(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａの１つのランチオニン架橋又は構造Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ若しくはＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕの１つのメチルランチオニン架橋を含む、一般式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４の環状アペリン類似体であって、
Ｘ１が、存在せず；
Ｘ２が、ｐＧｌｕであり；
Ｘ３が、Ａｒｇであり；
Ｘ４が、Ｐｒｏ、又はＰｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ５が、Ａｒｇ、（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｒｇ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ６が、Ｌｅｕ、（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＬｅｕ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ７が、Ａｌａ、又は（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ８が、Ｈｉｓ、又は（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ９が、Ｌｙｓ、（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＬｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１０が、Ｇｌｙ、又は（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１１が、Ｐｒｏ、（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＰｒｏ−Ｌａｎであり；
Ｘ１２が、Ｍｅｔ、（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＭｅｔ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１３が、存在しないか、又はＰｒｏ、Ｄｈｂ、及び（ｍｅ）Ｌａｎから選択され；
Ｘ１３が存在しない場合を除いて、Ｘ１４が、Ｃ末端であり、かつ存在しないか、又はＰｈｅであり；
Ａｂｕがアミノブチリン酸を指し、Ｄｈｂがデヒドロブチリンを指し；
（ｍｅ）ＬａｎがＬａｎ又はｍｅＬａｎを指し、Ｌａｎが、ランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）のＮ末端の半分又はＣ末端の半分を指し、ｍｅＬａｎが、メチルランチオニン（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕ）のＮ末端の半分又はＣ末端の半分を指し；
ただし：
（ｉ）類似体が、最大２つのＡｌａ残基を含み；
（ｉｉ）前記配列Ｘ４〜Ｘ１３が、一緒に（メチル）ランチオニン架橋を形成する一対のｍｅＬａｎ又は一対のＬａｎを含み；かつ
（ｉｉｉ）前記（メチル）ランチオニン架橋が、環の下に２つ、３つ、４つ、又は５つの残基を含むサイズである
ことを特徴とする環状アペリン類似体、若しくは前記環状アペリン類似体のアミド、エステル、又はその塩。
【請求項２】
請求項１に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩において、Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６が、ｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕであることを特徴とする、アペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩。
【請求項３】
請求項２に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩において、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、又はＸ９が（ｍｅ）Ｌａｎであることを特徴とする、アペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩において、前記配列Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０が（ｍｅ）Ｌａｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又は前記配列Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０が（ｍｅ）Ｌａｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ−Ｇｌｙであることを特徴とする、アペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩。
【請求項５】
請求項４に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩において、前記配列Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０がＬａｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌａｎ、又は前記配列Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０がＬａｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌａｎ−Ｇｌｙであることを特徴とする、アペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩。
【請求項６】
請求項１に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩において、前記配列Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８が、Ｐｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎ又はＰｒｏ−Ａｒｇ−（ｍｅ）Ｌａｎ−Ａｒｇ  Ｌｅｕ−Ａｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであることを特徴とする、アペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩において、前記配列Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４が、（ｍｅ）Ｌａｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅであることを特徴とする、アペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩。
【請求項８】
請求項１に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩において：
ｐＥＲＰｍｅＬａｎＲＬＡｍｅＬａｎＫＧＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＬａｎＲＬＡＬａｎＫＧＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＲｍｅＬａｎＬＡｍｅＬａｎＫＧＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＬａｎＬＡＨＬａｎＧＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬｍｅＬａｎＨＫｍｅＬａｎＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬｍｅＬａｎＨＫｍｅＬａｎＰＭｄｈｂＦ、ｐＥＲＰＲＬＬａｎＡＨＫＬａｎＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬＬａｎＡＨＫＬａｎＧＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬｍｅＬａｎＨＫｍｅＬａｎＧＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬｍｅＬａｎＨＫｍｅＬａｎＧＰＭＰＦ−ＮＨ２、ｐＥＲＰＲＬｍｅＬａｎＨＫｍｅＬａｎＧＰＭＰ、ｐＥＲＰＲＬＬａｎＨＫＬａｎＧＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬｍｅＬａｎＨＫＧｍｅＬａｎＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬＬａｎＨＫＧＬａｎＰＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬＡＨＬａｎＧＰＭＬａｎＦ、ｐＥＲＰＲＬＬａｎＨＫＧＬａｎＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬｍｅＬａｎＨＫＧｍｅＬａｎＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬＬａｎＨＫＧＰＬａｎＰＦ、ｐＥＲＰＲＬＬａｎＨＫＧＰＬａｎＭＰＦ、ｐＥＲＰＲＬＬａｎＨＫＧＰＭＬａｎＦ、及びｐＥＲＰＲＬＬａｎＨＫＧＰＭＬａｎＰＦからなる群から選択されることを特徴とする、アペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩において、０．１〜２００ｎＭのＥＣ５０で、アペリン（ＡＰＪ）受容体を発現する細胞でｃＡＭＰの産生を誘導することができることを特徴とする、アペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩において、天然アペリン１３と比較して、前記アペリン受容体の内在化に関連したβ−アレスチンの減少を示すことを特徴とする、アペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩において、少なくとも３時間、ラット血漿中で安定性（Ｔ５０）を示すことを特徴とする、アペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩。
【請求項１２】
請求項１乃至１１の何れか１項に記載の少なくとも１つのアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
水分バランスの変化に関連した状態、ストレス性の障害、不安及び抑うつ、心血管障害、又は代謝異常を処置するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
水分バランスの変化に関連した状態、ストレス性の障害、不安及び抑うつ、心血管障害、又は代謝異常を処置するための医薬の製造における、請求項１乃至１１の何れか１項に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩の使用。
【請求項１５】
請求項１乃至１１の何れか１項に記載のアペリン類似体、若しくはそのアミド、エステル、又はその塩を提供する方法において：
（ａ）宿主細胞を提供するステップにおいて、前記宿主細胞が：
ランチペプチド／ランチビオティックの前駆体ペプチド内で見出されるＮ末端リーダーペプチドをコードする第１の核酸断片、及びペプチド類似体をコードする第２の核酸断片を含む核酸分子において、前記第１及び第２の断片が、前記核酸分子の同じオープンリーディングフレーム内にある、核酸分子；
セリン及び／又はトレオニンを脱水することができる酵素をコードする核酸配列；
任意選択の、輸送タンパク質をコードする核酸配列を含む、ステップ；
（ｂ）前記第１の核酸の翻訳を可能にするステップ；及び
（ｃ）前記ペプチド類似体を回収するステップを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、化学手段又は酵素手段による閉環を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の方法において、前記第２の核酸断片が、ＱＲＰＴＲＬＡＣＫＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＳＲＬＡＣＫＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＴＬＡＣＫＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＳＬＡＨＣＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＴＨＫＣＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＡＨＫＣＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＡＨＫＣＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＴＨＫＣＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＴＨＫＣＧＰＭＰＦ−ＮＨ２、ＱＲＰＲＬＴＨＫＣＧＰＭＰ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＣＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＴＨＫＧＣＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＣＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＡＨＳＧＰＭＣＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＣＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＴＨＫＧＣＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＣＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＣＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＣＦ、及びＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＣＰＦからなる群から選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理学の分野に関する。特に、本発明は、アペリンの新規な類似体、及びその治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アペリン遺伝子は、３６、１７、又は１３のアミノ酸からなる生物活性ペプチド（それぞれ、アペリン３６、アペリン１７、及びアペリン１３）が生じるように処理される７７のアミノ酸のプレプロタンパク質をコードする。２つの主なイソ型は、アペリン１３とアペリン３６である。
【０００３】
アペリン受容体、ＡＰＪは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。典型的なアペリン刺激ＡＰＪシグナル伝達は、百日咳毒素感受性Ｇタンパク質（Ｇｉ又はＧｏ）の活性化を伴い、これによりｃＡＭＰの産生が減少すると共に、ホスホリパーゼＣ、プロテインキナーゼＣ、及び細胞外シグナル調節キナーゼ１及び２が活性化する。アペリンシグナル伝達の近年の概説については、Ｏ’Ｃａｒｒｏｌｌら（Ｊ．ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０１３）２１９，Ｒ１３−Ｒ３５）を参照されたい。加えて、ＡＰＪのアペリンでの刺激により、β−アレスチンがリクルートされる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０；３９５：１８５−１８９）。Ｍａ及びＰｅｉ（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）１２０，２１３−２１８）の概説によると、アレスチンは、受容体の脱感作及び内在化を調節するだけではなく、ＧＰＣＲの下流の代替Ｇタンパク質依存性シグナル伝達経路を活性化させる一群の足場タンパク質を生じさせる。例えば、特定のＧＰＣＲの活性に応答して、β−アレスチンは、細胞質から核に移行し、標的遺伝子のプロモーターにおいて転写補助因子、例えば、ｐ３００及びｃＡＭＰ−応答エレメント−結合タンパク質（ＣＲＥＢ）に結合して、転写を促進する。β−アレスチンはまた、細胞質で転写因子の調節因子、例えば、ＩＫＢα及びＭＤＭ２と相互作用して、転写を間接的に制御する。この転写のβ−アレスチン媒介調節は、細胞増殖、アポトーシス、及び免疫機能の調節に重要な役割を果たすようである。
【０００４】
アペリン及びＡＰＪは、アンジオテンシノーゲン及びアンジオテンシン受容体と共有のパターンで、動物の器官のホモジネートで広範に発現される。アペリンは、ＣＮＳ及び抹消、特に心臓、腎臓、肺、及び乳腺に広く分布する。アペリン様免疫反応性は、脂肪細胞、胃粘膜、内皮、及び肝臓のクッパー細胞で検出された。
【０００５】
アペリン１３は、０．３７ｎＭのＥＣ５０値でこのＧタンパク質共役受容体を活性化するＡＰＪ受容体の内因性リガンドである（アペリン１７及びアペリン３６のＥＣ５０値はそれぞれ、２．５及び２０ｎＭである）。アペリン１３は、主に末梢及び中枢神経系に作用し、心血管機能、体液の恒常性、高血圧、及びインスリン感受性の調節に重要な役割を果たす。アペリン３６とは異なり、アペリン１３は、ヒト免疫不全ウイルスの細胞への侵入を十分には阻止しない。
【０００６】
アペリン１３及び３６のＡＰＪへの結合は、ホルスコリン誘導性のｃＡＭＰの産生を阻害し、（ＥＲＫの）細胞外調節キナーゼのＲａｓ非依存性活性化を媒介する。アペリン１３及び３６の両方の結合は、ＡＰＪの内在化をもたらし、ＡＰＪは外部細胞表面に再循環される（Ｚｈｏｕ，Ｎ  ｅｔ  ａｔ．，２００３  ＡＰＪ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０７，２２−３６）。
【０００７】
外因性アペリンの投与は、心血管機能、血圧、体温、体液、並びに食物摂取及び水分摂取に関与する挙動を変更する。いくつかのヒト心血管疾患は、心血管組織でのアペリン及び／又はＡＰＪの発現の変化を伴う。動物実験では、アペリンは、血管拡張及び陽性変力作用をもたらす。アペリンは、内皮一酸化窒素合成酵素を活性化し、その結果として、血管内皮細胞から一酸化窒素の放出を刺激する。アペリンはまた、病的状態、例えば、実験的虚血及び再かん流傷害で、心機能の予後も改善した（Ｌｅｅ，Ｄ．Ｋ．，Ｇｅｏｒｇｅ，Ｓ．Ｒ．ａｎｄ  Ｏ’Ｄｏｗｄ，Ｂ．Ｆ．（２００６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７，１９０−１９４）。しかしながら、これらの心血管の効果は、アペリンペプチドの短い循環寿命により長続きしない。
【０００８】
アペリンの半減期を改善する試みは当分野で公知である。例えば、国際公開第２０１２／１２５４０８号パンフレットに、アペリンのＮ末端の少なくとも１つのアミノ酸残基に機能的に連結された１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含むペグアペリンが開示されている。ペグアペリンは、非ペグアペリンに対して延長された循環寿命及び変力作用を有することが分かった。アペリンの半減期を改善する別のアプローチで、環状変異体の作製を含む。例えば、ホルスコリン誘導性環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の蓄積に対して用量依存阻害効果を示すアペリン１２の大きい環状変異体（１〜１２；１〜７；及び７〜１２）を作製し、その最大の効果が、百日咳毒素（ＰＴｘ）処置によって殆どなくなった（Ｈａｍａｄａ，Ｊ．（２００８）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２２，５４７−５５２）。しかしながら、全ての環状類似体は、ｐＥ−アペリン１３と比較して数桁低い活性を有していた。
【０００９】
国際公開第２０１３／１１１１１０号パンフレットに、心不全の処置用の合成アペリン模倣剤が開示されている。変異体は、アミノ酸側鎖がモノスルフィド結合、ジスルフィド結合、又はアミド結合のいずれかによって互いに連結される環状構造を含む。
【発明の概要】
【００１０】
従って、循環寿命及び他の有利な特性を改善するために改善されたアペリン類似体が必要とされている。特に、この類似体が、異なる生物学的活性、例えば、ＡＰＪ受容体によって活性化される異なる経路と選択的に調節するために使用することができる生物学的活性と組み合わせられた長い半減期を有することが望ましいであろう。例えば、ｃＡＭＰ活性による著しい（アゴニスト）シグナル伝達を示すが、生物学的活性が促進されるようなβ−アレスチンのリクルートの誘導時、ＡＰＪ受容体の内在化時、及び／又は下方制御時に内因性アゴニストよりも作用が弱い類似体を有することが興味深いであろう。逆に、転写のβ−アレスチン媒介制御及び細胞増殖、アポトーシス、及び免疫機能の調節におけるその役割を考えると、アレスチンのリクルートのより強力な刺激である変異体が、興味深いバイアスアゴニストも提供する。特に、βアレスチンのリクルート及びＧｉ／０刺激に対する効果は、細胞内で異なる効果及び／又は異なる動力学を有する効果をもたらし得る。アレスチンは、Ａｋｔ経路を介して作用するようには思われないが、Ｇｉ／０はＡｋｔ経路を介して作用するように思われる。Ｇタンパク質依存性ＥＲＫ活性は、迅速かつ一過性であるようであり、百日咳毒素又はＰＫＡ阻害剤によって阻害され得る。対照的に、β−アレスチン依存性ＥＲＫ活性化は、開始が遅く、期間がより持続し、β−アレスチンの減少に敏感であるが、Ｇｉ／ＰＫＡの阻害やＧｓの減少には敏感でない（Ｌａｎ  Ｍａ  ２００６）。ＭＡＲＫのＧｉ／０刺激及びＭＡＰＫに対するアレスチン−足場効果は、細胞の運命にかかわる細胞質／核内でのＥＲＫの分布に異なって影響を与える。
【００１１】
驚くべきことに、上記の目標の少なくとも一部が、生物学的活性を有する空間的に制約されたポリペプチドを得るために２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸残基に亘るチオエーテル架橋によって特徴付けられる新規な環状アペリン化合物の提供によって果たされることが分かった。例えば、チオエーテル架橋のアペリンへの導入により、血漿中での安定性が２〜８倍に増大し、しかもシグナル伝達活性が維持された。さらに、天然のアペリンと比較して、アレスチンに対してｃＡＭＰによるシグナル伝達で著しい増加又は減少のいずれかを示す多数の興味深い変異体が同定された。
【００１２】
従って、本発明は、
構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａの１つのランチオニン架橋又は構造Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ若しくはＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕの１つのメチルランチオニン架橋を含む、一般式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４のポリペプチドからなるアペリン類似体において、
Ｘ１が、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ存在しないか、又はＬｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり；
Ｘ２が、存在しないか、又はｐＧｌｕ、Ｇｌｎ、及びＡｌａから選択され；
Ｘ３が、Ａｒｇ又はＡｌａであり；
Ｘ４が、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｐｒｏ−Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ５が、Ａｒｇ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ａｒｇ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ａｒｇ−Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ６が、Ｌｅｕ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ｌｅｕ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｌｅｕ−Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ７が、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ａｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、Ｄｈｂ−Ａｌａ、又は（ｍｅ）Ｌａｎ−Ａｌａであり；
Ｘ８が、Ｈｉｓ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ｈｉｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｈｉｓ−Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ９が、Ｌｙｓ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ｌｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｌｙｓ−Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１０が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１１が、Ｐｒｏ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｐｒｏ−Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１２が、Ｍｅｔ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｍｅｔ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１３が、存在しないか、又はＰｒｏ、Ｄｈｂ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｐｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎから選択され；
Ｘ１３が存在しない場合を除いて、Ｘ１４が、Ｃ末端であり、かつ存在しないか、又はＰｈｅ及びＡｌａから選択され；
Ｄｈｂはデヒドロブチリンを指し、（ｍｅ）ＬａｎはＬａｎ又はｍｅＬａｎを指し、Ｌａｎは、ランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）のＮ末端の半分又はＣ末端の半分を指し、ｍｅＬａｎは、メチルランチオニン（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕ）のＮ末端の半分又はＣ末端の半分を指し；
ただし：
（ｉ）類似体が、最大２つのＡｌａ残基を含み；
（ｉｉ）配列Ｘ４〜Ｘ１３が、一緒に（メチル）ランチオニン架橋を形成する一対のｍｅＬａｎ又は一対のＬａｎを含み；かつ
（ｉｉｉ）前記（メチル）ランチオニン架橋が、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４、ｉ、ｉ＋５、又はｉ、ｉ＋６、好ましくはｉ、ｉ＋３又はｉ、ｉ＋４のサイズであり；「ｉ」は、チオエーテル架橋形成に関与するＮ末端アミノ酸の残基（例えば、Ｘ４）を指し、「ｉ＋．．．」は、チオエーテル架橋形成に関与するＣ末端アミノ酸の残基（例えば、ｉ＋３の場合はＸ７）を指す、アペリン類似体；
又はアペリン類似体のアミド、エステル、若しくはその塩を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
一実施形態では、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ存在しないか、又はＬｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇであり；
Ｘ２は、存在しないか、又はｐＧｌｕ、Ｇｌｎ、及びＡｌａから選択され；
Ｘ３は、Ａｒｇ又はＡｌａであり；
Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ５は、Ａｒｇ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ａｒｇ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ６は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｌｅｕ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ７は、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ａｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又は（ｍｅ）Ｌａｎ−Ａｌａであり；
Ｘ８は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｈｉｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ９は、Ｌｙｓ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｌｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１０は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１１は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｐｒｏ−Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１２は、Ｍｅｔ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｍｅｔ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎであり；
Ｘ１３は、存在しないか、又はＰｒｏ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｐｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎから選択され；
Ｘ１３が存在しない場合を除いて、Ｘ１４は、Ｃ末端であり、かつ存在しないか、又はＰｈｅ及びＡｌａから選択され、
（ｍｅ）Ｌａｎは、Ｌａｎ又はｍｅＬａｎを指し、Ｌａｎは、ランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）のＮ−末端の半分又はＣ末端の半分を指し、ｍｅＬａｎは、メチルランチオニン（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ、又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕ）のＮ−末端の半分又はＣ末端の半分を指し；
ただし；
（ｉ）ポリペプチドは、最大２つのＡｌａ残基を含み；
（ｉｉ）配列Ｘ４〜Ｘ１３は、一緒に（メチル）ランチオニン架橋を形成する一対のｍｅＬａｎ、又は一緒にランチオニン架橋を形成する一対のＬａｎのいずれかを含み；かつ
（ｉｉｉ）前記（メチル）ランチオニン架橋が、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４、ｉ、ｉ＋５、又はｉ、ｉ＋６のサイズであり；「ｉ」は、チオエーテル架橋形成に関与するＮ末端アミノ酸の残基（例えば、Ｘ４）を指し、「ｉ＋．．．」は、チオエーテル架橋形成に関与するＣ末端アミノ酸の残基（例えば、ｉ＋３の場合はＸ７）を指す。言い換えれば、ｉ、ｉ＋３；ｉ、ｉ＋４、ｉ、ｉ＋５、又はｉ、ｉ＋６のサイズは、環の下に２つ、３つ、４つ、又は５つの残基が存在することを意味する。
【００１４】
ｉ、ｉ＋１のサイズの（メチル）ランチオニン架橋構造は、殆どタンパク質分解を防止せず、架橋ｉ、ｉ＋２は形成が困難であることが見出された。ｉ、ｉ＋５及びｉ、ｉ＋６は、シクラーゼ活性にとってはそれほど理想的な基質ではないが、より良いタンパク質分解耐性を付与する。好ましい一実施形態では、前記（メチル）ランチオニン架橋は、ｉ、ｉ＋３又はｉ、ｉ＋４のサイズであり、これにより環の下に２つ又は３つのいずれかの残基が存在する。
【００１５】
本発明は、チオエーテル架橋が、（ｉ）天然配列の２つのアミノ酸の置換；（ｉｉ）天然配列の１つのアミノ酸の置換、及びこの置換のＮ末端側又はＣ末端側のいずれかへの１つのアミノ酸の挿入；又は（ｉｉｉ）２つの挿入アミノ酸のいずれかによって形成されるアペリンの（メチル）ランチオニン変異体に関する。
【００１６】
ランチオニンを含む変異体は、ストレッチＸ４〜Ｘ１３に存在する２つの「Ｌａｎ」部分によって（置換又は挿入のいずれかによって）形成される構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａによって特徴付けられる。メチルランチオニンを含む変異体は、ストレッチＸ４〜Ｘ１３に存在する２つの「ｍｅＬａｎ」部分によって（置換又は挿入のいずれかによって）形成される構造Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕによって特徴付けられる。従って、Ｘ４〜Ｘ１３に含まれる注釈Ｌａｎ対又はｍｅＬａｎ対は、最終的な環化構造と呼ばれる。生合成的に、Ｌａｎ残基及びｍｅＬａｎ残基は、システイン残基、セリン残基、及びトレオニン残基を起源とする。まず、選択されたセリン残基及びトレオニン残基がそれぞれ酵素的に脱水されて、デヒドロアラニン（Ｄｈａ）残基及びデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）残基が形成される。次いで、Ｍｉｃｈａｅｌ方式でのシステインチオールのＤｈａ残基又はＤｈｂ残基への求核付加のそれぞれにより、Ｌａｎ残基又はＭｅＬａｎ残基が形成される。これらの修飾により、システインチオールと別の残基のβ炭素との間に共有結合が形成され、これによりチオエーテル架橋が形成される。より具体的には、Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ構造は、Ｄｈａ及びＣｙｓを起源とし得、Ｃｙｓは、ＤｈａからＮ末端側又はＣ末端側に位置し得る。構造Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕはそれぞれ、Ｄｈｂ及びＣｙｓ又はＣｙｓ及びＤｈｂを起源とする。
【００１７】
米国特許出願公開第２０１３／０１９６８９９号明細書は、アペリンの合成環状類似体及びこれを提供する方法を提供する。米国特許出願公開第２０１３／０１９６８９９号明細書の類似体の環は、その側鎖又は末端のそれぞれによってジスルフィド結合又はアミド結合を形成するアミノ酸によって形成される。しかしながら、ジスルフィド結合及びアミド結合は、チオエーテル結合よりも化学的に安定性が低い。さらに、ランチオニン形成中に立体化学が関与し、得られるペプチド構造が、より明確にされ、そしてより受容体特異的である。また、ランチオニン内のチオエーテル架橋は、ジスルフィド架橋及びアミド架橋よりも短い架橋である。結果として、ランチオニンは、ジスルフィド架橋及び／又はアミド架橋によって誘導される構造とは異なる構造を誘導する。
【００１８】
Ｈａｍａｄａら（２００８，Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２２：５４７−５５２）が、アペリン断片ＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＰＦ（アペリン１２）の環状類似体の合成を開示し、この環状類似体では、Ｎ末端がＣ末端に接続される、又は７位のＬｙｓの側鎖が、Ｎ末端残基又はＣ末端残基のいずれかで環を形成する。この場合、環状尿素結合も起こり、この環状尿素結合は、チオエーテル架橋よりも安定性が低い。加えて、Ｈａｍａｄａらの変異体は、遊離Ｎ末端及び／又は遊離Ｃ末端を有していない。
【００１９】
本発明のポリペプチド類似体では、Ｘ１〜Ｘ１４のそれぞれは、一連の選択された選択肢から選択される。
【００２０】
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端を指し、かつ存在しないか、又はＬｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇである。好ましい一態様では、Ｘ１は存在しない。
【００２１】
Ｘ２は、存在しないか、又はｐＧｌｕ、Ｇｌｎ、及びＡｌａから選択される。好ましくは、Ｘ１は存在せず、Ｘ２は、Ｇｌｕ又はｐＧｌｕ（ピログルタミン酸塩）である。特定の一態様では、Ｘ１はｐＧｌｕである。ピログルタミン酸塩のＮ末端への導入により、類似体をＮ末端のタンパク質分解から保護することができる。ピログルタミン酸（ＰＣＡ、５−オキソプロリン、ピドール酸、又はその塩基型のピログルタミン酸塩としても知られる）は、グルタミン酸又はグルタミンの遊離アミノ基が環化してラクタムを形成する珍しいアミノ酸誘導体である。このアミノ酸誘導体は、５−オキソプロリナーゼによってグルタミン酸塩に変換されるグルタチオンサイクルの代謝産物である。ピログルタミン酸塩は、バクテリオロドプシンを含む多数のタンパク質で見つかっている。Ｎ末端グルタミン酸及びグルタミン残基は、自然に環化してピログルタミン酸塩になり得る。
【００２２】
Ｘ３は、Ａｒｇ及びＡｌａから選択される塩基性アミノ酸残基であり、このうちＡｒｇが好ましい。
【００２３】
Ｘ４は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｐｒｏ−Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎ；例えば、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎからなる群から選択される。一実施形態では、Ｘ４は、Ｐｒｏ又はＡｌａであり、このうちＰｒｏが好ましい。別の態様では、Ｘ４は、チオエーテル架橋の形成に関与し、かつＰｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎから選択される。Ｘ４は、Ｐｒｏ−Ｌａｎ又はＡｌａ−Ｌａｎであり得、これにより、第２のＬａｎ残基で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａのランチオニンである。別法では、Ｘ４は、Ｐｒｏ−ｍｅＬａｎ又はＡｌａ−ｍｅＬａｎであり、これにより、第２のｍｅＬａｎ残基（例えば、Ｘ８の位置における（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｈｉｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎ）で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕのメチルランチオニンである。
【００２４】
Ｘ５は、Ａｒｇ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ａｒｇ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ａｒｇ−Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎである；例えば、Ｘ５は、Ａｒｇ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ａｒｇ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎである。好ましくは、Ｘ５は、Ａｒｇ又はＡｌａであり、このうちＡｒｇが好ましい。別の態様では、Ｘ５は、チオエーテル架橋の形成に関与し、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ａｒｇ−（ｍｅ）Ｌａｎ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎから選択される。Ｘ５は、Ｌａｎ、Ａｒｇ−Ｌａｎ、又はＡｌａ−Ｌａｎであり得、これにより、第２のＬａｎ残基（例えば、Ｘ９の位置におけるＬａｎ、Ｌｙｓ−Ｌａｎ、又はＡｌａ−Ｌａｎ）で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａのランチオニンである。別法では、Ｘ５は、ｍｅＬａｎ、Ａｒｇ−ｍｅＬａｎ、又はＡｌａ−ｍｅＬａｎであり、これにより、第２のｍｅＬａｎ残基で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕのメチルランチオニンである。
【００２５】
Ｘ６は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ｌｅｕ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｌｅｕ−Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎからなる群から選択される。例えば、Ｘ６は、Ｌｅｕ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｌｅｕ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎである。好ましくは、Ｘ６は、Ｌｅｕ、又はＡｌａであり、このうちＬｅｕが好ましい。別の態様では、Ｘ６は、チオエーテル架橋の形成に関与し、かつ（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｌｅｕ−（ｍｅ）Ｌａｎ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎから選択される。Ｘ６は、Ｌａｎ、Ｌｅｕ−Ｌａｎ、又はＡｌａ−Ｌａｎであり得、これにより、第２のＬａｎ残基（例えば、Ｘ１０の位置におけるＬａｎ又はＡｌａ−Ｌａｎ）で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａのランチオニンである。別法では、Ｘ６は、ｍｅＬａｎ、Ｌｅｕ−ｍｅＬａｎ、又はＡｌａ−ｍｅＬａｎであり、これにより、第２のｍｅＬａｎ残基で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕのメチルランチオニンである。
【００２６】
Ｘ７は、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ａｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、Ｄｈｂ−Ａｌａ、及び（ｍｅ）Ｌａｎ−Ａｌａからなる群から選択される。例えば、Ｘ７は、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ａｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又は（ｍｅ）Ｌａｎ−Ａｌａである。好ましくは、Ｘ７は、チオエーテル架橋の形成に関与し、かつ（ｍｅ）Ｌａｎ、Ａｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎから選択される。Ｘ７は、Ｌａｎ、Ａｌａ−Ｌａｎ、又はＬａｎ−Ａｌａであり得、これにより、第２のＬａｎ残基（例えば、Ｘ１１の位置におけるＬａｎ、Ｐｒｏ−Ｌａｎ、又はＡｌａ−Ｌａｎ）で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａのランチオニンである。別法では、Ｘ７は、ｍｅＬａｎ、Ａｌａ−ｍｅＬａｎ、又はｍｅＬａｎ−Ａｌａであり、これにより、第２のｍｅＬａｎ残基で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕのメチルランチオニンである。特定の一態様では、Ｘ７は、Ｌｙｓ−（ｍｅ）ＬａｎであるＸ９、又は（ｍｅ）Ｌａｎ若しくはＡｌａ−（ｍｅ）ＬａｎであるＸ１０、（ｍｅ）Ｌａｎ若しくはＡｌａ−（ｍｅ）ＬａｎであるＸ１１、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｍｅｔ−（ｍｅ）Ｌａｎ、若しくはＡｌａ−（ｍｅ）ＬａｎであるＸ１２のいずれかと任意選択的に組み合わせられる（ｍｅ）Ｌａｎである。
【００２７】
Ｘ８は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ｈｉｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｈｉｓ−Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎからなる群から選択される。例えば、Ｘ８は、Ｈｉｓ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｈｉｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎである。好ましくは、Ｘ８は、Ｈｉｓ又はＡｌａであり、このうちＨｉｓが好ましい。別の態様では、Ｘ８は、チオエーテル架橋の形成に関与し、かつ（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｈｉｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎから選択される。Ｘ８はＬａｎ、Ｈｉｓ−Ｌａｎ、又はＡｌａ−Ｌａｎであり得、これにより、第２のＬａｎ残基（例えば、Ｘ１２の位置におけるＬａｎ、Ｍｅｔ−Ｌａｎ、又はＡｌａ−Ｌａｎ）で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａのランチオニンである。別法では、Ｘ８は、ｍｅＬａｎ、Ｈｉｓ−ｍｅＬａｎ、又はＡｌａ−ｍｅＬａｎであり、これにより、第２のｍｅＬａｎ残基で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕのメチルランチオニンである。Ｈｉｓからなる、又はＨｉｓを含むＸ８が好ましい。
【００２８】
Ｘ９は、Ｌｙｓ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ｌｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｌｙｓ−Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎからなる群から選択される。例えば、Ｘ９は、Ｌｙｓ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｌｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎである。好ましくは、Ｘ９は、Ｌｙｓ又はＡｌａであり、このうちＬｙｓが好ましい。別の態様では、Ｘ９は、チオエーテル架橋の形成に関与し、かつ（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｌｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎから選択される。Ｘ９は、Ｌａｎ、Ｌｙｓ−Ｌａｎ、又はＡｌａ−Ｌａｎであり得、これにより、第２のＬａｎ残基（例えば、Ｘ１３の位置におけるＬａｎ、Ｐｒｏ−Ｌａｎ、及びＡｌａ−Ｌａｎ）で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａのランチオニンである。別法では、Ｘ９は、ｍｅＬａｎ、Ｌｙｓ−ｍｅＬａｎ、又はＡｌａ−ｍｅＬａｎであり、これにより、第２のｍｅＬａｎ残基で形成されるチオエーテル架橋が、構造Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ又はＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕのメチルランチオニンである。Ｌｙｓからなる、又はＬｙｓを含むＸ９が好ましい。特定の一態様では、Ｘ９はＬｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎである。
【００２９】
Ｘ１０は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｄｈｂ、Ａｌａ−Ｄｈｂ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎからなる群から選択される。例えば、Ｘ１０は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎである。一実施形態では、Ｘ１０はＧｌｙである。別の実施形態では、Ｘ１０はｍｅＬａｎである。
【００３０】
Ｘ１１は、Ｐｒｏ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｐｒｏ−Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎである。好ましくは、Ｘ１１は、Ｐｒｏ又は（ｍｅ）Ｌａｎである。
【００３１】
Ｘ１２は、Ｍｅｔ、Ａｌａ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｍｅｔ−（ｍｅ）Ｌａｎ、又はＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎである。好ましくは、Ｘ１２はＭｅｔである。
【００３２】
Ｘ１３は、存在しないか、又はＰｒｏ、Ｄｈｂ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｐｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎから選択される。好ましくは、Ｘ１３は、Ｐｒｏ、Ｄｈｂ、（ｍｅ）Ｌａｎ、Ｐｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ、及びＡｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎから選択され、より好ましくはＰｒｏ及び（ｍｅ）Ｌａｎから選択される。特定の一態様では、Ｘ１３はＰｒｏである。別の特定の態様では、Ｘ１３はＤｈｂである。
【００３３】
Ｘ１３が存在しない場合を除いて、Ｘ１４は、Ｃ末端であり、かつ存在しないか、又はＰｈｅ及びＡｌａから選択される。一実施形態では、Ｘ１４及びＸ１３は存在しない。別の実施形態では、Ｘ１４は、Ｐｈｅ又はＡｌａであり、このうちＰｈｅが好ましい。特定の一態様では、ペプチド変異体は、Ｃ末端がアミド化され、例えば、Ｘ１４はアミド化Ｐｈｅ（Ｐｈｅ−ＮＨ２）である。
【００３４】
特定の一実施形態では、Ｘ１は存在せず、配列Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６は、Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ又はｐＧｌｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌｅｕである。配列Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０が、（ｍｅ）Ｌａｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ、好ましくはｍｅＬａｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ｍｅＬａｎであるとき、又は配列Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０が、（ｍｅ）Ｌａｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−（ｍｅ）Ｌａｎ−Ｇｌｙ、好ましくはｍｅＬａｎ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−ｍｅＬａｎ−Ｇｌｙであるときに、非常に良い結果が得られた。他の変異体では、配列Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８は、Ｐｒｏ−（ｍｅ）Ｌａｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎ又はＰｒｏ−Ａｒｇ−（ｍｅ）Ｌａｎ−Ａｒｇ  Ｌｅｕ−Ａｌａ−（ｍｅ）Ｌａｎである。例示的な変異体は、配列Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅから構成される４つのＣ末端残基が好ましい変異体を含む。しかしながら、他の有用な変異体Ｘ１４は、存在しないか、又はＡｌａであり、例えば、Ｃ末端が、Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ又はＰｒｏ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａである。なお別の実施形態では、Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４は（ｍｅ）Ｌａｎ−Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅである。
【００３５】
前記ポリペプチドのアミド、エステル、又は塩も包含される。好ましくは、この塩は、薬学的に許容され得る塩、例えば、あらゆる無毒の塩、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、無機塩基との塩、有機塩基との塩、及びアミノ酸との塩である。本明細書で使用される「許容され得る塩」は、オリゴペプチド又は等価化合物の所望の特性を保持するが、好ましくは、オリゴペプチド、又はオリゴペプチドを使用する系の他の構成成分の活性に悪影響を与えない塩を指す。このような塩の例としては、無機酸で形成される酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、及び硝酸などが挙げられる。塩は、有機酸、例えば、酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、及びポリグルタミン酸などで形成することもできる。塩は、多価金属陽イオン、例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、及びニッケルなどで、又はΝ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン若しくはエチレンジアミンから形成される有機陽イオンで形成することができる、又はこれらの組み合わせ（例えば、タンニン酸亜鉛塩）である。
【００３６】
一実施形態では、本明細書に示される環状類似体は、アペリン１３又はｐｙｒ−１−アペリン１３と同様のＡＰＪ受容体能力を有する。一実施形態では、本発明の環状ＡＰＪアゴニストは、ｃＡＭＰ産生の阻害及び／又はアレスチンのリクルートの刺激の測定、及び／又はＡＰＪ媒介シグナル伝達のその他の測定のときに１００ｎＭ未満の最大の半分の効果濃度（ＥＣ５０）を有する。別の実施形態では、ＥＣ５０は、５０ｎＭ未満、好ましくは２５ｎＭ未満、より好ましくは１５ｎＭ未満である。特定の別の実施形態では、本発明の類似体は、１０ｎＭ未満のＥＣ５０を有する。
【００３７】
類似体は、好ましくは、アペリン１３又はｐｙｒ−１−アペリン１３よりも優れた血漿安定性を有する。一実施形態では、血漿安定性の改善は、既知のアペリンで観察された血漿安定性よりも少なくとも２倍高い。安定性は、半減期（ｔ５０）、即ち、当初の酵素活性の５０％が維持されている時間によって特徴付けられ得る。一実施形態では、本発明の類似体は、血漿中で少なくとも３０分の半減期（ｔ５０）を有する。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、少なくとも１０分、好ましくは少なくとも４０分、より好ましくは少なくとも６０分の半減期を有する。特定の一実施形態では、血漿中のｔ５０は、１時間超、好ましくは２時間超、最も好ましくは少なくとも４時間である。
【００３８】
本発明の特定のアペリン類似体が表１に示される。
0006740133.tif 000002
0006740133.tif 000003
【００３９】
本発明によるアペリン類似体を提供する方法も提供される。環状ペプチド中の２つのアミノ酸の側鎖間の分子内連結は、化学的又は酵素的に形成することができる。環状アペリン類似体は、ランチペプチド又はランチビオティック合成用の１つ以上の生合成酵素を含む宿主細胞を用いて有利に調製される（Ａｒｎｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｔ．２０１３  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ  Ｒｅｐ  ３０，１０８−１６０）。ランチペプチド及びランチビオティック（抗菌活性を有するランチペプチドのサブグループ）は、（メチル）ランチニオン残基又はリジノアラニル残基の形成から生じる内部架橋を含む小ペプチドである（ＭｃＡｕｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２５，２８５−３０８（２００１）で再考察されている）。ランチオニン（Ｌａｎ）及びメチルランチオニン（ＭｅＬａｎ）はそれぞれ、セリンのデヒドロアラニン（Ｄｈａ）への脱水及びトレオニンのデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）への脱水から生じ、これらのアミノ酸の同じペプチド内のシステイン残基との相互作用からチオエーテル結合が生じる。ランチビオティックの周知の例として、ナイシン、スブチリン、Ｐｅｐ５、及びエピデルミニンが挙げられる。ランチビオティックは、不活性プレペプチドとしてリボソームで合成され、アミノ末端リーダーペプチド及びカルボキシ末端プロペプチドを含む。このリーダーペプチドは、ランチビオティック前駆体とランチビオティック酵素との相互作用に必要である。このリーダーペプチドは、産生細胞内で又はこの細胞から輸送される最中又は後で、プロペプチドからタンパク分解的に切断される。ランチペプチド生合成遺伝子は、一緒にクラスターを形成し、ｌａｎという遺伝子座名が与えられている。ｌａｎＡは、ランチビオティックプレペプチドをコードする遺伝子であり、ｌａｎＢは、セリン又はトレオニンの脱水に関与する酵素をコードする遺伝子であり、ｌａｎＣは、環形成に関与する酵素をコードする遺伝子である。場合によっては、ＬａｎＢ及びＬａｎＣの活性は、プレペプチドのプロセシング及び／又は輸送に関与する酵素をコードする遺伝子、ｌａｎＭ、ｌａｎＰ、及びｌａｎＴによってコードされる二機能性酵素で接合される。
【００４０】
従って、本発明は、本発明による環状アペリン類似体の酵素的調製の方法を提供し、この方法は：
宿主細胞を提供するステップを含み、この宿主細胞が：
ランチペプチド又はランチビオティックの前駆体ペプチドで見出されるＮ末端リーダーペプチドをコードする第１の核酸断片、及びアペリン類似体をコードする第２の核酸断片を含む核酸分子において、前記第１及び第２の断片が、前記核酸分子の同じオープンリーディングフレーム内にある、核酸分子；
セリン及び／又はトレオニンを脱水することができる酵素をコードする核酸配列；
任意の、輸送タンパク質をコードする核酸配列；及び
ランチオニン又はメチルランチオニンの形成を誘導することができる酵素をコードする核酸配列を含む。
【００４１】
ランチペプチド／ランチビオティックの前駆体で見出されるあらゆるリーダーペプチドは、本発明による環状ペプチド類似体の調製の方法に使用するのに適している。このようなリーダーペプチドの例としては、ナイシン、スブチリン、Ｐｅｐ５、及びエピデルミニンのリーダーペプチドが挙げられる。好ましい一実施形態では、ナイシンリーダーペプチドが使用される。セリン及び／又はトレオニンを脱水することができる酵素は、好ましくは、ＬａｎＢ、例えば、ＮｉｓＢ、ＰｅｐＢ、ＳｐａＢ、又はこれらの機能的等価物である。ランチオニン及び／又はメチルランチオニンの形成を誘導することができる酵素は、好ましくは、ＬａｎＣ、例えば、ＮｉｓＣ、ＰｅｐＣ、ＳｐａＣ、又はこれらの機能的等価物である。一実施形態では、セリン及び／又はトレオニンの脱水、並びにランチオニン及び／又はメチルランチオニンの形成は、同じ酵素、ＬａｎＭ、例えば、ＣｉｎＭ、ＬｔｎＭ、ＬｃｔＭ、又はこれらの機能的等価物によって誘導される。デヒドロアラニンとシステインとの間のランチオニンの形成は、室温でエネルギー的に可能であり、ＬａｎＣ酵素又はＬａｎＭ酵素の関与なしで自然にも起こり得る。
【００４２】
従って、一実施形態では、（メチル）ランチオニン架橋を含む本発明による環状アペリン類似体の酵素的調製の方法が提供され、この方法は：
（ａ）宿主細胞を提供するステップにおいて、この宿主細胞が：
ランチペプチド／ランチビオティックの前駆体ペプチド内で見出されるＮ末端リーダーペプチドをコードする第１の核酸断片、及びアペリン類似体をコードする第２の核酸断片を含む核酸分子において、前記第１及び第２の断片が、前記核酸分子の同じオープンリーディングフレーム内にある、核酸分子；
セリン及び／又はトレオニンを脱水することができる酵素をコードする核酸配列；
（任意の）、輸送タンパク質をコードする核酸配列を含む、ステップ；及び
（ｂ）前記第１の核酸の翻訳を可能にするステップ；
（ｃ）前記ペプチド類似体を回収するステップ、好ましくは、このペプチドを培地から、又は細胞質から宿主細胞の溶解後に回収するステップを含む。
【００４３】
従って、（メチル）ランチオニン部分は、セリン及びトレオニンのそれぞれのα，β−不飽和残基２，３−ジデヒドロアラニン（Ｄｈａ）及び（Ｚ）−２，３−ジデヒドロブチリン（Ｄｈｂ）への酵素的脱水、これに続くシステインチオールの分子内Ｍｉｃｈａｅｌ型付加でチオエーテル架橋を生じさせることによって翻訳後に前駆体線状ペプチドに導入することができる。生合成機構を使用するこのアプローチは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は細菌宿主で再構成することができる。
【００４４】
一実施形態では、方法は、セリン／トレオニンを脱水して形成されたデヒドロアミノ酸をシステインに結合するランチペプチド修飾酵素をコードし、かつ任意にランチペプチド輸送体をコードするプラスミド、及びＮ末端ランチペプチドリーダーペプチド及びＣ末端アペリン類似体から構成される構築物をコードするプラスミドを用いて宿主細胞を樹立するステップを含む。
【００４５】
上で詳述したように、（メチル）ランチオニンは、脱水セリン又はトレオニン、即ち、それぞれデヒドロアラニン又はデヒドロブチリンの側鎖とシステインの側鎖との間で形成される。従って、（環化されると）少なくとも１つのランチオニン又はメチルランチオニンを含むアペリン類似体をコードする核酸配列は、ランチオニン又はメチルランチオニンを形成することになるペプチド類似体内の２つのアミノ酸位置に、セリン（ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、又はＡＧＣ）又はトレオニン（ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、又はＡＣＧ）をコードする核酸コドン、及びシステイン（ＴＧＴ又はＴＧＣ）をコードする核酸コドンを有する必要がある。
【００４６】
一実施形態では、アペリン類似体をコードする第２の核酸断片は、ＱＲＰＴＲＬＡＣＫＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＳＲＬＡＣＫＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＴＬＡＣＫＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＳＬＡＨＣＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＴＨＫＣＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＡＨＫＣＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＡＨＫＣＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＡＨＫＣＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＡＨＫＣＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＴＨＫＣＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＴＨＫＣＧＰＭＰＦ−ＮＨ２、ＱＲＰＲＬＴＨＫＣＧＰＭＰ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＣＧＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＴＨＫＧＣＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＣＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＣＰＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＡＨＳＧＰＭＣＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＣＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＴＨＫＧＣＭＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＣＰＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＣＭＰＦ、ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＴＨＫＣＰＭＰＦ、ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＴＨＫＣＧＰＭＰＦ、ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＡＨＫＣＰＭＰＦ、ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＡＨＫＣＧＰＭＰＦ、ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＳＨＫＧＣＰＭＰＦ、ＫＦＲＲＱＲＰＲＬＡＨＳＧＰＭＣＦ、ＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＣＦ、及びＱＲＰＲＬＳＨＫＧＰＭＣＰＦからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
【００４７】
このペプチドのＮ末端残基がグルタミン（Ｑ）の場合、この方法は、好ましくは、当分野で公知の方法、例えば、Ｒｉｎｋら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６１（２０１０）２１０−２１８）に記載されている方法に従ったＱのｐＥへの変換をさらに含む。
【００４８】
環状ペプチド類似体、又はまだ環化されていない脱水ペプチド類似体を培地から回収するためには、宿主細胞がグラム陽性細菌である場合は輸送タンパク質が存在することが特に好ましい。好ましくは、前記輸送タンパク質は、ＬａｎＴ、例えば、ＮｉｓＴ、又はこの機能的等価物である。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）では、輸送タンパク質は存在する必要はなく、ペプチド類似体の回収は、細胞の破壊の後が好ましい。
【００４９】
本発明による環状類似体の調製の方法に使用される宿主細胞は、好ましくは、グラム陽性原核生物、グラム陰性原核生物、又はグラム陰性真核生物である。適切な宿主細胞の例としては、乳酸菌、例えば、乳酸菌連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）、及びグラム陰性細菌大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。
【００５０】
デヒドロアミノ酸をシステインに結合する酵素的環化の代わりに、環化は、アルカリｐＨでのインキュベーションによっても可能である。このｐＨ誘導性結合は、例えば、プロリンが、効率的なシクラーゼ活性を排除するシステインに直接先行する場合に（メチル）ランチオニンを形成するために有利に使用される。別法では、シクラーゼＮｉｓＣによって環化されないペプチドの場合は、デヒドロアラニンとシステインとの間の環化は、ペプチドに依存して自然に起こり得、異なる異性体になることもあるし、ならないこともある。従って、本発明の代替の一実施形態では、閉環は、例えば、所望の位置にデヒドロアラニン残基又はデヒドロブチリン残基及びシステイン残基を含む脱水前駆体類似体を化学的に処理することによりチオエーテル架橋の形成を誘導することによって、非酵素的に達成される。例えば、化学閉環は、デヒドロアラニン及びシステインを含むペプチドの少なくとも１０分間のｐＨ８への暴露（Ｂｕｒｒａｇｅ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｅｕｒ  Ｊ，２０００  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．６，１４５５−１４６６）、又はデヒドロブチリン及びシステインを含むペプチドの約１０時間のｐＨ８〜９への暴露（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ  ２００３  Ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌａｎｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１，３３０４−３３１５）を伴い得る。
【００５１】
なお別の実施形態では、アペリン類似体は、例えば、Ｋｎｅｒｒら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１２，１３４（１８），ｐｐ  ７６４８−７６５１）又はこの文献で言及される参照文献に記載される手順に従って、固体支持化学合成によって合成される。
【００５２】
ＡＰＪ受容体に対するその（特異な）効果と安定性の増大とを合わせて考慮すると、本明細書に記載される環状アペリン類似体は、薬剤としての使用が有利に見出される。従って、本発明による少なくとも１つのアペリン類似体及び薬学的に許容され得る担体、希釈剤、又は賦形剤を含む医薬組成物も提供される。類似体は、それ自体を実体として、又は薬学的に許容され得る酸性又は塩基性付加塩として投与することができ、これらの付加塩は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、及びリン酸）；又は有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、及びフマル酸）；又は無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）；又は有機塩基（例えば、モノアルキルアミン、ジアルキルアミン、トリアルキルアミン、アリールアミン、及び置換エタノールアミン）との反応によって形成される。本発明における環状ペプチド化合物又はその薬学的に許容され得る塩としては、実質的に精製された形態の化合物又はその薬学的に許容され得る塩が好ましい。８０％以上の純度がより好ましい。
【００５３】
アペリン受容体ＡＰＪは、心血管障害、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、虚血性心疾患、ウイルス性心筋症、リンパ管の安定化、内分泌系及びホルモン障害、糖尿病性網膜症、及び代謝性疾患、胃腸及び肝臓の疾患、癌疾患、炎症性疾患、血液疾患、呼吸器疾患、筋骨格障害、神経障害、泌尿器系障害、皮膚疾患、創傷治癒、及び生殖障害に関連する。
【００５４】
本発明は、（メチル）ランチオニンを含むＡＰＪ受容体のアゴニスト及びアンタゴニストを提供し、これらの選択的な適用は疾患に依存する。ランチオニンアペリンが、治療への適用可能性を有するＡＴ１受容体とのＡＰＪ受容体の既知のヘテロ二量体化に影響を与えることがさらに想定される。
【００５５】
アペリン受容体アゴニストには、複数の治療領域が存在する。アペリンの新血管形成特性の一次標的は心筋及び脚筋である。ＡＰＪ受容体刺激は、一般に、心血管治療への適用可能性を有する。適用の他の分野は、例えば、（メチル）ランチオニン−アペリンが元の状態に戻る特性を有し得る線維症、及び神経防護作用である。アペリンは、酸素過剰症の新生児に治療効果を有する。他の疾患、例えば、病的な血管新生では、アペリン受容体アンタゴニストは、有益である：糖尿病性腎症（Ｚｈａｎｇ  ２０１３  ＰＬＯＳ  ８  ｜Ｉｓｓｕｅ  ４｜  ｅ６０４５７  ｐａｇｅ  １−１１）：抗腫瘍増殖（Ｓｏｒｌｉ  ２００６  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏｄａｙ  １１，１１００−１１０６）：静脈うっ血性網膜症。アンタゴニストは、例えば、Ｆ１３をａｌａ１３で置換することによって得られる。ＨＩＶ感染の補助受容体であるＡＰＪ受容体の遮断は、ＨＩＶ感染の予防に寄与する。ＡＰＪ受容体の遮断は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）で観察される血管（ｅｘｃｅｄｅｎｔａｒｙ  ｖｅｓｓｅｌ）の病的形成の軽減に寄与し得る。従って、例示的な治療適用例としては、アペリン作動系シグナル伝達を介したシグナル伝達に関連していることが既知である又は提案されている全ての適用例、例えば、水分バランスの変化に関連した状態、ストレス性の障害、例えば、不安及び抑うつ、心血管障害、及び代謝異常が挙げられる。一実施形態では、アペリン類似体は、内皮依存性血管拡張、内皮非依存性血管収縮、及び／又は心収縮力の増大をもたらす。アペリンは、酸素過剰処置を受けたラットの仔において抗炎症効果を有する。本発明は、例えば、低酸素症、虚血、及び肺動脈高血圧からなる群から選択される心血管病態の処置又は予防の方法に使用される環状アペリン類似体を提供する。さらなる実施形態では、アペリン類似体は、例えば、腫瘍における血管形成の調節にその使用が見出される。
【００５６】
ＡＰＪはまた、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）補助受容体であり、アペリンは、ＡＰＪを介してＨＩＶ−１の侵入を遮断する。アペリンペプチドとのプレインキュベーション後にＣＤ４及び受容体を発現するＣＨＯ細胞及びＮＰ−２細胞でのＨＩＶ感染の阻止は、ＨＩＶ及びＨＩＶ−２の補助受容体としてのＡＰＪの役割を補助する。ＣＤ４に対しては陰性であるがＡＰＪに対しては陽性である細胞の可溶性ＣＤ４とのインキュベーションは、ＨＩＶ感染を可能にした。従って、なおさらなる実施形態では、本発明の環状アペリンは、ＨＩＶの処置に使用される。
【００５７】
本明細書で使用される「処置」は、症状又は疾患、及び／又はそれに付随する症状を緩和又は治癒することを意味する。「予防」は、症状又は疾患、及び／又はそれに付随する症状の発症を遅延又は予防する方法、患者に症状が出ないようにする又は患者が疾患にかからないようにする方法、又は患者に症状が出る又は患者が疾患にかかるリスクを低減する方法を意味する。
【００５８】
本発明の医薬組成物は、医薬製剤の技術分野で公知の方法に従って、本発明の化合物又はその薬学的に許容され得る塩を、適切な量の少なくとも１種類以上の薬学的に許容され得る担体などと適切に混合することによって製造される。医薬組成物中の本発明の化合物又はその薬学的に許容され得る塩の含有量は、剤形、用量などによって変わるが、例えば、全医薬組成物に対する重量は０．１〜１００％である。
【００５９】
「医薬組成物」は、経口剤、例えば、タブレット、カプセル、顆粒、粉末、トローチ、シロップ、乳剤、及び懸濁液、並びに非経口剤、例えば、外用剤、座薬、注射、点眼剤、経鼻剤、及び窒息剤を含む。「薬学的に許容され得る担体」は、様々な従来の有機又は無機担体物質、例えば、固形剤中の物質、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、流動促進剤、及び滑沢剤、並びに液体製剤中の物質、例えば、溶媒、化溶化剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、及び無痛化剤を含む。必要に応じて、添加剤、例えば、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、及び甘味剤が使用される。「賦形剤」は、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、トウモロコシデンプン、デキストリン、微結晶セルロース、結晶セルロース、カルメロース、カルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、及びアカシアを含む。流動促進剤は、例えば、軽質無水ケイ酸及びステアリン酸マグネシウムを含む。滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、及びタルクを含む。溶媒は、例えば、精製水、エタノール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、及びオリーブ油を含む。可溶化剤は、例えば、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、及びクエン酸ナトリウムを含む。「懸濁化剤」は、例えば、塩化ベンザルコニウム、カルメロース、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、ポビドン、メチルセルロース、及びモノステアリン酸グリセリンを含む。緩衝剤は、例えば、リン酸水素二ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、及びクエン酸ナトリウムを含む。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル）及びヒトに治療有効量を経口又は非経口投与（例えば、局所投与、直腸投与、静脈投与）することができる。「治療有効量」は、患者、疾患、症状、剤形、投与経路によって変わるが、例えば、心血管疾患に罹患している成人患者（体重：約６０ｋｇ）に経口投与される場合の用量は、通常は、活性成分として使用される、本発明の環状アペリン類似体又はその薬学的に許容され得る塩では約１ｍｇ〜１ｇ／日である。このような量は、１日に１回又は数回患者に投与することができる。
【００６１】
活性成分又は活性化剤として本発明の化合物又はその薬学的に許容され得る塩を含む医薬組成物、及びキット（投与、処置、及び／又は予防キット）、パッケージ（包装物品など）、及び医薬組成物が処置及び／又は予防に使用できるか又は使用するべきかを示す医薬組成物についての添付文書を含む薬剤セット（及び／又は容器）も有用である。このようなキット、パッケージ、及び薬剤セットは、１つ以上の活性成分と他の薬剤、又は上述の医薬組成物のための薬剤（又は成分）が詰められた１つ以上の容器で提供され得る。このようなキット、パッケージ、及び薬剤セットの例として、目的の疾患の処置及び／又は予防用の適切な商業用キット、及び商業用パッケージが含まれる。このようなキット、パッケージ、及び薬剤セットに含められる添付文書として、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用、又は販売を規制する政府機関による注記、及びヒトへの薬物治療に適した製品の製造、使用、又は販売について政府機関の承認を示す注記が含まれる。上述のキット、パッケージ、及び薬剤セットには、包装製品も含めることができ、適切な薬物治療ステップ（ステップ）を採用することによって構成されるシステムを含めることができ、目的の疾患の処置、予防を含む、より好ましい薬剤での処置及び／又は予防を達成できるように構成されたシステムを含めることができる。
【００６２】
本発明の化合物又はその薬学的に許容され得る塩は、１つ又は複数の他の薬物（以降、「併用薬」）と併用（以降、「併用療法」）する医薬分野で現在行われている一般的な方法によって使用することができる。本発明のアペリン類似体又はその薬学的に許容され得る塩及び併用薬を投与するタイミングは制限されない。これらは、複合薬として患者に投与しても良いし、又は同時に又は一定の間隔で患者に投与しても良い。本発明の医薬組成物及び併用薬からなることを特徴とする医薬品キットを使用することができる。併用薬の用量は、臨床用途での用量に従うべきであり、この用量は、患者、疾患、症状、剤形、投与経路、投与時間、組み合わせによって適切に選択することができる。併用薬の投与方法は、特に限定されるものではなく、本発明の化合物又はその薬学的に許容され得る塩及び併用薬は単に一緒にするべきである。
【００６３】
併用薬は、例えば、
（１）心血管障害、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、又は虚血性心疾患の治療薬及び／又は予防薬
（２）内分泌系及びホルモン障害、糖尿病性網膜症、又は代謝性疾患の治療薬及び／又は予防薬
（３）癌の治療薬、
（４）炎症性疾患の治療薬及び／又は予防薬、及び
（５）ＨＩＶの治療薬を含み、これらの薬剤のいずれか１つ又は複数と本発明の化合物又はその薬学的に許容され得る塩とを併用することができる。
【００６４】
明瞭かつ簡潔な説明のために、同じ又は別の実施形態の一部として特徴を本明細書で説明するが、本発明の範囲が、説明される特徴の全て又は一部の組み合わせを有する実施形態を含み得ることを理解されたい。この節を考慮すると、出願される請求項１のバリエーションを、出願される本出願に記載の他の特徴、特に従属請求項に開示される特徴と組み合わせることができ、このような請求項は、通常は、本発明の最も好ましい実施形態に関連することは当業者が読めば明らかであろう。
【実施例】
【００６５】
実験のセクション
実施例１：ランチオニン安定化アペリン類似体の合成
ランチオニン含有アペリン変異体を、例えば、Ｋｌｕｓｋｅｎｓ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ＮｉｓＢ，ｔｈｅ  Ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｎｉｓｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，１２８２７−１２８３４；Ｋｌｕｓｋｅｎｓ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−（１−７）ｗｉｔｈ  ｔｈｉｏｅｔｈｅｒ−ｂｒｉｄｇｅ：ａｎ  ＡＣＥ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ，ｐｏｔｅｎｔ  Ａｎｇ−（ｌ−７）ａｎａｌｏｇｕｅ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．３２８，８４９−８５４；Ｒｉｎｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）ＮｉｓＣ，ｔｈｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｎｉｓｉｎ，ｃａｎ  ｃａｔａｌｙｚｅ  ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｎｏｎ−ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６，１３１７９−１３１８９に記載されている確立された手順に従って製造した。
【００６６】
簡単に述べると、２つのプラスミド系を含む乳酸菌連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）を使用した。第１のプラスミドは、ｉ位にセリン／トレオニン、ｉ＋３位、ｉ＋４位、ｉ＋５位、又はｉ＋６位にシステインを含む（メチル）ランチオニン−アペリンになる前駆体に、そのＣ末端で遺伝子的に融合されたランチビオティックナイシンのリーダーペプチドＭＳＴＫＤＦＮＬＤＬＶＳＶＳＫＫＤＳＧＡＳＰＲをコードしていた。別法では、第１のプラスミドは、ナイシンの最初の１７のアミノ酸及びエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ切断部位（Ｅ）が続くナイシンリーダー：ＭＳＴＫＤＦＮＬＤＬＶＳＶＳＫＫＤＳＧＡＳＰＲＩＴＳＩＳＬＣＴＰＧＣＫＴＧＡＬＭＩＥをコードしていた。Ｎ末端メチオニンは、通常は宿主によって切断される。
【００６７】
ナイシンリーダー及び（メチル）ランチオニンアペリン前駆体を含む融合ペプチドをコードするプラスミドを、成熟酵素ＮｉｓＢ及びＮｉｓＣ並びに転座酵素ＮｉｓＴをコードする第２のプラスミドｐＩＬ３ＢＴＣプラスミドと乳酸菌連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）で共発現させた。ＮｉｓＢが、セリン又はトレオニンを脱水してデヒドロアラニン及びデヒドロブチリンをそれぞれ生じさせた。続いて、シクラーゼＮｉｓＣが、デヒドロアミノ酸をシステインに共有結合させて、ランチオニン又はメチルランチオニンをそれぞれ生じさせた。乳酸菌連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）培養物を、４μｇ／ｍｌエリスロマイシン及び４μｇ／ｍｌクロロアムフェニコールが添加されたＧＭ１７培地で、３０℃で一晩増殖させた（Ｋｌｕｓｋｅｎｓ  ＬＤ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）．Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ＮｉｓＢ，ｔｈｅ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｎｉｓｉｎ）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：１２８２７−１２８３４）。次いで、１／１００の量を最少培地に移し、培養物を３０℃で一晩増殖させた（Ｒｉｎｋ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｓ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈａｔ  ｃａｎ  ｂｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４：８８７３−８８８２）。
【００６８】
遠心分離（１０分、１２８５７ｇ）によって上清を収集し、続いて減圧濾過（０．２μｍ）した。ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰイオン交換クロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて培地画分からペプチドを精製した。収集したペプチドを含む画分を脱塩し（ＰＤ１０カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）、これを真空乾燥させた。
【００６９】
（メチル）ランチオニン−アペリンペプチドを、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．６、３７℃で、１０Ｕ／ｍｌエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃでのタンパク分解によって放出させた。前記温度での４８時間のインキュベーションにより、Ｎ末端グルタミン（Ｑ）がピログルタミン酸塩（ｐＥ）に完全に変換される。Ｎ末端Ｑが必要な場合は、Ｇｌｕ−Ｃによる消化時間は、最低限の数時間に抑えられる。消化融合ペプチドを、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラム（Ｊｕｐｉｔｅｒ  ４  μｍ  Ｐｒｏｔｅｏ  ９０Å，Ｃ１２，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に分離した。分離は、０．１％トリフルオロ酢酸の存在下、ｍｉｌｌｉＱ水中、１５〜４０％のアセトニトリル勾配で、１．０ｍｌ／分で行った。（２１４ｎｍで検出された）ピーク画分を収集して、Ｍａｌｄｉ−ＴＯＦ質量分析（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  Ｐｒｏ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析した。（メチル）ランチオニンの存在又は非存在を、未修飾システインには付加されるが（メチル）ランチオニンには付加されないＣＤＡＰとのインキュベーションによって評価した（Ｒｉｎｋ  ２００７  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６，１３１７９−１３１８９）。
【００７０】
場合によっては、脱水セリンが非酵素的にシステインに結合して、異なる異性体になる。ランチオニン（Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａ）を［Ｌａｎ−Ｌａｎ］として示し；メチルランチオニン（Ａｂｕ−Ｓ−Ａｌａ及びＡｌａ−Ｓ−Ａｂｕ）を［ｍｅＬａｎ−ｍｅＬａｎ］として示す。
【００７１】
実施例２：ランチオニン−アペリン変異体のＡＰＪ受容体への結合
方法；ＡＰＪ競合結合アッセイ
［Ｇｌｐ６５、Ｎｌｅ７５、Ｔｙｒ７７］［１２５Ｉ］−アペリン１３結合実験を、ＳＰＡ９６−ウェル形式で行う。このアッセイに使用する膜は、組換えｈＡＰＪ又はｒＡＰＪのいずれかを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞から調製する。ＷＧＡ  ＰＶＴ  ＳＰＡビーズ（０．５ｍｇ／ウェル）と０．０８μｇの膜の混合物を、０．０６ｎＭ［Ｇｌｐ６５、Ｎｌｅ７５、Ｔｙｒ７７］［１２５Ｉ］−アペリン１３及び増加する濃度の試験化合物（１０点濃度反応曲線）を含むアッセイ緩衝液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に添加することによってインキュベーションを開始する。１００ｎＭアペリン１７の存在下、非特異的結合を決定した。サンプルを室温（２２℃）で８時間インキュベートする。次いで、９６ウェルプレートをＭｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘで読み取る。
【００７２】
結果：
0006740133.tif 000004
【００７３】
結論
ＰからＡ又はＰからＶへの突然変異により結合が破壊される。しかしながら、以下の本明細書の実施例８は、ＱＲＰＲＬＡＨＬａｎＧＰＭＬａｎＦの顕著な活性を示す。従って、プロリンのへリックス破壊効果をランチオニン架橋によって模倣することができる。ＦからＡへの突然変異体は結合しない。
【００７４】
２つのランチオニンを含むアペリンは、ＡＰＪ受容体に結合する能力を維持した。これらの結合能力は、野生型アペリン１３よりも低い。しかしながら、ランチオニンアペリンは、Ｑの代わりにｐＥを有し、これが、受容体結合の低下の一因であり得ることを理解されたい。
【００７５】
実施例３：ランチオニンアペリンは、ＡＰＪ受容体を発現する細胞におけるｃＡＭＰのレベルに影響を与える
方法：ホルスコリン刺激ｃＡＭＰアッセイ
組換えＡＰＪ受容体を発現するＨＥＫ２９３細胞での環状ＡＭＰのレベルを、ＨＴＲＦ競合イムノアッセイによって測定する。４０００細胞／ウェルの濃度の細胞を、アッセイ緩衝液（０．１％ＢＳＡ及び５ｍＭ  ＨＥＰＥＳが添加された、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含むＨＢＳＳ）に再懸濁し、アッセイプレートに加える。室温で４０分のインキュベーションは、１０μＭホルスコリン及び０．５ｍＭ  ＩＢＭＸを含む化合物の増加する濃度での添加で開始する。反応は、製造取扱説明書に従った、ｄ２標識ｃＡＭＰを含む溶解緩衝液の添加、これに続くクリプテート標識抗ｃＡＭＰモノクローナル抗体の添加によって停止させる。６２０及び６６５ｎｍでの時間分解蛍光を、暗所、室温での２時間のインキュベーション後にＥｎｖｉｓｉｏｎ器具で測定する。サンプル中のｃＡＭＰ含量を、ｃＡＭＰ標準曲線での補間によって決定する。
【００７６】
結果：
0006740133.tif 000005
【００７７】
結論：
実施例１で実証されているように受容体に結合する２つの変異体が、ｃＡＭＰレベルの変化に対して反応性である。
【００７８】
実施例４：ランチオニンアペリンはアレスチンのリクルートに影響を与える
方法：
ｈＡＰＪ  β−アレスチンのリクルートアッセイ
ｈＡＰＪのβ−アレスチンとの相互作用の刺激を、ＤｉｓｃｏｖｅＲｘのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（商標）システムを用いて研究する。ＣＨＯ−Ｋ１細胞系を、ＰｒｏＬｉｎｋ／酵素ドナー（ＰＫ）標識ＡＰＪと酵素活性化剤（ＥＡ）標識β−アレスチン融合タンパク質を共発現するようにエンジニアリングした。ＧＰＣＲの活性化で、酵素断片の相補性が生じ、活性β−Ｇａｌ酵素が産生される。これらの細胞を、１５０００細胞／ウェルの密度で播種する。翌日、細胞を、異なる濃度で潜在的なアゴニストプロフィールを有する化合物に暴露する。３７℃での９０分の化合物とのインキュベーション後、細胞を溶解し、室温で１時間、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ試薬と共にインキュベートする。次いで、サンプルを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ器具（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて超高感度蛍光プロトコルで読み取る。
【００７９】
結果：
0006740133.tif 000006
【００８０】
結論：
ｐＥＡｐｅＭ５変異体は、このアッセイにおいて有意な活性を有する。
【００８１】
実施例５：ランチオニン含有アペリンはアンジオテンシンＩＩ型１（ＡＴ１）受容体と相互作用しない
ＡＰＪとＡＴ１受容体との間の相同性を考慮して、ランチオニン−アペリンがアンジオテンシンＩＩ型１受容体と相互作用するか否かを調べた。例えば、アペリンのランチオニン変異体がＡＴ１受容体を刺激する場合は、様々な治療への応用には望ましくないであろう。
【００８２】
方法：
ランチオニンアペリンのアゴニスト及びアンタゴニスト作用を、ＡＴ１結合β−アレスチンアッセイによって測定した。
【００８３】
結果：
0006740133.tif 000007
【００８４】
結論：
ランチオニンアペリンは、アゴニスティックにもアンタゴニスティックにもＡＴ１受容体に作用しない。
【００８５】
実施例６：ｈＡＰＪ受容体の内在化アッセイ
方法：
ＨＥＫ２９３細胞を、５０％コンフルエンスでの実験の２４時間前に２つのＦ７５フラスコに播種する。翌朝、細胞をトリプシン処理し、６０秒間ボルテックスし、そして４０マイクロメートルのメッシュフィルターに通す。細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ＋２％ＦＢＳ中、３００，０００細胞／ｍｌの密度で再懸濁し、Ａｄ−ＧＦＰ−ｈＡＰＪウイルスを、１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで加える。細胞をボルテックスし、１０，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェル透明底の黒い皿に分注する。細胞を３０分間室温に維持して、５％ＣＯ２インキュベーター、３７℃での一晩のインキュベーションの前に細胞を皿に付着させる。翌朝、アペリン類似体を濃度反応曲線（最大５００ｎＭ）に適合させる。ＡＰＪ−ＧＦＰ転座が、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ共焦点顕微鏡で観察され、記録される。典型的な転座の動きは、３時間で完了し、殆どの効果が、化合物暴露の最初の９０分で観察される。
【００８６】
結果：
0006740133.tif 000008
【００８７】
結論：
内在化が脱感作に反映し得るため、シグナル伝達能力を示すが、内在化の減少した変異体が好ましい。このシリーズでは、実施例２のｃＡＭＰシグナル伝達を考慮すると、ｐＥＡｐｅＭ６が好ましい。
【００８８】
実施例７：ランチオニンアペリンは、血漿中のペプチドダーゼによる分解に対して高い耐性を有する
方法：
ラット血漿中のアペリン類似体の安定性。アペリン（０．１ｍｇ／ｍｌアペリン最終濃度）を３７℃、７．４の１６ｍＭリン酸緩衝液で緩衝化された１０％ラット血漿中でインキュベートした。サンプルを、５％ＴＦＡの最終濃度に酸性化することによってクエンチした。サンプルをＨＰＬＣで分析した。ピーク高さを、初期ピーク高さに対してプロットした。
【００８９】
結果：
0006740133.tif 000009
【００９０】
結論：
明らかに、ｐＧｌｕ及びランチオニンを有するペプチドは、Ｑを有する線状ペプチドよりも格段に安定している。ｐＧｌｕ及びランチオニンは共に、安定性に寄与する。変異体ｐＥＡｐｅＭ５ＴのｐＥＡｐｅＭ５との比較は、Ｄｈｂ残基による安定性の向上を実証している。
【００９１】
実施例８：ＡＰＪ受容体の刺激によるｃＡＭＰ経路の阻害及びＢ−アレスチン経路の刺激
（Ｍｅ）ｌａｎアペリン変異体を、ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社のｃＡＭＰ及びβアレスチンアッセイで試験した。
0006740133.tif 000010
0006740133.tif 000011
【００９２】
結論
いくつかの（メチル）ランチオニン変異体は、線状Ｓ〜Ａ対照の濃度よりも低い又はやや高い濃度でｃＡＭＰ経路を刺激する。
βアレスチン経路を刺激する能力は、かなり変化しやすく、ペプチドに依存する。これは、いくつかの変異体の強く特異な活性を示唆し；これは、両方の経路の比を示す最終列の値のばらつきによって例示されている。
特にランチオニン変異体は非常に活動性のようである。
アミノ酸のランチオニンの一部による置換だけではなく、ランチオニン（の一部）の挿入でも活性変異体が得られる。
２つの変異体が、ｃＡＭＰ経路よりもβアレスチン経路をより効果的に刺激する。
【配列表】
0006740133000001.app