(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオフィルムとして増殖させた、単離された、2015年6月10日にアクセッション番号PTA-122195としてブダペスト条約下でATCCに寄託された生物活性L. ファーメンタム (L. fermentum) Qi6細菌株を含み、かつ／または該バイオフィルムの生物活性抽出物を含む組成物であって、該株および／またはその抽出物の生物活性が、抗菌活性、共生細菌の増殖を促進するペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 (PPAR) に対するアゴニスト性、皮膚および／または粘膜バリア機能の強化、ならびに皮膚および／または粘膜自然免疫機能の強化より選択される、組成物。
【請求項２】
アクセッション番号PTA-122195を有するL. ファーメンタムQi6細菌株のバイオフィルムの生物活性抽出物を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
薬学的に許容される担体、美容的に許容される賦形剤、および/または、アルコールを含む担体をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
抗菌活性が、バイオフィルムの成長の阻害、バイオフィルムの接着の阻害、およびバイオフィルムの脱離の促進より選択され、および/または、組成物が、共生細菌集団の増加および病原体集団の減少を引き起こし、および/または、PPARに対してアゴニスト性であり、および/または、バリア機能または自然免疫機能の強化が、粘膜バリア機能また粘膜自然免疫機能の強化を含み、および/または、組成物が、好ましくは、脂質、グルコース、および/または脂肪酸の貯蔵を含む代謝活性を調節する、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
障害を処置する方法に使用するための、請求項1記載の組成物であって、該方法が請求項1記載の組成物の治療有効量を処置を必要とする対象に投与することを含む、組成物。
【請求項６】
障害が皮膚科学的障、粘膜もしくは腸障害、または、代謝障害であり、および/または、対象が皮膚バリア機能障害、皮膚ディスバイオシス、および皮膚自然免疫機能障害より選択される状態を有する、請求項5記載の使用のための組成物。
【請求項７】
傷害が代謝障害であり、および、方法が脂質、グルコース、および/または脂肪酸の貯蔵を調節する、請求項6記載の使用のための組成物。
【請求項８】
処置が全身性であり、および/または、方法が1つまたは複数の自然免疫ペプチドおよび／または炎症性サイトカインの発現を調節することによって、皮膚自然免疫機能の強化を引き起こす、請求項5記載の使用のための組成物。
【請求項９】
自然免疫ペプチドが、ヒトβデフェンシン1、ヒトβデフェンシン2、ヒトβデフェンシン3、およびヒトカテリシジン (LL-37)より選択され、および／または、炎症性サイトカインが、インターロイキン1α、インターロイキン4、インターロイキン13、および胸腺間質性リンパ球新生因子 (TSLP) より選択される、請求項8記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
組成物がL. ファーメンタムバイオフィルムの生物活性抽出物を含み、および/または、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) (MRSA) によって引き起こされる感染症を処置するために用いられ、および/または、方法が共生生物としての表皮ブドウ球菌 (Staphylococcus epidermidis) の増殖を促進し、および/または、皮膚バリア機能の強化が、フィラグリン1、フィラグリン2、ロリクリン、インボルクリン、ジャンクション (junction) タンパク質、および接着斑タンパク質より選択される1つまたは複数の皮膚バリアタンパク質の発現を上方制御することによって達成される、請求項5記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
請求項1記載の組成物の美容的に有効な量を対象に投与することを含む、皮膚の状態を改善する美容方法。
【請求項１２】
PPARのアゴニストで処置され得る状態を処置するための方法に用いるための、請求項1記載の組成物であって、該方法がそのような処置を必要とする対象に請求項1記載の組成物を投与することを含む、組成物。
【請求項１３】
無生物表面を消毒するための方法であって、該方法が請求項1記載の組成物の消毒量を表面に施すことを含む、方法。
【請求項１４】
抗菌活性、共生細菌の増殖の促進、皮膚バリア機能の強化、および皮膚自然免疫機能の強化より選択される1つまたは複数の生物活性を有する、請求項1〜10および12のいずれか一項記載の組成物を調製するための方法であって、
細菌を増殖させる段階；
該細菌をバイオフィルムとして増殖させる段階；
前記生物活性の1つまたは複数を有するバイオフィルムおよび／またはバイオフィルム由来の抽出物を回収する段階；ならびに
該バイオフィルムおよび／またはその抽出物を担体と共に製剤化する段階
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2015年7月20日に出願された米国仮特許出願第62/194,630号の恩典を主張し、これは全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトマイクロバイオームは、その多様な常在性共生微生物叢のゆえに、健康および疾患において果たす重要な役割についてかなりの注目を集めている。
【０００３】
外来侵入者に対する防御の前線である皮膚には、微生物の多様な集団が存在する。これらの微生物には、常在性共生生物、一過性微生物、および病原体が含まれる。皮膚の厳しい環境で生存するために、微生物は、生存および増殖に関して競争上の優位性をもたらすバイオフィルム表現型を示す場合が多い。多くの皮膚病原体は、共生生物として皮膚上に生存しているのが見出され得る；微生物のディスバイオシス、宿主の遺伝的変異、および免疫状態が、共生生物から病原体への移行を駆動し得る。
【０００４】
アトピー性皮膚炎 (AD) は、フィラグリン欠損 (1) などの遺伝的要因および黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) を含む環境トリガーが関与する多因子性の慢性炎症性皮膚疾患であり、「アレルギーマーチ」の最初の発現である場合が多い。世界的に見て、ADは小児のおよそ20%および成人の5%を冒し、典型的には、突発性の急性発赤を伴う、慢性的に乾燥したそう痒性の湿疹性皮膚炎として臨床的に現れる。ADはしばしば、喘息およびアレルギー性鼻炎を伴う。ADに罹患した個体の生活の質は顕著に妨げられ、本疾患と関連した経済的負担は重く、年間の国家の直接的コストの概算は364M USD〜3.8B USDである (4,5)。ADは、より効果的な治療法の必要性が大きくかつ満たされていないことを示す。
【０００５】
表皮ブドウ球菌 (S. epidermidis) のような共生細菌は、病原性細菌を回避するためのいくつかの抗菌機構を有する。いくつかの研究から、共生表皮ブドウ球菌由来のセリンタンパク質が、黄色ブドウ球菌の病原性株の増殖を妨げることが示された (40,41)。共生表皮ブドウ球菌由来の新規リポペプチドは、TLR2/CD36-MAPKを介してHβD2およびHβD3を増加させ、ひいては病原性感染に対する抗菌防御を強化する (42,43)。他の研究からは、ヒトの皮膚マイクロバイオーム内の表皮ブドウ球菌が二次発酵代謝物を産生して、さらなる病原性細菌株の増殖を阻害することが示された (44)。さらに、表皮ブドウ球菌などの共生生物を強化することは、他の有益な役割も有し得る。例えば、皮膚表皮ブドウ球菌は、局所的炎症環境を制御する上で、および常在性Tリンパ球の機能を変化させる上で自律的役割を有し、それによって皮膚病原体に対して防御免疫を与える (45)。
【０００６】
皮膚ディスバイオシスは、AD、ざ瘡、および酒さを含むよく見られる皮膚状態と関連づけられている (21)。急性AD発赤中の皮膚マイクロバイオーム配列決定は、発赤中の病原体黄色ブドウ球菌および共生表皮ブドウ球菌のレベル増加と、局所ステロイドおよび抗生物質などの標準的な医学的処置の適用中のその後の減少を関連づけた (22)。
【０００７】
皮膚ディスバイオシスは、重要な生化学的トリガーおよび免疫トリガーを惹起させることができ、研究によって、豊富な量のブドウ球菌とAD病変の臨床的悪化との間の関係が見出され；例えば、MRSAを有する患者はより高い全身臨床皮膚スコアを有した (15,29-31)。
【０００８】
リポテイコ酸は、それをアトピー性皮膚炎の悪化と関連づけ得る (31,35) 免疫学的効果を、主にTLR 2を介して発揮する (32-34)。研究から、AD患者の小児集団においては、健常対照と比較して、皮膚微生物叢における時間的シフトが、3つの病期：ベースライン、発赤、および発赤後、にわたって起こることが示された。特に、病変皮膚の細菌多様性は、黄色ブドウ球菌の相対存在量の増加と平行して、発赤期に減少するが、発赤後状態中には増加し、疾患重症度と微生物多様性との間の関連性を示している(21,22)。
【０００９】
フィラグリン欠損、黄色ブドウ球菌の定着、自然免疫不全、および皮膚の微生物ディスバイオシスは、当該疾患の進行における主要な根本的要因である。ADを有する個体の最大90%までに黄色ブドウ球菌が定着しており；ADにおけるMRSAの保有率は10〜30.8%である (15)。
【００１０】
ADの病態形成における皮膚バリアの役割は、現在では明らかである (18-20)。これに関連して、ADとの最も強い遺伝的関連が、重要なバリアタンパク質（プロフィラグリン）をコードするフィラグリン (FLG) 遺伝子の機能喪失型変異に関してこれまで実証されている (8,9)。フィラグリンは、ADの病態生理学においていくつかの役割を果たし、これは、表皮分化複合体の単一成分のより低い発現が、皮膚バリアの全機能に対してなぜそのように大きな影響を及ぼし得るのかを説明する。皮膚バリア機能は、皮膚共生細菌叢の平衡の主要な決定要因である。皮膚バリアタンパク質FLGは、細菌の病原性株がより深い層に侵入しないことを保証する。最近の研究では、フィラグリンのノックアウトにより、表皮黄色ブドウ球菌定着の顕著な増加、および黄色ブドウ球菌誘導性IL-8発現の上方制御が生じた (16)。
【００１１】
しかしながら、大部分のAD個体においてFLG変異は存在せず；ADでは二次的なフィラグリン欠損が一般的である (6)。これは、AD炎症において一般的なTh2/Th22サイトカイン環境、細菌外毒素、皮膚黄色ブドウ球菌およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) と関連したAD皮膚ディスバイオシス、ひっかき行動に伴う機械的損傷、皮膚脱水、ならびに局所的刺激物などの様々な環境要因に起因すると仮定されている (9-14)。
【００１２】
ADにおけるより低いフィラグリンレベルは黄色ブドウ球菌定着の素因になり (11,12)、より低いレベルの抗菌ペプチドは、自然免疫不全および黄色ブドウ球菌の細胞外アドヘシンの増加と関連している (16,17)。
【００１３】
皮膚における病原性バイオフィルムおよびその代謝産物の制御は、共生皮膚細菌叢の共生関係および皮膚の健康を回復させる上での主要な構成要素である。しかしながら、現在の治療法は、全体的なマイクロバイオームを調節して、ヒト皮膚における共生バイオフィルムの成長を促進しながら、病原性バイオフィルム活性の成長を阻害し、かつ病原性バイオフィルム活性の接着および付着を減少させることよりも、症状のコントロールに主に重点を置いている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、マイクロバイオームを中心とする処置アプローチを採用することにより、ヒトの皮膚科学的（および他の）状態を処置するための組成物および方法を提供する。本発明の好ましい態様は、薬学的および美容的組成物、ならびにそれらの使用方法を提供する。
【００１５】
好ましい態様において、本組成物は、ラクトバチルス・ファーメンタム (Lactobacillus fermentum) 細菌株またはその生物活性抽出物を含む。好ましい態様において、本細菌の抽出物は、この細菌をバイオフィルムとして増殖させた場合に得られる。本発明はまた、凍結乾燥、フリーズドライ、および／または溶解物形態の、L. ファーメンタム細菌またはその生物活性抽出物を含む組成物を提供する。
【００１６】
本発明のいくつかの態様において、皮膚バリア機能の強化は、本発明の細菌組成物を利用して、皮膚バリアタンパク質の発現を上方制御することによって達成される。他の態様において、皮膚自然免疫機能の強化は、本発明の細菌および組成物を利用して、皮膚自然免疫ペプチドおよび／または炎症性サイトカインの発現を調節することによって提供される。
【００１７】
別の局面において、本発明は、組成物の治療有効量を対象に投与する段階を含む、ヒトの皮膚科学的障害を処置する方法を提供し、この場合、組成物は、好ましくはLf Qi6バイオフィルムの1つまたは複数の生物活性抽出物を含む。
【００１８】
有利には、本明細書において提供される好ましい組成物および処置方法は、ヒトの皮膚バリア機能障害、ディスバイオシス、皮膚自然免疫機能障害、および／または炎症性皮膚疾患を処置するのに、ならびに皮膚の外観および／またはきめを改善するのに効果的である。本発明に従って処置された対象は、症状重症度の緩和、急性発赤の発生率の減少、および生活の質の改善を経験し得る。
【００１９】
1つの局面において、本発明は、細菌株またはそれ由来の生物活性抽出物および薬学的に許容される賦形剤を含む、ヒトの皮膚科学的障害を処置するための治療的組成物を提供する。本組成物は好ましくは、抗菌活性の阻害、病原性バイオフィルムの成長、病原性バイオフィルムの接着の阻害、病原性バイオフィルムの脱離の促進、共生バイオフィルムの成長の促進、皮膚バリア機能の強化、および皮膚自然免疫機能の強化より選択される、1つまたは複数の生物活性を有する。
【００２０】
例示的な態様において、病原性細菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) であり、共生細菌は表皮ブドウ球菌 (S. epidermidis) である。
【００２１】
いくつかの態様において、細菌株は、本明細書においてLf Qi6とも称されるラクトバチルス・ファーメンタムQi6である。1つの態様において、本発明は、Lf Qi6の単離されたまたは生物学的に純粋な培養物を提供する。別の態様において、本発明は、バイオフィルムとして増殖させた、Lf Qi6の生物学的に純粋な培養物を提供する。本明細書において具体的に教示されるのは、バイオフィルム表現型を誘導し同定する方法である。本明細書においてさらに提供されるのは、バイオフィルム表現型、ならびにバイオフィルム表現型の抽出物およびその溶解物を利用する方法である。好ましい態様において、薬学的組成物は、Lf Qi6バイオフィルムの生物活性抽出物を含む。
【００２２】
さらなる局面において、本発明は、Lf Qi6および／またはその生物活性抽出物を、1つまたは複数の美容的に許容される賦形剤と共に含む、ヒトの皮膚状態を改善するための美容的組成物を提供する。好ましい態様において、美容的組成物は、Lf Qi6バイオフィルムの生物活性抽出物を含む。
【００２３】
いくつかの態様において、美容的に許容される賦形剤は、ローション、クリーム、乳濁液、軟膏、油、ゲル、美容液、およびそれらの組み合わせより選択される製剤に使用される物質を含む。
【００２４】
さらなる別の局面において、本発明は、細菌株および／またはその生物活性抽出物、ならびに1つまたは複数の美容的に許容される賦形剤を含む組成物の有効量を対象に投与する段階を含む、ヒトの皮膚状態を改善する方法を提供する。治療的組成物と同様に、美容的組成物も、好ましくは、病原性バイオフィルムの成長の阻害、病原性バイオフィルムの接着の阻害、病原性バイオフィルムの脱離の促進、共生バイオフィルムの成長の促進、皮膚バリア機能の強化、皮膚自然免疫機能の強化、およびそれらの組み合わせより選択される、1つまたは複数の生物活性を有する。好ましい態様において、細菌株はLf Qi6である。
[本発明1001]
バイオフィルムとして増殖させた、単離された生物活性L. ファーメンタム (L. fermentum) 細菌株を含み、かつ／または該バイオフィルムの生物活性抽出物を含む組成物であって、該株および／またはその抽出物の生物活性が、抗菌活性、共生細菌の増殖を促進するペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 (PPAR) に対するアゴニスト性、皮膚および／または粘膜バリア機能の強化、ならびに皮膚および／または粘膜自然免疫機能の強化より選択される、組成物。
[本発明1002]
L. ファーメンタムバイオフィルムの生物活性抽出物を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
美容的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
ローション、クリーム、乳濁液、軟膏、油、またはゲルの形態をした、本発明1004の組成物。
[本発明1006]
アルコールを含む担体をさらに含む、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
抗菌活性が、バイオフィルムの成長の阻害、バイオフィルムの接着の阻害、およびバイオフィルムの脱離の促進より選択される、本発明1001の組成物。
[本発明1008]
PPARに対してアゴニスト性である、本発明1001の組成物。
[本発明1009]
共生細菌集団の増加および病原体集団の減少を引き起こす、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
バリア機能または自然免疫機能の強化が、粘膜バリア機能また粘膜自然免疫機能の強化を含む、本発明1001の組成物。
[本発明1011]
代謝活性を調節する、本発明1001の組成物。
[本発明1012]
代謝活性が、脂質、グルコース、および/または脂肪酸の貯蔵を含む、本発明1011の組成物。
[本発明1013]
細菌株が、アクセッション番号PTA-122195を有するL. ファーメンタムQi6である、本発明1001の組成物。
[本発明1014]
本発明1001の組成物の治療有効量を、処置を必要とする対象に投与する段階を含む、障害を処置する方法。
[本発明1015]
障害が皮膚科学的障害である、本発明1014の方法。
[本発明1016]
障害が粘膜または腸障害である、本発明1014の方法。
[本発明1017]
障害が代謝障害である、本発明1014の方法。
[本発明1018]
脂質、グルコース、および/または脂肪酸の貯蔵を調節する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
処置が全身性である、本発明1014の方法。
[本発明1020]
1つまたは複数の自然免疫ペプチドおよび／または炎症性サイトカインの発現を調節することによって、皮膚自然免疫機能の強化を引き起こす、本発明1014の方法。
[本発明1021]
自然免疫ペプチドが、ヒトβデフェンシン1、ヒトβデフェンシン2、ヒトβデフェンシン3、およびヒトカテリシジン (LL-37)より選択される、本発明1018の方法。
[本発明1022]
炎症性サイトカインが、インターロイキン1α、インターロイキン4、インターロイキン13、および胸腺間質性リンパ球新生因子 (TSLP) より選択される、本発明1018の方法。
[本発明1023]
対象が、皮膚バリア機能障害、皮膚ディスバイオシス、および皮膚自然免疫機能障害より選択される状態を有する、本発明1014の方法。
[本発明1024]
組成物がL. ファーメンタムバイオフィルムの生物活性抽出物を含む、本発明1014の方法。
[本発明1025]
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus) (MRSA) によって引き起こされる感染症を処置するために用いられる、本発明1014の方法。
[本発明1026]
共生生物としての表皮ブドウ球菌 (Staphylococcus epidermidis) の増殖を促進する、本発明1014の方法。
[本発明1027]
皮膚バリア機能の強化が、フィラグリン1、フィラグリン2、ロリクリン、インボルクリン、ジャンクション (junction) タンパク質、および接着斑タンパク質より選択される1つまたは複数の皮膚バリアタンパク質の発現を上方制御することによって達成される、本発明1014の方法。
[本発明1028]
細菌株が、アクセッション番号PTA-122195を有するラクトバチルス・ファーメンタム (Lactobacillus fermentum) Qi6である、本発明1014の方法。
[本発明1029]
本発明1001の組成物の美容的に有効な量を対象に投与する段階を含む、皮膚の状態を改善する方法。
[本発明1030]
本発明1001の組成物を、そのような処置を必要とする対象に投与する段階を含む、PPARのアゴニストで処置され得る状態を処置するための方法。
[本発明1031]
本発明1001の組成物の消毒量を表面に施す段階を含む、表面を消毒するための方法。
[本発明1032]
表面が無生物表面である、本発明1030の方法。
[本発明1033]
抗菌活性、共生細菌の増殖の促進、皮膚バリア機能の強化、および皮膚自然免疫機能の強化より選択される1つまたは複数の生物活性を有する組成物を調製するための方法であって、
細菌を増殖させる段階；
該細菌をバイオフィルムとして増殖させる段階；
前記生物活性の1つまたは複数を有するバイオフィルムおよび／またはバイオフィルム由来の抽出物を回収する段階；ならびに
該バイオフィルムおよび／またはその抽出物を担体と共に製剤化する段階
を含む、方法。
[本発明1034]
アクセッション番号PTA-122195を有するラクトバチルス・ファーメンタムQi6の、生物学的に純粋な培養物。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Lf Qi6培養手順を示す。段階1：Lf Qi6をMRS寒天プレートで培養する；段階2：Lf Qi6を5 ml MRSブロス中で37℃で24時間培養する；段階3：培養物0.1 mlを、25 ml MRSブロスを含むT-150組織培養プレートに移す；段階4：25 ml MRS培地を48時間ごとに交換し、バイオフィルムLf Qi6を底上に菌叢として成長させる；段階5：培養物を7日間増殖させて、底上に厚いバイオフィルム層を得る；段階6：バイオフィルム層を剥離し、新鮮な培地中に懸濁する。グリセロールを用いて冷凍庫貯蔵物を作製し、-80℃で貯蔵することができる。
【図２】Lf Qi6スケールアップ培養手順を図示する。段階1：バイオフィルム表現型Lf Qi6を、新鮮MRS培地10 ml中で37℃で24時間培養する；段階2：培養物10 mlを、500 gの無菌グラスウールを含む25 L MRS培地中に接種する；段階3：それを静的条件下で37℃で72時間培養する。穏やかに振盪させることにより、培養物を24時間ごとに混合する；段階4：培地およびグラスウールを回収する。グラスウールを超音波処理して、バイオフィルム細胞を分離する；段階5：細胞を遠心分離して、バイオフィルムLf Qi6を濃縮する。滅菌水中に懸濁する。
【図３】Lf Qi6の下流の加工の一例を図示する。段階1：50 gのバイオフィルム表現型Lf Qi6を1 Lの滅菌水中に懸濁する；段階2：生物活性物質の受動的放出のために、懸濁液を室温で24時間穏やかに混合する；段階3：次いで、OmniSonic Ruptor 400を用いて、混合物を30分間超音波処理して（50 KHz、200ワット）均一な溶解物にする；段階4：超音波処理した溶解物を凍結する；段階5：凍結した溶解物を凍結乾燥して微粉末にする。
【図４】スケールアップ培養における基材でのLf Qi6のバイオフィルム成長を図示する。
【図５】Lf Qi6バイフィルム表現型から調製された生物抽出物中の特有のタンパク質を示すSDSバンドを図示する。矢印は、プランクトン様表現型と比較してバイオフィルム表現型において特有のタンパク質を示す。
【図６】Lf Qi6バイオフィルム表現型から調製された生物抽出物中の特有のタンパク質を示すサイズ排除HPLCを図示する。
【図７】Lf Qi6バイオフィルム表現型から調製された生物抽出物中の特有のタンパク質を示すサイズ排除HPLCを図示する。
【図８】MRSAに対する高い抗バイオフィルム活性を有するLf Qi6バイオフィルム抽出物を図示する。
【図９】バイオフィルムにおけるMRSAコロニー形成単位を図示する。
【図１０】> 50 kDa Qi6培地画分による共生表皮ブドウ球菌バイオフィルムの促進（CV染色）を図示する。
【図１１】バイオフィルムにおける表皮ブドウ球菌コロニー形成単位を図示する。
【図１２】共生表皮ブドウ球菌の増殖対照を図示する。
【図１３】LfQi507が、エクスビボヒト皮膚器官型培養系においてMRSAバイオフィルムを迅速に脱離させることを図示する。
【図１４】図14Aは、インビトロにおける6ウェルプレートでの共培養モデルにおける、Lf Qi601バイオフィルムによる病原性MRSA 対 共生表皮ブドウ球菌の調節を図示する。図14Bは、エクスビボ皮膚外植片での共培養モデルにおける、Lf Qi601バイオフィルムによる病原性MRSA 対 共生表皮ブドウ球菌の調節を図示する。データは平均値±SEM（平均値の標準誤差）として表してあり、一元配置ANOVAを用いて、処理平均値間の差を決定した (P <0.05)。同じ文字を有する平均値は、互いに有意には異ならない（P <0.05、ニューマン・コイルス多重比較検定）。
【図１５】Lf Qi6由来の生物抽出物によって上方制御される、ケラチノサイトにおける皮膚バリアタンパク質フィラグリン (FLG) の発現を図示する。図15Aは、Lf Qi6生物抽出物の処理のないアイソタイプ対照を示す。図15Bは、PBSベースラインを示す。図15Cは、0.5 mg/mLのLf Qi6生物抽出物で処理されたエクスビボ皮膚外植片である。図15Dは、1 mg/mLのLf Qi6生物抽出物で処理されたエクスビボ皮膚外植片である。図15Eは、PBS、0.5 mg/mLのLf Qi6生物抽出物、または1 mg/mL Lf Qi6生物抽出物による皮膚外植片の処理の定量的immunoratioを示す。図15Fは、PBS、0.5 mg/mLのLf Qi6生物抽出物、または1 mg/mL Lf Qi6生物抽出物による皮膚外植片の処理の定量的 FLG ELISAを示す。データは平均値±SEM（平均値の標準誤差）として表してあり、一元配置ANOVAを用いて、処理平均値間の差を決定した (P <0.05)。**はP< 0.01を意味し、***はP< 0.001を意味する。
【図１６】Lf Qi6生物活性物質がケラチノサイトにおいてPPARβおよびPPARγを増加させることを図示する。
【図１７】LfQi507がヒトβデフェンシンの発現を増加させることを図示する。
【図１８Ａ】バンコマイシンおよびメロペネムと比較した、Lf Qi6生物抽出物によるパーセントMRSAバイオフィルム阻害を示す。データは平均値±SEM（平均値の標準誤差）として表してあり、一元配置ANOVAを用いて、処理平均値間の差を決定した (P <0.05)。有意差が認められた場合には、ニューマン・コイルス多重比較検定を用いて平均値を比較した。同じ文字を有する平均値は、互いに有意には異ならない。
【図１８Ｂ】バンコマイシンおよびメロペネムと比較した、Lf Qi6生物抽出物によるMRSAバイオフィルム接着のパーセント減少を示す。データは平均値±SEM（平均値の標準誤差）として表してあり、一元配置ANOVAを用いて、処理平均値間の差を決定した (P <0.05)。有意差が認められた場合には、ニューマン・コイルス多重比較検定を用いて平均値を比較した。同じ文字を有する平均値は、互いに有意には異ならない。
【図１８Ｃ】バンコマイシン、メロペネム、またはLf Qi6生物抽出物の処理後のパーセントMRSAバイオフィルム脱離を示す。データは平均値±SEM（平均値の標準誤差）として表してあり、一元配置ANOVAを用いて、処理平均値間の差を決定した (P <0.05)。有意差が認められた場合には、ニューマン・コイルス多重比較検定を用いて平均値を比較した。同じ文字を有する平均値は、互いに有意には異ならない。
【図１８Ｄ】クマシーバイオフィルム染色を用いた、6ウェルプレートにおける、Lf Qi6生物抽出物で処理されたMRSAバイオフィルムの阻害を示す。
【図１８Ｅ】ヘマトキシリン・エオシンで染色された、エクスビボ皮膚上に形成されたMRSAバイオフィルムを示し、矢印は頑強なバイオフィルム形成を示す。
【図１９Ａ】Lf Qi6生物抽出物によるヒトβデフェンシン2の上方制御を表す。データは平均値±SEM（平均値の標準誤差）として表してあり、一元配置ANOVAを用いて、処理平均値間の差を決定した (P <0.05)。***はP< 0.001を意味する。
【図１９Ｂ】LfQi6生物抽出物で処理されたエクスビボ皮膚モデルにおけるヒトβデフェンシン3の上方制御を示す。データは平均値±SEM（平均値の標準誤差）として表してあり、一元配置ANOVAを用いて、処理平均値間の差を決定した (P <0.05)。***はP< 0.001を意味する。
【図１９Ｃ】LfQi6生物抽出物で処理された組織培養液からのHPLCによるβデフェンシン2の同定を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトの皮膚科学的状態を処置するための組成物および方法を提供する。本発明の好ましい態様は、ヒト微生物叢に由来しかつバイオフィルム表現型で増殖し得るラクトバチルス・ファーメンタム細菌株、および／またはその1つもしくは複数の生物活性抽出物を含む薬学的および美容的組成物、ならびにそれらの使用方法を提供する。本発明はまた、凍結乾燥、フリーズドライ、および／または溶解物形態の、L. ファーメンタム細菌および／またはその生物活性抽出物を含む組成物を提供する。
【００２７】
有利には、本明細書において提供される好ましい組成物および処置方法は、ヒトの皮膚バリア機能障害、ディスバイオシス、皮膚自然免疫機能障害、炎症性皮膚疾患を処置するのに、ならびに皮膚の外観および／またはきめを改善するのに効果的である。このようにしてこのマイクロバイオームを中心とするアプローチで処置された対象は、症状重症度の緩和、急性発赤の発生率の減少、および生活の質の改善を経験し得る。
【００２８】
いくつかの態様において、細菌株は、本明細書においてLf Qi6とも称されるラクトバチルス・ファーメンタムQi6である。1つの態様において、本発明は、Lf Qi6の単離されたまたは生物学的に純粋な培養物を提供する。別の態様において、本発明は、バイオフィルムとして増殖させた、Lf Qi6の生物学的に純粋な培養物を提供する。本明細書において具体的に教示されるのは、バイオフィルム表現型を誘導し同定する方法である。本明細書においてさらに提供されるのは、バイオフィルム表現型、ならびにバイオフィルム表現型の溶解物を含むバイオフィルム表現型の抽出物を利用する方法である。好ましい態様において、薬学的組成物は、Lf Qi6バイオフィルムの生物活性抽出物を含む。
【００２９】
L. ファーメンタム微生物の培養物は、American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209 USAに寄託されている。寄託物には、受託機関によりアクセッション番号ATCC No. PTA-122195が割り当てられ、2015年6月10日に寄託された。
【００３０】
本培養物は、37 CFR 1.14および35 U.S.C 122の下、特許商標庁長官がそれを取得する資格があると判断した者にとって、本特許出願の係属中に培養物を利用可能であることを保証する条件の下で寄託されている。寄託物は、本出願の写しまたはその所産が提出されている国の外国特許法の要請に応じて利用することができる。しかしながら、寄託物の利用は、行政措置によって付与された特許権の適用を制限して本発明を実施する認可とはならないことが理解されるべきである。
【００３１】
さらに、本培養寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の規定に従って保管され、公的に利用可能となる、すなわちそれは、それを汚染させることなく生存させておくために必要なあらゆる注意を払いつつ、寄託試料の最新の分譲請求から少なくとも5年間、およびいかなる場合にも、寄託日から少なくとも30年間、または培養物の開示を公表し得るあらゆる特許の権利行使可能期間にわたって保管される。寄託者は、寄託物の状態に起因して保存機関が請求時に試料を分譲できない場合には、寄託物を交換する義務を受け入れる。本培養寄託物の公共への利用可能性に対する制限はすべて、それを開示する特許の付与に際して、変更不可に取り除かれる。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、「単離された」微生物への言及は、自然界でそれと共に存在する材料から取り出されているものを指す。微生物は、例えば、土壌、血液、粘膜、または乳汁から取り出され、かつそれらと自然界における程度まで混合されないかまたは別の方法で会合されないように、そのような材料から単離され得る。そのような単離を用いて、微生物がその天然状態で示すものとは異なる化合物または異なる量の化合物の産生などの、顕著に異なる特徴を微生物に付与することができる。
【００３３】
1つの局面において、本発明は、生物学的に純粋な細菌株および／またはその生物活性抽出物、ならびに1つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む、ヒトの皮膚科学的障害を処置するための薬学的組成物を提供し、細菌株およびその抽出物は、プランクトン様表現型およびバイオフィルム表現型の両方で増殖することができ、組成物は、一般的な抗菌活性、病原性バイオフィルムの成長の阻害、病原性バイオフィルムの接着の阻害、病原性バイオフィルムの脱離の促進、共生バイオフィルムの成長の促進、皮膚バリア機能の強化、および皮膚自然免疫機能の強化より選択される、1つまたは複数の生物活性を有する。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「抽出物」という用語は、バイオフィルム培養物を加工することによって得られた組成物を指す。加工は、例えば、物理的および／または化学的処理を含み得る。物理的および／または化学的処理は、例えば、濾過、遠心分離、超音波処理、加圧処理、放射線処理、溶解、溶媒または他の化学物質による処理、およびこれらの処理の組み合わせを含み得る。抽出物は、例えば、遠心分離によって生成されたような上清の形態であってよい。抽出物はまた、遠心分離によって得られた細胞塊を含み得る。細胞は、無傷であってもまたは無傷でなくてもよく、生存していてもまたは生存していなくてもよい。抽出物は、細胞膜成分および／または細胞内成分を含み得る。ある特定の態様において、抽出物の少なくとも80、85、90、または95重量%は細胞塊である。ある特定の態様において、無傷細胞の少なくとも95%は生存していない。ある特定の態様において、抽出物中の細胞塊の10%未満は無傷細胞である。
【００３５】
ヒトの皮膚は、2つの区画、深部区画（真皮）および表面区画（表皮）を含む。皮膚は、外部の攻撃、具体的には化学的、機械的、または感染性攻撃に対するバリア、ならびに例えば気候、紫外線、およびタバコなどの環境要因、および／または例えば微生物などの生体異物要因に対するいくつかの防御反応を構成する。この特性は皮膚バリア機能と称され、表皮の最表層、すなわち角質層 (stratum corneum) と称される角質層 (horny layer) によって主に提供される。バリアにおける有害変化は、例えば、皮膚の不快感、感覚現象、および／または皮膚の乾燥によって反映され得る。
【００３６】
本発明のいくつかの態様による組成物は、バリア機能の低下を防ぐ、および／またはバリア機能を修復もしくは再生するのに有用である。皮膚および／または粘膜バリアの破壊と関連した障害には、乾癬、魚鱗癬 (icthyosis)、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、ざ瘡（化膿性汗腺炎 (hiradenitis suppurativa) を含む）、熱傷、おむつ皮膚炎、ネザートン症候群、日光角化症、皮膚真菌症、皮膚症または外胚葉異形成症、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、脂漏性 (seborrehic) 皮膚炎、尋常性、好酸球性食道炎、フィラグリン欠損、ならびに皮膚および／または粘膜バリアの損傷または破壊と関連した他の障害が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
いくつかの態様において、バリアの修復または再生は、粘膜の修復または再生を含む。粘膜には、口腔粘膜（頬、軟口蓋、舌下面を含む舌、および口腔底の粘膜を含む）、鼻粘膜、咽喉粘膜（咽頭、喉頭、気管、および食道の粘膜を含む）、気管支粘膜、肺粘膜、眼粘膜、耳粘膜、胃腸管粘膜、膣粘膜、陰茎粘膜、尿道粘膜、膀胱粘膜、および肛門粘膜が含まれる。ある特定の態様において、本発明の組成物はまた、急性および慢性ウイルス感染症の処置に使用され得る。特に、集団において遍在性であり、免疫監視 (survillance) の減少と関連している、慢性エプスタイン・バーウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、および他のヘルペス型ウイルス感染症の処置。
【００３８】
本明細書において提供される薬学的組成物はまた、薬学的に許容される担体、補助剤、賦形剤、希釈剤、増量剤、緩衝剤、保存剤、抗酸化剤、潤滑剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば、湿潤剤）、マスキング剤、および着色剤を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の他の薬学的に許容される成分を含み得る。製剤は、例えば、他の治療薬または予防薬を含む他の活性薬剤をさらに含み得る。
【００３９】
本明細書において提供される場合、「薬学的に許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって認可されているもしくは認可され得るということ、またはヒトを含む動物に使用するための米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に掲載されているということを指す。
【００４０】
「薬学的に許容される賦形剤、担体、または補助剤」とは、活性成分と共に対象に投与され得、かつその薬理学的活性を損なわず、本明細書において提供される組成物の治療量を送達するのに十分な用量で投与された場合に非毒性である、賦形剤、担体、または補助剤を指す。
【００４１】
いくつかの態様において、生物学的に純粋な株は、以下Lf Qi6とも称されるラクトバチルス・ファーメンタムQi6である。好ましい態様において、本明細書において提供される薬学的組成物は、バイオフィルム表現型で増殖させた後に得られたLf Qi6の1つまたは複数の生物活性抽出物を含む。
【００４２】
「プランクトン様」とは、液体培地中に自由に浮遊する微生物（関連するバクテリオファージおよび他のウイルスを伴う、細菌、真菌、および／または原生動物）に典型的な表現型を指す。一方の「バイオフィルム」は、細胞外高分子マトリックス (EPS) 中に包埋された微生物の蓄積であり、生物学的または非生物的固体表面に対して接着性である。本明細書において提供される実施例において、Lf Qi6が、典型的なプランクトン様表現型をもつのに加えて、バイオフィルムも形成し得ることが観察され報告された。
【００４３】
バイオフィルムを成長させる方法は、当技術分野で公知であり、例えば、26〜31ページで引用されているようなその参考文献において引用されている出版物を含め、その全体が参照により本明細書に組み入れられるWO 2012/118535に記載されている。
【００４４】
黄色ブドウ球菌 (S. aureus) などの病原性細菌のバイオフィルムは、高度耐性細菌感染症を引き起こし得るのに対して、Lf Qi6のバイオフィルムおよびその抽出物は、抗ディスバイオシスおよび（例えば、病原性細菌の）抗バイオフィルム特性、皮膚バリア強化、ならびにヒトケラチノサイトおよびエクスビボヒト皮膚培養物に対する免疫調節効果を有することが見出された。
【００４５】
さらに、共培養研究により、0.5〜1.0 mg/mlのLf Qi6バイオフィルム抽出物が、共生細菌の増殖を促進しながら、皮膚に対する病原性バイオフィルムの負荷を減少させることが示された。常在性共生細菌の相対的比率を強化することは、表面に対する病原性バイオフィルムの負担を減少させ得る。
【００４６】
例示的な態様において、病原性細菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) であり、共生細菌は表皮ブドウ球菌 (S. epidermidis) である。
【００４７】
感染症は、疾患を引き起こす微生物が身体の組織に侵入する場合に生じる。そのような微生物およびそれらが産生する毒素は、身体の組織と反応して、感染宿主による免疫応答を引き起こす場合が多い。感染症は、細菌、ウイルス、ウイロイド、真菌、および他の寄生虫によって引き起こされ得る。感染症は、皮膚、腸、または膜などの、身体の組織のいずれかを介して生じ得る。特定の態様において、本発明は、身体の外表面、および具体的には皮膚の感染症を処置および／または予防するための組成物を提供する。感染症は、病原性ブドウ球菌などの細菌によって引き起こされ得る。本明細書において提供される薬学的組成物は、MRSAなどの感染性因子への曝露と別々に、連続して、または同時に適用され得る。他の態様において、本発明は、腸の障害および他の内部障害を処置するための材料および方法を提供する。
【００４８】
黄色ブドウ球菌は、鼠径部、腋窩、および前鼻孔などの、主に身体の湿った温かい領域における、皮膚の一過性生着菌である。人口の最大60%までが断続的な保因者である一方、別の20%には安定して定着している可能性がある。通常の保因は無症候性であるが、黄色ブドウ球菌は組織に侵入する可能性があり（例えば、傷ついた皮膚を通して）、そこで比較的軽微な膿痂疹および熱傷様皮膚症症候群から、敗血症などの生命を脅かす状態に及ぶ疾患を引き起こす。さらに、黄色ブドウ球菌感染症は、アトピー性皮膚炎 (AD) などの根底にある状態を伴う、皮膚における二次的現象である場合が多い。
【００４９】
本発明によって提供される例示的な組成物は、ブドウ球菌属種、シュードモナス属種、スタフィロコッカス・サプロフィティクス (Staphyloccus saprophyticus)、スタフィロコッカス・キシロサス (Staphyloccocus xylosus)、スタフィロコッカス・ルグデュネンシス (Staphyloccocus lugdunensis)、スタフィロコッカス・シュレイフェリ (Staphyloccocus schleiferi)、スタフィロコッカス・カプラエ (Stapylococcus caprae)、スタフィロコッカス・サプロフィティクス、スタフィロコッカス・ホミニス (Staphylococcus hominis)、黄色ブドウ球菌、フェカリス菌 (Enterococcus faecalis)、バンコマイシン耐性腸球菌 (VRE)、セレウス菌 (Bacillus cereus)、枯草菌 (Bacillus subtilis)、リステリア菌 (Listeria monocytogenes)、化膿性連鎖球菌 (Streptococcus pyrogenes)、ストレプトコッカス・サリバリウ (Streptococcus salivariu)、ミュータンス菌 (Streptococcus mutans)、および肺炎球菌 (Streptococcus pneumonia) を含むがこれらに限定されない、いくつかの病原性細菌による感染症の処置に有用である。他の病原性細菌は、当業者によって容易に認識されるであろう。
【００５０】
本明細書において提供されるある特定の組成物は、抗黄色ブドウ球菌活性、好ましくは抗MRSA活性を示し、したがって細菌の増殖の阻害、細菌の接着の阻害、および細菌の脱離の促進を含め、黄色ブドウ球菌感染症の処置または予防に有用である。
【００５１】
本発明に従って、Lf Qi6は、インビトロおよび生存エクスビボヒト皮膚外植片モデルの両方において、MRSAバイオフィルムに対する抗接着活性、阻害活性、および脱離活性を有することが見出された。Lf Qi6 MRSA抗バイオフィルム活性に関して、いくつかの潜在的機構が存在する。例えば、Lf Qi6またはその抽出物は、抗バイオフィルムペプチドもしくは熱ショックタンパク質、および／または (p)ppGppブロッカーを含み得る。Lf Qi6の全ゲノム配列決定からのプロテオミクス解析により、いくつかの特有の熱ショックタンパク質および他の関連ストレスタンパク質が示唆された。
【００５２】
本発明のいくつかの態様は、皮膚バリア機能の強化が、皮膚バリアタンパク質の発現を上方制御することによって達成されることを提供する。他の態様において、皮膚自然免疫機能の強化は、皮膚自然免疫ペプチドおよび／または炎症性サイトカインの発現を調節することによって提供される。
【００５３】
いくつかの態様において、Lf Qi6バイオフィルムから抽出された生物活性物質は、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 (PPAR)、すなわち、PPAR-α、PPAR-β/δ、および／またはPPAR-γに対するアゴニスト活性を有する。PPARは、核内受容体タンパク質の1つの群であり、転写因子として働いて、様々な生理的刺激に応答して遺伝子発現を調節する。それらの構造は、アミノ末端活性化ドメイン (AF1)、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、リガンド結合カルボキシ末端ドメイン、およびc末端の第2活性化ドメイン (AF2) から構成されて、高度に保存されている。
【００５４】
PPAR-αは、褐色脂肪、肝臓、心臓、筋肉、腎臓、免疫細胞などの、代謝的に活性な組織で発現される。そのリガンドには、ドコサヘキサエン酸 (docosahexanoic acid) (DHA)、WY 14643、クロフィブラート、酸化リン脂質、フタル酸エステル、および様々な除草剤が含まれる。最初の3つのリガンドは、フィラグリンおよび熱ショックタンパク質27 (HSP27) を増加させることが公知である。PPAR-αは、エネルギー欠乏の条件下で活性化されて、長時間の絶食に対する適応であるケトン体生成を開始させる、肝臓の脂質代謝の主要な調節因子である。PPAR-α合成リガンドには、抗高脂血症フィブラート系薬物が含まれる。PPAR-αリガンドは肝臓の脂質代謝を調節するため、それらは脂肪性肝炎 (steatohepatisis) または脂肪肝の処置において有用性を有し得る。
【００５５】
PPAR-β/δは、皮膚、腸管、肝臓、心臓、骨格筋、肺、脳、胸腺、脾臓、ケラチノサイト、および様々な免疫細胞を含む、代謝的に活性な組織で発現される。そのリガンドには、GW1514およびレチノイン酸が含まれる。PPAR-β/δのアゴニズムは、身体の燃料の優先度をグルコースから脂質に変更するばかりでなく、脳梁のミエリン形成、表皮細胞の増殖、ならびにケラチノサイトにおける分化、脂質蓄積、方向感知、極性化、および遊走において役割を果たすことが実証されている。
【００５６】
PPAR-γは、偏在性に発現されるが、主に脂肪組織、結腸、およびマクロファージに存在する。そのリガンドには、チアゾリジンジオン (TZD) ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾンが含まれるため、PPARγは「グリタゾン」受容体とも称される。脂肪細胞分化の調節因子として、これは脂肪酸貯蔵およびグルコース代謝の調節因子として重要である。PPAR-γ部位において活性を有する化合物は、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、肥満、アテローム硬化性心疾患、および他の代謝異常状態の、経口、注射、またはさもなければ全身処置として、特に有益な薬理的能力を有する。しかしながら、PPARγ受容体のリガンド媒介性活性化は、培養ヒト乳房細胞株、胃細胞株、肺細胞株、前立腺細胞株、および他の癌細胞株の増殖の阻害に関与すると考えられている (46)。
【００５７】
PPARは、抗アポトーシスおよび細胞分化、抗炎症活性、ならびに脂質およびグルコース代謝に対して顕著な影響を及ぼすため、本発明の態様はまた、Lf Qi6生物抽出物が、代謝異常状態、慢性炎症性状態、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病、メタボリック症候群、アテローム性動脈硬化、脂肪性肝炎、アルツハイマー病、ならびに皮膚障害、例えば、脱毛、急性および慢性創傷、慢性皮膚炎症の疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、酒さ、ざ瘡、脂漏性 (sebhorrheic) 皮膚炎、ならびに急性呼吸促迫症候群 (ARDS) および慢性閉塞性肺疾患 (COPD) などの、気道好中球増加症が関与すると考えられている疾患を含む、PPARアゴニズムから恩恵を受ける種々の障害において、局所または全身性の薬理的薬剤として特に有益な有用性を有することを提供する。代謝障害の処置は、例えば、脂質、グルコース、および／または脂肪酸の貯蔵の調節を含み得る。
【００５８】
本発明のいくつかの態様において、皮膚バリア機能の強化は、例えば、フィラグリン1、フィラグリン2、ロリクリン、インボルクリン、ジャンクション (junction) タンパク質、および／または接着斑タンパク質より選択される、1つまたは複数の皮膚バリアタンパク質の発現を上方制御することによって達成される。
【００５９】
いくつかの態様において、皮膚自然免疫機能の強化は、皮膚表面上の病原性バイオフィルム負荷の減少と関連している、1つまたは複数の自然免疫ペプチドおよび／または炎症性サイトカインの発現を調節することによって達成される。
【００６０】
いくつかの態様において、自然免疫ペプチドは、ヒトβデフェンシン1、ヒトβデフェンシン2、ヒトβデフェンシン3、ヒトカテリシジン (LL-37)、およびそれらの組み合わせより選択される。
【００６１】
いくつかの態様において、炎症性サイトカインは、インターロイキン1α、インターロイキン4、インターロイキン13、胸腺間質性リンパ球新生因子 (TSLP)、およびそれらの組み合わせより選択される。
【００６２】
ヒトの皮膚バリア機能、免疫機能、および抗炎症機能を調節する他のタンパク質、ペプチド、およびサイトカインは、当業者によって容易に認識されるであろう。
【００６３】
ある特定の態様において、本発明はまた、人体または動物体の医学的処置のためではない、洗浄製品、洗浄液、表面コーティング、または他の組成物の形態で、抗菌組成物を提供する。したがって、特定の態様において、これらの組成物は、無生物表面を消毒するために用いられる。
【００６４】
別の局面において、本発明は、薬学的組成物の治療有効量を対象に投与する段階を含む、ヒトの皮膚科学的障害を処置する方法を提供し、組成物は好ましくはLf Qi6バイオフィルムの1つまたは複数の生物活性抽出物を含む。
【００６５】
本明細書で用いられる「対象」とは、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、非ヒト霊長類、もしくは鳥類、例えばニワトリ、ならびに任意の他の脊椎動物または非脊椎動物を意味する。
【００６６】
本明細書において提供される薬学的組成物の投与は、好ましくは「治療有効量」で行われ、これは処置される細胞、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答をもたらすのに十分な量である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間的経過は、処置される疾患および対象の性質および重症度に依存するであろう。処置の処方、例えば投与量の決定等は、総合診療医および他の医師の責任の範囲内であり、典型的には、処置されるべき障害、個々の患者の状態、送達の部位、投与の方法、および診療医に公知の他の要因を考慮に入れる。
【００６７】
組成物は、処置されるべき状態に応じて、単独で、または他の処置と組み合わせて、同時または連続のいずれかで、投与され得る。本明細書において提供される薬学的組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される他の成分中に溶解され得るか、懸濁され得るか、またはそれらと混合され得る。組成物はまた、リポソームまたは他の微粒子中に存在してもよい。
【００６８】
好ましい態様において、薬学的組成物は、局所投与用に、具体的には皮膚へまたは皮膚上への使用または適用のために製剤化される。そのような製剤は、生物学的または非生物的表面上のMRSAなどの病原性細菌を除去する、死滅させる、もしくはその接着および蓄積を妨げるのに、または細菌の作用もしくは増殖を阻害するのに有用であり得る。さらに、特定の態様において、Lf Qi6のバイオフィルムまたはその抽出物を含む組成物は、ヒトの皮膚マイクロバイオーム中の共生細菌の増殖を促進する利点を有する。共生細菌の非限定的な例には、表皮ブドウ球菌 (S. epidermidis)、スタフィロコッカス・ワルネリ (Staphylococcus warneri)、ストレプトコッカス・ミティス (Streptococcus mitis)、プロピオニバクテリウム・アクネス (Propionibacterium acnes)、コリネバクテリウム属種、アシネトバクター・ジョンソニイ (Acinetobacter johnsonii)、および緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書において提供される薬学的組成物は、適切には、微生物バイオフィルムおよび／またはその1つもしくは複数の抽出物と、任意で、例えば浸透、透過、および吸収促進剤を含む1つまたは複数の他の薬学的に許容される成分とを、含浸させるか、またはそれでコーティングされた、パッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング、または同様の物として提供され得る。
【００７０】
本発明の態様による抗菌組成物は、対象への投与、また対象の処置、または対象における使用に先立って、生体材料、インプラント、および装具（ステント、弁、眼、補聴器、胃バンド、義歯、人工関節置換物等を含む）、手術器具、または他の医療機器を処理するのに有用であり得る。抗菌組成物は、細菌が定着しやすいかまたは細菌に曝露されやすい表面、例えば、手すり、食品調理面、台所表面もしくは台所用品、テーブル、シンク、トイレ、または他の浴室機器などを処理するのに有用であり得る。
【００７１】
抗菌組成物は、微生物（例えば、Lf Qi6）バイオフィルムまたはその生物活性抽出物に加えて、薬剤、例えば、洗浄剤、安定剤、陰イオン性界面活性剤、香料、キレート剤、酸、アルカリ、緩衝剤、または洗剤などを含み得る。そのような薬剤は、細菌を死滅させるかもしくは阻害する、または洗浄された表面の再定着を防ぐなど、組成物の抗菌特性を促進または強化し得る。
【００７２】
例示的な態様は、対象が、皮膚バリア機能障害、皮膚ディスバイオシス、皮膚自然免疫機能障害、およびそれらの組み合わせより選択される状態に罹患している対象であることを提供する。
【００７３】
本明細書において提供される態様は、乾癬、魚鱗癬、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、炎症性腸疾患、ざ瘡（化膿性汗腺炎を含む）、皮膚炎、創傷治癒、ざ瘡（化膿性汗腺炎を含む）、熱傷、おむつ皮膚炎、ネザートン症候群、日光角化症、皮膚真菌症、皮膚症または外胚葉異形成症、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、尋常性、好酸球性食道炎、フィラグリン欠損、ならびに／または皮膚バリアの損傷または破壊と関連した他の障害の処置に有用である。
【００７４】
いくつかの態様において、バリアの修復または再生は、粘膜の修復または再生を含む。粘膜には、口腔粘膜（頬、軟口蓋、舌下面を含む舌、および口腔底の粘膜を含む）、鼻粘膜、咽喉粘膜（咽頭、喉頭、気管、および食道の粘膜を含む）、気管支粘膜、肺粘膜、眼粘膜、耳粘膜、胃腸管粘膜、膣粘膜、陰茎粘膜、尿道粘膜、膀胱粘膜、および肛門粘膜が含まれる。
【００７５】
ある特定の態様において、本発明の組成物はまた、急性および慢性ウイルス感染症の処置に効果的に使用され得る。特に、集団において遍在性であり、免疫監視の減少と関連している、慢性エプスタイン・バーウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、および他のヘルペス型ウイルス感染症の処置である。
【００７６】
さらなる局面において、本発明は、細菌の生物学的に純粋な株および／またはその1つもしくは複数の生物活性抽出物、ならびに美容的に許容される賦形剤を含む、ヒトの皮膚状態を改善するための美容的組成物を提供する。好ましい態様において、組成物はLf Qi6バイオフィルムの生物活性抽出物を含む。
【００７７】
本明細書で用いられる「美容的」とは、非治療的である。そのような組成物は、治療によってヒトまたは動物を処置することを対象としていない。例えば、組成物は皮膚の水和レベルを増強し得る。水和レベルの上昇は、皮膚の外観を改善し、より健康な美容的外観をもたらすことが公知である。
【００７８】
いくつかの態様において、美容的に許容される賦形剤は、ローション、クリーム、乳濁液、軟膏、ゲル、美容液、およびそれらの組み合わせより選択される製剤に使用される物質を含む。
【００７９】
本発明の態様による美容的組成物は、バリアの維持および修復活性を有する。したがって、それらは、バリア機能の減少を防ぐのに、および／またはバリア機能を補強するのに有用である。これは、皮膚の水和を改善するのに、および／または皮膚の外観を改善するのに有用であり得る。
【００８０】
皮膚および／または経皮投与に適している製剤には、ゲル、ペースト、軟膏、クリーム、ローション、および油、ならびにパッチ、絆創膏、包帯、ドレッシング、デポー、セメント、グルー、およびリザーバーが含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
軟膏は典型的には、本明細書において提供される美容的組成物、およびパラフィン系または水混和性軟膏基剤から調製される。
【００８２】
クリームは典型的には、本明細書において提供される美容的組成物、および水中油型クリーム基剤から調製される。必要に応じて、クリーム基剤の水相は、例えば、少なくとも約30% w/wの多価アルコール、すなわち2つもしくはそれ以上のヒドロキシル基を有するアルコール、例えば、プロピレングリコール、ブタン1,3-ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、およびポリエチレングリコール、ならびにそれらの混合物などを含み得る。
【００８３】
当業者によって容易に認識されるように、本発明による製剤はまた、他のアルコール、例えばイソプロピルアルコールまたはエタノールなどを含んでよく、また他のアルコールベースの製剤、例えばアルコールベースの手指消毒薬をカバーし得る。
【００８４】
局所製剤は望ましくは、皮膚または他の患部を通じた活性化合物の吸収または浸透を強化する化合物を含み得る。そのような皮膚浸透促進剤の例には、ジメチルスルホキシドおよび関連類似体が含まれる。
【００８５】
乳濁液は典型的には、本明細書において提供される美容的組成物、および油相から調製され、それは単に乳化剤（さもなければエマルジェント (emulgent) として知られる）を任意に含んでよく、あるいはそれは少なくとも1つの乳化剤と脂肪もしくは油との、または脂肪および油の両方との混合物を含み得る。好ましくは、親水性乳化剤は、安定剤として作用する親油性乳化剤と共に含まれる。油および脂肪の両方を含めることも好ましい。総合すると、乳化剤は安定剤の有無にかかわらずいわゆる乳化ワックスを構成し、ワックスは油および／または脂肪と共に、クリーム製剤の油性分散相を形成するいわゆる乳化軟膏基剤を構成する。
【００８６】
適切なエマルジェントおよび乳化安定剤には、Tween 60、Span 80、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、およびラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。薬学的乳濁液製剤に使用される可能性の高い大部分の油における活性化合物の溶解度は非常に低いと考えられるため、製剤に適した油または脂肪の選択は、所望の美容的特性の達成に基づく。したがって、クリームは好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏出を避けるために適切な稠度を有する、べたつかず、非染色性であり、かつ洗浄可能な製品であるべきである。直鎖または分岐鎖の一塩基性または二塩基性アルキルエステル、例えば、ジイソアジペート (di-isoadipate)、ステアリン酸イソセチル、ヤシ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチン酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、パルミチン酸2-エチルヘキシル、またはCrodamol CAPとして知られる分岐鎖エステルの混合物などが使用され得るが、最後の3つが好ましいエステルである。これらは、必要とされる特性に応じて、単独でまたは組み合わせて使用され得る。あるいは、白色軟パラフィンおよび／もしくは流動パラフィンなどの高融点脂質、または他の鉱油が使用され得る。他の製剤には、歯科スプレー、口腔洗浄液、歯磨き粉、トローチ剤、抗菌洗浄液、飲料（例えば、牛乳、ヨーグルト）、食品（ヨーグルト、アイスクリーム、キャンディバーなど）、または粉末食品（粉乳など）が含まれる。
【００８７】
いくつかの態様において、美容的組成物は、病原性バイオフィルムの成長の阻害、病原性バイオフィルムの接着の阻害、病原性バイオフィルムの脱離の促進、共生バイオフィルムの成長の促進、皮膚バリア機能の強化、皮膚自然免疫機能の強化、およびそれらの組み合わせより選択される生物活性を有する。
【００８８】
さらなる別の局面において、本発明は、生物学的に純粋な細菌株および／またはその1つもしくは複数の生物活性抽出物、ならびに美容的に許容される賦形剤を含む組成物の美容的に有効な量を対象に投与する段階を含む、ヒトの皮膚状態を改善する方法を提供し、細菌株およびその抽出物は、プランクトン様表現型およびバイオフィルム表現型の両方で増殖することができ、組成物は、病原性バイオフィルムの成長の阻害、病原性バイオフィルムの接着の阻害、病原性バイオフィルムの脱離の促進、共生バイオフィルムの成長の促進、皮膚バリア機能の強化、皮膚自然免疫機能の強化、およびそれらの組み合わせより選択される生物活性を有する。好ましい態様において、細菌株はLf Qi6である。
【００８９】
美容的処置を用いて、皮膚の外観および／またはきめを改善することができる。例示的な態様において、本方法は、皮膚の水和レベルまたは外観の改善に関する。本明細書で用いられる場合、「美容的方法」という用語は、外科手術もしくは療法による人体もしくは動物体の処置のための方法、または人体もしくは動物体に対して行われる診断法を指すものではない。
【００９０】
処置されるべき対象は、任意の動物またはヒトであってよい。対象は非ヒト哺乳類であってよいが、より好ましくはヒトである。対象は雄性または雌性であってよい。いくつかの態様において、対象は、皮膚バリアの修復を必要としないか、または細菌感染症などの感染症に関して処置される必要がない。いくつかの態様において、対象は、美容的処置が適用されるべき部位において処置を必要としない。
【００９１】
本発明による美容方法は、好ましくは「美容的に有効な量」投与を伴う。これは、美容的利点を誘導するのに有効な量での、化合物、成分、材料、組成物、剤形等の投与に関する。これは、関連する診療医の健全な判断の範囲内である。活性化合物および活性化合物を含む組成物の適切な投与量が、対象ごとに異なり得ることは、当業者によって認識されるであろう。
【００９２】
本明細書において提供される薬学的または美容的組成物は、単回（単位）用量のプロバイオティクス細菌またはその溶解物もしくは抽出物を含み得る。プロバイオティクス細菌（無傷、溶解された、または抽出された）の適切な用量は、104〜1012 cfu、例えば、104〜1010、104〜108、106〜1012、106〜1010、または106〜108 cfuのうちの1つの範囲内であってよい。いくつかの態様において、用量は1日1回または2回投与され得る。いくつかの態様において、本発明による使用のための組成物は、重量で少なくとも約0.01%、約0.05%、約0.1%、約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.5%、約2.0%、約3.0%、約4.0%、約5.0%、約6.0%、約7.0%、約8.0%、約9.0%、約1 0.0%、約1 1.0%、約12.0%、約13.0%、約14.0%、約15.0%、約16.0%、約17.0%、約18.0%、約19.0%、約20.0%、約25.0%、約30.0%、約35.0%、約40.0%、約45.0%、約50.0%のLf Qi6抽出物を含み得る。いくつかの態様において、組成物は、重量で少なくとも約0.01%〜約30%、約0.01%〜約20%、約0.01%〜約5%、約0.1%〜約30%、約0.1%〜約20%、約0.1%〜約15%、約0.1%〜約10%、約0.1%〜約5%、約0.2%〜約5%、約0.3%〜約5%、約0.4%〜約5%、約0.5%〜約5%、約1 %〜10約5%のうちの1つのLf Qi6抽出物を含み得る。
【００９３】
本発明の目的のために、cfuという略語は、寒天プレート上の微生物数によって示される細菌細胞数と定義される「コロニー形成単位」を指定する。
【００９４】
本明細書において参照または引用されるすべての特許、特許出願、仮特許出願、および出版物は、すべての図面および表を含め、本明細書の明示的な教示と矛盾しない程度まで、参照により全体として組み入れられる。
【００９５】
材料および方法
細菌株および培養液
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) ATCC 33591（ATCC、Manassas, VA）は、20% (v/v) グリセロールを含むトリプトンソーヤブロス (TSB)（Thermo Scientific、Waltham, MA）中で-80℃で貯蔵した。110 rpmのロータリーシェーカー上で、培養物を37℃で好気的に一晩インキュベートした。分光光度計（SpectraMax Plus384、Molecular Devices、Sunnyvale, CA）を用いて一晩培養物の光学濃度を読み取り、0.2OD600になるように希釈した。この株はまた、MRSA状態を確認するために、確立されたプロトコールを用いてmetおよびeap PCRの両方に供した (23)。ラクトバチルス・ファーメンタムQi6 (Lf Qi6) は、MRS培地中で37℃で増殖させた。Lf Qi6は、独占所有権のある株である。この株のゲノムは配列決定されている（GenBankアクセッション番号LAIKO0OO0OOO）。Lf Qi6ゲノム配列の記載は、全体として参照により組み入れられ (24)、その中に具体的に含まれるのは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LAIK00000000からの全ゲノム配列へのウェブアクセスである。表皮ブドウ球菌K7は、ヒト微生物叢から単離して同定し、mecA、fdh、esp、eap遺伝子に関する標準的なPCR試験を用いて、その株の共生性質を検証する (25-26)。
【００９６】
Lf Qi6バイオフィルムの培養
図1は、Lf Qi6培養物を播種するための手順を示す。単離して同定した後、Lf Qi6をMRS寒天プレートで培養した。次いでこの培養物を、5 mlのMRSブロス中で37℃で24時間インキュベートした。培養物1 mlを、25 mlのMRSブロスを含むT-150組織培養プレートに移した。25 mlのMRS培地を48時間ごとに交換して、Lf Qi6のバイオフィルムを培養プレートの底上に菌叢として増殖させた。次いで培養物を7日間増殖させて、厚いバイオフィルム層を生成させた。その後、成長したバイオフィルム層を剥離し、新鮮な培地中に懸濁した。グリセロールを用いて冷凍庫貯蔵物を作製し、-80℃で貯蔵した。
【００９７】
Lf Qi6バイオフィルムのスケールアップ生成を図2に図示する。凍結貯蔵物中のバイオフィルム表現型のLf Qi6を、10 mlの新鮮MRS培地中で37℃で24時間培養した。培養物10 mlを、500 gの無菌グラスウールを含む25 LのMRS培地中に接種した。次いで、バイオフィルムを静的条件下で37℃で72時間培養した。穏やかに振盪させることにより培養物を24時間ごとに混合し、その後培地およびグラスウールを回収した。続いて、超音波処理によってバイオフィルム細胞をグラスウールから分離した。細胞をさらに遠心分離して、Lf Qi6のバイオフィルムを濃縮し、これを次いで滅菌水中に懸濁した。このスケールアップによって、50 g/25 Lの濃度のバイオフィルム培養物が得られた。Lf Qi6バイオフィルムの成長をさらに図4に図示するが、ここではバイオフィルムを、本明細書において記載されるようにスケールアップ培養において基材上で培養した。
【００９８】
Lf Qi6バイオフィルムの下流の加工
Lf Qi6バイオフィルムの下流の加工を図3に示す。50 gのバイオフィルム表現型のLf Qi6を1 Lの滅菌水中に懸濁した。懸濁液を室温で24時間穏やかに混合して、複数の生物活性物質の受動的放出を可能にした。次いで、OmniSonic Ruptor 400を用いて、混合物を30分間超音波処理して（50 KHz、200ワット）均一な溶解物にした。次いで超音波処理した溶解物を凍結し、凍結乾燥して微粉末にした。
【００９９】
ヒトケラチノサイト細胞株の培養
HEKa細胞は、Life Technologies (Grand Island, NY, USA Cat# C-005-5C) より購入した。HEKa細胞は、ヒトケラチノサイト成長補助物質 (Cat#S-001-5) を補充した培地154（Life Technologies、Grand Island, NY, USA Cat#M-154-500）中で維持した。
【０１００】
ヒトエクスビボ器官型培養
ヒト皮膚の外科手術標本を美容整形手術後に入手した。試料はすべて、研究目的のために余分の皮膚標本を使用することへのインフォームドコンセントを提出した患者から入手した。皮膚は、1%抗菌‐抗真菌溶液（ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン）（Hyclone、Thermo Scientific、Logan, UT）を補充した、L-グルタミン（ATCC、Manassas, VA）を含む新鮮なイーグル最小必須培地 (EMEM) 中で研究室に輸送した。培地および皮膚は、切断するまで4℃で貯蔵した。培養液は、ヒト組換え上皮成長因子 (0.2ng/ml EGF)、ウシ下垂体抽出物 (30μg/ml BPE)（Life technologies、Grand Island, NY）、および1%抗菌‐抗真菌溶液を補充した、ケラチノサイト完全無血清培地から構成された。6ウェルプレートを、ウェルあたり1.3 mlの培養液および1つのMillicell-CM細胞培養インサート（0.4μm、直径30mm）（EMD Millipore、Billerica, MA）を用いて調製した。無菌ペトリ皿内の新鮮な補充済みEMEM中で穏やかに洗浄することにより、外植片試料を切断用に調製した。外植片を、EMEMを含む新たな皿に無菌鉗子で移し、無菌外科用ハサミを用いて1 cm2の小片に切断し、6ウェルプレート中の細胞培養インサート上に配置して、皮膚の下面部を空気（気液界面）に曝露した。外植片を、実験プロトコールに基づいて、毎日培地交換しながら、細胞培養インサート上の気液界面において5% CO2と共に37℃で5〜7日間培養した。
【０１０１】
プロバイオティクス細菌からのLf Qi6の調製
独占所有権のある培養法を用いて、L. ファーメンタムQi6をMRS培地中で増殖させた。次いで、この場合も同様に独占所有権のある培養法を用いて、細菌をさらなる期間にわたって500ml MRS培地中に継代培養した。細菌を超音波処理し（Reliance Sonic 550、STERIS Corporation、Mentor, OH, USA）、10,000gで遠心分離し、細胞ペレットを滅菌水中に分散させ、回収された細胞を溶解し（Sonic Ruptor 400、OMNI International、Kennesaw, GA, USA）、再度10,000 gで遠心分離し、可溶性画分を遠心分離した（50kDa Amicon限外濾過膜、EMD Millipore Corporation、Darmstadt, Germany、Cat#UFC905008）。得られた画分を0.5mlの一定分量になるよう分注し、液体窒素中で瞬時凍結して-80℃で貯蔵した。
【０１０２】
バイオフィルム阻害アッセイ
MRSAを、無菌ポリスチレン、組織培養 (TC) 処理済み、平底プレート（Genesee Scientific、San Diego, CA、Cat #25-109）のウェルに添加した。TSBを無菌対照とした。増殖対照ウェルには、等量のMRSAおよび培養液を添加した。選択された濃度のLf Qi601または他の試験薬剤を添加し、プレートを37℃で18時間インキュベートし、次いで染色およびバイオフィルム定量化のセクションに記載されているようにバイオフィルムを定量化した。
【０１０３】
バイオフィルム脱離アッセイ
MRSAを無菌TCプレートのウェルに添加し、37℃で18時間インキュベートした。BioTek 405 Select LSマイクロプレートウォッシャー（BioTek、Winooski, VT）を用いて、プレートを1Xリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)（Thermo Scientific、Waltham, MA）で3回洗浄した。新鮮なTSBを各ウェルに添加した。選択された濃度のLf Qi6を添加し、次いでプレートを37℃のインキュベーター中に10分間置いた。残存するバイオフィルムを、以下に記載されるように染色し定量化した。
【０１０４】
抗バイオフィルム接着アッセイ
TCプレートのウェルを、選択された濃度のLf Qi6または他の試験薬剤でコーティングした；増殖対照ウェルおよび陰性対照ウェルにはPBSを添加し、4℃で静的に一晩インキュベートした。BioTekマイクロプレートウォッシャーを用いて、プレートをPBSで3回洗浄した。洗浄後、MRSAを添加し、プレートを4℃で5時間インキュベートした。接着したバイオフィルムを染色し定量化した。
【０１０５】
染色およびバイオフィルム定量化
BioTekプレートウォッシャーを用いてプレートをPBSで3回洗浄し、47℃のインキュベーター中に1時間入れて、バイオフィルムを熱固定した。プレートを室温まで冷却し、0.1 % (v/v) クリスタルバイオレットで15分間染色し、次いでマイクロプレートウォッシャーを用いて脱イオンH2Oで洗浄した。クリスタルバイオレット染色液を溶解するために、100%エタノールを添加して30分置いた。分光光度計（SpectraMax Plus384、Molecular Devices、Sunnyvale, CA）を用いて、プレートを590nmおよび600nmで読み取った。
【０１０６】
エクスビボ皮膚バイオフィルム研究
Hochstimら (2010) (27) によって開発されたヘマトキシリン・エオシン染色プロトコールを用いて、エクスビボ皮膚におけるバイオフィルムの組織学的検査を確認した。選択された濃度のLf Qi6でエクスビボ皮膚培養物を処理し、低密度または高密度のいずれかのMRSA培養物100μlを接種し、一晩増殖させた。次いで皮膚組織をホモジナイズし、希釈し、TSBプレート上で培養して、試料当たりのコロニー形成単位 (CFU) を定量化した。
【０１０７】
インビトロでの病原性および共生共培養物研究
6ウェルプレートをLf Qi6または細菌培養物で5時間処理した。同一光学濃度 (OD) のMRSAおよび表皮ブドウ球菌K7接種材料を、TSB中で調製した。2 mlのこれらの混合物を、6ウェルプレートの処理ウェル 対 対照ウェル中に3つ組で接種した。
【０１０８】
ヒト皮膚外植片におけるエクスビボでの病原性および共生共培養物研究
皮膚外植片表面を、Lf Qi6、陽性対照としての化学洗剤0.2% Triton、または陰性対照としてのPBSで処理し、37℃、5% CO2で一晩インキュベートした。同一光学濃度のMRSAおよびK7培養物を、TSB中で調製した。皮膚表面に50μlの各細菌培養物を接種し、37℃で一晩インキュベートした。次いで皮膚組織をホモジナイズし、希釈し、TSBプレートおよびORSABプレート上で培養して、組織当たりの病原性CFU 対 共生CFUを定量化し、識別した。
【０１０９】
フィラグリンELISA 
ヒトフィラグリンELISAキット（EIAab、Wuhan, China、Cat# 1186h）を用いて、フィラグリンを定量化した。処理済みの皮膚外植片組織を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Thermo Scientific、Product #78425）と混合した1 ml PBSを用いてホモジナイズし、-20℃で一晩凍結した。次いで試料を2回の凍結融解サイクルに供して、細胞膜を破壊した。ホモジネートを10000 x gで5分間遠心分離した。上清を一定分量に分割し、-20℃／-80℃で2〜5日間貯蔵した。製造業者の指示に従って、皮膚外植片のホモジネート中のフィラグリンのレベルを定量化した。アッセイは3つ組／試料条件で行った。ELISAの結果は、SoftMax（登録商標）Proソフトウェア（Molecular Devices、Sunnyvale, CA, USA）を用いてMolecular DeviceのSpectraMax Plus384で解析した。統計解析は、GraphPad Prismバージョン6.03（GraphPad Software, Inc.、La Jolla, CA, USA）を用いて行った。
【０１１０】
免疫組織化学的検査
5μmパラフィン包埋NEM切片において、形態学的解析および免疫蛍光解析を行った。形態の解析のついては、皮膚外植片を10%ホルマリンで固定し、切片化し、脱パラフィンし、再水和し、ヘマトキシリンおよびエオシン (HE) で染色した。フィラグリン発現の解析については、切片を切断し、脱パラフィンし再水和し、続いて熱媒介性抗原回復を行った。1%ウシ血清アルブミン（BSA、Sigma）および2%正常ヒト血清（NHS、Sanquin、Leiden, the Netherlands）を含むPBSを用いて非特異的結合をブロッキングした後、切片をフィラグリンに対する一次抗体（1:1000；Covance、Rotterdam, the Netherlands）と共に4℃で一晩インキュベートした。PBSで洗浄した後、切片を二次ヤギ抗体抗ウサギ（Rhodamine Red、1:300、Jackson Immuno Research、Amsterdam, the Netherlands）と共にインキュベートした。次いで切片をストレプトアビジンペルオキシダーゼと共に室温で10分間インキュベートし、緩衝液で4回リンスした。DAB色素原を切片に添加して、5分間かけて染色を可視化した。スライドをヘマトキシリン溶液で1分間、対比染色した。抗体を添加せずに、陰性対照を調製した。プロトコールにはアイソタイプ対照も含めた。核の可視化のためにDAPIを含むVectashield（Vector Laboratories、Amsterdam, the Netherlands）で、切片を封入した。Tuominenら (2010) (28) によって開発されたプロトコールを修正することにより、免疫染色したスライドからの様々な8〜9個の視野の定量的Immunoratio解析を行った。
【０１１１】
RNA単離、cDNA合成、およびqPCR解析
qRT-PCRのための組織外植片を、液体窒素中で瞬時凍結した。製造業者の説明書に従ってRNAqueous-4PCRキット (Ambion) を用いて、全RNAを単離し精製し、逆転写時まで-80℃で貯蔵した。リアルタイムPCR解析のために、製造業者の説明書に従って高容量cDNA逆転写キット（Applied Biosystems、Foster City, CA）を用いて、全RNA 0.1μgからcDNAを合成した。定量的PCRは、7500 Real-Time PCR システム (Applied Biosystems) においてPower SYBR Green PCRマスターミックスを用いて行った。プライマーは文献（表S1）から選択し、IDT technologiesから入手した。サイクリング条件は以下の通りであった： 50℃で2分、95℃で10分、ならびに95℃で15秒および60℃で1分の40サイクル。反応後に解離段階を行い、融解曲線をプライマー特異性について評価した。各鋳型についてのPCRを、96ウェルプレートにおいて3つ組で行った。Data Assist（商標）ソフトウェア (Applied Biosystems) と共に比較CT (ddCT) 法を用いて、mRNA発現レベルをβミクログロブリン参照遺伝子に対して標準化した。鋳型なしの陰性対照反応を、各プライマーの組み合わせについて含めた。
【０１１２】
統計解析
様々なパラメータの定量的データは、図中では平均値±SEM（平均値の標準誤差）として表してある。様々なパラメータにおける統計的有意差は、一元配置ANOVA検定により決定した。有意差 (p≦0.05) が存在する場合には、ニューマン・コイルス多重比較検定を用いて平均値を比較した。統計ソフトウェアGraphPad Prism（GraphPad Software, Inc.、San Diego, CA）を使用して、統計解析を行った。
【０１１３】
本発明者らのqRT-PCRの結果は、PBSベースラインと比較して、生物抽出物で処理した皮膚におけるフィラグリンのおよそ250倍の上方制御を示した。本発明者らは、ELISAおよび免疫組織化学的検査により、フィラグリンタンパク質産生の増加を確認する。
【０１１４】
以下は、本発明を実施するための手順を説明する実施例である。これらの実施例は、限定と解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１５】
実施例1‐Lf Qi6バイオフィルム表現型はプランクトン様表現型と異なる
生成物の抽出およびタンパク質の概算により、以下の表1に見られるように、バイオフィルム表現型とプランクトン様表現型との間の異なるタンパク質レベルが実証される。図5のSDSデータによりそのような違いがさらに裏付けられ、それは、バイオフィルムの生物抽出物中の特有のタンパク質を示す、プランクトン様表現型には存在しない、Lf Qi6バイフィルム表現型で発現される余分なバンドによって示される。図6および7のサイズ排除HPLCデータにより、Lf Qi6バイオフィルム表現型とプランクトン様表現型から調製された生物抽出物中のタンパク質の間の分子量の違いが説明される。
【０１１６】
（表１）バイオフィルムおよびプランクトン様からの生成物の抽出およびタンパク質の概算は、異なるタンパク質レベルを示す
0006727285.tif 000002
【０１１７】
図8に示されるように、MRSAに対する抗バイオフィルム活性を、6ウェルプレートにおいてLf Qi6バイオフィルム表現型とプランクトン様表現型との間で評価し、陰性対照はTSB中で増殖させたMRSAのGCリッチ培養物であり、陽性対照はバンコマイシンで処理したMRSAバイオフィルムであった。MRSA培養物に0.5%グルコースを接種し、37℃で一晩インキュベートした。プランクトン様またはバイオフィルム全細胞表現型の両方における、それぞれ0.5 mg/mLおよび1.0 mg/mLのLf Qi6を、各ウェルに4℃で2時間プレコーティングした。各表現型について2つの異なる濃度の使用済みLf Qi6培養物の> 50 kDa残留物を、観察に含めた。Lf Qi6バイオフィルム表現型の抽出物が、0.5および1.0 mg/mLの両方において、MRSAバイオフィルムの成長の阻害を示したことが明白である。これらの結果を定量化し、図9に示したが、MRSAのコロニー形成単位は、対照およびプランクトン様培養液の両方と比較して、Lf Qi6バイオフィルム培養液よって有意に減少した。
【０１１８】
Lf Qi6培地画分（抽出物の> 50 kDa）による共生細菌表皮ブドウ球菌の促進を、プランクトン様培養液およびバイオフィルム培養液の両方について評価した（図10）。結果から、表皮ブドウ球菌の増殖を70%を超えて強化するバイオフィルム培地の利点が実証される一方で、プランクトン様表現型は、共生バイオフィルムの成長のそのような促進において40%未満だけ効果的であった。Lf Qi6バイオフィルム培養液およびプランクトン様培養液の存在下における表皮ブドウ球菌の定量的コロニー形成単位を、図11に示されるチャートにおいて比較する。さらに、図12は、対照（すなわち、表皮ブドウ球菌の増殖培養物）、プランクトン様培養液からのLf Qi6生物抽出物 (> 50kDa)を伴う表皮ブドウ球菌、およびバイオフィルム培養液からのLf Qi6生物抽出物 (> 50kDa)を伴う表皮ブドウ球菌の間の視覚的比較の結果を示す。
【０１１９】
実施例2‐Lf Qi6バイオフィルムは、インビトロにおいて、MRSAに対する抗バイオフィルム活性：阻害、抗接着、および脱離を有する
阻害、抗接着、および脱離を含むLf Qi6の様々な抗バイオフィルム活性を、最初に96ウェルプレートアッセイによりインビトロで評価した。バイオフィルム阻害アッセイは、Lf Qi6と共インキュベートした場合のMRSAの新たなバイオフィルム形成能を評価する。結果から、0.5〜1.0 mg/mLのLf Qi6は、24時間の共インキュベーションで測定されるMRSAバイオフィルム形成を40〜50%阻害することが実証される（図19A）。抗接着アッセイは、MRSAが表面に結合するのを妨げるLf Qi6の能力を評価する。0.5〜1.0 mg/mL Lf Qi6で一晩前処理した後に、MRSAバイオフィルムに5時間曝露したところ、24時間培養アッセイにおいてMRSAバイオフィルム接着が80〜85%阻止された（図19B）。バイオフィルム脱離アッセイは、予め形成されたバイオフィルムを除去するLf Qi6の能力を実証する；5分間の処理で、0.5〜1.0 mg/mLのLf Qi6は、MRSAバイオフィルムの30%を脱離させ（図19C）、より大きな形式の組織培養プレート（6ウェルプレート、8.5 cm2）においても同様の結果が得られた（図19D）。
【０１２０】
実施例3‐Lf Qi6は、エクスビボヒト皮膚器官型培養系においてMRSAバイオフィルムを迅速に脱離させる
外科手術標本から得られた生存ヒト皮膚外植片へのバイオフィルム接種の目的で、エクスビボ器官型ヒト皮膚培養系を最適化した。MRSAバイオフィルム培養物をエクスビボ表面上に接種し、48時間増殖させた。バイオフィルムを染色により可視化したところ、24〜48時間で皮膚上に形成された頑強なバイオフィルムが見られた（図19E）。処理前と処理後を比較すると、0.5〜1.0 mg/mLのLf Qi6による10分間の処理において、MRSAバイオフィルム負荷の有意な減少が認められた（図13）。
【０１２１】
実施例4‐Lf Qi6は、インビトロおよびエクスビボ皮膚においてMRSAを減少させながら表皮ブドウ球菌を選択的に強化する
Lf Qi6のバイオフィルム調節特性に関する予備研究は、MRSAおよび表皮ブドウ球菌を用いる6ウェル病原体‐共生生物共培養モデルにおいて研究した。結果から、0.5〜1.0 mg/mLで適用されたLf Qi6が、共生細菌を促進しながらMRSAバイオフィルム病原体負荷を減少させることが示され（図14A）、エクスビボヒト器官型培養系においても同様の結果が得られた（図14B）。
【０１２２】
実施例5‐Lf Qi6は、RNA発現およびタンパク質レベルにおいて皮膚バリア恒常性タンパク質、フィラグリンを上方制御し、エクスビボヒト器官型培養系においてフィラグリン免疫組織化学染色を有意に増加させる
フィラグリン免疫組織化学的検査は、6時間にわたるLf Qi6の0.5〜1 mg/ml適用で処理されたエクスビボヒト器官型培養系からの試料の表皮上で、フィラグリンタンパク質の有意に増加した染色を示す（図15A〜D）。Lf Qi6で処理したエクスビボ皮膚は、ELISAを用いてフィラグリンタンパク質のおよそ3倍の増加を示すと同時に（図15E）、定量的PCRを用いてRNA発現のおよそ250倍の増加を示す（図15F）。
【０１２３】
実施例6‐Lf Qi6は、宿主自然免疫防御ペプチド、ヒトβデフェンシン-1、ヒトβデフェンシン-2、およびヒトβデフェンシン-3の発現を増加させる
図18は、ELISAによって処理された、HEK細胞モデルにおける、様々な濃度、すなわちそれぞれ0%、0.03%、および0.10%のLf Qi6バイオフィルム培養物の存在下におけるヒトβデフェンシン1、2、および3の発現の増加を比較する（図18）。結果から、前述のβデフェンシンの発現に対する用量依存的効果、および各々特徴的なβデフェンシンに対するLF Qi6の全体的な効果の違いが実証される。
【０１２４】
さらに、宿主自然免疫抗菌ペプチドは、皮膚防御系の不可欠な成分である。定量的PCRの結果により、対照に対してLf Qi6バイオフィルムで処理された皮膚におけるHβD-2（図19A）およびHβD-3（図19B）のおよそ800倍の上方制御が示された。
【０１２５】
実施例7‐Lf Qi6バイオフィルムはペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 (PPAR) を調節する
LfQi6はフィラグリン産生を増加させ、フィラグリンはPPAR-αの転写産物であるため、PPAR核内受容体を刺激する能力に関してLfQi6抽出物を調べた。Lf Qi6バイオフィルム抽出物の生物活性物質は、図16に示されるように、ケラチノサイトにおいてPPAR-βおよびPPAR-γの発現を増加させることが示された。特に、小さい分子サイズの分画抽出物（<30 kD用の特異的フィルターを用いる特定の時間にわたる全抽出物の分画遠心、例えば、Amicon Ultra-15, 30K NMWL, cat# UFC 903096；抽出物を4,000 rpm x 45分で遠心分離、によって生成された、< 30kD画分）は、分画されていないLfQi601抽出物よりも強力な活性を有するようであった。
【０１２６】
実施例8‐Lf Qi6バイオフィルムは、種々の保湿スキンケア製品中の有効成分として使用され得る
Lf Qi6バイオフィルム抽出物は、皮膚バリアの物理的および生化学的機能特性を改善することを目的とした種々の製品中の有効成分として使用され得る。例えば、Lf Qi6バイオフィルム抽出物は、経表皮水分喪失を減少させ、次には皮膚水和を改善するために使用され得る。以下の例示的な製剤は、化粧水、アイクリーム、美容液、および洗顔料を含む種々のスキンケア製品に関する。各成分は、それぞれその商品名／商標名および化粧品成分の国際命名法 (INCI) 名と共にパーセント組成で示してある。各製剤の典型的な特性および調製法もまた含める。
【０１２７】
（表２）Lf Qi6生物抽出物を含む化粧水製剤
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0006727285.tif 000004
【０１２８】
天然保湿因子 (NMF) の配合を表4に提供する。化粧水は、以下の手順を用いて調製した。油相（セラミドを除く）を、一定に撹拌しながら75℃まで加温した。水相は70℃まで加温した。最適な温度、例えば70℃において、油相を水相にゆっくりと添加し、一定に撹拌しながら70〜75℃で10分間、混合物を乳化させた。その後、混合物を撹拌しながらおよそ45〜50℃まで冷却した。セラミド、保存剤、活性物質、および芳香混合物を混合物に添加し、さらに10分間撹拌した。次いで、手持ち式ブレンダーを用いて混合物をおよそ2〜4分間さらに混合し、その後真空ミキサー中で4分間激しく混合した。得られたローション混合物を室温まで冷却し、ボトルに包装した。化粧水の典型的な特性を以下の表に示す。
【０１２９】
（表３）化粧水の典型的な特性
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【０１３０】
（表４）NMFx（商標）の配合
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【０１３１】
（表５）Lf Qi6生物抽出物を含むアイクリームの配合
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【０１３２】
アイクリームは、以下の手順を用いて調製した。油相（セラミドを除く）を、一定に撹拌しながら75℃まで加温した。水相は70℃まで加温した。最適な温度、例えば70℃において、油相を水相にゆっくりと添加し、一定に撹拌しながら70〜75℃で10分間、混合物を乳化させた。その後、混合物を撹拌しながらおよそ45〜50℃まで冷却した。セラミド、保存剤、活性物質、および芳香混合物を混合物に添加し、さらに10分間撹拌した。次いで、手持ち式ブレンダーを用いて混合物をおよそ2〜4分間さらに混合し、その後真空ミキサー中で4分間激しく混合した。得られたローション混合物を室温まで冷却し、ボトルに包装した。アイクリームの典型的な特性を以下の表に示す。
【０１３３】
（表６）アイクリームの典型的な特性
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【０１３４】
（表７）Lf Qi6生物抽出物を含む美容液の配合
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【０１３５】
美容液は、ヒアルロン酸が完全に水和して混合物中に取り込まれるように穏やかに撹拌しながら、表7に掲載されている成分をそこに示されている順序で混合することによって調製した。クエン酸を用いてpHをおよそ4.5〜5.0に調整した。美容液の典型的な特性を表8に掲載する。
【０１３６】
（表８）美容液の典型的な特性
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【０１３７】
（表９）Lf Qi6生物抽出物を含む洗顔料の配合
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【０１３８】
洗顔料は、以下の手順を用いて調製した。最初に水を混合容器に添加し、容器を低速 (100〜150 rpm) で作動させた。キシリトール、パンテノール、ナイアシンアミド、NMF、Geogard Ultraを順次添加し、水中に溶解させた。続いて、Geogard 221およびLf Qi6生物抽出物を混合物に添加した。次いでMiraCare Plaisantを混合物に添加し、混合物が透明になるまで撹拌した。Miranol Ultra 32を混合物に添加し、混合物が透明になるまで撹拌し、その後Plaanteron 2000を混合物に添加した。次いで混合物を透明になるまで撹拌し、続いてクエン酸を用いてpHを調整した。洗顔料の典型的な特性を以下の表10に掲載する。
【０１３９】
（表１０）洗顔料の典型的な特性
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【０１４０】
実施例9‐好酸球性消化管疾患の処置
好酸球性消化管疾患は、過去数十年間に発生率が顕著に上昇した。これらの疾患のうち、好酸球性食道炎が最もよく見られる。現在の処置は困難であり、かつ／または全身のステロイド曝露を伴う。例えば、牛乳、小麦、海産物、および大豆などの食物アレルゲンを含まない成分栄養は効果的であるが、患者にとって負担がかかる。したがって、局所ステロイドの経口スラリーが使用される場合が多い。これは、治療成分を炎症組織に直接送達するという利点を有する。その有効性にもかかわらず、経口ステロイドは、免疫抑制、増殖速度の低下、および有害な骨密度作用などの潜在的副作用を有し得る。好酸球性消化管疾患のための効果的で負担のかからない、ステロイドなしの処置の差し迫った必要性が存在する。製剤の活性成分への局所組織曝露を増加させるために、粘膜付着剤が有利に用いられる。ここで本発明者らは、ラクトバチルス抽出物を含む、安定で高粘度の経口投与ゲルの薬学的製剤を記載する。必要に応じて、ブデソニドなどのステロイド（例えば、全製剤の0.01%）が添加され得る。
ラクトバチルス抽出物  0.001〜0.5g
パラベン              0.5g
プロピレングリコール  5g
*Lutrol F127          20g
水                    75g
合計：                100g
80℃まで加熱した水中で、Lutrol F127およびパラベンを溶解する。
プロピレングリコールおよびラクトバチルス抽出物を添加する。
透明な無色のゲルが得られるまで、加熱を続ける。
*カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはヒドロドロキシプロピル (hydrodroxypropyl) セルロースなどの代替の粘膜付着剤も使用され得る。
【０１４１】
本明細書に記載される実施例および態様は説明の目的のためにのみ提供されるものであり、この点を考慮した様々な修正または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解されるべきである。
【０１４２】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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