(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）複数の部位を含むアレイを提供する工程であって、各部位は第１の核酸テンプレートおよび第２の核酸テンプレートを含み、
前記第１の核酸テンプレートは前記第２の核酸テンプレートの配列とは異なる配列を有し、
第１のプライマーが前記第１の核酸テンプレートに結合し、可逆的ブロッキング部分が前記第１のプライマーに付着しており、
第２のプライマーが前記第２の核酸テンプレートに結合し、可逆的ブロッキング部分が前記第２のプライマーに付着しており、
前記第１のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分は前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分とは異なる、アレイ提供工程；
（ｂ）前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第１のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；
（ｃ）可逆的ブロッキング部分を含む第１のヌクレオチド類似体を付加することにより前記第１のプライマーを伸長する工程；
（ｄ）前記第１のプライマーに付加された前記第１のヌクレオチド類似体の可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；
（ｅ）可逆的ブロッキング部分を含む第２のヌクレオチド類似体を付加して前記第２のプライマーを伸長する工程であって、前記第１のヌクレオチド類似体の可逆的ブロッキング部分は前記第２のヌクレオチド類似体の可逆的ブロッキング部分とは異なる、プライマー伸長工程；および、
（ｆ）各部位において、前記第１のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体および前記第２のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体を検出することにより、各部位において、前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートのそれぞれ異なる配列を、ヌクレオチドの選択的な脱ブロッキングを使用することによりオルトゴナルに決定する工程、を含む、核酸テンプレートのシーケンシング方法。
【請求項２】
（ｇ）前記第２のプライマーに付加された前記第２のヌクレオチド類似体の可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第１のプライマーに付加された前記第１のヌクレオチド類似体の可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；
（ｈ）前記工程（ｇ）の後、可逆的ブロッキング部分を含む第３のヌクレオチド類似体を付加して前記第１のプライマーを伸長する工程；
（ｉ）前記第１のプライマーに付加された前記第１のヌクレオチド類似体の可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第２のプライマーに付加された前記第２のヌクレオチド類似体の可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；
（ｊ）前記工程（ｉ）の後、可逆的ブロッキング部分を含む第４のヌクレオチド類似体を付加して前記第２のプライマーを伸長する工程であって、前記第３のヌクレオチド類似体の可逆的ブロッキング部分は前記第４のヌクレオチド類似体の可逆的ブロッキング部分とは異なる、プライマー伸長工程；および、
（ｋ）各部位において、前記工程（ｈ）で前記第１のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体、および、前記工程（ｊ）で前記第２のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体を検出することにより、各部位において、前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートのそれぞれ異なる配列を、ヌクレオチドの選択的な脱ブロッキングを使用することによりオルトゴナルに決定する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｇ）〜工程（ｋ）を繰り返す工程を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記検出は、各部位で前記第１のプライマーと前記第２のプライマーとの間の間隔に等しい距離で点同士を分離するには空間分解能が低すぎる検出器を使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記検出は光学検出器を用いて行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチド類似体は光標識を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のヌクレオチド類似体は、ヌクレオチド類似体の第１のセットに由来し、前記第２のヌクレオチド類似体はヌクレオチド類似体の第２のセットに由来し、ヌクレオチド類似体の前記第１のセットの光標識はヌクレオチド類似体の前記第２のセットの光標識とは異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のヌクレオチド類似体は、ヌクレオチド類似体の第１のセットに由来し、前記第２のヌクレオチド類似体はヌクレオチド類似体の第２のセットに由来し、ヌクレオチド類似体の前記第１のセットにおけるヌクレオチド類似体のサブセットは光標識を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ヌクレオチド類似体の前記第２のセットにおけるヌクレオチド類似体のサブセットは光標識を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ヌクレオチド類似体の前記第１のセットにおけるヌクレオチド類似体の前記サブセットは、ヌクレオチド類似体の前記第２のセットにおけるヌクレオチド類似体の前記サブセットの光標識とは異なる光標識を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のヌクレオチド類似体は、ヌクレオチド類似体の第１のセットに由来し、前記第２のヌクレオチド類似体はヌクレオチド類似体の第２のセットに由来し、ヌクレオチド類似体の前記第１のセットは前記工程（ｆ）で検出される１種類の光標識のみを含み、ヌクレオチド類似体の前記第２のセットは前記工程（ｆ）で検出される１種類の光標識のみを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１種類の光標識は、前記第１のセットにおける第１の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てに付着し、
前記１種類の光標識は、前記第１のセットにおける第２の種のヌクレオチド類似体のサブセットに付着し、
前記第１のセットにおける第３の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てがリガンドに付着し、かつ
前記第１のセットにおける第４の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てが前記１種類の光標識にも前記リガンドにも付着していない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のヌクレオチド類似体は、ヌクレオチド類似体の第１のセットに由来し、前記第２のヌクレオチド類似体はヌクレオチド類似体の第２のセットに由来し、ヌクレオチド類似体の前記第１のセットは前記工程（ｆ）で検出される２種類の光標識のみを含み、ヌクレオチド類似体の前記第２のセットは前記工程（ｆ）で検出される２種類の光標識のみを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記２種類の光標識のうちの第１の光標識のみが、前記第１のセットにおける第１の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てに付着し、
前記２種類の光標識のうちの第２の光標識のみが、前記第１のセットにおける第２の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てに付着し、
前記２種類の光標識のうちの第１の光標識および前記２種類の光標識のうちの第２の光標識が前記第１のセットにおける第３の種のヌクレオチド類似体に付着し、かつ
前記第１のセットにおける第４の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てが、前記２種類の光標識のうちの第１の光標識または前記２種類の光標識のうちの第２の光標識に付着していない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記検出は検出器を用いて行われ、前記検出器のピクセルは前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの両方から信号を同時に取得する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の核酸テンプレートは、前記第２の核酸テンプレート中の塩基部分と同じ種である少なくとも１つの塩基部分を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ｂ）および工程（ｄ）は連続的に行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｃ）および工程（ｅ）は連続的に行われる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
単一の核酸分子が前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートは、それぞれ異なる核酸分子上に存在する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アレイの複数の部位の各部位は１００μｍ２以下の面積を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アレイの複数の部位の各部位は、前記第１の核酸テンプレートの複数のアンプリコンおよび前記第２の核酸テンプレートの複数のアンプリコンを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数のアンプリコンは核酸クラスターを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アレイの複数の部位は１０μｍ以下のピッチを有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記アレイは少なくとも１×１０６個の部位を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
各部位は、前記アレイ中の他の全ての部位の核酸配列に対して固有である核酸配列を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１のプライマーは第１のユニバーサルプライマー配列を含み、前記アレイの各部位における前記第１の核酸テンプレートは、前記第１のユニバーサルプライマー配列に相補的な第１のユニバーサルプライマー結合配列を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２のプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列を含み、各部位における前記第２の核酸テンプレートは、前記第２のユニバーサルプライマー配列に相補的な第２のユニバーサルプライマー結合配列を含み、前記第１のユニバーサルプライマー結合配列は前記第２のユニバーサルプライマー結合配列とは異なる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記工程（ｃ）および工程（ｅ）は、同じポリメラーゼまたは同じ種のポリメラーゼによって行われる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
アジドメチルおよびｔｅｒｔ−ブトキシ−エトキシが可逆的ブロッキング部分として使用される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記アジドメチルはホスフィン処理によって選択的に除去され、前記ｔｅｒｔ−ブトキシ−エトキシは酸処理によって選択的に除去される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
可逆的ブロッキング部分の選択的除去は化学的処理、熱処理、光照射または電気的処理を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分は、前記第１のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分と同じ種である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分は、前記第２のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分と同じ種である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ａ）複数の部位のアレイであって、各部位は少なくとも２つの異なる核酸テンプレートの混合物を含むアレイを提供する工程；
（ｂ）各部位において、異なる可逆的ブロッキング部分をそれぞれ含む複数の異なるヌクレオチド類似体で、前記異なる核酸テンプレートにハイブリダイズしたそれぞれのプライマーを伸長することにより、各部位において異なるプライマー伸長産物を生成する工程；
（ｃ）前記異なるプライマー伸長産物を検出して、各部位において前記複数の異なるヌクレオチド類似体を識別する工程；
（ｄ）前記異なる可逆的ブロッキング部分の第１に対して選択的な第１の処理、および、前記異なる可逆的ブロッキング部分の第２に対して選択的な第２の処理を使用して、各部位において、前記プライマー伸長産物から前記異なる可逆的ブロッキング部分を除去する工程；および
（ｅ）前記工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し、各部位において、複数の伸長産物のそれぞれに付加された複数の異なるヌクレオチド類似体の配列をオルトゴナルに決定する工程、を含む、核酸テンプレートのシーケンシング方法。
【請求項３６】
前記異なる核酸テンプレートにそれぞれハイブリダイズした前記プライマーは、前記工程（ｂ）における伸長中に同時に存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記異なるプライマー伸長産物は、前記工程（ｃ）における検出中に同時に存在する、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記異なる可逆的ブロッキング部分の第１および前記異なる可逆的ブロッキング部分の第２は、前記工程（ｄ）における除去中、前記プライマー伸長生成物に同時に存在する、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記異なる核酸テンプレートの第１にハイブリダイズした前記プライマーの第１は、前記異なる核酸テンプレートの第２にハイブリダイズした前記プライマーの第２を伸長する前に、前記部位のアレイから除去される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記異なるプライマー伸長産物の第１は、前記異なるプライマー伸長産物の第２を検出する前に前記部位のアレイから除去される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記異なるプライマー伸長産物の第１は、前記第２の処理前に前記部位のアレイから除去される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
前記工程（ｃ）は前記工程（ｄ）の後に行われる、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記検出は、各部位で前記異なるプライマー伸長産物の間の間隔に等しい距離で点同士を分離するには空間分解能が低すぎる検出器を使用する、請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記検出は光学検出器を用いて行われる、請求項３５〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヌクレオチド類似体は光標識を有する、請求項３５〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ヌクレオチド類似体の第１のセットが前記異なるプライマー伸長産物の第１に付加され、ヌクレオチド類似体の第２のセットが前記異なるプライマー伸長産物の第２に付加され、ヌクレオチド類似体の前記第１のセットはヌクレオチド類似体の前記第２のセットの光標識とは異なる光標識を含む、請求項３５〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記検出は検出器を用いて行われ、前記検出器のピクセルは第１のプライマー伸長産物および第２のプライマー伸長産物の両方から信号を同時に取得する、請求項３５〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１の核酸テンプレートは前記第２の核酸テンプレート中の塩基部分と同じ種である少なくとも１つの塩基部分を含む、請求項３５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
単一の核酸分子が少なくとも２つの前記異なる核酸テンプレートを含む、請求項３５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
少なくとも２つの前記異なる核酸テンプレートの第１の核酸テンプレートおよび第２の核酸テンプレートはそれぞれ異なる核酸分子上に存在する、請求項３５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記アレイの複数の部位の各部位は１００μｍ２以下の面積を有する、請求項３５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記アレイの複数の部位の各部位は、少なくとも２つの前記異なる核酸テンプレートのそれぞれの複数のアンプリコンを含む、請求項３５〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記複数のアンプリコンは核酸クラスターを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記アレイの複数の部位は１０μｍ以下のピッチを有する、請求項３５〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記アレイは少なくとも１×１０６個の部位を有する、請求項３５〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
各部位は前記アレイにおける他の全ての部位の核酸配列に対して固有である核酸配列を含む、請求項３５〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
同じポリメラーゼまたは同種のポリメラーゼが、各部位において、前記異なる核酸テンプレートにそれぞれハイブリダイズした前記プライマーの伸長を行う、請求項３５〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
選択的な前記処理は、ホスフィン処理を用いてアジドメチルを含む可逆的ブロッキング部分を選択的に除去すること、および、酸処理を用いてｔｅｒｔ−ブトキシ−エトキシを含む可逆的ブロッキング部分を選択的に除去することを含む、請求項３５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記可逆的ブロッキング部分の選択的除去は化学的処理、熱処理、光照射または電気的処理を含む、請求項３５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
固体支持体上に複数の部位を含む核酸アレイであって、
各部位は第１の核酸テンプレートおよび第２の核酸テンプレートを含み、
前記第１の核酸テンプレートは前記第２の核酸テンプレートの配列とは異なる配列を有し、
第１のプライマーが前記第１の核酸テンプレートに結合し、第１の可逆的ブロッキング部分が前記第１のプライマーに付着しており、
第２のプライマーが前記第２の核酸テンプレートに結合し、第２の可逆的ブロッキング部分が前記第２のプライマーに付着しており、
前記第１の可逆的ブロッキング部分は前記第２の可逆的ブロッキング部分とは異なり、
前記第１の可逆的ブロッキング部分は第１の脱ブロッキング処理により脱ブロック可能であり、前記第２の可逆的ブロッキング部分は第２の脱ブロッキング処理により脱ブロック可能であり、前記第１の脱ブロッキング処理は前記第２の可逆的ブロッキング部分に比べて前記第１の可逆的ブロッキング部分に対して選択であり、前記第２の脱ブロッキング処理は前記第１の可逆的ブロッキング部分に比べて前記第２の可逆的ブロッキング部分に対して選択である、核酸アレイ。
【請求項６１】
各部位は固体支持体上の１００μｍ２以下の面積を占める、請求項６０に記載の核酸アレイ。
【請求項６２】
前記複数の部位は１０μｍ以下のピッチを有する、請求項６０または６１に記載の核酸アレイ。
【請求項６３】
前記複数の部位は少なくとも１×１０６個である、請求項６０〜６２のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
【請求項６４】
各部位は他の全ての部位の核酸配列に対して固有である核酸配列を含む、請求項６３に記載の核酸アレイ。
【請求項６５】
前記第１の可逆的ブロッキング部分は前記第１のプライマーの３’ヌクレオチドに付着している、請求項６０〜６４のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
【請求項６６】
前記第１のプライマーの３’ヌクレオチドは第１の光標識に付着している、請求項６５に記載の核酸アレイ。
【請求項６７】
前記第２の可逆的ブロッキング部分は前記第２のプライマーの３’ヌクレオチドに付着している、請求項６５または６６に記載の核酸アレイ。
【請求項６８】
前記第２のプライマーの３’ヌクレオチドは第２の光標識に付着しており、前記第２の光標識は前記第１の光標識と光学的に区別可能である、請求項６７に記載の核酸アレイ。
【請求項６９】
前記第１の光標識および前記第２の光標識はフルオロフォアを含む、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
【請求項７０】
前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートはＤＮＡを含む、請求項６０〜６９のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
【請求項７１】
単一の核酸分子が前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートを含む、請求項６０〜７０のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
【請求項７２】
前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートはそれぞれ異なる核酸分子上に存在する、請求項６０〜７１のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
【請求項７３】
前記複数の部位は、前記第１の核酸テンプレートの複数のアンプリコンおよび前記第２の核酸テンプレートの複数のアンプリコンを含む、請求項６０〜７２のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
【請求項７４】
前記複数のアンプリコンは核酸クラスターを含む、請求項７３に記載の核酸アレイ。
【請求項７５】
前記第１のプライマーは第１のユニバーサルプライマー配列を含み、前記複数の部位の各部位における前記第１の核酸テンプレートは、前記第１のユニバーサルプライマー配列に相補的な第１のユニバーサルプライマー結合配列を含む、請求項６０〜７４のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
【請求項７６】
前記第２のプライマーは第２のユニバーサルプライマー配列を含み、前記複数の部位の各部位における前記第２の核酸テンプレートは、前記第２のユニバーサルプライマー配列に相補的な第２のユニバーサルプライマー結合配列を含み、前記第１のユニバーサルプライマー結合配列は前記第２のユニバーサルプライマー結合配列とは異なる、請求項７５に記載の核酸アレイ。
【請求項７７】
第１のポリメラーゼが前記第１のプライマーおよび前記第１の核酸テンプレートに結合している、請求項６０〜７６のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
【請求項７８】
第２のポリメラーゼが前記第２のプライマーおよび前記第２の核酸テンプレートに結合しており、前記第１のポリメラーゼおよび前記第２のポリメラーゼは同種のポリメラーゼである、請求項７７に記載の核酸アレイ。
【請求項７９】
前記第１の可逆的ブロッキング部分はアジドメチルを含み、前記第２の可逆的ブロッキング部分はｔｅｒｔ−ブトキシ−エトキシを含む、請求項６０〜７８のいずれか一項に記載の核酸アレイ。
【請求項８０】
請求項６０〜７９のいずれか一項に記載の核酸アレイと、
複数の部位を検出するように配置された検出器と、を備える、検出装置。
【請求項８１】
前記検出器は、各部位で第１のプライマーと第２のプライマーとの間の間隔に等しい距離で点同士を分離するには空間分解能が低すぎる、請求項８０に記載の検出装置。
【請求項８２】
前記検出器は光学検出器である、請求項８０または８１に記載の検出装置。
【請求項８３】
前記検出器のピクセルは前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの両方から信号を同時に取得するように構成されている、請求項８０または８１に記載の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般的に、核酸分析、より具体的には核酸シーケンシングに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのシーケンシングに現在利用可能な市販のプラットフォームは比較的高価なものである。これらのプラットフォームは、いわゆる「合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」アプローチを用いる。成長ポリマー構造体への各モノマー（すなわちヌクレオチド）の付加を検出しながらＤＮＡポリマーを合成するからである。テンプレートＤＮＡ鎖は新しいＤＮＡポリマーの合成を厳格に指示するため、合成中に成長鎖に付加された一連のヌクレオチドモノマーからテンプレートＤＮＡの配列を推測することができる。生物学的システムにおいてＤＮＡ合成を通常行う生化学成分を特別に改変したバリアントによってモノマー付加の検出が容易となる。これらの改変成分は、比較的製造費用が高く、また合成によるシーケンシング中に比較的多量に消費される。さらに、反応のモニタリングには、レーザ、検出光学系、複雑な流体送達システムなどの比較的高価なハードウェアが使用される。また、現在までに最も成功している商業プラットフォームは、合成によるシーケンシングを開始する前でされもＤＮＡテンプレートの増幅に高価な試薬やハードウェアを必要とする。これらのプラットフォームの複雑さと費用によって、本技術が明らかに必要とされる臨床的・研究的状況の一部で、その使用が妨げられている。
【０００３】
したがって、合成によるシークエンシングのプラットフォームを改良して、コスト効率がより高く、迅速かつ便利なプラットフォームとする必要性がある。本開示はかかるニーズに対応するものであり、また他の利点も提供するものである。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は核酸テンプレートの同定方法を提供する。本方法は、（ａ）複数の部位のアレイであって、各部位は少なくとも２つの異なる核酸テンプレートの混合物を含むアレイを提供する工程；（ｂ）各部位において、異なる可逆的ブロッキング部分をそれぞれ有する複数の異なるヌクレオチド類似体で、前記異なる核酸テンプレートにハイブリダイズしたそれぞれのプライマーを伸長することにより、各部位において異なるプライマー伸長産物を生成する工程；（ｃ）前記異なるプライマー伸長産物を検出して、各部位において前記複数の異なるヌクレオチド類似体を識別する工程；および、（ｄ）前記異なる可逆的ブロッキング部分の第１に対して選択的な第１の処理、および、前記異なる可逆的ブロッキング部分の第２に対して選択的な第２の処理を使用して、各部位において、前記プライマー伸長産物から前記異なる可逆的ブロッキング部分を除去する工程、を含み得る。任意で、上記方法は、（ｅ）前記工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し、各部位において、複数の伸長産物のそれぞれに付加された複数の異なるヌクレオチド類似体の配列を決定する工程を含み得る。
【０００５】
また、（ａ）複数の部位のアレイを提供する工程であって、各部位は第１の核酸テンプレートおよび第２の核酸テンプレートを含み、前記第１の核酸テンプレートは前記第２の核酸テンプレートの配列とは異なる配列を有し、第１のプライマーが前記第１の核酸テンプレートに結合し、第２のプライマーが前記第２の核酸テンプレートに結合し、可逆的ブロッキング部分が前記第２のプライマーに付着している、アレイ提供工程；（ｂ）可逆的ブロッキング部分に付着している第１のヌクレオチド類似体を付加することにより前記第１のプライマーを伸長する工程であって、前記第１のヌクレオチドに付着している可逆的ブロッキング部分は前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分とは異なる、プライマー伸長工程；（ｃ）前記第１のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；（ｄ）可逆的ブロッキング部分に付着している第２のヌクレオチド類似体を付加することにより前記第２のプライマーを伸長する工程であって、前記第１のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分は前記第２のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分とは異なる、プライマー伸長工程；および、（ｅ）各部位において、前記第１のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体および前記第２のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体を検出することにより、各部位において、前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートのそれぞれ異なる配列を決定する工程を含み得る、核酸テンプレートのシーケンシング方法も提供される。任意で、上記方法は、（ｆ）前記第２のプライマーに付加された前記第２のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第１のプライマーに付加された前記第１のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；（ｇ）前記工程（ｆ）の後、可逆的ブロッキング部分に付着している第３のヌクレオチド類似体を付加して前記第１のプライマーを伸長する工程；（ｈ）前記第１のプライマーに付加された前記第１のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第２のプライマーに付加された前記第２のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；（ｉ）前記工程（ｈ）の後、可逆的ブロッキング部分に付着している第４のヌクレオチド類似体を付加して前記第２のプライマーを伸長する工程であって、前記第３のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分は前記第４のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分とは異なる、プライマー伸長工程；および、（ｈ）各部位において、工程（ｇ）で前記第１のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体、および、工程（ｉ）で前記第２のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体を検出することにより、各部位において、前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートのそれぞれ異なる配列を決定する工程を含み得る。任意で、前記工程（ｆ）〜（ｈ）が繰り返され得る。
【０００６】
また、（ａ）複数の部位のアレイを提供する工程であって、各部位は第１の核酸テンプレートおよび第２の核酸テンプレートを含み、前記第１の核酸テンプレートは前記第２の核酸テンプレートの配列とは異なる配列を有し、第１のプライマーが前記第１の核酸テンプレートに結合し、可逆的ブロッキング部分が前記第１のプライマーに付着しており、第２のプライマーが前記第２の核酸テンプレートに結合し、可逆的ブロッキング部分が前記第２のプライマーに付着しており、前記第１のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分は前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分とは異なる、アレイ提供工程；（ｂ）前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第１のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；（ｃ）可逆的ブロッキング部分に付着している第１のヌクレオチド類似体を付加することにより前記第１のプライマーを伸長する工程；（ｄ）前記第１のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；（ｅ）可逆的ブロッキング部分に付着している第２のヌクレオチド類似体を付加して前記第２のプライマーを伸長する工程であって、前記第１のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分は前記第２のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分とは異なる、プライマー伸長工程；および、（ｆ）各部位において、前記第１のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体および前記第２のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体を検出することにより、各部位において、前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートのそれぞれ異なる配列を決定する工程を含み得る、核酸テンプレートのシーケンシング方法も提供される。
【０００７】
さらに、本開示は、固体支持体上に複数の部位を含む核酸アレイであって、各部位は第１の核酸テンプレートおよび第２の核酸テンプレートを含み、前記第１の核酸テンプレートは前記第２の核酸テンプレートの配列とは異なる配列を有し、第１のプライマーが前記第１の核酸テンプレートに結合し、第１の可逆的ブロッキング部分が前記第１のプライマーに付着しており、第２のプライマーが前記第２の核酸テンプレートに結合し、第２の可逆的ブロッキング部分が前記第２のプライマーに付着しており、前記第１の可逆的ブロッキング部分は前記第２の可逆的ブロッキング部分とは異なる、核酸アレイを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】アレイの１つの部位で２つのテンプレートの混合物について「合成によるシーケンシング」を同時に行うサイクル図であって、同一の伸長産物に存在する標識部分および脱ブロッキング部分のサブセットが同時に切断される図を示す。
【図２】アレイの１つの部位で２つのテンプレートの混合物について「合成によるシーケンシング」を同時に行うサイクル図であって、異なる伸長産物（すなわち、Ｒ１の反応およびＲ２の反応の両方で生成されるもの）に存在する標識部分が同時に切断される図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本開示は核酸の高密度検出方法を提供する。本開示の方法の特定の実施形態は、核酸を操作および検出するための公知の技術を利用するが、以下に述べる改良は、これらの技術の使用により得られる情報の密度が増加するようなオルトゴナルな処理を提供する。
【００１０】
プライマー伸長に基づく検出技術の例は、得られる情報の密度が増加する一例である。具体的には、ある核酸の標的配列をプライマーにハイブリダイズさせ、そして、プライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて標識ヌクレオチド類似体が付加され得る。複数の部位を有するアレイ・フォーマットを使用することができ、各部位は他の部位に存在する標的配列とは異なる単一の標的配列を有する。任意で、識別可能な標識をそれぞれ有する数個の異なるヌクレオチド類似体種も同様に使用される。プライマーを伸長すると標的配列を有する核酸へ標識ヌクレオチド類似体が動員される。複数の異なる標識ヌクレオチド類似体を使用するアレイ・フォーマットでは、各部位に動員される標識を区別することができ、この情報を用いて当該部位の標的核酸を同定することができる。このアレイ・フォーマットから得られる情報の密度は部位ごとに識別される１つの標的配列である。
【００１１】
本開示のオルトゴナルなフォーマットでは、アレイの各部位は、同時に（例えば、化学試薬または物理的操作により）処理され、かつ同時に（例えば、混合物中の核酸同士を空間分解するには低すぎる解像度の検出器により）観察される２つ以上の異なる標的配列の混合物を含み得る。にもかかわらず、本明細書に記載のオルトゴナルな処理は、異なる標的配列を互いに区別可能にするディファレンシャルな効果を生じる。かかる場合、アレイから得られる情報は少なくとも２倍となり得る。２種類のプライマーをアレイに送達することができ、これらのプライマーは、異なる相補性により、それぞれの個々の部位で、２つの異なるテンプレート配列にそれぞれハイブリダイズする。第１のプライマーは、第１の脱ブロッキング処理が適用されるまでその伸長を防止する第１の可逆的ブロッキング部分を有することができ、第２のプライマーは、第２の脱ブロッキング処理が適用されるまでその伸長を防止する第２の可逆的ブロッキング部分を有することができる。この例では、第１の脱ブロッキング処理は第２の可逆的ブロッキング部分に比べて第１の可逆的ブロッキング部分に対して選択的であり、第２のブロッキング処理は第１の可逆的ブロッキング部分に比べて第２の可逆的ブロッキング部分に対して選択的である。この選択的な脱ブロッキング能は、これらのプライマーが、各脱ブロッキング処理に曝されても、伸長および検出のために個別に修飾できるようにするオルトゴナリティを提供する。よって、２つのプライマー、より重要なことにはそれらの伸長を指示するテンプレートが、それらの分子自体は使用中の検出システムを用いて空間的に区別できるように十分に分離されないかもしれない場合であっても、この化学スイッチングによって区別できる。
【００１２】
プライマー伸長に基づく検出技術について上に例示したオルトゴナリティの概念は、合成によるシーケンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＳＢＳ）技術に容易に適用することができる。ある１つの部位における２つのテンプレート（Ｒ１およびＲ２）に対するオルトゴナルなＳＢＳの例示的なサイクル図を図１に示す。図の第１列は、アレイが曝される処理を表す（すなわち、両方のテンプレートが処理に曝される）。第２列および第３列は、それぞれ、第１のテンプレートおよび第２のテンプレートに対する処理の効果を示す。第１のサイクルの第１工程において、プライマーの混合物をアレイと接触させて、それぞれのプライマー結合部位にハイブリダイズさせる。工程１の後、Ｒ１テンプレートにハイブリダイズしたＲ１プライマーはブロック１でブロックされ、Ｒ２プライマーにはブロック基がない（任意で、プライマーＲ２はオルトゴナルなブロッキング部分であるブロック２でブロックできる）。そのため、これらの２つのプライマーを別々に伸長することができる。例えば、第１のサイクルの第２工程において、ブロック２および標識２を有するヌクレオチドがアレイに送達されると、ブロックされていないＲ２プライマーが選択的に伸長する（すなわち、Ｒ１プライマーは伸長しない）。次いで、第１のサイクルの第３の工程において、アレイは、例えばブロック１を切断することにより、Ｒ１プライマーを選択的に脱ブロックする処理（すなわち、ブロック２は切断されない）に曝露され得る。第１のサイクルの第４工程では、ブロック１および標識１を有するヌクレオチドがアレイに送達され、その結果、ブロックされていないＲ１プライマーが選択的に伸長する（すなわち、Ｒ２プライマーは伸長しない）。次いで、検出装置を用いてアレイを観察して、各部位で２つの標識を区別することができる。図１に例示するように、１）ブロックおよび標識されたヌクレオチドの送達、２）ブロック基および標識の切断、および、３）検出のサイクルが周期的に繰り返され得る。
【００１３】
上で例示したように、また図１に例示するように、プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチド類似体は、合成プロセスによるシーケンシングの複数のサイクルを介してオルトゴナルな制御を提供するように選択的に切断可能な可逆的ブロッキング部分を含むことができる。したがって、これらのヌクレオチド類似体は以下の２つのセットで提供され得る：１）第１の可逆的ブロッキング部分（例えば、第１のプライマー上の可逆的ブロッキング部分（ブロック１）と同じもの）を有する第１のセット；および、第２の可逆的ブロッキング部分（例えば、ブロック２）を有する第２のセット。一部の実施形態では、第１のセット中のヌクレオチド類似体は、第２のセット中のヌクレオチド類似体上の標識と区別可能な標識を有することができる（例えば、図１中、第１のセットは標識１として示され、第２のセットは標識２として示される）。生化学的反応性および標識マネージメントのオルトゴナリティにより、２つのプライマー伸長イベントがアレイの各部位で区別できる。したがって、２つの標的配列を区別して検出することができる。
【００１４】
以下に更に詳細に説明するように、他の方法もオルトゴナルな操作・検出の利益を享受できることが理解されよう。よって、本明細書に記載の組成物、装置および方法はシーケンシング用途に限定される必要はない。
【００１５】
オルトゴナリティを利用して情報獲得密度を２倍以上に高めることができる。例えば、２つを超えるオルトゴナル試薬セットを用いることにより情報密度の増加を２倍超とすることができる。一例として、３つの異なる脱ブロッキング処理を含めた３つの試薬セットであって、各脱ブロッキング処理は、当該試薬セットのうちの１つのセットのプライマーおよび／またはヌクレオチド類似体に対して選択的であるものを使用することができる。
【００１６】
上述したように、また以下でさらに詳細に説明するように、本開示は、所定の１つの部位で同時に分離可能な標的配列の数を２以上とする、アレイの超解像イメージングという利点を提供する。超解像イメージングは、アレイ上の部位の数よりも多い多種類の標的核酸を同時に区別するという利点を提供することができる。同様に、基材上の２つの異なる標的配列の区別に必要とされる空間分解能よりも低い分解能の検出器を用いて２つの異なる標的配列を固相基材上で区別することができるという超解像が提供される。
【００１７】
特定の実施形態では、本開示は、効率的な核酸検出のための試薬・ハードウェア構成を提供する。例示的な構成は、プライマー伸長工程において区別されるべきヌクレオチド類似体種の数よりも少ない数の標識を使用する。例えば、単一の標識種の検出に基づいて４種のヌクレオチド類似体を区別することができる。以下に更に詳細に記載するように、これは以下の４つの種を含むヌクレオチド類似体の第１のセットを使用することによって達成され得る：（１）第１の標識を有する種；（２）リガンドを有する種；（３）第１の標識に対する切断可能な結合を有する種；および（４）後の工程で使用される如何なる標識またはリガンドを欠く種であり、ここで、４つの種は全て第１の処理によって選択的に脱ブロックされるブロッキング部分を有する。ヌクレオチド類似体のオルトゴナルなセットは以下の４種を含み得る：（５）第２の標識を有する種；（６）第１の標識および第２の標識の混合物を有する種、（７）第２の標識に対する切断可能な結合を有する種；および（８）後の工程で使用される如何なる標識またはリガンドを欠く種であり、ここで、４つの種は全て第２の処理によって選択的に脱ブロックされるブロッキング部分を有する。具体的には、第１の処理はヌクレオチド類似体の第１のセットの実質的な脱ブロックを引き起こさず、第２の処理はヌクレオチド類似体のオルトゴナルなセットの実質的な脱ブロックを引き起こさない。
【００１８】
上記の各セット内の種は、特定の流動工程の後にどの標識が出現または消失するかの適切な説明に基づいて互いに区別することができ、２つのオルトゴナルなヌクレオチド類似体セットは２つの異なる標識に基づいて区別することができる。より具体的には、種（１）および種（５）は、異なる標識に基づいて互いに区別でき、また、最初の標識化工程後に出現し、それぞれの切断剤に対して耐性を有することに基づいて他の全ての種と区別することができ；種（２）は、標識レセプターとのインキュベーション後の標識の出現に基づいて区別することができ；種（３）および種（７）は、異なる標識に基づいて互いに区別することができ、また、標識が最初に出現し、次いでそれぞれの切断試薬で処理すると標識が消失することに基づいて、すべての他の種と区別でき；種（６）は、完全に標識された種の強度の半分の強度で両方の標識が存在することに基づいて他のすべての種と区別することができ；そして、種（４）および種（８）は、検出された各セットにおいて他の種が欠如していることから推測して区別することができる。所定の数の標識を区別するために、標識の数、検出フェーズ中の流体操作回数および／または検出デバイスの複雑さを変更する多くの他の構成が可能である。そのため、特定のアプローチや用途に適合するように構成を合わせることができる。
【００１９】
本明細書で使用される用語は、他に特定されない限り、それらの通常の意味を有すると理解される。本明細書で使用されるいくつかの用語の例およびその定義を以下に示す。
【００２０】
本明細書中において、用語「アンプリコン」は、核酸に関連して使用される場合、核酸のコピー産物であって、そのヌクレオチド配列が当該核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と同一であるかまたは相補的であるものを意味する。アンプリコンは、核酸またはそのアプリコンをテンプレートとして、ポリメラーゼ伸長、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、ライゲーション伸長、またはライゲーション連鎖反応などの様々な増幅方法により生成することができる。アンプリコンは、特定のヌクレオチド配列の単一コピー（例えば、ＰＣＲ産物）または当該ヌクレオチド配列の複数コピー（例えば、ＲＣＡのコンカテマー生成物）を有する核酸分子であり得る。標的核酸の第１のアンプリコンは典型的には相補的コピーである。後続のアンプリコンは、第１のアンプリコンの生成後に、標的核酸または別のアンプリコンから生成されるコピーである。また後続アンプリコンは、標的核酸と実質的に相補的であるかまたは標的核酸と実質的に同一である配列を有し得る。
【００２１】
本明細書中において、用語「アレイ」は、相対的な位置によって互いに区別できる部位の集団をいう。アレイの異なる部位に存在する異なる分子は、アレイ中の当該部位の位置に応じて互いに区別することができる。アレイの１つ１つの部位は特定の種類の１つ以上の分子を含むことができる。例えば、ある１つの部位は、特定の配列を有する単一の標的核酸分子を含んでもよく、あるいは、ある１つの部位は、同じ配列（および／またはその相補的な配列）を有する数個の核酸分子を含んでもよい。あるいは、ある１つの部位は、標的核酸配列の混合物（ｍｉｘｔｕｒｅ）であって、例えば、個々の分子のそれぞれが２つ以上の異なる分子を含むように、あるいは、２つ以上の分子が当該混合物の単一の標的配列をそれぞれ含むようにされた標的核酸配列の混合物を含み得る。アレイの部位は１つの同じ基材上に配置された様々なフィーチャーであり得る。例示的なフィーチャーとしては、限定されないが、基材内のウェル、基材内または基材上のビーズ（または他の粒子）、基材からの突起物、基材上のリッジや基材内のチャネルが含まれる。アレイのこれらの部位は、それぞれが異なる分子を有する別々の基材であってもよい。別々の基材に付着された異なる分子は、これらの基材を結合させた表面上における当該基材の位置や、液体またはゲル中の当該基材の位置に応じて同定することができる。別々の基材が１つの表面上に配置されたアレイの例としては、限定されないが、ウェル中にビーズを有するものが挙げられる。
【００２２】
本明細書において、用語「付着」は、２つの物体が互いに接合、締結、接着、接続、または結合されている状態を指す。例えば、核酸などの分析対象は、共有結合または非共有結合によってゲルや固体支持体などの材料に付着させることができる。共有結合は原子間の電子対の共有によって特徴付けられる。非共有結合は電子対の共有を伴わないものであって、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用、および疎水性相互作用が挙げられる。核酸は、固体支持体上のゲルコーティングを介して固体支持体に付着させることができる。
【００２３】
本明細書において、用語「ブロッキング部分」は、ヌクレオチド類似体に関して使用される場合、ヌクレオチド類似体が第２のヌクレオチド類似体への共有結合を形成することを阻害または防止する、ヌクレオチド類似体の一部を意味する。例えば、ペントース部分を有するヌクレオチド類似体の場合、ブロッキング部分は、ヌクレオチド類似体の３’酸素と第２のヌクレオチド類似体の５’ホスフェートとの間のホスホジエステル結合の形成を妨げることができる。ブロッキング部分は、核酸ポリマー中に存在するモノマー単位であるヌクレオチド類似体の一部、または、遊離ヌクレオチド類似体（例えば、ヌクレオチド三リン酸）の一部であり得る。ヌクレオチド類似体の一部であるブロッキング部分は、当該ブロッキング部分を除去または修飾して当該ヌクレオチド類似体が第２のヌクレオチド類似体に対して共有結合を形成することができるように可逆的であり得る。特に有用な可逆的ブロッキング部分は、ホスフェート、ホスホエステル、アルキルアジド、アセタール、エステル、エーテルなどである。使用可能な可逆的ブロッキング部分の更なる例は下記に記載されており、また参照により援用する下記参考文献にも記載されている。特定の実施形態において、ブロッキング部分、例えば可逆的ブロッキング部分は、ヌクレオチド類似体のペントース部分の３’位または２’位に付着され得る。
【００２４】
本明細書中において、用語「クラスター」は、核酸に関して使用される場合、固体支持体に付着してフィーチャーまたは部位を形成する核酸の集団をいう。核酸は一般的には単一種であるため均質なクラスターを形成するが、一部の実施形態では核酸は不均質であってもよく、異なる配列を有する個々の分子が部位またはフィーチャーに存在することになる。核酸は、一般的には例えばその５’末端を介して固体支持体に共有結合によって付着されるが、他の付着手段が可能である場合もある。ある１つのクラスター内の核酸は一本鎖または二本鎖であり得る。全てではないが、一部の実施形態では、クラスターはブリッジ増幅として知られる固相増幅法によって作製される。クラスターのための例示的な構成およびその製造方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第５，６４１，６５８号明細書、米国特許出願公開第２００２／００５５１００号明細書、米国特許第７，１１５，４００号明細書、米国特許出願公開第２００４／００９６８５３号明細書、同第２００４／０００２０９０号明細書、同第２００７／０１２８６２４号明細書、および同第２００８／０００９４２０号明細書に記載されている。
【００２５】
本明細書において、用語「脱ブロッキング剤」は、ブロッキング部分を修飾または除去することができる触媒、酵素、試薬または他の物質を意味する。特定の実施形態では、脱ブロッキング剤は、特定のブロッキング部分に対して特異性を有することができる。したがって、脱ブロッキング剤は、別のブロッキング部分と比較してヌクレオチド類似体から特定のブロッキング部分を選択的に除去することができる。典型的な脱ブロッキング剤としては、限定されないが、ホスホエステラーゼ、エステラーゼ、アルキルトランスフェラーゼまたはメチルトランスフェラーゼなどの酵素；ホスフィン、プロトンなどの化学試薬；パラジウム触媒などの化学触媒などが挙げられる。脱ブロッキング剤の更なる例は以下に更に詳細に説明する。
【００２６】
本明細書中において、用語「異なる」とは、核酸に関して使用される場合、核酸が相互に同じではないヌクレオチド配列を有することを意味する。２つ以上の核酸は、それらの長さ方向全体に沿って異なるヌクレオチド配列を有し得る。あるいは、２つ以上の核酸は、それらの長さ方向の実質的な部分に沿って異なるヌクレオチド配列を有し得る。例えば、２つ以上の核酸は、双方に同一であるユニバーサル配列領域をも有しつつ、互いに異なる標的ヌクレオチド配列部分を有し得る。一般的に、本明細書において２つの種が「異なる」と記載される場合、一方の種は第２の種の構造特性とは同じではない構造特性を有する。例えば、２つの異なるポリマー種（２つのタンパク質など）は、異なるモノマーサブユニット配列（例えば、２つの異なるタンパク質の異なるアミノ酸配列）を有することができる。
【００２７】
本明細書で使用される「各」、「それぞれ」という用語は、項目の群に関して使用される場合、群内の個々の項目を識別することを意図しているが、当該群内の全ての項目を必ずしも指すものではない。明示的な開示または文脈が明確に指示している場合は例外となる。
【００２８】
本明細書において、用語「核酸」は、当該分野におけるその使用と一致するものであることが意図され、天然の核酸やその機能的類似体を含む。特に有用な機能的類似体は、配列特異的に核酸にハイブリダイズすることができるか、または特定のヌクレオチド配列の複製のテンプレートとして使用することができる。天然の核酸は、一般的に、ホスホジエステル結合を含む主鎖を有する。類似体の構造は当技術分野で知られている種々の代替の骨格結合を有することができる。天然の核酸は、一般的に、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に見出される）またはリボース糖（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）に見出される）を有する。核酸は当該分野で知られている上記糖部分の種々の類似体を含み得る。核酸は天然のまたは非天然の塩基を含み得る。これに関して、天然のデオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を、またリボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシン、およびグアニンからなる群から選択される１つ以上の塩基を有し得る。核酸に含めることができる有用な非天然の塩基は当該分野で知られている。「標的」という用語は、核酸に関して使用される場合、本明細書に記載の方法または組成物の文脈における核酸の意味的識別子として意図され、明示された核酸の構造または機能を必ずしも限定するものではない。
【００２９】
本明細書において、用語「核酸テンプレート」は、ポリメラーゼ触媒複製のためのガイドとして使用可能な核酸またはその一部分をいう。核酸分子は、その長さ方向に沿って複数のテンプレートを含むことができ、あるいは、本明細書の特定の実施形態では、１分子あたり単一のテンプレートのみが使用され得る。核酸テンプレートはリガーゼ触媒プライマー伸長のためのガイドとして機能することもできる。
【００３０】
本明細書において、用語「ヌクレオチド」または「ヌクレオチド類似体」は、天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、およびヌクレオチドとして知られる他の分子を含むことを意図する。例えば、かかる用語は、本明細書において、塩基部分を含み、任意で１つ以上のリン酸エステル部分に付着しているヌクレオシド部分（リボース、デオキシリボース、またはその類似体）を指すために一般的に使用される。この用語は、例えばＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖中に存在するサブユニットを識別するために、ポリマー中に存在するモノマーユニットを指すために使用され得る。この用語はまた、必ずしもポリマー中に存在しないモノマー分子、例えば、ポリメラーゼによってテンプレート依存的にポリヌクレオチドに取り込まれ得る分子を指すために使用され得る。
【００３１】
例示的なヌクレオチド類似体には、限定されないが、リボヌクレオチド一リン酸（リボヌクレオシド一リン酸とも呼ばれる）、リボヌクレオチド二リン酸（リボヌクレオシド二リン酸と呼ばれることもある）、リボヌクレオチド三リン酸（リボヌクレオシド三リン酸と呼ばれることもある）、デオキシヌクレオチド一リン酸（デオキシヌクレオシド一リン酸と呼ばれることもある）、デオキシヌクレオチド二リン酸（デオキシヌクレオシド二リン酸と呼ばれることもある）、およびデオキシヌクレオチド三リン酸（デオキシヌクレオシド三リン酸と呼ばれることもある）が挙げられる。明確化を目的としてＤＮＡ成分とＲＮＡ成分とを区別したい場合は、用語「リボヌクレオチド」を使用して、リボウリジン三リン酸、リボグアニジン三リン酸、リボシチジン三リン酸、リボアデノシン三リン酸などのＲＮＡヌクレオチドを特定することができ、また用語「デオキシヌクレオチド」を使用して、デオキシチミジン三リン酸、デオキシグアニジン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸などのＤＮＡヌクレオチドを特定することができる。特定の実施形態では、ヌクレオチドは「伸長可能」であり、例えば、ヌクレオチドの３’ヒドロキシルまたは任意の他の位置で伸長ブロッキング部分を欠いている。他の実施形態では、ヌクレオチドは「ブロック」されており、他のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが付加して３’位が伸長に関与することを防止する部分を有する。
【００３２】
本明細書において、用語「ピッチ」は、アレイ内の２つの部位の中心間距離を指す。部位のパターンは、平均ピッチの周りの変動係数が小さくするように規則的であったり、または、パターンは不規則であってよく、かかる場合は変動係数が比較的大きくなる。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、少なくとも１０ｎｍ、０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、１００μｍまたはそれ以上であり得る。これに代えてまたは加えて、平均ピッチは、たとえば、最大１００μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．１μｍまたはそれ以下であり得る。もちろん、部位の特定のパターンの平均ピッチは上記範囲から選ばれた上限値の１つと下限値の１つとの間であってもよい。
【００３３】
本明細書中において、用語「プライマー」は、テンプレート配列またはその近傍でプライマー結合部位に結合する配列を有する核酸を意味する。一般的に、プライマーは、プライマーのポリメラーゼ伸長などを介して、テンプレートの複製を可能にする形態で結合する。プライマーは、核酸分子の第１の部分であって、当該核酸分子の第２の部分に結合するものであってよく、ここで第１の部分はプライマー配列であり、第２の部分はプライマー結合配列（例えば、ヘアピンプライマー）である。あるいは、プライマーは、テンプレート配列を有する第２の核酸分子に結合する第１の核酸分子でもよい。プライマーはＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体からなり得る。
【００３４】
本明細書において、用語「プライマー伸長産物」は、少なくとも１つのヌクレオチド類似体の付加によって修飾されたプライマーを意味する。例えば、プライマーは、その３’末端に（例えば、ポリメラーゼ触媒作用を介して）１つ以上のヌクレオチド類似体が付加されることにより修飾されて、プライマー伸長産物となる。あるいは、プライマーの３’末端または５’末端にオリゴヌクレオチドがライゲーションされてプライマー伸長産物が生成され得る。かかる場合、プライマー伸長産物は、オリゴヌクレオチドの長さに等しい長さだけ伸長される。プライマー伸長産物は、プライマーよりも、少なくとも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、またはそれ以上長くされ得る。代替的または追加的に、プライマー伸長産物は、プライマーよりも１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、または１０００ヌクレオチド以下長くされ得る。例えば、ブロックされたヌクレオチド類似体を使用すると、プライマーよりも少なくとも１ヌクレオチド長く、かつ、プライマーよりも１ヌクレオチド以下長い伸長産物が得られる。
【００３５】
本明細書において、第２のものと比較して第１のものを「選択的に」操作する（または「選択的操作する」）とは、当該操作が、第２のものに対する効果と比較して第１のものに対してより大きな効果を有することを意味することを意図する。操作は第２のものに何ら影響を与える必要はない。操作は、第１のものに対して、第２のものの効果よりも少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、または９９％大きい効果を有し得る。操作は、第２のものに対する効果よりも少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍、１ｘ１０３倍、１ｘ１０４倍、または１ｘ１０６倍高い効果を第１のものに与え得る。操作には、修飾、接触、処理、変形、（例えば化学結合の）切断、（例えば化学結合の）光化学的切断、（例えば、化学結合の）形成、（例えば化学結合の）光化学的形成、共有結合的修飾、非共有結合的修飾、破壊、フォトアブレーション、除去、合成、重合、光重合、（例えば核酸の）増幅、（例えば核酸の）コピー、（例えば核酸の）伸長、（例えば核酸の）ライゲーションや、本明細書に記載されているかまたは当技術分野で知られている他の操作が含まれる。
【００３６】
本明細書において、用語「配列」は、核酸に関して使用される場合、核酸中のヌクレオチド（または塩基）の順序をいう。異なる種のヌクレオチドが核酸中に存在する場合、配列は、核酸中のそれぞれの位置にそれらのヌクレオチド（または塩基）の種の識別を含む。配列は、核酸分子の全部または一部の特性である。この用語は、タンパク質ポリマーのアミノ酸モノマー単位などの他のポリマーにおけるモノマー単位の順序および位置識別を記述するために同様に使用することができる。
【００３７】
本明細書において、用語「部位」は、少なくとも１つの分析対象分子が存在する、アレイにおける位置を意味する。ある１つの部位は、単一の分析対象分子のみを、または同じ種の複数の分析対象分子の集団を含み得る。ある実施形態では、ある１つの部位は複数の異なる分析対象分子種を含むことができ、各分子種は１つ以上のコピーで存在している。アレイの部位同士は、通常、分離している。分離している部位同士は連続していても、あるいは部位間にスペースを有してもよい。
【００３８】
本明細書において、用語「種」または「タイプ」は、同じ化学構造を共有する分子を識別するために使用される。例えば、ヌクレオチド類似体の混合物は数個のｄＣＴＰ分子を含むことができる。これらのｄＣＴＰ分子は、互いに同じ種またはタイプであるが、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなどとは異なる種またはタイプであると理解される。同様に、同じヌクレオチド配列を有する個々のＤＮＡ分子は同じ種またはタイプである一方、異なる配列を有する個々のＤＮＡ分子は異なる種またはタイプである。別の例として、ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼとは（これらの２つのポリメラーゼが同じ生物に由来する場合でも）異なるポリメラーゼ種またはタイプである。
【００３９】
本明細書中において、用語「ユニバーサル配列」は、２つ以上の核酸分子に共通の配列をいう（これらの核酸分子が互いに異なる配列の他の領域をも有する場合であっても）。分子群内の複数の異なるメンバーに存在する１つのユニバーサル配列は、当該ユニバーサル配列に相補的なユニバーサルキャプチャー核酸の集団を用いて、複数の異なる核酸の補足を可能にする。同様に、分子群内の様々なメンバーに存在するユニバーサル配列は、当該ユニバーサル配列に相補的なユニバーサルプライマーの集団を用いて、複数の異なる核酸の複製または増幅を可能にする。このように、ユニバーサルキャプチャー核酸またはユニバーサルプライマーは、ユニバーサル配列に特異的にハイブリダイズすることができる配列を含む。標的核酸分子は、ユニバーサルアダプターを、例えば異なる標的配列の一方または両方の末端に付着するように修飾することができる。
【００４０】
以下に記載され、かつ添付の特許請求の範囲に記載される実施形態は上記の定義を考慮して理解され得る。
【００４１】
本開示は核酸テンプレートのシーケンシング方法を提供する。本方法は、（ａ）複数の部位のアレイであって、各部位は少なくとも２つの異なる核酸テンプレートの混合物を含むアレイを提供する工程；（ｂ）各部位において、異なる可逆的ブロッキング部分をそれぞれ有する複数の異なるヌクレオチド類似体で、前記異なる核酸テンプレートにハイブリダイズしたそれぞれのプライマーを伸長することにより、各部位において異なるプライマー伸長産物を生成する工程；（ｃ）前記異なるプライマー伸長産物を検出して、各部位において前記複数の異なるヌクレオチド類似体を識別する工程；（ｄ）前記異なる可逆的ブロッキング部分の第１に対して選択的な第１の処理、および、前記異なる可逆的ブロッキング部分の第２に対して選択的な第２の処理を使用して、各部位において、前記異なるプライマー伸長産物から前記異なる可逆的ブロッキング部分を除去する工程；および（ｅ）前記工程（ｂ）〜（ｄ）を繰り返し、各部位において、複数の伸長産物のそれぞれに付加された複数の異なるヌクレオチド類似体の配列を決定する工程、を含み得る。
【００４２】
上述のとおり、本開示の方法は、配列がそれぞれ異なる第１および第２の核酸テンプレートを提供する工程を含み得る。これらの２つのテンプレート配列は、単一の核酸分子の一部であるか、または別々の分子上に位置し得る。本明細書の他の箇所でさらに詳細に述べるように、２つのテンプレート配列は使用される検出システムでは空間的に分離できない近接さで存在し得る。にもかかわらず、本開示のオルトゴナルな検出方法ではこれらのテンプレート配列を区別できる。オルトゴナルな検出スキームを２つのテンプレート配列について例示するが、２つ以上のテンプレート配列に使用することもできる。したがって、本明細書に記載のシステムまたは方法は、アレイの単一部位において、例えば単一核酸分子上で、互いに近接しているか、あるいは、使用される検出システムでは空間的に分離できない近さで近接している、少なくとも２個、３個、４個、５個、１０個またはそれ以上のテンプレートの配列を含むことができる。
【００４３】
本明細書中で使用される標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの類似体から構成され得る。標的核酸の供給源は、ゲノムＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、または天然源由来の他の核酸であり得る。場合によっては、このような供給源に由来する標的核酸は本明細書の方法または組成物での使用に先立って増幅され得る。
【００４４】
標的核酸の由来となり得る例示的な生体サンプルには、例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄動物、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒトまたは非ヒト霊長類などの哺乳類；シロイヌナズナ、トウモロコシ、ソルガム、オートムギ、コムギ、イネ、キャノーラまたはダイズなどの植物；コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）などの藻類；線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）などの線形動物；キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、蚊、ミバエ、ハチミツ、クモなどの昆虫；ゼブラフィッシュなどの魚類；爬虫類；カエル、アフリカツメガエルなどの両生類；キイロタマホコリカビ（ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）；ニューモシスチス・カリニ（ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、トラフグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）、酵母、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒａｍｏｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などの真菌；または、熱帯熱マラリア原虫（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来のものが挙げられる。標的核酸はまた、細菌、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ブドウ球菌（ｂｕｔｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、肺炎マイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）などの原核生物；古細菌；Ｃ型肝炎ウイルスやヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス；またはウイロイド由来であり得る。標的核酸は、上記生物の均質な培養物または集団、あるいは、例えばコミュニティや生態系における幾つかの異なる生物の集団に由来し得る。核酸は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）、またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍｄ．（１９９８）に記載されている方法を含む、当該分野で公知の方法を用いて単離することができ、それぞれ参照により本明細書に援用する。
【００４５】
特定の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の方法における使用のために核酸サンプルを修飾または調製することができる。１つ以上のプライマー結合部位を核酸に付加することが望ましい場合もある。既知の分子生物学的技術を用いて、例えば、プライマー結合部位を有するアダプターの挿入、プライマー結合部位を作る突然変異、プライマー結合部位を有するアダプターのライゲーションなどを介して、それぞれのテンプレート配列の上流にプライマー結合部位を導入することができる。有用な方法は、前述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌおよびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌに記載されている。米国特許出願公開第２０１５／００３１５６０Ａ１号明細書（参照により本明細書に援用する）では、タグメントテーションに基づくプライマー結合部位導入技術が記載されている。タグメントテーションは１つ以上のプライマー結合部位の導入に特に有用であり、例えば、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第６，２９４，３８５号明細書、同第８，３８３，３４５号明細書、および国際公開第２０１２／１０６５４６号公報に記載の技術を使用して行うことができる。それぞれのテンプレート配列の上流に存在する天然配列領域が本明細書に記載の方法においてプライマー結合部位として利用され得る場合があることが理解されよう。プライマー結合部位について上に例示したものと同様の方法を使用して、ＲＮＡポリメラーゼに基づく伸長のためのプロモーター要素やタグ配列などの他の所望の配列要素を導入することができる。
【００４６】
ユニバーサルプライミング部位は本明細書に記載の方法の多重適用に特に有用である。ユニバーサルプライミング部位は、２つ以上の核酸分子に共通の配列領域を提供し、該核酸分子はまた、異なる配列を有するテンプレート領域または標的領域を有する。分子群内の複数の異なるメンバーに存在する１つのユニバーサルプライミング配列によれば、ユニバーサルプライミング配列に相補的な単一のユニバーサルプライマー種を用いて、複数の異なる配列の複製、増幅または検出が可能となる。したがって、ユニバーサルプライマーはユニバーサルプライミング配列に特異的にハイブリダイズ可能な配列を含む。ユニバーサル配列を標的核酸の群に付着させる方法の例は、参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００７／０１２８６２４Ａ１号明細書に見出される。
【００４７】
一部の実施形態では、標的核酸は、１つ以上のより大きな核酸の断片として得ることができる。断片化は、噴霧化、超音波処理、化学切断、酵素切断、物理的せん断などの当該分野で公知の様々な技術を用いて行うことができる。フラグメント化はまた、より大きな核酸の一部のみをコピーすることによってアンプリコンを生成する特定の増幅技術を使用することにより起こり得る。例えば、ＰＣＲ増幅は、増幅のために使用されるプライマーで挟まれたフラグメントの長さによって規定されるサイズのフラグメントを生成する。
【００４８】
標的核酸またはそのアンプリコンの集団は、本明細書に記載の方法または組成物の特定の用途に望ましいかまたは適切である平均鎖長を有し得る。例えば、平均鎖長は、約１００，０００ヌクレオチド、約５０，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、または約５０ヌクレオチド未満であり得る。代替的または追加的に、平均鎖長は、約１０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、約５０，０００ヌクレオチド、または約１００，０００ヌクレオチド超であり得る。標的核酸またはそのアンプリコンの集団の平均鎖長は、上記の最大値と最小値との間の範囲であり得る。増幅部位で生成される（あるいは本明細書で作製または使用される）アンプリコンは、上で例示したものから選択される上限および下限の間の範囲にある平均鎖長を有し得ることが理解されよう。
【００４９】
標的核酸の集団は、メンバーの長さを最大とするように作製または構成され得ることがある。例えば、本明細書に記載されるように作製または使用されるメンバーの最大長は、約１００，０００ヌクレオチド、約５０，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、または約５０ヌクレオチド未満であり得る。代替的または追加的に、標的核酸またはそのアンプリコンの集団は、メンバーの長さを最小とする条件または他の方法で作製され得る。例えば、本明細書に記載の方法の１つまたは複数の工程で使用されるかまたは特定の組成物に存在するメンバーの最小長は、約１０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約１，０００ヌクレオチド、約５，０００ヌクレオチド、約１０，０００ヌクレオチド、約５０，０００ヌクレオチド、または約１００，０００ヌクレオチド超であり得る。集団中の標的核酸の最大及び最小鎖長は、上記の最大値と最小値との間の範囲であり得る。アレイのある１つの部位で生成される（あるいは本明細書で作製または使用される）アンプリコンは、上で例示した上限と下限との間の範囲で最大および／または最小の鎖長を有することができることが理解されよう。
【００５０】
様々な既知の増幅技術を用いて、本明細書に記載の方法で使用するために存在するテンプレート配列の量を増加させることができる。例示的な技術としては、限定されないが、テンプレート配列を有する核酸分子の、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）またはランダムプライム増幅（ＲＰＡ）が含まれる。本明細書に記載の方法または組成物で使用する前の標的核酸の増幅は任意であることが理解されるであろう。そのため、本明細書に記載の方法および組成物の一部の実施形態において、標的核酸は使用前に増幅されない。標的核酸は、任意で合成ライブラリーから得ることができる。合成核酸は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ組成物を有するか、またはそれらの類似体であり得る。また、固相増幅法も使用することができ、これには、例えば、クラスター増幅、ブリッジ増幅、またはアレイベースの方法の文脈において以下に記載される他の方法が含まれる。
【００５１】
本明細書に記載の方法で使用される核酸は溶液相または固相であり得る。溶液相の核酸は一般的に可溶性であるが、染色体や核酸ナノボールなどの一部の大型の核酸種の場合と同様、沈殿可能な懸濁形態であってもよい（例えば、参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００７／００９９２０８Ａ１号明細書を参照）。固相である核酸は、固相支持体中または固相支持体上に存在し得る。例示的な固相支持体としては、ガラス、ニトロセルロース、シリカ、金属、プラスチックや、例えばアレイ・フォーマットおよびフローセルに関して本明細書の他の場所に記載された他の材料からなるものが挙げられる。同様に、核酸はゲルなどの半固体支持体中または半固体支持体中上に存在し得る。例示的な有用なゲルとしては、限定されないが、アガロースなどのコロイド構造を有するもの；ゼラチンなどのポリマーメッシュ構造を有するもの；ポリアクリルアミドなどの架橋ポリマー構造を有するものが挙げられる。ヒドロゲルが特に有用であり、例えば、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５Ａ１号明細書および米国特許第９，０１２，０２２号明細書に記載されている。
【００５２】
核酸の支持体（剛性・半剛性のものを問わず）への付着は１または２以上の共有結合または非共有結合を介して起こり得る。結合の例は、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第６，７３７，２３６号明細書、同第７，２５９，２５８号明細書、同第７，３７５，２３４号明細書、同第７，４２７，６７８号明細書、および米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５Ａ１号明細書に記載されている。一部の実施形態では、核酸または他の反応成分は、固相支持体に付着または接着させたゲルまたは他の半固体支持体に付着され得る。このような実施形態では、核酸または他の反応成分は固相であると理解される。
【００５３】
多重反応は固相支持体（固体支持体としても知られている）を利用することができる。固相支持体は個々の反応を分離するのに有用であり、各反応を独立してまたは個別に調べることができる。例えば、混合物中の数種類の核酸を固相支持体に付着させることができる。これらの核酸はアレイ・フォーマットで固相支持体に付着させることができる。
【００５４】
一部の実施形態では、各部位が第１の核酸テンプレートおよび第２の核酸テンプレートを含み、第１の核酸テンプレートの配列が第２の核酸テンプレートの配列とは異なる、複数の部位のアレイが提供される。また一部の実施形態では、部位１つにつき３つ以上の異なるテンプレートが存在し得る。本明細書で使用するために改変可能な例示的なアレイ材料および製造方法としては、限定されないが、イルミナ（Ｒ）社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なＢｅａｄＣｈｉｐ  Ａｒｒａｙや、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第６，２６６，４５９号明細書、同第６，３５５，４３１号明細書、同第６，７７０，４４１号明細書、同６，８５９，５７０号明細書または同第７，６２２，２９４号明細書、あるいは国際公開第００／６３４３７号公報に記載されたアレイが挙げられる。使用可能な市販のアレイの更なる例には、例えば、ＶＬＳＩＰＳ（ＴＭ）（Ｖｅｒｙ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；超大規模固定化ポリマー合成）技術とも呼ばれる技術に従って合成されるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｒ）  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｒ）アレイまたは他のアレイが含まれる。一部の実施形態によれば、スポットアレイも使用することができる。例示的なスポットアレイは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可能なＣｏｄｅＬｉｎｋ（ＴＭ）アレイである。有用な別のアレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能なＳｕｒｅＰｒｉｎｔ（ＴＭ）技術などのインクジェット印刷方法を使用して製造されるアレイである。
【００５５】
複数の異なるテンプレート核酸配列を含むように部位を修飾すること等によって使用可能な他の有用なアレイには、核酸シーケンシング用途に使用されるものが含まれる。例えば、それぞれ参照により本明細書に援用するＢｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９（２００８）、国際公開第０４／０１８４９７号公報、同第９１／０６６７８号公報、同第０７／１２３７４４号公報；米国特許第７，０５７，０２６号明細書、同第７，３２９，４９２号明細書、同第７，２１１，４１４号明細書、同第７，３１５，０１９号明細書、同第７，４０５，２８１号明細書；米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２Ａ１などに記載されている、ゲノムフラグメントのアンプリコン（クラスターと呼ばれることが多い）を有するアレイが特に有用である。
【００５６】
核酸のクラスターは固相増幅法によって作製することができる。例えば、検出対象である１つ以上のテンプレート配列を有する核酸を表面に付着させ、ブリッジ増幅を用いて増幅することができる。有用なブリッジ増幅方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第第５，６４１，６５８号明細書、同第７，１１５，４００号明細書；または米国特許出願公開第２００５１００１００Ａ１号明細書、同第２００４／００９６８５３Ａ１号明細書、同第２００４／０００２０９０Ａ１号明細書、同第２００７／０１２８６２４Ａ１号明細書、同第２００８／０００９４２０Ａ１号明細書に記載されている。表面上の核酸を増幅するための別の有用な方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に援用するＬｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５−２３２（１９９８）および米国特許出願公開第２００７／００９９２０８Ａ１号明細書に記載されているローリングサークル増幅（ＲＣＡ）である。有用な別のタイプのアレイは、エマルジョンＰＣＲ増幅技術で製造された粒子のアレイであり、その例は、それぞれ参照により本明細書に援用するＤｒｅｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００：８８１７−８８２２  （２００３）、国際公開第０５／０１０１４５号公報、米国特許出願公開第２００５／０１３０１７３Ａ１号明細書、同２００５／００６４４６０Ａ１号明細書に記載されている。上記各種アレイはシーケンシング用途について記載されているものであるが、例えば、非サイクルプライマー伸長技術を使用する実施形態などの他の実施形態で使用され得ることが理解されよう。
【００５７】
検出は、アレイ上で、集団（アンサンブル）でまたは単一分子レベルで行うことができる。集団レベルの検出は、単一のテンプレート配列の数個のコピー（例えば、テンプレートの複数のアンプリコン）が各個々の部位で検出され、当該部位の個々のコピーが互いに区別されない態様での検出である。したがって、集団検出は、当該部位における１つの特定のテンプレート配列の多数のコピーからの平均シグナルを提供する。例えば、当該部位は１つの特定のテンプレート配列の少なくとも１０個、１００個、１０００個またはそれ以上の個数のコピーを含み得る。もちろん、１つの部位は、それぞれが集団として存在する、複数の異なるテンプレート配列を含み得る。あるいは、単一分子レベルでの検出は、個々の複数のテンプレート配列が、アレイ上で、それぞれ異なる部位において、個々に分離される態様での検出を含む。したがって、単一分子検出は個々の１つの分子からのシグナルを提供し、このシグナルは当該１つの分子が存在する分子集団から生じ得る１つ以上のシグナルとは区別されるものである。もちろん、単一分子アレイであっても、１つの部位は、数種類のテンプレート配列（例えば、単一の核酸分子に沿って位置する２つ以上のテンプレート配列領域）を含むことができる。
【００５８】
部位のアレイはスポットまたはパッチの格子（グリッド）のように見え得る。これらの部位は反復パターンまたは不規則な非反復パターンで配置され得る。特に有用なパターンは、六角形パターン、直線パターン、格子パターン、反射対称性を有するパターン、回転対称性を有するパターンなどである。非対称パターンもまた有用であり得る。
【００５９】
アレイ中の部位のサイズおよび／または間隔を変えて、高密度、中密度または低密度とすることができる。高密度アレイは、ピッチが約１５μｍ未満である部位を有するという特徴を有する。中密度アレイはピッチが約１５〜３０μｍの部位を、低密度アレイはピッチが３０μｍ超である部位を有する。一部の実施形態で有用なアレイは、ピッチが１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍまたは０．５μｍ未満の部位を有し得る。本明細書に記載の方法の一実施形態を使用して、上記の密度または密度範囲で部位を区別するのに十分な解像度でアレイを画像化することができる。しかしながら、検出工程は、典型的には、１つの個別の部位において、第１のテンプレート（またはそれにハイブリダイズした第１のプライマー伸長生成物）と第２のテンプレート（またはそれにハイブリダイズした第２のプライマー伸長生成物）との間の間隔に等しい距離で点同士を分離（解像）するには空間分解能が低すぎる検出器を使用する。特定の実施形態では、アレイの各部位は、約１００ｎｍ２、約２５０ｎｍ２、約５００ｎｍ２、約１μｍ２、約２．５μｍ２、約５μｍ２、約１０μｍ２、約１００μｍ２、または約５００μｍ２よりも大きい面積を有し得る。代替的または追加的に、アレイの各部位は、約１ｍｍ２、約５００μｍ２、約１００μｍ２、約２５μｍ２、約１０μｍ２、約５μｍ２、約１μｍ２、約５００ｎｍ２、または約１００ｎｍ２よりも小さい面積を有し得る。実際には、１つの部位は、上に例示したもの中から選択される上限と下限との間の範囲のサイズを有し得る。
【００６０】
本明細書に記載の方法は、例えば、少なくとも約１０個／ｃｍ２、約１００個／ｃｍ２、約５００個／ｃｍ２、約１，０００個／ｃｍ２、約５，０００個／ｃｍ２、約１０，０００個／ｃｍ２、約５０，０００個／ｃｍ２、約１００，０００個／ｃｍ２、約１，０００，０００個／ｃｍ２、約５，０００，０００個／ｃｍ２、またはそれ以上の任意の濃度で部位を有するアレイを使用し得る。
【００６１】
一般的に、１つのアレイは、核酸配列の内容がそれぞれ異なる複数の部位を有する。したがって、１つのアレイ中の各部位は、当該アレイ中の他の全ての部位の核酸配列に対して固有である核酸配列を含み得る。しかしながら、場合によっては、アレイは、２つ以上の部位が同じ核酸内容を有するような冗長性を有し得る。
【００６２】
本明細書に記載の方法の各工程は、アレイの１つの部位全体または複数の部位を処理に曝露するように行うことができることが理解されよう。例えば、プライマーの伸長を含む工程は、アレイの各部位おける複数の核酸（例えば、混合物中の異なる核酸）がプライマー伸長試薬と接触するように、プライマー伸長試薬をアレイに送達することにより実施され得る。同様に、ブロックされたプライマー伸長産物を脱ブロッキングする工程は、アレイの各部位おける複数の核酸（例えば、混合物中の異なる核酸）が脱ブロッキング処理と接触するように、アレイを脱ブロッキング処理に暴露することにより実施され得る。
【００６３】
合成によるシーケンシングまたは他のプライマー伸長反応における任意の所定の点において、第１のテンプレート中にプライマー伸長部位と相補的な位置で存在するヌクレオチド種は、第２のテンプレート中にプライマー伸長部位と相補的な位置で存在するヌクレオチド種と同一であり得る。言い換えると、アレイの１つの特定の部位における第１の核酸テンプレートは、当該特定の部位における第２の核酸テンプレートの塩基部分と同じ種である少なくとも１つの塩基部分を含み、相補的なヌクレオチド類似体が、これらの塩基部分が存在するこれらのテンプレートのそれぞれ位置において、それぞれのプライマーに付加され得る。これは、プライマーがハイブリダイズされるテンプレート配列同士が同一であるかまたは異なっているかどうかの場合であり得る。以下で更に詳細に説明する技術、例えば、相互に区別可能な標識を有するヌクレオチド類似体の異なるセットなどを用いて、２つのテンプレートを区別することができる。
【００６４】
生物系から単離したタンパク質酵素およびその機能的変異体を含む、様々な任意のポリメラーゼが本明細書に記載の方法または組成物において使用され得る。以下に例示するポリメラーゼなどの特定のポリメラーゼへの言及は、他に示されない限り、それらの機能的変異体を含むと理解される。ポリメラーゼの特に有用な機能は、存在する核酸をテンプレートとして用いて核酸鎖の重合を触媒することである。有用な他の機能は本明細書の他の箇所に記載されている。有用なポリメラーゼの例としては、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、およびＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００６５】
一部の実施形態では、内因性の３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが有用であり得る。３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くポリメラーゼもまた、一部の実施形態、例えば大部分のシーケンシングの実施形態で有用である。エキソヌクレアーゼ活性の欠如は、野生型の特徴であるか、またはポリメラーゼ構造の変異体もしくは改変体によって付与される特徴であり得る。例えば、ｅｘｏ  ｍｉｎｕｓ  Ｋｌｅｎｏｗ断片は、３’→５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を欠くＫｌｅｎｏｗ断片の突然変異バージョンである。
【００６６】
使用する実施形態に依存して、ポリメラーゼは好熱性または熱不活性化可能であり得る。好熱性ポリメラーゼは、一般的に、高温条件またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術に使用される熱サイクル条件下で有用である。好熱性ポリメラーゼの例としては、限定されないが、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＢ６９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＶｅｎｔＲ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。非好熱性生物から単離された大部分のポリメラーゼは熱不活性化することができ、ファージ由来のＤＮＡポリメラーゼがその例である。任意の様々な供給源に由来するポリメラーゼを改変して、高温条件に対する耐性を上昇または低下させることができることが理解されるであろう。標識および／または可逆的な停止部分を有するヌクレオチド類似体の取り込みに特に有用なポリメラーゼは、参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００６／０２８１１０９Ａ１号明細書に記載されている。
【００６７】
本明細書に記載の方法および組成物の特定の実施形態では単一種のポリメラーゼのみが使用される。そのような例では、アレイの各部位は、複数のポリメラーゼが当該部位に存在して各部位において複数のプライマー結合テンプレートに結合しうる場合であっても、所与の時間において１種類のみのポリメラーゼと相互作用する。例えば、１つのアレイの全ての部位はＤＮＡポリメラーゼの特定の種と相互作用し得、他のポリメラーゼ（例えばＲＮＡポリメラーゼ）はアレイに存在しない。
【００６８】
本明細書に記載の方法または組成物で使用するために改変することができる別の伸長技術は、上記ポリメラーゼ系伸長システムによって取り込まれるモノマーヌクレオチドの代わりにオリゴヌクレオチドを選択的に取り込むリガーゼ系システムである。第１の脱ブロッキング処理によって選択的に脱ブロックされる可逆的ブロッキング部分を有するオリゴヌクレオチドの第１のセットを使用するＤＮＡリガーゼ試薬系は、第２の脱ブロッキング処理で選択的に脱ブロックされる可逆的ブロッキング部分を有するオリゴヌクレオチドの第２のセットを使用する試薬システムに対してオルトゴナルである。可逆的にブロックされたオリゴヌクレオチドで伸長されたプライマーの脱ブロッキングは、可逆的にブロックされたヌクレオチド類似体で伸長されたプライマーの脱ブロッキングについて本明細書で例示したオルトゴナル様式と全く同様に行うことができる。ライゲーションによる伸長は、１塩基または２塩基のエンコードスキームを有する部分的にランダムなプローブオリゴヌクレオチドの集団を用いたシーケンシング用途で行うことができる。例えばシーケンシングについて本明細書での使用のために改変することができるライゲーション系伸長技術は、それぞれ参照により本明細書に援用するＭｃＫｅｒｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９  （９）：１５２７-４１  （２００９）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１７２８−１７３２  （２００５）；米国特許第５，５９９，６７５号明細書、同５，７５０，３４１号明細書に記載されている。
【００６９】
本明細書に記載の方法を用いて実施される核酸伸長反応または他のサイクル反応は、１サイクル以上進行することができる。特定の実施形態では、多サイクル反応は、少なくとも２サイクル、５サイクル、１０サイクル、５０サイクル、１００サイクル、５００サイクル、１，０００サイクル、５，０００サイクル、１０，０００サイクル以上を含み得る。代替的または追加的に、上記反応には上限があり、１サイクル、２サイクル、５サイクル、１０サイクル、５０サイクル、１００サイクル、５００サイクル、１，０００サイクル、５，０００サイクル、または１０，０００サイクルを超えない。一部の実施形態では、各サイクルで伸長プライマーに単一のヌクレオチド類似体が取り込まれる。この場合、上記で例示したサイクルの最小数または最大数は、ポリメラーゼ触媒反応において伸長産物に取り込まれるヌクレオチドの最小数または最大数を例示するものであることが理解できる。
【００７０】
一部の実施形態では、一塩基伸長（ｓｉｎｇｌｅ  ｂａｓｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；ＳＢＥ）反応や対立遺伝子特異的プライマー伸長（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ；ＡＳＰＥ）反応などの非サイクル伸長反応を使用することができる。可逆的ターミネーター部分を用いることにより、非サイクル伸長様式で２つの異なるプライマーをオルトゴナルに伸長させることができる。脱ブロッキング工程は、これらの非サイクル反応の継続には必要ではないため（すなわち、一旦プライマーが伸長されたら）、伸長工程で使用されるヌクレオチド類似体は、代わりに、非可逆的にターミネートさせることができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドを使用することができる。ＳＢＥ、ＡＳＰＥおよび他の有用な非サイクル伸長技術用の試薬や関連技術の例は、例えば、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第７，６７０，８１０号明細書、米国特許出願公開第２００３／０１０８８６７号明細書、同第２００３／０１０８９００号明細書、同第２００３／０１７０６８４号明細書、同第２００３／０２０７２９５号明細書、同第２００５／０１８１３９４号明細書に記載されている。非サイクル伸長技術を使用し、かつ本明細書に記載のオルトゴナルな検出方法によって情報量を増加させるように改変することができる市販の製品の例は、イルミナ（Ｒ）社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なＩｎｆｉｎｉｕｍ（Ｒ）ジェノタイピング製品である。
【００７１】
サイクル反応および非サイクル反応は同様に、反応成分を互いに分離するかまたは反応環境から除去する工程を含むことができる。例えば固相成分を液相成分から分離することにより、１つ以上の反応成分を分離することができる。１つ以上固相成分から望ましくない１つ以上の液相成分をより完全に除去するために、任意で洗浄工程を行うことができる。このような分離用の特に有用な反応容器はサイクルシーケンシング手順で一般的に使用されるようなフローセルである。例示的なフローセル、その製造方法およびその使用方法は、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８Ａ１号明細書、同第２０１２／０２７０３０５Ａ１号明細書、国際公開第０５／０６５８１４号公報に記載されている。固相分離法が使用されるか否かにかかわらず、反応成分は、液体−液体抽出、固相抽出、クロマトグラフィー、濾過、遠心分離などの当該技術分野で知られている任意の様々な他の技術によって除去することができる。
【００７２】
可逆的ターミネーター部分は、後続の脱ブロッキング工程が実施されるまでプライマーに単一のヌクレオチドのみを付加して伸長反応を制御する便利な方法を提供する。本明細書で述べるように、オルトゴナルなブロッキング部分および脱ブロッキング処理を使用することにより超解像検出が得られるため、非オルトゴナルな技術よりも複雑なテンプレートのモニタリング・検出が可能となる。可逆的ブロッキング部分およびそれらの脱ブロッキング条件の例としては、限定されないが、ｏ−ニトロベンジルエーテル、アルキルｏ−ニトロベンジルカーボネートなどの３’位から光切断可能に除去可能な部分；塩基加水分解によって除去可能なエステル部分；ＮａＩ、クロロトリメチルシランおよびＮａ２Ｓ２Ｏ３またはアセトン／水中のＨｇ（ＩＩ）で除去可能なアリル部分；トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）またはトリ（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）などのホスフィンで切断することができるアジドメチル（−ＣＨ２−Ｎ３）；酸性条件で切断することができるｔｅｒｔ−ブトキシ−エトキシなどのアセタール類；ＬｉＢＦ４およびＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで切断することができるＭＯＭ（−ＣＨ２ＯＣＨ３）部分；チオフェノールおよびチオスルフェートなどの求核試薬で切断することができる２，４−ジニトロベンゼンスルフェニル；Ａｇ（Ｉ）またはＨｇ（ＩＩ）で切断することができるテトラヒドロフラニルエーテル；およびホスファターゼ酵素（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）によって切断することができる３’ホスフェートが挙げられる。他の有用な可逆的部分としては、エーテル、−Ｆ、−ＮＨ２、−ＯＣＨ３、−Ｎ３、−ＮＨＣＯＣＨ３、および２−ニトロベンゼンカーボネートが挙げられる。有用な脱ブロッキング処理は、（例えば、光切断を誘発するための）光照射、加熱、化学反応物への暴露、触媒への暴露、（例えば、電気分解を誘導するための）電流への曝露などを含む。
【００７３】
本明細書の方法の特定の実施形態は、例えば、合成によるシーケンシングなどのマルチサイクルプロセスなどにおいて、可逆的にブロックされたプライマーおよび可逆的にブロックされたヌクレオチド類似体を使用することができる。前述のとおり、特定の可逆的にブロックされたプライマー、および特定の可逆的にブロックされたヌクレオチド類似体のセットは同じ脱ブロッキング条件の影響を受け易い。これは、同じ種の可逆的ブロッキング部分がプライマーおよびセット中のヌクレオチド類似体に存在するためであると思われる。しかしながら、それでもなお、同じ脱ブロッキング処理の影響を受けやすい複数の異なるブロッキング部分を使用することも可能である。
【００７４】
可逆的ブロッキング部分はプライマーの３’ヌクレオチドに付着させることができる。一般的に、可逆的ブロッキング部分は、リボース糖部分の３’位に付着される。しかしながら、ブロッキング部分は、例えば、リボースの２’位や塩基部分などの別の位置に付着させることもできる。また、プライマーの５’末端、例えば、末端ヌクレオチドのリボースの５’位や５’ホスフェート部分などにブロッキング部分を付着させることもできる。５’末端でブロックされたプライマーは、ライゲーション技術を用いる実施形態で有用であると考えられる。
【００７５】
プライマーの３’または５’末端は光標識などの標識部分に付着され得る。この標識は、可逆的なブロッキング部分もプライマー上にも存在するか否かにかかわらず存在することができる。ある特定の部分は、標識とプライマー伸長に対する可逆的ブロックの両方として機能することができる場合がある。
【００７６】
プライマーについて上に例示した、標識および／または可逆的ブロッキング部分の同じ付着点は個々のヌクレオチドに有用であり得る。
【００７７】
ブロッキング部分および脱ブロッキング処理に関する更なる例示の指針は、例えば、それぞれ参照により本明細書に援用するＢｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９（２００８）；国際公開第０４／０１８４９７号公報、同第９１／０６６７８号公報、同第０７／１２３７４４号公報；米国特許第７，０５７，０２６号明細書、同７，３２９，４９２号明細書、同７，２１１，４１４号明細書、同７，３１５，０１９号明細書、同８，０８８，５７５号明細書、同７，４０５，２８１号明細書；または米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２Ａ１号明細書に記載されている。
【００７８】
本開示に係るオルトゴナルな操作および検出は、２つのテンプレート配列がその長さに方向に沿った全ての位置で異なることを要しない。むしろ、同じ塩基部分が、第１のテンプレートおよび第２のテンプレート上でそれぞれ検出される位置に存在し得る。この２つの位置は、オルトゴナルな試薬システムに存在する標識の識別可能な特性と、適切に脱ブロックされたプライマーを伸長する試薬システムの特異性とに基づいて区別することができる。そして、この情報を使用することにより、２つのテンプレート配列の間隔に等しい距離で点同士を分離（解像）するには分解能が低すぎる検出器を用いて当該２つの位置を同時に検出したとしても、２つの異なるテンプレート配列を区別して検出することができる。
【００７９】
任意の様々な標識を使用することができる。ヌクレオチド類似体を検出する場合に使用される特に有用な標識部分は、その環境中に存在する他の分子と比較して識別可能な特性を提供する、ヌクレオチド類似体の任意の部分であり得る。識別可能な特性は、例えば、放射線の吸収、蛍光発光、ルミネセンス発光、蛍光寿命、蛍光偏光などの光信号；リガンドやレセプターに対する結合親和性；磁気特性；電気的性質；電荷；質量；放射活性などが挙げられる。例示的な標識部分としては、限定されないが、フルオロフォア、発光団、発色団、放射性同位体、質量標識、電荷標識、スピン標識、レセプター、リガンドなどが挙げられる。標識部分は、核酸ポリマー中に存在するモノマー単位であるヌクレオチドの一部、または、遊離ヌクレオチド類似体（例えば、ヌクレオチド三リン酸）の一部であり得る。
【００８０】
フルオロフォアが特に有用であり、例えば、蛍光ナノクリスタル、量子ドット、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、スチルベン、ルシファーイエロー、カスケードブルー、テキサスレッド、Ａｌｅｘａ色素、ＳＥＴＡ色素、ＡＴＴＯ色素、フィコエリトリン、Ｂｏｄｉｐｙ、およびそれらの類似体が挙げられる。有用な光学プローブは、それぞれ参照により本明細書に援用するＬａｋｏｗｉｃｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００６）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ，（２００２）；Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  ４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（２００３）；国際公開第９８／５９０６６号公報、同第９１／０６６７８号公報；米国特許出願公開第２０１０／００９２９５７Ａ１号明細書に記載されている。
【００８１】
他の標識（その一部は非光標識である）も本明細書に記載の方法および組成物の様々な実施形態において使用することができる。その例としては、限定されないが、天然に豊富に存在しない放射性または重同位体などの同位体標識；磁性物質；金属などの電子豊富な材料；Ｒｕ（ｂｐｙ）３２＋などの電気化学発光標識；核磁気特性、常磁特性、電気特性、質量対電荷特性、または熱特性に基づいて検出可能な部分が挙げられる。また、標識は磁性粒子または光学的にコードされたナノ粒子を含み得る。そのような標識は、当業者に知られている適切な方法を用いて検出することができる。例えば、帯電した標識は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（コネチカット州、ギルフォード、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販のシーケンシング・システムで使用されている電気検出器や、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００９／００２６０８２Ａ１号明細書；同第２００９／０１２７５８９Ａ１号明細書；同第２０１０／０１３７１４３Ａ１号明細書；または同第２０１０／０２８２６１７Ａ１号明細書に記載されている検出システムを用いて検出することができる。一部の実施形態では、ヌクレオチド類似体は、本明細書に記載される標識１つ以上欠いていてもよいことが理解されよう。
【００８２】
標識部分は種々の方法でヌクレオチド類似体に付着させることができる。ヌクレオチド類似体に有用な例示的なアタッチメントおよび標識組成物は、それぞれ参照により本明細書に援用するＢｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９（２００８）；国際公開第０４／０１８４９７号公報、同第９１／０６６７８号公報、同第０７／１２３７４４号公報；米国特許第７，０５７，０２６号明細書、同第７，３２９，４９２号明細書、同第７，２１１，４１４号明細書、同第７，３１５，０１９号明細書、同第８，０８８，５７５号明細書、同第７，４０５，２８１号明細書；米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２Ａ１号明細書に記載されている。
【００８３】
本明細書に記載の方法の検出工程は、使用する特定の標識に適した装置を使用して本開示の方法で行うことができる。例えば、蛍光検出器、吸光度検出器、ルミネセンス検出器などの光学検出器を使用して、適切な光標識を検出することができる。アレイベースの検出用に設計されたシステムは特に有用である。例えば、本明細書に記載の方法で使用するための光学システムは、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第８，２４１，５７３号明細書；同第７，３２９，８６０号明細書；同第８，０３９，８１７号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２７２９１４Ａ１号明細書；同第２０１２／０２７０３０５Ａ１号明細書に記載されている様々なコンポーネントおよびアセンブリを含むように構成され得る。
【００８４】
合成によるシーケンシングに使用されるシステムなどのオルトゴナルな検出システムは、複数の異なる標識を使用して各プライマーに付加される複数の異なるヌクレオチドを区別することができる。一実施形態では、各ヌクレオチド種は、当該ヌクレオチド種を識別するための固有のシグナルを生成する固有の光標識を有する。一例は８種色素アプローチである。この例では、４つの異なるヌクレオチド類似体の第１のセットは、それぞれ、当該４つの異なるヌクレオチド類似体のそれぞれを互いに区別する異なる蛍光色素を有し、ここで、第１のセットの４つの異なるヌクレオチド類似体は第１の処理により選択的に脱ブロック可能なブロッキング部分を有する。４つの異なるヌクレオチド類似体の第２のセットは、それぞれ、当該４つの異なるヌクレオチド類似体のそれぞれを互いに区別する異なる蛍光色素を有し、ここで、第２のセットの４つの異なるヌクレオチド類似体は第２の処理により選択的に脱ブロック可能なブロッキング部分を有する。この場合、第１の処理は第１のセットのヌクレオチドのブロック部分に対して選択的であり、第２の処理は第２のセットのヌクレオチドのブロック部分に対して選択的である。この色素の２つのセットは、８つの色素がそれぞれ８つの区別可能な信号を生成するように固有である。
【００８５】
上記８種色素アプローチなど、ヌクレオチド類似体の全てが識別可能に標識されている実施形態では、一対のテンプレート配列を全てのヌクレオチド類似体と接触させ、その後検出を行うことができる。ここで、固有の光標識によって全てのヌクレオチド類似体を区別できることにより、流体操作が比較的単純になるという利点が得られ、それにより、全てのヌクレオチド類似体が同時に存在するようにテンプレート配列へ当該ヌクレオチド類似体を送達できる。比較的簡単で好ましい一実施形態では、８種全てのヌクレオチド類似体が同時に送達されるが、必要に応じて、１つ以上サブセットが順次送達され得る。検出は、ヌクレオチド類似体を送達している間、またはその後に行うことができる。この比較的単純な流体プロセスは、全ての異なる信号を区別できる比較的複雑な検出装置により対応できる。例えば、８種類の異なる蛍光シグナルを区別できる蛍光検出システムを８種色素アプローチに使用することができる。当業者はこの種のシグナル差別化の適切な蛍光検出装置を知ることができ、あるいは決定することができる。例えば、蛍光標識の励起および発光特性を、生成された励起波長および蛍光光度計で検出された発光波長の組み合わせと適切にマッチさせることができる。多波長蛍光検出に有用な光学系および標識の例示的な指針は、それぞれ参照により本明細書に援用するＬａｋｏｗｉｃｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００６）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ９ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ，（２００２）；Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（２００３）に記載されている。
【００８６】
全てのヌクレオチドが識別可能に標識されている系について上に例示した原理は、容易にアレイ・フォーマットに拡張することができる。十分な数かつ種類の異なるテンプレート配列を有するアレイは、プライマー伸長反応系で処理した場合に全ての標識ヌクレオチドを取り込むことが期待される。より具体的には、アレイの部位全体に広範な種類の核酸を有し、かつ部位１つ当たり２つの異なるテンプレートを有するアレイベースのアプローチでは、８種全てのヌクレオチドをアレイに送達したプライマー伸長サイクルの後、全ての可能な２色素の色素コンビネーションがアレイ上に生じると予想される。これらの部位は、当該分野で公知の光学デバイス、例えば、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第８，２４１，５７３号明細書；同第７，３２９，８６０号明細書；同第８，０３９，８１７号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２７２９１４Ａ１号明細書；同第第２０１２／０２７０３０５Ａ１号明細書に記載されている光学デバイスを使用して空間的に区別され得る。このような検出システムは、上述したような８色蛍光検出に対応するように容易に改変することができる。このように改変された検出システムは、それぞれが異なる配列組成を有する複数の部位で２つの異なるテンプレートが（例えばシーケンシングで）区別されるように、多重のオルトゴナル検出が可能である。
【００８７】
一部の実施形態では、特定の方法で区別される異なるシグナルの数は、当該方法で使用される異なるヌクレオチド類似体種の数よりも少ない。例えば、複数の異なるヌクレオチド類似体種は同じ標識を有し、かつ／またはヌクレオチド種のサブセットは非標識とされ得る。複数の異なるヌクレオチド種に対して同じ標識を使用する構成の例は、４つの異なるヌクレオチド類似体の第１のセットが共通の第１の標識を共有し第１の選択的脱ブロッキング処理の影響を受ける一方、４つの異なるヌクレオチド類似体の第２のセットが共通の第２の標識を共有し第２の脱ブロッキング処理の影響を受ける、オルトゴナルなプライマー伸長法の場合である。この例では、第１の標識は第２の標識と光学的に区別可能であり、第１の処理はヌクレオチド類似体の第１のセットに対して選択的であり、第２の処理はヌクレオチド類似体の第２のセットに対して選択的である。この構成では、第１セット中の４つの異なるヌクレオチドは、送達・検出の連続サイクル（すなわち、異なるヌクレオチド類似体のそれぞれについての別個のサイクル）で互いに区別できる。この例では、第１の標識および第２の標識が識別可能である限り、４回の送達・検出サイクルにおいて、これらの２セットのヌクレオチドのメンバーをペア（第１のセットからの１つのヌクレオチド種と、第２のセットからの１つのヌクレオチド種の各１つ）で送達することができる。このように、プライマー伸長反応で使用されるヌクレオチド類似体の第１のセットのメンバーは、検出される光標識を１種類のみ含むことができ、第１のセットに対してオルトゴナルなヌクレオチド類似体の第２のセットもまた、検出される光標識を１種類のみ含むことができ、ここで、第１のセットで使用される標識は、第２のセットで使用される標識と光学的に区別可能なものである。
【００８８】
グレースケール化により、同じ標識を有する複数の異なるヌクレオチド類似体種を使用することができるようになる。ここで、異なるヌクレオチド類似体種は検出される標識シグナルの強度に基づいてそれぞれ区別することができる。例えば、各ヌクレオチド類似体種は、その標識および未標識ヌクレオチド類似体を固有の比率で含む混合物として送達され得る。各ヌクレオチド類似体種について標識体：未標識体の比が変動し、各混合物について固有にグレースケール化されたシグナル出力が得られる。より具体的な例として、第１のヌクレオチド類似体は完全に標識（未標識の第１のヌクレオチド類似体を混合しない）され；第２のヌクレオチド類似体は７５％標識（７５％標識および２５％未標識のミックス）され；第３のヌクレオチド類似体は５０％標識（５０％標識および５０％未標識のミックス）され；そして、第４のヌクレオチド類似体は２５％標識（２５％標識および７５％未標識のミックス）され得る。これらの４つのヌクレオチド類似体種は得られるシグナル強度の差に基づいて区別することができる。これにより、（例えば、ある１つのアレイ部位における）適切に脱ブロックされたプライマーの集団は、第１のヌクレオチド類似体の取り込みにより完全なシグナルを、第２のヌクレオチド類似体の取り込みにより７５％のシグナルを、第３のヌクレオチド類似体の取り込みにより５０％のシグナルを、そして、第４のヌクレオチド類似体の取り込みにより２５％のシグナルを、それぞれ生成する。
【００８９】
特定の実施形態では、ヌクレオチド類似体種の少なくとも１つが完全に未標識とされ得る。したがって、光標識がヌクレオチド類似体のセット中の他の全てのヌクレオチド類似体に存在する場合、「暗い」ヌクレオチド類似体も存在し得る。暗い（標識されていない）ヌクレオチド類似体を取り込むプライマーの伸長は、当該セット中の他の全てのヌクレオチド類似体が伸長反応によって取り込まれた場合に予想される標識が存在しないことに基づいた推測により決定することができる。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載のプライマー伸長反応で使用されるヌクレオチド類似体のサブセットのみが標識を有する必要がある。
【００９０】
完全に未標識のヌクレオチド類似体種の使用をグレースケール化と組み合わせることができる。例えば、セット（すなわち、共通の処理によって脱ブロックされ得るセット）中の４つの異なるヌクレオチド類似体種のうちの３つは、識別可能な非ゼロ量の特定の標識（例えば、混合物中の標識ヌクレオチド類似体と非標識ヌクレオチド類似体との比）を有し、第４のヌクレオチド類似体種は当該標識を欠くことができる。代替的にまたは追加的に、いくつかの光学的に区別可能な標識の使用とグレースケール化とを組み合わせることができる。例えば、いくつかのヌクレオチド類似体種は、伸長反応中、同じタイプのヌクレオチドではあるが異なる標識を有するヌクレオチドの混合物とされ得る。このような構成はそれぞれ参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２Ａ１号明細書または同第２０１５／００３１５６０Ａ１号明細書に記載されている。
【００９１】
複数の異なる標識、グレースケール化および／または非標識種を使用することに代えて、またはそれに加えて、本明細書に記載の一実施形態は、所定の処理により標識が得られるかまたは無くなる、リガンド、切断可能なリンカーまたは他の部分を使用することができる。このタイプの試薬システムは米国特許出願公開第２０１３／００７９２３２Ａ１号明細書または同第２０１５／００３１５６０Ａ１号明細書に記載されており、これらの文献中、いくつかのヌクレオチド類似体種は、当初は検出されないが適切に標識されたレセプターで処理後に出現するシグナルに基づいて他のヌクレオチド類似体と区別可能にするリガンドを有する。また、これらの文献では、（例えば、標識とヌクレオチド部分との間のリンカーを化学的に切断して）標識を改変する試薬で処理することによりその後に失われるかまたは少なくとも減衰する当初検出可能なシグナルに基づいて区別可能なヌクレオチド類似体を使用することが記載されている。この場合、セット中の他の全てのヌクレオチド類似体種は改変の影響を受けず（例えば、切断可能なリンカーを欠いている）、処置後のシグナル生成の持続性に基づいて区別される。
【００９２】
上述したとおり、一部の実施形態では、切断可能なリンカーを介して標識をヌクレオチド類似体に付着させることができる。特定の実施形態では、前述の化学的に切断可能なリンカーの代わりに光切断可能なリンカーを使用することができる。一部の実施形態では、リンカーは、酸不安定性リンカー（ジアルコキシベンジルリンカー、Ｓｉｅｂｅｒリンカー、インドールリンカー、ｔ−ブチルＳｉｅｂｅｒリンカーを含む）、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光切断可能なリンカー、還元条件または酸化条件下で切断されるリンカー条件、安全キャッチリンカー、および除去機構によって切断されるリンカーから選択される。そのようないくつかの実施形態において、リンカーは、ジスルフィドリンカー（−Ｓ−Ｓ−）、エステル、ニトロベンゼン、イミン、酵素的にまたは化学的に切断可能なペプチド、およびポリヌクレオチド、例えばＤＮＡから選択される。
【００９３】
一部の実施形態では、プライマー伸長反応において使用されるヌクレオチド類似体（例えば、第１の共通の処理によって選択的に脱ブロックされるヌクレオチド類似体）の第１のセットのメンバーは、検出される光標識を１種類のみ含み、第１のセットに対してオルトゴナルなヌクレオチド類似体（例えば、第２の共通処理により選択的に脱ブロックされたヌクレオチド類似体）の第２のセットもまた、検出される光標識を１種類のみ含み、ここで、第１のセットで使用される標識は、第２のセットで使用される標識と光学的に区別される。この実施形態では、１種類の光標識が第１のセットにおける第１の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てに付着することができ；１種類の光標識が第１のセットにおける第２の種のヌクレオチド類似体のサブセットに付着することができ；第１のセットにおける第３の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てがリガンドに付着することができ；そして、第１のセットにおける第４の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てが１種類の光標識にもリガンドにも付着しない。
【００９４】
別の一実施形態では、プライマー伸長反応で使用されるヌクレオチド類似体（例えば、第１の共通の処理によって選択的に脱ブロックされるヌクレオチド類似体）の第１のセットのメンバーは、検出される光標識を２種類のみ含み、第１のセットに対してオルトゴナルなヌクレオチド類似体（例えば、第２の共通の処理によって選択的に脱ブロックされるヌクレオチド類似体）の第２のセットもまた、検出される光標識を２種類のみ含む。この実施形態では、２種類の光標識の第１が第１のセットにおける第１の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てに付着することができ；２種類の光標識の第２が第１のセットにおける第２の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てに付着することができ；２種類の光標識の第１および２種類の光標識の第２が第１のセットにおける第３の種のヌクレオチド類似体に付着することができ；そして、第１のセットにおける第４の種のヌクレオチド類似体の実質的に全てが２種類の光標識の第１にも第２にも付着しない。
【００９５】
上記の例から、オルトゴナルな検出システムでは、異なる標識の数を減らすと、テンプレートに結合したプライマーに付加される異なるヌクレオチドの区別に必要な検出装置の複雑さを低減できるという利点が得られることが理解されるであろう。しかしながら、多くの実施形態では、これは、検出工程で使用される流体操作の数を各ヌクレオチド種が固有のラベルを有する場合よりも多くし、流体操作をより複雑にすることにより達成されるものである。本方法の一般的な利点は、当業者が、特定の用途または状況に適するように、標識、流体工程、および検出装置の適切な組み合わせを選択できることである。
【００９６】
上述の実施形態によって例示されるように、場合によっては、プライマー伸長工程中、ある１つの部位において２つ以上の異なる核酸テンプレートにそれぞれハイブリダイズした２つ以上のプライマーを同時に存在させることができる。あるいは、ある１つの部位で２つ以上の異なるテンプレートにそれぞれハイブリダイズした２つのプライマーのうちの第１のプライマーを、当該部位で２つ以上の異なるテンプレートにハイブリダイズした２つ以上のプライマーのうちの第２のプライマーを伸長する前に、当該部位から除去することができる。
【００９７】
さらに、上記工程から生じた２つ以上の異なるプライマー伸長産物を、検出工程中、部位に同時に存在させることができる。あるいは、２つ以上の異なるプライマー伸長産物のうちの第１のプライマー伸長産物を、当該部位で２つ以上の異なるプライマー伸長産物のうちの第２のプライマー伸長産物を検出する前に、当該部位から除去することができる。
【００９８】
さらに、それぞれが異なる可逆的ブロッキング部分を有する２つ以上のプライマー伸長生成物を脱ブロッキング工程中に同時に存在させることができる。脱ブロッキング工程は、少なくとも１つの他の可逆的ブロッキング部分が処理後に保持されるように（あるいは修飾されないように）、異なる可逆的なブロック部分のうちの１つまたはサブセットのみを選択的に除去（あるいは修飾）するように構成することができる。あるいは、例えば脱ブロッキング処理の組み合わせまたはユニバーサルな脱ブロッキング処理を使用して、同時に存在する異なる可逆的ブロッキング部分の全てを除去することができる。さらなる代替として、２つ以上の異なるプライマー伸長産物のうちの第１のプライマー伸長産物を、２つ以上のプライマー伸長産物のうちの第２のプライマー伸長産物を脱ブロッキング処理に供する前に、部位から除去することができる。
【００９９】
本開示は、成分の様々な組合せを含む反応混合物（本明細書中では試薬システムとも呼ばれる）を提供する。いくつかのケースでは、反応成分および成分のいくつかの組み合わせは、先の段落に記載された方法などの例示的な方法の文脈において記載される。反応混合物およびその成分は、本明細書中に例示される方法における使用に限定される必要はないことが理解されるであろう。他の用途も考えられる。したがって、これらの成分を様々な有用な組み合わせで集めて、例えばキットを作ることができる。キットは、本明細書に記載の成分の貯蔵、輸送または商業的取引に有用であり得る。またキットは、任意で、本明細書に記載の方法の１つ以上を実施するための説明書を含むことができる。
【０１００】
特定の実施形態では、本開示は、（ａ）複数の部位のアレイを提供する工程であって、各部位は第１の核酸テンプレートおよび第２の核酸テンプレートを含み、前記第１の核酸テンプレートは前記第２の核酸テンプレートの配列とは異なる配列を有し、第１のプライマーが前記第１の核酸テンプレートに結合し、可逆的ブロッキング部分が前記第１のプライマーに付着しており、第２のプライマーが前記第２の核酸テンプレートに結合し、可逆的ブロッキング部分が前記第２のプライマーに付着しており、前記第１のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分は前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分とは異なる、アレイ提供工程；（ｂ）前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第１のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；（ｃ）可逆的ブロッキング部分に付着している第１のヌクレオチド類似体を付加することにより前記第１のプライマーを伸長する工程；（ｄ）前記第１のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第２のプライマーに付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；（ｅ）可逆的ブロッキング部分に付着している第２のヌクレオチド類似体を付加して前記第２のプライマーを伸長する工程であって、前記第１のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分は前記第２のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分とは異なる、プライマー伸長工程；および、（ｆ）各部位において、前記第１のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体および前記第２のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体を検出することにより、各部位において、前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートのそれぞれ異なる配列を決定する工程を含み得る、核酸テンプレートのシーケンシング方法を提供する。
【０１０１】
一部の実施形態では、上記方法は、（ｇ）前記第２のプライマーに付加された前記第２のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第１のプライマーに付加された前記第１のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；（ｈ）前記工程（ｇ）の後、可逆的ブロッキング部分に付着している第３のヌクレオチド類似体を付加して前記第１のプライマーを伸長する工程；（ｉ）前記第１のプライマーに付加された前記第１のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を保持しつつ、前記第２のプライマーに付加された前記第２のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分を選択的に除去する工程；（ｊ）前記工程（ｉ）の後、可逆的ブロッキング部分に付着している第４のヌクレオチド類似体を付加して前記第２のプライマーを伸長する工程であって、前記第３のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分は前記第４のヌクレオチド類似体に付着している可逆的ブロッキング部分とは異なる、プライマー伸長工程；および、（ｋ）各部位において、工程（ｈ）で前記第１のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体、および、工程（ｊ）で前記第２のプライマーに付加された前記ヌクレオチド類似体を検出することにより、各部位において、前記第１の核酸テンプレートおよび前記第２の核酸テンプレートのそれぞれ異なる配列を決定する工程を含み得る。任意で、前記工程（ｇ）〜（ｋ）が繰り返され得る。
【０１０２】
本開示の上記の実施形態および他の実施形態で示された各工程は、例示された順序に従う必要はないことが理解されるであろう。先の段落の実施形態を例にとると、検出を記載する工程（ｆ）は、工程（ｅ）の後に行う必要はない。むしろ、工程（ｃ）で伸長された第１プライマーは、工程（ｄ）において第２プライマーを伸長する前に検出することができる。一般的に、検出工程は、１つ以上の異なる可逆的ブロッキング部分が除去される前にまたは後に行うことができる。
【０１０３】
他の各工程の順序は上記方法の特定の用途に合わせて変更することができる。同様のステップを異なる順序で実施できる２つの方法の一例は、図１および図２のサイクル図を比較することによって実証される。図１のサイクル図において、それぞれのプライマー伸長生成物上の標識は脱ブロックおよび標識切断の両方を行う前に検出される。各セット内のヌクレオチドについて脱ブロックおよび標識切断が同時に起きるように示されているが、これは、例えば、双方が同じ処理を受けやすかったり、各処理が両立する場合に好都合であり得る。しかしながら、脱ブロックと標識切断を別々に行うことも可能である。図２のサイクル図で例示するように、標識切断と脱ブロックは別々に起こる。この例では、２つの異なる反応（すなわち、Ｒ１およびＲ２）にわたって存在する異なる標識が同時に切断される。これは、例えば、両タイプの標識が同じ処理で切断できるか、または両立する処理で切断できる場合に好都合である。図１のサイクル図と図２のサイクル図を比較すると他の相違点も見える。例えば、図１において、両方の反応（Ｒ１およびＲ２）の伸長生成物の脱ブロックは前のサイクルの検出工程の後に行われるが、図２では、Ｒ２の伸長生成物は前のサイクルの検出ステップの前に脱ブロックされ、Ｒ１の伸長生成物は前のサイクルの検出ステップの後に脱ブロックされる。本明細書に記載された方法で使用することができる、ステップの様々な配置および順序が存在する。当業者は、本明細書に記載の教示および使用される試薬の既知の反応特性に基づいて、望ましい配置および順序を容易に決定することができるであろう。
【０１０４】
さらに、本明細書中で先に例示したように、本明細書に記載の方法の工程は、連続してまたは同時に実施することができる。例えば、異なる可逆的ブロッキング部分の選択除去（例えば、前の段落の工程（ｂ）および工程（ｄ））は、同時にまたは連続して行うことができる。同様に、それぞれの異なる脱ブロック処理で脱ブロックされた異なるプライマーの伸長（例えば、前の段落の工程（ｃ）および工程（ｅ））は、同時にまたは連続して行うことができる。
【０１０５】
ユニバーサルプライミング部位は本明細書に記載の方法の多重適用に特に有用である。ユニバーサルプライミング部位は、２つ以上の核酸分子（テンプレート領域の配列もそれぞれ異なる核酸分子）に共通の配列領域を提供する。分子の一群の複数の異なるメンバーに存在する１つのユニバーサルプライミング配列は、ユニバーサル配列に相補的な単一のユニバーサルプライマー種を用いて、複数の異なる配列の複製、増幅または検出を可能にする。ユニバーサル配列を標的核酸の群に付着させる方法の例は、参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２００７／０１２８６２４Ａ１号明細書に記載されている。
【０１０６】
本開示の実施形態では、第１のプライマーは、ある１つの部位において、第１のテンプレートの第１のユニバーサルプライミング部位に相補的な第１のユニバーサルプライマー配列を有することができる。同一のユニバーサルプライミング部位が、アレイの複数の異なる部位における様々な異なる第１のテンプレートについて存在し得る。そのため、単一種の第１のユニバーサルプライマーを使用して、当該部位において異なる第１のテンプレートを増幅または伸長することができる。続けて、第２のプライマーは、第１のテンプレートも存在する部位で、第２のテンプレートの第２のユニバーサルプライミング部位に相補的な第２のユニバーサルプライマー配列を有することができる。同じ第２のユニバーサルプライミング部位が、アレイの複数の異なる部位における様々な異なる第２のテンプレートについて存在し得る。そのため、単一種の第２のユニバーサルプライマーを用いて、当該部位において異なる第２のテンプレートを増幅または伸長させることができる。
【０１０７】
本明細書に記載のオルトゴナルなシーケンシング方法はペアエンドシーケンシング・アプローチで利用することができる。一般的に、ペアエンドシーケンシングでは、配列長が既知なテンプレート配列領域の２つの末端における配列を決定する。標的核酸試料（例えば、ゲノムＤＮＡ試料）を断片化し、ペアエンドリードに対応するプライマーを付着させ、断片の末端から配列を読み取る方法は公知であり、例えば、それぞれ参照により本明細書に援用する米国特許第７，７５４，４２９号、同第８，０１７，３３５号明細書または同第８，１９２，９３０号明細書に記載されている。
【０１０８】
合成によるシークエンシングの実施形態の場合、核酸フラグメントは２つのテンプレート配列を有するように構築することができ、そして、２つのテンプレートのそれぞれからペアリードを得て、単一のフラグメントから４つのリードを得ることができる。単一の断片から４つのリードを得るための例示的なコンストラクトおよび当該コンストラクトの作製方法は、参照により本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１５／００３１５６０Ａ１を参照されたい。
【０１０９】
さらに、本開示は、固体支持体上に複数の部位を含む核酸アレイであって、各部位は第１の核酸テンプレートおよび第２の核酸テンプレートを含み、前記第１の核酸テンプレートは前記第２の核酸テンプレートの配列とは異なる配列を有し、第１のプライマーが前記第１の核酸テンプレートに結合し、第１の可逆的ブロッキング部分が前記第１のプライマーに付着しており、第２のプライマーが前記第２の核酸テンプレートに結合し、第２の可逆的ブロッキング部分が前記第２のプライマーに付着しており、前記第１の可逆的ブロッキング部分は前記第２の可逆的ブロッキング部分とは異なる、核酸アレイを提供する。核酸アレイはまた、本開示の方法の文脈において記載される１つ以上の成分を更に含み得る。本明細書に記載の方法から内在的に生じる生成物もまた、一部の実施形態では、核酸の成分とみなすことを意図する。
【０１１０】
特定の実施形態では、核酸アレイは、ある１つの部位で第１のプライマーおよび第１の核酸テンプレートに結合している第１のポリメラーゼを含む。さらに、第２のポリメラーゼが当該部位において第２のプライマーおよび第２の核酸テンプレートに結合することができる。第１のポリメラーゼおよび第２のポリメラーゼは同一種のポリメラーゼである場合もある。しかしながら、一部の実施形態では、第１のポリメラーゼおよび第２のポリメラーゼが異なる種（例えば、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼ）であることも有用であり得る。
【０１１１】
本開示の核酸アレイは、核酸シーケンシング装置などの検出装置に存在し得る。例示的な検出装置は本明細書および参照により本明細書に援用する参考文献に記載されている。一般的に、検出装置は、核酸アレイと、当該アレイ中の１つ以上の部位を検出するように配置された検出器とを備え得る。典型的には、検出器は、各部位における第１のプライマーと第２のプライマーとの間の間隔に等しい距離で点同士を分離するには低すぎる空間分解能を有する。しかしながら、オルトゴナルなプライマーの脱ブロッキングおよび伸長を使用することによって２つのプライマーを分離（解像）することができる。検出器は、本明細書に例示される任意の様々な信号を観察するように構成することができる。例えば、一部の実施形態では検出器は光学検出器である。アレイの各部位は光検出器によって検出可能な光標識を有することができる。各部位における異なるプライマーを伸長して、異なる光標識をそれぞれ取り込ませることができ、光学検出器は、これらの異なる標識を（例えば、光吸収波長、発光励起波長または発光波長の違いにより）光学的に区別するように構成することができる。一部の構成では、検出器のピクセルは第１のプライマーおよび第２のプライマーから信号を同時に取得するように構成される。
【０１１２】
本出願では様々な刊行物、特許または特許出願が参照されるが、これらの刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１１３】
用語「含む、備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本明細書において、記載された要素だけでなく任意の追加の要素も包含するオープンエンドなものであることが意図される。
【０１１４】
以上、多数の実施形態を記載したが、様々な変更がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態も添付の特許請求の範囲内である。
【図１】
0006712606.tif 000002
【図２】
0006712606.tif 000003