（wBE）との間に配置され、それにより、少なくとも0以外の回折次数の分割されたビーム束について、異なる波長が前記さらなる像平面（wBE）の異なる位置に合焦されるようにされ、特に、前記少なくとも一つのスペクトル分散性要素（１２）は、前記さらなる像平面（wBE）を生成する光学系のコリメートされたビーム経路部分に配置される、態様１ないし６のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様８〕
前記スペクトル分散性要素（１２）は、前記顕微鏡対物レンズ（２）のひとみ面と共役な面（PE）に、または少なくとも近似的に該面内に、配置される、態様７記載の顕微鏡。
〔態様９〕
前記スペクトル分散性要素（１２）が、前記観察ビーム経路（A）から可逆的に取り外しするために移動可能に取り付けられる、態様７記載の顕微鏡。
〔態様１０〕
前記拡大された焦点深度を生成するための光学系（１０）が、
特に前記顕微鏡対物レンズのひとみ面と共役な面内の、三次位相変調マスクまたはベッセル・ビーム生成手段を有する、および／または、
特にビーム整形によって、特にコリメートされた光のビーム断面積を減らすために、前記顕微鏡対物レンズ（２）のひとみを完全に満たさないよう設計される、
態様２ないし９のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様１１〕
前記拡大された焦点深度を生成するための光学系（１０）が生成する照明体積の軸方向の広がりが、
その横方向の広がりの少なくとも五倍、特に少なくとも十倍、より特定的には少なくとも二十倍である、および／または、
所定の励起波長、前記顕微鏡対物レンズ（２）の所定の開口数、所定の共焦点絞り開口サイズおよび浸漬媒体の所定の屈折率について、当該顕微鏡の光学的断面少なくとも二つ分の厚さに対応する、
態様２ないし１０のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様１２〕
前記回折光学系（７）は、所定の励起波長、前記顕微鏡対物レンズ（２）の所定の開口数、所定の共焦点絞り開口サイズおよび浸漬媒体の所定の屈折率についての隣り合う軸方向測定体積の諸中点が、互いから、当該顕微鏡（１）の三つ以上の光学的断面の厚さ離間されるよう形成される、態様１ないし１１のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様１３〕
前記第一の回折光学系（７）は、前記顕微鏡対物レンズ（２）のひとみに共役な平面（Ge1）に、あるいは少なくとも近似的には該平面に、配置される、態様１ないし１２のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様１４〕
前記光学システムは、前記顕微鏡対物レンズ（２）と前記ビーム組み合わせ器（６）との間に、種々の測定体積を逐次的に走査するための調整可能なビーム偏向ユニット（４）と、前記偏向ユニット（４）を前記顕微鏡対物レンズ（２）のひとみにイメージングするための伝達光学系（３）とを有する、態様１ないし１３のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様１５〕
前記検出器（９）は、回折次数の少なくとも一つにおいて、好ましくは各回折次数において、点拡散関数の空間的な過剰サンプリングをするよう構成されている、態様１ないし１４のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様１６〕
前記焦点深度を拡大する光学系（１０）が、前記像平面（BE）にイメージングされる測定体積すべてが前記拡大された焦点深度の範囲内にあるよう形成される、態様２ないし１５のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
〔態様１７〕
照明焦点が線形であり、その線の長手方向は前記顕微鏡対物レンズ（２）の光軸と平行である、態様２ないし１５のうちいずれか一項記載の顕微鏡。
【符号の説明】
【００６０】
１  顕微鏡
２  対物鏡
３  伝達光学系
４  偏向ユニット
５  伝達光学系
６  ビームスプリッター
７  回折光学系
８  収集光学系
９  検出器マトリクス
１０  位相変調マスク
１１  光源（照明システム）
１２  スペクトル分散性要素
１３  回折光学系
１４  制御ユニット
１５  共焦点絞り
１６  次数分離要素
Ａ  照明ビーム経路
Ｂ  観察ビーム経路
Ｐ  試料
PHE  ピンホール面（Pinholebene）
ZBE  中間像平面（Zwischenbildebene）
L1、L2、L3  面
GE1、GE2、GE3  面
BE  像平面（Bildebene）
PE  ひとみ面（Pupillenebene）
wBE  さらなる像平面（weitere  Bildebene）
【図１】
0006701095.tif 000002
【図２】
0006701095.tif 000003
【図３】
0006701095.tif 000004