(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の患者特有の変異の影響を抑制することが可能な薬物を同定する方法であって、
ａ）１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子（複数可）を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｂ）前記アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｃ）前記発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、前記アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｄ）前記薬物の存在下と非存在下とで、前記１つまたは複数の患者特有の変異を含む前記遺伝子を発現する前記アッセイ細胞中の前記発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現遺伝子と比較するステップと；
を含み、
薬物の存在下と非存在下とで、前記１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子および／または前記対応する野生型遺伝子を発現する前記アッセイ細胞間での異なる結果が、前記患者特有の変異の影響を抑制することが可能な薬物を示す、方法。
【請求項２】
前記薬物が、抗癌薬である、あるいは
１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む、あるいは
様々な濃度の薬物（複数可）を添加して、薬物応答を測定することを含む、あるいは
前記ＦＴＲの標的遺伝子部分が、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、およびアダプタータンパク質から選択されるタンパク質をコードする、あるいは
前記ＦＴＲのレポータ遺伝子部分が、蛍光マーカをコードする、あるいは
前記患者が、癌患者である、あるいは
前記変異が、発癌性変異である、あるいは
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、遺伝子の一部を保有する、あるいは
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む、あるいは
発現構築物の前記第一および／または第二のセットのプロモータが、誘導型または構成型プロモータである、あるいは
トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で前記発現構築物を乾燥させることをさらに含む、あるいは
ステップｃ）が、ステップａ）および／またはステップｂ）に先行する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＦＴＲの属性が、蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記局在が、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞内局在を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記患者の遺伝子が、前記患者の生体試料に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料が、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液、微小環境抽出物、細胞外液、腫瘍から分泌された液体から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１つまたは複数の患者特有の変異の薬物処置への感受性を同定する方法であって、
ａ）前記１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｂ）前記アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｃ）前記発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、前記アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｄ）前記薬物の存在下と非存在下とで、前記１つまたは複数の患者特有の変異を含む前記遺伝子を発現する前記アッセイ細胞中の前記発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現遺伝子と比較するステップと；
を含み、
薬物の存在下と非存在下とで、前記１つまたは複数の患者特有の変異を含む前記遺伝子、および／または前記対応する野生型遺伝子を発現する前記アッセイ細胞間での異なる結果が、前記薬物での前記患者特有の変異の処置への感受性を示す、方法。
【請求項８】
前記薬物が、抗癌薬である、あるいは
１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む、あるいは
様々な濃度の薬物（複数可）を添加して、薬物応答を測定することを含む、あるいは
前記ＦＴＲのレポータ遺伝子部分が、蛍光マーカをコードする、あるいは
前記患者が、癌患者である、あるいは
前記変異が、発癌性変異である、あるいは
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、遺伝子の一部を保有する、あるいは
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む、あるいは
発現構築物の前記第一および／または第二のセットのプロモータが、誘導型または構成型プロモータである、あるいは
トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で前記発現構築物を乾燥させることをさらに含む、あるいは
ステップｃ）が、ステップａ）および／またはステップｂ）に先行する、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＦＴＲの属性が、蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記局在が、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞内局在を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者の遺伝子が、前記患者の生体試料に由来する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体試料が、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液、微小環境抽出物、細胞外液、腫瘍から分泌された液体から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
癌患者の１つまたは複数の患者特有の発癌性変異の薬物応答を検出する方法であって、
ａ）発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、前記アッセイ細胞をアドレス可能なアレー内の基板に添加するステップと；
ｂ）前記アレーにおける各場所について、特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターを前記アッセイ細胞に添加するステップと；
ｃ）前記アドレス可能なアレーの特定の場所の前記アッセイ細胞に、１つまたは複数の患者特有の発癌性変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットを添加し、そして特定の場所の前記アッセイ細胞に、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットを添加するステップであって、前記発現構築物の第一のセットおよび前記発現構築物の第二のセットが、共通の場所に添加されない、ステップと；
ｄ）前記薬物の存在下と非存在下とで、前記１つまたは複数の患者特有の発癌性変異を含む前記遺伝子を発現する前記アッセイ細胞中の前記発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現遺伝子と比較するステップと；
を含み、
薬物の存在下と非存在下とで、前記１つまたは複数の患者特有の発癌性変異を含む前記遺伝子、および／または前記対応する野生型遺伝子を発現する前記アッセイ細胞間での異なる結果が、前記１つまたは複数の患者特有の発癌性変異の薬物応答を示す、方法。
【請求項１４】
前記薬物が、抗癌薬である、あるいは
１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む、あるいは
様々な濃度の薬物（複数可）を添加して、薬物応答を測定することを含む、あるいは
前記ＦＴＲの属性が、蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される、あるいは
前記局在が、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞内局在を含む、あるいは
前記ＦＴＲのレポータ遺伝子部分が、蛍光マーカをコードする、あるいは
前記患者が、癌患者である、あるいは
前記変異が、発癌性変異である、あるいは
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、遺伝子の一部を保有する、あるいは
発現構築物の前記第一および／または第二のセットが、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む、あるいは
発現構築物の前記第一および／または第二のセットのプロモータが、誘導型または構成型プロモータである、あるいは
トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で前記発現構築物を乾燥させることをさらに含む、あるいは
ステップｃ）が、ステップａ）および／またはステップｂ）に先行する、あるいは
前記患者の遺伝子が、前記患者の生体試料に由来する、あるいは
前記患者の遺伝子が前記患者の生体試料に由来し、且つ前記生体試料が、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液、微小環境抽出物、細胞外液、腫瘍から分泌された液体から選択される、
請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
患者特有の変異の薬物応答を同定および測定する方法を提供する。該方法は、同定された患者特有の変異に及ぼす薬物の影響に基づいて、特有の（個人に合わせた）薬物処置の同定を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌（悪性腫瘍または悪性新生物）は、身体の他の部分に侵入または拡大する能力を有する異常な細胞増殖を含む疾患群である。癌は、極めて多様であり、様々な根底的分子メカニズムがそれに関与する。したがって様々な癌と診断された患者の臨床的治療プロトコルおよび予後は、根底にある分子メカニズムの正確な診断に加え、発癌性変異ならびにオートクリンおよびパラクリンの影響の同定に応じて、大きく異なり得る。癌患者では、細胞増殖および分化の制御に関与するシグナル伝達経路の多くは、これらの経路における重要なタンパク質の変異の結果、異常な方式で調節される。
【０００３】
癌の複雑さおよび異質性から、腫瘍シグナル伝達経路を刺激して患者特有のドライバー変異を同定することが可能な、より感度が高く識別力のある同定アプローチが求められる。例えば本出願の発明者らの国際公開ＷＯ２０１４／１１１９３６号は、患者特有のドライバー変異を同定する方法およびシステムに向けられる。現在の先端技術では、極わずかな個別のマーカを用いて、処置の有効性および毒性を予測することができる。その上、腫瘍内に蓄積した変異の大きなプール、同定されたドライバー変異の限定されたレパトア、および様々な変異の相互作用、特にその活性に関する洞察力が非常に限定されるために、標的治療を選択するための全ゲノムシーケンシング（次世代シーケンシング）の適切さが限定される。
【０００４】
したがって、より効率的かつより安全で費用効果および時間効果の両方を有し、患者特有のドライバー変異に特異的に適合および最適化させる能力を有する、個人に合わせた最適な薬物処置を決定するための患者特有のドライバー変異（複数可）の特異的薬物応答の同定を可能にする方法およびシステムが、当該技術分野で依然として求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の概要
本発明は、患者特有の発癌性変異に適応するように調整された最適な薬物処置を同定および／または測定する方法およびシステムを提供する。該患者特有の発癌性変異は、テスト細胞において、発癌性変異の機能に関連するシグナル伝達経路の活性の変化を同定することによって認識される。幾つかの実施形態によれば、シグナル伝達経路の活性の変化は、発癌性変異の機能に関連するレポータ遺伝子の細胞下局在の変化を同定することによって測定される。幾つかの実施形態において、特異的な患者由来マーカ（ＰＤＭ）遺伝子が、生体試料から得られ（直接的または間接的に）、対応する蛍光トランスロケーション（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）レポータ（ＦＴＲ）遺伝子の細胞下トランスロケーションに及ぼす影響を生存可能なテスト細胞でテストして、テストされたＰＤＭが変異しているか否かを決定する。幾つかの実施形態において、該特異的な患者由来マーカを得て、蛍光レポータに融合し、患者由来レポータ（ＰＤＲ）を生成して、そこでＰＤＲの細胞下トランスロケーションを生存可能なテスト細胞でテストして、テストされたＰＤＭが変異しているか否かを決定する。幾つかの実施形態において、発癌性変異の同定は、様々な薬物および／または薬物の組み合わせへの、同定された特有の変異の応答（または感受性）をテストおよび測定することができる。幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法は、患者に特有であり、特定の患者の変異に関連する条件に最も適した処置となる最適な薬物処置の同定を可能にする。
【０００６】
本明細書に開示された方法およびシステムは、ＰＤＭまたはＰＤＲの存在下で同定された異常な経路に影響を及ぼす（例えば阻害する）薬物の能力を決定または測定することができる。開示された方法は、薬物応答または耐性の検出／同定、ならびに同定された患者特有の発癌性変異に適合された、最適で個人に合わせた処置の決定および／または調整を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
幾つかの実施形態において、本発明は、癌に関与する患者特有の発癌性変異を同定する方法およびシステムを提供し、様々な薬物または薬物の組み合わせへの、同定された発癌性変異の薬物応答を検出または同定する方法をさらに提供する。幾つかの実施形態において、該変異は、発癌性変異である。幾つかの実施形態において、該変異は、ドライバー変異である。幾つかの実施形態において、該方法およびシステムは、患者特有の細胞経路および／または特有の変異（複数可）に及ぼすテスト薬物または薬物の組み合わせの影響を決定する予測プラットフォームを提供する。幾つかの実施形態において、該方法およびシステムは、患者に特有に調整された最適な処置を決定する予測プラットフォームを提供する。幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法は、細胞内および細胞間シグナル伝達経路に及ぼすオートクリンおよびパラクリンの影響の同定を可能にする。幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法は、内因的および後天的薬物耐性メカニズムの検出および／または予測を可能にする。
【０００８】
幾つかの実施形態によれば、患者特有の発癌性変異の薬物処置への薬物応答／感受性を同定／測定する方法であって、レポータマーカ遺伝子の細胞下局在／トランスロケーションの変化を同定することを含み、該細胞下局在の変化が、テスト薬物または薬物の組み合わせの存在下および／または非存在下で発癌性変異によって影響を受ける、方法が提供される。幾つかの実施形態によれば、ＰＤＭは、患者の生体試料から得られ（例えばシーケンシングデータに基づき、直接的または間接的に）、レポータキメラ遺伝子（レポータ遺伝子部分および標的遺伝子部分のキメラ生成物を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ））の存在下で生存可能なテスト細胞中で発現されるように操作（設計）される。テスト細胞におけるＦＴＲの細胞下局在を、その後に測定する。テストＰＤＭの存在下でのＦＴＲの細胞下局在が、正常な条件下（即ち、対応するＷＴ  ＰＤＭの存在下）、および／または他の公知参照との比較で、ＦＴＲの細胞下局在と異なる場合、テストされたＰＤＭが変異されていることが示される。さらに、同定された変異をテスト薬物またはテスト薬物の組み合わせの存在下でテストして、テストされたＰＤＭの特異的薬物応答（薬物処置への感受性）を同定する。したがって本明細書に開示された方法を用いて、同定された発癌性変異を薬物の存在下でさらにアッセイし、その発癌活性に影響を及ぼす薬物の能力を測定する。代わりまたは追加として、幾つかの実施形態において、ＦＴＲを使用せずにＰＤＲ（即ち、レポータ遺伝子に連結／付着／融合されたＰＤＭ）を作製することおよび細胞下局在を追跡することによって、ＰＤＭを直接テストすることができる。その上、そのような発癌性変異を測定することによって、患者の腫瘍内で動作する活性化されたシグナル伝達経路を同定することができる。さらにこれにより、特定の患者の腫瘍を根絶して耐性メカニズムを回避するのに必要となる標的治療的処置を精密かつ特異的に選択することができる。
【０００９】
幾つかの実施形態によれば、有利には、最適化で個人に合わせた癌治療を決定するために、特異的薬物応答を同定するための強化および改善された診断プラットフォームが提供される。幾つかの実施形態において、該方法は、生存する（生存可能な）細胞においてＦＴＲへの影響をモニタリングすることによって発癌性変異の活性化を同定することができ、同定された変異の薬物応答を効果的に同定および測定して、最終的に患者に特有で個人に合わせた薬物処置を確立することが可能な細胞に基づくアッセイを含む。有利には本明細書に開示された方法は実際に、異なる標的治療薬の耐性および感受性を高度の有意性で予測することができ、様々な患者の変異の薬物応答および薬物処置への感受性を同定することができ、さらに同じ標的に対して複数の薬物がある場合の薬物選択を提供することができる。さらに以下に例示される通り、本明細書に開示された方法によって同定された薬物応答は、臨床において観察された転帰とも一致し、これらの薬物の効率にメカニズム上の説明を与える。したがってこれらの結果は、様々な変異の薬物応答を同定するため、そして同じ標的に対して複数の薬物がある場合に薬物選択を提供するための開示された方法およびシステムの能力を示している。
【００１０】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法およびシステムは、生存可能なテスト細胞において様々なシグナル伝達タンパク質（例えば、膜局在および／または細胞内の受容体およびシグナル伝達タンパク質など）の活性化をモニタリングすることによって、患者の腫瘍活性化シグナル伝達経路のプロファイルの同定を可能にするプラットフォームを提供し、さらにテスト薬物またはそれらの組み合わせへの薬物応答（薬物処置への感受性）を測定する。幾つかの実施形態において、発癌性変異の同定は、ＦＴＲを含む細胞内／細胞下トランスロケーションイベントおよびタンパク質間相互作用（即ち、形質膜、細胞質、エンドソーム、核などへのトランスロケーション／それらの間の様々な細胞下局在）を検出することによって実施され得る。幾つかの実施形態によれば、本明細書に開示された方法およびシステムは、同じ患者の同じ生体試料における複数の変異イベント（まだ同定されていない変異、およびそのような変異の発癌活性の測定を含む）を同定することに加え、そのような変異の薬物応答を測定する能力も提供して、最終的に特定の患者の個人に合わせた処置レジメンを決定させ得るため有利である。したがって本明細書に開示された方法およびシステムはまた、癌をもたらす、または癌に関与する細胞内イベントの同定を可能にすることに加え、同定された細胞内イベントに特異的に適合し、特定の患者個人に合わせて調整された、効果的で最適な薬物処置の決定または同定も可能にし得る。
【００１１】
幾つかの実施形態によれば、患者特有の変異および関与するシグナル伝達経路の同定の際に、同定された経路／変異を阻害すること／それらに影響を及ぼすことが知られている標的治療薬／治療剤（またはそれらの組み合わせ）をテスト細胞と共にインキュベートし、阻害／抑制／修飾された発癌活性を再度テストして、腫瘍および患者への最良の効果を示す薬物／薬剤を同定することができる。幾つかの実施形態において、該様々な薬物／薬剤は、テストされた変異に影響を及ぼすことが必ずしも知られていない。幾つかの実施形態において、特定の患者の処置のために、該様々な薬物／薬剤の処置およびそれらの各治癒能力を腫瘍発癌マップに重ね合わせて、患者特有の根底的分子腫瘍メカニズム、処置選択、および各予測された効能を提供することができる。これにより、ヘルスケア提供者は、最適化された処置選択の決断が可能になる。
【００１２】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料における１種または複数の患者特有の変異の薬物処置への薬物応答を検出する方法、または感受性を測定する方法であって、
ａ）該生体試料から複数のｍＲＮＡを得るステップと；
ｂ）該複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡを増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させるステップと；
ｅ）該生体試料からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセットと、該対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレー（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ａｒｒａｙ）を形成させるステップと；
ｆ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｇ）該ＤＮＡ構築物およびベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｈ）該生体試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップと；
ｉ）ステップｇ）を薬物の存在下で繰り返して、該薬物の存在下と非存在下とで、該生体試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性および／または対応する野生型発現ｃＤＮＡを比較するステップと、
を含み、
該癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を、該生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有のドライバー変異として同定するために用い、薬物の存在下と非存在下とで、該癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の異なる結果が、該候補となる患者特有のドライバー変異の薬物応答を示す、方法が提供される。
【００１３】
幾つかの実施形態において、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの実施形態において、該薬物は、テスト薬物である。幾つかの実施形態において、該方法は、１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、薬物の組み合わせを添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、様々な濃度の薬物（複数可）を添加して、薬物応答を測定することを含む。
【００１４】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの属性は、蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択される。幾つかの実施形態において、該局在は、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞下局在を含む。幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの標的遺伝子部分は、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする。さらなる実施形態において、該ＦＴＲのレポータ遺伝子部分は、蛍光マーカをコードする。幾つかの実施形態において、該蛍光マーカは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＤｓＲｅｄ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１から選択され得る。
【００１５】
幾つかの実施形態において、該生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択される。
【００１６】
幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットは、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む。他の実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットのプロモータは、誘導型プロモータである。幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットのプロモータは、構成型プロモータである。
【００１７】
幾つかの実施形態において、該方法は、該トランスフェクトされた細胞において該発現構築物および／または発現ベクターの発現を誘導して、該アレーにおける各場所について、該試料からのｃＤＮＡの第一のセットとＦＴＲとの遺伝子産物を得ることをさらに含む。
【００１８】
さらなる実施形態において、該増幅されたｃＤＮＡの発現構築物は、ＩＲＥＳおよび第二のレポータ遺伝子をさらに含む。
【００１９】
幾つかの実施形態において、該方法は、トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で該ＤＮＡ構築物を乾燥させることをさらに含む。
【００２０】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの発現ベクターは、環状発現ベクターである。さらなる実施形態において、該発現ベクターは、構成型または誘導型プロモータを含む。
【００２１】
幾つかの実施形態において、ステップｇ）は、ステップｅ）および／またはｆ）に先行し、その場合、該アッセイ細胞は、発現構築物および／または発現ベクターの添加前に、各場所に添加される。
【００２２】
幾つかの実施形態において、該方法は、トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で該ＤＮＡ構築物を乾燥させることをさらに含む。
【００２３】
幾つかの実施形態によれば、１つまたは複数の患者特有の変異の影響を抑制することが可能な薬物を同定する方法であって、
ａ）１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｂ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｃ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｄ）該薬物の存在下と非存在下とで、該１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現遺伝子と比較するステップと；
を含み、
薬物の存在下と非存在下とで、１つもしくは複数の患者特有の変異を含む遺伝子および／または対応する野生型遺伝子を発現するアッセイ細胞の異なる結果が、１つまたは複数の患者特有の変異の影響を抑制することが可能な薬物を示す、方法が提供される。
【００２４】
幾つかの実施形態によれば、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの実施形態において、該方法は、１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、薬物の組み合わせを添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、様々な濃度の薬物（複数可）を添加して、薬物応答を測定することを含む。
【００２５】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの属性は、蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択され得る。幾つかの実施形態において、該局在は、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞下局在を含み得る。
【００２６】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの標的遺伝子部分は、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、該ＦＴＲのレポータ遺伝子部分は、蛍光タンパク質などの蛍光マーカをコードし得る。
【００２７】
幾つかの実施形態において、該患者遺伝子は、患者の生体試料から得ること／それに由来することができる。幾つかの実施形態において、該生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液、微小環境抽出物、細胞外液、腫瘍から分泌された液体から選択され得る。幾つかの実施形態において、該患者は、癌患者である。幾つかの実施形態において、該変異は、発癌性変異である。
【００２８】
幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットは、遺伝子の一部を保有する。幾つかの実施形態において、該方法の発現構築物の第一および／または第二のセットは、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットのプロモータは、誘導型または構成型プロモータであり得る。幾つかの実施形態において、該方法は、トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で該ＤＮＡ構築物を乾燥させることをさらに含む。幾つかの実施形態において、ステップｃ）は、ステップａ）および／またはｂ）に先行し得、その場合、該アッセイ細胞は、発現構築物および／または発現ベクターの添加前に、該アドレス可能なアレーに添加される。
【００２９】
幾つかの実施形態によれば、１つまたは複数の患者特有の変異の薬物処置への感受性を同定する方法であって、ａ）該１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；ｂ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；ｃ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；ｄ）該薬物の存在下と非存在下とで、該１つまたは複数の患者特有の変異を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現遺伝子と比較するステップと；を含み、薬物の非存在下および／または存在下で、１つもしくは複数の患者特有の変異を含む遺伝子、および／または対応する野生型遺伝子を発現するアッセイ細胞間での異なる結果が、該薬物での該患者特有の変異の処置への感受性を示す、方法が提供される。
【００３０】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の１つまたは複数の患者特有の発癌性変異の薬物応答を検出する方法であって、
ａ）発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞をアドレス可能なアレー内の基板に添加するステップと；
ｂ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターを該アッセイ細胞に添加するステップと；
ｃ）該アドレス可能なアレーの特定の場所の該アッセイ細胞に、患者特有の変異（複数可）を含む遺伝子（複数可）を保有する発現構築物の第一のセットを添加し、そして特定の場所の該アッセイ細胞に、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットを添加するステップであって、該発現構築物の第一のセットおよび該発現構築物の第二のセットが、共通の場所に添加されないステップと；
ｄ）該薬物の存在下と非存在下とで、該変異（複数可）を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現遺伝子と比較するステップと；
を含み、
薬物の存在下と非存在下とで、変異（複数可）を保有する遺伝子（複数可）および／または対応する野生型遺伝子を発現するアッセイ細胞間の異なる結果が、該患者特有の発癌性変異の薬物応答を示す、方法が提供される。
【００３１】
幾つかの実施形態によれば、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの実施形態において、該方法は、１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、薬物の組み合わせを添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、様々な濃度の薬物（複数可）を添加して、薬物応答を測定することを含む。
【００３２】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの属性は、蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択され得る。幾つかの実施形態において、該局在は、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞下局在を含み得る。
【００３３】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの標的遺伝子部分は、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、該ＦＴＲのレポータ遺伝子部分は、蛍光タンパク質などの蛍光マーカをコードし得る。
【００３４】
幾つかの実施形態において、該患者遺伝子は、患者の生体試料から得ること／それに由来することができる。幾つかの実施形態において、該生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液、微小環境抽出物、細胞外液、腫瘍から分泌された液体から選択され得る。幾つかの実施形態において、該患者は、癌患者である。幾つかの実施形態において、該変異は、発癌性変異である。
【００３５】
幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットは、遺伝子の一部を保有する。幾つかの実施形態において、該方法の発現構築物の第一および／または第二のセットは、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットのプロモータは、誘導型または構成型プロモータであり得る。幾つかの実施形態において、該方法は、トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で該ＤＮＡ構築物を乾燥させることをさらに含む。幾つかの実施形態において、ステップｂ）および／またはステップｃ）は、ステップａ）に先行し得る。
【００３６】
幾つかの実施形態によれば、該発現構築物は、以下のステップの１つまたは複数を含む工程によって得ることができる：ｉ）該患者の生体試料から得られた複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップ；ｉｉ）発癌性変異を保有することが疑われる遺伝子をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡを増幅するステップ；およびｉｉｉ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させるステップ。
【００３７】
幾つかの実施形態において、１つまたは複数の変異を保有することが疑われる該患者の遺伝子または遺伝子部分は、当該技術分野で公知の方法によって合成することができ、プロモータに動作可能に連結させて、該発現構築物を得ることができる。幾つかの実施形態において、該患者の遺伝子（またはその一部）および／または該対応する野生型遺伝子は、それらの配列に基づいて人工で合成することができ、さらに処理して対応するＰＤＭを作製することができる。
【００３８】
幾つかの実施形態によれば、患者特有の変異およびその薬物応答を同定するキットがさらに提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】幾つかの実施形態による、患者のドライバー変異の同定およびその薬物応答の検出のための方法のステップの略ブロック図である。
【図２】幾つかの実施形態による、特定の患者のドライバー変異の同定およびその薬物応答の検出を示す略図（ｓｃｈｅｍａｔｉｃ  ｃａｒｔｏｏｎ）（縮尺比に従っていない）である。
【図３Ａ】野生型のＢＲＡＦ（ＢＲＡＦ−ＷＴ）または患者の変異体ＢＲＡＦ（ＢＲＡＦ変異体、（Ｉ５５４Ｔ））をコードする遺伝子が、レポータタンパク質（ＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか、またはＥＲＢＢ２阻害剤ネラチニブで処置された。細胞を固定して（３０時間後）、画像化し、様々な実験条件下での核対細胞質比（Ｎ：Ｃ）を、自動画像解析を用いて計算した。
【図３Ｂ】図３Ａに示された同定された変異に関与するシグナル伝達経路およびテスト薬物（ネラチニブ）の阻害部位の略図である。
【図４Ａ】野生型のＢＲＡＦ（ＢＲＡＦ−ＷＴ）または患者の変異体ＢＲＡＦ（ＢＲＡＦ変異体、（Ｉ５５４Ｔ））をコードする遺伝子が、レポータタンパク質（ＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか、またはＢＲＡＦ阻害剤レゴラフェニブで処置された。細胞を固定して（３０時間後）、画像化し、様々な実験条件下での核対細胞質比（Ｎ：Ｃ）を、自動画像解析を用いて計算した。
【図４Ｂ】図４Ａに示された同定された変異に関与するシグナル伝達経路およびテスト薬物（レゴラフェニブ）の阻害部位の略図である。
【図５Ａ】野生型形態（ＥＧＦＲ−ＷＴ）または三重変異体形態（ＥＧＦＲ三重変異体、Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０ＭおよびＬ８６１Ｑ）のＥＧＦＲをコードする遺伝子が、レポータタンパク質（ＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか、またはＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブで処置された。細胞を固定して（３０時間後）、画像化し、様々な実験条件下での核対細胞質比（Ｎ：Ｃ）を、自動画像解析を用いて計算した。
【図５Ｂ】野生型形態（ＥＧＦＲ−ＷＴ）または三重変異体形態（ＥＧＦＲ三重変異体、Ｇ７１９Ａ、Ｔ７９０ＭおよびＬ８６１Ｑ）のＥＧＦＲをコードする遺伝子が、レポータタンパク質（ＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか、またはＥＧＦＲ阻害剤アフィチニブで処置された。細胞を固定して（３０時間後）、画像化し、様々な実験条件下での核対細胞質比（Ｎ：Ｃ）を、自動画像解析を用いて計算した。
【図６Ａ】ＰＤＭ（ＢＲＡＦ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けたシグナル伝達経路、ならびにテストされた薬物（ベムラフェニブ、レゴラフェニブおよびセルメチニブ）の阻害部位の略図である。
【図６Ｂ】変異体形態のＢＲＡＦをコードする遺伝子（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｇ４６９Ｖ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図６Ｃ】変異体形態のＢＲＡＦをコードする遺伝子（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｇ４６９Ｖ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＢＲＡＦ阻害剤レゴラフェニブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図６Ｄ】変異体形態のＢＲＡＦをコードする遺伝子（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｇ４６９Ｖ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図６Ｅ】変異体形態のＢＲＡＦをコードする遺伝子（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｇ４６９Ｖ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブ、ＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブもしくは両阻害剤の組み合わせで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図６Ｆ】変異体形態のＢＲＡＦをコードする遺伝子（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｇ４６９Ｖ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブ、レゴラフェニブもしくは両阻害剤の組み合わせで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図７Ａ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２、ＳＴＡＴ３）によって影響を受けたシグナル伝達経路、ならびにテスト薬物（アファチニブ、セルメチニブ、エルロチニブ、レゴラフェニブ）の阻害部位の略図である。
【図７Ｂ】変異体形態のＥＧＦＲをコードする遺伝子（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＥＧＦＲ阻害剤アフィチニブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図７Ｃ】変異体形態のＥＧＦＲをコードする遺伝子（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｌ８６１Ｑ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図７Ｄ】変異体形態のＥＧＦＲをコードする遺伝子（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｌ８６１Ｑ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図７Ｅ】変異体形態のＥＧＦＲをコードする遺伝子（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８６１Ｑ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＥＧＦＲ阻害剤アフィチニブ、ＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブ、もしくは両阻害剤の組み合わせで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図７Ｆ】変異体形態のＥＧＦＲをコードする遺伝子（ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ、Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ｓ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８６１Ｑ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＥＧＦＲ阻害剤アフィチニブ、ＢＲＡＦ阻害剤レゴラフェニブ、もしくは両阻害剤の組み合わせで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図８Ａ】ＰＤＭ（ＥＲＢＢ２）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２、ＳＴＡＴ３）によって影響を受けたシグナル伝達経路、ならびにテスト薬物（ラパチニブ、ネラチニブ、セルメチニブ）の阻害部位の略図である。
【図８Ｂ】変異体形態のＥＲＢＢ２をコードする遺伝子（ＥＲＢＢ２  Ｖ７７７Ｌ、ＥＲＢＢ２  Ｓ３１０Ｆ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＥＲＢＢ２阻害剤ネラチニブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図８Ｃ】変異体形態のＥＲＢＢ２をコードする遺伝子（ＥＲＢＢ２  Ｖ７７７Ｌ、ＥＲＢＢ２  Ｓ３１０Ｆ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＥＲＢＢ２阻害剤ラパチニブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図８Ｄ】変異体形態のＥＲＢＢ２をコードする遺伝子（ＥＲＢＢ２  Ｖ８４２Ｉ、ＥＲＢＢ２  Ｓ３１０Ｆ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図８Ｅ】変異体形態のＥＲＢＢ２をコードする遺伝子（ＥＲＢＢ２  Ｖ８４２Ｉ、ＥＲＢＢ２  Ｖ７７７Ｌ、ＥＲＢＢ２  Ｓ３１０Ｆ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＥＲＢＢ２阻害剤ネラチニブ、ＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブ、もしくは両阻害剤の組み合わせで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図８Ｆ】変異体形態のＥＲＢＢ２をコードする遺伝子（ＥＲＢＢ２  Ｖ８４２Ｉ、ＥＲＢＢ２  Ｓ３１０Ｆ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＥＲＢＢ２阻害剤ネラチニブ、ＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブ、もしくは両阻害剤の組み合わせで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図９Ａ】ＰＤＭ（ＰＩＫ３ＣＡ）および対応するＦＴＲ（Ｐ３８、ＲＥＬ−Ａ）によって影響を受けたシグナル伝達経路、ならびにテスト薬物（イデラリシブ、ブパルリシブ（Ｂｕｐａｒａｌｉｓｉｂ）、エベロリムス、テムシロリムス）の阻害部位の略図である。
【図９Ｂ】変異体形態のＰＩＫ３ＣＡをコードする遺伝子（ＰＩＫ３ＣＡ  Ｖ３４４Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｑ５４６Ｌ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｎ３４５Ｋ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＲＥＬ−Ａ−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＰＩＫ３ＣＡ阻害剤イデラリシブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図９Ｃ】変異体形態のＰＩＫ３ＣＡをコードする遺伝子（ＰＩＫ３ＣＡ  Ｖ３４４Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｎ３４５Ｋ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  Ｐ３８−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＰＩＫ３ＣＡ阻害剤イデラリシブ、エベロリムスで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図９Ｄ】変異体形態のＰＩＫ３ＣＡをコードする遺伝子（ＰＩＫ３ＣＡ  Ｎ３４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  Ｐ３８−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＰＩＫ３ＣＡ阻害剤ブパルリシブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図９Ｅ】変異体形態のＰＩＫ３ＣＡをコードする遺伝子（ＰＩＫ３ＣＡ  Ｎ３４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  Ｐ３８−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＰＩＫ３ＣＡ阻害剤テムシロリムスで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図９Ｆ】変異体形態のＰＩＫ３ＣＡをコードする遺伝子（ＰＩＫ３ＣＡ  Ｎ３４４Ａ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｎ３４５Ｋ、ＰＩＫ３ＣＡ  Ｈ１０４７Ｒ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  Ｐ３８−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＰＩＫ３ＣＡ阻害剤イデラリシブ、エベロリムス、もしくは両阻害剤の組み合わせで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１０Ａ】ＰＤＭ（ｃＫＩＴ）および対応するＦＴＲ（ＳＴＡＴ３）によって影響を受けたシグナル伝達経路、ならびにテスト薬物（イマチニブおよびセルメチニブ）の阻害部位の略図である。
【図１０Ｂ】変異体形態のｃＫＩＴをコードする遺伝子（ｃＫＩＴ  Ｗ５５７−Ｋ５５８ｄｅｌ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはｃＫＩＴ阻害剤イマチニブで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１０Ｃ】変異体形態のｃＫＩＴをコードする遺伝子（ｃＫＩＴ  Ｗ５５７−Ｋ５５８ｄｅｌ）が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＳＴＡＴ３−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示すグラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはｃＫＩＴ阻害剤イマチニブ、ＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブもしくは両阻害剤の組み合わせで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１１Ａ】ＰＤＭ（ＥＲＢＢ２およびＢＲＡＦ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けたシグナル伝達経路、ならびにテスト薬物（ネラチニブ、ベムラフェニブ）の阻害部位の略図である。
【図１１Ｂ】変異体形態のＥＲＢＢ２（ＥＲＢＢ２  Ｖ７７７Ｌ、ＥＲＢＢ２  Ｌ７５５Ｓ）または変異体形態のＢＲＡＦ（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ）をコードする遺伝子が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＥＲＢＢ２阻害剤ネラチニブ、ＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブ、もしくは両阻害剤の組み合わせで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【図１２Ａ】ＰＤＭ（ＥＧＦＲおよびＫＲＡＳ）および対応するＦＴＲ（ＥＲＫ２）によって影響を受けたシグナル伝達経路、ならびにテスト薬物（アファチニブ、セルメチニブ）の阻害部位の略図である。
【図１２Ｂ】変異体形態のＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）または変異体形態のＫＲＡＳ（ＫＲＡＳ  Ｇ１２Ｒ）をコードする遺伝子が、レポータタンパク質（ＦＴＲ  ＥＲＫ２−ＧＦＰ）と共にテスト細胞内で発現された、細胞に基づくアッセイの結果を示す棒グラフである。細胞は、未処置であるか（ＵＴ）、またはＥＧＦＲ阻害剤アフィチニブ、ＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブ、もしくは両阻害剤の組み合わせで処置された。細胞を固定して（２４時間後）、画像化し、核（Ｎ）と細胞質比（Ｃ）とのＦＴＲ強度の比率差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
幾つかの実施形態によれば、ドライバー変異の機能に関連するシグナル伝達経路の活性の変化を同定することによって、患者特有の発癌性変異の薬物応答（処置への感受性）を同定または検出する方法が提供される。幾つかの実施形態において、テスト薬物（または薬物の組み合わせ）の存在下および／または非存在下でのシグナル伝達経路活性の変化は、ドライバー変異によって影響を受けるレポータ遺伝子の細胞下局在の変化を同定することによって決定される。幾つかの実施形態において、患者由来マーカ（ＰＤＭ）が、患者の生体試料から得られ、レポータキメラ遺伝子（ＦＴＲ）の存在下、テスト細胞内で発現されるように操作（設計）される。幾つかの実施形態において、患者由来マーカ（ＰＤＭ）は、同定された配列に基づき対応する患者の遺伝子（複数可）を人工的に作製し（合成し）、テスト細胞内で発現されるようにそれらをさらに操作することによって、得ることができる。幾つかの実施形態において、追加または代わりとして、該患者特有のマーカは、蛍光レポータに融合されて、患者由来レポータ（ＰＤＲ）を作製する。その後、テスト細胞内でのＦＴＲ（適用可能ならば、および／またはＰＤＲ）の細胞下局在を測定する。テストＰＤＭ（適用可能ならば、および／またはＰＤＲ）の存在下でのＦＴＲの細胞下局在が、正常条件下で（即ち、対応するＷＴ  ＰＤＭの存在下で）、または他の所定の参照と比較して、ＦＴＲ（適用可能ならば、および／またはＰＤＲ）の細胞下局在と異なる場合、テストＰＤＭ（またはＰＤＲ）が変異していることを示している。さらに、該アッセイがテスト薬物（または薬物の組み合わせ）の存在下で実施され、同定されたＰＤＭ（適用可能ならば、および／またはＰＤＲ）の細胞下局在が異なっている場合、該方法は有利には、同定されたＰＤＭ（適用可能ならば、および／またはＰＤＲ）の薬物応答を精密に同定または検出することを可能にする。したがって、本明細書に開示された方法を用いれば、患者特有のＰＤＭを、発癌性変異であると同定／特徴づけすることができ、さらに、様々なテスト薬物および／またはそのようなテスト薬物の組み合わせへの精密かつ正確な薬物応答（感受性）を測定することができる。その上、そのような発癌性変異を測定することによって、患者の腫瘍内で動作する活性化されたシグナル伝達経路およびそれらの薬物応答を、同定することができる。これによって、特定の患者の腫瘍を根絶し、耐性メカニズムを回避するのに必要となる標的治療処置を精密かつ特異的に選択することができる。
【００４１】
幾つかの実施形態において、本発明は、癌シグナル伝達経路に関与するタンパク質が様々な因子に応答してトランスロケートし、そのためテスト薬物（複数可）の存在下および／または非存在下で、そのようなシグナル伝達経路によって影響を受けるキメラレポータ遺伝子の局在をテストすることによって、患者特有の発癌性変異を同定することができ、それらの薬物応答を同定することができる、という概念に基づく。幾つかの実施形態によれば、発癌性変異に関して膨大な量の情報が存在するが、まだ同定されていない変異に加え、同じ患者の同じ生体試料中の複数の変異イベントを同定するロバストな方法およびシステム、ならびにそれらの薬物応答の測定が、これまで入手できていないため、本明細書に開示された方法およびシステムは有利である。例えば、現在利用される処置方法では、ｃＫｉｔ変異を保有する消化管間質腫瘍の患者は、グリーベックで処置される。しかし、一般的耐性メカニズムが、ｃＫｉｔそのものまたはその下流経路での二次変異によって起こると、そのような処置が無効になる。同様に、ＥＧＦＲ発癌性変異を有する肺癌患者は、標的治療処置が適格とされるが、利用可能なそのような薬物が複数存在する。したがって本明細書に開示された方法は、様々なテスト薬物（複数可）への同定された変異の応答を検出および同定させて、最終的に、関与する特有の変異を考慮しながら、特定の患者への個人に合わせた最適な薬物処置を決定する。
【００４２】
幾つかの実施形態において、本明細書に開示された方法およびシステムは、患者の腫瘍と競合させて、活性化されたシグナル伝達経路および発癌遺伝子活性を同定し、さらに抗癌治療への腫瘍感受性を測定する。幾つかの実施形態において、これは、トランスフェクトされたテスト細胞を１種または複数のテスト薬物と共にインキュベートすることによって実施される。
【００４３】
本明細書で参照される用語「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列は、互換的に用いられ得る。該用語は、分離した断片の形態の、あるいはそれらのより大きな構築物、直鎖上もしくは分枝状、一本鎖、二本鎖、三本鎖、またはハイブリッドの構成要素としての、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、およびそれらの修飾形態のポリマーに向けられる。該用語はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを包含する。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を包含し得る。該ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、例えば相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡもしくはそれらのハイブリッド、またはＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどであり得るが、これらに限定されない。したがって本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「ヌクレオチド」配列は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方を指すことになる。該用語は、天然由来塩基、糖およびヌクレオチド間の共有結合で構成されたオリゴヌクレオチド、ならびに各天然由来部分と類似した機能の非天然由来部分を有するオリゴヌクレオチドをさらに包含する。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「構築物」は、コード配列（即ち、最終生成物をードする配列）、制御配列、非コード配列、または任意のそれらの組み合わせを含み得る核酸配列を１つまたは複数含み得る、人工的に構成された、または単離された核酸分子を指す。構築物という用語は、例えばベクターを包含するが、それに限定されると理解するべきでない。
【００４５】
用語「発現ベクター」は、標的細胞内に異種核酸断片（ＤＮＡなど）を組み込んで発現する能力を有するベクターを指す。言い換えれば、発現ベクターは、転写され得る核酸配列／断片を含む。多くのウイルス、原核生物および真核生物の発現ベクターが公知であり、そして／または市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【００４６】
本明細書で用いられる「上流」および「下流」は、ヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列などにおける相対的位置を指す。周知の通り、ヌクレオチド配列は、いわゆるヌクレオチドバックボーンの糖（デオキシリボースまたはリボース）環上の炭素に関して、５’末端および３’末端を有する。したがってヌクレオチド配列上の位置に対して、下流という用語は、該配列の３’末端に近い方の領域に関する。上流という用語は、鎖の５’末端に近い方の領域に関する。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「プロモータエレメント」、「プロモータ」または「プロモータ配列」は、一般にコード配列の５’末端に位置し（即ち、コード配列に先行し、コード配列の上流に位置し）、コード配列の発現を活性化するスイッチとして機能するヌクレオチド配列を指す。コード配列が、活性化されると、転写されると言われる。転写は一般に、コード配列からのＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡなど）の合成を含む。それゆえプロモータは、転写制御エレメントとして働き、ｍＲＮＡへのコード配列の転写の開始部位も提供する。プロモータは、全体としてネイティブ供給源に由来する場合があり、または天然に見出される異なるプロモータに由来する異なるエレメントで構成される場合があり、または合成ヌクレオチドセグメントを含む場合がある。異なるプロモータが、異なる組織もしくは細胞型、または異なる発達段階、または異なる環境条件への応答、または様々な発現レベルで、遺伝子の発現を管理し得ることは、当業者に理解されよう。遺伝子をほとんど常にほとんどの細胞型で発現させるプロモータは一般に、「構成型プロモータ」と称される。特異的組織内での遺伝子発現を誘導するプロモータは、「組織特異性プロモータ」と呼ばれる。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「導入すること」および「トランスフェクション」は、互換的に用いることができ、例えば核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクターなどの分子を、標的細胞（複数可）に、より具体的には細胞の細胞質、細胞の核、ミトコンドリアの内部空間、小胞体（ＥＲ）などの標的細胞（複数可）の膜封入空間の内部に、転移または導入することを指す。該分子は、当業者に知られる任意の手段によって、例えば内容が参照により本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）に教示される通り、標的細胞（複数可）に導入され得る。分子を細胞内に「導入する」手段としては、例えば熱ショック、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＰＥＩトランスフェクション、電気穿孔、リポフェクション、トランスフェクション試薬（複数可）、ウイルスを介した転移など、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、該導入された核酸は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡの形態であり得る修飾核酸であり得る。幾つかの実施形態において、該核酸は、細胞にトランスフェクトされる前に脱水される。幾つかの実施形態において、該核酸は、例えば発現ベクターなどのベクターに取り込まれる。各可能性は、本発明の別の実施形態を表す。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「発現」は、標的細胞における所望の最終生成物分子の産生を指す。該最終生成物分子としては、例えばＲＮＡ分子、ペプチドもしくはタンパク質など、またはそれらの組み合わせを挙げることができる。
【００５０】
本明細書で参照される用語「患者」は、疾患を有することが疑われる、または疾患と診断された対象に向けられる。幾つかの実施形態において、患者という用語は、癌を有することが疑われる、または癌と診断された対象に向けられる。幾つかの実施形態において、患者は、腫瘍生検を得るのに適格である。
【００５１】
本明細書で用いられる用語「生体試料」は、任意の適切な身体由来試料を包含するように向けられる。該試料は、全血、末梢血単球、白血球、骨髄などの液体試料を包含し得る。該試料は、様々な細胞および組織を包含し得る。該試料は、生検を包含し得る。該試料は、固定および／または包埋された組織切片を包含し得る。該試料は、新鮮な状態で抽出または凍結され得る。別の実施形態において、該試料は、血液試料である。別の実施形態において、該試料は、骨髄試料である。別の実施形態において、対象からの血液細胞を含む試料を単離および維持する方法は、平均的技能の当業者に知られている。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体断片およびそれらの誘導体を含む試料は、体液；細胞調製物の可溶性画分、または細胞を増殖させた培地；染色体、オルガネラ、または細胞から単離もしくは抽出された膜；溶液中の、または基板に結合させたゲノムＤＮＡ，ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリヌクレオチド、またはペプチド；細胞；組織；組織プリント；フィンガプリント、皮膚または毛髪；それらの断片および誘導体を含み得る。
【００５２】
本明細書で参照される用語「患者由来マーカ」（「ＰＤＭ」）および「対象のＰＤＭ」は、対象の生体試料から単離され、得られ、またはそれに由来し（直接的または間接的に）、機能的アッセイにおいてその活性が測定される、遺伝子または遺伝子産物（またはその一部）に向けられる。幾つかの実施形態において、該ＰＤＭ核酸配列（生体試料から直接得られた（例えば、ｃＤＮＡの作製によって）または人工で合成された（即ち、間接的に得られた））に、５’および／もしくは３’制御エレメント、ならびに／またはさらなるレポータ遺伝子が付加される。幾つかの実施例において、本明細書で用いられるＰＤＭは、必ずしもこの順序ではないが、制御エレメント（プロモータ）−ＰＤＭ配列−制御エレメント（ＩＲＥＳ）−レポータ遺伝子を含むキメラ核酸配列分子を含む。したがって、そのような核酸分子が、標的細胞内に導入され、発現されると、ＰＤＭ遺伝子産物（タンパク質）およびレポータ遺伝子産物（タンパク質）が、細胞内で発現される。追加または代わりとして、ＩＲＥＳ配列は、省略することができ、ＰＤＭ遺伝子産物およびレポータ遺伝子産物を含むキメラタンパク質が、細胞内で発現される。こうして形成されたキメラタンパク質が、本明細書では「患者由来レポータ」（「ＰＤＲ」）または「対象ＰＤＲ」と称される。幾つかの実施形態において、用語「対照ＰＤＭ」、「野生型ＰＤＭ」、「対応するＰＤＭ」および「対応する野生型ＰＤＭ」は、対照として用いられる、ＰＤＭ遺伝子に対応する（即ち、非変異で完全に活性の）野生型遺伝子に向けられる。幾つかの実施形態において、該野生型ＰＤＭは、患者の生体試料に由来しない。該対照ＰＤＭは、対象ＰＤＭと野生型（ｗｔ）ＰＤＭとで活性を比較するために用いられる。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「蛍光トランスロケーションレポータ」（「ＦＴＲ」）は、キメラレポータ遺伝子および対応する遺伝子産物に向けられる。標的（マーカ）遺伝子の少なくとも１つの属性が、テストＰＤＭによって影響を受け得る（直接的または間接的に）、所定の標的（マーカ）遺伝子部分（例えば細胞シグナル伝達タンパク質、キナーゼ、酵素など）に連結されたレポータ遺伝子部分（蛍光マーカ（タンパク質）など）を含むキメラＦＴＲ。
【００５４】
本明細書で参照される用語「テスト細胞」、「標的細胞」および「アッセイ細胞」は、互換的に用いられ得る。該用語は、本明細書に記載された通り、ＰＤＭおよび／またはＰＤＲおよび／またはＦＴＲおよび／または対照遺伝子のいずれかなど、ポリ核酸分子でトランスフェクトされたアッセイ細胞に向けられる。幾つかの実施形態において、該テスト細胞は、真核細胞である。幾つかの実施形態において、該テスト細胞は、初代細胞または細胞株であり得る。別の実施形態において、アッセイ細胞は、非癌性細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、細胞株に由来する。別の実施形態において、アッセイ細胞は、少なくとも１種の癌分泌増殖因子に応答する。別の実施形態において、アッセイ細胞は、トランスフェクションを受けることができる。別の実施形態において、アッセイ細胞は、一過性トランスフェクションを受けることができる。別の実施形態において、アッセイ細胞は、１つまたは複数の内在性遺伝子の発現が任意の分子方法によって減少または排除された細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、ＨｅＬａ細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、ＰＣ１２細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、Ｕ２ＯＳ細胞である。別の実施形態において、アッセイ細胞は、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９などのＮＣＩ６０細胞株である。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、患者由来の細胞である。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、癌患者由来の細胞である。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「細胞下局在」、「細胞下領域」および「細胞下区画」は、細胞の他の領域から様々な手段（例えば視覚的手段など）によって識別され得る細胞の任意の定義された部分を指す。幾つかの実施例において、細胞下領域は、細胞内の制限された領域であり得る。幾つかの実施例において、細胞下領域は、オルガネラを包含し得る。細胞下局在の非限定的例としては、例えば核、核小体、細胞質、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、クロロプラスト、膜、樹状突起棘、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格などが挙げられるが、これらに限定されない。各可能性は、別の実施形態である。幾つかの実施例において、用語「細胞下トランスロケーション」は、様々な条件下でレポータ遺伝子（ＦＴＲまたはＰＤＲなど）の細胞下局在の検出された変化を指す。例えばトランスロケーションは、核へ／核から、細胞質から／細胞質へのものであり得る。
【００５６】
本明細書で参照される用語「薬物」および「テスト薬物」は、互換的に用いられ得る。薬物という用語は、疾病を処置する上で効果を有する任意の化合物、物質、分子、薬剤および／または試薬に向けられる。幾つかの実施例において、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの実施例において、薬物という用語は、１種よりも多くの薬物を包含し得る。幾つかの実施例において、薬物という用語は、薬物の組み合わせを包含する。幾つかの実施例において、該薬物は、細胞内タンパク質の阻害剤である。
【００５７】
本明細書で参照される用語「薬物応答」および「薬物への感受性」は、互換的に用いられ得る。該用語は、テスト薬物によって誘発された応答または効果を指す。該用語は、発癌性変異などの変異の影響を抑制する薬物（複数可）の能力を指す。
【００５８】
幾つかの実施例において、用語「疾患を処置すること」または「疾病を処置すること」は、疾患に関連する症状を改善すること、重症度を低減すること、疾患を治癒すること、または疾患の発生を予防すること、に効果的な１種もしくは複数の化合物を投与することに向けられる。
【００５９】
用語「検出」、「診断」は、疾患、症状、障害、病理学的状態または正常な状態の検出の方法；疾患、症状、障害、病理学的状態を分類する方法；疾患、症状、障害、病理学的状態の重症度を測定する方法；疾患、症状、障害、病理学的状態の進行をモニタリングする方法；転帰および／またはその回復の見込みを予測する方法を指す。用語「診断」は、病理学的状態の存在または性質を同定することを意味する。
【００６０】
用語「基板」は、核酸分子、構築物、ベクターおよび／またはアッセイ細胞が配置された固体担体に向けられる。該基板は、非限定的にチップ、スライド、ウェル、コンテナ、管、バイアルなどの適切な基板の任意のタイプを包含し得る。幾つかの実施例において、該基板は、チップである。幾つかの実施例において、該基板は、顕微鏡スライドである。幾つかの実施例において、該基板は、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、３８４ウェルプレートなどのマルチウェルプレートである。幾つかの実施例において、各場所（またはアレーのポイント）を指定して同定可能にするマトリックスアレー（場所）を含むように、該基板が構築される。幾つかの実施例において、該核酸分子は、基板上で脱水される。幾つかの実施例において、該核酸分子は、トランスフェクション試薬の存在下または非存在下、基板上で脱水される。
【００６１】
用語「ドライバー変異」および「発癌性変異」は、互換的に用いられ得る。該用語は、疾患に直接的または間接的に関係する、変異した遺伝子または遺伝子産物に向けられる。幾つかの実施例において、該用語は、癌などの疾患に関係する、そして／または疾患に関与する、そして／または疾患をもたらし得る、そして／または疾患を誘発し得る、変異した遺伝子または遺伝子産物に向けられる。
【００６２】
該用語「タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、対応するタンパク質またはその一部をコードするポリヌクレオチド配列または分子を指す。幾つかの実施例において、該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、対応するタンパク質またはその一部をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含む。
【００６３】
用語「アドレス可能なアレー」は、空間的に離れた場所を含み、その場所の位置が同定可能かつ識別可能である、マトリックスに向けられる。幾つかの例示的実施例において、アドレス可能なアレーは、各ウェル（場所）が空間的に同定可能であるマルチウェルプレートを包含し得る。別の例示的実施形態において、アドレス可能なアレーは、指定されたアレーに位置する／配置された分離可能な場所を有する任意の基板を包含し得る。
【００６４】
ここに、幾つかの実施形態による、患者の生体試料における患者特有の発癌性変異を同定し、そしてその薬物応答を同定する方法において例示的ステップのブロック図を概略的に示した図１を参照する。図１に示された通り、ステップ１００で、患者の生体試料が得られる。該生体試料は、血液、血清、生検、針生検、気管支肺胞洗浄液、胸水、腫瘍組織、尿、唾液および腫瘍組織から選択され得るが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、該生体試料は、新鮮であり得る（新鮮であり得る、または新鮮な状態で凍結され得る）、即ち、固定されていない試料であり得る（ステップ１０２）。幾つかの実施形態において、該生体試料は、生体試料の固体のために当該技術分野で公知の方法によって、固定され得る（ステップ１０４）。
【００６５】
図１に示された通り、新鮮な生体試料から（ステップ１０２）、様々な成分が、それぞれ当該技術分野で周知の適切な方法によって抽出され得る。例えばステップ１０６に示された通り、間質液（ＩＦ）（細胞外液）は、抽出されて、後の使用に向けて貯蔵され得る。加えてｍＲＮＡは、新鮮な生体試料から抽出され得る（ステップ１０８）。その後、抽出／単離されたｍＲＮＡは、当該技術分野で周知の方法によって（ポリｄＴプライマーを用いるなど）、ｃＤＮＡライブラリの作製に用いられる（ステップ１１０）。特定のＰＤＭのｃＤＮＡが、ｃＤＮＡライブラリから増幅されて、所定のＰＤＭの所望の遺伝子領域（ポリヌクレオチド）に対応する適切なプライマー対を用いることによって作製される。選択されるＰＤＭは、様々な疾患状態（例えば、発癌遺伝子）における対応するＷＴ  ＰＤＭまたは変異ＰＤＭの既知の機能／活性／役割に基づいて選択され得る。次にステップ１１２で、制御プロモータエレメントをＰＤＭ  ｃＤＮＡの５’末端に付加すること、および場合によりレポータ遺伝子、蛍光標識などの３’ＩＲＥＳおよび標識を付加することによって、アッセイＰＤＭが作製される。幾つかの実施形態において、該プロモータエレメントは、構成型プロモータまたは誘導型プロモータであり得る。幾つかの実施形態において、該ＰＤＭ  ｃＤＮＡは、ＦＴＲをコードする部分を含む追加的な発現カセットをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、ｃＤＮＡライブラリの作製ステップを行わずに該特定のＰＤＭを人工的に合成／作製することによって（それらの同定された配列に基づき）、該特定のＰＤＭが作製される。
【００６６】
図１にさらに示される通り、ステップ１１４で、ゲノムＤＮＡが、固定された生体試料（ホルマリン固定された試料など（ステップ１０４））から抽出され得る。ステップ１１６では、抽出されたＤＮＡが、特異的な所定のエクソン（癌の症例では変異していることが知られる）の増幅と、その結果である増幅された特異的エクソンが欠如した対応する全長遺伝子を含む発現構築物へのライゲーション／融合と、を受けて、テストされるＰＤＭを作製することができる。
【００６７】
次にステップ１１８において、ステップ１１２および／またはステップ１１６で作製された（ｃＤＮＡの作製を介して、または人工的に合成することによって）各ＰＤＭの核酸分子は、指定された場所（位置）にある担体基板（スライド、ウェル（例えばマイクロプレートウェル）、チップなど）の上に配置／スポットされ得る。ＰＤＭは、ＰＤＭに対応するように選択されたキメラレポータ（ＦＴＲ）をコードする核酸分子との混合物中に入れられる（即ち、選択されたＦＴＲは、ＰＤＭによって機能的に（直接的または間接的に）影響され得る）。ＰＤＭおよびＦＴＲをコードする核酸分子の混合物は、適切なトランスフェクション試薬をさらに含んで、テスト細胞への該分子のトランスフェクションを可能にし得る。場合によりＰＤＭ＋ＦＴＲ混合物は、基板上で脱水される。別の選択において、ＰＤＭおよびＦＴＲは、単一核酸分子上に配置されるように構築されて、細胞における両タンパク質の独立した発現を可能にする。並行して、ＷＴ  ＰＤＭおよび対応するＦＴＲを含む対照アッセイが、調製される。さらにステップ１１８において、十分量の選択されたテスト細胞が、適切な増殖培地と共に基板に添加される。核酸分子の添加前または添加後に、該細胞が添加され得る。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ウェル（９６ウェルプレートウェル）あたり約１〜１００００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ウェル（２４ウェルプレートウェル）あたり約１〜５００００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ウェル（１２ウェルプレートウェル）あたり約１〜１０００００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ウェル（９６ウェルプレートウェル）あたり約１〜１０００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、十分量のテスト細胞は、ウェル（３８４ウェルプレートウェル）あたり約１〜１０００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、テスト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ２ＯＳ、ＰＣ１２、ＮＣＩ６０、Ａ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９などから選択されるが、これらに限定されない。その後、該細胞は、指定された時間（約６〜６０時間の範囲内など）、インキュベートされてＦＴＲの、そして場合によりＰＤＭの発現を可能にする。場合により幾つかの実施形態において、ステップ１１８で、該細胞が一定時間（０．５〜４８時間など）、固体基板に添加され（適切な増殖培地と共に）、その後、ＰＤＭおよび／またはＦＴＲをコードする核酸分子が、該細胞への該分子のトランスフェクションを可能にする条件下で該細胞に添加される。
【００６８】
次にステップ１２０で、所定の時間（４〜６０時間など）の後、細胞増殖培地を、新しい培地と交換し得る。幾つかの実施形態において、該交換培地は、低血清培地である。次にさらなるインキュベーション時間（４〜１６時間の範囲内など）の後、誘導型プロモータによって制御されたＰＤＭの発現の導入が開始される。導入型プロモータの導入は、例えばテトラサイクリン導入型プロモータを用いた場合にはテトラサイクリンの添加によって、またはエクジソン誘導型プロモータを用いた場合にはエクジソンの添加によって、または当該技術分野で公知の任意の他の方法によって、開始され得る。
【００６９】
場合によりステップ１２２で、固定された試料から作製されたＰＤＭの場合（ステップ１１６）、所定の時間（４〜６０時間など）の後、細胞増殖培地を、新鮮な培地と交換し得る。幾つかの実施形態において、該交換培地は、低血清培地である。次にさらなるインキュベーション時間（４〜２４時間の範囲内など）の後、ＰＤＭが、構成型プロモータの制御下で発現される。
【００７０】
次にステップ１２４で、テスト細胞におけるＰＤＭの発現を可能にするさらなる時間（例えば、約４〜４８時間の範囲内など）の後、ＦＴＲの細胞下局在が測定される。ＦＴＲの細胞下局在の測定は、蛍光顕微鏡を用いた画像化、生化学的方法を用いた細胞下区画の分画などの様々な手段によって実施され得る。幾つかの例示的実施形態において、該細胞は固定されて、蛍光ＦＴＲ局在が、蛍光画像化によって測定される。様々な実験条件下でのＦＴＲの細胞下局在の分析および比較が、テストされたＰＤＭが欠失しているか（即ち、変異しているか）否かについての決定を可能にする。例えばＦＴＲの細胞下局在は、ＦＴＲをテストされたＰＤＭと共発現させて、細胞内で測定される（テストアッセイ）。加えて、同じＦＴＲの細胞下局在は、ＦＴＲをＷＴ  ＰＤＭと共発現させて、細胞内で測定される（対照アッセイ）。テストアッセイと対照アッセイとのＦＴＲの細胞下局在の差が、テストされたＰＤＭの機能的活性について示す。したがって例えばステップ１２６で、ＦＴＲが、テストアッセイにおいて、対照アッセイと同じ細胞下局在であると同定されれば、テストされたＰＤＭは、変異していない。例えばステップ１２８で、ＦＴＲが、テストアッセイにおいて、対照アッセイと異なる細胞下局在であると同定されれば、テストＰＤＭは変異しており、このＰＤＭが発癌性変異であることが示される。次にステップ１３０で、テストされたＰＤＭ（複数可）の薬物応答を測定するために、ステップ１２０〜１２４が、細胞に添加されて共にインキュベートされるテスト薬物（１種もしくは複数の薬物、または薬物の組み合わせ）の存在下で、繰り返される。該薬物は、様々な濃度で（薬物の特性によって決定される）、例えば１０分〜２４時間などの任意の時間、細胞に添加され、その後、薬物の型および効果的条件に応じて１ｎＭ〜１ｍＭの薬物濃度で細胞に固定される。薬物の存在下と非存在下との、ＦＴＲ局在に関する異なる結果は、テストされたＰＤＭの薬物応答（薬物処置への感受性）を示す。
【００７１】
ここに、幾つかの実施形態による、例示的細胞シグナル伝達経路における発癌性変異、およびテスト薬物へのその薬物応答を同定するための、本発明の方法の適用例の略図（縮尺比に従っていない）である図２を参照する。図２に示される通り、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の構成要素（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＲＡＳ、ＲＡＦ、およびＭＥＫ）である様々なＰＤＭを、先に記載された通り、患者の生体試料から調製する。この例示的アッセイにおけるＦＴＲは、ＭＡＰＫタンパク質（ＥＲＫ１またはＥＲＫ２）を、ＧＦＰレポータ遺伝子に融合された（レポータ遺伝子部分として）標的（マーカ）遺伝子部分として含む、キメラレポータである。ＰＤＭおよびＦＴＲのそれぞれが、本明細書の先に記載された通り処理され、様々な実験条件下でのＦＴＲの局在が、測定される。左側のパネルに示される通り、検出されたＦＴＲの局在がＷＴ条件と同様であり（即ち、ＦＴＲは、細胞質に局在しており）、それゆえテストされたＰＤＭはいずれも変異していない中央のパネルに示される通り、ＦＴＲの細胞下局在が、ＷＴ条件と異なるため（即ち、この例ではそれは核内にあるため）、テストされたＰＤＭの少なくとも１つは、変異している。テストされたＰＤＭのそれぞれが、別のテスト細胞内でＦＴＲと個別にテストされるため、特有の変異したＰＤＭの同定が実現可能である。右側のパネルに示される通り、例示的な細胞シグナル伝達経路の様々な構成要素に影響を及ぼす様々な薬物を用いて、特異的薬物応答を測定することができる。
【００７２】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料における異常なシグナル伝達経路の薬物応答、および／または１種もしくは複数の患者特有の発癌性変異の薬物応答を同定する方法であって、
ａ）腫瘍の生検からなど、癌患者の生体試料から複数のｍＲＮＡの試料を得るステップと；
ｂ）当該技術分野で公知の方法によって、該複数の腫瘍ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（遺伝子または遺伝子部分）に相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの個々のｃＤＮＡ試料を増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させて、テスト患者由来マーカ（テストＰＤＭ）を生成させるステップと；
ｅ）該腫瘍からの増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセット（テストＰＤＭ）と、並行して、対応する（マッチする）野生型タンパク質の発現構築物の第二のセット（ＷＴ  ＰＤＭ）と、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｆ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子（ＦＴＲ）に連結されたマーカ遺伝子のコトランスフェクションのために発現ベクターを添加するステップであって、該マーカ遺伝子が、対応するＰＤＭによって直接的または間接的に影響を受けるステップと；
ｇ）場合により、担体固体基板上で該ｃＤＮＡ構築物を乾燥させるステップと；
ｈ）該ＤＮＡ構築物を生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｉ）トランスフェクトされた細胞において該構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのｃＤＮＡの第一のセットと、該アレーの各場所に特有のレポータ遺伝子と、の遺伝子産物を得るステップと；
ｊ）該腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞におけるレポータ遺伝子の少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップと；
ａ）ステップｈ）〜ｉ）のうちの任意の１つを薬物の存在下で繰り返して、該薬物の存在下と非存在下とで、該腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性および／または対応する野生型発現ｃＤＮＡを比較するステップと、
の１つまたは複数を含み（任意の選択された順序で）、
癌患者の該生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有の発癌性変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用い、そして薬物の存在下と非存在下とで、該癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の異なる結果が、該候補となる患者特有の発癌性変異の薬物応答を示す、方法が提供される。
【００７３】
幾つかの実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、１つの発現構築物上（即ち、１つの分子上）に配置される。そのような実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、同一の、類似のまたは異なるプロモータを有し得る（即ち、ＰＤＭおよびＦＴＲの発現は、同一のまたは異なるプロモータによって制御され得る）。そのような実施形態において、先のステップｄ）およびｆ）は、１つのステップ（代わりのステップｄ）：増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させてｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させてテスト患者由来のマーカ（テストＰＤＭ）を生成するステップであって、前記発現構築物が、特異的レポータ遺伝子（ＦＴＲ）をさらに含むステップ、にまとめられる。幾つかの実施形態において、該ＦＴＲは、プロモータ（ＰＤＭのプロモータと同一であり得るか、または異なり得る）に連結されている。さらなる実施形態において、該ＦＴＲは、レポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む。
【００７４】
幾つかの実施形態において、ステップｇ）は、ステップｅ）および／またはステップｆ）に先行し、その場合、アッセイ細胞は、発現カセットの添加前に各場所に添加される。
【００７５】
幾つかの実施形態において、該方法は、ステップｅ）において、実験対照として用いられ得る、前記遺伝子における１つまたは複数の既知ドライバー変異を含むＰＤＭ（本明細書では「人工ＰＤＭ」）の対応するタンパク質の発現構築物の第三のセットを含む。発現構築物の第三のセットは、アドレス可能なアレーに添加される。
【００７６】
したがって幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料における１つまたは複数の患者特有の発癌性変異の薬物応答を同定する方法であって、
ａ）該生体試料から複数のｍＲＮＡを得るステップと；
ｂ）該複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡを増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させるステップと；
ｅ）該生体試料からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
の１つまたは複数を含み、
それによって該シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて候補となる変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレーを提供し、該アレーが該癌患者の生体試料における患者特有の発現遺伝子変異を同定するのに適する、方法が提供される。
【００７７】
幾つかの実施形態において、該方法は、該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップ（ｆ）をさらに含む。
【００７８】
さらなる実施形態において、該方法は、ｇ）該ＤＮＡ構築物およびベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；ｈ）該試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップと、をさらに含み、癌患者の生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有の発癌性変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いる。
【００７９】
さらなる実施形態において、該方法は、ステップｇ）〜ｈ）のうちの任意の１つを薬物の存在下で繰り返して、該薬物の存在下と非存在下とで、該試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性および／または対応する野生型発現ｃＤＮＡを比較することを含むステップｉ）をさらに含み、癌患者の生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有の発癌性変異として同定するために、癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用い、そして薬物の存在下と非存在下とで、該癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の異なる結果が、該候補となる患者特有の発癌性変異の薬物応答を示す。
【００８０】
幾つかの実施形態において、該方法は、でステップｅ）において、実験対照として用いられ得る、前記遺伝子における１つまたは複数の既知ドライバー変異を含むＰＤＭ（人工ＰＤＭ）の対応するタンパク質の発現構築物の第三のセットを含む。発現構築物の第三のセットは、アドレス可能なアレーに添加される。
【００８１】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料における１つまたは複数の患者特有の発癌性変異の薬物応答を同定または測定する方法であって、
ａ）該生体試料から複数のｍＲＮＡを得るステップと；
ｂ）該複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡを増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させるステップと；
ｅ）アドレス可能なアレーにおいて、生存可能なアッセイ細胞を基板に添加するステップと；
ｆ）該アッセイ細胞に、該生体試料からの増幅ｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセットと、を添加するステップであって、そこで、アッセイ細胞への発現構築物のトランスフェクションが可能な条件下で、該発現構築物のそれぞれが異なったアドレス可能な場所のアッセイ細胞に添加されるステップと、
を含み、
それにより該癌患者の生体試料における患者特有の発現遺伝子変異を同定するために、該シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて候補となる変異を保有する発現構築物を含むアッセイ細胞のアレーを作製する、方法が提供される。
【００８２】
幾つかの実施形態において、該方法は、該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターを、アッセイ細胞に添加するステップをさらに含む。
【００８３】
幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、指定されたＦＴＲで安定にトランスフェクトされ、対応するＦＴＲを発現するそのようなアッセイ細胞が、本明細書に開示された方法に用いられ得る。
【００８４】
幾つかの実施形態において、該方法は、ステップｆ）において、前記遺伝子における１つまたは複数の既知ドライバー変異を含むＰＤＭ（対応する人工ＰＤＭ）の対応するタンパク質の発現構築物の第三のセットを、トランスフェクションが可能な条件下で、異なるアドレス可能な場所のアッセイ細胞に添加することを含む。
【００８５】
幾つかの実施形態において、該方法は、該生体試料からのｃＤＮＡを発現する細胞におけるＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡおよび／または対応する人工ＰＤＭと比較することをさらに含み、該生体試料からのｃＤＮＡを候補となる患者特有の発癌性変異として同定するために、生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、の異なる結果を用いる。
【００８６】
幾つかの実施形態において、該方法は、アッセイ細胞に薬物を添加して、該薬物の存在下と非存在下とで、該生体試料からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性および／または対応する野生型発現ｃＤＮＡおよび／または対応する人工ＰＤＭを比較するステップをさらに含み、薬物の存在下と非存在下とで、該癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の異なる結果が、該候補となる患者特有の発癌性変異の薬物応答を示す。
【００８７】
幾つかの実施形態において、該生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液から選択される。
【００８８】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料における異常なシグナル伝達経路の薬物応答、および／または患者特有の発癌性変異の薬物応答を同定する方法であって、
ａ）腫瘍の生検からなど、癌患者の該生体試料から複数のｍＲＮＡの試料を得るステップと；
ｂ）当該技術分野で公知の方法によって、該複数の腫瘍ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）様々な細胞シグナル伝達経路に関与する既知のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの個々のｃＤＮＡ試料を増幅するステップと；
ｄ）増幅されたｃＤＮＡをプロモータおよびレポータ遺伝子に動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させて、キメラテスト患者由来レポータ（テストＰＤＲ）を生成させるステップと；
ｅ）該腫瘍からの増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセット（テストＰＤＲ）と、並行して、該ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセット（ｗｔ  ＰＤＲ）と、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｆ）場合により、担体固体基板上で該ｃＤＮＡ構築物を乾燥させるステップと；
ｇ）該ＤＮＡ構築物を生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｈ）トランスフェクトされた細胞において該構築物および発現ベクターの発現を可能にして、腫瘍からのｃＤＮＡの第一のセットの遺伝子産物を得るステップと；
ｉ）該腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該細胞におけるキメラレポータ遺伝子の少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップと；
ｊ）ステップｇ）〜ｈ）のうちの任意の１つを薬物の存在下で繰り返して、該薬物の存在下と非存在下とで、該腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性および／または対応する野生型発現ｃＤＮＡおよび／または対応する人工ＰＤＭを比較するステップと、
の１つまたは複数を含み（任意の適切な順序で）、
該腫瘍からのｃＤＮＡを候補となる異常なシグナル伝達タンパク質として同定するために、腫瘍由来ｃＤＮＡを発現する細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現する細胞との異なる結果を用い、そして薬物の存在下と非存在下とで、該癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の異なる結果が、該候補となる患者特有の発癌性変異の薬物応答を示す、方法が提供される。
【００８９】
幾つかの実施形態によれば、腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路の薬物応答を検出または同定する方法であって、
ａ）インビトロまたはインビボで得ることができる腫瘍細胞、例えば腫瘍の生検からｍＲＮＡの試料を得るステップと；
ｂ）得られた複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの個々のｃＤＮＡ試料を増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させるステップと；
ｅ）該腫瘍からの増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセットと、並行して、該対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセットと、場合により前記遺伝子における１つまたは複数の既知ドライバー変異を含むＰＤＭ（人工ＰＤＭ）の対応するタンパク質の発現構築物の第三のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｆ）該アレーにおける各場所のためにレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）キメラ遺伝子のコトランスフェクションのために発現ベクターを添加するステップと；
ｇ）該ＤＮＡ構築物を生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｈ）該腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該細胞中で発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップと；
ｉ）ステップｇ）〜ｈ）のうちの任意の１つを薬物の存在下で繰り返して、該薬物の存在下と非存在下とで、該腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性および／または対応する野生型発現ｃＤＮＡを比較するステップと、
の１つまたは複数を含み（任意の適切な順序で）、
該腫瘍からのｃＤＮＡを候補となる異常なシグナル伝達タンパク質として同定するために、腫瘍由来ｃＤＮＡを発現する細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用い、そして薬物の存在下と非存在下とで、該癌患者の生体試料に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞の異なる結果が、該異常なシグナル伝達経路の薬物応答を示す、方法が提供される。
【００９０】
幾つかの実施形態において、該薬物は、抗癌薬／抗癌剤である。幾つかの実施形態において、１種よりも多くの薬物が、細胞に添加される。幾つかの実施形態において、薬物の組み合わせ（カクテル）が、細胞に添加され得る。幾つかの実施形態において、１種よりも多くの薬物が、細胞に添加される場合、該薬物は、任意の時間間隔および任意のインキュベーション時間で、同時または連続して添加され得る。
【００９１】
幾つかの実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、１つの発現構築物上（即ち、１つの分子上）に配置される。そのような実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、同一の、類似のまたは異なるプロモータを有し得る（即ち、ＰＤＭおよびＦＴＲの発現は、同一のまたは異なるプロモータによって制御され得る）。幾つかの実施形態において、ステップｇ）は、ステップｅ）および／またはｆ）に先行することができ、その場合、該アッセイ細胞は、発現構築物および／または発現ベクターの添加前に、各場所に添加される。
【００９２】
したがって幾つかの実施形態によれば、腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路の薬物応答を同定する方法であって、
ａ）インビトロまたはインビボで得ることができる腫瘍細胞、例えば腫瘍の生検からｍＲＮＡの試料を得るステップと；
ｂ）得られた複数の腫瘍ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの個々のｃＤＮＡ試料を増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡを第一のプロモータに動作可能に連結させた該ｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させるステップであって、前記発現構築物が、第二のプロモータを含み、蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）キメラ遺伝子をコードする、発現カセットをさらに含み、前記ＦＴＲが、レポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含むステップと；
ｅ）該腫瘍からの増幅されたｃＤＮＡおよび該ＦＴＲカセットを保有する発現構築物の第一のセットと、並行して、該対応する野生型ｃＤＮＡおよび該ＦＴＲカセットの発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｆ）該ＤＮＡ構築物を生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｇ）該腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該細胞中で発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップと；
の１つまたは複数を含み（任意の適切な順序で）、
該腫瘍細胞からのｃＤＮＡを候補となる異常なシグナル伝達タンパク質として同定するために、腫瘍由来ｃＤＮＡを発現する細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現する細胞との異なる結果を用いる、方法が提供される。
【００９３】
幾つかの実施形態において、該第一および第二のプロモータは、同一または異なっている。
【００９４】
幾つかの実施形態によれば、腫瘍細胞において同定された異常なシグナル伝達経路の薬物応答を検出する方法であって、
ａ）該生体試料から複数のｍＲＮＡを得るステップと；
ｂ）該複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップと；
ｃ）既知のシグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡを増幅するステップと；
ｄ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させたステップ（ｃ）のｃＤＮＡの個々の発現構築物を形成させるステップと；
ｅ）該腫瘍からの増幅されたｃＤＮＡを保有する発現構築物の第一のセットと、該対応する野生型ｃＤＮＡの発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと、
を含み、
それにより腫瘍細胞における異常なシグナル伝達経路を同定するのに適した、該シグナル伝達タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおいて候補となる変異を保有する発現構築物のアドレス可能なアレーを提供する、方法が提供される。
【００９５】
幾つかの実施形態において、該方法は、該アレーにおける各場所のためのレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップ（ｆ）をさらに含む。
【００９６】
さらなる実施形態において、該方法は、ｇ）該ＤＮＡ構築物を生存可能なアッセイ細胞にコトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；ｈ）腫瘍からのｃＤＮＡを発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現ｃＤＮＡと比較するステップと、をさらに含み、該腫瘍細胞からのｃＤＮＡを候補となる異常なシグナル伝達タンパク質として同定するために、腫瘍細胞に由来するｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞と、対応する野生型ｃＤＮＡを発現するアッセイ細胞との異なる結果を用いる。
【００９７】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の生体試料からの腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な因子の薬物応答を同定する方法であって、
ａ）アドレス可能なアレーにおいて、生存可能なアッセイ細胞を基板に添加するステップと；
ｂ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターを該アッセイ細胞に添加するステップと；
ｃ）該アレーの特定の場所で、該アッセイ細胞に患者の生体試料を添加するステップと；
ｄ）該患者の生体試料が添加された細胞において発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、該生体試料が添加されていない対応する細胞と比較するステップと；
ｅ）ステップｃ）〜ｄ）のうちの任意の１つを薬物の存在下で繰り返して、該薬物の存在下と非存在下とで、該患者の生体試料が添加されたアッセイ細胞において発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、該生体試料が添加されていない対応する細胞と比較するステップと
の１つまたは複数を含み（任意の適切な順序で）、
腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な因子を含む生体試料を同定するために、該患者の生体試料が添加された細胞と、該生体試料が添加されていない対応する細胞と、の異なる結果が用いられ；そして薬物の存在下と非存在下で、該患者の生体試料が添加された細胞と該生体試料が添加されていない対応する細胞との異なる結果が、腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な因子の薬物応答を示す、方法が提供される。
【００９８】
幾つかの実施形態において、該生体試料は、患者の腫瘍の微小環境、細胞外液、腫瘍から分泌された液体、血漿、気管支肺胞洗浄液など、またはそれらの組み合わせから選択される。
【００９９】
幾つかの実施形態において、該腫瘍形成能に影響を及ぼすことが可能な因子は、オークリン因子、パラクリン因子、またはその両方から選択される。
【０１００】
幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、ＦＴＲを安定して発現する。幾つかの実施形態において、ステップｂ）は、ステップａ）に先行することができ、その場合、該細胞は、アドレス可能なアレーに添加されるＦＴＲの発現ベクターに添加される。
【０１０１】
幾つかの実施形態によれば、１つもしくは複数の患者特有の変異の影響および／または１つもしくは複数の患者特有の変異の薬物応答および／または１つもしくは複数の患者特有の変異の薬物（複数可）への感受性を抑制することが可能な薬物（複数可）を同定する方法であって、
ａ）患者特有の変異（複数可）を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｂ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｃ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｄ）該薬物の存在下と非存在下とで、該１つまたは複数の患者特有の変異（複数可）を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現遺伝子と比較するステップと；
の１つまたは複数を含み（任意の順序で）、
薬物の存在下と非存在下とで、該変異を含む遺伝子、および／または対応する野生型遺伝子を発現するアッセイ細胞間の異なる結果が、患者特有の変異の影響を抑制することが可能な薬物を示す、方法が提供される。
【０１０２】
幾つかの実施形態によれば、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの実施形態において、該方法は、１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、薬物の組み合わせを添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、様々な濃度の薬物（複数可）を添加して、薬物応答を測定することを含む。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの属性は、蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択され得る。幾つかの実施形態において、該局在は、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞下局在を含み得る。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの標的遺伝子部分は、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、該ＦＴＲのレポータ遺伝子部分は、蛍光タンパク質などの蛍光マーカをコードし得る。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、該患者遺伝子は、患者の生体試料から得ること／それに由来することができる。幾つかの実施形態において、該生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液、微小環境抽出物、細胞外液、腫瘍から分泌された液体から選択され得る。幾つかの実施形態において、該患者は、癌患者である。幾つかの実施形態において、該変異は、発癌性変異である。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットは、遺伝子の一部を保有する。幾つかの実施形態において、該方法の発現構築物の第一および／または第二のセットは、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットのプロモータは、誘導型または構成型プロモータであり得る。幾つかの実施形態において、該方法は、トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で該ＤＮＡ構築物を乾燥させることをさらに含む。幾つかの実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、１つの発現構築物上（即ち、１つの分子上）に配置される。そのような実施形態において、ＰＤＭの発現カセットおよびＦＴＲの発現カセットは、同一の、類似のまたは異なるプロモータを有し得る（即ち、ＰＤＭおよびＦＴＲの発現は、同一のまたは異なるプロモータによって制御され得る）。幾つかの実施形態において、ステップｃ）は、ステップａ）および／またはステップｂ）に先行することができ、その場合、該アッセイ細胞は、発現構築物および／または発現ベクターの添加前に、アドレス可能なアレーに添加される。
【０１０７】
幾つかの実施形態によれば、１つまたは複数の患者特有の変異の薬物処置への感受性を同定する方法であって、
ａ）患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットと、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットと、のアドレス可能なアレーを形成させるステップと；
ｂ）該アドレス可能なアレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子をコードする発現ベクターを添加するステップと；
ｃ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、該アッセイ細胞を各場所に添加するステップと；
ｄ）該薬物の存在下と非存在下とで、該変異（複数可）を含む遺伝子を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現遺伝子と比較するステップと；
を含み、
薬物の存在下と非存在下とで、該変異を保有する遺伝子、および／または対応する野生型遺伝子を発現するアッセイ細胞間の異なる結果が、薬物による患者特有の変異の処置への感受性を示す、方法が提供される。
【０１０８】
幾つかの実施形態によれば、癌患者の１つもしくは複数の患者特有の発癌性変異の薬物応答を検出する方法であって、
ａ）該発現構築物および発現ベクターを生存可能なアッセイ細胞にトランスフェクトすることが可能な条件下で、アドレス可能なアレーにおいて、生存可能なアッセイ細胞を基板に添加するステップと；
ｂ）該アレーにおける各場所に特有のレポータ遺伝子部分に連結された標的遺伝子部分を含む蛍光トランスロケーションレポータ（ＦＴＲ）遺伝子の発現ベクターを該アッセイ細胞に添加するステップと；
ｃ）該アドレス可能なアレーの特定の場所の該アッセイ細胞に、患者特有の変異を含む遺伝子を保有する発現構築物の第一のセットを添加し、そして特定の場所の該アッセイ細胞に、対応する野生型遺伝子の発現構築物の第二のセットを添加するステップであって、発現構築物の第一のセットおよび該発現構築物の第二のセットが、共通の場所に添加されないステップと；
ｄ）該薬物の存在下と非存在下とで、該発癌性変異（複数可）を発現する該アッセイ細胞中の該発現されたＦＴＲの少なくとも１つの属性を、対応する野生型発現遺伝子と比較するステップと；
を含み、
薬物の存在下および／または非存在下で、変異を保有する遺伝子および／または対応する野生型遺伝子を発現するアッセイ細胞間の異なる結果が、該患者特有のドライバー変異の薬物応答を示す、方法が提供される。
【０１０９】
幾つかの実施形態によれば、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの実施形態において、該方法は、１種より多くの薬物を同時に、または連続で添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、薬物の組み合わせを添加することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、様々な濃度の薬物（複数可）を添加して、薬物応答を測定することを含む。
【０１１０】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの属性は、蛍光タンパク質の局在および蛍光タンパク質のトランスロケーションから選択され得る。幾つかの実施形態において、該局在は、細胞質、核、核小体、形質膜、小胞体（ＥＲ）、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソーム、ペルオキシソーム、エンドソーム区画、および細胞骨格から選択される細胞下局在を含み得る。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの標的遺伝子部分は、腫瘍抑制因子、細胞骨格タンパク質、増殖因子受容体、Ｇタンパク質共役受容体、細胞接着タンパク質、プロテインキナーゼ、転写因子、アダプタータンパク質および交換因子から選択されるタンパク質をコードする。幾つかの実施形態において、該ＦＴＲのレポータ遺伝子部分は、蛍光タンパク質などの蛍光マーカをコードし得る。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、該患者遺伝子は、患者の生体試料から得ること／それに由来することができる。幾つかの実施形態において、該生体試料は、腫瘍細胞、腫瘍生検、腫瘍組織および体液、微小環境抽出物、細胞外液、腫瘍から分泌された液体から選択され得る。幾つかの実施形態において、該患者は、癌患者である。幾つかの実施形態において、該変異は、発癌性変異である。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットは、遺伝子の一部を保有する。幾つかの実施形態において、該方法の発現構築物の第一および／または第二のセットは、二本鎖直鎖状ＤＮＡを含む。幾つかの実施形態において、発現構築物の第一および／または第二のセットのプロモータは、誘導型または構成型プロモータであり得る。幾つかの実施形態において、該方法は、トランスフェクション試薬の存在下、固体担体上で該ＤＮＡ構築物を乾燥させることをさらに含む。幾つかの実施形態において、ステップｂ）および／またはステップｃ）は、ステップａ）に先行することができ、その場合、該細胞は、発現構築物および／または発現ベクターに添加され得る。
【０１１４】
幾つかの実施形態によれば、本明細書に開示された方法で用いられる発現構築物は、以下のステップの１つまたは複数を含む工程によって得ることができる：
ｉ）該患者の生体試料から得られた複数のｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリを作製するステップ；
ｉｉ）発癌性変異を保有することが疑われる遺伝子をコードするポリヌクレオチドに相補的なプライマーセットを用いて、該ｃＤＮＡライブラリの特定のｃＤＮＡを増幅するステップ；および
ｉｉｉ）該増幅されたｃＤＮＡをプロモータに動作可能に連結させるステップ。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、１つまたは複数の変異を保有することが疑われる該患者の遺伝子または遺伝子部分は、当該技術分野で公知の方法によって合成することができ、プロモータに動作可能に連結させて、該発現構築物を得ることができる。幾つかの実施形態において、該患者の遺伝子（またはその一部）および／または該対応する野生型遺伝子は、本明細書で詳述される通り、それらの配列に基づいて人工で合成することができ、さらに処理して対応するＰＤＭを作製することができる。
【０１１６】
幾つかの実施形態によれば、患者は、癌に罹患した患者である。幾つかの実施形態において、癌としては、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫および混合型の腫瘍などの癌が挙げられる。腫瘍の特定の分類としては、リンパ増殖性疾患、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌、骨癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部癌、中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、皮膚癌、腎臓癌、さらにはこれらの全ての転移が挙げられる。処置を受けることが可能な特定のタイプの腫瘍としては、肝細胞癌、肝癌、肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋皮肉腫、浸潤性乳管癌、乳頭腺癌、黒色腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌（高分化、中分化、低分化または未分化）、腎細胞癌、副腎腫、副腎様腺癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌（小細胞、非小細胞および大細胞肺癌など）、膀胱癌、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、網膜芽細胞腫、神経芽腫、結腸癌、直腸癌、造血器悪性腫瘍（急性骨髄性白血病、急性骨髄球性白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、脊髄リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫をはじめとする全てのタイプの白血病およびリンパ腫など）が挙げられる。
【０１１７】
特定の実施形態によれば、該癌は、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、骨髄腫、白血病、頭頸部癌、腎臓癌、卵巣癌、骨癌、肝臓癌または甲状腺癌からなる群から選択される。
【０１１８】
幾つかの実施形態において、該患者は、癌について陽性と診断されている。幾つかの実施形態において、該患者は、標的治療処置レジメンを受けていて、処置結果が既知または未知である。幾つかの実施形態において、該患者は、入手可能な患者腫瘍分子プロファイリング（ＩＨＣ、ＦＩＳＨ、ＰＣＲおよびシーケンシング）を有する。幾つかの実施形態において、該患者は、入手可能な患者履歴および転帰（患者の応答、耐性、再発率および生存率）を有する。
【０１１９】
幾つかの実施形態において、該生体試料は、血液、血清、生検、針生検、気管支肺胞洗浄液、胸水、尿、唾液および腫瘍から選択される。幾つかの実施形態において、該生体試料は、単離されたばかりであり得る。幾つかの実施形態において、該生体試料は、凍結されたものであり得る。幾つかの実施形態において、該生体試料は、固定されたものであり得る。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、アッセイ細胞中で発現される各タンパク質（テストされるＰＤＭ、ＦＴＲ、ＷＴ  ＰＤＭ、ＰＤＲなど）は、差次的に同定可能である。別の実施形態において、各タンパク質は、直接的または間接的に、異なるマーカもしくはレポータ、または異なる蛍光タンパク質によって同定され得る。別の実施形態において、各キメラタンパク質（ＦＴＲまたはＰＤＲなど）は、異なるレポータ部分を含む。別の実施形態において、異なるタンパク質は、蛍光タンパク質またはレポータを共有し得る。別の実施形態において、本発明の各キメラタンパク質は、異なるレポータ部分を含む。
【０１２１】
別の実施形態において、ＰＤＭは、癌の成長に関連する。別の実施形態において、ＰＤＭは、発癌遺伝子または腫瘍抑制因子である。別の実施形態において、ＰＤＭは、細胞骨格制御因子である。別の実施形態において、ＰＤＭは、腫瘍成長および転移において役割を有する。別の実施形態において、ＰＤＭは、小胞輸送タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、小胞テザリングタンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、細胞接着タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、核移入タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、増殖因子受容体である。別の実施形態において、ＰＤＭは、サイトカイン受容体である。別の実施形態において、ＰＤＭは、細胞付着タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、腫瘍炎症に関与する。別の実施形態において、ＰＤＭは、細胞極性タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、シグナル伝達タンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、アダプタータンパク質である。別の実施形態において、ＰＤＭは、プロテインキナーゼである。別の実施形態において、ＰＤＭは、交換因子である。別の実施形態において、ＰＤＭは、細胞骨格タンパク質である。幾つかの例示的実施形態において、ＰＤＭは、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＯ、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＧＦＢＲ２、ＦＢＸＷ７、ＭＹＣ、ＬＫＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＣＦ７Ｌ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＥＳＲ１、ＡＲ、ＰＲ、ＤＤＲ２、ＭＥＫ１またはそれらの任意の組み合わせを含む群またはそれらからなる群から選択される。
【０１２２】
別の実施形態において、ＰＤＭは、蛍光タンパク質など（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＧＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１など）のマーカ（標識）と共に発現される。幾つかの例示的実施形態において、該マーカは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）のマーカモチーフを含み、画像化の前に、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２またはＲｅＡｓＨ−ＥＤＴ２が、テストアッセイに添加されて、該Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓモチーフを含む組換えタンパク質への結合によって蛍光を発し得る。幾つかの実施形態において、該Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓを含む該タンパク質は、ＰＤＭ、単独の蛍光タンパク質、または細胞下オルガネラ、例えば形質膜または核を標識するためにさらに用いられ得る細胞下マーカに融合された蛍光タンパク質であり得る。幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭと共に発現される該マーカ（標識）は、アッセイ細胞におけるＰＤＭのトランスフェクションまたは発現を検証するマーカとして用いられる。
【０１２３】
別の実施形態において、ＰＤＲは、蛍光タンパク質など（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＧＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１など）のマーカ（標識）に融合されたＰＤＭである。幾つかの例示的実施形態において、ＰＤＲは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）モチーフを含み、マーカ（標識）に融合されたＰＤＭである。
【０１２４】
幾つかの例示的実施形態において、該ＦＴＲは、蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ＧＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、ＤｓＲｅｄ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ＡｍＣｙａｎ１、ＺｓＧｒｅｅｎ１、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、ＤｓＲｅｄ２、ＡｓＲｅｄ２、およびＨｃＲｅｄ１など）またはＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓモチーフなどのレポータ部分と、非限定的に癌の成長に関連するタンパク質、発癌遺伝子産物、細胞骨格制御因子、小胞輸送タンパク質、小胞テザリングタンパク質、細胞接着タンパク質、核移入タンパク質、増殖因子受容体、細胞付着タンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、腫瘍炎症に関与するタンパク質、細胞極性タンパク質、増殖因子シグナル伝達タンパク質、アダプター、細胞骨格タンパク質などから選択される標的タンパク質部分と、を含む融合（キメラ）タンパク質である。各可能性は、別の実施形態である。
【０１２５】
幾つかの例示的実施形態において、該ＦＴＲは、蛍光タンパク質などのレポータ部分と、非限定的にＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ｍＴＯＲ、ＲｅｌＡ、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＥＲＦ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、ＣＴＮＮＢ１、ＪＮＫ１α、ＪＮＫ１β、ＪＮＫ２α、ＪＮＫ２β、ＥＲＫ５、Ｐ３８α、Ｐ３８β、ＡＭＰＫ、ＳＴＫ１１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＰ５３、ＥＳＲ１、ＧＡＴＡ３、ＣＤＫ２、ＳＭＡＤ１、ＮＯＴＣＨ１、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＰＲＫＡＣＡ、ＮＬＫまたはそれらの任意の組み合わせを含むまたはそれらからなる群から選択される標的（マーカ）タンパク質部分と、を含む融合タンパク質である。各可能性は、別の実施形態である。
【０１２６】
幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭは、ＫＲａｓであり得、該ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２、ＥＲＦ、ＪＮＫおよびＡＫＴ１から選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【０１２７】
幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭは、ＡＫＴ２またはＡＫＴ３であり得、該ＦＴＲの標的部分は、ＡＫＴ１およびＲｅｌＡから選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【０１２８】
幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭは、ＦＧＦＲ１であり得、該ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２、ＪＮＫ（ＪＮＫ１α１など）、ｐ３８ｂ、ＡＫＴ１およびＳＴＡＴ３から選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【０１２９】
幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭは、ＢＲａｆであり得、該ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２およびＥＲＦから選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【０１３０】
幾つかの例示的実施形態において、該ＰＤＭは、ＥＧＦＲであり得、該ＦＴＲの標的部分は、ＥＲＫ２、ＲｅｌＡ、ＡＫＴ１、ｐ３８ｂ、ＪＮＫ１ａ１から選択され得る。各可能性は、別の実施形態である。
【０１３１】
別の実施形態において、本発明は、各アッセイ細胞がＰＤＭおよび／またはＦＴＲを発現するアッセイ細胞を含む。別の実施形態において、本発明は、各アッセイ細胞が異なるＰＤＭおよび／またはＦＴＲおよび／またはＰＤＲを発現するアッセイ細胞を含む。別の実施形態において、本発明は、各アッセイ細胞が異なるＤＮＡ断片でトランスフェクトされ、核ＤＮＡ断片が異なるＰＤＭおよび／またはＦＴＲをコードする、アッセイ細胞を含む。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、場所（位置）を指定された固体基板上に配置／播種／増殖される。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、各場所で同一である。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、各場所で同一でない。幾つかの実施形態において、該アッセイ細胞は、培地中で各場所に添加される。幾つかの実施形態において、該細胞は、ＤＮＡ構築物を既に脱水させた固体基板に添加される。幾つかの実施形態において、該細胞は最初、固体基板上に播種され、所定の時間の後、トランスフェクトされる。
【０１３２】
別の実施形態において、本発明は、各アッセイ細胞が異なるＤＮＡ断片でトランスフェクトされ、各ＤＮＡ断片が異なるＰＤＭおよび／またはＦＴＲおよび／またはＰＤＲをコードする、アッセイ細胞を含む。
【０１３３】
幾つかの実施形態において、該ＦＴＲの局在の同定は、タンパク質アッセイ、結合アッセイ、免疫アッセイ、顕微鏡画像化、または当業者に公知の任意の他の適切なアッセイを利用して実施される。
【０１３４】
幾つかの実施形態において、本発明は、アッセイ細胞における形態学的変化を検出するステップをさらに含む。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、任意の患者ＤＮＡのシーケンシングを必要としない。
【０１３５】
幾つかの実施形態によれば、該薬物は、抗癌薬である。幾つかの例示的実施形態において、該薬物は、アファチニブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、ブパルリシブ、カボザンチニブ、カルフィルゾミブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、デノスマブ、エルロチニブ、エベロリムス、ゲフィチニブ、イブリツモマブ・チウキセタン、イブルチニブ、イデラリシブ、イマチニブメシル酸塩、イピリムマブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ニロチニブ塩酸塩水和物、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペルツズマブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、リツキサン、ソラフェニブ、セルメチニブ、スニチニブ、テムシロリムス、トラメチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ、ジブ・アフリベルセプト、およびこれらの任意の組み合わせから選択され得るが、これらに限定されない。各可能性は、別の実施形態である。
【０１３６】
幾つかの実施形態によれば、該薬物（複数可）は、任意の所望の量／濃度でテスト細胞に添加され得る。例えば該薬物は、１ｎＭ〜１ｍＭおよびその部分範囲の濃度で、例えば非限定的に１５０ｎＭ〜７５０ｎＭ、１２．５μＭ〜１００μＭ、２００ｎＭ〜２５μＭなどの濃度で添加され得る。
【０１３７】
幾つかの実施形態によれば、該薬物（複数可）は、添加されて、テスト細胞と共に任意の所望の時間、例えば１０分〜２４時間の範囲内でインキュベートされ得る。
【０１３８】
幾つかの実施形態によれば、患者の癌を診断するキットが提供される。幾つかの実施形態において、腫瘍細胞における異常な細胞シグナル伝達経路を同定するキットが提供される。幾つかの実施形態において、患者特有の発癌性変異を同定するキットが提供される。幾つかの実施形態において、患者特有の発癌性変異の薬物応答を測定／検出／同定するキットが提供される。幾つかの実施形態において、薬物治療に対する患者の変異遺伝子の応答／耐性を測定するキットが提供される。
【０１３９】
幾つかの実施形態において、本発明は、患者特有の発癌性変異を同定することによって、対象における癌または分子上の癌プロファイルを診断するキットを提供する。該キットは、幾つかの実施形態によれば、処置の成功を予測するため、または癌に関与するパラクリンもしくはオートクリン因子を同定するために、用いられ得る。別の実施形態において、該キットは、レポータ遺伝子を検出する手段を少なくとも１つ含む。別の実施形態において、該キットは、マーカを検出する手段を含む。幾つかの実施形態において、該キットは、核酸分子および／もしくはテスト細胞を保持するための基板もしくはコンテナ、検出／トランスロケーションアッセイ（複数可）を実施するための指示、テスト細胞、トランスフェクション試薬、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つまたは複数を含む。
【０１４０】
本発明の診断組成物は、所望なら、製造品、例えば診断試薬および使用説明書を含み得るＦＤＡ認可キットなどのキットの中で提供され得る。該キットはまた、医薬品の製造、使用または販売を管理する政府機関によって処方された形態でコンテナに添付された注意書きに適合され得、該注意書きは、該組成物の形態、またはヒトもしくは獣医学的使用の機関による認可を反映している。
【０１４１】
別の実施形態において、本発明の方法およびキットは、癌患者の生存率を上昇させる。本発明のアッセイは、理想的にはキットの調製に適する。そのようなキットは、バイアル、管、プレート、スライドなどのコンテナ手段のそれぞれが細胞アッセイの分離エレメントを含みながら、該コンテナ手段を１つまたは複数備えて密封されて受け取るように区画化された運搬手段を含み得る。
【０１４２】
一実施形態において、それぞれが異なる本発明のタンパク質を含むアッセイ細胞のパネルを含む、対象の癌を診断するキットが提供され、該キットは、ＰＤＭ（患者の生体試料由来）および／またはＦＴＲおよび／またはＦＴＲをコードする核酸分子を有する基板を含み、該基板はさらに、アッセイ細胞と、癌を有することが疑われるヒト対象から単離された生体試料と、トランスロケーションイベントを反応、測定および／または検出するための印刷された使用説明書と、を保持することが可能である。
【０１４３】
幾つかの実施形態において、トランスフェクトされたアッセイ細胞は、効果的条件下で培養され、組換えタンパク質または標識されたタンパク質の発現を可能にする。一実施形態において、本発明の標識されたタンパク質またはマーカタンパク質（ＰＤＭ、ＦＴＲなど）は、組換えタンパク質またはキメラである。幾つかの実施形態において、効果的な培養条件としては、タンパク質の発現を可能にする効果的培地、バイオリアクタ、温度、ＣＯ２、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、効果的培地は、細胞を培養して本発明の組換えポリペプチドを生成する任意の培地を指す。幾つかの実施形態において、培地としては、典型的には同化可能な炭素、窒素およびリン酸供給源、ならびに適切な塩、無機質、金属および他の栄養素、例えばビタミンを有する水溶液が挙げられる。幾つかの実施形態において、本発明の細胞は、従来の発酵バイオリアクタ、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリプレートで培養され得る。幾つかの実施形態において、培養は、組換え細胞に適した温度、ｐＨおよび酸素量で実施される。幾つかの実施形態において、培養条件は、当業者の技能の範囲内である。
【０１４４】
幾つかの実施形態において、本発明は、タンパク質トランスロケーションイベントをモニタリングおよび記録するための再分配技術を利用する。別の実施形態において、タンパク質の標的が、緑色蛍光タンパク質または他の蛍光タンパク質でラベル化され、安定して、または一過性にトランスフェクトされた細胞株が作製される。別の実施形態において、本発明のアッセイは、ハイスループット光学顕微鏡を基にした機器を利用して読み取られる。
【０１４５】
別の実施形態において、本発明のタンパク質トランスロケーションアッセイは、主として細胞培地の成分としての生体試料に由来するＰＤＭのリードシリーズ（ｌｅａｄ  ｓｅｒｉｅｓ）のプロファイリング、一次スクリーニングに用いられる、ハイコンテントのハイスループットアッセイである。別の実施形態において、本発明のタンパク質トランスロケーションアッセイは、スピニングディスク技術または任意の他の顕微鏡に基づく技術を利用した生存細胞の画像化を含む。
【０１４６】
幾つかの実施形態において、トポノミックローカライゼーション（ｔｏｐｏｎｏｍｉｃ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）技術を用いて、タンパク質トランスロケーションイベントを追跡および記録する。幾つかの実施形態において、本発明のタンパク質の免疫蛍光手段が利用される。幾つかの実施形態において、本発明のタンパク質は、蛍光マーカでラベル化される。幾つかの実施形態において、共焦点顕微鏡画像が、評価および処理される。別の実施形態において、標準的なデータセットは、生物学的条件につき各細胞の２〜４０の画像を含む。別の実施形態において、自動化画像解析が、実施される。別の実施形態において、自動化画像解析は、細胞内コンパートメントまたは構造の同定を含む。
【０１４７】
別の実施形態において、空間的関係が、異なる次元で取り込まれる。別の実施形態において、有界領域中のタンパク質−マーカ濃度の定量的評価が、実施される。別の実施形態において、本発明はさらに、画素間の距離の等方性分布の測定および評価に基づく、タンパク質の共局在試験を提供する。別の実施形態において、本発明は、２次元解析（領域）を提供する。別の実施形態において、本発明はさらに、０次元解析（ポイント）を提供する。別の実施形態において、本発明は、１次元モデリングを提供する。
【０１４８】
用語「含む」、「含むこと」「包含する」、「包含すること」、「有する」およびそれらの活用語は、「包含するがそれに限定されないこと」を意味する。用語「含む」および「含むこと」は、幾つかの実施形態において、それぞれ「からなる」および「からなること」に限定される。用語「からなること」は、「包含し、それらに限定されること」を意味する。用語「から本質的になる」は、組成物、方法または構造が追加の成分、ステップおよび／または部分を包含し得るが、該追加の成分、ステップおよび／または部分が、特許請求された組成物、方法または構造の基本的特性および新規特性を実質的に変化させない場合に限ることを意味する。
【０１４９】
本明細書で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他の事柄を明示しない限り、複数の対象物を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、その混合物をはじめとする複数の化合物を包含し得る。
【０１５０】
本明細書に表示された数値を参照しながら本明細書で用いられる用語「約」は、表示された値＋／−１０％と理解されるべきである。
【０１５１】
本明細書で用いられる用語「方法」は、非限定的に化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られた手法、手段、技術および手順、または化学、薬理学、生物学、生化学および医学技術の実施者によって既知の手法、手段、技術ならびに手順から即座に開発された手法、手段、技術および手順など、所与のタスクを達成する手法、手段、技術および手順を指す。
【０１５２】
本発明のさらなる目的、利点、および新規な特徴は、限定することを意図するものではない以下の実施例を検討する際に、当業者に明白となろう。加えて上記の、そして以下の特許請求の範囲の部分で請求される本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれによって、以下の実施例の実験的裏づけが見出される。
【０１５３】
以下の実施例は、本発明の幾つかの実施形態をより完全に説明するために提示されている。しかしそれらは、本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１５４】
実施例
一般に、本明細書で用いられる命名法および本発明で利用される実験手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術を含む。そのような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）；  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．，  ｅｄ．  （１９９４）；  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；  Ｐｅｒｂａｌ，  ”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；  Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｂｉｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  ”Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，  Ｖｏｌｓ．  １−４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８０１，５３１号、同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に示された方法論；  ”Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）；  ”Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”  ｂｙ  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９９４），  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；  ”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９９４）；  Ｓｔｉｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ），  ”Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ  （１９９４）；  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  ”Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）を参照されたい；利用可能な免疫アッセイは、特許および科学文献に詳細に記載されており、例えば米国特許第３，７９１，９３２号、同第３，８３９，１５３号、同第３，８５０，７５２号、同第３，８５０，５７８号、同第３，８５３，９８７号、同第３，８６７，５１７号、同第３，８７９，２６２号、同第３，９０１，６５４号、同第３，９３５，０７４号、同第３，９８４，５３３号、同第３，９９６，３４５号、同第４，０３４，０７４号、同第４，０９８，８７６号、同第４，８７９，２１９号、同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号；  ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｇａｉｔ，  Ｍ．  Ｊ．，  ｅｄ．  （１９８４）；  “Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８５）；  ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．  Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８４）；  ”Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．  Ｉ．，  ｅｄ．  （１９８６）；  ”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）；  ”Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，  （１９８４）  ａｎｄ  ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌ．  １−３１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  ”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）；  Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）を参照されたい（それらの全てが、参照により本明細書に組み入れられる）。他の一般的参考資料は、この文書全体に提供されている。
【０１５５】
生体試料の採取
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍生検と凍結した新鮮な腫瘍部分または生検の両方を採取する。ＦＦＰＥ試料を用いて、癌の進行に関与することが知られている特異的ゲノムエクソン（ｃＫｉｔのエクソン１１など）を抽出する。新鮮な（新鮮な、または新鮮な状態で凍結された）生検を、ｍＲＮＡの抽出と間質液抽出の両方に使用する。
【０１５６】
このように、後向き試験と前向き試験の両方の試料を採取する。後向き試験は、処置の有効性が知られている症例からの凍結腫瘍切片に基づく。
【０１５７】
前向き試験は、手術／生検／気管支鏡検査の直後に採取された新鮮なまたはスナップ凍結された試料／生検組織／腫瘍切片に基づく。これは、関連する全てのテストタンパク質（発癌遺伝子または指示薬など）の増幅を可能にする。気管支鏡検査により得られる血漿試料（ヘパラン硫酸ゲルチューブを用いる）、血液試料、腹水、胸水および肺液などの他の体液は、それらが多くの腫瘍分泌物を蓄積するため非常に重要であり、同じく採取される。
【０１５８】
腫瘍切除（手術、生検、気管支鏡検査）の後に、腫瘍組織を氷上の滅菌バッグまたはチューブ内に入れる（ホルマリンで処理しない）。病理医は、腫瘍を、固定に必要なものと、さらなる分析のために氷上で新鮮なまま輸送される、腫瘍を最もよく表すものと、に分割する（生存可能な腫瘍切片のサイズおよび位置を考慮して）。病理医は、悪性細胞に富む組織切片または領域、および間質組織または他の非悪性組織の量が少ない組織切片または領域を同定し、それを切除する。組織の正味重量が１ｇを超える場合には、組織をさらに複数の小片に切断し、セルロースカラム上に置き、１００ｇで１０分間遠心分離する（組織グラムあたり１００±５０マイクロリットルのＩＦが予測される）。その後、組織を別の１５／５０ｍｌチューブに移し、−８０℃の冷凍庫で凍結させる。間質液（ＩＦ）として知られる遠心分離された液体を、元のチューブ内で凍結させる。
針生検  −  組織を１５コニカルチューブに入れ、−８０℃の冷凍庫で凍結させる。
気管支鏡検査による生検  −  組織を１５コニカルチューブに入れ、−８０℃の冷凍庫で凍結させる。
気管支肺胞洗浄液  −  抽出液を２本の５０ｍｌファルコンチューブに分配し、遠心分離する（３０００ＲＰＭ、１５分）。液体を新しいチューブに移し、液体と細胞（元のチューブの）の両方を−８０℃で凍結させる。
胸水  −  胸水を遠心分離し（３０００ＲＰＭ、１５分）、液体を新しいチューブに移し、液体と細胞（元のチューブの）の両方を−８０℃で凍結させる。
凍結切片  −  可能であれば、腫瘍をミクロトームで凍結し、切り出す。
【０１５９】
ホルマリン固定された包埋腫瘍生検からのゲノムＤＮＡの抽出
エクソン１１のｃＫｉｔ変異、ＥＧＦＲエクソン１９、２０、ＨＥＲ２エクソン２０など、特定のエクソンにおいて既知の変異が存在する遺伝子を同定するために、ＦＦＰＥ組織から抽出されたＤＮＡを用いる。この目的のために、標準的なＤＮＡ抽出キットおよびプロトコルを用いる（例えば、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ組織、カタログ番号５６４０４）。
【０１６０】
エクソンの増幅および全長遺伝子への挿入
所望のエクソンを発現させるために、ゲノムＤＮＡの増幅を実施し、このエクソンを欠く全長遺伝子にこのエクソンを挿入する。この目的のために、即発現可能なベクターにおいてこのエクソンを欠く全長遺伝子を作製し、その後、このエクソンを従来の分子生物学の技術を用いて該構築物中に組み込む。
【０１６１】
新鮮な生検：冷凍生検からの必要量の組織の抽出
生検の画分を、ＲＮＡ精製および間質液抽出に使用する。生物材料の残りを、将来の参照分析または追加の分析（免疫組織化学検査（ＩＨＣ）、ＦＩＳＨなど）のために貯蔵する。
【０１６２】
間質液（ＩＦ）の抽出
腫瘍細胞によって分泌され、抗癌薬への耐性を付与し得る物質の存在を検出するために、テスト細胞に対するアゴニストとしての後の使用のために、以下に詳述される通り抽出された間質液（ＩＦ）を貯蔵する。
【０１６３】
組織試料をガラス繊維フィルター付きカラム内で、４℃および１５００ｇで７分間遠心分離することによって、ＩＦ抽出を実施する。その後、該液体をカラムの底部から新しいチューブに採取する。
【０１６４】
ｍＲＮＡの抽出
試料から抽出されたｍＲＮＡは、患者由来のマーカ（ＰＤＭ）、即ち、既知の発癌遺伝子であり、細胞に発癌遺伝子特性をもたらす変異を潜在的に保有する遺伝子（発癌性変異を保有する可能性のある遺伝子）の増幅のために必要である。テストされる例示的遺伝子としては、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＡＦ１、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＳＭＯ、ＴＰ５３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＴＧＦＢＲ２、ＦＢＸＷ７、ＭＹＣ、ＬＫＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＴＣＦ７Ｌ２、ＭＡＰ３Ｋ１、ＡＲ、ＰＲ、ＥＳＲ１、ＤＤＲ２、ＭＥＫ１、およびＭＥＫ２が挙げられる。
【０１６５】
ＲＮＡ抽出を、グアニジウム−塩化セシウム法、グアニジウム酸（Ｇｕａｎｉｄｉｕｍ  Ａｃｉｄ）−フェノール法およびカオトロピック塩の存在下で核酸に結合するガラス繊維フィルターを含む、当技術分野で公知の方法によって、そして／または市販のキット（製造業者の使用説明書に従って用いられるＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット、カタログ番号７４１０６など）の使用によって実施する。
【０１６６】
ｃＤＮＡの作製
ＰＤＭの増幅を可能にするために、組織から抽出されたｍＲＮＡに基づいてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡを、テンプレートｍＲＮＡに基づき、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ逆転写酵素およびオリゴｄＴプライマー、ランダムヘキサマープライマー、または特異的プライマーを用いて合成する。例示的なプロトコルとしては、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘプロトコル（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１８０８０−０５１）の使用が挙げられる。
【０１６７】
テストＰＤＭの作製
テストＰＤＭの作製は、選択されたＰＤＭの増幅、およびアッセイ細胞での適正な発現を可能にするための追加的エレメントの付着、の２つのステップで実施される。
【０１６８】
直接的アプローチでは、増幅されるテストＰＤＭに関連するオリゴヌクレオチドを含む予備ＰＣＲ反応を実施して、ｃＤＮＡ試料中のこれらの選択された遺伝子の過剰提示を可能にする。間接的アプローチでは、特異的テストＰＤＭの配列に基づいてテストＰＤＭを人工的に合成し、この人工ＰＤＭを適切なプライマーを用いたＰＣＲ反応のテンプレートとして用いることができる。
【０１６９】
幾つかの実施例において、増幅される各遺伝子について別々のウェル／チューブにｃＤＮＡ試料を分取する。
【０１７０】
各ＰＤＭ用に設計されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を実施し、ｃＤＮＡライブラリから選択されたＰＤＭ遺伝子、または人工的に作製されたテンプレートＰＤＭに基づいて選択されたＰＤＭ遺伝子を増幅する。
【０１７１】
以下のテストＰＤＭのＰＣＲ増幅のために、以下のプライマーセットを用いる（表１）。
【表１】
0006700249.tif 000002
【０１７２】
ＰＤＭ遺伝子領域が増幅されたら、第２のＰＣＲ反応を実施して、各ＰＤＭ遺伝子配列の５’末端にプロモータ（ＣＭＶなどの構成型プロモータまたはテトラサイクリンプロモータなどの誘導型プロモータのいずれか）を付加し、３’末端にＩＲＥＳと、それに続いて蛍光レポータ遺伝子（指定された通りＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、または任意の他のレポータ遺伝子など）を付加する。
【０１７３】
幾つかの実施例において、プロモータおよびＩＲＥＳ＋蛍光レポータエレメントの付加を、分子生物学クローニングツールにより、ＰＣＲアプローチ、ライゲーション酵素または組換えアプローチ（それぞれ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼまたはＩｎＦｕｓｉｏｎ酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）など）による所望のエレメントへのＰＣＲ産物の融合によって実施する。
【０１７４】
全長核酸分子が形成されたら（即ち、５’プロモータ−ＰＤＭ−３’ＩＲＥＳ＋レポータ（またはこれらのエレメントの任意の他の順序））、ＰＣＲ反応を用いた増幅を実施して、細胞へのトランスフェクションに十分な量の核酸分子を得る。
【０１７５】
場合により、核酸分子の増幅は、適切な発現ベクターへの全長核酸分子のライゲーションおよび細菌の形質転換によって実現する。このように形成されたプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキットなどの標準的なプラスミド抽出キットを用いて抽出する。場合により、様々なＰＤＭの直鎖状ＰＣＲ断片を、テスト細胞へのトランスフェクションに使用する。
【０１７６】
ＦＴＲの作製
以下のプライマーセットを、以下のＦＴＲの標的部分のＰＣＲ増幅に使用した（表２）：
【表２】
0006700249.tif 000003
【０１７７】
発現構築物のトランスフェクション（ＦＴＲおよびＰＤＭ混合物）
予め設計されたマトリックスに従って、分析に用いられる各レポータ遺伝子（ＦＴＲ）を、先に記載された通り調製された対照の野生型ＰＤＭ遺伝子またテストＰＤＭ遺伝子のいずれかと混合し、適切なトランスフェクション試薬と混合する。
【０１７８】
１つの選択肢では、トランスフェクション混合物を適切な固体担体基板上に配置し、場合により脱水する。様々な設定において、基板としては、顕微鏡スライド、チップ、細胞培養プレート、マルチプレートのウェル、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなどの様々な固体基板が挙げられる。各混合物を、指定された追跡可能な場所／スポット（即ち、指定されたウェル、またはスライドもしくはチップ上の指定された位置）に配置する。基板上のトランスフェクション混合物に、一定数の細胞（基板の型に依存し、先に記載された通り、約１００〜１００，０００個の範囲内）を、通常の完全増殖培地中で、各スポット上に分注する。細胞は、テストＰＤＭおよびアッセイに基づいて、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＣＩ６０細胞、例えばＡ５４９、ＥＫＶＸ、Ｔ４７Ｄ、ＨＴ２９など、または任意の他の適切な細胞株から選択される。テスト細胞を固体基板上に配置し、細胞の型、増殖培地およびトランスフェクション条件に応じて１２〜４８時間インキュベートする。インキュベーション時間によって、細胞が基板に接着し、ＦＴＲおよびＰＤＭが導入および発現する。
【０１７９】
別の選択肢では、細胞を予め設計されたマトリックスに従って固体基板上に播種する（指定された、追跡可能な場所／スポット（即ち、指定されたウェル、またはスライドもしくはチップ上の指定された位置）に）。所定時間の後、細胞を適切なトランスフェクション条件下で、ＦＴＲおよび適切なＰＤＭ（ＷＴ  ＰＤＭまたはテストＰＤＭ）でトランスフェクトする。ＦＴＲおよび適切なＰＤＭは、２つの別の分子上に、または両方の遺伝子をコードする単一分子上に配置することができる。
【０１８０】
アッセイの実行：誘導型プロモータ
レポータＦＴＲの十分な発現後、増殖培地を低血清培地と交換して（培地中に存在する任意の増殖因子／リガンドを除去するため）、刺激されるシグナル伝達を最小のバックグラウンドまで低減する。
【０１８１】
シグナル伝達レベルが著しく低下したら（４〜１６時間以内）、ＰＤＭ発現の誘導を開始する。これは、テトラサイクリン誘導型プロモータを使用する場合にはテトラサイクリンの添加によって、そしてエクジソン誘導型プロモータを使用する場合にはエクジソンの添加によって実現される。
【０１８２】
幾つかの実施例において、間質液（ＩＦ）および／または抗癌薬を添加して、ＰＤＭの発現を誘導し、それによってＰＤＭに及ぼすＩＦまたは薬物の影響をテストする。
【０１８３】
アッセイの実行  −  構成型プロモータ
細胞におけるＦＴＲおよびＰＤＭの十分な発現後（両方とも構成型プロモータの制御下で）、増殖培地を低血清培地と交換して（培地中に存在する任意の増殖因子／リガンドを除去するため）、刺激されるシグナル伝達を最小のバックグラウンドまで低減する。
【０１８４】
幾つかの実施例において、間質液および／または抗癌薬を添加してＰＤＭの発現を誘導し、それによって、ＰＤＭに及ぼすＩＦまたは薬物の影響をテストする。
【０１８５】
画像の取得および解析
ＰＤＭの発現後（トランスフェクション後３０時間）に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で５分間インキュベートし、ＰＢＳで３回連続して洗浄することにより固定する。その後、スライドをカバースリップで覆い、対応する各ＦＴＲの局在を画像化する。
【０１８６】
対照の野生型細胞およびＰＤＭトランスフェクト細胞の両方における各ＦＴＲの画像解析を実施して、比較する。対照細胞対ＰＤＭトランスフェクト細胞におけるＦＴＲの局在化の差を定量し、それを用いて、テストＰＤＭの発癌性形態または野生型形態がテスト試料中に存在するか否かを決定する。定量は、ＩｍａｇｅＪなどの標準的な画像解析ソフトウェアを用いて実施する。
【０１８７】
アッセイ細胞としてＨｅＬａ細胞を用いる例示的アッセイ：
０日目：スライドを０．０１％のポリ−Ｌ−リシンで、室温（ＲＴ）にて５分間プレコーティングした後、滅菌水（ＤＤＷ）で洗浄する。水を吸引し、スライドを２時間乾燥させる。ＨｅＬａ細胞（１５０００細胞）を、各ウェルにつき２００μ１の完全培地（完全培地：ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ））中で播種する。
【０１８８】
１日目：トランスフェクション試薬（ＦｕｇｅｎｅＨＤ試薬（Ｐｒｏｍｅｇｅ、カタログ番号Ｅ２３１１）をＲＴに加温し、ボルテックス処理する。各ウェルについて、チューブ内にＰＤＭ発現構築物を５０／１００／２００ｎｇ；適切なＦＴＲ発現構築物を５０／１００ｎｇ；Ｏｐｔｉｍｅｍ緩衝液（総量１０μｌまで）およびＦｕｇｅｎｅＨＤ（各３μｇのＤＮＡに対して１μｌ）を含むトランスフェクション混合物を、チューブ内で調製する。トランスフェクション混合物を、室温で１５分間インキュベートする。細胞培地をウェルから吸引し、各ウェルに１００μｌのトランスフェクション培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、抗生物質不含）を補充する。トランスフェクション混合物１０μｌを各ウェルに添加する。その後、細胞を加湿インキュベータ（５％ＣＯ２）中、３７℃でインキュベートする。６８時間後、培地を飢餓培地１（０．１％ＦＣＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ）と交換し、細胞を３７℃の加湿インキュベータにて５％ＣＯ２でインキュベートする。薬物／化学的阻害剤の２４時間インキュベーションを要するアッセイでは、該薬物／阻害剤を必要な濃度で添加する。
【０１８９】
薬物とのインキュベーションを要するアッセイでは、必要となる薬物を補充された飢餓培地２で、培地を交換する。その後、細胞を加湿インキュベータ（５％ＣＯ２）中、３７℃でインキュベートする。加えて、薬物のより短いインキュベーションが必要な場合、それを実施することができる。
【０１９０】
２日目：２６時間後（即ち、細胞固定の４時間前）に、培地を飢餓培地２（１％Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ）に交換する。その後、細胞を加湿インキュベータ（５％ＣＯ２）中、３７℃でインキュベートする。
【０１９１】
シグナル伝達の誘導を要するアッセイでは、必要に応じて誘導物質を補充された飢餓培地２で、培地を交換する。その後、細胞を加湿インキュベータ（５％ＣＯ２）中、３７℃でインキュベートする。加えて、薬物のより短いインキュベーションが必要な場合、それを実施することができる。
【０１９２】
トランスフェクション後３０時間目に、細胞を以下の工程により固定する（全てのステップを室温で行う）：細胞をＰＢＳで３回洗浄する。固定溶液（ＰＢＳ中５％グルコース／４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ））で１０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄する。場合により、細胞をＤＡＰＩ溶液で染色し、その後、ＰＢＳで３回洗浄する。
【０１９３】
実施例１：患者のＢＲＡＦ変異はＥＲＢＢ２阻害剤ネラチニブへの耐性を付与する
６６歳男性が、転移性肺腺癌と診断された。患者は、ハーセプチンで、次にネラチニブで処置されたが、無増悪生存（ＰＦＳ）が得られず、進行性疾患が持続した。患者は、治療の２ヶ月後に死亡した。ＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２発癌性変異（Ａ７７１＿Ｙ７７２ｉｎｓＹＶＭＡ，Ｇ７７６Ｃ）およびＡＫＴ１増幅に加えて、ＢＲＡＦ  Ｉ５５４Ｔ変異が同定され、本明細書に開示された方法を利用して高度に発癌性であることが示された。肝転移部位からの針生検を、生体試料として用いた。
【０１９４】
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＥＲＫ２  ＧＦＰと共にＷＴ  ＢＲＡＦまたは患者の変異ＢＲＡＦでトランスフェクトした。細胞を未処置のままにするか、または６００ｎＭの濃度のＥＲＢＢ２阻害剤ネラチニブで６時間処置した。トランスフェクションの３０時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図３Ａ〜Ｂに示すが、それは、ＷＴ遺伝子に比較して、変異した患者遺伝子が細胞にトランスフェクトされると、ＥＲＫのより高いＮ：Ｃが観察されることを示している。図３Ａにさらに示される通り、ＷＴ  ＢＲＡＦまたは患者変異ＢＲＡＦのいずれかを発現する細胞のネラチニブ処置は、核へのＥＲＫトランスロケーションのわずかな減少をもたらしており、ＷＴ形態が細胞で発現された場合に観察されるものよりも、該活性が依然として有意に高いことから、テスト薬物の阻害活性の欠如が示される。
【０１９５】
実施例２：患者のＢＲＡＦ変異はＥＲＢＢ２阻害剤ネラチニブへの耐性を付与する
実施例１と同様に、Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＥＲＫ２  ＧＦＰと共にＷＴ  ＢＲＡＦまたは患者の変異ＢＲＡＦ（Ｉ５５４Ｔ）でトランスフェクトした。細胞を未処置のままにするか、または１μＭの濃度のＢＲＡＦ阻害剤レゴラフェニブで２４時間処置した。トランスフェクションの３０時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図４Ａ〜Ｂに示すが、それは、ＷＴ遺伝子に比較して、変異した患者遺伝子が細胞にトランスフェクトされると、ＥＲＫのより高いＮ：Ｃが観察されることを示している。図４Ａにさらに示される通り、直接的阻害剤レゴラフェニブへの患者変異体の応答を測定すると、該変異体の発癌活性が消失して、ＷＴ形態が発現された場合に観察されるものよりも低いレベルに戻された。レゴラフェニブはまた、ＷＴのシグナル伝達効果を有意に阻害した。
【０１９６】
実施例３：患者のＥＧＦＲ変異はエルロチニブに耐性であるがアファチニブには感受性である
３４歳女性が、ステージＩＶの肺腺癌と診断された。患者は、化学療法と共にエルロチニブで処置され、良好に応答した。１２ヶ月後に、処置への耐性が生じた。これに続いてアファチニブ処置を受け、良好に応答した。この応答は短期間であり（４ヶ月）、進行後に、セツキシマブまたはアファチニブのいずれにも応答しなかった。耐性が出現すると、以下の変異が、複数の遺伝子のシーケンシング（ＮＧＳ）によって同定された：ＭＵＴＹＨ（ｐ．Ｖ３７６Ｌ；．Ｖ３９０Ｌ；ｐ．Ｖ３６２Ｌ；．Ｖ３６３Ｌ；ｐ．Ｖ３８７Ｌ）；ＥＧＦＲ（ｐ．Ｇ７１９Ａ）；ＥＧＦＲ（ｐ．Ｔ７９０Ｍ）；ＥＧＦＲ（ｐ．Ｌ８６１Ｑ）；ＴＲＩＭ２４（ｐ．Ｃ５９５Ｓ；ｐ．Ｃ６２９Ｓ）；ＢＲＤ３（ｐ．Ｇ６７７Ｗ）；ＮＯＴＣＨ１（ｐ．Ｃ２２２ｆｓ）；ＢＩＶＭ−ＥＲＣＣ５；ＥＲＣＣ５（ｐ．Ｍ２５４Ｖ；ｐ．Ｍ７０８Ｖ）。
【０１９７】
本明細書に開示された方法を用いた過去の実験では、患者のＥＧＦＲ変異を高度に発癌性であり複数の経路に影響を及ぼすと同定された。ＥＧＦＲにおける三重変異は、２つの既知の発癌性変異Ｇ７１９ＡおよびＬ８６１Ｑと、複数のＥＧＦＲ阻害剤に耐性を付与する第三の発癌性変異（Ｔ７９０Ｍ）からなる。この変異は、ＥＧＦＲにおける二次変異として示されており、エルロチニブおよびゲフィチニブの結合部位と干渉するため、それらの効果を消失する。
【０１９８】
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰと共にＷＴ  ＥＧＦＲまたは患者の変異ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ａ／Ｔ７９０Ｍ／Ｌ８６１Ｑ）でトランスフェクトした。細胞を未処置のままにするか、または３００ｎＭの濃度のエルロチニブ（患者が耐性を生じたＥＧＦＲ阻害剤）で２４時間、もしくはアファチニブ（患者において複数の応答を示した第二世代ＥＧＦＲ阻害剤）で処置した。トランスフェクションの３０時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比を測定した（Ｎ：Ｃ比）。結果を図５Ａ〜Ｂに示すが、患者のＥＧＦＲに示された変異は、既知の機能であり、それゆえそれを、特異的な標的治療への応答が病院で認められた結果（即ち、エルロチニブへの耐性およびアファチニブへの感受性）と類似しているか否かテストした。図５Ａに示された通り、エルロチニブ処置は、ＷＴ  ＥＧＦＲの活性レベルを強力に阻害したが、患者の三重変異体ＥＧＦＲへの影響を有さなかった。これは、この阻害剤への耐性を付与することが知られるＴ７９０Ｍ変異から生じた。これは、この薬物での処置後の患者に報告された耐性と一致する。これに対して図５Ｂに示された通り、患者が良好な応答を示したＥＧＦＲ阻害剤アファチニブは、このアッセイ系において三重変異体ＥＧＦＲの発癌活性を強力に阻害することができた。その活性レベルは、ＷＴレベルには戻らなかったが、活性の低下は有意であった。
【０１９９】
総括すると、本明細書に示された結果から、本明細書に開示された方法が事実、テストされた２つの異なる標的治療薬の耐性および感受性を、高度の有意性をもって予測し得ることが示される。さらに図５Ａ〜Ｂに示された結果は、病院で観察された転帰とも一致しており、これらの薬物の効率に対する機構的説明が得られる。したがってこれらの結果は、様々な変異の薬物応答を同定するため、そして同じ標的に対して複数の薬物が存在する場合の薬物選択を可能にするための、開示された方法および系の能力を例示している。
【０２００】
実施例４：ＥＲＫ１／２経路の細胞下トランスロケーションアッセイは、異なる単一標的治療と複数の標的治療とで、それらへのＢＲＡＦ応答を識別して、ＢＲＡＦ耐性／感受性変異を同定することができる
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰと共にＷＴ  ＢＲＡＦまたは変異ＢＲＡＦでトランスフェクトした。細胞は、未処置であるか、または濃度を増加させたＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブ（７．５μＭ〜２５μＭ、図６Ｂ）、レゴラフェニブ（５００ｎＭ〜３μＭ、図６Ｃ）もしくはＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブ（３００ｎＭ〜３μＭ、図６Ｄ）で１８時間処置した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比におけるＢＲＡＦのＷＴ形態と異なる変異体との差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。図６Ｂ〜Ｄに示された結果から、ＷＴ遺伝子に比較して、変異形態では該薬物の用量が増加するとＥＲＫトランスロケーションにおける差が減少することが示される。非Ｖ６００変異体がＶ６００変異に比較して異なる薬物に感受性がないため、上述の影響が変異特異性であることが示される。図６Ｅおよび６Ｆにさらに示される通り、２種の異なる薬物を組み合わせると（ベムラフェニブとセルメチニブ、またはベムラフェニブとレゴラフェニブ）、各薬物が別々の場合と比較して、経路阻害において付加的利益を付与しない。
【０２０１】
実施例５：ＥＲＫ１／２およびＳＴＡＴ経路の細胞下トランスロケーションアッセイは、異なる単一標的治療と複数の標的治療とで、それらへのＥＧＦＲの応答を識別して、ＥＧＦＲ耐性／感受性変異を同定することができる
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰまたはＳＴＡＴ３−ＧＦＰと共にＷＴ−ＢＲＡＦまたは変異ＢＲＡＦでトランスフェクトした。細胞は、未処置であるか、または濃度を増加させたＥＧＦＲ阻害剤アファチニブ（６２５ｎＭ〜２．５μＭ、図７Ｂ）、もしくは濃度を増加させたＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブ（３００ｎＭ〜３０μＭ、図７Ｃ）で１８時間処置した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比におけるＥＧＦＲのＷＴ形態と異なる変異体との差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。図７Ｂに示された結果から、ＷＴ遺伝子に比較して、変異形態の幾つかで該薬物の用量が増加するとＥＲＫトランスロケーションにおける差が減少することが示される。おそらくＴ７９０Ｍ変異によって付与された耐性が原因で、Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ変異に比較してＬ８５８Ｒ変異体が該薬物に感受性があるため、上述の影響が変異特異性であることが示される。図７Ｃおよび７Ｄにさらに示される通り、同じく２種の異なるシグナル伝達経路（ＥＲＫ１／２およびＳＴＡＴ）において同じ薬物セルメチニブの影響をテストすると、非Ｔ７９０Ｍ含有変異体（Ｌ８５８ＲおよびＬ８１６Ｑ）は、ＭＥＫ阻害剤に感受性があるが、Ｔ７９０Ｍ変異は、非応答性であることが示される。重要なこととして、図７Ｅおよび図７Ｆから、２種の異なる薬物を組み合わせると（アファチニブとセルメチニブ、またはアファチニブとレゴラフェニブ）、各薬物が別々の場合と比較して、経路阻害において付加的利益をもたらすことが示される。それらの結果から、ＥＧＦＲ−ＥＲＫ１／２経路に沿った複数の標的ポイントを標的とする薬物の組み合わせが、Ｔ７９０Ｍ含有変異においても、各薬物が別々の場合よりも効果的であることが示される。
【０２０２】
実施例６：ＥＲＫ１／２およびＳＴＡＴ経路の細胞下トランスロケーションアッセイは、異なる単一標的治療と複数の標的治療とで、それらへのＥＲＢＢ２の応答を識別して、ＥＲＢＢ２耐性／感受性変異を同定することができる
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＥＲＫ−ＧＦＰまたはＳＴＡＴ３−ＧＦＰと共にＷＴ−ＥＲＢＢ２または変異ＥＲＢＢ２でトランスフェクトした。細胞は、未処置のままにするか、または濃度を増加させたＥＲＢＢ２阻害剤ネラチニブ（５００ｎＭ〜３μＭ、図８Ｂ）もしくはラパチニブ（５００ｎＭ〜３μＭ、図８Ｃ）もしくはＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブ（５００ｎＭ〜７μＭ、図８Ｄ）で１８時間処置した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比におけるＥＲＢＢ２のＷＴ形態と異なる変異体との差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。図８Ｂおよび８Ｃに示された結果から、ＥＲＢＢ２阻害剤の用量が増加するとＶ７７７Ｌ変異体におけるＳＴＡＴ３トランスロケーションの差が減少するが、Ｓ３１０Ｆ変異では減少しないことが示される。図８Ｄにさらに示される通り、ＥＲＫ１／２経路におけるＭＥＫ阻害剤セルメチニブの影響をテストすると、Ｓ３１０Ｆ変異がこの薬物に感受性があるが、別の変異Ｖ８４２Ｉが、影響を受けないことが示される。最後に図８Ｅおよび８Ｆから、２種の異なる薬物を組み合わせると（ネラチニブとセルメチニブ、またはラパチニブとセルメチニブ）、各薬物が別々の場合と比較して、Ｓ３１０Ｆ以外で、経路阻害において付加的利益をもたらさないことが示される（図８Ｆ）。これによって、ＥＲＢＢ２−ＥＲＫ１／２およびＥＲＢＢ２−ＳＴＡＴ経路に沿った複数のポイントを標的とする薬物の組み合わせが、各薬物が別々の場合よりも効果的ではないことが示される。
【０２０３】
実施例７：Ｐ３８およびＮＦｋＢ経路の細胞下トランスロケーションアッセイは、異なる単一標的治療と複数の標的治療とで、それらへのＰＩＫ３ＣＡの応答を識別して、ＰＩＫ３ＣＡ耐性／感受性変異を同定することができる
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、Ｐ３８またはＲＥＬ−Ａ  ＧＦＰと共にＷＴ  ＰＩＫ３ＣＡまたは変異ＰＩＫ３ＣＡでトランスフェクトした。細胞は、未処置のままにするか、または濃度を増加させたＰＩＫ３ＣＡ阻害剤イデラリシブ（１５０ｎＭ〜７５０ｎＭ、図９Ｂ）、エベロリムス（０．５μＭ〜４．５μＭ、図９Ｃ）、ブパルリシブ（１５０ｎＭ〜１μＭ、図９Ｄ）もしくはテムシロリムス（０．５μＭ〜３μＭ，図９Ｅ）で１８時間処置した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比におけるＰＩＫ３ＣＡのＷＴ形態と異なる変異体との差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。図９Ｂに示された結果から、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤の用量が増加するとＶ３４４Ａ、Ｑ５４６ＬおよびＮ３４５Ｋ変異体におけるＲＥＬ−Ａトランスロケーションの規模が増大することが示される。同様に図９Ｃは、ＰＩＫ３ＣＡ阻害剤の用量が増加すると、Ｖ３４４ＡおよびＨ１０４７Ｒ変異体のＰ３８トランスロケーションの規模が低減するが、Ｎ３４５Ｋ変異体には影響を及ぼさないことが示される。図９Ｄおよび図９Ｅにさらに示される通り、Ｐ３８経路におけるさらなるＰＩＫ３ＣＡ阻害剤ブパルリシブおよびテムシロリムスの影響をテストすると、Ｎ３４５ＫおよびＨ１０４７Ｒ変異体が最初の薬物に感受性があるが（図９Ｄ）、後者には感受性がないこと（図９Ｅ）が示される。最後に図９Ｆから、２種の異なる薬物を組み合わせると（イデラリシブおよびエベロリムス）、各薬物が別々の場合に比較して、Ｈ１０４７Ｒ以外で、経路阻害におけるさらなる利益をもたらさないことが示される。このことから、ＰＩＫ３ＣＡ−Ｐ３８経路に沿った複数のポイントを標的とする薬物の組み合わせが一般に、各薬物が別々の場合よりも効果的ではないが、特定の変異への依存性があることが示される。
【０２０４】
実施例８：ＳＴＡＴ３経路の細胞下トランスロケーションアッセイは、異なる単一標的治療と複数の標的治療とで、それらへのｃＫＩＴの応答を識別して、ｃＫＩＴ感受性変異を同定することができる
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＳＴＡＴ３  ＧＦＰと共にＷＴ  ｃＫＩＴまたは変異ｃＫＩＴでトランスフェクトした。細胞は、未処置のままにするか、または濃度を増加させたｃＫＩＴ阻害剤イマチニブ（２００ｎＭ〜２５μＭ、図１０Ｂ）で１８時間処置した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比におけるｃＫＩＴのＷＴ形態と異なる変異体との差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。図１０Ｂに示された結果から、ｃＫＩＴ阻害剤の用量が増加するとＷ５５７−Ｋ５５８ｄｅｌ変異体におけるＳＴＡＴ３トランスロケーションの規模が低減し、見かけ上、２００ｎＭで最大効果に達することが示される。図１０Ｃでは、２種の異なる薬物を組み合わせると（イマチニブおよびセルメチニブ）、各薬物が別々の場合に比較して、経路阻害におけるさらなる利益をもたらさないことが示される。
【０２０５】
実施例９：ＥＲＫ１／２経路の細胞下トランスロケーションアッセイは、異なる単一標的治療と複数の標的治療とで、それらへのＥＲＢＢ２およびＢＲＡＦの応答を別々に、そして組み合わせで識別することができる
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰと共にＷＴ  ＥＲＢＢ２もしくはＢＲＡＦ、変異ＥＲＢＢ２、変異ＢＲＡＦ、または両者の組み合わせでトランスフェクトした。細胞は、未処置のままにするか、またはＥＲＢＢ２阻害剤ネラチニブ、ＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブもしくはその両薬物の組み合わせ（図１１Ｂ）で１８時間処置した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比における両遺伝子のＷＴ形態と異なる変異体との差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。図１１Ｂに示された結果から、各薬物が別々に、ＥＲＫ１／２経路をある程度阻害する能力を有するが、２種の異なる薬物を組み合わせると（ネラチニブおよびベムラフェニブ）、別々に提供された場合の各薬物の影響に比較して、経路阻害におけるさらなる利益が観察されるため、その組み合わせは、相乗的阻害をもたらすことが示される。
【０２０６】
実施例１０：ＥＲＫ１／２経路の細胞下トランスロケーションアッセイは、異なる単一標的治療と複数の標的治療とで、それらへのＥＧＦＲおよびＫＲＡＳの応答を別々に、そして組み合わせで識別することができる
Ｈｅｌａアッセイ細胞を、対応するＦＴＲ、ＥＲＫ２−ＧＦＰと共にＷＴ  ＥＧＦＲもしくはＫＲＡＳ、変異ＥＧＦＲ、変異ＫＲＡＳ、または両者の組み合わせでトランスフェクトした。細胞は、未処置のままにするか、またはＥＧＦＲ阻害剤アファチニブ、ＭＥＫ１／２阻害剤セルメチニブもしくはそれらの両薬物の組み合わせ（図１２Ｂ）で１８時間処置した。トランスフェクションの２４時間後に、細胞を固定して、蛍光顕微鏡を利用して画像化した。細胞質および核の中のＦＴＲの量を定量した。核（Ｎ）中と細胞質（Ｃ）中でのＦＴＲ強度の比における両遺伝子のＷＴ形態と異なる変異体との差を測定した（デルタＮ：Ｃ比）。図１２Ｂに示された結果から、各薬物が別々に、ＥＲＫ１／２経路をある程度阻害する能力を有するが、２種の異なる薬物を組み合わせた場合のみ（アファチニブおよびセルメチニブ）、別々に提供された場合の各薬物の影響に比較して、経路阻害におけるさらなる利益をもたらすことが示される。
【０２０７】
具体的実施形態の前述の説明は、本発明の一般的性質を極めて完全に明示しているため、現在の知識を適用することによって、過度の実験を行わず、かつ一般的概念から逸脱せずに、他者がそのような具体的実施形態を即座に改良し、そして／または様々な適用例に適合させることができ、それゆえそのような適合および改良は、開示された実施形態の均等物の意味および範囲に含まれると解釈されなければならず、そしてそのことを意図するものである。本発明を具体的実施形態と共に記載したが、多くの代替例、改良および変更が当業者に明白になることは明らかである。したがって本発明は、添付の特許請求の範囲の主旨および範囲に含まれるそのような代替例、改良および変更の全てを包含するものとする。
【図１】
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【図２】
0006700249.tif 000005
【図３Ａ】
0006700249.tif 000006
【図３Ｂ】
0006700249.tif 000007
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0006700249.tif 000009
【図５Ａ】
0006700249.tif 000010
【図５Ｂ】
0006700249.tif 000011
【図６Ａ】
0006700249.tif 000012
【図６Ｂ】
0006700249.tif 000013
【図６Ｃ】
0006700249.tif 000014
【図６Ｄ】
0006700249.tif 000015
【図６Ｅ】
0006700249.tif 000016
【図６Ｆ】
0006700249.tif 000017
【図７Ａ】
0006700249.tif 000018
【図７Ｂ】
0006700249.tif 000019
【図７Ｃ】
0006700249.tif 000020
【図７Ｄ】
0006700249.tif 000021
【図７Ｅ】
0006700249.tif 000022
【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
0006700249.tif 000024
【図８Ｂ】
0006700249.tif 000025
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
0006700249.tif 000030
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
0006700249.tif 000034
【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
0006700249.tif 000036
【図１０Ｂ】
0006700249.tif 000037
【図１０Ｃ】
0006700249.tif 000038
【図１１Ａ】
0006700249.tif 000039
【図１１Ｂ】
0006700249.tif 000040
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【配列表】
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