(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ由来β−フルクトフラノシダーゼを有効成分とするスクロース特異的分解剤。
【請求項２】
請求項１に記載のスクロース特異的分解剤とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを反応させる工程を有するフラクトオリゴ糖含有液の製造方法。
【請求項３】
請求項２の方法により得られたフラクトオリゴ糖含有液中のグルコースとフルクトースを除去する工程を有するフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載のスクロース特異的分解剤を用いた糖アルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スクロース特異的分解剤に関し、特に、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ由来β−フルクトフラノシダーゼを有効成分とするスクロース特異的分解剤およびそれらを用いたフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法および糖アルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラクトオリゴ糖は、スクロースのフルクトース残基にフルクトースが１〜１０個程度結合してなる糖類をいう。例えば、スクロースのフルクトース残基に１個のフルクトースが結合したものが１−ケストース（ＧＦ２）、２個結合したものがニストース（ＧＦ３）、３個結合したものがフラクトシルニストース（ＧＦ４）などとして知られている。フラクトオリゴ糖は、スクロースを基質として、加水分解活性とフルクトース転移活性を有するβ−フルクトフラノシダーゼという酵素を反応させることにより、工業的に製造される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
早川幸男編著、「オリゴ糖の新知識」、株式会社食品化学新聞社、１９９８年１１月、ｐ．４８−６４
【０００４】
しかし、スクロースを基質とし、β−フルクトフラノシダーゼを用いてフラクトオリゴ糖を製造する際には、基質となるスクロースはすべて反応することなく反応液中に残存するほか、スクロースの分解によりグルコースとフルクトースが生成する。これら残存するスクロースや生成するグルコース、フルクトースは、クロマトグラフィー等によりフラクトオリゴ糖と分離されるが、このうち、スクロースは、２糖であるため、単糖であるグルコースやフルクトースと比較して、フラクトオリゴ糖との分離が困難であることが知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
β−フルクトフラノシダーゼは、スクロースをグルコースとフルクトースに分解し、生成したフルクトースをスクロース若しくはフラクトオリゴ糖に付加する。この反応により、重合度が２以上のフラクトオリゴ糖の混合物とスクロース分解により生じたグルコースや付加できなかったフルクトース等の単糖が生成する。また、基質となるスクロースはすべて反応しきることなく一部が未反応のまま残存する。フラクトオリゴ糖を工業的に生産する場合、これらフラクトオリゴ糖以外の糖である、スクロース、グルコース、フルクトースとフラクトオリゴ糖をクロマトグラフィーによって分離除去する必要がある。その際、フラクトオリゴ糖と分子量の近いスクロースとは、単糖であるグルコースやフルクトースと比較して、クロマトグラフィーで分離するのは非常に困難である。
【０００６】
そのため、酵素反応液中に多量のスクロースが残存した場合、クロマトグラフィー分離工程におけるフラクトオリゴ糖の分離精度が低下し、分離後のフラクトオリゴ糖純度低下や回収率の低下を引き起こす。つまり、酵素反応液中に残存するスクロースを分解することで、クロマト分離の負担を低減でき、効率的にフラクトオリゴ糖を高純度化できると考えられる。以上の理由から、フラクトオリゴ糖を分解ならびに生成することなく、スクロースのみを特異的に分解できるβ−フルクトフラノシダーゼの開発が求められている。しかし、フラクトオリゴ糖を分解ならびに生成せず、スクロースのみを特異的に分解するβ-フルクトフラノシダーゼは報告されておらず、遺伝子組み換え等の高度な技術を用いて特定のアミノ酸を置換するなどの改良が必要であった。
【０００７】
本発明は、このような課題を解決するためになされたものであって、フラクトオリゴ糖を分解ならびに生成することなく、スクロースのみを特異的に分解できるβ−フルクトフラノシダーゼを主成分とするスクロース特異的分解剤に関する発明である。上記β−フルクトフラノシダーゼを有効成分とする本発明を利用することで、２糖であるスクロースを特異的に分解し、グルコースとフルクトースといった単糖にすることで、フラクトオリゴ糖の効率的高純度化ならびに上記酵素を用いたスクロースからの糖アルコールの生成につなげることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ ＮＢＲＣ  １０７７６３由来β−フルクトフラノシダーゼを有効成分とするスクロース分解剤を用いることにより、フラクトオリゴ糖生成反応液中からスクロースを特異的に分解できることを見出した。
そこで、これらの知見に基づいて、下記の各発明を完成した。
【０００９】
（１）本発明に係るスクロース特異的分解剤の一態様は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ  ＮＢＲＣ  １０７７６３由来β−フルクトフラノシダーゼを有効成分とするスクロース特異的分解剤。
【００１０】
（２）（１）に記載のスクロース特異的分解剤とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを反応させる工程を有するフラクトオリゴ糖含有液の製造方法。
【００１１】
（３）（２）の方法により得られたフラクトオリゴ糖含有液中のグルコースとフルクトースを除去する工程を有するフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法。
【００１２】
（４）（１）に記載のスクロース特異的分解剤を用いた糖アルコールの製造方法。    
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るスクロース特異的分解剤によれば、フラクトオリゴ糖をほとんど分解せず、スクロースを特異的に分解することができる。よって、これを用いて、スクロースを含むフラクトオリゴ糖溶液からの、フラクトオリゴ糖の分離精製効率を向上させることができる。すなわち、これを用いて、フラクトオリゴ糖の製造工程において、フラクトオリゴ糖の高純度液を製造することができる。また、これを用いて、スクロースから糖アルコールを効率的に製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明に係るスクロース特異的分解剤を用いたフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法および糖アルコールの製造方法について詳細に説明する。
【００１５】
本発明において、「β−フルクトフラノシダーゼ」は、「フルクトシルトランスフェラーゼ」、「サッカラーゼ」、「β−Ｄ−フルクトフラノシダーゼ」、「インベルターゼ」、「インバーターゼ」または「インベルチン」と交換可能に用いられる場合がある。また、本発明における「野生型β−フルクトフラノシダーゼ」とは、遺伝子工学の手法を用いてアミノ酸変異を導入していないアミノ酸配列からなるβ−フルクトフラノシダーゼをいう。
【００１６】
本発明において、「β−フルクトフラノシダーゼがスクロースを特異的に分解する」とは、β−フルクトフラノシダーゼが有する「末端にフルクトース残基を含む糖質に対する加水分解活性」および「フルクトース転移活性」のうち、「スクロースに対する加水分解活性」が主となっている状態をいう。すなわち、「スクロースに対する加水分解活性」のみを呈する場合のほか、「スクロースに対する加水分解活性」を主としつつ「スクロース以外の末端にフルクトース残基を含む糖質に対する加水分解活性」や「フルクトース転移活性」をも呈する場合も含まれる。
【００１７】
（１）の本発明に係るスクロース特異的分解剤とスクロースとを接触させる方法としては、例えば、本発明に係るスクロース特異的分解剤をスクロースを含む溶液に添加し、３０℃〜５０℃で２０時間程度静置あるいは振盪する方法を挙げることができる。また、本発明に係るスクロース特異的分解剤は、β−フルクトフラノシダーゼを大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母、カビ、糸状菌等の宿主に導入する、形質転換を行ってもよい。宿主への導入（形質転換）は常法に従って行うことができ、例えば、大腸菌に導入する場合であれば、大腸菌のコンピテントセルに組換えベクターを加えて氷上で３０分間静置し、続いて４２℃のウォーターバスに入れて４５秒間静置した後、氷上で２分間静置し、その後、培地を加えて、３７℃で１時間振とうすることにより行うことができる。
【００１８】
次に、本発明は、フラクトオリゴ糖高純度液の製造方法を提供する。本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法は、（ア）本発明に係るスクロース特異的分解剤とフラクトオリゴ糖溶液に含有されるスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程を有する。なお、本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法において、上述した本発明に係るスクロース特異的分解剤については、再度の説明を省略する。
【００１９】
ここで、「フラクトオリゴ糖」とは、スクロースのフルクトース残基にフルクトースが１〜１０個程度結合してなる糖類をいう。本発明において、「フラクトオリゴ糖高純度液」とは、フラクトオリゴ糖の含有割合が、フラクトオリゴ糖以外の糖類の含有割合と比較して大きい糖類溶液をいう。
【００２０】
ここで、（ア）のスクロースを含有する「フラクトオリゴ糖溶液」は、例えば、加水分解活性とフルクトース転移活性とを有するβ−フルクトフラノシダーゼをスクロースを含む溶液に添加し、３０℃で２０時間程度反応させることにより得ることができる。
【００２１】
本発明に係るフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法は、（ア）のスクロースを単糖に分解する工程の後に、（イ）前記フラクトオリゴ糖溶液から単糖を除去する工程を有していてもよい。
【００２２】
（イ）のフラクトオリゴ糖溶液から単糖を除去する方法としては、例えば、液体クロマトグラフィー法や膜分離法を挙げることができる。液体クロマトグラフィー法の場合は、単糖を含有するフラクトオリゴ糖溶液を原料液とし、イオン交換水を溶離液として、カラムに陽イオン交換樹脂を充填し、５０℃に加温して各液を供給し、擬似移動床法（Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｂｅｄ）分離方式の液体クロマトグラフィーを行ってフラクトオリゴ糖と単糖とを分離して、フラクトオリゴ糖を高純度に含むフラクションを分取する方法を挙げることができる。また、膜分離法の場合は、単糖を含有するフラクトオリゴ糖溶液をナノろ過膜（ＮＦ膜；分画分子量２５００）に供して、単糖を高純度に含む透過液とフラクトオリゴ糖を高純度に含む保持液とに分離し、この保持液を回収する方法を挙げることができる。
【００２３】
（イ）の単糖に水素を付加する方法としては、例えば、高温高圧の水素雰囲気下にて、ニッケル等の金属触媒を用いて還元する方法（接触水素添加法）のほか、室温常圧の窒素雰囲気下にて、水素化ホウ素ナトリウム又は水素化アルミニウムリチウム等の還元剤を用いて還元する方法を挙げることができる。接触水素添加法の場合、より具体的には、単糖（グルコースまたはフルクトース）、適量の水およびニッケル触媒をオートクレーブに加えて懸濁し、そこに水素を加え、所定の反応温度および反応圧力で一定時間撹拌する方法を挙げることができる。
【００２４】
最後に、本発明は、糖アルコールの製造方法を提供する。本発明に係る糖アルコールの製造方法は、（ア）本発明に係るスクロース特異的分解剤とスクロースとを接触させて、前記スクロースを単糖に分解する工程を有する。なお、本発明に係る糖アルコールの製造方法において、上述した本発明に係るスクロース特異的分解剤については、再度の説明を省略する。
【００２５】
ここで、「糖アルコール」とは、アルドースやケトースのカルボニル基が還元されて生成する糖質である。よって、スクロースを原料として糖アルコールを製造する場合は、スクロースを単糖（フルクトースおよびグルコース）に分解した後、これらの単糖に水素を付加することにより、マンニトール（単糖がフルクトースである場合）やソルビトール（単糖がグルコースである場合）といった糖アルコールを製造することができる。
【００２６】
すなわち、本発明に係る糖アルコールの製造方法は、上記（ア）のスクロースを単糖に分解する工程の後に、（エ）単糖に水素を付加する工程を有していてもよい。
【００２７】
（エ）の単糖に水素を付加する工程としては、例えば、スクロースを原料として糖アルコールを製造する場合、スクロースを単糖（フルクトースおよびグルコース）に分解した後、フルクトースに水素を付加することによりソルビトールおよびマンニトールが、グルコースに水素を付加することによりソルビトールといった糖アルコールを製造することができる。
【００２８】
本発明に係る糖アルコールの製造方法またはフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法には、本発明に係る製造方法の特徴を損なわない限り、他の工程を有してもよく、例えば、結晶化工程、乾燥工程、洗浄工程、濾過工程、殺菌工程、食品添加物を添加する工程などを有してもよい。
【００２９】
以下、本発明に係るスクロース特異的分解剤、糖アルコールの製造方法およびフラクトオリゴ糖高純度液の製造方法について、各実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００３０】
＜実施例１＞ スクロース特異的分解剤の作成
Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ ＮＢＲＣ  １０７７６３（以下、「Ｇｅｏ」と略記する。）のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＧＡＪ４３５９０．１；配列番号２）からなるβ−フルクトフラノシダーゼを作成し、これをスクロース特異的分解剤とした。具体的な手順を以下に示す。
【００３１】
（１）Ｇｅｏ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの取得
まず、ＧｅｏのゲノムＤＮＡを常法に従って抽出した。続いて、Ｇｅｏ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの全長の塩基配列（配列番号１）を基に、下記の配列番号３および配列番号４のプライマーを設計し、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｇｅｏ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片１とした。
【００３２】
《ＰＣＲの条件》
鋳型；ＧｅｏのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＴＣＧ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  Ｃ−３’（配列番号３）
リバースプライマー；５’−ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＴＡ  ＣＡＡ  ＡＣＴ  ＣＣＡ  ＴＴＴ  ＴＴＣ−３’（配列番号４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
【００３３】
（２）Ｇｅｏ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のＰｇｓＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０１６２４５．１）をコードするＤＮＡを増幅した。得られたＰＣＲ産物を常法に従って制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化し、これをＤＮＡ断片２とした。また、ＤＮＡ断片２について、常法に従ってシークエンスを行い、ＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を確認した。確認したＰｇｓＡタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５に、それにコードされるＰｇｓＡタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６にそれぞれ示す。
【００３４】
《ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＩＡＭ１０２６、ＡＴＣＣ９４６６）のゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー（下線はＮｄｅＩサイトを示す）５’−ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧ−３’（配列番号7）
リバースプライマー（下線はＸｈｏＩサイトを示す）；５’−ＡＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧ−３’（配列番号8）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）
【００３５】
続いて、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで制限酵素処理を行ったｐＣＤＦＤｕｅｔ−１プラスミド（Ｍｅｒｃｋ社）に、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．１（タカラバイオ社）を用いて添付の使用書に従いＤＮＡ断片２を挿入し、これをｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクターとした。その後、下記の条件でＰＣＲを行うことによりｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクターのＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片３とした。
【００３６】
《ＰＣＲの条件》
鋳型；ｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクター
フォワードプライマー；５’−ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＡＡＡ−３’（配列番号９）
リバースプライマー；５’−ＧＧＡ ＴＣＴ ＴＴＴ ＡＧＡ ＴＴＴ ＴＡＧ ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＣＴ ＡＴＧ ＡＴＣ ＡＡ−３‘（配列番号１０）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
【００３７】
次に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片１およびＤＮＡ断片３を連結することにより、Ｇｅｏ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成し、これをＧｅｏ組換えベクターとした。
【００３８】
（３）形質転換および形質転換体の培養と回収
本実施例１（２）のＧｅｏ組換えベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセルに導入して、組換え大腸菌を回収した。続いて、組換え大腸菌から組換えベクターを回収し、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。これを３０℃で一晩プレート培養した後、組換え大腸菌のクローンをピックアップしてＭ９ ＳＥＥＤ培地０．５ｍＬに植菌し、３０℃、２２０ｍｉｎ−１で２０時間振盪培養した。続いて、培養物のうち５μＬをＭ９ Ｍａｉｎ培地５ｍＬに植え継ぎ、２５℃、２２０ｍｉｎ−１で２４時間振盪培養した。その後、培養物を１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより組換え大腸菌を集菌した。Ｍ９ ＳＥＥＤ培地およびＭ９ Ｍａｉｎ培地の組成を以下に示す。
【００３９】
Ｍ９ ＳＥＥＤ培地（計１００ｍＬ）；水  ７２ｍＬ、５×Ｍ９塩  ２０ｍＬ、２０％  カザミノ酸  ５ｍＬ、２０％ Ｄ−グルコース  ２ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン  １ｍＬ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ０．２ｍＬ、２．５Ｍ  ＭｇＣｌ２  ４０μＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４  ２８μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）。
Ｍ９ Ｍａｉｎ培地（計１００ｍＬ）；水  ６７ｍＬ、５×Ｍ９塩  ２０ｍＬ、２０％  カザミノ酸  ５ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ チミン  １ｍＬ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２  ０．２ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ ＦｅＳＯ４  ２８μＬ、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ １（Ｏ．Ｎ．Ｅ．；Ｍｅｒｃｋ社）Ｓｏｌ．１  ２ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．２  ５ｍＬ、Ｏ．Ｎ．Ｅ．Ｓｏｌ．３  １００μＬ、抗生物質（終濃度５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン）。
【００４０】
＜実施例２＞ Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼの作成
スクロースを特異的に加水分解する効果がβ−フルクトフラノシダーゼの由来により異なることを調べるため、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ ＮＢＲＣ３２５５（以下、「Ｇ．ｔｈａｉ」と略記する。）のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ ＷＰ＿００７２８１７７４；配列番号１２）からなるβ−フルクトフラノシダーゼを作成し、これをＧ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼとした。Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼはＧｅｏ由来β−フルクトフラノシダーゼとは異なるファミリー６８に属する酵素である。具体的な手順を以下に示す。
【００４１】
（１）Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの取得
まず、Ｇ．ｔｈａｉのゲノムＤＮＡを常法に従って抽出した。続いて、Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの全長の塩基配列（ＧＩ：４５９０１８８７７）（配列番号１１）を基に、下記の配列番号１３および配列番号１４のプライマーを設計し、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片４とした。
【００４２】
《ＰＣＲの条件》
鋳型；Ｇ．ｔｈａｉのゲノムＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＴＴＣＣＡＧＣＣＧ−３’（配列番号１３）
リバースプライマー；５’−ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＡＣＧＴＣＡＴＡＧ−３’（配列番号１４）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
【００４３】
（２）Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
実施例１（２）同様に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、作成したｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクターを鋳型として増幅したＤＮＡ断片３およびＤＮＡ断片４を連結することにより、Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成し、これをＧ．ｔｈａｉ組換えベクターとした。
【００４４】
（３）形質転換および形質転換体の培養と回収
実施例１（３）同様に、Ｇ．ｔｈａｉ組換えベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセルに導入して、組換え大腸菌を回収した。続いて、組換え大腸菌から組換えベクターを回収し、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。
【００４５】
＜実施例３＞ Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼの作成
スクロース特異的に加水分解する効果がβ−フルクトフラノシダーゼの由来により異なることを調べるため、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＩＦＯ４３０３（以下、「Ａ．ｋａｗａ」と略記する。）由来のβ−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列（ＮＣＢＩ  ＧＡＡ８８１０１．１；配列番号１６）からなるβ−フルクトフラノシダーゼを作成し、これをＡ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼとした。Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼはＧｅｏ由来β−フルクトフラノシダーゼと同じファミリー３２に属する酵素である。具体的な手順を以下に示す。
【００４６】
（１）Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの取得
まず、Ａ．ｋａｗａのβ−フルクトフラノシダーゼ（配列番号１６）をコードするＤＮＡを人工合成して取得した。Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの全長の塩基配列を配列番号１５に示す。なお、配列番号１６において、シグナル配列は１〜２４番目に相当する。続いて、Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡの全長の塩基配列（配列番号１５）を基に、下記の配列番号１７および配列番号１８のプライマーを設計し、下記の条件でＰＣＲを行うことにより、Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡを増幅し、これをＤＮＡ断片５とした。
【００４７】
《ＰＣＲの条件》
鋳型；Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼ人工合成ＤＮＡ
フォワードプライマー；５’−ＡＡＡ  ＴＣＴ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＣ−３’（配列番号１７）
リバースプライマー；５’−ＴＴＴ ＡＣＣ ＡＧＡ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＡ ＡＴＡ ＣＴＧ ＡＣＧ ＡＴＣ ＣＧＧ Ｃ−３’（配列番号１８）
ＰＣＲ用酵素；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ（東洋紡社）
【００４８】
（２）Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターの作成
実施例１（２）同様に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いて、作成したｐＣＤＦ−ｐｇｓＡ組換えベクターを鋳型として増幅したＤＮＡ断片３およびＤＮＡ断片５を連結することにより、Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼをコードするＤＮＡが挿入された組換えベクターを作成し、これをＡ．ｋａｗａ組換えベクターとした。
【００４９】
（３）形質転換および形質転換体の培養と回収
実施例１（３）同様に、Ａ．ｋａｗａ組換えベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９コンピテントセルに導入して、組換え大腸菌を回収した。続いて、組換え大腸菌から組換えベクターを回収し、これを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに導入して、形質転換体として組換え大腸菌を得た。
【００５０】
＜実施例４＞β−フルクトフラノシダーゼの評価
（１）β−フルクトフラノシダーゼの酵素反応
実施例１（３）、実施例２（３）、実施例３（３）の組換え大腸菌の培養液０．５ｍＬの集菌体、および、市販の酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（以下、「Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」と略記する。）由来インベルターゼのそれぞれに、６０（ｗ／ｗ）％のスクロース水溶液３５０μＬまたはフラクトオリゴ糖水溶液（Ｂｒｉｘ４７％） ５００ｍｇを加えて懸濁した。これらを３０℃（組換え大腸菌の場合）または６０℃（市販の酵母由来インベルターゼの場合）にて、２００ｍｉｎ―１で３〜２４時間振盪することにより、スクロース、フラクトオリゴ糖のそれぞれを基質としたβ−フルクトフラノシダーゼの酵素反応を行い、反応液を得た。すなわち、Ｇｅｏ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液においては、スクロース特異的分解剤により、Ｇ．ｔｈａｉ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液においては、Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼにより、Ａ．Ｋａｗａ組換えベクターを導入した組換え大腸菌の反応液においては、Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼにより、酵素反応を行った。
【００５１】
（２）酵素反応生成物の確認
本実施例４（１）の反応液５０μＬに水９５０μＬを加えることにより希釈し、１００℃で１０分間加熱した。これを４℃、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離に供して上清を回収した後、０．４５μｍ孔フィルターで濾過して、得られた濾液をＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣサンプルを下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、反応液に含まれる単糖（フルクトース、グルコース）、スクロース（２糖）およびフラクトオリゴ糖（３糖以上）の割合を確認した。各糖の割合は、検出された全ピークの面積の総和に対する各ピークの面積の割合として、面積百分率で算出した。スクロースを基質とした反応液の結果を表１に、フラクトオリゴ糖を基質とした反応液の結果を表２に、それぞれ示す。
【００５２】
《ＨＰＬＣの条件》
カラム；ＳＨＯＤＥＸ ＫＳ ８０２（８.０φ×３００ｍｍ）  ２本
移動相；水
流速  ；１．０ｍＬ／分
温度  ；５０℃
検出  ；示差屈折率検出器（ＲＩＤ；昭和電工社）（ピーク面積を用いた面積百分率）
【００５３】
【表１】
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【００５４】
表１に示すように、スクロースを基質とした場合、反応時間が２４時間において、スクロース特異的分解剤では、フラクトオリゴ糖は１．３％、スクロースが６１．２％、単糖が３７．５％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が４２．２％、スクロースが８．６％、単糖が４９．０％であった。Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖が５８．７％、スクロースが８．０％、単糖が３２．８％であった。また、市販の酵母由来インベルターゼ（日本バイオコン社）では、フラクトオリゴ糖がｎ．ｄ．（未検出）、スクロースが４．２％、単糖が９５．４％であった。市販の酵母由来インベルターゼ（三菱フードケミカル社）では、フラクトオリゴ糖がｎ．ｄ．（未検出）、スクロースが０．４％、単糖が９９．５％であった。
【００５５】
すなわち、スクロース特異的分解剤では、Ｇ．ｔｈａｉ由来、Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼと比較して、フラクトオリゴ糖の割合が小さく、また、反応時間に比例して単糖の割合が大きくなった。この結果から、スクロース特異的分解剤は、フラクトオリゴ糖の生成は起こさず、スクロース分解できることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼでは、フラクトオリゴ糖のおよびスクロースの割合が顕著に小さく、単糖の割合が顕著に大きかった。この結果から、市販の酵母由来インベルターゼは、フラクトオリゴ糖をほとんど生成せず、専らスクロースを分解することが明らかになった。
【００５６】
【表２】
0006727923.tif 000003
【００５７】
また、表２に示すように、フラクトオリゴ糖液を基質とした場合、反応時間が２４時間において、スクロース特異的分解剤では、フラクトオリゴ糖は５９．２％、スクロースが０．９％、単糖が３９．６％であった。これに対して、Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖は４８．８％、スクロースが９．９％、単糖が４０．６％であった。Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼでは、フラクトオリゴ糖は５７．２％、スクロースが８．０％、単糖が３２．８％であった。また、市販の酵母由来インベルターゼ（日本バイオコン社）では、フラクトオリゴ糖は１８．９％、スクロースが４．２％、単糖が７６．９％であった。市販の酵母由来インベルターゼ（三菱フードケミカル社）では、フラクトオリゴ糖はｎ．ｄ．（未検出）、スクロースが０．４％、単糖が９９．５％であった。
【００５８】
Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼでは、各フラクトオリゴ糖およびスクロースは減少し、単糖が増加した。すなわち、Ｇ．ｔｈａｉ由来β−フルクトフラノシダーゼは各フラクトオリゴ糖、スクロースを単糖に分解することが明らかになった。Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼは、時間が経つにつれより高分子のフラクトオリゴ糖は増加していき、スクロースは減少した。すなわち、Ａ．ｋａｗａ由来β−フルクトフラノシダーゼは、スクロースの分解は起こさずフラクトオリゴ糖を作ることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼでは、フラクトオリゴ糖の割合が顕著に小さく、スクロースの割合が小さく、単糖の割合が顕著に大きかった。すなわち、市販の酵母由来インベルターゼは、フラクトオリゴ糖、スクロースどちらも分解することが明らかになった。これらの酵素に比べて、スクロース特異的分解剤では、フラクトオリゴ糖の顕著な増加、減少はなく、スクロースのみ減少し、単糖の割合は増加した。この結果から、スクロース特異的分解剤は、その他のβ−フラクトフラノシダーゼに比べて、フラクトオリゴ糖の生成、分解は抑制しつつ、スクロースのみを分解できることが明らかになった。
【００５９】
以上の表１〜２の結果から、スクロース特異的分解剤は、フラクトオリゴ糖の生成および分解を抑制して、スクロースを特異的に分解できることが明らかになった。また、市販の酵母由来インベルターゼはフラクトオリゴ糖をほとんど生成しないが、スクロースのみならずフラクトオリゴ糖も分解する点で、加水分解の基質特異性は小さいことが明らかになった。
【００６０】
＜実施例５＞ フラクトオリゴ糖高純度化の評価
フラクトオリゴ糖高純度化に際し、スクロースを原料とし生成されたフラクトオリゴ糖を含む酵素反応液にスクロース特異的分解剤を添加し、スクロースを特異的に分解した。次いで、スクロースを特異的に分解した後の反応液を、クロマトグラフィーを用いて単糖を分離し、フラクトオリゴ糖の高純度化を行った。
【００６１】
（１）フラクトオリゴ糖含有反応液を用いたスクロース特異的分解試験
スクロースを原料とし生成された、種々の割合でフラクトオリゴ糖、スクロース、グルコースおよびフルクトースを含む反応液を得て、Ｎｏ．１〜５とした。また、この反応液を基質としてスクロース特異的分解剤を添加し、スクロースが特異的に分解された、種々の割合でフラクトオリゴ糖、スクロース、グルコースおよびフルクトースを含む反応液を得て、Ｎｏ．６〜１０とした。これらの反応液における糖組成の含有割合を表３に示す。
【００６２】
【表３】
0006727923.tif 000004
【００６３】
表３に示すように、フラクトオリゴ糖含有割合は、スクロース特異的分解剤を添加していない反応液Ｎｏ．１〜５でそれぞれ、５６．６％、５６．２％、５７．９％、５８．１％、５９．２％であった。また、スクロース含有割合は、それぞれ、２０．８％、２１．０％、２０．１％、２１．０％および１９．３％であった。また、単糖（グルコースおよびフルクトース）は、それぞれ２２．６％、２２．８％、２２．０％、２０．９％および２１．５％であった。これに対して、スクロース特異的分解剤を添加した反応液Ｎｏ．６〜１０のフラクトオリゴ糖含有割合はそれぞれ、５７．３％。５６．２％、５５．１％、５８．３％、５９．１％であった。また、スクロース含有割合はそれぞれ、１．１％、０．９％、１．５％、１．２％および０．８％であった。また、単糖（グルコースおよびフルクトース）はそれぞれ、４１．６％、４２．９％、４３．４％、４０．５％および４０．１％であった。
【００６４】
すなわち、スクロース特異的分解剤を添加したＮｏ．６〜１０は、フラクトオリゴ糖の生成、および分解を抑制しつつ、スクロースのみを特異的に分解し、単糖であるグルコースおよびフルクトースにすることができた。
【００６５】
（２）クロマトグラフィーを用いたフラクトオリゴ糖液分離試験
（１）で得られた反応液におけるフラクトオリゴ糖含有率を高めるために、イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに供してケストースの分離精製を行い、フラクトオリゴ糖液を得た。フラクトオリゴ糖液における糖組成の含有割合を表４に示す。
【００６６】
【表４】
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【００６７】
表４に示すように、クロマトグラフィーによる分離精製後のフラクトオリゴ糖含有割合は、スクロース特異的分解剤を添加していない反応液Ｎｏ．１〜５でそれぞれ、８０．１％、８１．１％、８０．３％、７９．４％および７９．１％であった。また、フラクトオリゴ糖の回収率は、それぞれ７０．３％、６８．５％、６６．１％、６８．２％および７７．４％であった。これに対して、スクロース特異的分解剤を添加した反応液Ｎｏ６〜１０のフラクトオリゴ糖含有割合はそれぞれ、９５．２％、９５．２％、９５．７％、９５．６％および９５．４％であった。また、フラクトオリゴ糖の回収率はそれぞれ９０．１％、９１．３％、９０．８％、８９．９％および９２．１％であった。
【００６８】
すなわち、スクロース特異的分解剤を添加していない反応液Ｎｏ．１〜５よりも、スクロース特異的分解剤を添加したＮｏ．６〜１０のほうが、糖組成中のフラクトオリゴ糖含有割合が高く、またフラクトオリゴ糖の回収率が高くなった。
【００６９】
以上の表３〜４の結果から、フラクトオリゴ糖含有液をスクロース特異的分解剤で処理した場合、クロマト分離後の糖組成中のフラクトオリゴ糖含有割合が約９５％以上、フラクトオリゴ糖の回収率が約９０％以上にすることができた。すなわち、フラクトオリゴ糖と分子量の近いスクロースを特異的に分解することで、フラクトオリゴ糖を効率よく分離することができ、フラクトオリゴ糖高純度液を製造すること生成できることが明らかになった。
【００７０】
＜実施例６＞スクロースを原料とした糖アルコール製造
（１）スクロース加水分解反応
実施例１（３）で得られたスクロース特異的分解剤に、３０％（ｗ／ｗ）スクロース水溶液１０ｇ（うち、Ｓｕｃ ３ｇ含有）を添加し、懸濁させ、３０℃、２００ｒｐｍで５５時間酵素反応を行い、スクロースを単糖に分解した。１００℃、1０分間熱処理を行い、酵素を失活させたのちに、遠心分離（１５，０００×ｇ, １０ｍｉｎ, ４℃）し上清を酵素反応液として回収した。
（２）ＮａＢＨ４還元反応
本実施例６（１）の酵素反応液をアルカリ性にし、スターラー撹拌しながら、室温にて０．３３ｇの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を徐々に加えた。すべて添加後、同温で２４時間撹拌した。その後、酢酸を加え、過剰のＮａＢＨ４は分解した。また、比較例Ｎａｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｏｒｏｌとして、酵素反応を行っていない３０％（ｗ／ｗ）  スクロース水溶液１０ｇも用意した。
【００７１】
（３）糖アルコール生成量の評価
本実施例５（２）のＮａＢＨ４還元反応後サンプルをイオン交換樹脂により処理し、０．４５μｍ孔フィルターで濾過して、得られた濾液をＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣサンプルを下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供して、反応液に含まれる単糖（フルクトース、グルコース）、スクロース（２糖）およびフラクトオリゴ糖（３糖以上）、糖アルコール（ソルビトール、マンニトール）の割合を確認した。各糖の割合は、検出された全ピークの面積の総和に対する各ピーク面積の割合として、面積百分率で算出した。ＮａＢＨ４還元反応後サンプルの結果を表４に示す。
【００７２】
《ＨＰＬＣの条件》
カラム：ＢｉｏＲａｄ製 Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｐ（７．８φ×３００ｍｍ）
流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：超純水
温度：８５℃
検出器：示差屈折率検出器  （ＲＩＤ；昭和電工社製）（ピーク面積を用いた面積百分率）
【００７３】
【表５】
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【００７４】
表５に示すように、スクロースを原料とし糖アルコールを作成した場合、スクロース特異的分解剤で処理しなかったもの（スクロース特異的分解剤未処理ＮａＢＨ４還元）は、スクロースが９９．１５％、グルコースがｎ．ｄ．（未検出）、フルクトースがｎ．ｄ．（未検出）、マンニトールがｎ．ｄ．（未検出）、ソルビトールがｎ．ｄ．（未検出）であった。これに対して、スクロース特異的分解剤処理を行ったものでは、スクロースが１１．８１％、グルコースが０．２７％、フルクトースが０．１４％、マンニトールが２２．３７％、ソルビトールが６３．５８％であった。
【００７５】
すなわち、スクロース液のみで還元した場合、スクロース特異的分解剤処理を行った場合と比較して、スクロース特異的分解剤処理を行った場合では糖アルコールが８５．９％の割合を占めるまで生成することができた。スクロース特異的分解剤処理を行うことで、表５のようにスクロースを効率よく単糖に分解でき、ソルビトール、マンニトールを生成できることが明らかになった。
【００７６】
以上の表１〜５の結果から、スクロース特異的分解剤は、遺伝子組換え等の改良を必要とすることなくフラクトオリゴ糖の生成および分解を抑制して、スクロースを特異的に分解できることが明らかになった。このβ−フルクトフラノシダーゼを含むスクロース特異的分解剤を用いることで、スクロース原料から酵素反応によって得られたフラクトオリゴ糖液中に残存してしまうスクロースを分解し、クロマト分離の負担を低減し、効率的にフラクトオリゴ糖を高純度化できることを見出した。また、スクロースを特異的に分解し、グルコース、フルクトースを生成することで、酸加水分解を使用することなく、糖アルコールを生成できることを見出した。
【配列表】
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