(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
0006632605.tif 000048
（Ｉ）
（式中、
Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−（Ｎ−）ＲＮ、または−ＢＨ３−から選択され、ＲＮは、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、または保護基であり、
Ｘは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド類似体の５’末端から選択され、Ｙは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド類似体の３’末端；−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨＲＮ、−Ｏ−ＰＧ、Ｓ−ＰＧ（式中、ＰＧは保護基である）；リンカ、一リン酸もしくは二リン酸、または標識もしくはクエンチャから選択され、
あるいは、
Ｙは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド類似体の３’末端から選択され、Ｘは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド類似体の５’末端、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＨＲＮ、−Ｏ−ＰＧ、またはＳ−ＰＧ（式中、ＰＧは保護基である）；リンカ、一リン酸もしくは二リン酸、または標識もしくはクエンチャから選択され、
Ｒ１は、−ＮＲ１ＡＲ１Ｂ、−ＯＲ３、−ＳＲ３、−Ｈ、−Ｓ（Ｏ）Ｈ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｈ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ３２、−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＮＲ２ＡＲ２Ｂ、−ＯＲ３、−ＳＲ３、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）Ｈ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｈ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ３２、−Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
各Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、およびＲ２Ｂは、独立して、−Ｈ、−Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に、２〜４個の原子の長さのアルキレンまたはヘテロアルキレン鎖を形成し、
任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、それらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環を形成し、
任意選択で、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、それらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環を形成し、
Ｒ３は、−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
各アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキレン、またはヘテロアルキレンは、任意選択で置換されており、
前記ヌクレオシド類似体は、糖部分がモルホリノ（ＰＭＯ）、トリシクロ−ＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、または２’−置換ヌクレオシドの単量体単位で置き換えられている修飾ヌクレオシドのうちの少なくとも１つであり、２’−置換ヌクレオシドは、２’−フルオロ、２−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−β−メトキシエチル、２’−アミノ、または、２’−Ｏ−アリルリボリボヌクレオシドであり、
前記オリゴヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＳ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、トリシクロ−ＤＮＡ、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）のうち少なくとも１つであり、
前記保護基は、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、イソブチリル（Ｉｂｕ）、ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル（Ｔａｃ）、レブリニル（Ｌｅｖ）、メチル（Ｍｅ）、２−シアノエチル（ＣＥ）、アリル（Ａｌｌ）、２−クロロフェニル（ｏ−ＣｌＰｈ）、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４−メトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、および、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）のうち少なくとも１つであり、
前記リンカは、スクシニル、ジグリコリル、オキサリル、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−ジアセチル（Ｑ−リンカ）、フタロイル、４，５−ジクロロフタロイル、マロニル、グルタリル、ジイソプロピルシリル、および、１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイルのうち少なくとも１つであり、
前記標識は、カルボキシフルオレセイン標識およびフルオレセイン標識のうち少なくとも１つであり、
前記クエンチャは、下記式で示されるＢＨＱである）
の化合物。
【化２】
0006632605.tif 000049
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、Ｒ１が、−ＮＲ１ＡＲ１Ｂ、−ＯＲ３、および−ＳＲ３であることを特徴とする化合物。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の化合物であって、Ｒ１が、−ＮＲ１ＡＲ１Ｂであることを特徴とする化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｒ２が、−Ｈ、−ＮＲ２ＡＲ２Ｂ、または−ＯＲ３であることを特徴とする化合物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｒ２が、ＮＲ２ＡＲ２Ｂであることを特徴とする化合物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物であって、各Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、およびＲ２Ｂが、独立して、−Ｈ、ならびに−Ｆ、−Ｃｌ、−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、および−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２から選択される少なくとも１つの置換基により任意選択で置換されている−Ｃ１〜４アルキルから選択されることを特徴とする化合物。
【請求項７】
請求項６に記載の化合物であって、Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、およびＲ２Ｂが、それぞれメチルであることを特徴とする化合物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａが、一緒に、２〜４個の原子の長さのアルキレンまたはヘテロアルキレン鎖を形成し、Ｒ１ＢおよびＲ２Ｂが、それぞれ独立して、−Ｈおよび−Ｃ１〜４アルキルから選択されることを特徴とする化合物。
【請求項９】
請求項８に記載の化合物であって、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａが、一緒に、−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し、Ｒ１ＢおよびＲ２Ｂが、それぞれ独立して、−Ｈおよびメチルから選択されることを特徴とする化合物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物であって、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂが、それらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環、任意選択でピロリジンを形成することを特徴とする化合物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の化合物であって、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂが、それらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環、任意選択でピロリジンを形成することを特徴とする化合物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物を合成する方法であって、亜リン酸誘導体の酸化を含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物を合成する方法であって、酸化剤、ならびに任意選択でシリル化剤および／または塩基の存在下における、亜リン酸誘導体のイミノ誘導体ＨＮ＝ＣＲ１Ｒ２またはＮシリル化誘導体ＲＳｉ３ＳｉＮ＝ＣＲ１Ｒ２との反応を含み、ＲＳｉは、アルキル基またはアリール基であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記亜リン酸誘導体が、ホスファイトまたはＨ−ホスホネートであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３または請求項１４に記載の方法であって、前記酸化剤が、ヨウ素（Ｉ２）、臭素（Ｂｒ２）、塩素（Ｃｌ２）、塩化ヨウ素（ＩＣｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、四塩化炭素（ＣＣｌ４）、ブロモトリクロロメタン（ＣＣｌ３Ｂｒ）、テトラブロモメタン（ＣＢｒ４）、テトラヨードメタン（ＣＩ４）、ヨードホルム（ＣＨＩ３）、ヘキサクロロエタン（Ｃ２Ｃｌ６）、またはヘキサクロロアセトン（（ＣＣｌ３）２ＣＯ）であることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物を合成する方法であって、任意選択で、シリル化剤および／または塩基の存在下における、亜リン酸誘導体の有機アジドとの反応を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記アジドが、
【化３】
0006632605.tif 000050
（式中、各Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂは、独立して、−Ｈまたは任意選択で置換されているＣ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、もしくは−Ｃ５〜１０ヘテロアリールであり、ならびに／あるいは
任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に、２〜４個の原子の長さのアルキレンもしくはヘテロアルキレン鎖を形成し、任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し、Ｒ１ＢおよびＲ２Ｂは、それぞれ独立して、−Ｈおよびメチルから選択され、
任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、これらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環を形成し、または、
任意選択で、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、これらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環、任意選択でピロリジンを形成する）
または
【化４】
0006632605.tif 000051
（式中、各Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、独立して−Ｈまたは任意選択で置換されているＣ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、もしくは−Ｃ５〜１０ヘテロアリールであり、あるいは、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、これらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環を形成し、Ｒ２は、−Ｈ、−Ｆ、−Ｏ−ＰＧ、Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＮ、−Ｎ３、−Ｏ−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｓ−ＰＧ、および−Ｓ−Ｃ１〜１０アルキルから選択され、ＰＧは、保護基である）
から選択されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法であって、前記反応が、シリル化剤の存在下で行われ、任意選択で、前記シリル化剤が、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）、クロロトリメチルシラン、ブロモトリメチルシラン、ヨードトリメチルシラン、トリエチルシリルクロリド、トリフェニルシリルクロリド、ヘキサメチルジシラザン、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）、ジメチルイソプロピルシリルクロリド、ジエチルイソプロピルシリルクロリド、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド、トリイソプロピルシリルクロリド、ジメチルジクロロシラン、またはジフェニルジクロロシランであることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法であって、前記反応が、塩基の存在下で行われ、任意選択で、塩基が、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、トリブチルアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、ピリジン、２，６−ルチジン、２，４，６−コリジン、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（「プロトンスポンジ」）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）、１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン（ＴＢＤ）、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン（ＭＴＢＤ）、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、２，８，９−トリメチル−２，５，８，９−テトラアザ−１−ホスファビシクロ［３．３．３］ウンデカン、またはホスファゼン塩基であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物のインビトロでの使用であって、前記化合物を、配列同一性を有するオリゴヌクレオチドと接触させてハイブリダイズさせることを特徴とする使用。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物の診断剤としてのインビトロでの使用。
【請求項２２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物であって、医療処置の方法において使用するための化合物。
【請求項２３】
疾患の処置において使用するための医薬品または医薬組成物の製造における請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、修飾リン酸基を有するヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、ならびにそれらの合成のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な追加の官能基が付加されたオリゴヌクレオチドなどの核酸誘導体は、生命科学において研究ツールとして広く使用されており、特に、これらは有望な治療薬［１］および分子診断用の高感度プローブと見なされている［２］。いくつかのオリゴヌクレオチド治療薬は、ＦＤＡの承認を受けて臨床現場に入っている。例としては、抗ウイルス剤のビトラベン（Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ）（ホミビルセン（Ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）、ＩＳＩＳ  ２９２２）［３］、抗血管新生アプタマのマクジェン（Ｍａｃｕｇｅｎ）（ペガプタニブナトリウム（Ｐｅｇａｐｔａｎｉｂ  ｓｏｄｉｕｍ））［４］、および抗コレステロールギャップマのミポメルセン（Ｍｉｐｏｍｅｒｓｅｎ）（カイナムロ（Ｋｙｎａｍｒｏ）、ＩＳＩＳ  ３０１０１２）［５］が含まれる。ｓｉＲＮＡ、ＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）およびアンチセンスモルホリノ類似体（ＰＭＯ）などのいくつかの他のオリゴヌクレオチド候補薬は、現在臨床試験の様々な段階にある。
【０００３】
可能性のある治療候補薬として見なされるためには、オリゴヌクレオチドは、以下の必要条件に対応すべきである。
【０００４】
１．それらの生物学的標的（ほとんどの場合、これは細胞内ＲＮＡである）との相補的複合体の十分な安定性および配列特異性。
２．血清などの生体媒質中の耐性増強。
３．水溶解度および化学的安定性などの有益な物理化学的性質。
４．費用効果の高い合成および適正な価格。
５．好ましくは、外部トランスフェクション薬剤の不在下での、効率的な細胞取り込みおよびインビボ送達。
【０００５】
作用機序によると、オリゴヌクレオチド類似体は、実際には、遺伝子情報伝達のいかなる段階でも、すなわち、ＤＮＡからＲＮＡへの（転写）またはＲＮＡからタンパク質への（翻訳）のいずれであっても妨害することができる。転写の阻害は、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド（ＴＦＯ）［６］によって、特にペプチド核酸（ＰＮＡ）［７］によって、ゲノムＤＮＡに結合することにより実行される。翻訳の阻害（アンチセンス機構）は、ｍＲＮＡの阻止を通して実現される［８］。今までに知られているオリゴヌクレオチド類似体のほとんどは、アンチセンス機構によって作用する。これらは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）［９］、核酸酵素（リボザイムまたはＤＮＡザイム）［１０］、および大部分の化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド類似体［１１］である。アプタマなどの特異的オリゴヌクレオチド誘導体も、タンパク質または小分子補因子への直接結合によって、タンパク質機能を阻止することができる［１２］。
【０００６】
ほとんどのアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体は、ｍＲＮＡに結合し、立体的障害を介して翻訳を阻害する［１３］。これらとしては、２’−フルオロ［１４］、２’−Ｏ−メチル［１５］、２’−Ｏ−β−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）［１６］などの糖における修飾を有する大部分の類似体またはロックド核酸（ＬＮＡ）［１７］誘導体が含まれる。メチルホスホネート［１８］、ホスホトリエステル［１９］またはホスホルアミデート［２０］などのアニオン性ヌクレオシド間リン酸基を非荷電の基に置換するオリゴヌクレオチド類似体も立体的障害により作用する。同じアンチセンス機構は、ＰＮＡ［２１］またはホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）［２２］などの隔たった（ｄｉｓｔａｎｔ）核酸模倣物の作用に関与する。
【０００７】
これらの類似体についてさらに興味深いことは、これらが、例えば、２’−デオキシホスホロチオエート［２３］、アラ−２’−フルオロ誘導体（２’−ＦＡＮＡ）［２４］またはギャップマ［２４］によって、細胞内酵素のＲＮアーゼＨ（ＲＮａｓｅ  Ｈ）を動員することを介して、その加水分解的開裂に触媒として機能することによって、不可逆的にＲＮＡを不活性化することができることである。ＳｉＲＮＡは、リボヌクレアーゼ活性でＲＩＳＣ複合体を活性化することによってｍＲＮＡの触媒的開裂を誘導するが［２５］、一方核酸酵素（リボザイムまたはＤＮＡザイム）は、それらの触媒的ＲＮＡ開裂作用のためにタンパク質を必要としない［２７］。
【０００８】
多くのオリゴヌクレオチド類似体は、修飾されたヌクレオシド間リン酸基を有する。その中でも、ホスホロチオエート［２８］、ホスホロジチオエート［２９］、およびボラノホスフェート［３０］が挙げられる。これらの誘導体のプラスの特徴は、天然２’−デオキシリボヌクレオチドおよび高度に有効な固相ＤＮＡホスホルアミダイト化学反応の使用のために、それらが比較的低コストであることである［３１］。リン酸修飾された類似体は、非対称のリン原子（複数可）を含有し、通常、ｎ−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドに対して２ｎ−１個のジアステレオマの混合物として得られる。異なるジアステレオマは、ＲＮＡに対する異なる親和性および酵素耐性を有することが多く、これは、潜在的アンチセンス作用にとって重要である。
【０００９】
現在、特に優先順位が高い課題は、好ましくは、カチオン性脂質、ポリマまたはナノ粒子などの外部送達薬剤の不在下における、効率的な細胞取り込みおよびインビボ送達を備えたオリゴヌクレオチド類似体の開発である。ここでは、負電荷が減少した、または負電荷が完全に排除されたオリゴヌクレオチド類似体は、特に興味深い場合がある［３２］。その中でも、アニオン性リン酸塩を電荷中性のホスホルアミデート基に置換するオリゴヌクレオシドホスホルアミデートが挙げられる。ホスホルアミデートの化学合成は、比較的簡単である。しかしながら、これらの類似体は、ＲＮＡに対して親和性の減少を示し［３３］、酸性加水分解に対して感受性である［３４］。Ｎ３’→Ｐ５’ホスホルアミデートは、改善されたＲＮＡ結合を有するが、合成が難しい［３５］。側鎖に正電荷の基を有するこれらの代表的なものは、よりアクセスしやすく、優れた酵素安定性を有するが、それらのＲＮＡに対する親和性は低い［３６］。同時に、モルホリノ（ＰＭＯ）［３７］のような有用なアンチセンス薬剤を含む大部分の既知のホスホルアミデート誘導体は、酸性ｐＨにおいて幾分の不安定性を示す。改善された酸安定性は、エンドソーム内部のオリゴヌクレオチド類似体の分解を防止するために必要とされるであろう。
【００１０】
過去１０年間、新たなリン酸オリゴヌクレオチド類似体が登場し、これらは、天然リン酸塩をイオン性リン酸基に置換している。その中でも、ホスホノアセテートならびにチオホスホノアセテート［３８］、ホスホノホルメート［３９］、および１，２，３−トリアゾール−４−イルホスホネート［４０］が挙げられる。これらの化合物は、生体耐性の増強および適切なＲＮＡ結合を示し、さらには、これらは、ＲＮアーゼＨ開裂を支援し、トランスフェクション薬剤の不在下においても改善された細胞取り込みを有する。しかしながら、これらの化学合成は困難で、費用高である。
【００１１】
構造Ｐ＝Ｎ−Ａｃｃ（式中、Ａｃｃは、電子受容体である）を少なくとも１回は含有する修飾ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドも記載されている［４１］。Ａｃｃについての好適な単位元は、−ＣＮ、−ＳＯ２Ｒ、および少なくとも１個の窒素がアルキル化され、オルトまたはパラ位にある、電子不足の６員Ｎ＋複素環である。
【００１２】
現時点では、公知のアンチセンス薬剤である、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）がかなりの注目を集めている［４２］。これらは、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ  ＬＬＣから市販されている。ＰＭＯは、Ｓａｒｅｐｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０１２年まではＡＶＩ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）によって、可能性のある治療薬として活発に探究されている。２０１３年に、この会社は、ジストロフィンのプレｍＲＮＡの異常スプライシングを修正するＰＭＯ薬のエテプリルセン（Ｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎ）（ＡＶＩ−４６５８）によるデュシェンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）に対する第ＩＩＩ相臨床試験が成功裏に完結したことを発表した［４３］。２０１４年初頭には、Ｓａｒｅｐｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、そのモルホリノ薬候補ＡＶＩ−７２８８が、ＲＮＡ含有ウイルスによって引き起こされる致命的なマールブルグ出血熱に対する第Ｉ相臨床試験に成功裏に合格したことを報告した［４４］。
【００１３】
しかしながら、モルホリノは、他のホスホルアミデートと同様に酸感受性である［４５］。さらに、これらの合成はＰ（Ｖ）化学反応に基づいている［４６］。この化学反応は、グアニン中のＯ６の修飾などの副反応をもたらす場合がある［４７］。これは、Ｏ６位の保護基によって防止することができるが［４８］、特別なＧモノマを必要とし、このことがＰＭＯ合成の費用を上乗せすることになる。この化学反応の別の欠点は、これが慣習的なホスホルアミダイト法と不適合であり、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．などの通常の供給元から入手可能な変性および標識試薬を使用することができないことである。
【００１４】
ＰＭＯの別の重大な不利益は、構造活性研究用に様々な誘導体を得るためのそれらの化学的修飾の難しさである。それらの細胞取り込みおよび治療有効性を向上させると主張されるＰＭＯに対するわずか数個の側鎖修飾だけが提案されている［４９］。
【００１５】
モルホリノは、細胞取り込みの比較的低い効率性を示すことが多く、したがって、良好な治療的効果が見られるために大量の繰り返し投与が必要とされる。ＰＭＯ−ペプチドコンジュゲートの細胞取り込みは、裸のＰＭＯのものよりも非常に高く、したがって、インビボでは非常に低い用量が必要とされる［５０］。細胞および組織送達のより高いレベルならびに送達補助の不在下で改善された治療有効性を示すより良好なオリゴヌクレオチド類似体を得ることが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】（４１）国際公開第２００７／０５９８１６Ａ１号パンフレット
【特許文献２】（４１）国際公開第２００８／１２８６８６Ａ１号パンフレット
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】（１）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｊ．グッドチャイルド（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ）（ｅｄ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７６４、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２０１１。
【非特許文献２】（２）ベル（Ｂｅｌｌ），Ｎ．Ｍ．；ミックルフィールド（Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ），Ｊ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００９、１０、２６９１。
【非特許文献３】（３）ムランバ（Ｍｕｌａｍｂａ），Ｇ．Ｂ．；ヒュー（Ｈｕ），Ａ．；アザド（Ａｚａｄ），Ｒ．Ｆ．；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ），Ｋ．Ｐ．；コーエン（Ｃｏｅｎ），Ｄ．Ｍ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９８、４２、９７１。
【非特許文献４】（４）ビノレス（Ｖｉｎｏｒｅｓ），Ｓ．Ａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．２００６、１、２６３。
【非特許文献５】（５）メルキ（Ｍｅｒｋｉ），Ｅ．：グラハム（Ｇｒａｈａｍ），Ｍ．Ｊ．；ムリック（Ｍｕｌｌｉｃｋ），Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００８、１１８、７４３。
【非特許文献６】（６）デュカ（Ｄｕｃａ），Ｍ．；ベクホッフ（Ｖｅｋｈｏｆｆ），Ｐ．；オウセディク（Ｏｕｓｓｅｄｉｋ），Ｋ．；ハルビイ（Ｈａｌｂｙ），Ｌ．；アリモンド（Ａｒｉｍｏｎｄｏ），Ｐ．Ｂ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８、３６、５１２３。
【非特許文献７】（７）ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ），Ｐ．Ｅ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０、１２、１８４。
【非特許文献８】（８）ザメクニック（Ｚａｍｅｃｎｉｋ），Ｐ．Ｃ．；ステフェンソン（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ），Ｍ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９７８、７５、２８０。
【非特許文献９】（９）ベールケ（Ｂｅｈｌｋｅ），Ｍ．Ａ．、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２００８、１８、３０５。
【非特許文献１０】（１０）シュー（Ｘｕ），Ｚ．Ｊ．；ヤング（Ｙａｎｇ），Ｌ．Ｆ．；サン（Ｓｕｎ），Ｌ．Ｑ．；カオ（Ｃａｏ），Ｙ．、Ｃｈｉｎ．Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．２０１２、５７、３４０４。
【非特許文献１１】（１１）ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ），Ｃ．；キーフ（Ｋｅｅｆｅ），Ａ．Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６、１０、６０７。
【非特許文献１２】（１２）リー（Ｌｅｅ），Ｊ．Ｆ．；ストーバル（Ｓｔｏｖａｌｌ），Ｇ．Ｍ．；エリングトン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ），Ａ．Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６、１０、２８２。
【非特許文献１３】（１３）ドゥ（Ｄｕ），Ｌ．；ガッティ（Ｇａｔｔｉ），Ｒ．Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９、１１、１１６
【非特許文献１４】（１３）ペレズ（Ｐｅｒｅｚ），Ｂ．；ローラ・ロドリゲス−パスカウ（Ｌａｕｒａ  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐａｓｃａｕ），Ｌ．；ビラゲリウ（Ｖｉｌａｇｅｌｉｕ），Ｌ．；グリンベルグ（Ｇｒｉｎｂｅｒｇ），Ｄ．；ウガルテ（Ｕｇａｒｔｅ），Ｍ．；デスビアト（Ｄｅｓｖｉａｔ），Ｌ．Ｒ．Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｄｉｓｅａｓｅ  ２０１０、３３、３９７。
【非特許文献１５】（１４）ラックマン（Ｒｕｃｋｍａｎ），Ｊ．；グリーン（Ｇｒｅｅｎ），Ｌ．Ｓ．；ビーソン（Ｂｅｅｓｏｎ），Ｊ．；ウォー（Ｗａｕｇｈ），Ｓ．；ギレット（Ｇｉｌｌｅｔｔｅ），Ｗ．Ｌ．；ヘンニンゲル（Ｈｅｎｎｉｎｇｅｒ），Ｄ．Ｄ．；クレソン−ウェルシュ（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ），Ｌ．；ジャニック（Ｊａｎｊｉｃ），Ｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８、２７３、２０５５６。
【非特許文献１６】（１５）ラモンド（Ｌａｍｏｎｄ），Ａ．Ｉ．；スプロート（Ｓｐｒｏａｔ），Ｂ．Ｓ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９３、３２５、１２３。
【非特許文献１７】（１６）チー（Ｃｈｉ），Ｋ．Ｎ．；アイゼンハウアー（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ），Ｅ．；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｅ．Ｃ．；ゴールデンバーグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ），Ｓ．Ｌ．、パワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ），Ｊ．；トゥ（Ｔｕ），Ｄ．；グレーベ（Ｇｌｅａｖｅ），Ｍ．Ｅ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００５、９７、１２８７。
【非特許文献１８】（１７）カウル（Ｋａｕｒ），Ｈ．；バブ（Ｂａｂｕ），Ｂ．Ｒ．；マイチ（Ｍａｉｔｉ），Ｓ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００７、１０７、４６７２。
【非特許文献１９】（１８）イェーガー（Ｊａｇｅｒ），Ａ．；エンジェルス（Ｅｎｇｅｌｓ），Ｊ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８４、２５、１４３７。
【非特許文献２０】（１９）ハウ（Ｈａｕ），Ｊ．Ｆ．；アスリーヌ（Ａｓｓｅｌｉｎｅ），Ｕ．；トゥオン（Ｔｈｕｏｎｇ），Ｎ．Ｔ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９１、３２、２４９７。
【非特許文献２１】（２０）イェーガー（Ｊａｇｅｒ），Ａ．；レビー（Ｌｅｖｙ），Ｍ．Ｊ．；ヘヒト（Ｈｅｃｈｔ），Ｓ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８、２７、７２３７。
【非特許文献２２】（２１）エゴルム（Ｅｇｈｏｌｍ）．Ｍ．；ブカルド（Ｂｕｃｈａｒｄｔ），Ｏ．；ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ），Ｐ．Ｅ．；ベルグ（Ｂｅｒｇ），Ｒ．Ｈ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２、１１４、１８９５。
【非特許文献２３】（２２）スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７、７、１８７。
【非特許文献２４】（２３）ステイン（Ｓｔｅｉｎ），Ｃ．Ａ．；スバシンギ（Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅ），Ｃ．；シノヅカ（Ｓｈｉｎｏｚｕｋａ），Ｋ．；コーエン（Ｃｏｈｅｎ），Ｊ．Ｓ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８、１６、３２０９。
【非特許文献２５】（２４）パツレアウ（Ｐａｔｕｒｅａｕ），Ｂ．Ｍ．；ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ），Ｒ．Ｈ．Ｅ．；ダムハ（Ｄａｍｈａ），Ｍ．Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００７、１８、４２１。
【非特許文献２６】（２５）クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｓ．Ｔ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００、３１３、３。
【非特許文献２７】（２６）ベールケ（Ｂｅｈｌｋｅ），Ｍ．Ａ．、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２００８、１８、３０５。
【非特許文献２８】（２７）シュー（Ｘｕ），Ｚ．Ｊ．；ヤング（Ｙａｎｇ），Ｌ．Ｆ．；サン（Ｓｕｎ），Ｌ．Ｑ．；カオ（Ｃａｏ），Ｙ．、Ｃｈｉｎ．Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．２０１２、５７、３４０４。
【非特許文献２９】（２８）ステック（Ｓｔｅｃ），Ｗ．Ｊ．；ゾーン（Ｚｏｎ），Ｇ．；イーガン（Ｅｇａｎ），Ｗ．；ステック（Ｓｔｅｃ），Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８４、１０６、６０７７。
【非特許文献３０】（２９）シーベルガー（Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ），Ｐ．Ｈ．；カルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），Ｍ．Ｈ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５、１１７、１４７２。
【非特許文献３１】（３０）ホール（Ｈａｌｌ），Ａ．Ｈ．；ワン（Ｗａｎ），Ｊ．；スペソック（Ｓｐｅｓｏｃｋ），Ａ．；セルギーバ（Ｓｅｒｇｕｅｅｖａ），Ｚ．；シャウ（Ｓｈａｗ），Ｂ．Ｒ．；アレキサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ），Ｋ．Ａ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００６、３４、２７７３。
【非特許文献３２】（３１）ビーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ），Ｓ．Ｌ．；カルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），Ｍ．Ｈ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８１、２２、１８５９。
【非特許文献３３】（３２）サザニ（Ｓａｚａｎｉ），Ｐ．；カン（Ｋａｎｇ），Ｓ．−Ｈ．；マイヤー（Ｍａｉｅｒ），Ｍ．Ａ．；ウェイ（Ｗｅｉ），Ｃ．；ディルマン（Ｄｉｌｌｍａｎ），Ｊ．；スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．；マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ），Ｍ．；コレ（Ｋｏｌｅ），Ｒ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１、２９、３９６５。
【非特許文献３４】（３３）フロエラー（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ），Ｂ．；ウン（Ｎｇ），Ｐ．；マテウッチィ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ），Ｍ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８、１６，４８３１。
【非特許文献３５】（３４）ドリンナヤ（Ｄｏｌｉｎｎａｙａ），Ｎ．Ｇ．；ソコルバ（Ｓｏｋｏｌｏｖａ），Ｎ．Ｉ．；グリアズノーバ（Ｇｒｙａｚｎｏｖａ），Ｏ．Ｉ．；シャバロバ（Ｓｈａｂａｒｏｖａ），Ｚ．Ａ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８、１６、３７２１。
【非特許文献３６】（３５）ミグネット（Ｍｉｇｎｅｔ），Ｎ．；グリアズノフ（Ｇｒｙａｚｎｏｖ），Ｓ．Ｍ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８、２６、４３１。
【非特許文献３７】（３６）レツシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ），Ｒ．Ｌ．；シングマン（Ｓｉｎｇｍａｎ），Ｃ．Ｎ．；ヒスタンド（Ｈｉｓｔａｎｄ），Ｇ．；サルンケ（Ｓａｌｕｎｋｈｅ），Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８８、１１０、４４７０。
【非特許文献３８】（３７）スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７、７、１８７。
【非特許文献３９】（３８）デリンジャー（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ）ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３、１２５、９４０。
【非特許文献４０】（３９）ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６、１２８、５２５１。
【非特許文献４１】（４０）クリシュナ（Ｋｒｉｓｈｎａ），Ｈ．；カルザー（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），Ｍ．Ｈ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２、１３４、１１６１８。
【非特許文献４２】（４２）スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７、７、１８７。
【非特許文献４３】（４３）メンデル（Ｍｅｎｄｅｌｌ），Ｊ．；ロジノ−クラパック（Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ），Ｌ．Ｒ．；サヘンク（Ｓａｈｅｎｋ），Ｚ．；ルーシュ（Ｒｏｕｓｈ），Ｋ．；バード（Ｂｉｒｄ），Ｌ．；ロウズ（Ｌｏｗｅｓ），Ｌ．Ｐ．；アルファノ（Ａｌｆａｎｏ），Ｌ．；ゴメズ（Ｇｏｍｅｚ），Ａ．Ｍ．；ルイス（Ｌｅｗｉｓ），Ａ．；コタ（Ｋｏｔａ），Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３、７４、６３７；ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１３９６２３９．
【非特許文献４４】（４４）ｍａｉｌ．ｐｉｐｅｌｉｎｅｒｅｖｉｅｗ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／２０１４０２１０５３４０２／ＤＮＡ−ＲＮＡ−ａｎｄ−Ｃｅｌｌｓ／Ｓａｒｅｐｔａ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−Ａｎｎｏｕｎｃｅｓ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｓａｆｅｔｙ−Ｒｅｓｕｌｔｓ−ｆｒｏｍ−Ｐｈａｓｅ−Ｉ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ−Ｓｔｕｄｙ−ｏｆ−Ｍａｒｂｕｒｇ−Ｄｒｕｇ−Ｃａｎｄｉｄａｔｅ．ｈｔｍｌ．
【非特許文献４５】（４５）スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．Ｅ．Ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ジャンソン（Ｊａｎｓｏｎ），Ｃ．Ｇ．；デューリング（Ｄｕｒｉｎｇ），Ｍ．Ｊ．，Ｅｄｓ）、２００３、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６。
【非特許文献４６】（４６）スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７、７、１８７。
【非特許文献４７】（４７）リース（Ｒｅｅｓｅ），Ｃ．Ｂ．、ウバサワ（Ｕｂａｓａｗａ），Ａ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８０、２１、２２６５。
【非特許文献４８】（４８）ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｓ．Ｓ．；リース（Ｒｅｅｓｅ），Ｃ．Ｂ．；シバンダ（Ｓｉｂａｎｄａ），Ｓ．；ウバサワ（Ｕｂａｓａｗａ），Ａ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８１、２２、４７５５。
【非特許文献４９】（４９）スウェエンソン（Ｓｗｅｎｓｏｎ），Ｄ．Ｌ．；ウォーフィールド（Ｗａｒｆｉｅｌｄ），Ｋ．Ｌ．；ワーレン（Ｗａｒｒｅｎ），Ｔ．Ｋ．；ラブジョイ（Ｌｏｖｅｊｏｙ），Ｃ．；ハッシンジャー（Ｈａｓｓｉｎｇｅｒ），Ｊ．Ｎ．；ルゼル（Ｒｕｔｈｅｌ），Ｇ．；ブロウホ（Ｂｌｏｕｃｈ），Ｒ．Ｅ．；モールトン（Ｍｏｕｌｔｏｎ），Ｈ．Ｍ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．Ｄ．；イベルセン（Ｉｖｅｒｓｅｎ），Ｐ．Ｌ．；ババリ（Ｂａｖａｒｉ），Ｓ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００９、５３、２０８９
【非特許文献５０】（４９）メルビー（Ｍｅｌｌｂｙｅ），Ｂ．Ｍ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．Ｄ．；ハッシンジャー（Ｈａｓｓｉｎｇｅｒ），Ｊ．Ｎ．；リーベス（Ｒｅｅｖｅｓ），Ｍ．Ｄ．；ラブジョイ（Ｌｏｖｅｊｏｙ），Ｃ．Ｅ．；イベルセン（Ｉｖｅｒｓｅｎ），Ｐ．Ｌ．；ゲラー（Ｇｅｌｌｅｒ），Ｂ．Ｌ．、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１０、６５、９８。
【非特許文献５１】（５０）ジェアラウィリヤパイサルン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ），Ｎ．；モールトン（Ｍｏｕｌｔｏｎ），Ｈ．Ｍ．；バックレー（Ｂｕｃｋｌｅｙ），Ｂ．；ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ），Ｊ．；サザニ（Ｓａｚａｎｉ），Ｐ．；フカロエン（Ｆｕｃｈａｒｏｅｎ），Ｓ．；イベルセン（Ｉｖｅｒｓｅｎ），Ｐ．Ｌ．；コレ（Ｋｏｌｅ），Ｒ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００８、１６、１６２４
【非特許文献５２】（５０）ウー（Ｗｕ），Ｂ．；モールトン（Ｍｏｕｌｔｏｎ），Ｈ．Ｍ．；イベルセン（Ｉｖｅｒｓｅｎ），Ｐ．Ｌ．；ジュアング（Ｊｕａｎｇ），Ｊ．；リ（Ｌｉ），Ｊ．；スパルネイ（Ｓｐｕｒｎｅｙ），Ｃ．Ｆ．；サリ（Ｓａｌｉ），Ａ．；グエロン（Ｇｕｅｒｒｏｎ），Ａ．Ｄ．；ナガラジュ（Ｎａｇａｒａｊｕ），Ｋ．；ドーラン（Ｄｏｒａｎ），Ｔ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００８、１０５、１４８１４
【非特許文献５３】（５０）イン（Ｙｉｎ），Ｈ．；モールトン（Ｍｏｕｌｔｏｎ），Ｈ．Ｍ．；セオウ（Ｓｅｏｗ），Ｙ．；ボイド（Ｂｏｙｄ），Ｃ．；ボウチリアー（Ｂｏｕｔｉｌｉｅｒ），Ｊ．；イベルセン（Ｉｖｅｒｓｅｎ），Ｐ．；ウッド（Ｗｏｏｄ），Ｍ．Ｊ．Ａ．、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００８、１７、３９０９。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、新しいオリゴヌクレオチド類似体の開発は、重要な課題であり続けている。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、改善された細胞取り込みを備えたオリゴヌクレオチド治療薬についての見込みのある候補薬剤への本発明者らの洞察に基づいている。具体的には、本発明は、新しいこのようなオリゴヌクレオチド治療薬のための好適なアプローチ／特性についての以下の発想に基づいている。
１．電荷中性基または正荷電基が、天然アニオン性リン酸に取って代わること。
２．上で概説された見込みのあるオリゴヌクレオチド治療薬についての必要条件に応じること。
３．好ましくは、従来のヌクレオチド骨格を保持すること。
４．十分な化学的安定性を表すこと。
５．多様な側鎖基の組み込みを可能にする構造上の柔軟性を有すること。
６．低毒性を有すること。
【００２０】
上記必要条件に対応し、改善された細胞取り込みを呈する可能性があり得る新しいオリゴヌクレオチド類似体が、本明細書に開示される。大まかに言えば、これらのオリゴヌクレオチド類似体は、ホスホリルイミンおよびそれらの類似体の部類であり、例えば、ホスホリルグアニジン、ホスホリルアミジン、ホスホリルイソ尿素、ホスホリルイソチオ尿素、ホスホリルイミデート、ホスホリルイミドチオエート、およびこれらの類似体である。
【００２１】
したがって、一態様では、本発明は、ホスホリルグアニジン（ＦＩ）、ホスホリルアミジン（ＦＩＩ）、ホスホリルイソ尿素（ＦＩＩＩ）、ホスホリルイソチオ尿素（ＦＩＶ）、ホスホリルイミデート（ＦＶ）、またはホスホリルイミドチオエート（ＦＶＩ）、例えば、ホスホリルグアニジン（ＦＩ）、ホスホリルアミジン（ＦＩＩ）、ホスホリルイソ尿素（ＦＩＩＩ）、ホスホリルイソチオ尿素（ＦＩＶ）を含むヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関する。本発明はまた、これらの部分の修飾リン酸変形、すなわち、リン原子を包囲する酸素原子のうちの１個以上が、例えば、硫黄原子、セレン原子、イミノ基、またはボランによって置き換えられたリン酸にも関することが理解されるであろう。
【００２２】
例えば、本発明は、とりわけ、以下のモチーフ：
【化１】
0006632605.tif 000002
ＦＩ
【化２】
0006632605.tif 000003
ＦＩＩ
【化３】
0006632605.tif 000004
ＦＩＩＩ
【化４】
0006632605.tif 000005
ＦＩＶ
【化５】
0006632605.tif 000006
ＦＶ
【化６】
0006632605.tif 000007
ＦＶＩ
（式中、−−−−は、置換基への結合点を示す）
の１つ以上を含む、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、およびそれらの類似体に関する。
【００２３】
これらの修飾リン酸基は、それらの物理化学的性質のために相当興味深い。いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、本発明者らは、これらの部分が、生理的ｐＨにおいて中性電荷、負電荷、または正電荷を帯びることができ、これらを治療、診断、および研究用途で有用なヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの合成のために相当に興味深いものにすると考える。
【００２４】
さらに、本発明者らは、これらの修飾リン酸基が、本明細書に記載される方法を用いて好都合にオリゴヌクレオチド構造に組み込まれることが可能であり、多くの既知の生物学的に興味深い修飾および／または標識オリゴヌクレオチドモチーフならびに配列と適合性があることを見出した。
【００２５】
例えば、このモチーフは、
【化７】
0006632605.tif 000008
ＦＶＩＩ
（式中、
Ｒ１は、−ＮＲ１ＡＲ１Ｂ、−ＯＲ３、−ＳＲ３、−Ｈ、−Ｓ（Ｏ）Ｈ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｈ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ３２、−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＮＲ２ＡＲ２Ｂ、−ＯＲ３、−ＳＲ３、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）Ｈ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｈ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ３２、−Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
各Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、およびＲ２Ｂは、独立して、−Ｈ、−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に、２〜４個の原子の長さのアルキレンまたはヘテロアルキレン鎖を形成し、
任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、それらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環を形成し、
任意選択で、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、それらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環を形成し、
Ｒ３は、−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
各アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキレン、またはヘテロアルキレンは、任意選択で置換されている）
であってもよい。
【００２６】
したがって、第１の態様では、本発明は、式（Ｉ）：
【化８】
0006632605.tif 000009
（Ｉ）
（式中、Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−Ｎ−ＲＮ、または−ＢＨ３−から選択され、ＲＮは、Ｈ、Ｃ１〜４アルキル、または保護基であり、
Ｘは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド類似体の５’末端から選択され、Ｙは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド類似体の３’末端；−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＨＲＮ、−Ｏ−ＰＧ、またはＳ−ＰＧ（式中、ＰＧは保護基である）；リンカ、一リン酸もしくは二リン酸、または標識もしくはクエンチャから選択され、
あるいは、
Ｙは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド類似体の３’末端から選択され、Ｘは、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体、オリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド類似体の５’末端、−Ｈ、−ＯＨ、−ＳＨ、ＮＨＲＮ、−Ｏ−ＰＧ、またはＳ−ＰＧ（式中、ＰＧは保護基である）；リンカ、一リン酸もしくは二リン酸、または標識もしくはクエンチャから選択され、
Ｒ１は、−ＮＲ１ＡＲ１Ｂ、−ＯＲ３、−ＳＲ３、−Ｈ、−Ｓ（Ｏ）Ｈ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｈ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ３２、−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＮＲ２ＡＲ２Ｂ、−ＯＲ３、−ＳＲ３、ハロゲン、−ＣＮ、−Ｓ（Ｏ）Ｈ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｈ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ３２、−Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
各Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、およびＲ２Ｂは、独立して、−Ｈ、−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に、２〜４個の原子の長さのアルキレンまたはヘテロアルキレン鎖を形成し、
任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、それらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環を形成し、
任意選択で、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、それらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環を形成し、
Ｒ３は、−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、
各アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキレン、またはヘテロアルキレンは、任意選択で置換されている）
の化合物を提供することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−ＮＲ１ＡＲ１Ｂ、−ＯＲ３、および−ＳＲ３から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−ＮＲ１ＡＲ１Ｂである。
【００２８】
したがって、この化合物は、式（Ｉａ）
【化９】
0006632605.tif 000010
（Ｉａ）
（式中、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、およびＲ２は、本明細書で定義された通りである）
の化合物であってもよい。
【００２９】
この化合物は、「修飾」ヌクレオチド、「修飾」オリゴヌクレオチド、または「修飾」ヌクレオシド三リン酸であってもよい。この文脈における用語「修飾」とは、式（Ｉ）に描写された修飾リン酸部分、すなわち、式（ＦＶＩＩ）に描写されたモチーフを含むリン酸の組み込みを指すことが理解されるであろう。
【００３０】
ヌクレオシド三リン酸は、３個のリン酸基に結合したヌクレオシドを含有する分子である。この文脈において、用語リン酸は、本明細書に定義される修飾リン酸を含むことが理解されるであろう。好適には、ヌクレオシド三リン酸は、列をなして互いに連結した３個のリン酸である三リン酸基を有し、すなわち、この分子はｄＮＴＰまたは類似物であってもよい。他の実施形態では、ヌクレオシドは、５’および３’位の両方においてリン酸を有してもよく、例えば、５’位に単一のリン酸基を、３’位に二リン酸基（互いに連結した２個のリン酸）を有してもよい。ありとあらゆるこれらのリン酸基は、本明細書に記載されるように修飾されてもよいことが理解されるであろう。
【００３１】
この化合物がオリゴヌクレオチドであるとき、それぞれのさらなるヌクレオシドは、それ自体が独立してヌクレオシド類似体であってもよく、追加的にまたは代替的に、それぞれのさらなるリン酸基（存在する場合）は、それ自体で修飾されてもよいことが理解されるであろう。
【００３２】
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−Ｈ、−ＮＲ２ＡＲ２Ｂ、−ＯＲ３、−ＳＲ３、−Ｓ（Ｏ）Ｈ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２Ｈ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ３、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ３２、−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールから選択され、各アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキレン、またはヘテロアルキレンは、任意選択で置換されている。
【００３３】
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−Ｈ、−ＮＲ２ＡＲ２Ｂ、−ＯＲ３、−ＳＲ３、−Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールであり、各アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキレン、またはヘテロアルキレンは、任意選択で置換されている。
【００３４】
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−Ｈ、−ＮＲ２ＡＲ２Ｂ、−ＯＲ３である。例えば、この化合物は、ホスホリルホルムアミジン（Ｐ−Ｎ＝ＣＨＮＲ１ＡＲ１Ｂ）基、ホスホリルグアニジン（Ｐ−Ｎ＝Ｃ（ＮＲ１ＡＲ１Ｂ）（ＮＲ２ＡＲ２Ｂ））、またはホスホリルイソ尿素（Ｐ−Ｎ＝Ｃ（ＮＲ１ＡＲ１Ｂ）ＯＲ３）基を含有してもよい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１〜４アルキル、好ましくはメチルである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１Ａは、独立して、−Ｈ、ならびに−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、および−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２から選択される１個以上の置換基で任意選択で置換されている−Ｃ１〜４アルキルから選択され、好ましくは、−Ｈおよび−Ｃ１〜４アルキルから選択され、より好ましくは、−Ｈおよびメチルから選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１Ｂは、独立して、−Ｈ、ならびに−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、および−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２から選択される１個以上の置換基で任意選択で置換されている−Ｃ１〜４アルキルから選択され、好ましくは、−Ｈおよび−Ｃ１〜４アルキルから選択され、より好ましくは、−Ｈおよびメチルから選択される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、Ｒ２Ａは、独立して、−Ｈ、ならびに−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、および−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２から選択される１個以上の置換基で任意選択で置換されている−Ｃ１〜４アルキルから選択され、好ましくは、−Ｈおよび−Ｃ１〜４アルキルから選択され、より好ましくは、−Ｈおよびメチルから選択される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、Ｒ２Ｂは、独立して、−Ｈ、ならびに−Ｆ、−Ｃｌ、−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、および−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２から選択される１個以上の置換基で任意選択で置換されている−Ｃ１〜４アルキルから選択され、好ましくは、−Ｈおよび−Ｃ１〜４アルキルから選択され、より好ましくは、−Ｈおよびメチルから選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、各Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、およびＲ２Ｂは、独立して、−Ｈ、ならびに−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＯＨ、−Ｃ１〜４アルコキシ、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１〜４アルキル）、および−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２から選択される１個以上の置換基で任意選択で置換されている−Ｃ１〜４アルキルから選択され、好ましくは、−Ｈ、ならびに−Ｆ、−Ｃｌ、−ＯＨ、および−ＮＨ２から選択される１〜３個の置換基で任意選択で置換されている−Ｃ１〜４アルキルから選択され、より好ましくは、−Ｈおよび−Ｃ１〜４アルキルから選択され、より好ましくは、−Ｈおよびメチルから選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、−ＮＲ２ＡＲ２Ｂであり、好ましくは、−ＮＭｅ２である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、−ＮＨ２または−ＮＭｅ２である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に２〜４個の原子の長さのアルキレンまたはヘテロアルキレン鎖を形成し、Ｒ１ＢおよびＲ２Ｂは、それぞれ独立して、−Ｈおよび−Ｃ１〜４アルキルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し、Ｒ１ＢおよびＲ２Ｂは、−Ｈまたはメチルである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、それらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環、好ましくは、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、またはモルホリンを形成する。好適には、これらは、これらが結合する原子と一緒に、５員の複素環、好ましくはピロリジンを形成する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、それらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環、好ましくは、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、またはモルホリンを形成する。好適には、これらは、これらが結合する原子と一緒に、５員の複素環、好ましくはピロリジンを形成する。
【００４６】
本明細書に記載されるように、Ｚは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓｅ−、−Ｎ−ＲＮ、または−ＢＨ３−から選択されてもよく、式中、ＲＮは、−Ｈ、−Ｃ１〜４アルキル、または保護基である。好ましくは、Ｚは、−Ｏ−または−Ｓ−から選択され、最も好ましくは−Ｏ−である。−Ｐ＋−Ｏ−は−Ｐ＝Ｏの共鳴構造であることが理解されるであろう。
【００４７】
特定の好ましい化合物は、以下の式：
【化１０】
0006632605.tif 000011
【化１１】
0006632605.tif 000012
【化１２】
0006632605.tif 000013
【化１３】
0006632605.tif 000014
【化１４】
0006632605.tif 000015
【化１５】
0006632605.tif 000016
【化１６】
0006632605.tif 000017
【化１７】
0006632605.tif 000018
の化合物である。
さらなる態様では、本発明は、式ＦＶＩＩ：
【化１８】
0006632605.tif 000019
（式中、Ｒ１およびＲ２は、本明細書で定義された通りである）
の少なくとも１つの修飾リン酸部分を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４８】
さらなる態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドを提供し、隣接するヌクレオシド／ヌクレオシド類似体を連結するリン酸は、ホスホリルグアニジン、ホスホリルアミジン、ホスホリルイソ尿素、ホスホリルイソチオ尿素、ホスホリルイミデート、またはホスホリルイミドチオエートを含む。
【００４９】
さらなる態様では、本発明は、式ＦＶＩＩ：
【化１９】
0006632605.tif 000020
ＦＶＩＩ
のモチーフを含む化合物を合成する方法を提供する。
【００５０】
一態様では、この方法は、酸化剤、ならびに任意選択でシリル化剤および／または塩基の存在下における、亜リン酸誘導体のイミノ誘導体ＨＮ＝ＣＲ１Ｒ２またはＮシリル化イミノ誘導体ＲＳｉ３ＳｉＮ＝ＣＲ１Ｒ２との反応（手順Ａ）を含み、式中、各ＲＳｉは、アルキルまたはアリール基である。例えば、亜リン酸誘導体は、ホスファイトまたはＨ−ホスホネートであってもよい。
【００５１】
手順Ａについてのイミノ誘導体の例としては、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）、グアニジン塩酸塩、１，１−ジメチルグアニジン硫酸塩、１，３−ジフェニルグアニジン、ホルムアミジン塩酸塩、アセトアミジン塩酸塩、１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミジン塩酸塩、Ｎ−Ｂｏｃ−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミジン、エチルホルムイミデート塩酸塩、エチルアセトイミデート塩酸塩、Ｏ−メチルイソ尿素硫酸水素塩、Ｓ−メチルイソチオ尿素硫酸水素塩、Ｓ−ベンジルイソチオ尿素塩酸塩などが限定することなく含まれる。
【００５２】
イミノ誘導体は、本明細書に記載される遊離塩基または塩の形態であってもよいことが理解されるであろう。イミノ誘導体が塩である場合、塩基を添加して、イミノ誘導体の遊離塩基を遊離させてもよく、および／またはシリル化剤を使用して、イミノ化合物のＮ−シリル化誘導体を生成してもよい。
【００５３】
酸化剤は、ヨウ素Ｉ２、臭素Ｂｒ２、塩素Ｃｌ２、塩化ヨウ素ＩＣｌ、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、四塩化炭素ＣＣｌ４、ブロモトリクロロメタンＣＣｌ３Ｂｒ、テトラブロモメタンＣＢｒ４、テトラヨードメタンＣＩ４、ヨードホルムＣＨＩ３、ヘキサクロロエタンＣ２Ｃｌ６、ヘキサクロロアセトン（ＣＣｌ３）２ＣＯなどであってもよい。好ましい酸化剤は、ヨウ素Ｉ２である。
【００５４】
さらなる態様では、この方法は、任意選択でシリル化剤および／または塩基の存在下における、亜リン酸誘導体の有機アジドとの反応（手順Ｂ）を含む。
【００５５】
例えば、有機アジドは、ビス（二置換アミノ）−１−アジドカルベニウム塩、１−（二置換アミノ）−１−アジドカルバミジニウム塩、１−（二置換アミノ）−１−アジド−エテン、Ｎ−置換−１−アジドカルバミジンなどから選択されてもよい。
【００５６】
手順Ａおよび手順Ｂの反応において、反応は、シリル化剤、例えば、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）、クロロトリメチルシラン、ブロモトリメチルシラン、ヨードトリメチルシラン、トリエチルシリルクロリド、トリフェニルシリルクロリド、ヘキサメチルジシラザン、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）、ジメチルイソプロピルシリルクロリド、ジエチルイソプロピルシリルクロリド、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド、トリイソプロピルシリルクロリド、ジメチルジクロロシラン、ジフェニルジクロロシランなどの存在下で行われてもよい。例えば、反応は、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）、およびクロロトリメチルシランから選択されるシリル化剤の存在下で行われてもよい。
【００５７】
手順Ａおよび手順Ｂの反応において、反応は、塩基、例えば、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、トリブチルアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、ピリジン、２，６−ルチジン、２，４，６−コリジン、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（「プロトンスポンジ」）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）、１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン（ＴＢＤ）、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン（ＭＴＢＤ）、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、２，８，９−トリメチル−２，５，８，９−テトラアザ−１−ホスファビシクロ［３．３．３］ウンデカン、ホスファゼン塩基などの存在下で行われてもよい。
【００５８】
手順Ａについての溶媒の例としては、ピリジン、２−ピコリン、３−ピコリン、４−ピコリン、キノリン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、ジエチレングリコールジメチルエーテル（ジグリム）、ジエチルエーテル、アセトニトリルなどが限定することなく含まれる。
【００５９】
手順Ｂについての溶媒の例としては、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、テトラメチル尿素、１，３−ジメチルイミダゾリジン−２−オン、スルホラン、ヘキサメチルホスホルトリアミド（ＨＭＰＴ）、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、酢酸エチルなどが限定することなく含まれる。これらの手順のさらなる詳細は、以下に提供されている。
【００６０】
本明細書に記載されるように、本発明の修飾リン酸部分の主な長所は、本発明者らにより立証されるような、これらの部分の好都合な組み込みである。例えば、式ＶＩの修飾リン酸部分は、Ｈ−ホスホネートまたはホスホルアミダイト化学反応に基づく逐次的オリゴヌクレオチド合成中に、オリゴヌクレオチドに容易に組み込まれ得る。さらなる詳細は、以下に提供されている。
【００６１】
本発明の態様のうちのいずれか１つ以上は、本発明の他の態様のうちのいずれか１つ以上と組み合わされてもよい。同様に、態様のいずれかの特徴および任意選択の特徴のうちのいずれか１つ以上は、他の態様のうちのいずれか１つに適用されてもよい。したがって、任意選択かつ好ましい特徴の本明細書における論議は、態様の一部または全てに適用されてもよい。特に、化合物、モチーフ、および中間体、化合物を作製する方法ならびにこの化合物を使用する方法などに関する任意選択かつ好ましい特徴は、他の態様の全てに適用される。例えば、化合物に対する置換基の選択は、アジド／イミノ誘導体にも適用され、逆もまた同様である。さらに、方法または使用に関連する任意選択かつ好ましい特徴も、生成物に適用してもよく、逆もまた同様である。
【００６２】
本発明は、以下を参照して、限定することなくさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ”−ホスホリルグアニジン基で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧＣＧＣＣＡＡＡＣｐＡ）（黒色細線）、５’−ｄ（ＧＣＧＣＣＡＡＡｐＣｐＡ）（灰色線）、および５’−ｄ（ＧＣＧＣＣＡＡｐＡｐＣｐＡ）（黒色太線）のＲＰ−ＨＰＬＣであり、以下、ｐは、修飾基の位置を示す。
【図２】Ｎ−ホスホリルグアニジン基で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｐＴ）のＲＰ−ＨＰＬＣである。
【図３】Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ”−ホスホリルグアニジン基で修飾されたＬＮＡヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴ）ｔｄＴ（黒色細線）、５’−ｄ（ＴＴＴＴ）ｔｐｄＴ（灰色線）、および５’−ｔｐｄ（ＴＴＴＴＴ）（点線）を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣであり、ｔは、ＬＮＡヌクレオチドの位置を示す。
【図４】Ｎ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）−Ｎ”−ホスホリルグアニジン基で修飾されたオリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド５’−ＵＵＵＵＵｐ＊Ｕ（黒色太線）、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ”−ホスホリルイミノ−２−イミダゾリジン基で修飾された５’−ＵＵＵＵＵｐＵ（灰色線）、および非修飾のオリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド５’−ＵＵＵＵＵＵ（黒色細線）のＲＰ−ＨＰＬＣである。
【図５】Ｎ−シアノイミノリン酸基で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴｐＴＴＴＴＴ）のＲＰ−ＨＰＬＣである。
【図６】Ｎ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）−Ｎ”−グアニジノリン酸基で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴ）ｐ（黒色太線）、５’−ＤＭＴｒ−Ｆｌｕ  ｐｄ（ＴＴＴＴＴＴ）（黒色細線）、およびヌクレオチド５’−ＤＭＴｒ−Ｆｌｕ  ｐｄＴ（灰色線）のＲＰ−ＨＰＬＣである。
【図７】Ｎ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ”−ホスホリルイミノ−２−イミダゾリジン基で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）、５’−ｄ（ＴＴＴＴｐＴｐＴ）、５’−ｄ（ＴＴＴｐＴｐＴｐＴ）、５’−ｄ（ＴＴｐＴｐＴｐＴｐＴ）、および５’−ｄ（ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ）のＲＰ−ＨＰＬＣであり、ｐは、修飾基の位置を示す。
【図８】全てのヌクレオシド間位置においてＮ，Ｎ’−ジメチル−Ｎ”−ホスホリルイミノ−２−イミダゾリジン基で完全に修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡ）のＲＰ−ＨＰＬＣである。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
［略語および注釈］
ｐ−記載された修飾リン酸基の位置を表す
ｔ−ＬＮＡ−Ｔヌクレオチドの位置を表す
ａ−ＬＮＡ−Ａヌクレオチドの位置を表す
ｃ−ＬＮＡ−５−Ｍｅ−Ｃヌクレオチドの位置を表す
ｇ−ＬＮＡ−Ｇヌクレオチドの位置を表す
Ｆ−２−ヒドロキシメチル−３−ヒドロキシテトラヒドロフラン（無プリン／無ピリミジン部位）ホスフェート
ＢＨＱ−ＢｌａｃｋＨｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）
ＤＤ−１，１２−ドデカンジオールホスフェート
Ｆｌｕ−５（６）−カルボキシフルオレセイン標識
ＮＳ−ヌクレオチド「Ｎ」のホスホロチオエート残基を表す
ＢＳＡ−Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド
ＢＳＴＦＡ−Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド
ＤＩＥＡ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＮＭＩ−Ｎ−メチルイミダゾール
ＤＭＡＰ−４−ジメチルアミノピリジン
ＤＢＵ−１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＴＭＧ−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン
【００６５】
ホスホリルグアニジンは、リン酸クレアチンおよびホスホアルギニンなどの化合物によって自然界で代表される。合成低分子量ホスホリルグアニジンは、少なくとも１９６０年代から知られている［５２］。小分子ホスホリルグアニジンは、殺虫剤［５３］、難燃剤［５４］、および治療薬［５５］として限定された使用が見出されてきた。ホスホリルグアニジンジエステルは、グアニジンの窒素を通して金属イオンと錯体を形成する［５６］。Ｏ，Ｏ’−ジイソプロピルホスホリルグアニジンのＸ線解析は、結晶構造におけるホスホリルイミノ基＞Ｐ（＝Ｏ）−Ｎ＝Ｃ＜を有する互変異性体の存在のみを確認している。
【００６６】
しかしながら、現在までヌクレオシドもオリゴヌクレオチド誘導体も記載されておらず、それらの性質は未知のままである。本発明者らは、初めに、第一級アミンに関して以前に記載されたもの［５７］と同様な方法論を用いて、ピリジン中のＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）の存在下で、ジチミジンβ−シアノエチルホスファイトのヨウ素酸化によって、オリゴヌクレオシドホスホリルグアニジンを調製した。
【００６７】
本発明者らは、β−シアノエチルホスホルアミダイト法［５８］に従って、固相ＤＮＡ合成において共通の中間体であるＣＰＧ結合３’，５’−ジチミジンβ−シアノエチルホスファイトの酸化を研究した。本明細書に記載されるように、１ＭのＴＭＧおよび２０％のＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミドの存在下での、乾燥ピリジン中、ヨウ素の０．１Ｍ溶液による上記亜リン酸の酸化は、３’，５’−ジチミジン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジンを主生成物として生成した。オリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）（式中、ｐは修飾リン酸基の位置を表す）を、周囲温度で１時間の濃縮水性アンモニア処理の後に、２つのジアステレオマの混合物として単離した（実施例１．１）。単離された副産物はｄＴ６のみであり、これは、微量の水分による反応性ヨードホスホニウム中間体の同時加水分解の結果である可能性が高い。本発明者らは、ホスホリルグアニジン基が、固相オリゴヌクレオチド合成およびｐＨ１１でのアンモニア脱保護の間に安定であると結論付けた。
【００６８】
オリゴチミジンモノホスホリルグアニジンの一体性を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって確認した。２０％ポリアクリルアミドゲル中のゲル電気泳動中のその移動度は、ｄＴ６のものよりも低く、これはｐＨ７．４におけるテトラメチルホスホリルグアニジン基の電荷中性特性を示唆し、これは、低分子量ホスホリルグアニジンについての文献データ［５９］と一致する。
【００６９】
１個のテトラメチルホスホリルグアニジン基を有する２０ｍｅｒのオリゴチミジレートの合成を通して、本発明者らは、連続的に５’−ｄ（Ｔ１８ＴｐＴ）＞５’−ｄ（Ｔ１０ＴｐＴ９）＞５’−ｄ（ＴＴｐＴ１８）で支持体から増加するにつれて、収率が次第に悪化することに気づいた。得られたオリゴチミジレートを用いて、単一のテトラメチルホスホリルグアニジン基のオリゴヌクレオチド５’−ｄ（Ｃ２Ａ２０Ｃ２）との相補的二本鎖の熱安定性に及ぼす影響を、非修飾のｄＴ２０と比較して確認した。
【００７０】
本発明者らは、非置換のホスホリルグアニジン基を有するオリゴヌクレオチドも成功裏に得た。０．５Ｍのグアニジン塩酸塩、０．５Ｍの１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、および２０％のＢＳＡの存在下でのピリジン中０．１Ｍのヨウ素溶液によるＣＰＧ結合３’，５’−ジチミジンβ−シアノエチルホスファイトの酸化、その後のオリゴヌクレオチド合成は、ホスホリルグアニジン基を有するヘキサチミジレートを主生成物として、それと共にｄＴ６加水分解生成物を生成した（実施例５）。
【００７１】
同様に、ピリジン中、ホルムアミジン塩酸塩、ＤＢＵ、およびＢＳＡの存在下でのジチミジン亜リン酸のヨウ素酸化、その後のオリゴヌクレオチドの合成は、ヘキサチミジンホスホリルホルムアミジンの形成をもたらし、これは、ホスホリルイミノ化合物の別の部類の代表：ホスホリルアミジンである（実施例３９）。
【００７２】
０．５ＭのＯ−メチルイソ尿素硫酸水素塩、１ＭのＤＢＵ、および２０％のＢＳＡの存在下での、ピリジン中０．１Ｍのヨウ素溶液によるＣＰＧ結合３’，５’−ジチミジンβ−シアノエチルホスファイトの酸化、その後のオリゴヌクレオチド合成および濃縮水性アンモニアによる周囲温度における１時間の脱保護は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによると、ｄＴ６、オリゴヌクレオシドＯ−メチルホスホリルイソ尿素、およびホスホリルグアニジンを含有する生成物の混合物をもたらした（実施例７）。後者は、アンモニアによるホスホリルイソ尿素のメトキシ基の置換を通して形成される可能性が高い。５５℃で１６時間にわたるさらなるアンモニア処理は、ホスホリルグアニジンの量の増加、およびＯ−メチルホスホリルイソ尿素の量の減少をもたらした。同様に、エタノール中のエチレンジアミン（１：１ｖ／ｖ）での５５℃で１６時間にわたる混合物の処理は、Ｏ−メチルホスホリルイソ尿素の消失をもたらし、Ｎ−β−アミノエチルホスホリルグアニジンを主生成物として提供した（実施例８）。これは、Ｎ−β−アミノエチルホスホリルグアニジン基が、生理的ｐＨにおいて正電荷を帯びるべきであるために、オリゴヌクレオチド配列において正電荷を帯びた基が負電荷を帯びたリン酸に取って代わるための道を開く。カチオン性オリゴヌクレオシドホスホリルグアニジンは、外部トランスフェクション薬剤の不在下で、改善された細胞取り込みおよびインビボ送達を潜在的に呈することができる。
【００７３】
本明細書に記載されるように、本発明者らは、単一の非置換ホスホリルグアニジン基を有する２０ｍｅｒのオリゴチミジレートを得た（図２）。収率は、連続的にｄ（Ｔ１８ＴｐＴ）＞ｄ（Ｔ１０ＴｐＴ９）＞ｄ（ＴＴｐＴ１８）でオリゴヌクレオチドの長さと共に減少した。２個および３個のホスホリルグアニジン基を有するオリゴヌクレオチドも調製したが、この反応は、分離するのに難しい生成物の混合物をもたらし、本発明者らは、ヨウ素酸化化学反応が一置換のオリゴヌクレオチドの調製のために最も有効であるとの結論を導いた。
【００７４】
本明細書に記載されるように、Ｈ−ホスホネート化学反応は、２つおよび３つの修飾を有するオリゴヌクレオチドを調製するために使用することができる［６３］。ＣＰＧ担持３’，５’−ジチミジン−Ｈ−ホスホネートは、ＢＳＡありまたはなしで、ピリジン中の０．１Ｍのヨウ素および２０体積％のＴＭＧによって（実施例１．２および１．３）、またはピリジン中、ＣＣｌ４もしくはＣＣｌ３Ｂｒおよび２０体積％のＴＭＧによって（実施例１．４および１．５）のいずれかで、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジンに酸化され得る［６４］。ヨウ素の場合の変換（７０〜７５％）は、ＣＣｌ４またはＣＣｌ３Ｂｒの場合（１０〜２０％）よりも高かった。ＢＳＡの存在下において、変換は、８０〜８５％まで増加した。ホスホルアミダイト法を用いる固相合成後に、テトラメチルホスホリルグアニジン基を有するヘキサチミジレート５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）を、副産物ｄＴ５およびｄＴ６と共に、良好な収率で得た（実施例１．３）。本発明者らは、ヨウ素／ＴＭＧ／ＢＳＡ酸化を介して、二置換ならびに三置換されたホスホリルグアニジン５’−ｄ（ＴＴＴＴｐＴｐＴ）（実施例３．１）および５’−ｄ（ＴＴＴｐＴｐＴｐＴ）（実施例４．１）を成功裏に得たが、後者の場合、収率は低かった。
【００７５】
オリゴヌクレオシドホスホリルグアニジンの収率を増加させるために、本発明者らは、ＢＳＡありまたはなしでのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドまたはアセトニトリル中、ＣＰＧ結合ジヌクレオシドβ−シアノエチルホスファイトとテトラアルキルアジドカルベニウム塩との間の新規反応を探索した。この反応は、周囲温度または４０〜４５℃で起こり得る。５％のトリエチルアミンならびにＢＳＡの添加は、収率を増加させる。この方法は、複数のテトラアルキルホスホリルグアニジノ基を有するオリゴヌクレオチドの調製に有効であることが判明した（図１）。ＤＮＡシンセサイザによる方法の自動バージョンを用いて、完全修飾されたオリゴヌクレオシドホスホリルグアニジンを生成した（実施例４７）。
【００７６】
電荷中性またはカチオン性ホスホリルグアニジンと共に、本発明者らは、イオン性Ｎ−シアノイミノリン酸基を含有するオリゴヌクレオチドも調製した。この場合には、ＣＰＧ結合ジヌクレオシド亜リン酸を、アセトニトリル中、シアノゲンアジドの０．２５Ｍ溶液と周囲温度で反応させた。この結果は、オリゴヌクレオチドの収率が、使用される脱保護法に依存することを示唆している。エチレンジアミンおよびエタノールの混合物（１：１ｖ／ｖ）［６５］が、水性アンモニアに取って代わり、Ｎ−シアノイミノリン酸基を有するオリゴヌクレオチドを７０℃で１時間にわたって脱保護するために用いられる場合に、良好な結果が得られた（実施例４０および４１）。
【００７７】
得られたＮ−シアノイミノヘキサチミジレート５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）および５’−ｄ（ＴｐＴＴＴＴＴ）の電気泳動移動度は、ｄＴ６と酷似し、これは、Ｎ−シアノイミノ基が、生理的ｐＨにおいて負電荷を有することを示唆している。これらのオリゴヌクレオチドは、非修飾のヘキサチミジレートよりもわずかに疎水性であった。２つのジアステレオマが、ＲＰ−ＨＰＬＣのトレースにより観測された（図５）。
【００７８】
様々な修飾オリゴヌクレオチドが、ホスホリルグアニジン修飾物、特に、オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（図４）、ＬＮＡ（図３）、およびＲＮＡそれ自体（実施例４６）などのリボヌクレオチド誘導体と適合性があることを見出した。ホスホロチオエート基は、ホスホリルグアニジン基と共に、オリゴヌクレオチドに成功裏に組み込まれ得る（実施例３２〜３５）。フルオレセイン、無塩基部位、非ヌクレオシドインサート、またはブラックホールクエンチャなどの広い範囲の他の修飾が許容された。３’−または５’−ホスホリルグアニジン基のいずれかを有するモノヌクレオチドも調製した（実施例４２および４４、図６）。
【００７９】
［定義］
用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドと、共有結合によってこれに連結された少なくとも１個のリン酸基または修飾リン酸基とを含有する化合物を指す。例示的な共有結合としては、ヌクレオシドの３’、２’、または５’ヒドロキシル基とリン酸基との間のエステル結合が限定することなく含まれる。
【００８０】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、ポリマ鎖中に互いに結合された２個以上のヌクレオチドを含有する化合物を指す。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸であってもよい。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよい。二本鎖オリゴヌクレオチドの場合には、一方または両方の鎖は、本発明による修飾リン酸を含有してもよい。
【００８１】
オリゴヌクレオチドは、２個以上のヌクレオチドのポリマであってもよいが、ｙは、任意の長さを有してもよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のヌクレオチドのうちの１つの最小長を有してもよい。任意選択で、これは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、または５００個のヌクレオチドのうちの１つの最大長を有してもよいが、いくつかの実施形態では、より長いオリゴヌクレオチドも提供される。純粋に例として、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のヌクレオチドのうちの１つを有するオリゴヌクレオチドが提供される。
【００８２】
本発明のオリゴヌクレオチドにおいて、１個の、数個の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）またはそれぞれのヌクレオチドは、本発明による修飾リン酸を含有してもよい。
【００８３】
本発明のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、修飾ヌクレオチドの組み込み、キャッピング部分の組み込み（例えば、３’キャッピング）、高分子量の非免疫原性化合物（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））へのコンジュゲーション、低分子量化合物（例えば、コレステロール）へのコンジュゲーション、ペプチド（例えば、細胞透過性ペプチド）へのコンジュゲーション、リン酸基（例えば、ホスホロチオエート）における置換を含む、核酸の糖位置、リン酸位置、および／または塩基位置における化学的置換などの本明細書に記載される化学的修飾を含んでもよい。塩基修飾は、５位のピリミジン修飾、環外アミンにおける修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモ−または５−ヨード−ウラシルの置換、主鎖修飾を含んでもよい。糖修飾は、２’−アミノヌクレオチド（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロヌクレオチド（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−アリルヌクレオチド、２’−Ｏ−β−メトキシエチルヌクレオチド、「ロックド」ヌクレオチド（例えば、ＬＮＡ）、またはトリシクロ−ＤＮＡヌクレオチドを含んでもよい。リン酸の中心リン原子とヌクレオシドまたは各ヌクレオシドとの間の結合は、適切には、酸素を介しており、すなわち、ヌクレオシドの３’および／または５’末端は、アルコールである。しかしながら、ヌクレオシドの３’および／または５’末端がアルコールではなく、むしろ好適な類似体であるヌクレオシド類似体も想定される。例えば、ヌクレオシドの３’および／または５’末端は、チオール、セレノール、またはアミンであってもよい。
【００８４】
本発明によるヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、単離または精製された形態で提供されてもよい。
【００８５】
用語「ヌクレオシド」とは、糖部分と核酸塩基とを含有する化合物を指す。例示的な糖としては、リボース、２−デオキシリボース、アラビノースなどが限定することなく含まれる。例示的な核酸塩基としては、チミン、ウラシル、シトシン、アデニン、グアニン、プリン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、４−フルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−トリフルオロメチルウラシル、５−フルオロシトシン、５−クロロシトシン、５−ブロモシトシン、５−ヨードシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−８−アザグアニン、イソシトシン、イソグアニンなどが限定することなく含まれる。
【００８６】
本明細書で使用される用語「ヌクレオシド類似体」とは、糖部分が任意の他の環式または非環式構造で置き換えられている修飾ヌクレオシドを指す。糖部分が別の環式構造で置き換えられている例示的なヌクレオシド類似体としては、モルホリノ（ＰＭＯ）の単量体単位およびトリシクロ−ＤＮＡが限定することなく含まれる。糖部分が非環式構造で置き換えられている例示的なヌクレオシド類似体としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の単量体単位およびグリセリン核酸（ＧＮＡ）が限定することなく含まれる。
【００８７】
用語「ヌクレオシド類似体」は、その任意の部分がいかなる性質の化学基によっても置き換えられているヌクレオシドをさらに指す。例示的なこのようなヌクレオシド類似体としては、２’−フルオロ、２−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−β−メトキシエチル、２’−Ｏ−アリルリボリボヌクレオシド、２’−アミノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）単量体などの２’−置換ヌクレオシドが限定することなく含まれる。
【００８８】
好適には、ヌクレオシド類似体は、糖部分が、以下に描写されるモルホリン環によって置き換えられているヌクレオシド類似体を含んでもよい。
【化２０】
0006632605.tif 000021
【００８９】
この種類の構造において、従来の糖化学反応に適用される符号３’および５’が類推によって適用されることが理解されるであろう。すなわち、描写された構造において、環のヒドロキシメチル置換基は、５’末端と見なされ、一方三価の窒素は、３’末端と見なされる。
【００９０】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド類似体」とは、いずれかのそのリン酸基において化学的に修飾されているか、またはそのヌクレオシドがヌクレオシド類似体によって置き換えられた、修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。例示的なオリゴヌクレオチド類似体としては、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＳ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（モルホリノ、ＰＭＯ）、トリシクロ−ＤＮＡ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が限定することなく含まれる。
【００９１】
用語「ペプチド核酸」は、通常、ペプチド結合がリン酸基に取って代わるオリゴヌクレオチド類似体に関する。しかしながら、本明細書で使用されるように、これは、本発明による修飾リン酸基を組み込むことができる化合物を含む。これらの化合物もまた、本出願によってカバーされることが理解される。
【００９２】
本明細書で使用される用語「リン酸基」とは、任意の水素原子が、１、２、または３個の有機ラジカルによって置き換えられ、それぞれホスホエステル、ホスホジエステル、またはホスホトリエステルを供与するリン酸Ｈ３ＰＯ４を指す。
【００９３】
用語「修飾リン酸基」とは、リン原子に連結する任意の酸素が、いかなる性質の化学基によっても置き換えられているリン酸基を指す。好適な置き換えは、硫黄、セレン、イミノ（ＮＲ）、およびボラン（−ＢＨ３−）を含んでもよい。例えば、この基は、ホスホロチオエート基、ホスホロセレノエート、またはボラノリン酸基であってもよい。好ましくは、「修飾リン酸基」は、ホスホロチオエート基である。
【００９４】
それらの置換に応じて、本明細書に記載されるリン酸および修飾リン酸は、キラルであってもよいことが理解されるであろう。立体化学反応が表示されていない場合、その構造は、ＲｐおよびＳｐ配置の両方を、それぞれ分離した状態で、およびその混合物として（例えば、ラセミ混合物）として包含する。例えば、限定されるものではないが、描写される構造：
【化２１】
0006632605.tif 000022
は、
【化２２】
0006632605.tif 000023
【化２３】
0006632605.tif 000024
【化２４】
0006632605.tif 000025
を包含する。
【００９５】
本明細書に記載される化合物は、複数のキラル中心を含有してもよいことが理解されるであろう。他の指示がある場合を除き、全てのエナンチオマおよびジアステレオマが包含されることが意図されている。
【００９６】
本明細書で使用される用語「保護オリゴヌクレオチド」とは、１個以上の保護基を組み込むオリゴヌクレオチドを指す。
【００９７】
本明細書で使用される用語「脱保護オリゴヌクレオチド」とは、１個以上の保護基が除去されたオリゴヌクレオチドを指す。
【００９８】
ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドへの言及は、それらの保護された形態を含むことが理解されるであろう。
【００９９】
用語「保護基」とは、化合物中の反応性部位を一時的に遮断するために用いられる化学基を指す。保護基は、特定の条件下で除去される。例示的な保護基としては、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、イソブチリル（Ｉｂｕ）、ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル（Ｔａｃ）、レブリニル（Ｌｅｖ）、メチル（Ｍｅ）、２−シアノエチル（ＣＥ）、アリル（Ａｌｌ）、２−クロロフェニル（ｏ−ＣｌＰｈ）、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、４−メトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）などが限定することなく含まれる。
【０１００】
本明細書で使用される用語「リンカ」は、化合物を固体支持体に連結し、前記化合物を前記固体支持体から解放する特定の条件下で切断される化学基を包含する。固相オリゴヌクレオチド合成で使用される例示的なリンカとしては、スクシニル、ジグリコリル、オキサリル、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−ジアセチル（Ｑ−リンカ）、フタロイル、４，５−ジクロロフタロイル、マロニル、グルタリル、ジイソプロピルシリル、１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイルなどが限定することなく含まれる。
【０１０１】
他のリンカは、オリゴヌクレオチドもしくは修飾オリゴヌクレオチドに挿入された非ヌクレオチド化学基（「ヌクレオシド間／ヌクレオチド間リンカ」）、またはヌクレオチドと別の化学的部分との間の連結を形成する非ヌクレオチド化学基、例えば、標識もしくはクエンチャを含んでもよい。好適なリンカは、当該技術分野において公知であり、１，１２−ドデカンジオールホスフェート（ＤＤ）を含む。
【０１０２】
用語「固体支持体」とは、固相オリゴヌクレオチド合成で使用されるポリマ支持体を指す。例示的な固体支持体としては、多孔性球状グラスビーズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、ポリスチレン樹脂、ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）樹脂、ＴＳＫ  Ｇｅｌ（登録商標）Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）樹脂、ポリ（ビニルアルコール）樹脂などが限定することなく含まれる。本明細書で使用される用語「固体支持体」は、例えば、多重オリゴヌクレオチド合成で使用される固体支持体の非樹脂型も指し、フィルタディスク、マルチピンシステム、マルチウェルプレートなどが限定することなく含まれる。
【０１０３】
本明細書で使用される用語「有機ラジカル」とは、炭素における遊離原子価を伴う、任意の他の原子に連結された１個以上の炭素原子を含有する化学基を指す。他の原子の例としては、水素、窒素、酸素、フッ素、ケイ素、リン、硫黄、塩素、臭素、およびヨウ素が限定することなく含まれる。
【０１０４】
本明細書で使用される用語アルキルとは、直鎖および分岐鎖の環式および非環式形態の両方を指す。用語「アルキル」は、一価の直鎖状または分岐状の飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。Ｃ１〜４アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、またはｔ−ブチル基が限定することなく含まれる。
【０１０５】
用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し、いくつかの実施形態では、炭素−炭素三重結合を含まない、一価の、直鎖状または分岐状の、不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。いくつかの実施形態では、アルケニルは、Ｃ２〜１０アルケニルであり、いくつかの実施形態では、Ｃ２〜６アルケニルであり、いくつかの実施形態では、Ｃ２〜４アルケニルである。
【０１０６】
用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し、いくつかの実施形態では、炭素−炭素二重結合を含まない、一価の、直鎖状または分岐状の、不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。いくつかの実施形態では、アルキニルは、Ｃ２〜１０アルキニルであり、いくつかの実施形態では、Ｃ２〜６アルキニルであり、いくつかの実施形態では、Ｃ２〜４アルキニルである。
【０１０７】
用語「複素環式化合物」とは、複素環式基を含む化合物を指す。用語「複素環式基」とは、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｔ（式中、ｔは、０、１、または２である）、またはＮから選択される１個以上の（例えば、１、２、３、４、または５個の）環ヘテロ原子を含有する、飽和の、部分的に不飽和の、または不飽和の（例えば、芳香族）単環式または二環式基を指し、非置換基と、１個以上の置換基（例えば、１、２、３、４、または５個の置換基）で置換された基とを含み、任意選択で、１個以上の置換基が一緒になって、さらなる環系を形成する。本明細書に特に明記されない限り、複素環式基が別の基に結合される場合、複素環式基は、Ｃ連結またはＮ連結してもよく、すなわち、これは、環炭素原子を通して、または環窒素原子（すなわち、環内窒素原子）を通して分子の残りの部分に連結してもよい。したがって、用語複素環式基は、本明細書で定義される、任意選択で置換されているヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルケニル、およびヘテロアリール基を含む。
【０１０８】
用語「アリール」は、フェニルまたはナフチル（例えば、１−ナフチルまたは２−ナフチル）などの一価の芳香族環式ヒドロカルビル基を含む。一般に、アリール基は、単環式または多環式縮合環芳香族基であってもよい。
【０１０９】
用語「ヘテロアリール」は、１個以上の炭素原子が、それぞれ、Ｏ、Ｓ、Ｎ、およびＮＲＮ（式中、ＲＮは、本明細書で定義されている）から独立して選択されるヘテロ原子によって置き換えられているアリール基を含む。
【０１１０】
用語「ハロゲン」とは、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および−Ｉを指す。いくつかの実施形態では、ハロゲンは、−Ｆ、−Ｃｌ、または−Ｂｒである。いくつかの実施形態では、ハロゲンは、−Ｆまたは−Ｃｌであり、例えばＣｌである。
【０１１１】
一般に、ヘテロアリール基は、単環式または多環式（例えば、二環式）縮合環ヘテロ芳香族基であってもよい。通常、ヘテロアリール基は、５〜１０員を含有し、１、２、３、または４個の環員は、独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ、およびＮＲＮから選択される。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、用語「任意選択で置換されている」とは、１個以上の（その置換基上の遊離原子価の最大数までの）置換基で置換され得る置換基を指す。置換基は、
−Ｃ１〜４アルキル、
−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、
−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＳＣＦ３、
−ＯＨ、−Ｌ−ＯＨ、−Ｏ−Ｌ−ＯＨ、−ＮＨ−Ｌ−ＯＨ、−ＮＲ３０−Ｌ−ＯＨ、
−ＯＣ１〜４アルキル、−Ｌ−ＯＣ１〜４アルキル、−Ｏ−Ｌ−ＯＣ１〜４アルキル、−ＮＨ−Ｌ−ＯＣ１〜４アルキル、−ＮＲ３０−Ｌ−Ｏ  Ｃ１〜４アルキル、
−ＳＨ、−ＳＣ１〜４アルキル、
−ＣＮ、
−ＮＨ２、−ＮＨＣ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−Ｌ−ＮＨ２、−Ｌ−ＮＨＣ１〜４アルキル、−Ｌ−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜４アルキル、
−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、
−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ１〜４アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２、
−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜４アルキル、および
＝Ｏから選択されてもよく、
式中、各−Ｌ−は、結合またはＣ１〜４アルキレンであり、Ｒ３０は、−Ｃ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、または−Ｃ５〜１０ヘテロアリールである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、これらの任意選択の置換基は、−Ｃ１〜４アルキル、−Ｆ、−Ｃｌ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＯＣ１〜４アルキル、−ＮＨ２、−ＮＨＣ１〜４アルキル、および−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）２から選択される。
【０１１４】
本明細書で使用される用語「周囲温度」とは、１５〜２９℃の範囲、好ましくは２０〜２５℃の範囲の温度を指す。
【０１１５】
［反応］
本明細書に記載されるように、本発明の修飾リン酸部分の主な長所は、本発明者らにより立証されるような、これらの部分の好都合な組み込みである。例えば、式ＶＩの修飾リン酸部分は、Ｈ−ホスホネートまたはホスホルアミダイト化学反応に基づく逐次的オリゴヌクレオチド合成中に、オリゴヌクレオチドに容易に組み込まれ得る。したがって、本発明は、本発明の化合物を合成する方法を提供する。これらの方法は、固体支持試薬を用いてもよく、ＤＮＡシンセサイザで行われてもよい。
【０１１６】
ホスホリルイソ尿素、ホスホリルイソチオ尿素、ホスホリルイミデート、およびホスホリルイミドチオエートは、とりわけ反応性の中間体であり、これは、第一級または第二級アミンとの反応の際に、本明細書に記載されるように、ホスホリルグアニジンまたはホスホリルアミジンに変換され得ることが理解されるであろう（例えば、実施例７および８を参照）。したがって、本発明はまた、ホスホリルグアニジンまたはホスホリルアミジン基を有する本明細書に記載される化合物を合成する方法も提供し、この方法は、ホスホリルイソ尿素、ホスホリルイソチオ尿素、ホスホリルイミデート、またはホスホリルイミドチオエート基を有する本明細書に記載される化合物を、第一級または第二級アミンと反応させることを含む。
【０１１７】
（Ｈ−ホスホネート化学反応）
Ｈ−ホスホネート化学反応は、化学的オリゴヌクレオチド合成の便利で確立された方法である。好適には、固体支持体にリンカを介して固定された５’−ＤＭＴ−保護ヌクレオチドは、逐次的脱保護、次いで、Ｈ−ホスホネートモノエステルとのカップリング反応を受け、Ｈ−ホスホネートジエステルを形成する。さらに、ヌクレオシド単位が、順序通りに添加され、脱トリチル、次いでカップリングのステップ後に、ヌクレオシド間Ｈ−ホスホネートジエステル連結のホスホジエステル連結への酸化が、酸化剤、通常はヨウ素によって、組立ての終わりに起こる。
【０１１８】
本発明者らは、本明細書に記載されるように、本発明の修飾リン酸基が、Ｈ−ホスホネート化学反応によって組み立てられたオリゴヌクレオチドに容易に組み込まれ得ることを示した。修飾リン酸を組み込むために、本明細書に記載されるように、遊離塩基として、またはその塩形態で、例えば、塩酸塩または他の塩として存在し得る好適なグアニジン、アミジン、イソ尿素、イソチオ尿素、イミデート、またはイミドチオエートの存在下で、好適な酸化剤を用いて、酸化を行うことができる。好適な酸化剤としては、ヨウ素Ｉ２、臭素Ｂｒ２、塩素Ｃｌ２、塩化ヨウ素ＩＣｌ、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミド、四塩化炭素ＣＣｌ４、ブロモトリクロロメタンＣＣｌ３Ｂｒ、テトラブロモメタンＣＢｒ４、テトラヨードメタンＣＩ４、ヨードホルムＣＨＩ３、ヘキサクロロエタンＣ２Ｃｌ６、およびヘキサクロロアセトン（ＣＣｌ３）２ＣＯが含まれる。好ましい酸化剤は、ヨウ素である。
【０１１９】
当然のことながら、１個以上の修飾リン酸基を組み込むための酸化の後に、鎖組立て中の適切な時点でさらなる酸化ステップが行われつつ、脱トリチル、その後のカップリングのサイクルを再開することができることが理解されるであろう。このようにして、本発明による修飾リン酸基は、鎖組立て中の適切な時点で組み込まれ得る。
【０１２０】
ピリジン、２−ピコリン、３−ピコリン、４−ピコリン、キノリン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、アセトニトリルを含む、当該技術分野において公知の様々な溶媒が使用されてもよい。ピリジンが好ましい溶媒である。
【０１２１】
酸化ステップ中に塩基を含むことが好ましい場合がある。好適には、塩基は、アミン塩基、例えば、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、トリブチルアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、ピリジン、２，６−ルチジン、２，４，６−コリジン、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（「プロトンスポンジ」）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン（ＭＴＢＤ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、２，８，９−トリメチル−２，５，８，９−テトラアザ−１−ホスファビシクロ［３．３．３］ウンデカン、またはホスファゼン塩基である。例えば、塩基は、トリエチルアミンまたはＤＢＵであってもよい。
【０１２２】
本発明者らは、修飾リン酸モチーフ（複数可）を組み込む酸化ステップ中に、シリル化試薬の添加が望ましい場合があることを見出した。したがって、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）、クロロトリメチルシラン、ブロモトリメチルシラン、ヨードトリメチルシラン、トリエチルシリルクロリド、トリフェニルシリルクロリド、ヘキサメチルジシラザン、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）、ジメチルイソプロピルシリルクロリド、ジエチルイソプロピルシリルクロリド、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド、トリイソプロピルシリルクロリド、ジメチルジクロロシラン、ジフェニルジクロロシランまたは類似物が添加されてもよい。好ましいシリル化試薬は、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）である。
【０１２３】
（ホスホルアミダイト化学反応）
ホスホルアミダイト化学反応も、化学的オリゴヌクレオチド合成の魅力的な方法である。ホスホルアミダイト化学反応をベースとするオリゴヌクレオチド化学反応に関連するサイクルは、当該技術分野において公知である。簡単に言うと、固体支持されたヌクレオチドを脱トリチルし、次いで、適切に活性化されたヌクレオシドホスホルアミダイトとカップリングし、亜リン酸トリエステル連結を形成する。次いでキャッピングが起こり、その後、亜リン酸トリエステルの酸化剤、通常ヨウ素による酸化が続く。次いで、このサイクルが繰り返され、鎖を組み立てる。
【０１２４】
本発明者らは、本明細書に記載されるように、その塩形態で、例えば、塩酸塩として存在してもよい好適なグアニジン、アミジン、イソ尿素、またはイソチオ尿素の存在下でこのような酸化ステップを行うことを、所望の修飾リン酸基（複数可）を生成するために使用することができることを見出した。β−シアノエチルホスファイト保護基の除去が、合成を完結させる。Ｈ−ホスホネート法における酸化ステップについて上に記載したように、塩基および／またはシリル化剤の組み入れが、望ましい場合がある。
【０１２５】
（有機アジドの使用）
任意選択でＢＳＡなどのシリル化剤の存在下で、ジヌクレオシドβ−シアノエチルホスファイトと好適な有機アジドとの反応を通して本発明の修飾リン酸基を得るための新規反応も本明細書に記載される。塩基、例えば、アミン塩基、例えば、トリエチルアミンが組み入れられてもよい。
【０１２６】
本発明者らは、この方法が、非置換の、一置換の、二置換の、三置換の、および四置換のホスホリルグアニジン基を有するものなどの様々なホスホリルグアニジン置換パターンを備えたオリゴヌクレオチドの調製に、ならびにこのタイプの複数の修飾リン酸基を有するオリゴヌクレオチドの調製に有効であることを示した。
【０１２７】
好適には、有機アジドは、式Ｒ１−Ｃ＋（Ｎ３）−Ｒ２のアジド、例えば、ビス（二置換アミノ）−１−アジドカルベニウム塩、１−（二置換アミノ）−１−アジドカルバミジニウム塩など、または１−（二置換アミノ）−１−アジド−エテン、Ｎ−置換−１−アジドカルバミジン、または式（Ｎ３）２Ｃ＝ＮＲ２、（Ｎ３）２Ｃ＝Ｎ＋Ｒ１ＡＲ１Ｂのアジド、もしくはシアノゲンアジドＮ３−ＣＮであり得る。この有機アジドは、当該技術分野において公知の方法を用いて調製されてもよい。例えば、テトラアルキル尿素は、アジドビス（ジアルキルアミノ）カルベニウム塩に変換することができ［６０］、ジアルキルアミドは、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−アジドカルバミジニウム塩に変換することができ［６１］、一方トリアルキル尿素またはモノアルキルアミドは、中性アジドを供与することができる［６２］。
【０１２８】
好適には、有機アジドは、
【化２５】
0006632605.tif 000026
または
【化２６】
0006632605.tif 000027
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、およびＲ２Ｂは、本明細書で定義された通りである）から選択されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、さらに−Ｎ３であってもよい。
【０１２９】
例えば、アジドは、
【化２７】
0006632605.tif 000028
（式中、各Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂは、独立して、−Ｈまたは任意選択で置換されているＣ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、もしくは−Ｃ５〜１０ヘテロアリールであり、ならびに／あるいは
任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に、２〜４個の原子の長さのアルキレンもしくはヘテロアルキレン鎖を形成し、任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し、Ｒ１ＢおよびＲ２Ｂは、それぞれ独立して、−Ｈおよびメチルから選択され、
任意選択で、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、これらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環を形成し、または、
任意選択で、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、これらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環、任意選択でピロリジンを形成する）
または
【化２８】
0006632605.tif 000029
（式中、各Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、独立して−Ｈまたは任意選択で置換されているＣ１〜１０アルキル、−Ｃ２〜１０アルケニル、−Ｃ２〜１０アルキニル、−Ｃ６〜１０アリール、もしくは−Ｃ５〜１０ヘテロアリールであり、あるいは、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、これらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環を形成し、Ｒ２は、−Ｈ、−Ｆ、−ＯＰＧ、Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＣＮ、−Ｎ３、−Ｏ−Ｃ１〜１０アルキル、−ＳＰＧ、および−Ｓ−Ｃ１〜１０アルキルから選択され、ＰＧは、保護基である）
から選択されてもよい。
【０１３０】
いくつかの好ましい反応において、有機アジドは、好適な対イオン、例えば塩化物を伴う
【化２９】
0006632605.tif 000030
である。
【０１３１】
好適な対イオンとしては、塩化物Ｃｌ−、臭化物Ｂｒ−、ヨウ化物Ｉ−、トリフレート（トリフルオロメタンスルホネート）ＣＦ３ＳＯ３−、ｐ−トルエンスルホネートＣ７Ｈ７ＳＯ３−、ジクロロホスフェートＰＯ２Ｃｌ２−、過塩素酸塩ＣｌＯ４−、テトラフルオロボレートＢＦ４−、テトラフェニルボレートＢＰｈ４−、ヘキサフルオロホスフェートＰＦ６−などが限定することなく含まれる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、およびＲ２Ｂのそれぞれは、独立して、−Ｈまたは任意選択で置換されているＣ１〜１０アルキルであり、例えば、Ｈまたは任意選択で置換されているＣ１〜４アルキルであり、例えば、−Ｈまたはメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１Ａ、Ｒ１Ｂ、Ｒ２Ａ、およびＲ２Ｂのそれぞれは、メチルであり、すなわち、得られたリン酸は、テトラメチルグアニジンで修飾されている。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に２〜４個の原子の長さのアルキレンまたはヘテロアルキレン鎖を形成し、Ｒ１ＢおよびＲ２Ｂは、それぞれ独立して、−Ｈおよび−Ｃ１〜４アルキルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ１ＡおよびＲ２Ａは、一緒に−ＣＨ２−ＣＨ２−を形成し、Ｒ１ＢおよびＲ２Ｂは、−Ｈまたはメチルである。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１ＡおよびＲ１Ｂは、これらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環、好ましくは、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、またはモルホリンを形成する。例えば、これらは、これらが結合する原子と一緒に、５員の複素環、好ましくはピロリジンを形成する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、Ｒ２ＡおよびＲ２Ｂは、これらが結合する原子と一緒に、５〜８員の複素環、好ましくは、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、またはモルホリンを形成する。例えば、これらは、これらが結合する原子と一緒に、５員の複素環、好ましくはピロリジンを形成する。
【０１３６】
（手順Ａおよび手順Ｂ）
本明細書に記載される化合物は、本明細書に記載されるように、手順Ａまたは手順Ｂを用いて合成されてもよい。これらの手順は、本明細書に記載され、添付の実施例で例示されるように、自動オリゴヌクレオチド合成で使用されてもよい。
【０１３７】
手順Ａは、
（ｉ）前記亜リン酸誘導体を含有する保護されたオリゴヌクレオチドまたは保護された修飾オリゴヌクレオチドが取り付けられた固体支持体を、前記酸化剤、イミノ誘導体、ならびに任意選択で、シリル化試薬、塩基、および溶媒を含有する混合物中に浸漬することと、
（ｉｉ）必要とされる範囲内に温度を維持しながら、前記亜リン酸誘導体の修飾リン酸基への変換を確実にするのに十分な時間にわたって固体支持体の浸漬を保持し、これによって、修飾リン酸基を有する式（Ｉ）の修飾オリゴヌクレオチドを生成することと、
（ｉｉｉ）望ましいプロトコルに従って、固相オリゴヌクレオチド合成を、修飾の次の所望の位置まで続けて、次いで、ステップ（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すか、またはオリゴヌクレオチド配列の末端まで続けることと、
（ｉｖ）所望の脱保護および／または固体支持体からの切断を行い、これによって、１個以上の修飾リン酸基を有する式（Ｉ）の脱保護された修飾オリゴヌクレオチドを生成することと
を含む。
【０１３８】
手順Ｂは、
（ｉ）前記亜リン酸誘導体を含有する保護されたオリゴヌクレオチドまたは保護された修飾オリゴヌクレオチドが取り付けられた固体支持体を、前記有機アジド、溶媒、ならびに任意選択で、シリル化試薬および塩基を含有する混合物中に浸漬することと、
（ｉｉ）手順Ａのステップ（ｉｉ）〜（ｉｖ）を繰り返すことと
を含む。
【０１３９】
修飾オリゴヌクレオチドは、この方法の終わりに回収される。
【０１４０】
これらの方法は、−２０〜１５０℃、好ましくは０〜１００℃、より好ましくは１５〜８０℃の温度で行われてもよい。
【０１４１】
好ましくは、手順Ａは、周囲温度で行われる。
【０１４２】
手順Ａにおけるイミノ誘導体の濃度は、好適には０．００５〜３Ｍであり、より好ましくは０．１〜１．５Ｍである。
【０１４３】
手順Ｂにおけるアジドの濃度は、好適には０．００５〜３Ｍであり、好ましくは０．１〜１．５Ｍである。
【０１４４】
任意選択で、シリル化試薬が添加されてもよい。好適なシリル化剤としては、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（ＢＳＴＦＡ）、クロロトリメチルシラン、ブロモトリメチルシラン、ヨードトリメチルシラン、トリエチルシリルクロリド、トリフェニルシリルクロリド、ヘキサメチルジシラザン、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）、ジメチルイソプロピルシリルクロリド、ジエチルイソプロピルシリルクロリド、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロリド、トリイソプロピルシリルクロリド、ジメチルジクロロシラン、ジフェニルジクロロシランなどが含まれる。いくつかの好ましい実施形態では、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）が、シリル化剤として用いられる。
【０１４５】
任意選択で、塩基が添加されてもよい。好適な塩基はアミン塩基、例えば、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン、トリブチルアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ）、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）、ピリジン、２，６−ルチジン、２，４，６−コリジン、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１，８−ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン（「プロトンスポンジ」）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、１，５−ジアザビシクロ［４．３．０］ノナ−５−エン（ＤＢＮ）、１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン（ＴＢＤ）、７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン（ＭＴＢＤ）、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）、２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、２，８，９−トリメチル−２，５，８，９−テトラアザ−１−ホスファビシクロ［３．３．３］ウンデカン、ホスファゼン塩基などである。
【０１４６】
好ましい塩基は、トリエチルアミンである。
【０１４７】
手順Ａに好適な溶媒としては、ピリジン、２−ピコリン、３−ピコリン、４−ピコリン、キノリン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタン（ＤＭＥ）、ジエチレングリコールジメチルエーテル（ジグリム）、ジエチルエーテル、アセトニトリルなどが含まれる。
【０１４８】
手順Ａに好ましい溶媒は、ピリジンである。
【０１４９】
手順Ｂに好適な溶媒としては、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、テトラメチル尿素、１，３−ジメチルイミダゾリジン−２−オン、スルホラン、ヘキサメチルホスホルトリアミド（ＨＭＰＴ）、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、アセトン、酢酸エチルなどが含まれる。
【０１５０】
手順Ｂに好ましい溶媒は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、およびアセトニトリルを含む。
【０１５１】
［オリゴヌクレオチド用途］
本発明によるオリゴヌクレオチドは、広範囲にわたる用途に使用されてもよい。例えば、これらは、インビトロで、例えば、研究もしくは診断剤として、またはインビボで、例えば、治療剤、診断剤もしくは研究剤として使用されてもよい。
【０１５２】
したがって、本発明の一態様では、方法が提供され、この方法は、本発明によるオリゴヌクレオチド（好ましくは一本鎖）を、高度の配列同一性を有するオリゴヌクレオチド（好ましくは一本鎖）と、インビトロまたはインビボで接触させ、これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する）ことを含む。この方法は、任意選択で、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出および／または定量化するステップをさらに含んでもよい。この方法は、特異的オリゴヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドを含有する変異体、バリアント、または一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する方法であり得る。この方法は、例えば、患者から採集した組織または体液の試料中のオリゴヌクレオチドの検出を伴う、患者における疾患の存在を診断する方法であってもよい。
【０１５３】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法などの核酸の増幅の方法におけるプライマとして働くよう設計および合成されてもよい。
【０１５４】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイの使用が必要である方法において使用されるオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（「ＤＮＡチップ」）として設計および製造されてもよい。
【０１５５】
本発明によるオリグヌクレオチドはまた、ｓｉＲＮＡ（エンジェル（Ａｎｇｅｌｌ）＆バウルクーム（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ）（１９９７）Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６、１２：３６７５〜３６８４；ならびにヴォワネ（Ｖｏｉｎｎｅｔ）＆バウルクーム（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ）（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：ｐｇ５５３；ファイヤー（Ｆｉｒｅ）  Ａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ  ３９１、（１９９８）；ファイヤー（Ｆｉｒｅ）（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５：３５８〜３６３、シャープ（Ｓｈａｒｐ）（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５〜４９０、ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）ｅｔ  ａｌ．、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｓ  ２：１１１０〜１１１９およびトゥシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）（２００１）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２：２３９〜２４５）、リボザイム、アプタマ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９０  Ａｕｇ  ３；２４９（４９６８）：５０５〜１０；国際公開第９１／１９８１３号）、ＤＮＡザイム、アンチセンス、ＰＭＯ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、またはギャップマなどの治療用核酸を設計および合成するために使用されてもよい。オリゴヌクレオチドをベースとする療法は、例えば、ウイルス感染またはウイルス媒介性疾患、癌、加齢黄斑変性症などの眼の障害の処置において、不要な血管新生、デュシェンヌ型筋ジストロフィなどのエクソンスプライシング欠乏障害の予防において、および抗コレステロール剤としてなど、様々な疾患を処置することが当該技術分野において周知である。このような処置のための既知のまたは提案されるオリゴヌクレオチド薬剤の設計は、本明細書に記載される修飾リン酸（複数可）を組み込むように修飾され得る。任意選択で、治療用核酸は、細胞透過性ペプチド（例えば、国際公開第２００９／１４７３６８号に記載されるもの）などの送達薬剤にコンジュゲートされてもよい。
【０１５６】
したがって、一態様では、本発明によるオリゴヌクレオチドは、医学的処置の方法において使用するために、または療法で使用するために提供される。別の態様では、疾患の処置における使用のための医薬品または医薬組成物の製造における本発明によるオリゴヌクレオチドの使用が提供される。別の態様では、疾患の処置方法が提供され、この方法は、本発明によるオリゴヌクレオチドを、それを必要とする患者に投与し、これによって前記疾患を処置することを含む。
【０１５７】
本発明によるオリゴヌクレオチドは、医薬品または医薬組成物として製剤化されてもよい。医薬品または医薬組成物は、例えば、精製または単離された形態の本発明のオリゴヌクレオチドと、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはアジュバントとを含んでもよい。
【０１５８】
本発明の態様による医薬品および医薬組成物は、非経口、静脈内、動脈内、筋肉内、経口、および経鼻が含まれるが、これらに限定されないいくつかの経路による投与のために製剤化され得る。医薬品および組成物は、液体または固体形態で製剤化されてもよい。液体製剤は、ヒトまたは動物の体の選択された領域への注射による投与用に製剤化され得る。
【０１５９】
投与は、「治療的有効量」であることが好ましく、これは、個体への利益を示すのに十分なものである。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置される疾患の性質および重症度に応じるであろう。処置の処方、例えば、投与量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、通常は、処置される障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、および施術者に既知の他の因子を考慮に入れる。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ出版で見ることができる。
【０１６０】
本発明による方法は、インビトロまたはインビボで行われてもよい。用語「インビトロ」は、実験室条件での、または培養における材料、生体物質、細胞および／または組織を用いる実験を包含することが意図され、一方、用語「インビボ」は、完全な多細胞生物を用いる実験および手順を包含することが意図される。
【０１６１】
処置される対象は、任意の動物またはヒトであってもよい。対象は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。対象は、非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。対象は、男性であってもまたは女性であってもよい。対象は、患者であってもよい。
【０１６２】
本発明は、態様と記載される好ましい特徴との組み合わせを含むが、このような組み合わせが、明らかに許容されないか、または明示的に回避される場合は除く。
【０１６３】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成的目的のためのものにすぎず、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１６４】
本発明の態様および実施形態が、添付の図面を参照して、例としてここで例証される。さらなる態様および実施形態は、当業者に明らかであろう。本文書で言及される全ての文献は、本願に引用して援用する。
【０１６５】
以下に続く特許請求の範囲を含める本明細書の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化型は、記載されている整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含めることを暗示するが、他のいかなる整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群も除外することを暗示するものではないことが理解されるであろう。
【０１６６】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを指示していない限り、複数の指示対象を含むことに留意せねばならない。範囲は、「約」１つの特定値から、および／または「約」別の特定値までとして、本明細書で表されてもよい。このような範囲が表されるとき、別の実施形態は、１つの特定値からおよび／または他の特定値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用によって近似値として表されるとき、特定値は別の実施形態を形成することが理解されるであろう。
【０１６７】
本発明は、その特定の実施形態を参照して記載されてきたが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更および等価物の置換がなされてもよいことを当業者は理解するべきである。
【０１６８】
加えて、特定の状況、材料、物質の組成、工程、１つ以上の工程ステップを本発明の目的とする趣旨および範囲に適合させるために、多くの修正が行われてもよい。全てのこのような修正は、本明細書に添付された請求項の範囲内であることが意図される。
【０１６９】
本発明は、対応する図面を参照して、以下の非限定的な実施例によって、ここで例証される。
【実施例】
【０１７０】
以下の実施例は、例証として提供されるものであり、本発明を限定するよう意図されない。
【０１７１】
［一般法］
修飾オリゴヌクレオチドを、標準１２μｌのカラムを使用する０．２μｍｏｌスケールで、β−シアノエチルホスホルアミダイト化学反応［５８］またはＨ−ホスホネート化学反応［６６］のいずれかを用いて、Ｂｉｏｓｓｅｔ自動ＤＮＡシンセサイザＡＳＭ−８００で合成した。
【０１７２】
全ての反応は、ねじ込みキャップおよびゴム製Ｏリングを備えた１．５ｍｌのポリプロピレン管内で行った。固相合成後に、ポリマ支持体を、カラムからプラスチック管に移し、支持体５ｍｇ当たり２００μｌのデブロッキング溶液で処理した。濃縮（約３３％）水性アンモニア溶液（溶液Ａ）またはエチレンジアミンと無水エタノールとの１：１容量比の混合物（溶液Ｂ）を、デブロッキング溶液として使用した。デブロッキング後に、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器を用いて、上清を減圧中で蒸発させ、２０ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７、４００μｌを添加し、支持体を遠心分離によって除去した。
【０１７３】
修飾オリゴヌクレオチドを、Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ−Ｃ１８（５μｍ）カラム（４．６×１５０ｍｍ）上で、０．０２Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７中、３０分間、アセトニトリルの０〜４０％の勾配、流速２ｃｍ３ｍｉｎ−１を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズクロマトグラフで、ＤＭＴｒ  ＯＦＦまたはＤＭＴＲ  ＯＮモードのいずれかにおける逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣによって精製した。５’末端ＤＭＴｒ基を、８０％の酢酸１００μｌによる１５分の処理によって除去し、その後、２０ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７．０、４００μｌで中和し、ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器で蒸発させた。次いで、アセトン中１ＭのＬｉＣｌＯ４、１ｍｌを添加することによって、オリゴヌクレオチドを沈殿させ、ペレットをアセトンで洗浄し、空気で２０分間乾燥させた。２０％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）中の変性ゲル電気泳動を用いて、ステインズ−オール（Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ）による染色によって可視化されたバンドで、オリゴヌクレオチドの純度をチェックした。修飾オリゴヌクレオチドの構造を、３−ヒドロキシピコリン酸をマトリックスとして用いるブルカーリフレックスＩＩＩオートフレックススピード（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＩＩ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  Ｓｐｅｅｄ）質量分析計で、陰イオンまたは陽イオンモードのいずれかで記録されたマトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトルによって確認した。
【０１７４】
（ビス（ジメチルアミノ）アジドカルベニウムジクロロホスフェートの０．５Ｍ溶液の調製）
乾燥ＭｅＣＮ（１０ｍｌ）中、ビス（ジメチルアミノ）クロロカルベニウムジクロロホスフェート（１．１０５ｇ、４．１ｍｍｏｌ）の溶液に、粉末化した乾燥ＮａＮ３（１．１当量、２８８ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を添加した。懸濁液を周囲温度で２時間撹拌し、濾過し、乾燥ＭｅＣＮで洗浄し、減圧中で蒸発および乾燥させ、油状生成物１．０８ｇ（９５％）を得た。生成物の６９ミリグラムを、ＤＭＦ−Ｅｔ３Ｎ  ９５：５（ｖ／ｖ）１ｍｌ中に溶解し、２分間激しく振盪し、１４，５００ｒｐｍでの３分間の遠心分離によって、沈殿物を分離し、０．５Ｍ溶液を得た。この溶液は、周囲温度で最長１週間保管することができる。
【０１７５】
（２−アジド−１，３−ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスフェートの１Ｍ溶液の調製）
２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリニウムヘキサフルオロホスフェート（１３９ｍｇ）およびＮａＮ３（１．１当量、３６ｍｇ）を秤量して、１．５ｍｌのプラスチック管に入れ、乾燥アセトニトリル（０．５ｍｌ）を添加し、懸濁液を３０℃で２時間振盪し、次いで、沈殿物を、１４，５００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって分離した。この溶液を、−１８℃で保管した。
【０１７６】
（アジドジピロリジノカルベニウムヘキサフルオロホスフェートの１Ｍ溶液の調製）
クロロジピロリジノカルベニウムヘキサフルオロホスフェート（１６６ｍｇ）およびＮａＮ３（１．１当量、３６ｍｇ）を秤量して、１．５ｍｌのプラスチック管に入れ、乾燥アセトニトリル（０．５ｍｌ）を添加し、懸濁液を３０℃で２時間振盪し、次いで、沈殿物を、１４，５００ｒｐｍでの５分間の遠心分離によって分離した。この溶液を、−１８℃で保管した。
【０１７７】
＜実施例１：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）の調製；ここおよび以下の実施例でのｐは、修飾リン酸基の位置を表す。＞
【化３０】
0006632605.tif 000031
（ＦＶＩＩＩ）
【０１７８】
１．１．β−シアノエチルホスファイトおよびヨウ素を用いる手順（ａ）
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０１７９】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）１２４μｌ、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＳＡ）５０μｌ、および乾燥ピリジン３２５μｌを混合し、３Åの分子篩を添加して、約１／４容量にすることによって調製した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、プラスチック管内で混合し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、１分待ってから、内容物を、ポリマを含む管に移した。この管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０１８０】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０１８１】
分子質量：計算値［Ｍ］１８６０．３９、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８６０．９３、［Ｍ−Ｈ］１８５９．１４。
【０１８２】
１．２．Ｈ−ホスホネートおよびヨウ素を用いる手順（ａ）
５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、Ｈ−ホスホネート法による自動固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチルおよびＨ−ホスホネートカップリング後に中断させ、カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ジヌクレオシドＨ−ホスホネートが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０１８３】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、ＴＭＧ  １００μｌおよび乾燥ピリジン（２０体積％）４００μｌを混合し、３Åの分子篩を添加して、約１／４容量にすることによって調製した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、支持体を含む管に添加し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０１８４】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０１８５】
分子質量：計算値［Ｍ］１８６０．３９、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８６１．１７、［Ｍ−Ｈ］１８５７．９６。
【０１８６】
１．３．Ｈ−ホスホネート、ＢＳＡ、およびヨウ素を用いる手順（ａ）
５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、Ｈ−ホスホネート法による自動固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチルおよびＨ−ホスホネートカップリング後に中断させ、カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ジヌクレオシドＨ−ホスホネートが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０１８７】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、ＴＭＧ（２Ｍ）１２５μｌ、ＢＳＡ（１Ｍ）５０μｌ、および乾燥ピリジン（２０体積％）３２５μｌを混合し、３Åの分子篩を添加して、約１／４容量にすることによって調製した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、支持体を含む管に添加し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０１８８】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０１８９】
分子質量：計算値［Ｍ］１８６０．３９、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８６１．１７、［Ｍ−Ｈ］１８５７．９６。
【０１９０】
１．４．Ｈ−ホスホネートおよびＣＣｌ４を用いる手順（ａ）
５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、Ｈ−ホスホネート法による自動固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチルおよびＨ−ホスホネートカップリング後に中断させ、カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ジヌクレオシドＨ−ホスホネートが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０１９１】
溶液１を、ＣＣｌ４を３Åの分子篩上に１６時間にわたって保持することによって調製した。溶液２を、ＴＭＧ  １００μｌおよび乾燥ピリジン（２０体積％）４００μｌを混合し、３Åの分子篩を添加し、約１／４の容量にすることによって調製した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、支持体を含む管に添加し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０１９２】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０１９３】
分子質量：計算値［Ｍ］１８６０．３９、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８６０．７８、［Ｍ−Ｈ］１８５８．６７。
【０１９４】
１．５．Ｈ−ホスホネートおよびＣＣｌ３Ｂｒを用いる手順（ａ）
５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、Ｈ−ホスホネート法による自動固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチルおよびＨ−ホスホネートカップリング後に中断させ、カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ジヌクレオシドＨ−ホスホネートが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０１９５】
溶液１を、ＣＣｌ３Ｂｒを３Åの分子篩上に１６時間にわたって保持することによって調製した。溶液２を、ＴＭＧ  １００μｌおよび乾燥ピリジン（２０体積％）４００μｌを混合し、３Åの分子篩を添加して、約１／４容量にすることによって調製した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、支持体を含む管に添加し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０１９６】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０１９７】
分子質量：計算値［Ｍ］１８６０．３９、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８６１．１３、［Ｍ−Ｈ］１８５９．２５。
【０１９８】
１．６．β−シアノエチルホスファイトおよびビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートを用いる手順（ｂ）
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０１９９】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２００】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２０１】
分子質量：計算値［Ｍ］１８６０．３９、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８６０．３５、［Ｍ−Ｈ］１８５７．５４。
【０２０２】
＜実施例２：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴｐＴＴＴＴＴ）の調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、４つのｄＴの組み込み、その後の５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２０３】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、５’−脱トリチルによって、合成を完結させた。
【０２０４】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２０５】
分子質量：計算値［Ｍ］１８６０．３９、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８６０．３４、［Ｍ−Ｈ］１８５８．６３。
【０２０６】
＜実施例３：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴｐＴｐＴ）の調製＞
３．１．Ｈ−ホスホネート、ＢＳＡ、およびヨウ素を用いる手順（ａ）
５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、Ｈ−ホスホネート法による自動固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、２つのｄＴ  Ｈ−ホスホネートの組み込み後に中断させ、カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、トリヌクレオシドビス−Ｈ−ホスホネートが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２０７】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、ＴＭＧ（２Ｍ）１２５μｌ、ＢＳＡ（１Ｍ）５０μｌ、および乾燥ピリジン（２０体積％）３２５μｌを混合し、３Åの分子篩を添加して、約１／４容量にすることによって調製した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、支持体を含む管に添加し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で１０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２０８】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２０９】
分子質量：計算値［Ｍ］１９５７．５５、計測値［Ｍ＋Ｈ］１９５８．２８、［Ｍ−Ｈ］１９５６．３４。
【０２１０】
３．２．β−シアノエチルホスファイトおよびビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートを用いる手順（ｂ）
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２１１】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート８０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ２０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、別のｄＴホスホルアミダイトをカップリングさせ、酸化の前に合成を中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２１２】
アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２１３】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２１４】
分子質量：計算値［Ｍ］１９５７．５５、計測値［Ｍ＋Ｈ］１９５８．３２、［Ｍ−Ｈ］１９５５．４４。
【０２１５】
＜実施例４：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴｐＴｐＴｐＴ）の調製＞
４．１．Ｈ−ホスホネート、ＢＳＡ、およびヨウ素を用いる手順（ａ）
５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、Ｈ−ホスホネート法による自動固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、３つのｄＴ  Ｈ−ホスホネートの組み込み後に中断させ、カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、テトラヌクレオシドトリス−Ｈ−ホスホネートが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２１６】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、ＴＭＧ（２Ｍ）１２５μｌ、ＢＳＡ（１Ｍ）５０μｌ、および乾燥ピリジン（２０体積％）３２５μｌを混合し、３Åの分子篩を添加して、約１／４容量にすることによって調製した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、支持体を含む管に添加し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で１０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２１７】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２１８】
分子質量：計算値［Ｍ］２０５４．７２、計測値［Ｍ＋Ｈ］２０５５．４９。
【０２１９】
４．２．β−シアノエチルホスファイトおよびビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートを用いる手順（ｂ）
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２２０】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート１２０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ３０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、別のｄＴホスホルアミダイトをカップリングさせ、酸化の前に合成を中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２２１】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、別のｄＴホスホルアミダイトをカップリングさせ、酸化の前に合成を中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２２２】
第３のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２２３】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２２４】
分子質量：計算値［Ｍ］２０５４．７２、計測値［Ｍ＋Ｈ］２０５４．４９。
【０２２５】
＜実施例５：ホスホリルグアニジン基（ＦＩＸ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）の調製＞
【化３１】
0006632605.tif 000032
（ＦＩＸ）
【０２２６】
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２２７】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、乾燥グアニジン塩酸塩９．６ｍｇを秤量し、プラスチック管に入れ、乾燥ピリジン８５μｌ、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）１５μｌ、ＢＳＡ  １０μｌを添加することによって調製し、管を５分間ボルテックスし、透明になるまで超音波処理した（約５分間）。溶液１および２のアリコート２０μｌを、プラスチック管中で混合し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、１分待ってから、内容物を、ポリマを含む管に移した。管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２２８】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２２９】
分子質量：計算値［Ｍ］１８０４．２８、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８０４．６２、［Ｍ−Ｈ］１８０３．２５。
【０２３０】
＜実施例６：ホスホリルグアニジン基（ＦＩＸ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴｐＴＴＴＴＴ）の調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、４つのｄＴの組み込み、その後の５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２３１】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、乾燥グアニジン塩酸塩９．６ｍｇを秤量し、プラスチック管に入れ、乾燥ピリジン８５μｌ、ＤＢＵ  １５μｌ、ＢＳＡ  １０μｌを添加することによって調製し、管を５分間ボルテックスし、透明になるまで超音波処理した（約５分間）。溶液１および２のアリコート２０μｌを、プラスチック管中で混合し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、１分待ってから、内容物を、ポリマを含む管に移した。管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、５’−脱トリチルによって、合成を完結させた。
【０２３２】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２３３】
分子質量：計算値［Ｍ］１８０４．２８、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８０４．７６、［Ｍ−Ｈ］１８０３．０６。
【０２３４】
＜実施例７：Ｏ−メチルホスホリルイソ尿素基（ＦＸ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）の調製＞
【化３２】
0006632605.tif 000033
（ＦＸ）
【０２３５】
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２３６】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、乾燥Ｏ−メチルイソ尿素硫酸水素塩８．６ｍｇを秤量し、プラスチック管に入れ、乾燥ピリジン３５μｌ、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）１５μｌ、ＢＳＡ  ５μｌを添加することによって調製し、管を５分間ボルテックスし、透明になるまで超音波処理し（約１０分間）、その後１４，５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、プラスチック管中で混合し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、１分待ってから、内容物を、ポリマを含む管に移した。管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２３７】
溶液Ａで５５℃にて１６時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２３８】
分子質量：計算値［Ｍ］１８１９．２９、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８１９．５９、［Ｍ−Ｈ］１８１８．２６。
【０２３９】
＜実施例８：Ｎ−β−アミノエチルホスホリルグアニジン基（ＦＸＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）の調製＞
【化３３】
0006632605.tif 000034
（ＦＸＩ）
【０２４０】
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２４１】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、乾燥Ｏ−メチルイソ尿素硫酸水素塩８．６ｍｇを秤量し、プラスチック管に入れ、乾燥ピリジン３５μｌ、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）１５μｌ、ＢＳＡ  ５μｌを添加することによって調製し、管を５分間ボルテックスし、透明になるまで超音波処理し（約１０分間）、その後１４，５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、プラスチック管中で混合し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、１分待ってから、内容物を、ポリマを含む管に移した。管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２４２】
溶液Ｂで５５℃にて１６時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２４３】
分子質量：計算値［Ｍ］１８４７．３５、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８４７．１６、［Ｍ−Ｈ］１８４４．７６。
【０２４４】
＜実施例９：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＣｐＡ）の調製＞
５’−ＤＭＴｒ−ｄＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２４５】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２４６】
溶液Ａで周囲温度にて１６時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２４７】
分子質量：計算値［Ｍ］９４１．８０、計測値［Ｍ＋Ｈ］９４２．１７、［Ｍ−Ｈ］９３８．９７。
【０２４８】
３１Ｐ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、δ、ｐｐｍ）：「高速」ジアステレオマ０．３７、「低速」ジアステレオマ０．２１。
【０２４９】
＜実施例１０：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧＣＧＣＣＡＡＡＣｐＡ）の調製＞
５’−ＤＭＴｒ−ｄＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２５０】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２５１】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。このオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣトレースを、図１に提供する。
【０２５２】
分子質量：計算値［Ｍ］３１０３．２１、計測値［Ｍ＋Ｈ］３１０２．１２、［Ｍ−Ｈ］３１００．６１。
【０２５３】
＜実施例１１：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧＣＧＣＣＡＡＡｐＣｐＡ）の調製＞
５’−ＤＭＴｒ−ｄＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２５４】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート８０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ２０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、ｄＡホスホルアミダイトをカップリングさせ、酸化の前に合成を中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２５５】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２５６】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。このオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣトレースを、図１に提供する。
【０２５７】
分子質量：計算値［Ｍ］３２００．３８、計測値［Ｍ＋Ｈ］３１９９．９０、［Ｍ−Ｈ］３１９９．００。
【０２５８】
＜実施例１２：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧＣＧＣＣＡＡｐＡＣｐＡ）の調製＞
５’−ＤＭＴｒ−ｄＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２５９】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート８０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ２０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、次いでｄＡホスホルアミダイト、その後別のｄＡをカップリングさせ、最後の酸化ステップの前に合成を中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２６０】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２６１】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２６２】
分子質量：計算値［Ｍ］３２００．３８、計測値［Ｍ−Ｈ］３１９９．５１。
【０２６３】
＜実施例１３：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧＣＧＣＣＡｐＡＡＣｐＡ）の調製＞
５’−ＤＭＴｒ−ｄＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２６４】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート８０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ２０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、次いで２つのｄＡホスホルアミダイト、その後別のｄＡをカップリングさせ、最後の酸化ステップの前に合成を中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２６５】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２６６】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２６７】
分子質量：計算値［Ｍ］３２００．３８、計測値［Ｍ−Ｈ］３１９９．１５。
【０２６８】
＜実施例１４：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧＣＧＣＣＡＡｐＡｐＣｐＡ）の調製＞
５’−ＤＭＴｒ−ｄＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２６９】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート１２０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ３０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、ｄＡホスホルアミダイトをカップリングさせ、酸化の前に合成を中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２７０】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、ｄＡホスホルアミダイトをカップリングさせ、酸化の前に合成を中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２７１】
第３のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２７２】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。このオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣトレースを、図１に提供する。
【０２７３】
分子質量：計算値［Ｍ］３２９７．５４、計測値［Ｍ−Ｈ］３２９６．８０。
【０２７４】
＜実施例１５：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＡＧｐＡ）の調製＞
５’−ＤＭＴｒ−ｄＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＧホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２７５】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２７６】
溶液Ａで５５℃にて１６時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２７７】
分子質量：計算値［Ｍ］４２３４．９４、計測値［Ｍ−Ｈ］４２３３．８４。
【０２７８】
＜実施例１６：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｐＴ）の調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２７９】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、ＴＭＧ  １２４μｌ、ＢＳＡ  ５０μｌ、および乾燥ピリジン３２５μｌを混合し、３Åの分子篩を添加して、約１／４容量にすることによって調製した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、プラスチック管中で混合し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、１分待ってから、内容物を、ポリマを含む管に移した。管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２８０】
溶液Ａで周囲温度にて２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２８１】
分子質量：計算値［Ｍ］６１１９．１６、計測値［Ｍ＋Ｈ］６１２１．１３、［Ｍ−Ｈ］６１１３．８０。
【０２８２】
＜実施例１７：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｐＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）の調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、ｄＴ組み込みの８サイクル、その後の５’−脱トリチル、別のｄＴホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２８３】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、ＴＭＧ  １２４μｌ、ＢＳＡ  ５０μｌ、および乾燥ピリジン３２５μｌを混合し、３Åの分子篩を添加して、約１／４容量にすることによって調製した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、プラスチック管中で混合し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、１分待ってから、内容物を、ポリマを含む管に移した。管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２８４】
溶液Ａで周囲温度にて２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２８５】
分子質量：計算値［Ｍ］６１１９．１６、計測値［Ｍ＋Ｈ］６１２１．５４。
【０２８６】
＜実施例１８：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴｐＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）の調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、ｄＴ組み込みの１７サイクル、その後の５’−脱トリチル、別のｄＴホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２８７】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、ＴＭＧ  １２４μｌ、ＢＳＡ  ５０μｌ、および乾燥ピリジン３２５μｌを混合し、３Åの分子篩を添加して、約１／４容量にすることによって調製した。溶液１および２のアリコート２０μｌを、プラスチック管中で混合し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、１分待ってから、内容物を、ポリマを含む管に移した。管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２８８】
溶液Ａで周囲温度にて２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２８９】
分子質量：計算値［Ｍ］６１１９．１６、計測値［Ｍ＋Ｈ］６１２０．０１、［Ｍ−Ｈ］６１１４．１９。
【０２９０】
＜実施例１９：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴｐＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｐＴ）の調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＴホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２９１】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート８０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ２０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、１７個のｄＴヌクレオチドを組み込むことによって合成を再開し、別のｄＴカップリングおよびキャッピング後、酸化の前に停止させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２９２】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０２９３】
溶液Ａで周囲温度にて２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０２９４】
分子質量：計算値［Ｍ］６２１６．３３、計測値［Ｍ−Ｈ］６２２１．１１。
【０２９５】
＜実施例２０：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴрＴＴＴＴＴＴＴＴＴｐＴＴＴＴＴＴＴＴрＴ）の調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＴホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２９６】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート１２０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ３０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、８個のｄＴヌクレオチドを組み込み、酸化の前に最後のｄＴで合成を中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２９７】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、９個のｄＴヌクレオチドを組み込み、酸化の前に最後のｄＴで合成を中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０２９８】
第３のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、最後のｄＴヌクレオチドを組み込んだ。
【０２９９】
溶液Ａで周囲温度にて２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３００】
分子質量：計算値［Ｍ］６３１３．４９、計測値［Ｍ−Ｈ］６３１０．７１。
【０３０１】
＜実施例２１：ホスホリルグアニジン基（ＦＩＸ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｐＴ）の調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、４つのｄＴの組み込み、その後の５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３０２】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、乾燥グアニジン塩酸塩９．６ｍｇを秤量し、プラスチック管に入れ、乾燥ピリジン８５μｌ、ＤＢＵ  １５μｌ、ＢＳＡ  １０μｌを添加することによって調製し、管を５分間ボルテックスし、透明になるまで超音波処理した（約５分間）。溶液１および２のアリコート２０μｌを、プラスチック管中で混合し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、１分待ってから、内容物を、ポリマを含む管に移した。管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３０３】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３０４】
分子質量：計算値［Ｍ］６０６３．０５、計測値［Ｍ＋Ｈ］６０６５．０２、［Ｍ−Ｈ］６０５８．３０。
【０３０５】
＜実施例２２：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴデオキシリボヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴ）ｔｐｄＴの調製；ここおよび以下の実施例のｔは、ＬＮＡ−Ｔヌクレオチドの位置を表す。＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。ＬＮＡ−Ｔを組み込むためのカップリングステップを、６分まで延長した。合成を、５’−脱トリチル、ＬＮＡ−Ｔホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３０６】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。次いで内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３０７】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。このオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣトレースを図３に示す。
【０３０８】
分子質量；計算値［Ｍ］１８８８．４０、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８８８．１５、［Ｍ−Ｈ］１８８６．８６。
【０３０９】
＜実施例２３：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴデオキシリボヌクレオチド５’−ｔｐｄ（ＴＴＴＴＴ）の調製；ｐは、修飾リン酸基の位置を表し；ｔは、ＬＮＡ−Ｔヌクレオチドの位置を表す。＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。ＬＮＡ−Ｔを組み込むためのカップリングステップを、６分まで延長した。合成を、ｄＴ組み込みの４サイクル、５’−脱トリチル、ＬＮＡ−Ｔホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３１０】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、５’−脱トリチルによって、合成を完結させた。
【０３１１】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。このオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣトレースを図３に示す。
【０３１２】
分子質量；計算値［Ｍ］１８８８．４０、計測値［Ｍ＋Ｈ］１８８８．２７、［Ｍ−Ｈ］１８８７．４４。
【０３１３】
＜実施例２４：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（式ＸＩＶ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＡＡＣＧＴＣＡＧＧＧＴＣＴＴＣＣｐ）ＢＨＱの調製。ここおよび以下の実施例では、ＢＨＱはＢｌａｃｋＨｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＦＸＩＩ）である。＞
【化３４】
0006632605.tif 000035
（ＦＸＩＩ）
【０３１４】
ＢＨＱ  ＣＰＧ支持体（４２μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３１５】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。次いで内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３１６】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３１７】
分子質量；計算値［Ｍ］５５１０．９２、計測値［Ｍ−Ｈ］５５０９．５０。
【０３１８】
＜実施例２５：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−Ｆｌｕ  ｄ（ＧＧＡＡＧ  ＤＤ  ＣＣＣＴＧＡＣＧＴＴｐ）ＢＨＱの調製。ＤＤは、１，１２−ドデカンジオールホスフェート（ＦＸＩＩＩ）であり、Ｆｌｕは、５（６）−カルボキシフルオレセイン標識（ＦＸＩＶ）である。＞
【化３５】
0006632605.tif 000036
（ＦＸＩＩＩ）
【化３６】
0006632605.tif 000037
（ＦＸＩＶ）
【０３１９】
ＢＨＱ  ＣＰＧ支持体（４２μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＴホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３２０】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。次いで内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、対応する１，１２−ドデカンジオールおよびフルオレセインホスホルアミダイトを調節剤として用いて、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３２１】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３２２】
分子質量；計算値［Ｍ］６０７８．５０、計測値［Ｍ＋Ｈ］６０８４．３８。
【０３２３】
＜実施例２６：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（式ＸＩＶ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＣＴＣＴＣｐＦＣＣＴＴＣｐＣ）の調製。ここおよび次の実施例のＦは、２−ヒドロキシメチル−３−ヒドロキシテトラヒドロフラン（無プリン／無ピリミジン部位）ホスフェート（ＦＸＶ）である。＞
【化３７】
0006632605.tif 000038
（ＦＸＶ）
【０３２４】
５’−ＤＭＴｒ−ｄＣ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３２５】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート８０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ２０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、ｄＦ単位を含む５個のヌクレオチドを、次のｄＣヌクレオチドまで組み込み、合成を酸化ステップの前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３２６】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３２７】
溶液Ａで周囲温度にて１６時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３２８】
分子質量：計算値［Ｍ］３８５７．７６、計測値［Ｍ−Ｈ］３８５６．７４。
【０３２９】
＜実施例２７：１，３−ジメチル−２−（ホスホリルイミノ）イミダゾリジン基（ＦＸＶＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧＣＧＣＣＡＡＡＣｐＡ）の調製＞
【化３８】
0006632605.tif 000039
（ＦＸＶＩ）
【０３３０】
５’−ＤＭＴｒ−ｄＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３３１】
１Ｍの２−アジド−４，５−ジヒドロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−イミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート１００μｌに、ＢＳＡ  ２５μｌおよびトリエチルアミン５μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３３２】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３３３】
分子質量：計算値［Ｍ］３１０１．２０、計測値［Ｍ−Ｈ］３１０１．５５。
【０３３４】
＜実施例２８：Ｎ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）−Ｎ”−ホスホリルグアニジン基（ＦＸＶＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧＣＧＣＣＡＡＡＣｐＡ）の調製＞
【化３９】
0006632605.tif 000040
（ＦＸＶＩＩ）
【０３３５】
５’−ＤＭＴｒ−ｄＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３３６】
１Ｍのアジドジピロリジノカルベニウムヘキサフルオロホスフェート１００μｌに、ＢＳＡ  ２５μｌおよびトリエチルアミン５μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３３７】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３３８】
分子質量：計算値［Ｍ］３１５５．２９、計測値［Ｍ−Ｈ］３１５３．７５。
【０３３９】
＜実施例２９：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド５’−ＡＵＣＧｐＵの調製＞
５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−ｒＵ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、２’−ＯＭｅ−ｒＧホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３４０】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３４１】
溶液Ａで５５℃にて１６時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３４２】
分子質量：計算値［Ｍ］１６９７．２８、計測値［Ｍ＋Ｈ］１６９７．５９、［Ｍ−Ｈ］１６９４．７７。
【０３４３】
＜実施例３０：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド５’−ＧＣＧＣＣＡＡＡＣｐＡの調製＞
５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−ｒＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（６０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、２’−ＯＭｅ−ｒＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３４４】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート４０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３４５】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３４６】
分子質量：計算値［Ｍ］３４０３．４８、計測値［Ｍ−Ｈ］３４０２．５５。
【０３４７】
＜実施例３１：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド５’−ＧＣＧＣＣＡＡＡｐＣｐＡの調製＞
５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−ｒＡ（Ｂｚ）ＣＰＧ支持体（６０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、２’−ＯＭｅ−ｒＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３４８】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート８０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ２０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、２’−ＯＭｅ−ｒＵホスホルアミダイトをカップリングさせ、合成を酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３４９】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３５０】
溶液Ａで５５℃にて１２時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３５１】
分子質量：計算値［Ｍ］３５００．６４、計測値［Ｍ＋Ｈ］３１９９．９０、［Ｍ−Ｈ］３４９９．７５。
【０３５２】
＜実施例３２：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（式ＸＩＶ）で修飾されたオリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドホスホロチオエート５’−ＧＳＡＳＣＳＡＳＵＳＣＳＣＳＡＳＵＳＵＳＣＳＡＳＡＳＡＳＵＳＧＳＧＳＵＳＵｐＵｐＧの調製；ここおよび以下の実施例のＳは、ホスホロチオエート残基（ＦＸＶＩＩＩ）を表す。＞
【化４０】
0006632605.tif 000041
（ＦＸＶＩＩＩ）
【０３５３】
５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−ｒＧ（Ｔａｃ）ＣＰＧ支持体（６０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、２’−ＯＭｅ−ｒＵホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３５４】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート８０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ２０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、２’−ＯＭｅ−ｒＡホスホルアミダイトをカップリングさせ、合成を酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３５５】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、ヨウ素酸化を乾燥ピリジン中０．１Ｍの３−［（ジメチルアミノメチレン）イミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオンによる硫化に置き換えて合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３５６】
溶液Ａで７０℃にて３時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３５７】
分子質量：計算値［Ｍ］７４３６．１４、計測値［Ｍ−Ｈ］７４３３．８９。
【０３５８】
＜実施例３３：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドホスホロチオエート５’−Ｆｌｕ  ＧＳＡＳＣＳＡＳＵＳＣＳＣＳＡＳＵＳＵＳＣＳＡＳＡＳＡＳＵＳＧＳＧＳＵＳＵｐＵｐＧの調製；Ｆｌｕは、５’−フルオレセイン標識（ＦＸＩＸＶ）を表し；Ｓは、ホスホロチオエート残基（ＦＸＶＩＩＩ）を表す。＞
【化４１】
0006632605.tif 000042
（ＦＸＩＸ）
【０３５９】
５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−ｒＧ（Ｔａｃ）ＣＰＧ支持体（６０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、２’−ＯＭｅ−ｒＵホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３６０】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート８０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ２０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、２’−ＯＭｅ−ｒＡホスホルアミダイトをカップリングさせ、合成を酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３６１】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃にて１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、ヨウ素酸化を乾燥ピリジン中０．１Ｍの３−［（ジメチルアミノメチレン）イミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオンによる硫化に置き換えて合成を再開し、配列の末端まで行った。ＤＭＴｒ  ＯＮモードにおける対応するフルオレセインホスホルアミダイトの組み込みによって、合成を完結した。
【０３６２】
溶液Ａで７０℃にて３時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３６３】
分子質量：計算値［Ｍ］８００３．６３、計測値［Ｍ−Ｈ］８００１．２５。
【０３６４】
＜実施例３４：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）で修飾されたオリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドホスホロチオエート５’−Ｆｌｕ  ＧＳＧＳＣＳＣＳＡＳＡＳＡＳＣＳＣＳＵＳＣＳＣＳＧＳＣＳＵｐＵｐＡＣｐＣｐＵの調製；Ｆｌｕは５’−フルオレセイン標識（ＦＸＩＸ）を表し；Ｓは、ホスホロチオエート残基（ＦＸＶＩＩＩ）を表す。＞
５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−ｒＵ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、２’−ＯＭｅ−ｒＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３６５】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート１６０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ４０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、２’−ＯＭｅ−ｒＣホスホルアミダイトをカップリングさせ、合成を酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３６６】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、２’−ＯＭｅ−ｒＡホスホルアミダイト、その後２’−ＯＭｅ−ｒＵをカップリングさせ、合成を最後の酸化ステップの前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３６７】
第３のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４５℃で１．５時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、２’−ＯＭｅ−ｒＵホスホルアミダイトをカップリングさせ、合成を酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３６８】
第４のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４５℃で１．５時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、ヨウ素酸化を乾燥ピリジン中０．１Ｍの３−［（ジメチルアミノメチレン）イミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオンによる硫化に置き換えて合成を再開し、配列の末端まで行った。ＤＭＴｒ  ＯＮモードにおける対応するフルオレセインホスホルアミダイトの組み込みによって、合成を完結した。
【０３６９】
溶液Ａで７０℃にて３時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３７０】
分子質量：計算値［Ｍ］７７６３．４８、計測値［Ｍ−Ｈ］７７５９．３７。
【０３７１】
＜実施例３５：Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホリルグアニジン基（ＦＶＩＩＩ）と混合されたＬＮＡ−オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドホスホロチオエート５’−Ｆｌｕ  ＧＳｇＳＣＳｇＳＡＳａＳＡＳＣＳｃＳＵＳＣＳＣＳｃＳＣＳＵｐＵｐａＣｐＣｐＵの調製；Ｆｌｕは、５’−フルオレセイン標識（ＦＸＩＸ）を表し；Ｓは、ホスホロチオエート残基（ＦＸＶＩＩＩ）を表し；ＬＮＡヌクレオチドＡ、５−Ｍｅ−Ｃ、およびＧは、それぞれ小文字ａ、ｃ、およびｇによって示される。＞
５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−ｒＵ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、２’−ＯＭｅ−ｒＣホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３７２】
０．５Ｍのビス（ジメチルアミノ）−１−アジドカルベニウムジクロロホスフェートのアリコート１６０μｌをプラスチック管に移し、ＢＳＡ  ４０μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。アリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、２’−ＯＭｅ−ｒＣホスホルアミダイトをカップリングさせ、合成を酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３７３】
第２のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４０℃で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、ＬＮＡ−Ａホスホルアミダイト、その後２’−ＯＭｅ−ｒＵをカップリングさせ、合成を最後の酸化ステップの前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３７４】
第３のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４５℃で１．５時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、２’−ＯＭｅ−ｒＵホスホルアミダイトをカップリングさせ、合成を酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３７５】
第４のアリコート５０μｌを、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、４５℃で１．５時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、ヨウ素酸化を乾燥ピリジン中０．１Ｍの３−［（ジメチルアミノメチレン）イミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオンによる硫化に置き換え、ＬＮＡおよび２’−ＯＭｅホスホルアミダイトを用いて、合成を再開し、配列の末端まで行った。ＤＭＴｒ  ＯＮモードにおける対応するフルオレセインホスホルアミダイトの組み込みによって、合成を完結した。
【０３７６】
溶液Ａで７０℃にて３時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３７７】
分子質量：計算値［Ｍ］７７９３．４７、計測値［Ｍ−Ｈ］７７９２．９２。
【０３７８】
＜実施例３６：１，３−ジメチル−２−（ホスホリルイミノ）イミダゾリジン基（ＦＸＶＩ）で修飾されたオリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド５’−ＵＵＵＵＵｐＵの調製＞
５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−ｒＵ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、２’−ＯＭｅ−ｒＵホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３７９】
１Ｍの２−アジド−４，５−ジヒドロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−イミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート１００μｌに、ＢＳＡ  ２５μｌおよびトリエチルアミン５μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３８０】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。このオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣトレースを図４に示す。
【０３８１】
分子質量；計算値［Ｍ］１９５４．３７、計測値［Ｍ−Ｈ］１９５３．３７。
【０３８２】
＜実施例３７：Ｎ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）−Ｎ”−ホスホリルグアニジン基（ＦＸＶＩＩ）で修飾されたオリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド５’−ＵＵＵＵＵｐＵの調製＞
５’−ＤＭＴｒ−２’−ＯＭｅ−ｒＵ  ＣＰＧ支持体（４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相オリゴ−２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、２’−ＯＭｅ−ｒＵホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３８３】
１Ｍのアジドジピロリジノカルベニウムヘキサフルオロホスフェート１００μｌに、ＢＳＡ  ２５μｌおよびトリエチルアミン５μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３８４】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。このオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣトレースを図４に示す。
【０３８５】
分子質量；計算値［Ｍ］２００８．４６、計測値［Ｍ−Ｈ］２００７．５７。
【０３８６】
＜実施例３８：Ｎ，Ｎ−ジメチルホスホリルグアニジン基（ＦＸＸ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）の調製＞
【化４２】
0006632605.tif 000043
（ＦＸＸ）
【０３８７】
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３８８】
プラスチック管中の（クロロメチレン）ジメチルイミニウムクロリド１２ｍｇおよびＮａＮ３  ４ｍｇ（１．１当量）に、乾燥ＭｅＣＮ  １００μｌを添加し、管を３０℃で２時間振盪し、１４，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＢＳＡ  ２５μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で３０分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３８９】
溶液Ａで５５℃にて１８時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３９０】
分子質量：計算値［Ｍ］１８３２．２２、計測値［Ｍ−Ｈ］１８３１．５７。
【０３９１】
＜実施例３９：Ｎ−ホスホリルホルムアミジン基（ＦＸＸＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）の調製＞
【化４３】
0006632605.tif 000044
（ＦＸＸＩ）
【０３９２】
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３９３】
溶液１を、ヨウ素結晶を乾燥ピリジン中に０．２Ｍの濃度（１ｍｌ当たり５１ｍｇ）まで溶解することによって調製した。溶液２を、乾燥ホルムアミジン塩酸塩４０ｍｇを秤量し、プラスチック管に入れ、乾燥ピリジン３７５μｌ、ＤＢＵ  ７５μｌ、およびＢＳＡ  ５０μｌを添加することによって調製し、管を３〜４分間ボルテックスし、透明になるまで超音波処理した（約３〜４分間）。溶液１および２のアリコート２０μｌを、プラスチック管中で混合し、ＢＳＡ  １０μｌを添加し、１分待ってから、内容物を、ポリマを含む管に移した。管を３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３９４】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０３９５】
分子質量：計算値［Ｍ］１７８９．２７、計測値［Ｍ−Ｈ］１７８８．６０。
【０３９６】
＜実施例４０：Ｎ−シアノイミノリン酸基（ＦＸＸＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）の調製＞
【化４４】
0006632605.tif 000045
（ＦＸＸＩＩ）
【０３９７】
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０３９８】
マクマリー（ＭｃＭｕｒｒｙ）［５１］によって記載されたように調製された、乾燥ＭｅＣＮ中のシアノゲンアジドの０．２５Ｍ溶液２０μｌに、ＢＳＡ  ５μｌを添加し、管を周囲温度で１５分間保持し、内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０３９９】
溶液Ｂで７０℃にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。
【０４００】
分子質量：計算値［Ｍ］１７８７．２５、計測値［Ｍ＋Ｈ］１７８７．２７、［Ｍ−Ｈ］１７８５．１９。
【０４０１】
＜実施例４１：Ｎ−シアノイミノリン酸基（ＦＸＸＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴｐＴＴＴＴＴ）の調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、ｄＴ組み込みの４サイクル、５’−脱トリチル、ｄＴホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０４０２】
マクマリー（ＭｃＭｕｒｒｙ）［５１］によって記載されたように調製された、乾燥ＭｅＣＮ中のシアノゲンアジドの０．２５Ｍ溶液２０μｌに、ＢＳＡ  ５μｌを添加し、管を周囲温度で１５分間保持し、内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１５秒間遠心分離し、周囲温度で５分間振盪した。上清を廃棄し、支持体を２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、β−シアノエチルホスホルアミダイト固相合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０４０３】
溶液Ｂで７０℃にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。このオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣを図５に示す。
【０４０４】
分子質量：計算値［Ｍ］１７８７．２５、計測値［Ｍ＋Ｈ］１７８７．１９、［Ｍ−Ｈ］１７８５．１１。
【０４０５】
＜実施例４２：３’−Ｎ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）−Ｎ”−グアニジノリン酸基（ＦＸＸＩＩＩ）で修飾されたヌクレオシドｄＴｐの調製＞
【化４５】
0006632605.tif 000046
（ＦＸＸＩＩＩ）
【０４０６】
３’−ホスフェートＣＰＧ支持体（３０〜４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＴホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０４０７】
１Ｍのアジドジピロリジノカルベニウムヘキサフルオロホスフェート１００μｌに、ＢＳＡ  ２５μｌおよびトリエチルアミン５μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、５’−脱トリチルによって、合成を完結させた。
【０４０８】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、ヌクレオチドを支持体から取り外した。
【０４０９】
分子質量：計算値［Ｍ］４７１．４５、計測値［Ｍ−Ｈ］４７１．０８。
【０４１０】
＜実施例４３：３’−Ｎ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）−Ｎ”−グアニジノリン酸基（ＦＸＸＩＩＩ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴＴ）ｐの調製＞
３’−ホスフェートＣＰＧ支持体（３０〜４０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、ｄＴホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０４１１】
１Ｍのアジドジピロリジノカルベニウムヘキサフルオロホスフェート１００μｌに、ＢＳＡ  ２５μｌおよびトリエチルアミン５μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０４１２】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、ヌクレオチドを支持体から取り外した。このオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣを図６に示す。
【０４１３】
分子質量：計算値［Ｍ］１９９２．４４、計測値［Ｍ−Ｈ］１９９１．４６。
【０４１４】
＜実施例４４：５’−Ｎ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）−Ｎ”−ホスホリルグアニジン基およびフルオレセイン標識（ＦＸＸＩＶ）で修飾されたチミジンヌクレオシドの調製＞
【化４６】
0006632605.tif 000047
（ＦＸＸＩＶ）
【０４１５】
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、実施例２５と同じフルオレセインホスホルアミダイトを用いて、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌで開始した。合成を酸化の前に中断させ、カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０４１６】
１Ｍのアジドジピロリジノカルベニウムヘキサフルオロホスフェート１００μｌに、ＢＳＡ  ２５μｌおよびトリエチルアミン５μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、空気で５分間乾燥させた。
【０４１７】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、ヌクレオチドを支持体から取り外した。このオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣを図６に示す。
【０４１８】
分子質量：計算値［Ｍ］１２６３．３２、計測値［Ｍ−Ｈ］１２６２．２２。
【０４１９】
＜実施例４５：５’−Ｎ，Ｎ’−ビス（テトラメチレン）−Ｎ”−ホスホリルグアニジン基およびフルオレセイン標識（ＦＸＸＩＶ）で修飾されたオリゴヌクレオチド５’−Ｆｌｕ  ｐｄ（ＴＴＴＴＴＴ）の調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌで開始した。合成を、５個のｄＴ残基およびフルオレセイン標識Ｆｌｕ’（ＸＸＶ）の組み込み後、最後の酸化ステップの前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０４２０】
１Ｍのアジドジピロリジノカルベニウムヘキサフルオロホスフェート１００μｌに、ＢＳＡ  ２５μｌおよびトリエチルアミン５μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、空気で５分間乾燥させた。
【０４２１】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外した。このオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣを図６に示す。
【０４２２】
分子質量：計算値［Ｍ］２７８４．３１、計測値［Ｍ−Ｈ］２７８２．９６。
【０４２３】
＜実施例４６：１，３−ジメチル−２−（ホスホリルイミノ）イミダゾリジン基（ＦＸＶＩ）で修飾されたハイブリッドＤＮＡ−ＲＮＡオリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴ）ｒＵｐｄＴの調製＞
Ｈｉｇｈ  Ｌｏａｄ  ５’−ＤＭＴｒ−ｄＴ  ＣＰＧ支持体（１１０μｍｏｌｇ−１）５ｍｇを含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザ中に配置し、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相オリゴヌクレオチド合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。合成を、５’−脱トリチル、２’−ＴＯＭ−ｒＵホスホルアミダイトカップリング、およびキャッピング後、酸化の前に中断させた。カラムをシンセサイザから取り外し、水ポンプで水抜きし、ＭｅＣＮで濯ぎ、ホスファイトが結合した支持体をプラスチック管に移した。
【０４２４】
１Ｍの２−アジド−４，５−ジヒドロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−イミダゾリウムヘキサフルオロホスフェート１００μｌに、ＢＳＡ  ２５μｌおよびトリエチルアミン５μｌを添加し、管を１分間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで１分間遠心分離し、周囲温度で３０分間放置した。内容物を、支持体を含む管に移し、３０秒間ボルテックスし、１４，５００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、周囲温度で１時間振盪した。上清を廃棄し、支持体を、２×２００μｌのＭｅＣＮで濯ぎ、シンセサイザカラムに移し、合成を再開し、配列の末端まで行った。
【０４２５】
溶液Ａで周囲温度にて１時間処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外し、保護基を除去した。次いで、ＴＯＭ基を、トリエチルアミントリヒドロフルオリド−トリエチルアミン−ＮＭＰ（４：３：６ｖ／ｖ／ｖ）で６５℃にて２時間処理することによって除去した。
【０４２６】
分子質量：計算値［Ｍ］１８６０．３４、計測値［Ｍ−Ｈ］１８５９．２１。
【０４２７】
＜実施例４７：自動ＤＮＡシンセサイザを用いる、１，３−ジメチル−Ｎ−ホスホリルイミノ−２−イミダゾリジン基（ＦＸＶＩ）で修飾されたオリゴデオキシリボヌクレオチド５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）、５’−ｄ（ＴＴＴＴｐＴｐＴ）、５’−ｄ（ＴＴＴｐＴｐＴｐＴ）、５’−ｄ（ＴＴｐＴｐＴｐＴｐＴ）、５’−ｄ（ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ）、５’−ｄ（ＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡ）の調製のためのプロトコル＞
５’−ＤＭＴｒ−ｄＴまたはｄＡ  ＣＰＧ支持体（３５〜１１０μｍｏｌｇ−１）のいずれかを５ｍｇ含有するカラムを、ＤＮＡシンセサイザに配置し、配列内の対応する位置（ｐ）に対するヨウ素酸化を乾燥アセトニトリル中１Ｍの２−アジド−４，５−ジヒドロ−１，３−ジメチル−１Ｈ−イミダゾリウムヘキサフルオロホスフェートによる処理に置き換えて、自動β−シアノエチルホスホルアミダイト固相ＤＮＡ合成を、０．２μｍｏｌスケールで開始した。
【０４２８】
オリゴヌクレオチド５’−ｄ（ＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡ）については５５℃で１２時間、またはオリゴチミジレートについては周囲温度で１時間、溶液Ａで処理することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から取り外した。これらのオリゴヌクレオチドのＲＰ−ＨＰＬＣを、図７および８に示す。
【０４２９】
分子質量：
５’−ｄ（ＴＴＴＴＴｐＴ）−計算値［Ｍ］１８５８．３７、計測値［Ｍ−Ｈ］１８５７．５７；
５’−ｄ（ＴＴＴＴｐＴｐＴ）−計算値［Ｍ］１９５３．３２、計測値［Ｍ−Ｈ］１９５２．５７；
５’−ｄ（ＴＴＴｐＴｐＴｐＴ）−計算値［Ｍ］２０４８．６７、計測値［Ｍ−Ｈ］２０４７．７７；
５’−ｄ（ＴＴｐＴｐＴｐＴｐＴ）−計算値［Ｍ］２１４３．８２、計測値［Ｍ−Ｈ］２１４２．７７；
５’−ｄ（ＴｐＴｐＴｐＴｐＴｐＴ）−計算値［Ｍ］２２３８．９６、計測値［Ｍ−Ｈ］２２３７．９７；
５’−ｄ（ＧｐＣｐＧｐＣｐＣｐＡｐＡｐＡｐＣｐＡ）−計算値［Ｍ］３８６２．３８、計測値［Ｍ−Ｈ］３８６０．５０。
【０４３０】
［参考文献］
本発明および本発明が属する現況技術をより完全に説明および開示するためにいくつかの刊行物が本明細書で引用される。これらの参考文献についての全引用が以下に提供される。これらの参考文献のそれぞれは、それぞれの個々の参考文献が、本願に引用して援用することが具体的かつ個々に示された場合と同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
（１）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｊ．グッドチャイルド（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ）（ｅｄ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７６４、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２０１１。
（２）ベル（Ｂｅｌｌ），Ｎ．Ｍ．；ミックルフィールド（Ｍｉｃｋｌｅｆｉｅｌｄ），Ｊ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００９、１０、２６９１。
（３）ムランバ（Ｍｕｌａｍｂａ），Ｇ．Ｂ．；ヒュー（Ｈｕ），Ａ．；アザド（Ａｚａｄ），Ｒ．Ｆ．；アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ），Ｋ．Ｐ．；コーエン（Ｃｏｅｎ），Ｄ．Ｍ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９８、４２、９７１。
（４）ビノレス（Ｖｉｎｏｒｅｓ），Ｓ．Ａ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｎａｎｏｍｅｄ．２００６、１、２６３。
（５）メルキ（Ｍｅｒｋｉ），Ｅ．：グラハム（Ｇｒａｈａｍ），Ｍ．Ｊ．；ムリック（Ｍｕｌｌｉｃｋ），Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００８、１１８、７４３。
（６）デュカ（Ｄｕｃａ），Ｍ．；ベクホッフ（Ｖｅｋｈｏｆｆ），Ｐ．；オウセディク（Ｏｕｓｓｅｄｉｋ），Ｋ．；ハルビイ（Ｈａｌｂｙ），Ｌ．；アリモンド（Ａｒｉｍｏｎｄｏ），Ｐ．Ｂ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００８、３６、５１２３。
（７）ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ），Ｐ．Ｅ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０、１２、１８４。
（８）ザメクニック（Ｚａｍｅｃｎｉｋ），Ｐ．Ｃ．；ステフェンソン（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ），Ｍ．Ｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９７８、７５、２８０。
（９）ベールケ（Ｂｅｈｌｋｅ），Ｍ．Ａ．、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２００８、１８、３０５。
（１０）シュー（Ｘｕ），Ｚ．Ｊ．；ヤング（Ｙａｎｇ），Ｌ．Ｆ．；サン（Ｓｕｎ），Ｌ．Ｑ．；カオ（Ｃａｏ），Ｙ．、Ｃｈｉｎ．Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．２０１２、５７、３４０４。
（１１）ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ），Ｃ．；キーフ（Ｋｅｅｆｅ），Ａ．Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６、１０、６０７。
（１２）リー（Ｌｅｅ），Ｊ．Ｆ．；ストーバル（Ｓｔｏｖａｌｌ），Ｇ．Ｍ．；エリングトン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ），Ａ．Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６、１０、２８２。
（１３）ドゥ（Ｄｕ），Ｌ．；ガッティ（Ｇａｔｔｉ），Ｒ．Ａ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００９、１１、１１６；ペレズ（Ｐｅｒｅｚ），Ｂ．；ローラ・ロドリゲス−パスカウ（Ｌａｕｒａ  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐａｓｃａｕ），Ｌ．；ビラゲリウ（Ｖｉｌａｇｅｌｉｕ），Ｌ．；グリンベルグ（Ｇｒｉｎｂｅｒｇ），Ｄ．；ウガルテ（Ｕｇａｒｔｅ），Ｍ．；デスビアト（Ｄｅｓｖｉａｔ），Ｌ．Ｒ．Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｄｉｓｅａｓｅ  ２０１０、３３、３９７。
（１４）ラックマン（Ｒｕｃｋｍａｎ），Ｊ．；グリーン（Ｇｒｅｅｎ），Ｌ．Ｓ．；ビーソン（Ｂｅｅｓｏｎ），Ｊ．；ウォー（Ｗａｕｇｈ），Ｓ．；ギレット（Ｇｉｌｌｅｔｔｅ），Ｗ．Ｌ．；ヘンニンゲル（Ｈｅｎｎｉｎｇｅｒ），Ｄ．Ｄ．；クレソン−ウェルシュ（Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ），Ｌ．；ジャニック（Ｊａｎｊｉｃ），Ｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８、２７３、２０５５６。
（１５）ラモンド（Ｌａｍｏｎｄ），Ａ．Ｉ．；スプロート（Ｓｐｒｏａｔ），Ｂ．Ｓ．、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９３、３２５、１２３。
（１６）チー（Ｃｈｉ），Ｋ．Ｎ．；アイゼンハウアー（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ），Ｅ．；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｅ．Ｃ．；ゴールデンバーグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ），Ｓ．Ｌ．、パワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ），Ｊ．；トゥ（Ｔｕ），Ｄ．；グレーベ（Ｇｌｅａｖｅ），Ｍ．Ｅ．、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００５、９７、１２８７。
（１７）カウル（Ｋａｕｒ），Ｈ．；バブ（Ｂａｂｕ），Ｂ．Ｒ．；マイチ（Ｍａｉｔｉ），Ｓ．、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００７、１０７、４６７２。
（１８）イェーガー（Ｊａｇｅｒ），Ａ．；エンジェルス（Ｅｎｇｅｌｓ），Ｊ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８４、２５、１４３７。
（１９）ハウ（Ｈａｕ），Ｊ．Ｆ．；アスリーヌ（Ａｓｓｅｌｉｎｅ），Ｕ．；トゥオン（Ｔｈｕｏｎｇ），Ｎ．Ｔ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９１、３２、２４９７。
（２０）イェーガー（Ｊａｇｅｒ），Ａ．；レビー（Ｌｅｖｙ），Ｍ．Ｊ．；ヘヒト（Ｈｅｃｈｔ），Ｓ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８、２７、７２３７。
（２１）エゴルム（Ｅｇｈｏｌｍ）．Ｍ．；ブカルド（Ｂｕｃｈａｒｄｔ），Ｏ．；ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ），Ｐ．Ｅ．；ベルグ（Ｂｅｒｇ），Ｒ．Ｈ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２、１１４、１８９５。
（２２）スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７、７、１８７。
（２３）ステイン（Ｓｔｅｉｎ），Ｃ．Ａ．；スバシンギ（Ｓｕｂａｓｉｎｇｈｅ），Ｃ．；シノヅカ（Ｓｈｉｎｏｚｕｋａ），Ｋ．；コーエン（Ｃｏｈｅｎ），Ｊ．Ｓ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８、１６、３２０９。
（２４）パツレアウ（Ｐａｔｕｒｅａｕ），Ｂ．Ｍ．；ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ），Ｒ．Ｈ．Ｅ．；ダムハ（Ｄａｍｈａ），Ｍ．Ｊ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００７、１８、４２１。
（２５）クルック（Ｃｒｏｏｋｅ），Ｓ．Ｔ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０００、３１３、３。
（２６）ベールケ（Ｂｅｈｌｋｅ），Ｍ．Ａ．、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２００８、１８、３０５。
（２７）シュー（Ｘｕ），Ｚ．Ｊ．；ヤング（Ｙａｎｇ），Ｌ．Ｆ．；サン（Ｓｕｎ），Ｌ．Ｑ．；カオ（Ｃａｏ），Ｙ．、Ｃｈｉｎ．Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．２０１２、５７、３４０４。
（２８）ステック（Ｓｔｅｃ），Ｗ．Ｊ．；ゾーン（Ｚｏｎ），Ｇ．；イーガン（Ｅｇａｎ），Ｗ．；ステック（Ｓｔｅｃ），Ｂ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８４、１０６、６０７７。
（２９）シーベルガー（Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ），Ｐ．Ｈ．；カルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），Ｍ．Ｈ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５、１１７、１４７２。
（３０）ホール（Ｈａｌｌ），Ａ．Ｈ．；ワン（Ｗａｎ），Ｊ．；スペソック（Ｓｐｅｓｏｃｋ），Ａ．；セルギーバ（Ｓｅｒｇｕｅｅｖａ），Ｚ．；シャウ（Ｓｈａｗ），Ｂ．Ｒ．；アレキサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ），Ｋ．Ａ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００６、３４、２７７３。
（３１）ビーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ），Ｓ．Ｌ．；カルザース（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），Ｍ．Ｈ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８１、２２、１８５９。
（３２）サザニ（Ｓａｚａｎｉ），Ｐ．；カン（Ｋａｎｇ），Ｓ．−Ｈ．；マイヤー（Ｍａｉｅｒ），Ｍ．Ａ．；ウェイ（Ｗｅｉ），Ｃ．；ディルマン（Ｄｉｌｌｍａｎ），Ｊ．；スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．；マノハラン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ），Ｍ．；コレ（Ｋｏｌｅ），Ｒ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１、２９、３９６５。
（３３）フロエラー（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ），Ｂ．；ウン（Ｎｇ），Ｐ．；マテウッチィ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ），Ｍ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８、１６，４８３１。
（３４）ドリンナヤ（Ｄｏｌｉｎｎａｙａ），Ｎ．Ｇ．；ソコルバ（Ｓｏｋｏｌｏｖａ），Ｎ．Ｉ．；グリアズノーバ（Ｇｒｙａｚｎｏｖａ），Ｏ．Ｉ．；シャバロバ（Ｓｈａｂａｒｏｖａ），Ｚ．Ａ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８、１６、３７２１。
（３５）ミグネット（Ｍｉｇｎｅｔ），Ｎ．；グリアズノフ（Ｇｒｙａｚｎｏｖ），Ｓ．Ｍ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９８、２６、４３１。
（３６）レツシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ），Ｒ．Ｌ．；シングマン（Ｓｉｎｇｍａｎ），Ｃ．Ｎ．；ヒスタンド（Ｈｉｓｔａｎｄ），Ｇ．；サルンケ（Ｓａｌｕｎｋｈｅ），Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８８、１１０、４４７０。
（３７）スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７、７、１８７。
（３８）デリンジャー（Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ）ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３、１２５、９４０。
（３９）ヤマダ（Ｙａｍａｄａ）ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６、１２８、５２５１。
（４０）クリシュナ（Ｋｒｉｓｈｎａ），Ｈ．；カルザー（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），Ｍ．Ｈ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２、１３４、１１６１８。
（４１）国際公開第２００７／０５９８１６Ａ１号および国際公開第２００８／１２８６８６Ａ１号。
（４２）スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７、７、１８７。
（４３）メンデル（Ｍｅｎｄｅｌｌ），Ｊ．；ロジノ−クラパック（Ｒｏｄｉｎｏ−Ｋｌａｐａｃ），Ｌ．Ｒ．；サヘンク（Ｓａｈｅｎｋ），Ｚ．；ルーシュ（Ｒｏｕｓｈ），Ｋ．；バード（Ｂｉｒｄ），Ｌ．；ロウズ（Ｌｏｗｅｓ），Ｌ．Ｐ．；アルファノ（Ａｌｆａｎｏ），Ｌ．；ゴメズ（Ｇｏｍｅｚ），Ａ．Ｍ．；ルイス（Ｌｅｗｉｓ），Ａ．；コタ（Ｋｏｔａ），Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３、７４、６３７；ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１３９６２３９。
（４４）ｍａｉｌ．ｐｉｐｅｌｉｎｅｒｅｖｉｅｗ．ｃｏｍ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／２０１４０２１０５３４０２／ＤＮＡ−ＲＮＡ−ａｎｄ−Ｃｅｌｌｓ／Ｓａｒｅｐｔａ−Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−Ａｎｎｏｕｎｃｅｓ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ−Ｓａｆｅｔｙ−Ｒｅｓｕｌｔｓ−ｆｒｏｍ−Ｐｈａｓｅ−Ｉ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ−Ｓｔｕｄｙ−ｏｆ−Ｍａｒｂｕｒｇ−Ｄｒｕｇ−Ｃａｎｄｉｄａｔｅ．ｈｔｍｌ。
（４５）スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．Ｅ．Ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（ジャンソン（Ｊａｎｓｏｎ），Ｃ．Ｇ．；デューリング（Ｄｕｒｉｎｇ），Ｍ．Ｊ．，Ｅｄｓ）、２００３、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ６。
（４６）スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１９９７、７、１８７。
（４７）リース（Ｒｅｅｓｅ），Ｃ．Ｂ．、ウバサワ（Ｕｂａｓａｗａ），Ａ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８０、２１、２２６５。
（４８）ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｓ．Ｓ．；リース（Ｒｅｅｓｅ），Ｃ．Ｂ．；シバンダ（Ｓｉｂａｎｄａ），Ｓ．；ウバサワ（Ｕｂａｓａｗａ），Ａ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８１、２２、４７５５。
（４９）スウェエンソン（Ｓｗｅｎｓｏｎ），Ｄ．Ｌ．；ウォーフィールド（Ｗａｒｆｉｅｌｄ），Ｋ．Ｌ．；ワーレン（Ｗａｒｒｅｎ），Ｔ．Ｋ．；ラブジョイ（Ｌｏｖｅｊｏｙ），Ｃ．；ハッシンジャー（Ｈａｓｓｉｎｇｅｒ），Ｊ．Ｎ．；ルゼル（Ｒｕｔｈｅｌ），Ｇ．；ブロウホ（Ｂｌｏｕｃｈ），Ｒ．Ｅ．；モールトン（Ｍｏｕｌｔｏｎ），Ｈ．Ｍ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．Ｄ．；イベルセン（Ｉｖｅｒｓｅｎ），Ｐ．Ｌ．；ババリ（Ｂａｖａｒｉ），Ｓ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００９、５３、２０８９；メルビー（Ｍｅｌｌｂｙｅ），Ｂ．Ｍ．；ウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．Ｄ．；ハッシンジャー（Ｈａｓｓｉｎｇｅｒ），Ｊ．Ｎ．；リーベス（Ｒｅｅｖｅｓ），Ｍ．Ｄ．；ラブジョイ（Ｌｏｖｅｊｏｙ），Ｃ．Ｅ．；イベルセン（Ｉｖｅｒｓｅｎ），Ｐ．Ｌ．；ゲラー（Ｇｅｌｌｅｒ），Ｂ．Ｌ．、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１０、６５、９８。
（５０）ジェアラウィリヤパイサルン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ），Ｎ．；モールトン（Ｍｏｕｌｔｏｎ），Ｈ．Ｍ．；バックレー（Ｂｕｃｋｌｅｙ），Ｂ．；ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ），Ｊ．；サザニ（Ｓａｚａｎｉ），Ｐ．；フカロエン（Ｆｕｃｈａｒｏｅｎ），Ｓ．；イベルセン（Ｉｖｅｒｓｅｎ），Ｐ．Ｌ．；コレ（Ｋｏｌｅ），Ｒ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００８、１６、１６２４；ウー（Ｗｕ），Ｂ．；モールトン（Ｍｏｕｌｔｏｎ），Ｈ．Ｍ．；イベルセン（Ｉｖｅｒｓｅｎ），Ｐ．Ｌ．；ジュアング（Ｊｕａｎｇ），Ｊ．；リ（Ｌｉ），Ｊ．；スパルネイ（Ｓｐｕｒｎｅｙ），Ｃ．Ｆ．；サリ（Ｓａｌｉ），Ａ．；グエロン（Ｇｕｅｒｒｏｎ），Ａ．Ｄ．；ナガラジュ（Ｎａｇａｒａｊｕ），Ｋ．；ドーラン（Ｄｏｒａｎ），Ｔ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００８、１０５、１４８１４；イン（Ｙｉｎ），Ｈ．；モールトン（Ｍｏｕｌｔｏｎ），Ｈ．Ｍ．；セオウ（Ｓｅｏｗ），Ｙ．；ボイド（Ｂｏｙｄ），Ｃ．；ボウチリアー（Ｂｏｕｔｉｌｉｅｒ），Ｊ．；イベルセン（Ｉｖｅｒｓｅｎ），Ｐ．；ウッド（Ｗｏｏｄ），Ｍ．Ｊ．Ａ．、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００８、１７、３９０９。
（５１）マクマリー（ＭｃＭｕｒｒｙ），Ｊ．Ｅ．；コッポリーノ（Ｃｏｐｐｏｌｉｎｏ），Ａ．Ｐ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７３、３８、２８２１。
（５２）アリモフ（Ａｌｉｍｏｖ），Ｐ．Ｉ．；レフコバ（Ｌｅｖｋｏｖａ），Ｌ．Ｎ．、Ｉｚｖ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ  ＳＳＳＲ、Ｓｅｒ．Ｋｈｉｍ．１９６４、１８８９；ケイツ（Ｃａｔｅｓ），Ｌ．Ａ．；フェルグソン（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ），Ｎ．Ｍ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｃｈｅｍ．１９６６、５５、９６６。
（５３）ラトジェブ（Ｒａｔｈｇｅｂ），Ｐ．、米国特許第４１５４８２６Ａ号、優先日１９７６年１２月３０日。
（５４）シェリフ（Ｓｈｅｒｉｆ），Ｆ．Ｇ．、米国特許第３６３４５５５Ａ号、優先日１９６９年７月３１日。
（５５）アナトール（Ａｎａｔｏｌ），Ｊ．；ビダレンク（Ｖｉｄａｌｅｎｃ），Ｈ．；ロイセアウ（Ｌｏｉｓｅａｕ），Ｇ．、米国特許第３７６９４０６Ａ号、優先日１９７０年６月１９日。
（５６）リン（Ｌｉｎ），Ｗ．Ｏ．；ジマラテス（Ｇｕｉｍａｒａｔｅｓ），Ｃ．Ｎ．；デソウザ（Ｄｅ  Ｓｏｕｚａ），Ｊ．Ｂ．Ｎ．；アルト（Ａｌｔ），Ｈ．Ｇ．、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  Ｓｕｌｆｕｒ  １９９４、９２、１。
（５７）イェーガー（Ｊａｇｅｒ），Ａ．；レビー（Ｌｅｖｙ），Ｍ．Ｊ．；ヘヒト（Ｈｅｃｈｔ），Ｓ．Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８８、２７、７２３７。
（５８）シンハ（Ｓｉｎｈａ），Ｎ．Ｄ．；ビエルナット（Ｂｉｅｒｎａｔ），Ｊ．；マクマナス（ＭｃＭａｎｕｓ），Ｊ．；コスター（Ｋｏｓｔｅｒ），Ｈ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８４、１２、４５３９。
（５９）シー（Ｘｉ），Ｓ．−Ｋ．；ツァオ（Ｚｈａｏ），Ｙ．−Ｆ．、Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９０、２０、３２９５。
（６０）キタムラ（Ｋｉｔａｍｕｒａ），Ｍ．；ヤノ（Ｙａｎｏ），Ｍ．；タシロ（Ｔａｓｈｉｒｏ），Ｎ．；ミヤガワ（Ｍｉｙａｇａｗａ），Ｓ．；サンド（Ｓａｎｄｏ），Ｍ．；オカウチ（Ｏｋａｕｃｈｉ），Ｔ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１１、４５８。
（６１）コーケル（Ｋｏｋｅｌ），Ｂ．；ビーヘ（Ｖｉｅｈｅ），Ｈ．Ｇ．、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９８０、１９、７１６。
（６２）ボイド（Ｂｏｙｄ），Ｇ．Ｖ．；リンドレイ（Ｌｉｎｄｌｅｙ），Ｐ．Ｆ．；ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ），Ｊ．Ｃ．；ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｏｕ），Ｇ．Ａ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８５、１５２２。
（６３）グレッグ（Ｇａｒｅｇｇ），Ｐ．Ｊ．；リンド（Ｌｉｎｄｈ），Ｉ．；レグベルグ（Ｒｅｇｂｅｒｇ），Ｔ．；スタウィンスキー（Ｓｔａｗｉｎｓｋｉ），Ｊ．；ストロンバーグ（Ｓｔｒｏｍｂｅｒｇ），Ｒ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８６、２７、４０５１。
（６４）アテルトン（Ａｔｈｅｒｔｏｎ），Ｆ．Ｒ．；オープンショー（Ｏｐｅｎｓｈａｗ），Ｈ．Ｔ．；トッド（Ｔｏｄｄ），Ａ．Ｒ．、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４５、６６０。
（６５）バルネット（Ｂａｒｎｅｔｔ），Ｒ．Ｗ．；レツインジェー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ），Ｒ．Ｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８１、２２、９９１。
（６６）フロエラー（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ），Ｂ．Ｃ．；ウン（Ｎｇ），Ｐ．Ｇ．；マテウッチィ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ），Ｍ．Ｄ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８６、１４、５３９９。
（６７）ベズグベンコ（Ｂｅｚｇｕｂｅｎｋｏ），Ｌ．Ｖ．；ピプコ（Ｐｉｐｋｏ），Ｓ．Ｅ．；シャリモフ（Ｓｈａｌｉｍｏｖ），Ａ．Ａ．；シニタ（Ｓｉｎｉｔｓａ），Ａ．Ｄ．、Ｈｅｔｅｒｏａｔｏｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８、１９、４０８。
【図１】
0006632605.tif 000052
【図２】
0006632605.tif 000053
【図３】
0006632605.tif 000054
【図４】
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【図５】
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【図６】
0006632605.tif 000057
【図７】
0006632605.tif 000058
【図８】
0006632605.tif 000059
【配列表】
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