(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体フローセルであって、前記フローセルが、
ａ）マイクロ流体サブアセンブリであって、当該サブアセンブリが、
積層平面アセンブリであって、接着層と、透明基板層と、ガスケット層とを含み、
前記基板層が、一方の側で前記ガスケット層に接続され、他方の側で前記接着層に接続され、接着層及びガスケット層が基板層の範囲を超えて延在し、前記ガスケット層及び前記接着層の少なくとも一方が少なくとも１つの開口部を含む、積層平面アセンブリ、及び
基板層の境界の外側の位置で前記ガスケット層及び／又は前記接着層に配置された流体入口ポート及び出口ポート、ならびに入口ポートに接続された１つのポンプおよび出口ポートに接続された１つのポンプ
を備える、サブアセンブリと、
ｂ）前記マイクロ流体サブアセンブリに接着した固体支持体と、
を備え、
前記基板層が、前記ポンプによるチャンバへの流体の添加又はチャンバからの流体の除去を通して正圧を印加することによって前記固体支持体から遠ざかるように曲がり、負圧を印加することによって前記固体支持体に向いて曲がり、かつその中心点から±２００μｍの範囲で撓み、前記固体支持体に担持される試料の取り込み画像の質を調整するように構成された、前記基板層と前記固体支持体との間にチャンバの可撓性の透明蓋を形成する、フローセル。
【請求項２】
透明基板層がガラス、プラスチック又はこれらの組合せを含む、請求項１に記載のフローセル。
【請求項３】
可撓性の透明蓋が、−５０から＋１００μｍの範囲で撓むように構成される、請求項１に記載のフローセル。
【請求項４】
可撓性の透明蓋が、−２０から＋５０μｍの範囲で撓むように構成される、請求項１に記載のフローセル。
【請求項５】
内部寸法が１μＬから１０００μＬの範囲の体積容量を有する、請求項１に記載のフローセル。
【請求項６】
体積容量が２５μＬから２００μＬの範囲である、請求項５に記載のフローセル。
【請求項７】
流体ポートが、積層平面アセンブリと流体接続にある１以上のマイクロ流体チャネルを含む薄膜流体コネクターであり、基板層の境界の外側に位置する、請求項１に記載のフローセル。
【請求項８】
薄膜流体コネクターがガスケット層に接続される、請求項７に記載のフローセル。
【請求項９】
流体ポートが、マイクロ流体フローセルにおいて流体流動及び圧力を調節するバルブをさらに含み、流体送達系に接続可能である、請求項８に記載のフローセル。
【請求項１０】
撮像装置の取付け点と一致するように構成された１以上の取付け点をさらに含む、請求項８に記載のフローセル。
【請求項１１】
１以上の取付け点が、フローセルを撮像装置の対物レンズと位置合わせするように構成される、請求項１０に記載のフローセル。
【請求項１２】
請求項１１に記載のフローセルの固体支持体に担持された試料の取り込み画像の質を調整する方法であって、
フローセルと撮像装置の対物レンズとの位置を合わせるステップ、及び
フローセル中の液体の量を調節して、その中心点から±２００μｍの範囲で可撓性の蓋を撓ませるステップ
を含む方法。
【請求項１３】
可撓性の透明蓋が、−５０から＋１００μｍの範囲で撓むように構成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
可撓性の透明蓋が、−２０から＋５０μｍの範囲で撓むように構成される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
試料が生体試料である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
画像取り込み装置を使用して試料の画像を取り込むステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は撮像用マイクロ流体フローセルアセンブリ及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は全体として、試料を封入して、その後の試薬の試料への制御送達、例えば、多重インサイチュバイオマーカー染色及び色素循環を使用する載置された生体試料の分析を可能にする、マイクロ流体フローセルサブアセンブリの作製及び使用に関する。
【０００３】
多重インサイチュバイオマーカー分析のために、スライドグラスに載置された組織試料又は組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）は複数の分子プローブにより染色され、バイオマーカーの発現又は空間分布を定量的又は定性的に調査される必要がある。染色及びデータ収集工程は、通常、エラーが起こりやすい、時間のかかる手作業の技術を使用して実施される。染色後、後続の撮像（データ収集）の間試料を湿潤したままに保つために、試料の上にカバースリップを置く必要がある。カバースリップはその後、次の染色ラウンドの前に取り外す必要がある。カバースリップを載せ、カバースリップを外すこの過程は、試料の喪失又はスライドグラス上の試料の移動をもたらす可能性があり、このことは下流の分析を混乱させる。染色は概して、染色試薬を試料に塗工し、この染色試薬を所定のインキュベーション期間の間放置させることによって実施される。したがって、染色時間はバルク溶液から試料への染色成分の分子拡散により決定される。インキュベーションの間に試料の上部において試薬を活発に混合する方法は、試料全体にわたって確実に均一に染色し、染色成分と試料との間の相互作用を促進することを目的としている。このような方法は、染色の均一性に影響を与える流体分離領域を有さない、バルク流体移動の誘導に頼るので、試薬容積に下限がある。
【０００４】
したがって、試薬送達及びデータ収集のための最適な条件を提供しながらインサイチュ多重バイオマーカー分析のワークフローを自動化し得るシステムの必要性が存在する。少容積の試薬の試薬送達を制御する１つの方法は、流体チャネルを使用することによって、試料に近い領域に試薬を限定することである。拡散距離は、チャネルの高さにより決定され、新しい（十分に混合された）試薬がチャネルの中を流動して、試料の近くで最適な試薬濃度を維持することができる。
【０００５】
概して、マイクロ流体フローセルは、２つの実質的に平らな基盤層に挟まれた１以上のシーリング層を備える。このシーリング層は、流体チャネルの形状を作り出し、チャネル壁の一部を形成し、通常チャネルの厚さを画成する。このシーリング層は、固体材料の外側を画成された形状に切り出すか、もしくはモールド成形することによって、又は固体化する液体材料を一方の基板の上にプリントすることによって形成することができる。２つの基盤は、流体チャネルを封入し、上下のチャネル壁として機能する。漏れ止めシールは、基板の間にシーリング層をクランプすることによって、及び／又はシーリング層を基板の１つもしくは両方に接着することによって作製される。
【０００６】
さらに、フローセルの構築は、包み込まれた試料を伝統的な撮像装置を通して検出及び分析することができる方法には限界が存在することを指示している。特に、取り込んだ画像の焦点を合わせ、質を調整する、並びにフローセルと撮像装置の対物レンズとの位置合わせする手段を提供する、フローセルを介した試料の撮像方法が必要である。
【０００７】
したがって、広範囲の基板材料が可能であり、撮像装置及び方法論へのアクセスを容易にしながら、いずれの基板によっても流体接続される必要がないマイクロ流体フローセルが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願第２０１３／０２８７６４５号明細書
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、主要な基板の外側に流体接続を有する、フローセル内に組み立て得るマイクロ流体サブアセンブリを提供することによって、前述の欠点を克服する。
【００１０】
本発明の一態様に従って、積層平面アセンブリを有するマイクロ流体サブアセンブリを開示する。この積層平面アセンブリは、接着層、透明基板層及び各層が互いに接着されるガスケット層を備え、接着層及びガスケット層は基板層の範囲を超えて延在する。さらに、基板層の境界の外側に位置する１以上の流体ポートが存在する。構成により、基板層は、いずれの方向にも曲がってサブアセンブリの内部寸法を変更することのできる可撓性の透明蓋を形成する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様に従って、上記のサブアセンブリを備え、マイクロ流体フローセルサブアセンブリに接着された固体支持体をさらに備えたマイクロ流体フローセルを開示する。
【００１２】
本発明の別の態様に従って、固体支持体に結合された生体試料を、記載のマイクロ流体フローセルを使用して分析する方法を開示する。この方法は、フローセルと撮像装置の対物レンズとの位置を合わせることによってフローセルの固体支持体に担持された試料の取り込み画像の質を調整するステップ、及びフローセル中の流体の量を調節して、その中心点から±約２００μｍの範囲で可撓性の蓋を撓ませるステップ、を含む。
【００１３】
本発明のさまざまな他の特色及び有利性は、下記の詳細な説明及び図面から明らかになると思われる。
【００１４】
これらの図面は、本発明を実施するために現在企図される実施形態を例示するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】組み立て前の、積層平面アセンブリを示す代表的サブアセンブリの概略図（Ａ）、ガスケット側から見た、積層平面アセンブリを示す代表的サブアセンブリの概略図（Ｂ）、接着層側から見た、積層平面アセンブリを示す代表的サブアセンブリの概略図（Ｃ）である。
【図２】組み立て前の、固体支持体（１５０）に接着されたサブアセンブリ（１００）を備えた組立てフローセル（１６０）の概略図（Ａ）、サブアセンブリ側から見た、固体支持体（１５０）に接着されたサブアセンブリ（１００）を備えた組立てフローセル（１６０）の概略図（Ｂ）、固体支持体側から見た、固体支持体（１５０）に接着されたサブアセンブリ（１００）を備えた組立てフローセル（１６０）の概略図（Ｃ）である。
【図３】薄膜コネクター（３６０）を形成する積層板層（３００）及びアセンブリ取付具（３５０）を表すコネクターアセンブリの概略図である。
【図４】サブアセンブリ（４２０）の一部としてフローセルガスケット材料（４１０）にまず結合された薄膜コネクターを表す略図（Ａ）、サブアセンブリ（４２０）の一部としてフローセルガスケット材料（４１０）にまず結合された薄膜コネクターが固体支持体（４３０）に接着され、マイクロ流体フローセル（４４０）を形成する略図（Ｂ）である。
【図５】組み込まれた試薬ウェル（５１０）及びバルブ（５２０）により構成された薄膜コネクターを示す概略図である。
【図６】曲げられた、薄膜流体接続により配列された流体モジュールを示す概略図（Ａ）、ねじられた、薄膜流体接続により配列された流体モジュールを示す概略図（Ｂ）、直列に配列され、多重モジュールを可能にするように積み重ねられた、薄膜流体接続により配列された流体モジュールを示す概略図（Ｃ）である。
【図７Ａ−７Ｂ】ガスケット層が組立てフローにおいてバルブとなり得ることを示す２つの概略図である。
【図７Ｃ】ガスケット層を変形させることによって、どのように流体バルブが閉鎖されるかを表す概略図である。
【図８Ａ】流体接続取付具が、高さのあるリング又はシーリング装置を備える一実施形態の概略図である。
【図８Ｂ】マイクロ流体フローセルが高さのあるシーリング表面（１９０）に接触することにより、どのようにガスケット層に対するシールを形成するかを示す概略図である。
【図９】ガスケット及び接着層の別のデザインを使用する組立てフローセルの概略図である。図９Ａは、ガスケット（１３０）及びレッジ（１９５）を示す高さのあるシーリング装置の一つの図である。図９Ｂは、フローチャネルが、ガスケット層（１３０）を底面として形成され得ることを示す図である。
【図１０】倍率×２０の対物レンズによるヒト組織切片の撮像結果を示す図であり、連続画像は、５０μｍの凸状の過充填フローセルから約−５０μｍの凹状のアンダーフィルフローセルまでのさまざまな進行時点における進行を示す。
【図１１】フローセルにおけるＤＮＡ  ＦＩＳＨ自動化のための１つのワークフロー候補を表す工程系統図である。
【図１２】ぴったりと合う小さい内径のチュービング及び環状磁石の内側接着からなる磁気補助流体接続の画像を示し、図１２Ａは、薄膜コネクターの反対側に配置された円筒形磁石を示す図であり、図１２Ｂは、さらに磁石が、どのようにポートを遮断し、チャンバーを封鎖するために使用されるかを示す図である。
【図１３】ＤＡＰＩ、ＣＥＰ１７及びＨｅｒ２染色を示す、マイクロ流体フローセルにおけるＤＮＡ  ＦＩＳＨ実験の成功の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
特許請求する発明の主題をより明確かつ簡潔に記載するために、下記の説明及び添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語に対して、下記の定義が提供される。
【００１７】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」は、文脈が特に他のことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。本明細書及び特許請求の範囲を通してここで使用される、概略を表す言葉（Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｎｇ  ｌａｎｇｕａｇｅ）は、関連する基本的機能に変化をもたらすことなく、差し支えない程度に変動できる任意の量的表現を修飾するために適用することができる。したがって、「約」などの用語により修飾された値は、指定された正確な値に限定されるものではない。特に他のことが明記されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に使用される原料、分子量などの特性、反応条件などの量を表現するすべての数字は、すべてにおいて「約」という用語により修飾されていると理解するべきである。したがって、特に反対のことが示されない限り、上記の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメーターは、本発明により得ることが探求されている所望の特性に依存して変動し得る近似値である。少なくとも、各数値パラメーターは、少なくとも報告された有効数字を考慮して、普通の四捨五入技術の適用により解釈されるべきである。
【００１８】
本明細書において使用する場合、「生体試料」という用語は、インビボ又はインビトロ由来の生体組織又は体液の試料を含む生体対象から得られた試料を指す。このような試料は、限定するものではないが、ヒトを含む哺乳動物から分離された全細胞、組織、分画及び細胞、血液試料全体又はその一部並びに他の生体体液であってよい。生体試料は、固体支持体上に載置又は固定されてよく、例えば、顕微鏡用スライドグラス上に載置された組織切片、組織マイクロアレイもしくは血液塗抹であってよく、又はサブアセンブリが固体支持体に接着された後でフローセルに導入されてもよい。
【００１９】
本明細書において使用する場合、「消耗品」という用語は、単回使用又は限定使用のために設計された使い捨て部品を指す。ある状況においては、消耗品は使用されている系の有効寿命より短い有効寿命を有することがあり、他の状況においては、消耗品は、使用が意図される系から分離する部品であり、分離して保存され、製造されてよい。
【００２０】
特定の実施形態では、マイクロ流体サブアセンブリは、連続して、色素により染色され、任意の高解像度顕微鏡で撮像され、蛍光レポーターが不活性化又は失活され、その後このサイクルが反復されるように、生体試料を封入する手段を提供する。本明細書において使用する場合、マイクロ流体サブアセンブリは、組立てフローセルの中心にあるチャンバーを作り出すマイクロ流体チャンバーとも称され得る。本明細書において使用する場合、マイクロ流体サブアセンブリはサブアセンブリとも称され得る。特定の実施形態では、サブアセンブリは、サブアセンブリが単回使用又は限定使用のために設計されたような消耗品である。
【００２１】
サブアセンブリ装置は、試料をチャンバー内に封入する手段を提供する。特定の実施形態では、試料は、標準的顕微鏡用スライドグラスなどの固体支持体に載置された生体試料であり、試料は後続の処理ステップの間管理された環境下に維持される。生体試料は、固体支持体上に配置され、その後フローセルの形成をもたらすサブアセンブリ装置に封入されてよい。特定の実施形態では、生体試料は、限定するものではないが、全細胞、組織切片、組織マイクロアレイ又は血液試料を含み得る。特定の実施形態では、組織切片は固定組織試料であってよい。特定の実施形態では、サブアセンブリを備えるフローセルは、リアルタイム又はほぼリアルタイムの分析のために、サブアセンブリが恒久的に固体支持体に結合されるような消耗品であってよい。特定の実施形態では、組立てフローセルは、将来の試験又は分析のための試料のアーカイブとして機能してもよい。
【００２２】
生体試料は、フローセル形成の後で、生体試料をセル内に流動させ、化学的又は生物学的手段、静電相互作用、非特異的吸着、誘電泳動力、磁力、光学ピンセット、微細構造による物理的捕捉又は類似の手段により生体試料を捕捉することによって、固体支持体に結合させることもできる。特定の実施形態では、封入された試料を含有するフローセルは、その後の分析のためにそのまま保管されてもよい。
【００２３】
一実施形態では、サブアセンブリを使用して形成されたマイクロ流体フローセルは、物理的にクランプして、固体支持体へのシールを維持する、又はそのシールの完全性を維持する必要はない。
【００２４】
特定の実施形態では、フローセルの内容物は、フローセルと通信しているさまざまな光学的、電気的、磁気的又は電気機械的装置を使用して、インサイチュ分析することができる。別の実施形態では、物質は後続の分析のためにフローセルの外に輸送することができる。一実施形態では、フローセルは、米国特許出願第２００９２５３１６３号及び米国特許第７６２９１２５号に記載の多重組織染色及び撮像のために使用される。さらに他の実施形態では、フローセルは、他の細胞分析技術又は抽出方法を含むか、もしくは含まない形態学を伴う技術の組合せに使用することができる。分析技術としては、限定するものではないが、ＤＮＡの分析又は増幅、ＲＮＡの分析又は増幅、核酸シークエンシング、タンパク質分析、抗原賦活化、ヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）、免疫蛍光染色（ＩＦ）、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又は他の組織学的及び形態学的染色技術を挙げることができる。
【００２５】
サブアセンブリの代表的実施形態は、図１Ａ及び１Ｂ及び１Ｃに示される。サブアセンブリ装置（１００）は、接着層（１１０）、基板層（１２０）及びガスケット層（１３０）を備える積層平面アセンブリからなり、ガスケット層及び接着層は、基板層を超えて延在している。これらの層は共に接着し、接着層及びガスケット層の外側境界に沿って位置する穴を有し、流体の入口／出口ポート（１４０）を形成する。流体の入口／出口ポートは、本明細書においてポートとも称され得る。図１Ｂは、ガスケット（１３０）側から見たサブアセンブリを示し、図１Ｃは接着層（１１０）側から見たサブアセンブリを示す。
【００２６】
基板層（１２０）、特定の実施形態では、基板材料はガラスで構成されてよいが、プラスチック、金属、ケイ素、セラミック、絶縁体、シリコーン又はこれらの組合せで構成されてもよい。特定の実施形態では、好ましい材料はガラスであり、又は基板はカバーガラススリップである。特定の実施形態では、例えば、基板がカバースリップである場合、このカバースリップはケイ酸塩ガラスもしくはホウケイ酸ガラスなどのガラス、又はポリオレフィンから作られる、正確な光透過性を有するＮＵＮＣ（商標）ブランドＴｈｅｒｍａｎｏｘ（登録商標）カバースリップなどのスペシャリティープラスチックからなり得る。例えば蛍光顕微鏡のために紫外線透過性が要求される場合、石英ガラスカバースリップもまた使用することができる。
【００２７】
サブアセンブリ（１００）は、図２に示すように固体支持体（１５０）に接着可能である。図２の実施例において、組織マイクロアレイが固体支持体に載置される。効率的にサブアセンブリを接着させることにより、境界全体に沿ってシールされたマイクロ流体フローセル（１６０）が形成される。このことは、組立てフローセルを両側から示す図２Ｂ及び２Ｃにおいてさらに示され、図２Ｂはガスケット側から表したフローセルであり、２Ｃは固体支持体側から表している。いくつかの実施形態では、サブアセンブリの総厚は、約２５から約１２００μｍであるように設計することができ、この厚さは、約２０から約１０００μｍの間のガスケット及び約５から約２００μｍの間の接着層を組合せた厚さである。
【００２８】
特定の実施形態では、基板（１２０）の一方又は両方及び固体支持体（１５０）は、特定の範囲の波長において透明である。したがって、フローセル内の材料／構造の光学的分析は、落射照明又は両方が透過性である場合の透過照明のいずれかによって達成することができる。組立てフローセルが多重組織染色及び分析に使用できる実施形態では、透過性基板及び固体支持体の両方を使用することによって、落射蛍光撮像及び透過明視野撮像の両方が可能になる。これは、蛍光に基づく分子病理学並びに例えば、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色又はヘマトキシリン及びエオシン色素（Ｈ＆Ｅ）発色染色に基づく従来の明視野撮像を可能にする。
【００２９】
本明細書において使用する場合、「共に接着する」又は「接着可能」という用語は、部品又は材料が共に連結され、材料の接合面においてシールを形成することを指す。接着は、結合を形成するための化学的接着剤の使用を指し、化学的接着剤としては、限定するものではないが、シリコーン、エポキシ、アクリル系、室温硬化材料（ＲＴＶ）、熱可塑性物質又はこれらの組合せが挙げられる。接着は、１つの材料を別の材料の上にオーバーモールド成形して、２つの材料の接合面において機械的又は化学的相互作用によりシールを作ることによっても達成することができる。特定の実施形態では、接着は、圧力、温度又は光もしくは照射に対する曝露などの外部条件の適用を介して達成することができる。接着は、分離の際に凝集破壊が起こるほど強力な結合を接合面にもたらし得る。他の事例では、接着は、接合面が再配置できるような、又は結合が一時的結合と考えられるような、最小限の力で破壊され得る結合を接合面にもたらし得る。
【００３０】
特定の実施形態では、固体支持体は、試料が得られたフローセルに封入されるように、固定された生体試料を担持する。流体入口／出口ポート（１４０）は、基板（１２０）又は固体支持体（１５０）のいずれにも貫通孔が必要ないように、基板（１２０）を超えて延在するように構成される。
【００３１】
特定の実施形態では、接着材料は接着性を有し、限定するものではないが、シリコーン、アクリル系、エポキシ、室温硬化材料（ＲＴＶ）、熱可塑性物質又はこれらの組合せなどの化学的接着剤を含む。特定の他の実施形態では、接着材料は、接着テープ、シリコーン、熱可塑性エラストマー、パラフィンワックス、プリント接着材料又はプラスチックフィルムであってもよい。さらに他の実施形態では、接着材料は、光、熱又は圧力の適用が接着を強化する、光、熱、化学物質又は圧力感受性接着剤であってよい。さらに他の実施形態では、接着材料は、表面のプラズマ活性化、例えば空気又は酸素の補助により、基板、固体支持体、ガスケット又はこれらの組合せに接着される。
【００３２】
流体入口及び出口ポートは、接着材料が基板の端を超えて延在することによって作られる。特定の実施形態では、基板の外側の接着材料は、ガスケット材料によりキャップされてよい。ガスケット材料は、限定するものではないが、シリコーン、熱可塑性エラストマー、接着テープ、ゴム又はプラスチックで構成され得る。フローセル内又はその外につながる流体入口及び出口ポートは、これらのポートがガスケット構造に組み込まれるように、ガスケット材料中に存在する貫通穴で構成され得る。さらに他の実施形態では、ポートは、ガスケット層とは異なる材料であってよく、ガスケットに組み込まれて、層の間を通る開放口を提供する。
【００３３】
特定の実施形態では、流体入口及び出口ポートは、試薬がその間を流動可能なマイクロ流体チャネルを含有する薄膜流体コネクターを備える。このコネクターは、積層平面アセンブリとの流体接続によってマイクロ流体フローセルに直接結合することができ、それ自体が、外部のマクロスケール流体装置と組立てフローセルとの間の少容積の使い易い流体接続、例えば、ポンプ、バルブ及びリザーバを提供する。
【００３４】
特定の実施形態では、マイクロ流体チャネルに加えて、薄膜は試薬の切り替えを容易にするマイクロバルブを収容でき、試薬貯蔵ウェルをポリマー薄膜に直接組み込み又は連結可能にし、特定の工程ステップの間のフローセルの分離を提供する。バルブはフローセルを分離して、漏れ止めシールを提供し、液体蒸発を防止し、又は所望の圧力又は真空レベルを保持できる。バルブはフローセルの充填をさらに容易にすることができ、フローセルはバルブの開放前に真空を構成できる。
【００３５】
特定の実施形態では、薄膜コネクターは、概して１ｍｍ未満の厚さを有する可撓性プラスチックで構成されてよい。可撓性プラスチックは、限定するものではないが、Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ）などのポリイミドフィルム、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ）などのポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリスルホン（ｐｏｌｙｓｕｆｌｏｎｅ）（ＰＳＵ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、感熱性もしくは感圧性接着剤、熱可塑性エラストマー又はシリコーンエラストマーフィルムであってよい。特定の実施形態では、プラスチックは、使用する試薬による分解に抵抗する十分な耐化学性を有する。
【００３６】
特定の実施形態では、コネクターは、共に積層され、所望のマイクロ流体特色を形成する複数のプラスチック層から作製される。特定の実施形態では、これらの層の１以上は、いったんこれらの層が共に積層されると、封入されたマイクロ流体チャネルを作る、予備形成スロット又は切り出されるか、もしくは形成された溝を有する。これらの層は共に直接熱結合されてもよく、又は限定するものではないが、感圧接着剤、Ｂステージ型接着剤、グルー、化学的中間層又はこれらの組合せを含む接着性中間層を使用して結合されても、いずれでもよい。化学的中間層は、例えば、薄層に用いられる化学的プライマーであってよく、表面に共有結合することができる。
【００３７】
図３は、１つのこのような積層板（３００）を使用するアセンブリを示す。図に示すように、チャネル積層板は、上層及び下層（３１０）、感圧接着剤（３２０）及びシリコーンガスケット（３３０）などのＫａｐｔｏｎ（登録商標）のさまざまな層により形成される。チャネルは、予備形成層（３４０）に存在してよい。取付具（３５０）は、組み立ての間に個別の層を位置合わせするために使用して、位置合わせの再現性及び厳しい公差を可能にすることができる。これは、チャネルと流体連絡可能な流体ポートを含有する、ポリマー薄膜コネクター（３６０）内に封入された流体チャネルをもたらす。
【００３８】
図４に示すように、特定の実施形態では、薄膜コネクターは、サブアセンブリ（４２０）の一部としてフローセルのガスケット材料（４１０）（図４Ａ）にまず結合され得る。得られたサブアセンブリは次いで、生体試料（４３０）（図４Ｂ）に接着され、マイクロ流体フローセル（４４０）を形成することができる。特定の他の実施形態では、膜コネクターはガスケット材料それ自体の一部であってよく、その場合、ガスケットが単一の部品構築体としてフローセルサブアセンブリを超えて延在するか、又はガスケット材料の一部が又はマイクロ流体チャネルを含む積層板の一部を形成する。
【００３９】
特定の実施形態では、接着中間層は、場合により中間層の中を切り通すマイクロ流体特色を有し得る。特定の実施形態では、バルブはシリコーン膜及び対応するマイクロ流体チャネル及びバルブシートの組合せにより形成することができる。
【００４０】
特定の実施形態では、薄膜電子素子を構築するための十分に開発された方法をマイクロ流体チャネルの構築方法と組合せて、流体素子及び電子素子の統合を実現でき、加熱／冷却、電磁波の発生／変換／センシング、圧力／真空の発生／変換／センシング及び流動／電気のセンシング素子を可能にする。
【００４１】
特定の実施形態では、薄膜流体コネクターは、消耗品マイクロ流体フローセルのシリコーンガスケット層に直接結合されてもよい。又は、薄膜流体コネクターは、感圧接着剤によりフローセルカバースリップの端に結合され、フローセルガスケット層の必要性を排除することもできる。
【００４２】
特定の実施形態では、薄膜コネクターのアライメントフィーチャは、例えば、いつ顕微鏡に載置されたかなどの簡易登録を機器において可能にする。このコネクターは、流体シールとフローセル載置との間の分離を可能にし、使用の容易さを強化する。
【００４３】
特定の実施形態では、薄膜コネクターは別の流体接続が可能なように設計される。単独接続として機能する１つのポートが使用されてもよく、他の設計は、複数の入口及び出口ポートを可能にしてもよい。他の実施形態では、このポートは、流動を指示又は管理するために使用される流動チャネル又はバルブとインターフェイスで連結される。さらに他の実施形態では、図５に示すように、コネクターは、組み込まれた試薬ウェル（５１０）及びバルブ（５２０）により構成され、複数の入口及び最小希釈のフローセル内への試薬の流動を提供する。
【００４４】
特定の実施形態では、バルブは、薄膜コネクターに直接組み込まれても、又はコネクターと流体接続して、フローセル内外への試薬の流動を管理されてもよい。
【００４５】
特定の実施形態では、電気トレースはポリマー薄膜に組み込むことができ、センシング及び加熱素子並びに先に記載の流体チャネルと密接に結合された電子素子となり得、加熱／冷却、電磁波、発生／変換／センシング、圧力／真空の発生／変換センシング及び流動／電気センシング素子が可能になる。薄膜検出器、例えばＯＬＥＤもまた、光のセンシング及び検出のために組み込まれてもよい。
【００４６】
特定の実施形態では、薄膜は可撓性であってよく、この薄膜が３次元の流体経路を可能にし、接続の間もしくは接続のある位置の間の距離が一様ではない間隙充填（ｇａｐ  ｆｉｌｉｎｇを可能にする、又は異なるサイズの異なる装置の間の切り替え又は挿入を可能にするこのことは図６に示され、流体モジュール（例えば、フローセル）が、曲げられた（Ａ）、ねじられた（Ｂ）、又は直列に配置され、多重モジュールを可能にするように積み重ねられた（Ｃ）、薄膜流体接続により配列されることをさらに可能にする。これは、限定するものではないが、１８０°の接続を含む。
【００４７】
図７Ａ及び７Ｂに示すように、特定の他の実施形態では、ガスケット層（１３０）は、ポート（１４０）と組立てフローセル（１６０）との間の試薬の流動を遮断するバルブとして機能でき、フローセル内の内容物の分離を提供する。バルブは、基板とポート（１４０）（図７Ｃ）との間のチャネル領域（１７０）においてガスケットを固体支持体（１５０）と接触させるように、ガスケットを変形することによって閉じられる。この変形は、限定するものではないが、固体構造をガスケットに対して押し、ガスケットの特定の部位に局所的に空気圧を印加する動きを含む方法により誘導できる。ガスケットを変形させ、ガスケットを固体支持体に対してシーリングする他の方法も使用され得る。
【００４８】
図８Ａは、流体接続取付具が高さのあるリング又はシーリング装置取付具（２００）をさらに含む、流体接続が達成される一実施形態を示す。図に示すように、マイクロ流体フローセルを高さのあるシーリング表面（１９０）に接触させることにより、ガスケット層に対するシールが形成される（図８Ｂ）。取付具上のレッジ（１９５）はガスケット圧縮距離を限定でき、固体支持体を撮像装置の顕微鏡対物レンズなどの外部実体に記録させる水準面を提供する。
【００４９】
図９Ａは、ガスケット（１３０）及びレッジ（１９５）をより詳細に示す、高さのあるシーリング装置の一つの図である。ガスケット（１３０）は、高さのある表面に対して配置される。
【００５０】
特定の実施形態では、圧縮の量は、ガスケットの厚さ及び高さのあるシールとレッジとの間の距離により決定される。例えば、組立てフローセルの総厚が約５２５μｍであり、シールとレッジとの間の距離が約５００μｍであった場合、圧縮距離は約２５μｍであるように設計される。
【００５１】
別の実施形態では、圧縮公差は、接着層に形成されたチャネルの上のガスケット領域を完全に取り囲むシールを形成することによって低減でき（図９Ｂ）、これにより、ガスケットが固体支持体に向かって撓むのを防止できる。これは図９Ｂに例示され、フローチャネルはガスケット層（１３０）を底面として形成され得る。これにより、コネクターの流動抵抗に悪影響を与えずに、製作公差による可変圧縮が可能になる。
【００５２】
特定の実施形態では、ガスケットは、少なくとも５μｍ及び３０μｍ以下で圧縮されるように設計される。他の実施形態では、圧縮距離は、少なくとも５μｍであるように設計されるが、最大距離は、圧縮がガスケットを変形させなければ、２００μｍまであり得る。図に表されるように、ガスケットと流体コネクターとの間の強固なシールを作製するためには、ガスケットの表面の粗度／変化より大きい距離でガスケットが圧縮されることが望ましい。いくつかの実施形態では、ガスケットは、ガスケットが変形して、固体支持体表面に対してシールする（基板を超えて延在するチャネルを遮断する）ほど強く圧縮されるべきではない。ガスケットの圧縮は、好ましくはチャネルの高さの半分未満でなければならない。ガスケットの表面粗度を、非常になめらかなマスターモールドを使用したモールド成形の後で＜１μｍであると仮定すれば、厚さ／表面の変動は支配的パラメーターである。ガスケットの厚さの変動は±５−１０μｍのオーダーであってよく、同様の公差が流体コネクターのステップサイズにも予想される。特定の実施形態では、標的ガスケットは、２５μｍ±１２．５μｍに画成されてよい。
【００５３】
特定の実施形態では、固体支持体（１５０）生体試料を含有してよい。特定の実施形態では、サブアセンブリ（１００）の基板（１２０）との結合力は、組立て装置（１６０）がシールを維持するためにクランプされる必要がなければ十分であると思われる。必要な結合力は、正常な流動条件下で起こる圧力降下、基板及び固体支持体の可撓性、正常な動作温度並びにサブアセンブリ材料及び固体支持体と接触する化学物質に依存すると思われる。
【００５４】
サブアセンブリ（１００）及び関連する組立てフローセル（１６０）の高さは、試料の厚さに基づいて決定することができる。試料が組織切片である場合、試料は約１μｍから約１００μｍの間の厚さを有すると思われる。いくつかの実施形態では、組織切片は最大２５ｍｍ×５０ｍｍの面積を占めてよい。これは、１μＬから１０００μＬ、好ましくは２５μＬから２００μＬの範囲の少量のセル内容積又はサブアセンブリの保持容量をもたらし、サブアセンブリの寸法により決定される。サブアセンブリは、試料の寸法の違いに応じて異なった設計にし、試料を封入したままでセル内容積を最小化することができる。特定の実施形態では、寸法公差は、互換性のある自動装置又は試薬容積の調節に関連すると思われる。例えば、特定の実施形態では、壁の幅又は高さの寸法公差は±１０μｍであり得る。他の実施形態では、公差は±６．２５μｍであり得、さらに他の実施形態では、公差は±５μｍであり得る。公差は、自動装置の使用をさらに補助し得るものである。
【００５５】
サブアセンブリ（１００）が機械的に可撓性である場合、流体が組立てフローセルの中を流動する時にサブアセンブリ（１００）は曲がってもよい。機械的に可撓性の原因は、接着層、ガスケット、基板又はこれらの組合せによる。例えば、特定の実施形態では、基板（１２０）は、軟質可撓性ポリマーフィルム又は破壊せずに変形する十分な曲げ弾性率を有するガラスであってよい。他の実施形態では、ガスケットは、ガラスカバースリップ上にオーバーモールドされ、それによってこのガラスカバースリップが基板層（１２０）になってもよい。
【００５６】
したがって、特定の実施形態では、基板は可撓性材料層として機能可能である。流動が正圧で誘導される場合、可撓性材料層は、固体支持体から遠ざかるように曲がり、フローセルの中心においてより大きなチャンバー容積を効率的に作り出す。これらの場合、流動抵抗は中心においてより小さく、中心ではより多くの流動が起こる。流動が負圧で誘導される場合、可撓性材料層は固体支持体に向いて曲がり、フローセルの中心においてより小さなチャンバー容積を効率的に作り出す。このことは、フローセルの外側の端がより小さい流動抵抗を有し、より多くの流動がこれらの領域において起こることを意味する。したがって、可撓性材料は、流動コントローラーとして機能し得る。特定の実施形態では、固体支持体（１５０）は可撓性であり、同様の様式で機能的であり得る。
【００５７】
特定の実施形態では、この切り替え可能な流動抵抗を使用して、連続的な正圧及び負圧により前後に流動することによって、フローセル全体に確実に均一な流体送達が可能である。流体は、フローセルの中心域を優先的に流動し、その後セルの外縁を優先的に流動する。このことは、組織染色が非常に幅の広いフローセルで実施され、均一な染色が重量である分子病理学応用にとって特に有用である。
【００５８】
切り替え可能な流動抵抗はさらに、フローセルの中心に確実に気泡を進入させないように使用することができる。例えば、フローセルと流体送達との間の流体接続を作製する場合、空気を接続接合面において導入する可能性がある。このような接続を作製後、負圧により流動させることによって、系の中のすべての空気がフローセルの外縁に沿って流動し、その後セルから出て行く。基板が可撓性ではなかった場合、空気はフローセルの中心に進入すると思われ、セルの寸法及び流動特性に依存して捕捉され得る。これらの気泡は流体流動を遮断し、セル内の内容物への均一な流体送達を妨げることがある。さらに、機械的可撓性材料を使用することは、フローセル全体にわたる流動抵抗の変化を調節して、より均一な流体送達並びに系の始動及びセル中の空気の捕捉の防止を容易にする優先的流動を達成することができる。
【００５９】
特定の実施形態では、可撓性材料層又は蓋として機能する基板及び／又はガスケットの可撓性は、マイクロ流体フローセル内において最適な高倍率撮像を提供する方法をさらに提供する。したがって、好ましい実施形態では、例えば、基板がカバースリップ又はカバースリップ材料を含む場合、基板は、適切な波長範囲における撮像のために透明である。したがって、フローチャンバーは、可撓性の透過性の蓋と共に得られ、この蓋は試料に対して引き下げて、従来のカバースリップ固体支持体をシミュレーションし、マイクロ流体チャンバーを損傷又は取り外さずに画像の質を改良することができる。
【００６０】
特定の実施形態では、可撓性材料層は、チャンバーが加圧又は減圧された場合、試料から遠ざかるように押される、又は試料に向かって曲がるように構成される。これは、マイクロ流体系における典型的動作である、フローセルチャンバー由来の流体、ガス又は液体の添加又は除去によって容易に達成される。入口のポンプ及び出口のポンプを用いて、これらのポンプは蓋の曲率に大幅な影響を与えずに、ユニゾンで運転して液体を流動させることができる。曲げが望ましい場合、ポンプは、不一致の速度で、又は逆方向に動作するように作製して、正又は負の曲率を得ることができる。負圧下のチャンバーを用いて、蓋を試料に向かって（又は対抗して）引き下げ、試料と蓋との間の流体の高さを低減する。このことにより、撮像系が画像撮影する流体の深さが低減され、画像の質が改良される。特定の解像度／コントラストにおいて、マイクロ流体チャネルの撮像の際に、流体の中の光散乱及び準最適光結合のために不都合を被ることがある。したがって、撮像の間フローチャンバー中の流体の総高をさらに低減させるために流体を正常に流動させながら、可撓性の蓋は、試料全域にわたるマイクロ流体チャンバーを作り出す。
【００６１】
図１０は、倍率×２０の対物レンズによるヒト組織切片の撮像の結果である。連続画像は、５０μｍの凸状の過充填フローセルから約−５０μｍの凹状のアンダーフィルフローセルまでのさまざまな進行時点における進行を示す。測定は、顕微鏡の焦点を変えることにより測定された約のｚ−高さである。ゼロ点はほぼ平坦なフローセルガラス表面に相当する。図に示されるように、画像の質は、試料と可撓性の蓋との間の液体の高さに影響を与えるチャンバー中の圧力変化に基づいて変化する。
【００６２】
特定の実施形態では、カバースリップはケイ酸塩ガラスもしくはホウケイ酸ガラスなどのガラス、又は正確な光透過性を有するＮＵＮＣ（商標）ブランドのＴｈｅｒｍａｎｏｘ（登録商標）カバースリップなどのスペシャリティープラスチックからなり得る。例えば蛍光顕微鏡のために紫外線透過性が要求される場合、石英ガラスカバースリップもまた使用することができる。
【００６３】
特定の実施形態では、可撓性の蓋の変形は、フローセルの体積容量に依存する。特定の実施形態では、蓋の撓みは、使用する材料に関係すると思われ、例えば材料がシリコーンである場合、材料が可撓性透過性の袋として機能することによって大幅な可撓性が得られる。特定の実施形態では、蓋の撓みは、約±２００μｍである。好ましい実施形態では、撓みは−５０から＋２００μｍの間であり、最も好ましくは−５０から＋１００μｍの間であり、−２０から＋５０μｍのｚ高さの変化をもたらし得る。したがって、可撓性の蓋の変形は、フローチャンバー内の流体の高さを最小化して、流体により引き起こされる球面収差を最小化することによって、試料の最適な撮像（最大の解像度及びコントラスト）を可能にする。
【００６４】
特定の実施形態では、好ましい変形は、試料と可撓性の蓋との間に液体がほとんどないことである。したがって一実施形態では、撓みは、接着層の厚さ−試料の厚さ（２５ｕｍの高さのチャンバー及び４ｕｍの組織切片に対して約２０ｕｍ）の範囲である。
【００６５】
特定の実施形態では、組立てフローセル（１６０）は、チャンバー内を流動し得る流体又は再水和される乾燥試薬を収容できるプラスチックカートリッジと整合させることができる。特定の分子病理学用途において、このような試薬カートリッジを使用して、特定の試験用のバイオマーカーを予めパックした特定のパネルを収容することができる。このカートリッジは、使用者によりカスタマイズされた試薬を添加するように設計することもできる。
【００６６】
特定の実施形態では、組立てフローセルは、サブアセンブリ及び固体支持体を備え、この固体支持体は生体試料を担持している。試料は、固体支持体に結合されたサブアセンブリにより完全に封入される。特定の実施形態では、接着は、恒久的又は半恒久的に固体支持体に結合されたサブアセンブリをもたらし、それによって、サブアセンブリの取り外しがフローセルを消耗し、試料のさらなる分析のために新しいフローセルのアセンブリを必要とする恐れがある。フローセルが再使用可能である必要はないが、単一の固体支持体に取り付けたままで消耗可能な部品であり得るような、単純な装置構造が低コストの製造を可能にする。
【００６７】
特定の実施形態では、フローセルは、撮像装置ステージ、例えば顕微鏡、温度管理系又は流体装置などの装置の別の部品の取付け点と適合するように構成された１以上の取付け点を備える。特定の実施形態では、取付け点は、フローセルと撮像装置の対物レンズと位置が合うように構成される。
【００６８】
特定の実施形態では、生体試料を封入する得られたフローセルは、さまざまな試薬及び撮像工程に曝露され得る。特定の実施形態では、封入された試料を含有するフローセルは、その後の分析のために、又は初期工程の後の事後分析のためにそのまま保管されてもよい。他の実施形態では、サブアセンブリは、生体試料以外の材料を担持する固体支持体に接着されてもよい。例えば、固体支持体は、限定するものではないが、化学物質、機械的構造又はこれらの組合せを含有してもよい。特定の実施形態では、材料は、表面に結合された化学品、ポリマー及び機械的構造、例えば、限定するものではないが、マイクロ電気機械的センサー、アクチュエーター及び流動遮断素子であってもよい。得られたマイクロ流体フローセルはその後、含有される材料の分析又は機能化に使用できる。
【００６９】
特定の実施形態では、フローセルは、限定するものではないが、ＤＮＡの分析又は増幅、ＲＮＡの分析又は増幅、核酸シークエンシング、タンパク質分析、抗原賦活化、ヘマトキシリン及びエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）、免疫蛍光染色（ＩＦ）、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又は他の組織学的及び形態学的染色技術を含む組織又は細胞分析に使用することができる。
【００７０】
特定の実施形態では、組織切片に対するＤＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）又はＲＮＡ  ＦＩＳＨが、マイクロ流体チャンバーにおいて実施できる。したがって、特定の実施形態では、接着フローセルを組織スライドに適用して、マイクロ流体チャンバーが作り出される。次いで、試薬の流動、場合により（蒸発防止又は加圧を可能にするために）フローセルのシーリング及び必要に応じてフローセルの温度調節により、ＦＩＳＨが組織に対して実施される。この工程が完了後、チャンバーは場合により封入剤で満たされ、組織はフローセル中で撮像可能になる。フローセルは、後続の工程ステップ又は貯蔵のために組織スライド上に留まる。
【００７１】
フローセルは、組織に対して安全な一貫した手段で、信頼できる気密なチャンバーを作り出す。この取り組みもまた、その後のチャンバーの取り外しを必要としない。フローセルを流体素子の自動化に使用して、ＦＩＳＨ工程を実施することができ、この例は図１１の工程マップに示される。このステップは、限定するものではないが、水によるすすぎ（Ａ）、ペプシン消化（Ｂ）、水によるすすぎ（Ｃ）、ＰＢＳ洗浄（Ｄ）、ホルマリン固定（Ｅ）、ＰＢＳ＋ＭｇＣＬ２洗浄（Ｆ）、ＰＢＳ洗浄（Ｇ）、アルコール脱水（Ｈ）、さまざまな条件におけるプローブのインキュベーション（Ｉ及びＪ）、ＳＳＣ及びＮＰ４０の溶液によるその後の洗浄（Ｋ）、ＤＡＰＩ染色（Ｌ）、ＳＳＣ洗浄（Ｍ）並びに撮像（Ｎ）を含む。
【００７２】
したがって、他の実施形態では、マイクロ流体フローの固体支持体に結合された生体試料の分析の一般的方法は、（ａ）試料と、組織学、形態学又は分子分析を伴う技術に対応する試薬とを、試薬を流体コネクターを通して流動させることによって接触させるステップ、（ｂ）生体試料からのシグナルを検出するステップ、並びに（ｃ）試料の組織学的、形態学的又は分子的成分を分析するステップ、を含む。他の実施形態では、試料からのシグナルを不活性化して、この工程ステップを反復してもよい。
【実施例】
【００７３】
マイクロ流体フローセル内に封入され、半自動熱流体系に整合された組織マイクロアレイを用いて実験を実施した。全ＤＮＡ  ＦＩＳＨ工程が、マイクロ流体フローセル中での実施及びこの系を使用した検証に成功した。
【００７４】
マイクロ流体フローセルは、自動化及び反復性の利益を免疫組織化学（ＩＨＣ）処理にもたらし、したがって同じ利益がＤＮＡ  ＦＩＳＨに適用される。マイクロ流体フローセル中のＩＨＣの自動化と比較して、ＤＮＡ  ＦＩＳＨの自動化は、熱及び多種多様な試薬の添加のためより複雑である。
【００７５】
ＤＮＡ  ＦＩＳＨ工程は、スライドを１時間、６０℃において焼き、その後スライドをきれいにし、水和及び抗原賦活化の試料調製をフローセル組立ての前に含んだ。フローセルにおけるＤＮＡ  ＦＩＳＨプロトコルは、Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより供給されたＶｙｓｉｓの市販のプローブのＨｅｒ２／ＣＥＰ１７遺伝子マーカー用に最適化した。
【００７６】
フローセルプロトコルは、試薬希釈の最小化及び気泡捕捉の回避のために各ステップの間にパージ及び始動のステップを含んだ。パージ及び始動ステップは、フローセルの入口から、チュービングライン（ｔｕｂｉｎｇ  ｌｉｎｅ）に液体がなくなるまで吸引し、ＣＯ2エアガンを手作業で使用してフローセルから空気をパージし、すべての液体残留物を出口に押し出して、ＣＯ2エアガンを手作業で使用して空気を出口チュービングからパージするステップ、及び、フローセルを次の試薬により始動させるステップからなる。ＣＯ2によるパージ、その後の急速な始動が、気泡と比較して高いＣＯ2泡の水への溶解度のため、気泡の捕捉を防止する。ＣＯ２パージの自動化は当業者には明らかであると思われる。
【００７７】
実験の構成は、加熱系と連動した順方向流体流動のためのシリンジポンプからなった。各試薬を、指定の流速で指定の時間、プロトコルに従って連続して流動させた。その後フローセルを流動構成から取り外し（下記にさらに記載）、試薬シリンジを次の試薬に交換し、系のチュービングを再始動した。フローセルをまず液体を引き抜く（シリンジを使用して吸引を適用）ことによって空にして、その後、フローセルをＣＯ2でパージして液体を系から押し出し、フローセル中の大気をＣＯ2（より容易に水に溶解し、フローセル中に捕捉される気泡を最小化する）と置き換えた。この取り組みは自動ではなかったが、試薬希釈はフローセル内部で１つの試薬を別の試薬に完全に交換するためにより大きな試薬容積を必要とするので、試薬希釈を最小化するために用いた。
【００７８】
圧力下で水が沸騰した結果、セル中に気泡形成が観察され得ることは注目に値する。ＦＩＳＨプローブは通常、普通ホルムアミド、デキストラン及びクエン酸緩衝食塩水（ＳＳＣ）の混合物からなる特殊なバッファー希釈される。このようなバッファーは水より高い沸点を有し、このことが８０℃におけるＤＮＡ  ＦＩＳＨインキュベーションの間の沸騰を防止するはずである。フローセル設計は溶液成分の蒸発を防止する。
【００７９】
ＤＮＡ  ＦＩＳＨの実演に利用されるフローセルを図４に示す。これらのフローセルは、試薬流動のためのチュービングに容易に接続するための薄膜流体コネクターを組み込んだ。この場合、ポンプ系への接続は、チュービングと薄膜コネクターとの間の開閉磁気接続により作製した。このコネクターは、入口、Ｋａｐｔｏｎにより製造された薄いマイクロ流体チャネル及び接着層並びにフローセルに結合された出口を有する。入口はガスケットとして機能する薄いシリコーン層を有する。磁石（約２，０００−２，７００ガウス）を互いに引き合うようにコネクターの両側に配置して、コネクターをしっかりクランプし、ガスケット層の助けにより緊密なシールを形成する。
【００８０】
磁気補助流体接続は、ぴったりと合う小さい内径のチュービング及び環状磁石の内側接着からなる。これらのコネクターは、図１２Ａに示すように、薄膜コネクターの入口側に対して配置され、より小さな円筒形磁石が薄膜コネクターの反対側に配置される。これらの磁石は薄膜コネクターへチュービングを引きつけ、結合し、２つの間に堅いシールを作り出す。磁石は、図１２Ｂに示すように、チャンバーを封鎖するためにも使用される。この場合、同様の磁気強度を有する小型の固体円筒形磁石を使用して、入口及び出口に対して堅いシールを作り出し、どのような流体漏出も防止する。この取り組みはＤＮＡ  ＦＩＳＨに使用した。
【００８１】
図１３に示す画像は、消化で始まり、封入剤の適用とその後の撮像で終わる、マイクロ流体フローセルにおけるＤＮＡ  ＦＩＳＨ実験の成功を明示している。
【００８２】
図１３に示すように、画像はＤＡＰＩ、ＣＥＲＰ１７及びＨｅｒ２染色を含む。核は適切に消化されたように見え、ＦＩＳＨプローブは正確にハイブリダイズされ、蛍光シグナルがＣＥＰ１７及びＨｅｒ２チャネルの両方に存在した。
【００８３】
本発明は、好ましい実施形態に関して記載してきたが、明白に述べられたものの他にも等価物、代替物及び変形が可能であり、それらは添付の特許請求の範囲内にあることが認知される。
【符号の説明】
【００８４】
１００  サブアセンブリ装置、サブアセンブリ
１１０  接着層
１２０  基板層、基板
１３０  ガスケット、ガスケット層
１４０  流体の入口／出口ポート
１５０  固体支持体
１６０  マイクロ流体フローセル、組立てフローセル、組立て装置
１７０  チャネル領域
１９０  突出シーリング表面
１９５  レッジ
２００  シーリング装置取付具
３００  積層板、積層板層
３１０  上層及び下層
３２０  感圧接着剤
３３０  シリコーンガスケット
３４０  予備形成層
３５０  アセンブリ取付具
３６０  ポリマー薄膜コネクター
４１０  フローセルガスケット材料
４２０  サブアセンブリ
４３０  固体支持体
４４０  マイクロ流体フローセル
５１０  試薬ウェル
５２０  バルブ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0006723541.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
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