(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
足場相互作用を介して連結された１種以上の機能部を含むナノリングを含み、
各足場相互作用が、前記１種以上の機能部のそれぞれにおける相補的な一本鎖核酸にハイブリッド形成するナノリング上に一本鎖核形成部位を含む、ＲＮＡナノ粒子（ＲＮＡ  ＮＰ）。
【請求項２】
ＲＮＡ又はＤＮＡ標的アプタマー、抑制性核酸、蛍光色素、小分子、分割機能部を有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、分割リパーゼ、分割ＧＦＰ、タンパク質、治療薬及び造影剤からなる群の１種以上から選択される１種以上の薬剤を含む、請求項１に記載のＲＮＡ  ＮＰ。
【請求項３】
前記１種以上の薬剤が、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマー及びリボザイムからなる群から選択される抑制性核酸である、請求項２に記載のＲＮＡ  ＮＰ。
【請求項４】
前記１種以上の薬剤が同じである、請求項２に記載のＲＮＡ  ＮＰ。
【請求項５】
前記１種以上の薬剤が異なる、請求項２に記載のＲＮＡ  ＮＰ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＲＮＡ  ＮＰを含む組成物。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載のＲＮＡ  ＮＰを含む薬剤組成物。
【請求項８】
薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を更に含む、請求項７に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
前記薬剤組成物が疾患の治療のために処方される、請求項７又は８に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
前記薬剤組成物が、病原体による感染症の治療のために処方される、請求項７又は８に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
前記病原体が、ウイルス、細菌、真菌又は寄生生物である、請求項１０に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記薬剤組成物が、病原体による感染症に付随する症候を治療又は軽減する第２の薬剤を更に含む、請求項１０又は１１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
前記第２の薬剤が抗ウイルス剤である、請求項１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
前記薬剤組成物が新形成の治療のために処方される、請求項７又は８に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
前記第２の薬剤が抗癌剤である、請求項１２又は１３に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
細胞における標的遺伝子の発現を阻害又は抑制するための薬剤であって、
治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡ  ＮＰ又は請求項６〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、薬剤。
【請求項１７】
病原体感染細胞を死滅させるための薬剤であって、
治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡ  ＮＰ又は請求項６〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、薬剤。
【請求項１８】
細胞における病原体の複製を阻害するための薬剤であって、
治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡ  ＮＰ又は請求項６〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、薬剤。
【請求項１９】
前記細胞が対象中にある、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２０】
対象における病原体負荷を軽減するための薬剤であって、
治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡ  ＮＰ又は請求項６〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、薬剤。
【請求項２１】
前記対象が病原体感染症にかかるリスクがある、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２２】
前記対象が病原体感染症であると診断されている、請求項２０に記載の薬剤。
【請求項２３】
対象における病原体感染症を治療又は予防するための薬剤であって、
治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡ  ＮＰ又は請求項６〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、薬剤。
【請求項２４】
前記薬剤が病原体負荷を軽減し、それによって前記病原体感染症を治療又は予防する、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２５】
前記薬剤が感染細胞の死を誘発し、それによって前記病原体感染症を治療又は予防する、請求項２３に記載の薬剤。
【請求項２６】
前記対象がほ乳動物である、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２７】
前記対象がヒトである、請求項２６に記載の薬剤。
【請求項２８】
病原体がウイルス、細菌、真菌又は寄生生物である、請求項１０〜１２、１７、１８、及び２０〜２５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項２９】
治療有効量の第２の治療薬を更に含む、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３０】
前記第２の治療薬が、病原体感染症、又は前記病原体感染症に付随する症候を治療する、請求項２９に記載の薬剤。
【請求項３１】
新生細胞を死滅させるための薬剤であって、
治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡ  ＮＰ又は請求項６〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、薬剤。
【請求項３２】
新生細胞を有する対象を治療するための薬剤であって、
治療有効量の請求項１〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡ  ＮＰ又は請求項６〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、薬剤。
【請求項３３】
前記新生細胞が、固形腫よう中に存在する癌細胞である、請求項３１又は３２に記載の薬剤。
【請求項３４】
治療有効量の第２の治療薬を更に含む、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項３５】
前記第２の治療薬が抗癌剤である、請求項３４に記載の薬剤。
【請求項３６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＲＮＡ  ＮＰ又は請求項６〜１５のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。
【請求項３７】
前記キットが更に第２の治療薬を含む、請求項３６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、「多機能ＲＮＡナノ粒子及び使用方法（Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ）」と題する２０１３年９月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／８７８，７５８号の優先権を主張し、米国特許法第１１９（ｅ）条によるその利益を主張するものである。この出願の教示全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
政府資金
本願を支える研究は、保健社会福祉省長官によって代表される米国によって実施された。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、途方もない可能性を秘めているものの、それを実行可能な療法にすることができる前に、ＲＮＡｉ技術の適用に伴う多数の難題に対処しなければならない。最も顕著なのは、患者の血流に注射後に、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を腫よう細胞に輸送し、届け、安定化させることである。現在、最も有望な解決策の１つは、種々のナノ粒子（ＮＰ：ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を使用するものである（例えば、非特許文献１又は２参照）。
【０００４】
急速に拡大しているナノバイオロジーの分野は、複数の疾患及び症状の診断、予後及び治療に使用することができる新しい方法及び組成物の開発の可能性を切り開いている。しかし、発見される新規の薬物及び治療薬の数は増加しているが、それらを所望の部位又は細胞に特異的に送達する問題は解決されていない。ＲＮＡナノ粒子は、特異的細胞認識、画像検出及び治療処置のための分子を含めて、複数の成分を輸送できることが示された。かかる無タンパク質ナノ粒子の使用は、慢性疾患の免疫応答の少ない繰り返し長期治療に有望であり、小分子の保持時間が短いという問題、及び１００ナノメートルを超える粒子の送達が困難であるという問題を回避しなくてはならない。
【０００５】
例えば、ＮＰは、ＲＮＡｉ治療法の進歩に対して幾つかの明確な利点をもたらすことができる。例えば、それらは、細胞内取り込みを改善するナノ粒子効果を生じることが判明した。さらに、ＮＰは、リボヌクレアーゼの分解に対する保護の程度を増し、同時に細胞ターゲティングを支援するアプタマーのような追加の機能性グループも有する。
【０００６】
幾つかの新型の合成材料を含めた広範囲の材料がＲＮＡｉナノ技術に使用されているが、ＮＰの治療上と構造上の両方の核として働く無修飾ＲＮＡヌクレオチドは、独特の利点をもたらすと考えられる。例えば、天然ＲＮＡヌクレオチドの使用は、その生体適合性に加えて、ＲＮＡ固有の自己集合能力を利用し、複数のｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマー、蛍光色素、小分子、分割機能部を有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、及びタンパク質を空間的に配列する。さらに、無修飾ヌクレオチドでできたＮＰは、ランオフ転写によって直接合成することができ、大規模製造時のその合成の容易さ及び製造コストを魅力的なものにしている。
【０００７】
したがって、細胞ターゲティング、合成の容易さ、及び治療機能部の活性化の誘発を含めて、ＮＰによるｓｉＲＮＡ送達に付随する現在の幾つかの難題に対処するｓｉＲＮＡナノ骨格であって、有効な治療及び診断用ｓｉＲＮＡの送達に必要な安全で効率的なナノ粒子を提供するｓｉＲＮＡナノ骨格の開発が当該技術分野において依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら、２００９年
【非特許文献２】オー（Ｏｈ）及びパーク（Ｐａｒｋ）、２００９年
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
機能性ＲＮＡ  ＮＰの形成は、機能性ＲＮＡ  ＮＰの組成物の一部である特異的に設計されたＲＮＡをコードする等モル量の鋳型ＤＮＡのとき、ワンポット集合によって、又は直接的にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写反応によって生じる（例えば、参照によりその全体を本明細書に援用する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８４９２号参照）。生成する高収率機能性ＲＮＡ  ＮＰは、エンドトキシンを含まず、広範囲の生物医学用途に使用することができる。ＲＮＡ  ＮＰは、ＲＮＡｉ治療法の進歩に対して幾つかの明確な利点をもたらすことができる。例えば、それらは、細胞及びインビボにおける細胞内取り込み及び特異的遺伝子サイレンシングを低濃度で改善するナノ粒子効果を生じることが判明した。さらに、ＮＰは、リボヌクレアーゼの分解に対する保護の程度を増し、同時に細胞ターゲティングを支援するアプタマーのような追加の機能性グループも有する。天然ＲＮＡナノ骨格の使用は、その生体適合性に加えて、ＲＮＡ固有の自己集合能力を利用し、同時に、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマー、蛍光色素、小分子、分割機能部を有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、タンパク質などの複数の機能部を空間的に配列する。
【００１０】
本明細書に示すように、コンビナトリアルＲＮＡ干渉のための複数の低分子干渉ＲＮＡによる機能化に加えて、これらのナノ骨格は、類別されたＲＮＡアプタマー、蛍光色素、タンパク質、及び複数の分割機能部を条件付きで活性化するのに使用される最近開発された自己認識ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの同時埋め込みも可能にする。
【００１１】
したがって、第１の態様においては、本発明は、１個以上の機能部を含むＲＮＡナノ粒子（ＲＮＡ  ＮＰ：ＲＮＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を特徴とする。
【００１２】
別の一態様においては、本発明は、１個以上の機能部を含むＲ／ＤＮＡキメラナノ粒子（Ｒ／ＤＮＡ  ＮＰ：Ｒ／ＤＮＡ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を特徴とする。
【００１３】
本発明の別の一態様は、ナノリング構造を有し、１個以上の機能部を有するＲ／ＤＮＡキメラナノ粒子（Ｒ／ＤＮＡ  ＮＰ）を提供する。
【００１４】
一実施形態においては、Ｒ／ＤＮＡ  ＮＰは、１個以上のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアーム伸長部を有する。場合によっては、１個以上のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドアーム伸長部は、ｄｓＲＮＡの放出、形成及び／又は活性化を誘発することができる。
【００１５】
一実施形態においては、機能部は、１種以上の薬剤を含む。別の一実施形態においては、薬剤は、抑制性核酸、蛍光色素、小分子、分割機能部を有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、分割リパーゼ、分割ＧＦＰ、タンパク質、治療薬及び造影剤からなる群の１種以上から選択される。関連した一実施形態においては、抑制性核酸は、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマー及びリボザイムからなる群から選択される。
【００１６】
一実施形態においては、１種以上の薬剤は同じである。別の一実施形態においては、１種以上の薬剤は異なる。
【００１７】
一実施形態においては、Ｒ／ＤＮＡナノ粒子は、少なくとも２個のキメラナノ粒子を含む。別の一実施形態においては、第１のキメラナノ粒子は、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチド、及び１個以上の機能部を含む相補的な第１のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、第２のキメラナノ粒子は、第２のＤＮＡオリゴヌクレオチド、及び１個以上の機能部を含む相補的な第２のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。別の一実施形態においては、第１のＤＮＡオリゴヌクレオチドは５’足場配列を含み、第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドは３’足場配列を含む。
【００１８】
別の一実施形態においては、第１のＲＮＡは、第２のＲＮＡに相補的であり、二重にするとｓｉＲＮＡを形成する。
【００１９】
別の一実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡを阻害する。別の一実施形態においては、標的ＲＮＡは、阻害されると治療上有益な結果を生じるものである。別の更なる一実施形態においては、標的ＲＮＡは、疾患過程に関与するタンパク質又はその一部をコードするＲＮＡを含む。上記態様のいずれか一つの更なる関連した一実施形態においては、標的ＲＮＡはアポトーシス阻害タンパク質をコードする。上記態様のいずれか一つの別の更なる関連した一実施形態においては、標的ＲＮＡは、病原性ＲＮＡゲノム、病原体のゲノムに由来するＲＮＡ転写物、又はその一部である。一実施形態においては、病原体は、ウイルス、細菌、真菌又は寄生生物である。別の一実施形態においては、標的ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡゲノム又はその一部である。
【００２０】
本発明は、上記態様のいずれか一つのＲＮＡ  ＮＰ又はＲ／ＤＮＡ  ＮＰを含む組成物も特徴とする。
【００２１】
本発明は、上記態様のいずれか一つのＲＮＡ  ＮＰ又はＲ／ＤＮＡ  ＮＰを含む薬剤組成物も特徴とする。
【００２２】
一実施形態においては、薬剤組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を更に含む。
【００２３】
別の一実施形態においては、薬剤組成物は、疾患の治療のために処方される。更に別の一実施形態においては、薬剤組成物が、病原体による感染症の治療のために処方される、請求項２０又は２１に記載の薬剤組成物。別の関連した一実施形態においては、病原体は、ウイルス、細菌、真菌又は寄生生物である。
【００２４】
上記態様又は実施形態のいずれかの別の一実施形態においては、薬剤組成物は、病原体による感染症に付随する症候を治療又は軽減する第２の薬剤を更に含む。
【００２５】
一実施形態においては、第２の薬剤は抗ウイルス剤である。
【００２６】
別の一実施形態においては、薬剤組成物は、新形成の治療のために処方される。
【００２７】
別の更なる一実施形態においては、第２の薬剤は抗癌剤である。
【００２８】
本発明は、細胞における標的遺伝子の発現を阻害又は抑制する方法であって、細胞を治療有効量の上記態様若しくは実施形態のいずれかのＲＮＡ  ＮＰ若しくはＲ／ＤＮＡ  ＮＰ又は上記態様若しくは実施形態のいずれか一つの組成物と接触させるステップを含む、方法も特徴とする。
【００２９】
本発明は、病原体感染細胞を死滅させる方法であって、細胞を治療有効量の上記態様若しくは実施形態のいずれか一つのＲＮＡ  ＮＰ若しくはＲ／ＤＮＡ  ＮＰ又は上記態様若しくは実施形態のいずれか一つの組成物と接触させるステップを含む、方法も特徴とする。
【００３０】
本発明は、細胞における病原体の複製を阻害する方法であって、細胞を治療有効量の上記態様若しくは実施形態のいずれか一つのＲＮＡ  ＮＰ若しくはＲ／ＤＮＡ  ＮＰ又は上記態様若しくは実施形態のいずれか一つの組成物と接触させるステップを含む、方法も特徴とする。
【００３１】
一実施形態においては、細胞は対象中にある。
【００３２】
本発明は、対象における病原体負荷を軽減する方法であって、治療有効量の上記態様若しくは実施形態のいずれか一つのＲＮＡ  ＮＰ若しくはＲ／ＤＮＡ  ＮＰ又は上記態様若しくは実施形態のいずれか一つの組成物を投与するステップを含む、方法も特徴とする。
【００３３】
一実施形態においては、対象は、病原体感染症にかかるリスクがある。
【００３４】
別の一実施形態においては、対象は、病原体感染症であると診断された。
【００３５】
本発明は、対象における病原体感染症を治療又は予防する方法であって、治療有効量の上記態様若しくは実施形態のいずれか一つのＲＮＡ  ＮＰ若しくはＲ／ＤＮＡ  ＮＰ又は上記態様若しくは実施形態のいずれか一つの組成物を投与するステップを含む、方法も特徴とする。
【００３６】
一実施形態においては、方法は、病原体負荷を軽減し、それによって病原体感染症を治療又は予防する。別の一実施形態においては、方法は、感染細胞における死を誘発し、それによって病原体感染症を治療又は予防する。
【００３７】
一実施形態においては、対象はほ乳動物である。別の一実施形態においては、対象はヒトである。
【００３８】
一実施形態においては、病原体は、ウイルス、細菌、真菌又は寄生生物である。
【００３９】
上記態様又は実施形態のいずれか一つの別の一実施形態においては、方法は、細胞を治療有効量の第２の治療薬と接触させるステップ、又は治療有効量の第２の治療薬を対象に投与するステップを更に含む。
【００４０】
一実施形態においては、第２の治療薬は、病原体感染症、又は病原体感染症に付随する症候を治療する。
【００４１】
本発明は、新生細胞を死滅させる方法であって、癌細胞を治療有効量の上記態様若しくは実施形態のいずれか一つのＲＮＡ  ＮＰ若しくはＲ／ＤＮＡ  ＮＰ又は上記態様若しくは実施形態のいずれか一つの組成物と接触させ、それによって新生細胞を死滅させるステップを含む、方法も特徴とする。
【００４２】
本発明は、新形成を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の上記態様若しくは実施形態のいずれか一つのＲＮＡ  ＮＰ若しくはＲ／ＤＮＡ  ＮＰ又は上記態様若しくは実施形態のいずれか一つの組成物を対象に投与し、それによって対象を治療するステップを含む、方法も特徴とする。
【００４３】
一実施形態においては、新生細胞は、固形腫よう中に存在する癌細胞である。
【００４４】
別の一実施形態においては、方法は、細胞を治療有効量の第２の治療薬と接触させるステップ、又は治療有効量の第２の治療薬を対象に投与するステップを更に含む。
【００４５】
一実施形態においては、第２の治療薬は抗癌剤である。
【００４６】
本発明は、上記態様若しくは実施形態のいずれか一つのＲＮＡ  ＮＰ若しくはＲ／ＤＮＡ  ＮＰ又は上記態様若しくは実施形態のいずれか一つの組成物を含むキットも特徴とする。
【００４７】
一態様においては、キットは、第２の治療薬を更に含む。
【００４８】
本発明の別の態様は、以下の開示に記述され、又は以下の開示から自明であり、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１ａ】図１ａ〜ｈは、６個の異なるｓｉＲＮＡ及び／又は別の機能部で機能化されたＲＮＡナノリングの集合体であり、図１ａは、６個のｓｉＲＮＡで機能化されたＲＮＡナノリングを形成する集合体の略図である。機能性ｓｉＲＮＡは、ダイサーヌクレアーゼによって放出させることができる。
【図１ｂ】異なる数のＤＳ  ＲＮＡ（０〜６）で機能化されたＲＮＡナノリングの形成をもたらす集合体を示す未変性ＰＡＧＥ結果の図である。動的光散乱（ＤＬＳ：Ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）も集合結果を示し、ナノリング半径を示している。
【図１ｃ】インビトロ切断実験の図である。６個のｓｉＲＮＡで機能化されたＲＮＡナノリングをヒト組換えダイサー酵素（方法）と一緒にインキュベートした。切断結果を未変性ＰＡＧＥ（左）及び変性８Ｍ尿素ＰＡＧＥ（右）によって分析した。切断結果は、ｓｉＲＮＡ開裂の成功を示している。非機能性ＲＮＡナノリングを対照として使用した。
【図１ｄ】異なる数（０〜６）のマラカイトグリーン（ＭＧ：Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎ）アプタマーで機能化されたＲＮＡナノリングの集合体は、ＭＧ色素の蛍光が連続して増加することを示す図である。
【図１ｅ】インビトロ可視化のためのＭＧアプタマーの略図である。
【図１ｆ】細胞ターゲティングのためのＪ１８アプタマー、及びインビボ可視化のためのフィコエリトリンの図である。
【図１ｇ】足場相互作用によって導入されたダイサー基質ＲＮＡの図である。
【図１ｈ】分割機能部（ＲＮＡｉ及びＦＲＥＴ）を有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの図である。機能性ｓｉＲＮＡは、ダイサーヌクレアーゼによって放出させることができる。
【図２ａ】図２ａ及びｂは、低温ＥＭによるｓｉＲＮＡナノリングの構造的特性分析を示す図である。図２ａ左上図：ｓｉＲＮＡナノリング粒子の典型的な低温ＥＭ画像である。右図：低温ＥＭによって観察された各ｓｉＲＮＡナノリングのクラス平均。再構成された３次元構造体の対応する投影を有する。左下図：ｓｉＲＮＡナノリングの単一粒子再構成。モデルの側面図及び正面図である。
【図２ｂ】機能性ＲＮＡナノリングの追加の単一粒子再構成の図である。電子密度体積が一致するモデルの異なる図である。体積マップは、モデルの全原子が体積内に入ることができる最小レベルでしきい値処理されている。解像度は１６Åである。
【図３ａ】図３は、機能性ナノリングの相対導入／細胞取り込み、エンドソーム共存、サイレンシング及びＲＮＡアプタマー媒介結合効率の図である。図３ａは、ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）の導入効率の図である。二重鎖１本当たり１個のＡｌｅｘａ５４６で共有結合標識されたＤＳ  ＲＮＡ（最終６０ｎＭ）を、６個のＡｌｅｘａ５４６色素で標識された機能性ナノリング（最終１０ｎＭ）と比較した。導入から１日後、効率を共焦点蛍光顕微鏡法及びフローサイトメトリー実験によって分析した。
【図３ｂ】一般に使用されるエンドソーム区画マーカーである初期エンドソーム抗原１（ＥＥＡ１：Ｅａｒｌｙ  Ｅｎｄｏｓｏｍｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  １）及びＲａｂ７を用いてナノリングの局在化を調べた図である。
【図３ｃ】高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）におけるＧＦＰノックダウンアッセイの図である。ｅＧＦＰに対するｓｉＲＮＡ二重鎖及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリングを細胞に導入してから３日後のｅＧＦＰ発現の蛍光顕微鏡法（左図）、及びフローサイトメトリー実験の統計解析（３００００細胞／試料）（右図）である。ｓｉＲＮＡ二重鎖とＤＳ  ＲＮＡナノリングの比は、６対１であった。
【図３ｄ】Ａ４３１細胞上で発現されるＥＧＦＲに特異的に結合するように選択された異なる数のＪ１８アプタマーを含む、フィコエリトリン（ＰＥ：ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）で標識されたナノリングの相対結合効率をフローサイトメトリー実験で試験した。図３ｂの画像番号は、微分干渉（ＤＩＣ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ）画像（１）、Ａｌｅｘａ５４６発光（２）、ＥＡＡ１抗体染色（３）及びＲａｂ７抗体染色（４）に対応する。画像（１＋２＋３）及び（１＋２＋４）は、３枚の異なる画像の重ね合わせである。
【図４ａ】図４は、Ｒ／ＤＮＡハイブリッドによる異なる機能部の活性化を示す図である。図４ａは、ＲＮＡ−ＤＮＡ（Ｒ／ＤＮＡ）ハイブリッド及び６個の非機能性Ｒ／ＤＮＡハイブリッドで修飾された非機能性ナノリングの再会合による複数の機能部（ＲＮＡｉ、ＦＲＥＴ）の活性化を示すスキームである。
【図４ｂ】自己認識Ｒ／ＤＮＡナノリングとＡｌｅｘａ５４６及びＡｌｅｘａ４８８で標識された６個のＲ／ＤＮＡハイブリッドの再会合中のＦＲＥＴ時間追跡の図である。
【図４ｃ】ＦＲＥＴ実験：Ａｌｅｘａ５４６及びＡｌｅｘａ４８８で標識された自己認識Ｒ／ＤＮＡナノリング及び６個のＲ／ＤＮＡハイブリッドを細胞に同時導入し、翌日に画像を撮影した。
【図４ｄ】高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）のＧＦＰノックダウンアッセイの図である。自己認識Ｒ／ＤＮＡナノリング、及びｅＧＦＰに対してＤＳ  ＲＮＡを放出するようにプログラムされたＲ／ＤＮＡハイブリッドを細胞に導入してから３日後、ｅＧＦＰ発現をフローサイトメトリー実験によって統計解析した。対照として、ｅＧＦＰに対するＤＳ  ＲＮＡ二重鎖を使用した。個々のＲ／ＤＮＡナノリング及びＲ／ＤＮＡハイブリッドは、ｅＧＦＰ産生を減少させないことに留意されたい。図４ｃの画像番号は、微分干渉（ＤＩＣ）画像（１）、Ａｌｅｘａ４８８発光（２）、Ａｌｅｘａ５４６発光（３）、裏抜け補正された（ｂｌｅｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）ＦＲＥＴ画像（４）、黄色の星が対応を示す裏抜け補正されたＦＲＥＴ画像の白色の四角によって示される拡大断片の３Ｄ表示（５）に対応する。
【図５】腫よう異種移植片マウスモデルにおける６個のｓｉＲＮＡで機能化されたナノリングのインビボ試験を示す図である。インビボ注射から５日後の腫ようの蛍光画像化、及び対応する定量化によれば、６個のｓｉＲＮＡで機能化されたナノリングに起因するｅＧＦＰサイレンシングのレベルは、遊離ｓｉＲＮＡよりも高い。遊離ｓｉＲＮＡ二重鎖は、６個のｓｉＲＮＡを有する対応するナノリングよりも６倍高濃度であることに留意されたい。
【図６】ＨＩＶ−１発現及び生成が個々の二重鎖ｓｉＲＮＡ及び抗ＨＩＶ−１ナノリング（ＮＲ−ＨＩＶ）によって阻害されることを示す図である。Ｇａｇ及びＰｏｌ  ｍＲＮＡにおける異なる部位を標的とした。Ｎｅｆ及びＥｎｖ  ｍＲＮＡも標的として使用された。ナノリングは、全６個のｓｉＲＮＡを含む。ＨｅＬａ細胞にｐＮＬ４−３を導入し、ｓｉＲＮＡも導入した、又はｓｉＲＮＡを導入しなかった。ウイルス上清を収集し、ＲＴ活性を測定した。ｓｉＲＮＡを含まないウイルス対照（ＶＣ．１及びＶＣ．２）を基準にしてデータを示す。（ＰＢＳ−プライマー結合部位；ｐ１７−マトリックス；ｐ２４−カプシド；Ｐｒｏ−プロテアーゼ；ＲＴ−逆転写酵素；Ｅｎｖ−ｇｐ１２０、並びに使用濃度０．１及び１ｎＭ）。
【図７】個々の二重鎖ｓｉＲＮＡ及び抗ＨＩＶ−１ナノリングの細胞傷害性を示す図である。ｐＮＬ４−３及びｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を同時導入し、ｓｉＲＮＡも同時導入した、又はｓｉＲＮＡを同時導入していない、ＨＩＶ−１発現ＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼカウント／秒（ＬＣＰＳ：ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｓｅｃｏｎｄ）。導入から４８時間後、細胞を溶解し、ウミシイタケルシフェラーゼを測定した。（ＰＢＳ−プライマー結合部位；ｐ１７−マトリックス；ｐ２４−カプシド；Ｐｒｏ−プロテアーゼ；ＲＴ−逆転写酵素；Ｅｎｖ−ｇｐ１２０；ＨＩＶ−ＮＲ−ナノリング；６ｓｉＲＮＡ−６個の異なるｓｉＲＮＡの混合、並びに使用濃度０．１及び１ｎＭ）。
【図８ａ】図８は、ＨＩＶ−１発現及び生成が機能性ナノリングによって阻害されたことを示す別のヒストグラムであり、図８ａは、細胞内のＨＩＶ−１発現を導入から４８時間後に測定した図である。ＨｅＬａ細胞を溶解し、ウエスタンブロット法によってＨＩＶ−１タンパク質を探索した。Ｐｒ５５Ｇａｇ（Ｐｒ５５）、マトリックス−カプシド（ｐ４１）及びカプシド／カプシド−ＳＰ１（ｐ２４／ｐ２５）の位置を示した。全細胞内Ｇａｇ（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｇａｇ）の定量化：Ｐｒ５５＋ｐ４１＋ｐ２５＋ｐ２４。ナノリングもダイサー基質（ＤＳ：ｄｉｃｅｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）ＲＮＡも含まないウイルス対照（ＨＩＶ−１）中の全Ｇａｇを１００に設定した。エラーバーは、＋／−ＳＥＭ；Ｎ＝４を表す。
【図８ｂ】ＨｅＬａ細胞にｐＮＬ４−３（完全長ＨＩＶ−１分子クローン）を導入し、ナノリング又はＤＳ  ＲＮＡも導入した、又はナノリングもＤＳ  ＲＮＡも導入していない図である。ウイルス上清を導入から４８時間後に収集し、逆転写酵素（ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）産生を測定した（このアッセイは、細胞によって生成されるウイルスを定量化するものである）。機能性ナノリングもＤＳ  ＲＮＡも含まないウイルス対照（ＨＩＶ−１）を基準にしてデータを示す。ニセ（Ｍｏｃｋ）は、導入のないＨｅＬａ細胞である。６個の異なる抗ＨＩＶ  ＤＳ  ＲＮＡの対応する混合物（Ａ及びＢ）を正の対照として使用した。抗ＨＩＶ  ＤＳ  ＲＮＡを含まないナノリング対照を負の対照として使用した。エラーバーは、＋／−ＳＥＭ；Ｎ＝４を表す。
【図９ａ】図９ａから９ｄは、ＤＳ  ＲＮＡ又はＭＧアプタマーで機能化されたナノリングの集合体を示す図である。図９ａは、異なる数のＤＳ  ＲＮＡ（０〜６）で機能化されたＲＮＡナノリングの形成をもたらす集合体を示す未変性ＰＡＧＥ結果を示す図である。動的光散乱（ＤＬＳ）は集合結果を裏づけ、ナノリング半径を示している。
【図９ｂ】インビトロ切断実験を示す図である（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ネイチャー・プロトコル（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ）２０１１年、６、２０２２〜３４）。６個のｓｉＲＮＡで機能化されたＲＮＡナノリングをヒト組換えダイサー酵素と一緒にインキュベートした。ダイサーで処理した構築物を未変性ＰＡＧＥ（左）及び変性８Ｍ尿素ＰＡＧＥ（右）によって分析した。この構築物は、ｓｉＲＮＡ開裂の成功を示している。非機能性ＲＮＡナノリングを対照として使用した。
【図９ｃ】図９ｃ及び９ｄは、最高６個のマラカイトグリーン（ＭＧ：Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎ）アプタマーで機能化されたナノリングのワンポット（ｃ）及び同時転写（ｄ）集合体を示す図である。異なる数（０〜６）のマラカイトグリーン（ＭＧ）特異的アプタマー（ＰＤＢ：１Ｆ１Ｔ（ボー（Ｂａｕｇｈ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラ・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）２０００年、３０１、１１７〜２８））で機能化されたＲＮＡナノリングの集合体は、ＭＧ色素の蛍光の連続した増加を示す。
【図９ｄ】転写時間にわたるＭＧ色素の蛍光の増加（下のグラフ）によって可視化された６個のＭＧアプタマーで機能化されたＲＮＡナノリングの同時転写集合体の図である（未変性ＰＡＧＥによって確認、上方；アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ）２０１２年、１２、５１９２〜５）。
【図１０】ＤＳ  ＲＮＡ及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリングの相対導入効率を示す図である。ＤＳ  ＲＮＡ及びＡｌｅｘａ５４６で標識された６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリングを細胞に導入した翌日に（約９０％コンフルエント）、効率を共焦点蛍光顕微鏡法によって分析した。
【図１１】異なる濃度の６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング（最終１００、５０、２５、１２、６、３、１．５及び０．７５ｎＭ）及びＤＳ  ＲＮＡ二重鎖（最終６００、３００、１５０、７５、３０、１５、９及び４．５ｎＭ）が導入された高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）のＧＦＰノックダウン可視化アッセイを示す図である。ｅＧＦＰに対して１種類のｓｉＲＮＡを使用したため、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、対応する機能性ナノリングよりも６倍高い濃度で導入されたことに留意されたい。相対ｅＧＦＰ発現レベルをＧＦＰ発現のサイレンシングについて導入から３日後に蛍光顕微鏡法によって視覚的に分析した。無作為に選択された１視野当たりの全細胞数は、試料ごとに異なり得ることに留意されたい。
【図１２ａ】ＤＳ  ＲＮＡ（最終６ｎＭ）及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング（最終１ｎＭ）が導入された高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）のＧＦＰノックダウンアッセイを示す図である。相対ｅＧＦＰ発現レベルを、導入から１５時間後にフローサイトメトリー実験によって統計的に（３００００細胞）分析した。
【図１２ｂ】ＤＳ  ＲＮＡ（最終６ｎＭ）及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング（最終１ｎＭ）が導入された高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）のＧＦＰノックダウンアッセイを示す図である。相対ｅＧＦＰ発現レベルを、導入から２日後にフローサイトメトリー実験によって統計的に（３００００細胞）分析した。
【図１２ｃ】ＤＳ  ＲＮＡ（最終６ｎＭ）及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング（最終１ｎＭ）が導入された高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）のＧＦＰノックダウンアッセイを示す図である。相対ｅＧＦＰ発現レベルを、導入から３日後にフローサイトメトリー実験によって統計的に（３００００細胞）分析した。
【図１２ｄ】ＤＳ  ＲＮＡ（最終６ｎＭ）及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング（最終１ｎＭ）が導入された高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）のＧＦＰノックダウンアッセイを示す図である。相対ｅＧＦＰ発現レベルを、導入から４日後にフローサイトメトリー実験によって統計的に（３００００細胞）分析した。
【図１２ｅ】ＤＳ  ＲＮＡ（最終６ｎＭ）及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング（最終１ｎＭ）が導入された高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）のＧＦＰノックダウンアッセイを示す図である。相対ｅＧＦＰ発現レベルを、導入から５日後にフローサイトメトリー実験によって統計的に（３００００細胞）分析した。
【図１２ｆ】ＤＳ  ＲＮＡ（最終６ｎＭ）及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング（最終１ｎＭ）が導入された高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）のＧＦＰノックダウンアッセイを示す図である。相対ｅＧＦＰ発現レベルを、導入から６日後にフローサイトメトリー実験によって統計的に（３００００細胞）分析した。
【図１２ｇ】ＤＳ  ＲＮＡ（最終６ｎＭ）及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング（最終１ｎＭ）が導入された高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）のＧＦＰノックダウンアッセイを示す図である。相対ｅＧＦＰ発現レベルを、導入から１０日後にフローサイトメトリー実験によって統計的に（３００００細胞）分析した。
【図１３ａ】図１３ａから１３ｄは、ＧＦＰノックダウン実験のヒストグラム及びＦＡＣＳデータプロットである。図１３ａは、各１００ｎＭにおいてナノリング、ＧＦＰに対して６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング、及びＧＳＴＰ１に対して６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリングが導入された高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）のＧＦＰノックダウンアッセイの図である。
【図１３ｂ】異なる時点で実施された細胞生存率アッセイの図である。エラーバーは、ＳＤ、Ｎ＝３を表す。
【図１３ｃ】異なる時点で記録されたＤＳ  ＲＮＡ（６ｎＭ）及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング（１ｎＭ）のＧＦＰノックダウンアッセイの図である。相対ｅＧＦＰ発現レベルを、導入から１日、２日、５日、６日、７日、８日及び９日後にフローサイトメトリー実験によって統計的に（３００００細胞）分析した。
【図１３ｄ】異なる時点における対応する非基準化対照細胞のＦＡＣＳデータの図である。図１３ａ及びｃにおいては、ｇＭＦＩは、幾何平均蛍光強度に対応する。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図１４ａ】図１４ａから１４ｄは、Ａ４３１細胞上の標的ＥＧＦＲに特異的に結合するＪ１８アプタマーで機能化されたナノリングを示す図である。図１４ａは、Ａ４３１細胞上で発現されるＥＧＦＲに特異的に結合するように選択された５個のＪ１８アプタマーを含む、フィコエリトリン（ＰＥ）で標識されたナノリングを表す３Ｄモデルの図である。
【図１４ｂ】リボヌクレアーゼ処理によって蛍光シグナルが減少するので、ＮＰの結合がＲＮＡアプタマーによって媒介されることを示す図である。
【図１４ｃ】ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体の結合を示す図である。ＥＧＦＲに対するｍＡｂとリボヌクレアーゼを用いた同時処理は、ＥＧＦＲの検出ロスを生じず、リボヌクレアーゼ処理によるシグナルの減少がＲＮＡアプタマーの分解に起因し、その標的に起因しないことが裏づけられる。
【図１４ｄ】ｒＥＧＦを用いたＮＰ結合の競合によって、１個のＪ１８アプタマーを有するＮＰで見られるようにシグナルが減少した。さらに、ｒＩｇＧ処理はシグナルを変化させないので、組換えタンパク質によるＲＮＡの非特異的分解によって蛍光の減少は生じなかった。
【図１５ａ】図１５は、足場相互作用によるナノリングの機能化を示す図である。図１５ａは、足場相互作用を介して６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたＲＮＡナノリングを形成する集合体の略図である。
【図１５ｂ】６個のｓｓＲＮＡ足場及び６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたＲＮＡナノリングを形成する集合体を示す未変性ＰＡＧＥ結果の図である。
【図１５ｃ】高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）を安定に発現するヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰ）におけるＧＦＰノックダウンアッセイの図である。６個の足場を有するナノリング及び足場相互作用によってｅＧＦＰに対する６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリングを細胞に導入してから３日後のｅＧＦＰ発現のフローサイトメトリー実験の統計解析（３００００細胞／試料）。
【図１６】本発明の一連の機能性ＲＮＡナノ粒子を示す追加の画像である。
【図１７ａ】図１７ａから１７ｃは低温ＥＭ再構成を示す図であり、ｓｉＲＮＡリングのアームがまっすぐ外に向いていないことを示している。図１７ａは、上から見ると、ＤＳ  ＲＮＡアームがリングの周りに風車の様式で位置することを示す図である。６個のＤＳ  ＲＮＡアームは、図１のモデルのアームに比べて約５３度時計回り方向を指している。
【図１７ｂ】横から見ると、ｓｉＲＮＡアームが約２５度上向きであり、したがって六角形分子の冠形状を成している図である。
【図１７ｃ】２つの独立した半セットのデータからフーリエシェル相関（ＦＳＣ：Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｓｈｅｌｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）カットオフ０．１４３の最も標準的な判定基準によって低温ＥＭ密度マップの解像度を１６Åであると評価したことを示す図である。
【図１８】ＨＩＶ−１を発現するＨｅＬａ細胞における機能性抗ＨＩＶナノリング構築物Ａ及びＢ並びに対照の細胞傷害性を示す別のヒストグラムである（ＬＣＰＳ：ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｓｅｃｏｎｄ＝ルシフェラーゼカウント／秒）。細胞傷害性は、１ｎＭのナノリング（Ｂ）において最小であった。細胞にｐＮＬ４−３（ＨＩＶ−１分子クローン）及びｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−１（ウミシイタケルシフェラーゼベクター、Ｐｒｏｍｅｇａ）を同時導入し、ナノリング若しくはダイサー基質（ＤＳ）ＲＮＡも同時導入した、又はナノリング若しくはダイサー基質（ＤＳ）ＲＮＡを同時導入しなかった。導入から４８時間後、細胞を溶解し、ウミシイタケルシフェラーゼを測定した。データをウイルス対照（ＨＩＶ−１）を基準にして示す。抗ＨＩＶ  ＤＳ  ＲＮＡ（Ａ及びＢ）、６個の異なるＤＳ  ＲＮＡの混合物を正の対照として使用した。ナノリング対照は、ＧＳＴＰ１  ＤＳ  ＲＮＡの６個のコピーを有し、それを負の対照として使用した。ＨＩＶ−１、ウイルス対照。エラーバーは、＋／−ＳＥＭ；Ｎ＝４を表す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は、少なくとも部分的に、ナノリングを用いたｓｉＲＮＡナノ骨格の継続的な開発を対象とし、このシステムが、細胞ターゲティング、合成の容易さ、及び治療機能部の活性化の誘発を含めて、ＮＰによるｓｉＲＮＡ送達に付随する現在の幾つかの難題に対処するように設計することができる方法を説明するものである。本発明は、１個以上の機能部を含む多価ＲＮＡナノ粒子を提供する。これらの機能性多価ＲＮＡナノ粒子は、幾つかの疾患又は障害における治療上又は診断上の使用に適している。
【００５１】
本明細書に記載のＲＮＡナノ粒子は、集合して、例えば、自己集合して、高次構造、例えば、リング、ケージ又はナノチューブを構築する能力を有する。集合する能力を有するＲＮＡナノ粒子の方法及び組成物は、米国特許出願公開第２０１２０２６３６４８号に記載されている。さらに、ナノリングは、そのぶら下がった粘着性末端を介して集合して、ナノアレイ、ナノケージ及びナノチューブを構築するように設計することができる。それらは、生物学的及び生物医学的に応用するために環境要因に反応することができる多価多機能ナノ粒子として作製することもできる。
【００５２】
有利なことに、本発明のナノ粒子は、現在利用可能なナノ粒子よりも幾つかの点で改善されている。例えば、本発明のＲＮＡナノ粒子は、現行のタンパク質ナノ粒子のように重大な免疫応答を誘発しないこともある。さらに、本発明のナノ粒子は、多数の現在利用可能なナノ粒子よりも小さく、したがって投与効率を高くすることができる。本明細書に記載のナノ粒子は、複数のＲＮＡサブユニットを含み、その各々が薬剤に結合する能力を有する。さらに、複数の異なる薬剤が単一のナノ粒子中に存在することができる。以前の研究によれば、ＲＮＡナノ構造体は、有効な薬物送達媒体である（例えば、カレド（Ｋｈａｌｅｄ）ら、（２００５）ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）５：１７９７〜１８０８参照）。
【００５３】
本発明は、ナノリング設計が、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ：Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に特異的なＲＮＡアプタマーの取り込みによって細胞ターゲティング性を得ることができる方法を例示する。ナノ骨格へのＲＮＡ機能部かかるアプタマー又はダイサー基質（ＤＳ）ＲＮＡの取り込みは、ＲＮＡ成分が一般に６０ヌクレオチド長を超えることができないので、固体状態の化学合成に関して難点がある。本発明は、ＲＮＡアプタマーとダイサー基質ＲＮＡの両方を一本鎖足場認識部位を用いてナノ骨格にアニールすることによって、この問題に対処する。この付着システムによって、単一ナノ骨格の多機能的使用が可能になる。というのは、異なる核酸機能部は、ナノ骨格中に存在する足場と相補的な同種の足場を有する限り、連結することができるからである。本発明は、ナノリングの治療上の機能性をＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの取り込みによって誘発できる方法も示す。この新規に開発された技術は、ＲＮＡ／ＤＮＡナノリングとＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの間の目的とするＲＮＡに基づく機能部、この場合ダイサー−基質ＲＮＡの分割を含む。ＤＮＡ鎖は、相補的足場を副生物として含む。相補的足場は、近接していると、互いに結合して、ＤＮＡ二重鎖に沿ってナノリング内のＤＳ  ＲＮＡの再会合を可能にする。遺伝子サイレンシングは、ダイサー−基質ＲＮＡが形成したときのみ起こり、治療物質が活性になったときに更なる制御を可能にする。本明細書に記載のＲＮＡナノリング系の増強とは、この技術を臨床応用に用いる際に残る幾つかの難題に対処することを意味する。
【００５４】
定義
本発明は、ＲＮＡモチーフを構成要素として含む多価ＲＮＡナノ粒子を提供する。本明細書に記載の多価ＲＮＡナノ粒子は、治療薬、診断薬及び／又は送達剤を更に含むことができる。さらに、本明細書に記載の多価ＲＮＡナノ粒子は、種々の疾患又は症状を治療する薬物送達組成物として使用することができる。
【００５５】
以下の定義は、本発明の理解に有用である。
【００５６】
本明細書では「含む」という用語は、組成物及び方法が、列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味するものとする。「から本質的になる」とは、組成物及び方法を定義するときに、組合せに本質的に重要である他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義された要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法由来の微量混入物、及びリン酸緩衝食塩水、防腐剤などの薬学的に許容される担体を除外しない。「からなる」とは、他の成分の微量を超える元素及び本発明の組成物を投与する実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００５７】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される単数形「１つの（ａ、ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」は、特に明示しない限り、その複数形を含む。
【００５８】
本明細書における範囲は、範囲内の値すべてに対する略記であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９及び５０からなる群の任意の数、数の組合せ、又は部分範囲を含むと理解される。
【００５９】
特に明示しない限り、又は状況から自明である場合を除いて、本明細書では「又は」という用語は、包括的であると理解される。
【００６０】
本明細書における変数の定義における化学基のリストの記述は、その変数の定義を任意の単一の基又は列挙された基の組合せとして含む。本明細書における変数又は態様の実施形態の記述は、その実施形態を任意の単一の実施形態として又は任意の他の実施形態若しくはその一部と組み合わせて含む。
【００６１】
本明細書に記載の任意の組成物又は方法は、本明細書に記載の他の組成物及び方法のいずれかの１つ以上と組み合わせることができる。
【００６２】
本明細書では「投与する」という用語は、組成物が対象の体内に存在するように組成物を対象に与える手段を指すものとする。かかる投与は、皮下、皮内、静脈内、動脈内、腹腔内及び筋肉内を含めて、ただしそれだけに限定されない任意の経路によることができる。
【００６３】
本明細書では「機能部」という用語は、ナノ粒子に含まれ得る物質、又はナノ粒子に付着し得る物質を指す。例示的実施形態においては、機能部は薬剤である。例示的な薬剤としては、例えば、プロドラッグ、診断薬、造影剤、治療薬、化学療法剤、医薬品、薬物、合成有機分子、タンパク質、ペプチド、ビタミン、及びステロイド、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマー、蛍光色素、小分子、分割機能部を有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、分割リパーゼ、分割ＧＦＰ及びタンパク質が挙げられる。
【００６４】
本明細書では「アプタマー」は、塩基対ハイブリダイゼーション以外によって目的分析物に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、一般に、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡの混合物を含む。アプタマーは、天然のものとすることができ、又は合成若しくは組換え手段によって製造することができる。アプタマーは、一般に一本鎖であるが、二本鎖又は三本鎖とすることもできる。それらは、天然ヌクレオチド、化学修飾など何らかの方法で修飾されたヌクレオチド、及び非天然塩基、例えば２−アミノプリンを含むことができる。例えば、米国特許第５，８４０，８６７号を参照されたい。アプタマーは、例えば、蛍光団などの標識の添加によって、又はそれが結合する分子にアプタマーが架橋できるようにする分子の添加によって、化学修飾することができる。アプタマーは、同じ配列を有する場合、又は同じ分子に特異的に結合可能である場合、同じ「タイプ」である。アプタマーの長さは様々であるが、一般には約１００ヌクレオチド未満である。
【００６５】
本明細書では「治療薬」という用語は、インビトロ又はインビボで標的に対して作用を及ぼす能力のある薬剤を指すものとする。
【００６６】
本明細書では「化学療法剤」という用語は、癌を治療又は予防するのに使用することができる化合物又は分子を含むものとする。「化学療法剤」は、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシラート；ビセレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロランブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシラート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシラート；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩ、すなわちｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；マイタンシン；メクロレタミン、メクロレタミン酸化物塩酸塩レタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲステロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；トレストロン酢酸塩；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシナート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩、インプロスルファン、ベンゾデパ、カルボコン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、トリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、クロルナファジン、ノブエンビキン、フェネステリン、トロホスファミド、エステルムスチン（ｅｓｔｅｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン、ジェムザール、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、アクラシノマイシン、アクチノマイシンＦ（１）、アザセリン、ブレオマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、６−ジアゾ−５−オキソ−１−ノルロイシン、ドキソルビシン、オリボマイシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ツベルシジン、ゾルビシン、デノプテリン、プテロプテリン、６−メルカプトプリン、アンシタビン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、エノシタビン、プルモザイム、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、ベストラブシル、デフォファミド（ｄｅｆｏｆａｍｉｄｅ）、デメコルチン、エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、エリプチニウム酢酸塩、エトグルシド、フルタミド、ヒドロキシ尿素、レンチナン、フェナメット、ポドフィリニック酸、２−エチルヒドラジド、ラゾキサン、スピロゲルマニウム、タモキシフェン、タキソテール、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及び関連した薬剤を含むものとする。２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫ拮抗物質；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレライド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；拮抗物質Ｄ；拮抗物質Ｇ；アンタレリクス；抗背方化形態形成（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン剤；抗新生物薬；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子調節物質；アポトーシス制御物質；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗物質；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビセレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトセシン誘導体；カナリアポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン（ｃｈｌｏｒｌｎｓ）；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シスポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタアントラキノン；シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）；シペマイシン；シタラビンオクフォスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）；デシタビン；デヒドロディデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ディデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲン作動物質；エストロゲン拮抗物質；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルビシン（ｆｌｕｏｒｏｄａｕｎｏｒｕｎｉｃｉｎ）塩酸塩；ホルフェニメクス；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫賦活ペプチド；インスリン様成長因子−１受容体阻害剤；インターフェロン作動物質；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４−；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン；イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセタート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；線状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテフォシン；ミリモスチム；不適性二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；メトナフィド；マイトトキシン（ｍｉｔｏｔｏｘｉｎ）線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒトじゅう毛性ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドＡ＋マイコバクテリウム（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫よう抑制因子１に基づく療法；マスタード抗癌剤；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；
ナグレスチプ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調節物質；窒素酸化物抗酸化剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘発物質；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキザウノマイシン；タキセル；タキセル類似体；タキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリスルファートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸塩；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチン（ｐｌａｃｅｔｉｎ）Ａ；プラセチンＢ；プラスミノゲン活性化因子阻害剤；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡ系免疫調節物質；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン複合物；ｒａｆ拮抗物質；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；レテリプチン脱メチル化；レニウムＲｅ１８６エチドロナート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣物；セムスチン；老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達調節物質；単鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテイト；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作動性腸ペプチド拮抗物質；スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（ｔｅｌｌｕｒａｐｙｒｙｌｉｕｍ）；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロマイド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模倣物；チマルファシン；サイモポイエチン受容体作動物質；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンすず；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チロホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長抑制因子；ウロキナーゼ受容体拮抗物質；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子療法；ベラレソール；ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）；ベルジン（ｖｅｒｄｉｎｓ）；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；Ｖｉｔａｘｉｎ；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマー。好ましい追加の抗癌薬は、５−フルオロウラシル及びロイコボリンである。追加の癌治療物質としては、リツキシマブ、トラスツヅマブ、セツキシマブなどのモノクローナル抗体が挙げられる。
【００６７】
本明細書では「有効量」という用語は、患者において所望の効果（疾患などの病状の治療、とう痛などの症候の軽減など）を生じる治療薬単体の量を指す。一部の態様においては、この句は、本発明の一組成物に混合されたときに、特別な疾患又は障害に付随する将来の医学的リスクから個体を予防又は保護するのに十分な予防効果を生じる治療薬の量を指す。通常の技量の医師又は獣医師は、症状の治療及び／又は進行防止に必要な生理活性薬剤の有効量を容易に決定し、処方することができる。
【００６８】
本明細書では「癌」という用語は、対象の体の細胞が異常な抑制されない増殖を起こす状態を意味するのに使用される。したがって、「癌」は、細胞増殖性障害である。癌の例としては、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増多症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、並びに肉腫及び癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管肉腫、滑膜性腫よう、中皮腫、ユーイング腫よう、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、すい癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、へん平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌（ｎｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、じゅう毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫よう、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ぼうこう癌、上皮癌、神経こう腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起こう腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）などの固形腫ようが挙げられるが、それだけに限定されない。リンパ球増殖性疾患も、増殖性疾患であるとみなされる。
【００６９】
「癌」、「新生物」及び「腫よう」という用語は、区別なく使用され、単数形又は複数形で、宿主生物体に対して病的になる悪性転換を起こした細胞を指す。「新生細胞」とは、新形成の成分である細胞を意味する。
【００７０】
本明細書では「組成物」とは、活性薬剤（例えば、多価ＲＮＡナノ粒子）の組合せを指す。さらに、組成物は、薬学的に許容される担体若しくは賦形剤、及び／又はインビトロ若しくはインビボで使用される１種以上の治療薬を含むことができる。
【００７１】
本明細書では「接合」という用語は、ナノ粒子上に付着した、結合した、又は存在する状態と理解される。
【００７２】
本明細書では「疾患」とは、細胞、組織又は器官の正常な機能を損なう、又は妨害する任意の症状又は障害を指すものとする。
【００７３】
本明細書では「有効量」とは、無処置の患者に比べて疾患の症候を改善するのに必要な量を指すものとする。疾患の治療処置のために本発明を実施するのに使用される活性化合物（単数又は複数）の有効量は、投与方式、対象の年齢、体重及び全般的健康状態に応じて変わる。最終的には、主治医又は獣医師が、適切な量及び投与計画を決定する。かかる量を「有効」量と称する。
【００７４】
本発明は、本明細書に記載の方法によって特徴付けられる障害を治療するための極めて特異的な薬剤の開発に有用である幾つかの標的を提供する。さらに、本発明の方法は、対象における使用に安全である療法を特定するための容易な手段も提供する。さらに、本発明の方法は、実質的に任意の数の化合物の本明細書に記載の疾患に対する効果を高処理量、高感度及び低複雑度で解析するための経路も提供する。
【００７５】
本明細書では「新形成を阻害する」とは、細胞が発達して新形成になる傾向を抑制し、又は新形成の成長若しくは増殖を遅らせる、減少させる、若しくは安定化することを意味する。
【００７６】
本明細書では「抑制性核酸」とは、ほ乳動物細胞に投与すると標的遺伝子の発現を（例えば、１０％、２５％、５０％、７５％、更には９０〜１００％だけ）減少させる二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ、又はその一部、又はその模倣物を意味する。一般に、核酸阻害剤は、標的核酸分子の少なくとも一部、若しくはそのオルソログを含み、又は標的核酸分子の相補鎖の少なくとも一部を含む。例えば、抑制性核酸分子は、本明細書に記載の核酸のいずれか又はすべての少なくとも一部を含む。
【００７７】
本明細書では「キット」は、本発明の少なくとも非標準実験用試薬、及び本発明の方法に使用する１種以上の非標準実験用試薬を含むと理解される。
【００７８】
本明細書では「ナノ粒子」という用語は、１０ｎｍから２００ｎｍのサイズの粒子を指すものとする。本発明によるナノ粒子は、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む。ＲＮＡは、任意の供給源、例えば、バクテリオファージｐｈｉ２９、ＨＩＶ、ショウジョウバエ、リボソームから得ることができ、又は合成ＲＮＡとすることができる。
【００７９】
「得ること」という用語は、本明細書では製造すること、購入すること、又は所有することとして理解される。
【００８０】
本明細書では「オリゴヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドなどを含めて、ヌクレオチドの線状オリゴマー、又はその類似体を含む。一般に、オリゴヌクレオチドのサイズは、数単量体単位、例えば３〜４から、数百単量体単位の範囲である。オリゴヌクレオチドは、阻害活性又は刺激活性を有し得る。
【００８１】
本明細書では「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水又は水／油乳濁液などの乳濁液、種々の湿潤剤などの標準薬剤担体のいずれをも包含する。組成物は、安定剤及び防腐剤も含むことができる。担体、安定剤及びアジュバントの例は、マーチン  レミントンの薬学（Ｍａｒｔｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．）、１５版（マックパブリッシング（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．）、イーストン（１９７５年））を参照されたい。
【００８２】
「対象」という用語は、処置を必要とする生物体を含むものとする。対象の例としては、ほ乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット及びトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。ある実施形態においては、対象はヒトである。
【００８３】
「足場」という用語は、領域と相補的核酸配列のハイブリダイゼーションを惹起するように設計された核酸配列を含む、領域の核形成部位を指す。
【００８４】
本明細書では「治療薬」という用語は、薬物を含み、診断、治療、予防医学又は獣医学目的で生物体に投与される分子、分子グループ、複合体又は物質を意味する。この用語は、臨床スクリーニング、防止、予防、治癒、健康、検出、画像化、診断、療法、手術、監視、化粧品、義装具、科学捜査などに有用である製剤を含めて、外部及び内部投与される局所的、局在的及び全身的なヒト及び動物の医薬品、処置剤、治療剤、機能性食品、薬用化粧品、生物製剤、装置、診断薬及び避妊薬を含む。この用語は、細胞受容体、膜受容体、ホルモン受容体、治療受容体、微生物、ウイルス、又は植物、動物及び／又はヒトとの接触を含む若しくは接触可能な選択された標的を認識可能な選択された分子若しくは選択された核酸配列を含む、農業、職場、軍隊、産業及び環境の治療物質若しくは治療剤に関連して使用することもできる。この用語は、特に、核酸、及び生理活性作用を生じる核酸を含む化合物、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、又はその混合物若しくは組合せ、例えばＤＮＡナノ構成単位（ｎａｎｏｐｌｅｘ）を含むこともできる。薬学的に活性な薬剤は、本明細書に開示したカテゴリ及び具体例を含む。カテゴリが具体例によって限定されることは意図されない。当業者は、本発明に従って有用である、カテゴリ内の多数の他の化合物も認識するはずである。例としては、成長因子、例えば、ＮＧＦ若しくはＧＮＤＦ、ステロイド、キサンチン、ベータ−２−作動物質気管支拡張剤、抗炎症剤、鎮痛薬、カルシウム拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ベータ遮断薬、中枢作用性アルファ−作動物質、アルファ−１−拮抗物質、抗コリン作用薬／鎮けい剤、バソプレシン類似体、抗不整脈薬、抗パーキンソン病薬、抗狭心症薬／血圧降下剤、抗凝固薬、抗血小板薬、鎮静薬、抗不安（ａｎｓｉｏｌｙｔｉｃ）薬、ペプチド薬、生体高分子薬、抗腫よう薬、下剤、止しゃ薬、抗菌剤、抗真菌（ａｎｔｉｆｉｎｇａｌ）剤、ワクチン、タンパク質、又は核酸が挙げられる。更に別の一態様においては、薬学的に活性な薬剤は、クマリン、アルブミン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、ヒドロコルチゾン、薬学的に許容されるヒドロコルチゾン誘導体などのステロイド；テオフィリン、ドキソフィリンなどのキサンチン；サルブタモール、フェノテロール（ｆｅｎｔｅｒｏｌ）、クレンブテロール、バンブテロール、サルメテロール、フェノテロールなどのベータ−２−作動物質気管支拡張剤；抗ぜん息抗炎症剤、抗関節炎抗炎症剤及び非ステロイド性抗炎症剤を含めた抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤の例としては、スルフィド、メサラミン、ブデソニド、サラゾピリン、ジクロフェナク、薬学的に許容されるジクロフェナク塩、ニメスリド、ナプロキセン、アセトアミノフェン（ａｃｅｔｏｍｉｎｏｐｈｅｎ）、イブプロフェン、ケトプロフェン及びピロキシカムが挙げられるが、それだけに限定されない；サリチラートなどの鎮痛薬；ニフェジピン、アムロジピン、ニカルジピンなどのカルシウムチャネル遮��薬；カプトプリル、ベナゼプリル塩酸塩、フォシノプリルナトリウム、トランドラプリル、ラミプリル、リシノプリル、エナラプリル、キナプリル塩酸塩、モエキシプリル塩酸塩などのアンジオテンシン変換酵素阻害剤；ソタロール塩酸塩、マレイン酸チモロール、エスモロール塩酸塩、カルテオロール、プロパノロール塩酸塩、ベタキソロール塩酸塩、ペンブトロール硫酸塩、酒石酸メトプロロール、コハク酸メトプロロール、アセブトロール塩酸塩、アテノロール、ピンドロール、フマル酸ビソプロロールなどのベータ遮断薬（すなわち、ベータアドレナリン作動性遮断薬）；クロニジンなどの中枢作用性アルファ−２−作動物質；ドキサゾシン、プラゾシンなどのアルファ−１−拮抗物質；ジシクロミン塩酸塩、スコポラミン臭化水素酸塩、グリコピロレート、臭化クリジニウム、フラボキサート、オキシブチニンなどの抗コリン作用薬／鎮けい剤；バソプレシン、デスモプレシンなどのバソプレシン類似体；キニジン、リドカイン、トカイニド塩酸塩、メキシレチン塩酸塩、ジゴキシン、ベラパミル塩酸塩、プロパフェノン塩酸塩、フレカイニド酢酸塩、プロカインアミド塩酸塩、モリシジン塩酸塩、ジソピラミドリン酸塩などの抗不整脈薬；ドパミン、Ｌドーパ／カルビドパ、セレギリン、ジヒドロエルゴクリプチン、ペルゴリド、リスリド、アポモルヒネ、ブロモクリプチンなどの抗パーキンソン病薬；一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、プロプラノロール、アテノロール、ベラパミルなどの抗狭心症薬及び血圧降下剤；クマジン、ワルファリン、アセチルサリチル酸、チクロピジンなどの抗凝固薬及び抗血小板薬；ベンゾジアゼピン、バルビツル酸塩などの鎮静薬；ロラゼパム、ブロマゼパム、ジアゼパムなどの抗不安薬；カルシトニン、ロイプロリド及び他のＬＨＲＨ作動物質、ヒルジン、シクロスポリン、インスリン、ソマトスタチン、プロチレリン、インターフェロン、デスモプレシン、ソマトトロピン、チモペンチン、ピドチモド、エリスロポイエチン、インターロイキン、メラトニン、顆粒球／マクロファージ−ＣＳＦ、ヘパリンなどのペプチド薬及び生体高分子薬；エトポシド、リン酸エトポシド、シクロホスファミド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ドキソルビシン、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、ロイコボリンカルシウム、タモキシフェン、フルタミド、アスパラギナーゼ、アルトレタミン、ミトタン、プロカルバジン塩酸塩などの抗腫よう薬；センナ濃縮物、カサンスラノール、ビサコジル、ピコスルファートナトリウムなどの下剤；ジフェノキシン塩酸塩、ロペラミド塩酸塩、フラゾリドン、ジフェノキシラート塩酸塩、微生物などの止しゃ薬；細菌及びウイルスワクチンなどのワクチン；ペニシリン、セファロスポリン、マクロライドなどの抗菌剤、イミダゾール誘導体、トリアゾール誘導体などの抗真菌剤；並びに生体タンパク質をコードするＤＮＡ配列、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの核酸とすることができる。
【００８５】
本明細書では「治療される（ｔｒｅａｔｅｄ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、治療される状態、障害又は疾患に付随又は起因する少なくとも１つの症候の縮小又は軽減を含む。治療された対象は、症候（例えば、腫よう量）の部分的又は完全な軽減を示し得る、又は症候が本発明による治療後に静的なままであり得る。「治療」という用語は、予防、療法及び治癒を包含するものとする。
【００８６】
本明細書では「５’又は３’付着末端」という句は、塩基の相補配列と結合するＤＮＡ又はＲＮＡの３’及び／又は５’突出末端を指すものとする。ある実施形態においては、ＲＮＡモチーフは５’又は３’付着末端を有する。ある実施形態においては、５’又は３’付着末端は、ヘリックスの中央に位置する。本発明によれば、５’及び３’付着末端は、ナノリングが自己集合してＲＮＡナノチューブになるために使用されるように操作することができる。
【００８７】
他の定義については、本開示を通して状況の中で記述する。
【００８８】
ＲＮＡ及びナノ構造設計
ＲＮＡは、ナノ構造設計に対して幾つかの利点がある。ナノ粒子構造体は、細胞から排除される問題を回避するのに十分大きいが、より大きい粒子ではしばしば遭遇する細胞送達の問題を回避するのに十分小さいサイズ範囲である。ＲＮＡは、遺伝情報を輸送することができ、触媒特性を有する唯一の生体高分子である。ＲＮＡは、複雑なモチーフに自然に折り畳むことができ、ＲＮＡモチーフは自己集合することができる。ＲＮＡは、天然の機能部を有し、例えば、ＲＮＡは、リボザイム又はリボスイッチとして機能することができる。さらに、ＲＮＡは、誘発する免疫応答が極めて小さい点で有利である。さらに、秩序のあるパターン化された高次構造へのＲＮＡの構築は、正確に定義された方法で自己集合する能力、編集及び複製を起こす能力、制御された分解を起こす能力を含めて、幾つかの望ましい特性を有する。ＲＮＡは、機能及び構造が多様である。機能上、ＲＮＡは、遺伝情報を輸送することができ、触媒特性を有する唯一の生体高分子である。構造的に、ＲＮＡは、周知の構造形態に対して予測可能な分子内及び分子間相互作用を有する。アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びウリジン（Ｕ）からなるＲＮＡ鎖は、相補的塩基対合を介して自然に自己集合することができ、又は自己集合するようにプログラムすることができる。ＲＮＡのらせん領域は、１１塩基対のらせん１回転当たり２．８６ｎｍ、及び直径２．３ｎｍの周知のナノメートルスケールの構造形態を有する。複雑な構造体へのＲＮＡの自己集合は、相補的塩基対合を介して、又は内部バルジ及びループモチーフ並びに一本鎖オーバーハング、すなわち「付着末端」を含めて、ＲＮＡ中の異なる一本鎖領域の分子間及び分子内相互作用を介して、促進することができる。ワトソン−クリック塩基対合に加えて、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴは、従来とは異なる他の塩基と対形成することもできる（すなわち、非標準塩基対合）。
【００８９】
本発明の方法は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５本又はそれ以上の異なるＲＮＡ鎖で構成されたＲＮＡ  ＮＰの集合に使用することができる。
【００９０】
ＲＮＡ合成
本発明のナノ粒子の製造に使用されるＲＮＡ分子は、当業者にとって定常的である方法によって組換え又は合成して製造することができる。例えば、合成ＲＮＡ分子は、米国特許出願公開第２００２０１６１２１９号、又は米国特許第６，４６９，１５８号、５，４６６，５８６号、５，２８１，７８１号若しくは６，７８７，３０５号に記載のように製造することができる。
【００９１】
ＲＮＡ自己集合
小ＲＮＡ構造モチーフは、大きい分子構造の正確な形態をコードすることができる。ＲＮＡ構造モチーフは、タンパク質を必要とせずに、ＲＮＡらせんを安定化し、配置し、詰めるのに予測可能な様式で関与することが示された（クウォロス（Ｃｈｗｏｒｏｓ）Ａら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）３０６：２０６８〜２０７２．２００４年）。ＲＮＡＩ及びＲＮＡＩＩは、いわゆる「キス」又は「キッシング」複合体において相互作用するループ構造体である（リー（Ｌｅｅ）ら、ストラクチャ（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）６：９９３〜１００５．１９９８年）。この接触は、２個のＲＮＡが二重鎖を形成するまで、ＲＮＡＩループとＲＮＡＩＩループの対合を促進する。したがって、ＲＮＡＩとＲＮＡＩＩの「キッシング」相互作用は、ＲＮＡ構成要素間の自己集合の一手段である。ＲＮＡＩｉ／ＲＮＡＩＩｉ複合体の相互作用は、塩基対合における塩基すべてを含み、野生型複合体よりもほぼ７０００倍遅く解離する。
【００９２】
ＲＮＡ由来のナノ粒子の自己集合は、既定の様式で自発的に集合してより大きい２又は３次元構造を形成する個々のＲＮＡ分子の協同的相互作用を含む。自己集合の範囲内で、２つの主カテゴリ、すなわちテンプレートと非テンプレートが記述された（リー（Ｌｅｅ）ら、ジャーナル・オブ・ナノサイエンス・アンド・ナノテクノロジー（Ｊ  Ｎａｎｏｓｃｉ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．）２００５年１２月；５（１２）：１９６４〜８２）。テンプレートの集合は、ＲＮＡ転写、ハイブリダイゼーション、複製、アニーリング、モールディング、レプリカなどの特定の外部配列、力又は空間的制約の影響下におけるＲＮＡ分子の相互作用を含む。それに対して、非テンプレートの集合は、外力の影響なしに、個々の成分によるより大きい構造の形成を含む。非テンプレートの集合の例は、ＲＮＡの連結、化学的接合、共有結合及びループ／ループ相互作用、特にＲＮＡ多量体複合体の形成である（リー（Ｌｅｅ）ら、２００５年、同上）。
【００９３】
以前に、ＲＮＡは、集合して様々な形状及びサイズのナノ粒子になることが実証された。第１のＲＮＡナノ粒子は、ループ−受容体界面を利用して生成され、二量体ナノ粒子を形成した。このＨ形ナノ粒子の集合は、ＧＡＡＡ／Ｈｎｔ受容体相互作用によって媒介され、グループＩ及びグループＩＩイントロン並びに他のリボザイム及びリボスイッチにおいて見られる反復性の高いモチーフである。さらに、この相互作用を使用して、複数のループ−受容体相互作用を４方向連結モチーフと組み合わせることによって配向フィラメントを生成した。複数のＲＮＡモチーフをその構成に組み込んだＲＮＡナノ粒子の第１の例の一つは、テクトスクエア（ｔｅｃｔｏｓｑｕａｒｅ）である。テクトスクエアは、各基部の末端に存在するキッシングループ（ＫＬ：ｋｉｓｓｉｎｇ  ｌｏｏｐｓ）と呼ばれる特定の非共有結合性ループ−ループ相互作用によって自己集合するｔｅｃｔｏＲＮＡと呼ばれる４個の人工ＲＮＡ構成要素で構成される。さらに、これらのｔｅｃｔｏＲＮＡは、制御可能な形態、方向性及び形状を有する３’粘着性末端を介して自己集合して複合体アレイになるようにプログラムされた。治療用ＲＮＡナノ粒子の第１の例は、バクテリオファージ中に存在する天然ＲＮＡモチーフである、ｐｈｉ−２９によってコードされたパッケージングモーター（ｐＲＮＡ）から設計された。ｐＲＮＡ二量体は、リボザイムを標的に送達させ、ウイルスのポリＡシグナルの特異的開裂によってＢ型肝炎ウイルスを攻撃するように再設計された。それに続く研究においては、ｐＲＮＡ三量体が細胞受容体結合ＲＮＡアプタマーで機能化され、癌細胞におけるサイレンシング、したがってアポトーシスを可能にするための特定の遺伝子を標的にしてｓｉＲＮＡを送達させるのに使用された。
【００９４】
ある実施形態においては、本発明のＲＮＡ構成要素は、ＲＮＡに適し、当業者が決定することができる緩衝条件で自己集合することができる。ある別の実施形態においては、本発明のナノ構造体を細胞中で形成することができる。ある例においては、ＲＮＡ配列が細胞中で発現され、ナノ粒子の形成が電子顕微鏡断層撮影（ＥＭＴ：ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）によって観察される。ＥＭＴの解像度要件を満足させるために、ナノ粒子の最小サイズは１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ又はそれ以上である。好ましい実施形態においては、ナノ粒子の最小サイズは２５ｎｍである。さらに、好ましい実施形態においては、ナノ粒子は更に集合して、ナノチューブ、シート、クラスターなどの束になることができる。
【００９５】
ＲＮＡナノ粒子
天然又は人工的に選択されたＲＮＡモチーフ及びモジュールを使用して、ＲＮＡ分子をプログラムして、広範な臨床及びナノ技術用途に適した（ＲＮＡ  ＮＰと呼ばれる）多種多様な小型の安定な人工３次元ナノ構造体を形成することができる（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０１４年、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｒ４００３２９ｚ；アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）２０１０年、５、（９）、６７６〜８２；セバーカン（Ｓｅｖｅｒｃａｎ）ら、ネイチャー・ケミストリー（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ）２０１０年、２、（９）、７７２〜９；グラボー（Ｇｒａｂｏｗ）ら、ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ）２０１１年、１１、（２）、８７８〜８７；グオ（Ｇｕｏ）ら、Ｍ．モレキュラ・セル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ）１９９８年、２、（１）、１４９〜５５）（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０１４年、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｒ４００３２９ｚ；アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ネイチャー・プロトコル（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ）２０１１年、６、（１２）、２０２２〜３４；グオ（Ｇｕｏ），Ｐ．ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）２０１０年、５、（１２）、８３３〜４２；シュクラ（Ｓｈｕｋｌａ）ら、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）２０１１年、５、（５）、３４０５〜３４１８；シュ（Ｓｈｕ）ら、Ｒｎａ  ２０１３年、１９、（６）、７６７〜７７；コイフマン（Ｋｏｙｆｍａｎ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ）２００５年、１２７、（３４）、１１８８６〜７；シュ（Ｓｈｕ）ら、アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ）２０１４年、６６Ｃ、７４〜８９；キサムジノフ（Ｋｈｉｓａｍｕｔｄｉｎｏｖ）ら、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）２０１４年；ハオ（Ｈａｏ）ら、ネイチャー・コミュニケーションズ（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ）２０１４年、５、３８９０；オオノ（Ｏｈｎｏ）ら、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）２０１１年、６、（２）、１１６〜２０；オサダ（Ｏｓａｄａ）ら、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）２０１４年；ハク（Ｈａｑｕｅ）ら、ナノ・トゥディ（Ｎａｎｏ  Ｔｏｄａｙ）２０１２年、７、（４）、２４５〜２５７；タラポレ（Ｔａｒａｐｏｒｅ）ら、モレキュラ・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）２０１１年、１９、（２）、３８６〜９４）。治療用核酸、タンパク質又は小分子は、ＲＮＡ  ＮＰの組成物に入るプログラム可能なＲＮＡモノマーに異なる技術を用いて個々に付着させることができる（シュ（Ｓｈｕ）ら、アドバンスト・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ）２０１４年、６６Ｃ、７４〜８９）。モノマーの集合は、所望の機能部を一か所に集め、したがってその形態、組成及びモジュール性を正確に制御する。機能性Ｒ���Ａ  ＮＰのインビボでの使用によって、より高濃度及び所望の化学量論の治療成分が局所的に確保される。
【００９６】
本発明では、以前に設計されたＲＮＡナノリング（グラボー（Ｇｒａｂｏｗ）ら、ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ）２０１１年、１１、（２）、８７８〜８７；イングリング（Ｙｉｎｇｌｉｎｇ）及びシャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）．ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ）２００７年、７、（８）、２３２８〜３４）に基づいて構築された新しい多機能ＲＮＡ  ＮＰが確認された。本発明は、このシステムを、複数のｓｉＲＮＡ（図１ａ）、アプタマー（図１ｅ）、タンパク質（図１ｆ）、小分子（図１ｈ）などの異なるクラスの分子による機能化を含めて、ＲＮＡ  ＮＰに付随する現在の幾つかの難題に対処するのに使用することができる方法を説明する。（未変性ＰＡＧＥ、ＤＬＳ、低温ＥＭ及び蛍光試験による）インビトロ、種々の細胞培養、さらにインビボにおける生成した機能性ＲＮＡ  ＮＰの詳細な特性分析を示した。
【００９７】
ヒト上皮成長因子受容体ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に特異的なＲＮＡアプタマー（図１ｆ）の取り込みによってナノリング設計が細胞ターゲティング特性を果たすことができる方法も本明細書に開示した。ＥＧＦＲは、幾つかの癌細胞タイプの表面で高度に過剰発現され、そのために癌治療物質のアプタマー媒介性送達によるターゲティングの理想的な候補になった（リ（Ｌｉ）ら、ジャーナル・オブ・プロテオーム・リサーチ２００９年、８、（５）、２４３８〜４８）。ＤＮＡナノ構造体（コイフマン（Ｋｏｙｆｍａｎ）ら、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）２００９年、２５、（２）、１０９１〜６）は、以前に癌細胞系を標的にし、抗体によってＥＧＦ受容体に特異的に付着して、複数の細胞を架橋し、細胞集合体を形成した（コイフマン（Ｋｏｙｆｍａｎ）ら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ）２００９年、１３１、（４０）、１４２３７〜９）。
【００９８】
ナノ骨格へのダイサー基質（ＤＳ）ＲＮＡなどのＲＮＡ機能部の取り込みは（ローズ（Ｒｏｓｅ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）２００５年、３３、（１３）、４１４０〜５６）、ＲＮＡ成分が一般に約６０ヌクレオチド長を超えることができないので、固体状態の化学合成に関して難点がある。この問題は、一本鎖足場認識部位を用いてＤＳ  ＲＮＡをナノ骨格にアニーリングすることによって対処された（図１ｇ）。
【００９９】
最後に、ナノリングの治療上の機能性をＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの取り込みによって誘発できる方法が本発明で確立された（図１ｈ）。この新規に開発された技術（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）２０１３年、８、（４）、２９６〜３０４；アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ）２０１４年）は、ＲＮＡ−ＤＮＡナノリングと同種のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの間の異なる機能部を、これらの機能部の更なる条件付きの細胞内活性化によって分割することを含む。
【０１００】
ＲＮＡは、効率的ナノ粒子であることが示された（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ＲＮＡナノテクノロジー（ＲＮＡ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１：１〜１５、２０１３年；カスプリャック（Ｋａｓｐｒｚａｋ）ら、「ＲＮＡナノテクノロジー及び治療学（ＲＮＡ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」フロリダ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；２０１３年ｐ．１３９〜１５８；グラボー（Ｇｒａｂｏｗ）ら、「ナノサイエンス及びナノテクノロジーにおける最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」１巻、ニュージャージー：アップル・アカデミック・プレス（Ａｐｐｌｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；２０１２年ｐ．２０８〜２２０；シュクラ（Ｓｈｕｋｌａ）ら、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）．５：３４０５〜３４１８、２０１１年；アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）．５：６７６〜８２、２０１０年）。バクテリオファージｐｈｉ２９によってコードされたＲＮＡ（ｐＲＮＡ）は、連結ループの相互作用によって数ミクロンサイズの二量体（ｄｉｍｍｅｒｓ）、三量体、棒、六量体及び３Ｄアレイを形成するように再設計された（シュ（Ｓｈｕ）、Ｄ．；モル（Ｍｏｌｌ），Ｗ．−Ｄ．；デン（Ｄｅｎｇ），Ｚ．；マオ（Ｍａｏ），Ｃ；グオ（Ｇｕｏ），Ｐ．ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）２００４年、４、（９）、１７１７〜１７２３；グオ（Ｇｕｏ），Ｐ．ジャーナル・オブ・ナノサイエンス・アンド・ナノテクノロジー（Ｊ  Ｎａｎｏｓｃｉ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）２００５年、５、（１２）、１９６４〜８２）。送達媒体としてｐＲＮＡ三量体を含むナノ粒子を使用して、ｓｉＲＮＡ及び受容体結合アプタマーが送達され、細胞培養におけるインビトロとマウスにおけるインビボの両方で癌発生を阻害することが示された（カレド（Ｋｈａｌｅｄ），Ａ．；グオ（Ｇｕｏ），Ｓ．；リ（Ｌｉ），Ｆ．；グオ（Ｇｕｏ），Ｐ．ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ）２００５年、５、（９）、１７９７〜８０８；グオ（Ｇｕｏ），Ｓ．；フワン（Ｈｕａｎｇ），Ｆ．；グオ（Ｇｕｏ），Ｐ．ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ）２００６年、１３、（１０）、８１４〜２０）。グループＩイントロン領域の一部から構築されたＨ状ＲＮＡ分子単位は、配向フィラメントを形成することが示された（ハンスマ（Ｈａｎｓｍａ），Ｈ．Ｇ．；オロウジェフ（Ｏｒｏｕｄｊｅｖ），Ｅ．；ボードリー（Ｂａｕｄｒｅｙ），Ｓ．；イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ），Ｌ．ジャーナル・オブ・マイクロスコピー（Ｊ  Ｍｉｃｒｏｓｃ）２００３年、２１２、（Ｐｔ３）、２７３〜９；ナサリーン（Ｎａｓａｌｅａｎ），Ｌ．；ボードリー（Ｂａｕｄｒｅｙ），Ｓ．；レオンティス（Ｌｅｏｎｔｉｓ），Ｎ．Ｂ．；イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ），Ｌ．ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）２００６年、３４、（５）、１３８１〜９２）。さらに、ＨＩＶ二量体化開始部位ステムループに基づく特定のＲＮＡナノ配列は、別の構造に熱異性化可能であることが示された（ホリヤ（Ｈｏｒｉｙ���），Ｓ．；リ（Ｌｉ），Ｘ．；カワイ（Ｋａｗａｉ），Ｇ．；サイトウ（Ｓａｉｔｏ），Ｒ．；カトウ（Ｋａｔｏｈ），Ａ．；コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ），Ｋ．；ハラダ（Ｈａｒａｄａ），Ｋ．ヌクレイック・アシッズ・リサーチ・サプリメント（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｕｐｐｌ）２００２年、（２）、４１〜２；ホリヤ（Ｈｏｒｉｙａ），Ｓ．；リ（Ｌｉ），Ｘ．；カワイ（Ｋａｗａｉ），Ｇ．；サイトウ（Ｓａｉｔｏ），Ｒ．；カトウ（Ｋａｔｏｈ），Ａ．；コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ），Ｋ．；ハラダ（Ｈａｒａｄａ），Ｋ．ケミストリー・アンド・バイオロジー（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ）２００３年、１０、（７）、６４５〜５４．；リ（Ｌｉ），Ｘ．；ホリヤ（Ｈｏｒｉｙａ），Ｓ．；ハラダ（Ｈａｒａｄａ），Ｋ．ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ）２００６年、１２８、（１２）、４０３５〜４０）。リボソーム及びＨＩＶ中に存在する小さい構造断片は、ｔｅｃｔｏＲＮＡと呼ばれる人工ＲＮＡ構成要素の設計に使用された（クウォロス（Ｃｈｗｏｒｏｓ），Ａ．；セバーカン（Ｓｅｖｅｒｃａｎ），Ｉ．；コイフマン（Ｋｏｙｆｍａｎ），Ａ．Ｙ．；ウェインカム（Ｗｅｉｎｋａｍ），Ｐ．；オロウジェフ（Ｏｒｏｕｄｊｅｖ），Ｅ．；ハンスマ（Ｈａｎｓｍａ），Ｈ．Ｇ．；イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ），Ｌ．サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２００４年、３０６、（５７０４）、２０６８〜７２）。各ｔｅｃｔｏＲＮＡは、隣接らせん間で９０度の角度を成す直角モチーフ、各基部の末端の２個の相互作用ヘアピンループ、及び３’「粘着性基部」を含む。ヘアピンループは、「キッシングループ」と呼ばれる特定の非共有結合性ループ−ループ相互作用の形成を介して四量体の形成を導き、「粘着性基部」は、四量体を更に集めて複合体ナノアレイを形成する。バイオナノテクノロジーにおいては、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用は、金ナノ粒子の正確な堆積を導くことができる（ベーツ（Ｂａｔｅｓ），Ａ．Ｄ．；カレン（Ｃａｌｌｅｎ），Ｂ．Ｐ．；クーパー（Ｃｏｏｐｅｒ），Ｊ．Ｍ．；コススティック（Ｃｏｓｓｔｉｃｋ），Ｒ．；ギアリー（Ｇｅａｒｙ），Ｃ；グリドル（Ｇｌｉｄｌｅ），Ａ．；イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ），Ｌ．；ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ），Ｊ．Ｌ．；プルーピン−ペレス（Ｐｒｏｕｐｉｎ−Ｐｅｒｅｚ），Ｍ．；クー（Ｘｕ），Ｃ．；カミング（Ｃｕｍｍｉｎｇ），Ｄ．Ｒ．ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ）２００６年、６、（３）、４４５〜８）。自動ナノ医療用ｓｉＲＮＡ機能化ＲＮＡナノ粒子の設計及び自己集合が記述された（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ネイチャー・プロトコル（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ）．６：２０２２〜３４、２０１１年）。自己集合ｔｅｃｔｏＲＮＡラダーは、カチオン性金ナノ粒子を正確に線状配置することが示され、ＲＮＡが金ナノ粒子の規則的なスペーシングを制御し、ナノクラウン骨格として作用し得ることを示した（コイフマン（Ｋｏｙｆｍａｎ），Ａ．Ｙ．；ブラウン（Ｂｒａｕｎ），Ｇ．；マゴノフ（Ｍａｇｏｎｏｖ），Ｓ．；クウォロス（Ｃｈｗｏｒｏｓ），Ａ．；ライヒ（Ｒｅｉｃｈ），Ｎ．Ｏ．；イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ），Ｌ．���ャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ）２００５年、１２７、（３４）、１１８８６〜７）。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの再会合に対する異なる分割機能部の活性化が記述された（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）．８：２９６〜３０４、２０１３年）。コンピュータ、インビトロ及びインビボ試験は、治療用ｓｉＲＮＡ送達のための双頭型両親媒性物質の使用可能性を示した（キム（Ｋｉｍ）ら、モレキュラ・セラピー・ヌクレイック・アシッズ（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）２：ｅ８０、２０１３年）。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写中の化学修飾機能性ＲＮＡナノ粒子のワンポット製造の一般的方法が記述された（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．）１２：５１９２〜５１９５、２０１２）。ＨＩＶ−１サブタイプＡ及びサブタイプＢキッシングループモノマー構造体における塩濃度及びマグネシウム結合の役割が記述された（キム（Ｋｉｍ）ら、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラ・ストラクチャ・アンド・ダイナミクス（Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ）２０１３年；３１（５）：４９５〜５１０）。ＲＮＡＩ／ＩＩ逆キッシング複合体に基づく自己集合ＲＮＡナノリングが記述された（グラボー（Ｇｒａｂｏｗ）ら、ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．）１１：８７８〜８７、２０１１年）。ＲＮＡ構造柔軟性データがナノ構造モデリングに使用された（カスプリャック（Ｋａｓｐｒｚａｋ）ら、メソッズ（Ｍｅｔｈｏｄｓ）５４：２３９〜２５０、２０１１年）。粗粒ＲＮＡナノ構造体が分子動力学シミュレーションに使用された（パリー（Ｐａｌｉｙ）ら、フィジカル・バイオロジー（Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ．）７（３）：０３６００１、２０１０年）。エシェリキア  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ゲノムにおける小さい調節ＲＮＡの構造的特徴の特性分析が報告された（リー（Ｌｅ）ら、バイオインフォマティクス及び生物医学に関するＩＥＥＥ会議（ＩＥＥＥ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）、ＢＩＢＭ２０１０年）。コンピュータ及び実験によるＲＮＡナノ粒子設計が報告され（セバーカン（Ｓｅｖｅｒｃａｎ）ら、「ゲノム科学及びプロテオミクスにおける自動化：エンジニアリング事例に基づく手法（Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：Ａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃａｓｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」）、ＲＮＡナノ構造体の分子動力学的研究のためのメゾスコピックモデルが記述された（パリー（Ｐａｌｉｙ）ら、第８回コンピュータシステムバイオインフォマティクスに関する年次国際会議（８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、８巻、２００９年８月１０〜１２日；スタンフォード大学、カリフォルニア州パロアルト、ｐ．７１〜７９）。
【０１０１】
（例えば、複数のＨＩＶ−１遺伝子に対する）コンビナトリアルＲＮＡ干渉のための複数の異なる低分子干渉ＲＮＡによる機能化に加えて、本発明のナノリングは、類別されたＲＮＡアプタマー、蛍光色素、タンパク質、並びに細胞内の複数の分割機能部を条件付きで活性化するための最近開発されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを同時に埋め込むこともできる。
【０１０２】
現代社会における生活の質の改善によって、集団の平均余命が延長が促進される。その結果、重篤な感染又は疾病に罹患する可能性が増加する。最近、ナノ技術が、生命にかかわる様々な疾患の検出及び療法のための新しい革命的手法をもたらすことが大いに期待されている。ナノ技術は、例えば、標的に送達される薬物の濃度をかなり増加させ、同時にその毒性を最小限にすることによって、癌を診断し、治療する方法を全く変える見込みがある（ファロクザド（Ｆａｒｏｋｈｚａｄ）及びランガー（Ｌａｎｇｅｒ）、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）２００９年、３、（１）、１６〜２０；ペトロス（Ｐｅｔｒｏｓ）及びデ  シモーネ（ＤｅＳｉｍｏｎｅ）、ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ）２０１０年、９、（８）、６１５〜２７）。
【０１０３】
診断法及び治療のためのナノ粒子（ＮＰ）製造に無機又は合成材料を使用することは、しばしば、高レベルのエンドトキシン内容物、及び市販出発材料又は残留製造成分に由来する無菌性の問題を伴う（クリスト（Ｃｒｉｓｔ）ら、インテグラティブ・バイオロジー（ケンブリッジ）（Ｉｎｔｅｇｒ  Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ））２０１３年、５、（１）、６６〜７３；モギミ（Ｍｏｇｈｉｍｉ）ら、アニュアル・レビュー・オブ・ファーマコロジー・アンド・トキシコロジー（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ）２０１２年、５２、４８１〜５０３）。したがって、これらのＮＰは、前臨床試験を開始する前でも追加の精製又は再製造を必要とする。一部の合成及び無機化合物に付随する別の問題は、その生体非適合性及び人体への蓄積であり、患者の生涯の後期に何らかの健康合併症を起こす恐れがある（ペトロス（Ｐｅｔｒｏｓ）及びデ  シモーネ（ＤｅＳｉｍｏｎｅ）、ネイチャー・レビューズ・ドラッグ・ディスカバリー（Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ）２０１０年、９、（８）、６１５〜２７；モギミ（Ｍｏｇｈｉｍｉ）ら、アニュアル・レビュー・オブ・ファーマコロジー・アンド・トキシコロジー（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ）２０１２年、５２、４８１〜５０３）。（ＲＮＡ、ＤＮＡなどの）生体材料を製剤に使用することは、ＮＰ療法の開発において次の大きなステップになり得る。さらに、過去数年、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づく前臨床及び臨床試験の総数はかなり増加している（チェン（Ｃｈｅｎ）及びシェ（Ｘｉｅ）．Ｊ．インターナショナル・ジャーナル・オブ・ナノメディシン（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）２０１２年、７、３９７１〜８０）。ＲＮＡｉは、小さい二本鎖ＲＮＡを用いて相同性依存型遺伝子サイレンシングを導き、誘発する天然細胞転写後遺伝子調節プロセスである（フィレ（Ｆｉｒｅ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）１９９８年、３９１、（６６６９）、８０６〜１１）。ＲＮＡｉ機構は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）と呼ばれる短い合成ＲＮＡ二重鎖を外部から導入することによって治療用遺伝子調節及び種々の疾患の治療にますます利用されている（ブラムセン（Ｂｒａｍｓｅｎ）及びクジェムス（Ｋｊｅｍｓ）、フロンティアズ・イン・ジェネティクス（Ｆｒｏｎｔ  Ｇｅｎｅｔ）２０１２年、３、（１５４））。現在、２０種を超える様々な治療用ｓｉＲＮＡが臨床試験されている（チョウ（Ｚｈｏｕ）ら、ファーマシューティカルズ（バーゼル）（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ））２０１３年、６、（１）、８５〜１０７）。特定のｓｉＲＮＡ（又はマイクロＲＮＡ）に加えて、アンチセンス、アプタマー、リボザイムなどの幾つかの別の有望な治療効力のあるＲＮＡクラスも考察に値する。複数の異なるＲＮＡ治療物質の同時使用は、かなりの相乗効果があると予想される。周知の例の一つは、（例えば、ＨＩＶの場合）ＲＮＡｉからの変異補助的な逸脱を防止する高度に有効な同時同義遺伝子抑制に使用されるコンビナトリアルＲＮＡｉである（グリム（Ｇｒｉｍｍ）及びケイ（Ｋａｙ）、モレキュラ・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）２００７年、１５、（５）、８７８〜８８）。
【０１０４】
設計
ＲＮＡナノ粒子及びナノ材料を生成するのに使用される一般的手法は、公知のＲＮＡ構造体を採取し、それを構成要素に切断し、一本鎖ループ及び領域を再設計して、所望の自己集合を促進することである。上で考察したＲＮＡ構成要素すべてからナノ構造体への自己集合は、非共有結合性ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を形成するヘアピンループとループ受容体の相補性によって媒介される。ＲＮＡ構成要素の正確な集合のために、対応する相補的ループ−ループ相互作用の各々が独自に再設計される。
【０１０５】
主に二つの実験手法が、核酸ナノ構造体のプログラム可能な自己集合に使用される（イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ），Ｌ．；クウォロス（Ｃｈｗｏｒｏｓ），Ａ．カレント・オピニオン・イン・ストラクチャル・バイオロジー（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ）２００６年、１６、（４）、５３１〜４３）。第１のものは、ＤＮＡナノ構造体に一般に使用される１段階集合である（チェルヤポフ（Ｃｈｅｌｙａｐｏｖ），Ｎ．；ブルン（Ｂｒｕｎ），Ｙ．；ゴパルクリシュナン（Ｇｏｐａｌｋｒｉｓｈｎａｎ），Ｍ．；レイシュス（Ｒｅｉｓｈｕｓ），Ｄ．；ショー（Ｓｈａｗ），Ｂ．；アドルマン（Ａｄｌｅｍａｎ），Ｌ．ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ）２００４年、１２６、（４３）、１３９２４〜５；マシュー（Ｍａｔｈｉｅｕ），Ｆ．；リャオ（Ｌｉａｏ），Ｓ．；コバチュ（Ｋｏｐａｔｓｃｈ），Ｊ．；ワン（Ｗａｎｇ），Ｔ．；マオ（Ｍａｏ），Ｃ；ゼーマン（Ｓｅｅｍａｎ），Ｎ．Ｃ．ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ）２００５年、５、（４）、６６１〜５）。第２のものは、ＲＮＡナノ構造体に対して一般に記述される段階的集合である（クウォロス（Ｃｈｗｏｒｏｓ），Ａ．；セバーカン（Ｓｅｖｅｒｃａｎ），Ｉ．；コイフマン（Ｋｏｙｆｍａｎ），Ａ．Ｙ．；ウェインカム（Ｗｅｉｎｋａｍ），Ｐ．；オロウジェフ（Ｏｒｏｕｄｊｅｖ），Ｅ．；ハンスマ（Ｈａｎｓｍａ），Ｈ．Ｇ．；イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ），Ｌ．サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２００４年、３０６、（５７０４）、２０６８〜７２）。１段階集合手法においては、すべての分子を混合し、その後に徐冷アニーリング手順が続く。これは、標的構成要素構造が最多のワトソン−クリック塩基対を有し、したがって最も安定である場合にのみ可能である。しかし、異なる形状のナノ粒子の熱力学的安定性がワトソン塩基対合よりも重要な考慮事項である場合もあると理解される。したがって、この手法は、より高温における構成要素の優先的な折りたたみと、それに続いて、より低温におけるより弱い相互作用を介した最終ナノ構造体へのこれらの構成要素の自己集合に基づく。しかし、通常、わずかに不安定であるだけの多数の他の可能な構造が存在する。この場合、段階的手法を使用することができ、構成要素は第一ステップで別々に形成され、次いで高マグネシウム（Ｍｇ＋＋）濃度下で混合されて、最終ナノ構造を形成する。この手法は、より時間がかかり、構成要素と最終ナノ構造体の融解温度は、十分離れていなくてはならない。
【０１０６】
ＲＮＡＩ及び／又はＲＮＡＩＩモチーフ、キッシングループ、ＲＮＡＩ逆（ＲＮＡＩｉ：ＲＮＡ  Ｉ  ｉｎｖｅｒｓｅ）及び／又はＲＮＡＩＩ逆（ＲＮＡＩＩｉ：ＲＮＡ  ＩＩ  ｉｎｖｅｒｓｅ）モチーフを含めて、ただしそれだけに限定されない幾つかのＲＮＡモチーフが構成要素として利用可能である。本明細書ではナノ粒子に関連した「モチーフ」という用語は、二本鎖若しくは一本鎖リボ核酸又はその類似体を指すものとする。個々のモチーフは、互いに付着して連結されることによってより大きい粒子になる。付着は、非共有結合によって起こり得る。ＮＭＲ又はＸ線結晶学によって決定された多数の高解像度ＲＮＡ構造体を、新しいＲＮＡナノ粒子及びナノ材料の設計のための構成要素に分解することができる。参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許出願第１３／３７８，９８５号は、ＲＮＡナノ粒子を製造する方法を記述している。
【０１０７】
本発明による１個以上の機能部を含むＲＮＡ  ＮＰは、環状、正方形状又は三角形状とすることができるが、別の形状も可能であることを理解されたい。ある実施形態においては、ＲＮＡ集合体の安定性と集合を規定する三次構造の複雑さには正の関係がある。
【０１０８】
Ｒ／ＤＮＡハイブリッド
ある実施形態においては、本発明は、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ二重鎖の機能部を２個のＲ／ＤＮＡハイブリッドに分割するものであり、同じ疾患細胞内に同時に存在することによって、足場相互作用によって互いを認識し、再会合して、活性なｓｉＲＮＡを放出する。この手法は、血管内分解（Ｒ／ＤＮＡハイブリッドでは減少）、組織特異性（ＤＮＡの化学的性質はＲＮＡよりも簡潔であり、ターゲティング又は送達に対して異なる特徴を有する化学修飾を受け易い）、薬力学（Ｒ／ＤＮＡハイブリッド再会合によって蛍光タグを活性化して、送達及び応答のフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ：Ｆｏｅｒｓｔｅｒ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）画像化を支援することができる）などのＲＮＡｉの臨床送達に付随する幾つかの難題を克服する。さらに、これらの追加の機能部はすべて、Ｒ／ＤＮＡハイブリッド中のＤＮＡ鎖の化学修飾によって導入することができ、したがって、放出ｓｉＲＮＡの処理能力を妨げない。さらに、これらの機能部の数は、二重鎖ハイブリッド又はより複雑なハイブリッドナノ構造体の組成物に入るＤＮＡ鎖の数の少なくとも２倍とすることができる。Ｒ／ＤＮＡハイブリッドは、２０１２年１１月１９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５９４５号に記載されており、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【０１０９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を治療薬として使用して、疾患細胞における標的遺伝子の発現を抑制することが常法に従って可能である。ＲＮＡｉ機構を開始する方法の一つは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）二重鎖を細胞に直接外部から導入することである。ある実施形態においては、本発明は、ＲＮＡｉ経路及び疾患細胞内部の他の機能部を作動させるのに一般に使用することができる治療用ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに基づく戦略を提供する。ハイブリッドの各々は、個々には、機能的に不活性であり、治療用ｓｉＲＮＡとしては、同じ細胞中に同時に存在する少なくとも２個の同種のハイブリッドの再会合によってのみ活性化することができる。本発明は、同種のハイブリッドが同じ日又は２つの異なる日に細胞に送達されるｓｉＲＮＡ放出方法を特徴とする。本発明は、核酸に基づく「スマート」ナノ粒子を生物医学用途に提供する。
【０１１０】
ある実施形態においては、Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの設計原理は以下の通りである。すなわち、機能性ダイサー基質ｓｉＲＮＡを２個のＲ／ＤＮＡハイブリッドに分割して、それが切断されるのを防止して、非機能的にする。さらに、一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖をＤＮＡで置換するとＲＮＡｉが完全になくなることが示された。次に、ハイブリッドＤＮＡ鎖の各々を、ダイサー基質ｓｉＲＮＡ放出をもたらすハイブリッド再会合に必要な相補的足場で修飾する。
【０１１１】
足場相互作用
鎖交換反応速度は、足場によって媒介される鎖置換によって１０６倍にすることができる（ユルケ（Ｙｕｒｋｅ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２０００年、４０６、６０５；ユルケ（Ｙｕｒｋｅ）ら、ジェネティック・プログラミング・アンド・イボルバブル・マシーンズ（Ｇｅｎｅｔ．Ｐｒｏｇｒａｍ．Ｅｖｏｌ．Ｍａｃｈ．）２００３年、４、１１１）。侵入鎖のハイブリダイゼーションは、基質の一端に付着した短い一本鎖「足場」領域において開始され、標的鎖を基質から移動させる分岐点移動反応を起こす。ユルケ（Ｙｕｒｋｅ）及び共同研究者によって示され（ユルケ（Ｙｕｒｋｅ）ら、２０００年；ユルケ（Ｙｕｒｋｅ）ら、２００３年）、現在広く採用されている（ディトメレト（Ｄｉｔｔｍｅｒｅｔ）ら、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．）２００４年、４３、３５５０；シーリグ（Ｓｅｅｌｉｇ），Ｇ．ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２００６年、３１４、１５８５；チエン（Ｑｉａｎ）ら、「ＤＮＡコンピューティングに関する第１４回国際会議予稿集（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ＤＮＡ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）」；ゴエル（Ｇｏｅｌ）ら編；シュプリンガー：ベルリン、２００９年；５３４７巻、ｐｐ７０〜８９；シリャホフスキー（Ｓｈｌｙａｈｏｖｓｋｙ）ら、ＡＣＳナノ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ）２００９年、３、１８３１）実施例においては、足場と置換領域は介在スペーサーなしに互いに隣接しており、この単純な構造は「近位」と称される。近位足場機能は、アドレスタグとして、かつ鎖置換率及び平衡を制御する手段として、機能する。
【０１１２】
「足場」という用語は、領域と相補的核酸配列のハイブリダイゼーションを惹起するように設計された核酸配列を含む、領域の核形成部位を指す。ナノ粒子の二次構造は、足場が露出した又は隔絶されたものとすることができる。例えば、一部の実施形態においては、足場の二次構造は、足場が相補的核酸とハイブリッド形成するのに利用可能なものであり（足場は「露出している」又は「接近可能である」）、別の実施形態においては、足場の二次構造は、足場が相補的核酸とハイブリッド形成するのに利用不可能なものである（足場は「隔絶されている」又は「接近不可能である」）。足場が隔絶されている、又は利用不可能である場合、例えば、その一部であるヘアピンの開口などのある種の事象によって足場を利用可能にすることができる。足場は、露出しているときには、相補的核酸配列が足場において核形成するように構成される。
【０１１３】
ハイブリッドのための再会合スキームは、２０１２年１１月１９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５９４５号に記載されており、参照によりその全体を本明細書に援用する。安定な二次構造を回避するために、Ｍｆｏｌｄを用いてＲ／ＤＮＡハイブリッド中の相補的一本鎖の開いた（ｕｎｚｉｐｐｅｄ）足場が設計された（ズッカー（Ｚｕｋｅｒ），Ｍ、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）３１、３４０６〜３４１５（２００３年））。３７℃の融解温度（Ｔｍ）を超えるために、ＧＣ含量６０％以上の開いた足場の最小長さは、少なくとも１２ヌクレオチド（ｎｔｓ：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）とすべきである。設計された一本鎖足場のＴｍは、ウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）則によって約４０℃と推定される（ウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ），Ｒ．Ｂ．ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）６、３５４３〜３５５７（１９７９年））。
【０１１４】
ナノ粒子との接合
１個以上の機能部を含む多価ＲＮＡナノ粒子を薬剤送達に使用することができる。例えば、１個以上の機能部を含む多価ＲＮＡナノ粒子を使用して、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマー、蛍光色素、小分子、分割機能部を有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、分割リパーゼ、分割ＧＦＰ、タンパク質、治療薬及び造影剤からなる群の１種以上から選択される１種以上の薬剤を送達することができる。
【０１１５】
本発明の組成物は、治療用途を有する。任意の数の疾患又は障害を本発明の組成物によって治療することができ、その数は、実際には、ナノ粒子内部に充填することができる、又は外部に接合することができる、薬剤（単数又は複数）によってのみ限定され得る。
【０１１６】
例えば、ＲＮＡ  ＮＰは、複数のｓｉＲＮＡを異なる疾患標的に対して輸送するように操作することができる。例示的な一実施形態においては、ＨＩＶ−１ゲノムの異なる部分に対して６個の異なるｓｉＲＮＡをコンビナトリアルＲＮＡｉ療法で使用することができる。本発明は、ＨＩＶに限定されず、疾患や疾患グループにも限定されないが、特定の疾患の治療に使用することができるｓｉＲＮＡによって規定される。細胞質における特別なＲＮＡの存在に基づいて特定の経路を標的にするこの概念は、（癌幹細胞を含めた）癌又はＲＮＡウイルス全般（例えば、フラビウイルス、アルファウイルス）に適用することができる。現行のＨＡＡＲＴ療法は、ヒト宿主内のウイルス複製をうまく抑制することができる。しかし、この手法では、現在、ＨＩＶウイルスを感染患者から完全に除去することができない。というのは、認可されたＨＩＶ薬物は、ウイルス抑制薬として作用し、ウイルスが感染したヒト細胞を死滅させないからである。本発明は、特定のｓｉＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡｓｉＲＮＡハイブリッドを含むＲＮＡ  ＮＰに付随する適切なアプタマーを細胞ターゲティングに使用して、ＨＩＶ感染細胞を選択的に死滅させる独特の特徴を有する新規抗ウイルス薬ももたらすことができる。ガイド鎖は、ヒトアポトーシス阻害遺伝子（ＢＣＬ−２、ＦＬＩＰ、ＳＴＡＴ３、ＸＩＡＰ、ＳＵＲＶＩＶＩＮなど）に対してアンチセンスであるように設計される。したがって、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉経路）の活性化は、ＨＩＶ感染細胞のアポトーシスをもたらす。さらに、より一般的な意味で、ｓｉＲＮＡ標的は、癌関連遺伝子、例えば、それだけに限定されないが、低酸素経路：Ｈｉｆｌａｌｐｈａ、ＶＥＧＦ；ＤＮＡ修復経路：ＰＡＲＰ；ミクロＲＮＡＳ：ｍｉＲ２１、ｍｉＲ７、ｍＩＲ１２８ａ、ｍＩＲ２１０；癌幹細胞：ＮＯＴＣＨ、ＨＥＤＧＥＨＯＧ、ＰＴＥＮ、ＷＮＴ、ＴＧＦベータ経路中の遺伝子；免疫調節：インターロイキン（ＩＬ−６、ＩＬ−１０）及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＳＭＡＤ、ＴＮＦアルファ中の遺伝子を含むことができる。原則的には、この概念は、あらゆる遺伝関連疾患を含むように拡大することができる。
【０１１７】
２、３、４種又はそれ以上の薬剤がナノ粒子に結合した本発明の多機能ナノ粒子の例示的な潜在的用途は、１種以上の薬剤を使用して巨大分子構造若しくは細胞を標的とし、第２の薬剤を使用して巨大分子若しくは細胞の機能／性質を改変すること、例えば、タンパク質を使用して細胞を標的とし、毒素若しくは細胞死タンパク質を使用して標的細胞を死滅させること、ｓｉＲＮＡを使用して遺伝子の発現を抑制すること、又は蛍光性粒子を可視化のために使用すること、又は化学物質若しくはタンパク質を使用して複合体内のタンパク質を標的とし、別の薬剤を使用して複合体の異なる成分の機能を改変することを含む。
【０１１８】
ある実施形態においては、ナノ粒子は、１種以上の薬剤を含む。更なる好ましい実施形態においては、薬剤をナノ粒子に接合することができる。接合は、マグネトリポソームの上若しくは中に付着、結合、混合又は存在することと理解することができる。例えば、薬剤は、共有結合又はイオン結合によって、キレート又は別のリンカー成分の使用によって、接合することができる。本明細書では、薬剤とナノ粒子の接合は、薬剤の所望の活性を阻害しない。
【０１１９】
薬剤は、ナノ粒子内部に封入することができる画像化、診断若しくは治療処置のためにインビボ若しくはインビトロで使用される任意の材料、化合物、組成物若しくは薬剤を含むことができ、又はナノ粒子の物理的完全性をさほど阻害せずに、ナノ粒子と接合することができる。ナノ粒子は、１タイプ以上の１個以上の薬剤を含むことができる。例えば、ナノ粒子は治療薬を含むことができ、薬剤のターゲティングの後に造影剤との更なる接合が続く。同様に、治療薬のカクテルは、一般に、癌の治療に使用される。ナノ粒子は、１タイプを超える治療薬を含むことができる。
【０１２０】
薬剤の例としては、ｓｉＲＮＡを含めて、ただしそれだけに限定されない抑制性核酸、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマー、蛍光色素、小分子、分割機能部を有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、分割リパーゼ、分割ＧＦＰ、タンパク質、治療薬及び造影剤（例えば、ガドリニウム、マンガン、クロム又は鉄）が挙げられる。
【０１２１】
ある実施形態においては、本明細書に記載のＮＰ分子は、標的細胞中で抑制性核酸分子を一度形成することによって働く。かかる抑制性核酸としては、標的ＲＮＡ（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）をコードする核酸分子に結合する一本鎖及び二本鎖核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びその類似体）、並びに標的ポリペプチドに直接結合して、その生物活性を調節する核酸分子（例えば、アプタマー）が挙げられる。
【０１２２】
本開示のアンチセンス標的ＲＮＡ配列を含む触媒ＲＮＡ分子、すなわちリボザイムを使用して、標的ＲＮＡの発現をインビボで阻害することができる。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列を封入すると、ＲＮＡ開裂活性をそれに付与し、それによって構築物の活性を増大させる。標的ＲＮＡ特異的リボザイムの設計及び使用は、ハゼルオフ（Ｈａｓｅｌｏｆｆ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３３４：５８５〜５９１．１９８８年、及び米国特許出願公開第２００３／０００３４６９（Ａ１）号に記載されており、その各々を参照により本明細書に援用する。
【０１２３】
本開示は、８から１９個の連続核酸塩基を有するアンチセンスＲＮＡを結合アームに含む触媒ＲＮＡ分子も特徴とする。本開示の好ましい実施形態においては、触媒核酸分子は、ハンマーヘッド又はヘアピンモチーフで形成される。かかるハンマーヘッドモチーフの例は、ロッシ（Ｒｏｓｓｉ）ら、エイズ・リサーチ・アンド・ヒューマン・レトロヴァイラシズ（Ａｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、８：１８３、１９９２に記載されている。ヘアピンモチーフの例は、１９８８年９月２０日に出願された米国特許出願第０７／２４７，１００号の一部継続出願である、１９８９年９月２０日に出願されたハンペル（Ｈａｍｐｅｌ）ら、「特定のＲＮＡ配列を開裂させるためのＲＮＡ触媒（ＲＮＡ  Ｃａｔａｌｙｓｔ  ｆｏｒ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、ハンペル（Ｈａｍｐｅｌ）及びトリッツ（Ｔｒｉｔｚ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２８：４９２９、１９８９、並びにハンペル（Ｈａｍｐｅｌ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１８：２９９、１９９０に記載されている。これらの特定のモチーフは、本開示において限定されず、当業者は、本開示の酵素核酸分子において重要であるのは、それが１個以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有することであり、ＲＮＡ開裂活性を分子に付与するヌクレオチド配列を基質結合部位内又はその周囲に有することであると認識するはずである。
【０１２４】
小さいヘアピンＲＮＡは、３’ＵＵ−オーバーハングを場合によっては有するステムループ構造からなる。ステムは、変動があり得るものの、２１から３１ｂｐ（望ましくは２５から２９ｂｐ）の範囲とすることができ、ループは４から３０ｂｐ（望ましくは４から２３ｂｐ）の範囲とすることができる。細胞内のｓｈＲＮＡの発現の場合、ポリメラーゼＩＩＩ  Ｈ１−ＲＮＡ又はＵ６プロモーターを含むプラスミドベクター、ステムループＲＮＡ挿入のためのクローニング部位、及び４−５−チミジン転写終結シグナルを使用することができる。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、一般に、明確に定義された開始部位と終結部位を有し、その転写物はポリ（Ａ）テールがない。これらのプロモーターの終結シグナルは、ポリチミジントラクト（ｐｏｌｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）によって規定され、転写物は、一般に、第２ウリジンの後で開裂する。この位置で開裂すると、発現されたｓｈＲＮＡにおいて、合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングと類似した３’ＵＵオーバーハングが生成する。ほ乳動物細胞においてｓｈＲＮＡを発現する更に別の方法は、上記参考文献に記載されている。
【０１２５】
ｓｉＲＮＡ
「ｓｉＲＮＡ」とは、二本鎖ＲＮＡを意味する。最適には、ｓｉＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又はそれ以上のヌクレオチド長であり、その３’末端に２塩基オーバーハングを有する。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、切断可能なｓｉＲＮＡと切断不可能なｓｉＲＮＡの両方を含むと理解される。これらのｄｓＲＮＡは、個々の細胞又は動物全体に導入することができ、例えば、血流によって全身に導入することができる。かかるｓｉＲＮＡを使用して、ｍＲＮＡレベル又はプロモーター活性を下方制御する。機能性ｓｉＲＮＡは、ダイサーヌクレアーゼによって放出させることができる。短い２１から２５ヌクレオチド二本鎖ＲＮＡは、遺伝子発現を下方制御するのに有効である（参照により本明細書に援用するザモレ（Ｚａｍｏｒｅ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）１０１：２５〜３３；エルバシア（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４１１：４９４〜４９８、２００１年）。ほ乳動物におけるｓｉＲＮＡ手法の治療有効性は、マキャフリー（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ）らによってインビボで実証された（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４１８：３８〜３９、２００２年）。
【０１２６】
標的遺伝子の配列を考慮して、ｓｉＲＮＡは、該遺伝子を不活性化するように設計することができる。かかるｓｉＲＮＡは、例えば、患部組織に直接投与することができ、又は全身投与することができる。Ｐａｒ１遺伝子の核酸配列を使用して低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を設計することができる。２１から２５ヌクレオチドｓｉＲＮＡを、例えば、治療物質として使用して、疾患関連遺伝子を阻害することができる。
【０１２７】
本開示の抑制性核酸分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって媒介される標的ＲＮＡ発現の抑制のための二本鎖ＲＮＡとして使用することができる。治療実施形態においては、標的ＲＮＡは、疾患関連遺伝子である。例えば、非限定的実施形態においては、標的ＲＮＡは、ＨＩＶに関与する遺伝子である。別の一実施形態においては、標的ＲＮＡ遺伝子は、癌の発生又は進行に関与する遺伝子である。別の一実施形態においては、標的ＲＮＡ発現は、ウイルス感染細胞において減少する。別の一実施形態においては、標的ＲＮＡは、アポトーシス阻害タンパク質をコードし、細胞はＨＩＶに感染している。ＲＮＡｉは、特定の目的タンパク質の細胞発現を減少させる方法である（ツシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）、ケムバイオケム（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ）２：２３９〜２４５、２００１年；シャープ（Ｓｈａｒｐ）、ジーンズ・アンド・ディベロップメント（Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ）１５：４８５〜４９０、２０００年；ハトワグネル（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ）及びザモレ（Ｚａｍｏｒｅ）、カレント・オピニオン・イン・ジェネティクス・アンド・ディベロップメント（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖｅｌ）１２：２２５〜２３２、２００２年；及びハノン（Ｈａｎｎｏｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４１８：２４４〜２５１、２００２年に概説されている）。ｄｓＲＮＡの導入による、又はプラスミド発現系を用いたｓｉＲＮＡの発現による、細胞へのｓｉＲＮＡの導入は、ほ乳動物細胞における機能喪失型の作成にますます使用されている。
【０１２８】
本開示の一実施形態においては、本開示の核酸塩基オリゴマーの８から１９連続核酸塩基を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ）分子が作製される。ｄｓＲＮＡは、二重にされた２本の異なるＲＮＡ鎖、又はそれ自体が二重鎖である単一ＲＮＡ鎖（低分子ヘアピン（ｓｈ：ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ）ＲＮＡ）とすることができる。一般に、ｄｓＲＮＡは、約２１又は２２塩基対であるが、必要に応じてそれより短くても長くてもよい（最高約２９核酸塩基）。ｄｓＲＮＡは、標準技術（例えば、化学合成又はインビトロ転写）によって作製することができる。キットは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースティン）及びＥｐｉｃｅｎｔｒｅ（ウィスコンシン州マディソン）から入手可能である。ほ乳動物細胞においてｄｓＲＮＡを発現する方法は、その各々を参照により本明細書に援用する、ブルメルカンプ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２９６：５５０〜５５３、２００２年；パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ）ら、ジーンズ・アンド・ディベロップメント（Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ）１６：９４８〜９５８、２００２年、ポール（Ｐａｕｌ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）２０：５０５〜５０８、２００２年；スイ（Ｓｕｉ）ら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）９９：５５１５〜５５２０、２００２年；ユ（Ｙｕ）ら、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）９９：６０４７〜６０５２、２００２年；ミヤギシ（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）２０：４９７〜５００、２００２年；及びリー（Ｌｅｅ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）２０：５００〜５０５、２００２年に記載されている。ある実施形態においては、二本鎖ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、三本鎖ｓｉＲＮＡとも称される２個のより小さいオリゴヌクレオチドに分割される。
【０１２９】
小さいヘアピンＲＮＡは、３’ＵＵ−オーバーハングを場合によっては有するステムループ構造からなる。ステムは、変動があり得るものの、２１から３１ｂｐ（望ましくは２５から２９ｂｐ）の範囲とすることができ、ループは４から３０ｂｐ（望ましくは４から２３ｂｐ）の範囲とすることができる。細胞内のｓｈＲＮＡの発現の場合、ポリメラーゼＩＩＩ  Ｈ１−ＲＮＡ又はＵ６プロモーターを含むプラスミドベクター、ステムループＲＮＡ挿入のためのクローニング部位、及び４−５−チミジン転写終結シグナルを使用することができる。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、一般に、明確に定義された開始部位と終結部位を有し、その転写物はポリ（Ａ）テールがない。これらのプロモーターの終結シグナルは、ポリチミジントラクト（ｐｏｌｙｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）によって規定され、転写物は、一般に、第２ウリジンの後で開裂する。この位置で開裂すると、発現されたｓｈＲＮＡにおいて、合成ｓｉＲＮＡの３’オーバーハングと類似した３’ＵＵオーバーハングが生成する。ほ乳動物細胞においてｓｈＲＮＡを発現する更に別の方法は、上記参考文献に記載されている。本発明は、３’及び５’エキソヌクレアーゼ並びにエンドヌクレアーゼから保護する修飾を有する安定化Ｒ／ＤＮＡ  ＮＰを包含する。かかる修飾は、望ましくは、標的親和性を維持しながら、インビボでの安定性を増大させる。様々な実施形態においては、本発明のＲ／ＤＮＡ  ＮＰは、所与の核酸塩基配列のリボース及び／又はリン酸及び／又は塩基位置に化学置換を含む。例えば、本発明のＲ／ＤＮＡ  ＮＰは、リボース部分の２’位置の化学修飾、アプタマーの環状化、３’キャッピング、及び「Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ」技術を含む。その２’−ＯＣＨ３修飾対応物で順次置換されたＡ及びＧヌクレオチドを有するＲ／ＤＮＡ  ＮＰは、本発明の方法に特に有用である。かかる修飾は、一般に、親和性及び特異性の保持の点で十分な耐性がある。様々な実施形態においては、Ｒ／ＤＮＡ  ＮＰは、少なくとも１０％、２５％、５０％又は７５％修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態においては、Ｒ／ＤＮＡ  ＮＰのヌクレオチドの８０〜９０％もが安定化置換を含む。別の実施形態においては、Ｒ／ＤＮＡ  ＮＰを含む２’−ＯＭｅを合成する。かかるＲ／ＤＮＡ  ＮＰは、合成が安価であり、天然ポリメラーゼが２’−ＯＭｅヌクレオチド三リン酸塩を基質として認めず、２’−ＯＭｅヌクレオチドを宿主ＤＮＡに再利用できないので、望ましい。本明細書に記載の方法を用いると、Ｒ／ＤＮＡ  ＮＰは、高いインビボ安定性のために選択される。一実施形態においては、２’−Ｆ及び２’−ＯＣＨ３修飾を有するＲ／ＤＮＡ  ＮＰを使用して、ヌクレアーゼ耐性のアプタマーを生成する。別の実施形態においては、本発明の核酸は、１個以上のロックド核酸（ＬＮＡ：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）を有する。ＬＮＡとは、修飾ＲＮＡヌクレオチドを指す。ＬＮＡのリボースは、２’酸素と４’炭素を連結してリボースをＮｏｒｔｈ型、すなわち３’エンド配座にロックする余分な架橋で修飾されている。例えば、カウル（Ｋａｕｒ），Ｈ．ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、４５巻、７��４７〜５５ページ、及びコシキン（Ｋｏｓｈｋｉｎ），Ａ．Ａ．ら、テトラへドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、５４巻、３６０７〜３６３０ページを参照されたい。別の実施形態においては、本発明の１個以上の核酸は、モルホリノ（ｍｏｒｐｏｌｉｎｏ）構造を取り込み、核酸塩基は、デオキシリボース環の代わりにモルホリン環に結合し、リン酸の代わりにホスホロジアミダート基を介して結合する。例えば、サマートン（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ），Ｊ．及びウェラー（Ｗｅｌｌｅｒ），Ｄ．、アンチセンス・アンド・ヌクレイック・アシッド・ドラッグ・ディベロップメント（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、７巻、１８７〜１９５ページを参照されたい。更に別の修飾は、（ＰＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｕｌｆｕｒ）リン酸硫黄修飾を含み、核酸のリン酸骨格は、リン酸骨格中の酸素族を１個以上の硫黄族で置換することによって修飾される。核酸を安定化する別の修飾も当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５８０，７３７号、並びに米国特許出願公開第２００５００３７３９４号、２００４０２５３６７９号、２００４０１９７８０４号及び２００４０１８０３６０号に記載されている。
【０１３０】
薬剤は、ＲＮＡ又はＤＮＡアプタマーとすることができる。アプタマーは、小さい有機物、ペプチド、タンパク質、細胞、組織などの標的に高い親和性及び特異性で結合する安定なＤＮＡ、ＲＮＡ又はペプチドである。抗体とは異なり、一部のアプタマーは立体選択性を示す。本発明は、特定のアプタマーに限定されず、疾患や症状の治療に有用であることが当該技術分野で知られている任意のアプタマーとすることができる。例えば、アプタマーデータベースは、アプタマー及びインビトロ選択についての情報の包括的な注釈付きの保管場所である。この資源は、アプタマー選択に関する公知情報すべてを収集し、編成し、配布するものであり、ｈｔｔｐ：／／ａｐｔａｍｅｒ．ｉｃｍｂ．ｕｔｅｘａｓ．ｅｄｕ／で公開されている。
【０１３１】
薬剤は、下記のように、分割機能部を有するＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドとすることができる。
【０１３２】
薬剤は、ナノ粒子を送達部位に向けるターゲティング剤とすることもできる。例えば、ターゲティング剤は、標的細胞表面で優先的に提示される特定の細胞表面結合パートナー、例えばリガンド受容体を有するリガンド、例えばペプチドリガンドとすることができる。本明細書では「受容体」及び「リガンド」とは、結合パートナーである特異的結合対の２つのメンバーを指す。受容体は、標的表面に局在する対のメンバーであり、リガンドは、ナノ粒子表面に存在する対のメンバーである。したがって、ある実施形態においては、本発明は、結合対の他方のメンバーに特異的に結合する能力を保持する結合対の一メンバー又はその断片をその表面に含むナノ粒子を特徴とし、そのパートナーに特異的に結合する能力を保持するその結合対の他方のメンバー又はその断片は標的表面に存在する。ある実施形態においては、ターゲティング剤は、抗体、例えば単鎖抗体とすることができ、その結合パートナーは、単鎖抗体に結合する能力を保持するその抗原又はその断片、誘導体若しくは変異体を含む。
【０１３３】
治療薬は、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、脂質、標的細胞、標的器官、標的組織などの標的を検出、同定、阻害、処理、触媒、制御、死滅、増強又は改変する能力のある分子、原子、イオン、受容体及び／又は他の実体とすることができる。
【０１３４】
ある例においては、治療薬は、放射線治療薬であり、放射性ガドリニウム、放射性ホウ素及び放射性ヨウ素から選択することができるが、それだけに限定されない。
【０１３５】
ある例においては、薬剤は、アセトアミノフェン（ａｃｅｔａｍｉｎａｐｈｅｎ）、アシクロビル、アルケラン、アミカシン、アンピシリン、アスピリン、ビサントレン、ブレオマイシン、ネオカルチノスタチン（ｎｅｏｃａｒｄｉｏｓｔａｔｉｎ）、カルボプラチン、クロラムブシル、クロラムフェニコール、シタラビン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲンタマイシン、イブプロフェン、カナマイシン、メプロバメート、メトトレキサート、ノバントロン、ナイスタチン、オンコビン、フェノバルビタール、ポリミキシン、プロブコール、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｂｉｚｉｎｅ）、リファンピン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、シンメトレル、チオグアニン、トブラマイシン、テモゾロマイド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、トリメトプリム、シスプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロランブシル、アザチオプリン、メルカプトプリン、ビンカアルカロイド、タキサン、ビンクリスチン、ビンブラスチン  ビノレルビン、ビンデシン、エトポシド、テニポシド、パクリタキセル、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、及びダクチノマイシン及びバルバン（ｖａｌｂａｎ）などの抗生物質、鎮痛薬、高血圧薬、強心薬などの薬物；ジフテリア毒素、ゲロニン、エキソトキシンＡ、アブリン、モデシン、リシン、放射性ガドリニウム、放射性ホウ素及び放射性ヨウ素；又はその毒性断片；アルカリ及びアルカリ土類金属などの金属イオン；アクチニド、ランタニド又は他の類似の遷移元素から生成されるもの、５１Ｃｒ、４７Ｓｃ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８２Ｒｂ、８９Ｓｒ、８８Ｙ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ｉｎ、１１５ｍＩｎ、１２５１、１３１１、１４０Ｂａ、１４０Ｌａ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１９４Ｉｒ、１９９Ａｕなどの他の元素から生成されるものなどの放射性核種；蛍光物、リン光物、放射線などのその存在に起因する系の検出可能及び測定可能な摂動をもたらす何かを含むシグナル発生物質；常磁性物、例えば、Ｆｅ、Ｇｄ、Ｃｒ、Ｍｎなどのシグナル反射物；キレート剤と結合したときに放射性であるか否かにかかわらず、上記金属のいずれかなどのキレート金属；造影剤、電子線乳白剤、例えば、Ｆｅ、Ｇｄ、Ｃｒ、Ｍｎなどのシグナル吸収体；モノクローナル抗体及び抗イディオタイプ抗体を含めた抗体；抗体断片；ホルモン；インターロイキン、インターフェロン、ウイルス、ウイルス断片などの生体応答調節物質；診断用乳白剤；蛍光成分とすることができるが、それだけに限定されない。他の医薬品材料としては、キレート剤、抗原、抗体、治療薬又は診断薬を選択的に捕捉可能な部分などの捕捉剤が挙げられる。
【０１３６】
治療薬の他の例としては、抗菌剤、鎮痛薬、抗炎症剤、反対刺激薬、凝固改質剤（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、利尿薬、交感神経作動薬、食欲抑制薬、制酸剤及び他の胃腸薬；駆虫薬、抗うつ薬、高血圧治療薬、抗コリン作用薬、刺激薬、抗ホルモン薬、中枢神経刺激薬及び呼吸刺激薬、薬物拮抗物質、脂質制御薬、尿酸排せつ薬、強心配糖体、電解質、麦角及びその誘導体、去痰剤、催眠薬及び鎮静薬、抗糖尿病薬、ドパミン作動薬、制吐薬、筋弛緩薬、副交感神経作動薬、抗けいれん薬、抗ヒスタミン剤、ベータ遮断薬、下剤、抗不整脈薬、造影剤、放射性医薬品、抗アレルギー剤、トランキライザー、血管拡張剤、抗ウイルス剤、及び抗腫よう薬若しくは細胞分裂阻害剤若しくは抗癌性を有する別の薬剤、又はその組合せが挙げられる。他の適切な治療成分としては、避妊薬及びビタミン並びに微量栄養素及び多量栄養素が挙げられる。更に別の例としては、抗生物質、抗ウイルス剤などの感染症治療薬；鎮痛薬及び鎮痛薬の組合せ；食欲抑制薬；駆虫薬（ａｎｔｉｈｅｉｍｉｎｔｉｃｓ）；抗関節炎薬；抗ぜん息薬；抗けいれん薬；抗うつ薬；抗利尿薬；止しゃ薬（ａｎｔｉｄｉａｒｒｌｅａｌｓ）；抗ヒスタミン剤；抗炎症剤；抗片頭痛製剤；制吐薬；抗腫よう薬；抗パーキンソン病薬；鎮痒薬；抗精神病薬；解熱薬、鎮けい剤；抗コリン作用薬；交感神経作動薬；キサンチン誘導体；カルシウムチャネル遮断薬、ピンドロールなどのベータ遮断薬、及び抗不整脈薬を含めた循環器製剤；高血圧治療薬；利尿薬；一般的な冠動脈、末梢及び大脳を含めた血管拡張剤；中枢神経興奮薬；うっ血除去薬を含めた咳及びかぜの製剤；エストラジオール、及びコルチコステロイドを含めた他のステロイドなどのホルモン；催眠薬；免疫抑制薬；筋弛緩薬；副交感神経遮断薬；精神刺激薬；鎮静薬；及びトランキライザー；並びに天然由来の又は遺伝子操作されたタンパク質、多糖、糖タンパク質又はリポタンパク質が挙げられる。
【０１３７】
ナノ粒子を標的部位に向けることができる。好ましい標的部位は、癌細胞、固形腫よう、炎症部位、及び損傷を受けた骨又は組織を含む。
【０１３８】
例えば、ナノ粒子は、抗体又はペプチドを更に含むことができ、抗体又はペプチドは、標的分子、例えば、抗体若しくはペプチドが向けられる細胞表面マーカー、又は抗体若しくはペプチドが向けられる疾患特異的マーカーを有する標的細胞との特異的結合を可能にするターゲティング部分として働く。ナノ粒子は、標的分子を有する標的細胞との特異的結合（ｓｐｅｃｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を可能にするターゲティング部分として働くヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドを更に含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、特定の標的分子に結合するアプタマーとすることができる。
【０１３９】
本発明の多機能ナノ粒子の更なる例示的な潜在的用途としては、リボスイッチアプタマー、リボザイム又はビーコンとしてのナノ粒子の使用が挙げられる。
【０１４０】
リボスイッチは、ｍＲＮＡ中の非翻訳配列を使用して、その遺伝子の発現を調節する代謝産物に対する結合ポケットを形成するタイプの調節領域である。リボスイッチは、立体構造変化を起こし、代謝産物結合を一般に発現プラットフォームを介して転写終結の増加又は翻訳効率の低下として伝達する二重機能分子である。
【０１４１】
リボザイムは、エステル交換によるＲＮＡ開裂などの基礎的な生物学的過程を触媒する。本発明の多価ＲＮＡナノ粒子は、例えば、参照によりその全体を本明細書に援用する米国特許第６，９１６，６５３号に記載の方法によってリボザイムに組み込むことができる。
【０１４２】
幾つかの「分子ビーコン」（しばしば蛍光化合物）を本発明のＲＮＡナノ粒子に付着させて、標的分析物の存在をシグナル伝達し、定量化する手段を提供することができる。分子ビーコンは、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動に基づく方法を用いて、目的とする特定の分析物／バイオマーカーの存在下で蛍光シグナルを発する。好ましい実施形態においては、「分子ビーコン」という用語は、事前に選択された条件下で検出可能になり、ナノ粒子に付着することができる、分子又は分子グループ（すなわち、エネルギー移動複合体又は発色団（単数又は複数）とハイブリッド形成する核酸分子）を指す。同様に、増幅蛍光ポリマー（ＡＦＰ：ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒ）を本発明において利用することができる。ＡＦＰは、連結された幾つかの発色団を含むポリマーである。従来の蛍光検出において分析物との１：１相互作用を必要とする単離発色団とは対照的に、ＡＦＰにおける多数の発色団の蛍光は、単一分子によって影響され得る。例えば、ＡＦＰとの単一の結合事象によって、多数のポリマー繰り返し単位の蛍光をクエンチして、消光を増幅することができる。消光は、蛍光発光強度を減少させるプロセスである。本発明に使用することができる分子ビーコン及びＡＦＰは、その調製方法を含めて、米国特許第６，２６１，７８３号を含めた多数の特許及び刊行物に記載されている。
【０１４３】
任意のタンパク質をナノ粒子に結合することができる。例えば、糖タンパク質は、最も容易に結合し、酸化されて活性アルデヒド基を生成し得る。他のタンパク質もその−ＣＯＯＨ基（単数又は複数）を介して結合することができるが、効率が低い。しかしながら、ジイミド試薬、例えばカルボジイミドなどの当該技術分野で公知の他の手段を使用して、糖のないタンパク質をナノ粒子に結合させることができる。
【０１４４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｏｃｏｌ）鎖をナノ粒子に接合することができる。ＰＥＧ鎖は、ナノチューブを高度に水溶性にする。ＰＥＧ−リン脂質（ＰＥＧ−ＰＬ）は、薬物送達用のミセル及びリポソームの形成に使用されてきた（アドラカ−ハッチオン（Ａｄｌａｋｈａ−Ｈｕｔｃｈｅｏｎ），Ｇ．；バリー（Ｂａｌｌｙ），Ｍ．Ｂ．；シュー（Ｓｈｅｗ），Ｃ．Ｒ．；マッデン（Ｍａｄｄｅｎ），Ｔ．Ｄ．ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、１９９９年、１７、７７５〜７７９；マイヤー（Ｍｅｙｅｒ），Ｏ．；キルポーチン（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ），Ｄ．；ホン（Ｈｏｎｇ），Ｋ．；スタンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ），Ｂ．；パーク（Ｐａｒｋ），Ｊ．Ｗ．；ウッドル（Ｗｏｏｄｌｅ），Ｍ．Ｃ；パパハジョポウロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ），Ｄ．ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）１９９８年、２７３、１５６２１〜１５６２７；パパハジョポウロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ），Ｄ．；アレン（Ａｌｌｅｎ），Ｔ．Ｍ．；ガビゾン（Ｇａｂｉｚｏｎ），Ａ．；メイヒュー（Ｍａｙｈｅｗ），Ｅ．；マッテイ（Ｍａｔｔｈａｙ），Ｋ．；フワン（Ｈｕａｎｇ），Ｓ．Ｋ．；リー（Ｌｅｅ），Ｋ．Ｄ．；ウッドル（Ｗｏｏｄｌｅ），Ｍ．Ｃ；ラシック（Ｌａｓｉｃ），Ｄ．Ｄ．；レデマン（Ｒｅｄｅｍａｎｎ），Ｃ；マーチン（Ｍａｒｔｉｎ），Ｆ．Ｊ．米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）１９９１年、８８、１１４６０〜１１４６４）。
【０１４５】
機能性グループは、ナノ粒子と結合することができ、例えば、機能性グループは反応性機能性グループとすることができる。適切な機能性グループとしては、ハロアセチル基、アミン、チオール、ホスファート、カルボキシラート、ヒドラジン、ヒドラジド、アルデヒド又はその組合せが挙げられるが、それだけに限定されない。他の機能性グループとしては、反応性機能部、相補的グループなどのグループが挙げられる。さらに、ＲＮＡ機能性グループを、例えば、リボザイム又はリボスイッチアプタマーとして付着させることができる。
【０１４６】
ナノ粒子は、核酸、炭水化物、脂質、タンパク質、抗体又は他のリガンドとの特異的相互作用のための小分子の付着に使用することができる。
【０１４７】
ナノ粒子は、付着した色素を有することができる。色素は、蛍光色素又は複数の蛍光色素とすることができる。適切な色素としては、ＹＯＹＯ−１、ＪＯＪＯ−１、ＬＯＬＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ、ＢＯＢＯ−３、ＳＹＢＲ、ＳＹＴＯ、ＳＹＴＯＸ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ及びその組合せが挙げられるが、それだけに限定されない。他の色素としては、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、又はフルオレセイン、ローダミン、シアニン、クマリン系色素などの非挿入（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ）色素、及びその組合せが挙げられる。他の適切な色素としては、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジン及び誘導体：アクリジン、アクリジンイソチオシアナート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホナート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリン及び誘導体：クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（Ｃｏｕｍａｒａｎ１５１）；シアニン色素；シアノシン；４’，６−ジアミジノ（ｄｉａｍｉｎｉｄｉｎｏ）−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレン（ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセタート；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，−２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアナート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン及び誘導体：エオシン、エオシンイソチオシアナート、エリスロシン及び誘導体：エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアナート；エチジウム；フルオレセイン及び誘導体：５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアナート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラロザニリン；フェノールレッド；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン及び誘導体：ピレン、ピレンブチラート、スクシンイミジル１−ピレン；ブチラート量子ドット；Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）ローダミン及び誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ���、リサミンローダミンＢ塩化スルホニルローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアナート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ７００；ＩＲＤ８００；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；並びにナフタロシアニンが挙げられるが、それだけに限定されない。本発明のナノ粒子に使用される適切な色素としては、ＹＯＹＯ−１（４８８／５０９）、ＪＯＪＯ−１（５３２／５４５）、ＬＯＬＯ−１（５６５／５７９）、及びＹＯＹＯ−３（６１２／６３１）、ＳＹＢＲ−１０１（４８８／５０５）及びＳＹＴＯ−６２（６５２／６７６）などの可視スペクトルを包含するＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ製ホモ二量体シアニンＤＮＡ挿入色素のファミリーが挙げられるが、それだけに限定されない。十分な検出ＳＮがあれば、色素を単一粒子中で様々な比で混合し、例えば、異なる蛍光スペクトルがわずか２種の色素の混合物から得られる。本発明によれば、１種以上の治療薬、診断薬又は送達剤が構成要素配列に直接含まれる。ある実施形態においては、送達剤はターゲティング剤とすることができる。ターゲティング剤を使用して、ナノ粒子を組織又は細胞標的に向ける。ターゲティング剤の例示的実施形態は、抗体である。例えば、本発明においてターゲティング剤として使用するのに適切な抗体としては、抗体−ナノ粒子複合体を直接的又は間接的に内在化させる細胞表面抗原に対する抗体が挙げられる。例えば、癌の治療においては、適切な抗体としてはＣＤ３３及びＣＤ２２に対する抗体が挙げられる。リンパ腫上で過剰発現され、二量体化されるＣＤ３３及びＣＤ２２。
【０１４８】
本発明のある好ましい実施形態においては、ビオチンがナノ粒子に接合している。例えば、本発明のナノ粒子は、多角体、例えば多角体ケージの内部又は外部に分子を固定化するビオチン−ストレプトアビジン相互作用を利用して更に機能化することができる。例えば、ストレプトアビジンをビオチンリンカーによってグアノシンモノ−ホスホチオアート（ＧＭＰＳ：ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）修飾ｔｅｃｔｏＲＮＡに接合させることができる。ある好ましい実施形態においては、ビオチンリンカーは、ｔｅｃｔｏＲＮＡの５’位置のモノ−ホスホチオアートに取り込まれる。
【０１４９】
広範囲の粒径が本発明では適切である。ある態様においては、粒子の直径は約１０ナノメートルから約１０ミクロンである。好ましくは、粒径は、約１０から７００ナノメートル、より好ましくは約１０ナノメートルから約１００ナノメートルである。
【０１５０】
本明細書に記載の多価ＲＮＡナノ粒子又は多価ＲＮＡナノチューブは、幾つかの用途を有する。例えば、多価ＲＮＡナノ粒子又は多価ＲＮＡナノチューブは、薬物送達、画像化、ナノ回路、細胞増殖表面、医療移植片、医学的検査又は遺伝子療法に使用することができる。
【０１５１】
特定の一実施形態においては、上記の多価ＲＮＡナノ粒子又は多価ＲＮＡ多角体、例えばケージは、生物学的メッシュに使用することができる。例示的一実施形態においては、本明細書に記載の発明は、例えば、病原体検出におけるバイオセンサとして使用することができる。特定の一実施形態においては、自己集合ナノメッシュを使用して、タンパク質又は機能性ＲＮＡの複数のコピーを例えばメッシュ上に配置することによって、病原体検出用又はＸ線結晶学用のバイオセンサを取り付ける。病原体検出用バイオセンサは、有利には、バイオテロリズム対応能力（ｂｉｏｔｅｒｒｏｒｉｓｍ  ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ）に使用される。
【０１５２】
別の例示的一実施形態においては、本明細書に記載の発明の多価ナノ粒子は、組織成長用骨格又は足場として使用される。
【０１５３】
これらの用途は例示であり、非限定的であるとみなされる。
【０１５４】
組成物
本発明は、部分的に、本明細書に記載のＮＰを含む薬物送達組成物に関する。本発明の薬物送達組成物は、細胞又は組織に入ることができる。
【０１５５】
有利には、本発明の薬物送達組成物は、活性薬剤、特に治療薬を作用部位に最適な速度及び治療量でより制御された形で送達する。したがって、治療指数の改善は、体内の活性成分分布を調節することによって得ることができる。活性成分と送達系の連係によって、特に、作用部位へのその特異的送達、又は作用部位のターゲティング後のその制御放出を可能にする。活性成分の存在が望ましくない区画における活性成分の量を削減することによって、活性成分の効力を増大させ、その有毒な副作用を低下させ、更にはその活性を変更又は回復することができる。
【０１５６】
当業者の理解するところによれば、ＲＮＡの塩基組成を変えると、ＲＮＡの半減期が変わり、したがって組成物からのＲＮＡの放出が変わる。例えば、組成物は、多価ＲＮＡナノ粒子の高速放出、低速放出又は段階的放出からなるように改変することができる。
【０１５７】
ある好ましい実施形態においては、薬物送達組成物は、第２の治療薬を含むことができる。一部の実施形態においては、ナノ粒子を含む組成物と第２の治療薬を、同じ組成物で又は別々の組成物で同時に投与する。一部の実施形態においては、ナノ粒子組成物と第２の治療薬を逐次的に投与する。すなわち、ナノ粒子組成物を第２の治療薬の投与前又は後に投与する。本明細書では「逐次投与」という用語は、ナノ粒子組成物中の薬物と第２の薬剤を、２０、３０、４０、５０、６０分又はそれ以上のいずれか以上などの約１５分を超える間隔で投与することを意味する。ナノ粒子組成物又は化学療法剤を最初に投与することができる。ナノ粒子組成物と化学療法剤は、同じ又は異なるパッケージに含むことができる別々の組成物に含まれる。一部の実施形態においては、ナノ粒子組成物と第２の治療薬の投与は同時である。すなわち、ナノ粒子組成物の投与期間と第２の治療薬のそれが重複する。一部の実施形態においては、ナノ粒子組成物と第２の治療薬の投与は、同時ではない。例えば、一部の実施形態においては、ナノ粒子組成物の投与は、第２の治療薬を投与する前に終結する。一部の実施形態においては、第２の治療薬の投与は、ナノ粒子組成物を投与する前に終結する。ＲＮＡナノ粒子又はナノチューブの半減期が異なるように設計することによって投与を制御することもできる。したがって、設計されたＲＮＡ安定性の変化に基づく設定時間の放出によって粒子溶解を制御する。
【０１５８】
第２の治療薬は、化学療法剤、循環器薬、呼吸器薬、交感神経作動薬、コリン様作用薬、アドレナリン作動性又はアドレナリン作動性ニューロン遮断薬、鎮痛薬／解熱薬、麻酔薬、抗ぜん息薬、抗生物質、抗うつ薬、抗糖尿病薬、抗真菌薬、高血圧治療薬、抗炎症剤、抗不安薬、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗片頭痛薬、鎮静薬／催眠薬、抗狭心症薬、抗精神病薬、抗そう薬、抗不整脈薬、抗関節炎薬、抗痛風薬、抗凝固薬、血栓溶解剤、抗線溶剤、血行動態薬、抗血小板薬、抗けいれん薬、抗パーキンソン病薬、抗ヒスタミン剤／鎮痒薬、カルシウム調節に有用な薬剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗微生物剤、感染症治療薬、気管支拡張剤、ホルモン、血糖降下剤、脂質低下薬、タンパク質、ペプチド、核酸、赤血球形成刺激に有用な薬剤、抗潰よう薬／抗逆流薬、制吐薬／鎮吐薬及び油溶性ビタミン、又はその組合せから選択されるが、それだけに限定されない。
【０１５９】
第２の治療薬が化学療法剤であるときには、化学療法剤は、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシラート；ビセレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロランブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシラート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシラート；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩ、すなわちｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；マイタンシン；メクロレタミン、メクロレタミン酸化物塩酸塩レタミン塩酸塩；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲステロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；トレストロン酢酸塩；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシナート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩、インプロスルファン、ベンゾデパ、カルボコン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、トリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）、クロルナファジン、ノブエンビキン、フェネステリン、トロホスファミド、エステルムスチン（ｅｓｔｅｒｍｕｓｔｉｎｅ）、クロロゾトシン、ジェムザール、ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、アクラシノマイシン、アクチノマイシンＦ（１）、アザセリン、ブレオマイシン、カルビシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダウノルビシン、ダウノマイシン、６−ジアゾ−５−オキソ−１−ノルロイシン、ドキソルビシン、オリボマイシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ツベルシジン、ゾルビシン、デノプテリン、プテロプテリン、６−メルカプトプリン、アンシタビン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、エノシタビン、プルモザイム、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、ベストラブシル、デフォファミド（ｄｅｆｏｆａｍｉｄｅ）、デメコルチン、エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）、エリプチニウム酢酸塩、エトグルシド、フルタミド、ヒドロキシ尿素、レンチナン、フェナメット、ポドフィリニック酸、２−エチルヒドラジド、ラゾキサン、スピロゲルマニウム、タモキシフェン、タキソテール、テヌアゾン酸、トリアジコン、２，２，２樗−トリクロロトリエチルアミン、ウレタン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン及び関連した薬剤から選択されるが、それだけに限定されない。２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫ拮抗物質；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレライド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；拮抗物質Ｄ；拮抗物質Ｇ；アンタレリクス；抗背方化形態形成（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ）タンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン剤；抗新生物薬；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシナート；アポトーシス遺伝子調節物質；アポトーシス制御物質；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬ拮抗物質；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビセレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトセシン誘導体；カナリアポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン（ｃｈｌｏｒｌｎｓ）；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シスポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタアントラキノン；シクロプラタム（ｃｙｃｌｏｐｌａｔａｍ）；シペマイシン；シタラビンオクフォスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ（ｄａｃｌｉｘｉｍａｂ）；デシタビン；デヒドロディデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド（ｄｅｘｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ディデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール，９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲン作動物質；エストロゲン拮抗物質；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルビシン（ｆｌｕｏｒｏｄａｕｎｏｒｕｎｉｃｉｎ）塩酸塩；ホルフェニメクス；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫賦活ペプチド；インスリン様成長因子−１受容体阻害剤；インターフェロン作動物質；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４−；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラジン；イソベンガゾール（ｉｓｏｂｅｎｇａｚｏｌｅ）；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセタート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミソール；リアロゾール；線状ポリアミン類似体；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リッソクリナミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテフォシン；ミリモスチム；不適性二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；メトナフィド；マイトトキシン（ｍｉｔｏｔｏｘｉｎ）線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒトじゅう毛性ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドＡ＋マイコバクテリウム（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫よう抑制因子１に基づく療法；マスタード抗癌剤；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチプ（ｎａｇｒｅｓｔｉｐ）；ナロキソン＋ペンタゾシ
ン；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素調節物質；窒素酸化物抗酸化剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘発物質；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキザウノマイシン；タキセル；タキセル類似体；タキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリスルファートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（ｐｅｎｔｒｏｚｏｌｅ）；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸塩；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチン（ｐｌａｃｅｔｉｎ）Ａ；プラセチンＢ；プラスミノゲン活性化因子阻害剤；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡ系免疫調節物質；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン複合物；ｒａｆ拮抗物質；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；レテリプチン脱メチル化；レニウムＲｅ１８６エチドロナート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣物；セムスチン；老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達調節物質；単鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテイト；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（ｓｏｌｖｅｒｏｌ）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンギスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作動性腸ペプチド拮抗物質；スラジスタ（ｓｕｒａｄｉｓｔａ）；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（ｔｅｌｌｕｒａｐｙｒｙｌｉｕｍ）；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロマイド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポイエチン；トロンボポイエチン模倣物；チマルファシン；サイモポイエチン受容体作動物質；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；エチルエチオプルプリンすず；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チロホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長抑制因子；ウロキナーゼ受容体拮抗物質；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子療法；ベラレソール；ベラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）；ベルジン（ｖｅｒｄｉｎｓ）；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（ｖｉｎｘａｌｔｉｎｅ）；Ｖｉｔａｘｉｎ；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；及びジノスタチンスチマラマー。好ましい追加の抗癌薬は、５−フルオロウラシル及びロイコボリンである。追加の癌治療物質としては、リツキシマブ、トラスツヅマブ、セツキシマブなどのモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１６０】
本明細書における化学療法剤とは、化学療法剤又はその誘導体に該当し、したがって本発明は、これらの実施形態を企図し、含むものである（薬剤；薬剤又は誘導体（単数又は複数））。化学療法剤の「誘導体」若しくは「類似体」又は他の化学成分としては、化学療法剤若しくは成分と構造的に類似した化合物、又は化学療法剤若しくは成分と同じ一般的化学クラスである化合物が挙げられるが、それだけに限定されない。一部の実施形態においては、化学療法剤又は成分の誘導体又は類似体は、化学療法剤又は成分の類似の（例えば、機能性を含めた）化学的及び／又は物理的性質を保持する。
【０１６１】
本発明は、本発明のナノ粒子と薬学的に許容される担体とを含む医薬又は診断組成物にも関する。「薬学的に許容される担体」という句は、当該技術分野で認知されており、本明細書に記載の方法に使用される化合物を対象、例えばほ乳動物に投与するのに適した薬学的に許容される材料、組成物又は媒体を含む。担体としては、対象薬剤を一器官又は体の一部から別の器官又は体の一部に運搬又は輸送するのに関与する、液体若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又はカプセル化材料が挙げられる。各担体は、製剤の他の成分と適合性であるという意味で「許容され」なければならず、患者に無害でなければならない。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料の幾つかの例としては、ラクトース、グルコース、スクロースなどの糖；コーンスターチ、ジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、及びカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオ脂、坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、ダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；並びに医薬製剤に使用される他の無毒適合物質が挙げられる。適切な薬剤担体は、この分野の標準参考書であるレミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）に記載されている。
【０１６２】
治療方法
本発明の方法は、本明細書に記載の１個以上の機能部を含む有効量の多価ＲＮＡナノ粒子をそれを必要とする対象に投与することによって疾患又は障害を治療又は予防する方法を含む。したがって、幾つかの疾患又は障害が本発明の方法による治療に適している。例としては、腺腫、老化、ＡＩＤＳ／ＨＩＶ、脱毛症、アルツハイマー病、貧血、関節炎、ぜん息、アテローム性動脈硬化症、癌、心臓病又は疾患、真性糖尿病、飲食に起因する健康被害、血友病Ａ〜Ｅ、ヘルペス、ハンチントン病、高血圧、頭痛、インフルエンザ、多発性硬化症、重症筋無力症、新生物、肥満、骨関節炎、すい炎、パーキンソン病、骨盤内炎症性疾患、腹膜炎、歯周病、リウマチ様関節炎、敗血症、鎌状赤血球症、奇形腫、潰よう性大腸炎及びブドウ膜炎が挙げられるが、それだけに限定されない。
【０１６３】
本発明の方法は、更に診断法を包含する。
【０１６４】
この方法は、アジュバントを使う状況で実施することができる。「アジュバントを使う状況」とは、例えば、個体が増殖性疾患、特に癌の病歴があり、手術（外科的切除など）、放射線治療及び化学療法を含めて、ただしそれだけに限定されない療法に一般に応答性である（ただし、応答性とは限らない）、臨床状況を指す。しかし、これらの個体は、増殖性疾患（癌など）の病歴のために、疾患を発症するリスクがあると考えられる。「アジュバントを使う状況」における治療又は投与とは、それに続く治療様式を指す。危険度（すなわち、アジュバントを使う状況にある個体が「高リスク」又は「低リスク」と考えられるとき）は、幾つかの要因、最も一般的には、最初に治療したときの疾患の程度に依存する。本明細書に記載の方法は、ネオアジュバントを使う状況でも実施することができる。すなわち、この方法は、一次療法／最終療法の前に実施することができる。したがって、一部の実施形態においては、個体は、以前に治療を受けている。別の実施形態においては、個体は、以前に治療を受けていない。一部の実施形態においては、治療は、一次治療である。
【０１６５】
投与量
ヒト投与量は、最初に、マウスに使用される化合物量から外挿することによって決定することができる。当業者は、ヒトへの投与量を動物モデルと比べて修正することが当該技術分野において通例であることを認識している。ある実施形態においては、投与量は、約１ｍｇ化合物／Ｋｇ体重から約５０００ｍｇ化合物／Ｋｇ体重、又は約５ｍｇ／Ｋｇ体重から約４０００ｍｇ／Ｋｇ体重若しくは約１０ｍｇ／Ｋｇ体重から約３０００ｍｇ／Ｋｇ体重、又は約５０ｍｇ／Ｋｇ体重から約２０００ｍｇ／Ｋｇ体重、又は約１００ｍｇ／Ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／Ｋｇ体重、又は約１５０ｍｇ／Ｋｇ体重から約５００ｍｇ／Ｋｇ体重であり得ることが予見される。別の実施形態においては、この用量は、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００ｍｇ／Ｋｇ体重とすることができる。別の実施形態においては、より高い用量（ｄｏｅｓ）を使用することができると予想される。かかる用量は、約５ｍｇ化合物／Ｋｇ体重から約２０ｍｇ化合物／Ｋｇ体重の範囲とすることができる。別の実施形態においては、用量は、約８、１０、１２、１４、１６又は１８ｍｇ／Ｋｇ体重であり得る。言うまでもなく、この投与量は、特定の患者の初期臨床試験の結果及び必要に応じて、かかる治療手順において常法に従って実施されるように、上方又は下方に調節することができる。
【０１６６】
送達方法
本明細書に記載のナノ粒子組成物は、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、経口、吸入、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内又は経皮を含めて、非経口などの様々な経路によって個体（ヒトなど）に投与することができる。例えば、ナノ粒子組成物は、気道の症状を治療するために吸入によって投与することができる。この組成物は、肺線維症、閉塞性細気管支炎、肺癌、細気管支肺胞上皮癌などの呼吸器の症状を治療するのに使用することができる。一部の実施形態においては、ナノ粒子組成物を静脈内に投与する。一部の実施形態においては、ナノ粒子組成物を経口投与する。
【０１６７】
ナノ粒子組成物の投薬頻度は、療法及び治療する特定の疾患の性質に依存する。例えば、投薬頻度としては、毎週休まずに１日１回、１日２回；毎週、４週間のうち３週間；３週間ごとに１回；２週間ごとに１回；毎週、３週間のうち２週間が挙げられるが、それだけに限定されない。
【０１６８】
ナノ粒子の投与は、単一用量で、又はある時間間隔後に１回若しくは数回繰り返しの用量で実施することができる。適切な投与量は、種々のパラメータ、例えば、治療する個体又は投与方法に応じて変わる。
【０１６９】
ナノ粒子組成物又はナノ粒子組成物と第２の治療薬の投薬頻度は、投与医師の判断に基づいて、治療過程を通して調節することができる。
【０１７０】
別々に投与するときには、ナノ粒子組成物と第２の治療薬を異なる投薬頻度又は間隔で投与することができる。例えば、ナノ粒子組成物を毎週投与することができ、第２の薬剤をそれよりも高頻度又は低頻度で投与することができる。一部の実施形態においては、ナノ粒子及び／又は第２の薬剤の持続性連続放出処方を使用することができる。徐放性が得られる種々の製剤及び装置は当該技術分野で公知である。ナノ粒子組成物及び／又は第２の薬剤に必要な用量は、各薬剤を単独で投与するときに通常必要な用量よりも少なくすることができる（ただし、必ずしもそうとは限らない）。したがって、一部の実施形態においては、治療量以下のナノ粒子組成物中の薬物及び／又は第２の薬剤を投与する。「治療量以下」又は「治療レベル以下」とは、治療量未満、すなわち、ナノ粒子組成物中の薬物及び／又は第２の薬剤を単独で投与するときに通常用いられる量未満である量を指す。減少は、所与の投与で投与される量、及び／又は所与の期間投与される量に反映することができる（頻度の低下）。
【０１７１】
本明細書に記載の投与構成の組合せを使用することができる。本明細書に記載の併用療法は、単独で、又は手術、放射線、化学療法、免疫療法、遺伝子療法などの別の療法と併せて実施することができる。さらに、治療する疾患を発症するリスクがより高い人は、疾患の発症を阻害及び／又は遅延する治療を受けることができる。ナノ粒子組成物の用量は、療法及び治療する特定の疾患の性質に応じて変わる。用量は、特定の疾患に対する治療反応、予防反応などの望ましい反応をもたらすのに十分なものとすべきである。適切な用量は、医師などの投薬の技術分野の当業者が規定する。
【０１７２】
ある実施形態においては、ｓｉＲＮＡは、双頭型両親媒性物質として投与することができる。双頭型両親媒性物質は、毒性が比較的低く、血流中に長く残留し、最も重要なことには、水溶液状態でポリカチオンミセルを形成することができ、したがってｓｉＲＮＡとの会合を受け易くなる。用途に応じて、ｓｉＲＮＡ化学保護の程度、送達効率、さらに細胞内放出は、使用する双頭型両親媒性物質のタイプを単に変更することによって変えることができる（例えば、キム（Ｋｉｍ）ら、モレキュラ・セラピー・ヌクレイック・アシッズ（参照によりその全体を本明細書に援用するＭｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）２：ｅ８０、２０１３年参照）。
【０１７３】
キット
本開示は、疾患の治療又は予防キットを提供する。一実施形態においては、キットは、単位剤形の有効量の本発明の薬剤（例えば、ＮＰ）を含む治療又は予防組成物を含む。一部の実施形態においては、キットは、治療又は予防化合物を含む無菌容器を含む。かかる容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で公知の他の適切な容器形態とすることができる。かかる容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は医薬品を保持するのに適切な他の材料で作製することができる。
【０１７４】
必要に応じて、本開示の薬剤は、疾患を発症した、又は発症するリスクのある対象にそれを投与するための説明書と一緒に提供される。説明書は、一般に、疾患（例えば、新形成又はウイルス感染）の治療又は予防用組成物の使用についての情報を含む。別の実施形態においては、説明書は、以下の少なくとも１つを含む：化合物の記述；疾患又はその症候の治療又は予防のための投与計画及び投与；注意；警告；適応症；使用禁忌；過量情報；有害反応；動物薬理；臨床試験；及び／又は参考文献。説明書は、容器（存在するとき）に直接印刷することができ、又は容器に貼るラベルとして印刷することができ、又は容器の中若しくは容器と一緒に提供される分離したシート、パンフレット、カード若しくはフォルダとして印刷することができる。
【０１７５】
組換えポリペプチド発現
本発明の実施は、別段の記載がない限り、当業者の十分範囲内である、（組換え技術を含めた）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は、「分子クローニング：実習マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、１９８９年）；「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（ゲイト（Ｇａｉｔ）、１９８４年）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）、１９８７年）；「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」「実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（ウィア（Ｗｅｉｒ）、１９９６年）；「ほ乳動物細胞用遺伝子導入ベクター（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ）」（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）及びカロス（Ｃａｌｏｓ）、１９８７年）；「分子生物学の最新手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）、１９８７年）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」、（マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）、１９９４年）；「免疫学の最新手順（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」（コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）、１９９１年）などの文献に十分説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの製造に適用可能であり、それ自体として、本発明を構成し、実施する際に考慮することができる。特定の実施形態に特に有用である技術を以下のセクションで考察する。
【０１７６】
以下の例は、本発明のアッセイ、スクリーニング及び治療方法を作成し、使用する方法の完全な開示及び記述を当業者に提供するためのものであって、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【０１７７】
ＲＮＡ干渉に基づく治療法の見込みは、かかる療法及びヒト臨床試験へのその発展を探究する生物工学的薬物会社の最近の急増によって明らかになった。ＲＮＡナノ技術における最近の成果によって、生物医学的用途に広範に使用される可能性を有するナノ骨格（ナノリング）が導入された（参照によりその全体を本明細書に援用する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／３８８１８号）。本明細書に示すように、コンビナトリアルＲＮＡ干渉のための複数の低分子干渉ＲＮＡによる機能化に加えて、これらのナノ骨格は、類別されたＲＮＡアプタマー、蛍光色素、タンパク質、及び複数の分割機能部を条件付きで活性化するのに使用される最近開発された自己認識ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの同時埋め込みも可能にする。これらの新しい構築物は、様々な実験技術によってインビトロ、細胞培養及びインビボで広範に特徴づけられ、可視化された。その結果、疾患細胞の検出感度が向上し、等量の従来のｓｉＲＮＡに起因するサイレンシングに比べて標的遺伝子のサイレンシング効率が大きく増加した。コンビナトリアルという性質及び相対的なエンジニアリングの単純さのため、これらのＲＮＡナノ粒子は、様々なナノ技術用途に有用であることが予想される。
【０１７８】
実施例１  機能性ナノリングの集合及び特性分析
図１ａに示した集合プロセスは、他の場所に詳述された４、５幾つかのインキュベーションステップ及びある種の緩衝条件を必要とする。異なる数の細長いＤＳ  ＲＮＡ６で機能化されたインビトロで集合したナノリングを、未変性ＰＡＧＥ及び動的光散乱によって構造的に特徴づけた（図１ｂ）。切断プロセスを介した機能性部分（ｓｉＲＮＡ）の放出を、ヒト組換えダイサーを用いたインビトロアッセイによって確認した（図１ｃ）。骨格及びｓｉＲＮＡ生成物を、未変性及び変性ＰＡＧＥを用いた適切な対照との比較によって同定した。結果は、以前の研究５と一致した。
【０１７９】
骨格のコンビナトリアル的性質を実証するために、マラカイトグリーン（ＭＧ）色素に結合し、水溶液中でさもなければ検出不可能であるその発光をかなり増加させるように選択された最高６個のＲＮＡアプタマーでナノリングを機能化した７〜９（図１ｄ及び図９ｃ）。このアプタマーは、これまで、ＲＮＡ転写物のレーザーによる不活性化８、未変性ＲＮＡ７、ＤＮＡ９及び小分子１０のバイオセンシング、同時転写集合体の実時間可視化１１、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド再会合１２、並びにＲＮＡナノ粒子の形成１３に使用された。現在の蛍光研究によれば、ＭＧの蛍光の連続増加は、ナノリング骨格に導入されるアプタマーの数に正比例する。さらに、機能性骨格は、同時転写的に生成することができ、６個のアプタマーを有するナノリングの集合は、蛍光実験及び未変性ＰＡＧＥ実験によって実時間で追跡することができる（図９ｄ）。
【０１８０】
ナノリングを含むＤＳ  ＲＮＡの形成を低温電子顕微鏡法（低温ＥＭ：ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）画像化及び更なる単一粒子再構成によっても可視化した。低温ＥＭ画像によれば、ＲＮＡ粒子は、画像化領域全体にわたって予想されたサイズ及び均一な分布を有する（図２）。ナノリングを含むＤＳ  ＲＮＡの３次元構造をＥＭＡＮ２再構成によって得た。低温ＥＭ画像によれば、ＲＮＡ粒子は、画像化領域全体にわたって予想されたサイズ及び均一な分布を有する（図２ａ）。これらの３次元再構成から計算された投影は、類似の外観を有する観察粒子のクラス平均とよく一致した（図２ａ）。ナノリングの再構成モデルは、図２ｂに示した予測３次元ナノリングモデルと構造的特徴がよく一致した。特に、６回対称性が課せられた最終１６Ａ低温ＥＭマップは、ｓｉＲＮＡリングのアームがまっすぐ外に向いていないことを示した。（図２ｂ及び１７）。横から見ると、ｓｉＲＮＡアームが約２５度上向きであり、したがって六角形分子の冠形状を成している。さらに、上から見ると、ＤＳ  ＲＮＡアームがリングの周りに風車の様式で位置する。６個のＤＳ  ＲＮＡアームは、図１のモデルのアームに比べて約５３度時計回り方向を指している。ＤＳ  ＲＮＡリングのコンピュータモデリングは、冠状モデルのクラスター、及びＤＳアームの向きが上又は下に変化した代替物を形成し、大部分は、上から見て風車の位置を示唆した。低温ＥＭ密度マップに最も一致するモデルを図２ｂに示す。
【０１８１】
原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ：Ａｔｏｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）特性分析を使用して、ナノリングの形成を評価することもできる（例えば、グラボー（Ｇｒａｂｏｗ）ら、ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．）２０１１年２月９日；１１（２）：８７８〜８８７参照）。
【０１８２】
実施例２  インビトロでの導入、遺伝子サイレンシング及びターゲティング実験
複数のｓｉＲＮＡの同時送達用骨格としてナノリングを使用する可能性を試験するために、６個の蛍光標識ＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリングをヒト乳癌細胞に導入した（図３ａ、図１０）。翌日、導入効率を共焦点蛍光顕微鏡法によって可視化し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）によって統計解析した。図３ａの結果によれば、エンドサイトーシスによる細胞内取り込みは、６倍高い濃度で導入された蛍光標識された個々のｓｉＲＮＡの取り込みよりも機能性ナノリングがかなり高かった（エンドサイトーシスによる取り込みを、図３ｂに示した共存実験によって確認した）。これは、（そのサイズ及び全電荷のために）ＲＮＡ  ＮＰとポリカチオン担体（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００、すなわちＬ２Ｋ）の結合が遊離ｓｉＲＮＡ二重鎖よりも密であることに起因し得る１４。
【０１８３】
理論に拘泥するものではないが、ｓｉＲＮＡで機能化されたナノ粒子を使用すると、製剤及びより高い局所濃度のｓｉＲＮＡが正確に制御され、その結果、特定の細胞質の場所に存在するときのみ、ＲＩＳＣの添加を改善する可能性がある（リー（Ｌｅｅ）ら、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）２００９年、１１、（９）、１１５０〜６；セン（Ｓｅｎ）及びブラウ（Ｂｌａｕ）、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）２００５年、７、（６）、６３３〜６）。細胞内部での切断による機能性ナノリングからのｓｉＲＮＡの放出を評価するために、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を安定に発現するヒト乳癌細胞を用いた実験を実施した（図３ｂ及び図１１〜１２）。まず、ｅＧＦＰに対する６個のＤＳ  ＲＮＡを有するナノリング及び個々のＤＳ  ＲＮＡを様々な濃度で細胞に導入した。ｅＧＦＰに対して１タイプのｓｉＲＮＡを使用するために、常に、遊離ＤＳ  ＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ）を対応する機能性ナノリングよりも６倍高い濃度で比較する。３日後、ｅＧＦＰ産生量を調べた（図１０）。視覚的分析によれば、ＤＳ  ＲＮＡで修飾されたナノリングとＤＳ  ＲＮＡ二重鎖のどちらも、それぞれ０．７５ｎＭ及び４ｎＭという低濃度で類似した高いサイレンシング効率を示した（図１１）。サイレンシングの程度を統計的に比較するために、少量の機能性ナノリング（最終１ｎＭ）及びｓｉＲＮＡ又はＤＳ  ＲＮＡ二重鎖（最終６ｎＭ）を導入した細胞をＦＡＣＳで分析した（図３ｃ及び裏づけとなる図１２）。その結果、低濃度の機能性ＲＮＡナノ粒子（１ｎＭ）においてかなりのＧＦＰサイレンシングレベルを示した。負の対照として、異なる遺伝子に対して設計されたＤＳ  ＲＮＡのないナノリング及びＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリングを使用した（図１３ａ）。特異的遺伝子サイレンシングは、標的ＧＦＰに対して設計したナノリングの場合にのみ認められた。細胞生存率に対する機能性ナノリングの効果はＤＳ  ＲＮＡよりも小さかった（裏づけとなる図１３ｂ）。遺伝子サイレンシングの効果は、９日間持続し（裏づけとなる図１３ｃ）、機能性ナノリングと６倍高い濃度で導入したＤＳ  ＲＮＡでは類似した。したがって、結果は、本発明の機能性ナノリングが個々のｓｉＲＮＡよりも有効であることを示した。これは、ナノリングを使用するとＤＳ  ＲＮＡ濃度が局所的に高くなり、ひいては特定の細胞質の場所に存在するときのみ、ＲＩＳＣの添加を改善するという事実によって説明することができる１５、１６。興味深いことに、６個のＤＳ  ＲＮＡを有するナノリングを導入した細胞では、サイレンシングの効果は、遊離ＤＳ  ＲＮＡよりも長期間持続した（図１２）。この現象は、以前に発表された分岐ＲＮＡナノ構造体によるＲＮＡｉ活性化の結果と一致する１７。
【０１８４】
受容体特異的アプタマーを用いたナノリングのターゲティングも評価した。目的細胞に対するＮＰの特異的ターゲティングは、バイオセンシング、及びインビボへの適用の可能性のために重要な課題を提起するものである。ＮＰが特定の細胞を標的にし得ることを示すために、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に特異的であるＪ１８ＲＮＡアプタマーの最高５コピーを含むＮＰを作製した１。可視化するために、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジン結合によってフィコエリトリン（ＰＥ）に連結し、ナノリングの集合に用いた（図３ｄ及び図１４）。このカップリングシステムは、タンパク質成分をナノ骨格に組み込むことができる方法を示すものである。ナノリングは、高レベルのＥＧＦＲを発現する標的類表皮癌細胞（Ａ４３１）に結合することが認められた。４及び５個のアプタマーを有するＮＰは、より少ないアプタマーコピーを有する環に比べて最も強いシグナルを示した。例えば、１個のアプタマーを有するナノリングで処理した細胞の蛍光シグナルは、４個のアプタマーを有するナノリングよりも３倍以上弱かった。これは、ＮＰ１個当たりのアプタマー数が多いほど標的細胞との結合親和性が高くなることを示唆している。リボヌクレアーゼを用いた細胞の同時処理では蛍光が完全に消失したので、これらの結果は、ＮＰと細胞の結合がＲＮＡアプタマー分子によって媒介されたことを示している（図１４ｂ）。ＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体はリボヌクレアーゼ存在下でＥＧＦＲを検出するので、シグナルの消失は、その標的ではなくＲＮＡ分子の酵素分解に起因する（図１４）。さらに、ＥＧＦＲのリガンドである組換え上皮成長因子（ｒＥＧＦ：ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）を添加すると、蛍光シグナルが減少し（図１２ｃ）、細胞のＥＧＦＲとの結合においてｒＥＧＦがＪ１８アプタマーと競合することが示唆された。無関係な組換えタンパク質（ｒＩｇＧ）の存在はＮＰ結合に対して負の効果を持たないので、ｒＥＧＦによるアプタマーの非特異的分解によってシグナルの減少は生じなかった。同様の効果は、ＰＥ標識Ｊ１８アプタマーを用いて処理した細胞でも見られた（データ示さず）。
【０１８５】
実施例３  足場相互作用によるナノリングの機能化
ＤＳ  ＲＮＡ鎖によって連結されたナノリング骨格モノマーの合成に加えて、ナノリング骨格を足場相互作用によって機能化することも一方では可能である。異なる核酸機能部はナノ骨格中に存在する足場と相補的な同種の足場を有する限り連結可能であるので、この付着システムによって、単一ナノ骨格の多機能的使用が可能になる。これを実証するために、６個の骨格モノマーが１０ｎｔ一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ：ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ）足場を３’末端に有するように操作した。この足場をＧＦＰ  ＤＳ  ＲＮＡのアンチセンス成分中の相補的足場配列にアニールするように設計した（図１４）。この集合方法を用いて、同じナノリング骨格を足場認識に基づいて幾つかの異なる機能部と一緒にひとまとめにすることができる。さらに、ｓｉＲＮＡ成分はもはや連結されないので、骨格鎖の長さをこの２部構成の集合プロセスによって短縮することができ、それによって合成効率が向上する。３’末端にアニールされた６個のＧＦＰ  ＤＳ  ＲＮＡを有するナノリング構築物の形成を確認するために、対照として足場のあるナノリングと足場のないナノリングを用いて未変性ＰＡＧＥを実施した。アニールされたＤＳ  ＲＮＡの切断によるｓｉＲＮＡの放出をＧＦＰノックダウンアッセイによって確認した。図１５に足場相互作用によるナノリングの機能化を示す。
【０１８６】
実施例４  ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを有するナノリングによる細胞内ＦＲＥＴ及びＲＮＡｉの制御された条件付きの活性化
異なる機能部の活性化の更に別の制御は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに基づく最近開発された技術によって行うことができる１２。このスキームにおいては、複数の機能部が、分割ＤＳ  ＲＮＡ、及びＲＮＡ−ＤＮＡナノリングとハイブリッドのフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を有し、したがって機能部を不活性化する（図４ａ）。ダイサーは、リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素であり、これはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド１２、１８をプロセシングしてそれらをＲＩＳＣに添加可能にする能力がない。ナノリングモノマーの３’末端に連結されたＤＳ  ＲＮＡの鎖を相補ＤＮＡにアニールし、それによってダイサーがこれらの二重鎖をプロセシングすることを防止し、ナノリングを非機能的にする。これらのＤＮＡは、ＤＳ  ＲＮＡのセンスとハイブリッドを形成するＤＮＡの５’末端に位置する足場に相補的な一本鎖３’末端足場を含む。ＤＳ  ＲＮＡの分割に加えて、ＦＲＥＴ対（Ａｌｅｘａ４８８とＡｌｅｘａ５４６）は、色素とＤＮＡ成分の接合によって非機能性ＲＮＡ−ＤＮＡ環とハイブリッドの間で分離した。ｓｓＤＮＡ相補的足場は、近接すると、互いに認識することができ、再会合を誘発することができる。これは、ＦＲＥＴ誘発と一緒にＤＳ  ＲＮＡ機能性ナノリングの同時形成をもたらす。
【０１８７】
再会合を実時間で追跡するために、ＦＲＥＴ時間追跡を実施した。アンチセンス結合ＤＮＡ鎖の５’末端及びセンス結合ＤＮＡ鎖の３’末端をそれぞれＡｌｅｘａ５４６及びＡｌｅｘａ４８８で蛍光標識した。非機能性ＲＮＡ−ＤＮＡ環を６個のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドと混合すると、ｄｓＤＮＡ形成によってＡｌｅｘａ４８８がＡｌｅｘａ５４６のフェルスター距離（Ｒ０＝６．３１ｎｍ）内に入った。その結果、Ａｌｅｘａ５４６の発光が増加し、Ａｌｅｘａ４８８のシグナルが低下した（図４ｂ）。ＦＲＥＴ時間追跡の結果によれば、部分的再会合の急速な突発段階とそれに続く蛍光タグのより完全な対形成が生じた。細胞内再会合を可視化するために、Ａｌｅｘａ５４６及びＡｌｅｘａ４８８で標識された非機能性ＲＮＡ−ＤＮＡ環及びハイブリッド（図４ｃ）をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に同時導入し、翌日に共焦点顕微鏡法によって調べた。裏抜け補正後のＦＲＥＴシグナルを先の詳述のように計算し、図４ｃ（１＋４及び５）に示した。
【０１８８】
同種のハイブリッド環及び二重鎖が細胞内で結合して機能性ＤＳ  ＲＮＡナノリングを形成し得るかどうかを評価するために、ｅＧＦＰを安定に発現するヒト乳癌細胞に非機能性成分を同時導入した（図４ｄ）。細胞を別々にハイブリッド環又はハイブリッドで処理して、個々の成分がｅＧＦＰ発現のノックダウンを誘発し得るかどうかも判定した。導入から３日後、ｅＧＦＰ発現レベルをフローサイトメトリーによって測定した。その結果、個々の成分に起因するｅＧＦＰ産生のサイレンシングは起こらなかった。しかし、Ｌ２Ｋ／ハイブリッド環及びＬ２Ｋ／ハイブリッドの別個に調製した複合体を細胞に同時導入すると、３日後に測定したサイレンシングレベルは、対照の前もって形成されたＧＦＰ  ｓｉＲＮＡの導入に起因するサイレンシングとほぼ同等であった。
【０１８９】
実施例５  インビボでの機能性ナノリングの実施
さらに、ＧＦＰを発現する異種移植片腫ようを有する胸腺欠損ヌードマウスにおいてインビボ遺伝子サイレンシングを実施した（図５）。機能性ナノリング及び対照ｓｉＲＮＡを腫よう内注射によって異なるマウスに投与した。５日後、処理腫ようにおける未変性ｅＧＦＰの蛍光強度を対照動物の腫ようと比べて測定することによってサイレンシング効率を生体外で分析した。どちらの注射によってもＧＦＰ蛍光強度がかなり減少し、機能性ナノリングでは約９０％、対照ｓｉＲＮＡでは約８０％減少した。これらの結果は、細胞培養物を用いた複数の実験とよく一致し、機能性ナノリングによる標的遺伝子の効率的送達及び更なるサイレンシングが確認された。
【０１９０】
実施例６  ＨＩＶ−１に対する機能性ナノリング
ナノリングの実現性を示すために、下記方法セクションに明記したように、１セットの２個のナノリング構築物（ナノリングＡ及びＢと称する）を作製し、異なるＤＳ  ＲＮＡ組成物を用いて機能化した。各ナノリングは、ＨＩＶ−１の６個の異なる領域、すなわちＰＢＳマトリックス、カプシド、プロテアーゼ、逆転写酵素、エンベロープ、Ｎｅｆ及びＲｅｖ−Ｔａｔを標的にした。これらのナノリングを用いた実験によれば、濃度１ｎＭのナノリングＡ及びＢの両方で導入細胞内のウイルスタンパク質発現が７４〜８３％減少した（図８ａ）。ＨＩＶ−１構造タンパク質（Ｇａｇ）のレベルを定量化して（５５ｋＤａ  Ｇａｇ前駆体＋マトリックス／カプシドｐ４１＋カプシド、カプシド／ＳＰ１  ｐ２４／ｐ２５）、タンパク質ノックダウンの効率を評価した。両方のナノリングが上清におけるＨＩＶ−１産生を阻害することができた。ウイルス阻害は、ナノリング１ｎＭ濃度で約１００％のレベルに達した。値は、アッセイによって検出されたバックグラウンドレベルに匹敵した（図８ｂ）。これらの結果は、対照、すなわち６個の対応するＤＳ  ＲＮＡの混合物によって得られた阻害レベルと同等であった。より低いナノリング濃度（０．１ｎＭ）では、ウイルス生成は７１〜７５％阻害された。細胞傷害性は、１ｎＭ濃度のナノリングＢで最小であり、ノックダウンの特異性が強調された（図１８）。
【０１９１】
方法
上記実験を、それだけに限定されないが、以下の方法及び材料を用いて実施した。
ＲＮＡナノリング配列設計集合体及び未変性ＰＡＧＥ。６個のｓｉＲＮＡで機能化されたナノリングの組成物に入ったＲＮＡ鎖の詳細な設計及び製造については、他の場所に包括的に記述されている４。使用したＲＮＡ配列の全リストが利用可能であり、以下に示す。
【０１９２】
太字の文字配列は、キッシングループ領域を示す。
【０１９３】
【表１】
0006669655.tif 000002
【０１９４】
【表２】
0006669655.tif 000003
【０１９５】
【表３】
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【０１９６】
６個の異なるＨＩＶ−１に対するＤＳアンチセンスで機能化されたＲＮＡナノリング３’側５
対応するダイサー基質（ＤＳ）ＲＮＡの名称を連結された各リング鎖に対して示す。ナノリング構築物は、ＨＩＶ−１ゲノムを標的にする６個の異なるＤＳ  ＲＮＡの組合せを含む。ナノリング構築物Ａ標的：ＰＢＳマトリックス（ＰＢＳ−ＭＡ）、エンベロープ（ｇｐ１２０）、カプシド（ＣＡ）、逆転写酵素（ＲＴ）、プロテアーゼ（ＰＲ）及びＮｅｆ。ナノリング構築物Ｂ標的：ＰＢＳマトリックス（ＰＢＳ−ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、逆転写酵素（ＲＴ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、Ｎｅｆ及びＲｅｖ−Ｔａｔ。略語：ＰＢＳ、プライマー結合部位（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）領域；ｇｐ１２０、１２０ＫＤａの表面糖タンパク質；Ｒｅｖ、発現ビリオンタンパク質の制御因子；Ｔａｔ、転写のトランス活性化因子；Ｎｅｆ、ネガティブ因子。
【０１９７】
【表４】
0006669655.tif 000005
【０１９８】
【表５】
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【０１９９】
【表６】
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【０２００】
【表７】
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【０２０１】
【表８】
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【０２０２】
【表９】
0006669655.tif 000010
【０２０３】
【表１０】
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【０２０４】
【表１１】
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【０２０５】
【表１２】
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【０２０６】
【表１３】
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【０２０７】
ＲＮＡ分子を（短いＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ及び／又はＤｓｉＲＮＡの場合はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から）購入し、又はＰＣＲ増幅された鋳型ＤＮＡの転写によって調製した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを用いてＰＣＲによって既に増幅された設計ＲＮＡの配列をコードする合成ＤＮＡ分子を購入した（参照によりその全体を本明細書に援用する、２０１３年９月６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８４９２号）。ＰＣＲ産物をＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＲＮＡ分子をＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって酵素的に調製した。集合ＲＮＡ  ＮＰ品質管理実験を可視化するために、［３２Ｐ］Ｃｐ標識ＲＮＡ分子を使用した（Ｔ４ＲＮＡリガーゼを使用して、［３２Ｐ］Ｃｐを付着させることによってＲＮＡ分子の３’末端を標識する１９）。最初の放射性標識未変性ＰＡＧＥアッセイの場合、放射性標識ＲＮＡ骨格鎖を連結鎖と個々に混合し、続いて集合手順に従った４。切断機能的制御実験（ｄｉｃｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）の場合、ＲＮＡ分子を同時転写的にα［Ｐ３２］ＡＴＰ本体標識した（ＡＴＰ  ｂｏｄｙ−ｌａｂｅｌｅｄ）。未変性ＰＡＧＥ実験を既述のとおりに実施した２０。一般に、報告した集合実験を、８９ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、ｐＨ８．３、２ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２の存在下で７％（２９：１）未変性ポリアクリルアミドゲル上で１０℃で分析した。Ｈｉｔａｃｈｉ  ＦＭＢＩＯＩＩ  Ｍｕｌｔｉ−Ｖｉｅｗ  Ｉｍａｇｅｒを使用して、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色したＲ／ＤＮＡハイブリッドを可視化した。
【０２０８】
動的光散乱（ＤＬＳ：Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）実験。ＤＬＳのために、６個のＤＳ  ＲＮＡを有する集合済みナノリングを含有する試料溶液１０μｌをＤｙｎａＰｒｏ９９（タンパク質溶液／Ｗｙａｔｔ）によってレーザー波長８２４ｎｍで２４℃で測定した１１。３次元ＣＰＫモデルを測定することによって理論的流体力学半径（Ｒｈ）を計算した。
【０２０９】
組換えヒトダイサーアッセイ。６個のＤＳ  ＲＮＡを有するナノリングを上述したように最終濃度３μＭで調製した。切断実験のために、超活性型のヒト組換えダイサー酵素を含む組換えヒトターボダイサー酵素キット（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）を用いて製造者の示した手順５に従って試料を３７℃で４時間インキュベートした。（上記の）２ｍＭ  Ｍｇ（ＯＡｃ）２未変性７％ＰＡＧＥ上で分析する前に（製造者によって提供された）ダイサー停止液を添加することによって切断反応物をクエンチした。
【０２１０】
マラカイトグリーン（ＭＧ）アプタマー蛍光実験。ＭＧアプタマー機能性ナノリング（最終１μΜ）の蛍光試験すべてを３７℃でインキュベーション中に集合緩衝剤中で実施した。すべての試料で、励起を４２５ｎｍに設定した。最高６個のＭＧアプタマーで機能化されたＲＮＡナノリングの同時転写集合体の場合、一定分量の転写混合物を採取し、ＭＧを各一定分量に添加し（最終１０μΜ）、発光をすばやく測定した。転写混合物によるＭＧの幾らかの退色が経時的に観察された。
【０２１１】
低温電子顕微鏡法（低温ＥＭ）実験。Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ  Ｃｏｐｐｅｒ２００メッシュＲ３．５／１グリッドをアセトンで終夜洗浄した。凍結水和グリッドを調製するために、ＶｉｔｒｏｂｏｔＩＩＩ（ＦＥＩ、オレゴン州ヒルズボロ）を用いて試料２．５μＬをグリッドに塗布し、ブロットし、液体エタンに入れた。電界放出電子銃（ＦＥＧ：ｆｉｅｌｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｇｕｎ）及びエネルギーフィルタを備えたＪＥＭ−２２００ＦＳ（ＪＥＯＬ  Ｉｎｃ．、東京、日本）透過電子低温顕微鏡、並びにＦＥＧ（インカラムエネルギーフィルタ）を備えたＪＥＭ−２０１０Ｆを用いて画像を液体窒素温度（約１００Ｋ）で収集した。ＪＥＭ−２２００ＦＳ及びＪＥＭ−２０１０Ｆは、２００ｋＶで作動し、Ｇａｔａｎ低温ホルダー（モデル６２６）（Ｇａｔａｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州プレザントン）を備える。画像を４ｋ×４ｋＣＣＤカメラ（Ｇａｔａｎ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州プレザントン）によって記録した。２〜５μｍ不足焦点を目標にした有効倍率８３５５５×で試料を画像化した。各画像の総試料曝露を３３ｅ−／Å２ｓｅｃとした。
【０２１２】
低温電子顕微鏡法（低温ＥＭ）再構成。ＲＮＡ粒子をＥＭＡＮ２ボクサーによってボックス化した（ｂｏｘｅｄ）。３Ｄ再構成をＥＭＡＮ２ソフトウェア２１を用いて実施し、ＥＭＡＮ２で実行される多変量統計解析に基づくｅ２ｒｅｆｉｎｅ２ｄ．ｐｙ反復リッファレンスフリーアラインメント（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｒｅｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）２２アルゴリズムを採用した。６回対称性を構造決定のために課した。２つの独立した半セットのデータからフーリエシェル相関（ＦＳＣ）カットオフ０．１４３の最も標準的な判定基準によってマップの解像度を１６Ａであると評価した（シュレス（Ｓｃｈｅｒｅｓ）及びチェン（Ｃｈｅｎ）、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）２０１２年、９、８５３〜４）。マップをＥＭＤＢに寄託した。
【０２１３】
６量体ナノリングモデル。本発明者らのプログラムＮａｎｏＴｉｌｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｌｅｃｂ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／〜ｂｓｈａｐｉｒｏ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌ；ビンデワルド（Ｂｉｎｄｅｗａｌｄ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・グラフィックス・アンド・モデリング（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｇｒａｐｈ  Ｍｏｄｅｌ）２００８年、２７、２９９〜３０８）を利用して構築された６量体リング骨格のモデルとｓｉＲＮＡアームを有する一モノマーの幾つかの代替モデルとを統合することによって６個のＤＳ  ｓｉＲＮＡアームを有する６量体ナノリングのモデルを作成した。プログラムＲＮＡ２Ｄ３Ｄ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｌｅｃｂ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／〜ｂｓｈａｐｉｒｏ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌ；マルティネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）ら、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラ・ストラクチャ・アンド・ダイナミクス（Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｄｙｎ）２００８年、２５、６６９〜８３）、ＭＣＳｙｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｊｏｒ．ｉｒｉｃ．ｃａ／ＭＣ−Ｐｉｐｅｌｉｎｅ／；パリシエン（Ｐａｒｉｓｉｅｎ）及びメージャー（Ｍａｊｏｒ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２００８年、４５２、（７１８３）、５１〜５）及びＲＮＡＣｏｍｐｏｓｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｅｕｔｅｒｐｅ．ｍａｎ．ｐｏｚｎａｎ．ｐｌ／Ｈｏｍｅ；ポペンダ（Ｐｏｐｅｎｄａ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）２０１２年、４０、ｅ１１２）を利用してモノマーモデルを構築した。３つのプログラムはすべて、入力及び出力３Ｄ構造として配列及び二次構造記述子を採用している（ＰＤＢ形式ファイル）。プログラムによって作成された複数のモデルの中から幾つかの代表を、（カスタムスクリプトを用いた）ＰｙＭＯＬ分子グラフィックスシステム（シュレーディンガー（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）、ＬＬＣ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ／）を利用して実施された３Ｄ構造と６量体環の最良（最低）自由エネルギー、最良構造適合の組合せに基づいて選択した。ナノリングの面（ｐｌａｉｎ）に対するｓｉＲＮＡアームの別の配向候補となるモデルも選択した。すべてのモデルをＲＮＡ力場ｆｆ１０を用いたＡｍｂｅｒ１２におけるＧＢＳＡに基づくエネルギー最小化（陰溶媒法）に供して（ケース（Ｃａｓｅ）ら、カリフォルニア大学におけるＡＭＢＥＲ１２：サンフランシスコ、２０１２；エスマン（Ｅｓｓｍａｎｎ）ら、ジャーナル・オブ・ケミカル・フィジックス（Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓ）１９９５年、１０３、８５７７〜９３；ワン（Ｗａｎｇ）ら、ジャーナル・オブ・コンピューテイショナル・ケミストリー（Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ）２０００年、２１、１０４９〜７４）、構造的に改良した。
【０２１４】
低温ＥＭ密度マップへの６量体ナノリングモデルのフィッティング。最後に、低温ＥＭ再構成を想定して、ＵＣＳＦキメラパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｇｌ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｃｈｉｍｅｒａ；ペターセン（Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ）ら、ジャーナル・オブ・コンピューテイショナル・ケミストリー（Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ）２００４年、２５、１６０５〜１２）を密度体積（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｖｏｌｕｍｅ）の最適モデルに使用した。図２ｂに示したフィッティングは、モデルの全原子が体積内部に適合することができる最小レベル（又はモデルの全原子を収容する最大密度レベル）でしきい値処理された体積マップを有する。
【０２１５】
導入実験。機能性ナノリングの送達を分析するために、（ｅＧＦＰを含む、又は含まない）ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、５％ＣＯ２恒温器中の１０％ＦＢＳ及びペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で増殖させた。この計画におけるすべてのインビトロ導入をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌ２Ｋ）を用いて実施した。Ｒ／ＤＮＡハイブリッドの１０×又は５０×溶液を３０℃でＬ２Ｋと一緒にプレインキュベートした。（別段の記載がない限り）すべての導入で、ＤＳ  ＲＮＡ濃度は、６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリングよりも６倍高かった。各導入前に、細胞培地をＯＰＴＩ−ＭＥＭと交換し、調製した１０×又は５０×ＲＮＡ／Ｌ２Ｋ複合体を１×の最終濃度まで添加した。細胞を４時間インキュベートし、続いて培地を変えた（Ｄ−ＭＥＭ、１０％ＦＣＳ、１％ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ）。
【０２１６】
ターゲティング実験では、Ａ４３１細胞をＤＰＢＳ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２で３回洗浄し、２×１０５個の細胞をナノリングＲＮＡ粒子約１７０ｎＭ（最終濃度）の存在下で暗所で３０分間室温でインキュベートした。続いて、細胞をＤＰＢＳ  ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２で３回洗浄し、１０，０００個の細胞をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）フローサイトメータを用いて分析した。データをＦｌｏｗＪｏ＿Ｖ１０ソフトウェアを用いて解析した。ＲｉｂｏＳｈｒｅｄｄｅｒ（商標）リボヌクレアーゼブレンド（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ウィスコンシン州マディソン）を最終濃度約０．０３Ｕ／μＬで添加し、細胞を氷上で維持して、結合ＮＰのエンドソーム取り込みを防止した。ｒＥＧＦ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）及びｒＩｇＧタンパク質（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、メリーランド州ベセズダ）の最終濃度は、それぞれ５００ｎＭ及び１５０ｎＭであった。
【０２１７】
顕微鏡法。細胞における機能性ナノリングの送達を評価するために、６３×、１．４ＮＡ拡大レンズを備えたＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて測定を実施した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をガラス底ペトリ皿（Ｉｂｉｄｉ、ドイツ）中で培養し、上述したようにナノリングを導入した。次いで、細胞の画像を撮影して、試料内のＦＲＥＴの出現を評価した。Ａｌｅｘａ５４６画像化の場合、ＤＰＳＳ５６１レーザーを使用して励起し、５６６から６８０ｎｍの発光を収集した。全画像を１ＡＵ（ａｉｒｙ  ｕｎｉｔ）に調節したピンホールを用いて撮影した。
【０２１８】
エンドソーム共存試験。細胞中に取り込まれた蛍光標識機能性ＲＮＡナノリングのエンドソーム位置を確認するために、エンドソームマーカー（ＥＥＡ１及びＲａｂ７）を用いた共染色実験を実施した（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）２０１３年、８、（４）、２９６〜３０４）。６個のＡｌｅｘａ５４６色素で標識されたＲＮＡ  ＮＰを細胞に導入した。翌日、導入細胞を４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２０分間固定し、その後この温度で取り扱った。試料をＰＢＳで３回洗浄し、次いで０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて２０分間透過処理した。ＰＢＳで３回洗浄後、試料を１％ＢＳＡで１時間ブロックし、次いで初期エンドソーム関連タンパク質ＥＥＡ１（細胞シグナル伝達）に対する、又は後期エンドソームマーカーＲａｂ７（細胞シグナル伝達）に対する一次抗体に暴露した。ＰＢＳで３回洗浄後、試料を二次Ａｌｅｘａ４８８抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。比較として、蛍光標識ＤＳ  ＲＮＡを６倍高い濃度で使用した。
【０２１９】
ＦＲＥＴによって評価した細胞中のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの再会合（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）２０１３年、８、（４）、２９６〜３０４）。全測定を６３×、１．４ＮＡ拡大レンズを備えたＬＳＭ７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。全画像を１ＡＵ（ａｉｒｙ  ｕｎｉｔ）に調節したピンホールを用いて撮影した。蛍光標識ハイブリッドＮＰ及び同種のハイブリッドを個々にＬ２Ｋと一緒にプレインキュベートし、細胞に同時導入した。翌日、試料を４％パラホルムアルデヒド中で室温で２０分間インキュベーションして固定した。次いで、細胞の画像を撮影して、試料内のＦＲＥＴの出現を評価した。Ａｌｅｘａ４８８画像化の場合、アルゴンレーザーの４８８ｎｍ線を使用して励起し、４９３から５５７ｎｍの発光を収集した。Ａｌｅｘａ５４６画像化の場合、ＤＰＳＳ５６１レーザーを使用して励起し、５６６から６８０ｎｍの発光を収集した。ＦＲＥＴによる増感発光を評価するために、画像を撮影し、試料を４８８ｎｍ線で励起し、５６６から６８０ｎｍの発光を収集した。スペクトルが重複していることから、ＦＲＥＴの信号には、受容体チャネル中への供与体発光、及び供与体励起波長による受容体分子の励起が混入している。この裏抜けを、個々の色素を導入した試料を用いて行った測定によって算定し、ＦＲＥＴの画像から数学的に除去した。
【０２２０】
フローサイトメトリー実験。フローサイトメトリー実験による統計解析のために、１２ウェルプレート中で増殖させた（ｅＧＦＰを含む、又は含まない）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ２３１細胞（１０×１０４細胞／ウェル）を細胞解離緩衝剤を用いて取り出し、ＰＢＳで２回洗浄し、ｅＧＦＰの発現レベルをＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析によって求めた。少なくとも３０，０００事象を収集し、細胞探索ソフトウェアによって解析した。
【０２２１】
インビボ実験。動物試験をフレデリック国立癌研究所（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（メリーランド州フレデリック）動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）指針に従って実施した。画像化試験をＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫ようを有する胸腺欠損ヌードマウス（チャールズリバー研究所（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、メリーランド州フレデリック）に対して実施した。腫ようを誘発させるために、ＧＦＰを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＧＦＰヒト乳癌細胞系の単一癌細胞懸濁液をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ：Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中で調製した。７〜９週齢雌性胸腺欠損ヌードマウスの側腹部に１００μＬ  ＨＢＳＳ中１×１０７個の癌細胞を皮下移植した。インビボ送達のために、キム（Ｋｉｍ）ら、モレキュラ・セラピー・ヌクレイック・アシッズ（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）２０１３年、２、ｅ８０に記載のように、ＤＳ  ＲＮＡ及び機能性ナノリングを双頭型両親媒性（ｂｏｌａｓ：ｂｏｌａａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）カチオン性担体に結合させた。柔らかい腫ようが十分成長した後（約１週間）、２匹のマウスにＤＳ  ＲＮＡ（ＰＢＳ注射混合物１００μｌ中３００ｎＭ  ＲＮＡ及び１０μｇ／ｍｌ  ｂｏｌａ）を腫よう内注射し、２匹のマウスに６個のＤＳ  ＲＮＡで機能化されたナノリング（ＰＢＳ注射混合物１００μｌ中５０ｎＭ  ＲＮＡ及び１０μｇ／ｍｌ  ｂｏｌａ）を注射した。１匹の対照マウスに１×ＰＢＳ緩衝剤１００μｌを注射した。５日（１２０時間）後に、マウスを屠殺した。腫ようをマウスから取り出し、４％ＰＦＡ中で４℃で終夜固定し、次いで２０％スクロースに４℃で終夜移行させた。過剰のスクロースを腫ようから吸い取り、腫ようをＯＣＴ化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に包埋した。１０μｍ凍結切片をスライドに載せ、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、次いでＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ａ／Ｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒にしてカバーガラスを載せた。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ８０ｉ顕微鏡、ＱＩｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｔｉｇａ−２０００Ｒカメラ及びＮｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ画像化ソフトウェアを用いて画像を取得した。データを定量化し、所与の視野の総細胞数を基準にした全ＧＦＰシグナルに基づいて示した。体内分布実験のために、注射したＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ｅＧＦＰなし）腫ようが十分成長した後（約２週間）、２匹のマウスの尾静脈に（他の場所に記述された２３）双頭型両親媒性カチオン性担体に結合したｓｉＲＮＡ＿ＩＲＤｙｅ７００及びナノリング＿ＩＲＤｙｅ７００を注射し、１匹の対照マウスに１×ＰＢＳ緩衝剤を注射した。動物に麻酔をかけて（流量１Ｌ／ｍｉｎのＯ２中１〜２％イソフルラン）、蛍光イメージング（Ｍａｅｓｔｒｏ  ＧＮＩＲ−ＦＬＥＸ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ウォバーン）をベースライン（自己蛍光を求めるために注射前）並びに注射後１０分、２０分、３０分、４５分、１時間及び２���間及び３時間目に実施した。動物の内部温度を、走査前、走査中（加熱した画像化テーブル）、及び動物が麻酔から覚醒する画像化後維持した。画像解析（自己蛍光及び造影剤の画像ライブラリー）を製造者の手順（Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェア２．１０．０、ＣＲｉ、マサチューセッツ州ウォバーン）に従って実施した。造影剤のＩＲ波長パラメータのために、画像収集には、励起フィルタ（５９０±１５ｎｍ）、発光フィルタ（６４５ｎｍロングパス）、及び１０ｎｍ刻みで６５０〜８５０ｎｍの多スペクトル取得を利用した。目的領域を様々な器官の周囲で選び、全シグナル（カウント／秒）を異なる時点で回収した。次いで、シグナルを様々な器官の重量によって基準化した。注射時点から３時間後、マウスを安楽死させて（ＡＣＵＣ指針に従ったＣＯ２窒息）、関連する器官（ひ臓、肺、脳、肝臓、腎臓、腸、心臓、腫よう及びぼうこう）の重量、及びインビボ画像取得パラメータを満たす取り込み量を測定した。サイレンシング実験のために、注射したＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ｅＧＦＰ腫ようが十分成長した後（約１週間）、２匹のマウスの腫よう内に（他の場所に記述された）双頭型両親媒性カチオン性担体に結合したｓｉＲＮＡ及び６個のｓｉＲＮＡを有するナノリングを注射し、１匹の対照マウスに１×ＰＢＳ緩衝剤を注射した。５日（１２０時間）後に、マウスを屠殺した。腫ようをマウスから取り出し、４％ＰＦＡ中で４℃で終夜固定し、次いで２０％スクロースに４℃で終夜移行させた。過剰のスクロースを腫ようから吸い取り、腫ようをＯＣＴ化合物（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）に包埋した。１０μｍ凍結切片をスライドに載せ、ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、次いでＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ａ／Ｆａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と一緒にしてカバーガラスを載せた。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ８０ｉ顕微鏡、ＱＩｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｔｉｇａ−２０００Ｒカメラ及びＮｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ＡＲ画像化ソフトウェアを用いて画像を取得した。
【０２２２】
細胞生存率アッセイ。細胞を実験の２４時間前に９６ウェルプレート中の血清添加培地に密度１０，０００細胞／ウェルで播いた。試料を無血清培地中の細胞に３つ組で添加し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、無血清培地を血清添加培地で置換した。異なる時点において、製造者の手順に従って、細胞タイターブルー試薬を各ウェルに添加し、細胞を３７℃で３時間更にインキュベートした。（生細胞によってレサズリンから転化された）レゾルフィン（ｒｅｓｏｆｕｒｉｎ）の蛍光を、蛍光ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）において自動カットオフを用いてλｅｘ５６０ｎｍ及びλｅｍ５９０ｎｍで測定した。
【０２２３】
機能性ナノリングによるＨＩＶ−１阻害。ＨＩＶ−１の阻害を試験するために、６個のダイサー基質（ＤＳ）ＲＮＡで機能化されたナノリングによって媒介される遺伝子発現を、ＨＩＶ−１ゲノムの複数の領域に対して選択した。細胞内部のダイサーによる開裂後、これらのｓｉＲＮＡは、ＨＩＶ−１遺伝子発現及びウイルス粒子産生を抑制することができた。ナノリングＡは、プライマー結合部位（ＰＢＳ：ｐｒｉｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）−マトリックス（ＰＢＳ−ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）、表面エンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）及びＮｅｆにおけるＨＩＶ−１ゲノムを標的にした。ナノリング構築物Ｂは、ＰＢＳマトリックス（ＰＢＳ−ＭＡ）、カプシド（ＣＡ）、プロテアーゼ（ＰＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）、Ｎｅｆ及びＲｅｖ−ＴａｔにおけるＨＩＶ−１ゲノムを標的にした。Ｒｅｖは、発現ビリオンタンパク質の制御因子（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｉｒｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を表す。Ｔａｔは、転写のトランス活性化因子（Ｔｒａｎｓ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を表し、Ｎｅｆは、負の因子（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｆａｃｔｏｒ）を表す。ナノリング構築物Ａ及びＢのノックダウンを確認するために、個々のＤＳ  ＲＮＡの対応する混合物を使用した。負の対照として、細胞タンパク質ＧＳＴＰ１に対するＤＳ  ＲＮＡの６個のコピーを含むナノリングを使用した（アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）２０１３年、８、（４）、２９６〜３０４；アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ）ら、アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ（Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ）２０１４年）。Ｈｅｌａ細胞にＷＴ  ＨＩＶ−１分子クローン、ｐＮＬ４−３、ｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−１（ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター、Ｐｒｏｍｅｇａ）及び機能性ナノリング又はＤＳ混合物をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて同時導入した。導入から４８時間後、上清を収集し、逆転写酵素（ＲＴ）活性をインビトロ反応において測定した（フリード（Ｆｒｅｅｄ）及びマーチン（Ｍａｒｔｉｎ）、ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ）１９９４年、６８、（４）、２５０３〜１２）。ＲＴ活性レベルは、放出ウイルス量に正比例した。ウイルスタンパク質発現をウエスタンブロット法によって分析した。細胞を１×ウミシイタケ溶解緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて製造の手順に従って溶解した。タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、半乾燥エレクトロブロッティングによってポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。膜を一次抗体（ＨＩＶ−１感染者由来のプール免疫グロブリン、ＨＩＶ−Ｉｇ；ＮＩＨエイズ研究及び基準試薬プログラム（ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ））で４℃で終夜プローブし、洗浄し、次いでヒト特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化二次抗体と一緒に１時間インキュベートした。次いで、膜をＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓ���  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と一緒にインキュベートした。室温でインキュベーション後、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈｏｏｄ  ＩＩ（Ｂｉｏｒａｄ）中の電荷結合装置に膜を暴露した。定量化をＩｍａｇｅＬａｂソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて実施した。総ＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質を測定し（５５ｋＤａ  Ｇａｇ前駆体＋マトリックス／カプシドｐ４１＋カプシド、カプシド／ＳＰ１  ｐ２４／ｐ２５）、値を（ｐＮＬ４−３を同時導入されたｓｉＲＮＡのない）ウイルス対照に対して基準化した。非導入細胞溶解物ではシグナルが検出されなかった（データ示さず）。Ｎ＝４。
【０２２４】
均等物
当業者は、本明細書に記載した発明の具体的実施形態の多数の均等形態を、単なる定常的な実験によって認識するはずであり、又は確認することができるはずである。かかる均等形態も、以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【０２２５】
参照による援用
本明細書に引用した出願及び特許の各々、並びに（各発行済み特許の手続中を含めた）出願及び特許の各々に引用された各文献又は参考文献（「出願引用文献」）、並びにこれらの出願及び特許のいずれかに対応する、及び／又はその優先権を主張するＰＣＴ及び外国出願又は特許の各々、並びに出願引用文献の各々に引用又は参照された文献の各々を、明確に参照により本明細書に援用する。より一般的には、文献又は参考文献は、本明細書において、特許請求の範囲の前の参考文献リスト、又は本明細書それ自体に引用されている。これらの文献又は参考文献（「本明細書引用参考文献」）の各々、並びに（任意の製造者の仕様書、説明書などを含めた）本明細書引用参考文献の各々に引用された各文献又は参考文献を、明確に参照により本明細書に援用する。
【０２２６】
参考文献
以下の特定の参考文献は、参照によっても本明細書に援用され、上では対応する参照番号によって示されている。
１．リ（Ｌｉ），Ｎ．ら、「アプタマーを用いた細胞分類に関連する技術的及び生物学的問題（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｓｓｕｅｓ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａｐｔａｍｅｒｓ）」、ジャーナル・オブ・プロテオーム・リサーチ（Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ）８、２４３８〜２４４８（２００９年）。
２．リ（Ｌｉ），Ｎ．、ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ），Ｔ．、グエン（Ｎｇｕｙｅｎ），Ｈ．Ｈ．、ソコロフ（Ｓｏｋｏｌｏｖ），Ｋ．Ｖ．＆エリントン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ），Ａ．Ｄ．「細胞への金ナノ粒子送達の定向進化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ）」、ケミカル・コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）（ケンブリッジ、英国）４６、３９２〜３９４（２０１０年）。
３．リ（Ｌｉ），Ｎ．、グエン（Ｎｇｕｙｅｎ），Ｈ．Ｈ．、バイロム（Ｂｙｒｏｍ），Ｍ．＆エリントン（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ），Ａ．Ｄ．「抗ＥＧＦＲアプタマーによる細胞増殖の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＥＧＦＲ  ａｐｔａｍｅｒ）」、プロス・ワン（ＰｌｏＳ  ｏｎｅ）６、ｅ２０２９９（２０１１年）。
４．アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ），Ｋ．Ａ．ら、「自動ナノ医療用ｓｉＲＮＡ機能化ＲＮＡナノ粒子の設計及び自己集合（Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、ネイチャー・プロトコル（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ）６、２０２２〜２０３４（２０１１年）。
５．グラボー（Ｇｒａｂｏｗ），Ｗ．Ｗ．ら、「ＲＮＡＩ／ＩＩ逆キッシング複合体に基づく自己集合ＲＮＡナノリング（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ＲＮＡ  ｎａｎｏｒｉｎｇｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＲＮＡＩ／ＩＩ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｋｉｓｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」、ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ）１１、８７８〜８８７（２０１１年）。
６．ローズ（Ｒｏｓｅ），Ｓ．Ｄ．ら、「機能的極性は、短い基質ＲＮＡのダイサープロセシングによって導入される（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｉｓ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｄｉｃｅｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＲＮＡ）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）３３、４１４０〜４１５６（２００５）。
７．アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ），Ｋ．Ａ．、ダニロフ（Ｄａｎｉｌｏｖ），Ｅ．Ｏ．、ノビコワ（Ｎｏｖｉｋｏｖａ），Ｉ．Ｖ．＆レオンティス（Ｌｅｏｎｔｉｓ），Ｎ．Ｂ．、「ＴｏｋｅｎＲＮＡ：折り畳みＲＮＡ分子用の新しいタイプの配列特異的無標識蛍光バイオセンサ（ＴｏｋｅｎＲＮＡ：  ａ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｆｏｌｄｅｄ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、ケムバイオケム（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ）９、１９０２〜１９０５（２００８年）。
８．グレート（Ｇｒａｔｅ），Ｄ．＆ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ），Ｃ．、「ＲＮＡ転写物のレーザー媒介部位特異的不活性化（Ｌａｓｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ，  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）」、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）９６、６１３１〜６１３６（１９９９年）。
９．コルパシチコフ（Ｋｏｌｐａｓｈｃｈｉｋｏｖ），Ｄ．Ｍ．、「核酸の蛍光検出用バイナリーマラカイトグリーンアプタマー（Ｂｉｎａｒｙ  ｍａｌａｃｈｉｔｅ  ｇｒｅｅｎ  ａｐｔａｍｅｒ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ）１２７、１２４４２〜１２４４３（２００５）。
１０．ストヤノビッチ（Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ），Ｍ．Ｎ．＆コルパシチコフ（Ｋｏｌｐａｓｈｃｈｉｋｏｖ），Ｄ．Ｍ．、「モジュラーアプタマーセンサ（Ｍｏｄｕｌａｒ  ａｐｔａｍｅｒｉｃ  ｓｅｎｓｏｒｓ）」、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ）１２６、９２６６〜９２７０（２００４年）。
１１．アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ），Ｋ．Ａ．ら、「コンピュータで設計された立方体ＲＮＡ骨格のインビトロ構築（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｕｂｉｃ  ＲＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）」、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）５、６７６〜６８２（２０１０年）。
１２．アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ），Ｋ．Ａ．ら、「ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの再会合に対する異なる分割機能部の活性化（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｐｌｉｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ  ｏｎ  ｒｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｓ）」、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）８、２９６〜３０４（２０１３年）。
１３．シュ（Ｓｈｕ），Ｄ．、シュ（Ｓｈｕ），Ｙ．、ハク（Ｈａｑｕｅ），Ｆ．、アブデルマウラ（Ａｂｄｅｌｍａｗｌａ），Ｓ．＆グオ（Ｇｕｏ），Ｐ．「治療剤送達用多機能ナノ粒子を構築するための熱力学的に安定なＲＮＡ三方向接合部（Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ＲＮＡ  ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）６、６５８〜６６７（２０１１年）。
１４．チャン（Ｃｈａｎｇ），Ｃ．Ｉ．ら、「三脚ＲＮＡ構造によって誘発された細胞内送達及び多標的遺伝子サイレンシングの増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｂｙ  ｔｒｉｐｏｄａｌ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」、ジャーナル・オブ・ジーン・メディスン（Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ）１４、１３８〜１４６（２０１２）。
１５．リー（Ｌｅｅ），Ｙ．Ｓ．ら、「小ＲＮＡによるサイレンシングは、エンドソーム輸送と関連する（Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ｉｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）」、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）１１、１１５０〜１１５６（２００９年）。
１６．セン（Ｓｅｎ），Ｇ．Ｌ．＆ブラウ（Ｂｌａｕ），Ｈ．Ｍ．、「アルゴノート２／ＲＩＳＣは、細胞質体として知られるほ乳動物ｍＲＮＡ分解部位に存在する（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ  ２／ＲＩＳＣ  ｒｅｓｉｄｅｓ  ｉｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍＲＮＡ  ｄｅｃａｙ  ｋｎｏｗｎ  ａｓ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｂｏｄｉｅｓ）」、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）７、６３３〜６３６（２００５）。
１７．ナカシマ（Ｎａｋａｓｈｉｍａ），Ｙ．、アベ（Ａｂｅ），Ｈ．、アベ（Ａｂｅ），Ｎ．、アイカワ（Ａｉｋａｗａ），Ｋ．＆イトウ（Ｉｔｏ），Ｙ．、「ＲＮＡ干渉用分岐ＲＮＡナノ構造体」、ケミカル・コミュニケーションズ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）（ケンブリッジ、英国）（２０１１年）。
１８．チャン（Ｚｈａｎｇ），Ｈ．、コルブ（Ｋｏｌｂ），Ｆ．Ａ．、ブロンダニ（Ｂｒｏｎｄａｎｉ），Ｖ．、ビリー（Ｂｉｌｌｙ），Ｅ．＆フィリポウィッチ（Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ），Ｗ．、「ヒトダイサーは、ＡＴＰを必要とせずに、ｄｓＲＮＡをその末端で優先的に切断する（Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｃｅｒ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｄｓＲＮＡ  ａｔ  ｔｈｅｉｒ  ｔｅｒｍｉｎｉ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＡＴＰ）」、エンボ・ジャーナル（Ｅｍｂｏ  Ｊ）２１、５８７５〜５８８５（２００２年）。
１９．アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ），Ｋ．Ａ．、シープライ（Ｃｉｅｐｌｙ），Ｄ．Ｊ．＆レオンティス（Ｌｅｏｎｔｉｓ），Ｎ．Ｂ．、「最小並行モチーフによる特異的ＲＮＡ自己集合（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｗｉｔｈ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｐａｒａｎｅｍｉｃ  ｍｏｔｉｆｓ）」、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ）１３０、９３〜１０２（２００８年）。
２０．アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ），Ｋ．Ａ．＆レオンティス（Ｌｅｏｎｔｉｓ），Ｎ．Ｂ．、「Ｃループを用いた新しい特異的ＲＮＡ相互作用インターフェースの生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｎｅｗ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃ−ｌｏｏｐｓ）」、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイアティー（Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ）１２８、１６１３１〜１６１３７（２００６年）。
２１．タン（Ｔａｎｇ），Ｇ．ら、「ＥＭＡＮ２：電子顕微鏡法用の拡張可能な画像処理スイート（ＥＭＡＮ２：ａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ  ｉｍａｇｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ  ｆｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）」、ジャーナル・オブ・ストラクチャル・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）１５７、３８〜４６（２００７）。
２２．ワカバヤシ（Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ），Ｈ．、バルファジ（Ｖａｒｆａｊ），Ｆ．、ディーンゲリス（Ｄｅａｎｇｅｌｉｓ），Ｊ．＆フェイ（Ｆａｙ），Ｐ．Ｊ．、「Ａ２領域界面におれる荷電残基の置換による高安定因子ＶＩＩＩ変異体の生成（Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｂｙ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈａｒｇｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ａ２  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）」、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）１１２、２７６１〜２７６９（２００８年）。
２３．キム（Ｋｉｍ），Ｔ．ら、「コンピュータ、インビトロ及びインビボ試験は、治療用ｓｉＲＮＡ送達のための双頭型両親媒性物質の使用可能性を示している（Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ，  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｉｎｄｉｃａｔｅ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｏｌａａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、モレキュラ・セラピー・ヌクレイック・アシッズ（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）２、ｅ８０（２０１３年）。
２４．アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ），Ｋ．Ａ．ら、「自動ナノ医療用ｓｉＲＮＡ機能化ＲＮＡナノ粒子の設計及び自己集合（Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、ネイチャー・プロトコル（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ）６、２０２２〜２０３４（２０１１年）。
２５．ローズ（Ｒｏｓｅ），Ｓ．Ｄ．ら、「機能的極性は、短い基質ＲＮＡのダイサープロセシングによって導入される（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｉｓ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｄｉｃｅｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｓｈｏｒｔ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＲＮＡ）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）３３、４１４０〜４１５６（２００５）。
２６．アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ），Ｋ．Ａ．、ダニロフ（Ｄａｎｉｌｏｖ），Ｅ．Ｏ．、ノビコワ（Ｎｏｖｉｋｏｖａ），Ｉ．Ｖ．＆レオンティス（Ｌｅｏｎｔｉｓ），Ｎ．Ｂ．、「ＴｏｋｅｎＲＮＡ：折り畳みＲＮＡ分子用の新しいタイプの配列特異的無標識蛍光バイオセンサ（ＴｏｋｅｎＲＮＡ：  ａ  ｎｅｗ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ，  ｌａｂｅｌ−ｆｒｅｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｆｏｌｄｅｄ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」、ケムバイオケム（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ）９、１９０２〜１９０５（２００８年）。
２７．グレート（Ｇｒａｔｅ），Ｄ．＆ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ），Ｃ．、「ＲＮＡ転写物のレーザー媒介部位特異的不活性化（Ｌａｓｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ，  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ）」、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）９６、６１３１〜６１３６（１９９９年）。
２８．リ（Ｌｉ），Ｎ．ら、「アプタマーを用いた細胞分類に関連する技術的及び生物学的問題（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｓｓｕｅｓ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａｐｔａｍｅｒｓ）」、ジャーナル・オブ・プロテオーム・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）８、２４３８〜２４４８（２００９年）。
２９．ロウ（Ｌｏｗ），Ｊ．Ｔ．ら、「ＨＩＶ−１の強力なｓｈＲＮＡ阻害剤のＳＨＡＰＥによる発見（ＳＨＡＰＥ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｈＲＮＡ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＨＩＶ−１）」、モレキュラ・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）２０、８２０〜８２８（２０１２）。
３０．アフォニン（Ａｆｏｎｉｎ），Ｋ．Ａ．ら、「ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの再会合に対する異なる分割機能部の活性化（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｐｌｉｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ  ｏｎ  ｒｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ−ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｓ）」、ネイチャー・ナノテクノロジー（Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ）８、２９６〜３０４。
３１．シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）Ｂら、「ナノ構造設計の方法及び手順（Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、ニュージャージー州トトワ、フマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、２００８年、ｐ．９３〜１１５の「ＲＮＡナノ構造体のコンピュータ設計手順（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」［本の一章］
３２．ビンデワルド（Ｂｉｎｄｅｗａｌｄ）ら、「ＮａｎｏＴｉｌｅｒを用いた構成要素からのＲＮＡナノスケール構造の自動設計のためのコンピュータ戦略（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｌｏｃｋｓ  ｕｓｉｎｇ  ＮａｎｏＴｉｌｅｒ）」、ジャーナル・オブ・モレキュラ・グラフィックス・アンド・モデリング（Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．Ｍｏｄｅｌ．）２７（３）：２９９〜３０８、２００８年。
３３．シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）ＢＡら、「ＲＮＡナノ構造体のコンピュータ設計手順（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」、メソッズ・イン・モレキュラ・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）４７４：９３〜１１５、２００８年。
３４．マルティネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）ＨＭら、「ＲＮＡ２Ｄ３Ｄ：ＲＮＡの３次元モデルを作成し、観察し、比較するためのプログラム（Ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ，  Ｖｉｅｗｉｎｇ，  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ３−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ＲＮＡ）」、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラ・ストラクチャ・アンド・ダイナミクス（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．）２５：６６９〜８３、２００８年。［雑誌］
３５．ビンデワルド（Ｂｉｎｄｅｗａｌｄ）Ｅら、「ＲＮＡ接合部：３次元構造解析及びナノ設計のためのＲＮＡ接合部及びキッシングループのデータベース（ＲＮＡＪｕｎｃｔｉｏｎ：  ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｋｉｓｓｉｎｇ  ｌｏｏｐｓ  ｆｏｒ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｎａｎｏｄｅｓｉｇｎ）」、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）３６：Ｄ３９２〜７、２００８年。
３６．イングリング（Ｙｉｎｇｌｉｎｇ）ＹＧら、「ＲＮＡ六角形ナノリング及びＲＮＡナノチューブのコンピュータ設計（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ  Ｈｅｘａｇｏｎａｌ  Ｎａｎｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎ  ＲＮＡ  Ｎａｎｏｔｕｂｅ）」、ナノ・レターズ（Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．）７（８）：２３２８〜２３３４、２００７年。全文論文。
３７．ヘイスティングズ（Ｈａｓｔｉｎｇｓ）Ｗら、「ナノ構造設計のためのＲＮＡ一塩基バルジの構造的及び動力学的分類（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｓｅ  ｂｕｌｇｅｓ  ｆｏｒ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｄｅｓｉｇｎ）」、ジャーナル・オブ・コンピューテイショナル・アンド・セオレティカル・ナノサイエンス（Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｔｈｅｏｒ．Ｎａｎｏｓｃｉｅｎｃｅ）３：６３〜７７、２００６年。
３８．パリー（Ｐａｌｉｙ）Ｍら、「ＲＮＡリングナノ構造体の分子動力学的研究：自己安定化の現象（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｒｉｎｇ  ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：  ａ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）」、フィジカル・バイオロジー（Ｐｈｙｓ  Ｂｉｏｌ．）６（４）：４６００３、２００９年。
【図１ａ】
0006669655.tif 000015
【図１ｂ】
0006669655.tif 000016
【図１ｃ】
0006669655.tif 000017
【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図１ｇ】
0006669655.tif 000021
【図１ｈ】
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【図２ａ】
0006669655.tif 000023
【図２ｂ】
0006669655.tif 000024
【図３ａ】
0006669655.tif 000025
【図３ｂ】
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【図３ｃ】
0006669655.tif 000027
【図３ｄ】
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【図４ａ】
0006669655.tif 000029
【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
0006669655.tif 000039
【図９ｃ】
0006669655.tif 000040
【図９ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１２ｇ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１４ｄ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１８】
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