(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(配列番号23)からなるポリペプチド。
【請求項２】
小胞体移行シグナル配列をＮ末端に更に含んでなる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ユビキチンをＣ末端部に更に含んでなる請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドをワクチン接種したHHDマウスの過半数においてCEA188、HER-2/neu246、TERT444、MAGE273 A6、MAGE273 V6及びMAGE273 I6からなる群より選択される少なくとも２つのエピトープに対するCD8+ Ｔ細胞応答を誘導することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
健常HLA-B*0702ドナーのヒトPBMCを用いるインビトロアッセイにおいてCEA188、HER-2/neu246、TERT444、MAGE273 A6、MAGE273 V6及びMAGE273 I6からなる群より選択される少なくとも２つのエピトープに対するCD8+ Ｔ細胞応答を誘導することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをロードした単離樹状細胞。
【請求項７】
ペプチド送達ベクターと請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドとを含んでなる複合体。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド及び/又は請求項６に記載の樹状細胞及び/又請求項７に記載の複合体を含んでなる医薬組成物。
【請求項９】
HLA-B*0702表現型を有する患者におけるガン免疫療法に使用するための請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド及び/又は請求項６に記載の樹状細胞及び/又請求項７に記載の複合体。
【請求項１０】
少なくとも１用量の請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドと少なくとも１用量のアジュバントとを含んでなるキット。
【請求項１１】
少なくとも２用量の請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んでなるキット。
【請求項１２】
６〜20用量の請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んでなる請求項１０又は１１に記載のキット。
【請求項１３】
ポリペプチドの各用量が0.5〜10mgのポリペプチドを含んでなる請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ガンワクチンの分野に関する。より具体的には、本発明は、潜在腫瘍エピトープに由来し、その免疫原性が高められるように最適化された４つのペプチドを含んでなる、HLA-B7ガン患者に使用するための最適化キメラポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在開発中の抗腫瘍ワクチンは、遊離ペプチド、組換えタンパク質、ペプチド又は腫瘍溶解物をロードした樹状細胞、及びDNAを含む多くの形態をとる。ペプチドベースのワクチンは、実現可能性の観点から他の形態に比して非常に魅力的であるが、優性腫瘍ペプチドを標的するワクチンを用いた多くの研究により、弱い免疫学的及び臨床的応答しか誘発せず、患者間のバラツキが大きいと判明している。幾つかの臨床研究で試験された幾つかのgp100由来ペプチドワクチン、無作為化第II相試験で試験されたMUC1由来BLP25ペプチド及び非常に多くの第Ｉ相及び第II相臨床試験で試験されたHER-2/neu由来E75ペプチドがそうであった(Buttsら，2005；Peoplesら，2008；Rosenbergら，2004)。
【０００３】
最適化された潜在ペプチドは、トランスジェニックマウスモデルにおいて優性ペプチドより効率的に抗腫瘍免疫を誘導する(Grossら，2004)。この技術に基づく２つのワクチンが現在開発中である：
−  Vx-001(NSCLCガンHLA-A2患者に向けられたTERT由来モノエピトープペプチド)は第IIb相試験中であり、
−  Vx-006(これもまたHLA-A2患者に向けられた、普遍的腫瘍抗原TERT、MAGE-A及びHER-2/neuを標的する３エピトープポリペプチド)は第Ｉ相試験中である。
【０００４】
ポリペプチドベースのワクチンを用いて複数抗原に対してCTL応答を誘発するアプローチは、幾つかの利点を有する。特に、少なくとも１つの標的抗原の発現は、ワクチン誘導CTLによる腫瘍細胞の殺傷を誘引するに十分であるはずであり、腫瘍細胞が標的抗原を全て同時に喪失することは(該抗原が細胞生存及び腫瘍成長に必須である場合には特に)ありそうにない。このアプローチは強力な免疫応答を誘発することができ(Oukkaら，1996)、ワクチンの恩恵を受けることができそうな患者の割合を増大させることができる。更に、スペクトルが広いガンワクチンは、種々の腫瘍により過剰発現される普遍的腫瘍抗原、例えば、TERT、HER-2/neu、MUC-1、CEA、EphA2及びMAGE-Aを標的しているに違いない(Minevら，2000；Ofujiら，1998；Ogataら，1992；Reese & Slamon，1997；Slamonら，1987；Van den Eynde & van der Bruggen，1997；Vonderheideら，1999)。これら抗原のほとんどが腫瘍細胞生存及び腫瘍原性に関与し、したがって免疫応答を回避するようなダウンレギュレーションは、腫瘍成長に対して有害効果を有する可能性がある。
【０００５】
このような製品の恩恵を受けることができる患者の数を増大させるため、本発明者らは、広範に発現する４つの腫瘍抗原：TERT、HER-2/neu、MAGE及びCEAを標的する、HLA-B7発現患者に向けられたポリペプチドベースのワクチン(Vbx-016と名付けた)を開発した。Vbx-016を構成する４つの最適化された潜在ペプチド(表１)は既に記載されている(WO2008/010098、WO2010/143010)。４つのペプチドの各々は、最適化ペプチド及び腫瘍細胞が天然に発現する天然型同族ペプチド(表１)の両方に対して抗腫瘍応答をインビボ及びインビトロで誘発することが示されている(WO2008/010098、WO2010/143010)。興味深いことに、MAGE-A273 V6 L9により誘発されたCTLは、６つのMAGE-A抗原(-A1、-A2、-A3、-A4、-A6及び-A12)を標的した。実際、MAGE-A273V6L9を用いて誘導した特異的CTLは、(MAGE-A1及びMAGE-A4に含まれる)MAGE-A273A6、(MAGE-A2及びMAGE-A6に含まれる)MAGE-A273I6及び(MAGE-A3及びMAGE-A12に含まれる)MAGE-A273V6をロードした細胞を認識することができる。
【０００６】
【表１】
0006701164.tif 000002
【０００７】
古典的には、ポリペプチドベースのワクチンは、皮下注射の前にアジュバント、例えばMontanide ISA51VG(Seppic, Castres, France)で乳化する。注射後、ポリペプチドはプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)、特に、皮膚に局在するランゲルハンス細胞に内在化する。その後、ポリペプチドはゴルジ体でプロテアソームによりプロセスされ、エピトープが細胞表面でHLA分子と共に提示される。ポリペプチドの各エピトープの効率的提示を確実にするためには、各接合部がプロテアソームにより正確にプロセスされるかどうかを調べる必要がある。更に、本発明者らは、３エピトープポリペプチドVx006を用いて、ポリエピトープワクチンの配列中でのエピトープの順序が各エピトープのプロセシングに重要であり、最終的には、対応するエピトープ全てに対する免疫応答を得るために重要であることを以前に記載した(WO2007/073768)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
想定される24の配置の試験を回避するため、ポリペプチド中での４つの最適化ペプチドの最適な編成を、次２工程：(i)各接合配列の試験；及び(ii)対応する完全ポリペプチドの試験  で決定した。
こうして、可能性のある各接合部を試験した。表２に示す可能な12のジペプチドを、HLA-B*0702トランスジェニックマウスにおいてインビボで、健常ドナーPBMC培養物においてインビトロで、次の能力：
−  ジペプチドが効率的にプロセスされ、各最適化エピトープをロードした細胞を認識することができる特異的CTLを誘導する能力、
−  誘導CTLが腫瘍細胞表面に天然に存在する配列に対応する同族天然型ペプチドを認識する能力
について試験した。
【０００９】
【表２】
0006701164.tif 000003
【００１０】
最初に、各ジペプチド配列を、各エピトープのプロセシング可能性を予測する２つの主要なプロテアソーム切断予測コンピュータソフトウェア、MAPPP(マックスプランク感染生物学研究所のJorg Hakenberg及びHans-Joachim Mollenkopfが開発し、ウェブサイトから入手可能である)及びPAProC(Prediction Algorithm for Proteasomal Cleavages)(これもウェブサイトから入手可能)に供した。
PAProCによれば、両エピトープを生じ得る7T5HN3M(切断部位に二重ダッシュ)を除き、いずれのジペプチドも、プロテアソームにより正確にプロセスされないようである(予測される切断部位にダッシュ。表３)。
【００１１】
【表３】
0006701164.tif 000004
【００１２】
MAPPP予測モデルによれば、多くの組合せが４つのエピトープのプロセシングを可能にするようである(データは示さず)。プロテアソームによる各エピトープの効率的なプロセシングを確実にすると予想される最良配列は、CEA188L9/MAGE273L9/TERT444A1/HER-2/neu246A1である。
次いで、ジペプチドをHLA-B*0702トランスジェニックマウスにおいてインビボで試験した。実施例１に記載するように、組合せ7C1HN3M、7C1T5M、7T5HN3M、7M1HN3M及び7T5M1Mは、応答マウスの数に関して、対応する逆配列より良好な結果であった。7C1M1Mと7M1C1Mとは同じ結果であった。
これらインビボ実験データに基いて、以下の理論上の最適ポリペプチドを設計した：CEA188L9/TERT444A1/MAGE273L9/HER-2/neu246A1。
【００１３】
この四連ペプチドでエピトープが効率的にプロセスされるかどうかを評価するため、対応するポリペプチドSPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(配列番号23)を、HLA-B*0702トランスジェニックマウスにおいて、４つの最適化エピトープ及び腫瘍細胞表面に天然に存在する４つの同族天然型ペプチドを認識する特異的CTLを誘導する能力について試験した。実施例２に記載するように、該ポリペプチドでの２回のワクチン接種後、全てのマウスが少なくとも１つの天然型ペプチドに応答し、ワクチン接種したマウスの大多数が２以上の同族天然型ペプチドに応答した。このことから、該ポリペプチドがプロテアソームにより効率的にプロセスされることが確証される。重要なことに、天然型ペプチドの全てが１匹のワクチン接種マウスで少なくとも１回は認識された。
興味深いことに、この配列は、プロテアソームMAPPP切断予測モデルにより選択された配列とは異なる。なぜならば、7M1T5Mは、インビボで起きることとは反対に、正確にプロセスされないと予測されたからである。
【００１４】
HLA-B*0702トランスジェニックマウスで得られた結果をヒトにおけるインビトロで確証するために、規定ポリペプチドの各接合部(CEA188L9/TERT444A1、TERT444A1/MAGE273L9及びMAGE273L9/HER-2/neu246A1)を、健常ヒトドナーのPBMC培養物においてインビトロで独立に試験した。実施例３に記載した結果は、各ジペプチドがヒトにおいてインビトロで効率的にプロセスされたこと及び誘導された特異的CTLが最適化ペプチド又は同族天然型ペプチドをロードした細胞のいずれも認識することができたことを示す。
最後に、ポリペプチドSPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(配列番号23)を、１人のHLA-B*0702健常ドナーのPBMC培養物で試験した(実施例４)。結果は、該ポリペプチドの多重特異的CTL免疫応答を生じる能力を確証する。重要なことに、幾つかの天然型ペプチドが認識された。これら結果は、該ポリペプチドがプロテアソームにより効率的にプロセスされること及び誘導された免疫応答が多重特異的であることを確証する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
よって、本発明の第１の観点は、配列SPRLQLSNLXXXAPRRLVQLLXXXGPRALVETLXXXAPKHSDCLA(配列番号24)を含んでなるポリペプチドである。この配列において、CEA188L9、TERT444A1、MAGE273L9及びHER-2/neu246A1エピトープはスペーサーXXX(式中、各Ｘは(互いに独立して)任意のアミノ酸であるか又はアミノ酸なし)で分離されている。よって、該ポリペプチドは少なくとも36アミノ酸長である；その長さは、エピトープ間へのスペーサーの付加並びに/又はＮ末端部及び/若しくはＣ末端部への(プロセシングに好ましい)シグナルの付加により増大させることができる。特に、本発明によるポリペプチドは、小胞体移行シグナル配列をＮ末端部に更に含んでなることができる。幾つかの小胞体移行シグナル配列が科学文献に記載されており、それらを本発明に関して用いることができる。例えば、Igκ鎖シグナル配列(Ishiokaら，1999)及びE3/19kDタンパク質のシグナル配列(Andersonら，1991)を、本発明によるペプチドのＮ末端部に付加することができる。択一的に又は付加的に、本発明によるポリペプチドはユビキチンをＣ末端部に更に含んでなることができる。なぜならば、タンパク質のユビキチン化はタンパク質分解の増大をもたらすからである。
【００１６】
本発明によるポリペプチドの１つの好適な実施形態において、４つのエピトープは、スペーサーを用いることなく互いに直接結合する(各位置のＸ＝アミノ酸なし)。よって、ポリペプチドは配列SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA(配列番号23)を含んでなる。よって、ユビキチン及びER移行シグナルが存在しなければ、該ポリペプチドは下記実施例で例示するポリペプチド(SPRLQLSNLAPRRLVQLLGPRALVETLAPKHSDCLA、配列番号23)からなる。
本発明によるポリペプチドにおいて、アミノ酸はＬ-アミノ酸又はＤ-アミノ酸のいずれであることもできる。
本発明によるポリペプチドは、該ポリペプチドをワクチン接種したHLA-B*0702トランスジェニックマウスの過半数において、CEA188、TERT444、MAGE273及びHER-2/neu246同族天然型ペプチドから選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのペプチドに対して特異的CD8+ Ｔ細胞応答を誘導する。
本発明によるポリペプチドはまた、健常HLA-B*0702ドナーのヒトPBMCを用いるインビトロアッセイにおいて、CEA188、TERT444、MAGE273及びHER-2/neu246天然型ペプチドから選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのペプチドに対して特異的CD8+ Ｔ細胞応答を誘導する。
【００１７】
配列番号23のポリペプチドが正確にプロセスれ、良好な免疫原性を有することを確証するため、本発明者らは、次のこと：
−  各天然型ペプチドが１匹のHLA-B*0702トランスジェニックマウスで少なくとも１回認識されること；
−  配列番号23のポリペプチドが、健常HLA-B*0702ドナーのヒトPBMCを用いるインビトロアッセイにおいて、CEA188、TERT444、MAGE273及びHER-2/neu246同族天然型ペプチドから選択される少なくとも１つ、通常２以上のペプチドに対して特異的CD8+ Ｔ細胞応答を誘導すること；及び
−  これら特異的応答が２人以上の健常HLA-B*0702ドナーのPBMCを用いて得られ、各最適化ペプチドがHLA-B*0702健常ドナーのヒトPBMCを用いるインビトロアッセイで少なくとも１回認識されること
も証明した。
１つの更に好適な実施形態において、本発明によるポリペプチドは、上記特性の全てを示す。このことは、下記の実験の部に記載のプロトコール及びアッセイを用いて当業者が容易に試験することができる。
【００１８】
本発明の別の１つの観点は、上記ポリペプチドをロードした単離樹状細胞である。本発明に関して、「単離」は、樹状細胞が患者の体外にあることを意味する。樹状細胞は好ましくはエクスビボでロードする。例えば、樹状細胞に、Vonderheideら(Vonderheideら，2004)が記載した技法により該ポリペプチドをロードすることができる。
本発明はまた、ペプチド送達ベクター及び上記ポリペプチドを含んでなる複合体に関する。本発明に従って用いることができるペプチド送達ベクターの例は、例えばWO2013/150338、EP1795539及びWO2014/053629として公表された特許出願に記載されたもののような細胞透過性ペプチド、百日咳菌(B. pertussis)のアデニレートシクラーゼ(Fayolleら，1999)、ジフテリア毒素(Fayolleら，1999)、炭疽毒素(Dolingら，1999)、シガトキシンのＢサブユニット(Haicheurら，2000)のような細菌性毒素、及びハチ毒PLA2(Babonら，2005)、リポソーム、ビロゾーム(Bungenerら，2002)のような他のベクターなどである。
【００１９】
本発明はまた、上記のポリペプチド及び/又は操作された樹状細胞及び/又は複合体と医薬的に許容され得るキャリアとを含んでなる医薬組成物に関する。特に、本発明によるポリペプチド、樹状細胞及び複合体は、抗ガン免疫療法用免疫原性組成物の製造に用いることができる。これら組成物は、MAGE-Aファミリー、HERファミリー、CEA及びTERTからなる群より選択される少なくとも１つの抗原を発現する腫瘍の免疫療法、特にHLA-B*0702個体の治療に、特に有用である。
本発明は、実質的に任意のタイプのガン、例えば副腎皮質ガン、結腸直腸ガン、胆管ガン腫、膀胱ガン、骨ガン、脳及び中枢神経系ガン、乳ガン、子宮頸ガン、子宮内膜ガン、食道ガン、胃ガン、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓ガン、頭部頸部ガン、肝臓ガン、肺ガン 中皮腫、卵巣ガン、膵臓ガン、陰茎ガン、下垂体ガン、前立腺ガン、網膜芽種、横紋筋肉腫、皮膚ガン(例えば、メラノーマ、非メラノーマ皮膚ガン)、睾丸ガン、胸腺ガン、甲状腺ガン、膣ガン、外陰ガン及び子宮ガンを治療(又はその再発を防止)するために用いることができる。
本発明によるポリペプチドとアジュバントとを乳化し、ガンのワクチン接種又は治療の必要がある患者に該ポリペプチドをインビボ投与する工程を含んでなるガンのワクチン接種又は治療法、及び上記の操作した樹状細胞又は複合体を個体に投与する工程を含んでなるワクチン接種又は治療法もまた本発明の一部である。
【００２０】
本発明の別の１つの観点は、少なくとも１用量の上記ポリペプチド(又は複合体)及び少なくとも１用量のアジュバントを含んでなるキットである。免疫学的アジュバントは、ワクチン製剤の効力を増大させるために該ワクチン製剤に添加する物質である。アジュバントは、ワクチン接種により誘導される免疫応答の大きさ及び持続時間を増大させることができる。本発明によるキットに用いることができるアジュバントの好適な例は、不完全フロイントアジュバント(IFA)に由来するものである。これらアジュバントを有するワクチン製剤は、油中水(W/O)エマルジョンである。本発明によるペプチドとのエマルジョンに用いることができるIFAタイプ無毒化アジュバントの非限定的例としては、鉱油ベースのMontanide(登録商標) ISA 51及びスクアレンベースのMontanide(登録商標) ISA 720(SEPPIC，France)が挙げられる。
本発明による別の１つのキットは、少なくとも２用量の上記ポリペプチド又は複合体を含んでなる。ペプチドは、既にアジュバントを用いて製剤化されていてもよいし、されていなくてもよい。
ガンワクチン接種は、十分に効率的であるために数回の刺激を必要とするので、本発明によるキットは、３〜50、好ましくは６〜20用量の上記ポリペプチドを含んでなることができる。
上記キットの１つの好適な実施形態によれば、ポリペプチドの各用量は0.5〜10mgのポリペプチドを含んでなる。
【実施例】
【００２１】
下記の実施例により本発明を更に説明する。
実施例
実施例は以下の材料及び方法を用いて行った：
トランスジェニックマウス．HLA-B7 H-2クラス-Ｉノックアウトマウスは、以前(Rohrlichら，2003)に記載されており、F. Lemonnier(Institut Pasteur，Paris，France)の厚意により提供を受けた。
細胞．HLA-B*0702トランスフェクトヒトT2-B7細胞は、以前(Rohrlichら，2003)に記載されている。細胞は、ペニシリン ストレプトマイシン FCS 20％補充RPMI1640培養培地で生育させた。
ペプチド及びプラスミド．ペプチドはMillegen(Labege，France)又はEurogentec(Seraing，Belgique)が合成した。
HLA-B*0702トランスジェニックマウスにおけるインビボCTL誘導．HLA-B*0702トランスジェニックマウスの尾基部に、不完全フロイントアジュバント(IFA)又はMontanide ISA51VG(Seppic，Castres，France)中に乳化した200μgの最適化ジペプチド又は400μgのVbx-016及びHBVコアT13Lヘルパーペプチド(150μg)を、２週間間隔で２回、皮下ワクチン接種した。
最後のワクチン接種の７日後、脾臓を取り出し、Ｔ細胞をフィコール遠心分離により単離し、10μMの天然型又は最適化ペプチドの認識についてエクスビボで試験した。ポジティブコントロールはコンカナバリンＡであり、ネガティブコントロールは培地のみであった。全ての条件を４連で試験した。IFNγ産生Ｔ細胞を、Diaclone Kit Murine IFNγ ELISpotを用いるELISpotにより定量した。
１)ネガティブコントロールと試験ペプチドとの間に10スポット/106細胞より大きい差が存在し、及び２)この２群間にｔ検定で統計学的有意差(ｐ＜0.05)が存在すれば、免疫応答をポジティブとみなした。
【００２２】
ヒトPBMCからのCTLの創出．健常HLA-B*0702ボランティアから白血球搬出法によりPBMCを採集した。樹状細胞(DC)は、完全合成培地(AIMV)で500IU/ml GM-CSF及び500IU/ml IL-4と共に７日間培養した接着性細胞から作製した。６日目に、DCを10μMのポリペプチドで一晩パルスした。７日目に、CD8 Dynabeads Untouched Human CD8を用いるネガティブ選択によりCD8+細胞を精製した。CD8+細胞(２×105)＋CD8-細胞(６×104)を、丸底96ウェルプレートにおいて、1000IU/ml IL-6及び５IU/ml IL-12、１μg/ml 抗CD40及び500IU/ml IFNγを補充したAIMV培地中、３×104のペプチドパルスDCで刺激した。
７日目から、培養物を、20IU/ml IL-2及び10ng/ml IL-7、１μg/ml 抗CD40及び500IU/ml IFNγの存在下、ペプチドロードDCで毎週再刺激した。
３回目の再刺激の後、CD8細胞を、20IU/ml IL-2を補充したAIMV中で７日間維持した。培養物をAIMVで一晩飢餓状態にした後、IFNγ ELISpotアッセイで試験した。
IFNγ ELISpotアッセイ．96ウェルの１培養物につき、24ウェルの４プールを集め、CD8細胞を計数し、ウェルあたり50,000のCD8を、10μMの各天然型モノペプチド又は10μMの(該ポリペプチドを構成する)改変モノペプチドをロードした25,000のT2B7と共にELISpotプレートに素早く移した。各条件について８回行った。ポジティブコントロールはフィトヘマグルチニンＡであり、ネガティブコントロールは、HLA-B7分子に結合できない無関係のペプチドをロードしたT2B7であった。
【００２３】
実施例１：HLA-B*0702トランスジェニックマウスにおいて、異なるジペプチドの全ての組合せで２回ワクチン接種した後に生じるＴ細胞免疫応答の評価
各ジペプチドを用いて、HLA-B*0702トランスジェニックマウスに２週間間隔で２回ワクチン接種し、最適化ペプチド及びその同族天然型対応物の両方に対する免疫応答を誘導する能力について試験した。ジペプチドを表２に記載する。各実験において、最良の組合せを灰色で強調する。7C1HN3M、7C1T5M、7T5HN3M、7M1HN3M及び7T5M1Mは、応答マウスの数に関して、逆配列より良好な結果であった。7C1M1Mと7M1C1Mとは同じ結果であった。
【００２４】
【表４】
0006701164.tif 000005
【００２５】
実施例２：HLA-B*0702マウスにおいて、Vbx-016での２回のワクチン接種後に生じるＴ細胞免疫応答の評価
ジペプチド実験で決定したVbx-016(配列番号23)が最適であるかどうかを評価するため、HLA-B*0702トランスジェニックマウスの尾基部に、不完全フロイントアジュバント(IFA)又はMontanide ISA51VG(Seppic，Castres，France)に乳化した400μgのVbx-016及び150μgのHBVコアT13Lヘルパーペプチドを、２週間間隔で２回、皮下ワクチン接種をした。
２回のワクチン接種後、全てのマウスが少なくとも１つの天然型ペプチドに応答し、13/14のワクチン接種マウスが２以上の同族天然型ペプチドに応答した。重要なことに、各天然型ペプチドは１匹のワクチン接種マウスで少なくとも１回は認識された。
【００２６】
【表５】
0006701164.tif 000006
【００２７】
実施例３：HLA-B*0702トランスジェニックマウスで選択したジペプチドを用いるヒト末梢血単核細胞からの特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のインビトロ誘導によるＴ細胞免疫応答の評価
トランスジェニックマウスで検証されたポリペプチドCEA188L9/TERT444A1/MAGE273L9/HER-2/neu246A1に存在する接合部がヒトで効率的にプロセスされるかどうかを評価するため、ヒトPBMCを、「方法」に記載したプロトコールに従って各ジペプチド(CEA188L9/TERT444A1、TERT444A1/MAGE273L9及びMAGE273L9/HER-2/neu246A1)で刺激した。同族天然型ペプチドの認識を、ジペプチドで刺激したCD8+(本試験用に４プールに分割)に由来する特異的IFNγ産生細胞の測定により評価した。興味対象のペプチドについて得られる平均スポット数が無関係のペプチドで得られる平均スポット数を上回った場合、ｔ検定を行った；ｔ検定値が0.05未満の場合、結果を有意にポジティブであるとみなして、下記表において灰色で強調した。
各ドナーにおいて、CTLは、最適化及び同族天然型ペプチド(及びMAGE-A273L9を共有するペプチドの４つの天然型)の両方を認識することができた。このことから、各接合部がプロテアソームにより良好にプロセスされることが確証される。
【００２８】
【表６】
0006701164.tif 000007
【００２９】
実施例４：Vbx-016を用いるヒト末梢血単核細胞からの特異的細胞傷害性Ｔリンパ球のインビトロ誘導
最後に、Vbx-016を用いて健常ドナーのヒトPBMCを刺激した。
興味対象のペプチドについて得られる平均スポット数が無関係のペプチドで得られる平均スポット数を上回った場合、ｔ検定を行った；ｔ検定値が0.05未満の場合、結果を有意にポジティブであるとみなして、下記表において灰色で強調した。多重特異的応答が含まれており、幾つかの天然型ペプチドが、誘導されたCTLにより認識された。このことから、該ポリペプチドがプロテアソームにより良好にプロセスされ、誘導された応答が多重特異的であることが確証される。
【００３０】
【表７】
0006701164.tif 000008
【００３１】
参考文献
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