(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
機器内に搭載されたサンプルホルダを、２つ以上のチャネルで画像化することであって、前記サンプルホルダが複数の反応位置と２種類以上の染料とを含み、各染料が２つ以上の反応位置を占有している画像化と、
各染料についてのピークチャネルを、前記サンプルホルダにおいて特定することと、
各チャネルを、各染料についての前記ピークチャネルに対して正規化することと、
所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置について、二次元の二次多項式関数を適用することと、
１セットの染料参照値を含む染料マトリクスを生成することとを含む、
蛍光染料を較正するためのコンピュータ実行方法。
【請求項２】
各染料が、実質的に同じ数の前記反応位置を占有するように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置される、請求項１に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項３】
隣接する反応位置を占有する染料が異なるように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置される、請求項１に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項４】
前記染料が、前記反応位置に沿って、繰返しの交互パターンで配置される、請求項１に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項５】
前記二次元の二次多項式関数の結果についての適合度のチェックを実行することを更に含む、請求項１に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項６】
所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第２のモデリングを実行することを更に含む、請求項１に記載のコンピュータ実行方法。
【請求項７】
蛍光染料を較正するために、プロセッサにより実行可能な命令によりエンコードされる非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、前記命令が、
機器内に搭載されたサンプルホルダを、２つ以上のチャネルで画像化することであって、前記サンプルホルダが複数の反応位置と２種類以上の染料とを含み、各染料が２つ以上の反応位置を占有している画像化をし、
各染料についてのピークチャネルを、前記サンプルホルダにおいて特定し、
各チャネルを、各染料についての前記ピークチャネルに対して正規化し、
所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置について、二次元の二次多項式関数を適用し、
１セットの染料参照値を含む染料マトリクスを生成するための命令を含む、
非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項８】
各染料が、実質的に同じ数の前記反応位置を占有するように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置される、請求項７に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項９】
隣接する反応位置を占有する染料が異なるように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置される、請求項７に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１０】
前記染料が、前記反応位置に沿って、繰返しの交互パターンで配置される、請求項７に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１１】
所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第２のモデリングを実行することを更に含む、請求項７に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１２】
プロセッサと、
前記プロセッサにより実行可能な命令によりエンコードされるメモリとを含み、前記命令が、
機器内に搭載されたサンプルホルダを、２つ以上のチャネルで画像化することであって、前記サンプルホルダが複数の反応位置と２種類以上の染料とを含み、各染料が２つ以上の反応位置を占有している画像化をし、
各染料についてのピークチャネルを、前記サンプルホルダにおいて特定し、
各チャネルを、各染料についての前記ピークチャネルに対して正規化し、
所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置について、二次元の二次多項式関数を適用し、
１セットの染料参照値を含む染料マトリクスを生成する命令である、
蛍光染料を較正するためのシステム。
【請求項１３】
各染料が、実質的に同じ数の前記反応位置を占有するように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
隣接する反応位置を占有する染料が異なるように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記染料が、前記反応位置に沿って、繰返しの交互パターンで配置される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記二次元の二次多項式関数の結果についての適合度のチェックを実行することを更に含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１７】
所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第２のモデリングを実行することを更に含む、請求項１２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物学的分析、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等、及び、生物学的分析装置、例えば、ＰＣＲ用機器等に関し、特に、染料較正プレート、並びに、染料較正プレートを使用して染料を較正するための方法に関連するコンピュータシステム及びコンピュータソフトウェアに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的には、オペレーターが自身の意図した目的で生物学的分析システムをより素早くかつ効率的に使用できるように、生物学的分析システムの取付け及び設定を簡易化する必要性が高まっている。例えば、生物学的分析機器の較正における進歩により、オペレーターによるエラーの減少、オペレーターによる入力の減少、並びに、適切かつ効率的な取付けのために生物学的分析機器及びその種々のコンポーネントを較正するのに必要な時間の減少が有利に可能となっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一部の実施形態では、本開示は、蛍光染料を較正するためのコンピュータ実行方法に関する。本方法は、機器内に搭載されたサンプルホルダを、２つ以上のチャネルで画像化することを含み得る。前記サンプルホルダは、複数の反応位置と２種類以上の染料とを含み得る。ここで、各染料は、２つ以上の反応位置を占有している。本方法は、各染料についてのピークチャネルを、前記サンプルホルダにおいて特定することと、各チャネルを、各染料についての前記ピークチャネルに対して正規化することと、１セットの染料参照値を含み得る染料マトリクスを生成することとを更に含み得る。前記染料マトリクスは、各反応位置について、１セットの染料参照値を含み得る。
【０００４】
実施形態において、プロセッサにより実行可能な命令によりエンコードされる非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供され得る。前記命令は、機器内に搭載されたサンプルホルダを、２つ以上のチャネルで画像化するための命令を含み得る。前記サンプルホルダは、複数の反応位置と２種類以上の染料とを含み得る。ここで、各染料は、２つ以上の反応位置を占有している。前記命令は、各染料についてのピークチャネルを、前記サンプルホルダにおいて特定し、各チャネルを、各染料についての前記ピークチャネルに対して正規化し、１セットの染料参照値を含み得る染料マトリクスを生成するための命令を更に含み得る。前記染料マトリクスは、各反応位置について、１セットの染料参照値を含み得る。
【０００５】
別の実施形態では、蛍光染料を較正するためのシステムが提供される。本システムは、プロセッサと、前記プロセッサにより実行可能な命令によりエンコードされるメモリとを含む。前記命令は、機器内に搭載されたサンプルホルダを、２つ以上のチャネルで画像化するための命令を含み得る。前記サンプルホルダは、複数の反応位置と２種類以上の染料とを含み得る。ここで、各染料は、２つ以上の反応位置を占有している。前記命令は、各染料についてのピークチャネルを、前記サンプルホルダにおいて特定し、各チャネルを、各染料についての前記ピークチャネルに対して正規化し、１セットの染料参照値を含み得る染料マトリクスを生成するための命令を更に含み得る。前記染料マトリクスは、各反応位置について、１セットの染料参照値を含み得る。
【０００６】
更なる実施形態では、蛍光染料を較正するためのサンプルホルダが提供される。本サンプルホルダは、複数の反応位置を含み得る。前記複数の反応位置はそれぞれ、１つの染料を受容するように構成され得る。本サンプルホルダは、２つ以上の染料を受容するように構成され得る。あるいは、本サンプルホルダは、プレートであり得る。また、前記複数の反応位置は、複数のウェルであることもできる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、９６ウェル較正プレートの各ウェルを占有しているＦＡＭ染料を含む較正プレートの画像である。
【図２】図２は、本開示の一部の例示的な実施形態に基づいて、処理機能を実行するのに利用され得るコンピュータシステム２００を例示するブロック図である。
【図３】図３は、本教示の実施形態が実施され得るＰＣＲ機器３００を例示するブロック図である。
【図４】図４は、本明細書で記載された実施形態に基づいて、画像化に使用され得る例示的な光学系４００を示す。
【図５】図５は、本開示の実施形態に基づく例示となるワークフローを示す。
【図６】図６は、本開示の実施形態に基づく例示となるワークフローを示す。
【図７Ａ】図７Ａは、本開示の実施形態に基づいて、チェッカーボード構成を有する較正プレートを例示する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａにおけるプレート７００により例示されたとの同じ較正において、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、及びＳＹＢＲ染料を含む、４つの染料のチェッカーボード９６ウェル較正プレートの画像である。
【図８】図８は、本開示の実施形態に基づいて、チャネルＸ１Ｍ２での、ＦＡＭ染料を含む９６ウェルチェッカーボードプレートについてのグローバルモデルとして適用された、２Ｄの二次多項式関数の例を例示する。
【図９】図９は、本開示の実施形態に基づいて、プレート全体について測定された染料較正係数（ｘ軸）及びチェッカーボードプレートについてモデル化された染料較正係数（ｙ軸）によるグローバルモデリング性能を例示する。
【図１０】図１０は、本開示の実施形態に基づくチェッカーボード較正を有する較正プレートを例示する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のより完全な理解を提供するために、下記説明は、数多くの具体的な詳細、例えば、具体的な構成、パラメータ、例示等を説明している。ただし、このような説明は、本発明の範囲を限定するものと意図するものではなく、例示的な実施形態のより良好な説明を提供するのを意図していると認識されたい。
【０００９】
また、本明細書で記載された方法及びシステムは、種々の種類のシステム、機器、及び機械、例えば、生物学的分析システムにおいて実施されてもよいとも認識されるべきである。例えば、種々の実施形態は、複数のサンプルについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する機器、システム、又は機械で実施されてもよい。一般的には、大量のサンプルが処理される定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）に適用可能であるが、任意の適切なＰＣＲ法が本明細書で記載された種々の実施形態に基づいて使用されてもよいと認識されたい。適切なＰＣＲ法は、制限されず、例えば、デジタルＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ライゲーション媒介性ＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ゲノムウォーキング、及びブリッジＰＣＲを含む。さらに、本明細書で使用する場合、熱サイクルは、サーマルサイクラー、等温増幅、熱対流、赤外媒介性熱サイクル、又はヘリカーゼ依存性増幅の使用を含んでもよい。
【００１０】
上記されたように、オペレーターが自身の意図した目的で生物学的分析システムをより素早くかつ効率的に使用することができるように、生物学的分析システムの取付け及び設定を簡易化する必要性が高まっている。この必要性は、例えば、生物学的分析機器及び関連するコンポーネントを較正するのにおいて明らかである。１つの例示的な較正は、生物学的分析システム、例えば、ｑＰＣＲシステム等において、蛍光検出に使用される蛍光染料の較正である。
【００１１】
ｑＰＣＲ機器に使用される蛍光染料を較正することにより、機器のソフトウェアが、この機器により収集された総蛍光における各染料の個々の寄与を特徴付け、区別するのに、染料標準から収集された較正データを使用するのが可能となる。サンプルをランした後に、前記機器のソフトウェアは、各読取りについて、生のスペクトルシグナルの形式においてデータを受容する。前記ソフトウェアは、各染料が関与する生スペクトルを純粋なスペクトル較正データと比較することにより、各反応位置に使用される前記蛍光染料それぞれの寄与を決定する。ユーザが分析後に実験を保存する場合、前記機器のソフトウェアは、その実験について収集された蛍光データと共に、前記純粋なスペクトルと、ウェル当たりの各蛍光染料の寄与を記憶する。
【００１２】
ｑＰＣＲ機器における染料較正の結果は、例えば、各反応位置について、各染料標準の蛍光サインを表わすスペクトルプロファイルの収集である。各プロファイルは、サンプルホルダ、例えば、較正プレート又はアレイカード等の反応位置、例えば、ウェルから収集された蛍光に対応する、１セットのスペクトルからなる。各染料の前記較正後に、前記機器のソフトウェアは、各反応位置における各染料についてのスペクトルプロファイルを「抽出する」。前記ソフトウェアは、各プロファイルについて得られたデータを、蛍光対フィルタのグラフにプロットする。前記ソフトウェアが前記染料較正データを抽出した時点で、前記ソフトウェアは、各ウェルにより生成された蛍光シグナルを、較正プレート又はアレイカード全体についての集合スペクトルについて評価する。染料スペクトルは、それらがそれらのグループとして同じフィルタ内でピークを有するが、他の波長においてわずかに分散する場合、概ね許容され得る。
【００１３】
サンプルホルダ、例えば、較正プレートにおいて染料較正を実行した場合、前記反応位置（例えば、ウェル）は、一般的には、前記プレートの各ウェルにおいて純粋なスペクトル値の生成を可能にするように、同一濃度の染料を収容する。図１は、９６ウェル較正プレートの各ウェルを占有する、１つ染料（この場合には、ＦＡＭ染料）を含む較正プレートの画像を表わす。これにより、ランにおける各ウェルにより生成された蛍光シグナルのそのウェルについての純粋なスペクトル読取りに対する比較が可能となる。較正プレートの各ウェルに１つの染料を使用することにより、前記ウェルについて得られたシグナルは、同様であるべきである。スペクトル位置及びピーク位置の変動は、例えば、個々のウェル間の光学特性及び励起エネルギーにおける小さな差により生じ得る。染料較正におけるこれらの変動を考慮することにより、理論的に、より正確な染料較正がもたらされる。
【００１４】
しかしながら、較正プレートあたりに１つの染料を使用することは、特に、数多くの染料を較正する場合、時間集約的であり、複雑であるおそれがある。蛍光染料の非限定的な例は、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、ＳＹＢＲ、ＭＰ、ＡＢＹ、ＪＵＮ、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ、及びＣＹ５を含む。したがって、染料較正プロセスを簡易にし、較正に必要な時間を短縮しながら、染料較正の結果の同じ品質を維持する必要性がある。
コンピュータ実行システム
【００１５】
本明細書で記載された実施形態に基づく染料較正方法は、コンピュータシステムにおいて実施されてもよい。
【００１６】
当業者であれば、種々の実施形態の動作は、必要に応じて、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、又はそれらの組み合わせを使用して実行されてもよいことを認識するであろう。例えば、一部のプロセスは、プロセッサ又は他のデジタル回路を使用して、ソフトウェア、ファームウェア、又はハードウェアにより実現されているロジックの制御下において実行され得る（本明細書において、「ロジック」という用語は、列記された機能を実行するのに当業者により認識されるであろうように、固定ハードウェア、プログラマブルロジック、及び／又はそれらの適切な組み合わせを意味する）。ソフトウェア及びファームウェアは、非一時的コンピュータ可読媒体に記憶され得る。一部の他のプロセスは、当業者に周知なように、アナログ回路を使用して実行され得る。加えて、メモリ又は他の記憶デバイス及び通信コンポーネントが、本発明の実施形態において利用されてもよい。
【００１７】
図２は、種々の実施形態に基づいて、処理機能を実行するのに利用され得るコンピュータシステム２００を例示するブロック図である。実験を実行するための機器は、例示的なコンピュータシステム２００に接続されてもよい。種々の実施形態に基づいて、利用され得る前記機器は、例えば、以下でより詳細に検討される、図３のサーマルサイクラーシステム３００を含む。コンピュータシステム２００は、１つ以上のプロセッサ、例えば、プロセッサ２０４を含み得る。プロセッサ２０４は、汎用又は特別な処理エンジン、例えば、マイクロプロセッサ、コントローラ、又は他の制御ロジック等を使用して実装され得る。この例では、プロセッサ２０４は、ｂｕｓ２０２又は他の通信媒体に接続している。
【００１８】
さらに、図２のコンピュータシステム２００は、数多くの形式、例えば、ラックマウントコンピュータ、メインフレーム、スーパーコンピュータ、サーバ、クライアント、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレットコンピュータ、携帯コンピュータデバイス（例えば、ＰＤＡ、携帯電話、スマートフォン、パームトップ等）、クラスターグリッド、ネットブック、組込システムのいずれかに具体化されてもよく、又は、任意の他の種類の特別又は汎用のコンピュータデバイスが、所定のアプリケーション又は環境に望まれ若しくは適切であってもよい。加えて、コンピュータシステム２００は、従来のネットワークシステム、例えば、クライアント／サーバ環境及び１つ以上のデータベースサーバ、又は、ＬＩＳ／ＬＩＭＳインフラとの統合を含み得る。数多くの従来のネットワークシステム、例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）又はワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）並びに、例えば、無線及び／若しくは有線コンポーネントが、当技術分野において公知である。加えて、クライアント／サーバ環境、データベースサーバ、及びネットワークは、当技術分野において十分詳細に記載されている。本明細書で記載された種々の実施形態に基づいて、コンピュータシステム２００は、分散ネットワークにおける１つ以上のサーバに接続するように構成されてもよい。コンピュータシステム２００は、前記分散ネットワークから、情報又はアップデートを受容してもよい。また、コンピュータシステム２００は、前記分散ネットワークに接続している他のクライアントによりアクセスされてもよい、前記分散ネットワーク内に記憶される情報を伝送してもよい。
【００１９】
コンピュータシステム２００は、情報を通信するためのｂｕｓ２０２又は他の通信機構と、情報を処理するためにｂｕｓ２０２に接続しているプロセッサ２０４とを含んでもよい。
【００２０】
また、コンピュータシステム２００は、メモリ２０６も含む。メモリ２０６は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は他の動的メモリであることができ、プロセッサ２０４により実行される命令を記憶するためにｂｕｓ２０２に接続している。また、メモリ２０６は、プロセッサ２０４により実行される命令の実行中に、一時的な可変情報又は他の中間情報を記憶するのに使用されてもよい。コンピュータシステム２００は、プロセッサ２０４のための静的情報及び命令を記憶するために、ｂｕｓ２０２に接続している、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）２０８又は他のスタティック記憶デバイスを更に含む。
【００２１】
また、コンピュータシステム２００は、情報及び命令を記憶するために、ｂｕｓ２０２により提供され、同ｂｕｓ２０２に接続している、記憶デバイス２１０、例えば、磁気ディスク、光学ディスク、又はソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）を含んでもよい。記憶デバイス２１０は、媒体ドライブ及びリムーバブル記憶インターフェースを含んでもよい。媒体ドライブは、固定又はリムーバブル記憶媒体を支持するドライブ又は他の機構、例えば、ハードディスクドライブ、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光学ディスクドライブ、ＣＤ若しくはＤＶＤドライブ（Ｒ若しくはＲＷ）、フラッシュドライブ、又は他のリムーバブル若しくは固定媒体ドライブを含んでもよい。これらの例を例示する際、前記記憶媒体は、特定のコンピュータソフトウェア、命令、又はデータをその中に記憶しているコンピュータ可読記憶媒体を含んでもよい。
【００２２】
別の実施形態では、記憶デバイス２１０は、コンピュータプログラム又は他の命令若しくはデータが、コンピュータシステム２００内にロードされるのを可能にする、他の同様の手段を含んでもよい。このような手段は、例えば、リムーバブル記憶ユニット及びインターフェース、例えば、プログラムカートリッジ及びカートリッジインターフェース、リムーバブルメモリ（例えば、フラッシュメモリ又は他のリムーバブルメモリモジュール）、及びメモリスロット、並びに、ソフトウェア及びデータが記憶デバイス２１０からコンピュータシステム２００に伝送されるのを可能にする他のリムーバブル記憶ユニット及びインターフェースを含んでもよい。
【００２３】
また、コンピュータシステム２００は、通信インターフェース２１８も含み得る。通信インターフェース２１８は、ソフトウェア及びデータが、コンピュータシステム２００と外部装置との間を伝送されるのを可能にするのに使用され得る。通信インターフェース２１８の例は、モデム、ネットワークインターフェース（例えば、イーサネット（登録商標）又は他のＮＩＣカード）、通信ポート（例えば、ＵＳＢポート、ＲＳ−２３２Ｃシリアルポート等）、ＰＣＭＣＩＡスロット及びカード、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）等を含み得る。通信インターフェース２１８を介して伝送されるソフトウェア及びデータは、通信インターフェース２１８により受容され得る、電子的、電磁気的、光学的、及び／又は他のシグナルであり得るシグナルの形式にある。これらのシグナルは、チャネル、例えば、無線媒体、ワイヤ若しくはケーブル、光ファイバ、又は他の通信媒体を介して、通信インターフェース２１８により、伝送され、受容されてもよい。チャネルの一部の例は、電話回線、携帯電話リンク、ＲＦリンク、ネットワークインターフェース、ローカル若しくはワイドエリアネットワーク、及び他の通信チャネルを含む。
【００２４】
コンピュータシステム２００は、ｂｕｓ２０２を介して、コンピュータのユーザに情報を提示するためのディスプレイ２１２、例えば、陰極線管（ＣＲＴ）又は液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）に接続していてもよい。入力デバイス２１４、例えば、アルファベットと数字を組み合わせたキー及び他のキーが、例えば、情報及びコマンド選択をプロセッサ２０４に通信するために、ｂｕｓ２０２に接続している。入力デバイスは、タッチスクリーン入力能を有するように構成されているディスプレイ、例えば、ＬＣＤディスプレイでもよい。別の種類のユーザ入力デバイスは、方向情報及びコマンド選択をプロセッサ２０４に通信し、カーソル移動をディスプレイ２１２上で制御するためのカーソルコントロール２１６、例えば、マウス、トラックボール、又はカーソル方向キーである。この入力デバイスは、典型的には、デバイスが平面における位置を特定するのを可能にする２つの軸、第１の軸（例えば、ｘ）及び第２の軸（例えば、ｙ）における２つの自由度を有する。コンピュータシステム２００は、データ処理を提供し、このようなデータについての信頼レベルを提供する。本教示の実施形態の特定の実施と一致して、データ処理及び信頼値は、コンピュータシステム２００により、メモリ２０６に収容された１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行するプロセッサ２０４に応答して提供される。このような命令は、メモリ２０６内で、別のコンピュータ可読媒体、例えば、記憶デバイス２１０から読み取られてもよい。メモリ２０６に収容された前記命令シーケンスの実行により、プロセッサ２０４は、本明細書で記載された処置状態を実行する。あるいは、ハードウェアにより実現されている回路が、ソフトウェア命令に代えて、又は、同ソフトウェア命令と組み合わせて、本教示の実施形態を実施するのに使用されてもよい。このため、本教示の実施形態の実施は、ハードウェア回路及びソフトウェアの任意の特定の組み合わせに限定されない。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「コンピュータ可読媒体」及び「コンピュータプログラム製品」という用語は、一般的には、実行のために、１つ以上のシーケンス又は１つ以上の命令をプロセッサ２０４に提供するのに関与する任意の媒体を意味する。このような命令は、一般的には、「コンピュータプログラムコード」と呼ばれ（同コンピュータプログラムコードは、コンピュータプログラム又は他の分類の形式に分類される場合がある）、実行されると、コンピュータシステム２００が、本発明の実施形態の特徴又は機能を実行するのを可能にする。これら及び他の形式の非一時的コンピュータ可読媒体は、多くの形式、例えば、制限されず、不揮発性媒体、揮発性媒体、及び伝送媒体をとってもよい。不揮発性媒体は、例えば、ソリッドステート、光学、又は磁気ディスク、例えば、記憶デバイス２１０を含む。揮発性媒体は、動的メモリ、例えば、メモリ２０６を含む。伝送媒体は、同軸ケーブル、銅ワイヤ、及び光ファイバ、例えば、ｂｕｓ２０２を含むワイヤを含む。
【００２６】
一般的な形式のコンピュータ可読媒体は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ若しくは任意の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、孔パターンを有する他の物理的な媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ若しくはカートリッジ、以下に記載された搬送波、又はコンピュータが読み取ることができる任意の他の媒体を含む。
【００２７】
種々の形式のコンピュータ可読媒体が、１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを、実行のために、プロセッサ２０４に伝送するのに関与してもよい。例えば、前記命令は、最初に、リモートコンピュータの磁気ディスクに保持されてもよい。前記リモートコンピュータは、前記命令をその動的メモリ内にロードし、モデムを使用して前記命令を電話回線上で送信することができる。コンピュータシステム２００に位置するモデムは、前記電話回線上のデータを受容し、赤外線トランスミッタを使用して、前記データを赤外線シグナルに変換することができる。ｂｕｓ２０２に接続している赤外線検出器は、前記赤外線シグナルに保持された前記データを受容し、前記データをｂｕｓ２０２に移動させることができる。ｂｕｓ２０２は、前記データをメモリ２０６に伝送する。メモリ２０６から、プロセッサ２０４は、前記命令を検索し、実行する。メモリ２０６に受容された前記命令は、場合により、プロセッサ２０４による実行の前後のいずれかにおいて、記憶デバイス２１０に記憶されてもよい。
【００２８】
明確性の目的で、上記説明は、種々の機能ユニット及びプロセッサを参照して、本発明の実施形態を説明していることが理解されるであろう。ただし、種々の機能的なユニット、プロセッサ、又はドメイン間の機能の任意の適切な配置が本発明を逸脱することなく使用されてもよいことが明らかであろう。例えば、別箇のプロセッサ又はコントローラにより実行されるように例示された機能は、同じプロセッサ又はコントローラにより実行されてもよい。したがって、具体的な機能ユニットへの言及は、厳密な論理的又は物理的構造又は組織を示すのではなく、記載された機能を提供するのに適した手段への言及としてのみ見られる。
ＰＣＲ機器
【００２９】
上記されたように、種々の実施形態に基づいて利用されてもよい機器は、制限されず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）機器である。図３は、ＰＣＲ機器３００を例示するブロック図である。ＰＣＲ機器３００に基づいて、本教示の実施形態が実施されてもよい。ＰＣＲ機器３００は、基材（図示せず）に収容された複数のサンプル３１２上に配置される加熱カバー３１０を含んでもよい。種々の実施形態では、基材は、複数のサンプル領域を有するガラス又はプラスチックスライドでもよい。同サンプル領域は、前記サンプル領域と加熱カバー３１０との間にカバーを有する。基材の一部の例は、制限されず、マルチウェルプレート、例えば、標準的なマイクロタイター９６ウェル、３８４ウェルプレート、若しくはマイクロカード、又は、実質的に平坦な支持体、例えば、ガラス若しくはプラスチックスライドを含んでもよい。基材の種々の実施形態における前記反応位置は、前記基材表面に形成され、規則的又は不規則なアレイでパターン化された、窪み、ギザギザ、隆起、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。ＰＣＲ機器の種々の実施形態は、サンプルブロック３１４、加熱及び冷却用素子３１６、熱交換機３１８、コントロールシステム３２０、及びユーザインターフェース３２２を含む。本教示に基づくサーマルブロックアッセンブリの種々の実施形態は、図３のＰＣＲ機器３００のコンポーネント３１４〜３１８を含む。
【００３０】
リアルタイムＰＣＲ機器３００は、光学系３２４を有する。図３において、光学系３２４は、電磁エネルギーを発する照明光源（図示せず）と、基材におけるサンプル３１２からの電磁エネルギーを受容するための光学センサ、検出器、又は撮像素子（図示せず）と、各ＤＮＡサンプルから前記撮像素子に前記電磁エネルギーをガイドするのに使用される光学系３４０とを有してもよい。図３のＰＣＲ機器３００及び図３のリアルタイムＰＣＲ機器３００の実施形態について、コントロールシステム３２０は、検出システム、加熱カバー、及びサーマルブロックアッセンブリの機能を制御するのに使用されてもよい。コントロールシステム３２０は、図３のＰＣＲ機器３００及び図３のリアルタイムＰＣＲ機器３００のユーザインターフェース３２２を通して、エンドユーザにアクセス可能でもよい。また、図２に示されたコンピュータシステム２００も、図３のＰＣＲ機器３００の機能及びユーザインターフェース機能の制御を提供するように機能してもよい。加えて、図２のコンピュータシステム２００は、データ処理を提供し、作製機能を表示し、報告してもよい。このような機器制御機能は全て、前記ＰＣＲ機器にローカル専用でもよく、又は、後により詳細に検討されるであろうように、図２のコンピュータシステム２００が、制御、分析、及び報告機能の一部若しくは全部のリモートコントロールを提供してもよい。
画像化用の光学系
【００３１】
図４は、本明細書で記載された実施形態に基づいて、画像化に使用されてもよい例示的な光学系４００を示す。光学系４００は、例示的な光学系であり、当業者であれば、他の光学系が関心対象の画像をキャプチャするのに使用されてもよいことを認識するであろうことを認識されたい。種々の実施形態に基づいて、関心対象は、サンプルホルダ、例えば、本明細書で記載された較正プレート等でもよい。カメラ４０４に含まれる光学センサ４０２は、例えば、関心対象４１０を画像化してもよい。光学センサ４０２は、ＣＣＤセンサでもよい。カメラ４０４は、ＣＣＤカメラでもよい。さらに、前記光学センサは、カメラレンズ４０６を含む。
【００３２】
前記関心対象に応じて、発光フィルタ４０８は、種々の実施形態に基づいて、関心対象４１０を画像化するのに選択され得る。発光フィルタ４０８は、他の実施形態では、関心対象４０１から発せられた蛍光放出を画像化するのに変更されてもよい。
【００３３】
光学系４００は、反射光源４１２を使用して、関心対象４１０を画像化してもよい。光源４１２からの光は、非球面４１４、焦点器／分散器４１６、及び励起フィルタ４１８を通してフィルタリングされ、その後、ビームスプリッタ４２０により関心対象４１０に反射されてもよい。また、光学系４００は、視野レンズ４２２を含んでもよい。前記関心対象に応じて、励起フィルタ４１８が、種々の実施形態に基づいて、関心対象４１０を画像化するために選択され、又は、変更され得る。
【００３４】
本教示の種々の実施の下記説明は、例示及び説明の目的で提供されている。同例示及び説明は、排他的なものではなく、本教示を開示された正確な形態に限定するものではない。改変及び変更が、上記教示を考慮して可能であり、又は、本教示の実施から得られてもよい。加えて、記載された実装は、ソフトウェアを含むが、本教示は、ハードウェアとソフトウェアとの組み合わせとして、又は、ハードウェア単独において実施されてもよい。本教示は、オブジェクト指向及び非オブジェクト指向プログラムシステムの両方により実施されてもよい。
蛍光染料を較正するための改善されたワークフロー及びプレート
【００３５】
図５及び図６は、本明細書で記載された実施形態に基づいて、蛍光染料を較正する例示的な方法５００を示すフローチャートを例示する。方法５００の工程は、図２に示されたプロセッサ２０４により実施されてもよい。さらに、本方法をプロセッサ２０４により実行するための命令は、メモリ２０６に記憶されてもよい。
【００３６】
図５を参照して、工程５０２において、較正プレートは、染料を、処理用の基材の反応位置に載せることにより準備される。この場合、前記基材は、９６ウェルプレートである。ただし、種々の基材、例えば、３８４ウェルプレート等が使用されてもよい。種々の実施形態では、前記基材は、複数のサンプル領域を有するガラス又はプラスチックスライドでもよい。基材の一部の例は、制限されず、マルチウェルプレート、例えば、標準的なマイクロタイター９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、若しくはマイクロカード、実質的に平坦な支持体、例えば、ガラス若しくはプラスチックスライド、又は、任意の他の種類のアレイ若しくはマイクロアレイを含んでもよい。基材の種々の実施形態における前記反応位置は、前記基材表面に形成され、規則的又は不規則なアレイでパターン化された、ウェル、窪み、ギザギザ、隆起、及びそれらの組み合わせを含んでもよい。これまで、ウェル又はプレートへの言及は、単に例示を目的とするのみであり、本明細書で使用できる反応位置又はサンプルホルダの種類を何ら限定するものではない。
【００３７】
前記較正プレートは、図７Ａ（又は、以下でより詳細に検討された３８４ウェルプレートについては、図１０）に例示されたチェッカーボードパターンで準備されてもよい。較正プレート７００、７２０、及び７４０に例示されたように、前記プレート自体は、９６ウェルのフォーマットのものでもよいが、前記較正プレートのウェル数は、必要に応じて、例えば、較正を必要とする染料数、前記較正プレートを受容するサンプルブロック３１４（図３を参照のこと）のフォーマット、又は、種々のウェル密度のプレートを画像化する機器（例えば、ＰＣＲ機器３００）の性能に応じて、変更され得る。
【００３８】
染料配置の前記チェッカーボードパターンにより、較正プレートあたりに複数の染料を較正するのが可能となる。較正プレートあたりに１つの染料を較正するのとは対照的に、前記チェッカーボードパターンにより、ユーザがより少ないプレートを使用して、染料セットを較正するのが可能となるために、染料較正に必要となる時間及び処理工程を短縮することができる。
【００３９】
図７Ａに例示された実施形態では、３つのプレートが、１０個の別箇の染料を較正するのに使用される。各較正プレート７００／７２０／７４０は、４種類の染料を、前記プレートの各列のウェルに沿って交互の染料の繰返しパターンで収容するように構成されている。これにより、各ウェルには、特定の染料が繰返しパターンで存在する（染料存在ウェル）。例えば、プレート７００は、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、及びＳＹＢＲ染料を、ウェル７０２（ＦＡＭ）、７０４（ＶＩＣ）、７０６（ＲＯＸ）、及び７０８（ＳＹＢＲ）により例示された、交互のウェルに収容する。プレート７２０は、バッファー、ＭＰ染料、ＡＢＹ染料、及びＪＵＮ染料を、ウェル７２２（バッファー）、７２４（ＭＰ）、７２６（ＡＢＹ）、及び７２８（ＪＵＮ）により例示された、交互のウェルに収容する。プレート７４０は、ＮＥＤ染料、ＴＡＭＲＡ染料、ＣＹ５染料、及びバッファーを、ウェル７４２（ＮＥＤ）、７４４（ＴＡＭＲＡ）、７４６（ＣＹ５）、及び７４８（バッファー）により例示された、交互のウェルに収容する。この実施形態では、１０個の染料のみが較正されるため、バッファーが、プレート７２０及び７４０において、較正される染料を収容していないウェルの充填材として使用される。
【００４０】
図７Ａ及び図７Ｂにおける実施形態は、単なる例示であり、較正される染料の総数、プレートあたりの染料数、及び前記プレート数は全て、例えば、ユーザの較正の必要性、前記プレートのウェル数、及び、前記較正を取り扱う機器の能力に基づいて、必要に応じて変動し得ることを理解されたい。例えば、１２個の染料が図７Ａで例示された実施形態において較正された場合、合計１２個の染料について、４つの染料が３つの較正プレート７００／７２０／７４０それぞれにおいて較正され得るため、バッファーは、プレート７２０及び７４０には必要ないであろう。
【００４１】
さらに、プレートあたりの染料数は、２つ以上であり得る。ここで、プレートあたりの染料の最大数は、例えば、前記較正プレートのウェル数、プレート全体を適切にモデリングするのに使用される機器の能力（更なる説明については、以下を参照のこと）、及び、選択された前記プレートから有用な蛍光データを得るための画像化システムの能力に基づいている。例えば、図７Ａで例示された９６ウェルプレートを使用する以外に、図１０で提供された３８４ウェル較正プレートを使用するのが可能である、十分堅牢な機器及び関連する画像化システムを有してもよい。提供された更なるウェル密度により、プレートあたりにより多くの染料、例えば、プレートあたりに１６個の染料を較正でき、十分なグローバルモデル（以下でより詳細に検討）を得るのに必要とされる、ウェルあたりに同じ数（例えば２４個）のデータ点（すなわち、染料存在ウェル）をも得ることができる。図１０において、例えば、１０個の染料が、２つのプレートを使用して、プレートあたりに５個の染料で較正され得る。
【００４２】
サンプルホルダの種類及び反応位置の種類も、可能な染料数に影響を及ぼす場合がある。上記されたように、他の種類のサンプルホルダ及び反応位置が、較正に使用されてもよい。
【００４３】
図５に戻って、工程５０４において、準備されたチェッカーボード較正プレートは、前記機器内に搭載され得る。一度に機器内に搭載可能なプレート数は、使用される前記機器の性能及び容量により決まる。例えば、９６ウェルブロックを有する標準的なｑＰＣＲサーマルサイクラーは、較正プレート上において１回のみで受容するであろう。一方、マルチブロックサーマルサイクラーは、較正プレートそれぞれを受容し得る複数のブロックを提供してもよい。さらに、較正プレートが使用されない場合、使用される前記サンプルホルダのフォーマット（例えば、マイクロアレイ又はマイクロチップアレイ）に応じて、複数のサンプルホルダは、例えば、前記機器に取り付けられる搭載アッセンブリを使用して、１つの機器に受容されてもよい。
【００４４】
図５の工程５０６において、その関連する光学画像化システム（例えば、図４を参照のこと）を使用する前記機器は、搭載された１つ以上のプレートの画像を、直列又は並列に取得する。前記取得された画像及び関連するデータは、例えば、図２のコンピュータシステム２００のメモリ２０６又は記憶デバイス２１０に記憶され得る。前記光学画像化システムは、各光学チャネルにおいて、各プレートの画像を取得し得る。前記チャネル数は、前記画像化システムに提供された励起及び発光フィルタの数により決まる。例えば、６つの励起フィルタ（Ｘフィルタ）及び６つの発光フィルタ（Ｍフィルタ）を有する光学画像化システムについて、前記チャネルの総数は、２１であり、下記フィルタ組み合わせ：Ｘ１Ｍｌ、Ｘ１Ｍ２、Ｘ１Ｍ３、Ｘ１Ｍ４、Ｘ１Ｍ５、Ｘ１Ｍ６、Ｘ２Ｍ２、Ｘ２Ｍ３、Ｘ２Ｍ４、Ｘ２Ｍ５、Ｘ２Ｍ６、Ｘ３Ｍ３、Ｘ３Ｍ４、Ｘ３Ｍ５、Ｘ３Ｍ６、Ｘ４Ｍ４、Ｘ４Ｍ５、Ｘ４Ｍ６、Ｘ５Ｍ５、Ｘ５Ｍ６、及びＸ６Ｍ６により表わされる。各チャネルにおいて取得される画像又は露光の数は変動し得る。例えば、前記画像化システムは、チャネルあたりに、２つの画像又は露光を取得し得る。取得される画像又は露光数は、チャネルあたりにより少ない画像又は露光を取得することが画像又は露光を取得するのに必要な時間を短縮してもよく、一方、チャネルあたりにより多くの画像又は露光を取得することが品質データのより高い可能性を提供するように、ユーザニーズにより決まる。
【００４５】
図５の工程５０８において、前記光学画像化システム（例えば、図４を参照のこと）により取得される前記画像又は露光から収集されたデータを使用して、前記機器は、前記各染料についてのピークチャネルを、前記較正プレートにおいて特定する。各反応位置についてのこのピークチャネルは、分析された特定の染料がその反応位置について最も高い蛍光を示すチャネルである。前記ピークチャネルの特定は、例えば、９５％以上の反応位置が染料により占められた場合に生じ得る。この場合、較正中に、５％以下のはずれ値の反応位置が許容される。許容可能なはずれ値の割合は変動し得る。ついで、はずれ値の反応位置は、将来の算出及び分析から排除され得る。はずれ値は、例えば、不適切な染料が載せられた場合、前記染料が不正確な構成で載せられた場合、染料の不正確な搭載が存在した場合、又は、光学コンポーネントが汚れた（例えば、ちり粒子）場合に生じ得る。前記較正プレートにおける各染料についての前記ピークチャネルは、例えば、コンピュータシステム２００のプロセッサ２０４により、メモリ２０６に記憶されたデータを利用して特定され得る。前記特定結果は、例えば、コンピュータシステム２００のメモリ２０６又は記憶デバイス２１０に記憶され得る。
【００４６】
あるいは、各反応位置において各フィルタ組み合わせについて前記光学画像化システムにより取得された前記画像又は露光から収集された収集蛍光データは、ピークチャネル特定前に、バックグラウンド及び均一補正により、当技術分野において公知のバックグラウンド及び均一性較正法を使用して決定されるバックグラウンド成分及び均一性要因を使用して補正され得る。
【００４７】
図５の工程５１０において、前記光学画像化システム（例えば、図４を参照のこと）により取得された前記画像又は露光から収集された前記データを使用して、前記機器は、各チャネルを、全ての染料存在ウェルについて工程５０８の前記特定されたピークチャネルに対して正規化する。各チャネルは、例えば、コンピュータシステム２００のプロセッサ２０４により、メモリ２０６に記憶されたデータを利用して、前記特定されたピークチャネルに正規化され得る。前記正規化の結果は、例えば、コンピュータシステム２００のメモリ２０６又は記憶デバイス２１０に記憶され得る。
【００４８】
全ての染料存在ウェルは、正規化するためのベースライン定量値を与えられる。一般的には、前記定量値が高いほど、前記検出蛍光が大きくなる。したがって、所定の染料について前記特定されたピークチャネルは、ピークチャネルはずれ値を除いて、前記染料存在ウェルにおいて、その染料についての最も大きい定量値を有するであろう。正規化するそのピークチャネルにおける前記定量値に関わらず、そのチャネルにおけるその定量値は、１の値にリセットされる。ついで、他のチャネルにおけるその同じ占領についての残りの定量値は、前記ピークチャネルについて、１のリセット値に基づいて調節される。例えば、染料Ｘについて、ピークチャネルＡが、ウェルにおいて、１００の定量値を有し、他のチャネルＢが、前記ウェルにおいて、４０の定量値を有した場合、正規化に基づいて、ピークチャネルＡは、１．０に設定され、チャネルＢは、０．４０に設定される。この正規化された値は、較正係数とも呼ばれ得る。ここで、前記ピークチャネルについての前記較正係数は、上記されたように、１．０に設定される。
【００４９】
図７Ａ及び図７Ｂに例示された実施形態では、４つの染料が９６ウェルプレートのウェルに等しく配置された場合、染料あたりの染料存在ウェルの数は、２４個であろう。前記染料存在ウェルの数は、先に検討された理由、例えば、前記サンプルホルダ（例えば、較正プレート）における前記反応位置（例えば、ウェル）の数、前記サンプルホルダに配置された染料数等について変動し得る。例えば、９６ウェルプレートにおいて、３つの染料が配置された場合、前記染料存在ウェルの数は、染料あたりに３２個であろう。６つの染料が９６ウェルプレートに配置された場合、前記染料存在ウェルの数は、染料あたりに１６個であろう。
【００５０】
ここから図６を参照して、工程５１２において、前記機器は、染料あたりに、全てのウェルについてのグローバルモデリングを実行する。サンプルホルダフォーマットの全てのウェルについて染料を較正するために、前記機器は、特定の染料についての前記染料存在ウェルからの前記データを使用して、前記特定の染料を以外の染料を含む全てのウェルをモデリングし得る。前記グローバルモデリングは、例えば、コンピュータシステム２００のプロセッサ２０４により、特定の染料についての前記染料存在ウェルからの前記データを使用することにより実行され、全てのウェルについてモデリングし得る。前記得られたモデルは、例えば、メモリ２０６又は記憶デバイス２１０に記憶され得る。図７Ａを参照して、ＦＡＭ染料が、プレート７００の２４個のウェル７０２に存在し、そのプレートの他の７２個のウェルには、ＦＡＭ染料は存在しないであろう。同じ２４個の存在し／７２個の存在しない配置が、図７Ａにおける各染料に適用されるであろう。染料不存在ウェルの数は、前記染料存在ウェルの数により決まる。同染料存在ウェルは、上記されたように、種々の理由により決まり得る。いずれにしても、所定のプレートについての前記染料存在ウェル及び染料不存在ウェルの合計は、そのプレートのウェル数に等しい。図７Ｂは、図７Ａにおけるプレート７００により例示されたのと同じ構成において、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、及びＳＹＢＲ染料を含む、４つの染料のチェッカーボード９６ウェル較正プレートの画像である。
【００５１】
別の実施形態では、前記機器は、全てのチャネル又は正規化された値を有するそれらのチャネル、例えば、０．０１又は１％超の前記特定されたピークチャネルについて、グローバルモデリングを実行する。この閾値を下回るそれらのチャネルについて、前記機器は、グローバルモデリングの実行に代えて、ローカルモデリングを実行するであろう（図６の工程５２２を参照のこと）。グローバルモデリングは、特定のチャネルにおいてこのように低いレベルでは必須となる場合がある。これにより、検出された蛍光は、実際の染料の寄与が較正される以外に、例えば、主に、ノイズ又は他の妨害の結果である。
【００５２】
グローバルモデリングアルゴリズムは、前記特定の染料存在ウェルの測定された染料較正係数に基づいて、各染料用の各フィルタチャネルについての染料較正係数のモデルを得るのに、染料較正において機能し得る。例えば、２４個のウェルが特定の染料用に９６ウェルチェッカーボードプレートに存在する場合、グローバルモデリングは、それらの２４個のウェルの前記染料較正係数を利用して、他の染料が存在しない７２個のウェルを含む全てのウェルについての較正係数を得ることにより、チャネルあたり、染料当たりのプレート全体についてのモデルを生成する。
【００５３】
２次元（２Ｄ）の二次多項式関数は、染料較正係数についてのグローバルモデルとして適用され得る関数の例である。他のグローバルモデリング関数が公知であり、本明細書に使用され得る。非線形最少二乗ソルバは、特定の染料存在ウェルにおいて測定された染料較正係数から、モデリング残差（前記モデルから算出された値と前記測定された染料較正係数との間の差異）を最小化することにより、前記２Ｄ二次多項式関数を得るのに使用され得る。Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ信頼領域アルゴリズムが、このソルバにおいて、最適化アルゴリズムとして使用され得る。多くの他の最適化アルゴリズムが本明細書で使用可能であるが、１つの他の例は、Ｄｏｇｌｅｇ法である。その重要なアイデアは、Ｇａｕｓｓ−Ｎｅｗｔｏｎ及びＣａｕｔｈｙ法の両方を使用して、非線形目的を最適化する最適化工程を算出することである。このアプローチは、信頼領域として公知の検索空間の部分集合上で、モデル関数（多くの場合、二次）を使用する目的関数を近似させる。前記モデル関数が前記信頼目的関数を最小化するのに成功した場合、前記信頼領域は拡張される。逆に、前記近似が十分でない場合には、前記領域は収縮され、前記モデル関数が再度適用される。また、例えば、損失関数が、高い残差（算出された較正係数と測定された較正係数との間の最大差異）の影響を低減させるのに使用されてもよい。これらの高い残差は、通常、最適化におけるはずれ値を構成する。
【００５４】
図６の工程５１４において、全てのウェルが所定の１つ以上の染料についてモデリングされた後に、前記機器は、適合度（ＧＯＦ）のチェックを実行する。これにより、グローバルモデリング工程が十分な信頼性を有するのが確保され得る。ＧＯＦチェックは、例えば、コンピュータシステム２００のプロセッサ２０４により、例えば、メモリ２０６又は記憶デバイス２１０に記憶された結果を使用して実行され得る。適合度の測定は、典型的には、観察された値と当該モデル下で予測される値との間の不一致を概説する。ＧＯＦは、多くの方法、例えば、決定係数であるＲ−２乗及び平均平方誤差（ＲＭＳＥ）値等において決定され得る。Ｒ−２乗は、例えば、モデルの適合度について、幾らかの情報を与えるであろう統計値である。回帰において、Ｒ−２乗決定係数は、回帰線が実際のデータ点にどの程度十分に近似しているかの統計学的測定である。１のＲ−２乗は、回帰線が完全にデータと適合していることを示す。ＲＭＳＥは、観察された値と当該モデル下で予測された値との間の差異又は残差の平均平方の平方根である。ＲＭＳＥは、モデルの予測正確性の良好な測定値である。０のＲＭＳＥは、前記モデル下で予測された値が前記観察値に正確に一致していることを示す。
【００５５】
図８は、チャネルＸ１Ｍ２において、ＦＡＭ染料を含む９６ウェルチェッカーボードプレートについてのグローバルモデルとして適用される２Ｄの二次多項式関数の例を例示する。比較のために、９６個の検出値を有する染料プレート全体からの純粋なＦＡＭによる値は、前記モデルに重なっている。図９は、プレート全体について測定された染料較正係数（ｘ軸）をチェッカーボードプレートについてモデリングされた染料較正係数（ｙ軸）に対して比較することにより、グローバルモデリング性能の例示を提供する。この例において算出されたＲ−２乗値は、０．９８３であり、良好なＧＯＦを確立している。
【００５６】
図６の工程５１６において、良好な適合が存在する場合には、前記機器は、図６の工程５１８において、染料マトリクスを出力する。例えば、図９に例示されたように、Ｒ−２乗値が、例えば、０．８５以上であるか、又は、ＲＭＳＥ値が、例えば、０．０１以下である場合、統計学的に良好な適合が、Ｒ−２乗分析において生じてもよい。前記染料マトリクスは、例えば、コンピュータシステム２００のプロセッサ２０４により作製され、ディスプレイ２１２に出力され得る。
【００５７】
図６の工程５２０において、不適合が存在する場合には、前記機器は、図６の工程５２２において、ローカルモデリングを実行する。これは、例えば、ＧＯＦチェックについて算出されたＲ２値が、０．８５未満であり、例えば、ＲＭＳＥ値が、０．０１超である場合に、例えば、必要となる場合がある。前記ローカルモデリングは、残りの染料不存在ウェルについてモデリングするために、例えば、コンピュータシステム２００のプロセッサ２０４により、特定の染料についての前記染料存在ウェルからのデータを使用することにより実行され得る。前記得られたモデルは、例えば、メモリ２０６又は記憶デバイス２１０に記憶され得る。
【００５８】
ローカルモデリング法は、例えば、前記プレートにおいて同じ染料についての周りの染料存在ウェルからの較正係数を使用することを含み得る。例えば、特定の染料についての染料不存在ウェルにおける較正係数値を決定するために、前記ローカルモデルは、周囲のウェルの５×５ローカルウインドウ内又はプレート全体からの同じ染料の全ての特定の染料存在ウェルの中央値を取り得る。その中央値は、前記プレートの完全なモデリングが完了されるまでに決定される。ついで、前記ローカルモデリングの出力は、前記グローバルモデリングの出力を置き換え得る。
【００５９】
前記ローカルモデリング終了時に、前記染料マトリクスは、前記機器が図６の工程５１８での前記染料マトリクスを出力するのに十分である。この染料マトリクスは、較正された各染料の蛍光サインのプロファイルとして機能する。各ラン後に、前記機器は、各読取りについての生のスペクトルシグナルの形式で、データを受容する。前記機器は、前記生のスペクトルを前記染料マトリクスの純粋なスペクトル較正データに対して比較することにより、各反応に使用される前記蛍光染料の寄与を決定する。前記機器は、染料標準から収集された前記較正データ（すなわち、前記染料マトリクス）を使用して、前記機器により収集された総蛍光における各染料の個々の寄与を特徴付け、区別する。
【００６０】
第１の実施形態では、機器内に搭載されたサンプルホルダを、２つ以上のチャネルで画像化することであって、前記サンプルホルダが複数の反応位置と２種類以上の染料とを含み、各染料が２つ以上の反応位置を占有している画像化と、各染料についてのピークチャネルを、前記サンプルホルダにおいて特定することと、各チャネルを、各染料についての前記ピークチャネルに対して正規化することと、１セットの染料参照値を含む染料マトリクスを生成することとを含む、蛍光染料を較正するためのコンピュータ実行方法が提供される。
【００６１】
第２の実施形態では、前記サンプルホルダが、プレートである、第１の実施形態記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００６２】
第３の実施形態では、前記複数の反応位置が、複数のウェルである、第１及び第２の実施形態記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００６３】
第４の実施形態では、１つの染料が、各ウェルを占有している、第１〜第３の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００６４】
第５の実施形態では、各染料が、実質的に同じ数の前記反応位置を占有するように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置されている、第１〜第４の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００６５】
第６の実施形態では、隣接する反応位置を占有する染料が異なるように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置されている、第１〜第５の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００６６】
第７の実施形態では、前記機器が、生物学的分析装置である、第１〜第６の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００６７】
第８の実施形態では、前記機器が、ＰＣＲ機器である、第１〜第７の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００６８】
第９の実施形態では、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第１のモデルを実行することを更に含む、第１〜第８の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００６９】
第１０の実施形態では、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第１のモデルとして、二次元の二次多項式関数を適用することを更に含む、第１〜第９の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００７０】
第１１の実施形態では、前記第１のモデルの結果についての適合度のチェックを実行することを更に含む、第９及び第１０の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００７１】
第１２の実施形態では、前記第１のモデルの結果について、ｒ−２乗分析又はＲＭＳＥを実行することを更に含む、第９及び第１０の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００７２】
第１３の実施形態では、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第２のモデリングを実行することを更に含む、第９〜第１２の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００７３】
第１４の実施形態では、前記第１のモデルの適合度が閾値を超えない場合、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第２のモデリングを実行することを更に含む、第９〜第１２の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００７４】
第１５の実施形態では、前記第１のモデルのｒ−２乗分析が閾値を超えない場合、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についてのｒ−２乗又はＲＭＳＥ分析を実行することを更に含む、第１２の実施形態記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００７５】
第１６の実施形態では、ｒ−２乗の閾値が０．８５であり、ＲＭＳＥの閾値が０．０１である、第１４及び第１５の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００７６】
第１７の実施形態では、前記２つ以上の染料が、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、ＳＹＢＲ、ＭＰ、ＡＢＹ、ＪＵＮ、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ、ＣＹ５、特注染料、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、第１〜第１６の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【００７７】
第１８の実施形態では、蛍光染料を較正するために、プロセッサにより実行可能な命令によりエンコードされる非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、前記命令が、機器内に搭載されたサンプルホルダを、２つ以上のチャネルで画像化することであって、前記サンプルホルダが複数の反応位置と２種類以上の染料とを含み、各染料が２つ以上の反応位置を占有している画像化をし、各染料についてのピークチャネルを、前記サンプルホルダにおいて特定し、各チャネルを、各染料についての前記ピークチャネルに対して正規化し、１セットの染料参照値を含む染料マトリクスを生成するための命令を含む、非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００７８】
第１９の実施形態では、前記サンプルホルダが、プレートである、第１８の実施形態記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００７９】
第２０の実施形態では、前記複数の反応位置が、複数のウェルである、第１８及び第１９の実施形態記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００８０】
第２１の実施形態では、１つの染料が、各ウェルを占有している、第１８〜第２０の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００８１】
第２２の実施形態では、各染料が、実質的に同じ数の前記反応位置を占有するように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置されている、第１８〜第２１の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００８２】
第２３の実施形態では、隣接する反応位置を占有する染料が異なるように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置されている、第１８〜第２２の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００８３】
第２４の実施形態では、前記機器が、生物学的分析装置である、第１８〜第２３の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００８４】
第２５の実施形態では、前記機器が、ＰＣＲ機器である、第１８〜第２４の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００８５】
第２６の実施形態では、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第１のモデルを実行することを更に含む、第１８〜第２５の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００８６】
第２７の実施形態では、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第１のモデルとして、二次元の二次多項式関数を適用することを更に含む、第１８〜第２６の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００８７】
第２８の実施形態では、前記第１のモデルの結果についての適合度のチェックを実行することを更に含む、第２６及び第２７の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００８８】
第２９の実施形態では、前記第１のモデルの結果について、ｒ−２乗分析を実行することを更に含む、第２６及び第２７の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００８９】
第３０の実施形態では、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第２のモデリングを実行することを更に含む、第２６〜第２９の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００９０】
第３１の実施形態では、前記第１のモデルの適合度が閾値を超えない場合、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第２のモデリングを実行することを更に含む、第２６〜第２９の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００９１】
第３２の実施形態では、前記第１のモデルのｒ−２乗分析が閾値を超えない場合、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についてのｒ−２乗又はＲＭＳＥを実行することを更に含む、第２６〜第２９の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００９２】
第３３の実施形態では、ｒ−２乗の閾値が０．８５であり、ＲＭＳＥの閾値が０．０１である、第３１〜第３２の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００９３】
第３４の実施形態では、前記２つ以上の染料が、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、ＳＹＢＲ、ＭＰ、ＡＢＹ、ＪＵＮ、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ、ＣＹ５、特注染料、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、第１８〜第３３の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【００９４】
第３５の実施形態では、プロセッサと、前記プロセッサにより実行可能な命令によりエンコードされるメモリとを含み、前記命令が、機器内に搭載されたサンプルホルダを、２つ以上のチャネルで画像化することであって、前記サンプルホルダが複数の反応位置と２種類以上の染料とを含み、各染料が２つ以上の反応位置を占有している画像化をし、各染料についてのピークチャネルを、前記サンプルホルダにおいて特定し、各チャネルを、各染料についての前記ピークチャネルに対して正規化し、１セットの染料参照値を含む染料マトリクスを生成するためものである、蛍光染料を較正するためのシステムが提供される。
【００９５】
第３６の実施形態では、前記サンプルホルダが、プレートである、第３５の実施形態記載のシステムが提供される。
【００９６】
第３７の実施形態では、前記複数の反応位置が、複数のウェルである、第３５及び第３６の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【００９７】
第３８の実施形態では、１つの染料が、各ウェルを占有している、第３５〜第３７の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【００９８】
第３９の実施形態では、各染料が、実質的に同じ数の前記反応位置を占有するように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置されている、第３５〜第３８の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【００９９】
第４０の実施形態では、隣接する反応位置を占有する染料が異なるように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置されている、第３５〜第３９の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１００】
第４１の実施形態では、前記機器が、生物学的分析装置である、第３５〜第４０の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１０１】
第４２の実施形態では、前記機器が、ＰＣＲ機器である、第３５〜第４１の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１０２】
第４３の実施形態では、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第１のモデルを実行することを更に含む、第３５〜第４２の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１０３】
第４４の実施形態では、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第１のモデルとして、二次元の二次多項式関数を適用することを更に含む、第３５〜第４２の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１０４】
第４５の実施形態では、前記第１のモデルの結果についての適合度のチェックを実行することを更に含む、第４３〜第４４の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１０５】
第４６の実施形態では、前記第１のモデルの結果について、ｒ−２乗又はＲＭＳＥ分析を実行することを更に含む、第４３〜第４４の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１０６】
第４７の実施形態では、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第２のモデリングを実行することを更に含む、第４３〜第４６の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１０７】
第４８の実施形態では、前記第１のモデルの適合度が閾値を超えない場合、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についての第２のモデリングを実行することを更に含む、第４３〜第４６の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１０８】
第４９の実施形態では、前記第１のモデルのｒ−２乗分析が閾値を超えない場合、所定の染料について、前記所定の染料により占有されていない反応位置についてのｒ−２乗分析を実行することを更に含む、第４３〜第４６の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１０９】
第５０の実施形態では、ｒ−２乗の閾値が０．８５であり、ＲＭＳＥの閾値が０．０１である、第４８〜第４９の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１１０】
第５１の実施形態では、前記２つ以上の染料が、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＲＯＸ、ＳＹＢＲ、ＭＰ、ＡＢＹ、ＪＵＮ、ＮＥＤ、ＴＡＭＲＡ、ＣＹ５、特注染料、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、第３５〜第５０の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１１１】
第５２の実施形態では、蛍光染料を較正するためのサンプルホルダであって、複数の反応位置を含み、前記複数の反応位置がそれぞれ、１つの染料を受容するように構成されており、前記サンプルホルダが、２つ以上の染料を受容するように構成されている、サンプルホルダが提供される。
【０１１２】
第５３の実施形態では、前記サンプルホルダが、プレートである、第５２の実施形態記載のサンプルホルダが提供される。
【０１１３】
第５４の実施形態では、前記複数の反応位置が、複数のウェルである、第５２〜第５３の実施形態のいずれかに記載のサンプルホルダが提供される。
【０１１４】
第５５の実施形態では、前記２つ以上の染料の各染料が、前記２つ以上の染料の他のものと実質的に同じ数の前記反応位置を占有するように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置されている、第５２〜第５４の実施形態のいずれかに記載のサンプルホルダが提供される。
【０１１５】
第５６の実施形態では、隣接する反応位置を占有する染料が異なるように、前記反応位置に沿ったパターンで、前記染料が配置されている、第５２〜第５５の実施形態のいずれかに記載のサンプルホルダが提供される。
【０１１６】
第５７の実施形態では、前記染料が、前記反応位置に沿って、繰返しの交互パターンで配置されている、第５２〜第５５の実施形態のいずれかに記載のサンプルホルダが提供される。
【０１１７】
第５８の実施形態では、前記染料の配置が、チェッカーボードパターンを形成している、第５２〜第５６の実施形態のいずれかに記載のサンプルホルダが提供される。
【０１１８】
第５９の実施形態では、１つの染料が、各反応位置に配置されている、第５２〜第５７の実施形態のいずれかに記載のサンプルホルダが提供される。
【０１１９】
第６０の実施形態では、前記染料が、前記反応位置に沿って、繰返しの交互パターンで配置されている、第１〜第６の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【０１２０】
第６１の実施形態では、前記染料の配置が、チェッカーボードパターンを形成している、第１〜第６の実施形態のいずれかに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【０１２１】
第６２の実施形態では、前記染料が、前記反応位置に沿って、繰返しの交互パターンで配置されている、第１８〜第２３の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【０１２２】
第６３の実施形態では、前記染料の配置が、チェッカーボードパターンを形成している、第１８〜第２３の実施形態のいずれかに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【０１２３】
第６４の実施形態では、前記染料が、前記反応位置に沿って、繰返しの交互パターンで配置されている、第３５〜第４０の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１２４】
第６５の実施形態では、前記染料の配置が、チェッカーボードパターンを形成している、第３５〜第４０の実施形態のいずれかに記載のシステムが提供される。
【０１２５】
第６６の実施形態では、前記サンプルホルダが、３つの染料を含む、第１〜第１７の実施形態のいずれか１つに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【０１２６】
第６７の実施形態では、前記サンプルホルダが、４つの染料を含む、第１〜第１７の実施形態のいずれか１つに記載のコンピュータ実行方法が提供される。
【０１２７】
第６８の実施形態では、前記サンプルホルダが、３つの染料を含む、第１８〜第３４の実施形態のいずれか１つに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【０１２８】
第６９の実施形態では、前記サンプルホルダが、４つの染料を含む、第１８〜第３４の実施形態のいずれか１つに記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体が提供される。
【０１２９】
第７０の実施形態では、前記サンプルホルダが、３つの染料を含む、第３５〜第５１の実施形態のいずれか１つに記載のシステムが提供される。
【０１３０】
第７１の実施形態では、前記サンプルホルダが、４つの染料を含む、第３５〜第５１の実施形態のいずれか１つに記載のシステムが提供される。
【０１３１】
第７２の実施形態では、前記サンプルホルダが、３つの染料を受容するように構成されている、第５２〜第５８の実施形態のいずれか１つに記載のサンプルホルダが提供される。
【０１３２】
第７３の実施形態では、前記サンプルホルダが、４つの染料を受容するように構成されている、第５２〜第５８の実施形態のいずれか１つに記載のサンプルホルダが提供される。
【０１３３】
第７４の実施形態では、３つの染料を更に含む、第５９の実施形態記載のサンプルホルダが提供される。
【０１３４】
第７５の実施形態では、４つの染料を更に含む、第５９の実施形態記載のサンプルホルダが提供される。
【０１３５】
本発明の種々の実施形態が上記されている。これらの実施形態は、単に例として提供されており、限定するものではないことを理解されたい。関連する分野の当業者であれば、上記された実施形態の形式及び詳細における種々の変更が、特許請求の範囲において定義された本発明の精神及び範囲を逸脱することなくなされてもよいことを理解するであろう。このため、本発明の広さ及び範囲は、上記された例示的な実施形態のいずれによっても限定されるべきでなく、下記特許請求の範囲及びその均等物によってのみ定義されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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