(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ１）下記（１）又は（３）のアミノ酸配列を有し、かつ（ａ２）環状エノン還元活性を有するタンパク質、（４）〜（５）のいずれかの塩基配列を有する遺伝子をベクター中に含むプラスミドを宿主生物中に前記遺伝子がコードする環状エノン還元酵素を発現可能に含む形質転換体およびその菌体処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素源を、環構造の炭素数が１２〜１５個の環状エノンに作用させて、前記環状エノンの炭素−炭素２重結合の還元生成物である環状ケトンを得る工程を含む、環状ケトンの製造方法。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列；
（４）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有し、環状エノン還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（５）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、環状エノン還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項２】
前記環状エノンが、下式（１）で示される化合物である請求項１に記載の製造方法。
式（１）：
【化１】
0006669437.tif 000008
（式中、nは７〜１０の整数であり、Ｒは水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基である。）
【請求項３】
前記環状エノン還元活性は、シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンから成る群から選ばれる少なくとも1種の環状エノンの還元活性である請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記シクロドデセノンの還元活性は、以下の測定法により測定される請求項３に記載の製造方法。
測定法: 100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、0.2 mM NADPH、20 mM シクロドデセノン及び前記タンパク質を含む反応液中30℃で反応させ、生成したシクロドデカノンをGC/MSで定量する。
【請求項５】
前記シクロペンタデセノンの還元活性は、以下の測定法により測定される請求項３に記載の製造方法。測定法: 100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、0.2 mM NADPH、20 mM シクロペンタデセノン及び前記タンパク質を含む反応液中30℃で反応させ、生成したシクロペンタデカノンをGC/MSで定量する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状エノン還元酵素及びこの酵素を用いることにより、環状エノンの炭素−炭素２重結合を還元して、環状ケトンを製造する方法に関する。前記酵素は、例えば、ヤロウィア・リポリティカ NBRC 0746に由来する酵素である。
【背景技術】
【０００２】
環状ケトンは、医薬品や有機合成における原料として汎用性の高い有用な化合物であり、光学活性アルコール、光学活性アミンの原料としても重要な化合物である。これらの環状ケトンの製造方法として、例えば、環状エノンの還元が有用である。
【０００３】
化学的にエノンの炭素−炭素２重結合を還元する方法としては、パラジウム(0)-トリブチルスズを用いる方法（非特許文献１）、サマリウム(0)を用いる方法（非特許文献２）、コバルトヒドリドを用いる方法（非特許文献３）、鉄ヒドリドを用いる方法（非特許文献４）、立体選択的に還元する方法としては、銅―キラルホスフィンを用いる方法（非特許文献５−７）、キラル有機分子触媒（非特許文献８）などが知られている。
【０００４】
一方、生物学的な反応によって環状エノンの炭素−炭素２重結合を還元する酵素としては、以下のような酵素が報告されている。Nicotiana tabacum由来のエノン還元酵素であるp44、p90（非特許文献９）、Candida castellii、Kazachstania spencerorum、Kluyveromyces matrixianus由来のLevodione還元酵素（非特許文献１０）、Saccharomyces carlsbergensis由来のOld Yellow Enzyme（非特許文献１１）、Bacillus subtilis由来のYqjM（非特許文献１２）が５員環エノンまたは６員環エノンを立体選択的に還元することが知られている。また、Pseudomonas putida M10由来のMorphinone reductase（非特許文献１３）、Digitalis purpurea由来のprogesterone 5α-reductase（非特許文献１４）は多環式化合物のエノンを還元することが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tetrahedron Lett.,23巻, 477〜480ページ（1981年）
【非特許文献２】Synlett, 443〜444ページ (1995年)
【非特許文献３】Synlett, 96〜98ページ (1999年)
【非特許文献４】J. Org. Chem., 37巻, 1542〜1545ページ (1972年)
【非特許文献５】J. Am. Chem. Soc., 121巻, 9473〜9474ページ (1999年)
【非特許文献６】J. Am. Chem. Soc., 126巻, 8352〜8353ページ (2004年)
【非特許文献７】Org. Lett., 6巻, 1273〜1275ページ (2004年)
【非特許文献８】J. Am. Chem. Soc., 128巻, 13368〜13369ページ (2006年)
【非特許文献９】Tetrahedron: Asymmetry, 15巻, 2443〜2446 ページ (2004 年)
【非特許文献１０】J. Biotechnol., 156巻, 279〜285 ページ (2011 年)
【非特許文献１１】J. Mol. Catal. B: Enzyme, 4 2巻, 52〜54 ページ (2006 年)
【非特許文献１２】Adv. Synth. Catal., 351巻, 3287〜3305 ページ (2009 年)
【非特許文献１３】Biochem. J., 301巻, 97〜103 ページ (1994 年)
【非特許文献１４】J. Plant. Physiol., 141巻, 269〜275 ページ (1993 年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、環状エノンの炭素−炭素２重結合を還元する酵素は知られている。しかしか、５員環エノンや６員環エノンなどの小員環エノンと、一部の多環式化合物を基質とするもので、例えば、７員環以上の単環の大環状エノンを還元し得る酵素は知られていない。そのため、大環状エノンの炭素−炭素２重結合の還元は化学的な方法に限られていた。
【０００７】
しかし、化学的な方法によるエノンの還元方法は、嫌気条件や非水条件などの厳密な反応条件を必要とするなどの欠点がある。
【０００８】
そこで本発明は、７員環以上の単環の大環状エノンであっても還元可能な、新規な環状エノン還元酵素を提供すること、及びこの環状エノン還元酵素を用いて、７員環以上の単環の大環状エノンを含む環状エノンの炭素−炭素２重結合を還元して、環状ケトンを製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) NBRC 0746由来の新規な環状エノン還元酵素が、５員環エノンや６員環エノンなどの小環状エノンのみならず、７員環以上の大環状エノンの炭素−炭素２重結合を還元し得ることを発見し、さらに、ヤロウィア・リポリティカ NBRC 0746の菌体、酵素、形質転換体およびその菌体処理物を用いて、穏和な条件下で大環状エノンを還元すると大環状ケトンを生成することができることを見出して、本発明を完成した。
【００１０】
以下、本発明を示す。
［１］
（Ａ）〜（Ｈ）に示す性質を有する環状エノン還元酵素。
（Ａ）ＮＡＤＰＨを電子供与体として環状エノンの炭素−炭素２重結合を還元し、対応する環状ケトンを生成する。
（Ｂ）分子量  ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）により約45,000。ゲル濾過により約40,000。
（Ｃ）至適ｐＨ  ｐＨ４．５−８．５。
（Ｄ）至適温度  ３５−５０℃。
（Ｅ）温度安定性  ５−４０℃。
（Ｆ）ｐＨ安定性  ｐＨ３．５−１０．０。
（Ｇ）阻害剤  硝酸亜鉛  塩化水銀、硝酸銀。
（Ｈ）補欠分子族  フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）。
［２］
前記（Ａ）における環状エノンはシクロへキセノン、シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンから成る群から選ばれる少なくとも1種の環状エノンである［１］に記載の環状エノン還元酵素。
［３］
ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) NBRC 0746由来である［１］又は［２］に記載の環状エノン還元酵素。
［４］
（ａ１）下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ（ａ２）環状エノン還元活性を有する、タンパク質。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
［５］
前記環状エノン還元活性は、シクロへキセノン、シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンから成る群から選ばれる少なくとも1種の環状エノンの還元活性である［４］に記載のタンパク質。
［６］
前記シクロへキセノンの還元活性は、以下の測定法により測定される［５］に記載のタンパク質。
測定法: 100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、0.2 mM NADPH、20 mM シクロへキセノン及び前記タンパク質を含む反応液中30℃で反応させ、NADPHの減少にともなう340 nmの吸光度の減少を測定する。
［７］
［４］に記載のタンパク質をコードする遺伝子又は下記の（４）〜（６）の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（４）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有し、環状エノン還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（５）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、環状エノン還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（６）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、環状エノン還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
［８］
前記環状エノン還元活性は、シクロへキセノン、シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンから成る群から選ばれる少なくとも1種の環状エノンの還元活性である［７］に記載の遺伝子。
［９］
前記シクロへキセノンの還元活性は、以下の測定法により測定される［８］に記載の遺伝子。
測定法: 100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、0.2 mM NADPH、20 mM シクロへキセノン及び前記タンパク質を含む反応液中30℃で反応させ、NADPHの減少にともなう340 nmの吸光度の減少を測定する。
［１０］
［７］〜［９］のいずれかに記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミド。
［１１］
宿主生物中に、［１０］に記載のプラスミドを前記遺伝子がコードする環状エノン還元酵素を発現可能に含む、形質転換体。
［１２］
［１］〜［６］のいずれか１項に記載の酵素又はタンパク質、［１１］に記載の形質転換体およびその菌体処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素源を、環構造の炭素数が５〜２０個の環状エノンに作用させて、前記環状エノンの炭素−炭素２重結合の還元生成物である環状ケトンを得る工程を含む、環状ケトンの製造方法。
［１３］
前記環状エノンが、下式（１）で示される化合物である［１２］に記載の製造方法。
式（１）：
【化１】
0006669437.tif 000002
（式中、nは１〜１５の整数であり、Ｒは水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基である。）
［１４］
前記環状エノンが、式（１）のnが７〜１０の１２員環エノン〜１５員環エノンである［１３］に記載の製造方法。
［１５］
前記式（１）の環状エノンが、３-メチル−２−シクロへキセノンであり、
３-メチル−２−シクロへキセノンの炭素−炭素２重結合を立体選択的に還元して、
環状ケトンとして、(S)-３-メチル−シクロへキサノンを得る、［１２］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、５員環エノンや６員環エノンなどの小環状エノンのみならず、７員環以上の大環状エノンの炭素−炭素２重結合をも還元することができる環状エノン還元酵素を提供することができる。この環状エノン還元酵素は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) NBRC 0746に由来する物であることができ、この菌体、環状エノン還元酵素、環状エノン還元酵素の遺伝子を含む形質転換体、並びに前記菌体及び形質転換体の菌体処理物を用いることで、穏和な条件で、５員環エノンや６員環エノンなどの小環状エノンのみならず、７員環以上の大環状エノンを還元する方法を提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、SDS-PAGEにおけるパターンを示す写真である。レーン１は分子量マーカー、レーン２、レーン３は実施例１で得られた酵素を示す。
【図２】図２は、実施例１で得られた酵素の至適pHを示す図である。
【図３】図３は、実施例１で得られた酵素の至適温度を示す図である。
【図４】図４は、実施例１で得られた酵素の温度安定性を示す図である。
【図５】図５は、実施例１で得られた酵素のpH安定性を示す図である。
【図６】図６は、実施例１で得られた酵素の紫外可視吸収スペクトルである。
【図７】図７は、ＦＡＤ、ＦＭＮ標準品と実施例１で得られた酵素のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】図８は、実施例１で得られた酵素とシクロへキセノンの酵素反応を行った場合の反応液とシクロヘキサノン標準品のGC/MSクロマトグラムである。
【図９】図９は、実施例１で得られた酵素と3-メチルシクロへキセノンの酵素反応を行った場合の反応液と3-メチルシクロヘキサノン標準品のGC/MSクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、実施例１で得られた酵素と3-メチルシクロへキセノンの酵素反応を行った場合の反応液と(R/S)-3-メチルシクロヘキサノン標準品のGC/MSクロマトグラムである。
【図１１】図１１は、実施例１で得られた酵素とシクロドデセノンの酵素反応を行った場合の反応液とシクロドデカノン標準品のGC/MSクロマトグラムである。
【図１２】図１２は、実施例１で得られた酵素とシクロペンタデセノンの酵素反応を行った場合の反応液とシクロペンタデカノン標準品のGC/MSクロマトグラムである。
【図１３】図１３は、環状エノン還元酵素遺伝子の塩基配列（配列番号１）である。
【図１４】図１４は、環状エノン還元酵素のアミノ酸配列（配列番号２）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を以下に説明する。
【００１４】
１．環状エノン還元酵素
本発明は、（Ａ）〜（Ｈ）に示す性質を有する環状エノン還元酵素を包含する。
（Ａ）ＮＡＤＰＨを電子供与体として環状エノンの炭素−炭素２重結合を還元し、対応する環状ケトンを生成する。
（Ａ）における環状エノンは、例えば、シクロへキセノン、シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンから成る群から選ばれる少なくとも1種の環状ケトンである。本発明の環状エノン還元酵素が、シクロへキセノン、シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンの炭素−炭素２重結合を還元して、対応する環状ケトンを生成することは実施例において具体的に示されている。
【００１５】
下記（Ｂ）〜（Ｈ）は、具体的には、実施例に記載されている。
（Ｂ）分子量  ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により約45,000。ゲル濾過により約40,000。
（Ｃ）至適ｐＨ  ｐＨ４．５−８．５。
（Ｄ）至適温度  ３５−５０℃。
（Ｅ）温度安定性  ５−４０℃。
（Ｆ）ｐＨ安定性  ｐＨ３．５−１０．０。
（Ｇ）阻害剤  硝酸亜鉛  塩化水銀、硝酸銀。
（Ｈ）補欠分子族  フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）。
【００１６】
２．本発明の酵素の製造
本発明の環状エノン還元酵素は、本発明の環状エノン還元酵素を産生する微生物であるヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) NBRC 0746を培養し、培養物から通常の蛋白質の精製方法により、精製して調製することができる。ヤロウィア・リポリティカ NBRC 0746は、入手または購入が容易な保存株から得ることができる。例えば、以下のカルチャーコレクションより入手可能である。独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）（〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）。
【００１７】
上記微生物は、ＹＰＤ培地等の一般的な培地で培養される。また、目的の環状エノン還元酵素を誘導させるために、各種エノン化合物を培地に添加すると優れた結果が得られるため、好ましい。例えば、シクロへキセノンを０．０１〜０.１％（Ｗ／Ｖ）培地に添加する。微生物の培養は、一般的な条件により行なうことができる。例えば、ｐＨ４．０〜９．５、温度範囲２０℃〜３７℃の範囲で、好気的に２４〜７２時間培養するのが好ましい。
【００１８】
十分に増殖させた後に菌体を回収し、緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、培養物からの蛋白質の精製は、例えば、菌体を破砕後、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過などを組み合わせることにより行うことができる。より具体的には、蛋白質の溶解度による分画（硫安などによる塩析など）や、陽イオン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせることにより精製することができる。たとえば、Q Sepharoseを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー、Toyopearl Butyl カラムを用いた疎水性クロマトグラフィー、MonoQを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、RESOURCE PHEを用いた疎水クロマトグラフィー、HiTrap Qを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、Superdexを用いたゲルろ過等を経て電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。
【００１９】
本発明の環状エノン還元酵素の環状エノンに対する還元活性は、次のようにして確認することができる。
還元活性測定法: 100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、0.2 mM NADPH、20 mM シクロへキセノン及び酵素を含む反応液中30℃で反応させ、NADPHの減少にともなう340 nmの吸光度の減少を測定する。1 Uは、1分間に1μmolのNADPHの減少を触媒する酵素量とした。また、蛋白質の定量は、バイオラッド製蛋白質アッセイキットを用いた色素結合法により行うことができる。
【００２０】
上記環状エノンに対する還元活性は、シクロへキセノンに対する還元活性であるが、シクロへキセノン以外の環状エノンに対する還元活性も、シクロへキセノンに代えて還元活性を測定したい環状エノンを用いることでほぼ同様の方法で測定できる。シクロへキセノン以外の環状エノンは、例えば、７員環以上の単環の大環状エノンである、シクロドデセノン又はシクロペンタデセノンであることができる。シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンに対する還元活性の測定方法を以下に例示する。3.0 mM シクロドデセノン又はシクロペンタデセノン、酵素 3.4 U (シクロへキセノンに対して)、100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、20 mM NADPH、10 mMグルタミン酸、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ 2 Uを含む反応液1 mLで30℃で24時間反応させ、反応液を酢酸エチルで抽出し、分析条件１でGC/MS分析を行う。標準物質との面積比からシクロドデカノン又はシクロペンタデカノンの生産量を求めることができる。グルタミン酸及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼは、後述するように、NADP+をNADPH還元するための系である。
【００２１】
３．本発明のタンパク質
本発明は、（ａ１）下記（１）〜（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつ（ａ２）環状エノン還元活性を有する、タンパク質を包含する。
（１）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００２２】
本発明の環状エノン還元活性を有するタンパク質の（ａ２）の環状エノン還元活性は、シクロへキセノン、シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンから成る群から選ばれる少なくとも1種の環状ケトンの還元活性であることができ、好ましくは、シクロへキセノン、シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンに対する還元活性である。特に、本発明の環状エノン還元活性を有するタンパク質は、７員環以上の単環の大環状エノンである、シクロドデセノン及び／又はシクロペンタデセノンに対する還元活性を有するタンパク質であることで、従来知られている環状エノン還元酵素と明確に異なる酵素である。環状エノン還元活性、即ち、環状エノンに対する還元活性は、前述１．の本発明の酵素について説明した測定方法で測定することができる。
【００２３】
本発明のタンパク質の（１）における、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) NBRC 0746から単離された環状エノン還元活性を有する、タンパク質(環状エノン還元酵素)のアミノ酸配列である。実施例１０にアミノ酸配列決定については詳述する。
【００２４】
本発明のタンパク質の（２）は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで言う「１から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から５０個」の範囲は、欠失等を有するタンパク質が、前記（２ａ）の環状エノン還元活性を有する酵素であることを意味する。前記「１から５０個」の範囲は、前記環状エノン還元活性を有するタンパク質である割合が高いという観点から、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、一層好ましくは１から７個、さらに一層好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度であることができる。
【００２５】
本発明のタンパク質の（３）は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで言う「配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における同一性は、前記アミノ酸配列の同一性を有するタンパク質が、前記（２ａ）の環状エノン還元活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の同一性は、９０％以上であれば特に限定されないが、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％、特に好ましくは９９％以上である。
【００２６】
本発明の環状エノン還元活性を有するタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するように当該タンパク質をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、上記環状エノン還元酵素を産生することができる。
【００２７】
本発明の環状エノン還元活性を有するタンパク質は、上記タンパク質をコードする遺伝子をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、生産方法により調製することができる。上記タンパク質をコードする遺伝子の取得方法は、特に限定されないが、４．において後述する。本発明のタンパク質の調製方法は、５．プラスミド及び形質転換体の項で後述する。
【００２８】
４．遺伝子
本発明は、上記３．で説明したタンパク質をコードする遺伝子又は下記の（４）〜（６）の何れかの塩基配列を有する遺伝子を包含する。
（４）配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有し、環状エノン還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（５）配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、環状エノン還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（６）配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、環状エノン還元活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【００２９】
本発明の遺伝子において、「環状エノン還元活性を有するタンパク質」における「環状エノン還元活性」とは、シクロへキセノン、シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンから成る群から選ばれる少なくとも1種の環状ケトンの還元活性であることができ、好ましくは、シクロへキセノン、シクロドデセノン及びシクロペンタデセノンに対する還元活性である。特に、本発明の環状エノン還元活性を有するタンパク質は、７員環以上の単環の大環状エノンである、シクロドデセノン及び／又はシクロペンタデセノンに対する還元活性を有するタンパク質であることで、従来知られている環状エノン還元酵素と明確に異なる酵素である。環状エノン還元活性、即ち、環状エノンに対する還元活性は、前述１．の本発明の酵素について説明した測定方法で測定することができる。
【００３０】
本明細書で言う「１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から５０個」の範囲は特には限定されないが、例えば、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００３１】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、環状エノン還元活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；並びに配列表の配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、環状エノン還元活性を有少なくともタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号１及び２に記載の塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００３２】
例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて調製することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３３】
上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０MのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
【００３５】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１及び２に記載した塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、既存の生物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している、例えば、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica) NBRC 0746の培養物から得られた細胞から常法により作製することができる。ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。上記ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００３６】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知の方法で行うことができる。
【００３７】
５．ペラスミド及び／又は形質転換体
本発明は、上記本発明の遺伝子をベクター中に含むプラスミドを包含する。さらに本発明は、宿主生物中に、本発明のプラスミドを前記本発明の遺伝子がコードする環状エノン還元酵素を発現可能に含む、形質転換体を包含する。
【００３８】
本発明において、エノン還元酵素をコードするＤＮＡを含む形質転換体を使用して、本発明の環状エノン還元活性を有するタンパク質を発現させることで、調製することができ、かつ得られるタンパク質を環状エノンの還元反応に利用することができる。
【００３９】
上記環状エノン還元酵素の遺伝子は適当なベクター中に挿入する。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。即ち、本発明のプラスミドに用いるベクターとしては、宿主生物内で本発明に利用する還元酵素をコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとして、例えば大腸菌の場合では、pUC19 (タカラバイオ社製)、酵母の場合では、pPCIZA（ライフテクノロジーズ社製）などが挙げられる。
【００４０】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Geobacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus subtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosidase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌（E. coli）のlac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
【００４１】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００４２】
また、上記環状エノン還元酵素の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。環状エノン還元酵素の遺伝子を含む組換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。環状エノン還元酵素の遺伝子を含む組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００４３】
環状エノン還元酵素の遺伝子を含む組換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。環状エノン還元酵素の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００４４】
環状エノン還元酵素の遺伝子を含む組換えベクターを適当な宿主生物に導入することによって形質転換体を作製することができる。用いる宿主生物は、該酵素をコードするＤＮＡを含む酵素発現ベクターにより形質転換され、ＤＮＡを導入した酵素を発現することができる生物であれば、特に制限するものではない。環状エノン還元酵素の遺伝子を含む組換えベクターを導入される宿主細胞は、環状エノン還元酵素の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。このような宿主生物として、より具体的には、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や酵母（Pichia pastoris）が挙げられる。
【００４５】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌（E. coli）等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００４６】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００４７】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００４８】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、公知の方法を用いて組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。
【００４９】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
【００５０】
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００５１】
本発明に利用する還元酵素をコードするＤＮＡを含むベクターは、上記のように公知の方法により宿主微生物に導入することができる。例えば、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のEscherichia coli JM109（以下、E. coli JM109）コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。宿主微生物として酵母を用いる場合は、市販のPichia pastoris X-33株、GS-115株、KM71H株（ライフテクノロジーズ社製）などを用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００５２】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明で用いる環状エノン還元酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明で用いる環状エノン還元酵素が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明の環状エノン還元酵素を精製標品として得ることができる。
【００５３】
６．環状ケトンの製造方法
本発明は、前記１．及び２．に記載の酵素又はタンパク質、前記５．に記載の形質転換体およびその菌体処理物からなる群から選択されるいずれかの酵素源を、環構造の炭素数が５〜２０個の環状エノンに作用させて、前記環状エノンの炭素−炭素２重結合の還元生成物である環状ケトンを得る工程を含む、環状ケトンの製造方法を包含する。
【００５４】
「環状エノン」
「環状エノン」は、少なくとも１個、例えば、１個又は２個、好ましくは１個の炭素−炭素２重結合をα位とβ位の間に有する環状の炭化水素化合物である。環構造の炭素数は、５〜２０個の範囲であり、好ましくは環構造の炭素数が５〜１５個の範囲である。「環状エノン」は、例えば、下式（１）に示される化合物であることができる。
【００５５】
【化２】
0006669437.tif 000003
【００５６】
式（１）中、nは、１〜１５の範囲の整数であり、Ｒは水素原子又は炭素数１〜６個のアルキル基である。前記式（１）の環状エノンは、nが７〜１０の１２員環エノン〜１５員環エノンであっても、本発明の還元酵素を用いることで、環状ケトンにすることができる。
【００５７】
「酵素源」としては、目的とする還元活性を有する限りにおいては、酵素そのものだけでなく、当該酵素を生成する微生物の菌体そのもの、または菌体処理物であってもよい。また、当該微生物由来の還元活性を有する酵素をコードするＤＮＡが導入された形質転換体も含むものとする。
【００５８】
酵素源を用いた還元反応の際には、適当な溶媒と基質の環状エノン化合物、上記微生物、またはその処理物等を混合し、ｐＨ調整下に攪拌、振とうまたは静置する。
【００５９】
反応溶媒としては、通常、水や緩衝液等の水性媒体を用いる。緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液やトリス−塩酸緩衝液が挙げられる。但し、これらの限定される意図ではない。
【００６０】
基質である環状エノン化合物は、反応の初期に一括添加してもよく、反応の進行にあわせて逐次分割して添加してもよい。
【００６１】
反応時の温度は、還元酵素の至適温度及び温度安定性等を考慮して適宜決定することができ、通常、１０〜６０℃、好ましくは３５〜５０℃とする。
【００６２】
反応時のｐＨは、還元酵素の至適ｐＨ等を考慮して適宜決定することができ、通常、２．５〜１０、好ましくはｐＨ４．５〜８．５の範囲である。
【００６３】
反応液中の基質濃度は０．０１〜1％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、より好ましくは、０．０１〜０．2％（Ｗ／Ｖ）である。
【００６４】
反応時間は、基質濃度、微生物の量及びその他の反応条件により適宜決定される。通常、２〜１６８時間で反応が終了するように各条件を設定することが好ましい。但し、この範囲に限定される意図ではない。
【００６５】
還元反応を促進させるために、反応液にグルコースなどのエネルギー源を０．５〜３０％（Ｗ／Ｖ）の割合で加えるのが好ましい。
【００６６】
一般に、生物学的方法による還元反応に必要とされているＮＡＤＰＨ等の補酵素を添加することにより、反応を促進させることもできる。この場合、通常は、反応液に直接これらを添加する。
【００６７】
また、還元反応を促進させるために、ＮＡＤＰ+をそれぞれの還元型へ還元する酵素と、該還元のための基質を共存させて反応を行うのが好ましい。例えば、還元型へ還元する酵素としてグルタミン酸脱水素酵素、還元のための基質としてグルタミン酸をそれぞれ共存させるか、または、還元型へ還元する酵素としてグルコース脱水素酵素、還元のための基質としてグルコースをそれぞれ共存させるのがよい。
【００６８】
還元反応により生成した環状ケトンを取り出す方法は特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後に、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、ジクロロメタン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留やシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製することにより、高純度の環状ケトンを容易に得ることができる。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。
【００７０】
実施例１  環状エノン還元酵素の精製
ヤロウィア・リポリティカ NBRC0746株をシクロへキセノン(10 g, 90.8 mmol)を含む表１の培地20 Lに植菌し、30℃で48時間振盪培養した。この培養液を4℃、10,000×ｇで25分間遠心分離して集菌し、20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)で洗浄した。さらに、洗浄した菌を同緩衝液に懸濁し、多検体細胞破砕機（安井器械社製「マルチビーズショッカー」）を用い、菌体を2,500 rpmで6分間破砕した。次に、菌体破砕液を４℃、24,100×gで30分間遠心分離することにより菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。
【００７１】
この無細胞抽出液を20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)で平衡化したQ Sepharose(GEヘルスケア社製、5.6 cm×15 cm)に添加した。同緩衝液で洗浄後、0-1.0 M 塩化ナトリウムで勾配溶出を行い、溶出した画分を回収した。
【００７２】
活性画分として溶出した素通り画分に硫安を30% 飽和添加し、30% 飽和硫安を含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)で平衡化したToyopearl Butyl-650M(東ソー社製、5.6 cm×15 cm)に添加した。同緩衝液で洗浄後、30-0 % 飽和硫安で勾配溶出を行い、溶出した画分を回収した。
【００７３】
以後の精製は、タンパク質精製用液体クロマトグラフィーシステム (GEヘルスケア社製、AKTAexplorer 10S) を用いて行った。
得られた画分を20 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0)に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したMono Q 10/100 GL(GEヘルスケア社製、8 mL)に添加し、0-0.5 M 塩化ナトリウムで勾配溶出を行い、溶出した画分を回収した。
得られた画分を20 mM リン酸緩衝液 (pH 7.0) に対して透析した後、硫安を30% 飽和添加し、30% 飽和硫安を含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)で平衡化したRESOURCE PHE(Amersham Pharmacia Biotech社製、1 ml)に添加し、30-0 % 飽和硫安で勾配溶出を行い、溶出した画分を回収した。
得られた画分を20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したHiTrap Q(GEヘルスケア社製、5 mL)に添加し、0-0.5 M 塩化ナトリウムで勾配溶出を行い、溶出した画分を回収した。
得られた画分を20 mM リン酸緩衝液(pH 7.0)に対して透析した後、限外濾過 (メルクミリポア社製、Amicon(R) Ultra) により濃縮、同緩衝液で平衡化したSuperdex 200 10/300 GL (Amersham Biosciences K.K.社製、1 cm×30 cm)に添加し、溶出した。
【００７４】
Superdex 200 10/300 GLにより得られた活性画分を、SDS-PAGEにより解析した結果、ほぼ単一バンドであった（図１）。精製酵素のシクロへキセノンに対する比活性は14.1 U/mgであった。精製の要約を表２に示す。
【００７５】
【表１】
0006669437.tif 000004
【００７６】
【表２】
0006669437.tif 000005
【００７７】
実施例２  環状エノン還元酵素の分子量測定
実施例１で得られた酵素のサブユニットの分子量をSDS-PAGEにより求めた結果、4.5万であった。また、Superdex 200 10/300 GLのゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ、約4.0万であった。これらの結果より、本発明のエノン還元酵素はモノマー酵素と予想された。
【００７８】
実施例３  環状エノン還元酵素の至適ｐＨ
リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いてｐＨを変化させて、実施例１で得られた酵素のシクロへキセノン還元活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図２に示した。反応の至適ｐＨは７．０であり、ｐＨ４．５−８．５の極めて広い範囲で最大活性の８０％以上の活性を示した。
【００７９】
実施例４  環状エノン還元酵素の至適温度
実施例１で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけを変化させて、シクロへキセノン還元活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３に示した。反応の至適温度は４０℃であり、３５−５０℃において最大活性の８０％以上の活性を示した。
【００８０】
実施例５  環状エノン還元酵素の温度安定性
実施例１で得られた酵素を５−８０℃で３０分間インキュベートした後、標準反応条件でシクロへキセノン還元活性を測定した。未処理の酵素を用いたときの活性を１００とした相対活性で表し、図４に示した。酵素は５−４０℃において最大活性の８０％以上の活性を示した。
【００８１】
実施例６  環状エノン還元酵素のｐＨ安定性
実施例１で得られた酵素をｐＨ３．５−１１．５で３０分間インキュベートした後、標準反応条件でシクロへキセノン還元活性を測定した。未処理の酵素を用いたときの活性を１００とした相対活性で表し、図５に示した。酵素はｐＨ３．５−１０．０において最大活性の８０％以上の活性を示した。
【００８２】
実施例７  環状エノン還元酵素の阻害剤
実施例１で得られた酵素を標準反応条件に、種々の阻害剤を１ ｍM 添加して、シクロへキセノン還元活性を測定し、阻害剤未添加の活性を１００とした相対活性で表し、表３に示した。硝酸銀、塩化水銀、硝酸亜鉛において最大活性の２０％以上の活性の阻害を示した。
【００８３】
【表３】
0006669437.tif 000006
【００８４】
実施例８  環状エノン還元酵素の補欠分子族
実施例１で得られた酵素の紫外可視吸収スペクトルを測定した。（図６）
また、実施例１で得られた酵素を(5 mg/mL)100μLを10分間、100℃で処理し、16,000 ×gで5分間遠心分離を行った。その上清を10 mM リン酸二水素カリウム（15 mM 酢酸マンガン溶液）：15 % アセトニトリル＝85：15（pH 3.4）で二倍希釈して以下の条件でHPLC分析を行った。その結果、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）標準品と同様に11.9 minにピークが認められた。なお、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）のピークは8.06 minに認められた。
【００８５】
ＨＰＬＣシステム
分析条件
ＨＰＬＣシステム：島津製作所社製「ＬＣ−２０ＡＤ」
カラム：ジーエルサイエンス社製「Inertsil ODS-3」(２．１×３０cm)
カラム温度：４０℃
移動相：10 mM リン酸二水素カリウム（15 mM 酢酸マンガン溶液）：15 % アセトニトリル＝85：15（pH 3.4）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：４４５ｎｍ
【００８６】
実施例９  環状エノン還元酵素のKm、Vmax
実施例１で得られた酵素を標準反応条件で反応させ、Vmax、 Km値を算出した。（表４）
【００８７】
【表４】
0006669437.tif 000007
【００８８】
実施例１０  環状エノン還元酵素のアミノ酸配列
実施例１で得られた酵素を用いて、SDS-PAGEのゲルより、環状エノン還元酵素を含むゲル断片を切り出し、30 % のアセトニトリルを含む25 mM 炭酸水素アンモニウムを用いて洗浄後、ヨードアセトアミドを用いた還元アルキル化、トリプシンを用いて37℃で終夜ゲル内消化を行った。消化したペプチドを抽出し、nanoLC/nanoESI-QTOFで分析を行った。その結果、精製した酵素はYarrowia lipolytica CLIB122株の酵素 (Accession number: CAG82798) と同一のアミノ酸配列を有する酵素であった。
【００８９】
分析条件
LC/MS
ＵＰＬＣシステム：Waters社製「nanoACQUITY UPLC」
Trapカラム：Waters社製「nanoACQUITY  symmetry C18」( φ5 μm, 180 μm × 20 mm)
分析カラム：Waters社製「nanoACQUITY CSH 130 C18」(φ1.7 μm, 75 μm × 200 mm)
カラム温度：35℃
移動相：水（0.1 % ギ酸/ アセトニトリル（0.1 % ギ酸）
1 % (0−1 min)、1-50 % (1-50 min)、50-95 % (50-55 min)、95 %(55-75             min)、95-99 % (75-78 min) アセトニトリル（0.1 % ギ酸）
流速：０．３μＬ／ｍｉｎ
【００９０】
ＭＳシステム：Waters社製「SYNAPT G2-Si」
イオン化方法：nanoESI,  ポジティブイオンモード
コーン電圧：３ kV
【００９１】
LC/MS/MS
フラグメンテーションモード: CID
トラップコリジョンエネルギー: ５，１５，２５，３５Ｖ
トランスファーコリジョンエネルギー： off
【００９２】
実施例１１  ヤロウィア・リポリティカ NBRC0746由来環状エノンを生産する形質転換大腸菌の作製
ヤロウィア・リポリティカNBRC0746由来の環状エノンをコードする遺伝子配列を元にORFクローニング用のプライマー1（配列番号：３）、プライマー2（配列番号：４）を合成した。プライマーを各100 pmol、dNTP 0.2 mmol、ヤロウィア・リポリティカNBRC0746由来染色体DNA 50 ng、硫酸マグネシウム 1 mM、KOD -Plus- PCR用緩衝液、KOD -Plus- polymerase 0.2 U (TOYOBO製)を含む50μLの反応液を用い、初期変性後（94℃、2分）、変性（94℃、15秒）、アニール（58℃、30秒）、伸張（68℃、2分30秒）を30サイクル、Peliter Thermal Cycler PTC-200（エムジェイジャパン社製）を用いて行った。PCR後、増幅した遺伝子と発現用ベクターpUC19をEcoR IとHind IIIで消化し、T4 DNA Ligase (タカラ社製)を用いて、ライゲーションし、大腸菌E. coli JM109株を形質転換した。
【００９３】
配列番号：３：CCGCAAGCTTAAGGAGATGTCAACTGTCAACC
配列番号：４：CCGCGAATTCTTACTGCTTCAGCTCCTGAT
【００９４】
実施例１２  組換え環状エノン還元酵素の大腸菌による生産
環状エノン還元酵素を発現するプラスミドpUC19で形質転換された大腸菌E. coli JM109株を、アンピシリンを含む液体LB培地で３７℃で12時間振とう培養し、1.0mM IPTGを加え、さらに24時間振とう培養を行った。 菌体を遠心分離により集菌した後、１0mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）に懸濁し、超音波で１５分処理して菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中として回収し、シクロへキセノンに対する活性を測定した。また該プラスミドを含まない大腸菌E. coli JM109株をLB培地で３７℃で12時間振とう培養し、1.0mM IPTGを加え、さらに24時間振とう培養を行った菌体を、同様に破砕してシクロへキセノンに対する活性を測定した。
【００９５】
実施例１３  ヤロウィア・リポリティカ NBRC0746由来環状エノンを生産する形質転換酵母の作製
ヤロウィア・リポリティカ NBRC0746由来の環状エノンをコードする遺伝子配列を元にORFクローニング用のプライマー3（配列番号：５）、プライマー4（配列番号：６）を合成した。プライマーを各100 pmol、dNTP 0.2 mmol、ヤロウィア・リポリティカNBRC0746由来染色体DNA 50 ng、硫酸マグネシウム 1 mM、KOD -Plus- PCR用緩衝液、KOD -Plus- polymerase 0.2 Uを含む50μLの反応液を用い、初期変性後（94℃、2分）、変性（94℃、15秒）、アニール（58℃、30秒）、伸張（68℃、2分30秒）を30サイクル、S1000 Thermal Cycler (BIO RAD社製) を用いて行った。PCR後、増幅した遺伝子と発現用ベクターpPCIZAをEcoR IとXho Iで消化し、T4 DNA Ligaseを用いて、ライゲーションし、酵母Pichia pastoris X-33を形質転換した。
【００９６】
配列番号：５：TCGAAACGAGGAATTCAAAAAAATGTCAACTGTCAACCTTTTC 
配列番号：６：GCCGCGGCTCGAG TTACTGCTTCAGCTCCTGAT
【００９７】
実施例１４  組換え環状エノン還元酵素の酵母による生産
環状エノン還元酵素を発現するプラスミドpPCIZAで形質転換された酵母Pichia pastorisを、100μg/mL ゼオシン (Invitrogen製)を含む5 mLのＹＰＤ培地で30℃、24時間振とう培養した。50μLの培養液を100 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.0、1.34% yeast nitrogen base without amino acid、4×10-5% ビオチン、0.36% 硫酸アンモニウム、1% グリセロールを含む培地 10 mLで28℃、２日間振とう培養した。遠心分離(6,000 × g, 4℃, 5 min)で菌体を回収し、100 mM リン酸カリウム緩衝液 pH 7.0、1.34% yeast nitrogen base without amino acid、4 × 10-5% ビオチン、0.36% 硫酸アンモニウム、0.5% メタノールを含む培地 10 mL に移し、28℃で振とう培養した。24時間毎にメタノールを添加し、72時間振とう培養した後、遠心分離(6,000 × g, 4℃, 5 min)で菌体を回収した。菌体を100 mMリン酸カリウム緩衝液で洗浄後、300 mM グルコースを含む10 mLのリン酸カリウム緩衝液に懸濁した。
【００９８】
実施例１５  精製酵素を用いたシクロへキセノンの還元
実施例１で得られた酵素 3.4 U (シクロへキセノンに対して)、100 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）、20 mM NADPH、2.0 mM シクロへキセノン、10 mMグルタミン酸、及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ 2 Uを含む反応液1 mLで、30℃で24時間反応させ、以下の条件（分析条件１）でGC/MS分析を行った。その結果、反応生成物はシクロヘキサノン標準品と同様に10.5 minに溶出した。シクロへキセノンは12.1 minに溶出した。生成したシクロヘキサノンをGC/MSで定量し、出発物質であるシクロへキセノンに対するモル収率を求めた結果、反応収率91.1 %でシクロヘキサノンが生成していた。GC/MSの全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を図８に示す。
【００９９】
GC/MSシステム
分析条件１
GC/MSシステム：島津製作所社製「GC/MS-QP2010 plus」
カラム：GLサイエンス社製「TC-70 column」（φ 0.25μm, 0.25 mm×60 m）
カラム初期温度：60℃
保持時間：3 min
昇温速度：10.2℃/min
到達温度：290℃
キャリアガス：ヘリウム
流速：30 cm/s 
キャリアガス圧力：149 kPa
イオン源温度：200℃
【０１００】
実施例１６  精製酵素を用いた３−メチルシクロへキセノンの還元
2.0 mM ３−メチルシクロへキセノンを出発物質として、実施例１５と同様の条件で反応を行い、分析条件１でGC/MS分析を行った。その結果、反応生成物は３−メチルシクロヘキサノン標準品と同様に10.8 minに溶出した。３−メチルシクロヘキセノンは14.6 minに溶出した。生成した３−メチルシクロヘキサノンをGC/MSで定量し、出発物質である３−メチルシクロへキセノンに対するモル収率を求めた結果、反応収率25.2 %で３−メチルシクロへキサノンが生成していた。GC/MSのイオンクロマトグラム（m/z 112）を図９に示す。
【０１０１】
立体化学の確認を以下に示した分析条件（分析条件２）で行った結果、生成物は(S)-３−メチルシクロヘキサノンと同様に8.15 minに溶出した。(R)-３−メチルシクロヘキサノンは8.04 minに溶出する。反応はＳ選択的に進行しており、生成物のエナンチオマー過剰率は100%であった。（図１０）
【０１０２】
分析条件２
GC/MSシステム：島津製作所社製「GC/MS-QP2010 plus」
カラム：シグマアルドリッチ社製「Beta DexTM 325 column」（φ 0.25μm, 0.25 mm × 30 m）
カラム初期温度：80℃
保持時間：5 min
昇温速度：5℃/min
到達温度：230℃
キャリアガス：ヘリウム
流速：28 cm/s 
キャリアガス圧力：150 kPa
イオン源温度：230℃
【０１０３】
実施例１７  精製酵素を用いたシクロドデセノンの還元
3.0 mM シクロドデセノンを出発物質として、実施例１５と同様の条件で反応を行い、分析条件１で反応液の酢酸エチル抽出物のGC/MS分析を行った。その結果、反応生成物はシクロドデカノン標準品と同様に17.8 minに溶出した。シクロドデセノンは20.1 minに溶出した。生成したシクロドデカノンをGC/MSで定量し、出発物質であるシクロドデセノンに対するモル収率を求めた結果、反応収率9.9 %でシクロドデカノンが生成していた。GC/MSの全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）を図１１に示す。
【０１０４】
実施例１９  精製酵素を用いたシクロペンタデセノンの還元
3.0 mM シクロペンタデセノンを出発物質として、実施例１５と同様の条件で反応を行い、分析条件１で反応液の酢酸エチル抽出物のGC/MS分析を行った。その結果、反応生成物はシクロペンタデカノン標準品と同様に20.5 minに溶出した。シクロペンタデセノンは22.3 minに溶出した。生成したシクロペンタデカノンをGC/MSで定量し、出発物質であるシクロペンタデセノンに対するモル収率を求めた結果、反応収率0.0025%でシクロペンタデカノンが生成していた。GC/MSのイオンクロマトグラム（m/z 224）を図１２に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明は、環状エノン還元酵素を用いる技術分野に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０６】
配列番号１：環状エノン還元酵素遺伝子の塩基配列
配列番号２：環状エノン還元酵素のアミノ酸配列
配列番号３：ORFクローニング用のプライマー1
配列番号４：ORFクローニング用のプライマー2
配列番号５：ORFクローニング用のプライマー3
配列番号６：ORFクローニング用のプライマー4
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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