(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイズ胚芽に酸性溶液を投与する工程、および、得られた酸抽出物の濃度を、２質量％を超え５質量％以下とする工程を含む、エラスターゼ活性阻害剤の製造方法。
【請求項２】
エラスターゼが白血球由来である、請求項１に記載のエラスターゼ活性阻害剤の製造方法。
【請求項３】
酸性溶液が塩酸又はクエン酸の溶液である請求項１又は２に記載のエラスターゼ活性阻害剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイズの酸抽出物を有効成分とする血管内皮細胞保護剤、及びこれを含む医薬組成物、食品、飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血球はプロテアーゼ、特にエラスターゼを分泌することにより細胞外基質を溶かし、血管外に浸出し組織に到達する。敗血症、成人型呼吸緊迫症候群、急性心筋梗塞のような病態では血中白血球由来のエラスターゼ値が上昇することから（非特許文献１参照）、白血球エラスターゼが血管内皮細胞に作用し、病態の発症や進展に深く関与していると考えられている。また活性化白血球による血管内皮細胞障害をプロテアーゼインヒビターが抑制することから、プロテアーゼが細胞障害に関与していることが示唆されている（非特許文献２参照）。
【０００３】
また血管内皮細胞の障害は動脈硬化の早期から生じると考えており、動脈硬化の予防には内皮細胞の保護が重要である。これまでに血管内皮細胞保護作用としてマイタケ抽出物（特許文献１）や魚類の動脈球から得られる不溶性タンパク質の加水分解物（特許文献２）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２３２７５１号公報
【特許文献２】特開２０１１−２２５４９５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】小川道雄：好中球エラスターゼ（へるす出版）P126-192, 1992
【非特許文献２】藤田 博、森田育男、室田誠逸：白血球による血管内皮細胞障害に対する各種プロテアーゼインヒビターの効果,炎症  11:501-502,1991
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
血管内皮細胞の障害によって引き起こされる各種疾患を予防のため、血管内皮細胞の障害に関与する白血球エラスターゼの阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはダイズの酸抽出物が優れたエラスターゼ阻害活性を示すことを見出し、本発明を完成させた。本発明は、白血球エラスターゼの阻害活性を持つダイズの酸抽出物を含むことを特徴とした血管内皮細胞保護剤であり、以下の構成からなる。
【０００８】
［１］  ダイズの酸抽出物を含むことを特徴とする血管内皮細胞保護剤。
［２］  ダイズの酸抽出物が、ダイズ胚芽の酸抽出物である［１］に記載の血管内皮細胞保護剤。
［３］  ダイズの酸抽出物が、ダイズの塩酸又はクエン酸抽出物である［１］又は［２］に記載の血管内皮細胞保護剤。
［４］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の血管内皮細胞保護剤を含む医薬組成物。
［５］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の血管内皮細胞保護剤を含む食品。
［６］  ［１］〜［３］のいずれかに記載の血管内皮細胞保護剤を含む飼料。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によると、ダイズの酸抽出物によるエラスターゼ阻害活性、とくに白血球由来エラスターゼの活性阻害効果により、天然由来で安全性の高い血管内皮細胞保護剤及びこれを含む医薬組成物、食品、飼料等を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のダイズの酸抽出物に用いられる原料となるダイズ（Glycine max）は、ダイズの全樹、花、蕾、子房、果実、葉、子葉、茎、芽、根、種子、乾燥種子、胚、胚芽、根等あらゆる部位を用いることができるが、好ましくは、ダイズの種子、乾燥種子、胚芽、胚であり、特に好ましくはダイズ胚芽である。
【００１１】
本発明における酸抽出物とは、原料となるダイズに酸溶液を投与し、酸性条件下で静置もしくは撹拌によりダイズから有効成分を抽出した抽出物のことをいう。酸性条件下とはｐＨ６以下の条件をいい、好ましくはｐＨ４以下であり、更に好ましくはｐＨ２以下である。酸性条件下での処理時間は、１０分間以上が好ましく、より好ましくは３０分間以上、１０分間より短いと、本処理工程における十分量の有効成分が抽出されない場合がある。上限は限定されないが、通常は２４時間以下、好ましくは１２時間以下、特に好ましくは６時間以下である。２４時間以上処理したとしても、有効成分の抽出量は飽和に向かい、その後新たに抽出できる量は限られると考えられる。
【００１２】
酸性条件下で処理するために使用される酸性溶液としては、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、リン酸、クエン酸、乳酸、プロピオン酸、酪酸、蓚酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、酒石酸、安息香酸、スルホサリチル酸及びギ酸からなる群より選ばれた少なくとも１種の酸性溶液が挙げられる。化粧品、食品、医薬品、医薬部外品、動物飼料への使用の観点から、塩酸及び／又はクエン酸の酸性溶液を使用することが好ましく、クエン酸の酸性溶液を使用することが特に好ましい。
【００１３】
本発明の別の態様において、ダイズの酸抽出を行う前工程として、ダイズをエタノールで処理する工程、及び／又はダイズを水で処理する工程を設けることができる。
【００１４】
ダイズをエタノールで処理する工程とは、原料となるダイズをエタノール溶液中に浸し、静置もしくは攪拌する工程をいう。本工程により、多糖類、ポリフェノール、二次代謝産物がエタノール中に抽出される。これらが抽出されることにより、本工程における抽出液の粘度が低下し、さらに次工程における抽出液の粘度も抑えることができて、作業性が大いに向上する。また、ダイズ中に含まれるポリアミン以外の成分が除去されることにより、最終的な酸抽出物における固形分当たりのポリアミン含量を向上させることができる。本工程におけるエタノール溶液の濃度は、好ましくは２０％（ｖ／ｖ）以上９０％（ｖ／ｖ）以下であり、さらに好ましくは３０％（ｖ／ｖ）以上７０％（ｖ／ｖ）以下である。２０％（ｖ／ｖ）より低い濃度では、多糖類、ポリフェノール、二次代謝産物等の抽出が不十分となって粘度が上昇してしまうと共に、ポリアミンの抽出量も多くなってしまい、好ましくない。一方、９０％（ｖ／ｖ）より高い濃度では、抽出効率が低下するため、やはり好ましくない。処理時間は抽出量により異なるが１０分間以上であることが好ましく、より好ましくは３０分間以上、さらに好ましくは１時間以上である。１０分間より短いと、本処理工程におけるポリアミン以外の成分が十分に抽出されない場合がある。上限は制限されないが、通常は２４時間以下で行われ、好ましくは１２時間以下、さらに好ましくは６時間以下で行われる。
【００１５】
ダイズを水で処理する工程とは、原料となるダイズを水中に浸し、静置もしくは撹拌により有効成分を抽出する工程をいう。「水」は酸溶液もしくはアルカリ溶液を加えていない水のことをいう。処理時間は抽出量により異なるが１０分間以上であることが好ましく、より好ましくは３０分間以上、さらに好ましくは１時間以上である。上限は制限されないが、通常は２４時間以下で行われ、好ましくは１２時間以下、特に好ましくは６時間以下で行われる。本工程における好ましい実施態様としては、前記ダイズをエタノールで処理する工程の後、遠心分離及び／又はろ過分離によって液体画分と植物体残渣や沈殿分と分離し、植物体残渣や沈殿分を回収して、本工程に処する。
【００１６】
ダイズの酸抽出を行う前工程として、ダイズをエタノールで処理する工程、及び／又はダイズを水で処理する工程を行った場合、ダイズの酸抽出の条件は、最終組成物の塩濃度の低減、及びステンレスタンクの腐食防止の観点から、弱酸条件であることが好ましい。これはエタノール処理及び／又は水処理を行うことにより、ダイズからの抽出物の粘度が低下して作業性が向上するとともに、強酸条件でなくても固形分あたりのポリアミンを含む有効成分を高濃度に得ることができるからである。具体的にはｐＨ３．０〜ｐＨ６．０の間で工程を実施することが好ましく、より好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ６．０の間である。ここでいうｐＨは、酸もしくは酸溶液投入後静置または攪拌により１０分経過後に測定した数値に基づく。
【００１７】
本発明における酸抽出物は、抽出工程の後、液体画分を分離し採取する工程を経て得ることができる。本工程は、ダイズを酸性条件下で処理した後、遠心分離及び／又はろ過分離によって液体画分と植物体残渣や沈殿分と分離し、液体画分を回収する工程である。回収された液体画分にはポリアミンが多く含まれていることが特徴である。
【００１８】
酸抽出物の製造工程において、必要に応じて酸性条件の溶液をｐＨ６．５〜ｐＨ７．５に調整する工程が含まれる。この工程は、液体画分を分離し採取する工程の前もしくは後のいずれにも行うことができるが、液体画分を分離し採取する工程の後に本工程を行うことが好ましい。ｐＨ調整は、アルカリ溶液を添加することにより行うことができ、アルカリ溶液としては、例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化バリウム、アンモニアの溶液などが挙げられる。中和した際に生じる塩の人体への安全性の観点から、水酸化ナトリウムを使用することが好ましい。
【００１９】
ダイズの酸抽出物の製造工程において、ポリフェノール吸着剤を添加することができる。ポリフェノール吸着剤としては、ポリビニルポリピロリドン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が好ましく使用できる。また、必要に応じて、イオン交換法、膜分画法、ゲル濾過法、電気透析法で脱塩処理や精製処理を行っても良い。
【００２０】
ダイズの酸抽出物は水溶液の形態もしくは粉体の形態で提供される。ダイズの酸抽出物の粉体は、酸性条件下での抽出後、遠心分離もしくはろ過分離によって回収した液体画分を、スプレードライもしくは真空凍結乾燥により処理することにより得ることができる。粉体にする場合は、賦形剤として結晶セルロース、酵素分解デキストリン、難消化性デキストリン、クラスターデキストリン、シクロデキストリン、マルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、デンプンなどを添加してもよい。
【００２１】
本発明のダイズの酸抽出物は、ポリアミンを多く含有することと特徴とする。ポリアミンとは、第１級アミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍的に存在する天然物であり、２０種類以上のポリアミンが見いだされている。例えば、１，３−ジアミノプロパン、プトレシン（またはプトレスシンとも呼ばれる）、カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチルノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ−ビス（アミノプロピル）カダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、カルドヘキサミン、ホモカルドヘキサミンなどが挙げられる。代表的なポリアミンとしてはプトレシン、スペルミジン、スペルミンがある。ダイズの酸抽出物は、ポリアミン以外の天然有効成分も含み、例えば、天然有効成分としては単糖、オリゴ糖等の糖類、ペプチド、蛋白質等が挙げられる。ポリアミンとポリアミン以外の天然有効成分を同時に含むことで、優れたエラスターゼ阻害活性を示す。
【００２２】
本発明の血管内皮細胞保護剤は、医薬組成物、食品、飼料等として提供することができる。
【００２３】
本発明の血管内皮細胞保護剤を配合してなる医薬組成物は、そのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物及びヒトに投与することができる。医薬組成物の剤型としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜に選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤などの経口剤、注射剤、坐剤などの非経口剤が挙げられる。
【００２４】
本発明において、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤はたとえばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などを用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の血管内皮細胞保護剤は０．０１から２０．０重量％、好ましくは０．０５から１０．０重量％含有する。
【００２５】
本発明の血管内皮細胞保護剤を配合してなる食品は、そのまま食品として調製したもの、他の食品に添加したもの、あるいはカプセル、錠剤など、食品または健康食品に通常用いられる任意の形態をとることができる。食品中に配合して摂取あるいは投与する場合には、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤などの形に成形することができる。また食品原料中に混合して食品を調製し、錠剤などの形に成形することができる。
【００２６】
本発明の血管内皮細胞保護剤を配合してなる飼料とは、そのまま調製したものまたは飼料に配合したものなど、様々な形態をとることができる。飼料中に混合して、家畜などの動物に投与する場合には、予め飼料の原料中に配合して、機能性を付与した飼料として調製することができる。また、飼料に添加して投与することもできる。すなわち、本発明の血管内皮細胞保護剤をブタ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ヒツジなどの家畜や魚類、ペット、などの飼料に添加することにより、安全で、血管内皮細胞保護効果を有する機能性飼料として用いることができる。
【実施例】
【００２７】
［実施例１：ダイズ酸抽出物の調製］
各１ｋｇのダイズ胚芽（大豆胚芽・粉タイプ，フォーユー社製）に各６Ｌの０．１Ｎ、０．５Ｎ、１Ｎの塩酸溶液を加えた。さらに、ポリフェノール吸着剤であるダイバガンＦ（ＢＡＳＦ社製）を各８０ｇ添加し、スリーワンモーターで室温下にて２時間攪拌して酸性条件下で抽出した。攪拌物を４℃、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離して液体画分を採取し、３０％の水酸化ナトリウム溶液で中和した後に４℃、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離して液体画分を採取し、本液をダイズ酸抽出物（ダイズ胚芽抽出物）とした。前記ダイズ酸抽出物を真空凍結乾燥に処し得られた粉末を３０％１，３−ブチレングリコール（ＢＧ）に溶解し、エラスターゼ阻害活性の評価に用いた。ダイズ酸抽出物の濃度はそれぞれ５質量％、２質量％、１質量％とした。
【００２８】
［実施例２：エラスターゼ阻害活性に関する試験］
エラスターゼの基質としてＭｅｔｈｏｘｙ―ｓｕｃｃｉｎｙｌ―Ａｌａ―Ａｌａ―ＰｒｏｐｙｌＶａｌ―Ｐ―ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ社製）を８０ｍＭになるようにＤＭＳＯに溶解し、反応緩衝液で８ｍＭに希釈した。ヒト白血球由来エラスターゼ（ＥＬＡＳＴＩＮ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＣＯＭＰＡＮＹ社製）は反応緩衝液で５μｇ／ｍｌになるよう希釈した。反応緩衝液として０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ・Ｎａ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を用いた。
【００２９】
９６ｗｅｌｌプレートに、８ｍＭエラスターゼ基質を２５μｌずつ分注し、実施例１で作成したＢＧ溶解ダイズ胚芽抽出物の試料を各５０μｌ添加した。氷上で５μｇ／ｍｌ エラスターゼを２５μｌずつ添加し、３５℃で６０分間インキュベート後、４１５ｎｍで吸光度を測定した。反応阻害率は次式より求めた。
阻害率(%)＝１００−（阻害物質存在下の吸光度/阻害物なしの吸光度）×１００
【００３０】
［比較例１］
ダイズ酸抽出物の比較対照として、ＢＧ溶解ダイズ熱水抽出物、ダイズエタノール抽出物をそれぞれ試料として用い、濃度を各５質量％、２質量％、１質量％に調製したものについて、実施例２と同様にエラスターゼ阻害活性に関する試験を行った。
【００３１】
［比較例２］
エラスターゼ阻害剤として知られているカニナバラ果実エキスを、２種の異なる濃度（４質量％及び２質量％）で試料として用い、実施例２と同様にエラスターゼ阻害活性に関する試験を行った。
【００３２】
実施例２及び比較例１，２の結果を表１に示す。本発明のダイズの酸抽出物は優れたエラスターゼ阻害活性を示した。一方ＢＧ溶解ダイズ熱水抽出物、ダイズエタノール抽出物、カニナバラエキスについては、ダイズの酸抽出物に比べてエラスターゼ阻害活性が極めて低い結果となった。
【００３３】
【表１】
0006701876.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、天然成分由来であり安全性の高い血管内皮細胞保護剤を提供することができ、敗血症、成人型呼吸緊迫症候群、急性心筋梗塞、動脈硬化に対して有効である。その他慢性関節リウマチ、変形性関節症、全身性炎症反応症候群、急性肺障害等の疾患治療・予防に有効である。また、エラスターゼの働きを抑えて、皮膚に弾力やハリを与えるエラスチンの変性・破壊を防止することにより皮膚の老化防止も期待できる。