(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、
フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの総アミノ酸含量に関して、天然フィブロインと少なくとも４％異なり、
フィブロインのフィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、
前記組成物が、４６．５％超のグリシンアミノ酸及び３０％超のアラニンアミノ酸を含み、
前記組成物が、８％未満のセリンアミノ酸を含むように、天然フィブロインタンパク質と比較して４０％超低減されたセリン含量を有し、
フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量が、１００ｋＤａ未満である、
タンパク質組成物。
【請求項２】
１０％ｗ／ｗの水溶液として、４ｃＰ未満の水溶液粘度を有する、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項３】
２４％ｗ／ｗの水溶液として、１０ｃＰ未満の水溶液粘度を有する、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項４】
沈殿することなく、４０％ｗ／ｗで水に可溶性である、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項５】
１０％ｗ／ｗまでの濃度で、タンパク質組成物の水溶液の超音波処理において、ゲル化しない、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項６】
６％未満のセリンアミノ酸残基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質組成物。
ク質組成物。
【請求項７】
４８％超のグリシンアミノ酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質組成物。
【請求項８】
３１．５％超のアラニンアミノ酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質組成物。
【請求項９】
薄膜に乾燥された後、水に完全に再溶解する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質組成物。
【請求項１０】
水溶液中で、βシートタンパク質構造を欠く、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質組成物。
【請求項１１】
少なくとも５秒間の超音波処理後、５５０ｎｍで０．２５未満の水溶液中における光学的吸光度を維持する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質組成物。
【請求項１２】
４０％ｗ／ｗの濃度で水に完全に溶解する、水と組み合わされた請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質組成物。
【請求項１３】
フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも６％異なり、フィブロインに由来するタンパク質の平均分子量が、１００ｋＤａ未満、３０ｋＤａ超であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２５未満の光学的吸光度を維持する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質組成物。
【請求項１４】
高圧でフィブロイン水溶液を加熱することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質組成物を調製するための方法であって、
フィブロイン水溶液が、少なくとも８Ｍの濃度で臭化リチウムを含み、
フィブロイン水溶液を、少なくとも１０ＰＳＩの圧力下、少なくとも２０分間、少なくとも１０５℃（２２１°Ｆ）に加熱して、タンパク質組成物が得られ、
タンパク質組成物が、８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、タンパク質組成物が、１０％ｗ／ｗの水溶液として、５ｃＰ未満の水溶液粘度を有する、
方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質組成物と食品又は飲料成分とを含む、食品又は飲料組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のタンパク質組成物と眼科用製剤成分とを含む、眼科用製剤。
【請求項１７】
タンパク質組成物が眼科用製剤の０．１重量％〜１０重量％で存在する、請求項１６に記載の眼科用製剤。
【請求項１８】
緩衝剤、安定化剤及び粘滑剤の１又は複数をさらに含む、請求項１６又は１７に記載の眼科用製剤。
【請求項１９】
タンパク質組成物中のフィブロインに由来するタンパク質の平均分子量が、７０ｋＤａ未満である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の眼科用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１４年８月２０に出願された米国特許仮出願第６２／０３９，６７５号及び２０１５年７月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／１９３，７９０号の優先権を主張し、これらの出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
家蚕（カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ））からのシルク繊維及び分泌タンパク質は、繊維産業において、何世紀にもわたって使用されてきた。上記分泌タンパク質は、より最近では、生物医学的な応用のための生体材料として、例えば、構造的成分として及びタンパク質溶液として使用されている。天然には、カイコタンパク質は、シルクタンパク質であるフィブロイン及びセリシンの混合物（ａｍａｌｇａｍ）として存在し、セリシンは、フィブロインと結合する接着剤様物質として働き、繭の形状を維持する。界面活性剤が媒介する抽出又は高温での強アルカリ洗浄等によるセリシンの除去は、１つのジスルフィド結合を介して会合した重鎖及び軽鎖フィブロインタンパク質を含むセリシン不含フィブロイン繊維をもたらす。これらの小繊維の水溶性のシルクフィブロインタンパク質への変換は、濃厚な高濃度の塩（例えば、８〜１０Ｍの臭化リチウム）の添加を必要とし、そうでなければ、フィブロインタンパク質を水不溶性にするであろう分子内及び分子間のイオン及び水素結合を妨害する。
【０００３】
シルクフィブロインタンパク質の応用には、典型的には、塩が所定の環境において材料の適切な機能を妨害しないように、例えば、透析の使用による、高濃度のＬｉＢｒ塩の除去を必要とする。可溶化したシルクフィブロインのイオン及び水素結合と競合するこれらの塩が無いと、シルクフィブロインタンパク質溶液は比較的不安定で、タンパク質の凝集に対して脆弱で、水溶液からしばしば沈殿する。凝集は、フィブロインタンパク質間の相互作用によって生じると考えられ、次いで、フィブロイン重鎖の疎水性アミノ酸モチーフ間のβシート二次タンパク質構造の形成によって、続く材料のゲル化に至る。これらの構造の形成において、可溶性のフィブロイン溶液から不溶性のフィブロインゲルへの移行は、迅速かつほぼ不可逆的であり、それによって、材料の限られた保存可能期間のために、水溶液系で応用するための溶液の応用が制限されている。
【０００４】
水溶性フィブロインのゲル化特性に対抗するために、タンパク質凝集とそれに続くβシート形成を最小化する試みがなされている。溶液中でフィブロイン濃度を下げることは、これらの構造の形成に先行する、タンパク質−タンパク質相互作用を弱めることを目的とする束一的な手法であるが、関連するタンパク質の応用のために非常に希薄なフィブロイン溶液をもたらすことがある。或いは、タンパク質凝集及び／又はβシート形成を妨害するであろう水溶液の改変（例えば、溶液のｐＨ、安定化賦形剤の添加）は、これらの現象を未然に防ぐことがある。しかしながら、これらの改変及び化学物質の添加は、生物学的毒性を増加させることによって、又は溶液中に不適合な薬剤を導入することによって、川下での応用を制限することがある。従って、必要とされているのは、凝集に対して抵抗性で、様々な産業にわたって有用な保存可能期間の安定性プロファイルを有する、シルクに由来するタンパク質（ＳＤＰ）材料である。
【０００５】
水溶性シルクフィブロインの前述の脆弱性を回避するために新規な戦略は、水溶液の環境よりもむしろ、シルクフィブロインタンパク質自体の生化学的な構造及び性質の改変である。この目的に向けて、水溶性シルクフィブロインの生成に関与するシルク繊維の抽出方法及び／又は条件の改変は、アミノ酸の一次配列、従って、タンパク質凝集及びβシート形成の化学的原因に影響を及ぼし得る。このように、シルクフィブロイン材料を改変する方法の開発は、シルク溶液製品の安定性及び保存可能期間を劇的に延長するだろう。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、シルクフィブロインに由来するタンパク質組成物を提供する。上記組成物は、水溶液中における溶解性及び安定性が本質的に増強されている。１つの実施形態において、本発明は、高圧でフィブロイン水溶液を加熱することを含む方法によって調製されたタンパク質組成物を提供する。フィブロイン水溶液は、少なくとも８Ｍの濃度で臭化リチウムを含む。フィブロイン水溶液を、少なくとも約１０ＰＳＩの圧力下、少なくとも約２０分間、少なくとも約１０５℃（２２１°Ｆ）に加熱して、タンパク質組成物を得る。タンパク質組成物のポリペプチドは、８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、タンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗの水溶液として、５ｃＰ未満の水溶液粘度を有する。
【０００７】
他の実施形態において、本発明は、高圧でフィブロイン水溶液を加熱することを含む方法によって調製されたタンパク質組成物であって、フィブロイン水溶液が、９〜１０Ｍの濃度で臭化リチウムを含み、フィブロイン水溶液を、約１４ＰＳＩ〜約２０ＰＳＩの圧力下、少なくとも約２０分間、約１１５℃（２３９°Ｆ）〜約１２５℃（２５７°Ｆ）の範囲内の温度に加熱して、タンパク質組成物を得る、タンパク質組成物を提供する。タンパク質組成物は６．５％未満のセリンアミノ酸残基を含んでいてもよく、タンパク質組成物は、１５％ｗ／ｗの水溶液として、１０ｃＰ未満の水溶液粘度を有していてもよい。
【０００８】
本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも４％異なり、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、上記組成物が、天然フィブロインタンパク質と比較して２５％超低減されたセリン含量を有し、シルクに由来するタンパク質の平均分子量が、約１００ｋＤａ未満である、タンパク質組成物も提供する。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも６％異なり、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、上記組成物が、天然フィブロインタンパク質と比較して４０％超低減されたセリン含量を有し、シルクに由来するタンパク質の平均分子量が、約９６ｋＤａ未満である、タンパク質組成物を提供する。
【００１０】
本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、天然シルクフィブロインから改変され、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、シルクに由来するタンパク質の平均分子量が、約１００ｋＤａ未満であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２５未満の光学的吸光度を維持する、タンパク質組成物を更に提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも５％異なるように、天然シルクフィブロインから改変され、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、シルクに由来するタンパク質の平均分子量が、約９６ｋＤａ未満であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２未満の光学的吸光度を維持する、タンパク質組成物を提供する。
【００１２】
フィブロインに由来するタンパク質組成物は、例えば、透析及び／又はろ過によって、乾燥粉末又は乾燥膜として、単離及び／又は精製することができる。或いは、フィブロインに由来するタンパク質組成物は、安定な水溶液として、単離及び／又は精製することができ、食品又は飲料組成物として又は眼科用製剤等の治療用製剤としての使用のために改変することができる。
【００１３】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の幾つかの実施形態又は様々な態様を更に説明するために含まれる。場合によっては、本発明の実施形態は、本明細書に示す詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することによって、最もよく理解できる。明細書及び添付の図面は、本発明の幾つかの詳細な実施例又は幾つかの態様を強調してもよい。しかしながら、当業者には、実施例又は態様の一部を、本発明の他の実施例又は態様と組み合わせて使用してもよいことが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＳＤＰ溶液及び従来技術のシルクフィブロイン溶液の両方を得るための重要な処理ステップを示すフローチャートである。ＳＤＰの製造方法は、経時的に溶液の安定性を増強するための追加ステップ（中央のイタリック体）を含み、このステップは、従来技術のシルクフィブロイン溶液の製造方法では実施されない。
【図２】安定なＳＤＰ溶液（試料１、左側、実施例１に記載の方法によって製造）、及び従来技術のシルクフィブロイン溶液（試料２、右側、標準的な加水分解条件によって製造）についてのローレンス安定性試験の結果を示す写真である。試料１はゲル化していない安定な水溶液であるが、試料２はゲル化し、従って安定な水溶液ではないことを、目視検査が明らかにする。
【図３】水溶性シルクフィブロインタンパク質からＳＤＰ溶液へのプロセスが媒介する改変を示すゲルを示す写真である。写真は、ＳＤＰ溶液（レーン３、オートクレーブ）対従来技術のシルクフィブロイン溶液（レーン２、オートクレーブなし）の分子量（ＭＷ）分布を示す。タンパク質の標準ラダー（レーン１）及び関連する重量（レーン１の左の数字）をＭＷの参照として示す。レーン２における２３〜２６ｋＤの顕著なＭＷバンドに注目すべきであり、オートクレーブプロセス後には全く存在せず、フィブロイン軽鎖の分解がＳＤＰタンパク質材料の増強された安定性に寄与していることを示す。また、オートクレーブ後のフィブロインタンパク質のＭＷ範囲について明らかなシフトが観察され（レーン３）、天然シルクフィブロインタンパク質からＳＤＰ材料組成物への改変を示す。
【図４】（Ａ）はＳＤＰ溶液材料がゲル化していないことを示す画像であり、（Ｂ）は従来技術のシルクフィブロイン溶液材料が超音波処理後２時間以内にゲル化したことを示す画像である。
【図５】タンパク質溶液安定性及び粘度に対する本明細書に記載のフィブロイン処理の影響を示すグラフである。要約グラフは、従来技術のシルクフィブロイン（ＰＡＳＦ）、２２５°Ｆで３０分間加熱されたＰＡＳＦ（ＰＡＳＦ−２２５°Ｆ）及びＳＤＰにおけるタンパク質濃度の関数としての溶液の粘度を図示する。ＰＡＳＦ及びＰＡＳＦ−２２５°Ｆは、溶液の粘度が７５ｍｇ／ｇ（７．５％ｗ／ｗ）超で鋭く上昇することを示し、タンパク質が溶液から析出することなく、２００ｍｇ／ｇよりも高く濃縮できなかった。対照的にＳＤＰは、全ての濃度で低い粘度を維持し、２４０ｍｇ／ｇを超えるレベルに濃縮することが可能であった。
【図６】シルクフィブロインタンパク質の加熱処理によって、フィブロイン一次構造の改変を示すピルベートの生成が起こることを示すグラフである。（Ａ）非加熱、又は６５℃（約１５０°Ｆ）、９０℃（約２００°Ｆ）及び９９℃（約２１０°Ｆ）への加熱に曝露された、シルクフィブロインタンパク質溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）のピルベートの濃度を示す要約グラフ。（Ｂ）熱処理の持続が、シルクフィブロインからのピルベートの形成を更に増強する。水溶性シルクタンパク質を９９℃（約２１０°Ｆ）に３０分曝露すると、当該温度に最初に達した時点でのピルベートのレベルに対して、ピルベートレベルの約２倍の増加、及び非加熱試料の４倍を上回る増加をもたらす。
【図７】加熱処理により天然シルクタンパク質のアミノ酸組成が変化することを示すグラフである。（Ａ）加熱していない（即ち、「非加熱」／従来技術）のシルクタンパク質溶液（左カラム、１０％セリン）、及び、実施例１に記載の処理（例えば、約１２１℃、１７ｐｓｉ）に３０分間予め付したＳＤＰ溶液（「加熱」、右カラム、５．７％セリン）における、フィブロインタンパク質の総アミノ酸の割合に対するセリン組成を示す要約グラフ。加熱処理は、従来技術のシルクフィブロイン溶液試料と比較して、ＳＤＰ溶液試料のセリン組成を４０％超減少させた。（Ｂ）従来技術のシルクフィブロインタンパク質溶液（左の「非加熱」カラム）、並びに、加熱及び圧力処理（約１２１℃、１７ｐｓｉ）されたＳＤＰ溶液（右の「加熱」カラム）の、グリシン及びアラニンのパーセント濃度を表す要約グラフ。加熱及び圧力処理は、対照の従来技術のシルクフィブロイン溶液に対して、グリシン及びアラニンのレベルの増加を促進する。
【図８】様々な製剤の拡散を示す画像及び拡散面積を示すグラフである。様々な試料製剤を疎水性のワックス表面上に置いた：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、テラティアーズ（ＴｈｅｒａＴｅａｒｓ）（ＴＴ）、ブリンク（Ｂｌｉｎｋ）、シスタンバランス（Ｓｙｓｔａｎｅ  Ｂａｌａｎｃｅ）（ＳＢ）、及び５％ｗ／ｖのＳＤＰ製剤（図の左側に示す）。製剤溶液の拡散を画像化し、次いで拡散面積を機械的拡散の前後のタイムポイントで測定した（図の右側に示すデータ）。機械的拡散後、ＳＤＰ製剤は、全ての他の試料製剤と比較して、顕著に増強された拡散（３倍を上回る）を示した。
【図９】ＳＤＰにおけるアミノ酸変換が、二次タンパク質構造を弱めて、溶解を可能にすることを示す図である。（Ａ）ＰＡＳＦ溶液及びＳＤＰ溶液の、水アニーリング処理前及び処理後の両方の試料のＦＴＩＲスペクトル。従来技術の試料は、水アニーリング後に１６２４ｃｍ−１及び１５１０ｃｍ−１周辺にβシートを示す顕著なピークを示す一方、ＳＤＰ溶液のスペクトルは、βシート形成のピークを示さず、代わりに処理後のβシート含量が顕著に低減されたことを示す。（Ｂ）乾燥して膜を形成したＳＤＰ及びＰＡＳＦシルク溶液の代表画像。（Ｃ）続く水へのＳＤＰ膜の溶解が完了し、βシート二次構造が形成されなかったことを示す。しかしながら、ＰＡＳＦ膜は全てを溶解することができず、部分的に溶解したＰＡＳＦと溶解しなかったβシートを含有するタンパク質凝集体との混合物を与えた。
【図１０】トリプシンでのシルクフィブロインの酵素的切断は、不安定性を増強し、ゲル形成を加速するが、ＳＤＰには影響を及ぼさないことを示す要約グラフである。要約グラフは、所定のタイムポイントについて、超音波処理したトリプシン前処理ＰＡＳＦの吸光度（５５０ｎｍ）を示している。吸光度の上昇は、ゲル形成をもたらすフィブロインβシート形成を示し、溶液の不安定性を示す。
【図１１】超音波処理前に、０（対照）、１０又は１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で３０分間処理したＰＡＳＦ溶液の長期的な光学的吸光度（５５０ｎｍ）を示す要約グラフである。データは、経時的なＰＡＳＦ又はＳＤＰ溶液中での二次構造形成の指標を与える。吸光度の上昇として示される、βシート形成の蓄積は、ＰＡＳＦ溶液の超音波処理後直ぐに生じる（例えば、３０分以内、続いて上昇）。逆に、ＳＤＰは二次構造形成の傾向を示さない。ＤＴＴで架橋したジスルフィドの減少は、対照ＰＡＳＦと比較して、βシートと続くゲル形成とを遅らせるが、上記材料はかなりの量のβシートを最終的に形成する。対照的に、ＳＤＰは二次構造を形成する傾向を示さず、安定なままであった。このように、天然フィブロインのジスルフィド架橋の減少は、安定性を向上させるが、ゲル形成を防がず、ＰＡＳＦの長期的な不安定性は、ＳＤＰでは消失している。
【図１２】臭化リチウム（ＬｉＢｒ）不存在中でのＰＡＳＦの加熱はゲル化を弱めることを示す要約グラフである。要約グラフは、超音波処理前の所定の期間に加熱していない（対照）又は約２００°Ｆで加熱したＰＡＳＦ溶液の光学的吸光度（５５０ｎｍ）を示している。溶液の加熱は、加熱されていないＰＡＳＦに対して、加熱時間と共に上昇する基礎吸光度の上昇をもたらした。全てのＰＡＳＦ溶液は、タンパク質特性の変化を示す、経時的な吸光度の上昇を示した。対照的に、ＳＤＰは、実験期間を通じて、超音波処理後の吸光度の変化を示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、シルクフィブロインに由来するタンパク質組成物を提供する。上記タンパク質組成物は、水溶液における溶解性及び安定性が増強されている。天然フィブロインの一次アミノ酸配列は、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去されるように、フィブロインに由来するタンパク質組成物において改変される。更に、上記組成物は、天然フィブロインタンパク質と比較して４０％超低減されたセリン含量を有することができ、組成物中のタンパク質の平均分子量は約１００ｋＤａ未満である。
【００１６】
定義
以下の定義は、明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために含まれる。本明細書で使用されるように、列挙された用語は以下の意味を有する。本明細書で使用される全ての他の用語及び語句は、当業者が理解するようなそれらの通常の意味を有する。そのような通常の意味は、Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ（第１４版、Ｒ．Ｊ．Ｌｅｗｉｓ著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、Ｎ．Ｙ．、２００１）等の技術辞書を参照することによって得ることができる。
【００１７】
「１つの実施形態」、「実施形態」等の本明細書における言及は、記載された実施形態が特定の態様、特徴、構造、部分又は特性を含んでいてもよいが、全ての実施形態が、態様、特徴、構造、部分又は特性を必ず含むわけではないことを示す。また、そのような語句は、本明細書の他の部分で言及された同様の実施形態を示してもよいが、必ず示すわけではない。更に、特定の態様、特徴、構造、部分又は特性が、ある実施形態と組み合わせて記載されている場合、明示的に記載されているか否かに関わらず、そのような態様、特徴、構造、部分又は特性が、他の実施形態に、影響を与える又は結合されることは、当業者の知識の範囲内である。
【００１８】
単数形の形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段の指示を明確にしない限り、複数への言及を含む。このように、例えば、「成分（単数）」という言及は複数のそのような成分を含み、従って、成分Ｘ（単数）は複数の成分Ｘを含む。更に、特許請求の範囲は、任意選択の要素を排除するように記載されてもよいことに留意されたい。このように、当該記載は、排他的な用法の使用、例えば、本明細書に記載の任意の要素との結合における、「専ら」、「のみ」、「以外の」等、及び／又は、特許請求の範囲の要素の列挙若しくは「否定的な」限定の使用のための先行詞として扱われることを意図している。
【００１９】
「及び／又は」という用語は、当該用語が関連する、項目の任意の１つ、項目の任意の組み合わせ、又は項目の全てを意味する。「１又は複数」及び「少なくとも１」という語句は、特にその用法の文脈で読んだ場合に、当業者には容易に理解される。例えば、上記語句は、１、２、３、４、５、６、１０、１００、又は列挙した下限よりも約１０、１００又は１０００倍高い任意の上限を意味することができる。
【００２０】
「約」という用語は、特定の値の±５％、±１０％、±２０％、又は±２５％の変動を表すことができる。例えば、「約５０」パーセントとは、幾つかの実施形態において、４５〜５５パーセントの変動を有していてもよい。整数の範囲については、「約」という用語は、範囲の各端で挙げられた整数を、超える及び／又は未満の、１つ又は２つの整数を含んでいてもよい。本明細書において別段の指示がない限り、「約」という用語は、値、例えば、個々の成分、要素、組成又は実施形態の機能性の観点から等価である列挙された範囲に近似する、重量割合を含むことを意図している。約という用語はまた、本段落で上述したように、列挙された範囲の終点を変更することができる。
【００２１】
当業者に理解されるように、成分の量、分子量等の特性、反応条件を表すもの等を含む、全ての数字は、近似値であり、全ての場合において、「約」という用語によって、任意選択で変更されるものとして理解される。これらの値は、本明細書に記載の教示を利用する当業者が得ようする所望の特性に応じて変更することができる。そのような値は、それらそれぞれの試験の測定値で認められる標準偏差から必然的にもたらされるばらつきを本質的に含むことも理解される。
【００２２】
当業者に理解されるように、任意及び全ての目的のために、特に明細書を提供するという観点から、本明細書に列挙された全ての範囲は、任意及び全ての、可能な部分的な範囲及びその部分的な範囲の組み合わせ、並びに特に整数値の範囲をなす個々の値も包含する。列挙された範囲（例えば、重量割合又は炭素群）は、範囲内のそれぞれの特定の値、整数、小数、又は同一性を含む。任意に記載された範囲は、同じ範囲を、少なくとも、半分、３分の１、４分の１、５分の１又は１０分の１に分割することが、十分に記載され、かつ可能なように、容易に認識することができる。非限定的な実施例のように、本明細書で議論した各範囲は、下３分の１、中３分の１及び上３分の１等に容易に分解することができる。当業者に理解されるように、例えば、「まで」、「少なくとも」、「超」、「未満」、「超える」、「以上」等の全ての言葉は、列挙された数字を含み、そのような用語は、上述のように、部分的な範囲に後で分解することができる範囲を指す。同様に、本明細書に列挙された全ての比率は、より広い比率内にある全ての部分的な比率も含む。従って、ラジカル、置換基、及び範囲について列挙された特定の値は、説明のみのためであり、ラジカル及び置換基の定義された範囲内の他に定義された値又は他の値を排除しない。
【００２３】
当業者であれば、マーカッシュ群等の一般的な方法でメンバーが一緒にグループ化されていることも容易に認識でき、本発明は、全体として列挙されたグループ全体だけでなく、個々のグループの各メンバー、及び、主要グループのすべての可能なサブグループを包含する。更に、全ての目的のために、本発明は、主要グループだけでなく、１又は複数のグループのメンバーが存在しない主要グループも包含する。本発明は、従って、列挙されたグループの任意の１又は複数のメンバーを明示的に排除することも想定している。従って、但し書きを任意の開示されたカテゴリー又は実施形態に応用してもよく、それによって、任意の１又は複数の列挙された要素、種又は実施形態を、例えば、明示的な否定的な限定での使用のために、そのようなカテゴリー又は実施形態から排除してもよい。
【００２４】
「接触する」という用語は、例えば、溶液中、反応混合物中、インビトロ又はインビボで、例えば、生理学的反応、化学反応、又は物理的変化を引き起こすための、細胞レベル又は分子レベルを含んで、接触する、接触を行う、又は直ぐに若しくは近接をもたらす行為を指す。
【００２５】
治療への適用の場合は、「有効量」は、疾患、障害及び／又は状態の処置のため、或いは列挙された効果をもたらすのに有効な量を指す。例えば、有効量は、処置される状態又は症状の進行又は重症度を低減させるのに有効な量であってもよい。治療的有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。「有効量」という用語は、本明細書に記載の組成物の量、又は本明細書に記載のペプチドの組み合わせの量を含むことを意図しており、例えば、疾患若しくは障害を処置若しくは予防するために、又は宿主の疾患若しくは障害の症状を処置するために有効な量である。このように、「有効量」とは、一般には、所望の効果をもたらす量を意味する。
【００２６】
方法及び調製への適用の場合は、「有効量」とは、列挙された効果をもたらすのに有効な量、例えば、反応混合物中に生成物を形成するために必要な量を指す。有効量の決定は、特に本明細書に示す詳細な説明の観点において、典型的には、当業者の能力の範囲内である。「有効量」という用語は、例えば、反応混合物中で所望の生成物を形成するために有効な、本明細書に記載の化合物若しくは試薬の量、又は本明細書に記載の化合物又は試薬の組み合わせの量、又は本明細書に記載の方法に関する条件を含むことを意図している。このように、「有効量」とは、一般には、列挙された所望の効果をもたらす量を意味する。
【００２７】
フィブロインは、カイコの繭に由来する。フィブロインタンパク質は、分子量が約３５０〜４００ｋＤａである重鎖と、分子量が約２５ｋＤａである軽鎖とを含み、重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合によって互いに結合している。重鎖及び軽鎖の一次配列は、当技術分野において公知である。フィブロインタンパク質鎖は、親水性のＮ及びＣ末端ドメインを有し、疎水性／親水性アミノ酸配列の交互ブロックは、混合物が溶液中で周囲の分子と立体的及び静電気的に相互作用することを可能にする。低濃度の希釈物（１％以下）では、フィブロインタンパク質分子はタンパク質鎖が伸びた形態を取り、溶液中で直ぐに凝集しないことが知られている。フィブロインタンパク質は、ＨＡ、ＰＥＧ、グリセリン、及びＣＭＣ等の水和する分子と高混和性であり、高生体適合性で、酵素の作用により体内で自然に統合又は分解することが見出されている。天然フィブロイン、又は従来技術のシルクフィブロイン（ＰＡＳＦ）は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｄａｉｔｈａｎｋａｒら（Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，４，１１５〜１２１）によって記載されている。
【００２８】
「シルクに由来するタンパク質」（ＳＤＰ）及び「フィブロインに由来するタンパク質」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。これらの材料は、熱、圧力及び高濃度の重塩溶液が関与する、本明細書に記載の方法によって調製される。従って、「シルクに由来する」及び「フィブロインに由来する」とは、本明細書に記載の構造的、化学的及び物理的特性を有するタンパク質組成物に到達するために、シルクフィブロインタンパク質を改変する方法の出発材料を指す。
【００２９】
フィブロインに由来するタンパク質組成物の調製
本明細書に記載のフィブロインに由来するタンパク質組成物は、水溶液中で、天然フィブロインと比較して増強された安定性を有する。増強された安定性はフィブロインに由来するタンパク質組成物によって達成され、シルクに由来するタンパク質（ＳＤＰ）として本明細書に示され、材料が、天然／従来技術のシルクフィブロインタンパク質（本明細書でＰＡＳＦという）よりも顕著に長く溶液のままで存在することを可能にする。ＳＤＰ材料の増強された安定性はまた、凝集、沈殿又はゲル化しない、高濃度のＳＤＰ溶液の調製を可能にする。食品、飲料、点眼剤、又は溶液中で可溶性のタンパク質が要求される応用等の商業的な応用において、増強された安定性は、タンパク質凝集を低減することによって、製品の適切で長い保存可能期間と品質の向上とをもたらす。溶液中でのタンパク質凝集の可能性は、特定の応用のための製品の所望の性能に負の影響を及ぼす。ＳＤＰを溶液中で高い組成（５０％ｗ／ｖを上回る、又は５００ｍｇ／ｍＬ超）に濃縮する能力は、様々な応用のために、そのまま又は希釈して使用することができる有用な希釈標準溶液の在庫において、顕著に有利である。そのような応用の例は、タンパク質サプリメント又は添加物としての、食品、飲料、又は眼科用製剤の成分としてのＳＤＰの使用である。
【００３０】
水溶液における増強された安定性は、ＳＤＰ材料への天然フィブロインタンパク質の一次アミノ酸配列の変換に由来する。一次配列の変化は、凝集に対する分子の感受性を低下させる。凝集は、最終的にゲル形成をもたらす。天然フィブロインの変換において、セリン及びシステインアミノ酸の両方は、高温及び脱水条件の存在中で切断される。同様に、Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６４，８６，１２０６）は、デヒドロアラニン（ＤＨＡ）中間体が、溶液中で、セリン及びシステインから形成されることを示した。アミノ酸分解は、本明細書に記載の５０〜５５％ｗ／ｖのＬｉＢｒ溶液等の強力な脱水溶媒系が存在する場合において更に進行し、水の除去を引き起こすためにヒドリドシフトが起こる。分解反応は、水酸化物イオン（例えば、ｐＨ７．５〜ｐＨ１１）の存在中で行うことができ、これはＤＨＡ中間体の切断を更に進行させる。この切断は、アミド、ピルボイルペプチド及びＬｉＢｒを形成する。セリンアミノ酸について、１つの可能な化学機構をスキーム１に概説し、このスキームはシステインアミノ酸にも応用可能である。更なる加水分解的切断による、ＤＨＡ中間体へのＰＡＳＦタンパク質のセリン及びシステインアミノ酸の化学的変質は、ＳＤＰ製品の増強された溶液安定性をもたらす。
【００３１】
スキーム１．セリン及びシステイン分解のための、基礎となる化学反応の模式的な詳細。分解は、脱水する高い塩濃度環境の存在中で、ヒドリドシフト反応から形成されるＤＨＡ中間体の生成によって進行する。次いで、ＤＨＡの分解は、塩基性溶媒環境中で、ＳＮ２反応によって達成される。
【化１】
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【００３２】
上述の切断反応は、得られたペプチドの高分子特性に重大な影響を与え、その結果、安定化されたＳＤＰ材料の水溶液をもたらす。フィブロインの初期のタンパク質凝集は、Ｇｒｅｖｉｎｇら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１２，１３（３）：６７６〜６８２）によって記載されたシステインアミノ酸での天然フィブロイン重鎖及び軽鎖の相互作用によって引き起こされると考えられる。フィブロインタンパク質軽鎖及び重鎖内のシステインアミノ酸は、ジスルフィド結合を介して互いに相互作用する。これらのジスルフィド架橋はフィブロインタンパク質の凝集及びゲルネットワークの軟凝集に関与する。天然フィブロイン軽鎖が存在しないと、タンパク質は凝集に対して非常に感受性が低い。従って、本明細書に記載の方法は、システイン含量を低減することによってジスルフィド結合を形成する天然フィブロイン軽鎖の能力を効果的に低減し、その結果、ジスルフィド結合形成能は低減又は除去される。この機構により、本明細書に記載の改変方法は、システインに由来する凝集を形成する能力を低減又は除去することによって、得られたＳＤＰを溶液中で機能的に安定化する。
【００３３】
ジスルフィド架橋が誘導する凝集に加えて、軟凝集した構造への更なる凝集に対するシルクフィブロインの感受性は、Ｍａｙｅｎら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１５，１９７：１０〜１７）によって記載されたタンパク質のアミノ酸化学によっても活性化する。シルクフィブロインのセリン、アラニン及びグリシンのアミノ酸配列の分子モデリングは、隣接するフィブロインタンパク質鎖部分の間の水素結合を生じるより大きな傾向によって、セリンの存在が初期のタンパク質−タンパク質相互作用を増強することを示した。このモデルは、低減したセリンと増加したアラニン及びグリシンとが、初期のタンパク質凝集の傾向を減少させることを示す。分子モデリングの知見は、フィブロインタンパク質の天然アミノ酸化学の代替として、材料が水溶液中で高い安定性をもたらし得ることを示す。
【００３４】
増強された安定性を達成するための１つの戦略は、ヒドロキル等の帯電する官能基をタンパク質から除去することである。比較的高い電気陰性度のヒドロキシル基によって、この化学は、有効な水素原子との水素結合と、正に帯電したアミノ酸基との非特異的な帯電相互作用との両方によって進行し得る。天然フィブロインタンパク質含量のほぼ１２％をセリンが構成し、これはヒドロキシル官能基と結合する。従って、水素結合を促進する有効なヒドロキシル基を低減することによって、溶液中での全体的なタンパク質安定性を増強することができる。本明細書に記載の方法は、セリン含量を効果的に低減し、相対的にアラニン及びグリシン含量を増加し、水素結合を有効に生じる有効な数のヒドロキシル基を除去する。この機構によって、本明細書に記載の方法は、溶液中で得られたＳＤＰを、長期間（例えば、少なくとも数（６〜８）カ月、及び／又は１．５年を超えて；２年を超えて、又は３年を超えて安定性を維持することができることを示す、拡大した検討が進行中である）、機能的に安定化する。
【００３５】
システイン及びセリン部分の低減に加えて、溶媒の帯電相互作用がタンパク質溶液の安定化に重要である。初期のタンパク質の軟凝集後、ゲル化プロセスは、天然フィブロイン重鎖の中で密接な会合の進行が継続していると考えられており、これは、重鎖の疎水性ブロック中で分子内及び分子間の両方でのβシート形成をもたらす。著しいβシート形成が生じたら、フィブロイン溶液はゲルに移行する。溶液がゲルに移行するにつれて、フィブロインは不溶性になり、溶液系製品として、もはや有用ではなくなる。ゲル化を防ぐために、ＳＤＰ溶液のｐＨを、例えばｐＨ７．５を上回る、高アルカリ度に上げて、安定性を増強することができる。その結果、高いｐＨは、溶液中でＳＰＤ分子の周囲を保護する原子価を形成する、更なる遊離ヒドロキシル基を生成する。形成された保護する原子価は、水素結合、或いは、非特異的な帯電及び／又は疎水性相互作用に由来するタンパク質−タンパク質相互作用を低減することによって、タンパク質を安定化するゼータ電位を生じる働きをする。フィブロインの変換プロセスは、この機構及び他によって、溶液中で処理されたＳＤＰを機能的に安定化する。
【００３６】
ＳＤＰ材料は、以下の方法によって調製することができる。
１．蛹を取り除くことによってシルク繭を調製し、材料を温水で予め水洗する。
２．天然フィブロインタンパク質の繊維を、高水温、典型的には９５℃以上で、アルカリ性のｐＨで、水中で繭を洗浄することによって、ガム様のセリシンタンパク質から抽出する。
３．抽出されたフィブロイン繊維を乾燥し、次いで、βシート間の水素結合を中和する溶媒系を使用して溶解し、２０％ｗ／ｖシルクフィブロインタンパク質の５４％のＬｉＢｒ水溶液はこの中和ステップで有効である。
４．ＬｉＢｒ溶液に溶解したフィブロインタンパク質をオートクレーブ環境（約１２１℃（約２５０°Ｆ）、約１５〜１７ＰＳＩの圧力、この温度で約３０分間）で処理する。
５．次いで、加熱処理したフィブロインタンパク質及びＬｉＢｒ溶液を、透析して、リチウム及び臭化物イオンを溶液から除去する。方法のこの時点で、材料はＳＤＰに化学的に変換されている。
６．次いで、透析したＳＤＰをろ過して、任意の不溶性の凝集物及び混入したバイオバーデンを除去する。
【００３７】
ＳＤＰ溶液は、図１に模式的に図示されているように、現行のシルクフィブロイン溶液の製造に使用される方法とは明確に異なる方法を使用して製造される。注目すべきことに、シルクフィブロインタンパク質のオートクレーブ処理は、溶液中でＬｉＢｒと混合されている間に、化学的な移行を開始して安定化されたＳＤＰ材料を生成する。フィブロインタンパク質をＬｉＢｒ溶液に溶解し、可溶化した天然フィブロインタンパク質の水素結合及び静電相互作用を中和する。これによって、溶液中で特異的な二次構造が確認されないタンパク質が生じる。結果として、フィブロインタンパク質鎖内の共有結合を加水分解するために必要な熱力学的エネルギーは、加水分解的切断を開始するための最低エネルギー要件である。
【００３８】
１つの実施形態において、３０分間、１５〜１７ＰＳＩのオートクレーブ条件で１２１℃に温度を設定する。しかしながら、様々な実施形態において、処理条件は、ＳＤＰ材料を安定化するために、様々な程度で改変してもよい。他の実施形態において、他の又は追加の、塩化カルシウム及びチオシアン酸ナトリウム等のハロゲン化物塩、尿素、グアニジン塩酸塩及び１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール等の有機剤、硝酸カルシウム及び１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライド等の追加の強イオン性液体溶液添加剤、又はこれらの組み合わせを含む、追加のタンパク質可溶剤を本方法で使用することができる。
【００３９】
フィブロインに由来するタンパク質組成物
本発明は、シルクフィブロインに由来するタンパク質組成物を提供し、上記組成物は、水溶液における溶解性及び安定性が増強されている。１つの実施形態において、本発明は、高圧でフィブロイン水溶液を加熱することを含む方法によって調製されたタンパク質組成物を提供する。フィブロイン水溶液は、少なくとも８Ｍの濃度で臭化リチウムを含む。フィブロイン水溶液を、少なくとも約１０ＰＳＩの圧力下、少なくとも約２０分間、少なくとも約１０５℃（２２１°Ｆ）に加熱して、タンパク質組成物を得る。タンパク質組成物のポリペプチドは、８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、タンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗの水溶液として、５ｃＰ未満の水溶液粘度を有する。
【００４０】
他の実施形態において、本発明は、高圧でフィブロイン水溶液を加熱することを含む方法によって調製されたタンパク質組成物であって、フィブロイン水溶液が、９〜１０Ｍの濃度で臭化リチウムを含み、フィブロイン水溶液を、約１５ＰＳＩ〜約２０ＰＳＩの圧力下、少なくとも２０分間、約１１５℃（２３９°Ｆ）〜約１２５℃（２５７°Ｆ）の範囲内の温度に加熱して、タンパク質組成物を得る、タンパク質組成物を提供する。タンパク質組成物は、６．５％未満のセリンアミノ酸残基を含んでいてもよく、タンパク質組成物は、１５％ｗ／ｗの水溶液として、１０ｃＰ未満の水溶液粘度を有していてもよい。
【００４１】
本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも４％異なり（フィブロイン由来対ＰＡＳＦ）、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、上記組成物が、天然フィブロインタンパク質と比較して２５％超低減されたセリン含量を有する、タンパク質組成物も提供する。フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量は、約１００ｋＤａ未満、約２５ｋＤａ超であってもよい。
【００４２】
別の実施形態において、本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも６％異なり、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、上記組成物が、天然フィブロインタンパク質と比較して４０％超低減されたセリン含量を有する、タンパク質組成物を提供する。フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量は、約９６ｋＤａ未満、約２５ｋＤａ超であってもよい。
【００４３】
本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、天然シルクフィブロインから改変され、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量が、約１００ｋＤａ未満、約２５ｋＤａ超であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２５未満の光学的吸光度を維持する、タンパク質組成物を更に提供する。例えば、タンパク質組成物の５％ｗ／ｗ溶液は、１０Ｈｚ及び２０％の振幅での５秒間の超音波処理後、５５０ｎｍで０．１未満の光学的吸光度を維持することができ、これは、本明細書に記載の超音波処理に使用される標準的な条件である。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも５％異なるように、天然シルクフィブロインから改変され、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量が、約９６ｋＤａ未満、約２５ｋＤａ超であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２未満の光学的吸光度を維持する、タンパク質組成物を提供する。
【００４５】
様々な実施形態において、フィブロインに由来するタンパク質組成物は、例えば、透析及び／又はろ過によって、乾燥粉末又は乾燥膜として、単離及び／又は精製することができる。或いは、フィブロインに由来するタンパク質組成物は、安定な水溶液として、単離及び／又は精製することができ、これは、食品又は飲料組成物として、又は眼科用製剤等の治療用製剤として、使用するために改変することができる。従って、本発明は、本明細書に記載のタンパク質組成物と食品又は飲料成分とを含む、食品又は飲料組成物も提供する。食品成分は、１又は複数の、単糖、二糖、炭水化物、脂肪、油、ビタミン、ミネラル及び水を含んでいてもよい。飲料成分は、１又は複数の、水、着色剤（例えば、合成着色剤、又はサフラン等の天然着色剤）、ビタミン、及びミネラルを含んでいてもよい。
【００４６】
様々な実施形態において、フィブロインに由来するタンパク質のアミノ酸組成は、セリン、グリシン及びアラニンの合計含量に対して、天然フィブロインのアミノ酸組成と、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、少なくとも５．５％、又は少なくとも６％異なる。
【００４７】
上記組成物は、天然フィブロインタンパク質のセリン含量と比較して、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、又は４５％超、低減されたセリン含量を有していてもよい。
【００４８】
フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量は、約１００ｋＤａ未満、約９８ｋＤａ未満、約９６ｋＤａ未満、約９５ｋＤａ未満、約９０ｋＤａ未満、約８５ｋＤａ未満、約８０ｋＤａ未満、約７５ｋＤａ未満、又は約７０ｋＤａ未満であってもよい。様々な実施形態において、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量は、約３０ｋＤａ超、約３５ｋＤａ超、約４０ｋＤａ超、約５０ｋＤａ超、約６０ｋＤａ超、又は約７０ｋＤａ超であってもよい。従って、フィブロインに由来するタンパク質組成物の（重量平均の）平均分子量は、約３０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約９６ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約９０ｋＤａ、約３５ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約３５ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約６０ｋＤａであってもよい。様々な実施形態において、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量は、約６０ｋＤａ〜約８０ｋＤａ、約５０ｋＤａ〜約７０ｋＤａ、約４０ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、約３０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、約３５ｋＤａ〜約４５ｋＤａ、又は約４０ｋＤａ〜約４３ｋＤａである。
【００４９】
様々な実施形態において、タンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗの水溶液として、４ｃＰ未満の水溶液粘度を有する。更なる実施形態において、タンパク質組成物は、２４％ｗ／ｗの水溶液として、１０ｃＰ未満の水溶液粘度を有する。
【００５０】
幾つかの実施形態において、タンパク質組成物は、目視検査で観察可能な任意の沈殿を生じず、４０％ｗ／ｗで、水に可溶性である。
【００５１】
様々な実施形態において、タンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗまでの濃度のタンパク質組成物の水溶液の超音波処理において、ゲル化しない。更なる実施形態において、タンパク質組成物は、１５％ｗ／ｗまで、２０％ｗ／ｗまで、２５％ｗ／ｗまで、３０％ｗ／ｗまで、３５％ｗ／ｗまで、又は４０％ｗ／ｗまでの濃度のタンパク質組成物の水溶液の超音波処理において、ゲル化しない。
【００５２】
幾つかの実施形態において、タンパク質組成物は、８％未満のセリンアミノ酸残基を含む。他の実施形態において、タンパク質組成物は、７．５％未満のセリンアミノ酸残基、７％未満のセリンアミノ酸残基、６．５％未満のセリンアミノ酸残基、又は６％未満のセリンアミノ酸残基を含む。
【００５３】
幾つかの実施形態において、タンパク質組成物は、タンパク質組成物の総アミノ酸含量に対して、４６．５％超のグリシンアミノ酸を含む。他の実施形態において、タンパク質組成物は、４７％超のグリシンアミノ酸、４７．５％超のグリシンアミノ酸、又は４８％超のグリシンアミノ酸を含む。
【００５４】
幾つかの実施形態において、タンパク質組成物は、タンパク質組成物の総アミノ酸含量に対して、３０％超のアラニンアミノ酸を含む。他の実施形態において、タンパク質組成物は、３０．５％超のアラニン、３１％超のアラニン、又は３１．５％超のアラニンを含む。
【００５５】
幾つかの実施形態において、タンパク質組成物は、薄膜に乾燥された後、完全に再溶解する。様々な実施形態において、タンパク質組成物は、水溶液中で、βシートタンパク質構造を欠く。ある実施形態において、タンパク質組成物は、少なくとも５秒間の超音波処理後、５５０ｎｍで０．２５未満の水溶液中における光学的吸光度を維持する。
【００５６】
幾つかの実施形態において、タンパク質組成物は水と組み合わされる。タンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗの濃度、又は更に濃い濃度、例えば、１５％ｗ／ｗ、２０％ｗ／ｗ、２５％ｗ／ｗ、３０％ｗ／ｗ、３５％ｗ／ｗ、又は４０％ｗ／ｗで水に完全に溶解することができる。幾つかの実施形態において、タンパク質組成物は、例えば、透析、ろ過、又はこれらの組み合わせによって、単離及び精製することができる。
【００５７】
様々な実施形態において、タンパク質組成物は、例えば、タンパク質組成物を含まない対応する組成物の拡散と比較して、タンパク質組成物と眼科用製剤成分とを含む水溶液の拡散を増強する。拡散の増強によって、水溶液の表面積は、２倍超、又は３倍超に増加するという結果をもたらすことができる。
【００５８】
幾つかの実施形態において、タンパク質組成物は、２０％ｗ／ｖまで、３０％ｗ／ｖまで、又は４０％ｗ／ｖまでの濃度でゲルを形成しない。タンパク質組成物は、少なくとも９．８ｃＰの粘度まで、溶液のままで存在することができる。
【００５９】
幾つかの実施形態において、フィブロインに由来するタンパク質組成物は、フィブロインに由来するタンパク質組成物のアミノ酸の少なくとも約４７．５％を構成する、グリシン−アラニン−グリシン−アラニン（ＧＡＧＡ）のアミノ酸セグメントを有していてもよい。フィブロインに由来するタンパク質組成物はまた、タンパク質組成物のアミノ酸の、少なくとも約４８％、少なくとも約４８．５％、少なくとも約４９％、少なくとも約４９．５％、又は少なくとも約５０％を構成する、グリシン−アラニン−グリシン−アラニン（ＧＡＧＡ）のアミノ酸セグメントを有していてもよい。
【００６０】
様々な実施形態において、フィブロインに由来するタンパク質組成物は、フィブロインに由来するタンパク質組成物のアミノ酸の少なくとも約５９％を構成する、グリシン−アラニン（ＧＡ）のアミノ酸セグメントを有していてもよい。フィブロインに由来するタンパク質組成物はまた、タンパク質組成物のアミノ酸の少なくとも約５９．５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６０．５％、少なくとも約６１％、又は少なくとも約６１．５％を構成する、グリシン−アラニン（ＧＡ）のアミノ酸セグメントを有することもできる。
【００６１】
別の実施形態において、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列は、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも６％異なり、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量が、約１００ｋＤａ未満であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２５未満の光学的吸光度を維持する。このように、１つの詳細な実施形態において、本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも６％異なり、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、上記組成物が、天然フィブロインタンパク質と比較して４０％超低減されたセリン含量を有し、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量が、約９６ｋＤａ未満である、タンパク質組成物を提供する。
【００６２】
別の実施形態において、本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、天然シルクフィブロインから改変され、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量が、約１００ｋＤａ未満であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２５未満の光学的吸光度を維持する、タンパク質組成物を提供する。１つの詳細な実施形態において、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも５％異なるように、天然シルクフィブロインから改変され、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量が、約９６ｋＤａ未満であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２未満の光学的吸光度を維持する。
【００６３】
このように、１つの詳細な実施形態において、本発明は、水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも５％異なるように、天然シルクフィブロインから改変され、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量が約９６ｋＤａ未満であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２未満の光学的吸光度を維持する、タンパク質組成物を提供する。
【００６４】
本発明は、高圧でフィブロイン水溶液を加熱することを含む方法によって調製されたタンパク質組成物であって、フィブロイン水溶液が、少なくとも８Ｍの濃度で臭化リチウムを含み、フィブロイン水溶液を、少なくとも約１０ＰＳＩの圧力下、少なくとも約２０分間、少なくとも約１０５℃（２２１°Ｆ）に加熱してタンパク質組成物が得られ、タンパク質組成物が、８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、タンパク質組成物が、１０％ｗ／ｗの水溶液として、５ｃＰ未満の水溶液粘度を有する、タンパク質組成物も提供する。従って、本発明は、本明細書に記載の１又は複数のプロセスステップを含む、フィブロインに由来するタンパク質組成物を調製する方法を提供する。
【００６５】
１つの実施形態において、臭化リチウムの濃度は、約８．５Ｍ〜約１１Ｍである。幾つかの実施形態において、臭化リチウムの濃度は、約９Ｍ〜約１０Ｍ、又は約９．５Ｍ〜約１０Ｍである。
【００６６】
幾つかの実施形態において、臭化リチウムを含むフィブロイン水溶液は、少なくとも約１０７℃（２２５°Ｆ）、少なくとも約１１０℃（２３０°Ｆ）、少なくとも約１１３℃（２３５°Ｆ）、少なくとも約１１５℃（２３９°Ｆ）、又は少なくとも約１２０℃（２４８°Ｆ）に加熱される。
【００６７】
幾つかの実施形態において、臭化リチウムを含むフィブロイン水溶液は、少なくとも約１２ＰＳＩ、少なくとも約１４ＰＳＩ、少なくとも約１５ＰＳＩ、又は少なくとも約１６ＰＳＩ、約１８ＰＳＩまで、又は約２０ＰＳＩまでの圧力下、加熱される。
【００６８】
幾つかの実施形態において、臭化リチウムを含むフィブロイン水溶液は、少なくとも２０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、又は少なくとも約１時間、数（例えば、１２〜２４）時間まで、加熱される。
【００６９】
幾つかの実施形態において、タンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗの水溶液として、４ｃＰ未満の水溶液粘度を有する。様々な実施形態において、タンパク質組成物は、２４％ｗ／ｗの水溶液として、１０ｃＰ未満の水溶液粘度を有する。
【００７０】
幾つかの実施形態において、タンパク質組成物は、観察可能な沈殿を生じず、４０％ｗ／ｗで、水に溶解することができる。
【００７１】
幾つかの実施形態において、フィブロインは、セリシンから分離される。
【００７２】
幾つかの実施形態において、臭化リチウムは、タンパク質組成物から除去されて、精製タンパク質組成物を与える。様々な実施形態において、タンパク質組成物は、例えば、透析、ろ過、又はこれらの組み合わせによって、単離及び精製される。
【００７３】
様々な実施形態において、タンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗまで、１５％ｗ／ｗまで、２０％ｗ／ｗまで、２５％ｗ／ｗまで、３０％ｗ／ｗまで、３５％ｗ／ｗまで、又は４０％ｗ／ｗまでの濃度での組成物の水溶液の超音波処理において、ゲル化しない。
【００７４】
更なる実施形態において、タンパク質組成物は、上記したような特性と、セリン、グリシン及びアラニン含量に関して上記したようなアミノ酸組成とを有する。
【００７５】
様々な実施形態において、タンパク質組成物は、薄膜に乾燥された後、再溶解する。タンパク質組成物は、溶液中でβシートタンパク質構造を欠いていてもよい。タンパク質組成物は、溶液中で、少なくとも５秒間の超音波処理後、５５０ｎｍで０．２５未満の光学的吸光度を維持することができる。
【００７６】
１つの詳細な実施形態において、本発明は、高圧でフィブロイン水溶液を加熱することを含む方法によって調製されたタンパク質組成物であって、フィブロイン水溶液が、９〜１０Ｍの濃度で臭化リチウムを含み、フィブロイン水溶液を、約１５ＰＳＩ〜約２０ＰＳＩの圧力下、少なくとも約３０分間、約１１５℃（２３９°Ｆ）〜約１２５℃（２５７°Ｆ）の範囲内の温度に加熱してタンパク質組成物が得られ、タンパク質組成物が、６．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、タンパク質組成物が、１５％ｗ／ｗの水溶液として、１０ｃＰ未満の水溶液粘度を有する、タンパク質組成物を提供する。
【００７７】
更なる本発明の実施形態を以下の本明細書に記載する。
【００７８】
本発明は、天然のシルクフィブロインタンパク質と化学的に異なる新規なシルクに由来するタンパク質（ＳＤＰ）組成物を提供する。ＳＤＰは、水溶液中における安定性が増強されている。ＳＤＰは、本明細書に記載のタンパク質組成物、例えば、タンパク質組成物の水溶液と共に、食品、飲料又は眼科用成分を組み合わせて含む、食品組成物、飲料、又は眼科用製剤を形成するための方法において使用することができる。上記溶液は、約０．０１％〜約９２％ｗ／ｖのＳＤＰを含んでいてもよい。上記溶液は、約８％〜約９９．９％ｗ／ｖが水であってもよい。
【００７９】
１つの実施形態において、増強された溶液安定性を持つＳＤＰ材料は、ヒト又は動物用の摂取のための飲料の成分として、例えば、スポーツドリンク、栄養ドリンク、ソフトドリンク、又はボトル入り飲料水の成分又は添加物として、使用することができる。別の実施形態において、増強された溶液安定性を持つＳＤＰ材料は、食品製品、例えば、乳製品、シリアル、又は加工食品における成分として使用することができる。更に別の実施形態において、増強された溶液安定性を持つＳＤＰ材料は、点眼製剤、例えば、人工涙液、眼科用潤滑剤、リッドスクラブ（ｌｉｄ  ｓｃｒｕｂ）、治療用製剤における成分として使用することができる。
【００８０】
１つの態様において、本発明は、従来技術の方法を使用して製造される約１００〜２００ｋＤａのシルクフィブロインから、本明細書に記載の約３０〜９０ｋＤａ又は約３０〜５０ｋＤａのＳＤＰ材料へ、タンパク質の平均分子量を低減するような、フィブロインタンパク質の、加水分解、アミノ酸分解、又はこれらの組み合わせを誘導する方法を提供する。得られたポリペプチドは、本明細書に挙げた範囲に平均された様々な分子量のペプチドの無作為の組み合わせであってもよい。更に、標準的な分析手順によって、検出不可能なレベルにシステイン含量を低減することによって、アミノ酸化学を変更することができる。例えば、セリン含量は、標準的な分析手順によって測定されるように、天然フィブロインで見いだされるレベルから５０％を超えて低減することができ、アラニン及びグリシンの全含量の５％まで（アミノ酸含量での比較）の増加をもたらすことができる。上記方法は、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動法を使用して試料を流す場合と同様に、処理後、フィブロイン軽鎖タンパク質が認識されない、タンパク質組成物を提供することができる。更に、得られたＳＤＰ材料は、処理後にβシートタンパク質二次構造を最小限形成〜形成しない一方、従来技術の方法を使用して製造されたシルクフィブロイン溶液はかなりの量のβシート二次構造を形成する。１つの実施形態において、ＳＤＰ材料は、オートクレーブ又はオートクレーブ様の条件（即ち、約１２０℃で１４〜１８ＰＳＩ）下、４０〜６０％ｗ／ｖの臭化リチウム（ＬｉＢｒ）溶液の存在中、シルクフィブロイン繊維を処理することによって調製することができる。
【００８１】
幾つかの実施形態において、本発明は、成分としてＳＤＰを含む食品又は飲料製品を提供する。ＳＤＰは、食品又は飲料を消費するヒト又は動物に対して改善された栄養価、健康上の利益及び／又は治療上の利点をもたらす、更なるタンパク質含量を提供するのに役立ち得る。１つの実施形態において、ＳＤＰは、水、スポーツドリンク、エネルギードリンク又は炭酸飲料等の飲料に含まれる。別の実施形態において、ＳＤＰは、ヨーグルト、エネルギーバー、シリアル、パン又はパスタ等の食品製品に含まれる。
【００８２】
食品又は飲料製品は、ＳＤＰの有効量、例えば、約０．０１重量％〜約９２重量％のＳＤＰを含んでいてもよい。様々な実施形態において、ＳＤＰは、約０．１重量％〜約３０重量％、約０．５重量％〜約２０重量％、又は約１重量％〜約１０重量％で存在することができる。幾つかの詳細な実施形態において、ＳＤＰは、カイコフィブロインに由来していてもよい。
【００８３】
別の実施形態において、本発明は、ヒト又は哺乳動物のドライアイ症候群の処置のための眼科用組成物を提供する。上記組成物は、ドライアイ症候群を処置するための有効量のＳＤＰを含む水溶液であってもよい。例えば、上記水溶液は約０．０１重量％〜約８０重量％のＳＤＰを含んでいてもよい。他の実施形態において、上記水溶液は、約０．１重量％〜約１０重量％、又は約０．５重量％〜約２重量％でＳＤＰを含んでいてもよい。幾つかの詳細な実施形態において、眼科用組成物は、約０．０５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．１％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．２％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．２５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．７５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約１％ｗ／ｖのＳＤＰ、約１．５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約２％ｗ／ｖのＳＤＰ、約２．５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約８％ｗ／ｖのＳＤＰ、又は約１０％ｗ／ｖのＳＤＰを含んでいてもよい。ＳＤＰは、カイコフィブロインに由来していてもよい。
【００８４】
様々な実施形態において、眼科用製剤は、粘滑剤、緩衝剤及び／又は安定化剤等の追加成分を、水溶液中に含んでいてもよい。粘滑剤は、例えば、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストラン、ゼラチン、ポリオール、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール（ＰＧ）、ヒプロメロース、グリセリン、ポリソルベート８０、ポリビニルアルコール、又はポビドンであってもよい。粘滑剤は、例えば、約０．０１重量％〜約１０重量％、又は約０．２重量％〜約２重量％で存在していてもよい。１つの詳細な実施形態において、粘滑剤はＨＡである。様々な実施形態において、ＨＡは、製剤に対して約０．２重量％で存在していてもよい。
【００８５】
眼科用製剤のための緩衝剤又は安定化剤は、リン酸緩衝食塩水、ホウ酸緩衝食塩水、クエン酸緩衝食塩水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛、塩酸、水酸化ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、又はこれらの組み合わせであってもよい。
【００８６】
眼科用製剤は、有効量の抗菌防腐剤を更に含んでいてもよい。抗菌防腐剤は、例えば、過ホウ酸ナトリウム、ポリクオタニウム−１（例えば、ポリクォッド（Ｐｏｌｙｑｕａｄ）（登録商標）防腐剤）、ベンザルコニウム（ＢＡＫ）クロライド、亜塩素酸ナトリウム、ブリモニジン、ブリモニジンプリート、ポレキシトニウム（ｐｏｌｅｘｉｔｏｎｉｕｍ）、又はこれらの組み合わせであってもよい。
【００８７】
眼科用製剤はまた、有効量の血管収縮剤、抗ヒスタミン剤、又はこれらの組み合わせも含んでいてもよい。血管収縮剤又は抗ヒスタミン剤は、ナファゾリン塩酸塩、エフェドリン塩酸塩、フェニレフリン塩酸塩、テトラヒドロゾリン塩酸塩、フェニラミンマレイン酸塩、又はこれらの組み合わせであってもよい。
【００８８】
１つの実施形態において、眼科用製剤は、水と組み合わされた、有効量の本明細書に記載のフィブロインに由来するタンパク質と、１又は複数の眼科用成分とを含んでいてもよい。眼科用成分は、例えば、ａ）ポリビニルアルコール、ｂ）ＰＥＧ−４００及びヒアルロン酸、ｃ）ＰＥＧ−４００及びプロピレングリコール、ｄ）ＣＭＣ及びグリセリン、ｅ）プロピレングリコール及びグリセリン、ｆ）グリセリン、ヒプロメース及びＰＥＧ−４００、又は前記成分の任意の１つ又は複数の組み合わせであってもよい。眼科用製剤は、例えば、ＨＰ−グアー、ホウ酸塩、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化亜鉛等の１又は複数の不活性成分を含んでいてもよい。眼科用製剤はまた、例えば、亜塩素酸ナトリウム（プリート（登録商標）防腐剤（ＮａＣｌＯ２））、ポリクォッド、ＢＡＫ、ＥＤＴＡ、ソルビン酸、ベンジルアルコール等の１又は複数の眼科用防腐剤を含んでいてもよい。眼科用成分、不活性成分及び防腐剤は、約０．２５％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、２．５％又は５％等の、約０．１％〜約５％ｗ／ｖ、又は前述の値の任意の２つの間の範囲で含まれていてもよい。
【００８９】
従って、本発明は、天然フィブロインの一次アミノ酸配列が天然シルクフィブロインから改変された、水溶液中における安定性が増強された、シルクに由来するタンパク質（ＳＤＰ）組成物であって、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、上記組成物が天然フィブロインタンパク質と比較して４０％超低減されたセリン含量を有し、シルクに由来するタンパク質の平均分子量が、約９６ｋＤａ未満である、組成物を提供する。
【００９０】
本発明は、ヒト又は哺乳動物における眼科疾患の処置のための眼科用製剤であって、眼科用製剤が水及び有効量の上記に記載のＳＤＰを含む、製剤も提供する。本発明は、ヒト又は哺乳動物の眼の処置に使用するための眼科用組成物であって、眼科用組成物が水、１又は複数の緩衝剤及び安定化剤、並びに有効量の上記に記載のＳＤＰを含む、組成物も更に提供する。
【００９１】
ＳＤＰは水中で非常に安定であり、保存可能期間の溶液安定性は、溶液中の天然シルクフィブロインの安定性の２倍を超える。例えば、ＳＤＰは水中で非常に安定であり、保存可能期間の溶液安定性は、溶液中の天然シルクフィブロインと比較して１０倍を超える。ＳＤＰ材料は、水溶液中の場合、５％（５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度の溶液の超音波処理でゲル化しない。他の実施形態において、ＳＤＰ材料は、水溶液中の場合、１０％（１００ｍｇ／ｍＬ）の濃度の溶液の超音波処理でゲル化しない。
【００９２】
ＳＤＰ材料は、天然シルクフィブロインタンパク質と比較した場合に５０％超除去されたフィブロイン軽鎖を有していてもよい。ＳＤＰ材料は、アミノ酸含量に対して約８％未満のセリンアミノ酸含量、又はアミノ酸含量に対して約６％未満のセリンアミノ酸含量を有していてもよい。
【００９３】
ＳＤＰ材料は、約４６．５％超のグリシンアミノ酸含量を有していてもよい。ＳＤＰ材料は、約３０％超又は約３０．５％超のアラニンアミノ酸含量を有していてもよい。ＳＤＰ材料は、例えば、タンパク質組成物の加水分解ポリペプチドのＨＰＬＣ分析によって測定される、検出可能なシステインアミノ酸含量を有していない。
【００９４】
ＳＤＰ材料は、天然シルクフィブロインタンパク質と比較して、例えば、以下の実施例８に記載のＦＴＩＲ分析によって検出される、９０％未満、９５％未満、又は９８％未満のβシート二次タンパク質構造を形成できる。
【００９５】
本発明は、ヒト又は哺乳動物における眼の処置に使用するための眼科用組成物であって、上記組成物が、有効量の上記に記載のＳＤＰ材料及び緩衝剤又は安定化剤を含む水溶液を含む、組成物を更に提供する。
【００９６】
本発明はまた、ヒト又は哺乳動物における眼科疾患の処置のための眼科用製剤であって、上記組成物が、本明細書に記載の増強された安定性を有するＳＤＰ材料の有効量を含む水溶液を含む、製剤を更に提供する。
【００９７】
本発明は、食品、飲料又は眼科用成分を、本明細書に記載のフィブロインに由来するタンパク質組成物と組み合わせて含むシルクタンパク質を用いる、飲料混合物、食品組成物又は眼科用組成物を形成するための方法も提供する。
【００９８】
以下の実施例は、上記発明を説明することを意図しており、その範囲を狭めるものとして解釈されるべきではない。当業者は、実施例が本発明を実施できる多くの他の方法を示唆していることを容易に認識するだろう。本発明の範囲内において、多くの変形及び改変を行ってもよいことが理解されるべきである。
【００９９】
実施例１．シルクに由来するタンパク質の調製及びローレンス安定性試験
材料：カイコ繭はＴａｊｉｍａ  Ｓｈｏｊｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（日本）から入手した。臭化リチウム（ＬｉＢｒ）はＦＭＣ  Ｌｉｔｈｉｕｍ，Ｉｎｃ．（ノースカロライナ）から入手した。オートクレーブはＴｕｔｔｎａｕｅｒ  Ｌｔｄ．（ニューヨーク）から入手した。３，５００Ｄａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）透析膜はＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ）から入手した。オークトン（Ｏａｋｔｏｎ）臭化物（Ｂｒ−）ダブルジャンクション型イオン選択性電極はＩＳＥ，Ｏａｋｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（イリノイ）から入手した。
【０１００】
処理：ＳＤＰ及び従来技術のシルクフィブロインの２つの試料を図１に示すようにして調製した。簡単には、蛹を取り除いてカットしたカイコ繭（３〜５カット／繭）を、９５℃に温めた０．３ｗｔ％のＮａＣＯ３を含有する脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）に、２３３ｍＬ水／ｇ繭で浸すことによって、ＳＤＰを製造した。繭をこの溶液中で７５分間撹拌して、セリシンを溶解し、シルク繊維から分離した。続いて、繭を１回の洗浄あたり２０分間、同等のｄｉＨ２Ｏ希釈物で４回洗浄して、洗浄されたシルク繊維から残ったセリシンを除去した。次いで、繊維を、対流式オーブン中、６０℃で２時間乾燥し、秤量し、抽出した繊維のｇに対して４倍容量のＬｉＢｒの比率で、５４ｗｔ％のＬｉＢｒ水に溶解した。この溶液を覆い、次いで対流式オーブン中、６０℃で２時間温めて、抽出した繊維の溶解を促進した。次いで、溶液をオートクレーブに入れ、滅菌条件（１２１℃、１７ＰＳＩ、湿度９０〜１００％）に３０分間曝露して、フィブロインの変換を促進した。得られた溶液を室温に放冷し、次いで、ｄｉＨ２Ｏを用いて５％フィブロインに希釈し、３，５００ＤａのＭＷＣＯ膜を使用して、ＬｉＢｒ塩を除去するために透析した。Ｂｒ−イオンが、オークトン臭化物（Ｂｒ−）ダブルジャンクション型イオン選択性電極で読み取る、加水分解されたフィブロイン溶液の測定で１ｐｐｍ未満になるまで、複数回の交換をｄｉＨ２Ｏ中で行った。次いで、溶液を１〜５μｍの多孔度のフィルターを使用して更にろ過し、続いて０．２μｍの精製用フィルターを通じてろ過した。この生成物を図２において「ＳＤＰ溶液」として示す。
【０１０１】
「対照」のシルクフィブロイン溶液を、図１に示すようにして調製して、図２に示す「従来技術のシルクフィブロイン溶液」を得た。オートクレーブステップを除き、同様の方法を上記のようにして行った。各試料のサンプリング量（５ｍＬ）を別々の２０ｍＬのガラスビーカーに入れ、ビーカーをホイルで封をした。次いで、試料をローレンス安定性試験に付した。
【０１０２】
タンパク質の試験水溶液（５％ｗ／ｖ、５０ｍｇ／ｍＬ）をオートクレーブチャンバー内に入れて、ローレンス安定性試験を行う。次いで、オートクレーブを１２１℃、１７ＰＳＩ、３０分間、湿度９７〜１００％のサイクルで作動させる。サイクルの終了後、溶液を放冷し、次いでオートクレーブチャンバーから取り出す。次いで、溶液を振とうして、溶液のゲル化挙動を観察する。溶液が約１０秒間の浸透でゲル化した場合、試料はローレンス安定性試験に不合格となる。試験の不合格とは、材料が、タンパク質溶液として本質的に不安定であることを示す。
【０１０３】
ローレンス安定性試験をＳＤＰ溶液及び従来技術のシルクフィブロイン溶液の両方で行った。従来技術のシルクフィブロイン溶液試料はすぐにゲル化し、従って、ローレンス安定性試験に不合格であった。逆に、ＳＤＰ溶液試料はいつまでも溶液のままであり、従って、ローレンス安定性試験に合格した。ゲル化しないことは、上記図１に示すように、ＳＤＰ溶液の製造にオートクレーブ処理ステップが組み込まれたという事実に起因すると考えることができる。異なる試験結果の画像（ゲル化しない対ゲル化）を図２に示す。
【０１０４】
実施例２．シルクに由来するタンパク質の分子量特性
可溶化したタンパク質の分子量分布に対する処理の効果を評価するために、ＳＤＰ溶液及び従来技術のシルクフィブロイン溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に付し、分子量によってタンパク質を分離した。詳細には、１５μｇの各試料にドデシル硫酸ナトリウム及びジチオスレイトール（Ｂｉｏｒａｄ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア）を含有する緩衝液を流しながら混合して、任意の二次折りたたみ構造及びジスルフィド結合をそれぞれ取り除いた。次いで、混合物を７０℃で５分間加熱した。混合物を、プレキャストしたＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝塩（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア）を含有する、４〜１２％のポリアクリルアミド勾配ゲル上に２．５〜２００ｋＤａ分子量ラダー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア）と共に乗せて、次いで、バイオラッドパワーパックパワーサプライ（ＢｉｏＲａｄ  ＰｏｗｅｒＰａｃ  Ｐｏｗｅｒ  ｓｕｐｐｌｙ）（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア）で、９０分間、１２０Ｖの電場に曝した。次いで、ゲルを除去し、クーマシーブルー染料中に１２時間置いてタンパク質を染色し、続いて、ｄｉＨ２Ｏ中で６時間洗浄した。次いで、ゲルをバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）ＧＳ−８００キャリブレーティド・デンシトメーター（Ｃａｌｉｂｉａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア）でスキャンした。
【０１０５】
得られたゲルを図３に示す。結果は、ＳＤＰ溶液を調製するために使用した処理が、平均分子量を１５０〜２００ｋＤａから８０ｋＤａ未満まで大きく変化させたことを示す（図３）。分子量の変化は、元の天然フィブロインの一次及び／又は二次構造の変換を明確に示す。更に、フィブロインのフィブロイン軽鎖は、オートクレーブプロセス後のＳＤＰに存在せず（従来技術フィブロインのレーン２の２３〜２６ｋＤａに認められる）、タンパク質のフィブロイン軽鎖部分が、処理によって分解されたか又は除去されたことを示す。これらの結果は、オートクレーブ処理が、天然フィブロインタンパク質を、天然フィブロインタンパク質よりも小さいペプチド断片を有する新規材料に変換したことを実証する。方法は、更にフィブロイン軽鎖を分解／改変する。これらの変換は、これらの化学的変化の結果として、増強された溶液安定性を有するＳＤＰ材料をもたらす。
【０１０６】
実施例３．シルクに由来するタンパク質の安定性検討
従来技術のフィブロインの安定性と比較して、得られたＳＤＰの安定性に対するオートクレーブプロセスの機能的な影響を更に測定するために、シルクフィブロインタンパク質のゲル化をよく特徴づけるモデルを再現する、Ｗａｎｇら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８、２９（８）：１０５４〜１０６４）の方法を使用して、試料を分析した。多量の両試料（０．５ｍＬ、ＳＤＰ及びＰＡＳＦ）を１．７ｍＬの透明遠心チューブに添加し、超音波処理（２０％振幅、１０Ｈｚ、１５秒）に付した。次いで、ゲル化の検査として、ゲル形成について、溶液を含有する透明チューブを目視でモニターした。
【０１０７】
図４Ａに示すように、ＳＤＰ溶液試料はゲルを形成しなかった。超音波処理後３カ月経っても、ＳＤＰ試料は、目視検査によって判定される通り、溶液のままであり、タンパク質凝集しなかった。従来技術のシルクフィブロイン溶液試料は、超音波処理後迅速に（２時間以内に）ゲル化した。得られたゲル化した従来技術のシルクフィブロインを図４Ｂに示す。これらの結果は、オートクレーブプロセスが、従来技術のフィブロインを新規材料に変換し、得られたＳＤＰ材料に安定性をもたらすことを更に示す。
【０１０８】
実施例４．シルク水溶液の粘度プロファイルに対する加熱の影響
ＰＡＳＦ及びＳＤＰの物理化学的特性について、溶液の粘度に対するタンパク質の濃度の影響に特に注意しながら検討した。シルクフィブロイン重鎖及び軽鎖タンパク質がそれらのレオロジー特性で区別され、従って、ＰＡＳＦ中のそれらの成分の異なる分解割合が、経時的に所定の溶液の粘度に予測不可能な変化を引きおこすであろうことが、Ｚａｆａｒら（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１５、１６（２）：６０６〜６１４）によって示されている。更に、粘度に対する全てのフィブロインタンパク質の濃度の影響は、Ｚａｆａｒらにも示されている非線形であって、精製フィブロイン溶液が１００ｍｇ／ｍＬを超えると急激に増加し、そのため、特定の応用のためのタンパク質溶液の使用可能な濃度が制限されている。
【０１０９】
これらの制限がＳＤＰに行ったアミノ酸変換によって克服できるか否かを判定するために、８０〜１００ｍＬのＰＡＳＦ又はオートクレーブで処理されたＳＤＰを５０〜８０ｍｇ／ｍＬで作製した。オートクレーブ条件を下回るレベルでのＰＡＳＦの加熱の影響を評価するために、ＰＡＳＦを上記に記載するようにして、ジャケット付反応容器で、２２５°Ｆで３０分間加熱した。精製溶液を、蒸発を促進するために、約２２℃で層流フード（ベーカーステリガード（Ｂａｋｅｒ  Ｓｔｅｒｉｌｇａｒｄ）５６４００、クラスＩＩ）内の１４０ｍｍの浅いプラスチック製の秤量ボートに入れた。定期的に、濃縮された試料を集めてタンパク質含量（％ｗ／ｗで計算）を測定し、粘度計（ブルックフィールド（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ）ＬＶＤＶ−Ｅ、スピンドル００）を使用して粘度を評価した。測定は、正確な粘度測定を可能にするであろうトルク範囲を可能にする１分あたりのスピンドル回転数（約１〜１００ｒｐｍ）で行い、１６ｍＬの試料量で、２５℃で測定した。
【０１１０】
図５にまとめるように、ＰＡＳＦの粘度は、溶液が７５ｍｇ／ｇを超えた時に急上昇した。更に、ＰＡＳＦは２００ｍｇ／ｇ超に濃縮することができず、その時点でフィブロインタンパク質の不溶化が開始した。透析の前に２２５°Ｆに加熱したＰＡＳＦ溶液は、溶液の粘度に対する加熱の影響を実証した。特に、加熱したＰＡＳＦは、加熱していないＰＡＳＦと比較して任意の所定の濃度で低い粘度を示した。対照的に、ＳＤＰは、１４０ｍｇ／ｇ又はこれを下回る濃度で、溶液の粘度の最も小さな変化を示した（図５）。更に、ＳＤＰの粘度は、ＰＡＳＦが溶液として存在できなかったタンパク質濃度（例えば、２４０ｍｇ／ｇ）で、約１０ｃＰを下回ったままであった。重要なことは、ＳＤＰは、４００ｍｇ／ｇを超える濃度で均質なままであることが可能で、粘度は１５０ｃＰ未満であった。
【０１１１】
このように、ＳＤＰの水溶液は、４％ｗ／ｗを上回る全ての濃度で、ＰＡＳＦと比較して低い粘度を示す。更に、ＰＡＳＦ溶液については、ゲル化は、正確な粘度測定が不可能なポイントである約２０％ｗ／ｗで起こり始めるが、ＳＤＰ材料は、２５％ｗ／ｗ溶液に至るまで、ゲル化、凝集挙動、又は粘度の有意な増加を示さずに、濃度は上昇した。
【０１１２】
総合すると、これらの結果は、ＳＤＰの調製のための本明細書に記載の方法が関連するタンパク質の変換が、高濃度で低粘度のタンパク質溶液の製造に必要であることを明確に実証している。
【０１１３】
実施例５．ピルボイルペプチドの形成
上記に記載のスキーム１に示す化学反応は、ピルボイルペプチドの生成をもたらす。ピルボイルペプチドはピルベートに分解し、これは標準のピルベートアッセイによって迅速に検出可能である。熱及び圧力の適用（例えば、オートクレーブ内の環境）によってシルクフィブロインタンパク質の処理におけるピルボイルの生成を促進することができることを実証するために、シルクフィブロイン水溶液（水中に５％ｗ／ｖ）を、上記に記載の従来技術の方法を使用して製造した。次いで、２１０°Ｆまで又はタンパク質溶液の沸点直下の所定温度で、熱ジャケット付ビーカー（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ、ニュージャージー）中で材料を加熱した。詳細には、従来技術のシルクフィブロインタンパク質溶液を約６５℃（約１５０°Ｆ）、約９０℃（約２００°Ｆ）、又は約９９℃（約２１０°Ｆ）に加熱し、次いで、これらの温度に達した時にサンプリングして、比色アッセイ（ピルベートアッセイキット、ＭＡＫ０７１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によってピルベート濃度を測定した。
【０１１４】
ピルベートの生成は、９０℃及び９９℃に加熱した試料の両方で増加した。ピルベートは９９℃で５０％に増加した（図６Ａ）。ピルベートの変換が経時的に更に増強されるか否かを判定するために、試料を９９℃に加熱し、この温度で３０分間維持した（図６Ｂ）。継続的な加熱はピルベートの形成の着実な増加を引き起こし、非加熱試料に対して４倍以上のピルベートの増加をもたらした。これらの結果は、シルクフィブロインタンパク質の加熱において、ピルベートアッセイによって検出されるようなピルボイル含有材料への化学的変化が存在することを示す。このデータから、オートクレーブプロセス等のより極端な加熱環境において、シルクフィブロインタンパク質が刺激されて、更に大きな程度でピルベートが生成すると結論づけることができる。このことは、最終のＳＤＰ生成物が従来技術のシルクフィブロインとは化学的に異なる物質であるという証拠を更に与える。
【０１１５】
実施例６．アミノ酸プロファイルの分析
アミノ酸プロファイルに対する、９．３ＭのＬｉＢｒ溶液に溶解されたシルクフィブロイン繊維の加熱の影響を、イオン交換クロマトグラフィー（ＡＯＡＣ公認法９９４．１２、Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ．ｃｏｍ、ミネソタ）を使用して検討した。ＳＤＰ溶液及び従来技術のシルクフィブロイン溶液の両方について、実施例１に記載の方法を使用して試料を製造した。次いで、溶液を、クロマトグラフィーによる評価のために同様の濃度にした。シルクフィブロインタンパク質の一次配列における顕著な組成及び二次構造形成における重要な役割を考慮して、セリン、グリシン及びアラニンのアミノ酸に特に注意を払った。
【０１１６】
ＳＤＰ溶液試料は、従来技術のシルクフィブロイン溶液試料（図７Ａ）と比較して４０％未満のセリンを含むことが見出され、対応してグリシン及びアラニンのレベルが増加した（図７Ｂ）。これらの結果はアミノ酸含量における顕著な変化を示し、この変化は、オートクレーブプロセスの結果として、異なる（及び増強された）化学的及び物理的特性をもたらす。これらの結果は、セリン含量の増加がシルクフィブロインタンパク質の初期の凝集の増加を示した一方で、グリシン及びアラニン含量が増加したシルクフィブロインタンパク質は、最初の凝集に対してより大きなエネルギー閾値を必要とし、Ｍａｙｅｎら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１５．１９７：１０〜１７）による文献の知見を裏付ける。従って、セリンの減少、並びにアラニン及びグリシン含量両方の増加によって、凝集傾向（及び／又は可能性）を低減するか又は除去して、より高いＳＤＰの溶液安定性をもたらす。
【０１１７】
実施例７．人工涙液製剤
ＳＤＰ溶液を使用して、眼の状態及び疾患を処置するために使用される人工涙液を製剤した。人工涙液は、疾患「ドライアイ」の処置のために、特別に製剤して、使用することができる。人工涙液はまた、偶発的又は外科的のいずれかの損傷によって生じた眼の外傷の処置のために、製剤して、使用することができる。
【０１１８】
人工涙液製剤へのＳＤＰの組み込みは、製剤の展延性を向上させるので、特に有利である。ＳＤＰを含有する人工涙液は、それらの溶液安定性に起因する極めて長い保存可能期間も有する。ＳＤＰタンパク質の主鎖に位置する親水性及び疎水性アミノ酸基のブロックコポリマー配列は、分子が、涙膜内の水溶性及び水不溶性の両方の化学物質と相互作用することを可能にする。人工涙液の点眼製剤に成分として含ませる場合、ＳＤＰ成分は、人工涙液の展延性を増強する作用をし、これは、患者に更なる快適さをもたらし、製品の有効性を延長した。凝集する従来技術のシルクフィブロイン溶液群は、この拡散性を可能にすることを必要としないので、経時的に溶液中でのタンパク質製品の安定性を増強するこれらの領域を除去することが有利である。
【０１１９】
人工涙液の増強された拡散能力を、ＳＤＰ成分を使用して製剤された人工涙液と人工涙液製品の主要ブランドとを比較することによって実証した。試験プロトコルを使用して、様々な点眼剤製品の濡れ性に対する機械的拡散の効果を評価した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ＡＶＲのテラティアーズ（登録商標）（ＴＴ）人工涙液、ＡＭＯのブリンク（登録商標）ティアーズ点眼剤、Ａｌｃｏｎのシスタンバランス（登録商標）（ＳＢ）点眼剤、及びＳＤＰを含む製剤を実験で比較した。参考のために、ＰＢＳは水中に１００ｍｍｏｌのＰＢＳ塩を含み、ＴＴは、水中に有効成分として０．２５重量％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）と追加の緩衝塩とを含み、ブリンクは、水中に有効成分として０．２重量％のヒアルロン酸（ＨＡ）と緩衝塩とを含み、ＳＢは、有効成分として０．６重量％のプロピレングリコール（ＰＧ）と、緩衝塩と共に増強賦形剤としてＨＰ−グアー及び鉱油とを含み、ＳＤＰ溶液は、０．２５重量％のＣＭＣと、１重量／容積％でＳＤＰ及び緩衝塩（即ち、１３７ｍＭのＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液）とを含んでいた。
【０１２０】
この比較製品群は、複数の粘滑剤及び追加の有効成分を増強する賦形剤を含んでいた。図８は、ＳＤＰ成分の含有が、機械的拡散能力を、主要ブランド製剤を約４倍上回って増強することを示す。この拡散後の増強は、眼球の表面全体での眼瞼清拭と比較することができる。このように、ＳＤＰ成分は、製品の有効性及び安定性を増強しながら、患者に対するより良い快適さを与える。更に、成分としての従来技術のシルクフィブロイン溶液と比較して、ＳＤＰの添加は、従来技術のシルクフィブロイン溶液が製品の保存可能期間中にゲル化及び凝集するので、有利である。これらの凝集は、現行の米国薬局方（ＵＳＰ）の要件に基づく眼科用製剤では許容されないだろう（Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｍａｔｔｅｒ  ｉｎ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ：ＵＳＰ＜７８８〜７８９＞）。
【０１２１】
実施例８．タンパク質二次構造の分析
二次構造形成に対するオートクレーブ処理の影響を評価した。５％ｗ／ｖのＳＤＰ溶液及び５％ｗ／ｖの従来技術のシルクフィブロイン溶液（それぞれ１００μＬ）を直径１４ｍｍのシリコンゴム表面（ｎ＝６）に置き、数時間かけて固体膜まで風乾した。次いで、膜をＡＴＲ−ＦＴＩＲ（ニコレー（Ｎｉｃｏｌｅｔ）ｉＳ１０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ）によって、それぞれ４ｎｍの解像度で１６回スキャンして、評価した。
【０１２２】
膜はまた、１００％ＲＨ環境を作製するボウルを水で満たした真空容器である、水アニーリングチャンバー内で５時間処理した。水蒸気は、Ｊｉｎら（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００５、１５：１２４１〜１２４７）によって示されたような最も顕著なβシート構造である、フィブロインタンパク質膜の二次構造の形成を誘導する。次いで、膜試料を、上記に記載のようにして、ＦＴＩＲで再度分析した。スペクトル分析は、ＳＤＰ及び従来技術シルクフィブロイン膜は、材料の処理前は、同様のＩＲ特性を示すが、ＳＤＰ材料は、それぞれ１６２４ｃｍ−１及び１５１０ｃｍ−１でのＩＲスペクトルのアミドＩ及びＩＩ領域における周知のβシート吸収ピークが存在しないことが示すように、処理後にβシート二次構造を形成する能力を欠くことを明らかにした（図９Ａ）。この知見は２つの試料の材料組成物における顕著な相違を表し、これは、ＳＤＰ及びＰＡＳＦ試料においてアミノ酸の性質が本質的に相違することを直接的に示す。
【０１２３】
二次構造の影響を機能的に表すために、１５０ｍＬの溶液試料を両方とも、対流清浄空気環境中、室温で４８時間乾燥した。これは、２つの溶液の間に存在する著しい相違を実証する固体タンパク質材料の形成をもたらした（図９Ｂ）。最も注目すべきは、オートクレーブで処理したＳＤＰ材料は、透過性のより透明なＰＡＳＦ材料と比較して、芳香族アミノ酸への化学的変化を示すより暗い黄色の半透明性を示した。更に、ＳＤＰ材料は、容積の下部を完全な脱水から防ぎ、従って部分的には液体のままで残る、乾燥膜を形成した。これは従来技術のシルクフィブロイン材料の場合では無く、完全に乾燥して、波状の材料に物理的に歪めた。これらの結果は、ＳＤＰ材料を形成するオートクレーブ処理の結果として、材料の機械的特性、従って化学的相互作用に対する顕著な変化を示す。
【０１２４】
オートクレーブ処理の機能としての溶解性の評価のために、両方の乾燥材料の試料を秤量し、脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）で再構成した。ＳＤＰ材料については、硬い外膜を後で剥離して秤量した一方、従来技術のシルクフィブロインについては、材料の一部を破壊して秤量した。両方の試料について、５００ｍｇの材料を２５ｍＬのｄｉＨ２Ｏに添加し（２％ｗ／ｖ溶液）、次いで、高速設定で１０分間ボルテックスした。興味深いことに、ＳＤＰ材料はｄｉＨ２Ｏの容積に完全に溶解した一方、従来技術のシルクフィブロイン材料は極わずかしか溶解しなかった（図９Ｃ）。これらの結果は、材料の溶解性及び溶解性の性質が、オートクレーブ処理によって、ＳＤＰ及び従来技術のシルクフィブロイン材料の間で明確に変化したことを示す。
【０１２５】
実施例９．溶液安定性に対するフィブロインの酵素的切断の影響
ＳＤＰの増加した安定性が、アミノ酸変換の直接的な結果であるのか、又は加水分解によって生じるより小さなフィブロインタンパク質の生成に単に起因するのか否かを特定するために、従来技術のシルクフィブロイン（ＰＡＳＦ）を、Ｓｈａｗ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９６４、９３（１）、４５〜５４）によって行われたように、セリンプロテアーゼのトリプシンで処理して、酵素的にフィブロインを分解した。簡単には、ウシの膵臓から単離されたトリプシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ１４２６、ミズーリ）０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬを、ＨＥＰＥＳ緩衝塩を含むＰＡＳＦ（７８ｍｇ／ｍＬ）溶液に添加し、混合し、次いで、３７℃で１、２、４又は６時間インキュベートした。２ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を添加して反応を停止し、フィブロイン分画の範囲を１Ｄ−ＰＡＧＥ及び実施例３に記載の濃度計によって測定した。
【０１２６】
【表１】
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【０１２７】
表１に示すように、トリプシン処理は、４時間までＰＡＳＦの平均分子量を効果的に徐々に減少させることを証明した。次いで、これらの材料を超音波処理に付して、Ｗａｎｇら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８．２９（８）：１０５４〜１０６４）によって実施及び記載されているように、βシート形成及びゲル化を開始した。トリプシンによるＰＡＳＦの分画は、ゲル化速度の著しい増加をもたらし、しかしながら、これを図１０にまとめる。詳細には、１時間のＰＡＳＦのトリプシン処理は超音波処理後約４０分までにゲル形成をもたらし、４時間トリプシンに曝露したＰＡＳＦでは約６０分に遅くなった。対照のＰＡＳＦ（不活性化トリプシンの存在中）は、時間とともに不安定性が増加することを示し、最大のβシート形成（５５０ｎｍでの吸光度によって示される、図１０）に約１３００分で達した（データは示さない）。対照的に、シルクに由来するタンパク質（ＳＤＰ）は、このタイムフレーム中に不安定性に向かう傾向を示さず、これは５５０ｎｍでの最小かつ未変化の吸光度によって証拠づけられた（図１０）。これらの結果は、アミノ酸変換を伴わない選択したペプチド結合の酵素的切断によるＰＡＳＦの分画は、効果がなく、事実上、βシート形成、不安定性及びゲル形成を未然に防ぐためには逆効果であることを示す。
【０１２８】
実施例１０．フィブロイン安定性に対するジスルフィド結合の影響
フィブロイン重鎖及び軽鎖の二量体間の会合は、Ｔａｎａｋａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９９、１４３２（１）：９２〜１０３）によって解明されたように、単一の共有結合性のジスルフィド結合を介して存在している。二量体の分離はフィブロインのペプチド−ペプチド相互作用を引き起こすことができ、これは、βシート形成及びゲル化を進行させる（Ｎａｇａｒｋａｒら、Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２０１０、１２：３８３４〜３８４４）、不溶性のタンパク質凝集（Ｓｈｕｌｈａら、Ｐｏｌｙｍｅｒ  ２００６、４７：５８２１〜５８３０）という結果になる。従って、フィブロインの重鎖−軽鎖二量体の破壊がタンパク質凝集、従って不安定性を刺激するかを判定するために、ＰＡＳＦを、ジスルフィド結合低減剤である、０（対照）、１０又は１００ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ）で処理し、次いで超音波処理に付して、βシート及びゲル形成を引き起こした。図１１に示すように、１０ｍＭのＤＴＴによるＰＡＳＦのジスルフィド結合の低減は遅かったが、不安定性は示さず、対照試料に対して、５５０ｎｍの吸光度の経時的な増加を示した。これらの効果は、１００ｍＭのＤＴＴで更に明らかであったが、不安定性を防止するには有効ではなかった。対照的に、ＳＤＰは、次の超音波処理で不安定性の傾向を示さなかったが、ベースライン吸光度が未変化であることを示し、ＤＴＴの添加によって影響されなかった（図１１）。まとめると、これらの結果は、フィブロインジスルフィドの架橋がＰＡＳＦの不安定性の根底にある機構に関与するが、それらの低減は、βシート形成及びゲル化を防ぐのに有効ではないことを実証する。
【０１２９】
実施例１１．臭化リチウムの存在中での加熱を必要とするフィブロインの安定性
ＰＡＳＦ中での加熱が関与するアミノ酸の変換に臭化リチウムが必要か否かを判定するために、ＰＡＳＦを最終の水溶液（臭化リチウムを含まない）中で加熱した場合に、同様の安定性が達成できるかを特定するために検討を行った。この目的で、ＰＡＳＦを（更に加熱をせずに）５０ｍｇ／ｍＬの濃度で調製し、次いで、シリコーンオイル熱交換流体（ＡｃｅＧｌａｓｓ、１４１１５−０５、ニュージャージー）が能動的に循環するヒーター／チラー（ネスラブ（Ｎｅｓｌａｂ）、ＲＴＥ−７、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ）に接続した、ジャケット付反応ビーカー（Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ、ＣＧ−１１０３−０１、ニュージャージー）で加熱した。循環装置を、臭化リチウム塩を含まないＰＡＳＦの沸点の直下の温度である約２００°Ｆに設定し、１５±１分間安定化させた。ＰＡＳＦ（２５ｍＬ）を、均一な溶液温度を確保するために、ＰＴＦＥ被覆撹拌バーを用いて、撹拌プレート（ＩＫＡ  Ｃ−ＭＡＧ  ＨＳ７、ノースカロライナ）上に置いた反応ビーカー中でインキュベートした。ＰＡＳＦの温度を、外部熱電対（オメガ（Ｏｍｅｇａ）ＨＨ−６０３、Ｏｍｅｇａ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、コネチカット）を使用して、加熱時間中能動的にモニターし、以下のタイムポイントで試料（３ｍＬ）取り出した。
【０１３０】
【表２】
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【０１３１】
次いで、示した試料を、Ｗａｎｇら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８、２９（８）：１０５４〜１０６４）によって以前に記載されているようにして、βシート形成及びゲル化を引き起こすために超音波処理に付した。臭化リチウムの存在中で加熱されたＰＡＳＦとこれらの結果を比較するために、ＳＤＰも別途超音波処理し、５５０ｎｍでの吸光度を長時間モニターして、フィブロインの不安定化の速度を比較した。図１２に示すように、ＰＡＳＦへの熱の適用は、非加熱の対照試料に対して、ベースライン吸光度、従って不安定性を、実際に増加させた。更に、ＰＡＳＦに対する持続的な熱暴露（３０〜１２０分）は、基礎吸光度に反比例しており、この後者の溶液で観察された最小吸光度を達成するために、ＳＤＰ製造中の臭化リチウムの存在が必要であることを示した（図１２）。更に、５５０ｎｍでの吸光度は、加熱された全てのＰＡＳＦ溶液において経時的に増加し続けたが、超音波処理されたＳＤＰ溶液はベースラインから変化せず、熱処理された試料がβシート形成を起こして、従って不安定になることを明確に実証した。まとめると、これらの結果は、臭化リチウム不存在中での熱が媒介するＰＡＳＦの加水分解は、本明細書に記載のＳＤＰと同程度のタンパク質安定性を促進する、アミノ酸変換を媒介するには不十分であることを示す。
【０１３２】
本発明の実施形態としては、以下に列挙する実施形態が挙げられる。
１．水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの総アミノ酸含量に関して、天然フィブロインと少なくとも４％異なり、フィブロインのフィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、上記組成物が、天然フィブロインタンパク質と比較して２５％超低減されたセリン含量を有し、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量が、約１００ｋＤａ未満、任意選択で２５ｋＤａ超である、タンパク質組成物。
２．タンパク質組成物が、１０％ｗ／ｗの水溶液として、４ｃＰ未満の水溶液粘度を有する、実施形態１に記載のタンパク質組成物。
３．タンパク質組成物が、２４％ｗ／ｗの水溶液として、１０ｃＰ未満の水溶液粘度を有する、実施形態１又は２に記載のタンパク質組成物。
４．タンパク質組成物が、沈殿することなく、４０％ｗ／ｗで水に可溶性である、実施形態１〜３のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
５．タンパク質組成物が、１０％ｗ／ｗまでの濃度で、タンパク質組成物の水溶液の超音波処理において、ゲル化しない、実施形態１〜４のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
６．タンパク質組成物が、８％未満のセリンアミノ酸残基を含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
７．タンパク質組成物が、６％未満のセリンアミノ酸残基を含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
８．タンパク質組成物が、４６．５％超のグリシンアミノ酸を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
９．タンパク質組成物が、４８％超のグリシンアミノ酸を含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
１０．タンパク質組成物が、３０％超のアラニンアミノ酸を含む、実施形態１〜９のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
１１．タンパク質組成物が、３１．５％超のアラニンアミノ酸を含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
１２．タンパク質組成物が、薄膜に乾燥された後、水に完全に再溶解する、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
１３．タンパク質組成物が、水溶液中で、βシートタンパク質構造を欠く、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
１４．タンパク質組成物が、少なくとも５秒間の超音波処理後、５５０ｎｍで０．２５未満の水溶液中における光学的吸光度を維持する、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
１５．タンパク質組成物が、４０％ｗ／ｗの濃度で水に完全に溶解する、水と組み合わされた実施形態１〜１４のいずれか１つに記載のタンパク質組成物。
１６．フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも６％異なり、フィブロインに由来するタンパク質の平均分子量が、約１００ｋＤａ未満、約３０ｋＤａ超であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２５未満の光学的吸光度を維持する、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載のフィブロインに由来するタンパク質組成物。
１７．水溶液中における安定性が増強された、フィブロインに由来するタンパク質組成物であって、フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、天然シルクフィブロインから改変され、フィブロインタンパク質重鎖及びフィブロインタンパク質軽鎖の間のシステインジスルフィド結合が、低減されるか又は除去され、フィブロインに由来するタンパク質の平均分子量が、約１００ｋＤａ未満、２５ｋＤａ超であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２５未満の光学的吸光度を維持する、タンパク質組成物。
１７Ａ．実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の１又は複数の要素を含む、実施形態１７に記載のフィブロインに由来するタンパク質組成物。
１８．フィブロインに由来するタンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、セリン、グリシン及びアラニンの含量における合計の相違に関して、天然フィブロインと少なくとも５％異なるように、天然シルクフィブロインから改変され、フィブロインに由来するタンパク質組成物の平均分子量が、約７０ｋＤａ未満であり、フィブロインに由来するタンパク質組成物が、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間、５５０ｎｍで０．２未満の光学的吸光度を維持する、実施形態１７又は１７Ａに記載のフィブロインに由来するタンパク質組成物。
１９．高圧でフィブロイン水溶液を加熱することを含む方法によって調製されたタンパク質組成物であって、フィブロイン水溶液が、少なくとも８Ｍの濃度で臭化リチウムを含み、フィブロイン水溶液を、少なくとも約１０ＰＳＩの圧力下、少なくとも約２０分間、少なくとも約１０５℃（２２１°Ｆ）に加熱してタンパク質組成物が得られ、タンパク質組成物が、８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、タンパク質組成物が、１０％ｗ／ｗの水溶液として、５ｃＰ未満の水溶液粘度を有する、タンパク質組成物。
１９Ａ．実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の１又は複数の要素を含む、実施形態１９に記載のタンパク質組成物。
２０．実施形態１〜１９のいずれか一つに記載のタンパク質組成物と食品又は飲料成分とを含む、食品又は飲料組成物。
【０１３３】
開示した実施形態及び実施例を参照して詳細な実施形態を上述してきたが、そのような実施形態は単なる説明であって、本発明の範囲を限定するものではない。以下の特許請求の範囲で定義されるような、より広範な態様において、本発明から逸脱することなく、当技術分野の通常の技術に従って、変更及び改変を行うことができる。
【０１３４】
本明細書で引用された全ての刊行物、特許及び特許文献は、参照によって個々に組み込まれるように、参照によって本明細書に組み込まれる。本開示と矛盾する限定は、それらから理解すべきではない。本発明について、様々な詳細かつ好適な実施形態及び手法を参照して記載してきた。しかしながら、本発明の精神及び範囲内に留まりながら、多くの変形及び改変を行うことができることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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