(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、エンテロウイルスＡウイルスを作製する方法：
（ａ）接着細胞を、マクロキャリアを備える固定層で培養することであって、前記細胞は第一の細胞培養培地中で培養され、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が培養されること、
（ｂ）前記エンテロウイルスＡウイルスが細胞に感染する条件下で、前記エンテロウイルスＡウイルスを約０．０２５〜約０．０００９の感染多重度（ＭＯＩ）で細胞に接種することであって、約１００，０００細胞／ｃｍ２〜約８００，０００細胞／ｃｍ２が接種されること、
（ｃ）感染細胞がエンテロウイルスＡウイルスを産生する条件下で、感染細胞を第二の細胞培養培地中、固定層で培養すること、及び
（ｄ）前記細胞により産生されたエンテロウイルスＡウイルスを回収すること。
【請求項２】
前記細胞が哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞がＶｅｒｏ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｖｅｒｏ細胞の株が、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、及びＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記エンテロウイルスＡウイルスが、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項から選択される方法。
【請求項６】
前記エンテロウイルスＡウイルスが、少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記エンテロウイルスＡウイルスがＥＶ７１であり、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異がＶＰ１ポリペプチドの変異を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記エンテロウイルスＡウイルスがＣＡ６であり、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異は、ＶＰ１ポリペプチドの変異、ＶＰ２ポリペプチドの変異、ＶＰ３ポリペプチドの変異、及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の変異からなる群から選択される変異を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記エンテロウイルスＡウイルスがＣＡ１６であり、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異は、２Ａポリペプチドの変異、ＶＰ１ポリペプチドの変異、ＶＰ２ポリペプチドの変異、及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の変異からなる群から選択される変異を含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約６，０００細胞／ｃｍ２が培養される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ａ）において、約５，０００細胞／ｃｍ２が培養される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）において、約１００，０００細胞／ｃｍ２〜約５００，０００細胞／ｃｍ２が接種される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において、約２００，０００細胞／ｃｍ２〜約３５０，０００細胞／ｃｍ２が接種される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の細胞培養培地が血清を含有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の細胞培養培地が、１０％未満のウシ胎児血清を含有し、及び細胞は無血清培地に適合されていない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一の細胞培養培地が５％ウシ胎児血清を含有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一の細胞培養培地及び前記第二の細胞培養培地が異なっている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、前記第一の細胞培養培地を除去すること、及び前記第二の細胞培養培地で前記細胞をリンスすること、をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第二の細胞培養培地が無血清培地である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、約０．０１〜約０．０００９のＭＯＩで、エンテロウイルスＡウイルスを接種される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、約０．００１のＭＯＩで、エンテロウイルスＡウイルスを接種される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞が、工程（ａ）、工程（ｂ）、及び／又は工程（ｃ）の間に、約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積の比率で培養される、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）の間の前記第一の細胞培養培地中の乳酸塩の濃度が、約２５ｍＭを超えない、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）の間の前記第二の細胞培養培地中の乳酸塩の濃度が、約２５ｍＭを超えない、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）の間の前記第一の細胞培養培地中の酸素濃度（ＤＯ）が、約５０％を超えて維持される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｃ）の間の前記第二の細胞培養培地中の酸素濃度（ＤＯ）が、約５０％を超えて維持される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記固定層が、約２ｃｍの層高を有している、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記固定層が、約１０ｃｍの層高を有している、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記マクロキャリアが、マイクロファイバーマトリクスである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記マクロキャリアが、約６０％〜９９％の多孔性を有している、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記多孔性が、約８０％〜約９０％である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記マクロキャリアが、約１５０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１０００ｃｍ２／ｃｍ３の細胞へアクセス可能な表面積を有している、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも５．０ｘ１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬのエンテロウイルスＡウイルスが、工程（d）で回収される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）のうちの１つ以上を用いてエンテロウイルスＡを不活化させることをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記エンテロウイルスＡウイルスが、弱毒化ウイルスである、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体で本明細書により援用される２０１５年２月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／１１６，３６１号明細書の利益を主張するものである。  
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、その全体で本明細書に参照により援用される：コンピューター読み取り可能な形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイルの名称：606772001140SEQLIST.txt。データの記録日は、２０１６年２月１２日。サイズ：２８ＫＢ）。  
【０００３】
本開示は、ワクチン製造用のウイルス（例えばエンテロウイルスＡウイルス）を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
手足口病（ＨＦＭＤ：Ｈａｎｄ，ｆｏｏｔ，ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ）は、ヒトエンテロウイルスＡ（ＨＥＶ−Ａ）群のいくつかのメンバーにより引き起こされる。一般的に、ほとんどは子供が罹患する自己限定的な感染であり、手、足及び口腔の潰瘍と小胞に特徴づけられる。しかし、肺水腫や死をもたらす、例えば髄膜炎、脳炎、ポリオ様麻痺、及び脳幹脳炎などの神経症状を伴う、より重症型の疾患が発生する場合がある（Huang,  CC.,  et  al.,  (1999)  N  Engl  J  Med  341:  936-942,  Chang,  LY.,  et  al.  (1998)  Lancet  352:  367-368,  Ooi,  MH.,  et  al.  (2009)  BMC  Infect  Dis  9:  3）。１９９０年代の中頃から、ヒトエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）が原因となるＨＦＭＤ感染症により、特にアジア太平洋地域において高い罹患率及び死亡率が生じている(Solomon,  T  et  al.,  (2010)  Lancet  Infect  Dis  10(11):778-90;  and  McMinn,  PC  (2002)  FEMS  Microbiol  Rev  26:  91-107)。２０１１年の同時期と比較し、２０１２年の１〜５月に中国、ベトナム及びシンガポールにおいて活発化が報告されている。手足口病の大流行によって、疾患の感染を制御するために学校及び保育所が閉鎖し、教育及び経済活動に混乱が生じている。
【０００５】
ヒトエンテロウイルスＡは、非エンベロープ型のプラス鎖ＲＮＡウイルスのピコルナウイルス科に属し、また当該科はポリオウイルス及びライノウイルスも含んでいる。ＨＦＭＤの原因となるＨＥＶ−Ａ群のメンバーとしては、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、ならびに血清型Ａ１、Ａ４、Ａ６、Ａ１０及びＡ１６を含むコクサッキーウイルスが挙げられる（Pallansch  and  Roos,  (2007)  Knipe  DM,  Howley  PM,  Griffin  DE,  editors.  Fields  Virology.  Philadelphia,  PA  Lippincott  Williams  &  Wilkins.  pp.  839-894;  and  Kobayashi  M  et  al.,  Jpn  J  Infect  Dis  2013;  66:260-1）。ＥＶ７１感染によるＨＦＭＤの大流行は、重篤な神経疾患を引き起こす傾向が最も高い。カニクイザルの実験感染により、数十年にわたり単離された株はすべて神経向性であり、ポリオウイルスよりも広範な組織親和性を示すことが示されている(Nagata,  N  et  al.,  (2002)  J  Med  Virol  67:  207-216)。
【０００６】
ＥＶ７１は、４個のカプシドタンパク質（ＶＰ１〜ＶＰ４）と７個の非構造タンパク質を有している。ウイルスＲＮＡの防御に加え、カプシドタンパク質は宿主細胞表面上の受容体を認識し、ウイルスの抗原プロファイルに寄与している(Pallansch  and  Roos,  (2007)  Knipe  DM,  Howley  PM,  Griffin  DE,  editors.  Fields  Virology.  Philadelphia,  PA  Lippincott  Williams  &  Wilkins.  pp.  839-894)。ＥＶ７１に対する公知のヒト細胞表面受容体はスカベンジャー受容体Ｂ２（ＳＣＡＲＢ２：ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂ２）とＰセレクチン糖タンパク質リガンド１（ＰＳＧＬ−１：Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  １）である。(Yamayoshi,  S  et  al.,  (2009)  Nat  Med  15:798-801;  and  Nishimura,  Y  et  al.,  (2009)  Nat  Med  15:  794-797)。
【０００７】
エンテロウイルスの血清中和による伝統的な型決定法により、ＥＶ７１は単一の血清型であると定義されているが(Oberste,  MS  et  al.  (1999)  J  Clin  Microbiol  37:  1288-1293)、近年の分子学的型決定法により、少なくとも１９９０年代以降、数種のジェノグループがアジア太平洋地域に広まってきていることが指摘されている  (Lee,  MS  et  al.,  (2012)  PLoS  Negl  Trop  Dis  6:  e1737)。従前にＥＶ７１の単離株はジェノグループのＡ、Ｂ及びＣ、ならびにＶＰ１ヌクレオチド配列のみに基づきサブジェノグループに分類されている  (Brown,  BA  et  al.,  (1999)  J  Virol  73:  9969-9975)；ＶＰ１遺伝子のヌクレオチド配列の同一性は、ジェノグループ内では９２％超である一方で、ジェノグループ間のヌクレオチド配列の同一性は７８〜８３％である(Solomon,  T  et  al.,  (2010)  Lancet  Infect  Dis  10(11):778-90)。しかしながら、全ゲノム配列解析により、サブジェノグループＢ５をＢ４の下へと再分類し、ジェノグループＤを加えることとなった；著者らは、ＶＰ１と共に３Ｄポリメラーゼの配列解析を行うことで、全ゲノムをさらに説明できるであろうと提言している(Chan,  YF  et  al.,  (2009)  Infect  Genet  Evol  10(3):404-12)。ジェノグループ間の組み換え、及び他のヒトエンテロウイルスＡ血清型との組み換えも発生している(Yoke-Fun  and  AbuBakar  (2006)  BMC  Microbiol  6:  74)。
【０００８】
現在のところ、利用可能なＥＶ７１に対する特異的な抗ウイルス療法又はワクチンはない。重篤なＨＦＭＤの症例で静脈内イムノグロブリン投与が使用されており、その転帰から何らかの治療利益が示唆されているが、今のところ臨床試験では立証されていない(Ooi,  MH  et  al.,  (2009)  BMC  Infect  Dis  9:  3;及びWang,  SM  et  al.,  (1999)  Clin  Infect  Dis  29:  184-190)。ＥＶ７１流行中の予防的手段及び制御手段は、サーベイランス、教育機関及び保育園の閉鎖、ならびに患者の隔離に限られている。
【０００９】
ワクチン候補の製造に関しては、通常、足場依存性細胞株（例えばＶＥＲＯ細胞など）によりウイルスワクチンが製造されている。産業規模では、これら細胞は、マルチプレートシステム（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｂｅなど）上の静的モードで培養されるか、回転瓶上で培養されるか、又はバイオリアクターにおいて懸濁液中でマイクロキャリア（多孔性又は非多孔性）上で培養される。マルチプレートシステムは大規模であり、相当数の操作作業が必要とされ、一方でマイクロキャリア培養も多数の作業（キャリアの滅菌及び水和など）と、前培養から最終プロセスへの複雑な作業を伴う多くの工程（すなわち、ビーズからビーズへの移送）を必要とする。
多くの他の腸内ウイルスと同様に、エンテロウイルスＡ（例えばＥＶ７１ウイルス）は、完全な細胞溶解を伴うＣＰＥを生じさせ、細胞培養液へウイルスを放出する細胞株（例えばＶｅｒｏ細胞）上での増殖に適合している。エンテロウイルスＡウイルス（例えばＥＶ７１ウイルス）の培養は、他のウイルスよりもさらに困難である。その理由は、細胞１つ当たりのウイルス産生量が少なく、そして急速に細胞崩壊が生じるためであり、このため、１回の培養当たりの産生率は低い。細胞溶解が非常に急速に発生するため、ウイルス粒子の大量産生は非常に困難な課題であり、例えば数百個の回転瓶やセルファクトリー、又は数リットルの大規模マイクロキャリア培養タンクといった、従来型システムの大規模な細胞培養デバイスをいくつか必要とし、それゆえ、長期間の前培養工程ならびに複雑な複合的作業が必要とされる。近年の規制環境下では、コンタミネーションのリスクに満ちた、再利用可能な培養方法、ならびに複合的な無菌作業工程及び移送は回避することが求められている。しかしながら現在利用可能な単回使用のリアクターのほとんどは、マイクロキャリア上に固定された動物細胞の培養にうまく適合されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Huang,  CC.,  et  al.,  (1999)  N  Engl  J  Med  341:  936-942
【非特許文献２】Chang,  LY.,  et  al.  (1998)  Lancet  352:  367-368
【非特許文献３】Ooi,  MH.,  et  al.  (2009)  BMC  Infect  Dis  9:  3
【非特許文献４】Solomon,  T  et  al.,  (2010)  Lancet  Infect  Dis  10(11):778-90
【非特許文献５】McMinn,  PC  (2002)  FEMS  Microbiol  Rev  26:  91-107
【非特許文献６】Pallansch  and  Roos,  (2007)  Knipe  DM,  Howley  PM,  Griffin  DE,  editors.  Fields  Virology.  Philadelphia,  PA  Lippincott  Williams  &  Wilkins.  pp.  839-894
【非特許文献７】Kobayashi  M  et  al.,  Jpn  J  Infect  Dis  2013;  66:260-1Nagata,  N  et  al.,  (2002)  J  Med  Virol  67:  207-216
【非特許文献８】Virology.  Philadelphia,  PA  Lippincott  Williams  &  Wilkins.  pp.  839-894
【非特許文献９】Yamayoshi,  S  et  al.,  (2009)  Nat  Med  15:798-801
【非特許文献１０】Nishimura,  Y  et  al.,  (2009)  Nat  Med  15:  794-797
【非特許文献１１】Oberste,  MS  et  al.  (1999)  J  Clin  Microbiol  37:  1288-1293
【非特許文献１２】Lee,  MS  et  al.,  (2012)  PLoS  Negl  Trop  Dis  6:  e1737
【非特許文献１３】Brown,  BA  et  al.,  (1999)  J  Virol  73:  9969-9975
【非特許文献１４】Chan,  YF  et  al.,  (2009)  Infect  Genet  Evol  10(3):404-12
【非特許文献１５】Yoke-Fun  and  AbuBakar  (2006)  BMC  Microbiol  6:  74
【非特許文献１６】Wang,  SM  et  al.,  (1999)  Clin  Infect  Dis  29:  184-190
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ゆえに、エンテロウイルスＡの製造のための方法、例えば産業規模でのウイルス製造が可能となる方法の開発が求められている。本明細書に開示されるように、本開示方法は、とくに、費用効果が大きく、処理が合理化された、ウイルス製造の増大化を可能とする固定層培養システムを使用する。これらの方法は、例えば大規模又は産業規模のエンテロウイルスＡの製造に有益に使用することができ、そのエンテロウイルスＡはワクチン及び／又は免疫原性組成物の製造に有用である。
【００１２】
したがって、本開示の特定の態様は、（ａ）マクロキャリアを含有する固定層で接着細胞を培養することであって、当該細胞は第一の細胞培養培地中で培養されること；（ｂ）エンテロウイルスＡが当該細胞に感染する条件下で、エンテロウイルスＡを当該細胞に接種すること；（ｃ）当該感染細胞がエンテロウイルスＡウイルスを産生する条件下で、第二の細胞培養培地中、固定層において当該感染細胞を培養すること；及び（ｄ）当該細胞により産生されたエンテロウイルスＡウイルスを回収すること、を含む、エンテロウイルスＡウイルスを製造する方法を提供するものである。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該細胞は哺乳類細胞である。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該細胞はＶｅｒｏ細胞である。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該Ｖｅｒｏ細胞株は、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、及びＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）から選択される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該エンテロウイルスＡウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６から選択される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該エンテロウイルスＡウイルスは、少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異を含有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該エンテロウイルスＡウイルスは、ＥＶ７１であり、及び当該少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異はＶＰ１ポリペプチドの変異を含有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該エンテロウイルスＡウイルスは、ＣＡ６であり、及び当該少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異は、ＶＰ１ポリペプチドの変異、ＶＰ２ポリペプチドの変異、ＶＰ３ポリペプチドの変異、及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の変異から選択される変異を含有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該エンテロウイルスＡウイルスは、ＣＡ１６であり、及び当該少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異は、２Ａポリペプチドの変異、ＶＰ１ポリペプチドの変異、ＶＰ２ポリペプチドの変異、及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の変異から選択される変異を含有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、細胞が第一の細胞培養培地中で培養される、マクロキャリアを含有する固定層において接着細胞を培養する工程において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が培養される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、細胞が第一の細胞培養培地中で培養される、マクロキャリアを含有する固定層において接着細胞を培養する工程において、約５，０００細胞／ｃｍ２が培養される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、エンテロウイルスＡウイルスが細胞に感染する条件下で細胞にエンテロウイルスＡ��イルスを接種する工程において、約１００，０００細胞／ｃｍ２〜約８００，０００細胞／ｃｍ２が接種される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、エンテロウイルスＡウイルスが細胞に感染する条件下で細胞にエンテロウイルスＡウイルスを接種する工程において、約２００，０００細胞／ｃｍ２〜約３５０，０００細胞／ｃｍ２が接種される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、第一の細胞培養培地は、血清を含有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、第一の細胞培養培地は、１０％未満のウシ胎児血清を含有し、及び細胞は無血清培地に適合されていない。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、第一の細胞培養培地は、５％のウシ胎児血清を含有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、第一の細胞培養培地と第二の細胞培養培地は、異なっている。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該方法はさらに、細胞が第一の細胞培養培地中で培養される、マクロキャリアを含有する固定層において接着細胞を培養する工程と、エンテロウイルスＡウイルスが当該細胞に感染する条件下でエンテロウイルスＡウイルスを当該細胞に接種する工程の間に、第一の細胞培養培地を取り除き、細胞を第二の培養培地でリンスする工程を含む。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、第二の細胞培養培地は、無血清培地である。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、約０．０２５〜約０．０００９のＭＯＩで、エンテロウイルスＡウイルスが細胞に接種される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、約０．００１のＭＯＩで、エンテロウイルスＡウイルスが細胞に接種される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、細胞が第一の細胞培養培地中で培養されるマクロキャリアを含有する固定層において接着細胞を培養する工程、エンテロウイルスＡウイルスが当該細胞に感染する条件下でエンテロウイルスＡウイルスを当該細胞に接種する工程、及び感染細胞がエンテロウイルスＡウイルスを産生する条件下で第二の細胞培養培地中で固定層において約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積の比率で感染細胞を培養する工程の間、細胞は培養される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、細胞が第一の細胞培養培地中で培養されるマクロキャリアを含有する固定層において接着細胞を培養する工程、及び／又はエンテロウイルスＡウイルスが当該細胞に感染する条件下でエンテロウイルスＡウイルスを当該細胞に接種する工程の間、第一の細胞培養培地中の乳酸濃度は約２５ｍＭを超えない。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、感染細胞がエンテロウイルスＡウイルスを産生する条件下で感染細胞を第二の細胞培養培地中、固定層において培養する工程の間、第二の細胞培養培地中の乳酸濃度は約２５ｍＭを超えない。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実��形態において、細胞が第一の細胞培養培地中で培養されるマクロキャリアを含有する固定層において接着細胞を培養する工程、及び／又はエンテロウイルスＡウイルスが細胞に感染する条件下で細胞にエンテロウイルスＡウイルスを接種する工程の間、第一の細胞培養培地中の酸素濃度（ＤＯ）は約５０％超で維持される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、感染細胞がエンテロウイルスＡウイルスを産生する条件下で感染細胞を第二の細胞培養培地中、固定層において培養する工程の間、第二の細胞培養培地中の酸素濃度（ＤＯ）は約５０％超で維持される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、固定層は約２ｃｍの層高を有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、固定層は約１０ｃｍの層高を有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、マクロキャリアは、マイクロファイバーマトリクスである。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、マクロキャリアは、約６０％〜９９％の多孔率を有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、多孔率は、約８０％〜約９０％の多孔率である。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、マクロキャリアは、約１５０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１０００ｃｍ２／ｃｍ３の、細胞にアクセス可能な表面積を有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、細胞により産生されたエンテロウイルスＡを回収する工程で、少なくとも５．０×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬのエンテロウイルスＡが回収される。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該方法はさらに、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）のうちの１つ以上を用いてエンテロウイルスＡを不活化させることを含む。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、当該エンテロウイルスＡウイルスは、弱毒化ウイルスである。
【００１３】
本開示の他の態様は、上述の実施形態のいずれかの方法により産生されたエンテロウイルスＡに関するものである。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、ウイルスは、１つ以上の抗原を含有する。上述の実施形態のいずれかと併せることができる一部の実施形態において、ウイルスは、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）のうちの１つ以上で不活化されている。
【００１４】
本開示の他の態様は、上述の実施形態のいずれかの方法により産生されたエンテロウイルスＡを含有する組成物に関するものである。本開示の他の態様は、上述の実施形態のいずれかの方法により産生されたエンテロウイルスＡを含有する免疫原性組成物に関するものである。本開示の他の態様は、上述の実施形態のいずれかの方法により産生されたエンテロウイルスＡを含有するワクチンに関するものである。
本開示の特定の態様では、例えば以下の項目が提供される：
（書類名）特許請求の範囲
（項目１）
以下を含む、エンテロウイルスＡウイルスを作製する方法：
（ａ）接着細胞を、マクロキャリアを備える固定層で培養することであって、前記細胞は第一の細胞培養培地中で培養されること、
（ｂ）前記エンテロウイルスＡウイルスが細胞に感染する条件下で、前記エンテロウイルスＡウイルスを細胞に接種すること、
（ｃ）感染細胞がエンテロウイルスＡウイルスを産生する条件下で、感染細胞を第二の細胞培養培地中、固定層で培養すること、及び
（ｄ）前記細胞により産生されたエンテロウイルスＡウイルスを回収すること。
（項目２）
前記細胞が哺乳類細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞がＶｅｒｏ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記Ｖｅｒｏ細胞の株が、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、及びＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）からなる群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記エンテロウイルスＡウイルスが、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６からなる群から選択される、項目１〜４のいずれか１項から選択される方法。
（項目６）
前記エンテロウイルスＡウイルスが、少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記エンテロウイルスＡウイルスがＥＶ７１であり、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異がＶＰ１ポリペプチドの変異を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記エンテロウイルスＡウイルスがＣＡ６であり、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異は、ＶＰ１ポリペプチドの変異、ＶＰ２ポリペプチドの変異、ＶＰ３ポリペプチドの変異、及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の変異からなる群から選択される変異を含有する、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記エンテロウイルスＡウイルスがＣＡ１６であり、前記少なくとも１つの非ヒト細胞適合突然変異は、２Ａポリペプチドの変異、ＶＰ１ポリペプチドの変異、ＶＰ２ポリペプチドの変異、及び５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の変異からなる群から選択される変異を含有する、項目６に記載の方法。
（項目１０）
工程（ａ）において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が培養される、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
工程（ａ）において、約５，０００細胞／ｃｍ２が培養される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
工程（ｂ）において、約１００，０００細胞／ｃｍ２〜約８００，０００細胞／ｃｍ２が接種される、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
工程（ｂ）において、約２００，０００細胞／ｃｍ２〜約３５０，０００細胞／ｃｍ２が接種される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記第一の細胞培養培地が血清を含有する、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記第一の細胞培養培地が、１０％未満のウシ胎児血清を含有し、及び細胞は無血清培地に適合されていない、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記第一の細胞培養培地が５％ウシ胎児血清を含有する、項目１４に記載の方法。
（項目１７）
前記第一の細胞培養培地及び前記第二の細胞培養培地が異なっている、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
工程（ａ）と工程（ｂ）の間に、前記第一の細胞培養培地を除去すること、及び前記第二の細胞培養培地で前記細胞をリンスすること、をさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第二の細胞培養培地が無血清培地である、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞が、約０．０２５〜約０．０００９のＭＯＩで、エンテロウイルスＡウイルスを接種される、項目１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞が、約０．００１のＭＯＩで、エンテロウイルスＡウイルスを接種される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞が、工程（ａ）、工程（ｂ）、及び／又は工程（ｃ）の間に、約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積の比率で培養される、項目１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）の間の前記第一の細胞培養培地中の乳酸塩の濃度が、約２５ｍＭを超えない、項目１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
工程（ｃ）の間の前記第二の細胞培養培地中の乳酸塩の濃度が、約２５ｍＭを超えない、項目１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
工程（ａ）及び／又は工程（ｂ）の間の前記第一の細胞培養培地中の酸素濃度（ＤＯ）が、約５０％を超えて維持される、項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
工程（ｃ）の間の前記第二の細胞培養培地中の酸素濃度（ＤＯ）が、約５０％を超えて維持される、項目１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記固定層が、約２ｃｍの層高を有している、項目１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記固定層が、約１０ｃｍの層高を有している、項目１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記マクロキャリアが、マイクロファイバーマトリクスである、項目１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記マクロキャリアが、約６０％〜９９％の多孔性を有している、項目１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記多孔性が、約８０％〜約９０％である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記マクロキャリアが、約１５０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１０００ｃｍ２／ｃｍ３の細胞へアクセス可能な表面積を有している、項目３０又は項目３１に記載の方法。
（項目３３）
少なくとも５．０ｘ１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬのエンテロウイルスＡウイルスが、工程（d）で回収される、項目１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）のうちの１つ以上を用いてエンテロウイルスＡを不活化させることをさらに含む、項目１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記エンテロウイルスＡウイルスが、弱毒化ウイルスである、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
項目１〜３５のいずれか１項に記載の方法により作製されたエンテロウイルスＡウイルス。
（項目３７）
前記ウイルスが１つ以上の抗原を含有している、項目３６に記載のエンテロウイルスＡウイルス。
（項目３８）
前記ウイルスが、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、ホルマリン、又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）のうちの１つ以上を用いて不活化される、項目３６又は３７に記載のエンテロウイルスＡウイルス。
（項目３９）
前記ウイルスが弱毒化ウイルスである、項目３６又は３７に記載のエンテロウイルスＡウイルス。
（項目４０）
項目３６〜３９のいずれか１項に記載のウイルスを含有する組成物。
（項目４１）
項目３６〜３９のいずれか１項に記載のウイルスを含有する免疫原性組成物。
（項目４２）
項目３６〜３９のいずれか１項に記載のウイルスを含有するワクチン。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
特許又は出願ファイルは、カラーで描かれた少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面付きの本特許または特許出願公開のコピーは、要求を行い、及び必要な料金を支払うことにより当局から提供される。
【００１６】
【図１】図１は、ＮＡＮＯにおける実験的細胞培養設定を示す。再循環のために、ＥａｓｙＬｏａｄヘッド（示されていない）が取り付けられたＭａｓｔｅｒＦｌｅｘポンプを、この図に示されるかん流モジュールの代わりに使用した。
【００１７】
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、ＮＡＮＯキャリアの写真を示す。キャリアは異なる時点でサンプル採取され、クリスタルバイオレットを使用して色付けされた。図２Ａは、空のキャリアを示す。図２Ｂは、３日目のキャリアを示す。図２Ｃは、６日目のキャリアを示す。
【００１８】
【図３】図３は、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯの監視結果を示す。測定されたパラメータは、細胞数、グルコース濃度及び乳酸塩濃度、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、ならびに温度であった。培地交換は３日目と６日目に行われた。
【００１９】
【図４】図４は、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおける細胞密度と、対照のＣｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓにおける細胞密度の比較を示す。ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯに関しては、細胞は核計数法を用いて計数され、一方でＣｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓに関しては、細胞はトリパンブルー法を使用し、トリプシン処理後に計数された。
【００２０】
【図５】図５は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用したＥＶ７１  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養の実験計画を示す。
【００２１】
【図６】図６は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した対照ＥＶ７１  Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の実験計画を示す。
【００２２】
【図７】図７は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用したＥＶ７１  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養の監視結果を示す。測定されたパラメータは、細胞数、グルコース濃度及び乳酸塩濃度、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、ならびに温度であった。培地交換は３日目に行われ、６日目に感染させた。
【００２３】
【図８】図８は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した対照ＥＶ７１  Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の監視結果を示す。測定されたパラメータは、グルコース濃度と乳酸塩濃度であった。４日目に感染させた。
【００２４】
【図９】図９は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した、ＥＶ７１Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の細胞変成効果（ＣＰＥ）を示す。
【００２５】
【図１０】図１０は、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した、ＥＶ７１のｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養と対照Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の実験計画を示す。
【００２６】
【図１１】図１１は、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用したＥＶ７１  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養の監視結果を示す。測定されたパラメータは、細胞数、グルコース濃度及び乳酸塩濃度、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、ならびに温度であった。４日目に感染させた。
【００２７】
【図１２】図１２は、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した対照ＥＶ７１  Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の監視結果を示す。測定されたパラメータは、グルコース濃度と乳酸塩濃度であった。４日目に感染させた。
【００２８】
【図１３】図１３は、ポリオＳ２産生に関する、標準Ｃｙｔｏｄｅｘ処理の実験計画を示す。
【００２９】
【図１４】図１４は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用したポリオＳ２  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養の実験計画を示す。
【００３０】
【図１５】図１５は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した対照ポリオＳ２  Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の実験計画を示す。
【００３１】
【図１６】図１６は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用したポリオＳ２  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養の監視結果を示す。測定されたパラメータは、細胞数、グルコース濃度と乳酸塩濃度であった。培地交換は３日目に行われ、６日目に感染させた。
【００３２】
【図１７】図１７は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した対照ポリオＳ２  Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の監視結果を示す。測定されたパラメータは、グルコース濃度と乳酸塩濃度であった。４日目に感染させた。
【００３３】
【図１８】図１８は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した、ポリオＳ２  Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の細胞変成効果（ＣＰＥ）を示す。
【００３４】
【図１９】図１９は、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した、ポリオＳ２のｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養と対照Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の実験計画を示す。
【００３５】
【図２０】図２０は、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用したポリオＳ２  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養の監視結果を示す。測定されたパラメータは、細胞数、グルコース濃度及び乳酸塩濃度、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、ならびに温度であった。４日目に感染させた。
【００３６】
【図２１】図２１は、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した対照ポリオＳ２  Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の監視結果を示す。測定されたパラメータは、グルコース濃度と乳酸塩濃度であった。４日目に感染させた。
【００３７】
【図２２】図２２は、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用した、ポリオＳ２  Ｃｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓ培養の細胞変成効果（ＣＰＥ）を示す。
【００３８】
【図２３】図２３Ａは、感染時の細胞密度による、個別の（細胞当たりの）最大ＥＶ７１生産性を示す。図２３Ｂは、感染時の細胞密度による、総（回収量当たりの）最大ＥＶ７１生産性を示す。図２３Ｃは、細胞当たりのウイルス放出動態を示す。図２３Ｄは、回収量当たりのウイルス放出動態を示す。
【００３９】
【図２４】図２４は、ＥＶ７１接種時の細胞密度低下の評価を示す。２個のｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯに接種を行い、１個は１５，０００細胞／ｃｍ２（上のパネル）、他方は３倍低い細胞密度（５，０００細胞／ｃｍ２；下のパネル）であった。グルコース（赤い曲線）及び乳酸塩（青い曲線）は、培養期間を通じて監視された。
【００４０】
【図２５】図２５は、Ｔフラスコ中の最終細胞密度に対する、体積／表面積の比率とＦＢＳ濃度の影響を示す。
【００４１】
【図２６】図２６は、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおけるＥＶ７１最適化処理の概略図を示す。
【００４２】
【図２７】図２７は、すべてのｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ実験でＥＶ７１に関して得られた、最大ウイルス生産性の概要を示す。
【００４３】
【図２８】図２８は、ｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００におけるＥＶ７１処理の概要を示す。
【００４４】
【図２９】図２９は、  ＥＶ７１のｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００実験の実験設定を示す。
【００４５】
【図３０−１】図３０Ａ〜図３０Ｃは、ｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００におけるＥＶ７１細胞培養パラメータを示す。図３０Ａは、細胞密度を示す。図３０Ｂは、溶存酸素（設定は５０％）を示す。図３０Ｃは、グルコース濃度と乳酸塩濃度を示す。図３０Ｄ〜図３０Ｆは、対照ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおけるＥＶ７１細胞培養パラメータを示す。図３０Ｄは、細胞密度を示す。図３０Ｅは、溶存酸素（設定は５０％）を示す。図３０Ｆは、グルコース濃度と乳酸塩濃度を示す。
【図３０−２】同上。
【００４６】
【図３１】図３１Ａは、ｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００における感染後のＥＶ７１ウイルスの放出動態を示す。ウイルスはＴＣＩＤ５０法により定量された。図３１Ｂは、ｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００における感染後のＨＣＰ放出動態を示す。ＨＣＰは、Ｏｃｔｅｔ及びＳｉｇｎｕｓの抗Ｖｅｒｏ−ＨＣＰ抗体を使用して定量された。図３１Ｃは、ｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００における感染後のＤＮＡの放出動態を示す。ＤＮＡはピコ−グリーン法を使用し定量された。
【００４７】
【図３２】図３２は、ＥＶ７１  ｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００実験の産生率を要約する概略図を示す。
【００４８】
【図３３】図３３は、無血清培地（ＳＦＭ、ＯｐｔｉＰｒｏ）又は１０％ＦＢＳ（Ｍ１９９）培地を使用した、ＴフラスコにおけるＥＶ７１感染の概略図を示す。
【００４９】
【図３４】図３４は、ＥＶ７１処理の開発戦略の概要を示す。
【００５０】
【図３５】図３５は、ｉＣＥＬＬｉｓ５００／５００におけるＥＶ７１の工業規模処理の概要を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
一般的方法
本明細書に記述される、又は参照される技術及び手順は一般的に当分野の当業者により理解され、及び例えば、Sambrook  et  al.,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  3d  edition  (2001)  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.;  Current  Protocols  in  Molecular  Biology  (F.M.  Ausubel,  et  al.  eds.,  (2003));  the  series  Methods  in  Enzymology  (Academic  Press,  Inc.):  PCR  2:  A  Practical  Approach  (M.J.  MacPherson,  B.D.  Hames  and  G.R.  Taylor  eds.  (1995)),  Harlow  and  Lane,  eds.  (1988)  Antibodies,  A  Laboratory  Manual,  and  Animal  Cell  Culture  (R.I.  Freshney,  ed.  (1987));    Oligonucleotide  Synthesis  (M.J.  Gait,  ed.,  1984);  Methods  in  Molecular  Biology,  Humana  Press;  Cell  Biology:  A  Laboratory  Notebook  (J.E.  Cellis,  ed.,  1998)  Academic  Press;  Animal  Cell  Culture  (R.I.  Freshney),  ed.,  1987);  Introduction  to  Cell  and  Tissue  Culture  (J.P.  Mather  and  P.E.  Roberts,  1998)  Plenum  Press;  Cell  and  Tissue  Culture:  Laboratory  Procedures  (A.  Doyle,  J.B.  Griffiths,  and  D.G.  Newell,  eds.,  1993-8)  J.  Wiley  and  Sons;  Handbook  of  Experimental  Immunology  (D.M.  Weir  and  C.C.  Blackwell,  eds.);  Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells  (J.M.  Miller  and  M.P.  Calos,  eds.,  1987);  PCR:  The  Polymerase  Chain  Reaction,  (Mullis  et  al.,  eds.,  1994);  Current  Protocols  in  Immunology  (J.E.  Coligan  et  al.,  eds.,  1991);  Short  Protocols  in  Molecular  Biology  (Wiley  and  Sons,  1999);  Immunobiology  (C.A.  Janeway  and  P.  Travers,  1997);  Antibodies  (P.  Finch,  1997);  Antibodies:  A  Practical  Approach  (D.  Catty.,  ed.,  IRL  Press,  1988-1989);  Monoclonal  Antibodies:  A  Practical  Approach  (P.  Shepherd  and  C.  Dean,  eds.,  Oxford  University  Press,  2000);  Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual  (E.  Harlow  and  D.  Lane  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  1999);  The  Antibodies  (M.  Zanetti  and  J.  D.  Capra,  eds.,  Harwood  Academic  Publishers,  1995);及び  Cancer:  Principles  and  Practice  of  Oncology  (V.T.  DeVita  et  al.,  eds.,  J.B.  Lippincott  Company,  1993)などに記述される広く使用されている技法などの標準的な技法を用いて普遍的に利用されている。
細胞培養
【００５２】
本開示の特定の態様は、エンテロウイルスＡウイルス（本明細書において「エンテロウイルスＡ」という用語を相互交換可能に使用することができる）の製造方法に関するものである。例えば、限定されないが、精製ウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、又はサブユニットワクチンのための精製及び／もしくは組み換えウイルスタンパク質をはじめとするワクチン及び／又は免疫原性組成物にエンテロウイルスＡの製造は有用であり得る。一部の実施形態において、エンテロウイルスＡウイルスの製造のための本開示方法は、第一の細胞培養培地中で細胞が培養されるマトリクスを含有する層において細胞を培養すること；エンテロウイルスＡウイルスが当該細胞に感染する条件下で、エンテロウイルスＡを当該細胞に接種すること；当該感染細胞がエンテロウイルスＡウイルスを産生する条件下で、第二の細胞培養培地中、固定層において当該感染細胞を培養すること；及び当該細胞により産生されたエンテロウイルスＡウイルスを回収すること、を含む。
【００５３】
一部の実施形態において、本開示細胞は哺乳類細胞である（例えば哺乳類細胞株）。本開示の少なくとも１つのウイルスの増殖に適した細胞株は、哺乳類起源が好ましく、限定されないが、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）又はＭＤＣＫ  ３３０１６、寄託番号はＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９であり、ＷＯ９７／３７００１に記述されている）、ネコ及び齧歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などのハムスター細胞）が挙げられ、例えば、成体、新生仔、胎子、及び胚をはじめとする広範な発育段階から得てもよい。ある実施形態では、細胞は不死化されている（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記述され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０で寄託されているＰＥＲＣ．６細胞など）。好ましい実施形態において、哺乳類細胞が使用され、ならびに哺乳類細胞は、以下の非限定的な細胞型のうちの１つ以上から選択されてもよく、及び／又は誘導されてもよい：線維芽細胞（例えば、皮膚、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠状動脈、肺、血管、皮膚微小血管、臍帯）、肝細胞、角化細胞、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、子宮頚、網膜周皮細胞）、メラニン細胞、神経系細胞（例えば、星状膠細胞）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地中での増殖が可能で、ウイルスの産生及び複製に有用な動物細胞及び細胞株の製造を記載している。
【００５４】
一部の実施形態では、細胞は、Ｖｅｒｏ細胞である。適切なＶｅｒｏ細胞株の例としては、限定されないが、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、又はＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）が挙げられる。
【００５５】
一部の実施形態では、細胞は、接着細胞である。本明細書において使用される場合、接着細胞とは、培養の間、基質に接着する、又は固定される任意の細胞を指す場合がある。
【００５６】
上述の細胞型の培養条件は公知であり、様々な公表文献中に記載されており、あるいは培養培地、補充物質、及び状態が、市販されている場合があり、例えばＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ，  Ｎ．Ｊ．）のカタログ及び追加文献中に記載されている。
【００５７】
公知の無血清培地としては、イスコフ培地、Ｕｌｔｒａ−ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）又はＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）が挙げられる。通常の血清含有培地としては、イーグル基礎培地（ＢＭＥ）又は最小必須培地（ＭＥＭ）（Eagle,  Science,  130,  432  (1959)）又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ又はＥＤＭ）が挙げられ、それらは通常、最大で１０％のウシ胎児血清又は類似の添加物と共に使用される。任意選択で、最小必須培地（ＭＥＭ）(Eagle,  Science,  130,  432  (1959))又はダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ又はＥＤＭ）が、血清含有補充物質をいずれも含まずに用いられてもよい。無タンパク質培地様ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、既知組成培地様ＰｒｏＣＨＯ  ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）、又はＳＭＩＦ  ７  （Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、及びマイトジェンペプチド様Ｐｒｉｍａｃｔｏｎｅ、Ｐｅｐｔｉｃａｓｅ又はＨｙＰｅｐ．ＴＭ．（すべてＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）、又はラクトアルブミン水解物（Ｇｉｂｃｏ社及び他のメーカー）もまた、従来技術として十分に公知である。植物水解物を基にした培地添加物は、ウイルス、マイコプラズマ又は未知の感染体の混入を排除することができるという特別な利点を有している。
【００５８】
本開示方法の特定の態様は、細胞が培養される密度に関するものである。一部の実施形態において、第一の細胞培養培地中で培養される細胞の密度又は絶対数とは、細胞培養物が播種される、すなわちウイルス接種前の細胞の密度又は絶対数を指す場合がある。本明細書に記載される場合、学説に拘束されることは望まないが、低密度での細胞培養は、ウイルス接種時の細胞密度を低下させる点、細胞増殖期を延長させる点、ならびに／又は限定されないが、接種物のサイズ、作業時間、培養前工程における負荷、インキュベーターの数、及び／もしくはコンタミネーションのリスクをはじめとする因子を低減させる点で有益である場合がある。
【００５９】
一部の実施形態において、約４，０００細胞／ｃｍ２〜約１６，０００細胞／ｃｍ２が培養される。一部の実施形態において、約４，０００細胞／ｃｍ２；約５，０００細胞／ｃｍ２；約６，０００細胞／ｃｍ２；約７，０００細胞／ｃｍ２；約８，０００細胞／ｃｍ２；約９，０００細胞／ｃｍ２；約１０，０００細胞／ｃｍ２；約１１，０００細胞／ｃｍ２；約１２，０００細胞／ｃｍ２；約１３，０００細胞／ｃｍ２；約１４，０００細胞／ｃｍ２；約１５，０００細胞／ｃｍ２；又は約１６，０００細胞／ｃｍ２が、その間の任意の値を含み、培養される。一部の実施形態において、接種前の細胞密度は、以下の密度（細胞／ｃｍ２）のうちのいずれかのおよその密度よりも低い：１６，０００；１５，５００；１５，０００；１４，５００；１４，０００；１３，５００；１３，０００；１２，５００；１２，０００；１１，５００；１１，０００；１０，５００；９，０００；８，５００；８，０００；７，５００；７，０００；６，５００；６，０００；５，５００；５，０００；又は４，５００。一部の実施形態において、接種前の細胞密度は、以下の密度（細胞／ｃｍ２）のうちのいずれかのおよその密度よりも高い：４，０００；４，５００；５，０００；５，５００；６，０００；６，５００；７，０００；７，５００；８，０００；８，５００；９，０００；９，５００；１０，０００；１０，５００；１１，０００；１１，５００；１２，０００；１２，５００；１３，０００；１３，５００；１４，０００；１４，５００；１５，０００；又は１５，５００。すなわち、接種前の細胞密度は、１６，０００；１５，５００；１５，０００；１４，５００；１４，０００；１３，５００；１３，０００；１２，５００；１２，０００；１１，５００；１１，０００；１０，５００；９，０００；８，５００；８，０００；７，５００；７，０００；６，５００；６，０００；５，５００；５，０００；又は４，５００の上限、及び独立して選択される４，０００；４，５００；５，０００；５，５００；６，０００；６，５００；７，０００；７，５００；８，０００；８，５００；９，０００；９，５００；１０，０００；１０，５００；１１，０００；１１，５００；１２，０００；１２，５００；１３，０００；１３，５００；１４，０００；１４，５００；１５，０００；又は１５，５００の下限を有する密度範囲のいずれかであってもよく、この場合において下限は上限未満である。特定の実施形態において、約５，０００細胞／ｃｍ２が培養される。
【００６０】
一部の実施形態において、細胞にエンテロウイルスＡウイルスが感染する条件下で、本開示の細胞に、本開示のエンテロウイルスＡウイルスが接種される。細胞にエンテロウイルスＡが感染する条件は当分野に公知であり、その条件は細胞型、エンテロウイルスＡのタイプ、培養培地、温度、細胞密度、ウイルス密度（例えばＭＯＩ）、細胞増殖速度、細胞継代数などに依存し得る。細胞にエンテロウイルスが感染する条件の例示的な記載を以下に提示する。
【００６１】
本開示方法の特定の態様は、ウイルス接種時の細胞密度に関するものである。本明細書に記載される場合、学説に拘束されることは望まないが、感染時の細胞密度は、ウイルス産生（例えばウイルス生産性）に影響を与える場合がある。ウイルス接種時に最適な細胞密度にすることによって、個別の（細胞当たりの）生産性、体積（回収物１ｍＬ当たりの）生産性、及び／又は安定性の上昇、ならびに培地消費量の減少及び／又は回収物のコンタミネーションの低減がもたらされ得る。
【００６２】
一部の実施形態において、約１００，０００細胞／ｃｍ２〜約８００，０００細胞／ｃｍ２にエンテロウイルスＡが接種される。一部の実施形態において、約２００，０００細胞／ｃｍ２〜約３５０，０００細胞／ｃｍ２にエンテロウイルスＡが接種される。一部の実施形態において、接種時の細胞密度は、以下の密度（細胞／ｃｍ２）のいずれかのおよその値よりも低い：８００，０００；７５０，０００；７００，０００；６５０，０００；６００，０００；５５０，０００；５００，０００；４５０，０００；４００，０００；３５０，０００；３００，０００；２５０，０００；２００，０００；又は１５０，０００。一部の実施形態において、接種前の細胞密度は、以下の密度（細胞／ｃｍ２）のうちのいずれかのおよその密度よりも高い：１００，０００；１５０，０００；２００，０００；２５０，０００；３００，０００；３５０，０００；４００，０００；４５０，０００；５００，０００；５５０，０００；６００，０００；６５０，０００；７００，０００；又は７５０，０００。すなわち、接種前の細胞密度は、８００，０００；７５０，０００；７００，０００；６５０，０００；６００，０００；５５０，０００；５００，０００；４５０，０００；４００，０００；３５０，０００；３００，０００；２５０，０００；２００，０００；又は１５０，０００の上限、及び独立して選択される１００，０００；１５０，０００；２００，０００；２５０，０００；３００，０００；３５０，０００；４００，０００；４５０，０００；５００，０００；５５０，０００；６００，０００；６５０，０００；７００，０００；又は７５０，０００の下限を有する密度範囲のいずれかであってもよく、この場合において下限は上限未満である。
【００６３】
本開示方法の特定の態様は、本開示の細胞培養物に接種するために使用されるエンテロウイルスのＭＯＩに関するものである。本明細書において、ＭＯＩは、当分野において受容される意味と一致して使用される。すなわち、ウイルス性因子（例えばエンテロウイルスＡウイルス）とウイルス標的（例えば本開示の細胞）の公知の比率又は予測される比率である。ＭＯＩは当分野において、少なくとも１つのウイルスが感染した培養物中の細胞の割合に影響を与えることが知られている。ＭＯＩが高いとウイルスの生産性が高くなる一方で、ＭＯＩの特定の範囲では感染率は飽和状態となっており、閾値に達した後、又は所望される感染率に達した後にＭＯＩを低下させることにより、対応するウイルス種バンクの量及びコストを低減させることができる。
【００６４】
一部の実施形態において、約０．０２５〜約０．０００９のＭＯＩで、エンテロウイルスＡウイルスが細胞に接種される。一部の実施形態において、ＭＯＩは、以下のＭＯＩのうちのいずれかのおよその値よりも低い：０．０２５、０．０２２、０．０２０、０．０１８、０．０１５、０．０１２、０．０１０、０．００８、０．００５、０．００２、又は０．００１０。一部の実施形態において、ＭＯＩは、以下のＭＯＩのうちのいずれかのおよその値よりも高い：０．０００９、０．００１０、０．００２、０．００５、０．００８、０．０１０、０．０１２、０．０１５、０．０１８、０．０２０、又は０．０２２。すなわち、接種前の細胞密度は、０．０２５、０．０２２、０．０２０、０．０１８、０．０１５、０．０１２、０．０１０、０．００８、０．００５、０．００２、又は０．００１０の上限、及び独立して選択される０．０００９、０．００１０、０．００２、０．００５、０．００８、０．０１０、０．０１２、０．０１５、０．０１８、０．０２０、又は０．０２２の下限を有するＭＯＩの範囲のいずれかであってもよく、この場合において下限は上限未満である。一部の実施形態において、約０．００１のＭＯＩで、エンテロウイルスＡウイルスが細胞に接種される。
【００６５】
感染した時点で、本開示の感染細胞は、第二の細胞培養培地中（例えば、本開示の固定層において）培養されてもよい。本明細書に記載されるように培養された細胞は、ウイルス接種前は第一の培養培地中で培養され、ならびにウイルス接種時及び／又はウイルス接種後は第二の培養培地中で培養されてもよい。例えば、一部の実施形態において、本開示の細胞は、第一の細胞培養培地中で培養され、次いで第一の細胞培養培地が除去され、当該細胞は任意で（例えばＰＢＳなどの水性緩衝溶液で）リンスされ、及び第二の培養培地が当該細胞に添加されてもよい。一部の実施形態において、第二の培養培地は、細胞接種のためのエンテロウイルスＡウイルスを含有してもよい。一部の実施形態において、第一の培養培地及び第二の培養培地は、同じ培養培地である（例えば同じ組成を有しているが、一部の実施形態において、それらは必ずしも同じ物質の培地ではない）。他の実施形態において、第一の培養培地と第二の培養培地は異なっている（例えば異なる組成を有している）。
【００６６】
一部の実施形態において、第一の細胞培養培地は血清（例えばウシ胎児血清）を含有している。培養細胞の増殖に適した血清の型のいずれかを用いることができる    当分野における血清の例としては、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ及びｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ウマ血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ラット血清、マウス血清、及びヒト血清が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、第一の細胞培養培地は、１０％未満の血清（例えばウシ胎児血清）を含有し、及び細胞は無血清培地に適合されていない。特定の実施形態において、第一の細胞培養培地は５％の血清（例えばウシ胎児血清）を含有している。
【００６７】
一部の実施形態において、第二の培養培地は無血清培地である。一部の実施形態において、第二の培養培地は無タンパク質培地である。ヒトまたは動物を源とする血清由来の添加物が無い場合の本開示の文脈において、培地（例えば本開示の培養培地）とは、無血清培地を指す。無タンパク質とは、タンパク質、増殖因子、他のタンパク質添加物、及び非血清タンパク質が除外されて細胞の増殖が発生するが、任意選択で例えばトリプシン又はウイルス増殖に必要な場合があり得る他のプロテアーゼなどのタンパク質を含み得る培養を意味すると理解される。かかる培養での細胞の増殖は、当然ながら、それ自身のタンパク質は含有する。
【００６８】
ウイルス接種物、及びウイルス培養物は、好ましくは単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオ―マウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、及び／又はパルボウイルスが無い状態である。（すなわち、これらウイルスによる汚染を検査し、陰性結果を得ている）［ＷＯ２００６／０２７６９８］
【００６９】
細胞培養及び細胞培養培地の他のパラメータもまたウイルス産生に影響を与え得る。一部の実施形態において、本開示の細胞は、所望される体積／表面積の比率の本開示の第一及び／又は第二の培養培地中で培養されてもよい。学説に拘束されることは望まないが、細胞が培養される体積／表面積の比率は、例えば細胞生産性、細胞サイズ、増殖速度、ならびに／又は栄養素及び培養培地中の他の成分へのアクセスなどのパラメータに影響を与えうる。特定の実施形態において、細胞は、約０．３ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積の比率で（例えばウイルス接種の前、ウイルス接種の間、及び／又はウイルス接種の後に）培養される。
【００７０】
一部の条件下では、本開示の細胞は培養の間、乳酸塩を産生する場合がある。当分野において、培養中の細胞は解糖代謝又は嫌気的代謝の結果として乳酸塩を産生し得ることが知られている。学説に拘束されることは望まないが、細胞培養培地中に過剰な乳酸塩があると、例えば培養培地のｐＨの低下によって、細胞の成長、代謝、及び／又はウイルス生産性に負の影響を与え得ると考えられている。さらに、培養細胞による過剰な乳酸塩産生は、ウイルス産生及び／又は増殖にとって望ましくない細胞の代謝状態を示唆する場合がある。一部の実施形態において、第一の細胞培養培地中及び／又は第二の細胞培養培地中の乳酸塩濃度は、約２５ｍＭを超えない。細胞培養培地中の乳酸濃度の測定方法は当分野に公知であり、乳比重計、乳酸酵素アッセイ（例えば乳酸脱水素酵素、及び比色分析試薬又は蛍光検出試薬の使用を介して）、微小透析サンプリング機器などの使用が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
一部の実施形態において、本開示の感染細胞は、感染細胞がエンテロウイルスＡウイルスを産生する条件下で第二の細胞培養培地中で（例えば本開示の固定層において）培養されてもよい。感染細胞がエンテロウイルスＡを産生する条件は当分野に公知であり、その条件は細胞型、エンテロウイルスＡのタイプ、培養培地、温度、細胞密度、ウイルス密度（例えばＭＯＩ）、細胞増殖速度、細胞継代数などに依存し得る。細胞にエンテロウイルスが感染する条件の例示的な記載を以下に提示する。
【００７２】
本明細書に記載される方法の他の態様は、細胞培養培地中の酸素濃度（ＤＯ）に関するものである。細胞培養培地中の適切な酸素濃度を維持することにより、細胞呼吸のための酸素が供給され、細胞増殖及び／又はウイルス生産性が促進され得る。さらに、細胞培養中の細胞による酸素の利用は、その健康状態、増殖、及び／又は代謝に反映され得る。一部の実施形態において、第一の細胞培養培地中及び／又は第二の細胞培養培地中の酸素濃度は、約５０％を超えて維持される。細胞培養培地中でＤＯを維持する方法及び／又はＤＯを測定する方法は当分野に公知であり、自動酸素注入、細胞培養培地の酸素への曝露（好ましくはコンタミネーションのリスクを最小限にしながら）、酸素制御装置の使用、酸素センサーの使用が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７３】
当分野に公知の様々な方法を使用して、本開示方法により産生された感染性ウイルスの力価を測定することができる。かかる方法としては、エンドポイント希釈アッセイ（例えばＴＣＩＤ５０値を測定するための）、タンパク質アッセイ、定量的透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、プラークアッセイ、フォーカスフォーミングアッセイ（ＦＦＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、ウイルス力価はＴＣＩＤ５０／ｍＬで測定される。一部の実施形態において、少なくとも５．０×１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬのエンテロウイルスＡウイルスが回収される。
細胞培養用デバイス
【００７４】
本開示の特定の態様は、固定層において細胞を培養する方法に関連するものである。例示的な細胞培養デバイスは、ＵＳ８５９７９３９、ＵＳ８１３７９５９、ＵＳ  ＰＧ  Ｐｕｂ  ２００８／０２４８５５２、及びＷＯ２０１４０９３４４４に言及されており、市販されている（例えばＰａｌｌ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹのｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＢｉｏｒｅａｃｔｏｒｓのたとえばＮａｎｏ及び５００／１００バイオリアクターなど）。
【００７５】
一部の実施形態において、細胞は固定層バイオリアクターにおいて培養される。固定層バイオリアクターは、細胞の接着と増殖を促進するための固定層又は充填層を形成する固定充填マテリアルの形態のキャリアを含む。固定層の充填マテリアルの配置は、局所の液体、熱、及び物質の移行に影響を与え、通常は高密度であり、所与のスペース中の細胞培養を最大化する。１つの実施形態において、リアクターは、細胞の接着及び増殖を促進するための充填マテリアル（例えばファイバー、ビーズ、球又は同様のもの）から構成される充填層又は固定層を備える内部を形成する壁を含む。マテリアルはリアクターの内部内の区画に位置し、当該区画は、空洞で、垂直に伸長している管の上部を備えていてもよい。第二の区画は、少なくとも部分的に固定層を形成している区画のマテリアルへ液体を往復で運ぶためのリアクターの内部内に提供されている。典型的には、充填マテリアルは、細胞増殖のための表面積を最大化するように配置されていなければならず、１，０００平方メーターが、有益な表面積量であると考えられる（例えば、充填マテリアルとして医療グレードのポリエステルマイクロファイバーを使用して得ることができる）。１つの実施形態において、均一に分配された培地の循環は、内蔵式の磁気駆動羽根車により達成され、それにより剪断応力が低くなり、細胞活性が高くなる。細胞培養培地は、固定層を底部から上部へと流れる。上部では、薄いフィルムのように培地が外壁を落ち、ここでＯ２が取り込まれ、バイオリアクター内の高いＫＬａが維持される。この滝のような酸素化は、穏やかな攪拌とバイオマスの固定化と共に行われ、これによりバイオリアクターが高い細胞密度を得て、維持することができるようになる。一部の実施形態において、固定層は約２ｃｍの層高を有する。他の実施形態において、固定層は約１０ｃｍの層高を有する。
【００７６】
一部の実施形態において、固定層はマクロキャリア（例えばマトリクス）を含有する。一部の実施形態において、マクロキャリアはファイバーマトリクスである。一部の実施形態において、マクロキャリアはカーボンファイバーマトリクスである。マクロキャリアは、織りマイクロファイバー又は不繊マイクロファイバー、ポリエステルマイクロファイバー（例えば医療グレードのポリエステルマイクロファイバー）多孔質炭素及びキトサンのマトリクスから選択されてもよい。マイクロファイバーは任意でＰＥＴ、又は他の任意のポリマーもしくはバイオポリマーから作製されてもよい。一部の実施形態において、マクロキャリアはビーズを含有する。ポリマーは、もしかかる処置が必要であれば、細胞培養に適合するよう処置されてもよい。
【００７７】
適切なマクロキャリア、マトリクス、又は「担持マテリアル」は、例えばケイ酸塩、リン酸カルシウムなどのミネラルキャリア、例えば多孔質炭素などの有機化合物、例えばキトサンなど天然生成物、細胞増殖に適合したポリマー、又はバイオポリマーである。マトリクスは、正規構造又は非正規構造を伴うビーズの形態を有することができ、又はポリマーの織りマイクロファイバーもしくは不繊マイクロファイバー、又は細胞増殖に適合した任意の他のマテリアルを含有してもよい。また、充填物は、孔及び、又はチャンネルを有する１つの成形物として提供されることもできる。レシピエント内の充填物は、様々な形態及び大きさを有することができる。一部の実施形態において、マトリクスは、固形もしくは多孔性の球、薄片、多角形の微粒子マテリアルである。典型的には、充分な量のマトリクスを使用し、マトリクス粒子が使用時にレシピエント内を移動しないようにするが、これは、移動が細胞にダメージを与える可能性があり、ならびに気体及び／又は培地の循環に影響を与える可能性があるためである。あるいは、マトリクスは、内部レシピエントに適合する要素、又はレシピエントの区画に適合する要素からなり、ならびに適切な多孔性及び表面を有している。本明細書の例としては、Ｃｉｎｖｅｎｔｉｏｎ社（ドイツ）により作製されるカーボンマトリクス（Ｃａｒｂｏｓｃａｌｅ）が挙げられる。一部の実施形態において、ファイバーマトリクスは、約１５０ｃｍ２／ｃｍ３〜約１０００ｃｍ２／ｃｍ３の、細胞にアクセス可能な表面積を有する。
【００７８】
一部の実施形態において、マクロキャリア（例えばファイバーマトリクス）は、約６０〜９９％の多孔性を有している。一部の実施形態において、マクロキャリア（例えばファイバーマトリクス）は、約８０〜約９０％の多孔性を有している。任意で、充填物は、５０％〜９８％の範囲の多孔性Ｐを有していてもよい。多孔性Ｐという用語は、マテリアルの所与の体積に存在する空気の体積であり、マテリアルの所与の体積の割合として表される。多孔性は、多孔質マテリアルの体積当たりの重量Ｗｘを測定し、以下の式を使用することで測定することができる：
P=100-(1-Wx  Wspec)
式中、Ｗｓｐｅｃは、マテリアルの比重である。多孔性マテリアルは、１つの固体単位の多孔性マテリアルであってもよく、又は複数の個々の単位であってもよく、例えばグレイン、チップ、ビーズ、ファイバー、又はファイバー凝集体などであってもよい。
【００７９】
一部の実施形態において、固定層は、単回使用、又は使い捨ての固定層である。例えば、市販のバイオリアクターの例えばｉＣＥＬＬｉｓ（登録商標）ＮＡＮＯ及び５００／１００バイオリアクターのＢｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ（Ｐａｌｌ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）は、取り外し可能で、使い捨て又は単回使用の固定層を備えたバイオリアクターシステムを含んでもよく、その固定層により、小型のバイオリアクターの容積で、大きな増殖表面積がもたらされる。マイクロキャリアを使用する標準的な攪拌タンク型バイオリアクターと比較し、かかるシステムは、マイクロキャリアの手動操作、滅菌、及び水和、ならびに前培養プロセスから最終プロセスへのビーズ間の移送を含む、いくつかの繊細で時間のかかる手順を回避する。本明細書に記載される場合、かかるバイオリアクターは、大規模（例えば５００平方メートル）の培養面積相当での処理と、最大で１５００〜２０００Ｌの回収液量を可能にすることができ、これは、ウイルスの産業規模での生産（例えばワクチン製造での使用）に有益である。本明細書に例示される場合、かかるデバイスは、例えば、少ない細胞接種材料；短い前培養期間で感染に最適な細胞密度に達すること；ならびに／又は培養増殖期の間のＭＯＩ、培地、及び血清の濃度の最適化といったさらなる利点が可能となり得る。かかるデバイスは、培養中の細胞の急速なかん流が可能となるように構成されてもよく、それによって例えば、９０％以上の細胞が同じ培地環境におかれる。さらに、学説に拘束されることは望まないが、単回使用、又は使い捨ての固定層によって合理化された下流処理が可能となり、それに伴い生産性は最大化され、ならびに、たとえ大規模な従来型培養容器の数個に相当するスケールアップがなされていても、処理面積の負荷は低減される。ゆえに、有益な生産性及び純度を、最小限の工程とコストで達成することができる。
【００８０】
１つの実施形態において、細胞培養のレシピエントは内部空間を有しており、それは環状である場合もあるが、他の形態をとっている場合もある。その空間は充填物を含有している。レシピエントが細胞培養に使用される予定である場合、充填物は、細胞増殖に適合していなければならない。環状構造の場合、内部空間は、第一の外端と第二の外端を有する外側管状壁と、縦軸方向に延びる縦壁により区切られた環状の体積を有している。外側管状壁は、環状体積の外側境界を縦軸方向に区切る；第一のクロージャと第二のクロージャは、外側管状壁のそれぞれ第一の外端と第二の外端で環状体積を区切り、閉鎖する；内側伸長壁は、外側管状壁の第一の外端へと向かう第一の外端と、外側管状壁の第二の外端へと向かう第二の外端を有している。内側伸長壁は、外側管状壁内に位置づけられている。内側伸長壁は、縦軸方向に伸長しており、環状体積の内部境界を区切り、その内部境界は外部境界に取り囲まれている。内部伸長壁の第二の外端は、第二のクロージャと同一の空間に存在する。例としては、外側管状壁は、シリンダー状の外側管状エレメントにより提供される。内側伸長壁は、固形状の内側シリンダー状エレメント、例えばシリンダー状の棒により提供される場合もある。外側管状エレメントは、シリンダー状の管状エレメントであり、縦軸方向に平行な中心軸を有している。内側シリンダー状エレメントと外側管状エレメントは、同軸上に取り付けられていてもよい。
【００８１】
一部の実施形態において、内部シリンダー状エレメントの第一の外端は、内側シリンダー状エレメントと外側管状エレメントに固定されているクロージャ、さらに外側管状エレメントを使用して、内側シリンダー状エレメントを、例えばバイオリアクターのモーターなどの動力機械装置に連結するためのカップリングエレメントを備えていてもよい。第二のクロージャは、培地及び／もしくはガスを、内部空間へ、ならびに／又は内部空間から、提供するための、ならびに／又は抽出するための、培地又はガス源へレシピエントを連結するのに適したコネクターと共に提供される。このコネクター、又はあるいは追加のコネクターが、第一のクロージャ又は第二のクロージャへと備え付けられていてもよい。
【００８２】
一部の実施形態において、レシピエントの移動時、充填物、特に多孔性マテリアルは、レシピエントに対し固定された相対位置に置かれてもよく、又はレシピエント内をレシピエントに関連して移動してもよく、又は場合によっては、レシピエントの区画内を移動してもよい。レシピエントは、任意で０．１〜２５回転／分の回転スピードで、その軸を中心として回るものである。
【００８３】
一部の実施形態において、内部空間は、培養培地、例えば細胞培養培地で部分的に満たされている。例として、液面は少なくとも内側伸長壁に接触し、又は内側伸長壁は部分的に培地中に沈んでいる。液面下に位置する充填物部分は、培養培地、例えば細胞培養培地により湿っている。液面上に位置する充填物は、内部空間に存在するガス又は空気と接触している。レシピエントが軸を中心として一方向、例えば時計回りに回転する場合、培養培地、例えば細胞培養培地は、充填物に対して反対方向に、すなわち反時計回りの方向に回転する。培養培地、例えば細胞培養培地は、栓流に従って全充填物を通過する。レシピエント例えば時計回りに回転すると、培養培地、例えば細胞培養培地は、栓流の前縁のガス又は空気を強引に動かし、反時計回りに移動させる。培地の後縁では、任意で限定的な沈下が生じ、それによってガス又は気体は後縁へと吸い込まれる。そのようにして、培地、及びガス又は気体は全充填物を通過する。
【００８４】
一部の実施形態において、シリンダー状管状エレメントによって、別のレシピエントの内側伸長壁が提供される場合もある。例として、外側管状壁は、外側管状エレメントにより提供される。内側伸長壁は、伸長シリンダー状管状エレメントにより提供される。外側管状エレメントと伸長シリンダー状管状エレメントは、２つの取り外し可能なクロージャに固定されている。第一のクロージャは、レシピエントを縦軸方向に軸を中心として回転させるための駆動手段にレシピエントを連結させるためのカップリングエレメントと共に提供される。第一のクロージャはさらに、内部空間を導管、例えば可撓管に接続するためのコネクターを備えている。
【００８５】
一部の実施形態において、外側管状エレメントは、例えば１１０ｍｍの長さＬと、例えば１３５ｍｍの内側直径Ｄｏを有するガラス管であってもよい。内側伸長エレメントは、例えば８８．９ｍｍの外側直径Ｄｉを有するポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）管であってもよい。内側伸長エレメントの外端、すなわち内側伸長壁の外端は、クロージャと同じ場所にある。このクロージャは、ステンレススチール又はＰＶＤＦの環状ディスクであってもよく、それらはシリコンを使用し、内側エレメント及び外側エレメントに付加されていてもよい。コネクターを備えて提供され得る第一のクロージャは、例えば約３５ｍｍの外側直径Ｄｅｅを有するカップリングエレメントを有する。内側空間は、充填物で少なくとも部分的に満たされている。
【００８６】
一部の実施形態において、レシピエントはさらに、内側空間を２つの区画に分割する２個の流体透過可能な分割物を備えている。流体透過可能な分割物は、内側伸長壁から外側管状壁へ、及び第一のクロージャから第二のクロージャへと、管の軸の方向と平行な縦方向に伸長している。１つの区画は充填物と共に提供される。１つの区画は充填物と共に提供されない。流体透過可能な分割物は、例えば多孔性分割物を提供するための多孔性マテリアルを使用することにより、孔を備えて提供されてもよく、又は液体すなわち培養培地及びガスの通過を許可する場合には、開口部を備えて提供される。しかしながら分割物は、分割物の片側から反対側へと充填物が通過してしまうのを防ぐのに充分な小ささの孔又は開口部を備えて提供される。
【００８７】
一部の実施形態において、外側管状壁は、縦軸方向に対して垂直な面に沿った水路横断面を有する外側管状エレメントにより提供され、当該横断面は、円の形状を有している。内側伸長壁は、縦軸方向に対して垂直な面に沿った水路横断面を有する内側伸長エレメントにより提供され、その横断面は、不完全な円又は弓型の形を有している。１つの実施形態において、当該弓型は、円部分と弦を有している。例えば当該弓型の高さは、２００ｍｍの（Ｄｅｃ）、４００ｍｍ（Ｄｏ）、２４０ｍｍ（Ｄｉ）及び１２５ｍｍ（Ｌ）の寸法を有している。分割物はこの実施形態において当該弓型の弦と同一平面上にある。二つのクロージャのうちの第二のクロージャは、二つのコネクターを備えて提供される。第一のコネクターは、外側管状壁の近くに提供される。第二のコネクターは、内側伸長壁の近くに提供される。レシピエントが部分的にのみ培養培地で満たされている場合、その培地は液体表面を有し、レシピエントは、その液体が内側伸長壁に接触せず、しかし内側伸長壁から所与の距離に留まるような位置へ回転してもよい。レシピエントがこの位置に移動したとき、第一のコネクターを使用して、充填物で満たされていない区画に対し、培地を除去してもよく、又は培地を提供してもよい。コネクターを用いて、その培地液体表面の上にガスを提供してもよく、又は除去してもよい。時計回り、又は反時計回りのいずれかに、例えば３６０°以下又はそれ以上の角度でレシピエントを回転させることにより、培地は２つの分割物のうちの１つを通過し、より具体的には、培地中に徐々に沈む分割物を通過する。回転によって充填物が徐々に培地を通過するに従い、培地はゆっくりと充填物を流れて通る。レシピエントの回転によって、培地は栓流に従い全充填物を流れて通過する。環状体積のあらゆる場所で培地と充填物の間に均一な接触が生じる。充填物の一部が培地を通過すると、培地は徐々に充填物から吐き出され、それに従い、レシピエント中のガスが再び充填物と接触することができ、それによって充填物のあらゆる場所での均一な細胞の増殖が可能となる。
【００８８】
レシピエントの別の実施形態において、内部空間の環状体積は、複数の環状セクションにより提供され、この特定の場合においては、４つの環状の４半分（クオーター）により提供される。各セクションは、外側管状壁セクションによって外側管状壁の一部を提供する。各セクションは、内側伸長壁セクションによって内側伸長壁の一部を提供する。各セクションは、２個の放射状に伸長するセクション壁を有する。これらのセクション壁は、液体及びガスが不透過性である。各セクション壁は、隣接するセクションとの相互連結が可能となる取付手段を備えて提供される。第一のセクションのクロージャと第二のセクションのクロージャは、それぞれ、外側管状壁の第一と第二の外端で、環状セクションの体積を区切り、閉鎖する。セクションのクロージャはともに、それぞれ、レシピエントの環状体積の第一及び第二のクロージャを形成する。
【００８９】
一部の実施形態において、各セクションはさらに、２個の流体透過可能な分割物を備えて提供されてもよく、それらは３個の区画の各環状セクションの内部空間を分割する。流体透過可能な分割物、例えば多孔性分割物は、内側伸長壁から外側管状壁へ、及び第一のクロージャから第二のクロージャへと、管の軸の方向と平行な縦軸方向に伸長する。１つの区画は充填物を備えて提供される。２つの区画は充填物を備えて提供されない。各環状セクションに対し、第一のコネクターは、外側管状壁の近くに提供される。第二のコネクターは、内側伸長壁の近くに提供される。各セクションは、レシピエントが軸を中心として回転しているとき、レシピエントの独立したレシピエントセクションとして機能してもよい。各セクションの充填物は、培地を備えて提供され、セクションの半径上の位置に従ってこのセクション中に存在する。
【００９０】
セクションを取り付けることによって、４セクションのこの実施形態においては、外側管状壁と内側伸長壁を有するレシピエントが得られ、その環状体積は、２個のクロージャを用いて、外側管状壁の２個の外端で閉鎖される。２個の放射状に伸長したセクション壁の取り付けと連結によって、セクションの連結が行われるため、２個の連続的なセクション壁の組み合わせが液体及びガスが不透過性の分割物を形成し、分割物は内側伸長壁から外側管状壁へ、及び第一のクロージャから第二のクロージャへと、管の軸の方向と平行な縦軸方向に伸長する。この実施形態には、各セクションが、異なる細胞培養用の異なる培地を備えて提供され得るという利点を有する。また、セクションのうちの１つにおいて充填反応が不完全に機能した場合、その１つのセクションのみが置き換えられる。レシピエント（又は本明細書に開示される任意の他のレシピエント）の回転は、回転機により提供される場合がある。１つの例において、この回転機は、外側管状壁と、少なくとも２個の支持車輪を接触させることを含んでもよく、その車輪の少なくとも１つが駆動している。
【００９１】
別の実施形態において、レシピエントの各セクションは、２個の放射状に伸長するセクション壁を有する。これらのセクション壁は、液体及びガスが透過性である。各セクションは、いくつかの開口部を備えており、これら開口部の各々は、隣接する区画の第二のセクション壁の対応する開口部につながる。第一のセクション壁の開口部は、外向きに伸長する縁を備えて提供されてもよく、その縁は、第二のセクション壁の対応する開口部を通って伸長する。任意で、接触している壁の間に培地が漏れることを防ぐため、隣接するセクション壁の開口部周囲にシールが備えられる。別の実施形態においては、シールの代わりに可撓菅がレシピエント間に配置される。
【００９２】
バイオリアクターがレシピエントを使用する実施形態において、少なくとも１個のレシピエントが容器内に回転可能に取り付けられ、例えば円形、又は長方形などの多角形（任意で正方形）といった任意の適切な放射状の横断面を有してもよい。容器は、部分的に培養培地で満たされ、それによって液面は、任意でバイオリアクターの軸よりも高く上昇しないが、少なくとも内側伸長壁には接触する。レシピエントは軸を中心として回転し、その軸はレシピエントの縦軸と一致している。レシピエントの縦軸は、外側管状壁の縦軸方向と平行な軸である。任意で、外側管状壁は、開口部を備えて提供され、又は例えば液体及びガス透過性マテリアルなどの多孔質から作製される。かかる液体透過性の外側管状壁が、外側管状壁の一部のみが培地中に沈むように部分的に培地で満たされた容器の中で回転する場合、充填物は培地を備えて提供され、培地は外側管状壁を通って環状体積へと流れ込む。レシピエントが容器の中で回転する場合、培地の一部は、充填物に沿ってのろのろと進む場合がある。
【００９３】
一部の実施形態において、レシピエントのうちの少なくとも１つは、磁気エレメントを備えている。さらにバイオリアクターも磁気エレメントを備え、この磁気エレメントは、レシピエントの磁気エレメントと協働する。両磁気エレメントは、バイオリアクターの磁気エレメントの回転軸を中心とした回転が、レシピエントの磁気エレメントの回転を誘導するよう配置され、それによって全レシピエントが回転する。隣接するレシピエントは、それらが回転する近くの共通シャフト上に取り付けられてもよい。隣接するレシピエントは、固定された位置で互いに連結されてもよく、それによって、レシピエントの回転が、次のレシピエントの回転を誘導する。
【００９４】
一部の実施形態において、レシピエントは液体及びガスが不透過性の外側管状壁を有しており、壁は、レシピエントと、ガス又は培地の貯蔵場所を、任意で可撓管によって接続するためのコネクターを有する。レシピエントは、バイオリアクターを提供するための駆動システムを用いて回転されてもよい。レシピエントは回転可能なシャフト上に取り付けられ、そのシャフトは、レシピエントの軸と一致する回転軸を中心として回転可能である。シャフトは、内側伸長エレメントの内部空間内の固有の回転位置に配置され、適合される。したがって、シャフトの回転位置を制御することにより、軸周囲のレシピエントの位置が明確に定義される。駆動システムはさらに、例えばリニアモーターなどのモーター、又はシャフト回転の正確な制御に適した任意の他の手段を備えていてもよい。レシピエントがシャフトを超えて縦軸方向にずれることを防ぐための締め付けねじ、又は任意の適切な手段が、シャフト上で縦軸方向にレシピエントの位置を固定してもよい。任意で２個以上のレシピエントが共通シャフト上に取り付けられる場合があることを理解されたい。内側伸長エレメントの内部空間の形状、及びシャフト外周の形状は、シャフトとレシピエントが、限定された方法、さらには固有の方法で取り付けられることができるよう選択される。
【００９５】
レシピエントの１つの実施形態において、内側伸長エレメントは、内側伸長エレメントの内側壁に縦軸のくぼみを有する。シャフトの頭部はこのくぼみに適合する。レシピエントは、シャフト上に明白な形で適合する。頭部は、くぼみの中で滑るように動くことが可能であってもよい。レシピエントの別の実施形態において、内側伸長エレメントは、内側伸長エレメントの内側壁に縦軸のくぼみを２個有する。シャフト上の２個の互いに垂直な頭部は、これらのくぼみに適合する。レシピエントは、２つの方法でシャフト上に適合する。第一の位置は、第二の位置に対し、軸を中心として１８０°回転している。頭部は、くぼみの中で滑るように動くことが可能であってもよい。レシピエントのさらなる実施形態において、内側伸長エレメントは、４個の縦軸のくぼみを有し、内側伸長エレメントの内側壁の各々のくぼみは、区画によりもたらされる。シャフトは、実質的に十字形様の横断面を有し、シャフト上に４つの相互に垂直な頭部を備えている。各頭部は、区画のうちの１つのくぼみに適合する。レシピエントは、シャフト上に４つの方法で適合する。頭部は、くぼみの中で滑るように動くことが可能であってもよい。
【００９６】
バイオリアクターのレシピエントのさらなる実施形態において、内部空間の体積は、複数のセグメントにより提供され、この特定の場合においては４つの４半分（クオーター）により提供される。各セクションは、外側管状壁部分を用いて外側管状壁の一部を提供する。各セグメントは、内側伸長壁部分を用いて内側伸長壁の一部を提供する。各セグメントは、２個の放射状に伸長するセグメント壁を有する。例として、セグメントは、２個の放射状に伸長するセグメント壁を有する。さらに、培養培地が内側伸長壁の内部空間を満たしてもよい。開口部を通り、培養培地がそのセクションに流入又は流出してもよく、及び任意で隣接するセクションへと流れてもよい。レシピエントは、縦壁、及びキャップの形態の末端を形成する体部を含む。このキャップは取り外し可能であってもよく、及び接続された位置で、体部内に任意の液体を含有するための、液密シールを形成してもよい。各キャップは、培養培地を受け入れるための流入口と流出口を形成する開口部を含んでもよいが、この流入口と流出口は各々、同様に同じキャップに備えられてもよく、又は体部の縦壁に備えられてもよい。少なくとも１つ又はペアの液体透過性の構造、例えば穴の開いた仕切りなどが備えられ、任意の充填物を含有するための区画を形成する。各仕切りの穴は、区画内の液体の流れ及び滞留時間を制御するための形状及びサイズで備えられてもよく、及びそれら仕切りは同じであっても、異なっていてもよい。充填物は、レシピエントの区画を完全に占有するような方法で備えられることができ、それによって、体部の壁の内側表面、ならびに液体透過性構造に周辺が接触する。
【００９７】
一部の実施形態において、レシピエントは、回転デバイスと関連づけられていてもよい。そのデバイスは、体部の縦軸を中心としてレシピエントを受け取り、支持し、及び回転するための一対のローラーを含んでもよい。レシピエントは、多くの場合、このローラーと連動し、このローラーによって回転されるよう適合されたシリンダー状の体部を備えて提供され、区画内に存在する任意の充填物を通過させて任意の液体（例えば培養培地又は任意のリンス剤又は回収剤）が分配されるのを補助してもよい。また、区画に液体を送達するために、管状コネクターを流入口と流出口に関連付けて提供してもよい。これは、レシピエントが静止状態にある間、又は回転している間に行われてもよい。後者の場合、コネクターは、例えばスナップ式の咬合などを経由して作製される回転ジョイントを使用して、又はベアリングを使用して、相対的回転が可能となるような方法で接続されてもよい。例えばＯリングなどのシールを使用して、何らかの漏出を防ぐことを補助し、及び細胞培養に望ましい滅菌状態を維持することを補助してもよい。レシピエントの１つの利点は、アレンジの単純さである。例えば、レシピエントは、センサー、プローブ、ミキサーまたは同様のものを含まず、しかしかかる構造を含むことが望ましい場合には、これは可能であり、閉回路でレシピエントをレゼルボアに接続することにより達成することができる。レゼルボアは、任意の数のセンサー、又は循環液の特性の１つ以上を測定するための同種のものを含んでもよく、及び単回使用の容器（例えば可撓性バッグを含み、洗浄と滅菌の必要性を無くしてもよい。液体を、ループを通って循環させるために、例えば蠕動ポンプなどのポンプを備えてもよい。
【００９８】
この実施形態において、レシピエントは、上述のいずれかに従い構築されてもよく（そして回転瓶を形成する）、及び流入口と流出口を含有する。流入口と流出口のそれぞれは、レシピエントの回転が可能な導管に接続されていてもよく、導管は過度に巻かれたり回転させられることなく、液体の移送に干渉することのない方法で接続され、及びそれによって、回転しながら、レシピエントからの継続的な液体の流出と流入が可能となる。具体的には、導管は、流出口と流入口のそれぞれに接続するための開口端を有するコイル管を備えていてもよく、及び反対側の端で、任意の液体レゼルボアと関連づけられていてもよい。また、導管とレシピエントを通り液体を移動させるための、適切なポンプ配置が備えられていてもよい。
【００９９】
１つの実施形態において、レシピエントは、適切な回転機（例えば、ローラー）を使用して、例えば時計回りなどの第一の方向に、１回以上の全回転の間、回転していてもよい。導管を巻き付けることなく可能な回転数は変動し得るが、最小で２〜３回転が可能であろうと予想される。次いで、レシピエントはすぐに１回以上の全回転の間、反対方向に回転されてもよい。より具体的には、回転は、コイル管がそのホームポジションへと戻るための第一の方向での回転数に、コイル管が巻き付かず、又はさもなければ液体移送に干渉しない間は、第二の方向での対応する回転数を加えたものであってもよい。回転、及び反回転は、連続的に、又は断続的に行われてもよく、及び導管を介した液体の送達及び回収も同様である。また、レシピエントがセンサーを含む場合には、検出に使用される任意のエネルギー源へとレシピエントが接続され得ることを理解することができるであろう。そのような場合には、例えばケーブルなどの任意の伝送回線をぐるぐる巻き、又はらせん巻きにし、回転又は巻き付けられることのない上述の予期される方法での相対的回転に適合させてもよい。とはいえ、再度ではあるが、任意のセンサー又は同種のものを、いずれかの再循環ループ内に配置したほうが望ましく、その理由は、これによって、レシピエントのコストが低下するからである。
【０１００】
レシピエントが回転瓶の形態であるさらなる実施形態において、流入口と流出口は、共有壁に備えられてもよい。また、流入口は、固定層内の液体透過性内部シリンダー内に位置付けられた管と関連づけられていてもよく、それによって、導入された流体（ガス、液体、又はその両方）が、ただちに単純に流出口から出て行ってしまうことを防ぐ補助となる。ガスは、再循環ループ内において、例えばロータメーターなどのインジェクターを配置することにより液体へと導入されてもよい。配置は、流入口のすぐ上流であってもよい。液流と接続されたガス導入のこの方法は、泡の発生の低減、及び物質移動速度の改善に有益に役に立ち、その理由は、ガスが液体により分離されるポケット内に留まるためである。流出口と関連づけられた移送ラインはレゼルボアへと戻り、これは示されているフィルターを介して放出され、レシピエントとの直接接続用の排出口を回避する。
【０１０１】
一部の実施形態において、他のエレメントをレシピエントとバイオリアクターに付加してもよい。例として、内側伸長壁は、伸長管状の、任意でシリンダー状の壁であってもよい。内側管状壁の内部空間を使用して、例えば温度センサー、位置センサー（例えば、回転軸に対し、レシピエントの方向を定義するため）、光学センサー（例えば、細胞培養培地などの培養培地のカラーデータを作成するため）、ｐＨセンサー、酸素センサー（例えば溶存酸素（ＤＯ）センサー）、ＣＯ２センサー、アンモニアセンサー、又は細胞バイオマスセンサー（例えば、濁度密度計）などのセンサーの１つ以上を収容してもよい。かかるセンサーは、付加的に、もしくは任意で、クロージャ内又はクロージャ上に位置付けられてもよい。レシピエントはまた、かん流、新鮮な栄養培地の連続的な添加、及び使用した培地と等量の培地の廃棄に適合してもよく、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏの状況に可能な限り近い細胞培養状態を実現することができる。かん流細胞培養と、例えば酵素グルコースバイオセンサーを組み合わせることによって、細胞培養のグルコース消費を連続的にモニターすることが可能となる。また、レシピエント内の培地及び充填物を加熱し、その温度を維持するために、例えば加熱ブランケットなどの加熱エレメントを、外側壁、及び任意で内側壁に備えてもよい。
【０１０２】
別の実施形態において、バイオリアクターは、実質的に垂直でシリンダー状の培養容器を備える細胞培養容器を備えているが、他の形態、例えば任意の角柱型、好ましくは正の角柱型などを予期することもできる。培養容器は、互いに連通している少なくとも四個のゾーンを備えている。容器の中心から外側に向かって、容器は第一のゾーン、第三のゾーン、第二のゾーン、及び第四のゾーンを備えている。
【０１０３】
一部の実施形態において、培養容器は、底部に培地循環手段を備えている。培地循環手段は、この好ましい実施形態においては、例えば現実又はバーチャルな中心回転軸を中心とした回転をする磁気棒などの磁気デバイスから構成されており、その第一末端は上部咬合手段に収納され、その第二末端は、底部咬合手段に収納されている。磁気棒は、培養容器の外部にある回転磁気駆動モーターにより駆動されるが、本明細書には示されていない。循環手段は、少なくとも１つの培地流入口を備えている。培地流入口は、少なくとも１つの第一末端を備えており、その末端は培地の流入のための分水バッフルに終わる。磁気棒は、遠心力ポンプとして機能し、すなわち、培地はこの棒により生じた培地移動によって、比較的中心のゾーンへと吸い込まれ、そして培地は中心点に対して外側へと推進される。培地分水バッフルは、培地を、この棒の比較的中心ゾーンへと導き、それによって培地はその中に吸い込まれ、次いで外側に推進される。流入口は同じ平面にあり（星型構成）、流入口の数は、その位置が対称を示すような数であるのが有益である。より具体的には、もし３個の流入口を検討する場合、およそ１２０°の角度でそれらを互いに分離すると好都合であり、もし流入口の数が４個である場合、流入口は実質的に９０°に等しい角度で互いに分離され、もし流入口の数が１０個である場合、流入口はおよそ３６°の分離角度で配置される。また、培地循環手段は、少なくとも１つの培地流出口を備えている。培地流出口は、培地が磁気棒の遠心効果によって推進される場所に置かれるのが有益である。流出口の数は、その位置が対称を示すような数が有益である。より具体的には、もし３個の流出口を検討する場合、およそ１２０°の角度でそれらを互いに分離すると好都合であり、もし流出口の数が４個である場合、流出口は実質的に９０°に等しい角度で互いに分離され、もし流出口の数が１０個である場合、流出口はおよそ３６°の分離角度で配置される。好ましくは、流出口は、流入口のように同じ水平面には配置されない。培養容器の底部は、少なくとも１つの培地誘導手段を備え、その手段は前記少なくとも１つの流出口に隣接し、推進された培養培地を培養容器の上部へと誘導する。
【０１０４】
一部の実施形態において、培養容器の第一のゾーンが実質的に中心ゾーンであり、培地移送ゾーンである。第一のゾーンは、基底部分を備え、特定の実施形態においては、第一のゾーンは任意でシリンダー部分も備えている。基底部分の直径は、培養容器の直径よりも小さい。基底部分は、前記培地循環手段の前記少なくとも１つの培地流出口と培地が連通している。基底部分は、第一のゾーンの上部において、シリンダーへと小さくなっており、基底部分よりも直径が小さい。上部のシリンダー状部分は外壁を備えており、前記第一の培地移送ゾーンの基底部分と直接、培地が連通している。第三のゾーンは、培地移送ゾーンであり、第一の培地移送ゾーンに対して外側にある。第三のゾーンは、実質的に基底部分（スリーブの形状）を備え、特定の実施形態においては、第三のゾーンは任意でシリンダー状の上部も備えている。
【０１０５】
一部の実施形態において、第三の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分は、第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分と、原則として同心にあり、これら２つの部分は培地が連通している。培地の連通は、排水管を介して水をあふれさせること（図に示す）により、又はこの連通を行うための任意の他の可能な手段により、開口部又は管を介して行われる。第二のゾーンは細胞培養ゾーンであり、担体もしくはマイクロキャリアを伴う、又は伴わない。第二のゾーンはまた、スリーブの形状であり、その中心は、第一と第三の培地移送ゾーンである。第二のゾーンは、底部壁と上部壁を備えており、各壁は開口部が備えられ、それによって、原則的に細胞の無い培養済み培地の移送が行われる。第二の培養ゾーンは、培地の通過が可能な底部壁の開口部によって、第三の培地移送ゾーンの比較的底の部分と培地が連通している。第四のゾーンは、培地移送ゾーンであり、第二の培養ゾーンの外側であるが、培養容器の内部にある。第四のゾーンは、第二の培養ゾーンと培地が連通している。また、前記少なくとも１つの流入口を介して、培地循環手段と培地が連通している。培地の連通は、水をあふれさせることにより、又はこの連通を行うための任意の他の可能な手段により、開口部又は管を介して行われる。
【０１０６】
一部の実施形態において、培養デバイスは、実質的にシリンダー状の培養容器を備えているが、他の実施形態では、上述されるように例えば実質的に角柱型の容器、好ましくは正の角柱型の容器が予期され得る。また、このことが様々な培地及び培養移送ゾーンにも当てはまることが明白である。また、角柱型、好ましくは正の角柱型であってもよく、任意の形状の組み合わせの可能性もある。この場合において、スリーブという用語は、角柱の想定される横断面と類似した横断面を有するエンベロープとして想定されるはずである。培地循環手段が操作中であるとき、培地は、前記少なくとも１つの流出口を通って出る。培地循環手段が複数ある場合、様々な流出口を通り、誘導手段により流用され、最終的には第一の培地移送ゾーンの実質的に底の部分に行き着く。第一の培地移送ゾーンの構造、及びポンプの拍出量は、培地が第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分へと向かうことが必要とされる。実質的にシリンダー状の部分の壁の上部に達したとき、排水管を介して第三の培地移送ゾーンへと培地があふれ出る。
【０１０７】
この特定の実施形態において、第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分の壁が、効率性及び流速を理由として、第三の培地移送ゾーンの壁よりも低い高さであることが当分野の当業者には明白であるが、第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分の壁が、第三の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分の壁よりも高い場合もあり得ることが容易に理解されるであろう。それゆえ、培地は、ポンプにより与えられた流速、及び重力に従い、実質的にシリンダー状の部分を流れ落ちながら第三の培地移送ゾーンから下に向かい、第三の培地移送ゾーンの実質的に底の部分へと到達する。次に、培地の流れは、ポンプの与えられた流速による、連通容器の効力を介して、上向きの方向を有しており、及び第二の培養ゾーンの上部に到達する。培地は、第二の培養ゾーンの底部壁の、実質的に細胞が無い培地の継代用の開口部を介して、第三の培地移送ゾーンから第二の培養ゾーンに到達する。すでに述べたように、培地移動開口部は、培養のタイプに従った大きさである。培養が、キャリアを使用しない培養である場合、開口部を備えた壁は、多孔質の膜であり、膜の孔のサイズは、細胞の直径よりも小さい。培養がマイクロキャリア又はキャリア上で行われる場合、開口部のサイズは、マイクロキャリア又はキャリアのサイズよりも小さい。培地の流れの縁が第二の培養ゾーンの壁の上部に到達したとき、培地は第四の培地移送ゾーンへとあふれ出る。当然ながら、もし開口部が存在する場合、又は管である場合、培地の流れの縁が開口部又は管に到達したとき、培地は第四のゾーンへと流れることが理解されるはずである。
【０１０８】
１つの実施形態において、第四の培地移送ゾーンは傾斜壁を備えており、培地が第二のゾーンから第四のゾーンへと通過するとき、傾斜壁の上を培地が流れる。好ましくは傾斜壁は、前記傾斜壁のフィルムの形成を改善するための親水性膜を備えている。フィルムは、好ましくは、可能な限り発泡を防ぐための薄層でなければならない。フィルムを安定化させるため、培養培地に添加物を加え、水、特に培養培地のレオロジー特性を改変することも可能であり、例えば添加剤は、界面活性剤、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８、グリセリン、第四級アンモニウム、及び培養培地のレオロジー特性を改変するための任意の他の添加剤からなる群に含まれる。親水性膜は、例えば、ポリオキシエチレンからなる膜である。傾斜壁上でのフィルムの形成は重要な工程であり、その理由は、「薄いフィルム」上での酸素化が可能となるためである。実際に、この第四の培地移送ゾーンの培地量に対してガス性体積は大きく、交換を改善する。さらに、傾斜壁上でのフィルム形成は、ガス−液体の接触表面積を増加させる。
【０１０９】
一部の実施形態において、培養容器は好ましくはカバーを備えており、カバーを介して少なくとも１つのガス流入開口部と、少なくとも１つのガス流出開口部が通っている。ガス流入開口部は好ましくは、第四の培地移送ゾーンと直接連通するよう配置されている。一部の変化形では、ガス流入開口部は、培養容器の垂直壁、又は培養容器の底部に存在することが好ましい場合があり、すなわち、ガスは、カバーと反対側の培養容器の壁を通った開口部を介して通過し、及びこの開口部は、液面上で終わるよう、管を備えて提供されることが好ましい場合がある。
【０１１０】
この実施形態において、カバーは、固定手段によって、第二の培養ゾーンの上部壁に固定されている。変化形において、カバーは、第二の培養ゾーンの上部壁の不可欠な部分を形成していてもよく、この部分は、培養容器のカバーが持ち上げられたときに開く。この方法では、例えば細胞密度、細胞の構造、及び培養の健常状態を反映している細胞の他の物質的な特性などを評価するための細胞サンプルの採取が、キャリアの有無にかかわらず容易となる。実際に、この２つを共に接続することによって、培養容器のカバーを単純に持ち上げるだけで、培養区画を開くことが可能となる。懸濁液での培養の場合において、第二の培養ゾーンの開口部を備えた上部壁に多孔質の膜を接続したほうが有益であり、この組立によって、サンプル採取のためのカバー／膜の組立の硬直性を改善することができる。
【０１１１】
一部の実施形態において、磁気棒は、らせんの形状を有している。実質的な中心回転軸を有する磁気デバイスの設計は、原則として培養量に依存している。実際に、少量の培養に対しては、デバイスは、例えば培地循環用の磁気チップなどのシンプルな棒を使用できるように設定される。多量の場合には、デバイスは、例えば高速の培地循環速度が可能な、水槽で使用されるローター等の、外部モーターにより駆動される磁気ローターが想定される。
【０１１２】
細胞培養デバイスの一部の実施形態は、気泡生成デバイス、より普遍的には、生成される泡のサイズによって、「スパージャー」又は「マイクロスパージャー」と呼称されるデバイスを使用することが想定される場合がある。気泡が使用される場合、気泡生成デバイスの穴の開いた末端、例えば管などは、第四の培地移送ゾーンの底部で培地中に浸され、又は第一の培地移送ゾーンに浸されることが有益である。このタイプの酸素化が選択される場合、薄フィルム上での酸素化を継続することが常に出来、それによって、ガスの流れを低下させ、泡の形成を少なくすることができ、その結果、発泡の形成が低下する。この場合において、培養容器のカバーに、又は後者の垂直壁上に２つのガス流入口を設けるという対策が想定される。さらに、気泡生成デバイスが、単にＳＯＳ手順としてのみ存在すること、及び必要な場合にのみ使用されることを想定することが可能である。
【０１１３】
一部の実施形態において、培養デバイスはまた、例えば溶存酸素分圧ｐＯ２、酸性ｐＨ、温度、混濁度、光学密度、グルコース、ＣＯ２、乳酸塩、アンモニウム、及び細胞培養をモニターするために通常に使用される他の任意のパラメータなどの、一連の培養パラメータセンサーを備えている。これらのセンサーは好ましくは、培養容器の内側と外側の間の接続を必要としない光学センサーである。これらセンサーの好ましい配置は、それらを培養容器の壁近くに位置づけること、それらを培地と接触させること、及び好ましくは、例えば培地が細胞を通過する前又は通過した直後に培地が通過するゾーンなどの戦略的配置におくことが有益であるという点で重要な配置である。
【０１１４】
一部の実施形態において、細胞培養デバイスは、上述の単純性及び経済性などの全ての理由から、使い捨てのバイオリアクターを備えている。結果として、これが、培養容器の内側と外側の間の接続を減少させる理由である。さらに、バイオリアクターは、特に信頼できるバイオリアクターを備えており、使い捨てであることによってコンタミネーションのリスクが特に低くなっている。
【０１１５】
また、ある実施形態でデバイスは、大量培養用の一連のモジュールを備えたモジュール設計を想定している。例えば、このタイプのモジュール設計では、非常に限定された数の標準的なモジュールの使用を介して、例えば約５００ｍｌ〜１００リットルの培養量が想定される。一部の実施形態において、デバイスは、培地循環手段とカバーを備えた標準的な培養容器に配置された、第一の培地移送ゾーンの周囲に、「滑らせる」ことができる一連のモジュールを提供する。特定の変化形において、デバイスは、様々な標準的なモジュールを備えた取付システムを備えている。これら標準的なモジュールは、例えば組立の底部に配置される循環手段モジュール、１つ以上の培養モジュール、及びカバーモジュールである。これらモジュールを固定する他の手段も想定され得るが、モジュールは、例えば液体及びガスという観点で完全に不浸透性なレイピッドコネクター（ｒａｐｉｄ  ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ）の手段によって、互いに固定される。
【０１１６】
結果として、培養のタイプ及び必要とされる量に従い、ユーザは、ストックから、培地循環手段を備えた基礎モジュールを選ぶことができ、また、必要とされる培養量に従い、ユーザが必要とする培養モジュールの数をそれらから選択し、次いでカバーに対応するヘッドモジュールを選択しなければならない。次に、これらすべてのモジュールは滅菌方式でパッケージされ、ユーザに必要なのは、ただそれらを開き、上下に「クリップする」だけである。積み重ねることにより、「使い捨てのバイオリアクター」を形成することができ、又は適切な容器内に配置することができる。
【０１１７】
一部の実施形態において、循環手段を備えた基礎モジュールは培養容器の底部に固定することができ、また培養容器へと滑り込ませて配置することができ、他の培養用には他のものを使用することにより、交差汚染を防ぐことができる。これら培地循環手段は、中心回転軸を中心とした回転をする磁気デバイスを備えており、その第一末端は上部咬合手段に収納され、その第二末端は、底部咬合手段に収納されている。循環手段は、少なくとも１つの培地流入口を備えている。また、培地循環手段は、少なくとも１つの培地流出口を備えている。培養容器の基礎モジュールは、少なくとも１つの培地誘導手段を備え、その手段は前記少なくとも１つの流出口に隣接し、推進された培養培地を培養容器の上部へと誘導する。
【０１１８】
一部の実施形態において、培養容器は、上下に積み重ねられた一連の培養モジュールを備えている。また、それらは単純に互いに隣接していること、すなわち並んで配置されていることも想定され得る。一部の実施形態において、モジュールはレイピッドコネクター又はクリップによって互いに固定される。さらに、各モジュールが、各培養モジュールの第四のゾーンと連通したガス流入口又はガス混合物流入口を備えることが有益である場合がある。また容器は、その部分に関して、過剰なガス又はガス混合物のための流出口を備えていてもよい。例えば、ガス流入開口部は、培養容器の底部に存在してもよく、すなわち、ガスは、カバーと反対側の培養容器の壁を通った開口部を介して通過し、及びこの開口部は、モジュールの液面上で終わるよう、管を備えて提供される。結果として、ガス性混合物は、このモジュールの第四の培地移送ゾーンに到達する。モジュールの上に配置されたモジュールもまた、培養モジュールの第四のゾーンに存在するガス性混合物を、モジュールの第四のゾーンと連通させることができる管を備え得る。したがって、この管は、モジュールの底部壁を有益に貫通している。
【０１１９】
特定の実施形態において、長期間培養中、培養培地の一部を、新鮮な培地を交換することが有益である場合があり、又は栄養素の添加を行うことが有益である場合がある。結果として、基礎モジュールは栄養素流入口を備える場合がある。また有益なことに、培養容器は、培地循環手段で、あふれることを防ぐための培地流出口を備える場合がある。類似した方法で、培養容器は、カバーを備えたヘッドモジュールを備えており、カバーは、上記のように位置づけられたモジュール中でのサンプル採取を単純化するため、培地継代開口部を備えて提供される上部壁に固定手段により有益に接続されている。さらに有益なことに、培養パラメータセンサーを各培養モジュールに備えてもよい。また、センサーを、たった１つの培養モジュール、又は数個の培養モジュールに、全てのゾーンで、又は基礎モジュールにおいて備えることが可能である。
【０１２０】
一部の実施形態又は基礎モジュールにおいて、培地は、前記少なくとも１つの流出口を介して培地循環手段から推進され、流出口が数個ある場合には様々な流出口を通って推進され、誘導手段により流される。第一の培地移送ゾーンの実質的に基礎部分で、終了する。この実施形態の実質的な基礎部分は、全ての培養モジュールに共通のゾーンであり、解説される実施形態において、基礎モジュール内に位置付けられている。これは、培養モジュールが積み重ねられているか、又は並置されているかにかかわらず有効である。第一の培地移送ゾーンの構造、及びポンプの拍出量は、培地が、第一のモジュールの第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分へと向かい、第二のモジュールの第一の培地移送ゾーンの実質的にシリンダー状の部分へと向かうことを必要とする。この実施形態では、実質的にシリンダー状の部分を備えた大きな第一の培地移送ゾーンを生成するモジュールの組立である。培地が、第二の培養モジュールの実質的にシリンダー状の部分の壁上部に到達したとき、第二の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンへと培地があふれ出る。
【０１２１】
一部の実施形態において、培地はそれゆえに、ポンプにより与えられた流速、及び重力に従い、第二の培養モジュールの実質的にシリンダー状の部分を流れ落ちながら、第二のモジュールの第三の培地移送ゾーンの底に向かい、第二の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンの実質的に基礎部分へと到達する。次に、培地の流れは、連通容器の効力を介して、及びポンプにより与えられた流速を介して、上向きの方向を有し、そして第二の培養モジュールの第二の培養ゾーンの上部に到達する。培地は、第二の培養モジュールの底部壁の、実質的に細胞が無い培地の継代用の開口部を介して、第二の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンから、第二の培養モジュールの第二の培養ゾーンに到達する。培地の流れの縁が第二の培養モジュールの第二の培養ゾーンの外壁の上部に到達したとき、培地は第二の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンへとあふれ出る。当然ながら、もし培養ゾーンの外壁に開口部又は管が存在する場合、培地の流れの縁が開口部又は管に到達したとき、培地は第二の培養モジュールの第四のゾーンへと流れることを理解することが必要である。デバイスの特定の好ましい実施形態において、第二の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンは傾斜壁を備えており、培地が第二の培養モジュールの第二のゾーンから第二の培養モジュールの第四のゾーンへと通過するとき、傾斜壁の上を培地が流れる。好ましくは傾斜壁は、前記傾斜壁上のフィルムの形成を改善するための親水性膜を備えている。フィルムは、好ましくは、可能な限り発泡を防ぐための薄層でなければならない。フィルムを安定化させるために、前述のように培養培地に添加剤を加え、水のレオロジー特性を改変することも可能である。次に、第二の培養モジュールの第四の培地移送ゾーン中に存在する培養培地は、第二の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンの管を通って、又は壁の上部を超えてのいずれかで、第一の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンへとあふれ出る。
【０１２２】
一部の実施形態において、培地は、ポンプにより与えられた流速、及び重力に従い、第一の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンから下に向かい、第一の培養モジュールの実質的にシリンダー状の部分を流れ落ちながら、第一の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンの実質的な基礎部分に到達する。次に、培地の流れは、連通容器の効力を介して、及びポンプにより与えられた流速を介して、上向きの方向を有し、そして第一の培養モジュールの第二の培養ゾーンの上部に到達する。培地は、第一の培養モジュールの底部壁の、実質的に細胞が無い培地の継代用の開口部を介して、第一の培養モジュールの第三の培地移送ゾーンから、第一の培養モジュールの第二のゾーンに到達する。培地の流れの縁が、第一の培養モジュールの第二の培養ゾーンの壁の頂点に到達したとき、培地は第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンへとあふれ出る。当然ながら、もしこの壁に開口部又は管が存在する場合には、培地の流れの縁が開口部又は管に到達したとき、培地は第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンへと流れることが理解されるはずである。第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンは、傾斜壁を備えることもでき、培地が第一の培養モジュールの第二の培養ゾーンから第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンへと通過するとき、傾斜壁の上を培地が流れる。この傾斜壁は、上述のように親水性膜を備えて提供される場合もある。次に、培地は、流入口（パイプ）を通って基礎モジュール及び培地循環手段に戻り、すなわち、第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンに存在する培養培地は、第一の培養モジュールの第四の培地移送ゾーンの管を介して、又は壁の上部を超えてのいずれかで、パイプにおいてあふれ出る。パイプは、培地循環手段を構成する前記遠心力ポンプにより形成されるサイフォンの実質的に中心ゾーンに終わる。
【０１２３】
この実施形態の変化形において、積み重ねられたモジュールが培養容器を構成する。この変化形において、例えば、基礎モジュール、四個のゾーンを備えるモジュール、及びヘッドモジュールｍｘの三種のモジュールが存在してもよい。基礎モジュール又は基礎的モジュールは、培地循環手段及び組立手段を備えている。基礎モジュールは、上記に説明されるように、４ゾーンモジュールの第一の組立手段を連動させるように、及び容器の底部を構成するように設計される。ヘッドモジュールは、４ゾーンモジュールの第二の組立手段を連動させるように設計される。基礎モジュールにより連動された４ゾーンモジュールは、ヘッドモジュールにより連動されたものと同じであってもよく、又は基礎モジュールにより連動された４ゾーンモジュールは、第一の一連の４ゾーンモジュールであってもよく、及びヘッドモジュールにより連動されたものは、その結果として、前記一連の４ゾーンモジュールにおける第二の４ゾーンモジュールである。
【０１２４】
一部の実施形態において、全てのモジュールは固定手段を備えており、それによって、他の培養モジュールと、基礎モジュール又はヘッドモジュールの両方と組み立てることができる単一の培養モジュールを得ることができる。これら固定手段は例えば、円形のシール、細胞培養分野において公知のレイピッドコネクター、スクリューピンチ、及びセラーション（ｓｅｒｒａｔｉｏｎ）、又はこれらモジュールの組立用の任意の他のデバイスを備えて提供される二個の同心円である。
【０１２５】
この実施形態において、基礎モジュールの基礎部分は、実質的に管形状の開口部と結合され、この場合において開口部はガス又はガス混合物の導入を可能とする開口部である。ガス流入口開口部は、管に接続され、管は培養培地の面の上で終わり、それによって、ガス又はガス混合物は、培養デバイスの少なくとも第四の培地移送ゾーンに到達することができる。第四の培地移送ゾーンのすべての外気は、類似した管により接続され、ガス混合物が上部に到達できるようになっている。高さに対し積み重ね可能なモジュールを備えたデバイスは、非常に高くなることができ、リアクターの底部を通ってガス供給を提供することができる点で特に有益である。変化形において、基礎部分は、磁気デバイスが置かれているゾーンへガス性物質を運ぶためのガス又はガス混合物のフィードチューブを備えている。この方法において、流入ガスは、磁気デバイスの回転により攪拌され、酸素の溶解は培地の移動により改善される。過剰なガスもまた攪拌され、小さな泡の形態となって再度上昇する。加えて、外部からこれら開口部へアクセスするためのへこみもまた提供され、それによって、これら開口部が、ガス、ガス混合物、新鮮な培地などの供給口に接続されることができる。モジュールの上部部分の集団は、固定手段によりグリップされ、及び基礎モジュールの底部上の円形シールにより密閉されるよう設計されたエレメントである。
【０１２６】
一部の実施形態において、デバイスは、カバーを通る管、又はデバイスの壁のうちの１つを通る管のいずれかにおいて、栄養素供給口も備えている。同様に、デバイス、又はモジュールもしくは各４ゾーンモジュールの第一のゾーン又は第四のゾーンに加熱手段が存在してもよい。場合によって、デバイスは、例えば数個の遠心力ポンプなどの数個の培地循環手段を備えることができる。第二のゾーンの底部の開口部を通って培養培地が入ると、及びその後に、この第二のゾーンを通って培地がさらに移動する間も、デバイスは培養培地の均一な流れを可能とする。第一のゾーンが第二のゾーンに直接接触し、それによって第二のゾーン全体に非均一な流れが生じているデバイスとは対照的である。そのような非均一な流れによって、酸素と栄養素が充分に供給されない、細胞培養ゾーン内の供給不足な領域又はデッドゾーンが生じてしまい、そこでは細胞増殖及び／又は代謝は決して最適とはならない。
【０１２７】
デバイスおよび方法の特定の実施形態は、第三のゾーンが、前記第二のゾーンに対し内部のゾーンであり、前記第一のゾーンに対し外部のゾーンである、デバイスおよびその使用に関するものである。第一のゾーンの基礎部分から、第一のゾーンの上部シリンダー状部分を経由して上へ、さらに第三の移送ゾーンのシリンダー状上部部分を経由して第三のゾーンの基礎部分へ下へと向かう培地の流れは、第二のゾーンの底部に入った時点で所望される均一な流れを生じさせる。シリンダー状部分の存在により、第二のゾーンへ入る前のその特性を分析するための培地へのアクセスがさらに容易となる。シリンダー状エレメントの存在はまた、デバイス中に高い圧力が生じることも防ぐ。さらにシリンダー状部分の存在により、異なるモジュールを備えたデバイスの製造が可能となる。
【０１２８】
他の実施形態は、シリンダー状部分を通る液体の流れが迂回されるよう改変されたデバイスに関する。これらデバイスの別の実施形態において、第三のゾーンは、完全に第二のゾーンの下に位置づけられ、及び完全に第一のゾーンの上に位置づけられる。デバイスの１つの実施形態において、第一のゾーンと第二のゾーンのシリンダー状部分に相当するデバイスの部分は、例えばプラスチック、ガラス、又は金属などの固体エレメントにより置き換えられる。
【０１２９】
他の実施形態において、第一のゾーンと第二のゾーンは、それぞれ基礎部分に相当する平坦な形状の体積からなり、シリンダー状部分を欠いている。この適合により、培養培地は、排水管を経由し、第一のゾーンから第三のゾーンへと均等にあふれることができる。攪拌デバイスにより生じた培地の流れは、第一のゾーンと第三のゾーンの間の分離壁により均一な状態となり、第二のゾーンへの流入時に均一な流れを生じさせる。
【０１３０】
特定の実施形態において、第一のゾーンと第三のゾーンの間の分離壁は、水平部分ならびに垂直部分からなり、排水管を伴うこの垂直部分は、第三のゾーンの高さの約５％以下、１０％以下、２０％以下、又はさらには５０％以下の高さを有している。他の特定の実施形態において、第一のゾーンと第三のゾーンの間の分離壁の垂直部分は存在しない。
【０１３１】
特定の実施形態において、固体エレメントは、例えば第三のゾーン中の培地の状態（ｐＨ、酸素、温度）を測定するためのプローブを組み込むために適合されたチャンネルを伴い提供される。他の特定の実施形態において、固体エレメントは、過剰な圧力が第一のゾーンと第三のゾーンに生じたときに開くことができる安全圧力弁を備えたチャンネルを伴い提供される。デバイスの別の実施形態において、第一のゾーンと第三のゾーン、第二のゾーンのそれぞれのシリンダー状部分は存在しない。以前にエレメントによって占有されていた体積は、今や、細胞増殖に適した拡張された体積から生じたデバイスのより効率的な使用を生じさせる第二のゾーンの部分となる。
【０１３２】
第三のゾーンへの均一な流量分布を伴わない、第一のゾーンから第二のゾーンへの培地の直接的な流入を防ぐため、第二のゾーンの底部壁の開口部は、第一のゾーンと第三のゾーンの間の壁の開口部の上に位置する領域では閉じられる。開口部の上に閉鎖領域を備えたことによるデバイス適合によって、第一の培養培地移送ゾーンから第三の培養培地移送ゾーンへの培養培地のオーバーフローが生じ、その後、培地は均一に流れながら第二のゾーンへと入る。
【０１３３】
特定の実施形態において、複数の開口部と、対応する閉鎖領域がそれぞれ、第一のゾーンと第三のゾーンの間の分離壁に、及び第三のゾーンと第二のゾーンの間の壁に備えられる。典型的には、そのような複数の開口部と対応する閉鎖領域は対称性に分布する。
【０１３４】
デバイスの別の実施形態において、培地の均一な流れは、第三のゾーン内に流れ再分布エレメントを備えることにより達成される。そのようなエレメントは、第一のゾーンから来た培地を適切に再分布させ、第三のゾーンに均一な液体の流れを形成させ、その後に第二のゾーンへと入るために適した任意の形状を有することができる。特定の実施形態において、エレメントは、円形、ひし形、又は卵型の横断面を有する、一連の放射状に伸長する棒の形状を有しており、放射状に適合された対応する開口部の上に位置付けられる。
ウイルス
【０１３５】
本開示の特定の態様は、エンテロウイルスＡの生成に関する。ヒトの手足口病（ＨＦＭＤ）は、ヒトエンテロウイルスＡ（ＨＥＶ−Ａ）群のいくつかのメンバーにより引き起こされる。ヒトエンテロウイルスＡは、非エンベロープ型のプラス鎖ＲＮＡウイルスのピコルナウイルス科に属し、また当該科はポリオウイルス及びライノウイルスも含んでいる。ＨＦＭＤを引き起こし得るＨＥＶ−Ａ群のメンバーとしては、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）及びコクサッキーウイルスが挙げられる。したがって、適切なエンテロウイルスＡの例としては、限定されないが、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、血清型Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ９、Ａ１０もしくはＡ１６をはじめとするコクサッキーウイルスＡ株、血清型Ｂ３もしくはＢ５をはじめとするコクサッキーウイルスＢ株、又はそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書において用いられる場合、「ＣＡ６」という用語は、「ＣＶＡ６」及び「コクサッキーウイルスＡ６」と相互交換可能に用いられる。本明細書において用いられる場合、「ＣＡ１６」という用語は、「ＣＶＡ１６」及び「コクサッキーウイルスＡ１６」と相互交換可能に用いられる。一部の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６から選択される１つ以上、２つ以上、又は３つのウイルスであってもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１及びＣＡ６であってもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１及びＣＡ１６であってもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＣＡ６及びＣＡ１６であってもよい。一部の実施形態において、少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１であってもよい。
【０１３６】
したがって、一部の実施形態において、本開示のエンテロウイルスＡは、本明細書に開示されるワクチン及び／又は免疫原性組成物のいずれかに使用されてもよい。例えば、本開示のエンテロウイルスＡは、その必要のある対象における手足口病の治療又は予防に有用な１つ以上の抗原を提供するために使用されてもよく、及び／又はその必要のある対象における手足口病に対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用な１つ以上の抗原を提供するために使用されてもよい。
【０１３７】
本開示の抗原は、本開示のエンテロウイルスＡ（例えば本明細書に記載される方法により生成及び／又は精製されたエンテロウイルスＡなど）から誘導されてもよい。本開示の抗原は、免疫反応を惹起させることができる任意の物質であってもよい。適切な抗原の例としては、限定されないが、全粒子ウイルス（ｗｈｏｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質及びタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを含む）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド模倣体及び非ペプチド模倣体、ならびに他の分子、小分子、脂質、糖脂質及び炭水化物が挙げられる。
【０１３８】
本開示のエンテロウイルスＡは、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異を含んでもよい。適応突然変異は、特定の細胞株で増殖するようウイルスを適応させることにより生成されてもよい。たとえば、細胞にウイルスをトランスフェクトさせ、及び継代させて、当該ウイルスを複製させ、その核酸を突然変異させてもよい。核酸突然変異は、点突然変異、挿入突然変異、又は欠失突然変異であってもよい。核酸突然変異は、非ヒト細胞中のウイルスの増殖を促進させるウイルスタンパク質内のアミノ酸変化をもたらしてもよい。適応突然変異は、プラークサイズの変化、増殖速度の変化、温度感受性の変化、薬剤耐性の変化、病原性の変化、及び細胞培養におけるウイルス産生率の変化をはじめとするウイルスの表現型の変化を促進してもよい。これら適応突然変異は、細胞株で培養されるウイルスのスピード及び産生率を上昇させることにより、ワクチン製造に有用であり得る。さらに、適応突然変異は、免疫原性エピトープの構造を変化させることにより、ウイルス抗原の免疫原性を増強させ得る。
【０１３９】
したがって、特定の実施形態において、本開示のエンテロウイルスＡは、少なくとも１つの非ヒト細胞の適応突然変異を含んでもよい。ある実施形態では、適応突然変異は非ヒト細胞へのウイルス抗原の突然変異である。一部の実施形態では、非ヒト細胞は哺乳類の細胞であってもよい。非ヒト哺乳類細胞の例としては、限定されないが、例えばＶＥＲＯ細胞（サルの腎臓由来）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記述される、寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などの上述される細胞が挙げられる。一部の実施形態では、非ヒト細胞はサルの細胞であってもよい。一部の実施形態では、サルの細胞は、Ｖｅｒｏ細胞株由来であってもよい。適切なＶｅｒｏ細胞株の例としては、限定されないが、ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１、Ｖｅｒｏ  ７６（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８７）、又はＶｅｒｏ  Ｃ１００８（ＡＴＣＣアクセッション番号ＣＲＬ−１５８６）が挙げられる。
【０１４０】
例えばＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６などのエンテロウイルスＡは、直線状のプラス鎖、一本鎖ＲＮＡゲノムを有している。これら各ウイルスゲノムは構造ポリペプチド及び非構造ポリペプチドの両方をコードしている。これら各ウイルスによりコードされる構造ポリペプチドとしては、限定されないが、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４が挙げられ、それらはともにウイルスカプシドを構成し得る。これら各ウイルスによりコードされる非構造ポリペプチドとしては、限定されないが、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄが挙げられ、それらは例えば、ウイルスの複製及び病原性に関与している。
【０１４１】
したがって、特定の実施形態において、本開示のエンテロウイルスＡは、限定されないが、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄをはじめとする１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上のウイルス抗原内に、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、またはそれ以上の非ヒト細胞適応突然変異を含有してもよい。一部の実施形態において、本開示のエンテロウイルスＡは、ウイルスの５’又は３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）内に少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、又はそれ以上の非ヒト細胞適応突然変異を含有し得る全粒子不活化ウイルスを含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチド内にある。他の実施形態において、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ１ポリペプチド内である。他の実施形態において、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ２ポリペプチド内である。他の実施形態において、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ３ポリペプチド内である。他の実施形態において、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６の２Ａポリペプチド内である。他の実施形態において、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチド内である。他の実施形態において、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチド内である。一部の実施形態において、本開示の抗原は、限定されないが、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６をはじめとする本開示のエンテロウイルスＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の非ヒト細胞適応突然変異を少なくとも１つ含有してもよい。
【０１４３】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチド内にある。例示的なＥＶ７１株由来のＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
GDRVADVIESSIGDSVSRALTQALPAPTGQNTQVSSHRLDTGEVPALQAAEIGASSNTSDESMIETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLEGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMRFDAEFTFVACTPTGEVVPQLLQYMFVPPGAPKPESRESLAWQTATNPSVFVKLTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGSSKSKYPLVVRIYMRMKHVRAWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSIKPTGTSRNAITTL（配列番号１）
【０１４４】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異はＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号１の７、１４、１４５及び２８２から選択される１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つのアミノ酸の位置で、又はＥＶ７１のＶＰ１ポリペプチドをペアワイズアライメントアルゴリズム（ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて配列番号１と平行に並べたときには配列番号１の７位、１４位、１４５位又は２８２位に相当する位置で、発生してもよい。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号１の７位で、又はペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１と平行に並べたときには配列番号１の７位に相当する位置で、発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号１の７位で、又は配列番号１の７位、１４位、１４５位、もしくは２８２位のうちの２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで、又はＥＶ７１のＶＰ１ポリぺプチドをペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号１と平行に並べたときには配列番号１の７位、１４位、１４５位、もしくは２８２位に相当する位置で、発生する。    一部の実施形態では、７位の突然変異は、バリンからメチオニンへの置換である。一部の実施形態では、１４位の突然変異は、アスパラギン酸からアスパラギンへの置換である。一部の実施形態では、１４５位の突然変異は、グルタミン酸からグルタミンへの置換である。一部の実施形態では、２８２位の突然変異は、アスパラギンからアスパラギン酸への置換である。
【０１４５】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ１ポリペプチド内である。例示的なＣＡ６株由来のＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
NDPISNAIENAVSTLADTTISRVTAANTAASSHSLGTGRVPALQAAETGASSNASDENLIETRCVMNRNGVNEASVEHFYSRAGLVGVVEVKDSGTSQDGYTVWPIDVMGFVQQRRKLELSTYMRFDAEFTFVSNLNDSTTPGMLLQYMYVPPGAPKPDGRKSYQWQTATNPSIFAKLSDPPPQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQATNLQYGQCPNNMMGHFAIRTVSESTTGKNVHVRVYMRIKHVRAWVPRPFRSQAYMVKNYPTYSQTISNTAADRASITTTDYEGGVPANPQRTF（配列番号２）
【０１４６】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異はＣＡ６のＶＰ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号２の４６、９０、９６及び２６８から選択される１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つのアミノ酸の位置で、又はＣＡ６のＶＰ１ポリペプチドをペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２と平行に並べたときには配列番号２の４６位、９０位、９６位及び２６８位に相当する位置で、発生してもよい。  一部の実施形態では、突然変異は、配列番号２の４６位、９０位、９６位及び２６８位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、又は４つすべてで、又はＣＡ６のＶＰ１ポリペプチドをペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号２と平行に並べたときには配列番号２の４６位、９０位、９６位及び２６８位に相当する位置で、発生する。一部の実施形態では、４６位の突然変異は、アラニンからバリンへの置換である。一部の実施形態では、９０位の突然変異は、グルタミン酸からリシンへの置換である。一部の実施形態では、９６位の突然変異は、スレオニンからアラニンへの置換である。一部の実施形態では、２６８位の突然変異は、バリンからイソロイシンへの置換である。
【０１４７】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ２ポリペプチド内である。例示的なＣＡ６株由来のＶＰ２ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
SPSVEACGYSDRVAQLTVGNSTITTQEAANIVLSYGEWPGYCPSTDATAVDKPTRPDVSVNRFYTLSTKSWKTESTGWYWKFPDVLNDTGVFGQNAQFHYLYRSGFCMHVQCNASKFHQGALLVVVIPEFVVAASSPAMKPNGQGLYPDFAHTNPGKEGQVFRDPYVLDAGIPLSQALVFPHQWINLRTNNCATIIMPYVNALPFDSALNHSNFGLAVIPISPLKYCNGATTEVPITLTIAPLNSEFSGLRQAIKQ（配列番号３）
【０１４８】
一部の実施形態では、突然変異は、配列番号３のアミノ酸１４４位で、又はＣＡ６のＶＰ２ポリペプチドがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号３と平行に並べられたときには配列番号３の１４４位に相当する位置で、発生してもよい。  一部の実施形態では、１４４位の突然変異は、グルタミンからリシンへの置換である。
【０１４９】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ３ポリペプチド内である。例示的なＣＡ６株由来のＶＰ３ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
GLPTELKPGTNQFLTTDDGTSPPILPGFEPTPLIHIPGEFTSLLDLCRIETILEVNNTTGTTGVNRLLIPVRAQNNVDQLCASFQVDPGRNGPWQSTMVGQICRYYTQWSGSLKVTFMFTGSFMATGKMLIAYTPPGSAQPTTREAAMLGTHIVWDFGLQSSVTLVIPWISNTHFRAVKTGGVYDYYATGIVTIWYQTNFVVPPDTPSEANIIALGAAQENFTLKLCKDTDEIRQTAEYQ（配列番号４）
【０１５０】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６のＶＰ３ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号４のアミノ酸１０２位で、又はＣＡ６のＶＰ３ポリペプチドがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号４と平行に並べられたときには配列番号４の１０２位に相当する位置で、発生してもよい。  一部の実施形態では、１０２位の突然変異は、イソロイシンからバリンへの置換である。
【０１５１】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６の５’ＵＴＲ内である。例示的なＣＡ６株由来の５’ＵＴＲの核酸配列を以下に記載する。
TTAAAACAGCTAGTGGGTTGCACCCACTCACAGGGCCCACTGGGCGCTAGCACACTGATTTCCCGGAATCCTTGTGCGCCTGTTTTATATCCCCTCCCCCATGCGCAACTTAGAAGCAATCTACACCTTCGATCAATAGCAGGCGTGGCGCGCCAGCCATGTCTAGATCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGACTGAGTATCAATAAACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAATGTTCGTTACCCGGCTAACTACTTCGAGAAACCTAGTAGCACCATGAAAATTGCAGAGCGTTtCGcTCAGCGcTtCCCCcGCGtAGATCAGGCTGATGAGTCACTGCATTCCTCACGGGCGACCGTGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGACGCTCTAATATGGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACATACCCCCAAACCAGGGGGCGGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCTTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAAAGATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGAATAACAGAGCCTTGATATACCTTTTTGTAGGGTTTATACCACTTACTCTTCGCGTTGTTGAGACTCTAAAGTACATTCTAATCTTGAACACTAGAAA（配列番号８）
【０１５２】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ６の５’ＵＴＲ内の１つ以上の核酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４及び４０から選択される１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つの核酸の位置で、又はＣＡ６の５’ＵＴＲがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８と平行に並べられたときには配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４及び４０の位置に相当する位置で、発生してもよい。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、及び４０位のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで、又はＣＡ６の５’ＵＴＲがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号８と平行に並べられたときには配列番号８の１、１３、１４、１５、１６、２１、２３、３４、及び４０位に相当する位置で、発生する。一部の実施形態では、１位の突然変異は、チミンからグアニンへの置換である。一部の実施形態では、１３位の突然変異は、グアニンからアデニンへの置換である。一部の実施形態では、１４位の突然変異は、チミンからグアニンへの置換である。一部の実施形態では、１５位の突然変異は、グアニンからシトシンへの置換である。一部の実施形態では、１６位の突然変異は、グアニンからアデニンへの置換である。一部の実施形態では、２１位の突然変異は、シトシンからチミンへの置換である。一部の実施形態では、２３位の突然変異は、シトシンからチミンへの置換である。一部の実施形態では、３４位の突然変異は、グアニンからチミンへの置換である。一部の実施形態では、４０位の突然変異は、シトシンからグアニンへの置換である。
【０１５３】
一部の実施形態は、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６の２Ａポリペプチド内である。例示的なＣＡ１６株の２Ａポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
GKFGQQSGAIYVGNYRVVNRHLATHNDWANLVWEDSSRDLLVSSTTAQGCDTIARCDCQTGIYYCSSKRKHYPVSFTKPSLIFVEASEYYPARYQSHLMLAVGHSEPGDCGGILRCQHGVVGIVSTGGNGLVGFADVRDLLWLDEEAMEQ（配列番号５）
【０１５４】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６の２Ａポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号５のアミノ酸２位で、又はＣＡ１６の２Ａポリペプチドがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号５と平行に並べられるときには配列番号５の２位に相当する位置で、発生する。  一部の実施形態では、２位の突然変異は、リシンからグルタミン酸への置換である。
【０１５５】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチド内である。例示的なＣＡ１６株のＶＰ２ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
SPSAEACGYSDRVAQLTIGNSTITTQEAANIVIAYGEWPEYCPDTDATAVDKPTRPDVSVNRFFTLDTKSWAKDSKGWYWKFPDVLTEVGVFGQNAQFHYLYRSGFCVHVQCNASKFHQGALLVAVLPEYVLGTIAGGTGNENSHPPYATTQPGQVGAVLMHPYVLDAGIPLSQLTVCPHQWINLRTNNCATIIVPYMNTVPFDSALNHCNFGLLVIPVVPLDFNAGATSEIPITVTIAPMCAEFAGLRQAVKQ（配列番号６）
【０１５６】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号６のアミノ酸１６１位で、又はＣＡ１６のＶＰ２ポリペプチドがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号６と平行に並べられるときには配列番号６の１６１位に相当する位置で、発生する。  一部の実施形態では、１６１位の突然変異はメチオニンからスレオニンへの置換である。
【０１５７】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチド内である。例示的なＣＡ１６株のＶＰ１ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に記載する。
GDPIADMIDQTVNNQVNRSLTALQVLPTAANTEASSHRLGTGVVPALQAAETGASSNASDKNLIETRCVLNHHSTQETAIGNFFSRAGLVSIITMPTTDTQNTDGYVNWDIDLMGYAQLRRKCELFTYMRFDAEFTFVVAKPNGVLVPQLLQYMYVPPGAPKPTSRDSFAWQTATNPSVFVKMTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHLQANDLDYGQCPNNMMGTFSIRTVGTEKSPHSITLRVYMRIKHVRAWIPRPLRNQPYLFKTNPNYKGNDIKCTSTSRDKITTL（配列番号７）
【０１５８】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号７のアミノ酸９９及び１４５から選択される１つ以上又は２つのアミノ酸の位置で、又はＣＡ１６のＶＰ１ポリペプチドがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号７と平行に並べられるときには配列番号７の９９位又は１４５位に相当する位置で、発生してもよい。  一部の実施形態では、９９位の突然変異は、アスパラギン酸からグリシンへの置換である。一部の実施形態では、１４５位の突然変異は、バリンからグルタミン酸への置換である。
【０１５９】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６の５’ＵＴＲ内である。例示的なＣＡ１６株の５’ＵＴＲの核酸配列を以下に記載する。
AGCCTGTGGGTTGTTCCCACCCACAGGGCCCAGTGGGCGCTAGCACACTGATTCTGCGGGATCTTTGTGCGCCTGTTTTATAACCCCTTCCCTAAGCAGCAACTTAGAAGTTTCACACAATCACGACCAGTAGTGGGCGTGGCGCGCCAGTCACGTCTTGGTCAAGCACTTCTGTTCCCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAACGTTCGTTATCCGGCTAACTACTTCGAGAAACCTAGtAGCACCGTGAAAGTTGCGGAGtGTttCGCTCAGCACTTCCCCCGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACTGTAAACCCCACGGGCGACCGTGACAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACGCACCCTCAACCCAGGGGGCGGCGTGTCGTAATGGGTAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCCTTATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAAAAGTTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTCTAACAGAGCTATTGTTTACCTATTTATTGGATACGTCCCTCTTAATCTCAAGGCCATTCAAACTCTTGATTATATATTGCTCCTTAACTGTAAGAAA（配列番号９）
【０１６０】
一部の実施形態では、少なくとも１つの非ヒト細胞適応突然変異は、ＣＡ１６の５’ＵＴＲ内の１つ以上の核酸の位置で発生する。一部の実施形態では、突然変異は、配列番号９の６及び３３から選択される１つ以上、または２つの核酸の位置で、又はＣＡ１６の５’ＵＴＲがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号９と平行に並べられたときには配列番号９の６及び３３の位置に相当する位置で、発生してもよい。  一部の実施形態では、突然変異は、配列番号９の６位及び３３位の両方で、またはＣＡ１６の５’ＵＴＲがペアワイズアライメントアルゴリズムを用いて配列番号９と平行に並べられたときには配列番号９の６及び３３の位置に相当する位置で、発生する。  一部の実施形態では、６位の突然変異は、グアニンからアデニンへの置換である。一部の実施形態では、３３位の突然変異は、グアニンからシトシンへの置換である。
【０１６１】
本開示の上述の実施形態において、例示的なペアワイズアライメントアルゴリズムは、デフォルトのパラメータを用いたＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムである（たとえば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを用いて、Ｇａｐ開始（ｏｐｅｎｉｎｇ）ペナルティ＝１０．０、及びＧａｐ伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ペナルティ＝０．５）。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルツール中に簡便に実装される。
【０１６２】
一部の実施形態において、エンテロウイルスＡは、本開示のワクチン及び免疫原性組成物のいずれかにおいて使用されてもよい。例えば、本開示のエンテロウイルスＡは、その必要のある対象における手足口病の治療又は予防に有用であり得、及び／又はその必要のある対象における手足口病に対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用であり得る。
抗原の製造  
【０１６３】
手足口病を治療もしくは予防するための、及び／又は手足口病に対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応を誘導するための、限定されないが、精製ウイルス、不活化ウイルス、弱毒化ウイルス、組み換えウイルス、ならびに／又はサブユニットワクチンのための精製ウイルスタンパク質及び／もしくは組み換えウイルスタンパク質をはじめとする、ワクチン及び／又は免疫原性組成物における使用のための本開示の抗原は、当分野に公知の任意の適切な方法により製造されてもよく、及び／又は精製されてもよく、もしくはさもなければ単離されてもよい。本開示の抗原の例としては、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスから産生された、誘導された、精製された、及び／又はさもなければ単離された、全粒子ウイルス、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ポリペプチド（活性タンパク質及びタンパク質内の個々のポリペプチドエピトープを含む）、グリコポリペプチド、リポポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖結合体、多糖のペプチド模倣体及び非ペプチド模倣体、ならびに他の分子、小分子、脂質、糖脂質及び炭水化物が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、適切な抗原としては、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６などのウイルス由来のＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３及びＶＰ４などの構造ポリペプチド、ならびに２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、及び３Ｄなどの非構造ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６４】
本開示の抗原は、化学的又は酵素的に合成されてもよく、組み換え技術により製造されてもよく、天然源から単離されてもよく、又は前述の組み合わせであってもよい。ある実施形態では、本開示の抗原は、例えばＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６などの手足口病を引き起こす本開示のウイルスの少なくとも１つから産生、精製、単離、及び／又は誘導される。本開示の抗原は、精製されていてもよく、部分的に精製されていてもよく、又は粗抽出物であってもよい。一部の実施形態では、本開示の抗原は、上記の「ワクチン及び免疫原性組成物の製造」の項に記載されるように製造された例えば不活化ウイルスなどのウイルスである。
【０１６５】
ある実施形態では、本開示の１つ以上の抗原は、非ヒト細胞を培養することにより製造されてもよい。本開示の１つ以上の抗原の製造に適した細胞株は、好ましくは哺乳類起源であり、限定されないが、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、イヌ腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）又はＭＤＣＫ  ３３０１６、寄託番号はＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９であり、ＷＯ９７／３７００１に記述されている）、ネコ及び齧歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などのハムスター細胞）が挙げられ、例えば、成体、新生仔、胎子、及び胚をはじめとする広範な発育段階から得てもよい。ある実施形態では、細胞は不死化されている（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記述され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０で寄託されているＰＥＲＣ．６細胞など）。好ましい実施形態では哺乳類細胞が使用され、以下の非限定的な細胞型のうちの１つ以上から選択されてもよく、及び／又は誘導されてもよい：線維芽細胞（例えば、皮膚、肺）、内皮細胞（大動脈、冠状動脈、肺、血管、皮膚微小血管、臍帯）、肝臓細胞、角化細胞、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、子宮頚、網膜周皮細胞）、メラニン細胞、神経系細胞（例えば、星状膠細胞）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝臓細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地中での増殖が可能で、ウイルス抗原の製造に有用な動物細胞及び細胞株の製造を記載している。ある実施形態では、非ヒト細胞は無血清培地中で培養される。
【０１６６】
ポリペプチド抗原は、当分野に公知の標準的なタンパク質精製法を用いて天然源から単離されてもよく、当該方法としては、液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー、高速タンパク質液体クロマトグラフィーなど）、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動（一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動を含む）、アフィニティークロマトグラフィー、又は他の精製技術が挙げられるがこれらに限定されない。多くの実施形態において、抗原は、例えば、約５０％〜約７５％の純度、約７５％〜約８５％の純度、約８５％〜約９０％の純度、約９０％〜約９５％の純度、約９５％〜約９８％の純度、約９８％〜約９９％の純度、又は９９％超の純度の精製抗原である。
【０１６７】
固相ペプチド合成法を用いてもよく、かかる技術は当分野の当業者に公知である。Jones,  The  Chemical  Synthesis  of  Peptides  (Clarendon  Press,  Oxford)  (1994)を参照のこと。一般的に、かかる方法において、ペプチドは、固相結合伸長ペプチド鎖に活性化単量体単位を連続添加することにより製造される。
【０１６８】
ポリペプチドの製造に、確立された組み換えＤＮＡ法を用いてもよく、この場合、例えばポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を備える発現構築物を適切な宿主細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で単細胞体として増殖される真核宿主細胞であり、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞など）又は原核細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養で増殖する）に導入し、遺伝子改変された宿主細胞を生成し、適切な培養条件下で当該遺伝子改変された宿主細胞からタンパク質を産生させる。
【０１６９】
死滅ウイルス及び弱毒化ウイルスの免疫原性組成物に加え、サブユニット免疫原性組成物、又は手足口病ウイルスの抗原性構成要素を動物に提示する他のタイプの免疫原性組成物を使用してもよい。抗原性構成要素は、ヒトに注入された際にヒトの免疫反応を刺激し、ヒトが手足口病に対する防御的免疫を発現するタンパク質、糖タンパク質、脂質結合したタンパク質もしくは糖タンパク質、改変脂質部分、又は他のウイルス構成要素であってもよい。サブユニット免疫原性組成物に関しては、ウイルスは上述の哺乳類細胞上で培養されてもよい。細胞培養物をホモジナイズし、この細胞培養物ホモジネートを適切なカラム上で免疫原性組成物を単離してもよく、又は適切な孔サイズのフィルターを通して免疫原性組成物を単離してもよく、又はこの細胞培養物ホモジネートを遠心することにより免疫原性組成物を単離してもよい。
【０１７０】
抗原性構成要素がタンパク質である場合、そのタンパク質をコードする核酸を単離し、当該単離された核酸を含有する免疫原性組成物を作製してもよい。抗原性構成要素をコードする核酸は、真核細胞プロモーターのシグナル配列の下流で、プラスミド上に配置されていてもよい。そのプラスミドは、１つ以上の選択可能なマーカーを含有してもよく、例えばサルモネラ属、シゲラ属、又は他の適切な細菌などの弱毒化原核生物へとトランスフェクトされてもよい。次いで、ヒトが抗原性構成要素に対する防御的免疫反応を起こすことができるよう、この細菌をヒトに投与してもよい。あるいは、抗原性構成要素をコードする核酸は、原核細胞プロモーターの下流に配置されてもよく、１つ以上の選択可能マーカーを有してもよく、及びサルモネラ属、シゲラ属又は他の適切な細菌などの弱毒化された原核生物へとトランスフェクトされてもよい。次いで、対象抗原に対する免疫反応が所望される真核生物対象へと細菌が投与されてもよい。例えば、Honeらへの米国特許  第６，５００，４１９号を参照のこと。
【０１７１】
サブユニット免疫原性組成物に関し、手足口病ウイルスのタンパク性抗原性構成要素をコードする核酸を、例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／３２０４７（Ｇａｌｅｎ）及び国際特許出願公開ＷＯ０２／０８３８９０（Ｇａｌｅｎ）に記載されるプラスミドなどのプラスミドへとクローニングしてもよい。次いで、プラスミドを細菌へとトランスフェクトし、その細菌が所望される抗原性タンパク質を産生してもよい。両特許出願に記載されている様々な方法により、所望される抗原性タンパク質を単離及び精製してもよい。
ウイルス不活化
【０１７２】
一部の実施形態において、本開示方法により生成及び／又は精製されたエンテロウイルスＡウイルスは不活化されている。哺乳類細胞への感染能力を破壊するためのウイルスの不活化方法又は死滅方法は当分野に公知である。かかる方法としては、化学的手段及び物理的手段の両方が挙げられる。ウイルス不活化の適切な手段としては、洗剤、ホルマリン（本明細書において、「ホルムアルデヒド」とも呼称される）、ベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、加熱、電磁線照射、Ｘ線照射、γ線照射、紫外線照射（ＵＶ照射）、ＵＶ−Ａ照射、ＵＶ−Ｂ照射、ＵＶ−Ｃ照射、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、及びそれらすべての任意の組み合わせから選択される１つ以上の手段の有効量を用いた処置が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
化学的不活化のための剤、及び化学的不活化のための方法は、当分野に公知であり、本明細書に記載されている。一部の実施形態において、エンテロウイルスＡは、ＢＰＬ、ホルマリン、又はＢＥＩのうちの１つ以上を用いて化学的に不活化されている。エンテロウイルスＡがＢＰＬを用いて化学的に不活化されている特定の実施形態において、ウイルスは１つ以上の改変を含有していてもよい。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、改変核酸を含んでもよい。一部の実施形態では、改変核酸は、アルキル化核酸である。他の実施形態では、１つ以上の改変は、改変ポリペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、改変ポリペプチドは、改変されたシステイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リシン、セリン、及びスレオニンのうちの１つ以上を含む改変アミノ酸を含有する。エンテロウイルスＡがホルマリンを用いて化学的に不活化されている特定の実施形態において、ウイルスは１つ以上の改変を含有していてもよい。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、改変ポリペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、架橋ポリペプチドを含んでもよい。エンテロウイルスＡがホルマリンを用いて化学的に不活化されている一部の実施形態において、ワクチン又は免疫原性組成物はホルマリンをさらに含む。本開示の特定の実施形態において、エンテロウイルスＡは、ＢＥＩを用いて不活化されていた。エンテロウイルスＡがＢＥＩを用いて不活化されていた特定の実施形態において、ウイルスは１つ以上の改変を含有している。一部の実施形態では、１つ以上の改変は、改変核酸を含む。一部の実施形態では、改変核酸は、アルキル化核酸である。
【０１７４】
エンテロウイルスＡがＢＥＩ又はＢＰＬを用いて化学的に不活化されている一部の実施形態では、反応しなかった残留ＢＥＩ又は残留ＢＰＬはいずれもチオ硫酸ナトリウムを用いて中和されていてもよい（すなわち加水分解されていてもよい）。一般的に、チオ硫酸ナトリウムは過剰に添加される。一部の実施形態では、チオ硫酸ナトリウムは、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で添加されてもよい。ある実施形態では、チオ硫酸ナトリウムは、ＢＥＩが２０に対し、濃チオ硫酸ナトリウムが１の比率で、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭ、約３０ｍＭ、約３１ｍＭ、約３２ｍＭ、約３３ｍＭ、約３４ｍＭ、約３５ｍＭ、約３６ｍＭ、約３７ｍＭ、約３８ｍＭ、約３９ｍＭ、又は約４０ｍＭの濃度で添加されてもよい。一部の実施形態では、溶液は、たとえばインライン静的ミキサーなどのミキサーを用いて混合され、次いでろ過（例えば、浄化）されてもよい。一般的に、２つの溶液はポンプでミキサーに通すことにより完全に混合し、チオ硫酸ナトリウムによりＢＥＩが中和される。
【０１７５】
本開示の特定の実施形態は、エンテロウイルスＡを不活化する方法に関する。一部の実施形態において、当該方法は、有効量のＢＥＩを用いてウイルス調製物を処置することを含む。ある実施形態では、ＢＥＩの有効量を用いた処置は、約０．２５％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖの範囲の量でＢＥＩを用いて処置することを含むが、これに限定されない。  ある実施形態では、単離され、処置されるウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択される。この方法のある実施形態では、ウイルス調製物は、約２５℃〜約４２℃の範囲の温度でＢＥＩを用いて処置される。この方法のある実施形態では、ウイルス調製物は、約１時間〜約１０時間の範囲の期間、ＢＥＩを用いて処置される。ある実施形態では、当該方法はさらに、チオ硫酸ナトリウムの有効量を用いて、反応しなかったＢＥＩを不活化する（すなわち、加水分解する）ことを含む。一部の実施形態では、チオ硫酸ナトリウムの有効量は、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲である。
【０１７６】
一部の実施形態では、有効量のベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いてウイルス調製物を処置すること、及び任意で、有効量のベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いてウイルスを調製するときと同時、またはその後に、有効量のホルマリンを用いてウイルス調製物を処置すること、を含む。あるいは、一部の実施形態では、当該方法は、有効量のベータ−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いてウイルス調製物を第一の期間、処置すること、及び有効量のＢＰＬを用いてウイルス調製物を第二の期間、処置して、ウイルス調製物を完全に不活化すること、を含む。一部の実施形態において、第一の期間及び／又は第二の期間は、約１２時間〜約３６時間の範囲である。ある実施形態においては、第一の期間及び／又は第二の期間は、約２４時間である。ある実施形態においては、有効量のＢＰＬを用いた処置は、約０．０５％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖ、０．１％％ｖ／ｖ〜約２％ｖ／ｖ、又は約０．１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖの範囲の量で、ＢＰＬを用いて処置することを含むが、これに限定されない。ある実施形態では、有効量のＢＰＬを用いて処置は、０．０５％ｖ／ｖ、０．０６％ｖ／ｖ、０．０７％ｖ／ｖ、０．０８％ｖ／ｖ、０．０９％ｖ／ｖ、０．１％ｖ／ｖ、０．２％ｖ／ｖ、０．３％ｖ／ｖ、０．４％ｖ／ｖ、０．５％ｖ／ｖ、０．６％ｖ／ｖ、０．７％ｖ／ｖ、０．８％ｖ／ｖ、０．９％ｖ／ｖ、又は１％ｖ／ｖのＢＰＬを用いて処置することを含むが、これに限定されない。ある実施形態では、単離され、処置されるウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択される。この方法のある実施形態では、ウイルス調製物は、約２℃〜約８℃の範囲の温度でＢＥＩを用いて処置される。ある実施形態では、この方法は、ＢＰＬを加水分解するのに十分な期間、３７℃の温度でウイルス調製物を加熱することを含む。ある実施形態では、当該期間は、約１時間〜約６時間の範囲である。あるいは、一部の実施形態では、当該方法はさらに、チオ硫酸ナトリウムの有効量を用いて反応していないＢＰＬを不活化（すなわち加水分解）することを含む。一部の実施形態では、チオ硫酸ナトリウムの有効量は、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、又は約２５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲である。
【０１７７】
一部の実施形態において、当該方法は、有効量のホルマリンを用いてウイルス調製物を処置すること、及びホルマリンからウイルス調製物を精製すること、を含む。ある実施形態では、ホルマリンの有効量を用いた処置は、約０．０５％ｖ／ｖ〜約３．０％ｖ／ｖ、０．１％ｖ／ｖ〜約２％ｖ／ｖ、又は約０．１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖの範囲の量でホルマリンを用いて処置することを含むが、これに限定されない。ある実施形態では、単離され、ホルマリン処置されるウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択される。ある実施形態では、ウイルス調製物は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又はそれ以上の量でホルマリンから高度に精製される。
ワクチン及び／又は免疫原性組成物の製剤化  
【０１７８】
本開示のさらなる態様は、本開示方法により生成されたウイルス（例えば本開示のエンテロウイルスＡ）を含有する組成物、免疫原性組成物、及び／又はワクチンに関する。かかる組成物、ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、その必要のある対象における手足口病の治療又は予防に有用であり得、及び／又はその必要のある対象における手足口病に対する例えば防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用であり得る。
【０１７９】
典型的には、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、溶液又は懸濁液のいずれかの注射物質として調製される。注射の前に液体となる溶液又は懸濁液に適した固形形態が調製されてもよい。かかる調製物はまた、乳化されてもよく、又は乾燥粉末として製造されてもよい。活性な免疫原性成分はしばしば、薬学的に受容可能であり、当該活性成分と適合性のある賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば水、生理食塩水、デキストロース、スクロース、グリセロール、エタノール又はその同等物、及びそれらの組み合わせである。さらに、もし所望の場合には、ワクチン又は免疫原性組成物は、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又は当該ワクチンもしくは免疫原性組成物の効果を増強させるアジュバントなどの補助的物質を含有してもよい。
【０１８０】
ワクチン又は免疫原性組成物は、非経口的に注射によって、例えば皮下、経皮、皮内、真皮下、又は筋肉内に簡便に投与されてもよい。他の投与様式に適したさらなる剤型としては、座薬が挙げられ、及び一部の場合においては、口腔、経口、鼻内、頬側、舌下、腹腔、膣内及び頭蓋内の剤型が挙げられる。座薬に関しては、従来型の結合剤及び担体として、例えばポリアルカレングリコール又はトリグリセリドなどが挙げられ、かかる座薬は、０．５％〜１０％、又はさらには１〜２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成される。ある実施形態では、例えば脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物などの低融点ワックスが最初に溶け、本明細書に記載される手足口病のワクチン又は免疫原性組成物抗原が例えば攪拌などにより均一に分散される。溶解した均一な混合物は、次いで、利便なサイズの型に注がれ、冷却され、凝固する。
【０１８１】
鼻内送達に適した剤型としては、液体（例えば、エアロゾル又は点鼻薬としての投与のための水溶液）及び乾燥粉末（例えば鼻腔内での急速な沈着のための）が挙げられる。製剤は、通常に用いられる賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、キシリトール、及びキトサンなどを含有する。例えばキトサンなどの粘膜付着剤は、鼻内投与された製剤の粘膜絨毛クリアランスを遅延させる液体又は粉末製剤のいずれかで使用されてもよい。例えばマンニトール及びスクロースなどの糖類は、液体製剤中の安定剤として使用することができ、乾燥粉末製剤中では安定剤、膨化剤、粉体流剤、及びサイズ剤として使用することができる。さらに、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）又はその誘導体、又はＣｐＧオリゴヌクレオチドなどのアジュバントは、免疫賦活剤として液体製剤及び乾燥粉末製剤の両方において使用することができる。
【０１８２】
経口送達に適した剤型としては、液体、固体、半固体、ゲル、錠剤、カプセル、トローチなどが挙げられる。経口送達に適した剤型としては、錠剤、トローチ、カプセル、ゲル、液体、食品、飲料、栄養補助食品などが挙げられる。製剤は、このように通常に使用される賦形剤、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含有する。他の手足口病のワクチン及び免疫原性組成物は、溶液、懸濁液、丸薬、徐放製剤又は粉末の形態をとってもよく、及び１０〜９５％の活性成分、又は２５〜７０％の活性成分を含有してもよい。経口製剤に関し、コレラ毒素は興味深い製剤パートナーである（また、可能性のある結合パートナーである）。
【０１８３】
膣投与用に製剤化された場合、手足口病のワクチン及び免疫原性組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体、又はスプレーの形態であってもよい。前述の剤型のいずれも、手足口病のワクチン及び免疫原性組成物抗原に加え、例えば適切であると当分野において知られている例えば担体などの剤を含有してもよい。
【０１８４】
一部の実施形態では、本開示の手足口病のワクチン及び免疫原性組成物は、全身送達用又は局所送達用に製剤化されていてもよい。かかる製剤は、当分野に公知である。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、液体、及び栄養補助物質、電解質補助物質（例えば、リンゲルのデキストロースに基づいたもの）などが挙げられる。全身及び局所の投与経路としては、例えば皮内、局所塗布、静脈内、筋肉内などが挙げられる。
【０１８５】
本開示のワクチン及び免疫原性組成物は、投与製剤に適合した様式で、治療有効であり、及び免疫原性のある量で、投与されてもよい。投与される量は、例えば、免疫反応を開始させる個々の免疫システムの能力、及び所望される防御の程度などをはじめとする、治療される対象に依存している。適切な用量範囲は、ワクチン１回当たり数百マイクログラムの活性成分の桁の用量であり、例示的な範囲は約０．１μｇ〜１０μｇ（より高い量の１〜１０ｍｇの範囲も予期されるが）であり、例えば、約０．１μｇ〜５μｇの範囲、又は０．６μｇ〜３μｇの範囲、又は約１μｇ〜３μｇの範囲、又は約１μｇ〜３μｇの範囲、又は０．１μｇ〜１μｇの範囲である。ある実施形態では、用量は、１回投与量当たり約０．１μｇ、約０．２μｇ、約０．３μｇ、約０．４μｇ、約０．５μｇ、約０．６μｇ、約０．７μｇ、約０．８μｇ、約０．９μｇ、約１μｇ、約１．１μｇ、約１．２μｇ、約１．３μｇ、約１．４μｇ、約１．５μｇ、約１．６μｇ、約１．７μｇ、約１．８μｇ、約１．９μｇ、約２μｇ、約２．１μｇ、約２．２μｇ、約２．３μｇ、約２．４μｇ、約２．５μｇ、約２．６μｇ、約２．７μｇ、約２．８μｇ、約２．９μｇ、又は約３μｇであってもよい。ある実施形態では、本開示のワクチン及び免疫原性組成物は、１回投与量当たり、１μｇの量で投与されてもよい。例えば、ＥＶ７１、ＣＡ６、及びＣＡ１６のうちの２つ以上からの抗原を含有する二価もしくは三価のワクチン及び／又は免疫原性組成物などの多価である本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物において、各構成要素の用量は、同等の用量比で投与される（すなわち、二価のワクチン及び／又は免疫原性組成物であれば１：１、三価及び／又は免疫原性組成物であれば１：１：１）。
【０１８６】
最初の投与及びブースター接種に対する適切なレジメンもまた可変であるが、最初の投与の後に引き続く接種又は他の投与が行われるのが典型である。
【０１８７】
適用方法は広く変化し得る。ワクチン又は免疫原性組成物の任意の簡便な投与方法が適用可能である。これらには、生理学的に受容可能な固形の基剤、又は生理学的に受容可能な分散剤での経口適用、注射などによる非経口適用が挙げられる。ワクチン又は免疫原性組成物の用量は、投与経路に依存し、ワクチン接種される人物の年齢、及び抗原の剤型に従い変化する。ワクチン又は免疫原性組成物は、本明細書に記載されるように、０．５ｍＬ超の単位用量、０．５ｍＬの単位用量、又は０．５ｍＬ未満の単位用量を有してもよい。例えば、０．２５ｍＬの量で投与されてもよい。
【０１８８】
粘膜付着を改善させる送達剤を用いて、特に鼻内、経口、肺をベースとした送達剤型に対する送達、及び免疫原性を改善してもよい。そのような化合物の１つであるキトサンは、キチンのＮ脱アセチル型であり、多くの医薬製剤に使用されている。キトサンは、粘膜絨毛クリアランスを遅延させるその能力から、鼻内ワクチン送達の魅力的な粘膜付着剤であり、粘膜の抗原取込と処理のための時間をより長期化させる。さらに、キトサンは、抗原のＮＡＬＴへの経上皮輸送を増強させ得るタイトジャンクションを一過性に開かせることができる。最近のヒト臨床試験において、キトサンのみを用いて、追加のアジュバントは何も用いていない鼻内投与された三価の不活化インフルエンザワクチンにより、抗体陽転が生じ、ＨＩ価は、鼻内接種後に得られたＨＩ価よりもわずかに低かった。
【０１８９】
キトサンはまた、例えば、遺伝子的に無毒化された大腸菌の易熱性エンテロトキシン変異体ＬＴＫ６３などの鼻内で良く機能するアジュバントと共に製剤化されてもよい。これにより、キトサンにより与えられた送達及び付着の利益に加えて免疫刺激効果が加わり、粘膜と全身の反応が増強される。
【０１９０】
最後に、キトサン製剤はまた、乾燥粉末形式でも調製することができ、それによりワクチンの安定性が改善され、液体製剤よりも粘膜絨毛クリアランスがさらに遅延させ得ることが示されていることに注意されたい。このことは、キトサンを用いて製剤化された鼻内乾燥粉末ジフテリアトキソイドワクチンを含む最近のヒト臨床試験において確認され、鼻内経路は、従来的な筋肉内経路と同じくらい有効であり、分泌性ＩｇＡ反応というさらなる利益も伴っていた。また、このワクチンは非常に耐容性であった。キトサン及びＭＬＡ、又はその誘導体を含有する炭疽に対する鼻内粉末乾燥ワクチンは、ウサギにおいて筋肉内接種よりも強い反応を誘導し、エアロゾルの芽胞チャレンジに対しても防御的である。
【０１９１】
鼻内ワクチンは、下部気道により強く作用する非経口投与されたワクチンとは対照的に、上部気道及び下部気道に作用することができる例示的な製剤である。これは、アレルゲンをベースとしたワクチンに対する寛容の誘導、及び病原体をベースとしたワクチンに対する免疫の誘導に有益であり得る。
【０１９２】
上部気道と下部気道の両方に防御をもたらすことに加え、鼻内ワクチンは針接種による合併症を忌避し、粒子状及び／又は可溶性の抗原と鼻咽喉関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）との相互作用を介して、粘膜及び全身の液性反応と細胞性反応の両方を誘導する手段をもたらす。
【０１９３】
本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、薬学的に受容可能である。それらは抗原とアジュバントに追加して構成要素を含有してもよく、例えばそれらは一般的に１つ以上の医薬担体（複数含む）及び／又は賦形剤（複数含む）を含有する。かかる構成要素に関する詳細な検討は、Gennaro  (2000)  Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy.  20th  edition,  ISBN:  0683306472で入手可能である。
【０１９４】
張性を制御するために、たとえばナトリウム塩などの生理学的な塩を含有することが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、塩化ナトリウムは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１９５】
ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、１つ以上の緩衝液を含有してもよい。典型的な緩衝液としては、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバントと共に）、又はクエン酸緩衝液が挙げられる。緩衝液は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含有される。
【０１９６】
ワクチン又は免疫原性組成物のｐＨは、多くの場合、５．０〜８．１、より典型的には６．０〜８．０、例えば、６．５〜７．５、又は７．０〜７．８である。本開示の製造方法は、したがって、包装の前にバルクワクチンのｐＨを調整する工程を含む。
【０１９７】
ワクチン又は免疫原性組成物は、好ましくは滅菌されている。好ましくは非発熱性であり、例えば、１回投与量当たり１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的測定）未満、及び好ましくは１回投与量当たり０．１ＥＵ未満を含有する。好ましくはグルテンフリーである。
【０１９８】
ある実施形態では、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、有効な濃度で洗剤を含有してもよい。一部の実施形態では、洗剤の有効量は、約０．００００５％  ｖ／ｖ〜約５％  ｖ／ｖ、又は約０．０００１％  ｖ／ｖ〜約１％  ｖ／ｖを含み得るが、これに限定されない。ある実施形態では、洗剤の有効量は、約０．００１％  ｖ／ｖ、約０．００２％  ｖ／ｖ、約０．００３％  ｖ／ｖ、約０．００４％  ｖ／ｖ、約０．００５％  ｖ／ｖ、約０．００６％  ｖ／ｖ、約０．００７％  ｖ／ｖ、約０．００８％  ｖ／ｖ、約０．００９％  ｖ／ｖ、又は約０．０１％  ｖ／ｖである。学説には拘らないが、洗剤は、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の溶解を補助し、ワクチン及び／又は免疫原性組成物の凝集予防を補助する。
【０１９９】
特にスプリットワクチン又は表面抗原ワクチンに対して適切な洗剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（Ｔｗｅｅｎとして知られている）、オクトキシノール（例えば、オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ１００）又はｔオクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、及びデオキシコール酸ナトリウムなどが挙げられる。潜在は、微量のみで存在してもよい。微量の他の残りの構成要素は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。一部の実施形態では、洗剤はポリソルベートを含有する。一部の実施形態では、洗剤の有効濃度は、約０．００００５％  ｖ／ｖ〜約５％  ｖ／ｖの範囲を含む。
【０２００】
ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、好ましくは２℃〜８℃で保存される。それらは凍結させてはならない。それらは理想的には直射日光を避けなければならない。抗原及び乳液は、典型的には混合されているが、はじめはその場で混合するための別々の構成要素のキットの形態であってもよい。ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、対象に投与されるとき、多くの場合は水性形態である。
アジュバント
【０２０１】
本開示の組成物、免疫原性組成物、及び／又はワクチンは、１つ以上のアジュバントと組み合わせて使用されてもよい。本開示のかかるアジュバント化ワクチン及び／又は免疫原性組成物は、その必要のある対象における手足口病の治療又は予防に有用であってもよく、又はその必要のある対象において手足口病に対する防御的免疫反応などの免疫反応の誘導に有用であってもよい。
【０２０２】
ワクチンに対しアジュバント効果を得るためのさまざまな方法が公知であり、本明細書に開示される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物と併せて使用されてもよい。一般的な原理と方法は、"The  Theory  and  Practical  Application  of  Adjuvants",  1995,  Duncan  E.  S.  Stewart-Tull  (ed.),  John  Wiley  &  Sons  Ltd,  ISBN  0-471-95170-6に、また"Vaccines:  New  Generation  Immunological  Adjuvants",  1995,  Gregoriadis  G  et  al.  (eds.),  Plenum  Press,  New  York,  ISBN  0-306-45283-9に詳述されている。
【０２０３】
一部の実施形態では、手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、抗原とアジュバントを含有する。抗原は、少なくとも１つのアジュバントと、約１０：１〜約１０１０：１の抗原：アジュバントの重量を基にした比率で混合されていてもよく、例えば、約１０：１〜約１００：１、約１００：１〜約１０３：１、約１０３：１〜約１０４：１、約１０４：１〜約１０５：１、約１０５：１〜約１０６：１、約１０６：１〜約１０７：１、約１０７：１〜約１０８：１、約１０８：１〜約１０９：１、又は約１０９：１〜約１０１０：１の抗原：アジュバントの比率で混合されていてもよい。当業者であれば、アジュバントに関する情報と、最適な比率を決定するための日常的な実験を介して適切な比率を容易に決定することができる。
【０２０４】
例示的なアジュバントとしては、限定されないが、アルミニウム塩、トールライク受容体（ＴＬＲ）作動薬、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ＭＬＡ誘導体、合成リピドＡ、リピドＡの模倣体又はアナログ、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルション、ビロゾーム、コクリエート、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマ粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。一部の実施形態では、アジュバントはＭＬＡ又はその誘導体である。
【０２０５】
一部の実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。一部の実施形態では、アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５のうち少なくとも１つを含有する。一部の実施形態では、本開示のアルミニウム塩アジュバントは、本開示のＨＦＭＤワクチン及び／又は免疫原性組成物の抗原の吸着を増強することが判明している。したがって、一部の実施形態では、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の抗原がアルミニウム塩アジュバントに吸着している。
【０２０６】
本開示のある実施形態は、手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物の作製方法を含み、当該方法は、（ａ）アルミニウム塩アジュバントと、ワクチン又は免疫原性組成物を混合することであって、ワクチン又は免疫原性組成物は手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有していること、及び（ｂ）約１６時間〜約２４時間の範囲の期間、適切な条件下で混合物をインキュベートすることであって、抗原の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％がアルミニウム塩アジュバントに吸着していること、を含む。当該方法のある実施形態では、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスは、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上から選択される。当該方法の一部の実施形態では、混合物は、約２℃〜約８℃の範囲の温度でインキュベートされる。当該方法の一部の実施形態では、混合物は、当分野に公知の任意の適切なミキサーを用いて持続的に混合されながらインキュベートされる。当該方法の一部の実施形態では、混合物は、約６．５〜約８、約６．８〜約７.８、約６．９〜約７．６、又は約７〜約７．５の値の範囲のｐＨでインキュベートされる。ある好ましい実施形態では、混合物は中性ｐＨでインキュベートされる。当該方法の一部の実施形態では、アルミニウム塩アジュバントは、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５から選択される。
【０２０７】
モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）はサルモネラ由来のリピドＡの非毒性誘導体であり、ワクチンアジュバントとして開発された強力なＴＬＲ−４作動薬である（Evans  et  al.    2003）。前臨床マウス実験において、鼻内ＭＬＡは、分泌反応ならびに全身反応、液性反応を増強することが示されている  （Baldridge  et  al.  2000;  Yang  et  al.    2002）。また、１２０，０００人を超える患者の臨床試験においても、ワクチンアジュバントとしての安全性及び有効性が証明されている（Baldrick  et  al.  ,  2002;  2004）。ＭＬＡは、ＴＬＲ−４受容体を介して自然免疫の誘導を刺激し、それにより、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方、ウイルスならびに寄生虫をはじめとする広範な感染性病原体に対する非特異的免疫反応を惹起することができる（Baldrick  et  al.    2004;  Persing  et  al.    2002）。鼻内製剤中のＭＬＡの含有は、自然免疫の急速な誘導をもたらし、ウイルスチャレンジから非特異的免疫反応を惹起させ、一方で、ワクチンの抗原性構成要素により生じする特異的反応を増強させるはずである。
【０２０８】
したがって、１つの実施形態において、本開示は、獲得免疫及び自然免疫の増強剤としてのモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＬＡ）、又はそれらの誘導体を含有する組成物を提供する。化学的に、３Ｄ−ＭＬＡは、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、４、５又は６個のアシル化鎖の混合物である。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい形態は、欧州特許０  ６８９  ４５４  Ｂ１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＳＡ社）に開示されている。他の実施形態では、本開示は、例えばＢｉｏＭｉｒａ’ｓ  ＰＥＴ  Ｌｉｐｉｄ  Ａなどの合成リピドＡ、リピドＡ模倣体もしくはアナログ、又はＴＬＲ−４作動薬のように機能するよう設計された合成誘導体を含有する組成物を提供する。
【０２０９】
さらなる例示的なアジュバントとしては、ポリペプチド構成要素との共発現により、又はキメラポリペプチドを産生するポリペプチド構成要素との融合により、本明細書に開示される抗原に容易に付加され得るポリペプチドアジュバントが挙げられるが、これに限定されない。細菌フラジェリンは、鞭毛の主要なタンパク構成物質であり、トールライク受容体ＴＬＲ５により自然免疫系に認識されることを理由に、アジュバントタンパク質として注目が高まっているアジュバントである（65）。ＴＬＲ５を介したフラジェリンのシグナル伝達は、ＤＣの成熟と移動を誘導し、ならびにマクロファージ、好中球及び腸上皮細胞を活性化し、その結果、炎症促進性メディエーターが産生されることによって、自然免疫と獲得免疫の両方に効果を有している（66-72）。
【０２１０】
ＴＬＲ５は、このタンパク質に固有であり、鞭毛の機能に必要なフラジェリン単量体内の保存構造を認識しており、その変異体は免疫的圧力に対する反応ができない（73）。受容体は、１００ｆＭの濃度に感受性であるが、そのままのフィラメントは認識しない。結合及び刺激には鞭毛の単量体への分解が必要である。
【０２１１】
非経口又は鼻内のいずれかで投与された異種抗原に対する防御的反応の誘導に関し、アジュバントとしてフラジェリンは強力な活性を有しており、ＤＮＡワクチンに対するアジュバント効果も報告されている。フラジェリンが用いられた場合、例えばインフルエンザなどの呼吸器系のウイルスに適したＴｈ２偏向が観察されているが、マウス又はサルにおいてＩｇＥ誘導の証拠は観察されていない。さらに、サルにおいて、鼻内または全身への投与後の局所炎症反応又は全身炎症反応は報告されていない。ＭｙＤ８８依存性の様式のＴＬＲ５を介したフラジェリンのシグナル、及びＴＬＲを介した他のすべてのＭｙＤ８８依存性のシグナルは、Ｔｈ１偏向を生じさせることが示されていることから、フラジェリン使用後に惹起されるＴｈ２を特徴とする反応はいささか驚きである。重要なことは、従前から存在したフラジェリンに対する抗体は、アジュバント効果に関しては適切な効果を有しておらず、このことから、本発明は多様な使用ができるアジュバントとして魅力的である。
【０２１２】
近年の多くの鼻内ワクチン試験における普遍的なテーマは、ワクチン効果を改善するためのアジュバント及び／又は送達システムの使用である。そのような試験の一つにおいて、遺伝的に非毒化された大腸菌易熱性エンテロトキシンアジュバント（ＬＴ  Ｒ１９２Ｇ）を含有するインフルエンザＨ３ワクチンは、Ｈ５チャレンジに対して異種部分的防御を生じさせたが、鼻内送達後のみであった。防御は、交差中和抗体の誘導に基づいたものであり、新たなワクチンの開発における鼻内経路の重要な関与を示していた。
【０２１３】
サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦなど）、腫瘍壊死因子、インターロイキン２、７、１２、インターフェロン及び他の成長因子のようなものをアジュバントとして用いてもよく、それらはポリペプチド構成要素と混合することにより、又は融合させることにより容易に手足口病のワクチン又は免疫原性組成物中に含ませることができる。
【０２１４】
一部の実施形態では、本明細書に開示される手足口病のワクチン及び免疫原性組成物は、例えば５’−ＴＣＧ−３’配列を含有する核酸ＴＬＲ９リガンド、イミダゾキノリンＴＬＲ７リガンド、置換グアニンＴＬＲ７／８リガンド、例えばロキソリビン、７−デアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、イミキモド（Ｒ−８３７）、及びレシキモド（Ｒ−８４８）などの他のＴＬＲ７リガンド、などのトールライク受容体を介して作用する他のアジュバントを含有してもよい。
【０２１５】
あるアジュバントは、例えば樹状細胞などのＡＰＣによるワクチン分子の取り込みを促進し、これらを活性化する。非限定的な例は、免疫標的化アジュバント、例えば毒素、サイトカイン及びマイコバクテリア誘導体などの免疫調節アジュバント、油性製剤、ポリマー、ミセル形成アジュバント、サポニン、免疫刺激複合体マトリクス（ＩＳＣＯＭマトリクス：ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍａｔｒｉｘ）、粒子、ＤＤＡ、アルミニウムアジュバント、ＤＮＡアジュバント、ＭＬＡ、及びカプセル化アジュバントからなる群から選択される。
【０２１６】
アジュバントのさらなる例としては、例えば水酸化物又はリン酸塩などのアルミニウム塩（ミョウバン）などの剤が挙げられ、それらは通常、緩衝生理食塩水中０．０５〜０．１％溶液として使用され（例えば、Nicklas  (1992)  Res.  Immunol.  143:489-493を参照のこと）、０．２５％溶液として使用される糖類の合成ポリマー（例えば、カーボポール（登録商標））と混合され、７０℃〜１０１℃の範囲の温度でそれぞれ３０秒〜２分の間の加熱処置によりワクチン中のタンパク質を凝集させ、また、架橋剤による凝集も可能である。ペプシン処置抗体（Ｆａｂ断片）を用いた再活性化によるアルブミンへの凝集、例えばクリプトスポリジウム・パルバムなどの細菌細胞、又はエンドトキシン、又はグラム陰性細菌のリポ多糖成分との混合、たとえばマンニド一モノオレイン酸塩（Ａｒａｃｅｌ  Ａ）などの生理学的に受容可能な油性ビヒクル中のエマルション、又はブロック代替品（ｂｌｏｃｋ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）として用いられるパーフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０％溶液とのエマルションを用いてもよい。例えば、スクアレン及びＩＦＡなどの油との混合を用いてもよい。
【０２１７】
ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）は興味深いアジュバント候補であるが、フロイントの完全及び不完全アジュバント、ならびに例えばＱｕｉｌＡ及びＱＳ２１などのキラヤ属サポニンも興味深い。さらなる可能性としては、例えばモノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、及びスレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ）などのリポ多糖体のポリ［［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰ）誘導体が挙げられる。Ｔｈ１型反応を優先的に生じさせるために、例えば３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡなどのモノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせをはじめとするリポ多糖をベースとしたアジュバントを使用してもよい。
【０２１８】
リポソーム製剤もまた、アジュバント効果をもたらすことが知られており、そのため、リポソームアジュバントを手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物と併せて用いてもよい。
【０２１９】
免疫刺激複合体マトリクス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリクス）アジュバントを、手足口病の抗原及び免疫原性組成物と共に用いてもよく、特に、このタイプのアジュバントはＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ発現を上方制御させることができることが示されている。ＩＳＣＯＭマトリクスは、シャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来の（任意選択で分画化された）サポニン（トリペルテノイド）、コレステロール、及びリン脂質からなる。例えば手足口病のワクチン又は免疫原性組成物抗原などの免疫原性タンパク質と混合し、得られた微粒子製剤は、サポニンが６０〜７０％  ｗ／ｗを構成し、コレステロール及びリン脂質が１０〜１５％  ｗ／ｗを構成し、及びタンパク質が１０〜１５％  ｗ／ｗを構成し得るＩＳＣＯＭ粒子として知られる製剤である。組成及び免疫刺激複合体の使用に関する詳細は、例えばアジュバントを扱っている上述のテキスト中に見いだされ、また、Morein  B  et  al.,  1995,  Clin.  Immunother.  3:  461-475、ならびにBarr  I  G  and  Mitchell  G  F,  1996,  Immunol.  and  Cell  Biol.  74:  8-25は、完全免疫刺激複合体の調製に関する有用な解説を提供している。
【０２２０】
ｉｓｃｏｍの形態であるか否かを問わず、サポニンは本明細書に開示される手足口病ワクチン抗原及び免疫原性組成物とのアジュバントの組み合わせに用いられてもよく、米国特許  第５，０５７，５４０号及び"Saponins  as  vaccine  adjuvants",  Kensil,  C.  R.,  Crit  Rev  Ther  Drug  Carrier  Syst,  1996,  12  (1-2):1-55、及びＥＰ  ０  ３６２  ２７９  Ｂ１に記載されるＱｕｉｌＡと称されるシャボンノキ（Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の樹皮から誘導されるサポニン及びその画分を含み得る。例示的なＱｕｉｌＡ画分は、ＱＳ２１、ＱＳ７、及びＱＳ１７である。
【０２２１】
β−エスシン（ｅｓｃｉｎ）は、手足口病ワクチン及び／又は免疫原性組成物のアジュバント組成物における使用のための他の溶血性サポニンである。エスシンは、セイヨウトチノキ（ｈｏｒｓｅ  ｃｈｅｓｔｎｕｔ  ｔｒｅｅ）、Ｌａｔ：Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍの種子中に生じるサポニンの混合物として、メルクインデックス（第１２版：エントリー３７３７）に記述されている。その単離は、クロマトグラフィー及び精製（Fiedler,  Arzneimittel-Forsch.  4,  213  (1953)）、及びイオン交換樹脂（Erbring  et  al.,  米国特許第３，２３８，１９０号）により行うと記載されている。エスシンの画分は精製され、生物的に活性があることが示されている（Yoshikawa  M,  et  al.  (Chem  Pharm  Bull  (Tokyo)  1996  August;44(8):1454-1464)）。β−エスシンは、エスシン（ａｅｓｃｉｎ）とも知られている。
【０２２２】
手足口病ワクチン及び／又は免疫原性組成物における使用のための他の溶血性サポニンはジギトニンである。ジギトニンはメルクインデックス（第１２版：エントリー３２０４）にサポニンとして記載されており、宿根草（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）の種子から誘導され、Gisvold  et  al.,  J.Am.Pharm.Assoc.,  1934,  23,  664、及びRuhenstroth-Bauer,  Physiol.Chem.,  1955,  301,  621に記載される手順に従い精製される。 その使用は、コレステロール定量のための臨床試薬であるとして記載されている。
【０２２３】
アジュバント効果が得られる他の興味深い可能性は、Gosselin  et  al.,  1992に記載される技術を用いることである。簡潔に述べると、例えば本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物中の抗原などの関連抗原の提示は、単球／マクロファージのＦＣ受容体に対する抗体にこの抗原を結合させることにより増強させることができる。特に、抗原と抗ＦＣＲＩの間の結合は、ワクチンを目的とした免疫原性を増強させることが示されている。抗体は、生成された後に、又は手足口病のワクチン及び免疫原性組成物の抗原のポリペプチド成分のいずれか１つへの融合物として発現させることを含む生成物の一部として、手足口病のワクチン又は免疫原性組成物に結合されてもよい。
【０２２４】
他の可能性は、標的化物質及び免疫調節物質（すなわちサイトカイン）の使用を含む。さらに、例えばポリＩ：Ｃなどのサイトカインの合成誘導物質を用いてもよい。
【０２２５】
適切なマイコバクテリア派生物は、ムラミルジペプチド、完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｍｏｎｔ．）、ならびに例えばＴＤＭ及びＴＤＥなどのトレハロースのジエステルからなる群から選択されてもよい。
【０２２６】
適切な免疫標的化アジュバントの例としては、ＣＤ４０リガンド及びＣＤ４０抗体、又は特にそれらの結合断片（上述を参照）、マンノース、Ｆａｂ断片、ならびにＣＴＬＡ−４が挙げられる。
【０２２７】
適切なポリマーアジュバントの例としては、例えばデキストラン、ＰＥＧ、デンプン、マンナン、及びマンノースなどの炭水化物、プラスチックポリマー、及び例えばラテックスビーズなどのラテックスが挙げられる。
【０２２８】
免疫反応を調節する他のさらなる興味深い方法は、免疫原を（任意選択でアジュバントならびに薬学的に受容可能な担体及びビヒクルとともに）、「バーチャルリンパ節（ＶＬＮ：ｖｉｒｔｕａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）」（ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ，  Ｉｎｃ．，  ３６０  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．  １００１７−６５０１により開発され、所有される医療デバイス）に含ませることである。ＶＬＮ（薄い管状のデバイス）はリンパ節の構造及び機能を模倣している。皮膚の下にＶＬＮを挿入することで無菌の炎症部位が創出され、サイトカイン及びケモカインが急増する。Ｔ細胞及びＢ細胞ならびにＡＰＣがこの危険なシグナルに急速に反応し、炎症部位に誘導され、ＶＬＮの多孔質マトリクスの内部に蓄積される。ＶＬＮを使用した場合、抗原に対する免疫反応を開始させるために必要とされる抗原の必要投与量は少ないことが示されており、及びＶＬＮを用いたワクチン化により与えられる免疫防御は、アジュバントとしてＲｉｂｉを使用した従来的なワクチン化を凌いだことが示されている。この技術は、Gelber  C  et  al.,  1998,  "Elicitation  of  Robust  Cellular  and  Humoral  Immune  Responses  to  Small  Amounts  of  Immunogens  Using  a  Novel  Medical  Device  Designated  the  Virtual  Lymph  Node"、"From  the  Laboratory  to  the  Clinic,  Book  of  Abstracts,  Oct.  12-15,  1998,  Seascape  Resort,  Aptos,  Calif."に簡潔に記載されている。
【０２２９】
手足口病のワクチン及び免疫原性組成物の抗原と併せて、オリゴヌクレオチドをアジュバントとして用いてもよく、及びオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つ以上、又はさらには少なくとも６つ以上のヌクレオチドにより区別される２つ以上のジヌクレオチドＣｐＧモチーフを含有してもよい。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）は、Ｔｈ１反応を優先的に誘導する。かかるオリゴヌクレオチドは公知であり、例えば、ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８、ならびに米国特許第６，００８，２００号及び第５，８５６，４６２号に記載されている。  
【０２３０】
かかるオリゴヌクレオチドアジュバントは、デオキシオリゴヌクレオチドであってもよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド主鎖は、ホスホロジチオアート、またはホスホロチオアートの結合であるが、ホスホジエステル、及び例えば混合主鎖結合を有するオリゴヌクレオチドを含むＰＮＡなどの他のヌクレオチド主鎖を用いてもよい。ホスホロチオアートオリゴヌクレオチド又はホスホロジチオアートの作製方法は、米国特許  第５，６６６，１５３号、米国特許  第５，２７８，３０２号、及びＷ０９５／２６２０４に記載されている。
【０２３１】
例示的なオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有するものである。この配列は、ホスホロチオアート改変ヌクレオチド主鎖を含有してもよい。
（配列番号１０）オリゴ１：TCC  ATG  ACG  TTC  CTG  ACG  TT  (CpG  1826)  、
（配列番号１１）オリゴ２：TCT  CCC  AGC  GTG  CGC  CAT  (CpG  1758)  、
（配列番号１２）オリゴ３：ACC  GAT  GAC  GTC  GCC  GGT  GAC  GGC  ACC  ACG、
（配列番号１３）オリゴ４：TCG  TCG  TTT  TGT  CGT  TTT  GTC  GTT  (CpG  2006)、及び
（配列番号１４）オリゴ５：TCC  ATG  ACG  TTC  CTG  ATG  CT  (CpG  1668)  
【０２３２】
別のＣｐＧオリゴヌクレオチドとしては、配列に些末な欠失または付加を伴う上述の配列が挙げられる。アジュバントとしてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当分野に公知の任意の方法により合成されてもよい（例えば、ＥＰ４６８５２０）。例えば、かかるオリゴヌクレオチドは、自動合成装置を利用して合成されてもよい。かかるオリゴヌクレオチドアジュバントは、１０〜５０塩基の長さであってもよい。他のアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせがＷＯ００／０９１５９に公開されている。
【０２３３】
多くの単層又は多層のエマルション系が記載されている。当業者であれば、このエマルションが抗原構造を破壊しないように、かかるエマルション系を手足口病のワクチン及び免疫原性組成物の抗原との使用に容易に適合させることができる。水中油型エマルションアジュバントはそもそもアジュバント組成物として有用であることが提唱されており（ＥＰＯ  ３９９  ８４３Ｂ）、水中油型エマルションと他の活性剤との組み合わせもワクチンのアジュバントとして記載されている（ＷＯ９５／１７２１０、ＷＯ９８／５６４１４、ＷＯ９９／１２５６５、ＷＯ９９／１１２４１）。例えば油中水型エマルション（米国特許第５，４２２，１０９号、ＥＰ  ０  ４８０  ９８２  Ｂ２）及び水中油中水型エマルション（米国特許第５，４２４，０６７号、ＥＰ  ０  ４８０  ９８１  Ｂ）などの他の油性エマルションアジュバントが記載されている。
【０２３４】
本明細書に記載される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成との使用のための油性エマルションアジュバントは、天然であっても又は合成であってもよく、及び鉱物又は有機であってもよい。鉱物油及び有機油の例は、当分野の当業者には容易に明白であろう。
【０２３５】
任意の水中油型組成物をヒト投与に適合させるために、エマルション系の油相に代謝可能な油を含有させてもよい。代謝可能な油という用語の意味は、当分野に公知である。代謝可能とは、「代謝により転換されることができる」と定義することができる（Dorland's  Illustrated  Medical  Dictionary,  W.B.  Sanders  Company,  25th  edition  (1974)）。油は任意の植物油、魚油、動物油、または合成油であってもよく、それらはレシピエントに対して非毒性であり、代謝により転換されることができるものである。堅果（例えば、ピーナッツ油）、種子、及び穀物が植物油の一般的な源である。合成油を用いてもよく、合成油は例えばＮＥＯＢＥＥ（登録商標）などの市販の油を含有してもよい。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）は、サメ肝臓油中に大量に存在するが、オリーブオイル、コムギ胚種油、ぬか油、及び酵母中には少量で存在する不飽和油であり、手足口病のワクチン及び免疫原性組成物の抗原と共に用いられてもよい。スクアレンはコレステロールの生合成中の中間体であるという事実により代謝可能な油である（メルクインデックス、第１０版、エントリー番号８６１９）。
【０２３６】
例示的な油性エマルションは、水中油型エマルションであり、特に水中スクアレンエマルションである。
【０２３７】
さらに、手足口病のワクチン及び免疫原性組成物の抗原との使用のための油性エマルションアジュバントは、例えば油性α−トコフェロール（ビタミンＥ、ＥＰ  ０  ３８２  ２７１  Ｂ１）などの抗酸化剤を含有してもよい。
【０２３８】
ＷＯ９５／１７２１０及びＷＯ９９／１１２４１は、スクアレン、α−トコフェロール、及びＴＷＥＥＮ８０（商標）を基にし、任意選択で免疫刺激物質ＱＳ２１及び／又は３Ｄ−ＭＬＡを用いて製剤化したエマルションアジュバントを公開している。ＷＯ９９／１２５６５は、油相にステロールを添付した、これらスクアレンエマルションに対する改善を記載している。さらに例えばトリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６）などのトリグリセリドを油相に添加し、エマルションを安定化させてもよい（ＷＯ９８／５６４１４）。
【０２３９】
この安定な水中油型エマルション内に存在する油滴のサイズは、１ミクロン未満であってもよく、光子相関法（ｐｈｏｔｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）による測定で、実質的に３０〜６００ｎｍの範囲であってもよく、実質的に約３０〜５００ｎｍの直径であってもよく、又は実質的に１５０〜５００ｎｍの直径であってもよく、及び特に約１５０ｎｍの直径であってもよい。この点で、数により８０％の油滴は、これら範囲内にあってもよく、数により９０％超または９５％超の油滴は、既定のサイズ範囲内である。油性エマルション中に存在する成分の量は、例えばスクアレンなど、慣例的に２〜１０％の油の範囲内であり、存在する場合にはアルファトコフェロールは２〜１０％の範囲であり、及び例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの界面活性剤は、０．３〜３％の範囲である。油：アルファトコフェロールの比率は、等しいか、１未満であり、これにより安定なエマルションが提供される。ＳＰＡＮ８５（商標）もまた、約１％のレベルで存在してもよい。一部の例では、本明細書に開示される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は安定剤をさらに含有することが有益である場合がある。
【０２４０】
水中油型エマルションの作製方法は当分野の当業者に公知である。一般的に、当該方法は、油相と、例えばＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液などの界面活性剤を混合する工程、次いで、ホモジナイザーを用いてホモジナイズする工程を含み、少量の液体をホモジナイズするには、この混合物を注射針に２回通すことを含む方法が適していることは当業者には明らかである。同様に、当業者であれば、マイクロフルダイザーにおける乳化プロセス（Ｍ１１０Ｓ微小流体装置、最大５０パス、６バールの最大入力圧力で２分間（出力圧力は約８５０バール））を適合させ、より小量、またはより多量のエマルションを製造することができる。この適合は、必要とされる直径の油滴を有する調製物を得るまで、得られたエマルションを測定することを含む、日常的な実験により行うことができる。
【０２４１】
あるいは、手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、キトサン（上述）から構成されるワクチンビヒクルと混合されてもよく、または他のポリカチオン性ポリマー、ポリラクチド、及びポリラクチド−コグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンを基にしたポリマーマトリクス、多糖又は化学的に改変された多糖から構成される粒子、リポソーム及び脂質を基にした粒子、グリセロールモノエステルから構成される粒子などと混合されてもよい。例えばリポソーム又はＩＳＣＯＭなどの粒子構造を形成させるために、コレステロールの存在下でサポニンもまた製剤化されてもよい。さらに、サポニンは、非粒子溶液もしくは懸濁液中、又は寡層薄膜（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームもしくはＩＳＣＯＭなどの粒状構造中のいずれかにおいて、例えばポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと共に製剤化されてもよい。
【０２４２】
本明細書に記載される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物における使用のためのさらなる実例となるアジュバントとしては、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ社、Ｃａｌｉｆ．米国）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ社、例えば、Granoff  et  al.  (1997)  Infect  Immun.  65  (5):1710-1715を参照のこと。）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えばＳＢ−ＡＳ２（ＭＬＡ及びＱＳ２１を含有する水中油型エマルション）、ＳＢＡＳ−４（ミョウバン及びＭＬＡを含有するアジュバント系）、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ社、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、ベルギーから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、ＲＣ−５１２、ＲＣ−５２２、ＲＣ−５２７、ＲＣ−５２９、ＲＣ−５４４、及びＲＣ−５６０（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ社）、及び例えば係属中の米国特許出願０８／８５３，８２６及び０９／０７４，７２０に記載されているものなどの他のアミノアルキルグルコサミド４−リン酸塩（ＡＧＰ）が挙げられる。    
【０２４３】
他のアジュバントの例としては、Ｈｕｎｔｅｒ’ｓ  ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバント  (ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ジョージア州)、Ｇｅｒｂｕアジュバント（Ｇｅｒｂｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ、Ｇａｉｂｅｒｇ、ドイツ）、ニトロセルロース（Nilsson  and  Larsson  (1992)  Res.  Immunol.  143:553-557）、ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）エマルションを基にした、鉱物油、非鉱物油を含む製剤、油中水型エマルション又は水中油型エマルション、例えば、Ｓｅｐｐｉｃ  ＩＳＡシリーズのＭｏｎｔａｍｉｄｅアジュバント（例えば、ＩＳＡ−５１、ＩＳＡ−５７、ＩＳＡ−７２０、ＩＳＡ−１５１など。Ｓｅｐｐｉｃ社、パリ、フランス）、及びＰＲＯＶＡＸ（登録商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、ＯＭ−１７４（リピドＡに関連したグルコサミン二糖）、リーシュマニア伸長因子、例えばＣＲＬ１００５などのミセルを形成する非イオン性ブロックコポリマー、及びＳｙｎｔｅｘアジュバント製剤が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、O'Hagan  et  al.  (2001)  Biomol  Engl.  18(3):69-85;  and  "Vaccine  Adjuvants:  Preparation  Methods  and  Research  Protocols"  D.  O'Hagan,  ed.  (2000)  Humana  Press.を参照のこと。
【０２４４】
他の例示的なアジュバントとしては、以下の一般式のアジュバント分子が挙げられる：
ＨＯ（ＣＨ  ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ，  （Ｉ）
式中、ｎは１〜５０であり、Ａは結合又は−−Ｃ（Ｏ）−−、であり、Ｒは、Ｃ１〜５０アルキル又はフェニルＣ１〜５０アルキルである。
【０２４５】
１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含有するワクチン製剤からなり、式中、ｎは１〜５０であり、４〜２４、又は９であり、Ｒ構成要素は、Ｃ１−５０、Ｃ４−Ｃ２０アルキル、又はＣ１２アルキルであり、Ａは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、０．１〜１０％の範囲、または０．１〜１％の範囲でなければならない。例示的なポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：  ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、  ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、  ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、  ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、  ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、及び  ポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。例えばポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレンエーテルは、メルクインデックス（第１２版、エントリー７７１７）に記載されている。 これらアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載されている。
【０２４６】
上述の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、もし望ましい場合には、他のアジュバントと混合されてもよい。例えば、アジュバントの組み合わせは、上述のＣｐＧを含んでもよい。
【０２４７】
本明細書に記載される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物との使用に適切な薬学的に受容可能な賦形剤のさらなる例としては、水、リン酸緩衝生理食塩水、等張緩衝溶液が挙げられる。
【０２４８】
本開示のさらなる態様は、その必要のある対象における手足口病を治療または予防するための、及び／又はその必要のある対象において手足口病に対する免疫反応を誘導するための、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の使用方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することによる、その必要のある対象における手足口病を治療または予防する方法に関する。一部の実施形態では、本開示は、手足口病を引き起こす少なくとも１つのウイルスからの１つ以上の抗原を含有する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することによる、その必要のある対象において手足口病に対する免疫反応を誘導する方法に関する。
【０２４９】
一部の実施形態では、防御的免疫反応は、ＥＶ７１、ＣＡ６及びＣＡ１６のうちの１つ以上に対する免疫反応を含む。一部の実施形態では、防御的免疫反応は、例えばＢ４、Ｃ２、Ｃ４及びＣ５などのＥＶ７１ウイルス遺伝子型の１つ以上に対する免疫反応を誘導する。
【０２５０】
本明細書に開示される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、当該ワクチンの、鼻内、口腔、経口、頬側、舌下、筋肉内、腹腔、皮内、経真皮、真皮下、膣内、肛門、頭蓋内、静脈内、経皮又は皮下へ投与によって、ウイルス感染に感受性の、もしくはウイルス感染に苦しむ、哺乳類又は鳥類を防御又は治療するために使用されてもよい。本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の全身投与方法は、伝統的なシリンジと針、又は固形ワクチンの衝撃送達用に設計されたデバイス（ＷＯ９９／２７９６１）または針の無い圧力液体ジェットデバイス（米国特許第４，５９６，５５６号、米国特許第５，９９３，４１２号）、または経真皮パッチ（ＷＯ９７／４８４４０、ＷＯ９８／２８０３７）を含んでもよい。本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、皮膚に塗布されてもよい（経真皮及び経皮送達。ＷＯ９８／２０７３４、ＷＯ９８／２８０３７）。本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、したがって、手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物が前もって充填された全身投与用の送達デバイスを含んでもよい。したがって、任意選択的にアジュバント及び／又は担体を含む、本開示のワクチン又は免疫原性組成物を対象に投与する工程を含む、例えば哺乳類又は鳥類などの対象において手足口病を治療又は予防する方法、及び免疫反応を誘導する方法が提供され、当該ワクチン又は免疫原性組成物は、非経口又は全身の経路を介して投与される。
【０２５１】
本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物を用いて、例えば経口／消化管又は鼻の経路などの粘膜経路を介して、当該ワクチン又は免疫原性組成物を投与することにより、ウイルス感染に感受性の、もしくはウイルス感染に苦しむ哺乳類又は鳥類を防御又は治療してもよい。別の粘膜経路は、膣内及び直腸内である。投与の粘膜経路は、鼻を介した経路であってもよく、鼻内ワクチン化と称される。鼻内ワクチン化の方法は当分野に公知であり、液滴形態、スプレー形態、又は粉末乾燥形態のワクチンを免疫化される個体の鼻咽頭内へ投与することを含む。霧状化ワクチン製剤またはエアロゾル化ワクチン製剤も、本明細書に開示される手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物の可能性のある形態である。例えば胃抵抗性カプセルなどの腸溶性製剤、及び経口投与用の顆粒、直腸投与又は膣投与用の座薬もまた、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の剤型である。
【０２５２】
本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、経口経路を介して投与されてもよい。そのような場合において、薬学的に受容可能な賦形剤はまた、アルカリ緩衝液、又は腸溶性カプセルもしくは微粒剤を含有してもよい。本開示の手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物は、膣経路により投与されてもよい。そのような場合において、薬学的に受容可能な賦形剤はまた、乳化剤、例えばカーボポール（登録商標）などのポリマー類、ならびに膣クリーム及び座薬の他の公知の安定剤を含有してもよい。手足口病のワクチン及び／又は免疫原性組成物はまた、直腸経路により投与されてもよい。そのような場合において、賦形剤はまた、ワックス、及び直腸座薬の成形に関し当分野に公知のポリマーを含有してもよい。
【０２５３】
一部の実施形態では、投与工程は、１回以上の投与を含む。投与は、単回投与スケジュールによるものであってもよく、又は複数回の投与スケジュール（プライム−ブースト）によるものであってもよい。複数回の投与スケジュールにおいて、様々な投与量が同じ経路又は異なる経路により与えられてもよく、例えば、プライムが非経口でブーストが粘膜、プライムが粘膜でブーストが非経口などがある。典型的には、それらは同じ経路で投与される。複数回の投与は、典型的には、少なくとも１週（例えば、約２週、約３週、約４週、約６週、約８週、約１２週、約１６週など）離れて投与される。２５〜３０日間（例えば、２８日間）に分けて２回投与することが特に有用である。
【０２５４】
本開示方法は、本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の治療有効量又は免疫刺激量を投与することを含む。治療有効量または免疫刺激量は、投与される非感染対象、感染対象、又は非曝露対象において、防御的免疫反応を誘導する本開示のワクチン及び／又は免疫原性組成物の量であってもよい。かかる反応は、多くの場合、対象において、ワクチンに対する分泌性、細胞性、及び／又は抗体介在性の免疫反応の発現をもたらす。通常、かかる反応は、以下の効果のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない。例えばイムノグロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＭなどの任意の免疫学的分類の抗体の産生。Ｂリンパ球及びＴリンパ球の増殖。免疫細胞に対する活性化、増殖、及び分化のシグナルの提示。ヘルパーＴ細胞、抑制性Ｔ細胞、及び／又は細胞障害性Ｔ細胞の拡張。
【０２５５】
好ましくは、治療有効量又は免疫刺激量は、疾患の症状の治療または予防をもたらすのに十分な量である。正確な必要量は、他の因子の中でも治療される対象、治療される対象の年齢及び一般状態、対象の免疫システムが抗体を合成する能力、望ましい防御の程度、治療される状態の重篤度、選択された特定の手足口病の抗原ポリペプチド、及びその投与様式によって変化する。適切な治療有効量又は免疫刺激量は、当分野の当業者により容易に決定することができる。治療有効量又は免疫刺激量は、日常的な試験を介して決定することができる、比較的広い範囲におさまる。
【０２５６】
本開示は、以下の実施例を参照することにより、さらに充分に理解される。しかしながら、これら実施例は本開示の任意の態様又は範囲を限定するとは決して見なされるべきではない。
【実施例】
【０２５７】
実施例１  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおける細胞増殖評価
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯバイオリアクターにおけるＶｅｒｏ細胞株の増殖を評価した。
方法
細胞及び核の計数
【０２５８】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯに関しては、細胞は核計数法を使用して計測され、一方でＣｅｌｌ−Ｓｔａｃｋｓに関しては、細胞はトリパンブルー法を使用して計測された。
グルコース／乳酸塩の測定
【０２５９】
乳酸塩は、ＳｃｏｕｔＴＭ乳比重計を使用して測定された。グルコースは、ＡＣＣＵ−ＣＨＥＫ  Ａｖｉｖａ  Ｐｌｕｓシステムを使用して測定された。
Ｖｅｒｏの蘇生
【０２６０】
Ｖｅｒｏ細胞の蘇生が行われた。１ｍｌバイアルのＶｅｒｏ細胞を速やかに溶解させ（３分未満）、ＩｓａＳｅｐｔを用いて拭い、１９ｍＬの前もって温められたＤＭＥＭ  Ｄ１１４５（１０％ＦＢＳと２ｍＭグルタミンを補充されている）とＴ−７５フラスコ中で混合させた。アリコート（０．４ｍｌ）を細胞の計数及び活性のために採取し、Ｔ−７５フラスコを、３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーターに置いた。翌日、使用済み培地を廃棄し、新鮮な培地（２０ｍｌ）と入れ替え、培養を継続した。
Ｔ−１７５フラスコにおける培養及び継代
【０２６１】
Ｖｅｒｏ細胞の培養と継代が行われた。Ｔ−１７５に、２．６  Ｅ６細胞（０．０１５  Ｅ６細胞／ｃｍ２）で、５５ｍＬのワーキングボリューム（体積／表面積＝０．３１ｍＬ／ｃｍ２）で播種し、３７℃、ＣＯ２（５％）インキュベーター内でコンフルエンスに達するまで培養した。継代のために、Ｔ−１７５を２５ｍｌのＤＰＢＳを用いて２回リンスし、３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーター内で４ｍｌのＴｒｙｐＬＥを用いて５分間、細胞にトリプシン処理を行った。２１ｍＬの完全培地を加え、細胞計数のためにアリコートを採取した。
Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋｓにおける培養及び継代
【０２６２】
Ｖｅｒｏ細胞の培養と継代が行われた。Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋｓに、９．５  Ｅ６細胞／プレート（０．０１５  Ｅ６細胞／ｃｍ２）で、２００ｍＬ／プラトーのワーキングボリューム（体積／表面積＝０．３１ｍＬ／ｃｍ２）で播種し、３７℃、ＣＯ２（５％）インキュベーター内でコンフルエンスに達するまで培養した。継代のために、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋｓを１００ｍｌのＤＰＢＳ／プラトーを用いて２回リンスし、３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーター内で１０ｍｌのＴｒｙｐＬＥ／プラトーを用いて５分間、細胞にトリプシン処理を行った。５０ｍＬ／プラトーの完全培地を加え、細胞を回収し、細胞計数のためにアリコートを採取した。
対照Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋの感染
【０２６３】
培養培地を除去し、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ（ＣＳ）を１００ｍｌのＤＰＢＳ／プラトーを用いて２回リンスした。感染培地（２００ｍＬ／プラトー、ウイルス含有）でＣＳを満たし、５％ＣＯ２、３７℃で感染を行った。
ＮＡＮＯにおける培養
【０２６４】
ＮＡＮＯを組立て、６００ｍｌの培養培地で前もって満たし、調節を開始した。設定温度（３７℃）とｐＨ（７．２〜７．４）に達した時点で、ＮＡＮＯに播種した。播種に関し、所望された数の細胞を１Ｌ瓶において２００ｍｌの培養培地に再懸濁し、サンプリングループを使用して種細胞をバイオリアクターに投入した。サンプリングループは、瓶内で培地を前後に循環させることによりリンスされた。再循環ループは、播種後４時間〜１６時間（一晩）活性化され、それによって、キャリアへの細胞の最適な付着を得た。ＮＡＮＯの監視（グルコース及び乳酸塩の測定、培養パラメータのチェック）は、毎日行われた。
【０２６５】
感染を行う前に、バイオリアクターはＤＰＢＳで２回リンスされた。再循環ポンプ、及びすべての調節を停止させ、培養培地（８００ｍＬ）をＮＡＮＯから取り除いた。次いで８００ｍｌのＤＰＢＳでバイオリアクターを満たし、加熱及び攪拌を開始させ、５分間、リンスを行わせた。ＤＰＢＳを廃棄し、リンスを繰り返した。感染のため、所望される量のウイルス粒子を８００ｍＬの感染培地と混合させた。感染培地（ウイルス含有）でバイオリアクターを満たし、調節を開始した。残った感染培地（ウイルスは含まれていない）を含有する再循環瓶を循環ループに接続し、翌日に開始した。ＮＡＮＯ培養の間に使用されたコントローラー設定を以下の表１にまとめる。
【表１】
0006723253.tif 000002
TCID50テスト
【０２６６】
TCID50テストを行った。
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおけるＶｅｒｏ細胞増殖の評価
【０２６７】
４０ｍＬの固定層（２ｃｍの層高）圧縮（Ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）１ｘＮＡＮＯを使用してバイオリアクターでの培養を行った。バイオリアクターに、ランニングボリューム８００ｍＬで、０．０１５Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度で接種した。残りの８５０ｍＬを含有する瓶を、循環ループを介してバイオリアクターに接続し、総培養量１，６５０ｍＬとした。Ａｄｖａｎｃｅｄコントローラーをプログラムし、Ｔ°を３７℃に、（ＣＯ２又はＮａＯＨ注入により）ｐＨを７．４に、（空気／Ｏ２注入により）ＤＯを５０％超に、及び攪拌を６００ｒｐｍ（降下フィルムスピード２ｃｍ／秒に相当）に維持した。ＮＡＮＯと再循環瓶の間の培地の再循環のために、ＥａｓｙＬｏａｄヘッドが取り付けられたＭａｓｔｅｒＦｌｅｘポンプを２０ｒｐｍの速度で使用した（図１）。温度、ｐＨ及びＤＯは、Ａｄｖａｎｃｅｄコントローラーを使用して記録された。３日目及び６日目に、培地の完全交換を行い、８日目に培養を停止した。異なる時点でキャリアをサンプル採取し、クリスタルバイオレットを用いて染色した（図２Ａ〜２Ｃ）。対照として、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ１０（ＣＳ−１０）とＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ２（ＣＳ−２）を、３〜４日間、（同じ接種時細胞密度、培地量と面積の比を使用して）それぞれ培養し、培地交換は行わず、細胞はトリプシン処理され、計数された。
結果
【０２６８】
培養期間を通じて、継続的なグルコース消費と乳酸塩の産生が観察された。培地交換は３日目及び６日目に行われ、グルコース欠乏を回避し、乳酸蓄積が臨界濃度の２０〜２５ｍＭを超えないようにした。酸素消費は経時的に増加し、溶存酸素（ＤＯ）は空気／酸素の自動注入により設定された５０％を超えて維持されていた。温度及びｐＨは安定に維持された（図３）。
【０２６９】
最大細胞密度は８日目に達し、約０．８  Ｅ６細胞／ｃｍ２であった。対照Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋｓにおいて、細胞密度は３日目及び４日目でそれぞれ０．１３、及び０．２６  Ｅ６／ｃｍ２に達した（図４）。これらの結果から、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋと比較し、Ｖｅｒｏ細胞はｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおいて３倍を超える高い密度を達成したことが示された。１つのＮＡＮＯ  ４０ｍＬ固定層圧縮１ｘで、ＣＳ−１０の３個分と同数の細胞が生成された。
【０２７０】
培養培地の消費に関しては、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおいて、４．２  Ｅ９細胞を産生するために総量でおよそ５リットルが使用されたことから、１ｍｌで０．８５  Ｅ６個の細胞が産生出来ることを示している。比較としては、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋプレートにおいて、１ｍｌの培養培地で０．４２〜０．８２  Ｅ６個の細胞が産生された。したがって、ＮＡＮＯで観察された高い細胞密度は、類似した細胞当たりの培地量消費で得られた。
実施例２  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおける、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２でのＥＶ７１感染評価
【０２７１】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯで増殖したＶｅｒｏ細胞による、ＥＶ７１ウイルス産生の動態及び産生量を評価した。４０ｍｌの固定層圧縮１ｘバイオリアクターを使用し、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度でＥＶ７１感染を行った。
方法
【０２７２】
実施例１に記載されるようにＮＡＮＯに播種し、使用した総培養量は１，６５０ｍＬであった。３日目、培養培地を完全に入れ替えた。６日目、細胞密度は、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍに達した。従前に特徴解析がなされているＶｅｒｏ適合ＥＶ７１ウイルス株を使用した。継代８（Ｐ８）Ｖｅｒｏ適合ＥＶ７１株のアミノ酸突然変異を表２に示す。
【表２】
0006723253.tif 000003
【０２７３】
バイオリアクターをＤＰＢＳを用いて２回リンスし、２ｍＭグルタミンが補充されているが、ＦＢＳを欠くＤＭＥＭ  Ｄ１１４５を使用し、実施例１に記載されるように、ＥＶ７１を用いた感染を開始させた。バイオリアクター中の細胞密度が、対照のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋの細胞密度の２倍であったという事実を踏まえて、２倍量の感染培地を使用した（３，３００ｍＬ、すなわち、０．６２ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積の比率）。
【０２７４】
対照として、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ１０（６３６０ｃｍ２）に、同じ接種密度を使用して播種し、３７℃、ＣＯ２（５％）インキュベーター内で細胞を増殖させた。４日後（すなわち、３日目）、培養培地を破棄し、Ｃｅｌｌ  ＳｔａｃｋをＤＰＢＳを用いて２回リンスし、０．０２４のＭＯＩを使用してＥＶ７１感染を行った。使用した感染培地は培養培地と同じであるが、ＦＢＳを欠いていた。Ｖｅｒｏ細胞増殖及び感染に使用した培地の組成を表３に要約する。対照実験に対しては、一定の体積／表面積の比率、０．３１ｍＬ／ｃｍ２を使用した。ＥＶ７１  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養、及び対照のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ培養の概要を、それぞれ図５及び図６に示す。
【表３】
0006723253.tif 000004
結果
【０２７５】
前培養段階の間（すなわち、ウイルス感染前）、継続的なグルコース消費と乳酸塩の産生が、培養期間を通じて観察された（図７及び図８）。培地交換は３日目に行われ、グルコース欠乏を回避し、及び乳酸蓄積が臨界濃度の２０〜２５ｍＭを超えないようにした。酸素消費は経時的に増加し、溶存酸素（ＤＯ）は空気／酸素の自動注入により設定された５０％を超えて維持されていた。温度及びｐＨは安定に維持された。
【０２７６】
細胞密度は、６日目、感染の当日に０．５５  Ｅ６細胞／ｃｍ２に達した。感染後、グルコース消費と乳酸塩の産生は、きわめて低くなった（グルコースについては計測不能であり、乳酸塩については１ｇ／Ｌ−１／日未満であった）。これと一致して、著しいＤＯ増加により示されるように、酸素消費も低下した（図７）。細胞残渣の浮遊は、２ＤＰＩから見え始め、経時的に数が増加した。
【０２７７】
対照のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋにおいて、細胞変性効果（ＣＰＥ）は２ＤＰＩから見え、経時的に増加した（図９）。４ＤＰＩで、約５％未満のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋが未だ接着細胞で覆われていた。
【０２７８】
指定された感染後日数（ＤＰＩ）のサンプルに対するＴＣＩＤ５０検査結果を表４及び表５に示す。ＴＣＩＤ５０の結果は、シンガポールとブリュッセルで行われた検査間で、類似していた。
【表４】
0006723253.tif 000005
【表５】
0006723253.tif 000006
実施例３  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおける、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度でのＥＶ７１感染評価
【０２７９】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯで増殖したＶｅｒｏ細胞による、ＥＶ７１ウイルス産生の動態及び産生量を評価した。４０ｍｌの固定層圧縮１．５ｘバイオリアクターを使用し、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度でＥＶ７１感染を行った。
方法
【０２８０】
実施例１に記載されるようにＮＡＮＯに播種し、使用した総培養量は２，５００ｍＬであった。前培養段階の間、培地交換は行われなかった。３日目、細胞密度は、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２に達した。バイオリアクターはＤＰＢＳでリンスされ、ＥＶ７１感染は０．０２４のＭＯＩを使用して開始された。実施例２に記載されるように、使用した感染培地は培養培地と同じであるが、ＦＢＳを欠いていた。感染の間に使用された培養量は２，５００ｍＬであった（すなわち、０．３１ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積の比率）。対照として、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ５（ＣＳ−５）を実施例２に記載されるように培養し、感染させた。Ｖｅｒｏ細胞増殖及び感染に使用した培地の組成は、実施例２の表３に要約されている。ＥＶ７１  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養の概要を図１０に示す。
結果
【０２８１】
前培養段階の間（すなわち、ウイルス感染前）、グルコース消費と乳酸塩の産生が、培養期間を通じて観察された（図１１及び図１２）。ＤＯの低下により示されるように、酸素消費は増加した。ＤＯは空気／酸素の自動注入により設定された５０％を超えて維持されていた。温度及びｐＨは安定に維持された。４日目の細胞の総量は、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ４０  圧縮１ｘを使用した細胞の約１．５  Ｅ９と比較し、２．０Ｅ９であった。この増加（約３５％）は、圧縮１．５Ｘを使用して展開された、より大きな表面積と一致していた。
【０２８２】
４日目、細胞密度は０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２に達し、感染が開始された。感染後、グルコース、酸素消費、及び乳酸塩の産生は著しく低くなった。細胞残渣の浮遊は、２ＤＰＩから見え始め、経時的に数が増加した。対照Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ５は、実験２の対照と同様に振る舞い、ＣＰＥは２ＤＰＩから見え始めた。
【０２８３】
指定された感染後日数（ＤＰＩ）のサンプルに対するＴＣＩＤ５０検査結果を表６及び表７に示す。最も高い力価（３．１６Ｅ７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、表６）は、ＮＡＮＯにおいて４ＤＰＩ後に得られ、これは対照のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋで得られた最も高い力価（１．０  Ｅ７ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、表６）よりもやや高かった。同じサンプルで行われた補助的なＴＣＩＤ５０分析で、ＮＡＮＯで得られるウイルス力価が、対照Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋよりもやや高かったことが確認された（表７）。
【表６】
0006723253.tif 000007
【表７】
0006723253.tif 000008
実施例４  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおける、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度でのポリオＳ２感染評価
【０２８４】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯバイオリアクターで増殖したＶｅｒｏ細胞によるポリオＳ２ウイルス産生を評価した。４０ｍｌの固定層圧縮１ｘバイオリアクターを使用し、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度でポリオ感染を行った。
方法
【０２８５】
Ｃｙｔｏｄｅｘバイオリアクターを使用し、ポリオＳ２を培養した。増殖期に使用した培地は、１ｇ／Ｌのグルコースを含有し、フルクトース（１ｇ／Ｌ）と５％ＦＢＳを補充されたＤＭＥであった。ｐＨの設定は７．１５であった。播種密度は０．００２〜０．００４５  Ｅ６細胞／ｃｍ２であった。培養量と表面積の比率は０．０４５ｍＬ／ｃｍ２、及び感染時の密度は０．０５５  Ｅ６細胞／ｃｍ２であった。図１３にポリオＳ２Ｃｙｔｏｄｅｘ処理を要約する。
【０２８６】
１，６５０ｍＬの総培養量を使用し、記載されるようにｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯに播種し、細胞を増殖させた。３日目、培養培地を入れ替えた。６日目、細胞密度は、１．５５  Ｅ６細胞／ｃｍ２に達した。バイオリアクターはＤＰＢＳでリンスされ、ポリオＳ２を用いた感染は、感染培地としてＭ１９９を使用し、０．００２のＭＯＩを用いて開始された。バイオリアクター中の細胞密度が、対照のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋの細胞密度の２倍であったことから、２倍量の感染培地を使用した（３，３００ｍＬ、すなわち、０．６２ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積の比率）。感染の間、温度は３４℃に設定された。
【０２８７】
対照として、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ１０（６３００ｃｍ２）に、同じ接種密度を使用して播種し、３７℃、ＣＯ２（５％）インキュベーター内で細胞を増殖させた。４日後、培養培地を破棄し、Ｃｅｌｌ  ＳｔａｃｋをＤＰＢＳを用いて２回リンスした。ＦＢＳを欠いているが同じ培養培地を使用して、ポリオＳ２感染を行った。対照実験の間、一定の体積／表面積の比率の０．３１ｍＬ／ｃｍ２を使用した。Ｖｅｒｏ細胞増殖及びポリオ感染に使用した培地の組成を表８に要約する。ポリオ  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養、及び対照のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ培養の概要を、それぞれ図１４及び図１５に示す。ＮＡＮＯ培養の間に使用されたコントローラー設定を以下の表９にまとめる。
【表８】
0006723253.tif 000009
【表９】
0006723253.tif 000010
結果
【０２８８】
前培養の間、グルコース消費と乳酸塩の産生が観察された（図１６）。３日目、細胞密度は０．１３５  Ｅ６細胞／ｃｍ２に達し、培地交換が行われた。６日目、細胞密度は０．５５  Ｅ６細胞／ｃｍ２に達し、Ｍ１９９培地（グルコース濃度は１ｇ／Ｌ）を使用して感染が行われた。感染後、グルコース消費と乳酸塩の産生は、きわめて低くなった（グルコースについては検出限界以下。乳酸塩については１ｇ．Ｌ−１／日未満）。細胞残渣の浮遊は、３ＤＰＩから見え始め、経時的に数が増加した。
【０２８９】
対照Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋにおいて、継続的なグルコースの減少が観察され、８日目（４ＤＰＩ）には検出限界にまで低下した（図１７）。上清の濁りは４ＤＰＩから観察され、経時的に増加したことから、細胞変性効果（ＣＰＥ）が示唆される（図１８）。
【０２９０】
指定された感染後日数（ＤＰＩ）のサンプルに対するＴＣＩＤ５０検査結果を表１０に示す。ＮＡＮＯで得られた最も高い力価（１０７．９）と、対照Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋで得られた最も高い力価（１０８．３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）は類似していた。Ｄ抗原含有量検査がＥＬＩＳＡにより行われ、結果はＴＣＩＤ５０値と一致していた。
【表１０】
0006723253.tif 000011
実施例５  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおける、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度でのポリオＳ２感染評価
【０２９１】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯバイオリアクターで増殖したＶｅｒｏ細胞によるポリオＳ２ウイルス産生を評価した。４０ｍｌの固定層圧縮１．５ｘバイオリアクターを使用し、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度で感染を行った。
方法
【０２９２】
実施例１に記載されるようにＮＡＮＯに播種し、使用した総培養量は２，５００ｍＬであった。前培養段階の間、培地交換は行われなかった。４日目、細胞密度は、０．２３  Ｅ６細胞／ｃｍ２に達した。バイオリアクターはＤＰＢＳでリンスされ、ポリオＳ２を用いた感染は、感染培地としてＭ１９９を使用し、０．０２のＭＯＩを用いて開始された。感染の間に使用された培養量は２，５００ｍＬであった（すなわち、０．３１ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積の比率）。
【０２９３】
対照として、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ５を実験２に記載されるように培養し、感染させた。６日目のグルコース消費は０．２８ｇ／Ｌにまで低下した。０．７２ｇのグルコースを２５ｍｌのＤＰＢＳに溶解させ、０．２２ミクロンでろ過し、これを添加して１ｇ／Ｌの最終濃度に達した。Ｖｅｒｏ細胞増殖とポリオの感染に使用された培地の組成は、実施例４の表８に要約されている。ポリオ  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養の概要を図１９に示す。ＮＡＮＯ培養の間に使用されたコントローラー設定は、実施例４の表９に要約されている。
結果
【０２９４】
前培養段階の間、乳酸塩の増加が観察された。溶存酸素（ＤＯ）の低下により示されるように、酸素消費は増加した。ＤＯは空気／酸素の自動注入により設定された５０％を超えて維持されていた。温度及びｐＨは安定に維持された（図２０）。
【０２９５】
４日目、細胞密度は０．２３  Ｅ６細胞／ｃｍ２に達し、感染が開始された。ポリオＳ２の感染後、グルコース、酸素消費、及び乳酸塩の産生は著しく低くなった（図２０）。細胞残渣の浮遊は、２ＤＰＩから見え始め、経時的に数が増加した。
【０２９６】
対照Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋにおいて、継続的なグルコースの減少が観察され、６日目には０．２８ｇ／Ｌにまで低下した。１．７２ｇのグルコースを添加し、培養を続行した（図２１）。上清の濁りは４ＤＰＩから観察され、経時的に増加したことから、細胞変性効果（ＣＰＥ）が示唆される（図２２）。
【０２９７】
指定された感染後日数（ＤＰＩ）のサンプルに対するＴＣＩＤ５０検査結果を表１１に示す。ＮＡＮＯで得られた最も高い力価（１０７．８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）と、対照Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋで得られた最も高い力価（１０８．３  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）は類似していた。Ｄ抗原含有量検査がＥＬＩＳＡにより行われ、結果はＴＣＩＤ５０値と一致していた。
【表１１】
0006723253.tif 000012
実施例６  実験パラメータの要約
【０２９８】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ及びＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋで行われた実験１〜５の重要なパラメータの要約を以下の表１２及び１３に示す。
【表１２】
0006723253.tif 000013
【表１３】
0006723253.tif 000014
実施例７  最適化実験：ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養中のＥＶ７１  ＭＯＩを２０倍まで減少させることによる影響
【０２９９】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養中のＥＶ７１  ＭＯＩを２０倍まで、つまり０．０２から０．００１まで減少させることの影響を評価した。ＭＯＩを減少させることにより、対応するウイルス種バンクの量とコストが低下する。
方法
【０３００】
接種時の細胞密度を２０倍減少させることによる影響を評価するために、２つのｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養を行い、０．００１のＭＯＩを使用して、０．２５、又は０．５ｘ１０Ｅ６細胞／ｃｍ２のいずれかの密度で感染させた。次いでこれらの培養を、同様の条件下で、しかしＭＯＩは０．０２で感染させたｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養と比較した。ウイルス生産性を、ＴＣＩＤ５０法を使用して評価した。
結果
【０３０１】
ＴＣＩＤ５０の結果を表１４に示す。０．２５ｘ１０Ｅ６細胞／ｃｍ２の低細胞密度では、高いＭＯＩで５倍高い生産性が得られた。０．５ｘ１０Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度では、高いＭＯＩと低いＭＯＩの間で有意な差は観察されなかった。さらに、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋで行われた実験から、ＭＯＩ（０．０２〜０．０００１）は生産性に有意な影響を与えないことが示唆された。これらの結果にもとづき、低ＭＯＩ（０．００１）がその後の実験に選択された。
【表１４】
0006723253.tif 000015
実施例８  最適化実験：ＥＶ７１感染時の最適な細胞密度の決定及び生産性のピーク
【０３０２】
感染時の細胞密度はウイルス生産性に大きな影響を与える。ＥＶ７１感染時の最適な細胞密度、及びウイルス放出動態を評価し、生産性のピークを決定した。
方法
【０３０３】
一連の５つのｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養に、ＥＶ７１（ＭＯＩは０．００１）を異なる細胞密度で感染させた。以下の培養条件を使用した：接種時の細胞密度：１５，０００細胞／ｃｍ２、増殖培地：Sigma  D1145+10%  FBS+  4mMグルタミン、感染培地：ＦＢＳが無い増殖培地、体積／表面積の比率：0.3mL/cm2.  増殖期の間に培地を完全に交換し、以下の密度に達した：０．５５、０．７及び０．８６ｘ１０  Ｅ６細胞／ｃｍ２.  培養は完全に監視され（グルコース消費、乳酸塩の産生、細胞密度、ＤＯ、ｐＨ）、ウイルス生産性は感染後のそれぞれの日にＴＣＩＤ５０法により測定された。
結果
【０３０４】
個別の（細胞当たりの）生産性は、細胞密度が増加するにつれて低下した（図２３Ａ〜２３Ｄ）。最も高い体積生産性は、最も低い細胞密度で観察されたことから、細胞密度を高くしても、個別生産性の低さを補完しなかったことが示唆される。
【０３０５】
全体として、０．２及び０．３５ｘ１０  Ｅ６細胞／ｃｍ２の密度の両方で類似した最大生産性が得られたことから、この範囲内で総生産性は細胞密度と無関係であることが示唆された。最大生産性は、感染３日後に（感染日が０日目）低い細胞密度で得られ、少なくともさらに４日、安定したままであった。高い細胞密度では、生産性のピークは感染４〜５日後に達し、その後、生産性は低下した。
【０３０６】
結論として、学説に拘束されることは望まないが、低細胞密度（例えば０．２〜０．３５ｘ１０５細胞／ｃｍ２）が有益であることがデータから示されるが、その理由としては限定されないが以下が挙げられる：個別の生産性（細胞当たり）、体積生産性（回収物ｍＬ当たり）、経時的な安定性、培地消費の少なさ、及び低密度の細胞を起因とするＨＣＰとＤＮＡのコンタミネーションの少なさ。逆に、学説に拘束されることは望まないが、高細胞密度（例えば＞０．５ｘ１０５細胞／ｃｍ２）では生産性が低く、経時的に安定性が乏しくなり、培地消費も高く、そして高い細胞密度を起因とするＨＣＰとＤＮＡのコンタミネーションの多さが生じ得ることがデータから示される。
実施例９  最適化実験：ＥＶ７１接種時の細胞密度低下の影響
【０３０７】
接種量低下による潜在的な利益としては以下が挙げられる：（ｉ）作業時間の短縮、及び（ｉｉ）コンタミネーションのリスク低下。接種時、細胞密度を３倍まで低下させることによる影響を評価した。
方法
【０３０８】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養に、５，０００細胞／ｃｍ２の低密度で接種し、１５，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で接種されたｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯと比較した。両方のｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯに、０．００１のＭＯＩを使用して、３５０，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で感染させた。増殖期及び感染期の間の体積／表面積の比率は、０．３ｍＬ／ｃｍ２であった。
結果
【０３０９】
増殖期の間、グルコース消費と乳酸塩の産生は、２条件の間で類似していた（図２４）。接種時に低細胞密度を使用した場合、感染時の標的細胞密度に達するまで、約４８時間の遅延が観察された。２つの培養の間に、ウイルスの生産性には有意差は観察されなかった（表１５）。
【表１５】
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【０３１０】
データから、接種時の細胞密度を５，０００細胞／ｃｍ２にまで低下させることにより、（ｉ）ウイルス生産性には影響を与えないこと、（ｉｉ）培地／代謝物の消費が増加しないこと、及び（ｉｉｉ）最大で４８時間まで増殖期が延長されること、が示された。結論として、学説に拘束されることは望まないが、接種時の細胞密度を低下させることが有益であることがデータから示され、その理由としては、限定されないが以下が挙げられる：接種菌量、作業時間、前培養段階の負荷量、インキュベーターの数、及びコンタミネーションのリスク。
実施例１０  最適化実験：増殖期の間のＦＢＳ濃度、及び体積／表面積比率の低下の影響
【０３１１】
細胞増殖又はウイルス生産性に対する、使用する培養量の低下（体積／表面積の比率の低下）の影響、又はＦＢＳ濃度の低下の影響を評価した。
方法
【０３１２】
一連の実験はＴ−フラスコで行い、グルコース消費と乳酸塩の産生と共に細胞密度を監視した。また、増殖期に５％ＦＢＳを使用し、５，０００細胞／ｃｍ２の低接種密度を使用したｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯの培養も行った。約０．２５ｘ１０  Ｅ６細胞／ｃｍ２の密度まで細胞を増殖させ、その後、ＥＶ７１を感染させた（ＭＯＩ＝０．００１）。ウイルス生産性を分析した。
結果
【０３１３】
Ｔフラスコ培養での２つの条件ともに、２００，０００細胞／ｃｍ２の標的細胞密度に達した。（１）は１０％ＦＢＳ、体積／表面積の比率が０．２、（２）は５％ＦＢＳ、体積／表面積の比率は０．３であった（図２５）。ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養において、ＦＢＳ濃度の２倍の低下は、増殖期又はウイルス生産性に有意な影響を与えなかった（表１６）。
【表１６】
0006723253.tif 000017
【０３１４】
データから、増殖期にＦＢＳ濃度を１０％から５％に低下させても増殖期間又はウイルス生産性に有意な影響を与えなかったことが示された。
実施例１１  最適化されたＥＶ７１  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養の条件の要約
【０３１５】
最適化実験（実施例７〜１０）前及び後の両方のｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおけるＥＶ７１の培養パラメータを、表１７に示す。得られたｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ実験の設定も図２６に要約する。最適化実験の設定において、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯに、５，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で接種し、４ｍＭグルタミンと５％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ  Ｄ１１４５、４．５ｇ／Ｌのグルコース含有）中、３７℃、ｐＨ７．４で６日間、細胞を増殖させ（培地交換は行っていない）、０．２ｘ１０６細胞／ｃｍ２の細胞密度に到達させた。体積／表面積の比率は０．３ｍＬ／ｃｍ２であった。感染のために、２回のリンス工程を行い、アルブミンと他のＦＢＳ含有タンパク質を取り除いた。感染は、４ｍＭグルタミンを補充したが、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ  Ｄ１１４５）中で行い、同じ体積／表面積の比率の０．３ｍＬ／ｃｍ２と、０．００１のＭＯＩを使用した。感染後、３〜４日で回収を行った。
【表１７】
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実施例１２  最適化：ＥＶ７１プロセスの頑健性
【０３１６】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ実験の最大ＥＶ７１生産性のまとめを図２７に示す。これら各実験は、０．００１〜０．０２の範囲のＭＯＩ、５，０００〜１５，０００細胞／ｃｍ２の接種物密度、０．２〜約０．８ｘ１０６細胞／ｃｍ２の範囲の感染時密度、及び様々なＦＢＳ濃度を使用して行われた。ウイルス生産性は、１ログ未満で変化し、回収物は１０７〜１０８のＴＣＩＤ５０／ｍＬの範囲であった。
実施例１３  ｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００におけるＥＶ７１プロセス
【０３１７】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（２ｃｍの層高）からｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００（２ｃｍの層高）へと、ＥＶ７１産生の規模を拡大させる能力について評価した。実施例１１に提示される、最適化後の細胞培養パラメータを使用した。ただし、１０％のＦＢＳ濃度を増殖期に使用した点は除く。
方法
【０３１８】
単回使用のバイオマスプローブを備え、ｉＣＥＬＬｉｓ  Ｓｋｉｄにより操作される、ｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００バイオリアクター（２ｃｍの層高、５Ｌの固定層で１００ｍ２の表面積を展開する）を使用し、培養を行った。培養プロセスの全体図を図２８に示し、ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００培養の実験設定を図２９に示す。対照として、ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００培養に対し使用されたものと同じ原料物質を使用してｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養とＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ培養が行われた。
接種物
【０３１９】
５０億個のＶｅｒｏ細胞（５ｘ１０９）を使用し、５，０００細胞／ｃｍ２の密度でｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００に播種した。接種物は、一連の増幅工程を介して作製された。４個のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ１０を使用し、ｉＣＥＬＬｉｓ  １００ｍ２に対し所望される量の接種物を生成した。
増殖期
【０３２０】
増殖期は、４ｍＭグルタミンと１０％ＦＢＳを補充された０．３ｍＬ／ｃｍ２のＤＭＥＭ培地（４．５ｇ／Ｌグルコース）を使用し、６日間行われ（抗生物質は添加されていない）、細胞密度は、０．２ｘ１０６細胞／ｃｍ２の最適密度に達した。培地交換は行われなかった。温度は３７℃に維持され、ｐＨはＣＯ２とＮａＯＨの自動注入により７．４で維持された。酸素濃度は、空気／又は酸素の自動注入により５０％を超えて維持された。
【０３２１】
培養は、再循環バッチモードで行われ、以下の様に分けられた総量３００Ｌを使用した：６５Ｌがバイオリアクター内に、残りの２３５Ｌは、ｐａｌｌｅｔａｎｋ内の５００Ｌバッグに入れた。バイオリアクターとバッグの間の再循環は、Ｓｋｉｄの蠕動ポンプを使用して０．２５Ｌ／分の速度で行い、それによって２０時間毎に培養培地の完全な再循環が可能となった。再循環は播種後４０時間で開始され、（ｉ）キャリアへの細胞の最適な固着が可能となり、及び（ｉｉ）分泌増殖因子の希釈が低下した。
【０３２２】
以下のパラメータの継続監視は、Ｓｋｉｄコントローラーによって自動で行われた：Ｔ°、ｐＨ、固定層前後のＤＯ、伝導性、及びバイオマス（静電容量）。バイオマスプローブを使用して、細胞密度（及び、感染の時機）を評価し、及び細胞変性効果を監視したところ、変性に起因して進行性で大きなバイオマスシグナルの低下が発生した（図３０Ａ〜３０Ｃ）。培養の間に消費された空気、酸素、ＣＯ２及びＮａＯＨの量も記録された。毎日のサンプル採取が行われ、ｐＨ（測定値外）、グルコース、及び乳酸塩濃度を測定した。
感染期
【０３２３】
感染期は、増殖期と同一のＴ°、ｐＨ及びＤＯ条件下で、４ｍＭグルタミンを補充された０．３ｍＬ／ｃｍ２のＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌグルコース）を使用した無血清感染培地中で行われた。
【０３２４】
感染の前に、バイオリアクターの固定層を６５Ｌの感染培地で２回リンスし、ＦＢＳと他の血清タンパク質を除去した。感染は、バイオリアクターにおいて、適切な量のウイルス種を、０．００１のＭＯＩに達するまで混合することにより行われた。この工程の間、バッグ内のウイルスのロスを防ぐために、バイオリアクターとバッグの間の再循環を４時間停止させ、再スタートさせた。
【０３２５】
細胞培養の監視は、増殖期と同じように行われた。さらに、リアクター及び再循環バッグにおいて、ＱＣ分析（ＴＣＩＤ５０、ＨＣＰ、ＤＮＡ定量）のためのサンプルが採取された。
回収及び精製
【０３２６】
長期間にわたるウイルス動態実験を行うため、感染後６日（６ＤＰＩ）まで感染を続行させた。中間回収（４０Ｌ）が３ＤＰＩで行われ、最終回収は６ＤＰＩで行われた。両回収物は、引き続くＤＳＰ実験のためにＢｉｏ−２０（ＰＡＬＬ社）深層フィルター上で精製された。
ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００の操作
【０３２７】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００実験は、抗生物質無しの滅菌条件下で行われた。全ての接続は、Ｂｉｏ−Ｗｅｌｄｅｒ又は無菌コネクターを使用し、無菌的に行われた。適切な連結管を使用し、層流の下で培養サンプルが採取された。
結果
【０３２８】
細胞増殖、代謝物消費（グルコース、溶存酸素）、及び代謝物産生（乳酸塩）に関し、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ対照と類似の方法でｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００培養が行われた（図３０Ａ〜３０Ｅ）。
【０３２９】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００においてウイルスの生産性は、３ＤＰＩの回収物で最大で５．０ｘ１０７ＴＣＩＤ５０／ｍＬの力価に達し、総量で１．５ｘ１０１３ＴＣＩＤ５０の産生量であった（図３１Ａ〜３１Ｃ及び図３２）。生産性は６ＤＰＩまで安定に維持されていた。ＨＣＰとＤＮＡは、それぞれ、４ＤＰＩと５ＤＰＩで最大に達した。
【０３３０】
これらの結果から、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおいて開発され、小規模で最適化されていたＥＶ７１培養プロセスのスケールアップが成功したことが示された。ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００で得られたウイルス力価及び総産生量は、小規模培養で得られたものと類似していた。
実施例１４  増殖期に５％ＦＢＳを用いたｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００
【０３３１】
ＥＶ７１を、５％に低下させたＦＢＳ濃度を使用したことを除き、実施例１３に記載されるようにｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００において産生させる。
実施例１５  無血清培地（ＳＦＭ）におけるＥＶ７１処理
【０３３２】
Ｔ−フラスコにおけるＥＶ７１感染は、無血清（ＳＦＭ、ＯｐｔｉＰｒｏ）培地又は１０％ＦＢＳ（Ｍ１９９）培地を使用して行われた（図３３）。徐々に適合されたＶｅｒｏ細胞株におけるウイルス産生、及び永続的に無血清培地に適合された細胞株におけるウイルス産生を評価した。ウイルス感染期に無血清培地又は１０％ＦＢＳ培地を使用した場合、細胞増殖及びウイルス生産性（ＴＣＩＤ５０）は類似していた（表１８）。無血清条件下でのＥＶ７１の産生は、ＧＭＰ  Ｖｅｒｏ  ＳＦＭ適合細胞株を使用し、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおいて引き続き評価される。
【表１８】
0006723253.tif 000019
実施例１６  プロセス開発戦略
【０３３３】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＥＶ７１産生の全体的なプロセス開発戦略を図３４に示す。第一の工程（実現可能性の検討実験）は実施例１〜３に示した。第二の工程（ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ  ２ｃｍ層高でのプロセス最適化）は実施例７〜１０に示した。第三の工程のスケールアップは、「水平」スケールアップ（バイオリアクターの固定層高さは一定に維持し、その直径を大きくする）と「垂直」スケールアップ（固定層高さを高くし、直径は一定に維持する）へと分けられる。水平スケールアップ（ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００、２ｃｍ層高）は実施例１３に示した。垂直スケールアップは、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ  １０ｃｍ層高（２００ｍＬ、４ｍ２）において、５％ＦＢＳで最適化されたプロセスを使用し行われる。工業規模のＥＶ７１培養は、ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／５００（１０ｃｍの層高）で行われる（図３５）。
実施例１７  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおける、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度でのＣＡ６及びＣＡ１６の感染評価
【０３３４】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯで増殖したＶｅｒｏ細胞による、ＣＡ６ウイルス及びＣＡ１６ウイルス産生の動態及び産生量を評価する。４０ｍｌの固定層圧縮１ｘバイオリアクターを使用し、０．５２  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度でＣＡ６とＣＡ１６の感染を行う。
方法
【０３３５】
実施例１に記載されるようにＮＡＮＯに播種し、使用する総培養量は１，６５０ｍＬである。３日目、培養培地を完全に入れ替える。従前に特徴解析されているＶｅｒｏ適合ＣＡ６ウイルス株及びＣＡ１６ウイルス株を使用する。継代１１（Ｐ１１）ＣＡ６及び継代３（Ｐ３）ＣＡ１６のＶｅｒｏ適合株の核酸突然変異及びアミノ酸突然変異を表１９及び２０に示す。
【表１９】
0006723253.tif 000020
【表２０】
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【０３３６】
バイオリアクターをＤＰＢＳを用いて２回リンスし、２ｍＭグルタミンが補充されているが、ＦＢＳを欠くＤＭＥＭ  Ｄ１１４５を使用し、実施例１に記載されるように、ＣＡ６とＣＡ１６を用いた感染を開始させる。バイオリアクター中の細胞密度は、対照のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋの細胞密度の２倍であるという事実を踏まえ、感染培地の量も２倍を使用する（３，３００ｍＬ、すなわち、体積／表面積の比率は０．６２ｍＬ／ｃｍ２）。
【０３３７】
対照として、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ１０（６３６０ｃｍ２）に、同じ接種密度を使用して播種し、３７℃、ＣＯ２（５％）インキュベーター内で細胞を増殖させる。４日後（すなわち、３日目）、培養培地を破棄し、Ｃｅｌｌ  ＳｔａｃｋをＤＰＢＳを用いて２回リンスし、０．０２４のＭＯＩを使用してＣＡ６とＣＡ１６の感染を行う。使用する感染培地は培養培地と同じであるが、ＦＢＳを欠いている。Ｖｅｒｏ細胞増殖及び感染に使用する培地の組成を表２１に要約する。対照実験に対しては、一定の体積／表面積の比率、０．３１ｍＬ／ｃｍ２を使用する。
【表２１】
0006723253.tif 000022
実施例１８  ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおける、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度でのＣＡ６及びＣＡ１６の感染評価
【０３３８】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯで増殖したＶｅｒｏ細胞による、ＣＡ６ウイルス及びＣＡ１６ウイルス産生の動態及び産生量を評価する。４０ｍｌの固定層圧縮１．５ｘバイオリアクターを使用し、０．２５  Ｅ６細胞／ｃｍ２の細胞密度でＣＡ６とＣＡ１６の感染を行う。
方法
【０３３９】
実施例１に記載されるようにＮＡＮＯに播種し、使用する総培養量は２，５００ｍＬである。前培養段階の間、培地交換は行われない。バイオリアクターはＤＰＢＳでリンスされ、ＣＡ６とＣＡ１６の感染は０．０２４のＭＯＩを使用して開始される。実施例１７に記載されるように、使用される感染培地は培養培地と同じであるが、ＦＢＳを欠いている。感染の間に使用される培養量は２，５００ｍＬである（すなわち、０．３１ｍＬ／ｃｍ２の体積／表面積の比率）。対照として、Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ５（ＣＳ−５）を実施例１７に記載されるように培養し、感染させる。Ｖｅｒｏ細胞増殖及び感染に使用される培地の組成は、実施例１７の表２１に要約されている。
実施例１９  最適化実験：ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養においてＣＡ６とＣＡ１６のＭＯＩを２０倍まで低下させることによる影響
【０３４０】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養においてＣＡ６とＣＡ１６のＭＯＩを２０倍まで、つまり０．０２から０．００１まで減少させることの影響を評価する。ＭＯＩを減少させることにより、対応するウイルス種バンクの量とコストが低下する。
方法
【０３４１】
接種時の細胞密度を２０倍減少させることによる影響を評価するために、２つのｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養を行い、０．００１のＭＯＩを使用して、０．２５、又は０．５ｘ１０Ｅ６細胞／ｃｍ２  のいずれかの密度で感染させる。次いでこれらの培養を、同様の条件下で、しかしＭＯＩは０．０２で感染させたｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養と比較する。ウイルス生産性を、ＴＣＩＤ５０法を使用して評価する。
実施例２０  最適化実験：ＣＡ６とＣＡ１６の感染時の最適な細胞密度の決定及び生産性のピーク
【０３４２】
感染時の細胞密度はウイルス生産性に大きな影響を与える。ＣＡ６とＣＡ１６の感染時の最適な細胞密度、及びウイルス放出動態を評価し、生産性のピークを決定する。
方法
【０３４３】
一連の５つのｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養に、ＣＡ６とＣＡ１６（ＭＯＩは０．００１）を異なる細胞密度で感染させる。以下の培養条件を使用する：接種時の細胞密度：１５，０００細胞／ｃｍ２、増殖培地：Sigma  D1145+10%  FBS+  4mMグルタミン、感染培地：ＦＢＳが無い増殖培地、体積／表面積の比率：0.3mL/cm2。増殖期の間に培地を完全に交換し、以下の密度に達する：０．５５、０．７及び０．８６ｘ１０  Ｅ６細胞／ｃｍ２。培養は完全に監視され（グルコース消費、乳酸塩の産生、細胞密度、ＤＯ、ｐＨ）、ウイルス生産性は感染後のそれぞれの日にＴＣＩＤ５０法により測定される。
実施例２１  最適化実験：ＣＡ６とＣＡ１６の接種時の細胞密度低下の影響
【０３４４】
接種量低下による潜在的な利益としては以下が挙げられる：（ｉ）作業時間の短縮、及び（ｉｉ）コンタミネーションのリスク低下。接種時、細胞密度を３倍まで低下させることによる影響を評価する。
方法
【０３４５】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養に、５，０００細胞／ｃｍ２の低密度で接種し、１５，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で接種されたｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯと比較する。両方のｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯに、０．００１のＭＯＩを使用して、３５０，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度でＣＡ６とＣＡ１６を感染させる。増殖期及び感染段階の体積／表面積の比率は、０．３ｍＬ／ｃｍ２である。
実施例２２  最適化実験：増殖期の間のＦＢＳ濃度、及び体積／表面積比率の低下の影響
【０３４６】
細胞増殖、又はＣＡ６及びＣＡ１６のウイルス生産性に対する、使用する培養量の低下（体積／表面積の比率の低下）の影響、又はＦＢＳ濃度の低下の影響を評価する。
方法
【０３４７】
一連の実験はＴ−フラスコで行い、グルコース消費と乳酸塩の産生と共に細胞密度が監視される。また、増殖期に５％ＦＢＳを使用し、５，０００細胞／ｃｍ２の低接種密度を使用したｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯの培養も行う。約０．２５ｘ１０  Ｅ６細胞／ｃｍ２の密度まで細胞を増殖させ、その後、ＣＡ６及びＣＡ１６を感染させた（ＭＯＩ＝０．００１）。ＣＡ６とＣＡ１６のウイルス生産性を分析する。
実施例２３  ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００におけるＣＡ６及びＣＡ１６のプロセス
【０３４８】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ（２ｃｍの層高）からｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００（２ｃｍの層高）へと、ＣＡ６及びＣＡ１６の産生をスケールアップさせる能力について評価した。最適化後の細胞培養パラメータを使用する。ただし、１０％のＦＢＳ濃度を増殖期に使用する点は除く。
方法
【０３４９】
単回使用のバイオマスプローブを備え、ｉＣＥＬＬｉｓ  Ｓｋｉｄにより操作される、ｉＣＥＬＬｉｓ５００／１００バイオリアクター（２ｃｍの層高、５Ｌの固定層で１００ｍ２の表面積を展開する）を使用し、培養を行う。対照として、ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００培養に対し使用されたものと同じ原料物質を使用してｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯ培養とＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ培養が行う。
接種物
【０３５０】
５０億個のＶｅｒｏ細胞（５ｘ１０９）を使用し、５，０００細胞／ｃｍ２の密度でｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００に播種する。接種物は、一連の増幅工程を介して作製される。４個のＣｅｌｌ  Ｓｔａｃｋ１０を使用し、ｉＣＥＬＬｉｓ  １００ｍ２に対し所望される量の接種物を産生する。
増殖期
【０３５１】
増殖期は、４ｍＭグルタミンと１０％ＦＢＳを補充された０．３ｍＬ／ｃｍ２のＤＭＥＭ培地（４．５ｇ／Ｌグルコース）を使用し、６日間行われ（抗生物質は添加されていない）、細胞密度は、０．２ｘ１０６細胞／ｃｍ２の最適密度に達する。培地交換は行われない。温度は３７℃であり、ｐＨはＣＯ２とＮａＯＨの自動注入により７．４で維持される。酸素濃度は、空気／又は酸素の自動注入により５０％を超えて維持される。
【０３５２】
培養は、再循環バッチモードで行われ、以下の様に分けられた総量３００Ｌを使用する：６５Ｌがバイオリアクター内に、残りの２３５Ｌは、ｐａｌｌｅｔａｎｋ内の５００Ｌバッグに入れた。バイオリアクターとバッグの間の再循環は、Ｓｋｉｄの蠕動ポンプを使用して０．２５Ｌ／分の速度で行い、それによって２０時間毎の培養培地の完全な再循環が可能となる。再循環は播種後４０時間で開始され、（ｉ）キャリアへの細胞の最適な固着が可能となり、及び（ｉｉ）分泌増殖因子の希釈が低下する。
【０３５３】
以下のパラメータの継続的監視は、Ｓｋｉｄコントローラーによって自動で行われる：Ｔ°、ｐＨ、固定層前後のＤＯ、伝導性、及びバイオマス（静電容量）。バイオマスプローブを使用して、細胞密度（及び、感染の時期）を評価し、及び細胞変性効果を監視する。培養の間に消費された空気、酸素、ＣＯ２及びＮａＯＨの量も記録される。毎日のサンプル採取が行われ、ｐＨ（測定値外）、グルコース、及び乳酸塩濃度が測定される。
感染期
【０３５４】
感染期は、増殖期と同一のＴ°、ｐＨ及びＤＯ条件下で、４ｍＭグルタミンを補充された０．３ｍＬ／ｃｍ２のＤＭＥＭ（４．５ｇ／Ｌグルコース）を使用した無血清感染培地中で行われる。
【０３５５】
感染の前に、バイオリアクターの固定層を６５Ｌの感染培地で２回リンスし、ＦＢＳと他の血清タンパク質を除去する。感染は、バイオリアクターにおいて、適切な量のウイルス種を、０．００１のＭＯＩに達するまで混合することにより行われる。この工程の間、バッグ内のウイルスのロスを防ぐために、バイオリアクターとバッグの間の再循環を４時間停止させ、再スタートさせる。
【０３５６】
細胞培養の監視は、増殖期と同じように行われる。さらに、リアクター及び再循環バッグにおいて、ＱＣ分析（ＴＣＩＤ５０、ＨＣＰ、ＤＮＡ定量）のためのサンプルが採取される。
回収及び精製
【０３５７】
長期間にわたるウイルス動態実験を行うため、感染後６日（６ＤＰＩ）まで感染を続行させる。中間回収（４０Ｌ）が３ＤＰＩで行われ、最終回収は６ＤＰＩで行われる。両回収物は、引き続くＤＳＰ実験のためにＢｉｏ−２０（ＰＡＬＬ社）深層フィルター上で精製される。
ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００の操作
【０３５８】
ｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００実験は、抗生物質無しの滅菌条件下で行われる。全ての接続は、Ｂｉｏ−Ｗｅｌｄｅｒ又は無菌コネクターを使用し、無菌的に行われる。適切な連結管を使用し、層流の下で培養サンプルが採取される。
実施例２４  増殖期に５％ＦＢＳを用いたｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００
【０３５９】
５％に低下させたＦＢＳ濃度を使用したことを除き、実施例２３に記載されるようにｉＣＥＬＬｉｓ  ５００／１００においてＣＡ６とＣＡ１６を産生させる。
実施例２５  無血清培地（ＳＦＭ）におけるＣＡ６及びＣＡ１６のプロセス
【０３６０】
完全無血清プロセスを使用し、ＣＡ６とＣＡ１６を産生させる。増殖期に無血清（ＳＦＭ、ＯｐｔｉＰｒｏ）培地又は１０％ＦＢＳの培地を使用したものの間で細胞増殖とウイルス生産性を比較する（ＴＣＩＤ５０）。無血清条件下でのＣＡ６とＣＡ１６の産生は、ＧＭＰ  Ｖｅｒｏ  ＳＦＭ適合細胞株を使用し、ｉＣＥＬＬｉｓ  ＮＡＮＯにおいて評価される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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