(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｐ２）で表わされ、分子量が８０００以上である重合体。
【化１０】
0006789636.tif 000039
【化１１】
0006789636.tif 000040
【化１２】
0006789636.tif 000041
ただし、上記式（Ｐ２）において、ｎ２は１以上の整数であり、
Ｒ０は直鎖または分岐の炭素数１乃至５のアルキル基、または式（ｉ３）で表わされる基であり、
Ｌ０は炭素数１乃至１０のアルキレン基またはオキシアルキレン基、あるいはなくてもよく、Ｄ０は式（ｄ１−１０）であり、
Ｌ２は直鎖の炭素数１乃至３のアルキレン基であり、
Ｒ４２はＺ基、Ｂｏｃ基、トシル基、ノシル基のいずれかであり、
上記式（ｉ３）における＊は式（Ｐ２）の窒素原子に結合することを表わし、
上記式（ｄ１−１０）における＊＊は、式（Ｐ２）のＬ０またはＬ０が存在しない場合は式（Ｐ２）の繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを表わす。
【請求項２】
前記Ｒ０が下記式（ｉ４）または（ｉ５）で表わされる請求項１に記載の重合体。
【化１３】
0006789636.tif 000042
【化１４】
0006789636.tif 000043
ただし、上記式（ｉ４）、（ｉ５）における＊は前記式（Ｐ２）の窒素原子に結合することを表わす。
【請求項３】
下記式（ｉ６）または（ｉ７）を重合開始剤とし、サルコシンＮＣＡをモノマーとして重合反応を行い、重合する工程と、
前記工程で得られた重合体と下記式（ｄ１−１１）で表わされる化合物とを結合させる工程と、を有する重合体の製造方法。
【化１５】
0006789636.tif 000044
【化１６】
0006789636.tif 000045
【化１７】
0006789636.tif 000046
ただし、上記式（ｉ６）において、Ｒ４３は直鎖または分岐の炭素数１乃至５のアルキレン基であり、
上記式（ｉ７）において、Ｌ３は直鎖の炭素数１乃至３のアルキル基であり、Ｒ４４はＺ基、Ｂｏｃ基、トシル基、ノシル基のいずれかである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重合体、および前記重合体を有する光音響イメージング用造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算した画像を得ることができる。
ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものでも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、インドシアニングリーン（Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子を体内に投与し、造影剤として利用することもできる。ＩＣＧは、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高い近赤外波長領域の光をよく吸収することから、ＰＡＴ装置における造影剤（光音響造影剤と略すことがある）として好適に用いることができる。なお、本明細書において、ＩＣＧとは下記式の構造で示される化合物を指す。
【化１】
0006789636.tif 000002
ただし、対イオンはＮａ＋でなくてもよく、Ｈ＋あるいはＫ＋など任意の対イオンを用いることができる。なお、ＩＣＧは血中での半減期が数分程度と非常に短いことが知られている。
また、特許文献１では、近赤外色素にポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、以下ＰＥＧと略すことがある）を共有結合させた造影剤を用いて腫瘍集積を確認した例が報告されている。近赤外色素をＰＥＧに結合させることで、近赤外色素単独に比べて、血中での半減期を長くすることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１２−５２０８５６号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，（２００９），４５７，９１０−９１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特許文献１に開示された近赤外色素を結合させたＰＥＧでは、高い腫瘍集積性を示す一方で、血中滞留性も高いため、その腫瘍血液比が低いという課題がある。
そこで本発明では、腫瘍血液比が高い重合体および重合体を有する光音響イメージング用造影剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
下記式（Ｐ１）で表わされる重合体を提供する。
【化２】
0006789636.tif 000003
ただし、上記式（Ｐ１）中、Ｒは重合開始剤に由来する残基、または官能基のいずれかを表し、Ａは存在しなくとも良く、存在する場合は低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体、またはＤのいずれかを表し、Ｌはリンカーで、Ｌは存在しなくてもよく、ｎ１は１以上の整数であり、Ｄは近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明に係る重合体によれば、主鎖がポリサルコシンの構造を有するため、腫瘍に集積し、また時間がたつにつれ血中から排出されるため、腫瘍血液比が大きくなり、腫瘍を選択的に検出できる造影剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の重合体ＰＳ４を投与した後、２４時間目の担癌マウスの全身蛍光像。
【図２】本発明の重合体ＰＳ４および比較例ＰＥＧ１の腫瘍集積量と腫瘍血液比。（Ａ）投与後１０時間、（Ｂ）投与後２４時間。
【図３】（Ａ）本発明の重合体ＰＳ３投与後１０時間の腫瘍部と非腫瘍部の光音響信号画像とマウス全身写真との重ね合わせ。（Ｂ）本発明の重合体ＰＳ３投与後の腫瘍部と非腫瘍部の、投与前に対する投与後１０時間における光音響信号強度比。
【図４】本発明の重合体ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ７を投与した後、１、６、２４、４８時間目の担癌マウスの全身蛍光像。
【図５】本発明の重合体を投与した後、１、６、２４、４８時間目の担癌マウスの主要臓器からの蛍光強度。（Ａ）ＰＳ５、（Ｂ）ＰＳ６、（Ｃ）ＰＳ７。
【図６】担癌マウスへ投与した本発明の重合体ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ７の（Ａ）腫瘍集積量と（Ｂ）血中濃度の経時変化。
【図７】本発明の重合体ＰＳ７および比較例ＰＥＧ２の細胞取り込み評価。（Ａ）３７℃または４℃で、１または６時間培養した細胞取り込み評価。（Ｂ）各種阻害剤を用いた細胞取り込み阻害評価。
【図８】本発明の重合体ＰＳ７投与前および投与２４時間後の腫瘍部の光音響信号画像。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
（実施形態１  重合体）
（重合体）
本発明の実施形態に係る重合体について説明するが、本発明はこれらに限られない。本実施形態に係る重合体は、ポリサルコシンを主鎖とし、重合体末端に近赤外色素が結合した構造である。具体的には、下記式（Ｐ１）で表わされる。
【化３】
0006789636.tif 000004
上記式（Ｐ１）中、Ｒは重合開始剤に由来する残基、または官能基のいずれかを表し、Ａは存在しなくとも良く、存在する場合は低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体、またはＤのいずれかを表し、Ｌはリンカーで、Ｌは存在しなくてもよく、ｎ１は１以上の整数であり、Ｄは近赤外領域に吸収を持つ色素の色素骨格である。
【００１０】
（色素）
本実施形態に係る重合体の式（Ｐ１）中のＤの一例としては下記式（ｄ１）または（ｄ２）を挙げることができる。
【化４】
0006789636.tif 000005
【００１１】
上記式（ｄ１）において、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨまたはＣＲ１５を表しＲ１５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１３、Ｌ１４、Ｌ１５は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ１−ＳＯ３−、−ＲＤ１−ＳＯ３Ｘ１１を表す。ＲＣ１、ＲＤ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ１１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＥ１−ＳＯ３−、−ＲＦ１−ＳＯ３Ｘ１２、または、−ＲＧ１−ＣＯ２Ｘ１３を表す。Ｘ１２、Ｘ１３は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＥ１、ＲＦ１、ＲＧ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ１が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｚ１１は水素原子、−ＳＯ３Ｘ１４、またはＺ１１に結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−ＳＯ３Ｘ１５で置換されていてよい。Ｘ１４、Ｘ１５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかであり、＊はＬに結合する、または重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
【００１２】
上記式（ｄ２）において、Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨまたはＣＲ１０５を表し、Ｒ１０５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ１０１、Ｌ１０２、Ｌ１０３、Ｌ１０４、Ｌ１０５、Ｌ１０６、Ｌ１０７は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ１１−ＳＯ３−、−ＲＤ１１−ＳＯ３Ｘ１０１を表す。ＲＣ１１、ＲＤ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ１０１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＥ１１−ＳＯ３−、−ＲＦ１１−ＳＯ３Ｘ１０２、または、−ＲＧ１１−ＣＯ２Ｘ１０３を表す。Ｘ１０２、Ｘ１０３は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＥ１１、ＲＦ１１、ＲＧ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ１１が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ１１は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｚ１０１は水素原子、−ＳＯ３Ｘ１０４、またはＺ１０１に結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−ＳＯ３Ｘ１０５で置換されていてよい。Ｘ１０４、Ｘ１０５は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかであり、＊はＬに結合する、または重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
【００１３】
さらには、Ｄの例として、以下の（ｄ３）（ｄ４）を挙げることができる。
【化５】
0006789636.tif 000006
上記式（ｄ３）において、Ｒ２０１乃至Ｒ２１２は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＳＯ３Ｘ２１を表す。Ｘ２１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨまたはＣＲ２５を表し、Ｒ２５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ２−ＳＯ３−、−ＲＤ２−ＳＯ３Ｘ２２を表す。ＲＣ２、ＲＤ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ２２は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＥ２−ＳＯ３−、−ＲＦ２−ＳＯ３Ｘ２３、または、−ＲＧ２−ＣＯ２Ｘ２４を表す。Ｘ２３、Ｘ２４は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＥ２、ＲＦ２、ＲＧ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ２が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ２は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。＊はＬに結合する、または重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
上記式（ｄ４）において、Ｒ３０１乃至Ｒ３１２は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＳＯ３Ｘ３１を表す。Ｘ３１は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ３７は各々が同一でも異なっていてもよく、ＣＨまたはＣＲ３５を表し、Ｒ３５は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基を表す。Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３３、Ｌ３４、Ｌ３５、Ｌ３６、Ｌ３７は互いに４員環乃至６員環を形成していてもよい。Ｒ３１、Ｒ３２、Ｒ３３、Ｒ３４は各々が同一でも異なっていてもよく、水素原子、または、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＣ３−ＳＯ３−、−ＲＤ３−ＳＯ３Ｘ３２を表す。ＲＣ３、ＲＤ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。Ｘ３２は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＡ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基、−ＲＥ３−ＳＯ３−、−ＲＦ３−ＳＯ３Ｘ３３、または、−ＲＧ３−ＣＯ２Ｘ３４を表す。Ｘ３３、Ｘ３４は、水素原子、ナトリウム原子、カリウム原子、あるいはアンモニア、トリエチルアミン、リジン、またはアルギニンに由来する陽イオンのいずれかを表す。ＲＥ３、ＲＦ３、ＲＧ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。ＲＡ３が、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキル基の場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていて良い。ＲＢ３は、直鎖または分岐の炭素数１乃至１０のアルキレン基を表す。＊はＬに結合する、または重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）における繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを示す。
【００１４】
Ｒは上述のとおり、重合開始剤に由来する残基、あるいは官能基のいずれかを表わす。ここで、官能基とは、一般的な官能基全ての他、さらに、式（Ｐ１）においてＡで表わされる低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体などに由来する基を含む。Ａで表わされる低分子化合物、色素、レポーター分子、標的結合性分子、重合体などに由来する基とは、それらが、重合開始剤に由来する残基を介して結合したものを表わす。
【００１５】
本実施形態に係る重合体におけるＲとしての官能基としてはあらゆる基が含まれ、一例として、アルキル基、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、アジド基、ジアミン、スクシニミジエステル基、マレイミド基、スクシンイミド基を挙げることができる。また、Ａとしての低分子化合物の例としてゲフィチニブのような阻害薬が挙げられる。Ａとしてのレポーター分子の例として、放射性信号、磁場信号、超音波信号、蛍光信号、光超音波信号などの物理的な信号を発生する分子、治療用薬剤である、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、色素、抗癌剤などを挙げられる。Ａとしての色素の例として蛍光性化合物、燐光性化合物、近赤外光吸収性化合物が挙げられる。Ａとしての標的結合性分子の例としては、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。Ａとしての他の重合体の例としては、ポリエチレングリコールが挙げられるが、重合度は任意であり、エチレングリコールであってもよい。
【００１６】
また、Ｌが存在する場合、Ｌの一例として、下記式（ｌ１）乃至（ｌ１３）を含む構造、あるいはポリエチレングリコールを含む構造が挙げられる。下記式（ｌ１）乃至（ｌ１３）において＊は他の原子と結合することを示す。下記式（ｌ１）乃至（ｌ１３）は単独で使用しても良く、同一種類または複数種類を繰り返して使用しても良い。
【化６】
0006789636.tif 000007
前記の化学構造の中の＊は、前記Ｄまたは繰り返し単位の末端の炭素原子と直接結合または間接結合する。
【００１７】
前記Ｌの形成は、前記のＤに、例えば、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボキシル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−スクシンイミジルオキシ基、Ｎ−スルホスクシンイミジル基、Ｎ−マレイミドアルキル基、ヨードアセトアミド基、ブロモアセトアミド基、イソチオシアノ基、スルホン酸塩化物基、およびカルボン酸塩化物基等の反応性基を有するものを用い、結合反応を起す組合せで選ばれた前記反応性基の間で結合を生じさせることにより行うことができる。また、前記で生じた結合がシッフ塩基やカルボニル基を含む場合には、それらを還元して結合のさらなる安定化を図ることができる。
【００１８】
また、上記式（Ｐ１）の例として下記式（１）または（２）または（３）で表わされる重合体が挙げられる。なお、（２）で表わされる重合体においては、さらに、末端のフェニルメチレン基に直接、またはベンジルオキシカルボニル基を脱保護した上で、レポーター分子や標的結合性分子を導入することができる。ｎ１１、ｎ１２、ｎ１３は１以上の整数である。
【化７】
0006789636.tif 000008
【化８】
0006789636.tif 000009
【化９】
0006789636.tif 000010
【００１９】
（腫瘍血液比が大きくなる理由）
本実施形態に係る重合体の腫瘍血液比が大きくなる理由として考えられるメカニズムの一つについて説明する。ここでは、式（Ｐ１）の主鎖としてポリサルコシン（以下ＰＳＡＲと略すことがある）、およびＤで表わされる近赤外色素として、ＩＣＧを有する場合を例に説明する。これまでに前立腺癌などの腫瘍部位においてサルコシン濃度が増加することが報告されている（非特許文献１）。この機構に加えて、腫瘍近傍で血管が疎な状態となるＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（以下ＥＰＲと略すことがある）効果によって、血中に存在するＩＣＧ結合ＰＳＡＲは腫瘍に集積すると考えられる。また、ＰＳＡＲはサルコシンモノマーがアミド結合で結合したポリマーであり、その結合様式はポリペプチドと同一であることから、ポリペプチドと同様に生体内で酵素的分解を受けると考えられる。分解されたサルコシンモノマーはサルコシンデヒドロゲナーゼ（Ｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によってグリシンに変換され代謝されることが報告されている（非特許文献１）。そのため血中に滞留するプローブは時間が経過するにつれ、分解により代謝排泄されるため血中濃度が低下すると考えられる。その結果、腫瘍血液比が高くなる効果を奏する。一方で従来技術のＩＣＧ結合ＰＥＧは分解されず長期間血中に滞留するため、腫瘍血液比は低くなる。なお、サルコシンは式（ｓ１）で表わされ、以下では、ＳＡＲと略することがある。
【化１０】
0006789636.tif 000011
【００２０】
（光音響イメージング用造影剤）
本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、上記重合体単独であるか、または上記重合体と分散媒とを有する。分散媒として例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖水溶液が挙げられる。また本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、必要に応じて薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤などを有していても良い。本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、上記の分散媒に予め分散させておいてもよいし、キットにしておき、生体内に投与する前に分散媒に分散させて使用してもよい。本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、ＥＰＲ効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。さらに血中濃度は速やかに減少するため腫瘍血液比が高くなる効果を奏する。その結果、造影剤を生体内に投与した後、生体に光を照射して音響波を検出する際に、正常部位よりも腫瘍部位から大きな信号を検出することができる。以上のように本発明に係る光音響イメージング用造影剤は腫瘍の造影用として好適に用いることができる。
【００２１】
さらに、本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、その細胞取り込み機構を利用して関連する疾患をイメージングする用途に用いることもできる。例えば、実施例で記載したように、本発明の重合体はマクロピノサイトーシスによって細胞内に取り込まれていることが示唆されていることから、このような機構が亢進している疾患部位を選択的にイメージングする用途に有用なことが期待できる。
【００２２】
（重合体の製造方法）
本実施形態に係る重合体の製造方法は、以下の２つの工程を有する。
（１）重合開始剤を用いて、式（ｓ２）で表わされるサルコシンＮＣＡ（サルコシンα−アミノ酸−Ｎ−カルボン酸無水物）をモノマー（単量体ともいう）としてポリサルコシンを重合する工程、
（２）（１）で重合して得たポリサルコシンと近赤外色素とを結合させる工程。
なお、上記（１）（２）以外に、下記の工程を有していても良い。
（３）（２）の工程で得られた近赤外色素が結合したポリサルコシンを精製し純度を高める工程。
【化１１】
0006789636.tif 000012
【００２３】
（工程（１）について）
（サルコシン、ポリサルコシン）
本実施形態においてＳＡＲは、Ｎ−メチル−グリシン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌ  ｇｌｙｃｉｎｅ）とも表される。本実施形態の主鎖であるＰＳＡＲは、水溶性の高分子であり、高い生体適合性と低い細胞毒性という性質を有する。また、生体内で分解され代謝されることが期待される。以降で記載される分子量および平均分子量は、特に指定されない場合には、重量平均分子量を表わす。
【００２４】
本実施形態の重合体のＰＳＡＲの平均分子量は、６０００以上であることが好ましく、１３０００以上であることがさらに好ましい。平均分子量の上限値は１０００００以下の範囲であることが好ましく、５００００以下であることがさらに好ましい。すなわち、重合体の平均分子量は、好ましくは、６０００以上１０００００以下、さらに好ましくは６０００以上５００００以下、さらに好ましくは１３０００以上５００００以下である。
平均分子量が６０００以上であれば、ＥＰＲ効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。また、重合体の分子量増大に伴い、重合反応の進行が困難になること、および溶液粘性が増大することから重合体の分子量は５００００以下であることが好ましい。このような特徴を有するＰＳＡＲと色素からなる本実施形態に係る重合体および該重合体を有する光音響イメージング用造影剤は、腫瘍部へ集積する一方で、血中濃度は速やかに減少するため腫瘍血液比が高くなる効果を奏する。
なお、本実施形態の重合体の分子量はＧＰＣ法やプロトンＮＭＲ法によって測定することができる。
【００２５】
ＳＡＲは、α−アミノ酸の重合反応と同様の反応様式によりポリマー化しＰＳＡＲを生成する。重合反応としては任意の方法を用いることができるが、α−アミノ酸−Ｎ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を用いる方法が、高重合度のポリマーが得られるため好ましい。ＳＡＲのＮＣＡ作製方法としては、例えばジオキサン（Ｄｉｏｘａｎｅ）や、テトラヒドロフラン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ）などの有機溶媒中でのＳＡＲとホスゲンとの反応や、カルボベンゾキシ（Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ）基（ベンジルオキシカルボニル（Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）基とも呼ぶ）で保護されたＳＡＲ（Ｎ−α−Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙｓａｒｃｏｓｉｎｅ）と塩化チオニル（Ｔｈｉｏｎｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）との反応を挙げることができる。
【００２６】
（重合開始剤）
重合開始剤としては任意の物質を用いることができるが、常温において効率良く反応を進行させる重合開始剤としては、アミンおよびアルコキシド（特に有機金属アルコキシド）が好ましい。重合は一般的な反応に基づき実施することができるが、ＮＣＡの加温による分解や水分の混入による副反応を抑制することが好ましい。例えば、不活化ガス（窒素ガス）で充填したグローブボックス内で十分水分を除去し、不活化ガスで充填したシュレンク管を用いて室温で長時間撹拌する方法が挙げられる。また、重合反応時に不活化ガスを流し続けていることで、反応時に生じる二酸化炭素を除去することができ、高分子量体が得られるため好ましい。ＰＳＡＲの重合度は、重合開始剤に対するＳＡＲのＮＣＡの物質量比で調整することができる。高分子量のＰＳＡＲの重合のためには、下式（ｉ１）または、（ｉ２）から選択される重合開始剤が工業的利便性および純度の高さの観点から好ましい。
【化１２】
0006789636.tif 000013
【化１３】
0006789636.tif 000014
【００２７】
ここで、式（ｉ１）において、Ｒ４１は直鎖または分岐の炭素数５以下のアルキル基であり、Ａ４０は水素原子または、Ｒ４１である。式（ｉ２）において、Ｌ１は直鎖の炭素数３以下のアルキレン基であり、Ｐｒｏはベンジルオキシカルボニル（以下、Ｃｂｚ、または、Ｚと略すことがある）基、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（以下、Ｂｏｃと略すことがある）基、ｐ−トルエンスルホニル（以下、トシル、または、Ｔｏｓ、または、Ｔｓと略すことがある）基、２−ニトロベンゼンスルホニル（以下、ノシル、Ｎｓと略すことがある）基のいずれかであり、Ａ５０は水素原子または、直鎖または分岐の炭素数５以下のアルキル基である。なお、Ｐｒｏは保護基であり、重合反応の後、脱保護することができ、また、保護基を介して、さらにレポーター分子や標的結合性分子を結合すること、あるいは保護基をレポーター分子や標的結合性分子で置換することもできる。
【００２８】
本実施形態に係る重合体の主鎖であるＰＳＡＲには、以下に示す種々の方法で官能基を導入し機能化することができる。例えば、重合開始剤に由来するα位へ導入できる官能基には、アルケニル基、アルキル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基等が挙げられる。アルキンはクリック反応によってアジド−アルキン環状付加させることができる。また、アルケンは、ｔｈｉｏｌ−ｅｎｅクリック反応によってチオール基を有する化合物を付加させることができる。別の例として重合反応終了時においてＰＳＡＲのω位は、２級アミンであるため、これに反応させることのできる官能基であれば任意のものを使用することができる。
【００２９】
（工程（２）について）
具体的に、本実施形態に係る重合体および該重合体を有する光音響イメージング用造影剤では、ＰＳＡＲの２級アミンへスクシニミジエステル基を有する色素を反応させることにより、色素を共有結合させているが、色素の導入方法はこれに限定されない。上述の反応によって重合体の主鎖であるＰＳＡＲにレポーター分子や標的結合性分子を導入することができる。ここで、レポーター分子とは、放射性信号、磁場信号、超音波信号、蛍光信号、光超音波信号などの物理的な信号を発生する分子や治療用薬剤を意味し、放射性ハロゲン、放射性同位元素、常磁性金属イオン、酸化鉄粒子、金ナノ粒子、マイクロバブル、色素、抗癌剤などが例として挙げられる。色素の例として蛍光性化合物、燐光性化合物が挙げられるが、光超音波信号を発生する分子としては、目的に応じた波長域の光を吸収する性質を有していればよい。レポーター分子を有していることにより、コントラストを強調する造影剤としての利用が可能である。ここで、標的結合性分子とは、腫瘍やその周辺部などに特異的な標的に選択的に結合する物質であり、生体分子や医薬品等の化合物から任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。標的結合性分子が結合された化合物を用いることで、腫瘍やその周辺部などに特異的な標的の検出を可能にし、動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
【００３０】
（近赤外色素）
本実施形態に用いられる色素は、蛍光信号、光超音波信号などの物理的な信号を発生する分子である。本実施形態に係る重合体は色素を一つ以上有することで、診断用造影剤として用いることができ、最も好ましくは光音響イメージング用造影剤として使用することができる。前記色素の中でも人体の透過性の比較的高い近赤外波長領域の光を吸収する性質を有する色素が好ましい。本実施形態に用いられる色素の例としては蛍光色素が挙げられるが、蛍光量子収率の低い色素は、吸収したエネルギーが、蛍光よりも光音響信号に多く使用されることから好ましい。さらに蛍光色素が消光状態にある場合でも光を吸収する性質を有している場合には、光音響信号を得ることができる。ここで、近赤外波長領域とは、６００ｎｍ以上１３００ｎｍの範囲である。本実施形態における近赤外有機色素としては、例えば、アジン系色素、アクリジン系色素、トリフェニルメタン系色素、キサンテン系色素、ポルフィリン系色素、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、スチリル系色素、ピリリウム系色素、アゾ系色素、キノン系色素、テトラサイクリン系色素、フラボン系色素、ポリエン系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、インジゴイド系色素を挙げることができる。別の例としては、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、ＩＣＧ−ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（登録商標）、ＩＣＧ−ＥＧ４−ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（登録商標）、ＩＣＧ−ＥＧ８−ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（登録商標）（同仁化学社製）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０などのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｊａｐａｎ社製）、Ｃｙ（登録商標）系色素（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、ＩＲ−７８３、ＩＲ−８０６、ＩＲ−８２０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｊａｐａｎ社製）、ＩＲＤｙｅ  ７００ＤＸ（登録商標）、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ（登録商標）、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ（登録商標）（ＬＩ−ＣＯＲ社製）、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ７９５ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、ＡＤＳ８３２ＷＳ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｙｅ  Ｓｏｕｒｃｅ社製）、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）系色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）系色素（ＡｎａＳｐｅｃ社製）、ＤＹ（登録商標）系色素（Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）を挙げることができる。スクシニミジエステル基を有する色素はＰＳＡＲと反応し共有結合を形成することができるため好ましい。一般市販の色素へスクシニミジエステル基のような官能基を導入しＰＳＡＲと結合させることもできる。色素は非共有結合、共有結合のいずれか、またはその組み合わせでＰＳＡＲと結合することができる。体内に投与する場合は色素と主鎖であるＰＳＡＲが一定時間以上は一体化した状態で存在することが望ましいことから、重合体内で色素とＰＳＡＲは共有結合で結合していることが望ましい。
【００３１】
また、本実施形態に用いられる色素の例として、下記式（ｄ１−１）乃至（ｄ１−１０）が挙げられる。
【化１４】
0006789636.tif 000015
【化１５】
0006789636.tif 000016
【化１６】
0006789636.tif 000017
【化１７】
0006789636.tif 000018
【化１８】
0006789636.tif 000019
【化１９】
0006789636.tif 000020
【００３２】
上記式（ｄ１−１）乃至（ｄ１−１０）において＊は前記式（Ｐ１）または式（１）Ｌに結合すること、あるいは、重合体がＬを含まない場合は、式（Ｐ１）または式（１）の繰り返し単位の末端の炭素原子に直接結合することを示す。
【００３３】
（工程（３）について）
本実施形態に係る重合体の精製方法としては、種々のカラムを用いたクロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙを含む）や透析精製法、再結晶法が挙げられるが、これに限定されない。本実施形態に係る重合体のうち、特にＩＣＧを結合させた場合、未反応ＩＣＧの除去にはメタノールを透析外液に用いた透析精製法が有効である。これは以下のように説明することができる。ＩＣＧは、特に水系溶媒において、クロマトグラフィー担体と相互作用し、重合体への結合体と未反応体を分離することが困難である。透析法においても水系溶媒では重合体と非特異的に相互作用し、分離が困難である。一方で、メタノールを用いた透析法では、未反応のＩＣＧは重合体から遊離し、透析外液へ拡散するため純度の高い重合体を得ることができる。
【００３４】
（光音響イメージング方法）
生体内に投与された本発明に係る光音響イメージング用造影剤を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。本発明に係る光音響イメージング用造影剤を検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本発明に係る光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本発明に係る光音響イメージング用造影剤が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｂ）前記検体内に存在する前記光音響イメージング用造影剤から発生する音響波を検出する工程
【００３５】
また、本発明に係る光音響イメージング用造影剤は、前記（ｂ）で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなもの構わないし、２次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。上記（ａ）の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係る重合体を投与された検体を用いることができる。また、上記（ｂ）の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係る重合体から発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。上記（ｂ）の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射させることができれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製）、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８、Ｅｎｄｒａ  Ｉｎｃ．製）を用いて行うことができる。
【００３６】
本発明に係る光音響イメージング用造影剤を用いたイメージング方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。
【００３７】
（実施形態２）
本発明のさらなる実施形態として、以下の重合体を挙げることができる。
下記式（Ｐ２）で表わされ、分子量が８０００以上である重合体。
【化２０】
0006789636.tif 000021
【化２１】
0006789636.tif 000022
【化２２】
0006789636.tif 000023
ただし、上記式（Ｐ２）において、ｎ２は１以上の整数であり、Ｒ０は直鎖または分岐の炭素数１乃至５のアルキル基、または式（ｉ３）で表わされる基であり、Ｌ０は炭素数１乃至１０のアルキレン基またはオキシアルキレン基、あるいはなくてもよく、Ｄ０は式（ｄ１−１０）であり、
Ｌ２は直鎖の炭素数１乃至３のアルキレン基であり、Ｒ４２はＺ基、Ｂｏｃ基、トシル基、ノシル基のいずれかであり、上記式（ｉ３）における＊は式（Ｐ２）の窒素原子に結合することを表わし、上記式（ｄ１−１０）における＊＊は、式（Ｐ２）のＬ０またはＬ０が存在しない場合は式（Ｐ２）の繰り返し単位の末端の炭素原子に結合することを表わす。
【００３８】
なお、Ｒ０は下記式（ｉ４）または（ｉ５）で表すことができる。
【化２３】
0006789636.tif 000024
【化２４】
0006789636.tif 000025
ただし上記式（ｉ４）、（ｉ５）における＊は前記式（Ｐ２）の窒素原子に結合することを表わす。
【００３９】
さらに本実施形態は、下記式（ｉ６）または（ｉ７）を重合開始剤とし、サルコシンＮＣＡをモノマーとして重合反応を行い、重合する工程と、前記工程で得られた重合体と下記式（ｄ１−１１）で表わされる化合物とを結合させる工程と、を有する重合体の製造方法を含む。
【化２５】
0006789636.tif 000026
【化２６】
0006789636.tif 000027
【化２７】
0006789636.tif 000028
ただし、上記式（ｉ６）において、Ｒ４３は直鎖または分岐の炭素数１乃至５のアルキレン基であり、上記式（ｉ７）において、Ｒ４４はＺ基、Ｂｏｃ基、トシル基、ノシル基のいずれかである。
【００４０】
（実施形態３）
本発明のさらなる実施形態として、下記式（Ｐ３）で表わされ、分子量が８０００以上である重合体を含むことができる。
【化２８】
0006789636.tif 000029
【化２９】
0006789636.tif 000030
ただし、上記式（Ｐ３）において、ｎ３は１以上の整数であり、Ｒ２は直鎖または分岐の炭素数１乃至５のアルキル基、または式（ｉ３）で表わされる基であり、上記式（ｉ３）における＊は式（Ｐ３）の窒素原子に結合することを表わし、Ｌ２は直鎖の炭素数１乃至３のアルキレン基であり、Ｒ４２はＺ基、Ｂｏｃ基、トシル基、ノシル基のいずれかである。
【００４１】
本実施形態は、下式（ｉ１）または（ｉ２）を重合開始剤とし、サルコシンＮＣＡをモノマーとして重合反応を行い得られる重合体の製造方法を含む。
【化３０】
0006789636.tif 000031
【化３１】
0006789636.tif 000032
ただし、式（ｉ１）において、Ｒ４１は直鎖または分岐の炭素数５以下のアルキル基であり、Ａ４０は水素原子または、Ｒ４１である。式（ｉ２）において、Ｌ１は直鎖の炭素数３以下のアルキレン基であり、ＰｒｏはＺ基、Ｂｏｃ基、トシル基、ノシル基のいずれかであり、Ａ５０は水素原子または、直鎖または分岐の炭素数５以下のアルキル基である。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を用いてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００４３】
［実施例１］
（色素結合ＰＳＡＲの合成）
Ｎ−α−Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙｓａｒｃｏｓｉｎｅ（国産化学株式会社製、５ｇ）と塩化チオニル（和光純薬工業株式会社製、５ｍＬ）を混合し、５５℃に加温したオイルバスで５〜１０分間加温した。反応後の溶液を石油エーテル（ナカライテスク株式会社製、１００ｍｌ）に滴下し非溶解性の物質を析出させ、良く混和した後、ガラスフィルターを用いてろ過することにより析出物を回収した。前記析出物を充分真空乾燥した後、超脱水酢酸エチル（和光純薬工業株式会社製、２０ｍｌ）に溶解させた。ガラスフィルターで非溶解性の物質を除去した後、石油エーテル（５０ｍｌ）に滴下し非溶解性の物質を析出させ、良く混和した。その後、ガラスフィルターを用いてろ過することにより析出物を回収し、真空乾燥後、超脱水酢酸エチルへの溶解、フィルター除去、石油エーテルの添加という一連の操作を２回繰り返した。上述の操作により、ＳＡＲのＮＣＡを回収した。（１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）＝４．１３（２Ｈ、ｓ、−ＣＨ２−ＣＯ−）、３．０５（３Ｈ、Ｓ、−ＣＨ３））
【００４４】
重合反応における重合開始剤としては、ヘキシルアミン（Ｈｅｘｙｌａｍｉｎｅ、以下ＨＥＡと略す、和光純薬工業社製）、または、Ｎ−カルボベンゾキシ−１，２−ジアミノエタン（Ｎ−Ｃａｒｂｏｂｅｎｚｏｘｙ−１，２−ｄｉａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ、以下Ｚ−ＥＤＡと略す、東京化成工業株式会社製）または、ネオペンチルアミン（Ｎｅｏｐｅｎｔｈｙｌａｍｉｎｅ、以下ＮＰＡと略す、東京化成工業株式会社製）を使用し、反応溶媒としては超脱水ジメチルホルムアミド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、以下ＤＭＦと略すことがある、和光純薬工業株式会社製）を使用した。重合反応は、充分水分を除去し窒素ガスで置換したシュレンク管中で混和し、室温でおこなった。重合反応における、重合開始剤の種類、重合開始剤とモノマーの反応開始時の物質量に基づく混合割合、重合反応時間は表１に示した。反応後の溶液を氷冷ジエチルエーテル（和光純薬工業株式会社製、２０ｍｌ）に溶解させ、析出したＰＳＡＲを遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、１５分）により回収した。回収したＰＳＡＲ（１００ｍｇ）を５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５、１ｍｌ）に溶解させ、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（同仁化学研究所製、１ｍｇ／１００μｌ  ジメチルスルフォキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、以下ＤＭＳＯと略すことがある、和光純薬工業株式会社製））を加えて遮光下で室温にて２４時間反応させた。反応後の溶液をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）７  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（スペクトラム  ラボラトリーズ社製）を用いてメタノール（キシダ化学株式会社製）に対して透析することにより精製した。ＰＳＡＲとＩＣＧの結合は電気泳動により確認した。作製したＰＳＡＲとＩＣＧの結合体である重合体を表１にまとめる通り、ＰＳ１、ＰＳ２、ＰＳ３およびＰＳ４と以降では呼ぶ。上述の方法で得られたＰＳ１は上述の式（３）で表わされ、ｎ１３はＰＳＡＲ部分の平均分子量が３８００となる整数である。同様に、ＰＳ２およびＰＳ３は上述の式（２）で表わされ、ｎ１２はＰＳＡＲ部分の平均分子量が６０００（ＰＳ２）または８０００（ＰＳ３）となる整数である。同様に、ＰＳ４は上述の式（１）で表わされ、ｎ１１はＰＳＡＲ部分の平均分子量が２６０００となる整数である。
【００４５】
【表１】
0006789636.tif 000033
【００４６】
［実施例２］
（分子量評価）
作製した重合体ＰＳ１からＰＳ４のＩＣＧ結合前のＰＳＡＲの分子量をＧｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（以下、ＧＰＣと略すことがある）システム（株式会社島津製作所製）により評価した。具体的には、システムコントローラとしてＣＢＭ−２０Ａ、分析用送液ユニットとしてＬＣ−２０ＡＤ、オンライン脱気ユニットとしてＤＧＵ−２０Ａ３、カラムオーブンとしてＣＴＯ−２０ＡＣ、示差屈折率検出器としてＲＩＤ−１０Ａ、ＵＶ−ＶＩＳ検出器としてＳＰＤ−２０Ａ、ＬＣワークステーション、ＧＰＣソフトウェアから構成されるＧＰＣシステムを用いた。分析用カラムとしてＰＬｇｅｌ  ＭＩＸＥＤ−Ｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、溶離液としてＤＭＦを用いた。標準分子量物質としてポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、以下ＰＥＧと略すことがある）を用いてキャリブレーションを実施した。ＰＳＡＲのＤＭＦ溶液を流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで４０℃に設定したカラムへ流し、溶出時間から分子量を算出した（表１）。モノマーの仕込み割合と反応時間の増加に伴って平均分子量が増加した。また、重合開始剤としてＮＰＡを用いた場合に最も分子量が増加する傾向が見られた。
【００４７】
［実施例３］
（腫瘍集積性評価および血中濃度評価）
本発明の実施例において腫瘍塊への重合体の移行量の評価は腫瘍移植モデルマウスを用いて行った。マウスには雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃ  ｓｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、床敷きを用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。前記マウスに、１０６個のマウス直腸がん細胞株（ｃｏｌｏｎ２６）を皮下移植し、腫瘍塊サイズが５〜１０ｍｍになるまで飼育した。腫瘍移植マウスへ本発明の重合体を色素量で１３ｎｍｏｌ投与し、投与１日後における腫瘍移植マウスの蛍光イメージングを実施した。蛍光イメージングはＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて行った。本発明の重合体ＰＳ４を腫瘍移植マウスに投与し、１日後に全身蛍光像を撮像した結果が図１である。腫瘍へ集積した重合体ＰＳ４からの強い蛍光を観察した。
【００４８】
本発明の重合体の腫瘍集積性を確認するために、重合体投与１０時間後または１日後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、腫瘍組織を摘出した。腫瘍組織にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（和光純薬工業株式会社製）水溶液を添加してホモジネートした後に、ＤＭＳＯを加えて色素を抽出し色素抽出溶液を作製した。一方で、何も投与していない腫瘍移植マウスからも癌組織を摘出し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液を添加して腫瘍ホモジネート溶液を調製した。次いで、既知濃度の重合体を、前記腫瘍ホモジネート溶液で種々の濃度へ希釈し、この希釈溶液に対し、ＤＭＳＯを加えて色素を抽出した検量用標準液を調製した。ＩＶＩＳ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、または、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、色素抽出溶液および検量用標準液の蛍光強度を測定することで腫瘍組織中の色素量を定量した。腫瘍組織の単位重量あたりの、投与量に対する腫瘍組織への色素移行率（腫瘍集積量とも呼ぶ、％ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｄｏｓｅ／ｇ：％ＩＤ／ｇと略す）を算出した。
【００４９】
前記腫瘍集積性評価において、本発明の重合体の投与１０時間後または１日後にマウスを炭酸ガスで安楽死させる直前に、尾静脈から血液を採取した。採取した血液にＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液を添加して、次いでＤＭＳＯを加えて色素を抽出し色素抽出血液溶液を作製した。一方で、既知濃度の本発明の重合体を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液で種々の濃度に希釈し、希釈した溶液と、同量の未投与マウスから採取した血液とを混合した。次いで、この血液との混合溶液に対し、さらにＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００水溶液およびＤＭＳＯを添加して検量用標準血液溶液を作製した。ＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ、または、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、色素抽出血液溶液および検量用標準血液溶液の蛍光強度を測定することで血液中の色素量（％ＩＤ／ｇ）を定量した。腫瘍集積量と血液中の色素量から腫瘍集積量を血液の色素量で除した値（以下、腫瘍血液比、またはＴ／Ｂと略す）を算出した。結果を表２および表３にまとめた。ＰＳ１は投与後１０時間および２４時間のどちらの時間でも腫瘍集積量が低く、腫瘍造影には適していないことが示された。一方で、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４は投与後１０時間および２４時間のどちらの時間でも、光音響による腫瘍イメージングに資する腫瘍集積量であり、また重合体の分子量が増加するに伴い腫瘍集積量が増加することを確認した。また、ＰＳ２、ＰＳ３、ＰＳ４はいずれの時間においても腫瘍血液比が２を超えており、血液からの光音響信号と腫瘍部位の光音響信号をコントラスト良く分離できる可能性が示された。
【００５０】
【表２】
0006789636.tif 000034
【００５１】
【表３】
0006789636.tif 000035
【００５２】
［比較例１］
（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と色素の結合体）
末端にモノアミノ基を有するＰＥＧ（ＭＥ−２００ＥＡ（日油社製、重量平均分子量２００００））とＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとの結合体は定法に従って作製した（ＰＥＧ１）。ＰＥＧとＩＣＧの結合は電気泳動により確認した。上述の方法で作製したＰＥＧ１は下式（Ｐｇ１）で表わされ、ｎ１４はＰＥＧ部分の平均分子量が２００００となる整数である。
【化３２】
0006789636.tif 000036
前述の本発明の重合体と同じ方法で、ＰＥＧ１の腫瘍集積量と血液中の色素量、および腫瘍血液比を定量し、表２および表３にまとめた。ＰＥＧ１は、腫瘍集積量は高いものの投与後１０時間での腫瘍血液比は０．５と低かった。また、投与後２４時間においても腫瘍血液比は１．７であった。本発明の重合体ＰＳ４と、ＰＥＧ１について比較した結果、投与後１０時間における腫瘍集積量および腫瘍血液比はＰＳ４が有意に高い値を示した（図２Ａ）。さらに投与後２４時間における腫瘍血液比についてもＰＳ４が有意に高い値を示した（図２Ｂ）。ここで有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより行いＰ＜０．０５を有意差ありと判定した。
【００５３】
［実施例４］
（ｉｎ  ｖｉｖｏ光音響腫瘍イメージング）
本発明の実施例においてｉｎ  ｖｉｖｏ光音響腫瘍イメージングは、光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ．Ｉｎｃ．製）を用いて実施した。前述の腫瘍集積性評価と同様に作製した担癌マウスを、麻酔で眠らせた後、イメージング装置に固定し、本発明の重合体を投与する前、投与後１０時間後において光音響信号を測定し、それぞれの３次元再構成データを得た。投与後１０時間後において得られた３次元再構成データを用いてＯｓｉｒｉＸ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより光音響信号画像を描出し、マウス全身画像と重ね合わせた（図３Ａ）。さらにＧＥＨＣ  ＭＩＣＲＯＶＩＥＷ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｃａｒｅ社製）により腫瘍領域に関心領域（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆＩｎｔｅｒｅｓｔ）を設定し、各時間における光音響信号強度を計測した後、本発明の重合体を投与する前の光音響信号強度に対する、投与後１０時間の光音響信号強度の比を算出した（図３Ｂ）。本発明の重合体ＰＳ３を投与した担癌マウスにおいて、投与後１０時間において腫瘍部では非腫瘍部（大腿部）に比較して有意に高い光音響信号が確認されたことから本発明の重合体の光音響イメージング用造影剤としての有用性が示された。
【００５４】
［実施例５］
（色素結合ＰＳＡＲの合成）
実施例１に記載した方法と類似の方法で重合反応を行った。具体的には、重合開始剤としてＮＰＡ、反応溶媒として超脱水ＤＭＦを、充分水分を除去し窒素ガスで置換したシュレンク管中でモノマー（ＳＡＲのＮＣＡ）と混和し、室温で反応させた。重合反応における、重合開始剤の種類、重合開始剤とモノマーの反応開始時の物質量に基づく混合割合、重合反応時間は表４に示した。反応後の溶液を氷冷ジエチルエーテルと混合し、析出したＰＳＡＲを遠心分離（２０００ｒｐｍ、４℃、１５分）により回収した。回収したＰＳＡＲの分子量は前述のＧＰＣシステムを用いて、分析用カラムとしてＫＤ８０３（昭和電工社製）を用い、溶離液としてＤＭＦを用いた。標準分子量物質としてＰＥＧを用いてキャリブレーションを実施した。ＰＳＡＲのＤＭＦ溶液を流速１ｍｌ／ｍｉｎで４０℃に設定したカラムへ流し、溶出時間から分子量を算出した。回収したＰＳＡＲを５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．６、１ｍｌ）に溶解し、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（１ｍｇ／１００μｌ  ＤＭＳＯ溶液）を、ＰＳＡＲ：ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ＝１：１となるように混合し、遮光下で室温にて２４時間反応した。反応後の溶液をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）７  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＷＣＯ：３．５ｋＤａ）を用いてメタノールに対して透析することにより精製した。ＰＳＡＲとＩＣＧの結合を吸光度と重さにより確認した結果、得られた重合体ＰＳ５、ＰＳ６，ＰＳ７のいずれにおいても、１分子のＰＳＡＲに対し、約１分子のＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕが結合していた。さらに、電気泳動による分析の結果、９５％以上のＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕがＰＳＡＲに共有結合していた。上述の方法で得られたＰＳ５、ＰＳ６、およびＰＳ７は上述の式（１）で表わされ、ｎ１１はＰＳＡＲ部分の平均分子量が８０３０（ＰＳ５）、１７５４０（ＰＳ６）、３１５００（ＰＳ７）となる整数である。
【００５５】
【表４】
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【００５６】
［実施例６］
（体内分布評価）
実施例３と同様の方法にて重合体ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ７の体内分布を評価した。具体的には、Ｃｏｌｏｎ２６腫瘍移植マウスへ本発明の重合体を色素量で５ｎｍｏｌ投与し、投与から１、６、２４、４８時間後における腫瘍移植マウスの蛍光イメージングを、ＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍにて実施した。重合体ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ７をそれぞれ投与したマウスの全身蛍光像を撮像した結果が図４である。腫瘍へ集積した重合体ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ７からの強い蛍光を観察した。
【００５７】
続いて、重合体ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ７を投与した腫瘍移植マウスを、投与から１、６、２４、４８時間後に安楽死させ、主要な臓器を摘出し蛍光イメージングを実施した。結果を図５にまとめた。どの重合体も腫瘍から強い蛍光を観察した。図５に示す以外では、肝臓と腎臓に比較的強い蛍光がみられた。
【００５８】
重合体ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ７の腫瘍集積性、血中色素量および腫瘍血液比を上述の方法により求めた。結果を図６および表５にまとめた。その結果、重合体ＰＳ７が、ＰＳ５およびＰＳ６に比較して多く腫瘍へ集積した。血中から消失するまでの時間は、重合体の分子量が大きくなるに従い延長した。また投与２４時間後において、ＰＳ５、ＰＳ６、ＰＳ７の腫瘍血液比が２を超えており、腫瘍部位の光音響信号をコントラスト良く識別できる可能性が示された。
【００５９】
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【００６０】
［比較例２］
（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と色素の結合体）
末端にモノアミノ基を有するＰＥＧ（ＭＥ−３００ＥＡ（日油社製、重量平均分子量３００００））とＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕとの結合体は定法に従って作製した（ＰＥＧ２）。ＰＥＧとＩＣＧの結合体の生成は電気泳動により確認した。上述の方法で作製したＰＥＧ２は上述の式（Ｐｇ１）で表わされ、ｎ１４はＰＥＧ部分の平均分子量が３００００となる整数である。
実施例６と同じ方法で、ＰＥＧ２の腫瘍集積量と血液中の色素量、および腫瘍血液比を定量し、表５にまとめた。投与２４時間後のＰＥＧ２の腫瘍集積量は高いものの、腫瘍血液比は０．６と低かった。重合体ＰＳ７と、ＰＥＧ２について投与２４時間後の腫瘍血液比を比較した結果、重合体ＰＳ７が有意に高い値を示した。ここで有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより行いＰ＜０．０５を有意差ありと判定した。
【００６１】
［実施例７］
（細胞取り込み実験）
重合体ＰＳ７、および、比較例２で作製したＰＥＧ２の細胞取り込みについて蛍光測定により評価した。Ｃｏｌｏｎ２６細胞は６ウェルプレートで２日間培養した。その後、重合体ＰＳ７、および、ＰＥＧ２（各５００μＭ  ＩＣＧ）を培地に添加し、１時間または６時間３７℃で培養した。続いて、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと略すことがある）で洗浄し、細胞を回収した。細胞塊の蛍光測定はＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍで実施し、求めた蛍光強度は細胞数で補正した。上述の細胞取り込み実験を、能動輸送機構の関与を評価するために４℃の条件でも同様に実施した。その際の培養液は、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、２５ｍＭＨＥＰＥＳ含有）で実施した。結果を図７Ａにまとめた。
１時間または６時間３７℃で培養した場合、重合体ＰＳ７を添加した細胞塊からの蛍光強度は、ＰＥＧ２の結果の蛍光強度と比較して有意に高かった（Ｐ＜０．００１）。ここで有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより行った。また、ＰＳ７の蛍光強度は、４℃で培養した場合に大幅に（９４％）低下した。
続いて、重合体ＰＳ７、および、ＰＥＧ２の細胞取り込み機構を調べるために、エンドサイトーシス阻害剤を用いて細胞取り込みを評価した。エンドサイトーシス阻害剤として、アミロライド（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ：マクロピノサイトーシス阻害剤、１ｍＭ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ：カベオラ介在エンドサイトーシス阻害剤、２００μＭ）、クロルプロマジン（ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ：クラスリン介在エンドサイトーシス阻害剤、７μＭ）、サイトカラシンＤ（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎｅ  Ｄ：ファゴサイトーシス阻害剤、５μＭ）を、６ウェルプレートで２日間培養したＣｏｌｏｎ２６細胞に添加した。添加１時間後に、重合体ＰＳ７およびＰＥＧ２（各５００μＭ  ＩＣＧ）を添加し、６時間培養した。また、阻害剤を添加せずに同時間培養した場合をコントロールとした。続いてＰＢＳで洗浄し、細胞を回収した。細胞塊の蛍光測定は上述の方法で実施し、結果を図７Ｂにまとめた。４種のエンドサイトーシス阻害剤の中では、ａｍｉｌｏｒｉｄｅによってＰＳ７の細胞取り込みが有意に阻害されたことが分かった（Ｐ＜０．０５）。ここで有意差検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより行った。
【００６２】
［実施例８］
（タンパク結合実験）
本発明の重合体ＰＳ７（０−６０μＭ）、または、比較例２で作製したＰＥＧ２（０−６０μＭ）、または、平均分子量３１５００のＰＳＡＲ（ＩＣＧが結合していないＰＳ７、０−６０μＭ）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、２μＭ）溶液と混合した。３０分後に、ＢＳＡのトリプトファン由来の蛍光強度を ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ （ＲＦ−５３００ＰＣ、島津製作所製）により測定した（励起波長２７９ｎｍ、蛍光波長３４２ｎｍ）。ＢＳＡと各化合物との結合親和力は、下式（１）で表わされるＨｉｌｌの式より算出した。
ｌｏｇ［（Ｆ０−Ｆ）／Ｆ］＝ｌｏｇＫｂ＋ｎｌｏｇＣ          （１）
式（１）において、Ｋｂは結合定数を、ｎは結合部位の数を、ＦおよびＦ０は、各化合物を添加した場合と、添加していない場合のＢＳＡのトリプトファン由来の蛍光強度を、Ｃは各化合物の添加濃度を表わす。結果は次の通りとなった。平均分子量３１５００のＰＳＡＲはＢＳＡと相互作用しなかった。一方、重合体ＰＳ７およびＰＥＧ２は、ＢＳＡに対し弱く結合した。Ｋｂ値は重合体ＰＳ７が０．４０×１０５Ｍ−１、ＰＥＧ２が０．４４×１０５Ｍ−１となった。
【００６３】
［実施例９］
（ｉｎ  ｖｉｖｏ光音響腫瘍イメージング）
重合体ＰＳ７を用いて、実施例４と同様にｉｎ  ｖｉｖｏ光音響腫瘍イメージングを実施した。具体的には、実施例３と同様に作製した担癌マウスに本発明の重合体ＰＳ７（４０ｎｍｏｌ  ＩＣＧ）を投与する前、投与２４時間後において、麻酔で眠らせた後、イメージング装置に固定し、光音響信号を測定し、それぞれの３次元再構成データを得た。得られた３次元再構成データを用いてＯｓｉｒｉＸ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより光音響信号画像を描出した結果が図８である。さらに、フリー医用画像解析ソフトウェアＡＭＩＤＥにより腫瘍領域に関心領域（ＲＯＩ：Ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆＩｎｔｅｒｅｓｔ）を設定し、各時間における光音響信号強度を計測した後、本発明の重合体を投与する前の光音響信号強度に対する、投与２４時間後の光音響信号強度の比を算出した。重合体ＰＳ７を投与した担癌マウスにおいて、投与２４時間後において腫瘍部で光音響信号が２．５倍増加し、腫瘍を明瞭に描出することができた。さらに、重合体ＰＳ７は腫瘍血液比が高いため、図８中の矢印で示した血管からの信号が低くコントラストの高いＰＡイメージが得られた。以上の結果から、本発明の重合体の光音響イメージング用造影剤としての有用性が示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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