(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一次細胞壁を除去又は破砕した植物細胞を、ｐＨが２．５以上３．５以下の環境下において、下記（１）〜（４）のいずれかの加熱条件で加熱し、
加熱後に不溶物を除去して二次細胞壁の可溶化物を調製する方法。
（１）ｐＨが２．５以上３．０未満の場合において、８０℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（２）ｐＨが３．０の場合において、１００℃以上、１０分間以上の加熱条件。
（３）ｐＨが３．０より大きく３．５未満の場合において、１００℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（４）ｐＨが３．５の場合において、１２１℃以上、２０分間以上の加熱条件。
【請求項２】
前記不溶物を除去して得られた処理物から凝集物を生じさせる工程と、
当該凝集物を回収して二次細胞壁の可溶化物を調製する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凝集物を生じさせる工程は、冷却する工程、凍結後に解凍する方法、分子量５０００以上の分離膜で濃縮する工程、塩析する工程、カルシウムイオンを添加してゲル化する工程の何れかである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
一次細胞壁を除去又は破砕した植物細胞を、ｐＨが２．５以上３．５以下の環境下において、下記（１）〜（４）のいずれかの加熱条件で加熱する工程と、前記加熱して得られた処理物から不溶物を除去する工程とにより得られる植物二次細胞壁の可溶化物。
（１）ｐＨが２．５以上３．０未満の場合において、８０℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（２）ｐＨが３．０の場合において、１００℃以上、１０分間以上の加熱条件。
（３）ｐＨが３．０より大きく３．５未満の場合において、１００℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（４）ｐＨが３．５の場合において、１２１℃以上、２０分間以上の加熱条件。
【請求項５】
一次細胞壁を除去又は破砕した植物細胞を、ｐＨが２．５以上３．５以下の環境下において、下記（１）〜（４）のいずれかの加熱条件で加熱する工程と、
前記加熱して得られた処理物から不溶物を除去する工程と、
前記不溶物を除去した処理物から凝集物を生じさせる工程と、
生じた凝集物を回収する工程と、
により得られる植物二次細胞壁の可溶化物。
（１）ｐＨが２．５以上３．０未満の場合において、８０℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（２）ｐＨが３．０の場合において、１００℃以上、１０分間以上の加熱条件。
（３）ｐＨが３．０より大きく３．５未満の場合において、１００℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（４）ｐＨが３．５の場合において、１２１℃以上、２０分間以上の加熱条件。
【請求項６】
一次細胞壁を除去又は破砕した植物細胞を、ｐＨが２．５以上３．５以下の環境下において、下記（１）〜（４）のいずれかの加熱条件で加熱する工程と、
前記加熱して得られた処理物から不溶物を除去する工程と、
前記不溶物を除去した処理物からゲルろ過クロマトグラフィによって、分子量が４５００〜７５０００の画分を分取する工程と、
により得られる植物二次細胞壁の可溶化物。
（１）ｐＨが２．５以上３．０未満の場合において、８０℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（２）ｐＨが３．０の場合において、１００℃以上、１０分間以上の加熱条件。
（３）ｐＨが３．０より大きく３．５未満の場合において、１００℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（４）ｐＨが３．５の場合において、１２１℃以上、２０分間以上の加熱条件。
【請求項７】
一次細胞壁を除去又は破砕した植物細胞を、ｐＨが２．５以上３．５以下の環境下において、下記（１）〜（４）のいずれかの加熱条件で加熱し、加熱後に不溶物を除去して得られる植物二次細胞壁由来のペクチン−タンパク質の可溶化物であって、
ゲルろ過クロマトグラフィによる分子量が４５００〜７５０００の糖タンパク質であり、
圧力２ＭＰａ以上の加力によって分子量が５０万以上に会合し、
前記糖タンパク質ユニットのメチル化度がいずれも２５〜３５％である植物二次細胞壁由来のペクチン−タンパク質の可溶化物。
（１）ｐＨが２．５以上３．０未満の場合において、８０℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（２）ｐＨが３．０の場合において、１００℃以上、１０分間以上の加熱条件。
（３）ｐＨが３．０より大きく３．５未満の場合において、１００℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（４）ｐＨが３．５の場合において、１２１℃以上、２０分間以上の加熱条件。
【請求項８】
イソロイシンが全アミノ酸中の１８〜２５モル％である請求項７に記載の植物二次細胞壁由来のペクチン−タンパク質の可溶化物。
【請求項９】
一次細胞壁を除去又は破砕した植物細胞を、ｐＨが２．５以上３．５以下の環境下において、下記（１）〜（４）のいずれかの加熱条件で加熱する工程と、
前記加熱して得られた処理物から不溶物を除去する工程と
前記不溶物を除去した処理物から凝集物を生じさせる工程と、
を有する請求項７又は８に記載のタンパク質− ペクチン可溶化物の調製方法。
（１）ｐＨが２．５以上３．０未満の場合において、８０℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（２）ｐＨが３．０の場合において、１００℃以上、１０分間以上の加熱条件。
（３）ｐＨが３．０より大きく３．５未満の場合において、１００℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（４）ｐＨが３．５の場合において、１２１℃以上、２０分間以上の加熱条件。
【請求項１０】
一次細胞壁を除去又は破砕した植物細胞を、ｐＨが２．５以上３．５以下の環境下において、下記（１）〜（４）のいずれかの加熱条件で加熱する工程と、
前記加熱して得られた処理物から不溶物を除去する工程と
前記不溶物を除去した処理物から分子量ふるいにより分画する工程と、
を有する請求項７又は８に記載のタンパク質− ペクチン可溶化物の調製方法。
（１）ｐＨが２．５以上３．０未満の場合において、８０℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（２）ｐＨが３．０の場合において、１００℃以上、１０分間以上の加熱条件。
（３）ｐＨが３．０より大きく３．５未満の場合において、１００℃以上、２０分間以上の加熱条件。
（４）ｐＨが３．５の場合において、１２１℃以上、２０分間以上の加熱条件。
【請求項１１】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法により得られた可溶化物又は請求項４〜８の何れか１項に記載の可溶化物の食品素材又は飼料若しくは肥料としての使用。
【請求項１２】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法により得られた可溶化物又は請求項４〜８の何れか１項に記載の可溶化物の乳化剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は植物二次細胞壁の可溶化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物性の食品素材は、穀物、果実、あるいは芋などの農業生産物として巨大な量が生産され、種々の食品用原料や果汁、発酵原料、飼料に用いられている。しかしながら、容易に加工されないいわゆる未利用農産物が多くある。これらは難分解繊維などとして取り扱われ、その一部は飼料として利用されるものの、そのほとんどは廃棄されてきた。また、その飼料でさえも、その難分解性のために肥育効果が少ない、すなわち消化しにくく、利用成分が抽出されにくいという問題点を抱えているものが多い。例えば、ダイズにおいては雪花菜(オカラ)であり、醤油粕であり、ジャガイモにおいては、ポテトパルプであり、リンゴやミカンにおいてはリンゴ粕、ミカン粕である。これらは、いずれも油脂やタンパク質やデンプンや果汁を搾り取った細胞壁を主とするいわゆる粕である。また、発酵原料などに汎用されるダイズ、サツマイモ、リンゴなどからも、発酵後に大量の粕(発酵粕)が出てきて、その多くは廃棄される。そして、粕だけでなく農産物そのものも十分には加工も利用もできていない。一方、バイオエタノールやバイオマスなどの原料として、植物性素材の利用も研究されているが、難分解性であるがゆえに、この分野でも十分には利用されていない。
【０００３】
ところで、これらの難分解性である植物性素材をこれまで以上に利用するためには可溶化が重要であり、容易に可溶化できれば食品素材やバイオマス原料として更に利用できるはずである。これらの難分解性植物食品素材については、その組織と構成成分が明らかにされており、細胞壁のうち、難分解性繊維とされているものの主要な組織は、細胞内部側に存在する二次細胞壁であるとされている(非特許文献１〜３)。したがって、難分解性繊維の有効利用のためには、二次細胞壁を可溶化する方法が望まれる。例えばダイズ種子では、一次細胞壁の内側にある二次細胞壁の内部に油分を含むオイルボディ及びタンパク質を含むプロテインボディからなるダイズボディ構造体が存在している。一次細胞壁はセルロースを主体とするので単細胞化すればセルラーゼにより容易に可溶化除去できるが、二次細胞壁はペクチンとタンパク質を主体とした糖タンパク質なのでセルラーゼや通常のペクチナーゼでは可溶化できない。
【０００４】
これまで、二次細胞壁を可溶化する方法として、水酸化ナトリウムのような強アルカリを用いる方法が知られているが（非特許文献２）、これらの方法では可溶化後にそのままでは食品素材として利用できない。また、アルカリ域での可溶化ではリジノアラニンのような腎毒性物質の生成が容易におこるので、当該方法も利用できない。変性剤であるドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を用いる方法もあるが、ＳＤＳも有毒であるために食品素材への利用はできない。また、強酸分解はバイオマス分野では単糖の生成のために利用されているが、例えば、食品分野で利用可能な粘性物であったり、ゲル化物であったり、多糖やタンパク質の形で利用する場合には低分子量過ぎて不向きである。また、特定のペクチナーゼにより二次細胞壁を可溶化する方法も報告されてはいるが(特許文献１、非特許文献２)、酵素分解では単糖やオリゴ糖、そしてペプチドといった低分子性の消化物の生成には適しているが、このような低分子性消化物以外の使用用途には不向きであり、しかも酵素生産に費用がかかることも好ましくはないと考えられ、別の簡便で安価な方法が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−４３５８４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bob. B. Buchanan et al.、  植物の生化学・分子生物学、学会出版センター、47-48ページ
【非特許文献２】Kasai et al.、Enzymatic High Digestion of Soybean Milk Residue (Okara)、J. Agr & Food Chem.、2004、Vol. 52、No. 18、pp.5709-5716
【非特許文献３】Kasai、Are Agricultural Plant Products and Residues Indigestive Fiberes？、J. Appl. Glycosci.、2008、55、pp.133-141 (2008).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願発明は、酵素を用いることなく緩和な条件で二次細胞壁を分解することで、新たな食品素材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明は、ｐＨ２.５〜３.５の環境下で加熱する工程を含む二次細胞壁の可溶化方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本願発明によると、緩和な条件で二次細胞壁が分解、可溶化され、乳化剤として使用し得る分解産物を含む新たな食品素材が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は二次細胞壁の加熱処理前後の大豆細胞の顕微鏡画像である。（A)は一次細胞壁分解後の画像、（B)は二次細胞壁分解後の画像である。（A）の破線囲みは二次細胞壁を示す。
【図２】図２はｐＨの変化が大豆二次細胞壁の可溶化に与える影響を示す図である。
【図３】図３は加熱時間の変化が大豆二次細胞壁の可溶化に与える影響を示す図である。
【図４】図４は加熱温度の変化が大豆二次細胞壁の可溶化に与える影響を示す図である。
【図５】図５は大豆二次細胞壁の可溶化可能なｐＨと加熱温度との関係を示す図である。
【図６】図６は市販の生オカラをｐＨ３.０で加熱した後の顕微鏡画像である。(A)は加熱前の画像、（B)は加熱後の画像である。（A）の囲みは二次細胞壁を示す。
【図７】図７は大豆二次細胞壁の加熱処理前後の液の状態変化を示す画像である。(A)は加熱前の状態を、（B)は加熱後の状態を示す。
【図８】図８は大豆二次細胞壁の可溶化物のSDS-PAGE画像である。(A)はBio-Safe CBB G250によるタンパク質の染色を、(B)は同CBB R-250によるタンパク質の染色を、（C)はPAS染色による糖の染色を示す。
【図９】図９は各種ｐＨ条件における大豆二次細胞壁の可溶化物のHPLC分析におけるクロマト図である。
【図１０】図１０は大豆二次細胞壁を可溶化して得られる凝集物のHPLC分析におけるクロマト図である。Aは可溶化して得られた溶液の上清を、Bはそれを凍結、解凍して得られた溶液の上清を、Cは凍結、解凍して得られた凝集物を再溶解した溶液を示す。
【図１１】図１１は大豆二次細胞壁の可溶化物のゲルろ過クロマトグラフィ（Sephacryl S-100HRによる）におけるクロマト図である。
【図１２】図１２はゲルろ過クロマトグラフィ（Sephacryl S-100HRによる）で得られたフラクションのHPLC分析におけるクロマト図である。
【図１３】図１３はゲルろ過クロマトグラフィ（Sephacryl S-100HRによる）で得られたフラクションのSDS-PAGE画像である。
【図１４】図１４はゲルろ過クロマトグラフィ（Sephacryl S-100HRによる）で得られたフラクション中の中性糖の分析結果を示す図である。
【図１５】図１５はゲルろ過クロマトグラフィ（Sephacryl S-100HRによる）で得られたフラクション中のウロン酸のメチル化度を示す図である。
【図１６】図１６はゲルろ過クロマトグラフィ（Sephacryl S-100HRによる）で得られたフラクション中のアミノ酸分析の結果を示す図である。
【図１７】図１７はゲルろ過クロマトグラフィ（Sephacryl S-100HRによる）で得られたフラクション（Fr.20）のHPLC分析におけるクロマト図である。(A)は検出波長280nmによるクロマト図、（B)はRIによるクロマト図である。
【図１８】図１８はゲルろ過クロマトグラフィ（Sephacryl S-100HRによる）で得られたフラクション（Fr.20）のHPLC分析におけるクロマト図である。(A)は検出波長280nmによるクロマト図、（B)はRIによるクロマト図である。
【図１９】図１９は大豆二次細胞壁の可溶化物による乳化作用を示す顕微鏡画像である。
【図２０】図２０は大豆二次細胞壁の可溶化物による乳化安定性を示すグラフである。
【図２１】図２１は大豆二次細胞壁の可溶化物による乳化５時間後の状態を示す顕微鏡画像である。
【図２２】図２２はｐＨ変化が大豆二次細胞壁の可溶化物による乳化作用に与える影響を示す顕微鏡画像である。
【図２３】図２３は大豆二次細胞壁の可溶化物による起泡性を示す画像である。（A)は大豆二次細胞壁の可溶化物による画像、（B)はカゼイン水溶液による画像を、（C)はアルブミン水溶液による画像である。
【図２４】図２４はｐＨ変化が起泡性に与える影響を示す図である。
【図２５】図２５は小豆の二次細胞壁をｐＨ３.０で加熱した後の顕微鏡画像である。(A)は加熱前の画像、（B)は加熱後の画像である。図中の矢印は二次細胞壁を示す。
【図２６】図２６はミカンの二次細胞壁をｐＨ３.０で加熱した後の顕微鏡画像である。(A)は加熱前の画像、（B)は加熱後の画像である。図中の矢印は二次細胞壁を示す。
【図２７】図２７はリンゴの二次細胞壁を可溶化して得られる凝集物のHPLC分析におけるクロマト図である。(A)は検出波長280nmによるクロマト図、（B)はRIによるクロマト図である。
【図２８】図２８はミカンの二次細胞壁を可溶化して得られる凝集物のHPLC分析におけるクロマト図である。(A)は検出波長280nmによるクロマト図、（B)はRIによるクロマト図である。
【図２９】図２９はリンゴ二次細胞壁の可溶化物による乳化作用を示す画像である。
【図３０】図３０はリンゴ二次細胞壁の可溶化物による起泡性を示す画像である。（A)はリンゴ二次細胞壁の可溶化物による画像、（B)はカゼイン水溶液による画像を、（C)はアルブミン水溶液による画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明における可溶化方法は、ｐＨ２.５以上３.５以下の環境下で加熱することで二次細胞壁を可溶化する方法である。これにより二次細胞壁が選択的に可溶化される。ここで選択的とは、二次細胞壁のみを分解して可溶化することを意味し、二次細胞壁が選択的に可溶化されることで、一次細胞壁が除去又は破砕された細胞から二次細胞壁が可溶化され、いわゆるボディ部分が残る。また、選択的とは、ボディ部分の化学構成物がほとんど分解されないことを意味し、望ましくはボディ構造体の構造が破壊されずにボディ構造体が残る。もっとも、飼料として用いる場合、消化を良くするためにボディ構造が構造的に破壊されることが好ましい場合もあり、ボディ構造体が破壊されていても差し支えない。本発明の可溶化では、ボディ構造体が破壊され、さらにボディ部分の化学構成物が分解して可溶化物の一部として溶出する場合も含み得るが、ボディ構造体が破壊されて、ボディ部分の化学構成物が可溶化物に溶出した細胞の割合は加熱前に二次細胞壁を有していた細胞数に対して好ましくは１０％未満、さらに好ましくは５％未満、望ましくは１％未満である。また、二次細胞壁が選択的に可溶化されることで一次細胞壁が除去されていない細胞から二次細胞壁が可溶化され、後にセルラーゼにより一次細胞壁を可溶化除去すればボディ構造体が残る。また、選択的に可溶化されるとは、二次細胞壁の可溶化率、つまり、加熱前に二次細胞壁を有していた細胞数に対して加熱後に二次細胞壁を失った細胞数の割合が少なくとも３０％以上であり、好ましくは７０％以上であり、さらに望ましくは９０％以上であり、より望ましくは９５％以上であることを意味する。
【００１２】
本発明における可溶化の植物は、二次細胞壁を有する限り特に制約がなく、好ましくは食品素材となり得る植物の細胞であり得る。植物性の食品素材は、例えば大豆や小豆などの豆類であり、ジャガイモやサツマイモのイモ類であり、コメやムギ、トウモロコシなどの穀類であり、バナナやみかん、リンゴなどの果物類であり、ゴマやヒマワリなどのその他の植物種子であり、ほうれん草や小松菜の葉物類であり得る。可溶化の対象は、これらの食品素材そのものでもよいが、好ましくは、食品に加工された後の残渣であるオカラや醤油粕、リンゴ粕、脱脂大豆などの各種絞り粕である。また、これら食品素材以外にも、ツバキの種子などの油糧種子なども好ましい対象となり得る。
【００１３】
本発明においては、可溶化前に植物細胞を単細胞化する工程が必要において備えられる。単細胞化の方法も前記植物細胞を単細胞にできる方法であれば特に制約されず、例えば、特許文献１や特開２００２−２５６２８１号公報に記載された方法、すなわち熱水に浸漬する方法やオートクレーブによる加熱する方法が示される。単細胞化した後には、全ての細胞が単細胞化していることが望ましいが、細胞のいくつかが細胞間接着物質を介して他の細胞と接触していてもかまわない。好ましくは、単細胞化された細胞数が全体の細胞数の６０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上である。また、可溶性ペクチンが多い植物の場合には、単細胞化することなく、あるいは単細胞化した後に熱水などを用いて可溶性ペクチンを除去しておくのが好ましい。
【００１４】
本発明において、二次細胞壁の可溶化物を取得するためには、可溶化の前に植物細胞の一次細胞壁を除去することが好ましい。一次細胞壁の除去方法として、例えばセルラーゼによる方法、具体的には例えば特許文献１に記載された方法が例示される。また、一次細胞壁を除去するまでもなく、一次細胞壁を破砕又は破壊しておくのでもよい。例えば、エクストゥルダーや溶媒抽出を用いて脂質を除去する、または乾燥する方法が例示される。例えば、脱脂大豆では一次細胞壁が除去されているとは言えないが、脱脂処理における圧扁、油脂の抽出（脱脂）により一次細胞壁が破砕（又は破壊）されて一次細胞壁にいわゆる孔が空いている状態になっている。このような状態にある脱脂大豆を酸性環境下で加熱すれば、二次細胞壁が可溶化される。従って、脱脂大豆ではこのような一次細胞壁を除去する作業が不要になるが、さらに一次細胞壁を除去することで二次細胞壁の可溶化が進みやすくなる。
【００１５】
植物細胞は、ｐＨが２.５以上３.５以下、好ましくは３.０以上３.５以下の環境下で加熱される。ｐＨが２.５を下回る酸性下では、二次細胞壁のみならずいわゆるボディ構造体などの二次細胞壁以外からのタンパク質などの成分が可溶化もしくは抽出されてくるだけでなく、酸により低分子化された物質が多くなる。また、ｐＨが３.５よりも高い液性下では、二次細胞壁を十分に可溶化できなくなる。
【００１６】
加熱温度は８０℃以上１２５℃以下、好ましくは１００℃以上１２５℃以下である。加熱時間は１０分以上３０分以下、好ましくは２０分程度である。３０分を越えると漏出するボディ部分からのタンパク質などの量が多くなったり、二次細胞壁のさらなる低分子化が起こりえる。また、８０℃未満の温度では３０分以上の加熱が必要となり、二次細胞壁が十分に可溶化できない場合がある。
【００１７】
植物細胞は加熱時において上記ｐＨの環境下におかれればよく、ペースト状に濡れている状態にあればよい。また、得られた可溶化物を分離するために好ましくは上記ｐＨ域に調整された液中で加熱される。当該液は好ましくは水である。水の添加量は植物細胞がペースト状に濡れる量であればよく、好ましくは細胞量と質量比で１／１０量以上、さらに好ましくは２倍量以上、より望ましくは１０倍量程度である。
【００１８】
本発明に係る可溶化物は、一次細胞壁を除去又は破砕した後の植物細胞を前記条件にて加熱して得られた溶液から不溶物を除去して得られる二次細胞壁の分解物である。当該分解物は分解生成物の混合物でもあり、また、混合物から分離して得られる物質（可溶化物質）でもあり得る。本発明に係る可溶化物は、混合物として取得する場合、前記条件において加熱した後に可溶化しなかった不溶物を除去した溶液でもあり、加熱により可溶化せずに残ったボディや細胞間組織を含んだ溶液でもあり得る。さらにこれらの溶液を濃縮して得られる濃縮物でもあり得る。
【００１９】
前記可溶化物質は、上記条件で可溶化されずに残ったボディ部分や細胞間組織を除いた液体から凝集させることで回収された凝集物でもあり、ボディ部分や細胞間組織を除いた液体から、ゲルろ過クロマトグラフィなどの分画操作により回収された画分（当該凝集物となりえる物質を含む画分）でもあり得る。この凝集物は、ボディ部分や細胞間組織を除去した溶液(例えば遠心分離の上清)を、冷却する方法、凍結後に解凍する方法、分子量５０００以上の分離膜で濃縮する方法(この場合には必要に応じて濃縮後に凍結乾燥などの方法が加えられる)、エタノールやアセトンなどの有機溶媒を添加する方法、カルシウムイオンを加えてゲル化する方法、凍結乾燥する方法などで得られる。凝集物として回収された可溶化物は、酸やアルカリ、キレート剤で容易に再可溶化される。
【００２０】
当該凝集物（可溶化物質）は、実施例に述べるHPLC条件下において高分子ピークＨとして現れる物質であって、ガラクチュロン酸が重合した高分子から構成されるペクチンとそれと一緒に構成されるタンパク質を含む二次細胞壁の分解物である。この分解物は、ゲルろ過クロマトグラフィ（Sephacryl S-100HRによる）を行った場合に分子量が４５００〜７５０００の糖タンパク質であって、圧力２ＭＰａ以上の加力によって分子量が５０万以上に会合するという特徴を有する。また、当該糖タンパク質のメチル化度が２５〜３５％であって、イソロイシン（Ile）が全アミノ酸中の１２〜２５モル％であるという特徴を有する。ここでのメチル化度は、前記糖タンパク質ユニットをケン化することで生成されるメタノールの、前記糖タンパク質ユニット中の全ガラクチュロン酸に対するモル比(MtOH/Gal A)である。なお、前記示された特徴は、可溶化物質として特定可能な程度に必要とされる最小限の特徴である。また、本発明に係る可溶化物質は、ガラクチュロン酸を中心とする糖鎖にタンパク質が結合した高分子物質であって、直接的に可溶化物質の構造を特定することは不可能であり、構造を厳密に特定することはおよそ実際的でないと言える。可溶化物質を構成する中性糖や構成アミノ酸のプロファイルの一例を挙げると、特徴的に出現するアミノ酸の構成比は、例えば大豆では、アスパラギン酸及びアスパラギン（Asx）が９〜１０モル％、グルタミン酸及びグルタミン（Glx）が８〜２０モル％、リシン（Lys）が３〜８モル％、アラニン（Ala）が２〜１０モル％、アルギニン（Arg）が３〜６モル％、バリン（Val）が３〜８モル％である。また、特徴的に出現する中性糖の構成比は、例えば大豆では、アラビノース（Ara）が２０〜３０モル％、ガラクトースが３０〜７０％,ラムノースが０〜３０％であり、グルコースが１０％以下である。なお、本発明に係る可溶化物は植物二次細胞壁から得られたものであり、植物一次細胞壁間隙であるミドルラメラから得られたものとは異なる。
【００２１】
本発明に係る可溶化物は乳化作用を発揮し、起泡性に優れているので、乳化剤や発泡剤として利用できる。また、ｐＨ２.５以上３.５以下の弱酸性下で得られるので、二次細胞壁を可溶化後、ボディ部分及び細胞間組織を除去した溶液を、中和することなく例えば食品の添加剤や飼料、肥料として使用することができる。もっとも、当該溶液を中和した後の溶液を用いることにしてもよく、当該溶液から前記手段により回収した可溶化物質を乳化剤や発泡剤として用いることもできる。中和することなくそのまま、例えば食品の添加剤や飼料、肥料として使用することができる。乳化剤や発泡剤としての使用量は、使用目的、乳化対象物に応じて当業者により適宜決定され得る。さらに、ペクチン分解物はビフィズス菌をよく生育させることからプレバイオティクス効果が期待されるので、本発明に係る可溶化物はプレバイオティクス効果のある食品素材としても使用され得る。
【００２２】
次に下記の実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に限られることがないのはいうまでもない。
【実施例１】
【００２３】
〔一次細胞壁分解ダイズ(2CWペースト)の調製〕
精油用米国産の生大豆(油脂含量：ソックスレー抽出法により20.68%)10ｇに100mlの水(大豆の重量に対して10倍量)を加え、オートクレーブ処理を121℃で20分間行った。抽出液を除いた後、ペースト状にした。この大豆ペーストに20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を100ml、セルラーゼ(GODO-TCF：合同酒精株式会社)を全量に対して5%加え、37℃で一晩反応させた。遠心分離(2000rpm、10分)により上清を除いた後、20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を100ml加えて懸濁した後、再び遠心分離して上清を捨てた(3回の繰り返し)。その後、残査と等容量の20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を加えて混和し、一次細胞壁を分解した後のダイズ細胞(以下「2CWペースト」と称する。)を得た。ダイズは単細胞化され、二次細胞壁が膨らんだ細胞が位相差顕微鏡下で観察された。
【００２４】
〔酸性熱処理による二次細胞壁(2CW)の可溶化〕
(１)ｐＨによる影響
0.1M酢酸緩衝液又はCH3COONa/HCl緩衝液(pH4〜1.5)800μLに2CWペースト80μLを添加した。撹拌後、その400μLを採取し、100℃で20分間加熱した後、遠心分離(10000rpm、10分、4℃)により上清を回収した。上清につき加熱前後の全糖量、タンパク質量、全ウロン酸量の測定を行い、加熱による全糖量、タンパク質量、全ウロン酸量の増加量を算出した。また、位相差顕微鏡により、2CWの可溶化率を測定した。全糖量、タンパク質量、全ウロン酸量は次の方法により求めた。なお、これらの測定は以下において同じ方法によった。蒸留水(pH5.3)を用いて同様の加熱を行ったときの増加量をブランクとして加熱前後の各増加量から差し引き、加熱前後の増加量とした。
【００２５】
加熱処理前後（pH3.0）の大豆細胞の位相差顕微鏡下における画像を図１に示した。また、それらの結果を図２に示した。2CWはpH3.5付近で可溶化されるようになり、2CWのほぼ１００％を可溶化するのに最低限必要な酸性条件はpH3.0であった。pH2.0以下ではさらにTP、TS、TUの増加量が大きくなったことから、2CWのさらなる低分子化や大豆ボディの可溶化の可能性が認められた。
【００２６】
ａ)全糖量(TS：Total Sugar)の測定
フェノール硫酸法により求めた。試料に5%フェノールと濃硫酸を加え、492nmの吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線から試料中の全糖量を求めた。
ｂ)タンパク質量(TP：Total Protein)の測定
ブラッドフォード法により求めた。試料にプロテインアッセイ染色液を加えて混合し、室温で5分静置した後、600nmの吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線から、試料中のタンパク質濃度を求めた。
ｃ)全ウロン酸量(TU：Total Uronic acid)の測定
3-フェニルフェノール法により求めた。試料にNa2B4O7/H2SO4を加えてよく混合し、100℃で加熱した後、流水で冷却し、3-フェニルフェノールを加えてよく混合した後、546nmの吸光度を測定し、予め作成しておいた検量線から、試料中のタンパク質濃+度を求めた。
ｄ)可溶化率の算出
可溶化率は下記の式(数１)により求めた。加熱前に既に2CWがない細胞の割合(％)をブランクとした。
【００２７】
【数１】
0006632318.tif 000002
【００２８】
(２)加熱時間による影響
0.1M酢酸緩衝液80μLに2CWペースト80μLを添加した。撹拌後、その400μLを採取し、100℃で3〜20分間加熱した後、遠心分離(10000rpm、10分、4℃)により上清を回収した。上清中の全糖量、タンパク質量、全ウロン酸量の測定を行った。また、位相差顕微鏡により、2CW可溶化率を測定した。その結果を図３に示す。今回の結果ではpH3.0、100℃の条件で少なくとも10分間加熱すると2CWをほぼ可溶化出来ることがわかった。
【００２９】
(３)加熱温度による影響
0.1M酢酸緩衝液800μLに2CWペースト80μLを添加した。撹拌後、その400μLを採取し、60〜100℃及びオートクレーブ121℃で20分間加熱した後、遠心分離(10000rpm、10分、4℃)により上清を回収した。上清中の全糖量、タンパク質量、全ウロン酸量の測定を行った。また位相差顕微鏡により、2CW可溶化率を測定した。その結果を図４に示す。pH3.0、20分間の条件では少なくとも100℃で加熱すると2CWをほぼ可溶化出来ることがわかった。また温度を121℃以上にするとTP、TS、TUの増加量が大きくなることが認められた。2CWのみならず、大豆ボディの可溶化の可能性も考えられた。
【００３０】
(４)可溶化可能なpHと加熱温度の最低条件の決定
pHが2、2.5、3、3.5の0.1M酢酸緩衝液を調製し、それぞれ800μLに2CWペースト80μLを添加した。撹拌後、その400μLを採取し、20〜110℃及びオートクレーブ121℃で20分間加熱した後、位相差顕微鏡により、2CW可溶化率を測定することで、20分間の加熱で2CWが95％以上可溶化されるときの温度条件を決定した。その結果を図５に示す。この結果、pH3.0では100℃での加熱が必要であることがわかった。またpH3.5でもオートクレーブ処理をすれば2CWは可溶化出来た。pHを2.0まで下げると60℃でも可溶化出来た。
【００３１】
(５)生オカラの可溶化
市販の生オカラに質量比で10倍量の蒸留水を加え、セルラーゼ(GODO-TCF)を全量に対して5％加えて、37℃で一晩反応させた。遠心分離(2000rpm、10分)により上清を除いた後、同量の水を加えて、オカラ2CWペーストを調製した。0.1M pH3.0酢酸緩衝液3mLと、オカラ2CWペースト600μLの割合で両者を混和して、100℃で20分間加熱し、二次細胞壁を可溶化した。その後、遠心(3500rpm、5min)した。
【００３２】
加熱前後について位相差顕微鏡で観察したところ、加熱前には、透明な膜状の2CWが観察されるが、煮沸後には2CWが消失し、大豆ボディと細胞間組織が観察された（図６参照）。また、加熱前後のペースト溶液(14mL)を遠心分離したところ、加熱後の沈殿物は、加熱前の沈殿物に対して18％に減少していた（図７参照）。このように大豆粕であるオカラから二次細胞壁が可溶化したことが確認された。
【実施例２】
【００３３】
〔酸性熱処理による二次細胞壁(2CW)の可溶化物の特徴化１〕
酸性下における加熱により得られた可溶化物の特徴について検討を行った。
(１)SDS-PAGE
イオン交換水40mLに実施例１で調製した2CWペースト10mLを加え、6M HClを用いてpH5~1の溶液をそれぞれ調製した。これらから3mLをそれぞれ試験管に移し、60℃、80℃、100℃、アルミブロック恒温槽121℃でそれぞれ20分間加熱した。遠心分離(4000rpm、10分)により上清を採取し、さらにメンブレフィルター(0.2μm)でろ過したもの1mLを凍結乾燥した。これにイオン交換水100μLを加え、サンプルとした。これらのサンプルとサンプル処理液を4:1の割合で混合した後、10分間加熱し、その後放冷した。電気泳動装置及び15%ゲル(アトー社)と15％トリシン系ゲル(アトー社)を用いて、20mA、75分間、電気泳動を行い、Bio-Safe CBB G250及びCBB R-250(それぞれ Quick Start(商品名) Bradford 1x Dye Reagent：バイオ・ラッド ラボラトリーズ社)によるタンパク質の染色及びPAS染色による糖の染色を行った。
【００３４】
サンプル処理液には、3.75gのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と、2.50mLの2-メルカプトエタノールと、8.38mLの1M Tris-HCl緩衝液(pH6.8)と、6.25mLのグリセリンと、2.50mgのBPB(ブロモフェノールブルー)をイオン交換水に溶解し500mLとしたものを用いた。また、泳動バッファー(10倍液)には、1.5g(25mM)のトリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)と、0.5g(0.1%)のSDSと、7.2g(192mM)のグリシンをイオン交換水に溶解し、全量を500mLとした溶液を用いた。
【００３５】
SDS-PAGE画像を図８に示した。CBB G250染色、CBB R-250染色において平均分子量約6.6kDa(色が強く出現した付近の中心値から分子量を算出した。)にpH3.0、100℃の加熱において2CWが可溶化して生成された物質と考えられるバンドがあることがわかった。PAS染色においても同じ分子量あたりに薄い染色が見られ、当該物質はタンパクに糖が結合した化合物である可能性が示唆された。pH3.5／121℃、pH2.5／80℃、pH2.0／60℃でも同様に6.6kDa付近にバンドが見られた。またpH3.0未満の熱処理抽出物では分子量50kDa以上にも染色バンドが見られ、当該物質以外のものが多く可溶化していることが示唆された。
【００３６】
(２)HPLC分析
イオン交換水40mLに実施例１で調製した2CWペースト10mLを加え、6M HClを用いてpH5〜1の溶液をそれぞれ調製した。これらから3mLをそれぞれ試験管に移し、100℃で加熱した(pH2、2.5、3.5はそれぞれ60℃、80℃、121℃でも加熱した)後、遠心分離(4000rpm、10分)を行い、上清をメンブレンフィルター(0.20μm)でろ過して分析用サンプルを調製した。得られたサンプルについてHPLC分析を行った。HPLC分析には、ポンプDP-8020(東ソー株式会社製)、紫外・可視分光光度UV-8020(東ソー株式会社製)、示差屈折率(RI)検出器RID-6A(島津製作所)、HPLC用カラムTSK-GEL G3000 SWXL(東ソー株式会社製)を用いた。蒸留水を溶離液として、流量1.0mL/minで分析を行った。
【００３７】
その結果を図９に示す。pHを下げていくと、pH3.5〜2.5でUV280、RIに高分子ピークH(約3.5min)が出現することがわかり、この高分子ピークHが二次細胞壁の可溶化で生成された物質の主たる成分である可能性が示唆された。pHを2.5よりさらに下げていくと高分子ピークHはさらに大きくなるとともにその他のピーク(約12min及び約13min)の出現が徐々に見られ始めることから、水素イオン強度が高い条件(pH2.5未満)では2CW以外のものも可溶化されていることが推察される。
【００３８】
(３)凍結による凝集物の形成
イオン交換水40mLに実施例１で調製した2CWペースト10mLを加え、6M HClを用いてpH3.0の2CW混合溶液を調製した。この溶液1600μLを100℃、20分間加熱した。遠心分離(13200rpm、4℃、10分)した後、上清を採取(この溶液をAとした)し、そのうち1200μLを凍結した。これを解凍した後に生じた凝集を、遠心分離(13200rpm、4℃、10分)によりこの上清を採取し、溶液Bとした。また残った凝集物はイオン交換水を加えて洗浄し、遠心分離(13200rpm、4℃、10分)により上清を捨てた。そして、この操作を２回繰り返した。洗浄した凝集物に解凍後に採取した上清と同量のpH3.0に調整したHCl水溶液を加えて撹拌した後、100℃、20分間加熱したものを溶液Cとした。調製した溶液A、B、Cについて全糖量、タンパク質量、全ウロン酸量の測定を行い、またフィルターろ過を行った各溶液について前記実施例２(２)と同じ条件にてHPLC分析を行った。その結果を図１０に示す。
【００３９】
沈殿を再溶解させた溶液Cでは図９で示したpH3.0／100℃で可溶化される高分子ピークHがメインピークとして現れることがわかった。また凍結後の凝集物を除いた残りの溶液Bでは高分子ピークHがなくなっていた。表１に溶液A、B、CのTS、TP、TUの濃度を示した。溶液Cは溶液A中の約60％のウロン酸を含んでいたことがわかった。また溶液AのTU/TS＝0.26であるのに対して、溶液CはTU/TS＝0.42と溶液中の全糖量に対するウロン酸の割合が高くなった。この結果から、凍結により生じた凝集物はpH3.0における加熱により生成した可溶化物の主たる物質であり、かつHPLC分析によって高分子ピークHが現れるウロン酸含量の高い物質であり、タンパク質も含有するものと考えられた。
【００４０】
【表１】
0006632318.tif 000003
【実施例３】
【００４１】
〔酸性熱処理による二次細胞壁(2CW)の可溶化物の特徴化２〕
pH3.0での加熱により可溶化された2CW可溶化物についてゲルろ過クロマトグラフィ(Sephacryl S-100HR)を行い、さらに可溶化物の特徴を調べた。
(１)ゲルろ過クロマトグラフィ(Sephacryl S-100HR)による分画
2CWペースト60mLに6M HClを少量加えてpHを3.0に調整し、100℃で10分間煮沸した後、顕微鏡観察にて2CWが可溶化されていることを確認後、遠心分離(4000rpm、5分)で上清を回収した。さらに遠心分離(10000rpm、10分)を２回繰り返すことで油分を除去して可溶化物の溶液を得た。この溶液をカラムのフィッティング部分のフィルターに通し、溶液がフィルターを通過することを確認してサンプルとした。
【００４２】
サンプル18mL(TP：43540μg、TS：32400μg)をSephacryl S-100HR(GEヘルスケア・ジャパン)を充填したオープンカラム(2.5×94cm)により分画しフラクションコレクターにより10mLずつ回収した。溶出は流速0.3mL/minのイオン交換水で行った。回収したフラクションの全糖量、タンパク質量、全ウロン酸量を測定した。ゲルろ過クロマトグラフィによるクロマト図を図１１に示した。
【００４３】
Fr.20、24、29、36、46にTPのピークが得られ、そのうちFr.20、29、36ではTSのピークが重なっており、糖とタンパク質が結合した状態で可溶化しているものと考えられた。またFr.20、29にはTUのピークも認められ、ウロン酸も含有することがわかった。pH3.0/100℃の加熱により得られる高分子ピークH（実施例２（２）参照）を単離するためにこのゲルろ過クロマトグラフィを行ったが、Sephacryl S-100HRでは比較的低分子のFr.20(elution volume 200mL)に最初のピークが得られた。カラム容積に対する溶出量の比から分子量を算出すると、Fr.20、29に対応する分子量はそれぞれ約46kDa、7.4kDaであった。
【００４４】
(２)各フラクションのHPLC分析
回収したFr.20、29、36、46をメンブレンフィルターでろ過し、実施例２（２）と同じ条件によりHPLC分析を行った。その結果を図１２に示した。Fr.20、29に、上記実施例２の可溶化物に認められた高分子ピークHがメインに現れた。Fr.36、46にも少しピークが認められた。HPLC分析で得られた高分子ピークHは、カラム(TSK gel G3000 SWXL)の排除限界が500kDa以上であるため、分子量はそれ以上と考えられた。
【００４５】
(３)各フラクションのSDS-PAGE
10kcutスピンカラム(VIVASPIN 500(分子量分画10kDa：sartorius stedim社)を用いた遠心(13200rpm)によりFr.20は1.5倍、3.0倍、7.0倍に、Fr.24は7.0倍に、Fr.29は2.0倍、4.0倍に、Fr.36は3kcutスピンカラム(VIVASPIN 500(分子量分画3kDa：sartorius stedim社)を用いた遠心(13200rpm)により7.0倍にそれぞれ濃縮した。これらの濃縮物について、実施例２（１）に記載の方法に準じて、SDS-PAGEを行った。なお、タンパク質染色にはBio-Safe Coomassie G250を用いた。その結果を図１３に示した。
【００４６】
15%ゲルを用いた場合には、Fr.20、24、29においてはCBB G250、PAS染色どちらとも図８と同様に、加熱で得られる可溶化物質である思われるバンドが見られた(15%ゲルを用いたときのPAS染色は染色液、もしくはサンプルの濃度が低かったため、バンドは痕跡程度しか見られなかった)(図１３(A))。このことから、HPLC分析では高分子ピークHとして出現する可溶化物は、Sephacryl S-100HRによるゲルろ過クロマトグラフィでは比較的低分子に出現することがわかった。また、15%トリシン系ゲルにおいて、Fr.36においてもCBB G250による染色では可溶化物質であると思われるバンドが見られた(図１３(B))。しかし、PAS染色ではバンドが見られず、Fr.36はFr.20、24、29とは違う可溶化物と考えられた。
【００４７】
(４)各フラクションの中性糖分析
回収したFr.20、29、36についてガスクロマトグラフィ(アルジトールアセテート誘導体化法)による中性糖の分析を行った。各サンプルを1mL取り、181μLのTFAと20μLの1％イノシトールを加えて混合し、密封した。121℃で2時間加熱後、減圧蒸留によりTFAを除去した。さらにエタノールを加え、再び減圧蒸留によりTFAを除去し、加水分解を行った。これに、NaBH4液500μLを添加し、室温で60分還元させた。その後、氷酢酸を泡が消失するまでゆっくりと滴下した。酸性メタノール500μLを添加、蒸発乾固を3回以上、メタノール250μLを添加、蒸発乾固を5回以上繰り返し、糖アルコール(乾固)を得た。次いで、無水ピリジン500μLを加え、直ちに無水酢酸400μLを添加、混合し、70℃で20分間アセチル化を行った。これに蒸留水を4mL添加、攪拌し、続いてクロロホルム800μLを添加、充分に攪拌した。水層を除き、クロロホルム層を数回水洗し、このクロロホルム溶液をサンプルとした。ガスクロマトグラフィは、シリカキャピラリーカラム(内径0.25mm、長さ30m、フィルム厚み0.25μm、DB−225：J&W社製)を用い、カラム温度180℃−230℃(1分ごとに5℃ずつ上昇)で、キャリアガスであるN2ガスを100mL/分でカラムに流して行った。検出器にはＦＩＤを用いた。その結果を図１４及び表２に示した。
【００４８】
Fr.20、29、36全てにガラクトース、アラビノースが含まれていて、それぞれガラクトースが最も多く、次いでアラビノースが多かった。このことから本可溶化物質にはアラビナン、ガラクタン、アラビノガラクタンが多く存在することが示唆された(Fr.20、29、36はそれぞれAra：Gal=1：1.3、1：2.7、1：1.6)。Fr.20ではラムノースやキシロースが含まれており、Rha：Gal A=1：1.2であった。このことから、Fr.20はラムノガラクチュロナンやキシロガラクチュロナンを主鎖として、アラビノガラクタンなどが結合した構造であると考えられた。Fr.29はアラビノースとガラクトースで全体の90%を占めており、主にアラビノガラクタンなどが含まれていると考えられた。Fr.36は約50%がグルコースであり、次いでガラクトース、アラビノース、ラムノースの順に多く含まれていた。HPLC分析の結果ではFr.20、29には加熱により生成される可溶化物質である高分子ピークHがメインピークであり、Fr.36は高分子ピークHが少ししか認められなかった。
【００４９】
【表２】
0006632318.tif 000004
【００５０】
(５)フラクションのメチル化度測定
ウロン酸が検出されたFr.20、24、29についてウロン酸中のメチル化度を測定した。Fr.20、24、29のそれぞれ500μLに2M NaOHを5μL加え、1h、室温で放置した。その後、0.5M HClで中和したもの10μLをガスクロマトグラフィに供し、メタノールを検出した。ガスクロマトグラフィは、カラム担体として5％PEG20Mを含むUniport HP(60/80mesh)を充填したガラスカラム(内径：3.4mm、カラム長：1m)を用い、カラム温度70℃で、キャリアガスであるN2ガスを110mL/分でカラムに流して行った。検出器にはＦＩＤを用いた。メチル化度は次式により求めた。
メチル化度＝(メタノールmol/Gal A mol)×100
その結果を図１５に示した。Fr.20、24、29全てのフラクションでメチル化度が約30％であった。
【００５１】
(６)フラクションのアミノ酸分析
Fr.20、29、36についてアミノ酸分析(フェニルイソチオシアネート(PTC)誘導体化法)を行った。試料に1mLの濃塩酸を加えて6N 塩酸溶液とし、減圧下、110℃で24時間加水分解を行った。加水分解後、ロータリーエバポレーターで速やかに蒸発乾固した。これにエタノール/水/TEA混合溶液(2:2:1)を20μL添加し、減圧乾固を行った。エタノール/水/TEA/PITC混合溶液(7:1:1:1)を50μL添加して室温で20分間静置後、減圧乾固を行い余剰試薬を除去した。HPLC溶出液1mLに溶解させたものをさらに100倍に希釈し、0.45μmのHPLCフィルター(IWAKI社)でろ過後、サンプル50μLについてHPLC分析を行った。
【００５２】
HPLCは、TSK-GEL Super-ODSカラム(TOSOH社)を用いて、次の溶出液を用いたグラジエント(流速：1.5mL/min)溶出を行った。溶出液A(アセトニトリル/50mM 酢酸緩衝液(pH6.0)＝3/97)と溶出液B(アセトニトリル/50mM 酢酸緩衝液＝60/40)を、0→12minでは溶出液Bが5→70v/v％、12→16minでは溶出液Bが70v/v％、16→20minでは溶出液Bが70→100v/v％、20→25minでは溶出液B が100v/v％、25→30minでは溶出液Bが100→3v/v％となるように４０℃でカラムに流した。検出はUV 254nmで行った。その結果を図１６及び表３に示した。なお、図１６及び表３中のSoybeanは、一般的な大豆タンパク質のアミノ酸分析値を示す。
【００５３】
全てのフラクションで類似の組成をしており、Asx、Glx、Ileが多く含まれているという特徴が見られた。しかし、Fr.20はFr.29,36に比べてGlx(10.88%)、Lys(3.69%)が少なく、Ala(8.22%)、Leu(9.14%)が多かった。Fr.29は他のフラクションに比べてThr(5.46%)の割合が比較的やや高く、Ile(13.6%)が低かった。
【００５４】
【表３】
0006632318.tif 000005
【００５５】
以上の分析結果から、Fr.20〜29は高分子ピークHとして現れる可溶化物質を含む画分であり、当該可溶化物質はガラクトースとアラビノースが主な構成糖とする糖鎖にラムノースがランダムに結合した物質である一方、Fr.36は本手法により生成された主たる物質とは異なる可溶化物であると考えられた。また、可溶化物質に含まれるタンパク質は、その構成アミノ酸としてイソロイシンを多く含み、次いでグルタミン酸及びグルタミン（Glx)、アスパラギン酸及びアスパラギン（Asx）、ロイシンを多く含む。
【実施例４】
【００５６】
〔酸性熱処理による二次細胞壁(2CW)の可溶化物の特徴化３〕
実施例２において明らかにされた、選択的に可溶化される高分子ピークHについての特徴化をさらに行った。
(１)HPLC分析による分子量推定
実施例２で得られたFr.20(Sephacryl S-100HRによる画分)を用いて、高分子ピークHの分子量を、分子量200万のブルーデキストランとの比較から推定した。得られたFr.20の溶液を蒸留水により１０倍に希釈してサンプルとした。ブルーデキストラン(sigma社製)の粉末10mgを蒸留水1mLに溶解し、これを希釈して0.08%溶液を作製した。それぞれをHPLC用フィルターでろ過し、20μLをHPLCに供した。さらにこれらを同量ずつ取り混合溶液を調製したもの40μLをHPLC分析に供した。HPLC分析は、実施例２(２)に記載の方法により行った。また、HPLC分析における流速を1/2、1/4としてHPLC分析を行った。
【００５７】
それらの結果を図１７及び図１８に示した。Sephacryl S-100HRを用いたゲルろ過クロマトグラフィにおけるFr.20(高分子ピークH)とブルーデキストランはHPLC分析でおおよそ同じ時間でピークが出現した。高分子ピークHは排除限界の分子量であるので、ほとんど同じ時間に出現したと考えられた。ブルーデキストランの分子量は2000kDaであり、用いたカラムであるTSK-GEL G3000SWXLの排除限界は500kDaであるため、高分子ピークHの分子量は500kDa以上であると考えられた。流速を2分の1、4分の1にすると、本可溶化物高分子ピークHの出現時間は2倍、4倍と遅くなり、ピークの形状が変化した。流速を1.0mL/分から0.5mL/分に変化したとき、UV280、RIともに二つあったピークが低分子側に一つに変化し、0.5mL/分から0.25L/分に変化したときは本来の高分子ピークHが出現する約14分あたりのピークが小さくなり、UV280では約25分あたりに大きなピークが出現していた。このことから、流速を遅くすれば、高分子ピークHを示す可溶化物質は低分子化するなどのピークの形状が変化すると考えられる。実施例３におけるゲルろ過クロマトグラフィにおける溶出プロフィールでは可溶化物質は低分子側に出現した。これは、ゲルろ過クロマトグラフィに用いたオープンカラムではHPLCに比べて流速が小さく、圧力は非常に小さいので、低分子側に出現したことを意味する。すなわち、当該可溶化物質(高分子ピークH)は、HPLC分析における圧力条件(約２ＭＰａ)から、２ＭＰａ以上の加圧下で会合する性質を持っていることが示された。
【実施例５】
【００５８】
〔酸性熱処理による二次細胞壁(2CW)の可溶化物の乳化作用〕
(１)乳化作用の有無
蒸留水と実施例１で調製した大豆2CWペーストを10：1の割合で懸濁したものを6M HClでpH3.0に調整し、100℃で20分間煮沸し、遠心(4000rpm、1分)後、上清をフィルターでろ過したものを2CW可溶化物として使用した。この2CW可溶化物495μLに大豆油5μLを加えて1分間激しく撹拌した。その後すぐに溶液を底から100μL取り、蒸留水300μLに加えて4倍希釈したものから200μLをマイクロプレートに添加し、波長630nmでの吸光度を測定した。なお、2CW可溶化物の代わりに蒸留水を用いて同様に操作したものをコントロールとして、波長630nmの吸光度を測定した。また、蒸留水のみをマイクロプレートに200μL添加した吸光度をブランクとした。さらに、大豆油を加えて撹拌後直ちに顕微鏡を用いて大豆油の粒子の大きさを観察し、乳化作用の有無を調べた。
【００５９】
その結果を図１９及び表４に示す。顕微鏡による観察では、2CW可溶化物と大豆油を混合した溶液において大豆油の粒子直径が小さくなっていることが確認された。また吸光度測定では蒸留水に大豆油を混合した溶液に比べて高い値となった。これらの結果から、2CW可溶化物には乳化作用が認められた。
【００６０】
【表４】
0006632318.tif 000006
【００６１】
(２)時間経過における乳化安定性
前記実施例５(１)で調製した2CW可溶化物792μLに大豆油8μLを加えて1分間激しく撹拌した。その後、溶液を0、1、2、3、4、5時間ごとに底から60μL取り、蒸留水180μLに加えて4倍希釈したものから200μLをマイクロプレートに添加し、波長630nmでの吸光度を測定した。2CW可溶化物の代わりに蒸留水を用いて同様に操作したものをコントロールとした。
【００６２】
その結果を図２０及び図２１に示した。吸光度測定の結果では時間が経つにつれやや吸光度が低くなる(図２０参照)が、顕微鏡による観察では５時間後の大豆油の粒子は撹拌直後と変わらず小さいままのものも多く見られ(図２１参照)、乳化作用はよく維持できていることが認められた。
【００６３】
(３)ｐＨ変化における乳化安定性
前記実施例５(１)調製した2CW可溶化物に0.1〜0.5M NaOHを少量ずつ加えてpHが3、5、7、9の2CW可溶化物を調製した(このとき、NaOHを加えたことによる可溶化物の希釈が一定となるように同量の蒸留水を加えた。)。これらの2CW可溶化物を用いてｐＨが乳化作用に与える影響を調べた。乳化作用は実施例６(１)に記載の方法で行った。
【００６４】
その結果を図２２及び表５に示した（pH3.0については、pH9.0とほぼ同じような画像であったので省略した。）。顕微鏡による観察と吸光度測定のどちらにおいても、pH5.0、7.0ではpH3.0、9.0に比べて大豆油の粒子が大きいものが多く、また吸光度も低い値となった。これらから、酸性熱処理による2CW可溶化物は、pHが3.0や9.0などでは乳化作用が高くなり、中性付近では弱くなるという特徴があることが認められた。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
(４)起泡性
前記実施例６(１)で調製した2CW可溶化物と、1%カゼイン(0.01M NaOHで中和して溶解した溶液)と、480μg/mLの卵白アルブミンをそれぞれ2mLずつ試験管に入れ、1分間激しく撹拌した。撹拌後に生じた泡の液面から泡上部までの高さ(ｈ)でもって起泡性とした。図２３に示したように、卵白アルブミンに比べて、2CW可溶化物の起泡性は非常に高いと考えられた。また400分後でも攪拌直後に対して約53％高さの泡が残っており（図示せず）、安定性も高いと考えられた。
【００６７】
(５)ｐＨ変化における起泡性
前記実施例５(３)で調製したpHが3、5、7、9の2CW可溶化物を用いて、上記実施例５(４)に記載の方法にて起泡性への影響を調べた。図２４に示すようにpH5.0で泡の減少が最も早く、pH3.0が最も遅かった。撹拌直後においてpH9.0では液面から泡上部までの高さ(ｈ)がやや高くなった。
【実施例６】
【００６８】
〔その他植物での酸性熱処理による二次細胞壁(2CW)の可溶化〕
その他植物として、小豆、リンゴ、ミカン、ポテトを用いた。可溶化に際し、次の方法にて二次細胞壁を調製した。
【００６９】
(１)2CWペーストの調製
(a)小豆
小豆7gに70mlの水を加え、オートクレーブ処理を121℃で20分間行った。抽出液を除いた後、皮をむき、スパーテルで軽くつぶしペースト状にした。この小豆ペーストに20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を70ml、セルラーゼ(GODO-TCF)を全量に対して1%となるように加え、37℃で一晩反応させた。遠心分離(2000rpm、10分)により上清を除いた後、20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を100ml加えて再び遠心分離して、上清を捨てた 。この操作を３回繰り返した後、残査と等量の20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を加え、小豆2CWペーストとした。
【００７０】
(b)リンゴ
リンゴ(ふじ)の皮を剥き、芯部分を除去した後、家庭用ジューサーにて果汁と絞り粕を調製した。リンゴ粕は水洗したのち、4000rpm、10分間の遠心処理にて集めた。リンゴ粕23.2gに2mLの0.5M酢酸緩衝液を加え、合同酒精社製セルラーゼを2.5mL、さらに水を加えて全量を30mLとして攪拌した。その後45℃で一晩放置した。この操作により１次細胞壁が可溶化除去されたのを位相差顕微鏡にて確認し、リンゴ2CWペーストとした。
(c)ミカン
【００７１】
ミカンの皮を除いた果肉部20gに20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を200mL、セルラーゼ(GODO-TCF)を全量に対して1%となるように加え、37℃で一晩反応させた。遠心分離(10000rpm、10分)により上清を除いた後、20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を100ml加えて再び遠心分離して、上清を捨てた。この操作を３回繰り返した後、残査と等量の20mM酢酸緩衝液(pH5.0)を加え、ミカン2CWペーストとした。
【００７２】
(d)ポテト
男爵薯の皮をむき、おろし金を用いて磨砕した。これを数回水洗いして、でんぷんを除いた。約50mLのジャガイモ溶液に等量の0.1M酢酸緩衝液を加え、セルラーゼ(GODO-TCF)を1%添加し、37℃で一晩、攪拌しながら反応させた。遠心分離(4,000rpm、10分)を行い、イオン交換水で沈殿を3回洗浄した。これを約15倍の水で希釈して、ポテト2CWペーストとした。
【００７３】
(２)２次細胞壁(2CWペースト)の可溶化
0.1M酢酸緩衝液(pH3.0)800μLに上記で調製した各植物由来の2CWペースト160μLを添加した。撹拌後、400μLを採取し、100℃で20分間熱処理した後一晩放置し、エッベンチューブ内での容積を熱処理前と比較した。また遠心分離(10000rpm、10分、4℃)により上清を回収し、位相差顕微鏡により、2CW可溶化を観察した。顕微鏡による観察では、0.1M酢酸緩衝液(pH3.0)の代わりに蒸留水を800μL加えて撹拌したものをブランク(pH5.3)とした。
【００７４】
小豆及びミカンについての顕微鏡画像をそれぞれ図２５、図２６に示した。各植物とも加熱前に比べて各図に矢印で示した透明な２次細胞壁が消失していた。また、チューブ内の容積は減少していた(図示せず)ことより、２次細胞壁が選択的に可溶化されていたことが確認できた。
【００７５】
(３)可溶化物のHPLC分析
調製したリンゴ、ミカンの2CWペーストを酸性熱処理して得られた可溶化物のHPLC分析を行い、高分子ピークHの出現を調べた。HPLC分析は、実施例２(２)に記載の方法で行った。
(ａ)リンゴ
pH3.0に調整したHCl水溶液800μLにリンゴ2CWペースト200μLを加え、さらにpH2.0に調整したHCl水溶液を加えてpHを3.0に調整した。その400μLを取り、100℃で20分間加熱した。その後、遠心分離(1000rpm、5分)後、上清をフィルターでろ過してサンプルを調製した。
【００７６】
(ｂ)ミカン
ミカン2CW 800μLにpH1.0に調整したHCl水溶液を8μL添加し、pHを3.0に調整した。その400μLを取り、100℃で20分間加熱した。その後、遠心分離(1000rpm、5分)後、上清をフィルターでろ過してサンプルを調製した。
【００７７】
図２７及び図２８にそれらの結果を示す。リンゴ及びミカンともに熱処理により高分子ピークHが出現した。これにより、大豆以外の植物においてもpH3.0の加熱処理により高分子ピークHが確認され、当該処理により２CW可溶化された可溶化物質（高分子ピークH）が生成されると言える。
【００７８】
(４)可溶化物の乳化作用及び起泡性
前記実施例６(２)で得られたリンゴ二次細胞壁の可溶化物の乳化作用及び起泡性を調べた。実施例５（１）（４）に記載の方法に準じて乳化作用及び起泡性について調べた。それらの結果をそれぞれ図２９及び図３０に示した。顕微鏡による観察では５時間後の大豆油の粒子は撹拌直後と変わらず小さいままのものも多く見られ(図２９参照)、乳化作用はよく維持できていることが認められた。また、カゼインやアルブミンとほぼ同様な起泡性を有していた（図３０参照）。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によると、緩和な条件で二次細胞壁を可溶化することができ、新たな食品素材を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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