(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮頸部から単離された子宮頸部上皮試料について、ＭＵＣ１の発現を検出する工程を含み、前記ＭＵＣ１の発現が、子宮頸がんの罹患の可能性を示す指標であることを特徴とする子宮頸がんの罹患の可能性を試験する試験方法。
【請求項２】
前記検出工程が、ＭＵＣ１に対する結合物質により、ＭＵＣ１の発現を検出する工程である、請求項１記載の試験方法。
【請求項３】
前記検出工程において、ＭＵＣ１に結合した前記結合物質を検出することにより、間接的に、ＭＵＣ１の発現を検出する、請求項２記載の試験方法。
【請求項４】
前記ＭＵＣ１と前記結合物質との結合によって直接的または間接的に生じるシグナルを検出することにより、ＭＵＣ１の発現を検出する、請求項２または３記載の試験方法。
【請求項５】
前記結合物質が、抗ＭＵＣ１抗体である、請求項２から４のいずれか一項に記載の試験方法。
【請求項６】
前記子宮頸部上皮試料が、子宮頸部上皮由来の細胞または組織である、請求項１から５のいずれか一項に記載の試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸がんの試験方法およびそれに用いる試験試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸がんの検診は、細胞診によって行われており、死亡率の軽減が証明されている数少ない検診法である。一般的に、子宮頸部より擦過により得た検体について、パパニコロウ（Ｐａｐ．）染色標本を作製し、細胞検査士と病理医とが、顕微鏡観察により、特徴的な形態をとるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染の上皮細胞を探し、前がん病変の進行度等をベセスダシステムに沿って分類し、リスクが判定されている。このような方法により、前がん病変を早期発見することで、患者の治療に役立てることが有用とされている。
【０００３】
近年、子宮頸がんの低年齢化をうけ、検診対象年齢と受診期間が、２０歳から２年ごととなり、受診率は、２０％台と低いものの、受診者数は、１０年前と比較して２．５倍に増加している。特に、子宮頸がんの大部分は、性交が原因となるＨＰＶ感染によること、性行為の低年齢化傾向等から、子宮頸がんの検診は、今後、さらに増加することが予想される。しかしながら、細胞診による子宮頸がんの検診は、専門家である細胞検査士らによる人力での判定であるため、労力やコストがかかり、市区町村にとって検診費用は大きな負担となっている。さらに、細胞診の対象となる上皮細胞は、年齢や炎症の有無、ホルモン環境によりさまざま形態を呈するため、判定が困難な場合があり、また、人力であるため、熟練が必要であり、検査士によって判断が異なる可能性もある。
【０００４】
そこで、新たに、ＨＰＶ由来のタンパク質を検出する方法（特許文献１）や、ＨＰＶへの感染をＨＰＶのｍＲＮＡまたはＤＮＡの検出により判定するＨＰＶテストの併用が試みられている（特許文献２）。しかし、ＨＰＶテストは、生体組織から遺伝子を抽出し、遺伝子増幅を行う必要があるため、その導入には、コストや人員等の問題がある。また、遺伝子増幅の場合、例えば、プライマーセットの特異性の点から、偽陽性や偽陰性の問題も指摘されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１３−５１６６２３号公報
【特許文献２】特表２００８−５２８０５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、子宮頸がんの罹患可能性を試験する新たな方法、および、それに用いる新たな試験試薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の試験方法は、子宮頸がんの罹患の可能性を試験する方法であり、子宮頸部から単離された生体試料について、ＭＵＣの発現を検出する工程を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の試験試薬は、子宮頸がんの試験試薬であり、ＭＵＣに対する結合物質を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、子宮頸部から単離された生体試料におけるＭＵＣの有無を検出するのみで、容易に、子宮頸がんの罹患可能性を判断できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例１において、ＣＩＮ患者の検体におけるＭＵＣ１の発現を示す免疫染色の結果である。
【図２】図２は、実施例２において、子宮頸がん患者のＬＢＣ検体におけるＭＵＣ１の発現を示す免疫染色の結果である。
【図３】図３は、実施例３において、ＣＩＮ患者およびＳＣＣ陽性患者の検体におけるＭＵＣ１の発現を示す免疫染色の結果である。
【図４】図４は、実施例３において、ＣＩＮ患者およびＳＣＣ陽性患者の検体におけるＭＵＣ１の発現を示す免疫染色の結果である。
【図５】図５は、実施例４において、ＣＩＮ患者の検体におけるＭＵＣ１の発現を示す免疫染色の結果である。
【図６】図６は、実施例５において、内膜腺細胞におけるＭＵＣ１の発現を示す免疫染色の結果である。
【図７】図７は、実施例６において、子宮頸がん患者の検体におけるＭＵＣ１の発現を示す免疫染色の結果である。
【図８】図８は、実施例６において、子宮頸がん患者の検体におけるＭＵＣ１の発現を示す免疫染色の結果である。
【図９】図９は、実施例６において、子宮頸がん患者の検体におけるＭＵＣ１の発現を示す免疫染色の結果である。
【図１０】図１０は、実施例７において、ＮＩＬＭと判断された検体におけるＭＵＣ１の発現を示す免疫染色の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜試験方法＞
本発明の試験方法は、前述のように、子宮頸がんの罹患の可能性を試験する方法であって、子宮頸部から単離された生体試料について、ＭＵＣの発現を検出する工程を含むことを特徴とする。
【００１２】
ＭＵＣは、ムチンのコアタンパク質であり、粘液の成分として知られている。一方、子宮頸部上皮は、粘液を有さないため、子宮頸部上皮にＭＵＣは存在しないというのが技術常識である。しかしながら、本発明者らは、鋭意研究の結果、子宮頸部上皮内腫瘍においては、正常上皮で発現が確認されないＭＵＣが、特異的な形質発現をしていることの知見を得た。そして、このことから、子宮頸部上皮から単離した生体試料について、ＭＵＣの存在を検出することで、子宮頸がんの罹患の可能性を試験できることを見出すに至った。ＭＵＣは、正常上皮では発現が確認されないことから、本発明によれば、例えば、ＭＵＣの存在の有無によって、子宮頸がんか否かを判断でき、また、正常上皮では発現が確認されていないことから、偽陽性または偽陰性の問題も回避でき、信頼性の高い結果を得ることができる。さらに、本発明によれば、ＭＵＣの存在の有無を確認すれば足りることから、例えば、ＭＵＣの検出には、目的物質を検出するための既存の手法を適宜選択でき、子宮頸がんの試験について、低コスト化、簡便化、自動化等も可能となる。
【００１３】
また、前述した細胞診においては、ベセスダシステムにおいて下記表に示すような種類に分類される。そして、実情として、９０〜９５％の検体が、ベセスダシステムにおいて陰性であるＮＩＬＭ（Negative  for  intraepithelial  lesion  or  malignancy）と判断される。これに対して、本発明の試験方法によれば、例えば、まず、本発明の試験方法により、全検体のうち９０〜９５％を占める陰性の検体についてＭＵＣが検出されないことをもって陰性との判断ができる。したがって、本発明の試験方法によりＭＵＣが検出された場合、その検体について、前述のような細胞診をさらに行うことが可能となる。これによって、検診におけるコストや労力を大幅に軽減することも可能である。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
本発明は、前述のように、前記生体試料についてＭＵＣの発現を検出することが特徴であり、その他の条件や工程等は、何ら制限されない。前記検出工程において、ＭＵＣの発現の検出とは、例えば、ＭＵＣの有無の検出（定性）でもよいし、ＭＵＣの量の検出（定量）でもよい。
【００１６】
本発明の試験方法は、例えば、医師による行為を除く。
【００１７】
本発明の試験方法は、例えば、前記検出工程において、ＭＵＣが検出された場合に、子宮頸がんの罹患可能性ありと判断する。
【００１８】
本発明において、前記検出工程は、例えば、ＭＵＣに対する結合物質により、ＭＵＣの発現を検出する工程があげられる。前記結合物質によれば、例えば、ＭＵＣと前記結合物質との結合の有無が、ＭＵＣの有無と相関し、ＭＵＣと前記結合物質との結合の量が、ＭＵＣの量と相関する。このため、前記結合によって、間接的に、ＭＵＣの発現を検出できる。本発明における前記結合物質は、例えば、後述する本発明の試験試薬を援用でき、本発明の試験試薬に読み替えできる。
【００１９】
本発明において、前記検出工程は、例えば、ＭＵＣに結合した前記結合物質を検出することにより、間接的に、ＭＵＣの発現を検出できる。
【００２０】
本発明において、前記検出工程は、例えば、前記ＭＵＣと前記結合物質との結合によって直接的または間接的に生じるシグナルを検出することにより、ＭＵＣの発現を検出できる。前記シグナルは、例えば、後述するような標識物質で前記結合物質を標識化することによって、発生させることができる。
【００２１】
前記結合物質は、ＭＵＣに結合する物質であればよく、特に制限されないが、例えば、ＭＵＣに特異的に結合する物質であることが好ましい。また、前記結合物質は、例えば、ＭＵＣに結合し、且つ、前記子宮頸部から単離される生体試料に含まれるＭＵＣ以外の物質に対して実質的に結合しないことが好ましい。
【００２２】
前記結合物質は、例えば、抗体等のタンパク質、前記抗体の抗原結合断片等のペプチド、核酸等があげられ、中でも、ターゲットとの結合の検出が容易であることから、抗体、すなわち抗ＭＵＣ抗体が好ましい。
【００２３】
ＭＵＣと前記結合物質との結合の検出は、例えば、ターゲットと前記ターゲットに対する結合物質との結合に関する、従来公知の検出方法を採用できる。前記結合物質が抗体の場合は、例えば、抗原−抗体反応の検出方法が採用できる。具体例としては、ＥＬＩＳＡ(Enzyme−Linked  Immuno  Sorbent  Assay)法、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）法、イムノクロマト法、免疫組織化学染色等の免疫染色法、フローサイトメトリー法等があげられる。前記結合物質は、例えば、前記検出方法の種類に応じて、酵素、放射性同位元素、粒子等の標識物質、蛍光色素等の色素、酵素の発色基質等で標識化してもよい。前記粒子は、例えば、金、銀等の金属粒子、着色ラテックス粒子等のラテックス粒子等があげられる。また、前記結合物質は、例えば、前記検出方法の種類に応じて、酵素の基質、二価鉄（Ｆｅ２＋）等の還元剤等と併用してもよい。
【００２４】
前記結合物質が抗体の場合、例えば、ＭＵＣに結合する一次抗体（抗ＭＵＣ抗体）のみを使用してもよいし、ＭＵＣに結合する一次抗体（抗ＭＵＣ抗体）と前記一次抗体に結合する二次抗体とを併用してもよい。前者の場合は、例えば、ＭＵＣに対する一次抗体の結合を検出すればよく、後者の場合、例えば、ＭＵＣに結合した一次抗体に対する二次抗体の結合を検出すればよい。前者の場合、前記一次抗体が、例えば、前記標識物質で標識化された標識化抗体であることが好ましい。後者の場合、前記二次抗体が、例えば、前記標識物質で標識化された標識化抗体であることが好ましい。
【００２５】
ＭＵＣは、前述のように、ムチンのコアタンパク質ファミリーであり、例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７等があげられる。本発明における検出対象のＭＵＣは、例えば、いずれか一種類でもよいし、二種類以上であってもよい。前記検出対象のＭＵＣは、例えば、ＭＵＣ１が好ましい。また、ＭＵＣ以外のターゲットとしては、例えば、扁平上皮から腺組織の分化の過程で発現してくる分子、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ５／６、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ７、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ８、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  １７、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  １８、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  １９、ＢＣＡ２２５、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＡ５０、ＣＡ５４／６１、ＣＡ７２−４、ＣＡ１２５、ＣＡ１３０、ＣＡ６０２、ＣＳＬＥＸ、ＤＵＰＡＮ−２、ＫＭＯ−１、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＳＬＸ、ＳＰａｎ−１、ＳＴＮ、ＣＹＦＲＡ等があげられる。本発明においては、前記ＭＵＣの発現の検出に加えて、例えば、これらの他のターゲットの発現を検出してもよい。
【００２６】
本発明における前記生体試料は、例えば、細胞でもよいし、組織でもよい。前記生体試料は、例えば、子宮頸部上皮由来の試料であることが好ましい。前記生体試料の形態は、固体でも液体でもよく、後者の場合、例えば、細胞もしくは組織を溶媒に懸濁した懸濁液、または細胞もしくは組織を溶媒に浮遊させた浮遊液等があげられる。前記溶媒の種類は、特に制限されず、水、生理食塩水、緩衝液、細胞または組織の保存液等があげられる。
【００２７】
前記生体試料は、例えば、子宮頸部から擦過により得た試料でもよく、前述の細胞診に供する試料のうち、標本の調製において残存した試料を使用してもよい。近年、細胞診に使用する標本の調製には、液化検体細胞診（Liquid  based  cytology法：ＬＢＣ法）が汎用されている。ＬＢＣ法は、専用ブラシで子宮頸部を擦過し、ＬＢＣ専用保存液中で前記専用ブラシを洗浄して細胞を浮遊させ、得られた細胞浮遊液をスライドに均一に塗付することで、標本を作製する方法である。この方法によれば、例えば、細胞の量が足りない、細胞の乾燥等により正しい判定ができないというような不適切標本の問題を回避できる。このため、本発明においては、例えば、前記細胞浮遊液を、前記生体試料として用いてもよい。前記細胞浮遊液を用いる場合、例えば、フローサイトメトリー法を組合せることが好ましい。前記専用ブラシとしては、例えば、ブルーム型ブラシ（例えば、サーベックスブラシ）等があげられ、前記専用保存液としては、例えば、市販品が使用できる。
【００２８】
＜試験試薬＞
本発明の試験試薬は、前述のように、子宮頸がんの試験試薬であり、ＭＵＣに対する結合物質を含むことを特徴とする。本発明の試験試薬は、前記本発明の子宮頸がんの試験方法に使用することができる。本発明の試験試薬は、前記結合物質を含むことが特徴であって、その他の条件や構成は、何ら制限されない。また、本発明の試験試薬は、特に示さない限り、前記本発明の試験方法における前記結合物質の記載を援用できる。
【００２９】
本発明の試験試薬において、前記結合物質は、特に制限されず、前述の通りであり、中でも、抗ＭＵＣ抗体が好ましい。
【００３０】
＜診断方法および診断試薬＞
本発明の診断方法は、例えば、子宮頸がんの診断方法であり、子宮頸部から単離された生体試料について、ＭＵＣの発現を検出する工程を含むことを特徴とする。本発明の診断方法は、前記生体試料についてＭＵＣの発現を検出することが特徴であり、その他の条件や工程は、何ら制限されない。本発明の診断方法は、前記本発明の試験方法における記載を援用でき、医師の行為を含んでもよい。
【００３１】
また、本発明の診断試薬は、子宮頸がんの診断試薬であり、ＭＵＣに対する結合物質を含むことを特徴とする。本発明の診断試薬は、前記本発明の子宮頸がんの診断方法に使用することができる。本発明の診断試薬は、前記結合物質を含むことが特徴であって、その他の条件や構成は、何ら制限されない。また、本発明の診断試薬は、特に示さない限り、前記本発明の試験試薬の記載を援用できる。
【００３２】
本発明の診断方法は、細胞診との組合せで行うことが好ましい。例えば、患者から生体試料を採取し、一部は、細胞診用の検体とし、一部は、ＭＵＣの検出用の検体とする。そして、ＭＵＣの検出によりＭＵＣ陽性と判断された生体試料についてのみ、前記細胞診用の検体について細胞診を行う。このような方法によれば、前述のように、大量の生体試料について細胞診を行うことを回避し、コストや労力を大幅に軽減できる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
［実施例１］
細胞診により子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）が確認された患者３０人から、子宮頸部上皮の生体組織を採取し、これらの検体について、ＭＵＣ１の発現を確認した。
【００３５】
ＭＵＣ１の発現は、１次抗体として、抗ＭＵＣ１抗体〔Ma695〕（商品名Novocastra（商標）  Lyophilized  Mouse  Monoclonal  Antibody  Muc−1  Glycoprotein  NCL−MUC−1、クローン名  Ｍａ６９５；セルラインＺＲ７５−１、Leica社）および（商品名Anti−MUC1  antibody  [M4H2]  ab10120、Abcam社、クローン名  Ｍ４Ｈ２、エピトープ  GVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA）を用い、２次抗体として、デキストランポリマーに抗マウスＩｇＧとＨＲＰとが結合した試薬（商品名EnVision+Kit  K4007、DAKO社）を用い、ＨＲＰの基質であるＤＡＢの発色により確認した。
【００３６】
その結果、患者２７人の検体において、抗ＭＵＣ１抗体による染色が見られたことから、ＭＵＣ１が発現していることがわかった。図１は、これらの結果の一部を示す。図１は、抗ＭＵＣ抗体を用いた免疫染色の結果であり、３０検体のうち、代表してＣＩＮ分類によりＣＩＮ１（軽度異形成）と判断された患者の検体、ＣＩＮ３（高度異形成）と判断された患者の検体の結果を示す。図１において、バーは、１００μｍの長さを示し、点線で囲んだ領域が染色された領域である。（Ａ）が、ＣＩＮ１検体の結果、（Ｂ）が、ＣＩＮ３検体の結果、（Ｃ）が、Ｃ１Ｎ１検体のＣＩＮ１側方浸襲と正常粘膜との境界のＨＥ染色の結果、（Ｄ）が、前記（Ｃ）に示す検体の連続切片についてのＭＵＣ１染色の結果である。これらの結果から、ＨＥ染色では不明瞭であったＣＩＮ浸襲領域を、抗ＭＵＣ１抗体を用いた免疫染色により、明らかにできることがわかった。つまり、ＭＵＣ１の発現の検出によって、ＣＩＮか否かを判断できるといえる。
【００３７】
図１（Ａ）および（Ｂ）に示すように、いずれのＣＩＮ患者も、抗ＣＩＮ抗体により染色されたことから、ＭＵＣ１が異所性発現していることが確認できた。これに対して、（Ｃ）および（Ｄ）に示すように、正常な子宮頸部の扁平上皮組織では、ＭＵＣ１が発現していないことが確認できた。
【００３８】
［実施例２］
細胞診により子宮頸がんと診断された患者から、子宮頸部上皮の生体組織を採取し、液状細胞診（ＬＢＣ）用の検体を調製し、前記検体について、ＭＵＣ１の発現を確認した。
【００３９】
ＬＢＣ用キットThin  Prep（登録商標、ホロジック社）を用いて、ＬＢＣ用検体を調製し、以下の方法で、プレパラートへの細胞塗抹を行った。
（１）  前記キットの容器内でＬＢＣ用の検体を混和し、ディスポーザブルのスポイトで、前記容器中のＬＢＣ細胞浮遊液を１０ｍｌ採取してスピッツ管に移し、８００Ｇ、２分間で遠心後、上清を除去した。
（２）前記スピッツ管内の沈渣に１％カーボワックス含有５０％エタノール５ｍｌを加え、前記沈渣を再浮遊させ、５分間静置後、８００Ｇ、２分間で遠心し、さらに上清を除去した。
（３）前記スピッツ管内の沈渣を、前記（１）で使用したディスポーザブルピペットで吸い上げ、適量（０．５〜１ｍｌ）を、２枚のスライドガラスの下から１／３位の領域にすり合わせ、３０分間、ふ卵器内で、完全に塗抹細胞を乾燥させた。
（４）局方エタノールを染色用バットに用意し、乾燥させた前記スライドを入れて、３０分間以上固定した。
（５）固定完了後、蒸留水バットに前記乾燥スライドを５分間浸し、免疫染色用ＰＢＳバットに移した。この染色前処理を施した前記スライドを、免疫染色に使用した。
【００４０】
つぎに、前記スライドに固定した前記検体について、免疫染色によりＭＵＣ１の発現を確認した。前記発現は、第１抗体として、前記実施例１で使用した抗ＭＵＣ１抗体〔Ma695〕（商品名Novocastra）を用い、第２抗体として、以下の３種類（ａ）〜（ｃ）の発色系または蛍光系を使用した。
（ａ）Alexa  Fluor  488で標識化した２次抗体
商品名  Alexa  Fluor  488,  Life  Technologies社、goat  anti−mouse  IgG
（ｂ）デキストランポリマーに抗マウスＩｇＧとＨＲＰが結合した２次抗体
商品名  EnVision（商標）+Kit,  K4007  DAKO社、HRP（ペルオキシダーゼ）標識goat  anti−mouse  IgG
発色基質：ＤＡＢ
（ｃ）ビオチン標識した抗マウスIgGにAP（アルカリホスファターゼ）標識ストレプトアビジンを結合した２次抗体
商品名  ヒストファインSAB−APキット
発色基質：Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ
商品名  Vulcam  Fast  Red  Chromogen  Kit2、Biocare  Medical社
【００４１】
そして、具体的には、以下のように発現を確認した。
（１）  前記スライドを軽くＰＢＳに浸してから、細胞塗抹領域を避けて余分なＰＢＳを拭き上げたのち、湿潤チャンバー内にスライドを並べ、前記スライドに、５００倍に希釈した前記（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の抗ＭＵＣ１抗体を１００μｌ滴下して、前記スライドにおける塗抹面全体にわたせた。そして、３０分反応後、前記スライドをＰＢＳで３回洗浄後、前記各発色系または蛍光系に応じて、下記（２ａ）、（２ｂ）または（２ｃ）の染色ステップを行った。
【００４２】
（２ａ）  前記（ａ）のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識化２次抗体は、２００倍希釈して、遮光した湿潤チャンバー内で前記スライドと１時間反応させ、前記スライドをＰＢＳで３回洗浄した。前記スライドを、ＰＢＳで１０００倍に希釈したＤＡＰＩで約１０秒間核染を行い、その後、前記スライドをＰＢＳで３回洗浄し、蛍光色素用封入を施して、蛍光顕微鏡にて観察した。
【００４３】
（２ｂ）  ＤＡＢ発色の場合は、前記スライドを、前記（ｃ）のキット（EnVision（商標）  Kit）で３０分間反応させた後、ＰＢＳにて３回洗浄した。その後、前記スライドを、発色基質ＤＡＢで処理し、発色反応を３０秒間行った。そして、前記スライドを、ヘマトキシリンで約１０秒間核染を行った後、光学顕微鏡下で観察した。
【００４４】
（２ｃ）Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ発色の場合は、前記スライドと前記（ｃ）の２次抗体とを、湿潤チャンバー内で３０分間反応させた。反応後、前記スライドをＴＢＳ（トリスバッファーサリン）で３回洗浄し、２００倍に希釈したＡＰ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社）と、湿潤チャンバー内で約３０分間染色反応を行った。そして、前記スライドをＴＢＳで３回洗浄し、前記（ｃ）のキット（Vulcam  Fast  Red  Chromogen  Kit）で１０分間発色反応を行った。そして、前記スライドを流水で水洗し、ヘマトキシリンで核染した後、さらに水洗して、蒸留水に通し、水溶性封入剤にて封入を行い、光学顕微鏡下で観察した。
【００４５】
これらの結果を、図２に示す。図２は、抗ＭＵＣ抗体を用いた免疫染色の結果であり、（Ａ）は、３０検体のうち、代表してベセスダシステムによりＨＳＩＬ（中等度異形成：Moderate  dysplasia）と判断された患者の検体、ＬＳＩＬ（軽度異形成：Maild  dysplasia）と判断された患者の検体の結果を示す。図２において、（Ａ）が、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８で蛍光させた結果であり、点線で囲んだ領域が染色された領域であり、（Ｂ）が、ＤＡＢで発色させた結果、（Ｃ）が、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄで発色させた結果であり、上段が、ＨＳＩＬの結果を示し、下段が、ＬＳＩＬの結果を示す。いずれの発色法によっても、染色性にブレが無く、ＭＵＣ１との反応性を反映した染色態度であることがわかった。ＬＢＣ（液状細胞診）検体に出現した異型細胞においても、組織切片と同様に、ＭＵＣ１の高発現が確認できた。また、恣意的操作を避けるため、異なる標識にて発色を行った結果においても、観察に問題ないことが確認できた。
【００４６】
図２に示すように、いずれの標識を使用した場合でも、抗ＭＵＣ１抗体により、ＭＵＣ１の高発現が確認できた。
【００４７】
［実施例３］
ＭＵＣ１を抗原とする異なる抗ＭＵＣ１抗体を用いて、子宮頸部上皮の検体について染色性の確認を行った。
【００４８】
検体は、ＣＩＮ２（中等度異形成）の患者、子宮頸がんの腫瘍マーカーＳＣＣ陽性の患者から採取した。
【００４９】
前記実施例１と同様に、１次抗体（抗ＭＵＣ１抗体）として、アブカム社のモノクローナル抗体１（商品名Anti−MUC1  antibody  [M4H2]  ab10120、Abcam社、クローン名  Ｍ４Ｈ２；エピトープGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA）およびモノクローナル抗体２（商品名Novocastra（商標）  Lyophilized  Mouse  Monoclonal  Antibody  Muc−1  Glycoprotein  NCL−MUC−1、クローン名  Ｍａ６９５、セルラインＺＲ７５−１、Leica社）を使用した。そして、前記実施例１と同様にして、免疫染色を行った。
【００５０】
これらの結果を図３に示す。図３は、各抗ＭＵＣ抗体を用いた免疫染色の結果である。図３において、点線で囲んだ領域が染色された領域であり、上段が、ＣＩＮ２の検体、下段が、ＳＣＣの検体であり、（Ａ）が、前記モノクローナル抗体１の結果、（Ｂ）が、前記モノクローナル抗体２の結果を示す。
【００５１】
図３に示すように、ＣＩＮ２とＳＣＣについて、２種類の抗ＭＵＣ１抗体の染色性を確認した。その結果、いずれの抗体を使用した場合でも、ＣＩＮ２およびＳＣＣにおけるＭＵＣ１の発現を確認することができた。中でも、図３（Ｂ）に示すように、前記モノクローナル抗体２〔Ｍａ６９５〕の染色態度は、より特異性および感度に優れていた。
【００５２】
また、ＣＩＮ１患者、ＣＩＮ２患者、ＣＩＮ３患者およびＳＣＣ陽性患者について、同様に、抗ＭＵＣ１抗体として前記モノクローナル抗体２〔Ｍａ６９５〕を用い、前記実施例１と同様にして、免疫染色を行った。これらの結果を図４に示す。図４において、点線で囲んだ領域が染色された領域であり、（Ａ）が、ＣＩＮ１の検体、（Ｂ）が、ＣＩＮ３の検体、（Ｃ）が、ＣＩＮ２の結果、（Ｄ）が、ＳＣＣ陽性の結果である。（Ａ）および（Ｂ）のバーは、１００μｍであり、（Ｃ）および（Ｄ）のバーは、２００μｍである。図４に示すように、子宮頚内膜病変の進行度に拘わらず。概ね基底層〜表層に至る全層性に強い染色性が得られることがわかった。
【００５３】
［実施例４］
子宮頸部上皮組織において、正常扁平上皮組織と子宮頸部上皮内病変との境界が、ＭＵＣ１の局在によって判別できるかを確認した。
【００５４】
ＣＩＮ１の患者から採取した検体（１５例）を使用し、実施例１と同様にして、１次抗体として前記抗ＭＵＣ１抗体〔Ma695〕を使用し、免疫染色を行った。この結果を図５に示す。図５において、点線で囲んだ領域が染色された領域であり、バーは、１００μｍであり、（Ａ）は、ＨＥ染色の結果であり、（Ｂ）は、同じ検体に対する免疫染色の結果である。図５に示すように、抗ＭＵＣ１抗体〔Ma695〕を用いた免疫染色によって、染色された領域と未染色の領域との境界が明らかとなり、ＭＵＣ１発現が局在していることがわかった。このことから、抗ＭＵＣ１抗体〔Ma695〕を用いた免疫染色によれば、正常扁平上皮組織が同様に染色されることはなく、特異的に高感度で子宮頸部上皮内病変を判断できることがわかった。
【００５５】
［実施例５］
子宮頸部の内膜腺細胞（ＥＣ）におけるＭＵＣ１の染色性を確認した。
【００５６】
患者から採取した正常腺細胞５例、異型性腺細胞（ＡＧＣ）５例および腺癌細胞９例の検体を使用し、実施例１と同様にして同様にして、１次抗体として前記抗ＭＵＣ１抗体〔Ma695〕を使用し、免疫染色を行った。この結果を図６に示す。図６において、点線で囲んだ領域が染色された領域であり、バーは、２００μｍであり、（Ａ）は、正常腺細胞、（Ｂ）は、異型性腺細胞、（Ｃ）は、腺癌細胞の結果である。図６に示すように、抗ＭＵＣ１抗体〔Ma695〕を用いた免疫染色によって、正常腺細胞は染色されないが、異型性腺細胞および腺癌細胞は染色され、ＭＵＣ１発現が確認できた。
【００５７】
［実施例６］
ベセスダシステムにより、ＨＳＩＬ（高度扁平上皮内病変）、ＡＳＣ−ＵＳ（意義不明異型扁平上皮細胞）、ＡＳＣ−Ｈ（ＨＳＩＬを除外できない異型扁平上皮細胞）と判定された検体について、抗ＭＵＣ１抗体によりＭＵＣ１の発現を確認した。
【００５８】
前記検体１９例を使用し、前記実施例１と同様にして、１次抗体として前記抗ＭＵＣ１抗体〔Ma695〕を使用し、免疫染色を行った。これらの結果を図７〜図９に示す。各図において、点線で囲んだ領域が染色された領域である。
【００５９】
図７は、ＨＩＳＬ検体の結果であり、（Ａ）は、パパニコロウ染色の結果、（Ｂ）は、Ｆａｓｔ  ｒｅｄ発色によるＭＵＣ１の染色の結果、（Ｃ）は、ＤＡＢ発色によるＭＵＣ１の染色の結果、（Ｄ）は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８によるＭＵＣ１の蛍光発色の結果を示す。図７において、（Ａ）に示すように、パパニコロウ染色では、核の腫大および大小不同が目立つ、解れの少ない細胞集塊が確認されたが、ＭＵＣ１発現を検出する（Ｂ）〜（Ｃ）の発色および（Ｄ）の蛍光からも、異型形質を示す扁平上皮細胞および頸内膜腺細胞であることが推測された。
【００６０】
図８は、ＡＳＣ−ＵＳ検体の結果であり、（Ａ）は、パパニコロウ染色の結果、（Ｂ）は、ＤＡＢ発色によるＭＵＣ１の染色とエオジンによる後染色の結果、（Ｃ）は、パパニコロウ染色の結果、（Ｄ）は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８によるＭＵＣ１の蛍光発色の結果を示す。図８において、（Ａ）に示すように、パパニコロウ染色では、核の腫大がみられるるものの、Ｎ／Ｃ比が低い細胞集塊が確認されたが、ＭＵＣ１発現を検出する（Ｂ）の発色から、異型形質を示す扁平上皮細胞および頸内膜腺細胞であることが推測された。また、図８において、（Ｃ）に示すように、パパニコロウ染色では、軽度の核腫大を伴う類円形細胞が認められ、ＭＵＣ１発現を検出する（Ｄ）の蛍光からは、異型形質を示す扁平上皮細胞および頸内膜腺細胞であることが推測された。
【００６１】
図９は、ＡＳＣ−Ｈ検体の結果であり、（Ａ）は、パパニコロウ染色の結果、（Ｂ）は、ＤＡＢ発色によるＭＵＣ１の染色の結果、（Ｃ）は、パパニコロウ染色の結果、（Ｄ）は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８によるＭＵＣ１の蛍光発色の結果を示す。図９において、（Ａ）に示すように、パパニコロウ染色では、核腫大した細胞密度の高い子宮頚部異型腺細胞集塊が確認され、ＭＵＣ１発現を検出する（Ｂ）の発色から、異型形質を示す扁平上皮細胞および頸内膜腺細胞であることが推測された。また、図９において、（Ｃ）に示すように、パパニコロウ染色では、粘液と炎症細胞で覆われている異型腺管が認められ、ＭＵＣ１発現を検出する（Ｄ）の蛍光からは、異型形質を示す扁平上皮細胞および頸内膜腺細胞であることが推測された。
【００６２】
このように、図７〜９の結果から、子宮頸管病変において抗ＭＵＣ１抗体に反応性を示す細胞群は、異型形質を示す扁平上皮細胞および頸内膜腺細胞であると判断できることがわかった。
【００６３】
［実施例７］
ベセスダシステムにより、ＮＩＬＭ（上皮内病変または悪性病変を認めず）と判定された検体について、抗ＭＵＣ１抗体によりＭＵＣ１の発現を確認した。
【００６４】
ＮＩＬＭ検体は、Ｐａｐ．標本について、化生細胞として認識されたためＮＩＬＭと判定された患者（Ａ）、病変が小型および少数であったことからＮＩＬＭと判定された患者（Ｂ）、病変が認められないことからＮＩＬＭと判定された患者（Ｃ）より調製した。そして、ＭＵＣ１の発現は、実施例１と同様にして、１次抗体として前記抗ＭＵＣ１抗体〔Ma695〕を使用し、確認した。これらの結果を図１０に示す。図１０（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）は、３人の患者（Ａ、Ｂ、Ｃ）のそれぞれの結果を示す。図１０に示すように、いずれの患者も抗ＭＵＣ１抗体による染色が認められたことから、ＭＵＣ１発現が確認された。前述の各実施例において、子宮頸がんとＭＵＣ１発現との高い相関性が確認されていることから、ベセスダ判定によりＮＩＬＭと判定された患者であっても、ＭＵＣ１発現の確認によって、ＡＳＣ−ＵＳまたはＡＳＣ−Ｈ相当の所見が得られるといえる。
【００６５】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上のように、本発明によれば、子宮頸部から単離された生体試料におけるＭＵＣの有無を検出するのみで、容易に、子宮頸がんの罹患可能性を判断できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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