(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＨＬＳＤＮＹＴ（配列番号２）またはＤＨＨＳＤＮＹＴ（配列番号３）の配列からなる単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、安定化部分及び／または担体に結合されている、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする、単離核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の単離核酸を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリペプチドを発現し、かつ／または請求項３に記載の単離核酸もしくは請求項４に記載のベクターを含む、組換え細胞。
【請求項６】
前記細胞が、コンドロサイト系譜細胞、幹細胞、または椎間板細胞であり、任意選択で前記幹細胞が間葉系幹細胞である、請求項５に記載の組換え細胞。
【請求項７】
請求項１または２に記載の単離ポリペプチドと、任意選択で、担体、安定化剤、もしくは希釈剤、及び／または請求項５または６に記載の組換え細胞とを含む、組成物。
【請求項８】
前記組成物が、薬学的に許容される担体、安定化剤、または希釈剤を含む薬学的組成物である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１、２、５、及び６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチド及び／または組換え細胞を含む生体適合性材料で形成されたスキャフォールドを含み、任意選択で前記スキャフォールドがアルギン酸塩スキャフォールドまたはハイドロゲルスキャフォールドであり、かつ前記組換え細胞が前記スキャフォールド上またはその中に配置される、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
軟骨内、軟骨細胞内、及び／または椎間板細胞内、もしくは軟骨、軟骨細胞、及び／または椎間板細胞を含む組織内において、マトリックス合成、任意選択でプロテオグリカン合成、及び／またはＩＩ型コラーゲン合成を誘導するインビトロの方法であって、前記方法が、前記軟骨、軟骨細胞、及び／または椎間板細胞を、有効量の、請求項１または２に記載の単離ポリペプチド、請求項５または６に記載の組換え細胞、及び／または請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物とともに、プロテオグリカン合成を誘導するような条件下でインキュベート／培養することにより、増加したマトリックス合成を伴う誘導軟骨、軟骨細胞、及び／または椎間板細胞を産生することを含む、方法。
【請求項１１】
対象に移植するための軟骨及び／または椎間板組織を産生するインビトロの方法であって、前記方法が、軟骨、軟骨細胞、及び／または椎間板細胞を、有効量の、請求項１または２に記載の単離ポリペプチド、請求項５または６に記載の組換え細胞、及び／または請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物とともに、プロテオグリカン合成を誘導する条件下でインキュベート／培養することにより、増加したマトリックス合成を伴う誘導軟骨、軟骨細胞、及び／または椎間板細胞を産生することと、誘導軟骨、軟骨細胞、及び／または椎間板細胞の実質的に純粋な集団を単離することと、を含む、方法。
【請求項１２】
前記細胞及び／または組織を、任意選択で軟骨移植における使用のための、軟骨を産生するような条件下で接触させる、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象の軟骨障害及び／または椎間板障害の症状を緩和し、かつ／もしくは対象の軟骨障害及び／または椎間板障害を治療するための薬学的組成物であって、請求項１または２に記載の単離ポリペプチド、あるいは請求項５または６に記載の組換え細胞を有効成分として含有する、薬学的組成物。
【請求項１４】
軟骨障害及び／または椎間板障害が、椎間円板変性症である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
軟骨障害及び／または椎間板障害が、関節炎、望ましくない骨形成、及び／または石灰化から選択される、炎症性または変性性関節疾患である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記関節炎が、骨関節炎である、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記関節炎が、関節リウマチである、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記対象が、ヒトである、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記対象に対してスキャフォールドで投与される、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記組換え細胞が、請求項１または２に記載の単離ポリペプチドを発現する、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、軟骨細胞、または椎間板細胞である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換え細胞または誘導細胞が、コンドロサイト、任意選択で自家コンドロサイトである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、移植を受けたことがある、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記方法が、前記軟骨、軟骨細胞、及び／または椎間板細胞もしくは組織を、請求項１または２に記載の単離ポリペプチド、請求項５または６に記載の組換え細胞、及び／または請求項７〜９のいずれか１項に記載の組成物と組み合わせて、ＭＳＣと接触させることをさらに含む、請求項１０〜１２、２０、及び２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記対象が、減少した細胞密度及び／または代謝活性を有し、任意選択で前記減少した細胞密度及び／または代謝活性が年齢に起因するものである、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１３年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６１／８７０，３９４号及び２０１４年８月４日に出願された同第６１／９７５，３２９号の優先権に基づく米国特許法第１１９条の利益を主張する特許協力条約出願であり、これらの出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、軟骨障害及び椎間板障害の治療のための方法及び組成物に関し、具体的には関節炎及び椎間円板変性症等の軟骨障害及び椎間板障害の治療のための、リンクＮ断片を用いる方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
椎間円板（ＩＶＤ）は、脊椎内の隣接する椎骨を連結する。椎間円板は、周辺の線維輪（ＡＦ）と、中心の髄核（ＮＰ）とから構成される。ＡＦは、コラーゲン原線維（１）が豊富な同心の薄板を伴う繊維組織である。ＮＰは、ランダムな配向及び高含有量のアグリカンを有するコラーゲン原線維を伴って、より無定形の密度を有し、これによりゼラチン状の外見がＮＰに付与され、圧縮荷重に抗する能力がもたらされる。アグリカンは、そのコアタンパク質に結合する複数のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖を伴う巨大プロテオグリカンであり、これがＮＰにおいて圧縮効果に対向するために必要とされる浸透圧特性を提供する。
【０００４】
椎間板における変性変化に寄与する機序は、枯渇した合成及び増加する分解の両方に起因して、細胞外マトリックスの組成及び構造における生化学的な変化につながり、このうちアグリカンがタンパク質分解性の損傷及び損失の影響を特に受けやすい。老化、栄養不良、生体力学的影響（２〜５）、生化学的影響（６〜１０）、及び遺伝的影響（１１〜１４）が、増加したＩＶＤ変性と関連付けられる。変性の間、ＮＰ中のＧＡＧの含有量の喪失が起こり、ＮＰがよりコラーゲン性になるにつれて、ＮＰをゼラチン状構造から線維性テクスチャへ変化させ、ＮＰ及びＡＦの両方において裂け目が生じる（１５、１６）。これは、一般的に、プロテオグリカンの枯渇によって助長される神経の内部成長及び椎間板の高さの喪失に起因し得る腰痛と関連付けられる（１７）。現状において、ＩＶＤ変性に対する内科的治療は存在せず、究極的には、損傷を受けた組織の外科的切除、ＩＶＤの空間を復元するためのケージまたは補綴の挿入、及び椎骨の融合を、提供される選択肢として残すのみである。これは、疼痛の緩和において、相対的には良好な短期的臨床結果をもたらし得るが（１８）、多くの事例において、脊椎の生体力学を変化させ、後の隣接する椎レベルの椎間板変性につながる。
【０００５】
変性するＩＶＤの生物学的修復が、外科的切除よりも好ましい。
椎間板の変性は人生の早期において始まり、年齢の増加と共に進行する（４８、４９）。このプロセスは、常在細胞の表現型変化によって特徴付けられ、炎症性サイトカインの産生の増加をもたらす（５０、５１）。いくつかのサイトカインが椎間板変性と関連付けられており、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αが最初に説明されたものであったが、ＩＬ−６及びＩＬ−８等の更なる候補が、特に動物モデルにおいて最近より説明されている（１７）。変性／ヘルニア性の標本からのヒト椎間板の研究により、健康な対照と比較した際に、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−αに加えて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１７の増加したレベルが示された（５２）。増加したサイトカイン産生につながる正確な機序は明確でない。遺伝、機械的荷重、酸素化、または炎症性細胞の存在等の、複数の内的及び外的な刺激がサイトカイン産生に影響を与え得る（１７）。加えて、特定のマトリックス断片化産物の蓄積が、Ｔｏｌｌ様受容体を活性化し、それによりサイトカイン産生を誘導し得る。
【０００６】
炎症性サイトカインはプロテアーゼ産生を誘導することが知られ、これは後に、アグリカン及びコラーゲンを含む細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解に起因するＩＶＤの高さの構造破損及び喪失につながる（５３）。プロテアーゼはＥＣＭの重要な構成要素の断片化及び分解を担うが、椎間板の通常の組織修復においても大きな役割を果たす。カテプシンＫ活性が、アグリカンのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）タンパク質分解と共に、椎間板の通常の組織修復の主なプロセスとして提唱されている（５４、５５）。しかしながら、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ１、２、３、７、９、１３）、アグリカナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ４、５）、及びカテプシン（カテプシンＤ及びＬ）は全て、椎間板変性の間上昇する（５６、９）。加えて、セリンプロテアーゼＨＴＲＡ１が、ＨＴＲＡ１の上昇するレベルとそのＣＨＡＤの変性とが椎間板変性の程度と相関するため、椎間板変性において中心的役割を果たすと考えられている（１０、５７）。
【０００７】
タンパク質の分解及び髄核（ＮＰ）のプロテオグリカン含有量が、椎間板の高さ及び椎間板の荷重負荷容量の喪失を結果として生じ得る。椎間板変性の最終段階においては、環状輪の裂け目が起こり、ＮＰ物質の押出及び神経の圧縮に起因する疼痛につながる。疼痛をもたらす変性椎間板の修復方策は、ＥＣＭ構成要素の産生と、炎症性環境におけるプロテイナーゼ活性の下方制御を必要とする。これらの特性は、ＴＧＦ−β及びＢＭＰ７等のいくつかの成長因子と関連付けられる（５８〜６１）。しかしながら、臨床診療における成長因子の使用は、それらの高コストと副作用の可能性から制限される。
【０００８】
骨関節炎（ＯＡ）は、数百万の人々に影響を及ぼしている慢性的変性性関節障害である。骨関節炎は、コンドロサイトの同化作用及び異化作用における不均衡に起因する関節軟骨の破壊によって特徴付けられる。関節軟骨は、無血管性結合組織であり、可動関節の骨部を覆い、荷重を吸収及び分散することによって、関節の摩擦のない動きを可能にする。これらの特性は、その細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の組成及び構造に関する。関節軟骨は、コラーゲン原線維、プロテオグリカン（主としてアグリカン）、非コラーゲン性タンパク質、及び高い含有量の水で構成される。関節軟骨中の唯一の細胞の種類はコンドロサイトであり、細胞外マトリックスの合成及び維持を担う。
【０００９】
関節軟骨の分解及び滑膜の炎症によって特徴付けられる骨関節炎（ＯＡ）の間、この平衡は、コラーゲン及びマトリックスからのプロテオグリカンの分解の増加、ならびに分子合成の枯渇に起因して撹乱される。軟骨は、コンドロサイトにおける遺伝子発現及びタンパク質合成を調節する、複雑な多数のオートクリン及びパラクリン（同化及び異化）因子に応答する。
【００１０】
マトリックス分解は、ＯＡに関与する主要なサイトカインであるインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）によって誘導される、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及びＡＤＡＭＴＳ−４及び−５によって媒介される。ＯＡの発病機序に関与している他のサイトカインとしては、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１等の他の一般的なｃ鎖サイトカイン、ＩＬ−６、及びケモカインが挙げられる。滑膜細胞及びコンドロサイトによって産生されるこれらの因子は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）のメンバー及び酵素のトロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）ファミリーの発現上昇を結果として生じる。ＭＭＰは、ＥＣＭのターンオーバーと、軟骨の変性とに関与する。老化、肥満、及び関節損傷は、増加するＯＡと関連付けられる。ＯＡは、関節軟骨、軟骨下骨、滑膜、靭帯、及び関節周囲の筋肉を含む全ての関節組織における進行性の細胞変化及び分子変化によって特徴付けられる。現在のところ、ＯＡ患者の軟骨分解を逆行させる、または修復する療法は存在しない。
【００１１】
炎症プロセスは、ＯＡ及び関節リウマチ（ＲＡ）等の様々なリウマチ性疾患の発病機序において根本的な役割を果たすため、炎症活性の選択的阻害が療法にとって極めて重要であること、ならびにＮＦ−κＢ転写因子のファミリーが、このプロセスにおいて卓越した役割を果たすことについては、一般的に了解されている。したがって、いくつかの研究が、非ステロイド系抗炎症薬、コルチコステロイド、機能性食品、アンチセンスＤＮＡ療法、ＲＮＡ干渉法、及び抗リウマチ薬を用いた、ＮＦ−κＢ経路の薬理学的調節を対象としてきた。
【００１２】
リンクＮは１６個のアミノ酸からなる配列であり、プロテオグリカン合成及びＩＶＤ細胞による他のマトリックス構成要素の産生を増加させることが示されている（２９、３４）。リンクＮはまた、ウサギ椎間板穿刺変性モデルにおいて椎間板の高さを増加させることが示されており、それによってインビボにおいても再生の潜在性を実証している（３１）。この天然に存在するペプチドは、椎間板及び軟骨の両方においてプロテオグリカン凝集体を安定化させ、インビボの組織のターンオーバー中にＭＭＰによって生成される、リンクタンパク質のＮ末端領域を表す。リンクＮは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）受容体ＩＩ型と相互作用し、培養ウサギＩＶＤ細胞中のＳｍａｄ１／５シグナル伝達を活性化する（３３）。
【００１３】
リンクＮの断片が試験されてきた。Ｗａｎｇらは、アミノ酸残基１−１２にまたがるペプチドを含む、いくつかのより短いリンクＮ由来のペプチドを評価した際、リンクＮの刺激効果は失われたと報告した（３３）。
【発明の概要】
【００１４】
本開示の態様は、
ｉ）ＤＨＸ１ＳＤＮＹＴ（Ｘ１はＬまたはＨ）（配列番号１）、
ｉｉ）ｉ）の保存的変異型、
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）の断片、から選択されるペプチドを含む単離ポリペプチドを含み、
保存的変異型及び／または断片は、生物学的活性を保持し、ペプチドは１５個以下のアミノ酸である。
【００１５】
ある実施形態において、単離ポリペプチドは、１）ＤＨＬＳＤＮＹＴ（配列番号２）、及び／もしくは生物学的活性を保持するその保存的変異型、または２）ＤＨＨＳＤＮＹＴ（配列番号３）、及び／もしくは生物学的活性を保持するその保存的変異型からなるペプチド配列を含む。
【００１６】
別の実施形態において、本単離ポリペプチドは、
ｉ）Ｘ１がＬまたはＨであり、Ｘ２がＬまたはＶであり、かつＸ３がＡまたはＶである、ＤＨＸ１ＳＤＮＹＴＸ２ＤＨＤＲＸ３Ｉ（配列番号４）
ｉｉ）ｉ）の保存的変異型、及び
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）の断片、から選択されるペプチドを含み、
保存的変異型及び／または断片は、生物学的活性を保持する。
【００１７】
別の態様は、リンクＮ断片ペプチドを含むポリペプチドをコードする単離核酸を含む。
更なる態様は、１）リンクＮ断片ペプチドを含むポリペプチドをコードする核酸、または２）リンクＮ断片ポリペプチドを含むベクターを含む。
【００１８】
更なる態様は、リンクＮ断片ペプチドを含むポリペプチドを発現する組換え細胞である。
更に別の態様は、リンク断片ポリペプチドを含むポリペプチド、リンクＮ断片ペプチドを含むポリペプチドを発現する組換え細胞を含む、組成物である。
【００１９】
該産物を作製及び使用するための方法もまた記載される。
本開示の他の特色及び利点が、以下の詳細な記載から明白になる。しかしながら、本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正がこの詳細な記載から当業者には明白であるため、発明を実施するための形態及び具体的な実施例は、本開示の好ましい実施形態を示してはいるものの、単に例証用に提供されていることを理解されたい。
【００２０】
ここで、本開示の実施形態を図面に関して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ウシまたはヒト椎間板細胞によるプロテオグリカン合成。合成は、リンクＮ（１μｇ／ｍＬ）、スクランブルＳ−リンクＮ（１μｇ／ｍＬ）、反転Ｒ−リンクＮ（１μｇ／ｍＬ）の存在下、またはペプチド補充を伴わない培地において、４８時間後に、３５ＳＯ４の組み込みを評価することによって推定した。相対プロテオグリカン発現を、ウシ髄核（ＮＰ）細胞及び線維輪（ＡＦ）細胞において（ａ）、ならびにヒト髄核（ＮＰ）細胞及び内側線維輪（ｉＡＦ）細胞において（ｂ）示す。データは、培地単独に曝露された対照細胞による取り込みに対する比率の平均±ＳＤとして表される（ｎ＝３）。ｐ≦０．０５（＊）である値を有意とみなした。
【図２】培養培地におけるリンク−Ｎの安定性。リンクＮを培養培地において５％ＣＯ２、３７℃で４８時間インキュベートし、インタクトなペプチドのピーク強度を質量分析法で調べた。アリコートを、６、１２、２４、３６、及び４８時間で分析した。データを、時間０におけるシグナル強度に対する比率としてプロットする。このプロットは、３回の代表的な実験のうちの１回である。
【図３】細胞の存在におけるリンク−Ｎの安定性。リンクＮをヒトＮＰ（ａ）またはＡＦ（ｂ）細胞の存在下において５％ＣＯ２、３７℃で４８時間インキュベートし、インタクトなペプチドのピーク強度を質量分析法で調べた。アリコートを、６、１２、２４、３６、及び４８時間で分析した。データを、時間０におけるシグナル強度に対する比率としてプロットする。このプロットは、３人の異なる提供者からの細胞に実行された３回の代表的な実験のうちの１回である。
【図４】プロセシングされたリンクＮの質量分析法。（ａ）ヒトＮＰ細胞（黒）及びＡＦ細胞（灰）由来の培地において検出されたペプチドの質量スペクトル。９６４．４Ｄａの質量を有する断片化されたリンクＮがグラフに示される。９６４．４Ｄａのペプチドが、２つの異なる領域において、保持時間約２３分及び３２分でカラムから溶出した。（ｂ）２つの可能性のある９６４．４ＤａのリンクＮ断片、リンクＮ１−８（暗灰色でハイライトされた部分）及びリンクＮ４−１１（明灰色でハイライトされた部分）の概略図。（ｃ）生成された９６４．４Ｄａ断片のアミノ酸配列を、タンデムＭＳによって特定した。配列を、ペプチドの生成された断片化産物の評価によって確認した。検出された主要なピークは、Ａ［（８４５．３Ｄａ）ＤＨＬＳＤＮＹ（配列番号１９）（＋１）］、Ｂ［（６８２．２８Ｄａ）ＤＨＬＳＤＮ（配列番号２０）（＋１）］、及びＣ［（５６８．２Ｄａ）ＤＨＬＳＤ（配列番号２１）（＋１）］であり、これらの質量は１−８配列によってのみ生成され得る。
【図５】リンクＮ断片に応答する、ウシ及びヒト細胞によるプロテオグリカン合成。合成は、リンクＮ（１μｇ／ｍＬ）、リンクＮ１−８（０．５μｇ／ｍＬ）、リンクＮ９−１６（０．５μｇ／ｍＬ）の存在下、またはペプチド補充を伴わない培地において、４８時間後に、３５ＳＯ４の組み込みを評価することによって推定した。相対プロテオグリカン発現を、ウシ髄核（ＮＰ）及び線維輪（ＡＦ）において（ａ）、ならびにヒト髄核（ＮＰ）細胞及び内側線維輪（ｉＡＦ）細胞において（ｂ）示す。データは、培地単独に曝露された対照細胞による組み込みに対する比率の平均±標準偏差標準偏差として表される（ｎ＝３）。ｐ≦０．０５（＊）である値を有意とみなした。
【図６】椎間板変性に関与すると説明されるプロテイナーゼに対するリンク１−１６の曝露。リンク１−１６を、ＭＭＰ３、７、１２、１３、カテプシンＬ、Ｋ、及びＢ、ＡＤＡＭＴＳ４、５、ならびにＨＴＲＡ１に対して曝露し、ピーク面積強度を質量分析法を用いて定量化した。Ａ、インタクトリンクＮ１−１６ペプチドの相対強度。Ｂ、リンクＮ１−８ペプチドの相対強度。Ｃ、リンクＮ９−１６ペプチドの相対強度。
【図７】炎症性環境における、リンクＮ断片に応答する、ウシ及びヒト細胞によるプロテオグリカン合成。合成は、リンクＮ（１μｇ／ｍＬ）、リンクＮ１−８（０．５μｇ／ｍＬ）、リンクＮ９−１６（０．５μｇ／ｍＬ）で補充されたＩＬ−１含有培地において、またはペプチド補充を伴わない培地において、４８時間後に、３５ＳＯ４の組み込みを評価することによって推定した。相対プロテオグリカン発現を、ウシ髄核（ＮＰ）及び線維輪（ＡＦ）において（Ａ）、ならびにヒト髄核（ＮＰ）細胞及び内側線維輪（ｉＡＦ）細胞において（Ｂ）示す。データは、ＩＬ−１含有培地に曝露された細胞によって産生されたプロテオグリカンに対する比率の平均±標準偏差として表される（ｎ＝３）。ｐ≦０．０５（＊）である値を有意とみなした。
【図８】炎症性環境における、リンクＮに応答する、ヒト骨関節炎（ＯＡ）軟骨中のプロテオグリカン（ＧＡＧ）濃度。プロテオグリカン濃度を、リンクＮ（１μｇ／ｍｌ）と共に、ＩＬ−１含有培地（５ｎｇ／ｍｌ）で、リンクＮ及びＩＬ−１に共曝露して、またはペプチド補充を伴わない培地（対照）で、２１日間培養したＯＡ軟骨外植片において判定した。結果は、対照に対して正規化した、軟骨に保持されるＧＡＧのパーセンテージとして提示される。ｐ≦０．０５（＊）である値を有意とみなした。
【図９】ヒト骨関節炎軟骨におけるアグリカンコアタンパク質及び新規に合成されたＩＩ型コラーゲンの分析。（Ａ）対照、リンクＮ、ＩＬ−１、ならびにリンクＮ及びＩＬ−１の両方で処理された軟骨におけるアグリカン（ＡＧＧ）コアタンパク質の免疫ブロッティング、ならびに約３２０ｋＤａの分子量を伴うインタクトアグリカンコアタンパク質の半定量分析。（Ｂ）対照、リンクＮ、ＩＬ−１、ならびにリンクＮ及びＩＬ−１の両方で処理された軟骨におけるＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ  ＩＩ）の免疫ブロッティング、ならびに３６０ｋＤａの分子量を伴うコラーゲンの半定量分析。結果は、異なる提供者からの４つの軟骨試料の平均±標準偏差として表される（＊ｐ＜０．０５）。
【図１０】ヒト骨関節炎軟骨におけるＭＭＰ−１３及びＸ型コラーゲン（Ｃｏｌ  Ｘ）発現の分析。（Ａ）対照、リンクＮ、ＩＬ−１、ならびにリンクＮ及びＩＬ−１の両方で処理された軟骨におけるＭＭＰ−１３の免疫ブロッティング、ならびに５５ｋＤａの分子量を伴うＭＭＰ−１３タンパク質の半定量分析。（Ｂ）対照、リンクＮ、ＩＬ−１、ならびにリンクＮ及びＩＬ−１の両方で処理された軟骨におけるＸ型コラーゲンの免疫ブロッティング、ならびに６０ｋＤａの分子量を伴うコラーゲンα鎖の半定量分析。結果は、異なる提供者からの４つの軟骨試料の平均±標準偏差として表される（＊ｐ＜０．０５）。
【図１１Ａ】炎症性環境における、リンクＮで補充された、ＯＡ及び正常提供者からのコンドロサイト中のＮＦκＢの分析。コンドロサイト対照、リンクＮ処理、ＩＬ−１処理、リンクＮ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１、リンクＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１、及びリンクＮ（１０００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１におけるＮＦκＢのウェスタンブロット解析。結果は、異なる提供者からの３つの実験の平均±標準偏差として表される（＊ｐ＜０．０５）。結果は、正常ヒトコンドロサイトにおいて、ＮＦ−κＢのＩＬ−１誘導活性化が、リンクＮによって用量依存的に抑制されることを実証する。
【図１１Ｂ】炎症性環境における、リンクＮで補充された、ＯＡ及び正常提供者からのコンドロサイト中のＮＦκＢの分析。コンドロサイト対照、リンクＮ処理、ＩＬ−１処理、リンクＮ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１、リンクＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１、及びリンクＮ（１０００ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１におけるＮＦκＢのウェスタンブロット解析。結果は、異なる提供者からの３つの実験の平均±標準偏差として表される（＊ｐ＜０．０５）。結果は、ＯＡコンドロサイトにおいて、ＮＦ−κＢのＩＬ−１誘導活性化が、リンクＮによって用量依存的に抑制されることを実証する。
【図１２】椎間板中のプロテオグリカン濃度。プロテオグリカン濃度を、誘導された変性を伴う椎間板、リンクＮ、ＭＳＣ、リンクＮ及びＭＳＣの両方で処理された椎間板、ならびに非変性対照椎間板において判定した。結果は、異なるウシの尾からの７個の椎間板の平均±標準偏差として表される。（＊ｐ＜０．０５）
【図１３】椎間板中のプロテオグリカンのサイズ分布。異なる処理を伴う７つの椎間板から単離されたプロテオグリカンをプールし、アガロースゲル電気泳動法によって分析した。プロテオグリカンを、トルイジンブルー染色によって視覚化した。
【図１４】椎間板中のアグリカンコアタンパク質の分析。変性対照椎間板、リンクＮ処理椎間板、ＭＳＣ処理椎間板、リンクＮ及びＭＳＣの両方で処理された椎間板、ならびに非変性対照椎間板における、約３２０ｋＤａの分子量を伴うインタクトアグリカンコアタンパク質の、免疫ブロッティング及び半定量分析。結果は、異なるウシの尾からの７個の椎間板の平均±標準偏差として表される。（＊ｐ＜０．０５）
【図１５】椎間板中の新規に合成されたＩＩ型コラーゲンの分析。変性対照椎間板、リンクＮ処理椎間板、ＭＳＣ処理椎間板、リンクＮ及びＭＳＣの両方で処理された椎間板、ならびに非変性対照椎間板における、１２０ｋＤａの分子量を伴うＩＩ型コラーゲンα鎖の、免疫ブロッティング及び半定量分析。結果は、異なるウシの尾からの７個の椎間板の平均±標準偏差として表される。（＊ｐ＜０．０５）
【図１６】椎間板の髄核部位におけるプロテオグリカン分布。トリプシン誘導変性を伴う椎間板を、リンクＮ、ＭＳＣ、またはリンクＮ及びＭＳＣの注入後１４日間培養した。これらを、変性対照椎間板及び非変性対照椎間板と比較した。椎間板を、サフラニンＯ染色（スケールバー、１００μｍ）を用いた組織学的検査によって評価した。
【図１７】ＭＳＣの標識及び追跡。Ａ．ＭＳＣ細胞膜を、ＰＫＨ６７キット（緑色蛍光、矢印）を用いて標識し、蛍光顕微鏡検査を用いて標識の効率性を評価した。Ｂ．標識したＭＳＣを拡張培地において２日間培養し、維持された標識を蛍光顕微鏡検査を用いて確かめた。Ｃ．ＮＰ部位における標識したＭＳＣの存在を、器官培養の１４日後に判定した。Ｄ．Ｃの拡大図。
【図１８】トリプシン誘導変性後２週間での、ウシ椎間板器官培養における、プロテオグリカン合成、アグリカン、及びＩＩ型コラーゲン発現へのリンクＮ１−８の効果。（Ａ）椎間板中のプロテオグリカンの濃度を、誘導された変性を伴う椎間板、誘導された変性を伴いかつリンクＮ１−８で処理された椎間板、及び非変性対照椎間板において、処理後２週間で判定した。結果は、異なるウシの尾からの３個の椎間板の平均±標準偏差として表される。（＊ｐ＜０．０５）。（Ｂ）誘導された変性を伴う椎間板、誘導された変性を伴いかつリンクＮ１−８で処理された椎間板、非変性対照椎間板、及びリンクＮ１−８で処理された非変性椎間板における、処理後２週間での、約３６０ｋＤａの分子量を伴う新規に合成されたＩＩ型コラーゲンの、免疫ブロッティング及び半定量分析。結果は、異なるウシの尾からの７個の椎間板の平均±標準偏差として表される。（＊ｐ＜０．０５）。（Ｃ）誘導された変性を伴う椎間板、誘導された変性を伴いかつリンクＮ１−８で処理された椎間板、非変性対照椎間板、及びリンクＮ１−８で処理された非変性椎間板における、処理後２週間での、約３２０ｋＤａの分子量を伴うインタクトアグリカンコアタンパク質の、免疫ブロッティング及び半定量分析。結果は、異なるウシの尾からの７個の椎間板の平均±標準偏差として表される。（＊ｐ＜０．０５）。
【図１９】アグリカンＧ１ドメインとヒアルロン酸塩との間の相互作用を安定化するリンクタンパク質の概略図。リンクタンパク質（ＬＰ）は、アグリカンＧ１ドメインとヒアルロン酸塩（ＨＡ）との間の相互作用を安定化している。この図はまた、リンクタンパク質のＮ末端であるヒトリンクＮ［ＤＨＬＳＤＮＹＴＬＤＬＤＲＡＩＨ（配列番号３２）］及びウシリンクＮ［ＤＨＨＳＤＮＹＴＶＤＨＤＲＶＩＨ（配列番号５）］を描写し、ウシ配列において起こる残基の置換（太字で表される）を強調表示する。
【図２０】ヒトまたはウシリンクＮのいずれかで補充されたアルギン酸塩中で培養されたウシ椎間円板細胞の細胞生存率。細胞生存率は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）生存率／細胞毒性アッセイを用いて測定した。アルギン酸塩に埋め込まれたウシ椎間円板（ＩＶＤ）細胞を、１μｇ／ｍｌのウシリンクＮ（ＢＬＮ）またはヒトリンクＮ（ＨＬＮ）のいずれかで補充された培地において、１８日間インキュベートした。同じ期間、培地単独で培養したビーズを、対照（ＣＴＬ）として使用した。１８日後、ビーズを収集して、細胞生存率を評価した。全てのビーズの細胞生存率が、９８％超であるとして評価された（白い輝点）。
【図２１】１．２％アルギン酸塩においてビーズ化された髄核ウシ細胞による、培養培地へのグリコサミノグリカンの累積的な放出。１．２％アルギン酸塩においてビーズ化された髄核（ＮＰ）ウシ細胞を、ウシリンクＮ（ＢＬＮ）またはヒトリンクＮ（ＨＬＮ）のいずれか（１μｇ／ｍｌ）で補充された培地において培養するか、あるいは培地単独（対照）に対して曝露した。各条件について、培地を培養の３、６、９、１２、１５、及び１８日目に収集した。培地中へのグリコサミノグリカン硫酸塩（ＧＡＧ）の放出を、１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）色素結合アッセイによって測定した。結果は箱髭図として提示し、ここでの箱は、３連で行われた３回の独立した実験の統合データの中央の５０％（２５％〜７５％パーセンタイル）を表す（＊ｐ＜０．０５または＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図２２】１．２％アルギン酸塩においてビーズ化された線維輪ウシ細胞による、培養培地へのグリコサミノグリカンの累積的な放出。１．２％アルギン酸塩においてビーズ化された線維輪（ＡＦ）ウシ細胞を、ウシリンクＮ（ＢＬＮ）またはヒトリンクＮ（ＨＬＮ）のいずれか（１μｇ／ｍｌ）で補充された培地において培養するか、あるいは培地単独（対照）に対して曝露した。各条件について、培地を培養の３、６、９、１２、１５、及び１８日目に収集した。培地中へのグリコサミノグリカン硫酸塩（ＧＡＧ）の放出を、１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）色素結合アッセイによって測定した。結果は箱髭図として提示し、ここでの箱は、３連で行われた３回の独立した実験の統合データの中央の５０％（２５％〜７５％パーセンタイル）を表す（＊ｐ＜０．００５または＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図２３】アグリカン遺伝子発現における変化。１μｇ／ｍｌのウシリンクＮ（ＢＬＮ）またはヒトリンクＮ（ＨＬＮ）のいずれかで補充された培地におけるインキュベーションの後１週間での、１．２％アルギン酸塩においてビーズ化された線維輪（ＡＦ）及び髄核（ＮＰ）ウシ細胞のアグリカン（ＡＧＧ）遺伝子発現における変化。遺伝子発現は、ＲＴ−ＰＣＲで測定した。１８Ｓ  ｒＲＮＡが、ハウスキーピング遺伝子として使用され、結果を正規化する働きをした。値は、リンクＮに曝露された細胞の遺伝子発現の、培地単独に曝露された細胞の遺伝子発現（対照）に対する比率として表される。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２４】アグリカンＡＤＡＭＴＳ−４及びＡＤＡＭＴＳ−５遺伝子発現における変化。１μｇ／ｍｌのウシリンクＮ（ＢＬＮ）またはヒトリンクＮ（ＨＬＮ）のいずれかで補充された培地におけるインキュベーションの後１週間及び２週間での、１．２％アルギン酸塩においてビーズ化された線維輪（ＡＦ）及び髄核（ＮＰ）ウシ細胞の（Ａ、Ｂ）ＡＤＡＭＴＳ−４及び（Ｃ、Ｄ）ＡＤＡＭＴＳ−５遺伝子発現における変化。遺伝子発現は、ＲＴ−ＰＣＲで測定した。１８Ｓ  ｒＲＮＡが、ハウスキーピング遺伝子として使用され、結果を正規化する働きをした。値は、リンクＮに曝露された細胞の遺伝子発現の、培地単独に曝露された細胞の遺伝子発現（対照）に対する比率として表される。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１）。
【図２５】線維輪及び髄核ウシ細胞におけるＳｍａｄ１／５活性化への、ウシまたはヒトリンクＮの効果。線維輪（ＡＦ）及び髄核（ＮＰ）ウシ細胞を、１μｇ／ｍｌのウシリンクＮ（ＢＬＮ）またはヒトリンクＮ（ＨＬＮ）のいずれかで補充された培地において６時間培養した。タンパク質発現は、総Ｓｍａｄ１及びホスホ−Ｓｍａｄ１／５に対する特定の抗体を用いた免疫ブロッティングで分析した。３連で行われた３回の独立した実験の統合データを表す定量的結果を、平均±標準偏差として提示する（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１；†ｐ＜０．００１；§ｐ＜０．０００１）。ゲル上のバンドは、１回の代表的な実験に関して示されるものである。
【図２６】線維輪及び髄核ウシ細胞におけるＳｍａｄ２活性化への、ウシまたはヒトリンクＮの効果。線維輪（ＡＦ）及び髄核（ＮＰ）ウシ細胞を、１μｇ／ｍｌのウシリンクＮ（ＢＬＮ）またはヒトリンクＮ（ＨＬＮ）のいずれかで補充された培地において６時間培養した。タンパク質発現は、総Ｓｍａｄ２及びホスホ−Ｓｍａｄ２に対する特定の抗体を用いた免疫ブロッティングで分析した。３連で行われた３回の独立した実験の統合データを表す定量的結果を、平均±標準偏差として提示する（＊ｐ＜０．０５）。ゲル上のバンドは、１回の代表的な実験に関して示されるものである。
【図２７】変性を伴う、グレード２〜４のヒト椎間板（ＡＦ及びＮＰ部位）におけるＮＧＦ発現。この図は、一連の組織染色、及びヒトＩＶＤにおけるＮＧＦ発現が変性と共に増加することを示す免疫ブロットである。
【図２８】リンクＮは、線維輪（ＡＦ）細胞において、ニューロトロフィン（ＮＧＦ及びＢＤＮＦ）、ならびにサブスタンスＰ（ＴＡＣ１）のＴＮＦα刺激発現を抑制する。グレード２のヒト椎間板からのＡＦ細胞を、リンクＮ（１μｇ／ｍｌ）＋ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ）単独のいずれかで２４時間刺激した。結果は、４人の異なる提供者での４回の独立した実験の平均±標準偏差として示される。＊ｐ＜０．０５対対照。
【図２９】リンクＮは、線維輪（ＡＦ）細胞において、ニューロトロフィン（ＮＧＦ及びＢＤＮＦ）、ならびにサブスタンスＰ（ＴＡＣ１）のＩＬ−１β刺激発現を抑制する。グレード２のヒト椎間板からのＡＦ細胞を、リンクＮ（１μｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、またはＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）単独のいずれかで２４時間刺激した。結果は、４人の異なる提供者での４回の独立した実験の平均±標準偏差として示される。＊ｐ＜０．０５対対照。
【図３０】リンクＮは、ニューロトロフィン（ＴＲＫＡ及びＴＲＫＢ）、ならびにサブスタンスＰ（ＴＡＣ１Ｒ）受容体のＴＮＦα刺激発現を抑制する。リンクＮ（１μｇ／ｍｌ）＋ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ）単独の補充後２４時間刺激された、グレード２のヒト椎間板からの線維輪（ＡＦ）による、ニュートロフィン（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）及びサブスタンスＰの遺伝子発現における変化。結果は、４人の異なる提供者での４回の独立した実験の平均±標準偏差として示される。＊ｐ＜０．０５対対照。
【図３１】リンクＮは、ニューロトロフィン（ＴＲＫＡ及びＴＲＫＢ）、ならびにサブスタンスＰ（ＴＡＣ１Ｒ）受容体のＩＬ−１β刺激発現を抑制する。リンクＮ（１μｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、またはＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）単独の補充後２４時間刺激された、グレード２のヒト椎間板からの線維輪（ＡＦ）による、ニュートロフィン及びサブスタンスＰの遺伝子発現における変化。結果は、４人の異なる提供者での４回の独立した実験の平均±標準偏差として示される。＊ｐ＜０．０５対対照。
【図３２】ＮＧＦ遺伝子発現、及びリンクＮと共にインキュベートされたＡＦ細胞の培地に放出されたＮＧＦの分析。リンクＮ、ＩＬ−１βで処理された、あるいはリンクＮ及びＩＬ−１β処理のグレード４のＡＦ細胞における、約２７ｋＤａの分子量を伴うＮＧＦタンパク質の、ウェスタンブロット解析及び半定量分析。結果は、異なる提供者からの４つの椎間板の平均±標準偏差として表される（＊ｐ＜０．０５）。
【図３３】ウシ尾骨ＩＶＤの写真と、リンクＮが、損傷を受けたウシＩＶＤからのサブスタンスＰの放出を低減させたことを実証するグラフである。カプサイシンで処理された、穿刺のみされた、あるいは穿刺されかつリンクＮ（１０μｇ／ｍｌ）を補充された、４時間後または２４時間後の、ウシ椎間板によるサブスタンスＰの放出の変化。結果は、４回の独立した実験の平均±標準偏差として示される。＊ｐ＜０．０５対対照。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
Ｉ．定義
用語「軟骨細胞」は、本明細書で使用する場合、例えば軟骨組織中において見出され、かつ軟骨組織を産生するために使用することができるコンドロサイト系譜細胞を意味する。
【００２３】
用語「コンドロサイト系譜細胞」は、本明細書で使用する場合、コンドロサイトと、細胞化学的に類似であり、例えばＳｏｘ９及びＩＩ型コラーゲンを含むコンドロサイトマーカーを発現し、かつコンドロサイト細胞として振る舞う細胞とを意味する。コンドロサイト細胞は、関節軟骨系譜コンドロサイトまたは、肥大可能である肥大性系譜コンドロサイトであり得る。
【００２４】
用語「軟骨組織」は、本明細書で使用する場合、軟骨組織と、組織学的に類似であり、軟骨マーカー、例えばＩＩ型コラーゲン及びアグリカンを発現し、かつ軟骨として振る舞う、関節軟骨組織及び／または成長板軟骨様組織を含む組織とを意味する。
【００２５】
用語「保存的変異型」は、本明細書で使用する場合、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含む、リンクＮポリペプチド断片を意味する。
「保存的アミノ酸置換」は、本明細書で使用する場合、１つのアミノ酸残基がそのペプチドの所望される特性を無効にすることなく別のアミノ酸残基で置き換えられる置換のことである。好適な保存的アミノ酸置換は、類似の疎水性、極性、及びＲ鎖長をもつアミノ酸で互いに置換することによって為し得る。保存的アミノ酸置換の例としては、以下が挙げられる。
【００２６】
【表１】
0006700182.tif 000002
【００２７】
用語「培養物」は、本明細書で使用する場合、被着材、懸濁液、もしくは３Ｄ細胞、及び／または器官培養におけるインキュベーション細胞及び／または継代細胞である。３Ｄ細胞または器官培養は、細胞が３次元スキャフォールド中または上で培養される培養物を含み得る。
【００２８】
用語「椎間板細胞」は、本明細書で使用する場合、ＮＰまたはＡＦ細胞系譜の細胞を意味する。
用語「富化」または「富化された」は、本明細書で使用する場合、１つの種類の細胞の収率（分留物）が、その種類の細胞の、開始培養物または調製物における分留物よりも、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％増加していることを意味する。富化または部分的な精製は、交換可能に使用され得る。
【００２９】
細胞の集団は、細胞表面マーカー等のマーカーに基づく方法等の異なる方法を用いて富化することができる（例えば、ＦＡＣＳ分類等）。
本明細書で使用する場合、用語「発現する」は、分子のレベルが、その分子と接触していない、あるいはその分子に曝露されていない細胞中における分子のレベルよりも、その分子と接触した、あるいはその分子に曝露された細胞中において測定可能に高いような、細胞中におけるポリヌクレオチドの転写またはポリペプチドの翻訳を指す。分子の発現を測定するための方法は、当業者には周知であり、限定されるものではないが、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、ウェスタンブロット法、及びＦＡＣＳ等の免疫染色法が挙げられる。
【００３０】
用語「ハイブリダイズする」とは、相補的な核酸との、配列特異的で非共有結合性の結合相互作用を指す。ハイブリダイゼーションは、少なくとも中程度にストリンジェントな条件下において実行される。好ましい実施形態においては、ハイブリダイゼーションは、高度にストリンジェントな条件下である。ハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件は、当業者には既知であり、あるいはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１  ６．３．６．に見出すことができる。例えば、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で１５分間、それに続く５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄を１５分間行うことが採用され得る。ストリンジェンシーは、洗浄ステップにおいて使用される条件に基づいて選択され得る。例えば、洗浄ステップにおける塩の濃度は、５０℃の約０．２×ＳＳＣで１５分間という高いストリンジェンシーから選択することができる。加えて、洗浄ステップにおける温度は、約６５℃で１５分間という、高度にストリンジェントな条件であることができる。
【００３１】
「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中の２つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全てまたは一部に対して起こり得る。ハイブリダイズする部分は、典型的には少なくとも１５（例えば２０、２５、３０、４０、または５０）ヌクレオチド長である。当業者ならば、核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性は、ナトリウム含有緩衝液中の、ナトリウムイオン濃度と温度との関数であるＴｍ（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／ｌ）、または類似の等式）によって決定されることを理解するであろう。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメータは、イオン濃度及び温度である。既知の核酸分子に類似するが同一ではない分子を特定するためには、１％のずれがＴｍにおいて約１℃の低下をもたらすと推測され得るため、例えば、９５％超の配列同一性を有する核酸分子が希求される場合、最終洗浄温度は約５℃低下させられることになる。これらの検討に基づいて、当業者は適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができる。好ましい実施形態においては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、以下の条件、上の等式に基づくＴｍ−５℃における、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、それに続く６０℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの洗浄を１５分間行うことが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するために採用され得る。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、４２℃での３×ＳＳＣの１５分間の洗浄ステップが挙げられる。しかしながら、同等のストリンジェンシーは、代替的な緩衝液、塩、及び温度を用いて達成され得ることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関する更なる案内は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，６．３．１−６．３．６、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎにおいて見出し得る。
【００３２】
用語「配列同一性」は、本明細書で使用する場合、２つのポリペプチド配列または２つの核酸配列間の配列同一性のパーセンテージを指す。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性のパーセントを決定するために、配列は最適な比較という目的のために整合させられる（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整合のために、第１のアミノ酸の配列または核酸配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列におけるある位置が、第２の配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基で占有されているとき、その位置における分子は同一である。２つの配列間における同一性のパーセントは、それらの配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の重複する位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態において、２つの配列は同一の長さである。２つの配列間における同一性パーセントの決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて実現することもできる。２つの配列の比較について活用される数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４−２２６８のアルゴリズム、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５８７７において修正されたものである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドの追求は、本出願の核酸分子に対して相同のヌクレオチド配列を獲得するために、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセット、例えばスコア＝１００、語長＝１２で実行することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質の追求は、本明細書に記載されるタンパク質分子に対して相同のアミノ酸配列を獲得するために、ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータセット、例えばスコア−５０、語長＝３で実行することができる。比較目的のため、ギャップ化整合を獲得するために、ギャップ化ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるように活用することができる。代わりに、分子間の離れた関係性を検出するＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して、反復追求を行うことができる（Ｉｄ．）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ化ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを活用するとき、それぞれのプログラムの（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴの）初期設定パラメータを使用することができる（例えばＮＣＢＩのウェブサイトを参照）。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの許容を伴って、または伴わずに、上に記載されるものに類似の技法を用いて決定することができる。同一性パーセントを計算する際、典型的には完全な一致のみが数えられる。ある実施形態において、単離核酸がプライマーとして有用である。
【００３３】
用語「単離」は、本明細書で使用する場合、ある構成成分（例えば、ポリペプチド、核酸、組換え細胞、誘導細胞）のハットが、その構成成分を含む混合された、または不均一な環境から除去及び分離されていることを指す。例えば、ポリペプチドに関して、用語「単離ポリペプチド」は、組換えで産生される場合、細胞性物質または培養培地を実質的に含まない、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質等のタンパク質性薬剤、あるいは化学的に合成される場合、化学前駆体または他の化学物質を指す。用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用する場合、鎖状に共に結合する複数のアミノ酸残基からなるポリマーを指し、天然型アミノ酸ならびに修飾塩基を含むポリマーを含むことができる。
【００３４】
核酸に関して、組換えＤＮＡ技術で産生される場合、細胞性物質または培養培地を実質的に含まない、Ａ、Ｇ、Ｔ、ＣのポリマーならびにまたはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｃＤＮＡ等の修飾残基あるいは化学的に合成される場合、化学前駆体または他の化学物質を意味する。「単離核酸」はまた、核酸が誘導される元となる、核酸と天然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’及び３’末端に位置する配列）も実質的には含まない。用語「核酸」は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むことが意図され、二本鎖または一本鎖のどちらでもあり得る。
【００３５】
細胞の単離集団に関して、細胞の混合された、または不均一な集団から除去及び分離された細胞の集団を指す。一部の実施形態において、単離集団は、細胞が単離されるかまたは富化される元となる不均一な集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団である。
【００３６】
用語「リンクＮ」は、本明細書で使用する場合、ＭＭＰによってリンクタンパク質から切断された天然型の１６個のアミノ酸からなるペプチドを意味し、配列ＤＨＬＳＤＮＹＴＬＤＨＤＲＡＩＨ（配列番号１５）を有するヒトリンクＮ及び配列ＤＨＨＳＤＮＹＴＶＤＨＤＲＶＩＨ（配列番号５）を有するウシリンクＮを含む。リンクＮは、関節円板及び椎間円板の両方において産生され、アグリカン／コラーゲン合成を、椎間板（ＮＰ及びＡＦ）ならびに関節軟骨（コンドロサイト）細胞によって促進する。
【００３７】
用語「リンクＮ断片」は、本明細書で使用する場合、ｉ）Ｘ１がＬまたはＨである、ＤＨＸ１ＳＤＮＹＴ（配列番号１）、ｉｉ）ｉ）の保存的変異型、ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）の断片から選択されるペプチドを含むポリペプチドであって、保存的変異型及び／または断片は生物学的活性を保持し、ペプチドは１５個以下のアミノ酸である、ポリペプチドを意味する。例えば、リンクＮ断片は、配列番号１〜６のうちのいずれか１つから選択される配列、生物学的活性を保持するその保存的変異型及び／またはその断片を有するポリペプチドであり得る。
【００３８】
用語「間葉系幹細胞」またはＭＳＣは、本明細書で使用する場合、異なる条件下において、２つ以上の分化型の間葉系細胞型へと分化する能力を持つ細胞を指す。ＭＳＣは、間葉系幹細胞及び非誘導型の幹細胞を含む。
【００３９】
特定の細胞集団に関して、用語「実質的に純粋」とは、総細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％純粋である細胞の集団を指す。
【００４０】
用語「対象」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物、好ましくはヒトを含む、動物界の全てのメンバーを含む。
用語「処理する（ｔｒｅａｔ）」、「処理（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」等は、単離細胞に適用される場合、細胞を任意の種類のプロセスまたは条件に供すること、あるいは任意の種類の操作または手技を細胞に実行することを含む。対象に適用される場合、これらの用語は、対象に対して内科的もしくは外科的処置、看護、または管理を提供することを指す。
【００４１】
用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象に適用するように本明細書で使用する場合、臨床結果を含む有益または所望の結果を獲得することを目標とする手法を指し、例えば薬学的介入、手術、放射線療法、及び自然療法介入、ならびに軟骨及び／または椎間板組織病理を治療するための試験治療を含む医療手技及び適用を含む。有益または所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、検出可能または検出不可能にかかわらず、１つ以上の症状または条件の緩和または改善、疾患の程度の縮減、疾患の安定化（すなわち悪化しない）状態、疾患の広まりの予防、疾患進行の遅延または減速すること、病態の改善または寛解、及び緩解（部分的または総合的にかかわらず）を挙げることができる。治療としては例えば、単離リンクＮ断片ポリペプチドを対象に投与すること、あるいは、単離リンクＮ断片ポリペプチド、及び／または該ポリペプチドを発現する組換え細胞で処理された細胞を埋め込むかまたは組織を移植することが挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「投与」、「埋め込み」、及び「移植」は、導入される細胞の少なくとも部分的な局在化を所望の部位においてもたらす方法または経路によって、本明細書に記載される単離ポリペプチド、細胞、組織、及び／または産物を対象へ送達する文脈において、交換可能に使用される。細胞は、椎骨または関節に直接埋め込むことができ、代わりに、対象中の所望の場所への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することもできる。
【００４２】
本開示の範囲を理解する際に、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びその派生語は、本明細書で使用する場合、明言された特色、要素、構成成分、群、整数、及び／またはステップの存在を指定するが、他の明言されていない特色、要素、構成成分、群、整数、及び／またはステップの存在を排除しない、非限定的な用語であることを意図する。前述されたことはまた、用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を有する」、及びそれらの派生語等の類似の意味を有する言葉に対しても当てはまる。
【００４３】
用語「からなる」及びその派生語は、本明細書で使用する場合、明言された特色、要素、構成成分、群、整数、及び／またはステップの存在を指定し、他の明言されていない特色、要素、構成成分、群、整数、及び／またはステップの存在を排除する、限定的な用語であることを意図する。
【００４４】
更に、「実質的に」、「約」、及び「およそ」等の程度についての用語は、本明細書で使用する場合、最終結果が大きくは変化しないような、修飾された用語の合理的な量の偏差を意味する。程度についてのこれらの用語は、それが修飾する言葉の意味をこの偏差が打ち消さない場合、修飾された用語の少なくとも±５％の偏差を含むとして解釈されるべきである。
【００４５】
より具体的には、用語「約」は、参照が為される数字の０．１〜５０％、５〜５０％、または１０〜４０％、１０〜２０％、１０％〜１５％、好ましくは５〜１０％、最も好ましくは約５％、プラスであるかマイナスであることを意味する。
【００４６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明確に別様に規定しない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を含有する組成物は、２つ以上の化合物の混合物を含む。また、用語「または（ｏｒ）」は、内容が明確に別様に規定しない限り、「及び／または」を含むその意味で概して使用されることに留意されたい。
【００４７】
特定の節において記載される定義及び実施形態は、当業者によって好適であると理解される、本明細書に記載される他の実施形態に対しても適用可能であることが意図される。
本明細書の、終末点による数値域の列挙は、その範囲内に包含される全ての数及び分数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、及び５を含む）。全ての数及びその分数は、用語「約」によって修飾されるものと推定されることもまた理解されるであろう。
【００４８】
更に、記載される定義及び実施形態は、当業者によって好適であると理解される、本明細書に記載される他の実施形態に対しても適用可能であることが意図される。例えば、本明細書の節において、本発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義される各態様は、明確に反対に指示されない限り、任意の他の態様または複数の態様と組み合わせることができる。特に、好ましいかまたは有利であると示される任意の特色は、好ましいかまたは有利であると示される任意の他の特色または複数の特色と組み合わせることができる。
【００４９】
更に、特定の節において記載される定義及び実施形態は、当業者によって好適であると理解される、本明細書に記載される他の実施形態に対しても適用可能であることが意図される。例えば、以下の節において、本発明の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義される各態様は、明確に反対に指示されない限り、任意の他の態様または複数の態様と組み合わせ得る。特に、好ましいかまたは有利であると示される任意の特色は、好ましいかまたは有利であると示される任意の他の特色または複数の特色と組み合わせ得る。
【００５０】
ＩＩＩ．方法及び産物
本明細書に記載されるように、最初の８個のアミノ酸を含むリンクＮの断片が、器官培養物における細胞外プロテオグリカンレベルを誘導及び復元し、更に、炎症性環境を含む、椎間板細胞及び軟骨細胞において、プロテオグリカン及びＩＩ型コラーゲン合成を誘導することが発見されている。例えば、実施例３において実証されるように、ＧＡＧの含有量は、ＩＬ−１βの存在下においてリンクＮで骨関節炎の外植片を処理したとき、対照と比較して著しく増加した。ウェスタンブロット解析によって、これはまた、ＩＬ−１β単独のときと比較すると、ＭＭＰ−１３の活性形態の量の減少につながることが明らかになった。抽出可能なＩＩ型コラーゲンの量もまた、ＩＬ−１βの存在下においてリンクＮでＯＡ軟骨からの外植片を処理したとき、増加された。リンクＮは、正常及びＯＡ患者からのコンドロサイトにおいて、ＩＬ−１β刺激性のＰ−Ｐ６５（ＮＦ−κＢ）を著しく阻害した。
【００５１】
更に、ウシリンクＮ（ＢＬＮ）もまた、ヒトリンクＮ（ＨＬＮ）の場合と同様、椎間板細胞においてプロテオグリカン及びＩＩ型コラーゲン合成を誘導することが実証される。
リンクＮは１６アミノ酸ペプチドである。本開示以前には、リンクＮの断片が存在するか、及び／またはそれが活性であるか否かについては知られていなかった。例えば、Ｗａｎｇら（３３）によって、リンクＮの最初の１２個のアミノ酸を含むリンクＮ断片は活性を有さないことが報告された。
【００５２】
ある態様は、単離ポリペプチド（本明細書においてはリンクＮ断片またはリンクＮ断片ポリペプチドと称される）を含み、この単離ポリペプチドは、
ｉ）ＤＨＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６（配列番号３０）、
（Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でＬ、Ｈ、Ｒ、Ｑであり、
Ｘ２はＳまたはＬであり、
Ｘ３はＤ、Ｓ、またはＮであり、
Ｘ４はＮまたはＤであり、
Ｘ５はＹまたはＳであり、かつ／あるいは
Ｘ６はＴまたはＹである）
ｉｉ）ｉ）の保存的変異型、及び／または
ｉｉｉ）ｉ）及び／またはｉｉ）の断片、から選択されるペプチドを含み、
保存的変異型及び／または断片は、生物学的活性を保持し、ペプチドは１５個以下のアミノ酸である。
【００５３】
リンクＮ配列の例は、実施例１０において提供される。ある実施形態において、リンクＮ断片ポリペプチドは、実施例１０に記載されるか、そこに記載される配列から決定可能な保存モチーフに基づく配列を含む。
【００５４】
ある実施形態において、単離ポリペプチドは、Ｘ１が任意のアミノ酸であり、任意選択でＬ、Ｈ、Ｒ、Ｑであり、かつ／またはＸ３がＤ、Ｓ、もしくはＮである、ＤＨＸ１ＳＸ３ＮＹＴ（配列番号３１）、その保存的変異型、ならびに／あるいはその断片からなるペプチドを含み、保存的変異型及び／または断片は生物学的活性を保持し、ペプチドは１５個以下のアミノ酸である。
【００５５】
ある実施形態において、単離ポリペプチド（本明細書においてはリンクＮ断片またはリンクＮ断片ポリペプチドと称される）は、
ｉ）ＤＨＸ１ＳＤＮＹＴ（Ｘ１はＬまたはＨ）（配列番号１）、
ｉｉ）ｉ）の保存的変異型、及び
ｉｉｉ）ｉ）及び／またはｉｉ）の断片、から選択されるペプチドを含み、
保存的変異型及び／または断片は、生物学的活性を保持し、ペプチドは１５個以下のアミノ酸である。
【００５６】
保存的変異型ｂ）は、例えば１つ以上の保存的変異型置換を含むことができる。
ある実施形態において、生物学的活性は、ＢＭＰ受容体ＩＩ型の結合及び／またはＳＭＡＤ１／５活性の活性化である。
【００５７】
ある実施形態において、包括される保存的変異型ポリペプチドは、スクランブルまたは反転リンクＮと比較して、ＢＭＰ受容体ＩＩ型に結合し、ＳＭＡＤ１／５活性を活性化するものである。
【００５８】
断片ｃ）は例えば、配列番号１、２、３、４、または５の４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、または７個のアミノ酸であり得る。この断片は、最もＮ末端側のアミノ酸、または最もＣ末端側のアミノ酸を含み得る。
【００５９】
例えば、より小さい断片を、例えば実施例９において記載されるような活性について試験することができる。
ある実施形態において、この断片は、スクランブルまたは反転リンクＮと比較して、ＢＭＰ受容体ＩＩ型に結合し、ＳＭＡＤ１／５活性を活性化する。
【００６０】
ＢＭＰ受容体ＩＩ型結合及び／またはＳＭＡＤ活性化は、例えば、Ｗａｎｇらの文献（３３）において記載されるように評価することができる。
ある実施形態において、ペプチドは、ＤＨＸ１ＳＤＮＹＴ（配列番号１）（Ｘ１はＬまたはＨである）、または生物学的活性を保持するその保存的変異型からなる。
【００６１】
別の実施形態において、単離ポリペプチドは、ＤＨＬＳＤＮＹＴ（配列番号２）からなるペプチド配列、または生物学的活性を保持するその保存的変異型を含む。
別の実施形態において、単離ポリペプチドは、ＤＨＨＳＤＮＹＴ（配列番号３）からなるペプチド配列、または生物学的活性を保持するその保存的変異型を含む。ある実施形態において、単離ポリペプチドは、ＤＨＬＳＤＮＹＴ（配列番号２）またはＤＨＨＳＤＮＹＴ（配列番号３）からなるペプチドを含む。
【００６２】
より大きな断片は、リンクＮ（例えばヒトまたはウシリンクＮ）の最大１５個のアミノ酸を含む。ある実施形態において、ペプチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個のアミノ酸である。
【００６３】
したがって、ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、
ｉ）ＤＨＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＤＸ１０Ｘ１１Ｘ１２，Ｘ１３（配列番号６）、
（Ｘ１は任意のアミノ酸、任意選択でＬ、Ｈ、Ｒ、Ｑであり、
Ｘ２はＳまたはＬであり、
Ｘ３はＤ、Ｓ、またはＮであり、
Ｘ４はＮまたはＤであり、
Ｘ５はＹまたはＳであり、
Ｘ６はＴまたはＹであり、
Ｘ７はＬ、Ｖ、またはＴであり、
Ｘ８は任意のアミノ酸、任意選択でＤ、Ｇ、Ｎ、またはＰであり、
Ｘ９はＨ、Ｙ、またはＰであり、
Ｘ１０はＲまたはＱであり、
Ｘ１１はＡ、Ｖ、またはＤであり、
Ｘ１２はＩまたはＲであり、かつ／あるいは
Ｘ１３はＨまたはＹである）
ｉｉ）ｉ）の保存的変異型、及び／または
ｉｉｉ）ｉ）及び／またはｉｉ）の断片、から選択されるペプチドを含み、
保存的変異型及び／または断片は、生物学的活性を保持し、ペプチドは１５個以下のアミノ酸であり、１つ以上の連続するＣ末端及び／またはＮ末端残基が欠失する。
【００６４】
ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、
ｉ）Ｘ１がＬまたはＨであり、Ｘ７がＬまたはＶであり、かつ／あるいはＸ１２がＡまたはＶである、ＤＨＸ１ＳＸ３ＮＹＴＸ７Ｘ８ＨＤＲＶＩＨ（配列番号７）またはＤＨＸ１ＳＤＮＹＴＸ７ＤＨＤＲＸ１２Ｉ（配列番号８）、
ｉｉ）ｉ）の保存的変異型、及び
ｉｉｉ）ｉ）及び／またはｉｉ）の断片、から選択されるペプチドを含み、
保存的変異型及び／または断片は、生物学的活性を保持する。
【００６５】
別の実施形態において、単離ポリペプチドは、配列ＤＨＬＳＤＮＹＴＬＤＨＤＲＡＩ（配列番号９）、または生物学的活性を保持するその保存的変異型及び／もしくは断片を含む。
【００６６】
別の実施形態において、単離ポリペプチドは、配列ＤＨＨＳＤＮＹＴＶＤＨＤＲＶＩ（配列番号１０）、または生物学的活性を保持するその保存的変異型及び／もしくは断片を含む。
【００６７】
８１％の配列同一性を共有するウシリンクＮ及びヒトリンクＮの両方が、生物学的活性を有することが、本明細書に実証される。したがって、ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、または６に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有するペプチドを含む。ある実施形態において、配列番号４のＸ１、Ｘ２、及び／またはＸ３に対応する残基が修飾される。
【００６８】
ある実施形態において、断片は、配列番号４、５、または６の４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、８個のアミノ酸、９個のアミノ酸、１０個のアミノ酸、１１個のアミノ酸、１２個のアミノ酸、１３個のアミノ酸、１４個のアミノ酸、または１５個のアミノ酸であり得る。この断片は、最もＮ末端側のアミノ酸、または最もＣ末端側のアミノ酸を含み得る。
【００６９】
ある実施形態において、この断片は、スクランブルまたは反転リンクＮと比較して、ＢＭＰ受容体ＩＩ型に結合し、ＳＭＡＤ１／５活性を活性化する。
ある実施形態において、単離ペプチドは、固体支持体に結合され、任意選択で官能基の分散を伴う溶媒和ポリマー、例えばポリスチレン（１〜２％ジビニルベンゼンで架橋されたスチレン）、ポリアクリルアミド（ポリスチレンに対する親水性の代案）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）等のゼラチン状支持体に結合される。ある実施形態において、固体支持体は、例えばポリアミドまたはポリスチレンを伴う、ＰＥＧ−ポリプロピレングリコールネットワークまたはＰＥＧで構成される、ＰＥＧ系支持体である。ある実施形態において、固体支持体は、例えば制御された細孔ガラス、セルロース繊維、及び高度に架橋されたポリスチレンを含む、表面形式支持体である。ある実施形態において、固体支持体は、合成物、例えば剛性マトリックスによって支持されるゼラチン状ポリマーである。
【００７０】
ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、１つ以上の保護基を含む。ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、Ｎ末端保護基を有する。ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、Ｃ末端保護基を有する。ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、サイドチェンジの保護基を有する。
【００７１】
ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、Ｎ保護基を含む。
ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、Ｆｍｏｃ保護基を含む。ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、ｔ−Ｂｏｃ保護基を含む。Ｆｍｏｃ。ある実施形態において、保護基は、ベンジルオジカルボニル（Ｂｅｎｚｙｌｏｚｙ  ｃａｒｂｏｎｙｌ）（Ｚ）基である。ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、アロック保護基を有する。別の実施形態において、本単離ポリペプチドは、リソグラフィック保護基を有する。
【００７２】
ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、デンドリマーで構成される、またはデンドリマーに含まれる。ある実施形態において、デンドリマーは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、またはそれ以上の、デンドリマースキャフォールドに結合される、本明細書に記載される単離ポリペプチドを含む。ある実施形態において、デンドリマースキャフォールドは、ポリリジンスキャフォールドである。
【００７３】
ある実施形態において、単離ポリペプチドは、ＰＥＧまたはアルブミン、ビーズ等の担体部分に結合される。
ある実施形態において、ペプチドは、ホーミング部分、安定化部分、保護部分、及び管理部分から選択される活性部分に結合され、任意選択で活性部分はタンパク質性である。
【００７４】
例えば、安定化部分は、免疫グロブリンＦｃ部分、アルブミン、及び同類のもの等の、自然な分解及び／またはタンパク質のターンオーバーに抗するアミノ酸のタンパク質配列であり得、この安定化部分は、単離ペプチドのＮ及び／またはＣ末端に結合される。
【００７５】
ある実施形態において、単離ポリペプチドは、検出可能または精製標識、例えば、組換えタンパク質に付加または導入することができ、その発現の検出またはポリペプチドの精製に有用であるペプチド配列等の部分に結合される。ある実施形態において、精製タグは、タンパク質分解性の切断部位を含むリンカーを介して、単離ペプチドに結合される。
【００７６】
ある実施形態において、単離ペプチドは、リポソームまたはナノ粒子で構成される。ある実施形態において、リポソームは徐放性リポソームである。ある実施形態において、リポソームはペグ化されたリポソームである。
【００７７】
更なる態様は、本明細書に記載される単離リンクＮ断片ポリペプチドをコードする単離核酸である。本単離核酸は、むき出しでも、ベクターに含まれてもよい。また、ある実施形態において、本明細書に記載される単離リンクＮ断片ポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸も提供される。ある実施形態において、核酸はコドン最適化される。
【００７８】
したがって、更なる態様は、本明細書に記載される単離核酸及び／または単離ポリペプチドを含むベクターを含む。ベクターとしては、核酸用のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びＤＮＡウイルスベクター、ならびにポリペプチド用のリポソームまたはナノ粒子を挙げることができる。ある実施形態において、ベクターはリポソームまたはナノ粒子である。ある実施形態において、リポソームは徐放性リポソームである。
【００７９】
本単離ポリペプチド及び／または核酸は、組換え技術を用いて作製することができ、かつまたは合成的に合成することができる。
ある実施形態において、本単離ポリペプチドは合成的に産生され、非グリコシル化であるかまたはヒトインビボ発現ポリペプチドとは異なるようにグリコシル化される。
【００８０】
ある実施形態において、本単離ポリペプチドは環化される。ある実施形態において、本単離ポリペプチドは、１つ以上のＤアミノ酸またはより多くのＬアミノ酸を含む。
更なる態様は、本明細書に記載される単離リンクＮ断片ポリペプチドを発現し、かつ／または本明細書に記載される単離核酸もしくはベクターを含む、組換え細胞を含む。
【００８１】
本開示のリンクＮ断片を発現する様々な組換え細胞を作製することができる。例えば、細胞は、本出願のリンクＮ断片をコードする核酸を含むベクターと変換、形質移入、または形質導入することができる。
【００８２】
ある実施形態において、この細胞は、コンドロサイト系譜細胞、幹細胞、または椎間板細胞であり、任意選択で幹細胞は間葉系幹細胞である。ある実施形態において、本組換え細胞は、治療上の使用のためのものである。
【００８３】
更なる態様は、本明細書に記載される単離ポリペプチド、及び任意選択で担体または希釈剤を含む、組成物である。
本明細書に記載される単離核酸、ベクター、または組換え細胞を含む、組成物もまた、別の態様において提供される。
【００８４】
ある実施形態において、本希釈剤は、生理学的緩衝液であり、任意選択で無菌の生理学的緩衝液である。
ある実施形態において、本組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤を含む薬学的組成物である。
【００８５】
本単離ポリペプチド、単離核酸、ベクター、組換え細胞は、場合によっては凍結乾燥することができ、あるいは液体、ゲル、または固体組成物中にあることができる。
本組成物は、凍結乾燥粉末、または水溶液もしくは非水溶液、もしくは懸濁液であり得、これは更に抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、及び溶質を含有してもよい。そのような組成物中に存在してもよい他の構成成分としては、例えば水、（Ｔｗｅｅｎ等の）界面活性剤、アルコール、ポリオール、グリセリン、及び植物油が挙げられる。
【００８６】
核酸にとって好適な希釈剤としては、限定されるものではないが、水、食塩水、及びエタノールが挙げられる。
ポリペプチド及び／または細胞にとって好適な希釈剤としては、限定されるものではないが、食塩水、ｐＨ緩衝溶液、及びグリセロール溶液、またはポリペプチド及び／または細胞を凍結するために好適な他の溶液が挙げられる。
【００８７】
本組成物は更に、安定化剤、例えば還元剤、疎水性の添加剤、及びプロテアーゼ阻害因子を含むことができ、これらは生理学的緩衝液に添加される。
ある実施形態において、本組成物は、本明細書に記載される単離ポリペプチド、組換え細胞、及び／または組成物を含む生体適合性材料で形成されるスキャフォールドを含む。
【００８８】
ある実施形態において、生体適合性材料は、アルギン酸塩、アガロース、キトサン、ポリカプロラクトン、及び／またはヒアルロン酸（ヒアルロン酸塩）に基づく生体材料から選択される。コンドロサイト及び／またはＩＶＤ細胞用の一般的なスキャフォールドもまた使用することができる。
【００８９】
実施形態において、スキャフォールドは、ハイドロゲル、ミクロスフェア、マイクロカプセル、スポンジ、発泡体、または繊維へと形成される。
ある実施形態において、本組成物は、対象への移植のための軟骨または椎間板細胞を調製するためのものであり、本組成物は、本明細書に記載される単離ポリペプチド及び／または組換え細胞、軟骨及び／または椎間板細胞、ならびに担体または希釈剤を含み、軟骨及び／または椎間板細胞は、軟骨細胞及び／または椎間板細胞を誘導してプロテオグリカン及び／またはＩＩ型コラーゲン合成を増加させるのに十分な、有効量の該単離ポリペプチド及び／または組換え細胞に曝露される。本組成物及び／または本組成物の細胞は、例えば、本組成物の対象への投与に際して、対象の組織病理を治療するために単離及び使用することができる。
【００９０】
ある実施形態において、本薬学的組成物は、対象の軟骨または椎間板組織病理の治療における使用のためのものであり、本組成物は、本明細書に記載される単離ポリペプチド及び／または組換え細胞、軟骨及び／または椎間板細胞、ならびに薬学的に許容される担体または希釈剤を含み、この治療は、本組成物の対象への投与に際して、対象の組織病理を治療するために、軟骨細胞及び／または椎間板細胞を誘導してプロテオグリカン及び／またはＩＩ型コラーゲン合成を増加させるのに十分な、有効量の該単離ポリペプチド及び／または組換え細胞に、軟骨及び／または椎間板細胞を曝露することを含む。
【００９１】
ある実施形態において、本組成物（本薬学的組成物を含む）は、生体適合性材料で形成されるスキャフォールドを含み、軟骨及び／または椎間板細胞は、スキャフォールド上またはその中に配置される。
【００９２】
ある実施形態において、軟骨及び／または椎間板細胞を含む本組成物は、投与前に少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、または少なくとも５日間培養される。
【００９３】
別の態様は、軟骨及び／もしくは椎間板細胞内、または軟骨及び／もしくは椎間板細胞を含む組織内において、マトリックス合成、任意選択でプロテオグリカン合成、及び／またはＩＩ型コラーゲン合成を誘導する方法を含み、本方法は、軟骨及び／または椎間板細胞を、有効量の、単離ポリペプチド、該単離ポリペプチドを発現する組換え細胞、及び／または本明細書に記載される組成物とともに、プロテオグリカン合成を誘導するような条件下でインキュベートし、増加したマトリックス合成を伴う誘導軟骨及び／または椎間板細胞を産生することを含む。
【００９４】
マトリックス合成は、例えば実施例において記載されるプロテオグリカン及び／またはＩＩ型コラーゲン合成を評価することによって、測定することができる。
ある実施形態において、本方法は、細胞培養物、任意選択で椎間板器官培養物中でインビトロで実行されて、増加したマトリックス合成を伴う細胞または組織を産生する。
【００９５】
ある実施形態において、細胞及び／または組織は、任意選択で軟骨移植における使用のための、軟骨を産生するような条件下で接触させられる。
ある実施形態において、軟骨細胞は、コンドロサイトである。ある実施形態において、椎間板細胞はＡＰ細胞であり、任意選択でｉＡＰ細胞である。別の実施形態において、椎間板細胞はＮＰ細胞である。更なる実施形態において、細胞の混合集団、例えばＡＰ及びＮＰを含む集団が使用される。ある実施形態において、組織は、軟骨系譜細胞を含む。ある実施形態において、組織は、ＡＰ及び／またはＮＰ系譜細胞を含む。
【００９６】
ある実施形態において、組換え細胞は、本明細書に記載される単離ポリペプチドを発現するＭＳＣである。
ある実施形態において、軟骨細胞、椎間板細胞、及び／または組織は、対象中にあり、接触は、本明細書に記載される単離ポリペプチド、組換え細胞、または請求項１４もしくは１５に記載の組成物を対象に投与することによって実行される。
【００９７】
ある実施形態において、誘導軟骨及び／または椎間板細胞が、対象へ導入される。
ある実施形態において、軟骨細胞及び／または椎間板細胞は、インビトロで処理された自家細胞である。例えば、モザイクプラスティにおいては、小さく、多くの場合円形（４〜８ｍｍ）の自家グラフトを、例えば膝の非荷重負荷部位から採取する。ある実施形態において、リンクＮが、採取前及び／または自家グラフトを再導入して修復の促進を試みるときに、注入または投与される。例えば、これは、収集部位の修復に役立ち得、かつ／または埋め込み部位の処理は、グラフトの周囲及びグラフトが採取された場所の修復を促進し得る。
【００９８】
別の態様は、対象に移植するための軟骨及び／または椎間板組織を産生する方法を含み、本方法は、軟骨及び／または椎間板細胞を、有効量の、単離ポリペプチド、該単離ポリペプチドを発現する組換え細胞、及び／または本明細書に記載される組成物とともに、プロテオグリカン合成を誘導するような条件下でインキュベート／培養し、増加したマトリックス合成、任意選択で増加したプロテオグリカン合成を伴う誘導軟骨及び／または椎間板細胞を産生することと、誘導軟骨及び／または椎間板細胞の実質的に純粋な集団を単離することとを含む。
【００９９】
ある実施形態において、マトリックスは、軟骨性マトリックスを含む。ある実施形態において、軟骨性マトリックスは、プロテオグリカン及び／またはコラーゲン、例えばＩＩ型コラーゲンを含む。
【０１００】
ある実施形態において、プロテオグリカン合成はアグリカンである。
ある実施形態において、軟骨及び／または椎間板細胞は、例えば実施例に記載されるアルギン酸塩スキャフォールド等の、スキャフォールドを含む３Ｄ培養物中にある。
【０１０１】
ある実施形態において、誘導軟骨及び／または椎間板細胞が、対象へ埋め込まれる。
ある実施形態において、例えばおよそ０．５マイクログラム／ｍＬが、細胞培養において、及び／または投与のために使用される。別の実施形態において、約０．５マイクログラム／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍｌが使用され、場合によっては約１０マイクログラム／ｍＬが使用される。約１００マイクログラム／ｍＬ、約１０００マイクログラム／ｍＬ、約２ミリグラム／ｍＬ、約３ミリグラム／ｍＬ、約４ミリグラム／ｍＬ、約５ミリグラム／ｍＬ、約６ミリグラム／ｍＬ、約７ミリグラム／ｍＬ、約８ミリグラム／ｍＬ、約９ミリグラム／ｍＬ、または約１０ミリグラム／ｍＬ。ある実施形態において、用量は、１０マイクログラム／ｍＬずつの任意の増加で、約０．５マイクログラム／ｍＬ〜最大約１０ｍｇ／ｍｌである。ある実施形態において、量は、重量／容積である。ある実施形態において、注入当たりの量が投与される。例えば、ある実施形態において、腰部椎間板当たり最大もしくは約１ｍｇが注入されるか、あるいは関節当たり最大１ｍｇが導入される。
【０１０２】
更なる態様は、軟骨及び／または椎間板組織病理に関連付けられる症状を緩和し、かつ／または軟骨及び／または椎間板組織病理を治療する方法を含み、この方法は、それらを必要とする対象に対して、本明細書に記載される、単離ポリペプチド、組換え細胞、誘導軟骨及び／もしくは椎間板細胞、ならびに／または薬学的組成物を投与することを含む。
【０１０３】
ある実施形態において、症状は疼痛である。図２７〜３０において実証されるように、ＩＶＤにおけるＮＧＦ発現は、ＮＰ及びＡＦ細胞の両方における変性とともに増加し、リンクＮは、ＡＦ細胞における、ニューロトロフィン（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ）及びサブスタンスＰ（ＴＡＣ１）のＴＮＦα誘導遺伝子発現を抑制することができる。図２９は、リンクＮが、ＡＦ細胞において、ニューロトロフィン（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ）及びサブスタンスＰ（ＴＡＣ１）のＩＬ−１β誘導発現を抑制することを実証する。ニューロトロフィン及びサブスタンスＰは、疼痛の媒介物である。
【０１０４】
ある実施形態において、軟骨及び／または椎間板組織の病理は、椎間円板変性症である。ある実施形態において、椎間円板変性症は早期段階である。例えば、早期段階の椎間板変性症としては、トンプソングレード１、２、及び／または３の変性、あるいは場合によっては、例えばＭＲＩ等の画像診断時に決定可能であるようにＡＦが実質的にインタクトである間が挙げられる。後期段階の椎間板変性症としては、例えば、トンプソングレード４、トンプソングレード５、またはより大きな変性及び／もしくは融合が起こっている場合を挙げることができる。例えば、本明細書に記載される産物及び方法を、融合後の隣接する椎間板の変性を治療及び／または予防するために使用することができる。
【０１０５】
高感度及び／または定量ＭＲＩ法を、本明細書に記載される治療を受けるのに好適な対象を選択するために使用することができる。ある実施形態において、治療は、例えば変性が検出可能なほどに存在するが、変性を修復及び／または遅らせる必要があるほどに疼痛をもたらしているわけではない変性椎間板に対して、予防的に投与される。
【０１０６】
ある実施形態において、対象は、減少した細胞密度及び／または代謝活性を有し、場合によっては減少した細胞密度及び／または代謝活性は年齢に起因するものである。
ある実施形態において、軟骨及び／または椎間板組織の病理は、関節炎、望ましくない骨形成、及び／または石灰化から選択される、炎症性または変性性関節疾患である。
【０１０７】
ある実施形態において、関節炎は骨関節炎である。
別の実施形態において、関節炎は関節リウマチである。
ある実施形態において、軟骨及び／または椎間板組織の病理は、骨粗鬆症である。ある実施形態において、軟骨及び／または椎間板組織は、骨溶解症である。
【０１０８】
ある実施形態において、軟骨及び／または椎間板組織の病理は、機械的損傷である。
ある実施形態において、対象は、任意選択でヒト、ウマ、ウシ、ヤギ、またはイヌから選択される哺乳動物である。ある実施形態において、対象はヒトである。
【０１０９】
ＢＭＰ受容体ＩＩ型発現の喪失が、マウスモデルにおいて、内皮炎症及びアテローム性動脈硬化症を引き起こすことが示されている。リンクＮは、ＢＭＰ受容体ＩＩ型に結合することが示されており、本明細書において、ＮＦκＢ活性を阻害することが示される。したがって、更なる態様は、症状を緩和し、かつ／または内皮炎症及び／もしくはアテローム性動脈硬化症を有する対象を治療する方法であり、この方法は、それらを必要とする対象に対して、本明細書に記載される、単離リンクＮ断片ポリペプチド、組換え細胞、誘導軟骨及び／もしくは椎間板細胞、ならびに／または薬学的組成物を投与することを含む。
【０１１０】
ある実施形態において、単離ポリペプチド、組換え細胞、誘導細胞、及び／または薬学的組成物は、対象に対してスキャフォールドで投与される。
単離リンクＮポリペプチド、組換え細胞、誘導細胞、または薬学的組成物は、対象に対して、経皮的に、かつ／または組織病理の部位付近、もしくはその部位に投与することができる。椎間板組織の病理については、単離リンクＮ断片ポリペプチド、組換え細胞、及び／または誘導細胞は、対象に、椎間板内注射、例えばＮＰ、ＡＦ、場合によっては内側ＡＦへの注射によって投与、埋め込み、または移植することができる。関節の病理については、単離リンクＮ断片ポリペプチド、組換え細胞、及び／または誘導細胞は、対象に、冒されている局部への注入によって投与、埋め込み、または移植することができる。一部の実施形態において、自家細胞及び／または組織が例えば、モザイクプラスティにおいてなされるように、記載の通りに切除、処理され、再び埋め込まれる。
【０１１１】
ある実施形態において、単離リンクＮ断片ポリペプチド、組換え細胞、及び／または誘導細胞は、対象に、滑液への注入によって投与、埋め込み、または移植することができる。ある実施形態において、対象が例えば病変を修復するための埋め込みスキャフォールドを有する場合、投与は、埋め込まれている埋め込みスキャフォールドへの注入／導入によって進行させることができる。
【０１１２】
ある実施形態において、コンドロサイト、及び／またはＭＳＣ、及び／または誘導細胞を含む既存のエキソビボスキャフォールドを、本明細書に記載される単離リンクＮポリペプチド、リンクＮ断片産物を含む組成物に更に含浸させることができる。スキャフォールドはその後、それを必要とする対象に注入することができる。
【０１１３】
椎間板及び軟骨の修復は、細胞外マトリックス産生を最大化するために間葉系ＭＳＣ及びリンクＮを補充することによって増進することができる。
ある実施形態において、単離リンクＮ断片ポリペプチド、組換え細胞、誘導細胞、及び／または前述のうちの１つ以上を含む組成物が、椎間板病変を修復するために使用される。天然の椎間板変性は、裂け目の創成を伴う。そのような病変を修復するために、リンクＮ断片及び幹細胞を、病変を満たし、導入される薬剤の均一な分布を可能にする重合可能なスキャフォールドに埋め込むことができる。
【０１１４】
更なる実施形態において、本単離ポリペプチド、または本単離ポリペプチドを含む組成物は、併用療法において投与される。
ある実施形態において、対象は、埋め込みを受けており、場合によっては本明細書に記載されるように治療を受けているか、または治療されていない。対象は、例えばプロテオグリカン産生を増加させるために、本明細書に記載される単離ポリペプチドを投与される。
【０１１５】
ある実施形態において、本方法は更に、細胞または組織を、本明細書に記載される単離ポリペプチド、組換え細胞、または組成物と共にＭＳＣと接触させること、あるいは対象にこれらを投与することを含む。
【０１１６】
上の開示は、本出願を概略的に説明する。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照して得ることができる。これらの実施例は、例証の目的のためにのみ記載され、本出願の範囲を制限することを意図しない。均等物の形態及び置換における変化が、状況が好都合であると示唆または表すとき、企図される。本明細書において特定の用語が使用されているが、そのような用語は、記述的な意味を意図するものであり、制限目的ではない。
【０１１７】
以下の非制限的実施例は、本開示の例証である。
【実施例】
【０１１８】
実施例１
現状、椎間板変性から生じる腰痛を予防、停止、または遅らせるための治療すら確立されていない。これまでの研究により、ＩＶＤにおいて、リンクＮは成長因子として振る舞い、プロテオグリカン及びコラーゲンの合成を刺激し得ることが示されている。しかしながら、細胞活性の調節に関与するリンクＮの配列は、よく理解されていない。椎間板細胞がリンクＮをタンパク質分解性でプロセシングすることができるかどうかを判定するため、ヒト椎間板細胞を天然リンクＮに４８時間に亘って曝し、下において更に記載されるように、質量分光分析によって、残基１−８にまたがるペプチドが、ＡＦ細胞の存在下では生成されたが、ＮＰ細胞の存在下では生成されなかったことが明らかになった。リンクＮ１−８は、ＩＬ−１βＮＰ及びＡＦ細胞の存在下においてプロテオグリカン産生を著しく誘導し、ペプチドの最初の８個のアミノ酸において生物学的効果は維持されることが確認され、この効果は炎症性環境において持続性であることが指し示される。
【０１１９】
細胞活性を調節する際のリンクＮの独特な効果は、配列及び／またはモチーフ特異的な相互作用を示唆する。しかしながら、リンクＮが生物学的システムにおいて安定であるかどうかはあまり明確でない。生物学的システムにおけるリンクＮの成り行きもまた研究された。
【０１２０】
方法及び材料
材料
プロナーゼは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のものであった。コラゲナーゼ１Ａ、ＧｌｕｔａＭＡＸ、ＮａＣｌ、及びギ酸は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。低粘度アルギン酸塩（Ｋｅｌｔｏｎｅ  ＬＶ）を、Ｋｅｌｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手した。ペニシリン／ストレプトマイシン、硫酸ゲンタマイシン、アンホテリシンＢ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及びウシ胎仔血清（ＦＣＳ）は、Ｇｉｂｃｏ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。アルギン酸塩ビーズを作製するための２０Ｇ  １  １／２インチ針は、ＢＤ  ｓｙｒｉｎｇｅｓ，（Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。ＨＰＬＣグレードアセトニトリルは、Ｒａｔｈｂｕｒｎ（Ｗａｌｋｅｒｂｕｒｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）から購入した。トリプシンゴールド質量分析グレードは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から購入した。トップ１５ｍｍの容量０．２ｍＬのＧｌａｓｓ−Ｍｉｃｒｏ−Ｉｎｓｅｒｔを組み込む、寸法３２×１１．６ｍｍのＴｏｐＳｅｒｔ，ＴＰＸ−Ｓｈｏｒｔ  Ｔｈｒｅａｄ−Ｖｉａｌを、Ｓｋａｎｄｉｎａｖｉｓｋａ  ＧｅｎｅＴｅｃ  ＡＢ（Ｖａｅｓｔｒａ  Ｆｒｏｅｌｕｎｄａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｖｙｄａｃ  ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏ  Ｓｐｉｎ（登録商標）Ｓｉｌｉｃａ  Ｃ１８  ３００Åカラムを、Ｔｈｅ  Ｎｅｓｔ  Ｇｒｏｕｐ（Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。配列決定グレードキモトリプシンを、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。３５ＳＯ４、２ｍＣｉ，安定化水溶液を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）から注文した。ＮＵＮＣ  ６ウェル培養プレートを、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。ＭＭＰ  ３、７、１２、１３、ＡＤＡＭＴＳ  ４、５は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のものであった。ＨＴＲＡ１は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からのものであった。カテプシンＫ、Ｂ、及びＬは提供された。
【０１２１】
リンクＮペプチド
リンクＮ、ＤＨＬＳＤＮＹＴＬＤＨＤＲＡＩＨ（配列番号１５）、反転リンクＮ、ＨＩＡＲＤＨＤＬＴＹＮＤＳＬＨＤ（Ｒ−リンクＮ）（配列番号１６）、スクランブルリンクＮ、ＤＬＮＲＡＨＬＨＩＤＹＨＴＤＳＤ（Ｓ−リンクＮ）（配列番号１７）、リンクＮの最初の８個のペプチド残基、ＤＨＬＳＤＮＹＴ（リンクＮ１−８）（配列番号２）、及び後半の８個のペプチド残基、ＬＤＨＤＲＡＩＨ（リンクＮ９−１６）（配列番号１８）を、ＣａｎＰｅｐｔｉｄｅ（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｃｌａｉｒｅ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）で合成した。スクランブルされた１６個のアミノ酸からなるペプチド配列は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｂｙｌｅ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ）からの生命情報科学ツールを用いて設計した。この配列は、元々のペプチドの等電点及び溶解性等の、リンクＮの全体的な特性を模倣するように選択された。ペプチドの保存溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をＤＭＥＭ中で調製し、ＨＥＰＥＳで補充し、ｐＨを使用前に７．４に調節した。
【０１２２】
組織のソース
ヒトの胸腰部の脊椎を、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｑｕｅｂｅｃ臓器提供プログラムを通じて回収した。椎間板を７人の提供者（男性１名、女性６名）から入手し、平均年齢は２９．６歳であり、年齢の範囲は１６〜４７歳であった（表１）。脊椎に最新の化学療法、放射線療法を受けた提供者、または長年に亘って著しい麻痺を有した提供者は、研究から除外された。脊椎の回収は、死亡から８時間以内に行われた。石灰化を伴う椎間板、及び高さを喪失した椎間板は、研究には含まれなかった。全ての手順は、Ｍｏｎｔｒｅａｌ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの施設内倫理委員会によって承認を受けた。
【０１２３】
１８〜２７月齢の去勢牛のウシの尾を、屠殺から６時間以内に地域の畜殺場から入手した。
ヒト及びウシＩＶＤ細胞の単離
ヒト及びウシのＩＶＤを、近接する椎体から分離し、ウシＩＶＤについてはＮＰ及びＡＦへ、ヒトＩＶＤについてはＮＰ及び内側線維輪（ｉＡＦ）へ分割した。ヒトの外側線維輪（ｏＡＦ）からの組織は、この研究においては細胞単離に使用しなかった。細胞は、前に記載したように、各部位から酵素的に単離した（６３）。簡潔に述べれば、ＮＰ及びＡＦ組織は、およそ２ｍｍの厚さの小片に解剖し、５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、１００μｇ／ｍＬのペニシリン、１００Ｕストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのファンギゾンを含有するＰＢＳ中で２回洗浄し、０．２％プロナーゼで１時間温浸し、その後血清を含まないＤＭＥＭ中で４時間、ＮＰについては０．０１％のコラゲナーゼＩＡ型で、ならびにＡＦ組織については０．０４％で温浸した。
【０１２４】
ヒトＩＶＤ細胞の単分子層培養
リンクＮの安定性を評価するため、単離されたばかりのＮＰ及びＡＦ部位からのヒト細胞を、ウェル当たり細胞２５０，０００個という密度で、６ウェル培養プレートに蒔いた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２において、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有し、１０％のＦＣＳ、２５ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、５０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのファンギゾン、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸塩、及び２ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸで補充された３ｍＬのＤＭＥＭ中で培養した。ウェルはリンクＮ（１μｇ／ｍＬ）への曝露前に２日間放置された。２００μＬの培地を、固定した時間点（０時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、及び４８時間）において収集した。ペプチドの安定性もまた、同じ時間点において、細胞の不在下で調査した。
【０１２５】
リンクＮのプロテイナーゼ処理
３００μｇのリンクＮ１−１６を、１０種の異なるプロテイナーゼの存在下で、３０分間、２時間、及び２４時間インキュベートした。ＭＭＰ３、７、１２、１３、ＡＤＡＭＴＳ４、５、ＨＴＲＡ１について使用された緩衝液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＲａｐｉｇｅｓｔで構成された。カテプシンＫ、Ｂ、及びＬについては、温浸緩衝液は、２．５ｍＭのＤＴＴ、０．１５％のコンドロイチン硫酸塩Ａ、０．１Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５で構成された。
【０１２６】
質量分析法
上述の単分子層培養物から収集された２５μＬの培地試料、またはペプチド消化物を、標準プロトコルにしたがってＣ１８スピンカラム上で精製した（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）。溶出したペプチドを、２０μＬの２％アセトニトリル及び０．２％ギ酸（ＦＡ）中で再構成した。試料を、ｅａｓｙ  ｎａｎｏ−ＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を備える三連四重極型質量分析計ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて注入及び定量した。質量分析計は、単位導出において、Ｑ１及びＱ３設定の両方を伴うＳＲＭモードで運転された（ＦＷＨＭ  ０．７Ｄａ）。＋１，７００Ｖの噴出電圧を、２７０℃の加熱イオン伝達設定で脱溶媒和のために使用した。データは、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア（バージョン２．１）を用いて獲得した。使用された移動相は、Ａ（水中の０．１％ＦＡ）及びＢ（０．１％中の１００％アセトニトリル）であった。分離を、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−Ｐｕｒ  Ｃ１８−ＡＱ樹脂（３μｍ，Ｄｒ．Ｍａｉｃｈ  ＧｍｂＨ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で充填された、１０μｍチップ、７５μｍ×１５ｃｍ毛細管カラム（ＰｉｃｏＴｉｐ（商標）エミッタ、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）上で行った。１μＬの試料を注入し、３００ｎＬ／分の流量で、９７％移動相Ａを５分間、８５％Ａを８分間、６５％Ａを４２分間、及び１９％Ａを４５〜５０分間という勾配を用いて分離を行った。
【０１２７】
リンクＮペプチドについての多重反応モニタリング法（ＭＲＭ）が、開発、最適化、及び推移によるピーク面積の和と付随して使用され、リンク１−１６推移：６４１．３０（３＋）→８６３．４１（ｙ７）、６４１．３０→７４８．３８（ｙ６）、６４１．３０→６１１．３３（ｙ５）及び６４１．３０→６８２．２８（ｂ６）、リンク１−８推移：９６４．４０（１＋）→８４５．４３（ｂ７）→６８２．８７（ｂ６）→５６８．２３（ｂ５）→４５３．２０（ｂ４）→７１２．３１（ｙ６）→８４９，３７（ｙ７）、リンク９−１６推移：４８８．７５（２＋）→８２１．４３（ｂ７）→７０８．３４（ｂ６）→４９６．３０（（ｙ４）→６１１．３２（ｙ５）→７４８．３８（ｙ６）であった。ＭＲＭデータは、Ｓｋｙｌｉｎｅ  １．４ソフトウェア（ＭａｃＣｏｓｓ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて分析した。
【０１２８】
ペプチドのあらゆる断片化を特定するために、前に記載したように、エレクトロスプレーイオントラップ質量分析とオンラインである逆相液体クロマトグラフィー（ＬＣ  ＥＳＩ  ＭＳ）上に８μＬの試料を注入することによって、発見実験もまた実行された（６４）。
【０１２９】
３ＤスキャフォールドにおけるＩＶＤ細胞の培養
様々なリンクＮペプチドに対する代謝応答を比較するために、ＮＰ及びＡＦ部位から単離されたばかりのヒト及びウシ細胞を、前に記載したように、１．２％アルギン酸塩ビーズに埋め込んだ（６５）。アルギン酸塩ビーズ中の細胞を、３７℃、５％ＣＯ２において、４．５ｇ／Ｌのグルコースを含有し、１０％のＦＣＳ、２５ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ、５０μｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン、０．２５μｇ／ｍＬのファンギゾン、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸塩、及び２ｍｍｏｌ／ＬのＧｌｕｔａＭＡＸで補充されたＤＭＥＭ中で培養した。ビーズを７日間安定化させ、細胞生存率を、更なる処理の前にＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）アッセイで評価した。次いで、０．５ｍＬのＤＭＥＭ中、リンクＮ（１μｇ／ｍＬ）、Ｒ−リンクＮ（１μｇ／ｍＬ）、Ｓ−リンクＮ（１μｇ／ｍＬ）、リンクＮ１−８（０．５μｇ／ｍＬ）、またはリンクＮ９−１６（０．５μｇ／ｍＬ）それぞれの等モル濃度の存在下において、４８ウェルプレートでウェル当たり５個のビーズを培養した。２５μＣｉ／ｍＬの３５ＳＯ４を培地に添加して、プロテオグリカン剛性の評価を可能にした（６６）。加えて、ビーズを４８時間、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）単独に、またはペプチドとＩＬ−１βとの組み合わせに曝した（５１）。培養期間の終わりに、培地を収集し、ミリＱ水に対して１８．２Ωで徹底的に透析し（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）３）、その後１ＭのＭｇＳＯ４によるコールドチェイスを２時間行い、あらゆる残存する組み込まれていない３５ＳＯ４を除去した。３５ＳＯ４の組み込みは、βシンチレーションカウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ６５００，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）を用いて測定した。
【０１３０】
統計的分析
片側対応ｔ検定を実行し、値ｐ≦０．０５を有意とみなした。
結果
１６アミノ酸リンクＮペプチドは、単離椎間板細胞及びインタクトヒト椎間板においてプロテオグリカン合成を誘導し、またウサギ椎間板穿刺変性モデルにおいて椎間板の高さを増加させることが知られている（３４、３１、２９）。しかしながら、この効果が厳密に配列に対して依存性なのか、あるいはペプチドの全体的な特性に起因するものであるのかについては明らかでない。ペプチドの３つの変異型、天然（リンクＮ）、反転（Ｒ−リンクＮ）、及びスクランブル（Ｓ−リンクＮ）が、この問題に対処するために合成され、３５ＳＯ４の組み込みを、ペプチドに応答するプロテオグリカン合成を評価するために使用した。ウシ及びヒトのＮＰ及びＡＦ細胞を、１μｇ／ｍＬのペプチドに４８時間曝した。ウシ細胞は、リンクＮに応答して、プロテオグリカン合成において統計学的に有意な増加を示した（ＮＰ  ｐ＝０．０３、ＡＦ  ｐ＝０．０３）が、細胞が反転またはスクランブルペプチドに曝露されたときには何の効果も確認されなかった（図１ａ）。ヒト細胞も、天然リンクＮへの応答が有意に増加し（ＮＰ  ｐ＝０．００８、ＡＦ  ｐ＝０．０２）、スクランブルまたは反転ペプチドに対しては応答しないという類似の傾向を示し、配列特異的な応答であるということを示した（図１ｂ）。ウシ及びヒト両方のＡＦ細胞が、ＮＰ細胞と比較してより強く応答するという傾向を示した。
【０１３１】
持続的な治療の効果を確実にするためには、ペプチドの安定性または活性の維持が重要である。それ故に、溶液中におけるリンクＮの安定性を評価するために、質量分光分析を行った。１９２２Ｄａの分子質量をもつ天然リンクＮを培養培地において３７℃で４８時間インキュベートし、ペプチドの強度を標的質量分析法を用いて定量化した。この時間の中で、１９２２ＤａのリンクＮペプチドの喪失は見出されず（図２）、ペプチドが３７℃の溶液中で安定であることが示された。
【０１３２】
代謝的に活性な細胞は、短鎖ペプチドをプロセシングする潜在性を有し、それによってそれらの短鎖ペプチドの生物学的効果を変更する可能性がある（６７〜６９）。椎間板細胞がリンクＮをタンパク質分解性でプロセシングすることができるかどうかを判定するため、単分子層中のヒト椎間板細胞を天然リンクＮに４８時間に亘って曝し、１９２２Ｄａのペプチドのピーク面積強を、その成り行きを評価するために定量化した。ペプチドは、ＮＰ細胞の存在下で、少なくとも４８時間の間安定であることが確認された（図３ａ）。しかしながら、ＡＦ細胞の存在下ではリンクＮの減少が６時間までに検出され、４８時間後には痕跡量しか存在せず（図３ｂ）、ＡＦ細胞はリンクＮペプチドをプロセシングする能力を有することが実証された。
【０１３３】
プロセシングされたリンクＮの産物を特定するために、０〜１９３０Ｄａの範囲の質量スペクトルにおける、より短鎖のペプチドの存在を分析した。リンクＮを含有するＮＰ細胞からの培地とＡＦ細胞からの培地とを比較したとき、ＡＦ細胞培養培地においては、９６４．４Ｄａの質量を有するペプチドが蓄積されたことが明白である（図４ａ）。同じペプチドは、ＮＰ細胞培養培地においては非常に低いレベルでしか存在しなかった（図４ａ）。９６４．４Ｄａのペプチドは、２つの異なる保持時間でカラムから溶出した。この現象は時折観察されるが、高い濃度の結果として生じる、カラム上でのペプチド沈殿によるものである可能性が最も高い。アミノ酸１−８、または４−１１を表す、天然の１６アミノ酸リンクＮの２つの別々の部分が、この質量のペプチドを生成し得る可能性がある（図４ｂ）。タンデム質量分析の分析によって、ＡＦ細胞の存在下で残基１−８にまたがるペプチドが生成されることが確認されたが、ペプチド９−１６の痕跡は見出されなかった（図４ｃ）。
【０１３４】
生物学的治療のために設計されるペプチドの活性の維持は非常に重要であり、リンクＮのＡＦ細胞によるプロセシングは、その生物学的効果を変更し得る可能性がある。これを評価するために、アミノ酸配列１−８及び９−１６に対応する２つのペプチド（リンクＮ１−８及びリンクＮ９−１６）を合成し、プロテオグリカン合成におけるそれらの効果を天然ヒトリンクＮによる効果と比較した。プロテオグリカン合成は、３５ＳＯ４の組み込みを用いて評価し、ウシ及びヒトＮＰ及びＡＦ細胞を、等モル濃度のペプチドに４８時間曝した。ウシ細胞がリンクＮ１−８単独に曝露されたとき、３５ＳＯ４の組み込みにおいて、天然ペプチドと同一の規模の統計学的に有意な増加が観察された（ＮＰ  ｐ＝０．００６、ならびにＡＦ  ｐ＝０．００７）が、リンクＮ９−１６では効果は確認されなかった（図５ａ）。ヒト細胞も、リンク１−８への応答が有意に増加する（ＮＰ  ｐ＝０．００４、ならびにＡＦ  ｐ＝０．０１）が、リンクＮ９−１６に対しては応答しないという類似の傾向を示し、生物学的効果が、ペプチドの最初の８個のアミノ酸で維持される配列に特異的であるということを示した（図５ｂ）。ウシ及びヒト両方のＡＦ細胞が、ＮＰ細胞と比較してより強い応答を示した。
【０１３５】
リンク１−１６の切断を担うプロテイナーゼを決定するために、１０種の異なるプロテイナーゼとの温浸を、３０分間、２時間、及び２４時間実行した。試験したプロテイナーゼはＭＭＰ３、７、１２、１３、ＡＤＡＭＴＳ４、５、ＨＴＲＡ１、ならびにカテプシンＫ、Ｂ、及びＬであった。１９２２Ｄａのリンク１−１６ペプチドのピーク面積強度を、質量分析法を用いて定量化した。カテプシンＫとのインキュベーションでは、ピーク強度は３０分後にして既に著しく減少し、２時間後及び２４時間後にはほぼ検出不可能であったが、一方でＭＭＰ３、７、１２、１３、ＡＤＡＭＴＳ４、５、ＨＴＲＡ１、ならびにカテプシンＢ、及びＬにはピーク強度は影響されなかった（２時間後の時間点が図６Ａに示される）。１９２２Ｄａのペプチド強度が消える際にｍ／ｚ  ９６４．４Ｄａ（＋１）リンク１−８が現れるかどうかを評価するために、ＭＲＭ法を設定した。この方法により、カテプシンＫによって、リンク１−８が２時間後に生成されることが確認された（図６Ｂ）。カテプシンＫがアミノ酸８と９との間の切断を生成するか否か、あるいはリンク１−１６が残基８−１６領域内のいくつかの部位でプロセシングされるか否かを評価するために、ｍ／ｚ  ４８８．７５Ｄａ（２＋）リンク９−１６ペプチドについてもＭＲＭ法を設定した。この分析により、２時間後のリンク９−１６の存在が示され、リンクＮが、アミノ酸８と９との間の単一の切断によってプロセシングされることが確認された（図６Ｃ）。
【０１３６】
椎間板変性はインビボの炎症性サイトカインの存在に密接に関連し（５１）、天然リンクＮは、炎症性環境においても同等に働くことが知られている（３４）。ＩＬ−１βの存在下でペプチドに対する応答を評価して、炎症性環境においてペプチドの有益な効果が維持されるかどうかを判定した。プロテオグリカン合成は、３５ＳＯ４の組み込みを用いて評価した。ウシＮＰ及びＡＦ細胞において、リンクＮ１−８は、ＩＬ−１βの存在下で天然リンクＮと同程度にプロテオグリカン産生を有意に誘導した（ＮＰ  ｐ＝０．００６、ならびにＡＦ  ｐ＝０．０１３）（図７Ａ）。ヒト細胞においても、リンクＮ１−８に対する応答の有意な増加（ＮＰ  ｐ＝０．００２、ならびにＡＦ  ｐ＝０．００４）、ならびにリンクＮ９−１６に対しては応答しないという同様の傾向が見出され、ペプチドの最初の８個のアミノ酸において生物学的効果が維持されることが確認され、この効果が炎症性環境において持続することが指し示された。
【０１３７】
考察
リンクＮは、コンドロサイト（７０）、インビボのＩＶＤ細胞、及びエキソビボのインタクトヒトＩＶＤ（１９、２０）におけるコラーゲン及びプロテオグリカン合成を刺激することができ、ならびに椎間板変性のウサギモデルにおいて椎間板の高さを増加させることができる（３１）ということが従来から報告されている。しかしながら、天然リンクＮが生物学的システムにおいてどの程度安定であるかについては知られていない。本研究は、ＡＦ細胞が、リンクＮペプチドをタンパク質分解性でプロセシングする能力を有し、結果としてアミノ酸残基１−８にまたがる断片を生じることを実証する。データはまた、生物学的に活性な配列はこの断片内に保存され、ペプチドが、炎症性環境においてもＮＰ細胞及びＡＦ細胞の両方においてプロテオグリカン合成を増加させ得ることを指し示す。ＡＦ細胞が、ＮＰ細胞よりも、プロテオグリカンの大きな増加を、基線を超えて示した。しかしながら、産生された絶対濃度は、使用された方法では評定できない。ＮＰ細胞がより高い産生のベースラインを有し、結果としてリンクＮの曝露を伴う場合も伴わない場合も、プロテオグリカンのより高い全濃度を生じるということが可能である。反転またはスクランブルリンクＮペプチド、ならびにリンクＮの残基９−１６は、生物学的効果を有さなかった。
【０１３８】
Ｗａｎｇらは、アミノ酸残基１−１２にまたがるペプチドを含む、いくつかのより短いリンクＮ由来のペプチドを評価した際、リンクＮの刺激効果は失われた（３３）と以前から報告している。対照的に、リンクＮの残基１−８にまたがるペプチドは活性であるということが、ここでは確認された。本結果と一致して、反転またはスクランブルペプチドは効果を有さないことが確認された。残基１−１２ペプチドがそれらの系において不活性である理由については明確でないが、使用された異なる条件に関する可能性がある。Ｗａｎｇらは、サイズからは独立する、１００ｎｇ／ｍＬの異なるペプチドを使用した。
【０１３９】
１６アミノ酸天然リンクＮの１μｇ／ｍＬの最適な濃度が存在すると決定されたため、この濃度を使用し、８残基の０．５μｇ／ｍＬの等モル濃度を維持するために、短鎖ペプチドを使用した。Ｗａｎｇらは、細胞可溶化液中の細胞結合性硫酸化ＧＡＧを測定したが、培養培地に放出されたＧＡＧ中の放射性硫酸塩の組み込みを、本明細書においては測定した。使用された細胞のソースもまた異なっており、Ｗａｎｇらは脊椎融合のための手術の間に抽出された変性した椎間板組織から細胞を単離し、この細胞を３Ｄ培養物へ移送する前に単分子層培養物中で拡張したが、この手順は、細胞の表現型を変化させ、それによって細胞の応答を変更した可能性もある。
【０１４０】
Ａｂｂｏｔｔら（７１）によって、変性ヒト椎間板からの単分子層拡張細胞は天然リンクＮに対する応答性が低く、アグリカンのメッセージレベルはわずかしか発現上昇せず、ＭＭＰ３メッセージレベルは強く誘導されることが実証されている（７１、１８）。Ｗａｎｇらの研究において使用されたリンクＮの用量は、これもまた決定された最適な用量よりも低く、この場合１０分の１であった（７１）。本明細書において試験される細胞は、中程度の変性を伴う臓器提供者から単離され、表現型を保存するために、細胞は単分子層に拡張されなかった。この差異と、評価される細胞が、重度に変性した、外科的に除去された椎間板からのものではないという事実が、異なった結果の説明となり得る］。重度の変性を伴う椎間板は、検出可能な治療上の応答をもたらすのに十分な細胞を有していない場合がある。また、外科的に除去された変性した椎間板の異なる部位を分離するのは、肉眼形態が失われ、ＮＰ細胞とＡＦ細胞との差異を見分けることが難しくなるため、困難である。加えて、細胞の収率が重度に変性した椎間板では低く、細胞の数を増やすために細胞を拡張することが必要であり、これが細胞の表現型に影響を及ぼし得る（７２）。
【０１４１】
椎間板変性の早期の事象及び顕著な特徴は、アグリカンの喪失であり、変性の早期段階で使用される任意の治療剤は、アグリカンの合成を増加させねばならない。したがって、現在のアグリカン合成は、リンクＮ断片の効果の有益性を評価するための読み出し情報として注目された。しかしながら、インビボの椎間板変性は、椎間板マトリックスにおける増加した異化作用と強く関連付けられる。このプロセスは、疾患プロセスの早期においてこれもまた発現される、様々なサイトカイン及びプロテアーゼの発現上昇を伴う（１７、５３）。椎間板における変性プロセスを逆行または遅延させる能力をもつ生物活性剤にとって、この異化作用の環境においてその同化作用の効果を発揮することは必須である。このデータは、リンク１−８がこれらの特性を有することを指し示している。
【０１４２】
リンクＮはＡＦ細胞によってプロセシングされるものの、活性配列はインタクトのまま残ることも確認された。リンクＮの、残基８と９との間でのカテプシンＫによる切断から、結果として２つのペプチド、リンク１−８及びリンク９−１６が生じる一方で、ＭＭＰ３、７、１２、１３、ＡＤＡＭＴＳ４、５、ＨＴＲＡ１、ならびにカテプシンＢ、及びＬは、リンクＮをプロセシングしなかった。椎間板変性におけるカテプシンＫの役割が示唆された（５５、７３）。リンク１−８が、変性している椎間円板の細胞外マトリックスにおいて生成されるか否かは知られていない。
【０１４３】
リンクＮはＢＭＰ受容体ＩＩ型を通じて作動することと、受容体の活性化が、Ｓｍａｄ１／５シグナル伝達及びＢＭＰ−４及びＢＭＰ−７メッセージレベルの発現上昇につながることが示されている（３２）。ＢＭＰ受容体ＩＩ型は、リンクＮのパートナーとして説明される唯一の受容体である。それ故に、リンク１−８がリンクＮと同じ受容体と相互作用し、リンクＮ及びリンク１−８の両方のペプチドが、同様の程度までプロテオグリカン合成を誘導する可能性が高い。そうである場合、リンクＮはまた、メタロプロテイナーゼの発現を下方制御する能力等の、リンクＮの他の代謝特性も有することが予期される。
【０１４４】
リンクＮ１−８は、変性性椎間板疾患の治療にとって有望な生物活性物質である。この治療から利益を得ることができる患者としては、例えば早期の椎間板変性を有する者、例えば大きなコラーゲン変性が起こる前の、ＡＦがインタクトなままである場合が挙げられる。トンプソングレード３を超える変性は、細胞の数の少なさ、及び椎間板中に残る重度に破壊されたＥＣＭに起因して、外科的な治療を必要とする場合がある。しかしながら、リンクＮ１−８は、これらのより高いグレードの変性を有する個体においても有用であり得、ここでリンクＮ１−８は、融合後の隣接する椎レベルの椎間板疾患を遅延させるために使用することができる（７４〜７６）。療法において元々の１６個のアミノ酸からなるリンクＮではなく、より短いこの８個のアミノ酸からなるペプチドを用いることの利点の一つは、産生コストであり得る。また、小さなサイズもインビボ送達により適し得る。
【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
実施例２
以前に実証されたように、リンクＮはＭＭＰの切断によってリンクタンパク質から放出される。リンクＮは、関節円板及び椎間円板の両方において産生され、アグリカン／コラーゲン合成を、椎間板（ＮＰ及びＡＦ）ならびに関節軟骨（コンドロサイト）細胞によって促進する。
【０１４７】
器官培養中のヒト椎間板におけるリンクＮ刺激は、培地が単独で注入された椎間板と比較して、１．１５〜７倍を超えて増加することが報告されている。プロテオグリカン合成は、リンクＮ刺激後９日目に検出可能である。
【０１４８】
椎間板変性のウサギモデルにおいて、Ｌ２／３環状穿刺の２週間後に、１０マイクロリットルの生理食塩水中、リンクＮ１００マイクログラムの濃度でリンクＮを注入し、リンクＮ感染の１４週間後にＩＶＤの椎間板の高さが有意に増加した。アグリカンｍＲＮＡが、ＡＦ細胞及びＮＰ細胞において有意に増加した（特にＡＦ細胞において）。なお、ＭＭＰ−３及びＡＤＡＭＴＳ−４プロテイナーゼ発現は有意に減少した。ヒト円板においてリンクＮは保持され、終板を通じて緩徐に失われるのみであり、ＡＦからは失われないということが実証された。スクランブルリンクＮまたは反転リンクＮがヒトＮＰ細胞またはヒトｉＡＦ細胞において効果を有さなかったため、リンクＮの特異性は配列依存性である。例えば参考文献２９及び３４を参照されたい。
【０１４９】
ＮＰ及びＡＦの存在下における培養物中でのリンクＮの安定性を、図３に示されるように、ならびに上述されるように試験した。リンクＮはＡＦ細胞によってプロセシングされるものの、ＮＰ細胞によってはプロセシングされない。
【０１５０】
図４ｂ及び４ｃは、質量分析法によって特定される、可能性のあるリンクＮ断片を示す。様々な異なるプロテイナーゼを伴うインキュベーション後の、リンクＮペプチド１−１６の多重反応モニタリングにより、シグナルは、カテプシンＫインキュベーションの存在下でのみ喪失することが確認された（図６Ａ）。これは、図６Ｂ及び６Ｃに示されるピークの出現に対応する。リンクＮ１−８は、ヒトＮＰ細胞及びヒトｉＡＦ細胞と接触するとき、プロテオグリカン合成の誘導について活性であるが、リンクＮ９−１６は活性ではない（図７Ａ）。リンクＮ１−８は完全な長さのリンクＮと類似の、またはそれよりも良好な活性を示す（図７Ｂ）。リンクＮ及びリンクＮ１−８は、炎症性環境においてプロテオグリカン合成を促進することができるが、リンクＮ９−１６はできない。
【０１５１】
これらの結果から、アグリカン産生はＮＦ細胞及びＡＦ細胞の両方で増加され、リンクＮは椎間板中に保持され、終板を通じて緩徐に失われるのみであり、ＡＦからは失われないということが示される。リンクＮはＡＦ細胞によってプロセシングされ、ＮＰ細胞によってはプロセシングされない。リンクＮはカテプシンＫによって切断され、１−８断片を生成し、ＡＦ細胞によって産生されるリンクＮ断片は活性である。リンクＮ及びこの断片は、炎症性環境において働く。
【０１５２】
実施例３
方法論：
骨関節炎（ＯＡ）の軟骨を、全膝関節置換術を受けた４人の提供者からインフォームドコンセントの下に入手し、ＯＡ軟骨の骨外植片及びＯＡコンドロサイトを、各提供者から調製した。正常ヒトコンドロサイト（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びウシ関節軟骨（１２ヶ月）を、対照として使用した。
【０１５３】
外植片調製及び処理
およそ１ｃｍ２の軟骨外植片は、同じ提供者らから調製し、これは皮質骨を伴う軟骨を含んだ。外植片を、１０％熱失活ＦＢＳを補充したＤＭＥＭで培養した。標準の培養条件下で７日後、外植片を２１日間、ＩＬ−１β（５ｎｇ／ｍｌ）、リンクＮ（１μｇ／ｍｌ）に曝し、ならびにＩＬ１βとリンクＮとに共曝露し、培養培地を３日毎に取り替えた。
【０１５４】
組織プロセシング及び分析
直径３ｍｍの軟骨プラグを各外植片の異なる領域から単離した。Ｃｏｌ  ＩＩ、Ａｇｇ、Ｃｏｌ  Ｘ、及びＭＭＰ−１３の発現を、ウェスタンブロット法で評価した。簡潔に述べれば、軟骨プラグを、プロテイナーゼ阻害剤を含有する、ｐＨ７．４で１５体積量（ｖ／ｗ）の４Ｍの塩化グアニジウム、１００ｍＭの酢酸ナトリウムを用いて、４８時間４℃で抽出した。ウェスタンブロット解析に使用する１００μｌのアリコートを、９体積量のエタノールと共に沈殿させ、５０ｍＵのケラタナーゼＩ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）と共に３７℃で１時間インキュベートし、その後２０ｍＵのコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ）と共に３７℃で夜通しインキュベートした。軟骨マトリックスの構成成分を、還元条件下において、４〜２０％勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上でＳＤＳ／ＰＡＧＥを用いて分解し、免疫ブロッティングのために０．２ｕｍのＰＶＤＦ膜に転写した。アグリカンは、アミノ末端Ｇ１を認識するウサギポリクローナル抗体（抗Ｇ１）を用いて検出した。Ｃｏｌ  ＩＩ及びＭＭＰ１３は、抗Ｃｏｌ  ＩＩ及び抗ＭＭＰ１３ウサギポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて認識し、一方で、Ｘ型コラーゲンは、抗Ｃｏｌ  Ｘマウスモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）で認識した。
【０１５５】
組織中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ、主としてアグリカン）の総含有量を、１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）色素結合アッセイを用いて定量化した。
ＯＡコンドロサイト単離及び培養
ＯＡコンドロサイトを、０．１２５％プロナーゼ、それに続く０．２％コラゲナーゼでの連続的な温浸によって各膝の軟骨から回収した。単離後、細胞を、１０％熱失活ＦＢＳ及び１％ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭで拡張した。
【０１５６】
ＮＦκＢシグナル伝達
ＯＡ及び正常コンドロサイトを、６ウェルプレートに移し、培養密度９０％まで成長させた。細胞を夜通し血清除去し、３７℃で１０分間、ＩＬ−１β（５ｎｇ／ｍｌ）、リンクＮ（１μｇ／ｍｌ）、またはこれら２つの組み合わせを含有する培養培地でインキュベートした。細胞をＲＩＰＡ（放射性免疫沈降アッセイ）緩衝液、ならびにプロテアーゼカクテルＩＩ（Ｓｉｇｍａ）、及びホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）阻害剤中に溶解させた。可溶化液を、還元条件下において、４〜２０％勾配ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で電気泳動させ、０．２ｕｍのＰＶＤＦ膜に転写した。ブロットを、正規化のために抗ホスホＮＦκＢ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ならびにＮＦκＢ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及びＧＡＰＤＨ（Ｓｉｇｍａ）を用いて調べた。
【０１５７】
結果：
ＯＡ外植片及びコンドロサイトにおいて、リンクＮは、ＩＬ−１βの存在下でプロテオグリカン産生を有意に誘導した。ＯＡ軟骨において、プロテオグリカン合成における有意な増加が、リンクＮに応答してマトリックス中で観察された保持された。同様の結果がＣｏｌ  ＩＩについても観察された。リンクＮはまた、ＭＭＰ−１３の活性化と、Ｃｏｌ  Ｘの発現とを抑制した。興味深いことに、ＯＡ及び正常コンドロサイトにおいて、ＮＦ−κＢのＩＬ−１β誘導活性化は、リンクＮによって用量依存的に抑制された。
【０１５８】
図８は、ＧＡＧがリンクＮで処理されたＯＡ外植片において保持されることを実証する。ＧＡＧ保持率は、対照（ＣＴＬ）外植片の保持％として計算された。
図８は、ＯＡ外植片及びコンドロサイトにおいて、リンクＮが、ＩＬ−１βの存在下でプロテオグリカン産生を有意に誘導したことを実証する。
【０１５９】
図９は、ＯＡ軟骨において、アグリカン合成における有意な増加が、リンクＮに応答してマトリックス中で観察及び保持されたことを実証する。同様の結果がＣｏｌ  ＩＩについても観察される。
【０１６０】
図１０は、リンクＮがＩＬ−１β誘導のＭＭＰ−１３活性化（Ａ）及びＣｏｌ  Ｘの発現（Ｂ）を抑制することを実証し、図１１は、正常ヒトコンドロサイト（Ａ）及びＯＡコンドロサイト（Ｂ）において、ＮＦ−κＢのＩＬ−１β誘導活性化が、リンクＮによって用量依存的に抑制されることを実証する。
【０１６１】
したがって、リンクＮは、骨関節炎の軟骨におけるプロテオグリカンの保持を刺激し、炎症性環境におけるプロテオグリカン及びコラーゲンを刺激することができる。リンクＮは、骨関節炎の軟骨におけるＭＭＰ−１３の活性形態を抑制することができ、リンクＮは、ＩＬ−１β誘導プロテアーゼ発現を抑制し、これは例えばＮＦκＢの下方制御によるものであるという理論によって束縛されることはない。
【０１６２】
ＯＡは、インビボの炎症性サイトカインの存在に密接に関連付けられる。椎間円板中の炎症性環境において、リンクＮが、プロテオグリカン合成を誘導し得ることは実証されている。しかしながら、炎症性環境の骨関節炎軟骨において、リンクＮが、プロテオグリカンの含有量を復元し得るか否かについては知られていない。これを試験するために、骨関節炎軟骨由来のヒト外植片を、リンクＮと共に、ＩＬ−１βの存在下で、リンクＮ及びＩＬ−１βの組み合わせと共に、または培地単独で、２１日間培養した。抽出可能なプロテオグリカンの濃度を、ＤＭＭＢアッセイで定量化した。リンクＮは、対照に対して正規化したとき、約５０％まで外植片のＧＡＧ含有量を増加させた。ＩＬ−１βは、対照と比較したとき、プロテオグリカン濃度を減少させた。しかしながら、リンクＮは、対照に対して正規化したとき、ＩＬ−１βの存在下で約３０％まで外植片のＧＡＧ含有量を増加させた。これは、軟骨変性中に、リンクＮがプロテオグリカンを復元する潜在性を有していることと、この効果が炎症性環境においても持続されるということとを指し示す。
【０１６３】
次に、Ｇ１ドメインに対する抗体を用いる、組織中のアグリカンの合成及び保持へのリンクＮの効果を分析した。補充無しに２１日間外植片を培養した後、外植片は貧弱なアグリカンのＧ１含有断片を示す。リンクＮの補充によって、アグリカンＧ１含有断片の含有量は、有意に増加する（Ｐ＜０．０００１）。外植片がＩＬ−１単独で処理されたとき、アグリカンＧ１含有断片の染色強度は対照の強度と比較して類似するが、低分子量断片のほとんどが観察されなかった一方で、リンクＮ及びＩＬ−１の補充は、リンクＮ単独で処理された外植片に匹敵するレベルまで、量を有意に増加させた。
【０１６４】
次に、Ｇ１ドメインバンドは、マトリックスの進行中の代謝作用の結果として、インビボの軟骨中のアグリカナーゼ及びＭＭＰ活性によって産生されるため、炎症性環境におけるリンクＮのＭＭＰ−１３発現への効果について試験した。ＭＭＰ−１３発現を、リンクＮ単独の不在下もしくは存在下、ＩＬ−１単独の不在下もしくは存在下、またはリンクＮを一緒に伴うＩＬ−１の不在下もしくは存在下における外植片の培養後のウェスタンブロッティングによって分析した。補充無しに２１日間外植片を培養した後、外植片は貧弱な活性ＭＭＰ−１３を示す。リンクＮは、対照と比較したとき、活性ＭＭＰ−１３を有意に誘導した。ＩＬ−１補充によって、活性ＭＭＰ−１３は、リンクＮによって刺激された場合よりも増加した。対照的に、ＩＬ−１βの存在下へのリンクＮの添加は、ＩＬ−１β単独のときと比較すると、ＭＭＰ−１３の活性形態の量の減少につながった。したがって、炎症性環境において、リンクＮは、ＭＭＰ−１３の活性形態を抑制する。
【０１６５】
軟骨修復はまた、安定したマトリックスを生成するためのコラーゲン産生を必要とする。それ故に、直近に産生された抽出可能なＩＩ型コラーゲンのレベルを評価した。骨関節炎対照外植片から抽出されたＩＩ型コラーゲンの量は、リンクＮを補充された外植片における量よりも少なかったが、有意な差ではなかった。外植片をＩＬ−１単独で処理すると、ＩＩ型コラーゲンの量は、対照外植片と比較して有意に減少した。対照的に、ＩＬ−１βの存在下へのリンクＮの添加は、ＩＬ−１β単独のときと比較すると、ＩＩ型コラーゲンの量の増加につながった。したがって、炎症性環境において、リンクＮはアグリカン産生を刺激するだけでなく、ＩＩ型コラーゲンの産生も刺激した。
【０１６６】
いくつかの研究により、炎症性サイトカイン及びマトリックス変性酵素をコードする多くの遺伝子が、転写因子である核内因子κＢ（ＮＦ−κＢ）によって制御されることが示されている。リンクＮを用いたＮＦ−κＢ活性化カスケードの抑制は、炎症性媒介物の発現を下方制御し得る。
【０１６７】
次に、正常コンドロサイトにおける、ＩＬ−１によるＮＦ−κＢ活性化へのリンクＮの効果を分析した。からの正常コンドロサイトを、リンクＮの様々な濃度の存在下または不在下において、ＩＬ−１βで刺激した。リン酸化ＮＦ−κＢ  ＲｅｌＡ（ｐ６５）の刺激を、Ｐ−Ｐ６５（ＮＦ−κＢ）に対して特異的な抗体を用いて、ウェスタンブロッティングによって判定した。ＩＬ−１βの不在下でコンドロサイト細胞を培養した後、コンドロサイトはＰ−Ｐ６５（ＮＦ−κＢ）タンパク質を示さない。リンクＮの補充によっても、Ｐ−Ｐ６５（ＮＦ−κＢ）タンパク質への影響は観察されなかった。予期されたとおり、Ｐ−Ｐ６５（ＮＦ−κＢ）は、ＩＬ−１βによる刺激後に顕著である。リンクＮは、ＩＬ−１β刺激性のＰ−Ｐ６５（ＮＦ−κＢ）を、用量依存的な様式で著しく阻害した。１００ｎｇのリンクＮは１０００ｎｇのリンクＮと非常に類似した。ＯＡ患者からのコンドロサイトが使用されたときにも同様の結果が観察された。このデータは、リンクＮがＩＬ−１β媒介ＮＦ−κＢ活性化を抑制することと、ＮＦ−κＢシグナル伝達を阻害することによって、ＩＬ−１β刺激性ＭＭＰ−１３及び炎症性サイトカインを抑制し得ることを実証する。
【０１６８】
考察
関節軟骨アーキテクチャは、同化因子及び異化因子を通じてインタクトかつ機能的に保たれ、この同化因子及び異化因子は、コンドロサイトに働きかけ、今度はこのコンドロサイトが合成と変性とのバランスをとることによって組織の恒常性を維持する。コラーゲン及びアグリカンの変性及び喪失、軟骨下骨の組織修復、ならびに滑膜の炎症は、平衡が異化に対して移動するため、骨関節炎を特徴付ける。リンクＮは、コンドロサイトにおいてコラーゲン及びプロテオグリカン合成を刺激することができるということが従来から報告されている。しかしながら、炎症性環境の骨関節炎軟骨において、リンクＮが、プロテオグリカン及びコラーゲンの含有量を復元し得るか否かについては知られていない。本明細書の結果によって、早期ＯＡにおいて、リンクＮはプロテオグリカン及びコラーゲンの含有量を復元する潜在性を有することが実証される。このデータはまた、リンクＮがタンパク質分解を抑制し、炎症性環境においてもＮＦ−κＢシグナル伝達を阻害することによって、プロテオグリカン及びコラーゲン合成を増加させ得ることを指し示す。
【０１６９】
生物活性因子であるリンクＮは、椎間板の修復を刺激する潜在性を有するように実証されている。リンクＮは、単離ＩＶＤ細胞をインビトロで用いることで、コラーゲン及びプロテオグリカンのメッセージレベルを誘導することが特定されており、かつ放射性３５ＳＯ４の新たに合成されたプロテオグリカンへの組み込みを増加させることが報告されている（６、１６、１８）。実際、エキソビボでのインタクトヒトＩＶＤへのリンクＮの注入は、新たに合成されたプロテオグリカンへの放射性３５ＳＯ４の組み込みの増加をもたらし、椎間板変性の穿刺モデルにおいてウサギ椎間板に注入されたとき、椎間板の高さの部分的な復元につながった。この結果は、リンクＮが、ＯＡ患者からのコンドロサイトにおいてプロテオグリカン及びコラーゲン発現を刺激することができ、軟骨の機能的特性の復元という機能的役割と一貫していることを指し示す。
【０１７０】
リンクＮは、コンドロサイトにおいて、Ｐ−Ｐ６５（ＮＦ−κＢ）の活性化を抑制した。ＮＦ−κＢシグナル伝達経路は、インビボの関節炎の進展及び進行において能動的な役割を果たす（１９、２０）。実際、我々の研究は、ＩＬ−１ｂによる刺激に続く、関節コンドロサイトにおけるＮＦ−κＢの活性化を示しており、これは関節軟骨の異化において重要な役割を果たす。ＮＦ−κＢ発現は、コラゲナーゼ−３（メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）−１３）及びストロメライシン１（ＭＭＰ−３）のレベルと相関関係にあった。また、核ＮＦ−κＢの局在性への移動が、ＩＩ型コラーゲンで免疫化されたＤＢＡ／１マウスにおける関節炎の早期段階での軟骨の破壊中に、コンドロサイト中で示された。本結果によって、ＩＬ−１ｂによる刺激が、関節コンドロサイトにおけるＮＦ−κＢ活性化の刺激を引き起こすことが示される。
【０１７１】
機能的マトリックスを有するためには、新規に規定されるマトリックスが組織修復されねばならない。これは、様々なプロテアーゼの発現上昇を伴う。この研究において、リンクＮは、対照と比較したとき、活性ＭＭＰ−１３を有意に誘導した。したがって、軟骨内でその新規の機能のために、新規に合成されたＥＣＭを組織修復するには、これらのプロテアーゼの発現上昇が必要とされる。リンクＮを補充されたヒト椎間板細胞は、インビトロで、ならびに椎間板変性のウサギインビボモデルにおいて、プロテアーゼの発現を上昇させる。したがって、リンクＮは、椎間板ＥＣＭを組織修復して軟骨の機能を復元することを伴って、軟骨の修復を刺激するのに有効であることが窺える。
【０１７２】
関節炎においてＭＭＰによって関節軟骨変性を低減するための、ＮＦ−κＢの阻害剤の潜在的な使用について記載してきた。非ステロイド性の抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、及び異なる薬剤を用いた好ましい結果は、ＮＦ−κＢ活性化の減少を実証する。しかしながら、ＮＳＡＩＤの使用は、胃腸における副作用及びアンチセンスの特異性の喪失を結果として生じる可能性が有り、転写因子デコイの方策は、単一の器官においてのみ遺伝子発現を阻害することを標的とするとき、大きな課題を呈する。更に、タンパク質送達、免疫原性、及び治療のコストの問題が、療法のための全体的なタンパク質についての現実的な見通しを制限している。
【０１７３】
実施例４
プロテオグリカンは枯渇しているが実質的なコラーゲンの破損は伴わない、早期椎間板変性の器官培養モデルを、リンクＮを経済的な成長因子類似体として、ならびに間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を細胞補充として用いる、分子及び細胞療法の効果を研究するために使用する。
【０１７４】
材料及び方法
間葉系幹細胞培養
骨髄から収集されたヒトＭＳＣを、Ｌｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。供給業者によれば、この細胞はＣＤ１０５、ＣＤ１６６、ＣＤ２９、及びＣＤ４４に対して陽性であり、ＣＤ１４、ＣＤ３４、及びＣＤ４５に対して陰性である。加えて、この細胞は、骨形成、軟骨形成、及び脂肪生成の分化系列へと分化し得ることが確認された。全ての細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンで補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で拡張し、４継代内で使用した（１９、２０）。全ての培養試薬は、Ｗｉｓｅｎｔ  Ｉｎｃ．（Ｓｔ−Ｂｒｕｎｏ，Ｃａｎａｄａ）から入手した。
【０１７５】
間葉系幹細胞標識及び追跡
ＭＳＣを、供給業者の説明書に従い、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，Ｃａｎａｄａ）で標識した。簡潔に述べれば、２×１０６ＭＳＣを、ＦＢＳを伴わずにＤＭＥＭで洗浄し、４００ｇ、５分間の遠心分離によって緩いペレットとして収集した。このペレットを、希釈剤Ｃ中に再懸濁させ、色素溶液と速やかに混合させた。次いで、細胞／色素懸濁液を５分間インキュベートし、その後等容積のＦＢＳを添加することによって、反応を停止させた。細胞の生存率を、トリパンブルーで染色することによって測定した。アリコートを、単分子層（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｓａｉｎｔ−Ｌeｏｎａｒｄ，Ｃａｎａｄａ）中で二日間培養して、標識の効率性を追跡した。細胞の残余を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（Ｗｉｓｅｎｔ）または１ｍｇ／ｍＬのリンクＮ（ＣａｎＰｅｐｔｉｄｅ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）で補充されたＰＢＳのいずれかに再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を、トリプシンで前処理して変性を誘導したウシ椎間板に注入した（２１）。
【０１７６】
椎間板単離及び培養
前に記載したように、最も大きい最初の３〜４個の尾部の椎間板を、２４〜３０月齢の去勢牛の尾から単離した（２１、２２）。簡潔に述べれば、それらの尾は、皮膚、筋肉、及び靭帯を外すように解剖され、各区分の椎弓根を取り除いた。骨、及び軟骨性終板の隣接する石灰化部分を取り除き、それにより椎間板の表面は、検出可能な石灰化組織を伴わずに軟質であり、可撓性であった。椎間板を、１，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬのファンギゾン（ＧＩＢＣＯ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を補充されたＰＢＳ中ですすいだ後、それらの椎間板を、５０ｍＬの培養培地（５％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍＬのＬ−アスコルビン酸塩を補充された、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ及び２５ｍＭのＨｅｐｅｓを伴うＤＭＥＭ）を格納する無菌８０ｍＬ検体容器中で３日間予備調整した。２８Ｇ１／２針を用いた、椎間板の中心への、７５μＬのＰＢＳ中に溶解させた１００μｇのトリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の単回の注入によって、変性を誘導した（２１）。この針は、中心に到達するために必要な距離を測るために椎間板の上面に置かれ、次いで同じ深さまで挿入された。中心に到達すると、トリプシン溶液を緩徐に注入し、次いで逆流を防ぐために針を徐々に引き抜いた。次いで、椎間板を更に４日間培養し、その後７５μＬの最終容積のＰＢＳ中のＭＳＣ（１０５個の細胞）、リンクＮ（７５μｇ）、またはＭＳＣ（１０５個の細胞）とリンクＮ（７５μｇ）の組み合わせを注入した。リンクＮの濃度は、ウシ椎間板の平均容積が７．５ｍＬであると想定し、単離ウシ椎間板細胞にとっての最適な用量（１μｇ／ｍＬ）に基づいた。使用されたＭＳＣの数は、健康なヒト椎間板の細胞密度を測定した、Ｌｉｅｂｓｃｈｅｒらによる研究（２３）に基づいた。ウシ椎間板は既に高い細胞密度を有するため、栄養の欠乏に起因する細胞生存への潜在的な有害な影響を回避するために、健康な大人のヒト椎間板中において確認される細胞の数の約半分をこの研究において使用した。７個の椎間板は、全ての実験的条件について注入した。トリプシン処理した椎間板のうちの７個は、変性対照として働かせるために、ならびにＮＰのプロテオグリカン含有量を分解するのにトリプシンが活性であるかを確かめるために、ＰＢＳのみを注入した。７個の椎間板は、非変性対照として働かせるために、いかなる注入も伴わずに培養した。次いで、椎間板を１４日間培養し、培地を３日毎に取り替えた。
【０１７７】
顕微鏡検査及び組織学的検査による椎間板の分析
培養の終結時に、２枚のミクロトーム刃からなる社内設計の切削工具を用いて、椎間板の中心を通して２つの薄片を採取した（２１）。これにより、幅約３ｃｍ（椎間板の直径）及び高さ１ｃｍ（椎間板の高さ）で厚さ７５０μｍの２枚の切片を得る。１枚の切片は、組織学的分析のために、ホルマリンを含まない固定剤（Ａｃｃｕｓｔａｉｎ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で固定した。固定した試料は、パラフィンワックス中に埋め込み、５μｍの厚さの薄片を切り出し、ヘマトキシリン及びサフラニンＯ−ファストグリーンで染色した（２４）。他方の切片は、椎間板組織中でのＭＳＣの分布を調査するために、そのまま使用した。椎間板に定植する標識された幹細胞を、倒立型共焦点レーザ走査顕微鏡（ＣＬＳＭ、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０）を用いて可視化した。２０枚の連続する６μｍの薄片を画像化し、ＣＬＳＭスタックを単独の画像へと分割した。
【０１７８】
細胞外ＥＣＭタンパク質及びプロテオグリカンの抽出
残存する髄核（ＮＰ）組織を収集し、湿重量を記録した（２１）。組織を小片へと切り分け、タンパク質及びプロテオグリカン抽出のために、１４体積量の抽出緩衝液［４Ｍの塩化グアニジウム、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．８、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ＣＯＭＰＬＥＴＥ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｌａｖａｌ，Ｃａｎａｄａ）中に懸濁させた。４℃で４８時間の連続攪拌によって組織を抽出し、抽出物を４℃で３０分間、１２，０００ｇの遠心分離によって透明にした。上清を収集し、更なる分析のために−８０℃で保管した。
【０１７９】
ＧＡＧ分析
組織抽出物中の硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を、改変ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）色素結合アッセイによって定量化した（２５、２６）。試料を、検量線の比例領域の中間に入るように希釈した。潜在的な干渉を補正するために、組織抽出物と等容積の抽出緩衝液を検量線に添加した。
【０１８０】
アガロースゲル電気泳動法によるプロテオグリカン分析
プロテオグリカン組成物を、アガロースゲル電気泳動法によって分析した（２７）。椎間板抽出物の１０μＬのアリコート中のプロテオグリカンを、無水エタノールで沈澱させ、蒸留水に溶解させた。試料を、試料緩衝液（０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．７６８Ｍのグリシン、０．０１％のブロモフェノールブルー、１．２％のグリセロール、０．０５％のＳＤＳ、ｐＨ８．３）と混合し、１０分間沸騰させた。１．２％アガロースゲルの電気泳動によって、プロテオグリカンを分離した。ゲルを、０．５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ１００を伴う、３％酢酸中の０．０２％（ｗ／ｖ）トルイジンブルーで染色し、３％酢酸、次いで蒸留水で脱染した。
【０１８１】
ウェスタンブロットによるアグリカン及びＩＩ型コラーゲン分析
椎間板抽出物の１０μＬのアリコート中のタンパク質及びプロテオグリカンを、９体積量の無水エタノールの添加によって沈澱させ、９５％エタノールで２回洗浄し、最終的に凍結乾燥させた。ＩＩ型コラーゲンの分析のための試料を、蒸留水に溶解させた。アグリカンの分析のための試料を、緩衝液（０．０３Ｍの酢酸ナトリウムを伴う０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、ＣＯＭＰＬＥＴＥ（登録商標））に溶解させ、ケラタナーゼＩ及びコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ａｍｓｂｉｏ，Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，ＣＡ，ＵＳ）で温浸させた。同じ処理群からの試料をプールし、ＳＤＳ試料緩衝液と混合し、１０分間沸騰させた。次いでタンパク質を、還元条件下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％  Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ゲル）で分離した。分離したタンパク質を、ニトロセルロース膜に転写し、これらのタンパク質は、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（ブロッキング緩衝液）でブロックされた。次いで、タンパク質を、４℃のブロッキング緩衝液中、希釈度１：２，０００の一次抗体と共に夜通しインキュベートし、その後、ブロッキング緩衝液中で、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合する二次抗体と共に（希釈度１：５，０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）インキュベートした。ＩＩ型コラーゲンを認識する一次抗体はＡｂｃａｍ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）より入手し、アグリカンＧ１ドメインを認識する一次抗体は、前に記載したように調製した（２８）。結合された抗体を、化学発光法（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂａｉｅ  ｄ’Ｕｒｆｅ  Ｃａｎａｄａ）で可視化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＶｅｒｓａＤｏｃ画像分析システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｃａｎａｄａ）を用いて分析した。
【０１８２】
統計的分析
統計的分析を、分散の分析と、それに続く、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたフィッシャー保護最小有意差事後検定を用いて行った。結果は、異なるウシの尾からの椎間板を用いた、７つの独立した実験の平均±標準偏差（ＳＤ）として提示される。差分は、ｐ＜０．０５の場合に統計学的に有意であるとみなした。
【０１８３】
結果
リンクＮは、プロテオグリカン合成を、単離椎間板細胞によって、ならびに変性ウサギ椎間板において誘導することと、インビトロのＭＳＣの軟骨形成を増進することが知られている（２０、２９〜３２）。しかしながら、リンクＮまたはＭＳＣが単独で、早期変性を伴うより大きな椎間板においてプロテオグリカン含有量を復元することができるか否かについては知られていない。また、リンクＮ及びＭＳＣの組み合わせが相加効果を有するか否かについても知られていない。これを試験するために、タンパク質分解性に誘導されたアグリカンの枯渇を伴うウシ椎間板を、リンクＮもしくはＭＳＣ単独で、またはリンクＮとＭＳＣとの組み合わせで処理した。椎間板を処理後２週間培養し、抽出可能なプロテオグリカンの濃度を、ＤＭＭＢアッセイで定量化した（図１２）。介入無しに、変性椎間板中のＧＡＧ含有量は、非変性対照のＧＡＧ含有量の約５０％まで下落した。対照的に、リンクＮ及びＭＳＣ単独、またはそれらの組み合わせは、変性対照椎間板中のＧＡＧ含有量と比較して、椎間板のＧＡＧ含有量を有意に増加させた（ｐ＜０．０５）。処理された椎間板中のプロテオグリカン濃度は、非変性椎間板のプロテオグリカン濃度と同様であった。しかしながら、処理された群内に置いて、統計的有意性は観察されなかった（ｐ＞０．０５）。これは、早期変性において、リンクＮまたはＭＳＣはどちらも単独で、プロテオグリカンをその元々のレベルまで復元する潜在性を有しており、併用療法による追加的な利益は得られないことを指し示している。
【０１８４】
等しいプロテオグリカン含有量を有することは、構造が正常な椎間板の構造と同じであることを必ずしも意味しない。これに対処するために、抽出したプロテオグリカンを、アガロースゲル電気泳動法によって分析した。処理された椎間板における染色のサイズ分布及び強度は、非変性対照椎間板のものと同等であるが、一方で、染色の強度は、変性対照椎間板においてより低かった（図１３）。このデータは、処理された椎間板中で産生された、新規に合成されたプロテオグリカンが、非変性椎間板のプロテオグリカンと同じサイズ範囲であることを実証する。
【０１８５】
加えて、インタクトアグリカンコアタンパク質の存在または存在量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。２５０ｋＤａよりも大きい質量を伴うインタクトアグリカンコアタンパク質は、非変性対照椎間板と比較して、変性対照椎間板において有意に少なく（ｐ＜０．０５）、一方でリンクＮ及び／またはＭＳＣの注入は、非変性対照椎間板に匹敵するレベルまで、そのタンパク質の量を有意に増加させた（図１４）。
【０１８６】
椎間板修復はまた、安定したマトリックスを生成するためのコラーゲン産生を必要とする。それ故に、直近に産生された抽出可能なＩＩ型コラーゲンのレベルを評価した（図１５）。変性対照椎間板から抽出されたＩＩ型コラーゲンの量は、非変性対照椎間板における量よりも有意に少なかった。椎間板にＭＳＣ及び／またはリンクＮを注入したとき、ＩＩ型コラーゲンの量は、非変性対照椎間板において検出される量と同様のレベルまで増加した。したがって、リンクＮ及びＭＳＣはアグリカン産生を刺激するだけでなく、ＩＩ型コラーゲンの産生も刺激した。
【０１８７】
修復組織内でのプロテオグリカンの分布を評価するために、組織学的分析を使用した。組織薄片のサフラニンＯ及びファストグリーン染色によって、サフラニンＯ（赤）染色がほぼ見出されず、変性対照椎間板におけるプロテオグリカンの均一な喪失が確認された（図１６）。この結果によって更に、変性対照椎間板におけるプロテオグリカン含有量が、ＮＰ部位にわたって枯渇したことが確認された。ＭＳＣまたはリンクＮ単独またはそれらで共に処理された椎間板においては、サフラニンＯ染色の強度及び分布は、非変性対照椎間板のものと同様の、ＮＰ部位にわたって一様な分布を示した。したがって、新規に合成されたプロテオグリカンは、ＥＣＭにわたって拡散することができ、細胞から離れた領域においても組織含有量を復元することができた。
【０１８８】
ＭＳＣ誘導修復プロセスが持続するためには、注入された幹細胞は生存可能なままである必要が有り、修復組織にわたって分布した。これに対処するために、ＭＳＣをＰＫＨ６７で標識し（図１７Ａ、Ｂ）、標識の効率性及び色素の持続可能性を評価するために、単分子層で２日間培養した。ＭＳＣの生存率は、トリプシン処理された椎間板に注入される前に細胞を標識し、ＰＢＳまたはリンクＮ／ＰＢＳ溶液中で懸濁させたとき、９０％よりも高かった。注入されたＭＳＣが生き残り、椎間板のＥＣＭ中に統合されたか否かを評価するために、細胞を共焦点顕微鏡で追跡した。標識されたＭＳＣは、２週間の器官培養期間の後に、ＮＰ部位にわたって分布されていることが見出され（図１７Ｃ、Ｄ）、持続可能な修復プロセスの実行可能性を指し示した。
【０１８９】
考察
本研究において、ＩＶＤプロテオグリカン含有量を復元するための分子及び細胞療法の潜在性を研究するために、早期椎間板変性の器官培養モデルを使用した。リンクＮを分子薬剤として使用し、ＭＳＣを細胞補充として使用した。変性椎間板を、いずれかの療法で別個に、または組み合わせて処理し、その結果によって、リンクＮまたはＭＳＣが単独で、組織プロテオグリカンを復元する能力を有していることと、２つの組み合わせによる追加的な効果は観察されなかったことが明らかになった。
【０１９０】
従前の研究によって、リンクＮが椎間板修復を刺激するという潜在性が実証されている（２０、２９、３１〜３５）。リンクＮは本明細書に示されるようにＡＦ細胞によって切断されるものの、結果として生じるＮ末端の８個のアミノ酸からなるペプチドは、タンパク質分解性に安定であるようであり、生物学的活性を保持する。単離ＩＶＤ細胞をインビトロで活用する研究によって、リンクＮは、コラーゲン及びプロテオグリカンのメッセージレベルを誘導し、新たに合成されたプロテオグリカンへの放射性３５ＳＯ４の組み込みの増加に帰着し得ることが示されている（３４、３５）。加えて、エキソビボでのインタクトヒトＩＶＤへのリンクＮの注入（３４）は、新たに合成されたプロテオグリカンへの放射性３５ＳＯ４の組み込みの増加をもたらし、リンクＮは、椎間板変性の穿刺モデルにおいてウサギ椎間板に注入されたとき、椎間板の高さの部分的な復元につながった。本研究において使用されたモデルは若年成人における早期段階の変性を模倣しており、ここでは組織はリンクＮの刺激に応答可能な細胞を十分な数有している。一方では対照的に、減少する細胞の数、細胞老化、及び潜在的には炎症性環境が、ヒト椎間板変性を特徴付けることが多い。我々のグループの以前の研究によって、リンクＮは炎症性環境において等しく効能があることが示されている（３４）。この段階では、椎間板ＥＣＭを合成可能である追加的な細胞を供給することもまた必要であり得る。
【０１９１】
自家ＩＶＤ細胞を収集することができ、ＩＶＤ修復のための細胞のソースとして使用することができる良性の部位は存在せず、ＭＳＣが有力な選択肢として残る。ＩＶＤ修復のためのＭＳＣの潜在的な使用については、小動物において記載されている（３６〜３８）。ウサギにおける好ましい結果は、椎間板の高さの増加、ならびにＥＣＭの沈着及び水和作用を実証する。しかしながら、ウサギについての他の研究は、特にＭＳＣがスキャフォールドを伴わずに、またはＡＦの密閉を伴わずに投与されたとき、骨棘の形成を報告している（３９）。リンクＮは、軟骨形成を促進し、かつヒトＭＳＣの骨形成をインビトロで低減すると知られているため、併用療法にとって理想的な候補であり得る（２０）。動物試験に加えて、小規模のヒト臨床治験では、改善された疼痛スコア及び障害スコアが報告されている（４０）。臨床治験においては椎間板の高さの増加は確認されなかったが、ＭＲＩによって測定された水和作用の増加は検出することができた。本結果は、ＭＳＣ補充が、早期変性において実行可能な選択肢であり得ることを指し示す。しかしながら、終板の石灰化が変性と関連付けられるため（４１）、変性椎間板に結果として生じる損なわれた栄養経路が、追加的な細胞の代謝活性を指示するか否かについては、確認する必要が残る（４２、４３）。
【０１９２】
現行のモデルは裂け目の生成に帰着せず、分子の枯渇しかもたらさないが、一方で天然の椎間板変性は、多くの場合裂け目の創成を伴う。そのような病変を修復するために、リンクＮ及び幹細胞を、病変を満たし、治療剤の均一な分布を可能にする重合可能なスキャフォールドに注入することが必要とされ得る。
【０１９３】
【表３】
0006700182.tif 000004
【０１９４】
実施例５
ウシ椎間板器官培養物を用いて、追加的な試験を実行した。図１８は、リンクＮ１−８が、リンクＮ１−８処理の２週間後に、変性ウシ椎間板で、プロテオグリカン合成、アグリカン及びＩＩ型コラーゲン発現における統計学的に有意な増加を誘導することを実証する。
【０１９５】
リンクＮ及びアミノ酸１−８を含む断片が、変性椎間板においてアグリカンのレベルを復元できることが実証される。
実施例６
ヒトリンクＮ［ＤＨＬＳＤＮＹＴＬＤＨＤＲＡＩＨ］（配列番号１５）は、インビトロ及びインビボの両方において、椎間円板（ＩＶＤ）細胞によって細胞外マトリックスの生合成を刺激することができる。現在まで、ウシリンクＮ［ＤＨＨＳＤＮＹＴＶＤＨＤＲＶＩＨ］（配列番号５）の椎間板細胞への効果について、報告はなかった。本研究の目的は、ウシ線維輪（ＡＦ）及び髄核（ＮＰ）細胞への、ウシリンクＮ（ＢＬＮ）の効果と、ヒトリンクＮ（ＨＬＮ）の効果とを比較することである。
【０１９６】
方法：健康な２２〜２４月齢の去勢牛の尾骨椎間板のＮＰ及びＡＦ部位から単離した細胞を、プロテオグリカン合成及び遺伝子発現のために１．２％アルギン酸塩ビーズに直ぐ埋め込むか、またはタンパク質抽出のために単分子層において培養した。ビーズを、１μｇ／ｍｌのＨＬＮまたはＢＬＮのいずれかで補充された培地において、１８日間インキュベートした。硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）放出を分析した。培養の７日後及び１４日後に、定量的ＰＣＲを、アグリカン（ＡＧＧ）、ＡＤＡＭＴＳ−４、及びＡＤＡＭＴＳ−５について行った。Ｓｍａｄ活性化を、Ｐ−Ｓｍａｄ１／５及びＰ−Ｓｍａｄ２を対象とする特定の抗体を用いて、免疫ブロッティングで分析した。
【０１９７】
結果：ＮＰ及びＡＦ細胞において、ＢＬＮ及びＨＬＮを伴うインキュベーションは、培養培地中へのＧＡＧ放出の増加を結果としてもたらした。ＧＡＧ放出は、対照培地と比較して、ＢＬＮまたはＨＬＮのいずれかと共にインキュベートされたＡＦ細胞において有意に高かった。しかしながら、ＮＰ細胞は、ＨＬＮと共にインキュベートされたとき、ＧＡＧ放出の有意かつ一貫した増加を有した。ＡＦ細胞において、リンクＮ補充の両方が、Ｓｍａｄ１／５の速やかな活性化（１０分未満）を誘導し、これは６時間を経て対照レベルより下に減少した。ＮＰ細胞においては、Ｓｍａｄ１／５は遅延されたようであり、３０分後から始まり時間と共に増加した。
【０１９８】
ＢＬＮは、Ｓｍａｄ１／５の活性化を通じて、ウシＩＶＤ細胞におけるＧＡＧ放出を刺激することができる。ＡＦ細胞中におけるＢＬＮによるＳｍａｄ１／５の速やかな活性化は、ＡＦ細胞の方がＮＰ細胞よりも、ＧＡＧ合成を促進する際のＢＬＮ補充に対して良好に応答するという我々の所見を説明し得、椎間板修復を刺激するように設計されるあらゆる薬剤にとって必要とされる特色を、両方のペプチドが有する。
【０１９９】
更なる詳細が、実施例７において見出される。
実施例７
椎間円板（ＩＶＤ）は、プロテオグリカンに富む中心の髄核（ＮＰ）を包囲する、周辺のコラーゲンに富む線維輪（ＡＦ）からなる、複合構造物である［７７］。ＩＶＤは、ヒアルロン酸塩と相互作用して大きなプロテオグリカン凝集体を産生するプロテオグリカンアグリカンを高含有量有するため、圧縮に抗う。これらの相互作用は、リンクタンパク質の更なる相互作用によって安定化される（図１９）［７８、７９］。ＡＦ及びＮＰに備わる椎間板細胞は、代謝プロセスを通じてＩＶＤの恒常性を制御し、同化因子と異化因子との間の均衡を維持し、マトリックス分子及び変性性酵素の発現を制御する。この定常状態の代謝の不均衡は、枯渇した合成及び増加する分解の両方に起因して、ＩＶＤマトリックスの組成及び構造における生化学的な改変につながり、アグリカンはタンパク質分解性の損傷及び損失の影響を特に受けやすい。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の進行性の分解は、椎間板変性と密接に関連付けられる［８０］。
【０２００】
ＩＶＤ変性は、人々の半数以上に大きな影響を及ぼし得る腰痛の病因において、主要な役割を果たす［５３、８１〜８２］。したがって、腰痛療法にとって、変性プロセスを逆行させ、変性したＩＶＤを修復（変性したＩＶＤの構造または機能を復元）することは、極めて重要である。最近、細胞または成長因子療法が、ＩＶＤ修復を誘導すると提唱されている［８３〜８６］。いくつかの研究において、細胞の代謝を刺激し、組織の恒常性を同化状態へと変化させ（マトリックス合成）、それによって変性プロセスを逆行させるために成長因子を使用することが提唱されている。
【０２０１】
椎間板修復は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）及び形質転換成長因子−β（ＴＧＦ  β）等の成長因子の補充によって増進し得る。これらの成長因子は、細胞外マトリックスの産生を最大化し、組織の再生を促進するように、直接的に適用することができる。成長因子に対する経済的な代案として、リンクＮを組織再生のために使用することが可能であり得る。ヒトリンクＮペプチド［ＤＨＬＳＤＮＹＴＬＤＨＤＲＡＩＨ］（配列番号１５）はリンクタンパク質、すなわちアグリカンＧ１ドメインとヒアルロン酸塩との間の非共有結合性相互作用を安定化する糖タンパク質のＮ末端ペプチドである（図１９）。リンクＮは、インビトロでヒト関節軟骨及びウシＩＶＤ細胞におけるコラーゲン及びプロテオグリカン合成を刺激することができ［８７〜８８、３５］、ならびにインビボの椎間板変性のウサギモデルにおいて椎間板の高さを増加させることができる［３１］。これまでの研究により、リンクＮはまた、コンドロサイト肥大のマーカーであるＸ型コラーゲンの発現を減少させ［８９］、軟骨及び椎間板ＥＣＭ形成のマーカーであるＩＩ型コラーゲンの発現を刺激し得ることが示されている［９０］。それ故に、リンクＮは、ＩＶＤ修復のために必要なＥＣＭ形成を促進するために、幹細胞と共に使用できる可能性を有する。
【０２０２】
現在まで、ウシリンクＮ
【０２０３】
【化１】
0006700182.tif 000005
【０２０４】
（配列番号５）の椎間板細胞への効果について、報告はなかった。本研究の目的は、ＢＬＮ配列で起こる残基の置換（太字で表される）が、リンクＮの機能を改変するか否かを判定するために、ウシＩＶＤ細胞への、ウシリンクＮ（ＢＬＮ）の効果と、ヒトリンクＮ（ＨＬＮ）の効果とを比較することである。
【０２０５】
材料及び方法
ウシ椎間板細胞の単離
２０〜２４月齢の健康な去勢牛の尾骨ＩＶＤを、屠殺から２〜３時間で地域の畜殺場から入手した。ＩＶＤをそれらに隣接する椎体から分離し、前に記載したように、細胞を、０．２％プロナーゼ、それに続く０．１２５％コラゲナーゼでの連続的な温浸によってＮＰ及びＡＦ部位から単離した［８８］。単離後、ＮＰ及びＡＦ細胞を、アルギン酸塩ビーズに直ぐ埋め込むか、またはタンパク質抽出のために６ウェルプレートに蒔いた。
【０２０６】
アルギン酸塩への埋め込み
単離後、ＮＰ及びＡＦ細胞を、ｍｌ当たり２百万個の細胞という濃度で、１．２％アルギン酸塩（０．１５ＭのＮａＣｌに溶解）中に再懸濁した。アルギン酸塩は、大規模な細胞増殖の不在下におけるマトリックス産生の効果を評価するために選択した［９１〜９２］。細胞懸濁液の液滴を、１０２ｍＭの塩化カルシウム溶液中に１８ゲージの針を通じて放出し、１０分間重合させた。続いて、アルギン酸塩ビーズを培養培地（１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質で補充された、ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース））において７日間安定化させた。
【０２０７】
アルギン酸塩ビーズの培養及び処理
安定化の後、アルギン酸塩ビーズを、ウェル当たり９個のビーズという密度で２４ウェルプレート中に配置し、１μｇ／ｍｌのＨＬＮまたはＢＬＮのいずれか（ＣａｎＰｅｐｔｉｄｅ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ）で補充された培地において、１８日間インキュベートした。同じ期間、培地単独で培養したビーズを、対照（ＣＴＬ）として使用した。ＢＬＮ及びＨＬＮ補充の濃度は、１μｇ／ｍＬのリンクＮが椎間板細胞におけるプロテオグリカン合成を刺激する際に最大の応答を誘導する［９３］という所見に基づき、選択した。異なるリンクＮ補充の下で、任意の表現型変化が起こるのに十分な時間を確保するために、培養培地は１８日間、３日毎に取り替えた。
【０２０８】
椎間板細胞の培養及び処理
ＡＦ及びＮＰ細胞を、８０〜９０％コンフルエンスに到達するまで、６ウェルプレート中に（７．５×１０５個の細胞／ウェル）、培養培地（１０％ウシ胎仔血清及び抗生物質で補充された、ダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース））において拡張させた。細胞は、血清を含まない培地において夜通し予備インキュベートし、次いで最大６時間までの異なる時間点の間、１μｇ／ｍＬのＨＬＮまたはＢＬＮにおいてインキュベートした。培地単独でインキュベートした細胞が、対照（ＣＴＬ）としての使用であった。
【０２０９】
細胞生存率
アルギン酸塩ビーズ上の細胞生存率を、生死蛍光アッセイ（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１８日目に評価し、蛍光顕微鏡検査によって視覚化した。
【０２１０】
プロテオグリカン含有量
リンクＮを伴う、または伴わないアルギン酸塩ビーズの培養培地は３日毎に取り替え、培地中に放出された硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ、主としてアグリカン）を、１，９−ジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ）色素結合アッセイを用いて分析した［９４］。アルギン酸塩はＤＭＭＢと反応する多価陰イオンであり、それ故にアッセイに干渉するため、アルギン酸塩中のＧＡＧ保持率は測定しなかった。
総ＲＮＡ単離及び遺伝子発現
７日目及び１４日目に、アルギン酸塩ビーズをクエン酸塩緩衝液に再懸濁し、細胞を遺伝子発現のために回収した。総ＲＮＡを、製造業者の説明書に従い、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて椎間板細胞から抽出した。１マイクログラムの総ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡへと逆転写した。逆転写に続いて、リアルタイムＰＣＲを適用して、アグリカン（ＡＧＧ）、ＡＤＡＭＴＳ−４、及びＡＤＡＭＴＳ−５のメッセージレベルを定量的に分析した。１マイクロリットルのｃＤＮＡを、遺伝子特異的プライマーを用いて増幅した（表３）。最初に、標的遺伝子の発現を１８Ｓ  ｒＲＮＡ発現レベルに対して正規化し、次いでリンクＮと共にインキュベートされたビーズの発現を対照のビーズに対して正規化した。
【０２１１】
タンパク質発現
インキュベートしたＡＦ及びＮＰ細胞を次いで、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７、５０ｍＭのＮａＦ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１％トリトンＸ１００（全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより入手）、ならびにプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌａｖａｌ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）を含有する緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させた。タンパク質を１０％アクリルアミドゲル上で分離し、ウェスタンブロットのためにＰＶＤＦ膜に転写して、Ｐ−Ｓｍａｄ１／５、Ｐ−Ｓｍａｄ２、Ｓｍａｄ１、及びＳｍａｄ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を対象とする特定の抗体を用いてタンパク質発現を測定した。膜をＥＳＬ化学発光試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）中でインキュベートし、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＶｅｒｓａＤｏｃ（商標）ＭＰ  ４０００  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃａｎａｄａ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて走査した。バンド強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアプログラムを用いて、濃度測定で定量化した。Ｓｍａｄ１／５及びＳｍａｄ２のリン酸化反応を、対応するＳｍａｄ１及びＳｍａｄ２の総形態に対して正規化した。
【０２１２】
統計的分析
全ての実験を３連で行い、３つの独立した培養物で繰り返した。各時間点における処理及び培養期間の効果、ならびに実験群（対照、ＢＬＮ、及びＨＬＮ）間の差異の有意性を、反復測定分散分析とそれに続くチューキーの多重比較試験で評価した。０．０５未満のＰ値を、統計学的に有意であるとみなした。
【０２１３】
結果
アルギン酸塩ビーズ生存率
１μｇ／ｍｌのＨＬＮまたはＢＬＮの補充が、ＡＦ及びＮＰ細胞の生存率に対して有害であることを確かめるために、細胞播種アルギン酸塩スキャフォールドを、１８日間培養物中に維持した。ＨＬＮまたはＢＬＮのいずれかで補充されたスキャフォールドの場合、細胞生存率は９８％超に維持された（図２０）。
プロテオグリカン合成への、ウシ及びヒトリンクＮの効果
リンクＮと共に、あるいはリンクＮを伴わずにインキュベートされたＮＰ及びＡＦ細胞の両方において、培養培地中へのＧＡＧ放出の速度は、時間と共に増加した（図２１及び２２）。ＮＰ細胞は、ＡＦ細胞の総ＧＡＧ放出と同様の総ＧＡＧ放出を提示する傾向にあった。
【０２１４】
１μｇ／ｍｌのＨＬＮを補充されたＮＰ細胞によるＧＡＧ放出は、全ての時間点において対照よりも有意に高かった（３日目はｐ＜０．０５、ならびに６、９、１２、１５、１８日目はｐ＜０．０００１）。ＢＬＮを補充されたＮＰ細胞によるＧＡＧ放出と比べると、この差異は１２日目からのみ有意であった（ｐ＜０．０５）。対照的に、ＢＬＮを補充されたＮＰ細胞によるＧＡＧ放出と対照との間において、増加に向かう傾向は観察されたものの、統計学的有意性は観察されなかった（図２１）。
【０２１５】
１μｇ／ｍｌのＨＬＮを補充されたＡＦ細胞において、ＧＡＧ放出は６日目から対照よりも有意に高かったが（６日目はｐ＜０．００５、ならびに９、１２、１５、１８日目はｐ＜０．０００１）、一方で１μｇ／ｍｌのＢＬＮを補充されたＡＦ細胞においては、ＧＡＧ放出は９日目から対照よりも有意に高かった（ｐ＜０．００１）（図２２）。最後に、ＧＡＧ放出は、全ての時間点において、ＢＬＮを補充されたＡＦ細胞よりもＨＬＮを補充されたＡＦ細胞においてより高い傾向にあったが、この差異が有意であったのは１８日目のみであった。
【０２１６】
我々の以前の実験の結果［９５］と同様に、ＧＡＧ合成の大部分は、アルギン酸塩ビーズにおける最小の保持を伴って、培養培地中で放出されることが確認された。それ故に、ＧＡＧ放出は、プロテオグリカン合成の尺度であり、ＢＬＮもまたＧＡＧ放出を刺激できることが窺える。
【０２１７】
マトリックス合成への、ウシ及びヒトリンクＮの効果
プロテオグリカン及びプロテイナーゼ発現へのＢＬＮまたはＨＬＮの効果を調査するため、ウシ細胞播種アルギン酸塩スキャフォールドを、１μｇ／ｍＬのリンクＮに対して曝露し、相対遺伝子発現を、ＡＧＧ、ＡＤＡＭＴＳ−４、及びＡＤＡＭＴＳ−５について評価した。結果は、リンクＮに曝露されていない細胞（対照）と対比して表す。両方のリンクＮによる処理は、対照と比較した際、ＮＰ細胞中のＡＧＧ遺伝子発現の増加につながったが、ＨＬＮインキュベーションにおいて、この増加はより大きく、統計学的に有意であった（ｐ＝０．０１０７）（図２３）。ＡＦ細胞において、ＡＧＧ発現は、対照と比較すると、ＨＬＮインキュベーションに応答して発現上昇したが（ｐ＝０．０２５７）、対照と比較すると、ＢＬＮ間では有意な効果は観察されなかった（ｐ＞０．１）。
【０２１８】
７日目にはＮＰ細胞のＡＤＡＭＴＳ−４発現において重要な変化は観察されなかったが、この発現は、１４日目には、有意ではない減少傾向を指し示した（図２４Ｂ）。対照的に、ＡＦ細胞では、ＢＬＮ及びＨＬＮインキュベーションの両方において、ｍＲＮＡ  ＡＤＡＭＴＳ−４発現の増加が観察されたものの、この差異は対照と比較すると有意なものではなかった。
【０２１９】
７日目には、ＨＬＮインキュベーションに応答して、ＡＦ及びＮＰ細胞の両方について、ＡＤＡＭＴＳ−５発現が発現上昇された。しかしながら、この増加は、ＡＦ細胞についてのみ有意であった（ｐ＝０．０１４９）。ＢＬＮインキュベーションに応答して、ＡＤＡＭＴＳ−５発現は、対照と比較すると、ＡＦ細胞において下方制御され（ｐ＝０．０３２９）、ＮＰ細胞においては上方制御された（ｐ＝０．００５８）（図２４Ｃ及び２４Ｄ）。
ウシ椎間板細胞における、ヒト及びウシリンクＮ機能の制御因子としての、標準Ｓｍａｄ媒介シグナル伝達
ＢＬＮ及びＨＬＮの、ウシＮＰ及びＡＦ細胞における同化応答の誘導を引き起こす分子機序を説明するために、ＢＬＮ及びＨＬＮが、Ｓｍａｄ標準シグナル伝達経路の主要なトランスデューサとしてＳｍａｄ１／５を活性化するか否かについて調査した。
【０２２０】
ウェスタンブロットの結果によって、ＨＬＮはウシＡＦ細胞においてＳｍａｄ１／５を５分以内に活性化し、一方でＢＬＮによる活性化は１０分以内に起こり、３０分の時点で最大の活性化を達成することが明らかになった（図２５）。両方のリンクＮ補充について、ＡＦ細胞のＳｍａｄ１／５レベルは、６時間後に対照レベルより下まで減少した。ＮＰ細胞においては、ＢＬＮ及びＨＬＮ補充は、Ｓｍａｄ１／５を３０分後から有意に刺激し、時間と共に増加し続けた。しかしながら、両方のＩＶＤ細胞で、ＨＬＮがＢＬＮよりもＳｍａｄ１／５活性化においてより有効であることが窺えた。
【０２２１】
ＡＦ細胞においては、ＨＬＮまたはＢＬＮのいずれかにおけるインキュベーションは、最大３時間まで、Ｓｍａｄ２の活性化の僅かな増加を誘導するようであった。対照的に、リンクＮ中でインキュベートされたＮＰ細胞においては、Ｓｍａｄ２の活性化は検出されなかった（図２６）。
【０２２２】
考察
これまでの研究により、ウシＩＶＤにおいて、インビトロで、リンクＮは成長因子として振る舞い、プロテオグリカン及びコラーゲンの合成を刺激することができ［８８、３５］、インビボの椎間板変性のウサギモデルにおいて、椎間板の高さを増加させることができる［３１］ということが示されている。リンクＮはまた、３次元スキャフォールド中、ならびにインタクトヒト椎間板中のヒト椎間板細胞によるプロテオグリカン合成を刺激することもできる［９３］。本データは、ＨＬＮが、ＮＰ細胞では全ての時間点において、ならびにＡＦ細胞では６日目から、プロテオグリカン合成を有意に刺激したことを指し示す。ＢＬＮを補充されたＮＰ細胞は、プロテオグリカン合成における有意ではない増加に向かう傾向を示した。興味深いことに、ＢＬＮを補充されたＡＦ細胞のＧＡＧ放出は、９日目以降、対照よりも有意に高く、ＢＬＮは、ＮＰ細胞よりもＡＦ細胞でのプロテオグリカン合成を刺激するのにより有効であることが示唆される。加えて、ＨＬＮは、ウシＮＰ細胞においては１４日目以後、ＡＤＡＭＴＳ−４発現を下方制御することができるが、ＡＦ細胞のＡＤＡＭＴＳ−４発現には有意には影響を及ぼさない。ＢＬＮは、ＮＰ細胞においては１４日目以後、ＡＤＡＭＴＳ−４発現に対して有意な効果を有さないが、ＡＦ細胞では増加に向かう傾向が観察された。ＢＬＮは、ＡＦ細胞においてはＡＤＡＭＴＳ−５を下方制御することができ、一方でＮＰ細胞では１４日目以後ＡＤＡＭＴＳ−５を上方制御する。最終的に、ＢＬＮ及びＨＬＮは、Ｓｍａｄ１／５シグナル伝達経路を通じて、ＮＰ及びＡＦ細胞によるプロテオグリカン合成を刺激する。
【０２２３】
以前に、細胞増殖はアルギン酸塩中では大規模であることが予期されないが［９１〜９２］、ＧＡＧ産生における変化に対して寄与し得ることを我々は発見した。この研究において、我々はアグリカンのメッセージレベル及び累積的なプロテオグリカン放出について分析し、リンクＮと共にインキュベートされたＡＦ細胞及びＮＰ細胞の両方について、アグリカンのｍＲＮＡ発現が増加するのと同様に、ＧＡＧ放出が対照と比較して増加することを発見した。我々が発見したＮＰ細胞及びＡＦ細胞によるＧＡＧ合成の類似性、ならびにタンパク質分解性単離中のＡＦ細胞の存在及び生存の増加は、ＡＦ細胞がＮＰ細胞の機能的代用物として働けることを意味し得、これは組織工学にとって有益である。
【０２２４】
ＢＬＮがＮＰにおいてＡＤＡＭＴＳ−５を刺激する一方で、ＡＦにおいてはそれを下方制御するという事実は、修復が椎間板ＥＣＭの組織修復を伴い、組織修復がタンパク質分解を伴うという事実によって説明し得る。したがって、マトリックス合成がターンオーバーを超える限り、修復中にタンパク質分解の完全な不在が必要なわけではない。ＨＬＮ及びＢＬＮは、プロテオグリカン産生を刺激して、椎間板機能の復元に役立つことができる。ＨＬＮがウシＡＦ細胞においてＳｍａｄ１／５を５分以内に直ぐ活性化し、一方でＢＬＮによる活性化は３０分以内に徐々に起こるという事実は、ＨＬＮの活性化は直接的であり得るのに対し、ＢＬＮの活性化は間接的であり得ることを示唆する。この間接的な活性化はまた、ＮＰ細胞の場合でもあてはまり得、ここではＢＬＮ及びＨＬＮの補充は、Ｓｍａｄ１／５を３０分後に有意に刺激し、試験が持続する期間にわたって増加し続けた。したがって、ＡＦ及びＮＰ中のＢＬＮ、ならびにＮＰ中のＨＬＮは、他の分子を活性化し、この分子が今度はプロテオグリカン合成を刺激するという可能性がある。
【０２２５】
ＡＦ細胞中におけるＢＬＮによるＳｍａｄ１／５の１０分以内での速やかな活性化は、ＡＦ細胞の方がＮＰ細胞よりも、プロテオグリカン合成を促進する際のＢＬＮ補充に対して良好に応答するという我々の所見を説明し得る。これまでの研究により、ウシ椎間板由来のＡＦ細胞は、ＴＧＦ−βで刺激されるとき、ＮＰ細胞よりも多くのプロテオグリカンを産生することが示されている［９６］。しかしながら、ＮＰ細胞及びＡＦ細胞は同様の様式で応答することが可能であるため、これは常に当てはまるわけではない［９７］。Ｓｍａｄ１／５を直接的に刺激するというリンクＮの能力は、年齢の差異によって変動し得る。若い椎間板においては、ＮＰがプロテオグリカンの主なソースである。しかしながら、おそらくはＳｍａｄ１／５シグナル伝達の直接的な活性化を通じて、年齢及び変性と共に、ＡＦにおける増加したプロテオグリカンの含有量が観察される［９６、９８］。
両方のペプチドが、椎間板修復を刺激するように設計されるあらゆる薬剤にとって必要とされる特色を有するが、ＨＬＮの補充の方が、ＡＦがまだインタクトである椎間板変性の早期段階においては、それを治療するためのより良好な選択肢であり得る。この原理は、潜在的にはプロテオグリカンの蓄積と関連付けられる増加した膨潤に起因するＮＰの突出を予防するための、最適な修復のためのインタクトＡＦを仮定する。
【０２２６】
ＢＬＮは、Ｓｍａｄ１／５シグナル伝達の間接的な活性化によって、ＮＰ細胞及びＡＦ細胞の両方において、インビトロで、プロテオグリカン産生を刺激することができる。それ故に、原則的に、ＢＬＮの補充もまた、椎間板変性を治療するための選択肢であり得る。１ｕｇ／ｍｌの濃度のＨＬＮが、プロテオグリカン合成の刺激に対して有効であり、年齢及び変性を伴う場合のプロテオグリカン合成の主なソースであるＡＦ中において、Ｓｍａｄ１／５シグナル伝達を直接的に活性化することができる。
【０２２７】
略語の一覧表
１８Ｓ  ｒＲＮＡ：１８ＳリボソームＲＮＡ、ＡＤＡＭＴＳ：トロンボスポンジン様反復を伴うディスインテグリン及びメタロプロテアーゼ、ＡＧＧ：アグリカン、ＡＦ：線維輪、ＢＬＮ：ウシリンクＮ、ＢＭＰ：骨形成タンパク質、ＤＭＭＢ：１，９−ジメチルメチレンブルー、ＥＣＭ：細胞外マトリックス、ＧＡＧ：硫酸化グリコサミノグリカン、ＨＡ：ヒアルロン酸塩、ＨＬＮ：ヒトリンクＮ、ＩＶＤ：椎間円板、ＬＰ：リンクタンパク質、ＮＰ：髄核、ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応、ＲＴ：逆転写、ＴＧＦ  β：形質転換成長因子−β。
【０２２８】
【表４】
0006700182.tif 000006
【０２２９】
実施例８
図２７は、一連の組織染色、及びＩＶＤにおけるＮＧＦ発現が、ＮＰ細胞及びＡＦ細胞の両方において変性と共に増加することを示す免疫ブロットである。図２８は、リンクＮが、ＡＦ細胞において、ニューロトロフィン（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ）及びサブスタンスＰ（ＴＡＣ１）のＴＮＦα誘導遺伝子発現を抑制することを実証する。図２９は、リンクＮが、ＡＦ細胞において、ニューロトロフィン（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ）及びサブスタンスＰ（ＴＡＣ１）のＩＬ−１β誘導発現を抑制することを実証する。図３０及び３１は、ニューロトロフィン及びＳＰ受容体のレベルを低減することによって、リンクＮの効果が媒介されることを実証する。
【０２３０】
図３２は、リンクＮが、グレード４のヒトＡＦ細胞におけるＩＬ−１β誘導ＮＧＦ放出を阻害し、抑制できることを示す。図３３は、リンクＮ（１０μｇ／ｍｌ）の補充が、穿刺後２４時間の損傷を受けたウシ椎間板からのサブスタンスＰの放出を低減させたことを実証する。
ＮＧＦ発現ヒトＩＶＤが、変性と共に増加することが実証される。リンクＮは、機械的に損傷したＩＶＤからのサブスタンスＰの放出を減少させる。リンクＮは、ＡＦ細胞において、ＴＮＦα及びＩＬ−１β誘導ニューロトロフィン遺伝子発現、ならびにニューロトロフィン受容体を有意に抑制する。
【０２３１】
実施例９
より小さい断片を、活性について試験する。アミノ酸の断片、配列番号１の１−４、４−８、及び３−６を試験する。例えばアミノ酸１−７、１−６、１−５等からなるより小さくなっていく断片を、活性が失われるまで試験する。同様に、ＮＨ２端からアミノ酸を失っていくより小さな断片を試験し、例えばアミノ酸２−８、３−８、４−８、５−８等を試験する。他の実施形態において記載されたようなＰＣＲ分析及び３５Ｓを、読み出し情報として使用することができる。
【０２３２】
実施例１０
リンクＮ断片は、下の表の種のうちの１つに見出される、１つ以上のアミノ酸変化を含み得る。
【０２３３】
【表５】
0006700182.tif 000007
【０２３４】
本出願は、現在好ましいと考えられている実施例を参照して記載されてきたが、本出願は開示された実施例に制限されないということが理解されるべきである。反対に、本出願は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれる、種々の修正及び同等の手配を網羅することを意図する。
【０２３５】
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、特異的かつ個別にその全体で参照により組み込まれるのと同じ度合いで、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。具体的には、例えば、表またはその他の場所において提供される受入番号及び／またはバイオマーカー配列（例えばタンパク質及び／または核酸）を含む、本明細書に提供される各受入番号と関連付けられる配列は、その全体が参照により組み込まれる。
【０２３６】
本明細書において言及された参考文献の引用
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８．Ｏｅｇｅｍａ，Ｔ．Ｒ．，Ｊｒ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ａｇｕｉａｒ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｊ．Ｗ．（２０００）Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｓｐｉｎｅ  ２５，２７４２−２７４７．
９．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．，Ｃａｔｅｒｓｏｎ，Ｂ．，Ｍｅｎａｇｅ，Ｊ．，Ｅｖａｎｓ，Ｅ．Ｈ．，Ｊａｆｆｒａｙ，Ｄ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｍ．（２０００）Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ：  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ  Ｐａ  １９７６）２５，３００５−３０１３
１０．Ａｋｈａｔｉｂ，Ｂ．，Ｏｎｎｅｒｆｊｏｒｄ，Ｐ．，Ｇａｗｒｉ，Ｒ．，Ｏｕｅｌｌｅｔ，Ｊ．，Ｊａｒｚｅｍ，Ｐ．，Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．，Ｍｏｒｔ，Ｊ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｈａｇｌｕｎｄ，Ｌ．（２０１３）Ｃｈｏｎｄｒｏａｄｈｅｒｉｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ＨＴＲＡ１  Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｎｏｒｍａｌ  Ａｇｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８，１９２８０−１９２８７
１１．Ａｎｎｕｎｅｎ，Ｓ．，Ｐａａｓｓｉｌｔａ，Ｐ．，Ｌｏｈｉｎｉｖａ，Ｊ．，Ｐｅｒａｌａ，Ｍ．，Ｐｉｈｌａｊａｍａａ，Ｔ．，Ｋａｒｐｐｉｎｅｎ，Ｊ．，Ｔｅｒｖｏｎｅｎ，Ｏ．，Ｋｒｏｇｅｒ，Ｈ．，Ｌａｈｄｅ，Ｓ．，Ｖａｎｈａｒａｎｔａ，Ｈ．，Ｒｙｈａｎｅｎ，Ｌ．，Ｇｏｒｉｎｇ，Ｈ．Ｈ．，Ｏｔｔ，Ｊ．，Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．，ａｎｄ  Ａｌａ−Ｋｏｋｋｏ，Ｌ．（１９９９）Ａｎ  ａｌｌｅｌｅ  ｏｆ  ＣＯＬ９Ａ２  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，４０９−４１２．
１２．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｏｓａｄａ，Ｒ．，Ｋａｎａｍｏｒｉ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｈ．，Ｏｈｍｏｒｉ，Ｋ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｋｉｍｕｒａ，Ｔ．（１９９９）Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｎ  ａｇｇｒｅｃａｎ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｌｕｍｂａｒ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｐｉｎｅ  ２４，２４５６−２４６０．
１３．Ａｌａ−Ｋｏｋｋｏ，Ｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｌｕｍｂａｒ  ｄｉｓｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ  ３４，４２−４７
１４．Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．，Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｄ．，Ｒａｎｔａｋｏｋｋｏ，Ｊ．，Ａｌｉｎｉ，Ｍ．，Ｍｗａｌｅ，Ｆ．，ａｎｄ  Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．（２００６）Ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｃａｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｉｎ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ａｎｄ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ．Ｅｕｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｔｅｒ  １１，１−７；  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ７
１５．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｅａｒｃｅ，Ｒ．Ｈ．，Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｍ．Ｔ．，Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｅ．，Ｔｓａｎｇ，Ｉ．Ｋ．，ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ，Ｐ．Ｂ．（１９９０）Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｒｏｓｓ  ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｓｐｉｎｅ  １５，４１１−４１５．
１６．Ｍｗａｌｅ，Ｆ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．，ａｎｄ  Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．（２００４）Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｐｕｌｐｏｓｕｓ  ａｎｄ  ｈｙａｌｉｎｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ：  ａ  ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｅｕｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｔｅｒ  ８，５８−６４
１７．Ｗｕｅｒｔｚ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｈａｇｌｕｎｄ，Ｌ．（２０１３）Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｋ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｇｅｎｉｃ  Ｐａｉｎ．Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ  ３，１７５−１８４
１８．Ａｂｂａｓｚａｄｅ，Ｉ．，Ｌｉｕ，Ｒ．Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｓ．Ａ．，Ｒｏｓｓ，Ｏ．Ｈ．，Ｌｉｎｋ，Ｊ．Ｒ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｄ．Ｍ．，Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ，Ｍ．Ｄ．，Ｐｒａｔｔａ，Ｍ．Ａ．，Ｈｏｌｌｉｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｗｙｎｎ，Ｒ．，Ｄｕｋｅ，Ｊ．Ｌ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｈ．Ｊ．，Ｈｉｌｌｍａｎ，Ｍ．Ｃ．，Ｊｒ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．，Ｗｉｓｗａｌｌ，Ｂ．Ｈ．，Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｒ．Ａ．，Ｄｅｃｉｃｃｏ，Ｃ．Ｐ．，Ｂｒｕｃｋｎｅｒ，Ｒ．，Ｎａｇａｓｅ，Ｈ．，Ｉｔｏｈ，Ｙ．，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｍａｇｏｌｄａ，Ｒ．Ｌ．，Ｔｒｚａｓｋｏｓ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｕｒｎ，Ｔ．Ｃ．（１９９９）Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＤＡＭＴＳ１１，ａｎ  ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＡＤＡＭＴＳ  ｆａｍｉｌｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２３４４３−２３４５０
１９．Ａｌｍａａｗｉ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｔ．，Ｃｉｏｂａｎｕ，Ｏ．，Ｒｏｗａｓ，Ｓ．Ａ．，Ｒａｍｐｅｒｓａｄ，Ｓ．，Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｗａｌｅ，Ｆ．（２０１３）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｃｅｔａｍｉｎｏｐｈｅｎ  ａｎｄ  ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ  １９，１０３９−１０４６
２０．Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｔ．，Ａｌａｓｅｅｍ，Ａ．Ｍ．，Ｈａｇｌｕｎｄ，Ｌ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｗａｌｅ，Ｆ．（２０１２）Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌｉｎｋ  Ｎ  ｏｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  ｔｈｅｒａｐｙ  １４，Ｒ２６７
２１．Ｊｉｍ，Ｂ．，Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｔ．，Ｍｏｉｒ，Ｊ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｈａｇｌｕｎｄ，Ｌ．（２０１１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｏｒｇａｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｃａｎ  ｂｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｓ  ａ  ｐｒｅｌｕｄｅ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙｉｎｇ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｅｕｒ  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ  ２０，１２４４−１２５４
２２．Ｄｅｍｅｒｓ，Ｃ．Ｎ．，Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｗａｌｅ，Ｆ．（２００４）Ｖａｌｕｅ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｔａｉｌ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｍｂａｒ  ｓｐｉｎｅ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ  Ｐａ  １９７６）２９，２７９３−２７９９
２３．Ｌｉｅｂｓｃｈｅｒ，Ｔ．，Ｈａｅｆｅｌｉ，Ｍ．，Ｗｕｅｒｔｚ，Ｋ．，Ｎｅｒｌｉｃｈ，Ａ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｂｏｏｓ，Ｎ．（２０１１）Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｍｂａｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ  Ｐａ  １９７６）３６，１５３−１５９
２４．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．（１９７１）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓａｆｒａｎｉｎ  Ｏ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ  ５３，６９−８２
２５．Ｂａｒｂｏｓａ，Ｉ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｓ．，Ｂａｒｂｉｅｒ−Ｃｈａｓｓｅｆｉｅｒｅ，Ｖ．，Ｃａｒｕｅｌｌｅ，Ｊ．Ｐ．，Ｍａｒｔｅｌｌｙ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｐａｐｙ−Ｇａｒｃｉａ，Ｄ．（２００３）Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｄ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｉｃｒｏ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １３，６４７−６５３
２６．Ｍｏｒｔ，Ｊ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．（２００７）Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｅｘｐｌａｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １３５，２０１−２０９
２７．Ｂｊｏｒｎｓｓｏｎ，Ｓ．（１９９３）Ｓｉｚｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｉｎ  ｇｅｌｓ  ｏｆ  ｐｕｒｅ  ａｇａｒｏｓｅ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２１０，２９２−２９８
２８．Ｓｚｔｒｏｌｏｖｉｃｓ，Ｒ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｔ，Ｊ．Ｓ．（２００２）Ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｃａｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｄｉｆｆｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｇｅｎｔ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６２，４６５−４７２
２９．Ｍｗａｌｅ，Ｆ．，Ｄｅｍｅｒｓ，Ｃ．Ｎ．，Ｐｅｔｉｔ，Ａ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．，Ｐｏｏｌｅ，Ａ．Ｒ．，Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｔ．，Ａｅｂｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．（２００３）Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ＩＩ，ＩＸ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８８，１２０２−１２１３．３１．Ｍｗａｌｅ，Ｆ．，Ｍａｓｕｄａ，Ｋ．，Ｐｉｃｈｉｋａ，Ｒ．，Ｅｐｕｒｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｈｅｍｍａｄ，Ａ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．，ａｎｄ  Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．（２０１１）Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｌｉｎｋ  Ｎ  ａｓ  ａ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １３，Ｒ１２０
３２．Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｗｅｉｔｚｍａｎｎ，Ｍ．Ｎ．，Ｓａｎｇａｄａｌａ，Ｓ．，Ｈｕｔｔｏｎ，Ｗ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｔ．（２０１３）Ｌｉｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｄｒｉｖｅｓ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｄｉｓｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８，２８２４３−２８２５３
３３．Ｗａｎｇ，Ｚ．，Ｈｕｔｔｏｎ，Ｗ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｙｏｏｎ，Ｓ．Ｔ．（２０１３）ＩＳＳＬＳ  Ｐｒｉｚｅ  ｗｉｎｎｅｒ：  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ  Ｐａ  １９７６）３８，１５０１−１５０７
３４．Ｇａｗｒｉ，Ｒ．，Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．，Ｏｕｅｌｌｅｔ，Ｊ．，Ａｗｗａｄ，Ｗ．，Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｔ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．，Ｈａｇｌｕｎｄ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｍｗａｌｅ，Ｆ．（２０１３）Ｂｅｓｔ  Ｐａｐｅｒ  ＮＡＳＳ  ２０１３：  Ｌｉｎｋ−Ｎ  ｃａｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｃｅｌｌｓ  ＆  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６，１０７−１１９
３５．Ｐｅｔｉｔ，Ａ．，Ｙａｏ，Ｇ．，Ｒｏｗａｓ，Ｓ．Ａ．，Ｇａｗｒｉ，Ｒ．，Ｅｐｕｒｅ，Ｌ．，Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｗａｌｅ，Ｆ．（２０１１）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｉｎｋ  Ｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ  １７，８９９−９０４
３６．Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｅｂｒａｈｅｉｍ，Ｍ．，Ｃａｓｔｉｌｌｏ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｔａｎｇ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｅｂｒａｈｅｉｍ，Ｎ．Ａ．（２０１０）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｐｕｒｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｕｓ  ｇｅｌａｔｉｎ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ１  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ｒａｂｂｉｔ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｐｉｎｅ  Ｊ  １０，８０２−８１０
３７．Ｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｍｏｃｈｉｄａ，Ｊ．，Ｉｗａｓｈｉｎａ，Ｔ．，Ｏｍｉ，Ｈ．，Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．，Ｓｅｒｉｇａｎｏ，Ｋ．，Ｔａｍｕｒａ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｓａｋａｉ，Ｄ．（２００８）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｃａｎｉｎｅ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ．Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ２６，５８９−６００
３８．Ｓａｋａｉ，Ｄ．，Ｍｏｃｈｉｄａ，Ｊ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｎｏｍｕｒａ，Ｔ．，Ｏｋｕｍａ，Ｍ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｋ．，Ｎａｋａｉ，Ｔ．，Ａｎｄｏ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｈｏｔｔａ，Ｔ．（２００３）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｉｎ  Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｇｅｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４，３５３１−３５４１
３９．Ｖａｄａｌａ，Ｇ．，Ｓｏｗａ，Ｇ．，Ｈｕｂｅｒｔ，Ｍ．，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ，Ｌ．Ｇ．，Ｄｅｎａｒｏ，Ｖ．，ａｎｄ  Ｋａｎｇ，Ｊ．Ｄ．（２０１２）Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ：  ｃｅｌｌ  ｌｅａｋａｇｅ  ｍａｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ｏｓｔｅｏｐｈｙｔｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｒｅｇｅｎ  Ｍｅｄ  ６，３４８−３５５
４０．Ｏｒｏｚｃｏ，Ｌ．，Ｓｏｌｅｒ，Ｒ．，Ｍｏｒｅｒａ，Ｃ．，Ａｌｂｅｒｃａ，Ｍ．，Ｓａｎｃｈｅｚ，Ａ．，ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｎｃｈｏ，Ｊ．（２０１１）Ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｒｅｐａｉｒ  ｂｙ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９２，８２２−８２８
４１．Ｈｒｉｓｔｏｖａ，Ｇ．Ｉ．，Ｊａｒｚｅｍ，Ｐ．，Ｏｕｅｌｌｅｔ，Ｊ．Ａ．，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｅｐｕｒｅ，Ｌ．Ｍ．，Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｗａｌｅ，Ｆ．（２０１１）Ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｃｏｌｉｏｓｉｓ．Ｊ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｒｅｓ  ２９，１８８８−１８９５
４２．Ｎａｃｈｅｍｓｏｎ，Ａ．，Ｌｅｗｉｎ，Ｔ．，Ｍａｒｏｕｄａｓ，Ａ．，ａｎｄ  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｍ．Ａ．（１９７０）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｅｎｄ−ｐｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｎｎｕｌｕｓ  ｆｉｂｒｏｓｕｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｍｂａｒ  ｉｎｔｅｒ−ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃｓ．Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄ  ４１，５８９−６０７
４３．Ｕｒｂａｎ，Ｊ．Ｐ．，ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．（２００３）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ５，１２０−１３０
４５．Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．，Ｅｐｕｒｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｍｉｃｈａｌｅｋ，Ａ．Ｊ．，Ｇｒａｎｔ，Ｍ．Ｐ．，Ｉａｔｒｉｄｉｓ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｍｗａｌｅ，Ｆ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｃｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｇｒａｄｅｓ  ｏｆ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  
４６．Ｍａｊｕｍｄａｒ，Ｓ．，Ｌｉｎｋ，Ｔ．Ｍ．，Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，Ｌ．Ｓ．，Ｈｕ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｕｒｈａｎｅｗｉｃｚ，Ｊ．（２０１１）Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｋ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｏｒｔｈｏｐ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ４２，５０１−５１１，ｖｉｉｉ
４７．Ｂｏｒｔｈａｋｕｒ，Ａ．，Ｍａｕｒｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｆｅｎｔｙ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．，Ｙｏｄｅｒ，Ｊ．，Ｂａｌｄｅｒｓｔｏｎ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ  Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｄ．Ｍ．（２０１１）Ｔ１ｒｈｏ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｏｇｒａｐｈｙ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｗ  ｂａｃｋ  ｐａｉｎ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ  Ｐａ  １９７６）３６，２１９０−２１９６
４８．Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．Ｊ．（２００４）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ．Ｓｐｉｎｅ  ２９，２６９１−２６９９
４９．Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．，Ｓｔｅｆｆｅｎ，Ｔ．，Ｎｅｌｓｏｎ，Ｆ．，Ｗｉｎｔｅｒｂｏｔｔｏｍ，Ｎ．，Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ，Ａ．Ｐ．，Ｐｏｏｌｅ，Ｒ．Ａ．，Ａｅｂｉ，Ｍ．，ａｎｄ  Ａｌｉｎｉ，Ｍ．（１９９６）Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｍｂａｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇｒｏｗｔｈ，ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，ａｇｅｉｎｇ，ａｎｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８，９９６−１００３
５０．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．，Ｅｖａｎｓ，Ｅ．Ｈ．，Ｋｌｅｔｓａｓ，Ｄ．，Ｊａｆｆｒａｙ，Ｄ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｍ．（２００６）Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃｓ．Ｅｕｒ．Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．１５  Ｓｕｐｐｌ  ３，Ｓ３１２−Ｓ３１６
５１．Ｌｅ  Ｍａｉｔｒｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ａ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｈｏｙｌａｎｄ，Ｊ．Ａ．（２００５）Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．Ｔｈｅｒ．７，Ｒ７３２−Ｒ７４５
５２．Ｓｈａｍｊｉ，Ｍ．Ｆ．，Ｓｅｔｔｏｎ，Ｌ．Ａ．，Ｊａｒｖｉｓ，Ｗ．，Ｓｏ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｊｉｎｇ，Ｌ．，Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｒ．，Ｉｓａａｃｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｗ．Ｊ．（２０１０）Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ａｎｄ  ｈｅｒｎｉａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６２，１９７４−１９８２
５３．Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ａ．Ｊ．（２００９）Ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｋ  ｐａｉｎ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．（Ｏｘｆｏｒｄ）４８，５−１０
５４．Ｓｔｒｕｇｌｉｃｓ，Ａ．，ａｎｄ  Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｍ．（２０１２）ＭＭＰ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｃａｎ  ｉｓ  ｍａｉｎｌｙ  ａ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ４４６，２１３−２２３
５５．Ｇｒｕｂｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｉｎｇｒａｍ，Ｊ．Ａ．，Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ，Ｇ．Ｌ．，Ｚｉｎｃｈｅｎｋｏ，Ｎ．，Ｎｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｈａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｎ．，Ｊｒ．（２０１１）Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ：  ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  ｄｉｓｃ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ  ｌｉｇａｎｄ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  ｔｈｅｒａｐｙ  １３，Ｒ１４０
５６．Ｂａｃｈｍｅｉｅｒ，Ｂ．Ｅ．，Ｎｅｒｌｉｃｈ，Ａ．，Ｍｉｔｔｅｒｍａｉｅｒ，Ｎ．，Ｗｅｉｌｅｒ，Ｃ．，Ｌｕｍｅｎｔａ，Ｃ．，Ｗｕｅｒｔｚ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｂｏｏｓ，Ｎ．（２００９）Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｓｕｇｇｅｓｔ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｏｌｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌｕｍｂａｒ  ｄｉｓｃ  ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｓｐｉｎｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｅｆｏｒｍｉｔｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｓｐｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １８，１５７３−１５８６
５７．Ｔｉａｄｅｎ，Ａ．Ｎ．，Ｋｌａｗｉｔｔｅｒ，Ｍ．，Ｌｕｘ，Ｖ．，Ｍｉｒｓａｉｄｉ，Ａ．，Ｂａｈｒｅｎｂｅｒｇ，Ｇ．，Ｇｌａｎｚ，Ｓ．，Ｑｕｅｒｏ，Ｌ．，Ｌｉｅｂｓｃｈｅｒ，Ｔ．，Ｗｕｅｒｔｚ，Ｋ．，Ｅｈｒｍａｎｎ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｐ．Ｊ．（２０１２）Ｄｅｔｒｉｍｅｎｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｈｉｇｈ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ａ１（ＨＴＲＡ１）ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ（ＩＶＤ）ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８７，２１３３５−２１３４５
５８．Ｇｒｕｂｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．，Ｊｒ．，Ｄｅｓａｉ，Ｂ．，Ｓｔａｓｋｙ，Ａ．Ａ．，Ｈｏｅｌｓｃｈｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｈａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｎ．，Ｊｒ．（１９９７）Ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｎｎｕｌｕｓ：  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  ａｇａｒｏｓｅ  ｏｒ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ１．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２３５，１３−２１
５９．Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｌｏ，Ｗ．Ｃ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｕ，Ｃ．Ｈ．，Ｌｉｎ，Ｃ．Ｔ．，Ｌｉｕ，Ｈ．Ｙ．，Ｌｉｎ，Ｔ．Ｗ．，Ｌｉｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｄｅｎｇ，Ｗ．Ｐ．（２００６）Ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ａｎｄ  ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｐｕｌｐｏｓｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ１  ｉｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２０９，７４４−７５４
６０．Ｈｉｙａｍａ，Ａ．，Ｇｏｇａｔｅ，Ｓ．Ｓ．，Ｇａｊｇｈａｔｅ，Ｓ．，Ｍｏｃｈｉｄａ，Ｊ．，Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｉ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｒｉｓｂｕｄ，Ｍ．Ｖ．（２０１０）ＢＭＰ−２  ａｎｄ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ１，３−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １（ＧｌｃＡＴ−１）ｉｎ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｐｕｌｐｏｓｕｓ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＡＰ１，ＴｏｎＥＢＰ，ａｎｄ  Ｓｐ１：  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＭＡＰＫｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ａｎｄ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ｔｈｅ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５，１１７９−１１９０
６１．Ｊｉｎ，Ｈ．，Ｓｈｅｎ，Ｊ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．，Ｗａｎｇ，Ｍ．，Ｓｈｕ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｄ．（２０１１）ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｌａｙｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｔｉｓｓｕｅ．ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８５，１２０９−１２１５
６２．Ｂｉｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｍａｓｏｎ，Ｐ．，Ｍａｇｎｙ，Ｍ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｍｏｒｔ，Ｊ．Ｓ．（２０００）Ｔｈｅ  ｓｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  ｂｙ  ｉｔｓ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２７６，９２４−９２９
６３．Ｒｏｕｇｈｌｅｙ，Ｐ．，Ｈｏｅｍａｎｎ，Ｃ．，ＤｅｓＲｏｓｉｅｒｓ，Ｅ．，Ｍｗａｌｅ，Ｆ．，Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｊ．，ａｎｄ  Ａｌｉｎｉ，Ｍ．（２００６）Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｈｉｔｏｓａｎ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｐｕｌｐｏｓｕｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２７，３８８−３９６
６４．Ｄａｎｆｅｌｔｅｒ，Ｍ．，Ｏｎｎｅｒｆｊｏｒｄ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ，Ｄ．（２００７）Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１：  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＸ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  １３  ｒｅｌｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ＮＣ４  ｄｏｍａｉｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８２，３６９３３−３６９４１
６５．Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄ  Ｏｅｇｅｍａ，Ｔ．Ｒ．，Ｊｒ．（１９９２）Ｉｎｉｔｉａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １０，６７７−６９０
６６．Ｍａｌｅｍｕｄ，Ｃ．Ｊ．，Ｋｉｌｌｅｅｎ，Ｗ．，Ｈｅｒｉｎｇ，Ｔ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｐｕｒｃｈｉｏ，Ａ．Ｆ．（１９９１）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｕｌｆａｔｅｄ−ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  １．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １４９，１５２−１５９
６７．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｅｒｄｏｓ，Ｅ．Ｇ．（１９７７）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｉ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ｋｉｎｉｎａｓｅ  ＩＩ）ａｎｄ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎａｓｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ５９，６８４−６９５
６８．Ｌｕ，Ｈ．，Ｄａｌｇａｒｄ，Ｃ．Ｌ．，Ｍｏｈｙｅｌｄｉｎ，Ａ．，ＭｃＦａｔｅ，Ｔ．，Ｔａｉｔ，Ａ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｖｅｒｍａ，Ａ．（２００５）Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＦ−１  ｐｒｏｌｙｌ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅｓ  ａｌｌｏｗｓ  ｃｅｌｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｂａｓａｌ  ＨＩＦ−１．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８０，４１９２８−４１９３９
６９．Ｗｉｃｋｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｌｕｉ，Ｓ．，Ａｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ，Ｎ．，Ｍａｓｏｎ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｃｈａｎｔｒｙ，Ａ．（２０００）Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｄ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｃａ（２＋）−ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＩＩ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０，８１０３−８１１１
７０．ＭｃＫｅｎｎａ，Ｌ．Ａ．，Ｌｉｕ，Ｈ．，Ｓａｎｓｏｍ，Ｐ．Ａ．，ａｎｄ  Ｄｅａｎ，Ｍ．Ｆ．（１９９８）Ａｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４１，１５７−１６２
７１．Ａｂｂｏｔｔ，Ｒ．Ｄ．，Ｐｕｒｍｅｓｓｕｒ，Ｄ．，Ｍｏｎｓｅｙ，Ｒ．Ｄ．，Ｂｒｉｇｓｔｏｃｋ，Ｄ．Ｒ．，Ｌａｕｄｉｅｒ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｉａｔｒｉｄｉｓ，Ｊ．Ｃ．（２０１３）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｇｒａｄｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｐｕｌｐｏｓｕｓ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｌｉｎｋ−Ｎ，ＣＴＧＦ，ａｎｄ  ＴＧＦｂｅｔａ３．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ＆  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６，Ｅ８６−９４
７２．Ｋａｎｄｅｌ，Ｒ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｕｒｂａｎ，Ｊ．Ｐ．（２００８）Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ：  ｔｈｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｓｐｉｎｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｐｉｎａｌ  Ｄｅｆｏｒｍｉｔｙ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｓｐｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １７  Ｓｕｐｐｌ  ４，４８０−４９１
７３．Ａｒｉｇａ，Ｋ．，Ｙｏｎｅｎｏｂｕ，Ｋ．，Ｎａｋａｓｅ，Ｔ．，Ｋａｎｅｋｏ，Ｍ．，Ｏｋｕｄａ，Ｓ．，Ｕｃｈｉｙａｍａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．（２００１）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ  Ｄ，Ｋ，ａｎｄ  Ｌ  ｉｎ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃｓ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ  Ｐａ  １９７６）２６，２６６６−２６７２
７４．Ｚｉｇｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｇｌｅｎｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｄｅｌａｍａｒｔｅｒ，Ｒ．Ｂ．（２０１２）Ｆｉｖｅ−ｙｅａｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ−ｌｅｖｅｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｎｇｌｅ−ｌｅｖｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｌｕｍｂａｒ  ｔｏｔａｌ  ｄｉｓｃ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＰｒｏＤｉｓｃ−Ｌ  ｖｅｒｓｕｓ  ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆｕｓｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ．Ｓｐｉｎｅ  １７，５０４−５１１
７５．Ｒｕｂｅｒｔｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ｒ．Ｎ．，ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｇ．Ｂ．（２００９）Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｌｅｖｅｌ  ｌｕｍｂａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ−−ａ  ｆｉｎｉｔｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｍｏｄｅｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ４２，３４１−３４８
７６．Ｌｕｎｄ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｏｘｌａｎｄ，Ｔ．Ｒ．（２０１１）Ａｄｊａｃｅｎｔ  ｌｅｖｅｌ  ｄｉｓｋ  ｄｉｓｅａｓｅ−−ｉｓ  ｉｔ  ｒｅａｌｌｙ  ａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ？  Ｔｈｅ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ４２，５２９−５４１，ｖｉｉｉ
７７  Ｈａｙｅｓ  ＡＪ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｍ，Ｒａｌｐｈｓ  ＪＲ．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ  ２００１；２０：１０７−２１．
７８．Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｈ，Ｙａｍａｄａ  Ｙ，Ｋｉｍａｔａ  Ｋ．Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｃａｎ，ａ  ｌａｒｇｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ，ｉｎ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１９９８；１２４：６８７−６９３．
７９．Ｒｏｕｇｈｌｅｙ  ＰＪ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ．Ｓｐｉｎｅ．２００４；２９：２６９１−２６９９
８０．Ｌｉ  Ｘ，Ａｎ  ＨＳ，Ｅｌｌｍａｎ  Ｍ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｆ，Ｔｈｏｎａｒ  ＥＪ，Ｐａｒｋ  ＤＫ，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  ２００８；１０：Ｒ４８．
８１．Ｓｍｉｔｈ  ＬＪ，Ｎｅｒｕｒｋａｒ  ＮＬ，Ｃｈｏｉ  ＫＳ，Ｈａｒｆｅ  ＢＤ，Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＤＭ．Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ：  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｄｉｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｍｅｃｈ．２０１１；１４：３１−４１．
８２．Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＡ，Ｓｃｈｍａｔｚ  Ｃ，Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＡＢ．Ｌｕｍｂａｒ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｇｅ，ｓｅｘ  ａｎｄ  ｓｐｉｎｅ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ６００  ａｕｔｏｐｓｙ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ．Ｓｐｉｎｅ．１９８８；１４：１７３−１７８．
８３．Ｍａｓｕｄａ  Ｋ，Ａｎ  ＨＳ．Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．２００４；４：３３０Ｓ−３４０Ｓ．
８４．Ａｎ  ＨＳ，Ｔａｋｅｇａｍｉ  Ｋ，Ｋａｍａｄａ  Ｈ，Ｎｇｕｙｅｎ  ＣＭ，Ｔｈｏｎａｒ  ＥＪ，Ｓｉｎｇｈ  Ｋ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ＧＢ，Ｍａｓｕｄａ  Ｋ．Ｉｎｔｒａｄｉｓｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｈｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｐｕｌｐｏｓｕｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ  ｒａｂｂｉｔｓ．Ｓｐｉｎｅ．２００５；３０：２５−３１．
８５．Ｈｅｎｒｉｋｓｓｏｎ  ＨＢ，Ｓｖａｎｖｉｋ  Ｔ，Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｍ，Ｈａｇｍａｎ  Ｍ，Ｈｏｒｎ  Ｍ，Ｌｉｎｄａｈｌ  Ａ，Ｂｒｉｓｂｙ  Ｈ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍｓ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃｓ  ｉｎ  ａ  ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｓｐｉｎｅ．２００９；３４：１４１−１４８
８６．Ｓａｋａｉ  Ｄ，Ｍｏｃｈｉｄａ  Ｊ，Ｉｗａｓｈｉｎａ  Ｔ，Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｔ，Ｎａｋａｉ  Ｔ，Ａｎｄｏ  Ｋ，Ｈｏｔｔａ  Ｔ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ａ  ｒａｂｂｉｔ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｃ  ｍｏｄｅｌ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｄｉｓｃ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｓｐｉｎｅ．２００５；３０：２３７９−２３８７．
８７．Ｌｉｕ  Ｈ，ＭｃＫｅｎｎａ  ＬＡ，Ｄｅａｎ  ＭＦ．Ａｎ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０００；１４：１１６−１２２．
８８．Ｍｗａｌｅ  Ｆ，Ｄｅｍｅｒｓ  ＣＮ，Ｐｅｔｉｔ  Ａ，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ  Ｐ，Ｐｏｏｌｅ  ＡＲ，Ｓｔｅｆｆｅｎ  Ｔ，Ａｅｂｉ  Ｍ，Ａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｊ．Ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｌａｇｅｎｓ  ＩＩ，ＩＸ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｂｙ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３；１４：１２０２−１２１３．
８９．Ｔｃｈｅｔｉｎａ  Ｅ，Ｍｗａｌｅ  Ｆ，Ｐｏｏｌｅ  ＡＲ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｈａｓｅｓ  ｏｆ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐｌａｔｅ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；１４：８４４−８５１．
９０．Ｍｗａｌｅ  Ｆ，Ｄｅｍｅｒｓ  ＣＮ，Ｐｅｔｉｔ  Ａ，Ａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  Ｌｉｎｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００８；１４：９９．
９１．Ｌｉ  Ｚ，Ｇｕｎｎ  Ｊ，Ｃｈｅｎ  ＭＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎ−ｓｉｔｅ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｇｅｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｎｉｆｏｒｍ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｒｏｕｓ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ２００８；  ８６：５５２−９．
９２．Ｌｉｎ  ＹＪ，Ｙｅｎ  ＣＮ，Ｈｕ  ＹＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｏｒｏｕｓ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍａｔｒｉｘ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ２００９；  ８８：２３−３３．
９３．Ｇａｗｒｉ  Ｒ，Ａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｊ，Ｏｕｅｌｌｅｔ  Ｊ，Ａｗｗａｄ  Ｗ，Ｓｔｅｆｆｅｎ  Ｔ，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ  Ｐ，Ｈａｇｌｕｎｄ  Ｌ，Ｍｗａｌｅ  Ｆ．Ｌｉｎｋ−Ｎ  ｃａｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃｓ．Ｅｕｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍａｔｅｒ  ２０１３，Ｉｎ  Ｐｒｅｓｓ．
９４．Ｆａｒｎｄａｌｅ  ＲＷ，Ｂｕｔｔｌｅ  ＤＪ，Ｂａｒｒｅｔｔ  ＡＪ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｌｐｈａｔｅｄ  ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｉｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｌｕｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９８６；  ８８３：１７３−７．
９５．Ｍｗａｌｅ  Ｆ，Ｃｉｏｂａｎｕ  Ｉ，Ｇｉａｎｎｉｔｓｉｏｓ  Ｄ，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ  Ｐ，Ｓｔｅｆｆｅｎ  Ｔ，Ａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｊ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｏｘｙｇｅｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｎ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｐｉｎｅ  ２０１１；  ３６（２）：Ｅ１３１−８．
９６．Ａｌｉｎｉ  Ｍ，Ｒｏｕｇｈｌｅｙ  ＰＪ，Ａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｊ，Ｓｔｏｌｌ  Ｔ，Ａｅｂｉ  Ｍ．Ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｄｉｓｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：  ｎｏｔ  ｆｏｒ  ｔｏｄａｙ，ｂｕｔ  ｍａｙｂｅ  ｆｏｒ  ｔｏｍｏｒｒｏｗ．Ｅｕｒ  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．２００２，Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ２１５−２０．
９７．Ｃｈｏｕ  ＡＩ，Ｒｅｚａ  ＡＴ，Ｎｉｃｏｌｌ  ＳＢ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｄｏｐｔ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ａ．２００８；  １４（１２）：２０７９−８７．
９８．Ｒｏｕｇｈｌｅｙ  ＰＪ，Ｍｅｌｃｈｉｎｇ  ＬＩ，Ｈｅａｔｈｆｉｅｌｄ  ＴＦ，Ｐｅａｒｃｅ  ＲＨ，Ｍｏｒｔ  ＪＳ．Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｃａｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ．Ｅｕｒ  Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．２００６  Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ３２６−３２．
【図１】
0006700182.tif 000008
【図２】
0006700182.tif 000009
【図３】
0006700182.tif 000010
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
0006700182.tif 000040
【図３３】
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【配列表】
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