(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  アミノ酸配列RGDを含む、インテグリンに結合するペプチド;
(b)  該ペプチドのアミノ末端に共有結合した第1のポリエチレングリコール(PEG)部分;  および
(c)  該ペプチドのカルボキシル末端に共有結合した第2のPEG部分
を含み、
ペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合した画像化剤または治療剤をさらに含む、
結合体。
【請求項２】
インテグリンがαvβ3インテグリン、αIIbβ3インテグリン、またはαvβ6インテグリンである、請求項1に記載の結合体。
【請求項３】
(a)  ペプチドがアミノ酸配列RGDLX1X2X3を含み、式中、X1およびX2が独立して選択されるアミノ酸であり、X3がLもしくはIである、
(b)  ペプチドがアミノ酸配列RGDLX1X2X3を含み、式中、X1およびX2が独立して選択されるアミノ酸であり、X3がLもしくはIであり、かつ
(i)  X1がQであり、X2がVであり、X3がLである、かつ／もしくは
(ii)  ペプチドがアミノ酸配列RGDLX1X2X3AQX6を含み、X6がRもしくはKである、
または
(c)  ペプチドが、NAVPNLRGDLQVLAQRVART (A20FMDV2 K16R)およびNAVPNLRGDLQVLAQKVART (A20FMDV2)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項2に記載の結合体。
【請求項４】
ペプチドが、インテグリンおよび該インテグリンと同時発現される受容体に結合する、またはインテグリンおよびCXCR4に結合する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項５】
(a)  ペプチドが約8〜約45アミノ酸長、約8〜約25アミノ酸長、もしくは約21アミノ酸長もしくはそれ以上である、
(b)  第1のPEG部分および第2のPEG部分がそれぞれ約3000ダルトン(Da)未満の分子量を有する、もしくは第1のPEG部分および第2のPEG部分がそれぞれ約3000ダルトン(Da)未満の分子量を有し、かつPEG12(PEG  800)、PEG28(PEG  1500)、および(PEG28)2(PEG  1500x2)からなる群より独立して選択される、
(c)  第1のPEG部分および第2のPEG部分が、同じものである、もしくはいずれもPEG28(PEG  1500)である、かつ／または
(d)  第1のPEG部分および第2のPEG部分が、規定の鎖長を有する単分散PEG部分である、もしくは第1のPEG部分および第2のPEG部分が、規定の鎖長を有する単分散PEG部分であり、かつ単分散PEG部分が約95%を超えるオリゴマー純度を有する、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項６】
(a)  画像化剤が放射性核種、ビオチン、フルオロフォア、蛍光タンパク質、抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、
(b)  画像化剤が、放射性核種、ビオチン、フルオロフォア、蛍光タンパク質、抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ該放射性核種が、
(i)  11C、13N、15O、18F、19F、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、111In、124I、125I、および131Iからなる群より選択される、かつ／もしくは
(ii)  補欠分子族によってペプチド、第1のPEG部分、もしくは第2のPEG部分に結合している、
(c)  治療剤が、放射性核種、アポトーシス促進性ペプチド、ナノ粒子、化学療法剤、ナノ液滴、リポソーム薬、サイトカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、
または
(d)  治療剤が、放射性核種、アポトーシス促進性ペプチド、ナノ粒子、化学療法剤、ナノ液滴、リポソーム薬、サイトカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
(i)  放射性核種が
−  90Yおよび177Luからなる群より選択される、かつ／もしくは
−  キレート剤によってペプチド、第1のPEG部分、もしくは第2のPEG部分に結合している、
(ii)  アポトーシス促進性ペプチドが
−  D(KLAKLAK)2を含む、かつ／もしくは
−  グリシンリンカーによってペプチド、第1のPEG部分、もしくは第2のPEG部分に結合している、
(iii)  ナノ粒子が、化学療法剤を担持するPEG5KCA8を含む、かつ／もしくは
(iv)  化学療法剤がパクリタキセル(PTX)、ゲムシタビン、もしくはそれらの組み合わせである、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項７】
ペプチド、第1のPEG部分、もしくは第2のPEG部分に共有結合したアルブミン結合性モチーフをさらに含む、または、ペプチド、第1のPEG部分、もしくは第2のPEG部分に共有結合した4-(4-ヨードフェニル)酪酸をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項８】
請求項1〜7のいずれか一項に記載の結合体もしくは複数の該結合体を含む組成物、
または
請求項1〜7のいずれか一項に記載の結合体もしくは複数の該結合体を含む組成物であって、
(a)  規定の鎖長を有する単分散PEG部分が前記複数の結合体中に存在する、
(b)  前記複数の結合体が互いに連結されて多量体結合体を形成する、かつ／もしくは
(c)  前記複数の結合体が互いに連結されて多量体結合体を形成し、かつ
(i)  多量体結合体が前記複数の結合体の二量体もしくは四量体である、かつ／もしくは
(ii)  前記複数の結合体が少なくとも1つのリジン残基によって各結合体の第2のPEG部分において互いに連結されている、
組成物。
【請求項９】
薬学的担体または賦形剤をさらに含む、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
(a)  請求項1〜7のいずれか一項に記載の結合体または請求項8もしくは9に記載の組成物;および
(b)  画像化または治療における該結合体または該組成物の使用説明書
を含む、画像化用または治療用のキット。
【請求項１１】
画像化剤がペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の結合体または請求項8もしくは9に記載の組成物を含む、対象における標的組織のインビボ画像化のための薬学的組成物であって、
該結合体の検出によって、該結合体が該対象中のどこに濃縮されているかが測定される、薬学的組成物。
【請求項１２】
(a)  標的組織ががん組織もしくは臓器である、
(b)  標的組織が、膵がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、もしくは口腔扁平上皮がんに関連しているがん組織もしくは臓器である、
(c)  画像化剤が、放射性核種、ビオチン、フルオロフォア、蛍光タンパク質、抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、
(d)  画像化剤が放射性核種であり、該放射性核種からの放射線が、結合体が対象中のどこに濃縮されているかを測定するために使用される、
(e)  結合体が磁気共鳴画像法(MRI)、磁気共鳴分光法(MRS)、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、陽電子放射断層撮影法(PET)、もしくは光学画像化により検出される、
(f)  結合体が、インテグリンにより媒介される疾患もしくは障害の診断もしくは予後予測のために検出される、
かつ／または
(g)  結合体が、インテグリンにより媒介される疾患もしくは障害の診断もしくは予後予測のために検出され、疾患もしくは障害が
(i)  インテグリンの発現、過剰発現、もしくは活性化に関連している、かつ／もしくは
(ii)  αvβ6インテグリン媒介性の疾患もしくは障害である、
請求項11に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
治療剤がペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載の結合体または請求項8もしくは9に記載の組成物を含む、対象においてインテグリン媒介性の疾患または障害を処置するための薬学的組成物。
【請求項１４】
(a)  疾患もしくは障害がインテグリンの発現、過剰発現、もしくは活性化に関連している、
(b)  疾患もしくは障害ががん、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、および慢性創傷性皮膚疾患からなる群より選択される、
(c)  治療剤が、放射性核種、アポトーシス促進性ペプチド、ナノ粒子、化学療法剤、ナノ液滴、リポソーム薬、サイトカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、
(d)  疾患もしくは障害がαvβ6インテグリン媒介性の疾患もしくは障害である、
(e)  疾患もしくは障害が膵がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、もしくは口腔扁平上皮がんであるαvβ6インテグリン媒介性の疾患もしくは障害である、かつ／または
(f)  結合体もしくは組成物の治療有効量が、インテグリンを発現する細胞に治療剤の送達を標的化するために十分な量である、
請求項13に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
(a) インテグリンに結合するペプチドであって、アミノ酸配列RGDLX1X2X3を含み、式中、X1およびX2が独立して選択されるアミノ酸であり、X3がLまたはIである、ペプチド;
(b) 該ペプチドのアミノ末端に共有結合した第1のポリエチレングリコール(PEG)部分; および
(c) 該ペプチドのカルボキシル末端に共有結合した第2のPEG部分
を含む、結合体であって、第1のPEG部分および第2のPEG部分がそれぞれ約3000ダルトン(Da)未満の分子量を有する、結合体。
【請求項１６】
(a)  インテグリンに結合し、アミノ酸配列RGDLX1X2X3またはアミノ酸配列RGDLX1X2X3AQX6を含むペプチドであって、式中、X1およびX2が独立して選択されるアミノ酸であり、X3がLもしくはIであり、かつX6がRもしくはKである、ペプチド；
(b)  該ペプチドのアミノ末端に共有結合した第1のポリエチレングリコール(PEG)部分;  ならびに
(c)  該ペプチドのカルボキシル末端に共有結合した第2のPEG部分
を含む、
結合体。
【請求項１７】
インテグリンがαvβ3インテグリン、αIIbβ3インテグリン、またはαvβ6インテグリンである、請求項15または16に記載の結合体。
【請求項１８】
(a) X1がQであり、X2がVであり、かつX3がLである；かつ／または
(b) ペプチドがアミノ酸配列RGDLX1X2X3AQX6を含み、式中、X6がKもしくはRである、
請求項15〜17のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項１９】
ペプチドが、NAVPNLRGDLQVLAQRVART (A20FMDV2 K16R)およびNAVPNLRGDLQVLAQKVART (A20FMDV2)からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項15〜18のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２０】
(a)  ペプチド、第1のPEG部分、もしくは第2のPEG部分に共有結合した画像化剤もしくは治療剤をさらに含む、
(b)  ペプチドが約8〜約45アミノ酸長、約8〜約25アミノ酸長、もしくは約21アミノ酸長もしくはそれ以上である、
(c)  第1のPEG部分および第2のPEG部分が、PEG12(PEG  800)、PEG28(PEG  1500)、および(PEG28)2(PEG  1500x2)からなる群より独立して選択される、
(d)  第1のPEG部分および第2のPEG部分が同じものである、もしくは第1のPEG部分および第2のPEG部分が同じものであり、かついずれもPEG28(PEG  1500)である、かつ／または
(e)  第1のPEG部分および第2のPEG部分が規定の鎖長を有する単分散PEG部分である、もしくは第1のPEG部分および第2のPEG部分が規定の鎖長を有する単分散PEG部分であり、かつ単分散PEG部分が約95%を超えるオリゴマー純度を有する、
請求項15〜19のいずれか一項に記載の結合体。
【請求項２１】
(a)  画像化剤が、放射性核種、ビオチン、フルオロフォア、蛍光タンパク質、抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、
(b)  画像化剤が、放射性核種、ビオチン、フルオロフォア、蛍光タンパク質、抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ該放射性核種が、
(i)  11C、13N、15O、18F、19F、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、111In、124I、125I、および131Iからなる群より選択される、かつ／もしくは
(ii)  補欠分子族によってペプチド、第1のPEG部分、もしくは第2のPEG部分に結合している、
(c)  治療剤が、放射性核種、アポトーシス促進性ペプチド、ナノ粒子、化学療法剤、ナノ液滴、リポソーム薬、サイトカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、
または
(d)  治療剤が、放射性核種、アポトーシス促進性ペプチド、ナノ粒子、化学療法剤、ナノ液滴、リポソーム薬、サイトカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され、かつ
(i)  放射性核種が
−  90Yおよび177Luからなる群より選択される、かつ／もしくは
−  キレート剤によってペプチド、第1のPEG部分、もしくは第2のPEG部分に結合している、
(ii)  アポトーシス促進性ペプチドが
−  D(KLAKLAK)2を含む、かつ／もしくは
−  グリシンリンカーによってペプチド、第1のPEG部分、もしくは第2のPEG部分に結合している、
(iii)  ナノ粒子が、化学療法剤を担持するPEG5KCA8を含む、かつ／もしくは
(iv)  化学療法剤がパクリタキセル(PTX)、ゲムシタビン、もしくはそれらの組み合わせである、
請求項20に記載の結合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年4月15日出願の米国仮出願第61/979,997号の優先権を主張し、その開示全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府の支援による研究および開発に基づいてなされた発明の権利に関する記載
本発明は、米国エネルギー省が授与した助成番号DE-SC0002061に基づく政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
インテグリンは、細胞-細胞接着および細胞-細胞外マトリックス(ECM)接着の媒介を担う細胞表面受容体の大きなファミリーである。少なくとも24種の異なるインテグリンが存在し、それぞれαおよびβサブユニットで構成されるヘテロ二量体であり、その発現は、組織型、発生段階、ならびに炎症およびがんなどの様々な組織病態を含むいくつかの要因により決定される。インテグリンは固有の酵素活性を有さないが、リガンド結合の後に、インテグリンは細胞質構造分子とシグナル伝達分子の複合体を並置することで細胞外の合図を細胞内シグナルに変換し、次にこれらは相互作用して細胞応答を決定する。インテグリンが運動、増殖、浸潤、および生存を含む細胞挙動の大部分の要素に関与していることから、疾患におけるインテグリンの役割が広く報告されている。実際、いくつかのインテグリンは、がんを含む特定の疾患を促進する上で能動的役割を果たすと考えられる。例えば、αvβ3インテグリンは、浸潤促進メタロプロテイナーゼを上方制御することならびに遊走促進シグナルおよび生存シグナルを与えることを含むその複数の能力の結果として、黒色腫および神経膠芽腫の浸潤性表現型を促進することに関与している。αvβ3が血管新生性血管の内皮細胞上でも上方制御されており、がんにおける新生血管の発生のために同様のシグナルを与えうることから、そのようなデータによって、多くの薬学的および学術的拠点は、その多くがペプチドまたはペプチド模倣体であるαvβ3アンタゴニストを、治療目的で開発するに至った。したがって、インテグリン-リガンド相互作用の構造的基礎を理解することは、改善されたインテグリンアンタゴニストの設計に役立つであろう。
【０００４】
αvβ6インテグリン受容体は上皮細胞上でのみ発現される。このインテグリンは正常組織および病理組織の両方のプロセスに関与している。例えば、αvβ6は創傷治癒および炎症中に上皮細胞により上方制御される。おそらくは、αvβ6がTGF-βの保護プロペプチド、すなわち潜在関連ペプチド(LAP)に結合することでTGF-βを局所的に活性化する能力が、これら一過性の病態におけるこのインテグリンの機能の理由である。したがって、TGF-βは炎症応答および上皮増殖を抑制することができ、このことは、αvβ6がこれらのプロセスを減弱させる負の制御として働くことを示している。しかし、慢性炎症はTGF-βの過剰なαvβ6依存性活性化を導くことがあり、これにより実験動物の肺中で線維症が生じる。結果として、ヒトにおいて線維症を生じさせるいくつかの病態に、αvβ6依存性TGF-β活性化が関与することもある。マウスの皮膚中での構成的αvβ6過剰発現は、著しい数のトランスジェニック動物に現れる慢性創傷を生じさせる。したがって、ヒト疾患に関連する慢性創傷(例えば特定の形態の表皮水疱症)が、創傷ケラチノサイトにより発現されるαvβ6の上方制御によって促進されるかまたは悪化することもある。
【０００５】
最近、αvβ6インテグリンががんにおける新たな主要標的であることが明らかになった。αvβ6は上皮特異的であるが、大部分の上皮静止組織中では弱いかまたは検出不能である。但し、多くの種類のがんでは、しばしば浸潤先進部で強く上方制御される。例えば、αvβ6は口腔扁平上皮がん(OSCC)、膵がん、卵巣がん、および結腸がんにおいて高度に上方制御される。がん細胞の生存がAkt上方制御によって促進されるようにメタロプロテイナーゼを上方制御しかつ運動性の増加を促進することで、αvβ6ががん浸潤を促進することができることが示された。これらのデータは、αvβ6が浸潤性表現型を能動的に促進することを示している。また、αvβ6の高発現が結腸がん患者の生存期間中央値の有意な減少と相関していることも示された。
【０００６】
さらに、αvβ6インテグリンは、ウイルスカプシドタンパク質VP1中のRGDモチーフを通じた結合によるインビトロの口蹄疫ウイルス(FMDV)の受容体として同定された。構造試験は、FMDVが細胞に結合する様式の1つが、タンパク質シェル上にループを含む小さな31アミノ酸を通じての結合であることを明らかにした。このFMDVループは高い選択性および特異性でαvβ6に結合する。PCT公開番号WO 07/039728(特許文献1)では、競合的ELISA結合アッセイにおいて固定化したヒトαvβ6に高い特異性および選択性で結合した、FMDVループの20個のコアアミノ酸からなる放射標識αvβ6標的化ペプチドA20FMDV2が記載されている。また、放射標識A20FMDV2がαvβ6発現ヒト腫瘍を画像化する能力が、胸腺欠損nu/nuマウスモデルにおいてPETを使用することで評価された。しかし、これらのインビボ試験は放射標識αvβ6標的化ペプチドの急速な代謝を示した。実際、尿中の放射能は1時間で3つの代謝物の間でほぼ均等に分布し、未代謝ペプチドは検出されなかった。αvβ6発現腫瘍からの放射能の洗い出し(washout)も同様に観察された。特に、腫瘍1グラム当たりのペプチド注入量パーセント(% ID/g)は注入後1時間、2時間、および4時間の時点でそれぞれ0.66、0.28、および0.06であった。
【０００７】
上記に鑑み、αvβ6発現腫瘍に対する高い腫瘍選択性および腫瘍特異性を示すだけでなく、αvβ6発現腫瘍中での増加した代謝安定性および滞留性を示すことも可能である、腫瘍標的化剤が当技術分野において必要である。本発明はこの必要性を満たし、関連する利点も同様に提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 07/039728
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、αvβ6インテグリンなどのインテグリンを標的とする両末端PEG化ペプチド結合体を提供する。特定の態様では、本発明のペプチド結合体は、例えば1つのPEG部分に共有結合した画像化剤または治療剤などの生物学的剤をさらに含む。本発明のペプチド結合体は、腫瘍、臓器、または組織を画像化するために、ならびに、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、および慢性創傷性皮膚疾患などのインテグリン媒介性の疾患および障害を処置するために特に有用である。本発明のペプチド結合体を含む組成物およびキットは、例えばインビボ画像化および免疫療法を含む、広範な用途において有用である。
【００１０】
一局面では、本発明は、
(a) インテグリンに結合するペプチド;
(b) 該ペプチドのアミノ末端に共有結合した第1のポリエチレングリコール(PEG)部分; および
(c) 該ペプチドのカルボキシル末端に共有結合した第2のPEG部分
を含む、結合体を提供する。
【００１１】
いくつかの態様では、ペプチドは、RGD、LDV、およびGFOGERからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、式中、Oはヒドロキシプロリンである。他の態様では、インテグリンはαvβ3インテグリン、αIIbβ3インテグリン、またはαvβ6インテグリンである。好ましい態様では、インテグリンはαvβ6インテグリンである。特定の態様では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドはアミノ酸配列RGDLX1X2X3を含み、式中、X1およびX2は独立して選択されるアミノ酸であり、X3はLまたはIである。特定の態様では、X1はQであり、X2はVであり、X3はLである。特定の態様では、ペプチドはアミノ酸配列RGDLX1X2X3AQX6を含み、式中、X6はKまたはRである。特定の場合では、X6はRである。他の態様では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドはアミノ酸配列RSDLTPLFX7を含み、式中、X7は存在しないかまたは任意のアミノ酸である。特定の場合では、X7は存在しない(すなわち、ペプチドはアミノ酸配列RSDLTPLFを含む)。特定の他の場合では、X7はKである(すなわち、ペプチドはアミノ酸配列RSDLTPLFKを含む)。好ましい態様では、ペプチドは、
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からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。代替態様では、ペプチドは、標的インテグリン、例えばαvβ6インテグリンに結合するペプチド模倣体である。
【００１２】
他の態様では、ペプチドはインテグリン、および該インテグリンと同時発現される受容体に結合する。特定の場合では、インテグリンと同時発現される受容体はC-X-Cケモカイン受容体4型(CXCR4)である。さらなる態様では、ペプチドは約8〜約45アミノ酸長である。特定の場合では、ペプチドは20アミノ酸長である。
【００１３】
いくつかの態様では、第1のPEG部分および第2のPEG部分はそれぞれ約5000ダルトン(Da)未満、例えば約3000Da未満の分子量を有する。好ましい態様では、第1のPEG部分および第2のPEG部分は、規定の鎖長を有する単分散PEG部分である。規定の鎖長を有するPEG部分の非限定的な例としては、約95%を超えるオリゴマー純度を有する単分散PEG小分子が挙げられる。特定の場合では、第1のPEG部分および第2のPEG部分はPEG11、PEG12(PEG 800)、PEG28(PEG 1500)、および(PEG28)2(PEG 1500x2)からなる群より独立して選択される。特定の態様では、第1のPEG部分および第2のPEG部分は同じものである。好ましい態様では、第1のPEG部分および第2のPEG部分はいずれもPEG28(PEG 1500)である。
【００１４】
特定の態様では、結合体は、ペプチド、第1のPEG部分、および/または第2のPEG部分に共有結合した画像化剤または治療剤をさらに含む。特定の態様では、画像化剤または治療剤は第1のPEG部分に共有結合している。特定の場合では、画像化剤または治療剤は結合体中の最もN末端の部分として共有結合している。
【００１５】
いくつかの態様では、画像化剤は放射性核種、ビオチン、フルオロフォア、蛍光タンパク質、抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の態様では、放射性核種は11C、13N、15O、18F、19F、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、111In、124I、125I、および131Iからなる群より選択される。特定の場合では、放射性核種は補欠分子族によってペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に結合している。いくつかの場合では、放射性核種は補欠分子族によって結合体中の最もN末端の部分として結合している。
【００１６】
いくつかの態様では、治療剤は放射性核種、アポトーシス促進性ペプチド、ナノ粒子、化学療法剤、ナノ液滴、リポソーム薬、サイトカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の態様では、治療剤は、90Yおよび177Luからなる群より選択される放射性核種である。特定の場合では、放射性核種はキレート剤によってペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に結合している。いくつかの場合では、放射性核種はキレート剤によって結合体中の最もN末端の部分として結合している。
【００１７】
他の態様では、治療剤は、アミノ酸配列D(KLAKLAK)2を含むアポトーシス促進性ペプチドである。特定の場合では、アポトーシス促進性ペプチドはグリシンリンカーによってペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に結合している。特定の場合では、アポトーシス促進性ペプチドは例えばグリシンリンカーによって、第1のPEG部分に結合している。
【００１８】
さらに他の態様では、治療剤は、テロデンドリマー(telodendrimer)骨格または他のミセルベースのナノ担体系を含む、ナノ粒子である。特定の態様では、テロデンドリマー骨格はPEG5KCA8である。特定の場合では、ナノ粒子は化学療法剤を担持している。化学療法剤の非限定的な例としてはパクリタキセル(PTX)、および本明細書に記載の他の細胞毒性化学療法剤が挙げられる。
【００１９】
特定の態様では、結合体は、ペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合したアルブミン結合性モチーフをさらに含む。特定の態様では、アルブミン結合性モチーフは4-(4-ヨードフェニル)酪酸(IPA)、またはより短いアルキル鎖を有するその同族体、例えば4-(4-ヨードフェニル)プロピオン酸もしくは4-(4-ヨードフェニル)酢酸である。特定の場合では、アルブミン結合性モチーフは、グルタミン酸(E)リンカーまたは当業者に公知である他の好適なリンカー(例えばアミノ酸もしくはペプチドリンカー)などのリンカーによって、第1および/または第2のPEG部分に共有結合している。特定の態様では、アルブミン結合性モチーフはε-(4-(4-ヨードフェニル)ブチルアミド)リジン-グルタミン酸(「K(IPA)E」)であり、これは、リジン-グルタミン酸ペプチドリンカーのリジン残基の側鎖に共有結合したIPAに対応している。いくつかの態様では、K(IPA)Eアルブミン結合性モチーフは第1のPEG部分に共有結合している。他の態様では、画像化剤または治療剤は、第1のPEG部分に共有結合したアルブミン結合性モチーフに共有結合している(例えば補欠分子族、キレート剤、またはリンカーによって)。
【００２０】
別の局面では、本発明は、本明細書に記載の両末端PEG化ペプチド結合体または複数の該結合体を含む、組成物を提供する。特定の態様では、複数の結合体は、規定の鎖長を有する単分散PEG部分(例えば約95%を超えるオリゴマー純度の)を含む。特定の場合では、複数の結合体の各々における第1のPEG部分および第2のPEG部分はPEG11、PEG12(PEG 800)、PEG28(PEG 1500)、および(PEG28)2(PEG 1500x2)からなる群より独立して選択される。特定の態様では、複数の結合体の各々における第1のPEG部分および第2のPEG部分は同じものである。好ましい態様では、複数の結合体の各々における第1のPEG部分および第2のPEG部分はいずれもPEG28(PEG 1500)である。
【００２１】
いくつかの態様では、本発明は、複数の結合体が互いに連結された、多量体ペプチド結合体を提供する。特定の態様では、多量体結合体は複数の結合体の二量体または四量体である。特定の態様では、多量体ペプチド結合体は、各結合体の第2のPEG部分間の連結によって形成される。いくつかの場合では、結合体は、少なくとも1つのリジン残基によって第2のPEG部分において互いに連結されている。他の態様では、組成物は薬学的担体または賦形剤をさらに含む。
【００２２】
さらに別の局面では、本発明は、
(a) 本明細書に記載の両末端PEG化ペプチド結合体、またはその組成物(例えば複数の結合体、もしくは結合体の多量体); および
(b) 画像化または治療における該結合体または該組成物の使用説明書
を含む、画像化用または治療用のキットを提供する。
【００２３】
さらなる局面では、本発明は、標的組織のインビボ画像化のための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する:
(a) 画像化剤がペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合した、本明細書に記載の両末端PEG化ペプチド結合体、またはその組成物(例えば複数の結合体、もしくは結合体の多量体)を、そのような画像化を必要とする対象に投与する段階; および
(b) 該結合体が該対象中のどこに濃縮されているかを測定するために該結合体を検出する段階。
【００２４】
いくつかの態様では、標的組織はがん組織または臓器である。がん組織の非限定的な例としては、膵がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、子宮頸がん、および口腔扁平上皮がんに関連するがん組織または腫瘍が挙げられる。好ましい態様では、ペプチド結合体は、膵腫瘍などの腫瘍を画像化するために投与される。
【００２５】
他の態様では、ペプチド結合体は磁気共鳴画像法(MRI)、磁気共鳴分光法(MRS)、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、陽電子放射断層撮影法(PET)、または光学画像化により検出される。さらに他の態様では、結合体は、インテグリンにより媒介される疾患または障害の診断または予後予測のために検出される。特定の態様では、疾患または障害はインテグリンの発現、過剰発現、および/または活性化に関連している。好ましい態様では、疾患または障害はαvβ6インテグリン媒介性の疾患または障害である。
【００２６】
関連する局面では、本発明は、インテグリン媒介性の疾患または障害の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する:
治療剤がペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合した、治療有効量の本明細書に記載の両末端PEG化ペプチド結合体、またはその組成物(例えば複数の結合体、もしくは結合体の多量体)を、該対象に投与する段階。
【００２７】
特定の態様では、疾患または障害はインテグリンの発現、過剰発現、および/または活性化に関連している。インテグリン媒介性の疾患または障害の非限定的な例としては、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、および慢性創傷性皮膚疾患が挙げられる。特定の態様では、疾患または障害はαvβ6インテグリン媒介性の疾患または障害である。いくつかの場合では、αvβ6インテグリン媒介性の疾患または障害は、膵がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、子宮頸がん、および口腔扁平上皮がんからなる群より選択されるがんである。
【００２８】
[本発明1001]
(a) インテグリンに結合するペプチド;
(b) 該ペプチドのアミノ末端に共有結合した第1のポリエチレングリコール(PEG)部分; および
(c) 該ペプチドのカルボキシル末端に共有結合した第2のPEG部分
を含む、結合体。
[本発明1002]
ペプチドが、RGD、LDV、およびGFOGERからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、式中、Oがヒドロキシプロリンである、本発明1001の結合体。
[本発明1003]
インテグリンがαvβ3インテグリン、αIIbβ3インテグリン、またはαvβ6インテグリンである、本発明1001または1002の結合体。
[本発明1004]
インテグリンがαvβ6インテグリンである、本発明1003の結合体。
[本発明1005]
ペプチドがアミノ酸配列RGDLX1X2X3を含み、式中、X1およびX2が独立して選択されるアミノ酸であり、X3がLまたはIである、本発明1004の結合体。
[本発明1006]
X1がQであり、X2がVであり、X3がLである、本発明1005の結合体。
[本発明1007]
ペプチドがアミノ酸配列RGDLX1X2X3AQX6を含み、式中、X6がKまたはRである、本発明1005または1006の結合体。
[本発明1008]
X6がRである、本発明1007の結合体。
[本発明1009]
ペプチドが、
0006789823.tif 000003
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1004の結合体。
[本発明1010]
ペプチドがインテグリン、および該インテグリンと同時発現される受容体に結合する、本発明1001〜1009のいずれかの結合体。
[本発明1011]
インテグリンと同時発現される受容体がCXCR4である、本発明1010の結合体。
[本発明1012]
ペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合した画像化剤または治療剤をさらに含む、本発明1001〜1011のいずれかの結合体。
[本発明1013]
ペプチドが約8〜約45アミノ酸長である、本発明1001〜1012のいずれかの結合体。
[本発明1014]
第1のPEG部分および第2のPEG部分がそれぞれ約3000ダルトン(Da)未満の分子量を有する、本発明1001〜1013のいずれかの結合体。
[本発明1015]
第1のPEG部分および第2のPEG部分がPEG12(PEG 800)、PEG28(PEG 1500)、および(PEG28)2(PEG 1500x2)からなる群より独立して選択される、本発明1014の結合体。
[本発明1016]
第1のPEG部分および第2のPEG部分が同じものである、本発明1001〜1015のいずれかの結合体。
[本発明1017]
第1のPEG部分および第2のPEG部分がいずれもPEG28(PEG 1500)である、本発明1016の結合体。
[本発明1018]
第1のPEG部分および第2のPEG部分が、規定の鎖長を有する単分散PEG部分である、本発明1001〜1017のいずれかの結合体。
[本発明1019]
単分散PEG部分が約95%を超えるオリゴマー純度を有する、本発明1018の組成物。
[本発明1020]
画像化剤が放射性核種、ビオチン、フルオロフォア、蛍光タンパク質、抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1012〜1019のいずれかの結合体。
[本発明1021]
放射性核種が11C、13N、15O、18F、19F、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、111In、124I、125I、および131Iからなる群より選択される、本発明1020の結合体。
[本発明1022]
放射性核種が補欠分子族によってペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に結合している、本発明1020または1021の結合体。
[本発明1023]
治療剤が放射性核種、アポトーシス促進性ペプチド、ナノ粒子、化学療法剤、ナノ液滴、リポソーム薬、サイトカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1012〜1019のいずれかの結合体。
[本発明1024]
放射性核種が90Yおよび177Luからなる群より選択される、本発明1023の結合体。
[本発明1025]
放射性核種がキレート剤によってペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に結合している、本発明1023または1024の結合体。
[本発明1026]
アポトーシス促進性ペプチドがD(KLAKLAK)2を含む、本発明1023の結合体。
[本発明1027]
アポトーシス促進性ペプチドがグリシンリンカーによってペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に結合している、本発明1023または1026の結合体。
[本発明1028]
ナノ粒子が、化学療法剤を担持するPEG5KCA8を含む、本発明1023の結合体。
[本発明1029]
化学療法剤がパクリタキセル(PTX)である、本発明1023または1028の結合体。
[本発明1030]
ペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合したアルブミン結合性モチーフをさらに含む、本発明1001〜1029のいずれかの結合体。
[本発明1031]
アルブミン結合性モチーフが4-(4-ヨードフェニル)酪酸である、本発明1030の結合体。
[本発明1032]
本発明1001〜1031のいずれかの結合体または複数の該結合体を含む、組成物。
[本発明1033]
規定の鎖長を有する単分散PEG部分が前記複数の結合体中に存在する、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
前記複数の結合体が互いに連結されて多量体結合体を形成する、本発明1032または1033の組成物。
[本発明1035]
多量体結合体が前記複数の結合体の二量体または四量体である、本発明1034の組成物。
[本発明1036]
前記複数の結合体が少なくとも1つのリジン残基によって各結合体の第2のPEG部分において互いに連結されている、本発明1034または1035の組成物。
[本発明1037]
薬学的担体または賦形剤をさらに含む、本発明1032〜1036のいずれかの組成物。
[本発明1038]
(a) 本発明1001〜1031のいずれかの結合体または本発明1032〜1037のいずれかの組成物; および
(b) 画像化または治療における該結合体または該組成物の使用説明書
を含む、画像化用または治療用のキット。
[本発明1039]
標的組織のインビボ画像化のための方法であって、以下の段階を含む方法:
(a) 画像化剤がペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合した、本発明1001〜1031のいずれかの結合体または本発明1032〜1037のいずれかの組成物を、そのような画像化を必要とする対象に投与する段階; および
(b) 該結合体が該対象中のどこに濃縮されているかを測定するために該結合体を検出する段階。
[本発明1040]
標的組織ががん組織または臓器である、本発明1039の方法。
[本発明1041]
がん組織が膵がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、または口腔扁平上皮がんに関連している、本発明1040の方法。
[本発明1042]
画像化剤が放射性核種であり、該放射性核種からの放射線が、結合体が対象中のどこに濃縮されているかを測定するために使用される、本発明1039〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
結合体が磁気共鳴画像法(MRI)、磁気共鳴分光法(MRS)、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、陽電子放射断層撮影法(PET)、または光学画像化により検出される、本発明1039〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
結合体が、インテグリンにより媒介される疾患または障害の診断または予後予測のために検出される、本発明1039〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
疾患または障害がインテグリンの発現、過剰発現、または活性化に関連している、本発明1044の方法。
[本発明1046]
疾患または障害がαvβ6インテグリン媒介性の疾患または障害である、本発明1044または1045の方法。
[本発明1047]
インテグリン媒介性の疾患または障害の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、以下の段階を含む方法:
治療剤がペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合した、治療有効量の本発明1001〜1031のいずれかの結合体または本発明1032〜1037のいずれかの組成物を、該対象に投与する段階。
[本発明1048]
疾患または障害がインテグリンの発現、過剰発現、または活性化に関連している、本発明1047の方法。
[本発明1049]
疾患または障害ががん、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、および慢性創傷性皮膚疾患からなる群より選択される、本発明1047または1048の方法。
[本発明1050]
疾患または障害がαvβ6インテグリン媒介性の疾患または障害である、本発明1047〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
αvβ6インテグリン媒介性の疾患または障害が膵がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、または口腔扁平上皮がんである、本発明1050の方法。
[本発明1052]
結合体または組成物の治療有効量が、インテグリンを発現する細胞に治療剤の送達を標的化するために十分な量である、本発明1047〜1051のいずれかの方法。
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本明細書に記載の試験において評価された例示的PEG化変種の構造を示す。すべての化合物をC末端アミドとして得た。
【図２】インテグリンαvβ6発現DX3puroβ6腫瘍および非発現DX3puro対照腫瘍における化合物1(18F-FBA-A20FMDV2)の体内分布データを示す。
【図３】BxPC-3(およびMIA PaCa-2)腫瘍における化合物1(18F-FBA-A20FMDV2)の体内分布データを示す。
【図４】DX3puroβ6およびDx3puro腫瘍における化合物2(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2)の体内分布データを示す。
【図５】BxPC-3腫瘍における化合物2(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2)の体内分布データを示す。
【図６】DX3puroβ6およびDx3puro腫瘍における化合物3(18F-FBA-PEG28-PEG28-A20FMDV2)の体内分布データを示す。
【図７】BxPC-3(およびMIA PaCa-2)腫瘍における化合物3(18F-FBA-PEG28-PEG28-A20FMDV2)の体内分布データを示す。
【図８】DX3puroβ6およびDx3puro腫瘍における化合物4(18F-FBA-A20FMDV2-PEG28)の体内分布データを示す。
【図９】DX3puroβ6およびDx3puro腫瘍における化合物5(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28)の体内分布データを示す。
【図１０−１】BxPC-3腫瘍における化合物5(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28)の体内分布データを示す。
【図１０−２】BxPC-3腫瘍における化合物5(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28)の体内分布データを示す。
【図１１】インテグリンαvβ6発現DX3puroβ6細胞株(+)およびその非発現DX3puro対照(-)を使用するインビトロでの放射性トレーサーの結合および内部移行を示す。プロットは、総放射能の比率を示すものであり、60分のインキュベーション期間後の各放射性トレーサー/細胞株に関する細胞3.75x106個を用いる四つ組実験を表す。塗りつぶされた柱: 細胞試料中で検出された総放射能のパーセント(黒色: 総結合; 灰色: 内部移行); バー: 標準偏差。DX3puroβ6/DX3puro対に関するスチューデントの不対両側t検定: 各総結合データおよび内部移行データにおける2つの細胞株間の対応するデータセットについてP≦0.0001。化合物1〜3のデータはHausner et al., Cancer Res 2009;69:5843-50から再現される。
【図１２】異種移植マウスモデルにおける体内分布試験により測定された化合物1のインビボデータを示す。腫瘍異種移植片取り込み(A)および取り込み比(B)、ならびに腎取り込み(C)。取り込みデータは注入量/グラム%(% ID/g)で表される。データ点: % ID/g; バー: 標準偏差; n = 3/時点。
【図１３】異種移植マウスモデルにおける体内分布試験により測定された化合物2のインビボデータを示す。腫瘍異種移植片取り込み(A)および取り込み比(B)、ならびに腎取り込み(C)。取り込みデータは注入量/グラム%(% ID/g)で表される。データ点: % ID/g; バー: 標準偏差; n = 3/時点。
【図１４】異種移植マウスモデルにおける体内分布試験により測定された化合物3のインビボデータを示す。腫瘍異種移植片取り込み(A)および取り込み比(B)、ならびに腎取り込み(C)。取り込みデータは注入量/グラム%(% ID/g)で表される。データ点: % ID/g; バー: 標準偏差; n = 3/時点。
【図１５】異種移植マウスモデルにおける体内分布試験により測定された化合物4のインビボデータを示す。腫瘍異種移植片取り込み(A)および取り込み比(B)、ならびに腎取り込み(C)。取り込みデータは注入量/グラム%(% ID/g)で表される。データ点: % ID/g; バー: 標準偏差; n = 3/時点。
【図１６】異種移植マウスモデルにおける体内分布試験により測定された化合物5のインビボデータを示す。腫瘍異種移植片取り込み(A)および取り込み比(B)、ならびに腎取り込み(C)。取り込みデータは注入量/グラム%(% ID/g)で表される。データ点: % ID/g; バー: 標準偏差; n = 3/時点。
【図１７】インテグリンαvβ6発現DX3puroβ6細胞株およびその非発現DX3puro対照を使用するリジン置換を有するモノPEG化およびジPEG化放射性トレーサーのインビトロでの結合および内部移行を示す。プロットは、総放射能の比率を示すものであり、60分のインキュベーション期間後の各放射性トレーサー/細胞株に関する細胞3.75x106個を用いる四つ組実験を表す。塗りつぶされた柱: 細胞試料中で検出された総放射能のパーセント(黒色: 総結合; 灰色: 内部移行); バー: 標準偏差。
【図１８】異種移植マウスモデルにおける体内分布試験により測定された化合物5Rのインビボデータを示す。腫瘍異種移植片取り込み(A)および取り込み比(B)、ならびに腎取り込み(C)。取り込みデータは注入量/グラム%(% ID/g)で表される。データ点: % ID/g; バー: 標準偏差; n = 3/時点。
【図１９】製剤化された化合物5(A)および5R(B)の代表的HPLCトレースを示す。放射性HPLCトレースが上部トレースであり、220nmのUVトレース(中央トレース)および254nmのUVトレース(下部トレース)も示される。化合物5の生成物ピークの周りのベースラインの上昇に注目されたい(おそらくは酸化または放射線分解による部分分解を示す)。これに比べて、化合物5Rの生成物ピークの周りのベースラインは平らなままである。220nmトレースにおける初期の急上昇は注入溶媒により引き起こされる;「溶媒先端」。略語: UV吸光度について、単位はミリ吸光度単位[mAU]とし、放射能[RA]シグナルについて、単位はミリボルト[mV]とし、UVスケール上に重ね合わせられる。
【図２０】αvβ6(+)/αvβ6(-)の対の腫瘍マウスモデルにおける[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の細胞結合、内部移行、αvβ6腫瘍標的化、および腎クリアランスを示す。
【図２１】インテグリンαvβ6発現DX3puroβ6細胞およびαvβ6陰性DX3puro対照への結合および内部移行を示す。図示されるデータは、各放射性トレーサーでの平均(色付きバー)±標準偏差(線)である(n = 4/細胞株および条件)。
【図２２】本発明のペプチド-ミセル構築体を示す。
【図２３】本発明のペプチド結合体の単量体、二量体、および四量体の模式図を示す。
【図２４】例示的なアリル保護アルブミンバインダーを示す。
【図２５】αvβ6(+)/αvβ6(-)の対の腫瘍マウスモデルにおける注入後(p.i.)1時間、2時間、および4時間の時点でのAl[18F]NOTA-PEG28-A20FMDV2および[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28についての体内分布データを示す。
【図２６】放射標識アルブミンバインダー修飾ペプチドの段階的構築を示すスキーム1である。キレート剤結合ペプチドに関するスキームを示す。固相放射標識(例えば[18F]FBAによる)では、補欠分子族を遊離N末端にカップリングした後、TFA切断および放射性HPLC精製を行った。
【図２７】インテグリンαvβ6発現DX3puroβ6細胞およびαvβ6陰性DX3puro対照への結合および内部移行を示す。図示されるデータは、各放射性トレーサーについての平均(色付きバー)±標準偏差(線)である(n = 4/細胞株および条件)。
【図２８】健康なアカゲザルにおいて[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28で得られた共焦点PET/CTスキャン画像を示す。動物を注入後(p.i.)の所定の時点で横に並べて仰臥位で画像化した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
I. 序論
本発明は、インテグリン結合性ペプチド上のPEG部分のサイズおよび位置の両方が、得られるペプチド結合体の標的化特性および薬物動態特性に著しく影響するという驚くべき発見に一部基づく。特に、実施例1および2は、両末端PEG化(すなわちペプチドのN末端およびC末端の両方にPEG単位を結合させること)が、例示的なαvβ6インテグリン結合性A20FMDV2ペプチドおよびその変異体(例えばK16R変異体)に優れた標的化特性およびインビボ薬物動態を与えることができたことを示す。特に、両末端PEG化A20FMDV2およびA20FMDV2(K16R)ペプチドは、個々のN末端またはC末端PEG化から予測されたプロファイルを超えて大きく改善された薬物動態プロファイルを示した。実際、2個のPEG単位は、大きく改善された安定性を高いαvβ6(+)腫瘍取り込み性および腫瘍滞留性と共に実現するように相乗的に作用した。これらの効果は、N末端およびC末端における、医学目的で一般的に使用されるPEG単位(例えば分子量 = 約5000〜約50,000)に比べて相対的に小さな単分散PEG鎖、例えば正確に規定された数のエチレングリコール繰り返し単位「n」を有するPEG鎖(例えば分子量約3000未満)によって実現された。
【００３１】
実施例3に示すように、本発明はさらに、本明細書に記載の両末端PEG化ペプチド結合体をアポトーシス促進性ペプチド、治療用放射性核種、ミセルベースのナノ担体、多量体化、および/または血液アルブミン結合性モチーフ付加によって修飾して該ペプチド結合体の親和性、インビボ安定性、標的化能力、および/またはクリアランス挙動をさらに改善することに基づいて改善された親和性および薬物動態を有する、新規分子画像化剤および治療剤を提供する。
【００３２】
さらに、実施例4に提示された結果は、8アミノ酸と短いインテグリン結合性ペプチドのいっそう短いPEG単位(例えばPEG11)による両末端PEG化が、親ペプチド配列、該ペプチドの環状バージョン、および該ペプチドのN末端またはC末端が個々にPEG化されたバージョンに比べて高い選択性、改善された血清安定性、放射標識収率、および親油性などの有利な特性を該ペプチドに与えることを示す。したがって、短いペプチド配列(例えば約8アミノ酸長)および短いPEG単位(例えばPEG11)を有する本発明の両末端PEG化ペプチド結合体は、該結合体をインビボ画像化および治療に好適にする望ましい標的化特性および薬物動態特性を有する。
【００３３】
本発明の両末端PEG化ペプチド結合体は標準的方法を使用して調製することができる。固相上での合成を可能にする比較的短いPEGポリマーしか必要ではない。これにより簡単な調製および精製が確実になる。ペプチド結合体は、位置異性を示しかつ平均的な長さのPEG鎖の混合物を含むことがある他のPEG化化合物に比べて、正確な組成および分子量を有する1つの化合物として得られる。
【００３４】
まとめると、本発明のペプチド結合体による腫瘍中のインテグリン(例えばαvβ6)発現の画像化および標的化は、それを用いなければ見過ごされる腫瘍の検出および処置をもたらすものであり、がんの非侵襲的な予後指標としての役割も果たす。
【００３５】
II. 定義
別途具体的に指示がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同一の意味を有する。さらに、本明細書に記載の方法または材料と同様または等価である任意の方法または材料を、本発明の実施において使用することができる。本発明においては以下の用語が定義される。
【００３６】
「結合体」という用語は、2つ以上の化合物の連結または結合により形成された化合物を含むように意図されている。特に、本発明の結合体は、ペプチドのアミノ末端にある第1のポリエチレングリコール(PEG)部分およびペプチドのカルボキシル末端にある第2のPEG部分に共有結合したインテグリン結合性ペプチドを含んだ、「両末端PEG化ペプチド結合体」を含む。本発明の結合体は、ペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合した画像化剤または治療剤をさらに含みうる。
【００３７】
「インテグリン結合性ペプチド」および「インテグリンに結合するペプチド」という用語は、特定のインテグリンまたは特定のインテグリン群との特定の相互作用の能力を示す結合体中のペプチドモチーフの結合/相互作用を意味する。特定の態様では、これらの用語は、ペプチドまたはその一部分が、標的インテグリンと、同様の配列または構造の分子との交差反応なしに相互作用しかつ/または結合する能力を意味する。いくつかの場合では、ペプチドは、標的インテグリンに、同様の配列または構造の分子よりも実質的に低い解離定数で結合する(すなわち、結合がより堅固である)場合に、標的インテグリンに特異的に結合する。例えば、特定の場合では、特異的結合は、ペプチドが標的インテグリンに関連分子の約2、3、4、5、6、8、10、15、20、25、30、40、50、100、もしくは1000倍、またはそれ以上の親和性で結合する場合に生じる。標的インテグリン上の部位へのペプチドの結合は、イオン結合、水素結合、疎水性相互作用、双極子-双極子結合、および/またはファンデルワールス力などの分子間力によって生じうる。交差反応性は、例えば、通常条件下での標的インテグリンならびにいくつかの多少なりとも(例えば構造的および/または機能的に)密接に関連する分子へのペプチドの結合を評価することにより試験することができる。これらの方法としては、結合試験、密接に関連する分子を用いるブロッキング試験および競合試験、FACS解析、表面プラズモン共鳴法(例えばBIAcoreを用いる)、分析用超遠心法、等温滴定熱量測定、蛍光偏光測定、蛍光分光法、放射標識リガンド結合アッセイ、ならびにそれらの組み合わせを挙げることができるが、それに限定されない。
【００３８】
本明細書において使用される「PEG化」という用語は、ポリエチレングリコール(PEG)分子を別の分子、例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体などに共有結合的にカップリングするプロセスを意味し、この分子は「PEG化された」と呼ばれる。非限定的な例として、インテグリン結合性ペプチドを、規定の鎖長を有する単分散PEG分子によってアミノ末端およびカルボキシル末端の両方でPEG化することで、本発明の両末端PEG化ペプチド結合体を生成することができる。通常、単分散PEG分子は、正確に規定された数のエチレングリコール繰り返し単位を有する離散的な分子量を備える。本発明における使用に好適なPEG部分はPolypure AS(ノルウェー・オスロ)から市販されており、同社は、実質的に1つのオリゴマーのみからなる(例えば約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えるオリゴマー純度の)、単分散PEG分子およびそのPEG誘導体を供給している。特定の態様では、インテグリン結合性ペプチドは、約3000ダルトン(Da)未満の分子量を有する1つの種類の単分散PEG部分または複数の種類の単分散PEG部分の混合物、例えばPEG11、PEG12(PEG 800)、PEG28(PEG 1500)、および/または(PEG28)2(PEG 1500x2)によって両末端でPEG化されている。
【００３９】
「ペプチド模倣体」とは、既存のペプチドの一般的構造とは異なる構造を有するが、例えば既存のペプチドの生物活性を模倣することでそのペプチドと同様に機能する、化合物を意味する。ペプチド模倣体は、天然アミノ酸および/または非天然アミノ酸を通常は含むが、ペプチド骨格に対する修飾を含んでもよい。ペプチド模倣体は、既存のペプチドに比べて増加した親和性、特異性、および/または安定性を示しうる。
【００４０】
「アミノ酸」という用語は、天然α-アミノ酸およびそれらの立体異性体、ならびに非天然アミノ酸およびそれらの立体異性体を含む。アミノ酸の「立体異性体」とは、アミノ酸の鏡像異性体、例えばL-アミノ酸またはD-アミノ酸を意味する。例えば、天然アミノ酸の立体異性体とは、天然アミノ酸の鏡像異性体、すなわちD-アミノ酸を意味する。
【００４１】
天然アミノ酸とは、遺伝暗号によりコードされたアミノ酸、ならびに後に修飾されたそれらアミノ酸、例えばγ-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンのことである。天然α-アミノ酸としてはアラニン(Ala)、システイン(Cys)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、フェニルアラニン(Phe)、グリシン(Gly)、ヒスチジン(His)、イソロイシン(Ile)、アルギニン(Arg)、リジン(Lys)、ロイシン(Leu)、メチオニン(Met)、アスパラギン(Asn)、プロリン(Pro)、グルタミン(Gln)、セリン(Ser)、スレオニン(Thr)、バリン(Val)、トリプトファン(Trp)、チロシン(Tyr)、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、それに限定されない。天然α-アミノ酸の立体異性体としてはD-アラニン(D-Ala)、D-システイン(D-Cys)、D-アスパラギン酸(D-Asp)、D-グルタミン酸(D-Glu)、D-フェニルアラニン(D-Phe)、D-ヒスチジン(D-His)、D-イソロイシン(D-Ile)、D-アルギニン(D-Arg)、D-リジン(D-Lys)、D-ロイシン(D-Leu)、D-メチオニン(D-Met)、D-アスパラギン(D-Asn)、D-プロリン(D-Pro)、D-グルタミン(D-Gln)、D-セリン(D-Ser)、D-スレオニン(D-Thr)、D-バリン(D-Val)、D-トリプトファン(D-Trp)、D-チロシン(D-Tyr)、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、それに限定されない。
【００４２】
非天然アミノ酸としては、天然アミノ酸と同様に機能するL配置またはD配置のアミノ酸類似体、アミノ酸模倣体、合成アミノ酸、N-置換グリシン、およびN-メチルアミノ酸が挙げられるが、それに限定されない。例えば、「アミノ酸類似体」とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基に結合したα炭素を有するが、修飾されたR(すなわち側鎖)基を有する、非天然アミノ酸のことである。
【００４３】
非天然アミノ酸の非限定的な例としては1-アミノシクロペンタン-1-カルボン酸(Acp)、1-アミノシクロブタン-1-カルボン酸(Acb)、1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸(Acpc)、シトルリン(Cit)、ホモシトルリン(HoCit)、α-アミノヘキサン二酸(Aad)、3-(4-ピリジル)アラニン(4-Pal)、3-(3-ピリジル)アラニン(3-Pal)、プロパルギルグリシン(Pra)、α-アミノイソ酪酸(Aib)、α-アミノ酪酸(Abu)、ノルバリン(Nva)、α,β-ジアミノプロピオン酸(Dpr)、α,γ-ジアミノ酪酸(Dbu)、α-tert-ブチルグリシン(Bug)、3,5-ジニトロチロシン(Tyr(3,5-ジNO2))、ノルロイシン(Nle)、3-(2-ナフチル)アラニン(Nal-2)、3-(1-ナフチル)アラニン(Nal-1)、シクロヘキシルアラニン(Cha)、ジ-n-プロピルグリシン(Dpg)、シクロプロピルアラニン(Cpa)、ホモロイシン(Hle)、ホモセリン(HoSer)、ホモアルギニン(Har)、ホモシステイン(Hcy)、メチオニンスルホキシド(Met(O))、メチオニンメチルスルホニウム(Met(S-Me))、α-シクロヘキシルグリシン(Chg)、3-ベンゾ-チエニルアラニン(Bta)、タウリン(Tau)、ヒドロキシプロリン(Hyp)、O-ベンジル-ヒドロキシプロリン(Hyp(Bzl))、ホモプロリン(HoPro)、β-ホモプロリン(βHoPro)、チアゾリジン-4-カルボン酸(Thz)、ニペコ酸(Nip)、イソニペコ酸(IsoNip)、3-カルボキシメチル-1-フェニル-1,3,8-トリアザスピロ[4,5]デカン-4-オン(Cptd)、テトラヒドロ-イソキノリン-3-カルボン酸(3-Tic)、5H-チアゾロ[3,2-a]ピリジン-3-カルボン酸(Btd)、3-アミノ安息香酸(3-Abz)、3-(2-チエニル)アラニン(2-Thi)、3-(3-チエニル)アラニン(3-Thi)、α-アミノオクタン二酸(Asu)、ジエチルグリシン(Deg)、4-アミノ-4-カルボキシ-1,1-ジオキソ-テトラヒドロチオピラン(Acdt)、1-アミノ-1-(4-ヒドロキシシクロヘキシル)カルボン酸(Ahch)、1-アミノ-1-(4-ケトシクロヘキシル)カルボン酸(Akch)、4-アミノ-4-カルボキシテトラヒドロピラン(Actp)、3-ニトロチロシン(Tyr(3-NO2))、1-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸(Ach)、1-アミノ-1-(3-ピペリジニル)カルボン酸(3-Apc)、1-アミノ-1-(4-ピペリジニル)カルボン酸(4-Apc)、2-アミノ-3-(4-ピペリジニル)プロピオン酸(4-App)、2-アミノインダン-2-カルボン酸(Aic)、2-アミノ-2-ナフチル酢酸(Ana)、(2S,5R)-5-フェニルピロリジン-2-カルボン酸(Ppca)、4-チアゾイルアラニン(Tha)、2-アミノオクタン酸(Aoa)、2-アミノヘプタン酸(Aha)、オルニチン(Orn)、アゼチジン-2-カルボン酸(Aca)、α-アミノ-3-クロロ-4,5-ジヒドロ-5-イソオキサゾール酢酸(Acdi)、チアゾリジン-2-カルボン酸(Thz(2-COOH))、アリルグリシン(Agl)、4-シアノ-2-アミノ酪酸(Cab)、2-ピリジルアラニン(2-Pal)、2-キノイルアラニン(2-Qal)、シクロブチルアラニン(Cba)、フェニルアラニン類似体、リジンの誘導体、オルニチン(Orn)の誘導体、およびα,γ-ジアミノ酪酸(Dbu)の誘導体、それらの立体異性体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる(例えばLiu et al., Anal. Biochem., 295:9-16 (2001)を参照)。したがって、非天然α-アミノ酸は非天然L-α-アミノ酸、非天然D-α-アミノ酸、またはそれらの組み合わせとして存在する。
【００４４】
「アミノ酸模倣体」とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが天然アミノ酸と同様に機能する、化合物のことである。好適なアミノ酸模倣体としてはβ-アミノ酸およびγ-アミノ酸が挙げられるがそれに限定されない。β-アミノ酸では、アミノ基とカルボキシル基との間に2個の炭素原子が存在するように、アミノ基がカルボキシル基のβ-炭素原子に結合している。γ-アミノ酸では、アミノ基とカルボキシル基との間に3個の炭素原子が存在するように、アミノ基がカルボキシル基のγ-炭素原子に結合している。β-またはγ-アミノ酸に好適なR基としては、天然アミノ酸および非天然アミノ酸に存在する側鎖が挙げられるが、それに限定されない。
【００４５】
「N-置換グリシン」とは、アミノ酸側鎖がグリシン窒素原子に結合した、グリシンに基づく非天然アミノ酸のことである。好適なアミノ酸側鎖(例えばR基)としては、天然アミノ酸に存在する側鎖、およびアミノ酸類似体などの非天然アミノ酸に存在する側鎖が挙げられるが、それに限定されない。N-置換グリシンの非限定的な例としてはN-(2-アミノエチル)グリシン、N-(3-アミノプロピル)グリシン、N-(2-メトキシエチル)グリシン、N-ベンジルグリシン、(S)-N-(1-フェニルエチル)グリシン、N-シクロヘキシルメチルグリシン、N-(2-フェニルエチル)グリシン、N-(3-フェニルプロピル)グリシン、N-(6-アミノガラクトシル)グリシン、N-(2-(3'-インドリルエチル)グリシン、N-(2-(p-メトキシフェニルエチル))グリシン、N-(2-(p-クロロフェニルエチル)グリシン、およびN-[2-(p-ヒドロキシフェニルエチル)]グリシンが挙げられる。本明細書において「ペプトイド」と呼ばれるN-置換グリシンオリゴマーは、プロテアーゼ抵抗性があることが示された(例えばMiller et al., Drug Dev. Res., 35:20-32 (1995)を参照)。
【００４６】
本明細書においてアミノ酸は、一般的に知られている3文字記号で、またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionが推奨する1文字記号で表されることがある。例えば、本明細書においてL-アミノ酸は、一般的に知られている3文字記号(例えばL-アルギニンはArg)で、または大文字の1文字アミノ酸記号(例えばL-アルギニンはR)で表されることがある。本明細書においてD-アミノ酸は、一般的に知られている3文字記号(例えばD-アルギニンはD-Arg)で、または小文字の1文字アミノ酸記号(例えばD-アルギニンはr)で表されることがある。
【００４７】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コード配列中で1つのアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を改変し、付加し、または欠失させる、ペプチド配列、ポリペプチド配列、またはタンパク質配列に対する個々の置換、付加、または欠失が、改変によりアミノ酸が化学的に同様のアミノ酸で置換された「保存的修飾変異体」となることを認識するであろう。化学的に同様のアミノ酸としては、L-アミノ酸などの天然アミノ酸、D-アミノ酸などの天然アミノ酸の立体異性体、ならびにアミノ酸類似体、アミノ酸模倣体、合成アミノ酸、N-置換グリシン、およびN-メチルアミノ酸などの非天然アミノ酸が挙げられるがそれに限定されない。
【００４８】
機能的に同様のアミノ酸を示す保存的置換表は、当技術分野において周知である。例えば、脂肪族アミノ酸(例えばG、A、I、L、またはV)がこの群の別のメンバーで置換される置換を行うことができる。同様に、C、S、T、M、N、またはQなどの極性無電荷脂肪族基はこの群の別のメンバーで置換することができ、塩基性残基、例えばK、R、またはHは互いに置換することができる。いくつかの態様では、酸性側鎖を有するアミノ酸、例えばEまたはDをそれぞれその無電荷対応物、例えばQまたはNで置換することができ、その逆も成り立つ。以下の8つの各群は、互いに対して保存的置換である他の例示的なアミノ酸を含む:
1) アラニン(A)、グリシン(G);
2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
4) アルギニン(R)、リジン(K);
5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);
6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);
7) セリン(S)、スレオニン(T); および
8) システイン(C)、メチオニン(M)
(例えばCreighton, Proteins, 1993を参照)。
【００４９】
「ペプチド」という用語は、D-もしくはL-アミノ酸の1本の鎖で構成される化合物、またはペプチド結合により接合されたD-およびL-アミノ酸の混合物で構成される化合物を意味する。一般に、ペプチドは約2〜約50アミノ酸長である。非限定的な例として、本明細書に記載の結合体中に存在するインテグリン結合性ペプチドは、約5〜約45アミノ酸長、約8〜約45アミノ酸長、約8〜約25アミノ酸長、約8〜約20アミノ酸長、約12〜約45アミノ酸長、約12〜約30アミノ酸長、約8アミノ酸長、または約20アミノ酸長である。
【００５０】
「環状ペプチド」とは、ペプチドのアミノ末端、または遊離アミノ基を有するペプチド上の側鎖(例えばリジン)が、ペプチド結合によってペプチドのカルボキシル末端、または遊離カルボキシル基を有するペプチド上の側鎖(例えばアスパラギン酸、グルタミン酸)に接合された、ペプチドを意味する。しかし、当業者は、ジスルフィド結合、エステル結合、またはエーテル結合により形成されるヘテロデチック環状ペプチドも本発明の範囲内であることを認識するであろう。
【００５１】
「ヘリックス促進残基」という用語は、αヘリックスの中央に見られることに関して1.0を超える立体配座優位性を示すアミノ酸を含む(例えばCreighton, Proteins, 1993; およびPace et al., Biophysical J., 75:422-427 (1998)を参照)。しかし、アミノ酸の非正統的なヘリックス促進性の組み合わせも、標的インテグリン、例えばαvβ6インテグリンへの結合特異性および/または結合親和性を増強する場合、本発明の範囲内である。
【００５２】
「治療有効量」という用語は、治療効果の実現を、それを必要とする対象において行うことが可能な本発明の結合体または組成物の量を意味する。例えば、本発明の結合体または組成物の治療有効量は、疾患または障害に関連する1つまたは複数の症状を予防または軽減することが可能な量でありうる。当業者は、本発明の結合体および組成物を抗がん剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗生物質、および/または抗真菌剤などの他の治療剤と同時投与することができることを認識するであろう。
【００５３】
本明細書において使用される「投与すること」という用語は、対象に対する経口投与、局所接触、坐薬としての投与、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、病変内投与、くも膜下腔内投与、鼻腔内投与、もしくは皮下投与、または緩徐放出装置、例えばミニ浸透圧ポンプの埋め込みを含む。投与は、非経口および経粘膜(例えば頬側、舌下、口蓋、歯肉、経鼻、膣内、直腸、または経皮)を含む任意の経路による。非経口投与としては例えば静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内投与が挙げられる。他の投与様式としてはリポソーム製剤、静脈内注入、経皮パッチなどの使用が挙げられるがそれに限定されない。当業者は、がんまたは炎症性疾患もしくは自己免疫疾患などの疾患または障害に関連する1つまたは複数の症状を予防または軽減するために治療有効量の本発明の結合体または組成物を投与するためのさらなる方法について知っているであろう。「同時投与する」とは、第2の薬物(例えば抗がん剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤など)の投与と同時に、該投与の直前に、または該投与の直後に本発明の結合体または組成物を投与することを意味する。
【００５４】
「放射性核種」という用語は、放射能を示す任意の核種を含むように意図されている。「核種」とは、炭素14(14C)などの、原子番号、原子質量、およびエネルギー状態により規定される原子の種類を意味する。「放射能」とは、α粒子、β粒子、核子、電子、陽電子、ニュートリノ、およびγ線を含む、放射性物質により放出される放射線を意味する。本発明における使用に好適な放射性核種の例としてはフッ素18(18F)、フッ素19(19F)、リン32(32P)、スカンジウム47(47Sc)、コバルト55(55Co)、銅60(60Cu)、銅61(61Cu)、銅62(62Cu)、銅64(64Cu)、ガリウム66(66Ga)、銅67(67Cu)、ガリウム67(67Ga)、ガリウム68(68Ga)、ルビジウム82(82Rb)、イットリウム86(86Y)、イットリウム87(87Y)、ストロンチウム89(89Sr)、イットリウム90(90Y)、ロジウム105(105Rh)、銀111(111Ag)、インジウム111(111In)、ヨウ素124(124I)、ヨウ素125(125I)、ヨウ素131(131I)、スズ117m(117mSn)、テクネチウム99m(99mTc)、プロメチウム149(149Pm)、サマリウム153(153Sm)、ホルミウム166(166Ho)、ルテチウム177(177Lu)、レニウム186(186Re)、レニウム188(188Re)、タリウム201(201Tl)、アスタチン211(211At)、およびビスマス212(212Bi)が挙げられるがそれに限定されない。本明細書において使用される、117mSnおよび99mTc中の「m」は準安定状態を表す。さらに、通常は放射性同位体の混合物であるウラン、ラジウム、およびトリウムなどの天然放射性元素が、放射性核種の好適な例である。67Cu、131I、177Lu、および186Reはβ線およびγ線放出放射性核種である。212Biはα線およびβ線放出放射性核種である。211Atはα線放出放射性核種である。32P、47Sc、89Sr、90Y、105Rh、111Ag、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、および188Reはβ線放出放射性核種の例である。67Ga、111In、99mTc、および201Tlはγ線放出放射性核種の例である。55Co、60Cu、61Cu、62Cu、66Ga、68Ga、82Rb、および86Yは陽電子放出放射性核種の例である。64Cuはβ線および陽電子放出放射性核種である。
【００５５】
「対象」または「患者」という用語は、通常はヒトを意味するが、例えば他の霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどの他の動物を含んでもよい。
【００５６】
III. 態様の説明
本発明は、αvβ6インテグリンなどのインテグリンを標的とする両末端PEG化ペプチド結合体を提供する。特定の態様では、本発明のペプチド結合体は、例えば1つのPEG部分に共有結合した、画像化剤または治療剤などの生物学的剤をさらに含む。本発明のペプチド結合体は、腫瘍、臓器、または組織を画像化するために、ならびに、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、および慢性創傷性皮膚疾患などのインテグリン媒介性の疾患および障害を処置するために特に有用である。本発明のペプチド結合体を含む組成物およびキットは、例えばインビボ画像化および免疫療法を含む、広範な用途において有用である。
【００５７】
一局面では、本発明は、
(a) インテグリンに結合するペプチド;
(b) 該ペプチドのアミノ末端に共有結合した第1のポリエチレングリコール(PEG)部分; および
(c) 該ペプチドのカルボキシル末端に共有結合した第2のPEG部分
を含む、結合体を提供する。
【００５８】
いくつかの態様では、ペプチドは、RGD、LDV、およびGFOGERからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、式中、Oはヒドロキシプロリンである。他の態様では、インテグリンはαvβ3インテグリン、αIIbβ3インテグリン、またはαvβ6インテグリンである。好ましい態様では、インテグリンはαvβ6インテグリンである。
【００５９】
特定の態様では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドはアミノ酸配列RGDLX1X2X3を含み、式中、X1およびX2は独立して選択されるアミノ酸であり、X3はLまたはIである。いくつかの場合では、X1およびX2はGlu、Ala、Leu、Met、Gln、Lys、Arg、Val、Ile、His、Thr、Trp、Phe、およびAspからなる群より独立して選択される。特定の態様では、X1はQであり、X2はVであり、X3はLである。特定の態様では、ペプチドはアミノ酸配列RGDLX1X2X3AQX6を含み、式中、X6はKまたはRである。特定の場合では、X6はRである。好ましい態様では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドは、
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からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００６０】
他の態様では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドはアミノ酸配列RSDLTPLFX7を含み、式中、X7は存在しないかまたは任意のアミノ酸である。特定の場合では、X7は存在しない(すなわち、ペプチドはアミノ酸配列RSDLTPLFを含むかまたはそれからなる)。特定の他の場合では、X7はKである(すなわち、ペプチドはアミノ酸配列RSDLTPLFKを含むかまたはそれからなる)。
【００６１】
他の態様では、ペプチドはインテグリン、および該インテグリンと同時発現される受容体に結合する。特定の場合では、インテグリンと同時発現される受容体はC-X-Cケモカイン受容体4型(CXCR4)である。特定の場合では、ペプチドはαvβ6インテグリンおよびCXCR4の両方に結合する。特定の他の場合では、インテグリンと同時発現される受容体は別のインテグリン、例えば、αvβ5インテグリンと同時発現されるαvβ3インテグリンである。特定の場合では、ペプチドはαvβ3インテグリンおよびαvβ5インテグリンの両方に結合する。さらなる態様では、ペプチドは約8〜約45アミノ酸長である。特定の場合では、ペプチドは20アミノ酸長である。
【００６２】
いくつかの態様では、第1のPEG部分および第2のPEG部分はそれぞれ約5000ダルトン(Da)未満の分子量を有する。特定の態様では、第1のPEG部分および第2のPEG部分はそれぞれ約3000ダルトン(Da)未満の分子量を有する。好ましい態様では、第1のPEG部分および第2のPEG部分は、規定の鎖長を有する単分散PEG部分である。一般に、規定の鎖長を有するPEG部分は、正確に規定された数のエチレングリコール繰り返し単位を有する離散的な分子量のPEG分子を含む。規定の鎖長を有するPEG部分の非限定的な例としては、約90%、91%、92%、93%、94%、または95%を超えるオリゴマー純度を有する単分散PEG小分子が挙げられる。特定の態様では、平均的な分子量を有するPEG化合物の混合物は、本発明の結合体において使用されない。
【００６３】
特定の場合では、第1のPEG部分および第2のPEG部分はPEG11、PEG12(PEG 800)、PEG28(PEG 1500)、および(PEG28)2(PEG 1500x2)からなる群より独立して選択される。特定の態様では、第1のPEG部分および第2のPEG部分は同じものである。好ましい態様では、第1のPEG部分および第2のPEG部分はいずれもPEG28(PEG 1500)である。本発明の結合体中の第1および/または第2のPEG部分としての使用に好適なPEG単位の他の非限定的な例としては、PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 500、PEG 600、PEG 700、PEG 900、PEG 1000、PEG 1100、PEG 1200、PEG 1300、PEG 1400、PEG 1600、PEG 1700、PEG 1800、PEG 1900、PEG 2000、PEG 2100、PEG 2200、PEG 2300、PEG 2400、PEG 2500、PEG 2600、PEG 2700、PEG 2800、PEG 2900、PEG 3000、PEG 3250、PEG 3350、PEG 3500、PEG 3750、PEG 4000、PEG 4250、PEG 4500、PEG 4750、およびPEG 5000、ならびに分岐型PEG誘導体などのそれらの誘導体が挙げられる。好ましい態様では、これらのPEG分子は、正確に規定された数の繰り返し単位「n」を含み、単分散である(例えば約95%を超えるオリゴマー純度を有する)。本発明における使用に好適なPEG部分はEMD Chemicals, Inc.(カリフォルニア州サンジエゴ)およびPolypure AS(ノルウェー・オスロ)から市販されている。
【００６４】
特定の態様では、結合体は、ペプチド、第1のPEG部分、および/または第2のPEG部分に共有結合した画像化剤または治療剤をさらに含む。特定の態様では、画像化剤または治療剤は第1のPEG部分に共有結合している。特定の場合では、画像化剤または治療剤は結合体中の最もN末端の部分として共有結合している。
【００６５】
いくつかの態様では、画像化剤は放射性核種、ビオチン、フルオロフォア、蛍光タンパク質、抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の態様では、放射性核種は11C、13N、15O、18F、19F、61Cu、62Cu、64Cu、67Cu、68Ga、111In、124I、125I、および131Iからなる群より選択される。特定の場合では、放射性核種は補欠分子族によってペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に結合している。特定の態様では、放射性核種は補欠分子族によって第1のPEG部分に結合している。他の態様では、放射性核種は補欠分子族によって結合体中の最もN末端の部分として結合している。補欠分子族の非限定的な例としてはベンゾイル基(例えばフルオロ安息香酸(FBA))、フルオロプロピオン酸(FPA)、ピリジン(Py)、ジピリジル-テトラジン(Tz)、trans-シクロオクテン(TCO)、それらの誘導体、およびそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい態様では、放射性核種は、FBAなどのベンゾイル基によって第1のPEG部分に共有結合した18Fまたは19Fである。例えば、4-[18F]-フルオロ安息香酸([18F]FBA)または4-[19F]-フルオロ安息香酸([19F]FBA)を使用して本発明のペプチド結合体を放射標識することができる。
【００６６】
いくつかの態様では、治療剤は放射性核種、アポトーシス促進性ペプチド、ナノ粒子、化学療法剤、ナノ液滴、リポソーム薬、サイトカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。特定の態様では、治療剤は、90Yおよび177Luからなる群より選択される放射性核種である。特定の場合では、放射性核種はキレート剤によってペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に結合している。特定の態様では、放射性核種はキレート剤によって第1のPEG部分に結合している。他の態様では、放射性核種はキレート剤によって結合体中の最もN末端の部分として結合している。キレート剤の非限定的な例としてはDOTA(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N',N'',N'''-テトラ酢酸)、NOTA(1,4,7-トリアザシクロノナン-N,N',N''-トリ酢酸)、DTPA(ジエチレントリアミン五酢酸無水物)、TETA(1,4,8,11-テトラアザシクロテトラデカン-N,N',N'',N'''-テトラ酢酸)、およびDTTA(N-(p-イソチオシアナトベンジル)-ジエチレントリアミン-N,N',N'',N'''-テトラ酢酸)などの大環状金属キレート剤が挙げられる。
【００６７】
他の態様では、治療剤は、アミノ酸配列D(KLAKLAK)2を含むアポトーシス促進性ペプチドである。特定の場合では、アポトーシス促進性ペプチドはグリシンリンカーによってペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に結合している。特定の態様では、アポトーシス促進性ペプチドはグリシンリンカーによって第1のPEG部分に結合している。グリシンリンカーの非限定的な例としては、1個のグリシン残基、または少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20個の、連続したグリシン残基、もしくは他のアミノ酸残基で隔てられたグリシン残基が挙げられる。好ましい態様では、グリシンリンカーはグリシニルグリシンリンカーである。当業者は、例えば個々の各成分の標的化特性および機能に著しく干渉することなく、アポトーシス促進性ペプチドを本発明のペプチド結合体に結合させるために好適な、他のリンカーについて知っているであろう。
【００６８】
さらに他の態様では、治療剤は、テロデンドリマー骨格または他のミセルベースのナノ担体系を含む、ナノ粒子である。特定の態様では、テロデンドリマー骨格はPEG5KCA8である。本発明における使用に好適なテロデンドリマーは米国特許出願公開第20130164369号に記載されており、その開示全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられる。特定の場合では、ナノ粒子は化学療法剤を担持している。化学療法剤の非限定的な例としてはパクリタキセル(PTX)、および本明細書に記載の他の細胞毒性化学療法剤が挙げられる。
【００６９】
特定の態様では、結合体は、ペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合したアルブミン結合性モチーフをさらに含む。特定の態様では、アルブミン結合性モチーフは4-(4-ヨードフェニル)酪酸(IPA)、またはより短いアルキル鎖を有するその同族体、例えば4-(4-ヨードフェニル)プロピオン酸もしくは4-(4-ヨードフェニル)酢酸である。他の態様では、アルブミン結合性モチーフは4-(4-メチルフェニル)酪酸もしくは4-(4-ブロモフェニル)酪酸、またはより短いアルキル鎖を有するその同族体、例えばそれらのプロピオン酸もしくは酢酸同族体である。特定の態様では、アルブミン結合性モチーフは第1および/または第2のPEG部分に共有結合している。特定の場合では、アルブミン結合性モチーフは、グルタミン酸(E)リンカーまたは当業者に公知である他の好適なリンカー(例えばアミノ酸もしくはペプチドリンカー)などのリンカーによって、第1および/または第2のPEG部分に共有結合している。特定の態様では、アルブミン結合性モチーフはε-(4-(4-ヨードフェニル)ブチルアミド)リジン-グルタミン酸(「K(IPA)E」)であり、これは、リジン-グルタミン酸ペプチドリンカーのリジン残基の側鎖に共有結合したIPAに対応している。いくつかの態様では、K(IPA)Eアルブミン結合性モチーフは第1のPEG部分に共有結合している。他の態様では、画像化剤または治療剤は、画像化剤または治療剤が結合体中の最もN末端の部分になるように、第1のPEG部分に共有結合したアルブミン結合性モチーフに共有結合している(例えば補欠分子族、キレート剤、またはリンカーによって)。
【００７０】
別の局面では、本発明は、本明細書に記載の両末端PEG化ペプチド結合体または複数の該結合体(例えば、インテグリン結合性ペプチド配列、第1および/もしくは第2のPEG部分、画像化剤および/もしくは治療剤、またはそれらの組み合わせが異なる少なくとも約2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、25個、30個、またはそれ以上の本発明のペプチド結合体)を含む、組成物を提供する。特定の態様では、複数の結合体(すなわち複数の結合体の各々における第1および第2のPEG部分)は、規定の鎖長を有する単分散PEG部分(例えば約90%、91%、92%、93%、94%、または95%を超えるオリゴマー純度の)を含む。特定の場合では、複数の結合体の各々における第1のPEG部分および第2のPEG部分はPEG11、PEG12(PEG 800)、PEG28(PEG 1500)、および(PEG28)2(PEG 1500x2)からなる群より独立して選択される。特定の態様では、複数の結合体の各々における第1のPEG部分および第2のPEG部分は同じものである。好ましい態様では、複数の結合体の各々における第1のPEG部分および第2のPEG部分はいずれもPEG28(PEG 1500)である。
【００７１】
いくつかの態様では、本発明は、複数の結合体が互いに連結された、多量体ペプチド結合体を提供する。特定の態様では、多量体結合体は複数の結合体の二量体または四量体である。特定の態様では、多量体ペプチド結合体は、各結合体の第2のPEG部分間の結合によって形成される。いくつかの場合では、結合体は、少なくとも1つのリジン残基(例えば少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、またはそれ以上のリジン(K)残基)によって第2のPEG部分において互いに連結されている。他の場合では、1つまたは複数のリジン残基は、そこに結合した画像化剤または治療剤、例えば放射性核種(例えば放射標識として使用される)を含む。他の態様では、組成物は薬学的担体または賦形剤をさらに含む。
【００７２】
さらに別の局面では、本発明は、
(a) 本明細書に記載の両末端PEG化ペプチド結合体、またはその組成物(例えば複数の結合体、もしくは結合体の多量体); および
(b) 画像化または治療における該結合体または該組成物の使用説明書
を含む、画像化用または治療用のキットを提供する。
【００７３】
さらなる局面では、本発明は、標的組織のインビボ画像化のための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する:
(a) 画像化剤がペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合した、本明細書に記載の両末端PEG化ペプチド結合体、またはその組成物(例えば複数の結合体、もしくは結合体の多量体)を、そのような画像化を必要とする対象に投与する段階; および
(b) 該結合体が該対象中のどこに濃縮されているかを測定するために該結合体を検出する段階。
【００７４】
いくつかの態様では、標的組織はがん組織または臓器である。がん組織の非限定的な例としては、膵がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、子宮頸がん、および口腔扁平上皮がんに関連するがん組織または腫瘍が挙げられる。好ましい態様では、ペプチド結合体は、膵腫瘍などの腫瘍を画像化するために投与される。本発明に従って画像化するために好適な膵腫瘍の例としては腺がん、漿液性嚢胞腺腫、腺房細胞がん、膵内分泌腫瘍(例えばインスリノーマ)などが挙げられるがそれに限定されない。
【００７５】
特定の場合では、画像化剤は放射性核種(例えばベンゾイル基などの補欠分子族に結合した、もしくはキレート剤に結合した)、ビオチン、フルオロフォア、蛍光タンパク質、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはアルカリホスファターゼを含む。放射性核種が画像化剤を構成する場合では、検出は、ペプチド結合体が対象中のどこに濃縮されているかを測定するために放射性核種からの放射線を使用する際に行われる。フルオロフォアまたは蛍光タンパク質が画像化剤を構成する場合では、検出は、ペプチド結合体が対象中のどこに濃縮されているかを測定するためにフルオロフォアまたは蛍光タンパク質からの蛍光を使用する際に行われる。
【００７６】
他の態様では、ペプチド結合体は磁気共鳴画像法(MRI)、磁気共鳴分光法(MRS)、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、陽電子放射断層撮影法(PET)、または光学画像化により検出される。さらに他の態様では、結合体は、インテグリンにより媒介される疾患または障害の診断または予後予測のために検出される。特定の態様では、疾患または障害はインテグリンの発現、過剰発現、および/または活性化に関連している。好ましい態様では、疾患または障害はαvβ6インテグリン媒介性の疾患または障害であり、例えば、ペプチド結合体は、αvβ6媒介性の疾患または障害の診断または予後予測のために検出される。
【００７７】
関連する局面では、本発明は、インテグリン媒介性の疾患または障害の処置を、それを必要とする対象において行うための方法であって、以下の段階を含む方法を提供する:
治療剤がペプチド、第1のPEG部分、または第2のPEG部分に共有結合した、治療有効量の本明細書に記載の両末端PEG化ペプチド結合体、またはその組成物(例えば複数の結合体、もしくは結合体の多量体)を、該対象に投与する段階。
【００７８】
特定の態様では、疾患または障害はインテグリンの発現、過剰発現、および/または活性化に関連している。インテグリン媒介性の疾患または障害の非限定的な例としては、がん、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、および慢性創傷性皮膚疾患が挙げられる。特定の態様では、疾患または障害はαvβ6インテグリン媒介性の疾患または障害である。いくつかの場合では、αvβ6インテグリン媒介性の疾患または障害は膵がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、子宮頸がん、または口腔扁平上皮がんである。他の態様では、結合体または組成物の治療有効量は、対象において治療効果を実現するために十分な量である。さらに他の態様では、結合体または組成物の治療有効量は、インテグリンを発現する細胞に治療剤の送達を標的化するために十分な量である。
【００７９】
さらなる局面では、本発明は、対象の体内で関心対象のインテグリン(例えばαvβ6インテグリン)を発現または過剰発現する上皮細胞を画像化する方法であって、治療有効量の本明細書に記載のペプチド結合体または組成物を該対象に投与する段階を含む方法を提供する。本方法は、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、慢性創傷性皮膚疾患(例えば表皮水疱症)、または上皮腫瘍細胞の画像化に特に有用である。例えば、αvβ6過剰発現上皮細胞を画像化する方法は、結合体のペプチドまたは一方のPEG成分を蛍光プローブに連結させる段階、および、得られたペプチド結合体を、αvβ6インテグリン結合性の結合体を投与時にその蛍光タグにより可視化できるような好適な剤形に組み込む段階を含みうる。
【００８０】
さらなる局面では、本発明は、対象において関心対象のインテグリン(例えばαvβ6インテグリン)を発現もしくは過剰発現する細胞に、または関心対象のインテグリン(例えばαvβ6インテグリン)を発現もしくは過剰発現する細胞を含む腫瘍、臓器、または組織に治療剤を送達するための方法であって、本明細書に記載の治療剤を含むペプチド結合体または組成物を該対象に投与する段階を含む方法を提供する。
【００８１】
A. インテグリン結合性ペプチド
特定の局面では、本発明は、両末端PEG化インテグリン結合性ペプチド結合体を提供する。インテグリンは、細胞外マトリックスリガンド、細胞表面リガンド、および可溶性リガンドに結合する細胞接着受容体のスーパーファミリーである。インテグリンは膜貫通αβヘテロ二量体であり、24種のヘテロ二量体を生み出す少なくとも18種のαサブユニットおよび8種のβサブユニットがヒトにおいて知られている。αおよびβサブユニットは異なるドメイン構造を有しており、各サブユニットの細胞外ドメインがヘテロ二量体のリガンド結合部位に寄与する。インテグリンの非限定的な例としてはα1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1、α9β1、α10β1、α11β1、αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、αIIbβ3、α4β7、αEβ7、α6β4、αLβ2、αMβ2、αXβ2、αDβ2、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、インテグリンはαvβ3インテグリン、αIIbβ3インテグリン、またはαvβ6インテグリンである。他の態様では、インテグリン結合性ペプチドは、RGD、LDV、およびGFOGERからなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、式中、Oはヒドロキシプロリンである。
【００８２】
特定の態様では、ペプチドはαvβ6インテグリンに結合する(例えばそれを標的とする)。特定の場合では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドはアミノ酸配列RGDLX1X2X3を含み、式中、X1およびX2は独立して選択されるアミノ酸であり、X3はLeu(L)またはIle(I)である。特定の場合では、X1はQであり、X2はVであり、X3はLである。別途指定がない限り、本明細書におけるアミノ酸位置はペプチドのアミノ末端からカルボキシル末端に向かって番号付けされる。
【００８３】
いくつかの態様では、残基LX1X2X3がαヘリックス内に存在する。αヘリックスは、特定の水素結合パターンで相互作用してヘリックス構造を画定するペプチド中のアミノ酸の連続群であると理解される。例えば、標準的αヘリックス中の水素結合パターンは残基nのカルボニル酸素と残基n+4のアミド水素との間である。310ヘリックスでは、この水素結合パターンは残基nと残基n+3との間である。πヘリックスでは、この水素結合パターンは残基nと残基n+5との間である。各αヘリックス中のターン当たりの残基の数は標準的αヘリックス、310ヘリックス、およびπヘリックスでそれぞれ3.6、3.0、および4.4である。一態様では、ペプチドのαヘリックスは、残基LX1X2L/Iの疎水性側鎖がヘリックスの片側から突出することを可能にする。別の態様では、αヘリックスは少なくとも1つのターンを有する。本発明において有用なαヘリックスは、PCT公開番号WO 95/00534に例えば記載されているαヘリックス模倣体でありうる。αヘリックス模倣体は、天然または合成ペプチドの構造を安定化することができるαヘリックス構造である。
【００８４】
本発明の結合体中で使用されるαvβ6インテグリン結合性ペプチドは標準的ヘリックス、310ヘリックス、πヘリックス、またはそれらの任意の組み合わせを含みうる。例えば、ヘリックスは、ヘリックスに隣接する「キャップ」構造、例えばアミノ末端キャップおよび/またはカルボキシル末端キャップを形成するアミノ酸を含みうる。
【００８５】
他の態様では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドは配列RGDLX1X2LX4X5X6を含み、式中、X1、X2、X4、X5、およびX6は独立して選択されるアミノ酸である。特定の場合では、X1、X2、X4、X5、およびX6はヘリックス促進残基である。例えば、ヘリックス促進残基はGlu、Ala、Leu、Met、Gln、Lys、Arg、Val、Ile、His、Thr、Trp、Phe、およびAspからなる群より独立して選択されうる。ヘリックス促進残基は天然アミノ酸、または人工アミノ酸もしくは修飾アミノ酸などの非天然アミノ酸を含みうる。いくつかの態様では、ペプチドは配列RGDLX1X2LX4X5X6Znを含み、式中、Zはヘリックス促進残基であり、nは1〜20の任意の数である。好ましくは、nは5〜15、または8〜12である。さらに、Z位置にヘリックス残基を含むようにヘリックスを延長することで、ヘリックス双極子を増加させ、αvβ6インテグリンへの結合を増強することができる。
【００８６】
さらなる態様では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドは式:BmRGDLX1X2LX4X5X6Znで表すことができ、式中、Bは、LX1X2Lから画定されるヘリックスとの疎水性相互作用を増強しかつ結合のためにRGDドメインを増強する、m個のアミノ酸であり、Zはヘリックス促進残基であり、nは1〜35の数であり、mは1〜35の数である。好ましくは、mは、Bが疎水性/非共有結合性相互作用コアを促進するために十分な長さを有するように選択される。これらの残基の正確な性質は領域の一般的設計に依存する。特に、疎水性相互作用(Val、Ile、Leuなどの残基からの)ならびに/または静電的相互作用(Asp、Glu、Lys、および/もしくはArgをX1および/もしくはX2において対応イオン対と共に使用する)の混合を有することが好ましい。
【００８７】
特定の態様では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドはアミノ酸配列RGDLX1X2X3AQX6を含み、式中、X6はLys(K)またはArg(R)である。好ましい態様では、X6はRである。
【００８８】
特定の態様では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドは、
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、およびそれらの組み合わせより選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなる。
【００８９】
他の態様では、αvβ6インテグリン結合性ペプチドはアミノ酸配列RSDLTPLFX7を含み、式中、X7は存在しないかまたは任意のアミノ酸である。特定の場合では、X7は存在しない(すなわち、ペプチドはアミノ酸配列RSDLTPLFを含むかまたはそれからなる)。特定の他の場合では、X7はKである(すなわち、ペプチドはアミノ酸配列RSDLTPLFKを含むかまたはそれからなる)。
【００９０】
αvβ6インテグリンは、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、TGF-βの潜在関連ペプチド(LAP)、および口蹄疫ウイルス(FMDV)のウイルスカプシドタンパク質(VP1)の受容体であり、正常成人組織における上皮細胞のサブセット中でのみ非常に低いレベルまたは検出不能なレベルで発現される(Breuss et al., J. Cell Sci., 108:2241-2251 (1995))。しかし、αvβ6インテグリン発現は、発生中に、傷害もしくは炎症後に、または種々の上皮性腫瘍中で劇的に増加する。例えば、ケラチノサイトは口腔および皮膚の両方の創傷においてαvβ6インテグリンの新規発現を示す(Breuss et al., supra; Clark et al., Am. J. Path., 148:1407-1421 (1996))。さらに、口腔扁平上皮がんの浸潤先進部において多くの場合、αvβ6インテグリンの発現が比較的高いことから、αvβ6インテグリンは腫瘍浸潤において能動的な役割を果たす。その結果、αvβ6インテグリンは、膵がん、口腔がん、卵巣がん、乳がん、および結腸がんなどの疾患または障害の画像化および治療の両方に関する優れた標的となる。したがって、規定の鎖長を有する単分散PEG小分子(例えばPEG28)によるαvβ6インテグリン結合性ペプチドの両末端PEG化を使用して、個々のN末端またはC末端PEG化を示すペプチドに比べて、αvβ6発現腫瘍に対する高い腫瘍選択性および腫瘍特異性を提供すること、ならびに増加した代謝安定性および腫瘍部位での滞留性を有することで、著しく向上した局在化能力および/または標的化能力を示す、本発明の結合体を生成することができる。
【００９１】
いくつかの態様では、ペプチドは、インテグリン、および該インテグリンと同時発現される受容体に結合する二価ペプチドである。同時発現される受容体の非限定的な例としてはCXCR4が挙げられる。特定の態様では、二価ペプチドはαvβ6インテグリンおよびCXCR4の両方に結合する。他の態様では、インテグリンと同時発現される受容体は別のインテグリン、例えば、αvβ5インテグリンと同時発現されるαvβ3インテグリンである。特定の態様では、二価ペプチドはαvβ3インテグリンおよびαvβ5インテグリンの両方に結合する。特定の場合では、ペプチドは、同時発現される受容体に結合する第2のペプチド断片に連結された、インテグリンに結合する第1のペプチド断片を含む。他の場合では、ペプチドは、インテグリンに結合する第2のペプチド断片に連結された、同時発現される受容体に結合する第1のペプチド断片を含む。第1および第2のペプチド断片は、互いに直接連結されていてもよく、グリシンリンカーまたは当技術分野において公知である他の好適なリンカーによって連結されていてもよい。いくつかの場合では、第1のペプチド断片がN末端でPEG化され、第2のペプチド断片がC末端でPEG化されることで、本発明の両末端PEG化二価ペプチド結合体が形成される。
【００９２】
他の態様では、本発明のペプチドは約5〜約45アミノ酸長、約8〜約45アミノ酸長、約8〜約25アミノ酸長、約12〜約45アミノ酸長、約5〜約40アミノ酸長、約10〜約40アミノ酸長、または約35、30、25、20、15、もしくは10アミノ酸長である。例えば、ペプチドは約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45アミノ酸長、またはそれ以上でありうる。通常、ペプチドは、単独分子として存在する場合に、三次構造の形成を可能にする長さを超えないべきであり、例えば45アミノ酸を超えないべきである。しかし、ペプチドは、ペプチド内での三次構造の形成を妨げうる抗体または別のタンパク質もしくは巨大分子などのより大きな分子に融合される場合に、45アミノ酸を超えることがある。また、ペプチドは、異なる受容体に結合する第1および第2のペプチド断片を有する二価ペプチドである場合に、45アミノ酸を超えることがある。好ましくは、ペプチドは約20アミノ酸長である。
【００９３】
本発明の結合体において使用されるペプチドは、上記のペプチドと少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上の配列同一性を有するペプチドを含む、上記で規定したペプチドの機能的変異体であってもよい。特定の場合では、ペプチドは天然アミノ酸および/または非天然アミノ酸を含みうる。非天然アミノ酸の例としてはD-アミノ酸、オルニチン、ジアミノ酪酸オルニチン、ノルロイシンオルニチン、ピリイルアラニン(pyriylalanine)、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、フェニルグリシン、αおよびα-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、天然アミノ酸のハロゲン化物誘導体(例えばトリフルオロチロシン、p-Cl-フェニルアラニン、p-Br-フェニルアラニン、p-I-フェニルアラニンなど)、L-アリル-グリシン、b-アラニン、L-a-アミノ酪酸、L-g-アミノ酪酸、L-a-アミノイソ酪酸、L-e-アミノカプロン酸、7-アミノヘプタン酸、Lメチオニンスルホン、L-ノルロイシン、L-ノルバリン、p-ニトロ-L-フェニルアラニン、L-ヒドロキシプロリン、L-チオプロリン、フェニルアラニンのメチル誘導体(例えば1-メチル-Phe、ペンタメチル-Phe、L-Phe(4-アミノ)、L-Tyr(メチル)、L-Phe(4-イソプロピル)、L-Tic(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボキシル酸)、L-ジアミノプロピオン酸、L-Phe(4-ベンジル)など)が挙げられるがそれに限定されない。ペプチドをさらに修飾することができる。例えば、1つまたは複数のアミド結合をエステルまたはアルキル骨格結合で置き換えることができる。N-またはC-アルキル置換基、側鎖修飾、または、ジスルフィド架橋または側鎖アミドもしくはアルキル結合などの拘束が存在しうる。
【００９４】
本発明の結合体において使用されるペプチドは、修飾ペプチドおよび合成ペプチド類似体の両方を含みうる。製剤化特性および貯蔵特性を改善するために、または弱いペプチド結合を保護するために、非ペプチド構造を取り込むことでペプチドを保護することができる。本発明のペプチドは、当技術分野において公知の方法を使用して調製することができる。例えば、化学合成によって、例えば固相技術および/もしくは自動ペプチド合成機を使用して、または組換え手段によって、ペプチドを生成することができる。特定の場合では、自動複数ペプチド合成機(Abimed AMS 422)上で固相戦略を使用して9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)化学反応によってペプチドを合成することができる。次にペプチドを逆相HPLCで精製し、凍結乾燥させることができる。あるいは、より長いペプチド配列または完全長タンパク質配列の切断によってペプチドを調製することもできる。例えば、完全長タンパク質の切断によって、フィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、TGF-βの潜在関連ペプチド(LAP)、または口蹄疫ウイルス(FMDV)のウイルスカプシドタンパク質(VP1)のαvβ6インテグリン結合性ドメインを含む断片を単離することができる。
【００９５】
他の態様では、本発明の結合体のペプチド成分は環化されていてもよい。安定性の強化をもたらす立体配座拘束を選択して構造に付与するために環状構造をペプチドに導入するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、酸化される際にペプチドがジスルフィド結合を含んで環状ペプチドを生み出すように、C末端またはN末端システインをペプチドに加えることができる。他のペプチド環化方法としては、チオエーテル、ならびにカルボキシル末端およびアミノ末端のアミドおよびエステルの形成が挙げられる。合成環状ペプチドを生み出すためのいくつかの合成技術が開発された(例えばTarn et al., Protein Sci., 7:1583-1592 (1998); Romanovskis et al., J. Pept. Res., 52: 356-374 (1998); Camarero et al., J. Amer. Chem. Soc., 121: 5597-5598 (1999); Valero et al., J. Pept. Res., 53(1): 56-67 (1999)を参照)。一般に、ペプチドを環化することの役割は以下の2つである: (1) インビボで加水分解を減少させること; および(2) アンフォールド状態を熱力学的に不安定化し、二次構造形成を促進すること。
【００９６】
IV. 投与方法
本発明の両末端PEG化インテグリン結合性ペプチド結合体は、ヒトおよび動物の画像化、治療、予後予測、および診断の用途において特別な有用性を示す。例えば、結合体を、悪性膵腫瘍(例えば腺がん、漿液性嚢胞腺腫、腺房細胞がん、インスリノーマなどの膵内分泌腫瘍、など)などの腫瘍、または任意の他の組織もしくは臓器を画像化するために使用することができる。結合体は、がん(例えば膵がん、乳がん、結腸がん、子宮頸がん、肺がんなど)、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、および慢性創傷性皮膚疾患などの疾患および障害を処置することにも有用である。
【００９７】
必要に応じて好適な薬学的賦形剤と共に本発明のペプチド結合体を投与することを、任意の許容される投与様式によって行うことができる。したがって、投与は例えば静脈内、局所、皮下、経皮(subcutaneous)、経皮(transcutaneous)、筋肉内、経口、関節内、非経口、細動脈内、皮内、脳室内投与、頭蓋内投与、腹腔内、病変内、鼻腔内、直腸、膣内、または吸入投与でありうる。さらに、注射が腫瘍を処置するためのものである場合、投与は腫瘍への直接投与、および/または腫瘍を取り囲む組織中への投与でありうる。
【００９８】
本発明の結合体または結合体の組み合わせを含む組成物を反復的に、例えば少なくとも2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、またはそれ以上投与することができ、あるいは該組成物を持続注入により投与することができる。好適な投与部位としては皮膚、粘膜、気管支、胃腸、肛門、膣、眼、および耳が挙げられるがそれに限定されない。製剤は、固体、半固体、凍結乾燥粉末、または液体の剤形、例えば錠剤、丸剤、舐剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、坐薬、停留浣腸剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、エアロゾル剤などの形態を、好ましくは正確な投与量の簡便な投与に好適な単位剤形として取りうる。
【００９９】
「単位剤形」という用語は、ヒト対象および他の哺乳動物(例えばイヌ)用の単位剤形として好適な物理的に別々の単位を意味し、各単位は、所望の作用発現、耐容性、および/または治療効果を生じるように計算された所定量の有効物質と好適な薬学的賦形剤との組み合わせを含む(例えばアンプル)。さらに、濃縮組成物を調製することができ、次に該濃縮組成物から希釈単位投薬組成物を生成することができる。したがって、濃縮組成物は実質的により多くの、例えば少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれ以上の結合体または結合体の組み合わせの量を含む。
【０１００】
そのような剤形を調製するための方法は当業者に公知である(例えばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)を参照)。投与される組成物は、本発明の教示に従って投与される場合に、腫瘍、臓器、もしくは組織の画像化、または処置される状態の軽減のために薬学的に有効な量で、結合体または結合体の組み合わせを含む。さらに、本発明の結合体の薬学的に許容される塩(例えば酸付加塩)を、有機合成化学分野の当業者に公知でありかつ例えばMarch, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 4th Ed., New York, Wiley-Interscience (1992)に記載されている標準的手順を使用して調製し、組成物に取り込むことができる。
【０１０１】
通常、組成物は、従来の薬学的担体または賦形剤を含むものであり、他の薬剤、担体、補助剤、希釈剤、組織浸透促進剤、可溶化剤などをさらに含んでもよい。好ましくは、組成物は本発明の結合体またはその組み合わせ約0.01重量%〜約90重量%、約0.1重量%〜約75重量%、約0.1重量%〜50重量%、または約0.1重量%〜10重量%を含み、残りは好適な薬学的担体および/または賦形剤からなる。当技術分野において周知の方法によって、適切な賦形剤を特定の組成および投与経路に適応させることができる。例えば前掲のREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCESを参照。
【０１０２】
好適な賦形剤の例としては乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、および、Carbopol、例えばCarbopol 941、Carbopol 980、Carbopol 981などのポリアクリル酸などが挙げられるがそれに限定されない。組成物は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、およびミネラルオイルなどの潤滑剤; 湿潤剤; 乳化剤; 懸濁化剤; ヒドロキシ安息香酸メチル、エチル、およびプロピル(すなわちパラベン)などの保存料; 無機および有機の酸および塩基などのpH調整剤; 甘味料; 着色料; ならびに香料をさらに含んでもよい。組成物は生分解性ポリマービーズ、デキストラン、およびシクロデキストリン包接錯体を含んでもよい。
【０１０３】
経口投与では、組成物は錠剤、舐剤、カプセル剤、乳剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、スプレー剤、散剤、および持続放出製剤の形態でありうる。経口投与に好適な賦形剤としては薬学的グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、ゼラチン、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。
【０１０４】
いくつかの態様では、薬学的組成物は丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態を取り、したがって組成物は、結合体または結合体の組み合わせと共に、以下のうちいずれかを含みうる: 乳糖、ショ糖、リン酸二カルシウムなどの希釈剤; デンプンまたはその誘導体などの崩壊剤; ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤; ならびにデンプン、アラビアゴム、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、セルロースおよびセルロース誘導体などの結合剤。結合体を、例えばポリエチレングリコール(PEG)担体中に配置することで坐薬として製剤化してもよい。
【０１０５】
液体組成物の調製を、結合体または結合体の組み合わせ、および場合によっては1つまたは複数の薬学的に許容される補助剤を例えば生理食塩水(例えば0.9% w/v塩化ナトリウム)、ブドウ糖水溶液、グリセリン、エタノールなどの担体に溶解または懸濁させて、例えば経口投与、局所投与、または静脈内投与用の液剤または懸濁剤を形成することによって行うことができる。本発明の結合体を停留浣腸剤に製剤化してもよい。
【０１０６】
局所投与では、本発明の組成物は乳剤、ローション剤、ゲル剤、クリーム剤、ゼリー剤、液剤、懸濁剤、軟膏剤、および経皮パッチ剤の形態でありうる。吸入による送達では、組成物を乾燥散剤として、または液体形態でネブライザーによって送達することができる。非経口投与では、組成物は滅菌注射用液剤および滅菌包装散剤の形態でありうる。好ましくは、注射用液剤はpH約4.5〜約7.5で製剤化される。
【０１０７】
本発明の組成物を凍結乾燥形態で提供してもよい。そのような組成物は投与前の再構成用に緩衝液、例えば炭酸水素緩衝液を含んでもよく、あるいは、この緩衝液は例えば水による再構成用に凍結乾燥組成物に含まれてもよい。凍結乾燥組成物は好適な血管収縮薬、例えばエピネフリンを含んでもよい。凍結乾燥組成物はシリンジ中で提供することができ、シリンジは、再構成組成物を患者に直ちに投与することができるように再構成用の緩衝液との組み合わせで包装されていてもよい。
【０１０８】
一般に、投与される投与量は、ピコモル〜マイクロモル濃度の結合体を適切な部位に送達するために有効である。しかし、当業者は、投与される用量が、投与される特定の結合体または結合体のセット、投与様式、用途の種類(例えば画像化、診断、予後予測、治療など)、患者の年齢、および患者の体調を含むがそれに限定されないいくつかの要因に応じて変動することを理解する。好ましくは、所望の結果を生じるために必要な最小用量および最小濃度を使用すべきである。子ども、高齢者、衰弱した患者、ならびに心疾患および/または肝疾患の患者に合わせて投与量を適切に調整すべきである。さらなる指針は、投与量を評価するために実験動物モデルを使用する当技術分野において公知の試験から得ることができる。しかし、本発明の結合体に関連して代謝安定性、腫瘍滞留性、および腫瘍対血液比が増加することで、投与濃度および反復投与に関する安全性の範囲が広くなる。
【０１０９】
V. 治療用途
特定の局面では、本発明の両末端PEG化インテグリン結合性ペプチド結合体は、インテグリン媒介性の疾患または障害の処置を必要とする対象におけるその処置に使用される。本明細書に記載のペプチド結合体による処置に好適な疾患または障害の例としてはアレルギー、不安障害、自己免疫疾患、行動障害、先天性欠損、血液障害、骨疾患、がん、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性創傷性皮膚疾患、循環器疾患、歯科疾患、うつ病性障害、解離性障害、耳状態、摂食障害、眼状態、食物アレルギー、食中毒、胃腸疾患、遺伝性障害、心疾患、ホルモン障害、免疫不全、感染性疾患、炎症性疾患、昆虫伝染病、栄養障害、腎疾患、白質ジストロフィー、肝疾患、肺気腫、メンタルヘルス障害、代謝疾患、気分障害、筋変性障害、神経障害、神経変性障害、神経筋障害、人格障害、恐怖症、妊娠合併症、プリオン病、前立腺疾患、心理障害、精神障害、呼吸器疾患、性障害、皮膚状態、睡眠障害、言語障害、スポーツ外傷、熱帯病、前庭障害、および消耗性疾患が挙げられるがそれに限定されない。好ましくは、αvβ6媒介性の疾患または障害はがん、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性線維症、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、および慢性創傷性皮膚疾患(例えば表皮水疱症)である。
【０１１０】
一般に、がんは、周囲組織に浸潤しかつ新たな身体部位に転移する傾向がある未分化細胞の増殖を特徴とする、様々な悪性腫瘍のいずれかを含む。本発明の結合体または組成物を使用する処置に好適な異なる種類のがんの非限定的な例としては、卵巣がん、乳がん、肺がん、膀胱がん、甲状腺がん、肝がん、胸膜がん、膵がん、子宮頸がん、前立腺がん、精巣がん、結腸がん、肛門がん、胆管がん、消化管カルチノイド腫瘍、食道がん、胆嚢がん、直腸がん、虫垂がん、小腸がん、胃がん、腎がん(すなわち腎細胞がん)、中枢神経系がん、皮膚がん、絨毛がん、頭頸部がん、骨がん、骨肉腫、線維肉腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、黒色腫、白血病(例えば急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、またはヘアリーセル白血病)、リンパ腫(例えば非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、B細胞リンパ腫、またはバーキットリンパ腫)、および多発性骨髄腫が挙げられる。
【０１１１】
また、当業者は、本発明の結合体をがんの処置のために他の治療剤と同時投与することができることを認識するであろう。併用療法に好適な抗がん剤としては、代謝拮抗剤、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗生物質、有糸分裂阻害剤、プロカルバジン、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、コルチコステロイド、インターフェロン、放射性医薬、TNF-αなどの抗腫瘍活性を有するペプチド、それらの薬学的に許容される塩、それらの誘導体、それらのプロドラッグ、およびそれらの組み合わせなどの、細胞毒および剤が挙げられるがそれに限定されない。例えば、本発明の1つまたは複数の結合体を含む薬学的組成物を、化学療法の前、途中、または後に、抗がん剤または抗がん剤の組み合わせの投与の前、途中、または後に、患者に投与することができる。腫瘍の再発または転移を減少させかつ/または予防するには、化学療法後の結合体による処置が特に有用でありうる。いくつかの態様では、抗がん剤は、本明細書に記載の両末端PEG化インテグリン結合性ペプチドに直接的にまたは間接的に(例えばリポソームもしくはナノ粒子によって)共有結合しうる。
【０１１２】
通常、炎症性疾患は、炎症を特徴とするかまたは炎症により引き起こされる疾患または障害を含む。炎症は、細胞傷害に対する局所応答により生じうるものであり、この局所応答は、毛細血管拡張、白血球浸潤、発赤、熱、および疼痛を特徴とし、有害作用物質および損傷組織の除去を開始する機構としての役割を果たす。炎症部位としては例えば肺、胸膜、腱、リンパ節またはリンパ腺、口蓋垂、膣、脳、脊髄、鼻粘膜および咽頭粘膜、筋肉、皮膚、骨または骨組織、関節、膀胱、網膜、子宮頸部、眼角、腸管、椎骨、直腸、肛門、滑液包、濾胞などを挙げることができる。本発明の結合体を使用する処置に好適な炎症性疾患の例としては、炎症性腸疾患(例えばクローン病または潰瘍性大腸炎)、関節リウマチなどのリウマチ性疾患、結合織炎、骨盤内炎症性疾患、ざ瘡、乾癬、放線菌症、赤痢、胆汁性肝硬変、ライム病、紅色汗疹、スティーブンス・ジョンソン症候群、流行性耳下腺炎、尋常性天疱瘡、およびブラストミセス症が挙げられるがそれに限定されない。
【０１１３】
一般に、自己免疫疾患は、自己組織または組織成分に対する免疫応答、例えば自己抗体応答または細胞媒介性応答により生じる疾患または障害を含む。本発明の結合体を使用する処置に好適な自己免疫疾患の例としては、自己免疫応答が1つの組織に対して向けられる臓器特異的自己免疫疾患、例えばI型糖尿病、重症筋無力症、白斑、グレーブス病、橋本病、アジソン病、自己免疫性胃炎、および自己免疫性肝炎; ならびに、自己免疫応答が身体中のいくつかの臓器または多くの臓器に存在する成分に対して向けられる臓器非特異的自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、進行性全身性硬化症および変種、多発性筋炎、ならびに皮膚筋炎が挙げられるがそれに限定されない。さらなる自己免疫疾患としては例えば悪性貧血、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性血小板減少症、シェーグレン症候群、および多発性硬化症が挙げられる。
【０１１４】
当業者は、本発明の結合体を炎症性疾患または自己免疫疾患の処置のために他の治療剤と同時投与することができることを認識するであろう。併用療法に好適な抗炎症剤としてはコルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、インフリキシマブなどの抗体、5-アミノサリチル酸、抗生物質、それらの薬学的に許容される塩、それらの誘導体、それらのプロドラッグ、およびそれらの組み合わせが挙げられるがそれに限定されない。併用療法に好適な免疫抑制剤としてはアザチオプリンおよびその代謝物、メトトレキサートなどの代謝拮抗剤、免疫抑制抗体、ミゾリビン一リン酸、シクロスポリン、スコパロン、FK-506(タクロリムス)、FK-778、ラパマイシン(シロリムス)、グラチラマー酢酸塩、ミコフェノール酸、それらの薬学的に許容される塩、それらの誘導体、それらのプロドラッグ、およびそれらの組み合わせが挙げられるがそれに限定されない。
【０１１５】
別の態様では、本発明の結合体は、例えばウイルス、細菌、真菌、寄生虫、または任意の他の感染性作用物質により引き起こされる感染症または感染性疾患を処置するために有用である。処置に好適な感染性疾患の非限定的な例としては、後天性免疫不全症候群(AIDS/HIV)またはHIV関連障害、アルパース症候群、炭疽、ウシ海綿状脳症(狂牛病)、水痘、コレラ、結膜炎、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、デング熱、エボラ、象皮症、脳炎、致死性家族性不眠症、第五病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群、ハンタウイルス感染症、ピロリ菌(Helicobacter pylori)感染症、肝炎(A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎)、疱疹、インフルエンザ(例えばトリインフルエンザA型(鳥インフルエンザ))、クールー病、ハンセン病、ライム病、マラリア、出血熱(例えばリフトバレー熱、クリミア・コンゴ出血熱、ラッサ熱、マールブルグ病、およびエボラ出血熱)、麻疹、髄膜炎(ウイルス性、細菌性)、単核球症、院内感染症、中耳炎、骨盤内炎症性疾患(PID)、ペスト、肺炎、ポリオ、プリオン病、狂犬病、リウマチ熱、バラ疹、ロスリバーウイルス感染症、風疹、サルモネラ症、敗血症性関節炎、性行為感染症(STD)、帯状疱疹、天然痘、連鎖球菌性咽頭炎、破傷風、毒素性ショック症候群、トキソプラズマ症、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、渓谷熱、百日咳、ならびに黄熱病が挙げられるがそれに限定されない。
【０１１６】
特定の態様では、本発明の結合体は、神経障害または筋骨格障害を処置するために有用である。そのような障害の例としてはアルツハイマー病、アイカルディ症候群、健忘症、筋萎縮性側索硬化症(ルー・ゲーリック病)、無脳症、失語症、くも膜炎、アーノルド・キアリ奇形、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病、ベル麻痺、腕神経叢損傷、脳損傷、脳腫瘍、シャルコー・マリー・トゥース病、脳炎、てんかん、本態性振戦、ギラン・バレー症候群、水頭症、多汗症、クラッベ病、髄膜炎、メビウス症候群、筋ジストロフィー、多発性硬化症、パーキンソン病、末梢神経障害、体位性または起立性頻拍症候群、進行性核上性麻痺、ライ症候群、帯状疱疹、シャイ・ドレーガー症候群、痙性斜頸、二分脊椎、脊髄性筋萎縮症、全身硬直症候群、共感覚、脊髄空洞症、胸郭出口症候群、トゥレット症候群、トキソプラズマ症、および三叉神経痛が挙げられるがそれに限定されない。
【０１１７】
治療用途で使用される場合、本発明の結合体は通常、ペプチドまたは第1もしくは第2のPEG部分のうち1つまたは複数に共有結合的または非共有結合的に結合した治療剤を有する。特定の場合では、治療剤は細胞毒性のものである。好適な治療剤は、有益な予防特性および/または治療特性を対象に対して示すものであり、放射性核種、化学療法剤、ナノ粒子、ナノ液滴、リポソーム薬、およびサイトカインが挙げられるがそれに限定されない。当業者は、ペプチドまたはPEG部分上に存在する官能基に治療剤を結合させるための方法を熟知しているであろう。例えば、結合体のペプチドまたはPEG部分に存在する第一級アミン基に治療剤を共有結合させることにより、治療剤をペプチドまたはPEG部分に直接共有結合させることができる。当業者は、非共有結合性相互作用(例えばイオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子-双極子結合など)によって治療剤を結合体のペプチドまたはPEG部分に結合させることもできることを認識するであろう。
【０１１８】
いくつかの態様では、治療剤は細胞毒性化学療法剤である。細胞毒性化学療法剤は当技術分野において周知であり、抗がん剤、例えば、アルキル化剤(例えば、メクロレタミン(HN2)、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン(L-サルコリシン)、およびクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタード、エチレンイミンおよびメチルメラミン(例えばヘキサメチルメラミン、チオテパ)、ブスルファンなどのアルキルスルホン酸エステル、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNLJ)、セムスチン(メチル-CCN-U)、およびストレプトゾシン(ストレプトゾトシン)などのニトロソ尿素、ならびにダカルバジン(DTIC; ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド)などのトリアゼン)、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキサート(アメトプテリン)などの葉酸類似体、フルオロウラシル(5-フルオロウラシル; 5-FU)、フロクスウリジン(フルオロデオキシウリジン; FUdR)、およびシタラビン(シトシンアラビノシド)などのピリミジン類似体、ならびにメルカプトプリン(6-メルカプトプリン; 6-MP)、チオグアニン(6-チオグアニン; 6-TG)、およびペントスタチン(2'-デオキシコホルマイシン)などのプリン類似体および関連阻害剤)、天然産物(例えば、ビンブラスチン(VLB)およびビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン、ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン(ダウノマイシン; ルビドマイシン)、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミスラマイシン)、およびマイトマイシン(マイトマイシンQ)などの抗生物質、L-アスパラギナーゼなどの酵素、ならびにインターフェロンアルフェノーム(alphenome)などの生体応答修飾物質)、種々の剤(例えば、シスプラチン(cis-DDP)およびカルボプラチンなどの白金配位錯体、ミトキサントロンおよびアントラサイクリンなどのアントラセンジオン、ヒドロキシ尿素などの置換尿素、プロカルバジン(N-メチルヒドラジン; MIH)などのメチルヒドラジン誘導体、ミトタン(o,p'-DDD)およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制剤、パクリタキセル(タキソール)および類似体/誘導体、ならびにフルタミドおよびタモキシフェンなどのホルモンアゴニスト/アンタゴニスト)、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１１９】
他の態様では、結合体のペプチドまたは第1もしくは第2のPEG部分のうち1つまたは複数が、治療剤を含む粒子に連結される。この場合の粒子としてはナノ粒子および脂質ベースのベシクル、例えばリポソーム、または脂質で構成される他の同様の構造が挙げられるがそれに限定されない。通常、リポソームは、薬物または他の化合物などの物質を送達するための剤として使用可能なリン脂質二重層を含んだ球状ベシクルである。リポソームは、混合脂質鎖を有する天然由来のリン脂質(卵ホスファチジルエタノールアミン)で構成されてもよく、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)のような純粋な成分で構成されてもよい。現在、リポソームの合成および使用は当技術分野において確立している。一般に、リポソームは水などの好適な媒体中でリン脂質を超音波処理することで作り出される。低い剪断速度によって、多層構造を有する多重膜リポソームが作り出される。連続高剪断超音波処理は、小さめの単層リポソームを形成する傾向がある。また、研究によって、例えばリポソームをポリエチレングリコール(PEG)でコーティングすることでリポソームが免疫系による検出を回避することを可能にすることができた。本発明のペプチド結合体などの種をリポソームに組み込むことで、これらの種を送達部位に、例えば細胞、腫瘍、臓器、組織などに標的化するのを促進することも可能である。
【０１２０】
ナノ粒子に会合または結合した物質の送達剤としてのナノ粒子の使用は当技術分野において公知である。いくつかの種類のナノ粒子はコア、多くの場合では金属原子および/または半導体原子のコアを含み、このコアに結合体のペプチドまたは第1もしくは第2のPEG部分のうち1つまたは複数を連結させることができる(例えばPCT公開番号WO 02/32404、WO 05/10816、およびWO 05/116226を参照)。他の種類のナノ粒子はリポソームなどの材料から形成することができる。いくつかの場合では、ナノ粒子は、化学特性および物理特性がバルク固体のそれと著しく異なる半導体材料の量子ドット、例えばナノ結晶でありうる(例えばGleiter, Adv. Mater., 4:474-481 (1992)を参照)。量子ドットの量子サイズ効果が理解されている現在、これらの系に関する基礎研究および応用研究がますます盛んになっている。興味深い用途は、生体系の発光標識としてのナノ結晶の使用である(例えばBrucher et al., Science, 281:2013-2016 (1998); Chan et al., Science, 281:2016-2018 (1998); Mattousi et al., J. Am. Chem. Soc., 122:12142-12150 (2000); およびAlivisatos, Pure Appl. Chem., 72:3-9 (2000)を参照)。量子ドットは、従来の蛍光色素に対するいくつかの利点を有する。例えば、量子ドットは、サイズに応じて種々の正確な波長で発光し、長い発光寿命を有する。
【０１２１】
さらなる態様では、治療剤は、細胞死を促進することが可能な細胞毒性ペプチドまたはポリペプチドである。細胞毒性ペプチドおよびポリペプチドは当技術分野において周知であり、例えばリシン、アブリン、シュードモナス外毒素、組織因子などが挙げられる。細胞毒性剤としてのリシンの使用はBurrows et al., P.N.A.S. USA, 90:8996-9000 (1993)に記載されている。局所的な血液凝固および腫瘍の梗塞を誘導する、組織因子の使用は、Ran et al., Cancer Res., 58:4646-4653 (1998)およびHuang et al., Science, 275:547-550 (1997)に記載されている。Tsai et al., Dis. Colon Rectum, 38:1067-1074 (1995)では、モノクローナル抗体に結合したアブリンA鎖が記載されている。PCT公開番号WO 96/06641では他のリボソーム不活性化タンパク質が細胞毒性剤として記載されている。シュードモナス外毒素を細胞毒性ポリペプチドとして使用してもよい(例えばAiello et al., P.N.A.S. USA, 92:10457-10461 (1995)を参照)。TNF-αおよびIL-2などの特定のサイトカインも細胞毒性剤および/または治療剤として有用でありうる。
【０１２２】
特定の放射性原子も、十分な用量で送達される際に、細胞毒性でありうる。したがって、治療剤は、細胞毒性であるために使用時に十分な量の放射能を標的部位に送達する、放射性原子を含みうる。本発明のペプチド結合体中での使用に好適な放射性原子としては、本明細書に記載の放射性核種のいずれか、または、標的の細胞、腫瘍、臓器、もしくは組織を破壊するために十分なエネルギーを放出する任意の他の同位体が挙げられる。好ましくは、結合体中の同位体および放射性原子密度は、少なくとも約4000、6000、8000、または10000cGyの線量が標的部位に、好ましくは標的部位における細胞、および細胞の小器官、特に核に送達されるようなものである。放射性原子を公知のやり方で結合体のペプチドまたは第1もしくは第2のPEG部分のうち1つもしくは複数に結合させることができる。例えば、EDTAまたは別のキレート剤を、ペプチドまたはPEG部分に結合させて、111Inまたは90Yを結合させるために使用することができる。いくつかの場合では、ペプチドに存在するチロシン残基を125Iまたは131Iで標識することができる。好ましくは、ベンゾイル基をペプチドまたはPEG部分に結合させて、18Fまたは19Fを結合させるために使用する。例えば、4-[18F]-フルオロ安息香酸または4-[19F]-フルオロ安息香酸を使用して本発明のペプチド結合体を放射標識することができる。
【０１２３】
VI. 画像化用途
特定の他の局面では、本発明の両末端PEG化インテグリン結合性ペプチド結合体は、腫瘍の画像化、臓器の断層撮影、臓器機能のモニタリング、冠動脈造影検査、蛍光内視鏡検査、レーザー誘導手術、光音響法、および音響蛍光法などを含むがそれに限定されない様々な生物医学的用途における組織および臓器のインビボ光学画像化剤(例えば放射性トレーサーまたは画像化プローブ)として使用される。一態様では、本発明の結合体は、特定の結合体が対象中のどこに濃縮されているかをモニタリングすることによる腫瘍および他の異常の存在の検出に有用である。別の態様では、結合体は、腹腔鏡検査時の腫瘍の微小転移の検出のためのレーザー支援誘導手術に有用である。さらに別の態様では、結合体は、動脈硬化巣および血餅の診断において有用である。
【０１２４】
さらなる態様では、本発明の結合体は(1) 例えば血管障害、網膜症、血管新生、および腫瘍などの脈絡網膜疾患の可視化を増強するための直接顕微鏡画像化による、眼科学における眼疾患の画像化; (2) 直接顕微鏡画像化による皮膚腫瘍などの皮膚疾患の画像化; (3) 内視鏡検査による胃腸、口腔、気管支、子宮頸部、および泌尿器の疾患および腫瘍の画像化; (4) 内視鏡用可撓性カテーテルによる動脈硬化巣および他の血管異常の画像化; ならびに(5) 二次元または三次元画像再構成による膵腫瘍、乳房腫瘍、脳腫瘍、灌流、および脳卒中の画像化において有用である。
【０１２５】
本発明の結合体を、画像化手順前に、全身的にまたは画像化すべき腫瘍、臓器、もしくは組織に局所的に投与することができる。一般に、結合体は、腫瘍、組織、または臓器の所望の光学画像を実現するために有効な用量で投与される。そのような用量は、使用される特定の結合体、画像化手順に供される腫瘍、組織、または臓器、使用される画像化機器などに応じて広範に変動しうる。
【０１２６】
いくつかの態様では、本明細書に記載の結合体は、試料を同定または定量化することができるように試料を直接染色または標識するために使用される。例えば、特定の結合体を、生体標的分析物(例えば抗原)に関するアッセイの一部として、生体液もしくは非生体液中の検出可能なトレーサー要素として、または当業者に公知である他のインビトロ目的で、加えることができる。通常、試料は、液体源から直接得られるか、あるいは、細胞が培養のために導入された固体材料(有機もしくは無機)からの洗浄液または増殖培地として、あるいは細胞が評価のために配置された緩衝溶液として得られる。試料が細胞を含む場合、細胞は、微生物を含む単細胞であってもよく、多細胞生物、胚、組織、生検材料、線維、バイオフィルムなどを含む、二次元層または三次元層の状態で他の細胞と会合する多細胞であってもよい。
【０１２７】
一般に、検出可能な応答とは、目視観察または機器により検出可能な光学シグナルの変化または発生を意味する。特定の場合では、検出可能な応答は、α粒子、β粒子、核子、電子、陽電子、ニュートリノ、およびγ線を含む、放射性核種などの放射性物質により放出される放射能(すなわち放射線)である。特定の他の場合では、検出可能な応答は、蛍光、または蛍光の変化、例えば蛍光強度、蛍光励起波長もしくは蛍光発光波長の分布、蛍光寿命、および/または蛍光偏光の変化である。当業者は、対象または試料中での標識の程度および/または場所を標準または対照(例えば健康な組織または臓器)と比較することができることを認識するであろう。
【０１２８】
画像化用途で使用される場合、本発明の結合体は通常、ペプチドまたは第1もしくは第2のPEG部分のうち1つまたは複数に共有結合的または非共有結合的に結合した画像化剤を有する。好適な画像化剤としては放射性核種、検出可能タグ、フルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素タンパク質などが挙げられるがそれに限定されない。当業者は、ペプチドまたはPEG部分上に存在する官能基に画像化剤を結合させるための方法を熟知しているであろう。例えば、結合体のペプチドまたはPEG部分に存在する第一級アミン基に画像化剤を共有結合させることにより、画像化剤をペプチドまたはPEG部分に直接共有結合させることができる。当業者は、非共有結合性相互作用(例えばイオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子-双極子結合など)によって画像化剤を結合体のペプチドまたはPEG部分に結合させることもできることを認識するであろう。
【０１２９】
特定の場合では、結合体は、放射性核種を結合体のペプチドまたは第1もしくは第2のPEG部分のうち1つまたは複数に直接結合させることで、放射性核種で放射標識される。特定の他の場合では、放射性核種で標識されたベンゾイル基を結合体のペプチドまたはPEG部分に直接結合させる。例えば、4-[18F]-フルオロ安息香酸(「[18F]FBA」)または4-[19F]-フルオロ安息香酸(「[19F]FBA」)を使用して本発明の結合体を放射標識することができる。さらなる場合では、放射性核種は、結合体に結合したキレート剤またはキレート剤リンカーに結合している。直接結合に好適な放射性核種としては18F、19F、124I、125I、131I、およびそれらの混合物が挙げられるがそれに限定されない。キレート剤と共に使用するために好適な放射性核種としては47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi、およびそれらの混合物が挙げられるがそれに限定されない。好適なキレート剤としてはDOTA、NOTA、NOTA-TCO、BAD、TETA、DTPA、EDTA、NTA、HDTA、それらのホスホン酸類似体、ならびにそれらの混合物が挙げられるがそれに限定されない。当業者は、本発明の結合体に放射性核種、キレート剤、およびキレート剤リンカーを結合させるための方法を熟知しているであろう。特に、結合体上の非干渉位置に存在する官能基に結合可能であり、次に放射性核種、キレート剤、またはキレート剤リンカーにさらに連結可能である、市販の二官能性連結基(一般にヘテロ二官能性連結基)を例えば使用することで、結合を好都合に達成することができる。
【０１３０】
画像化剤としての使用に好適なフルオロフォアまたは蛍光色素の非限定的な例としてはAlexa Fluor(登録商標)色素(Invitrogen Corp.; カリフォルニア州カールスバッド)、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Oregon Green(商標); ローダミン、Texas red、テトラローダミンイソチオシアネート(TRITC)、CyDye(商標)蛍光(例えばCy2、Cy3、Cy5)などが挙げられる。
【０１３１】
画像化剤としての使用に好適な蛍光タンパク質の例としては緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質(例えばDsRed)、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、およびそれらの変異体が挙げられるがそれに限定されない(例えば米国特許第6,403,374号、第6,800,733号、および第7,157,566号を参照)。GFP変異体の具体例としては高感度GFP(EGFP)、不安定化EGFP、Doan et al., Mol. Microbiol., 55:1767-1781 (2005)に記載のGFP変異体、Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 (1996)に記載のGFP変異体、Rizzo et al., Nat. Biotechnol., 22:445 (2004)およびTsien, Annu. Rev. Biochem., 67:509 (1998)に記載のセルリアン蛍光タンパク質、ならびにNagal et al., Nat. Biotechnol., 20:87-90 (2002)に記載の黄色蛍光タンパク質が挙げられるがそれに限定されない。DsRed変異体は例えばShaner et al., Nat. Biotechnol., 22:1567-1572 (2004)に記載されており、mStrawberry、mCherry、mOrange、mBanana、mHoneydew、およびmTangerineが挙げられる。さらなるDsRed変異体は例えばWang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101:16745-16749 (2004)に記載されており、mRaspberryおよびmPlumが挙げられる。DsRed変異体のさらなる例としては、Fischer et al., FEBS Lett., 577:227-232 (2004)に記載のmRFPmars、およびFischer et al., FEBS Lett., 580:2495-2502 (2006)に記載のmRFPrubyが挙げられる。
【０１３２】
他の態様では、本発明の結合体に結合している画像化剤は、例えばビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジンなどの検出可能なタグを含む。さらなる態様では、画像化剤は、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、キシラナーゼ、アルカリホスファターゼなどを含むがそれに限定されない酵素タンパク質を含む。
【０１３３】
対象において放射性核種の放射線放出を検出するための当技術分野において公知である任意の装置または方法が、本発明における使用に好適である。例えば、回転ガンマカメラを使用して単一光子γ線放出放射性核種からの放射線を検出する、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、および、シンチレーションガンマカメラを使用して組織、臓器、または全身中の放射性核種の分布に関する画像または一連の連続画像を得る、放射性核種シンチグラフィーなどの方法を、本発明の放射標識結合体から放出される放射線を検出するために使用することができる。陽電子放射断層撮影法(PET)は、対象において放射線を検出するために好適な別の技術である。さらに、米国特許第5,429,133号では、固体組織腫瘍中で濃縮された放射線を検出するための腹腔鏡下プローブが記載されている。医学的使用が意図されているミニチュア可撓性放射線検出器がIntra-Medical LLC(カリフォルニア州サンタモニカ)によって製造されている。磁気共鳴画像法(MRI)または当業者に公知である任意の他の画像化技術も、放射性核種の放射線放出を検出するために好適である。使用される方法または装置にかかわらず、そのような検出は、結合体が対象中のどこに濃縮されているかを測定することを目的としており、そのような濃縮は腫瘍または腫瘍細胞の位置の指標である。
【０１３４】
動物およびヒトの非侵襲的蛍光画像化は、インビボ診断情報または予後情報を与えることもでき、多種多様な臨床専門領域において使用可能である。例えば、高度な機器を使用する精巧な分光画像化のUV励起後の単純な目視観察のための技術が多年にわたって開発された(例えばAndersson-Engels et al., Phys. Med. Biol., 42:815-824 (1997)を参照)。例えばフルオロフォアまたは蛍光タンパク質からの蛍光のインビボ検出のための当技術分野において公知である具体的な装置または方法としては、インビボ近赤外蛍光法(例えばFrangioni, Curr. Opin. Chem. Biol., 7:626-634 (2003)を参照)、Maestro(商標)インビボ蛍光画像化システム(Cambridge Research & Instrumentation, Inc.; マサチューセッツ州ウーバン)、フライングスポットスキャナを使用するインビボ蛍光画像化(例えばRamanujam et al., IEEE Transactions on Biomedical Engineering, 48:1034-1041 (2001)を参照)などが挙げられるがそれに限定されない。
【０１３５】
光学応答を検出するための他の方法または装置としては目視検査、CCDカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、レーザー走査装置、蛍光光度計、フォトダイオード、量子カウンター、落射蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、フローサイトメーター、蛍光マイクロプレートリーダー、および、光電子増倍管を使用するシグナル増幅が挙げられるがそれに限定されない。
【０１３６】
VII. 本発明のキット
本発明はまた、本明細書に記載の結合体および組成物の使用を容易にするおよび/または標準化するための、ならびに、本明細書に記載の方法を容易にするための、キットを提供する。これら様々な方法を行うための材料および試薬を、該方法の実行を容易にするためにキット中で提供することができる。本明細書において使用される「キット」という用語は、プロセス、アッセイ、解析、または操作を容易にする物品の組み合わせを含む。特に、本発明の結合体または組成物を含むキットは、例えば細胞、腫瘍、臓器、組織、バイオアグリゲート、バイオフィルムなどの免疫治療およびインビボ画像化を含む、多種多様な用途において有用である。
【０１３７】
キットは化学試薬および他の成分を含みうる。さらに、本発明のキットは、非限定的に、キットユーザーに対する指示書(例えば、免疫療法における結合体または組成物の使用説明書、細胞、腫瘍、臓器、または組織を画像化する上での結合体または組成物の使用説明書)、試料採取および/または精製用の装置および試薬、生成物採取および/または精製用の装置および試薬、細菌細胞形質転換用試薬、真核細胞遺伝子導入用試薬、既に形質転換または遺伝子導入された宿主細胞、試料管、ホルダー、トレー、ラック、ディッシュ、プレート、溶液、緩衝液、または他の化学試薬、標準化や正規化に使用されるために好適な試料、ならびに/あるいは対照試料を含みうる。本発明のキットを、好都合な貯蔵および安全な輸送のために、例えば蓋付きの箱に包装してもよい。
【実施例】
【０１３８】
VIII. 実施例
以下の実施例は、特許請求される発明を限定するためではなく例示するために提供される。
【０１３９】
実施例1
標的化ペプチドの薬物動態およびインビボ安定性の改善のための両末端PEG化
本実施例は、本発明のペプチドベースの分子画像化プローブ(結合体)であるFBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28が、αvβ6インテグリンを選択的に標的化し、有利な薬物動態プロファイルを有することを示す。このプローブは、A20FMDV2と呼ばれる20アミノ酸コアをベースとしており、このアミノ酸コアは、口蹄疫ウイルスのコートタンパク質のペプチド断片に由来しており(Jackson et al., Virus Res., 2003;91:33-46; Logan et al., Nature, 1993;362:566-8)、アミノ酸配列
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を有する(N末端からC末端へと左から右に記される1文字アミノ酸識別子を使用)。特に、αvβ6標的化腫瘍取り込み性および薬物動態の改善のために、単分散PEG鎖(Roberts et al., Adv. Drug Deliver. Rev., 2002;54:459-76; Knop et al., Angewandte Chemie., 2010;49:6288-308)、すなわち、正確に規定された数のエチレングリコール繰り返し単位「n」をN末端およびC末端に有するPEG鎖でペプチドを修飾した。画像化プローブは、γプローブによるまたは陽電子放射断層撮影(PET)スキャナ内での検出用のフッ素18含有フルオロ安息香酸(18F FBA)補欠分子族も保有する。
【０１４０】
序論
インテグリンは、ヘテロ二量体の双方向性膜貫通細胞表面受容体の群である(Hynes, Cell, 2002;110:673-87)。大部分のインテグリンは適切な生体機能に必須であるが、一部のインテグリンは患部組織中でのみ高度に局在化され、著しく上方制御される。それらのうち、インテグリンαvβ6、すなわちα(v)β(6)が、腫瘍形成中の重要なマーカーとして認識されており(Bandyopadhyay et al., Current drug targets, 2009;10:645-52)、さらには、肺がん(Elayadi et al., Cancer Res., 2007;67:5889-95)、結腸直腸がん(Bates, Cell Cycle, 2005;4:1350-2)、子宮頸がん(Hazelbag et al., J Pathol., 2007;212:316-24)、および胃がん(Zhang et al., Clin Oncol-UK, 2008;20:61-6)などの対応困難な悪性腫瘍の疾患重症度に関連する予後指標としても同定されている。
【０１４１】
したがって、信頼性のあるαvβ6のインビボ局在化およびαvβ6発現レベルの定量化が、疾患の適切な検出、特徴づけ、および(個別化)管理に大きく寄与する可能性がある。それはまた、悪性腫瘍の均一性(または不均一性)に関する情報を提供するであろうし、αvβ6標的化治療に感受性がある遠隔疾患(転移)の検出に役立つであろう。これを実現するには、細胞レベルでインテグリンαvβ6を選択的に標的化する分子プローブが必要である。
【０１４２】
本発明者らは既に、γプローブによるまたは陽電子放射断層撮影(PET)スキャナ内での検出用の陽電子放出放射性同位体補欠分子族で(放射)標識されたA20FMDV2ペプチドがインビトロおよびインビボでインテグリンαvβ6の検出に成功しうることを示した(Hausner et al., Cancer Res., 2007;67:7833-40)。このプローブ18F FBA-A20FMDV2は、αvβ6発現膵がんBxPC-3異種移植片を有するマウスモデルにおいて評価された際に、非標的組織から速やかに排除され、優先的に腎経路を通じて尿中に排泄されたが、なおいくつかの薬物動態的欠点、特に、血流からの非常に速やかな排出、低い安定性、および標的腫瘍組織からの洗い出しを示した(Hausner et al., supra; Hausner et al., Cancer Res., 2009;69:5843-50)。
【０１４３】
ペプチドのN末端に中程度のサイズのポリ(エチレングリコール)(PEG)を加えることで、腫瘍中での取り込みが相当に改善され、薬物動態に影響があった。特に、1個のPEG28単位を加えることで、腫瘍取り込みは1% ID/g未満から約2% ID/gに増加し、腫瘍からの洗い出しがなくなり、これにより特に後の時点でシグナル/バックグラウンド比が大きく改善された。しかし、このプローブ18F FBA-PEG28-A20FMDV2は、腎臓中での初期取り込みの増加も示したが、後の時点で洗い出された。N末端に第2のPEG28単位を加えることで、腫瘍中での取り込みのさらなる有意な増加は生じなかった。実際、プローブ18F FBA-(PEG28)2-A20FMDV2がやはり腎臓中に高レベル(40% ID/g)で捕捉され、放出を示さなかったことから、第2のPEG単位の付加は不利であった。同様に、PEG単位をC末端に移動させることは、わずかな効果しか示さなかった。プローブFBA-A20FMDV2-PEG28は1% ID/g超といういくらかの初期腫瘍取り込みを示したが、やはり洗い出された。したがって、経時的なシグナル/バックグラウンド比の改善は生じなかった。
【０１４４】
さらに、すべてのこれらのプローブは速やかなインビボ代謝を示した。例えば、尿試料を評価した際に、N末端へのPEGの導入によって動物モデルにおける主要な放射性代謝物の数が3(PEGなし)から1(PEGあり)に減少したものの、いずれの場合でもインタクトなプローブが見られなかったことが判明した。PEGがC末端にある場合、3つの代謝物が見られ、インタクトなプローブは見られなかった。
【０１４５】
結果
N末端におけるPEG基またはC末端におけるPEG基を有するプローブとは対照的に、例えばFBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28などの本発明の両末端PEG化プローブはN末端における1個のPEGおよびC末端における1個のPEGを有しており、これにより薬物動態プロファイルが大きく改善される。主要な特徴としては高い腫瘍取り込み性および腫瘍滞留性、ならびに高い代謝安定性が挙げられる。他の戦略(例えば環化、非天然アミノ酸の使用)(Kimura et al., Clin Cancer Res., 2012;18:839-49; Briand et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1997;94:12545-50; Fletcher et al., Chem Rev., 1998;98:763-95; Fischer, Curr Protein Pept Sc., 2003;4:339-56)との比較で、驚くべきことに、本発明者らは、本発明による標的化ペプチドのPEG化が、予想外に高い標的親和性、選択性、腫瘍取り込み性、および腫瘍滞留性、ならびに高い代謝安定性および優れた腎臓からのクリアランスを実現する実験的に単純かつ簡単なやり方であることを発見した。
【０１４６】
マウスモデルにおいて、本発明者らはBxPC-3異種移植片に関して4.7% ID/g(1時間)という高い腫瘍取り込みを良好な滞留(4時間で3.4% ID/g)と共に発見した。これらの取り込み値は、任意の他のプローブについて観察された値よりも有意に高く、20〜80mgの範囲の非常に小さなBxPC-3異種移植腫瘍について得られた。これらの結果によって、検出がしばしば困難である小さな初期病変の可視化が可能になる。
【０１４７】
さらに、両末端PEG化によって代謝安定性が大きく改善された。プローブの3分の2超が尿中にて1時間の時点でインタクトなままであった(約半分が4時間の時点でインタクトなままであった)。DX3puroB6およびBxPC-3腫瘍に関するさらなる試験は、プローブの80%超が腫瘍中にて1時間の時点でインタクトなままであり、プローブの約90%がインタクトな状態で腎臓から回収されたことを示した。
【０１４８】
特に、本明細書に記載の観察および結果は、評価した他のPEG化パターン(例えば、N末端のみに1個または2個のPEG鎖、C末端のみに1個のPEG鎖、PEG化なし)に基づいても予測不能であったし、それとは有意に異なっている。他のPEG化パターンはいずれも、プローブFBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28により例示される両末端PEG化によって実現された優れた薬物動態プロファイルおよび安定性プロファイルに接近または匹敵することができなかった。
【０１４９】
図1は、本明細書に記載の試験において評価されたA20FMDV2 PEG化変種の構造を示す。図2〜図10は、これらのA20FMDV2 PEG化変種の体内分布および画像化プローブ安定性に関する主要パラメータの詳細な比較を示す。表1は、各PEG修飾A20FMDV2変異体の選択された主要な薬物動態データおよび安定性データの概要を示す。
【０１５０】
（表１）A20FMDV2 PEG化化合物の体内分布および安定性の実験データの概要
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「PEG28」および「PEG1500」は同義語として使用されるものであり、「Fmoc-アミノPEGプロピオン酸」(分子量 = 1544.8Da、PolyPure #15137-2790またはNovabiochem #851033)を試薬として使用してプローブに組み込まれた正確に同じ分子実体を記述する。「PEG1500」は該化合物の分子量概算値を指し、「PEG28」は試薬中のエチレングリコール単位の数を指す。
体内分布データは、意識下での取り込み後の所与の時点で動物を切開(一般にn≧3/時点または条件)した後、蓄積された活性をγカウンター中で計測し、臓器を秤量することによって測定した。データは組織1グラム当たりの減衰補正済注入量の%(% ID/g)として表される。
PBSおよび血清中の安定性を、通常は室温(PBS)または37℃(血清)にて所与の媒体中でアリコートをインキュベートした後、放射性HPLCで分析することにより、エクスビボで測定した。データは、試料中でインタクトなままであるプローブの%として表す。
尿、腎臓、および腫瘍中の代謝物をインビボで測定した。組織/臓器をプローブの静脈内注入後の意識下での取り込みに続く所与の時点で動物から採取した。試料を必要に応じて均質化および抽出し、放射性HPLCで分析した。データは、組織/臓器試料中でインタクトなままであるプローブの%として表す。
腫瘍モデル - DX3puroβ6/DX3puro: ヒト黒色腫細胞株。DX3puroβ6を安定的に遺伝子導入することでインテグリンαvβ6を発現した。DX3puroは陰性対照細胞株である。いずれも同等レベルの他のインテグリン(αvβ3を含む)を発現する。BxPC-3: 内在性αvβ6発現を示す膵細胞株。MIA PaCa-2: 膵細胞株、αvβ6発現なし。
【０１５１】
図2は、DX3puroB6およびDx3puro腫瘍における化合物1(18F-FBA-A20FMDV2)の体内分布データを示す。主要な観察としては速やかな血液クリアランスが挙げられる: (1) 腎クリアランス(尿では1時間、2時間で非常に高度(900% ID/g超))、腎臓では比較的低度、十分に経時的に排出(1時間で6% ID/g未満、4時間で0.5% ID/g未満); (2) わずかな消化管クリアランス(胆嚢では最初は高度だがその後排出; 胃では低度、排出(1時間で4% ID/g未満); (3) 肺では1時間で1.6% ID/g、2時間、4時間で0.4% ID/gに低下。腫瘍は中程度のサイズ〜大きいサイズであった。腫瘍サイズの% ID/gに対する効果はあったとしても最小限であったようである(最大効果は壊死性でありうる): POS: 1時間で0.88→4時間で0.23% ID/g→中程度、洗い出しあり; NEG: 1時間で0.49→4時間で0.19% ID/g→低度、洗い出しあり。POS/NEG比は中程度、4時間でほぼ均衡。
【０１５２】
図3は、BxPC-3(およびMIA PaCa-2)腫瘍における化合物1(18F-FBA-A20FMDV2)の体内分布データを示す。主要な観察としては速やかな血液クリアランスが挙げられる: (1) 腎クリアランス(尿では1時間、2時間で高度(300% ID/g超))、腎臓では比較的低度、十分に経時的に排出(1時間で4% ID/g未満、4時間で0.2% ID/g未満); (2) わずかな消化管クリアランス(胆嚢では最初は高度だがその後排出; 胃では低度、排出(1時間で0.5% ID/g); (3) 肺では1時間で0.8% ID/g、2時間、4時間で0.1% ID/g未満に低下。BxPC-3腫瘍は中程度のサイズであった。MIA PaCa-2腫瘍は中程度のサイズ〜大きいサイズであった。腫瘍サイズの% ID/gに対する効果はあったとしても最小限であったようである: POS: 1時間で0.69→4時間で0.12% ID/g→中程度、洗い出しあり、Dx3puroB6と同等; NEG: 1時間で0.16→4時間で0.01% ID/g→低度、速やかな洗い出し。POS/NEG比は良好、経時的に増加、Dx3puroB6/Dx3puro対よりも優れている。
【０１５３】
図4は、DX3puroB6およびDx3puro腫瘍における化合物2(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2)の体内分布データを示す。主要な観察としては速やかな血液クリアランスが挙げられる: (1) 腎クリアランス(尿では1時間で高度(約200% ID/g)、排出); 腎臓では比較的低度、十分に経時的に排出(1時間で25% ID/g→4時間で2.7% ID/g); (2) 実質的に消化管クリアランスなし(胆嚢3% ID/g未満; 肝臓0.1% ID/g未満); 胃では低度、排出(1時間で7% ID/g→4時間で1.8% ID/g); (3) 肺では1時間で2.0% ID/g、4時間で1.4% ID/gに低下。腫瘍は中程度のサイズ〜大きいサイズであった。腫瘍サイズの% ID/gに対する効果はあったとしても最小限であったようである(最大効果は壊死性でありうる): POS: 1時間で0.49→4時間で0.49% ID/g→安定、洗い出しなし; NEG: 1時間で0.11→4時間で0.07% ID/g→低度、洗い出しあり。POS/NEG比は良好、後の時点で増加、2時間で最高。
【０１５４】
図5は、BxPC-3腫瘍における化合物2(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2)の体内分布データを示す。主要な観察としては速やかな血液クリアランスが挙げられる: (1) 腎クリアランス(尿では1時間で高度(約400% ID/g)、排出); 腎臓では比較的低度、十分に経時的に排出(1時間で19% ID/g→4時間で3.3% ID/g); (2) 実質的に消化管クリアランスなし(胆嚢4% ID/g未満; 肝臓0.2% ID/g未満); 胃では低度、排出(1時間で2.6% ID/g→4時間で1.9% ID/g); (3) 肺では1時間で2.1% ID/g、4時間で1.7% ID/gに低下。腫瘍は中程度のサイズであった。腫瘍サイズの% ID/gに対する効果はあったとしても最小限であったようである。取り込み: 1時間で1.9→4時間で1.5% ID/g→1時間後に低下、その後は安定; Dx3puroB6よりも取り込み性が高い。
【０１５５】
図6は、DX3puroB6およびDx3puro腫瘍における化合物3(18F-FBA-PEG28-PEG28-A20FMDV2)の体内分布データを示す。主要な観察としては速やかな血液クリアランスが挙げられる: (1) 腎クリアランス(尿では1時間で中程度(約60% ID/g)、排出); 腎臓では高度、排出なし(1時間で41% ID/g→4時間で46% ID/g); (2) わずかな消化管クリアランス(胆嚢3% ID/g未満; 肝臓0.1% ID/g未満); 胃では中程度、安定(1時間で5.5% ID/g→4時間で5.5% ID/g); (3) 肺では1時間で1.1→4時間で1.3% ID/g。腫瘍は中程度のサイズ〜大きいサイズであった。腫瘍サイズの% ID/gに対する効果はあったとしても最小限であったようである(最大効果は壊死性でありうる): POS: 1時間で0.52→4時間で0.54% ID/g→安定、洗い出しなし; NEG: 1時間で0.11→4時間で0.07% ID/g→低度、洗い出しあり。POS/NEG比は良好、経時的に増加。
【０１５６】
図7は、BxPC-3(およびMIA PaCa-2)腫瘍における化合物3(18F-FBA-PEG28-PEG28-A20FMDV2)の体内分布データを示す。主要な観察としては速やかな血液クリアランスが挙げられる: (1) 腎クリアランス(尿では1時間で中程度(約1500% ID/g)、排出); 腎臓では高度、排出なし(1時間で43% ID/g→4時間で42% ID/g); (2) わずかな消化管クリアランス(胆嚢1.5% ID/g未満; 肝臓0.2% ID/g未満); 胃では中程度、多少上昇(1時間で2.3% ID/g→4時間で6.6% ID/g); (3) 肺では1時間で1.7→4時間で1.3% ID/g。腫瘍は中程度のサイズであった。腫瘍サイズは% ID/gに対する効果を示さなかったようである: POS: 1時間で1.6→4時間で2.1% ID/g→安定、増加、Dx3puroB6よりも取り込み性および滞留性が高い; NEG: 1時間で0.22→4時間で0.12% ID/g→低度、洗い出しあり。POS/NEG比は良好、経時的に有意に増加。
【０１５７】
図8は、DX3puroB6およびDx3puro腫瘍における化合物4(18F-FBA-A20FMDV2-PEG28)の体内分布データを示す。主要な観察としては速やかな血液クリアランスが挙げられる: (1) 腎クリアランス(尿では1時間、2時間で非常に高度(1000% ID/g超))、腎臓では比較的低度、約2% ID/gまで十分に経時的に排出); (2) わずかな消化管クリアランス(胆嚢では10% ID/g未満、排出; 胃では約12% ID/g→2% ID/g、排出; 大腸では約9→2% ID/g、排出; 肝臓では低度(！)、0.5% ID/g未満、低下); (3) 肺では約3→2% ID/g、小さな低下。大部分は小さな腫瘍。腫瘍サイズは% ID/gに対して効果を示さなかった/効果が最小限であったようである(POS 1時間): POS: 1時間、2時間、4時間で1.3、1.0、0.3% ID/g→中程度、洗い出しあり; NEG: 1時間、2時間、4時間で0.5、0.3、0.1% ID/g→低度、洗い出しあり。POS/NEGは中程度であり、経時的に相対的に安定。
【０１５８】
図9は、DX3puroB6およびDx3puro腫瘍における化合物5(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28)の体内分布データを示す。主要な観察としては速やかな血液クリアランスが挙げられる: (1) 主に腎クリアランス(尿: 高度、排出、1時間で396→4時間で135% ID/g); 腎臓: 高度、排出、1時間で58→4時間で20% ID/g); (2) いくらかの消化管クリアランス(胆嚢では1時間で7→4時間で2.7% ID/g; 胃では1時間で11% ID/g→4時間で8% ID/g、ゆっくりと排出; 大腸では約5% ID/gで安定; 肝臓では低度、1時間で0.5% ID/g未満、低下); (3) 肺では約2% ID/gで安定。大部分は小さな腫瘍と評価された。腫瘍サイズは% ID/gに対する効果を示さなかったようである: POS: 1時間で2.3→4時間で1.4% ID/g→1時間後に低下、その後安定; NEG: 1時間で0.39→4時間で0.14%→低度、洗い出しあり。POS/NEG比は良好、経時的に増加。
【０１５９】
図10は、BxPC-3腫瘍における化合物5(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28)の体内分布データを示す。主要な観察としては非常に速やかな血液クリアランスが挙げられる: 主要な排泄経路は腎臓であり、一部の排泄は肝胆道も通る。腫瘍取り込み: 非常に良好(1時間で4.7% ID/g)、4時間で3.4% ID/gにわずかに低下。注目すべき他の臓器: 尿では初期は非常に高度(1時間で482% ID/g)、低下(4時間で223%)、腎臓では高度(1時間で76% ID/g)、洗い出しあり(4時間で19.3% ID/g)、いくらかの消化管クリアランス: 胆嚢、胃、腸(いずれも1時間で20% ID/g未満、4時間で10% ID/g未満)、肺ではわずかに上昇(約2% ID/g、経時的に安定)、肝臓、膵臓: 低度(1% ID/g未満)。洗い出し: 腫瘍中では低レベル、大部分の臓器からは良好。肺、膵臓、筋肉、および骨では比較的安定なようである。腫瘍サイズ: 20〜80mg(小)。腫瘍取り込み: 1時間で4.7→4時間で3.4% ID/g→高度、その後わずかに低下。Dx3puroB6よりも取り込み性が高い。最も小さい腫瘍は多少低い取り込み性を示すようである(各コホート内で)。腫瘍対臓器比: 腫瘍/腎臓を除いては良好〜優良。実行したブロッキング実験: ブロッキング剤/量/時間: T=-10分でFBA-PEG28-A20FMDV2を30mg/kg; 観察: 腫瘍取り込みが大きく減少(非ブロッキングに比べて92%減少); 尿中のインタクトトレーサーの% ID/gは非ブロッキング試料よりもわずかに高い; 腎臓、肺、腸、および胃を含む、尿および胆嚢を除いたすべての臓器は、% ID/gの低下を示した。
【０１６０】
化合物の安定性を、尿代謝物を解析することで評価した。化合物1(18F-FBA-A20FMDV2)はより短い保持時間を有する3つの代謝物に代謝された。放射性トレーサーは15.9分で溶出された。化合物1の尿代謝物は9.0分(44%)、10.4分(30%)、および10.8分(26%)で溶出された。比率は動物/時点によって変動する。化合物2(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2)はわずかに短い保持時間を有する主要代謝物に代謝された。放射性トレーサーは16.2分で溶出された。1時間での尿: 化合物2の代謝物は15.4分(推定90%); 16.4(推定10%; インタクトではないようである)で溶出された。4時間での尿: 1時間と同じ。化合物3(18F-FBA-PEG28-PEG28-A20FMDV2)はわずかに長い保持時間で代謝された。放射性トレーサーは17.4分で溶出された。1時間での尿: 化合物3の代謝物は17.8分で溶出され、18.1分に小さな肩があった。化合物4(18F-FBA-A20FMDV2-PEG28)はより短い保持時間を有する3つの代謝物に代謝された。放射性トレーサーは17.0分で溶出された。化合物4の尿代謝物は10.3分、11.7分、および12.1分で溶出された。化合物1〜4とは対照的に、化合物5(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28)は大部分がインタクトなままであり、わずかに長い保持時間を有する代謝物が1つだけあった。放射性トレーサーは17.4分で溶出された。尿: 17.4分(インタクト1時間69%、1時間67%、2時間78%、4時間45%); 18.6分(主要代謝物1時間31%、1時間29%、2時間16%、4時間55%)。
【０１６１】
化合物5(18F-FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28)についてさらなる安定性試験を行った。DX3puroB6腫瘍では、腫瘍が小さいにもかかわらず良好なHPLCシグナルが存在した。化合物5は大部分がインタクトなままであり、いくつかのリードイン代謝物が生じた。ピークパターンは血清安定性パターンと同様であった。17.4分での、化合物5の約82〜84%がインタクトであり、一方、17.0〜17.2分で、小さなピークを有する約14〜18%の恐らくは代謝物が観察された。BxPC-3腫瘍では、化合物5は注入1時間後に安定性81.45%を実現し(保持時間17.46分)、少量の代謝物が17.19分(17.88%)および17.91分(0.67%)で見られた。腎臓では、化合物5は注入1時間後に安定性88.5%を1個の鋭いピークとして実現し(保持時間17.4分)、少量の代謝物が14.5分(0.4%)、14.9分(1.3%)、15.2分(2.3%)、および18.6分(7.5%)で見られた。血清では、化合物5は2時間で安定性約80%以上を実現した。特に、37℃での血清インキュベーションでは、インタクトなままの化合物5の量は以下の通りであった: 30分で81.7%、60分で80.4%、120分で79.6%(保持時間17.4分)。さらに、化合物5の約92%超はPBS中、約6時間でインタクトなままであった。
【０１６２】
方法
プローブ合成
プローブを固相ペプチド合成技術および固相放射標識技術を使用して合成することができる。したがって、ペプチドを固体支持体上で合成し、PEG化し、フッ素18含有フルオロ安息香酸(18F FBA)補欠分子族で放射標識した(固相ペプチド合成および固相放射標識)。この調製は標準的なペプチド化学反応に完全に適合性があり、したがってペプチド中でのPEG鎖の部位特異的導入(例えばN末端、C末端、またはその両方における)が可能になる。さらに、この調製は固相放射標識化学反応にも完全に適合性があり、これにより、正確に画定された高純度の放射性画像化プローブが得られる。
【０１６３】
固体支持体は、Rinkアミドリンカー表面修飾を有するペプチド合成樹脂ビーズで構成された。アミノ酸は、トリフルオロ酢酸感受性の側鎖保護を伴うFmoc保護天然(L-)アミノ酸とした。平均分子量付近のポリマー混合物で構成される多分散PEGではなく、単分散PEG鎖、すなわち、正確に規定された数のエチレングリコール繰り返し単位「n」を有するPEG鎖をPEG化に使用した(使用試薬:「Fmoc-アミノPEGプロピオン酸」、88原子、分子量 = 1544.8Da、PolyPure #15137-2790またはNovabiochem #851033)。ペプチド合成およびPEG単位導入を、N,N-ジメチルホルムアミド中でのHATU/DIPEA活性化に基づく標準的固相Fmoc/ピペリジン化学反応を使用して達成した。PEG単位の導入では、カップリング時間を数時間に延長した。反応の進行をピクリルスルホン酸試験でモニタリングした。非放射性標準物質として、4-フルオロ安息香酸をアミノ酸と同じように結合させた。ワークアップは、固体支持体からの切断およびトリフルオロ酢酸(TFA)/1,2-エタンジチオール(EDT)/トリイソプロピルシラン(TIPS)/水(94/1/2.5/2.5 v/v/v/v)またはTFA/TIPS/水(95/2.5/2.5 v/v/v)による室温で3時間かけての側鎖保護基の除去、半分取逆相HPLCクロマトグラフィーでの精製、ならびに溶媒の除去からなった。生成物は通常、純度95%超(UV、220nm)で無色固体として得られた。独自性をMALDI質量分析によって確立した。
【０１６４】
現行の放射性合成
現行のアプローチにおいて、4-[18F]フルオロ安息香酸をHATU/DIPEA活性化を使用して固相上のプローブに結合させ(30分、室温、H2N-ペプチジル樹脂5mg)、次にTFA混合物(2x15分)による処理およびHPLC精製を行った(Sutcliffe-Goulden et al., Bioorg Med Chem Lett., 2000;10:1501-3; Sutcliffe-Goulden et al., Eur J Nucl Med Mol I., 2002;29:754-9; Hausner et al., J Med Chem., 2008;51:5901-4)。[18F]F-フッ化物の照射終了(EoB)後4時間の合成時間で、放射標識ペプチド[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28をリン酸緩衝食塩水(PBS)中溶液として減衰補正放射化学収率5%で得た。放射化学純度は95%超であった。独自性を非放射性標準物質の同時注入、ならびにUVおよび放射性HPLCトレースの共溶出の観察によって確認した。
【０１６５】
インビトロ評価
PBS中での安定性
PBS中での安定を確認するために、製剤化されたプローブのアリコートを室温での貯蔵後の様々な時点でHPLC分析により分析した。
【０１６６】
血清中での安定性
血清中での安定性を確認するために、血液を安楽死後のマウスから採取し、室温で1時間凝血させ、遠心分離した。血清を採取し、製剤化された放射性トレーサー(0.74MBq)のアリコートとマイクロチューブ中で組み合わせた。アッセイ管を穏やかに攪拌し、37℃に保持した。選択された時点でアリコートを取り出し、無水エタノール(4℃)と混合し、遠心分離して血清タンパク質を沈殿させた。上清試料のHPLC分析を行ってインタクト放射性トレーサーのパーセントを測定した。
【０１６７】
細胞結合
αvβ6標的化結合の維持を確認するために、画像化プローブによる細胞結合試験を行った。実験前に、細胞株をフローサイトメトリーで解析してインテグリン発現レベルを確認した。細胞結合実験において、無血清培地(pH 7.2)中の放射性トレーサーの7.4KBqアリコートを細胞懸濁液(無血清DMEM中DX3puroB6、DX3puro、BxPC-3細胞3.75x106個)に加え、密閉マイクロチューブ中にて室温で1時間インキュベートした(n=4/細胞株)。非特異的結合をブロッキングするためにウシ血清アルブミンで予備処理されたアッセイ管を規則的に攪拌することで、細胞の沈殿を防止した。遠心分離後、上清を取り出し、細胞ペレットを無血清培地で洗浄した。上清を組み合わせ、細胞を無血清培地に再懸濁させた。結合放射能の比率をγカウンターによって測定した(細胞ペレット対上清組み合わせ)。60分の時点で内部移行放射能の比率を測定するために、続いて細胞を酸性洗浄緩衝液(pH 2.5、4℃)で処理して表面結合放射能を取り除き(Reilly et al., J. Nuclear Medicine, 2000;41:429-38)、次にPBSで洗浄した。内部移行比率をγカウンターによって測定した(細胞ペレット対上清中放出放射能)。
【０１６８】
インビボ評価
マウスモデル
インビボ画像化用のマウスモデルは、肩の近傍の側腹部にヒトがん細胞株が皮下注入された胸腺欠損nu/nuマウスからなった。内部標準ありの動物モデル用に、ヒト黒色腫細胞株(DX3)の対を使用し、そのうち一方はインテグリンαvβ6を発現するように既に遺伝子導入されており(DX3PuroB6)、他方は陰性対照の役割を果たした(Dx3Puro)。膵がん試験では、BxPC-3(αvβ6を自然に発現)細胞株を選択した。いずれの場合でも、注入細胞株のインテグリン発現レベルをフローサイトメトリーで確認した。腫瘍の最大径が約2〜8mmになった時点で動物を画像化試験および体内分布試験に使用した。
【０１６９】
画像化および体内分布
画像化を専用の高分解能小動物PET/CTシステム(Siemens Inveon)上で行った。データ解析を付帯のソフトウェアパケットを使用して行った。実験を標準的な小動物画像化プロトコルに従って行った。画像化プローブ(100〜250μCi)を麻酔動物(イソフルラン)の尾静脈に静脈内(iv)注入した後、ダイナミック4x15分スキャンを麻酔動物(イソフルラン)に対して注入15分後より行い、続いて後の時点(2時間、4時間)で15分スキャンを行った。各スキャン後に、透過スキャンおよびCTスキャンをそれぞれ減衰補正および解剖学的コレジストレーション用に行った。
【０１７０】
体内分布試験では、動物に画像化プローブ(約50μCi)を上記のように注入し、所与の時点で屠殺した(注入1時間後、2時間後、4時間後、n=3動物/時点)。切開後、放射能レベルを各臓器、組織、または腫瘍について計測し、減衰補正し、正規化取り込み値を計算し、組織1グラム当たりの注入量のパーセント(% ID/g)として表した。
【０１７１】
安定性試験
尿からの画像化プローブ回収
可能な場合、尿を体内分布試験中にHPLC分析用に採取した。尿アリコート中のタンパク質を、10倍過剰の無水エタノールによる沈殿、およびそれに続く遠心分離によって除去した。上清試料をHPLCにより評価した。
【０１７２】
腫瘍からの画像化プローブ回収
画像化プローブ(1mCi)を注入し、αvβ6陽性腫瘍を1時間の時点で採取した。腫瘍をPBS中で均質化し、タンパク質を無水エタノールの添加により沈殿させた。遠心分離後、上清を採取し、残りのタンパク質をアセトニトリルの添加により沈殿させた。上清の希釈アリコートをHPLCにより評価した。
【０１７３】
腎臓からの画像化プローブ回収
安定性試験中に腎臓を腫瘍と共に採取した。腎臓をPBS中で均質化し、タンパク質を無水エタノールの添加により沈殿させた。遠心分離後、上清を採取し、残りのタンパク質をアセトニトリルの添加により沈殿させた。上清の希釈アリコートをHPLCにより評価した。
【０１７４】
さらなるインビボ実験
腫瘍組織のオートラジオグラフィーおよび免疫組織化学染色
画像化プローブ(1mCi)を注入し、腫瘍を1時間で採取した。腫瘍を凍結培地に埋め込み、直ちに切片にした(オートラジオグラフィー用に20μm、組織学的検出用に5μm)。オートラジオグラフィー試料をストレージフォスファスクリーンに終夜曝露した。スクリーンをホスフォイメージャー(GE Healthcare Storm 860)を使用して分解能50μmで読み取った。αvβ6インテグリンの組織学的検出では、凍結切片を放射能が減衰するまで貯蔵し、過ヨウ素酸-リジン-パラホルムアルデヒド溶液で5分間固定し、Tris緩衝食塩水中で洗浄した。内因性ペルオキシダーゼをPBS中3%過酸化水素でブロッキングした後、2.5%正常ウマ血清と共にインキュベートした。切片を抗インテグリンβ(6)抗体(PBS)と共に1時間インキュベートし、TBS中で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識二次抗体(抗ヤギIg)と共にインキュベートした。染色を3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)で発色させ、マイヤーヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、DPXマウント培地でマウントした。すべてのインキュベーションは室温で行った。
【０１７５】
実施例2
インテグリンαvβ6の標的化の改善に関するホーミング(腫瘍標的化)ペプチドの両末端PEG化およびペプチドのアミノ酸修飾の正のインビボ効果
本実施例は、両末端PEG化がA20FMDV2ペプチドおよびその変異体(例えばK16R変異体)に優れた標的化特性およびインビボ薬物動態を与えることができたことを示す。特に、両末端PEG化A20FMDV2およびA20FMDV2(K16R)ペプチドは、個々のN末端またはC末端PEG化から予測されたプロファイルを超えて大きく改善された薬物動態プロファイルを示した。実際、2個のPEG単位は、大きく改善された安定性を高いαvβ6(+)腫瘍取り込み性および腫瘍滞留性と共に実現するように相乗的に作用した。したがって、本実施例は、PEG化が、生体適合性を示し、他の戦略(例えば環化)と比較した場合に、立体配座拘束を強制することがなく、合成は単純かつ簡単であり、広範な他のペプチド修飾と容易に組み合わせ可能であるということを示す。
【０１７６】
序論
本実施例に記載の試験は、細胞表面受容体インテグリンαvβ6を選択的に標的化するペプチドである20アミノ酸含有モデルペプチドA20FMDV2から出発して行った。このインテグリンは、いくつかの対応困難ながんの予後指標として同定された。いずれの場合でも高い発現レベルが疾患の重症度および予後不良と相関していることから(Ahmed et al., J Histochem Cytochem., 2002;50:1371-80; Elayadi et al., Cancer Res., 2007;67:5889-95; Liu et al., Head Neck Oncol., 2013;5:7; Bandyopadhyay et al., Curr Drug Targets, 2009;10:645-52; Bates, Cell Cycle, 2005;4:1350-2; Sipos et al., Histopathology, 2004;45:226-36)、このインテグリンは診断(例えば放射性トレーサーによる非侵襲的画像化)の重要な標的となる。4-[18F]フルオロ安息香酸(すなわち[18F]FBA)で標識されたA20FMDV2ペプチドに関する以前の小動物画像化試験において、ポリ(エチレングリコール)(PEG)単位の導入によって、αvβ6発現腫瘍中での取り込み増加を含む薬物動態の改善をもたらすことができることが示された(Hausner et al., Cancer Res., 2007;67:7833-40; Hausner et al., Cancer Res., 2009;69:5843-50)。これらの試験では、C末端またはN末端にPEGを有する[18F]FBA標識A20FMDV2放射性トレーサーと比較した場合の、両末端PEG化放射性トレーサー[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2-PEG28(5)をリード化合物として生じさせる部位特異的(N末端および/またはC末端)PEG化(図1)の効果を、放射性トレーサーの安定性およびαvβ6標的化腫瘍取り込み性に基づいて評価した。ペプチド配列の修飾によるさらなる利点を実現することを目的として、アミノ酸置換も評価した。特に、これらの試験は、化合物5中の位置16においてリジンをアルギニンに置き換えて[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2 K16R-PEG28(5R)を作り出すことで、予想外に高いインビトロでのαvβ6親和性/滞留性/選択性が得られ、改善されたインビボでの結果が得られ、腎臓からの良好な排出が示され、高い放射性トレーサー安定性が示されたことを示す。
【０１７７】
方法
放射性トレーサーを標準的ペプチド化学反応を使用して固相上で調製および放射標識した(Hausner et al., Cancer Res., 2007;67:7833-40; Sutcliffe-Goulden et al., Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2002;29:754-9)。3つの細胞株、すなわちDX3puroβ6[αvβ6(+)]、対応する陰性対照DX3puro[αvβ6(-)]、および内因性αvβ6(+)発現を示す膵がんBxPC-3を使用して、DX3puroβ6/DX3puroの対またはBxPC-3の異種移植片を有するマウスモデルにおいて放射性トレーサーをインビトロ(細胞結合および内部移行)ならびにインビボで評価した。
【０１７８】
結果
PEG化
PEG単位のサイズおよび位置はαvβ6標的化および薬物動態に有意に影響を与えた。細胞結合試験では、放射性トレーサー2〜5(非PEG化1との比較; 図11)について見られたように、一般にPEG化は、αvβ6発現細胞株に対する親和性および選択性を大きく改善し、αvβ6発現細胞への高度の内部移行を生じさせた。
【０１７９】
PEG化は、インビボでも有益であった(αvβ6(+)腫瘍取り込みおよび腫瘍滞留、ならびに非標的組織からの排出により計測)が、PEG基のサイズおよび配置に対する感受性を示した。腎臓中での3(N末端に2個のPEG28単位を有する)の取り込みおよび捕捉が2(N末端に1個のPEG28単位を有する)に比べて大きく増加したことに見られるように(図13および図14)、特定の値を超えてサイズを増加させることで薬物動態性能が減少した。(1個の)PEG28単位のC末端への移動(4)は、腎滞留性に対する効果が最小限であったが、残念ながらαvβ6陽性異種移植片中での滞留性を減少させた(図13および図15)。
【０１８０】
驚くべきことに、1個のPEG28単位をN末端に結合させ、1個のPEG28単位をC末端に結合させた(5を得た)ところ、正の効果(高いαvβ6親和性/滞留性/選択性)が保存され、さらには改善された一方で、負のインビボ副効果(すなわち腎捕捉性)の大部分が回避された。インビトロでは、5はαvβ6(+)発現細胞株DX3puroβ6およびBxPC-3にそれぞれ51.0±0.9%および37.2±1.9%で結合し、放射能の多くは内部移行した(DX3puroβ6: 総放射能の33.5±1.8%、BxPC-3: 総放射能の28.4±0.9%; 図11)。これに比べて、対照細胞株DX3puroは3.5±0.2%の結合および0.9±0.1%の内部移行を示した。インビボで、5はDX3puroβ6/DX3puroの対のモデルにおいて高いαvβ6指向性結合を維持した(取り込み比: 1時間: 5.8/1; 4時間: 9.8/1)。膵BxPC-3モデルにおいても、非常に小さな腫瘍が存在したが(43±19mg; 図16)、高取り込みが観察された(取り込み: 1時間: 4.71±0.88% ID/g; 4時間: 3.39±1.34% ID/g)。これらの試験は、5が小さなαvβ6陽性原発腫瘍および転移の検出に有益であることを示す。これらの試験は、他のA20FMDV2トレーサーとは対照的に、5の大部分がインタクトなままであった(腫瘍中1時間で80%超)ことも示す。
【０１８１】
アミノ酸置換; Lys16の置き換え
位置16のリジンをいくつかの理由で置き換えの標的とした。その理由は特に以下の通りである。(1) リジン側鎖アミン基によって、溶液相でのペプチドのアミド結合ベースの部位特異的放射標識(例えば[18F]FBAによる)の可能性がなくなる。というのも、このアミン基が補欠分子族への結合をめぐってN末端アミンと競合するからである(固相放射標識中は、リジンのアミン基を含むアミノ酸側鎖が放射標識後まで保護されたままであることから、このことは懸念事項ではない)。(2) 同様に塩基性であるアミノ酸(但しアミンを欠く)による置き換えによって、標的親和性および標的選択性を維持しながら安定性を増加させることができる。位置16のリジンの重要性を細胞結合実験により評価する初期実験をモノPEG化された2により行った。置換は単純アルキルアミノ酸であるアラニン(置換: K16A; 2A); 酸性アミノ酸であるグルタミン酸(K16E; 2E); および塩基性アミノ酸であるアルギニン(K16R; 2R)により行った。図17に示すように、K16R置換(2R)のみがαvβ6(+)発現細胞株DX3puroβ6に対する親和性および選択性を維持した。このことは、この位置における塩基性の(但し必ずしもアミンではない)側鎖が重要であることを示している。対照的に、非官能化修飾(K16A)および酸性修飾(K16E)によって性能は有意に減少した。
【０１８２】
K16R修飾と両末端PEG化との組み合わせ([18F]FBA-PEG28-A20FMDV2 K16R-PEG28; 5Rが得られる)は、αvβ6(+)発現細胞株DX3puroβ6に対する優れた親和性および選択性の維持を示した(図17)。したがって、化合物5RもDX3puroβ6/DX3puroの対の異種移植片マウスモデルにおいてインビボで試験した。図18に示すように、5Rはその親である5で見られたプロファイル(図16)よりも良好な薬物動態プロファイルを示した。DX3puroβ6/DX3puro異種移植片取り込み比は評価したすべての時点でより高く(4時間で12.9/1に到達)、一方、腎臓中の放射能濃度は全体を通じてより低かった。また、K16R変異の全体的利点を、表2に列挙する体内分布データにより示す。大多数の組織は5よりも低い5Rの% ID/g取り込みを示し(例外: 胆嚢(より高いが許容される絶対取り込み)、肺(ほぼ同等)、およびDX3puroβ6腫瘍(より高い - 望ましい))、したがって、5Rの主要なDX3puroβ6/臓器比は5に比べて有意に増加した。さらなる利点として、図19に示すように、K16R置換は放射性トレーサー安定性に対しても正の効果を示した。製剤化された5Rで部分分解(放射線分解/酸化)が観察されなかった一方で、親である5は一般に放射性トレーサー製剤の約5%の分解を示した。
【０１８３】
（表２）DX3puroβ6/DX3puroの対のマウスモデルにおける注入2時間後の5および5Rの体内分布データ。臓器取り込みを% ID/g±標準偏差として列挙する(n = 3/放射性トレーサー/時点; αvβ6陽性標的DX3puroβ6腫瘍を除いて、低取り込みが望ましい)。各臓器での5Rと5との間の差(相対変化%)(αvβ6陽性標的DX3puroβ6腫瘍を除いて、減少が望ましい)、およびαvβ6陽性DX3puroβ6腫瘍と様々な臓器との間の取り込み比(比が高いほど望ましい)も列挙する。
0006789823.tif 000008
【０１８４】
結論
PEG単位の付加に関して、化合物5で見られるように、両末端PEG化のみがA20FMDV2ベースの放射性トレーサーに良好な標的化特性および良好な全体的インビボプロファイルを与えることができた。化合物5は、個々のN末端またはC末端PEG化から予測されたプロファイルを超えて大きく改善された薬物動態プロファイルを示した。2個のPEG単位は、大きく改善された安定性を高いαvβ6(+)腫瘍取り込み性および腫瘍滞留性と共に実現するように相乗的に作用した。両末端PEG化戦略も、環化と同様に、他のホーミングペプチドに有益でありうる(White et al., Nat Chem., 2011;3:509-24; Okarvi, Med Res Rev., 2004;24:357-97; Roxin et al., Future Med Chem., 2012;4:1601-18)。特に、PEG化は、生体適合性を示し、他の戦略(例えば環化)と比較した場合に、立体配座拘束を強制することがなく、合成は単純かつ簡単であり、広範な他のペプチド修飾と容易に組み合わせ可能である。
【０１８５】
A20FMDV2ベースのαvβ6(+)標的化ペプチドについて両末端PEG化戦略を評価した際に、リジン残基における修飾を調査したところ、K16R置換が特に有益であることがわかった。化合物5Rは、インビトロで高いαvβ6親和性/滞留性/選択性を維持し、インビボ結果の改善(最良のαvβ6(+)DX3puroβ6/αvβ6(-)DX3puro異種移植片比12.9/1を含む)をもたらし、腎臓からの良好な排出および高い放射性トレーサー安定性を示した。
【０１８６】
実施例3
改善された親和性および薬物動態を有するαvβ6標的化分子画像化および治療用の両末端PEG化ペプチドの開発
本実施例は、改善された親和性および薬物動態を有する新規分子画像化剤の開発、ならびにいくつかの新規αvβ6標的化治療戦略の開発および有効性試験を示す。特に、本実施例は、以下の3つの治療戦略のための送達手段としてのPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28ベースのαvβ6標的化治療を提供する: (i) アポトーシス促進性ペプチドD(KLAKLAK)2; (ii) 治療用放射性核種90Y; および(iii) ミセルベースのパクリタキセル(PTX)ナノ担体。本実施例はまた、PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の親和性、インビボ安定性、標的化能力、および/またはクリアランス挙動をさらに改善するための、多量体化および/または血液アルブミン結合性モチーフの付加を含む修飾を提供する。
【０１８７】
背景および臨床的意義
がん画像化およびがん治療用の分子標的としてのαvβ6インテグリン
αvβ6インテグリンが画像化および治療用の極めて魅力的な分子であることを示唆する文献の数は著しく、その数は急速に増加している。αvβ6は、健康な成人の上皮中では検出不能であるが広範な上皮由来腫瘍中で有意に上方制御される、上皮特異的細胞表面受容体である(1〜12)。この受容体は、腫瘍の浸潤先進部および浸潤辺縁部にしばしば局在化され、浸潤および転移において重要な役割を果たすものであり、その発現は予後不良にしばしば関連している(13〜19)。αvβ6の独特の発現が無増悪生存率(PFS)、奏効率(RR)、および全生存率(OS)の減少の予測因子であることから(20、21)、本発明者らおよび他の研究者らは、この負の相関の利点は、診断手段および治療手段の両方にαvβ6を利用するという必要性の高い機会を与えることであると考える。特に高悪性度表現型を有する疾患における、悪性組織と健康組織との間の大きな対照、およびαvβ6の機能的関連性は共に、その診断用および治療用の化合物の開発が非常に広範な浸潤疾患の今後の管理に重要である標的の選抜リストにαvβ6を正当に位置づけるものである。
【０１８８】
αvβ6標的化分子画像化剤および治療薬の臨床的影響
さらに、αvβ6の異常だが特異的な発現により得られる大きな対照を示す疾患に関する有用性の範囲は、小さな患者群に限定されない。むしろ、これらのαvβ6標的化画像化剤および治療剤は、起源またはグレードが本発明者らの現行の治癒能力の範囲外であるいくつかの悪性腫瘍の処置および管理において卓越している可能性がある。αvβ6の幅広い生物学的影響および臨床的有用性が定説になっていることから、これらの主張を裏づける文献報告(22〜25)は数多く、指数関数的に増加している。ここで本発明者らは、αvβ6標的化診断薬および治療薬の開発を直ちに行う必要があることを益々示す結腸直腸がんおよび乳がんにおける、直近の適応/適用を取り上げる。
【０１８９】
結腸直腸がん(CRC)は、肝転移に大きく起因するがん関連死の2番目に多い原因である(11、18、26)。数多くの報告が、CRCモデル内での細胞遊走、細胞増殖、および細胞浸潤におけるαvβ6の決定的な役割、ならびに、肝転移におけるαvβ6の役割をさらに規定するαvβ6とCXCR4との間のクロストークを明らかにしている(25)。最近の第II相試験において、KRASを転移性結腸直腸がんと共に有する患者の処置におけるアビツズマブ(Abituzumab)とセツキシマブ/イリノテカン標準治療(SoC)との組み合わせの有効性が調査された(27)。この試験では、αvβ6が、SoCを受けた患者のOSの負の予後因子であることが確認された。さらに、遡及的バイオマーカー解析によって、αvβ6発現の増加が、OSの増加と正の相関があり(死亡リスクがSoCに比べて最大59%減少)、おそらくはアビツズマブ/SoC併用処置レジメンでのPFSおよびRRの正の予測因子でもあることが判明した。このランダム化試験において一次エンドポイント(PFS)は満たされなかった。著者らが示唆した結果は、併用処置の利点を享受する可能性がより高い患者集団(すなわちαvβ6+転移を有する患者)の選択によって逆転されることがある。αvβ6標的化診断薬が決定的に必要だがそれが満たされていないことを取り上げた、著者らの言によれば、「適切な患者集団を選択するためのコンパニオン診断試験の開発がさらなる試験のために重要である」。
【０１９０】
非浸潤性乳管がん(DCIS)は乳がんの25〜30%を占め、そのうち小さなサブセットのみが浸潤がんに進行する。しかし、DCISを有する女性のための予後指標の欠如により過剰診断および過剰処置が生じている。診断時に、DCIS患者は直ちに、処置に関する重大な決断に直面する。これらの決断の指針となる関連バイオマーカーが存在しないことは、正す必要がある医療上の失敗である。依然として残る患者にとって大きな問題は「私のDCISは生涯中に浸潤がんに進行するのか？」というものである。現在、DCISを浸潤がんと区別する強力なマーカーが利用可能ではないことから、DCIS患者はDCISが進行するかのように処置される。Monica Morrow, M.D., Chief of Breast Service at MSKCC「われわれがDCISを処置するのは、DCISがそれ自体で問題を引き起こすからではなく、浸潤がんの発生の主要な危険因子であるからである」。疾患が数十年かけて進行する可能性がある50歳超の女性に関するジレンマは、経過観察が根治的乳房切除術よりも良い選択肢であるのか否かというものである。Monica Morrow, M.D「どのDCISが浸潤がんに進行するかを、これに対してどのDCISが永遠にDCISにとどまるかを予測することができる分子マーカーをわれわれが同定することができれば、それは甚大な臨床上の進歩となるであろう」(28)。もし成功すれば、明らかに、この画像化剤は、進行疾患を有する患者に対して、および疾患が決して進行しない可能性がある患者を同定することに対して、両方に有意な影響および利点を示すであろうし、処置に関する信じがたく困難な決断に直面する女性が切実に必要としている情報および選択肢をその女性に与える予測および予後診断の状況において使用されうる。この対応困難な状況に対応して、予測用バイオマーカーに関する研究を促進したところ、αvβ6が最も有望な候補の1つとなっている。遡及的解析は、DCISにおける筋上皮細胞中でのαvβ6発現が進行および再発の予測因子であり、αvβ6+ DCISの100%が浸潤疾患に関連していることを明らかにした(14)。したがって、αvβ6標的化画像化剤の開発は、臨床医が浸潤がんへの進行の危険性に基づいて患者を層別化する能力を著しく強化し、DCIS患者が処置選択肢を考慮する際に非常に求めている情報を該患者に提供するであろう。
【０１９１】
乳がんと診断された患者のうち約25〜30%が、より高悪性度の部分群であるHER2+である。トラスツズマブがHER2+患者向けの補助処置薬として使用されているが、残念ながら患者の70%超が耐性を発生させており、新たな治療薬が切望されている。最近のエビデンスは、αvβ6+/HER2+疾患が乳がんの最も深刻なクラスの1つであることを示し、OSはかろうじて50%を超えた(HER2+患者のOSはαvβ6状態とは無関係に65.1%である)。トラスツズマブ耐性の病態は不均一であるが、PI3Kシグナル伝達系のメンバーが共通して関与しており、相当なデータがαvβ6とこの経路との間の直接的な連関およびクロストークを示している。また、この観察によって、最低限、αvβ6発現に基づく患者の層別化、および、より多くの情報に基づく処置に関する検討が可能になる。当然ながら、これらはいずれもαvβ6標的化診断薬の利用可能性に依存する。HER2+疾患の処置においては、トラスツズマブ耐性の獲得は決定的な臨床上の問題である。疾患が最終的にトラスツズマブの作用を無効化する患者では、αvβ6シグナル伝達を直接標的化するかαvβ6+細胞を単純に標的化する治療薬は、代替案が存在しない段階でさらなる処置上の選択肢を提供する。
【０１９２】
αvβ6が同定された疾患のリストは大きく拡張し続けているが、αvβ6が最初に同定されたのは膵がんにおいてであった。Siposらは、膵管腺がん(PDAC)における高レベルのαvβ6発現を実証し、試料の94%(32/34)は最大スコアを受けた(29)。膵がんは米国における最も致死性の高い悪性腫瘍であり、この疾患と診断された人の98%超が最終的にそれにより死亡する(30)。膵がんの治癒的処置が存在するのは、限局性疾患が同定される場合のみであるが、その外科的切除によって治癒の可能性が得られる膵臓または所属リンパ節にがんが限定されると診断されるのは、患者の20%のみである。現行の管理における困難に輪をかけるように、現在利用可能な画像化様式(造影コンピュータ断層撮影[CT]スキャンまたは18FDG-陽電子放射断層撮影-PET/CT)に基づいて限局性疾患を有すると考えられた患者の最大50%が、診査手術の時点で転移性疾患を有する(31、32)。限局性腫瘍を有する患者が、潜在的に治癒的な切除を受ける高い見込みをもって診査手術に進むことができ、その一方で、進行がんを有する患者が、疾患の程度を同定するためだけに行われる診査手術を回避することができるように、疾患の程度を正確に測定するための非侵襲的画像化が、明らかに求められている。PDACに関するNCIの助成によるシンクタンクは、この疾患と戦う上で満たされていない最も決定的な必要性の1つとして、早期検出のための方法を同定した。一致した見解は、より早期の検出、患者層別化、およびより早期の時点での治療有効性の評価を可能にする手段が最も重要であるというものであった。改善された画像化剤および治療薬の必要性は明らかに満たされておらず、αvβ6標的化化合物はその必要性を満たす大きな有望性を持っている。
【０１９３】
要するに、αvβ6指向性の画像化および治療は、ステージおよびグレード(低悪性度/高悪性度)に関する決定的な情報を提供し、現行の診断アプローチでは実行困難な治療上の決断の指針となり、過小処置および過剰処置の両方のがん患者に対して著しい成果をもたらすものである。本実施例に記載のアプローチの臨床的影響は、広範な疾患において即時的であり、今日臨床医が直面する最も致死性が高い一部の悪性腫瘍の処置における障壁を打破する可能性を持っている。
【０１９４】
αvβ6特異的分子画像化剤
現在まで、αvβ6用の分子画像化剤で、臨床応用されているものはなく、開発中のものはほとんどない。肺腺がん細胞株に対する不偏ファージバイオパニングを通じて、Brownらは20アミノ酸ペプチドH2009.1を同定し、続いて結合標的をαvβ6として同定した(33)。Brownらは、αvβ6が多くの非小細胞肺がん(NSCLC)患者において上方制御され、αvβ6が独立した負の予後指標であることを示し、αvβ6がNSCLCの疾患進行において「作動する」ことを報告した(2)。2013年にBrownは、ドキソルビシンのリポソーム製剤の標的化を改善する四量体としてのこのペプチドの使用を記述した(34)。Gambhirグループがとった別のアプローチは改変シスチンノットαvβ6ペプチドであり、Gambhirらは18Fフッ素で放射標識された2つのペプチドを報告した。これらのペプチドの80%超は1時間後にヒト血清(エクスビボ)中でインタクトであったが、これらのノッチンペプチドのインビボ評価は27% ID/g超の腎取り込みを示した(35、36)。
【０１９５】
本発明者らのアプローチ
本発明者らは、αvβ6特異的ペプチドリガンドを同定するために2つのアプローチを選択した。本発明者らは、口蹄疫ウイルス(FMDV)のエンベロープタンパク質のGHループに基づく「合理的」アプローチ、およびコンビナトリアル1ビーズ1化合物(OBOC)ライブラリーアプローチを使用する(37)。合理的アプローチによって、以下に提示する好結果が得られた。OBOCおよびファージなどのライブラリーアプローチは、多くのリードを同定する上で大きな可能性を有するが、ディスプレイプラットフォーム(ビーズまたはファージ)からペプチドを単離することで得られる単量体は、多くの場合、分離後に示す親和性が中程度であり、さらなる最適化が必要である(34、38)。このことは本発明者らがOBOCライブラリーで経験したことでもあり、本発明者らの経験では、スクリーニングにより同定されたリードが本発明者らの現行のA20FMDV2ベースのペプチドの高い親和性およびインビボ選択性と匹敵するようになるまで、そのリードに対して相当な最適化を行わなければならない。
【０１９６】
A20FMDV2ベースのペプチドを使用するデータ
αvβ6インテグリンはフィブロネクチン、テネイシン、ビトロネクチン、TGFβの潜在関連ペプチド(LAP)、およびFMDVのVP1コートタンパク質の受容体である。本発明者らの第一世代αvβ6標的化ペプチドは、FMDVのVP1タンパク質のGHループの配列に基づく20アミノ酸ペプチド
0006789823.tif 000009
である、A20FMDV2であった。A20FMDV2は、固定化αvβ6に対する3nMという高い親和性を、他のRGD結合性インテグリンに比べて少なくとも1000倍の選択性と共に示した(39、40)。本発明者らは最初に、αvβ6のインビボ画像化剤としてのA20FMDV2の有望性を[18F]FBA-A20FMDV2と共に実証した。インビボでのαvβ6特異的標的化は観察されたが、速やかな腫瘍洗い出し(1時間で0.66% ID/g、4時間で0.06% ID/g)および低いインビボ安定性により、そのさらなる適用が妨げられ、結合体[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28に到達するための一連の改善(主にPEGのサイズおよび位置、ならびに使用される放射標識補欠分子族を通じて)が促された(39〜44)。リジンからアルギニンへの置換を特徴とする両PEG化ペプチドである[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28は、4時間で2.64% ID/gのαvβ6陽性腫瘍滞留を示し、4時間で8% ID/g未満を含む優先的腎排泄を示し、血清中にて2時間で90%インタクトであり、4時間でαvβ6陽性対陰性腫瘍比12.5:1を示す(図20)。リジンの置き換えによって、N末端に1個のアミン基のみを有するペプチドが得られ、これにより、[18F]SFBまたは同様の活性化エステルによる部位特異的溶液相放射標識も可能になる。まとめると、[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28はαvβ6標的ペプチドとして優れた可能性を示す。
【０１９７】
技術革新
αvβ6発現が広く見られること、ならびにαvβ6発現とがんの浸潤性表現型との相関、およびαvβ6発現と患者生存率との負の相関は、αvβ6が疾患の画像化および治療の両方のための特に魅力的な標的であることを明らかに示している。臨床応用されているαvβ6特異的分子画像化剤がまだなく、本発明者らが知る限り、評価中の抗体ベースのαvβ6標的化治療が1つしかない(NCT01371305; clinicaltrials.gov、特発性肺線維症)ことから、診断用画像化剤および標的化治療戦略の開発の必要性はいずれも明らかに満たされていない。したがって、診断用画像化剤の開発および新規標的化治療薬の開発の両方に向けて著しい努力がなされるのは当然のことである。本実施例では、以下のように要約される、改善された親和性および薬物動態を有する新規分子画像化剤の開発、ならびにいくつかの新規αvβ6標的化治療戦略の開発および有効性試験を説明する。
1. 送達媒体としてのPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28に基づくαvβ6標的化治療
PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28を以下の3つの治療戦略用の担体として使用する: i) D(KLAKLAK)2(アポトーシス促進性ペプチド); ii) 治療用放射性核種90イットリウム(β放射体、エネルギーは大きな腫瘍を処置するために好適); およびiii) ミセルベースのパクリタキセル(PTX)ナノ担体。3つすべての戦略の有効性をインビトロ細胞アッセイおよびインビボ動物モデルの両方において評価する。陽電子放射断層撮影(PET)、生物発光画像化(BLI)、およびチェレンコフ発光画像化(CLI)を、インビボ体内分布を追跡しかつ治療有効性を定量化するために使用する。
2. PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の薬物動態特性を改善することでファースト・イン・ヒューマン試験に向けて進む
多量体化および/または血液アルブミン結合性モチーフの付加を、PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の親和性、インビボ安定性、標的化能力、およびクリアランス挙動をさらに改善するために使用する。様々な共有結合性補欠分子族、キレート剤、および「クリック」化学反応を、最良の放射標識アプローチを設計するために使用する。全体的な選択基準は、収率、合成の容易さおよび速度、部位特異的標識、親和性および選択性、ならびにインビボでの腫瘍標的化・滞留および非腫瘍組織からのクリアランスである。
【０１９８】
アプローチ
1. αvβ6標的化治療
理論的根拠
がんの処置の成功は、治療薬の効率的な標的化送達、標的化時の効率的な細胞内浸透を必要とするものであり、将来的には異なる機構を有する治療の組み合わせによる利点をおそらく享受するであろう。αvβ6受容体が正常成人上皮中で発現されないという事実は、αvβ6受容体が治療のための良い分子標的であることを示唆している(正常隣接組織に影響を与えるべきではない)。ペプチドPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28のαvβ6受容体への独特の「ホーミング」およびその速やかな内部移行によって、そのペプチドはαvβ6標的化治療に理想的な担体となる。PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28を異なる機構を有する以下の3つの治療薬の担体として使用する: i) D(KLAKLAK)2(ミトコンドリア膜の破壊により細胞毒性を引き起こすアポトーシス促進性ペプチド)の送達; ii) 治療用放射性核種90イットリウム(β放射体、エネルギーは大きな腫瘍を処置するために好適)の送達; およびiii) ミセルベースのパクリタキセル(PTX、微小管の異常な安定化により有糸分裂停止を引き起こし、これにより細胞死を生じさせる)のナノ担体製剤の送達。3つすべての戦略の有効性をインビトロ細胞アッセイ(例えばWST-1、TUNEL、およびCaspase 3/7)ならびにインビボマウスモデル(例えば陽性および陰性皮下異種移植片の対、ならびに抗原陽性同所性異種移植片)の両方において評価する。陽電子放射断層撮影(PET)、生物発光画像化(BLI)、およびチェレンコフ発光画像化(CLI)を、インビボ体内分布を追跡しかつこれらの標的化治療の治療有効性を計測するために使用する。
【０１９９】
モデルの説明
インビトロ試験
別途記載がない限り、DX3/mTFL/ITGB6およびDX3/mTFL(いずれも親DX3黒色腫細胞株に由来)をすべてのインビトロアッセイの陽性対照および陰性対照として使用する。DX3/mTFL/ITGB6はCMVプロモーターの制御下でβ6インテグリン(親細胞株またはDX3/mTFL中では発現されない)を安定的に発現する。αvインテグリン(β6とヘテロ二量体形成可能な唯一のインテグリン)がDX3細胞株中で正常に発現されることから、β6の外因性発現の結果として細胞表面上のαvβ6が生じる。
マウスモデル
DX3/mTFL/ITGB6およびDX3/mTFL細胞株の対は、3つの治療薬の作用のαvβ6に基づく選択性のインビボ調査も可能にする。したがって、DX3/mTFL/ITGB6およびDX3/mTFLの対の異種移植モデルを、3つすべてのPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28標的化治療薬の最大耐量(MTD)および治療効果を測定するために使用する。MTD試験では、薬物分布、全身的健康、および体重に対する影響、ならびに解釈の交絡因子となる腫瘍の速やかな成長を回避するために、非担腫瘍マウスを使用する。異種移植片の対を確立するために、麻酔(イソフルラン)マウスは肩甲下領域に対するDX3/mTFL/ITGB6およびDX3/mTFL細胞(無血清培地100μL中3x106個)の両側皮下(SC)注入を受ける。腫瘍の対が100〜200mgに到達したとキャリパー計測およびBLIによって測定した時点で、マウスを以下に記載のようにコホートに分ける。一対SC試験の終わりに、1つのリード治療薬を、BxPC-3/mTFL(天然の高ITGB6発現を示すヒト膵腺がん細胞株)を使用する同所性異種移植モデルにおけるさらなる解析用に選択する。BxPC-3/mTFL細胞(生理食塩水100μL中1x106個)を、肋骨下切開を通じて到達される遠位膵臓に注入する。穿刺部位の止血を促進しかつ細胞懸濁液の溢流を防止するために、圧力を1分間保持する。次に外科的切開を5-0ナイロン縫合または止血クリップで閉鎖し、1週間後にこれらを取り除く。麻酔が速やかに消失したことから、回復が最初の10分以内に生じ、マウスを呼吸活性、皮膚緊張度、および運動について1時間持続的に観察する。ブプレノルフィンを手術後に投与し、これを手術後12時間毎に合計48時間にわたって続ける。マウスを動物施設に収容し、触知可能な腫瘍が発生するまで毎日モニタリングし、その時点でマウスを以下に記載のようにコホートに分ける。試験手順の完了後にすべての動物を安楽死させた(麻酔下で頚椎脱臼)。すべての細胞株および得られる異種移植片は、ホタルルシフェラーゼの熱安定性変異体mTFLを発現し、これにより、縦断的試験のための得られる腫瘍の生物発光画像化が可能になる。
【０２００】
1.1 PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28によるアポトーシス促進性ペプチドD(KLAKLAK)2の選択的標的化
当初、14アミノ酸両親媒性ペプチドD(KLAKLAK)2は、細菌細胞膜を破壊する抗菌性ペプチドとして記述された(56)。ミトコンドリア膜および細菌膜の構造が進化的に類似していることから、D(KLAKLAK)2は真核細胞に内部移行する際にミトコンドリア膜を破壊し、これによりアポトーシスが誘発される(57)。D(KLAKLAK)2は、「ホーミング」ペプチドに結合させた際に、細胞中に特異的に蓄積して細胞死を引き起こすことに成功した(58〜60)。D(KLAKLAK)2およびPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の結合体の有効性および特異性を評価する。PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28は、その独特のαvβ6受容体への「ホーミング」およびその速やかな内部移行(αvβ6細胞中にて1時間で結合70%超および内部移行50%超)により、D(KLAKLAK)2の理想的な送達媒体となる(図20)。
【０２０１】
特定の態様では、D(KLAKLAK)2-GG-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28結合体は固相ペプチド合成(SPPS)を使用して合成される。他の態様では、D(KLAKLAK)2-GG-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28結合体は、2つのペプチドの間の収束的アジド-アルキンヒュスゲン1,3-双極子環化付加(「クリック」反応)アプローチを使用して合成されうる。特定の態様では、例えばD(KLAKLAK)2が単独で毒性があることがわかっている場合、所望の治療効果を実現するためにナノ製剤を使用することができる。
【０２０２】
1.1.a) D(KLAKLAK)2-GG-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28結合体の合成
使用するすべてのペプチドを、Rink樹脂上で標準的Fmoc化学反応を使用して手動で合成する。D(KLAKLAK)2およびPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の結合体では、結合および内部移行を妨げる可能性がある立体障害を最小化するために、グリシン-グリシン(GG)リンカーを2つのペプチドの間に組み込む。すべてのペプチドを標準的RP-HPLC法を使用して精製し、MALDI-MSを使用して特性評価する。PEG28-A20FMDV2-GG-D(KLAKLAK)2-KおよびD(KLAKLAK)2-GG-PEG28-A20FMDV2-Kを調製し、特性評価し、[18F]FBAを使用して放射標識し、細胞結合試験を行った(図21)。結果は、D(KLAKLAK)2のPEG28-A20FMDV2-PEG28への結合が、インテグリンαvβ6に対するその親和性、特異性、および内部移行可能性に影響しないことを示している。ペプチド結合体の血清安定性を24時間にわたって評価する。D(KLAKLAK)2-GG-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28結合体を血清と共に37℃でインキュベートし、アリコートを1時間、2時間、4時間、12時間、および24時間で採取し、血漿タンパク質をエタノールで沈殿させ、上清をHPLCで分析してインタクトな結合体のパーセントを測定する。
【０２０３】
1.1.b) D(KLAKLAK)2-GG-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28結合体のインビトロ有効性
水溶性テトラゾリウム(WST-1、Roche)細胞増殖アッセイ、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼdUTPニック末端標識(Click-iT TUNEL、Life Technologies)アッセイ、およびCaspase 3/7(Caspase-Glo、Promega)アッセイを利用して、D(KLAKLAK)2-GG-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の治療有効性を測定する。96ウェルプレート(WST-1、Caspase 3/7)または8ウェルチャンバスライド(TUNELアッセイ)上で培養した細胞を、0〜500μMの範囲の20種の濃度のD(KLAKLAK)2-GG-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28または対応する濃度の以下のうち1つの対照で処理する: i) 非結合D(KLAKLAK)2およびPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28; ii) D(KLAKLAK)2単独; iii) PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28単独; またはiv) 対照(生理食塩水)のみ。処置の2時間後、6時間後、24時間後、および48時間後にアッセイを製造者の推奨に従って完了させる。データの非線形回帰解析をPrism 6.0ソフトウェア(GraphPad)を使用して完了させることで、結合体および対照の最大半量阻害濃度(IC50)を測定する。
【０２０４】
1.1.c) 最大耐量(MTD)の測定
MTDは、送達される治療薬と試験が完了されるモデルとの両方に依存するものであり、提示される各治療薬について経験的に決定しなければならない。非担腫瘍マウスを6つのコホートに分ける。コホートは尾静脈注入により一回量で濃度範囲(0、5、10、15、20、または25μg/g)のうち1つの濃度のD(KLAKLAK)2-GG-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28結合体を受ける。次に動物を苦痛の徴候、許容されない副作用、または体重減少について30日間モニタリングする。試験の終わりにMTDを計算し、このデータを、以下に記載の有効性試験において使用される治療量を測定するために使用する。
【０２０５】
1.1.d) D(KLAKLAK)2-GG-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28結合体の治療有効性
DX3/mTFL/ITGB6およびDX3/mTFL由来の異種移植片の対(100〜200mg)を有するマウスを6つのコホートに分ける。コホートは結合体(実験群#1)、未結合のD(KLAKLAK)2およびPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28(対照群#1)、D(KLAKLAK)2単独(対照群#2)、PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28単独(対照群#3)、または生理食塩水(対照群#4)の1回の注入を受ける。処置の96時間後に、各コホートからの3匹のマウスを安楽死させ、組織、腫瘍、および臓器を形態(H&E)および他の苦痛/死の指標(caspase-3、TUNELなど)に関する免疫組織化学(IHC)解析のために確保する。残りのマウスについて、腫瘍サイズをBLIによって週2回計測する。BLIを完了するために、画像取得の15分前に麻酔(イソフルラン)マウスにD-ルシフェリン(150mg/kg)を腹腔内注入する。この取り込み期間の後、マウス(一度に最大5匹)を予め温めた画像化面上に一定のイソフルラン下で配置する。写真画像および発光画像を合計スキャン時間1分未満で取得する。各画像化時点の後、許容されない体重減少(動物の体重の10%を超える)を処置後に示す動物がないことを確実にするために、動物の体重を記録する。IACUC Policy on Humane Endpointsが規定する最大サイズに腫瘍が到達するまで、すべての動物についてこのスケジュールに従う。
【０２０６】
1.2 90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28によるαvβ6標的化放射線療法
ペプチドは、ペプチド受容体標的化療法(PRTT)としても知られる放射性核種療法の標的化送達媒体として臨床において成功を示した。現在までの最も成功したPRTTに関する報告は、神経内分泌腫瘍(NET)を有する患者を処置するためのソマトスタチン受容体(SSTR)ペプチド類似体90Y-DOTA-TOCおよび177Lu-DOTA-TATEの使用であった(66〜68)。PRTTの成功にはi) 有効放射線量を送達するためのペプチドの特異的標的化; ii) ペプチドの良好なインビボ安定性および内部移行; ならびにiii) 放射性核種の適切な物理的特性が必要である。111In-Octreoscan(SSTR発現腫瘍の診断剤)と同様に、αvβ6標的化治療はPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28を治療用放射性核種で放射標識することを含みうる(69)。90Yは、組織12mmを最大範囲とするβ粒子の高エネルギー(2.3MeV)(比較的大きな腫瘍の処置によく適している)が理由で、また、腫瘍部位における蓄積をモニタリングするためにCLIを使用してβ線放出を画像化する能力が理由で有用である、例示的な放射性核種である。PRTTでは、腎保護剤として患者において使用されているリジンなどの塩基性アミノ酸の同時注入により、腎毒性の減少に成功した(70、71)。ペプチドの薬物動態特性を改善する可能性を有するPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の多量体化および/またはPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28へのアルブミン結合性モチーフの付加により、腎滞留を減少させることもできる。特定の態様では、PRTTと複数放射性核種アプローチおよび複数受容体/アルブミン担体アプローチの両方との組み合わせを使用する。他の態様では、90Yおよび177Luの異なる物理的特性を利用することで、90Y/177Lu-DOTA-TATEに関してNET患者において既に実証されたように、様々な腫瘍サイズにおける広範な標的化が可能になる(72)。
【０２０７】
1.2.a) 90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の合成
標準的方法およびキレート剤としてのDOTAを使用して、PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28を90Yで標識する。[90Y]Cl3(1〜5 mCi)の0.05M塩酸水溶液中溶液に酢酸アンモニウム水溶液(1M、pH 8.0〜8.5)およびDOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28溶液(20nmol)を加える。pHを酢酸アンモニウム水溶液(1M)で7〜8に調整し、反応混合物を室温で1時間インキュベートする。DTPAを加えて、残ったすべての遊離90Y3+を除去する。90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28をC-18 Sep-Pakで精製し、PBS/生理食塩水中で製剤化し、RP-HPLCで分析する。
【０２０８】
1.2.b) 細胞結合および内部移行
細胞結合および内部移行を標準的方法を使用して評価する。90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の200nCiアリコートを細胞(DX3/mTFL/ITGB6またはDX3/mTFL3.75x106個)に加え、室温で1時間インキュベートする(n = 4/細胞株)。遠心分離後、上清を取り出し、細胞ペレットを無血清DMEM 0.5mLで洗浄する。結合放射能の比率をγカウンターによって測定する(細胞ペレット対上清組み合わせ)。内部移行放射能の比率を測定するために、続いて細胞を酸性洗浄緩衝液で処理して表面結合放射能を取り除き、次にPBSで洗浄する。内部移行比率をγカウンターによって測定する(細胞ペレット対上清中放出放射能)。
【０２０９】
1.2.c) インビトロ血清安定性
安定性を評価するために、90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28(27μCi)を血清と共に37℃で(またはPBS対照と共に)インキュベートし、アリコートを0時間、4時間、24時間、48時間、および144時間で取得し、血漿タンパク質をエタノールで沈殿させる。タンパク質結合放射能の比率をγカウンターによって測定し(ペレット対上清)、上清のHPLC分析を行ってインタクト90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28のパーセントを測定する。
【０２１０】
1.2.d) 90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28のインビトロ有効性
90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28のインビトロ解析は、試料当たり0〜1μCiの範囲を網羅するものであり、上記1.1.b)と同様に解析および完了される(WST-1、TUNEL、およびCaspase 3/7アッセイ)。対照は対応する濃度の[90Y]Cl3およびDOTA-PEG28-A20FMDV2-PEG28とする。
【０２１１】
1.2.e) 最大耐量(MTD)の測定
MTDを上記1.1c)に記載のように測定する。SC異種移植片の対を有するマウスは、90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28 0、5、8.75、12.5、16.25、または20μCi/gを受け、上記のようにモニタリングされる。この放射性核種がCLIを可能にすることから、注射後(PI)0〜72時間の画像を取得することで、腫瘍部位における90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の蓄積および滞留を非侵襲的にモニタリングする。CLI画像取得手順はBLIのそれ(上記1.1.d)において概説)と同一であり、総スキャン時間は15分未満である。
【０２１２】
1.2.f) 90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の治療有効性
90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28処置の有効性を上記1.1.d)に記載の方法により測定する。SC異種移植片の対を有するマウスを2つのコホートに分ける。コホートは90Y-DOTA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28(MTD)または生理食塩水対照を受け、いずれも1回の尾静脈注入により送達される。上記1.1.d)に記載のようにマウスを処置後に画像化およびモニタリングする。
【０２１３】
1.3 PEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8によるパクリタキセルの標的化送達
ナノ粒子(NP)は、治療薬および分子画像化剤用の送達媒体として著しい有望性を示す(61)。ナノ粒子は、薬物の耐容性および/または有効性を強化することで、臨床成績に著しく寄与する。最近、第一世代ナノメディシンの1つであるAbraxane(登録商標)(アルブミン安定化パクリタキセル、nab-PTX)が、転移性膵がんを有する患者向けの第一選択処置薬としてのゲムシタビンとの組み合わせでFDAにより承認された(62)。本発明者らが無数の高悪性度疾患を処置しようと努力していることから、おそらく、改善された抗がん効果を示すもっと多くの併用レジメンが承認されるであろう。受動的標的化では十分ではない場合に能動的標的化が腫瘍部位においてナノ粒子蓄積を増加させる上で有望性を示すことから[(63)において概説]、化学療法薬PTXを送達するためにαvβ6標的化NPを使用する。上記のようにペプチドを治療薬に直接結合させる代わりに、PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28をNP(すなわち治療薬-担体)に結合させる。PTXのαvβ6標的化送達を実現するために、ミセルベースのナノ担体であるテロデンドリマー骨格PEG5KCA8を媒体(NP)として使用し、ペプチドに結合させることができる(64、65)。このナノ担体系は、3つの生体適合性ビルディングブロック、すなわちポリエチレングリコール(PEG)、L-リジン、およびコール酸(CA)を使用する両親媒性線状-樹状ブロック共重合体である。PEG5KCA8は水溶性であり、高いPTX担持能力(12mg/mL)を有するミセル(21±4nm)に自己組織化される。PTX担持PEG5KCA8のインビボ抗腫瘍有効性を卵巣がんマウスモデルにおいて実証したところ、Taxol(登録商標)およびAbraxane(登録商標)に比べて優れた毒性が示された。このNP系の利点とペプチドPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28のαvβ6受容体への独特の「ホーミング」およびその速やかな内部移行とを組み合わせることで、能動対受動という難問を克服することができる。代替態様では、リポソームアプローチを使用する。他の態様では、NPの表面に2コピーおよび4コピーのペプチドを付加するために二価および/または四価のリジンコアを使用するという多価アプローチを使用する。さらなる態様では、マレイミド-チオールアプローチを使用する。
【０２１４】
1.3.a) PEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8-PTXの合成および特性評価
N3-PEG5KCA8およびアルキニル-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28を、アジド-アルキンヒュスゲン1,3-双極子環化付加反応による連結用に合成する。N3-PEG5KCA8を溶液中で合成し、透析し、凍結乾燥させる(図22)。アルキニル-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28をSPPSを使用して合成する。ミセルをTEMを使用して特性評価する。サイズおよびサイズ分布を動的光散乱法(DLS)により計測する。PTXの担持を既に記載のように行う(例えば、PTXおよびPEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8をクロロホルムに溶解させ、乾燥させ、続いてPBS緩衝液中で超音波処理し、非担持薬物沈殿物を0.22μm濾過により除去し、担持量をRP-HPLCにより計算する)。PEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8-PTXの血清安定性を上記1.1.a)に記載のように試験し、PTX放出を透析およびRP-HPLCを使用して評価する。
【０２１５】
1.3.b) PEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8-PTXのインビトロ有効性
PEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8-PTXのインビトロ解析は、0〜25ng/mLの範囲の濃度を網羅するものであり、上記1.1.b)に記載のように解析および完了される(例えばWST-1、TUNEL、およびCaspase 3/7アッセイ)。対照処置薬は対応する濃度の3つの対照、すなわちi) PEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8; ii) PEG5KCA8-PTX; およびiii) PEG5KCA8とする。
【０２１６】
1.3.c) 最大耐量(MTD)の測定
MTDを上記SA 1.1.c)に記載のように測定する。非担腫瘍マウスを6つのコホートに分ける。コホートはPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28-PEG5KCA8-PTX 0、12、24、36、48、または60μg/gを受け、既に記載のようにモニタリングされる。
【０２１７】
1.3.d) PEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8-PTXの治療有効性
PEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8-PTX処置の有効性を上記1.1.d)に記載の方法により測定する。SC異種移植片の対を有するマウスを5つのコホートに分ける。コホートはPEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8-PTX(実験群#1)、PEG28-A20FMDV2(K16R)PEG28-PEG5KCA8(対照群#1)、PEG5KCA8-PTX(対照群#2)、PEG5KCA8(対照群#3)、または生理食塩水(対照群#4)を受ける。上記1.1.d)に記載のようにマウスを処置後に画像化およびモニタリングする。
【０２１８】
1.4 同所性膵がんモデルにおけるリード治療薬の治療有効性
MTDおよび皮下異種移植片試験の終了後に、BxPC-3/mTFL同所性モデル内でのさらなる解析のために、1つのリード化合物を腫瘍退縮/非進行の最高比率(ベースの統計解析)に基づいて選択する。このモデルでは、病変は正常な微小環境内で発生する。さらに、このモデルにおける腫瘍部位への治療薬の送達によって、所望の薬物動態をより正確に確認することができる。同所性BxPC-3/mTFL腫瘍を有するマウスを4つのコホートに分ける。コホートは3つのうち1つの用量の標的化治療薬(例えば0.25X、0.5X、もしくは1X MTD)または生理食塩水対照を受ける。治療効果の解析およびマウスのすべての処置後モニタリングを上記1.1.d)に記載のように完了させる。
【０２１９】
1.5 統計解析
治療効果を主に腫瘍のサイズ/成長速度の減少および動物の生存率によって測定することができる。第1の解析目標は、用量規制毒性(DLT)を経験する動物が10%以下となる最大用量として規定される、各候補治療薬の最大耐量(MTD)を推定することにある。本発明者らは、DLTを経験するマウスの数にロジット線形素量用量反応モデルをフィッティングすることができ、修正フィラーの定理アプローチにより計算される95%信頼区画でMTD-10%を較正によって推定することができる。DLTが観察されない場合、本発明者らは、5つの用量の範囲にわたるDLTの可能性の上限を推定することで、MTDの下限を得ることができる。第2の解析目標は、マウス内ペア腫瘍モデル(標的陽性および標的陰性)における、適切な対照との比較での、90Yで放射標識されたかまたはD(KLAKLAK)2もしくはPEG5KCA8と結合した標的化ペプチドの有効性を評価することにある。主要評価項目は、BLIによって週2回計測される腫瘍成長速度でありうる。本発明者らは、構造回帰係数アプローチを使用して、能動的処置下での成長速度を生理食塩水処置腫瘍中での予想線形成長と比較する、混合効果反復計測成長曲線回帰モデルをフィッティングすることができる。一次比較は、標的陽性腫瘍の結合/放射標識処置と未処置の標的陽性腫瘍との間の比較でありうる。二次比較では、適切な対照の効果、および標的陽性対標的陰性での腫瘍に対する効果の差を評価することができる。未処置動物における線形腫瘍成長を平均±50%の範囲で仮定すると、α=0.05での両側検定は、臨床的に有意な改善である、実験治療薬の結合形/放射標識形の使用による成長速度の3分の2の減少を検出する少なくとも85%の検出力を示す。モデルを図表的および解析的に検証することができ、仮定が破られる場合は代替モデルを考慮する(非線形フィット、変換)を考慮することができる。
【０２２０】
2. PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の薬物動態特性を改善することでファースト・イン・ヒューマン試験に向けて進む
PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28のαvβ6受容体に対する高い親和性および選択性を、本明細書に記載のようにインビトロ(ELISAおよび細胞結合)ならびにインビボ(小動物PET画像化)の両方で実証した。このペプチド結合体は、特に好ましい標的化特性および薬物動態特性を有する。本節に記載のように、親和性ならびにインビボ薬物動態および循環時間に関してこのペプチドにさらなる改善を加えることができる。例えば、多量体化および/または非共有結合性血液アルブミン結合性モチーフの付加を使用することで、親和性、インビボ性能、および標的化能力をさらに改善することができる。様々な共有結合性補欠分子族、キレート剤、および「クリック」化学反応を、ペプチドを放射標識するために最良のアプローチを設計するために調査することができる。
【０２２１】
2.1 多量体アプローチ
多量体誘導体は、単量体ペプチドに比べて大きく増強された、細胞表面受容体に対する標的親和性を示した。特に、単量体ペプチドから二量体および四量体ペプチドに移行させる際に、親和性が二倍超/四倍超になるという親和性の非線形改善がしばしば観察される(34)。さらなる利点は、結合力に基づき、多量体サブユニットと複数の細胞表面受容体との相乗的(多価)相互作用に由来すると考えられる。おそらく、これにより細胞表面受容体の構造再構築が促されることで、接着斑ホットスポットの形成を通じて結合が増加するであろう。この多価性ベースの親和性ブーストは、シクロ(RGD)ペプチドによる関連インテグリンαvβ3の標的化インビボ標的化に関して最も徹底的に記録されている(45〜47)。成功のための主要なパラメータはi) 出発単量体の標的親和性および選択性; ならびにii) 多量体のサイズ(単量体の数および単量体間のリンカーの長さ - リンカーをより長くすることで多価結合が促進される)であった。また、最近の予備報告は線形αvβ6標的化ペプチド64Cu-M10の同様の正の効果を示しており、ここで二量体64Cu-(M10)2の腫瘍取り込みは早期の時点で約3倍増加した(1時間で0.55→1.6% ID/g)(34)。これに比べて、本発明者らの現行の単量体リード化合物(すなわちPEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28)が、1時間で2.51% ID/gの腫瘍結合を示し、4時間にわたって一定のままであるということに注目されたい。したがって、PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28由来ペプチドの多量体化を通じたインビトロおよびインビボでのαvβ6受容体に対する親和性増強の評価が、上記で概説した分子画像化および治療の両方のために重要な段階である。代替態様では、異なる長さのPEGリンカー(例えばPEG5、PEG11)およびヘッドトゥーテール多量体化(例えば溶液相クリック化学反応を使用)を使用して、結合力効果を測定することができる。
【０２２２】
2.1.a) 合成
単量体、二量体、および四量体ペプチドならびにそれらの放射標識類似体を調製することができる(図23)。分岐リジンにC末端PEG28スペーサーを接続することで立体的込み合いを最小化する。すべてのペプチドを、Rink樹脂上で標準的Fmoc化学反応を使用して合成する。ペプチド合成の終わりに、Pd(PPh3)4(「Pd」)による脱保護後に、β-アラニンスペーサーに続いてLys(Alloc)残基を部位特異的放射標識のために導入する。Fmoc-Lys(Fmoc)-OHの使用を通じて分岐化を1回(二量体用)または2回(四量体用)実現する(図23参照)。Fmoc-Lys(ivDde)-OHが使用される単量体では、ヒドラジンによる選択的脱保護の後に(無水酢酸を使用して)それを酢酸で封止することで、多量体のC末端と等しいC末端を有する対照が得られる。残りのペプチド構築ではFmoc-アミノ酸およびFmoc-PEG28-COOHならびに無水酢酸(末端封止用)を使用し、試薬の当量は多量体に合わせて調整される。
【０２２３】
2.1.b) 放射標識アプローチ
特定の場合では、ペプチドを放射標識するために使用される補欠分子族が全体的な薬物動態に影響しうる。したがって、標識アプローチには偏りはなく(共有結合とキレート剤ベースとの間で)、むしろ、18F、64Cu、および90Yを含む放射性同位体による放射標識を促進するモジュラー戦略が提示される。4-[18F]フルオロ安息香酸([18F]FBA)を使用する固相放射標識アプローチを含む確立された方法を利用する(48)。18F放射標識ペプチドのαvβ6受容体に対するインビトロおよびインビボでの安定性、親和性、および選択性が確立された時点で、標的中でのインビボ循環または滞留の増加が理由で放射性半減期の延長が必要になる場合は、代替の放射性同位体および戦略を使用することができる。特定の態様では、DOTA、NOTA、およびNOTA-TCO(TCO = trans-シクロオクテン)などの確かな金属キレート剤を放射性同位体の寿命延長に使用する。金属放射標識では、DOTA(OtBu)3-COOHまたはNOTA(OtBu)2-COOHをカップリングした後、溶液中でTFA切断、HPLC精製、および金属キレート化を行う。
【０２２４】
2.1.c) インビトロ解析(競合的ELISA)
競合的ELISAを使用して、精製インテグリンαvβ6に対する親和性および選択性を測定することができる。インテグリンαvβ3を、選択性を測定するための対照として並行的に使用することができる。インテグリンを96ウェルプレート(αv捕捉抗体P2W7)上で捕捉する。競合実験では、三つ組のウェルを等量のビオチン化フィブロネクチン(BtFn; αvβ6用のビオチン化天然リガンド)またはビトロネクチン(BtVn; αvβ3用)およびペプチドの段階希釈液(非放射性類似体; ストック: 2mM; 最終濃度範囲10pM〜100μM)で1時間コーティングする。対照: i) ペプチドなし、ii) ペプチドなしおよび抗体なし、iii) ペプチドなしおよびBtリガンドなし。ExtrAvidin-西洋ワサビペルオキシダーゼ、続いてテトラメチルベンジジン(TMB)溶液を加えることで、結合BtFn(またはBtVn)を検出する。反応を1N硫酸により終了させ、吸光度を450nmで計測する。結合Btリガンド%をペプチド濃度に対してプロットすることでIC50値を測定する。5nM未満のIC50およびαvβ3に対する選択性に比べて1000倍超のαvβ6に対する選択性を有するすべての化合物は、細胞結合試験に進むことができる。このアプローチにより、αvβ6特異的標的化ペプチドの同定が可能になり、αvβ3などのインテグリンファミリーの他の密接に関連するメンバーに結合するペプチドが排除される。この戦略を使用することで、A20FMDV2は、固定化αvβ6に対する高い親和性(例えば3nM)を、他のRGD結合性インテグリンに比べて少なくとも1000倍の選択性と共に示した(40)。
【０２２５】
モデルの説明
インビトロ試験
別途記載がない限り、DX3/mTFL/ITGB6およびDX3/mTFL(いずれも親DX3黒色腫細胞株に由来しかつそれぞれDX3puroβ6およびDX3puroと等価、さらに、動物試験における腫瘍の生物発光画像化[BLI]を可能にするホタルルシフェラーゼの熱安定性変異体であるmTFLを発現)をそれぞれすべてのインビトロアッセイの陽性対照および陰性対照として使用する。DX3/mTFL/ITGB6はCMVプロモーターの制御下でβ6インテグリンを安定的に発現する。αvインテグリン(β6とヘテロ二量体形成可能な唯一のインテグリン)がDX3細胞株中で正常に発現されることから、β6の外因性発現の結果として細胞表面上のαvβ6が生じる。インテグリンαvβ6はDX3/mTFL(または親細胞株)中では発現されず、両細胞株はαvβ3、αvβ5、およびα5β1、ならびにインテグリンファミリーの他の密接に関連するメンバーを発現する。
マウスモデル
DX3/mTFL/ITGB6およびDX3/mTFL細胞株の対は、上記の放射標識ペプチドおよび潜在的治療薬の両方のαvβ6に基づく選択性のインビボ調査を可能にする。異種移植片の対を確立するために、麻酔(イソフルラン)マウスは肩甲下に対するDX3/mTFL/ITGB6およびDX3/mTFL細胞(無血清培地100μL中3x106個)の両側皮下(SC)注入を受ける。腫瘍の対が100〜200mgに到達したと触診によって測定した時点で、マウスを画像化試験または治療試験に使用する。
【０２２６】
2.1.d) インビトロ解析(細胞結合)
細胞結合を各放射標識ペプチドについてDX3/mTFL/ITGB6およびDX3/mTFLを使用して上記のように評価することができる。放射標識ペプチドのアリコートを細胞懸濁液(例えば細胞3.75x106個/100μl; n = 4/細胞株)と共に1時間インキュベートすることができる。以前の試験は、細胞結合が最初の30分以内に速やかに生じたことを示した(39)。遠心分離後、上清を取り出し、細胞ペレットをSF-DMEM 0.5mLで洗浄する。結合放射能の比率をγカウンターによって測定する。内部移行放射能の比率を測定するために、続いて細胞を酸性洗浄緩衝液で処理して表面結合放射能を取り除き、γカウンター中で計測する。結合50%超および内部移行40%超を有し、かつDX3/mTFL/ITGB6に対する10倍の選択性を有する、すべての放射標識ペプチドは、血清安定性試験に進むことができる。
【０２２７】
2.1.e) インビトロ解析(血清安定性)
各放射標識ペプチドの血清安定性を、血清と共に37℃で(対照: PBS中で)インキュベートすることで2時間(18F)または24時間(64Cu)にわたって評価することができる。アリコートを0.5時間、1時間、2時間で(64Cu: 4時間、12時間、および24時間でも)取得し、血漿タンパク質をエタノールで沈殿させ、上清をHPLCで分析することでインタクト放射標識ペプチドのパーセントを測定することができる。2時間後に95%超インタクトでありかつすべての上記の細胞結合判定基準を満たす、すべての放射標識ペプチドは、インビボ試験に進むことができる。
【０２２８】
2.1.f) 小動物PET/CT画像化
DX3/mTFL/ITGB6およびDX3/mTFLの対の異種移植モデルは上記の通りである。各放射標識ペプチドについて、腫瘍が100〜200mgに到達した時点で、動物をIACUC承認のプロトコルに従って画像化試験(PET/CT)および体内分布試験に使用する。画像化試験では、放射標識ペプチド(約200μCi)を尾静脈注入によって麻酔マウス(イソフルラン)に送達し、マウスを画像化する(例えば18F: 0〜1時間、2時間、4時間; 64Cu: 1時間、4時間、24時間)。各放射スキャン後に透過スキャン(減衰補正用)およびCTスキャン(解剖学的参照用)を行うことができる。CT参照データに基づいて関心対象の腫瘍および臓器(腎臓、膀胱、肝臓、心臓、筋肉)の周りに関心対象の領域(RoI)を描くことで画像データをビニングし、再構築し、コレジストレーションし、解析し、画像データを時間放射能曲線としてプロットすることができる。体内分布試験では、放射標識ペプチド(約20μCi)を上記のように注入する。組織、臓器、および腫瘍を速やかに採取し(例えば18Fでは1時間、2時間、4時間; 64Cuでは1時間、4時間、24時間の時点)、PBSですすぎ、放射能をγカウンター中で計測する。較正され、減衰補正された放射能濃度を試料1グラム当たりの注入量のパーセント(% ID/g)として表すことができる。さらに、ブロッキング実験では、実証されたαvβ6標的化ペプチド[19F]FBA-PEG28-A20FMDV2を放射性トレーサーの10分前に静脈内注入することができ(30mg/kg、生理食塩水中10mg/ml)、切開および解析を上記のように1時間の時点で行うことができる。インビボでのトレーサー安定性の評価のために、腫瘍、腎臓、および尿の試料を解析する。腫瘍および腎臓中での安定性を評価するために、放射標識ペプチドを上記のように注入することができる。αvβ6陽性の腫瘍および腎臓を収集し(1時間)、PBS中で均質化することができる。タンパク質をエタノールで沈殿させ、放射能を計測し、上清をHPLCで分析してインタクト放射標識ペプチドのパーセントを測定する。入手可能な場合は、体内分布試験中に過剰の尿をHPLC分析用に採取する。さらに、2組の腫瘍を凍結培地に埋め込み、直ちに切片にすることができる(オートラジオグラフィー用に20μm、IHC用に5μm、交互)。オートラジオグラフィー試料をストレージフォスファスクリーンに終夜曝露し、ホスフォイメージャーを使用して読み取る。放射能が減衰した時点でIHCを行うことができる。切片を固定し(ホルムアルデヒド)、ブロッキングし(3% H2O2水溶液)、抗インテグリンβ6抗体およびペルオキシダーゼ標識二次抗体と共にインキュベートした後、3-アミノ-9-エチルカルバゾール(AEC)で発色させ、マイヤーヘマトキシリンで対比染色する。
【０２２９】
2.2 インビボ薬物動態を改善するためのアルブミン結合性モチーフ
「ホーミング」ペプチドを腫瘍標的化に適用することの1つの欠点は、インビボ半減期が短いことである。半減期を増加させるための以前の努力は、投与前の精製アルブミンなどの担体分子への共有結合を含んだ(49、50)。他の非共有結合的アプローチも検討された。Dennisらは、アルブミンとアルブミン結合性ペプチドに結合した抗体断片との間の非共有結合的相互作用を記述した(51)。ここでは、薬物動態的利点は、放射性トレーサーと血流中に存在するアルブミンとの非共有結合的相互作用によって実現される。このアプローチでは、断片の腫瘍取り込みの増加が観察されなかっただけでなく、腎滞留も観察されなかった。直近では、DNAコード化学ライブラリーをスクリーニングすることで発見された、HSAに結合する4-(4-ヨードフェニル)酪酸ベースの小分子を使用することで、小さな葉酸結合体を使用する葉酸受容体の最初の標的化を促進した(52)。Schibliらによる研究に記載のように、このアルブミンバインダー(図24)が177Lu標識葉酸に結合した際に、高い腫瘍取り込みおよび有意に減少した腎蓄積が観察された(53、54)。PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28および他の類似体の血中半減期を改善するために、この非共有結合的アプローチを使用することができる。放射標識に対するキレート剤ベースのアプローチは、放射性同位体の選択に関する柔軟性が最大であり、最終精製が容易である。さらに、腎捕捉において役割を果たすと考えられる補欠分子族放射標識の形式電荷を、異なる数の負電荷を有するキレート剤(例えばDOTA、NOTA、CB-TE2A)を選択することで修正することができる。このアプローチは、ペプチドの循環時間を増加させることに加え、放射標識キレート類似体で観察された問題ある腎滞留を減少させる可能性も有する。Al[18F]-NOTA-PEG28-A20FMDV2は4時間で229% ID/gの腎取り込みを示し、これに対して、[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28は4時間で7.87% ID/gの腎取り込みしか示さなかった(図25)。
【０２３０】
特定の場合では、アルブミンに対するアルブミンバインダーの親和性が微調整可能であると示されたことから、4-(4-ヨードフェニル)酪酸中のヨウ素をメチルもしくは臭素などの基で置き換え、かつ/またはアルキル鎖を短縮する。他の場合では、単一のシステイン残基がアルブミンのCys34と一時的ジスルフィド結合を形成することでペプチドトレーサーの腫瘍標的化を促進すると示されたことから、ペプチドのモノシステイン修飾を導入する(55)。
【０２３１】
2.2.a) 合成
アルブミンバインダーを4-(4-ヨードフェニル)酪酸(IPA)およびFmoc-Lys-OAllからFmoc化学反応(図26のスキーム1)を使用して構築することができる。Fmoc除去後、アリル保護アルブミンバインダー(図24)を第1のアミノ酸の側鎖(Fmoc-Glu(OH)-)に固相でカップリングし、続いて標準的なペプチド構築を行うことができる(アリル保護基をアルブミンバインダーから除去した後、トリフルオロ酢酸(TFA)切断を行うことができる)。放射性金属標識では、キレート剤(DOTA、NOTA)をモノ無保護酸、続いて酸として導入した後、切断、HPLC精製、および溶液相放射標識を行う(図26のスキーム1)。固相放射標識(例えば[18F]FBAによる)では、補欠分子族を(キレート剤の代わりに)遊離N末端にカップリングした後、切断、続いて放射性HPLC精製を行うことができる。
【０２３２】
両末端PEG化A20FMDV2ペプチドのN末端に導入されたK(IPA)Eと呼ばれるアルブミン結合基(すなわちε-(4-(4-ヨードフェニル)ブチルアミド)リジン-グルタミン酸)
0006789823.tif 000010
を用いる試験は、K(IPA)Eを有さないPEG化A20FMDV2の標的に対する親和性(IC50 = 2nM)に比べて高い標的に対する親和性(IC50 = 1nM)を(ELISAにおいて)示した。また、インテグリンαvβ6発現DX3puroβ6細胞およびαvβ6陰性DX3puro対照を使用する細胞ベースの結合および内部移行アッセイにおいて、腫瘍特異性および腫瘍選択性が示された(図27)。K(IPA)E含有放射性トレーサーおよびそのK(IPA)E無しの対照はいずれも52%でDX3puroβ6細胞に結合し、K(IPA)E含有放射性トレーサーでは結合放射能の56%が内部移行した(一方、対照では44%)。これに比べて、αvβ6陰性DX3puro対照では、両放射性トレーサーの結合および内部移行は少なかった。
【０２３３】
2.2.b) インビトロ解析(タンパク質結合アッセイ)
以前に記載された方法を使用する限外濾過アッセイを使用して放射標識アルブミンバインダー・ペプチドの結合を測定する。インキュベーション期間の終わりにCentrifree限外濾過装置を使用することで、血漿アルブミン結合画分から遊離放射標識ペプチドを分離することができる。濾液をγカウンター中で計測し、結合パーセントを測定することができる。ペプチドと共にインキュベート(37℃; 5分、15分、30分、60分)した血漿試料に対してサイズ排除HPLCを行うことで、結合動態を評価することができる。すべての他のインビトロおよびインビボスクリーニングは上記1.2.b)節、1.2.c)節、および2.1節に記載のように進行しうる。
【０２３４】
2.2.c) 非ヒト霊長類試験
多量体化およびアルブミン結合性モチーフ付加の影響をインビトロおよびインビボで明確に定量化することができ、αvβ6に対する高い親和性(例えば1nM未満)、良好な選択性(例えば他のインテグリンに対する親和性の1000倍超の親和性)を良好なインビボ挙動および有意に改善されたインビボ安定性と共に有する化合物を同定することができる。総腫瘍取り込み、腎臓などの臓器からの速やかなクリアランス、合成速度、単純性、部位特異的標識、放射化学的収率、および比放射能などの他の判定基準を、アカゲザルなどの非ヒト霊長類(NHP)におけるさらなる評価に進めるべき化合物のさらなる選択のために考慮に入れることができる。最適化されたペプチドの体内分布および安全性を評価するために、NHP試験を行うことができる。NHPは、ヒトと比較して生殖的、発育的、生理的、遺伝子的、および免疫的に類似していることから、必要かつ予測的なトランスレーショナルモデルおよび前臨床モデルを提供する。これらの試験では、αvβ6親和性および選択性に基づいて同定される2つのリードペプチドを選択することができ、インビボでのαvβ6(+)腫瘍標的化および腫瘍滞留性ならびに非腫瘍組織からのクリアランスを、既定の技術を使用して4匹のアカゲザル(雄2匹、雌2匹)において評価することができる。マウスにおける広範な試験の後に試験される各ペプチドについて、4匹のアカゲザル(Macaca mulatta)が2つの対(それぞれ雄1匹、雌1匹)として含まれる。このアプローチは、雄/雌の対の同時試験を可能にするものであり、動物の数を保ちながら交絡変数を排除する。これらの試験は、動物を同時に画像化することも可能にする。
【０２３５】
全身線量測定を行うことができる。動物を終夜絶食させた後、標準化プロトコルを使用してこれらの手順のためにテラゾール(telazol)/ケタミンで鎮静させる。動物をPET/CTスキャンベッド上に仰臥位で置き、動物に放射標識ペプチドを静脈内(IV)注入し(2匹同時に注入)、30分間画像化し、次にこれを注入2時間後および4時間後に繰り返す。血液(末梢血管; 約2ml)および尿試料(超音波ガイド下膀胱穿刺; 約1mL)を各時点でHPLC分析用に採取する。画像化中に酸素飽和度をパルスオキシメーターでモニタリングし、循環水加熱パッドを使用して体温を維持する。画像化後に動物を放射線モニタリングのために指定の代謝室に置いた後、放射線が排出された時点で通常の飼育場に戻す。作成された豊富なマウスおよび霊長類データから、αvβ6標的化腫瘍取り込み性および腫瘍滞留性(マウスモデル)と好ましい全体的薬物動態、特に腎クリアランス(霊長類画像化)との最も好ましいバランスを取る、リード画像化剤を選択することができる。図28は、健康なアカゲザルにおいて[18F]FBA-PEG28-A20FMDV2(K16R)-PEG28の共焦点PET/CTスキャン画像を示す。
【０２３６】
要約
本実施例は、新規αvβ6インテグリン標的化分子画像化剤および治療戦略の設計、合成、および評価を示す。この受容体が、がんにおいて広く認められ、転移能に関連し、患者生存率と負の相関にあることから、また、画像化および治療用の標的としてαvβ6に言及する文献報告が増えていることから、これらの新規分子画像化剤および治療戦略は、時宜にかなっており、非常に臨床的に関連性が高い。
【０２３７】
参考文献
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0006789823.tif 000012
0006789823.tif 000013
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【０２３８】
実施例4
改善された安定性、放射標識収率、および親油性を有するαvβ6標的化分子画像化および治療用の両末端PEG化ペプチド
本実施例は、PEG11(すなわち11個の繰り返し単位のポリエチレングリコール)などの比較的短いPEG部分を使用する両末端PEG化が、αvβ6インテグリンに結合する8アミノ酸ペプチド(すなわちRSDLTPLF)に、該ペプチドの血清中での安定性、放射標識収率、および親油性を改善することで、優れたインビトロ特性を与えることができたことを示す。親ペプチドH-RSDLTPLFNH2は7nMという高い親和性を有し、αvβ3に対する選択性よりも100倍高いαvβ6に対する選択性を示すが、このペプチドに関する血清安定性試験は低いインビトロ安定性を示した。したがって、本実施例は、このペプチドの両末端PEG化バージョンが、インビボ画像化および治療のために、高いαvβ6インテグリンに対する選択性および高い血清安定性を好都合に提供することを示す。
【０２３９】
I. 材料および方法
材料
別途指定がない限り、すべての化学物質をSigma Aldrich(ミズーリ州セントルイス)、Acros(ニュージャージー州)、Fluka(ミズーリ州セントルイス)、およびFisher Scientific(マサチューセッツ州ウォルサム)から購入した。NovaSyn TGR樹脂をNovabiochem(カリフォルニア州ラホヤ)から購入した。9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)アミノ酸およびペプチド合成試薬をNovabiochemおよびGLS-China(中国・上海)から購入した。11個の繰り返し単位のポリエチレングリコール(PEG11)をPolypure(ノルウェー・オスロ)から購入した。使用したすべてのアミノ酸はL-アミノ酸とした。
【０２４０】
手動固相ペプチド合成を、Breakwood Enterprises(オハイオ州アクロン)およびFisher Scientificから購入したフリット付き1mLまたは5mL反応バイアル中で標準的Fmoc化学反応を使用して行った。逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を、220nmおよび254nmのダイオードアレイUV検出器を32Karatソフトウェアパッケージと共に備えるBeckman-Coulter(カリフォルニア州ブレア)クロマトグラフィーシステムを使用して、またはダイオードアレイUV検出器をChromeleonソフトウェアパッケージと共に備えるDionex(カリフォルニア州サニーベール)によるUltimate 3000 RP-HPLCシステムを使用して行った。精製および分析を、Jupiter C-12カラム(250x460mm、4ミクロン、Phenomenex)を水中0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)(溶媒A)および100%アセトニトリル(溶媒B)からなる移動相と共に使用して行った。生成物を、2分間の9% 溶媒Bから30分かけて81% 溶媒Bに増加する直線勾配を使用して、1.5mL/分の一定流量でカラムから溶離した。精製化合物の質量分析(MS)を、ABI 4700高分解能マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)システム(カリフォルニア州フォスターシティ、Applied Biosystems)を使用して行った。
【０２４１】
放射標識用[18F]フッ化物イオンを、Center for Molecular and Genomic Imaging(カリフォルニア州デイビス)においてインハウスで11MeV Siemens RDS 111陰イオンサイクロトロンを使用する18O(p,n)18F反応によって生成したか、またはPETNET Solutions(カリフォルニア州サクラメント)から購入した。放射能をCapintecドーズキャリブレータ(ニュージャージー州ラムジー、Capintec Inc)を使用して計測した。HPLC gold 168(Beckman-Coulter)をGabistar放射線検出器(ドイツ・シュトラウベンハウト、Raytest)と直列させて使用することで、試料の純度および放射化学純度をそれぞれ計測した。検出器を並列接続したところ、放射性化合物およびそれらの対応する非放射性標準について保持時間のわずかな差が観察された。
【０２４２】
各ペプチドの親和性をNunc Maxisorp平底96ウェルプレート(カリフォルニア州サンジエゴ、affymetrix ebioscience)上でELISAにより評価した。インテグリンαV抗体P2W7をNovus Biologicals(コロラド州リトルトン)から購入した。ウシ血清アルブミン(BSA)をVWR(ペンシルベニア州ラドノール)から購入し、TMB one溶液をPromega(ウィスコンシン州マジソン)から購入した。αvβ6インテグリンをR&D systems(ミネソタ州ミネアポリス)から購入した。タンパク質ビオチン化キットをAmersham plc(英国Amersham)から購入し、一方、競合性天然リガンドフィブロネクチンをInvitrogen(カリフォルニア州カールスバッド)から購入した。親和性を、Ascentの関連ソフトウェアを備えたThermo Multiscanプレートリーダー(マサチューセッツ州ウォルサム、Thermofisher)によって吸光度単位で計測した。
【０２４３】
NH2-ペプチドの固相合成
ペプチド合成を標準的Fmoc固相技術を使用して手動で行った(表3)(Chan et al., (2003) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis. A Practical Approach. Oxford University Press)。Novasyn TGR樹脂(300mg)を秤量し、5ml反応バイアルに移した。N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)を反応バイアルに1.5時間かけて加えて樹脂を膨潤させ、次に減圧排水した。アミノ酸カップリングを、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HATU)および(Fmoc)保護アミノ酸3当量ならびにN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)6当量を反応バイアルに加え、自動回転子上で1.5時間かけてカップリングすることで行った。
【０２４４】
（表３）合成されたペプチドのリスト。[19F]FBAなしで合成されたペプチド(左欄)、FBAありで合成されたペプチド(右欄)。
0006789823.tif 000019
【０２４５】
カップリング反応を、プロリンを除くすべてのアミノ酸についてピクリルスルホン酸(PSA)試験によりモニタリングし、プロリンではクロラニル試験を使用した(Chan et al., 2003)。樹脂ビーズの試料をセラミック試験プレート上に置き、DMF 100μL、DIPEA 10μL、およびPSA 1滴からなるPSA試験溶液1滴を試料に加えた。第二級アミンの場合、DMF(3x)で洗浄した後にクロラニル試験を行った; DMF 2.5mL中のp-テトラクロロベンゾキノン53mgおよびアセトアルデヒド50μLからなるクロラニル溶液1滴(Chan et al., 2003)。未反応遊離アミンの存在により、PSA試験では赤色のビーズが生じ、クロラニル試験では青色が生じる。カップリング反応の完了後、ビーズをDMF(3x)ですすぎ、排水した。Fmoc除去を、DMF中20%ピペリジンを15分間(2x)使用して実現した。続いて樹脂をDMF(3x)、メタノール(3x)、およびDMF(3x)で洗浄した後、PSA試験またはクロラニル試験を行った。所望のペプチド配列が完成されるまで、アミノ酸をカップリングするためのプロセスを繰り返した。
【０２４６】
Boc-RSDLTPLFK(NH2)-NH2の場合、Fmoc-Lys(ivDde)-OH(3当量)、HATU(2.99当量)、およびDIPEA(6当量)をDMF中に加え、固相ペプチド合成について記載の条件でカップリングを行うことで、Fmoc-Lys(ivDde)-OHを最初に樹脂にカップリングした。残りの配列のカップリングは、アミノ酸を標準的な保護基と共に使用したが、但しアルギニンの付加ではBoc-Arg(Pbf)-OHをFmoc-Arg(Pbf)-OHの代わりに使用し、これにより、樹脂からの切断後に遊離N末端アミンを得た。配列の伸長が完了した後、リジン上の1-(4,4-ジメチル-2,6-ジオキソシクロヘキサ-1-イリデン)イソバレリル(ivDde)保護基の脱保護を、該ペプチドとヒドラジン60μLとをDMF 2.94mL中で15分間(2x)混合することで行った(Conroy et al., (2008) Efficient use of the Dmab protecting group: applications for the solid-phase synthesis of N-linked glycopeptides. Organic & Biomolecular Chemistry 7(11):2255-2258)。樹脂をDMF(3x)、MeOH(3x)、およびDMF(3x)ですすぎ、PSA溶液で試験して遊離アミンの存在を測定した。
【０２４７】
H-RSDLTPLFK(Boc)-NH2の場合、Fmoc-Lys(Boc)-OH(3当量)、HATU(2.99当量)、およびDIPEA(6当量)をDMF中に加え、固相ペプチド合成について記載の条件でカップリングを行うことで、Fmoc-Lys(Boc)-OHを最初に樹脂にカップリングした。残りのカップリングはアミノ酸を標準的な保護基と共に使用した。
【０２４８】
H-RSDLTPLF-PEG11-NH2およびH-PEG11-RSDLTPLF-PEG11-NH2の合成では、Fmoc-PEG11-OH(1.1当量)、HATU(1.1当量)、およびDIPEA(2当量)をDMF中に加え、自動回転子上に16時間置くことでFmoc-PEG11-OHを最初に樹脂にカップリングした後、2回目のカップリングを6時間かけて行った。カップリング反応をPSA試験でモニタリングした。カップリング反応の完了後、ビーズをDMF(3x)ですすぎ、排水した。Fmoc除去を行った。残りの配列は、アミノ酸と標準的な保護基とをカップリングすることで完成させた。H-PEG11-RSDLTPLF-NH2およびH-PEG11-RSDLTPLF-PEG11-NH2のN末端PEG化を、カップリングおよびN末端アルギニンのFmoc脱保護の成功後に行った。Fmoc-PEG11-OH(1.1当量)、HATU(1.1当量)、およびDIPEA(2当量)をDMF中に加え、自動回転子上に16時間置くことでFmoc-PEG11-OHを樹脂(ペプチジル樹脂)上のペプチドにカップリングした後、2回目のカップリングを6時間かけて行った。カップリング反応をピクリルスルホン酸(PSA)試験でモニタリングした。
【０２４９】
c(RSDLTPLFE)Kの合成および環化を固相ペプチド合成によって実現した。Fmoc-Lys(ivDde)-OH(3当量)、HATU(2.99当量)、およびDIPEA(6当量)をDMF中に加え、固相ペプチド合成について記載の条件でカップリングを行うことで、Fmoc-Lys(ivDde)-OHを最初に樹脂にカップリングすることによって、c(RSDLTPLFE)K-NH2の合成を実現した。その後、Fmoc-Glu(OAll)-OH(3当量)、HATU(2.99当量)、およびDIPEA(6当量)をDMF中に加えることで、Fmoc-Glu(OAll)-OHをカップリングした。残りのカップリングはアミノ酸を標準的な保護基と共に使用した。配列が完全に構築された後、樹脂を凍結乾燥器によって終夜乾燥させた。ペプチジル樹脂をすすぎ、ジクロロメタン(DCM)中で膨潤させた。フェニルシラン20当量およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)0.5当量をDCM約2〜3mL中に加えることで、グルタミン酸のアリル側鎖を脱保護した。
【０２５０】
フェニルシラン/テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)溶液を窒素で短時間バブリングし、ピペットで反応容器に入れることでペプチジル樹脂に加え、回転子上に30分間(2x)置いた。その後、ペプチジル樹脂をDMF中1% DIPEA(v/v)(3x)、100% DMF(3x)、DMF中5%ジエチルジチオカルバミン酸(wt/v)ナトリウム塩(3x)、および100% DMF(3x)で洗浄した(Chan et al., 2003)。次にペプチジル樹脂をMeOH(3x)およびDMF(3x)で洗浄した。Fmoc保護基を除去した。ペプチドを環化するために、HATU(0.99当量)およびDIPEA(2.0当量)をDMF 2mLと混合し、ペプチジル樹脂に加え、回転子上に16時間置いた。カップリングの完了をPSA試験で計測した。環化後、ペプチジル樹脂とDMF中2%ヒドラジン溶液とを15分間(2x)混合することで、(ivDde)の側鎖を除去した。ペプチジル樹脂をDMF(3x)、MeOH(3x)、およびDMF(3x)ですすぎ、PSA溶液で試験して遊離アミンの存在を測定した。
【０２５１】
純度を試験するために、ペプチドの試料を樹脂(10mg)から切断し、側鎖保護基を94:2.5:1:2.5(v/v/v/v)のトリフルオロ酢酸(TFA)/1,2-エタンジチオール/TIPS/水を3時間使用することで除去した。切断後ワークアップは、TFAを低圧気流で蒸発させた後、水1mLを加えることからなった。次に粗ペプチドを水およびエチルエーテルに溶解させ、緩やかに混合し、エーテル層を除去した。混合およびエーテル除去を行った(3x)ところ、粗ペプチドが水層中に単離された。水層を凍結乾燥させた。分析精製を、2分間の9% 溶媒Bから30分かけて81% 溶媒Bに増加する直線勾配でのRP-HPLCにより実現した。生成物を収集し、凍結乾燥させ、生成物の質量をMALDI-TOFを使用して測定した。
【０２５２】
[19F]FBAペプチドの合成
NH2-ペプチド配列の完成後、[19F]FBA(非放射性FBA)を各ペプチドに部位特異的に結合させた(表3)。各ペプチジル樹脂10mgを[19F]FBA(10当量)、HATU(20当量)、およびDIPEA(40当量)と1.5時間かけてカップリングした。次にペプチドを切断した。生成物をRP-HPLCで分析し、質量をMALDI-TOFで確認した。
【０２５３】
インテグリンαvβ6用の[19F]FBAペプチドのELISA
αvβ6およびαvβ3に対する各[19F]FBAペプチドの親和性を競合的結合ELISAによって比較した(Gagnon et al., (2009) High-throughput in vivo screening of targeted molecular imaging agents. Proceedings of the National Academy of Sciences 106(42):17904-17909)。ペプチドを、αvβ6の天然リガンドであるビオチン化フィブロネクチンと、またはαvβ3をめぐって競合する場合はビオチン化ビトロネクチンと1時間競合させた。簡潔にいえば、96ウェルプレートを50μL/ウェルのリン酸緩衝食塩水(PBS)中5μg/mL P2W7で37℃で1時間コーティングした。プレートをPBSで3回洗浄した後、5%ウシ血清アルブミン(BSA; 画分V; w/v)および1% Tween 20(v/v)を含有するPBSにより4℃で16時間処理して非特異的結合をブロッキングした。プレートをPBSで洗浄し、50μL/ウェルの洗浄緩衝液(WaB)中インテグリンで1時間コーティングした後、WaBで3回洗浄した。WaBは、2mmol/L Tris緩衝液(pH 7.6)、150mmol/L塩化ナトリウム、1mmol/L塩化マンガン、および0.1% Tween 20(v/v)の脱イオン水溶液からなった。三つ組のウェルを、WaB中1% BSA(画分V; w/v)からなる結合緩衝液中のαvβ6用ビオチン化フィブロネクチン(BtFn)またはαvβ3用ビオチン化ビトロネクチン(BtVn)と、ペプチドストック(2mmol/L; 水中10% DMSO(v/v))の1μM〜1pMの段階希釈液との等量混合物50μL/ウェルでコーティングした。ペプチドを含まないウェル、ペプチドおよび抗体を含まないウェル、またはペプチドおよびリガンドを含まないウェルを対照として使用した。プレートを室温で1時間インキュベートし、WaBで3回洗浄した後、ExtrAvidin-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体(50μL/ウェル、結合緩衝液中1:1,000希釈)を室温で1時間かけて加えた。WaBで洗浄した後、結合BtFnまたはBtVnをTMB(50μL/ウェル)の添加および10〜15分間のインキュベーションによって検出した。反応を1N硫酸50μL/ウェルの添加により終了させ、吸光度を450nmで計測した(酸性化酸化TMBの黄色はフィブロネクチン結合を示す)。IC50値の計算はPrismソフトウェア(GraphPad Software)によるデータ解析に基づく。
【０２５４】
[18F]FBAによるαvβ6標的化ペプチドの固相放射標識
以前に公開された方法を固相放射標識技術に応用した(Hausner et al., (2009) Targeted In vivo imaging of intergrin αvβ6 with an improved radiotracer and its relevance in a pancreatic tumor model, Cancer Research, 69:5843)。[18F]フッ化物イオン(0.6〜2.8Ci)をサイクロトロンにより生成し、イオン交換捕捉および放出カラム(テネシー州オークデール、ORTG)上に送達した。次に[18F]フッ化物イオンを4,7,13,16,21,24-ヘキサオキサ-1,-10-ジアザビシクロ[8.8.8]ヘキサコサン(K222)および炭酸カリウム(K2CO3)溶液(ACN 9.4mL中K222 100mg、H2O 0.6mL中K2CO3 20mg)2mLと共に5mL円錐バイアル中に溶出した。残留水を窒素流を使用する100℃での蒸発により除去し、ACN 1mL(3x)の添加による共沸蒸留により乾燥させた。[18F]FBA前駆体溶液(無水DMSO 0.5mL中エチル4-(トリメチルアンモニウムトリフレート)ベンゾエート 5mg)を円錐バイアル(15分、100℃)に加えた後、0.5N水酸化ナトリウム(NaOH)1.0mLを加え、100℃で10分間加熱した。次に溶液を吸引して、1N塩酸(HCL)2mLおよびH2O 6mLを収容するシリンジに入れた。生成物をC-18 SepPakカラム(マサチューセッツ州ミルフォード、Waters)上に捕捉し、H2O 5mLで洗浄し、ACN 2.2mLで溶出してDMF 50μLを収容する5mL円錐バイアルに入れた。残留溶媒を蒸発させてDMF中に[18F]FBAを残した。
【０２５５】
[18F]FBA(500mCi)を各ペプチジル樹脂に固相カップリング技術を使用してカップリングした。ペプチジル樹脂(3〜5mg)をフリット付き1mLシリンジ中に入れ、DMF中で1時間膨潤させた後、放射標識した。DMFを各ペプチドシリンジから追い出し、DMF中の[18F]FBA 0.5〜1.0Ciを各ペプチドシリンジに取り込んで樹脂結合ペプチドにカップリングした。次にHATU(DMF 30μL中15〜30当量)およびDIPEA(DMF 20μL中30〜60当量)をシリンジに取り込み、室温で30分間反応させた。[18F]FBAのカップリング後、ペプチジル樹脂をDMF(3x)、MeOH(3x)、および空気(3x)で徹底的に洗浄し、放射能を記録した。TFA/TIPs/水95:2.5:2.5(v/v/v)250μLを15分(2x)かけて加えることで、最終生成物を樹脂から切断した。放射能をCapintecドーズキャリブレータで計測し、合成の開始時、カップリング後、およびTFA蒸発後(合成の終了時)に記録した。次に切断混合物を窒素下で蒸発させ、最終生成物をHPLC溶媒A/ACN 50/50(v/v)混合物0.5mL中で再構成した。HPLC前の総合成時間および最終生成物の放射能を記録した。RP-HPLCについて以前に記載の条件で放射性RP-HPLCを使用して精製を行った。次に各HPLC精製[18F]FBAペプチドをC18 SepPak plus(条件は無水EtOH 10mL、水10mL、空気3x10mL)上に捕捉した。SepPakを水5mLおよび空気20mL、続いて無水EtOH 250uLおよび空気20mLで洗浄した。次に[18F]FBAペプチドを無水EtOH/氷酢酸100:1 1mLでSepPakから溶出し、乾燥させ(50℃、25分)、次にPBS 1mL中で製剤化した。
【０２５６】
[18F]FBAペプチドの血清安定性
マウス血清中のプロテアーゼに対するペプチド感受性を測定した。製剤化された[18F]FBAペプチド(100μCi)をマウス血清1mLと共に37℃で1時間インキュベートした。100μLアリコートを1時間で採取し、無水EtOH 500μLを収容するエッペンチューブ(4℃)に移して血清タンパク質を沈殿させた。試料を短時間混合し、ドライアイス上で3分間冷凍した後、10,000gで2.5分間遠心分離した。次に上清100μLをHPLC溶媒A(0.05% TFA/水)700μLおよび氷酢酸(HOAc)20μLと混合し、放射性RP-HPLCで分析した。
【０２５７】
αvβ6標的化ペプチドの分配係数
分配係数(logD)は、イオン化溶液中の化合物の親油性の尺度となる。製剤化された[18F]FBAペプチドをPBS中で濃度4μCi/mLに希釈して放射標識ペプチドストック溶液を形成した。放射標識ペプチドストック溶液50μLのアリコートをエッペンチューブ(1.5mL)に移した。PBS(親水性層)450μLおよびn-オクタノール(親油性層)500μLを加えた。エッペンチューブを3分間ボルテックスした(実験を四つ組で行った)。試料を10,000rpmで6分間遠心分離して、上層(n-オクタノール)および下層(PBS)からなる2つの別々の層を形成した。各層100μLをピペット採取し、各層中の放射能をγカウンターで計測および記録した。logDは下記式から計算する。
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【０２５８】
II. 結果
[19F]FBAペプチドのELISA
[19F]FBAペプチド配列のαvβ6およびαvβ3の両方に対する親和性をELISAによって計測した。αvβ6に対するペプチドのIC50は1.97nM(H-RSDLTPLFK([19F]FBA)-NH2)から300nM超(c(RSDLTPLFE)K([19F]FBA)-NH2)の範囲であった(表4)。
【０２５９】
（表４）PRISMにより計算されたELISAによるαvβ6に対する[19F]FBAペプチドのnM単位のIC50値
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【０２６０】
αvβ3に対するすべてのペプチドのIC50は100μM超であった。αvβ6対αvβ3で[19F]FBAペプチドの選択性を比べると300〜10,000倍の範囲でαvβ6が上回った。[19F]FBAペプチドのELISAは、c(RSDLTPLFE)K([19F]FBA)-NH2を例外として、一桁〜二桁のナノモルという低範囲のIC50でαvβ6に対する高い親和性を示した。
【０２６１】
[18F]FBAによるαvβ6標的化ペプチドの固相放射標識
[18F]FBAを最終純度95%超で合成した。[18F]FBAを収率80.5±12%で合成し、放射性RP-HPLCにより純度95%超であると確認した。[18F]FBAペプチドを、[18F]FBAカップリングの開始からTFA蒸発の終了までの減衰補正後の6.8±1.0%〜65.9±5.5%の範囲の放射標識収率で合成した(表5)。
【０２６２】
（表５）[18F]FBAペプチドおよび[18F]FBAカップリングの開始に対して減衰補正されたそれらの放射標識収率
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【０２６３】
PEG11の付加により放射標識収率が2〜7倍増加した。[18F]FBA-PEG11-RSDLTPLF上のN末端のPEG11により放射標識収率が9.2%から17%にほぼ倍増し、一方、C末端のPEG11により放射標識収率が9.2%から42.2%へと4倍に増加した。両PEG化ペプチド[18F]FBA-PEG11-RSDLTPLF-PEG11-NH2は放射標識収率を9.2%から65.9%へと7倍に増加させた。特定の理論に拘束されるものではないが、PEG単位を付加することで、遊離アミンが樹脂からさらに伸長し、これにより潜在的に該アミンが[18F]FBAにより到達しやすくなり、したがって放射標識収率が増加すると考えられる。
【０２６４】
[18F]FBAペプチドの血清安定性
インタクトペプチドのレベルを各[18F]FBAペプチドについてマウス血清中で1時間のインキュベーション後に計測した(表6)。無修飾ペプチド[18F]FBA-RSDLTPLF-NH2はマウス血清中、1時間で66%インタクトであることを示した。全体的に、インタクト[18F]FBAペプチドのパーセントは18.6〜99.7%の範囲であった。
【０２６５】
（表６）[18F]FBAペプチドおよび放射性RP-HPLCで計測されたそれらの1時間血清安定性
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【０２６６】
最初の修飾NH2-RSDLTPLFK([18F]FBA)-NH2は、該ペプチドがマウス血清中で1時間後に18.6%に分解されたことから、より悪い結果を示した。曝露されたN末端がアミノペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼなどの酵素に感受性があることから、ペプチドが速やかに分解される。[18F]FBA-RSDLTPLFK(NH2)-NH2中の[18F]FBA標識N末端について、プロテアーゼによるペプチドの分解はほぼ観察されず、マウス血清中で1時間後にペプチドの95.2%がインタクトであった。
【０２６７】
H-RSDLTPLF-NH2のC末端にリジンを付加することは、ペプチド配列のプロテアーゼ認識を減少させて、潜在的にペプチドの大部分をインタクトなままにすることに役割を果たすようである。同様に、N末端もしくはC末端でのPEG化、または両PEG化によって血清安定性が有意に改善され、血清安定性はそれぞれ94.6%、99.1%、および99.7%であった。N末端またはC末端にPEG11を付加することは、プロテアーゼ相互作用を防止することに役割を果たした。したがって、両PEG化[18F]FBA-PEG11-RSDLTPLF-PEG11-NH2は、マウス血清中で1時間インキュベートした後に最大パーセントのインタクトペプチドを有することで、この傾向をさらに永続させた。
【０２６８】
αvβ6標的化ペプチドの分配係数
各放射標識ペプチドの親油性を各修飾について計測した。logDは-1.86±0.26〜0.45±0.03の範囲であった(表7)。ベースペプチド[18F]FBA-RSDLTPLF-NH2は初期logD値0.45を有し、わずかな親油性を示した。多くの場合、親油性であるペプチドは、腹部中で比較的高いシグナルを示すインビボ画像を生じさせる肝胆道クリアランスに関連している(Hosseinimehr et al., (2012) Liver uptake of radiolabeled targeting proteins and peptides: considerations for targeting peptide conjugated design, Drug Discovery Today 17(21-22):1224-32)。すべての修飾は親油性を減少させ、減少が最小なのはc(RSDLTPLFE)K([18F]FBA)-NH2でlogDは0.02であり、減少が最大なのは両PEG化によるものでlogDは-1.86であった。親油性の減少はいくつかの潜在的な薬物動態上の利点を示し、その利点としては、肝胆道クリアランスから腎クリアランスへの移行、および、望ましい速やかな腎排泄を可能にすることで潜在的にインビボ画像化のために腹部バックグラウンドを減少させることなどがある(Hosseinimehr et al., 2012)。
【０２６９】
（表７）[18F]FBAペプチドのLogD値
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【０２７０】
結論として、本実施例は、構造PEG11-RSDLTPLF-PEG11を有する本発明の両末端PEG化ペプチドが、親ペプチド配列、該ペプチドの環化バージョン、および該ペプチドの個々のN末端またはC末端PEG化バージョンに比べて高いαvβ6インテグリンに対する選択性ならびに改善された血清安定性、放射標識収率、および親油性を好都合に提供することを示す。
【０２７１】
本明細書中で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み入れられるように指示されているかのように、参照により本明細書に組み入れられる。以上の発明を、理解を明確にする目的で例証および例示を用いて若干詳細に説明してきたが、本発明の教示に照らせば、当業者には、添付の特許請求の範囲の真意および範囲を逸脱することなく、特定の変更および修正を本発明に加えることができることは自明であろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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