(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法であって、
（ａ）前記生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることであって、前記生体試料が前記対象から直接得られ、さらなる処理をせずに前記反応器中に準備され、前記逆転写酵素および前記ＤＮＡポリメラーゼが異なる酵素である、ことと、
（ｂ）前記ＤＮＡ増幅とは別の前記逆転写増幅に適した条件に前記反応混合物を最初に付すことなく、前記反応器中の前記反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）６０秒以下の変性化継続時間にわたって変性化温度で前記反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）６０秒以下の伸長継続時間にわたって伸長温度で前記反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、前記標的ＲＮＡを逆転写し、並行して増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって前記標的ＲＮＡを増幅することであって、前記増幅ＤＮＡ産物の存在が前記標的ＲＮＡの存在を示す、ことと
を含む、方法。
【請求項２】
前記試薬が、前記増幅ＤＮＡ産物の存在を示す検出可能なシグナルを生じるレポーター剤をさらに含む、および／または前記検出可能なシグナルの強度が、前記増幅ＤＮＡ産物または標的ＲＮＡの量に比例する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プライマーセットが、前記標的ＲＮＡに相補的である鎖を生成するための第１のプライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的ＲＮＡがウイルスＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の前またはその間に前記反応器に溶解剤を添加するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅することが、４０未満のサイクル閾値（Ｃｔ）でおよび／または１０分以下の時間で、前記生体試料中の前記標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量のＤＮＡ産物を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法であって、
（ａ）前記対象から得られた前記生体試料を受け取ることと；
（ｂ）前記生体試料と、逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを、反応器中に準備して、反応混合物を得ることであって、前記逆転写酵素および前記ＤＮＡポリメラーゼが異なる酵素であり、前記生体試料が前記対象から直接得られ、さらなる処理をせずに前記反応器中に準備される、ことと；
（ｃ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅とは別の前記逆転写増幅に適した条件に前記反応混合物を最初に付すことなく、前記反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、前記生体試料中の前記標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を得ることと；
（ｄ）（ｃ）の前記量の増幅ＤＮＡ産物を検出することと；
（ｅ）レシピエントに前記量の増幅ＤＮＡ産物に関する情報を出力することと
を含み、
（ａ）〜（ｅ）を完了するための時間は、３０分以下である、方法。
【請求項９】
前記レシピエントが、治療医師、製薬会社、または前記対象である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｃ）が、３０サイクル以下で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記情報が、レポートとしてまたは電子ディスプレイに出力される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅するためのシステムであって、
（ａ）前記生体試料中の前記標的ＲＮＡを増幅するためのユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；
（ｂ）増幅モジュールであって、前記ユーザーリクエストに応えて：
前記生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り、前記逆転写酵素および前記ＤＮＡポリメラーゼが異なる酵素であり、前記生体試料が前記対象から直接得られ、さらなる処理をせずに前記反応器中に準備され；
前記ＤＮＡ増幅とは別の前記逆転写増幅に適した条件に前記反応混合物を最初に付すことなく、前記反応器中の前記反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）６０秒以下の変性化継続時間にわたって変性化温度で前記反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）６０秒以下の伸長継続時間にわたって伸長温度で前記反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、前記標的ＲＮＡを逆転写し、並行して増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって前記標的ＲＮＡを増幅し、前記増幅ＤＮＡ産物の存在が前記標的ＲＮＡの存在を示す、増幅モジュール；ならびに
（ｃ）前記増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、レシピエントに前記標的ＲＮＡまたは前記ＤＮＡ産物に関する情報を出力する、出力モジュール
を含む、システム。
【請求項１３】
前記標的ＲＮＡが、ステップ（ｉ）の前に濃縮にかけられていない、および／またはステップ（ｉ）において、前記生体試料がＲＮＡ抽出にかけられていない、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記増幅モジュールが、４０未満のサイクル閾値（Ｃｔ）でおよび／または１０分以下の時間で、前記生体試料中の前記標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量のＤＮＡ産物を生じさせる、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅するためのシステムであって、
（ａ）前記生体試料中の前記標的ＲＮＡを増幅するためのユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；
（ｂ）増幅モジュールであって、前記ユーザーリクエストに応えて：
（ｉ）前記対象から得られた前記生体試料と、逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（１）逆転写酵素、（２）ＤＮＡポリメラーゼ、および（３）前記標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り、前記逆転写酵素および前記ＤＮＡポリメラーゼが異なる酵素であり、前記生体試料が前記対象から直接得られ、さらなる処理をせずに前記反応器中に準備され；
（ｉｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅とは別の前記逆転写増幅に適した条件に前記反応混合物を最初に付すことなく、前記反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、前記生体試料中の前記標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を得；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の前記量の増幅ＤＮＡ産物を検出し；
（ｉｖ）レシピエントに前記量の増幅ＤＮＡ産物に関する情報を出力する
増幅モジュールであって、
（ｉ）〜（ｉｖ）を完了するための時間は、３０分以下である、増幅モジュール；ならびに
（ｃ）前記増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、前記情報をレシピエントに伝達する、出力モジュール
を含む、システム。
【請求項１６】
前記レシピエントが、治療医師、製薬会社、または前記対象である、請求項１５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１３年１２月２５日に出願された特許協力条約出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１３／０９０４２５号に基づく優先権を主張し、この出願は、すべての目的についてその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は、生体試料などの複合混合物から目的の核酸の選択された増幅および識別を可能にする。生体試料中の核酸を検出するために、生体試料は、典型的には、生体試料の他の成分ならびに核酸および／または増幅を妨害し得る他の作用物質から核酸を単離するために処理される。生体試料から目的の核酸を単離した後、目的の核酸を、例えば、サーマルサイクリングベース手法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））などの当技術分野で公知の増幅法を介して増幅することができる。目的の核酸を増幅した後、増幅の産物を検出することができ、検出の結果を最終使用者が解明することができる。しかし、核酸を増幅する前の生体試料からの核酸の抽出は、時間のかかるものであり得、全体としてプロセスの時間効率を低減する。
【０００３】
ポイントオブケア（ＰＯＣ）検査は、劣った実験室でのインフラストラクチャを伴ったリソースの限られた設定において、または実験室結果の受領の遅延および患者をフォローアップすることの潜在的な複雑化がある遠隔地において、感染性疾患の検出および管理を改善する潜在性を有する。ＰＯＣ検査は、最先端の医療施設を、１回の訪問中に患者にサンプルツーアンサー結果を届けることをより可能にすることもできる。しかし、ＰＯＣの方法およびデバイスの非効率性は、実現することができることを制限する。例えば、複合試料タイプ（例えば、生体試料）からの核酸（例えば、病原体の）調製は、多数の処理ステップおよび後続の検査を手作業で実施するのに、専用の実験室スペースで高度に熟練した人員を必然的に伴い、結果の報告は、数時間後、または数日後にさえ行われる。
【０００４】
したがって、複合試料タイプから核酸を分析するための迅速な、正確な方法およびデバイスの必要性が存在する。このような方法およびデバイスは、例えば、疾患の核酸を介して検出可能な疾患の速いサンプルツーアンサー検出および管理を実現することにおいて有用であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、ＲＮＡおよびＤＮＡ分子などの核酸を効率的に増幅するための方法およびシステムを提供する。増幅核酸産物は、迅速に、かつ良好な感度で検出することができる。
【０００６】
一態様では、本開示は、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、（ａ）生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと、（ｂ）反応器中の反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）６０秒未満またはそれに等しい変性化継続時間にわたって変性化温度で反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）６０秒未満またはそれに等しい伸長継続時間にわたって伸長温度で反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、標的ＲＮＡの存在を示す増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって標的ＲＮＡを増幅することとを含む。別の実施形態では、本方法は、（ａ）対象から得られた生体試料を受け取ることと；（ｂ）生体試料と、逆転写増幅、および任意選択でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、および（ｉｉ）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと；（ｃ）反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を得ることと；（ｄ）（ｃ）のその量の増幅ＤＮＡ産物を検出することと；レシピエントにその量の増幅ＤＮＡ産物に関する情報を出力することとを含み、（ａ）〜（ｅ）を完了するための時間は、約３０分未満またはそれに等しい。一部の実施形態では、時間は、２０分未満もしくはそれに等しく、１０分未満もしくはそれに等しく、または５分未満もしくはそれに等しい。
【０００７】
一部の実施形態では、試薬は、増幅ＤＮＡ産物の存在を示す検出可能なシグナルを生じるレポーター剤をさらに含む。一部の実施形態では、検出可能なシグナルの強度は、増幅ＤＮＡ産物または標的ＲＮＡの量に比例する。一部の実施形態では、レポーター剤は、色素である。一部の実施形態では、プライマーセットは、１種または複数のプライマーを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、標的ＲＮＡに相補的である鎖を生成するための第１のプライマーを含む。一部の実施形態では、プライマーセットは、標的ＲＮＡの少なくとも一部に相補的であるＤＮＡ産物に相補的である鎖を生成するための第２のプライマーを含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡである。一部の実施形態では、ウイルスＲＮＡは、対象に対して病原性である。一部の実施形態では、ウイルスＲＮＡは、ＨＩＶ  Ｉ、ＨＩＶ  ＩＩ、エボラウイルス、デングウイルス、オルソミクソウイルス、ヘペウイルス、ならびに／またはＡ、Ｂ、Ｃ（例えば、アーマード（armored）ＲＮＡ−ＨＣＶウイルス）、Ｄ、およびＥ型肝炎のウイルスからなる群から選択される。
【０００８】
一部の実施形態では、反応器は、ボディおよびキャップを含む。一部の実施形態では、キャップは、脱着可能である。一部の実施形態では、反応器は、ピペットチップのフォーマットを採る。一部の実施形態では、反応器は、反応器のアレイの一部である。一部の実施形態では、反応器のアレイの反応器部分は、流体操作デバイスによって個々にアドレス可能である。一部の実施形態では、反応器は、２つまたはそれ超の熱ゾーンを含む。一部の実施形態では、反応器は、封じられており、任意選択で密閉されている。
【０００９】
一部の実施形態では、変性化温度は、約９０℃〜１００℃、または約９２℃〜９５℃である。一部の実施形態では、伸長温度は、約３５℃〜７２℃、または約４５℃〜６５℃である。一部の実施形態では、変性化継続時間は、３０秒未満またはそれに等しい。一部の実施形態では、伸長継続時間は、３０秒未満またはそれに等しい。
【００１０】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬とを含む反応器を準備する前に濃縮にかけられていない。一部の実施形態では、生体試料は、生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬とを含む反応器を準備するとき、ＲＮＡ抽出にかけられていない。一部の実施形態では、本方法は、生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬とを含む反応器を準備する前、またはそれを準備している間に反応器に溶解剤を添加するステップをさらに含む。一部の実施形態では、溶解剤は、緩衝液を含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、プライマーエクステンション反応の１つまたは複数のサイクル中に生体試料から放出される。
【００１１】
一部の実施形態では、生体試料は、対象に由来する生体液である。一部の実施形態では、生体試料は、呼気、血液、尿、糞便、唾液、脳脊髄液、および汗からなる群から選択される。
【００１２】
一部の実施形態では、ＤＮＡ増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を介するものでる。一部の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応は、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応である。一部の実施形態では、ＤＮＡ増幅は、線形増幅である。一部の実施形態では、増幅することにより、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、または５未満のサイクル閾値（Ｃｔ）で生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量のＤＮＡ産物が生じる。一部の実施形態では、増幅することにより、３０分もしくはそれ未満、２０分もしくはそれ未満、または１０分もしくはそれ未満の時間で生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量のＤＮＡ産物が生じる。一部の実施形態では、増幅は、非エマルジョンベースである。
【００１３】
一部の実施形態では、レシピエントは、治療医師、製薬会社、または対象である。一部の実施形態では、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を得るために反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付すことは、３０サイクルもしくはそれ未満、２０サイクルもしくはそれ未満、または１０サイクルもしくはそれ未満内で行われる。一部の実施形態では、検出は、光学的検出、静電気的検出、または電気化学的検出である。一部の実施形態では、本方法は、生体試料と、逆転写増幅およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅を行うのに必要な試薬とを含む反応器を準備することを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、情報は、レポートとして出力される。一部の実施形態では、レポートは、電子レポートである。一部の実施形態では、情報は、電子ディスプレイに出力される。
【００１５】
別の態様では、本開示は、対象から得られる生体試料中に存在する標的核酸を増幅する方法を提供する。本方法は、（ａ）生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリメラーゼ、および任意選択で逆転写酵素、ならびに（ｉｉ）標的核酸のためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと；（ｂ）反応器中の反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応であって、各シリーズが、（ｉ）変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含み、個々のシリーズが、変性化条件および／または伸長条件に関して複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的核酸の存在を示す増幅産物を生成することとを含む。
【００１６】
一部の実施形態では、標的核酸は、リボ核酸である。一部の実施形態では、試薬は、デオキシリボ核酸増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要である。一部の実施形態では、増幅産物は、増幅デオキシリボ核酸産物である。一部の実施形態では、生体試料は、（ａ）において精製されない。一部の実施形態では、本方法は、（ｂ）の前に標的核酸を１つまたは複数の変性化条件に付すことをさらに含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の変性化条件は、変性化温度プロファイルおよび変性化剤から選択される。
【００１７】
一部の実施形態では、生体試料は、希釈される。これは、阻害を最小限にすることを助ける場合がある。一部の実施形態では、生体試料は、濃縮される。これは、感度を増大させ、または別段に改善することを助ける場合がある。
【００１８】
一部の実施形態では、本方法は、標的核酸を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応の第１のシリーズと第２のシリーズとの間に１つまたは複数の変性化条件に付すことをさらに含む。一部の実施形態では、個々のシリーズは、変性化温度と伸長温度との間のランピングレート、変性化温度、変性化継続時間、伸長温度、および伸長継続時間のうちの少なくとも任意の１つ、少なくとも任意の２つ、少なくとも任意の３つ、少なくとも任意の４つに関して異なる。一部の実施形態では、個々のシリーズは、変性化温度と伸長温度との間のランピングレート、変性化温度、変性化継続時間、伸長温度、および伸長継続時間に関して異なる。
【００１９】
一部の実施形態では、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応は、第１のシリーズおよび第２のシリーズを含み、第１のシリーズは、１０超のサイクルを含み、第１のシリーズの各サイクルは、（ｉ）反応混合物を約９２℃〜９５℃で３０秒以下にわたってインキュベートし、その後、（ｉｉ）反応混合物を約３５℃〜６５℃で１分以下にわたってインキュベートすることを含み、第２のシリーズは、１０超のサイクルを含み、第２のシリーズの各サイクルは、（ｉ）反応混合物を約９２℃〜９５℃で３０秒以下にわたってインキュベートし、その後、（ｉｉ）反応混合物を約４０℃〜６０℃で１分以下にわたってインキュベートすることを含む。
【００２０】
一部の実施形態では、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応は、同等の変性化および伸長条件下での単一のシリーズのプライマーエクステンション反応と比較して、より低いサイクル閾値で生体試料中の標的核酸の存在を示す検出可能量の増幅産物を生じる。一部の実施形態では、本方法は、（ｂ）の前に、９０℃〜１００℃の予熱温度で、１０分、２分、または１分以下の予熱継続時間にわたって生体試料を予熱することをさらに含む。一部の実施形態では、予熱温度は、９２℃〜９５℃である。一部の実施形態では、予熱継続時間は、約３０秒以下である。
【００２１】
別の態様では、本開示は、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅するシステムを提供する。一実施形態では、システムは、（ａ）生体試料中の標的ＲＮＡを増幅するためのユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；（ｂ）ユーザーリクエストに応えて：生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り；反応器中の反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）変性化温度で６０秒未満またはそれに等しい変性化継続時間にわたって反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度で６０秒未満またはそれに等しい伸長継続時間にわたって反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、標的ＲＮＡの存在を示す増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって標的ＲＮＡを増幅する増幅モジュール；ならびに（ｃ）増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、レシピエントに標的ＲＮＡまたはＤＮＡ産物に関する情報を出力する、出力モジュールを含む。
【００２２】
別の実施形態では、システムは、（ａ）生体試料中の標的ＲＮＡを増幅するためにユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；（ｂ）ユーザーリクエストに応えて：（ｉ）対象から得られた生体試料と、逆転写増幅および任意選択でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅を行うのに必要な試薬であって、（１）逆転写酵素、および（２）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り；（ｉｉ）反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を生じ；（ｉｉｉ）（ｉｉｉ）のその量の増幅ＤＮＡ産物を検出し；（ｉｖ）レシピエントにその量の増幅ＤＮＡ産物に関する情報を出力する増幅モジュールであって、（ｉ）〜（ｉｖ）を完了するための時間は、約３０分未満またはそれに等しい、増幅モジュール；ならびに（ｃ）増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、レシピエントに情報を伝達する、出力モジュールを含む。一部の実施形態では、出力モジュールは、電子ディスプレイである。一部の実施形態では、電子ディスプレイは、ユーザーインターフェースを含む。一部の実施形態では、出力モジュールは、コンピューターネットワークに作動可能にカップリングした通信インターフェースである。
【００２３】
別の態様では、本開示は、対象から得られる生体試料中に存在する標的核酸を増幅するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）生体試料中の標的核酸を増幅するためのユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；（ｂ）ユーザーリクエストに応えて：生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および任意選択で逆転写酵素、ならびに（ｉｉ）標的核酸のためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り；反応器中の反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応であって、各シリーズが、（ｉ）変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含み、個々のシリーズが、変性化条件および／または伸長条件に関して複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的核酸の存在を示す増幅産物を生成する増幅モジュール；ならびに（ｃ）増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、レシピエントに核酸または増幅産物に関する情報を出力する、出力モジュールを含む。
【００２４】
別の態様では、本開示は、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによって実行されると、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法を遂行する機械実行可能コードを含むコンピューター可読媒体を提供する。一実施形態では、本方法は、（ａ）反応混合物を得るために、生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備することと、（ｂ）反応器中の反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）６０秒未満またはそれに等しい変性化継続時間にわたって変性化温度で反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）６０秒未満またはそれに等しい伸長継続時間にわたって伸長温度で反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、標的ＲＮＡの存在を示す増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって標的ＲＮＡを増幅することとを含む。
【００２５】
別の実施形態では、本方法は、（ａ）対象から得られた生体試料を受け取ることと；（ｂ）反応混合物を得るために、生体試料と、逆転写増幅、および任意選択でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、および（ｉｉ）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備することと；（ｃ）反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を得ることと；（ｄ）（ｃ）のその量のＤＮＡ産物を検出することと；（ｅ）レシピエントにその量のＤＮＡ産物に関する情報を出力することとを含み、（ａ）〜（ｅ）を完了するための時間の量は、約３０分未満またはそれに等しい。
【００２６】
別の態様では、本開示は、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによって実行されると、対象から得られる生体試料中に存在する標的核酸を増幅する方法を遂行する機械実行可能コードを含むコンピューター可読媒体を提供する。一実施形態では、本方法は、（ａ）生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよび任意選択で逆転写酵素、ならびに（ｉｉ）標的核酸のためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと；（ｂ）反応器中の反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応であって、各シリーズが、（ｉ）変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含み、個々のシリーズが、変性化条件および／または伸長条件に関して複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、標的核酸に由来する増幅産物を生成することとを含む。
【００２７】
本開示の追加の態様は、対象から得られる生体試料中の標的核酸を増幅するためのシステムを提供する。システムは、生体試料中の標的核酸を増幅する増幅プロトコールを実行するのにユーザーがアクセス可能なグラフィカル要素を表示するユーザーインターフェースを含む電子ディスプレイスクリーンを含み得る。システムは、電子ディスプレイスクリーンにカップリングされ、ユーザーがグラフィカル要素を選択すると増幅プロトコールを実行するようにプログラムされたコンピュータープロセッサーも含み得る。増幅プロトコールは、生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬とを含む反応混合物を複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的核酸の存在を示す増幅産物を生成することを含むことができる。プライマーエクステンション反応の各シリーズは、変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で反応混合物をインキュベートし、その後、伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含むことができる。個々のシリーズは、変性化条件および／または伸長条件に関して複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる場合がある。
【００２８】
一部の実施形態では、増幅プロトコールは、標的核酸のためのプライマーセットを選択することをさらに含むことができる。一部の実施形態では、試薬は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリメラーゼ、任意選択の逆転写酵素、および標的核酸のためのプライマーセットを含み得る。一部の実施形態では、ユーザーインターフェースは、複数のグラフィカル要素を表示することができる。グラフィカル要素のそれぞれは、複数の増幅プロトコールの中の所与の増幅プロトコールに関連していることができる。一部の実施形態では、グラフィカル要素のそれぞれは、疾患と関連している場合がある。複数の増幅プロトコールの中の所与の増幅プロトコールは、対象における疾患の存在をアッセイすることに向けられ得る。一部の実施形態では、疾患は、ウイルス、例えば、ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスなどと関連している場合がある。一部の実施形態では、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ  Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ（ＨＩＶ  ＩＩ）、オルソミクソウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ヘペウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単核球症ウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、西ナイル熱ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、アデノウイルス、および水痘ウイルスからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１ウイルス、Ｈ３Ｎ２ウイルス、Ｈ７Ｎ９ウイルス、およびＨ５Ｎ１ウイルスからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、アデノウイルスは、アデノウイルス５５型（ＡＤＶ５５）またはアデノウイルス７型（ＡＤＶ７）であり得る。一部の実施形態では、Ｃ型肝炎ウイルスは、アーマードＲＮＡ−Ｃ型肝炎ウイルス（ＲＮＡ−ＨＣＶ）であり得る。一部の実施形態では、疾患は、病原性細菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）または病原性原虫（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）と関連している場合がある。
【００２９】
一部の実施形態では、標的核酸は、疾患と関連している場合がある。一部の実施形態では、増幅プロトコールは、増幅産物の存在に基づいて疾患の存在をアッセイすることに向けられ得る。一部の実施形態では、疾患は、ウイルス、例えば、ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスなどと関連している場合がある。一部の実施形態では、ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ  Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ（ＨＩＶ  ＩＩ）、オルソミクソウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ヘペウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単核球症ウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、西ナイル熱ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、アデノウイルス、および水痘ウイルスからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、インフルエンザウイルスは、Ｈ１Ｎ１ウイルス、Ｈ３Ｎ２ウイルス、Ｈ７Ｎ９ウイルス、およびＨ５Ｎ１ウイルスからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、アデノウイルスは、アデノウイルス５５型（ＡＤＶ５５）またはアデノウイルス７型（ＡＤＶ７）であり得る。一部の実施形態では、Ｃ型肝炎ウイルスは、アーマードＲＮＡ−Ｃ型肝炎ウイルス（ＲＮＡ−ＨＣＶ）であり得る。一部の実施形態では、疾患は、病原性細菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）または病原性原虫（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）と関連している場合がある。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法であって、
（ａ）前記生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと、
（ｂ）前記反応器中の前記反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）６０秒未満またはそれに等しい変性化継続時間にわたって変性化温度で前記反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）６０秒未満またはそれに等しい伸長継続時間にわたって伸長温度で前記反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、前記標的ＲＮＡの存在を示す増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって前記標的ＲＮＡを増幅することと
を含む、方法。
（項目２）
前記試薬が、前記増幅ＤＮＡ産物の存在を示す検出可能なシグナルを生じるレポーター剤をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記検出可能なシグナルの強度が、前記増幅ＤＮＡ産物または標的ＲＮＡの量に比例する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記レポーター剤が色素である、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記プライマーセットが、１種または複数のプライマーを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記セットが、前記標的ＲＮＡに相補的である鎖を生成するための第１のプライマーを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記標的ＲＮＡがウイルスＲＮＡである、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記反応器が、ボディおよびキャップを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記反応器が、ピペットチップのフォーマットを採る、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記反応器が、反応器のアレイの一部である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記反応器が、流体操作デバイスによって個々にアドレス可能である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記反応器が、２つまたはそれ超の熱ゾーンを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記変性化温度が、約９０℃〜１００℃である、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記変性化温度が、約９２℃〜９５℃である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記伸長温度が、約３５℃〜７２℃である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記伸長温度が、約４５℃〜６５℃である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記変性化継続時間が、３０秒未満またはそれに等しい、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記伸長継続時間が、３０秒未満またはそれに等しい、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記標的ＲＮＡが、ステップ（ａ）の前に濃縮にかけられていない、項目１に記載の方法。
（項目２０）
ステップ（ａ）において、前記生体試料が、ＲＮＡ抽出にかけられていない、項目１に記載の方法。
（項目２１）
ステップ（ａ）の前またはその間に前記反応器に溶解剤を添加するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記生体試料が、前記対象に由来する生体液である、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記増幅することが、４０未満のサイクル閾値（Ｃｔ）で、前記生体試料中の前記標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量のＤＮＡ産物を生じる、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記増幅することが、１０分またはそれ未満の時間で前記生体試料中の前記標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量のＤＮＡ産物を生じる、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記反応器が封じられている、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記ＤＮＡ増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応である、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記ポリメラーゼ連鎖反応が、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記標的ＲＮＡが、前記プライマーエクステンション反応の１つまたは複数のサイクル中に前記生体試料から放出される、項目１に記載の方法。
（項目２９）
対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法であって、
（ａ）前記対象から得られた前記生体試料を受け取ることと；
（ｂ）前記生体試料と、逆転写増幅、および任意選択でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、および（ｉｉ）前記標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと；
（ｃ）前記反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、前記生体試料中の前記標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を得ることと；
（ｄ）（ｃ）の前記量の増幅ＤＮＡ産物を検出することと；
（ｅ）レシピエントに前記量の増幅ＤＮＡ産物に関する情報を出力することと
を含み、
（ａ）〜（ｅ）を完了するための時間は、約３０分未満またはそれに等しい、方法。
（項目３０）
前記レシピエントが、治療医師、製薬会社、または前記対象である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
（ｂ）がＤＮＡ増幅を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
（ｃ）が、３０サイクルまたはそれ未満で行われる、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記情報が、レポートとして出力される、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
前記情報が、電子ディスプレイに出力される、項目２９に記載の方法。
（項目３５）
前記時間が、１０分未満またはそれに等しい、項目２９に記載の方法。
（項目３６）
対象から得られる生体試料中に存在する標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）前記生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリメラーゼ、および任意選択で逆転写酵素、ならびに（ｉｉ）前記標的核酸のためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと；
（ｂ）前記反応器中の前記反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応であって、各シリーズが、（ｉ）変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で前記反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で前記反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含み、個々のシリーズが、前記変性化条件および／または前記伸長条件に関して前記複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、前記生体試料中の前記標的核酸の存在を示す増幅産物を生成することとを含む、方法。
（項目３７）
前記標的核酸がリボ核酸である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記試薬が、デオキシリボ核酸増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要である、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
（ｂ）において、前記増幅産物が、増幅デオキシリボ核酸産物である、項目３６に記載の方法。
（項目４０）
（ａ）において、前記生体試料が精製されていない、項目３６に記載の方法。
（項目４１）
（ａ）において、前記生体試料が濃縮されている、項目３６に記載の方法。
（項目４２）
（ａ）において、前記生体試料が希釈されている、項目３６に記載の方法。
（項目４３）
（ｂ）の前に前記標的核酸を１つまたは複数の変性化条件に付すことをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目４４）
前記１つまたは複数の変性化条件が、変性化温度プロファイルおよび変性化剤から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記複数のシリーズのプライマーエクステンション反応の第１のシリーズと第２のシリーズとの間で前記標的核酸を１つまたは複数の変性化条件に付すことをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目４６）
前記個々のシリーズが、変性化温度と伸長温度との間のランピングレート、変性化温度、変性化継続時間、伸長温度、および伸長継続時間の少なくともいずれか１つに関して異なる、項目３６に記載の方法。
（項目４７）
前記個々のシリーズが、変性化温度と伸長温度との間のランピングレート、変性化温度、変性化継続時間、伸長温度、および伸長継続時間の少なくともいずれか２つに関して異なる、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記複数のシリーズのプライマーエクステンション反応が、第１のシリーズおよび第２のシリーズを含み、前記第１のシリーズは、１０超のサイクルを含み、前記第１のシリーズの各サイクルは、（ｉ）前記反応混合物を約９２℃〜９５℃で３０秒以下にわたってインキュベートし、その後、（ｉｉ）前記反応混合物を約３５℃〜６５℃で１分以下にわたってインキュベートすることを含み、前記第２のシリーズは、１０超のサイクルを含み、前記第２のシリーズの各サイクルは、（ｉ）前記反応混合物を約９２℃〜９５℃で３０秒以下にわたってインキュベートし、その後、（ｉｉ）前記反応混合物を約４０℃〜６０℃で１分以下にわたってインキュベートすることを含む、項目３６に記載の方法。
（項目４９）
前記複数のシリーズのプライマーエクステンション反応が、同等の変性化および伸長条件下での単一のシリーズのプライマーエクステンション反応と比較して、より低いサイクル閾値で前記生体試料中の前記標的核酸の存在を示す検出可能量の増幅産物を生じる、項目３６に記載の方法。
（項目５０）
（ｂ）の前に、９０℃〜１００℃の予熱温度で、１０分以下の予熱継続時間にわたって前記生体試料を予熱することをさらに含む、項目３６に記載の方法。
（項目５１）
前記予熱継続時間が１分以下である、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅するためのシステムであって、
（ａ）前記生体試料中の前記標的ＲＮＡを増幅するためのユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；
（ｂ）増幅モジュールであって、前記ユーザーリクエストに応えて：
前記生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り；
前記反応器中の前記反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）６０秒未満またはそれに等しい変性化継続時間にわたって変性化温度で前記反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）６０秒未満またはそれに等しい伸長継続時間にわたって伸長温度で前記反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、前記標的ＲＮＡの存在を示す増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって前記標的ＲＮＡを増幅する増幅モジュール；ならびに
（ｃ）前記増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、レシピエントに前記標的ＲＮＡまたは前記ＤＮＡ産物に関する情報を出力する、出力モジュール
を含む、システム。
（項目５３）
対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅するためのシステムであって、
（ａ）前記生体試料中の前記標的ＲＮＡを増幅するためのユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；
（ｂ）増幅モジュールであって、前記ユーザーリクエストに応えて：
（ｉ）前記対象から得られた前記生体試料と、逆転写増幅および任意選択でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅を行うのに必要な試薬であって、（１）逆転写酵素および（２）前記標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り；
（ｉｉ）前記反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、前記生体試料中の前記標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を得；
（ｉｉｉ）（ｉｉｉ）の前記量の増幅ＤＮＡ産物を検出し；
（ｉｖ）レシピエントに前記量の増幅ＤＮＡ産物に関する情報を出力する
増幅モジュールであって、
（ｉ）〜（ｉｖ）を完了するための時間は、約３０分未満またはそれに等しい、増幅モジュール；ならびに
（ｃ）前記増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、前記情報をレシピエントに伝達する、出力モジュール
を含む、システム。
（項目５４）
対象から得られる生体試料中に存在する標的核酸を増幅するためのシステムであって、
（ａ）前記生体試料中の前記標的核酸を増幅するためのユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；
（ｂ）増幅モジュールであって、前記ユーザーリクエストに応えて：
前記生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよび任意選択で逆転写酵素、ならびに（ｉｉ）前記標的核酸のためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り；
前記反応器中の前記反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応であって、各シリーズが、（ｉ）変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で前記反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で前記反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含み、個々のシリーズが、前記変性化条件および／または前記伸長条件に関して前記複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、前記生体試料中の前記標的核酸の存在を示す増幅産物を生成する、増幅モジュール；ならびに
（ｃ）前記増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、前記標的核酸または前記増幅産物に関する情報をレシピエントに出力する、出力モジュールを含む、システム。
（項目５５）
１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによって実行されると、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法を遂行する機械実行可能コードを含むコンピューター可読媒体であって、前記方法は、
（ａ）前記生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと、
（ｂ）前記反応器中の前記反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）６０秒未満またはそれに等しい変性化継続時間にわたって変性化温度で前記反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）６０秒未満またはそれに等しい伸長継続時間にわたって伸長温度で前記反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、前記標的ＲＮＡの存在を示す増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって前記標的ＲＮＡを増幅することと
を含む、コンピューター可読媒体。
（項目５６）
１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによって実行されると、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法を遂行する機械実行可能コードを含むコンピューター可読媒体であって、前記方法は、
（ａ）前記対象から得られた前記生体試料を受け取ることと；
（ｂ）前記生体試料と、逆転写増幅、および任意選択でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、および（ｉｉ）前記標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと；
（ｃ）前記反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、前記生体試料中の前記標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を得ることと；
（ｄ）（ｃ）の前記量のＤＮＡ産物を検出することと；
（ｅ）レシピエントに前記量のＤＮＡ産物に関する情報を出力することとを含み、
（ａ）〜（ｅ）を完了するための時間は、約３０分未満またはそれに等しい、コンピューター可読媒体。
（項目５７）
１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによって実行されると、対象から得られる生体試料中に存在する標的核酸を増幅する方法を遂行する機械実行可能コードを含むコンピューター可読媒体であって、前記方法は、
（ａ）前記生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および任意選択で逆転写酵素、ならびに（ｉｉ）前記標的核酸のためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと；
（ｂ）前記反応器中の前記反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応であって、各シリーズが、（ｉ）変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で前記反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で前記反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含み、個々のシリーズが、前記変性化条件および／または前記伸長条件に関して前記複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、前記生体試料中の前記標的核酸の存在を示す増幅産物を生成することと
を含む、コンピューター可読媒体。
（項目５８）
対象から得られる生体試料中の標的核酸を増幅するためのシステムであって、
前記生体試料中の前記標的核酸を増幅する増幅プロトコールを実行するのにユーザーがアクセス可能なグラフィカル要素を表示するユーザーインターフェースを含む電子ディスプレイスクリーン；および
前記電子ディスプレイスクリーンにカップリングされ、前記ユーザーが前記グラフィカル要素を選択すると前記増幅プロトコールを実行するようにプログラムされたコンピュータープロセッサーであって、前記増幅プロトコールは、
前記生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬とを含む反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応であって、各シリーズが、（ｉ）変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で前記反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で前記反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含み、個々のシリーズが、前記変性化条件および／または前記伸長条件に関して前記複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、前記生体試料中の前記標的核酸の存在を示す増幅産物を生成することを含む、コンピュータープロセッサー
を含む、システム。
（項目５９）
前記増幅プロトコールが、前記標的核酸のためのプライマーセットを選択することをさらに含む、項目５８に記載のシステム。
（項目６０）
前記試薬が、（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリメラーゼおよび任意選択で逆転写酵素、ならびに（ｉｉ）前記標的核酸のためのプライマーセットを含む、項目５８に記載のシステム。
（項目６１）
前記ユーザーインターフェースが、複数のグラフィカル要素を表示し、前記グラフィカル要素のそれぞれが、複数の増幅プロトコールの中の所与の増幅プロトコールに関連している、項目５８に記載のシステム。
（項目６２）
前記グラフィカル要素のそれぞれが、疾患と関連しており、前記複数の増幅プロトコールの中の所与の増幅プロトコールが、前記対象における前記疾患の存在をアッセイすることに向けられている、項目６１に記載のシステム。
（項目６３）
前記疾患が、ウイルスと関連している、項目６２に記載のシステム。
（項目６４）
前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、項目６３に記載のシステム。
（項目６５）
前記ウイルスがＤＮＡウイルスである、項目６３に記載のシステム。
（項目６６）
前記ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ  Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ（ＨＩＶ  ＩＩ）、オルソミクソウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ヘペウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単核球症ウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、西ナイル熱ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、アデノウイルス、および水痘ウイルスからなる群から選択される、項目６３に記載のシステム。
（項目６７）
前記インフルエンザウイルスが、Ｈ１Ｎ１ウイルス、Ｈ３Ｎ２ウイルス、Ｈ７Ｎ９ウイルス、およびＨ５Ｎ１ウイルスからなる群から選択される、項目６６に記載のシステム。
（項目６８）
前記アデノウイルスが、アデノウイルス５５型（ＡＤＶ５５）またはアデノウイルス７型（ＡＤＶ７）である、項目６６に記載のシステム。
（項目６９）
前記Ｃ型肝炎ウイルスが、アーマードＲＮＡ−Ｃ型肝炎ウイルス（ＲＮＡ−ＨＣＶ）である、項目６６に記載のシステム。
（項目７０）
前記疾患が、病原性細菌または病原性原虫と関連している、項目６１に記載のシステム。
（項目７１）
前記病原性細菌が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである、項目６８に記載のシステム。
（項目７２）
前記病原性原虫がＰｌａｓｍｏｄｉｕｍである、項目６８に記載のシステム。
（項目７３）
前記標的核酸が、疾患と関連している、項目５８に記載のシステム。
（項目７４）
前記増幅プロトコールが、前記増幅産物の存在に基づいて前記疾患の存在をアッセイすることに向けられている、項目７３に記載のシステム。
（項目７５）
前記疾患が、ウイルスと関連している、項目７３に記載のシステム。
（項目７６）
前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、項目７５に記載のシステム。
（項目７７）
前記ウイルスがＤＮＡウイルスである、項目７５に記載のシステム。
（項目７８）
前記ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ  Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ（ＨＩＶ  ＩＩ）、オルソミクソウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、インフルエンザウイルス、ヘペウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単核球症ウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、西ナイル熱ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、アデノウイルス、および水痘ウイルスからなる群から選択される、項目７５に記載のシステム。
（項目７９）
前記インフルエンザウイルスが、Ｈ１Ｎ１ウイルス、Ｈ３Ｎ２ウイルス、Ｈ７Ｎ９ウイルス、およびＨ５Ｎ１ウイルスからなる群から選択される、項目７８に記載のシステム。
（項目８０）
前記アデノウイルスが、アデノウイルス５５型（ＡＤＶ５５）またはアデノウイルス７型（ＡＤＶ７）である、項目７８に記載のシステム。
（項目８１）
前記Ｃ型肝炎ウイルスが、アーマードＲＮＡ−Ｃ型肝炎ウイルス（ＲＮＡ−ＨＣＶ）である、項目７８に記載のシステム。
（項目８２）
前記疾患が、病原性細菌または病原性原虫と関連している、項目７３に記載のシステム。
（項目８３）
前記病原性細菌が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓである、項目８２に記載のシステム。
（項目８４）
前記病原性原虫がＰｌａｓｍｏｄｉｕｍである、項目８２に記載のシステム。
【００３０】
本開示の追加の態様および利点は、本開示の単に例示的な実施形態が示され、記載されている以下の詳細な説明から当業者に直ちに明らかとなる。認識されることになるように、本開示は、本開示から逸脱することなく、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な明白な観点において改変が可能である。したがって、図面および記載は、本質的に例示的であると見なされるべきであり、限定的であると見なされるべきでない。
【００３１】
参照による組込み
本明細書で述べられるすべての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれるように具体的に、かつ個々に示されているのと同じ程度に参照により本明細書に組み込まれている。
【００３２】
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲における特定性とともに示されている。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、本発明の原理が利用されている例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、および添付の図面（本明細書でまた、「図（Figure）」および「図（Fig）」）を参照することによって得られることになる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、例示的なシステムを表す概略図である。
【００３４】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、実施例１に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００３５】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、実施例１に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００３６】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、実施例２に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００３７】
【図５】図５は、実施例３に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００３８】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、実施例４に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００３９】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、実施例４に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００４０】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、実施例４に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００４１】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、実施例４に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００４２】
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂは、実施例４に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００４３】
【図１１】図１１は、実施例５に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００４４】
【図１２】図１２は、実施例５に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００４５】
【図１３】図１３は、実施例７に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００４６】
【図１４】図１４は、実施例９に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００４７】
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、実施例１０に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００４８】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、実施例１０に記載した例示的な核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００４９】
【図１７】図１７は、実施例１１に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００５０】
【図１８】図１８は、実施例１２に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００５１】
【図１９Ａ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、実施例１３に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【図１９Ｂ】図１９Ａおよび図１９Ｂは、実施例１３に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００５２】
【図２０】図２０は、実施例１４に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００５３】
【図２１】図２１は、実施例１５に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００５４】
【図２２Ａ】図２２Ａおよび図２２Ｂは、実施例１７に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【図２２Ｂ】図２２Ａおよび図２２Ｂは、実施例１７に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００５５】
【図２３Ａ】図２３Ａ、図２３Ｂ、および図２３Ｃは、実施例１８に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【図２３Ｂ】図２３Ａ、図２３Ｂ、および図２３Ｃは、実施例１８に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【図２３Ｃ】図２３Ａ、図２３Ｂ、および図２３Ｃは、実施例１８に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００５６】
【図２４Ａ】図２４Ａおよび図２４Ｂは、実施例１９に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【図２４Ｂ】図２４Ａおよび図２４Ｂは、実施例１９に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００５７】
【図２５Ａ】図２５Ａおよび図２５Ｂは、実施例１９に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【図２５Ｂ】図２５Ａおよび図２５Ｂは、実施例１９に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００５８】
【図２６Ａ】図２６Ａおよび図２６Ｂは、実施例２０に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【図２６Ｂ】図２６Ａおよび図２６Ｂは、実施例２０に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００５９】
【図２７】図２７は、実施例２１に記載した核酸増幅反応の結果を表すグラフである。
【００６０】
【図２８Ａ】図２８Ａは、例示的なユーザーインターフェースを有する例示的な電子ディスプレイの概略図である。
【００６１】
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、例示的なユーザーインターフェースを有する例示的な電子ディスプレイの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明の様々な実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、このような実施形態は、単なる例として提供されていることが当業者に明白となるであろう。数多くのバリエーション、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に想起され得る。本明細書に記載した本発明の実施形態の様々な代替案が使用され得ることが理解されるべきである。
【００６３】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、脈絡による別段の明らかな要求のない限り、複数形の言及を含む。例えば、用語「細胞（a  cell）」は、細胞の混合物を含めた複数の細胞を含む。
【００６４】
本明細書において、用語「増幅すること」および「増幅」は、互換的に使用され、一般に、核酸の１つまたは複数のコピーまたは「増幅産物」を生成することを指す。用語「ＤＮＡ増幅」は一般に、ＤＮＡ分子または「増幅ＤＮＡ産物」の１つまたは複数のコピーを生成することを指す。用語「逆転写増幅」は一般に、逆転写酵素の作用を介したリボ核酸（ＲＮＡ）鋳型からのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の生成を指す。
【００６５】
本明細書において、用語「サイクル閾値」または「Ｃｔ」は一般に、増幅産物に起因する検出可能なシグナルの増大がバックグラウンドシグナルの上の統計的に有意なレベルに到達するサーモサイクリング中のサイクルを指す。
【００６６】
本明細書において、用語「変性化」および「変性」は、互換的に使用され、一般に、二本鎖核酸のへリックス構造の完全または部分的な巻き戻し、および一部の場合では、一本鎖核酸の二次構造の巻き戻しを指す。変性は、病原体の細胞壁（複数可）またはウイルスのシェルの不活化、および阻害剤のタンパク質（複数可）の不活化を含み得る。変性が起こり得る条件には、一般に変性が起こることが可能になる温度を指す「変性温度」、および一般に変性が行われることに割り当てられる時間を指す「変性継続時間」が含まれる。
【００６７】
本明細書において、用語「伸長」は一般に、鋳型指向様式での核酸へのヌクレオチドの組込みを指す。伸長は、酵素、例えば、ポリメラーゼまたは逆転写酵素などの助けを介して起こり得る。伸長が起こり得る条件には、一般に伸長が起こることが可能になる温度を指す「伸長温度」、および一般に伸長が行われることに割り当てられる時間を指す「伸長継続時間」が含まれる。
【００６８】
本明細書において、用語「核酸」は一般に、デオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）もしくはリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）、またはこれらの類似体の任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。核酸は、任意の３次元構造を有し得、公知または未知の任意の機能を実施し得る。核酸の非限定的な例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子または遺伝子断片のコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（loci）（遺伝子座（locus））、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ、（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分枝核酸、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーがある。核酸は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、核酸をアセンブリーする前または後に行われ得る。核酸のヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。核酸は、レポーター剤とのコンジュゲーションまたは結合などによって重合後にさらに修飾され得る。
【００６９】
本明細書において、用語「プライマーエクステンション反応」は一般に、二本鎖核酸の変性化、変性核酸の一方または両方の鎖へのプライマーの結合、その後のプライマー（複数可）の伸長を指す。
【００７０】
本明細書において、用語「反応混合物」は一般に、核酸増幅（例えば、ＤＮＡ増幅、ＲＮＡ増幅）を完了するのに必要な試薬を含む組成物を指し、このような試薬の非限定例としては、標的ＲＮＡまたは標的ＤＮＡに対して特異性を有するプライマーセット、ＲＮＡの逆転写から生成されるＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素（例えば、ＲＮＡの逆転写のための）、適当な緩衝液（双性イオン緩衝液を含む）、補助因子（例えば、二価および一価陽イオン）、ｄＮＴＰ、ならびに他の酵素（例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ））など）がある。一部の場合では、反応混合物は、１種または複数のレポーター剤も含むことができる。
【００７１】
本明細書において、「レポーター剤」は一般に、その存在または非存在を増幅産物の存在を検出するのに使用することができる検出可能なシグナルを生じる組成物を指す。
【００７２】
本明細書において、用語「標的核酸」は一般に、その存在、量、および／もしくは配列、またはこれらの１つもしくは複数の変化が判定されるように望まれているヌクレオチド配列を有する核酸分子の出発集団中の一核酸分子を指す。標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびこれらの類似体を含めた任意のタイプの核酸であり得る。本明細書において、「標的リボ核酸（ＲＮＡ）」は一般に、ＲＮＡである標的核酸を指す。本明細書において、「標的デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）」は一般に、ＤＮＡである標的核酸を指す。
【００７３】
本明細書において、用語「対象」は一般に、検査可能または検出可能な遺伝情報を有するエンティティまたは媒体を指す。対象は、人または個体であり得る。対象は、例えば、哺乳動物などの脊椎動物であり得る。哺乳動物の非限定的な例としては、マウス、サル、ヒト、家畜、競技動物、およびペットがある。対象の他の例としては、食物、植物、土壌、および水がある。
【００７４】
一態様では、本開示は、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法を提供する。本方法は、（ａ）反応混合物を得るために、生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備することと、（ｂ）反応器中の反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）６０秒未満またはそれに等しい変性化継続時間にわたって変性化温度で反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）６０秒未満またはそれに等しい伸長継続時間にわたって伸長温度で反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、標的ＲＮＡの存在を示す増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって標的ＲＮＡを増幅することとを含む。
【００７５】
別の態様では、本開示は、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法を提供する。本方法は、（ａ）対象から得られた生体試料を受け取ることと；（ｂ）反応混合物を得るために、生体試料と、逆転写増幅、および任意選択でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、および（ｉｉ）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備することと；（ｃ）反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を得ることと；（ｄ）（ｃ）のその量の増幅ＤＮＡ産物を検出することと；（ｅ）レシピエントにその量の増幅ＤＮＡ産物に関する情報を出力することとを含み、（ａ）〜（ｅ）を完了するための時間の量は、約３０分未満またはそれに等しい。
【００７６】
一態様では、本開示は、対象から得られる生体試料中に存在する標的核酸を増幅する方法を提供する。本方法は、（ａ）反応混合物を得るために、生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリメラーゼ、および任意選択で逆転写酵素、ならびに（ｉｉ）標的核酸のためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備することと；（ｂ）反応器中の反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応であって、各シリーズが、（ｉ）変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含み、個々のシリーズが、変性化条件および／または伸長条件に関して複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的核酸の存在を示す増幅産物を生成することとを含む。
【００７７】
様々な態様のいずれにおいても、対象から得られる生体試料に由来する核酸が増幅される。一部の場合では、生体試料は、対象から直接得られる。対象から直接得られる生体試料は一般に、さらなる処理のために対象から生体試料を収集するのに使用される任意の手段を例外として、対象から得られた後に、さらに処理されていない生体試料を指す。例えば、血液は、対象の循環系にアクセスし、対象から血液を取り出し（例えば、針を介して）、容器内に取り出した血液を入れることによって対象から直接得られる。容器は、血液試料がさらなる分析に有用であるように試薬（例えば、抗血液凝固剤）を含み得る。別の例では、対象の口咽頭表面上の上皮細胞にアクセスするのにスワブが使用される場合がある。対象から生体試料を得た後、生体試料を含有するスワブを流体（例えば、緩衝液）と接触させてスワブから生体液を収集することができる。
【００７８】
一部の実施形態では、生体試料は、反応器内に供給されるとき、精製されていない。一部の実施形態では、生体試料の核酸は、生体試料が反応器に供給されるとき、抽出されていない。例えば、生体試料中のＲＮＡまたはＤＮＡは、反応器に生体試料を供給するとき、生体試料から抽出されていなくてもよい。さらに、一部の実施形態では、生体試料中に存在する標的核酸（例えば、標的ＲＮＡまたは標的ＤＮＡ）は、反応器に生体試料を供給する前に濃縮されていなくてもよい。
【００７９】
核酸を含む任意の適当な生体試料を対象から得ることができる。生体試料は、固形物（例えば、生物組織）であってもよく、または流体（例えば、生体液）であってもよい。一般に、生体液として、生命体と関連した任意の流体を挙げることができる。生体試料の非限定的な例としては、対象の任意の解剖学的位置（例えば、組織、循環系、骨髄）から得られる血液（もしくは血液の成分  −  例えば、白血球、赤血球、血小板）、対象の任意の解剖学的位置から得られる細胞、皮膚、心臓、肺、腎臓、呼気、骨髄、糞便、精液、膣液、腫瘍性組織に由来する間質液、乳房、膵臓、脳脊髄液、組織、咽頭スワブ、生検、胎盤流体、羊水、肝臓、筋肉、平滑筋、膀胱、胆嚢、結腸、腸、脳、腔流体（cavity  fluid）、痰、膿汁、微生物叢（micropiota）、胎便、母乳、前立腺、食道、甲状腺、血清、唾液、尿、胃液および消化液、涙、眼液、汗、粘液、耳あか、油状物、腺分泌物、脊髄液、毛髪、爪、皮膚細胞、血漿、鼻腔スワブもしくは上咽頭洗浄液（nasopharyngeal  wash）、脊髄液、臍帯血、エンファティク流体（emphatic  fluid）、ならびに／または他の排泄物もしくは体組織がある。
【００８０】
生体試料は、当技術分野で公知の任意の手段によって対象から得ることができる。対象から直接生体試料を得るための手段の非限定的な例としては、循環系へのアクセス（例えば、シリンジまたは他の針を介して静脈内または動脈内に）、分泌された生体試料（例えば、糞便、尿、痰、唾液など）の収集、外科的（例えば、生検）、スワビング（例えば、頬側スワブ、口咽頭スワブ）、ピペット操作、および呼吸がある。さらに、生体試料は、所望の生体試料が位置している対象の任意の解剖学的部分から得ることができる。
【００８１】
様々な態様のいずれにおいても、標的核酸が増幅されて増幅産物が生成される。標的核酸は、標的ＲＮＡまたは標的ＤＮＡであり得る。標的核酸が標的ＲＮＡである場合では、標的ＲＮＡは、本明細書の他の場所で記載されるＲＮＡのタイプを含めて、任意のタイプのＲＮＡであり得る。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡである。一部の実施形態では、ウイルスＲＮＡは、対象に対して病原性であり得る。病原性ウイルスＲＮＡの非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ  Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ（ＨＩＶ  ＩＩ）、オルソミクソウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ９、またはＨ５Ｎ１）、ヘペウイルス（hepesvirus）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎（例えば、アーマードＲＮＡ−ＨＣＶウイルス）ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単核球症ウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、西ナイル熱ウイルス、ポリオウイルス、および麻疹ウイルスがある。
【００８２】
標的核酸が標的ＤＮＡである場合では、標的ＤＮＡは、本明細書の他の場所で記載されるＤＮＡのタイプを含めて、任意のタイプのＤＮＡであり得る。一部の実施形態では、標的ＤＮＡは、ウイルスＤＮＡである。一部の実施形態では、ウイルスＤＮＡは、対象に対して病原性であり得る。ＤＮＡウイルスの非限定的な例としては、単純ヘルペスウイルス、天然痘、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス５５型、アデノウイルス７型）、および水痘（Varicella）ウイルス（例えば、水痘（chickenpox））がある。一部の場合では、標的ＤＮＡは、細菌ＤＮＡであり得る。細菌ＤＮＡは、例えば、結核を引き起こすことが知られている細菌であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどの対象に対して病原性である細菌に由来し得る。一部の場合では、標的ＤＮＡは、病原性原虫、例えば、マラリアを引き起こし得るＰｌａｓｍｏｄｉｕｍタイプの１種または複数の原虫などに由来するＤＮＡであり得る。
【００８３】
本開示の様々な態様のいずれにおいても、対象から得られる生体試料は、反応混合物を得るために反応器内に核酸増幅に必要な試薬とともに提供される。任意の適当な反応器が使用され得る。一部の実施形態では、反応器は、内面、外面、開放端、および対向する閉端を含み得るボディを含む。一部の実施形態では、反応器は、キャップを含み得る。キャップは、その開放端でボディと接触するように構成することができ、その結果接触が行われるとき、反応器の開放端は閉じられる。一部の場合では、キャップは、反応器と永続的に付随しており、その結果これは、開いた構成および閉じた構成で反応器に付いたままである。一部の場合では、キャップは、脱着可能であり、その結果、反応器が開いているとき、キャップは、反応器から分離される。一部の実施形態では、反応器は、封じられており、任意選択で密閉されている場合がある。
【００８４】
反応器は、様々なサイズ、形状、重量、および構成のものであり得る。一部の例では、反応器は、円形または長円形の管状形状をしている場合がある。一部の実施形態では、反応器は、矩形、正方形、菱形、環状、楕円、または三角形の形状をしている場合がある。反応器は、規則正しく成形され、または不規則に成形され得る。一部の実施形態では、反応器の閉端は、先細りした、丸みを帯びた、または平らな表面を有しうる。反応器のタイプの非限定的な例としては、チューブ、ウェル、キャピラリー管、カートリッジ、キュベット、遠心管、またはピペットチップがある。反応器は、任意の適当な材料で構築することができ、このような材料の非限定的な例としては、ガラス、金属、プラスチック、およびこれらの組合せがある。
【００８５】
一部の実施形態では、反応器は、反応器のアレイの一部である。反応器のアレイは、方法を自動化し、かつ／またはいくつもの試料を同時に処理するのに特に有用であり得る。例えば、反応器は、いくつかのウェルで構成されるマイクロウェルプレートの一ウェルであり得る。別の例では、反応器は、サーモサイクラーのサーマルブロックのウェル中にホールドされている場合があり、ここでサーマルサイクルのブロックは、それぞれが試料容器を受け取ることができる多重のウェルを含む。反応器から構成されるアレイは、任意の適切な数の反応器を含み得る。例えば、アレイは、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３５、４８、９６、１４４、３８４、またはそれ超の反応器を含み得る。反応器のアレイの反応器部分はまた、流体操作デバイスによって個々にアドレス可能であり得、その結果流体操作デバイスは、反応器を正確に識別し、適切な流体材料を反応器中に分注することができる。流体操作デバイスは、流体材料の反応器への添加を自動化することにおいて有用であり得る。
【００８６】
一部の実施形態では、反応器は、多重の熱ゾーンを含み得る。反応器内の熱ゾーンは、反応器の異なる領域を異なる温度サイクリング条件に曝露することによって実現され得る。例えば、反応器は、上側の熱ゾーンおよび下側の熱ゾーンを含み得る。上側の熱ゾーンは、核酸増幅のための反応混合物を得るのに必要な生体試料および試薬を受け取ることができる場合がある。次いで反応混合物を第１のサーモサイクリングプロトコールに付すことができる。所望の数のサイクルの後、例えば、反応混合物を徐々に、しかし連続的に上側の熱ゾーンから下側の熱ゾーンに流すことができる。下側の熱ゾーンでは、次いで反応混合物は、上側の熱ゾーンにおけるものと異なる第２のサーモサイクリングプロトコールの所望の数のサイクルに付される。このようなストラテジーは、ネステッドＰＣＲがＤＮＡを増幅するのに使用されるとき、特に有用であり得る。一部の実施形態では、熱ゾーンは、反応器内の熱感受性層化材料（thermal  sensitive  layering  material）を活用して反応器内に創製することができる。このような場合では、熱感受性層化材料の加熱を使用して、１つの熱ゾーンから次の熱ゾーンに反応混合物を放出することができる。一部の実施形態では、反応器は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ超の熱ゾーンを含む。
【００８７】
一部の実施形態では、熱ゾーンを含む反応器は、核酸増幅の前に生体試料を処理するのに使用され得る。例えば、溶解剤を、核酸増幅に必要な生体試料および試薬を添加する前に反応器の第１の熱ゾーンに添加してもよい。生体試料および試薬が溶解剤を含む反応器に添加される場合、生体試料（biological）内の種（例えば、細胞またはウイルス粒子）を溶解することができる反応混合物が得られる。代わりに、溶解剤は、生体試料および試薬と同時的に反応混合物の第１の熱ゾーンに添加することができる。溶解剤の作用に適した温度条件に第１の熱ゾーンを曝すことを、第１の熱ゾーン内の生体試料中の細胞およびウイルス粒子を溶解させるのに使用することができ、その結果生体試料中の核酸が反応混合物に放出される。溶解させた後、次いで反応混合物は、本明細書に記載の増幅法を使用して放出された核酸を増幅するために、反応器の第２の熱ゾーンに入ることが可能になり得る。
【００８８】
溶解剤が望まれる場合では、市販の溶解剤を含めた当技術分野で公知の任意の適当な溶解剤が使用され得る。溶解剤の非限定例としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＳＤＳ）、リゾチーム、グルコラーゼ（glucolase）、プロテイナーゼＥ、ウイルスエンドリシン、エキソリシン、ザイモローゼ（zymolose）、リチカーゼ（Iyticase）、プロテイナーゼＫ、バクテリオファージ由来のエンドリシンおよびエキソリシン、バクテリオファージＰＭ２由来のエンドリシン、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓバクテリオファージＰＢＳＸ由来のエンドリシン、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓプロファージＬｊ９２８、Ｌｊ９６５由来のエンドリシン、バクテリオファージ１５  Ｐｈｉａｄｈ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅバクテリオファージＣｐ−Ｉ由来のエンドリシン、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅバクテリオファージＢ３０の二官能性ペプチドグリカン溶解素、プロファージ細菌由来のエンドリシンおよびエキソリシン、Ｌｉｓｔｅｒｉａバクテリオファージ由来のエンドリシン、ホリン−エンドリシン、細胞２０溶解遺伝子（cell  20  lysis  gene）、ｈｏｌＷＭＹ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｍｅｒｉ  ＭファージｖａｒｐｈｉＷＭＹ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｗａｍｅｒｉ  ＭファージｖａｒｐｈｉＷＭＹのＩｙ５ＷＭＹ、ならびにこれらの組合せがある。一部の場合では、緩衝液は、溶解剤を含み得る（例えば、溶解緩衝液）。溶解緩衝液の一例は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である。
【００８９】
当技術分野で公知の任意のタイプの核酸増幅反応を、標的核酸を増幅し、増幅産物を生成するのに使用することができる。さらに、核酸の増幅は、線形、指数関数的、またはこれらの組合せであり得る。増幅は、エマルジョンベースであってもよく、または非エマルジョンベースであってもよい。核酸増幅法の非限定的な例としては、逆転写、プライマーエクステンション、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、ヘリカーゼ依存性増幅、非対称増幅、ローリングサークル増幅、および多置換増幅（ＭＤＡ）がある。一部の実施形態では、増幅産物は、ＤＮＡであり得る。標的ＲＮＡが増幅される場合では、ＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得ることができ、後続のＤＮＡの増幅を使用して増幅ＤＮＡ産物を生成することができる。増幅ＤＮＡ産物は、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示すことができる。ＤＮＡが増幅される場合では、当技術分野で公知の任意のＤＮＡ増幅法が使用され得る。ＤＮＡ増幅法の非限定的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＰＣＲの変形（例えば、リアルタイムＰＣＲ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アセンブリーＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、ダイヤルアウトＰＣＲ（dial-out  PCR）、ヘリカーゼ依存性ＰＣＲ（helicase-dependent  PCR）、ネステッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、逆ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップ−エクステンションＰＣＲ、熱非対称インタレースＰＣＲ（thermal  asymmetric  interlaced  PCR）、タッチダウンＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）がある。一部の場合では、ＤＮＡ増幅は、線形である。一部の場合では、ＤＮＡ増幅は、指数関数的である。一部の場合では、ＤＮＡ増幅は、ネステッドＰＣＲで実現され、これは、増幅ＤＮＡ産物を検出する感度を改善することができる。
【００９０】
様々な態様では、本明細書に記載の核酸増幅反応は、並行して行われる場合がある。一般に、並列の増幅反応は、同じ反応器内で、同じ時間に行われる増幅反応である。並列の核酸増幅反応は、例えば、反応器内に各核酸増幅反応に必要な試薬を含めて反応混合物を得、反応混合物を各核酸増幅反応（nucleic  amplification  reaction）に必要な条件に付すことによって行うことができる。例えば、逆転写増幅およびＤＮＡ増幅は、反応器内に両方の増幅法に必要な試薬を供給して反応混合物を得、反応混合物を両方の増幅反応を行うのに適した条件に付すことによって並行して行うことができる。ＲＮＡの逆転写から生成されるＤＮＡを並行して増幅して、増幅ＤＮＡ産物を生成することができる。任意の適当な数の核酸増幅反応を並行して行うことができる。一部の場合では、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ超の核酸増幅反応が並行して行われる。
【００９１】
並行して核酸増幅反応を行うことの利点として、カップリングした核酸増幅反応同士間の速い移行を挙げることができる。例えば、標的核酸（例えば、標的ＲＮＡ、標的ＤＮＡ）を、並列の核酸増幅の加熱フェーズ中に生体試料から抽出または放出することができる。標的ＲＮＡの場合では、例えば、標的ＲＮＡを含む生体試料を加熱することができ、標的ＲＮＡを生体試料から放出することができる。放出された標的ＲＮＡは、逆転写を直ちに開始して（逆転写増幅を介して）、相補的ＤＮＡを生成することができる。次いで相補的ＤＮＡは、多くの場合数秒の程度で直ちに増幅され得る。生体試料からの標的ＲＮＡの放出と標的ＲＮＡの相補的ＤＮＡへの逆転写との間の短い時間は、逆転写および／またはＤＮＡ増幅を妨害し得る生体試料中の阻害剤の効果を最小限にするのに役立ち得る。
【００９２】
様々な態様のいずれにおいても、標的核酸に向けられたプライマーセットを利用して核酸増幅反応を行うことができる。プライマーセットは一般に、１種または複数のプライマーを含む。例えば、プライマーセットは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超のプライマーを含み得る。一部の場合では、プライマーセットは、異なる増幅産物または異なる核酸増幅反応に向けられたプライマーを含み得る。例えば、プライマーセットは、標的核酸の少なくとも一部に相補的である核酸産物の第１の鎖を生成するのに必要な第１のプライマー、および核酸産物の第１の鎖の少なくとも一部に相補的である核酸産物の第２の鎖を生成するのに必要な核酸鎖産物に相補的な第２のプライマーを含み得る。
【００９３】
例えば、プライマーセットは、標的ＲＮＡに向けられている場合がある。プライマーセットは、標的ＲＮＡの少なくとも一部に相補的である核酸産物の第１の鎖を生成するのに使用することができる第１のプライマーを含み得る。逆転写反応の場合では、核酸産物の第１の鎖は、ＤＮＡであり得る。プライマーセットは、核酸産物の第１の鎖の少なくとも一部に相補的である核酸産物の第２の鎖を生成するのに使用することができる第２のプライマーも含み得る。ＤＮＡ増幅と並行して行われる逆転写反応の場合では、核酸産物の第２の鎖は、ＲＮＡ鋳型から生成されるＤＮＡの鎖に相補的である核酸（例えば、ＤＮＡ）産物の鎖であり得る。
【００９４】
望まれる場合、任意の適当な数のプライマーセットを使用することができる。例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超のプライマーセットを使用することができる。多重のプライマーセットが使用される場合、１つまたは複数のプライマーセットは、特定の核酸増幅反応または増幅産物にそれぞれ対応し得る。
【００９５】
一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼが使用される。市販のＤＮＡポリメラーゼを含めた任意の適当なＤＮＡポリメラーゼが使用され得る。ＤＮＡポリメラーゼは一般に、鋳型結合様式でＤＮＡの鎖にヌクレオチドを組み込むことができる酵素を指す。ＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例としては、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｌｉポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＶＥＮＴポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ、ＥＸ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼ、Ｓｓｏポリメラーゼ、Ｐｏｃポリメラーゼ、Ｐａｂポリメラーゼ、Ｍｔｈポリメラーゼ、Ｐｈｏポリメラーゼ、ＥＳ４ポリメラーゼ、Ｔｒｕポリメラーゼ、Ｔａｃポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｔｉｈポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、白金Ｔａｑポリメラーゼ、Ｈｉ−Ｆｉポリメラーゼ、Ｔｂｒポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｐｆｕｔｕｂｏポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ、Ｐｗｏポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｓａｃポリメラーゼ、クレノウ断片、ならびにこれらのバリアント、修飾産物、および誘導体がある。ある特定のホットスタートポリメラーゼについては、２分〜１０分にわたる９４℃〜９５℃での変性ステップが要求される場合があり、これは、異なるポリメラーゼに基づいてサーマルプロファイルを変更し得る。
【００９６】
一部の実施形態では、逆転写酵素が使用される。任意の適当な逆転写酵素が使用され得る。逆転写酵素は一般に、ＲＮＡ鋳型に結合しているとき、ＤＮＡの鎖にヌクレオチドを組み込むことができる酵素を指す。逆転写酵素の非限定的な例としては、ＨＩＶ−１逆転写酵素、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、テロメラーゼ逆転写酵素、ならびにこれらのバリアント、修飾産物、および誘導体がある。
【００９７】
様々な態様では、プライマーエクステンション反応が、増幅産物を生成するのに利用される。プライマーエクステンション反応は一般に、変性温度で変性継続時間にわたって反応混合物をインキュベートし、伸長温度で伸長継続時間にわたって反応混合物をインキュベートするサイクルを含む。
【００９８】
変性温度は、例えば、分析される特定の生体試料、生体試料中の標的核酸の特定の源（例えば、ウイルス粒子、細菌）、使用される試薬、および／または所望の反応条件に応じて変動し得る。例えば、変性温度は、約８０℃〜約１１０℃であり得る。一部の例では、変性温度は、約９０℃〜約１００℃であり得る。一部の例では、変性温度は、約９０℃〜約９７℃であり得る。一部の例では、変性温度は、約９２℃〜約９５℃であり得る。さらに他の例では、変性温度は、約８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、または１００℃であり得る。
【００９９】
変性継続時間は、例えば、分析される特定の生体試料、生体試料中の標的核酸の特定の源（例えば、ウイルス粒子、細菌）、使用される試薬、および／または所望の反応条件に応じて変動し得る。例えば、変性継続時間は、３００秒、２４０秒、１８０秒、１２０秒、９０秒、６０秒、５５秒、５０秒、４５秒、４０秒、３５秒、３０秒、２５秒、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、２秒、もしくは１秒未満、またはそれに等しい場合がある。例えば、変性継続時間は、１２０秒、９０秒、６０秒、５５秒、５０秒、４５秒、４０秒、３５秒、３０秒、２５秒、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、２秒、または１秒以下であり得る。
【０１００】
伸長温度は、例えば、分析される特定の生体試料、生体試料中の標的核酸の特定の源（例えば、ウイルス粒子、細菌）、使用される試薬、および／または所望の反応条件に応じて変動し得る。例えば、伸長温度は、約３０℃〜約８０℃であり得る。一部の例では、伸長温度は、約３５℃〜約７２℃であり得る。一部の例では、伸長温度は、約４５℃〜約６５℃であり得る。一部の例では、伸長温度は、約３５℃〜約６５℃であり得る。一部の例では、伸長温度は、約４０℃〜約６０℃であり得る。一部の例では、伸長温度は、約５０℃〜約６０℃であり得る。さらに他の例では、伸長温度は、約３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃、または８０℃であり得る。
【０１０１】
伸長継続時間は、例えば、分析される特定の生体試料、生体試料中の標的核酸の特定の源（例えば、ウイルス粒子、細菌）、使用される試薬、および／または所望の反応条件に応じて変動し得る。例えば、伸長継続時間は、３００秒、２４０秒、１８０秒、１２０秒、９０秒、６０秒、５５秒、５０秒、４５秒、４０秒、３５秒、３０秒、２５秒、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、２秒、もしくは１秒未満、またはそれに等しい場合がある。例えば、伸長継続時間は、１２０秒、９０秒、６０秒、５５秒、５０秒、４５秒、４０秒、３５秒、３０秒、２５秒、２０秒、１５秒、１０秒、５秒、２秒、または１秒以下であり得る。
【０１０２】
様々な態様のいずれにおいても、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応を行うことができる。任意の適当な数のサイクルが行われ得る。例えば、行われるサイクルの数は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５未満のサイクルであり得る。行われるサイクルの数は、検出可能な増幅産物（例えば、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物）を得るのに必要なサイクルの数（例えば、サイクル閾値（Ｃｔ））に依存し得る。例えば、検出可能な増幅産物（例えば、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量のＤＮＡ産物）を得るのに必要なサイクルの数は、約１００サイクル未満もしくは約１００サイクル、約７５サイクル未満もしくは約７５サイクル、約７０サイクル未満もしくは約７０サイクル、約６５サイクル未満もしくは約６５サイクル、約６０サイクル未満もしくは約６０サイクル、約５５サイクル未満もしくは約５５サイクル、約５０サイクル未満もしくは約５０サイクル、約４０サイクル未満もしくは約４０サイクル、約３５サイクル未満もしくは約３５サイクル、約３０サイクル未満もしくは約３０サイクル、約２５サイクル未満もしくは約２５サイクル、約２０サイクル未満もしくは約２０サイクル、約１５サイクル未満もしくは約１５サイクル、約１０サイクル未満もしくは約１０サイクル、または約５サイクル未満もしくは約５サイクルであり得る。さらに、一部の実施形態では、検出可能量の増幅可能な産物（例えば、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量のＤＮＡ産物）は、１００、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、または５未満のサイクル閾値（Ｃｔ）で得ることができる。
【０１０３】
増幅が、増幅される標的核酸の存在を示す検出可能量の増幅産物を生じる時間は、標的核酸が得られた生体試料、行われる特定の核酸増幅反応、および望まれる増幅反応のサイクルの特定の数に応じて変更することができる。例えば、標的核酸の増幅は、１２０分もしくはそれ未満；９０分もしくはそれ未満；６０分もしくはそれ未満；５０分もしくはそれ未満；４５分もしくはそれ未満；４０分もしくはそれ未満；３５分もしくはそれ未満；３０分もしくはそれ未満；２５分もしくはそれ未満；２０分もしくはそれ未満；１５分もしくはそれ未満；１０分もしくはそれ未満；または５分もしくはそれ未満の時間で標的核酸の存在を示す検出可能量の増幅産物を生じ得る。
【０１０４】
一部の実施形態では、標的ＲＮＡの増幅は、１２０分もしくはそれ未満；９０分もしくはそれ未満；６０分もしくはそれ未満；５０分もしくはそれ未満；４５分もしくはそれ未満；４０分もしくはそれ未満；３５分もしくはそれ未満；３０分もしくはそれ未満；２５分もしくはそれ未満；２０分もしくはそれ未満；１５分もしくはそれ未満；１０分もしくはそれ未満；または５分もしくはそれ未満の時間で標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を生じ得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、反応混合物は、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付される場合がある。複数のうちの個々のシリーズは、例えば、本明細書の他の場所で記載した特定の変性および伸長条件によって特徴付けられる多重のサイクルの特定のプライマーエクステンション反応を含み得る。一般に、それぞれの個々のシリーズは、例えば、変性条件および／または伸長条件に関して複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる。個々のシリーズは、例えば、変性化温度、変性化継続時間、伸長温度、および伸長継続時間のうちの任意の１つ、２つ、３つ、または４つすべてに関して複数のシリーズのうちの別の個々のシリーズと異なり得る。さらに、複数のシリーズは、例えば、少なくとも約もしくは約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超の個々のシリーズなどの任意の数の個々のシリーズを含み得る。
【０１０６】
例えば、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応は、第１のシリーズおよび第２のシリーズを含み得る。第１のシリーズは、例えば、１０超のサイクルのプライマーエクステンション反応を含み得、第１のシリーズの各サイクルは、（ｉ）約９２℃〜約９５℃で３０秒以下にわたって反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）約３５℃〜約６５℃で約１分以下にわたって反応混合物をインキュベートすることを含む。第２のシリーズは、例えば、１０超のサイクルのプライマーエクステンション反応を含み得、第２のシリーズの各サイクルは、（ｉ）約９２℃〜約９５℃で３０秒以下にわたって反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）約４０℃〜約６０℃で約１分以下にわたって反応混合物をインキュベートすることを含む。この特定の例では、第１および第２のシリーズは、その伸長温度条件が異なる。しかし、例は、限定的であるように意味しておらず、理由は、異なる伸長および変性化条件の任意の組合せを使用することができるためである。
【０１０７】
一部の実施形態では、ランピング時間（すなわち、サーマルサイクラーが１つの温度から別の温度に移行するのに要する時間）および／またはランピングレートは、増幅において重要な要因であり得る。例えば、増幅が標的核酸の存在を示す検出可能量の増幅産物を生じる温度および時間は、ランピングレートおよび／またはランピング時間に応じて変更することができる。ランピングレートは、増幅に使用される温度（複数可）および時間（複数可）に強い影響を与え得る。
【０１０８】
一部の場合では、ランピング時間および／またはランピングレートは、サイクル同士間で異なり得る。しかし、いくつかの状況では、サイクル同士間のランピング時間および／またはランピングレートは、同じであり得る。ランピング時間および／またはランピングレートは、処理されている試料（複数可）に基づいて調整することができる。
【０１０９】
一部の状況では、異なる温度間のランピング時間は、例えば、試料の特質および反応条件に基づいて決定することができる。正確な温度およびインキュベーション時間も、試料の特質および反応条件に基づいて決定することができる。一部の実施形態では、単一の試料を、多重のサーマルサイクルを使用して複数回処理する（増幅条件に付す）ことができ、各サーマルサイクルは、例えば、ランピング時間、温度、および／またはインキュベーション時間が異なる。次いで最良または最適のサーマルサイクルを、その特定の試料について選択することができる。これは、検査されている具体的な試料または試料の組合せにサーマルサイクルを適応させるロバストで効率的な方法をもたらす。
【０１１０】
一部の実施形態では、標的核酸は、プライマーエクステンション反応を開始する前に変性化条件に付される場合がある。複数のシリーズのプライマーエクステンション反応の場合では、標的核酸は、複数のシリーズを実行する前に変性化条件に付される場合があり、または複数のうちのシリーズの間に変性化条件に付される場合がある。例えば、標的核酸は、複数のシリーズのうちの第１のシリーズと第２のシリーズとの間に変性化条件に付される場合がある。このような変性化条件の非限定的な例としては、変性化温度プロファイル（例えば、１つまたは複数の変性化温度）および変性化剤がある。
【０１１１】
複数のシリーズのプライマーエクステンション反応を行うことの利点は、同等の変性化および伸長条件下で単一のシリーズのプライマーエクステンション反応と比較したとき、複数のシリーズ手法が、より低いサイクル閾値で生体試料中の標的核酸の存在を示す検出可能量の増幅産物を生じることであり得る。複数のシリーズのプライマーエクステンション反応を使用すると、同等の変性化および伸長条件下で単一のシリーズと比較したとき、少なくとも約もしくは約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、このようなサイクル閾値が低減され得る。
【０１１２】
一部の実施形態では、生体試料は、プライマーエクステンション反応を行う前に予熱される場合がある。生体試料が予熱される温度（例えば、予熱温度）および継続時間（例えば、予熱継続時間）は、例えば、分析されている特定の生体試料に応じて変動し得る。一部の例では、生体試料は、約６０分、５０分、４０分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、１分、４５秒、３０秒、２０秒、１５秒、１０秒、または５秒以下にわたって予熱され得る。一部の例では、生体試料は、約８０℃〜約１１０℃の温度で予熱され得る。一部の例では、生体試料は、約９０℃〜約１００℃の温度で予熱され得る。一部の例では、生体試料は、約９０℃〜約９７℃の温度で予熱され得る。一部の例では、生体試料は、約９２℃〜約９５℃の温度で予熱され得る。さらに他の例では、生体試料は、約８０℃、８１℃、８２℃、８３℃、８４℃、８５℃、８６℃、８７℃、８８℃、８９℃、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、または１００℃の温度で予熱され得る。
【０１１３】
一部の実施形態では、並列の核酸増幅を行うのに必要な試薬を含めた核酸増幅を行うのに必要な試薬は、その存在または非存在が増幅産物の存在を示す検出可能なシグナルを生じるレポーター剤も含み得る。検出可能なシグナルの強度は、増幅産物の量に比例し得る。一部の場合では、最初に増幅された標的核酸と異なるタイプの核酸の増幅産物が生成される場合、検出可能なシグナルの強度は、最初に増幅された標的核酸の量に比例し得る。例えば、並列の逆転写および逆転写から得られるＤＮＡの増幅を介して標的ＲＮＡを増幅する場合では、両方の反応に必要な試薬は、増幅ＤＮＡ産物および／または増幅された標的ＲＮＡの存在を示す検出可能なシグナルを生じ得るレポーター剤も含む場合がある。検出可能なシグナルの強度は、増幅ＤＮＡ産物および／または増幅された元の標的ＲＮＡの量に比例し得る。レポーター剤を使用すると、ＤＮＡ増幅のためのリアルタイムＰＣＲを含めたリアルタイム増幅法も可能になる。
【０１１４】
レポーター剤は、共有結合性または非共有結合性手段によって、増幅産物を含めた核酸と連結される場合がある。非共有結合性手段の非限定的な例としては、イオン相互作用、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、水素結合、およびこれらの組合せがある。一部の実施形態では、レポーター剤は、最初の反応物に結合することができ、レポーター剤レベルの変化を使用して増幅産物を検出することができる。一部の実施形態では、レポーター剤は、核酸増幅が進行する際にのみ検出可能（または非検出可能）であり得る。一部の実施形態では、光学活性色素（例えば、蛍光色素）が、レポーター剤として使用され得る。色素の非限定的な例としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、ヨウ化プロピジウム（propidium  iodine）、ホエスト（Hoeste）、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマリン（fluorcoumanin）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシン、フェナントリジン、ならびにアクリジン、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモ二量体−１および−２、モノアジ化エチジウム（ethidium  monoazide）、ならびにＡＣＭＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３４５８０、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ、７−ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、ヒドロキシスチルブアミジン、ＳＹＴＯＸブルー、ＳＹＴＯＸグリーン、ＳＹＴＯＸオレンジ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＪＯＪＯ−１、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲゴールド、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲグリーンＩＩ、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＴＯ−４０、−４１、−４２、−４３、−４４、−４５（青色）、ＳＹＴＯ−１３、−１６、−２４、−２１、−２３、−１２、−１１、−２０、−２２、−１５、−１４、−２５（緑色）、ＳＹＴＯ−８１、−８０、−８２、−８３、−８４、−８５（橙色）、ＳＹＴＯ−６４、−１７、−５９、−６１、−６２、−６０、−６３（赤色）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃｙ−２、Ｃｙ−３、Ｃｙ−３．５、Ｃｙ−５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ−７、テキサスレッド、Ｐｈａｒ−Ｒｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＳｙｂｒグリーンＩ、ＳｙｂｒグリーンＩＩ、Ｓｙｂｒゴールド、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒグリーン、７−ＡＡＤ、エチジウムホモ二量体Ｉ、エチジウムホモ二量体ＩＩ、エチジウムホモ二量体ＩＩＩ、臭化エチジウム、ウンベリフェロン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、エリトロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、ユウロピウムおよびテルビウムを含むものなどの蛍光性ランタニド錯体、カルボキシテトラクロロフルオレセイン（carboxytetrachloro  fluorescein）、５および／もしくは６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（もしくは６−）ヨードアセトアミドフルオレセイン、５−｛［２（および３）−５−（アセチルメルカプト）−スクシニル］アミノ｝フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ−フルオレセイン）、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、５および／もしくは６カルボキシローダミン（ＲＯＸ）、７−アミノ−メチル−クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、ＢＯＤＩＰＹフルオロフォア、８−メトキシピレン−１，３，６−トリスルホン酸三ナトリウム塩、３，６−ジスルホネート−４−アミノ−ナフタルイミド、フィコビリタンパク質、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３５０、４０５、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０、および７９０色素、ＤｙＬｉｇｈｔ３５０、４０５、４８８、５５０、５９４、６３３、６５０、６８０、７５５、および８００色素、または他のフルオロフォアがある。
【０１１５】
一部の実施形態では、レポーター剤は、増幅産物とハイブリダイズしたとき光学的に活性である配列特異的オリゴヌクレオチドプローブであり得る。プローブの増幅産物への配列特異的結合に起因して、オリゴヌクレオチドプローブを使用すると、検出の特異性および感度を増大させることができる。プローブは、本明細書に記載の光学活性レポーター剤（例えば、色素）のいずれかに連結され得、付随する色素の光学活性を遮断することができるクエンチャーも含み得る。レポーター剤として有用に使用され得るプローブの非限定的な例としては、ＴａｑＭａｎプローブ、ＴａｑＭａｎ  Ｔａｍａｒａプローブ、ＴａｑＭａｎ  ＭＧＢプローブ、またはＬｉｏｎプローブがある。
【０１１６】
一部の実施形態では、レポーター剤は、プローブ上に隣接して位置した光学活性色素（例えば、蛍光色素）およびクエンチャーを含むＲＮＡオリゴヌクレオチド（oliognucleotide）プローブであり得る。色素がクエンチャーと近接近すると、色素の光学活性が遮断され得る。プローブは、増幅される標的配列に結合する場合がある。増幅中にＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性でプローブが分解すると、クエンチャーと色素が分離され、遊離色素は、その光学活性を回復し、それは、引き続いて検出することができる。
【０１１７】
一部の実施形態では、レポーター剤は、分子ビーコンであり得る。分子ビーコンは、例えば、ヘアピンコンホメーションでオリゴヌクレオチドの一端で連結されたクエンチャーを含む。オリゴヌクレオチドの他端では、例えば、蛍光色素などの光学活性色素である。ヘアピン構成では、光学活性色素およびクエンチャーは、クエンチャーが色素の光学活性を遮断することができるように、十分近くに近接される。しかし、増幅産物とハイブリダイズすると、オリゴヌクレオチドは、線形コンホメーションを帯び、増幅産物上の標的配列とハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドが線形化すると、光学活性色素およびクエンチャーが分離し、その結果光学活性が復活され、検出され得る。増幅産物上の標的配列に対する分子ビーコンの配列特異性は、検出の特異性および感度を改善することができる。
【０１１８】
一部の実施形態では、レポーター剤は、放射性種であり得る。放射性種の非限定的な例としては、１４Ｃ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、Ｔｃ９９ｍ、３５Ｓ、または３Ｈがある。
【０１１９】
一部の実施形態では、レポーター剤は、検出可能なシグナルを生成することができる酵素であり得る。検出可能なシグナルは、酵素の活性によって、酵素の基質または酵素が複数の基質を有する場合では特定の基質とともに生成され得る。レポーター剤として使用され得る酵素の非限定的な例としては、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、Ｉ２−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、およびルシフェラーゼがある。
【０１２０】
様々な態様では、増幅産物（例えば、増幅ＤＮＡ産物、増幅ＲＮＡ産物）が検出され得る。増幅ＤＮＡを含めた増幅産物の検出は、当技術分野で公知の任意の適当な検出法を用いて達成することができる。使用される検出法の特定のタイプは、例えば、特定の増幅産物、増幅に使用される反応器のタイプ、反応混合物中の他の試薬、レポーター剤が反応混合物中に含まれているか否か、およびレポーター剤が使用される場合、使用されるレポーター剤の特定のタイプに依存する場合がある。検出法の非限定的な例としては、光学的検出、分光学的検出、静電気的検出、電気化学的検出などがある。光学的検出法としては、それだけに限らないが、蛍光定量法およびＵＶ−可視吸光度がある。分光学的検出法としては、それだけに限らないが、質量分析、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、および赤外分光法がある。静電気的検出法としては、それだけに限らないが、例えば、ゲル電気泳動などのゲルベース技法がある。電気化学的検出法としては、それだけに限らないが、増幅産物を高速液体クロマトグラフィーで分離した後の増幅産物の電気化学的検出がある。
【０１２１】
様々な態様のいずれにおいても、方法の要素を完了するのに要求される時間は、方法の特定のステップに応じて変動し得る。例えば、方法の要素を完了するための時間は、約５分〜約１２０分であり得る。他の例では、方法の要素を完了するための時間は、約５分〜約６０分であり得る。他の例では、方法の要素を完了するための時間は、約５分〜約３０分であり得る。他の例では、方法の要素を完了するための時間は、１２０分未満もしくはそれに等しい、９０分未満もしくはそれに等しい、７５分未満もしくはそれに等しい、６０分未満もしくはそれに等しい、４５分未満もしくはそれに等しい、４０分未満もしくはそれに等しい、３５分未満もしくはそれに等しい、３０分未満もしくはそれに等しい、２５分未満もしくはそれに等しい、２０分未満もしくはそれに等しい、１５分未満もしくはそれに等しい、１０分未満もしくはそれに等しい、または５分未満もしくはそれに等しい場合がある。
【０１２２】
一部の実施形態では、増幅産物（例えば、増幅ＤＮＡ産物）の存在および／または量に関する情報は、レシピエントに出力され得る。増幅産物に関する情報は、当技術分野で公知の任意の適当な手段を介して出力され得る。一部の実施形態では、このような情報は、レシピエントに口頭で提供される場合がある。一部の実施形態では、このような情報は、レポートで提供される場合がある。レポートは、任意の数の所望の要素を含み得、非限定的な例としては、対象に関する情報（例えば、性別、年齢、人種、健康状態など）の生データ、処理データ（例えば、グラフ表示（例えば、図、チャート、データの表、データの概要）、決定したサイクル閾値、標的ポリヌクレオチドの出発量の計算）、標的核酸の存在についての結論、診断情報、予後情報、疾患情報など、およびこれらの組合せがある。レポートは、印刷されたレポート（例えば、ハードコピー）として提供されてもよく、または電子レポートとして提供されてもよい。一部の実施形態では、電子レポートが提供される場合を含めて、このような情報は、電子ディスプレイ（例えば、電子ディスプレイスクリーン）、例えば、モニターまたはテレビなど、増幅産物を得るのに使用されるユニットと作動可能に連結されたスクリーン、タブレットコンピュータースクリーン、モバイルデバイススクリーンなどを介して出力され得る。印刷されたレポートおよび電子レポートはともに、それぞれファイルまたはデータベースに保管することができ、その結果これらは、将来のレポートとの比較にアクセス可能である。
【０１２３】
さらに、レポートは、例えば、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続を含めた任意の適当な通信媒体を使用して地元の場所または遠隔地におけるレシピエントに伝達することができる。一部の実施形態では、レポートは、レシピエントのデバイス、例えば、パーソナルコンピューター、電話、タブレット、または他のデバイスなどに送ることができる。レポートは、オンラインで閲覧され、レシピエントのデバイスに保存され、または印刷される場合がある。レポートは、情報を伝達するための任意の他の適当な手段によって伝達することもでき、非限定的な例としては、レシピエントが受信および／またはレビューするためにハードコピーレポートを郵送することがある。
【０１２４】
さらに、このような情報は、様々なタイプのレシピエントに出力され得る。このようなレシピエントの非限定的な例としては、生体試料が得られた対象、医師、対象を処置している医師、臨床試験のための臨床モニター、看護師、研究者、検査技師、製薬会社の代表、ヘルスケア企業、バイオテクノロジー企業、病院、人間の援助団体、ヘルスケアマネージャー、電子システム（例えば、対象の医療記録を記憶する、例えば、１つもしくは複数のコンピューターおよび／または１種もしくは複数のコンピューターサーバー）、公衆衛生の労働者、他の医療関係者、ならびに他の医療施設がある。
【０１２５】
一態様では、本開示は、本明細書に開示の方法のいずれかによって一方法を遂行するシステムを提供する。別の態様では、本開示は、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅するシステムを提供する。システムは、（ａ）生体試料中の標的ＲＮＡを増幅するためのユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；（ｂ）ユーザーリクエストに応えて：生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り；反応器中の反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）変性化温度で６０秒未満またはそれに等しい変性化継続時間にわたって反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度で６０秒未満またはそれに等しい伸長継続時間にわたって反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、標的ＲＮＡの存在を示す増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって標的ＲＮＡを増幅する増幅モジュール；ならびに（ｃ）増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、レシピエントに標的ＲＮＡまたはＤＮＡ産物に関する情報を出力する、出力モジュールを含む。
【０１２６】
別の態様では、本開示は、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅するシステムを提供する。システムは、（ａ）生体試料中の標的ＲＮＡを増幅するためにユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；（ｂ）ユーザーリクエストに応えて：（ｉ）対象から得られた生体試料と、逆転写増幅および任意選択でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅を行うのに必要な試薬であって、（１）逆転写酵素、および（２）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り；（ｉｉ）反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を生じ；（ｉｉｉ）（ｉｉｉ）のその量の増幅ＤＮＡ産物を検出し；（ｉｖ）レシピエントにその量の増幅ＤＮＡ産物に関する情報を出力する増幅モジュールであって、（ｉ）〜（ｉｖ）を完了するための時間の量は、約３０分未満またはそれに等しい、増幅モジュール；ならびに（ｃ）増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、レシピエントに情報を伝達する、出力モジュールを含む。
【０１２７】
別の態様では、本開示は、対象から得られる生体試料中に存在する標的核酸を増幅するためのシステムを提供する。システムは、（ａ）生体試料中の標的ＲＮＡを増幅するためのユーザーリクエストを受け取る入力モジュール；（ｂ）ユーザーリクエストに応えて：生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および任意選択で逆転写酵素、ならびに（ｉｉ）標的核酸のためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応混合物を反応器内に受け取り；反応器中の反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応であって、各シリーズが、（ｉ）変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含み、個々のシリーズが、変性化条件および／または伸長条件に関して複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的核酸の存在を示す増幅産物を生成する増幅モジュール；ならびに（ｃ）増幅モジュールに作動可能にカップリングした出力モジュールであって、レシピエントに標的ＲＮＡまたはＤＮＡ産物に関する情報を出力する、出力モジュールを含む。
【０１２８】
別の態様では、本開示は、対象から得られる生体試料中の標的核酸を増幅するためのシステムを提供する。システムは、生体試料中の標的核酸を増幅する増幅プロトコールを実行するために、ユーザーがアクセス可能なグラフィカル要素を表示するユーザーインターフェースを有する電子ディスプレイスクリーンを含むことができる。システムは、電子ディスプレイスクリーンにカップリングされ、ユーザーがグラフィカル要素を選択すると増幅プロトコールを実行するようにプログラムされたコンピュータープロセッサー（本明細書の他の場所で記載したコンピュータープロセッサーを有する任意の適当なデバイスを含む）も含むことができる。増幅プロトコールは、生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬とを含む反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して増幅産物を生成することを含み得る。増幅産物は、生体試料中の標的核酸の存在を示すことができる。さらに、プライマーエクステンション反応の各シリーズは、変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で反応混合物をインキュベートし、その後、伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含むことができる。個々のシリーズは、変性化条件および／または伸長条件に関して複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なり得る。
【０１２９】
一部の実施形態では、標的核酸は、疾患に関連している場合がある。疾患は、例えば、ＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに関連している場合がある。ウイルスの例は、本明細書の他の場所で示されている。一部の実施形態では、疾患は、本明細書の他の場所で記載した病原体の例を含めて、病原性細菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）または病原性原虫（例えば、マラリアにおけるようなＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ）と関連している場合がある。一部の実施形態では、増幅プロトコールは、増幅産物の存在に基づいて前記疾患の存在についてアッセイすることに向けることができる。
【０１３０】
一部の場合では、ユーザーインターフェースは、グラフィカルユーザーインターフェースであり得る。さらに、ユーザーインターフェースは、１つまたは複数のグラフィカル要素を含むことができる。グラフィカル要素は、画像および／または文字情報、例えば、写真、アイコン、およびテキストなどを含むことができる。グラフィカル要素は、ユーザーインターフェース上で様々なサイズおよび向きを有することができる。さらに、電子ディスプレイスクリーンは、本明細書の他の場所で記載した例を含む任意の適当な電子ディスプレイであり得る。電子ディスプレイスクリーンの非限定的な例としては、モニター、モバイルデバイススクリーン、ラップトップコンピュータースクリーン、テレビ、ポータブルビデオゲームシステムスクリーン、および計算機のスクリーンがある。一部の実施形態では、電子ディスプレイスクリーンは、タッチスクリーン（例えば、静電容量式または抵抗膜式タッチスクリーン）を含み得、その結果、電子ディスプレイスクリーンのユーザーインターフェース上に表示されるグラフィカル要素は、電子ディスプレイスクリーンにユーザーが触れることによって選択することができる。
【０１３１】
一部の実施形態では、増幅プロトコールは、標的核酸のためのプライマーセットを選択することをさらに含み得る。このような場合では、プライマーセットは、標的核酸分子の１つまたは複数の配列を増幅するように特別に設計されたプライマーセットであってもよい。一部の実施形態では、増幅プロトコールは、標的核酸分子の１つまたは複数の配列に特異的であるレポーター剤（例えば、光学活性種を含むオリゴヌクレオチドプローブまたは本明細書の他の場所で記載した他のタイプのレポーター剤）を選択することをさらに含み得る。さらに、一部の実施形態では、試薬は、本明細書の他の場所で記載した核酸増幅に必要な任意の適当な試薬、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリメラーゼ、標的核酸のためのプライマーセット、（任意選択で）逆転写酵素などを含み得る。
【０１３２】
一部の実施形態では、ユーザーインターフェースは、複数のグラフィカル要素を表示することができる。グラフィカル要素のそれぞれは、複数の増幅プロトコールの中の所与の増幅プロトコールと関連していることができる。複数の増幅プロトコールのそれぞれは、プライマーエクステンション反応のシリーズの異なる組合せを含み得る。しかし一部の場合では、ユーザーインターフェースは、同じ増幅プロトコールに関連した複数のグラフィカル要素を表示し得る。それぞれが所与の増幅プロトコールと関連した複数のグラフィカル要素を有するユーザーインターフェースの一例を図２８Ａに示す。図２８Ａに示したように、コンピュータープロセッサーに付随した例示的な電子ディスプレイスクリーン２８００は、ユーザーインターフェース２８０１を含む。ユーザーインターフェース２８０１は、グラフィカル要素２８０２、２８０３、および２８０４の表示を含む。グラフィカル要素のそれぞれを、特定の増幅プロトコールと関連していることができる（例えば、グラフィカル要素２８０２について、「プロトコール１」、グラフィカル要素２８０３について「プロトコール２」、およびグラフィカル要素２８０４について「プロトコール４」）。ユーザーが特定のグラフィカル要素を選択すると（例えば、電子ディスプレイスクリーン２８００がユーザーインターフェースを有するタッチスクリーンを含む場合のユーザータッチ）、グラフィカル要素と関連した特定の増幅プロトコールを、付随したコンピュータープロセッサーによって実行することができる。例えば、ユーザーがグラフィカル要素２８０３を選択する場合、増幅「プロトコール２」が、付随したコンピュータープロセッサーによって実行される。３つのグラフィカル要素のみが図２８Ａの例示的なユーザーインターフェース２８０１に示されているのに対して、ユーザーインターフェースは、任意の適当な数のグラフィカル要素を有し得る。さらに、図２８Ａのユーザーインターフェース２８０１に示した各グラフィカル要素は、ただ１つの増幅プロトコールと関連しているのに対して、ユーザーインターフェースの各グラフィカル要素は、１つまたは複数の増幅プロトコール（例えば、一連の増幅プロトコール）に関連していることができ、その結果、付随したコンピュータープロセッサーは、ユーザーがグラフィカル要素と対話した後、一連の増幅プロトコールを実行する。
【０１３３】
一部の実施形態では、グラフィカル要素のそれぞれは、疾患と関連している場合があり、複数の増幅プロトコールの中の所与の増幅プロトコールは、対象における疾患の存在をアッセイすることに向けられている場合がある。したがって、このような場合では、ユーザーは、特定の疾患についてアッセイするための増幅プロトコール（または一連の増幅プロトコール）をランさせるためにグラフィカル要素を選択することができる。一部の実施形態では、疾患は、ウイルス、例えば、本明細書の他の場所で記載したウイルスの例を含めた任意のＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスなどと関連している場合がある。ウイルスの非限定的な例は、ヒト免疫不全ウイルスＩ（ＨＩＶ  Ｉ）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ（ＨＩＶ  ＩＩ）、オルソミクソウイルス、エボラウイルス、デングウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、Ｈ１Ｎ１ウイルス、Ｈ３Ｎ２ウイルス、Ｈ７Ｎ９ウイルス、またはＨ５Ｎ１ウイルス）、ヘペウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（例えば、アーマードＲＮＡ−Ｃ型肝炎ウイルス（ＲＮＡ−ＨＣＶ））、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単核球症ウイルス、サイトメガロウイルス、ＳＡＲＳウイルス、西ナイル熱ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、天然痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス５５型（ＡＤＶ５５）、アデノウイルス７型（ＡＤＶ７））、および水痘ウイルスがある。一部の実施形態では、疾患は、本明細書の他の場所で記載した病原体の例を含めて、病原性細菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）または病原性原虫（例えば、マラリアにおけるようなＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ）と関連している場合がある。
【０１３４】
それぞれが所与の増幅プロトコールと関連している複数のグラフィカル要素を有するユーザーインターフェースの一例を、図２８Ｂに示す。図２８Ｂに示したように、コンピュータープロセッサーと付随した例示的な電子ディスプレイスクリーン２８１０は、ユーザーインターフェース２８１１を含む。ユーザーインターフェース２８１１は、グラフィカル要素２８１２、２８１３、および２８１４の表示を含む。グラフィカル要素のそれぞれは、特定の疾患に関連している（例えば、グラフィカル要素２８１２について「エボラ」、グラフィカル要素２８１３について「Ｈ１Ｎ１」、およびグラフィカル要素２８１４について「Ｈｅｐ  Ｃ」（Ｃ型肝炎））、すなわち、ひいては特定の疾患に向けられた１つまたは複数の増幅プロトコールに関連していることができる。ユーザーが特定のグラフィカル要素を選択すると（例えば、電子ディスプレイスクリーン２８１０がユーザーインターフェースを有するタッチスクリーンを含む場合のユーザータッチ）、グラフィカル要素と関連した疾患と関連した特定の増幅プロトコール（複数可）を、付随したコンピュータープロセッサーによって実行することができる。例えば、ユーザーがグラフィカル要素２８１２と対話する場合、エボラウイルスについてアッセイすることと関連した１つまたは複数の増幅プロトコールを、付随したコンピュータープロセッサーによって実行することができる。３つのグラフィカル要素のみが図２８Ｂの例示的なユーザーインターフェース２８１１に示されているのに対して、ユーザーインターフェースは、それぞれが様々な疾患に対応する任意の適当な数のグラフィカル要素を有し得る。さらに、図２８Ｂのユーザーインターフェース２８１１に示した各グラフィカル要素は、ただ１つの疾患と関連しているのに対して、ユーザーインターフェースの各グラフィカル要素は、１つまたは複数の疾患に関連していることができ、その結果、付随したコンピュータープロセッサーは、ユーザーがグラフィカル要素を選択した後、一連の増幅プロトコール（例えば、特定の疾患に向けられたそれぞれ個々の増幅プロトコール）を実行する。例えば、グラフィカル要素は、エボラウイルスおよびＨ１Ｎ１ウイルスに対応している場合があり、その結果、このグラフィカル要素を選択すると、付随したコンピュータープロセッサーは、エボラウイルスおよびＨ１Ｎ１ウイルスの両方のための増幅プロトコールを実行する。
【０１３５】
様々な態様では、システムは、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的核酸（例えば、標的ＲＮＡ、標的ＤＮＡ）を増幅するためのユーザーリクエストを受け取る入力モジュールを含む。このようなユーザーリクエストを受け入れることができる任意の適当なモジュールが使用され得る。入力モジュールは、例えば、１つまたは複数のプロセッサーを含むデバイスを含み得る。プロセッサー（例えば、コンピュータープロセッサー）を含むデバイスの非限定的な例は、デスクトップコンピューター、ラップトップコンピューター、タブレットコンピューター（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ  Ｔａｂ）、携帯電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ（登録商標）対応電話）、パーソナルデジタルアシスタント（ＰＤＡ）、ビデオゲームコンソール、テレビ、音楽再生デバイス（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｏｄ（登録商標））、ビデオ再生デバイス、ページャー、および計算機がある。プロセッサーは、１つもしくは複数のコントローラー、演算部、および／もしくはコンピューターシステムの他のユニットに付随している場合があり、または望まれるファームウェア中に据え付けられている場合がある。ソフトウェアで遂行される場合、ルーチン（またはプログラム）は、任意のコンピューター可読メモリー、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリー、磁気ディスク、レーザーディスク（登録商標）、または他の記憶媒体中などに記憶され得る。同様に、このソフトウェアは、例えば、通信チャネル、例えば、電話線、インターネット、ローカルイントラネット、無線接続などによって、または可搬媒体、例えば、コンピューター可読ディスク、フラッシュドライブなどを介してを含めた任意の公知の送達方法を介してデバイスに送達され得る。様々なステップを様々なブロック、オペレーション、ツール、モジュール、またはテクニックとして遂行することができ、これらは、ひいては、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、またはこれらの任意の組合せで遂行することができる。ハードウェアで遂行される場合、ブロック、オペレーション、テクニックなどの一部またはすべては、例えば、カスタム集積回路（ＩＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルロジックアレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）などで遂行され得る。
【０１３６】
一部の実施形態では、入力モジュールは、標的核酸の増幅を実施するためのユーザーリクエストを受け取るように構成されている。入力モジュールは、直接に（例えば、ユーザーによって操作される入力デバイス、例えば、キーボード、マウス、もしくはタッチスクリーンなどによって）、または間接的に（例えば、インターネットによってを含めた有線接続もしくは無線接続によって）ユーザーリクエストを受け取ることができる。出力電子機器を介して、入力モジュールは、増幅モジュールにユーザーのリクエストを提供することができる。一部の実施形態では、入力モジュールは、ユーザーが標的核酸を増幅するためのリクエストを提供することを可能にするように構成されているグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）などのユーザーインターフェース（ＵＩ）を含み得る。ＧＵＩは、テキストコンポーネント、グラフィカルコンポーネント、および／またはオーディオコンポーネントを含むことができる。ＧＵＩは、コンピュータープロセッサーを含むデバイスのディスプレイを含めた電子ディスプレイに備えることができる。このようなディスプレイは、抵抗膜式または静電容量式タッチスクリーンを含み得る。
【０１３７】
ユーザーの非限定的な例としては、生体試料が得られた対象、医療関係者、臨床医（例えば、医者、看護師、検査技師）、実験室職員（例えば、病院の検査技師、研究科学者、製薬科学者）、臨床試験のための臨床モニター、またはヘルスケア産業におけるその他のユーザーがある。
【０１３８】
様々な態様では、システムは、入力モジュールによって受け取られたユーザーリクエストに応答して標的核酸またはその部分に対して核酸増幅反応を実施するための増幅モジュールを含む。増幅モジュールは、本明細書に記載の方法のいずれかを実行することができる場合があり、流体操作デバイス、１つまたは複数のサーモサイクラー、１つまたは複数の反応器（例えば、サーモサイクラーの熱ブロックのウェル）を受け取るための手段、増幅産物を検出することができる検出器（例えば、光検出器、分光学的検出器、電気化学検出器）、ならびにレシピエントに増幅産物（例えば、増幅ＤＮＡ産物）の存在および／または量に関する情報（例えば、生データ、処理されたデータ、または本明細書に記載の任意の他のタイプの情報）を出力するための手段のいずれかを含み得る。一部の場合では、増幅モジュールは、本明細書の他の場所で記載したコンピュータープロセッサーを有するデバイスを含み得、適切なソフトウェアを活用して検出からの生データを分析することができる場合もある。さらに、一部の実施形態では、増幅モジュールは、入力モジュールから指示を受け取るのに必要な入力電子機器を含み得、出力モジュールと交信するのに必要な出力電子機器を含み得る。
【０１３９】
一部の実施形態では、反応器への材料の供給、核酸の増幅、増幅産物の検出、および情報の出力のうちの１つまたは複数のステップは、増幅モジュールによって自動化されている場合がある。一部の実施形態では、自動化は、１つまたは複数の流体ハンドラーおよび関連したソフトウェアの使用を含み得る。いくつかの市販の流体操作システムは、このようなプロセスの自動化を実施するのに利用することができる。このような流体ハンドラーの非限定的な例としては、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｅｃａｎ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ａｐｒｉｃｏｔ  Ｄｅｓｉｇｎ、およびＶｅｌｏｃｉｔｙ  １１からの流体ハンドラーがある。
【０１４０】
一部の実施形態では、増幅モジュールは、リアルタイム検出機器を含み得る。このような機器の非限定的な例としては、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７３００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７９００  ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）；ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）；Ｍｘ３０００Ｐ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｘ３００５Ｐ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ、およびＭｘ４０００（登録商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）；ならびにＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって流通されている）がある。一部の実施形態では、増幅モジュールは、別の自動機器、例えば、ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡｍｐｌｉＰｒｅｐ／ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＩＧＲＩＳ  ＤＴＳシステム（Ｈｏｌｏｇｉｃ  Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＡＮＴＨＥＲシステム（Ｈｏｌｏｇｉｃ  Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＢＤ  ＭＡＸ（商標）システム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＧｅｎｅＸｐｅｒｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｅｉｄ）、Ｆｉｌｍａｒｒａｙ（登録商標）（ＢｉｏＦｉｒｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）システム、ｉＣｕｂａｔｅシステム、ＩＤＢｏｘシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、ＥｎｃｏｍｐａｓｓＭＤｘ（商標）（Ｒｈｅｏｎｉｘ）システム、Ｌｉａｔ（商標）Ａａｎｌｙｚｅｒ（ＩＱｕｕｍ）システム、Ｂｉｏｃａｒｔｉｓ’Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｌａｔｆｏｒｍシステム、Ｅｎｉｇｍａ（登録商標）ＭＬシステム（Ｅｎｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｔ２Ｄｘ（登録商標）システム（Ｔ２  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｖｅｒｉｇｅｎｅ（登録商標）システム（ＮａｎｏＳｐｈｅｒｅ）、Ｇｒｅａｔ  Ｂａｓｉｎ’ｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｕｎｙｖｅｒｏ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｃｕｒｅｔｉｓ）、ＰａｎＮＡＴシステム（Ｍｉｃｒｏｎｉｃｓ）、またはＳｐａｒｔａｎ（商標）ＲＸシステム（Ｓｐａｒｔａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などを含み得る。
【０１４１】
様々な態様では、システムは、増幅モジュールに作動可能に接続された出力モジュールを含む。一部の実施形態では、出力モジュールは、入力モジュールのための上述したプロセッサーを有するデバイスを含み得る。出力モジュールは、本明細書に記載の入力デバイスを含み得、かつ／または増幅モジュールと通信するための入力電子機器を含み得る。一部の実施形態では、出力モジュールは、電子ディスプレイ、一部の場合では、ＵＩを含む電子ディスプレイであり得る。一部の実施形態では、出力モジュールは、例えば、インターネットなどのコンピューターネットワークに作動可能にカップリングした通信インターフェースである。一部の実施形態では、出力モジュールは、コンピューターネットワーク、無線ネットワーク、ローカルイントラネット、またはインターネットを含めた任意の適当な通信媒体を使用して地元の場所または遠隔地でレシピエントに情報を伝達することができる。一部の実施形態では、出力モジュールは、増幅モジュールから受け取ったデータを分析することができる。一部の場合では、出力モジュールは、レポートを作成し、レシピエントにレポートを伝達することができるレポートジェネレーターを含み、レポートは、本明細書の他の場所で記載した増幅産物の量および／または存在に関する任意の情報を含有する。一部の実施形態では、出力モジュールは、生データ、または増幅モジュールに含まれるソフトウェアによって実施されるデータ分析の形態などで、増幅モジュールから受け取った情報に応答して自動的に情報を伝達し得る。代わりに、出力モジュールは、ユーザーから指示を受け取った後に情報を伝達することができる。出力モジュールによって伝達された情報は、電子的に閲覧し、またはプリンターから印刷することができる。
【０１４２】
入力モジュール、増幅モジュール、および出力モジュールの１つまたは複数は、同じデバイス内に収められる場合があり、または同じコンポーネントの１つまたは複数を含み得る。例えば、増幅モジュールは、入力モジュール、出力モジュール、または両方も含み得る。他の例では、プロセッサーを含むデバイスは、入力モジュールおよび出力モジュールの両方の中に含められる場合がある。ユーザーは、標的核酸を増幅することをリクエストするためにデバイスを使用することができ、レシピエントに増幅産物に関する情報を伝達する手段として使用される場合もある。一部の場合では、プロセッサーを含むデバイスは、３つすべてのモジュール内に含められる場合があり、その結果、プロセッサーを含むデバイスは、増幅モジュールまたは任意の他のモジュール内に含まれる器具類（例えば、サーモサイクラー、検出器、流体操作デバイス）を制御し、それに指示を提供し、それから情報を受け取るのにも使用され得る。
【０１４３】
本明細書に記載の方法によって標的核酸を増幅するための例示的なシステムは、図１に表されている。システムは、入力および出力モジュールの両方の一部として機能を果たし得るコンピューター１０１を含む。ユーザーは、核酸増幅の準備のできた反応混合物を含む反応器１０２を増幅モジュール１０４に入れる。増幅モジュールは、サーモサイクラー１０５および検出器１０６を含む。入力モジュール１０７は、反応混合物中の標的核酸を増幅するためのユーザーのリクエストを受け取ることができるコンピューター１０１および付随した入力デバイス１０３（例えば、キーボード、マウスなど）を含む。入力モジュール１０７は、ユーザーのリクエストを増幅モジュール１０４に伝え、核酸増幅がサーモサイクラー１０５内で始まる。増幅が進行するにつれて、増幅モジュールの検出器１０６が増幅産物を検出する。増幅産物に関する情報（例えば、検出器によって得られる生データ）は、検出器１０６からコンピューター１０１に伝達され、このコンピューターは、出力モジュール１０８のコンポーネントとしても機能を果たす。コンピューター１０１は、増幅モジュール１０４から情報を受け取り、情報に対して任意の追加の操作を実施し、次いで処理された情報を含有するレポートを作成する。レポートが作成されると、次いでコンピューター１０１は、コンピューターネットワークインターフェース１１０を介するコンピューターネットワーク（例えば、イントラネット、インターネット）によって、プリンター１１１を介したハードコピーフォーマットで、またはコンピューター１０１に作動可能に連結された電子ディスプレイ１１２を介してそのエンドレシピエント１０９にレポートを伝達する。一部の場合では、電子ディスプレイ１１２。
【０１４４】
一態様では、本開示は、１つまたは複数のプロセッサーによって実行されると、本明細書に開示の方法のいずれかによる一方法を遂行する機械実行可能コードを含むコンピューター可読媒体を提供する。別の態様では、本開示は、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによって実行されると、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法を遂行する機械実行可能コードを含むコンピューター可読媒体であって、方法は、ａ）生体試料と、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅と並行して逆転写増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉｉ）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと、（ｂ）反応器中の反応混合物を、各サイクルが、（ｉ）６０秒未満またはそれに等しい変性化継続時間にわたって変性化温度で反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）６０秒未満またはそれに等しい伸長継続時間にわたって伸長温度で反応混合物をインキュベートすることを含む、多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、標的ＲＮＡの存在を示す増幅ＤＮＡ産物を生成し、それによって標的ＲＮＡを増幅することとを含む、コンピューター可読媒体を提供する。
【０１４５】
別の態様では、本開示は、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによって実行されると、対象から直接得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法を遂行する機械実行可能コードを含むコンピューター可読媒体であって、方法は、（ａ）対象から得られた生体試料を受け取ることと；（ｂ）生体試料と、逆転写増幅、および任意選択でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）逆転写酵素および（ｉｉ）標的ＲＮＡのためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと；（ｃ）反応混合物を多重のサイクルのプライマーエクステンション反応に付して、生体試料中の標的ＲＮＡの存在を示す検出可能量の増幅ＤＮＡ産物を得ることと；（ｄ）（ｃ）のその量のＤＮＡ産物を検出することと；（ｅ）レシピエントにその量のＤＮＡ産物に関する情報を出力することとを含み、（ａ）〜（ｅ）を完了するための時間は、約３０分未満またはそれに等しい、コンピューター可読媒体を提供する。
【０１４６】
一態様では、本開示は、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによって実行されると、対象から得られる生体試料中に存在する標的リボ核酸（ＲＮＡ）を増幅する方法を遂行する機械実行可能コードを含むコンピューター可読媒体であって、方法は、（ａ）生体試料と、核酸増幅を行うのに必要な試薬であって、（ｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよび任意選択で逆転写酵素、ならびに（ｉｉ）標的核酸のためのプライマーセットを含む、試薬とを含む反応器を準備して、反応混合物を得ることと；（ｂ）反応器中の反応混合物を、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応であって、各シリーズが、（ｉ）変性化温度および変性化継続時間によって特徴付けられる変性化条件下で反応混合物をインキュベートし、その後、（ｉｉ）伸長温度および伸長継続時間によって特徴付けられる伸長条件下で反応混合物をインキュベートする２つまたはそれ超のサイクルを含み、個々のシリーズが、変性化条件および／または伸長条件に関して複数のうちの少なくとも１つの他の個々のシリーズと異なる、複数のシリーズのプライマーエクステンション反応に付して、標的核酸に由来する増幅産物を生成することとを含む、コンピューター可読媒体を提供する。
【０１４７】
コンピューター可読媒体は、それだけに限らないが、実体のある（または非一時的）記憶媒体、搬送波媒体、または物理的な伝送媒体を含めた多くの形態を採り得る。非揮発性記憶媒体としては、例えば、計算ステップ、処理ステップなどを遂行するのに使用され得るような任意のコンピューター（複数可）などの中の記憶デバイスのいずれかなどの光学または磁気ディスクがある。揮発性記憶媒体としては、コンピューターのメインメモリなどのダイナミックメモリがある。実体のある伝送媒体としては、コンピューターシステム内にバスを含むワイヤーを含めた、同軸ケーブル；銅線および光ファイバーがある。搬送波伝送媒体は、無線周波数（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信中に生成されるものなどの電気信号もしくは電磁信号、または音波もしくは光波の形態を採ることができる。したがって、コンピューター可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁性媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、もしくはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、およびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリーチップもしくはカートリッジ、搬送波輸送データもしくはインストラクション、このような搬送波を輸送するケーブルもしくはリンク、またはコンピューターがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読むことができる任意の他の媒体がある。コンピューター可読媒体のこれらの形態の多くは、実行のために１つまたは複数のインストラクションの１つまたは複数のシーケンスをプロセッサーに搬送することに関与している場合がある。
【実施例】
【０１４８】
（実施例１）
ウイルスストック試料および生体試料中の核酸の増幅および検出
増幅および検出実験を実施して、ウイルス標準試料および生体試料から得られた結果を比較した。ＲＮＡウイルス病原体を含む生体試料およびウイルス病原体の標準試料を、病原体のＲＮＡが増幅されるように増幅条件に付した。一連の実験を、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１（２００７）インフルエンザウイルスのそれぞれについて行った。各生体試料は、口咽頭スワブを介して対象から直接得た。各ウイルス標準試料は、ウイルスを含む原液の連続希釈液として得た。Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１（２００７）の濃度は、１０６ＩＵ／ｍＬであった。Ｈ５Ｎ１およびＨ１Ｎ１（２００７）については、１／２、１／２０、１／２００、１／２０００、および１／２００００の希釈液を増幅にかけた。各実験セットにおいて、陰性対照（例えば、ウイルスＲＮＡを含まない試料）も増幅にかけた。
【０１４９】
各試料５マイクロリットルを、ウイルスＲＮＡの逆転写を行うのに必要な試薬および逆転写から得られる相補的ＤＮＡの増幅（例えば、並列の核酸増幅）を完了するのに必要な試薬と２５μＬの反応管中で組み合わせた。逆転写およびＤＮＡ増幅を行うのに必要な試薬は、逆転写酵素（例えば、ＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔおよびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ転写酵素）、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、およびｄＮＴＰを含む市販の予混合物（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲまたはＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲキット）として供給した。さらに、反応管に、増幅ＤＮＡ産物を検出するためのＦＡＭ色素を含むＴａｑＭａｎプローブも含めた。増幅ＤＮＡ産物を生成するために、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９５℃で５分、その後４５℃で２０分、その後９５℃で２分、その後９５℃で５秒と５５℃で３０秒の４０サイクルを含む変性化および伸長条件のプロトコールに従って、各反応混合物をインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。
【０１５０】
Ｈ３Ｎ２の増幅結果を図２にグラフで表し（図２Ａは、様々なウイルス標準試料に対応し、図２Ｂは、生体試料に対応する）、Ｈ１Ｎ１（２００７）の増幅結果を図３にグラフで表す（図３Ａは、様々なウイルス標準試料に対応し、図３Ｂは、生体試料に対応する）。ＦＡＭ色素の記録された蛍光をサイクルの数に対してプロットする。
【０１５１】
図２Ａに示したように、Ｈ３Ｎ２ウイルス標準試料のそれぞれは、陰性対照に対して検出可能なシグナルを示し、Ｃｔ値は、１８〜３２の範囲であった。図２Ｂに示したように、ウイルスＨ３Ｎ２生体試料のそれぞれは、陰性対照に対して検出可能なシグナルを示し、Ｃｔ値は、２９〜３５の範囲であった。
【０１５２】
図３Ａに示したように、かつ１／２００００希釈液を例外として、Ｈ１Ｎ１（２００７）ウイルス標準試料のそれぞれは、陰性対照に対して検出可能なシグナルを示し、Ｃｔ値は、２４〜３５の範囲であった。図３Ｂに示したように、Ｈ１Ｎ１（２００７）生体試料のそれぞれは、陰性対照に対して検出可能なシグナルを示し、Ｃｔ値は、２８〜３５の範囲であった。
【０１５３】
一般に、図２および図３に示したデータは、検査したウイルスを、良好な感度で、５０ＩＵ／ｍＬという低い濃度で、４対数の濃度範囲にわたって、約４０以下のサイクル閾値で増幅ＤＮＡ産物を介して検出することができたことを示す。さらに、データは、対象から得た生体試料から得たウイルスＲＮＡの検出も同様の様式で検出することができたことも示す。
【０１５４】
（実施例２）
異なる緩衝系中のウイルス核酸の増幅および検出
増幅および検出実験を実施して、増幅のために異なる緩衝系を使用して得た結果を比較した。一連の実験は、２つの異なる緩衝系、Ｓ１およびＳ２について行った。Ｓ１緩衝液は、双性イオン緩衝剤およびＢＳＡを含んでおり、Ｓ２緩衝液は、双性イオン緩衝剤および水酸化ナトリウムを含んでいた。各緩衝液の実験は、ウイルスを含む原液の連続希釈液として得た一連のＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス標準試料を使用して完了した。Ｈ５Ｎ１の濃度は、１０６ＩＵ／ｍＬであった。１／２、１／２０、１／２００、１／２０００、１／２００００、１／２０００００の希釈液、および陰性対照を、増幅にかけた。
【０１５５】
各試料５マイクロリットルを、ウイルスＲＮＡの逆転写を行うのに必要な試薬および逆転写から得られる相補的ＤＮＡの増幅（例えば、並列の核酸増幅）を完了するのに必要な試薬と２５μＬの反応管中で組み合わせた。逆転写およびＤＮＡ増幅を行うのに必要な試薬は、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および適切なＳ１またはＳ２緩衝液を含んでいた。さらに、反応管に、増幅ＤＮＡ産物を検出するためのＦＡＭ色素を含むＴａｑＭａｎプローブも含めた。増幅ＤＮＡ産物を生成するために、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９５℃で５分、その後４５℃で２０分、その後９５℃で２分、その後９５℃で５秒と５５℃で３０秒の４０サイクルを含む変性化および伸長条件のプロトコールに従って、各反応混合物をインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。
【０１５６】
緩衝系Ｓ１の増幅結果を図４Ａにグラフで表す。緩衝系Ｓ２の増幅結果を、図４Ｂにグラフで表した。ＦＡＭ色素の記録された蛍光をサイクルの数に対してプロットする。
【０１５７】
図４Ａに示したように、緩衝系Ｓ１中で増幅させたウイルス標準試料のそれぞれは、陰性対照に対して検出可能なシグナルを示し、Ｃｔ値は、２５〜３６の範囲であった。図４Ｂに示したように、緩衝液Ｓ２中で増幅させたウイルス標準試料のそれぞれは、陰性対照に対して検出可能なシグナルを示し、Ｃｔ値は、２５〜３５の範囲であった。
【０１５８】
一般に、図４に示したデータは、検査したウイルスを、良好な感度で、５０ＩＵ／ｍＬという低い濃度で、５対数の濃度範囲にわたって、約４０以下のサイクル閾値で増幅ＤＮＡ産物を介して検出することができたことを示す。さらに、データは、同様の増幅結果を、異なる緩衝系を用いて得ることができることも示す。
【０１５９】
（実施例３）
血漿試料中のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の増幅および検出
増幅実験を実施して、生体試料中の標的核酸を検出する増幅法のロバスト性を判定した。様々な濃度（例えば、１ミリリットル当たり５０感染ユニット（ＩＵ／ｍＬ）、２００ＩＵ／ｍＬ、２０００ＩＵ／ｍＬ、２００００ＩＵ／ｍＬ）でＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）を含む希釈したヒト血漿試料をそれぞれ増幅反応に付した。ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体を介して複製するＤＮＡウイルスである。ＨＢＶは、ＤＮＡウイルスの直接ＰＣＲを介して検出可能である。複数の試料（ｎ＝２〜４）を、陰性対照（例えば、ＨＢＶを含まない血漿）の複数の試料に加えて、各濃度について検査した。
【０１６０】
反応混合物を得るために５０μＬ反応管中の、ＲＮＡの逆転写を行うのに必要な試薬および逆転写から得られる相補的ＤＮＡの増幅（例えば、並列の核酸増幅）を完了するのに必要な試薬を含む各試料２．５μＬ。逆転写およびＤＮＡ増幅を行うのに必要な試薬は、逆転写酵素（例えば、ＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔおよびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ転写酵素）、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、およびｄＮＴＰを含む市販の予混合物（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲまたはＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲキット）として供給した。さらに、混合物に、増幅ＤＮＡ産物を検出するためのＦＡＭ色素を含むＴａｑＭａｎプローブも含めた。また、反応混合物に、血漿中に見つかる増幅阻害剤の阻害作用を防止するための双性イオン緩衝剤およびウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）酵素を含めた。リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（thermocyler）内で、９４℃で１分、その後５０℃で１０分、その後９４℃で２分、その後９４℃で５秒と５８℃で３５秒の５０サイクルを含む変性化および伸長条件のプロトコールに従って、各反応混合物をインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。
【０１６１】
増幅結果を図５にグラフで表し、判定したＣｔ値を表１に表化する。ＦＡＭ色素の記録された相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、図５にサイクルの数に対してプロットする。図５および表１に示したように、ＨＢＶを検査した各濃度で検出することができ、サイクル閾値は、２８．９９〜３９．３９の範囲であった。一般に、より高い濃度の試料は、より低いサイクル閾値に対応した。
【０１６２】
一般に、図５および表１に示したデータは、ＨＢＶを、良好な感度で、５０ＩＵ／ｍＬという低い濃度で（検査した最低）、約４０以下のサイクル閾値で増幅ＤＮＡ産物を介して検出することができたことを示す。検査した最高の濃度（２００００ＩＵ／ｍＬ）は、検査した最低の濃度（５０ＩＵ／ｍＬ）より４００倍濃縮されていたが、サイクル閾値は、より低い濃度について約２５％だけより高く、増幅スキームが一般にロバストであったことを示す。
【表１】
0006723925.tif 000002
【０１６３】
（実施例４）
生体試料中の核酸を増幅する前の生体試料の予熱、および一連の増幅反応
増幅実験を行って、検出感度に対する生体試料の予熱の効果を判定し、検出感度に対する多重のシリーズの増幅反応を使用する効果も判定した。
【０１６４】
各反応混合物が病原性種１μＬ、適切な核酸増幅反応（例えば、ＲＮＡ種について逆転写およびＤＮＡ増幅、ならびにＤＮＡ種についてＤＮＡ増幅）を完了するのに必要な試薬、ならびにＦＡＭ色素を含むＴａｑＭａｎプローブを含む、２０の反応混合物２５μＬを調製した。反応混合物のうちの４つは、Ｈ１Ｎ１（２００７）（すなわち、ＲＮＡウイルス）を含有し、反応混合物のうちの４つは、Ｈ３Ｎ２（すなわち、ＲＮＡウイルス）を含有し、反応混合物のうちの４つは、Ｈ１Ｎ１（２００９）を含有し、反応混合物のうちの４つは、結核（ＴＢ）（すなわち、細菌試料）を含有し、反応混合物のうちの４つは、アリューシャン病ウイルス（ＡＤＶ）（すなわち、ＤＮＡウイルス）を含有していた。Ｈ１Ｎ１（２００７）、Ｈ１Ｎ１（２００９）、Ｈ３Ｎ２、およびＡＤＶ病原性種は、対象から得た口咽頭スワブに由来した。ＴＢは、細菌ストックから得た。
【０１６５】
予熱および増幅プロトコールの様々な組合せを利用した。これらを表２に要約する。各病原性種の第１の反応混合物について、病原性種を９５℃で１０分予熱した後、反応混合物に添加した。反応混合物に病原性種を添加した後、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９５℃で２分、その後９５℃で５秒と５５℃で３０秒の４０サイクルを含む変性化および伸長条件のプロトコールに従って反応混合物をインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。これらの反応混合物をＰＨ−１混合物と呼ぶ。
【０１６６】
各病原性種の第２の反応混合物について、病原性種を５０℃で３０分予熱した後、反応混合物に添加した。反応混合物に病原性種を添加した後、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９５℃で２分、その後９５℃で５秒と５５℃で３０秒の４０サイクルを含む変性化および伸長条件のプロトコールに従って反応混合物をインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。これらの反応混合物をＰＨ−２混合物と呼ぶ。
【０１６７】
各病原性種の第３の反応混合物について、病原性種は、反応混合物に添加する前に予熱しなかった。リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９５℃で１分、その後５５℃で１０分、その後９５℃で２分、その後９５℃で５秒と５５℃で３０秒の４０サイクルを含む変性化および伸長条件のプロトコールに従ってこれらの反応混合物をインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。これらの反応混合物をＰＴＣ−１混合物と呼ぶ。
【０１６８】
各病原性種の第４の反応混合物について、病原性種は、反応混合物に添加する前に予熱しなかった。これらの反応混合物を、各シリーズが変性化および伸長条件の多重のサイクルを含む、複数のシリーズの増幅反応を含むプロトコールに付した。リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９５℃で１分、その後、シリーズ１（９５℃  ５秒間、１℃／サイクルでステップダウンして６０〜５０℃の２０秒、および６０℃  １０秒間）の１０サイクル、その後９５℃  ２分間、その後シリーズ２（９５℃  ５秒間、５５℃  ３０秒間）の４０サイクルを含むプロトコールに従って反応混合物をインキュベートした。シリーズ１およびシリーズ２は、伸長温度および伸長継続時間が異なる。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。これらの反応混合物をＰＴＣ−２混合物と呼ぶ。
【表２】
0006723925.tif 000003
【０１６９】
各病原性種からの結果を、図６（Ｈ１Ｎ１（２００７）、図７（Ｈ３Ｎ２）、図８（Ｈ１Ｎ１（２００９））、図９（ＴＢ）、および図１０（ＡＤＶ）にグラフで表す。図６〜１０のそれぞれにおけるアイテムＡは、反応混合物ＰＨ−１およびＰＨ−２について得られた結果を表し、一方、図６〜１０のそれぞれにおけるアイテムＢは、反応混合物ＰＴＣ−１およびＰＴＣ−２について得られた結果を表す。各実験について判定したＣｔ値を表３に要約する。Ｃｔ値は、ＰＨ−１およびＰＨ−２  ＡＤＶ反応混合物について判定することができず、図１０Ａに示したデータに相応する。
【０１７０】
表３に示したデータによれば、間のＣｔ値は、ＰＨ−１とＰＨ−２反応混合物の間で事実上同様であり、病原性種（または病原性種を含む生体試料）を一連の条件で予熱して同様の検出感度を得ることができることを示した。さらに、ＰＴＣ−１反応混合物は、ＰＨ−１およびＰＨ−２反応混合物について判定したものと同様のＣｔ値を有していた。ＰＴＣ−１およびＰＨ−１／ＰＨ−２プロトコールは、ＰＴＣ−１が予熱ステップを含まなかったことを除いて同様であった。したがって、ＰＴＣ−１データのＰＨ−１／ＰＨ−２データとの比較は、病原性種を反応混合物に供給する前の病原性種の予熱は、良好な感度を伴った結果を得るのに必要でない場合があることを示す。しかし、一部の場合では、ＴＢおよびＡＤＶ試料について、予熱は、予熱なしより悪くさえなり得る。
【０１７１】
しかし、検査したすべての病原性種について、ＰＴＣ−２のＣｔ値は、ＰＨ−１、ＰＨ−２、またはＰＴＣ−１のいずれよりも低かった。ＰＴＣ−１およびＰＴＣ−２のデータの比較は、反応混合物を、各シリーズが変性化および伸長条件の多重のサイクルを含む多重のシリーズの増幅反応に付すと、検出感度が改善され得ることを示す。
【表３】
0006723925.tif 000004
【０１７２】
（実施例５）
試料の多重化
増幅および検出実験を実施して、様々な増幅プロトコールをベンチマークし、多重化が実現され得るか否かを判定した。ＲＮＡ（例えば、Ｈ１Ｎ１（２００７）、Ｈ１Ｎ１（２００９）、Ｈ３Ｎ２）、またはＤＮＡ（例えば、ＡＤＶ、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）ウイルス病原体、またはＤＮＡ細菌性病原体（例えば、ＴＢ）を含む生体試料を、様々な増幅条件に付した。各生体試料は、細菌ストックから得たＴＢ試料を除いて、口咽頭スワブを介して対象から直接得た。各試料１マイクロリットルを、本明細書に記載するように核酸増幅を行い、増幅産物を検出するのに必要な試薬と２５μＬ反応管中で組み合わせて反応混合物を得た。
【０１７３】
増幅プロトコールの多重化能力を評価するために、それぞれがＨ３Ｎ２、ＡＤＶ、またはＨ３Ｎ２とＡＤＶの混合物の１つを含む、３つの反応混合物を、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９４℃で２分、４５℃で２０分、９４℃で１分、その後９４℃で５秒と５５℃で３５秒の５０サイクルを含む増幅プロトコールに従ってインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。
【０１７４】
実験の結果を、図１１にグラフで表し、表４で以下に示す。図１１に示したように、Ｈ３Ｎ２およびＴＢはともに、他方との組み合わせ、または他方の非存在下のとき同様に検出することができた。ＡＤＶの非存在下では、２６．０３のＣｔ値がＨ３Ｎ２反応混合物について記録され、Ｈ３Ｎ２の非存在下では、３０．５のＣｔ値がＡＤＶ反応混合物について記録された。Ｈ３Ｎ２およびＡＤＶの両方を組み合わせて単一反応混合物にしたとき、２６（Ｈ３Ｎ２）および３０（ＡＤＶ）のＣｔ値が得られた。Ｃｔ値は、単一成分の反応混合物と比較したとき、組み合わせた反応混合物についてほぼ同一であった。結果は、多重化が良好な感度を伴って達成可能であり、ＲＮＡおよびＤＮＡ種の両方が検出され得ることを示す。
【表４】
0006723925.tif 000005
【０１７５】
増幅プロトコールの多重化能力を評価するための別の実験では、それぞれがＨ３Ｎ２、ＴＢ、またはＨ３Ｎ２とＴＢの混合物の１つを含む、３つの反応混合物を、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９５℃で２分、その後９５℃で５秒と５５℃で３０秒の４０サイクルを含む増幅プロトコールに従ってインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。
【０１７６】
実験の結果を、図１２にグラフで表し、表５で以下に示す。図１２に示したように、Ｈ３Ｎ２およびＴＢはともに、他方との組み合わせ、または他方の非存在下のとき同様に検出することができた。ＴＢの非存在下では、３２のＣｔ値がＨ３Ｎ２反応混合物について記録され、Ｈ３Ｎ２の非存在下では、３２のＣｔ値がＴＢ反応混合物について記録された。Ｈ３Ｎ２およびＴＢの両方を組み合わせて単一反応混合物にしたとき、２９（Ｈ３Ｎ２）および３０（ＴＢ）のＣｔ値が得られた。Ｃｔ値は、単一成分の反応混合物と比較したとき、組み合わせた反応混合物について同様であった。結果は、多重化が良好な感度を伴って達成可能であり、ＲＮＡおよびＤＮＡ種の両方が多重化スキームで検出され得ることを示す。
【表５】
0006723925.tif 000006
【０１７７】
（実施例６）
多重のシリーズの増幅反応のベンチマーキング
増幅および検出実験を実施して、多重のシリーズの増幅反応を含む様々な増幅プロトコールをベンチマークした。ＲＮＡ（例えば、Ｈ１Ｎ１（２００７）、Ｈ１Ｎ１（２００９）、Ｈ３Ｎ２）、またはＤＮＡ（例えば、ＡＤＶ、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）ウイルス病原体、またはＤＮＡ細菌性病原体（例えば、ＴＢ）を含む生体試料を、様々な増幅条件に付した。各生体試料は、細菌ストックから得たＴＢ試料を除いて、口咽頭スワブを介して対象から直接得た。各試料１マイクロリットルを、本明細書に記載するように核酸増幅を行い、増幅産物を検出するのに必要な試薬と２５μＬ反応管中で組み合わせて反応混合物を得た。
【０１７８】
実験の１つのセットでは、増幅混合物を、各シリーズが異なる変性および伸長条件を含む２つのシリーズの増幅反応を含む増幅プロトコールに付した。６つの反応混合物（Ｈ３Ｎ２を含む２つ、ＡＤＶを含む２つ、ＨＢｏＶを含む２つ）を、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９４℃で１秒、その後シリーズ１（９４℃で１秒および４５℃で１０秒）の１１サイクル、その後９５℃で１分、その後シリーズ２（９５℃で５秒および５５℃で３０秒）の４０サイクルを含む増幅プロトコールに従ってインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。
【０１７９】
実験の結果を表６で以下に示す。表６に示したように、判定したＣｔ値は、８．３５〜２３の範囲であった。結果は、多重のシリーズの増幅反応を含むプロトコールは、良好な感度を実現するのに有用であり得ることを示す。さらに、結果は、ＲＮＡおよびＤＮＡ種の両方が多重のシリーズの増幅反応を含むプロトコールを用いて検出され得ることも示す。
【表６】
0006723925.tif 000007
【０１８０】
実験の別のセットでは、増幅混合物を、３つのシリーズの増幅反応であって、シリーズは、これらの変性および／または伸長条件に関して他と異なる、増幅反応を含む増幅プロトコールに付した。５つの反応混合物（ｓＨ１Ｎ１（２００７）を含む１つ、Ｈ３Ｎ２を含む１つ、ｐＨ１Ｎ１（２００９）を含む１つ、ＡＤＶを含む１つ、およびＴＢを含む１つ）を、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９４℃で１分、その後シリーズ１（９４℃で５秒、および１℃／サイクルでステップダウンした６０〜５０℃で３０秒）の５サイクル、その後シリーズ２（９４℃で５秒および５０℃で３０秒）の５サイクル、その後９５℃で２分、その後シリーズ３（９５℃で５秒および５５℃で３０秒）の４０サイクルを含む増幅プロトコールに従ってインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。
【０１８１】
実験の結果を表７で以下に示す。表７に示したように、判定したＣｔ値は、２０〜３０の範囲であった。結果は、多重のシリーズの増幅反応を含むプロトコールは、良好な感度を実現するのに有用であり得ることを示す。さらに、結果は、ＲＮＡおよびＤＮＡ種の両方が多重のシリーズの増幅反応を含むプロトコールを用いて検出され得ることも示す。
【表７】
0006723925.tif 000008
【０１８２】
（実施例７）
多重のシリーズの増幅反応のベンチマーキング
増幅および検出実験を実施して、多重のシリーズの増幅反応を含む様々な増幅プロトコールをベンチマークした。Ｈ３Ｎ２を含む生体試料を様々な増幅条件に付した。各生体試料は、口咽頭スワブを介して対象から直接得た。各試料１マイクロリットルを、本明細書に記載するように核酸増幅を行い、増幅産物を検出するのに必要な試薬と２５μＬ反応管中で組み合わせて反応混合物を得た。
【０１８３】
増幅混合物を、増幅プロトコールであって、一部が３つの異なる第１のシリーズの増幅反応の１つおよび同じ第２のシリーズを含み、３つの第１のシリーズは、第２のシリーズと異なる変性および伸長条件を含む、増幅プロトコールに付した。第１のシリーズおよび第２のシリーズのそれぞれは、多重のサイクルから構成した。第１のシリーズを伴わない、第２のシリーズのみを含む別の実験を行った。リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、Ｈ３Ｎ２を含む４つの反応混合物のそれぞれを、表８で以下に示した増幅プロトコールの１つに従ってインキュベートした。
【表８】
0006723925.tif 000009
【０１８４】
実験の結果を図１３にグラフで表し、表９で以下に表化する。図１３に示したように、反応混合物３が最高のＣｔ値（２８．５９）を有していた。多重のシリーズを含むその他は、８．５〜２６．５の範囲のより低い値を有していた。結果は、多重のシリーズの増幅反応を含むプロトコールは、良好な感度を実現するのに有用であり得ることを示す。さらに、結果は、多重のシリーズの増幅反応を含むプロトコールは、単一のシリーズのみを含むプロトコールと比較したとき、より良好な感度を実現し得ることも示す。
【表９】
0006723925.tif 000010
【０１８５】
（実施例８）
多重のシリーズの増幅反応のベンチマーキング
増幅および検出実験を実施して、多重のシリーズの増幅反応を含む様々な増幅プロトコールをベンチマークした。Ｈ３Ｎ２を含む生体試料を様々な増幅条件に付した。各生体試料は、口咽頭スワブを介して対象から直接得た。各試料１マイクロリットルを、本明細書に記載するように核酸増幅を行い、増幅産物を検出するのに必要な試薬と２５μＬ反応管中で組み合わせて反応混合物を得た。
【０１８６】
増幅混合物を、増幅プロトコールであって、一部が６つの第１のシリーズの増幅反応の１つおよび同じ第２のシリーズを含み、６つの第１のシリーズは、第２のシリーズと異なる変性および伸長条件を含む、増幅プロトコールに付した。別の６つの実験を第１のシリーズを用いずに行った。リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、Ｈ３Ｎ２を含む１２の反応混合物のそれぞれを、表１０で以下に示した増幅プロトコールの１つに従ってインキュベートした。
【表１０】
0006723925.tif 000011
【０１８７】
実験の結果を、表１１で以下に表化する。Ｃｔ値は、１４．５３〜２７．２８の範囲であり、反応混合物２〜５は、検出された産物を有さなかった。一般的に言えば、多重のシリーズの増幅反応に付されなかった反応混合物は、検出可能な産物を有さなかったか、または多重のシリーズの増幅反応に付された反応混合物より高いＣｔ値を有していた。結果は、多重のシリーズの増幅反応を含むプロトコールは、良好な感度を実現するのに有用であり得ることを示す。さらに、結果は、多重のシリーズの増幅反応を含むプロトコールは、単一のシリーズのみを含むプロトコールと比較したとき、より良好な感度を実現し得ることも示す。一部の場合では、多重のシリーズの増幅反応は、検出可能量の増幅産物を生成するのに必要であり得る。
【表１１】
0006723925.tif 000012
【０１８８】
（実施例９）
精製および未精製試料での結果の比較
増幅および検出実験を実施して、精製および未精製試料で得た結果を比較した。Ｈ１Ｎ１を含む精製および未精製生体試料を増幅プロトコールに付した。各生体試料は、口咽頭スワブを介して対象から直接得た。各試料１マイクロリットルを、本明細書に記載するように核酸増幅を行い、増幅産物を検出するのに必要な試薬と２５μＬ反応管中で組み合わせて反応混合物を得た。反応混合物のうちの２つがカラム精製または磁気精製のうちの１つによって精製した試料を含む、３つの反応混合物を生成した。第３の反応混合物は、未精製試料から構成した。
【０１８９】
リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、９４℃で２分、４５℃で２０分、９４℃で１分、その後９４℃で５秒と５５℃で３５秒の５０サイクルを含む増幅プロトコールに従って反応混合物をインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。
【０１９０】
実験の結果を図１４にグラフで表し、表１２で以下に示す。表１２に示したように、判定したＣｔ値は、２７〜３１の範囲であり、未精製試料と様々な手段によって精製した試料との間で同様であった。結果は、試料の精製は、同様の検出感度を実現するのに必要でない場合があることを示す。
【表１２】
0006723925.tif 000013
【０１９１】
（実施例１０）
全血および唾液試料の分析
増幅および検出実験を、Ｈ３Ｎ２ウイルス含有血液および唾液試料に対して実施した。４つの異なる試料を検査した。２つの試料は、全血または唾液試料のいずれかを含み、２つの試料は、全血または唾液試料のいずれかの１０倍希釈液（ＰＢＳ中）を含む。４つの試料のそれぞれを、ウイルスＲＮＡの逆転写を行うのに必要な試薬および逆転写から得た相補的ＤＮＡの増幅を完了するのに必要な試薬と組み合わせた。逆転写およびＤＮＡ増幅を行うのに必要な試薬は、逆転写酵素（例えば、ＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔおよびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ転写酵素）、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、およびｄＮＴＰを含む市販の予混合物（例えばＴａｋａｒａ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲまたはＯｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲキット）として供給した。さらに、反応管に、増幅ＤＮＡ産物を検出するためのＦＡＭ色素を含むＴａｑＭａｎプローブも含めた。増幅ＤＮＡ産物を生成するために、リアルタイムＰＣＲサーモサイクラー内で、４５℃で２０分、その後９４℃で２分、その後９４℃で５秒と５５℃で３５秒の４２サイクルを含む変性化および伸長条件のプロトコールに従って、各反応混合物をインキュベートした。増幅産物の検出は、インキュベーション中に行った。
【０１９２】
Ｈ３Ｎ２の増幅結果を、図１５（図１５Ａは、希釈していない血液に対応し、図１５Ｂは、希釈した血液に対応する）および図１６（図１６Ａは、希釈していない唾液に対応し、図１６Ｂは、希釈した唾液に対応する）にグラフで表す。ＦＡＭ色素の記録された蛍光を、サイクルの数に対してプロットする。
【０１９３】
図１５および図１６に示したように、希釈していないおよび希釈した血液および唾液反応混合物はともに、検出可能なシグナルを示し、Ｃｔ値は、２４〜３３の範囲であった。したがって、図１５および１６に示したデータは、希釈していない生体試料は、約４０以下のＣｔ値を伴って良好な感度で分析することができることを示す。さらに、データは、試料の希釈が分析に必要である場合では、増幅産物はまた、同様の様式で検出され得ることも示す。一部の場合では、試料からの阻害剤が多すぎる場合、希釈は、試料、例えば、全血からの阻害を排除する別の方法であり得る。
【０１９４】
（実施例１１）
ネステッドＰＣＲ
増幅および検出実験をＨ１Ｎ１ウイルス含有試料に対して実施する。８つの試料を検査する。試料はそれぞれ、Ｈ１Ｎ１（２００７）ウイルスストックを含む。試料をそれぞれ、以下の表１３に示した希釈でＰＢＳ中に希釈する。ウイルスストックの濃度は、１×１０６ＩＵ／ｍＬである。増幅ＤＮＡ産物を生成するために、所与の試料を含む反応混合物を、変性化および伸長条件のプロトコールに従ってインキュベートする。プロトコールは、（ｉ）第１のランにおいて、９４℃で１分間、その後９４℃で５秒と５７℃で１０秒の１０または１５サイクル（以下の表１３に示したように）のサーモサイクラー内での混合物の加熱、および（ｉｉ）第２のランにおいて、９４℃で１分間、その後９４℃で５秒と５７℃で３０秒の３５サイクルのサーモサイクラー内での混合物の加熱を含む。系列希釈（series  dilution）試料１μＬを、２５ｕＬ反応体積中のＴａｋａｒａ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｑＰＣＲ予混合物に添加する。ある特定のサイクルについての第１のランの後、反応からの１μＬを第２のランの反応混合物に添加する。Ｈ１Ｎ１の増幅結果を、図１７にグラフで表す。図は、サイクル数の関数としての記録された相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。８つの試料（１〜８）のそれぞれのプロットを図中に示した。検出可能なシグナルを有する試料は、表１３に示したＣｔ値を有する。
【表１３】
0006723925.tif 000014
【０１９５】
（実施例１２）
エボラ組換えプラスミドの増幅および検出
増幅および検出実験を、ザイールエボラウイルス（Ｚａｉｒｅ−ＥＢＯＶ）に対応する様々なコピー数の組換えプラスミドを含むヒト全血試料に対して実施した。８つの試料を検査した。試料のうちの６つは、特定のコピー数（２５００００、２５０００、２５００、２５０、２５、および２．５コピー）で組換えプラスミドを含み、試料のうちの２つ（１つは血液のみを有し、１つは水のみを有する）は、対照試料として機能を果たした。全血試料は、試料を精製することなく分析した。
【０１９６】
各試料を、核酸増幅に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、プライマー、補助因子、適当な緩衝液、プライマーなど）、およびレポーター剤（例えば、ＦＡＭ色素を含むオリゴヌクレオチドプローブ）と組み合わせて反応混合物にした。組換えプラスミドのコピー数を含めた試料番号による様々な反応混合物の概要を表１４に示す。増幅産物を生成するために、各反応混合物を２つのシリーズの変性化および伸長条件に付した。２つのシリーズは、以下の通りであった：（ｉ）第１のシリーズにおいて、９５℃で１秒と４５℃で１秒の１５サイクル、その後９５℃で１分、および（ｉｉ）第２のシリーズにおいて、９５℃で５秒と５５℃で１０秒の４５サイクル。第２のシリーズ中、レポーター剤からのシグナルを記録して増幅曲線を作成し、Ｃｔ値を得た。実験の増幅曲線を、それぞれを表１４に示した試料番号に対応する試料番号によって標識して図１８にグラフで表す。図１８に表した結果は、サイクル数の関数としての記録された相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。図１８に示した曲線から得たＣｔ値を、表１５に要約する。
【０１９７】
図１８に示したように、組換えプラスミドは、試料６を除いて組換えプラスミドを含んでいた試料のすべてについて増幅産物を介して検出された。さらに、組換えプラスミドは、対照試料（試料７および８）のいずれにおいても検出されなかった。したがって、図１８に示した結果は、一部の場合では、２５コピーのプラスミド／反応の検出感度を、多重のシリーズの変性化および伸長条件を使用して、試料を精製することなく得ることができることを示す。
【表１４】
0006723925.tif 000015
【表１５】
0006723925.tif 000016
【０１９８】
（実施例１３）
エボラウイルスの増幅および検出
増幅および検出実験を、様々なコピー数のザイールエボラウイルス（Ｚａｉｒｅ−ＥＢＯＶ）シュードウイルスを含むヒト全血試料に対して実施した。８つの試料を、合計１６の試料について２通りに（重複セット＃１および重複セット＃２）検査した。試料のうちの６つは、特定のコピー数（２５０００００、２５００００、２５０００、２５００、２５０、および２５コピー）でシュードウイルスを含み、試料のうちの２つ（１つは血液のみを有し、１つは水のみを有する）は、対照試料として機能を果たした。全血試料は、試料を精製することなく分析した。
【０１９９】
各試料を、逆転写および核酸増幅に必要な試薬（例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、補助因子、プライマー、適当な緩衝液など）、およびレポーター剤（例えば、ＦＡＭ色素を含むオリゴヌクレオチドプローブ）と組み合わせて反応混合物３０μＬにした。シュードウイルスのコピー数を含めた試料番号による反応混合物の概要を表１６に示す。シュードウイルスからの増幅産物を生成するために、各反応混合物を２つのシリーズの変性化および伸長条件に付した。２つのシリーズは、以下の通りであった：（ｉ）第１のシリーズにおいて、９５℃で１秒と４５℃で１秒の１５サイクル、その後９５℃で１分、および（ｉｉ）第２のシリーズにおいて、９５℃で５秒と５５℃で１０秒の４５サイクル。第２のシリーズ中、レポーター剤からのシグナルを記録して増幅曲線を作成し、Ｃｔ値を得た。実験の増幅曲線を、それぞれを表１６に示したものに対応する試料番号によって標識して図１９Ａ（重複セット＃１）および図１９Ｂ（重複セット＃２）にグラフで表す。図１９Ａおよび図１９Ｂに表した結果は、サイクル数の関数としての記録された相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。図１９Ａおよび図１９Ｂに示した曲線から得たＣｔ値を、「Ｃｔ１」が重複セット＃１に対応し、「Ｃｔ２」が重複セット＃２に対応する表１７に要約する。
【０２００】
図１９Ａおよび図１９Ｂに示したように、シュードウイルスは、シュードウイルスを含んでいた試料のすべて（試料１〜６）について増幅産物を介して両方の重複セットにおいて検出された。さらに、シュードウイルスは、対照試料（試料７および８）のいずれにおいても検出されなかった。したがって、図１９Ａおよび図１９Ｂに示した結果は、一部の場合では、２５コピーのウイルス／反応の検出感度を、多重のシリーズの変性化および伸長条件を使用して、試料を精製することなく得ることができることを示す。
【表１６】
0006723925.tif 000017
【表１７】
0006723925.tif 000018
【０２０１】
（実施例１４）
エボラウイルスの増幅および検出
増幅および検出実験を、様々なコピー数のザイールエボラウイルス（Ｚａｉｒｅ−ＥＢＯＶ）シュードウイルスを含むヒト全血試料に対して実施した。８つの試料を検査した。試料のうちの６つは、特定のコピー数（２５０００００、２５００００、２５０００、２５００、２５０、および２５）でシュードウイルスを含み、試料のうちの２つ（１つは２００００コピーのシュードウイルス陽性対照を有し、１つは水のみを有する）は、対照試料として機能を果たした。全血試料は、試料を精製することなく分析した。
【０２０２】
各試料を、逆転写および核酸増幅に必要な試薬（例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、補助因子、適当な緩衝液など）、およびレポーター剤（例えば、ＦＡＭ色素を含むオリゴヌクレオチドプローブ）と組み合わせて反応混合物３０μＬにした。シュードウイルスのコピー数を含めた試料番号による様々な反応混合物の概要を表１８に示す。シュードウイルスからの増幅産物を生成するために、各反応混合物を２つのシリーズの変性化および伸長条件に付した。２つのシリーズは、以下の通りであった：（ｉ）第１のシリーズにおいて、９５℃で１秒と４５℃で１秒の１５サイクル、その後９５℃で１分、および（ｉｉ）第２のシリーズにおいて、９５℃で５秒と５５℃で１０秒の３５サイクル。第２のシリーズ中、レポーター剤からのシグナルを記録して増幅曲線を作成し、Ｃｔ値を得た。実験の増幅曲線を、それぞれを表１８に示したものに対応する試料番号によって標識して図２０にグラフで表す。図２０に表した結果は、サイクル数の関数としての記録した相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。図２０に示した曲線から得たＣｔ値を、表１９に要約する。
【０２０３】
図２０に示したように、シュードウイルスは、陽性対照シュードウイルスを含む試料（試料７）を含めて、シュードウイルスを含んでいた試料のすべて（試料１〜６）について増幅産物を介して検出された。さらに、シュードウイルスは、水のみの対照試料（試料８）において検出されなかった。したがって、図２０に示した結果は、一部の場合では、２５コピーのウイルス／反応の検出感度を、多重のシリーズの変性化および伸長条件を使用して、試料を精製することなく得ることができることを示す。
【表１８】
0006723925.tif 000019
【表１９】
0006723925.tif 000020
【０２０４】
（実施例１５）
エボラウイルスの増幅および検出
増幅および検出実験を、２つのコピー数（２５０コピー／反応または２５コピー／反応）のザイールエボラウイルス（Ｚａｉｒｅ−ＥＢＯＶ）シュードウイルスのうちの１つを含むヒト全血試料に対して実施した。各全血試料を、合計８つの試料について４つの試薬システムの１つを使用して検査した。試薬システム（Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ−３、およびＢ−４）のそれぞれは、逆転写および核酸増幅に必要な試薬（例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、補助因子、適当な緩衝液など）、およびレポーター剤（例えば、ＦＡＭ色素を含むオリゴヌクレオチドプローブ）を含んでいた。異なる試薬システムのそれぞれは、試薬システム中に異なる濃度の様々な成分を含有していた。各全血試料をその適切な試薬システムと組み合わせて反応混合物３０μＬにした。シュードウイルスのコピー数および試薬システムを含めた試料番号による様々な反応混合物の概要を表２０で以下に示す。シュードウイルスからの増幅産物を生成するために、各反応混合物を２つのシリーズの変性化および伸長条件に付した。２つのシリーズは、以下の通りであった：（ｉ）第１のシリーズにおいて、９５℃で１秒と４５℃で１秒の１５サイクル、その後９５℃で１分、および（ｉｉ）第２のシリーズにおいて、９５℃で５秒と５５℃で１０秒の４０サイクル。第２のシリーズ中、レポーター剤からのシグナルを記録して増幅曲線を作成し、Ｃｔ値を得た。実験の増幅曲線を、それぞれを表２０に示したものに対応する試料番号によって標識して図２１にグラフで表す。図２１に表した結果は、サイクル数の関数としての記録された相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。図２１に示した曲線から得たＣｔ値を、表２１に要約する。
【０２０５】
図２１に示したように、シュードウイルスは、２５コピー／反応を有する試料を含めて、試料のすべてについて増幅産物を介して検出された。したがって、図２１に示した結果は、一部の場合では、２５コピーのウイルス／反応の検出感度を、多重のシリーズの変性化および伸長条件を使用して、異なる試薬システムを用いて、試料を精製することなく得ることができることを示す。
【表２０】
0006723925.tif 000021
【表２１】
0006723925.tif 000022
【０２０６】
（実施例１６）
ザイールエボラウイルスのリアルタイムＰＣＲ検出
本開示のワンステップｑＰＣＲ法を使用して、ザイールエボラウイルスについて患者血清試料を分析した。試料は、精製しなかった。試料は、９つのザイールエボラウイルス陽性試料および７つのザイールエボラウイルス陰性試料を含んでいた。Ｒｏｃｈｅ  ＬＣ９６リアルタイムＰＣＲシステムを使用した。
【０２０７】
試料を分析するのに本実施例で使用したプログラムを表２２に示す。
【表２２】
0006723925.tif 000023
【０２０８】
ワンステップｑＰＣＲ法の結果を表２３に示す。ザイールエボラウイルスについて検査するワンステップｑＰＣＲ法は、検証された試薬および方法と比較して１００％の一致を示した。
【表２３】
0006723925.tif 000024
【０２０９】
（実施例１７）
マラリアの増幅および検出
増幅および検出実験を、未知の濃度のマラリア病原体を含むヒト全血試料に対して実施した。２つのセットの実験を完了した。第１のセットの実験では、重複実験を、ヒト全血試料の１：４希釈液（１×ＰＢＳ中）について完了し、一実験を、全血およびマラリア病原体に対応するプラスミドを含む試料について完了し、一実験を水のみの対照について完了した。第２のセットの実験では、実験を、血液のみおよび水のみの対照試料とともに、１×ＰＢＳ中のヒト全血試料の様々な希釈液（１：４、１：４０、１：４００、１：４０００、１：４００００、および１：４０００００）を含む試料について完了した。全血試料は、試料を精製することなく分析した。
【０２１０】
各試料を、核酸増幅に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、補助因子、適当な緩衝液など）、およびレポーター剤（例えば、ＦＡＭ色素を含むオリゴヌクレオチドプローブ）と組み合わせて反応混合物３０μＬにした。第１のセットの実験について、希釈を含めた試料番号による反応混合物の概要を、表２４に示す。第２のセットの実験について、希釈を含めた試料番号による反応混合物の概要を、表２５に示す。マラリア病原体からの増幅産物を生成するために、各反応混合物を２つのシリーズの変性化および伸長条件に付した。２つのシリーズは、以下の通りであった：（ｉ）第１のシリーズにおいて、９５℃で１秒と４５℃で１秒の１３サイクル、その後９５℃で１分、および（ｉｉ）第２のシリーズにおいて、９５℃で５秒と５５℃で１０秒の４５サイクル。第２のシリーズ中、レポーター剤からのシグナルを記録して増幅曲線を作成した。実験の第１のセットについての増幅曲線を図２２Ａにグラフで表し、第２のセットの実験についての増幅曲線を図２２Ｂにグラフで表す。各曲線をそれぞれ表２４および２５中のその対応する試料番号によって標識する。図２２Ａおよび図２２Ｂに表した結果は、サイクル数の関数としての記録された相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。
【０２１１】
図２２Ａに示したように、マラリア病原体は、全血試料を含む２つの反応混合物（試料１および２）、ならびに組換えプラスミドを含む陽性対照（試料３）について増幅産物を介して検出された。さらに、マラリア病原体は、水のみの対照試料（試料４）において検出されなかった。したがって、図２２Ａに示した結果は、マラリア病原体を、一部の場合では、多重のシリーズの伸長および変性条件を使用して、試料を精製することなく検出することができることを示す。
【０２１２】
図２２Ｂに示したように、マラリア病原体は、全血試料（試料１〜６）を含有するすべての反応混合物について増幅産物を介して検出された。さらに、マラリア病原体は、水のみおよび血液のみの対照試料（試料７および８）において検出されなかった。したがって、図２２Ｂに示した結果は、マラリア病原体を含めて病原体（複数可）を、一部の場合では、多重のシリーズの変性化および伸長条件を使用して、試料を精製することなく、最大で１：４０００００の希釈で検出することができることを示す。
【表２４】
0006723925.tif 000025
【表２５】
0006723925.tif 000026
【０２１３】
（実施例１８）
デングウイルスの増幅および検出
増幅および検出実験を、未知の濃度のデングウイルスを含む培養液から得た試料に対して実施した。３つのセットの実験を完了した。第１のセットの実験では、重複実験を不希釈培養液について完了し、一実験を培養液の１：１０希釈液について完了し、一実験を水のみの対照について完了した。第２のセットの実験では、実験を、水のみの対照試料とともに、培養液の様々な希釈液（希釈なし、１：１０、１：１００、１：１０００、１：１００００、１：１０００００、および１：１００００００）について完了した。第３のセットの実験では、実験を、水のみの対照試料とともに、培養液の様々な希釈液（希釈なし、１：１０、１：１００、１：１０００、および１：１００００）について完了した。培養試料は、試料を精製することなく分析した。
【０２１４】
各試料２μＬを、逆転写および核酸増幅に必要な試薬（例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、補助因子、適当な緩衝液など）、およびレポーター剤（例えば、ＦＡＭ色素を含むオリゴヌクレオチドプローブ）と組み合わせて反応混合物３０μＬにした。第１のセットの実験について、希釈を含めた反応混合物の概要を、表２６に示し、第２のセットの実験について、表２７に示し、第３のセットの実験について表２８に示す。ウイルスからの増幅産物を生成するために、各反応混合物を２つのシリーズの変性化および伸長条件に付した。２つのシリーズは、以下の通りであった：（ｉ）第１のシリーズにおいて、４２℃で１分、９５℃で５秒と４５℃で１０秒の１０サイクル、その後９５℃で１分、および（ｉｉ）第２のシリーズにおいて、９５℃で５秒と５５℃で１０秒の４５サイクル。第２のシリーズ中、レポーター剤からのシグナルを記録して増幅曲線を作成した。第１のセットの実験についての増幅曲線を図２３Ａにグラフで表し、第２のセットの実験についての増幅曲線を図２３Ｂにグラフで表し、第３のセットの実験についての増幅曲線を図２３Ｃにグラフで表す。各曲線を、それぞれ表２６、２７、および２８中のその対応する試料番号によって標識する。図２３Ａ、図２３Ｂ、および図２３Ｃに表した結果は、サイクル数の関数としての記録された相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。図２３Ａ、図２３Ｂ、および図２３Ｃに示した曲線から得たＣｔ値を、それぞれ表２６、２７、および２８に示す。
【０２１５】
図２３Ａに示したように、ウイルスは、ウイルスを含む３つの反応混合物（試料１〜３）について増幅産物を介して検出された。さらに、ウイルスは、水のみの対照試料（試料４）において検出されなかった。したがって、図２３Ａに示した結果は、デングウイルスを、一部の場合では、多重のシリーズの伸長および変性条件を使用して検出することができることを示す。
【０２１６】
図２３Ｂに示したように、ウイルスは、デングウイルスを含有し、希釈していない（試料１）または最大で１：１０００に希釈した（試料２、３、および４）反応混合物について増幅産物を介して検出された。しかし、Ｃｔ値は、１：１０００の反応混合物（試料４）について判定されなかった。ウイルスは、より高い希釈液（試料５、６、および７）、または水のみの対照試料（試料８）において検出されなかった。したがって、図２３Ｂに示した結果は、ウイルスを、一部の場合では、多重のシリーズの変性化および伸長条件を使用して、試料を精製することなく、最大で１：１０００の希釈で検出することができ、この場合Ｃｔ値は、最大で１：１００の希釈で生成することができることを示す。
【０２１７】
図２３Ｃに示したように、ウイルスは、デングウイルスを含有し、希釈していない（試料１）または最大で１：１０００に希釈した（試料２、３、および４）反応混合物について増幅産物を介して検出された。しかし、Ｃｔ値は、１：１０００の反応混合物について判定されなかった。ウイルスは、より高い希釈液（試料５）、または水のみの対照試料（試料６）において検出されなかった。したがって、図２３Ｃに示した結果は、ウイルスを、一部の場合では、多重のシリーズの変性化および伸長条件を使用して、試料を精製することなく、最大で１：１０００の希釈で検出することができ、この場合Ｃｔ値は、最大で１：１００の希釈で生成することができることを示す。
【表２６】
0006723925.tif 000027
【表２７】
0006723925.tif 000028
【表２８】
0006723925.tif 000029
【０２１８】
（実施例１９）
一塩基多型（ＳＮＰ）の検出
増幅および検出実験を、チトクロムＰ４５０  ２Ｃ１９の特定の遺伝子型、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２（「ＧＡ」遺伝子型を有する）またはＣＹＰ２Ｃ１９＊３（「ＧＧ」遺伝子型を有する）を含むヒト口咽頭スワブまたは血液試料に対して実施した。２つのセットの実験、ヒト口咽頭スワブから得た試料についての１セットおよび血液から得た試料についての１セットを行った。第１のセットの実験では、ヒト口咽頭スワブから得た７つの異なる試料を、試料を精製することなく分析した。第２のセットの実験では、５つの異なる血液試料を、試料を精製することなく分析した。
【０２１９】
各試料を、核酸増幅に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、補助因子、適当な緩衝液など）、および２種のレポーター剤（例えば、核酸の増幅を検出するためのＦＡＭ色素を含むオリゴヌクレオチドプローブ、「ＧＡ」遺伝子型を検出するためのテキサスレッド色素を含むオリゴヌクレオチドプローブ）と組み合わせて反応混合物にした。増幅産物を生成するために、各反応混合物を、９５℃で５分、その後９５℃で５秒と４９℃で１０秒の５０サイクルを含んでいたサーモサイクリングプロトコールに付した。サーモサイクリング中、レポーター剤からのシグナルを記録して増幅曲線を作成した。第１のセットの実験（ヒト口咽頭スワブ）についての増幅曲線を、図２４Ａ（ＦＡＭオリゴヌクレオチドプローブに対応するシグナル）および図２４Ｂ（テキサスレッドオリゴヌクレオチドプローブに対応するシグナル）にグラフで表す。第２のセットの実験（血液試料）についての増幅曲線を、図２５Ａ（ＦＡＭオリゴヌクレオチドプローブに対応するシグナル）および図２５Ｂ（テキサスレッドオリゴヌクレオチドプローブに対応するシグナル）にグラフで表す。図２４Ａ、図２４Ｂ、図２５Ａ、および図２５Ｂに表した結果は、サイクル数の関数としての記録された相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。各曲線を、表２９（口咽頭スワブ実験）または表３０（血液実験）中のその対応する反応混合物番号によって標識する。増幅曲線について判定したＣｔ値も、判定した遺伝子型とともに表２９または表３０に示す。テキサスレッドからのシグナルが図２４Ｂまたは図２５Ｂで観察された増幅曲線では、対応する反応混合物は、「ＧＡ」遺伝子型を有すると判定した。さらに、テキサスレッドからのシグナルが図２４Ｂまたは図２５Ｂで観察されなかった増幅曲線では、対応する反応混合物は、「ＧＧ」遺伝子型を有すると判定した。
【０２２０】
図２４Ａに示したように、増幅産物が口咽頭スワブから得た試料を有する反応混合物のそれぞれについて観察され、核酸の増幅が起こることを示唆した。しかし、図２４Ｂに示したように、増幅産物は、口咽頭スワブから得た試料を有する反応混合物の一部のみ（反応混合物１、４、６、および７）について観察され、これらの反応混合物は、「ＧＡ」遺伝子型に対応した。他の反応混合物（反応混合物２、３、および５）では、増幅産物は、観察されず、これらの反応混合物は、「ＧＧ」遺伝子型に対応した。図２４Ａおよび図２４Ｂに示した結果は、口腔スワブ試料から抽出したＤＮＡを使用する増幅および検出実験を介してバリデートした（データを示さず）。したがって、図２４Ａおよび図２４Ｂに示した結果は、一部の場合では、ＳＮＰは、試料を精製することなく口咽頭スワブから得られる試料中でリアルタイム増幅を介して検出することができることを示唆する。
【０２２１】
図２５Ａに示したように、増幅産物が血液から得た試料を有する反応混合物のそれぞれについて観察され、核酸の増幅が起こることを示唆した。しかし、図２５Ｂに示したように、増幅産物は、血液から得た試料を有する反応混合物の一部のみ（反応混合物１、２、および５）について観察され、これらの反応混合物は、「ＧＡ」遺伝子型に対応した。他の反応混合物（反応混合物３および４）では、増幅産物は、観察されず、これらの反応混合物は、「ＧＧ」遺伝子型に対応した。図２５Ａおよび図２５Ｂに示した結果は、核酸配列決定を使用してバリデートした。したがって、図２５Ａおよび図２５Ｂに示した結果は、一部の場合では、ＳＮＰは、試料を精製することなく血液から得られる試料中でリアルタイム増幅を介して検出することができることを示唆する。
【表２９】
0006723925.tif 000030
【表３０】
0006723925.tif 000031
【０２２２】
（実施例２０）
アデノウイルス５５型（ＡＤＶ５５）およびアデノウイルス７型（ＡＤＶ７）の増幅および検出
増幅および検出実験を、様々なコピー数のアデノウイルス５５型（ＡＤＶ５５）または未知の濃度のアデノウイルス７型（ＡＤＶ７）を含む口咽頭スワブから得た試料に対して実施した。２つのセットの実験、ＡＤＶ５５を有する試料について１セットおよびＡＤＶ７を有する実験について１セットを完了した。第１のセットの実験では、異なるコピー数（１、１０、１００、１０００、１００００、および１０００００コピー）のＡＤＶ５５を含む試料を有する６つの異なる実験を、陰性対照についての実験とともに、試料を精製することなく完了した。第２のセットの実験では、未知のコピー数のＡＤＶ７を含む試料を有する８つの異なる実験を、試料を精製することなく完了した。
【０２２３】
各試料を、核酸増幅に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、補助因子、適当な緩衝液など）、およびレポーター剤（例えば、ＦＡＭ色素を含むオリゴヌクレオチドプローブ）と組み合わせて反応混合物にした。第１のセットの実験について、ＡＤＶ５５のコピー数を含めた反応混合物の概要を表３１に示す。ウイルスからの増幅産物を生成するために、各反応混合物を２つのシリーズの変性化および伸長条件に付した。２つのシリーズは、以下の通りであった：（ｉ）第１のシリーズにおいて、９５℃で１秒と４５℃で１秒の２０サイクル、その後９５℃で１分、および（ｉｉ）第２のシリーズにおいて、９５℃で５秒と６０℃で３４秒の３５サイクル。第２のシリーズ中、レポーター剤からのシグナルを記録して増幅曲線を作成し、Ｃｔ値を得た。第１のセットの実験についての増幅曲線を、それぞれ表３１に示したものに対応する反応混合物番号によって標識して図２６Ａにグラフで表す。第２のセットの実験についての増幅曲線を図２６Ｂにグラフで表し、対応するＣｔ値を表３２に示す。図２６Ｂ中の増幅曲線を、これらが表３２に示した反応混合物番号に対応するように標識する。図２６Ａおよび図２６Ｂに表した結果は、サイクル数の関数としての記録された相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。
【０２２４】
図２６Ａに示したように、ＡＤＶ５５は、ウイルスを含有する試料を含む反応混合物のすべてについて（反応混合物１〜６）、増幅産物を介して検出された。さらに、ウイルスは、陰性対照反応混合物（反応混合物７）において検出されなかった。したがって、図２６Ａに示した結果は、ＡＤＶ５５ウイルスを、一部の場合では、多重のシリーズの伸長および変性条件を使用して、試料を精製することなく、様々なレベルの希釈で検出することができることを示す。
【０２２５】
図２６Ｂに示したように、ＡＤＶ７は、反応混合物のすべてについて増幅産物を介して検出された。したがって、図２６Ｂに示した結果は、ＡＤＶ７ウイルスを、一部の場合では、多重のシリーズの伸長および変性条件を使用して、試料を精製することなく検出することができることを示す。
【表３１】
0006723925.tif 000032
【表３２】
0006723925.tif 000033
【０２２６】
（実施例２１）
アーマードＲＮＡ  Ｃ型肝炎ウイルス（ＲＮＡ−ＨＣＶ）の増幅および検出
増幅および検出実験を、様々なコピー数のアーマードＲＮＡ  Ｃ型肝炎ウイルス（ＲＮＡ−ＨＣＶ）を含む血漿試料に対して実施した。異なるコピー数（１０、１００、および５００コピー）のＲＮＡ−ＨＣＶを含む試料を有する３つの異なる実験を、陰性対照について完了した実験とともに、試料を精製することなく完了した。
【０２２７】
各試料を、逆転写および核酸増幅に必要な試薬（例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、補助因子、適当な緩衝液など）、およびレポーター剤（例えば、ＦＡＭ色素を含むオリゴヌクレオチドプローブ）と組み合わせて反応混合物にした。ＲＮＡ−ＨＣＶコピー数を含めた反応混合物の概要を表３３に示す。ウイルスから増幅ＤＮＡ産物を生成するために、各反応混合物を２つのシリーズの変性化および伸長条件に付した。２つのシリーズは、以下の通りであった：（ｉ）第１のシリーズにおいて、９５℃で１秒と４５℃で１秒の２０サイクル、その後９５℃で１分、および（ｉｉ）第２のシリーズにおいて、９５℃で５秒と６０℃で３４秒の５５サイクル。第２のシリーズ中、レポーター剤からのシグナルを記録して増幅曲線を作成した。第１のセットの実験についての増幅曲線を、それぞれ表３３に示した反応混合物番号に対応する数によって標識して図２７にグラフで表す。図２７に表した結果は、サイクル数の関数としての記録された相対蛍光単位（ＲＦＵ）を示す。
【０２２８】
図２７に示したように、ＲＮＡ−ＨＣＶは、ウイルスを含有する試料を含む反応混合物のすべて（反応混合物１〜３）について増幅産物を介して検出された。さらに、ＲＮＡ−ＨＣＶは、陰性対照反応混合物（反応混合物４）において検出されなかった。したがって、図２７に示した結果は、ＲＮＡ−ＨＣＶを、一部の場合では、多重のシリーズの伸長および変性条件を使用して、試料を精製することなく検出することができることを示す。１０コピー／反応の検出感度も実現することができる。
【表３３】
0006723925.tif 000034
【０２２９】
本発明の好適な実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、このような実施形態は、単なる例として提供されていることが当業者に明白となる。数多くのバリエーション、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に今では想起されるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行することにおいて使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の射程を規定し、これらの特許請求の範囲の射程内の方法および構造、ならびにこれらの同等物は、それによって保護されることが意図されている。
【図１】
0006723925.tif 000035
【図２】
0006723925.tif 000036
【図３】
0006723925.tif 000037
【図４】
0006723925.tif 000038
【図５】
0006723925.tif 000039
【図６】
0006723925.tif 000040
【図７】
0006723925.tif 000041
【図８】
0006723925.tif 000042
【図９】
0006723925.tif 000043
【図１０】
0006723925.tif 000044
【図１１】
0006723925.tif 000045
【図１２】
0006723925.tif 000046
【図１３】
0006723925.tif 000047
【図１４】
0006723925.tif 000048
【図１５】
0006723925.tif 000049
【図１６】
0006723925.tif 000050
【図１７】
0006723925.tif 000051
【図１８】
0006723925.tif 000052
【図１９Ａ】
0006723925.tif 000053
【図１９Ｂ】
0006723925.tif 000054
【図２０】
0006723925.tif 000055
【図２１】
0006723925.tif 000056
【図２２Ａ】
0006723925.tif 000057
【図２２Ｂ】
0006723925.tif 000058
【図２３Ａ】
0006723925.tif 000059
【図２３Ｂ】
0006723925.tif 000060
【図２３Ｃ】
0006723925.tif 000061
【図２４Ａ】
0006723925.tif 000062
【図２４Ｂ】
0006723925.tif 000063
【図２５Ａ】
0006723925.tif 000064
【図２５Ｂ】
0006723925.tif 000065
【図２６Ａ】
0006723925.tif 000066
【図２６Ｂ】
0006723925.tif 000067
【図２７】
0006723925.tif 000068
【図２８Ａ】
0006723925.tif 000069
【図２８Ｂ】
0006723925.tif 000070