(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
観察対象物の蛍光を励起するポンプ光を周波数ｆ１で強度変調する第１の強度変調部と、
前記観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調する第２の強度変調部と、
強度変調された前記ポンプ光および前記プローブ光を照射した前記観察対象物からの蛍光を受光する受光部と、
前記受光部で検出される受光信号のうち周波数ｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ただし、ｉおよびｊは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する検出部と
を備える蛍光観察装置。
【請求項２】
前記ポンプ光および前記プローブ光で前記観察対象物を二次元的に走査する走査部をさらに備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
前記走査部は、主走査方向を走査する共振ミラーと副走査方向を走査するガルバノミラーとを有する請求項２に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
前記受光部は、前記走査部を前記ポンプ光および前記プローブ光とは逆方向に通過した蛍光を受光する請求項３に記載の蛍光観察装置。
【請求項５】
前記受光部の直前に配されたピンホールをさらに備え、前記受光部は前記ピンホールを通過した蛍光を受光する請求項４に記載の蛍光観察装置。
【請求項６】
前記第１の強度変調部は、
前記ポンプ光を二つの直交する偏光に分離する偏光ビームスプリッタと、
一方の偏光の光周波数を音響波の周波数ｇ１だけシフトする第１の音響光学周波数シフターと、
他方の偏光の光周波数を音響波の周波数（ｇ１＋ｆ１）だけシフトする第２の音響光学周波数シフターと、
強度が変調された二つの偏光を合波する偏光ビームコンバイナと、
合波されたポンプ光のうち、前記二つの直交する偏光の偏光方向とは異なる偏光方向の偏光を透過することにより、前記周波数ｆ１で強度変調されたポンプ光を出射する偏光子と
を有し、
ｉが２以上である請求項１から５のいずれか１項に記載の蛍光観察装置。
【請求項７】
前記第２の強度変調部は、
前記プローブ光を二つの直交する偏光に分離する偏光ビームスプリッタと、
一方の偏光の光周波数を音響波の周波数ｇ２だけシフトする第１の音響光学周波数シフターと、
他方の偏光の強度を光周波数を音響波の周波数（ｇ２＋ｆ２）だけシフトする第２の音響光学周波数シフターと、
強度が変調された二つの偏光を合波する偏光ビームコンバイナと
合波されたプローブ光のうち、前記二つの直交する偏光の偏光方向とは異なる偏光方向の偏光を透過することにより、前記周波数ｆ２で強度変調されたプローブ光を出射する偏光子と
を有し、
ｊが２以上である請求項１から６のいずれか１項に記載の蛍光観察装置。
【請求項８】
観察対象物の蛍光を励起するポンプ光を周波数ｆ１で強度変調する第１の強度変調部と、
前記観察対象物の誘導放出を誘起する第１のプローブ光を前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調する第２の強度変調部と、
前記観察対象物の誘導放出を誘起する、前記第１のプローブ光とは異なる波長の第２のプローブ光を、前記周波数ｆ１およびｆ２とは異なる周波数ｆ３で強度変調する第３の強度変調部と、
強度変調された前記ポンプ光、前記第１のプローブ光および前記第２のプローブ光を照射した前記観察対象物からの、前記ポンプ光および前記第１のプローブ光に対応する蛍光を受光する第１の受光部と、
前記第１の受光部で検出される受光信号のうち周波数ｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ただし、ｉおよびｊは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する第１の検出部と、
強度変調された前記ポンプ光、前記第１のプローブ光および前記第２のプローブ光を照射した前記観察対象物からの、前記ポンプ光および前記第２のプローブ光に対応する蛍光を受光する第２の受光部と、
前記第２の受光部で検出される受光信号のうち周波数ｐ×ｆ１±ｑ×ｆ３（ただし、ｐおよびｑは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する第２の検出部と
を備える蛍光観察装置。
【請求項９】
前記第１の強度変調部は、
前記ポンプ光を二つの直交する偏光に分離する偏光ビームスプリッタと、
一方の偏光の光周波数を音響波の周波数ｇ１だけシフトする第１の音響光学周波数シフターと、
他方の偏光の光周波数を音響波の周波数（ｇ１＋ｆ１）だけシフトする第２の音響光学周波数シフターと、
強度が変調された二つの偏光を合波する偏光ビームコンバイナと、
合波されたポンプ光のうち、前記二つの直交する偏光の偏光方向とは異なる偏光方向の偏光を透過することにより、前記周波数ｆ１で強度変調されたポンプ光を出射する偏光子と
を有し、
ｉおよびｐが２以上である請求項８に記載の蛍光観察装置。
【請求項１０】
観察対象物の蛍光を励起する第１のポンプ光を周波数ｆ１で強度変調する第１の強度変調部と、
前記観察対象物の蛍光を励起する、前記第１のポンプ光とは異なる波長の第２のポンプ光を、前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調する第２の強度変調部と、
前記観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を前記周波数ｆ１およびｆ２とは異なる周波数ｆ３で強度変調する第３の強度変調部と、
強度変調された前記第１のポンプ光、前記第２のポンプ光および前記プローブ光を照射した前記観察対象物からの、前記第１のポンプ光および前記プローブ光に対応する蛍光を受光する第１の受光部と、
前記第１の受光部で検出される受光信号のうち周波数ｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ただし、ｉおよびｊは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する第１の検出部と、
強度変調された前記第１のポンプ光、前記第２のポンプ光および前記プローブ光を照射した前記観察対象物からの、前記第２のポンプ光および前記プローブ光に対応する蛍光を受光する第２の受光部と、
前記第２の受光部で検出される受光信号のうち周波数ｐ×ｆ２±ｑ×ｆ３（ただし、ｐおよびｑは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する第２の検出部と
を備える蛍光観察装置。
【請求項１１】
前記第３の強度変調部は、
前記プローブ光を二つの直交する偏光に分離する偏光ビームスプリッタと、
一方の偏光の光周波数を音響波の周波数ｇ３だけシフトする第１の音響光学周波数シフターと、
他方の偏光の光周波数を音響波の周波数（ｇ３＋ｆ３）だけシフト変調する第２の音響光学周波数シフターと、
強度が変調された二つの偏光を合波する偏光ビームコンバイナと
合波されたプローブ光のうち、前記二つの直交する偏光の偏光方向とは異なる偏光方向の偏光を透過することにより、前記周波数ｆ３で強度変調されたプローブ光を出射する偏光子と
を有し、
ｊおよびｑが２以上である請求項１０に記載の蛍光観察装置。
【請求項１２】
観察対象物の蛍光を励起するポンプ光を周波数ｆ１で強度変調し、
前記観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調し、
強度変調された前記ポンプ光および前記プローブ光を照射した前記観察対象物からの蛍光を受光部で受光し、
前記受光部で検出される受光信号のうち周波数ｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ただし、ｉおよびｊは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する
蛍光観察方法。
【請求項１３】
観察対象物の蛍光を励起するポンプ光を周波数ｆ１で強度変調し、
前記観察対象物の誘導放出を誘起する第１のプローブ光を前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調し、
前記観察対象物の誘導放出を誘起する、前記第１のプローブ光とは異なる波長の第２のプローブ光を、前記周波数ｆ１およびｆ２とは異なる周波数ｆ３で強度変調し、
強度変調された前記ポンプ光、前記第１のプローブ光および前記第２のプローブ光を照射した前記観察対象物からの、前記ポンプ光および前記第１のプローブ光に対応する蛍光を第１の受光部で受光し、
前記第１の受光部で検出される受光信号のうち周波数ｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ただし、ｉおよびｊは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出し、
強度変調された前記ポンプ光、前記第１のプローブ光および前記第２のプローブ光を照射した前記観察対象物からの、前記ポンプ光および前記第２のプローブ光に対応する蛍光を第２の受光部で受光し、
前記第２の受光部で検出される受光信号のうち周波数ｐ×ｆ１±ｑ×ｆ３（ただし、ｐおよびｑは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する
蛍光観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光物質を２光子で励起し、誘導放出を誘起するレーザビームを照射して、減衰した蛍光を取得して画像を構築する顕微鏡が知られている。（例えば、非特許文献１を参照）。
【非特許文献１】Lu Wei et. al., Biomedical Optics Express 1465-1475, vol. 3, No.6, 1 June 2012
【発明の概要】
【０００３】
本発明の第１の態様である蛍光観察装置は、観察対象物の蛍光を励起するポンプ光を周波数ｆ１で強度変調する第１の強度変調部と、観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を前記周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調する第２の強度変調部と、強度変調されたポンプ光およびプローブ光を照射した観察対象物からの蛍光を受光する受光部と、前記受光部で検出される受光信号のうち周波数ｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ただし、ｉおよびｊは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する検出部とを備える。
【０００４】
本発明の第２の態様である蛍光観察装置は、観察対象物の蛍光を励起するポンプ光を周波数ｆ１で強度変調する第１の強度変調部と、観察対象物の誘導放出を誘起する第１のプローブ光を周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調する第２の強度変調部と、観察対象物の誘導放出を誘起する、第１のプローブ光とは異なる波長の第２のプローブ光を、周波数ｆ１およびｆ２とは異なる周波数ｆ３で強度変調する第３の強度変調部と、強度変調されたポンプ光、第１のプローブ光および第２のプローブ光を照射した観察対象物からの、ポンプ光および第１のプローブ光に対応する蛍光を受光する第１の受光部と、第１の受光部で検出される受光信号のうち周波数ｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ただし、ｉおよびｊは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する第１の検出部と、強度変調されたポンプ光、第１のプローブ光および第２のプローブ光を照射した観察対象物からの、ポンプ光および第２のプローブ光に対応する蛍光を受光する第２の受光部と、第２の受光部で検出される受光信号のうち周波数ｐ×ｆ１±ｑ×ｆ３（ただし、ｐおよびｑは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する第２の検出部とを備える。
【０００５】
本発明の第３の態様である蛍光観察方法は、観察対象物の蛍光を励起するポンプ光を周波数ｆ１で強度変調し、観察対象物の誘導放出を誘起するプローブ光を周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調し、強度変調されたポンプ光およびプローブ光を照射した観察対象物からの蛍光を受光部で受光し、受光部で検出される受光信号のうち周波数ｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ただし、ｉおよびｊは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する。
【０００６】
本発明の第４の態様である蛍光観察方法は、観察対象物の蛍光を励起するポンプ光を周波数ｆ１で強度変調し、観察対象物の誘導放出を誘起する第１のプローブ光を周波数ｆ１とは異なる周波数ｆ２で強度変調し、観察対象物の誘導放出を誘起する、第１のプローブ光とは異なる波長の第２のプローブ光を、周波数ｆ１およびｆ２とは異なる周波数ｆ３で強度変調し、強度変調されたポンプ光、第１のプローブ光および第２のプローブ光を照射した観察対象物からの、ポンプ光および第１のプローブ光に対応する蛍光を第１の受光部で受光し、第１の受光部で検出される受光信号のうち周波数ｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ただし、ｉおよびｊは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出し、強度変調されたポンプ光、第１のプローブ光および第２のプローブ光を照射した観察対象物からの、ポンプ光および第２のプローブ光に対応する蛍光を第２の受光部で受光し、第２の受光部で検出される受光信号のうち周波数ｐ×ｆ１±ｑ×ｆ３（ただし、ｐおよびｑは正の整数であって少なくとも一方が２以上である）の成分を検出する。
【０００７】
上記の発明の概要は、本発明の特徴の全てを列挙したものではない。これらの特徴群のサブコンビネーションも発明となりうる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態に係る顕微鏡装置１０の構成を示す図である。
【図２】状態遷移図である。
【図３】分解能向上の原理について説明する図である。
【図４】信号発生領域のシミュレーション結果を示す。
【図５】スキャン速度と検出の速度を説明する概念図である。
【図６】他の走査部１５１の例を示す。
【図７】さらに他の走査部１５６の例を示す。
【図８】他の顕微鏡装置１２の構成を示す図である。
【図９】顕微鏡装置１２で用いられるＧＵＩ画面３００の一例である。
【図１０】顕微鏡装置１２の動作の一例を示すフローチャートである。
【図１１】共焦点観察に基づいて減衰蛍光観察の範囲を選択する動作のフローチャートである。
【図１２】顕微鏡装置１２において、共焦点観察をするか減衰蛍光観察をするかを自動選択する動作のフローチャートである。
【図１３】当該動作で用いられるＧＵＩ画面３５０を示す。
【図１４】さらに他の顕微鏡装置１４の構成を示す図である。
【図１５】状態遷移図である。
【図１６】分解能向上の原理について説明する図である。
【図１７】信号発生領域のシミュレーション結果を示す。
【図１８】さらに他の顕微鏡装置１６の構成を示す図である。
【図１９】さらに他の顕微鏡装置１８の構成を示す図である。
【図２０】各蛍光物質の励起・蛍光スペクトル、ポンプ光、プローブ光および検出波長領域の波長の関係を示す。
【図２１】さらに他の顕微鏡装置２０の構成を示す図である。
【図２２】さらに他の顕微鏡装置２２の構成を示す図である。
【図２３】各蛍光物質の励起・蛍光スペクトル、ポンプ光、プローブ光および検出波長領域の波長の関係を示す。
【図２４】さらに他の顕微鏡装置２４の構成を示す図である。
【図２５】さらに他の顕微鏡装置２６の構成を示す図である。
【図２６】状態遷移図である。
【図２７】信号発生領域のシミュレーション結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、発明の実施の形態を通じて本発明を説明するが、以下の実施形態は請求の範囲にかかる発明を限定するものではない。また、実施形態の中で説明されている特徴の組み合わせの全てが発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【００１０】
図１は、本実施形態に係る蛍光観察装置の一例として顕微鏡装置１０の構成を示す図である。顕微鏡装置１０は、ポンプ光およびプローブ光を観察対象物に照射することで、観察対象物の蛍光物質より生じる誘導放出により減衰した蛍光信号（以下、減衰蛍光、減衰蛍光信号などと記載する）を発生させる。減衰蛍光信号は、ポンプ光およびプローブ光を強度変調させることにより検出することができる。具体的な方法としてはロックイン検出等があげられる。同様に、ポンプ光による複数回の誘導吸収および誘導放出を経た減衰蛍光信号もロックイン検出することができる。ロックイン検出により得られる減衰蛍光信号は、ポンプ光、プローブ光の多重積の結果として得られるために、信号発生領域が制限される。特に、ポンプ光による複数回の誘導吸収および誘導放出を経た減衰蛍光信号は、信号発生領域が一回の誘導吸収および誘導放出を経た減衰蛍光信号よりも制限されている。これにより、空間分解能を向上させることができる。なお、以下、減衰蛍光を蛍光と総称して記載する場合もある。また、以下、減衰蛍光を取得する顕微鏡を減衰蛍光顕微鏡と記載する。図１では説明のためにｘｙｚ軸を示す。
【００１１】
顕微鏡装置１０は、ポンプ光およびプローブ光を出力する光源１００と、ポンプ光およびプローブ光で観察対象物１８４を照明する照明光学系１４０と、観察対象物１８４から発せられた光を観察する観察光学系１６０と、観察光学系１６０を介して光を検出する検出部１３６を備える。顕微鏡装置１０はさらに、観察対象物１８４を支持するステージ１８０を備える。顕微鏡装置１０はさらに、顕微鏡装置１０全体を制御する制御部１３０と、当該制御部１３０との間で信号を送受信する入力部２２０、表示部２２４および記憶部２２６を備える。
【００１２】
観察対象物１８４と、観察対象物１８４を載置するスライドガラス１８２とにより標本１８６が形成される。観察対象物１８４は例えば生物細胞である。観察対象物１８４には蛍光物質が含まれる。
【００１３】
光源１００は、ポンプ光用のレーザ光源１０２、プローブ光用のレーザ光源１０４を有する。ポンプ光およびプローブ光を合波するダイクロイックミラーを有していてもよい。レーザ光源１０２、１０４は例えばいずれも連続発振方式であって、かつ、互いに異なる波長のレーザ光を出力する。ポンプ光は蛍光物質を励起して蛍光を発生させる。プローブ光は蛍光物質において誘導放出を誘起することで、蛍光を減衰させる。ポンプ光の波長はプローブ光の波長より短く、例えば、ポンプ光は５３２ｎｍ，プローブ光は６４０ｎｍである。これらポンプ光およびプローブ光の波長は蛍光物質の吸収帯（吸収スペクトル）および蛍光帯（蛍光スペクトル）に合せて適宜設定される。これらポンプ光およびプローブ光の波長は自動的に設定されてもよいし、入力部２２０でユーザからの入力を受け付けてもよい。
【００１４】
照明光学系１４０は、ポンプ光用として半波長板６００、偏光ビームスプリッタ６０２、ミラー６０４、６０６、６１０、６１２、６１６、音響光学周波数シフター（以下、ＡＯＦＳともいう）５１４、５２４、および偏光板６１４を有する。照明光学系１４０は、さらにプローブ光用として、音響光学素子５３４（以下、ＡＯＭともいう）および半波長板６２０を有する。さらに照明光学系１４０は、ダイクロイックミラー６１８と、走査部１５０と、レンズペア１７３と、ダイクロイックミラー１６２と、対物レンズ１６４とを有する。観察光学系１６０は、対物レンズ１６４と、ダイクロイックミラー１６２と、光学フィルタ１６６と、レンズペア１７２とを有する。
【００１５】
半波長板６００は、レーザ光源１０２から出射された、電場がｘ方向に振動する直線偏光のポンプ光を、ｘｚ面内でｘ軸から４５度回転する。偏光ビームスプリッタ６０２は、ｘｚ面内でｘ軸から４５度傾いた方向に電場が振動する直線偏光のポンプ光を、二つの直交する偏光方向に分離する。例えば、偏光ビームスプリッタ６０２は、電場がｘ方向に振動する直線偏光を反射し、ｚ方向に振動する直線偏光を透過する。
【００１６】
ＡＯＦＳ５１４は光にとって回折格子として機能する。発振器１３２からの電気信号に基づいて決まる音響周波数で、ドライバ５１２がＡＯＦＳ５１４を駆動し、＋１次回折光の周波数を音響波の周波数だけシフトさせる。ＡＯＦＳ５１４により生じた＋１次回折光はミラー６０６で反射されて偏光ビームスプリッタ６０８に導かれる。同様に、ＡＯＦＳ５２４は光にとって回折格子として機能し、ＡＯＦＳ５２４により生じた＋１次回折光は偏光ビームスプリッタ６０８に導かれる。それぞれのＡＯＦＳ直後のポンプ光の光強度はまだ変調されておらず、時間的に一定である。
【００１７】
２つのＡＯＦＳ５１４、５２４の音響波の周波数には数ＭＨｚの差ｆ１を設ける。例えば、発振器１３２からドライバ５１２、５２２に付与する直流電圧を制御することで、ＡＯＦＳ５１４の音響波周波数をｆ０ＭＨｚ、ＡＯＦＳ５２４の音響波の周波数をｆ０＋ｆ１ＭＨｚとする。双方のＡＯＦＳ５１４、５３４から生じる＋１次回折光の周波数は、音響波の周波数だけシフトすることになる。例えば、ポンプ光の波長を５３２ｎｍとすると、その光周波数は５６４ＴＨｚに相当する。この場合、ＡＯＦＳ５１４で回折した光の周波数は５６４＋（ｆ０×１０−６）ＴＨｚとなり、ＡＯＦＳ５２４で回折した光の周波数は５６４＋（（ｆ０＋ｆ１）×１０−６）ＴＨｚとなる。
【００１８】
それぞれの回折光は偏光ビームスプリッタ６０８により同軸に合成される。なおこれにより偏光ビームスプリッタ６０８は偏光ビームコンバイナとして機能しているといえる。
【００１９】
合成されたポンプ光はそれぞれの偏光方向を保っているが、偏光板６１４で互いに平行な偏光成分、例えばｘｚ面内でｘ軸から４５度傾いた方向に電場が振動する偏光成分が透過する。これによりポンプ光が互いに干渉し、上記音響波の周波数の差ｆ１で光強度が変調される。なお、これらＡＯＦＳ５１４、５２４、ドライバ５１２、５２２、半波長板６００、偏光ビームスプリッタ６０２、６０８、ミラー６０４、６０６、６１０、６１２、偏光板６１４が第１強度変調部５１０を構成する。
【００２０】
一方、プローブ光が入射するＡＯＭ５３４を駆動するドライバ５３２の電圧を制御することで、プローブ光の一次回折光の発生を制御する。常に１次回折光を生じさせる状態（ＯＮ状態、すなわち強度が最大の状態）とすることもできるし、常に生じさせない状態（ＯＦＦ状態、すなわち強度が最小の状態）とすることもできるし、光強度を変調することもできる。例えば、ドライバ５３２から一定の電圧値を付与した場合には、電圧値に応じて光強度は一定値となる。例えば、ドライバ５３２から付与される電圧値が時間的にゼロであれば、光強度もゼロになる。例えばドライバ５３２の電圧波形が正弦波の場合に光の強度を正弦波に変調する。本実施形態では、発振器１３２からの発振に基づいて、ＡＯＭ５３４によりプローブ光を、例えば数十ＭＨｚの周波数ｆ２で強度変調する。ＡＯＭ５３４の利点は、数十ＭＨｚという比較的高い周波数で強度変調できることである。なお、これらＡＯＭ５３４とドライバ５３２とにより第２強度変調部５３０が構成される。
【００２１】
ダイクロイックミラー６１８は、それぞれに強度変調されたポンプ光とプローブ光とを同軸に合波し、走査部１５０に導く。
【００２２】
走査部１５０は対物レンズ１６４の瞳面とほぼ共役な位置に配される。このために、走査部１５０とダイクロイックミラー１６２の間にはレンズペア１７３が設置されていることが望ましい。走査部１５０の一例はガルバノスキャナであり、互いに直交する方向に回転可能な一対のガルバノミラーを有する。それらガルバノミラーの角度を変化させることで観察対象物１８４におけるレーザ光のスポット位置をｘｙ方向でスキャンする。走査部１５０の他の例はレゾナントスキャナ（共振型スキャナ）である。レゾナントスキャナは、共振により動作する共振ミラー（レゾナントミラー）を有する。レゾナントスキャナは、例えば、主走査用のレゾナントミラーと、副走査用のガルバノミラーを備える。レゾナントスキャナを用いることで、より高速なスキャンをすることができる。
【００２３】
走査部１５０から出力されたレーザ光はダイクロイックミラー１６２を透過して、対物レンズ１６４に導かれる。対物レンズ１６４はレーザ光を観察対象物１８４に集光する。
【００２４】
観察対象物１８４の蛍光物質から生じた蛍光は、対物レンズ１６４を通してダイクロイックミラー１６２で反射し、光学フィルタ１６６によりポンプ光とプローブ光が除去される。蛍光はレンズペア１７２により対物レンズ瞳面とほぼ共役な位置に設置された受光部１７４に入射する。なお、ダイクロイックミラー１６２は、レンズペア１７３と走査部１５０の間に設置されても良いし、走査部１５０よりも光源側に設置されても良い。
【００２５】
検出部１３６は、受光部１７４およびロックインアンプ１３４を備える。受光部１７４は対物レンズ１６４の瞳面とほぼ共役な位置に配される。受光部１７４の一例は、光電子増倍管である。受光部１７４は光電変換によって、受光した蛍光の強度に応じた電気信号を出力する。受光部１７４の出力はロックインアンプ１３４に入力されてロックイン検出される。ロックイン検出については後述する。
【００２６】
入力部２２０、表示部２２４、記憶部２２６および制御部１３０は例えばＰＣ等であってもよい。入力部２２０は、ユーザから制御部１３０への入力を受け付けるものであって、例えば、キーボード、タッチパネル、マウス等である。表示部２２４は、例えば、ＧＵＩ、検出結果、観察画像を表示するディスプレイである。記憶部２２６は、顕微鏡装置１０を制御するプログラム、パラメータ等、および、検出結果、観察画像等が記憶される。
【００２７】
制御部１３０は、周波数制御部２２９、スキャナ制御部２２８および画像生成部２２２を有する。周波数制御部２２９はユーザからの入力により、または、蛍光物質に基づいて自動で、発振器１３２に発生させる発振周波数を制御する。スキャナ制御部２２８は、走査部１５０を制御する。画像生成部２２２は検出部１３６の検出結果に基づいて画像を生成し、表示部２２４に表示する。
【００２８】
図２および図４を用いて顕微鏡装置１０の減衰蛍光による観察の原理を説明する。図２は状態遷移図である。図４に信号発生領域のシミュレーション結果を示す。
【００２９】
蛍光物質に、当該蛍光物質を励起するポンプ光と、誘導放出を誘起するプローブ光を入射する。ポンプ光およびプローブ光は時間的に周波数ｆ１，ｆ２で強度変調されており、それぞれの時間波形をＩＰｕｍｐ，ＩＰｒｏｂｅとすると、
【数１】
0006777160.tif 000002
ここで、Ｉ１，Ｉ２はポンプ光、プローブ光の強度であり、ｍ，ｎは変調のコントラストである。
【００３０】
この時、光と物質の相互作用において、図２に示すように、ある確率で、
（ｓｔｅｐ１）ポンプ光による誘導吸収(1)
（ｓｔｅｐ２）ポンプ光による誘導放出(2)
（ｓｔｅｐ３）ポンプ光による２回目の誘導吸収(3)
（ｓｔｅｐ４）プローブ光による誘導放出(4)
という過程が時系列で生じる（図２において実線がポンプ光による誘導吸収および放出、破線がプローブ光による誘導放出）。この結果生じる減衰蛍光信号をＣＥＲＦ（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）信号(5)とすると（図２における一点鎖線が蛍光）、
【数２】
0006777160.tif 000003
蛍光試料の中では、このような光と物質の相互作用が絶えず繰り返されている。
【００３１】
一方、通常の減衰蛍光信号は、
【数３】
0006777160.tif 000004
【００３２】
従って、２ｆ１＋ｆ２もしくは２ｆ１−ｆ２で、または３ｆ１＋ｆ２もしくは３ｆ１−ｆ２を復調周波数としてロックインアンプ１３４で復調することで、通常の減衰蛍光信号を除去して、ＣＥＲＦ信号のみを検出することができる。復調周波数は、強度変調した２以上の周波数の和または差のいずれであってもよい。この場合、単に「±」と表記する。これらの信号を検出する利点は、検出信号がポンプ光、プローブ光の多重積の結果として得られるために、信号発生領域が制限されることである。このメカニズムは後述する。また、この信号はＩ１の３乗、Ｉ２の１乗にそれぞれ比例するので、ポンプ光強度Ｉ１を強くすることで、信号量も大きく増大し、信号対雑音比も有利になる。
【００３３】
具体的には発振器１３２から上記復調周波数がロックインアンプ１３４に入力される。ロックインアンプ１３４は復調周波数に同期する信号を抽出する。走査部１５０で観察対象物１８４における光スポット位置を走査しつつ、ロックインアンプ１３４でピクセルごとにロックイン検出を実施し、当該ピクセルの位置情報に対応付けて記憶部２２６に記憶する。画像生成部２２２は、記憶部２２６から位置情報に対応付けられた検出結果を読み出して、減衰蛍光の観察画像を生成し、表示部２２４に表示する。
【００３４】
図３は、分解能向上の原理について説明する図である。ポンプ光、プローブ光の光スポットの強度分布をそれぞれＳ１、Ｓ２とする。図中の各スポットにおける縦軸は強度を表し、横軸は空間座標を表す。
Ｓｔｅｐ１
ポンプ光により誘導吸収が発生する発生分布をＡ１とすると、それはポンプ光の強度分布に等しいので、
【数４】
0006777160.tif 000005
Ｓｔｅｐ２
ポンプ光により誘導放出が発生する発生分布をＡ２とする。この信号発生領域は、Ｓｔｅｐ１のポンプ光による誘導吸収の発生分布と、ポンプ光による誘導放出の発生分布の積に等しいので、
【数５】
0006777160.tif 000006
Ｓｔｅｐ３
Ｓｔｅｐ２を経た後、さらにポンプ光により誘導吸収が発生する発生分布をＡ３とする。この信号発生分布は、Ｓｔｅｐ１のポンプ光による誘導吸収の発生分布と、Ｓｔｅｐ２のポンプ光による誘導放出の発生分布と、ポンプ光による誘導吸収の発生分布の積に等しいので、
【数６】
0006777160.tif 000007
Ｓｔｅｐ４
Ｓｔｅｐ３を経た後、プローブ光により誘導放出が発生する発生分布をＡ４とする。この信号発生分布は、Ｓｔｅｐ１のポンプ光による誘導吸収の発生分布と、Ｓｔｅｐ２のポンプ光による誘導放出の発生分布と、Ｓｔｅｐ３のポンプ光による誘導吸収の発生分布と、プローブ光による誘導放出の発生分布の積に等しいので、
【数７】
0006777160.tif 000008
この発生分布Ａ４はロックイン検出により可視化されるＣＥＲＦ信号の発生分布と等価である。このように、ポンプ光による複数の誘導吸収、誘導放出を経て生じる減衰蛍光信号を検出することで、図３に示すように、光スポットの中心からの蛍光発生の寄与を大きくかつ周辺からの蛍光発生の寄与を小さくすることができるので、観察対象物１８４からの信号発生領域を回折限界以下に制限でき、結果として分解能を向上させることができる。
【００３５】
図４に信号発生領域のシミュレーション結果を示す。比較のために、通常の共焦点顕微鏡（ＣＭ）と、減衰蛍光（ＲＦ）顕微鏡の信号発生領域も示す。信号がポンプ光とプローブ光の多重積で生じる効果によって、ＣＥＲＦではＸ方向、Ｚ方向ともに、信号発生領域がシャープになることがわかる。
【００３６】
なお、ここでは、（ｓｔｅｐ１）ポンプ光による誘導吸収、（ｓｔｅｐ２）ポンプ光による誘導放出、（ｓｔｅｐ３）ポンプ光による誘導吸収を経て、（Ｓｔｅｐ４）プローブ光による誘導放出によって生じる減衰蛍光信号を検出することを考えたが、ｓｔｅｐ３のあとに、さらにポンプ光による誘導放出、ポンプ光による誘導吸収を経て、プローブ光による誘導放出によって生じる減衰蛍光信号を検出しても良い。この場合、復調周波数としては、４ｆ１±ｆ２、５ｆ１±ｆ２とすることが望ましい。この信号はＩ１の５乗、Ｉ２の１乗にそれぞれ比例するので、ポンプ光強度Ｉ１を強くすることで、信号量も大きく増大し、信号対雑音比も向上させることができる。以上、一般化すればｉ×ｆ１±ｆ２（ｉは２以上の正の整数）を復調周波数としてロックイン検出することにより、より空間分解能の高い減衰蛍光信号を検出することができる。
【００３７】
図５は、走査部１５０のスキャン速度と検出の速度を説明する概念図である。ガルバノスキャナにおいて主走査（図中ｘ方向）のスキャンに要する時間はレゾナントスキャナと比較して長いので、図５の（ａ）に示すように差周波の復調で検出するのにかかる時間の間にビームの位置はほぼ変わらないと考えてよい。しかしながら、レゾナントスキャナにおいて主走査（図中ｘ方向）のスキャンに要する時間はガルバノスキャナと比較して短いので、差周波の復調で検出するのにかかる時間の間に、図５の（ｂ）に示すようにビームの位置は変わってしまい正確な画像取得が困難になるというおそれがある。しかしながら和周波で復調した場合、復調の周波数が高いので検出にかかる時間も短くなり、レゾナントスキャナを用いても所定位置における信号検出に必要な所定時間の間にビームの位置はほぼ変わらないと考えてよい。したがって、レゾナントスキャナを用いて高速で検出しつつ、正確な画像取得をすることができる。
【００３８】
顕微鏡装置１０において２つのＡＯＦＳ５１４、５２４を用いる理由は、変調歪による高調波を抑制するためである。提案手法では、ポンプ光によって生じる繰り返しの誘導吸収・誘導放出を経た信号を検出する。この信号は、時間的に、基本変調周波数ｆ１の整数倍で生じるため、元々の変調は基本周波数ｆ１のみの正弦波で実施することが望ましい。ＡＯＭ単体による変調では、僅かにｆ１の整数倍の周波数成分が混入してしまうという課題が一般的にある。これに対しＡＯＦＳ方式では、その影響を大きく抑制できる。すなわち、ＡＯＭによる直接変調と比較して、変調歪成分を大きく低減できるのでより好ましい構成となる。
【００３９】
また、変調のコントラストを最大にするために、２つのＡＯＦＳ５１４、５２４から回折する１次回折光の強度を等しくすることが望ましい。このために、ポンプ光レーザ射出直後の半波長板６００を用いてそれぞれのＡＯＦＳ５１４、５２４に入射する光強度を等しく設定することが望ましい。さらに、偏光板６１４の角度を微調整することでＡＯＦＳの個体差によって生じる光強度差を補正して、干渉のコントラストを最大にすることが望ましい。
【００４０】
図６は、他の走査部１５１の例を示す。走査部１５１は、レゾナントスキャナ１５２、ガルバノスキャナ１５３および一対のミラー１５４、１５５を有する。一対のミラー１５４、１５５はそれぞれ図中矢印の方向に移動可能に設けられており、これらの位置に基づいて、レゾナントスキャナ１５２、ガルバノスキャナ１５３のいずれを用いるかが選択される。
【００４１】
図６は、レゾナントスキャナ１５２が選択された状態が示されている。この場合、ダイクロイックミラー１４４から出射される光の光路上にミラー１５４が配され、レゾナントスキャナ１５２から出射される光の光路上にミラー１５５が配されている。これにより、ミラー１５４で反射された光はレゾナントスキャナ１５２に入射する。レゾナントスキャナ１５２で所定の方向に偏向された光はミラー１５５で反射されて、ダイクロイックミラー１６２を透過して、対物レンズ１６４に入射する。
【００４２】
一方、ガルバノスキャナ１５３が選択される場合には、ダイクロイックミラー６１８から出射される光の光路上からミラー１５４が退避するとともに、ガルバノスキャナ１５３とダイクロイックミラー１６２との間からミラー１５５が退避する。これにより、ガルバノスキャナ１５３に光が入射し、ガルバノスキャナ１５３で偏向された光がダイクロイックミラー１６２を透過して、対物レンズ１６４に入射する。
【００４３】
走査部１５１によれば、用途に応じてレゾナントスキャナ１５２とガルバノスキャナ１５３を使い分けることができる。なお、一対のミラー１５４、１５５の位置を移動させる手段は、例えばリニアモーターが挙げられるが、これに限られずそれぞれが対応するターレット上に配され、当該ターレットの回転によりミラー１５４、１５５が移動してもよい。一対のミラー１５４、１５５に代えて、一対のダイクロイックミラーを配することにより、当該一対のダイクロイックミラーを反射する波長の光に対してはレゾナントスキャナ１５２を用い、当該一対のダイクロイックミラーを透過する波長の光に対してガルバノスキャナ１５３を用いることができる。なお、レゾナントスキャナ１５２とガルバノスキャナ１５３の位置は図６と逆でもよい。
【００４４】
図７は、さらに他の走査部１５６の例を示す。図７において図６と同じ構成については同じ番号を付して説明を省略する。
【００４５】
走査部１５６は、走査部１５１の一対のミラー１５４、１５５に代えて、それらが一体化したミラー１５７を有する。当該ミラー１５７は紙面に垂直な方向に移動可能に設けられる。ここで図７の状態は図６の状態に対応しており、ミラー１５７によって光が反射されることにより、レゾナントスキャナ１５２が用いられる状態が示されている。一方、図７の状態からミラー１５７が紙面に垂直な方向に移動して、ダイクロイックミラー６１８とガルバノスキャナ１５３との間の光路、および、ガルバノスキャナ１５３とダイクロイックミラー１６２との間の光路から同時に退避することで、ガルバノスキャナ１５３が用いられる状態となる。
【００４６】
図８は他の顕微鏡装置１２の構成を示す図である。顕微鏡装置１２は顕微鏡装置１０と同様に減衰蛍光顕微鏡として用いることができるとともに、共焦点顕微鏡としても用いることができる。顕微鏡装置１２において顕微鏡装置１０と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
【００４７】
顕微鏡装置１２において、蛍光を反射して、ポンプ光およびプローブ光を透過するダイクロイックミラー４０２はダイクロイックミラー６１８と走査部１５０との間の光路上に配される。さらに、ダイクロイックミラー４０２で反射された光が入射する、光学フィルタ４０４、レンズ４０６、受光部４１０を有する。光学フィルタ４０４および受光部４１０は、顕微鏡装置１０の光学フィルタ１６６および受光部１７４と同様の構成であってよい。顕微鏡装置１２はさらにピンホール４０８を有する。ピンホール４０８は、観察対象物１８４と共役の位置に配される。レンズ４０６はピンホール４０８に光を集光する。また、受光部４１０はピンホール４０８に近接して設置される。あるいは、不図示のレンズにより、ピンホールと略共役位置に設置されても良い。
【００４８】
顕微鏡装置１２はさらに、レーザ光源１０２、１０４の光の波長を制御する波長制御部２３０を有する。
【００４９】
上記構成により、観察対象物１８４からの蛍光は走査部１５０を通り、ダイクロイックミラー４０２で反射されて、光学フィルタ４０４、レンズ４０６およびピンホール４０８を介して受光部４１０で受光される。これら、これにより、走査部１５０により観察対象物１８４の観察位置が変わっても、走査部１５０でデスキャンされて、ピンホール４０８でのスポット位置は不変である。ピンホール４０８は穴の大きさが可変となっており、詳細は後述する。
【００５０】
図９は顕微鏡装置１２で用いられるＧＵＩ画面３００の一例である。ＧＵＩ画面３００は表示部２２４に表示され、入力部２２０を用いてユーザからの入力を受け付ける。
【００５１】
チェックボックス３０２は共焦点観察の画像を取得するか否かの入力欄である。チェックボックス３０４は共焦点観察においてポンプ光を変調することを指定する入力欄であり、チェックボックス３０６は変調しないことを指定する入力欄である。
【００５２】
入力欄３０８はポンプ光の変調周波数の入力欄であり、ＭＨｚを単位とした数字の目盛りとともに、指定された変調周波数が縦の太線で示されている。入力欄３１０はピンホールの大きさを指定する入力欄である。入力欄３１０の「ＯＰＥＮ」は穴の大きさが最大であることを示す。さらに、「１」をエアリーサイズとしたときの大きさの目盛りとともに、指定された穴の大きさが縦の太線で示されている。ここで、エアリーサイズとは、波長と開口数で決まる回折限界の光スポットの大きさで、ピンホール径を規格化した値である。
【００５３】
さらに、チェックボックス３１２は、共焦点観察のタイムラプス画像を取得するか否かの入力欄である。入力欄３１４はタイムラプスの時間間隔の入力欄である。
【００５４】
チェックボックス３１６は減衰蛍光観察の画像を取得するか否かの入力欄である。入力欄３１８はポンプ光の変調周波数の入力欄であり、ＭＨｚを単位とした数字の目盛りとともに、指定された変調周波数が縦の太線で示されている。入力欄３２０はプローブ光の変調周波数の入力欄であり、ＭＨｚを単位とした数字の目盛りとともに、指定された変調周波数が縦の太線で示されている。
【００５５】
入力欄３２２は減衰蛍光観察におけるピンホール４０８の穴の大きさの入力欄であって、入力欄３１０と同様の構成である。また、チェックボックス３２４および入力欄３２６は減衰蛍光観察におけるタイムラプスに関する入力欄であり、チェックボックス３１２、入力欄３１４と同様の構成である。
【００５６】
入力欄３２３、３２５は復調周波数を入力する欄である。入力欄３２３には１以上の正数が入力可能になっている。一方、入力欄３２５はプラスまたはマイナスが選択可能になっている。図９には、入力欄３２３には「３」が入力され、入力欄３２５ではプラスが線選択されたことにより、復調周波数として３ｆ１＋ｆ２が設定されたことを示している。なお、入力欄３２３に１を入力した場合には、通常の減衰蛍光顕微鏡画像を取得することができる。
【００５７】
ＧＵＩ画面３００には、共焦点の観察画像３３０と減衰蛍光の観察画像３３２とが並べて表示される。これに代えて、重ねて表示されてもよい。また、互いにリンク付けされることで、共焦点の観察画像３３０の対象領域をクリックする減衰蛍光の観察画像３３２が表示されるようにしてもよい。さらに、共焦点観察のタイムラプスによる画像取得が指定されている場合には、タイムラプス画像３３４が時間順に並べて表示される。同様に、減衰蛍光観察のタイムラプスによる画像取得が指定されている場合には、タイムラプス画像３３５が時間順に並べて表示される。
【００５８】
図１０は顕微鏡装置１２の動作（Ｓ１０）の一例を示すフローチャートである。
【００５９】
フローチャートＳ１０において、制御部１３０は、ＧＵＩ画面３００のチェックボックス３１６の入力に基づいて、減衰蛍光観察の画像を取得するかどうかを判断する（Ｓ１００）。ステップＳ１００の判断がＹｅｓの場合に、制御部１３０は入力欄３１８、３２０の入力に基づいて、減衰蛍光観察のポンプ光およびプローブ光の変調周波数を発振器１３
２に設定する（Ｓ１０２）。さらに、制御部１３０は入力欄３２３、３２５の入力に基づいて復調周波数を発振器１３２に設定する（Ｓ１０１）。
【００６０】
制御部１３０はピンホール４０８の径を設定する（Ｓ１０４）。減衰蛍光観察時においてピンホール４０８はデフォルトで開放、すなわち図１０の入力欄３２２においてデフォルトで「ＯＰＥＮ」が設定されている。ユーザが入力欄３２２の値をデフォルトから変更した場合には、変更された値に基づいてピンポール４０８の大きさが設定される。減衰蛍光観察時において、ピンホール４０８を開放することで、ピンホール共役面である焦点面から生じたにも関わらず散乱等により結像関係が乱されてしまった蛍光も検出することができるので、より多くの光子を検出することができ、結果として信号対雑音比の向上が可能となる。
【００６１】
以上の設定に基づいて、減衰蛍光観察の画像が取得される（Ｓ１０６）。減衰蛍光観察の画像を取得する方法は、顕微鏡装置１０で説明したものと同一であり、説明を省略する。
【００６２】
ステップＳ１０６の後、または、ステップＳ１００の判断がＮｏの場合に、共焦点観察の画像を取得するかどうかが、チェックボックス３０２の入力に基づいて判断される（Ｓ１０８）。共焦点観察の画像を取得すると判断された場合に（Ｓ１０８：Ｙｅｓ）、チェックボックス３０４、３０６に基づいて共焦点観察に用いられるポンプ光を変調するか否かが判断され（Ｓ１１２）、変調する場合には（Ｓ１１２：Ｙｅｓ）、入力欄３０８に入力された変調周波数が設定される（Ｓ１１４）。
【００６３】
ステップＳ１１４の後にまたはステップＳ１１２でポンプ光を変調しない場合に（Ｓ１１２：Ｎｏ）、ユーザからの入力欄３１０への入力に基づいてピンホール４０８の径が設定される（Ｓ１１６）。
【００６４】
上記設定に基づいて共焦点観察の画像が取得される（Ｓ１１８）。より詳しくは、ポンプ光についてＡＯＦＳ５１４、５２４のいずれか一方のみをＯＮ状態にするか、または、強度変調し、プローブ光をＯＦＦ状態にして、走査部１５０で観察対象物１８４を走査しつつ、ピクセルごと検出部１３６で蛍光を検出する。当該検出結果を位置情報に対応付けて記憶部２２６に記憶する。ポンプ光を強度変調しない場合には、受光部４１０の出力をロックインアンプを介さずに、位置情報に対応付けて記憶部２２６に記憶する。
【００６５】
画像生成部２２２は、記憶部２２６から位置情報に対応付けられた検出結果を読み出して、共焦点の観察画像３３０および減衰蛍光の観察画像３３２を生成し、表示部２２４に表示する（Ｓ１２０）。
【００６６】
さらに、チェックボックス３１２で共焦点観察のタイムラプス画像の取得を受け付けた場合に、顕微鏡装置１２は入力欄３１４で設定された時間間隔で共焦点観察を実行してそれぞれの観察画像を生成する。同様に、チェックボックス３２４で減衰蛍光観察のタイムラプス画像の取得を受け付けた場合に、顕微鏡装置１２は入力欄３２６で設定された時間間隔で減衰蛍光観察を実行してそれぞれの観察画像を生成する。
【００６７】
なお、観察対象物１８４の広い視野の画像を共焦点観察で取得し、共焦点観察の画像のうちの一部の領域を指定して減衰蛍光観察の画像を取得する構成としても良い。この場合、共焦点観察で画像を取得して、減衰蛍光観察に適した範囲が自動で選択されてもよい。
【００６８】
図１１は、共焦点観察に基づいて減衰蛍光観察の範囲を選択する動作（Ｓ３０）のフローチャートである。まず、共焦点観察により画像が取得される（Ｓ３００）。この場合に図１０の動作（Ｓ１０）におけるステップＳ１１２からＳ１１８が実行される。次に、ユーザからの入力に基づいて減衰蛍光観察の範囲を自動選択するか否かが判断される（Ｓ３０２）。
【００６９】
自動選択する場合には（Ｓ３０２：Ｙｅｓ）、共焦点画像を画像処理解析し、減衰蛍光観察に適した範囲を選択する。例えば、画像を微分フィルタ処理し、ピークが多く生じる領域を選択する。
【００７０】
一方、自動選択しない場合には（Ｓ３０２：Ｎｏ）、ユーザからの指定に基づいて減衰蛍光観察の領域を設定する（Ｓ３０８）。この場合に、図９の共焦点の観察画像３３０上で領域指定を受け付けてもよい。
【００７１】
ステップＳ３０４またはＳ３０８で設定された領域について、減衰蛍光観察を実行して観察画像を取得する（Ｓ３０６）。この場合に、図１０の動作（Ｓ１０）におけるステップＳ１０２からＳ１０６が実行される。
【００７２】
図１２は、顕微鏡装置１２において、共焦点観察をするか減衰蛍光観察をするかを自動選択する動作（Ｓ２０）のフローチャートであり、図１３は当該動作で用いられるＧＵＩ画面３５０を示す。
【００７３】
記憶部２２６には、蛍光物質の名称に対応付けて、共焦点観察が好ましいか減衰蛍光観察が好ましいか、および、共焦点観察の場合のポンプ光の波長または減衰蛍光観察の場合のポンプ光およびプローブ光の波長が記憶されている。ＧＵＩ画面３５０には、記憶部２２６に記憶されている蛍光物質の名称３５３がチェックボックス３５２とともに表示される。
【００７４】
ユーザによるチェックボックス３５２へのチェックにより蛍光物質が選択される（Ｓ２００）。制御部１３０は、選択された蛍光物質に応じて、記憶部２２６を参照して共焦点観察が好ましいか減衰蛍光観察が好ましいかを判断する（Ｓ２０２）。共焦点観察が好ましいと判断した場合には、ＧＵＩ画面３５０においてポンプ光のボックス３５５に色が付き、当該蛍光物質に対応したポンプ光の波長が自動選択されて、表示欄３５４に表示される（Ｓ２０４）。この場合、プローブ光のボックス３５７は白色であって、波長の表示欄３５６がグレーアウトされる。減衰蛍光観察が好ましいと判断した場合には、ＧＵＩ画面３５０においてポンプ光のボックス３５５に色が付き、当該蛍光物質に対応したポンプ光の波長が自動選択されて表示欄３５４に表示されるとともに、プローブ光のボックス３５７にも色が付いて、当該蛍光物質に対応したプローブ光の波長が自動選択されて表示欄３５６に表示される（Ｓ２０４）。いずれの場合も、表示欄３５８に蛍光物質の吸収帯、蛍光帯、光源の波長および検出領域の関係が図示される（Ｓ２０６）。
【００７５】
減衰蛍光観察が好ましいと判断された場合には、ユーザの実行の指示に基づき、波長制御部２３０がレーザ光源１０２、１０４の光の波長を設定する。さらに、周波数制御部２２９が発振器１３２に変調周波数を設定する。この場合に、図９のＧＵＩ画面３００で変調周波数の入力を受け付けてもよいし、蛍光物質に変調周波数を対応付けて記憶部２２６に記憶しておき、蛍光物質の選択に伴って当該変調周波数を自動的に設定してもよい。上記設定に基づいて、図１０のステップＳ１０２からＳ１０６と同様に減衰蛍光観察の画像が取得される。
【００７６】
一方、共焦点観察が好ましいと判断された場合には、ユーザの実行の指示に基づき、波長制御部２３０がレーザ光源１０２の光の波長を設定する。上記設定に基づいて、図１０のステップＳ１１２からＳ１１８と同様に共焦点観察の画像が取得される。
【００７７】
図１４は、さらに他の顕微鏡装置１４の構成を示す図である。顕微鏡装置１４において顕微鏡装置１０、１２と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。顕微鏡装置１４は、プローブ光による複数回の誘導吸収および誘導放出を経た減衰蛍光信号をロックイン検出する。
【００７８】
顕微鏡装置１４では、ポンプ光に対する強度変調の方法と、プローブ光に対する強度変調の方法とが、顕微鏡装置１０と入れ替わっている。具体的には、ポンプ光を強度変調する第１強度変調部５４０は、ドライバ５４２とＡＯＭ５４４とを有する。これらの機能は顕微鏡装置１０の第２強度変調部５３０と同様であるが、顕微鏡装置１４ではポンプ光を周波数ｆ１で強度変調する。
【００７９】
一方、プローブ光を強度変調する第２強度変調部５５０は、ドライバ５５２、５６２と、ＡＯＦＳ５５４、５６４と、半波長板６２６と、偏光ビームスプリッタ６２８、６３２と、ミラー６３０、６３１と、偏光板６３４とを有する。これらの機能は顕微鏡装置１０の第１強度変調部５１０と同様であるが、顕微鏡装置１４ではプローブ光を周波数ｆ２で強度変調する。
【００８０】
図１５および図１７を用いて顕微鏡装置１４の減衰蛍光による観察の原理を説明する。図１５は状態遷移図である。図１７に信号発生領域のシミュレーション結果を示す。
【００８１】
図１５に示すように、蛍光試料に、試料を励起するポンプ光と、誘導放出を誘起するプローブ光を入射する。ポンプ光、プローブ光は時間的に周波数ｆ１，ｆ２で強度変調されており、それぞれの時間波形は顕微鏡装置１０と同様に式(1.1), (1.2)で表されるとする。
この時、光と物質の相互作用において、図１５に示すように、ある確率で、
（ｓｔｅｐ１）ポンプ光による誘導吸収(1)
（ｓｔｅｐ２）プローブ光による誘導放出(2)
（ｓｔｅｐ３）プローブ光による誘導吸収(3)
（ｓｔｅｐ４）プローブ光による誘導放出(4)
という過程が時系列で生じる。この結果生じる減衰蛍光信号をＣＳＲＦ（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ）ｃｅ）信号(5)とすると、
【数８】
0006777160.tif 000009
蛍光試料の中では、このような光と物質の相互作用が絶えず繰り返されている。
【００８２】
式(2.1)より、ｆ１±２ｆ２、あるいはｆ１±３ｆ２復調することで、通常の減衰蛍光
信号を除去して、ＣＳＲＦ信号のみを検出することができる。これらの信号を検出する利点は、検出信号がポンプ光、プローブ光の多重積の結果として得られるために、信号発生領域が制限されることである。また、この信号はＩ１の１乗、Ｉ２の３乗にそれぞれ比例するので、プローブ光強度Ｉ２を強くすることで、信号量も大きく増大し、信号対雑音比も有利になる。
【００８３】
図１６はＣＳＲＦ信号による分解能向上の原理について説明する図である。ポンプ光、プローブ光の光スポットの強度分布をそれぞれＳ１、Ｓ２とする。
Ｓｔｅｐ１
ポンプ光により誘導吸収が発生する発生分布をＡ１とすると、それはポンプ光の強度分布に等しいので、
【数９】
0006777160.tif 000010
Ｓｔｅｐ２
プローブ光により誘導放出が発生する発生分布をＡ２とする。この信号発生分布は、Ｓｔｅｐ１のポンプ光による誘導吸収の発生分布と、プローブ光による誘導放出の発生分布の積に等しいので、
【数１０】
0006777160.tif 000011
Ｓｔｅｐ３
プローブ光により誘導吸収が発生する発生分布をＡ３とする。この信号発生分布は、Ｓｔｅｐ１のポンプ光による誘導吸収の発生分布と、Ｓｔｅｐ２のプローブ光による誘導放出の発生分布と、プローブ光による誘導吸収の発生分布の積に等しいので、
【数１１】
0006777160.tif 000012
Ｓｔｅｐ４
プローブ光による誘導放出が発生する発生分布をＡ４とする。この信号発生分布は、Ｓｔｅｐ１のポンプ光による誘導吸収の発生分布と、Ｓｔｅｐ２のプローブ光による誘導放出の発生分布と、Ｓｔｅｐ３のプローブ光による誘導吸収の発生分布と、プローブ光による誘導放出の発生分布の積によって生じるので、
【数１２】
0006777160.tif 000013
この発生分布Ａ４はロックイン検出により可視化されるＣＳＲＦ信号の発生分布と等価である。このように、プローブ光による複数の誘導吸収、誘導放出を経て生じる減衰蛍光信号を検出することで、図１６に示すように、光スポットの中心からの蛍光発生の寄与を大きくかつ周辺からの蛍光発生の寄与を小さくすることができるので、観察対象物１８４からの信号発生領域を制限でき、結果として分解能を向上させることができる。
【００８４】
図１７に信号発生領域のシミュレーション結果を示す。比較のために、通常の共焦点顕微鏡（ＣＭ）と、減衰蛍光（ＲＦ）顕微鏡の信号発生領域も示す。信号がポンプ光とプローブ光の多重積で生じる効果によって、ＣＳＲＦではＸ方向、Ｚ方向ともに、信号発生領域がシャープになることがわかる。
【００８５】
なお、ここでは、ポンプ光による（ｓｔｅｐ１）誘導吸収、（ｓｔｅｐ２）プローブ光による誘導放出、（ｓｔｅｐ３） プローブ光による誘導吸収を経て、（Ｓｔｅｐ４）プローブ光による誘導放出によって生じる減衰蛍光信号を検出することを考えたが、ｓｔｅｐ３のあとに、さらにプローブ光による誘導放出、プローブ光による誘導吸収を経て、プローブ光による誘導放出によって生じる減衰蛍光信号を検出しても良い。この場合、復調周波数としては、ｆ１±４ｆ２、ｆ１±５ｆ２とすることが望ましい。この信号はＩ１の１乗、Ｉ２の５乗にそれぞれ比例するので、プローブ光強度Ｉ２を強くすることで、信号量も大きく増大し、信号対雑音比も向上させることができる。以上、一般化すればｆ１±ｊ×ｆ２（ｊは２以上の正の整数）を復調周波数としてロックイン検出することにより、より空間分解能の高い減衰蛍光信号を検出することができる。
【００８６】
図１８はさらに他の顕微鏡装置１６の構成を示す図である。顕微鏡装置１６は顕微鏡装置１４と同様に減衰蛍光顕微鏡として用いることができるとともに、共焦点顕微鏡としても用いることができる。顕微鏡装置１４において顕微鏡装置１０、１２、１４と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
【００８７】
顕微鏡装置１６において、蛍光を反射して、ポンプ光およびプローブ光を透過するダイクロイックミラー４０２はダイクロイックミラー６２４と走査部１５０との間の光路上に配される。さらに、ダイクロイックミラー４０２で反射された光が入射する、光学フィルタ４０４、レンズ４０６、受光部４１０を有する。光学フィルタ４０４、レンズ４０６および受光部４１０は、顕微鏡装置１４の光学フィルタ１６６および受光部１７４と同様の構成であってよい。顕微鏡装置１６はさらにピンホール４０８を有する。ピンホール４０８は、観察光学系の標本共役位置に設置することができる。受光部４１０はピンホール４０８に近接して設置される。レンズ４０６はピンホール４０８に光を集光する。
【００８８】
上記構成により、観察対象物１８４からの蛍光は走査部１５０を通り、ダイクロイックミラー４０２で反射されて、光学フィルタ４０４、レンズ４０６およびピンホール４０８を介して受光部４１０で受光される。これら、これにより、走査部１５０により観察対象物１８４の観察位置が変わっても、走査部１５０でデスキャンされて、受光部４１０でのスポット位置は不変である。ピンホール４０８は穴の大きさが可変となっており、詳細は顕微鏡装置１２と同様であるので、説明を省略する。
【００８９】
図１９はさらに他の顕微鏡装置１８の構成を示す図であり、図２０は各蛍光物質の励起・蛍光スペクトル、ポンプ光、プローブ光および検出波長領域の波長の関係を示す。顕微鏡装置１８は、多色の蛍光による減衰蛍光観察に用いられる。特に顕微鏡装置１８は、蛍光物質が二種類であって、ポンプ光が共通でプローブ光が異なる場合に用いられる。顕微鏡装置１８において顕微鏡装置１２と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
【００９０】
顕微鏡装置１８は、第１のプローブ光用のレーザ光源１０４に加えて、第２のプローブ光用のレーザ光源５００と、第２のプローブ光を強度変調する第３強度変調部５７０と、第２のプローブ光の偏光方向を回転する半波長板６４０、第２のプローブ光を第１のプローブ光に合波するミラー６４４およびダイクロイックミラー６４２とをさらに有する。ダイクロイックミラー６１８は、ポンプ光を第１および第２のプローブ光に合波する。第３強度変調部５７０は、ドライバ５７２およびＡＯＦＳ５７４を有する。
【００９１】
図２０に示すように、ポンプ光の波長は第１の蛍光物質の吸収スペクトルＣと第２の吸収スペクトルＤとの共通部分にあり、両方の蛍光物質を励起する。第１のプローブ光の波長は第１の蛍光物質の蛍光スペクトルＡ内にあり、第１の蛍光物質の誘導放出を誘起する。第２のプローブ光の波長は第２の蛍光物質の蛍光スペクトルＢ内にあり、第２の蛍光物質の誘導放出を誘起する。ストークスシフトの大きな蛍光物質を用いてポンプ光を共通にすることで、光源数を減らして装置構成を簡便にすることができる。なお、観察対象物１８４には第１および第２の蛍光物質が含まれる。
【００９２】
顕微鏡装置１８において、ポンプ光は２つのＡＯＦＳ５１４、５２４によって、 第１のプローブ光、第２のプローブ光はＡＯＭ５３４、５７４によって、それぞれ異なる周波数ｆ１，ｆ２，ｆ３で強度変調されている。ポンプ, 第１のプローブ、第２のプローブの光強度をそれぞれＩＰｕｍｐ，ＩＰｒｏｂｅ１，ＩＰｒｏｂｅ２とすると、それぞれの時間波形は、
【数１３】
0006777160.tif 000014
【００９３】
これらの３色の光はダイクロイックミラー６１８により合波され、走査部１５０を経て、対物レンズ１６４により観察対象物１８４に集光される。
【００９４】
顕微鏡装置１６は、ダイクロイックミラー６１８と走査部１５０との間にダイクロイックミラー４０２を有する。ダイクロイックミラー４０２は、第１の蛍光物質からの蛍光を検出する第１検出波長領域および第２の蛍光物質からの蛍光を検出する第２検出波長領域を含む波長領域を反射する。
【００９５】
ダイクロイックミラー４０２により反射された光の光路上にはさらにダイクロイックミラー４１２が配される。ダイクロイックミラー４１２は、第１検出波長領域を含む波長領域を透過し、第２検出波長領域を含む波長領域を反射する。なお、ダイクロイックミラー４１２は、第１検出波長領域が反射され、第２検出波長領域が透過する構成としても良い。
【００９６】
ダイクロイックミラー４１２を透過した第１の蛍光物質からの蛍光は光学フィルタ４０４で第１検出波長領域以外の波長領域がカットされ、レンズ４０６を通って受光部４１０で受光される。受光部４１０で光電変換された受光信号はロックインアンプ１３４でロックイン検出される。
【００９７】
一方、ダイクロイックミラー４１２で反射した第２の蛍光物質からの蛍光は光学フィルタ４１４で第２検出波長領域以外の波長領域がカットされ、レンズ４１６を通って受光部４２０で検出される。受光部４２０で光電変換された受光信号はロックインアンプ１３５でロックイン検出される。
【００９８】
受光部４１０で受光される信号と、受光部４２０で受光される信号をそれぞれＩＣＥＲＦ１，ＩＣＥＲＦ２とすると、
【数１４】
0006777160.tif 000015
従って、式(3.4)より、受光部４１０で受光されてロックインアンプ１３４で復調される信号の復調周波数は、
【数１５】
0006777160.tif 000016
一方、式(3.5)より、受光部４２０で受光されてロックインアンプ１３５で復調される信号の復調周波数は、
【数１６】
0006777160.tif 000017
とすることが望ましい。ここで、ａ≧ｂ≧ａ−１である。
【００９９】
図２０に示すように、一般的な多色観察において、第２検出波長領域では蛍光物質１から生じる蛍光も検出されてしまうため、蛍光のクロストークが課題になる。しかしながら、検出領域２に混入する蛍光物質１のＣＥＲＦ信号は、周波数ｆｄｅ１で生じるのに対し、検出領域２で取得したい蛍光物質２のＣＥＲＦ信号は周波数ｆｄｅ２で生じる。従って、第２検出波長領域の復調周波数をｆｄｅ２とすることで、蛍光のクロストークを抑制することができる。このように、２つのプローブ光の変調周波数をそれぞれ異なる値に設定することによって、蛍光信号のクロストークを抑制することができるので、２色同時観察も可能となる。
【０１００】
図２１はさらに他の顕微鏡装置２０の構成を示す図である。顕微鏡装置１８においては、プローブ光の強度変調のために、それぞれの光路にＡＯＭ５３４、５７４を設置したが、顕微鏡装置２０では、単体の音響光学チューナブルフィルタ５９４（ＡＯＴＦともいう）により第１および第２のプローブ光の両方を変調する構成としても良い。この場合に、ＡＯＴＦ５９４により、第１のプローブをｆ２で、第２のプローブをｆ３でそれぞれ強度変調する。ＡＯＴＦ５９４では波長ごとに異なる周波数で強度変調することができるため、より簡易な装置構成で多色観察を実現することができる。
【０１０１】
図２２はさらに他の顕微鏡装置２２の構成を示す図であり、図２３は各蛍光物質の励起・蛍光スペクトルと、光源波長、検出蛍光の波長関係を示す。顕微鏡装置２２も顕微鏡装置１８と同様に、多色の蛍光による減衰蛍光観察に用いられる。特に顕微鏡装置２２は、蛍光物質が二種類であって、プローブ光が共通でポンプ光が異なる場合に用いられる。顕微鏡装置２２において顕微鏡装置１０から２０と同じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
【０１０２】
顕微鏡装置２２は、第１のポンプ光用のレーザ光源１０２に加えて、第２のポンプ光用のレーザ光源５０２と、第２のポンプ光を強度変調する強度変調部５８０と、第２プローブ光の偏光方向を回転する半波長板６２６、第２のポンプ光を第１のポンプ光に合波するミラー６２２およびダイクロイックミラー６５４とをさらに有する。ダイクロイックミラー６２４は、第１および第２のポンプ光をプローブ光に合波する。強度変調部５８０は、ドライバ５８２およびＡＯＭ５８４を有する。
【０１０３】
図２３に示すように、第１のポンプ光の波長は第１の蛍光物質の吸収スペクトルＨ内にあり、第１の蛍光物質を励起する。第２のポンプ光の波長は第２の蛍光物質の吸収スペクトルＧ内にあり、第２の蛍光物質を励起する。プローブ光の波長は第１の蛍光物質の蛍光スペクトルＥと第２の蛍光スペクトルＦとの共通部分にあり、両方の蛍光物質の誘導放出を誘起する。ストークスシフトの大きな蛍光物質を用いてプローブ光を共通にすることで、光源数を減らして装置構成を簡便にすることができる。なお、観察対象物１８４には第１および第２の蛍光物質が含まれる。
【０１０４】
顕微鏡装置２２において、第１のポンプ光、第２のポンプ光はＡＯＭ５４４、５８４によって、プローブ光は２つのＡＯＦＳ５５４、５６４によって、それぞれ異なる周波数ｆ１，ｆ２，ｆ３で強度変調されている。第１のポンプ, 第２のプローブ、プローブの光強度をそれぞれＩＰｕｍｐ１，ＩＰｕｍｐ２，ＩＰｒｏｂｅとすると、それぞれの時間波形は、
【数１７】
0006777160.tif 000018
【０１０５】
これらの３色の光はダイクロイックミラー６２４により合波され、走査部１５０を経て、対物レンズ１６４により観察対象物１８４に集光される。
【０１０６】
顕微鏡装置１６は、ダイクロイックミラー１４４と走査部１５０との間にダイクロイックミラー４０２を有する。ダイクロイックミラー４０２は、第１の蛍光物質からの蛍光を検出する第１検出波長領域および第２の蛍光物質からの蛍光を検出する第２検出波長領域を含む波長領域を反射する。
【０１０７】
ダイクロイックミラー４０２により反射された光の光路上にはさらにダイクロイックミラー４１２が配される。ダイクロイックミラー４１２は、第１検出波長領域を含む波長領域を透過し、第２検出波長領域を含む波長領域を反射する。なお、ダイクロイックミラー４１２は、第１検出波長領域が反射され、第２検出波長領域が透過する構成としても良い。
【０１０８】
ダイクロイックミラー４１２を透過した第１の蛍光物質からの蛍光は光学フィルタ４０４で第１検出波長領域以外の波長領域がカットされ、レンズ４０６を通って受光部４１０で受光される。受光部４１０で光電変換された受光信号はロックインアンプ１３４でロックイン検出される。
【０１０９】
一方、ダイクロイックミラー４１２で反射した第２の蛍光物質からの蛍光は光学フィルタ４１４で第２検出波長領域以外の波長領域がカットされ、レンズ４１６を通って受光部４２０で検出される。受光部４２０で光電変換された受光信号はロックインアンプ１３５でロックイン検出される。
【０１１０】
受光部４１０で受光される信号と、受光部４２０で受光される信号をそれぞれＩＣＳＲＦ１，ＩＣＳＲＦ２とすると、
【数１８】
0006777160.tif 000019
従って、式(3.11)より、受光部４１０で受光されてロックインアンプ１３４で復調される信号の復調周波数は、
【数１９】
0006777160.tif 000020
一方、式(3.12)より、受光部４２０で受光されてロックインアンプ１３５で復調される信号の復調周波数は、
【数２０】
0006777160.tif 000021
とすることが望ましい。ここで、a≧b≧a-1である。
【０１１１】
図２３に示すように、一般的な多色観察において、第２検出波長領域では蛍光物質１から生じる蛍光も検出されてしまうため、蛍光のクロストークが課題になる。しかしながら、第２検出波長領域に混入する蛍光物質１のＣＥＲＦ信号は、ｆ'ｄｅ１で生じるのに対し、第２検出波長領域で取得したい蛍光物質２のＣＥＲＦ信号はｆ'ｄｅ２で生じる。従って、第２検出波長領域の復調周波数をｆ'ｄｅ２とすることで、蛍光のクロストークを抑制することができる。このように、２つのプローブ光の変調周波数をそれぞれ異なる値に設定することによって、蛍光信号のクロストークを抑制することができるので、２色同時観察も可能となる。
【０１１２】
図２４はさらに他の顕微鏡装置２４の構成を示す図である。顕微鏡装置２２においては、ポンプ光の強度変調のために、それぞれの光路にＡＯＭ５４４、５８４を設置したが、顕微鏡装置２０では、単体のＡＯＴＦ５９４により第１および第２のポンプ光の両方を変調する構成としても良い。この場合に、ＡＯＴＦ５９４により、第１のポンプ光をｆ１で、第２のポンプ光をｆ２でそれぞれ強度変調する。ＡＯＴＦ５９４では波長ごとに異なる周波数で強度変調することができるため、より簡易な装置構成で多色観察を実現することができる。
【０１１３】
なお、２色観察時において、第１の蛍光物質用の第１のポンプ光, 第１のプローブ光、第２の蛍光物質用の第２のポンプ光, 第２のプローブ光というように光源を４つ用意しても良い。ＣＥＲＦの場合、第１のポンプ光と第２のポンプ光はそれぞれに２つのＡＯＦＳを用いて光干渉により強度変調を実施し、第１のプローブ光と第２のプローブ光はそれぞれＡＯＭにより強度変調を実施することが望ましい。ＣＳＲＦの場合、第１のポンプ光と第２のポンプ光はそれぞれＡＯＭにより強度変調を実施し、第１のプローブ光と第２のプローブ光はそれぞれに２つのＡＯＦＳを用いて光干渉により強度変調を実施することが望ましい。
【０１１４】
図２５はさらに他の顕微鏡装置２６の構成を示す図である。図２６は状態遷移図であり、図２７に信号発生領域のシミュレーション結果を示す。顕微鏡装置２６は、ポンプ光が誘起する多数の誘導吸収・誘導放出と、プローブ光が誘起する多数の誘導吸収・誘導放出が同時に生じる場合に発生する減衰蛍光信号を取得することで、両方の効果を利用して空間分解能を向上させる手法（ＣＥＳ−ＲＦ，  Ｃｙｃｌｉｃ  Ｅｘｃｉｔａｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ)に用いられる。顕微鏡装置２６において顕微鏡装置１０から２４と同
じ構成については同じ参照番号を付して説明を省略する。
【０１１５】
顕微鏡装置２６において、ポンプ光の強度変調には、顕微鏡装置１０と同様に２つのＡＯＦＳ５１４、５２４を用い、２つの音響波の周波数にｆ１の差を設ける。プローブ光強の強度変調には、顕微鏡装置１４と同様に２つのＡＯＦＳ５５４、５６４を用い、２つの音響波の周波数にｆ２の差を設ける。
【０１１６】
それぞれｆ１，ｆ２で強度変調が施されたポンプ光とプローブ光はダイクロイックミラー ６２４により合波され、走査部１５０に導かれる。走査部１５０によりスキャンされた光は対物レンズ１６４により観察対象物１８４に集光される。観察対象物１８４から生じた蛍光信号を検出する光学系は顕微鏡装置１０と同じであるので、説明を省略する。
【０１１７】
図２６に提案手法の原理について示す。ポンプ光、プローブ光は時間的に周波数ｆ１，ｆ２で強度変調されており、それぞれの時間波形ＩＰｕｍｐ，ＩＰｒｏｂｅは、式(1.1),(1.2)で表されるとする。
この時、光と物質の相互作用において、ある確率で、
（ｓｔｅｐ１）ポンプ光による誘導吸収(1)
（ｓｔｅｐ２）ポンプ光による誘導放出(2)
（ｓｔｅｐ３）ポンプ光による誘導吸収(3)
（ｓｔｅｐ４）プローブ光による誘導放出(4)
（ｓｔｅｐ５）プローブ光による誘導吸収(5)
（ｓｔｅｐ６）プローブ光による誘導放出(6)
という過程が時系列で生じる。この結果生じる減衰蛍光信号をＣＥＳ−ＲＦ信号(7)とすると、
【数２１】
0006777160.tif 000022
【０１１８】
蛍光試料の中では、このような光と物質の相互作用が絶えず繰り返されている。式(5.1)に含まれる周波数成分を表1に示す。
【表１】
0006777160.tif 000023
【０１１９】
従って、２ｆ１±２ｆ２, ３ｆ１±３ｆ２, ３ｆ１±２ｆ２, ２ｆ１±３ｆ２のいずれかで復調することで、ＣＥＳ−ＲＦ信号を検出することができる。これらの信号を検出する利点は、検出信号がポンプ光、プローブ光の多重積の結果として得られるために、信号発生領域が制限されることである。また、この信号はＩ１の３乗、Ｉ２の３乗にそれぞれ比例するので、ポンプ光強度Ｉ１を強くすることで、あるいはプローブ光強度Ｉ２を強くすることで、信号量も大きく増大し、信号対雑音比も向上させることができる。
【０１２０】
図２７に信号発生領域のシミュレーション結果を示す。比較のために、通常の共焦点顕微鏡（ＣＭ）と、減衰蛍光（ＲＦ）顕微鏡、ＣＥＲＦ、ＣＳＲＦの信号発生領域も示す。信号がポンプ光とプローブ光の多重積で生じる効果によって、ＣＥＳ−ＲＦではＸ方向、Ｚ方向ともに、信号発生領域がシャープになることがわかる。
【０１２１】
なお、Ｓｔｅｐ１−６で示した順序は、一例であり、ポンプ光による誘導吸収・誘導放出とプローブ光による誘導吸収・放出の順序は可逆であり、様々な組み合わせが存在する。また、繰り返し回数がさらに多い信号を検出してもよく、その場合は更なる分解能向上が期待される。これらを一般化すると復調周波数はｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ｉおよびｊは正の整数であって、いずれか一方は２以上）と表される。
【０１２２】
なお、顕微鏡装置１２から２６において走査部１５０に代えて、図６の走査部１５１または図７の走査部１５６が用いられてもよい。
【０１２３】
レーザ光源１０２等として連続発振方式を用いたが、パルスレーザを用いてもよい。パルスレーザの方がピーク強度が大きいので誘導放出が効率よく生じ、減衰蛍光信号も効率良く生じるという利点がある。また、パルスの時間差を利用して、蛍光寿命を反映した減衰蛍光信号を取得できるという利点もある。なお、パルスの繰り返し周波数は蛍光寿命やピークパワーによるダメージを考慮して決定されることが望ましい。一方、ＣＷレーザの方が価格が安いという利点がる。また、受光部１７４等として光電子増倍管を用いたが、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を用いても良い。
【０１２４】
また、上記実施形態において励起には一光子励起を用いたが、二光子励起、三光子励起といった多光子励起を用いても良い。
【０１２５】
上記実施形態において、減衰蛍光観察時、デスキャンにより蛍光を検出する構成において、ピンホール４０８等を絞る構成としても良い。その結果、結像系の点像分布関数も光学分解能向上に寄与するため、さらなる分解能向上が可能となる。光量が十分確保される明るい蛍光物質を観察する場合には、ピンホール４０８等を絞る構成とすることが望ましい。一方で、光量が十分に確保されない暗い蛍光物質を観察する場合には、ピンホール４０８等を開放することが望ましい。
【０１２６】
また、広視野観察時において倍率色収差によりポンプ光とプローブ光の面内方向のスポットズレが問題となる場合や、深部観察において軸上色収差によりポンプ光とプローブ光の光軸方向のスポットずれが問題となる場合は、ポンプ光のビーム径をプローブ光のビーム径に比べて細くすることが望ましい。これにより、ポンプ光のスポットが面内方向・光軸方向に広がり、ビームのオーバーラップがより容易になる。なお、ポンプ光のビーム径を細くする理由は、ポンプ光はプローブ光に比べて波長が短いことから、同一の対物レンズにおいて同一のビーム径でスポットを生成した際に、ポンプ光の方がプローブ光に比べてスポット径が小さいためである。
【０１２７】
顕微鏡装置２６で顕微鏡装置１２と同様にデスキャン光学系を用いてもよい。一方、顕微鏡装置１８から２４においてデスキャン光学系を用いなくてもよい。多色観察にデスキャン光学系を用いて共焦点の観察画像を取得する場合に、第１および第２のポンプ光（または第１および第２のプローブ光）を周波数ｆ１、ｆ２で変調し、ロックイン検出してもよい。それにより、蛍光のクロストークの影響を抑制できる。
【０１２８】
上記いずれの実施形態においても、励起状態から基底状態への遷移過程には、ポンプ光による誘導放出、あるいはプローブ光による誘導放出を利用したが、本発明はこれに限定されず、他の遷移過程が寄与しても良い。例えば、自然放出(蛍光)が寄与しても良い。あるいは、蛍光がポンプ光に線形比例しなくなる現象（蛍光の飽和）を利用して高分解能な減衰蛍光信号を取得しても良い。この場合、ｉ×ｆ１±ｆ２（ｉは２以上の整数）の周波数で復調するのが望ましい。またこの場合に、ｉ×ｆ１（ｉは２以上の整数）で復調することで、非線形な蛍光・繰り返し励起による蛍光信号を取得することができるのでこれを取得する構成としても良い。あるいは、誘導放出光がプローブ光に線形比例しなくなる現象（誘導放出の飽和）を利用して高分解能な減衰蛍光信号を取得しても良い。この場合、ｆ１±ｊ×ｆ２（ｊは２以上の整数）の周波数で復調するのが望ましい。これらが同時に生じる場合には、ｉ×ｆ１±ｊ×ｆ２（ｉ、ｊは２以上の整数）で復調することが望ましい。
【０１２９】
上記いずれの実施形態においても、ＡＯＭに代えて、ＥＯＭ(電気光学素子)と偏光子を用いて、偏光方向を高速に切り替えることで、光強度の変調を実現しても良い。あるいは、チョッパーなどのメカニカルシャッターを用いても良い。
【０１３０】
顕微鏡装置１０から２６のいずれかの光の光路に、位相板(ラジアル偏光子)を挿入する構成としても良い。これにより、位相板を透過した光の点像分布関数が面内方向でよりシャープになり、分解能向上効果が増大する。一般的にこのような位相板を用いると、面内方向の分布がシャープになる代わりに、(i)サイドローブが生じる、(ii)光軸方向の分布が太くなるといった課題がある。しかしながら、提案手法では、信号発生領域は複数の光の重複領域となるために、これらの課題が解消され、面内方向分布がシャープになるという恩恵だけを受けることができる。なお、各光それぞれに異なる位相板を挿入しても良いし、２つの光の共通光路に同一の位相板を挿入しても良い。なお、他の形状の位相板でも良い。また、位相板の変わりにマスクを挿入し、光の振幅に分布を持たせることで、点像分布関数の形状を制御しても良い。例えば、輪帯板を挿入してベッセルビームを生成しても同様の効果が得られる。
【０１３１】
なお、ＡＯＭによる変調歪が無視できる場合には、ポンプ光、プローブ光ともに、独立のＡＯＭで変調する方式としても良い。あるいは、音響光学チューナブルフィルタ（ＡＯＴＦ）を用いて、ポンプ光とプローブ光を単一の音響光学チューナブルフィルタで変調しても良い。ＡＯＴＦでは、波長ごとに異なる変調周波数で光強度を変調することができる。多色観察時、ポンプ光、プローブ光が複数ある場合においても、単一のＡＯＴＦをもちいて、それぞれの光を異なる周波数で変調する方式としても良い。
【０１３２】
なお、点像分布関数は波長に比例するので、プローブ光よりもポンプ光の方が点像分布関数は小さくなる。これは、ポンプ光の方が波長が短いためである。従って、ＣＥＳ−ＲＦ観察において、繰り返しの次数が等しい場合、ポンプ光による繰り返し作用を利用するＣＥＲＦの方がプローブ光による繰り返しを利用するＣＳＲＦよりも分解能が高くなる。これより、復調の周波数をｉ＞ｊとする構成が分解能をあげるためには、より望ましい。一方、ポンプ光のパワーを増大させることによるダメージが問題となる場合には、ｉ＜ｊとする構成が望ましい。
【０１３３】
また、顕微鏡装置１０、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６においても、顕微鏡装置１２と同様に、波長制御部２３０を設けてレーザ光源の光の波長を制御してもよい。また、上記実施形態はいずれも顕微鏡装置を用いたが、減衰蛍光が観察できる蛍光観察装置であれば顕微鏡に限られない。
【０１３４】
また、ダイクロイックミラー１６２、４０２は照明光を透過させて、蛍光を反射するが、これに代えて、照明光を反射して蛍光を透過するようにしてもよい。
【０１３５】
なお、特定の周波数の信号成分を検出する方式としてロックインアンプについて説明したが、他の方法でも良い。例えば、時間信号をフーリエ変換することで特定の周波数の信号成分を検出しても良い。例えば、周波数変換器により、復調周波数を持つ参照信号と信号光を乗算し、直流成分のみを抽出する構成としても良い。なお、ここでいう直流成分とは、正弦波の振動成分を直流に変換した値に相当する。
【０１３６】
また、いずれかの顕微鏡装置においてＡＯＦＳを駆動するドライバへの電圧入力は、直流電源であってもよい。２つのＡＯＦＳのうち、一方のみの音響周波数を可変できる構成としても良い。あるいは、２つのＡＯＦＳの音響周波数が予め異なる値で固定されていても良い。
【０１３７】
なお、ある特定の復調周波数で生じる信号が、ポンプ光とプローブ光の何乗に比例するかは、その信号を生じさせている支配的な過程に依存する。例えば、２ｆ１±ｆ２の周波数で復調する場合に、ポンプ光の２乗に比例しても良いし、３乗に比例しても良い。プローブ光の１乗に比例しても良いし、２乗に比例しても良い。また、例えば、ｆ１±２ｆ２の周波数で復調する場合に、ポンプ光の１乗に比例しても良いし、２乗に比例しても良い。プローブ光の２乗に比例しても良いし、３乗に比例しても良い。
【０１３８】
なお、いずれかの顕微鏡装置において、ポンプ光とプローブ光の偏光は同一であることが望ましい。例えば、同一の直線偏光、円偏光であることが望ましい。あるいは、ポンプ光とプローブ光の偏光を直交する直線偏光とした場合と、平行な直線偏光とした場合でそれぞれ減衰蛍光による画像を取得し、両者を比較することで、観察対象物の偏光特性を可視化する構成としても良い。これは、誘導放出の効率が偏光に依存するためである。
【符号の説明】
【０１３９】
１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６  顕微鏡装置
１００  光源
１０２、１０４、５００、５０２  レーザ光源
１３０  制御部
１３２  発振器
１３４、１３５  ロックインアンプ
１３６  検出部
１４０  照明光学系
１５０、１５１、１５６  走査部
１５２  レゾナントスキャナ
１５３  ガルバノスキャナ
１５４、１５５  ミラー
１６０  観察光学系
１６２、６１８、６２４、６４２  ダイクロイックミラー
１６４  対物レンズ
１６６、４０４、４１４  光学フィルタ
４０６、４１６  レンズ
１７２、１７３  レンズペア
１７４、４１０、４２０  受光部
１８０  ステージ
１８２  スライドガラス
１８４  観察対象物
１８６  標本
２２０  入力部
２２２  画像生成部
２２４  表示部
２２６  記憶部
２２８  スキャナ制御部
２２９  周波数制御部
４０８  ピンホール
５１０、５４０  第１強度変調部
５１２、５２２、５３２、５４２、５５２、５６２、５７２  ドライバ
５１４、５２４、５５４、５６４  音響光学周波数シフタ
５３０、５５０  第２強度変調部
５３４、５４４、５７４、５８４  音響光学素子
５９４  音響光学チューナブルフィルタ
５７０  第３強度変調部
６００、６２０、６２６  半波長板
６０２、６０８、６２８、６３２  偏光ビームスプリッタ
６０４、６０６、６１０、６１２、６１６、６２２、６３０、６４４  ミラー
６１４、６３４  偏光板
３００、３５０  ＧＵＩ画面
３０２、３０４、３１２、３１６、３２４、３５２  チェックボックス
３５４、３５６、３５８  表示欄
３０８、３１０、３１４、３１８、３２０、３２２、３２３、３２５、３２６  入力欄
３３０、３３２  観察画像
３３４  タイムラプス画像
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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