(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地に対して０．０５％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の添加量のアミノ酸の存在下で納豆菌を培養して、ナットウキナーゼを生産する方法であって、
前記アミノ酸が、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、トレオニン、チロシン、グルタミンのＬ体、フェニルアラニン、リジン、プロリン、アスパラギン、イソロイシン、メチオニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン酸、ロイシン、トレオニン、トリプトファン、アラニンのＤ体、グリシンのうち少なくとも１つであることを特徴とするナットウキナーゼの生産方法。
【請求項２】
請求項１に記載のナットウキナーゼの生産方法であって、
前記Ｄ体のアミノ酸のうち少なくとも１つの存在下で納豆菌を培養して、ナットウキナーゼを生産することを特徴とするナットウキナーゼの生産方法。
【請求項３】
請求項１に記載のナットウキナーゼの生産方法であって、
前記アミノ酸が、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファンのＬ体、フェニルアラニン、リジン、プロリン、アスパラギン、イソロイシン、メチオニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン酸のＤ体のうち少なくとも１つであることを特徴とするナットウキナーゼの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナットウキナーゼの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナットウキナーゼは納豆菌（Bacillus subtilis natto）が産生する酵素であり、その構造もよく知られている（例えば、非特許文献１−３参照）。これまでに、ナットウキナーゼを精製し、工業化に成功したことが報告されている（例えば、特許文献１参照）。現在、ナットウキナーゼは、強力な血栓溶解効果または血圧安定効果等を有することから、臨床でも使用されている（例えば、非特許文献４−６参照）。
【０００３】
このように有用なナットウキナーゼの生産性を高めることが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特公平８−１３２７１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】H. Sumi, H. Hamada, H. Tsushima, H. Mihara, H. Muraki, A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean in food of the Japanese diet, Experientia, 43, 1110-1111, 1987
【非特許文献２】Y. Yanagisawa, T. Chatake, K. Chiba, S. Naito, T. Ohsugi, H. Sumi, I. Yasuda and Y. Morimoto, Purification, crystallization and preliminary X-ray diffraction experiment of nattokinase from Bacillus subtilis natto, Acta. Cryst. F66, 1670-1673, 2010
【非特許文献３】Y. Yanagisawa, T. Chatake, S.Naito, T.Ohsugi, C.Yatagai, H. Sumi, A. Kawaguchi, K. Chiba-Kamosida, M. Ogawa, T. Adachi, and Y. Morimoto, X-ray structure determination and deuteration of nattokinase, J Synchrotron Radiat. 20(Pt 6): 875-879 (2013)
【非特許文献４】H. Sumi, H. Hamada, H. Nakanishi and H. Hiratani, Enhancement of fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase, Acta. Haematol., 84, 139-143, 1990
【非特許文献５】須見洋行，第4章  納豆の食品機能性に関する研究  1．ナットウキナーゼ，第11章  ナットを利用した新商品開発  3．ナットウキナーゼ製剤，納豆の化学，p.53-57，p.244-245，建帛社，東京，2008
【非特許文献６】須見洋行，大豆と日本人の健康，第1章  納豆，p.66-79，幸書房，東京，2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性を高めることが可能な、ナットウキナーゼの生産方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、液体培地に対して０．０５％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の添加量のアミノ酸の存在下で納豆菌を培養して、ナットウキナーゼを生産する方法であって、前記アミノ酸が、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、トレオニン、チロシン、グルタミンのＬ体、フェニルアラニン、リジン、プロリン、アスパラギン、イソロイシン、メチオニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン酸、ロイシン、トレオニン、トリプトファン、アラニンのＤ体、グリシンのうち少なくとも１つである、ナットウキナーゼの生産方法である。
【０００９】
前記ナットウキナーゼの生産方法において、前記Ｄ体のアミノ酸のうち少なくとも１つの存在下で納豆菌を培養して、ナットウキナーゼを生産することが好ましい。
【００１０】
前記ナットウキナーゼの生産方法において、前記アミノ酸が、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファンのＬ体、フェニルアラニン、リジン、プロリン、アスパラギン、イソロイシン、メチオニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン酸のＤ体のうち少なくとも１つであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のナットウキナーゼの生産方法によれば、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１における、各種アミノ酸添加によるフィブリン平板溶解活性（１％Ｌ体アミノ酸、３７℃、１４日培養）を示す写真である。
【図２】実施例１における、各種アミノ酸添加によるフィブリン平板溶解活性（１％Ｌ体アミノ酸、３７℃、１４日培養）を示すグラフである。
【図３】実施例１における、各種アミノ酸添加による合成基質分解活性（１％Ｌ体アミノ酸種添加、３７℃、７日培養）を示すグラフである。
【図４】実施例２における、各種アミノ酸添加によるフィブリン溶解活性（１％Ｄ体アミノ酸添加、４１℃、７日培養）を示す写真である。
【図５】実施例２における、各種アミノ酸添加によるフィブリン平板溶解活性（１％Ｄ体アミノ酸添加、４１℃、７日培養）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００１５】
本実施形態に係るナットウキナーゼの生産方法は、アミノ酸の存在下で納豆菌を培養して、ナットウキナーゼを生産する方法である。
【００１６】
アミノ酸の存在下で納豆菌を培養することによって、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性を高めることが可能となる。幾つかの培養実験でグリセロールが添加効果を示すことはこれまで知られていたが、このアミノ酸の添加効果は従来、全く知られていなかった。
【００１７】
納豆菌は、学名：Bacillus subtilis nattoであり、一般的には納豆の製造に利用される菌である。ナットウキナーゼは、納豆菌が大豆（Soybean）から生産する血栓溶解（線溶）酵素であり、その分子構造は２７５残基が一本鎖でつながったポリペプチドである（分子量２７，７２４、ｐＩ８．７）。
【００１８】
アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン等のアミノ酸のＬ体またはＤ体、不斉炭素を持たないグリシン等のアミノ酸が挙げられる。これらのうち、１つを用いても、２つ以上を用いてもよい。これらのアミノ酸のうち、特に、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファンのＬ体アミノ酸、フェニルアラニン、リジン、プロリン、アスパラギン、イソロイシン、メチオニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン酸のＤ体アミノ酸が、フィブリン平板法による評価で、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性がより高いため、好ましい。また、特に、アスパラギン、ロイシン、プロリン、トレオニン、アルギニン、バリン、セリンのＬ体アミノ酸が、合成基質法による評価で、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性がより高いため、好ましい。また、Ｄ体アミノ酸はフィブリン平板法による評価でＬ体アミノ酸に比べてナットウキナーゼの生産性が高いため、好ましい。
【００１９】
アミノ酸の添加量は、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性を高めることができればよく、特に制限はないが、例えば、液体培地に対して、０．０５％〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲であり、０．１％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲であることが好ましく、０．１％〜０．５％（ｗ／ｖ）の範囲であることがより好ましい。アミノ酸の添加量が液体培地に対して、０．０５％（ｗ／ｖ）未満であると、アミノ酸非添加培地の方が活性が高くなる場合があり、１％（ｗ／ｖ）を超えると、アミノ酸添加培地の方が活性が低くなる場合がある。
【００２０】
納豆菌の培養に用いる培地としては、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性を高めることができればよく、特に制限はないが、例えば、乾燥ブイヨン培地、ハイポリペプトンＳ培地等が挙げられる。培地中の主原料に脱脂大豆を使用していることや納豆菌が大豆に繁殖しやすいこと等から、ハイポリペプトンＳ培地が好ましい。
【００２１】
培養温度は、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性を高めることができればよく、特に制限はないが、例えば、３２℃〜５０℃の範囲であり、好ましくは、３７℃〜４５℃の範囲であり、より好ましくは、３７℃〜４２℃の範囲である。培養温度が３２℃未満であると、納豆菌の増殖が悪くなり、ナットウキナーゼの生産性に影響を及ぼす場合があり、５０℃を超えると、ナットウキナーゼ活性の減少が認められる場合がある。
【００２２】
培養時間は、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性を高めることができればよく、特に制限はないが、例えば、７２時間〜１４４時間の範囲であり、好ましくは、９６時間〜１２４時間の範囲である。培養時間が７２時間未満であると、納豆菌の生育不足からナットウキナーゼ生産量に期待できない場合があり、１４４時間を超えると、最大の生産量を超え、自己消化によってナットウキナーゼ活性が低下する場合がある。
【００２３】
培養のｐＨは、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性を高めることができればよく、特に制限はないが、例えば、５．５〜９．５の範囲であり、好ましくは、６．５〜９．５の範囲であり、より好ましくは６．５〜８．０の範囲である。培養のｐＨが５．５未満であると、ナットウキナーゼの生産量が少ない場合があり、８．０を超えると、コントロールのナットウキナーゼ活性に比べて生産性が増加している場合がある。
【００２４】
培養方法は、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性を高めることができればよく、特に制限はないが、例えば、振とう培養、静置培養等である。
【００２５】
培地には、例えば、グリセロール、スクロース、他のアミノ酸等を添加してもよい。
【００２６】
得られたナットウキナーゼを、疎水クロマトグラフィ、陰イオンクロマトグラフィ、または、ゲルろ過クロマトグラフィ等により、精製してもよい。
【００２７】
ナットウキナーゼの生産性は、フィブリン平板法で評価される血栓溶解活性、合成基質法で評価される分解活性、二重免疫拡散法で評価される抗原性等の指標で表すことができる。本実施形態に係るナットウキナーゼの生産方法により、フィブリン平板法で評価される血栓溶解活性を最大で８倍以上にすることができる。合成基質法で評価される分解活性を３．５倍以上にすることができる。二重免疫拡散法で培養によってナットウキナーゼが生産されたことを証明することができる。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。なお、％は全て重量／体積（ｗ／ｖ）％を表す。
【００２９】
＜実施例１および比較例１＞
［培養方法］
２％ハイポリペプトンＳ−３％グリセロールに各アミノ酸が１％になるよう添加し、ｐＨ７．０に調整した培地を用いた。前培養はスラント培養した納豆菌（Bacillus subtilis natto）をスタータとして用い、３７℃で７日、１４日間、１，２００ｒｐｍで振とう培養した。なお、Ｌ体アミノ酸非添加のものをコントロールとした（比較例１）。
【００３０】
アミノ酸としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンのＬ体とグリシンを用いた。
【００３１】
［フィブリン平板法］
培養後のサンプルについて、血栓溶解活性をフィブリン平板法（例えば、非特許文献１参照）により測定した。０．５％フィブリノーゲン溶液（０．１７Ｍホウ酸−生食緩衝液：ｐＨ７．８)１０ｍＬと５０Ｕ／ｍＬのトロンビン５００μＬを用いて平板を作製し、試料３０μＬをのせ、３７℃でインキュベーションし、１，４，１８時間後に生じる溶解面積（長径×短径：ｍｍ２)を測定した。
【００３２】
［合成基質法］
合成基質Ｉ（Bz-Ile-Glu-(OR)-Gly-Arg-pNA（Ｓ−２２２２）：積水メディカル）を用いて分解活性を測定した（例えば、非特許文献１、および、須見洋行、「ナットウキナーゼの合成アミドに対する基質特異性、並びにキニン産生能（血圧降下、循環改善）」、和光純薬時報, 78, 7-9, 2010参照）。合成基質はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し５×１０−３Ｍのものを用いた。０．１７Ｍホウ酸−生食緩衝液（ｐＨ７．８）を用いた反応系で、３７℃、１分間に１μｍｏｌのｐＮＡが生成する酵素活性を、ナットウキナーゼ１国際単位（ＩＵ：International Unit）とした。また、合成基質ＩＩ（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA：Sigma）を用いて同様に活性を測定し、合成基質Ｉを用いたときの活性と比較した。
【００３３】
［二重免疫拡散法］
純化したナットウキナーゼに対する抗血清は、Freund's complete adjuvantを用い家兎（New Zealand White）に皮下注射し、Kekwickに基づきγ−グロブリンを調製した。二重免疫拡散法（Ouchterlony法）は常法通りに行った（須見洋行、大杉忠則、矢田貝智恵子、内藤佐和、丸山眞杉、斉藤丈介、「納豆菌と枯草菌の違いはナットウキナーゼ分子の有無で判別可能」、薬理と臨床, 19, 255-260, 2009）参照）。
【００３４】
（結果）
［フィブリン平板法の結果］
実施例１の１％Ｌ体アミノ酸添加、３７℃で１４日培養したサンプルについて、フィブリン平板法で調べた結果の写真を図１に、比較のグラフを図２に示す。その結果、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、トレオニン、グルタミンのＬ体を添加した場合、特に、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファンのＬ体を添加した場合、コントロールに比べて血栓溶解活性が高いことが確認された。最も高いアミノ酸（ヒスチジン）では血栓溶解活性はコントロールの約２倍以上に達し、はるかに活性が高いことがわかった（図１，２参照）。アミノ酸の添加効果は、より短い７日間培養でも見られた。
【００３５】
［合成基質法および二重免疫拡散法の結果］
フィブリン平板法よりもさらに線溶酵素に特異的とされる合成基質を用いてその分解能を調べた。結果を図３に示す。その結果、アスパラギン、ロイシン、プロリン、トレオニン、アルギニン、バリン、セリン、アラニン、リジン、トリプトファン、グルタミン酸、チロシン、ヒスチジンのＬ体、グリシンを添加した場合、コントロールに比べて合成基質（Ｉ）に対する分解能が高まることがわかった。アスパラギン、ロイシン、プロリン、トレオニン、アルギニン、バリン、セリン、アラニン、リジンのＬ体、グリシンを添加した場合、コントロールに比べて合成基質（Ｉ）に対する分解能が１．５倍以上高まり、アスパラギン、ロイシン、プロリン、トレオニン、アルギニン、バリンのＬ体を添加した場合には、コントロールに比べて合成基質（Ｉ）に対する分解能が２倍以上高まることがわかった。また、添加効果が認められたフェニルアラニンの場合、合成基質ＩＩ（Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA）を用いたときの活性に対する合成基質Ｉを用いたときの活性（活性比Ｉ／ＩＩ）は約２倍を示し、ナットウキナーゼを生じていると思われた。さらに、二重免疫拡散法で抗原性を同じくしていたことから見ても、培養液中にナットウキナーゼを生じたことが確認された。
【００３６】
＜実施例２および比較例２＞
上記アミノ酸のＤ体を用い、４１℃で７日、１４日間、１，２００ｒｐｍで振とう培養した以外は、実施例１と同様にして、培養を行った。培養後のサンプルについて、実施例１と同様にして、フィブリン平板法による評価を行った。なお、Ｄ体アミノ酸非添加のものをコントロールとした（比較例２）。
【００３７】
実施例２の１％Ｄ体アミノ酸添加、４１℃で７日培養したサンプルについて、フィブリン平板法で調べた結果の写真を図４に、比較のグラフを図５に示す。その結果、フェニルアラニン、リジン、プロリン、アスパラギン、イソロイシン、メチオニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン酸、ロイシン、トレオニン、トリプトファン、アラニンのＤ体、グリシンを添加した場合、コントロールに比べて血栓溶解活性が高いことが確認された。このように、Ｄ体アミノ酸添加で培養７日でも実施例１と同様に活性の増加が見られた。特に２倍以上の活性の増加が、フェニルアラニン、リジン、プロリン、アスパラギン、イソロイシン、メチオニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン酸のＤ体で認められ、３倍以上の活性の増加が、フェニルアラニン、リジン、プロリン、アスパラギン、イソロイシン、メチオニン、システイン、グルタミン酸のＤ体で認められ、アミノ酸の添加効果がみられた（図４，５参照）。
【００３８】
以上の結果から、アミノ酸として、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンのＬ体またはＤ体、グリシンを添加することにより、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性を高めることができることがわかった。フィブリン平板法による評価では、特に、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、トリプトファンのＬ体、および、フェニルアラニン、リジン、プロリン、アスパラギン、イソロイシン、メチオニン、システイン、グルタミン酸、ヒスチジン、アスパラギン酸のＤ体を添加することにより、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性をより高めることができることがわかった。合成基質法による評価では、特に、アスパラギン、ロイシン、プロリン、トレオニン、アルギニン、バリン、セリンのＬ体を添加することにより、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性をより高めることができることがわかった。また、Ｄ体アミノ酸を添加する方が、Ｌ体アミノ酸を添加するよりも、納豆菌によるナットウキナーゼの生産性をより高めることができることがわかった。
【００３９】
このように、基質がフィブリンであっても合成基質であっても、アミノ酸によって、著しく活性が亢進することがわかった。その活性はナットウキナーゼによるものであった。このようなアミノ酸類の添加効果を示した報告はなく、初めてのことと思われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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