(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)全長水晶体上皮由来増殖因子(LEDGF)のN末端のアミノ酸からなり、該N末端のアミノ酸がアミノ酸1〜326（LEDGF1-326）（SEQ ID NO:2）である、第一のペプチド、または
(b) タンパク質タグを持つ該アミノ酸1〜326を有する第四のペプチド、のいずれかの、LEDGFの断片又はタンパク質タグを持つ該LEDGFの断片である、精製ペプチドあって、
該精製ペプチドは、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル、カルシウム、リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオビウム、モリブデン、パラジウム、インジウム、錫、タングステン、レニウム、白金、およびガドリニウムのコロイド金属ナノ粒子からなる群より選択されるコロイド金属ナノ粒子に結合しているかまたは会合している、
精製ペプチドを含む、タンパク質凝集を介する疾患を処置するための組成物。
【請求項２】
第四のペプチドがHisタグ付きLEDGF1-326（His-LEDGF1-326）（SEQID NO:1）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
薬学的な担体、希釈剤、賦形剤またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ペプチドが、亜鉛コロイド金属ナノ粒子に結合しているかまたは会合している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
ペプチドが内側粒子に結合しているかまたは内側粒子内に被包されており、かつ該内側粒子が多孔性の外側粒子内に負荷されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
内側粒子が、超臨界二酸化炭素中で膨張しない粒子材料から作製されている、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
タンパク質凝集を介する疾患を処置するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物を含む薬学的製剤。
【請求項８】
凝集を介する疾患が眼疾患である、請求項７に記載の薬学的製剤。
【請求項９】
眼疾患が加齢性黄斑変性症または網膜色素変性症である、請求項８に記載の薬学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2012年5月21日付で出願された米国仮特許出願第61/649,847号、および2012年11月16日付で出願された国際特許出願第PCT/US2012/065620号の優先権を主張する。上記に特定した優先出願の内容は、参照により本明細書に完全に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は全体として、変性疾患ならびに酸化ストレスおよびタンパク質凝集ストレスを含むさまざまな細胞ストレスを伴う疾患の処置で用いるための水晶体上皮由来増殖因子(LEDGF)の新規ペプチドおよびその組成物に関する。より具体的には、本発明は、安定性の増強および持続的送達プロファイルを有するLEDGF1〜326の新規製剤、ならびにタンパク質凝集を介する疾患、年齢に関連する疾患および変性疾患の処置でのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
加齢性黄斑変性症(AMD)および網膜色素変性症(RP)を含む後眼部の疾患は、米国における主な失明原因である。(Jager et al., N ENGL J MED, 2008. 358(24): 2606-17（非特許文献1）)。現在、約800万人の個人が米国においてAMDに苦しんでおり、2020年までにこの数は1200万に達するものと予想される。(Jager et al.; Friedman et al. Arch Ophthalmol, 2004. 122(4): p. 564-72（非特許文献2）)。慢性酸化ストレスおよび炎症に関連する乾燥型のAMD (乾燥AMD)は、AMD症例の90%を占める。(Libby et al. Adv Exp Med Biol, 2010. 664: p. 403-9（非特許文献3）; Stuen. Generations, 2003. 27: p. 8-14（非特許文献4）)。他方でRPは、50種超の異なる遺伝子変異によって引き起こされる、遺伝的に受け継がれる疾患である。(Ohguro, H., et al., Nihon Ganka Gakkai Zasshi, 2002. 106(8): p. 461-73（非特許文献5）; Dryja,, et al., Nature, 1990. 343(6256): p. 364-6（非特許文献6）)。世界中で150万前後の人々が現在、RPに苦しんでいる。
【０００４】
眼に特有の構造および生理機能は、網膜変性疾患を含めて眼底の薬物治療の進展における大きな障害である。(Kompella et al., Ther Deliv. 1(3): p. 435-56（非特許文献7）)。局所の投与経路は、さまざまな静的障壁(数ある組織の中で特に角膜、結膜、および強膜)ならびに動的障壁(まばたき、涙液膜、涙液代謝回転、および涙液分泌の誘導)のため、眼底へ薬物を送達するには非効率的である。(Gaudana, R., et al., Ocular drug delivery. Aaps J, 2010. 12(3): p. 348-60（非特許文献8）; Thrimawithana et al. Drug Discov Today, 2011. 16(5-6): p. 270-7（非特許文献9）)。他方で血液網膜関門(BRB)、全身性分解、全身性副作用、および標的部位での低濃度は、静脈内経路の主な課題である。眼房内、眼周囲、網膜下のような他の経路は、それら特有の一部の問題を抱えており、局所および全身の投与経路と同じようないくつかの問題点も共有している(Baid et al. Drug Development and the back of the eye. ed. Kompella UB. 2010, p.409-448: Springer（非特許文献10）)。硝子体内注射のような局部送達では、薬物を網膜(網膜変性疾患の標的組織)に極めて接近させて配し、かくして薬物を網膜に送達するうえで最も効果的な経路である。しかしながら、薬物の頻繁な硝子体内注射は、さまざまな合併症、例えば網膜剥離、網膜出血、眼内炎、眼圧の増大、ならびに言うまでもなく患者の薬剤服用順守および感染症をもたらす。(Peyman et al. Retina, 2009. 29(7): p. 875-912（非特許文献11）; Wu et al. Semin Ophthalmol, 2009. 24(2): p. 100-5（非特許文献12）)。したがって、眼内での薬物の滞留を延ばしうる組成物および送達系が必要とされている。
【０００５】
タンパク質、遺伝子および他の小分子のような治療剤の安定性および生物学的利用能を増すだけでなく、長期間、薬物の放出を持続または制御しうる新規の薬物送達系が主な注目を集めている。生分解性(PLGA、PCL)ならびに非生分解性(例えばVitrasetおよびRetisert)インプラントは、数ヶ月から数年にわたる薬物の持続放出の基盤となる。しかしながら、生分解性インプラントの不規則な薬物放出プロファイルおよび高侵襲性の眼科手術が必要であることは、ほとんど欠点ではない。マイクロ粒子およびナノ粒子は、数週間から数ヶ月間の被包分子の持続放出を提供する。しかしながら、調製中にジクロロメタンのような有機溶媒を用いることで、タンパク質が変性されて、タンパク質の有効性が低減され、非効果的な処置につながる。さらに、他の障害としては、調製中の被包の効率、粒子サイズの制御、および無菌性が挙げられる。イオン導入、顕微針、超音波に基づく眼送達も試みられているが、しかし主な進歩は小分子薬を用いたものであって、まだ研究段階にあり、その有効性および安全性を立証するには検証が必要とされる。かくして、後部への非侵襲性または低侵襲性の、制御され、かつ持続した送達は、網膜変性に対する新興治療法の進歩の拡大で極めて不可欠になっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jager et al., N ENGL J MED, 2008. 358(24): 2606-17
【非特許文献２】Friedman et al. Arch Ophthalmol, 2004. 122(4): p. 564-72
【非特許文献３】Libby et al. Adv Exp Med Biol, 2010. 664: p. 403-9
【非特許文献４】Stuen. Generations, 2003. 27: p. 8-14
【非特許文献５】Ohguro, H., et al., Nihon Ganka Gakkai Zasshi, 2002. 106(8): p. 461-73
【非特許文献６】Dryja,, et al., Nature, 1990. 343(6256): p. 364-6
【非特許文献７】Kompella et al., Ther Deliv. 1(3): p. 435-56
【非特許文献８】Gaudana, R., et al., Ocular drug delivery. Aaps J, 2010. 12(3): p. 348-60
【非特許文献９】Thrimawithana et al. Drug Discov Today, 2011. 16(5-6): p. 270-7
【非特許文献１０】Baid et al. Drug Development and the back of the eye. ed. Kompella UB. 2010, p.409-448: Springer
【非特許文献１１】Peyman et al. Retina, 2009. 29(7): p. 875-912
【非特許文献１２】Wu et al. Semin Ophthalmol, 2009. 24(2): p. 100-5
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明は、大量に、高純度で、またはその両方で産生されうる生物学的に活性なLEDGFペプチドを対象にする。例えば、本発明は、SDS-PAGEおよびSEC-HPLCによって定量化した場合に、培養液1リットルあたり20 mgでまたはそれを上回って、かつ90%の純度でまたはそれを上回って産生されうる、LEDGFペプチドを対象にする。1つの例示的な態様において、ペプチドは、80 kDaの二量体として存在しうる、およそ40 kDaの単量体である。別の例示的な態様において、ペプチドは、主にランダムコイル構造を有し、N末端のストレス関連結合ドメイン、および任意でTAT結合ドメインを含む。
【０００８】
別の例示的な態様において、ペプチドはLEDGFのアミノ酸番号1〜326 (LEDGF1〜326)を含む。別の例示的な態様において、ペプチドはSEQ ID NO:2を含む。別の例示的な態様において、ペプチドは、SEQ ID NO:2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに、本発明は、SEQ ID NO:2をコードする核酸配列、またはSEQ ID NO:2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、もしくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。本発明は、そのような核酸配列を含有するベクターをさらに含む。1つの例示的な態様において、ベクターはpET-28a(+)ベクターである。
【０００９】
別の局面において、本発明は、LEDGFペプチドを含有する組成物を含む。1つの例示的な態様において、組成物は、薬学的担体、希釈剤、賦形剤、またはその組み合わせと組み合わせたLEDGFペプチドを含む。別の例示的な態様において、組成物は、ナノアセンブリを形成させるために、亜鉛のような、コロイド金属粒子に結び付けられたまたは結合されたLEDGFペプチドを含む。別の例示的な態様において、組成物は、多孔性の外側粒子内に負荷された内側粒子に被包されたまたは結合されたLEDGFペプチドを含む。ある種の例示的な態様において、上記の組成物において用いられるLEDGFペプチドは、LEDGF1〜326である。
【００１０】
別の局面において、本発明は、上記のLEDGFペプチド組成物を、それを必要としている患者に投与することによって、タンパク質凝集を介する疾患を処置する方法を対象にする。ある種の例示的な態様において、タンパク質凝集を介する疾患は網膜変性疾患である。例示的な網膜変性疾患としては、加齢性黄斑変性症(AMD)、網膜色素変性症(RP)および糖尿病性網膜症(DR)が挙げられるが、これらに限定されることはない。別の例示的な態様において、タンパク質凝集を介する疾患は、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症、またはプリオン病を含むが、これらに限定されない、神経変性疾患である。
[本発明1001]
水晶体上皮由来増殖因子(LEDGF)のN末端のストレス関連結合ドメインを含む、 LEDGFのアミノ酸配列を含むペプチド。
[本発明1002]
TAT結合ドメインをさらに含む、本発明1001のペプチド。
[本発明1003]
およそ40 kDaの分子量を有する、本発明1001のペプチド。
[本発明1004]
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:2に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、もしくは少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、本発明1001のペプチド。
[本発明1005]
本発明1004のペプチドをコードする核酸配列。
[本発明1006]
本発明1005の核酸配列を含むベクター。
[本発明1007]
本発明1001〜1004のいずれかのペプチドを含む組成物。
[本発明1008]
薬学的な担体、希釈剤、賦形剤またはそれらの組み合わせをさらに含む、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
ペプチドがコロイド金属ナノ粒子に結合しているかまたは会合している、本発明1007の組成物。
[本発明1010]
コロイド金属ナノ粒子が金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル、カルシウム、リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオビウム、モリブデン、パラジウム、インジウム、錫、タングステン、レニウム、白金、またはガドリニウムのコロイド金属ナノ粒子である、本発明1009の組成物。
[本発明1011]
ナノ粒子が亜鉛ナノ粒子である、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
薬学的な担体、希釈剤、賦形剤またはそれらの組み合わせをさらに含む、本発明1009〜1011のいずれかの組成物。
[本発明1013]
ペプチドが内側粒子に結合しているかまたは内側粒子内に被包されており、かつ該内側粒子が多孔性の外側粒子内に負荷されている、本発明1007の組成物。
[本発明1014]
内側粒子が、超臨界二酸化炭素中で膨張しない粒子材料から作製されている、本発明1013の組成物。
[本発明1015]
内側粒子の材料が重合体材料である、本発明1013の組成物。
[本発明1016]
内側粒子の重合体材料が、ポリ乳酸(PLA)、ポリ(グリコール酸) (PGA)、乳酸およびグリコール酸の共重合体(PLGA)、セルロース誘導体、ならびにキトサンからなる群より選択される、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
内側粒子の重合体材料がポリ乳酸(PLA)である、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
外側粒子が、超臨界二酸化炭素中で膨張する粒子材料から作製されている、本発明1013の組成物。
[本発明1019]
外側粒子が重合体材料である、本発明1018の組成物。
[本発明1020]
重合体材料が、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、およびそれらの共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルの重合体、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルロースポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアセテート)、ならびにポリビニルピロリドンより選択される材料である、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
外側粒子の材料がラクチド-コ-グリコリドである、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
それを必要としている患者に本発明1007〜1021のいずれかの組成物を投与する段階を含む、タンパク質凝集を介する疾患を処置する方法。
[本発明1023]
凝集を介する疾患が眼疾患である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
眼疾患が網膜変性疾患である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
網膜変性疾患が加齢性黄斑変性症(AMD)、または網膜色素変性症(RP)である、本発明1024の方法。
[本発明1026]
凝集を介する疾患が神経変性疾患である、本発明1022の方法。
[本発明1027]
神経変性疾患がアルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症、またはプリオン病である、本発明1026の方法。
[本発明1028]
それを必要としている患者に本発明1007〜1021のいずれかの組成物を投与する段階を含む、タンパク質凝集を介する疾患におけるタンパク質凝集を低減する方法。
[本発明1029]
タンパク質凝集が小胞体ストレス、酸化ストレス、またはそれらの両方によって引き起こされる、本発明1028の方法。
[本発明1030]
患者が網膜変性疾患を有する、本発明1028の方法。
[本発明1031]
網膜変性疾患がAMDまたはRPである、本発明1030の方法。
[本発明1032]
患者が神経変性疾患を有する、本発明1028の方法。
[本発明1033]
神経変性疾患がAD、PH、HD、筋萎縮性側索硬化症、またはプリオン病である、本発明1032の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】全長LEDGFを精製する試みによって不安定なかつ断片化された産物がもたらされることを示す精製された全長LEDGFの免疫ブロットである。
【図２】全長LEDGFをLEDGF1〜326と比較している略図である。
【図３】pET-28a(+)への、LEDGF1〜326をコードする核酸配列のクローニング成功を示すアガロースゲルの写真である。Ledgf1〜326遺伝子をPCR増幅し、その後、pET-28a(+)ベクターへライゲーションした。レーン1: PCR増幅されたLedgf1〜326遺伝子、レーン2: 未切断の環状pET-28a(+)、レーン3: 直線化されたBamHI消化pET-28a(+)、レーン4: 未切断の環状pLEDGF1〜326 (Ledgf1〜326とライゲーションされたpET-28a(+))、レーン5: 直線化されたBamHI消化pLEDGF1〜326、レーン6: 直線化されたHindIII消化pLEDGF1〜326、レーン7: BamHIおよびHindIII二重消化pLEDGF1〜326、レーン8: pLEDGF1〜326からのLedgf1〜326遺伝子のPCR増幅。
【図４】図4A〜Cは、LEDGF1〜326の発現および精製の成功を示すグラフのセットである: A) SDS-PAGE - レーン1 プロテインマーカー(Fermentas, Glen Burnie, MD)、レーン2 非誘導性の細胞溶解物、レーン3 IPTG誘導された細胞溶解物、レーン4 溶解物の可溶性画分、レーン5 FPLC-陽イオン交換カラムから得られたLEDGF1〜326、レーン6 FPLC-ゲルろ過カラムから得られたLEDGF1〜326; B) FPLC-陽イオン交換クロマトグラム; C) FPLC-ゲルろ過クロマトグラム。
【図５】図5A〜Dは、LEDGF1〜326のある種の物理的特徴を示すグラフのセットである。A) SEC-HPLC: 1 mM CaCl2, pH 7.0を含有する25 mM Tris-HCL緩衝液を用いAgilent Bio-SECカラムにてLEDGF1〜326をサイズ分離した。LEDGF1〜326は、11.5分の位置に単一のピークとして主に溶出され、約5%の、より高分子量の種を伴った。B) MALDI-TOF: LEDGF1〜326は40 kDaの分子量を有し、二量体として存在しうる。C) DLS: Nano ZSを用い25 mMリン酸緩衝液, pH 7.0中でLEDGF1〜326のサイズを分析した。LEDGF1〜326は直径約10 nmの単分散集団を有し、凝集体の存在を伴わなかった。D) SDS-PAGE: LEDGF1〜326を還元(β-メルカプトエタノールおよび煮沸)条件ならびに非還元(β-メルカプトエタノールなしおよび煮沸なし)条件の下、4〜15%のSDS-PAGEゲル上でサイズ分離した。非還元ゲルから、LEDGF1〜326の二量体の存在が示唆された。
【図６】図6A〜Bは、LEDGF1〜326の、予測された構造的特徴に関するさらなるデータを表す一連のグラフである。A) 円偏光二色性: Chirascanを用いて25 mMリン酸緩衝液pH 7.0中の500 μg/mlのLEDGF1〜326の二次構造を分析した。α-ヘリックスまたはβ-シートについて特徴的なピークは得られなかった。さらに、200 nmでの強い負のシグナルの存在から、LEDGF1〜326が主にランダムコイルタンパク質であることが示唆された。B) LEDGF1〜326 三次元モデル: LEDGF1〜326 三次元構造を、そのアミノ酸配列、およびタンパク質データバンクにおいて構造が利用可能なタンパク質との相同性に基づきI-Tasserタンパク質モデリングサーバーによって予測した。三次元モデルによれば、LEDGF1〜326はランダムコイルタンパク質である。
【図７】図7A〜Fは、LEDGF1〜326の、予測された構造的特徴に関するさらなるデータを表すさらなるグラフを提供する。蛍光分光法-化学変性: A) pH 7.0の25 mMリン酸緩衝液中0〜6 Mの尿素とともにインキュベーションされた300 μg/mlのLEDGF1〜326の蛍光スペクトルを280 nmの励起波長で300から400 nmまで記録した。B) 340/356 nmでの蛍光強度の比率を尿素濃度に対してプロットし、立体構造安定性パラメータを決定した。C) pH 7.0の25 mMリン酸緩衝液中0〜6 Mの尿素とともにインキュベーションされた300 μg/mlのLEDGF1〜326のCDスペクトルを220から260 nmまで記録した。D) 230 nmでのCDシグナルを尿素濃度に対してプロットし、立体構造安定性パラメータを決定した。E) LEDGF1〜326を熱により変性させ、CDシグナルの、対応する変化を215から250 nmまで記録した。F) 222 nmでのCDシグナルを温度に対してプロットし、LEDGF1〜326の融解温度を決定した。
【図８】図8A〜Bは、凝集を介するストレスからARPE-19細胞をレスキューするLEDGF1〜326の能力を示す一連のグラフである。ARPE-19細胞を凝集ストレスのA) 非存在下またはB) 存在下において48時間LEDGF1〜326で処理した。
【図９】図9A〜Bは、LEDGF1〜326がRCSラットにおいて光受容体の機能喪失を遅延させることを実証する一連のグラフである。A) 0.4 log cd-s/m2のフラッシュを用いて暗順応ERGを記録し、ラットの年齢に対して暗順応B波振幅をプロットした。明順応ERGの場合、ERGを記録する前に3分間30 cd/m2の背景光を用いてラットを明順応させた。B) 明順応B波振幅をラットの年齢に対してプロットした。個々のラットに対して3回のERGを平均化し、各群内のB波振幅を平均化して、平均値を得た。データはN=3の平均値±S.D.を表す。＊, 対応する未処置群と比べてp<0.05。
【図１０】LEDGF1〜326/亜鉛ナノアセンブリが希釈後に安定であることを示す一連のグラフである。
【図１１】図11A〜Cは、添加物の非存在下または存在下でのLEDGF1〜326の三次構造、二次構造およびサイズ変化を示す一連のグラフである。
【図１２】還元条件下で投入されたLEDGF1〜326のSDS-PAGEゲルの写真である。
【図１３】図13A〜Bは、さまざまな添加物の非存在下および存在下でのLEDGF1〜326の可溶性タンパク質および不溶性凝集体の量を示す一連のグラフである。図13Cは、さまざまな添加物の存在下でLEDGF1〜326の不溶性凝集体が存在しないことを示す微小遠心管の写真である。
【図１４】さまざまな添加物の存在下および非存在下でのLEDGF1〜326の免疫反応性を描くグラフである。
【図１５】図15A〜Cは、添加物の存在下でのLEDGF1〜326の構造的完全性および立体構造安定性の生物物理学的特徴決定を示す一連のグラフである。A) さまざまな添加物の存在下における時間に応じた280 nmでの励起による342 nmでのLEDGF1〜326の蛍光強度。B) 時間および添加物に応じた208 nmでのLEDGF1〜326の円偏光二色性(CD)。C) 時間および添加物に応じたLEDGF1〜326の流体力学的サイズ。
【図１６】時間に応じたLEDGF1〜326の分子量分析を提供するSDS-PAGEゲルの写真である。
【図１７】図17A〜Dは、亜鉛の存在下でのLEDGF1〜326ナノアセンブリの形成を示す一連のグラフである。A) 動的光散乱。LEDGF1〜326は亜鉛の存在下でナノアセンブリを形成する。B) 円偏光二色性。LEDGF1〜326の二次構造は亜鉛の存在下で変化する。C) 蛍光分光法。LEDGF1〜326の蛍光スペクトルは亜鉛の存在下で消光され、より極性の環境への疎水性残基の曝露を示唆している。D) 紫外分光法: LEDGF1〜326の紫外吸光度は0.1 mMおよび1 mM亜鉛の存在下で消光されたが、10 mM亜鉛では消光されなかった。
【図１８】LEDGF1〜326亜鉛ナノアセンブリの一連のTEM画像である。
【図１９】図19A〜Dは、LEDGF1〜326ナノアセンブリの可逆的形成を実証する一連のグラフである。
【図２０】図20A〜Dは、経時的なLEDGF1〜326ナノアセンブリの安定性の増大を実証する一連のグラフおよびSDS-PAGEゲルの画像である。
【図２１】ARPE-19細胞によるLEDGF1〜326ナノアセンブリの取込みの増大を実証するグラフである。
【図２２】血清飢餓からARPE-19細胞をレスキューするLEDGF1〜326ナノアセンブリの能力を実証するMTTアッセイ法の結果を描くグラフである。
【図２３】図23A〜Dは、網膜電図検査を用いて調べた網膜変性を低減するLEDGF1〜326ナノアセンブリの能力を実証する一連のグラフである。
【図２４】図24A〜Hは、正常SDラットにおけるAlexa-LEDGF1〜326の蛍光シグナルを検出することによって測定した、少なくとも14日間の、硝子体中でのLEDGF1〜326ナノアセンブリの残留性を実証する一連のグラフである。A)は、SDラット眼の硝子体内注射前のブランクスキャンの結果を実証する。B)およびC)は、それぞれ、対照およびLEDGF1〜326アセンブリの標準曲線を実証する。D)およびE)は、Flurotronスキャンから得られた、硝子体液、脈絡膜-RPE、および房水を含むさまざまな組織における蛍光シグナルを実証する; F)、G)、およびH)は、上記で測定された蛍光シグナルを、それぞれ、硝子体液、脈絡膜-RPE、および房水に対する実際のLEDGF1〜326ナノアセンブリに変換する。
【図２５】LEDGF1〜326の免疫反応性を保存するナノアセンブリの能力を実証するグラフである。
【図２６】図26A〜Bは、A) LEDGF1〜326でトランスフェクションされたARPE-19細胞の細胞カウントアッセイ法の一連の画像、ならびにB) LEDGF1〜326の時間および濃度に応じた細胞カウントアッセイ法の結果を実証するグラフである。
【図２７】貪食活性を測定するアッセイ法の結果を実証し、かつLEDGF1〜326でトランスフェクションされたARPE-19細胞での貪食活性の増大を示唆しているグラフである。
【図２８】図28A〜Dは、LEDGF1〜326を注射したSDラット眼の組織学的分析の結果を実証する一連の画像およびグラフである。A)は、硝子体内注射部位の眼の縦断面のグラフィック描画である。B)は、正常SD、未処置RCS、およびLEDGF1〜326処置RCS網膜の横断面の一連の画像である。C)およびD)は、それぞれ、対照およびLEDGF1〜326処置網膜における眼の外核層および内核層の、測定された厚さを描くグラフである。
【図２９】対照およびLEDGF1〜326処置ラットSD網膜の免疫蛍光像のパネルである。
【図３０】例示的なPinP組成物からのHis-LEDGF1〜326の累積放出を示すグラフである。
【図３１】ラット眼におけるAlexa-His-LEDGF1〜326の硝子体内注射後の非侵襲性の眼蛍光測定の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
詳細な説明
定義
本明細書において用いられる場合、「網膜および網膜の」は、網膜および網膜に隣接した全般的な後眼部の両方をいう。
【００１３】
本明細書において用いられる場合、「処置するまたは処置」は、基礎疾患の完全な回復または消失、疾患進行の一時的または持続的阻止、疾患の一時的または持続的退行、および疾患に関連した1つまたは複数の症状の寛解をいう。
【００１４】
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。特に断りのない限り、これらの用語は、ペプチド結合を通じて連結された少なくとも2個のアミノ酸を有する重合体をいう。これらの用語はしたがって、オリゴペプチド、タンパク質断片、類似体、誘導体、グリコシル化誘導体、ペグ化誘導体、融合タンパク質などを含む。
【００１５】
本明細書において用いられる場合、「配列同一性/類似性」は、2つ以上のアミノ酸配列の同一性、または類似性をいう。配列同一性は、同一性の割合という観点から測定することができ、割合が高いほど配列がより同一である。アライメントの方法および比較のための配列は、当技術分野において周知である。さまざまなプログラムおよびアライメントアルゴリズムが、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443; Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, Gene, 73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, CABIOS 5: 151-3, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids. Res. 16: 10881-10, 1990に記述されており、配列アライメント法および相同性計算の詳細な検討を提示している。
【００１６】
配列解析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastn、およびtblastxと共に用いるNCBI Basic Local Alignment Research Tool (BLAST) (Altschule et l al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)は、いくつかの供給源、例えば米国国立生物学情報センター(National Center for Biological Information) (NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894)から、およびインターネット上で、入手可能である。Blastpは、アミノ酸配列を比較するために用いられる。さらなる情報は、NCBIウェブサイトで見出すことができる。
【００１７】
一般に、整列されたら、同一のアミノ酸残基が両配列に存在する位置の数をカウントすることによって適合数を決定する。適合数を、特定された配列に記載されている配列の長さで割るか、または繋がれた長さ(例えば、特定された配列に記載されている配列由来の100個の連続的なヌクレオチドもしくはアミノ酸残基)で割り、その後、得られた値に100を乗じることによって、%同一性を決定する。
【００１８】
導入
全長LEDGFは、P23H変異体ロドプシン凝集誘導ストレスから網膜色素上皮細胞をレスキューする能力を有する(Baid et al., PLoS One. 6(9): p. e24616)。しかしながら、治療用ペプチドの使用は、タンパク質が、生物学的に活性なままであるために、特定の三次元構造を維持する必要があるため困難である。加えて、産生および生合成は、生合成および精製プロセス全体にわたるタンパク質安定性の欠如のため、失敗することが多い。さらに、タンパク質治療剤を効果的に用いるためには、タンパク質特性を効果的に特徴決定するために数ミリグラムの産生を達成することが必要な場合が多い。例えば、全長LEDGFは、タンパク質を適切に特徴決定するために必要とされる数十ミリグラムには程遠い、500 mlあたり0.9 mgしか得られず、断片化された産物をもたらす。
【００１９】
本発明は、LEDGFペプチドの大量のおよび高純度の産生および精製を可能にしながらも全長タンパク質の細胞生存活性を保持する、LEDGFのペプチドを提供する。さらに、本発明のLEDGFペプチドは、抗タンパク質凝集活性を有する。本発明のLEDGFペプチドは、変性疾患ならびに酸化ストレスおよびタンパク質凝集ストレスを含むさまざまな細胞ストレスに関連する疾患を処置する能力を示す。したがって、本発明のLEDGFペプチドのような分子は、他の網膜変性疾患および神経変性疾患を含む、複数のタンパク質凝集を介する疾患を処置するための汎用的な治療用タンパク質に相当しうる。本発明は、上記の疾患の処置で有用なLEDGFペプチドの持続放出製剤をさらに含む。
【００２０】
LEDGFペプチド
本発明のLEDGFペプチドは、全長LEDGFのN末端ペプチドを含む。1つの例示的な態様において、LEDGFペプチドは、LEDGFのN末端のストレス関連結合ドメインを含む。以下の理論によって限定されるわけではないが、転写因子として機能し、他のストレス応答遺伝子の転写を開始するLEDGFの能力は、タンパク質凝集を介する疾患を防ぐLEDGFペプチドの能力に寄与しうる。あるいは、LEDGFペプチドは、誤って折り畳まれたタンパク質に直接的にまたは他の中間タンパク質を介して結合し、かつ、通常の折り畳みをまたは誤って折り畳まれたタンパク質のユビキチン化を促進して、タンパク質分解を確実にしうる。ある種の例示的な態様において、LEDGFペプチドはTAT結合ドメインをさらに含みうる。
【００２１】
1つの例示的な態様において、LEDGFペプチドは、LEDGF1〜326(SEQ ID NO: 2)である。LEDGF1〜326は、ほぼ均質になるまで精製された。LEDGF1〜326は、主にランダムコイル構造を有し、室温で安定であり、かつ40 kDaの単量体および/または80 kDaの二量体として存在する。以下の実施例の項においてさらに詳細に記述されているように、LEDGF1〜326は、ARPE-19細胞においてP23H変異体ロドプシンを介する凝集ストレスを阻止することができた。LEDGF1〜326の単回の硝子体内注射により、8週間以上にわたって網膜変性ラットモデルでの光受容体の機能喪失が低減された。
【００２２】
本発明のLEDGFペプチドはまた、LEDGF1〜326に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の配列同一性を有するLEDGFペプチドを含む。1つの例示的な態様において、LEDGFペプチドは、全長LEDGFのN末端のストレス関連結合ドメインならびにLEDGF1〜326に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の配列同一性を包含するペプチドを含む。別の例示的な態様において、LEDGFペプチドは、N末端のストレス関連結合ドメインおよびTAT結合ドメインならびにLEDGF1〜326に対して少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%の配列同一性を有するペプチドを含む。さらに、本発明は、SEQ ID NO: 2の326アミノ酸を上回ってまたは下回って包含するペプチドを含み、ここで、より大きなまたはより小さなペプチドは、生合成および精製の間にLEDGFの生物活性または安定性の有意な低下を引き起こさない。当業者は、以下の実施例の項において記述されるアッセイ法を用いて生物物理学的および生化学的特性ならびに生物活性に対する推定上のペプチドの類似性を評価することにより、本発明の使用に関するLEDGFペプチドの適合性を判定することができる。当業者は、LEDGF1〜326と類似の生物物理学的特性、生化学的特性、および生物活性を有するLEDGFペプチドが類似の有用性を有し得ること、およびしたがって本発明の範囲内に含まれ得ることを、予測可能に認識することができる。
【００２３】
ある種の例示的な態様において、上記のLEDGFペプチドは、合成により作製される。ある種の他の例示的な態様において、上記のLEDGFペプチドは、組み換えにより作製される。LEDGFペプチドの発現に適した宿主は、大腸菌(E. coli)、サッカロマイセス(Saccharomces)、ピチア(Picchia)、バチルス(Bacillus)、CHO、BHK、COS、およびNSO細胞を含むが、これらに限定されることはない。
【００２４】
標準的な薬学的製剤
本明細書において記述されるLEDGFペプチドは、公知の技法を用いて生理学的に許容される製剤として提供することができる。E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition (1995)によるRemington's Pharmaceutical Sciencesには、本明細書において開示されるLEDGFペプチドの薬学的送達に適した組成物および製剤が記述されている。
【００２５】
本発明による製剤は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、カシェ剤、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、エアロゾル、坐薬、スプレー、トローチ、軟膏、クリーム、ペースト、フォーム、ゲル、タンポン、膣坐薬、顆粒、ボーラス投与、うがい薬、インプラントの形態で、装置中で、点眼薬として、または経皮パッチとして、投与することができる。
【００２６】
製剤は、経口、直腸、経鼻、吸入、局所(皮膚、経皮、頬側、および点眼薬を含む)、腟内、非経口(皮下、筋肉内、静脈内、皮内、眼内、気管内、および硬膜外を含む)、眼部(眼周囲、眼内、例えば脈絡膜上、網膜下および硝子体内)、または吸入投与に適したものを含む。1つの例示的な態様において、本発明のペプチドは経強膜的送達、脈絡膜上送達、網膜下送達、または硝子体内送達用に製剤化される。経強膜的送達は結膜下送達、テノン嚢下送達、および眼球後方の経強膜的送達を含む。製剤は好都合に単位剤形で与えられてもよく、従来の薬学的技法によって調製されてもよい。そのような技法は、活性成分と薬学的担体または賦形剤とを会合させる段階を含む。一般に、製剤は、活性成分と、液体担体もしくは超微粒子固体担体またはその両者とを均一かつ密接に会合させ、次に必要ならば、生成物を成形することで調製される。
【００２７】
経口投与に適した本発明の製剤は、それぞれ所定量の活性成分を含むカプセル、カシェ剤もしくは錠剤などの個別の単位として；粉末もしくは顆粒として；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として；または水中油型の液体乳濁液もしくは油中水型の乳濁液などとして、与えられてもよい。
【００２８】
錠剤は、任意で1種または複数種の補助成分とともに、圧縮または成形によって作製されうる。圧縮錠剤は、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、界面活性剤または分散剤と任意で混合された、粉末または顆粒のような自由流動性形態の活性成分を、適当な機器中で圧縮することによって調製されうる。成形錠剤は、適当な機器中で、不活性な液体希釈剤で加湿した粉末状化合物の混合物を成形することによって作製されうる。錠剤は、任意でコーティングされてもよくまたは割線を付けられてもよく、その中の活性成分の徐放または制御放出をもたらすように製剤化されうる。
【００２９】
口内での局所投与に適した製剤は、風味つき基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に成分を含むロゼンジ; ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に活性成分を含むトローチ; ならびに投与される成分を適当な液体担体中に含むうがい薬を含む。
【００３０】
皮膚への局所投与に適した製剤は、投与される成分を薬学的に許容される担体中に含む軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、および点眼薬として与えられてもよい。
【００３１】
直腸投与のための製剤は、例えば、カカオバターまたはサリチル酸塩を含む適当な基剤の坐薬として与えられてもよい。
【００３２】
担体が固体である、経鼻投与に適した製剤は、鼻から吸入する様式で、すなわち鼻の近くに保持される粉末容器から鼻腔を通じて迅速に吸入することによって投与される、例えば、20〜500ミクロンの範囲にある粒度を有する粗粉末を含む。例えば、鼻腔用スプレーとしてまたは点鼻薬として投与するための担体が液体である適当な製剤は、活性成分の水性または油性溶液を含む。
【００３３】
腟内投与に適した製剤は、活性成分に加えて、当技術分野において適切なことが知られている担体などの成分を含有する、膣坐薬、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤として与えられてもよい。
【００３４】
吸入に適した製剤は、活性成分に加えて、当技術分野において適していることが知られている担体などの成分を含有する、噴霧、微粉末、粉末またはスプレー製剤として与えられてもよい。
【００３５】
非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および、意図されるレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性の無菌注射溶液; ならびに懸濁化剤と増粘剤を含んでもよい水性および非水性の無菌懸濁液; ゲル; ならびに外科的に設置したインプラントを含む。
【００３６】
ナノアセンブリ製剤
ある種の例示的な態様において、本発明のLEDGFペプチドは、LEDGFペプチドをコロイド金属粒子と結合させるか、または他の方法で会合させることによりナノ粒子アセンブリとして送達されうる。任意のコロイド金属を本発明において用いることができる。コロイド金属は、任意の水不溶性の金属粒子、液体水中に分散された金属化合物、ヒドロゾル、または金属ゾルを含む。コロイド金属粒子は、周期表のIA、IB、IIB、およびIIIB族の金属、ならびに遷移金属、特にVIII族の金属から選択されうる。例示的な金属としては、亜鉛、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、鉄、ニッケル、およびカルシウムが挙げられる。他の適当な金属には、それらの種々の酸化状態の全てにおける以下のものが含まれる: リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオビウム、モリブデン、パラジウム、インジウム、錫、タングステン、レニウム、白金、およびガドリニウム。金属は、好ましくは、イオン形態の適切な金属化合物、例えばAl3+、Ru3+、Zn2+、Fe3+、Ni2+、およびCa2+に由来する。
【００３７】
1つの例示的な態様において、ナノ粒子は、LEDGFペプチドを含有する溶液に直接コロイド金属を加えることによって形成される。本明細書において用いられる場合、「ナノ粒子」は、単一のコロイド金属粒子の表面に結合もしくは吸着された1種もしくは複数種のペプチド、または複数種のコロイド金属粒子に結合もしくは吸着されたペプチドをいう。例として、LEDGF/Znナノ粒子は、室温で10 mMの制御された様式でZn(II)を加えることによって形成される。その後、ナノアセンブリを37℃で24時間の期間にわたって形成させる。他のコロイド金属を用いた他のナノアセンブリの形成のための条件は、当業者によって容易に決定されうる。
【００３８】
粒子中粒子(particle-in-particle)型の製剤
別の例示的な態様において、LEDGFペプチドは粒子中粒子型の持続放出製剤として製剤化される。本発明の持続放出組成物は、多孔性マイクロ粒子中のナノ粒子(NPinPMP)、多孔性大型ナノ粒子中の小型ナノ粒子(SNPinPLNP)、および多孔性大型マイクロ粒子中の小型マイクロ粒子(SMPinPLMP)のような種々の構造物を含む、より大きな多孔性の外側粒子内に含有される内側粒子を含む。内側粒子は、大きい方の粒子と比べて小さく、相対的に非膨張性である。外側粒子は膨張性であり、外側粒子の多孔性構造内への内側粒子の包埋を可能にする処理の間にかなり多孔性の構造を形成する。
【００３９】
本発明の文脈において用いられる場合、粒子の最初の表面積がおよそ1.25倍〜およそ100倍の範囲内で増加する場合、粒子は超臨界流体の存在下で膨張するものと考えられる。ある種の例示的な態様において、粒子の最初の表面積がおよそ1.25倍〜およそ5倍、およそ5倍〜およそ25倍、およそ25倍〜およそ50倍、およそ50倍〜およそ75倍、またはおよそ75倍〜100倍の範囲内で膨張する場合、粒子は膨張するものと考えられる。あるいは、粒子の最初のサイズが少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、または50%増加する場合、粒子は膨張するものと考えられる。
【００４０】
本発明の内側粒子は、超臨界流体の存在下で膨張しない重合体材料または非重合体材料を用いて作製される。ある種の例示的な態様において、ナノ粒子材料は、超臨界流体の存在下で膨張しない重合体材料である。ある種の例示的な態様において、重合体材料は、超臨界二酸化炭素の存在下で膨張しない材料である。本発明において用いられうる適当な重合体材料および非重合体材料の例としては、ポリ乳酸(PLA)、ポリ(グリコール酸)、乳酸およびグリコール酸の共重合体(PLGA)、セルロース誘導体、キトサン、ポリエチレン(PE)、ポリプロピレン、ポリ(テトラフルオロエチレン)、ポリ(エチレンテレフタレート)、酸化鉄、酸化セリウム、酸化亜鉛、金、銀、他の生体適合性の金属および結晶、ならびにシリカが挙げられる。結晶材料または大きな結晶領域を有する材料は、超臨界流体処理の間に膨張する可能性が低い。重合体性の内側粒子は、従来の乳化溶媒蒸発法または他の同様に適当な合成法を用いて調製されうる。LEDGFペプチドは、形成中に内側粒子内に被包されてもよく、または内側粒子の形成後に表面上に負荷されてもよい。
【００４１】
本発明の外側粒子は、超臨界流体の存在下で膨張する材料を用いて作製される。ある種の例示的な態様において、マイクロ粒子材料は、超臨界流体の存在下で膨張する重合体材料である。ある種の例示的な態様において、超臨界二酸化炭素の存在下で膨張する材料。本発明において用いられうる適当な重合体材料の例としては、ラクチド-コ-グリコリド、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド、およびそれらの共重合体が挙げられる。さらに、適当な重合体材料にはまた、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルの重合体、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート  セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルロースポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(エチルメタクリレート)、ポリ(ブチルメタクリレート)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルアセテート)、ならびにポリビニルピロリドンが含まれる。一般に、無定形材料または大きな無定形領域を有するものは、超臨界流体処理の間の膨張に適している。重合体性の外側粒子は、従来の乳化溶媒蒸発法、または他の同様に適当な合成法を用いて調製されうる。ある種の例示的な態様において、LEDGFペプチドは、形成中に外側粒子内に被包されてもよく、または外側粒子の形成後に表面上に負荷されてもよい。
【００４２】
さまざまな粒子構造物を産生するプロセスは、超臨界流体流の技法を用いて達成される。結果として行われる有機溶媒を使用しない負荷は、凝集または分解の影響を受けやすい、ペプチドおよびヌクレオチドに基づく薬物などの薬物に特によく適している。例えば、LEDGFペプチドは内側粒子、外側粒子もしくはそれらの両方の表面上に負荷されてもよく; 内側粒子、外側粒子もしくはそれらの両方のマトリックス中に負荷されてもよく; 外側粒子の細孔中に存在してもよく; またはそれらの組み合わせであってもよい。ある種の例示的な態様において、LEDGFペプチドは内側粒子の表面上に存在してもよい。別の例示的な態様において、LEDGFペプチドは内側粒子および外側粒子の表面上に存在してもよい。別の例示的な態様において、LEDGFペプチドは内側粒子のマトリックス中に存在してもよい。別の例示的な態様において、LEDGFペプチドは内側粒子および外側粒子の両方のマトリックス中に存在してもよい。別の例示的な態様において、治療剤はさらに、外側粒子の多孔性構造中に存在してもよい。
【００４３】
内側粒子および外側粒子を一緒に混和し、高圧下で超臨界流体に曝露する。ある種の例示的な態様において、超臨界流体は二酸化炭素である。超臨界流体に曝露すると、外側粒子は膨張して、外側表面上に多孔性構造を生じる。超臨界流体は次に、内側粒子を外側粒子内に導入して、粒子中粒子型の持続放出製剤を形成させる。1つの例示的な態様において、粒子中粒子型の持続放出製剤は、およそ1 μm〜およそ100 μmの直径を有する外側マイクロ粒子中の、およそ1 nm〜およそ900 nmの直径を有する内側ナノ粒子の取り込みを含む。別の例示的な態様において、粒子中粒子型の持続放出製剤は、およそ10 nm〜およそ999 nmの直径を有する外側ナノ粒子中の、およそ1 nm〜およそ300 nmの直径を有する内側ナノ粒子の取り込みを含む。なお別の例示的な態様において、粒子中粒子型の持続放出製剤は、およそ2 μm〜およそ500 μmの直径を有する外側マイクロ粒子中の、およそ1 μm〜およそ100 μmの直径を有する内側マイクロ粒子の取り込みを含む。適切なサイズの内側粒子および外側粒子の選択は、粒子を含む材料のタイプ、用いられる超臨界流体中での外側粒子の膨張能、および外側粒子内に取り込まれる内側粒子のサイズに依るであろう。これらはすべて、当業者が容易に選択できる要素である。一般に、内側粒子と外側粒子との間のサイズ比は、およそ1:5からおよそ1:100まで変化しうる。1つの例示的な態様において、サイズ比は、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、または1:100でありうる。
【００４４】
NPinPMPの形成は、およそ1000 psi〜およそ1400 psiでのナノ粒子およびマイクロ粒子の曝露によって達成されうる。曝露の時間は、例えば、およそ5分間からおよそ2時間まで変化しうる。温度は30℃から45℃まで変動しうる。適切な圧力および温度範囲の選択は、所与の超臨界流体の超臨界点近傍での温度および圧力の範囲によって主に決定される。したがって、当業者は、用いられる超臨界流体、所望の外側粒子の膨張のサイズまたは量、および所望の外側粒子における多孔性度に基づいて変動する、適切な時間、温度、および圧力を選択することができよう。例えば、より長い時間および/またはより高い圧力で曝露した後、圧力をクエンチすることによって、より短い曝露時間および/または圧力と比べて高い膨張および多孔性が得られる。
【００４５】
1つの例示的な態様において、内側粒子および外側粒子は、およそ1:3の比率で混合される。1つの例示的な態様において、用いられる内側粒子と外側粒子との比率は、およそ1:9である。これらの比率は、ナノ粒子の取り込みの程度および薬物の徐放に影響を与えるであろう。一般に、外側粒子に対する内側粒子の量が多くなればなるほど、外側粒子に取り込まれる内側粒子の量が多くなり、薬物の放出速度および用量を増加させる。外側粒子に対する内側粒子の量が少なくなればなるほど、バースト放出は少なくなる。
【００４６】
タンパク質凝集を介する疾患および処置の方法
本発明のLEDGF製剤は、タンパク質凝集を介する疾患を処置するために用いられうる。本発明のLEDGF組成物で処置されうるタンパク質凝集を介する疾患には、網膜変性疾患および神経変性疾患が含まれる。網膜変性疾患には、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、および糖尿病性網膜症が含まれる。神経変性疾患には、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症、およびプリオン病が含まれる。
【００４７】
1つの例示的な態様において、本発明は、網膜変性疾患を有する患者に、本発明のLEDGFペプチドを含む組成物を投与する段階を含む、網膜変性疾患を処置する方法を含む。ある種の例示的な態様において、LEDGFペプチドはSEQ OD NO:2である。1つの例示的な態様において、LEDGF組成物は経強膜的に送達される。別の例示的な態様において、LEDGF組成物は点眼薬の形態で局所的に眼に投与される。別の例示的な態様において、LEDGF組成物は持続放出製剤の状態で埋め込まれるかまたは全身投与される。1つの例示的な態様において、持続放出製剤は、LEDGF/亜鉛ナノアセンブリ製剤のような、ナノアセンブリ持続放出製剤である。別の例示的な態様において、持続放出製剤は、多孔性マイクロ粒子中のナノ粒子(NPinPMP)製剤のような、粒子中粒子型の製剤である。
【００４８】
1つの例示的な態様において、本発明は、網膜変性疾患を有する患者に、本発明のLEDGFペプチドを含む組成物を投与する段階を含む、網膜変性疾患におけるタンパク質凝集を低減する方法を含む。ある種の例示的な態様において、LEDGFペプチドはLEDGF1〜326である。1つの例示的な態様において、LEDGF組成物は経強膜的に送達される。別の例示的な態様において、LEDGF組成物は点眼薬の形態で局所的に眼に投与される。別の例示的な態様において、LEDGF組成物は持続放出製剤の状態で埋め込まれるかまたは全身投与される。1つの例示的な態様において、持続放出製剤は、LEDGF/亜鉛ナノ粒子製剤のような、本発明のナノ粒子持続放出製剤である。別の例示的な態様において、持続放出製剤は、多孔性マイクロ粒子中のナノ粒子(NPinPMP)製剤のような、粒子中粒子型の製剤である。
【００４９】
別の例示的な態様において、本発明は、神経変性疾患を有する患者に、本発明のLEDGFペプチドを含む組成物を投与する段階を含む、神経変性疾患を処置する方法を含む。ある種の例示的な態様において、LEDGFペプチドはLEDGF1〜326である。1つの例示的な態様において、LEDGF組成物は腹腔内に送達される。別の例示的な態様において、LEDGF組成物は経口投与される。別の例示的な態様において、LEDGF組成物は持続放出製剤の状態で全身投与される。1つの例示的な態様において、持続放出製剤は、LEDGF/亜鉛ナノ粒子製剤のような、本発明のナノ粒子持続放出製剤である。別の例示的な態様において、持続放出製剤は、多孔性マイクロ粒子中のナノ粒子(NPinPMP)製剤のような、粒子中粒子型の製剤である。
【００５０】
別の例示的な態様において、本発明は、神経変性疾患を有する患者に、本発明のLEDGFペプチドを含む組成物を投与する段階を含む、神経変性疾患におけるタンパク質凝集を低減する方法を含む。ある種の例示的な態様において、LEDGFペプチドはLEDGF1〜326である。1つの例示的な態様において、LEDGF組成物は腹腔内に送達される。別の例示的な態様において、LEDGF組成物は経口投与される。別の例示的な態様において、LEDGF組成物は持続放出製剤の状態で投与される。1つの例示的な態様において、持続放出製剤は、LEDGF/亜鉛ナノ粒子製剤のような、本発明のナノ粒子持続放出製剤である。別の例示的な態様において、持続放出製剤は、多孔性マイクロ粒子中のナノ粒子(NPinPMP)製剤のような、粒子中粒子型の製剤である。
【００５１】
組成物および方法を、以下の非限定的な例によってさらに例示するが、これらは、それらの範囲に制限を課すものと決して解釈されるべきではない。それどころか、本明細書における記述を読んだ後の当業者が本発明の趣旨から逸脱することなく想起しうるそれらの他のさまざまな態様、改変物、および等価物を用いてもよいことが、明白に理解されるべきである。
【実施例】
【００５２】
実施例1
1. 材料
プラスミドpEGFP-LEDGFは、Toshimichi Shinohara博士(University of Nebraska Medical Center, Omaha, NE)から贈呈された。フォワードおよびリバースプライマーは、Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)から得られた。DNAポリメラーゼI、T4 DNAリガーゼ、および制限酵素はNew England Biolab Inc. (Ipswich, MA)から得られた。QIAquickゲル抽出キット、QIAprepスピンミニプレップキット、およびQIAGENプラスミドミニキットは、Qiagen (Valencia, CA)から得られた。XK 16/20カラム、S-200ゲルろ過カラム、SPセファロースビーズは、GE Lifesciences Healthcare (Piscataway, NJ)から得られた。ARPE-19細胞はATCC (Manassas, VA)から得られた。DMEM/F12細胞培養培地、ウシ胎仔血清、Lipofectamine 2000、LB培地、および超高純度アガロースは、Invitrogen (Carsbad, CA)から得られた。他の全ての材料は、特別の定めがなければ、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から得られた。
【００５３】
LEDGF1〜326 DNA構築体の調製
LEDGF1〜326タンパク質をコードする遺伝子を、pET-28a(+)ベクター(Novagen, Madison, WI)にクローニングした。手短に言えば、Ledgf1〜326遺伝子を、HindＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位からなるフォワードプライマー
0006632376.tif 000002
およびBamHI制限エンドヌクレアーゼ部位からなるリバースプライマー
0006632376.tif 000003
を用いてpEGFP-LEDGFプラスミドからPCR (ポリメラーゼ連鎖反応)増幅させた。PCR増幅はDNAポリメラーゼIを用いて、5分間94℃での変性、引き続いて36サイクルの、30秒間94℃での変性、45秒間50℃でのアニーリングおよび2分間72℃での伸長、ならびに5分間72℃での伸長の最終段階にて行った。増幅されたLedgf1〜326遺伝子を、製造元のプロトコルにしたがってQIAquickゲル抽出キットを用いて精製した。その後、精製されたLedgf1〜326遺伝子挿入断片およびpET-28a(+)ベクターを、それぞれHindＩＩＩおよびBamHI制限酵素を用いて5'および3'末端の位置で連続的に消化した。それらを次に、製造元のプロトコルにしたがってQIAprepスピンミニプレップキットを用いて精製した。挿入断片およびベクターの付着末端を、T4 DNAリガーゼを用いて4℃で終夜、ライゲーションさせた。製造元のプロトコルにしたがい熱ショック手順を用いて、コンピテントな大腸菌(Escherichia coli) DH5α細胞を、ライゲーション産物で形質転換した。10個のコロニーを選択し、QIAGENプラスミドミニキットを用いてプラスミドを増幅し、抽出し、かつ精製した。pET-28a(+)ベクターにおけるLedgf1〜326の挿入は、3通りの異なる方法により、第1にPCRスクリーニングにより、第2に制限消化により、および最後にDNA配列決定により確認された。組み換えDNAの純度およびサイズは、2%アガロースゲルを用いて分析された。DNA定量化は、NanoDrop 1000 (Thermo scientific, Wilmington, DE)を用いて行った。陽性PCRシグナルおよび正しい配列決定の結果を示すコロニーをさらに培養し、全て将来使うために、その細菌グリセロールストックを作製し、-80℃で貯蔵した。
【００５４】
バイオインフォマティク分析
LEDGF1〜326アミノ酸配列をExPASy bioinformatics resource portalに供し、LEDGF1〜326の分子量、理論的pI、アミノ酸組成、原子組成、吸光係数、推定半減期をコンピュータで計算した。
【００５５】
LEDGF1〜326の発現および精製
タンパク質生合成のため、製造元のプロトコルにしたがってQIAGENプラスミドミニキットを用い大腸菌DH5αコロニーからpLEDGF1〜326プラスミドを増幅かつ精製した。次にこのプラスミドで、製造元のプロトコルにしたがって大腸菌BL21 (DE3)菌株を形質転換した。その後、プラスミドを含有する細菌の単一のコロニーを、50 μg/mlのカナマイシンを含有するLB (Luriaブロス)培地に終夜接種した。終夜増殖された培養物の1%接種材料を、50 μg/mlのカナマイシンを含有するLB培地1リットルに加えた。培養培地について0.6〜0.8の光学密度(O.D.)に達するまで、培養物を37℃で増殖させた。200 μMの終濃度までIPTG (イソプロピル-β-D-チオ-ガラクトシド)を加えることによってタンパク質の発現を誘導した。その後、細胞を37℃で3時間さらにインキュベーションし、4℃で15分間3000 gでの遠心分離によって収集した。収集された細胞を緩衝液A (25 mM Tris-HCl pH 7.0、1 mM EDTA、1 mM PMSF、および5%スクロース)に再懸濁した。細胞を、出力70%(36ワット)の5秒間のパルス超音波処理(Mesonix, Sonicator 3000, Farmingdale, NY)および続く15秒間の冷却に、計30分間供した。溶解された細胞を4℃で20分間13000 gで遠心分離して、溶解物の可溶性画分および不溶性画分を分離した。可溶性(上清)および不溶性(ペレット)画分を、産生されたタンパク質の可溶性/不溶性の判定およびタンパク質含量のためにSDS-PAGEにて分析した。
【００５６】
FPLC:
SDS-PAGEによって判定されたとおり、LEDGF1〜326はもっぱら可溶性画分中に発現していた。LEDGF1〜326は、最初に電荷(陽イオン交換)に基づき、その後サイズ(ゲルろ過)に基づく、2段階の高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)技法を用いて精製された。手短に言えば、陽イオン交換SPセファロースビーズをXK 16/20カラムに充填し、2 ml/分の流速で緩衝液Aを用いて平衡化した。その後、可溶性画分を1 ml/分の流速でカラムに投入した。カラムを次に、2 ml/分の流速で5カラム容量の緩衝液Aにより洗浄した。非特異的にかつ緩く結合した不純物の大部分は、急勾配の塩化ナトリウム(0〜28%の伝導率)を用いて溶出された。カラムに結合した不純物のかなりの割合が除去された後、40分で伝導率28〜40%のNaClの第2の勾配を用いてLEDGF1〜326のさらなる溶出が達成された。内蔵UV検出器を用い280 nmで吸光度を測定することによって、タンパク質溶出プロファイルをモニターした。2.5 mlの画分を、溶出プロセスの間に集め、SDS-PAGEにて分析し、純度を決定した。高いタンパク質量を含有する画分をともにプールした。プールした画分を、透析緩衝液(25 mM Tris pH 7.0、および0.1%スクロース)を用いて透析し、その後、48時間凍結乾燥した。凍結乾燥したタンパク質を蒸留水2 ml中に可溶化した。次段階の精製のため、1 ml/分の流速で平衡化緩衝液B (25 mM Tris-HCl pH 7.0、および100 mM NaCl)を用いて、予め充填されたS-200ゲルろ過カラムを平衡化した。陽イオン交換からのLEDGF1〜326濃縮溶液を次に、S-200カラムに投入した。1 ml/分の流速で緩衝液Bを用いて、LEDGF1〜326を溶出させた。約100分の位置に鋭いピークが得られ、1 mlの画分を回収した。回収した画分を、SDS-PAGEを用いて分析した。純粋なLEDGF1〜326を含有する画分をともにプールした。精製されたLEDGF1〜326を次に、4℃で48時間、3回緩衝液を交換しながら、透析緩衝液(25 mM Tris-HCl pH 7.0、および0.1%スクロース)中で徹底的に透析して、過剰の塩および他の不純物を除去した。透析したLEDGF1〜326を凍結し、-80℃で48時間、凍結乾燥した。凍結乾燥したLEDGF1〜326を全て将来のために分注し、-80℃で貯蔵した。
【００５７】
UV分光法:
凍結乾燥したLEDGF1〜326 12 mgを正確に秤量し、その後、蒸留水1 mlに溶解した。Spectramax M5 (Molecular Devices, Downingtown, PA)を用い200 nm〜400 nmでUV吸光度スペクトルを記録した。280 nmで1未満の吸光度が得られるまで、蒸留水を用いてサンプルを連続的に希釈した。この吸光度を用い、モル吸光係数に基づいてサンプル中に存在する精製タンパク質の量を計算した。
【００５８】
物理的特徴決定
LEDGF1〜326タンパク質の分子量および純度を、SDS-PAGE、SEC-HPLC、およびMALDI-TOFによって決定した。
【００５９】
SDS-PAGE:
手短に言えば、LEDGF1〜326 5 μgをSDS-PAGEサンプル緩衝液(β-メルカプトエタノールを含有する)中で10分間煮沸した。タンパク質サンプルを4〜15%のSDS-PAGEゲル(Bio-Rad, Hercules, CA)に投入し、30 mAで90分間電気泳動した。ゲルを次に、クマシーブリリアントブルーで染色し、GelDoc(商標) XR (Biorad, Hercules, CA)を用いて白色光の下で可視化した。非還元性SDS-PAGEの場合、LEDGF1〜326を非還元性サンプル緩衝液(β-メルカプトエタノールなし)中で希釈し、煮沸を回避した。
【００６０】
SEC-HPLC:
凍結乾燥したタンパク質を500 μg/mlの終濃度まで蒸留水に溶解し、0.22 um (PVDF)のフィルタを通してろ過した。1 ml/分の流速で25℃にて1 mM CaCl2, pH 7.0を含有する25 mM Tris緩衝液を用いてAgilent Bio SEC-3カラムを使い、タンパク質を評価した。カラムを分子量標準(Invitrogen)で較正した。UV吸光度を214 nmで測定した。
【００６１】
MALDI-TOF:
4800 Plus MALDI TOF/TOF(商標) (AB Sciex, Framingham, MA)により分子量を決定することによってタンパク質の均質性および同一性を確認した。タンパク質サンプルを標準的なMALDIマトリックスシナピン酸の溶液に溶解し、金属標的プレート上にスポットし、乾燥した。5900強度の1000レーザーショットから全イオン電流(TIC)としてデータを集めた。
【００６２】
DLS:
zetasizer Nano ZS (Malvern, Westborough, MA)を用いてLEDGF1〜326タンパク質の均質性およびサイズを分析した。手短に言えば、凍結乾燥されたタンパク質サンプルを蒸留水に溶解して、2.5 mg/mlの最終のタンパク質濃度を得た。動的光散乱技法を用いて、173°の後方散乱角度でのデータ収集により、数、強度および容量の平均値という観点でサイズ測定した。測定値は13回のスキャンの平均であった。
【００６３】
生物物理学的特徴決定
生物物理学的特徴決定のため、タンパク質を25 mMリン酸緩衝液pH 7.0中で徹底的に透析して、Tris-HClおよびスクロースを除去し、0.22 μmのPVDFシリンジフィルタを通してろ過した。得られたスペクトルを、Origin(登録商標) 8.5 (OriginLab Corp., Northampton, MA)またはSigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc, Chicago, IL)のどちらかを用いて分析した。下記のようにScholtzらによって定義された方程式1および2を用いデータを適合させて、ΔG、m値、および[尿素]1/2を決定した[62]。
0006632376.tif 000004
ここでyF°およびyU°は切片であり、ここでy°Fおよびy°Uは切片であり、mFおよびmUはプレ移行期およびポスト移行期ベースラインの傾きであり、ならびにm値は移行期の傾きである。ΔGは任意の特定の尿素濃度での自由エネルギー変化であり、これは尿素濃度に対して直線的に変化し、ΔG(H2O)を推定するために用いられる。ΔG(H2O)は25℃で尿素の非存在下でのタンパク質の立体構造安定性と定義される。Rは一般気体定数であり、Tはサンプルの温度である。[尿素]1/2は、LEDGF1〜326が50%折り畳まれており、かつ50%折り畳まれていない、尿素の濃度である。
【００６４】
CD:
LEDGF1〜326の二次構造を決定するためおよびその立体構造安定性パラメータを決定するため、透析したタンパク質の遠紫外CDスペクトルを記録した。手短に言えば、500 μg/mlのタンパク質サンプルを1 mmの石英キュベットに入れ、Chirascan(登録商標) CD機器(Applied Photophysics Ltd, UK)を用いて0.5秒/時点のスキャン速度、1 nmの刻み幅および200から280 nmまで4 nmのバンド幅でスペクトルを記録した。全てのスキャンは三つ組で行った。このようにして得られた天然LEDGF1〜326のスペクトルを、CDNN 2.1 CDスペクトルデコンビュレーションソフトウェア(Gerald Bohm博士, Martin-Luther-University at Halle, Wittenberg, Germany, UK)によりデコンビュレートして、天然LEDGF1〜326タンパク質に存在するさまざまな二次構造の割合を得た。LEDGF1〜326の立体構造安定性のため、さまざまな尿素濃度で化学変性を行った。手短に言えば、300 μg/mlのタンパク質を24時間、25 mMリン酸緩衝液pH 7.0中0〜6 Mの尿素とともにインキュベーションした。CDシグナルを上記のように記録した。LEDGF1〜326の立体構造安定性パラメータを、尿素濃度に応じて230 nmでのCDシグナルをプロットすることにより決定し、この波長での折り畳まれたタンパク質のスペクトルと折り畳まれていないタンパク質のスペクトルとの間の最大CDシグナルの差異を得た。同様に、LEDGF1〜326の熱的安定性を調べるため、500 μg/mlのLEDGF1〜326を1℃/分のランプ速度でスムーズランプモードにて25℃から90℃までの熱変性に供した。222 nmでのCDシグナルを用いて、融点(Tm)を決定した。
【００６５】
蛍光分光法:
定常状態蛍光分光法を行って、三次構造の擾乱を判定した。タンパク質サンプル(終濃度300 μg/ml)を24時間、25 mMリン酸緩衝液pH 7.0中さまざまな濃度の尿素溶液(0〜6 M)とともにインキュベーションした。内因性トリプトファンの蛍光スペクトルを、Spectramax M5 (Molecular Devices, Downingtown, PA)を用いて増分1 nmで、励起波長280 nmで、300から400 nmまで記録した。尿素濃度に応じて340/356 nmでの蛍光強度比をプロットすることにより、LEDGF1〜326の立体構造安定性パラメータを決定した。緩衝液の影響および内側フィルタの影響について全ての強度値を補正した。
【００６６】
細胞生存性アッセイ法
ARPE-19細胞を用いて、凝集を介するストレスの存在下でLEDGF1〜326の細胞生存機能を決定した。手短に言えば、ARPE-19細胞を先に記述(Baid et al.,. PLoS One. 6(9): p. e24616)のように維持した。細胞生存性アッセイ法のため、細胞10,000個を96ウェルプレートにプレーティングし、24時間インキュベーションした。24時間後、血清を含有する培地を吸引除去した。試験群(pP23H-Rho+ LEDGF1〜326)に、製造元のプロトコルにしたがって無血清培地中1:3の比率のリポフェクタミン2000を用いてpP23H-Rhoプラスミド(1 μg/ml)を一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの6時間後に、培地を吸引除去し、細胞を48時間、0.001 μg/ml〜50 μg/mlの濃度範囲で漸増量のLEDGF1〜326により処理した。細胞なし(培地だけ)、リポフェクタミン2000を有しない細胞およびリポフェクタミン2000を有する細胞も対照として維持した。48時間後、培地を吸引除去し、新鮮な無血清培地200 μlを加えた。MTT試薬(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル四ナトリウムブロミド、PBS pH 7.4中で5 mg/ml) 20 μlを各ウェルに加え、さらなるインキュベーションを37℃で3時間行った。MTTを含有する培地を吸引除去し、形成されたホルマザン結晶をDMSO 200 μlに溶解した。発色の吸光度を、Spectramax M5を用いて570 nmで測定した。群の生存性の割合を、リポフェクタミン2000を有しない細胞を含有する対照群に対して計算した。全ての群をn=4として繰り返した。
【００６７】
動物維持
RCSラットコロニーは、コロラド大学アンシュッツ医学部キャンパスの動物施設内でおよびIUCACの承認を得て維持した。実験は、視覚および眼科研究における動物の使用についてのARVO宣言にしたがって行われた。
【００６８】
網膜電図検査
4週齢の時点で、ラットを30分間暗順応させた。その後、動物を暗赤色灯の下でERGのために準備した。手短に言えば、ラットを80 mg/kgのケタミンおよび12 mg/kgのキシラジンの混合物の腹腔内注射で麻酔した。瞳孔をその後、一滴の0.5%トロピカミド(Akorn, Lake Forest, IL)で開き、一滴の2.5%ヒプロメロース(Akorn, Lake Forest, IL)を用いて潤わせ続けた。その後、37℃で安定化された温水ジャケット上に動物を置いた。動物の尾および頬の中に参照電極(LKC Technologies Inc., Gaithersburg, MD)を挿入した。DTL plus電極(LKC Technologies Inc., Gaithersburg, MD)を、各眼の角膜を横切るようにして置いた。各動物を、各フラッシュ間の間隔を10秒とした0.4 log cd-s/m2の短時間のフラッシュに曝露し、暗順応ERGを記録した。その後、動物を30 cd/m2の背景光で3分間明順応させた。明順応ERGを同じ強度のフラッシュで、ただし背景光をつけて記録した。少なくとも3回のERGを平均化して、ラットごとに単一のERGを得た。その後、滅菌ろ過した、0.25、0.5、または2.5 mg/mlのLEDGF1〜326 2 μlを片側の眼の硝子体内に与え、媒体を反対側の眼に与えた。ERGを硝子体内注射後8週間、すなわちラットの12週齢まで2週間ごとに記録した。
【００６９】
統計分析
データは、平均±SDとして表されている。2つのまたは複数の実験群間の比較のため、独立したサンプルのスチューデントのt-検定または一元配置ANOVAに続いてチューキー(Tukey)のポストホック分析(SPSS, ver.11.5; SPSS, Chicago, IL)をそれぞれ行った。差異はp ≦ 0.05で統計的に有意とみなした。
【００７０】
2. 結果
pET28a(+)にクローニングされたLEDGF1〜326
pEGFP-LEDGFプラスミドからのLedgf1〜326遺伝子(図3、レーン1)のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅より、約1000塩基対のDNA断片を得た。未消化のpET-28a(+)ベクター(レーン2)は、約4.5 kbの位置に陽性バンドを示し、これはBamHIを用いて消化された場合に、直線化され、5〜6 kbのDNAマーカーの間に上方移行した(レーン3)。Ledgf1〜326遺伝子をpET-28a(+)ベクターにライゲーションした場合(このようにして得られたプラスミドは、このことからpLEDGF1〜326と表せる)、およそ1000 bpに相当する上向きのバンドシフトが認められ、pET28a(+)ベクターにおけるLedgf1〜326遺伝子の挿入の成功(レーン4)が示唆された。ライゲーションを確認するため、pLEDGF1〜326をBamHI (レーン5)またはHindＩＩＩ (レーン6)のいずれかで個々に消化した。pLEDGF1〜326は両制限酵素での消化反応により直線化され、DNAバンドが約6.4 kbの位置に見られ、これはpET28a(+)ベクターよりも1000 bp多かった。BamHIおよびHindＩＩＩを用いたpLEDGF1〜326の二重消化により、およそ5.4 kbの大きい方の断片(上方のバンド、レーン8)およびおよそ1000 bpの小さい方の断片(下方のバンド、レーン7)の2つの断片が生じた。pLEDGF1〜326からのLedgf1〜326遺伝子のPCR増幅によって、約1000塩基の陽性のDNAバンドが生じ(レーン8)、LEDGF1〜326がpET-28a(+)ベクターに成功裏に挿入されたことが示唆された。
【００７１】
LEDGF1〜326のバイオインフォマティク分析
SIB ExPASy (Gasteiger et al., Nucleic Acids Res, 2003. 31(13): p. 3784-8)を用いたLEDGF1〜326配列のバイオインフォマティク分析から、その理論的分子量36.9 kDaが示された。LEDGF1〜326の等電点計算値(pI)は9.23であり、正電荷を持つ(アルギニンおよびリジン)アミノ酸残基が73個、負電荷を持つ(アスパラギン酸およびグルタミン酸)アミノ酸残基が63個であった。理論的なモル吸光係数は、水中280 nmで15470 M-1 cm-1であった。そのN末端アミノ酸メチオニンに基づき、哺乳類細胞におけるその半減期は、30時間であると予測された。
【００７２】
バルク量で精製されたLEDGF1〜326
BL21(D3B)細胞において特定条件の下でLEDGF1〜326を発現させた場合に、約40 kDaの位置に、新しい強力な陽性バンドが現れ、LEDGF1〜326タンパク質の発現が示唆された(図4A、レーン3)。このバンドは細菌細胞の溶解後には上清画分中に現れ、これにより、細菌培養においてLEDGF1〜326が可溶性タンパク質として発現されたことが示唆された(レーン4)。高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)システムを用いて未精製の細胞溶解物からLEDGF1〜326が精製された。精製の第1段階において、陽イオン交換カラムを用いた(図4B)。未結合のタンパク質および脂質を含む他の細胞不純物は、カラム洗浄期の間に溶出された(100〜280 ml)。その後、塩化ナトリウム(NaCl)急勾配を用いて移動相の伝導率を0から28%まで増加させた場合に、カラムに緩く結合された他の細胞タンパク質が溶出された(280〜400 ml)。NaClの勾配を40%の伝導率に達するように40分にわたってゆっくりとさらに増大させると、LEDGF1〜326が溶出された(400〜450 ml)。SDS-PAGEを用いて回収された画分を分析した場合に、他のさらに低分子量のバンドとともにおよそ40 kDaの位置にLEDGF1〜326の強いバンドが認められた(図4A、レーン5)。ゲルろ過カラムを用いたさらなる精製により、LEDGF1〜326は最初のピーク(回収された画分)として溶出され、その後にさらに低分子量の他のタンパク質のピークが続いた(図4C)。ゲルろ過カラムからプールされた画分により、SDS-PAGEにおいて非常にかすかな低分子量のバンドとともにおよそ40 kDaの強力な陽性バンドが示され、LEDGF1〜326のほぼ完全な精製が示唆された(図4A、レーン6)。タンパク質評価から、振盪フラスコ培養1リットルあたりタンパク質約20 mgが得られたことが示唆された。
【００７３】
LEDGF1〜326はほぼ均質にまで精製される
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)によってLEDGF1〜326タンパク質の純度を決定した(図5A)。2本のピークが認められ、第1のピークは10.5分の保持時間を有し、第2のピークは約11.5分の保持時間を有していた。曲線下面積を積分した場合、第1のピークはわずか5%であって、第2のピークは95%であり、LEDGF1〜326タンパク質が約95%の純度であることが示唆された。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI-TOF)によりLEDGF1〜326の分子量が確認された。MALDI-TOFスペクトルにおいて得られた主なピークは、40314.32および80663.19 m/z (質量対電荷)比の位置にあった(図5B)。MALDI-TOFから、LEDGF1〜326が40 kDaの分子量を有することが示唆され、これは理論的分子量に等しかった。80663 m/zの位置に第2のピークも認められ、これより、LEDGF1〜326が二量体として存在しうることが示唆された。二量体の存在について調べるため、LEDGF1〜326のSDS-PAGEを還元条件および非還元条件の下で行った(図5D)。非還元条件の下で、95〜105 kDaのサイズへのLEDGF1〜326のバンドの上方シフトが認められ、LEDGF1〜326が二量体型として存在しうることが示唆された。還元/変性条件の下で、二量体は単量体に解離した。
【００７４】
LEDGF1〜326が自己会合して任意のさらに高分子量のオリゴマーを形成するかどうかさらに調べるため、動的光散乱(DLS)を行った(図5C)。粒子の強度または数または容量のサイズ分布に関して単一のピーク(100%の分布)を有する相同な集団を得た。全3本のピークは狭いサイズ分布のなかにあり、非常に近いサイズ範囲が示唆された。より高サイズの他のピークは認められず、いずれの種類のオリゴマーも存在しないことが示唆された。11.32 nmのz-平均直径、および0.15の多分散指数がDLSから得られた。
【００７５】
LEDGF1〜326はランダムコイル化される
LEDGF1〜326の二次構造について調べるため、天然LEDGF1〜326の遠紫外円偏光二色性(CD)スペクトルを分析した(図6A)。CDシグナルは280から200 nmまで負のままであった。220 nmの後、CDシグナルの急減が認められた。222 nmおよび208 nmに特徴的な負のバンドは認められず、200 nmの近傍に特徴的ないずれの正のバンドも認められず、LEDGF1〜326が主にα-ヘリックスまたはβ-シートを保有しないことが示唆された。実際に、210 nm超での非常に低い楕円率および200 nm未満での負のバンドから、LEDGF1〜326が主にランダムコイルから構成されうることが示唆された。
【００７６】
LEDGF1〜326の二次構造をさらに詳細に分析するため、CDNN 2.1ソフトウェアを用いてCDスペクトルをデコンビュレートした。得られるスペクトルが構成成分の二次構造要素の個々のスペクトルと芳香族発色団および補欠分子族によるノイズとの線形結合であるとすれば、LEDGF1〜326は45.1%がランダムコイルであると予測された。β-ターンは約21.2%であって、15%の平行β-シートおよび16%の逆平行β-シートが存在していた。α-ヘリックスからの寄与は、約16%だけであった。
【００７７】
I-Tasser (Iterative Threading Assembly Refinement)タンパク質モデリングサーバーを用いて、LEDGF1〜326天然タンパク質の三次元構造を予測した(図6B)。LEDGF1〜326予測モデルは-3.18の信頼スコア(C-スコア)、0.36±0.12の鋳型モデリング(TM-スコア)を有し、平均平方根偏差(RMSD)は14.1±8 Åに等しかったことから、予測モデルは信頼できることが示唆された。予測モデルによれば、LEDGF1〜326は主にランダムコイルタンパク質であった。
【００７８】
LEDGF1〜326は立体構造的に安定である
水中でのLEDGF1〜326の立体構造安定性を理解するために、LEDGF1〜326に存在するトリプトファン分子の内因性蛍光を測定することによって、化学変性による三次構造の擾乱を判定した(図7Aおよび7B)。尿素の非存在下での、天然LEDGF1〜326タンパク質の発光スペクトルは、340 nmでλ最大を有し、Δλ1/2 (Δλの半値幅) は56 nmであった(図7A)。尿素の濃度が0から5 Mまで増すにつれて、蛍光シグナルの消光および赤方シフト(右方向への蛍光最大値のシフト)が認められた。0.9 Mの尿素濃度に達するまでシグナルはゆっくり低下した。その後、2.3 Mの尿素濃度に達するまで蛍光シグナルの激減が認められた。この濃度を超えると、蛍光シグナルの低下は最小限であった。5 M尿素でLEDGF1〜326のλ最大は356 nmまでシフトし、Δλ1/2は71 nmであった。340対356 nmでのLEDGF1〜326蛍光シグナルの比率を尿素濃度に応じてプロットした場合、S字形曲線が得られた(図7B)。0〜1 M尿素までに蛍光シグナルの緩やかな衰退(プレ移行期)、次いで1〜3 M尿素までに急な減衰(移行期)、引き続いて3〜5 Mまでに緩やかな衰退期(ポスト移行期)が認められた。(方法に記述されている)方程式1および2を用いて、LEDGF1〜326のΔG(H2O)は3.24±0.48 kcal mol-1であるものと推定され、m値は1.70±0.22 kcal mol-1M-1であるものと推定され、[尿素]1/2は1.81±0.02 Mであるものと推定され、LEDGF1〜326が安定なタンパク質であることが示唆された。
【００７９】
遠紫外CD分光法を行って、尿素の存在下でのLEDGF1〜326の二次構造の擾乱について調べた(図7Cおよび7D)。各尿素濃度で波長に対するLEDGF1〜326のCDシグナルをトレースした(図7C)。尿素の濃度が増すにつれて、CDシグナルは持続的にさらに負になった。230 nmでのCDシグナルを尿素濃度に応じてプロットした場合(図7D)、S字形曲線が得られた。方程式1および2においてデータを適合させることで、LEDGF1〜326のΔG(H2O)は3.28±0.40 kcal mol-1であること、1.90±0.19 kcal mol-1M-1のm値、および[尿素]1/2は1.61±0.02 Mのものであることが示唆された。
【００８０】
LEDGF1〜326は熱的に安定である
遠紫外CD分光法を用いてLEDGF1〜326の熱的安定性を判定した(図7Eおよび7F)。変性剤としての熱の存在下でCDシグナルを215〜250 nmまで測定した(図7E)。LEDGF1〜326溶液の温度が増すにつれて、約235 nmで得られる負の傾斜は増すように思われた。CDシグナルは化学変性と同じパターン、つまりおよそ30〜35℃のプレ移行期、その後におよそ35〜55℃の移行期、その後におよそ55〜70℃のポスト移行期をたどった(図7F)。全体的適合分析を用いてこのデータを適合させた場合、得られたLEDGF1〜326のTm (融解温度)は44.82±0.17℃であり、LEDGF1〜326が25℃ (室温)で安定である可能性のあることが示唆された。
【００８１】
LEDGF1〜326は凝集を介するストレスからARPE-19細胞をレスキューする
タンパク質凝集を介するストレスからARPE-19細胞をレスキューするLEDGF1〜326の活性を細胞生存性アッセイ法によって測定した(図8)。最初に、ストレスが全く無いARPE-19細胞の生存性を増加させるLEDGF1〜326の能力について調べた(図8A)。処理から48時間後に未処理細胞および0.001〜50 μg/mlのLEDGF1〜326処理細胞での細胞生存性の有意差は認められなかった。より高用量のLEDGF1〜326 (50 μg/ml)で、細胞生存性は未処理細胞の100±13.19% (最も左側の棒線)と比べて108.14±5.63% (最も右側の棒線)であって、これは有意ではなかった。pP23H-RhoトランスフェクションARPE-19細胞において、LEDGF1〜326は異なる挙動をとった(図8B)。P23H変異体ロドプシンを発現する細胞は、48.25±5.62%への細胞生存性の低下を示した(棒線2)。細胞生存性のこの喪失は、細胞内での、凝集しやすいP23H変異体ロドプシンタンパク質の発現および蓄積の毒性作用に起因しうる。P23H変異体ロドプシンを発現する細胞(棒線3〜9)を、漸増量のLEDGF1〜326で処理した場合、細胞生存性の増大が認められた。LEDGF1〜326は0.001 μg/mlほどの低い濃度でARPE-19細胞の細胞生存性を48.25±5.62から77.02±10.20%まで増大させた。この点を超えると、細胞生存性は未処理pP23H-Rhoトランスフェクション群よりも有意に高いままであった(棒線2)。
【００８２】
LEDGF1〜326は光受容体の機能喪失を遅延させる
光受容体の視覚機能の喪失を遅延させるLEDGF1〜326の効力を、網膜電図(ERG)をモニタリングすることによりRCSラットにおいて調べた。暗所順応(暗順応) ERGにおいて、未処置および処置ラットのB波振幅は、硝子体内注射を施す前に、4週齢の時点(基準ERG)で180.17±27.42から216.60±35.30 μVに及んだ(図9A)。硝子体内注射後2週の時点で、全群においてB波振幅の急減が認められ、その値は65.80±15.44から91.13±13.94 μVに及んだ。未処置群およびLEDGF1〜326処置群の有意差は認められなかった。しかしながら、2週を超えると、全群においてB波振幅の持続的な減少が認められ、減少はLEDGF1〜326処置群においていっそう緩やかであった。硝子体内注射後8週の時点で、未処置群、LEDGF1〜326 0.5、1.0、および5 μg処置群のB波振幅は、それぞれ、9.40±4.57、32.43±10.34、37.93±0.60、および57.63±8.81 μVであった。LEDGF1〜326処置群のB波振幅は、未処置群よりも有意に(p<0.05)高かった。LEDGF1〜326処置群の場合にB波振幅減少の用量依存的な遅延が認められた。漸増用量のLEDGF1〜326により、B波振幅の喪失が低減された。
【００８３】
明所順応(明順応) ERGにおいて、4週時、硝子体内注射前の基準B波振幅は、69.83±16.49〜80.97±8.60 μVの範囲内であって、未処置群とLEDGF1〜326処置群との間に有意差はなかった(図9B)。未処置群のB波振幅は、80.97±8.60から10.90±5.64 μVまで減少したが、LEDGF1〜326 0.5、1.0、および5.0 μg処置群の場合、減少はそれぞれ、79.63±20.30から41.33±9.20 μVまで、69.83±16.49から28.00±7.23 μVまで、および68.75±15.93から45.78±15.18 μVまでであった。LEDGF1〜326処置群のB波振幅は、暗順応ERGと同様にLEDGF1〜326の単回硝子体内注射から8週後に未処置群よりも有意に(p<0.05)高かった。
【００８４】
実施例2
1. 材料および方法
材料- イソプロピル-β-D-チオ-ガラクトシド(IPTG)クエン酸、リン酸水素ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、Tween 20、スクロース、アジ化ナトリウムはSigma-Aldrich()から購入した。AKTA FLPCをタンパク質精製に用いた。全てのクロマトグラムはUNICORNソフトウェアを用いて分析した。全ての化学物質は、特別の定めがなければ、Sigma Aldrichから入手し、試薬等級またはそれよりも高い等級のものであった。
【００８５】
Hisタグ除去- LEDGF1〜326遺伝子を、それぞれNcoIおよびHindIII部位を含む
0006632376.tif 000005
プライマーを用いてpLEDGF1〜326から増幅させた。LEDGF1〜326遺伝子をその後、NcoIおよびHindIII酵素で消化した後にpET-28a(+)にライゲーションした。使用者マニュアルにしたがって、ライゲーション産物で、コンピテントな大腸菌DH5α細胞を形質転換した。遺伝子の挿入はPCR法、制限消化法および配列決定法によって確認された。
【００８６】
LEDGF1〜326生合成および精製:
LEDGF1〜326(Hisタグなし)を既述(Ref-JBC)のように生合成し、精製した。手短に言えば、LEDGF1〜326を、1 mM IPTGを用い大腸菌BL21 (DE3)において発現させた。LEDGF1〜326は、最初に電荷(陽イオン交換)に基づき、その後にサイズ(ゲルろ過)に基づく2段階の高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)技法を用いて、細胞溶解物から精製された。精製されたLEDGF1〜326をクエン酸-リン酸緩衝液pH 7.0中で徹底的に透析し、濃縮し、さらに使用するまで-80℃で貯蔵した。
【００８７】
製剤調製:
クエン酸-リン酸緩衝液中のLEDGF1〜326 (1または0.5 mg/ml)製剤を、6から7.5に及ぶpHで作製した。添加物のTween 20、EDTA、およびスクロースを、それぞれ、0.1% (w/v)、1 mM、10% (w/v)の終濃度まで加えた。0.02%アジ化ナトリウムを含有する製剤を、微生物増殖によって起こりうる任意の分解について試験した。調製したら全ての製剤を温度制御インキュベータ中25℃で貯蔵し、いかなる蒸発も回避するために十分な対策を取った。
【００８８】
蛍光分光法:
定常状態蛍光分光法を行って、三次構造の変化を判定した。製剤の内因性トリプトファン(Trp)の蛍光スペクトルを、Spectramax M5 (Molecular Devices, Downingtown, PA)を用いて増分1 nmごとで、励起280 nmで、300から400 nmまで記録した。蛍光の変化を測定するために、342 nmでの蛍光強度を各pHおよび各時点についてプロットした。全ての蛍光値について緩衝液および内側フィルタの影響を補正した。
【００８９】
円偏光二色性(CD):
LEDGF1〜326の二次構造変化を遠紫外CDスペクトルによって判定した。手短に言えば、製剤を1 mmの石英キュベットに入れ、Chirascan(登録商標) CD機器(Applied Photophysics Ltd, UK)を用いて0.5秒/時点のスキャン速度、1 nmの刻み幅および200から280 nmまで4 nmのバンド幅で、スペクトルを記録した。
【００９０】
動的光散乱(DLS):
Nano ZS (Malvern, Westborough, MA)を用いてLEDGF1〜326タンパク質のサイズをモニターした。手短に言えば、製剤100 μlを低容量ガラスキュベットの中に入れた。動的光散乱を用いて、LEDGF1〜326粒子散乱データを173°の後方散乱角度で集めた。各測定ごとに平均13回のスキャンを記録した。
【００９１】
ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE):
LEDGF1〜326製剤サンプル(10 μg)を2×ローディング緩衝液10 μlとともに75℃で10分間煮沸した。サンプルを4〜15%のミニPROTEAN TGXゲルに投入し、タンパク質をサイズ分離した。使用者プロトコルにしたがいCoomassie Blue染色を用いてタンパク質を可視化した。
【００９２】
タンパク質評価:
タンパク質評価のため、LEDGF1〜326製剤を5分間10000 gでスピンダウンし、上清を集めた。使用者マニュアルにしたがいBCAアッセイ法のキットを用いて、上清のタンパク質評価を行った。不溶性凝集体の評価のため、各時点で測定された可溶性タンパク質を、対応する製剤の0日目のタンパク質レベルから差し引いた。
【００９３】
ELISA:
製剤中の免疫反応性LEDGF1〜326の割合を決定するために、間接的ELISA法を開発した。手短に言えば、96ウェルプレート中に、標準的なLEDGF1〜326 (新たに精製された)または製剤サンプルのいずれか100 μlを三つ組で4℃にて終夜コーティングした。各段階の後に洗浄用緩衝液(PBS pH 7.0中0.1% w/vのTween 20)で3回ウェルを洗浄した。非特異的な結合部位を4時間、ブロッキング溶液(PBS pH 7.0中0.5%のウシ血清アルブミン、および0.1%のTween 20)でブロッキングした。LEDGF1〜326をマウス抗LEDGF抗体(BD Biosciences, San Diego, CA)によって検出し、マウス抗LEDGF抗体はHRP結合抗マウス二次抗体(source)で交差検出した。プレートの洗浄後、最後に3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を加えた。青色の発色による650 nmでの比色吸光度により免疫反応性LEDGF1〜326を定量化した。
【００９４】
統計分析:
全てのデータは、平均±SDとして表されている。複数の群間の比較の場合、データを全てのpHについて組み合わせ、平均化し、対応する添加物を含んだ製剤と比較した。統計は、一元配置ANOVAに続くチューキー(Tukey)ポストホック分析によって、行った(SPSS, ver.11.5; SPSS, Chicago, IL)。p ≦ 0.05を統計的に有意であるとみなした。
【００９５】
2. 結果
HisタグのないLEDGF1〜326のクローニングおよび精製
PCR増幅によってLEDGF1〜326の1000 bpのバンドが得られた。LEDGF1〜326遺伝子挿入プラスミドからの制限消化、ライゲーションおよびその後のPCR増幅によって、LEDGF1〜326の陽性のバンドが示された。LEDGF1〜326タンパク質の精製により、非常にかすかな低分子量のバンドとともに40 kDaの単量体バンドが示され、精製プロセスの間にLEDGF1〜326が何らかの分解を受けた可能性があることが示唆された。
【００９６】
添加物はLEDGF1〜326の安定性を増加させる
LEDGF1〜326の安定性に及ぼす添加物Tween 20、EDTA、およびスクロースの効果を、pH 6.0〜7.5のクエン酸-リン酸緩衝液中でモニターした。LEDGF1〜326におけるトリプトファン(Trp)の蛍光挙動を測定することによって、LEDGF1〜326における三次構造の擾乱をモニターした(図11A)。LEDGF1〜326製剤(0.5 mg/ml)は、緩衝液のpHに関して、342 nmでの蛍光強度に何の有意差も示さなかった(図11A(i))。0日目に、LEDGF1〜326の添加物不含(plain)緩衝液製剤では、6.0〜7.5のpH範囲において342 nmで5163±302 R.F.U.の初期蛍光強度が示された。1日目に6198±102まで蛍光強度が増加し、これが3日目までに3518±305 R.F.U.に大幅に低下したことから、1日目と比べておよそ43%のシグナル強度の喪失が示唆された。14日目までに、シグナル強度の87%の喪失が認められた。蛍光スペクトルは、3日目、7日目、およびスペクトルはほとんどが平らになって以降に、最大蛍光強度の赤方シフトを示した
【００９７】
添加物は初期LEDGF1〜326蛍光強度を変化させず、0日目に添加物有りまたは無しで製剤の蛍光強度の有意差は認められなかった(図11A(ii))。全てのpH範囲について60日目までに、蛍光シグナルの有意な喪失も、最大蛍光のシフトも、認められなかった。
【００９８】
LEDGF1〜326における二次構造の擾乱をCDによってモニターした。図11Bは、時間に応じて6.0〜7.5のpHで種々の製剤に対する208 nmでのLEDGF1〜326の楕円率を示す。CDにより、LEDGF1〜326の二次構造が主にランダムコイルであることが示唆された。LEDGF1〜326は0日目に-17.5±0.1 mDegの楕円率を示し、これは3日目までに-13.9±0.8 mDegへ大幅に低下した(図11B(i))。CDシグナルのさらなる低下が認められ、7日目以降では、楕円率が-3.4±2.3 mDegであった。0日目に添加物有りまたは無しの製剤でCDシグナルの有意差は、認められなかった(図11B(ii))。添加物を含有する全ての製剤に関して、0日目および60日目のCDシグナルはそれぞれ-17.9±0.3および-19.1±1.4 mDegであったことから、有意な変化のないことが示唆された。
【００９９】
LEDGF1〜326の流体力学的(粒子)サイズは、DLSによって示されるように、添加物有りまたは無しの全ての製剤で0日目に7±1 nmであった(図11C(i))。3日目までに、LEDGF1〜326の粒子サイズは、添加物不含緩衝液の製剤pH 6〜7.5において200〜700 nmに増大した。添加物の存在下で、LEDGF1〜326は0日目におよそ1 nmのサイズを示し、60日目までサイズの変化のないことが示された(図11C(ii))。
【０１００】
SDS-PAGEにより、LEDGF1〜326が40 kDaのタンパク質であることが示唆された。0日目に、全ての製剤において低分子量タンパク質の非常にかすかなバンドが認められた。添加物不含緩衝液の製剤において、さらに低分子量の断片が早くも1日目のうちに増した(図12(i))。3日目までに、かなりの量の、目に見える、さらに低分子量のバンドが認められた。7日目までに、40 kDaのバンドおよび他の断片の完全な喪失が認められた。添加物は、60日目までにさらに低分子量のバンドの増大を遅延させた(図12(ii))。60日目に、さらに低分子量のバンドが、緩衝液pHに関わりなく添加物を含有する製剤において40 kDaのバンドとともに目に見えた。
【０１０１】
添加物はLEDGF1〜326の不溶性凝集体を低減する
LEDGF1〜326の、添加物不含緩衝液の製剤pH 6.0〜7.5に対する0日目の可溶性タンパク質含量は、417.8±21.3 μg/mlであった(図13A)。7日目までに、142.5±60.7 μg/mlまでの可溶性タンパク質含量の有意な減少が認められた。その後、異なるpHでの、添加物不含緩衝液の製剤におけるタンパク質含量の高いバラツキが認められたが、しかし明らかな傾向は認められなかった。60日間までの平均で、全可溶性タンパク質含量は316.2±140.0 μg/mlであった。添加物を含有する製剤は、0日目に470.5±17.3 μg/mlのタンパク質含量を示し、60日目まででさえ469.0±33.4 μg/mlであり続けた。
【０１０２】
製剤中に存在する凝集体の割合を、可溶性タンパク質含量から計算した(図13B)。添加物不含緩衝液の製剤は、早くも3日目に不溶性凝集体の出現を示し、7日目までに64.6±14.0%の凝集体が認められた(図13B)。7日目を超えて、製剤中の凝集体含量の予測不能な変化が認められたが、しかし、凝集体の存在は全てのpH範囲で有意に高いままであった。添加物の存在下で、凝集体の割合は、22.3±9%の凝集体が存在していた30日目を除き、60日目までの全ての日に対して検出限界未満のままであった(図13B)。
【０１０３】
添加物不含緩衝液の製剤中では、製剤中に沈殿していた粒子が見られた(図13C)が、添加物を含有する製剤は60日目まで清澄であった。
【０１０４】
LEDGF1〜326は添加物の存在下で免疫反応性であり続ける
LEDGF1〜326の免疫反応性を間接的ELISAを用いて定量化した(図14)。ELISAにより、添加物不含緩衝液の製剤pH 6.0〜7.5において0日目に76.9±4.8%の免疫反応性LEDGF1〜326が示された。14日目に免疫反応性を試験した場合、LEDGF1〜326がその免疫反応性のほぼ全てを喪失し、3.1±2.4%しか残存していないことが分かった。60日目までには、免疫反応性LEDGF1〜326は検出不能であった。他方では、添加物を含有する製剤は、0日目、14日目、および60日目に、それぞれ、74.8±7.7、66.2±2.8、および70.4±24.5%の免疫反応性LEDGF1〜326を示した。免疫反応性はpH依存性を有するように見られたが、60日目にpH 6、および7.5では30±4および58±1%の免疫反応性LEDGF1〜326を示し、pH 6.5、6.75、7.0、および7.25では78±15、78±45、76±9、および102±13%の免疫反応性LEDGF1〜326を示した。
【０１０５】
個々の添加物はLEDGF1〜326安定性を増加させるうえで効果が少ない
LEDGF1〜326安定性に及ぼす個々の添加物の効果を理解するため、一度に1種だけの添加物をpH 7.0にてLEDGF1〜326 (1 mg/ml)の製剤中で試験した(図15、および16)。添加物不含クエン酸-リン酸緩衝液の製剤に関して、342 nmでのLEDGF1〜326の蛍光強度は、30日目までに8410±116から2178±22 R.F.Uまで低下した(図15A)。その一方で0.01% Tween 20、1 mM EDTA、および10%スクロースを含有する製剤の場合、蛍光強度は30日目にそれぞれ、4925±1249、4056±979、および6370±592 R.F.U.であった。微生物汚染をモニターするために対照として用いられたアジ化ナトリウムは、9136±241 R.F.Uの蛍光強度を示した。添加物の非存在下で、LEDGF1〜326蛍光シグナルの喪失は0日目のシグナルの75%であり、Tween 20、EDTA、およびスクロースはそれぞれ、およそ59、48、および76%まで蛍光シグナルを保持した。蛍光と同様に、CDシグナルも、LEDGF1〜326の不安定性を示した(図15B)。
【０１０６】
30日目に、全ての製剤は、0日目のシグナルと比べた208 nmでの楕円率における有意差を示した。大きなバックグラウンド・シグナル・ノイズが認められ、非天然構造の存在が示唆された。
【０１０７】
LEDGF1〜326は、スクロースを含有する製剤を除き(accept)、全ての製剤について0日目に7±1 nmの平均の流体力学的サイズを示した(図15C)。スクロースの存在下で、LEDGF1〜326は1 nmの流体力学的サイズを示した。30日目までに、粒子サイズは、添加物不含緩衝液、Tween 20、EDTA、およびスクロースを含有する製剤に関して、それぞれ578±366、726±444、490±423、および1052±125 nmにまで有意に増大した。アジ化ナトリウム群の場合、サイズの増大の代わりに、7から4 nmまでのサイズの低下が認められた。
【０１０８】
単量体の天然LEDGF1〜326をSDS-PAGEによってモニターした(図16)。当初、0日目には、40 kDaでのLEDGF1〜326のバンド強度は全ての群において同様であった。7日目までに、40 kdaのバンドが薄くなり、LEDGF1〜326単量体の喪失が示唆された。14日目には全ての群において、より低分子量のバンドが、0日目と比べてずっと有意に現れていた。
【０１０９】
実施例3
1. 材料および方法
ARPE-19細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection) (ATCC; Manassas, VA)から入手した。細胞培養材料、試薬およびリポフェクタミン2000は、Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA)から入手した。クロム酸、HCl、NaOHおよび円偏光二色性のための他の購入品は、Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)から入手した。Tris塩基、ZnCl2、EDTA (エチレンジアミン四酢酸)は、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)から入手した。
【０１１０】
ナノアセンブリの調製
凍結乾燥されたLEDGF1〜326を4℃にて25 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.4中で終夜、徹底的に透析した。ZnCl2ストック溶液(100 mM)を同じ緩衝液中で調製した。ナノアセンブリの調製のため、亜鉛ストック溶液を、25 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.4を用いて0.1 mM、1 mM、および10 mMの終濃度に希釈し、これにLEDGF1〜326 (終濃度1 mg/ml)を加え、24時間37℃でインキュベーションした。同様の条件下で亜鉛を有しないLEDGF1〜326を対照として保持した。製剤の調製の前に全ての溶液を0.2 μmのフィルタでろ過した。ナノ(xx)アセンブリとは、xx mMのZn(II)で調製されたLEDGF1〜326ナノアセンブリを示す。
【０１１１】
動的光散乱
ナノアセンブリの均質性およびサイズ分布を、動的光散乱(DLS)に基づきzeta sizer Nano ZS (Malvern, Westborough, MA)を用いて測定した。手短に言えば、サンプルを150 μlの石英キュベットに入れ、最終のサイズ分布プロットのために平均して11回のスキャンにより173°の後方散乱角度でデータを集めた。これらのナノアセンブリのサイズの時間依存性のバラツキおよびその安定性を、さまざまな時点で個数サイズ分布プロファイルを測定することによってモニターした。
【０１１２】
蛍光
トリプトファンの定常状態の内因性蛍光を測定することによって、LEDGF1〜326の三次構造の変化を判定した。サンプルを150 μlの石英キュベットに入れ、発光スペクトルを、Spectramax M5 (Molecular Devices, Downingtown, PA)を用いて増分1 nmで、励起波長280 nmで、300から400 nmまで記録した。データ点あたりのスキャン数は、6であった。
【０１１３】
円偏光二色性
LEDGF1〜326における二次構造の変化を判定するため、製剤の遠紫外CDスペクトルを記録した。手短に言えば、サンプルを1 mmの石英キュベットに入れ、Chirascan(登録商標) CD機器(Applied Photophysics Ltd, UK)を用いて0.5秒/時点のスキャン速度、1 nmの刻み幅および200から280 nmまで4 nmのバンド幅で、スペクトルを記録した。全てのスキャンは三つ組で行った。スキャンを緩衝液の成分について差し引いた。
【０１１４】
細胞生存性アッセイ法
ARPE-19細胞を用いて、凝集を介するストレスの存在下でLEDGF1〜326の細胞生存機能を決定した。手短に言えば、ARPE-19細胞を先に記述(Baid et al. PLoS One. 6(9):e24616)のように維持した。細胞生存性アッセイ法のため、細胞10000個を、血清を含有するDMEM-F12培地中で96ウェルプレートに播種した。24時間後、培地を吸引除去し、細胞を無血清培地100 μlで洗浄した。その後、細胞を48時間、LEDGF1〜326のみまたはLEDGF1〜326 +10 mM亜鉛ナノアセンブリのいずれか200 μlで処理した。細胞なし(単なる培地)、LEDGF1〜326のみの対照として25 mM Tris緩衝液を有する細胞、25 mM Tris +10 mM亜鉛(最大量の亜鉛を含有する群に相当する)を有する細胞を、対照として維持した。細胞を24時間、および48時間インキュベーションした。その後、培地を吸引除去し、新鮮な無血清培地200 μlを加えた。MTT試薬(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル四ナトリウムブロミド、PBS pH 7.4中で5 mg/ml) 20 μlを各ウェルに加え、さらなるインキュベーションを37℃で3時間行った。MTTを含有する培地を吸引除去し、形成されたホルマザン結晶をDMSO 200 μlに溶解した。発色の吸光度を、Spectramax M5を用いて570 nmで測定した。群の生存性の割合を、リポフェクタミン2000を有しない細胞を含有する対照群に対して計算した。全ての群をn=3として繰り返した。
【０１１５】
細胞取込み
ARPE-19 (50,000個)細胞を、血清を含有するDMEM-F12培地中で24ウェルプレートに播種した。24時間後、培地を吸引除去し、細胞を無血清培地100 μlで洗浄した。その後、細胞を1時間および6時間、LEDGF1〜326またはナノ(10)アセンブリのいずれか200 μlで処理した。LEDGF1〜326のみの対照として25 mM Tris緩衝液を有する細胞、25 mM Tris +10 mM亜鉛(最大量の亜鉛を含有する群に相当する)を有する細胞を、対照として維持した。2時間または6時間後、細胞を冷PBS pH 7.4 500 μlで2回洗浄し、引き続いて酸性PBS pH 5 500 μlでの2回の洗浄を行った。その後、細胞を室温で20分間1% triton-xで溶解させ、こすり取って回収した。励起488 nmおよび発光519 nmで蛍光を測定した。
【０１１６】
キレート化
ナノアセンブリの形成がキレート剤の存在下で反転されうるかどうか調べるため、上記のように37℃で24時間ナノアセンブリを形成させた。25 mM Tris-HClおよび100 mM NaCl, pH 7.4を用いて、EDTA 500 mMストック溶液を作製した。EDTAをLEDGF1〜326またはナノアセンブリのいずれかに、50 mMの終濃度まで加えた。それを室温で4時間インキュベーションし、その後、UV、蛍光、およびCDを上記のように計測した。
【０１１７】
2. 結果
LEDGF1〜326はZnCl2の存在下で構造変化および立体構造変化を受ける
Zn(II)の存在下でのナノアセンブリの形成を、動的光散乱(DLS)、内因性trp蛍光、遠紫外線CD、およびUV-visスペクトルによってモニターした(図17)。LEDGF1〜326は9±1 nmの流体力学直径を示し、これは、DLSによってモニターしたように、24時間以内に大きく変化することはなかった(図17A)。異なる濃度のZn(II)とともにインキュベーションされたLEDGF1〜326は、サイズの変化を起こし、ナノアセンブリの形成を示唆していた。0.1 mM ZnCl2では、24時間までにサイズの変化は認められなかった。1 mMおよび10 mM Zn(II)の存在下で、LEDGF1〜326は、37℃で30分のインキュベーションの間にサイズ増大を示した。24時間のインキュベーションで、LEDGF1〜326は、それぞれ対照、ナノ(0.1)、ナノ(1)、およびナノ(10)のアセンブリについて7±1、22±5、26±5、および28±5 nmのサイズを示した。
【０１１８】
Zn(II)の存在下でのLEDGF1〜326の二次構造の変化を調べるため、LEDGF1〜326の遠紫外CDスペクトルを200〜260 nmまでモニターした(図17B)。37℃で24時間のインキュベーション後、LEDGF1〜326は、200 nm未満で負の楕円率および230 nmで負の傾斜を示した。スペクトルのデコンボルーションから、LEDGF1〜326が主にランダムコイル構造であることが示唆された。Zn(II)の存在下で、CDスペクトルの有意な変化が示された。230 nmでの負の傾斜は、左側に(より低い波長へ)シフトした。LEDGF1〜326の楕円率から、Zn(II)の濃度が増すにつれて負のシグナルが増したことが示唆された。CDの変化はZn(II)濃度に依存しており、0.1 mM Zn(II)製剤で遅く、10 mM Zn(II)製剤で最速であった(データは示されていない)。230 nmでの負の傾斜は濃度依存的に低い波長の方へシフトすることが認められ、α-ヘリックスの形成の可能性が示唆された。しかしながら、200 nm未満では、Zn(II)濃度に依存して負のシグナルも増加した。CDスペクトルのデコンビュレーションから、ナノ(10)形成において、対照と比べてα-ヘリックスの2%の増加が示唆された。
【０１１９】
LEDGF1〜326の内因性trp蛍光スペクトル(図17C)から、Zn(II)の存在下で、蛍光シグナルの強度が200〜400 nmの間で低下したことが示された。興味深いことに、蛍光シグナルの低下は、10 mM Zn(II)製剤と比べて0.1 mM Zn(II)製剤でいっそう大きかった。
【０１２０】
LEDGF1〜326はUV吸光度スペクトルにおいて276 nmで吸光度最大(Amax)を示した(図17D)。Zn(II)の存在下で、0.1および1 mm Zn(II)製剤の場合にはUVシグナルの低下が認められたが、しかし10 mM亜鉛製剤の場合には変化が認められなかった。276 nmでのUVシグナル(Amax)は対照、ナノ(0.1)、ナノ(1)、およびナノ(10)アセンブリについて、それぞれ、0.47、0.33、0.32、および0.46であった。
【０１２１】
LEDGF1〜326はナノ構造を形成する
図18に示されるように、LEDGF1〜326ナノ(10)アセンブリ(最も右側のパネル)は、透過電子顕微鏡法(TEM)の下で可視化された場合、濃密な陰性染色によって分かるように、緩く形成されたナノ構造の存在を示した。ナノアセンブリのなかには互いと密着していたものもあったが、個々の粒子として存在していたものもあった。Zn(II)の非存在下で、LEDGF1〜326 (真ん中のパネル)はそのようないずれの構造の存在も示さなかった。
【０１２２】
ナノアセンブリは希釈に対して安定である
DLSを用いて希釈に対するナノアセンブリの安定性を研究した(図10)。いったん形成されたナノ(10)アセンブリは、2倍および4倍希釈された場合、いかなるサイズ変化も示さなかった。さらに、これらの希釈されたナノ(10)アセンブリを24時間4℃で貯蔵し、その後、サイズを測った場合、サイズ変化は認められなかった。
【０１２３】
ナノアセンブリの形成は可逆的である
LEDGF1〜326と亜鉛との間の相互作用の種類を調べるため、本発明者らは、ナノ(10)に及ぼすEDTAの効果をモニターした（図19）。対照LEDGF1〜326へのEDTAの添加は、いかなる有意なサイズ変化も示さず、LEDGF1〜326のサイズは依然として、およそ7〜8 nmであった(図19A)。EDTAの添加前に、ナノ(10)アセンブリは25±4のサイズを示し、これはEDTAの添加によって9±2まで低下した。ナノアセンブリの形成によって消光されたナノアセンブリの蛍光スペクトルは、元に戻った(図19B)。EDTAの添加後、対照およびナノ(10)アセンブリは、類似の蛍光スペクトルを示した。CDスペクトルによって示された二次構造の全ての変化も同様に戻った(図19C)。UV-visスペクトルも、アセンブリの形成によって起きた変化の反転を示した(図19D)。
【０１２４】
LEDGF1〜326の安定性はナノアセンブリにおいて増大する
25℃でのナノアセンブリにおけるLEDGF1〜326の安定性を、DLS、SDS-PAGE、CD、および蛍光を用いて30日間モニターした(図20)。対照LEDGF1〜326のサイズは、3日目に8±1から5±1 nmまで低下した(図20A)。ナノ(1)アセンブリは0日目に27±1 nmのサイズを示し、これは7日目に4±3 nmまで低下した。他方で、ナノ(10)アセンブリは、30日までサイズの変化のないことを示した。30日目に、ナノ(10)アセンブリについて27±1から8±2 nmまでのサイズ変化が認められた。
【０１２５】
40 kDaのバンドは、0日目にSDS-PAGEにおいて、対照LEDGF1〜326、ナノ(1)およびナノ(10)アセンブリで示された(図20B)。3日目までに、対照LEDGF1〜326においてこのバンドの完全な喪失が認められた。ナノ(1)アセンブリは7日目にこのバンドを喪失し、ナノ(10)は30日目に喪失した。
【０１２６】
対照LEDGF1〜326のCDスペクトルは、1日目以降から負の楕円率の持続的な喪失を、および30日目にシグナルの完全な喪失を示した(図20C)。ナノ(1)アセンブリは1日目以降から持続的なCDシグナルの喪失を示した; しかしながら、CDシグナルは30日目まで認められた。ナノ(10)アセンブリにおいて、14日目まで有意なシグナル喪失は認められず、30日目にCDシグナルの低下が認められたが、しかし、負のシグナルは依然としてはっきりと認められた。
【０１２７】
対照LEDGF1〜326の蛍光スペクトルから、0日目と比べて7日目に蛍光強度の有意な低下が示され、さらなる蛍光の喪失が30日目まで続いた(図20D)。ナノ(1)アセンブリは他方で、0日目のシグナルと比べて7日目まで蛍光シグナルの喪失のないことを示したが、しかし14日目以降に、シグナルの喪失が認められた。最も頑強であるナノ(10)は、0日目のシグナルと比べた強度喪失を14日目まで示しておらず、かつ、他の対応群と比べて極めて小さな、30日目における強度低下を示した。
【０１２８】
ARPE-19細胞はより多くの量のナノアセンブリを取り込む
Alexa結合LEDGF1〜326を用いARPE-19細胞においてLEDGF1〜326の細胞取込みを調べた(図21)。ARPE-19によるAlexa-LEDGF1〜326の取込みは、用量依存的であった。2時間以内に、2、10、および25 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326とともにインキュベーションされた場合、それぞれ、0.5±0.1、1.0±0.3、および1.4±0.2 μgのAlexa-LEDGF1〜326 (対照)がARPE-19細胞によって取り込まれた。インキュベーション時間を6時間まで増やした場合、Alexa-LEDGF1〜326の取込みの増大が認められた。LEDGF1〜326の取込みは、2、10、および25 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326処理に関して、6時間でそれぞれ1.2±0.2、1.2±0.2、および1.9±0.2 μgまで増大した。
【０１２９】
Alexa-LEDGF1〜326ナノ(10)アセンブリは、対応する対照群と比べて2時間、および6時間の時点で最も高い取込みを示した。2時間の時点で、2、10、および25 μg/mlのナノ(10)アセンブリ処理に関して、それぞれ0.7±0.08、1.0±0.2、および2.2±0.5 μgの取込みが認められた。ナノアセンブリの取込みは対照と比べて高かったが、有意差は認められなかった。インキュベーション時間を2時間から6時間まで増やすことで、ナノ(10)アセンブリの取込みが有意に増加した。取込みは、2、10、および25 μg/mlのナノ(10)アセンブリ処理に関して、6時間の時点でそれぞれ2.0±0.09、2.9±0.5、および2.9±0.2 μgであった。
【０１３０】
ナノアセンブリは血清飢餓からARPE-19細胞を生存させる
血清飢餓の下でARPE-19細胞を生存させるナノアセンブリの効力をMTTアッセイ法によってモニターした(図22)。未処理群(100%の生存性)と比べて、LEDGF1〜326処理群は用量依存的に生存性の増大を示した。ARPE-19細胞の生存性は0.01、0.1、および1.0 μg/mlのLEDGF1〜326処理により、それぞれ、124±11、148±12、および160±44%まで増大した。ナノ(10)アセンブリ処理群は、対応する対照LEDGF1〜326処理群と比べていっそう高い細胞生存性を示した。ARPE-19細胞の生存性は0.01、0.1、および1.0 μg/mlのLEDGF1〜326処理により、それぞれ、150±3、180±22、および200±8%まで増大した。
【０１３１】
ナノアセンブリは網膜変性の遅延におけるLEDGF1〜326の効力を増大させる
網膜の機能喪失を防ぐナノアセンブリの効力を、網膜電図検査(ERG)を用いRCSラットにおいて試験した(図23A)。4週目に、ラットに硝子体内注射する前、B波振幅は313±32 μVであり、全ての群で有意差はなかった。その後の10週の期間にわたって、すなわち14週の時点で、緩衝液およびZn(II)処置群は、それぞれ、307±44から17±10 μVまで、および302±37から11±7 μVまでのB波振幅の減少を示した。LEDGF1〜326処置(対照)はB波振幅の喪失を示し、14週目に、B波振幅は337±30から42±15 μVまで減少したが、14週目において緩衝液群、Zn(II)群および、対照群のB波振幅には有意差が認められなかった。ナノ(10)は14週まで、B波振幅の喪失からの有意な防御を示していた。B波振幅は14週目に305±36から65±15 μVまで減少し、これは、対応する緩衝液群またはZn(II)群と比べて有意に高いB波を示した。
【０１３２】
明順応ERGにおいて、4週目の全ての群のB波振幅は105±23であった(図23B)。暗順応ERGと同様に、B波振幅の減少が認められた。緩衝液およびZn(II)処置群は、それぞれ、94±26から12±7 μVまでおよび109±23から11±7 μVまでのB波振幅の喪失を示した。対照LEDGF1〜326およびナノ(10)アセンブリ処置群は、喪失を遅延させ、B波振幅は、それぞれ、100±28から22±5 μVまでおよび113±23から40±10 μVまで減少した。ナノ(10)アセンブリは、対応する緩衝液、Zn(II)および対照LEDGF1〜326による処置群と比べて有意に高いB波を示した。
【０１３３】
さらに、全ての群における律動様小波(OP)振幅は、4週目の時点で91.8±11.5 μVであった(図23C)。(OP)振幅の減少が全ての群にわたって認められた。14週目までに、OP振幅は緩衝液、Zn(II)、対照、およびナノ(10)アセンブリの群において、それぞれ、32±5、33±8、36±8、および36±9 μVであった。全ての群において有意差は認められなかった。
【０１３４】
30 hzのフリッカ振幅も測定された(図23D)。4週目にフリッカ振幅は全ての群で平均して10±2 μVであった。他の全てのERGと同様に、全ての群においてフリッカ振幅の減少が認められた; しかしながら14週目に、ナノ(10)アセンブリ群のフリッカ振幅は、緩衝液群、およびZn(II)群よりも有意に高かった。14週目のフリッカ振幅値は、緩衝液、Zn(II)、対照およびナノ(10)アセンブリについて、それぞれ、2±0.4、3.7±0.4、2.4±0.6、5.2±2.2 μVであった。
【０１３５】
ナノアセンブリは眼組織においてLEDGF1〜326の残留性を数日間増大させる
Alexa-LEDGF1〜326の蛍光シグナルを用いて正常SDラットにおけるLEDGF1〜326の残留性を測定した(図24)。図24Aは、SDラット眼の硝子体内注射前のブランクスキャンの平均(n=7)を示す。ブランクスキャンから、それぞれ約24、50、および88個のデータ点での、脈絡膜、水晶体、および角膜の自家蛍光が示された。このブランクスキャンに基づき、データ点を眼のさまざまな組織に割り当てた。割り当てたデータ点は、脈絡膜-RPE 24、硝子体液およそ40、水晶体 50、房水およそ70、および角膜88であった。図24Bおよび32Cは、対照およびナノ(10)アセンブリの標準曲線である。これを用いて、Flurotronスキャンからナトリウムフルオレセイン(NaF)濃度(ng/ml)に換算して得られた蛍光シグナルを実際のAlexa-LEDGF1〜326濃度(μg/ml)に変換した。図24Dおよび24Eは、硝子体内注射後2分から14日までの対照およびナノ(10)アセンブリ群のFlurotronスキャン(N=4)である。硝子体液、脈絡膜-RPE、および房水における蛍光シグナルをFlurotronスキャンから得て(図24D、および24E)、これをそれぞれ、図24F、24G、および24Hにおいて実際のAlexa-LEDGF1〜326濃度に変換した。図24C、および24Dにおける注射2分後での硝子体液における高いピークから、硝子体内注射が適切に行われたことが示唆された。
【０１３６】
3±0.5 ng/mlのNaFに等しい蛍光シグナルがブランクスキャンにおいて硝子体液中で認められ(図24A)、これが変換され、ベースラインとしての0 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326を生じた。硝子体内注射の2分後に、292±106 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326のピーク値が対照の硝子体液において示され、これは30分のうちに127±74 μg/mlに急減した(図24F)。3日目までに、対照群でのAlexa-LEDGF1〜326のピークは、ベースライン未満であった。ナノ(10)アセンブリは他方で、数日間の残留性を示した。注射2分後のピーク濃度は、321±54 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326であり、30分で100±45 μg/mlまでの最初の急減が認められた; その後、減少は対照と比べて緩徐であり、硝子体液におけるナノアセンブリの残留性が14日目まで示された。14日目にAlexa-LEDGF1〜326濃度はナノ(10)アセンブリ群において0.7±0.1 μg/mlであり、これは対照群およびベースラインよりも有意に高かった。
【０１３７】
また、ナノ(10)アセンブリ群に関して、Alexa-LEDGF1〜326の残留性は、房水においてだけでなく脈絡膜-RPEにおいても示された。脈絡膜RPEでの自家蛍光から、10±4 ng/mlのNaFが示され、これはAlexa-LEDGF1〜326濃度に変換すると0.1 μg/mlであった。かくして0.1 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326は脈絡膜-RPEのベースラインとみなされた(図24G)。硝子体内注射の直後、13.2±10.8 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326が脈絡膜-RPEにおいて示され、これは対照群において30分に30.0±22.6 μg/mlまで増大した。その後、Alexa-LEDGF1〜326レベルの減少が認められ、1日目までに検出不能となった。ナノ(10)アセンブリは他方、2分に14.3±9.8 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326を示し、これは30分に21.5±12.8 μg/mlまで増大した。1日目までに、Alexa-LEDGF1〜326のレベルは2.0±1.1 μg/mlまで落ち込んだが、しかし対照群のベースラインからは有意に高かった。Alexa-LEDGF1〜326のレベルは14日目まで有意に高いままであり、14日目に0.6±0.2 μg/mlであることが検出された。
【０１３８】
房水において、ブランクスキャンから計算されたベースラインは、0 μg/mlのAlexa-LEDGF1〜326に等しかった(図24A)。硝子体内注射後2分の時点で、Alexa-LEDGF1〜326濃度は対照、およびナノ(10)アセンブリ群について3.4±3および4.9±2.4 μg/mlであった(図24H)。Alexa-LEDGF1〜326は対照群の場合6時間以内にベースライン未満に減少したが、ナノ(10)アセンブリは、14日目までAlexa-LEDGF1〜326の存在を示し、この時点でAlexa-LEDGF1〜326の濃度は0.6±0.1 μg/mlであった。
【０１３９】
LEDGF1〜326はナノアセンブリとして投薬された場合に数日間インビボで免疫反応性であり続ける
間接的ELISAにより単回の硝子体内注射の14日後にさまざまな眼組織においておよび血液においてAlexa-LEDGF1〜326の免疫反応性を調べた(図25)。注射されていないブランクの眼組織については角膜、房水、水晶体、硝子体液、網膜、脈絡膜-RPE、強膜および血液において検出可能なレベルのAlexa-LEDGF1〜326は認められず、検出可能な量の内因性LEDGF1〜326が全く存在しないことが示唆された。興味深いことに、Alexa-LEDGF1〜326は対照群およびナノ(10)アセンブリ群の両方について網膜で検出可能であり、それぞれ0.2±0.2および1.3±0.4 μg/g組織重量であった。対照群およびブランク群には有意差がなかったが、ナノ(10)アセンブリは対照群またはブランク群と比べて有意に多い量のAlexa-LEDGF1〜326を有していた。
【０１４０】
実施例4
生/死細胞カウントアッセイ法-
細胞カウントアッセイ法のため、10000個のARPE-19細胞を96ウェルプレートにプレーティングし、24時間インキュベーションした(図26)。24時間後、血清を含有する培地を吸引除去した。試験群(pP23H-Rho+ LEDGF1〜326)に、製造元のプロトコルにしたがって無血清培地中1:3の比率のリポフェクタミン2000 (LP-2000)を用いてpP23H-Rhoプラスミド(1 μg/ml)を一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションの6時間後に、培地を吸引除去し、細胞を漸増量のLEDGF1〜326により処理した。細胞なし(単なる培地)、LP-2000を有しない細胞およびLP-2000を有する細胞も対照として維持した。LEDGF1〜326処理時間の終わりに、細胞をPBSで洗浄した。細胞を原形質膜浸透物(Hoechst 33342)、原形質膜不浸透性分子(BOBO(商標)3)、および核色素(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩; DAPI)の組み合わせで標識した。Hoechst 33342は細胞核を標識し、その一方でBOBO(商標)3は死んでいる細胞または死細胞を標識した。Operetta(登録商標)高含量画像化システムを用いて細胞を可視化した。Operetta(登録商標)機器内の自動ソフトウェアツールを用いて細胞カウントを得た。「全細胞」カウントから死細胞カウントを差し引くことによって、生細胞の数および割合を計算した。図26に示されるように、LEDGF1〜326はARPE-19細胞生存性を増大させる。
【０１４１】
免疫ブロッティング:
免疫ブロッティングのため、トランスフェクション用のP23H-Rhoの代わりにCFPタグ付きP23H-Rho (pP23H-CFP-Rho)を用いた。ARPE-19細胞を60 mmのプレートにプレーティングした; トランスフェクションおよび薬物処理を96ウェルプレート試験に対し比例してスケールアップした。LEDGF1〜326処理が終わった後に、細胞を冷PBSで1回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含有するRIPA緩衝液中での超音波処理によって溶解させた。等量の上清をSDS-PAGEゲルに投入し、Hsp70、Hsp40、Hsp27、CFP (P23H-CFP-Rhoの場合)、およびLEDGF1〜326、ならびにβ-アクチンについて免疫ブロットした。高感度化学発光ECL(商標)検出キット(GE Healthcare, Piscataway, NJ)を用いてタンパク質のバンドを可視化した。観察データから、LEDGF1〜326が内部移行されることが示唆される。
【０１４２】
貪食アッセイ法-
ARPE-19細胞を24ウェルプレートに播種し、siRNAトランスフェクション用薬剤(Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX)を用いて6時間、20 pM/mlのMERTK siRNA (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX)でトランスフェクションした。トランスフェクション用培地を除去し、24時間、無血清培地中で細胞をさらにインキュベーションした。MERTK siRNAなしでトランスフェクション用培地のみでトランスフェクションした細胞を、対照として維持した。細胞を1回洗浄し、24時間0.05、0.5、または5 μg/mlのLEDGF1〜326で処理し、その後、2 μmの粒子の貪食をモニターした。手短に言えば、100 μg/mlの2 μmの青色FluoSpheres (Life Technologies, Grand Island, NY)を3時間細胞とともにインキュベーションした。その後、細胞を冷PBS pH 7.4で2回洗浄し、引き続き冷PBS pH 5.0での2回の洗浄を行って、付着したFluoSpheresを除去した。1% Triton-xを用いて細胞を溶解させ、励起350 nmおよび発光430 nmを用いて細胞溶解物中の粒子の蛍光を測定した。siRNAなしでトランスフェクション用薬剤のみでトランスフェクションした細胞を、粒子取込みの対照として得た。粒子処理なしの細胞をバックグラウンドの蛍光測定に用いた。図27に示されるように、LEDGF1〜326は貪食活性を増大させる。網膜色素上皮細胞の貪食の減少は、変性疾患を含むいくつかの網膜疾患の顕著な特徴である。LEDGF1〜326は、貪食の障害を伴う疾患の処置において有用であろう。
【０１４３】
組織診断:
試験の終わりに、すなわち12週目に、眼をERG測定後に摘出し、室温で24時間Davidsonの固定剤(2%の37〜40%ホルムアルデヒド、35%エタノール、10%氷酢酸、および53%蒸留水)中で固定した。眼を次に、その後の連続脱水およびパラフィン中での包埋のために70%エタノール中で貯蔵した。厚さ6 μmの垂直切片3枚を標準的なミクロトームにて視神経の位置で鼻側から側頭側へ(500 μm離して)切り取った。全体の網膜形態を、組織切片のヘマトキシリン/エオシン染色の後に光学顕微鏡によって評価した。Aperio ImageScopeソフトウェアv11.1.2.760を用いて外核層(ONL)および内核層(INL)の厚さを系統的に測定した。光受容体細胞保護は網膜全体で一様でない可能性があるため、各切片において上縁から下縁まで500 μmごとに分析を行い、点ごとに切片3枚の平均を行った。データは眼3つの平均を表す。図28に示されるように、LEDGF1〜326は両網膜核の光受容体喪失を遅延させる。
【０１４４】
免疫蛍光:
免疫蛍光のため、パラフィンの除去後、他に指定のない限り、以下の逐次段階を通じて室温で眼切片を処理した。15分間80℃で切片を煮沸することによって抗原を回復させた。非特異的な結合をブロッキングした後に、切片を終夜4℃でマウス抗ロドプシン(1D4)一次抗体とともにインキュベーションし、引き続いてAlexa Fluor(登録商標) 594結合ロバ抗マウスIgGおよびDAPIとの30分のインキュベーションを行った。最後に、眼切片を洗浄し、Supermount H (Biogenex, San Ramon, CA)封入剤により封入して、急速な蛍光消失を防いだ。共焦点顕微鏡(Nikon Eclipse CI)を20倍光学ズームで用いて蛍光を可視化した。DAPIおよび、Alexa Fluorに用いた励起-発光波長は、それぞれ、408-450/35、および637-605/75 nmであった。Nikon EZ-C1ソフトウェア・バージョン3.40を用いて画像を捕捉した。図29に示されるように、LEDGF1〜326は桿体外節の喪失を遅延させた。
【０１４５】
実施例5
His-LEDGF1〜326のインビトロでの累積放出
His-LEDGF1〜326が被包されたNPinPMPを、PBS pH 7.4中でのインビトロ放出について評価した。粒子(2〜3 mg)を秤量し、PBS pH 7.4 1 ml中に分散させ、200 rpm (Max Q振盪機インキュベータ)での振盪下、37℃でインキュベーションした。所定の時点で、懸濁された粒子を15分間13,000 gで遠心分離し、上清を回収した。粒子を含むペレットを新鮮PBS pH 7.4 1 mlに再懸濁し、インキュベーションした。サンプル中のHis-LEDGF1〜326含量を、製造元の指示にしたがってマイクロBCAアッセイ法を用い推定した(Pierce Biotechnology, IL, USA)。インビトロの累積データにより、NPinPMPからのHis-LEDGF1〜326の持続放出が示された。図30に示されるように、累積60%のHis-LEDGF1〜326の放出が3ヶ月の終わりまでに観察された。
【０１４６】
ラットでのHis-LEDGF1〜326のインビボ送達
His-LEDGF1〜326のインビボ送達を、ラットモデルにおけるNPinPMP中のAlexa Fluor 488結合His-LEDGF1〜326の硝子体内投与後に評価した。NPinPMP中で未標識LEDGF1〜326は使われなかった。ラット眼に、Alexa-His-LEDGF1〜326が被包されたNPinPMP (His-LEDGF1〜326 6.0 μg/5 μl)を注射し、対照としてAlexa-His-LEDGF1〜326 = 当量濃度で(標識タンパク質1.5 μgおよび非標識タンパク質4.5 μg/5 μl)を注射した。この比率によって、本発明者らは、両群が初めに類似の蛍光強度を有する状態で始めることが可能になった。Alexa-His-LEDGF1〜326の放出による眼の蛍光を、蛍光が検出下限またはベースラインに達するまで、Fluorotron Master(商標) (Ocumetrics, CA, USA)を用いて周期的にモニターした。製剤を注射する前に眼のベースライン蛍光値をモニターした。各時点で、3回の蛍光スキャンを得て、平均値を用いた。異なる濃度でのAlexa-His-LEDGF1〜326の標準曲線を、キュベットおよびラット水晶体アダプタによる眼蛍光測定を用いて得た。標準曲線を用いて、蛍光光度計により得られたフルオレセイン当量濃度を、実際のAlexa-His-LEDGF1〜326濃度に変換した。
【０１４７】
Alexa-His-LEDGF1〜326を被包しているNPinPMP、および可溶性のAlexa-His-LEDGF1〜326の硝子体内注射後、眼の光学軸に沿ったHis-LEDGF1〜326の濃度分布を、前から後ろ方向のデータ点として示される、軸平面に沿ったalexa蛍光強度分布(ナトリウムフルオレセイン(sodium fluoresciene)濃度と同等のもの)曲線を測定することによって間接的に決定した。蛍光スキャンにより、溶液と比べてNPinPMPからのAlexa-His-LEDGF1〜326の持続的な送達が明らかになった。Fluorotron Masterにより報告されたフルオレセイン当量濃度を、Alexa-His-LEDGF1〜326濃度に変換した。異なる時点での溶液およびNPinPMPの群からの硝子体領域中のAlexa-His-LEDGF1〜326濃度をプロットした。標識されたベバシズマブの濃度だけが報告されている。硝子体内注射の前に、正常な眼のベースライン蛍光の読み取り値を得たところ、ベースラインの蛍光濃度は2.03 μg/mlであることが分かった。図31に示されるように、Alexa-His-LEDGF1〜326溶液を注射された群は、1日目に2.02 μg/mlのAlexa-His-LEDGF1〜326濃度を示し、硝子体領域からの急速な排除を示唆していた。NPinPMPを注射された群では、硝子体中のAlexa-His-LEDGF1〜326初期濃度は、18.23 μg/mlであることが分かり、ベースラインを上回るAlexa-His-LEDGF1〜326濃度が35日目まで維持され、50日の終わりまでに通常のベースラインレベルに達した。観察データから、例示的なPinP組成物からのAlexa-His-LEDGF1〜326の持続的なインビボ放出を達成する能力が示唆される。
【図１】
0006632376.tif 000006
【図２】
0006632376.tif 000007
【図３】
0006632376.tif 000008
【図４】
0006632376.tif 000009
【図５】
0006632376.tif 000010
【図６】
0006632376.tif 000011
【図７】
0006632376.tif 000012
【図８】
0006632376.tif 000013
【図９】
0006632376.tif 000014
【図１０】
0006632376.tif 000015
【図１１】
0006632376.tif 000016
【図１２】
0006632376.tif 000017
【図１３】
0006632376.tif 000018
【図１４】
0006632376.tif 000019
【図１５】
0006632376.tif 000020
【図１６】
0006632376.tif 000021
【図１７】
0006632376.tif 000022
【図１８】
0006632376.tif 000023
【図１９】
0006632376.tif 000024
【図２０】
0006632376.tif 000025
【図２１】
0006632376.tif 000026
【図２２】
0006632376.tif 000027
【図２３】
0006632376.tif 000028
【図２４】
0006632376.tif 000029
【図２５】
0006632376.tif 000030
【図２６】
0006632376.tif 000031
【図２７】
0006632376.tif 000032
【図２８】
0006632376.tif 000033
【図２９】
0006632376.tif 000034
【図３０】
0006632376.tif 000035
【図３１】
0006632376.tif 000036
【配列表】
0006632376000001.app