(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶媒補正曲線を確立するための方法であって、
（ａ）高濃度の有機溶媒を含む第１の溶液および低濃度の前記同じ有機溶媒を含む第２の溶液を用意するステップと、
（ｂ）作動中に統合マイクロ流体カートリッジ（ＩＦＣ）の流路で前記２種類の溶液を所定の割合で混合するステップであって、前記流路が、リガンドまたは類似物が固定化されていない光学センサ表面を有するフローセルを備えるステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）の前記光学センサ表面から前記混合された溶液のセンサーグラムを得るステップであって、前記センサーグラムが、該センサーグラムの安定セクションにレポートポイントを含むステップと、
（ｄ）作動中に前記統合マイクロ流体カートリッジ（ＩＦＣ）の別の流路で前記２種類の溶液を前記ステップ（ｂ）と同じ前記所定の割合で混合するステップであって、前記流路が、リガンドまたは類似物が固定化された光学センサ表面を有するフローセルを備えるステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の前記光学センサ表面から前記混合された溶液のセンサーグラムを得るステップであって、前記センサーグラムが、前記センサーグラムの安定セクションにレポートポイントを含むステップと、
（ｆ）ｎ回にわたってそれぞれ前記２種類の溶液の異なる所定の割合で前記ステップ（ｃ）および前記ステップ（ｅ）を繰り返すステップと、
（ｇ）前記レポートポイントを使用して溶媒補正曲線を確立するステップと
を含み、前記ｎが、少なくとも３である方法。
【請求項２】
前記２種類の溶液を混合する前記ステップが、前記２種類の溶液をそれぞれ予め設定した個々の流量で注入し、前記混合された溶液を前記フローセルを通して移動させ、前記混合された溶液が前記フローセルの２回目の通過を行うように流れを反転させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記流れが、前記混合された溶液が前記フローセルの３回目の通過を行うようにもう１回反転される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記２種類の溶液を混合する前記ステップが、前記２種類の溶液をそれぞれ予め設定した個々の流量で注入し、前記フローセルに流入させる前に、前記混合された溶液を流路および／または弁を通して移動させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記２種類の溶液を混合する前記ステップが、前記溶液のそれぞれの流量を制御することによって実現される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記溶液の流量が、１つ以上のポンプによって制御される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＦＣが、多数の平行流路を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記有機溶媒が、ＤＭＳＯである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
検体の補正された反応を得るための方法であって、
（ａ）固定化された前記検体のリガンドまたはリガンド類似物を含む光学センサ表面を含むフローセルで、前記検体を有する溶液のセンサーグラムを生成するステップと、
（ｂ）固定化された前記検体のリガンドまたはリガンド類似物を含まない光学センサ表面を有する前記同じフローセルまたは別のフローセルで前記溶液のセンサーグラムを生成するステップと、
（ｃ）最初に、修正されたセンサーグラムを生成するために各信号に関して工程（ａ）で生成されたセンサーグラムの信号から工程（ｂ）で生成されたセンサーグラムの信号を差し引き、その後、請求項１に記載の前記補正曲線に従って前記修正されたセンサーグラムの信号または前記センサーグラムからのレポートポイントを調整することによって、補正された反応を得るステップと
を含む方法。
【請求項１０】
前記検体が、約８０〜約１０００ダルトンのサイズを有する小分子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記光学センサ表面が、エバネッセント波検知に基づく検出器の一部である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記光学センサ表面が、表面プラズモン共鳴に基づく検出器の一部である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性検出表面と参照検出表面との間のバルク信号ミスマッチを調整するための方法に関する。より具体的には、本発明は、溶媒補正曲線を確立するための方法および補正されたセンサーグラムまたは検体のセンサーグラムからの補正されたレポートポイント（ｒｅｐｏｒｔ  ｐｏｉｎｔ）を得るためにこの曲線を使用するための方法に関する。また、本発明は、本方法のステップを実行するための解析システムおよびコンピュータプログラム製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
リアルタイムで分子間相互作用を監視し得る解析センサシステム（すなわち、標識なしのシステム）が高い関心を集めている。これらのシステムは、多くの場合、光学バイオセンサに基づいており、一般には、相互作用解析センサまたは生体特異的相互作用解析センサと呼ばれている。代表的なバイオセンサシステムは、ＧＥヘルスケアライフサイエンス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって販売されているビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）（登録商標）計測装置であり、これは、試料中の分子と検知表面に固定化した分子構造との相互作用を検出するために表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を使用する。ビアコア（登録商標）システムによって、標識化の使用なしに試料中の特定の分子の存在および濃度だけでなく、さらなる相互作用パラメータ（例えば、分子間相互作用の会合速度定数および解離速度定数など）もリアルタイムで測定することが可能である。この装置および理論的背景は、文献（例えば、Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．らのＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１１：６２０−６２７（１９９１）参照）に十分に記載されている。通常、この技術は、センサーチップ（フローセル）の特殊な光学センサ表面へのリガンドの固定化、目的の検体を含有する試料の流れをセンサーチップに接触させること、および次にリガンドと検体との結合から発生する、センサーチップの表面光学特性の変化を測定することを含む。ＳＰＲのさらなる詳細については、米国特許第５，３１３，２６４号明細書、米国特許第５，５７３，９５６号明細書、および米国特許第５，６４１，６４０号明細書も参照されたい。
【０００３】
わずかに疎水性の検体分子によってアッセイを行う場合、ランニングバッファおよび試料への有機溶媒の含有が必要な場合がある。より小さな有機分子検体（８０〜１０００Ｄａ）の場合、２〜５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機溶媒が一般的には使用される。これらの使用の多くは、十分なデータ品質を得るためには活性表面と参照表面との間の参照減算に依存する。しかしながら、バルク信号（ランニングバッファおよび試料の屈折率の差からの）は、活性表面に固定化したリガンドの量によっては、参照減算によって完全には消されない。これは、検体結合からの反応に加えられるが、ミスマッチは、ピペット誤差によっても変化するため、それは、かなり大きな正の値から負の値に及び得る。これは、レポートポイントの読み取りに依存するアッセイのデータ品質にとっては致命的であり得る。
【０００４】
しかしながら、これは、参照におけるバルク反応の関数として参照誤差を測定し、次に、この関数によってすべての試料を調整すること（すなわち、溶媒補正）によって補正され得る。溶媒補正を実行するとき、使用者は、代表的なバルク反応を有するたくさんの溶液（ビアコアの推奨手順によれば８つの）を調製しなければならない。これらの溶液は、補正曲線を確立するためにすべての参照−活性検出表面のペアに注入される。この手順は、実施の全体を通して少なくとも１回は繰り返されるため、また、複数回にわたって同じ位置を使用する手段がないため、プレート占有率および使用者の作業負荷は著しいものである。
【０００５】
溶媒補正工程を簡単にし、自動化する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、溶媒補正曲線を確立するための方法および補正されたセンサーグラムまたは検体のセンサーグラムからの補正されたレポートポイントを得るためにこの曲線を使用するための方法に関する。
【０００７】
一態様において、それは、溶媒補正曲線を確立するための方法を提供し、これは、（ａ）高濃度の有機溶媒を含む第１の溶液および低濃度の同じ有機溶媒を含む第２の溶液を用意するステップと、（ｂ）作動中に統合マイクロ流体カートリッジ（ＩＦＣ）の流路で２種類の溶液を所定の割合で混合するステップであって、流路が、リガンドまたは類似物が固定化されていない光学センサ表面を有するフローセルを備えるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の光学センサ表面から混合された溶液のセンサーグラムを得るステップであって、センサーグラムが、該センサーグラムの安定セクションにレポートポイントを含むステップと、（ｄ）作動中に統合マイクロ流体カートリッジ（ＩＦＣ）の別の流路で２種類の溶液をステップ（ｂ）と同じ所定の割合で混合するステップであって、流路が、リガンドまたは類似物が固定化された光学センサ表面を有するフローセルを備えるステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）の光学センサ表面から混合された溶液のセンサーグラムを得るステップであって、センサーグラムが、センサーグラムの安定セクションにレポートポイントを含むステップと、（ｆ）ｎ回にわたってそれぞれ２種類の溶液の異なる所定の割合でステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）を繰り返すステップと、（ｇ）レポートポイントを使用して溶媒補正曲線を確立するステップとを含み、ｎは、少なくとも３である。
【０００８】
別の態様において、それは、検体の補正された反応を得るための方法を提供し、これは、（ａ）検体の固定化した相手を含む光学センサ表面を含むフローセルで、検体を有する溶液のセンサーグラムを生成するステップと、（ｂ）検体の固定化した相手を含まない光学センサ表面を有する同じフローセルまたは別のフローセルで溶液のセンサーグラムを生成するステップと、（ｃ）最初に、修正されたセンサーグラムを生成するために各信号に関して（ａ）の信号から（ｂ）の信号を差し引き、その後、本発明の特定の実施形態によって得られた補正曲線に従って修正されたセンサーグラムの信号またはセンサーグラムからのレポートポイントを調整することによって、補正された反応を得るステップとを含む。
【０００９】
さらに別の態様において、それは、マイクロ流路で２種類の液体を混合するための方法を提供し、これは、（ａ）特定の組成を含む第１の液体および別の組成を含む第２の液体を用意するステップならびに（ｂ）作動中にマイクロ流路で２種類の液体を所定の割合で混合するステップを含み、２種類の液体を混合するステップは、２種類の液体をそれぞれ予め設定した個々の流量で注入し、組み合わされた液体をマイクロ流路を通して移動させ、組み合わされた液体がマイクロ流路の２回目の通過を行うように流れを反転させることを含む。
【００１０】
別の態様において、本発明は、分子間相互作用を研究するための解析システムであって、本方法のステップを実行するためのプログラムコード手段を含むコンピュータ処理手段を備える解析システムを提供する。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、本方法のステップを実行するためにコンピュータ可読媒体に記憶されるか、または電気信号もしくは光信号で伝送されるプログラムコード手段を備えるコンピュータプログラム製品を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる詳細および利点は、以下の説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】２種類の溶液が３回にわたって混合されるときのＩＦＣの一部の詳細を示しており、流路における方向（矢印）および混合パターンを示している。
【図１Ｂ】２種類の溶液が３回にわたって混合されるときのＩＦＣの一部の別の詳細を示しており、流路における方向（矢印）および混合パターンを示している。
【図２】本発明（逆流）によって作成された溶媒補正ポイントと手動混合方法（予備混合）によって作成された曲線との比較を示している。
【図３】本発明の実施形態を使用して収集したデータのセンサーグラムを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
少分子の使用が、標識なしのシステムを使用して次第に行われるようになっている。上述したように、これらの使用は、一般的には、相当量の実施時間を必要とし、誤りがちであり、機器の相当数の試薬／試料位置を占有する溶媒補正に依存する。これらの問題は、多流路構成を有するシステムの場合に悪化する。本発明の実施形態は、手動作業に比べて使用者の労力および位置占有の量を大幅に低減する。本発明の実施形態は、平行流路（すなわち、いわゆる多流路システム）を有する統合マイクロ流体カートリッジ（ＩＦＣ：ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）を使用するアッセイにとりわけ有用である。
【００１５】
本発明は、溶媒補正曲線を確立するための新規の方法および検体の補正された反応を得るための方法に関する。また、本発明はさらに、本方法のステップを実行するための解析システムおよびコンピュータプログラム製品に関する。
【００１６】
したがって、本発明は、溶媒補正曲線を確立するための方法であって、（ａ）高濃度の有機溶媒を含む第１の溶液および低濃度の同じ有機溶媒を含む第２の溶液を用意するステップと、（ｂ）作動中に統合マイクロ流体カートリッジ（ＩＦＣ）の流路で２種類の溶液を所定の割合で混合するステップであって、流路が、リガンドまたは類似物が固定化されていない光学センサ表面を有するフローセルを備えるステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の光学センサ表面から混合された溶液のセンサーグラムを得るステップであって、センサーグラムが、該センサーグラムの安定セクションにレポートポイントを含むステップと、（ｄ）作動中に統合マイクロ流体カートリッジ（ＩＦＣ）の別の流路で２種類の溶液をステップ（ｂ）と同じ所定の割合で混合するステップであって、流路が、リガンドまたは類似物が固定化された光学センサ表面を有するフローセルを備えるステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）の光学センサ表面から混合された溶液のセンサーグラムを得るステップであって、センサーグラムが、センサーグラムの安定セクションにレポートポイントを含むステップと、（ｆ）ｎ回にわたってそれぞれ２種類の溶液の異なる所定の割合でステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）を繰り返すステップと、（ｇ）レポートポイントを使用して溶媒補正曲線を確立するステップとを含み、ｎが、少なくとも３である方法に関する。
【００１７】
特定の実施形態において、ｎが３のとき、所定の割合は、１：０（１００％の第１の溶液および第２の溶液なし）、０：１（１００％の第２の溶液および第１の溶液なし）、ならびに第１の溶液および第２の溶液の混合（０．５：０．５の比率などでの）を含む。特定の実施形態において、複数の所定の割合は、１：０と０：１との間で間隔をあけられる。特定の好ましい実施形態において、複数の所定の割合は、１：０と０：１との間で均等に間隔をあけられる。
【００１８】
特定の実施形態において、レポートポイントは、注入の開始後の指定の時間に配置される。好ましくは、この時間は、同じ種類の注入のすべてに関して同じである。加えて、ベースラインレポートポイントは、注入または一連の注入前の指定の時間に配置される。ここで使用される反応は、これらの２つの差であり、相対反応と呼ばれる。
【００１９】
補正曲線に関して、固定化されたフローセルからのセンサーグラムから、参照（固定化されていない）からのセンサーグラムが減算され、レポートポイント相対反応は、ｙ軸の値を与える。参照センサーグラムからの同じ相対レポートポイント値は、ｘ軸の値を与える。３つより多くのポイントがプロットされるとき、溶媒補正曲線が、例えばこれらのポイントを二次多項式に適合させることによって生成され得る。
【００２０】
試料が流され、参照反応が、ｙ軸に基づく補正数を与えるｘ値として使用されるとき、この数は、補正された反応を与えるために、減算された参照試料反応の相対反応に加えられる。
【００２１】
特定の実施形態において、２種類の溶液を混合するステップは、２種類の溶液をそれぞれ予め設定した個々の流量で注入し、組み合わされた溶液をフローセルを通して移動させ、組み合わされた溶液がフローセルの２回目の通過を行うように流れを反転させることを含む。随意に、流れは、組み合わされた溶液がフローセルの３回目の通過を行うようにもう１回反転されてもよい。
【００２２】
特定の実施形態において、２種類の溶液を混合するステップは、２種類の溶液をそれぞれ予め設定した個々の流量で注入し、フローセルに流入させる前に、組み合わされた溶液を流路および／または弁を通して移動させることを含む。
【００２３】
特定の実施形態において、２種類の溶液を混合するステップは、溶液のそれぞれの流量を制御することによって実現される。
【００２４】
特定の実施形態において、溶液の流量は、１つ以上のポンプによって制御される。特定の実施形態において、一方の溶液は、ポンプによって制御されてもよく、一方、他方の溶液は、針による吸引によって導入されてもよい。一部の実施形態において、第２のポンプは、フローセルの他方の側に存在し、２つのポンプは、溶液にフローセルを横断させるために一斉に作動する。
【００２５】
特定の実施形態において、統合マイクロ流体カートリッジは、多数の平行流路を備える。
【００２６】
特定の実施形態において、有機溶媒は、バッファ（例えば、水）の主成分とは異なる屈折率を有する溶媒である。特定の実施形態において、有機溶媒は、ＤＭＳＯまたはグリセロールである。第１の溶液および第２の溶液中の有機溶媒の濃度は、試料とランニングバッファとの間の溶媒ミスマッチに対応する範囲をカバーするように選択される。一部の実施形態において、第１の溶液および第２の溶液中の有機溶媒の濃度は、その範囲の＋／−５０％、その範囲の＋／−４０％、その範囲の＋／−３０％、またはその範囲の＋／−２０％である。例えば、試料とランニングバッファとの間の潜在的な溶媒ミスマッチが、約２％のとき、第１の溶液は、３％の有機溶媒の濃度を有してもよく、第２の溶液は、１％の有機溶媒の濃度を有してもよい。
【００２７】
別の態様において、本発明は、検体の補正された反応を得るための方法であって、（ａ）検体の固定化した相手を含む光学センサ表面を含むフローセルで、検体を有する溶液のセンサーグラムを生成するステップと、（ｂ）検体の固定化した相手を含まない光学センサ表面を含む同じフローセルまたは別のフローセルで同じ溶液のセンサーグラムを生成するステップと、（ｃ）最初に、修正されたセンサーグラムを生成するために各信号に関して（ａ）の信号から（ｂ）の信号を差し引き、その後、本発明の特定の実施形態によって得られた補正曲線に従って修正されたセンサーグラムの信号または前記センサーグラムからの補正されたレポートポイントを調整することによって、補正された反応を得るステップとを含む方法に関する。
【００２８】
特定の実施形態において、検体は、溶液中の化合物または生体分子などの高分子粒子であってもよい。高分子粒子は、例えば、タンパク質、多糖、核酸分子であってもよい。特定の好ましい実施形態において、検体は、小分子である。特定の実施形態において、検体は、約８０〜約１０００ダルトンのサイズを有する小分子である。
【００２９】
特定の実施形態において、リガンドまたはその類似物は、本明細書ではその従来の意味で、検体のターゲット化合物との相互作用が可能な官能基を備える存在について使用される。リガンドの基の例は、電荷を帯びた基（陰イオン交換リガンド）、負電荷を帯びた基（陽イオン交換リガンド）、疎水基、特定のターゲット化合物に対する親和性（抗体に対する抗原の親和性）を有する基（親和性リガンド）などである。
【００３０】
したがって、ＩＦＣ内の融合注入を使用し、流れを反転させる（すなわち、検出スポットを横切って試料を逆流させる）ことによって試料混合を改善することにより、溶媒補正曲線を確立するための改善された方法が、２種類の極端な溶液間の様々な混合割合で上記の手順を繰り返すことを通して確立される。正確な溶媒補正曲線を生成するためには、異なる濃度の有機溶媒溶液からの少なくとも４つのレポートポイントが必要である。好ましくは、溶媒補正曲線は、８つより多くのレポートポイントを含む。
【００３１】
溶媒補正曲線：ＳＰＲ信号は、センサ表面における屈折率（ＲＩ：ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ）の変化を反映する。ＲＩは、センサ表面の近くの結合事象の結果として変化し、表面における質量の増加に関係する。さらなる信号が、注入される試料がランニングバッファとは異なるＲＩを有する場合に得られる。この信号は、溶媒効果と呼ばれる。溶媒効果が小さい（１００ＲＵのオーダー）とき、それは、通常、参照表面からの信号の減算によって信号全体から除去され得る。しかしながら、ＤＭＳＯなどの高ＲＩの溶媒の導入は、注入中にＲＩの大きなシフトを発生させ得るものであり、参照フローセルからのデータの単なる減算はもはや十分ではない。これらの効果を補正するために、溶媒較正手順が採用される。様々な濃度の溶媒を有するバッファ溶液が、参照境界表面およびリガンド境界表面に順に注入されてもよい。参照表面から得られる較正溶液の反応は、ベースラインに対して−８００〜＋１２００ＲＵの一般的な範囲を含む。溶媒補正曲線は、リガンドなしのフローセルの反応に対してリガンド境界フローセル間の反応の差をプロットすることによって作成される。この曲線は、試料注入中に得られる反応レベルを補正するために使用される。
【００３２】
次に、２つのポンプをフローセルの両側に１つずつ使用する、本発明の例示的な実施形態について説明する。図１Ａは、２種類の溶液が３回にわたってフローセルを通って移動するときのＩＦＣの一部の詳細を示しており、流路における方向（矢印）および混合パターンを示している。手動工程と比べて、使用者は、この場合、２種類の異なる溶液を調製する必要があるのみである。図において、２種類の溶液（一番上の流路における濃い影のものおよび淡い影のもの）は、フローセル（一番上の流路）を通過するときに中間の影によって示されているように混合される。溶液の運動は、流路内部の矢印によって示されている。１回目の通過の後、溶液は、良好な溶媒補正曲線を得るのに十分な程度に混合されていない。このため、溶液の流れは、真ん中の流路では溶液をさらに混合するために反転されている。このように、図面の上の２つの部分は、溶液の２回のフローセルの通過を示している。３番目の部分は、随意の３回目の通過を示している。必要に応じて、２回目および３回目の通過は、混合をさらに改善するために繰り返されてもよい。実際、２回の通過は、良好な溶媒補正曲線の生成のために十分に混合された溶液を提供する。
【００３３】
１回目の通過の最中、ポンプのうちの一方のより高い流量は、より幅の広い矢印によって示されている。他方のポンプのより低い流量および結果として生じる差流量（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ）は、より幅の狭い矢印によって示されている。例えば、フローセルの右にある第２のポンプの流量は、１０μｌ／ｍｉｎであり、第１のポンプ（溶液１用の左にある）の流量は、３μｌ／ｍｉｎであり、溶液２の結果として生じる差流量は、７μｌ／ｍｉｎである。結果として生じる混合比は、３０％の溶液１および７０％の溶液２である。しかしながら、混合は、センサーグラム（図３の融合部）に観察されるように完全ではない。注入の終了後に、第１のポンプは停止されてもよい。第２のポンプを反転させることによって、注入された溶液は、再びフローセルに送り返されてもよい。このとき、溶液は、拡散によって混合されるより多くの時間を有する。結果として得られるのは、溶液が２回目のフローセルの通過を行うときのより均一な溶液である（図３の逆流部）。２つのフローセルが、図には示されているが、これは、単なる例に過ぎない。特定の実施形態において、単一のフローセルが、２つのポンプ間に存在してもよい。あるいは、２つより多くのフローセルが、２つのポンプ間に存在してもよい。
【００３４】
代替的な実施形態において、混合された溶液を流路および弁を通して圧送することもまた、混合された溶液の所望の均一性を達成し得る。図１Ｂは、２つのポンプが流路で溶液を混合するために作動し、混合された溶液のみがフローセルに向けられる代替的な実施形態を示している。図１Ｂは、２種類の溶液が３回にわたってフローセルを通って移動するときのＩＦＣの一部の詳細を示しており、流路における方向（矢印）および混合パターンを示している。図において、２種類の溶液（一番上の流路における濃い影のものおよび淡い影のもの）は、流路（上方の）を通過するときに中間の影によって示されているように混合される。溶液の運動は、流路内部の矢印によって示されている。１回目の通過の後、溶液は、良好な溶媒補正曲線を得るのに十分な程度に混合されていない。このため、溶液の流れは、真ん中の流路では溶液をさらに混合するために反転されている。一番下の部分は、３回目の通過を示している。１回目の通過の最中、ポンプのうちの一方のより高い流量は、より幅の広い矢印によって示されている。他方のポンプのより低い流量および結果として生じる差流量は、より幅の狭い矢印によって示されている。例えば、右の方の第２のポンプの流量は、１０μｌ／ｍｉｎであり、第１のポンプ（溶液１用の左の方の）の流量は、３μｌ／ｍｉｎであり、溶液２の結果として生じる差流量は、７μｌ／ｍｉｎである。結果として生じる混合比は、３０％の溶液１および７０％の溶液２である。注入の終了後に、第１のポンプは停止されてもよい。第２のポンプを反転させることによって、注入された溶液は、再び送り返されてもよい。このとき、溶液は、拡散によって混合されるより多くの時間を有する。結果として得られるのは、溶液が２回目の流路の通過を行うときのより均一な溶液であり、溶液が３回目の流路の通過を行うときのさらに良好に混合された溶液である。
【００３５】
あるいは、両方のポンプは、図面の左側の流路に配置されてもよい。
【００３６】
実行された実験は、このようにして作成された溶媒補正曲線（例えば、二次多項式に適合された、参照反応に対してプロットされたリガンドを固定化した参照反応）が、手動で混合された溶液からの溶媒補正曲線と重なる曲線を与え（図２）、したがって、手動方法および自動方法が、同じ結果を達成し、つまりは、補正が、両方の場合に同じであることを示している。図２において、×軸およびｙ軸の両方の単位は、両方ともＲＵである。
【００３７】
用語「光学センサ表面」または「固体支持体」は、本明細書で使用される場合、広範に解釈されるべきであり、固体の（可撓性のまたは硬質の）サブストレート（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であって、その上に１種類以上の結合剤を固定化することができ、これとの分子間相互作用が選択された特定の検出システムによって検出されるサブストレートを備えることが意図されていることに留意すべきである。サブストレートは、生物学的な、非生物学的な、有機の、無機の、またはこれらの組み合わせのものであってもよく、ディスク、球形、円形などを含む任意の好適な形状を有する粒子、ストランド、沈殿物、ゲル、シート、チューブ（ｔｕｂｉｎｇ）、球体、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライドなどの形態のものであってもよい。サブストレート表面は、二次元構造を有してもよく、例えば、段、隆起、ねじれ、および台地などを含んでもよく、サブストレートの残りとは異なる材料の層の表面であってもよい。特定の実施形態において、光学センサ表面は、エバネッセント波検知に基づく検出器の一部である。好ましくは、光学センサ表面は、表面プラズモン共鳴に基づく検出器の一部である。
【００３８】
例えば上で言及したビアコア（登録商標）機器に使用される種類のフローセルで本発明の特定の方法を実行することは往々にして好適であり得る。本発明に使用され得る他のフローセルもまた、当業者にはよく知られており、本明細書で説明する必要はない。
【００３９】
別の態様において、マイクロ流路で２種類の液体を混合するための方法であって、（ｂ）特定の組成を含む第１の液体および別の組成を含む第２の液体を用意するステップならびに（ｃ）作動中にマイクロ流路で２種類の液体を所定の割合で混合するステップを含み、２種類の液体を混合するステップが、２種類の液体をそれぞれ予め設定した個々の流量で注入し、組み合わされた液体をマイクロ流路を通して移動させ、組み合わされた液体がマイクロ流路の２回目の通過を行うように流れを反転させることを含む方法が提供される。
【００４０】
２種類の液体を混合するための方法の特定の実施形態において、流れは、組み合わされた液体がマイクロ流路の３回目の通過を行うようにもう１回反転されてもよい。
【００４１】
特定の実施形態において、２種類の液体を混合するステップは、液体のそれぞれの流量を制御することによって実現される。
【００４２】
特定の実施形態において、液体の流量は、１つ以上のポンプによって制御される。
【００４３】
液体混合の有効性は、混合が検出スポットとの関連で実行される限り、混合有効性のパラメータとして滑らかさを評価すること（例えば、図３の融合部と逆流部との比較）によって容易に評価され得る。
【００４４】
以下の一般的原理は、本発明の特定の態様に適用可能である。
【００４５】
表面結合相互作用および屈折率のバルク変化の特徴は、たくさんの異なる相互作用解析技術を使用することにより示され得る。市販のバイオセンサは、上で言及したビアコア（登録商標）システム機器を含み、これは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づくものであり、表面相互作用のリアルタイムの監視を可能にする。
【００４６】
ＳＰＲの現象はよく知られている。ＳＰＲは、光が特定の条件下で屈折率の異なる２つの媒体間の、金属膜（一般的には銀または金）によって被覆された境界で反射するときに発生する。ビアコア（登録商標）機器において、媒体は、試料およびマイクロ流体流れシステムが試料を接触させるセンサーチップのガラスである。金属膜は、チップ表面上の金の薄層である。ＳＰＲは、特定の反射角の反射光の強度の低下をもたらす。最小反射光強度のこの角度は、反射光の反対側の、ビアコア（登録商標）システムの試料側の表面の近くの屈折率と共に変化する。
【００４７】
試料中の分子が、センサーチップ表面上の捕獲分子に結合すると、濃度、したがって、表面における屈折率が変化し、ＳＰＲ反応が検出される。相互作用の経過中に時間に対して反応をプロットすることにより、相互作用の推移の定量的測定が行われる。このようなグラフは、一般にはセンサーグラムと呼ばれている。ビアコア（登録商標）システムにおいて、ＳＰＲ反応値は、レゾナンスユニット（ＲＵ：ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｕｎｉｔ）で表される。１ＲＵは、大部分のタンパク質に関してセンサ表面上の約１ｐｇ／ｍｍ２の濃度の変化におおよそ相当する、最小反射光強度の角度の０．００００１°の変化を表す。検体を含有する試料が、センサ表面に接触すると、センサ表面に結合された捕獲分子（リガンド）が、「会合」と呼ばれるステップで検体と相互作用する。このステップは、センサーグラムでは、試料が最初の間にセンサ表面に接触するときのＲＵの増加によって示される。反対に、「解離」は、通常は、試料の流れが例えばバッファの流れに置き換えられるときに発生する。このステップは、センサーグラムでは、検体が表面に結合したリガンドから解離するときの経時的なＲＵの低下によって示される。
【００４８】
ビアコア（登録商標）機器の技術的態様およびＳＰＲの現象の詳細な解説は、米国特許第５，３１３，２６４号明細書に見出され得る。バイオセンサ検知表面のためのマトリックスコーティングのより詳細な情報は、例えば、米国特許第５，２４２，８２８号明細書および米国特許第５，４３６，１６１号明細書に記載されている。加えて、ビアコア（登録商標）機器との関連で使用されるバイオセンサーチップの技術的態様の詳細な解説は、米国特許第５，４９２，８４０号明細書に見出され得る。上で言及した米国特許の完全な開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
上記の説明は、ある程度ビアコア（登録商標）システムに関して行われてきたが、本発明が、同様に固体支持表面における溶媒補正を必要とする、屈折率の変化および他の物理現象に基づいて結合相互作用を検出するための多数の他の技術との関連で使用され得ることが理解される。しかしながら、リアルタイム検出システム、とりわけ、化学センサまたはバイオセンサ技術に基づくものが好ましい。
【００５０】
バイオセンサは、大まかには、固体の物理化学的トランスデューサまたはトランスデューサに関連する移動性担体ビーズ／粒子に直接関連して分子認識のための構成要素（例えば、固定化された抗体を有する層）を使用する装置として規定される。このようなセンサは、一般的には、標識なしの技術に基づいて例えば固定化した層の質量、屈折率、または厚さの変化を検出するが、ある種の標識化に依存するセンサも存在する。一般的なセンサ検出技術は、質量検出方法（光学的方法、熱光学的方法、および圧電方法または音波方法（例えば、表面音波（ＳＡＷ）方法および水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）方法を含む）など）ならびに電気化学的方法（電位差測定方法、電気伝導度測定方法、電流測定方法、および静電容量／インピーダンス方法など）を含むが、これらに限定されない。光学的検出方法に関して、代表的な方法は、外部反射方法および内部反射方法の両方を含む反射−光学的方法などの質量表面濃度を検出するものを含み、それは、角度、波長、偏光、または位相分解されるもの、例えば、エバネッセント波偏光解析法およびエバネッセント波分光法（ＥＷＳ（ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｗａｖｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）または  内部反射分光法）であってもよく、それらの両方は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるエバネッセント場強化、ブルースター角屈折率測定、臨界角屈折率測定、漏れ全反射  （ＦＴＲ：ｆｒｕｓｔｒａｔｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）、全内部乱反射  （ＳＴＩＲ：ｓｃａｔｔｅｒｅｄ  ｔｏｔａｌ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）を含んでもよく、それらは、散乱強化標識、光導波路センサ、外部反射撮像、エバネッセント波ベースの撮像、例えば臨界角分解撮像、ブルースター角分解撮像、およびＳＰＲ角分解撮像などを含んでもよい。さらに、例えば表面増強ラマン分光法  （ＳＥＲＳ：ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、表面増強共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ：ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｒａｍａｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、エバネッセント波蛍光（ＴＩＲＦ：ｅｖａｎｅｓｃｅｎｔ  ｗａｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）、および燐光に基づく、「それ自体の」または反射方法と組み合わされた光度計および撮像／顕微鏡方法ならびに導波路干渉計、導波路漏洩モード分光法、反射干渉分光法（ＲＩｆＳ：ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、透過干渉法、ホログラフィック分光法、および原子間力顕微鏡法（ＡＦＲ：ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）が参照されてもよい。
【実施例】
【００５１】
表面調製：
センサーチップＣＭ５を取り付け、１２０００ＲＵのヒト血清アルブミンを、ＧＥヘルスケアからのアミン結合キットを使用してアミン結合によって固定化した。１０ｍＭの酢酸塩ｐＨ５．０中の５０μｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを、７分間にわたって注入した。
【００５２】
バッファおよび溶媒補正溶液を、以下に説明されているように調製した。
【００５３】
ＧＥヘルスケアによって提供されているストック溶液１０×ＰＢＳ−Ｐ＋（０．５％Ｐ２０を有する）を、ランニングバッファを調製するために使用した。
【００５４】
（１）２リットルの１．０２×ＰＢＳ−Ｐ＋の調製：２０４ｍｌの１０×ＰＢＳ−Ｐ＋ストックを、ミリＱ水で２０００ｍｌに希釈した。このバッファを、ランニングバッファおよび溶媒補正ストック溶液を調製するために使用した。
【００５５】
（２）溶媒補正ストック溶液およびアッセイランニングバッファの調製：１．５％および２．８％のＤＭＳＯを有する１０ｍｌの溶媒補正ストック溶液および２％のＤＭＳＯを有する１リットルのアッセイランニングバッファを、表１に従って調製した。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
（３）溶媒補正作業溶液の調製：１．５％および２．８％のＤＭＳＯストック溶液を使用して、溶媒補正曲線用の一連のアリコートを、表２（μｌで与えられた量）に従って調製した。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
（４）これらの溶液１〜８を、「予備混合」データのために両方のフローセルに順に注入した。
【００６０】
（５）融合−逆流実験では、溶液１および８のみを使用したが、上で説明したようにＩＦＣに異なる流量で注入し、混合した。
【００６１】
手動注入および融合−逆流注入を使用して得られた結果は、図２に示されているように同等である。
【００６２】
本発明の特定の実施形態について示し、説明してきたが、本発明の教示から逸脱することなく変更および修正が行われ得ることは、当業者には明らかであろう。以上の説明および添付図面に記載されている主題は、限定としてではなく例示としてのみ提示されている。本発明の実際の範囲は、従来技術に基づくその適切な観点から考慮された場合の以下の特許請求の範囲において規定されることが意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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