(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵微生物の生育を抑制する物質を添加した培地としてデオキシコール酸ナトリウム添加ＬＳＴ培地を用いて、あらかじめ測定試料を培養し、その後に、検出対象の大腸菌群の迅速検出法としてＡＴＰ法を実施し、大腸菌群測定の公定法であるデソキシコーレイト寒天培地法と比較して、検出の所要時間が４０％以上５０％以下に短縮されることを特徴とする、発酵食品中の大腸菌群の検出法。
【請求項２】
発酵食品が、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、乳酸菌飲料、チーズ、発酵バターのいずれか１つである、請求項１に記載の検出法。
【請求項３】
発酵微生物が、乳酸菌またはビフィズス菌である、請求項１または２に記載の検出法。
【請求項４】
検出の所要時間が８時間以上１０時間以下であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中の微生物の検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
各種の食品中において、製品の出荷前に汚染微生物の有無、特に大腸菌群の有無を確認することは非常に重要である。乳および乳製品の成分規格に関する省令（乳等省令）では、牛乳および乳製品の成分規格が定められており、乳等省令では、牛乳および乳製品中の大腸菌群は、陰性であることが定められている。大腸菌群の検出法として、例えばデソキシコーレイト寒天培地法による推定試験（ＤＯＡ法）などが知られているが、ＤＯＡ法は判定を得るまでに２０時間程度を要する。したがって、製品の早期出荷のためには、更に迅速で高感度の大腸菌群の検出法が求められており、例えば、次のような大腸菌群の検出法が提案されている。
【０００３】
特開平７−２１３２９７号公報（特許文献１）には、ろ過膜を用いて測定試料を濃縮して生菌を捕捉し、デオキシコール酸ナトリウムなどが配合された培地で培養後、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を測定することを特徴とする、大腸菌群の検出法が記載されている。特開２００４−１５９６５０号公報（特許文献２）には、大腸菌群以外の微生物の増殖を選択的に阻害する物質であるデオキシコール酸ナトリウムやラウリル硫酸ナトリウムなどで測定試料を処理し、培養後にカタラーゼ活性を測定することを特徴とする大腸菌群の検出法が記載されている。特開２０１０−１９３８１５号公報（特許文献３）には、大腸菌群以外の微生物の増殖を選択的に阻害する物質であるデオキシコール酸ナトリウムやラウリル硫酸ナトリウムなどで、牛乳や豆乳などの測定試料を処理し、培養後に蛍光染色法で測定することを特徴とする大腸菌群の検出法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−２１３２９７号公報
【特許文献２】特開２００４−１５９６５０号公報
【特許文献３】特開２０１０−１９３８１５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
大腸菌群の検出法として、例えば、特許文献１に記載されているように、ＡＴＰ法を用いた方法などが既に知られている。ＡＴＰ法は、微生物をはじめとする生物細胞中に存在するＡＴＰを、ルシフェラーゼを用いた発光反応により検出する方法であり、試料中の微生物を感度良く検出や定量することができる。
【０００６】
しかし、試料が食品の場合、食品中の植物や動物細胞などに由来するＡＴＰが、バックグラウンドとして検出され、検出感度が低下する。特に、試料が発酵食品の場合、発酵中に増殖した微生物に由来するＡＴＰが試料中に大量に存在することとなるため、それ以外の汚染微生物などをＡＴＰ法で特異的に検出することは、極めて困難であった。そこで、本発明では、発酵食品のような、微生物に由来するＡＴＰが試料中に大量に存在する状況で、例えば大腸菌群などの汚染微生物をＡＴＰ法で特異的に検出する検出法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは、発酵食品中における大腸菌群などの汚染微生物の検出のために、試料の前処理の方法などを見直して検討した。そして、その結果として、あらかじめ測定試料を特定の培地を用いて培養した上で、ＡＴＰ法を実施することで、試料が発酵食品のような微生物に由来するＡＴＰが試料中に大量に存在する状況で、大腸菌群などの汚染微生物をＡＴＰ法で特異的に検出できることを見出し、本発明を完成させた。具体的には、あらかじめ測定試料をデオキシコール酸ナトリウム添加ＬＳＴ培地（ｄＬＳＴ培地）で培養した上で、ＡＴＰ法を実施することで、発酵食品中でも大腸菌群などの汚染微生物をＡＴＰ法で特異的に検出できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明の請求項１に記載の発明は、発酵微生物の生育を抑制する物質を添加した培地を用いて、あらかじめ測定試料を培養し、その後に、検出対象の微生物の迅速検出法を実施することを特徴とする、食品中の微生物の検出法、である。
【０００９】
請求項２に記載の発明は、発酵微生物の生育を抑制する物質を添加した培地が、ＬＳＴ培地、デオキシコール酸ナトリウム添加ＬＳＴ培地、ナイシン添加ＢＧＬＢ培地、バンコマイシン添加ＢＧＬＢ培地のいずれか１つである、請求項１に記載の検出法、である。
【００１０】
請求項３に記載の発明は、検出対象の微生物の迅速検出法が、ＡＴＰ法である、請求項１または２に記載の検出法、である。
【００１１】
請求項４に記載の発明は、食品が、発酵食品である、請求項１から３のいずれか一項に記載の検出法、である。
【００１２】
請求項５に記載の発明は、発酵食品が、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、乳酸菌飲料、チーズ、発酵バターのいずれか１つである、請求項４に記載の検出法、である。
【００１３】
請求項６に記載の発明は、検出対象の微生物が、大腸菌群である、請求項１から５のいずれか一項に記載の検出法、である。
【００１４】
請求項７に記載の発明は、発酵微生物が、乳酸菌またはビフィズス菌である、請求項１から６のいずれか一項に記載の検出法、である。
【００１５】
請求項８に記載の発明は、デソキシコーレイト寒天培地法と比較して、検出の所要時間が４０％以上５０％以下に短縮されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の検出法、である。
【００１６】
請求項９に記載の発明は、検出の所要時間が８時間以上１０時間以下であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の検出法、である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、従来、検出感度が低かった食品中の汚染微生物を、感度良く検出することができる。特に、発酵食品のような、微生物に由来するＡＴＰが試料中に大量に存在する状況でも、例えば大腸菌群などの汚染微生物をＡＴＰ法で特異的に検出できる。また、本発明によれば、所要時間が８時間程度であるから、検出に２０時間程度を要するＤＯＡ法と比べて、大腸菌群などの汚染微生物を迅速に検出でき、例えば製品の早期出荷の判定などに大きく寄与できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例１において、各種の培地を用いて発酵乳の希釈液を培養した後の、ＡＴＰ量の測定結果を示すグラフである。
【図２】実施例１において、各種の培地を用いて発酵乳の希釈液を培養した後の、乳酸菌数の測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の検出法では、発酵微生物の生育を抑制する物質を添加した培地を用いて、あらかじめ測定試料を培養する。発酵微生物の生育を抑制する物質として、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ナイシン、バンコマイシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。また、発酵微生物の生育を抑制する物質を添加した培地として、例えば、ＬＳＴ培地、デオキシコール酸ナトリウム添加ＬＳＴ培地（ｄＬＳＴ培地）、ナイシン添加ＢＧＬＢ培地（ｎＢＧＬＢ培地）、バンコマイシン添加ＢＧＬＢ培地（ｖＢＧＬＢ培地）などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明では、好ましくは、ｖＢＧＬＢ培地、ｎＢＧＬＢ培地、ＬＳＴ培地、ｄＬＳＴ培地のいずれか１つを用いることができ、より好ましくは、ｎＢＧＬＢ培地、ＬＳＴ培地、ｄＬＳＴ培地のいずれか１つを用いることができ、さらに好ましくは、ｄＬＳＴ培地を用いることができる。
このとき、培養時間は、本発明の効果が得られる範囲で任意に設定できるが、例えば、８時間以上１０時間以下であり、好ましくは、８時間以上９時間以下である。なお、ＢＧＬＢ培地は、日本の主な大腸菌群の検査の公定法で用いられる培地であり、ＬＳＴ培地は、アメリカ合衆国のAmerican Public Health Associationで定めている大腸菌群の試験法で用いられる培地である。ＬＳＴ培地、ＢＧＬＢ培地、デオキシコール酸ナトリウム、ナイシン、バンコマイシンは、それぞれ、市販されているものを入手して使用できる。
【００２０】
本発明の検出法では、ｄＬＳＴ培地を用いる場合、デオキシコール酸ナトリウムの添加濃度は、好ましくは、0.2mg/mL以上0.8mg/mL以下、より好ましくは、0.3mg/mL以上0.7mg/mL以下、さらに好ましくは、0.4mg/mL以上0.6mg/mL以下である。ｎＢＧＬＢ培地を用いる場合、ナイシンの添加濃度は、好ましくは、0.7mg/mL以上1.3mg/mL以下、より好ましくは、0.8mg/mL以上1.2mg/mL以下、さらに好ましくは、0.9mg/mL以上1.1mg/mL以下である。ｖＢＧＬＢ培地を用いる場合、バンコマイシンの添加濃度は、バンコマイシン塩酸塩の濃度として、好ましくは、0.007mg/mL以上0.013mg/mL以下、より好ましくは、0.008mg/mL以上0.012mg/mL以下、さらに好ましくは、0.009mg/mL以上0.011mg/mL以下である。デオキシコール酸ナトリウム、ナイシン、バンコマイシンの添加濃度が小さいと、本発明の特異的な検出感度が得られない。一方、添加濃度が大きいと、検出対象である汚染微生物に対しても悪影響を及ぼし、検出感度が低下する。
【００２１】
本発明の検出法では、測定試料を前記の培地で培養した後、検出対象の微生物を検出するための迅速検出法を実施する。このとき、迅速検出法は、本発明の効果が得られる任意の方法を採用できるが、好ましくはＡＴＰ法である。ＡＴＰ法は、微生物をはじめとする生物細胞中に存在するＡＴＰを、ルシフェラーゼを用いた発光反応により検出する方法である。この発光量を相対発光量（Relative Light Unit；RLU）として定量することも可能であり、試料中の微生物を感度良く検出や定量することができる。ただし、一般に、試料が食品の場合は、食品中の植物や動物細胞などに由来するＡＴＰが、バックグラウンドとして検出され、検出感度が低下する。食品中の微生物由来ＡＴＰを測定するため、例えば「ルシフェール（登録商標）ＡＴ」（キッコーマン株式会社）などの測定キットや、「ＭＬＳII」（スリーエムジャパン株式会社）などの自動ＡＴＰ測定システムが知られている。これらは、試料の測定時において、菌体外のＡＴＰを消去してから測定する工程を備えており、測定時のバックグラウンドを抑え、高感度で測定できる。ただし、これらは試料中に存在する全ての微生物由来のＡＴＰを検出するものであり、特異性の面で不十分であった。
【００２２】
しかし、本発明の検出法では、測定試料を前記の所定の培地で培養することにより、試料中に存在する食品由来の微生物の影響を、効果的に抑制できる。特に、発酵食品に多く存在する、乳酸菌などの発酵微生物の影響を、非常に効果的に抑制できる。
ここで、発酵食品とは、発酵微生物の代謝活動により、食品中に存在する有機物などの成分や性状が変化した食品をいい、例えば、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、乳酸菌飲料、チーズ、発酵バターなどが挙げられる。また、発酵微生物とは、例えば、乳酸菌、ビフィズス菌、カビ、酵母などが挙げられ、本発明では、好ましくは、乳酸菌、ビフィズス菌である。
本発明では、あらかじめ測定試料を所定の培地で培養することにより、測定試料に含まれる乳酸菌などの発酵微生物の菌数を大幅に減少できる。このとき、測定試料中に存在する大腸菌群などの汚染微生物数を減少させることはない。したがって、本発明の検出法では、例えばＡＴＰ法などの迅速検出法での測定に影響を及ぼす乳酸菌などの発酵微生物の菌数を減少させながら、大腸菌群などの検出対象の汚染微生物の菌数には何ら影響を及ぼさないことから、汚染微生物だけに由来するＡＴＰを測定することができ、汚染微生物に特異的な検出が可能となる。
【００２３】
本発明の検出法では、検出対象の微生物は、好ましくは大腸菌群である。ここで、大腸菌群とは、グラム陰性の芽胞を形成しない桿菌で、48時間以内に乳糖を分解して酸およびガスを産出する好気性細菌または通性嫌気性細菌の一群を指す。Klebsiella、Citrobacter、Enterobacter、Escherichiaなどの属が、大腸菌群に属する。
【００２４】
本発明の検出法は、大腸菌群の検出の公定法であるデソキシコーレイト寒天培地法（ＤＯＡ法）と比較して、検出の所要時間が短縮されることを特徴とする。具体的には、本発明の検出法は、例えば、ＤＯＡ法の所要時間の40%以上50%以下の所要時間に短縮され、好ましくはＤＯＡ法の所要時間の40%以上45%以下の所要時間に短縮される。
また、本発明の検出法は、検出の所要時間の全体が、短時間であることを特徴とする。具体的には、本発明の検出法は、例えば、検出の所要時間が8時間以上10時間以下であり、好ましくは検出の所要時間が8時間以上9時間以下である。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例に基づいて、本発明をより具体的に説明する。なお、この実施例は、本発明を限定するものではない。また、実施例で使用した微生物について、株名にATCCと記載された菌株は、American Type Culture Collectionから入手した基準株である。株名にJCMと記載された菌株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室から入手した基準株である。株名にNBRCと記載された菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンターから入手した基準株である。
【００２６】
［実施例１］
発酵乳（明治ブルガリアヨーグルト；株式会社明治製）の10倍希釈液の1mLを、表１に示したそれぞれの培地に接種した。35℃で8時間培養後、ＡＴＰ量と乳酸菌数を測定した。ＡＴＰ量は、「ＭＬＳII」（スリーエムジャパン株式会社）を用いて測定した。乳酸菌数は、「乳及び乳製品の成分規格等に関する省令」に記載の方法で測定した。
【００２７】
【表１】
0006712126.tif 000002
【００２８】
ＡＴＰ量の測定結果を図１に、乳酸菌数の測定結果を図２に示した。ＢＧＬＢ培地を使用した場合のＡＴＰ量は約10000 RLUで、乳酸菌数は106 CFU/mL程度であった。一方、ｖＢＧＬＢ培地を使用した場合のＡＴＰ量は約2000 RLUであり、ｖＢＧＬＢ培地を使用して培養することで、ＡＴＰ法の測定時のバックグラウンドが減少することが示された。
また、ｎＢＧＬＢ培地、ＬＳＴ培地、ｄＬＳＴ培地を使用した場合は、ＡＴＰ量、乳酸菌数ともに、ＢＧＬＢ培地の結果と比べて大きく減少した。これは、ｎＢＧＬＢ培地、ＬＳＴ培地、ｄＬＳＴ培地に含まれる、ナイシン、ラウリル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムが、グラム陽性菌である乳酸菌に対し、菌体膜への膜孔形成作用や溶菌作用を示し、その結果、乳酸菌数が減少するとともに、乳酸菌に由来するＡＴＰが菌体外に漏出し、ＡＴＰ法の測定時に菌体外ＡＴＰとして測定時に消去されたものと考えられた。以上の結果から、ｖＢＧＬＢ培地、ｎＢＧＬＢ培地、ＬＳＴ培地、ｄＬＳＴ培地を使用して培養することにより、ＡＴＰ法による測定において、乳酸菌に由来するＡＴＰの影響を、効果的に排除できることが確認できた。特に、ｎＢＧＬＢ培地、ＬＳＴ培地、ｄＬＳＴ培地を使用して培養することにより、ＡＴＰ法による測定において、乳酸菌に由来するＡＴＰの影響を、より効果的に排除できることが確認できた。
【００２９】
［実施例２］
発酵乳（明治ブルガリアヨーグルト；株式会社明治製）の10倍希釈液の1mLを、ＢＧＬＢ培地、ｄＬＳＴ培地に接種した。接種直後、および35℃で2、4、6、8時間培養後、実施例１と同様の方法でＡＴＰ量と乳酸菌数を測定した。
測定結果を表２に示した。ＢＧＬＢ培地を使用した場合、8時間培養後まで乳酸菌数が維持されたのに対し、ｄＬＳＴ培地を使用した場合、接種直後（培養後0時間）の時点で乳酸菌数が検出限界以下となり、ＡＴＰ量も大きく減少した。以上の結果から、ｄＬＳＴ培地を使用して培養することにより、時間をかけて培養する必要なしに、乳酸菌に由来するＡＴＰの影響を効果的に排除でき、迅速にＡＴＰ法の利用が可能になることが確認できた。
【００３０】
【表２】
0006712126.tif 000003
【００３１】
［実施例３］
発酵乳（明治ブルガリアヨーグルト；株式会社明治製）の0.1gに、表３に示した代表的な大腸菌群の4菌種を、1〜10 CFUまたは10〜100 CFUの２段階の菌数で接種した。また、発酵乳（明治ブルガリアヨーグルト；株式会社明治製）の0.1gに、表４に示した非大腸菌群の7菌種を、10〜100 CFUで接種した。さらに、菌を接種しない対照試料も用意した。それぞれの試料の10倍希釈液の1mLを、ｄＬＳＴ培地に接種し、35℃で8時間培養した。培養後、培養液のＡＴＰ量と接種菌の菌数を計測した。接種菌である大腸菌群は、標準寒天平板（ＳＭＡ）で35℃、48時間培養した後に計測した。
【００３２】
【表３】
0006712126.tif 000004
【００３３】
【表４】
0006712126.tif 000005
【００３４】
測定結果を表３、表４に示した。大腸菌群の接種試料では、いずれも接種した大腸菌群の菌数が増加した。また、ＡＴＰ量は、もっとも増加が小さかったCitrobacter freundii JCM1657においても、84 RLUであり、対照試料や非大腸菌群接種試料のＡＴＰ量と明確な差が認められた。よって、ｄＬＳＴ培地を使用して培養した後に、ＡＴＰ法を実施することで、発酵乳中の微量の大腸菌群を8時間で検出できることが確認できた。
なお、今回の結果は、比較のために実施した公定法（ＢＧＬＢ法、デソキシコーレイト寒天培地法（ＤＯＡ法））と同様の判定結果を示し（表３、表４中に合わせて記載）、ｄＬＳＴ培地を使用して培養した後に、ＡＴＰ法を実施する検出法の結果が妥当であることが示された。
【００３５】
［実施例４］
発酵乳として、「R-1」（製品名「明治プロビオヨーグルトR-1」）、「LG21」（製品名「明治プロビオヨーグルトLG21」）、「のむYo LB81プレーン」（製品名「明治ブルガリアのむヨーグルトLB81プレーン」）、「ブルガリアブルーベリー」（製品名「明治ブルガリアヨーグルトつぶごとブルーベリー」）、「ブルガリア朝のフルーツ」（製品名「明治ブルガリアヨーグルト朝のフルーツミックス」）、「クロレラ乳酸菌」（製品名「明治クロレラ乳酸菌」）、「PA3」（製品名「明治プロビオヨーグルトPA-3」）、「PA3ドリンクタイプ」（製品名「明治プロビオヨーグルトPA-3ドリンクタイプ」）（以上、全て株式会社明治製）の８種類を用意した。
それぞれの発酵乳の0.1gに、表５に示した代表的な大腸菌群の2菌種を1〜10 CFUで接種した。また、菌を接種しない対照試料も用意した。それぞれの試料の10倍希釈液の1mLを、ｄＬＳＴ培地に接種し、35℃で8時間培養した。培養後、実施例３と同様の方法で培養液のＡＴＰ量と接種菌の菌数を計測した。
測定結果を表５に示した。大腸菌群の接種試料では、いずれもＡＴＰ量が増加し、対照試料のＡＴＰ量と明確な差が認められた。よって、ｄＬＳＴ培地を使用して培養した後に、ＡＴＰ法を実施することで、発酵乳の種類にかかわらず、発酵乳中の微量の大腸菌群を8時間で検出できることが確認できた。なお、今回の結果は、比較のために実施した公定法（ＢＧＬＢ法、デソキシコーレイト寒天培地法（ＤＯＡ法））と同様の判定結果を示し（表５中に合わせて記載）、ｄＬＳＴ培地を使用して培養した後に、ＡＴＰ法を実施する検出法の結果が妥当であることが示された。
【００３６】
【表５】
0006712126.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、従来、検出感度が低かった食品中の汚染微生物を、感度良く検出することができる。特に、発酵食品のような、微生物に由来するＡＴＰが試料中に大量に存在する状況でも、例えば大腸菌群などの汚染微生物をＡＴＰ法で特異的に検出できる。また、本発明によれば、所要時間が８時間程度であるから、大腸菌群などの汚染微生物を迅速に検出でき、例えば製品の早期出荷の判定などに大きく寄与できる。
【図１】
0006712126.tif 000007
【図２】
0006712126.tif 000008