(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体膜を横切って薬物を送達するのに使用するための、薬物と少なくとも１つの非対称極性化学部分とのコンジュゲートであって、前記部分が、内部膜電場に従って疎水性膜環境内を膜中心部に向かって移動することができ、前記コンジュゲートが下記式（ＶＩ）で表される構造を有するか、又は、下記式（ＶＩＩ）で表される構造を有するか、又は、下記式（ＶＩＩａ）で表される構造を有するか、又は、下記式（ＶＩＩＩ）で表される構造を有するか、又は、下記式（ＩＸ）で表される構造を有するか、又は、下記式（ＩＸａ）で表される構造を有するか、又は、それらの薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物もしくは金属キレートである構造を有するコンジュゲート。
【化１】
0006669719.tif 000019

（式中、
ｎおよびｍはそれぞれ、ゼロおよび１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０から個別に選択される整数であり；
ｋは、２、３、４、５、６、または７から選択される整数であり；
Ｚは、存在しない、カルバメートおよび−Ｓ−Ｓ−から選択され；
Ｑは、薬物への連結箇所である）
【化２】
0006669719.tif 000020
（式中、Ｑは、薬物への連結箇所である）
【化３】
0006669719.tif 000021
（式中、Ｑは、薬物への連結箇所である）
【化４】
0006669719.tif 000022

（式中、
ｎおよびｍはそれぞれ、ゼロおよび１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０から個別に選択される整数であり；
Ｚは、存在しない、−Ｓ−Ｓ−またはカルバメートから選択され；
Ｑは、薬物への連結箇所である）
【化５】
0006669719.tif 000023
（式中、Ｑは、薬物への連結箇所である）
【化６】
0006669719.tif 000024
（式中、Ｑは、薬物への連結箇所である）
【請求項２】
前記薬物が、低分子薬、または天然型もしくは修飾型のＲＮＡまたはＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、または治療用タンパク質から選択される高分子薬物であり、
任意に、前記治療用タンパク質はＣａｓ９タンパク質などのＣＲＩＳＰＲタンパク質を含むか、または
前記薬物は、ターゲット遺伝子をサイレンシングするための配列を含む２５〜３０ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを含むダイサー基質を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
医薬において使用するための、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
医学的障害の処置において使用するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載のコンジュゲートであって、前記薬物が前記医学的障害の処置に有用である、コンジュゲート。
【請求項５】
前記医学的障害が、がん、毒性傷害、虚血性疾患、感染性疾患、タンパク質蓄積症、外傷、免疫介在性疾患、変性疾患、またはアルツハイマー病、運動ニューロン病、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症およびクロイツフェルト・ヤコブ病などの神経変性障害である、請求項４に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体膜を横切って細胞中に分子を送達し、任意に後続の細胞内捕捉を伴う、送達系および関連する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の病理学的変化は、変異型タンパク質の機能不全から、特定タンパク質がそのタンパク質を毒性にする新規な性質を獲得する病理学的機能獲得まで、数多くの医学的障害の病因または病理発生における一般的共通因子である。概念上、遺伝子療法によるこれらのタンパク質の合成の阻害は、上述のタンパク質異常を有する患者にとって有望でありうる。
【０００３】
近年の大きな進歩の一つは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を用いるＲＮＡ干渉による特定遺伝子のサイレンシングの概念である。ＲＮＡ干渉は、細胞の生物システム（とりわけ、二本鎖ＲＮＡを切断してｓｉＲＮＡを生産するダイサータンパク質複合体およびＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ））と協力して特定ｍＲＮＡ配列の翻訳を阻害し、特定ｍＲＮＡ配列を分解の標的とし、それによって遺伝子発現を翻訳段階で阻害するように作用することができる短い（約１９〜２７塩基対の）二本鎖ＲＮＡ配列に基づく。特定ｍＲＮＡに相補的な無修飾または化学修飾ＤＮＡ分子の短い配列（通常は１３〜２５ヌクレオチド）であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ：ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｏｌｅｏｔｉｄｅ）の使用は、各特定標的タンパク質の発現を阻害し、その生産をブロックすることも示唆されている。
【０００４】
しかし、上述のアプローチは医療にとって極めて大きな潜在的利益を有するにもかかわらず、そのような高分子の膜貫通送達は、ｓｉＲＮＡの比較的大きく高度に荷電した構造（１３ｋＤの平均ＭＷ、約４０個の負荷電リン酸基）ゆえに、依然として、かなりの難題である。それゆえ、ｓｉＲＮＡの膜貫通送達には、非常に大きなエネルギー障壁を克服する必要がある。
【０００５】
膜双極子ポテンシャルは、あらゆるリン脂質膜内に存在する水／膜界面と膜中心との間の電気ポテンシャルである（内側が正）。これはリン脂質グリセリルエステル（ｅｓｔｅｒｉｃ）結合の高度に秩序化されたカルボニル基によって生成されると考えられる。その大きさは約２２０〜２８０ｍＶである。これは、比誘電率が２〜４の疎水性が高い環境にあるので、結果として１０８〜１０９Ｖ／ｍという極めて高い電場になる。おそらく膜双極子ポテンシャルおよび関連する膜内電場は、膜タンパク質の機能にとって極めて重要であるだろう。双極子ポテンシャルは、膜タンパク質のコンフォメーションおよび活性を決定する上で、重要な生理学的役割を有する可能性が高い。しかし、今日までのところ、双極子ポテンシャルが医学的用途に起用されたことはなかった。
【０００６】
生体膜を横切ってオリゴヌクレオチドを送達するための方法は、種々開発されている。これらの方法にはウイルスベクターのほか、非ウイルス送達系、例えばカチオン性脂質またはリポソームが含まれる。しかし今日までのところ、これらの方法の使用は主としてインビトロでの応用に限定されるか、例えば眼への直接注入または肺への直接投与によるインビボでの限局的投与用であった。例えばエレクトロポレーションは、生物学的障壁を横切って高分子を送達するために広く使用されている効果的な方法である。この方法によれば、外部電場が細胞懸濁液に印加され、それが荷電標的分子と膜との衝突をもたらし、続いて一時的かつ限局的な膜不安定化をもたらし、結果として細胞内への高分子の通過につながる。しかし今日までのところ、エレクトロポレーションは主にインビトロで使用されている。インビボでのエレクトロポレーションは限られた成功しか収めておらず、標的器官内への外部電極の挿入ができる特定の器官（例えば筋、肺）にしか試みられなかった。
【０００７】
要するに、細胞膜および他の生物学的障壁、例えば血液脳関門を通した、オリゴヌクレオチドおよび他の治療剤などの高分子の送達は、今なお、重大な満たされていないニーズを示しており、そのような高分子の全身送達（すなわち静脈内投与による送達または経口送達）は今なお非常に大きな未着手の課題として残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、合理的設計の新規「分子モーター」に基づく送達系を提供する。本発明の実施形態による「分子モーター」は薬物の膜貫通送達に使用することができ、前記薬物は低分子薬または高分子、例えばペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチド（例えば一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ）を含みうる。ある特定の実施形態において、高分子は、遺伝子サイレンシングのためのＲＮＡ鎖、すなわちｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）として役立つように設計されたＤＮＡ配列を含みうる。
【０００９】
薬物（例えば低分子薬または高分子）と本発明の実施形態による「分子モーター」とのコンジュゲートは、医療行為において、とりわけ、異常タンパク質またはタンパク質機能異常が一因となる医学的障害であって、これらのタンパク質をコードする遺伝子の発現のサイレンシングが有益でありうる医学的障害の処置に、例えば変性障害、がん、毒性傷害または虚血性傷害、感染症、または免疫介在性障害の処置において、利用することができる。
【００１０】
一実施形態では、薬物の膜貫通送達のための、式ＩＩの化合物が提供される。
（Ａ）ａ−Ｂ−Ｑ−Ｌ
（式ＩＩ）
式中、ａは１、２、３または４の整数であり、Ａは式ＩＩＩ、式ＩＶおよび式Ｖに示す構造から選択され、
【００１１】
【化１】
0006669719.tif 000002
【００１２】
式中、Ｍは−Ｏ−または−ＣＨ２−から選択され、ｇおよびｈは個別に０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６から選択される整数であり；
Ｂは、線状、分枝状または環状の飽和または部分飽和のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、Ｃ４０、Ｃ４１、Ｃ４２のアルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、ヘテロアリール；ステロイドまたはそれらの組み合わせであり；
Ｑは、存在しない（ｎｕｌｌ）、エステル、チオエステル、アミド、カルバメート、ジスルフィド［−（Ｓ−Ｓ）−］、エーテル［−Ｏ−］、ｐＨ感受性部分、およびレドックス感受性部分から選択され；
Ｌは、存在しないか、または任意に置換されている線状、環状または分枝状の飽和、不飽和または部分飽和のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、Ｃ４０、Ｃ４１、Ｃ４２のアルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、ヘテロアリール；ステロイド、または−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｕ−（式中、ｕは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の整数である）；またはそれらの組み合わせであって、前記化合物は薬物に連結可能である。
【００１３】
一実施形態では、薬物に取り付けられた上述の化合物を含むコンジュゲートが提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態は、生体膜を横切って薬物を送達するための方法に関し、本方法は、細胞を上述のコンジュゲートと共にインキュベートするステップを含む。
【００１５】
別の実施形態は、医学的障害を処置するための方法に関し、前記方法は、必要とする患者に、上述のコンジュゲートを含む妥当な量の薬学的組成物を投与するステップを含む。
【００１６】
本発明をさらに十分に理解することができるように、以下に、説明に役立つ下記の図面を参照しつつ、いくつかの実施例および実施形態に関連して、非限定的に、本発明を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】本発明の実施形態による化合物の活性の基礎にある非対称極性の原理の模式図である。
【図１Ｂ】式ＩＸの化合物によって明示される本発明の分子の構造モチーフを模式的に表す。
【図２Ａ】本発明の実施形態によるコンジュゲートの考えうる作用機序を模式的に図解する。
【図２Ｂ】本発明の実施形態によるコンジュゲートの考えうる作用機序を模式的に図解する。
【図２Ｃ】本発明の実施形態によるコンジュゲートの考えうる作用機序を模式的に図解する。
【図３】ダイサー酵素を利用する細胞質内でのｓｉＲＮＡの捕捉の機序を模式的に図解する。
【図４】Ｃａｓ９タンパク質にコンジュゲートされた本発明の「分子モーター」を含むコンジュゲートの例示的構造を示す。
【図５Ａ】本発明の実施形態による化合物の生物学的性能の結果を示し、蛍光顕微鏡観察の結果を示している。
【図５Ｂ】本発明の実施形態による化合物の生物学的性能の結果を示し、２４時間インキュベートした時点でのＥＬＩＳＡリーダーによる定量的解析の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の実施形態は、リン脂質細胞膜などの生体膜を横切って細胞質中に薬物を送達するための送達系として作用しうる新規化合物に関する。本発明の実施形態による化合物は、膜双極子ポテンシャルに関係する内部膜電場を利用してリン脂質膜内を膜／水界面から膜中心部（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｃｏｒｅ）へと移動するように設計された、合理的設計の新規「分子モーター」を含む。前記送達系は、薬物に取り付けられると、薬物を膜中心部へと引っ張って、その膜貫通移動を容易にするように作用する。とりわけ、この送達系は、治療用高分子、すなわちタンパク質またはオリゴヌクレオチドの送達用に設計され、このオリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖または二本鎖である。とりわけ、前記送達系は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質などの治療用タンパク質の送達用に設計される。
【００１９】
本発明の実施形態による化合物の構造の基礎にある原理の一つは、それぞれのｌｏｇＰに従って生体膜中に分配する疎水性非荷電分子に関する「非対称極性」の原理である（図１Ａ参照）。これらの分子は極性があり、それらの部分電荷は不均等に分布している。すなわち、部分負電荷は著しく局在化して集中しており、その一方で、部分正電荷は分子内の炭化水素鎖に沿って分散している。加えて、部分正電荷は、膜脂質環境内での隣接炭化水素鎖とのロンドン型相互作用（ロンドン分散力）によって遮蔽されてもいる。その結果、図１Ａに模式的に図解したように、本発明の実施形態による分子は、膜環境中を負荷電分子として移動する。膜の内部電場は膜／水界面に負極を有し、膜中心に正極を有するので、分子は関連する電場内を膜中心に向かって移動し、カーゴ（例えばｓｉＲＮＡまたはＡＳＯ、治療用タンパク質または他の医薬）に取り付けられると、そのカーゴを膜中心に向かって引っ張る。
【００２０】
加えて、随意の切断可能基（例えばジスルフィド基またはダイサー酵素によって切断可能なオリゴヌクレオチド配列）が本発明の実施形態による分子に含まれている場合、それは、カーゴ（例えばｓｉＲＮＡもしくはＡＳＯまたは他の医薬）を標的細胞の細胞質で捕捉し、しかも細胞膜内外のコンジュゲートの濃度勾配を維持するのを補助するように作用することができる。それゆえに、本発明の文脈において「切断可能基」という用語は、ｐＨの変化またはレドックス状態の変化などといった或る生理的条件において自発的切断または酵素が媒介する切断を起こしうる化学部分に関連する。切断可能基の例は、エステル、チオエステル、アミド、カルバメート、ジスルフィド［−（Ｓ−Ｓ）−］、エーテル（−Ｏ−）またはチオエーテル（−Ｓ−）である。概念上、切断可能基は、薬物の膜貫通通過に続いて薬物をその標的細胞内で捕捉することを補助するか、生体膜内外の濃度勾配を維持するのを補助しうる。
【００２１】
例えば、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯまたは治療用タンパク質とジスルフィド基とを含む本発明の実施形態によるコンジュゲートの場合、ひとたび細胞質内に入ると、周囲を支配的に取り巻く還元的な環境がジスルフィド結合を−ＳＨ基に還元するように作用して、カーゴを送達部分から放出するであろう。「分子モーター」（送達部分）を失ったカーゴ高分子は次いで細胞質で捕捉され、そこでは、例えばｓｉＲＮＡであれば、特定遺伝子の発現をサイレンシングするために、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と相互作用する準備ができるであろう。本発明の実施形態によれば、前記遺伝子は、特定疾患の病因または病理発生に関与するタンパク質をコードしうる。
【００２２】
本発明の一実施形態によれば、カーゴは、細胞内タンパク質標的に対する有益な治療効果を発揮するために、細胞膜を横切って細胞中に送達される治療用タンパク質である。
【００２３】
細胞内標的用のタンパク質薬（ＰＤＩＴ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ）の分野は、ヒトゲノム配列決定プロジェクトの完了から一部派生した新規分野であり、タンパク質薬の投与、遺伝子サイレンシング、ＲＮＡ編集もしくはＤＮＡ編集、またはタンパク質補充療法による潜在的医療介入のための膨大な数の細胞内標的を同定することを可能にする。概念上、そのような治療戦略は、ほとんどどの医学的障害にも役立ちうる。ＰＤＩＴ分野において非常に魅力的で具体的な候補タンパク質はＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ：クラスター化した規則的に離間した短いパリンドローム様リピート）関連タンパク質、具体的にはＣａｓ９タンパク質である。ごく最近発見されたこのタンパク質は、そもそも、細菌によって抗ウイルス機構として元々利用されていた細菌タンパク質である。実用上、このタンパク質には任意のＲＮＡ配列を積み込むことができ、ゲノム内の任意の座位にこのタンパク質を特異的に向かわせる特異性を伴う。そのような座位は、可能性として、変異型欠損遺伝子を持つ部位であってもよい。次に、Ｃａｓ９タンパク質はその部位において正確な切り離しを誘発するであろう。すなわち、Ｃａｓ９タンパク質はＤＮＡの二本鎖破断を誘発するであろう。次に、元々あるＤＮＡ修復機構が活性化されて、機能不全を起こしている遺伝子の当該部位を修復する。それゆえに、このタンパク質は、生命の木のあらゆる場所にある種群に適用できる極めて効果的な遺伝子編集（特定遺伝子の配列を付加、破壊または改変すること）ならびに遺伝子の調節および修復を可能にする。細胞中にＣａｓ９タンパク質と適当なガイドＲＮＡとを送達することにより、その生命体のゲノムは、所望する任意の場所で切られて、編集および修復を受けることができる。
【００２４】
以下に例証するように、本発明の一実施形態は、１つ以上の「分子モーター」と、ＤＮＡまたはＲＮＡの編集に関与するＣａｓ９タンパク質または関連タンパク質とを含むコンジュゲートを含む。本発明の別の実施形態は、生理学的に重要な特定タンパク質のレベルの相対的低減に関連する疾患の補充療法として投与される治療用タンパク質を含む。
【００２５】
本発明の実施形態による化合物は、典型的には、非対称極性の原理（上で説明したもの）に従って設計された疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｐｏｂｉｃ）（オクタノール／水分配係数（ｌｏｇＰ＞１））双極性非荷電化学部分を含む。上で述べたように、疎水性で中性であるが、集中した部分負電荷と分散した部分正電荷を含むというユニークな分子構造が、膜の力場に置いたときに、ベクトル系を作り出し、これによって、当該分子がリン脂質膜内で膜／水界面から膜中心部に向かって移動する。薬物に取り付ければ、この分子はそれぞれが、当該薬物を膜中心部に向かって引っ張るであろう。
【００２６】
図１Ｂに模式的に図解されているように、本発明の実施形態による化合物（例えば式ＩＸの化合物によって明示されるもの）は、典型的には、「分子モーター」を含むが、これは、典型的には、以下の構造要素の組み合わせである。
【００２７】
（ｉ）．負極（Ａ）：典型的には、ハロゲン（例えばフッ素原子（１つまたは複数））および酸素から選択される少なくとも１つの電気陰性原子を含み、この極が数個の電気陰性原子を含む場合、それらは、集中した球状（または球状に近い）配置で、空間的に配置される。前記原子の電子求引性とそれらの空間的配置ゆえに、当該化合物の負極は電子が豊富に集まるところとなる。
【００２８】
（ｉｉ）．正極（Ｂ）：炭素、ケイ素、ホウ素、リン光体および硫黄から選択される相対的に電気陽性な原子を含み、リン脂質膜に置いたときに、好ましくは線状、分枝状もしくは環状鎖の脂肪族または芳香族構造またはそれらの組み合わせとしての配置により、隣接炭化水素鎖との最大の相互作用が可能になるように配置される。本発明の一実施形態において、正極は、線状飽和炭化水素鎖、ステロイド部分、例えばコレステロール、胆汁酸、エストラジオール、エストリオール、またはそれらの組み合わせを含む。
【００２９】
本発明の実施形態による化合物は、「分子モーター」に加えて、以下に詳述する１つ以上のリンカー（Ｌ）および切断可能基（Ｑ）を含んでもよい。化合物は、リンカーまたは切断可能基によって、薬物（Ｄ）とコンジュゲートされ、または薬物（Ｄ）に連結されうる。
【００３０】
本発明の実施形態はさらに、特定タンパク質が疾患の病因または病理発生の一因となりうる医学的障害であって、ｓｉＲＮＡまたはアンチセンス機序によってそれぞれの遺伝子（１つまたは複数）の発現をサイレンシングすることが疾患関連過程の阻害に有益な効果を有しうる医学的障害、例えば変性障害、がん、毒性傷害または虚血性傷害、感染症または免疫介在性障害を処置するための、タンパク質またはオリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡまたはＡＳＯ）などの薬物にコンジュゲートされた、本発明の実施形態による化合物の使用に関する。
【００３１】
例えば、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、特定タンパク質をコードするＤＮＡに結合するかそれぞれのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）に結合する核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは化学的類似体）の鎖または二本鎖の投与を含む医学的処置の形態であるアンチセンス療法として、使用されてもよい。この処置は、遺伝子の発現を阻害し、それぞれのタンパク質の生産を妨げるように作用する。あるいは、本発明のコンジュゲートは、Ｃａｓ９タンパク質などの治療用タンパク質を含んでもよい。
【００３２】
本発明の文脈において、「薬物」または「医薬」という用語は、疾患を患っている患者に投与されると、その患者に有益な効果を発揮することができる化学物質に関連する。前記有益な効果とは、症状の改善、または疾患過程の一因となる作用因子または物質の効果の減殺とすることができる。薬物は、遺伝子発現を阻害するために投与される低分子または高分子、例えばタンパク質またはＲＮＡ鎖もしくはＤＮＡ鎖を含みうる。とりわけ、薬物はｓｉＲＮＡまたはＡＳＯを含みうる。いくつかの実施形態において、薬物は、変性障害、がん、虚血性傷害、感染性傷害もしくは毒性傷害、または免疫介在性障害の処置を目的としている。
【００３３】
本発明の実施形態は、本発明の実施形態による化合物と薬物とを含む新規コンジュゲートを提供する。本発明の実施形態はさらに、前記コンジュゲートを含む新規薬学的組成物、およびそれらの薬学的組成物に基づく、医学的傷害を処置するための新規方法を提供する。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、補充タンパク質療法または遺伝子療法、例えばインビボでのｓｉＲＮＡ療法またはアンチセンス療法（ＡＳＯ）の、より効果的な遂行を達成するために、本発明の化合物および薬学的組成物が使用されうる。
【００３５】
本発明の実施形態によるコンジュゲートは、細胞膜を通って、または血液脳関門を通って、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯまたは治療用タンパク質を送達することを改良し、よって１つ以上の側面、例えば効力、毒性、または薬物動態などにおいて、ｓｉＲＮＡまたはＡＳＯの性能を改良するのに有利でありうる。
【００３６】
上述のように、ｓｉＲＮＡまたは治療用タンパク質などの薬物を含む本発明の実施形態によるコンジュゲートについて考えうる一つの非限定的な作用機序（ＭＯＡ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ）として、「分子モーター」（例えば上述したもの）は、リン脂質膜内に置かれると、薬物を膜中心部に向かって引っ張るように作用する。その結果、膜の限局的不安定化が、リン脂質頭部基の側方移動および一過性膜孔の生成を伴って起こり、その孔を通って、薬物の膜貫通通過が起こりうる。この考えうるＭＯＡを図２に模式的に要約する。
【００３７】
図２に模式的に表した一例において、コンジュゲートは、ｓｉＲＮＡ、ＡＳＯまたは治療用タンパク質であるカーゴと、細胞質でカーゴを捕捉するためのジスルフィド基とを含む。第１段階（Ａ）では、内部膜電場がかかると非対称極性の原理によって、「モーター」が膜表面から膜中心部へと移動させられる。
【００３８】
第２段階（Ｂ）では、「モーター」に連結された高分子が膜表面に近づくことを強いられ、よって水和殻を撹乱する。その結果として、リン脂質頭部基の側方移動および一過性膜孔の形成があり、その孔を通って、高分子が細胞中に送達される。それに続く一過性孔の閉鎖は、熱力学的に有利である（Ｃ）。
【００３９】
別の実施形態において、細胞質におけるｓｉＲＮＡの捕捉は、（ｉ）．標的遺伝子をサイレンシングするための配列を含む２５〜３０ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを含み、「分子モーター（１つまたは複数）」がセンス（パッセンジャー）鎖の３’末端および／またはアンチセンス（ガイド）鎖の５’末端に取り付けられている、ダイサー基質の投与；（ｉｉ）．薬物（例えばｓｉＲＮＡ）の膜貫通送達およびダイサー酵素によるｄｓＲＮＡの切断を引き起こし、よってコンジュゲートから「分子モーター（１つまたは複数）」を除去して、ｓｉＲＮＡを遊離させることになる、本発明の実施形態によるコンジュゲートの投与を含む方法を含みうる。ｓｉＲＮＡは、その数多くの負電荷ゆえに、細胞質で捕捉されることになり、標的遺伝子をサイレンシングするためにＲＩＳＣ複合体と相互作用することができるであろう。
【００４０】
図３に模式的に図解されている一実施形態には、ダイサー酵素を利用した細胞質内でのｓｉＲＮＡの捕捉の機序が示されている。標的遺伝子のサイレンシングのための配列を含む２５〜３０ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを含むダイサー基質が示されている。「分子モーター」（矢印）は、標的遺伝子をサイレンシングするように設計されたｓｉＲＮＡのセンス（パッセンジャー）鎖の３’末端および／またはアンチセンス（ガイド）鎖の５’末端に取り付けられる。膜貫通送達後に、ダイサー酵素によるｄｓＲＮＡの切断が起こって、「分子モーター」がコンジュゲートから外れ、ｓｉＲＮＡが遊離して、標的遺伝子のサイレンシングのためにＲＩＳＣ複合体と相互作用する。この機序により、ｓｉＲＮＡは、その数多くの負電荷ゆえに、こうして細胞質で捕捉される。
【００４１】
本発明の実施形態によるコンジュゲートは、一般式（Ｉ）に示す構造によって表される化合物の薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物および金属キレート、ならびに前記塩の溶媒和物および水和物を含む、式（Ｉ）によって記載することができる。
Ｅｙ−Ｄ−Ｅｚ
（式Ｉ）
式中、
Ｄは、生体膜を横切って送達される薬物である。Ｄは、低分子薬、ペプチド、タンパク質、または天然型もしくは修飾型の一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡまたはＡＳＯであることができ；
Ｅは、本発明の実施形態による化合物を表し；ｙおよびｚはそれぞれ、０、１、２、３、４、５、６から独立に選択される整数であり；ｙまたはｚの少なくとも一方はゼロ（ｎｕｌｌ）とは異なる。一実施形態ではｙ＝１およびｚ＝０であり、別の実施形態ではｙ＝１およびｚ＝１である。Ｅは、一般式（ＩＩ）によって記載することができる。
（Ａ）ａ−Ｂ−Ｑ−Ｌ
（式ＩＩ）
式中、ａは１、２、３または４から選択される整数であり、Ａは、後述の式ＩＩＩ、式ＩＶおよび式Ｖに示す構造から選択され；
Ｂは、線状、分枝状または環状の飽和または部分飽和のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、Ｃ４０、Ｃ４１、Ｃ４２のアルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、ヘテロアリールの化学基；コレステロール、胆汁酸、エストロゲンなどのステロイド部分、またはそれらの組み合わせであり；
Ｑは、存在しない、エステル、チオエステル、アミド、カルバメート、ジスルフィド［−（Ｓ−Ｓ）−］、エーテル［−Ｏ−］、ｐＨ感受性部分、およびレドックス感受性部分から選択され；
Ｌは、存在しないか、上に規定したＢと同じとすることができ、任意に（酸素、ヒドロキシル、窒素、リン酸基または硫黄で）置換されている線状、環状または分枝状の飽和、不飽和または部分飽和のＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ３１、Ｃ３２、Ｃ３３、Ｃ３４、Ｃ３５、Ｃ３６、Ｃ３７、Ｃ３８、Ｃ３９、Ｃ４０、Ｃ４１、Ｃ４２のアルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、アリール、ヘテロアリール；コレステロール、胆汁酸などのステロイド；エストロゲン、構造−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｕ−の化学部分（式中、ｕは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０の整数である）；またはそれらの組み合わせを含みうる。
【００４２】
上で述べたように、Ａは、以下の式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖに示す構造から選択される。式中、＊はＢ、Ｑ、ＬまたはＤへの取り付け箇所である。
【００４３】
【化２】
0006669719.tif 000003
【００４４】
式中、Ｍは−Ｏ−または−ＣＨ２−から選択される。
【００４５】
【化３】
0006669719.tif 000004
【００４６】
式中、ｇは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６から選択される整数である。
【００４７】
【化４】
0006669719.tif 000005
【００４８】
式中、ｈは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６から選択される整数である。
【００４９】
分子の一部へのＤの連結は、エーテル基、エステル基、アミド基、チオエステル基、チオエーテル基またはカルバメート基によることができる。Ｄがオリゴヌクレオチドである場合、連結は、ヌクレオチドの核酸塩基、リボース部分（例えば２’位、３’位または５’位によるもの）、またはリン酸部分への連結とすることができる。連結は、オリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチドへの連結であるか、あるいは非末端ヌクレオチドへの連結とすることができる。Ｄがタンパク質である場合、分子の他の部分へのＤの連結は、リジン、グルタメートまたはアスパルテートなどといった、タンパク質のアミノ酸の側鎖（１つまたは複数）への連結によるものとすることができる。
【００５０】
本発明の文脈において「オリゴヌクレオチド」という用語は、それぞれ１つ以上のヌクレオチドの一本鎖配列または二本鎖配列であるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を含みうる。各ヌクレオチドは、窒素塩基（核酸塩基）、五炭糖（リボースまたはデオキシリボース）、およびリン酸基を含む。核酸塩基は、プリン類（アデニン、グアニン）およびピリミジン類（チミン、シトシン、ウラシル）から選択される。加えて、この用語は修飾型のヌクレオチドを指すこともでき、その修飾は、分子の主鎖にあってもよいし（例えばホスホロチオエート）、核酸塩基にあってもよい（例えばＲＮＡ中のリボース基の２’位におけるメチル化）。これらの修飾は、オリゴヌクレオチドの改良された安定性または改良された薬物動態などといった性質を可能にし、そのような修飾オリゴヌクレオチドの使用も、本発明の範囲内にある。
【００５１】
連結は、ヌクレオチドの核酸塩基への連結、リボース部分への連結（例えば２’位、３’位または５’位によるもの）、またはリン酸部分への連結とすることができる。連結はオリゴヌクレオチド鎖の末端ヌクレオチドへの連結であるか、あるいは非末端ヌクレオチドへの連結とすることができる。
【００５２】
一実施形態では、インビトロまたはインビボで遺伝子発現を特異的に阻害するための方法が開示される。前記方法は、本発明のコンジュゲートまたはそれぞれの薬学的組成物の利用を含み、ここではＤが、ある疾患の病因または病理発生に関与する病原タンパク質をコードする特定遺伝子の発現をサイレンシングするように設計されたｓｉＲＮＡまたはＡＳＯである。
【００５３】
したがって、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、医学的障害の処置に使用されうる。本発明の実施形態は、必要とする患者への、妥当な量の、本発明の実施形態による薬学的組成物の投与を含む、医学的処置の方法も開示する。一実施形態において、投与される薬学的組成物は、特定病原（すなわち疾患関連）タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する活性を有するｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含みうる。
【００５４】
一実施形態において、一般式Ｉの分子は、式（ＶＩ）に示す構造を有するＥを含む。
【００５５】
【化５】
0006669719.tif 000006
【００５６】
式中、ｎおよびｍはそれぞれ、ゼロおよび１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０から個別に選択される整数であり；ｋは、２、３、４、５、６、７から選択される整数である。一実施形態では、ｋ＝２であり、Ｚは、存在しないおよび−Ｓ−Ｓ−から選択され、Ｑは上述したものであって、Ｄへの連結部である。
【００５７】
別の実施形態において、一般式Ｉの分子は、式ＶＩＩまたは式ＶＩＩａに示す構造を有するＥを含む。
【００５８】
【化６】
0006669719.tif 000007
【００５９】
別の実施形態において、一般式Ｉの分子は、式ＶＩＩＩに示す構造を有するＥを含む。
【００６０】
【化７】
0006669719.tif 000008
【００６１】
式中、ｎおよびｍはそれぞれ、ゼロおよび１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０から個別に選択される整数であり；Ｚは存在しないおよび−Ｓ−Ｓ−から選択され；Ｑ（上述のもの）はＤへの連結部である。
【００６２】
さらに別の実施形態において、一般式Ｉの分子は、式ＩＸまたはＩＸａに示す構造を有するＥを含む。
【００６３】
【化８】
0006669719.tif 000009
【００６４】
本発明の実施形態によるコンジュゲートの合成に使用される分子（「前駆体」ともいう）も本発明の範囲内である。
【００６５】
一実施形態において、そのような分子は式Ｘに示す構造を有する。
【００６６】
【化９】
0006669719.tif 000010
【００６７】
式中、Ｗは、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩａ、式ＶＩＩＩ、式ＩＸまたは式ＩＸａのいずれかの化合物である。この前駆体は、とりわけ、オリゴヌクレオチドの５’末端への取り付けに役立ちうる。
【００６８】
本発明の別の前駆体は、式（ＸＩ）の構造を有する。
【００６９】
【化１０】
0006669719.tif 000011
【００７０】
式中、Ｇは、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ、式ＶＩ、式ＶＩＩ、式ＶＩＩａ、式ＶＩＩＩ、式ＩＸまたは式ＩＸａのいずれかの化合物である。この前駆体は、とりわけ、オリゴヌクレオチドの３’末端への取り付けに役立ちうる。
【００７１】
本発明の実施形態はさらに、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩａ、ＶＩＩＩ、ＩＸまたはＩＸａのいずれかの分子を含むコンジュゲートと、薬学的に許容される塩または担体とを含む薬学的組成物を含みうる。
【００７２】
本発明は、インビトロまたはインビボで遺伝子発現を特異的に阻害するための方法も含む。一実施形態において、本方法は、式Ｉのコンジュゲートまたはそれぞれの薬学的組成物の利用を含むことができ、式中、Ｄは、疾患の病因または病理発生に関与する病原タンパク質をコードする特定遺伝子の発現をサイレンシングするように設計されたｓｉＲＮＡまたはＡＳＯであるか、治療用タンパク質である。
【００７３】
本発明の実施形態によるコンジュゲートは、医学的障害の処置に使用されうる。本発明の実施形態は、前記方法は、必要とする患者への、妥当な量の、式Ｉのコンジュゲートを含む薬学的組成物の投与含む医学的処置の方法を含み、式中、Ｄは、それぞれの医学的障害の処置に有用な薬物である。
【００７４】
一実施形態において、本方法はｓｉＲＮＡまたはＡＳＯによる遺伝子処置の方法であって、前記方法は、必要とする患者への、妥当な量の、式Ｉの本発明のコンジュゲートを含む薬学的組成物の投与を含み、式中、Ｄは、その特定患者の疾患に関与する遺伝子発現を阻害するのに有用なｓｉＲＮＡ、ＡＳＯまたは治療用タンパク質である。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、Ｄは、生物学的リン脂質膜を横切って細胞中に送達される、または血液脳関門などの生物学的障壁を通って送達される、タンパク質である。
【００７６】
本発明の別の実施形態において、Ｄは、例えば機能不全を起こしている変異型タンパク質と置き換えるために補充療法として投与される正常タンパク質である。
【００７７】
別の実施形態において、Ｄは、遺伝子調節に関与するタンパク質であり、とりわけ、ＤＮＡ編集またはＲＮＡ編集（特定遺伝子の配列を付加、破壊または改変すること）に関与するタンパク質が挙げられる。一実施形態において、前記タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ：クラスター化した規則的に離間した短いパリンドローム様リピート）関連タンパク質のメンバーでありうる。具体的には、前記タンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡヌクレアーゼ酵素であるＣａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９：ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）またはその類似体とすることができるか、またはそれを含みうる。
【００７８】
一実施形態において、本発明は、医学的障害の遺伝子処置の方法を記載する。前記方法は、必要とする患者への、妥当な量の、式Ｉのコンジュゲートを含む薬学的組成物の投与を含み、式中、Ｄは、適当なガイドオリゴヌクレオチドと一緒に投与されるＣａｓ９などのＣＲＩＳＰＲタンパク質である。こうして、それぞれのガイドオリゴヌクレオチドを積み込んだ前記タンパク質の、細胞中への送達が達成され、その細胞内で、ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイドオリゴヌクレオチドは、それらのゲノム編集活性を発揮することができる。この文脈において、ガイドオリゴヌクレオチドとは、遺伝物質中の欠陥を修復するために、Ｃａｓ−９タンパク質をＤＮＡ上の特定座位（場所）へと案内するＲＮＡまたはＤＮＡの配列である。Ｃａｓ９タンパク質の場合、ガイドオリゴヌクレオチドはＲＮＡである。
【００７９】
それゆえに、本発明の実施形態によるコンジュゲートならびにそれぞれの薬学的組成物および方法は、とりわけ、がん、毒性傷害、虚血性疾患、感染性疾患、タンパク質蓄積症、外傷、免疫介在性疾患、または変性疾患から選択される医学的障害の処置に有益でありうる。
【００８０】
神経障害の分野では、本発明の実施形態によるコンジュゲートは、とりわけ、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症およびクロイツフェルト・ヤコブ病などの神経変性障害の処置に役立ちうる。
【実施例】
【００８１】
実施例１：本発明の実施形態によるオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを合成するための一般的方法：
まず、サイレンシングされる遺伝子を、疾患の病因または病理発生におけるその役割に基づいて選ぶ。次に、当技術分野において知られているバイオインフォマティクス方法論に基づいて、ＡＳＯのＤＮＡ配列のそれぞれのｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列（典型的にはＲＩＳＣ基質の場合で１９〜２１塩基対、ダイサー基質の場合で２５〜２９）を決定する。
【００８２】
合成は３’→５’の方向に行う。保護２’−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵ）、または化学修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡ（ロックド核酸：ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはＢＮＡ（架橋核酸：ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）から誘導されるホスホロアミダイトビルディングブロックを使って、固相合成を適用する。成長中のオリゴヌクレオチド鎖に、所望のｓｉＲＮＡまたはＡＳＯの配列が要求する順序で、ビルディングブロックを逐次カップリングする。
【００８３】
オリゴヌクレオチドの構築後に、本発明の実施形態による化合物（上に規定したＥ）を、オリゴヌクレオチドのビルディングブロックの一つとして付加する。任意に、上記化合物を上述したその前駆体型で付加してもよい。オリゴヌクレオチドの５’末端に上記化合物を付加する場合、前駆体型の上記化合物は、ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｍｉｄｉｔｅ）部分を含みうる。オリゴヌクレオチドの３’末端に上記化合物を付加する場合、前駆体型の上記化合物は、アセチレン部分またはアジド部分を含みうる。通常、このプロセスは完全に自動化される。鎖のアセンブリが完了したら、生成物を固相から溶液中に放出させ、脱保護し、収集する。次に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって所望のコンジュゲートを収集し、単離することで、高純度の所望のオリゴヌクレオチドを得る。ｓｉＲＮＡの場合、相補的ＲＮＡ鎖のそれぞれを別々に合成してから、それら２つの鎖のアニーリングを行うことで、所望のｓｉＲＮＡ二本鎖ＲＮＡを得る。
【００８４】
実施例２：本発明の一実施形態による例示的特定化合物を合成するための方法：
本発明の実施形態による例示的化合物の合成を、胆汁酸であるリトコール酸（これは上述の部分Ｂの一例として役立ちうる）から開始する。
【００８５】
パーフルオロｔｅｒｔブタノールは市販されており、上述の部分Ａの一例として役立ちうる。
【００８６】
合成は下記のスキームＩに記載されるように進行する。この実施例では、オリゴヌクレオチドの５’末端に連結されるようにＥ部分が設計され、そのため合成の最後のステップで、ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍｉｏｄｉｔｅ）部分が付加される。
【００８７】
【化１１】
0006669719.tif 000012
【００８８】
２５ｇの材料１を２６ｇ（定量的）のメチルエステル（材料２）に転換した。２６ｇの材料２をＴＢＤＭＳＣｌと反応させた。２９ｇ（８７％）のＮＭＲ純度の材料３を得た。材料３（２９ｇ）をＮａＢＨ４  ＴＨＦ／ＭｅＯＨで材料４に還元することにより、後処理および精製後に、ＮＭＲに基づいて、いくらか微量の材料３が依然としてある２５ｇの材料４（８５％）を得た。材料４とパーフルオロｔ−ブタノールとの光延反応により、後処理カラムクロマトグラフィーおよびＭｅＯＨでのトリチュレーション後に、３３．５ｇ（９２％）の材料５を得た。次に、それを脱保護することにより、ステロイド６を得た。次に、ステロイド６（２．５ｇ）をＴＨＰ保護ブロモテトラデカノールにカップリングした。このカップリングは３日を要し、完全な転換を達成するには４等量のＴＨＰ保護ブロモテトラデカノールが必要であった。生成物をカラムクロマトグラフィーで精製した。保護基（ＴＨＰ）をＭｅＯＨ／１，４−ジオキサン（ＨＣｌ、４Ｎ）／ＴＨＦで除去した後、生成物７をカラムクロマトグラフィーで精製することで、不純物を除去した。生成物７（１．５ｇ，転換収率（ｃ．ｙ）４８％）を白色固形物として得た。次に、ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｍｉｄｉｔｅ）基を取り付けることによって、生成物７を、必要な化合物８に転換した。
【００８９】
実施例３：前駆体およびオリゴヌクレオチドに取り付けられたそれぞれの化合物の構造
ａ．５’修飾：
前駆体：
【００９０】
【化１２】
0006669719.tif 000013
【００９１】
オリゴヌクレオチドに取り付けられたもの：
【００９２】
【化１３】
0006669719.tif 000014
【００９３】
ｂ．３’修飾：
前駆体：
【００９４】
【化１４】
0006669719.tif 000015
【００９５】
ＤＭＴ＝ジメトキシトリチル
ＣＰＧ＝オリゴヌクレオチド合成用固形支持体としてのコントロールドポアガラス（ＣＰＧ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）
オリゴヌクレオチドに取り付けられたもの：
【００９６】
【化１５】
0006669719.tif 000016
【００９７】
ｃ．５’修飾；核酸塩基（例えばチミン）への化合物の取り付け：
前駆体 オリゴヌクレオチドに取り付けられたもの
【００９８】
【化１６】
0006669719.tif 000017
【００９９】
実施例４：本発明の実施形態によるＣａｓ９タンパク質とコンジュゲートした化合物の例示的構造
Ｃａｓ９タンパク質にコンジュゲートされた本発明の「分子モーター」の構造を図４に模式的に図解する。この構造は、Ｃａｓ９タンパク質の構造の結晶学的研究に基づいている（Ｎｉｓｈｉｍａｚｕ  ＦＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １５６：９３５−９４９，２０１４）。本発明の実施形態による化合物Ｅは、それらのＱ基によってタンパク質に取り付けられて、タンパク質表面上のリジン側鎖に結合することになる。取り付けには活性エステルが使用されることになる。アルコールは、酸素（水）より窒素（タンパク質リジン側鎖）と優先的に反応するカーボネート活性エステルに転換されることになる。反応は以下のスキームＩＩに従って行われることになる。
【０１００】
【化１７】
0006669719.tif 000018
【０１０１】
可能な誘導体化剤は以下のとおりである。
ａ）ホスゲン：連結はクロロギ酸エステルによる。
ｂ）ジスクシンイミジルカーボネート（Ｘ＝Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）：連結はスクシンイミジルカーボネートによる。
ｃ）カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、Ｘ＝イミダゾール）：連結はイミダゾリルカルバメートによる。
【０１０２】
これらの基のいずれかによるタンパク質標識化は、アミン非含有（Ｔｒｉｓではない）のわずかに塩基性の緩衝剤（ｐＨ＝８〜９）中で行う。連結箇所は疎水性であり、そのためタンパク質との反応には共溶媒（通常はＤＭＦまたはＤＭＳＯ）が必要になる。高い反応性は反応時間が短くなることを意味するが、酸素よりも窒素を選択する選択性の低下および水性緩衝液における寿命の短縮も意味する。どの活性エステルでも、生成物は、酵素的切断を受けやすいであろうカルバメートである。上記３つのこれらの選択肢のうち、カルボニルジイミダゾールは、酸素よりも窒素を選択する選択性が最も高いだけでなく、合成も最も簡単である。その一方で、タンパク質誘導体化に要する時間は長くなりうる（おそらく終夜）。１タンパク質分子あたりのＥ部分の数は、所望のモル比をあらかじめ設定することによって決まる。
【０１０３】
実施例５：本発明の実施形態によるインビトロでのＣｙ３標識ＳＳ２９マーＤＮＡ配列の細胞取り込みおよび局在化
細胞培養：
ＧＦＰで安定にトランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞株は、米国サンディエゴのセルバイオラボ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手した（カタログ番号ＡＫＲ２１４）。
【０１０４】
５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中、３７℃で、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ；バイオロジカルインダストリーズ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、カタログ番号０４−０１１−１Ａ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（バイオロジカルインダストリーズ、カタログ番号０３−０２０−１Ｂ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（バイオロジカルインダストリーズ、カタログ番号０３−０３１−１Ｂ）および１０μｇ／ｍｌブラストサイジン（エンゾ（Ｅｎｚｏ）、カタログ番号ＡＬＸ−３８０−０８９）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ；Ｇｉｂｃｏカタログ番号４１９６５）において、前記細胞を成長させた。
【０１０５】
細胞中への２９マーＤＮＡ送達の評価；インビトロアッセイ：
実験の前日に、指数増殖期にあるＮＩＨ−３Ｔ３−ＧＦＰ細胞を、抗生物質を含まないＤＭＥＭ＋サプリメント成長培地（５００μｌ／ウェル）を使って、４．５×１０４細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレートにプレーティングした。Ｃｙ３標識オリゴヌクレオチドのそれぞれを１００μｌ／ウェルのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）−カタログ番号３１９８５０６２）に希釈し、４０ｎＭから１００ｎＭまでのさまざまな最終濃度で、細胞に加えた。
【０１０６】
細胞内でのＣｙ３標識オリゴヌクレオチド送達系の蓄積を、２時間、４時間、８時間および２４時間のインキュベーション後に評価した。インキュベーション期間後に細胞をハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液；バイオロジカルインダストリーズ）で洗浄し、分析に付した。
【０１０７】
Ｃｙ３陽性集団の検出および定量は、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ＰＲＯマルチモードリーダーを使って行った（励起波長５４８±４．５ｎｍおよび発光５８０±１０ｎｍ）。
【０１０８】
Ｃｙ３−ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（２９ｎｔ）（Ｓｙｎｃｏｍ、オランダ；ＩＤＴ、米国）に取り付けられた本発明の実施形態による化合物の膜貫通送達を、対照Ｃｙ３−ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ、米国）と比較し、無処理細胞と比較したＣｙ３陽性細胞のパーセンテージとして表した。
【０１０９】
蛍光顕微鏡観察：
密度４．５×１０４／ウェルのＮＩＨ−３Ｔ３  ＧＦＰ細胞を実験の２４時間前にプレーティングした。成長培地を、Ｃｙ３−ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド（２９ｎｔ）に取り付けた本発明の実施形態による化合物（ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー水に溶解した４０〜１００ｎＭ）または対照Ｃｙ３−ｓｓＤＮＡ（ＩＤＴ、米国）を含有する新鮮培地で置き換え、３７℃で２時間、４時間、８時間および２４時間インキュベートした。
【０１１０】
インキュベーションに続いて、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、水銀ランプからのＵＶ照射により、オリンパス蛍光顕微鏡（ＢＸ５１ＴＦ；オリンパスオプティカル（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ）、英国）を使って可視化した。Ｃｙ３フルオロフォアを４７０〜４９５ｎｍにおける励起および５９０ｎｍにおける発光で可視化した。ＧＦＰフルオロフォアは５３０〜５５０ｎｍにおける励起および５１０〜５５０ｎｍにおける発光で可視化した。
【０１１１】
本発明の実施形態によるＥ部分（この実施例では式ＶＩＩａの化合物）にリン酸結合によってその５’末端で連結されたｓｓ２９マーＤＮＡのＡＳＯを、リン脂質膜を横切って細胞中へ送達することにおける、本発明の実施形態によるコンジュゲートの生物学的性能を、図５Ａおよび５Ｂに記載する。このコンストラクトは５’末端にｉＣｙ３フルオロフォアも有していた。ＧＦＰタンパク質で安定にトランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞において送達を評価した。
【０１１２】
図５Ａは、濃度が１００ｎＭの、Ｃｙ３−ｓｓＤＮＡに取り付けられた本発明の実施形態による化合物（「Ｅ−コンジュゲート」）またはＣｙ３−ｓｓＤＮＡと共に、８時間にわたってインキュベートした３Ｔ３−ＧＦＰ細胞の結果を示している。その後、細胞を蛍光顕微鏡観察（倍率×２０）によって分析した。
【０１１３】
Ｅ−コンジュゲートを上段に示す。一方、下段は本発明の実施形態による化合物（「Ｅ部分」）を欠く対照ＡＳＯのものである。
【０１１４】
図示したように、Ｅ部分を欠く対照コンストラクトが細胞中への有意な送達を何も明示しなかったのに対して、Ｅ−コンジュゲートはほぼ全ての細胞中への取り込みを明示した。画像は、３７℃で８時間インキュベートしたときに取得した。１００ｎＭのＥ−コンジュゲートとのインキュベーションを示す。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡによる定量分析
３Ｔ３−ＧＦＰ細胞を、さまざまな濃度（４０ｎＭおよび１００ｎＭ）でＥ−コンジュゲートまたはＣｙ３−ｓｓＤＮＡと共に２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＥｌＩＳＡ蛍光光度計で評価した。Ｃｙ３蛍光レベルを３Ｔ３−ＧＦＰ無処理細胞と比較した。図５Ｂに示すように、４０ｎＭおよび１００ｎＭの用量において、コンジュゲートは、対照と比較して、４倍および３倍増加した細胞中への送達を明示した。
【０１１６】
実施例６：インビトロでのｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡのノックダウン
ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：緑色蛍光タンパク質）リポーター遺伝子を安定に発現する細胞における２５〜２７ｂｐ  ｄｓＲＮＡの阻害活性を評価する。この目的のために、ＧＦＰを発現する安定にトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞に、２５〜２７マーｄｓＲＮＡ二重鎖（それぞれ１０〜４０ｎＭ）をトランスフェクトする。ＧＦＰ遺伝子ノックダウンの持続時間の定量的推定値を得るためには、トランスフェクション後のＧＦＰ発現を観察する時間経過実験を行うことになる。
【０１１７】
実験の前日に、指数増殖期にあるＮＩＨ−３Ｔ３−ＧＦＰ細胞を、抗生物質を含まないＤＭＥＭ＋サプリメント成長培地（５００μｌ／ウェル）を使って、４．５×１０４細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレートにプレーティングすることになる。Ｃｙ３標識オリゴヌクレオチドのそれぞれを１００μｌ／ウェルのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（ライフテクノロジーズ−カタログ番号３１９８５０６２）に希釈し、４０ｎＭから１００ｎＭまでのさまざまな最終濃度で細胞に加えた。
【０１１８】
細胞内でのＧＦＰのｍＲＮＡのノックダウンを、２４時間、４８時間および７２時間のインキュベーション後に評価することになる。インキュベーション期間後に細胞をハンクス緩衝塩類溶液（ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）緩衝液；バイオロジカルインダストリーズ）で洗浄し、分析に付した。
【０１１９】
ＧＦＰ陽性集団の検出および定量は、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ＰＲＯマルチモードリーダーを使って行った（励起波長４８８±４．５ｎｍおよび発光５３５±１０ｎｍ）。
【０１２０】
２５〜２７ｂｐ  ｄｓＲＮＡ（Ｓｙｎｃｏｍ、オランダ；ＩＤＴ、米国）に取り付けられた本発明の実施形態による化合物のノックダウン活性を、対照２５〜２７ｂｐ  ｄｓＲＮＡ（ＩＤＴ、米国）と比較し、無処理細胞と比較したＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージとして表すことになる。
【０１２１】
実施例７：ダイサー基質の投与を含むｓｉＲＮＡの細胞内捕捉の機序
本発明の一実施形態において、ｓｉＲＮＡを細胞質で捕捉するための方法は、二本鎖ＲＮＡをプロセシングして、遺伝子サイレンシングのためのＲＩＳＣ複合体との相互作用に適した１９〜２１塩基対のサイズで二本鎖ＲＮＡを切ることにおける酵素ダイサーの活性に基づく。前記方法は、（ｉ）．標的遺伝子をサイレンシングするための配列を含む２５〜３０ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを含み、本発明の実施形態による化合物がセンス（パッセンジャー）鎖の３’末端および／またはアンチセンス（ガイド）鎖の５’末端に取り付けられている、ダイサー基質の投与；（ｉｉ）．ｓｉＲＮＡの膜貫通送達；および（ｉｉｉ）．ダイサー酵素によるｄｓＲＮＡの切断を含み、こうしてｓｉＲＮＡを遊離させ、標的遺伝子をサイレンシングするためにＲＩＳＣ複合体と相互作用させる。
【０１２２】
インビトロでのダイサー切断アッセイのために、ｓｉＲＮＡ二重鎖（１００ｐｍｏｌ）を２０ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中で、１単位の組換えヒトダイサー（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））と共に２４時間インキュベートすることができる。各反応の３ｍｌアリコート（１５ｐｍｏｌ  ＲＮＡ）を、１５％非変性ポリアクリルアミドゲル中で分離し、ＧｅｌＳｔａｒ（Ａｍｂｒｅｘ）で染色し、ＵＶ励起を使って可視化する。ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎＴＳＱ７０００、Ｘｃａｌｉｂｕｒデータシステム、ＰｒｏＭａｓｓデータ処理ソフトウェアおよびＰａｒａｄｉｇｍ  ＭＳ４  ＨＰＬＣ（Ｍｉｃｈｒｏｍ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）からなるＯｌｉｇｏ  ＨＴＣＳシステム（Ｎｏｖａｔｉａ）を使って、ダイサーによる処理の前後に、二重鎖ＲＮＡのエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー質量分析（ＥＳＩＬＣＭＳ：ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を行うことになる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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